(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）１以上の化合物と、Ｇタンパク質結合レセプター２３遺伝子によってコードされたポリペプチド又は前記ポリペプチドの断片若しくは誘導体とを接触させる工程と、
（ｂ）前記ポリペプチドに対する前記化合物の結合親和性を決定する工程と、
（ｃ）少なくとも１０μモル濃度の結合親和性を示す前記化合物と、間葉系前駆細胞の個体群とを接触させる工程と、
（ｄ）前記間葉系前駆細胞の骨芽細胞への分化を誘導する化合物を同定する工程と、
で成ることを特徴とする間葉系前駆細胞の骨芽細胞への分化を誘導する化合物の同定方法。
【請求項２】
前記化合物は低分子化合物、ペプチド、脂質、天然物及び生理活性物質のグループから選択される請求項１に記載の間葉系前駆細胞の骨芽細胞への分化を誘導する化合物の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類の未分化細胞の骨芽細胞への分化を誘導する方法に関する。本発明は更に、分化を誘導するための化合物そのものと共に、分化を誘導する１又は２以上の化合物を同定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨には２つの異なる細胞系統、即ち骨形成細胞（例えば骨芽細胞）と骨再吸収細胞（例えば破骨細胞）とがある。骨はこれらの骨芽細胞と破骨細胞との間の複雑な相互作用によって破壊（再吸収）されたり、再形成される動的組織である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
破骨細胞に関しては、前駆細胞から機能的な破骨細胞への発達における転写因子と成長因子のカスケードはよく解明されている。対照的に、骨芽細胞系統に関してはわずかに解明されているのみである。骨芽細胞は、間充織前駆細胞（ＭＰＣ）の分化で発生する。骨芽細胞への分化中に、骨のアルカリ性ホスファターゼ活性（ＢＡＰ）は規制されない。生体内の骨形成は図１に示すような内軟骨性骨化又は膜性骨化のような２つの異なる初期発生過程を経て行われる。図１に示されるように、間葉系前駆細胞又は幹細胞は、骨形成の２つの出発点を示している。膜性骨化では、頭蓋骨又は鎖骨のような扁平骨は間葉系細胞の凝縮によって直接形成される。手足の骨のような長管骨の間充織細胞の凝縮は、先ず軟骨中間体となり、それは更なる発達過程の間に骨芽細胞及び骨細胞に分化する血管内皮細胞、破骨細胞及び間充織細胞がその軟骨中間体に侵入する（ナカジマ（Ｎａｋａｊｉｍａ）及びド・クロンブリュッゲ（ｄｅ  Ｃｒｏｍｂｒｕｇｇｈｅ）の２００３年の報告）。
【０００４】
多くの疾患は、骨再吸収と骨再生との間の微調整されたバランスが乱れることによって引き起こされることが分かっている。このような骨の疾患を持つ患者の数は多い。即ち、悪性高カルシウム血症、パジェット病、慢性関節リウマチや歯周炎といった骨の炎症、骨格の変移で起こる限局性骨形成、クルゾン症候群、くる病、成熟遅延骨異形成症、濃化異骨症（トゥールーズ−ロートレック変性）、骨形成不全症といったものであり、骨の疾患で最も重大なものの１つが骨粗鬆症である。
【０００５】
骨粗鬆症は、５０歳以上の女性の５人に一人、５０歳以上の男性の２０人に一人がかかっている。骨再吸収という多くの治療法が患者に役立っている。これらの多くは骨の再吸収の本当の増加に取り組むもので、ホルモン交替治療（ＨＲＴ）、選択的エストロゲンレセプタ変調法（ＳＥＲＭ）、ビスホスホン酸塩或いはビスホスホン酸エステル、カルシトニンの投与などがある。
【０００６】
以上の処置方法が骨の再吸収を遅くする一方で、欠損した骨は十分に補充されないので骨折を避けることはできない。骨折を食い止めることができるのは、骨形成が十分に増大したときである。そのため、効果として骨の同化作用を伴う治療的介入に寄与する骨形成経路を特定することは大いに関心が持たれている。今のところ、骨粗鬆症治療のための市場に行き渡っている骨同化治療法は、パラチロイドホルモン（ＰＴＨ）１〜３４番だけである。骨同化はＰＴＨを断続的に投与した時に効果を発揮する。その治療は、薬を患者に毎日注射する必要があるため、とても厄介である。更に、薬剤を多く投与した動物実験では腫瘍の形成が観察されている。しかも、高コストな治療である。
【０００７】
別の骨同一化方法には、骨モルホジェニックタンパク質（ＢＭＰ）を用いることがあるが、それはニッチ市場でのみ認可されている。骨の治療効果を高めるためにこれを治療薬として用いることには危険がある。骨モルホジェニックタンパク質のレセプタは多くの組織で特定されており、ＢＭＰ自体は様々な組織において特有の時空間パターンで発現している。このことは、ＢＭＰが骨以外の多くの組織に対し影響を与えているかもしれないこと、全身に投与した時に潜在的に治療薬としての有用性にのみ限定してしまっているかもしれないことを示唆している。従って、上記骨同化体の１又はそれ以上の欠点を解消する新規な同化体が必要とされている。
【０００８】
本発明の目的は、哺乳類の未分化細胞の骨芽細胞への分化を誘導する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この目的は、未分化細胞を表４に示された阻害剤としてのポリペプチド、及び／又は前記ポリペプチドの断片及び／又は誘導体と接触させることによって、哺乳類の未分化細胞が骨芽細胞へ分化することを誘導する方法によって達成される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、股関節、膝関節、指関節といった関節部分の人工移植や歯科インプラントのような顎への人工移植を含む軸受移植の準備のために用いられるマトリクスが成長する基質を生成する方法を提供する。また、スペーサといった特殊な外科装置や骨充填剤、そして骨の欠損部分やダメージを受けたり失われた骨の増量、削除、再形成のためにも用いることができる。骨の形成は、誘発的、伝導的過程両面による石灰化の多様性によって最適化される。また、本発明は、先の外科装置が取り替えられる時などの修正外科に関して非常に有効なものである。適合する未分化細胞は、血液細胞を含み特定の間質細胞の中の骨髄細胞である。骨髄細胞と特に間質細胞は、元の環境（患者）から採取されたとき骨生成過程で効果的であることが分かっている。未分化細胞は、直接基質へ適用することができるが、基質に適用する前に基質のない状態で増殖させることもできる。基質無しで増殖させる場合、細胞は増殖後でも大部分が未分化であるので、本発明の目的のため、それらはまだ未分化であるとみなすことにする。その後、細胞は分化される。このような未分化細胞はしばしば多量に得られ、成熟した骨細胞を用いるより簡便であり、病気の回復期間により低い罹病率を示している。それ以上に、未分化細胞は移植を考えている患者本人から得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明による“ポリペプチド阻害剤”は、例えばポリペプチドの生理活性をポリペプチドの発現及び／又は変換を抑制することによって、或いはポリペプチド自体を抑制することによって低下させる多くの分子に関連することに留意すべきである。
【００１２】
未分化細胞は分化の早い段階にあり、まだ最終機能を持っていないほとんどのタイプの細胞へ誘導できる多能性幹細胞である。特にこれらの細胞は例えば破骨細胞や骨芽細胞に分化されていない細胞といえる。このような細胞の例には、脂肪組織から運ばれてきた細胞と同じように、血液細胞や骨髄の中にある細胞がある。更に、本発明では間充織前駆細胞に分化できる細胞、例えば胚細胞のような全能性幹細胞を観察する。
【００１３】
骨芽細胞の分化は、アルカリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）、１型コラーゲン、オステオカルシン、オステオポンチンのような分化過程を誘発する酵素レベルを測定することによって測定することができる。アルカリ性ホスファターゼ活性（ＡＰ）は、細胞にメチルウンベリフェリル七リン酸塩（ＭＵＰ）溶液（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を添加することによって測定できる。ＡＰ活性によるＭＵＰ基質の卵割における蛍光性は、蛍光プレート読取器（フルオスター（Ｆｌｕｏｓｔａｒ），ビーエムジー（ＢＭＧ）社）で測定される。
【００１４】
本発明の実施するための最良の形態は、阻害剤がポリペプチドをコードするポリリボヌクレオチドの発現又は翻訳を阻害することである。
【００１５】
また別の実施例では、阻害剤がポリペプチドをコードするポリリボヌクレオチドの発現又は翻訳を阻害する核酸である。
【００１６】
好ましくは、核酸はベクターの中に包括される。更に好ましくは、ベクターはアデノウィルス、レトロウィルス、アデノアソシエイトウィルス、レンチウィルス、センダイウィルスベクターのいずれかである。
【００１７】
阻害剤として発現する核酸としては、例えばアンチセンスＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、及び／又はｓｉＲＮＡといったベクター及びウィルスベクターがあり、阻害剤を連続的に生成するのに有効である。ベクターにはプラスミドやウィルスが包まれる。ベクター内では、核酸配列はＣＭＶ，ＨＳ０Ｖ，ＴＫ，ＳＶ４０、又は特に延長の要因のような適切なプロモータの制御下に置かれる。阻害剤の持続的な生成はより長い阻害効果を与えると共に、より少ない形質移入が必要となる。
【００１８】
ある特定の好ましい形態では、阻害剤は、アンチセンスＲＮＡ、ポリリボヌクレオチドを開裂するリボザイム、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、及び小さなＲＮＡ干渉（ｓｉＲＮＡ）で成るグループから選択され、ｓｉＲＮＡはポリペプチドの生成を引き起こすポリリボヌクレオチドを阻害することができるように、ポリリボヌクレオチドの一部に十分に相同となっている。
【００１９】
阻害剤に化学的修飾を加えた変異体もまた本発明の一部であり、それらは阻害剤の安定性を増加させるために修飾されたものである。この結果、阻害剤は例えば修飾ヌクレオシド間相互作用、修飾核酸塩基及び／又は糖等のようなヌクレオティック低下に対する抵抗を与える修飾体で成る。本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた、細胞分割又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞吸収の活性を上げるために１つ或いはそれ以上のオリゴヌクレオチドを一部又は複合体と化学的に結合させることによって修飾することが可能である。その一部又は複合体とは、脂質、例えばコレステロール、コール酸、チオエーテル、脂肪族鎖、リン脂質、ポリアミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、パルミチルの一部を含むがそれだけに限定されるわけではない。他の生化学的修飾の形成は、例えば２′−Ｏ−メチル体、リン酸メチル体、フォスフォチオエート、逆転された末端修飾（３′−３′結合）などでも可能である。
【００２０】
発現−抑制因子の１つのタイプとしては、表４に示される遺伝子のいずれから成る核酸を阻害する核酸である。例えば、表４に示されている遺伝子のいずれから成る核酸の細胞における発現を阻害する遺伝子治療として、ＤＮＡのようなアンチセンス核酸は生体外で細胞に導入されたり、患者の生体内で管理されたりする。アンチセンス核酸とは、遺伝子の発現が減ぜられるといったターゲットの発現に含まれる特定の相補的核酸配列の基礎と組み合わせることを通して相互作用するヌクレオチド配列を持つ核酸を意味している。好ましくは、遺伝子の発現に含まれる特定の相補的核酸配列は、遺伝子をコードするゲノムＤＮＡ分子又はｍＲＮＡ分子である。このゲノムＤＮＡ分子は、遺伝子の通常部位か成熟した遺伝子のコード配列で成っている。
【００２１】
アンチセンス型核酸は好ましくは大体１７〜１００種類のヌクレオチドを含む配列から成るもので、より好ましくは大体１８〜３０種類のヌクレオチドにより構成されるアンチセンス型核酸である。本発明のアンチセンス型核酸は、好ましくは表４にリストアップされた遺伝子のどれかによってコードされた核酸の全て又は一部或いは対応するメッセンジャＲＮＡとハイブリッド化が可能な核酸断片、又は細胞内に発現した時表４にリストアップされた遺伝子のどれかによってコードされた核酸配列から成るｍＲＮＡの全て又は一部に相補的ＲＮＡを生産するＤＮＡ配列である。アンチセンス型核酸は表４に挙げるような遺伝子のいずれかをコードした核酸群から選択された配列の全て又は一部分の発現によって反対方向において用意される。好ましくは、アンチセンス型核酸はＳＥＱのＩＤ番号：１〜２２６番及び２４７〜３３３番から成るグループから選択された配列の発現によって反対方向において用意される。好ましくは、アンチセンス配列は少なくとも大体１７個のヌクレオチドの長さである。
【００２２】
アンチセンス核酸とその製造方法の背景におけるヌクレオチド配列に対する相補的という用語の意味するところは、細胞中の配列、即ち生理的条件下の配列にハイブリッド化できる程十分相補的であるということである。
【００２３】
本発明による発現−阻害の別の形態は、ＲＮＡ分子の分裂に触媒作用を及ぼすことのできる核酸である。ここで用いられる“リボザイム”発現は、配列に対して幾分特異なリン酸エステル結合の他のＲＮＡ分子を分裂させる触媒的ＲＮＡ分子のことに関する。分裂のターゲットである配列の加水分解は、リボザイムと基質ＲＮＡから成る触媒活性複合体を形成することによって始まる。リン酸エステル結合を分裂させるような全てのリボザイム類は、分子間的に切断するので本発明の目標にふさわしい。
【００２４】
また発現−阻害の別の形態はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）である。ＲＮＡｉとは、配列において静的ＲＮＡと相同で、動植物で観察される二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって静的に調停される遺伝子の転写後の工程のことである。
【００２５】
このことに関連する本発明の実施例によれば、阻害剤はｓｉＲＮＡであり、ｓｉＲＮＡは、表４にリストアップされた標的遺伝子のいずれかから選択されたヌクレオチド配列に相同な１７〜２３種のヌクレオチド類の第１ヌクレオチド配列と、その第１ヌクレオチド配列に相補的な１７〜２３種のヌクレオチド類の第２ヌクレオチド配列とで構成されている。好ましくは、阻害剤はｓｉＲＮＡであり、このｓｉＲＮＡは、表４及び表５のＳＥＱのＩＤ番号：１〜２２０番及び２４７〜３３３番で特定されるヌクレオチド配列から選択された１７〜２３種のヌクレオチド類の第１ヌクレオチド配列と、その第１ヌクレオチド配列に対称的な１７〜２３種のヌクレオチド類の第２ヌクレオチド配列とで構成されている。
【００２６】
他の形態ではｓｉＲＮＡはさらに、ｓｉＲＮＡ内部でステムループ構造を形成することができる第１，第２ヌクレオチド配列に結合される第３ヌクレオチド配列により構成されている。
【００２７】
本発明によるこのような自己補完型単鎖ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは少なくとも第１ガイド配列と、第１ガイド配列を補完する第２ガイド配列と、第２ガイド配列内にステムループ構造を形成する第３ガイド配列とで構成され、第３ガイド配列は第１ガイド配列の遠位端と第２ガイド配列の中央端に共有結合されている。第１及び第２配列を持つ全てのヌクレオチドは塩基対となっているか、又は第１配列と第２配列の間でミスマッチとなっている。そのヌクレオチド配列は、好ましくは１７〜２３個のヌクレオチドの長さである。好ましくは第１又は第２配列は表４に示されている遺伝子のポリヌクレオチド配列から選択された１７〜２３個のヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチド配列である。このようなループを伴ったｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは自己補完型であり、安定なヘアピン構造をとることができる。ヘアピン構造は通常のｄｓＲＮＡより安定である。更にそれらはより簡単にベクターから作られる。
【００２８】
更に好ましくは第１又は第２配列のヌクレオチドは、ＳＥＱのＩＤ番号：１〜２２０番と２４７〜３３３番から成るヌクレオチド配列で成る。そのＳＥＱのＩＤ番号：１〜２２０番と２４７〜３３３番のヌクレオチド配列は、ｓｉＲＮＡの設計ルールに則っていないヌクレオチド配列と比較される標的配列の減少を改善するｓｉＲＮＡの設計ルールに従って選択される（国際公開第２００４／０９４６３６号パンフレット参照）。
【００２９】
好ましくは、第３のヌクレオチド配列は４〜３０個のヌクレオチド長であり更に好ましくは５〜１５個分のヌクレオチド長であり、最適なのは８個長である。最適な実施例において、ヌクレオチド配列はＵＵＧＣＵＡＵＡである（ＳＥＱのＩＤ番号：３３４）。
【００３０】
本発明は更に哺乳類の未分化細胞の骨芽細胞への分化を誘導する化合物を同定する方法に関連している。以下の（ａ）〜（ｄ）で構成される。
（ａ）表４にリストアップされ、表４にリストアップされた遺伝子の幾つかによってコードされたポリペプチド、及び／又は前記ポリペプチドの断片及び／又は誘導体を１又はそれ以上の化合物と接触させる工程；
（ｂ）ポリペプチドに対する化合物の結合親和性を決定する工程；
（ｃ）哺乳類の未分化細胞を少なくとも１０μモル濃度の結合親和性を示す化合物と接触させる工程；
（ｄ）哺乳類の未分化細胞の分化を誘導する化合物を同定する工程。
【００３１】
上記の方法で用いられる本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドはおそらく溶液中で遊離しており、固相担持され、細胞表面に産出されるか細胞内に置かれる。
【００３２】
その方法を実施するために、試験片の自動化の調整と同様、本発明で用いられているポリペプチドか合成されていないポリペプチドから複合体の分離を容易にする化合物のどちらかを固定化することは可能である。本発明のポリペプチドと化合物との相互作用（例えば結合など）は、反応物質を収容できればいかなる容器でも可能である。容器の例としてはミクロ力価プレートや試験管、マイクロ遠心分離管などである。１つの形態において、ポリペプチドがマトリクス（細胞間物質）に結合するような領域を加える働きをする融解タンパク質が供される。例えば本発明におけるポリペプチドはヒスチジン（Ｈｉｓ）と相性がよく、Ｎｉ−ＮＴＡミクロ力価プレート上に吸収させたり、或いは本発明のポリペプチドと共に融解タンパク質（ＰｒｏｔＡ）をＩｇＧに吸収させたりして、それらを（分子量３５の硫黄で標識した）細胞リセーツ及び予備化合物と結合させ、混合物は例えば塩分及びｐＨを生理的条件にし、複合体の形成に適した条件下でインキュベーションされる。インキュベーション後に、そのプレートは、未結合のラベルを取り除いて洗浄し、そのマトリクスを固定する。放射能量は直接的或いは複合体を分離した後の上澄み液から測定される。代わりに、複合体をマトリクスから分離でき、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、本発明のタンパク質のレベルは標準的電気泳動技術を用いたゲルから定量される。
【００３３】
マトリクス上のタンパク質を固定の別の技術は、化合物を同定する方法に用いることができる。例えば本発明のポリペプチド又は化合物は、ビオチン及びストレプタビジンとの利用可能な結合を固定できる。本発明のビオチン化したタンパク質分子は、公知の技術、例えばピアスケミカル社（イリノイ州ロックホード）のビオチン化キットを用いてビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシイミド）から用意でき、またストレプタビチジンで被覆された９６ウェルプレート（ピアスケミカル社）のウェルに固定される。代わりに、本発明のポリペプチドで反応するが、化合物に対するポリペプチドの結合を妨げない抗体はプレートのウェルに被覆することができ、本発明のポリペプチドは抗体結合によってウェル内に閉じ込めることができる。上述のように、標識化された予備化合物の準備は本発明のポリペプチドがプレート上のウェルにある状態でインキュベートされ、ウェルにトラップされる複合体の量を定量できる。
【００３４】
化合物のポリペプチド又はポリヌクレオチドとの結合親和性は、表面プラズマ共振型バイオセンサ（バイアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ））を用いたり、置換反応を介して標識化合物を用いた飽和結合分析（例えばスカッチャードとリンドゥモの分析）や、差動式紫外吸収スペクトル法、蛍光偏光試験片、蛍光分析イメージプレート読取器（ＦＬＩＰＲ（登録商標））、蛍光共振エネルギー転移や生物発光共振エネルギー転移などの公知の方法を用いて測定できる。その化合物の結合親和性は、解離定数（Ｋｄ）で、或いはＩＣ５０又はＥＣ５０として示される。ＩＣ５０は、別の配位子のポリペプチドへの結合を５０％阻害するのに必要な化合物の濃度を示す。ＥＣ５０は、生体外で最大効果の５０％を得るために必要な濃度を表す。解離定数Ｋｄを用いることで配位子がポリペプチドとどの程度良く結合するかを測定することができ、それはポリペプチドの結合部位の半分を正確に飽和する配位子濃度と同じである。高い結合親和性を持つ化合物は、Ｋｄ、ＩＣ５０及びＥＣ５０の値が低く、即ち１００ｎＭ〜１ｐＭの範囲で、低い結合親和性を持つものは高いＫｄ、ＩＣ５０及びＥＣ５０の値となり、即ちマイクロモルの範囲となる。
【００３５】
高い処理量の目標のために、化合物のライブラリーは、ペプチドライブラリー（例えばＬＯＰＡＰ（商標），シグマアルドリッチ社）、脂質ライブラリー（バイオモル（ＢｉｏＭｏｌ）社）、合成化合物ライブラリー（例えばＬＯＰＡＣ（商標），シグマアルドリッチ社）又は天然化合物ライブラリー（スペックス（Ｓｐｅｃｓ），タイムテック（ＴｉｍＴｅｃ）社）を使用することができる。
【００３６】
本発明はまた、哺乳類の未分化細胞の骨芽細胞への分化を誘導する単一化合物及び混合化合物を同定する方法に関し、以下の工程で構成されている。
（ａ）表４にリストアップされた遺伝子によってコードされた表４のポリペプチド、及び／又は前記ポリペプチドの断片及び／又は誘導体を発現させる哺乳類の未分化細胞の個体群を培養する工程；
（ｂ）細胞の前記個体群を化合物又は化合物の混合物に晒す工程；
（ｃ）哺乳類の未分化細胞の骨芽細胞への分化を誘導する単一化合物又は混合化合物を選択する工程。
【００３７】
上記方法で同定された単一化合物又は混合化合物は、哺乳類の未分化細胞の骨芽細胞への分化を誘導することに適用できる。
【００３８】
好ましくは、本発明の方法で同定する化合物は、低分子量化合物についてである。低分子量化合物、つまり５００ダルトン若しくはそれ以下の分子重量を持つ化合物は生物組織において良好な透過や吸収があり、約５００ダルトン以上の分子重量を持つ化合物よりも成功率の高い薬剤模倣体となる（リピンスキー他、２００１年）。
【００３９】
別の実施形態によれば、化合物はペプチドである。ペプチドは良質な薬剤模倣体であり、繁殖性ホルモンや血小板凝結阻害剤（抗血栓剤）といった市場で価値を有するペプチドの多様な例がある。
【００４０】
また、別の実施形態では化合物は天然物化合物である。天然物化合物は、植物などの天然資源から抽出される。スクリーニングで天然物化合物を用いることは、より多くの分子をスクリーニングするのに好都合である。天然物化合物は異なる分子という点で非常に多様性がある。合成化合物は異なる分子のこのような多様性は示さない。他の化合物としては、炭水化物とグリコシル化したポリペプチドから選択される。
【００４１】
更に本発明では、表４に示される標的遺伝子のいずれかから選んだヌクレオチド配列に相同する１７〜２３個のヌクレオチドの配列と、その変異体及び／又は逆の補足（コンプリメンツ）から成るポリヌクレオチドに関連する。好ましくは、前記ポリヌクレオチドは表４と表５中のＳＥＱのＩＤ番号：１〜２２０番と２４７〜３３３番によって同定されるヌクレオチド配列から選択されたヌクレオチド配列を有する、或いは表４及び表５のＳＥＱのＩＤ番号：１〜２２０番及び２４７〜３３３番によって同定されるヌクレオチド配列から選択されたヌクレオチド配列の逆の補足（コンプリメンツ）を有する。本発明のポリヌクレオチドは骨芽細胞の分化の増加を示している。
【００４２】
本発明はまた、ポリヌクレオチドを薬剤として用いる場合にも関連している。
【００４３】
更に、本発明は全身或いは部分的な骨密度減少疾患の治療用薬剤を製造するために前記ポリヌクレオチドを用いることに関連している。
【００４４】
最初に示されているように、表４に示されているグループから選択されたアミノ酸配列で成るポリペプチドが哺乳類の未分化細胞の骨芽細胞への分化に含まれており、本発明の別の実施形態では表４のグループから選択されたアミノ酸配列で成るポリペプチドのいずれかの活性を阻害することが知られており、これらの化合物が哺乳類の未分化細胞を骨芽細胞に分化して誘導することに使用される。それ故に、本発明はまた、表４中のグループから選択されたアミノ酸配列から成るポリペプチドのいずれかの活性を阻害することが知られている化合物を薬剤として使用することに関連している。更に、本発明は表４中のグループから選択されたアミノ酸配列で成るポリペプチドのいずれかの活性を阻害することが知られている化合物を、全身又は部分的な骨密度減少疾患のための薬剤として使用することに関連している。
【００４５】
本発明は更に前述したポリヌクレオチドから成るベクターに関連し、更にはベクターを薬剤として用いることにも関連している。
【００４６】
また好ましい例では、ベクターにはアデノウィルス、レトロウィルス、アデノアソシエイトウィルス、レンチウィルス又はセンダイウィルスなどがある。好ましくは、ベクターはＳＥＱのＩＤ番号：１〜２２０番と２４７〜３３３番から成るグループから選択されたヌクレオチド配列から成るｓｉＲＮＡをコードする。
【００４７】
本発明は更に、全身又は部分的骨密度の減少を治療する薬剤の製造にベクターを用いることにも関連している。また本発明の好ましい例では、疾病群として骨化症、悪性高カルシウム血症、多発性骨髄腫、副甲状腺機能亢進症及び甲状腺機能亢進症が挙げられる。
【００４８】
組み換えウィルスは一般的に遺伝子の変換に用いられる。ここで、遺伝子組み換えで用いられる一般的な３つのウィルスはアデノウィルス、レトロウィルス、アデノアソシエイトウィルスである。最近では、レンチウィルス、レトロウィルス群のサブグループやセンダイウィルスが用いられている。アデノウィルスは分裂細胞と非分裂細胞の両方の形質導入が可能であり、高いウィルス滴定が可能である。レトロウィルスは分裂細胞にのみ感染することができ、ホストクロモソームの中にゲノムを一体化することができる。一体化により長い周期の遺伝子発現が達成される。レトロウィルスの仲間であるレンチウィルスは、レトロウィルスの標準的な性質を全て持ち合わせているが、それに加えて非分裂細胞の形質導入する力がある。アデノアソシエイトウィルス（ＡＡＶ）は小さく、非病原性で単一の標準的ＤＮＡウィルスである。アデノアソシエイトウィルスは、生産的な感染のためにはヘルパーウィルス（アデノウィルス又はヘルペスウィルス）と協働する必要がある。ヘルパーウィルスが存在しない場合、野生型ＡＡＶは特定部位でホストゲノムと一体化している。レトロウィルスと同様、一体化によって長い周期の遺伝子発現が容易になる。ＡＡＶは非分裂細胞及び分裂細胞の両方に感染する。センダイウィルスはパラミクソウィルスの１つであり、分裂細胞及び非分裂細胞の両方に核酸を導入できる単一標準的ＲＮＡウィルスである。センダイウィルスの細胞への導入方法は、多くの細胞の型に共通するシアル酸とコレステロールを用いる。ほとんどのウィルスが細胞核に入る必要があるのに対し、センダイウィルスの遺伝子発現と複製は細胞質中に制限される。
【００４９】
さらに、本発明は骨組織を生体外で生産する方法に関し、以下の工程で構成される。
（ａ）細胞基質を形成する基質上に哺乳類の未分化細胞を付与する工程；
（ｂ）哺乳類の未分化細胞を骨芽細胞に分化する間、ポリヌクレオチド或いはポリヌクレオチドで成るベクターのどれかを導入し、それによって連続的な骨マトリクスを生産する工程。好ましくは連続的な骨マトリクスは、基質の表面において少なくとも０．５μｍの厚さを有している。
【００５０】
本発明は、股関節、膝関節、指関節といった関節部分の人工移植や歯科インプラントのような顎への人工移植を含む軸受移植の準備のために用いられるマトリクスが成長する基質を生成する方法を提供する。また、スペーサといった特殊な外科装置や骨充填剤、そして骨の欠損部分やダメージを受けたり失われた骨の増量、削除、再形成のためにも用いることができる。骨の形成は、誘発的、伝導的過程両面による無機質化の多様性によって最適化される。
【００５１】
軸受移植（好ましくは上述のようにマトリクスが被覆されている）の供給とマトリクスから成る骨充填剤の組み合わせは、本発明では有効な構成となっている。
【００５２】
本発明はまた、先の外科装置が取り替えられる時など、外科的処置にも最適である。
【００５３】
適合する未分化細胞は、血液細胞を含み特定の間質細胞の中の骨髄細胞である。骨髄細胞と特に間質細胞は、元の環境（患者）から採取されたとき骨生成過程で効果的であることが分かっている。未分化細胞は、直接基質へ適用することができるが、基質に適用する前に基質のない状態で増殖させることもできる。基質無しで増殖させる場合、細胞は増殖後でも大部分が未分化であるので、本発明の目的のため、それらはまだ未分化であるとみなすことにする。その後、細胞は分化される。グルココルチコイドやデキサメタゾンのような適切な誘導剤があると、分化は誘導又は強化される。特に分化の適切な誘導体は、本発明の発現阻害剤である。
【００５４】
未分化細胞の使用はいくつかの利点を示している。第一に、未分化細胞の低い分化はより高い増殖率を意味し、一層直接的で制御された最終的な機能性を持つことを許容している。更に、未分化細胞は有機質及び無機質化合物で成る骨マトリクスを生産するだけでなく、組織の成長のためや生体組織に適応するためのいくつかの因子を培地媒体やマトリクスの中に存在させることになっている。また、培地は移植過程で用いられるとき、成長因子のような活性因子の源となる。このような未分化細胞はしばしば多量に得られ、成熟した骨細胞を用いるより簡便であり、病気の回復期間により低い罹病率を示している。更に、未分化細胞は移植を考えている患者から得ることができる。これらの細胞から作られた骨は、患者にとって自己のものであり免役応答が引き起こされることはない。１００μｍの厚さのマトリクスは、未分化細胞を用いた結果生産される。
【００５５】
未分化細胞が培養される基質はチタンやコバルトクロム合金或いはステンレス鋼などの金属や、リン酸カルシウムのような生理活性表面、ポリエチレンのようなポリマー表面などが使われる。わずかな例であるが、ガラスセラミックスのようなケイ素物質も基質として使われている。最も適しているのはチタンのような金属やリン酸カルシウムである。ただしリン酸カルシウムは基質に不可欠な化合物というわけではない。基質は多孔性でも非多孔性でも良い。細胞は例えば１ｃｍ２当たり１０３〜１０６個、特に１０４〜２×１０５個の割合で適用される。
【００５６】
本発明で使われる培地は、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）のような一般的に知られた培地である。培地は調整されたものであれば有利である。この調整された培地とは、その中で類似細胞が予めインキュベートされ、細胞成長と細胞分化に重要なポリペプチド群のような因子が細胞によって分泌され培地に含まれるようになる培地であると理解される。
【００５７】
細胞は、例えば少なくとも０．５μｍ、特に１μｍ以上１００μｍ以下、さらにいえば１０〜５０μｍ以内の厚さのマトリクス層を生成するのに十分な時間培養される。細胞は例えば２〜１５週間培地で培養され、特に４〜１０週間培養される。
【００５８】
マトリクスの生成では、基質に対して表面の少なくとも５０％、特に表面の８０％で連続的若しくは擬似連続的に基質を被膜するという結果になっている。
【００５９】
本発明の他の例では本発明の方法によって得られる骨芽細胞を提供することにある。
【００６０】
本発明の更に他の例には、骨組織の生成を生体外で行う本発明の方法によって得られる骨芽細胞の使用が含まれている。
【００６１】
また、さらに本発明では病気が引き起こす骨密度の全身的又は局所的な減少を診断したり、患者の状態を究明したりする方法に関し、以下の工程で構成される。
（ａ）前記患者から取り出した生理学的サンプルにおいて、表４に示されている標的遺伝子のいずれかによってコードされたポリヌクレオチドの発現レベルを決定する工程；
（ｂ）健康体の被験者から集めたサンプルのポリヌクレオチドの発現レベルで発現レベルを比較する工程。健康体の被験者のサンプルを含む患者のヌクレオチド量の増加は、この場合、病的な条件に誘導される。
【００６２】
更に、本発明は、病気が引き起こす骨密度の全身的又は局所的な減少を診断したり、患者の状態を究明したりする方法に関し、以下の工程で構成されている。
（ａ）前記患者から集めた生理学的サンプルを、表４中に示されている目標遺伝子をコードしたポリペプチドの量から決定する工程。
（ｂ）健康体の被験者から集めたサンプルにおけるポリペプチドの量から比較する工程；
健康体の被験者のサンプルで成る患者のポリペプチド量の増加も、この場合の病的な条件に誘導される。好ましくは、この場合の病的な条件というのは骨粗鬆症、悪性のカルシウム過多血症、多発性骨髄腫、副甲状腺機能亢進症、甲状腺機能亢進症に起因している。
【００６３】
本発明では、用語「ポリペプチドの誘導体」とはタンパク質、タンパク質分子、タンパク質断片、ペプチド、ポリペプチドの連続するアミノ酸残基の伸張変異から成りタンパク質の生理活性を保つオリゴペプチド、例えば、ポリペプチド自然発生型形態のアミノ酸配列と比較するとアミノ酸変異を有するポリペプチドに関する。ここでの誘導体はさらに自然発生型のアミノ酸配列と比較すると自然発生型形態に加わった変異、グリコシル化、アシル化、或いは非自然発生型のアミノ酸残基から成る。また、その誘導体は、自然派生型ポリペプチドのアミノ酸残基と比較される１又はそれ以上の非アミノ酸置換基をも含み、例えば、アミノ酸配列と共有結合又は非共有結合するレポータ分子や他の配位子である。
【００６４】
用語「ポリペプチドの断片」とは、伸びきったアミノ酸残基で成り、実質的な類似性を示すが、完全な配列と同じ機能活性を示すわけではないペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、酵素に関連する。
【００６５】
用語「ポリヌクレオチド」とは、二重鎖又は一本鎖ＤＮＡや（メッセンジャ）ＲＮＡといった核酸と、オリゴヌクレオチドの全形に関する。また、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ポリシロキサン、２′−Ｏ−（２−メトキシ）エチルチオリン酸のような変形体を含んだ核酸を含んでいる。
【００６６】
用語「ポリヌクレオチドの誘導体」とは、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、そしてポリヌクレオチドの伸びきった核酸残基で成るオリゴヌクレオチドで、例えば、ポリヌクレオチドの自然発生形態の核酸配列と比較すると核酸変異を生じたポリヌクレオチドに関する。ここでいう誘導体はペプチド核酸、ポリシロキサン、２’−Ｏ−（２‐メトキシ）エチルチオリン酸のような変形体を含んだ核酸と、非天然型の核酸残基、或いは１又はそれ以上の核酸の置換基を変換したもの、例えばメチル基、チオ、硫酸エステル、ベンゾイル基、フェニル基、アミノ基、プロピル基、クロロ基、そしてメタノカルバヌクレオシド、或いは方向を有効化するレポータ分子とで成っている。
【００６７】
用語「ポリヌクレオチド断片」は、実質的には類似性を示すが、完全な配列と同じ活性を示すわけではない連続する核酸残基の伸張変異から成るオリゴヌクレオチドに関する。
【００６８】
用語「相同性配列」では、核酸配列又はアミノ酸配列であろうとも親配列と同一か実質的に同一で親配列と同じ生物学的性質を持つ配列に限定される。この用語は、親配列の自然発生的な突然変異体を含むことを意味している。親配列は表４〜表６に示されているものか、これらの表の中の核酸データベースのアクセス番号（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒｓ）のいずれかである。一般的に、相同性配列というのは親配列と少なくとも９５％同じ配列のものを指す。しかしながら、１７〜２１個のｓｉＲＮＡ配列では２つまでの不適合は、相同性配列が親配列として対応する遺伝子の類似する下位規則を導いており、許容される。
【実施例】
【００６９】
［実施例１］内因性アルカリ性ホスファターゼ探知法による高処理スクリーニング法の開発
＜試験片の原則＞
間葉系前駆細胞（ＭＰＣｓ）は、例えばＢＭＰ２のような適切な因子により骨芽細胞への分化が決定される。このような因子のスクリーニングのための試験片は、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）酵素の活性、骨芽細胞分化プログラム中の早期マーカをモニタリングすることによって開発される。ＭＰＣｓを３８４ウェルプレートに植えつけると同時に、１日後にＳｉｌｅｎｃｅ  Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）コレクションからのヒトコクサッキーと、アデノウィルスレセプタ（ｈＣＡＲ；Ａｄ−ｈＣＡＲ）をコードするアデノウィルスと個々のｓｉＲＮＡアデノウィルス（Ａｄ−ｓｉＲＮＡ）を相互感染させた。ＡｄＣ１５‐ｈＣＡＲ／ＡｄＣ２０‐ｈＣＡＲの相互感染は、ＡｄＣ０１−ｓｉＲＮＡの感染率を上昇させる。細胞のＡＰ活性は、感染（１３  ｄｐｉ）から１３日後に決定された。図２は試験片の組成を図示している。
【００７０】
＜試験片の開発＞
ＭＰＣｓは、事前説明後に健康なボランティアの骨髄から採取した（ベルギー，ヴェルヴィエールズ，キャンブレックス社のＢｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）。
【００７１】
この一連の実験は３８４ウェルプレートで行い、いくつかのパラメータを最適化した。即ち、細胞植え付け密度、コントロールウィルス（Ａｄ−ＢＭＰ２又はＡｄ−ｅＧＦＰ）の感染の多重性（ＭＯＩ）、Ａｄ−ｈＣＡＲのＭＯＩ、感染の継続時間、毒性、感染率（Ａｄ−ｅＧＦＰ使用）、及び解読の日数である。
【００７２】
試験片の伝達のポジティブコントロールにＡｄ−ＢＭＰ２（ＢＭＰ２の過剰発現）を使用したとき、以下のプロトコルは、バックグラウンド信号上一番低い標準偏差で試験片の最も高い機能範囲内での結果が得られる。即ち、初日に３８４ウェルプレートのウェルに５００個のＭＰＣｓ細胞、一日後に、Ａｄ−ｈＣＡＲ（５μｌのＡｄ−ｈＣＡＲ溶液で混合総計ＭＯＩ＝１５５．７）と１μｌのＡｄ制御ウィルス（理論ＭＯＩが５０００に相当するＡｄ−ＢＭＰ２又はＡｄ−ｅＧＦＰ）の混合物を使って相互感染させる。５日後、ウィルスを含む培地を取り除き、ウィルスの存在しない清浄な別の培地に移した。アルカリ性ホスファターゼの発現上昇は、１３ｄｐｉで解読される。即ち、１５μｌの４−メチルウンベリフェリルリン酸（ＭＵＰ，シグマ社）を各々のウェルに加え、そのプレートを３７°Ｃで１５分間静置し、蛍光プレート読取器（フルオスター（Ｆｌｕｏｓｔａｒ），ビーエムジー（ＢＭＧ）社）を用いてＡＰ活性を観察した。
【００７３】
この試験片の最適化後、自動装置（スイス、テキャンＡＧ社製、ＴｅＭＯ９６，ＴｅＭＯ３８４，ＲｏＭａ装備のテキャンフリーダム（Ｔｅｃａｎ  Ｆｒｅｅｄｏｍ）２００の９６／３８４チャンネルディスペンサー）を用いスクリーニング（１０３個の異なるＡｄ−ｓｉＲＮＡウィルスに）された。このスクリーニングでヒットしたものは集められ同じ試験片で再検査された。最も高く評価された２種のＡｄ−ｓｉＲＮＡ（Ｈ９＝Ｈ２４−０１０；Ｈ１０＝Ｈ２４−０１１）は、Ａｄ−ｓｉＲＮＡを含んだコントロールプレート（ノックダウン（ＫＤ）制御プレート）を生成するのに用いられる。３つのネガティブ制御ウィルス（Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３）と３つのポジティブ制御ウィルス（Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３）を含んだ９６ウェルプレートが制御プレートとして図３に示されている。この“ノックダウン”制御プレートは、ポジティブ制御ウィルスＡｄ−Ｈ９（Ｈ２４−０１０）及びＡｄ−Ｈ１０（Ｈ２４−０１１）、感染制御ウィルスＡｄ−ｅＧＦＰ（ノックイン  ウィルス）、ネガティブ制御ウィルスＡｄ−ｅＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ、Ａｄ−Ｍ６ＰＲ−ｓｉＲＮＡ及びＡｄ−Ｌｕｃ−ｓｉＲＮＡ（この３種は全てノックダウンウィルス）を含んでいる。
【００７４】
制御ウィルスを、９６ウェルＫＤ制御プレートから３８４ウェルプレートに自動装置を用いて滴下した。３８４ウェルプレートの最終的なレイアウトを図４に示す。
【００７５】
図５はＫＤ制御プレートを用いた自動スクリーニング工程の結果を示している。ＫＤネガティブコントロールウィルス（Ｎ１−Ｎ３）の平均値と標準偏差は、ヒット分析のカットオフ値を計算するのに用い、カットオフ値はＮ１，Ｎ２，Ｎ３（‘全てネガティブ’）の平均値に‘全ネガティブウィルス’の標準偏差の３倍を足したものにセットした。ポジティブ制御ウィルス（Ｐ１及びＰ２）は、感染させたウェルの９５％以上の数値を示した。ネガティブコントロールウィルスは感染ウェルの５％以下の数値を示した。
【００７６】
［実施例２］骨芽細胞試験片における７９８０種Ａｄ−ｓｉＲＮＡアデノウィルスのスクリーニング
ＳｉｌｅｎｃｅＳｅｌｅｃｔライブラリーのスクリーニングの最適化プロトコルは、以下の通りである。即ち、初日に黒い３８４ウェルプレートで下部は透明なもの（Ｃｏｓｔａｒ或いはＮｕｎｃ）に１ウェル当たり５００個の細胞密度で６０μｌの培地にＭＰＣ細胞を植え付けた。翌日、３８４ウェルプレート（１ｍｌ当たり２．５×１０９個のウィルス粒子の推定滴定濃度）の５μｌのＡｄ−ｈＣＡＲ溶液（合計ＭＯＩ＝１５５）に蓄えられＶ字型９６ウェルプレートに調製されたＳｉｌｅｎｃｅＳｅｌｅｃｔ（商標）コレクションの１μｌのＡｄ−ｓｉＲＮＡウィルスを、９６／３８４チャンネルディスペンサー（スイス、テキャンＡＧ社製、ＴｅＭＯ９６，ＴｅＭＯ３８４，ＲｏＭａ装備のテキャンフリーダム（Ｔｅｃａｎ  Ｆｒｅｅｄｏｍ）２００）を用いてＡｄ−ｈＣＡＲ溶液を含む９６ウェルプレートのウェルからＭＰＣｓを含む３８４ウェルプレートの各ウェルに移した。ＫＤコントロールプレートは、ＳｉｌｅｎｃｅＳｅｌｅｃｔコレクションのアリコートプレートと同様の条件で用いられた。全てのＡｄ−ｓｉＲＮＡウィルスを２回ずつ異なるＭＰＣプレートでスクリーニングした。次にプレートを３７°Ｃでインキュベートする。感染４日後、アデノウィルスを含む培地はウィルスの無い新鮮な培地に置き換えられる。感染１３日後、ＡＰ活性の読み取りが行われる。３８４ウェルスクリーニングプレートの典型的な結果を図６に示す。そこでは関連蛍光ユニット（ＲＦＵ）が、Ｙ軸上に３８４ウェルプレートの各データポイントがプロットされ、３８４ウェルプレートの位置に対応する番号がＸ軸に示されている。
【００７７】
この２回ずつのスクリーニングは２回行なわれ、全ての４個ずつのデータポイントはヒットの呼び出しのために用いられた（実施例３参照）。
【００７８】
［実施例３］ＡＰ試験片を用いたターゲットの識別
この２回ずつのスクリーニングを行ってから、ＡＰ活性の測定によって得られたデータは以下の通り分析された。即ち、制御プレートを除く全てのプレートから得られたデータポイントの平均値を出しバックグラウンドが計算された。ヒットのためのカットオフ値は、制御プレートを除いた全てのデータポイントの標準偏差を３倍したものを足して計算した。各データポイントはカットオフ値より上か下の値どちらを取るか分析された。カットオフ値より上の値を取る内因性ＡＰ活性レベルを誘導するＡｄ−ｓｉＲＮＡのみが重要となる。ヒットの優先順位はシングルの数値より大きい値を取った方、また１回のスクリーニングより２回のスクーリングでヒットされたものとした。４０９１個の独立遺伝子を表す７９８０個のＡｄ−ｓｉＲＮＡウィルスの構成のためにデータが集められた。その構成は表４に示されている。
【００７９】
識別されたヒットの１つは、試験片により立証されるより前からそして試験片により立証された骨同化作用因子であることを示している。
【００８０】
＜Ｈ２４−０３４：ＳＲＣ＞
マーツィアら（Ｍａｒｚｉａ，ｅｔ  ａｌ．）の報告（２０００年）で、骨形成は野生のマウスに比べサーク（ＳＲＣ）の無いマウスの方が増加していると示されている。この研究の中で最も関連する事項は、サーク（ＳＲＣ）の無いマウスから抽出した骨芽細胞、或いはサーク（ＳＲＣ）アンチセンスオリゴヌクレオチドを除いた野生のマウスから抽出された骨芽細胞は、生体外でＡＰ活性の増加を示していることである。
【００８１】
このスクリーニングにおいて同定された８個の遺伝子は２個のＡｄ−ｓｉＲＮＡｓの標的とされている。これらの遺伝子は“ＡＶＰＲ１Ｂ，“ＦＬＪ２２９５５”，“ＩＬ１Ｆ８”，“ＰＰＩＡ”，“ＵＳＰ３８”，“Ｃ９”，“ＬＯＣ２５４３７８”及び“ＢＲＳ３”である（表４参照）。
【００８２】
［実施例４］標的Ａｄ‐ｓｉＲＮＡｓの性質制御
以後‘ターゲット’と表わすＡｄ−ｓｉＲＮＡｓのヒットは、骨同一化因子としての治療方法を確立するために更に分析されることになる。第一段階は、更に分析するために選択されたＡｄ−ｓｉＲＮＡの品質制御を伴う（本実施例）。他の検証段階として、ｍＲＮＡレベルにおけるターゲットの検証（実施例５）、無機化（石灰化）した試験片といった骨形成試験片におけるターゲットのスクリーニング（実施例６）、同定された遺伝子をターゲットとする付加Ａｄ−ｓｉＲＮＡｓの開発（実施例９）がある。これらの検証アッセイの後に重要性が残されたターゲットは、薬剤の発見のため検討される。即ち、標的Ａｄ−ｓｉＲＮＡｓの骨同一化作用を模倣する化合物の発見と最適化を与える試験片を開発する（実施例７）。更に、同定されたＡｄ−ｓｉＲＮＡｓの非吸収活性は破骨細胞で検証される（実施例８）。
【００８３】
＜標的Ａｄ−ｓｉＲＮＡｓの品質制御＞
標的Ａｄ−ｓｉＲＮＡｓは、９６ウェルプレートレベルでＰｅｒＣ６細胞（オランダ、レイデン（Ｌｅｉｄｅｎ）社のＣｒｕｃｅｌｌ）を用いて繁殖させ、これらのウィルスを最初の試験片で幾つかのＭＯＩで再スクリーニングし（実施例１参照）、標的Ａｄ−ｓｉＲＮＡウィルスによってコードされたｓｉＲＮＡの配列を決定する。
【００８４】
ＰｅｒＣ６／Ｅ２Ａ細胞は、１８０μｌのＰｅｒＣ６／Ｅ２Ａ培地の１ウェル当たり４０，０００個の細胞密度で９６ウェルプレートに植えつけられる。これらの細胞を、１０％の二酸化炭素の加湿培養器で３９°Ｃの状態で一晩インキュベートした。１日後、標的Ａｄ−ｓｉＲＮＡを含むＳｉｌｅｎｃｅＳｅｌｅｃｔのストックから粗細胞リセート１μｌを細胞に感染させた。１０％の二酸化炭素の恒温槽で３４°Ｃを保ち細胞変性効果が現れるまで、細胞をインキュベートした（感染後概ね７日程で臭いと細胞が丸く盛り上がってくることから知られる）。その上澄み液を採取し、その粗細胞ライセートをプロテナーゼＫを用いて処理した。即ち、先ず４μｌの可溶化バッファー（塩化マグネシウムを添加した１ｘ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙバッファー（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、カタログＮｏ．１３３２４６５））に１２μｌの粗細胞ライセートを加え、１ｍｇ／ｍｌのプロテナーゼＫ（前記Ｒｏｃｈｅ社、カタログＮｏ．７４５７２３）と０．４５％のＴｗｅｅｎ‐２０（前記Ｒｏｃｈｅ社、カタログＮｏ．１３３５４６５）を無菌ＰＣＲチューブの中で加えた。それらのＰＣＲチューブを５５°Ｃで２時間インキュベートし、次に１５分間９５°Ｃで活動を不活性化させた。そのＰＣＲ反応のため、塩化マグネシウムのある１０倍のＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、０．５μｌのｄＮＴＰ混合物（各ｄＮＴＰについて１０ｍＭ）、１μｌの前進プライマ（１０ｍＭ溶液、塩基配列は５′ＣＣＧ  ＣＣＡ  ＣＣＴ  ＴＡＴ  ＡＴＡ  ＴＡＴ  ＴＣＴ  ＴＴＣ  Ｃ，ＳＥＱのＩＤ番号：２４５）、１μｌの逆プライマ（１０ｍＭ溶液、塩基配列は５’ＣＣＣ  ＣＣＡ  ＣＣＴ  ＴＡＴ  ＡＴＡ  ＴＡＴ  ＴＣＴ  ＴＴＣ  Ｃ，ＳＥＱのＩＤ番号：２４６）、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡポリメラーゼ０．２μｌ（３．５Ｕ／μｌ、前記Ｒｏｃｈｅ社）と４１．３μｌの水を含んだＰＣＲマスター混合物に１μｌのライセートを加えた。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム９７００で以下のように行った。５０μｌのＰＣＲ混合物を９５°Ｃで５分間インキュベートし、３５サイクル数で９５°Ｃで１５秒間、５５°Ｃで３０秒間、６８°Ｃで４分間行った。最終インキュベーションは６８°Ｃで７分間行われた。５μｌのＰＣＲ混合物は６倍のゲルローディングバッファー２μｌと混ぜ、増幅産物の溶解のために臭化エチジウム０．５μｇ／μｌを含む０．８％のアガロースゲルに注ぎ込んだ。増幅産物の大きさは、同じゲルでロードされた標準ＤＮＡのラダー（梯子）から推定された。その予測される大きさは、〜５００ｂｐまでである。
【００８５】
標的アデノウィルスにより表されるｓｉＲＮＡの構成物は、配列分析のためにｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６−Ｕ６プラスミド（核外遺伝子）のＳｐａＩサイトに隣接するベクター配列に相補性のあるプライマを用いたＰＣＲによって増幅される。ＰＣＲフラグメントの配列は決定され、予測された配列と比較される。
【００８６】
＜複数のＭＯＩの再スクリーニング＞
繁殖させた目標Ａｄ‐ｓｉＲＮＡをＡＰ活性を持つ数種のＭＯＩで再スクリーニング化した（実施例１参照）。Ａｄ‐ｓｉＲＮＡは、性質制御工程を通過した少なくとも１つのＭＯＩの二重鎖に点数を数えなくてはならなかった。
【００８７】
表４に示されている全てのヒットはこの性質制御を次のように達成した。
ａ）ＰＣＲフラグメントの正確な長さを示す。
ｂ）ＰＣＲフラグメントの正確な配列を示す。
ｃ）少なくとも１つのＭＯＩでＡＰ活性を誘発させる。
【００８８】
［実施例５］同定標的のｍＲＮＡ確認実験
標的Ａｄ−ｓｉＲＮＡの初期確認は、感染したＭＰＣから分離されたＲＮＡについて行なわれた。最初に、標的の発現を初期型ヒトＭＰＣとヒト骨芽細胞（ｈＯＢｓ）のいくつかの異性体から分析した。次に、Ａｄ−ｓｉＲＮＡによる標的遺伝子発現のノックダウンを、ｍＲＮＡレベルにおいて証明した。三番目に、胎盤或いは腸の内在性骨型アルカリホスファターゼ（ＡＰ）ｍＲＮＡウィルスの調節向上を分析した。
【００８９】
＜同定された標的プロファイルのためのＭＰＣと骨芽細胞の発現分析＞
標的遺伝子の発現レベルを、４種の異なるＭＰＣ異性体と２種の異なるｈＯＢ異性体で決定した。ＭＰＣとｈＯＢ（ベルギー、ヴェルヴィエールズ、キャンブレックス／ビオウィッタッカー（Ｃａｍｂｒｅｘ／Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｃｋｅｒ）社より入手）はＴ１８０培養フラスコに１ｃｍ２当たり３０００個と５０００個の細胞になるよう別々に植え付け、８０％の細胞の密集度になるまで培養した。培養した細胞を氷冷したＰＢＳで洗浄し、１０５０μｌのＳＶ  ＲＮＡ緩衝溶液をＴ１８０培養フラスコに入れて採取した。総ＲＮＡをＴｏｔａｌ  ＲＮＡ多検体精製システム（プロメガ社製、カタログ番号Ｚ３１００）を用いて調製した。総ＲＮＡの濃度はＲｉｂｏＧｒｅｅｎ  ＲＮＡ定量キット（オランダ、ライデン、モルキュラープローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）社のカタログ番号Ｒ−１１４９０）で測定する。ｃＤＮＡ合成は、１反応当たり４０ｎｇの総ＲＮＡを用いＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、Ｎｏ  ＡｍｐＥｒａｓｅ  ＵＮＧ、Ｋｉｔ（英国、ワーリントン、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社、部品番号４３２４０１８）を用いて行った。各ＲＴ反応のためマイナスＲＴ反応（ネガティブコントロール：この反応に酵素はない）で行った。
【００９０】
リアルタイム逆転写酵素（ｒｔＲＴ）‐ＰＣＲ反応を、ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス（英国ワーリントンのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、部品番号４３０９１５５）中で、ｃＤＮＡ及び陰性逆転写酵素の両方に関連する遺伝子特殊プライマを用いて行った。発現レベルの普遍化では、ＲＴ‐ＰＣＲ反応をヒトβ‐アクチンキット（英国ワーリントンのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、部品番号４３１０８８１Ｅ）を用いたヒトβ‐アクチンについて行った。その後のプログラムではリアルタイムＰＣＲ装置（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００配列検出システム）で、２５℃で１０分、４８℃で３０分、９５℃で５分の条件で行った。図７Ａと図８において、１０個の遺伝子の発現レベルがＭＰＣとｈＯＢの分離の異性体のそれぞれについて示されている。図７Ａのデータでは、合計されたＲＮＡを４種のＭＰＣ異性体から抽出し、目標Ａｄ−ｓｉＲＮＡを経て同定された目標遺伝子の発現レベルを分析するのに用いた。ｒｔＲＴ‐ＰＣＲ共用プライマセットを１０個の遺伝子に伝達し、β‐アクチン反応の発現レベルと比較した。データはＹ軸について−ｌｏｇ（β‐アクチンの微分値）として示されている。図８に示したデータは２種の別個のｈＯＢ異性化体から抽出した。
【００９１】
＜Ａｄ‐ｓｉＲＮＡによる標的遺伝子発現のノックダウンの解析はｍＲＮＡレベルで確認された。＞
標的Ａｄ−ｓｉＲＮＡが対応する遺伝子からノックダウン発現する結果を決定するために、合計ＲＮＡをＡｄ−ｓｉＲＮＡに感染したＭＰＣから採取し、遺伝子の発現を遺伝子特異的プライマを用いて解析した。
【００９２】
２４ウェルプレートに１プレート当たり２５０００個のＭＰＣを植え付けた。２４時間後、骨遺伝子に関係しないＰＰＡＲγ（４つの公知スプライス変異体全て）とｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（発光酵素）それぞれの発現をノックダウンするノックダウンヒットウィルス或いはネガティブコントロールウィルスであるＡｄ−ｇＰＰＡＲｇやＡｄ−ＧＬ２．２を細胞に感染させた。Ａｄ−ｓｉＲＮＡについては、細胞はＡｄ−ｈＣＡＲとＡｄ−ｓｉＲＮＡの粗ライセート（ＭＯＩ  Ａｄ−ｈＣＡＲ：７５０；４０，１０，３．３μＬウィルスで平均滴定濃度１ｍｌに２．５×１０９個のウィルス小片を含んでいる）で、相互感染された。５ｄｐｉで培地を清浄化し、１４ｄｐｉで細胞溶菌液を調製した。先述のｍＲＮＡ分析で細胞を処理した。特定遺伝子のｍＲＮＡレベルをβ−アクチンレベルで標準化し、ネガティブコントロールＡｄ−ｓｉＲＮＡの測定レベルと比較した。これらの分析例を図７Ｂに示した。データはβ−アクチン発現レベルで標準化し、ネガティブコントロールウィルスを感染したＭＰＣの内在性遺伝子発現レベルと比較した（Ｙ軸：コード遺伝子の遺伝子発現率、１００％＝ネガティブコントロールサンプルに存在する内在性ｍＲＮＡレベル）。
【００９３】
＜胎盤又は腸のアルカリホスファターゼ（ＡＰ）ｍＲＮＡに内在する骨型アルカリホスファターゼ（ＡＰ）ｍＲＮＡウィルスの加減の分析＞
ＢＡＰ（骨型アルカリホスファターゼ）は骨形成に含まれる生理学上重要なＡＰである。測定されたＡＰ活性がＢＡＰ発現の加減か他のＡＰ遺伝子産物の加減によるものかを決定するために、全てのＡＰ遺伝子のｍＲＮＡレベルを感染したＭＰＣについて分析した。ｍＲＮＡレベルは先に説明したように決定される。違いは使用されるプライマセットにある（表２参照）。即ち、１つのセットはＢＡＰ  ＡＬＰＬ（ヒトアルカリ性ホスファターゼ（肝臓、骨、腎臓由来））のｍＲＮＡ発現を検出している。もう１つのセットは他の３つのＡＰ遺伝子、即ちＡＬＰＩ（腸由来のヒトアルカリ性ホスファターゼ），ＡＬＰＰ（胎盤由来のヒトアルカリ性ホスファターゼ（ＰＬＡＰ））、ＡＬＰＰＬ２（擬似胎盤型ヒトアルカリ性ホスファターゼ）である。ＡＬＰＩ、ＡＬＰＰ及びＡＬＰＰＬ２はヌクレオチドレベルに近接しており、従って１つのプライマ対を用いて増幅できる。
【００９４】
始めに、Ａｄ−ｅＧＦＰ及びＡｄ−ＢＭＰ２を感染させたＭＰＣから分離されたＲＮＡについてプライマ対を確認した。図９は、Ａｄ−ＢＭＰ２によるＢＡＰ型ｍＲＮＡの強い発現上昇と、他のＡＰ遺伝子発現の欠如を示している。ＭＰＣを２４ウェルプレートフォーマットで、Ａｄ−ｅＧＦＰ（ネガティブコントロール）又は骨ジェニックＡｄ−ＢＭＰ２を用い感染させた。細胞を採取し、他の３つのＡＰ遺伝子（ＰＬＡＰ／ＩＡＰ）からＢＡＰ  ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡを増幅するｒｔＲＴ−ＰＣＲ（リアルタイム逆転写酵素）を用いたプライマセットで反応させた。Ａｄ−ＢＭＰ２はＢＡＰ  ｍＲＮＡレベルを強く上昇させたが、他の３つのＡＰ遺伝子のｍＲＮＡレベルを上昇させることはなかった。
【００９５】
両プライマセットとも、ＭＰＣに感染したＡｄ‐ｓｉＲＮＡから分離したＲＮＡ中のＡＰ遺伝子全てのｍＲＮＡの測定レベルで使用した。
【００９６】
［実施例６］石灰化
骨形成の工程は、幾つかの連続した事象から成り立っている。骨形成の開始局面では、骨アルカリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）が上昇する。然しながら、石灰化のような骨形成の後のステージで起こる特定の事象を見ていくことも同じように重要である。
【００９７】
＜試験片の準備＞
骨形成の工程は、数種の連続した事象から成り立つ。骨形成の開始局面では、骨アルカリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）は発現上昇する。その後、骨分化の間に、石灰化した骨を形成するために、細胞は主成分がコラーゲンＩの細胞外マトリクス上に（ハイドロキシ）アパタイト（リン酸カルシウムの沈殿物）を沈殿させる。石灰化の骨細胞試験片（ＢＭ試験片）において、初期型ヒトＭＳＣ（間葉系幹細胞）は生体外で骨形成因子としてのＢＭＰ２（組換え型又はアデノウィルスの形質導入により抽出されたもの）を用いて無機質骨芽細胞に分化される。石灰化は、ＭＳＣがカルシウムに対し高い親和性を示す染料であるアリザリンレッドに着色されることで視覚化される（図１０参照）。
＜スクリーニング及びヒットコーリング＞
以下の最適化プロトコルは最初の試験片を同定したＡｄ−ｓｉＲＮＡ及びＡｄ−ｃＤＮＡターゲットのスクリーニングに使用される。
【００９８】
１０％のＦＣＳを含んだ２ｍｌのＭＳＣ培地中で６ウェルプレートの各プレートに１００，０００個のＭＰＣを植え付ける。翌日、３７°Ｃ、１０％の二酸化炭素の加湿培養器でインキュベートした後、細胞は最終ＭＯＩが１２５０，２５００，５０００でＡｄＣ１５−ｈＣＡＲ（最終ＭＯＩが７５０）とＡｄ−ｓｉＲＮＡ，Ａｄ−ｃＤＮＡ或いは制御ウィルスと相互感染させる。細胞は更に６日間、３７°Ｃ、１０％の二酸化炭素の加湿培養器でインキュベートされる。ウィルスは取り除かれ、１０％のＦＣＳを含む２ｍｌの新しいＭＳＣ培地に取り替えられる。次の２２日間、培地を２週間に３回の割合で新しくし、それ以外の時は培地を半分又は全部新しくする。実験を始めて２８日後、調節された培地を取り除き、細胞を１０％のパラホルムアルデヒドで固定し、ＭｉｌｌｉＱ（逆浸透水。ｐＨ＝４．２）での１ｍｌの１％までのアリザリンレッド水溶液（シグマ社、カタログ番号Ａ５５３３）で単分子層を着色する。感染率を査定するＡｄ−ｅＧＦＰ、強い造骨誘導因子であるＡｄ−ＢＭＰ２、弱い造骨因子であるＡｄ−Ｈ４−２を、それぞれネガティブ及びポジティブコントロールとして各実験に加える。いずれの実験でもＡｄ−Ｈ４−２が無機質化を誘発することは全くなかった。
【００９９】
石灰化を誘導するＡｄ−ｓｈＲＮＡは表６に示した。
【０１００】
［実施例７］同定した標的に対する薬の発見
本発明のポリペプチドに化合物を結合させるため化合物はスクリーニングされる。ポリプチドに対する化合物の親和性は、置き換え実験で確認される。このような置き換え実験は当業者に良く知られており、ポリペプチドの同定法において一般的な技術と考えることができる。
【０１０１】
要約すると、本発明のポリペプチドはポリペプチドと結合すると知られているラベルされた配位子（放射線標識、蛍光又は他の検出可能な標識）とインキュベートされ、更にラベルされていない化合物とインキュベートされる。
【０１０２】
ポリペプチドから標識配位子への置き換えは、ポリペプチドと関連している標識された配位子の量を測定することによって確認される。ペプチドに関連する標識された配位子の量は標識されていない化合物への親和性の指標となる。
【０１０３】
ポリペプチドに関連している標識配位子の量は、ＩＣ５０値を算出する未標識化合物の濃度に対してプロットされる。この値は目標、つまり本発明のポリペプチドに対する未標識化合物の結合親和性を表す。
【０１０４】
化合物のＩＣ５０値が、ナノモル又はピコモル濃度のとき、強結合と考えられる。少なくとも１０μモル或いは更に良くナノモル又はピコモル濃度の範囲のＩＣ５０値を持つ化合物を、ＢＡＰ試験片及び／又は骨芽細胞マーカや骨芽細胞機能の誘導に対する効果を決定するアッセイのいずれかに適応される。より低いＩＣ５０値の化合物は、一般的に重要性が低い。本発明のポリペプチドは、試験片をするのが細胞か細胞小片か又は生化学的に純粋なタンパク質かにより多くの方法に依存される。このような準備は、異なる試験片として当業者に公知である。
【０１０５】
［実施例８］破骨細胞試験片：同定されたターゲットの反吸収活性の検査
一生の間、骨格は常に再構築している状態に保たれている。骨の病巣部分は破骨細胞により再吸収され、骨芽細胞により新たに形成された骨マトリクスにより置き換えられている。骨粗鬆症の発生は、破骨細胞と骨芽細胞の働きのバランスが崩れることにより、破骨細胞が仲介する骨の再吸収の増加が導かれ、深刻な骨の喪失がおこることにより特徴づけられる。
【０１０６】
破骨細胞は単核細胞又はマクロファージ系列の細胞から生じる。生体内では、破骨細胞前駆体の破骨細胞への分化は、ストラーマ細胞（ＭＰＣｓ）によって発現する２つの中心的因子によって制御されている。即ち、ＮＦκＢ配位子（ＲＡＮＫＬ）の活性化レセプタと骨プロテゲリン（ＯＰＧ）である。ＲＡＮＫＬは、破骨細胞の分化を促すＭＰＣの表面に発現する膜の配位子である。ＯＰＧは、活性ＲＡＮＫＬを捕捉することによって破骨細胞の分化を阻害するＲＡＮＫＬの可溶性おとり型レセプタである。ＭＰＣによるＲＡＮＫＬとＯＰＧの発現のバランスが破骨細胞の分化レベルを決定する。
【０１０７】
ＭＰＣが破骨細胞の分化を制御するように、破骨細胞の分化又は活性における同定された標的Ａｄ−ｓｉＲＮＡの効果を知ることは重要である。２つのメカニズムによって骨の沈着を増加させると予測されるので、破骨細胞の分化と活性を減少させる標的Ａｄ−ｓｉＲＮＡは非常に価値がある。即ち、骨芽細胞の分化及び活性を増加と、破骨細胞の活性を低下である。そのことは、論文（スィルナヴカラス（Ｔｈｉｒｕｎａｖｕｋｋａｒａｓｕ）ら、２０００年「バイオロジカル  ケミストリ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」誌２７５巻２５１６３‐２５１７２ページ；山田ら、２００３年「血液学」１０１巻２２２７〜２２３４ページ）に掲載されているように、分裂因子の効果は予測可能である。
＜破骨細胞分化試験片＞
破骨細胞発生における骨形成因子の効果は２種類の試験片によって評価する。
【０１０８】
第１の試験片のセットアップでは、ＭＰＣと原始ヒト単核細胞を共培養する。破骨細胞発生を手助けするノックダウンウィルスを感染されたＭＰＣ単層の効果を評価する。望ましい効果は、次のようなものである。即ち、ＭＰＣにおけるＡｄ−ｓｉＲＮＡターゲット遺伝子発現のノックダウンが、例えば１０ｎＭの１．２５（ＯＨ）２ｖｉｔＤ３と５０ｎＭのＭ−ＣＳＦの混合物といった生理学的引き金によって引き起こされた破骨細胞の分化を阻害することである。使用されるモノサイトは、骨髄又は末梢血液由来とすることができる。本実施例では、末梢血液由来の単核細胞（ＰＢＭＣ）を基とした分化実験につき説明する。ＭＰＣ（ベルギー、ヴェルヴィエール（Ｖｅｒｖｉｅｒｓ）のキャンブレックス／ビオウィッタッカー（Ｃａｍｂｒｅｘ／Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｃｋｅｒ）社から入手）を、１０％のＦＢＳを加えたα−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ−ＬＩＦＥ  テクノロジー社）中の９６ウェルプレート（１ウェル当たり１０００個の細胞）に植え付ける。１日後これらを標的Ａｄ−ｓｉＲＮＡに感染させる。少なくとも３日後、１プレート当たり１００，０００個のＰＢＭＣをＭ‐ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社、最終濃度５０ｎｇ／ｍｌ）と共に加える。培地の半分の量を、１週間に２回、培地＋５０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦと１０ｎＭの１．２５（ＯＨ）２ｖｉｔＤ３でリフレッシュする。共培養にＰＢＭＣを加えてから１４日後に読み取りを行った。引き金となる生理学的関連混合物による自然発生的破骨細胞の分化は、複数の読み取りにより判断される。１ウェル当たりのＴＲＡＰ陽性多核細胞の微視的評価は破骨細胞分化レベルの一般的に認められている測定である。「ＴＲＡＰ陽性」とは、細胞が酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性を持っていることを意味している。これを評価するために、共培養は酸ホスファターゼ検出キット（シグマ社製、３８６−Ａ）により行われるｉｎ  ｓｉｔｕ（生体内の本来の場所）でＴＲＡＰ着色される。陽性細胞は処理されることにより紫色になる。もう一つの読み取り方法として、例えばＴＲＡＣＰ５ｂ（酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５ｂタイプ）、カルシトニンレセプタ（ＣＴＲ）又はキャセプシンＫ（ＣＴＳＫ）といった成熟した破骨細胞に特定のマーカを測定する。共培養の上澄み液の破骨細胞由来の酒石酸耐性酸性ホスファターゼタンパク質（ＴＲＡＣＰ５ｂ）量の測定は、市場で手に入るＥＬＩＳＡ（フィンランド、トゥルクのスバ  サイエンセズ（Ｓｂａ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ）社のＢｏｎｅＴＲＡＰアッセイ）で行う。ＣＴＲ又はＣＴＳＫは、以下の一般的なプロトコルを適用した上で免疫細胞化学によって検出する。培地を取り除き、共培養を固定し（４％のパラホルムアルデヒドと０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、４°Ｃで３０分間）、洗浄後、少なくとも４時間インキュベートするためにブロッキング緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を加える。ブロッキング緩衝液を取り除き、キャセプチンＫ（例えばオンコ遺伝子、ＩＭ５５Ｌ）又はカルシトニンレセプタ（例えばセロテックＡＨＰ６３５）に対する第一次抗体を、適した緩衝液（例えば０．０５Ｍトリス塩酸塩水溶液、ｐＨ７．４、１％のＢＳＡ）に希望する濃度で溶かしウェルに加える。４°Ｃで一晩インキュベートする。混合物を取り除き、細胞を洗浄（ＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ２０）し、第一抗体と同じ緩衝溶液で薄めた適切なＨＲＰ共役第二抗体を加える。少なくとも４時間インキュベートした後、洗浄（ＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ２０）し、ルミノール（蛍光信号を発生するＨＲＲ用基質：ＢＭ化学発光ＥＬＩＳＡ基質［ＰＯＤ］（ルミノール）、ローチェ  ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）社、カタログ番号１５８２９５０）を加える。５分間インキュベートした後、ルミノメーター（ラブシステム（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ）社のＬｕｍｉｎｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ）で読み取りを行った。説明した２つのアッセイ（多核細胞量の評価及び破骨細胞特定マーカ検出のための免疫化学）からは、破骨細胞への単核細胞の分化を評価することは出来るが、形成された破骨細胞の骨吸収活性に関する情報を得ることは出来ない。
【０１０９】
破骨細胞の活性をピット形成試験片で測定する。この目的のため、細胞の共培養と感染を、骨様基質が共培養が行われるウェルの底部にあるという点の違いはあるが上述の試験片で述べられているように行う。この骨擬似基質は象牙質の薄片（例えばシアトルのカミヤバイオケミカル（Ｋａｍｉｙａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）社のカタログ番号ＫＴ０１８）、或いは市場で入手できる同等の物（炭酸カルシウム被膜、ＯＡＡＳ（商標）、ゲンタウアー（Ｇｅｎｔａｕｒ）社；Ｂｉｏｃｏａｔ（商標）、Ｏｓｔｅｏｌｏｇｉｃ（商標）、ＢＤバイオサイエンス社）で良い。共培養は、その骨様基質で少なくとも１４日間行う。次に細胞を次亜塩素酸ナトリウムで処理し、破骨細胞により吸収された領域は微視的に評価される。これは、象牙質の薄片表面をトルイジンブルーで処理すると判明する。
【０１１０】
第２の試験片のセットアップでは、破骨細胞への分化の能力につきヒットしたウィルスを伴う破骨細胞前駆細胞（ＰＢＭＣ又はＢＭＭＣ）の感染効果を単一培地で測定する。この目的のため、モノサイト（ＰＢＭＣ又はＢＭＭＣ）を、１０％の血清と２５ｎｇ／ｍｌの再生Ｍ−ＣＳＦ（アール  アンド  ディー  システムズ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）社）を加えたα−ＭＥＭ培地の３８４ウェルプレートに植え付ける。１日後、細胞を標的Ａｄ−ｓｉＲＮＡで感染させる。感染４日後、再生ＲＡＮＫＬをウェル（２５ｎｇ／ｍｌ、アール  アンド  ディー  システムズ社）に加える。培地を１週間に２回洗浄する。ＲＡＮＫＬを加えて１４日後、破骨細胞への単核細胞の分化を第１の試験片のセットアップで述べられた読み取り方法のうちの１つを用いて測定する。この試験片は、Ｍ−ＣＳＦ又はＲＡＮＫＬへ破骨細胞前駆細胞が反応するのに必要な因子を同定することが可能である。
＜ＰＢＭＣ単離＞
以下のプロトコルに充てられるインフォームド・コンセント手続後の患者から得た末梢血液からＰＢＭＣを取り出す。血液を無菌状態で５０ｍｌのファルコンチューブに注ぎ、２５°Ｃで１０分間、３０００ｇで回転させる。その緩衝被覆を集め、緩衝被覆と同量のＰＢＳで薄める。その希釈緩衝被覆を５０ｍｌのファルコンチューブに入れられた２０ｍｌのリンパ液（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ−シグマ社）の上に注ぐ。遠心分離（２５°Ｃ、４００ｇで３５分間）し、リンホプレップの上の単核細胞の白い層を集めＰＢＳで２回洗浄（２５°Ｃ、２００ｇで１０分間の遠心分離）し、７ｍｌのＰＢＳで再び薄める。この溶液を１５ｍｌのファルコンチューブに含まれた高浸透圧パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）勾配７ｍｌの層の上にピペットし、２５°Ｃ、４００ｇで３５分間遠心分離する。高浸透圧パーコール勾配は、以下のように用意する。即ち、１．５Ｍの塩化ナトリウム溶液を１として、９倍のパーコール（ファーマシア製、ｄ＝１，１３０ｇ／ｍｌ）を混合する。この混合物をＰＢＳ／クエン酸緩衝液（リン酸二水素ナトリウム１．４９ｍＭ，リン酸水素二ナトリウム９．１５ｍＭ，塩化ナトリウム１３９．９７ｍＭ，クエン酸ナトリウム１３ｍＭ，ｐＨ７．２）に１：１になるように加える。遠心分離後、単核細胞は勾配のトップで不連続な円を形成する。このように細胞は試験片で用いられるよう用意される。
【０１１１】
［実施例９］‘オフターゲット’のノックダウン効果の分析
ｓｉＲＮＡは、近年の発見や機構の理解を介して遺伝子発現のノックダウンに影響を与えている。ｍＲＮＡへのｓｉＲＮＡの配列の特定アニーリング（加熱して二本鎖から一本鎖へ分離させたＤＮＡを冷やして相補鎖を対合させる処理）が特異遺伝子‘オンターゲット’ノックダウンの原因であることは、一般的に受け入れられている。しかし、ｓｉＲＮＡと別のｍＲＮＡの間の制限された不適当な組み合わせが、遺伝子発現の‘オフターゲット’ダウンレギュレーション（受容体の減少）を誘発してしまうということを排除することはまだ出来ない。
【０１１２】
‘オフターゲット’ｍＲＮＡのノックダウンが観察された造骨作用の原因であったということを排除するために、厳格な尺度を用いて石灰化（実施例６）を誘発する３８個のターゲットのために付加的なｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡを設計した。付加的なｓｈＲＮＡをＢＡＰ試験片で検査した。
【０１１３】
‘オフターゲット’効果の問題を解決するために、付加的なｓｉＲＮＡ配列を元のｓｉＲＮＡによってターゲットとされたｍＲＮＡと完全に適合するように設計した。好ましいｓｉＲＮＡ配列は、別のｍＲＮＡと適合しない。しかしながら、いくつかの事例では、ｓｉＲＮＡのみ別のｍＲＮＡといくらかオーバーラップするように設計することは可能であった。出来るだけ少ない‘オフターゲット’ｍＲＮＡ（１９ｍｅｒの全てのポジションにつきチェックされた２塩基対の非同一の最大限度）と適合するｓｉＲＮＡのためには、以下の規則が適用される。即ち、推定上の‘オフターゲット’ｍＲＮＡは元のｓｉＲＮＡのために同定された推定上の‘オフターゲット’ｍＲＮＡとは異なるに違いない。又、推定上の‘オフターゲット’ｍＲＮＡは全ての元の標的ｓｉＲＮＡのために同定された推定上の‘オフターゲット’ｍＲＮＡとは異なるに違いない。これらの実験の過程におけるこの規則の例外が適用されるのは、ＰＰＩＡのために設計されたｓｉＲＮＡについてだけである。
【０１１４】
３８の選択された標的遺伝子のそれぞれについて、再構成するアデノウィルスを運ぶために７種の付加的なｓｉＲＮＡを設計して調整した。全てのｓｉＲＮＡは同一性の証明やオリゴヌクレオチドの合成によるエラーを排除するためにクローニング配列した。
【０１１５】
２６１種のＡｄ−ｓｈＲＮＡが定量的に発生し、原型３８種のＡｄ−ｓｈＲＮＡと同時に２つの独立した実験で３つのＭＯＩのＢＡＰ試験片で試験した。
【０１１６】
設計ｓｈＲＮＡ（Ａｄ−ｓｈＲＮＡ）をコードする組み換えアデノウィルスを９６ウェルプレートで生成し、滴定濃度に等分し、−８０°Ｃで保管した。これらのプレートを、次のように初期型ＢＡＰ試験片で処理した。
【０１１７】
ＭＰＣ細胞を、マルチドロップ３８４（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社のディスペンサー）で黒色で底が透明の３８４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ或いはＮｕｎｃ）に、１０％の牛の胎児血清（オランダ、プロゲンティックス（Ｐｒｏｇｅｎｔｉｘ）社）を含んだＭＳＣ培地６０μｌに、１ウェル当たり５００個の細胞濃度で植え付けた。１日後、そのうちの等分されたＡｄ−ｓｈＲＮＡを含んだ９６ウェルプレートとネガティブ及びポジティブコントロールウィルスを含んだ別の９６ウェルプレートを凍結融解（ノックダウン制御プレート）し、９６チャンネルディスペンサー（スイス、Ｔｅｃａｎ  ＡＧ社、ＴｅＭ０９６とＲｏＭａプレートハンドラを備えたＴｅｃａｎ  Ｆｒｅｅｄｏｍ  ２００）を用いてウィルスを等分したものをＭＰＣプレートに移した。制御プレートとして、１μｌのウィルスストック（１ｍｌ当たりの平均滴定濃度を２×１０９ウィルスを平均力価とする）を３８４スクリーニングプレートに移した。制御プレート上で（図３参照）、ネガティブ制御ウィルス（Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３）とポジティブ制御ウィルス（Ｐ１，Ｐ２）を斜めに分配した。ここで、Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３は、其々ｅＧＦＰを標的としたＡｄ−ｓｉＲＮＡ、マンノース−６−リン酸レセプタ、ルシフェラーゼｍＲＮＡである。また、Ｐ１，Ｐ２は其々ＰＲＫＣＮ（Ｈ２４−０１０）を標的としたＡｄ−ｓｉＲＮＡ、ＭＰＰ６（Ｈ２４−０１１）ｍＲＮＡである。Ｐ３はＡｄ−ｅＧＦＰで、ｅＧＦＰの過剰発現は感染率をモニタリングさせる。
【０１１８】
Ａｄ−ｓｈＲＮＡを１２０００、４０００、１３３３の３種のＭＯＩにスクリーニングした。Ａｄ−ｓｈＲＮＡを９６ウェルプレートのインナーウェルに１．５×１０９／４μｌの力価で等分し、その１／３，１／９の希釈液をこのプレートに分割した（図１１）。その３つのプレートは、ＭＳＣが植え付けられた３×３８４ウェルプレートにｒｏｂｏｔｉｃを用いて４分割のＡ１とＢ２の位置に感染させるために用いられた。コントロールプレートからのウィルスはＡ２とＢ１の位置に滴下した。
【０１１９】
次に、ヒトコクサッキーとアデノウィルスレセプタ（ｈＣＡＲ）を発現するアデノウィルス５μｌを、９６チャンネルディスペンサーの助けを借りて９６ウェルＶ型プレートからこれらのプレート（最終ＭＯＩは１５５）に移した。
【０１２０】
そのプレートを、１０％二酸化炭素を充填した３７℃の恒温槽で４日間静置した。感染４日後、アデノウィルスを含んだ培地は１０％の無菌のＦＣＳを含む新鮮なＭＳＣ培地６０μｌに移した。それから９日後、培地を取り除き、４−メチルウンベリフェリルリン酸（シグマ社、カタログ番号．Ｍ３１６８）１５μＬをおのおののウェルに加え、３７°Ｃで１５分間インキュベートしてからＡＰ活性によって放出された４−メチルウンベリフェロンの蛍光を蛍光光度計（ＢＭＧ社、ＦｌｕｏＳｔａｒ、励起波長３６０ｎｍ、発光波長４４０ｎｍ）を用いて測定した。
【０１２１】
全てのＡｄ−ｓｈＲＮＡウィルスを、２つの独立したスクリーンに３つのＭＯＩに重複させてスクリーニングした。しきい値は１回のスクリーニングラウンド（‘ｇｌｏｂａｌ’全体的な分析）に存在する全てのネガティブコントロール、或いはスクリーニングプレート（‘ｌｏｃａｌ’局所的な分析）に存在するネガティブコントロールのいずれかを用いてヒットコーリング（ｈｉｔ  ｃａｌｌｉｎｇ）について計算した。しきい値はネガティブコントロールの平均値プラス標準偏差の３倍よりも高いＢＡＰシグナルに設定した。このバッチにおける各ウィルスの２つの別々のデータポイントは別々に分析された。１つのＡｄ−ｓｈＲＮＡが、少なくとも２つのスクリーンのうちの１つで、少なくとも２つのうちの１つのＭＯＩでしきい値以上の値を取るならばヒットとして選択した（表３参照）。
【０１２２】
データの‘ｇｌｏｂａｌ’分析により３２の遺伝子座を標的とした６１のｓｉＲＮＡが同定され、‘ｌｏｃａｌ’分析により３５の遺伝子座を標的とした８４のｓｉＲＮＡが同定された。選択した３８の遺伝子の同一性は、ＢＡＰ試験片で評価されたｓｉＲＮＡの最終番号と共に表１に示されている。表１ではその数は、元の３８のｓｉＲＮＡを含みＢＡＰ試験片で評価された全てのｓｉＲＮＡを示している。‘ｇｌｏｂａｌ’又‘ｌｏｃａｌ’分析それぞれに基づき、２．６１と３．２１構造物の平均値が３８の実証された標的の其々につき最終的に同定された。
【０１２３】
ＢＡＰ試験片で評価された元の３８のＡｄ−ｓｉＲＮＡの全ては、‘ｇｌｏｂａｌ’及び‘ｌｏｃａｌ’分析両方に基づいた。
【０１２４】
結果として、選択された３８種のターゲットを標的とした追加のＡｄ−ｓｈＲＮＡが設計、構成された。コントロールプレート上に存在するネガティブコントロールはヒットコーリング（ｈｉｔ  ｃａｌｌｉｎｇ）の切捨てを決定するために１プレート毎（‘ｌｏｃａｌ’分析）とプレートのバッチ毎（‘ｇｌｏｂａｌ’分析）に用いられた。
【０１２５】
ＢＡＰ試験片でポジティブと評価された６１のウィルスの結果を出した‘ｇｌｏｂａｌ’分析は、３８種の認証ターゲットのうち、３２種を確認した。ＢＡＰ試験片でポジティブと評価された８４のウィルスの結果を出した‘ｌｏｃａｌ’分析は、３８種の認証ターゲットのうち、３５種を確認した。‘ｇｌｏｂａｌ’又は‘ｌｏｃａｌ’分析のどちらかを用いた時、元の３８のＡｄ−ｓｈＲＮＡウィルスの全てがＢＡＰアッセイで評価された。ターゲットＬＯＣ１６０６６２、ＰＰＩＡ、ＳＬＣ３９Ａ４は、‘ｌｏｃａｌ’分析のみで同定された。
【０１２６】
【表１】
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表１の左側一列目に表された遺伝子のために遺伝子の特異的プライマは開発された。２列目で示されているのはそのプライマの方向でセンス（Ｆｏｒと示す）かアンチセンス（Ｒｅｖと示す）かを示している。３列目はプライマの配列である。
【０１２７】
【表２】
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【０１２８】
【表３】
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【０１２９】
【表４】
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【０１３０】
【表５】
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【０１３１】
【表６】
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0005667333.tif 000021
【０１３２】
【図面の簡単な説明】
【図１】
膜内部と軟骨内部の骨化を示す図である。
【図２】
骨芽細胞の分化試験の原理を示す図である。
【図３】
９６ウェルノックダウン制御プレートのレイアウト図である。
【図４】
３８４ウェル制御プレートのレイアウト図である。
【図５】
ＡＰ試験片におけるノックダウン制御プレートを用いた工程の実施結果を示す図である。
【図６】
１つのＳｉｌｅｎｃｅＳｅｌｅｃｔスクリーニングプレートのための生データのドット表示図である。
【図７】
ＭＰＣにおける標的の発現のプロファイル（Ａ）とＡｄ−ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現のノックダウン（Ｂ）を示す図である。
【図８】
初期型ヒト骨芽細胞における標的の発現のプロファイルを示す図である。
【図９】
ＢＡＰ−ｍＲＮＡウィルスとＰＬＡＰ又はＩＡＰ−ｍＲＮＡの発現上昇の解析図である。
【図１０】
石灰化試験の結果を示す図である。
【図１１】
３種のＭＯＩにおけるＡｄ−ｓｈＲＮＡをスクリーニングするための滴下の概要を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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