(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式Ｉの化合物：
（化学式Ｉ）
【化１】
0005657642.tif 000040
式中、ＲａはＣ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルケニル基、またはＣ２〜Ｃ６のアルキニル基であり；
Ｒｂはアリール基、置換されたアリール基、または−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｅであり、ここで、ＲｅはＣ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルケニル基、またはＣ２〜Ｃ６のアルキニル基であり；
Ｒｐは−Ｈ、−ＰＯ３Ｈ２、−ＨＰＯ３−Ｎａ＋、−ＰＯ３２−Ｎａ２＋、−ＰＯ３２−Ｋ２＋、−ＰＯ３２−Ｍｇ２＋、−ＰＯ３２−Ｃａ２＋、
【化２】
0005657642.tif 000041
、
【化３】
0005657642.tif 000042
または
【化４】
0005657642.tif 000043
である。
【請求項２】
ＲａはＣ１〜Ｃ６のアルキル基、またはＣ２〜Ｃ６のアルケニル基であり、
Ｒｂは−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｅであり、ここで、ＲｅはＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり、
Ｒｐは−Ｈ、−ＰＯ３Ｈ２、−ＨＰＯ３−Ｎａ＋、または−ＰＯ３２−Ｎａ２＋である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒａはメチルであり、
Ｒｂは−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｅであり、ＲｅはＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり、
Ｒｐは−Ｈである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒａはメチル基であり、
Ｒｂは−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｅであり、ＲｅはＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり、
Ｒｐは−ＰＯ３Ｈ２、−ＨＰＯ３−Ｎａ＋、または−ＰＯ３２−Ｎａ２＋である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記置換されたアリール基はアシル−置換されたアリール基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
前記化学式Ｉで表される化合物は、
８−（３−アセチル−１−メチル−１Ｈ−インドール−７−イルメチル）−２−アリル−６−（４−ヒドロキシ−ベンジル）−４，７−ジオキソ−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１−カルボン酸ベンジルアミド(8-(3-Acetyl-1-methyl-1H-indol-7-ylmethyl)-2-allyl-6-(4-hydroxy-benzyl)-4,7-dioxo-hexahydro-pyrazino[2,1-c][1,2,4]triazine-1-carboxylic acid benzylamide)、
２−アリル−８−［３−（３，３−ジメチル−ブチリル）−１−メチル−１Ｈ−インドール−７−イルメチル］−６−（４−ヒドロキシ−ベンジル）−４，７−ジオキソ−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１−カルボン酸ベンジルアミド(2-Allyl-8-[3-(3,3-dimethyl-butyryl)-1-methyl-1H-indol-7-ylmethyl]-6-(4-hydroxy-benzyl)-4,7-dioxo-hexahydro-pyrazino[2,1-c][1,2,4]triazine-1-carboxylic acid benzylamide)、
２−アリル−８−（３−シクロプロパンカルボニル−１−メチル−１Ｈ−インドール−７−イルメチル）−６−（４−ヒドロキシ−ベンジル）−４，７−ジオキソ−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１−カルボン酸ベンジルアミド(2-Allyl-8-(3-cyclopropanecarbonyl-1-methyl-1H-indol-7-ylmethyl)-6-(4-hydroxy-benzyl)-4,7-dioxo-hexahydro-pyrazino[2,1-c][1,2,4]triazine-1-carboxylic acid benzylamide)、
２−アリル−６−（４−ヒドロキシ−ベンジル）−８−［１−メチル−３−（３−メチル−ブチリル）−１Ｈ−インドール−７−イルメチル］−４，７−ジオキソ−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１−カルボン酸ベンジルアミド(2-Allyl-6-(4-hydroxy-benzyl)-8-[1-methyl-3-(3-methyl-butyryl)-1H-indol-7-ylmethyl]-4,7-dioxo-hexahydro-pyrazino[2,1-c][1,2,4]triazine-1-carboxylic acid benzylamide)、
２−アリル−８−（３−ブチリル−１−メチル−１Ｈ−インドール−７−イルメチル）−６−（４−ヒドロキシ−ベンジル）−４，７−ジオキソ−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１−カルボン酸ベンジルアミド(2-Allyl-8-(3-butyryl-1-methyl-1H-indol-7-ylmethyl)-6-(4-hydroxy-benzyl)-4,7-dioxo-hexahydro-pyrazino[2,1-c][1,2,4]triazine-1-carboxylic acid benzylamide)、
２−アリル−８−（３−シクロプロパンカルボニル−１−エチル−１Ｈ−インドール−７−イルメチル）−６−（４−ヒドロキシ−ベンジル）−４，７−ジオキソ−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１−カルボン酸ベンジルアミド(2-Allyl-8-(3-cyclopropanecarbonyl-1-ethyl-1H-indol-7-ylmethyl)-6-(4-hydroxy-benzyl)-4,7-dioxo-hexahydro-pyrazino[2,1-c][1,2,4]triazine-1-carboxylic acid benzylamide)、
２−アリル−８−（１−アリル−３−シクロプロパンカルボニル−１Ｈ−インドール−７−イルメチル）−６−（４−ヒドロキシ−ベンジル）−４，７−ジオキソ−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１−カルボン酸ベンジルアミド(2-Allyl-8-(1-allyl-3-cyclopropanecarbonyl-1H-indol-7-ylmethyl)-6-(4-hydroxy-benzyl)-4,7-dioxo-hexahydro-pyrazino[2,1-c][1,2,4]triazine-1-carboxylic acid benzylamide)、
２−アリル−６−（４−ヒドロキシ−ベンジル）−８−（１−メチル−３−ペンタノイル−１Ｈ−インドール−７−イルメチル）−４，７−ジオキソ−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１−カルボン酸ベンジルアミド(2-Allyl-6-(4-hydroxy-benzyl)-8-(1-methyl-3-pentanoyl-1H-indol-7-ylmethyl)-4,7-dioxo-hexahydro-pyrazino[2,1-c][1,2,4]triazine-1-carboxylic acid benzylamide)、
２−アリル−６−（４−ヒドロキシ−ベンジル）−８−（１−メチル−３−プロピオニル−１Ｈ−インドール−７−イルメチル）−４，７−ジオキソ−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１−カルボン酸ベンジルアミド(2-Allyl-6-(4-hydroxy-benzyl)-8-(1-methyl-3-propionyl-1H-indol-7-ylmethyl)-4,7-dioxo-hexahydro-pyrazino[2,1-c][1,2,4]triazine-1-carboxylic acid benzylamide)、
８−（３−アセチル−１−プロピル−１Ｈ−インドール−７−イルメチル）−２−アリル−６−（４−ヒドロキシ−ベンジル）−４，７−ジオキソ−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１−カルボン酸ベンジルアミド(8-(3-Acetyl-1-propyl-1H-indol-7-ylmethyl)-2-allyl-6-(4-hydroxy-benzyl)-4,7-dioxo-hexahydro-pyrazino[2,1-c][1,2,4]triazine-1-carboxylic acid benzylamide)、
２−アリル−８−［３−（３，３−ジメチル−ブチリル）−１−プロピル−１Ｈ−インドール−７−イルメチル］−６−（４−ヒドロキシ−ベンジル）−４，７−ジオキソ−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１−カルボン酸ベンジルアミド(2-Allyl-8-[3-(3,3-dimethyl-butyryl)-1-propyl-1H-indol-7-ylmethyl]-6-(4-hydroxy-benzyl)-4,7-dioxo-hexahydro-pyrazino[2,1-c][1,2,4]triazine-1-carboxylic acid benzylamide)、
２−アリル−８−［３−（３，３−ジメチル−ブチリル）−１−ヘキシル−１Ｈ−インドール−７−イルメチル］−６−（４−ヒドロキシ−ベンジル）−４，７−ジオキソ−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１−カルボン酸ベンジルアミド(2-Allyl-8-[3-(3,3-dimethyl-butyryl)-1-hexyl-1H-indol-7-ylmethyl]-6-(4-hydroxy-benzyl)-4,7-dioxo-hexahydro-pyrazino[2,1-c][1,2,4]triazine-1-carboxylic acid benzylamide)、または
２−アリル−８−（１−ブチル−３−シクロプロパンカルボニル−１Ｈ−インドール−７−イルメチル）−６−（４−ヒドロキシ−ベンジル）−４，７−ジオキソ−ヘキサヒドロ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１−カルボン酸ベンジルアミド(2-Allyl-8-(1-butyl-3-cyclopropanecarbonyl-1H-indol-7-ylmethyl)-6-(4-hydroxy-benzyl)-4,7-dioxo-hexahydro-pyrazino[2,1-c][1,2,4]triazine-1-carboxylic acid benzylamide)である、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学組成物。
【請求項８】
下記段階を含む、請求項１に記載の化合物を製造するための製造方法：
フリーデルクラフツ反応(Friedel-Crafts Acylation)によってインドール−７−カルバルデヒド(indole-7-carbaldehyde)にアシル基を導入して３−アシル−インドール−７−カルバルデヒド(3-acryl-indole-7-carbaldehyde)を製造する段階；
３−アシル−インドール−７−カルバルデヒド(3-acryl-indole-7-carbaldehyde)にアルキル基とアミノアセタール基を導入して１−アルキル−３−アシル−インドール誘導体(1-alkyl-3-acyl-indole derivative)を製造する段階；
１−アルキル−３−アシル−インドール誘導体(1-alkyl-3-acyl-indole derivative)をＣｂｚ−チロシン−ＯｔＢｕ(Cbz-Tyrosine-OtBu)および２−（１−アリル−４−ベンジルセミカルバジド）酢酸(2-(1-allyl-4-b enzylsemicarbazido)acetic acid)と共に立体選択的にアミド化して反応中間体を製造する段階；
ギ酸を用いて環化反応を行って環状中間体を製造する段階；および
前記環状中間体にリン酸化反応を行って化学式Ｉの化合物を製造する段階。
【請求項９】
２−（１−アリル−４−ベンジルセミカルバジド）酢酸(1-allyl-4-benzylsemicarbazido)acetic acid)は下記段階で製造される、請求項８に記載の方法：
エチルヒドラジノアセテート(ethylhydrazinoacetate)溶液にＴＥＡ(triethylamine)を投入して反応溶液を製造する段階、
前記反応溶液にアリルブロマイド(allyl bromide)を滴加する段階、および
ベンジルイソシアネート(Benzylisocyanate)を滴加する段階。
【請求項１０】
前記アリルブロマイドおよびベンジルイソシアネートが一滴ずつ添加される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
下記段階を含む、化学式Ｉの化合物を製造する方法：
インドール−７−カルバルデヒドを
【化５】
0005657642.tif 000044
に転換する段階であって、ここで、前記Ｒｂはアリール基、置換されたアリール基、または−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｅであり、この際、ＲｅはＣ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル基、またはＣ２〜Ｃ６アルキニル基である段階；
【化６】
0005657642.tif 000045
を
【化７】
0005657642.tif 000046
に転換する段階であって、ここで、ＲａはＣ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル基、またはＣ２〜Ｃ６アルキニル基である段階；
【化８】
0005657642.tif 000047
をＣｂｚ−チロシン−ＯｔＢｕ(Cbz-Tyrosine-OtBu)および２−（１−アリル−４−ベンジルセミカルバジド）酢酸(2-(1-allyl-4-benzylsemicarbazido)acetic acid)存在の下で、立体選択的にアミド化して
【化９】
0005657642.tif 000048
を製造する段階；
ギ酸の存在下で、
【化１０】
0005657642.tif 000049
を環化して
【化１１】
0005657642.tif 000050
を製造する段階；および
【化１２】
0005657642.tif 000051
を
【化１３】
0005657642.tif 000052
に転換する段階であって、ここで、Ｒｐは−ＰＯ３Ｈ２、−ＨＰＯ３−Ｎａ＋、−ＰＯ３２−Ｎａ２＋、−ＰＯ３２−Ｋ２＋、−ＰＯ３２−Ｍｇ２＋、−ＰＯ３２−Ｃａ２＋である段階。
【請求項１２】
Ｒａはメチルであり、Ｒｂは−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｅであり、Ｒｅはメチルまたはシクロプロピルである、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リバースターン類似体の新規な化合物、それらの製造方法、およびそれらの医療病態、例えば急性骨髄性白血病治療剤としての用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療剤としての可能性のある活性に対する分子のランダムスクリーニングは、多年間にわたって行われてきており、数多い重要な薬の発見をもたらしてきている。最近では、生物学的に活性のあるタンパク質またはペプチドから発見されるリバースターンの２次構造に類似した非ペプチド化合物が開発された。例えば、Ｋａｈｎの米国登録特許第５，４４０，０１３号およびＫａｈｎの公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９４／００３４９４Ａ１、ＷＯ０１／０００２１０Ａ１およびＷＯ０１／０１６１３５Ａ２それぞれには、リバースターンの２次構造を模倣した、コンフォメーションが制限された非ペプチド化合物が開示されている。その他に、Ｋａｈｎの米国登録特許第５，９２９，２３７号およびその一部継続出願（ＣＩＰ）である米国登録特許第６，０１３，４５８号には、生物学的に活性なペプチドおよびタンパク質のリバースターン領域の２次構造を模倣した、コンフォメーションが制限された化合物が開示されている。コンフォメーションが制限されたリバースターン類似体の合成および同定、並びにそれらの疾病への適用はＯｂｒｅｃｈｔによってもよくレビューされた(Advances in Med. Chem., 4, 1-68, 1999)。
【０００３】
前述したように、コンフォメーションが制限されたリバースターン類似体の合成および同定技術において相当な進歩があったが、ペプチドの２次構造を模倣した小さい分子に対するライブラリーメンバーを合成しスクリーニングして生活性ライブラリーメンバーを同定する研究が続けられてきた。これにより、生物学的に活性のあるペプチドおよびタンパク質のリバースターン領域の２次構造を模倣した、コンフォメーションが制限された化合物および生体内活性の高い化合物を見出すための研究が続けられてきた。例えば、ＷＯ０４／０９３８２８Ａ２、ＷＯ０５／１１６０３２Ａ２およびＷＯ０７／１３９３４６Ａ１それぞれには、これらのリバースターン類似体、その製造方法および生活性などが開示されている。
【０００４】
前述したように数多いリバースターン類似体が製造されたが、まだ生活性の高い化合物が具体的に検索されたものは多くなく、抗癌効果などの疾病治療に利用可能な化合物に対する化合物製造が引き続き行われている。
【０００５】
特に、癌治療などに利用するためには、Ｗｎｔシグナル伝達を強く抑え、これによりＷｎｔシグナル伝達経路が活性化されているものと知られている急性骨髄性白血病(Acute Myeloid Leukemia)癌細胞の増殖を効果的に抑える化合物を見出そうと努力が続けられてきた。
【０００６】
また、生体内活性の高い化合物を見出した場合、これを経済的に量産することが可能な製造方法の開発が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、新規な生体内活性を持つ化合物を提供し、その抗癌効果などの疾病治療剤またはプロドラッグ、特に急性骨髄性白血病治療剤として利用可能な化合物を見出し、これを量産することが可能な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、下記化学式Ｉの化合物を提供する：
（化学式Ｉ）
【化１】
0005657642.tif 000002
式中、ＲａはＣ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルケニル基、またはＣ２〜Ｃ６のアルキニル基であり；
Ｒｂはアリール基、置換されたアリール基、またはＣ（＝Ｏ）Ｒｅであり、この際、ＲｅはＣ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルケニル基、またはＣ２〜Ｃ６のアルキニル基であり；
Ｒｐは−Ｈ、−ＰＯ３Ｈ２、−ＨＰＯ３−Ｎａ＋、−ＰＯ３２−Ｎａ２＋、−ＰＯ３２−Ｋ２＋、−ＰＯ３２−Ｍｇ２＋、−ＰＯ３２−Ｃａ２＋、
【化２】
0005657642.tif 000003
、
【化３】
0005657642.tif 000004
または
【化４】
0005657642.tif 000005
である。
【０００９】
前記置換されたアリール基はアシル−置換されたアリール基であってもよい（ここで定義されたとおりである。）
【００１０】
本発明の一様態によれば、化学式Ｉにおいて、ＲａはＣ１〜Ｃ６アルキル基またはＣ２〜Ｃ６アルケニル基であり；Ｒｂは−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｅであり、この際、ＲｅはＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり；およびＲｐは−Ｈ、−ＰＯ３Ｈ２、−ＨＰＯ３−Ｎａ＋、または−ＰＯ３２−Ｎａ２＋である。
【００１１】
本発明の他の態様によれば、化学式Ｉにおいて、Ｒａはメチル基であり；Ｒｂは−（Ｃ＝０）Ｒｅであり、この際、ＲｅはＣ１〜Ｃ６アルキル基であり；およびＲｐは−Ｈである。
【００１２】
本発明の別の態様によれば、化学式Ｉにおいて、Ｒａはメチル基であり；Ｒｂは−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｅであり、この際、ＲｅはＣ１〜Ｃ６アルキル基であり；およびＲｐは−ＰＯ３Ｈ２、−ＨＰＯ３−Ｎａ＋、または−ＰＯ３２−Ｎａ２＋である。
【００１３】
一方、本発明は、前記化合物および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学組成物を提供する。
【００１４】
他の側面において、本発明は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者に本発明の化合物または組成物を有効量投与することを含む、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療方法を提供する。本発明の一様態によれば、前記方法は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者に本発明の化合物または組成物を有効量注射することを含む。
【００１５】
別の側面において、本発明は、下記段階を含む、前記化合物を製造する方法を提供する：（ａ）フリーデルクラフツ反応によってインドール−７−カルバルデヒド(indole-7-carbaldehyde)にアシル基を導入して３−アシル−インドール−７−カルバルデヒド(3-acryl-indole-7-carbaldehyde)を製造する段階、（ｂ）３−アシル−インドール−７−カルバルデヒドにアルキル基とアミノアセタール基を導入して１−アルキル−３−アシル−インドール誘導体(1-alkyl-3-acyl-indole derivative)を製造する段階、（ｃ）１−アルキル−３−アシル−インドール誘導体をＣｂｚ−チロシン−ＯｔＢｕ(Cbz-Tyrosine-OtBu)および２−（１−アリル−４−ベンジルセミカルバジド）酢酸(2-(1-allyl-4-benzylsemicarbazido)acetic acid)と共に立体選択的にアミド化して反応中間体を製造する段階、（ｄ）前記反応中間体をギ酸存在の下に環化して環状中間体を製造する段階、および（ｅ）前記環状中間体をリン酸化して化学式Ｉの化合物を製造する段階。
【００１６】
本発明の一つの様態において、２−（１−アリル−４−ベンジルセミカルバジド）酢酸(1-allyl-4-benzylsemicarbazido)acetic acid)は、下記段階によって製造される：
（１）エチルヒドラジノアセテート(ethylhydrazinoacetate)溶液にＴＥＡ(triethylamine)を添加して反応溶液を製造する段階、
（２）前記反応溶液にアリルブロマイド(allyl bromide)を添加する段階、および
（３）ベンジルイソシアネート(Benzylisocyanate)を添加する段階。
本発明の他の様態によれば、アリルブロマイドおよびベンジルイソシアネートが一滴ずつ添加される(in a dropwise manner)。
【００１７】
関連分野において、本発明は、下記段階を含む、化学式Ｉの化合物を製造する方法を提供する：
（ａ）インドール−７−カルバルデヒドを
【化５】
0005657642.tif 000006
に転換する段階であって、ここで、前記Ｒｂはアリール基、置換されたアリール基、または−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｅであり、この際、ＲｅはＣ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル基、またはＣ２〜Ｃ６アルキニル基である段階、
（ｂ）
【化６】
0005657642.tif 000007
を
【化７】
0005657642.tif 000008
に転換する段階であって、ここで、前記Ｒｂはアリール基、置換されたアリール基、または−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｅであり、この際、ＲｅはＣ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル基、またはＣ２〜Ｃ６アルキニル基である段階、
（ｃ）
【化８】
0005657642.tif 000009
をＣｂｚ−チロシン−ＯｔＢｕ(Cbz-Tyrosine-OtBu)および２−（１−アリル−４−ベンジルセミカルバジド）酢酸(2-(1-allyl-4-benzylsemicarbazido)acetic acid)存在の下で、立体選択的にアミド化して
【化９】
0005657642.tif 000010
を製造する段階、
（ｄ）ギ酸の存在下で、
【化１０】
0005657642.tif 000011
を環化して
【化１１】
0005657642.tif 000012
を製造する段階、および
（ｅ）
【化１２】
0005657642.tif 000013
を
【化１３】
0005657642.tif 000014
に転換する段階であって、ここで、Ｒｐは−ＰＯ３Ｈ２、−ＨＰＯ３−Ｎａ＋、−ＰＯ３２−Ｎａ２＋、−ＰＯ３２−Ｋ２＋、−ＰＯ３２−Ｍｇ２＋、−ＰＯ３２−Ｃａ２＋である段階。
【００１８】
本発明の一様態において、Ｒａはメチルであり、Ｒｂは−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｅであり、Ｒｅはメチルまたはシクロプロピルである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の新規なリバースターン類似化合物は、急性骨髄性白血病(Acute Myeloid Leukemia)癌試験の試験管内増殖を効果的に抑える。また、この化合物は急性骨髄性白血病マウス動物モデルにおける腫瘍の成長を効果的に抑える。
【００２０】
化学式Ｉの化合物は、離脱基Ｒｐが分離される場合、活性形態(active  form)となる。このような活性形態は、水によく溶けないため、水溶性を製造することが難しいという欠点があった。本発明の化学式Ｉの化合物は、プロドラッグ作用基を構造内に含むことにより、溶解度が高く、化合物の安定性が向上したうえ、注射剤に製造し易い特性を持つ。
【００２１】
本発明の化合物は動物実験において優れた薬効を持つことが確認されたが、これは静脈投与直後に薬物が活性形態に速く変化するので、初期の薬物濃度が高くなって良い薬効を示すものと思われる。このようにプロドラッグ化合物が静脈投与後にどれほど速く活性形態に転換されるかというのが薬効に影響を及ぼすので、最適の効果を示すプロドラッグ作用基の選択が重要である。
【００２２】
本発明において好ましい作用基は、フォスフェート形態の作用基であり、生体内における活性形態への転換が他の作用基を使用したときより速くて良い結果を示した。
【００２３】
また、本発明の化合物において、プロドラッグ作用基がナトリウム塩として製造される場合、製造が容易であるうえ、水に対する優れた溶解度を持つ。それだけでなく、室温での保管安定性が良い化合物を得る。
【００２４】
通常、適切な注射剤のｐＨは４〜９であると知られており、ヒトの血液ｐＨ７．４に近いものがよく、強酸または強塩基性の場合は注射剤として選好されない。本発明において、フォスフェート作用基の場合、プロドラッグ形態の最終化合物の製造の際に水酸化ナトリウムを入れる量に応じて単ナトリウムまたはニナトリウム形態の化合物が生成され、このような化合物は注射剤として使用するのに適切なｐＨの組成物を製造する上で有利であるという利点を持つ。
【００２５】
また、本発明の製造方法を用いる場合、化学式Ｉの化合物だけでなく、類似したリバースターン構造体を産業的規模で量産することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
図１は化合物製造方法の最終段階、すなわち４−（（（６Ｓ，９ａＳ）−１−（ベンジルカルバモイル）−８−（（３−アセチル−１−メチル−１Ｈ−インドール−７−イル）メチル）−２−アリル−オクタヒドロ−４，７−ジオキソ−１Ｈ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−６−イル）メチル）フェニルジハイドロジェンフォスフェート(4-(((6S,9aS)-1-(Benzylcarbamoyl)-8-((3-acetyl-1-methyl-1H-indol-7-yl)methyl)-2-allyl-octahydro-4,7-dioxo-1H-pyrazino[2,1-c][1,2,4]triazin-6-yl)methyl)phenyl dihydrogen phosphate)に水酸化ナトリウムを０．５モルずつ滴加投入したときのｐＨと電位差の変化を図式化したものである。グラフの横軸は滴加された水酸化ナトリウムの量を示す。グラフにおいて、最初の上昇曲線は単ナトリウムが生成される時点であり、２番目の上昇曲線はニナトリウムが生成されたときである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、下記化学式Ｉで表されるリバースターン類似体の新規な化合物を提供し、これにより急性骨髄性白血病治療剤として有用な化合物を提供する。
（化学式Ｉ）
【化１４】
0005657642.tif 000015
式中、Ｒｐはプロドラッグで利用可能なものであって、既存に用いられる任意の作用基が使用できる。前記任意の作用基の例としては、フォスフェート作用基、カルボキシ作用基、Ｃ１〜Ｃ６のアルキルアミノ作用基、アシルアミド作用基を挙げることができ、具体的に、−ＰＯ３Ｈ２、−ＨＰＯ３−Ｎａ＋、−ＰＯ３２−Ｎａ２＋、−ＰＯ３２−Ｋ２＋、−ＰＯ３２−Ｍｇ２＋、−ＰＯ３２−Ｃａ２＋、
【化１５】
0005657642.tif 000016
、
【化１６】
0005657642.tif 000017
または
【化１７】
0005657642.tif 000018
などを挙げることができる。
【００２８】
Ｒｐは好ましくはフォスフェート作用基（
【化１８】
0005657642.tif 000019
）であり、Ｒｃ、ＲｄはそれぞれＨ、Ｎａ、Ｍｇ、ＣａまたはＫであり、好ましくは、ＲｃおよびＲｄが両方ともＨであるか、両方ともＮａであるか、或いは一つはＮａ、もう一つはＨである。
【００２９】
また、Ｒｐはプロドラッグ作用基が離脱した活性形態の化合物構造をもつ−Ｈ基であってもよい。
【００３０】
Ｒａはアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基であり、好ましくはＣ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ２〜Ｃ６のアルケニル基またはＣ２〜Ｃ６のアルキニル基であり、より好ましくはＣ１〜Ｃ６のアルキル基である。
【００３１】
Ｒｂはアリール基、置換されたアリール基または−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｅであり、この際、ＲｅはＣ１〜Ｃ６のアルキル基；Ｃ２〜Ｃ６のアルケニル基；またはＣ２〜Ｃ６のアルキニル基であり、置換されたアリール基はアシル−置換されたアリール基であり、好ましくはアリール−置換されたフェニル基である。
【００３２】
前記化合物は、生体内で活性形態に変わるが、離脱基がフォスフェート作用基の場合、フォスファターゼ(phosphatase)という酵素によってＰＯ３ＲｃＲｄ基が速く分離されながら活性形態(active form)に変わる。この際、Ｒｐは−Ｈ基となる（プロドラッグ作用基が離脱した活性形態の化合物構造）。
【００３３】
本発明において、「アルキル」または「アルキル基」は炭素および水素原子を含む直鎖状(linear)、分枝状(branched)または環状(cyclic)炭化水素ラジカルを意味し、この際、前記炭素原子は単一結合によって連結される。本発明の一様態において、アルキルは２０個以下の炭素を含む。本発明の好適な様態によれば、アルキルは１〜６個の炭素原子を含んでもよく、「Ｃ１〜Ｃ６アルキル」で表される。アルキルは分子の残り部分に単一結合によって連結される。アルキルの例として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、１−メチルエチル（イソ−プロピル）、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、１，１−ジメチルエチル（ｔ−ブチル）、２，２−ジメチルプロピル（ネオ−ペンチル）、３−メチルヘキシル、２−メチルヘキシルなどが含まれるが、これらに限定されない。また、アルキルは単環式または二環式炭化水素環ラジカルであってもよく、環ラジカルは接合(fused)または架橋(bridged)環系を含んでもよい。また、環状アルキルは「シクロアルキル」で表される。ある具体例において、シクロアルキルは３〜６の炭素原子を含んでもよく、「Ｃ３−６シクロアルキル」で表される。 単環式シクロアルキルラジカルの例は例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロへプチルおよびシクロオクチルを含む。
【００３４】
「アルケニル」または「アルケニル基」は炭素および水素原子を含む直鎖状、分枝状または環状炭化水素ラジカルを意味し、この際、２つ以上の炭素原子が二重結合によって連結される。本発明の一様態において、アルキルは２０個以下の炭素を含む。本発明の好適な様態によれば、アルケニルは２〜６個の炭素原子を含んでもよく、「Ｃ３−６アルキル」で表される。アルケニルは分子の残り部分に単一結合または二重結合によって連結される。アルケニルの例として、エテニル、アリル、ブテニルなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００３５】
「アルキニル」または「アルキニル基」は炭素および水素原子を含む直鎖状、分枝状または環状炭化水素ラジカルを意味し、この際、２つ以上の炭素原子が三重結合によって連結される。本発明の一様態において、アルキニルは２０個以下の炭素を含む。本発明の好適な様態において、アルキニルは２〜６の炭素原子を含んでもよく、「Ｃ３−６アルキニル」で表される。アルキニルは分子の残り部分に単一結合によって連結される。アルキニルの例として、エチニル、１−プロピニル、または２−プロピニルなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００３６】
明細書で別途具体的に特定されない限り、前記用語「アルキル」は、炭素および水素原子のみを有するアルキルおよび「置換されたアルキル」のいずれも含むことを意味し、前記置換されたアルキルは、一つ以上の水素原子が、次の一つ以上の置換体によってそれぞれ置換されたものを意味する：ここで定義されたアシル、アルコキシ、アリール、シアノ、シクロアルキル、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ１１、−Ｎ（Ｒ１１）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１１、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１１）２、−Ｎ（Ｒ１１）Ｃ（Ｏ）ＯＲ１１、−Ｎ（Ｒ１１）Ｃ（Ｏ）Ｒ１１、−Ｎ（Ｒ１１）Ｓ（Ｏ）ｔＲ１１（ここで、ｔは１または２）、−Ｓ（Ｏ）ｔＯＲ１１（ここで、ｔは１または２）、−Ｓ（Ｏ）ｐＲ１１（ここで、ｐは０、１または２）、および−Ｓ（Ｏ）ｔＮ（Ｒ１１）２（ここで、ｔは１または２）。この際、それぞれのＲ１１は独立に水素、アルキル、アリールである。
【００３７】
明細書で別途具体的に特定されない限り、前記用語「アルケニル」および「アルキニル」はそれぞれ「置換されたアルケニル」および「置換されたアルキニル」を含む。
【００３８】
「アルコキシ」は化学式アルキル−Ｏ−で表されるラジカルを意味し、この際、アルキルはここで定義されたとおりである。アルキル部分は一つ以上のハロゲンでさらに置換できる。また、アルコキシは、例えば、Ｃ１−６アルコキシまたはＣ１−３アルコキシのように、アルキル基の炭素の数で表示できる。
【００３９】
「アシル」は化学式Ｒ１２Ｃ（＝Ｏ）―で表されるラジカルを意味し、この際、Ｒ１２はここに定義されたアルキルまたはアリールである。また、アルキルまたはアリールはアルキルまたはアリール基それぞれに対して記述された置換体によって選択的に置換できる。アシル基の例はメチルアシル（すなわち、アセチル）、フェニルアシル、シクロプロピルアシルなどが含まれてもよく、これらに限定されない。
【００４０】
「アリール」は、環炭素原子から一つの水素原子を除去することにより、芳香族単環式または二環式環系から誘導されたラジカルを示す。前記芳香族単環式または二環式炭化水素環系は６〜１２の炭素原子（すなわち、Ｃ６−１２アリール）を含み、ここで、前記環系内の少なくとも一つの環は完全に不飽和され、すなわち、それはヒュッケル理論(Huckel theory)にしたがって環の非局在化(delocalized)（４ｎ＋２）π−電子システムを含む。
【００４１】
アリールラジカルの例は、これに限定されないが、フェニルおよびナフチルを含む。
【００４２】
明細書で別途具体的に特定されない限り、前記用語「アリール」は、アリールおよび「置換されたアリール」のいずれも含むことを意味し、前記置換されたアリールは、一つ以上の水素原子がアシル、アルコキシ、アリール、シアノ、シクロアルキル、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、−ＯＣ（Ｏ）−Ｒ１１、−Ｎ（Ｒ１１）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１１、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１１）２、−Ｎ（Ｒ１１）Ｃ（Ｏ）ＯＲ１１、−Ｎ（Ｒ１１）Ｃ（Ｏ）Ｒ１１、−Ｎ（Ｒ１１）Ｓ（Ｏ）ｔＲ１１（ここで、ｔは１または２）、−Ｓ（Ｏ）ｔＯＲ１１（ここで、ｔは１または２）、−Ｓ（Ｏ）ｐＲ１１（ここで、ｐは０、１または２）、および−Ｓ（Ｏ）ｔＮ（Ｒ１１）２（ここで、ｔは１または２）で置換されたものを意味する。ここで、それぞれのＲ１１は独立に水素、アルキル、アリールを示す。
【００４３】
「ハロ」はフルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを示す。
【００４４】
前記化合物の活性形態は、水溶液（例えば、サリンまたは水）における低い溶解度によりＩＶ注射剤として適さない。かかる問題点を改善するために、フォスフェート形態のプロドラッグ形態を利用し、好ましくはフォスフェート形態のプロドラッグを利用し、これに１〜２個のＮａを置換させて水に対する溶解度を向上させることができた。置換方法では、フォスフェート形態に水酸化ナトリウムを滴加することにより特定のｐＨで１〜２個のＮａで置換される。
【００４５】
したがって、本発明の様態によれば、化学式Ｉの化合物および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学組成物を提供する。本発明の化合物または組成物は、下記で詳細に説明するようにＡＭＬを治療するための用途として使用できる。
【００４６】
本発明の薬学組成物は意図する投与経路に適するように製剤化できる。投与経路の例は、非経口、すなわち静脈注射(intravenous)、皮内(intraderma)、皮下(subcutaneous)、経口（すなわち、吸入）、経皮(transdermal)、経粘膜(transmucosal)、および直腸投与である。非経口、皮内または皮下適用のために使用される溶液またはサスペンションは、次の構成要素を含むことができる：注射用水などの滅菌希釈液、サリン溶液、固定油(fixed oils)、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗細菌性製剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などのバッファ、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの調節剤(adjustment of tonicity)。
【００４７】
本発明の好適な様態によれば、前記薬学的に許容される賦形剤は静脈（Ｉ．Ｖ．）注射または投入などの静脈（Ｉ．Ｖ．）投与用として適する。静脈（Ｉ．Ｖ．）投与に適した担体は生理学的サリン、静菌水(bacteriostatic water)、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）またはリン酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合において、組成物は滅菌状態でなければならず、容易な注射能が存在する程度の流動状態でなければならない。これは製造および貯蔵条件の下で安定しなければならず、微生物、例えば細菌および真菌の汚染作用に対して保存されるべきである。
【００４８】
本発明の他の様態によれば、経口組成物は、一般に希釈剤または薬学的に許容される食用担体を含む。これらはゼラチンカプセル内に封入されてもよく、錠剤に圧縮されてもよい。経口治療投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤と共に含まれてもよく、錠剤、トローチ、またはカプセルとして使用できる。また、経口組成物は口腔洗浄剤として使用するための流動担体を用いて製造できるが、ここで、流動担体中の化合物は経口的に適用され、吸い込まれたり、吐き出されたり、嚥下されたりする。薬学的に両立可能な結合剤、および／またはアジュバント物質は組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは下記成分中の任意の成分または類似した特性の化合物を含有することができる：結合剤、例えば微細結晶性セルロース、ガムトラガカント(gum tragacanth)またはゼラチン；賦形剤、例えば澱粉またはラクトース、崩壊剤(disintegrating agent)、例えばアルギン酸、プリモジェル(primojel)、またはコーンスターチ；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはステロテス(sterotes)；滑沢剤(glidant)、例えばコロイド性シリコンジオキシド；甘味剤(sweetening agent)、例えばスクロースまたはサッカリン、または着香剤、例えばペパミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香。
【００４９】
本発明の別の様態によれば、本発明は、癌患者（すなわち、ＡＭＬ患者）に有効量の化学式Ｉの化合物またはこれを含む薬学組成物を投与することを含む、疾病、特に癌、さらに具体的に急性骨髄性白血病を治療する方法を提供する。実施例２３は、本発明に開示された例示的化合物が動物モデルにおけるＡＭＬ治療に効果的であることを示す。
【００５０】
化学式Ｉの化合物の例を下記表１に示した。一方、下記表１では構造的に置換基Ｒｐ部分のみ−ＯＨまたはフォスフェート作用基として差異がある４個のそれぞれ異なる化合物に対して、これら化合物のＮＭＲ値が同一であるから、このような４つの化合物に対してＮＭＲ値を１回のみ記載した（１Ｈ ＮＭＲスペクトルでは、Ｒｐ部分がジュラテリウム(deuterium)で置換されて観測されない）。
【００５１】
【表１】
0005657642.tif 000020
0005657642.tif 000021
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0005657642.tif 000031
【００５２】
当業者における公知の方法が、ここで提供される化合物のＡＭＬのような癌治療有効量の決定に使用できる。例えば、実施例２３に記載された方法は、対象化合物の抗癌活性を評価するために使用できる。ＡＭＬ治療に対する化合物の活性を評価する追加の例示的方法は、Bishop et al., Blood 87: 1710-7, 1996; Bishop, Semin Oncol 24:57-69, 1997; aand Estey, Oncology 16: 343-52, 2002に開示された方法を含む。
【００５３】
本発明の化合物は、必要に応じて、経口、局所(topically)、経皮、または非経口的(parenterally)などの多様な経路を介して患者に投与できる。本発明の一様態によれば、前記化合物またはその組成物は非経口的(parenterally)に投与できる。前記用語「非経口的(parenteral)」は、ここで定義されたとおり、皮下注射(subcutaneous injections)、静脈注射(intravenous)、筋肉内注射(intramuscular)、嚢内注射(intracisternal injections)、および静脈内投与(intravenous infusions)を含む。本発明の好適な様態によれば、前記化合物または組成物は静注射などの注射で投与される。
【００５４】
本発明の化合物の特性および治療的有効性は、例えばＬＤ５０（総個体の５０％が死亡する用量）およびＥＤ５０（総個体の５０％で効果が示される用量）などの、細胞培養または実験動物における標準薬学的過程(standard pharmaceutical procedures)によって測定できる。毒性と治療効果との用量割合は治療的指標であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の割合で示すことができる。大きい治療的指標を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物が使用できるので、感染していない細胞に対して危険を出来る限り最小化して副作用を減らすために、このような化合物を感染組織に対するターゲットとする伝達システムのデザインは慎重でなければならない。細胞培養分析および動物研究から得たデータは、ヒトに使用する用量範囲の決定に使用できる。
【００５５】
前記化合物の用量は、好ましくは毒性が無いかほぼ無いＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。前記化合物の試験管内(in vitro)心臓毒性(cardiotoxicity)は、下記実施例２４に記載された方法によって測定できる。前記用量は、定められた用量および使用された投与経路に応じて、このような範囲内で多様であってもよい。本発明で使用されたある化合物において、薬学的有効量は細胞培養分析から１次的に評価できる。動物モデルにおいて、用量は、細胞培養で決定されたＩＣ５０（すなわち、症状を中間抑制させる試験化合物の濃度）を含むプラズマ濃度の範囲を巡回するように決定できる。このような情報は、人における有用な用量をさらに正確に決定するために使用できる。プラズマにおけるレベルは例えばＨＰＬＣ(high performance liquid chromatography)によって測定できる。
【００５６】
有効量は、疾病の形態、使用された組成物、投与経路、治療対象の形態、治療を考慮した特定対象の物理的特性、同時投与される薬物、および医薬分野の当業者における公知の他の要素によって決定できる。例えば、ＡＭＬを治療するために、本発明の化合物は静脈（Ｉ．Ｖ．）注射または投入によって０．５ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ（すなわち、０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ、１０〜１００ｍｇ／ｋｇ、約１００〜５００ｍｇ／ｋｇ体重）の量で投与できる。これは単回、毎日、毎週、毎月または他の適切な間隔をおいて投与できる。他の様態によれば、本発明の化合物はＡｒａ−Ｃに使用された方法と同様の方法でＡＭＬの治療に使用できる。
【００５７】
また、本発明のリバースターン類似体を経済的に量産することが可能な製造方法を提供する。本発明に係る製造方法は、下記の段階を含む：
インドール−７−カルバルデヒドからフリーデルクラフツ反応(Friedel-Crafts Acylation)によってインドール−７−カルバルデヒド(indole-7-carbaldehyde)にアシル基を導入して３−アシル−インドール−７−カルバルデヒド(3-acryl-indole-7-carbaldehyde)を製造する段階、
３−アシル−インドール−７−カルバルデヒド(3-acyl-indole-7-carbaldehyde)にアルキル基とアミノアセタール基を導入して１−アルキル−３−アシル−インドール誘導体(1-alkyl-3-acyl-indole derivative)を製造する段階、
１−アルキル−３−アシル−インドール誘導体(1-alkyl-3-acyl-indole derivative)をＣｂｚ−チロシン−ＯｔＢｕ(Cbz-Tyrosine-OtBu、すなわち（Ｓ）−２−（ベンジロキシカルボニルアミノ）−３−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシフェニル）プロピオン酸((S)-2-(benzyloxycarbonylamino)-3-(4-tert-butoxyphenyl)propanoic acid)）および２−（１−アリル−４−ベンジルセミカルバジド）酢酸(2-(1-allyl-4-b enzylsemicarbazido)acetic acid)と共に立体選択的にアミド化して反応中間体を製造する段階、
ギ酸を用いて環化反応を行って環状中間体を製造する段階、および
前記環状中間体に対してリン酸化反応を行って化学式Ｉの化合物を製造する段階。
【００５８】
前記製造方法において、２−（１−アリル−４−ベンジルセミカルバジド）酢酸は、下記の段階を含む方法で製造できる：
エチルヒドラジノアセテート(ethylhydrazinoacetate)溶液にＴＥＡ(triethylamine)を仕込んで反応溶液を製造する段階、
前記反応溶液にアリルブロマイド(allyl bromide)を滴加する段階（例えば、一滴ずつ滴加することができる。）、および
ベンジルイソシアネート(Benzylisocyanate)を滴加する段階（例えば、一滴ずつ滴加することができる。）。
【００５９】
本発明の化合物中の代表的な化合物の製造方法に対する概略的スキームは、次のとおりである。
【００６０】
【化１９】
0005657642.tif 000032
【００６１】
特定の様態において、Ｒａはメチル基であり、Ｒｂは−（Ｃ＝Ｏ）Ｒｅであり、Ｒｅはメチルまたはシクロプロピルである。
【００６２】
ここに示すように、前記反応スキームは、化学式Ｉで表される新規なリバース類似体に関するものである。
【００６３】
本化合物は、ピラジノ−トリアジノン(pyrazino-triazinone)を基本構造として４部分に異なる作用基を持っている。また、２つのキラール性を持っているため、立体選択的に合成しなければならない。
【００６４】
化合物１のインドール−７−カルバルデヒドにフリーデルクラフツ反応(Friedel-Crafts reaction)によってアシル基を導入し、メチル基とアミノアセタール基を導入する。
【００６５】
キラール化合物としてのＣｂｚ−チロシン−ＯｔＢｕと他の方法で合成された中間体をそれぞれＰｉｖＣｌ(Pivaloylchloride)とｉＢＣＦ(isobutylchloroformate)を用いて立体選択的にアミド反応を行って化合物３を合成する。その後、ギ酸を用いて環化反応を経てリン酸化反応を行った後、０．５モルの水酸化ナトリウム標準溶液を用いて、高純度の品質を持つピラジノトリアジノン化合物としての化合物４および化合物５を高収率で製造することができる。
【００６６】
以下、本発明を下記実施例によって詳細に説明する。但し、下記実施例は本発明をより具体的に説明するものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６７】
本発明の化合物は、前記化学式Ｉの構造を持つ化合物であり、抗癌効果などに対して活性を持つ。
【００６８】
本発明の製造方法の具体的な例示は、次のとおりである。
<製造スキーム１>
【００６９】
【化２０】
0005657642.tif 000033
【００７０】
前記製造例示におけるＳ３の製造方法は、次のとおりである。
【００７１】
【化２１】
0005657642.tif 000034
【００７２】
以下、前記製造方法の段階別実施例を実施例１〜実施例１０に詳細に記述する。
【００７３】
［実施例１］
Ｓ３の合成方法
２−（１−アリル−４−ベンゾセミカルバジド）酢酸(2-(1-allyl-4-benzylsemicarbazido)acetic acid)
エチルヒドラジノアセテート(Ethylhydrazinoacetate)６７ｇをＴＨＦ(Tetrahydrofuran)６７３ｍＬに溶かした後、ＴＥＡ(Triethylamine)１２１ｍＬを投入する。反応溶液にアリルブロマイド４１ｍＬを２０分間滴加する。この溶液を５時間攪拌し、反応液を濾過する。濾過した溶液にベンジルイソシアネート５３ｍＬを１５分間滴加し、３０分間常温で攪拌する。攪拌が完了した後、ＫＯＨ（水酸化カリウム）４８ｇを精製水６７３ｍＬに溶かして滴加した後、３０分間攪拌する。３０分間の攪拌が完了した後、ＭＣ（ジクロロメタン）４０３ｍＬとヘキサン(Hexane)２６９ｍＬを投入して攪拌した後、層分離し、水層をＭＣ（ジクロロメタン）２０１ｍＬを用いてさらに１回洗浄する。水層に濃い塩酸１００ｍＬを用いてｐＨを２〜３に調節する。ｐＨを調節した溶液を３０分間攪拌し、ＭＣ（ジクロロメタン）１００９ｍＬを用いて抽出する。抽出したＭＣ層をＮａ２ＳＯ４２６９ｇを用いて脱水処理し、濾過した後、減圧濃縮する。減圧濃縮した残渣にＥＡ(Ethylacetate)１３４ｍＬとヘキサン２６９ｍＬを用いて結晶化し、濾過する。濾過した固体をＥＡ(ethylacetate)１３４ｍＬを用いてスラリーにして０℃で濾過し、真空乾燥機を用いて真空乾燥してＳ３（４０ｇ、収率３５％）を白色固形物として得る。
1H NMR (500MHz, CDCl3) d 10.84 (bs, 1H), d 7.90 (s, 1H), d 7.4-7.3 (m, 5H), d 6.42 (t, J=5.0 Hz, 1H), d 5.85-5.72 (m, 1H), d 5.28 (dd, J=28.5, 2.0 Hz, 1H), d 5.19 (d, J=17 Hz, 1H), d 4.47-4.42 (m, 2H), d 3.70 (dd, J=40.0, 2.5Hz, 1H)
【００７４】
［実施例２］
Ｐ９の合成方法
３−アセチル−１Ｈ−インドール−７−カルバルデヒド(3-Acetyl-1H-indole-7-carbaldehyde)
出発物質（インドール−７−カルバルデヒド）に、ＡｌＣｌ３５５ｇをＭＣ（ジクロロメタン）４００ｍＬに入れて攪拌しながらＡｃＣｌ(Acetylchloride)２３．５ｍＬを滴加投入した後、出発物質（インドール−７−カルバルデヒド）４０ｇをＭＣ(Dichloromethane)４００ｍＬに溶かしてゆっくり滴加する。投入温度は０〜５℃を越えないように調節し、投入完了の後、常温に昇温して反応させる。反応終結は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）および高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって確認可能であり、反応終結の後には水を用いて層分離する。有機層をＭｇＳＯ４（硫酸マグネシウム）で脱水し、濾過した後、４０℃で濃縮してＰ９（４１ｇ、収率８０％）を濃縮残渣として得る。
【００７５】
［実施例３］
Ｐ８の合成方法
３−アセチル−１−メチル−１Ｈ−インドール７−カルバルデヒド(3-Acetyl-1-methyl-1H-indole-7-carbaldehyde)
４１ｇのＰ９をＤＭＦ(dimethylformamide)４１２ｍＬに溶かして攪拌する。１０℃に冷却してＫ２ＣＯ３（炭酸カリウム）９１ｇを投入し、ＭｅＩ(Methyliodide)２０ｍＬを滴加投入する。常温に昇温して４〜５時間攪拌した後、出発物質が無くなったことを確認し、しかる後に、Ｋ２ＣＯ３を濾過し、ヘキサンで結晶化してＰ８（３５ｇ、収率８０％）を黄色固体として合成した。
【００７６】
［実施例４］
Ｐ７の合成方法
１−（７−（（２，２−ジエトキシエチルアミノ）メチル）−１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）エタノン(1-(7-((2,2-Diethoxyethylamino)methyl)-1-methyl-1H-indol-3-yl)ethanone)
３５ｇのＰ８をＭｅＯＨ（メタノール）３５４ｍＬに溶かしてＡｃＯＨ（酢酸）３．５ｍＬを投入する。常温でアミノアセトアルデヒドジエチルアセタール(aminoacetaldehyde diethylacetal)３３ｍＬを投入して３〜４時間攪拌する。１０℃に冷却し、還元剤としてのＮａＢＨ４（ホウ化水素ナトリウム）３．３ｇをゆっくり仕込む。水素気体が発生し、発熱が起こるため、注意して投入する。常温で１時間攪拌した後、反応終結を確認し、しかる後に、ＥＡ(Ethylacetate)３５４ｍＬと精製水３５４ｍＬを用いて層分離する。有機層をＭｇＳＯ４（硫酸マグネシウム）１４１ｇを用いて脱水した後、ヘキサンで結晶化してＰ７（８５ｇ、収率８０％）を淡黄色固体として得る。
1H NMR (500MHz, CDCl3), d 8.36 (d, J=4.8 Hz, 1H), d 7.61 (s, 1H), d 7.17 (d, J=4.2 Hz, 1H), d 7.10 (d, J=4.2 Hz, 1H), d 4.58 (t, J=3.3, 1H), d 4.21 (s, 3H), d 4.07 (s, 3H), d 3.68 (m, 2H), d 3.51 (m, 2H), d 2.82 (d, J=3.3 Hz, 2H), d 2.48 (s, 3H), d 1.19 (t, J=4.2 Hz, 6H)
【００７７】
［実施例５］
Ｐ６の合成方法
ベンジル（Ｓ）−１−（Ｎ−（（３−アセチル−１−メチル−１Ｈ−インドール−７−イル）メチル）Ｎ−（２，２−エトキシエチル）カルバモイル）−２−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシフェニル）エチルカルバメート(Benzyl (S)-1-(N-((3-acetyl-1-methyl-1H-indol-7-yl)methyl)-N-(2,2-diethoxyethyl)carbamoyl)-2-(4-tert-butoxyphenyl)ethylcarbamate)
Ｃｂｚ−チロシン−Ｏｔｂｕ(Cbz-Tyrosine-OtBu)８５ｇをＥＡ (Ethylacetate)４４９ｍＬに溶かして攪拌する。０〜５℃に冷却してＮＭＭ(N-methylmorpholine)３１ｍＬと塩化ピバロイル１９ｍＬを滴加投入する。１〜２時間攪拌した後、０〜５℃で４４．９ｇのＰ７を投入する。常温に昇温した後、２〜３時間攪拌する。反応終結の後、精製水を仕込んで層分離する。有機層を５％クエン酸水溶液８９８ｍＬと５％ＮａＨＣＯ３水溶液８９８ｍＬを用いて洗浄し、ＭｇＳＯ４（硫酸マグネシウム）１７９ｇで脱水して濃縮する。Ｐ６（８５ｇ、収率９０％）を濃縮残渣としてを得る。
【００７８】
［実施例６］
Ｐ５の合成方法
（Ｓ）−３−（４−ｔｅｒｔ−ブトキシフェニル）−Ｎ−（（３−アセチル−１−メチル−１Ｈ−インドール−７−イル）メチル）−２−アミノ−Ｎ−（２，２−ジエトキシエチル）プロパンアミド((S)-3-(4-tert-butoxyphenyl)-N-((3-acetyl-1-methyl-1H-indol-7-yl)methyl)-2-amino-N-(2,2-diethoxyethyl)propanamide)
８５ｇのＰ６をＭｅＯＨ８５３ｍＬに溶かした後、Ｐｄ／Ｃ１０％ｗｅｔ８．５ｇを投入する。ギ酸アンモニウム１６ｇを投入した後、２時間還流させる。反応完了の後、常温に冷却し、Ｐｄ／Ｃを濾過した後、濃縮する。ＥＡ(ethylacetate)８５３ｍＬと精製水１７０６ｍＬを用いて層分離した後、有機層を５％クエン酸水溶液８５０ｍＬと５％ＮａＨＣＯ３水溶液８５０ｍＬを用いて洗浄し、濃縮してＰ５（５６ｇ、収率９０％）を合成する。
【００７９】
［実施例７］
Ｐ４の合成方法
４０ｇのＳ３をＥＡ(ethylacetate)４２６ｍＬに溶かした後、−１０℃に冷却する。ＮＭＭ(N-methylmorpholine)４１ｍＬとｉＢＣＦ(iso-butylchloroformate)２０ｍＬを同温度で滴加投入する。２〜３時間−１０℃で攪拌した後、５６ｇのＰ５をＥＡ２００ｍＬに溶かして滴加投入する。常温に昇温して１〜２時間攪拌する。反応終結確認の後、ＥＡと精製水８５０ｍＬを用いて層分離する。有機層は５％クエン酸水溶液８５０ｍＬと５％ＮａＨＣＯ３水溶液８５０ｍＬで洗浄し、ＭｇＳＯ４（硫酸マグネシウム）３４０ｇで脱水して濃縮する。Ｐ４（８１ｇ、収率９０％）を濃縮残渣として得る。
【００８０】
［実施例８］
Ｐ３の合成方法
（６Ｓ，９ａＳ）−６−（４−ヒドロキシベンジル）−８−（（３−アセチル−１−メチル−１Ｈ−インドール−７−イル）メチル）−２−アリル−Ｎ−ベンジル−ヘキサヒドロ−４，７−ジオキソ−２Ｈ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−１（６Ｈ）−カルボキサミド((6S,9aS)-6-(4-Hydroxybenzyl)-8-((3-acetyl-1-methyl-1H-indol-7-yl)methyl)-2-allyl-N-benzyl-hexahydro-4,7-dioxo-2H-pyrazino[2,1-c][1,2,4]triazine-1(6H)-carboxamide)
８１ｇのＰ４を８５％のギ酸３８３ｍＬで溶かした後、５０℃まで昇温する。１〜２時間同温度で攪拌した後、常温に冷却してアセトンを投入する。この溶液に５Ｎ  ＮａＯＨ溶液をｐＨ４．０〜４．２となるまでゆっくり滴加投入して粗結晶を取る。１０〜１５℃に冷却した後、濾過して得られた固体を７６７ｍＬのＭｅＯＨに入れ、しかる後に、加温して完全に溶かす。ゆっくり冷却して結晶を析出させる。濾過してＰ３（４０ｇ、収率６０％）を白桃色結晶として得る。
1H NMR (500MHz, CDCl3) 8.43 (d, J=4.8 Hz, 1H), 7.63 (s, 1H), 7.38-7.35 (m, 2H), 7.31-7.30 (m, 1H), 7.29-7.21 (m, 2H), 7.00 (d, J=4.8 Hz, 2H), 6.97 (d, J=4.8 Hz, 1H), 6.69-6.65 (m, 3H), 5.87 (s, 1H), 5.55-5.44 (m, 3H), 5.34 (t, J=4.6 Hz, 1H), 5.03 (d, J=6.3 Hz, 1H), 4.87 (d, J=9.0 Hz, 1H), 4.79 (d, J=7.5 Hz, 1H), 4.42 (dd, J=9.0, 3.6 Hz, 1H), 4.29 (dd, J=9.0, 3.6 Hz, 1H), 4.02 (s, 3H), 3.43 (d, J=7.2 Hz, 1H), 3.38-3.33 (m, 3H), 3.27 (d, J=7.2 Hz, 1H), 3.29-3.24 (m, 1H), 3.18 (dd, J=7.2, 2.4 Hz, 1H), 2.51 (s, 3H)
【００８１】
［実施例９］
Ｐ２の合成方法
４−（（（６Ｓ，９ａＳ）−１−（ベンジルカルバモイル）−８−（（３−アセチル−１−メチル−１Ｈ−インドール−７−イル）メチル）−２−アリル−オクタヒドロ−４，７−ジオキソ−１Ｈ−ピペラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−６−イル）メチル）フェニルジハイドロジェンフォスフェート (4-(((6S,9aS)-1-(Benzylcarbamoyl)-8-((3-acetyl-1-methyl-1H-indol-7-yl)methyl)-2-allyl-octahydro-4,7-dioxo-1H-pyrazino[2,1-c][1,2,4]triazin-6-yl)methyl)phenyl dihydrogen phosphate)
４０ｇのＰ３をＴＨＦ(Tetrahydrofuran)２１７ｍＬに溶かす。０〜５℃に冷却した後、ＰＯＣｌ３２５ｍＬを投入する。同温度でＴＥＡ(triethylamine)２８ｍＬを滴加投入する。１時間攪拌した後、精製水８７ｍＬをゆっくり滴加する。Ｓａｔ．ＮａＨＣＯ３水溶液３４８ｍＬを投入し、３０分間攪拌する。ＥＡ２１７ｍＬを投入して層分離し、水層にＭＣ（塩化メチレン）２１７ｍＬを投入し、濃塩酸１４ｍＬを用いてｐＨ１〜３に合わせて層分離する。有機層をＮａ２ＳＯ４（硫酸ナトリウム）１７４ｇを用いて脱水処理し、減圧濃縮する。ＴＨＦ(tetrahydrofuran)１３０ｍＬとｎ−ヘキサン４３５ｍＬを用いて結晶化した後、濾過して真空乾燥させる。Ｐ２（４０ｇ、収率９０％）を白色固体として得る。
1H NMR (500MHz, DMSO-d6) ? 8.27 (s, 1H), ? 8.16 (d, J=7.5 Hz, 1H), ? 7.85 (t, J=6.3 Hz, 1H), 7.34-7.29 (m, 3H), 7.22-7.01 (m, 9H), 6.79 (d, J=6.9 Hz, 1H), 5.84-5.75 (m, 1H), 5.52 (dd, J=8.1, 3.6 Hz, 1H), 5.38 (d, J=15.6 Hz, 1H), 5.17-5.13 (m, 1H), 5.09-5.03 (m, 2H), 4.90 (d, J=15.6 Hz, 1H), 4.22 (d, J=6.3 Hz, 2H), 4.06 (s, 3H), 3.76-3.68 (m, 1H), 3.61-3.55 (m, 2H), 3.33-3.27 (m, 4H), 3.07-3.02 (m, 2H), 2.41 (s, 3H)
【００８２】
［実施例１０］
Ｐ１の合成方法
ナトリウム４−（（（６Ｓ，９ａｓ）−１−（ベンジルカルバモイル）−８−（（３−アセチル−１−メチル−１Ｈ−インドール−７−イル）メチル）−２−アリル−オクダヒドロ−４，７−ジオキソ−１Ｈ−ピラジノ［２，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン−６−イル）メチル）フェニルハイドロジェンホスフェート(Sodium 4-(((6S,9aS)-1-(benzylcarbamoyl)-8-((3-acetyl-1-methyl-1H-indol-7-yl)methyl)-2-allyl-octahydro-4,7-dioxo-1H-pyrazino[2,1-c][1,2,4]triazin-6-yl)methyl)phenyl hydrogenphosphate )
精製水２０００ｍＬに、乾燥した４０ｇのＰ２を投入し、攪拌する。温度を０〜５℃に降温し、０．１モルの水酸化ナトリウム水溶液をゆっくり滴加してｐＨ４．６〜４．８（１３０〜１１０ｍＶ）に合わせた後、凍結乾燥させてＰ１（４０ｇ、収率９５％）を白色固体として得る。
1H NMR (300MHz, D2O)  7.86 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.60 (s, 1H), 7.07-6.93 (m, 10H), 6.56 (d, J=7.2 Hz, 1H), 5.39-5.32 (m, 2H), 5.09 (t, J=5.4 Hz, 1H), 4.95 (d, J=15.6 Hz, 1H), 4.70-4.53 (m, 2H), 4.14 (d, J=15.6 Hz, 1H), 3.97 (d, J=15.6 Hz, 1H), 3.57 (s, 3H), 3.56-3.49 (m, 1H), 3.30-2.81 (m, 6H), 2.84-2.81 (m, 1H), 2.18 (s, 3H)
【００８３】
前記化合物４および５の製造例の他に、本発明の別の代表的化合物の製造例が下記に提示される。
<製造スキーム２>
【００８４】
【化２２】
0005657642.tif 000035
【００８５】
【化２３】
0005657642.tif 000036
【００８６】
下記実施例１１〜実施例２１では、前記製造スキーム２の製造方法の具体的実施例を記述する。
【００８７】
［実施例１１］
Ｓ３の合成方法
実施例１の方法と同様にしてＳ３を得た。
【００８８】
［実施例１２］
Ｑ１０の合成方法
３−ヨード−１Ｈ−インドール−７−カルバルデヒド(3-Iodo-1H-indole-7-carbaldehyde)
出発物質（インドール−７−カルバルデヒド）に、Ｉ２２４ｇをＤＭＦ(Dimethylforamide)１２５ｍＬに仕込んで攪拌しながらＫＯＨ５．３ｇを投入した後、反応させる。反応終結は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって確認可能であり、反応完結の後にはＥＡ(Ethylacetate)３５４ｍＬと精製水３５４ｍＬを用いて層分離する。有機層を１０％Ｎａ２ＳＯ３水溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４(Sodium sulfate)で乾燥させ、濾過した後、４０℃で濃縮してＱ１０を濃縮残渣として得る。
1H-NMR (CDCl3, 300MHz) δ 10.3 (bs, 1H), 10.2 (s, 1H), 7.79 (d, 1H, J=7.8 Hz), 7.75 (d, 1H, J=7.2 Hz), 7.44 (d, 1H, J=2.1 Hz), 7.37 (t, 1H, J=7.2 Hz); m/z 272.14 [M+1]+
【００８９】
［実施例１３］
Ｑ９の合成方法
１７ｇのＱ１０をＤＭＦ(dimethylformamide)１００ｍＬに溶かして攪拌する。１０℃に冷却してＫ２ＣＯ３（炭酸カリウム）１８ｇを投入し、ＭｅＩ（ヨウ化メチル）６ｍＬを滴加投入する。常温に昇温して４〜５時間攪拌した後、出発物質が無くなったことを確認し、しかる後に、Ｋ２ＣＯ３を濾過し、ヘキサンで結晶化してＱ９を得る。
1H- NMR (CDCl3, 300MHz) δ 10.2 (s, 1H), 7.76 (td, 1H, J=7.8, 1.2 Hz), 7.31(t, 1H, J=7.8 Hz), 7.12 (s, 1H), 4.14 (s, 3H)
【００９０】
［実施例１４］
Ｑ８の合成方法
１８ｇのＱ９をＭｅＯＨ（メタノール）６００ｍＬに溶かしてＡｃＯＨ（酢酸）０．４ｍＬを投入する。常温でアミノアセトアルデヒドジエチルアセタール１４ｍＬを投入して３〜４時間攪拌する。１０℃に冷却し、還元剤としてのＮａＣＮＢＨ３(Sodiumcyanoborohydride)３．３ｇをゆっくり投入する。水素気体が発生し、発熱が起こるため、注意して投入する。常温で１時間攪拌した後、反応終結を確認し、しかる後に、ＥＡ(Ethylacetate)３５４ｍＬと精製水３５４ｍＬを用いて層分離する。有機層をＮａ２ＳＯ４（硫酸ナトリウム）１４１ｇを用いて脱水した後、ヘキサンで結晶化してＱ８を得る。
【００９１】
［実施例１５］
Ｑ７の合成方法
Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＯｔＢｕ）２７ｇをＭＣ（ジクロロメタン）２００ｍＬに溶かして攪拌する。常温でＨＡＴＵ(O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N`,N`-tetramethyluronium hexafluorophosphate)２３ｇ、ＤＩＰＥＡ (Diisopropylethylamine)２０ｍＬを滴加投入する。１〜２時間攪拌した後、１５．８ｇのＱ９を投入し、しかる後に、２〜３時間攪拌する。反応終結の後、精製水を投入して層分離する。有機層を５％クエン酸水溶液８９８ｍＬと５％ＮａＨＣＯ３水溶液８９８ｍＬを用いて洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４（硫酸ナトリウム）で脱水して濃縮する。Ｑ７を濃縮残渣として得る。
【００９２】
［実施例１６］
Ｑ６の合成方法
３４ｇのＱ７をＭＣ（ジクロロメタン）４００ｍＬに溶かした後、ピペリジン２０ｍＬを投入する。反応完了の後、濃縮する。ＭＣ（ジクロロメタン）４００ｍＬと精製水８００ｍＬを用いて層分離した後、有機層を５％クエン酸水溶液８５０ｍＬと５％ＮａＨＣＯ３水溶液８５０ｍＬを用いて洗浄し、濃縮してＱ６を得る。
【００９３】
［実施例１７］
Ｑ５の合成方法
１３ｇのＳ３をＭＣ（ジクロロメタン）４００ｍＬに溶かした後、ＨＡＴＵ(O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N`,N`-tetramethyluronium hexafluorophosphate))１９ｇとＤＩＰＥＡ(Diisopropylethylamine)１６ｍＬを常温で滴加投入する。２〜３時間攪拌した後、Ｐ６をＭＣ（ジクロロメタン）２００ｍＬに溶かして滴加投入する。常温で１〜２時間攪拌する。反応終結の確認後、ＭＣ（ジクロロメタン）と精製水２００ｍＬを用いて層分離する。有機層を５％クエン酸水溶液２００ｍＬと５％ＮａＨＣＯ３水溶液２００ｍＬで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４（硫酸ナトリウム）３４０ｇで脱水して濃縮する。Ｑ５を濃縮残渣として得る。
【００９４】
［実施例１８］
Ｑ４の合成方法
Ｑ５をトルエン１００ｍＬで溶かした後、ｐ−ＴｓＯＨ．Ｈ２Ｏ２８９ｍｇを投入し、８０℃まで昇温する。３０分間同温度で攪拌した後、常温に冷却して濃縮する。ＥＡと精製水を用いて層分離する。有機層を５％クエン酸水溶液２００ｍＬと５％ＮａＨＣＯ３水溶液２００ｍＬで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４３４０ｇで脱水して濃縮する。Ｑ４を濃縮残渣として得る。
1H-NMR (CDCl3, 300MHz) δ 7.43-7.27 (m, 3H), 7.23-7.21 (m, 2H), 7.12 (t, 1H, J=7.2Hz), 7.08 (s, 1H), 7.05 (d, 2H, J=7.8 Hz), 6.97 (d, 1H, J=7.2 Hz), 6.90 (d, 2H, J=8.4 Hz), 6.59 (t, 1H, J=6.0 Hz), 5.62 (dd, 1H, J=10.2, 4.8 Hz), 5.53-5.39 (m, 3H), 5.37 (t, 1H, J=6.0 Hz), 5.02 (d, 1H, J=10.2 Hz), 4.93 (d, 1H, J=16.5 Hz), 4.77 (d, 1H, J=17.1 Hz), 4.44 (dd, 1H, J=15.0, 6.3 Hz), 4.32 (dd, 1H, J=15.0, 6.0 Hz),  3.97 (s, 3H), 3.49-3.19 (m, 8H), 1.33 (s, 9H)
【００９５】
［実施例１９］
Ｑ３の合成方法
Ｑ４を１，４−ジオキサン８ｍＬと水４ｍＬに溶かした後、４−アセチルベンゼンボロン酸(4-acetylbenzeneboronic acid)３３ｍｇ、Ｎａ２ＣＯ３（炭酸ナトリウム）４１ｍｇとＰｄ（ＰＰｈ３）４(tetrakistriphenylphosphinopalladium)１５０ｍｇを投入し、９０℃まで昇温する。２時間同温度で攪拌した後、常温に冷却して濃縮する。ＥＡ(ethylacetate)と精製水を用いて層分離する。有機層を分離した後、Ｎａ２ＳＯ４（硫酸ナトリウム）で脱水して濃縮する。これをＭＣ（ジクロロメタン）に溶かした後、ＴＦＡ(trifluoroacetic acid)を滴加し、常温で攪拌する。反応完結の後、５％ＮａＨＣＯ３水溶液１０ｍＬで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４（硫酸ナトリウム）で脱水して濃縮する。Ｑ３を濃縮残渣として得る。
1H-NMR (CDCl3, 300MHz) δ 8.05 (d, 2H, J=8.4 Hz), 7.91 (d, 1H, J=7.2 Hz), 7.71 (d, 2H, J=8.4 Hz), 7.40-7.20 (m, 4H), 7.16 (t, 1H, J=7.2Hz), 7.05 (d, 2H, J=8.4 Hz), 6.96 (d, 1H, J=6.9 Hz), 6.69 (d, 2H, J=8.4 Hz), 6.68 (m, 1H), 5.58-5.44 (m, 3H), 5.37 (t, 1H, J=5.7 Hz), 5.03 (d, 1H, J=10.8 Hz), 4.97 (d, 1H, J=14.7 Hz), 4.81 (d, 1H, J=17.1 Hz), 4.47 (dd, 1H, J=15.3, 6.3 Hz), 4.33 (dd, 1H, J=15.3, 6.3 Hz),  4.33 (s, 3H), 3.47-3.24 (m, 8H), 2.64 (s, 3H); m/z 711.56 [M+1]+
【００９６】
［実施例２０］
Ｑ２の合成方法
Ｑ３をＴＨＦ(Tetrahydrofuran)２１７ｍＬに溶かす。０〜５℃に冷却した後、ＰＯＣｌ３２５ｍＬを投入する。同温度でＴＥＡ(triethylamine)２８ｍＬを滴加投入する。１時間攪拌した後、精製水８７ｍＬをゆっくり滴加する。Ｓａｔ．ＮａＨＣＯ３水溶液３４８ｍＬを投入し、３０分間攪拌する。ＥＡ(ethylacetate)２１７ｍＬを投入して層分離し、水層にＭＣ（塩化メチレン）２１７ｍＬを投入し、濃塩酸１４ｍＬを用いてｐＨを１〜３に合わせて層分離する。有機層をＮａ２ＳＯ４（硫酸ナトリウム）を用いて脱水処理し、減圧濃縮する。ＴＨＦ(tetrahydrofuran)１３０ｍＬとｎ−ヘキサン４３５ｍＬを用いて結晶化した後、濾過して真空乾燥する。
【００９７】
［実施例２１］
Ｑ１の合成方法
精製水２０００ｍＬに、乾燥した４４ｇのＱ２を投入し、攪拌する。温度を０〜５℃に降温し、０．１％水酸化ナトリウム水溶液をゆっくり滴加してｐＨ４．６〜４．８（１３０〜１１０ｍＶ）に合わせた後、凍結乾燥させてＱ１を得る。
【００９８】
以下では、製造された化合物の効果を詳細に説明する。
【００９９】
［実施例２２］
化合物の溶解度を高めるために、プロドラッグ化合物の形で製造された。なるべくプロドラッグ置換基としてフォスフェートを導入することができ、単ナトリウムおよび二ナトリウム形態のいずれも可能である。
【０１００】
このようなプロドラッグを、実施例９で生成されたＰ２に水酸化ナトリウムを滴加して製造した。二ナトリウムおよび単ナトリウム形態のいずれも、最大溶解度は４００ｍｇ／ｍＬ以上を示した。また、単ナトリウム形態の場合、ｐＨが４．４５であり、二ナトリウム形態の場合、ｐＨが７．６２であって、いずれも注射剤（Ｉ．Ｖ．）に製造する上で有利な利点を示した。
【０１０１】
図１は最終化合物における０．５モルの水酸化ナトリウムを滴加投入したときのｐＨと電位差の変化を図式化したものである。グラフの横軸は滴加された水酸化ナトリウムの量を示す。グラフにおいて、最初の上昇曲線は単ナトリウムが生成される時点であり、２番目の上昇曲線は二ナトリウムが生成されたときである。
【０１０２】
［実施例２３］
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）動物モデルにおける抗癌効能
テスト対象物質は、化合物の溶解度を高めるために、プロドラッグ化合物の形で製造された。さらに、プロドラッグ置換基としてフォスフェート作用基を導入した。この際、フォスフェート作用基は単ナトリウムおよび二ナトリウム形態の中から選択的に使用可能である。
【０１０３】
【化２４】
0005657642.tif 000037
【０１０４】
テスト比較対象物質：Ａｒａ−Ｃ（市販の急性骨髄性白血病治療剤）
人体に由来した急性骨髄性白血病細胞としてのＭＶ４−１１癌細胞株を購入（ＡＴＣＣ、米国）してＩｓｃｏｖｅ・ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ・ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ、ｃａｔ＃２１０５６）に１０％牛胎仔血清 （ＧＩＢＣＯ、ｃａｔ＃２５０３０−０８１）を添加した後、３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。５〜６週齢の雌Ｂａｌｂ／Ｃヌードマウス（オリエントバイオ社、城南市、韓国）を購入して動物飼育室環境に順化させた後で培養したＭＶ４−１１細胞（５×１０６／マウス）をマトリゲル(matrigel)と１：１（体積：体積）で混合した後、マウスの腋窩皮下に滅菌注射器を用いて移植した。癌細胞移植約２週後に腫瘍が一定のサイズに形成されると、各個体の腫瘍サイズおよび体重に応じて試験群間のバラツキが最小化されるように各試験群に５匹ずつ配定した。試験物質は生理食塩水に溶かして１０ｍＬ／ｋｇ投与液量で１日１回、週５回尾静脈を介して２週間静脈注射した（試験物質投与日、１日目〜５日目、８日目〜１２日目）。対照群には生理食塩水のみを投与した。腫瘍サイズはデジタルｃａｌｉｐｅｒ（Ｍｉｔｓｕｔｏｙｏ、日本）を用いて腫瘍の長軸および短軸の長さを測定して長軸×短軸×短軸／２で計算した。試験物質の抗癌効能は腫瘍成長抑制率（％）で次の公式によって数値化した。
腫瘍成長抑制率（％）＝１００×［１−（ｂ−ａ）／（Ｒｅｆ ｂ−Ｒｅｆ ａ）］
ａ＝１日目の薬物投与群の平均腫瘍サイズ
ｂ＝１２日目の薬物投与群の平均腫瘍サイズ
Ｒｅｆ ａ＝１日目の対照群の平均腫瘍サイズ
Ｒｅｆ ｂ＝１２日目の対照群の平均腫瘍サイズ
但し、１２日目の薬物投与群の平均腫瘍サイズが試験物質投与直前の腫瘍サイズよりも小さくなった場合には、退縮(regression)（＞１００％）で表示した。
【０１０５】
各試験物質の腫瘍成長抑制率を下記表に示した。
【０１０６】
【表２】
0005657642.tif 000038
【０１０７】
テスト結果、テストされた化合物はいずれも腫瘍成長抑制活性を示し、本発明の化合物Ａ１〜Ａ３、Ｂ１〜Ｂ３、Ｃ１〜Ｃ３は腫瘍成長抑制率が７０％〜退縮（＞１００％）の範囲であった。これに対し、急性骨髄性白血病治療剤として汎用されている薬物Ａｒａ−Ｃは腫瘍成長抑制率が６６％であった。このような結果より、本発明に係る化合物が優れた腫瘍成長抑制効果を示すことが分かる。
【０１０８】
［実施例２４］
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ心臓毒性試験：ｈＥＲＧ抑制活性アッセイ
ｈＥＲＧ(human Ether-・-go-go Related Gene)ｃＤＮＡを、継代培養されたＨＥＫ２９３細胞株にリポフェクタミン２０００を用いてトランスフェクション（４８ｈｒ）させ、実験に使用した。ＨＥＫ２９３細胞は、１０％ＦＢＳ、ピルビン酸ナトリウム（１０ｍＬ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１０ｍＬ）、ゼオシン(Zeocin)（１００μｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれたＭＥＭ(Modified Dulbocco’s Medium)（Ｇｉｂｃｏ、１Ｌ）培養液に入れ、３７℃の温度と５％ＣＯ２が維持される細胞培養器で培養した。培養されたＨＥＫ２９３細胞をトリプシン(trypsin)処理して細胞培養用培養容器から取り出した後、パッチクランプ(patch clamp)用チャンバーに細胞を播き、しかる後に、実験を行った。次の組成を持つ細胞内／外溶液を用いて全細胞パッチクランプ(whole-cell patch clamp)法を用いてｈＥＲＧによるＫ＋電流を記録した後、化合物を細胞外に投与してＫ＋電流に対する影響を観察した。
・細胞内液：Ｋ−アスパラギン酸塩１００ｍＭ、ＫＣｌ２５ｍＭ、ＮａＣｌ５ｍＭ、ＭｇＣｌ２１ｍＭ、Ｍｇ−ＡＴＰ４ｍＭ、ＢＡＰＴＡ(1,2-bis(o-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid)１０ｍＭ、ＨＥＰＥＳ(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)１０ｍＭ、およびＮＭＧ(normalized magnesium)を用いてｐＨ７．２に調節した。
・細胞外液：ＮａＣｌ１４５ｍＭ、ＫＣｌ５ｍＭ、グルコース１０ｍＭ、ＭｇＣｌ２１ｍＭ、ＣａＣｌ２２ｍＭ、ＨＥＰＥＳ１０ｍＭ、およびＨＣｌを用いてｐＨを７．４に調節した。
【０１０９】
全細胞パッチクランプモードで細胞膜の電圧を−８０ｍＶ〜＋２０ｍＶに１０００ｍｓ間低分極させた後、１０００ｍｓ間−４０ｍＶに再分極させる過程で記録される外向性ｈＥＲＧ Ｋ＋電流のテール電流(tail current)のサイズを記録した後、これに対する化合物の５０％抑制作用を示す濃度をＩＣ５０で表示した。
【０１１０】
【表３】
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【０１１１】
多くの薬物が心臓毒性に対する危険性を提起されるか、或いは市販の後に心臓毒性による突然死が発見されて市場から引き揚げられた。このような薬物による心臓毒性は、心電図上のＱＴ間隔の延長に関連しており、特にＱＴ間隔を延長する大多数の薬物がＩＫｒチャネルを阻害するものと知られている(Bernard Fermini and Anthony A. Fossa, Nature Reviews Drug Discovery, 2003, 2, 439-447)。ｈＥＲＧチャネルは、ＩＫｒチャネルのうち、心臓毒性に最も重要な作用をするチャネルであって、本実施例では、国際的に通用される試験系であるヒトのｈＥＲＧチャネルを発現する哺乳類細胞を用いて心臓毒性の危険度を評価しようとした(ICH guideline, S7B, Step4, 12, May, 2005)。概して、この試験では薬物の薬理活性度を勘案しなければならないが、通常、ＩＣ５０値が１０μＭ以上であれば、心臓毒性の危険性が低いと評価し、本試験では大部分の試験物質がこの基準を超過したが、Ａに比べてＡ１が、Ｂに比べてＢ１、Ｂ２、Ｂ３試験物質が高いＩＣ５０値を示してさらに心臓毒性に対する危険性が低いものと評価された。
【図１】
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