(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性マーカーを発現し且つ胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の集団を誘導する方法であって、
ａ．胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーＨＮＦ−３β、ＧＡＴＡ−４、Ｍｉｘｌ１、ＣＸＣＲ４及びＳＯＸ−１７を発現する細胞の集団を得る工程と、
ｂ．アクチビンＡ及びｗｎｔ−３ａと、ＩＧＦ−１か或いはインスリン、トランスフェリン及びセレニウムとで、補充された培地中の、タンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で、低酸素条件下にて前記細胞の集団を培養する工程と、を含み、前記培養された細胞が胚体内胚葉系統のマーカー及び多能性マーカーを発現する、
上記方法。
【請求項２】
前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する前記細胞の集団が、タンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で低酸素条件下にて前記細胞を培養する前に、正常酸素圧条件下で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する前記細胞の集団が、タンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で低酸素条件下にて前記細胞を培養する前に、低酸素条件下で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記低酸素条件が、１％〜２０％のＯ2濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記低酸素条件が、２％〜１０％のＯ2濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記低酸素条件が、３％のＯ2濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、２％〜５％の濃度の血清を含有する培地中で、タンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で低酸素条件下にて培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、２％の濃度の血清を含有する培地中で、タンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で低酸素条件下にて培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の集団が、２５ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＧＦ−１を含有する培地中で、タンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で低酸素条件下にて培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の集団が、５０ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＧＦ−１を含有する培地中で、タンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で低酸素条件下にて培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記多能性マーカーを発現する細胞が、ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＦｏｘＤ３、コネキシン４３、コネキシン４５、Ｏｃｔ４、ＳＯＸ−２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ−１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ１−６０、及びＴｒａ１−８１からなる群から選択される多能性マーカーの少なくとも１つを発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が、５０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度のアクチビン−Ａを含有する培地中で、タンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で低酸素条件下にて培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が、１００ｎｇ／ｍＬの濃度のアクチビン−Ａを含有する培地中で、タンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で低酸素条件下にて培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が、１０ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬの濃度のｗｎｔ−３ａを含有する培地中で、タンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で低酸素条件下にて培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が、２００ｎｇ／ｍＬの濃度のｗｎｔ−３ａを含有する培地中で、タンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で低酸素条件下にて培養される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織培養ポリスチレン上の培養物中で容易に増殖（expand）することができ、フィーダー細胞株を必要としない多能性幹細胞を目的とする。本発明はまた、ヒト胚幹細胞から多能性幹細胞株を誘導する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
１型糖尿病の細胞置換療法における進歩、及び移植可能なランゲルハンス島の不足のため、生着に適したインスリン産生細胞すなわちβ細胞の供給源の開発に注目が集まっている。１つの手法として、例えば、胚性幹細胞のような多能性幹細胞から機能性のβ細胞を生成することがある。
【０００３】
脊椎動物の胚発生において、多能性細胞は、原腸形成として公知のプロセスにて、３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）を含む細胞群を生じる。例えば、甲状腺、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓等の組織は、内胚葉から中間段階を経て発達する。このプロセスにおける中間段階は、胚体内胚葉の形成である。胚体内胚葉細胞は、ＨＮＦ−３β、ＧＡＴＡ４、Ｍｉｘｌ１、ＣＸＣＲ４及びＳＯＸ−１７などの多くのマーカーを発現する。
【０００４】
膵臓の形成は、胚体内胚葉の膵臓内胚葉への分化により起こる。膵臓内胚葉の細胞は膵臓−十二指腸ホメオボックス遺伝子、ＰＤＸ−１を発現する。ＰＤＸ−１が存在しない場合、膵臓は、腹側芽及び背側芽の形成を越えて発達しない。したがって、ＰＤＸ−１の発現は、膵臓器官形成において重要な工程をマークしている。成熟した膵臓は、他の細胞型の中でも、外分泌組織及び内分泌組織を含む。外分泌組織及び内分泌組織は、膵臓内胚葉の分化によって生じる。
【０００５】
島細胞の特徴を保持する細胞がマウスの胚細胞から誘導されたことが報告されている。例えば、Ｌｕｍｅｌｓｋｙら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：１３８９，２００１）は、マウスの胚幹細胞の、膵島と同様のインスリン分泌構造への分化を報告している。Ｓｏｒｉａら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４９：１５７，２０００）は、ストレプトゾトシン糖尿病のマウスにおいて、マウスの胚幹細胞から誘導されたインスリン分泌細胞が糖血症を正規化することを報告している。
【０００６】
一例において、Ｈｏｒｉら（ＰＮＡＳ  ９９：１６１０５，２００２）は、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＬＹ２９４００２）の阻害剤でマウス胚性幹細胞を処理することにより、β細胞に類似した細胞が生じたことを開示している。
【０００７】
他の例では、Ｂｌｙｓｚｃｚｕｋら（ＰＮＡＳ１００：９９８，２００３）が、Ｐａｘ４を構成的に発現するマウス胚幹細胞からのインスリン産生細胞の生成を報告している。
【０００８】
Ｍｉｃａｌｌｅｆらは、レチノイン酸が、胚幹細胞のＰＤＸ−１陽性膵臓内胚葉の形成に対する関与を制御することができることを報告している。レチノイン酸は、胚の原腸形成の最後に相当する期間中、胚幹細胞分化の４日目に培養物に添加したとき、ＰＤＸ−１発現の誘導において最も効果的である（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５４：３０１，２００５）。
【０００９】
Ｍｉｙａｚａｋｉらは、ＰＤＸ−１を過剰発現するマウス胚幹細胞株を報告している。Ｍｉｙａｚａｋｉらの結果は、外因性のＰＤＸ−１発現が、得られた分化細胞においてインスリン、ソマトスタチン、グルコキナーゼ、ニューロゲニン３、Ｐ４８、Ｐａｘ６、及びＨＮＦ６遺伝子の発現を明らかに増加させることを示している（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３：１０３０，２００４）。
【００１０】
Ｓｋｏｕｄｙらは、マウス胚幹細胞内で、アクチビンＡ（ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバー）が、膵臓外分泌遺伝子（ｐ４８及びアミラーゼ）、並びに内分泌遺伝子（ＰＤＸ−１、インスリン、及びグルカゴン）の発現を増大させることを報告している。最大の効果は、１ｎＭアクチビン−Ａを使用して観察された。Ｓｋｏｕｄｙらはまた、インスリン及びＰＤＸ−１  ｍＲＮＡの発現レベルはレチノイン酸により影響されなかったが、３ｎＭのＦＧＦ−７による処理によりＰＤＸ−１の転写産物のレベルが増加したことも観察している（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７９：７４９，２００４）。
【００１１】
Ｓｈｉｒａｋｉらは、胚幹細胞のＰＤＸ−１陽性細胞への分化を特異的に高める増殖因子の効果を研究した。Ｓｈｉｒａｋｉらは、ＴＧＦβ２によってＰＤＸ−１陽性細胞が高い比率で再現可能に得られたことを観察している（Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ．２００５  Ｊｕｎ；１０（６）：５０３〜１６）。
【００１２】
Ｇｏｒｄｏｎらは、血清の不在下、及びアクチビンとＷｎｔシグナル伝達阻害剤の存在下での、マウス胚幹細胞からの短尾奇形＋／ＨＮＦ−３β＋内胚葉細胞の誘発を示した（米国特許出願公開第２００６／０００３４４６Ａ１号）。
【００１３】
Ｇｏｒｄｏｎら（ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ１０３，ｐａｇｅ  １６８０６，２００６）は、「Ｗｎｔ及びＴＧＦ−β／ｎｏｄａｌ／アクチビンシグナル伝達は、前側の原始線条の生成のために同時に必要である」と述べている。
【００１４】
しかしながら、胚幹細胞発達のマウスモデルは、例えば、ヒト等のより高等な哺乳動物内の発達プログラムを正確に模倣していない恐れがある。
【００１５】
Ｔｈｏｍｓｏｎらは、ヒト胚盤胞から胚幹細胞を単離した（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４，１９９８）。同時に、Ｇｅａｒｈａｒｔ及び共同研究者は、胎児生殖腺組織から、ヒト胚生殖（ｈＥＧ）細胞株を誘導した（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３７２６，１９９８）。白血病阻害因子（ＬＩＦ）と共に培養するだけで分化を阻止し得るマウス胚幹細胞とは異なり、ヒト胚幹細胞は、非常に特殊な条件下で維持する必要がある（米国特許第６，２００，８０６号、国際公開第９９／２０７４１号、国際公開第０１／５１６１６号）。
【００１６】
Ｄ’Ａｍｏｕｒらは、高濃度のアクチビン及び低血清の存在下でのヒト胚幹細胞誘導による胚体内胚葉に富んだ培養液の生成について記載している（Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ＫＡ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。これらの細胞を、マウスの腎臓皮膜下で移植することにより、いくつかの内胚葉性器官の特徴を有する、より成熟した細胞への分化が見られた。ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞はＦＧＦ−１０の添加後、更にＰＤＸ−１陽性細胞に分化させることができる（米国特許出願公開第２００５／０２６６５５Ａ１号）。
【００１７】
Ｄ’Ａｍｏｕｒら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−２４，１３９２〜１４０１（２００６））は、「私達は、ヒト胚幹（ｈＥＳ）細胞を、膵臓ホルモンインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド及びグレリンを合成できる内分泌細胞に変換する分化プロセスを開発した。このプロセスは、胚体内胚葉、腸管内胚葉、膵臓内胚葉及び内分泌前駆体が、内分泌ホルモンを発現する細胞へと向かう段階に類似した段階を通して細胞を指向させることにより、インビボでの膵臓器官形成を模倣する。」と述べている。
【００１８】
別の例において、Ｆｉｓｋらは、ヒト胚幹細胞から膵島細胞を産生するシステムを報告している（米国特許出願公開第２００６／００４０３８７Ａ１号）。この場合、分化経路は３つの段階に分割された。ヒト胚幹細胞は、最初に、ｎ−ブチレートとアクチビン−Ａとの組み合わせを使用して、内胚葉に分化した。次に細胞をノギンなどのＴＧＦβアンタゴニストとＥＧＦ又はベータセルリンとの組み合わせと培養してＰＤＸ−１陽性細胞を作製した。最終分化は、ニコチンアミドにより誘発された。
【００１９】
１つの例において、Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｒｙらは、「我々は、ＰＤＸ−１の過剰発現が膵臓に多く見られる遺伝子の発現を高めたという結論を下す。インスリン発現の誘導には、インビボでのみ存在する更なるシグナルを必要とする可能性がある。」と述べている（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００６；２４：１９２３〜１９３０）。
【００２０】
ヒト胚幹細胞を培養する現在の方法は、細胞外マトリクスタンパク質若しくは線維芽細胞フィーダー層のいずれかの使用、又は例えばｂＦＧＦ等の外因性成長因子の添加を必要としている。
【００２１】
１つの例では、Ｃｈｅｏｎら（ＢｉｏＲｅｐｒｏｄ  ＤＯＩ：１０．１０９５／ｂｉｏｌｒｅｐｒｏｄ．１０５．０４６８７０，Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９，２００５）は、胚幹細胞の自己再生を誘発することができる様々な成長因子を添加した非馴化（unconditioned）血清代替（ＳＲ）培地中で胚幹細胞が維持される無フィーダー、無血清培養系を開示している。
【００２２】
別の例において、Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎら（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２４：５６８〜５７４，２００６）は、線維芽細胞又は馴化培地の非存在下で、ｂＦＧＦを添加した培地を使用して、胚幹細胞を長期間培養する方法を開示している。
【００２３】
別の例において、米国特許出願公開第２００５０１４８０７０号は、血清及び繊維芽細胞フィーダー細胞方法を含まない合成培地中でのヒト胚幹細胞の培養方法を開示し、同方法は、アルブミン、アミノ酸、ビタミン、無機物、少なくとも１つのトランスフェリン又はトランスフェリン代替物、少なくとも１つのインスリン又はインスリン代替物を含有する培地中で細胞を培養し、この培地は、本質的に哺乳動物胎児血清を含有せず、線維芽細胞増殖因子シグナル伝達受容体を活性化できる少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞増殖因子を含有し、ここで増殖因子は、線維芽細胞フィーダー層のみでなく他の源からも供給され、培地はフィーダー細胞又は馴化培地なしで、未分化状態の幹細胞の増殖を支持した。
【００２４】
別の例において、米国特許出願公開第２００５０２３３４４６号は、未分化の霊長類始原幹細胞を含む幹細胞の培養に有用な合成培地を開示している。溶液において、培地は、培養されている幹細胞と比較して実質的に等張である。所定の培養おいて、特定の培地は、基本培地と、実質的に未分化の始原幹細胞の増殖の支持に必要な、ある量のｂＦＧＦ、インスリン、及びアスコルビン酸の各々とを含有する。
【００２５】
別の例として、米国特許第６８００４８０号は、「１つの実施形態において、実質的に未分化状態の霊長類由来の始原幹細胞を増殖させるための細胞培地であって、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持するうえで効果的な低浸透圧、低エンドトキシンの基礎培地を含む細胞培地を提供する。この基本培地は、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持するうえで効果的な栄養素血清、並びに、フィーダー細胞、及びフィーダー細胞から誘導される細胞外基質成分からなる群から選択される基質と組み合わされる。培地は更に、非必須アミノ酸、抗酸化剤、並びにヌクレオシド及びピルビン酸塩からなる群から選択される第１の増殖因子を含む。」と述べている。
【００２６】
別の例では、米国特許出願公開第２００５０２４４９６２号は、「１つの態様において本発明は、霊長類の胚性幹細胞を培養する方法を提供する。哺乳動物の胎児血清を基本的に含まない（好ましくはあらゆる動物の血清をも基本的に含まない）培養中で、単に繊維芽フィーダー細胞層以外の供給源から供給される線維芽細胞増殖因子の存在下で幹細胞を培養する。好ましい１つの形態では、充分な量の繊維芽増殖因子を添加することによって、幹細胞の培養を維持するために従来必要とされていた繊維芽フィーダー細胞層の必要性がなくなる。」と述べている。
【００２７】
更なる例では、国際公開第２００５０６５３５４号は、ａ．基礎培地と；ｂ．実質的に未分化である哺乳類幹細胞の成長を支持するのに十分な量のｂＦＧＦと；ｃ．実質的に未分化である哺乳類幹細胞の成長を支持するのに十分な量のインスリンと；ｄ．実質的に未分化である哺乳類幹細胞の成長を支持するのに十分な量のアスコルビン酸と；を含む、本質的に無フィーダーかつ無血清である限定等張培地を開示している。
【００２８】
別の例として、国際公開第２００５０８６８４５号は、未分化の幹細胞を維持するための方法であって、幹細胞を未分化状態に維持するのに充分な量のトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）のタンパク質ファミリーのメンバー、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）のタンパク質ファミリーのメンバー、又はニコチンアミド（ＮＩＣ）に、所望の結果を得るのに充分な時間だけ、幹細胞を曝露することを含む方法を開示している。
【００２９】
更に、ヒト胚幹細胞からの膵臓内分泌細胞、膵臓ホルモン発現細胞、又は膵臓ホルモン分泌細胞の形成は、ヒト胚幹細胞の遺伝子操作を必要とする場合がある。例えばリポフェクタミン又は電気穿孔法等の従来の技術を用いるヒト胚幹細胞のトランスフェクションは非効率である。
【００３０】
国際公開第２００７０２７１５７号は、（ａ）胚幹細胞（ＥＳ）細胞を提供する工程と；（ｂ）胚幹細胞から前駆細胞株を確立する工程であって、前駆細胞株がその自己再生能に基づいて選択される工程と、を含む方法を開示している。好ましくは、方法は自己再生できないことに基づいて体細胞を淘汰する。好ましくは前駆細胞株は、共培養物の非存在下で、好ましくはフィーダー細胞の非存在下で誘導又は確立され、これらは好ましくは胚幹細胞を淘汰する。所望により、方法は（ｄ）前駆細胞株から分化細胞を誘導する工程を含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
したがって、膵臓内分泌細胞、膵臓ホルモン発現細胞、又は膵臓ホルモン分泌細胞に分化する可能性を維持する一方で、現在の臨床上の必要性に対処するよう拡張できる、多能性幹細胞株を確立するための条件を開発する有意な必要性が今尚存在する。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
本発明は、培養物中低血清下で容易に増殖することができ、フィーダー細胞株又は複合マトリクスタンパク質のコーティングの必要なく、単一細胞懸濁液中で継代することができ、非常に高効率でトランスフェクションすることができ、かつ低酸素条件下で培養される、ヒト胚幹細胞の特徴を有する細胞集団を提供する。この独特な特性の組み合わせにより、本発明に記載される細胞は先行技術と区別される。
【００３３】
１つの実施形態では、本発明は、多能性マーカーを発現する細胞を含む細胞集団を誘導する方法であって、
ａ．細胞を得る工程と、
ｂ．細胞を培養する前にタンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で、低酸素条件下にて細胞を培養する工程と、を含む方法を提供する。
【００３４】
細胞は、ヒト胚幹細胞であってもよく、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞であってもよい。ヒト胚幹細胞は、タンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で細胞を培養する前に、正常酸素圧条件下で培養してもよい。あるいは、ヒト胚幹細胞は低酸素条件下で培養してもよい。
【００３５】
ヒト胚幹細胞は、タンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で細胞を培養する前に、正常酸素圧条件下で培養し、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤で処理してもよい。あるいは、ヒト胚幹細胞を低酸素条件下で培養し、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤で処理してもよい。
【００３６】
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、タンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で細胞を培養する前に、正常酸素圧条件下で培養してもよい。あるいは、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を低酸素条件下で培養してもよい。
【００３７】
１つの実施形態では、本発明は、多能性マーカーを発現する細胞を含む細胞集団を誘導する方法であって、
ａ．ヒト胚幹細胞を培養する工程と、
ｂ．ヒト胚幹細胞を、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
ｃ．細胞を除去し、次いで細胞を、培養する前にタンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で、低酸素条件下にて細胞を培養する工程と、を含む方法を提供する。
【００３８】
細胞は、血清、アクチビン−Ａ、及びＷｎｔリガンドを含有している培地中で、タンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で、低酸素条件下にて培養してもよい。あるいは、細胞は、血清、アクチビン−Ａ、Ｗｎｔリガンド、及びＩＧＦ−１を含有している培地中で、タンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で、低酸素条件下にて培養してもよい。
【００３９】
細胞は、血清、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、アクチビン−Ａ、及びＷｎｔリガンドを含有している培地中で、タンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で、低酸素条件下にて培養してもよい。あるいは、細胞は、血清、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、アクチビン−Ａ、Ｗｎｔリガンド、及びＩＧＦ−１を含有している培地中で、タンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で、低酸素条件下にて培養してもよい。
【００４０】
１つの実施形態では、本発明は、多能性マーカーを発現する細胞を含む細胞集団を誘導する方法であって、
ａ．ヒト胚幹細胞を培養する工程と、
ｂ．細胞を除去し、次いで細胞を、タンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で、低酸素条件下にて細胞を培養する工程と、を含む方法を提供する。
【００４１】
細胞は、血清、アクチビン−Ａ、及びＷｎｔリガンドを含有している培地中で、タンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で、低酸素条件下にて培養してもよい。あるいは、細胞は、血清、アクチビン−Ａ、Ｗｎｔリガンド、及びＩＧＦ−１を含有している培地中で、タンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で、低酸素条件下にて培養してもよい。
【００４２】
細胞は、血清、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、アクチビン−Ａ、及びＷｎｔリガンドを含有している培地中で、タンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で、低酸素条件下にて培養してもよい。あるいは、細胞は、血清、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、アクチビン−Ａ、Ｗｎｔリガンド、及びＩＧＦ−１を含有している培地中で、タンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で、低酸素条件下にて培養してもよい。
【００４３】
本発明の方法により誘導される多能性マーカーを発現する細胞は、タンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で、低酸素条件下にて、培養物中で増殖することができる。
【００４４】
１つの実施形態では、本発明は、タンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で、低酸素条件下にて、細胞を培養する工程を含む、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を増殖させる方法を提供する。１つの実施形態では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、本発明の方法により形成される多能性細胞に由来する。
【００４５】
細胞は、血清、アクチビン−Ａ、Ｗｎｔリガンド、及びＧＳＫ−３Ｂ阻害剤を含有している培地中で、タンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で、低酸素条件下にて培養してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】４日間低血清＋アクチビン−Ａ＋ＷＮＴ−３Ａで処理した後、胚体内胚葉に分化している５４継代のヒト胚幹細胞株Ｈ９由来の細胞における、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４、Ｙ軸）及びＣＤ９（Ｘ軸）の発現を示す。
【図２】実施例５に概要を述べる胚体内胚葉分化プロトコルの４日目及び６日目における、５４継代のヒト胚幹細胞株Ｈ９由来の細胞のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。パネルａ）は、ＡＦＰ、Ｂｒｙ、ＣＸＣＲ４、ＧＳＣ、及びＳＯＸ−７の発現を示す。パネルｂ）は、ＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ−４、及びＨＮＦ−３βの発現を示す。
【図３】本発明の方法に係る胚幹細胞からＥＸＰＲＥＳ細胞を誘導するために用いられる単離プロトコルを示す。
【図４】２％  ＦＢＳ＋ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋１００ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ−Ａ（パネルａ）又は２％  ＦＢＳ＋ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋１００ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ−Ａ＋２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（パネルｂ）中で培養された、１１日目のＰ０の増殖したＥＸＰＲＥＳ細胞の形態を示す。パネルｃは、３継代のＥＸＰＲＥＳ細胞の形態を示す。
【図５】３継代の間２〜５％  ＦＢＳ＋ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋１００ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ−Ａ＋２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ中で培養された、増殖したＥＸＰＲＥＳ細胞のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。パネルａ）は、ＡＦＰ、Ｂｒｙ、ＣＸＣＲ４、ＧＳＣ、及びＳＯＸ−７の発現を示す。パネルｂ）は、ＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ−４、及びＨＮＦ−３βの発現を示す。
【図６】ＥＸＰＲＥＳ細胞の遺伝子発現に対するＷｎｔ−３Ａの添加の効果を示す。パネルａ）は、ＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ−４、及びＨＮＦ−３βのリアルタイムＰＣＲ発現を示す。パネルｂ）は、ＡＦＰ、Ｂｒｙ、ＣＸＣＲ４、ＧＳＣ、及びＳＯＸ−７のリアルタイムＰＣＲ発現を示す。
【図７】ＥＸＰＲＥＳ細胞の遺伝子発現に対するＩＧＦ−１、Ｗｎｔ−３Ａ及びアクチビン−Ａの効果を示す。パネルａ）は、ＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ−４、ＨＮＦ−３β、Ｂｒｙ、ＣＸＣＲ４、及びＧＳＣのリアルタイムＰＣＲ発現を示す。パネルｂ）は、ＳＯＸ−７及びＡＦＰのリアルタイムＰＣＲ発現を示す。パネルｃ）は、ＯＣＴ−４のリアルタイムＰＣＲ発現を示す。
【図８】ａ）２％  ＦＢＳ＋ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋１００ｎｇ／ｍＬのＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ、ｂ）２％  ＦＢＳ＋ＤＭＥＭＦ１２＋１００ｎｇ／ｍＬのＡＡ、ｃ）２％  ＦＢＳ＋ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋５０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−Ｉ中で培養された、５４継代のヒト胚幹細胞株Ｈ９から誘導された増殖したＥＸＰＲＥＳ細胞の形態を示す。
【図９】低酸素条件下にて組織培養ポリスチレン上で培養されたＥＸＰＲＥＳ  ０１及び０２細胞の増殖能を示す。ＥＸＰＲＥＳ  ０１は、２％  ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２＋１００ｎｇ／ｍＬのＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ＋５０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−Ｉ中で培養し、ＥＸＰＲＥＳ  ０２細胞は２％  ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２＋１００ｎｇ／ｍＬのＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ中で培養された。
【図１０】ＤＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ３Ａ＋５０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−Ｉ中のＴＣＰＳ（組織培養ポリスチレン）上で未分化ＥＳ細胞の単一細胞懸濁液から誘導されたＥＸＰＲＥＳ細胞の形態を示す。
【図１１】２４継代細胞のＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞において、ＦＡＣＳにより測定したタンパク質の発現を示す。パネルａ）はＥ−カドヘリンの発現量を示し、パネルｂ）はＣＸＣＲ４の発現量を示し、パネルｃ）はＣＤ９の発現量を示し、パネルｄ）はＣＤ１１７の発現量を示し、パネルｅ）はＣＤ３０の発現量を示し、パネルｆ）はＬＩＦ受容体の発現量を示し、パネルｇ）はＴＲＡ１−６０の発現量を示し、パネルｈ）はＴＲＡ１−８１の発現量を示し、パネルｉ）はＳＳＥＡ−１の発現量を示し、パネルｊ）はＳＳＥＡ−３の発現量を示し、パネルｋ）はＳＳＥＡ−４の発現量を示し、パネルｌ）はＣＤ５６の発現量を示す。
【図１２】２１継代細胞のＥＸＰＲＥＳ  ０２において、ＦＡＣＳにより測定したタンパク質の発現を示す。パネルａ）はＥ−カドヘリンの発現量を示し、パネルｂ）はＣＸＣＲ４の発現量を示し、パネルｃ）はＣＤ９の発現量を示し、パネルｄ）はＣＤ１１７の発現量を示し、パネルｅ）はＣＤ３０の発現量を示し、パネルｆ）はＬＩＦ受容体の発現量を示し、パネルｇ）はＴＲＡ１−６０の発現量を示し、パネルｈ）はＴＲＡ１−８１の発現量を示し、パネルｉ）はＳＳＥＡ−１の発現量を示し、パネルｊ）はＳＳＥＡ−３の発現量を示し、パネルｋ）はＳＳＥＡ−４の発現量を示し、パネルｌ）はＣＤ５６の発現量を示す。
【図１３】２％  ＦＢＳ＋ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋１００ｎｇ／ｍＬのＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ＋５０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−Ｉ中で培養された１０継代のＥＸＰＲＥＳ  ０１の免疫蛍光画像を示す。パネルａ）パネルｂのＤＡＰＩ画像、パネルｂ）Ｎａｎｏｇ、パネルｃ）ＤＡＰＩ（青）及びＯｃｔ−４（緑）共染色、パネルｄ）パネルｅのＤＡＰＩ画像、パネルｅ）ＳＯＸ−２、並びにパネルｆ）ＤＡＰＩ（青）及びＨＮＦ−３β（緑）共染色。
【図１４】２％  ＦＢＳ＋ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋１００ｎｇ／ｍＬのＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ中で培養された９継代のＥＸＰＲＥＳ  ０２の免疫蛍光画像を示す。パネルａ）パネルｂのＤＡＰＩ画像、パネルｂ）ＨＮｆ３Ｂ、パネルｃ）パネルｄのＤＡＰＩ画像、パネルｄ）ＯＣＴ−４、パネルｅ）パネルｆのＤＡＰＩ画像、パネルｆ）ＳＯＸ−２、パネルｇ）パネルｈのＤＡＰＩ画像、パネルｈ）ＮＡＮＯＧ。
【図１５】ＥＸＰＲＥＳ０１細胞、ＥＸＰＲＥＳ  ０２細胞、Ｈ９細胞から誘導されたＥＢ、ＭＥＦ−ＣＭ中のＭＡＴＲＩＧＥＬ上で培養されたＳＡ００２、及びＭＥＦＣＭ中のＭＡＴＲＩＧＥＬ上で培養された未分化Ｈ９細胞について、リアルタイムＰＣＲにより測定した遺伝子発現を示す。発現量は全て未分化Ｈ９細胞で正規化する。パネルａ）はＳＯＸ−１発現を示し、パネルｂ）はＦＯＸＤ３、ＭＹＯＤ１、ＰＯＵ５Ｆ１、及びＺＦＰ４２発現を示し、パネルｃ）はＡＢＣＧ２、コネキシン４３、コネキシン４５、及びサイトケラチン１５発現を示し、パネルｄ）は、ネスチン、ＳＯＸ−２、ＵＴＦ１、及びビメンチンを示し、パネルｅ）はＧＡＴＡ−２、短尾奇形、ＴＥＲＴ、及びチューブリンベータＩＩＩ発現を示し、パネルｆ）はＣＦＣ１及びＧＡＴＡ−４発現を示し、パネルｇ）はＡＦＰ及びＦＯＸＡ２発現を示し、パネルｈ）はＩＰＦ１Ａ及びＭＳＸ１発現を示す。
【図１６】ａ）成長培地中の組織培養ポリスチレン上で培養され、次いでＤＭＥＭ−Ｆ１２＋０．５％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビン−Ａ及び２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ３Ａに替えて２日間、続いて更に２日間ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビン−Ａ中で培養された５継代細胞ＥＸＰＲＥＳ０１細胞、ｂ）成長培地中の組織培養ポリスチレン上で培養され、次いでＤＭＥＭ−Ｆ１２＋０．５％ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビン−Ａ及び２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ３Ａに替えて２日間、続いて更に２日間ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビン−Ａ中で培養された４継代細胞ＥＸＰＲＥＳ０２細胞中の、ＣＸＣＲ４（Ｙ軸）及びＣＤ９（ｘ軸）のＦＡＣＳにより測定された発現を示す。
【図１７】低血清＋ＡＡ＋ＷＮＴ３ａで処理されたａ）ＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞及びｂ）ＥＸＰＲＥＳ  ０２細胞における、リアルタイムＰＣＲにより測定された遺伝子発現を示す。
【図１８】２％  ＦＢＳ＋ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋１００ｎｇ／ｍＬのＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ＋５０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−Ｉ中で培養し、次いでＤＭＥＭ−Ｆ１２＋０．５％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビン−Ａ及び２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ３Ａに替えて２日間、続いて更に２日間ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビン−Ａ中で培養された５継代ＥＸＰＲＥＳ０１細胞の免疫蛍光画像を示す。パネルａ）パネルｂのＤＡＰＩ画像、パネルｂ）ＧＡＴＡ−４、パネルｃ）パネルｄのＤＡＰＩ画像、パネルｄ）ＳＯＸ−１７、パネルｅ）パネルｆのＤＡＰＩ画像、パネルｆ）ＨＮＦ−３β、パネルｇ）パネルｈのＤＡＰＩ画像、及びパネルｈ）ＯＣＴ−４。
【図１９】２％  ＦＢＳ＋ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋１００ｎｇ／ｍＬのＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ中で培養し、次いでＤＭＥＭ−Ｆ１２＋０．５％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビン−Ａ及び２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ３Ａに替えて２日間、続いて更に２日間ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビン−Ａ中で培養された４継代ＥＸＰＲＥＳ  ０２細胞の免疫蛍光画像を示す。パネルａ）パネルｂのＤＡＰＩ画像、パネルｂ）ＧＡＴＡ−４、パネルｃ）パネルｄのＤＡＰＩ画像、パネルｄ）ＳＯＸ−１７、パネルｅ）パネルｆのＤＡＰＩ画像、パネルｆ）ＨＮＦ−３β、パネルｇ）パネルｈのＤＡＰＩ画像、及びパネルｈ）ＯＣＴ−４。
【図２０】成長培地中の組織培養ポリスチレン上で培養され、次いでＤＭＥＭ−Ｆ１２＋０．５％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビン−Ａ＋１００ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ３Ａに替えて４日間培養された、ａ）１９継代細胞のＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞及びｂ）１４継代細胞のＥＸＰＲＥＳ  ０２細胞について、ＣＸＣＲ４（Ｙ軸）及びＣＤ９（ｘ軸）のＦＡＣＳにより測定したタンパク質発現を示す。
【図２１】２％  ＦＢＳ＋ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋１００ｎｇ／ｍＬのＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ＋５０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−Ｉ中で培養された１９継代のＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞、及び２％  ＦＢＳ＋ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋１００ｎｇ／ｍＬのＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ中で培養され、次いでＤＭＥＭ−Ｆ１２＋０．５％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビン−Ａ＋１００ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ３Ａに替えて５日間培養された１４継代のＥＸＰＲＥＳ  ０２細胞の免疫蛍光画像を示す。パネルａ）パネルｂのＤＡＰＩ画像、パネルｂ）ＨＮＦ−３β、パネルｃ）パネルｄのＤＡＰＩ画像、パネルｄ）ＧＡＴＡ−４、パネルｅ）パネルｆのＤＡＰＩ画像、パネルｆ）ＳＯＸ−１７、パネルｇ）パネルｈのＤＡＰＩ画像、パネルｈ）ＨＮＦ−３β、パネルｉ）パネルｊのＤＡＰＩ画像、パネルｊ）ＧＡＴＡ−４、パネルｋ）パネルｌのＤＡＰＩ画像、パネルｌ）ＳＯＸ−１７。
【図２２】５日間低血清＋ＡＡ＋ＷＮＴ３ａ＋ＧＳＫ−３Ｂ  ＩＸ阻害剤で処理されたａ）ＥＸＰＲＥＳ  ０１及びＥＸＰＲＥＳ  ０２細胞について、リアルタイムＰＣＲデータにより測定された遺伝子発現を示す。パネルａは、ＡＦＰ、短尾奇形、ＣＤＸ２、Ｍｏｘ１、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ−７及びＺＩＣ１の発現を表し、パネルｂは、ＣＸＣＲ４、ＧＡＴＡ−４、グースコイド、ＨＮｆ３Ｂ及びＳＯＸ−１７の発現量を示す。
【図２３】成長培地中の組織培養ポリスチレン上に５０００〜４００００細胞／ｃｍ2で播種し、次いで低酸素条件下でＤＭＥＭ−Ｆ１２＋０．５％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ３Ａ＋１００ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸに替えて４日間培養したＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞について、リアルタイムＰＣＲにより測定された遺伝子発現を示す。パネルａは、ＡＦＰ、短尾奇形、ＳＯＸ−７、及びＯＴＸ２の発現量を表す。パネルｂは、ＣＸＣＲ４、ＨＮＦ−３β、ＧＡＴＡ−４、ＳＯＸ−１７、Ｃｅｒｂ、及びＧＳＣの発現量を表す。
【図２４】低テロメア対照細胞（レーン１）、２４継代のＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞（レーン２）、１７継代のＥＸＰＲＥＳ０２細胞（レーン３）、４０継代のヒト胚幹細胞株Ｈ１由来の未分化細胞（レーン４）、及び高テロメア長対照細胞（レーン５）におけるテロメア長アッセイの結果を示す。
【図２５】前腸内胚葉細胞（Ｓ３）、膵臓内胚葉細胞（Ｓ４）、及び膵臓内分泌細胞（Ｓ５）に分化した２１継代のＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞について、リアルタイムＰＣＲデータにより測定された遺伝子発現を示す。
【図２６】実施例１８にしたがって培養した３５継代のＥＸＰＲＥＳ  ０１の免疫蛍光画像を示す。パネルａ）パネルｂのＤＡＰＩ画像、パネルｂ）抗−１トリプシン、パネルｃ）緑のＨＮＦ−３β、赤のアルブミン、パネルｄ）赤のアルブミン及びＤＡＰＩ（青）、パネルｅ）パネルｆのＤＡＰＩ画像、パネルｆ）ＰＤＸ−１、パネルｇ）パネルｈのＤＡＰＩ画像、パネルｈ）ＳＯＸ−１７、パネルｉ）パネルｊのＤＡＰＩ画像、パネルｊ）ＣＤＸ−２。
【図２７】以下を比較したマイクロアレイデータの散布図を示す：パネルａ）ＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞（ｙ軸）対ヒト胚幹細胞株Ｈ９由来の未分化細胞（ｘ軸）、パネルｂ）ＥＸＰＲＥＳ  ０２細胞（ｙ軸）対ヒト胚幹細胞株Ｈ９由来の未分化細胞（ｘ軸）、パネルｃ）ＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞（ｙ軸）対ＥＸＰＲＥＳ  ０２細胞（ｘ軸）、パネルｄ）ＥＸＰＲＥＳ０１細胞（ｙ軸）対胚体内胚葉に分化しているヒト胚幹細胞株Ｈ９由来の細胞（ｘ軸）、パネルｅ）ＥＸＰＲＥＳ  ０２細胞（ｙ軸）対胚体内胚葉に分化しているヒト胚幹細胞株Ｈ９由来の細胞（ｘ軸）、パネルｆ）ヒト胚幹細胞株Ｈ９由来の未分化細胞（ｙ軸）対胚体内胚葉に分化しているヒト胚幹細胞株Ｈ９由来の細胞（ｘ軸）。
【図２８】ＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞により形成されたＥＢ体の形態を示す。
【図２９】ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの腎臓被膜下に移植した５週間後のＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞株の細胞、ＥＸＰＲＥＳ  ０２細胞株の細胞、及び４３継代のヒト胚幹細胞株Ｈ９由来の細胞についてリアルタイムＰＣＲにより測定された遺伝子発現を示す。パネルａ〜ｅは中胚葉マーカーを示す。パネルｆ＆ｇは外胚葉マーカーを示す。パネルｈ＆ｉは内胚葉マーカーを示す。パネルｊは胚体外内胚葉マーカーを示す。パネルｋ〜ｍは多能性マーカーを示す。
【図３０】ＢＲＤＵ導入により測定されたＥＸＰＲＥＳ  ０３細胞の増殖及び細胞周期状態を示す。ＥＸＰＲＥＳ  ０３細胞は、パネルａ）アクチビン−Ａ（１００ｎｇ／ｍＬ）及びｗｎｔ３ａ（２０ｎｇ／ｍＬ）、パネルｂ）アクチビン−Ａ（１００ｎｇ／ｍＬ）及びｗｎｔ３ａ（２０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＧＦ（５０ｎｈ／ｍＬ）を添加した、２％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養した。示される他の細胞としては、パネルｃ）ｈＥＳ細胞（Ｈ９ｐ４３）、パネルｄ）羊水細胞（ＡＦＤＸ００２）、及びパネルｅ）マイトマイシン処理ＭＥＦ細胞が挙げられる。パネルｆ）は、試験した異なる細胞集団の細胞周期のＳ期、Ｇ１及びＧ２／Ｍ期における細胞頻度を示す。
【図３１】単一細胞分散又は細胞塊としてプレーティングされたＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞及びヒト胚幹細胞におけるＥＧＦＰのトランスフェクション効率及び発現を示す。細胞は、蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリーにより２４時間後に分析された。パネルＡ）は、ＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞から得られるデータを示す。パネルＢ）は、ヒト胚幹細胞の単一細胞分散から得られたデータを示し、パネルＣ）はヒト胚幹細胞の細胞塊から得られたデータを示す。
【図３２】デヒドロゲナーゼ酵素活性を表す平均ＯＤ指数対ａ）大気中酸素（約２１％）下で培養されたＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞、ｂ）３％  Ｏ２下で培養されたＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞、ｃ）大気中酸素（約２１％）下で培養されたＥＸＰＲＥＳ  ０２細胞、ｄ）３％  Ｏ２条件下で培養されたＥＸＰＲＥＳ  ０２細胞について、ＭＴＳアッセイにより測定された細胞数を示す。
【図３３】ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋０．５％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ３Ａ＋１００ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ中の組織培養ポリスチレン上に１００００細胞／ｃｍ2で播種されたＥＸＰＲＥＳ  ０１  Ｐ２７細胞について、リアルタイムＰＣＲにより測定された遺伝子発現を示す。パネルａは、ＡＦＰ、短尾奇形、ＳＯＸ−７、及びＯＴＸ２の発現量を表す。パネルｂは、ＣＸＣＲ４、ＨＮＦ−３β、ＧＡＴＡ−４、ＳＯＸ−１７、Ｃｅｒ１、及びＧＳＣの発現量を表す。
【図３４】３継代中、ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋０．５％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ３Ａ＋１００ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ中の組織培養ポリスチレン上で培養されたＥＸＰＲＥＳ  ０１  Ｐ２７細胞について、ＦＡＣＳにより測定されたＣＸＣＲ４（Ｙ軸）及びＣＤ９（ｘ軸）のタンパク質発現を示す。
【図３５】ＧＳＫ−３Ｂ及びベータカテニンの発現に対するｓｉＲＮＡトランスフェクションの効果を示す。ＥＸＰＲＥＳ細胞は、蛍光顕微鏡及び定量ＲＴ−ＰＣＲ法により分析された。Ａ）ｉ）ＣＹ３標識ｓｉＲＮＡ及びｉｉ）フルオロセイン標識ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞の蛍光顕微鏡像。Ｂ）ｉ）ＧＳＫ−３Ｂ及びｉｉ）ベータカテニンｓｉＲＮＡオリゴ配列でトランスフェクトされた細胞中の残存活性（％）として表される標的遺伝子のノックダウン。
【図３６】本発明の方法により誘導された２種の細胞株の核型を示す。パネルａ：ＥＸＰＲＥＳ０１細胞株。パネルｂ：ＥＸＰＲＥＳ  ０２細胞株。
【図３７】ａ）２％  ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビン−Ａ＋２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ＋５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ又はｂ）２％  ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビン−Ａ＋２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ＋５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ＋１０μＭのＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ−２７６３２中で２４時間培養した後、０継代のＥＸＰＲＥＳ  １５細胞の形態を示す。
【図３８】１２継代中、２％  ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビン−Ａ＋２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ＋５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ＋１０μＭのＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ−２７６３２中で培養されたＥＸＰＲＥＳ  １５細胞の核型を示す。
【図３９】２４時間（パネルａ）、４８時間（パネルｂ）、及び９６時間（パネルｃ）、指定の濃度でＩＧＦ、アクチビン−Ａ、Ｗｎｔ３Ａ、及びＧＳＫ阻害剤ＩＸを添加した基本培地中で培養されたＥＸＰＲＥＳ１１細胞のＡ490により測定した増殖を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
開示を分かりやすくするため、限定を目的とすることなく、本発明の詳細な説明を、本発明の特定の特徴、実施形態、又は応用を説明又は図示した以下の小項目に分ける。
【００４８】
定義
幹細胞とは、１個の細胞レベルで自己再生し、かつ、自己再生性の前駆細胞、非自己再生性の前駆細胞、及び最終分化細胞のような後代細胞を生ずるように分化する能力によって定義される未分化細胞のことである。幹細胞はまた、インビトロで複数の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系統の機能的細胞に分化する能力によって、また移植後に複数の胚葉の組織を生じ、胚盤胞への注入後、全部ではないとしても殆どの組織を提供する能力によっても、特徴付けられる。
【００４９】
幹細胞は、それらの発達能力により：（１）全胚及び胚体外細胞型を生じる能力を意味する全能性、（２）全胚細胞型を生じる能力を意味する多能性、（３）細胞系統の小集合を生じるが、全て特定の組織、器官又は生理的システム内で生じる能力を有することを意味する多能性（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己複製）、血液細胞に限定された寡能性前駆細胞、並びに血液の通常の構成要素である全細胞型及び要素（例えば、血小板）を含む子孫を産生できる）、（４）多能性幹細胞と比較して限定された細胞系統の小集合を生じる能力を有することを意味する寡能性、並びに（５）１つの細胞系統を生じる能力を有することを意味する単能性（例えば、精子形成幹細胞）に分類される。
【００５０】
分化は、非特殊化の（「中立の」）又は比較的特殊化されていない細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞等の特殊化した細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した、又は分化を誘発された細胞は、細胞系統内でより特殊化した（「傾倒した（committed）」）状況を呈している細胞である。分化プロセスに適用した際の用語「傾倒した」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合に分化し続ける分化経路の地点に進行しており、通常の環境下で異なる細胞型に分化し、又はより分化されていない細胞型に戻ることができない細胞を指す。脱分化は、細胞が細胞系統内で比較的特殊化されて（又は傾倒して）いない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用される場合、細胞系統は、細胞の遺伝、即ちその細胞がどの細胞から来たか、またどの細胞を生じ得るかを規定する。細胞系統は、細胞を発達及び分化の遺伝的スキーム内に配置する。系統特異的なマーカーは、関心対象の細胞の表現型に特異的に関連した特徴を指し、中立細胞の関心対象系統への分化を評価する際に使用することができる。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「ＡＦＰ」又は「α−フェトプロテインタンパク質」は、肝臓発達の開始時に産生される抗原を指す。ＡＦＰは、胚体外細胞内にも発現され得る。
【００５２】
「アルブミン」は、成人の全血清タンパク質の約半分を占める可溶性の単量体タンパク質である。
【００５３】
「β−細胞系統」は、転写因子ＰＤＸ−１と、以下の転写因子：ＮＧＮ−３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌ−１、ＨＮＦ−３β、ＭＡＦＡ、Ｐａｘ４、及びＰａｘ６の少なくとも１つとに関する遺伝子発現が陽性の細胞を指す。β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、β細胞が挙げられる。
【００５４】
本明細書で使用される場合「短尾奇形」は、Ｔボックス遺伝子ファミリーのメンバーである。これは、原始線条及び中胚葉細胞に関するマーカーである。
【００５５】
本明細書で使用される場合「胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のマーカー：ＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ−４、ＨＮＦ−３β、ＧＳＣ、Ｃｅｒ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、短尾奇形、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４  ＣＤ４８、エオメソデルミン（eomesodermin）（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ−６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９又はＯＴＸ２の少なくとも１つを発現する細胞を指す。内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、原始線条前駆体細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞及び胚体内胚葉細胞を含む。
【００５６】
「ｃ−Ｋｉ」及び「ＣＤ１１７」は、両方とも、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｘ０６１８２に開示されている配列、又はその天然に存在する変異体配列（例えば、対立遺伝子変異体）を有する細胞表面受容体チロシンキナーゼを指す。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ９９」は、受入番号ＮＭ＿００２４１４を有する遺伝子によりコードされるタンパク質を指す。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現する細胞を指す：ＰＤＸ−１、ＨＮＦ−１β、ＰＴＦ−１α、ＨＮＦ−６、又はＨＢ９。膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内胚葉細胞を含む。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現する細胞を指す：ＮＧＮ−３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌｅｔ−１、ＰＤＸ−１、ＮＫＸ６．１、Ｐａｘ−４、Ｎｇｎ−３、又はＰＴＦ−１α。膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内分泌細胞、膵臓ホルモン発現細胞、及び膵臓ホルモン分泌細胞、並びにβ−細胞系統の細胞を含む。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「Ｃｅｒ１」又は「Ｃｅｒｅｂｒｕｓ」は、タンパク質のシステインノットスーパーファミリーのメンバーである。
【００６１】
本明細書で使用される場合「ＣＸＣＲ４」は、「ＬＥＳＴＥＲ」又は「フーシン」としても知られているストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）受容体を指す。原腸形成マウス胚では、ＣＸＣＲ４は、胚体内胚葉及び中胚葉で発現するが、胚体外内胚葉では発現しない。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「胚体内胚葉」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保持する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカーを発現する：ＨＮＦ−３β、ＧＡＴＡ−４、ＳＯＸ−１７、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ＯＴＸ２、グースコイド、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭｉｘｌ１。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「胚体外内胚葉」は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現する細胞の集団を指す：ＳＯＸ−７、ＡＦＰ、及びＳＰＡＲＣ。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「ＦＧＦ−２」「ＦＧＦ−４」「ＦＧＦ−８」「ＦＧＦ−１０」及び「ＦＧＦ−１７」は、繊維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバーである。
【００６５】
「ＧＡＴＡ−４」及び「ＧＡＴＡ−６」は、ＧＡＴＡ転写因子ファミリーのメンバーである。この転写因子のファミリーは、ＴＧＦ−βシグナル伝達により誘発され、早期の内胚葉マーカーの維持に寄与する。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「ＧＬＵＴ−２」は、膵臓、肝臓、腸、脳、及び腎臓を含む、胎児及び成人の多数の組織内にて発現されるブドウ糖輸送体分子を指す。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「グースコイド」又は「ＧＳＣ」は、原口背唇内に発現されたホメオドメイン転写因子を指す。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「ＨＢ９」は、ホメオボックス遺伝子９を指す。
「ＨＮＦ−１α」「ＨＮＦ−１β」「ＨＮＦ−３β」及び「ＨＮＦ−６」は、転写因子の肝臓核因子ファミリーに属し、高度に保護されたＤＮＡ結合ドメインと２つの短いカルボキシ−末端ドメインにより特徴付けられる。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「Ｉｓｌｅｔ−１」又は「Ｉｓｌ−１」は、転写因子のＬＩＭ／ホメオドメインファミリーのメンバーであり、発達中の膵臓内で発現する。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「ＭａｆＡ」は、膵臓内に発現された転写因子であり、インスリンの生合成及び分泌に関与する遺伝子の発現を制御する。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「マーカー」は、関心対象の細胞内で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。本文脈において、差異的な発現は、陽性マーカーのレベルの増大及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。検出可能なレベルのマーカー核酸又はポリペプチドは、他の細胞と比較して関心対象の細胞内で十分高いか、又は低く、そのため当技術分野で公知の多様な方法のいずれかを使用して、関心対象の細胞を他の細胞から識別及び区別することができる。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「中内胚葉細胞」は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現する細胞を指す：ＣＤ４８、エオメリデルミン（ＥＯＭＥＳ）、ＳＯＸ−１７、ＤＫＫ４、ＨＮＦ−３β、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ−６。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「Ｍｉｘｌ１」は、原始線条、中胚葉、及び内胚葉内の細胞のマーカーであるホメオボックス遺伝子を指す。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「ＮｅｕｒｏＤ」は、ニューロン新生に関わる塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂＨＬＨ）転写因子である。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「ＮＧＮ−３」は、塩基性ループヘリックス−ループ転写因子のニューロゲニンファミリーのメンバーである。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「Ｎｋｘ−２．２」及び「Ｎｋｘ−６．１」は、Ｎｋｘ転写因子ファミリーのメンバーである。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「Ｎｏｄａｌ」は、タンパク質のＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーである。
【００７８】
「Ｏｃｔ−４」は、ＰＯＵ−ドメイン転写因子のメンバーであり、多能性幹細胞の指標（hallmark）であると広く見なされている。Ｏｃｔ−４と多能性幹細胞との関係は、その発現が未分化多能性幹細胞に固く制限されていることによって示される。体細胞系統に分化した後、Ｏｃｔ−４の発現は急速に消失する。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「膵臓内分泌細胞」又は「膵臓ホルモン発現細胞」は、以下のホルモンの少なくとも１つを発現することができる細胞を指す：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチド。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「膵臓ホルモン分泌細胞」は、以下のホルモンの少なくとも１つを分泌できる細胞を指す：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチド。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「Ｐａｘ−４」及び「Ｐａｘ−６」は、膵島発達に関与する、膵臓β細胞に特異的な転写因子である。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「ＰＤＸ−１」は、膵臓発達に関与するホメオドメイン転写因子を指す。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「前原始線条細胞」は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現する細胞を指す：Ｎｏｄａｌ、又はＦＧＦ８。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「原始線条細胞」は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現する細胞を指す：短尾奇形、Ｍｉｘ−様ホメオボックスタンパク質、又はＦＧＦ４。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「ＰＴＦ−１α」は、三量体の膵臓転写因子−１（ＰＴＦ１）の配列特異的なＤＮＡ結合サブユニットである、４８ｋＤの塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質を指す。
【００８６】
本明細書で使用される場合、「ＳＯＸ−１」「ＳＯＸ−２」「ＳＯＸ−７」及び「ＳＯＸ−１７」は、ＳＯＸ転写因子ファミリーのメンバーであり、胚発生に関与している。
【００８７】
本明細書で使用される場合、「ＳＰＡＲＣ」は、「酸性の、システインに富んだ分泌タンパク質」としても公知である。
【００８８】
「ＳＳＥＡ−１」（段階特異的な胚抗原−１）は、ハツカネズミ奇形癌幹細胞（ＥＣ）、ハツカネズミ及びヒト胚生殖細胞（ＥＧ）、並びにハツカネズミ胚幹細胞（ＥＳ）の表面上に存在する糖脂質表面抗原である。
【００８９】
「ＳＳＥＡ−３」（段階特異的な胚抗原−３）は、ヒト奇形癌幹細胞（ＥＣ）、ヒト胚生殖細胞（ＥＧ）、及びヒト胚幹細胞（ＥＳ）の表面上に存在する糖脂質表面抗原である。
【００９０】
「ＳＳＥＡ−４」（段階特異的な胚抗原−４）は、ヒト奇形癌幹細胞（ＥＣ）、ヒト胚生殖細胞（ＥＧ）、及びヒト胚幹細胞（ＥＳ）の表面上に存在する糖脂質表面抗原である。
【００９１】
「ＴＲＡ１−６０」は、ヒト奇形癌幹細胞（ＥＣ）、ヒト胚生殖細胞（ＥＧ）、及びヒト胚幹細胞（ＥＳ）の表面上に発現するケラチン硫酸塩関連の抗原である。
【００９２】
「ＴＲＡ１−８１」は、ヒト奇形癌幹細胞（ＥＣ）、ヒト胚生殖細胞（ＥＧ）、及びヒト胚幹細胞（ＥＳ）の表面上に発現するケラチン硫酸塩関連の抗原である。
【００９３】
「ＴＲＡ２−４９」は、ヒト奇形癌幹細胞（ＥＣ）及びヒト胚幹細胞（ＥＳ）の表面に発現されるアルカリホスファターゼアイソザイムである。
【００９４】
本明細書で使用される場合、「ＵＴＦ−１」は、多能性胚幹細胞及び胚体外細胞内に発現される転写共役因子を指す。
【００９５】
本明細書で使用される場合、「Ｚｉｃ１」は、Ｚｉｃ転写因子ファミリーのメンバーである。Ｚｉｃ１は、神経及び神経堤に特異的な遺伝子の発現を調節し、背側神経管及び遊走前（premigratory）神経堤の細胞内に発現される。
【００９６】
多能性マーカーを発現する細胞を誘導する方法
本発明は、培養物中低血清下で容易に増殖することができ、フィーダー細胞株又は複合マトリクスタンパク質のコーティングの必要なく、単一細胞懸濁液中で継代することができ、非常に高効率でトランスフェクションすることができ、かつ低酸素条件下で培養される、ヒト胚幹細胞の特徴を有する細胞集団を提供する。この独特な特性の組み合わせにより、本発明に記載される細胞は先行技術と区別される。
【００９７】
１つの実施形態では、本発明は、多能性マーカーを発現する細胞を含む細胞集団を誘導する方法であって、
ａ．細胞を得る工程と、
ｂ．細胞を培養する前にタンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で、低酸素条件下にて細胞を培養する工程と、を含む方法を提供する。
【００９８】
細胞は、ヒト胚幹細胞であってもよく、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞であってもよい。ヒト胚幹細胞は、タンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で細胞を培養する前に、正常酸素圧条件下で培養してもよい。あるいは、ヒト胚幹細胞は低酸素条件下で培養してもよい。
【００９９】
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、タンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で細胞を培養する前に、正常酸素圧条件下で培養してもよい。あるいは、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を低酸素条件下で培養してもよい。
【０１００】
１つの実施形態では、本発明は、多能性マーカーを発現する細胞を含む細胞集団を誘導する方法であって、
ａ．ヒト胚幹細胞を培養する工程と、
ｂ．ヒト胚幹細胞を、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
ｃ．細胞を除去し、次いで細胞を、培養する前にタンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で、低酸素条件下にて細胞を培養する工程と、を含む方法を提供する。
【０１０１】
１つの実施形態では、本発明は、多能性マーカーを発現する細胞を含む細胞集団を誘導する方法であって、
ａ．ヒト胚幹細胞を培養する工程と、
ｂ．細胞を除去し、次いで細胞を、タンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で、低酸素条件下にて細胞を培養する工程と、を含む方法を提供する。
【０１０２】
タンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上での、低酸素条件下における細胞培養
１つの実施形態では、細胞は、約１〜約２０日間細胞外マトリクスでコーティングされていない組織培養基質上で、低酸素条件下にて培養される。代替実施形態では、細胞は、約５〜約２０日間細胞外マトリクスでコーティングされていない組織培養基質上で、低酸素条件下にて培養される。代替実施形態では、細胞は、約１５日間細胞外マトリクスでコーティングされていない組織培養基質上で、低酸素条件下にて培養される。
【０１０３】
１つの実施形態では、低酸素条件は約１％  Ｏ2〜約２０％  Ｏ2である。代替実施形態では、低酸素条件は約２％Ｏ2〜約１０％  Ｏ2である。代替実施形態では、低酸素条件は約３％  Ｏ2である。
【０１０４】
細胞は、血清、アクチビン−Ａ、及びＷｎｔリガンドを含有している培地中で、タンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で、低酸素条件下にて培養してもよい。あるいは、培地はＩＧＦ−１を含有していてもよい。
【０１０５】
培地は、約２％〜約５％の範囲内の血清濃度を有してもよい。代替的な実施形態において、血清濃度は、約２％であってもよい。
【０１０６】
アクチビン−Ａは、約１ｐｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬの濃度で使用されてもよい。代替的な実施形態において、濃度は、約１ｐｇ／ｍＬ〜約１μｇ／ｍＬであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約１ｐｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約５０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。
【０１０７】
Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−５ａ及びＷｎｔ−７ａからなる群より選択されてもよい。１つの実施形態では、Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−１である。代替的な実施形態において、Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−３ａである。
【０１０８】
Ｗｎｔリガンドは、約１ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用されてもよい。代替実施形態では、Ｗｎｔリガンドは、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用されてもよい。１つの実施形態では、Ｗｎｔリガンドの濃度は約２０ｎｇ／ｍＬである。
【０１０９】
ＩＧＦ−１は、約１ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用されてもよい。代替実施形態では、ＩＧＦ−１は、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用されてもよい。１つの実施形態では、ＩＧＦ−１の濃度は約５０ｎｇ／ｍＬである。
【０１１０】
本発明の方法により誘導される多能性マーカーを発現する細胞は、タンパク質又は細胞外マトリクスで前処理されていない組織培養基質上で、低酸素条件下にて、培養物中で増殖することができる。
【０１１１】
本発明の方法により誘導される多能性マーカーを発現する細胞は、ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＦｏｘＤ３、コネキシン４３、コネキシン４５、Ｏｃｔ４、ＳＯＸ−２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ−１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ１−６０、及びＴｒａ１−８１からなる群から選択される多能性マーカーの少なくとも１つを発現する。
【０１１２】
１つの実施形態では、本発明の方法により誘導される多能性マーカーを発現する細胞は、前原始線条細胞に特徴的なマーカーを発現することができる。
【０１１３】
１つの実施形態では、本発明の方法により誘導される多能性マーカーを発現する細胞は、原始線条細胞に特徴的なマーカーを発現することができる。
【０１１４】
１つの実施形態では、本発明の方法により誘導される多能性マーカーを発現する細胞は、中内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現することができる。
【０１１５】
１つの実施形態では、本発明の方法により誘導される多能性マーカーを発現する細胞は、胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーを発現することができる。
【０１１６】
本発明の方法により誘導される多能性マーカーを発現する細胞の更なる分化
本発明の方法により誘導される多能性マーカーを発現する細胞は、当該技術分野における任意の方法により、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化することができる。
【０１１７】
例えば、本発明の方法により誘導される多能性マーカーを発現する細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３，１５３４〜１５４１（２００５）に開示されている方法にしたがって、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化することができる。
【０１１８】
例えば、本発明の方法により誘導される多能性マーカーを発現する細胞は、Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３１，１６５１〜１６６２（２００４）に開示されている方法にしたがって、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化することができる。
【０１１９】
例えば、本発明の方法により誘導される多能性マーカーを発現する細胞は、ＭｃＬｅａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５，２９〜３８（２００７）に開示されている方法にしたがって、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化することができる。
【０１２０】
例えば、本発明の方法により誘導される多能性マーカーを発現する細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている方法にしたがって、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化することができる。
【０１２１】
例えば、本発明の方法により誘導される多能性マーカーを発現する細胞は、血清の非存在下にてアクチビン−Ａを含有している培地中で多能性幹細胞を培養し、次いで細胞をアクチビン−Ａ及び血清とともに培養し、次いで細胞をアクチビン−Ａ及び様々な濃度の血清とともに培養することによって、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化することができる。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３，１５３４〜１５４１，２００５に開示されている。
【０１２２】
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の更なる分化
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、当該技術分野における任意の方法により、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化することができる。
【０１２３】
例えば、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている方法にしたがって、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化することができる。
【０１２４】
例えば、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、繊維芽細胞増殖因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンで処理した後、繊維芽細胞増殖因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンを含有する培地を除去し、続いて細胞をレチノイン酸、繊維芽細胞増殖因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンを含有する培地中で培養することにより、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に分化される。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている。
【０１２５】
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の更なる分化
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、当該技術分野における任意の方法により、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化することができる。
【０１２６】
例えば、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている方法にしたがって、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化することができる。
【０１２７】
制限されるものではないが、以下のセクションは、本発明の方法に係る多能性マーカー及び胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を形成するための好適な出発物質である細胞を得るための方法の例を含む。
【０１２８】
ヒト胚幹細胞の単離、増殖、及び培養
ヒト胚幹細胞の特徴付け：ヒト胚幹細胞は、発生段階特異的胚性抗原（ＳＳＥＡ）３及び４の１つ以上、並びにＴｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１と呼ばれる抗体を用いて検出可能なマーカーを発現し得る（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５，１９９８）。インビトロでのヒト胚幹細胞の分化は、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１の発現（存在する場合）を消失させ、ＳＳＥＡ−１の発現を増加させる。未分化のヒト胚幹細胞は、通常、アルカリホスファターゼ活性を有し、この活性は、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ  Ｃａｌｉｆ．）によって述べられるようにＶｅｃｔｏｒＲｅｄを基質として現像することによって検出することができる。未分化多能性幹細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲで検出されるように、一般にＯｃｔ−４及びＴＥＲＴも発現する。
【０１２９】
増殖したヒト胚幹細胞の他の望ましい表現型は、３つの全胚葉：内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の細胞に分化する能力である。ヒト胚幹細胞の多能性は、例えば細胞をＳＣＩＤマウスに注入し、４％パラホルムアルデヒドを使用して、形成された奇形腫を固定した後、それらを３つの胚葉からの細胞型の痕跡に関して組織学的に検査することにより確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を形成し、この胚様体を３つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより決定することができる。
【０１３０】
増殖させたヒト胚幹細胞株は、標準的なＧバンド法を用いて核型を決定し、対応する霊長類種の公表されている核型と比較することができる。「正常な核型」を有する細胞を得ることが望ましい。これは、細胞が、ヒトの染色体がすべて揃っており、かつ目立った変化のない正倍数体であることを意味する。
【０１３１】
ヒト胚幹細胞の源：使用できるヒト胚幹細胞の種類は、妊娠後に形成された組織由来のヒト胚幹細胞の確立された株を含み、この組織には、前胚組織（例えば胚盤胞）、胚組織、又は妊娠中の任意の時点、必ずしもそうではないが典型的には妊娠約１０〜１２週の前に採取された胎児組織が含まれる。非限定的な例は、例えばヒト胚幹細胞株Ｈ１、Ｈ７、及びＨ９（ＷｉＣｅｌｌ）等のヒト胚幹細胞又はヒト胚生殖細胞の確立株である。それらの細胞の最初の確立又は安定化中に本開示の組成物を使用することも想定され、その場合、源となる細胞は、源となる組織から直接採取した一次多能性細胞であろう。フィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。例えば、ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ）等の変異ヒト胚幹細胞株も好適である。
【０１３２】
１つの実施形態では、ヒト胚性幹細胞をＴｈｏｍｓｏｎらによって述べられるように調製する（米国特許第５，８４３，７８０号、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５，１９９８；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３  ｆｆ．，１９９８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：７８４４，１９９５）。
【０１３３】
ヒト胚幹細胞の培養：１つの実施形態では、ヒト胚幹細胞は、本質的にフィーダー細胞を含まないにもかかわらず、実質的に分化を受けることなくヒト胚幹細胞の増殖を支持する培養系で培養される。分化をともなわない無フィーダー細胞培養中でのヒト胚幹細胞の増殖は、別の細胞種と予め培養することによって馴化した培地を用いることで支持される。また、分化をともなわない無フィーダー細胞培養中でのヒト胚幹細胞の増殖は、合成培地を用いることによっても支持される。
【０１３４】
代替実施形態では、ヒト胚幹細胞は、種々の方法でヒト胚幹細胞を支持するフィーダー細胞の最初に培養された層である。次いでヒト胚を、本質的にフィーダー細胞を含まないにもかかわらず、実質的に分化を受けることなくヒト胚幹細胞の増殖を支持する培養系に移す。
【０１３５】
本発明で用いるのに好適な馴化培地の例は、米国特許出願公開第２００２００７２１１７号、米国特許第６６４２０４８号、国際公開第２００５０１４７９９号、及びＸｕら（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２２：９７２〜９８０，２００４）に開示されている。
【０１３６】
本発明で用いるのに好適な合成培地の例は、米国特許出願公開第２００７００１００１１号中にも見出すことができる。
【０１３７】
好適な培地は、以下の成分、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ  Ｎｏ．１１９６５−０９２；ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（ＫＯ  ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ  Ｎｏ．１０８２９−０１８；ハムＦ１２／５０％  ＤＭＥＭ基礎培地；２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ  Ｎｏ．１５０３９−０２７；非必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ１１１４０−０５０、β−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ  Ｎｏ．７５２２；ヒト組み換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ  Ｎｏ．１３２５６−０２９などから調製することができる。
【０１３８】
１つの実施形態では、ヒト胚幹細胞は、本発明の方法にしたがって処理する前に処理される好適な培養基質上にプレーティングされる。１つの実施形態において、処理は、例えば基底膜から誘導されたもの、又は接着分子受容体−リガンド結合の一部を形成し得るもの等の細胞外マトリクス成分である。１つの実施形態では、好適な培養基質は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）である。ＭＡＴＲＩＧＥＬは、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞からの可溶性製剤であり、室温でゲル化して再構成基底膜を形成する。
【０１３９】
他の細胞外マトリクス成分及び成分混合物は代替物として好適である。これは、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫塩、及び同様物を、単独で又は様々な組み合わせで含み得る。
【０１４０】
ヒト胚幹細胞は、好適な分布で、細胞の生存、増殖、及び所望の特徴の維持を促進する培地の存在下、基質上にプレーティングされる。この特徴の全部は、播種分布に細心の注意を払うことから利益を得、当業者は容易に決定することができる。
【０１４１】
次いでヒト胚幹細胞は処理された組織培養基質から除去され、非処理組織培養基質上にプレーティングされ、その後本発明の方法にしたがって処理されて、多能性マーカー及び胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を形成する。
【０１４２】
ヒト胚幹細胞の胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化
ヒト胚幹細胞は、当技術分野における任意の方法により、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化することができる。胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、本発明の方法に係る処理に好適である。
【０１４３】
例えば、ヒト胚幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３，１５３４〜１５４１（２００５）に開示される方法にしたがって胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化することができる。
【０１４４】
例えば、ヒト胚幹細胞は、Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３１，１６５１〜１６６２（２００４）に開示される方法にしたがって胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化することができる。
【０１４５】
例えば、ヒト胚幹細胞は、ＭｃＬｅａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５，２９〜３８（２００７）に開示されている方法にしたがって胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化することができる。
【０１４６】
細胞外マトリクス上で培養されたヒト胚幹細胞の胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化
１つの実施形態では、本発明は、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現するヒト胚幹細胞を分化させる方法であって、
ａ．細胞外マトリクスでコーティングされた組織培養基質上に、ヒト胚幹細胞をプレーティングする工程と、
ｂ．アクチビン−Ａ及びＷｎｔリガンドとともにヒト胚幹細胞を培養する工程と、を含む方法を提供する。
【０１４７】
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、次いで本発明の方法により処理されて、多能性マーカー及び胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を形成する。
【０１４８】
ヒト胚幹細胞のアクチビン−Ａ及びＷｎｔリガンドとの培養は、単一の培地中で実行されてもよい。あるいは、ヒト胚幹細胞のアクチビン−Ａ及びＷｎｔリガンドとの培養は、２つ以上の培地中で実行されてもよい。１つの実施形態において、ヒト胚幹細胞のアクチビン−Ａ及びＷｎｔリガンドとの培養は、２つの培地中で実行される。
【０１４９】
細胞外マトリクス：本発明の１つの態様において、ヒト胚幹細胞は、細胞外マトリクスでコーティングされた組織培養基質上で培養及び分化される。細胞外マトリクスは、マウス肉腫細胞から抽出された可溶化基底膜製剤（商品名ＭＡＴＲＩＧＥＬでＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから販売されている）であってもよい。あるいは、細胞外マトリクスは、増殖因子減少ＭＡＴＲＩＧＥＬであってもよい。あるいは、細胞外マトリクスは、フィブロネクチンであってもよい。代替実施形態において、ヒト胚幹細胞は、ヒト血清でコーティングされた組織培養基質上で培養及び分化されてもよい。
【０１５０】
細胞外マトリクスは、組織培養基質でコーティングされる前に希釈されてもよい。細胞外マトリクスの希釈と、組織培養基質のコーティングに関する好適な方法の例は、Ｋｌｅｉｎｍａｎ，Ｈ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：３１２（１９８６年）、及びＨａｄｌｅｙ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：１５１１（１９８５年）に見出すことができる。
【０１５１】
１つの実施形態では、細胞外マトリクスは、ＭＡＴＲＩＧＥＬである。１つの実施形態では、組織培養基質は、１：１０希釈のＭＡＴＲＩＧＥＬによりコーティングされる。代替的な実施形態において、組織培養基質は、１：１５希釈のＭＡＴＲＩＧＥＬによりコーティングされる。代替的な実施形態において、組織培養基質は、１：３０希釈のＭＡＴＲＩＧＥＬによりコーティングされる。代替的な実施形態において、組織培養基質は、１：６０希釈のＭＡＴＲＩＧＥＬによりコーティングされる。
【０１５２】
１つの実施形態では、細胞外マトリクスは、増殖因子減少ＭＡＴＲＩＧＥＬである。１つの実施形態では、組織培養基質は、１：１０希釈の増殖因子減少ＭＡＴＲＩＧＥＬによりコーティングされる。代替的な実施形態において、組織培養基質は、１：１５希釈の増殖因子減少ＭＡＴＲＩＧＥＬによりコーティングされる。代替的な実施形態において、組織培養基質は、１：３０希釈の増殖因子減少ＭＡＴＲＩＧＥＬによりコーティングされる。代替的な実施形態において、組織培養基質は、１：６０希釈の増殖因子減少ＭＡＴＲＩＧＥＬによりコーティングされる。
【０１５３】
単一培地を用いた、細胞外マトリクス上における、ヒト胚幹細胞の胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化：１つの実施形態では、本発明は、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現するヒト胚幹細胞を分化させる方法であって、
ａ．細胞外マトリクスでコーティングされた組織培養基質上に、ヒト胚幹細胞をプレーティングする工程と、
ｂ．アクチビン−Ａ及びＷｎｔリガンドとともにヒト胚幹細胞を培養する工程と、を含む方法を提供する。
【０１５４】
単一培地は、ヒト胚幹細胞を胚体内胚葉へ分化させるのに十分低い濃度の所定の因子、例えばインスリン及びＩＧＦ等を含有すべきである（国際公開第２００６０２０９１９号に開示されているように）。このことは、血清濃度を低下させる、あるいはインスリン及びＩＧＦが欠乏した合成培地を使用することにより達成され得る。合成培地の例は、Ｗｉｌｅｓら（Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９９９  Ｆｅｂ  ２５；２４７（１）：２４１〜８）に開示されている。
【０１５５】
培地は、約０％〜約１０％の範囲内の血清濃度を有してもよい。代替的な実施形態において、濃度は、約０％〜約５％の範囲内であってもよい。代替的な実施形態において、濃度は、約０％〜約２％の範囲内であってもよい。代替的な実施形態において、濃度は、約２％であってもよい。
【０１５６】
アクチビン−Ａ及びＷｎｔリガンドとの培養時間は、約１日間〜約７日間にわたっていてもよい。代替的な実施形態において、培養時間は、約１日間〜約３日間にわたっていてもよい。代替的な実施形態において、培養時間は約３日間であってもよい。
【０１５７】
アクチビン−Ａは、好適な任意の濃度で使用されて、ヒト胚幹細胞を分化させることができる。濃度は、約１ｐｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬであってもよい。代替的な実施形態において、濃度は、約１ｐｇ／ｍＬ〜約１μｇ／ｍＬであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約１ｐｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約５０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。
【０１５８】
Ｗｎｔリガンドの選択は最適化されて、分化プロセスの効率を改善することができる。Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−５ａ及びＷｎｔ−７ａからなる群より選択されてもよい。１つの実施形態では、Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−１である。代替的な実施形態において、Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−３ａである。
【０１５９】
Ｗｎｔリガンドは、濃度約１ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬであってもよい。代替的な実施形態において、濃度は、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。
【０１６０】
単一の培地は、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤も含み得る。ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤は、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ及びＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＸＩからなる群より選択されてもよい。１つの実施形態では、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤は、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸである。
【０１６１】
ヒト胚幹細胞がＧＳＫ−３Ｂ阻害剤と共に培養される際、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤の濃度は、約１ｎＭ〜約１０００ｎＭであってもよい。代替的な実施形態において、ヒト胚幹細胞は、濃度約１０ｎＭ〜約１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤と共に培養される。
【０１６２】
単一の培地はまた、ヒト胚幹細胞からの胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成を向上させ得る少なくとも１つの他の追加の因子を含有してもよい。代替的に、少なくとも１つの他の追加の因子は、本発明の方法により形成された、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の増殖を高め得る。更に、少なくとも１つの他の追加の因子は、本発明の方法により形成された、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の、他の細胞型の形成の能力を向上させ、又は任意の他の追加の分化工程の効率を改善し得る。
【０１６３】
少なくとも１つの追加の因子は、例えば、ニコチンアミド、ＴＧＦ−β１、２、及び３を含むＴＧＦ−βファミリーのメンバー、血清アルブミン、繊維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバー、血小板由来増殖因子−ＡＡ、及び−ＢＢ、血小板に富んだ血漿、インスリン増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０、１１）、グルカゴン様ペプチド−Ｉ及びＩＩ（ＧＬＰ−Ｉ及びＩＩ）、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２疑似体、エキセンディン−４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、インスリン、プロゲステロン、アプロチニン、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、βメルカプトエタノール、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ガストリンＩ及びＩＩ、例えばトリエチレンペンタミン等の銅キレーター、フォルスコリン、酪酸Ｎａ、アクチビン、ベータセルリン、ＩＴＳ、ノギン、神経突起増殖因子、ｎｏｄａｌ、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、スフィンゴシン１、ＶＥＧＦ、ＭＧ１３２（ＥＭＤ，ＣＡ）、Ｎ２及びＢ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ，ＣＡ）、例えばシクロパミン（ＥＭＤ，ＣＡ）等のステロイドアルカロイド、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質ファミリー、ウシ下垂体抽出物、膵島新生に関連したタンパク質（ＩＮＧＡＰ）、インディアンヘッジホッグ、ソニックヘッジホッグ、プロテアソーム阻害剤、ノッチ経路阻害剤、ソニックヘッジホッグ阻害剤、又はそれらの組み合わせであってもよい。
【０１６４】
少なくとも１つの他の追加の因子は、例えば、ＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１４６９）、ＣＡＰＡＮ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＨＴＢ−７９）、ＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１６８７）、ＨＰＡＦ−ＩＩ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１９９７）等の膵臓細胞株、例えば、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＨＴＢ−８０６５）等の肝臓細胞株、及び例えば、ＦＨｓ７４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＣＬ−２４１）等の腸細胞株から得られた条件培地により供給されてもよい。
【０１６５】
２つの培地を用いた、細胞外マトリクス上における、ヒト胚幹細胞の胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化：ヒト胚幹細胞の胚体内胚葉系統の細胞への分化は、２つの培地を用いて、アクチビン−Ａ及びＷｎｔリガンドとともにヒト胚幹細胞を培養することにより達成し得る。したがって、ヒト胚幹細胞の分化は、以下のように達成され得る：
ａ．細胞外マトリクスでコーティングされた組織培養基質上に、ヒト胚幹細胞をプレーティングする工程と、
ｂ．ヒト胚幹細胞を、アクチビン−Ａ及びＷｎｔリガンドとともに第１の培地中で培養する工程と、
ｃ．ヒト胚幹細胞を、第２の培地中でアクチビン−Ａとともに培養する工程。
【０１６６】
第１の培地は、低濃度の血清を含有してもよく、第２の培地は、第１の培地よりも高い濃度の血清を含有してもよい。
【０１６７】
第２の培地は、Ｗｎｔリガンドを含有してもよい。
【０１６８】
第１の培地：第１の培地は、ヒト胚幹細胞を胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へ分化させるのに十分低い濃度の所定の因子、例えばインスリン及びＩＧＦ等を含有すべきである（国際公開第２００６０２０９１９号に開示されているように）。このことは、血清濃度を低下させ、又は代替的に、インスリン及びＩＧＦが欠乏した合成培地を使用することにより達成され得る。合成培地の例は、Ｗｉｌｅｓら（Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９９９  Ｆｅｂ  ２５、２４７（１）：２４１〜８．）に開示されている。
【０１６９】
第１の培地中に、第２の培地と比較して低い濃度の血清が存在してもよい。第２の培地の血清濃度を増大させることは、細胞の生存を増大させ、又は代替的に細胞の増殖を向上させ得る。第１の培地の血清濃度は、約０％〜約１０％の範囲内であってもよい。代替的に、第１の培地の血清濃度は、約０％〜約２％の範囲内であってもよい。代替的に、第１の培地の血清濃度は、約０％〜約１％の範囲内であってもよい。代替的に、第１の培地の血清濃度は、約０．５％であってもよい。
【０１７０】
ヒト胚幹細胞を、少なくとも２つの培地を用いてアクチビン−Ａ及びＷｎｔリガンドと共に培養する際、第１の培地中での培養時間は、約１日間〜約３日間にわたってもよい。
【０１７１】
アクチビン−Ａは、好適な任意の濃度で使用されて、ヒト胚幹細胞を分化させることができる。濃度は、約１ｐｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬであってもよい。代替的な実施形態において、濃度は、約１ｐｇ／ｍＬ〜約１μｇ／ｍＬであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約１ｐｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約５０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。
【０１７２】
Ｗｎｔリガンドの選択は最適化されて、分化プロセスの効率を改善することができる。Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−５ａ及びＷｎｔ−７ａからなる群より選択されてもよい。１つの実施形態では、Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−１である。代替的な実施形態において、Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−３ａである。
【０１７３】
Ｗｎｔリガンドは、濃度約１ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬであってもよい。代替的な実施形態において、濃度は、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。
【０１７４】
第１の培地は、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤も含有し得る。ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤は、第１の培地に、第２の培地に、又は第１の培地と第２の培地の両方に添加されてもよい。
【０１７５】
ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤は、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ及びＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＸＩからなる群より選択されてもよい。１つの実施形態では、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤は、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸである。
【０１７６】
ヒト胚幹細胞がＧＳＫ−３Ｂ阻害剤と共に培養される際、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤の濃度は、約１ｎＭ〜約１０００ｎＭであってもよい。代替的な実施形態において、ヒト胚幹細胞は、濃度約１０ｎＭ〜約１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤と共に培養される。
【０１７７】
第１の培地は、ヒト胚幹細胞からの、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成を向上させ得る少なくとも１つの他の追加の因子も含有し得る。代替的に、少なくとも１つの他の追加の因子は、本発明の方法により形成された、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の増殖を高め得る。更に、少なくとも１つの他の追加の因子は、本発明の方法により形成された、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の、他の細胞型の形成の能力を向上させ、又は任意の他の追加の分化工程の効率を改善し得る。
【０１７８】
少なくとも１つの追加の因子は、例えば、ニコチンアミド、ＴＧＦ−β１、２、及び３を含むＴＧＦ−βファミリーのメンバー、血清アルブミン、繊維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバー、血小板由来増殖因子−ＡＡ、及び−ＢＢ、血小板に富んだ血漿、インスリン増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０、１１）、グルカゴン様ペプチド−Ｉ及びＩＩ（ＧＬＰ−Ｉ及びＩＩ）、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２疑似体、エキセンディン−４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、インスリン、プロゲステロン、アプロチニン、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、βメルカプトエタノール、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ガストリンＩ及びＩＩ、例えばトリエチレンペンタミン等の銅キレーター、フォルスコリン、酪酸Ｎａ、アクチビン、ベータセルリン、ＩＴＳ、ノギン、神経突起増殖因子、ｎｏｄａｌ、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、スフィンゴシン−１、ＶＥＧＦ、ＭＧ１３２（ＥＭＤ，ＣＡ）、Ｎ２及びＢ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ，ＣＡ）、例えばシクロパミン（ＥＭＤ，ＣＡ）等のステロイドアルカロイド、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質ファミリー、ウシ下垂体抽出物、膵島新生に関連したタンパク質（ＩＮＧＡＰ）、インディアンヘッジホッグ、ソニックヘッジホッグ、プロテアソーム阻害剤、ノッチ経路阻害剤、ソニックヘッジホッグ阻害剤、又はそれらの組み合わせであってもよい。
【０１７９】
少なくとも１つの他の追加の因子は、例えば、ＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１４６９）、ＣＡＰＡＮ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＨＴＢ−７９）、ＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１６８７）、ＨＰＡＦ−ＩＩ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１９９７）等の膵臓細胞株、例えば、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＨＴＢ−８０６５）等の肝臓細胞株、及び例えば、ＦＨｓ７４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＣＬ−２４１）等の腸細胞株から得られた条件培地により供給されてもよい。
【０１８０】
第２の培地：第２の培地は、例えば、インスリン及びＩＧＦ（国際公開第２００６０２０９１９号に開示されているような）等の所定の因子を、培養された細胞の生存を促進するに十分な濃度で含有する必要がある。このことは、血清濃度を増大させることにより、又は代替的に、インスリン及びＩＧＦの濃度が、第１の培地と比較して増大されている合成培地を使用することにより達成し得る。合成培地の例は、Ｗｉｌｅｓら（Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９９９  Ｆｅｂ  ２５；２４７（１）：２４１〜８．）に開示されている。
【０１８１】
より高い血清濃度を有する第２の培地において、第２の培地の血清濃度は、約０．５％〜約１０％の範囲内であってもよい。代替的に、第２の培地の血清濃度は、約０．５％〜約５％の範囲内であってもよい。代替的に、第２の培地の血清濃度は、約０．５％〜約２％の範囲内であってもよい。あるいは、第２の培地の血清濃度は、約２％のであってもよい。ヒト胚幹細胞を第２の培地とともに培養するとき、培養時間は約１日間〜約４日間にわたってもよい。
【０１８２】
第１の培地と同様、アクチビン−Ａは、ヒト胚幹細胞を分化させる好適な任意の濃度で使用されてもよい。濃度は、約１ｐｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬであってもよい。代替的な実施形態において、濃度は、約１ｐｇ／ｍＬ〜約１μｇ／ｍＬであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約１ｐｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約５０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。別の代替的な実施形態において、濃度は、約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。
【０１８３】
Ｗｎｔリガンドは、濃度約１ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬであってもよい。代替的な実施形態において、濃度は、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬであってもよい。
【０１８４】
Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−５ａ及びＷｎｔ−７ａからなる群より選択されてもよい。１つの実施形態では、Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−１である。代替的な実施形態において、Ｗｎｔリガンドは、Ｗｎｔ−３ａである。
【０１８５】
第２の培地は、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤も含有し得る。ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤は、第１の培地に、第２の培地に、又は第１の培地と第２の培地の両方に添加されてもよい。
【０１８６】
ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤は、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ及びＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＸＩからなる群より選択されてもよい。１つの実施形態では、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤は、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸである。
【０１８７】
ヒト胚幹細胞がＧＳＫ−３Ｂ阻害剤と共に培養される際、ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤の濃度は、約１ｎＭ〜約１０００ｎＭであってもよい。代替的な実施形態において、ヒト胚幹細胞は、濃度約１０ｎＭ〜約１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤と共に培養される。
【０１８８】
第１の培地と同様、第２の培地はまた、ヒト胚幹細胞からの胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成を向上させ得る少なくとも１つの他の追加の因子を含有してもよい。代替的に、少なくとも１つの他の追加の因子は、本発明の方法により形成された、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の増殖を高め得る。更に、少なくとも１つの他の追加の因子は、本発明の方法により形成された、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の、他の細胞型の形成の能力を向上させ、又は任意の他の追加の分化工程の効率を改善し得る。
【０１８９】
少なくとも１つの追加の因子は、例えば、ニコチンアミド、ＴＧＦ−β１、２、及び３を含むＴＧＦ−βファミリーのメンバー、血清アルブミン、繊維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバー、血小板由来増殖因子−ＡＡ、及び−ＢＢ、血小板に富んだ血漿、インスリン増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０、１１）、グルカゴン様ペプチド−Ｉ及びＩＩ（ＧＬＰ−Ｉ及びＩＩ）、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２疑似体、エキセンディン−４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、インスリン、プロゲステロン、アプロチニン、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、βメルカプトエタノール、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ガストリンＩ及びＩＩ、例えばトリエチレンペンタミン等の銅キレーター、フォルスコリン、酪酸Ｎａ、アクチビン、ベータセルリン、ＩＴＳ、ノギン、神経突起増殖因子、ｎｏｄａｌ、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、スフィンゴシン−１、ＶＥＧＦ、ＭＧ１３２（ＥＭＤ，ＣＡ）、Ｎ２及びＢ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ，ＣＡ）、例えばシクロパミン（ＥＭＤ，ＣＡ）等のステロイドアルカロイド、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質ファミリー、ウシ下垂体抽出物、膵島新生に関連したタンパク質（ＩＮＧＡＰ）、インディアンヘッジホッグ、ソニックヘッジホッグ、プロテアソーム阻害剤、ノッチ経路阻害剤、ソニックヘッジホッグ阻害剤、又はそれらの組み合わせであってもよい。
【０１９０】
少なくとも１つの他の追加の因子は、例えば、ＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１４６９）、ＣＡＰＡＮ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＨＴＢ−７９）、ＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１６８７）、ＨＰＡＦ−ＩＩ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１９９７）等の膵臓細胞株、例えば、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＨＴＢ−８０６５）等の肝臓細胞株、及び例えば、ＦＨｓ７４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＣＬ−２４１）等の腸細胞株から得られた条件培地により供給されてもよい。
【０１９１】
本発明を以下の実施例により更に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【０１９２】
（実施例１）
ヒト胚幹細胞の培養
幹細胞とは、１個の細胞レベルで自己再生し、かつ自己再生性の前駆細胞、非自己再生性の前駆細胞、及び最終分化細胞のような後代細胞を生ずるように分化する能力によって定義される未分化細胞のことである。幹細胞はまた、インビトロで複数の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系統の機能的細胞に分化する能力によって、また移植後に複数の胚葉の組織を生じ、胚盤胞への注入後、全部ではないとしても殆どの組織を提供する能力によっても、特徴付けられる。
【０１９３】
ヒト胚幹細胞株Ｈ１、Ｈ７及びＨ９をＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から入手し、供給元の研究所から提供された取扱説明書にしたがって培養した。手短には、細胞を、２０％ノックアウト血清代替、１００ｎＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、０．５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、４ｎｇ／ｍＬヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を有する２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯより）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ）からなるＥＳ細胞培地中にてマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー細胞上で培養した。Ｅ１３〜１３．５マウス胚由来のＭＥＦ細胞をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから購入した。ＭＥＦ細胞を、１０％  ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２ｍＭグルタミン、及び１００ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸で補充したＤＭＥＭ培地中で増殖させた。サブコンフルエントなＭＥＦ細胞培養物を１０μｇ／ｍＬマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で３時間処理して、細胞分割を停止させた後、トリプシン処理して、２×１０４／ｃｍ２にて０．１％ウシゼラチンでコーティングされた皿上に播いた。継代２〜４からのＭＥＦ細胞をフィーダー層として使用した。ＭＥＦ細胞フィーダー層上に播いたヒト胚幹細胞を、加湿した組織培養インキュベータ内にて５％  ＣＯ2の雰囲気中で３７℃で培養した。コンフルエントとなった際（プレーティングの約５〜７日後）、ヒト胚幹細胞を１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼタイプＩＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ）により５〜１０分間処理し、次に５ｍＬピペットを使用して表面を穏やかに擦り落とした。細胞を９００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ペレットを再懸濁し、１：３〜１：４の細胞の比で新鮮培地に再びプレーティングした。
【０１９４】
並行して、成長因子減少ＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の１：３０希釈液でコーティングされたプレート上にＨ１、Ｈ７、及びＨ９ヒト胚幹細胞も播種し、８ｎｇ／ｍＬｂＦＧＦを添加したＭＥＦ−馴化培地中で培養した。ＭＡＴＲＩＧＥＬ上で培養した細胞を、コラゲナーゼＩＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ）、ディスパーゼ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、又はＬＩＢＥＲＡＳＥ酵素を用いてルーチン的に継代した。ヒト胚幹細胞培養物の一部は低酸素条件下（約３％  Ｏ2）でインキュベートした。
【０１９５】
（実施例２）
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析
ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）とともに５分間インキュベートすることにより、培養プレートから接着ヒト胚幹細胞を除去した。解放された細胞をヒト胚幹細胞培地中に再懸濁し、遠心分離により回収した後、洗浄して、細胞を、ＰＢＳ中の２％  ＢＳＡ、０．０５％アジ化ナトリウムからなる染色緩衝液（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）中に再懸濁した。適切な場合、細胞は、０．１％  γ−グロブリン（Ｓｉｇｍａ）溶液を使用して、Ｆｃ−受容体を１５分間ブロックされた。アリコート（約１×１０5細胞）を、表ＩＡに示すようにフィコエリトリン（phycoerythirin）（ＰＥ）若しくはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）複合体化モノクローナル抗体（５μＬ抗体／１×１０6細胞）のいずれかと共に、又は非複合体化一次抗体と共にインキュベートした。対照は、適切なアイソタイプ一致抗体、非染色細胞、及び二次結合抗体のみで染色した細胞を含んでいた。抗体を用いた全インキュベーションは、４℃で３０分間行い、その後細胞を染色緩衝液で洗浄した。非結合一次抗体で染色したサンプルを、二次結合ＰＥ又は−ＡＰＣラベル抗体と共に、更に４℃で３０分間インキュベートした。使用した二次抗体の一覧に関しては表ＩＢを参照されたい。洗浄した細胞をペレット化し、染色緩衝液中に再懸濁し、少なくとも１０，０００事象を収集することにより、細胞表面分子をＦＡＣＳアレイ（ＢＤバイオサイエンス）機器を使用して同定した。
【０１９６】
（実施例３）
免疫細胞化学
接着細胞を、室温で２０分間４％のパラホルムアルデヒドで固定した。固定した細胞を、ＰＢＳ／０．１％  ＢＳＡ／１０％正常ヒヨコ血清／０．５％トリトンＸ−１００により室温で１時間ブロックした後、ＰＢＳ／０．１％  ＢＳＡ／１０％正常ヒヨコ血清中の一次抗体と共に４℃で一夜インキュベートした。一次抗体及びそれらの作用希釈物の一覧を、表ＩＡに示す。ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中で３回洗浄した後、ＰＢＳ中で１：１００希釈した蛍光二次抗体（表ＩＢ）を、細胞と共に室温で１時間インキュベートして結合させた。対照サンプルは、一次抗体が省略されるか、又は一次抗体が、その一次抗体と同一濃度の対応する負の対応対照免疫グロブリンで代替された反応物を含んでいた。染色サンプルを濯ぎ、ジアミジノ−２−フェニルインドール，二塩酸塩（ＤＡＰＩ）を含有するＰＲＯＬＯＮＧ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）の１滴を各サンプルに加えて、核を対比染色し、また抗退色試薬として機能させた。Ｎｉｋｏｎ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｃ−１倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，Ｊａｐａｎ）及び１０−６０Ｘ対物レンズを使用して画像を得た。
【０１９７】
（実施例４）
ＥＳ由来細胞のＰＣＲ分析
ＲＮＡ抽出、精製、及びｃＤＮＡ合成：ＲＮＡサンプルを、エタノール含有、高塩濃度
緩衝液の存在下、シリカゲル膜（ＲＮｅａｓｙミニキット、Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）に結合させた後、混入物を洗浄して除去することにより精製した。ＲＮＡをＴＵＲＢＯ  ＤＮＡ−フリーキット（Ａｍｂｉｏｎ，ＩＮＣ）を使用して更に精製し、次いで高品質ＲＮＡを
水中に溶出した。収率及び純度を分光光度計のＡ２６０及びＡ２８０指数により評価した。ＣＤＮＡコピーを、ＡＢＩ（ＡＢＩ，ＣＡ）大容量ｃＤＮＡアーカイブキットを用いて精製ＲＮＡから作製した。
【０１９８】
リアルタイムＰＣＲ増幅及び定量分析：特に明記しない限り、試薬は全てＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００配列検出システムを使用して、リアルタイムＰＣＲ反応を行った。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＵＮＩＶＥＲＳＡＬ  ＰＣＲ  ＭＡＳＴＥＲ  ＭＩＸ（登録商標）（ＡＢＩ，ＣＡ）を、２０ｎｇの逆転写ＲＮＡと共に、２０μＬの全反応容積にて使用した。各ｃＤＮＡサンプルを２回使用（run）して、ピペッティング誤差に関して補正した。プライマー及びＦＡＭ標識ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブを、２００ｎＭの濃度で用いた。各標的遺伝子に関する発現レベルを、以前にＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより開発されたヒトグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）内在性対照を使用して正規化した。プライマー及びプローブのセットを表ＩＩに列挙する。ＳＯＸ−１７プライマーをＰＲＩＭＥＲＳプログラム（ＡＢＩ，ＣＡ）を用いて設計し、それは以下の配列を有していた：ＳＯＸ−１７：ＴＧＧＣＧＣＡＧＣＡＧＡＴＡＣＣＡ、ＡＧＣＧＣＣＴＴＣＣＡＣＧＡＣＴＴＧ、及びＣＣＡＧＣＡＴＣＴＴＧＣＴＣＡＡＣＴＣＧＧＣＧ。最初５０℃で２分間、次いで９５℃で１０分間のインキュベーション後、サンプルを２段階にて４０回サイクルした；９５℃で１５秒間の変性工程と、その後の６０℃で１分間のアニーリング／伸長工程。ＧＥＮＥＡＭＰ（登録商標）７０００配列検出システムソフトウエアを使用して、データ解析を行った。各プライマー／プローブセットに関して、増幅の指数関数領域の中央において蛍光強度が特定の値に到達したサイクル数としてのＣｔ値を決定した。比較Ｃｔ法を使用して、相対的な遺伝子発現レベルを計算した。手短には、各ｃＤＮＡサンプルに関して、内在性対照Ｃｔ値を関心対象遺伝子のＣｔから減算して、ＤＣｔ値（ΔＣｔ）を得た。標的の正規化した量を２−ΔＣｔとして計算し、増幅を１００％効率と仮定した。最終的なデータを、標準物質サンプルに関して表した。
【０１９９】
（実施例５）
ＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングされた組織培養基質上で培養したヒト胚幹細胞の胚体内胚葉（ＤＥ）への分化
低酸素条件（約３％Ｏ2）下で培養し、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（１：３０希釈）でコーティングされた皿上にプレーティングされた５４継代のヒト胚幹細胞株Ｈ９由来の細胞を、０．５％ＦＢＳ、２０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ−３ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ−００２、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビン−Ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間曝露し、続いて２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビン−Ａ（ＡＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３〜４日間処理した。図１は、４日目のＦＡＣＳによるＣＸＣＲ４発現を示す。図２は、４日目及び６日目の、低血清＋ＡＡ＋ＷＮＴ３Ａで処理したヒト胚幹細胞株Ｈ９由来の細胞の培養物のリアルタイムＰＣＲデータを示す。このプロトコルにより、胚体内胚葉マーカーが著しくアップレギュレートされる。この手順は、ＤＥ（胚体内胚葉）プロトコルとも称される。
【０２００】
（実施例６）
胚体内胚葉段階に分化したヒト胚幹細胞由来細胞の単離及び増殖
種々の継代数（３０〜５４継代）のヒト胚幹細胞株Ｈ１及びＨ９由来細胞を、少なくとも３継代低酸素条件下（約３％  Ｏ2）で培養した。細胞を８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＭＥＦ−ＣＭ中で培養し、実施例１にしたがってＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングされたプレート上にプレーティングした。細胞を、実施例５に概説するＤＥプロトコルに曝露した。３〜６日目に、細胞をＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）に５分間曝露した。遊離した細胞をＤＭＥＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ培地に再懸濁させ、遠心分離により回収し、血球計を用いて計数した。遊離した細胞を１０００〜１０，０００細胞／ｃｍ2で、組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）処理フラスコ上に播種し、標準的な組織培養インキュベータ内で、３７℃低酸素条件下（約３％  Ｏ2）にてＤＭＥＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬアクチビン−Ａ＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ−３Ａ中で培養した。ＴＣＰＳフラスコは、ＭＡＴＲＩＧＥＬでも他の細胞外マトリクスタンパク質でもコーティングしなかった。培地は毎日交換した。幾つかの培地では、培地に１０〜５０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−Ｉ（インスリン成長因子−Ｉ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮより）又は１Ｘ  ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン、及びセレニウム、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａより）を更に添加した。幾つかの培養条件では、基本培地（ＤＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ）に０．１ｍＭメルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）及び非必須アミノ酸（１Ｘ，ＮＥＡＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡより）を更に添加した。第１継代細胞をＰ１と称する。並行して、同様の培養物を正常酸素圧条件下（約２１％  Ｏ2）で確立した。この単離手順の概要を図３に示す。
【０２０１】
５〜１５日間培養した後、老化していると思われる多数の巨細胞に取り囲まれている明確な細胞コロニーが出現した（図４ａ〜ｂ）。培養密度約５０〜６０％で、室温で５分間ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ溶液に曝露することにより培養物を継代した。遊離した細胞をＤＭＥＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ培地に再懸濁させ、遠心分離により回収し、１０，０００細胞／ｃｍ2で、組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）処理フラスコ上に播種し、ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬアクチビン−Ａ＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ−３Ａ＋／−５０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−Ｉ中で培養した。この培地を更に「成長培地」と称する。図４ｃは、１０，０００細胞／ｃｍ2で播種した３継代の細胞の形態を示す。最初の単離後３継代（パネルｃ）で、細胞は、大きな核対細胞質比を有する均一な上皮様形態を有するように見えた。
【０２０２】
幾つかの培養物では、成長培地に１Ｘ  ＮＥＡＡ＋０．１ｍＭメルカプトエタノールを更に添加した。３〜４継代後、結合細胞は、大きな核対細胞質比を有する均一な形態を有するように見えた。正常酸素圧条件下で確立された並行培養物は、結合細胞によるロバストなコロニー形成を示さなかった。２〜３継代後、正常酸素圧条件下で確立された培養物は、成長速度が遅いため廃棄した。
【０２０３】
（実施例７）
複数継代後のＤＥマーカーの増殖及び維持におけるアクチビン−Ａ、ＷＮＴ３Ａ、及びＩＧＦ−Ｉの役割
実施例６に記載されている方法にしたがって親ヒト胚幹細胞株Ｈ９から誘導された培養物を、４〜７日毎に継代した。図５は、３継代２％  ＦＢＳ＋ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビン−Ａ＋２０のＷＮＴ３Ａ中で培養された増殖細胞についてのリアルタイムＰＣＲ結果を示す。このデータは、実施例５に概説したＤＥプロトコルの６日目に単離した株のデータである。各継代後、ＳＯＸ−１７及びＨＮＦ−３β等のＤＥマーカーは明らかに減少する。図６に示すように、アクチビン−Ａを含有している成長培地にＷＮＴ３Ａを添加することにより、ＤＥマーカーの発現が著しく促進される。しかし、５０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−Ｉ添加、並びにアクチビン−Ａ及びＷＮＴ−３Ａの除去（図７ａ〜ｃ）は、ＯＣＴ−４とともにＤＥマーカーの発現を急激に低下させ、ＳＯＸ−７及びＡＦＰ等の臓側内胚葉マーカーの発現を増加させる。図８ａ〜ｃは、ａ）２％  ＦＢＳ＋ＤＭＦ１２＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビン−Ａ＋２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ、ｂ）２％  ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビン−Ａ、ｃ）２％  ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２＋５０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−Ｉ中で培養された５継代のＨ９ｐ５４から誘導された増殖細胞の形態を示す。アクチビン−Ａ又はアクチビン−Ａ＋ＷＮＴ３Ａの存在下で培養された細胞の形態は非常に類似しており、２％ＦＢＳ＋ＩＧＦ−Ｉ中で培養された細胞の形態とは異なっていた。
【０２０４】
（実施例８）
胚体内胚葉段階に分化したヒト胚幹細胞由来細胞の増殖能
実施例６に記載の方法にしたがって親ヒト胚幹細胞株Ｈ９から確立された培養物を、成長培地が５０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−Ｉ又はＩＴＳを含有していたとき、４〜５日毎に継代した。しかし、ＩＧＦ又はＩＴＳを添加していない成長培地で培養すると成長速度が遅いため、５〜７日毎に継代した。成長培地＋５０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−Ｉを与えた細胞の集団倍加時間は約５５時間であったのに対して、成長培地のみを与えた培養物の集団倍加時間は約７５時間であった。実施例６にしたがって増殖した細胞集団をＥＸＰＲＥＳ細胞（EXpandable PRE-primitive Streak cells（増殖可能な前原始線条細胞））と称する。表ＩＩＩに、実施例６に概説された方法にしたがって確立された種々のＥＸＰＲＥＳ細胞を列挙する。２種の細胞株（ＥＸＰＲＥＳ  ０１及び０２）の増殖能を図９に示す。
【０２０５】
（実施例９）
単一ヒト胚幹細胞の懸濁液からのＥＸＰＲＥＳ細胞の誘導
ヒト胚幹細胞株Ｈ１Ｐ３３及びＨ９Ｐ４５由来細胞を、少なくとも３継代低酸素条件下（約３％Ｏ2）で培養した。細胞を８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＭＥＦ−ＣＭ中で培養し、実施例１にしたがってＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングされたプレート上にプレーティングした。培養密度約６０％で、培養物をＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）に５分間曝露した。遊離した細胞をＤＭＥＭ−Ｆ１２＋２％ＦＢＳ培地に再懸濁させ、遠心分離により回収し、血球計を用いて計数した。遊離した細胞を１０００〜１０，０００細胞／ｃｍ2の密度で組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）処理フラスコ上に播種し、標準的な組織培養インキュベータ内で、３７℃低酸素条件下（約３％  Ｏ2）にて、ＤＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬアクチビン−Ａ＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ−３Ａ＋５０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−Ｉ＋０．１ｍＭメルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）及び非必須アミノ酸（１Ｘ，ＮＥＡＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡより）中で培養した。ＴＣＰＳフラスコは、ＭＡＴＲＩＧＥＬでも他の細胞外マトリクスタンパク質でもコーティングしなかった。培地は毎日交換した。第１継代細胞をＰ１と称する。並行して、同様の培養物を正常酸素圧条件下（約２１％Ｏ2）で確立した。正常酸素圧条件下で確立された培養物はコロニーを形成せず、それほど細胞増殖しなかった。しかし、低酸素条件下で確立された培養物は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ又はＭＥＦフィーダー上で培養された胚幹細胞コロニーに類似する多くのコロニーを形成した（図１０）。これらの培養物は、ＥＳからＤＥへの分化中に単離されたＥＸＰＲＥＳ細胞の特性に非常に類似している。
【０２０６】
（実施例１０）
ＥＸＰＲＥＳ細胞による細胞表面タンパク質の発現
細胞株ＥＸＰＲＥＳ  ０１及びＥＸＰＲＥＳ  ０２を、多能性に関連するマーカーを含む種々の細胞表面マーカーの発現について評価した。ＥＸＰＲＥＳ  ０１由来の細胞は、９〜２４継代で評価した。ＥＸＰＲＥＳ  ０２由来の細胞は、７〜２０継代で評価した。両方の株は、典型的には未分化ヒト胚幹細胞に割り当てられる多能性マーカーを強く発現した。しかし、ＥＸＰＲＥＳ  ０２株は、ＥＸＰＲＥＳ０１株に比べて、ＣＸＣＲ４、ＬＩＦ受容体、及びＮＣＡＭ等の分化マーカーの発現の割合が高かった。ＥＸＰＲＥＳ  ０１Ｐ２４の代表的なＦＡＣＳプロットを図１１に、ＥＸＰＲＥＳ  ０２  Ｐ２１株については図１２に示す。表ＩＶは、３種の異なる実験から、評価した細胞表面マーカーの範囲（括弧内）と共に平均発現量を列挙する。
【０２０７】
（実施例１１）
ＥＸＰＲＥＳ細胞−免疫蛍光（ＩＦ）染色による、多能性関連マーカーの発現
それぞれの成長培地中で維持されたＥＸＰＲＥＳ  ０１及び０２細胞を、実施例３に概説された方法を用いて多能性関連マーカーで染色した。図１３は、２％  ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２＋１００ｎｇ／ｍＬアクチビン−Ａ＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ３Ａ＋５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ−Ｉ中で培養されたＥＸＰＲＥＳ  ０１  Ｐ１０細胞のＯＣＴ−４、Ｎａｎｏｇ、ＳＯＸ−２、及びＨＮＦ−３βのＩＦ画像を示す。図１４は、２％  ＦＢＳ＋ＤＭ−Ｆ１２＋１００ｎｇ／ｍＬアクチビン−Ａ＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ３Ａ中で培養された９継代のＥＸＰＲＥＳ  ０２細胞のＯＣＴ−４、Ｎａｎｏｇ、ＳＯＸ−２、及びＨＮＦ−３βのＩＦ画像を示す。ＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞は、ＯＣＴ−４、Ｎａｎｏｇ、及びＳＯＸ−２について強い陽性染色を示し、ＨＮＦ−３βについて弱い陽性染色を示す。しかし、ＥＸＰＲＥＳ  ０２細胞は、ＨＮＦ−３βについてより強い発現を示し、ＯＣＴ−４、Ｎａｎｏｇ、及びＳＯＸ−２についてより弱い発現を示す。
【０２０８】
（実施例１２）
リアルタイムＰＣＲによる胚体内胚葉及び未分化胚幹細胞マーカーの発現
それぞれの成長培地中で培養された１１継代のＥＸＰＲＥＳ  ０１及び７継代のＥＸＰＲＥＳ  ０２株が発現している胚マーカー（ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ−２、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、コネキシン４３、コネキシン４５、ＦＯＸＤ３）、胚体外マーカー（ＡＦＰ、ＫＲＴ１５）、外胚葉マーカー（ＳＯＸ−１、ＴＵＢＢ３、ネスチン）、内胚葉マーカー（ＦＯＸＡ２、ＩＰＦ１、ＫＲＴ１５、ＧＡＴＡ−４）、及び中胚葉マーカー（ＧＡＴＡ−４、ＧＡＴＡ−２、ＭＹＯＤ、ＭＳＸ１、ＣＦＣ１、ＡＢＣＧ２）のリアルタイムＰＣＲ分析を図１５ａ〜ｈに示す。データは全て、ＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングされたプレート上のＭＥＦ−ＣＭ中で培養された、ヒト胚幹細胞株Ｈ９由来の未分化細胞に対する倍数変化で正規化する。対照として、コラゲナーゼ消化の標準的な方法を用いてＨ９細胞からＥＢ体を形成し、約１０日間ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋２０％  ＦＢＳ中の非処理表面上に播種した。種々の胚葉の遺伝子発現は、未分化ＥＳ細胞に比べてＥＢ体によりアップレギュレートされた。別のリファレンスＲＮＡを、ＭＥＦ−ＣＭ中のＭＡＴＲＩＧＥＬ上にて培養された未分化ＳＡ００２株（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）から回収した。予想通り種々の胚葉の遺伝子発現は、ＥＢ体により、ＥＸＰＲＥＳ  ０１、ＥＸＰＲＥＳ  ０２、ＳＡ００２、及びＨ９株に比べてより強くアップレギュレートされた。ＥＸＰＲＥＳ  ０１及び０２株は両方、未分化ＳＡ００２及びＨ９株に比べてＦＯＸＡ２の発現を示した。ＥＸＰＲＥＳ株はいずれも、胚体外、中胚葉、又は内胚葉マーカーの強い発現を示した。更に、ＥＸＰＲＥＳ細胞による胚マーカーの発現は、ＳＡ００２及びＨ９リファレンス細胞株に類似していた。
【０２０９】
（実施例１３）
ＥＸＰＲＥＳ細胞の増殖に有用な種々の成長培地
ＥＸＰＲＥＳ細胞は、少なくとも２〜３０継代、以下の培地組成において成功裏に培養された：
１．ＤＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ−３Ａ
２．ＤＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ−３Ａ＋５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ−Ｉ
３．ＤＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ−３Ａ＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ−Ｉ
４．ＤＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋５０ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ−３Ａ＋５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ−Ｉ
５．ＤＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋５０ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ−３Ａ＋５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ−Ｉ
６．ＤＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋５０ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ−３Ａ＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ−Ｉ
７．ＤＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ−３Ａ＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ−Ｉ
８．ＨＥＳｃＧＲＯ合成培地（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＣＡ）
【０２１０】
上に列挙した培地の基本成分は、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、ＣＲＭＬ、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）ＤＭＥＭ、及びＦ１２等の類似培地に置き換えてもよい。
【０２１１】
（実施例１４）
組織培養基質上で培養されたＥＸＰＲＥＳ細胞の胚体内胚葉（ＤＥ）細胞への分化
それぞれの成長培地中のＴＣＰＳ上で培養された５継代のＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞及び４継代のＥＸＰＲＥＳ  ０２細胞を、０．５％  ＦＢＳ、２０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ−３ａ、及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビン−Ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間曝露し、続いて更に３〜５日間、２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビン−Ａ（ＡＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で処理した。図１６は、ＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞（図１６ａ、約１７％  ＣＸＣＲ４陽性）及びＥＸＰＲＥＳ  ０２細胞（図１６ｂ、約４０％  ＣＸＣＲ４陽性）について、４日目のＦＡＣＳによるＣＸＣＲ４の発現を示す。図１７は、２〜５日目に低血清＋ＡＡ＋ＷＮＴ３Ａで処理されたＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞（図１７ａ）及びＥＸＰＲＥＳ０２細胞（図１７ｂ）培養物のリアルタイムＰＣＲデータを示す。図１８及び１９は、４日間上記と同様の処理で処理された、それぞれＥＸＰＲＥＳ  ０１及び０２細胞の免疫蛍光画像を示す。ＥＸＰＲＥＳ  ０２細胞全体が、ＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞に比べてＤＥマーカーをより強く発現しているように見える。ＦＡＣＳ、免疫染色、及びＰＣＲデータにより証明されるように、血清濃度の低下及びＩＧＦの除去はＤＥマーカーの発現を増加させた。しかし、ＣＸＣＲ４及びＨＮＦ−３β等のＤＥマーカーの全体の発現量は、ＤＥ段階に分化した未分化ヒトＥＳ培養物でルーチン的に観察される発現量よりも低かった。
【０２１２】
ＤＥマーカーの発現を増加させるために、ＤＥ分化プロトコルを以下のように変更した：それぞれの培地中でＴＣＰＳ上で培養された１９継代のＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞及び１４継代のＥＸＰＲＥＳ  ０２細胞を、０．５％  ＦＢＳ、２０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ−３ａ、１００ｎｇ／ｍＬアクチビン−Ａ、及び１００ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ（カタログ番号３６１５５０，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＣＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に４〜５日間曝露した。図２０は、ＥＸＰＲＥＳ  ０１（図２０ａ、約５７％  ＣＸＣＲ４陽性）及びＥＸＰＲＥＳ  ０２（図２０ｂ、約８６％  ＣＸＣＲ４陽性）について、４日目のＦＡＣＳによるＣＸＣＲ４の発現を示す。図２１は、ＤＥ段階に分化したＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞（パネルａ〜ｆ）及びＥＸＰＲＥＳ  ０２細胞（パネルｇ〜ｌ）について、５日目の対応する免疫蛍光画像を示す。図２２は、ＥＸＰＲＥＳ  ０１（図２２ａ）及びＥＸＰＲＥＳ  ０２（図２２ｂ）のリアルタイムＰＣＲデータを示す。
【０２１３】
（実施例１５）
ＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞のＤＥへの分化に対する播種密度の効果
ＥＸＰＲＥＳ  ０１  Ｐ３１細胞を、標準的な組織培養インキュベータ内にて３７℃、低酸素条件下（約３％  Ｏ2）で、ＤＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋０．１ｍＭメルカプトエタノール＋１Ｘ，ＮＥＡＡ＋１００ｎｇ／ｍＬアクチビン−Ａ＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ３Ａ中でＴＣＰＳプレート上に５０００、１００００、２００００、又は４００００細胞／ｃｍ2で播種した。播種の２日後、培地をＤＭＥＭ−Ｆ１２＋０．５％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬアクチビン−Ａ＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ３Ａ＋１００ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸに替えて、標準的な組織培養インキュベータ内にて３７℃、低酸素条件下（約３％  Ｏ2）で４日間培養した。図２３は、分化４日目の胚体内胚葉マーカーのリアルタイムＰＣＲ分析を示す。胚体内胚葉のロバストな形成には、少なくとも１００００〜２００００細胞／ｃｍ2の播種密度が必要であると考えられる。
【０２１４】
（実施例１６）
ＥＸＰＲＥＳ細胞のテロメア長
ヒト胚幹細胞株Ｈ１由来の未分化細胞とともに、実施例５にしたがって単離された２種のＥＸＰＲＥＳ株のテロメア長を、Ｔｅｌｏ  ＴＡＧＧＧテロメア長アッセイ（Ｒｏｃｈｅ，ＩＮ）を用いて、製造業者の取扱説明書にしたがって分析した。図２４は、目盛マーカーとともに、Ｐ２４のＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞、Ｐ１７のＥＸＰＲＥＳ  ０２細胞、Ｐ４０のＨ１細胞、及びキットにより提供される高テロメア対照及び低テロメア対照のテロメア長を示す。両方の株は、未分化ＥＳ細胞より短いテロメア長を有するように見受けられる。
【０２１５】
（実施例１７）
組織培養基質上で培養されたＥＸＰＲＥＳ細胞の膵臓内胚葉への更なる分化
２１継代のＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞を、０．５％  ＦＢＳ、ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地中の１００ｎｇ／ｍＬアクチビン−Ａ、１０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ、及び１００ｎＭ  ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＩＸで処理することにより、５日間分化させた。細胞をＦＡＣＳにより分析したところ、８０％の細胞がＣＸＣＲ４陽性を示した。次いで、細胞を以下の各工程で３日間ずつ処理した：５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ−１０、及び０．２５μＭ  ＫＡＡＤ−シクロパミン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＣＡ）を含有している２％  ＦＢＳ  ＤＭＥＭ：Ｆ１２；続いて５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ−１０、０．２５μＭ  ＫＡＡＤ−シクロパミン及び１μＭレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）を含有している１％  Ｂ２７  ＤＭＥＭ、低グルコース；続いて、１μＭ  ＤＡＰＴ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＣＡ）＋５０ｎｇ／ｍＬエキセンディン４（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）を含有している１％Ｂ２７ＤＭＥＭ、低グルコース；続いて最後にそれぞれ５０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ、ＨＧＦ、及びエキセンディン４を含有している１％  Ｂ２７  ＤＭＥＭ  ＣＭＲＬ。各工程の最後にサンプルを採取し、細胞のＲＮＡを抽出した。示されたマーカーについてＱ−ＲＴ  ＰＣＲを実施した。図２５に示すように、インスリン量は未処理細胞に対して１００倍増加し、またＰＤＸ−１量は１０００倍超増加した。
【０２１６】
（実施例１８）
組織培養基質上で培養されたＥＸＰＲＥＳ細胞の前腸内胚葉への更なる分化
３５継代のＥＸＰＲＥＳ０１細胞を、０．５％  ＦＢＳ、ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地中の１００ｎｇ／ｍＬアクチビン−Ａ、２０ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａ、及び１００ｎＭ  ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＩＸで処理することにより、５日間分化させた。細胞をＦＡＣＳにより分析したところ、約７０％の細胞がＣＸＣＲ４陽性を示した。次いで、細胞を以下の各工程で処理した：５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ−１０、及び０．２５μＭ  ＫＡＡＤ−シクロパミン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＣＡ）を含有している２％  ＦＢＳ  ＤＭＥＭ：Ｆ１２で３日間；工程３、５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ−１０、０．２５μＭ  ＫＡＡＤ−シクロパミン、及び１μＭレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）を含有している１％  Ｂ２７  ＤＭＥＭ、低グルコースで４日間；並びに工程４、１μＭ  ＤＡＰＴ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＣＡ）＋５０ｎｇ／ｍＬエキセンディン４（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）を含有している１％  Ｂ２７  ＤＭＥＭ、低グルコースで４日間。このプロトコルは、Ｄ’Ａｍｏｕｒら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，２４，１３９２，２００６）により既に公開されているプロトコルに基づいている。段階４の最後に細胞を固定し、ＰＤＸ−１、ＨＮＦ−３β、ＳＯＸ−１７、アルブミン、抗トリプシン、及びＣＤＸ−２で染色した。図２６に示すように、ＥＸＰＲＥＳ細胞は、ＰＤＸ−１（培養物の約２０％が陽性染色）、ＨＮＦ−３β（約９０％陽性）、アルブミン（約５％陽性）、抗−１−トリプシン（約７０％陽性）、ＳＯＸ−１７（約７０％）、及びＣＤＸ−２（約５％陽性）の発現により測定したとき、前腸内胚葉に容易に分化することができた。
【０２１７】
（実施例１９）
ＥＸＰＲＥＳ細胞対未分化ヒト胚幹細胞のマイクロアレイ解析
ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて４４継代のヒト胚幹細胞株Ｈ９、ＥＸＰＲＥＳ  ０１  Ｐ１１、及びＥＸＰＲＥＳ  ０２  Ｐ７の培養物から全ＲＮＡを単離した：全グループは３つの生物学的複製物を含み、各生物学的複製物は２つの別個の遺伝子チップ上で反復された。サンプル調製、ハイブリダイゼーション及び画像分析は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙにしたがって行った。正規化及び対数変換の後、ＯｍｎｉＶｉｚ（登録商標）ソフトウエア（ＭＡ）及びＧＥＮＥＳＩＦＴＥＲ（ＶｉｚＸＬａｂｓ，ＷＡ）を使用してデータ解析を行った。分散分析と、０．０５以下の調整Ｐ値（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ及びＨｏｃｈｂｅｒｇ補正）を用いたＦ検定とを使用して、サンプル間の遺伝子発現における有意な差異を評価した。少なくとも１つのグループ内のプレゼントコールを伴う遺伝子のみを分析に含めた。表Ｖは、各遺伝子の調整Ｐ値とともに、群（未分化ＥＳ、ＥＸＰＲＥＳ  ０１、及びＥＸＰＲＥＳ  ０２細胞）間で少なくとも５倍の差を示す遺伝子の平均正規化対数変換シグナル強度を列挙する。原始線条又は胚体内胚葉を表す遺伝子を太字で強調する。アップレギュレート又はダウンレギュレートされた上位２００個の遺伝子のみを表Ｖに示す。
【０２１８】
（実施例２０）
ＤＥ段階に分化したＥＸＰＲＥＳ細胞対ＤＥ段階に分化したヒト胚幹細胞のマイクロアレイ解析
ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて以下の培養物から全ＲＮＡを抽出した：Ａ）ＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングされたプレート（１：３０希釈）上で培養され、２日間０．５％  ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビン−Ａ及び２０ｎｇ／ｍＬのｗｎｔ３Ａを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に曝露され、続いて更に３日間２％  ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビン−Ａ（ＡＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で処理されたＨ９Ｐ３３細胞；Ｂ）ＴＣＰＳ上で培養され、５日間０．５％  ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬアクチビン−Ａ、２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ３Ａ、及び１００ｎｍ  ＧＳＫ−３Ｂ  ＩＸ阻害剤（カタログ番号３６１５５０、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＣＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に曝露されたＥＸＰＲＥＳ  ０１  Ｐ２４細胞；Ｃ）ＴＣＰＳ上で培養され、５日間０．５％  ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬアクチビン−Ａ、２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ３Ａ、及び１００ｎｍ  ＧＳＫ−３Ｂ  ＩＸ阻害剤（カタログ番号３６１５５０、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＣＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に曝露されたＥＸＰＲＥＳ０２Ｐ１７細胞；Ｄ）ＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングされたプレート（１：３０希釈）上で培養され、２日間０．５％  ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビン−Ａ及び２０ｎｇ／ｍＬのｗｎｔ３Ａを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に曝露され、続いて更に２日間２％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍＬアクチビン−Ａ（ＡＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で処理されたＨ９Ｐ３９細胞。２時間、６時間、２４時間、３０時間、４８時間、７２時間、及び９６時間目に群ＤからＲＮＡサンプルを回収した。それぞれの成長培地中で培養されたＥＸＰＲＥＳ  ０１及びＥＸＰＲＥＳ  ０２も対照としてインキュベートした。全群は３つの生物学的複製物を含み、各生物学的複製物は２つの別個の遺伝子チップ上で反復された。
【０２１９】
サンプル調製、ハイブリダイゼーション及び画像分析は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙにしたがって行った。正規化及び対数変換の後、ＯｍｎｉＶｉｚ（登録商標）ソフトウエア（ＭＡ）及びＧＥＮＥＳＩＦＴＥＲ（ＶｉｚＸＬａｂｓ，ＷＡ）を使用してデータ解析を行った。分散分析と、０．０５以下の調整Ｐ値（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ及びＨｏｃｈｂｅｒｇ補正）を用いたＦ検定とを使用して、サンプル間の遺伝子発現における有意な差異を評価した。少なくとも１つのグループ内のプレゼントコールを伴う遺伝子のみを分析に含めた。表ＶＩに、種々の時点における、群Ａ、群Ｂ、群Ｃ及び群Ｄの間で少なくとも５倍の差異を示す遺伝子の平均正規化対数変換シグナル強度を、各遺伝子の調整Ｐ値と共に列挙する。アップレギュレート又はダウンレギュレートされた上位２００個の遺伝子のみを表ＶＩに示す。原始線条又は胚体内胚葉を表す遺伝子を太字で強調する。表ＶＩＩは、各比較群の相関係数を列挙する。相関係数に対応する散布図を図２７に示す。ＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞のグローバル発現プロファイルは、３０時間以下のＤＥ段階におけるサンプルの発現プロファイルに類似しているように見受けられ、一方ＥＸＰＲＥＳ  ０２細胞は４８時間超のＤＥ段階におけるサンプルの発現プロファイルに類似しているように見受けられる。
【０２２０】
（実施例２１）
胚様体の形成及び種々の系統への分化
２７継代のＥＸＰＲＥＳ  ０１培養物を、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ溶液を用いて単一細胞として取り出し、４分間２００ｇで回転させ、ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋２０％  ＦＢＳに再懸濁させた。細胞懸濁液を低接着ペトリ皿上に播種した。播種の３〜４日後、胚様体（ＥＢ）様構造が形成された（図２８）。ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋１マイクロモラーのレチノイン酸による培養物の処理は、ＮｅｕｒｏＤ等の外胚葉マーカーの発現を誘導した。
【０２２１】
（実施例２２）
ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの腎臓被膜における奇形腫形成
４２継代のヒト胚幹細胞株Ｈ９由来の未分化細胞、３０継代のＥＸＰＲＥＳ  ０１、ＥＸＰＲＥＳ  ０２  Ｐ２２細胞を、ＴＲＹＰＬＥを用いて培養物から遊離させ、基本培地で洗浄し、次いでＤＭＥＭ−Ｆ１２基本培地に懸濁させた。約１×１０6個の未分化Ｈ９Ｐ４２、１５０万個のＥＸＰＲＥＳ  ０１及び０２細胞を、６週齢のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの腎臓被膜に注入した。移植の５週間後、動物を屠殺し、腎臓を切除し、ホルマリンで固定するか、又は分解緩衝液に入れ、後のＰＣＲ分析のためにＲＮＡを回収した。図２９は、回収したサンプルの中胚葉、外胚葉、内胚葉、胚体外臓側内胚葉に特徴的なマーカー、及び多能性マーカーの発現を示す。Ｈ９株と同様に、両方のＥＸＰＲＥＳ株は、胚体外内胚葉とともに全ての胚葉で強い発現を示す。
【０２２２】
（実施例２３）
ＥＸＰＲＥＳ  ０３細胞の増殖及び細胞周期分析
ヒト胚幹細胞は、高比率のＳ期、及び短い又は不完全なギャップ期（Ｇ１及びＧ２）を特徴とする、他の体細胞とは識別可能な独自の細胞周期状態を有する。ｈＥＳ細胞における細胞周期制御機構は、自己再生及びこれらの細胞の多能性と機能的に関連している可能性があり、分化／傾倒対応物における制御機構とは異なっている可能性がある。これらの実験は、多能性ｈＥＳ細胞のマーカーの多くを発現することが示されているＥＸＰＲＥＳ細胞の細胞周期特性を決定するために設計した。
【０２２３】
方法：細胞を、細胞結合組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に５，０００〜１０，０００細胞／ｃｍ2で播種し、２〜４日間培養した。ＥＸＰＲＥＳ  ０３細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２中に２％  ＦＢＳを含有している成長培地、及びアクチビン−Ａ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ｗｎｔ３ａ（１０〜２０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）を含有している培地のいずれか中で培養した。比較増殖分析のために、場合によってＩＧＦを成長因子カクテルから除いた。製造業者（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の推奨にしたがってＡＰＣ  ＢＲＤＵ  Ｆｌｏｗキットを用いて細胞増殖を分析した。簡潔に述べると、培養期間の最後に１〜２時間細胞にＢＲＤＵをパルス導入し、Ｔｒｙｐｌｅ  Ｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓを用いて遊離させ、計数した。細胞をＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｓｐｅｒｍ緩衝液で固定し、３０分間インキュベートし、続いて氷上で１０分間ＢＤ  Ｃｙｔｏｐｅｒｍ緩衝液とともにインキュベートした。次いで、３７℃で１時間ＤＮＡｓｅで細胞を処理し、取り込まれたＢＲＤＵに曝露し、続いてＡＰＣ複合体化抗ＢＲＤＵ抗体で染色した。細胞周期分析では、細胞を７ＡＡＤで染色し、ＦＡＣＳアレイ上で分析した。
【０２２４】
結果：ｈＥＳ細胞に非常に類似して、ＥＸＰＲＥＳ  ０３細胞は高い増殖速度を保持しており、これは培養物中にＢＲＤＵを取り込む能力により決定されるようにＳ期にある細胞の割合が高いことにより示される。Ｓ期にある細胞の頻度は、ｈＥＳ細胞と同様に典型的には４５％超（４０％〜６０％の範囲）であった（図３０ａ〜ｃ）。ＩＧＦの存在下で成長したＥＸＰＲＥＳ  ０３細胞の数は、３〜４日後ＩＧＦの非存在下で成長した細胞の数の２〜３倍であったが、細胞を１時間以上ＢＲＤＵに曝露したときＳ期の細胞の頻度の差はほんの僅かであった（図３０ｆ）。この高頻度のＳ期細胞及び細胞周期構造は、ヒト羊水細胞（ＡＦＤＸ００２）で示されるように、体細胞で観察されるものとは異なる（図３０ｄ）。更に、マイトマイシン処理細胞マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ、図３０ｅ）はＳ期に移行せず、Ｇ２／Ｍ期に明らかに蓄積され（６４％）、これはマイトマイシン処理細胞が有糸分裂においてＤＮＡ鎖を分離できないことに関連している可能性がある。
【０２２５】
（実施例２４）
ＥＳ細胞対ＥＸＰＲＥＳ細胞のトランスフェクション効率
ｈＥＳの遺伝子操作の主な制限は、ｈＥＳが従来のトランスフェクション法及びウイルス導入法に対して比較的耐性であることである。その高い増殖速度に加えて、ＥＸＰＲＥＳ細胞はインビトロでのトランスフェクションが容易である。トランスフェクション効率を比較するために、ＥＸＰＲＥＳ細胞及びｈＥＳ細胞をＥＧＦＰとともに培養物にトランスフェクトし、蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリー法により分析した。
【０２２６】
方法：ＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞を、ヒトフィブロネクチンでコーティングされた（１０μｇ／ｍＬ）６ウェル培養プレート上、ＤＭＥＭ／Ｆ１２中２％  ＦＢＳ、アクチビン−Ａ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ｗｎｔ３ａ（１０〜２０ｎｇ／ｍＬ）、及びＩＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）を含む成長培地中に、播種した。細胞塊の場合、ｈＥＳ細胞をコラゲナーゼを用いてルーチンな方法によりＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングされた６ウェル培養プレートに継代し、ＭＥＦ馴化ｈＥＳ培地中で成長させた。単一細胞の場合、ｈＥＳ細胞を３７℃で３分間ＴＲＹＰＬＥに細胞を曝露させ、続いてＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングされた６ウェル培養プレート上にプレーティングすることにより継代した。細胞が所望の培養密度（７０〜８０％）を達成したとき、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の推奨にしたがって細胞をリポフェクタミン２０００でトランスフェクトした。簡潔に述べると、４μｇのＤＮＡを、２５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ還元血清培地で希釈した。５マイクロリットルのリポフェクタミン２０００を、５分間、合計２５０ｍμＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地と混合し、穏やかに希釈したＤＮＡと混合した。室温で２０分間ＤＮＡ／リポフェクタミン複合体を形成させ、次いで穏やかに混合するためにプレートを穏やかに旋回運動させながらそれぞれのウェルに添加した。細胞を更に２４時間複合体の存在下でインキュベートし、続いて培地を完全に交換した。トランスフェクションの４８時間後、蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリーにより細胞を分析した。
【０２２７】
結果：ｅＧＦＰの取り込み及び発現を、単一細胞分散又は細胞塊としてプレーティングされたＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞及びｈＥＳ細胞をトランスフェクションし、４８時間後に分析することにより比較した。ＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞は、最も高いレベルのｅＧＦＰタンパク質発現を示し、フローサイトメトリー分析によれば７５％の細胞がｅＧＦＰを発現していた（図３１）。対照的に、ｈＥＳはトランスフェクション耐性が高く、細胞塊を用いたときＦＡＣＳによりｅＧＦＰタンパク質を発現していた細胞は僅か３％であった。ｈＥＳの単一細胞分散を調製することによりＤＮＡ取り込みレベル及びｅＧＦＰ発現は約２０％に向上したが、これはまだＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞での発現の約３分の１である。
【０２２８】
（実施例２５）
スクリーニングの多用途ツールとしてのＥＸＰＲＥＳ細胞
ＥＸＰＲＥＳ細胞を２％  ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬ組み換えヒトアクチビン−Ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、及び２０ｎｇ／ｍＬ組み換えマウスＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有しているＤＭＥＭ：Ｆ１２培地中で成長させた。ＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞の成長培地はまた、５０ｎｇ／ｍＬ組み換えヒトＩＧＦ−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有していた。両方の細胞株を、低酸素（３％）及び５％  ＣＯ2雰囲気下で３７℃にてルーチン的に成長させた。ＥＸＰＲＥＳ  ０１及びＥＸＰＲＥＳ  ０２細胞を、ＴｒｙｐＬＥ酵素的消化（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を用いて単一細胞懸濁液として培養物から遊離させ、次いで洗浄し、計数して、正確な細胞数及び生存率（＞９５％）を測定した。１，２５０〜８０，０００細胞の範囲のアリコートを、最終体積１００μＬの培地になるように、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ）のヒトフィブロネクチンでコーティングされたウェルに分配した。対照ウェルもまたフィブロネクチンでコーティングされ、細胞無しで体積の等しい培地を含有していた。３７℃、標準的な低酸素、５％  ＣＯ2下でインキュベートされた加湿チャンバ内で一晩プレートを平衡化させた。この時間中、初期播種密度に応じて培養密度の程度が変動する単層培養物として細胞は付着した。一晩培養した後、２０μＬのＭＴＳ試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに添加した。ＭＴＳをホルマザンに還元し、生存細胞の数に正比例するデヒドロゲナーゼ酵素活性の尺度として用いることができる。１枚のプレートを低酸素培養に戻す一方、同一の対応するプレートを正常酸素（２０％）下でインキュベートした。４時間後、分光光度プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）の４９０ｎｍで吸光度を読み取った。各プレート内の複製サンプルセットについて、平均ＯＤ、標準偏差、及び変動係数（ＣＶ）（％）を求めるのための統計的計算を行い、両方のプレート間の類似ウェルを比較した。
【０２２９】
標準偏差及び変動係数（ＣＶ）（％）値は、ＥＸＰＲＥＳ細胞を、高プレーティング効率及び良好なウェル間再現性で、ウェル間に均一に分布させることができることを示す（表ＶＩＩＩａ〜ｆ）。等しい数の細胞の平均ＯＤ490指数から分かるように、ＥＸＰＲＥＳ  ０１株はＥＸＰＲＥＳ  ０２株より高い代謝活性を有する。各ＥＸＰＲＥＳ  ０株について、２つのプレート間のＣＶ値（％）は、この短期間アッセイにおいて大気酸素レベルにもかかわらず、対応する条件で代謝活性の差がないことを示唆する。このアッセイの線形領域内のウェル毎の最適細胞数を、平均ＯＤ指数をグラフ化することにより決定したところ（図３２）：ＥＸＰＲＥＳ  ０１では２０，０００細胞／ウェル及びＥＸＰＲＥＳ  ０２では４０，０００細胞／ウェルであった。ここでも、大気の酸素レベル差は、この短期間アッセイから得られる最適細胞数には影響を与えなかった。これらの結果は、ＥＸＰＲＥＳ細胞は、細胞増殖及び／又は代謝速度に対する種々の剤の毒性作用を測定できるスクリーニングプロトコルに従うことを示唆する。
【０２３０】
（実施例２６）
ＥＸＰＲＥＳ細胞から誘導されたＤＥ様細胞の増殖
以前の実施例は、ＥＸＰＲＥＳ細胞を胚幹細胞から誘導することができ、種々の成長培地中のＴＣＰＳ上で容易に増殖させ得ることを証明する。これらの培地処方のほとんとは、添加物としてＩＧＦを含有するか、又は成長培地中で用いられる２％  ＦＢＳにインスリン／ＩＧＦを含有する。これらの因子は、ＰＩ−３キナーゼ経路を通してＤＥ関連遺伝子を阻害することが示されている（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，２５：２９〜３８，２００７）。代替培地を、ＤＭ−Ｆ１２＋０．５％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ３Ａ＋１００ｎＭ  ＧＳＫ−３Ｂ阻害剤ＩＸ（更に「ＤＥ細胞用成長培地」と称される）に基づいて処方した。上記培地中で培養された２７継代のＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞は、ＤＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＡＡ＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ３Ａ＋５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ−Ｉ中で培養された細胞と同じ速度で増殖することができた。更に、ＤＥ細胞用成長培地中で培養された細胞は、３継代を通じてリアルタイムＰＣＲによりＤＥマーカーを強く発現していた（図３３）。約７２％の細胞がＣＸＣＲ４を発現していた（図３４）。
【０２３１】
（実施例２７）
ＥＸＰＲＥＳ細胞における標的遺伝子のｓｉＲＮＡノックダウン
ｓｉＲＮＡを用いるヒト胚幹細胞の標的遺伝子の効率的なノックダウンは、クラスタコロニーとして成長したヒト胚幹細胞において高レベルのトランスフェクションを達成する能力により厳しく制限される。ＥＸＰＲＥＳ細胞は、従来の方法を用いてｓｉＲＮＡで容易にトランスフェクトされ、したがってｓｉＲＮＡオリゴ配列をスクリーニングし、標的とする遺伝子の果たす役割を評価するための有用な系を提供する。
【０２３２】
方法：ＥＸＰＲＥＳ  ０３細胞を、ヒトフィブロネクチンでコーティングされた（１０μｇ／ｍＬ）６ウェル組織培養プレート上、ＤＭＥＭ／Ｆ１２中２％ＦＢＳ、アクチビン−Ａ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ｗｎｔ３ａ（１０〜２０ｎｇ／ｍＬ）、及びＩＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）を含む成長培地中に、播種した。６ウェルプレートの場合、２００，０００細胞を播種し、２４時間後ｓｉＲＮＡオリゴ配列でトランスフェトした。
【０２３３】
標的遺伝子のノックダウンを評価するために、７０〜８０％の培養密度の細胞を、製造業者（Ａｍｂｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ），Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）の推奨にしたがってリポフェクタミン２０００を用いてトランスフェクトした。簡潔に述べると、最終濃度が１００ｎｍｏｌになるよう適切な量のｓｉＲＮＡを２５０μＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ還元血清培地で希釈した。５マイクロリットルのリポフェクタミン２０００を、２５０μＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地で希釈し、５分間インキュベートした。複合体を室温で１５〜２０分間インキュベートし、次いで穏やかに混合するためにプレートを穏やかに旋回運動させながら細胞に添加した。細胞を更に２４時間ｓｉＲＮＡの存在下でインキュベートし、続いて培地を完全に交換した。トランスフェクションの２４〜４８時間後蛍光顕微鏡で細胞を可視化し、定量ＲＴ−ＰＣＲ法により標的遺伝子のノックダウンを分析するためにＲＮＡを回収した。Ａｍｂｉｏｎから購入した、以下の予め検証されているｓｉＲＮＡオリゴ配列を試験した：ベータカテニン（Ｉｄ．Ｎｏ．４２８１６）及びＧＳＫ３ｂ（Ｉｄ．Ｎｏ．４２８３９）。
【０２３４】
結果：蛍光顕微鏡により、蛍光標識されたｓｉＲＮＡを用いたとき、ＥＸＰＲＥＳ細胞により非常に高確率で（＞８０％）ｓｉＲＮＡが取り込まれたことが明らかになった（図３５）。細胞から回収したＲＮＡを、標的遺伝子のノックダウンについてＰＣＲにより分析し、対照ｓｉＲＮＡオリゴをトランスフェクトした細胞と比較した。ベータカテニン及びＧＳＫ３ｂ  ｓｉＲＮＡオリゴにより、ＥＸＰＲＥＳ細胞において非常に高い確率で遺伝子がノックダウンされた（９３％超の遺伝子がノックダウンされた）。他の遺伝子標的、例えばＨｅｓ−１、Ｏｃｔ−４に対して、他の検証されていないオリゴ配列は、より低く変動する確率で標的遺伝子をノックダウンした。オリゴ配列の特異性は、他の遺伝子転写産物の分析により検証され、これは検出できるノックダウンを全く示さなかった。
【０２３５】
（実施例２８）
ＥＸＰＲＥＳ  ０１及びＥＸＰＲＥＳ  ０２株のサイトカイン抗体アレイ分析
それぞれ２２継代及び２３継代のＥＸＰＲＥＳ  ０１及びＥＸＰＲＥＳ  ０２細胞を、それぞれの培地で培養密度約７０％まで成長させ、次いで細胞溶解物を哺乳類細胞溶解キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）を用いて回収した。ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，ＧＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ／）により提供されたサイトカインアレイパネルを使用して、サイトカインアレイ分析を完了した。表ＩＸａ〜ｃは、データの正規化及びバックグラウンド除去を行った後のサイトカイン、サイトカイン及び成長因子受容体発現を示す。各パネルに関して、正及び負の対照も含めた。パネルは、細胞種毎に２つの異なるサンプルで実行したものである。
【０２３６】
（実施例２９）
核型分析
２０継代のＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞及び１５継代のＥＸＰＲＥＳ  ０２細胞の核型をＧバンド分析により決定した。細胞遺伝学的分析を、ＥＸＰＲＥＳ  ０１由来の２１個のＧバンド染色した細胞、及びＥＸＰＲＥＳ  ０２由来の２０個のＧバンド染色した細胞について実施した。Ｇバンド染色したＥＸＰＲＥＳ  ０１細胞の半分は正常な４６ＸＸ核型を示したが、残りは１７番染色体トリソミー等の異常な核型を示した。ＥＸＰＲＥＳ  ０２株もまた、１番染色体短腕のほぼ全てが重複している染色体再配列を示した。
【０２３７】
（実施例３０）
Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤の存在下における単一ヒト胚幹細胞の懸濁液からのＥＸＰＲＥＳ細胞の誘導
３５継代のヒト胚幹細胞株Ｈ９由来細胞を、少なくとも３継代低酸素条件下（約３％Ｏ2）で培養した。細胞を８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＭＥＦ−ＣＭ中で培養し、実施例１にしたがってＭＡＴＲＩＧＥＬでコーティングされたプレート上にプレーティングした。培養密度約６０％で、培養物をＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）に５分間曝露した。遊離した細胞をＤＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ培地に再懸濁させ、遠心分離により回収し、血球計を用いて計数した。遊離した細胞を１０００〜１０，０００細胞／ｃｍ2の密度で組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）フラスコ上に播種し、標準的な組織培養インキュベータ内で、３７℃低酸素条件下（約３％  Ｏ2）にて、ＤＭ−Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬアクチビン−Ａ＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＷＮＴ−３Ａ＋５０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−Ｉ＋０．１ｍＭメルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）、非必須アミノ酸（１Ｘ，ＮＥＡＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡより）＋／−１０μｍ  ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＣＡ）中で培養した。ＴＣＰＳフラスコは、ＭＡＴＲＩＧＥＬでも他の細胞外マトリクスタンパク質でもコーティングしなかった。培地は毎日交換した。第１継代細胞をＰ１と称する。図３７に示すように、播種の２４時間後、ＲＯＣＫ阻害剤の添加により、ＲＯＣＫ阻害剤の非存在下で誘導された培養物と比べて、著しく多い数の付着細胞が得られた。ＲＯＣＫ阻害剤、Ｙ２７６３２を用いて誘導されたＥＸＰＲＥＳ細胞を、ＥＸＰＲＥＳ  １５と命名した。
【０２３８】
（実施例３１）
核型分析
５継代及び１２継代のＥＸＰＲＥＳ  １５細胞の核型を、Ｇバンド分析により決定した。ＥＸＰＲＥＳ  １５由来の２１個のＧバンド染色した細胞について細胞遺伝学的分析を実施したところ、全ての細胞が正常な４６ＸＸ核型を示した（図３８）。１２番及び１７番染色体のＦＩＳＨ分析はまた、全ての細胞が１２番染色体上に位置するＥＴＶ６  ＢＡＰ（ＴＥＬ）遺伝子の正常なシグナルパターンを示し、全ての細胞が１７番染色体上に位置するＨｅｒ２／ｎｅｕ遺伝子及び１７セントロメアの正常なシグナルパターンを示したことを示した。
【０２３９】
（実施例３２）
ＥＸＰＲＥＳ細胞は、ある濃度範囲のＩＧＦ、ＷＮＴ３Ａ、アクチビン−Ａ、及びＧＳＫ−３Ｂ阻害剤を含有している培地中で維持することができる
ＥＸＰＲＥＳ  １１細胞を、２％  ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬアクチビン−Ａ、２０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ３ａ、及び５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦを含有しているＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で成長させた。８０％の培養密度で、ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、９６ウェルプレートに、４０００細胞／ウェルの密度で、２％  ＦＢＳを含有しているＤＭＥＭ／Ｆ１２に細胞を継代した。５％  ＣＯ２、３７℃に保たれた加湿インキュベータ内で１時間、細胞を基材に付着させ、次いで５０〜１００ｎｇ／ｍＬの範囲のアクチビン−Ａ、１０〜２０ｎｇ／ｍＬの範囲のＷｎｔ３ａ、１０〜５０ｎｇ／ｍＬの範囲のＩＧＦ、及び５０〜１００ｎＭのＧＳＫ−３Ｂ阻害剤（ＩＸ）を添加した。２４、４８、及び９６時間目に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ（登録商標）９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞生存率を測定した。簡潔に述べると、ＭＴＳ試薬を９６ウェルプレートに添加し、細胞とともに１〜４時間インキュベートし、次いでプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を読み取った。吸光度指数は、生存細胞の数に正比例していた。図３９ａ〜ｃは、播種後ａ）２４時間、ｂ）４８時間、及びｃ）９６時間の吸光度指数を示す。
【０２４０】
本明細書を通して引用された刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明の様々な態様を、実施例及び好ましい実施形態を参照して説明してきたが、本発明の範囲は、以上の明細書の記述ではなく、特許法の原則の下で解釈される以下の特許請求の範囲により定義されることが理解されるであろう。
【０２４１】
【表１】
0005763524.tif 000002
【０２４２】
【表２】
0005763524.tif 000003
【０２４３】
【表３−１】
0005763524.tif 000004
【０２４４】
【表３−２】
0005763524.tif 000005
【０２４５】
【表３−３】
0005763524.tif 000006
【０２４６】
【表３−４】
0005763524.tif 000007
【０２４７】
【表４】
0005763524.tif 000008
【０２４８】
【表５】
0005763524.tif 000009
【０２４９】
【表６−１】
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【０２５０】
【表６−２】
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【０２５１】
【表６−３】
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【０２５２】
【表６−４】
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【０２５３】
【表６−５】
0005763524.tif 000014
【０２５４】
【表６−６】
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【０２５５】
【表６−７】
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【０２５６】
【表６−８】
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【０２５７】
【表６−９】
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【０２５８】
【表６−１０】
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【０２５９】
【表６−１１】
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【０２６０】
【表６−１２】
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【０２６１】
【表６−１３】
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【０２６２】
【表６−１４】
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【０２６３】
【表６−１５】
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【０２６４】
【表６−１６】
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【０２６５】
【表６−１７】
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【０２６６】
【表６−１８】
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【０２６７】
【表６−１９】
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【０２６８】
【表６−２０】
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【０２６９】
【表６−２１】
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【０２７０】
【表６−２２】
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【０２７１】
【表６−２３】
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【０２７２】
【表６−２４】
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【０２７３】
【表６−２５】
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【０２７４】
【表６−２６】
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【０２７５】
【表６−２７】
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【０２７６】
【表６−２８】
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【０２７７】
【表６−２９】
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【０２７８】
【表６−３０】
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【０２７９】
【表６−３１】
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【０２８０】
【表６−３２】
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【０２８１】
【表６−３３】
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【０２８２】
【表６−３４】
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【０２８３】
【表７−１】
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【０２８４】
【表７−２】
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【０２８５】
【表７−３】
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【０２８６】
【表７−４】
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【０２８７】
【表７−５】
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【０２８８】
【表７−６】
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【０２８９】
【表７−７】
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【０２９０】
【表７−８】
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【０２９１】
【表７−９】
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【０２９２】
【表７−１０】
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【０２９３】
【表７−１１】
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【０２９４】
【表７−１２】
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【０２９５】
【表７−１３】
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【０２９６】
【表７−１４】
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【０２９７】
【表７−１５】
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【０２９８】
【表７−１６】
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【０２９９】
【表７−１７】
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【０３００】
【表７−１８】
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【０３０１】
【表７−１９】
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【０３０２】
【表７−２０】
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【０３０３】
【表７−２１】
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【０３０４】
【表７−２２】
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【０３０５】
【表７−２３】
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【０３０６】
【表７−２４】
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【０３０７】
【表７−２５】
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【０３０８】
【表７−２６】
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【０３０９】
【表７−２７】
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【０３１０】
【表７−２８】
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【０３１１】
【表７−２９】
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【０３１２】
【表７−３０】
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【０３１３】
【表７−３１】
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【０３１４】
【表７−３２】
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【０３１５】
【表７−３３】
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【０３１６】
【表７−３４】
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【０３１７】
【表７−３５】
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【０３１８】
【表７−３６】
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【０３１９】
【表７−３７】
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【０３２０】
【表７−３８】
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【０３２１】
【表７−３９】
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【０３２２】
【表７−４０】
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【０３２３】
【表７−４１】
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【０３２４】
【表７−４２】
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【０３２５】
【表７−４３】
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【０３２６】
【表７−４４】
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【０３２７】
【表７−４５】
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【０３２８】
【表７−４６】
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【０３２９】
【表７−４７】
0005763524.tif 000090
【０３３０】
【表７−４８】
0005763524.tif 000091
【０３３１】
【表７−４９】
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【０３３２】
【表７−５０】
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【０３３３】
【表７−５１】
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【０３３４】
【表７−５２】
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【０３３５】
【表７−５３】
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【０３３６】
【表７−５４】
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【０３３７】
【表７−５５】
0005763524.tif 000098
【０３３８】
【表７−５６】
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【０３３９】
【表７−５７】
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【０３４０】
【表７−５８】
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【０３４１】
【表７−５９】
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【０３４２】
【表７−６０】
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【０３４３】
【表７−６１】
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【０３４４】
【表７−６２】
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【０３４５】
【表７−６３】
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【０３４６】
【表７−６４】
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【０３４７】
【表７−６５】
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【０３４８】
【表７−６６】
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【０３４９】
【表７−６７】
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【０３５０】
【表７−６８】
0005763524.tif 000111
【０３５１】
【表７−６９】
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【０３５２】
【表７−７０】
0005763524.tif 000113
【０３５３】
【表７−７１】
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【０３５４】
【表７−７２】
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【０３５５】
【表７−７３】
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【０３５６】
【表７−７４】
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【０３５７】
【表７−７５】
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【０３５８】
【表７−７６】
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【０３５９】
【表７−７７】
0005763524.tif 000120
【０３６０】
【表７−７８】
0005763524.tif 000121
【０３６１】
【表７−７９】
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【０３６２】
【表７−８０】
0005763524.tif 000123
【０３６３】
【表７−８１】
0005763524.tif 000124
【０３６４】
【表７−８２】
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【０３６５】
【表７−８３】
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【０３６６】
【表７−８４】
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【０３６７】
【表７−８５】
0005763524.tif 000128
【０３６８】
【表７−８６】
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【０３６９】
【表７−８７】
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【０３７０】
【表８】
0005763524.tif 000131
【０３７１】
【表９−１】
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【０３７２】
【表９−２】
0005763524.tif 000133
【０３７３】
【表９−３】
0005763524.tif 000134
【０３７４】
【表９−４】
0005763524.tif 000135
【０３７５】
【表１０−１】
0005763524.tif 000136
【０３７６】
【表１０−２】
0005763524.tif 000137
【０３７７】
【表１０−３】
0005763524.tif 000138
【０３７８】
【表１０−４】
0005763524.tif 000139
【０３７９】
【表１０−５】
0005763524.tif 000140
【０３８０】
【表１０−６】
0005763524.tif 000141
【図１】
0005763524.tif 000142
【図２】
0005763524.tif 000143
【図３】
0005763524.tif 000144
【図４】
0005763524.tif 000145
【図５】
0005763524.tif 000146
【図６】
0005763524.tif 000147
【図７】
0005763524.tif 000148
【図８】
0005763524.tif 000149
【図９】
0005763524.tif 000150
【図１０】
0005763524.tif 000151
【図１１】
0005763524.tif 000152
【図１２】
0005763524.tif 000153
【図１３】
0005763524.tif 000154
【図１４】
0005763524.tif 000155
【図１５】
0005763524.tif 000156
【図１６】
0005763524.tif 000157
【図１７】
0005763524.tif 000158
【図１８】
0005763524.tif 000159
【図１９】
0005763524.tif 000160
【図２０】
0005763524.tif 000161
【図２１】
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【図２２】
0005763524.tif 000163
【図２３】
0005763524.tif 000164
【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
0005763524.tif 000172
【図３２】
0005763524.tif 000173
【図３３】
0005763524.tif 000174
【図３４】
0005763524.tif 000175
【図３５】
0005763524.tif 000176
【図３６】
0005763524.tif 000177
【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
0005763524.tif 000180
【配列表】
0005763524000001.app