(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト塩味受容体のモジュレーターを同定する方法であって：
少なくとも１つのヒト塩味受容体を人工脂質膜において構築すること、ここで、前記ヒト塩味受容体は、少なくとも１つのベータサブユニット、少なくとも１つのガンマサブユニット、および少なくとも１つの配列番号１２のアミノ酸配列を含むデルタサブユニットを含み、
ヒト塩味受容体と試験化合物とを、ナトリウムまたはリチウムの存在下で接触させること、
および
前記試験化合物の非存在下における前記ヒト塩味受容体の生物学的活性と比較した、前記試験化合物の存在下における前記ヒト塩味受容体の生物学的活性の調節を決定すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
ヒト塩味受容体と上皮ナトリウムイオンチャネルアンタゴニストとを接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
人工脂質膜が、ミセル、リポソームまたは脂質二重層である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ヒト塩味受容体の少なくとも２つのサブユニットが、互いと比較して異なる比率で脂質膜に存在する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ハイスループットスクリーニングに適合している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１種のリン脂質と、上皮ナトリウムイオンチャネルもしくは特定の比率の上皮ナトリウムイオンチャネルサブユニットとを含み、少なくとも１つのアルファサブユニット、少なくとも１つのベータサブユニット、少なくとも１つの配列番号１２のアミノ酸配列を含むデルタサブユニット、および少なくとも１つのガンマサブユニットを含む少なくとも１つの上皮ナトリウムイオンチャネルを含む、ヒト塩味受容体のモジュレーターを同定するための人工脂質膜。
【請求項７】
膜がミセル、リポソームまたは脂質二重層である、請求項６に記載の人工脂質膜。
【請求項８】
少なくとも１つのイプシロンサブユニットをさらに含む、請求項６または７に記載の人工脂質膜。
【請求項９】
少なくとも１種のリン脂質と、上皮ナトリウムイオンチャネルもしくは特定の比率の上皮ナトリウムイオンチャネルサブユニットとを含み、少なくとも１つの配列番号１２のアミノ酸配列を含むデルタサブユニット、少なくとも１つのベータサブユニット、および少なくとも１つのガンマサブユニットを含む少なくとも１つの上皮ナトリウムチャネルを含む、ヒト塩味受容体のモジュレーターを同定するための人工脂質膜。
【請求項１０】
膜がミセル、リポソームまたは脂質二重層である、請求項９に記載の人工脂質膜。
【請求項１１】
請求項６〜１０のいずれか一項に記載の人工脂質膜を調製する方法であって：
少なくとも１種のリン脂質を含むミセルまたはリポソームと、上皮ナトリウムイオンチャネルまたは特定の比率の上皮ナトリウムイオンチャネルサブユニットとを混合すること、ここで、前記上皮ナトリウムイオンチャネルまたは上皮ナトリウムイオンチャネルサブユニットは、少なくとも１種の界面活性剤を含む好適な水性緩衝液に溶解しており、
前記ミセルまたはリポソームを、前記上皮ナトリウムイオンチャネルまたは上皮ナトリウムイオンチャネルサブユニットとともに、十分な時間インキュベートすること、および
前記少なくとも１種の界面活性剤を除去すること
を含む、前記方法。
【請求項１２】
平面脂質二重層にプロテオリポソームを再構成することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
塩味知覚のモジュレーターを同定する方法であって：
少なくとも１つの上皮ナトリウムイオンチャネルを人工脂質膜において構築すること、ここで、前記ナトリウムイオンチャネルは、少なくとも１つのベータサブユニット、少なくとも１つのガンマサブユニット、および少なくとも１つの配列番号１２のアミノ酸配列を含むデルタサブユニットを含み、
前記イオンチャネルと試験化合物とを、ナトリウムまたはリチウムの存在下で接触させること、
前記試験化合物の非存在下における前記上皮ナトリウムイオンチャネルの生物学的活性と比較した、前記試験化合物の存在下における前記上皮ナトリウムイオンチャネルの生物学的活性の調節を決定すること、および
前記試験化合物の非存在下における対象の塩味知覚のレベルと、前記試験化合物の存在下における対象の塩味知覚のレベルとを比較すること
を含む、前記方法。
【請求項１４】
細胞ベースのアッセイにおいて、上皮ナトリウムチャネル活性について陽性の候補化合物をスクリーニングする工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１つのベータポリペチドサブユニット、少なくとも１つのガンマポリペチドサブユニット、少なくとも１つのデルタポリペチドサブユニットを含み、ここで前記デルタポリペチドサブユニットが配列番号１２のアミノ酸配列を含む、単離されたヒト塩味受容体。
【請求項１６】
デルタポリペチドサブユニットが配列番号９のアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載の単離されたヒト塩味受容体。
【請求項１７】
ヒト塩味受容体のモジュレーターを同定するためのキットであって：
少なくとも１種のリン脂質、
デルタサブユニット、ベータサブユニット、および配列番号１２のアミノ酸配列を含むガンマサブユニットを含む、実質的に精製された上皮ナトリウムイオンチャネルサブユニット、
を含み、
任意に、上皮ナトリウムイオンチャネルモジュレーター、ナトリウムまたはリチウム、
および
ヒト塩味受容体のモジュレーターを同定する方法において前記キットを使用するための指示
を含む、前記キット。
【請求項１８】
サブユニットが単一の容器内で既知の比率で混合されている、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
少なくとも２つのサブユニットが、互いと比較して異なる比率で存在する、請求項１７または１８に記載のキット。
【請求項２０】
モジュレーターが、アミロライド、フェナミル、ベンザミル、クロルヘキシジンまたはグアニジンイオンの給源または有機ポリアミンである、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は２００６年１０月１９日出願の米国仮出願第６０／８５３，２９０号の利益を主張し、その全内容は、その全体があらゆるの目的のために、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
分野
本発明は、一般的には細胞生物学の分野に関する。より具体的には、本発明はナトリウムイオンチャネルおよびヒトでの塩味認識におけるその役割に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
特許、公開された出願、技術論文および学術論文を含む種々の出版物が本明細書中に引用されている。これらの引用された出版物の各々は、その全体があらゆるの目的のために、本明細書中の参照によって組み込まれる。
【０００４】
ナトリウムは、体の代謝において重要な役割を演じており、これは、とりわけ、電気刺激の伝達ならびに体液および電解質のホメオスタシスを含む。そのうえ、ナトリウムは動物、特にヒトによって摂取される種々の食品における風味の発現および安定性に寄与している。ナトリウムイオンはある種の刺激の苦味を妨げ、それによって食物の味を調節することができる。苦味に対するナトリウムのこの抑制効果は、ナトリウムイオンを含んでいる化合物の塩味に依存せず、むしろナトリウムイオンの濃度に依存する。
【０００５】
ナトリウムの過剰な摂取は、しかしながら、胃がんおよび高血圧を含む種々の疾病状態に関係している。高血圧は、心疾患、脳卒中および腎臓病の主要なリスク因子である。過剰なナトリウム消費の潜在的にネガティブな健康への影響のため、米国ＦＤＡは、成人にその摂取量を１日あたりナトリウム２４００ミリグラム未満に制限するよう推奨している。それでも、アメリカ人は一般的にこの推奨された許可量を大幅に超過している。このように、種々の医学団体や科学団体は、ナトリウム摂取の劇的な低減を推奨している。
【０００６】
ナトリウム摂取を低減するという目標を推進するために、多数の塩味模倣物質および塩味増強物質が開発された。一般に、かかる模倣物質は、これらが塩化ナトリウムのクリーンな塩味を欠いており、そのほとんどが食品の風味にナトリウム塩のようには影響を与えないことから、商業的に実現可能ではなかった。
【０００７】
代用塩として一般に知られている塩味模倣物質の不足は、味覚受容体の極端な構造特異性を反映している。知られている限りでは、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）および塩化リチウム（ＬｉＣｌ）のみが真の塩味をもたらす。ＮａおよびＬｉと対になったより重いアニオン、そして、Ｃｌと対になったより重いカチオンは、いずれも苦くなる傾向がある。カチオン特異性はイオンチャネルを示唆し、一方、塩化物の効果は細胞間シャント（paracellular shunt）を示唆する。さらに、ＮａＣｌが塩味を与える濃度は５０ｍＭを超えており、これは受容体プロセスの上限の濃度である。これらの２つの知見−ＮａおよびＬｉについての特異性、および有効濃度範囲−は、ヒトにおける塩味のメカニズムを見出す鍵になると考えられている。
【０００８】
過去２０年の間、特定の阻害物質および増強物質の存在下または非存在下における神経活動の、塩によって誘導された変化に関する質的および量的な多数の研究は、上皮ナトリウムチャネル（ＥＮａＣ）が塩味に関する主要な受容体として作用するという仮説を導いた（Brand et al. (1985) Brain Res. 334:207-14、Feigin et al. (1994) Am. J. Physiol. 266(Cell Physiol):C1165-72、および、Brelin et al. (2006) Adv. Otorhinolaryngol. 63:152-90)。ＥＮａＣは多くの実験動物において塩受容体として機能しているが（Halpern, BP (1998) Neurosci. Biobehav. Rev. 23(1):5-47）、同じことがヒトにも当てはまるという決定的証拠は明らかにならなかった。特に、ヒトにおいてアミロライドがナトリウムによって誘導された塩味反応を阻害することができないことは、ＥＮａＣがヒトの塩味認識に、少なくとも他の動物で観察される程には関与していないことを示唆する。
【０００９】
このヒトと動物モデルとの間の相違のため、ヒトにおける塩味知覚の基礎をなしている伝達機構は、依然研究中である。神経の十分な活性化は、結局より高い皮質野で塩味の感覚を引き起こす（Schoenfeld, MA  et al. (2004) Neuroscience. 127:347-53）。
【００１０】
多くの齧歯動物の味覚細胞がアミロライドに対して示す強い反応のため、これらの細胞のＥＮａＣは、タイトジャンクションのレベルより上の頂端膜に主に位置すると推測される。この位置は、これらがアミロライドなどの薬物の作用の影響を受けやすくする。アミロライドはタイトジャンクションを通過することができないと推測される。頂端膜において直接的な機構を増大させるのは、タイトジャンクションレベル以下の味蕾の側底部への細胞間シャント経路である（Mierson, S et al. (1996) J. Neurophysiol. 76:1297-309）。ナトリウムはタイトジャンクションを通過することができるため、細胞間機構はアミロライド不応性の塩味反応をもたらすはずである。大多数の味覚細胞ＥＮａＣがこれらのタイトジャンクションの下に位置するため、ヒトの塩味反応はアミロライド不応性である可能性がある。塩知覚のための他の機構が存在し得る。これらは、ＥＮａＣとは全く異なるか、またはナトリウム負荷によるＥＮａＣの代替的な作用であるか、またはＥＮａＣの発現または組成に対するホルモンの影響である可能性がある。
【００１１】
ＥＮａＣは、上皮におけるナトリウム透過を媒介するカチオンチャネルタンパク質のファミリーを含む（Mano, I et al. (1999) Bioessays 21:568-78）。発現クローニングは、当初３つの相同遺伝子があり、それぞれチャンネルの３つのサブユニットの１つ−すなわち、アルファ（α）、ベータ（β）およびガンマ（γ）をコードしていることを示した（Canessa, CM et al. (1994) Nature 367:463-7）。３つすべてのサブユニットの共発現は最大のＮａ＋チャネル活性にとって不可欠であるが、αサブユニットはそれ自体によりわずかな電流を生じる。第４のサブユニットであるデルタ（δ）が後にクローニングされ、構造的にも機能的にもαサブユニットと類似しているが、アミロライドに対して３０倍低い親和性を有することが示された（Waldmann et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:27411-4）。この低いアミロライド感受性は、ＰｒｅＭＲ２配列と呼ばれるモチーフに反映されていると推測される。ＥＮａＣの膜貫通トポロジーは、長い細胞外ループに隣接する、細胞内アミノ末端およびカルボキシル末端を有する２つの疎水性膜貫通ドメインを含む。ＥＮａＣのサブユニットの化学量論比は、ラットでα２βγ構成（Firsov et al. (1998) EMBO J. 17:344-52）、ヒトでα（１）β（１）γ（１）構成（Staruschenko, A (2005) Biophys. J. 88:3966-75）である証拠があるため、種特異的かつ組織特異的である可能性がある。
【００１２】
健全性および健康の向上のために、ナトリウム摂取を減らす必要がある。この必要性は、ナトリウム味に対する欲求および食品に改善された風味を与えるナトリウムの能力とバランスをとる必要がある。ナトリウム風味を犠牲にすることなく食事のナトリウムを減らす１つの魅力的な手段は、塩味のモジュレーターを用いることである。したがって、塩味知覚のための明確な受容体を確立するニーズ、および、塩味知覚のモジュレーターを同定する手段に対するニーズがある。
【発明の概要】
【００１３】
概要
本発明は、少なくとも１つのベータポリペチドサブユニット、少なくとも１つのガンマポリペチドサブユニット、および少なくとも１つのデルタポリペチドサブユニットを含む単離されたヒトの塩味受容体を提供し、ここで、デルタポリペチドサブユニットは配列番号１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの側面において、デルタポリペチドサブユニットは、配列番号９のアミノ酸配列を有する。また、少なくとも１つのアルファポリペチドサブユニット、少なくとも１つのベータポリペチドサブユニット、少なくとも１つのデルタポリペチドサブユニット、および少なくとも１つのガンマポリペチドサブユニットを含む、単離されたヒトの塩味受容体も提供される。
【００１４】
本発明はまた、上皮ナトリウムイオンチャネルのモジュレーターを同定するための方法を提供する。かかる方法は、少なくとも１つの上皮ナトリウムイオンチャネルを脂質膜において構築すること（ここで、上皮ナトリウムイオンチャネルは少なくとも３種類のサブユニットを含み、これらは独立して、アルファサブユニット、ベータサブユニット、ガンマサブユニット、デルタサブユニットおよびイプシロンサブユニットである）、イオンチャネルと試験化合物とを、ナトリウムイオンまたはリチウムイオンの存在下で接触させること、および、試験化合物の非存在下における上皮ナトリウムイオンチャネルの生物学的活性と比較した、試験化合物の存在下における上皮ナトリウムイオンチャネルの生物学的活性の調節（modulation）を決定することを含む。脂質膜は、好ましくは人工膜である。
【００１５】
いくつかの側面では、上皮イオンチャネルは、１つのアルファサブユニット、１つのベータサブユニット、および１つのガンマサブユニットを含む。別の側面では、上皮イオンチャネルは、１つのアルファサブユニット、１つのベータサブユニット、１つのガンマサブユニット、および１つのイプシロンサブユニットを含む。別の側面では、上皮イオンチャネルは、２つのアルファサブユニット、１つのベータサブユニット、および１つのガンマサブユニットを含む。さらなる側面では、上皮イオンチャネルは、３つのアルファサブユニット、３つのベータサブユニット、および３つのガンマサブユニットを含む。追加の側面は、上皮イオンチャネルが１つのデルタサブユニット、１つのベータサブユニット、および１つのガンマサブユニットを含むものを含む。別の側面では、上皮イオンチャネルは、２つのデルタサブユニット、１つのベータサブユニット、および１つのガンマサブユニットを含む。さらに別の側面では、上皮イオンチャネルは、２つのデルタサブユニット、２つのベータサブユニット、および２つのガンマサブユニットを含む。さらに別の側面では、上皮イオンチャネルは、３つのデルタサブユニット、３つのベータサブユニット、および３つのガンマサブユニットを含む。
【００１６】
上皮ナトリウムチャネルのモジュレーターを同定する方法において、該方法は、上皮ナトリウムイオンチャネルを、上皮ナトリウムイオンチャネルアンタゴニスト、例えば、限定することなく、クロルヘキシジン、アミロライド、フェナミル、ベンザミル、またはこれらのホモログ、アナログもしくは誘導体などと接触させることをさらに含んでもよい。
【００１７】
上皮ナトリウムチャネルのモジュレーターを同定する方法において、膜のための適当な脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリシン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、コレステロール、カルジオリピン、またはこれらのホモログ、アナログもしくは誘導体の少なくとも１つを含む。このようにして、脂質は、ミセル、リポソームまたは脂質二重層として組織され得る。
【００１８】
上皮ナトリウムチャネルのモジュレーターを同定する方法のいくつかの側面では、上皮ナトリウムイオンチャネルの少なくとも２つのサブユニットは、互いと比較して異なる比率で脂質膜に存在している。
【００１９】
上皮ナトリウムイオンチャネルの生物学的活性の調節を決定するための工程において、例えば、当該技術分野で知られている任意の好適な手段、例えば、限定することなく、電圧クランピング、および／または指示色素の測定などを用いることができる。本方法は、ハイスループットスクリーニングに適合させることができる。
【００２０】
このように、上皮ナトリウムチャネルのモジュレーターを同定する方法は、上皮ナトリウムチャネルのモジュレーターとして作用する、同方法によって同定された化合物を提供する。これらの化合物は、化合物を薬学的に許容し得る担体と混合することによって、組成物に製剤化することができる。
【００２１】
特定の側面において、本発明は、ヒト塩味受容体のモジュレーターを同定するための方法であって、脂質膜において少なくとも１つの塩味受容体を構築すること（ここで、該塩味受容体は少なくとも１つのベータサブユニット、少なくとも１つのガンマサブユニット、および少なくとも１つのデルタサブユニットを含む）、イオンチャネルと試験化合物とを、ナトリウムイオンまたはリチウムイオンの存在下で接触させること、および、試験化合物の非存在下における塩味受容体の生物学的活性と比較した、試験化合物の存在下における塩味受容体の生物学的活性の調節を決定することを含む。
【００２２】
いくつかの側面では、ヒト塩味受容体は、１つのアルファサブユニット、１つのベータサブユニット、および１つのガンマサブユニットを含む。別の側面では、塩味受容体は、１つのアルファサブユニット、１つのベータサブユニット、１つのガンマサブユニット、および１つのイプシロンサブユニットを含む。別の側面では、塩味受容体は、２つのアルファサブユニット、１つのベータサブユニット、および１つのガンマサブユニットを含む。さらなる側面では、塩味受容体は、３つのアルファサブユニット、３つのベータサブユニット、および３つのガンマサブユニットを含む。追加の側面は、塩味受容体が１つのデルタサブユニット、１つのベータサブユニット、および１つのガンマサブユニットを含むものを含む。別の側面では、塩味受容体は、２つのデルタサブユニット、１つのベータサブユニット、および１つのガンマサブユニットを含む。さらに別の側面では、塩味受容体は、２つのデルタサブユニット、２つのベータサブユニット、および２つのガンマサブユニットを含む。さらに別の側面では、塩味受容体は、３つのデルタサブユニット、３つのベータサブユニット、および３つのガンマサブユニットを含む。
【００２３】
ヒト塩味受容体のモジュレーターを同定する方法において、デルタサブユニットは、好ましくは配列番号１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの側面では、デルタ受容体は配列番号９のアミノ酸配列を含む。ヒト塩味受容体のモジュレーターを同定する方法において、該方法は、上皮ナトリウムイオンチャネルを、上皮ナトリウムイオンチャネルアンタゴニスト、例えば、限定することなく、クロルヘキシジン、アミロライド、フェナミル、ベンザミル、またはこれらのホモログ、アナログもしくは誘導体などと接触させることをさらに含んでもよい。
【００２４】
ヒト塩味受容体のモジュレーターを同定する方法において、脂質膜は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリシン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、コレステロール、カルジオリピン、またはこれらのホモログ、アナログもしくは誘導体の少なくとも１つを含んでもよい。脂質は、ミセル、リポソームまたは脂質二重層として組織され得る。
【００２５】
ヒト塩味受容体のモジュレーターを同定する方法のいくつかの側面では、上皮ナトリウムイオンチャネルの少なくとも２つのサブユニットは、互いと比較して異なる比率で脂質膜に存在している。膜におけるチャンネルは、好ましくは、機能的なヒト塩味受容体の少なくとも１つの生物学的活性を含む。
【００２６】
ヒト塩味受容体の生物学的活性の調節を決定するための工程において、例えば、当該技術分野で知られている任意の好適な手段、例えば、限定することなく、電圧クランピング、および／または指示色素の測定などを用いることができる。本方法は、ハイスループットスクリーニングに適合させることができる。
【００２７】
ヒトの塩味知覚を調節する化合物は、本発明の方法によって同定され、例えば、塩味模倣物質(mimic)、塩味増強物質(enhancer)、塩味修飾物質(modifier)および塩味阻害物質(inhibitor))を含んでもよい。したがって、本発明はヒトの塩味知覚のモジュレーターを提供し、これはさらに、当該化合物を薬学的に許容し得る担体と混合することにより組成物に用いることができ、または食品もしくは飲料において、当該食品もしくは飲料の塩味知覚を調節するために用いることができる。
【００２８】
本発明はまた、少なくとも１種のリン脂質と、上皮ナトリウムイオンチャネルまたは特定の比率の上皮ナトリウムイオンチャネルサブユニット（ここで、サブユニットは、アルファサブユニット、ベータサブユニット、ガンマサブユニット、デルタサブユニット、およびイプシロンサブユニットからなる群から選択される）とを含む人工脂質膜を提供する。
【００２９】
人工脂質膜は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリシン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、コレステロール、カルジオリピン、またはこれらのホモログ、アナログもしくは誘導体の少なくとも１つを含んでもよい。脂質膜は、例えば、リポソームまたは脂質二重層として組織され得る。
【００３０】
いくつかの側面では、人工脂質膜は、１つのアルファサブユニット、１つのベータサブユニット、および１つのガンマサブユニットを含む、少なくとも１つの上皮イオンチャネルを含む。別の側面では、上皮イオンチャネルは、１つのアルファサブユニット、１つのベータサブユニット、１つのガンマサブユニット、および１つのイプシロンサブユニットを含む。別の側面では、上皮イオンチャネルは、２つのアルファサブユニット、１つのベータサブユニット、および１つのガンマサブユニットを含む。さらなる側面では、上皮イオンチャネルは、３つのアルファサブユニット、３つのベータサブユニット、および３つのガンマサブユニットを含む。追加の側面は、上皮イオンチャネルが１つのデルタサブユニット、１つのベータサブユニット、および１つのガンマサブユニットを含むものを含む。別の側面では、上皮イオンチャネルは、２つのデルタサブユニット、１つのベータサブユニット、および１つのガンマサブユニットを含む。さらに別の側面では、上皮イオンチャネルは、２つのデルタサブユニット、２つのベータサブユニット、および２つのガンマサブユニットを含む。さらに別の側面では、上皮イオンチャネルは、３つのデルタサブユニット、３つのベータサブユニット、および３つのガンマサブユニットを含む。
【００３１】
本発明はまた、かかる人工脂質膜を調製する方法であって、少なくとも１つのリン脂質を含むリポソームと、上皮ナトリウムイオンチャネルまたは特定の比率の上皮ナトリウムイオンチャネルサブユニット（ここで、上皮ナトリウムイオンチャネルまたは上皮ナトリウムイオンチャネルサブユニットは、少なくとも１つの界面活性剤を含む好適な水性緩衝液に溶解されている）とを混合すること、リポソームを、上皮ナトリウムイオンチャネルまたは上皮ナトリウムイオンチャネルサブユニットとともに十分な時間インキュベートすること、および前記少なくとも１つの界面活性剤を除去することを含む方法を提供する。
【００３２】
人工脂質膜を調製する方法は、プロテオリポソームを平面脂質二重層に再構成することをさらに含んでもよい。
【００３３】
本発明はさらに、塩味知覚のモジュレーターを同定するための方法であって、少なくとも１つの上皮ナトリウムイオンチャネルを脂質膜において構築すること（ここで、上皮ナトリウムイオンチャネルは、アルファサブユニット、ベータサブユニット、ガンマサブユニット、デルタサブユニットまたはイプシロンサブユニットの少なくとも１つを含む）、イオンチャネルと試験化合物とを、ナトリウムイオンまたはリチウムイオンの存在下で接触させること、試験化合物の非存在下における上皮ナトリウムイオンチャネルの生物学的活性と比較した、試験化合物の存在下における上皮ナトリウムイオンチャネルの生物学的活性の調節を決定すること、および、試験化合物を対象に投与して、試験化合物の非存在下における対象の塩味知覚のレベルと比較した、対象の塩味知覚の調節を決定することを含む方法を提供する。
【００３４】
いくつかの側面では、上皮イオンチャネルは、１つのアルファサブユニット、１つのベータサブユニット、および１つのガンマサブユニットを含む。別の側面では、上皮イオンチャネルは、１つのアルファサブユニット、１つのベータサブユニット、１つのガンマサブユニット、および１つのイプシロンサブユニットを含む。別の側面では、上皮イオンチャネルは、２つのアルファサブユニット、１つのベータサブユニット、および１つのガンマサブユニットを含む。さらなる側面では、上皮イオンチャネルは、３つのアルファサブユニット、３つのベータサブユニット、および３つのガンマサブユニットを含む。追加の側面は、上皮イオンチャネルが１つのデルタサブユニット、１つのベータサブユニット、および１つのガンマサブユニットを含むものを含む。別の側面では、上皮イオンチャネルは、２つのデルタサブユニット、１つのベータサブユニット、および１つのガンマサブユニットを含む。さらに別の側面では、上皮イオンチャネルは、２つのデルタサブユニット、２つのベータサブユニット、および２つのガンマサブユニットを含む。さらに別の側面では、上皮イオンチャネルは、３つのデルタサブユニット、３つのベータサブユニット、および３つのガンマサブユニットを含む。
【００３５】
いくつかの側面では、デルタサブユニットは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの側面では、デルタサブユニットは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。
【００３６】
いくつかの側面において、対象はヒトである。
【００３７】
本方法により、in vitroでヒト塩味受容体と反応し、かつ、対象により塩辛いものとして知覚される化合物の同定が可能となる。本発明はしたがって、かかる化合物であって、当該化合物を薬学的に許容し得る担体と混合することにより組成物に用いることができ、または食品もしくは飲料において、当該食品もしくは飲料の塩味知覚を調節するために用いることができる化合物を提供する。好ましくは、該化合物は塩味の知覚を可能にするが、塩と比べて血圧への影響が少なく、かつ、対象に対する有害反応を有しない。
【００３８】
いくつかの側面において、化合物を、細胞ベースのアッセイにより、上皮ナトリウムチャネル活性についてさらにスクリーニングすることができる。
【００３９】
本発明はまた、ヒト塩味受容体のモジュレーターを同定するためのキットであって、少なくとも１つの形態のリン脂質と、アルファサブユニット、デルタサブユニット、ベータサブユニット、ガンマサブユニットまたはイプシロンサブユニットを含む、実質的に精製された上皮ナトリウムイオンチャネルサブユニットとを含み、任意に、上皮ナトリウムイオンチャネルモジュレーター、ナトリウムまたはリチウム、およびヒト塩味受容体のモジュレーターを同定する方法においてキットを使用するための指示を含むキットを提供する。
【００４０】
指示は、例えば、対象となる種々の形態の上皮ナトリウムイオンチャネルを得るために特定の比率でサブユニットを混合するための指図を提供してもよい。いくつかの側面では、少なくとも２つのサブユニットが、互いと比較して異なる比率で存在するように添加される。
【００４１】
本キットは、モジュレーター、例えば、限定することなく、アミロライド、フェナミル、ベンザミル、クロルヘキシジン、またはグアニジンイオンの給源などを含んでもよい。
【００４２】
本発明はまた、（塩味知覚を刺激することまたは塩味知覚を阻害することにより）塩味知覚を調節する方法であって、ヒト塩味受容体と、塩味知覚を刺激する化合物とを接触させることを含み、ここで該塩味受容体が少なくとも１つのベータポリペチドサブユニット、および少なくとも１つのデルタポリペチドサブユニットを含み、該デルタポリペチドサブユニットが配列番号１２のアミノ酸配列を含み、該化合物が該デルタサブユニットと特異的に相互作用する方法を提供する。
【００４３】
いくつかの側面では、ヒト塩味受容体は、１つのアルファサブユニット、１つのベータサブユニット、および１つのガンマサブユニットを含む。別の側面では、塩味受容体は、１つのアルファサブユニット、１つのベータサブユニット、１つのガンマサブユニット、および１つのイプシロンサブユニットを含む。別の側面では、塩味受容体は、２つのアルファサブユニット、１つのベータサブユニット、および１つのガンマサブユニットを含む。さらなる側面では、塩味受容体は、３つのアルファサブユニット、３つのベータサブユニット、および３つのガンマサブユニットを含む。追加の側面は、塩味受容体が１つのデルタサブユニット、１つのベータサブユニット、および１つのガンマサブユニットを含むものを含む。別の側面では、塩味受容体は、２つのデルタサブユニット、１つのベータサブユニット、および１つのガンマサブユニットを含む。さらに別の側面では、塩味受容体は、２つのデルタサブユニット、２つのベータサブユニット、および２つのガンマサブユニットを含む。さらに別の側面では、塩味受容体は、３つのデルタサブユニット、３つのベータサブユニット、および３つのガンマサブユニットを含む。
【００４４】
いくつかの側面では、化合物は、配列番号１２のアミノ酸配列を含むデルタサブユニットの部分と特異的に相互作用する。いくつかの側面では、化合物は、配列番号１２のアミノ酸配列を含むデルタサブユニットの部分と結合する。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、ＡＴＰアーゼ組織化学法によって染色されたヒトの味蕾を示した図である。
【図２】図２は、ヒトの味覚細胞に対する免疫組織化学法を用いた二次メッセンジャー酵素、ホスホリパーゼＣベータ２（ＰＬＣｂｅｔａ２）の抗体による検出を示した図である。パネルＡは、抗体によって標識された細胞のサブセットを示す。パネルＢは、味蕾およびその周囲の茸状乳頭のコントラスト像である。
【００４６】
【図３Ａ】図３Ａは、最上行のGenBank配列（ＤＥＮＡＣＧＢ）と比較した、１０個体（それぞれＤＥＮＡＣＡ、ＤＥＮＡＣＤ、ＤＥＮＡＣＥ、ＤＥＮＡＣＧ、ＤＥＮＡＣＨ、ＤＥＮＡＣＩ、ＤＥＮＡＣＪ、ＤＥＮＡＣＴ、ＤＥＮＡＣＶおよびＤＥＮＡＣＷとラベルされている）のｃＤＮＡからシーケンシングしたＥＮａＣデルタサブユニットのアラインメントを示した図である。ＤＥＮＡＣＡ、ＤＥＮＡＣＤ、ＤＥＮＡＣＥ、ＤＥＮＡＣＧ、ＤＥＮＡＣＨ、ＤＥＮＡＣＩ、ＤＥＮＡＣＪ、ＤＥＮＡＣＴ、ＤＥＮＡＣＶおよびＤＥＮＡＣＷは、それぞれ配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６に対応している。
【図３Ｂ】図３Ｂは、最上行のGenBank配列（ＤＥＮＡＣＧＢ）と比較した、１０個体（それぞれＤＥＮＡＣＡ、ＤＥＮＡＣＤ、ＤＥＮＡＣＥ、ＤＥＮＡＣＧ、ＤＥＮＡＣＨ、ＤＥＮＡＣＩ、ＤＥＮＡＣＪ、ＤＥＮＡＣＴ、ＤＥＮＡＣＶおよびＤＥＮＡＣＷとラベルされている）のｃＤＮＡからシーケンシングしたＥＮａＣデルタサブユニットのアラインメントを示した図である。ＤＥＮＡＣＡ、ＤＥＮＡＣＤ、ＤＥＮＡＣＥ、ＤＥＮＡＣＧ、ＤＥＮＡＣＨ、ＤＥＮＡＣＩ、ＤＥＮＡＣＪ、ＤＥＮＡＣＴ、ＤＥＮＡＣＶおよびＤＥＮＡＣＷは、それぞれ配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６に対応している。
【００４７】
【図３Ｃ】図３Ｃは、最上行のGenBank配列（ＤＥＮＡＣＧＢ）と比較した、１０個体（それぞれＤＥＮＡＣＡ、ＤＥＮＡＣＤ、ＤＥＮＡＣＥ、ＤＥＮＡＣＧ、ＤＥＮＡＣＨ、ＤＥＮＡＣＩ、ＤＥＮＡＣＪ、ＤＥＮＡＣＴ、ＤＥＮＡＣＶおよびＤＥＮＡＣＷとラベルされている）のｃＤＮＡからシーケンシングしたＥＮａＣデルタサブユニットのアラインメントを示した図である。ＤＥＮＡＣＡ、ＤＥＮＡＣＤ、ＤＥＮＡＣＥ、ＤＥＮＡＣＧ、ＤＥＮＡＣＨ、ＤＥＮＡＣＩ、ＤＥＮＡＣＪ、ＤＥＮＡＣＴ、ＤＥＮＡＣＶおよびＤＥＮＡＣＷは、それぞれ配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６に対応している。
【図３Ｄ】図３Ｄは、最上行のGenBank配列（ＤＥＮＡＣＧＢ）と比較した、１０個体（それぞれＤＥＮＡＣＡ、ＤＥＮＡＣＤ、ＤＥＮＡＣＥ、ＤＥＮＡＣＧ、ＤＥＮＡＣＨ、ＤＥＮＡＣＩ、ＤＥＮＡＣＪ、ＤＥＮＡＣＴ、ＤＥＮＡＣＶおよびＤＥＮＡＣＷとラベルされている）のｃＤＮＡからシーケンシングしたＥＮａＣデルタサブユニットのアラインメントを示した図である。ＤＥＮＡＣＡ、ＤＥＮＡＣＤ、ＤＥＮＡＣＥ、ＤＥＮＡＣＧ、ＤＥＮＡＣＨ、ＤＥＮＡＣＩ、ＤＥＮＡＣＪ、ＤＥＮＡＣＴ、ＤＥＮＡＣＶおよびＤＥＮＡＣＷは、それぞれ配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６に対応している。
【００４８】
【図４】図４は、異なる構成のＥＮａＣのアミロライドによる阻害を示した図である。ヒトデルタ、ベータ、ガンマで構成されたＥＮａＣは、ヒトアルファ、ベータ、ガンマから構成されるものよりもアミロライドに対して感受性が低かった。
【図５】図５は、ヒト味蕾における細胞のサブセットの免疫標識を示した図である。
【００４９】
【図６】図６は、水性懸濁液からの、マイクロピペットによる単離されたヒト味蕾細胞の回収を示した図である。このようにして回収された細胞は、さらなる研究のためにＲＮＡ保護媒体中に置く。
【００５０】
【図７】図７は、ＥＮａＣサブユニット、アルファ、ベータ、ガンマおよびデルタの部分的転写物の増幅をトレースした単一細胞の初期の定量ＲＴ−ＰＣＲを示した図である。結果は、アルファ転写物がゲノム対照を示すものとして、細胞が、デルタ、ベータおよびガンマの等量のコピーを含んでいることを示唆している。
【００５１】
【図８Ａ】図８Ａは、最上行のGenBank配列（ＧＥＮＡＣＧＢ）と比較した、１０個体（それぞれＧＥＮＡＣＡ、ＧＥＮＡＣＢ、ＧＥＮＡＣＤ、ＧＥＮＡＣＥ、ＧＥＮＡＣＧ、ＧＥＮＡＣＨ、ＧＥＮＡＣＪ、ＧＥＮＡＣＴ、ＧＥＮＡＣＶおよびＧＥＮＡＣＷとラベルされている）のｃＤＮＡからシーケンシングしたＥＮａＣガンマサブユニットのアラインメントを示した図である。ＧＥＮＡＣＡ、ＧＥＮＡＣＢ、ＧＥＮＡＣＤ、ＧＥＮＡＣＥ、ＧＥＮＡＣＧ、ＧＥＮＡＣＨ、ＧＥＮＡＣＪ、ＧＥＮＡＣＴ、ＧＥＮＡＣＶおよびＧＥＮＡＣＷは、それぞれ配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６に対応している。
【図８Ｂ】図８Ｂは、最上行のGenBank配列（ＧＥＮＡＣＧＢ）と比較した、１０個体（それぞれＧＥＮＡＣＡ、ＧＥＮＡＣＢ、ＧＥＮＡＣＤ、ＧＥＮＡＣＥ、ＧＥＮＡＣＧ、ＧＥＮＡＣＨ、ＧＥＮＡＣＪ、ＧＥＮＡＣＴ、ＧＥＮＡＣＶおよびＧＥＮＡＣＷとラベルされている）のｃＤＮＡからシーケンシングしたＥＮａＣガンマサブユニットのアラインメントを示した図である。ＧＥＮＡＣＡ、ＧＥＮＡＣＢ、ＧＥＮＡＣＤ、ＧＥＮＡＣＥ、ＧＥＮＡＣＧ、ＧＥＮＡＣＨ、ＧＥＮＡＣＪ、ＧＥＮＡＣＴ、ＧＥＮＡＣＶおよびＧＥＮＡＣＷは、それぞれ配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６に対応している。
【００５２】
【図８Ｃ】図８Ｃは、最上行のGenBank配列（ＧＥＮＡＣＧＢ）と比較した、１０個体（それぞれＧＥＮＡＣＡ、ＧＥＮＡＣＢ、ＧＥＮＡＣＤ、ＧＥＮＡＣＥ、ＧＥＮＡＣＧ、ＧＥＮＡＣＨ、ＧＥＮＡＣＪ、ＧＥＮＡＣＴ、ＧＥＮＡＣＶおよびＧＥＮＡＣＷとラベルされている）のｃＤＮＡからシーケンシングしたＥＮａＣガンマサブユニットのアラインメントを示した図である。ＧＥＮＡＣＡ、ＧＥＮＡＣＢ、ＧＥＮＡＣＤ、ＧＥＮＡＣＥ、ＧＥＮＡＣＧ、ＧＥＮＡＣＨ、ＧＥＮＡＣＪ、ＧＥＮＡＣＴ、ＧＥＮＡＣＶおよびＧＥＮＡＣＷは、それぞれ配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６に対応している。
【図８Ｄ】図８Ｄは、最上行のGenBank配列（ＧＥＮＡＣＧＢ）と比較した、１０個体（それぞれＧＥＮＡＣＡ、ＧＥＮＡＣＢ、ＧＥＮＡＣＤ、ＧＥＮＡＣＥ、ＧＥＮＡＣＧ、ＧＥＮＡＣＨ、ＧＥＮＡＣＪ、ＧＥＮＡＣＴ、ＧＥＮＡＣＶおよびＧＥＮＡＣＷとラベルされている）のｃＤＮＡからシーケンシングしたＥＮａＣガンマサブユニットのアラインメントを示した図である。ＧＥＮＡＣＡ、ＧＥＮＡＣＢ、ＧＥＮＡＣＤ、ＧＥＮＡＣＥ、ＧＥＮＡＣＧ、ＧＥＮＡＣＨ、ＧＥＮＡＣＪ、ＧＥＮＡＣＴ、ＧＥＮＡＣＶおよびＧＥＮＡＣＷは、それぞれ配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６に対応している。
【００５３】
【図９】図９は、平面脂質二重層における、Ｌ−アルギニンに対するナマズの推定味覚受容体活動のシングルチャンネル記録を示した図である。ナマズ味覚上皮からの精製された受容体タンパク質を含むプロテオリポソームを平面脂質二重層に融合させた。対照記録（パートＡに示されるトレース）は、プロテオリポソームを膜浴溶液（membrane bathing solution）に添加後、Ｌ−Ａｒｇ添加前に得た。二重層のシス側への１０μＭのＬ−Ａｒｇの添加は、規則的で周期的なチャンネル活動を引き起こした（当該記録を拡大目盛で示す差し込み図を含むパネルＢに示されるトレース）。数分のシングルチャンネル記録の後、１００μＭのＤ−Ａｒｇをシス側に添加し（パネルＣに示されるトレース）、活動は停止した。膜電位は−１００ｍＶであった。全てのパネルに示されるトレースは、この特定の状態の連続した記録である。
【００５４】
詳細な説明
当然のことながら、この発明は、特定の方法、試薬、化合物、組成物または生物系に限定されず、もちろん多様であり得る。また当然のことながら、ここで用いる用語は特定の側面だけを記述することを目的としているに過ぎず、限定することを意図するものではない。
【００５５】
本発明の方法および別の側面に関する種々の用語が、明細書および特許請求の範囲を通して用いられている。かかる用語は、特に明記しない限り、当該技術分野におけるその通常の意味が与えられることとする。他の具体的に定義された用語は、ここに提供される定義と一致した方法で解釈することとする。
【００５６】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いる場合、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈が明確に別様に決定づけない限り、複数の指示物を含む。したがって、例えば、単数形の「細胞」への言及は、２個または３個以上の細胞の組合わせなどを包含する。
【００５７】
ここで用いる用語「約」は、量、継続時間などの測定可能な値を示す場合、特定された値から±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、より一層好ましくは±１％、そしてさらにより好ましくは±０．１％の変動を包含することを意味し、かかる変動は開示された方法を実行するために適している。
【００５８】
ここで用いる場合、「上皮ナトリウムチャネル」または省略形の「ＥＮａＣ」は、特定の上皮または細胞膜を横切る、ナトリウムイオンの流れまたは輸送の原因となるマルチサブユニットタンパク質を指す。ＥＮａＣは一般的に複数のサブユニット、通常はα、β、γサブユニットから構成される。また、特定の組織の一部のＥＮａＣに存在することがあるδおよびεサブユニットもある。ここで見出された「塩味受容体」は、味覚細胞に局在するＥＮａＣの１種であり、一側面において、β、γ、およびδサブユニットで構成される。
【００５９】
ここで用いる場合、「試験化合物」は、任意の精製された分子、実質的に精製された分子、化合物の混合物の１または２以上の成分である分子、または化合物と、本発明の方法を用いて分析することができる任意の他の材料との混合物を指す。試験化合物は、有機もしくは無機化学物質、または生体分子、ならびにそのすべての断片、アナログ、ホモログ、結合体（conjugate）および誘導体であってもよい。生体分子は、タンパク質、ポリペチド、核酸、脂質、単糖、多糖、ならびにそのすべての断片、アナログ、ホモログ、結合体および誘導体を含む。試験化合物は天然由来であっても合成由来であってもよく、その天然に存在する給源から単離もしくは精製されても、de novo合成されてもよい。試験化合物は構造または組成に関して定義されていてもよく、または、未定義（undefined）であってもよい。化合物は、未知の構造の単離された製品であっても、複数の既知の物質の混合物であっても、または１種または２種以上の化合物を含む未定義の組成物であってもよい。未定義の組成物の例は、細胞および組織抽出物、原核細胞や真核細胞、古細菌細胞が培養された増殖培地、発酵ブロス、タンパク質発現ライブラリーなどを含む。
【００６０】
ここで用いる場合、「調節する」は、タンパク質の特定の活性の量、質または効果の任意の変化、増大または減少を意味する。「モジュレーター」は、例えば、アゴニスト、アンタゴニストについてのin vitroおよびin vivoアッセイを用いて同定した任意の阻害性分子または活性化分子、および、ここで定義された断片、変異体および模倣物を含むこれらのホモログであって、前記分子と実質的に同じ生物学的活性を示すものを指す。「阻害物質」または「アンタゴニスト」は、対象とする分子もしくは経路を低減し、減少させ、遮断し、妨げ、活性化を遅延させ、不活性化し、脱感作させ（desensitize）、またはその生物学的活性または発現を下方調節する調節化合物である。「インデューサー」、「アクチベーター」または「アゴニスト」は、対象とする分子もしくは経路を増大させ、誘導し、刺激し、開放し、活性化し、促進し、活性化を増進させ、感受性を高め、または上方調節する調節化合物である。本発明のいくつかの好ましい側面において、対象とする分子もしくは経路の生物学的活性または発現の阻害または上方調節のレベルは、約５０％〜約９９％より大きい、より具体的には、約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の減少（阻害または下方調節）または増加（上方調節）を指す。阻害または上方調節は直接的であっても、すなわち、対象とする分子もしくは経路自体に作用しても、または間接的であっても、すなわち、対象とする分子もしくは経路に影響を及ぼす分子もしくは経路に作用してもよい。
【００６１】
「薬学的に許容し得る担体」は、組成物の１種または２種以上の有効成分の生物学的活性の有効性を妨げず、それが投与される対象に対して毒性ではない媒体を指す。
【００６２】
「Ｃｔ」または「閾値サイクル」は、ベースラインシグナルより上の、顕著なリポーター蛍光の増加が最初に検出されるＰＣＲサイクルを指す。
【００６３】
「ΔＣｔ」は、サンプルアッセイのＣｔと対照サンプルのＣｔとの差を指す。したがって、ΔＣｔ＝Ｃｔ（標的）−Ｃｔ（対照）である。
【００６４】
「ΔΔＣｔ」は、標的サンプルの平均ΔＣｔ値と、対応するキャリブレーターサンプルの平均ΔＣｔ値との差を指す。したがって、ΔΔＣｔ（試験サンプル）＝ＡｖｇΔＣｔ（試験サンプル）−ＡｖｇΔＣｔ（キャリブレーターサンプル）である。
【００６５】
ここで用いる「生物学的活性」は、限定することなく、膜を隔てたナトリウム勾配の維持、イオン流量の変化、膜電位の変化、電流の振幅、電位開口、クロルヘキシジン、アミロライドまたはそのアナログに対する感受性、ブレチリウム、ノボビオシンまたはグアニジンイオンによる刺激、サブユニット特異的モノクローナル抗体への結合などを含む、ＥＮａＣの測定可能な機能を指す。
【００６６】
本発明は、ヒト塩味受容体が上皮ナトリウムイオンチャネルであるという知見に基づく。したがって、本発明の１つの目的は、ＥＮａＣサブユニットの正確なモル比を用い、ＥＮａＣの生物学的活性を調節する化合物を同定するために脂質二重層にＥＮａＣを再構成することである。特に、本発明の１つの目的は、ＥＮａＣサブユニットの正確なモル比を用いて、ＥＮａＣの生物学的活性を調節する化合物を同定するため、および、ヒトにおける塩味知覚を調節する化合物を同定するために、脂質二重層にＥＮａＣを再構成することである。いかなる特定の理論または作用機序に制限されることをも意図することなく、ある種の味覚受容体細胞の上皮ナトリウムチャネルを通してのナトリウムイオンの受動的な流入によって、脱分極をもたらす細胞内イオンバランスの変化が生じ、最終的に神経伝達物質の放出がもたらされ、これが今度は塩味の知覚を生じると考えられている。
【００６７】
一側面において、本発明は、ヒト塩味受容体を結合および／または調節する化合物を同定するためのアッセイを提供する。この方法は、脂質膜において少なくとも１つの上皮ナトリウムイオンチャネルを構築すること（ここで、上皮ナトリウムイオンチャネルは、アルファ、ベータ、ガンマまたはデルタサブユニットを含む）、少なくとも１つのイオンチャネルと試験化合物とを、ナトリウムまたはリチウムの存在下で接触させること、および、試験化合物の非存在下における前記少なくとも１つのイオンチャネルの生物学的活性と比較した、試験化合物の存在下における前記少なくとも１つのイオンチャネルの生物学的活性の調節を決定することを含む。
【００６８】
試験化合物を含んでいるサンプルの生物学的活性が試験化合物を欠くサンプルの活性より高い場合、当該化合物はアゴニストである。試験化合物を含んでいるサンプルの活性が試験化合物を欠くサンプルの活性より低いならば、当該化合物はアンタゴニストである。
【００６９】
上皮ナトリウムイオンチャネルは、異なるサブユニットを含むヘテロ多量体複合体である。ＥＮａＣの種々のサブユニットが同定されており、これは、限定することなく、アルファサブユニット、ベータサブユニット、ガンマサブユニット、デルタサブユニット、およびイプシロンサブユニットを含む。ＥＮａＣサブユニットは任意の種に由来してもよいが、哺乳類ＥＮａＣサブユニットが好ましく、最も好ましい種はヒトである。ヒトのＥＮａＣサブユニットをコードする核酸配列および推定アミノ酸配列の例は、本明細書に示されている。実質的に相同なアミノ酸配列を有する、または、サブユニットタンパク質のアイソフォームである他のサブユニットを、本発明を実行する際に用いてもよい。「実質的に相同な」アミノ酸配列は、少なくとも、サブユニット配列に関して本明細書に示されている配列と、約８０％〜約１００％同一であるタンパク質配列である。より好ましくは、配列は約８５％〜約１００％同一である。最も好ましくは、配列は、サブユニットに関して本明細書に記載されている参照配列と約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。
【００７０】
ヒトアルファサブユニット、ヒトベータサブユニット、ヒトガンマサブユニット、およびヒトデルタサブユニットをコードする代表的なヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７として示されている。ヒトアルファサブユニット、ヒトベータサブユニット、ヒトガンマサブユニット、およびヒトデルタサブユニットに対する推定アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８として示されている。塩味受容体に関する好ましい側面では、デルタサブユニットは、配列番号８に関して、５３２位にシステインを含む。Ｃｙｓ５３２を有するデルタ受容体は、配列番号９で示される。かかる置換は、ｔａｃからｔｇｃへのトリプレットコドンにおける変更により生じることがあり（配列番号７で示されるものに関して）、これはチロシン（Ｔｙｒ）からシステイン（Ｃｙｓ）への変化をもたらす。
【００７１】
いくつかの側面では、ＥＮａＣは、少なくとも１つのアルファサブユニット、少なくとも１つのベータサブユニット、および少なくとも１つのガンマサブユニットを含む（例えば、（α）１（β）１（γ）１）。別の側面では、ＥＮａＣは少なくとも１つのアルファサブユニット、少なくとも１つのベータサブユニット、少なくとも１つのガンマサブユニット、および少なくとも１つのデルタサブユニットを含む。別の側面では、ＥＮａＣは２つのアルファサブユニット、１つのベータサブユニット、１つのガンマサブユニットで構成される（α２βγ）。別の側面では、ＥＮａＣは３つのアルファサブユニット、３つのベータサブユニット、および３つのガンマサブユニットで構成される（（α）３（β）３（γ）３）。別な側面では、ＥＮａＣは、イプシロンサブユニットと、少なくとも１つの他のサブユニット、例えばアルファサブユニット、ベータサブユニット、デルタサブユニット、ガンマサブユニットまたはこれらの組合せとを含む。さらに別の側面では、ＥＮａＣは複数のベータサブユニットを含む。好ましい側面では、ＥＮａＣは少なくとも１つのベータサブユニット、少なくとも１つのガンマサブユニット、および少なくとも１つのデルタサブユニットを含む（塩味受容体）。最も好ましい側面は、少なくとも１つのベータサブユニット、少なくとも１つのガンマサブユニットおよび少なくとも１つのデルタサブユニットを含み（例えば（β）１（γ）１（δ）１）、デルタサブユニットがＣｙｓ５３２を含むＥＮａＣである。
【００７２】
種々のサブユニットは、ＥＮａＣにおいて、他のサブユニットと比較して異なる比率で存在してもよい。観察されるバリエーションは、対象とする特定のＥＮａＣがどの組織に発現されているかに関係していることがある。例えば、限定することなく、ＥＮａＣは２つのアルファサブユニット、１つのベータサブユニットおよび１つのガンマサブユニットを含んでもよい。したがって、本発明の特定の側面では、脂質膜に構築されたＥＮａＣは、他のサブユニットと比較して異なる比率で存在する少なくとも２つのサブユニットを含む。別の側面では、ＥＮａＣは他のサブユニットと比較して同じ比率で存在する少なくとも２つのサブユニットを含む。ＥＮａＣサブユニットの比率はまた、対象とするＥＮａＣが発現される組織に応じて異なり得る。さらに、種々の組織で発現される各々のサブユニットの形態に、重大な配列の多様性が存在し得る。例えば、限定することなく、塩味受容体に発現されているＥＮａＣのデルタサブユニットは、好ましくは配列番号８（腎臓由来のヒトデルタをコードする）の５３２位のデルタの推定アミロライド結合部位にシステインを有する。ヒト腎臓デルタは、この位置にチロシンを有する。したがって、ヒト塩味受容体を発現させる場合、ＣＹＳ５３２を含むＭＧＳＬＣＳＬＷＦＧＡ（配列番号１２）の推定アミロライド結合部位を有するデルタを用いることが好ましい。このモチーフは、少なくともアミロライド結合の推定部位であるため、ヒト塩味受容体を調節する他の化合物もまた、この部位に結合することができる。
【００７３】
本発明の特定の側面では、その中にＥＮａＣサブユニットを有するように製造された脂質膜は、塩味受容体を形成するＥＮａＣサブユニットを含む。これらの塩味受容体は、少なくとも１つのベータサブユニット、少なくとも１つのガンマサブユニットおよび少なくとも１つのデルタサブユニットを含む。好ましい側面では、デルタサブユニットは、Ｃｙｓ５３２を含む。別の側面では、ＥＮａＣはアルファ、ベータ、ガンマ、デルタおよびイプシロンから選択されるサブユニットを含む。いくつかの側面では、ＥＮａＣは少なくとも１つのアルファ、少なくとも１つのベータおよび少なくとも１つのガンマを含む。別の側面では、ＥＮａＣは少なくとも１つのイプシロンサブユニットを含む。
【００７４】
脂質膜に構築されるＥＮａＣまたは種々のサブユニットは、当該技術分野で好適な任意の給源から得ることができる。例えば、ＥＮａＣまたはその任意のサブユニットは、細胞系および安定した細胞系を含む、ＥＮａＣを発現する任意の細胞から新たに単離することができる。例えば、限定することなく、ＥＮａＣは神経組織、すい臓、精巣、卵巣、舌、大腸、腎臓、肺、汗腺などで発現している。いくつかの側面では、塩味知覚のためのＥＮａＣは、舌の乳頭から単離される。別の側面では、ＥＮａＣまたはその任意のサブユニットは、組換えにより発現させ、精製し、機能的なＥＮａＣを形成するために脂質膜を再構成するのに用いることができる。
【００７５】
特定の側面では、ＥＮａＣの各々のサブユニットは、組換え発現系、例えば、限定することなく、細菌細胞、Spodoptera frugiperda細胞、哺乳類細胞およびカエル卵母細胞などにおいて、個別に発現させる。発現させたサブユニットは、当該技術分野でよく知られた標準的な生化学的手段で精製する。あるいは、発現タンパク質は、ＥＮａＣサブユニットを特異的に結合する固定された抗体を用いて免疫精製してもよい。免疫親和性により（対象とするサブユニットまたはＥＮａＣを特異的に結合する抗体を用いて）タンパク質を精製する方法である。別の側面では、ＥＮａＣサブユニットは、発現タンパク質の迅速な精製およびその後のタンパク質からの切断を可能にするポリペチドとの融合タンパクとして発現させる。かかる精製システムは、限定することなく、ｐＧＥＸシステム（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質）および多ヒスチジン（multi-histidine）融合タンパク質（ニッケル結合アフィニティー精製のため）を含む。これらおよび他のタイプの精製は、多数の参考文献に記載され、当業者によく知られている。特定の好ましい側面では、ＥＮａＣサブユニットはバキュロウイルス系およびSpodoptera frugiperda細胞を用いて同時に発現させ、膜画分はRao, U.S. et al. (2002) “Activation of Large Conductance Sodium Channels Upon Expression of Amiloride-Sensitive Sodium Channel in SF9 Insect Cells” J. Biol. Chem. 277(7):4900-4905に記載されたとおりに調製する。
【００７６】
特定の側面では、ＥＮａＣのサブユニットは、膜に組み入れる前に実質的に精製される。ここで用いる場合、「実質的に精製される」とは、サブユニットが、それを得た細胞に由来する混入物質（例えばタンパク質、多糖および脂質）を少なくとも８０％含まないことを指す。好ましくは、サブユニットは混入物質を少なくとも約８５％含まない。より好ましくは、サブユニットは混入物質を少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上含まない。
【００７７】
組織に存在し得る特定のＥＮａＣを本発明の人工膜に再現するために、ＥＮａＣに存在するサブユニットの比率を定量ＰＣＲで決定することができる。多量体受容体のタンパク質サブユニットの比率は、しばしば所定の受容体について細胞内で産生されるｍＲＮＡの量に相関するため、定量ＰＣＲは、存在するｍＲＮＡの比率を決定する効率的な手段を提供することができる。定量ＰＣＲを実行するためのプロトコルは、当該技術分野でよく知られている。さらに、本明細書に示されているＥＮａＣの配列、ならびに特定の遺伝子のメッセージを特異的かつ確実に増幅することができるＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを選択するための、当該技術分野における知識および利用可能なソフトウェアに鑑みれば、当業者は、容易かつ日常的に、組織サンプルに対して定量ＰＣＲを行い、特定のＥＮａＣを形成するサブユニットの同一性および比率を決定することができる。ｍＲＮＡの相対量を決定するためのアッセイは、当該技術分野でよく知られている。一度ｍＲＮＡの比率が決定されたら、生物学的に活性を有するＥＮａＣを形成するための適切な化学量論のタンパク質を提供するために膜に加えられなければならない各々のサブユニットのタンパク質の量を推定することができる。
【００７８】
アフィニティー精製されたタンパク質の濃度は、タンパク質溶出液の総窒素含量を測定し、当該窒素含量を、溶出液の総タンパク質含量と比較することによって決定することができる。窒素含量は、当該技術分野における任意の好適な手段、例えばよく知られたケルダール窒素法により決定することができる。タンパク質濃度は、例えば、タンパク質サンプルを２８０ｎｍでの吸光度について分析し、吸収係数を導出する分光光度法により決定することができる。タンパク質の濃度および／または純度を評価するための当該技術分野で知られている任意の手段を用いることができる。
【００７９】
したがって、本発明は、機能的なＥＮａＣに構築される実質的に精製されたＥＮａＣタンパク質サブユニットを含む人工膜系を提供する。具体的には、本発明は、実質的に精製されたヒト塩味受容体を含む人工膜系を提供する。これらの膜系は、限定することなく、内因性のＥＮａＣなどの混入タンパク質から分離された塩味受容体を含む、ＥＮａＣの分析を可能にする。本発明は、選択したサブユニットの正確な比率の集合を可能にする既知の比率でサブユニットを加える、ＥＮａＣの構築を可能にする。脂質膜は、脂質の任意の組合せを含むことができる。好適な脂質の非限定例は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリシン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、コレステロール、カルジオリピン、またはこれらのホモログ、アナログもしくはその誘導体を含む。リン脂質が好ましく、当該技術分野において好適な任意の給源から得ることができる。例えば、リン脂質は細胞から抽出することができ、またはリン脂質は市販の合成リン脂質であってもよい。
【００８０】
脂質膜は、任意のコンフォメーションまたは相であってもよく、これは、限定なしに、リポソーム、脂質二重層または六方相を含む。リポソームおよび脂質二重層が特に好ましい。
【００８１】
試験化合物の、ＥＮａＣの生物学的活性に対する効果は、当該技術分野において好適な任意の手段で決定することができる。試験化合物は、複数の濃度で評価することができる。いくつかの側面では、試験化合物は、ＥＮａＣの少なくとも１つの生物学的活性を調節するその能力について評価される。好ましい側面では、ＥＮａＣは塩味受容体である。
【００８２】
ＥＮａＣの生物学的活性は、脂質膜に構築されたＥＮａＣの電流を測定することによって決定することができる。電圧クランピングは、ＥＮａＣ電流を測定する１つの好ましい技法である。電圧クランプ技法は当該技術分野でよく知られている（Nagel, G et al. (2005) J. Physiol. 564(Pt 3):671-82、Staruschenko, A et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:27729-34、Tong, Q et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:22654-63、Sheng, S et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:8572-81）。以下のパラメータを電圧クランプを用いて測定することができる：シングルチャネルコンダクタンス、チャンネル開口時間、電位依存性、特定の化合物の適用により誘導される遮断、および特定の化合物の適用により誘導される活性化。ＥＮａＣの生物学的活性を測定するための他の好適な技法は、フラックスアッセイ、パッチクランピング、電位感受性色素、およびイオン感受性色素を含む。好ましくは、ＥＮａＣ活性は、膜電気生理学によって、あるいは、ナトリウムもしくはリチウムまたはそのアナログ（例えばアイソトープ）に対する膜電位色素の蛍光の変化を評価することによって測定する。全てのかかるアッセイは当該技術分野でよく知られている。（Gill, S et al. (2003) Assay Drug Dev. Technol. 1:709-17、フラックスアッセイ、Caldwell, RA et al. (2005) Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 288:L813-9、パッチクランプ）。種々の電位感受性色素が市販されており、これは、限定することなく、スチリル、オキソノール色素およびメロシアニン−ローダニン色素を含む。好適な電位感受性色素の選択は、当該技術分野における関連する能力の範囲内である。同様に、種々のイオン感受性色素が市販されており、これは、単一励起色素、二重励起レシオメトリック色素および二重発色レシオメトリック色素を含む。
【００８３】
塩味受容体は、ナトリウムおよびリチウムイオンに応答する。しかしながら、他のＥＮａＣと異なり、ヒト塩味受容体は、アミロライドに感受性ではない。したがって、アミロライドは塩味受容体ＥＮａＣを阻害も刺激もしないはずである。逆に、クロルヘキシジンはヒトにおける塩味応答の阻害物質として作用し、塩味修飾物質を同定するためのアッセイに用いることができる。試験化合物による塩味受容体の刺激の特異性は、その効果がクロルヘキシジンによって阻害されることを示すことにより評価することができる。さらに、クロルヘキシジンの作用を克服すること（および本発明の膜系における塩味受容体を刺激すること）ができる試験化合物は、強い塩味増強物質である。グアニジンイオンを含む塩基性化合物、および一部のアミンは、塩味増強物質として作用する。これらは、グアニジン、アルギニンおよびホモアルギニンを含む。Ｌ−アルギニンおよびＤ−アルギニンのいずれも、等しく有効である。いかなる特定の作動理論に縛られることは望まないが、この鏡像異性特異性の欠如は、主要な増強効果が、コンパクトな塩基性部分、この場合はグアニジンイオンに由来することを示唆している。したがって、本発明の膜系の塩味受容体は、これをグアニジンイオンの給源と接触させることによって刺激され得る。大部分のナトリウムチャネルの遮断剤および増強物質がチャンネル孔内腔内側の酸性部分と相互作用するグアニジニウム基を含むことから、これらの増強化合物がヒト塩味イオンチャネルと直接相互作用することが推定できる。したがって、ヒト塩味の分子機構は、既知のナトリウムチャネルと共通の選択された機能的な特徴を共有するが、固有の薬理学的特質をも有している。
【００８４】
アミロライドおよびアミロライド誘導体（例えばフェナミル、ベンザミルなど）は、他のＥＮａＣ、例えばアルファサブユニットを含むものを評価するのに有用たり得る。アミロライドおよびその誘導体はまた、アッセイにおいて、サブユニット調製物の純度が低い場合、例えば、宿主細胞ＥＮａＣが調製物に混入している場合などに、バックグラウンド（内因性ＥＮａＣ）を阻害するために用いることができる。したがって、本発明のいくつかの側面において、本方法はナトリウムイオンチャネルアンタゴニストとＥＮａＣとを接触させることをさらに含む。かかるアンタゴニストは、当業者によく知られている。好ましくは、アンタゴニストは、アミロライド、クロルヘキシジンまたはそのホモログ、アナログもしくは誘導体である。
【００８５】
本発明はまた、その範囲に、塩味受容体の生物学的活性を調節する化合物を同定するためのハイスループットスクリーニングアッセイを含む。ハイスループットスクリーニングアッセイは、多数の試験化合物を効率的にスクリーニングすることを可能にする。例えば、限定することなく、構築されたＥＮａＣを含む脂質膜を、９６穴マイクロタイタープレートなどのマルチウェルプレートの全体にわたって分散させることができる。マイクロタイタープレートの各ウェルは、候補モジュレーターに対して別々のアッセイを行うために用いることができる。マイクロタイタープレートは、同一のアッセイ条件下で、複数の濃度の試験化合物、複数の試験化合物の、単独での、あるいは、他の試験化合物と組み合わせてのスクリーニング、および本明細書に記載され、例示されている、種々の比率のサブドメインを有するＥＮａＣを包含する複数のＥＮａＣのスクリーニングを可能にする。本発明の別の側面では、対象とするＥＮａＣを含む平面脂質二重層を試験化合物と接触させ、測定を行う。平面二重層の一方または両方の側の溶液を変え、二重層を第２の試験化合物と接触させる。これは、ハイスループットアッセイとして連続的に用いてもよい。アッセイは、追加のアゴニストまたはアンタゴニストの存在下で行ってもよい。試験化合物について得られるデータは、既知のアゴニストまたはアンタゴニストの存在下で得られた測定値、および／または対照サンプル（例えば非刺激性の／非阻害性の媒体）に対して得られた測定値と比較される。
【００８６】
連続アッセイ（serial assay）を、塩味修飾物質として作用する試験化合物のプールを絞り込むために行ってもよい。例えば、本発明のin vitroアッセイは、第二の、または、確認のためのスクリーニング工程としての細胞ベースのアッセイと組み合わせてもよい。かかるアッセイは、例えば、Servantらの米国出願公開第2005/0059094号に記載されている。
【００８７】
本発明の追加の側面は、in vitroおよびin vivoスクリーニングアッセイの組合せにより、対象における塩味知覚を調節する化合物を同定する方法を特徴とする。１つの側面において、試験化合物を、上皮ナトリウムイオンチャネルに対するその調節効果を決定するためにまずin vitroでスクリーニングし、次いで、該化合物が対象における塩味知覚を調節、好ましくは増強することができるか否かを決定するためにin vivoでさらにスクリーニングする。
【００８８】
１つの側面において、in vitroスクリーニングアッセイは、ヒト塩味受容体のモジュレーターを同定することを含み、これは、試験化合物を少なくとも１つのＥＮａＣと接触させること、および、試験化合物の非存在下におけるＥＮａＣの生物学的活性と比較した、試験化合物の存在下におけるＥＮａＣの生物学的活性の減少を決定することを含む。この側面は、本明細書に記載された詳細に従って実行することができる。１つの側面において、in vivoスクリーニングアッセイは、対象において塩味知覚を増強する化合物を同定することを含み、これは、対象に試験化合物を投与すること、および、対象における塩味知覚が、試験化合物の非存在下における対象による塩味知覚のレベルと比較して増強されているか否かを決定することを含む。
【００８９】
in vivoスクリーニングのために、対象は、施設内倫理委員会が認可した方法、例えば印刷媒体における一般的な広告などによって募集することができる。研究に入る前に、各々の対象はインフォームドコンセントを提供する。参加者には、試験前の少なくとも１時間、摂食、飲水またはガムをかむことを控えるよう要求することがある。対象は、研究に参加するために支払を受けることがある。
【００９０】
対象を研究するために投与される候補試験化合物を含む実験溶液は、二成分混合物の形態、例えば化合物とＮａＣｌなどの無機塩との混合物の形態で提示することができる。試験化合物および無機塩についての好適な濃度範囲を確立するために、予備実験を行うことができる。例えば、４種類の濃度の試験化合物を、４種類の濃度の無機塩とともに用いる。水溶液は、無機塩を含む試験化合物の濃度の全ての可能な組み合わせを包含するように調製することができる。
【００９１】
所定の刺激の塩味増幅特性を評価するために、当該技術分野で好適な任意の手段を用いることができる。かかる手段の１つの非限定例は、マグニチュード推定法である。マグニチュード推定法は、サンプルから知覚された塩味の強さのレーティングを測定する。塩味評価に参加している対象に、溶液の塩味または相対的な塩味をレーティングするように指示することができる。対象は、各々の溶液を、１回、２回、３回または４回以上試飲することができる。
【００９２】
試験溶液を試飲する前に、対象に、その口をすすぐように指示することができる。例えば、対象に、好ましくは約２分間などの短い時間内で、４回、水ですすいで吐き出すように指示することができる。その後、試験サンプルおよび無機塩溶液を、対象に、好ましくは順不同かつ非復元的に投与することができる。例えば、溶液は、１０ｍｌのアリコートでポリスチレン製医療カップ（Dynarex、NY）に調製し、対象に投与することができる。対象に、溶液の相対的な塩味をレーティングするように指示することができ、各々の溶液についての相対的な塩味のレーティングを算術的に平均し、単一の塩味レーティングを得ることができる。
【００９３】
マグニチュード推定法は、用いる対象数の変動による違いを示さないことがある。マグニチュード推定タスクにおける特異な数の使用によって生じる分散を排除するために、塩味レーティングを、水中のＮａＣｌのみの塩味レーティングの総算術平均（全てのＮａＣｌ濃度にわたる平均値）に対して標準化することができる。各々の対象の平均塩味レーティングは総塩味平均に分割することができ、この商を、その個人の塩味レーティングのための乗法標準化係数（multiplicative standardization factor）として用いることができる。この手法は、水中のＮａＣｌの平均塩味レーティングを対象にわたって同等にする。
【００９４】
分散分析（ANOVA）を、マグニチュード推定法からの標準化された反復測定データに対して行い、事後的対比較をチューキーの忠実有意差（ＨＳＤ）分析で行うことができる。
【００９５】
マグニチュード推定法に代わるものは、強制ランキング法であり、これは一連の二択式強制選択ペアリングを用いて、推定増強物質である試験化合物の存在下または非存在下におけるＮａＣｌ水溶液の塩味をランキングするものである。この手法において、対象に、第１のサンプルペアの第１の溶液（例えば、５ｍｌまたは１０ｍｌの溶液）の半量を３秒間味見し、吐き出すように指示することができる。次いで、対象は２回すすぎ、第２のサンプルの半量を味見し、吐き出し、２回すすいで、同じ手法により２つの溶液の残りを味見する。両方の溶液を２回味見した後、対象に、どちらの溶液がより塩辛いと思ったかを示すよう求めることができる。対象がいずれの溶液もより塩辛くないようであったと報告した場合、対象に推測することを求めることができる（強制選択）。この手法を、全てのサンプルについて反復することができる。
【００９６】
塩味ランキングは、特定の溶液が他の全ての溶液より塩辛いものとして選択された回数に基づき、ペアワイズランキングのフリードマン分析により計算することができる。個々のランキング間の違いが有意であるか否かを決定するために、チューキーＨＳＤを算出することができる。
【００９７】
上記の本発明のスクリーニング法のいずれかによって同定された化合物は、この発明の範囲内にあるものとする。かかる化合物は好ましくはＥＮａＣのアゴニスト、より好ましくはヒト塩味受容体のアゴニスト、より一層好ましくはヒト塩味受容体の増強物質である。本明細書に記載のとおり、かかる化合物を、それが投与される対象において塩味知覚を増強するために効果的な量で、薬学的にまたは栄養補助食品的に許容し得る担体と混合することにより、栄養補助食品または医薬組成物として製剤化することができる。
【００９８】
前記アッセイを用いて、塩辛いと知覚される化合物を同定すること、および塩味を増強する（例えば、低減した量のナトリウムまたはリチウムを、より高い濃度のナトリウムまたはリチウムとして知覚されるようにする）化合物を同定することは、本発明の対象である。本発明は、限定することなく、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、多糖、脂質、小有機分子などを含む天然分子または合成分子を含む化合物のライブラリーを、代用塩、塩味増強物質または塩味阻害物質として作用するその能力についてスクリーニングすることを可能にする。本発明は、本発明の方法によって同定された代用塩、塩味増強物質および塩味阻害物質を含む。
【００９９】
本発明が提供するものはまた、人工脂質膜およびこれを調製する方法である。人工脂質膜は少なくとも１種の脂質と、構築されたＥＮａＣまたは少なくとも１つのＥＮａＣのサブユニットである。好ましい側面では、ＥＮａＣは塩味受容体である。脂質膜は任意の好適な脂質を含むことができ、好ましくはリン脂質を含む。好適な脂質は、限定することなく、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリシン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、コレステロール、カルジオリピン、またはそのホモログ、アナログもしくはその誘導体を含み、これらは、当該技術分野で好適な任意の給源から得ることができる。これらは脂質膜は任意のコンフォメーションであってもよく、好ましくはリポソームまたは脂質二重層である。
【０１００】
１つの側面において、人工脂質膜は、少なくとも１つのリン脂質を含むリポソームを、好適な水性緩衝液に溶解したＥＮａＣまたは特定の１種または複数種のＥＮａＣのサブユニットと混合することによって調製される。水性緩衝液は、少なくとも１つの界面活性剤を含む。好適な界面活性剤は当該技術分野でよく知られており、限定することなく、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ、ＣＨＡＰＳ、コール酸ナトリウムおよびオクチルグルコシドを含む。リン脂質とＥＮａＣまたはそのサブユニットとを混合した後に、脂質膜中でのＥＮａＣの構築を可能にするために、混合物を数分、好ましくは少なくとも約２０分の間インキュベートする。インキュベーションの後で、界面活性剤を当該技術分野において好適な任意の手段、例えば本明細書に記載および例証されたものなどで除去する。当該技術分野で知られているタンパク質を含む脂質およびリポソームを調製する他の方法を、ＥＮａＣサブユニットを含む脂質およびリポソームを生成するのに用いることができる。
【０１０１】
いくつかの側面では、ＥＮａＣはリポソーム中で構築される。リポソームは、本明細書中に記載および例証されたものを含む、当該技術分野でよく知られた日常的な技法を用いることで、平面脂質二重層に変換することができる。いくつかの側面では、リポソームは周囲の環境に見出されるものとは別の物質を含む。例えば、限定することなく、リポソームは、試験化合物による刺激に伴うナトリウム流のマーカーとしてのナトリウム量の変化を示すために、ナトリウムまたはリチウムに応答する蛍光電位感受性色素、または、膜電位色素を含んでもよい。
【０１０２】
本発明はまた、ヒト塩味受容体のモジュレーターを同定するためのキットを提供する。本キットは、少なくとも１種のリン脂質、単離された１または２以上の上皮ナトリウムイオンチャネルサブユニットおよび任意にナトリウムおよび/またはリチウムイオンの給源、ならびに、ヒト塩味受容体のモジュレーターを同定する方法においてキットを用いるための指示を含む。いくつかの側面では、キットは任意に上皮ナトリウムイオンチャネルアンタゴニストおよび/またはアゴニストを含む。
【０１０３】
本発明は、塩味受容体と、Ｃｙｓ５３２を含むデルタサブユニットの推定アミロライド感受性領域と特異的に相互作用する化合物とを接触させることによって、対象における塩味知覚を調節するための方法を提供する。ヒト対象において、このデルタサブユニットは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。モジュレーターは、受容体を刺激することまたは受容体を遮断することによって、塩味知覚を増強または阻害し得る。化合物は、受容体と、好ましくは配列番号１２のアミノ酸配列を有する推定アミロライド感受性領域で結合することによって、デルタ受容体と相互作用し得る。
【０１０４】
当該技術分野で利用可能な、合理性に基づいたドラッグデザインのためのコンピュータプログラムを用いて、本明細書で利用可能な一次アミノ酸配列データおよびイオンチャネルの三次構造に関する当該技術分野における知識に基づいて分子モデリングを行い、ヒト塩味受容体の３次元モデルを提供することができる。かかるモデリングは、特定の調節部位、例えば、デルタサブユニットの推定アミロライド結合部位である配列番号１２のモチーフを含む部位と相互作用する候補化合物の合理的な選択を可能にする。これらの化合物または化合物群は、塩味修飾物質（salty taste modifier）として作用する。これらの領域（例えば、デルタサブユニット配列番号１２）と相互作用する化合物は、塩味知覚の修飾物質として有用である。したがって、本明細書に示すデータは、塩味受容体を含むサブユニットと、塩味知覚に関与しているとみられるサブユニットのエリアとの構造機能相関を提供する。
【０１０５】
以下の実例および理論例（prophetic example）は、本発明をさらに詳細に説明するために提供されている。これらは本発明を例証することを意図しており、限定することは意図しない。
【実施例】
【０１０６】
例１
ヒト茸状乳頭および味覚細胞を得るための手法
ヒト茸状乳頭を含む味蕾は、局所麻酔下で実行される小手術生検法によって、ボランティアの舌の前背面から日常的に得られる。一般的な手法は、Spielman, AI et al. Collection of taste tissue from mammals.  Experimental Cell Biology of Taste and Olfaction.  Spielman AI and Brand JG eds.  CRC Press, Boca Raton, FL, pp 25-32に記載されている。ボランティアは、インフォームドコンセントを提供する。この手法は施設内倫理委員会によりチェックされ、承認されたものである。切除された乳頭は、その後、ＲＮＡ抽出、免疫組織化学またはin situハイブリダイゼーションのために、または、単離された味覚細胞の懸濁液をもたらす手法に用いることができる。
【０１０７】
ＲＮＡ抽出、組織化学およびin situ分析
全ＲＮＡ抽出に用いる場合、乳頭を直ちにTRIzolTM試薬（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いた標準的な抽出手法に供する。ＲＮＡ抽出物は、大部分のゲノムＤＮＡを除去するために、ＤＮＡ分解酵素で処理する。さもなければ、残存するあらゆるＤＮＡは、イントロンを挟んだ（intron-spanning）プライマーが利用できないその後の工程において、偽陽性の結果をもたらし得る。しかしながら、ゲノム材料は、ゲノムＤＮＡの単一コピーがＰＣＲの最も高い感度の時点を知らせ、それによって当該手法における便利なエンドポイントを提供するため、定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＲＴ−ＰＣＲ）に有用である。その後、逆転写をＲＮＡに対して行い、相補的ＤＮＡまたはｃＤＮＡとして知られるＲＮＡのＤＮＡによるコピーを得る。このｃＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応において基質として用いる。
【０１０８】
茸状乳頭ＲＮＡおよびその後のｃＤＮＡは概して高品質であるため、研究対象のタンパク質の全コード配列またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を直ちに増幅することができる。この増幅を行うのに用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは、GenBankでアノテートされている同じ、または、類似したタンパク質の公開された配列に基づいて設計する。ＰＣＲ反応生成物は、アガロースゲル電気泳動によって分析することができる。この手法は、味蕾細胞で発現されることが知られている遺伝子の全コード配列（その全長配列は、単一細胞分析からは容易に得ることができない）を得るのにしばしば用いられる。
【０１０９】
切除された乳頭はまた、一般組織化学分析もしくは免疫組織化学分析、またはin situハイブリダイゼーション分析に用いてもよい。組織を固定し、保護するための種々の技法および手法が利用可能であり、これらを用いることができる。例えば、図１はＡＴＰアーゼ組織化学法によって染色されたヒトの味蕾を示す。図２は、ヒト味覚細胞に対する免疫組織化学法による、二次メッセンジャー酵素、ホスホリパーゼＣベータ２（ＰＬＣｂｅｔａ２）の抗体検出を示す。手順は以下の通りである。茸状乳頭の組織切片（８〜１０ミクロン）を１×ＰＢＳ中で１０分間、３回にわたって洗浄し、ブロッキングバッファー中に室温で４〜１８時間置いた。ブロッキングバッファーを除去し、一次抗体（ウサギ抗ＰＬＣｂｅｔａ２）を、３種の濃度（バッファー中、１：５０、１：１００および１：２００）で添加した。一次抗体液を除去し、スライドグラスを、ＰＢＳ中で３回洗浄した。最初の洗浄は直ちに流したが、それ以降の洗浄は、それぞれ１０〜２０分の間インキュベートした。過剰な流体を排出し、二次抗体液（ＣＹ３標識ヤギ抗ウサギ、１：１０００）を切片に加え、スライドグラスを４５〜１２０分間室温でインキュベートした。スライドグラスを、ＰＢＳ中で３回洗浄した。最初の洗浄は直ちに流したが、その後の以降の洗浄は、それぞれ１０〜２０分の間インキュベートした。過剰な流体は排出するが、スライドグラスは湿ったままにした。カバーグラスをスライドグラス上に置き、スライドグラスを蛍光顕微鏡下で検討した。
【０１１０】
ＥＮａＣサブユニットを同定し、これをシーケンシングするためのＲＴ−ＰＣＲ
生検で得た茸状乳頭からの総ＲＮＡの抽出を上記の通り、ＤＮＡ分解酵素処理なしで行い、次に第一鎖ｃＤＮＡの合成を行う。ＥＮａＣサブユニット（５００ｂｐ以下のサイズ）の増幅は、上記のプライマーを用いて、PCR Core System I試薬キット(Promega Corp., Madison WI)により行うことができる。
【０１１１】
明らかに正しいサイズの生成物が得られたら、この生成物をゲルから切除し、精製する。次いで、生成物をプラスミドベクターにライゲーションし、その中に挿入されたタンパク質（例えば、ＥＮａＣδ）のコード配列に関する遺伝子を有する組換えプラスミドを得る。組換えプラスミドは、細菌細胞を形質転換するのに用いる。この細菌細胞は、適切な細胞増殖培養液を提供した場合、大量のプラスミドを生成する。細菌培養物の精製は、純粋な形態の組換えプラスミドを生じ、これによりヒト茸状乳頭からのタンパク質遺伝子の配列を得ることが可能となる。最後に、ＢＬＡＳＴプログラムを用いた、配列の生物情報学的分析により、実際に正しい配列が得られたことを確認する。
【０１１２】
この手法を用い、ヒト茸状乳頭において４種のＥＮａＣサブユニットの転写物に関する証拠が見出された。これらのサブユニットは、アルファ、ベータ、ガンマおよびデルタＥＮａＣサブユニットである。アルファサブユニットの完全なＯＲＦはほとんど観察されなかったが、他のサブユニットの完全なＯＲＦはほぼ常に観察された。驚くべきことに、ＥＮａＣのデルタサブユニットがヒト茸状乳頭に存在することが見出された。
【０１１３】
例２
ヒト塩味受容体の同定およびデルタサブユニットの重要性
本発明により、ヒト茸状（味覚）乳頭におけるＥＮａＣのデルタサブユニットが提供される。当該サブユニットが見出されたクローンは、舌の前背面から複数の茸状乳頭を取り出すための生検処置を受けることに同意した３名の個人からのプールされたｃＤＮＡからのものであった。
【０１１４】
デルタサブユニットの特徴
上皮ナトリウムチャネルのデルタサブユニットは、ＲＴ−ＰＣＲによって１３名の個人からの茸状乳頭で検出された。検出された断片はＰＣＲによって増幅し、サブクローニングした。次いで、これらの１３名の個人からのデルタサブユニットをコードしているポリヌクレオチドを完全にシーケンシングした。茸状乳頭からのヒトのデルタサブユニットが、腎臓からクローニングしたヒトのデルタサブユニットと、推定アミロライド結合部位において異なることが決定された。推定アミロライド結合部位は、腎臓からのデルタサブユニットでは第５３２アミノ酸にチロシンを含むが（配列番号８）、茸状乳頭からのデルタの第５３２アミノ酸は、シーケンシングした１３サンプルの各々においてシステインであった（配列番号９）。
【表１】
0005657890.tif 000002
【０１１５】
図３は、１１のデルタサブユニットのアミノ酸配列配列を示し、ここで、最初の配列はGenBank配列であり、他の１０の配列は、１０名の異なる個人からのものである。１８０位に、可能な多型（ＲからＰ）を示す。可能な多型を示している他の位置は、２７８位（ＦからＩ）、３５５位（ＳからＲ）、３８９位（ＥからＱ）および５６６位（ＲからＨ）である。５６６位はまた、アミロライドの結合に関係している。いかなる特定の理論または作用機序に制限されることを意図することなく、多型は塩味刺激に対する感受性に関与し得るか、または、味覚モジュレーターに対する感受性に関与し得る。
【０１１６】
５３２位におけるＹからＣへの変更は、ラット塩味受容体が明らかにアミロライドに感受性であるが、ヒト塩味受容体はそうでない理由を説明する一助となり得るため、重要である。ラットのデルタＥＮａＣサブユニットは、偽遺伝子であるため発現されない。アミロライド感受性のアルファサブユニットがラットにおいて塩味受容体の一部として機能すると考えられる。この置換は、受容体の感受性および特異性を顕著に変えないが、チャンネルの薬理を変化させる。
【０１１７】
デルタサブユニットはアミロライド感受性であるが、それはアルファよりは感受性ではない（図４）。したがって、ヒト塩味受容体ＥＮａＣがデルタの通常の形態を含むのであれば、これもまたアミロライド感受性を示すはずである。しかし、ヒトの味覚細胞からのデルタの推定アミロライド結合部位は、非保存的置換を含んでおり、したがって、腎臓におけるデルタサブユニットとは異なる、アミロライド対する感受性を有し得る。いかなる特定の理論または作用機序に制限されることを意図することなく、デルタがより少ない感受性を示すのであれば、この知見は、特にアミロライドがタイトジャンクションを超えることができないことから、デルタがヒト塩味受容体であることを意味すると解釈できる可能性がある。ラットとヒトとの間の違いのため、ラットはおそらくヒトの塩味知覚のよいモデルではない。
【０１１８】
ヒト茸状乳頭デルタＥＮａＣサブユニットの細胞特異性
ヒトの味蕾は図１に示されており、そこでは、ヒト茸状乳頭の８ミクロン切片をＡＴＰアーゼ組織化学法によって染色してある。問題は今度は、これらの味覚細胞の一部がデルタＥＮａＣを発現するのか、全てが発現するのか、またはいずれも発現しないかということになる。デルタサブユニットを発現する細胞のみを見るために、デルタ型のヒトＥＮａＣに対する抗体をウサギで作製した。代表的な写真を図５に示す。スライドは、ヒト味蕾内の細胞のサブセットに対する組織特異的標識を示す。この意味は、ヒト塩味受容体が、デルタ、ベータおよびガンマサブユニット、あるいは、アルファ、デルタ、ベータおよびガンマサブユニットの多量体から構成されるＥＮａＣであるということである。味覚細胞におけるデルタのこの特異性は、これらの同じ味蕾における全長アルファの顕著な不足とともに、ヒト塩味受容体がデルタを含むＥＮａＣであり、他者が示唆するような単なるアルファ、ベータ、ガンマＥＮａＣではないことを示唆している。
【０１１９】
ヒトの味蕾細胞の単離
単離された味蕾単一細胞の懸濁液は、ヒト茸状乳頭から、生検で得た乳頭のコラゲナーゼベースの酵素的手法でのインキュベーション、引き続く、酵素を効果的に除去するための乳頭の洗浄、その後のガラスのピペットによるその破砕により調製した。得られた懸濁液は、味蕾細胞について濃縮した。個々の細胞をガラス製マイクロピペットで捕獲し（図６参照）、後に、２〜１０μｌのRNAlaterを含むチューブに個別に入れた。
【０１２０】
デルタサブユニットは味蕾細胞に位置する
ｃＤＮＡを、上述のとおり個別に単離、捕獲した７種のヒト茸状味覚細胞から得、次いでプールした。正しいサイズ（〜５００ｂｐ）の生成物が認められ、シーケンシングによりそのヒトＥＮａＣデルタサブユニットとしての同一性が確認された。デルタＥＮａＣのＯＲＦの重複セグメントを同定するこのＰＣＲ手法を用いて、味覚細胞デルタＥＮａＣの完全なＯＲＦを得た。
【０１２１】
ネステッドプライマーを用いた単一細胞ＲＴ−ＰＣＲも行い、試験した１２のヒト味蕾細胞のうち２つが、全長アルファを発現することなく、デルタ、ベータおよびガンマサブユニットを発現している強い証拠を提供したことが明らかになった（データは示さず）。１つの初期の単一細胞Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲは、アルファサブユニットについてのメッセージを示さなかったが、デルタ、ガンマおよびベータについてはほぼ同数のメッセージコピーを示した（図７）。
【０１２２】
単離された味覚細胞の調製物に対するカルシウムイメージングを用いることにより、塩化ナトリウムによって活性化される個々の細胞を特定することが可能である。これらの細胞は、捕獲し、その内容をＱ−ＳＣ−ＲＴ−ＰＣＲによって分析する。３０の塩感受性細胞群の中で、最も発現しているサブユニットは、デルタであることが決定された。８つはデルタ、ベータおよびガンマを発現したが、７つは、デルタ、アルファ、ベータおよびガンマを発現した。
【０１２３】
ガンマについてのGenBank配列と比較した、味覚細胞からシーケンシングした１０のガンマサブユニットのアミノ酸配列のアラインメントを図８に示す。
【０１２４】
塩味受容体をデルタ、ベータ、ガンマまたはデルタ、アルファ、ベータ、ガンマとして同定したことにより、下記の例に示すとおり、分析のために各々のサブユニットを発現し、脂質二重層に再構成する。
【０１２５】
例３
リポソームおよび人工脂質二重層の調製
この例は、大量の受容体をその膜環境から可溶化し、受容体を精製し、脂質二重層などの人工脂質膜に受容体を再構成するために容易に行うことができる技法を示す。かかる膜は、そこで受容体がそのネイティブなコンフォメーションを回復し、詳細に、単離状態で、例えば、他のタンパク質または生細胞の代謝的な気紛れからの干渉なしに研究できる、人工生体膜として用いられる。
【０１２６】
この例は、一つには、ナマズからのＬ−アルギニン（Ｌ−ａｒｇ）に対する味覚受容体の抽出、精製および膜再構成を説明する。Grosvenor, W et al. (2004) BMC Neuroscience 5:25に公開され、説明されている本方法は、下記のとおり、脂質膜におけるＥＮａＣ、ＥＮａＣサブユニット、および塩味受容体の再構成に容易に適合させることができる。ナマズは、受容体が特定のアミノ酸に極めて感受性であることから味覚受容体研究のモデルとした。かかるアミノ酸の１つは、Ｌ−ａｒｇである。ＥＮａＣと同様、ナマズのＬ−ａｒｇに対する味覚受容体はイオンチャネルである。同様のアプローチを、Ｌ−ａｒｇおよびＥＮａＣ型受容体を可溶化する際に利用する。受容体は主にその由来によって異なる。Ｌ−ａｒｇ受容体はナマズ味覚組織から精製し、ＥＮａＣサブユニットは異種細胞培養発現系によって合成する。
【０１２７】
リポソームの生成
リポソームは、可溶化された受容体を二重層構築物へ運ぶのに用いる。膜溶解性タンパク質を研究するための大きな課題は、タンパク質をその天然の膜または合成エンドポイントから人工脂質二重層まで動かすための手法を開発することである。可溶化は通常界面活性剤を用いるが、この界面活性剤は、二重層の損傷を避けるために除去しなければならない。リポソームは、界面活性剤系からタンパク質を取り込み、それを二重層に引き渡すことによって、この移送を実行する。
【０１２８】
リポソームは、０．５ｍｌのクロロホルム中の、２：１の比率の１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン：１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＥ：ＤＯＰＣ）の混合物５ｍｇを丸底フラスコに加えることによって調製する。フラスコは、３０〜４０分間、４℃で回転させる。クロロホルムを蒸発させた後、脂質の薄層が形成され、これに２ｍｌの緩衝液（３００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ＝７）を加える。緩衝液添加後、フラスコを３〜５分のパルスにて３回浴中で超音波処理し、リポソームの形成を誘導する。あるいは、プローブソニケーターで３０〜４０秒だけパルスしてもよい。
【０１２９】
Ｌ−ＡｒｇＲのリポソームへの溶解および脂質膜におけるＬ−ＡｒｇＲの薬理
複数の界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ、ＣＨＡＰＳ、Ｔｒｉｔｏｎ、コール酸ナトリウムまたは／およびオクチル−グルコシドのうちの１つを含む１００ｍＭのＮａＣｌ／５０ｍＭのトリス、ｐＨ＝７．１に溶解した、所定量（０．０１〜０．５μｇ）のＬ−ＡｒｇＲをリポソームに加えた。シングルチャンネル事象としてのチャンネル活性を測定するためのタンパク質の脂質に対する比率（質量：質量）は、１：２０００〜５０００である。巨視的特性を測定するための比率は、１：５０〜１００の範囲である。タンパク質−脂質混合物は、２０〜３０分間インキュベートする。
【０１３０】
二重層において測定したＬ−ＡｒｇＲの特性は、Ｌ−ＡｒｇＲがその天然の状態にあるときの、動物からの味覚神経記録を通して観察されるものと極めて類似している。例えば、味覚神経記録は、天然の受容体の感度がＬ−ａｒｇ０．数μＭの範囲であるが、Ｄ−ａｒｇは受容体を阻害することを示す。図９は、Ｌ−ＡｒｇＲが二重層に再構成された場合に、同様の特性が見られることを示す。これは、Ｌ−ＡｒｇＲなどの受容体が、二重層にある場合に、その活性を二次的な神経記録から推定しなければならない天然の状態にある場合よりも、より直接的かつより容易に研究されることを示すものである。
【０１３１】
リポソームへのＥＮａＣタンパク質の再構成
複数の界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ、ＣＨＡＰＳ、Ｔｒｉｔｏｎ、コール酸ナトリウムまたは／およびオクチル−グルコシドのうちの１つを含む１００ｍＭのＮａＣｌ／５０ｍＭのトリス、ｐＨ＝７．１に溶解した、所定量（０．０１〜０．５μｇ）の対象とするナトリウムチャネル、例えば、ＥＮａＣα、ＥＮａＣδ、またはＥＮａＣサブユニット、α、β、γ、δに由来する特定の比率の混合物をリポソームに加える。シングルチャンネル事象としてのチャンネル活性を測定するためのタンパク質の脂質に対する比率（質量：質量）は、１：２０００〜５０００である。巨視的特性を測定するための比率は、１：５０〜１００の範囲である。タンパク質−脂質混合物は、２０〜３０分間インキュベートする。膜チャネルであるＥＮａＣタンパク質は、リポソームに再構成される間溶液のままである必要があるため、この手順を引き続き行う。
【０１３２】
１種または２種以上のＥＮａＣを含む再構成された界面活性剤不含プロテオリポソームは、少なくとも２つの方法で調製することができる。１つの方法では、これらはタンパク質：脂質混合物の、ゲル濾過カラムを介した遠心により形成することができる。これらのゲルカラムはSephadex G-50（fine）から調製し、一晩膨潤させ、５ｍｌのディスポーザブルカラム（ベッド体積１．５ｍｌ）に注ぐ。カラムは、遠心機にて〜１，０００×ｇで事前に回転させておく。タンパク質：脂質混合物をカラムの最上部に負荷し、界面活性剤不含プロテオリポソームは、カラムを７００ｇで１分間回転させることによって回収することができる。あるいは、界面活性剤は透析によって除去することができる。透析のために、タンパク質：脂質混合物をカセット透析装置に装填し、混合物を、２０００ｍｌのＴｒｉｓ／ＮａＣｌ／スクロース（界面活性剤不含）バッファーに対して、４℃で一晩透析する。界面活性剤の濃度が透析の間に低下するため、タンパク質を含むリン脂質小胞が自発的に形成されるとみられる。
【０１３３】
チャンネルタンパク質のプロテオリポソームから平面脂質二重層への再構成
平面脂質二重層は２つの水性コンパートメントの間の開口上に形成され、これらを、作業上の目的のために、シスおよびトランスコンパートメントと呼ぶ。制御膜電位を制御するために、電圧発生器をシスコンパートメントにＡｇ／ＡｇＣｌ電極により接続する。トランスコンパートメント（仮想アース）は、第２のＡｇ／ＡｇＣｌ電極によって、電流測定用増幅器の入力に接続する。
【０１３４】
二重層の形成
ＤＯＰＥ：ＤＯＰＣの４：１混合物を２５μｌのｎ−デカンに溶解する（１５〜２５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度）。この混合は室温に保ち、実験を行う各日に調製する。電極コンパートメントを３ＭのＫＣｌで満たし、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極をコンパートメントに設置する。シスおよびトランスコンパートメントを記録用浴溶液（１００ｍＭのＮａＣｌ、１０のＴｒｉｓ、ｐＨ７）で満たし、これらと電極コンパートメントとの間に寒天ブリッジを設置する。二重層を形成するために、脂質混合物滴をシス側から穴の上へ散布する。
【０１３５】
抵抗が増加し、かつ、シグナルが飽和していないときに、脂質が穴の周囲に完全に形成されたことを決定することができる。組織化された二重層が形成されたことを確かめるために、二重層を横切る電圧パルスを印可することができ、容量性電流を測定することができる。１００μｍの穴に関して、キャパシタンスは５０〜１００ｐＦ程度であるとみられる。二重層の電気抵抗は、１０９オームを超えるとみられる。
【０１３６】
再構成
二重層が形成された後、１０〜１５μｌのプロテオリポソームを、継続的に攪拌しながら二重層のシス側に加える。チャンネルサブユニットが二重層に取り込まれるとき、電流は段階的に変化するとみられる。多数のチャンネルを組み入れる場合、巨視的な電流を測定する。
【０１３７】
リポソームの二重層との融合は自発的に生じ、電流は約５〜３０分以内で記録することができる。場合によっては、事前に３００ｍＭのＮａＣｌ中で形成したリポソームを１００ｍＭのＮａＣｌを含む二重層浴溶液に加えることによってリポソーム全体に濃度勾配を作出することにより、または、１００ｍＭのＮａＣｌをシス側に、１０ｍＭのＮａＣｌをトランス側に加えることによって脂質二重層を隔てた濃度勾配を作出することにより、または、二重層へのＤＯＰＳなどの負荷電脂質の添加によって二重層および／またはリポソーム脂質の組成を変えることにより、リポソーム融合を促進することが必要となることがある。
【０１３８】
例４
脂質二重層における種々の比率のＥＮａＣ受容体サブドメインの発現
これは、理論例である。ＥＮａＣは、通常、サブユニットα、βおよびγ（大部分の組織ではα２βγ複合体）か、サブユニットδ、βおよびγの、いずれかの３つのサブユニットを含むヘテロ多量体複合体である。これらのサブユニットは、しばしば組織源により決定される種々の比率で集合することができる。サブユニットの相対比を変えることにより、これらのチャンネルにユニークなキネティクスおよび薬理が付与される。いかなる特定の理論または作用機序に制限されることを意図することなく、δサブユニットは多くの組織でαサブユニットと置き換わっており、かかる置換が特にチャンネルの薬理を変更すると考えられる。
【０１３９】
ＥＮａＣサブユニットの比率の評価に特に関連する単一細胞定量ＰＣＲ
メッセージの量とタンパク質の量との間の１対１対応は保証されていないが、Ｑ−ＰＣＲはＥＮａＣ比率の評価に利用できる１つのツールである。塩味覚細胞が活動しているならば、特定のサブユニットの複数のコピーを有していると考えられる。メッセージのコピーの比率は、少なくとも近似的にタンパク質生成物の比率であると考えられる。定量単一細胞ＰＣＲを用いて、対象とする任意のタンパク質についての、メッセージの相対的存在量の半定量的な像を得ることができる。この手法は、理論的には単純であるが、多数の困難な障害がある。味覚細胞に関しては、例えば、現在単離細胞を得るために用いている時間のかかる手法（上記参照）がＲＮＡの破壊をもたらすため、ＲＮＡの品質が問題となることがある。実験技法を信頼あるものとするために、以下の手法を行うことができる。（１）対象とする各々の遺伝子について複数のユニークプライマーを設計し、同じＰＣＲ条件下で対象とするすべての遺伝子についてほぼ同一の効率を有するもののみを用いる。（２）水を対照とするＰＣＲを用いた場合にブランクとして記録されるものより上の適切なペアから、プライマーセット（プライマーペアの混合物）を構築する。（３）個別の細胞（上記のとおりの）をＲＮａｓｅのない環境で回収し、細胞を溶解させ、市販のキットを用いて単一細胞ｍＲＮＡ内容物を逆転写する。（４）全ての反応が線形増幅相となるよう、第１段階のＰＣＲの限定された数（１０〜２５）のサイクルを、上記のプライマーセットおよび条件で行う。（５）上記の反応物を希釈し（１００×〜１０００×）、アリコートをテンプレートとして、上記セットからの１対のプライマーとともに用い、Ｑ−ＰＣＲ装置を用いてＰＣＲの第２段階を行う（２反復／３反復で）。（６）データ分析に、相対定量法を用いる。正規化は、定義上、遺伝子の１つのコピーが存在する、翻訳／転写されていないゲノムＤＮＡの増幅に基づく。遺伝子発現の違いは、比率（サンプル中の標的遺伝子とゲノム参照配列との間のΔＣｔ）の差（２サンプル間のΔＣｔの差であるΔΔＣｔ）を比較することによって決定することができる。
【０１４０】
味蕾細胞がヒトＥＮａＣサブユニットδ、β、およびγについてのメッセージを含むが、αについてのメッセージは含まないことは明らかであった。この分析のＱ−ＰＣＲトレースを図７に示す。この単一細胞から、その細胞のＥＮＡＣが多量体構造、δ１β１γ１であることを結論づけることができる。しかしながら、これらのトレースは正規化されていないため、最終的な構造は異なる化学量論比を有し得る。しかし、最良の証拠は、ヒト塩味受容体がδ１β１γ１で構成されることを示唆している。
【０１４１】
一度配列の確証が得られたならば、組換えプラスミドを、in vitroタンパク質発現（ＩＶＰＥ）として知られるプロセスにおける基質として用いることができる。この手法は、細胞によるものであれ、無細胞系であれ、所望のタンパク質、この場合、ＥＮａＣサブユニットδ、α、βおよびγの大量（ｍＭ）の生成を可能にする。製造されたタンパク質の同一性を確認するためにウエスタンブロットを用いることができる。タンパク質に対する抗体を用いた反応混合物の分析（ウエスタンブロット）を、所望のタンパク質が実際に得られたことを確認するのに用いる。
【０１４２】
所望のタンパク質は単離および精製することができる。アフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質の精製は、Sephadexなどのカラムマトリックスで抗体をタンパク質に化学的に結合させることを含む。ＩＶＰＥ反応混合物をカラムに通すことにより、タンパク質が、カラム上のその抗体に結合することとなる。好適な試薬によるカラムの溶出は、濃縮されたタンパク質をもたらす。タンパク質溶出液は、ケルダール法におけるように、全窒素を測定することにより定量することができる。次いで、この総窒素含量の測定値を２８０ｎｍでのタンパク質の吸収と比較して、吸収係数を算出する。この点から、２８０ｎｍにおける吸収は、タンパク質濃度の便利で正確な測定値となる。
【０１４３】
ＥＮａＣの各々のサブユニットの実際の濃度を知ることにより、これらのサブユニットを、単一細胞のＱ−ＰＣＲによって推定した特定の比率で組合せることを可能にする。これらのタンパク質は膜に結合していることから、これらは可溶性のままで存在するために若干量の界面活性剤を要求する。これらが可溶性であることはこれらを特定の比率で組み込むために必要だが、界面活性剤は、活性を測定するためにこれらが再構成される必要がある脂質二重層を破壊する。したがって、単離されたタンパク質と共に脂質二重層を再構成するには、すべての界面活性剤を除去することを要する。界面活性剤は、当該技術分野で好適な任意の手段、例えば本明細書に記載された透析などにより除去することができる。単離されたタンパク質の脂質膜への再構成は既述であり（Grosvenor, W et al. (2004) BMC Neurosci. 5:2202-5）、上記の例にまとめてある。ヒトＥＮａＣのためのサブユニットが合成されているため、任意の推定塩味受容体サブユニットの組成および比率に対して慎重な制御を行うことができる利点が得られる。
【０１４４】
本発明は、上記で説明および例示された態様に限定されないが、添付の特許請求の範囲の範囲内で変更および改変が可能である。
【０１４５】
配列表
【表２】
0005657890.tif 000003
【０１４６】
【表３】
0005657890.tif 000004
【０１４７】
【表４】
0005657890.tif 000005
【０１４８】
【表５】
0005657890.tif 000006
【０１４９】
【表６】
0005657890.tif 000007
【０１５０】
【表７】
0005657890.tif 000008
【０１５１】
【表８】
0005657890.tif 000009
【０１５２】
【表９】
0005657890.tif 000010
【０１５３】
【表１０】
0005657890.tif 000011
【０１５４】
【表１１】
0005657890.tif 000012
【０１５５】
【表１２】
0005657890.tif 000013
【０１５６】
【表１３】
0005657890.tif 000014
【図１】
0005657890.tif 000015
【図２】
0005657890.tif 000016
【図３Ａ】
0005657890.tif 000017
【図３Ｂ】
0005657890.tif 000018
【図３Ｃ】
0005657890.tif 000019
【図３Ｄ】
0005657890.tif 000020
【図４】
0005657890.tif 000021
【図５】
0005657890.tif 000022
【図６】
0005657890.tif 000023
【図７】
0005657890.tif 000024
【図８Ａ】
0005657890.tif 000025
【図８Ｂ】
0005657890.tif 000026
【図８Ｃ】
0005657890.tif 000027
【図８Ｄ】
0005657890.tif 000028
【図９】
0005657890.tif 000029