(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸複合体を有する粒子を形成する方法であって、
核酸をカチオン性キャリア剤と接触させて核酸複合体を形成し、
ポリマー賦形剤を含む溶液に、核酸複合体を接触させて粒子形成溶液を生成し、ここでポリマー賦形剤はグリコーゲンを含み、
ポリエチレングリコールの添加により粒子形成溶液を相分離して粒子を形成することを含む方法。
【請求項２】
核酸がｓｉＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
形成された粒子を有機溶媒に懸濁させることをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
形成された粒子を徐放マトリクス内に配置することをさらに含む、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
カチオン性キャリア剤が、ペプチド、脂質またはカチオン性ポリマーのうちの１つ以上を含む、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
形成された粒子を溶出制御マトリクス内に配置することをさらに含む、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
活性剤送達装置であって、
当該装置が、核酸とカチオン性キャリア剤とを含む核酸複合体と、相分離されるポリマー賦形剤と、を含み、ここでポリマー賦形剤はグリコーゲンを含み、核酸複合体およびポリマー賦形剤が、一緒に配置されて粒子を形成し、粒子の平均直径が１００μｍ未満であり、当該粒子が、相分離を開始するためのポリエチレングリコールを更に含む、装置。
【請求項８】
カチオン性キャリア剤が、ペプチド、脂質またはカチオン性ポリマーのうちの１つ以上を含む、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
溶出制御マトリクスをさらに含み、粒子が溶出制御マトリクス内に配置される、請求項７又は８に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国を除くすべての指定国での出願人である米国籍企業SurModics, Inc.ならびに、指定国としての米国にかぎっての出願人であるオランダ国民であるJoram Slagerの名前で、２００９年５月７日にＰＣＴ国際特許出願として出願されており、２００８年５月７日出願の米国特許出願第６０／０５１，０４１号（その内容を本明細書に援用する）の優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は、活性剤を放出するための装置および方法に関する。特に、本発明は、粒子から核酸複合体を放出するための装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
さまざまな病状の治療に対する有望な手法のひとつに、治療剤としての核酸の投与がある。一例として、この手法は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸、アプタマー、リボザイム、触媒ＤＮＡなどの投与を含み得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
標的細胞に対する作用に介在するために、核酸ベースの活性剤は通常、いくつかあるステップのうち特に、適切な標的細胞まで送達され、細胞によって取り込まれ、エンドソームから放出され、核または細胞質まで運ばれ（細胞内移動）なければならない。それ自体、核酸を用いて成功する治療は、部位特異的送達、送達段階での安定性、以後の標的細胞内での生物活性の度合いに左右される。さまざまな理由で、これらのステップは、達成が困難な場合がある。一例として、核酸はin vivoの環境では酵素によって容易に分解される。
【０００５】
したがって、治療用核酸を標的組織に送達可能な装置ならびに、これを製造および使用する方法に需要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の実施形態は、核酸複合体を有する粒子、これを含む医療装置ならびに、関連の方法を含む。一実施形態では、本発明は、核酸をカチオン性キャリア剤と接触させて核酸複合体を形成し、核酸複合体を多孔性粒子に吸収することを含み、粒子の平均直径が約１００μｍ未満である、核酸複合体を有する粒子を形成する方法を含む。
【０００７】
一実施形態では、本発明は、核酸複合体を有する粒子を形成する方法を含む。この方法は、核酸をカチオン性キャリア剤と接触させて核酸複合体を形成し、核酸複合体をポリマーと接触させ、ポリマーを架橋させることを含む。
【０００８】
一実施形態では、本発明は、核酸をカチオン性キャリア剤と接触させて核酸複合体を形成し、ペプチドを含む溶液に核酸複合体を接触させることを含み、核酸複合体がペプチドの成核剤として作用する、核酸複合体を有する粒子を形成する方法を含み得る。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、医療装置の製造方法を含み得る。この方法は、核酸をカチオン性キャリア剤と接触させて核酸複合体を形成し、核酸複合体を多孔性粒子に吸着させて粒子を含有する核酸複合体を形成し、粒子を含有する核酸複合体をポリマー溶液と混合してコーティング混合物を生成し、当該コーティング混合物を基材に適用することを含み得る。
【００１０】
一実施形態では、本発明は、医療装置の製造方法を含み得る。この方法は、核酸をカチオン性キャリア剤と接触させて核酸複合体を形成し、核酸複合体を材料と組み合わせて粒子を含有する核酸複合体をin situで形成し、核酸複合体粒子をポリマー溶液と混合してコーティング混合物を生成し、当該コーティング混合物を基材に適用することを含み得る。
【００１１】
一実施形態では、本発明は、基材と、基材に配置された溶出制御マトリクスと、溶出制御マトリクス内に配置された複数の粒子と、粒子内に配置された複数の核酸複合体と、を含み、核酸複合体が核酸とカチオン性キャリア剤とを含む植込み型医療装置を含み得る。
【００１２】
上記の発明の概要は、それぞれ論じられている本発明の実施形態を説明することを意図するものではない。これは、以下の図面および詳細な説明の目的である。
【００１３】
以下の図面を参照することで、本発明を一層完全に理解できよう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本明細書に記載の実施形態による核酸複合体を含む粒子の概略断面図である。
【図２】本明細書に記載の実施形態による活性剤送達装置の概略断面図である。
【図３】本明細書に記載の実施形態による活性剤送達装置の概略断面図である。
【図４】本明細書に記載の実施形態による核酸複合体を含む粒子の概略断面図である。
【図５Ａ】蛍光顕微鏡法で撮影した粒子の画像である。
【図５Ｂ】蛍光顕微鏡法で撮影した粒子の画像である。
【図６】ポリアルジトール粒子からの核酸複合体の放出を示すグラフである。
【図７】蛍光顕微鏡法で撮影したＨＥＫ２９３細胞の画像である。
【図８Ａ−８Ｂ】蛍光顕微鏡法で撮影したＨＥＫ２９３細胞の画像である。
【図９Ａ】蛍光顕微鏡法で撮影したＨＥＫ２９３細胞の画像である。
【図９Ｂ】蛍光顕微鏡法で撮影したＨＥＫ２９３細胞の画像である。
【図９Ｃ】蛍光顕微鏡法で撮影したＨＥＫ２９３細胞の画像である。
【図９Ｄ】蛍光顕微鏡法で撮影したＨＥＫ２９３細胞の画像である。
【図９Ｅ】蛍光顕微鏡法で撮影したＨＥＫ２９３細胞の画像である。
【図９Ｆ】蛍光顕微鏡法で撮影したＨＥＫ２９３細胞の画像である。
【図９Ｇ】蛍光顕微鏡法で撮影したＨＥＫ２９３細胞の画像である。
【図９Ｈ】蛍光顕微鏡法で撮影したＨＥＫ２９３細胞の画像である。
【図９Ｉ】蛍光顕微鏡法で撮影したＨＥＫ２９３細胞の画像である。
【図９Ｊ】蛍光顕微鏡法で撮影したＨＥＫ２９３細胞の画像である。
【図１０Ａ】蛍光顕微鏡法で撮影したＨＥＫ２９３細胞の画像である。
【図１０Ｂ】蛍光顕微鏡法で撮影したＨＥＫ２９３細胞の画像である。
【図１０Ｃ】蛍光顕微鏡法で撮影したＨＥＫ２９３細胞の画像である。
【図１０Ｄ】蛍光顕微鏡法で撮影したＨＥＫ２９３細胞の画像である。
【図１０Ｅ】蛍光顕微鏡法で撮影したＨＥＫ２９３細胞の画像である。
【図１１Ａ】ミリグラム単位のＰＶＰ粒子の関数としてＤＮＡの放出を示す。
【図１１Ｂ】ミリグラム単位のＰＶＰ粒子の関数としてＤＮＡの放出を示す。
【図１２】ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションの結果としてのルシフェラーゼ発現のノックダウンの割合を示すグラフである。
【図１３】ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションの結果としてのルシフェラーゼ発現のノックダウンの割合を示すグラフである。
【図１４】ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションの結果としてのルシフェラーゼ発現のノックダウンの割合を示すグラフである。
【図１５】ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションの結果としてのルシフェラーゼ発現のノックダウンの割合を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書で使用する場合、「複合体」という用語は、非共有結合による２以上の化学種の化学的会合を示すものとする。
【００１６】
核酸ベースの治療剤の活性を維持するためのひとつの手法に、哺乳類の被検体への投与前に核酸を送達剤と複合化することがある。一例として、送達段階での分解を防止し、細胞侵入を促進するために、核酸（正味の負電荷を有する）を、ポリエチレンイミンなどの正味の正電荷を有するキャリア剤と複合化することが可能である。これらの核酸／キャリア複合体は、ポリプレックスまたは核酸複合体と呼ばれることもある（文脈によっては、これらの複合体は核酸送達粒子とも呼ばれてきたが、そこでの「粒子」という用語の使い方は、本明細書に記載の核酸複合体を含む粒子とは異なる）。ポリプレックスを使用すると送達段階で核酸の活性を保つ一助にはなり得るが、核酸の徐放という論点には触れていない。
【００１７】
溶出制御マトリクスを使用すれば、いくつかのタイプの活性剤の徐放が得られる。しかしながら、溶出制御コーティングなどの溶出制御マトリクスからの核酸複合体の送達は、特定の課題を提示し得るものである。これらが一般にコーティング形成で用いられる条件下で解離するか、そうでなければ不活性化される可能性があるためである。たとえば、核酸複合体は、ポリマー溶出制御コーティングを適用するのに普通に用いられる有機溶媒によって、不活性化したり、そうでなければ損なわれたりすることがある。
【００１８】
本発明の実施形態は、複合体を粒子内に配置した後、この粒子を装置および／またはコーティングに取り込むことを伴う、核酸複合体を投与するための方法を含み得る。核酸複合体を粒子内に配置した後、これらは一層丈夫で、以後の処理時に分解されにくくなる。それにもかかわらず、粒子内に配置された核酸複合体は、その活性を維持することが可能であり、図示のように、以下の実施例をうまく用いて標的細胞をトランスフェクトすることが可能である。いくつかの実施形態では、粒子内に配置される核酸複合体が、有機溶媒中に懸濁されているにもかかわらず、その活性を保持し得る。核酸複合体を配置する粒子は、多孔性セラミック粒子との関連など予備成形したものであってもよいし、核酸複合体と、ポリマー賦形剤などの少なくとも１種類の他の成分とを含む混合物からｉｎ  ｓｉｔｕで形成することも可能である。ポリマー賦形剤は、ペプチドおよび多糖を含み得るがこれに限定されるものではない。以下、代表的な実施形態の態様について、一層詳細に説明する。
【００１９】
ここで図１を参照すると、核酸複合体を含む粒子１００の概略断面図が示されている（原寸比例ではない）。粒子１００は、粒子材料１０２と、粒子材料１０２内部の１つ以上の核酸複合体１０６とを含み得る。粒子材料は、ポリマー（架橋ポリマーを含む）、セラミック、金属などであればよい。具体例としては、カオリン、架橋ポリビニルピロリドンまたは架橋メタクリレートマルトデキストリンがあげられるが、これに限定されるものではない。
【００２０】
粒子材料を予備成形した後に核酸複合体をこれに加えることが可能である。あるいは、核酸複合体の周りに粒子材料をin situで形成しても構わない。粒子材料の具体例については、後ほど詳細に説明する。核酸複合体は、核酸とカチオン性キャリア剤とを含み得る。代表的な核酸複合体に関するさらに詳細については、後述する。粒子１００は、直径１０８が約１μｍ〜約５０μｍであればよい。図１に示す粒子１００は断面が球状であるが、本発明の実施形態が不規則な形状をはじめとして異なる形状の粒子を含み得る旨は理解できよう。
【００２１】
粒子が相分離技術で形成されるものなどのいくつかの実施形態では、相分離を開始するのに用いられる残留量の両親媒性ポリマーが、粒子内に残っていてもよい。いくつかの実施形態では、粒子に残る両親媒性ポリマーの量が約５重量パーセント未満である。いくつかの実施形態では、それが約２重量パーセント未満である。いくつかの実施形態では、それが０重量パーセントよりも多い。いくつかの実施形態では、それが０重量パーセント〜５重量パーセントの間である。
【００２２】
本明細書のさまざまな実施形態によれば、核酸複合体を含有する粒子を、活性剤溶出制御マトリクス（または徐放マトリクス）内に取り込んでもよい。ここで図２を参照すると、活性剤送達装置２００を形成する溶出制御マトリクス２１０内に配置された複数の粒子１００が示されている。溶出制御マトリクス２１０は、粒子１００内の核酸複合体を溶出制御マトリクス２１０の外まで溶出させることのできる材料で生成可能なものである。溶出制御マトリクス２１０は、さまざまなポリマーなどのさまざまな材料を含み得る。いくつかの実施形態では、溶出制御マトリクス２１０が非分解性ポリマーを含み得る。代表的な非分解性ポリマーについては、後ほど詳細に説明する。いくつかの実施形態では、溶出制御マトリクス２１０が分解性ポリマーを含み得る。代表的な分解性ポリマーについては、後ほど詳細に説明する。いくつかの実施形態では、溶出制御マトリクス２１０が、分解性ポリマーと非分解性ポリマーの両方を含み得る。溶出制御マトリクス２１０は、さまざまな技術を用いて堆積可能なものである。一例として、噴霧堆積、ディップコーティング、ブラシコーティング、プリンティング、キャスティングなどがあげられる。噴霧堆積を容易にするなどのいくつかの実施形態では、粒子１００を堆積前に有機溶媒に懸濁させてもよい。一例として、粒子１００を溶出制御マトリクス２１０のポリマーと一緒に堆積前に有機溶媒に懸濁させてもよい。図２では、活性剤送達装置２００は、実質的に平坦な構成で示されている。しかしながら、装置２００が、フィラメント、円柱、不規則な形状などをはじめとする多くの異なる形態を取り得ることは、理解できよう。
【００２３】
いくつかの実施形態では、核酸複合体を含有する粒子を含む溶出制御マトリクスを、医療装置の基材上に配置可能である。一例として、このような溶出制御マトリクスを金属ステントに配置可能である。本明細書に含まれる医療装置の別の例については、後述する。ここで図３を参照すると、核酸複合体を含む粒子３０２のある溶出制御マトリクス３１０を含む装置３００であって、溶出制御マトリクス３１０が基材３１２に配置された状態が示されている。基材３１２は、ポリマー、金属、セラミックなどをはじめとするさまざまなタイプの材料を含み得る。基材材料の別の例については後述する。図示の基材３１２が、医療装置の一部をなすことも可能である。
【００２４】
核酸複合体を含有する粒子は、さまざまな方法で形成可能である。上述したように、いくつかの実施形態では、粒子材料を予備成形し、核酸複合体を粒子材料に加えるか、吸収させる。他の実施形態では、粒子材料を核酸複合体の周りにｉｎ  ｓｉｔｕで形成する。粒子材料を核酸複合体の周りに形成するには、さまざまな技術を用いることが可能である。いくつかの実施形態では、粒子材料がポリマー系であり、これを核酸複合体の周りに配置した後で架橋ステップを実施してポリマーを架橋させることが可能である。架橋は、光開始およびレドックス反応開始をはじめとする、当業者間で周知のさまざまな技術で開始可能である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、核酸複合体が効果的に成核剤として機能でき、粒子を形成するための材料を核酸複合体の周りに堆積可能である。一例として、相分離技術などの技術で、核酸複合体を用いて、タンパク質（Ｆａｂ断片など）を粒子に形成可能である。このような実施形態では、タンパク質またはペプチドが、相分離のなされるポリマー賦形剤として機能できる。この手法の一例を以下の実施例３に示す。このような手法では、成核剤をペプチド溶液に加えたときにペプチド核を形成するのに十分な濃度で、ペプチドを溶液に溶解させることが可能である。多くの調製物において、溶液中でのペプチドの濃度は通常、約１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度である。しかしながら、選択したペプチドが容易に成核剤と融合して核が形成されるのであれば、これよりも低濃度のペプチドを用いてもよい。実用上の特定のモードでは、ペプチドが抗体またはＦａｂ断片であり、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬの範囲、特に１５ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で溶液中にある。
【００２６】
ペプチド以外に、他の成分も相分離がなされるポリマー賦形剤として機能し得る旨は理解できよう。一例として、ポリマー賦形剤は、多糖を含み得る。代表的な多糖としてグリコーゲンがあげられるが、これに限定されるものではない。
【００２７】
ここで図４を参照すると、核酸複合体４０６を含む粒子４００の概略図が示されている。核酸複合体４０６は、核酸と、カチオン性キャリア剤とを含む。核酸複合体は、複数の正に荷電した基４０２を外面（本明細書では、説明の都合で概念的に図示してある）に有する。タンパク質などの材料からなる層４１０を核酸複合体４０６の周りに堆積させることが可能である。いくつかの実施形態では、層４１０は、ポリマー、炭水化物などをはじめとする他のタイプの材料を含み得る。
【００２８】
相分離技術は、粒子を形成するための成分の材料を含有する溶液に相分離剤を混合することを含み得る旨は理解できよう。相分離剤には、両親媒性化合物が可能である。両親媒性試薬をポリマー系と非ポリマー系の両親媒性材料から選択すればよい。本発明のいくつかの態様では、両親媒性試薬が両親媒性ポリマーである。代表的な両親媒性ポリマーおよび化合物として、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）およびＰＥＧコポリマー、テトラエチレングリコール、トリエチレングリコール、トリメチロールプロパンエトキシレートおよびペンタエリスリトールエトキシレート、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびＰＶＰコポリマー、デキストラン、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリビニルピリジン、ポリリシン、ポリアルギニン、スルホン酸ＰＥＧ、脂肪族第四級アミン、脂肪族スルホネート、脂肪酸、デキストラン、デキストリン、シクロデキストリンがあげられる。両親媒性ポリマーは、親水性と疎水性のポリマーブロックのコポリマーであってもよい。
【００２９】
いくつかの態様では、両親媒性試薬（両親媒性ポリマーなど）の濃縮溶液を調製した後、粒子を形成するための成分の材料を含有する溶液に加える。実用上の多くのモードでは、両親媒性試薬の最終濃度が約１％（ｗ／ｖ）以上になるように、両親媒性試薬を溶液に加える。いくつかの実施形態では、両親媒性試薬の最終濃度が、約２．５％（ｗ／ｖ）〜約１２．５％（ｗ／ｖ）、特に約５％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）の範囲である。たとえば、ＰＥＧなどの両親媒性試薬を、約７．５％の量で使用可能である。
【００３０】
核酸複合体
さまざまな実施形態で用いられる核酸複合体は、活性剤としての核酸と、この核酸に複合化されたキャリア剤とを含み得る。本発明の実施形態で用いられるキャリア剤は、製造および送達過程で核酸の活性を保つために核酸と複合化可能な化合物を含み得る。
【００３１】
代表的なクラスの好適なキャリア剤としては、カチオン性化合物（正味の正電荷を有する化合物）ならびに、電荷が中性の化合物があげられる。一例として、好適なキャリア剤は、カチオン性ポリマーおよびカチオン性脂質を含み得る。また、好適なカチオン性キャリア剤は、シクロデキストリン含有ポリカチオン、ヒストン、カチオン化ヒト血清アルブミン、キトサンなどのアミノ多糖、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｌ−オルニチンおよびポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステルなどのペプチド、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリプロピレンイミン、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリ（β−アミノエステル）などのポリアミンも含み得る。他のキャリア剤として、固体の核酸脂質ナノ粒子（ＳＮＡＬＰ）、リポソーム、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などがあげられる。さらに、キャリアを、特定の細胞型を標的できるようにする分子にコンジュゲートしてもよい。標的化剤の例として、特定の細胞表面分子を認識して結合する抗体およびペプチドがあげられる。
【００３２】
たとえば、実用上の一モードでは、ＰＥＩと核酸とを組み合わせてポリプレックスを調製する。一般論として、ＰＥＩ試薬は重量単位あたり特定数の第一級アミノ基（「Ｎ」）を提供し、核酸が重量単位あたり特定数の荷電したホスフェート基（「Ｐ」）を提供する。ＰＥＩと核酸とを組み合わせ、所望のＮ：Ｐ比を得ることが可能である。いくつかの態様では、Ｎ：Ｐ比が約１０：１〜約２５：１の範囲である。
【００３３】
いくつかの実施形態では、本発明の実施形態で用いる核酸送達コンストラクトが、対象となる細胞への核酸の送達を容易にするペプチドを含み得る。たとえば、代表的なペプチドは、核酸と会合し、細胞の細胞質に対するその核酸の送達を容易にする可能である。本明細書で使用する場合、「ペプチド」という用語は、あるアミノ酸（残基）のカルボキシル基と次のアミノ酸のアミノ基から形成されるアミド結合（単数または複数）で結合された２つ以上のアミノ酸残基を含有するあらゆる化合物を含むものとする。それ自体、ペプチドは、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質などを含み得る。
【００３４】
いくつかの実施形態では、本発明の実施形態で用いられる核酸送達コンストラクトが、細胞透過ドメインおよび核酸結合ドメインなどの少なくとも２つのドメインを有するペプチドを含み得る。本明細書で使用する場合、「細胞透過ドメイン」という用語は、細胞内への分子の侵入を容易にするよう機能するペプチド分子の領域を示すものとする。本明細書で使用する場合、「核酸結合ドメイン」という用語は、核酸と結合するよう機能するペプチド分子の領域を示すものとする。
【００３５】
多くの異なるペプチドが本明細書で企図されることは、理解できよう。ＭＰＧとして知られる代表的なペプチドのひとつは、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１タンパク質由来の疎水性ドメインと、ＳＶ４０ラージＴ抗原の核局在配列（ＮＬＳ）由来の塩基性ドメインとからなる２７アミノ酸の二分両親媒性ペプチドである（ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ）（N-TER Nanoparticle siRNA Transfection SystemとしてSigma-Aldrich, St. Louis, MOから市販されている）。ＭＰＧΔNLSとして知られるもうひとつの代表的なペプチドも、２７アミノ酸の二分両親媒性ペプチド（ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＳＫＲＫＶ）である。他の代表的なペプチドとしては、ポリ−アルギニン融合ペプチドがあげられる。さらに他の代表的なペプチドには、二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン（ＰＴＤ−ＤＲＢＤペプチド）で結合されたタンパク質形質導入ドメインを持つものがある。
【００３６】
本発明の実施形態で使用する核酸は、治療効果が得られるよう機能し得るさまざまなタイプの核酸を含み得る。代表的なタイプの核酸として、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンス核酸、アプタマー、リボザイム、ロックされた核酸、触媒ＤＮＡがあげられるが、これに限定されるものではない。
【００３７】
核酸送達複合体は、さまざまなプロセスを経てキャリア剤および核酸から形成可能である。場合によっては、たとえば、カチオン性キャリア剤がアニオン性核酸分子と相互作用し、小さく規則正しい複合体として凝縮される。それ自体、いくつかの実施形態では、核酸送達複合体を形成するのに核酸を単にカチオン性キャリア剤と接触させればよい。
【００３８】
ポリマー
核酸複合体が配置される粒子を形成する材料としてポリマーを含ませることが可能である。核酸を含み得る粒子の形成に使用可能なポリマーの例として、エチレンビニルアルコールコポリマー；ポリ（ヒドロキシバレレート）；ポリ（Ｌ−乳酸）；ポリカプロラクトン；ポリ（ラクチド−コ−グリコライド）；ポリ（ヒドロキシブチレート）；ポリ（ヒドロキシブチレート−コ−バレレート）；ポリジオキサノン；ポリオルトエステル；ポリ酸無水物；ポリ（グリコール酸）；ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）；ポリ（グリコール酸−コ−トリメチレンカーボネート）；ポリホスホエステル；ポリホスホエステルウレタン；ポリ（アミノ酸）；シアノアクリレート；ポリ（トリメチレンカーボネート）；ポリ（イミノカーボネート）；コポリ（エーテルエステル）（ＰＥＯ／ＰＬＡなど）；ポリアルキレンオキサレート；ポリホスファゼン；フィブリン、フィブリノゲン、セルロース、スターチ、コラーゲン、ヒアルロン酸などの生体分子；ポリウレタン；シリコーン；ポリエステル；ポリオレフィン；ポリイソブチレンおよびエチレン−αオレフィンコポリマー；アクリルポリマーおよびコポリマー；ポリ塩化ビニルなどのハロゲン化ビニルポリマーおよびコポリマー；ポリビニルメチルエーテルなどのポリビニルエーテル；ポリフッ化ビニリデンおよびポリ塩化ビニリデンなどのハロゲン化ポリビニリデン；ポリアクリロニトリル；ポリビニルケトン；ポリスチレンなどのポリビニル芳香族；ポリ酢酸ビニルなどのポリビニルエステル；エチレン−メタクリル酸メチルコポリマー、アクリロニトリルスチレンコポリマー、ＡＢＳ樹脂、エチレン−酢酸ビニルコポリマーなどのビニルモノマー同士やビニルモノマーとオレフィンとのコポリマー；ナイロン６６およびポリカプロラクタムなどのポリアミド；アルキド樹脂；ポリカーボネート；ポリオキシメチレン；ポリイミド；ポリエーテル；エポキシ樹脂；ポリウレタン；レーヨン；レーヨン−トリアセテート；セルロース；酢酸セルロース；酪酸セルロース；酪酸酢酸セルロース；セロファン；硝酸セルロース；プロピオン酸セルロース；セルロースエーテル；およびカルボキシメチルセルロースがあげられる。
【００３９】
さまざまな実施形態では、溶出制御マトリクスの一部としてポリマーを含めることも可能である。多くの異なるタイプのポリマーをこの目的で使用できる。溶出制御マトリクスの形成に用いることが可能なポリマーの具体例については後述する。
【００４０】
分解性ポリマー
分解性ポリマーを、本明細書のいくつかの実施形態と関連させることが可能である。一例として、いくつかの実施形態では、核酸複合体を含有する粒子に分解性ポリマーを含めることが可能である。いくつかの実施形態では、核酸複合体を有する粒子を含む溶出制御マトリクスに分解性ポリマーを含めることが可能である。本発明の実施形態で用いられる分解性ポリマーは、天然ポリマーまたは合成ポリマーの両方を含み得る。分解性ポリマーの例として、ポリマー骨格に加水分解的に不安定な結合を有するものがあげられる。本発明の分解性ポリマーは、バルク浸食特性を有するものと表面浸食特性を有するものの両方を含み得る。
【００４１】
理論に拘泥されることを意図したわけではないが、分解性ポリエステルを用いることは、核酸複合体の徐放を提供するという観点で利点となり得る。なぜなら、マトリクス内での拡散だけでなくマトリクスの分解によっても放出に介在可能であるからである。
【００４２】
合成分解性ポリマーは、分解性ポリエステル（ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、ポリ（ジオキサノン）、ポリラクトン（ポリ（カプロラクトン）など）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）、ポリ（３−ヒドロキシバレレート）、ポリ（バレロラクトン）、ポリ（タルトロン酸）、ポリ（β−マロン酸）、ポリ（プロピレンフマレート））など；分解性ポリエステルアミド；分解性ポリ酸無水物（ポリ（セバシン酸）、ポリ（１，６−ビス（カルボキシフェノキシ）ヘキサン、ポリ（１，３−ビス（カルボキシフェノキシ）プロパン）；分解性ポリカーボネート（チロシンベースのポリカーボネートなど）；分解性ポリイミノカーボネート；分解性ポリアリレート（チロシンベースのポリアリレートなど）；分解性ポリオルトエステル；分解性ポリウレタン；分解性ポリホスファゼン；およびこれらのコポリマーを含み得る。
【００４３】
天然または天然ベースの分解性ポリマーは、スターチ、セルロース、キチン、キトサン、およびこれらのコポリマーなど、多糖および修飾多糖を含み得る。
【００４４】
分解性ポリマーの具体例として、以下の一般構造で説明可能なポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）およびポリ（ブチレンテレフタレート）を主成分とするポリ（エーテルエステル）マルチブロックコポリマーがあげられる。
［−（ＯＣＨ2ＣＨ2）n−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ6Ｈ4−Ｃ（Ｏ）−］ｘ［−Ｏ−（ＣＨ2）4−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ6Ｈ4−Ｃ（Ｏ）−］ｙ，
式中、−Ｃ6Ｈ4−はテレフタル酸の各エステル化分子からの二価の芳香環残基を示し、ｎは各親水性ＰＥＧブロックにおけるエチレンオキシド単位の数を示し、ｘはコポリマー中の親水性ブロックの数を示し、ｙはコポリマー中の疎水性ブロックの数を示す。添え字「ｎ」は、ＰＥＧブロックの分子量が約３００〜約４０００になるように選択可能である。ブロックコポリマーを操作して、コポリマー構造の値ｎ、ｘ、ｙを変えることで幅広い物理的特性（親水性、密着性、強度、鍛造性、分解性、耐久性、可撓性など）ならびに、活性剤放出特性（制御されたポリマー分解および膨張によるなど）を得るようにしてもよい。このような分解性ポリマーは特に、米国特許第５，９８０，９４８号明細書（その内容全体を本明細書に援用する）に記載されているものを含み得る。
【００４５】
分解性ポリエステルアミドは、モノマーＯＨ−ｘ−ＯＨ、ｚおよびＣＯＯＨ−ｙ−ＣＯＯＨから形成されるものを含み得る。ここで、ｘはアルキル、ｙはアルキル、ｚはロイシンまたはフェニルアラニンである。このような分解性ポリエステルアミドは特に、米国特許第６，７０３，０４０号明細書（（その内容全体を本明細書に援用する）に記載されているものを含み得る。
【００４６】
分解性ポリマー材料は、（ａ）非ペプチドポリアミノポリマー；（ｂ）ポリイミノカーボネート；（ｃ）アミノ酸由来のポリカーボネートおよびポリアリレート；および（ｄ）ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーからも選択可能である。
【００４７】
一実施形態では、分解性ポリマー材料が、非ペプチドポリアミノ酸ポリマーからなる。代表的な非ペプチドポリアミノ酸ポリマーが、たとえば、米国特許第４，６３８，０４５号明細書（「Ｎｏｎ−Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｂｉｏｅｒｏｄｉｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ」、１９８７年１月２０日）に記載されている。一般的に言えば、これらのポリマー材料は、以下に示す２つの構造のうちの１つを有する、２つまたは３つのアミノ酸単位を含むモノマー由来である。
【００４８】
【化１】
0005763525.tif 000002
式中、モノマー単位は、側基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3の１箇所以上で加水分解的に不安定な結合によって結合され、ここでＲ1、Ｒ2、Ｒ3は、天然に生じるアミノ酸の側鎖であり；Ｚは望ましい任意のアミン保護基または水素であり、Ｙは望ましい任意のカルボキシル保護基またはヒドロキシルである。各モノマー単位が天然に生じるアミノ酸を含み、これが後にアミドまたは「ペプチド」結合以外の結合によってモノマー単位として重合される。モノマー単位は、ペプチド結合によって結ばれた２つまたは３つのアミノ酸からなるものであってもよく、よって、ジペプチドまたはトリペプチドを含む。モノマー単位の厳密な組成とは関係なく、いずれもポリペプチド鎖に典型的なアミド結合を形成するアミノ基およびカルボキシル基ではなく、それぞれの側鎖を介して加水分解的に不安定な結合によって重合される。このようなポリマー組成物は無毒かつ分解性で、多岐にわたる治療用途において活性剤の送達にゼロ次の放出動態を提供できる。これらの態様によれば、アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、リシン、ヒドロキシリシン、アルギニン、ヒドロキシプロリン、メチオニン、システイン、シスチン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、シトルリン、オルニチン、ランチオニン、ヒポグリシンＡ、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、αアミノアジピン酸、カナバニン、ｖｅｎｋｏｌｉｃ  ａｃｉｄ、チオールヒスチジン、エルゴチオニン、ジヒドロキシフェニルアラニンをはじめとする天然に生じるＬ−αアミノ酸ならびに、タンパク質化学において十分に認識されてキャラクタライズされている他のアミノ酸から選択される。
【００４９】
本発明の分解性ポリマーは、発明の名称「COATINGS FOR MEDICAL ARTICLES INCLUDING NATURAL BIODEGRADABLE POLYSACCHARIDES」として米国特許出願公開第２００５／０２５５１４２号明細書に記載されているもの、発明の名称「COATINGS INCLUDING NATURAL BIODEGRADABLE POLYSACCHARIDES AND USES THEREOF」として米国特許出願公開第２００７／００６５４８１号明細書に記載されているもの、発明の名称「HYDROPHOBIC DERIVATIVES OF NATURAL BIODEGRADABLE POLYSACCHARIDES」として米国特許出願公開第２００７０２１８１０２号明細書に記載されているもの（いずれもその内容全体を本明細書に援用する）などの重合化多糖も含み得る。
【００５０】
本発明の分解性ポリマーは、発明の名称「PROCESS FOR THE PREPARATION OF A CONTROLLED RELEASE SYSTEM」として米国特許第６，３０３，１４８号明細書に記載されているもの（その内容全体を本明細書に援用する）などのデキストランベースのポリマーも含み得る。商品名ＯＣＴＯＤＥＸで市販されているものを含む代表的なデキストランベースの分解性ポリマー。
【００５１】
本発明の分解性ポリマーはさらに、コラーゲン／ヒアルロン酸ポリマーを含み得る。
【００５２】
本発明の分解性ポリマーは、プレポリマーＡおよびＢ由来の少なくとも２つの加水分解性セグメントを含むマルチブロックコポリマーを含み得るものであり、これらのセグメントは多官能性鎖延長剤によって結合され、プレポリマーＡおよびＢならびに、トリブロックコポリマーＡＢＡおよびＢＡＢから選択され、ここで、マルチブロックコポリマーは非晶質であり、生理学的（身体）条件にて最大でも３７℃（Ｔｇ）で１以上のガラス転移点（Ｔｇ）を有する。プレポリマーＡおよびＢには、ラクチド（Ｌ，ＤまたはＬ／Ｄ）、グリコライド、ε−カプロラクトン、δ−バレロラクトン、炭酸トリメチレン、炭酸テトラメチレン、１，５−ジオキセパン−２−オン、１，４−ジオキサン−２−オン（ｐａｒａ−ジオキサノン）などの環状モノマーまたは環状無水物（オキセパン−２，７−ジオン）由来の加水分解性ポリエステル、ポリエーテルエステル、ポリカーボネート、ポリエステルカーボネート、ポリ酸無水物またはこれらのコポリマーが可能である。プレポリマーの組成については、得られるコポリマーの身体状態での最高ガラス転移点が３７℃未満になるように選択すればよい。３７℃未満というＴｇの要件を満たすのに、上述したモノマーまたはモノマーの組み合わせのうちのいくつかのほうが他のものより好ましいことがある。これだけでＴｇが下がることもあるし、あるいはコポリマーのガラス転移点を下げるのに十分な分子量のポリエチレングリコールでプレポリマーを修飾する。分解性マルチブロックコポリマーは、非晶質の加水分解性配列を含み得るものであり、物理的特性や分解特性の異なるセグメントが多官能性鎖延長剤によって結合されることもある。たとえば、グリコライド−ε−カプロラクトンセグメントおよびラクチド−グリコライドセグメントからなるマルチブロックコ−ポリエステルを、２種類のポリエステルプレポリマーで構成することが可能である。セグメントのモノマー組成、セグメント比、長さを制御することで、容易に調節可能な特性を持つ多岐にわたるポリマーが得られる。このような分解性マルチブロックコポリマーは特に、米国特許出願公開第２００７／０１５５９０６号明細書（その内容全体を本明細書に援用する）に記載されているものを含み得る。
【００５３】
非分解性ポリマー
非分解性ポリマーを、本明細書のいくつかの実施形態と関連させることが可能である。一例として、いくつかの実施形態では、核酸複合体を含有する粒子に非分解性ポリマーを含めることが可能である。いくつかの実施形態では、核酸複合体を有する粒子を含む溶出制御マトリクスに非分解性ポリマーを含めることが可能である。一実施形態では、非分解性ポリマーは、第１のポリマーおよび第２のポリマーを含む複数のポリマーを含む。コーティング溶液が１種類のポリマーしか含有しない場合、これは本明細書に記載したような第１のポリマーであっても第２のポリマーであってもよい。本明細書で使用する場合、「（メタ）アクリレート」という用語は、ポリマーを説明するのに用いる際、メチル基を含む形態（メタクリレート）またはメチル基を含まない形態（アクリレート）を意味するものとする。
【００５４】
本発明の第１のポリマーは、ポリ（アルキル（メタ）アクリレート）およびポリ（芳香族（メタ）アクリレート）からなる群から選択されるポリマーを含み得るものであり、ここで、当業者であれば「（メタ）」とはアクリルおよび／またはメタクリル形態（それぞれアクリレートおよび／またはメタクリレートに対応）におけるこのような分子を含むものと理解するであろう。代表的な第１のポリマーは、ポリ（ｎ−ブチルメタクリレート）（ｐＢＭＡ）である。このようなポリマーは、分子量約２００，０００ダルトン〜約３２０，０００ダルトンの範囲で、さまざまな内部粘度、溶解性および形態（結晶または粉末など）でＡｌｄｒｉｃｈなどから市販されている。いくつかの実施形態では、分子量約２００，０００ダルトン〜約３００，０００ダルトンのポリ（ｎ−ブチルメタクリレート）（ｐＢＭＡ）を使用する。
【００５５】
好適な第１のポリマーの例には、ポリ（アリール（メタ）アクリレート）、ポリ（アラルキル（メタ）アクリレート）、およびポリ（アリールオキシアルキル（メタ）アクリレート）からなる群から選択されるポリマーも含まれる。このような用語は、少なくとも１つの炭素鎖と少なくとも１つの芳香環が、一般にエステルであるアクリル基と組み合わさり、組成物が得られるポリマー構造を説明するのに用いられる。特に、代表的なポリマー構造は、６〜１６個の炭素原子を有し、重量平均分子量が約５０〜約９００キロダルトンであるアリール基を有するものを含む。好適なポリ（アラルキル（メタ）アクリレート）、ポリ（アリールアルキ（メタ）アクリレート）またはポリ（アリールオキシアルキル（メタ）アクリレート）は、同じく芳香族部分を含有するアルコール由来の芳香族エステルから生成可能である。ポリ（アリール（メタ）アクリレート）の例として、ポリ（９−アントラセニルメタクリレート）、ポリ（クロロフェニルアクリレート）、ポリ（メタクリルオキシ−２−ヒドロキシベンゾフェノン）、ポリ（メタクリルオキシベンゾトリアゾール）、ポリ（ナフチルアクリレート）および−メタクリレート）、ポリ（４−ニトロフェニルアクリレート）、ポリ（ペンタクロロ（ブロモ、フルオロ）アクリレート）および−メタクリレート）、ポリ（フェニルアクリレート）および−メタクリレート）があげられる。ポリ（アラルキル（メタ）アクリレート）の例として、ポリ（ベンジルアクリレート）および−メタクリレート）、ポリ（２−フェネチルアクリレート）および−メタクリレート、ポリ（１−ピレニルメチルメタクリレート）があげられる。ポリ（アリールオキシアルキル（メタ）アクリレート）の例として、ポリ（フェノキシエチルアクリレート）および−メタクリレート）、ポリ（ポリエチレングリコールフェニルエーテルアクリレート）および−メタクリレート（さまざまなポリエチレングリコール分子量である）があげられる。
【００５６】
好適な第２のポリマーの例は、市販されており、ビーズ、ペレット、顆粒などの形で、酢酸ビニル濃度が約１０％〜約５０％（１２％、１４％、１８％、２５％、３３％の製品が市販されている）のポリ（エチレン−コ−ビニルアセテート）（ｐＥＶＡ）を含む。これよりも酢酸ビニルの割合を減らすにつれてｐＥＶＡコ−ポリマーが一般的な溶媒に不溶になるのに対し、これよりも酢酸ビニルの割合を多くするにつれて耐性が低くなっていく。
【００５７】
代表的なポリマー混合物は、ｐＢＭＡおよびｐＥＶＡの混合物を含む。このポリマー混合物は、絶対ポリマー濃度（すなわち、コーティング材料中の両方のポリマーを組み合わせた合計濃度）約０．２５ｗｔ．％〜約９９ｗｔ．％で使用可能である。この混合物は、コーティング溶液中の個々のポリマー濃度約０．０５ｗｔ．％〜約９９ｗｔ．％でも使用可能である。一実施形態では、ポリマー混合物は、分子量１００キロダルトン〜９００キロダルトンのｐＢＭＡと、酢酸ビニル含有量２４〜３６重量パーセントのｐＥＶＡコポリマーを含む。一実施形態では、ポリマー混合物が、分子量２００キロダルトン〜３００キロダルトンのｐＢＭＡと、酢酸ビニル含有量２４〜３６重量パーセントのｐＥＶＡコポリマーを含む。コーティング混合物中に溶解または懸濁された活性剤（単数または複数）の濃度は、最終コーティング材料の重量に対して０．０１〜９９重量パーセントの範囲となり得る。
【００５８】
第２のポリマーは、（ｉ）ポリ（アルキレン−コ−アルキル（メタ）アクリレート、（ｉｉ）他のアルキレンとのエチレンコポリマー、（ｉｉｉ）ポリブテン、（ｉｖ）ジオレフィン由来非芳香族ポリマーおよびコポリマー、（ｖ）芳香族基含有コポリマー、および（ｖｉ）エピクロロヒドリン含有ポリマーからなる群から選択される１以上のポリマーも含み得る。
【００５９】
ポリ（アルキレン−コ−アルキル（メタ）アクリレート）は、アルキル基が直鎖または分岐鎖で、置換または未置換の非干渉基または原子を有するコポリマーを含む。このようなアルキル基は、１〜８個の炭素原子を含み得る。このようなアルキル基は、１〜４個の炭素原子を含み得る。一実施形態では、アルキル基がメチルである。いくつかの実施形態では、このようなアルキル基を含むコポリマーが、約１５％〜約８０％（ｗｔ）のアルキルアクリレートを含み得る。アルキル基がメチルである場合、いくつかの実施形態ではポリマーが約２０％〜約４０％のメチルアクリレートを含有し、特定の実施形態では約２５％〜約３０％のメチルアクリレートを含有する。アルキル基がエチルの場合、一実施形態ではポリマーが約１５％〜約４０％のエチルアクリレートを含有し、アルキル基がブチルの場合、一実施形態ではポリマーが約２０％〜約４０％のブチルアクリレートを含有する。
【００６０】
あるいは、第２のポリマーは、他のアルキレンとのエチレンコポリマーを含み得るものであり、これが直鎖および分岐鎖のアルキレンならびに、置換または未置換のアルキレンを含み得る。例として、３〜８個の分岐鎖または直鎖炭素原子を含むアルキレンから調製されるコポリマーがあげられる。一実施形態では、３〜４個の分岐鎖または直鎖炭素原子を含むアルキレン基から調製されるコポリマー。特定の実施形態では、３個の炭素原子を含有するアルキレン基から調製されるコポリマー（プロペンなど）。一例として、他のアルキレンが直鎖アルキレン（１−アルキレンなど）である。このタイプの代表的なコポリマーは、約２０％〜約９０％（モルベース）のエチレンを含み得る。一実施形態では、このタイプのコポリマーが約３５％〜約８０％（モル）のエチレンを含む。このようなコポリマーは、分子量が約３０キロダルトン〜約５００キロダルトンになる。代表的なコポリマーは、ポリ（エチレン−コ−プロピレン）、ポリ（エチレン−コ−１−ブテン）、ポリ（エチレン−コ−１−ブテン−コ−１−ヘキセン）および／またはポリ（エチレン−コ−１−オクテン）からなる群から選択される。
【００６１】
「ポリブテン」は、イソブチレン、１−ブテンおよび／または２−ブテンをホモ重合またはランダムに共重合することで誘導されるポリマーを含む。ポリブテンは、どのような異性体のホモポリマーであってもよく、あるいは、任意の比率での任意のモノマーからなるコポリマーまたはターポリマーであってもよい。一実施形態では、ポリブテンが少なくとも約９０％（ｗｔ）のイソブチレンまたは１−ブテンを含有する。特定の実施形態では、ポリブテンが少なくとも約９０％（ｗｔ）のイソブチレンを含有する。ポリブテンは、非干渉量の他の成分または添加剤を含有するものであってもよい。たとえば、最大１０００ｐｐｍの酸化防止剤（２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−メチルフェノールなど）を含有してもよい。一例として、ポリブテンは、分子量が約１５０キロダルトン〜約１，０００キロダルトンであり得る。一実施形態では、ポリブテンが、約２００キロダルトン〜約６００キロダルトンであり得る。特定の実施形態では、ポリブテンが約３５０キロダルトン〜約５００キロダルトンであり得る。分子量が約６００キロダルトンを超えるポリブテン（１，０００キロダルトンを超えるものを含む）も得られるが、扱いが困難になると想定される。
【００６２】
別の第２のポリマーとして、ジオレフィン由来の非芳香族ポリマーおよびコポリマーがあげられる（ポリマーまたはコポリマーの調製に用いられるジオレフィンモノマーがブタジエン（ＣＨ2＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ2）および／またはイソプレン（ＣＨ2＝ＣＨ−Ｃ（ＣＨ3）＝ＣＨ2）から選択されるものを含む）。一実施形態では、ポリマーがジオレフィンモノマー由来のホモポリマーであるか、あるいはジオレフィンモノマーと非芳香族モノオレフィンモノマーとのコポリマーであり、任意に、ホモポリマーまたはコポリマーが部分的に水素化されていてもよい。このようなポリマーは、ｃｉｓ−、ｔｒａｎｓ−および／または１，２−モノマー単位の重合によって調製されるポリブタジエンまたは３種類のモノマーすべての混合物、ｃｉｓ−１，４−および／またはｔｒａｎｓ−１，４−モノマー単位の重合によって調製されるポリイソプレンからなる群から選択可能である。あるいは、ポリマーがコポリマーである（アクリロニトリルなどの非芳香族モノオレフィンモノマーベースのグラフトコポリマーおよびランダムコポリマー、アルキル（メタ）アクリレートおよび／またはイソブチレンを含む）。一実施形態では、モノオレフィンモノマーがアクリロニトリルの場合、共重合アクリロニトリルが最大約５０重量％存在し、モノオレフィンモノマーがイソブチレンの場合、ジオレフィンがイソプレン（商業的に「ブチルゴム」として知られているものを形成するためなど）である。代表的なポリマーおよびコポリマーは、分子量が約１５０キロダルトン〜約１，０００キロダルトンである。一実施形態では、ポリマーおよびコポリマーの分子量が約２００キロダルトン〜約６００キロダルトンである。
【００６３】
別の第２のポリマーとして、芳香族基含有コポリマーがあげられる（ランダムコポリマー、ブロックコポリマーおよびグラフトコポリマーを含む）。一実施形態では、芳香族基がスチレンの重合によってコポリマーに取り込まれる。特定の実施形態では、ランダムコポリマーが、スチレンモノマーと、ブタジエン、イソプレン、アクリロニトリル、Ｃ1〜Ｃ4アルキル（メタ）アクリレート（メチルメタクリレートなど）および／またはブテンから選択される１つ以上のモノマーとの共重合由来のコポリマーである。有用なブロックコポリマーとして、（ａ）ポリスチレンのブロック、（ｂ）ポリブタジエン、ポリイソプレンおよび／またはポリブテンから選択されるポリオレフィンのブロック（イソブチレンなど）、（ｃ）任意に、ポリオレフィンブロックで共重合可能な第３のモノマー（エチレンなど）を含有するコポリマーがあげられる。芳香族基含有コポリマーは、約１０％〜約５０％（ｗｔ．）の重合された芳香族モノマーを含有し、コポリマーの分子量は約３００キロダルトン〜約５００キロダルトンである。一実施形態では、コポリマーの分子量が約１００キロダルトン〜約３００キロダルトンである。
【００６４】
別の第２のポリマーとして、エピクロロヒドリンホモポリマーおよびポリ（エピクロロヒドリン−コ−アルキレンオキシド）コポリマーがあげられる。一実施形態では、コポリマーの場合、共重合されたアルキレンオキシドがエチレンオキシドである。一例として、エピクロロヒドリン含有ポリマーのエピクロロヒドリン含有量が約３０％〜１００％（ｗｔ）である。一実施形態では、エピクロロヒドリン含有量が約５０％〜１００％（ｗｔ）である。一実施形態では、エピクロロヒドリン含有ポリマーの分子量が約１００キロダルトン〜約３００キロダルトンである。
【００６５】
非分解性ポリマーは、発明の名称「DEVICES, ARTICLES, COATINGS, AND METHODS FOR CONTROLLED ACTIVE AGENT RELEASE OR HEMOCOMPATIBILITY」として米国特許出願公開第２００７／００２６０３７号明細書（その内容全体を本明細書に援用する）に記載されているものを含み得る。具体例として、非分解性ポリマーは、ブチルメタクリレート−コ−アクリルアミド−メチル−プロパンスルホネート（ＢＭＡ−ＡＭＰＳ）のランダムコポリマーを含み得る。いくつかの実施形態では、ランダムコポリマーが、ＡＭＰＳを約０．５ｍｏｌ．％〜約４０ｍｏｌ．％に等しい量で含み得る。
【００６６】
基材
本明細書に記載のいくつかの実施形態によれば、核酸複合体を有する粒子を含むマトリクスを基材上に配置することが可能である。代表的な基材として、金属、ポリマー、セラミック、天然材料があげられる。基材ポリマーは、付加重合または縮合重合によって得られるオリゴマー、ホモポリマー、コポリマーを含む合成ポリマーからなるものを含む。例として、メチルアクリレート、メチルメタクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、アクリル酸、メタクリル酸、グリセリルアクリレート、グリセリルメタクリレート、メタクリルアミド、アクリルアミドから重合されるものなどのアクリル；エチレン、プロピレン、スチレン、塩化ビニル、酢酸ビニル、ビニルピロリドン、二フッ化ビニリデンなどのビニルならびに、ポリカプロラクタム、ポリラウリルラクタム、ポリヘキサメチレンアジパミド、ポリヘキサメチレンドデカンジアミドなどのポリアミドを含むがこれに限定されるものではない縮合ポリマー、さらにはポリウレタン、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリシロキサン（シリコーン）、セルロース、ポリエーテルエーテルケトンがあげられるが、これに限定されるものではない。
【００６７】
本発明の実施形態は、セラミックを基材として用いることを含み得る。セラミックとしては、窒化ケイ素、シリコンカーバイド、ジルコニア、アルミナならびにガラス、シリカ、およびサファイアがあげられるが、これに限定されるものではない。
【００６８】
基材金属としては、コバルト、クロム、ニッケル、チタン、タンタル、イリジウム、タングステンならびに、ステンレス鋼、ニチノールまたはコバルトクロムなどの合金があげられるが、これに限定されるものではない。好適な金属としては、金、銀、銅、白金などの貴金属ならびに、これを含む合金もあげられる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、装置の構成要素として用いる場合に、骨、軟骨、皮膚、エナメル質などのヒト組織を含む特定の天然材料ならびに、木材、セルロース、圧縮炭素、ゴム、絹、羊毛、綿などの他の有機物質も使用可能である。基材は、カーボンファイバも含み得る。基材は、樹脂、多糖、ケイ素またはシリカベースの材料、ガラス、フィルム、ゲル、膜も含み得る。
【００７０】
医療装置
本発明の実施形態は、グラフト（腹部大動脈瘤グラフトなど）、ステント（一般にニチノール製である自己拡張ステント、一般にステンレス鋼で作られるバルーン拡張ステント、分解性冠動脈ステントなど）、カテーテル（動脈、静脈、血圧、ステントグラフトなどを含む）、弁（ポリマーまたは炭素の機械弁、組織弁、経皮的、縫合カフを含む弁設計など）、塞栓保護フィルタ（遠位保護装置を含む）、大静脈フィルタ、動脈瘤空置装置、人工心臓、心臓ジャケット、心臓補助装置（左心補助装置を含む）、植込み型除細動器、電気刺激装置およびワイヤ（ペースメーカー、リードアダプタ、リードコネクタを含む）、植込み医療装置の電源（電池など）、末梢血管装置、心房中隔欠損症閉鎖栓、左心耳フィルタ、僧帽弁形成装置（僧帽弁形成環など）、僧帽弁修復装置、脈管介入装置、脈管補助ポンプ、脈管アクセス装置（非経口栄養カテーテル、脈管アクセスポート、中心静脈アクセスカテーテルを含む）などの血管装置；あらゆるタイプの縫合糸、止め金、吻合装置（吻合器を含む）、縫合糸アンカー、止血バリア、スクリュー、プレート、クリップ、脈管インプラント、組織スキャフォールド、脳脊髄液シャント、水頭症用シャント、ドレナージチューブ、胸腔吸引ドレナージカテーテルをはじめとするカテーテル、膿瘍ドレナージカテーテル、胆道ドレナージ製品、植込み型ポンプなどの外科用装置；関節インプラント、寛骨臼カップ、膝蓋骨ボタン、骨修復／増強装置、脊椎装置（椎間板など）、骨ピン、軟骨修復装置、人工腱などの整形外科用装置；歯科用インプラントおよび歯科用骨折修復装置などの歯科用装置；薬剤送達ポンプ、植込み型薬剤輸液チューブ、薬剤輸液カテーテル、硝子体内薬剤送達装置などの薬剤送達装置；眼窩インプラント、緑内障シャントおよび眼内レンズをはじめとする眼科用装置；陰茎装置（性交不能症インプラントなど）、括約筋、尿道、前立腺、膀胱装置（失禁装置、良性前立腺肥大症管理装置、前立腺癌インプラントなど）、留置（「Ｆｏｌｅｙ」）および非留置尿路カテーテルをはじめとする尿路カテーテル、腎臓装置などの泌尿器科用装置；義乳房および人工臓器（膵臓、肝臓、肺、心臓など）などの合成装具；肺カテーテルをはじめとする呼吸器装置；神経刺激装置、神経カテーテル、神経血管バルーンカテーテル、神経動脈瘤治療コイル、ｎｅｕｒｏｐａｔｃｈｅなどの神経装置；経鼻ボタン、鼻スプリントおよび気道スプリント、鼻タンポン、イヤーウィック、耳用ドレナージチューブ、鼓膜切開減圧管、耳鼻科用ストリップ、喉頭摘出管、食道管、食道ステント、咽頭ステント、唾液バイパス管、気管開口管などの耳鼻咽喉科用装置；グルコースセンサ、心臓センサ、動脈内血液ガスセンサをはじめとするバイオセンサ装置；腫瘍インプラント；および疼痛管理インプラントを含むがこれに限定されるものではない、植込み型装置または一過的植込み型装置（の表面に配置されるなど）を含み得るものであり、これと併用可能である。
【００７１】
いくつかの態様では、本発明の実施形態は、眼科用装置を含み得るものであり、これと併用可能である。これらの態様による好適な眼科用装置は、眼の所望の部分に生物活性剤を提供できるものである。いくつかの態様では、この装置を利用して、（水晶体の前にある）眼の前側セグメントおよび／または（水晶体の背後にある）眼の後側セグメントに生物活性剤を送達することが可能である。また、必要があれば、好適な眼科用装置を利用して、眼の近辺の組織に生物活性剤を提供することも可能である。
【００７２】
いくつかの態様では、眼の外部または内部の部位での配置用に構成された眼科用装置と本発明の実施形態を併用可能である。好適な外部装置は、生物活性剤の局所投与用に構成可能なものである。このような外部装置は、角膜（たとえばコンタクトレンズ）または眼球結膜などの眼の外面で使用できるものである。いくつかの実施形態では、好適な外部装置は、眼の外面の近辺で使用可能である。
【００７３】
眼の内部の部位での配置用に構成された装置は、眼の所望の部位内で使用可能である。いくつかの態様では、眼科用装置は、硝子体などの眼内部位への配置用に構成可能なものである。例示的な眼内装置として、米国特許第６，７１９，７５０号明細書（「Devices for Intraocular Drug Delivery」、Varnerら）および同第５，４６６，２３３号明細書（「Tack for Intraocular Drug Delivery and Method for Inserting and Removing Same」、Weinerら）；米国特許出願公開第２００５／００１９３７１号明細書（「Controlled Release Bioactive Agent Delivery Device」、Andersonら）、同第２００４／０１３３１５５号明細書（「Devices for Intraocular Drug Delivery」、 Varnerら）、同第２００５／００５９９５６号明細書（「Devices for Intraocular Drug Delivery」、 Varnerら）、同第２００３／００１４０３６号明細書（「Reservoir Device for Intraocular Drug Delivery」、 Varnerら）、米国特許出願第１１／２０４，１９５号明細書（２００５年８月１５日出願、Andersonら）、同第１１／２０４，２７１号明細書（２００５年８月１５日出願、Andersonら）、同第１１／２０３，９８１号明細書（２００５年８月１５日出願、Andersonら）、同第１１／２０３，８７９号明細書（２００５年８月１５日出願、Andersonら）、同第１１／２０３，９３１号明細書（２００５年８月１５日出願、Andersonら）ならびに関連の出願に記載されているものがあげられるが、これに限定されるものではない。
【００７４】
いくつかの態様では、眼科用装置は、眼内の網膜下領域での配置用に構成可能なものである。網膜下用の例示的な眼科用装置として、米国特許出願公開第２００５／０１４３３６３号明細書（「Method for Subretinal Administration of Therapeutics Including Steroids; Method for Localizing Pharmacodynamic Action at the Choroid and the Retina; and Related Methods for Treatment and/or Prevention of Retinal Diseases」、de Juanら）；米国特許出願第１１／１７５，８５０号明細書（「Methods and Devices for the Treatment of Ocular Conditions」、de Juanら）；および関連の出願に記載されているものがあげられるが、これに限定されるものではない。
【００７５】
好適な眼科用装置は、眼の所望の組織内での配置用に構成可能なものである。たとえば、眼科用装置は、緑内障ドレナージ装置といった強膜外であるが結膜の下に位置する装置など、眼の結膜下領域での配置用に構成可能なものである。
【００７６】
本発明の実施形態は基材なしでも使用可能である旨は理解できよう。一例として、基材を含むことなくフィラメントまたは他の形状での核酸複合体が内部に配置されたマトリクスを実施形態に含むことが可能である。
【００７７】
以下の実施例を参照することで、本発明について一層よく理解できよう。これらの実施例は、本発明の特定の実施形態を代表することを意図したものであり、本発明の範囲を限定することは想定していない。
【実施例】
【００７８】
実施例１：核酸複合体を有する粒子のＩｎ  Ｓｉｔｕ形成
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（分岐鎖２５ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を蒸留脱イオン水（ＤＤＷ）に２０ｍｌ中９ｍｇで溶解させ、アミン基の濃度が１０ｍＭの溶液を得た。塩酸（ＨＣｌ）を使用してこの溶液をｐＨ７．４に調整した。１０ｕｌのフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）２０ｍｇ／ｍｌを溶液に加えた。反応の進行を薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）で追跡した。
【００７９】
Ｎ／Ｐ（窒素／ホスフェート）比を６にして、ＤＮＡ（２５ｕｌ、１ｕｇ／ｕｌ）（（ニシン精子ＤＮＡ、５００〜１０００ｂｐに切断、Ｌｏｆｓｔｒａｎｄ  Ｌａｂｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）を６ｕｌの０．７５Ｍ  ＮａＣｌまたは６ｕｌのスクロースＤＤＷ溶液（０．７５Ｍ）と混合した。上記にて調製したフルオレセイン標識ＰＥＩ（１０ｍＭアミン濃縮、分岐鎖２５ｋＤａ、４５ｕｌ）を１１．２５ｕｌの０．７５Ｍ  ＮａＣｌまたは１１．２５ｕｌの０．７５Ｍ  スクロースＤＤＷのいずれかと混合した。最後のＮａＣｌまたはスクロース濃度は１５０ｍＭであった。次に、ＤＮＡ溶液にＰＥＩ溶液をゆっくりと加えた後、ボルテックスせずに上下に６回ピペットで動かし、核酸複合体溶液を生成した。
【００８０】
メタクリレート化ポリアルジトール（ＰＡ）（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｅｄｅｎ  Ｐｒａｉｒｉｅ，  ＭＮ）（１５０ｍＭ  ＮａＣｌまたは１５０ｍＭスクロース中１００ｍｇ／ｍｌ、合計で８ｍｇまたは２４ｍｇ）（アクリレート置換度０．５または１２）を核酸複合体溶液に加えた。０．５ｍｇ／ｍｌの４，５−ビス（４−ベンゾイルフェニルメチレンオキシ）ベンゼン−１，３−ジスルホン酸二ナトリウム塩を含有する１ｍｌの３０％ｗ／ｖのＰＥＧ  ２０ｋＤａ溶液を加えることで相分離を達成した。この混合物に、紫外線（約１〜２ｍＷ／ｃｍ2で３３０ｎｍにて動作するＤＹＭＡＸ  ＢＬＵＥ−ＷＡＶＥ  ２００））を１５秒間または１分間すみやかに照射した。さまざまな試験条件を以下の表１にまとめておく。
【００８１】
【表１】
0005763525.tif 000003
【００８２】
蛍光ＰＥＩを使用して、カプセル封入について判断した。図５Ａ〜図５Ｂに粒子の蛍光を示す。
【００８３】
粒子を秤量し、ＰＢＳ中に放出させた。それぞれの規定の時間が経過した後、ＰＢＳを交換し、蛍光を測定することでＰＢＳへの核酸複合体の放出量を評価した。図６は、核酸複合体の経時的な累積放出を示すグラフである。
【００８４】
これらの結果から、in situで形成された粒子内に核酸複合体を取り込んだ後、ＰＢＳ溶液に入れた際に粒子から放出できることが分かる。突発的な放出（または核酸複合体の初期放出）に関して、吸着量比（ＰＡ／ＤＮＡ比）およびＰＡの置換度には有意な効果があった。しかしながら、ＵＶ照射時間は突発的な放出に影響しなかった。放出プロファイル（または放出の直線性）に関して、ＰＡの置換度に有意な効果があった。ＵＶ照射時間およびＮａＣｌｖｓ．スクロースは放出の直線性に対して若干の効果があっただけなのに対し、吸着量比はまったく効果がなかった。粒子の形成に関して、低置換度および短いＵＶ照射時間では、粒子は形成されなかった。合計放出に関して、ポリアルジトールの置換度の強い影響があった。しかしながら、ＵＶ照射は合計放出に何ら影響しなかった。
【００８５】
実施例２：ＢＳＡ、マルトデキストリンまたはデキストランでの粒子のIn Situ形成ならびにトランスフェクション
ＨＥＫ２９３細胞（ATCC, Manasass, VA）を２４ウェルのプレートに細胞約８×１０4個／ウェルで蒔いた。細胞をＥＭＥＭ／１０％ＦＢＳと一緒に２４時間インキュベートした後、トランスフェクションを実施した。
【００８６】
マルトデキストリン（ＭＤ０７０）、デキストラン３５〜４５ｋＤａおよびＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を各々別個に１００ｍｇ／ｍｌで０．１５Ｍスクロースに溶解させた。
【００８７】
ＧＦＰ−ＤＮＡ（緑色蛍光タンパク質）（Aldevron, Fargo, ND）およびＰＥＩを用いてＮ／Ｐ比２４で核酸複合体を形成した。ＤＮＡ（２０ｕｌ、２０ｕｇ）を０．７５Ｍスクロース（２０ｕｌ）および蒸留脱イオン水（ＤＤＷ）（６０ｕｌ）と混合した。ＰＥＩ  ２５ｋＤａを合計２０ｍｌ中９ｍｇでＤＤＷに溶解させ、アミン基の濃度１０ｍＭの溶液を得た。ＨＣｌを使用して、この溶液をｐＨ７．４に中和した。スクロース溶液０．７５Ｍ（４０ｕｌ）およびＤＤＷ（１６ｕｌ）を１４４ｕｌのＰＥＩに加えた。両溶液の最終スクロース濃度は０．１５Ｍであった。ＰＥＩをＤＮＡに滴下して加えた；合計容積は３００ｕｌであった。
【００８８】
６００ｕｌのＢＳＡ、マルトデキストリンまたはデキストラン溶液を９０ｕｌの核酸複合体溶液に加え、軽く混合した。次に、７００ｕｌのＰＥＧ溶液（ＰＥＧ  ２０ｋＤａ  ３０％ｗ／ｖ、ＤＤＷ中）を加えて相分離を誘導した。得られた混合物をボルテックスし、ドライアイスにのせ、凍結乾燥した。凍結乾燥後、１ｍｌのクロロホルムを加え、粒子を７０００ｒｐｍで３分間スピニングすることで、ＰＥＧを抽出した。クロロホルム洗浄を３回実施した後、粒子を乾燥させた。
【００８９】
この試料に、１ｍｌのＥＭＥＭを加えた。次に、０．５ｍｌのＥＭＥＭ／粒子混合物を２４ウェルのプレートで細胞にのせた。４８時間後、蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰ発現を観察した。デキストランを用いた場合に最適な発現が達成されたのが観察された。ＢＳＡは、マルトデキストリンよりもトランスフェクション効率を落とすことが明らかになった。この実施例は、ＢＳＡ、デキストラン、マルトデキストリンを用いて核酸複合体を含有する粒子をｉｎ  ｓｉｔｕで形成可能であり、その内部の核酸複合体が細胞をトランスフェクトするための活性を保持し得ることを示すものである。
【００９０】
実施例３：核酸複合体での核生成
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｓｉｇｍａ、２５ｋＤａ分岐鎖）を９ｍｇで１０ｍＬの蒸留脱イオン水（ＤＤＷ）に溶解させた。ＨＣｌを使用して、最初の塩基性ｐＨを７．４に戻し、合計容積をＤＤＷで２０ｍＬに調整した（１０ｍＭの第一級アミノ基または「Ｎ」を生成）。ニシンＤＮＡ  ６００〜１０００ｂｐ（Ｌｏｆｓｔｒａｎｄ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）をＤＤＷに１μｇ／μＬで溶解させた。１μｇのＤＮＡが３ｎｍｏｌの負に荷電したホスフェート基（「Ｐ」）を含有する。ＤＮＡをＰＥＩと混合し、各々Ｎ／Ｐ比が１２および２４のＤＮＡ／ＰＥＩ溶液を得た。
【００９１】
Ｎ／Ｐ比１２の場合、５．５μｇのＤＮＡ（５．５μＬ）を１３．８μＬのスクロース  ０．７５Ｍ（水１０ｍｌ中２．５７ｇ、２５％ｗ／ｖ）と混合し、１５０ｍＭまたは５％ｗ／ｖの溶液を得た。２０μＬのＰＥＩ溶液を４μＬの０．７５Ｍスクロース溶液と混合した。ＰＥＩ混合物をゆっくりとＤＮＡ溶液に滴下した。添加後、混合物を軽くボルテックスした。
【００９２】
Ｎ／Ｐ比２４の場合：２．７５μｇのＤＮＡ（２．７５μＬ）を０．７μＬのスクロース  ０．７５Ｍ（水１０ｍｌ中２．５７ｇ、２５％ｗ／ｖ）と混合し、１５０ｍＭまたは５％ｗ／ｖの溶液を得た。２０μＬの量のＰＥＩ溶液を４μＬの０．７５Ｍスクロース溶液と混合した。ＰＥＩ混合物をゆっくりとＤＮＡ溶液に滴下した。添加後、混合物を軽くボルテックスした。
【００９３】
２００μｌのタンパク質（Ｆａｂ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を２０ｍｇ／ｍｌでｐＨ７．４にて各々室温でＤＮＡ／ＰＥＩ核酸複合体溶液に加え、試料を５０℃のオーブンに２０分間入れておいた。その後、７０μＬのＰＥＧ  ２０ｋＤａ溶液３０％ｗ／ｖ（５０℃まで加温）を、数秒間ボルテックスしながら滴下して核酸複合体／タンパク質混合物に加えた。
【００９４】
試料をすみやかにオーブンに戻して５０℃で３０分間おくか、オーブンから出して室温に３０分間おいた。続いて、混合物を−２０℃で凍結するまで冷凍庫に入れ、凍結乾燥させた。ＰＥＧをクロロホルムで抽出した。この実施例は、核酸複合体が核生成剤として機能する形で、核酸複合体およびタンパク質を用いて粒子を形成可能であることを示すものである。
【００９５】
実施例４：核酸複合体を有する粒子を含むコーティングを用いたコイルの形成ならびにトランスフェクション
２００ｕｇのＤＮＡ（４０ｕｌ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）コードプラスミド）を１０ｕｌのスクロース０．７５Ｍ（ＤＤＷ中）と混合することで、ＤＮＡ溶液を調製した。
【００９６】
１．４４ｍｌのポリエチレンイミン（０．４５ｍｇ／ｍｌ、ＤＤＷ中、数滴の０．１Ｎ  ＨＣｌを用いてｐＨ７．４に調整；１０ｍＭアミン基）を３６０ｕｌのスクロース０．７５Ｍ（ＤＤＷ中）と混合することで、ＰＥＩ溶液を調製した。ＰＥＩ溶液を０．２μｍのフィルタでの濾過により滅菌した。
【００９７】
１００ｍｇ／ｍｌのデキストランを０．１５０Ｍのスクロース（ＤＤＷ中）と混合することで、デキストラン溶液を調製した。デキストラン溶液を０．２μｍのフィルタでの濾過により滅菌した。
【００９８】
３０％ｗ／ｖのＰＥＧ  ２０ｋＤａをＤＤＷ中で混合してＰＥＧ溶液を調製した。ＰＥＧ溶液を０．２μｍのフィルタでの濾過により滅菌した。
【００９９】
ＰＥＩ溶液をＤＮＡ溶液にゆっくりと加え、ピペットで上下に６回動かし、５分間室温にて放置して核酸複合体混合物を形成した。５００ｕｌのデキストラン溶液（１００ｍｇ／ｍｌ、０．１５０Ｍスクロース中）を加えてデキストラン／核酸複合体混合物を形成した。
【０１００】
対照として、得られた混合物５ｕｌを２４ウェルに入れ、ＨＥＫ２９３細胞（９０％コンフルエント）を播種した。
【０１０１】
デキストラン／核酸複合体混合物に、７ｍｌのＰＥＧ溶液を加えた。得られた懸濁液を軽くボルテックスし、ドライアイスにのせ、凍結乾燥した。
【０１０２】
ＰＥＧを以下のようにして抽出した：４０ｍｌのクロロホルムを加え、懸濁液を１５ｍｌの遠心管４本に分けた。７．５ｋｒｐｍで１０分間スピニングした後、クロロホルムを吸引し、破棄した。試料を乾燥させ、ＥＭＥＭに溶解させ、２４ウェルのプレートで細胞にのせた。４８時間後、図７に示すようにトランスフェクションが認められた。
【０１０３】
新鮮なクロロホルム中で残基を組み合わせ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ遠心濾過チューブ（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＣＬ、０．２μｍ  Ｔｅｆｌｏｎフィルタ）に入れた。デキストラン粒子をクロロホルムで３回洗浄し、そのつど７．５ｋｒｐｍで濾過した。
【０１０４】
次に固体を１５ｍｌのクロロホルムに回収し、均質化（Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ，  ８０００ｒｐｍ）した。得られた懸濁液を濾過した（Ｂｕｃｈｎｅｒ、２０μｍフィルタ）。２５ｍｇの１０００ＰＥＧ４５ＰＢＴ５５（４５ｗｔ．％の１０００ｍｗポリエチレングリコール「ＰＥＧ」と５５ｗｔ．％のポリブチレンテレフタレート「ＰＢＴ」のブロックコポリマー）および２５ｍｇの２０ＧＡＰＥＧＣＬ８０ＧＡＬＡ（２０ｗｔ．％のグリコライド−ポリエチレングリコール−カプロラクトン「ＧＡＰＥＧＣＬ」と８０ｗｔ．％のグリコライド−ラクチド「ＧＡＬＡ」のブロックコポリマー）をクロロホルム中５０ｍｇのデキストラン／ポリプレックス粒子に加え、これを３７℃で３０分間振盪しながら溶解させた。次に、得られた混合物を使用して金属眼インプラント（Ｎ＝８）（Ｉ−ＶＡＴＩＯＮ（商標）、ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ，  Ｅｄｅｎ  Ｐｒａｉｒｉｅ，  ＭＮ）にコーティングした。気体噴霧タイプのスプレーコーターでインプラント４つの２シリーズでインプラントにコーティングをほどこした（コーティング重量１７００〜２０００ｍｇ）後、窒素下で一晩乾燥させた。インプラントのコーティング重量を以下の表２に示す。
【０１０５】
【表２】
0005763525.tif 000004
【０１０６】
ＨＥＫ  ２９３細胞を９６ウェルのプレートに蒔いた。トランスフェクション実験の前に、細胞をＥＭＥＭ／１０％ＦＢＳと一緒に２４時間インキュベートした。細胞は溶出実験前にコンフルエントであることが明らかになった。インプラントをイソプロピルアルコールに軽く浸漬し、浸漬乾燥させ、各々をＨＥＫ  ２９３細胞にのせてウェルに入れた。２４時間後、蛍光顕微鏡法を用いてトランスフェクションを評価し、インプラントを異なるウェルに移した。コイル＃２（第１シリーズ）の蛍光を図８Ａにおいて以下に示す。コイル＃３（第１シリーズ）の蛍光を図８Ａにおいて以下に示す。
【０１０７】
実施例５：予備成形粒子への核酸複合体の取り込み
この実施例のために、核酸複合体をさまざまな粒子に取り込んだ。核酸複合体溶液（ＰＥＩを有するＧＦＰコードＤＮＡ、Ｎ／Ｐ＝２４）を調製し、指定量の粉末上にピペットでたらし、十分に混合し、真空中にて乾燥させた。次に、粉末を細胞培地（ＥＭＥＭ）に再懸濁させた。一部を遠沈させ、上清をＨＥＫ  ２９３細胞にのせ、一部を懸濁液として細胞にのせた。
【０１０８】
多孔性の微粒子材料に粉砕多孔性セラミックを含めた。０．５μｍの孔があるセラミック円板を入手した後、乳鉢とペステルで粉砕して粒度の平均サイズが１０μｍ未満の粒子（ＳＥＭで確認した場合）にした。
【０１０９】
多孔性微粒子材料には、カオリン粒子も含めた。カオリン粒子は平均サイズが５μｍ未満であった。
【０１１０】
多孔性微粒子材料には、架橋ポリビニルピロリドン（クロスＰＶＰ）粒子（BASF Corporation）も含めた。クロスＰＶＰ粒子は平均サイズが１０μｍ未満であった。
【０１１１】
多孔性微粒子材料には、架橋メタクリレートマルトデキストリン粒子も含めた。架橋メタクリレートマルトデキストリン粒子については、以下のプロセスで形成した。第１に、５ｍｇ／ｍｌの４，５−ビス（４−ベンゾイルフェニルメチレンオキシ）ベンゼン−１，３−ジスルホン酸二ナトリウム塩を含有する３０％ｗ／ｖのＰＥＧ  ２０ｋＤａ溶液を加えることで、１００ｍｇ／ｍｌのメタクリレート化マルトデキストリンＭ４０混合物を相分離した。混合物にＵＶ（約１〜２ｍＷ／ｃｍ2で３３０ｎｍにて動作するＤＹＭＡＸ  ＢＬＵＥ−ＷＡＶＥ  ２００）を１分間照射した。架橋粒子をスピンした後、ＰＥＧをデカントした。次に、架橋粒子をＤＤＷで洗浄した。
【０１１２】
核酸複合体をＮ／Ｐ比２４で調製した。一般に、１２ｕｌのＤＮＡ溶液１ｕｇ／ｕｌ（１２ｕｇ）を１２ｕｌの０．７５Ｍスクロース溶液および３６ｕｌのＤＤＷと混合した。８６．４ｕｌのＰＥＩ溶液（１０ｍＭ［Ｎ］）を２４ｕｌの０．７５Ｍスクロース溶液および９．６ｕｌのＤＤＷと混合した。得られたＰＥＩ混合物をＤＮＡ溶液に加えて核酸複合体溶液を形成し、５分間放置した。核酸複合体溶液を１５ｕｌずつ（ＤＮＡごとに１ｕｇ）に分けた。
【０１１３】
ひとつの１５ｕｌの試料を対照とし、２４ウェルのプレートで細胞にのせた。核酸複合体溶液の他の１５ｕｌの試料を２ｍｇまたは１０ｍｇの固体材料（セラミック、カオリン、クロスＰＶＰまたは架橋メタクリレートマルトデキストリン）にのせた。室温にて１０分間インキュベーション後、各ウェルから試料を取り、ＥＭＥＭに加えた後、２４ウェルのプレートでＨＥＫ２９３細胞にのせた。各試料の残り（粒子）を真空オーブンで１時間乾燥させた。乾燥粒子にＥＭＥＭを加えて、十分にボルテックスした。次に、混合物を５ｋｒｐｍで５分間スピンした。上清を２４ウェルのプレートでＨＥＫ２９３細胞にのせた。残基（ペレット）をＥＭＥＭに再懸濁させ、ＨＥＫ２９３細胞にものせて２４ウェルのプレートに加え、「ブランケット」を形成した。もう光学顕微鏡では細胞が認められなかった。トランスフェクションの結果を以下の表３に示す。
【０１１４】
【表３】
0005763525.tif 000005
【０１１５】
実施例６：有機溶媒中のクロスＰＶＰ粒子
ＨＥＫ２９３細胞を２４ウェルのプレートに４８時間前に蒔いた。５％スクロース中にてＮ／Ｐ比１５（７ｕｇ  ＤＮＡ、合計容積１４０ｕｌ）でＤＮＡ／ＰＥＩ核酸複合体を調製した。ＤＮＡ溶液（０．５ｕｇ）のアリコート１０ｕｌを２つの異なるウェルに対照として入れた。残りの１２０ｕｌを５ｍｇのクロスＰＶＰ粒子が入った６本の微小遠心管（各々２０ｕｌ）にピペットで入れた。管を十分にボルテックスし、開き、ＲＴで２時間、真空中に放置して乾燥させた。
【０１１６】
続いて管１〜５（０．５ｍｌ）に溶媒としてＤＣＭ、クロロホルム、ＭｅＯＨ、ＴＨＦ、およびトルエンを加え、十分にボルテックスした。管６を対照とした。スピニング（１０ｋｒｐｍ、５分間）後、管１〜５から溶媒を吸引した。残りの溶媒を真空下で除去した。各管にＥＭＥＭ（細胞培地、２００ｕｌ）を加えた。２００ｕｌのピペットを用いて粒子を懸濁させ、懸濁液をＨＥＫ２９３細胞の２つのウェルに分けた。
【０１１７】
管６の粒子をＥＭＥＭに再懸濁させた後、懸濁液を遠沈させた。上清を２つのウェルに分けた。再びＥＭＥＭを加え、粒子を再懸濁させた。次に、懸濁液をＨＥＫ２９３細胞の２つのウェルに分けた。
【０１１８】
４８時間のインキュベーション後、蛍光顕微鏡法を用いてトランスフェクションを評価した。画像を図９Ａ〜図９Ｊに示す。
【０１１９】
蛍光顕微鏡を用いる定性的測定から、ほとんどの溶媒を使用可能であるが、メタノールでの処理後に最高の結果が得られたことが分かる。ＰＶＰ粒子は蒔かれた細胞上にブランケットを形成し、これが蛍光シグナルの減衰をかなり担っている。粒子をＴＨＦで処理した後、トランスフェクションはまったく認められなかった。同様に、室温にて５分間のインキュベーション後に細胞をＥＭＥＭと一緒にインキュベートし、粒子を遠沈させると、トランスフェクションは認められなかった。このことから、ＰＶＰ粒子がすぐには核酸複合体を放出しないことが分かる。
【０１２０】
実施例７：水性溶媒中での溶出のあるクロスＰＶＰ粒子ならびにトランスフェクション
この研究では、直径１０μｍのクロスＰＶＰ粒子（ＰＶＰ−ＣＭ，  ＢＡＳＦ）を使用した。３６０ｕｌのＰＥＩ溶液と、１００ｕｌの０．７５Ｍスクロース溶液と、４０ｕｌのＤＤＷ（５０ｕｌの１ｕｇ／ｕｌ  ＧＦＰ−ＤＮＡ溶液、５０ｕｌの０．７５Ｍスクロース溶液、１５０ｕｌのＤＤＷを含む）を加えることで、核酸複合体Ｎ／Ｐ＝２４を調製した。得られた核酸複合体溶液をＲＴで５分間放置した後、クロスＰＶＰ粒子１００ｍｇに加えた。混合物を十分にボルテックスして吸収させ、真空下にて乾燥させた。
【０１２１】
乾燥粉末をクロロホルム溶液に再懸濁させ、ポリマー（１０００ＰＥＧ４５ＰＢＴ５５および２０ＧＡＰＥＧＣＬ８０ＧＡＬＡ）を加えた。得られた溶液は粒子を５０％ｗ／ｗ、１０００ＰＥＧ４５ＰＢＴ５５を２５ｍｇ（２５％ｗ／ｗ）、２０ＧＡＰＥＧＣＬ８０ＧＡＬＡを２５ｍｇ（２５％ｗ／ｗ）含んでいた。クロスポビドンが膨潤するため、懸濁液を濾過しなかった。次に、気体噴霧タイプのスプレー系で溶液をコイルに噴霧した。この空気圧ベースのスプレー系ではコイルが一度に一回コーティングされる。コイルを窒素下で乾燥させた後、９６−ウェルのプレートでＨＥＫ２９３細胞にのせた。コイルの重量を以下の表４に示す。
【０１２２】
【表４】
0005763525.tif 000006
【０１２３】
３日後、コイルを他のウェルに移し、これを６日後と９日後にも繰り返した。３日後、若干のトランスフェクションが認められた。さらに３日後、１つまたは２つの細胞がトランスフェクトされただけであった。６日後には、細胞に対するそれ以上の影響は見られなかった。細胞の蛍光顕微鏡画像を図１０Ａ〜図１０Ｅに示す。
【０１２４】
実施例８：さまざまな量のＰＶＰ粒子を有する核酸複合体
１４４０ｕｌのＰＥＩ溶液と２０５ｕｌの０．７５Ｍスクロース溶液を、２００ｕｌの１ｕｇ／ｕｌ  ＤＮＡ溶液および２０５ｕｌの０．７５Ｍスクロース溶液に加えることで、核酸複合体（Ｎ対Ｐ比＝２４）を調製した。得られた核酸複合体溶液をＲＴで３０分間放置した。２ｍｇ、４ｍｇ、８ｍｇ、１０ｍｇの架橋ＰＶＰ粒子（ＢＡＳＦ  Ｋｏｌｌｉｄｏｎ  Ｃｌ−Ｍロット番号８７８２５２８８Ｑ０）を、５ｕｇのＤＮＡを含有する５０ｕｌのＤＮＡポリプレックス試料に加えた。粒子を凍結乾燥させるのではなく、単離し、秤量し、溶出試験用に１００×ＨＥＰＥＳ緩衝液に入れた。
【０１２５】
溶出試料を３７℃のオーブンで一晩おいた後、翌日に臭化エチジウム／ヘパリンアッセイを用いて試験した。臭化エチジウム／ヘパリンアッセイのために、以下の溶液を調製した。ａ．）ヘパリンナトリウム塩（Ｃｅｌｓｕｓロット番号ＰＨ−３９８９９）１５ｍｇ／ｍＬの蒸留脱イオン水（ＤＤＷ）溶液、ｂ．）１０００×溶液が形成されるようＤＤＷに溶解させた臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈタブレット（この溶液をＤＤＷで１００×に希釈した）。
【０１２６】
臭化エチジウム／ヘパリンアッセイでは、５０ｕｇ／ｍｌのストックＤＮＡ溶液を調製した。２５ｕｇ／ｍＬのＤＮＡから開始して段階希釈し、１９５ｎｇ／ｍＬまで希釈して９６ウェルの黒底プレート（Ｇｒｅｎｉｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ）１ウェルあたり１００ｕＬで標準を調製した。１０ｕｌの１００×臭化エチジウム溶液を各試料に加えた。Ｍ２  Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘプレートリーダーを用いて、以下のパラメータで試料を読み取った。励起２７３ｎｍ／発光６０３ｎｍ／カットオフ５７０ｎｍ。裸のＤＮＡとは対照的に、ポリプレックス形態のＤＮＡでは蛍光は得られないであろう。次に、１００ｕｌの新たに調製したヘパリン溶液を試料に加えた。最適な読み値が得られるまで（約１０分後）再び５分間隔でプレートを読み取った。このアッセイの結果を以下の表５にあげておく。
【０１２７】
【表５】
0005763525.tif 000007
【０１２８】
次に、第２のＮ／Ｐ比（２４および１０の両方）を加えて凍結乾燥させることで、実験を繰り返した。具体的には、上述したようにしてＤＮＡポリプレックスを形成したが、１つのバッチでＮ：Ｐ比を２４にし、もうひとつのバッチではＮ／Ｐ比を１０にした（ともに依然として２０％（ｗ／ｖ）スクロースに保ったまま）。この実験では、ＰＶＰ粒子の使用量が、２ｍｇ、６ｍｇ、１０ｍｇであった。ここでは、粒子を一晩凍結乾燥させた後、溶出試験用に１００×ＨＥＰＥＳ緩衝液に入れた。溶出試料を３７℃のオーブンに入れた後、６時間の時点と１日後に上述した臭化エチジウム／ヘパリンアッセイを用いて試験した。結果を以下の表６および図１１Ａ（６時間）および図１１Ｂ（２４時間）にあげておく。
【０１２９】
【表６】
0005763525.tif 000008
【０１３０】
臭化エチジウム／ヘパリンアッセイで判定した場合、Ｎ／Ｐ比が変わると、３７℃でインキュベートした場合の２４時間後に放出された割合とＤＮＡポリプレックス溶液に加えたＰＶＰ粒子の量に異なる相関が認められた。具体的には、ポリプレックスをＮ／Ｐ比２４で用いるとＰＶＰのミリグラムと放出されたＤＮＡの割合との線形相関が認められた。この相関は混合物を凍結乾燥した後ですら維持された。
【０１３１】
実施例９：相分離による離散的粒子形成時におけるペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体へのタンパク質およびマルトデキストリン誘導体の添加
タンパク質溶液（ＩｇＧおよびＦａｂ）を以下のようにして調製した：ＰＢＳ（Southern Biotech）またはＩｇＧ（凍結乾燥、Lampire、ＨＣｌ滴でわずかに酸性にしたＰＢＳで再構成）中のＦａｂをＢｉｏＲａｄ脱塩カラムに入れ、１０ｍＭ Ｐｓ／ＮａＣｌなしで溶出させた。遠心フィルタを用いてタンパク質溶液を約４０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。
【０１３２】
５０ｕｌのＮ−ｔｅｒ特異的緩衝液中３．７５ｕｌのＮ−ｔｅｒを用いて、ｓｉＲＮＡ複合体（１群あたり１．５ｕｌ  ２０ｕＭ  ｓｉＲＮＡ）を形成した。一般に６〜９倍の量を混合した後、緩衝液中で得られたｓｉＲＮＡ／Ｎｔｅｒ複合体を５０ｕｌずつに分けた。抗ルシフェラーゼｓｉＲＮＡならびに非コード（スクランブル）ｓｉＲＮＡでも同様の試料を調製した。この試料に、以下の溶液を５０ｕｌずつ加えた：４０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、１０ｍＭのＰｓ（ホスフェート、ＮａＣｌなし）中４０ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ、１０ｍＭ  Ｐｓ（ホスフェート、ＮａＣｌなし）中４０ｍｇ／ｍｌのＦａｂ、ＤＤＷ中４０ｍｇ／ｍｌのＭＤ−アクリレート、ＤＤＷ中４０ｍｇ／ｍｌのＭＤ−ヒドラジド。
【０１３３】
この溶液に、ボルテックスしながらＤＤＷ中４００ｕｌのＰＥＧ  ２０ｋＤａ  ３０％ｗ／ｗを加えた。相分離が生じた部分に白色の懸濁液が生成された。粒子を遠沈させ、ＰＥＧ相を破棄した。得られた粒子残基に、３５０ｕｌのＤＭＥＭ（ＦＢＳおよび５ｕｇ／ｍｌドキシサイクリンを含む）を加え、徹底的にボルテックスした。１．５ｕｌのｓｉＲＮＡを４５ｕｌのＮ−ｔｅｒ緩衝液に加えることで、対照試料を調製した（ルシフェラーゼおよびスクランブルｓｉＲＮＡを使用）。この溶液に、３．７５ｕｌのＮ−ｔｅｒを加え、ボルテックスした。試料を３００ｕｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／５ｕｇ／ｍｌドキシサイクリンで希釈した。
【０１３４】
ＨＲ５ＣＬ１１ドキシクリン誘導ルシフェラーゼ発現細胞を１０4個／ウェルで清潔な黒底９６ウェルのプレートに蒔き、２４時間インキュベートした上でトランスフェクションを実施した。
【０１３５】
１００ｕｌをＨＲ５ＣＬ１１細胞（８６ｎＭ濃度のｓｉＲＮＡ）の４２のウェルに加えた後、４５０ｕｌのＤＭＥＭを加え、４３のウェル（２１ｎＭ濃度のｓｉＲＮＡ）に１００ｕｌを加えた。再度、４５０ｕｌのＤＭＥＭを加え、１００ｕｌを３つのウェルに加えた（７ｎＭ濃度のｓｉＲＮＡ）。
【０１３６】
トランスフェクションの２４時間後、すべての培地を除去した。これらの細胞をまずＣｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ  Ｂｌｕｅ（試薬１部とＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳが４部；ドキシサイクリンを加えて最終濃度５ｕｇ／ｍｌとした）でインキュベートし、毒性評価を実施した。１．５時間のインキュベーション後、蛍光（λex＝５６０ｎｍ、λem＝５９０ｎｍ）を用いてプレートを読み取った。次に、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、５０ｕｌのＧｌｏ細胞溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて溶解させた。ルシフェリン試薬を加え（５０ｕｌ）、化学発光を利用してルシフェラーゼ発現レベルを測定した。データを図１２に示す。
【０１３７】
実施例１０：粒子中にＩｇＧを有するペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体に有機溶媒がおよぼす影響
５０ｕｌのＮ−ｔｅｒ特異的緩衝液中３．７５ｕｌのＮ−ｔｅｒを用いて、ｓｉＲＮＡ複合体（１群あたり１．５ｕｌ  ２０ｕＭ  ｓｉＲＮＡ）を形成した。一般に、６〜９倍の量を混合した後、緩衝液中で得られたｓｉＲＮＡ／Ｎｔｅｒ複合体を５０ｕｌずつに分けた。抗ルシフェラーゼｓｉＲＮＡならびに非コード（スクランブル、対照）ｓｉＲＮＡでも同様の試料を調製した。
【０１３８】
この試料に、１０ｍＭ  Ｐｓ（ホスフェート、ＮａＣｌなし）中４０ｍｇ／ｍｌで、５０ｕｌのＩｇＧを加えた。この溶液に、ボルテックスしながらＤＤＷ中４００ｕｌのＰＥＧ  ２０ｋＤａ  ３０％ｗ／ｗを加えた。相分離が生じた部分に白色の懸濁液が生成された。粒子を遠沈させ、ＰＥＧ相を破棄した。
【０１３９】
得られた残基に、まずはＩＰＡのアリコートを加えてから引き上げ、残っている水分を除去した。次に、以下の溶媒を粒子に加え（０．４ｍｌ）、徹底的にボルテックスした：ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、シクロヘキサン。１つの群の粒子には、溶媒を加えなかった。代わりに、粒子をすみやかに３００ｕｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／５ｕｇ／ｍｌドキシサイクリンに再溶解させた（グラフ中の「粒子」）。
【０１４０】
ボルテックス後、真空下で蒸発させて粒子から有機相を除去した。得られた残基に、６００ｕｌのＤＭＥＭ（ＦＢＳおよび５ｕｇ／ｍｌドキシサイクリンを含む）を加え、徹底的にボルテックスした。１．５ｕｌのｓｉＲＮＡを４５ｕｌのＮ−ｔｅｒ緩衝液に加えることで、対照試料を調製した（ルシフェラーゼおよびスクランブルｓｉＲＮＡを使用）。この溶液に、３．７５ｕｌのＮ−ｔｅｒを加え、ボルテックスした。試料を２５０ｕｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／５ｕｇ／ｍｌドキシサイクリンで希釈した。
【０１４１】
ＨＲ５ＣＬ１１ドキシクリン誘導ルシフェラーゼ発現細胞を１０4個／ウェルで清潔な黒底９６ウェルのプレートに蒔き、２４時間インキュベートした上でトランスフェクションを実施した。
【０１４２】
１００ｕｌをＨＲ５ＣＬ１１細胞（１００ｎＭ濃度のｓｉＲＮＡ）の４２のウェルに加えた後、３００ｕｌのＤＭＥＭを加え、１００ｕｌを３つのウェル（２５ｎＭ濃度のｓｉＲＮＡ）に加えた。再度、２００ｕｌのＤＭＥＭを加え、１００ｕｌを４３のウェル（８．３ｎＭ濃度のｓｉＲＮＡ）に加えた。実施例９で上述したようにしてノックダウンの割合を計算した。データを図１３に示す。
【０１４３】
実施例１１：粒子中にＨｕＳＡまたはグリコーゲンを有するペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体に有機溶媒がおよぼす影響
５０ｕｌのＮ−ｔｅｒ特異的緩衝液中３．７５ｕｌのＮ−ｔｅｒを用いて、ｓｉＲＮＡ複合体（１群あたり１．５ｕｌ  ２０ｕＭ  ｓｉＲＮＡ）を形成した。５倍の量を混合した後、緩衝液中で得られたｓｉＲＮＡ／Ｎｔｅｒ複合体を５０ｕｌずつに分けた。抗ルシフェラーゼｓｉＲＮＡならびに非コード（スクランブル、対照）ｓｉＲＮＡでも同様の試料を調製した。この試料に、以下の溶液５０ｕｌを加えた：４０ｍｇ／ｍｌのＨｕＳＡ（ヒト血清アルブミン）、４０ｍｇ／ｍｌのグリコーゲン。
【０１４４】
この溶液に、ボルテックスしながらＤＤＷ中４００ｕｌのＰＥＧ  ２０ｋＤａ  ３０％ｗ／ｗを加えた。相分離が生じた部分に白色の懸濁液が生成された。粒子を遠沈させ、ＰＥＧ相を破棄した。
【０１４５】
一組の試料の得られた残基に、６００ｕｌのＤＭＥＭ（ＦＢＳおよび５ｕｇ／ｍｌドキシサイクリンを含む）を加え、徹底的にボルテックスした（ｓｉＲＮＡは、ここでは５０ｎＭ濃度である）。もうひとつの組の試料の得られた残基に、まずＩＰＡのアリコートを加えてから引き上げ、残っている水分を除去した。この粒子にジクロロメタンを加え（０．４ｍｌ）、徹底的にボルテックスした。続いて、真空下で蒸発させて溶媒を除去した。６００ｕｌのＤＭＥＭ（ＦＢＳおよび５ｕｇ／ｍｌのドキシサイクリンを含む）を乾燥粒子に加え、徹底的にボルテックスした（ｓｉＲＮＡは、ここでは５０ｎＭ濃度である）。
【０１４６】
１．５ｕｌのｓｉＲＮＡを４５ｕｌのＮ−ｔｅｒ緩衝液に加えることで、対照試料を調製した（ルシフェラーゼおよびスクランブルｓｉＲＮＡを使用）。この溶液に、３．７５ｕｌのＮ−ｔｅｒを加え、ボルテックスした。試料を５５０ｕｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／５ｕｇ／ｍｌドキシサイクリンで希釈した。
【０１４７】
ＨＲ５ＣＬ１１ドキシクリン誘導ルシフェラーゼ発現細胞を１０4個／ウェルで清潔な黒底９６ウェルのプレートに蒔き、２４時間インキュベートした上でトランスフェクションを実施した。
【０１４８】
１００ｕｌをＨＲ５ＣＬ１１細胞（５０ｎＭ濃度のｓｉＲＮＡ）の４つのウェルに加えた後、２００ｕｌのＤＭＥＭを加え、１００ｕｌを４つのウェル（２５ｎＭ濃度のｓｉＲＮＡ）に加えた。データを図１４に示す。
【０１４９】
実施例１２：相分離による離散的粒子形成時におけるＤＯＴＡＰ／ｓｉＲＮＡ複合体へのタンパク質の添加
ＤＯＴＡＰ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）とコレステロールを１ｍｇ／ｍｌでエタノールに溶解させ、ＤＯＴＡＰ／コレステロール比９：１で混合した。４５ｕｌのダブル蒸留水中、４．２ｕｌのＤＯＴＡＰ／コレステロール混合物を用いて、ｓｉＲＮＡ複合体（１群あたり１．５ｕｌの２０ｕＭ  ｓｉＲＮＡ）を生成した。一般に６〜９倍の量を混合した後、緩衝液中で得られたｓｉＲＮＡ／Ｎｔｅｒ複合体を５０ｕｌずつに分けた。抗ルシフェラーゼｓｉＲＮＡならびに非コード（スクランブル、対照）ｓｉＲＮＡでも同様の試料を調製した。
【０１５０】
ＩｇＧタンパク質溶液（ＩｇＧ）を以下のようにして調製した：ＩｇＧ（凍結乾燥、Ｌａｍｐｉｒｅ、ＨＣｌ滴でわずかに酸性にしたＰＢＳで再構成）中のＦａｂをＢｉｏＲａｄ脱塩カラムに入れ、１０ｍＭ  Ｐｓ／ＮａＣｌなしで溶出させた。遠心フィルタを用いて、タンパク質溶液を約４０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。
【０１５１】
この試料に、以下の溶液５０ｕｌを加えた：１０ｍＭ  Ｐｓ（ホスフェート、ＮａＣｌなし中、４０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡまたは４０ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ。
【０１５２】
この溶液に、ボルテックスしながらＤＤＷ中４００ｕｌのＰＥＧ  ２０ｋＤａ  ３０％ｗ／ｗを加えた。
【０１５３】
相分離が生じた部分に白色の懸濁液が生成された。粒子を遠沈させ、ＰＥＧ相を破棄した。
【０１５４】
得られた残基に、６００ｕｌのＤＭＥＭ（ＦＢＳなし、ただし５ｕｇ／ｍｌドキシサイクリンを含む）を加え、徹底的にボルテックスした（ｓｉＲＮＡは、ここでは５０ｎＭ濃度である）。
【０１５５】
１．５ｕｌのｓｉＲＮＡを４５ｕｌのＤＤＷに加えることで、対照試料を調製した（ルシフェラーゼおよびスクランブルｓｉＲＮＡを使用）。この溶液に、４．２ｕｌのＤＯＴＡＰ／コレステロール混合物を加え、ボルテックスした。試料を５５０ｕｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／５ｕｇ／ｍｌドキシサイクリンで希釈した。
【０１５６】
ＨＲ５ＣＬ１１ドキシクリン誘導ルシフェラーゼ発現細胞を１０4個／ウェルで清潔な黒底９６ウェルのプレートに蒔き、２４時間インキュベートした上でトランスフェクションを実施した。
【０１５７】
１００ｕｌをＨＲ５ＣＬ１１細胞（５０ｎＭ濃度のｓｉＲＮＡ）の４つのウェルに加えた後、２００ｕｌのＤＭＥＭを加え、４つのウェル（２５ｎＭ濃度のｓｉＲＮＡ）に１００ｕｌを加えた。３７℃で３時間インキュベートした後、培地をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／５ｕｇ／ｍｌドキシサイクリンと交換した）。
【０１５８】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないことが明らかな場合を除いて、複数形も含む点に注意されたい。よって、たとえば、「化合物」を含む組成物とあれば、２種類以上の化合物の混合物も含まれる。また、「または」という表現は通常、文脈からそうでないことが明らかな場合を除いて、「および／または」を含む意味で用いられる点にも注意されたい。
【０１５９】
さらに、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、「構成される」という言い回しは、特定の作業を実施または特定の構成を採用するために構築または構成されるシステム、装置または他の構造を説明するものである点に注意されたい。「構成される」という言い回しは、配置および構成される、構築および配置される、構築される、製造および配置されるなどの他の同様の言い回しと同義に使用可能である。
【０１６０】
本明細書に記載の刊行物および特許出願はいずれも、本発明が属する分野での当業者のレベルを示すものである。これらの刊行物および特許出願はいずれも、個々の刊行物または特許出願を具体的かつ個々に援用したのと同程度に本明細書に援用される。本明細書のいずれも、当該刊行物および／または特許（本明細書に引用した刊行物および／または特許を含む）に先行することを本発明者らが認めたことを了承したものと解釈されるものではない。
【０１６１】
以上、具体的かつ好ましいさまざまな実施形態および技術を参照して本発明について説明した。しかしながら、本発明の主旨および範囲内のままで、多くの変形および改変をほどこし得ることは、理解されたい。
【０１６２】
別の実施形態：
一実施形態において、本発明は、核酸をカチオン性キャリア剤と接触させて核酸複合体を形成し、核酸複合体を多孔性粒子に吸収することを含み、粒子の平均直径が約１００μｍ未満である、核酸複合体を有する粒子を形成する方法を含む。
【０１６３】
この方法の一実施形態では、粒子の平均直径が４０μｍ以下である。一実施形態では、粒子の平均直径が１０μｍ以下である。一実施形態では、多孔性粒子が、核酸複合体をｉｎ  ｖｉｖｏで放出するよう構成される。一実施形態では、多孔性粒子が、セラミック、カオリン、および架橋ポリマーからなる群から選択される材料を含む。一実施形態では、カチオン性キャリア剤が、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。一実施形態では、この方法が、核酸をカチオン性キャリア剤と接触させて核酸複合体を形成し、核酸複合体をポリマーと接触させ、ポリマーを架橋させることを含む。一実施形態では、この方法がさらに、核酸複合体をポリマーと接触させるステップの後に、相分離を実施することを含む。いくつかの実施形態では、ポリマーを架橋させることが、ポリマーに紫外線を印加することを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリマーを架橋させることが、架橋剤を添加することを含み得る。
【０１６４】
一実施形態では、本発明は、核酸複合体を有する粒子を形成する方法を含む。この方法は、核酸をカチオン性キャリア剤と接触させて核酸複合体を形成し、タンパク質を含む溶液に、タンパク質の成核剤として作用する核酸複合体を接触させることを含み得る。一実施形態では、この方法は、タンパク質を含む溶液に核酸複合体を接触させるステップの後に、相分離を実施することを含み得る。一実施形態では、タンパク質がＦａｂ断片を含み得る。
【０１６５】
一実施形態では、本発明は、核酸をカチオン性キャリア剤と接触させて核酸複合体を形成し、核酸複合体を多孔性粒子に吸着させて粒子を含有する核酸複合体を形成し、粒子を含有する核酸複合体をポリマー溶液と混合してコーティング混合物を生成し、当該コーティング混合物を基材に適用することを含む、医療装置の製造方法を含み得る。多孔性粒子は、セラミック、カオリン、架橋ポリマーの群から選択される材料を含み得る。カチオン性キャリア剤は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含み得る。ポリマー溶液は、分解性ポリマーを含み得る。
【０１６６】
ポリマー溶液は、非分解性ポリマーを含み得る。ポリマー溶液は、有機溶媒を含み得る。当該コーティング混合物を基材に適用することは、コーティング混合物を基材にスプレーすることを含み得る。
【０１６７】
一実施形態では、本発明は、核酸をカチオン性キャリア剤と接触させて核酸複合体を形成し、核酸複合体を多孔性材料に吸着させて粒子を含有する核酸複合体を形成し、粒子を含有する核酸複合体をポリマー溶液と混合してコーティング混合物を生成し、コーティング混合物を硬化させることを含む、医療装置の製造方法を含み得る。
【０１６８】
一実施形態では、本発明は、核酸をカチオン性キャリア剤と接触させて核酸複合体を形成し、核酸複合体を材料と組み合わせて粒子を含有する核酸複合体をｉｎ  ｓｉｔｕで形成し、核酸複合体粒子をポリマー溶液と混合してコーティング混合物を生成し、当該コーティング混合物を基材に適用することを含む、医療装置の製造方法を含み得る。
【０１６９】
一実施形態では、本発明は、基材と、基材上に配置された溶出制御マトリクスと、溶出制御マトリクス内に配置された複数の粒子と、粒子内に配置された複数の核酸複合体とを含み、核酸複合体が核酸とカチオン性キャリア剤とを含む、植込み型医療装置を含み得る。
【０１７０】
一実施形態では、本発明は、溶出制御マトリクスと、溶出制御マトリクス内に配置された複数の粒子と、粒子内に配置された複数の核酸複合体とを含み、核酸複合体が核酸とカチオン性キャリア剤とを含む、植込み型医療装置を含み得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ−８Ｂ】
0005763525.tif 000017
【図９Ａ−９Ｊ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
0005763525.tif 000023
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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