(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物体中のクラソンリグニン含有量に対する酸可溶性リグニン含有量の比（［酸可溶性リグニン含有量］／［クラソンリグニン含有量］）を指標とし、前記比が低い植物体よりも、前記比が高い植物体のほうが、糖化効率が高いと評価することを特徴とする、植物体の易糖化性の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物体の糖化効率を改善する方法、バイオマスエタノールの原料として好適な植物、バイオマスエタノールの製造方法、及び、植物体の易糖化性を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
茎及び葉の中肋が褐色であるｂｒｏｗｎ  ｍｉｄｒｉｂ（ｂｍないしはｂｍｒ、以降、ｂｍｒと記載）変異体は、トウモロコシで古くから知られており、現在までに、トウジンビエ、ソルガム、スーダングラス等の同じくＣ４型光合成を行うイネ科草本植物でも見つかっている。ｂｍｒ表現型は、リグニン生合成に関わるシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）やカフェイン酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）の発現や活性の低下が関わっていることが分かっている。多くのｂｍｒ系統において、野生型よりも、リグニン含有量が低減している（例えば、非特許文献１参照。）。また、リグニン含有量の低減は、収穫量の減少、茎強度の低減等、植物体に様々な影響を与えることが知られている（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００３】
ＣＡＤは、Ｚｎ２＋依存性  ｍｅｄｉｕｍ  ｃｈａｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ／ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＭＤＲ）スーパーファミリーに属する酵素であり、補酵素ＮＡＤＰＨと共に、シンナミルアルデヒドからシンナミルアルコールを合成する反応を触媒する酵素である。シンナミルアルコール類は、リグニンの前駆体となる。ＣＡＤは２量体であり、サブユニット当たり２つのＺｎ２＋イオンを持つ。２つのＺｎ２＋イオンのうち、１つは触媒亜鉛（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｚｉｎｃ）であり、もう１つは構造亜鉛（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｚｉｎｃ）である（例えば、非特許文献３及び４参照。）。ＣＡＤ中の構造亜鉛に配位する４つのシステイン残基は高度に保存されているが、その機能的役割は未だ明らかにされていない。
【０００４】
ｂｍｒ系統は、その遺伝的背景により、リグニン含有量や収量、背丈等の形質が異なる。例えば、飼料用ソルガムには複数のｂｍｒ系統があるが、多くのｂｍｒ系統において、野生型よりも、乾物収量は低下し、ＮＤＦ（中性デタージェント繊維）の消化率が向上しているものの、ＡＤＬ（酸性デタージェント不溶リグニン）の含有量は、ｂｍｒ６系統（ｃａｄ２変異）では野生型と変わらないが、ｂｍｒ１２系統（ｃｏｍｔ変異）では野生型よりも低減している（例えば、非特許文献５及び６参照。）。
【０００５】
ソルガムのｂｍｒ６系統は、ＳｂＣＡＤ２に変異を有する変異体であり、ｂｍｒ２系統及びｂｍｒ１２系統と同様に、野生型と比べて植物体中のクラソンリグニン含有量が低下しており、糖化効率が高くなっている。ｂｍｒ６系統には、ＳｂＣＡＤ２中の変異が異なる複数のアリルが報告されている（例えば、非特許文献７参照。）。具体的には、ｂｍｒ６−ｒｅｆ変異体では、２８００番目の塩基シトシンがチミンに置換されることにより終止コドンが形成されている。このため、ｂｍｒ６−ｒｅｆ変異体中のＳｂＣＡＤ２は、１３１番目のアミノ酸までしか合成されておらず、ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ、ファクター結合サイト、及び基質結合サイトの大半を欠く変異型である。また、ｂｍｒ６−３変異体では、３８７５番目の塩基グアニンがアデニンに置換されている。当該変異により、コファクター結合サイトに存在し、ＭＤＲタンパク質に高度に保存されているグリシンリッチモチーフＧ（Ｘ）ＧＧＶ（Ｌ）Ｇを形成する１９１番目のグリシン(Ｇ)がセリン(Ｓ)に置換されている。さらに、ｂｍｒ６−２７変異体では、４２８８番目の塩基の後ろにグアニンが挿入されることにより、フレームシフトが起こっている。この結果、ｂｍｒ６−２７変異体中のＳｂＣＡＤ２は、Ｃ末端側３１アミノ酸領域が野生型ＳｂＣＡＤ２とは全く異なり、かつ終止コドンの形成により野生型より４アミノ酸残基短く、活性サイトの外側にある２次構造が壊れている変異型である。また、リグニンモノマーの組成比を調べたところ、ｂｍｒ６−ｒｅｆ変異体では、野生型のソルガムよりもＧ−リグニン含有量に対するＳ−リグニン含有量の割合が非常に小さくなっており、ＳｂＣＡＤ２の変異により、植物体中のリグニンモノマーの組成比が影響を受けていることが確認された（非特許文献８参照。）。
【０００６】
また、ｂｍｒ系統における糖化効率の向上は、必ずしもリグニン含有量の低下によるとは限らないことを示唆するデータも報告されている。例えば、非特許文献９によれば、ソルガムのｂｍｒ６系統のうち、ｂｍｒ６−ｒｅｆ変異体やｂｍｒ６−３変異体は、野生型と比べてクラソンリグニン含有量が低減し、かつリグニンモノマーの前駆体であるコニフェルアルデヒドの含有量が増大している点は共通しているものの、ｂｍｒ６−ｒｅｆ変異体は糖化効率において、野生型から有意な変化は観察されなかったのに対して、クラソンリグニン含有量の低下と前駆体蓄積の度合いがｂｍｒ６−ｒｅｆ変異体よりも小さかったｂｍｒ６−３変異体では、糖化効率が有意に改善されていた。
【０００７】
一方で、ソルガムにおいて、野生型、ｂｍｒ６系統、ｂｍｒ１２系統、及びｃａｄ２変異とｃｏｍｔ変異の両者を有する２重変異体を、それぞれバイオマス資源として用いた場合のエタノール変換効率は、ｂｍｒ６系統やｂｍｒ１２系統よりも、２重変異体のほうが、よりエタノール変換効率が高く、かつクラソンリグニン含有量とエタノール変換効率との間に強い負の相関があることが報告されている（例えば、非特許文献１０参照。）。当該報告によれば、リグノセルロースの酵素糖化には、クラソンリグニン含有量が大きく作用するとされている。
【０００８】
その他、ソルガム以外の植物においても、ＣＡＤ機能欠損変異系統についての解析が行われている。例えば、シロイヌナズナのＣＡＤには、２種類のパラログ（ＡｔＣＡＤ４、ＡｔＣＡＤ５）があるが、そのいずれにも、Ｔ−ＤＮＡが挿入されることによってｍＲＮＡが正常に合成されなくなった変異体が報告されている（例えば、非特許文献１１参照。）。 また、トウモロコシｂｍ１変異体では、遺伝解析の結果、ｂｍｒ表現型は、染色体上ＺｍＣＡＤ２の存在する領域と強く連鎖しており、ＣＡＤ酵素活性も野生型と比較して低下していることが明らかにされたが、変異体のＺｍＣＡＤ２遺伝子そのものに変異は発見されていない（例えば、非特許文献１２参照。）。
【０００９】
また、長らく、イネにはｂｍｒに相当する変異体は存在しないと考えられていたが（例えば、非特許文献１３参照。）、近年、イネのｇｈ２（ｇｏｌｄ  ｈｕｌｌ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｎｏｄｅ  ２）変異表現型の原因が、ｂｍｒ表現型の原因となるＣＡＤ遺伝子の相同遺伝子（ＯｓＣＡＤ２）にあることが報告された（非特許文献１４参照。）。ただし、イネのｇｈ２系統では、トウモロコシやソルガム等の他の植物のｂｍｒ系統とは異なり、葉の中肋に褐色の着色はないと報告されており、この葉の中肋への着色は、イネ等のＣ３型光合成を行うイネ科草本には見られない変異表現型であるとされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Sattler SE, et al. Plant Science (2010) 178(3): p229-238
【非特許文献２】Pedersen J, et al. Crop Science (2005) 45(3): p812-819
【非特許文献３】Bomati E, et al. The Plant Cell (2005) 17(5): p1598-1611
【非特許文献４】Youn B, et al. Organic and Biomolecular Chemistry (2006) 4(9): p1687-1697
【非特許文献５】Oliver A, et al. Crop Science (2005) 45(6): p2234-2239
【非特許文献６】Oliver A, et al. Crop Science (2005) 45(6): p2240-2245
【非特許文献７】Saballos A, et al. Genetics (2009) 181(2): p783-795
【非特許文献８】Sattler S, et al. Plant Physiology (2009) 150(2): p584-595
【非特許文献９】Saballos A, et al. BioEnergy Research (2008) 1(3): p193-204
【非特許文献１０】Dien B, et al. BioEnergy Research (2009) 2(3): p153-164
【非特許文献１１】Sibout R, et al. Plant physiology (2003) 132(2): p848-860
【非特許文献１２】Halpin C, et al. The Plant Journal (1998) 14(5): p545-553
【非特許文献１３】Barriиre Y, et al. Comptes Rendus Biologies (2004) 327(9-10): p847-860
【非特許文献１４】Zhang K, et al. Plant physiology (2006) 140(3): p972-983
【非特許文献１５】NREL(NATIONAL RENEWABLE ENERGY LABOLATORY), “Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass (Laboratory Analytical Procedure (LAP)”, 2008, NREL/TP-510-42618.
【非特許文献１６】Lin SY, et al. (ed), “Method in lignin chemistry”, 1994, Springer-Verlag (ユニ出版).
【非特許文献１７】山本隆一、他２名共編、「イネ育種マニュアル」、（1996）養賢堂、p180-184．
【非特許文献１８】Terada R., et al. Plant Physiol (2007) 144: p846-856.
【非特許文献１９】Kashiwagi, T. , et al. Plant physiology (2004) 134(2): p676-683.
【非特許文献２０】Sunohara, H,.et al., Breeding Science (2006) 56(3): p261-268.
【非特許文献２１】Ookawa, T.et al., Nature Communications (2010) 1(8): p132-143.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
飼料用やバイオマス資源として用いられる場合には、植物体中のリグニン含有量が低いほど、リグニンに半ば覆われているセルロースにセルロース分解酵素がアクセスしやすくなり、セルロース分解（糖化）効率が向上すると考えられている。
しかしながら、非特許文献２等に記載されているように、植物体中のリグニン含有量を低下させた場合には、収量が低減してしまい、また、植物体の剛性（耐倒伏性）が低下する場合もある。
また、糖化効率の高い植物体が飼料用やバイオマス資源としてより好ましいことは明らかであるものの、植物体を構成するリグノセルロースの組成や性状と糖化効率との関係性が明確ではない現状、どの植物体や部位が糖化効率に優れているのかについては、実際に糖化処理を行うことによってしか判定することができず、さらに様々な前処理法や糖化酵素が存在することを考慮すると、評価が困難であるという問題もある。
【００１２】
本発明は、植物体の糖化効率を改善する方法、当該方法に用いられる植物、当該植物を用いてバイオマスエタノールを製造する方法、及び、植物体の易糖化性を評価する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、植物体中のクラソンリグニン含有量に対する酸可溶性リグニン含有量の比（［酸可溶性リグニン含有量］／［クラソンリグニン含有量］）が、当該植物体の糖化効率に高い相関を有することを見出し、本発明を完成させた。  
【００１４】
すなわち、本発明は、
（１）  植物体中のクラソンリグニン含有量に対する酸可溶性リグニン含有量の比（［酸可溶性リグニン含有量］／［クラソンリグニン含有量］）を指標とし、前記比が低い植物体よりも、前記比が高い植物体のほうが、糖化効率が高いと評価することを特徴とする、植物体の易糖化性の評価方法、
を、提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の植物体の糖化効率の改善方法においては、特定のリグニン組成を有する植物体を糖化処理の原料として用いることにより、糖化効率を改善することができる。
また、本発明の植物は、野生型の植物よりも糖化効率に優れている。このため、当該植物を原料として用いる本発明のバイオマスエタノールの製造方法は、野生型の植物を原料として用いる場合よりも、より高効率かつ低コストでバイオマスエタノールを製造し得る。
さらに、本発明の植物体の易糖化性の評価方法を用いることにより、糖化処理を行う前に予め、原料の候補植物体が、糖化効率が高く、飼料用植物やバイオマス資源として好適な植物体であるか否かを評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】野生型イネ（左）とｇｈ２−２変異体（右）の穂（図１Ａ）、籾（図１Ｂ）、葉（図１Ｃ）、及び節間（図１Ｄ）の写真図である。
【図２】実施例１において、野生型イネとｇｈ２−２変異体の各器官の乾燥重量を測定した結果を示した図である。
【図３】実施例１において、野生型イネとｇｈ２−２変異体の各器官の乾燥重量当たりの総リグニン含有量を測定した結果を示した図である。
【図４】実施例１において、野生型イネとｇｈ２−２変異体の各器官の乾燥重量当たりのセルロース含有量を測定した結果を示した図である。
【図５】実施例１において、野生型イネとｇｈ２−２変異体の各器官の乾燥重量当たりのキシラン含有量を測定した結果を示した図である。
【図６】実施例１において、野生型イネとｇｈ２−２変異体の各器官の乾燥重量当たりの灰分含有量を測定した結果を示した図である。
【図７】実施例１において、野生型イネとｇｈ２−２変異体の稲藁全体における糖化効率とセルロース分解酵素反応の反応時間との関係を示した図である。
【図８】実施例１において、反応開始から４８時間経過後の野生型イネとｇｈ２−２変異体の各器官の糖化効率を算出した結果を示した図である。
【図９】実施例１において、反応開始から４８時間経過後の野生型イネとｇｈ２−２変異体の各器官の乾燥重量当たりのグルコース産生効率を算出した結果を示した図である。
【図１０】実施例１において、野生型イネとｇｈ２−２変異体の各器官における酸可溶性リグニン含有量と糖化効率との関係を示した図である。
【図１１】実施例１において、各成分の含有量と糖化率との相関関係を、共分散構造分析を利用してパス解析した結果を示した図である。
【図１２】実施例１において、野生型イネとｇｈ２−２変異体の各器官におけるＡＳＬ／ＫＬ比とセルロース含有量を独立変数とし、糖化効率を従属変数とした重回帰分析の結果を示した図である。縦軸は糖化効率の実測値であり、横軸は重回帰分析の結果得られた回帰式（下記式（２））から算出された糖化効率の予測値である。
【図１３】実施例１において、野生型イネとｇｈ２−２変異体の押し倒し抵抗値（Ｎ／分げつ）の測定結果を示した図である。
【図１４】実施例１において、野生型イネとｇｈ２−２変異体の節間の断面係数（ｍｍ３）の測定結果を示した図である。
【図１５】実施例１において、野生型イネとｇｈ２−２変異体の節間の曲げ応力（ｇ／ｍｍ２）の測定結果を示した図である。
【図１６】実施例１において、野生型イネとｇｈ２−２変異体の挫折時モーメント（ｋｇ・ｃｍ）の算出結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明及び本願明細書において、植物体の糖化効率とは、当該植物体中のセルロースがグルコースに変換される効率を意味する。また、植物体の易糖化性を評価するとは、当該植物体の糖化効率の高低を評価することを意味する。
【００１８】
＜植物体の易糖化性の評価方法＞
本発明の植物体の易糖化性の評価方法は、植物体中のクラソンリグニン含有量に対する酸可溶性リグニン含有量の比（［酸可溶性リグニン含有量］／［クラソンリグニン含有量］、以下、「ＡＳＬ／ＫＬ比」）を指標とすることを特徴とする。後記実施例１に示すように、植物体の糖化効率は、植物体中の総リグニン含有量やクラソンリグニン含有量とは統計学上有意に高い相関性がないが、ＡＳＬ／ＫＬ比とは高い相関を有する。このため、植物体中のＡＳＬ／ＫＬ比を指標とすることにより、当該植物体を糖化処理した場合の糖化効率を評価することができる。なお、植物体の糖化効率がＡＳＬ／ＫＬ比に高い相関を有することは、本発明者らにより初めて見いだされた知見である。
【００１９】
具体的には、ＡＳＬ／ＫＬ比が低い植物体よりも、ＡＳＬ／ＫＬ比が高い植物体のほうが、糖化効率が高いと評価することができる。例えば、評価対象の植物が複数ある場合、各植物のＡＳＬ／ＫＬ比を測定し、互いに比較することにより、実際に糖化処理を行う前に、いずれの植物がより糖化効率が高いかを評価することができる。
【００２０】
飼料作物の場合、糖化効率が高いほど、消化効率がよいことが期待できる。同様に、エタノール等の化合物を合成するための糖類等の原料の供給源として用いられるバイオマス資源としては、糖化処理によってより多くの糖類を効率よく得られる植物体のほうが、少量の糖類しか得られない植物体よりも好ましい。よって、本発明の植物体の易糖化性の評価方法は、候補の植物体が飼料作物やバイオマス資源として好適かどうかを評価したり、複数種類の候補植物の中から、飼料作物やバイオマス資源としてより好適な植物を選抜する場合に好適に用いることができる。
【００２１】
評価対象となる植物体は、植物個体全体であってもよいが、器官ごとに評価することもできる。例えば、同一種類の植物体由来の茎と葉とを比較し、どちらの器官が、糖化効率が高くバイオマス資源として好適か、を評価することもできる。
【００２２】
評価対象となる植物体の種類は、クラソンリグニンと酸可溶性リグニンを含む植物体であれば特に限定されるものではなく、単子葉植物であってもよく、双子葉植物であってもよい。また、Ｃ３型光合成を行う植物（Ｃ３植物）であってもよく、Ｃ４型光合成を行う植物（Ｃ４植物）であってもよい。
【００２３】
植物体中のＡＳＬ／ＫＬ比は、植物体中の酸可溶性リグニン含有量とクラソンリグニン含有量の測定結果から算出することができる。植物体中の酸可溶性リグニン含有量とクラソンリグニン含有量は常法により測定することができる（例えば、非特許文献１５、１６参照。）。より具体的には、例えば、以下の手法により測定することができる。まず、細断又は粉砕した植物体又はその器官を試料とし、当該試料中のデンプンを可溶化した後に濾過処理を行うことによって、当該試料からデンプンを除去する。洗浄、乾燥した濾過残渣を、硫酸溶液等の鉱酸水溶液に混和させた後、加水分解反応を行う。次いで、加水分解反応後の試料に対して、濾過処理等を行い、単糖や酸可溶性リグニン等の可溶性成分を含む液体成分（濾液）と、クラソンリグニンや灰分といった不溶性成分を含む固体成分（濾過残渣）に分離する。洗浄、乾燥させた濾過残渣を、６００℃程度の高温で焼成させた後の残渣分が灰分である。よって、焼成前の濾過残渣量から灰分の含有量を差し引くことにより、当該濾過残渣に含まれていたクラソンリグニン含有量を求めることができる。一方で、濾液中の酸可溶性リグニン含有量は、当該濾液の２０５ｎｍの吸光度から、Ｂｅｅｒ則にて下記式（１）から算出される。
酸可溶性リグニン含有量（ｇ・Ｌ−１）＝吸光度／［光路（ｃｍ）×吸光計数（Ｌ・ｇ−１・ｃｍ−１）］    ・・・（１）
【００２４】
＜植物体の糖化効率の改善方法＞
酸可溶性リグニンは、酸溶媒をはじめとする多くの溶媒に対して不溶性であるクラソンリグニンよりも、酸処理等の前処理によって分解されやすい。このため、リグノセルロース中に占める酸可溶性リグニンの含有量が多いほど、すなわち、ＡＳＬ／ＫＬ比が高いほど、前処理後の植物体にセルロース分解酵素がアクセスしやすくなり、セルロース分解（糖化）効率が向上する。したがって、植物体中のＡＳＬ／ＫＬ比を高めることにより、当該植物体の糖化効率を向上させることができる。
【００２５】
すなわち、本発明の植物体の糖化効率の改善方法は、糖化処理がなされる植物体が、少なくとも１種のリグニン生合成関連遺伝子に機能欠損変異を有しており、かつ当該植物体中のＡＳＬ／ＫＬ比が、前記機能欠損変異を有していない植物体よりも高いことを特徴とする。なお、「前記機能欠損変異を有していない植物体」は、当該機能欠損変異の有無以外は遺伝的背景が実質的に同一である植物体を意味する。具体的には、例えば、前記機能欠損変異が導入される前の植物体が挙げられる。
【００２６】
本発明及び本願明細書において、リグニン生合成関連遺伝子とは、当該遺伝子がコードするタンパク質が、リグニン生合成代謝経路に関連する遺伝子を意味する。リグニン生合成関連遺伝子としては、具体的には、リグニンモノマー生合成に関わるＣＡＤ遺伝子、ＣＯＭＴ遺伝子、４−ヒドロキシシンナモイル−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）遺伝子、フェルラ酸５ヒドロキシラーゼ（Ｆ５Ｈ）遺伝子、リグニンモノマーの重合に関わるペルオキシダーゼ（ＰＯ）やラッカーゼ（ＬＡＣ）をコードする遺伝子等が挙げられる。本発明において糖化処理がなされる植物体としては、１種類のリグニン生合成関連遺伝子にのみ機能欠損変異を有していてもよく、２種類以上のリグニン生合成関連遺伝子に機能欠損変異を有していてもよい。なお、リグニン生合成関連遺伝子が酵素をコードする遺伝子である場合には、機能欠損変異とは、当該酵素活性が欠失若しくは低下する遺伝子変異を意味する。
【００２７】
本発明の植物体の糖化効率の改善方法においては、少なくともＣＡＤ遺伝子に機能欠損変異を有する植物体に対して糖化処理がなされることが好ましい。植物体中において、ＣＡＤ（ＥＣ１．１．１．１９５）の酵素活性が低下することにより、ＡＳＬ／ＫＬ比をより効果的に高めることができる。ＣＡＤ遺伝子が有する機能欠損変異としては、当該変異が導入されたＣＡＤ遺伝子がコードする変異型ＣＡＤの酵素活性が、当該変異が導入されていないＣＡＤ遺伝子がコードするＣＡＤよりも低下するものであれば特に限定されるものではなく、ミスセンス変異であってもよく、ナンセンス変異であってもよく、フレームシフト変異であってもよい。
【００２８】
本発明の植物体の糖化効率の改善方法においては、ＣＡＤ遺伝子が有する機能欠損変異は、ミスセンス変異であることが好ましく、ＣＡＤ中の構造亜鉛に配位する４つのシステイン残基のうちの少なくとも１のシステイン残基が他のアミノ酸残基に置換された変異（以下、「システイン変異」ということがある。）であることがより好ましく、前記構造亜鉛に配位する４つのシステイン残基のうちのＮ末端側から３番目のシステイン残基が他のアミノ酸残基に置換された変異であることがさらに好ましく、ＣＡＤ中の構造亜鉛に配位する４つのシステイン残基のうちのＮ末端側から３番目のシステイン残基がフェニルアラニン残基に置換された変異であることが特に好ましい。なお、ＣＡＤ中の構造亜鉛に配位する４つのシステイン残基のうちのＮ末端側から３番目のシステイン残基が他のアミノ酸残基に置換された変異は、本発明者らにより初めて見出された変異である。
【００２９】
糖化効率が改善される植物体の種類は、クラソンリグニンと酸可溶性リグニンを含む植物体であれば特に限定されるものではなく、単子葉植物であってもよく、双子葉植物であってもよい。また、Ｃ３型光合成を行う植物であってもよく、Ｃ４型光合成を行う植物であってもよい。本発明の植物体の糖化効率の改善方法においては、糖化効率が改善される植物体がＣ３型光合成を行う植物であることが好ましく、Ｃ３型光合成を行う単子葉植物であることがより好ましく、イネであることが特に好ましい。
【００３０】
後記実施例１に示すように、システイン変異を有するイネは、葉の中肋部の一部又は全部が赤褐色に着色されている。したがって、本発明の植物体の糖化効率の改善方法においては、葉の中肋部の一部又は全部が赤褐色に着色されているＣ３型光合成を行う植物に対して糖化処理を行うことが好ましく、葉の中肋部の一部又は全部が赤褐色に着色されているイネに対して糖化処理を行うことがより好ましい。なお、イネ等のＣ３型光合成を行う植物において、葉の中肋部の一部又は全部が赤褐色に着色されている形質を有するリグニン生合成欠損変異体は、今まで知られていない。
【００３１】
植物体の糖化処理の方法は、植物体中のセルロースを分解し得る方法であれば、特に限定されるものではなく、トウモロコシ等の植物体中のセルロースを分解する際に通常用いられている手法の中から適宜選択して用いることができる。例えば、植物体を硫酸溶液等の酸性溶液に浸漬させた状態で加熱する酸糖化法であってもよく、セルロース分解酵素を用いた酵素糖化法であってもよい。酸糖化法では過分解による単糖収率の低下やフルフラールなど過分解生成物によるエタノール発酵阻害が起きるため、酵素糖化法がより好ましい。糖化処理における反応溶液の温度やｐＨ、反応時間等の反応条件は、酸糖化法の場合には用いる酸の種類や酸性溶液の濃度、植物体と酸性溶液の混合比等を考慮して、また酵素糖化法の場合には、用いるセルロース分解酵素の特性等を考慮して、適宜調整することができる。なお、糖化処理に供される植物体は、予め、細断又は粉砕してあることが好ましい。
【００３２】
酵素糖化法を用いる場合には、糖化処理の前に、予め植物体を酸性溶液（例えば、ｐＨ４〜６の溶液）中に浸漬させておくことが好ましい。酸性溶液に浸漬させることにより、植物体中の酸可溶性リグニンが溶出するため、植物体中のセルロースにセルロース分解酵素がアタックしやすくなる結果、糖化効率をより改善することができる。予め酸性溶液に浸漬させた植物体は、適当なバッファーにより洗浄してｐＨを調整した後に、セルロース分解酵素を添加して酵素反応を行うことができる。酸性条件下で酵素活性を有するセルロース分解酵素を用いて酸性溶液中で植物体の糖化処理を行う場合には、糖化処理前の酸性溶液への浸漬処理を省略することもできる。
【００３３】
＜バイオマスエタノールの製造方法＞
本発明のバイオマスエタノールの製造方法は、バイオマス資源として、少なくとも１種のリグニン生合成関連遺伝子に機能欠損変異を有しており、かつ当該植物体中のＡＳＬ／ＫＬ比が、前記機能欠損変異を有していない植物体よりも高い植物体を用いることを特徴とする。リグニン生合成関連遺伝子に機能欠損変異を導入された結果、ＡＳＬ／ＫＬ比が高められた植物体は、糖化効率が良好であるため、バイオマスエタノールを製造するためのバイオマス資源として好適である。
【００３４】
少なくとも１種のリグニン生合成関連遺伝子に機能欠損変異を導入することにより、植物体中のＡＳＬ／ＫＬ比が、前記機能欠損変異を有していない植物体よりも高められた植物体としては、前記植物体の糖化効率の改善方法において挙げられた植物体を用いることができる。本発明のバイオマスエタノールの製造方法においては、バイオマス資源として、ＣＡＤ中の構造亜鉛に配位する４つのシステイン残基のうちの少なくとも１のシステイン残基が他のアミノ酸残基に置換された変異（システイン変異）を有する植物体を用いることが好ましく、システイン変異を有するＣ３型光合成を行う植物であることがより好ましく、システイン変異を有するイネであることがさらに好ましい。バイオマス資源として用いられる植物体が備えるシステイン変異としては、ＣＡＤ中の構造亜鉛に配位する４つのシステイン残基のうちのＮ末端側から３番目のシステイン残基が他のアミノ酸残基に置換された変異であることが好ましく、ＣＡＤ中の構造亜鉛に配位する４つのシステイン残基のうちのＮ末端側から３番目のシステイン残基がフェニルアラニン残基に置換された変異であることがより好ましい。
【００３５】
バイオマス資源として用いる植物体に対して糖化処理を行った後、得られた糖化液中の糖類からエタノールを合成することにより、バイオエタノールを製造することができる。糖化処理は、前記植物体の糖化効率の改善方法において挙げられた方法により行うことができる。また、エタノール合成反応は、特に限定されるものではなく、酵母によるアルコール発酵法等のバイオエタノールを製造する際に通常用いられている手法の中から適宜選択して用いることができる。
【００３６】
＜植物体中のＡＳＬ／ＫＬ比が高められた植物＞
本発明の植物は、植物体を構成する少なくとも１以上の細胞のゲノムにおいて、ＣＡＤ遺伝子が、ＣＡＤ中の構造亜鉛に配位する４つのシステイン残基のうちの少なくとも１のシステイン残基が他のアミノ酸に置換されている変異（システイン変異）を有することを特徴とする。本発明の植物が備えるシステイン変異としては、ＣＡＤ中の構造亜鉛に配位する４つのシステイン残基のうちのＮ末端側から３番目のシステイン残基が他のアミノ酸残基に置換された変異であることが好ましく、ＣＡＤ中の構造亜鉛に配位する４つのシステイン残基のうちのＮ末端側から３番目のシステイン残基がフェニルアラニン残基に置換された変異であることがより好ましい。
【００３７】
システイン変異を有する植物の種類は、ＣＡＤ遺伝子を有する植物であれば特に限定されるものではなく、単子葉植物であってもよく、双子葉植物であってもよい。また、Ｃ３型光合成を行う植物であってもよく、Ｃ４型光合成を行う植物であってもよい。
【００３８】
ＣＡＤ中の構造亜鉛に配位する４つのシステイン残基は、さまざまな植物種で高度に保存されている。例えば、イネのＣＡＤ２（ＯｓＣＡＤ２）、シロイヌナズナのＣＡＤ５（ＡｔＣＡＤ５）、アスペンのＣＡＤ（ＰｏｔＣＡＤ）、テーダマツのＣＡＤ（ＰｔＣＡＤ）、トウモロコシのＣＡＤ（ＺｍＣＡＤ２）、ソルガムのＢｍｒ６（ＳｂＣＡＤ２）、イワヒバのＣＡＤ（ＳｍＣＡＤ）、タバコのＣＡＤ（ＮｔＣＡＤ１９）、サトウキビのＣＡＤ（ＳｏＣＡＤ）ではＮ末から１００、１０３、１０６、及び１１４番目のシステイン残基であり、シロイヌナズナのＣＡＤ４（ＡｔＣＡＤ４）ではＮ末から１０１、１０４、１０７、及び１１５番目のシステイン残基であり、ソルガムのＣＡＤ４（ＳｂＣＡＤ４）ではＮ末から９８、１０１、１０４、及び１１２番目のシステイン残基である。さらには、ＣＡＤ以外の他のアルコールデヒドロゲナーゼにおいても高度に保存されており、これらのシステインの置換は酵素機能の変化を引き起こす可能性が高いことが示唆される。本発明の植物としては、例えば、これらのシステイン残基の少なくとも１つが他のアミノ酸残基に置換された変異を有する植物を挙げることができる。
【００３９】
本発明の植物としては、前記変異を有するＣ３型光合成を行う植物であることが好ましく、前記変異を有するＣ３型光合成を行う単子葉植物であることがより好ましく、システイン変異を有するイネであることが特に好ましい。中でも、ＯｓＣＡＤ２中の構造亜鉛に配位する４つのシステイン残基のうちの少なくとも１のシステイン残基が他のアミノ酸残基に置換された変異を有するイネであることが好ましく、ＯｓＣＡＤ２中の構造亜鉛に配位する４つのシステイン残基のＮ末端側から３番目のシステイン残基が他のアミノ酸残基に置換された変異を有するイネであることが好ましい。具体的には、後記実施例１に記載のＯｓＣＡＤ２中の構造亜鉛に配位する４つのシステイン残基のうちのＮ末端側から３番目のシステイン残基（Ｎ末端側から１０６番目のアミノ酸残基）がフェニルアラニン残基に置換された変異を有するイネ（ｇｈ２−２変異体）が挙げられる。
【００４０】
本発明の植物としては、ＣＡＤ中の構造亜鉛に配位する４つのシステイン残基のうちのＮ末端側から３番目のシステイン残基は、フェニルアラニン残基以外のアミノ酸残基に置換されていてもよい。例えばイネでは、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１０６番目のフェニルアラニンが、システイン以外の他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子を有する植物も、本発明の植物である。
【００４１】
なお、本発明の植物としては、ＣＡＤ遺伝子は、システイン変異による植物体中のＡＳＬ／ＫＬ比が高められるという効果を損なわない限りにおいて、システイン変異以外の変異を有していてもよい。
【００４２】
システイン変異を有する植物は、植物において、ゲノム中の特定の領域に点突然変異を起こして変異体を作製する際に用いられる当該技術分野において公知の手法により、作製することができる。具体的には、ガンマ線による種子照射、化学変異剤ｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ若しくはアジ化ナトリウムによる種子処理、又は、ＭＮＵ（Ｎ-ｍｅｔｈｙｌ-Ｎ-ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）による受精卵処理などが挙げられる（例えば、非特許文献１７参照。）。
【００４３】
システイン変異を有する植物を作製する際には、例えば、下記のような塩基配列を有するポリヌクレオチドを組み込んだベクターを用いることができる。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１０６番目のフェニルアラニンが、システイン以外の他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１０６番目のフェニルアラニン以外のアミノ酸のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、かつ植物体中のクラソンリグニン含有量に対する酸可溶性リグニン含有量の比（［酸可溶性リグニン含有量］／［クラソンリグニン含有量］）を高める機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列と８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上）の相同性を有し、かつ、植物体中のクラソンリグニン含有量に対する酸可溶性リグニン含有量の比（［酸可溶性リグニン含有量］／［クラソンリグニン含有量］）を高める機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
【００４４】
例えば、前記（ａ）の塩基配列を有するポリヌクレオチドを相同組換えによる遺伝子ターゲティング（例えば、非特許論文１８参照。）を用いてイネゲノム中のＯｓＣＡＤ２遺伝子と組み換えることにより、ＯｓＣＡＤ２中の構造亜鉛に配位する４つのシステイン残基のうちのＮ末端側から３番目のシステイン残基（Ｎ末端側から１０６番目のアミノ酸残基）がフェニルアラニン残基に置換された変異を有するイネを、同じく前記（ｂ）の塩基配列を有するポリヌクレオチドで組み換えることによって、ＯｓＣＡＤ２中の構造亜鉛に配位する４つのシステイン残基のうちのＮ末端側から３番目のシステイン残基がフェニルアラニン残基以外のその他のアミノ酸残基に置換された変異を有するイネを、それぞれ作製することができる。同様に、前記（ｃ）や（ｄ）の塩基配列を有するポリヌクレオチドで置換することによって、例えば、ＯｓＣＡＤ２中の構造亜鉛に配位する４つのシステイン残基のうちのＮ末端側から３番目のシステイン残基（Ｎ末端側から１０６番目のアミノ酸残基）がフェニルアラニン残基に置換されており、さらにその他の変異を有するイネを作製することができる。
【実施例】
【００４５】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４６】
［実施例１］
＜ＣＡＤ遺伝子にシステイン変異を有するイネの作製＞
変異選抜・固定を進めてきたＭＮＵ処理によるイネ突然変異系統群より、稈、籾に赤褐色の呈色を示すｇｈ２（ｇｏｌｄ  ｈｕｌｌ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｎｏｄｅ２）様の表現型に加えて、上位葉の中肋に赤褐色の呈色を示す変異系統を選抜した。この選抜された変異体のリグニン生合成関連遺伝子の塩基配列を調べたところ、ＯｓＣＡＤ２遺伝子に変異を有していることがわかった。当該ＯｓＣＡＤ２遺伝子がコードするタンパク質ＯｓＣＡＤ２のアミノ酸配列を配列番号１に示す。当該変異体は、配列番号１の１０６番目のシステイン残基をコードする塩基配列ＴＧＣの２番目の塩基がグアニンからチミンに置換されており、当該変異により、ＯｓＣＡＤ２の１０６番目のシステイン残基がフェニルアラニン残基に置換されていた。さらにこの変異体に野生型ＯｓＣＡＤ２を組み込んだ形質転換体では、変異表現型が回復したことから、当該変異体はＯｓＣＡＤ２機能欠損変異体（ｇｈ２）の新規アリルであることが確認できた。以下、選抜された変異体を、ｇｈ２−２変異体とする。
【００４７】
＜イネの栽培及び収量＞
野生型のイネとｇｈ２−２変異体とを、水田にて慣行栽培し、植物体（イネ）の地上部を出穂後５０日目に収穫した。図１に、野生型イネ（左）とｇｈ２−２変異体（右）の穂（図１Ａ）、籾（図１Ｂ）、葉（図１Ｃ）、及び節間（図１Ｄ）の写真を示す。ｇｈ２−２変異体の穂、籾、及び節間は、野生型イネよりも褐色が濃く、また、葉では中肋が赤褐色に着色されていた。
収穫された植物体を屋内にて１週間程度自然乾燥した後、脱穀した。その後、藁と籾殻をドライオーブンで、５０℃で２週間乾燥させた。なお、脱穀後の植物体の一部は、器官別分析に供する試料を作製するために、葉身、葉鞘、稈、穂（籾は含まない）、及び籾殻にそれぞれ分けて回収した後、ドライオーブンで、５０℃で２週間乾燥させた。乾燥後の藁等は、それぞれ、ハサミで１ｃｍ程度に刻んだ後、カッターミル（製品名：ＭＫＣＭ−５、３ｍｍスクリーン装備、増幸産業社製）を用いて粉砕した。
【００４８】
得られた粉砕試料の乾燥重量を測定した結果を図２に示す。図１中、「ＷＴ」は野生型イネの結果であり、「ｇｈ」はｇｈ２−２変異体の結果である。また、「ＷＳ」は藁全体の結果を、「ＬＢ」は葉身の結果を、「ＬＳ」は葉鞘の結果を、「Ｃ」は稈の結果を、「Ｐ」は穂の結果を、「Ｈ」は籾殻の結果を、それぞれ示す。さらに、「＊」は、野生型イネとｇｈ２−２変異体との差が５％水準で、「＊＊」は１％水準で、「＊＊＊」は０．１％水準で、統計的に有意であったことを、「ＮＳ」は両者に有意差がなかったことを、それぞれ示す。この結果、稲藁全体において、野生型イネとｇｈ２−２変異体の収量は有意差がなく、ＣＡＤ遺伝子にシステイン変異を導入することによっては、稲藁全体として有意な変化は見られないことがわかった。
【００４９】
＜測定試料の作製＞
得られた粉砕試料中のデンプンを、Ｔｏｔａｌ  Ｓｔａｒｃｈ  Ｋｉｔ（製品名：Ｋ−ＴＳＴＡ、メガザイム社製）を用いた標準的な総デンプン分析法（ＡＯＡＣ法９９６．１１、ＡＡＣＣ法７６．１３）に従って、可溶化した後に濾過することによって除去した。濾過残渣を滅菌水で洗浄した後、４０℃で乾燥したものを、以降の細胞壁成分分析及び酵素糖化試験の試料としてそれぞれ用いた。            
【００５０】
＜細胞壁成分分析＞
試料中のセルロース、キシラン（ヘミルセルロース）、クラソンリグニン、酸可溶性リグニン、灰分を、非特許文献１５，１６に記載の方法に準じて定量した。なお、各成分の定量値は、最終的に試料乾物量当たりの重量％として算出した。また、総リグニン含有量は、クラソンリグニン含有量と酸可溶性リグニン含有量の和として算出した。
【００５１】
まず、試料３００ｍｇに７２％硫酸３ｍＬを加えて混和した後、３０℃で６０分間温浴させた。さらに水８４ｍＬを加えて混和した後、オートクレーブ（１２１℃、６０分間）にかけることによって、酸加水分解反応により、試料中のセルロース、キシラン等の多糖類を単糖にまで分解した。反応後の試料は、室温近くまで冷却させた後、氷中に静置した。その後、吸引濾過を行うことにより、酸加水分解反応後の試料を濾液と濾過残渣とに分離した。
【００５２】
得られた濾過残渣から、クラソンリグニン及び灰分を定量した。具体的には、当該濾過残渣を滅菌水で洗浄した後、るつぼに回収し、１０５℃で一昼夜乾燥させた後に重量を測定した（重量Ａ）。その後、さらに６００℃で４時間焼成させた後、再び重量を測定した（重量Ｂ）。焼成後の残渣が灰分（重量Ｂ）であり、焼成されたものがクラソンリグニン（重量Ａから重量Ｂを差し引いた重量）である。
【００５３】
得られた濾液の２０５ｎｍにおける吸光度を分光光度計で測定した。得られた吸光度から、濾液中の酸可溶性リグニン含有量を、Ｂｅｅｒ則にて前記式（１）から求めた。なお、吸光計数は１１０Ｌ・ｇ−１・ｃｍ−１を使用した。
【００５４】
得られた濾液から、セルロース及びキシランを定量した。具体的には、当該濾液に炭酸カルシウムを加えてｐＨ５．０〜６．０に調整した後、上澄みを０．２μｍフィルターに通したものを、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用試料とした。調製したＨＰＬＣ試料をＨＰＬＣに注入し、下記の条件でＨＰＬＣを行い、グルロース及びキシロースを分離して検出した。検出されたグルロース及びキシロースは、標品を用いた検量線法により定量した。グルロースの定量値に０．９を乗じた値をセルロースの定量値とし、キシロースの定量値に０．８８を乗じた値をキシランの定量値とした。
【００５５】
ＨＰＬＣ条件；
カラム：Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｐ（３００ｍｍ×Φ７．８ｍｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）、
カラムオーブン温度：８５℃、
移動相：水、
流量：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、
検出器：ＲＩ（示差屈折）検出器、
検出器内部温度：４０℃、
オートサンプラ温度：４℃、
サンプリング量：５０μＬ、
【００５６】
測定結果を図３〜６に示す。図３は総リグニン含有量の結果を、図４はセルロース含有量の結果を、図５はキシラン含有量の結果を、図６は灰分含有量の結果を、それぞれ示す。図３〜６中、「ＷＴ」、「ｇｈ」、「ＷＳ」、「ＬＢ」、「ＬＳ」、「Ｃ」、「Ｐ」、「Ｈ」、「＊」、「＊＊」、「＊＊＊」、及び「ＮＳ」の意味は、図２と同じである。図２に示すように、葉鞘では有意差がなかったものの、ｇｈ２−２変異体の総リグニン含有量は野生型イネよりも、葉身では約１０％、稈では約２０％、穂や籾殻では約１４％減少しており、藁全体でも約１４％減少していた。一方で、リグニンの他の主要成分であるセルロースやキシラン、灰分の含有量は、野生型イネとｇｈ２−２変異体では、藁全体でみると有意差がなかった
【００５７】
＜酵素糖化試験＞
粉砕試料からデンプンを除去して得られた試料２５ｍｇに、反応液（１．９％アクレモニウムセルラーゼ（明治製菓社製）、５０％酢酸バッファー（ｐＨ４．８）、０．０２％アジ化ナトリウム）１ｍＬを添加し、５０℃、１８０ｒｐｍで振とうさせた状態で酵素反応を行った。反応液中のグルコース含有量を測定するために、藁全体サンプルについては、反応開始後０、２、６、２４、３０、及び４８時間後に、反応液の一部を分取した。その他のサンプルについては、反応開始から４８時間経過後の反応液を用いた。いずれのサンプルにおいても、分取した反応液は、容器ごと沸騰水に５分間湯浴させることにより酵素反応を停止させた後、測定した。
測定用に分取された反応液中のグルコースを、グルコースＣＩＩテストワコー（和光純薬社製）を用いて定量した。得られた定量値を、ＨＰＬＣによる定量の結果から算出された試料２５ｍｇ中に含まれるグルコース含有量で除したものを、糖化効率とした。
【００５８】
図７は、野生型イネとｇｈ２−２変異体の稲藁全体における糖化効率とセルロース分解酵素反応の反応時間との関係を示した図であり、図８は反応終了後の野生型イネとｇｈ２−２変異体の各器官の糖化効率を算出した結果を示した図であり、図９は同じく反応終了後の野生型イネとｇｈ２−２変異体の各器官の乾燥重量当たりのグルコース産生効率（乾物糖化率）を算出した結果を示した図である。この結果、稲藁全体では、セルロース分解酵素反応の早い段階から反応終了時の４８時間経過後まで一貫して、ｇｈ２−２変異体のほうが野生型イネよりも糖化効率が高く、糖化されやすいことがわかった。より詳細には、ｇｈ２−２変異体の糖化効率は野生型イネの約１．２２倍であり、乾物糖化率は野生型イネの約１．２３倍であった。また、器官ごとに若干の多少はあるものの、いずれの器官においても、ｇｈ２−２変異体は野生型イネよりも糖化効率が有意に高いことがわかった。
【００５９】
＜糖化効率と各成分の含有量との間の相関係数の算出＞
糖化効率と各成分の含有量との間の相関係数を算出したところ、表１に示すように、糖化効率は、セルロースやキシラン、灰分の含有量とはほとんど相関がなかった。また、総リグニン含有量との相関係数は、−０．５７とやや高めであったものの、有意ではなく、クラソンリグニン含有量との相関係数は−０．６９であり、有意であったがそれほど高い相関は観察されなかった。これに対して、全体の３％程度しか含まれていない酸可溶性リグニン含有量と糖化効率の相関係数は０．８７と非常に高いことがわかった。これらの結果から、糖化効率は、植物体中の総リグニン含有量よりも、リグニンの質（組成）が大きく影響することが強く示唆された。
【００６０】
【表１】
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【００６１】
そこで、酸可溶性リグニン含有量と糖化効率との関係をより詳細に検討した。図１０は、野生型イネとｇｈ２−２変異体の各器官における酸可溶性リグニン含有量と糖化効率との関係をプロットした図である。この結果、籾殻（Ｈ）や葉鞘（ＬＳ）、葉身（ＬＢ）では、酸可溶性リグニン含有量が高いｇｈ２−２変異体のほうが、野生型イネよりも糖化効率が改善されていた。しかしながら、藁全体（ＷＳ）や稈（Ｃ）、穂（Ｐ）では、酸可溶性リグニン含有量に明らかな差はないにもかかわらず、高いｇｈ２−２変異体は野生型イネよりも糖化効率が顕著に改善されていた。これらの結果から、酸可溶性リグニン含有量のみからでは、ｇｈ２−２変異体において野生型イネよりも糖化効率が改善されたことの説明ができず、酸可溶性リグニン含有量と糖化効率との高い相関は、直接的な因果関係を反映していない可能性が示唆された。
【００６２】
＜パス解析による糖化効率と各成分の含有量の解析＞
各成分の含有量と糖化効率との相関関係をより詳細に調べるため、各種成分の含有率が糖化効率に及ぼす影響力の推定を試みた。解析は、糖化効率に対して、クラソンリグニン含有量や酸可溶性リグニン含有量が直接作用しているのか、又は両者の比という植物体中のリグニン組成の質的ファクターを介して間接的に作用しているのかを明らかにするために、説明変数から従属変数への直接効果ばかりではなく、別の説明変数を介した間接効果を求めることができるパス解析により行った。本実施例においては、パス解析を、構造方程式モデリング（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｅｑｕａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ：ＳＥＭ）を用いて実施し、各変数のそれぞれの影響の大きさを定量的に明らかにした。なお、ＳＥＭは、共分散構造分析とも呼ばれている。
【００６３】
まず、酸可溶性リグニン含有量とクラソンリグニン含有量が糖化効率に対して直接的な作用と両者の比（ＡＳＬ／ＫＬ比）を介した間接的な作用の両方を有することを前提として、各成分の含有量と糖化率との因果関係のモデル（パス図）を作成した。このモデルは、各細胞壁成分含有量により糖化効率の変動の９３％が説明可能という極めて高い説明率を示したものの、作用の大きさを示すパス係数の推定値のばらつきが大きいなどの不安定さが見られ、さらにはモデル全体が実データの構造に適合しているかどうかの検定において棄却（モデルが実データ構造と統計的に有意に異なることが示された）された。
【００６４】
そこで、各成分含有量間の関係性を見直した上、先のモデルにおいて酸可溶性リグニンから糖化効率への直接的な作用の大きさがほぼ０（標準化パス係数＝０．０３）であったことから、酸可溶性リグニンが糖化効率に直接的な作用を有しないことを前提としてモデルを組み直したところ、パス係数の推定精度、モデルの実データへの適合度とも大幅に改善され、良好な結果が得られた。作成されたパス図を図１１に示す。解析の結果、糖化効率へ有意な直接作用を有するのは、ＡＳＬ／ＫＬ比（標準化パス係数＝０．８４）とセルロース含有量（標準化パス係数＝−０．５７）であり、クラソンリグニン含有量や酸可溶性リグニンの含有量は、キシラン含有量や灰分含有量と同様に糖化効率に対して有意な直接作用をもたらさないことが示された。中でも、ＡＳＬ／ＫＬ比の糖化効率への直接効果が大きいことが明らかとなった。以上の結果から、糖化効率は、植物体中の総リグニン含有量よりも、ＡＳＬ／ＫＬ比が大きく影響すること、したがって、植物体中の総リグニン含有量を低減させずとも、ＡＳＬ／ＫＬ比を増大させることにより、総リグニン含有量の減少により引き起こされるデメリットを抑えつつ、リグノセルロースの易糖化性を変化させることが可能であることが示された。
【００６５】
測定データに基づき、野生型イネとｇｈ２−２変異体の各器官におけるＡＳＬ／ＫＬ比とセルロース含有量を独立変数とし、糖化効率を従属変数とした重回帰分析の結果、決定係数（Ｒ２）が０．９３と非常に高かった（図１２）。これより、バイオマスサンプル中のＡＳＬ／ＫＬ比とセルロース含有量を測定することで、セルロースの糖化効率を予測し得ること、すなわち、バイオマスサンプル中のＡＳＬ／ＫＬ比とセルロース含有量を指標として易糖化性を評価し得ることが明らかである。なお、本実施例と同じ条件で糖化処理を行った場合には、糖化効率の予測値は、下記の式（２）により算出することができると考えられる。酵素糖化反応に用いるセルロース量を一定とすることにより、ＡＳＬ／ＫＬ比のみから糖化効率の予測値を算出し得る。
糖化効率（予測値［％］）＝  227.9×［ＡＳＬ／ＫＬ比］−2.4×［セルロース含有量（％）］＋87.0  ・・・（２）
【００６６】
＜耐倒伏性試験＞
野生型のイネとｇｈ２−２変異体の耐倒伏性を比較するために、押し倒し抵抗値と挫折時モーメントを測定した。押し倒し抵抗値の測定は、出穂から３０日目の植物体（イネ）に対して、挫折時モーメントは出穂から４０日目の植物体（イネ）に対して、それぞれ実施した。
押し倒し抵抗値は、植物体を４５°押し倒すために要する力（Ｎ）である。測定は、Kashiwagi と Ishimaruの方法（非特許文献１９）に準じ、押し倒し抵抗測定器（大起理化工業社製）を用いて行った。具体的には、植物体の背丈が地面から４０ｃｍとなるように切りそろえた後、地面から２０ｃｍの位置に植物体に対して垂直に力をかけて、当該植物体が４５°に傾けるために要する力を押し倒し抵抗値とした。押し倒し抵抗値は、測定した植物体の分げつ数で除して株の太さによる影響を除いた。また、各植物体の第１〜第５節間の挫折時モーメント（ｋｇ・ｃｍ）をデジタルフォースゲージを組み込んだ装置を用いて測定（非特許文献２０）し、同時に測定した節間の外径及び内径を用いて、断面係数（ｍｍ３）と曲げ応力（ｇ／ｍｍ２）をOokawaらの方法（非特許文献２１）にしたがって算出した。
【００６７】
図１３に押し倒し抵抗値（Ｎ／分げつ）の測定結果を、図１４に節間の断面係数（ｍｍ３）の測定結果を、図１５に節間の曲げ応力（ｇ／ｍｍ２）の測定結果を、図１６に挫折時モーメント（ｋｇ・ｃｍ）の算出結果を、それぞれ示す。この結果、押し倒し抵抗値と挫折時モーメントは、いずれもｇｈ２−２変異体と野生型イネとの間に統計的に有意な差がなく、植物体の強度に有意な変化がみられないことがわかった。ｇｈ２−２変異体は、野生型イネよりも曲げ応力が小さく、断面係数が大きい傾向が示唆されたものの、ｇｈ２−２変異体と野生型イネとの間に統計学的有意差が認められたのは、曲げ応力は第３節間についてのみであり、断面係数では第２節間及び第３節間についてのみであった。これらの結果から、植物体中の総リグニン含有量を低減させた場合には、植物体の強度が低下するおそれがあるが、植物体中のＡＳＬ／ＫＬ比を高めることにより、当該植物体の糖化効率を高められる可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明の植物体の糖化効率の改善方法は、植物の品種改良やバイオマスエタノールの製造の分野において利用が可能である。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１】
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【配列表】
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