(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする被験体において免疫原性ペプチドに対するＴ細胞性免疫応答を誘導するための医薬組成物であって、
融合タンパク質をコードする核酸（該組換え融合タンパク質はペプチド結合された２つの部分を含み、第一の部分がタンパク粒誘導配列（ＰＢＩＳ）であり、第二の部分が免疫原性ポリペプチドである）であるワクチンを含んでなり、
ＰＢＩＳが、γ−ゼイン、α−ゼイン、δ−ゼイン、β−ゼイン、イネプロラミンおよびγ−グリアジンからなる群から選択されるプロラミン中に存在するプロラミン配列を含むものである、医薬組成物。
【請求項２】
ＰＢＩＳ配列が、タンパク質をＲＰＢＬＡ発現細胞の小胞体（ＥＲ）に向けるシグナルペプチド配列をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
免疫原性ポリペプチド配列が、
（ｉ）ＨＰＶ  Ｅ７遺伝子によりコードされるポリペプチド、
（ｉｉ）ＨＩＶ−１  ｇａｇ遺伝子によりコードされるポリペプチド、および
（ｉｉｉ）ＨＩＶ−１  ｐｏｌ遺伝子によりコードされるポリペプチド
の群から選択される、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
核酸ワクチンを用いたワクチン接種に先行して、免疫原性ポリペプチドまたは免疫原性ポリペプチドをコードする核酸を含んでなる組成物を用いたプライミングワクチン接種または接種の工程が行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
プライミングワクチン接種または刺激工程に用いられる免疫原性ポリペプチドを含んでなる組成物が、
（ｉ）組換え融合タンパク質（該組換え融合タンパク質はペプチド結合された２つの部分を含み、第一の部分がタンパク粒誘導配列（ＰＢＩＳ）であり、第二の部分が免疫原性ポリペプチドである）を含有する粒子状組換えタンパク粒様会合体（ＲＰＢＬＡ）、
（ｉｉ）免疫原性ポリペプチドをコードする核酸分子、および
（ｉｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸分子（該組換え融合タンパク質はペプチド結合された２つの部分を含み、第一の部分がタンパク粒誘導配列（ＰＢＩＳ）であり、第二の部分が免疫原性ポリペプチドである）
の群から選択され、
ＰＢＩＳが、γ−ゼイン、α−ゼイン、δ−ゼイン、β−ゼイン、イネプロラミンおよびγ−グリアジンからなる群から選択されるプロラミン中に存在するプロラミン配列を含むものである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ワクチンが筋肉内に投与される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、２００８年１０月１０日に出願された米国仮出願第６１／１０４，４０３号の利益を主張するものであり、その開示内容は引用することにより本明細書の一部とされる。
【発明の背景】
【０００２】
技術分野
本発明は、ワクチンまたは接種物用の免疫原特異的アジュバントを提供する。より具体的には、本発明は、組換え融合タンパク質を含有する組換えタンパク粒様会合体（ＲＰＢＬＡ）を含んでなるワクチンまたは接種物アジュバントを提供する。該組換え融合タンパク質は、ペプチド結合された２つの配列を含み、一方の配列はタンパク粒誘導配列（ＰＢＩＳ）であり、他方は、ワクチンまたは接種物に存在するかまたはワクチンまたは接種物によりコードされる病原性ポリペプチド配列の一部に相当するＴ細胞刺激性ポリペプチドである。
【０００３】
背景技術
タンパク粒（ＰＢ）は、タンパク質の蓄積に特化した細胞下のオルガネラ（または大きな小胞、直径約１〜３ミクロンで膜に取り囲まれている）。それらは天然では、種子などのいくつかの特定の植物組織で形成され、発芽や実生成長のための主要なアミノ酸供給源として働く。
【０００４】
貯蔵タンパク質は、ＥＲまたは液胞のいずれかに封入されるべく、シグナルペプチドを介して小胞体（ＥＲ）の管腔に同時翻訳により挿入され(Galili et al., 1993 Trends Cell Biol. 3:437-443)、これらの細胞下コンパートメント内で多量体単位へと組み立てられ、（ＥＲ）由来タンパク粒（ＰＢ）またはタンパク質貯蔵液胞（ＰＳＶ）と呼ばれる特定のオルガネラを発達させる(Okita and Rogers, 1996 Annu. Rev. Plant Physiol Mol. Biol. 47:327-350; Herman and Larkins, 1999 Plant Cell 11:601-613; Sanderfoot and Raikel, 1999 Plant Cell 11:629-642)。
【０００５】
双子葉(dicotiledoneous)植物の貯蔵タンパク質は、７Ｓグロブリンまたはビシリン種、１１Ｓグロブリンまたはレグミン種タンパク質などの主として可溶性のタンパク質であり、他のタンパク質（すなわち、プロテアーゼ阻害剤、タンパク質分解酵素、レクチンなど）、糖類および塩類とともにＰＳＶ内に隔離されている。
【０００６】
ＰＳＶとは対照的に、ＰＢ（１〜３ミクロン）は主として、穀類の疎水性高い貯蔵タンパク質（トウモロコシのゼインおよびコムギのグリアジンなど）であるプロラミンを隔離し、他の補助的タンパク質を欠いている(Herman et al., 1999 Plant Cell 11:601-613)。
【０００７】
現在のところ、ＥＲ体を除き、植物種子以外の組織に見られたＰＢは無い。ＥＲ体は小型（０．２〜０．４マイクロメーター）で、アラビドプシス(Arabidopsis)の葉で傷や昆虫による咀嚼によってのみ形成され、通常の条件下では生じない(Matsushima et al., 2003 Plant J. 33:493-502)。
【０００８】
植物ＰＢの形成、貯蔵タンパク質の組み立ておよび標的化を研究するために遺伝子工学的アプローチが用いられている。アラビドプシスおよびタバコにおいて組換えタンパク質、主として植物貯蔵タンパク質が発現され、封入される場合、ＰＢを含まない植物組織（栄養組織としての）はこれらのオルガネラを「de novo」発達させないことが示されている(Bagga et al., 1997 Plant Cell 9:1683-1696およびBagga et al., 1995 Plant Physiol. 107:13-23, および米国特許第５，９９０，３８４号、および同第５，２１５，９１２号、および同第５，５８９，６１６号;ならびにGeli et al., 1994 Plant Cell 6:1911-1922)。
【０００９】
トウモロコシβ−ゼインは、トランスジェニックタバコ植物で発現されると、葉細胞において新たに形成されたＥＲ由来ＰＢに正確に標的化された(Bagga et al., 1995 Plant Physiol. 107:13-23)。トウモロコシγ−ゼイン、およびアラビドプシス植物で発現された末端切断型γ−ゼインｃＤＮＡもまた、葉の新規なＥＲ由来ＰＢに蓄積する(Geli et al., 1994 Plant Cell 6:1911-1922)。トウモロコシ内胚乳で発現されたリシン豊富γ−ゼイン(Torrent et al. 1997 Plant Mol. Biol. 34(1):139-149)はトウモロコシＰＢに蓄積し、内因性ゼインと同時局在した。α−ゼイン遺伝子を発現するトランスジェニックタバコ植物は、α−ゼインがＰＢを形成できないことが示された。しかしながら、αおよびγ−ゼインが同時発現した場合には、α−ゼインの安定性が高まり、両タンパク質がＥＲ由来タンパク粒内で同時局在した(Coleman et al., 1996 Plant Cell 8:2335-2345)。また、メチオニン豊富な１０ｋＤａ  δ−ゼインで形質転換さされたトランスジェニックダイズでも、新たなＰＢの形成が記載されている(Bagga et al., 2000 Plant Sci. 150:21-28)。
【００１０】
組換え貯蔵タンパク質はまた、ツメガエル(Xenopus)卵母細胞および酵母などの非植物宿主系でも直径約１００〜約４００ｎｍのＰＢ様オルガネラにおいて組み立てられる。Rosenberg et al., 1993 Plant Physiol 102:61-69は、酵母におけるコムギγ−グリアジンの発現を報告している。適正に発現された遺伝子およびタンパク質はＥＲ由来ＰＢに蓄積された。ツメガエル卵母細胞において、Torrent et al., 1994 Planta 192:512-518は、γゼインはまた、そのタンパク質をコードする転写物が卵母細胞に注入された際にも、ＰＢ様オルガネラに蓄積することを示している。α−ゼインを用いたHurkman et al., 1981 J. Cell Biol. 87:292-299およびγ−グリアジンを用いたAltschuler et al., 1993 Plant Cell 5:443-450もツメガエル卵母細胞で同様の結果を得ている。
【００１１】
バイオテクノロジー（遺伝子工学）の分野の基本的功績の１つは、機能性食品的または工業的使用のためのタンパク質を生産するために生物を遺伝子操作できるということである。細菌、酵母、作物および哺乳類細胞培養の発酵培養液から組換えタンパク質を生産および回収する方法が提供されている。宿主細胞におけるタンパク質発現のための種々のアプローチが記載されている。これらのアプローチの不可欠な目的は、タンパク質の発現レベル、タンパク質の安定性およびタンパク質の回収である(Menkhaus et al., 2004 Biotechnol. Prog. 20: 1001-1014; Evangelista et al., 1998 Biotechnol. Prog. 14:607-614)。
【００１２】
タンパク質の回収に伴う問題を解決し得る１つの戦略が分泌である。しかしながら、分泌には、低い発現レベルや産物の不安定性が伴う場合がある。もう１つの戦略は、細胞内の最も有益な場所における組換えタンパク質の蓄積である。この戦略は、テトラペプチドのＣ末端延長（ＨＤＥＬ／ＫＤＥＬ）を操作することにより組換えタンパク質をＥＲに向けることによって広く用いられている(Conrad and Fiedler, 1998 Plant Mol. Biol. 38:101-109)。
【００１３】
異種タンパク質と融合された植物貯蔵タンパク質または貯蔵タンパク質ドメインを含む融合タンパク質が、組換えタンパク質をＥＲに向けるもう１つのアプローチとされている（ＷＯ２００４００３２０７）。１つの興味深い融合戦略が、植物油体の構成タンパク質であるオレオシンと融合された組換えタンパク質の生産である。油体の特異な特徴には、二相系を用いてタンパク質を容易に回収できるという利点がある(van Rooijen and Moloney, 1995 Bio/Technology 13:72-77)。
【００１４】
植物細胞では、異種タンパク質が首尾よく発現されており（総説：Horn et al., 2004 Plant Cell Rep. 22:711-720; Twyman et al., 2003, Trends in Biotechnology 21:570-578; Ma et al., 1995, Science 268: 716-719; Richter et al., 2000 Nat. Biotechnol. 18:1167-1171）、組換えタンパク質の発現がＥＲ由来ＰＢまたはＰＳＶ（ＰＳＶ）に向けられたものもある。Yang et al., 2003 Planta 216:597-603は、イネ種子において、グルテリンおよびグロブリン貯蔵タンパク質の種子特異的プロモーターを用いてヒトリゾチームを発現させた。免疫細胞化学的結果は、組換えタンパク質がＥＲ−ＰＢ内に局在し、内因性のイネグロブリンおよびグルテリンとともに蓄積することを示した。トランスジェニックタバコ植物におけるヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）の糖タンパク質Ｂの発現が、イネのグルテリンプロモーターを用いて行われた(Tackaberry et al., 1999 Vaccine 17:3020-3029)。最近では、Arcalis et al., 2004 Plant Physiology 136:1-10がイネ種子においてＣ末端延長（ＫＤＥＬ）を伴うヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を発現させた。組換えＨＳＡはＰＳＶ内に内因性のイネ貯蔵タンパク質とともに蓄積した。
【００１５】
生物工場としての植物の適用の１つの障害が、下流プロセシングに関してさらなる研究必要であるということである。植物からのタンパク質精製は、植物系の複雑さのために困難な仕事である。抽出物の植物固形分は大きく、濃厚で、比較的高い（９〜２０重量％）（総説Menkhaus et al., 2004 Biotechnol. Prog. 20:1001-1014参照）。現在のところ、組換えタンパク質精製技術には、抽出物の清澄化、脂質および色素を除去するための溶媒処理ならびにいくつかのイオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィーカラムによるタンパク質またはペプチドの精製が含まれる。既存のプロトコールは、各植物宿主系および組換えタンパク質に特異的な溶媒または水溶液の使用に頼るものである。当技術分野では、形質転換宿主から組換えタンパク質を回収するための効率的かつ一般的な手順が必要である。この必要は、特に、植物宿主で生産れた組換えタンパク質を単離しなければならない場合に関係する。宿主およびタンパク質が多様なこと、また、それらの間で物理化学的形質が異なるために、組換え産物を濃縮および回収するには効率的な方法が必要であった。
【００１６】
免疫アジュバントは、ワクチンおよび接種物に対する特異的免疫応答を増強する薬剤である。免疫アジュバントは、ワクチンまたは接種物に配合された際に、全般的または特異的に、その調製物中の免疫原性材料に対する特異的免疫応答を加速化する、延長する、またはその質を高める働きをする任意の物質または処方物と定義することができる。
【００１７】
アジュバントという言葉は、助けるまたは補助するを意味するラテン語の動詞「adjuvare」から来たものである。アジュバントの作用機序は、（１）ワクチンまたは接種物免疫原の生物学的または免疫学的半減期の延長；（２）抗原（免疫原）を提示細胞（ＡＰＣ）への免疫原送達、ならびにＡＰＣによる抗原（免疫原）のプロセシングおよび提示の改善；および（３）免疫調節サイトカインの生産の誘導を含む。
【００１８】
天然の病原体または他の因子の活性を模倣する生物活性の保有は、特に免疫されたヒトまたは他の動物において有効であるべき適切な免疫応答を誘導しなければならないワクチンまたは接種物に関連する。いくつかの新規なワクチンおよび接種物は、完全不活性化または生弱毒ワクチンよりも安全であると考えられる合成、組換えまたは高純度サブユニット免疫原（抗原）からなる。しかしながら、弱毒または死滅病原体ワクチンに一般に伴っている病原体関連免疫調節アジュバント成分は、このような合成、組換えまたは高純度サブユニット免疫原からは除かれ、このため、このような調製物の免疫原性は弱くなっている場合が多い。
【００１９】
食作用は、アポトーシス細胞または微生物そのものなどの大粒子が別の細胞に侵入することを含む。この細胞の大粒子を飲み込む能力は、単細胞生物においておそらく栄養機能として現れたものであるが、複雑な生物はこの食作用機構を付加的な機能を満たすために利用した。例えば、マクロファージ、Ｂ細胞または樹状細胞により行われる免疫原の食作用は生得免疫および適応免疫において重要なプロセスに相当する。実際、食作用およびその後のファゴソームにおける微生物の死滅は細胞内病原体に対する生物の生得的防御の基礎をなしている。さらに、特定のリンパ球を活性化するために食細胞により提供されるファゴソーム管腔における病原体の分解および抗原ペプチドの生産も食作用と適応免疫を結びつける(Jutras et al., 2005 Annual Review in Cell Development Biology. 21:511?527)。
【００２０】
飲み込まれた粒子上および粒子内に存在するタンパク質は、ファゴソーム内の一連の分解性プロテアーゼに遭遇する。さらに、この破壊的環境は、ＭＨＣクラスＩＩ分子と結合することができるペプチドを生じる。新たに形成された免疫原−ＭＨＣクラスＩＩ複合体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞への提示のために細胞表面に送達される(Boes et al., 2002 Nature 418:983-988)。これらの細胞の活性化は、Ｂ細胞の増殖および分化を助けるＩＬ−４およびＩＬ−５などのサイトカインのＴｈ２サブセットを誘導し、体液型免疫応答に関連する。
【００２１】
多くの証拠が、食作用を受けた病原体に対する免疫応答におけるＭＨＣクラスＩＩ経路の明らかな関与に加え、マイコバクテリア属、サルモネラ菌属、ブルセラ属およびリーシュマニア属を含む病原体に由来する免疫原が免疫原の交差提示を惹起し得るということを示している。すなわち、ＭＨＣクラスＩ依存性応答による食作用により飲み込まれた免疫原の提示は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の増殖を促進する(Ackerman et al., 2004 Nature Immunology 5(7):678-684; Kaufmann et al., 2005 Current Opinions in Immunology 17(1):79-87)。
【００２２】
樹状細胞は免疫系を誘導するために中枢的な免疫原提示の役割を果たす(Blander et al., Nature Immunology 2006 10:1029-1035)。数は少ないが、樹状細胞は最も専門性の高いＡＰＣであり、免疫反応を促進および調節する双方の能力を有する(Lau et al. 2003 Gut 52:307-314)。樹状細胞は免疫原の提示、特に、一次免疫応答の誘導に重要であるが、マクロファージは炎症部位において最も顕著なＡＰＣ型であり、壊死およびアポトーシス材料を排除するのに特化されている。マクロファージはＡＰＣとして働き得るだけでなく、それらが活性化される手段に応じて、炎症促進または抗炎症的役割のいずれか遂行し得る。
【００２３】
ＡＰＣが適応免疫（体液性および細胞性）の誘導および調節に中枢的役割を果たしていることを考えれば、これらの細胞による免疫原の認識および食作用は免疫化プロセスにおいて重要な工程であると考えられる。マクロファージによる食作用を研究するために、蛍光粒子の取り込みに基づく多様な技術が開発されている(Vergne et al,. 1998 Analytical Biochemistry 255:127-132)。
【００２４】
獣医学用ワクチンにおける重要な側面は、考えられる種の遺伝的多様性と異なる種で働く遺伝システムの必要性である。野生生物を含む多くの種でこれらの分子について最小限の知識しか得られていないので、この多様性はかなりの程度まで細胞表面マーカーおよびサイトカインなどの免疫モジュレーターへの分子標的技術の使用を制限する。よって、生得的免疫応答の万能活性化シグナル（すなわち、異なる種でも同一である）に頼るアジュバントが好ましいものである。これらの要件を考慮に入れると、粒子状ワクチン送達は獣医学用および野生生物ワクチンの戦略に十分好適である(Scheerlinck et al., 2004 Methods 40:118-124)。
【００２５】
第三世界諸国では、子宮頸癌（ｃｃ）は癌関連の死亡の主因の１つである。この疾病から死亡する女性の約８０％が、早期発見のためのスクリーニングプログラムおよび処置の医療基盤を利用できない貧困諸国に由来する。これに対し、先進世界では、細胞学的スクリーニングプログラムの結果としてここ５０年の間、死亡率は減少している（米国では７０％）[American Cancer Society, Cancer facts and figures 2004. Atlanta, GA.]。外科術、放射線療法または化学療法によるｃｃ患者の処置は、生活の質の著しい低下をもたらす。最適な処置が利用できるとしても、全ｃｃ患者の約４０％がこの疾病で死亡する[Gatta et al., 1998 Eur J Cancer 34(14 Spec.No.):2218?2225]。よって、有効かつ安全な治療用ワクチンの開発が必要とされる。
【００２６】
子宮頸上皮内新生物（ＣＩＮ）およびｃｃなどの前癌状態の発生に必要な事象は、ｈｒ−ＨＰＶのよる感染である[Walboomers et al., 1999 J Pathol 189(1):12-19]。これまでに１２０を超えるＨＰＶタイプが確認され[de Villiers et al., 2004 Virology 324(1):17?27]、そのうち１８がｃｃと関連することが分かっている[Munoz et al., 2003 N Engl J Med 348(6):518-527]。
【００２７】
ＨＰＶ−１６は症例の約５０％の原因となっている[Bosch et al., 1995 J Natl Cancer Inst 87(11):796-802]。ｈｒ−ＨＰＶの癌タンパク質Ｅ７はもっぱら、かつ一貫してＨＰＶ感染腫瘍細胞のより発現されるという事実[von Knebel Doeberitz et al., 1994 J Virol 68(5):2811-2821]により、そのタンパクはｃｃおよびその前悪性異形成に対して向けられる免疫療法の特異的標的に相当する。しかしながら、Ｅ７タンパク質は、細胞周期制御に干渉することにより機能する形質転換活性を有する癌タンパク質である。Ｅ７はｐＲＢ（網膜芽細胞腫）腫瘍サプレッサータンパク質を不活性化することにより細胞増殖調節を変化させ[Dyson et al., 1989 Science 243(4893):934-937; Munger et al., 1992 Cancer Surv 12:197-217]、２つの金属結合モチーフ（Ｃ−ＸＸ−Ｃ）[Edmonds et al., 1989 J Virol 63(6):2650-2656; Watanabe et al., 1990 J Virol 64(1):207-214]。
【００２８】
安全上の理由で、機能的癌遺伝子はヒトに適用することができない。従って、ＨＰＶ−１６  Ｅ７の発癌特性を不活性化する試みがなされた。形質転換能に関連するＥ７癌遺伝子の部位に点突然変異を導入した研究者もいた[Shi et al., 1999 J Virol 73(9):7877-7881;  Smahel et al., 2001 Virology 281(2):231-238]し、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）に限られた単一エピトープを用いた研究者もいた[Doan et al., 2000 Cancer Res 60(11):2810-2815;  Velders et al., 2001 J Immunol 166(9):5366-5373]。しかしながら、これらのアプローチは、ワクチン有効性に潜在的に関連する天然エピトープの望まない欠如を招き得る。
【００２９】
本発明者らの目的は、広範囲のＭＨＣ制限にわたるいくつかまたは可能性のある全ての天然Ｔ細胞エピトープを提供することであった。結論として、患者のＨＬＡ−ハプロタイプについての予備知識は必要でない。このことは特に非近交ヒト集団で重要である。
【００３０】
さらに、ワクチンに存在する総てのＨＬＡ−制限エレメントを含むより強力な免疫応答が誘導され得る。「原理証明」は第一世代の人工ＨＰＶ−１６  Ｅ７遺伝子（ＨＰＶ−１６  Ｅ７ＳＨ）を用いた研究でなされた[Osen et al., 2001 Vaccine 19(30):4276-4286]。その研究では、マウスにおいて再配列された一次配列を有する癌タンパク質がなおＥ７ＷＴ特異的ＣＴＬを誘導するが、形質転換特性を欠いていることが示された。その研究は、１型単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２遺伝子との融合がマウスにおいてＣＴＬ応答を増強するという初期の知見を利用したものである[Michel et al., 2002 Virology 294(1):47-59]。
【００３１】
ＨＩＶ−１ウイルスは、そのＲＮＡを取り巻くタンパク質と糖タンパク質の数層、ならびにタンパク質インテグラーゼおよび逆転写酵素からなる。ＲＮＡはキャプシドタンパク質（ＣＡ）ｐ２４により封入される。このキャプシド環境はまた、インテグラーゼおよび逆転写酵素などの他のウイルスタンパク質も含む。そして、キャプシドは基質タンパク質（ＭＡ）ｐ１７の層のより封入される。この基質タンパク質は脂質二重層またはエンベロープに関連している。
【００３２】
世界のいろいろな地方で流行している１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）サブタイプの大きな多様性は、広域予防ＨＩＶ−１ワクチンの開発の大きな障害となっている。よって、その地方の伝染病により密接に適合するワクチンを開発することが必要であり得る(Morris et al., 2001)。南アフリカでは、サブタイプＣ感染が優勢であり(UNAIDS, 2006)、このサブタイプの単離物が南アフリカでのＤＮＡワクチンの開発に選択された(Williamson et al., 2003)。この候補ワクチンが構築および特性決定されており(van Harmelen et al., 2003)、近く臨床試験で評価される予定である。
【００３３】
ＨＩＶまたはシミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）／シミアン−ヒト免疫不全ウイルス（ＳＨＩＶ）抗原をコードするＤＮＡワクチンが包括的に研究され、動物モデルならびにヒトで体液性応答と細胞性免疫応答の双方を誘導することが示されている[Boyer et al., 1997 J Infect Dis. 176(6):1501-1509; Calarota et al., 1998 Lancet 351(9112):1320-1325; Estcourt et al., Immunol. Rev. 2004 199:144-155; Letvin et al., 1997 Proc Natl Acad Sci U S A. 94(17):9378-9383; Yasutomi et al., 1996 J Virol.70(1):678-681]。しかしながら、ＤＮＡワクチンは安全であることが示されているものの、免疫かがもたらす免疫応答のレベルは低く、一時的である。異種プライム−ブースト免疫計画におけるそれらの使用[Casimiro et al., 2003 J Virol.77(13):7663-7668; Cherpelis et al., 2001 Immunol Lett. 79(1-2):47-55; Leung et al., 2004 AIDS 18(7):991-1001; Pal et al., 2006 Virology 348(2):341-353; Robinson et al., 1999 Int J Mol Med. 4(5):549-555; Suh et al., 2006 Vaccine 24(11):1811-1820. Epub 2005 Oct 25]を含め、ＤＮＡワクチンを増強するための種々のアプローチが試験されている[Barouch et al., 2000 Intervirology 43(4-6):282-287; Hemmi et al., 2003 J Immunol 170(6):3059-3064; Raviprakash et al., 2003 Virology.315(2):345-352]。
【００３４】
ＨＩＶ−１  Ｇａｇ遺伝子は、ＨＩＶウイルス粒子の構造を構成する主要なタンパク質である前駆体タンパク質Ｐｒ５５  Ｇａｇをコードする。ウイルス粒子の成熟時、Ｇａｇはウイルスプロテアーゼにより、キャプシド（ＣＡ）タンパク質ｐ２４、基質タンパク質ｐ１７ならびにタンパク質ｐ７およびｐ６を含むいくつかのより小さなタンパク質へと切断される。
【００３５】
ＨＩＶ−１  Ｐｒ５５ｇａｇ前駆体タンパク質は、非複製かつ非感染性ウイルス様粒子（ＶＬＰ）へと自己集合する能力を有し[Deml et al., 1997 Virology 235(1):26-39; Mergener et al., 1992 Virology 186(1):25-39; Sakuragi et al., 2002 Proc Natl Acad Sci U S A 99(12):7956-7961; Wagner et al., 1994 Behring Inst Mitt  (95):23-34; Wagner et al., 1996 Virology 220(1):128-140]、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）(Montefiori et al., 2001 J Virol. 75(21):10200-10207; Paliard et al., 2000 AIDS Res Hum Retroviruses 16(3):273-282]を含む動物において強い体液性および細胞性免疫応答を惹起する[Deml et al., 1997 Virology 235(1):26-39; Deml et al., 2004 Methods Mol Med 94:133-157; Jaffray et al., 2004 J Gen Virol. 85(Pt 2):409-413]。最近、Chege et al., J Gen Virol 2008 89:2214-2227が、サブタイプＣ  Ｐｒ５５ｇａｇ  ＶＬＰは適合したＤＮＡワクチンで初回免疫されたヒヒを極めて有効に追加免疫することができることを示した。
【００３６】
さらに、ＨＩＶ−１  Ｐｒ５５ｇａｇ  ＶＬＰは安全で、生産が容易であり、キメラ免疫原を含む可能性を有する(Doan et al., 2005; Halsey et al., 2008)。ＨＩＶ−１のものに近いそれらの粒子の性質および大きさは、ＨＩＶ−１  Ｐｒ５５ｇａｇ  ＶＬＰが非粒子状免疫原よりも良好に免疫系を刺激可能とする。
【００３７】
上記のように、ｐ２４タンパク質はウイルス粒子の、外面キャプシド層を形成する。このタンパク質は、ＨＩＶプロテオームの他の部分に比べて高い密度の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを有し(Novitsky et al., J. Virol. 2002 76(20):10155-10168)、これはワクチン候補として用いた場合に、広域の免疫応答を誘導するのにより有効とする。また、ｐ２４抗体の力価が皮下している個体においてＡＩＤＳのリスクが大幅に高まることが示されている。このことは、高い抗ｐ２４抗体力価は無病状態を維持するのに必要である可能性があることを示唆する。
【００３８】
さらに、ＨＩＶ−１  Ｐｒ５５ｇａｇ  ＶＬＰは安全で、生産が容易であり、キメラ免疫原を有する可能性を有する[Doan et al., 2005 Rev Med Virol. 15(2):75-88; Halsey et al., 2008 Virus Res. 2008 133(2):259-268. Epub 2008 Mar 10]。ＨＩＶ−１のものに近いそれらの粒子の性質および大きさは、ＨＩＶ−１  Ｐｒ５５ｇａｇ  ＶＬＰが非粒子状免疫原よりも良好に免疫系を刺激可能とする。
【００３９】
上記のように、ｐ２４タンパク質はウイルス粒子の、外面キャプシド層を形成する。このタンパク質は、ＨＩＶプロテオームの他の部分に比べて高い密度の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを有し(Novitsky et al., J. Virol. 2002 76(20):10155-10168)、これはワクチン候補として用いた場合に、広域の免疫応答を誘導するのにより有効とする。また、ｐ２４抗体の力価が皮下している個体においてＡＩＤＳのリスクが大幅に高まることが示されている。このことは、高い抗ｐ２４抗体力価は無病状態を維持するのに必要である可能性があることを示唆する。
【００４０】
基質タンパク質ｐ１７は、ウイルスの組み立てと放出に必要な膜内結合を促進する(Dorfman et al., 1994 J Virol 68(12):8180-8187]。タンパク質ｐ１７はまた、ウイルスの組込み前複合体の核への輸送にも関与する(Burkinsky et al., 1993)。ｐ２４とともに融合されると、このｐ１７／ｐ２４（ｐ４１）複合体は、ＨＩＶ−１ゲノム中最高密度のＣＴＬエピトープを含む(Novitsky et al., J. Virol. 2002 76(20):10155-10168)。
【００４１】
ＨＩＶ−１逆転写酵素（ＲＴ）は、ＤＮＡ鋳型を作製し、ＲＮＡからＤＮＡを合成するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。それはウイルス複製に不可欠である。ＨＩＶ−１  ＲＴはＨＩＶ−１プロテアーゼ（ＰＲ）によりＰｒ１６０ｇａｇ−ｐｏｌポリタンパク質から切断される。ＨＩＶ−１に対するいくつかのＣＴＬエピトープがＲＴにおいて確認されているが、それらはＧａｇ特異的エピトープに次ぐものであると思われる[Dela Cruz et al., 2000 Int Immunol 12(9):1293-1302]。
【００４２】
いくつかの研究が、免疫応答の増強が異種プライム−ブースト接種計画により達成可能であることを示している。マウスのプライム接種として用いられるｐＴＨＧａｇＣと呼ばれるＨＩＶ−１  ＤＮＡワクチンは、Ｐｒ５５Ｇａｇウイルス様粒子（ＶＬＰ）により有効に追加免疫されることが示されている(Chege et al., J. Gen. Virol. 2008 89:2214-2227)。ｐ２４はＨＩＶプロテオームの他の部分に比べて最も高い密度の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを有するｐ２４を含むタンパク粒の粒子の性質は、免疫系が初回免疫された後に免疫応答を拡大する類似の追加免疫作用を持ち得ると思われた。また、ｐ４１およびＲＴなどの種々のＨＩＶ−１抗原を含むタンパク粒の組合せを用いると、５つのＡＩＤＳ遺伝子、ｇａｇ、逆転写酵素、ポリタンパク質として発現されるｔａｔおよびｎｅｆ遺伝子、ならびに末端切断型ｅｎｖ遺伝子（ｇｐ１５０）を含む多遺伝子ＤＮＡワクチン「ｇｒｔｔｎ」(Burgers et al., AIDS Research and Human Retroviruses 2008 24(2):195-206)の使用において示されているように免疫応答が広がるものと思われた。
【発明の概要】
【００４３】
本発明は、ワクチンまたは接種物用の免疫原特異的アジュバントを意図する。アジュバントは、組換え融合タンパク質を含有する粒子状組換えタンパク粒様会合体（ＲＰＢＬＡ）からなる。組換え融合タンパク質はペプチド結合された２つの部分を含み、一方の配列がプロラミン配列などのタンパク粒誘導配列（ＰＢＩＳ）であり、他方が、その配列がワクチンまたは接種物に存在するかまたはワクチンまたは接種物により誘導される病原性ポリペプチド配列のものであるＴ細胞刺激免疫原性ポリペプチドである。アジュバントは、事前のプライミングワクチン接種(priming vaccination)または接種(inoculation)無しで接種物中に用いられた場合、その病原性配列に対する抗体の生産またはＴ細胞の活性化を誘導しない。意図されるアジュバントは一般に、薬学上許容される希釈剤に溶解または分散された、アジュバントとしての有効量で用いられる。
【００４４】
定義
「抗原」とは、抗体または受容体が結合するものを表して、また、ＣＤ４＋Ｔ細胞の生成など、抗体の生産または細胞応答を誘導するものを表して歴史的に用いられてきた。より最近の用法では抗原の意味を抗体または受容体が結合するものに限定し、「免疫原」という用語は、抗体生産または細胞応答を誘導するものとして用いられる。本明細書で述べられているものが免疫原性かつ抗原性の双方である場合には、それを免疫原というか抗原というかは、一般にその意図される用法に従ってなされる。
【００４５】
「抗原決定基」とは、抗体結合部位またはＴ細胞受容体が免疫学的に結合する抗原の実際の構造的部分を意味する。この用語はまた「エピトープ」と互換的に用いられる。
【００４６】
本明細書において「融合タンパク質」とは、それらの個々のカルボキシ末端およびアミノ末端アミノ酸残基の間のペプチド結合によりエンド−エンド（ヘッド−テール）で機能的に連結されている、自然界では通常連結が見られない少なくとも２つのアミノ酸残基配列を含むポリペプチドを表す。本発明の融合タンパク質は、ワクチンまたは接種物が向けられる病原体（標的）中に存在するＴ細胞刺激ポリペプチド（例えば、ペプチドまたはタンパク質）である第二の配列と連結されたタンパク粒誘導配列（ＰＢＩＳ）のキメラである。
【００４７】
本明細書において「免疫原特異的」とは、意図される組換えアジュバントとより一般的なアジュバントとのアジュバント活性を区別するために用いられる。より詳しくは、意図される免疫原特異的アジュバントは、そのアジュバントのアミノ酸残基配列を含む免疫原に対する細胞（Ｔ細胞）免疫応答を増強し、免疫系を全般的に活性化するのではない。よって、ワクチンまたは接種物はあるアミノ酸残基配列を共通に持つか、またはアジュバントと共通の配列をコードする。
【００４８】
「接種物」は、一般に水もまた含む薬学上許容される希釈組成物中に溶解または分散した免疫原的に有効な量の免疫原性キメラ粒子を含んでなる組成物である。免疫を必要とする、または抗体または活性化Ｔ細胞の誘導が望まれる、哺乳類（例えば、マウス、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、サル、無尾猿またはヒト）または鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒルまたはガチョウ）などの宿主動物に投与した場合に、接種物は接種された宿主動物において、キメラの免疫原と免疫反応する抗体の生産などのＢ細胞および／またはＴ細胞応答（刺激）を誘導し、かつ／または免疫原に応答するＴ細胞を誘導する。「ワクチン」は、ワクチンにより誘導された抗体が免疫原と免疫反応する、または活性化Ｔ細胞がその免疫原に応答するだけでなく、in vivoにおいてその免疫原が由来する病原体と免疫反応し、その病態からの保護を提供するタイプの接種物である。
【００４９】
「Ｔ細胞性免疫」とは、抗体または補体を含まないが、抗原に応答して、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の活性化、および種々のサイトカインの放出を含む免疫応答を意味する。歴史的に免疫系は、免疫の保護機能を体液（細胞不含体液または血清）中に見出すことがでできる体液性免疫と、免疫の保護機能が細胞に関連している細胞性免疫の２つの支流に分けられてきた。ＣＤ４細胞またはヘルパーＴ細胞は種々の病原体に対して保護を提供する。Ｔ細胞性免疫は、外来抗原に感受したＴ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞が標的細胞を攻撃し、それらを溶解する場合に生じる免疫応答である。細胞傷害性を指示する他、Ｔ細胞はマクロファージを活性化するリンホカインの生産を刺激することができる。細胞媒介免疫応答は、病原体、自己免疫疾患、ある種の後天的アレルギー、ある種の腫瘍および他の免疫反応に対する防御において重要である。
【発明の具体的説明】
【００５０】
本発明は、ワクチンまたは接種物用の免疫原特異的アジュバントを意図する。このアジュバントは、組換え融合タンパク質を含有する粒子状組換えタンパク粒様会合体（ＲＰＢＬＡ）からなる。組換え融合タンパク質は、ペプチド結合された２つの部分を含み、一方の配列が、好ましいプロラミン配列などのタンパク粒誘導配列（ＰＢＩＳ）であり、他方が、その配列が（ａ）ポリペプチド含有ワクチンまたは接種物中に存在する病原性ポリペプチド配列中に存在するか、または（ｂ）核酸ワクチンまたは接種物によりコードされるＴ細胞刺激免疫原性もしくは接種(inoculation)またはさらなる免疫原による事前のプライミング無しで宿主動物に用いられる濃度で、その宿主動物において、その病原性配列と免疫反応しないか、またはその病原性配列に対してＴ細胞の活性化を誘導する抗体の生産を誘導しない。
【００５１】
本発明はまた、それを必要とする被験体において免疫原性ペプチドに対するＴ細胞性免疫応答を誘導する方法を意図し、その方法は、それを必要とする被験体への、
（ｉ）組換え融合タンパク質（該組換え融合タンパク質はペプチド結合された２つの部分を含み、第一の部分がタンパク粒誘導配列（ＰＢＩＳ）であり、第二の部分が免疫原性ポリペプチドである）を含有する粒子状組換えタンパク粒様会合体（ＲＰＢＬＡ）および
（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸分子（該組換え融合タンパク質はペプチド結合された２つの部分を含み、第一の部分がタンパク粒誘導配列（ＰＢＩＳ）であり、第二の部分が免疫原性ポリペプチドである）
の群から選択されるワクチンの投与を含んでなる。
【００５２】
好ましい実施態様では、本発明の方法は、第一の部分のＰＢＩＳ形成部分がプロラミン配列を含むＲＰＢＬＡを用いて行われる。さらにより好ましい実施態様では、プロラミン配列は、γ−ゼイン、α−ゼイン、δ−ゼイン、β−ゼイン、イネプロラミンおよびγ−グリアジンからなる群から選択されるプロラミン中に存在する。
【００５３】
好ましい実施態様では、ＰＢＩＳ配列は、タンパク質をＲＰＢＬＡ発現細胞の小胞体（ＥＲ）に向けるシグナルペプチド配列をさらに含む。
【００５４】
好ましい実施態様では、ＲＰＢＬＡを形成する融合タンパク質に用いられる免疫原性ペプチドは、Ｔ細胞免疫応答を刺激し得るペプチドである。
【００５５】
別の好ましい実施態様では、本発明の方法は、免疫原性ポリペプチド配列が
（ｉ）ＨＰＶ  Ｅ７遺伝子によりコードされるポリペプチド、
（ｉｉ）ＨＩＶ−１  ｇａｇ遺伝子によりコードされるポリペプチド、および
（ｉｉｉ）ＨＩＶ−１  ｐｏｌ遺伝子によりコードされるポリペプチド
の群から選択される、第二の部分を含んでなるＲＰＢＬＡを用いて行われる。
【００５６】
好ましい実施態様では、本発明の方法は、in vitroにおいて精製組換え融合タンパク質から組み立てられる粒子状組換えタンパク粒様会合体（ＲＰＢＬＡ）を用いて行われる。
【００５７】
より好ましい実施態様では、本発明の方法の投与工程に先行して、免疫原性ポリペプチドまたは該免疫原性ポリペプチドをコードする核酸を含んでなる組成物を用いたプライミングワクチン接種または接種(inoculation)の工程が行われる。
【００５８】
さらにより好ましい実施態様では、プライミングワクチン接種または刺激工程に用いられる免疫原性ポリペプチドを含んでなる組成物は、
（ｉ）組換え融合タンパク質（該組換え融合タンパク質はペプチド結合された２つの部分を含み、第一の部分がタンパク粒誘導配列（ＰＢＩＳ）であり、第二の部分がＴ細胞刺激免疫原性ポリペプチドである）を含有する粒子状組換えタンパク粒様会合体（ＲＰＢＬＡ）、
（ｉｉ）免疫原性ポリペプチドをコードする核酸分子、および
（ｉｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸分子（該組換え融合タンパク質はペプチド結合された２つの部分を含み、第一の部分がタンパク粒誘導配列（ＰＢＩＳ）であり、第二の部分が免疫原性ポリペプチドである）
の群から選択される。
【００５９】
好ましい実施態様では、ＲＰＢＬＡを形成する融合タンパク質に用いられる免疫原性ペプチドは、Ｔ細胞免疫応答を刺激し得るペプチドである。
【００６０】
より好ましい実施態様では、ワクチンは筋肉内に投与する。
【００６１】
別の態様では、本発明は、それを必要とする被験体において、免疫原性ペプチドに対してＴ細胞性免疫応答を誘導する方法で用いるためのワクチンに関し、該ワクチンは、
（ｉ）組換え融合タンパク質（該組換え融合タンパク質はペプチド結合された２つの部分を含み、第一の部分がタンパク粒誘導配列（ＰＢＩＳ）であり、第二の部分が免疫原性ポリペプチドである）を含有する粒子状組換えタンパク粒様会合体（ＲＰＢＬＡ）および
（ｉｉ）融合タンパク質をコードする核酸分子（該組換え融合タンパク質はペプチド結合された２つの部分を含み、第一の部分がタンパク粒誘導配列（ＰＢＩＳ）であり、第二の部分が免疫原性ポリペプチドである）
の群から選択される。
【００６２】
意図されるアジュバントは、抗病原体ワクチンまたは接種物とともに、または抗病原体ワクチンまたは接種物に対するブーストとして別に投与することができる。このようなワクチンまたは接種物は、細菌もしくはウイルスなどの弱毒生病原体もしくは死滅病原体、病原体のあるタンパク質部分のみを含むサブユニットワクチンまたは接種物、または担体に結合されたポリペプチドからなる免疫原を含むワクチンもしくは接種物（該ワクチンまたは接種物の免疫原性部分はアジュバントにも存在するポリペプチド配列を含む）を含み得る。このワクチンまたは接種物は、ＤＮＡまたはＲＮＡワクチンなどの核酸調製物であり、この核酸は、アジュバントにも存在する免疫原性アミノ酸配列をコードする。ワクチンおよび接種物はそれ自体周知のものである。
【００６３】
意図されるアジュバントは、発現されたＲＰＢＬＡの調製物として、またはＲＰＢＬＡをコードする一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ配列などの核酸調製物として投与することができる。後者の場合には、ＲＰＢＬＡは宿主動物においてin vivoで発現される。いずれの場合でも、アジュバント組成物を形成するために発現されたＲＰＢＬＡまたは核酸が溶解または分散される培地も周知である。
【００６４】
ＲＰＢＬＡの特定の部分をコードする例示的核酸配列は以下に示されている。当技術分野で周知のように、異なる動物においてアミノ酸残基をコードするには特定のコドンが好ましく、結果として、当業者は所望の発限度を得るために特定の核酸配列を修正することができる。さらに、ヒトを含む動物宿主において外来核酸およびそれらのコードされるタンパク質を発現させるためにはいくつかのベクターが周知である。発現すると、コードされているポリペプチドはin vivoにおいて自己組み立てをしてＲＰＢＬＡを形成する。
【００６５】
ＨＩＶ−１ウイルスに関するいくつかの例示的アジュバントのＴ細胞刺激免疫原性ポリペプチド部分を以下に述べる。これらのアジュバントでは、ｇａｇ遺伝子の全部分を含んでなるＤＮＡワクチンが用いられる。ＨＩＶ−１  ｇａｇ遺伝子は、Ｐ２４キャプシド（ＣＡ）、Ｐ１７マトリックス（ＭＡ）、および２つのヌクレオキャプシドタンパク質（ＮＣ）Ｐ６とＰ９の４つのタンパク質をコードする。例示的アジュバントの融合タンパク質は、ｇａｇによりコードされるＰ２４配列またはＰ２４とＰ１７配列の融合から得られるＰ４１配列、およびＨＩＶ−１  ｐｏｌ遺伝子によりコードされる逆転写酵素（ＲＴ）を含む。
【００６６】
同様に、免疫原は、そのＴ細胞刺激免疫原性ポリペプチド部分が、以下のＴ細胞エピトープの表における表面タンパク質のＰｒｅＳ１および／またはＰｒｅＳ２部分を含む表面タンパク質の例示されている配列を含むアジュバントを使用することができるので、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対するワクチンまたは接種物は、表面（ＨＢｓＡｇ）タンパク質の１以上を用いる。このようなワクチンの１つに、酵母細胞で生産され、Merck Research Laboratoriesにより開発されたＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に由来する非感染性サブユニットウイルスワクチンである、ＲＥＣＯＭＢＩＶＡＸ  ＨＢ（登録商標）Ｂ型肝炎ワクチンの名称で販売されているものがある。同様に、ＨＢＶコアに基づく米国特許第７，３５１，４１３号のワクチンは、以下のＴ細胞エピトープの表に示される１以上のコア配列の使用により、アジュバントを提供することができる。さらなるアジュバントは、以下の表または文献から得られる他のＴ細胞エピトープの配列を用いて、本明細書に述べられているように作製することができる。
【００６７】
意図されるアジュバントは一般に、アジュバント組成物として薬学上許容される希釈剤中に溶解または分散された、アジュバントとしての有効量で用いられる。使用量は種々の宿主動物で使用するＴ細胞刺激免疫原性ポリペプチドおよび使用する構築物によって広く異なり得る。典型的な量は、宿主体重１キログラム（ｋｇ）当たりＲＰＢＬＡ約１マイクログラム（μｇ）（μｇ／ｋｇ）〜宿主体重１キログラム（ｋｇ）当たりＲＰＢＬＡ約１ミリグラム（ｍｇ）（ｍｇ／ｋｇ）である。より通常の量は、約５μｇ／宿主体重ｋｇ〜約０．５ｍｇ／宿主体重ｋｇである。
【００６８】
希釈剤は一般に水性であり、１以上の付加的アジュバント、バッファー、塩および増粘剤を含み得る。希釈剤の成分は、以下に述べるように、ワクチンまたは接種物中にしばしば存在するものである。
【００６９】
タンパク粒およびタンパク粒誘導配列
タンパク粒（ＰＢ）は唯一種子で適宜そう呼ばれているので、他の植物器官および非高等植物で生産される類似の構造は一般に合成ＰＢまたは「組換えタンパク粒様集合物」（ＲＰＢＬＡ）と呼ばれる。このようなＲＰＢＬＡは、細胞の小胞体（ＥＲ）と会合して見られる膜に封入された融合タンパク質である。
【００７０】
「精製ＲＰＢＬＡ」は、通常メルカプタン含有試薬での化学的還元により膜が除去されたＲＰＢＬＡの膜不含調製物、および膜および他の発現関連不純物から融合タンパク質を遊離させるためのクロマトグラフィー的手段によって精製された融合タンパク質である。得られた精製タンパク質はその後、in vitroで再組み立てされて精製ＲＰＢＬＡ粒子を形成する。その粒子の再形成は一般に、塩および酸化環境の存在下、水性組成物中で起こる。このような精製ＲＰＢＬＡの形成を以下に示す。
【００７１】
意図されるＲＰＢＬＡは、細胞の形質転換に用いる核酸に対して外来の細胞で発現される組換え生産される融合タンパク質（ポリペプチド）である。ポリペプチドが発現される細胞は宿主細胞であり、細胞または無傷の生物の細胞であり得る。無傷の生物はそれ自体、細菌もしくは真菌などの単細胞生物、または多細胞植物または動物（ヒトを含む）の群であり得る。ヒトが宿主である場合、そのヒトは核酸コード型のアジュバントのレシピエントであり、アジュバントは処置計画の一部として投与される。
【００７２】
生きている生物では、タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸残基配列は、遺伝コードを介して、そのタンパク質をコードする遺伝子のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列に直接関連する。よって、周知の遺伝コードの縮重により、所望により同じ融合タンパク質アミノ酸残基配列をコードするが、前述の遺伝子配列と、２つの配列が高ストリンジェンシーではハイブリダイズしないが、中ストリンジェンシーではハイブリダイズするように十分に異なるように、さらなるＤＮＡおよび対応するＲＮＡ配列（核酸）を作製することができる。
【００７３】
高ストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＣ中、約５０℃〜５５℃の温度でのｏハイブリダイゼーションと１〜３×ＳＳＣ中、６８℃の温度での最終洗浄を含んでなると定義することができる。中ストリンジェンシー条件は、０．２〜０．３Ｍ  ＮａＣｌ中、約５０℃〜約６５℃の温度でのハイブリダイゼーション、次いで、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）中、約５０℃〜約５５℃での洗浄を含んでなる。
【００７４】
本明細書では、（１）目的のタンパク粒誘導配列（ＰＢＩＳ）およびポリペプチドを含む融合タンパク質それ自体をコードする、またはその相補物をコードする核酸配列（ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列）も意図される。周知のように、意図される核酸配列などの核酸配列は、本明細書の他所に述べられているように、適当な発現系において適当なプロモーターを機能的に連結されている場合に発現される。
【００７５】
種々の宿主がしばしば、特定のアミノ酸残基をコードするために用いられる特定のコドンに優先性を有する。このようなコドンの優先性は周知であり、所望の融合タンパク質配列をコードするＤＮＡ配列は、例えば、融合タンパク質が発現される特定の宿主に関して宿主に好ましいコドンが用いられるように、in vitro突然変異誘発を用いて変更することができる。
【００７６】
ＲＰＢＬＡは通常、約０．５〜約３ミクロン（μ）、通常には約１μの直径を有する一般に球形で存在する。場合によっては、ＲＰＢＬＡは不定形で、寸法が広く異なる場合があるが、なおＥＲとの会合が見られる。
【００７７】
ＲＰＢＬＡの密度は一般に、内因性宿主細胞タンパク質の実質的に総てのものよりも大きく、一般に約１．１〜約１．３５ｇ／ｍｌである。意図されるＲＰＢＬＡが高密度なのは、組換え融合タンパク質の多量体としての組み立ておよび蓄積の一般的能力のためである。
【００７８】
アジュバントとして用いる意図されるＲＰＢＬＡは植物で発現される必要はない。むしろ、公開米国出願第２００６０１２１５７３号に開示されているように、ＲＰＢＬＡは他の形質転換真核生物、特に形質転換哺乳類細胞で発現させることができる。
【００７９】
アジュバントＲＰＢＬＡの融合タンパク質は、天然タンパク質または遺伝子操作核酸により発現されるポリペプチドに見られるように、ペプチド結合によりともに連結された２つのタンパク質配列を含む。意図される融合タンパク質では、一方の配列がプロラミンの配列などのタンパク粒誘導配列（ＰＢＩＳ）であり、他方が生物学的に活性な免疫原性ポリペプチドである。この２つの部分のいずれかは融合タンパク質のＮ末端にあってもよい。しかしながら、ＰＢＩＳをＮ末端に持つことが好ましい。
【００８０】
意図されるタンパク粒誘導配列（ＰＢＩＳ）は好ましくは、高等植物由来の全部または一部である。ＰＢＩＳの例示的な限定されない例としては、貯蔵タンパク質または修飾貯蔵タンパク質、例えば、プロラミンまたは修飾プロラミン、プロラミンドメインまたは修飾プロラミンドメインが挙げられる。プロラミンはShewry et al., 2002 J. Exp. Bot. 53(370):947-958に総説されている。好ましいＰＢＩＳ配列は、本明細書に述べられているγ−ゼイン、α−ゼイン、δ−ゼイン、β−ゼイン、イネプロラミンおよびγ−グリアジンなどのプロラミン化合物配列中に存在する。
【００８１】
ＰＢＩＳは、ＲＰＢＬＡ発現細胞の小胞体（ＥＲ）にタンパク質を向ける配列を含む。その配列はしばしばリーダー配列またはシグナルペプチドと呼ばれ、そのＰＢＩＳの残りの部分と同じ植物に由来してもよいし、あるいは異なる植物または動物または真菌に由来してもよい。例示的シグナルペプチドとしては、ＷＯ２００４００３２０７（ＵＳ２００４０００５６６０）に示されている１９残基のγ−ゼインシグナルペプチド配列、α−グリアジンの１９残基のシグナルペプチド配列または２１残基のγ−グリアジンシグナルペプチド配列（Altschuler et al., 1993 Plant Cell 5:443-450; Sugiyama et al., 1986 Plant Sci. 44:205-209;ならびにRafalski et al., 1984 EMBO J 3(6):1409-11415およびその中の引用を参照)がある。ＰＲ１０クラスの病原関連タンパク質は２５残基のシグナルペプチド配列を含み、これも本明細書において有用である。同様の機能を有する他の植物および動物由来のシグナルペプチドも文献で報告されている。
【００８２】
タンパク質をＥＲに向ける役割を担うシグナルペプチドの特徴は包括的に研究されている(von Heijne et al., 2001 Biochim. Biophys. Acta Dec 12 1541(1-2):114-119)。シグナルペプチドは一次構造に相同性を持たないが、中央の疎水性ｈ−領域と親水性ＮおよびＣ末端フランキング領域の共通の三部分構造を有する。これらの類似性と、タンパク質が明らかに共通の経路を用いてＥＲ膜を介して輸送されるという事実は、異なるタンパク質間または異なる門に属す異なる生物に由来するタンパク質間であってもシグナルペプチドを交換することを可能とする（Martoglio et al., 1998 Trends Cell Biol. Oct; 8(10):410-415参照）。よって、ＰＢＩＳは、高等植物とは異なる門に由来するタンパク質のシグナルペプチドを含み得る。
【００８３】
全プロラミン配列を使用する必要はないと理解すべきである。むしろ、以下に述べるように、全プロラミン配列を使用することができるが、必要なのは一部だけである。
【００８４】
トウモロコシの貯蔵タンパク質であるγ−ゼイン（ＤＮＡおよびアミノ酸残基配列を以下に示す）は、４つのトウモロコシプロラミンのうちの１つであり、トウモロコシ内胚乳中の全タンパク質の１０〜１５％に相当する。他の穀類プロラミンについては、αおよびγ−ゼインは粗面ＥＲの細胞質側の膜結合ポリソーム中で生合成され、管腔内で組み立てられ、その後、ＥＲ由来タンパク粒中に隔離される(Herman et al., 1999 Plant Cell 11:601-613; Ludevid et al., 1984 Plant Mol. Biol. 3:277-234; Torrent et al., 1986 Plant Mol. Biol. 7:93-403)。
【００８５】
γ−ゼインは、ｉ）１９アミノ酸のペプチドシグナル、ｉｉ）ヘキサペプチドＰＰＰＶＨＬの８つのユニットを含むリピートドメイン（配列番号２）［（５３アミノ酸残基（ａａ）］、ｉｉｉ）プロリン残基が他のアミノ酸に変更されたＰｒｏＸドメイン（２９ａａ）およびｉｖ）疎水性システイン豊富Ｃ末端ドメイン（１１１ａａ）の４つの特徴的なドメインからなる。
【００８６】
γ−ゼインのＥＲ由来ＲＰＢＬＡ中での組み立て能は種子に限定されない。実際、γ−ゼイン遺伝子はトランスジェニックアラビドプシス植物で構成的に発現された場合、この貯蔵タンパク質は葉肉細胞のＥＲ由来ＰＢＬＳ内に蓄積された(Geli et al., 1994 Plant Cell 6:1911-1922)。このγ−ゼインのＥＲ由来タンパク粒への堆積を担うシグナルを探したところ（プロラミンはＥＲ保持のためのＫＤＥＬシグナルを持たない）、タンデムリピートドメインを含む〆プロリン豊富Ｎ末端ドメインがＥＲ保持に必要であったことが示された。この研究ではまた、Ｃ末端ドメインがタンパク粒形成にも関与している可能性があることが示唆されたが、最近のデータ（ＷＯ２００４００３２０７Ａ１）では、ＥＲにおける保持およびタンパク粒形成の誘導にはプロリン豊富Ｎ末端ドメインが必要かつ十分であることを示されている。しかしながら、これらのドメインがタンパク粒の組み立てを促進する機構はまだ知られていなが、in vitro研究からの証拠は、γ−ゼインのＮ末端部分が規則正しい構造に自己組み立て可能であることを示唆している。
【００８７】
γ−ゼインに基づくＰＢＩＳは、少なくとも１つのリピートおよびＰｒｏＸドメインのアミノ末端９残基、より好ましくは、全Ｐｒｏ−Ｘドメインを含むことが好ましい。γ−ゼインのＣ末端部分は必要ではないが、存在してもよい。それらの配列はＵＳ２００４０００５６６０に示され、それぞれＲＸ３およびＰ４と呼ばれ、以下にも示す。
【００８８】
α、β、δおよびγの４つの異なるタイプのゼインがある。それらは内胚乳発達の際にＥＲ由来タンパク粒中に連続的に蓄積する。β−ゼインおよびδ−ゼインはトウモロコシＰＢ中には多量には蓄積しないが、それらは栄養組織中で安定であり、タバコ植物で発現させた場合にＥＲ由来タンパク粒様構造に堆積された(Bagga et al., 1997 Plant Cell Sep 9(9):1683-1696) 。この結果は、β−ゼインならびにδ−ゼインが、ＥＲ保持およびＰＢ形成を誘導し得ることを示唆する。
【００８９】
コムギプロラミン貯蔵タンパク質グリアジンはＫ／ＨＤＥＬを欠いたタンパク質群であり、ＥＲを介したその輸送は複雑であると思われる。これらのタンパク質はＥＲ内に隔離され、そこで保持されて高密度タンパク粒へとパッケージングされるか、またはゴルジ体によってＥＲから液胞へ輸送される(Altschuler et al., 1993 Plant Cell 5:443-450)。
【００９０】
グリアジンは、別々に折りたたまれた２つの自律的領域を含む天然キメラであると思われる。Ｎ末端はグルタミンおよびプロリン豊富な約７〜約１６のタンデムリピートからなる。タンデムリピートの配列は異なるグリアジン間で異なるが、１つまたはその他のコンセンサス配列ＰＱＱＰＦＰＱ（配列番号３）、ＰＱＱＱＰＰＦＳ（配列番号４）およびＰＱＱＰＱ（配列番号５）に基づく。このタンパク質のＣ末端領域は分子内ジスルフィド結合を形成する６〜８つのシステインを含む。Altschuler et al.らの研究は、Ｎ末端領域とコンセンサス配列がγ−グリアジンからのＥＲにおけるＰＢ形成を担っていることを示す(Altschuler et al., 1993 Plant Cell 5:443-450)。
【００９１】
例示的な有用プロラミン型配列は、下表にそれらのＧｅｎＢａｎｋ識別番号とともに示されている。
【００９２】
【表１】
0005667062.tif 000002
【００９３】
さらなる有用な配列は、Altschul et al., 1997 Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されているように、以下に示すものなどのクエリーを用いて、全非冗長GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF（環境サンプルを除く）データベースでＢＬＡＳＴ検索を行うことによって得られる。
【００９４】
【化１】
0005667062.tif 000003
【００９５】
例示的修飾プロラミンは、（ａ）シグナルペプチド配列、（ｂ）タンパク質γ−ゼインのリピートドメインヘキサペプチドＰＰＰＶＨＬ（配列番号２）の１以上のコピーの配列（全ドメインは８つのヘキサペプチドユニットを含む）および（ｃ）γ−ゼインのＰｒｏＸドメインの全部または一部の配列を含む。例示的な特定の修飾プロラミンはＲ３、ＲＸ３およびＰ４として以下に示されるポリペプチドを含む（そのＤＮＡおよびアミノ酸残基配列も以下に示す）。
【００９６】
特に好ましいプロラミンは、公開出願ＷＯ２００４００３２０７に開示されているγ−ゼインおよびその成分部分、イネｒＰ１３タンパク質および２２ｋＤａトウモロコシα−ゼインおよびそのＮ末端断片を含む。γ−ゼイン、イネおよびα−ゼインタンパク質のＤＮＡおよびアミノ酸残基配列を以下に示す。
【００９７】
２７ｋＤのγ−ゼイン
【化２】
0005667062.tif 000004
0005667062.tif 000005
【００９８】
ＲＸ３
【化３】
0005667062.tif 000006
【００９９】
Ｒ３
【化４】
0005667062.tif 000007
【０１００】
Ｐ４
【化５】
0005667062.tif 000008
【０１０１】
Ｘ１０
【化６】
0005667062.tif 000009
【０１０２】
クローンと相同な１３ｋＤのイネプロラミンｒＰ１３−ＡＢ０１６５０４  Sha et al., 1996 Biosci. Biotechnol. Biochem. 60(2):335-337; Wen et al., 1993 Plant Physiol. 101(3):1115-1116; Kawagoe et al., 2005 Plant Cell 17(4):1141-1153; Mullins et al., 2004 J. Agric. Food Chem. 52(8):2242-2246; Mitsukawa et al., 1999 Biosci. Biotechnol. Biochem. 63(11):1851-1858
【化７】
0005667062.tif 000010
【０１０３】
２２ｋＤのトウモロコシα−ゼインの２２ａＺｔＮ末端断片−Ｖ０１４７５  Kim et al., 2002 Plant Cell 14(3):655-672; Woo et al., 2001 Plant Cell 13(10):2297-2317; Matsushima et al., 1997 Biochim. Biophys. Acta 1339(1):14-22; Thompson et al., 1992 Plant Mol. Biol. 18(4):827-833
【化８】
0005667062.tif 000011
【０１０４】
γ−グリアジン前駆体−ＡＡＡ３４２７２−Scheets et al., 1988 Plant Sci. 57:141-150
【化９】
0005667062.tif 000012
0005667062.tif 000013
【０１０５】
βゼイン−ＡＦ３７１２６４−Woo et al., (2001) Plant Cell 13 (10), 2297-2317
【化１０】
0005667062.tif 000014
【０１０６】
δゼイン１０ｋＤ−ＡＦ３７１２６６−Woo et al., (2001) Plant Cell 13 (10), 2297-2317、およびKirihara et al., (1988) Gene. Nov 30;71(2):359-70
【化１１】
0005667062.tif 000015
【０１０７】
シグナルペプチド
【化１２】
0005667062.tif 000016
【０１０８】
Ｔ細胞刺激免疫原性ポリペプチド
文献で、多数のＴ細胞刺激免疫原性ポリペプチド配列が同定されている。一部のリストを下表に、１文字コードを用いて示す。
【０１０９】
【表２】
0005667062.tif 000017
0005667062.tif 000018
0005667062.tif 000019
【０１１０】
引用文献：
【表３】
0005667062.tif 000020
【０１１１】
好ましいＴ細胞刺激免疫原性配列の群はＨＰＶ−１６のＥ７遺伝子に存在する。これまでに述べられている。治療用ＤＮＡワクチン候補[Osen et al., 2001 Vaccine 19(30):4276?4286]を臨床試験に用いるためのワクチンへと転じるため、安全性をさらに高めた。このために、異種遺伝子を融合させた。むしろ、免疫原性は遺伝子の前にＫｏｚａｋ配列[Kozak et al., 1987 Nucleic Acids Res 15(20):8125?8148]を置くことにより増強された[Steinberg et al., 2005 Vaccine 23(9):1149-1157]。ヒトに適用可能である[Hanke et al., 2000 Nat Med 6(9):951?955]プラスミド−ベクターｐＴＨａｍｐ[Hanke et al., (1998) Vaccine 16(4):426?435]が選択された。多くの発現ベクターが知られており、ＤＮＡワクチンに用いるために利用可能である。例えば、米国特許第７，３５１，８１３Ｂ２号ならびにＥＰ１０２６２５３Ｂ１およびその中の引用を参照。
【０１１２】
より重要なことには、Ｅ７はそれ自体、再設計されたものである。配列は、タンパク質の形質転換特性に重要な場所（ｐＲＢ−結合部位、Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｃモチーフ）で正確に分析され、「コア」遺伝子として「シャッフルされた」順序で再組み立てされている。この配列はヒトに最適な（マウスとほぼ同一）コドンであった。切り出しにより破壊された元の接合部は、野生型配列を再構成する組換え事象を最小限にするために非コドン至適化配列を用いた「附属部分」として付加された（図６も参照）。
【０１１３】
腫瘍保護および退縮研究で、腫瘍ワクチンの免疫原性および有効性に対する第一印象が得られる。しかしながらこれらの研究は、ヒトにおいて誘導される応答を完全に反映するものではない。抗原負荷樹状細胞（ＤＣ）によるヒトリンパ球の「in vitro免疫」をヒト応答のモデルとして使用することができる[Nonn et al., 2003 J Cancer Res Clin Oncol 129(9):511?520]。ＤＮＡトランスフェクションによるＤＣの負荷は好適な技術であり[Lohmann et al., 2000 Cancer Gene Ther 7(4):605?614]、特異的Ｔ細胞プライミングによりＤＮＡワクチン候補の潜在的免疫原性が確認される。
【０１１４】
以下に示される結果は、第二世代のＨＰＶ−１６  Ｅ７ＳＨ  ＤＮＡワクチン候補がマウスにおいてin vivoで、また、ヒトリンパ球のin vitro免疫の後に特異的免疫を誘導し、従って、安全な治療用ＨＰＶ−ワクチンを提供し得ることを示す。
【０１１５】
ＨＰＶ−１６  Ｅ７ＳＨタンパク質を発現する遺伝子の配列は５’から３’方向へ次の通りである。
【化１３】
0005667062.tif 000021
【０１１６】
好ましいＴ細胞刺激免疫原性配列ももう１つの群はＨＩＶ−１に存在する。特に好ましい実践では、ＨＩＶ−１に含まれるポリペプチド配列はＨＩＶ−１  ｇａｇ遺伝子によりコードされる。よって、これらの配列は、ｇａｇ遺伝子によりコードされる〆Ｐ２４、Ｐ１７、Ｐ６またはＰ９タンパク質、またはＰ４１ポリペプチドなどのポリペプチドに存在する。
【０１１７】
特定のＴ細胞刺激免疫原性配列はそれ自体、ＨＩＶ−１または他のいずれかの病原体に一個のポリペプチドとして存在する必要はない。むしろ、このような配列は、病原性ゲノムのオープンリーディングフレームによりコードされる一個のポリペプチドまたはタンパク質性材料の一部として存在する。
【０１１８】
本明細書で有用な特定のＴ細胞刺激免疫原性配列を以下に示す。
【化１４】
0005667062.tif 000022
【０１１９】
【化１５】
0005667062.tif 000023
【０１２０】
【化１６】
0005667062.tif 000024
0005667062.tif 000025
【０１２１】
【化１７】
0005667062.tif 000026
0005667062.tif 000027
【０１２２】
【化１８】
0005667062.tif 000028
【０１２３】
意図されるアジュバントのＴ細胞刺激免疫原性は、周知の種々の技術によって測定することができる。有用な実践では、宿主動物に意図されるＲＰＢＬＡワクチンまたは接種物を接種し、その後、末梢単核血液細胞（ＰＭＢＣ）を回収する。次に、これらのＰＭＢＣをin vitroにおいて生物学的に活性なポリペプチド（Ｔ細胞免疫原）の存在下で、約３〜４日の期間培養する。培養されたＰＭＢＣを次に増殖またはＩＬ−２、ＩＦＮ−γのＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインの分泌に関してアッセイする。Ｔ細胞活性化に関するアッセイは当技術分野で周知である。例えば、米国特許第５，４７８，７２６号およびその中に引用されている技術を参照。
【０１２４】
意図されるアジュバントは一般に、回収されたＲＰＢＬＡ粒子から、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、酢酸緩衝生理食塩水（ＡＢＳ）またはリンゲル溶液などの、水性組成物を形成するための生理学的に耐用性のある（許容される）希釈ビヒクル中にＲＰＢＬＡを分散させることにより調製される。希釈ビヒクルはまた、周知のように、落花生油、スクアランおよびスクアレンなどの油性材料を含むこともできる。
【０１２５】
有効成分としてタンパク質性材料を含むアジュバントの調製も当技術分野で十分に理解されている。一般に、このようなアジュバントは、溶液または懸濁液のいずれかとして非経口剤形で調製され、また、注射前に液体に溶解または懸濁させるのに好適な固体形態で調製することもできる。調製物を乳化させることもでき、特に好ましい。
【０１２６】
免疫原的に活性なＲＰＢＬＡは多くの場合、薬学上許容され、かつ、有効成分に適合する賦形剤と混合される。好適な賦形剤は、例えば、デキストロース、グリセロールまたはエタノールなどおよびその組合せである。さらに所望により、アジュバントは、組成物の免疫原的有効性を増強する、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの微量の補助物質を含むことができる。
【０１２７】
さらに詳細に述べなくとも、当業者ならば以上の説明および以下に詳説される実施例を用いて本発明を最大限に利用できるものと考えられる。よって、以下の好ましい具体的実施態様は単に例示であって、開示の残りの部分を何ら限定するものではないと解釈される。
【実施例】
【０１２８】
実施例１：プラスミドの構築および植物の形質転換
クローニングされたＳｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａｎ  ＨＩＶ単離株Ｄｕ４２２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ５４４０１０）からの、ＨＩＶ−１  ｐ２４、ｐ４１およびＲＴをコードするＤＮＡを、ＰＣＲを用いてＺｅｒａ（登録商標）と融合し、その後、大腸菌で、Ａ．ツメファシエンス(A.tumefaciens)バイナリー発現ベクターｐＴＲＡｃ(Meyers, BMC Biotechnology 2008 8:53)にクローニングし、組換えクローンｐＴＲＡｃＲＸ３ｐ２４、ｐＴＲＡｃＲＸ３ｐ４１およびｐＴＲＡｃＲＸ３ＲＴを得た。
【０１２９】
ＨＰＶ−１６  Ｅ７ＳＨ遺伝子を、[Steinberg et al., 2995 Vaccine 23(9):1149-1157]に記載されているように３連続のＰＣＲ反応により操作した。得られたＨＰＶ１６  Ｅ７ＳＨ遺伝子をＰＣＲにより増幅し、タンパク質の５’末端にエンテロキナーゼ部位を付加した。次に、この構築物を、ＲＸ３  ＧＦＰ融合遺伝子を含んだＡ．ツメファシエンスバイナリーベクターｐＴＲＡ  Ｃ[Mclean et al., 2007 J Gen Virol 88:1460-1469]中のＧＦＰを置き換えることによってＲＸ３と融合させた。
【０１３０】
この組換えクローンを大腸菌から精製し、コンピテント宿主Ａ．ツメファシエンスＧＶ３１０１：：ｐＭＰ９０ＲＫ細胞にエレクトロポレーションを行った。ｐＴＲＡｃＲＸ３ｐ２４、ｐＴＲＡｃＲＸ３ｐ４１、ｐＴＲＡｃＲＸ３ＲＴおよびｐＲＸ３Ｅ７ＳＨを含む組換えＡ．ツメファシエンス培養物を６週齢のＮ．ベンサミアナ(N. benthamiana)植物に、ニードルとシリンジを用いて注射浸透させた。一時的タンパク質発現を増強するためにこれらの葉に、サイレンシングサプレッサーｐＢＩＮ−ＮＳを含むＡ．ツメファシエンスＬＢＡ４４０４の同時浸透を行った。浸透植物を２２℃、１６時間：８時間の明暗周期下で生長させた。
【０１３１】
一時的に発現されたＲＸ３融合タンパク質の回収および精製
浸透させた葉の組織 およそ１０ｇを液体窒素中で摩砕し、２０ｍｌのバッファーＰＢＰ３（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、５０ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．４Ｍ  ＮａＣｌ）に再懸濁させた。この懸濁液を３分間ホモジナイズした後、ミラクロス（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（登録商標）, San Diego, CAから入手可能な孔径２２〜２５ｍｍのレーヨンポリエステルとアクリル系結合剤からなる、ゼラチン状のホモジネートおよびプロトプラスト単離用の迅速濾材）で濾過した。濾液を密度ステップ勾配の上にのせた。この勾配はバッファーＰＢＰ３で作製した７ｍｌ容の１５、２５、３５および４５％濃度Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）密度勾配媒体からなった。この勾配をＢｅｃｋｍａｎ  ＳＷ２８ローターにて４℃、８００００Ｘｇで２分間遠心分離した。ペレットを５００μｌのバッファーＰＢＰ３に再懸濁させ、分析のためにアリコートを保存した。残りを−７０℃で保存した。
【０１３２】
実施例２：マウスの免疫
ＨＩＶ群試験
雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（８〜１０週齢）を適当数の群に分けた（５匹／群）。
群１−ｖＤＮＡプライム
群２−ｖＤＮＡプライム＋ｖＤＮＡブースト
群３−ｖＤＮＡプライム＋ＲＰＢＬＡブースト
群４−ＲＰＢＬＡプライム
【０１３３】
プライムおよびブースト接種に用いたＤＮＡワクチン（ｖＤＮＡ）は、（ｉ）Aldevron, Fargo, ND, USAのより製造され、１ｍｇ  ＤＮＡ／ｍｌ生理食塩水に再懸濁させたＤｕ４２２  ＨＩＶ−１サブタイプＣ  Ｇａｇ(van Harmelen, 2003)を発現するｐＴＨＧａｇＣ、および（ｉｉ）５つのＨＩＶ−１サブタイプＣ遺伝子ｇａｇ、逆転写酵素（ＲＴ）、ｔａｔおよびｎｅｆを発現するｐＶＲＣｇｒｔｔｎ(Burgers et al., AIDS Research and Human Retroviruses 2008 24(2):195-206)に相当する。このｖＤＮＡ（１００μｇ  ＤＮＡ／１００μｌ生理食塩水）を、各前脛骨筋に５０μｌを注射することにより投与した。
【０１３４】
対応するＲＸ３融合タンパク質（ＲＸ３−ｐ２４、ＲＸ３−ｐ４１およびＲＸ３−ＲＴ）を含むＲＰＢＬＡの筋肉内接種では、対応するＲＰＢＬＡ画分１００μｌを上記のように単離し、生理食塩水バッファーに再懸濁させた。以下の量のＲＰＢＬＡを前脛骨筋に注射した：ＲＸ３−ｐ２４は３．６μｇ；ＲＸ３−ｐ４１は３．１μｇ；およびＲＸ３−ＲＴは４μｇ。
【０１３５】
ＨＰＶ群試験
ＤＮＡワクチン接種
６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの各前脛骨筋に、ＤＮＡを注射する５〜６日前に１０μＭのカルジオトキシン５０μｌを注射した。ワクチン接種では、５０μｌのプラスミドＤＮＡ（１μｇ／ＰＢＳμｌ）を各前処理筋肉に注射した。１０日後にマウスを犠牲にし、脾臓から脾細胞を単離した。
【０１３６】
腫瘍保護および退縮
腫瘍保護および退縮試験は本質的に(Ohlschlager et al., Vaccine 2006 24(2):2880-2893)に記載されているように行った。プロトコールの具体的な修正は対応する実施例に示されている。
【０１３７】
実施例３：ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
ＨＩＶ抗原
１２日目または４０日目に回収し、各群マウス５匹からプールした脾臓から脾細胞の単細胞懸濁液を調製した。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ応答を、マウスＩＬ−２またはＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴセット(BD Pharmingen)を用いて測定した。脾細胞を最終容量２００μｌのＲ１０培養培地（１０％熱不活性化ＦＣＳ(Gibco)を加えた、１５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１００Ｕペニシリン／ｍｌおよび１００?μｇストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ）中、５×１０５／ウェルで、３反復で播種した。
【０１３８】
ペプチド（純度＞９５％、Bachem, Switzerland）ＧａｇＣＤ８  ＡＭＱＭＬＫＤＴＩ（配列番号１１６）、ｇａｇ  ＣＤ４（１３）ＮＰＰＩＰＶＧＤＩＹＫＲＷＩＩＧＬＮＫ（配列番号１１７）、ｇａｇ  ＣＤ４（１７）ＦＲＤＹＶＤＲＦＦＫＴＬＲＡＥＱＡＴＱＥ（配列番号１１８）、ＲＴ（ＣＤ８）ＶＹＹＤＰＳＫＤＬＩＡ（配列番号１２０）、またはＲＴ（ＣＤ４）ＰＫＶＫＱＷＰＬＴＥＶＫＩＫＡＬＴＡＩ（配列番号１１９）をアッセイにおける刺激として、終濃度４μｇ／ｍｌで用いた。Ｈ−２Ｋｄ?結合ペプチドＴＹＳＴＶＡＳＳＬ（配列番号１）（Elizabeth Reap, AlphaVaxから入手）を含む反応またはペプチドを含まない反応をバックグラウンド対照として用いた。２２時間目に検出抗体を用いてスポットを検出し、Ｎｏｖａ  Ｒｅｄで現像した後、ＣＴＬ  Ａｎａｌｙｚｅｒ(Cellular Technology, OH, USA)をＩｍｍｕｎｏｓｐｏｔバージョン３．０ソフトウエアとともに用いて計数した。３反復のウェルでのスポットの平均数を計算し、結果を１０６脾細胞当たりのスポット形成単位（ＳＦＵ）の平均値±標準偏差（ＳＤ）で表す。各マウス群で、ペプチドの不在下、および無関連のペプチドの存在下で得られた平均バックグラウンドスポット＋この平均の１標準偏差を陽性応答のカットオフとみなした。
【０１３９】
ＨＰＶ抗原
総ての試験で、ＥＬＩＳＰＯＴは(Steinberg et al., 2005 Vaccine 23:1149?1157)に本質的に記載されているようにex vivoで行った。ネズミＩＦＮ−γＥｌｉｓｐｏｔアッセイはex vivoで、また、最初に(Ohlschlager et al., 2006)に記載されているように各in vitro再負荷の５または６日後に行った。グランザイムＢ  Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイは、ＩＦＮ−γＥｌｉｓｐｏｔアッセイと同様に行った。このアッセイでは、抗マウスグランザイム捕捉抗体（１００ｎｇ／ウェル、クローンＲ４−６Ａ２；PharMingen, San Diego, USA）およびビオチン化抗マウスグランザイム検出抗体（５０ｎｇ／ウェル、クローンＸＭＧ１．２；PharMingen, San Diego, USA）を用いた。
【０１４０】
実施例４：抗血清のウエスタンブロット
ウエスタンブロットはＬＡＶ  Ｂｌｏｔ  Ｉ市販キット(Biorad)を用いて行った。接種マウスからのマウス血清を用い、アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧで抗体を検出した。
【０１４１】
実施例５：アグロインフィルトレーションされたタバコ葉からの密度勾配によるＲＸ３−ｐ２４、ＲＸ３−ｐ４１またはＲＸ３−ＲＴ含有ＲＰＢＬＡの単離（精製）
対応する構築物（ｐＲＸ３−ｐ２４、ｐＲＸ３−ｐ４１またはｐＲＸ３−ＲＴ）でアグロインフィルトレーションされた葉組織およそ１０ｇを液体窒素中で摩砕し、２０ｍｌのバッファーＰＢＰ３（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、５０ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．４Ｍ  ＮａＣｌ）に再懸濁させた。これを、ポリトロンホモジナイザーを用いて氷上で３分間ホモジナイズした後、ミラクロスで濾過した。対応する濾液を、バッファーＰＢＰ３で作製した７ｍｌ容の１５、２５、３５および４５％濃度Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）密度勾配媒体を含んでなる密度ステップ勾配の上にのせた。この勾配をＢｅｃｋｍａｎ  ＳＷ２８ローターにて４℃、８０，０００ｘｇで２時間遠心分離した。ペレットを５００μｌのバッファーＰＢＰ３に再懸濁させ、光学顕微鏡でＲＰＢＬＡの存在を確認し、分析のためにアリコートを保存した。残りを−７０℃で保存した。
【０１４２】
ＲＰＢＬＡ画分が対応するＲＸ３融合タンパク質を含んでいるかどうかを確認するため、そのアリコートを、融合タンパク質の完全性を確認するための抗ＲＸ３抗体および抗ｐ２４抗体を用い、ウエスタンブロットにより分析した（図１）。免疫原の量は、標品としてのＨＩＶ−１  ｐ１７／ｐ２４（ｐ４１とも呼ばれる）およびＨＩＶ−１  ＲＴのウエスタンブロット希釈液の濃度測定分析により定量した。対応する免疫原の濃度は、ＲＸ３−ｐ２４では３６ｎｇ／μｌ、ＲＸ３−ｐ４１では３１ｎｇ／μｌおよびＲＸ−ＲＴではおよそ４０ｎｇ／μｌと評価された。
【０１４３】
実施例６：ＲＸ３−ｐ２４の筋肉内接種におより誘発された細胞応答の測定
ＲＸ３−ｐ２４含有ＲＰＢＬＡの投与により誘発された細胞性免疫応答を測定するため、４群のマウスに次のように接種した：（ｉ）ＤＮＡワクチンを接種したマウス（ｐＴＨＧａｇｘ１）、（ｉｉ）ＤＮＡワクチンを接種し、別の用量の同じおよびＤＮＡワクチンで追加免疫したマウス（ｐＴＨＧａｇｘ２）、（ｉｉｉ）ＤＮＡワクチンを接種し、ＲＸ３−ｐ２４を含むが、さらなるＤＮＡを含まないＲＰＢＬＡで追加免疫したマウス（ｐＴＨＧａｇ＋ＲＸ３−ｐ２４）、および（ｉｖ）ＲＸ３−ｐ２４単独を含むＲＰＢＬＡを接種したマウス（ＲＸ３−ｐ２４）。
【０１４４】
ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイでは、ＤＮＡワクチン単独を接種したマウス（ｐＴＨＧａｇｘ１）は細胞応答を誘導したことが示された。図２に示されるように、ＣＤ４ならびにＣＤ８  Ｔ細胞は、刺激ペプチドｇａｇ  ＣＤ８、ｇａｇ  ＣＤ４（１３）またはｇａｇ  ＣＤ４（１７）とともにインキュベートした場合、無関連のペプチドとともにインキュベートされたＴ細胞に比べて、多量のＩＦＮ−γおよびＩＬ−２を分泌した。予測されたように、また、これまでに示されているように、２回のＤＮＡワクチンで追加免疫したマウス（ｐＴＨＧａｇｘ２）は、いっそう大きな細胞応答を示した（ｐＴＨＧａｇ群に比べて４倍）。
【０１４５】
ＲＸ３−ｐ２４単独を含むＲＰＢＬＡを接種したマウス群（ＲＸ３−ｐ２４）で同じアッセイを行ったところ、有意な応答は見られなかった。この結果は、ＲＰＢＬＡ内に凝集した免疫原は細胞応答を誘発することができないことを示唆した。しかしながらやはり、〆ＤＮＡワクチンを接種し、ＲＸ３−ｐ２４を含むがさらなるＤＮＡを含まないＲＰＢＬＡを含有する２回目の接種物で追加免疫したマウス（ｐＴＨＧａｇ＋ＲＸ３−ｐ２４）からのＴ細胞に対してＩＦＮ−γおよびＩＬ−２  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行ったところ、ｐＴＨＧａｇｘ１群に比べて３倍高い驚くべき細胞応答が見られた。ｐ２４マウス群で見られた細胞応答の欠場は、おそらく、より高い量のＲＰＢＬＡを接種すべきであることを示す。
【０１４６】
これらのデータは、ＲＰＢＬＡが細胞応答を誘導し得る好適な免疫原提供ビヒクルであることを示唆する。
【０１４７】
実施例７：ＲＸ３−ｐ２４の筋肉内接種により誘発される体液性応答の測定
ＡＩＤＳのリスクは、ｐ２４抗体の力価が低下した個体で著しく高まることが示されており、これは高い抗ｐ２４抗体力価が無病状態の維持に必要であり得ることを示唆している。
【０１４８】
ｐ２４抗原に対する抗体の存在を調べるため、ＨＩＶウイルスタンパク質の提示を含むストリップ［ＬＡＶ  Ｂｌｏｔ  Ｉ市販キット(Biorad)］を４つの接種群（ｐＴＨＧａｇｘ１、ｐＴＨＧａｇｘ２、ｐＴＨＧａｇ＋ＲＸ３−ｐ２４およびＲＸ３−ｐ２４）のマウス血清とともにインキュベートした。ｐ２４タンパク質に対する抗体は、ＤＮＡワクチンを接種し、２回目のＤＮＡ接種またはＲＸ３−ｐ２４を含むが、さらなるＤＮＡを含まないＲＰＢＬＡで追加免疫したマウスでのみ検出された（図３；ｐＴＨＧａｇｘ２およびｐＴＨＧａｇ＋ＲＸ３−ｐ２４マウス群）。興味深いことに、この２つ目の群から生じた抗体はｐ２４タンパク質の他、全長Ｇａｇタンパク質（ｐ５５）も認識し、このことは、ｐＴＨＧａｇｘ１群に比べてｐＴＨＧａｇ＋ＲＸ３−ｐ２４マウス群ではより高い力価の抗体が生産されることを示唆する。
【０１４９】
実施例８：ＲＸ３−ｐ４１の筋肉内接種により誘発される細胞応答の測定
従前に示されているように、ＨＩＶ  Ｇａｇタンパク質のｐ１７およびｐ２４断片（ｐ１７／２４）の融合から得られたｐ４１は、ＨＩＶ−１ゲノムにおいて最も高い密度のＣＴＬエピトープを含む(Novitsky et al., J. Virol. 2002 76(20):10155-10168)。これに関して、ＲＸ３−ｐ４１融合タンパク質を含むＲＰＢＬＡの、免疫系の細胞応答誘発効率を調べた。
【０１５０】
従前に実施例６で見られたように、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、単回用量のＤＮＡワクチンを接種したマウスは小さな細胞応答を誘発し、これはこのＤＮＡワクチンの２回目の接種でマウスを追加免疫した場合に有意に高まったことを示した（図４においてｐＴＨＧａｇｘ１とｐＴＨＧａｇｘ２を比較）。ＲＸ３−ｐ４１で追加免疫したマウス群（ｐＴＨＧａｇ＋ＲＸ３−ｐ４１）からの脾細胞は、それらがｇａｇＣＤ４（１３）およびｇａｇＣＤ４（１７）刺激ペプチドとともにインキュベートされた場合のｐＴＨＧａｇｘ２群よりもはるかに多量のＩＦＮγおよびＩＬ−２を分泌したことを指摘することは興味深い（図４）。ＩＦＮγおよびＩＬ−２の分泌は、ｐＴＨＧａｇ＋ＲＸ３−ｐ４１マウス群の脾細胞をｇａｇＣＤ８刺激ペプチドとともにインキュベートすることにより増加しなかったが、免疫系の細胞応答は、ＲＸ３−ｐ４１融合タンパク質を含むＲＰＢＬＡの接種により効果的に追加免疫されると結論付けることができる。
【０１５１】
実施例９：ＲＸ３−ＲＴの筋肉内接種により誘発される細胞応答の測定
ＨＩＶに対して有効な多価ワクチンは数種の抗原を含むことから、ＨＩＶウイルスタンパク質ＲＴを用いて同様の研究を行った。
【０１５２】
ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、単回用量のＤＮＡワクチンを接種したマウス（ｐＶＲＣｇｒｔｔｎｘ１）が誘導した細胞応答は極めて低かったことを示した。刺激ペプチドＲＴ単独とともにインキュベートしたＣＤ８  Ｔ細胞（ＣＤ８）は、無関連のペプチドＴＹＳＴＶＡＳＳＬ（配列番号１；図５）とともにインキュベートした同じ細胞よりも多量のＩＦＮ−γを分泌した。２回目のＤＮＡワクチン（ｐＶＲＣｇｒｔｔｎｘ２）またはＲＸ３−ＲＴを含むＲＰＢＬＡ（ｐＶＲＣｇｒｔｔｎ＋ＲＸ３−ＲＴ）による追加免疫は、細胞応答の一般的誘導を観察するために必要であった。図５は、対応する刺激ペプチドとともにインキュベートしたＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞は、対照処置（無関連ペプチドの不在または存在）に比べて多量のＩＦＮ−γおよびＩＬ−２を分泌したことを示す。
【０１５３】
実施例１０：ＲＸ３−ｐ２４、ＲＸ３−４１またはＲＸ３−ＲＴを発現するＤＮＡワクチンの筋肉内接種により誘発される免疫応答の測定
ＨＩＶ抗原をコードするＤＮＡワクチンは包括的に研究され、動物モデルならびにヒトにおいて体液性および細胞性双方の免疫応答を誘導することが示されている(Estcourt et al., Immunol. Rev. 2004 199:144-155)。しかしながら、ＤＮＡワクチンは安全であることが示されているが、免疫は低く、かつ、一時的レベルの免疫応答を生じるに過ぎなかった。
【０１５４】
ｐＴＨＧａｇはマウスモデルにおいて強力な細胞傷害性リンパ球応答を誘導することが示されている。種々の細胞系で発現されたＰｒ５５Ｇａｇは組み立てられ、原形質膜から発芽し、高免疫原性ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成することができる。ＲＰＢＬＡは、それらの組み立てが、ウイルス粒子の形成に関与するウイルスタンパク質ではないＲＸ３の凝集能により誘導されることから、従来のＶＬＰとはみなすことができない。しかしながら、ＲＸ３−２４、ＲＸ３−４１、ＲＸ３−ＲＴおよびＲＸ３Ｅ７ＳＨを含むＲＰＢＬＡを発現するＤＮＡワクチンの適合性を調べた。興味深いことに、対応するｐＴＨ由来ベクター（ｐＴＨＲＸ３−ｐ２４、ｐＴＨＲＸ３−ｐ４１、ｐＴＨＲＸ３−ＲＴおよびｐＴＨＲＸ３−Ｅ７ＳＨ）がひと度これまでの研究のｐＴＨＧａｇとして投与されると、有意な体液性および細胞性免疫応答が見られた。この予期しない結果は、ＲＰＢＬＡが、このオルガネラがＥＲ中に保存され、原形質膜から発芽して高免疫原性ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成するとは思われないにもかかわらず、ＤＮＡワクチン接種により投与可能であることを示す。
【０１５５】
実施例１１：in vitroで組み立てられたＲＰＢＬＡの接種により誘発される免疫応答の測定
密度勾配によるＲＰＢＬＡの単離はＲＰＢＬＡ高富化画分の回収を可能とするが、ある程度の夾雑物が一緒に精製される。夾雑物をできる限り除去するために、融合タンパク質（ＲＸ３−ｐ２４、ＲＸ３−ｐ４１、ＲＸ３−ＲＴおよびＲＸ３−Ｅ７ＳＨ）を対応するＲＰＢＬＡ画分から２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、２％ＤＯＣ、１０ｍＭ  ＤＴＴに可溶化し、軽く振盪させながら室温で１時間インキュベートし、ＲＰ−ＦＰＬＣにて精製した。９５％を超える純度で〆ＲＸ３融合タンパク質を含有する溶出画分をプールし、凍結乾燥させた。対応するペレットを蒸留水中、２００ｍＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのＣａＣｌの存在下で回収した。これらの条件で、ＲＸ３ペプチドを含む融合タンパク質は自発的に再組み立てられ、in vitroにおいて植物ＥＲの外部でＲＰＢＬＡを再形成する。
【０１５６】
対応するＲＸ３融合タンパク質を含む、in vitroで組み立てられたＲＰＢＬＡをマウスに接種したところ、ＩＦＮγ、ＩＬ−２およびグランザイムＢ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、ＲＰＢＬＡが、in vivo形成されたＲＰＢＬＡを用いて行ったものと同じ研究で有意な細胞応答を追加免疫することが示された。この驚くべき結果は、in vitroで組み立てられたＲＰＢＬＡが細胞応答誘導能を維持することを示唆する。
【０１５７】
ＲＸ３融合タンパク質は以下の条件でin vitro組み立ておよびＲＰＢＬＡ形成を誘導することができる：（ｉ）溶液のｐＨ値の低下、（ｉｉ）塩含量の上昇、（ｉｉｉ）還元剤濃度の低減または除去、（ｉｖ）酸化剤の付加、（ｖ）温度の低下、またはこの因子の組合せ。明らかに、in vitroＲＰＢＬＡは膜に取り囲まれていない。in vitro組み立ての誘導に好ましい塩はＮａＣｌ、ＣａＣｌおよびＫＣｌであり、好ましいｐＨ値は７より低い。
【０１５８】
従前に示されているように、二重免疫応答（細胞性および体液性）はＡＩＤＳに対してより高い保護効果をもたらす。ＤＮＡワクチンで初回免疫し、対応するin vitroで組み立てられたＲＰＢＬＡで追加免疫したマウスにおいて、ｐ２４、ｐ４１およびＲＴ抗原に対する抗体の存在は、ＨＩＶストリップ（ＬＡＶ  Ｂｌｏｔ  Ｉ市販キット(Biorad)）を用いることで示された。
【０１５９】
実施例１２：アグロインフィルトレーションされたタバコ葉からの密度勾配によるＲＸ３−Ｅ７ＳＨ含有ＲＰＢＬＡの単離（精製）
ＲＸ３と融合されたＨＰＶ−１６抗原Ｅ７ＳＨ（ｐＲＸ３−Ｅ７ＳＨ）でアグロインフィルトレーションされた葉組織およそ１０ｇを液体窒素中で摩砕し、２０ｍｌのバッファーＰＢＰ３（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、５０ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．４Ｍ  ＮａＣｌ）に再懸濁させた。これを、ポリトロンホモジナイザーを用いて氷上で３分間ホモジナイズした後、ミラクロスで濾過した。対応する濾液を、バッファーＰＢＰ３で作製した７ｍｌ容の１５、２５、３５および４５％濃度Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）密度勾配媒体を含んでなる密度ステップ勾配の上にのせた。この勾配をＢｅｃｋｍａｎ  ＳＷ２８ローターにて４℃、８０，０００ｘｇで２時間遠心分離した。ペレットを５００μｌのバッファーＰＢＰ３に再懸濁させ、光学顕微鏡でＲＰＢＬＡの存在を確認し、分析のためにアリコートを保存した。残りを−７０℃で保存した。
【０１６０】
ＲＸ２−Ｅ７ＳＨ融合タンパク質の遺伝子配列を以下に５’から３’方向に示す。
【化１９】
0005667062.tif 000029
【０１６１】
ＲＰＢＬＡ画分が対応するＲＸ３融合タンパク質を含んでいることを確認するため、そのアリコートを、融合タンパク質の完全性を確認するための抗ＲＸ３を用い、ウエスタンブロットにより分析した（図７）。
【０１６２】
実施例１３：ＲＸ３−Ｅ７ＳＨの接種により誘発される細胞応答の測定
ＲＰＢＬＡを含むＲＸ３−Ｅ７ＳＨの投与により誘導される細胞性免疫応答を測定するため、５つのマウス群に以下のように接種した：（ｉ）Ｅ７ＳＨ抗原を含むＤＮＡワクチンで背一種したマウス（ｐＴＨａｍｐ−Ｅ７ＳＨ）、（ｉｉ）配列：
【化２０】
0005667062.tif 000030
0005667062.tif 000031
0005667062.tif 000032
を有する対応するＤＮＡワクチン陰性対照を接種したマウス（ｐＴＨａｍｐ）、（ｉｉｉ）ＲＸ３−Ｅ７ＳＨを含むＲＰＢＬＡを接種したマウス（ＲＸ３−Ｅ７ＳＨ）、（ｉｖ）ＲＸ３−Ｅ７ＳＨおよびフロイントの不完全アジュバントを含むＲＰＢＬＡで同時接種したマウス（ＲＸ３−Ｅ７ＳＨ／ＩＦＡ）および最後に（ｖ）ＲＰＢＬＡの陰性対照として、Ｇｆｐと融合したＲＸ３を含むＲＰＢＬＡを接種したマウス（ＲＸ３−Ｇｆｐ）。
【０１６３】
予期されたように、ＩＦＮ−γおよびグランザイムＢ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、ＤＮＡワクチンを接種したマウス（ｐＴＨａｍｐ−Ｅ７ＳＨ）が細胞応答を誘導したことを明らかに示した。図８に示されるように、ｐＴＨａｍｐ−Ｅ７ＳＨ  ＤＮＡワクチンを接種したマウスからの脾細胞は、Ｅ７ＳＨ抗原の不在下でＤＮＡワクチンを接種したマウス（ｐＴＨａｍｐ）からのものに比べて有意に多量のＩＦＮ−γおよびグランザイムＢを分泌した。
【０１６４】
驚くことに、また、ＲＸ３−Ｅ７ＳＨを含むＲＰＢＬＡを接種したマウス（ＲＸ３−Ｅ７ＳＨ）から単離された脾細胞は、ＩＦＡ同時投与の存在下または不在下でも多量のＩＦＮ−γおよびグランザイムＢ（ｐＴＨａｍｐ−Ｅ７ＳＨマウス群と同等）を放出することが認められた（図８）。対照として、ＲＸ３−Ｇｆｐ群で見られた陰性結果は、ＲＰＢＬＡの投与によりＥ７ＳＨに対する非特異的細胞応答を誘発されないことを示す。
【０１６５】
これらの結果は、ＲＰＢＬＡ粒子中でＲＸ３との融合物として投与されたＥ７ＳＨ抗原は細胞応答を効果的に誘発することができることを明らかに示す。最大効果を達成するためにアジュバントが必要とされないという事実は、ＲＰＢＬＡ中のＲＸ３−Ｅ７ＳＨが細胞応答を誘導し得る有効な抗原提示ビヒクルであることを示す。この結論は、有効な細胞応答を誘導するためにＩＦＡをオボアルブミン（ＯＶＡ）と同時投与する必要があるという知見により裏付けられた（図９）。
【０１６６】
オボアルブミンのアミノ酸配列を１文字コードで以下に示す。
【化２１】
0005667062.tif 000033
【０１６７】
実施例１４：ＲＸ３−Ｅ７ＳＨ接種 により誘導される脾細胞の細胞溶解活性の測定
特異的に活性化された脾細胞が細胞溶解活性を持っていたかどうかを調べるために、５１Ｃｒ放出アッセイを行った。５１Ｃｒ放出アッセイは、他所に記載されているように[Steinberg et al., (2005) Vaccine 23(9):1149?1157]、ネズミ脾臓細胞のin vitro再負荷から５〜６日後に行った。特定の標的（ＲＸ３−Ｅ７またはｐＴＨａｍｐ−Ｅ７ＳＨ細胞）の特異的溶解が、タンパク質およびＤＮＡに基づくワクチンの対照標的（ＲＸ３−ＧｆｐまたはｐＴＨａｍｐ細胞）の溶解より少なくとも１０％高かった場合の動物を陽性とスコアリングした。初回のin vitro再負荷後に、Ｅ７ＷＴ発現ＲＭＡ−Ｅ７形質転換体に対する強い特異的細胞溶解活性が示された（下表参照）。
【０１６８】
【表４】
0005667062.tif 000034
【０１６９】
驚くべきことに、ＲＭＡ−Ｅ７細胞の特異的溶解率の平均はＲＸ３−Ｅ７ＳＨ群（３３％）およびｐＴＨａｍｐ−Ｅ７ＳＨ免疫動物（２６％）に匹敵し、対応する対照群ＲＸ３−Ｇｆｐ（１２％）およびｐＴＨａｍｐ（８％）よりも有意に高かった。この結果は、ＲＸ３−Ｅ７ＳＨ  ＲＰＢＬＡが、ＤＮＡワクチンｐＴＨａｍｐ−Ｅ７ＳＨを用いてすでに示されたもの[Ohlschlager et al., (2006) Vaccine 24:2880-2893]と同様に有効に、Ｅ７発現細胞に対して特異的細胞溶解活性を誘導できたことを示す。さらに、ＲＸ３−Ｅ７ＳＨ融合タンパク質を含むＲＰＢＬＡがＩＦＡと同時に投与された場合には細胞溶解活性は増大しなかったという事実（表のＲＸ３−Ｅ７ＳＨ／ＩＦＡ群参照）は、より低い用量であっても細胞溶解作用を誘発するのに有効であることを示唆し、ＲＰＢＬＡが特異的細胞溶解作用を誘発するのに有効な投与ビヒクルとなるという考えを裏付ける。
【０１７０】
細胞溶解応答が腫瘍増殖[Akazawa, 2004 Cancer Res 64:757?764]およびウイルス感染(Vine et al., 2004 J Immunol 173:5121-5129]の管理に重要な要素であることが広く実証されていることを付け加えておくことが重要である。
【０１７１】
実施例１５：ＲＸ３−Ｅ７ＳＨを接種したマウスにおける腫瘍増殖の測定
治療用腫瘍ワクチンの目的は定着腫瘍を根絶する有効な免疫応答を誘導することである。よって、in vivoにおいて定着したＥ７発現腫瘍細胞を管理することができた細胞性免疫応答を誘導できるかどうかを決定するためにＥ７ＳＨ遺伝子によるワクチン接種を検討した。４つの腫瘍退縮試験において、計８０匹の動物に腫瘍形成用量の同系Ｃ３腫瘍細胞を移植した（０日目）。５〜１８日目に腫瘍が平均サイズ４〜９ｍｍ２に達した際に、動物に（ｉ）１００μｇのＥ７ＳＨコードプラスミド（ｐＴＨａｍｐ−Ｅ７ＳＨ）、（ｉｉ）１００μｇのエンプティーｐＴＨａｍｐベクター（ｐＴＨａｍｐ）、（ｉｉｉ）５μｇのＲＸ３−Ｅ７ＳＨを含有するＲＰＢＬＡ（ＲＸ３−Ｅ７ＳＨ）、および（ｉｖ）ＩＦＡ  と同時投与される同量のＲＸ３−Ｅ７ＳＨ  ＲＰＢＬＡ（ＲＸ３−Ｅ７ＳＨ／ＩＦＡ）を接種した（０日目）。腫瘍サイズを、試験の終了時まで（１４日目）、定規で計ることにより２日おきに測定した。
【０１７２】
図１０Ａに示されるように、対照ＤＮＡベクターを接種したマウス（ｐＴＨａｍｐ）の腫瘍サイズは徐々に大きくなり、接種１４日後に最大平均サイズ１１０ｍｍ２に達した。ＲＸ３−Ｅ７ＳＨを含むＲＰＢＬＡを接種したマウスでは、腫瘍増殖は有意に低下した。この試験を通して、ＲＸ３−Ｅ７ＳＨマウス群は対照群よりも小さな腫瘍を示し、１４日目には平均値４０ｍｍ２に達した。このＲＸ３−Ｅ７ＳＨ接種の保護効果は、Ｅ７発現腫瘍に対して良好な治療ワクチンであることが報告されている[Ohlschlager et al., (2006) Vaccine 24:2880-2893]ＤＮＡワクチンｐＴＨａｍｐ−Ｅ７ＳＨに匹敵するものであることを指摘することは興味深い。さらに、従前に示されているように、ＲＸ３−Ｅ７ＳＨを含むＲＰＢＬＡとＩＦＡの同時投与（ＲＸ３−Ｅ７ＳＨ／ＩＦＡ）は、アジュバントの不在下で同量のＲＸ３−Ｅ７ＳＨ含有ＲＰＢＬＡ（ＲＸ３−Ｅ７ＳＨ）の保護効果を増大させなかったという事実は、より低量のＲＸ３−Ｅ７ＳＨでＥ７発現腫瘍の増殖に対して保護が得られるということを示唆する。
【０１７３】
ＲＰＢＬＡ調製物中に存在する何らかの夾雑物による、またはＲＸ３ポリペプチドそれ自体による非特異的な腫瘍増殖の低下を排除するため、独立した試験で同量のＲＸ３−Ｇｆｐ含有ＲＰＢＬＡを接種したところ、ｐＴＨａｍｐ  ＤＮＡ対照群を比較した際に腫瘍増殖に対する効果は見られなかった（図１０Ｂ参照）。
【０１７４】
マウスにはＲＸ３−Ｅ７ＳＨを含むＲＰＢＬＡを１回だけ接種したことを指摘しておかなければならない。プライムブースト試験では、治療効果が増強されると予測される。
【０１７５】
実施例１６：ＲＸ３−Ｅ７ＳＨを接種したマウスにおける腫瘍増殖に対する保護効果
治療ワクチンに加え、ＲＰＢＬＡに基づく保護的（予防）ワクチンの適用という目的を考慮に入れ、ＲＸ３−Ｅ７ＳＨ含有ＲＰＢＬＡがＥ７発現同系腫瘍の増殖から動物を保護することができるかどうかを決定するために、再負荷試験を行った。
【０１７６】
腫瘍退縮試験の終了から３週間後に、腫瘍退縮試験後に完全退縮を示したマウスの左大腿に、１００μｌ  ＰＢＳ中、０．５×１０６Ｃ３細胞を再び皮下注射した。最初のＣ３接種は右大腿に行った。対照として、同数の非免疫マウスに同じ処理を施した。この注射から２０日後に、総ての対照マウスは１００〜４００ｍｍ２の範囲の大きさの腫瘍を示したが、免疫マウスは腫瘍を発達させず、従って、腫瘍増殖からの明確な保護を示した（図１１参照）。
【０１７７】
本明細書に挙げられている特許、特許出願および文献はそれぞれ引用することにより本明細書の一部とされる。冠詞の「ａ」または「ａｎ」は１以上を含むものとする。
【０１７８】
以上の記載および実施例は例示を意図するものであって、限定と考えるべきでない。本発明の精神および範囲内で他のバリエーションも可能であり、それら自体当業者ならば容易に思い至るであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１】３つのパネル（図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃ）は、ＲＸ３−ｐ２４、ＲＸ３−ｐ４１およびＲＸ３−ＲＴでアグロインフィルトレーション(agroinfiltrated)を行ったタバコ植物から単離されたＲＰＢＬＡ画分のウエスタンブロットによる分析を示す。対応するＲＰＢＬＡ画分調製物中の全長ＲＸ３融合タンパク質の存在は、以下の抗体：（ｉ）ＲＸ３を認識するαＲ８、（ｉｉ）ｐ４１およびｐ２４抗原を認識するαｐ２４ｓおよび（ｉｉｉ）ＲＴ抗原を認識するαＲＴを用いることにより確認した。
【図２】ＢＡＬＢ／ｃマウスのワクチン接種後のｐ２４細胞応答のＩＦＮ−γ（図２Ａ）およびＩＬ−２（図２Ｂ）ＥＬＩＳＰＯＴ分析を示す２つのグラフを含む。示された免疫原の接種は、方法に明示されているように行った。対応するＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおける反応は、示されたＧａｇペプチド、無関連のペプチド（Ｉｒｒｅｌ  ｐｅｐｔ）またはペプチド不在（Ｍｅｄ）で３回行い、バーはスポット形成単位（ｓｆｕ）の平均値±ＳＤ／１０６脾細胞である。データはマウス５匹／群からプールした脾細胞を用いた代表的試験からものである。
【図３】マウス血清中の抗Ｇａｇ抗体のウエスタンブロット検出を示す。マウス血清中の抗Ｇａｇ抗体の含量は、方法に記載されているように市販のウエスタンブロットストリップを用いて検出した。Ｐｏｓ，陽性対照血清；Ｎｅｇ，陰性対照血清；ｄ４０，示され、方法に記載されているような接種後４０日目に採取したマウス血清；ｄ０，接種前のマウス血清。各ストリップセットの接種計画はストリップの右に示され、これらは（ｉ）単回ｇａｇ  ＤＮＡ接種（ｐＴＨＧａｇｘ１）、（ｉｉ）ｇａｇ  ＤＮＡプライム−ｇａｇ  ＤＮＡ追加免疫（ｐＴＨＧａｇｘ２）、（ｉｉｉ）ｇａｇ  ＤＮＡプライム−ＲＸ３−ｐ２４追加免疫（ｐＴＨＧａｇＣ＋ＲＸ３−ｐ２４）、（ｉｖ）単回ＲＸ３−ｐ２４接種（ＲＸ３−ｐ２４）であった。
【図４】ＢＡＬＢ／ｃマウスのワクチン接種後のｐ４１細胞応答のＩＦＮ−γ（図４Ａ）およびＩＬ−２（図４Ｂ）ＥＬＩＳＰＯＴ分析を示す２つのグラフを含む。示された免疫原の接種は、方法に明示されているように行った。対応するＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおける反応は、示されたＧａｇペプチド、無関連のペプチドＴＹＳＴＶＡＳＳＬ（配列番号１；ｉｒｒｅｌ  ｐｅｐｔ）またはペプチド不在（Ｍｅｄ）で３回行い、バーはスポット形成単位（ｓｆｕ）の平均値±ＳＤ／１０６脾細胞である。データはマウス５匹／群からプールした脾細胞を用いた代表的試験からものである。
【図５】ＢＡＬＢ／ｃマウスのワクチン接種のＲＴ細胞応答のＩＬ-２（図５Ａ）およびＩＦＮ−γ（図５Ｂ）ＥＬＩＳＰＯＴ分析を示す２つのグラフを含む。示された免疫原の接種は、方法に明示されているように行った。対応するＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおける反応は、示されたＧａｇペプチド、無関連のペプチドＴＹＳＴＶＡＳＳＬ（配列番号１；ｉｒｒｅｌ  ｐｅｐｔ）またはペプチド不在（Ｍｅｄ）で３回行い、バーはスポット形成単位（ｓｆｕ）の平均値±ＳＤ／１０６脾細胞である。データはマウス５匹／群からプールした脾細胞を用いた代表的試験からものである。
【図６】人工ＨＰＶ−１６  Ｅ７ＳＨ遺伝子のマップである。ＨＰＶ−１６  Ｅ７野生型遺伝子（Ｅ７ＷＴ、上）をｐＲＢ結合部位に相当する位置（ｎｔ７２／７３）と２つのＣ−Ｘ−Ｘ−Ｃモチーフの間（ｎｔ１７７／１７８およびｎｔ２７６／２７７）で切り出した。得られた４つの断片ａ、ｂ、ｃおよびｄを再配列（「シャッフル」）し、配列ａ、ｄ、ｃ、ｂを含むコアエレメントを形成した。接合部ａ−ｂ、ｂ−ｃおよびｃ−ｄにおける推定ＣＴＬエピトープの欠損を避けるため、これらの配列（３×２７ｎｔ＝３×９アミノ酸）を附属部分として付加し、完全なＨＰＶ−１６  Ｅ７ＳＨ遺伝子を形成した。「野生型復帰組換え」の潜在的リスクを最小にするため、コアエレメントのコドンを、kazusa.or.jp/codon/に見出すことができるＫａｚｕｓａコドン利用データベースに従ってヒトにおける発現のために至適化した。Ｋｏｚａｋ配列は翻訳を増強するために遺伝子の前に付加した。
【図７】ＲＸ３−Ｅ７ＳＨでアグロインフィルトレーションを行ったタバコ植物から単離されたＲＰＢＬＡ画分のウエスタンブロットによる分析を示す。対応するＲＰＢＬＡ画分調製物における全長ＲＸ３融合タンパク質の存在を、Ｅ７ＳＨ抗体を用いることにより確認した。
【図８】ＤＮＡおよびＲＰＢＬＡ免疫後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＣＴＬ応答を示す２つのグラフ（図８Ａおよび図８Ｂ）を含む。マウス４匹／群の各前脛骨筋に１回、（ｉ）５０μｇエンプティープラスミド（ｐＴＨａｍｐ）、（ｉｉ）５０μｇＥ７ＳＨ発現プラスミド（ｐＴＨａｍｐ−Ｅ７ＳＨ）、（ｉｉｉ）またはＲＸ３−Ｇｆｐ融合タンパク質（ＲＸ３−Ｇｆｐ）を含む５μｇのＲＰＢＬＡの大腿への皮下接種、（ｉｖ）ＲＸ３−Ｅ７ＳＨ融合タンパク質（ＲＸ３−Ｅ７ＳＨ）を含む５μｇのＲＰＢＬＡ、または（ｖ）ＲＸ３−Ｅ７ＳＨ融合タンパク質を含む５μｇのＲＰＢＬＡと１００μｌのＩＦＡ（１００μｌバッファー中５μｇのＲＸ３−Ｅ７ＳＨ＋１００μｌのＩＦＡ）筋肉内免疫を行った。ex vivo  ＩＦＮ−γおよびＧｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ  Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを行った。各バーは個々の動物からの活性化Ｔ細胞の数を表す。
【図９】ＲＰＢＬＡ免疫後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＣＴＬ応答のグラフである。マウス匹／群の前脛骨筋に１回、（ｉ）ＲＸ３−Ｇｆｐ融合タンパク質（ＲＸ３−Ｇｆｐ）を含む５μｇのＲＰＢＬＡ、（ｉｉ）ＲＸ３−Ｅ７ＳＨ融合タンパク質（ＲＸ３−Ｅ７ＳＨ）を含む５μｇのＲＰＢＬＡ、（ｉｉｉ）ＲＸ３−Ｅ７ＳＨ融合タンパク質を含む５μｇのＲＰＢＬＡと１００μｌのＩＦＡ（ＲＸ３−Ｅ７ＳＨ／ＩＦＡ）、（ｉｖ）５μｇのオボアルブミン（ＯＶＡ）、または（ｖ）５μｇのオボアルブミンと１００μｌのＩＦＡ（ＯＶＡ／ＩＦＡ）の筋肉内またはｓｃ（上記の通り免疫を行った。ex vivo  Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ  Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを行った。各バーは個々の動物からの活性化Ｔ細胞の数を表す。
【図１０】図１０Ａおよび図１０Ｂとしての２部は、（ｉ）１００μｇエンプティープラスミド（ｐＴＨａｍｐ）、（ｉｉ）１００μｇＥ７ＳＨ発現プラスミド（ｐＴＨａｍｐ−Ｅ７ＳＨ）、（ｉｉｉ）ＲＸ３−Ｇｆｐ融合タンパク質（ＲＸ３−Ｇｆｐ）を含む５μｇのＲＰＢＬＡ、（ｉｖ）ＲＸ３−Ｅ７ＳＨ融合タンパク質（ＲＸ３−Ｅ７ＳＨ）を含む５μｇのＲＰＢＬＡ、または（ｖ）ＲＸ３−Ｅ７ＳＨ融合タンパク質を含む５μｇのＲＰＢＬＡと１００μｌのＩＦＡ（ＲＸ３−Ｅ７ＳＨ／ＩＦＡ）で免疫した後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＣ３腫瘍の増殖を示す。示されているデータは、０〜１４日目までの腫瘍の表面積サイズを示す。図１０Ａは、腫瘍退縮に対するＤＮＡとＲＰＢＬＡの免疫効果の比較を示し、図１０Ｂは、Ｅ７ＳＨ抗原を欠いたＤＮＡおよびＲＰＢＬＡ免疫における非特異的な腫瘍退縮効果は無いことを示す。
【図１１】（ｉ）１００μｇＥ７ＳＨ発現プラスミド（ｐＴＨａｍｐ−Ｅ７ＳＨ）、（ｉｉ）ＲＸ３−Ｅ７ＳＨ融合タンパク質（ＲＸ３−Ｅ７ＳＨ）を含む５μｇのＲＰＢＬＡ、または（ｉｉｉ）ＲＸ３−Ｅ７ＳＨ融合タンパク質を含む５μｇのＲＰＢＬＡと１００μｌのＩＦＡ（ＲＸ３−Ｅ７ＳＨ／ＩＦＡ）による免疫後の再負荷試験に対する腫瘍増殖の結果を示すグラフである。図１０の腫瘍退縮試験後に完全退縮を示したマウスの大腿に、腫瘍退縮試験の完了３週間後に、１００μｌ  ＰＢＳ中、０．５×１０６Ｃ３細胞を再び皮下注射した。対照として、同数の非免疫マウスに同じ処置を施した。この注射から２０日後に、総ての対照マウスは腫瘍増殖を示したが、免疫マウスに腫瘍を発達させたものは無かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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