(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 少なくとも一の第一単鎖エフェクタ部分と、
(b) 第一および第二の抗原結合部分とを含むイムノコンジュゲートであって、
ここで、前記第一単鎖エフェクタ部分は、インターロイキン２(ＩＬ-２)、顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子(ＧＭ-ＣＳＦ)、インターフェロン-α(ＩＮＦ-α)、およびインターロイキン-１２(ＩＬ-１２)からなる群から選択されるサイトカインであって、
ここで、前記第一および第二の抗原結合部分の各々がＦａｂ分子であって、
ここで、前記第一単鎖エフェクタ部分は、前記第一抗原結合部分とアミノ−又はカルボキシ−末端ペプチド結合を共有しており、及び、
ここで、前記第二抗原結合部分は、前記第一エフェクタ部分とアミノ−又はカルボキシ−末端ペプチド結合を共有している、イムノコンジュゲート。
【請求項２】
前記イムノコンジュゲートが、第一エフェクタ部分と、一又はそれ以上のリンカー配列によって連結された第一および第二の抗原結合部分とから基本的になる、請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項３】
前記第一Ｆａｂ分子が、その重鎖又は軽鎖のカルボキシ末端で、前記エフェクタ部分のアミノ末端アミノ酸に連結しており、前記エフェクタ部分が、そのカルボキシ−末端アミノ酸で、第二Ｆａｂ分子の重鎖又は軽鎖のアミノ−末端アミノ酸に連結している、請求項１又は２に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項４】
前記第一および第二の抗原結合部分の可変領域が同じ抗原に特異的である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項５】
前記第一および第二の抗原結合部分の可変領域が異なる抗原に特異的である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項６】
前記第一および／または第二の抗原結合部分が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、テネイシンのＡ２ドメイン（ＴＮＣ−Ａ２）、テネイシンのＡ１ドメイン（ＴＮＣ−Ａ１）およびフィブロネクチンの外ドメインＢ（ＥＤＢ）からなる群から選択される抗原に特異的である、請求項４又は５に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項７】
前記第一および／または第二の抗原結合部分がテネイシンのＡ２ドメイン(ＴＮＣ-Ａ２)に特異的である、請求項６に記載のイムノコンジュゲートであって、前記イムノコンジュゲートが、配列番号：７、配列番号：１７９、配列番号：１８３、配列番号：１８７、配列番号：１９１、配列番号：１９５、配列番号：１９９、配列番号：２０３および配列番号：２０７の群から選択される重鎖可変領域配列と、配列番号：３、配列番号：５；配列番号：１７７、配列番号：１８１、配列番号：１８５、配列番号：１８９、配列番号：１９３、配列番号：１９７、配列番号：２０１および配列番号：２０５の群から選択される軽鎖可変領域配列とを含む、イムノコンジュゲート。
【請求項８】
前記第一および／または第二の抗原結合部分が線維芽細胞活性化タンパク質(ＦＡＰ)に特異的である、請求項６に記載のイムノコンジュゲートであって、前記イムノコンジュゲートが、配列番号：２１、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：３１、配列番号：３５、配列番号：３９、配列番号：４３、配列番号：４７、配列番号：５１、配列番号：６９、配列番号：７３、配列番号：７７、配列番号：８１、配列番号：８５、配列番号：８９、配列番号：９３、配列番号：１２３、配列番号：１２７、配列番号：１３１、配列番号：１３５、配列番号：１３９、配列番号：１４３、配列番号：１４７、配列番号：１５１、配列番号：１５５、配列番号：１５９、配列番号：１６３、配列番号：１６７、配列番号：１７１および配列番号：１７５からなる群から選択される重鎖可変領域配列と、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２３、配列番号：２９、配列番号：３３、配列番号：３７、配列番号：４１、配列番号：４５、配列番号：４９、配列番号：６７、配列番号：７１、配列番号：７５、配列番号：７９、配列番号：８３、配列番号：８７、配列番号：９１、配列番号：１２１、配列番号：１２５、配列番号：１２９、配列番号：１３３、配列番号：１３７、配列番号：１４１、配列番号：１４５、配列番号：１４９、配列番号：１５３、配列番号：１５７、配列番号：１６１、配列番号：１６５、配列番号：１６９および配列番号：１７３からなる群から選択される軽鎖可変領域配列とを含む、イムノコンジュゲート。
【請求項９】
前記第一および／または第二の抗原結合部分がメラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(ＭＣＳＰ)に特異的である、請求項６に記載のイムノコンジュゲートであって、前記イムノコンジュゲートが、配列番号：２５７又は配列番号：２６１の重鎖可変領域配列と、配列番号：２５９又は配列番号：２７１の軽鎖可変領域配列とを含む、イムノコンジュゲート。
【請求項１０】
前記サイトカインがＩＬ-２である、請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲートのフラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが、
(i) 前記第一および第二の抗原結合部分の重鎖と前記第一エフェクタ部分、
(ii) 前記第一および第二の抗原結合部分の軽鎖と前記第一エフェクタ部分、または、
(iii) 前記第一抗原結合部分からの一軽鎖と、前記第二抗原結合部分からの一重鎖と、前記第一エフェクタ部分
をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲートの製造方法であって、請求項１２に記載の宿主細胞を、イムノコンジュゲートの発現に適切な条件下で培養することを含む、方法。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲートと薬学的担体とを含む組成物。
【請求項１５】
必要とする患者の疾患の治療において使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲートを含む医薬。
【請求項１６】
前記疾患が癌である、請求項１５に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、細胞活性に影響するエフェクタ部分を選択的に運搬するための抗原特異性イムノコンジュゲートに関する。加えて、本発明は、このようなイムノコンジュゲートをコードする核酸分子及び、該核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞に関する。本発明は、さらに、本発明のイムノコンジュゲートを製造するための方法、そして、疾患の治療におけるこれらイムノコンジュゲートを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
個々の細胞又は特定の細胞種の選択的な破壊は、様々な臨床状況で望ましいことが多い。例えば、健康な細胞および組織を完全かつ損傷を与えないで、腫瘍細胞を特異的に破壊することは、癌治療の主要な目的である。細胞での多くのシグナル伝達経路は、細胞の生存および／または死と関連している。したがって、細胞生存又は死に伴う経路因子を直接運搬することによって、細胞の維持又は破壊に寄与しうる。
サイトカインは、免疫系の調節に関与する細胞シグナル伝達分子である。癌療法で用いられる場合、サイトカインは、抗腫瘍効果を有し、ある種の腫瘍の免疫原性を増やしうる免疫調節性薬剤として作用することができる。しかしながら、免疫応答を活性化したり抗腫瘍効果を示すのに十分な濃度のサイトカインを腫瘍部位に到達させるためには、迅速な血中クリアランスや腫瘍特異性を欠いているため、高用量のサイトカインの全身投与が必要となる。高レベルの全身サイトカインは、激しい毒性と有害な反応を引き起こしうる。
【０００３】
インビボで特定の部位（例えば腫瘍又は腫瘍微小環境）にサイトカインなどのシグナル伝達経路因子を運搬する一つの方法は、その部位に特異的な免疫グロブリンに因子をコンジュゲートすることである。サイトカインなどのシグナル伝達経路因子をインビボの特定の部位に運搬するための早期戦略は、リンホトキシン、腫瘍壊死因子-α(ＴＮＦ-α)、インターロイキン２(ＩＬ-２)および顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子(ＧＭ-ＣＳＦ)を含む様々なサイトカインに免疫グロブリン重鎖をコンジュゲートさせたものを含んでいた。免疫グロブリン重鎖は、化学的にサイトカインにコンジュゲートさせたり、免疫グロブリン−サイトカインコンジュゲートを融合タンパク質として発現させたりしていた。Nakamura K. and Kubo, A. Cancer Supplement 80:2650-2655 (1997)；Jun, L. et al., Chin. Med. J. 113:151-153 (2000)；及び、Becker J.C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7826-7831 (1996)を参照。研究者等は、インビボで特定の部位にサイトカインを標的化させることができることだけでなく、モノクローナル抗体は他の多くのタンパク質よりも血中半減期が長いという点において利点があったことを観察した。ある非コンジュゲートサイトカイン、すなわちＩＬ-２の高用量には全身性の毒性があるので、低用量で全身性の副作用を最小限に抑えつつ、腫瘍部位で免疫賦活性を最大に発揮する免疫グロブリン−サイトカイン融合タンパク質の能力は、研究者に、免疫グロブリン−サイトカインイムノコンジュゲートが適切な治療剤であることを確信させるものとなった。しかしながら、運搬薬剤としての免疫グロブリンの臨床的有用性を制限する主な理由の一つは、場合によって免疫グロブリン分子のサイズが大きいために、取り込みが不十分であり、腫瘍での破壊が不十分であることである。Xiang, J. et al., Immunol. Cell Biol. 72:275-285 (1994)を参照。加えて、免疫グロブリン−サイトカインイムノコンジュゲートが補体を活性化し、Ｆｃレセプターと相互作用しうることが示唆された。治療的イムノコンジュゲートが好適な抗原保持細胞よりむしろＦｃレセプターを発現する細胞に標的化されうるので、この固有の免疫グロブリン特性は不利と見られていた。
【０００４】
これらの問題を克服するための一つの試みは、操作された免疫グロブリンフラグメントの使用である。多くの研究は、免疫グロブリンフラグメント−サイトカインイムノコンジュゲートの特徴を詳述している。Savage, P. et al., Br. J. Cancer 67:304-310 (1993)；Harvill, E.T. and Morrison S.L., Immunotechnol. 1:95-105 (1995)；及び、Yang J. et al., Mol. Immunol. 32:873-881 (1995)を参照。通常は、２の一般的な免疫グロブリンフラグメント-サイトカイン融合タンパク質コンストラクトがあり、それは哺乳動物細胞で発現されるＦ(ａｂ')２-サイトカインと、大腸菌で発現されるｓｃＦｖ-サイトカインである。Xiang, J. Hum. Antibodies 9:23-36 (1999)を参照。免疫グロブリン親分子の腫瘍結合反応性およびサイトカインの機能的活性は、これら多くのタイプのイムノコンジュゲートに維持されている。近年の臨床前試験では、これら融合タンパク質は、インビボで腫瘍関連抗原を発現する腫瘍にサイトカインを標的化すること、及び免疫十分な動物モデルにおいて原発性及び転移性両方の腫瘍を阻害することが示された。
【０００５】
免疫グロブリンフラグメント−サイトカインイムノコンジュゲートの例には、ＰＣＴ公報ＷＯ２００１／０６２２９８Ａ２に記載されるｓｃＦｖ−ＩＬ-２イムノコンジュゲート；米国特許第５６５０１５０号に記載される免疫グロブリン重鎖フラグメント−ＧＭ−ＣＳＦイムノコンジュゲート；ＰＣＴ公報ＷＯ２００６／１１９８９７Ａ２に記載されるイムノコンジュゲート（ここではｓｃＦｖ−ＩＬ−１２第一サブユニットはＩＬ-１２第二サブユニット-ｓｃＦｖとジスルフィド結合(一又は複数)のみを共有している）、ＰＣＴ公報ＷＯ９９／２９７３２Ａ２に記載されるイムノコンジュゲート（ここではＩｇ重鎖フラグメント−ＩＬ−１２第一サブユニットはＩｇ重鎖フラグメント-ＩＬ-１２第二サブユニットとジスルフィド結合(一又は複数)のみを共有している）が含まれる。これら第二世代のイムノコンジュゲートが第一世代の免疫グロブリン−サイトカインコンジュゲートと比較して、いくらか向上する性質を有するが、腫瘍細胞に対してより有効性が高い、また、これら生成物の副作用（例えば毒性、非腫瘍細胞の破壊など）の数及び重症度が少ない、より多くかつさらにより安全な特異的治療薬の発達が望まれている。加えて、許容できる治療的活性レベルを維持しつつ、さらにイムノコンジュゲートを安定させる方法を同定することが望ましい。
本発明は、知られているイムノコンジュゲートと比較して、向上した有効性、作用の高い特異性、毒性の低減、及び向上した安定性を表すイムノコンジュゲートを提供する。
【発明の概要】
【０００６】
（発明の簡単な概要）
本発明の一態様は、知られているイムノコンジュゲートと比較して、向上した有効性、作用の高い特異性、毒性の低減、及び向上した安定性を表すイムノコンジュゲートに関する。本発明のイムノコンジュゲートは、インビボでエフェクタ部分を標的部位に選択的に運搬するために用いることができる。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、サイトカインを標的部位に運搬するものであり、このとき、サイトカインは、局在する生体学的効果、例えば局所の炎症反応、Ｔ細胞増殖および活性化の刺激および／またはＢおよび／またはＮＫ細胞の活性化を発揮することができる。
【０００７】
本発明の一態様は、少なくとも一の第一エフェクタ部分と、Ｆｖ及びＦａｂからなる群から独立して選択される少なくとも一の第一および一の第二の抗原結合部分とを含むイムノコンジュゲートであって、このとき第一エフェクタ部分は、第一抗原結合部分とアミノ−又はカルボキシ−末端ペプチド結合を共有しており、第二抗原結合部分は、ｉ)第一エフェクタ部分又はｉｉ)第一抗原結合部分の何れかとアミノ−又はカルボキシ−末端ペプチド結合を共有している、イムノコンジュゲートに関する。
【０００８】
本発明の別の態様は、そのアミノ末端アミノ酸で一又は複数のｓｃＦｖ分子に接合した少なくとも一の第一単鎖エフェクタ部分を含むイムノコンジュゲートであって、このときこの第一単鎖エフェクタ部分がそのカルボキシル末端アミノ酸で一又は複数のｓｃＦｖ分子に接合している、イムノコンジュゲートである。
【０００９】
本発明の別の態様は、少なくとも一の第一単鎖エフェクタ部分と第一および第二の抗原結合部分を含んでなるイムノコンジュゲートであって、このとき第一および第二各々の抗原結合部分は、そのカルボキシル末端アミノ酸で、ＩｇＧ ＣＨ１、ＩｇＧ ＣκおよびＩｇＥ ＣＨ４からなる群からそれぞれ選択される免疫グロブリン定常ドメインを含む定常領域に接合したｓｃＦｖ分子を含み、このとき第一抗原結合部分はエフェクタ部分のうちの一のアミノ末端アミノ酸にその定常領域カルボキシ末端アミノ酸で接合しており、そしてこのとき、第一および第二の抗原結合部分は少なくとも一のジスルフィド結合により共有結合されている、イムノコンジュゲートである。
【００１０】
本発明の別の態様は、少なくとも一の第一単鎖エフェクタ部分と第一および第二の抗原結合部分とを含んでなるイムノコンジュゲートであって、このとき第一および第二各々の抗原結合部分はＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインにそのカルボキシ末端アミノ酸で接合したｓｃＦｖ分子を含んでなり、このとき第一抗原結合部分はエフェクタ部分のうちの一のアミノ末端アミノ酸にそのカルボキシ末端アミノ酸で接合しており、そして、第一および第二の抗原結合部分は少なくとも一のジスルフィド結合により共有結合されている、イムノコンジュゲートである。
【００１１】
本発明の別の態様は、第一および第二の単鎖エフェクタ部分と第一および第二の抗原結合部分を含んでなるイムノコンジュゲートであって、このとき各々の抗原結合部分は、ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインにその重鎖又は軽鎖のカルボキシ末端アミノ酸で接合したＦａｂ分子を含み、そしてこのとき各々のＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインは、エフェクタ部分のうちの一のアミノ末端アミノ酸にそのカルボキシ末端アミノ酸で接合しており、そして、第一および第二の抗原結合部分は少なくとも一のジスルフィド結合により共有結合されている、イムノコンジュゲートに関する。
【００１２】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは配列番号：９５のポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは配列番号：１０４のポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは配列番号：１０５のポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは配列番号：１０６のポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは配列番号：１０７のポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは配列番号：９６のポリペプチド配列を含む。さらなる態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：９６のポリペプチド配列と、配列番号：９５および１０４−１０７からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：９５、９６および１０４−１０７からなる群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を有するポリペプチドを含む。
【００１３】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１０８と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１０８のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１７と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１７のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１８と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１８のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１９と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１９のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１２０と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１２０のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１０９と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１０９のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。
【００１４】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１３又は配列番号：１５の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：９又は配列番号：１１の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域を含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：１３又は配列番号：１５の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域と、配列番号：９又は配列番号：１１の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域とを含む。
【００１５】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１４又は配列番号：１６と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１４又は配列番号：１６のポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１０又は配列番号：１２と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１０又は配列番号：１２のポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域配列を含む。
【００１６】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：９９の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１００又は配列番号：２１５の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１０１又は配列番号：２３５の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：１００の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列と、配列番号：１０１の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列とを含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：２１５の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列と、配列番号：２３５の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列とを含む。
【００１７】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１２と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１２のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１３又は配列番号：２１６と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１３又は配列番号：２１６のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１４又は配列番号：２３６と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１４又は配列番号：２３６のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。
【００１８】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：７、配列番号：１７９、配列番号：１８３、配列番号：１８７、配列番号：１９１、配列番号：１９５、配列番号：１９９、配列番号：２０３および配列番号：２０７の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７７、配列番号：１８１、配列番号：１８５、配列番号：１８９、配列番号：１９３、配列番号：１９７、配列番号：２０１および配列番号：２０５の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列を含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：７、配列番号：１７９、配列番号：１８３、配列番号：１８７、配列番号：１９１、配列番号：１９５、配列番号：１９９、配列番号：２０３および配列番号：２０７の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７７、配列番号：１８１、配列番号：１８５、配列番号：１８９、配列番号：１９３、配列番号：１９７、配列番号：２０１および配列番号：２０５の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。
【００１９】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：８、配列番号：１８０、配列番号：１８４、配列番号：１８８、配列番号：１９２、配列番号：１９６、配列番号：２００、配列番号：２０４および配列番号：２０８の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：８、配列番号：１８０、配列番号：１８４、配列番号：１８８、配列番号：１９２、配列番号：１９６、配列番号：２００、配列番号：２０４および配列番号：２０８の群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：１７８、配列番号：１８２、配列番号：１８６、配列番号：１９０、配列番号：１９４、配列番号：１９８、配列番号：２０２および配列番号：２０６の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：１７８、配列番号：１８２、配列番号：１８６、配列番号：１９０、配列番号：１９４、配列番号：１９８、配列番号：２０２および配列番号：２０６の群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域配列を含む。
【００２０】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２３９、配列番号：２４１および配列番号：２４３の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、コンジュゲートは、配列番号：２４５、配列番号：２４７および配列番号：２４９の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：２３９、配列番号：２４１および配列番号：２４３の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列と、配列番号：２４５、配列番号：２４７および配列番号：２４９の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列とを含む。
【００２１】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２４０、配列番号：２４２および配列番号：２４４の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２４０、配列番号：２４２および配列番号：２４４の群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２４６、配列番号：２４８および配列番号：２５０の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２４６、配列番号：２４８および配列番号：２５０の群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。
【００２２】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２１、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：３１、配列番号：３５、配列番号：３９、配列番号：４３、配列番号：４７、配列番号：５１、配列番号：６９、配列番号：７３、配列番号：７７、配列番号：８１、配列番号：８５、配列番号：８９、配列番号：９３、配列番号：１２３、配列番号：１２７、配列番号：１３１、配列番号：１３５、配列番号：１３９、配列番号：１４３、配列番号：１４７、配列番号：１５１、配列番号：１５５、配列番号：１５９、配列番号：１６３、配列番号：１６７、配列番号：１７１および配列番号：１７５からなる群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２３、配列番号：２９、配列番号：３３、配列番号：３７、配列番号：４１、配列番号：４５、配列番号：４９、配列番号：６７、配列番号：７１、配列番号：７５、配列番号：７９、配列番号：８３、配列番号：８７、配列番号：９１、配列番号：１２１、配列番号：１２５、配列番号：１２９、配列番号：１３３、配列番号：１３７、配列番号：１４１、配列番号：１４５、配列番号：１４９、配列番号：１５３、配列番号：１５７、配列番号：１６１、配列番号：１６５、配列番号：１６９および配列番号：１７３からなる群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列を含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：２１、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：３１、配列番号：３５、配列番号：３９、配列番号：４３、配列番号：４７、配列番号：５１、配列番号：６９、配列番号：７３、配列番号：７７、配列番号：８１、配列番号：８５、配列番号：８９、配列番号：９３、配列番号：１２３、配列番号：１２７、配列番号：１３１、配列番号：１３５、配列番号：１３９、配列番号：１４３、配列番号：１４７、配列番号：１５１、配列番号：１５５、配列番号：１５９、配列番号：１６３、配列番号：１６７、配列番号：１７１および配列番号：１７５からなる群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２３、配列番号：２９、配列番号：３３、配列番号：３７、配列番号：４１、配列番号：４５、配列番号：４９、配列番号：６７、配列番号：７１、配列番号：７５、配列番号：７９、配列番号：８３、配列番号：８７、配列番号：９１、配列番号：１２１、配列番号：１２５、配列番号：１２９、配列番号：１３３、配列番号：１３７、配列番号：１４１、配列番号：１４５、配列番号：１４９、配列番号：１５３、配列番号：１５７、配列番号：１６１、配列番号：１６５、配列番号：１６９および配列番号：１７３からなる群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。
【００２３】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２２、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３２、配列番号：３６、配列番号：４０、配列番号：４４、配列番号：４８、配列番号：５２、配列番号：７０、配列番号：７４、配列番号：７８、配列番号：８２、配列番号：８６、配列番号：９０、配列番号：９４、配列番号：１２４、配列番号：１２８、配列番号：１３２、配列番号：１３６、配列番号：１４０、配列番号：１４４、配列番号：１４８、配列番号：１５２、配列番号：１５６、配列番号：１６０、配列番号：１６４、配列番号：１６８、配列番号：１７２および配列番号：１７６からなる群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２２、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３２、配列番号：３６、配列番号：４０、配列番号：４４、配列番号：４８、配列番号：５２、配列番号：７０、配列番号：７４、配列番号：７８、配列番号：８２、配列番号：８６、配列番号：９０、配列番号：９４、配列番号：１２４、配列番号：１２８、配列番号：１３２、配列番号：１３６、配列番号：１４０、配列番号：１４４、配列番号：１４８、配列番号：１５２、配列番号：１５６、配列番号：１６０、配列番号：１６４、配列番号：１６８、配列番号：１７２および配列番号：１７６からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされる重鎖可変領域配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２４、配列番号：３０、配列番号：３４、配列番号：３８、配列番号：４２、配列番号：４６、配列番号：５０、配列番号：６８、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：８０、配列番号：８４、配列番号：８８、配列番号：９２、配列番号：１２２、配列番号：１２６、配列番号：１３０、配列番号：１３４、配列番号：１３８、配列番号：１４２、配列番号：１４６、配列番号：１５０、配列番号：１５４、配列番号：１５８、配列番号：１６２、配列番号：１６６、配列番号：１７０および配列番号：１７４からなる群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２４、配列番号：３０、配列番号：３４、配列番号：３８、配列番号：４２、配列番号：４６、配列番号：５０、配列番号：６８、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：８０、配列番号：８４、配列番号：８８、配列番号：９２、配列番号：１２２、配列番号：１２６、配列番号：１３０、配列番号：１３４、配列番号：１３８、配列番号：１４２、配列番号：１４６、配列番号：１５０、配列番号：１５４、配列番号：１５８、配列番号：１６２、配列番号：１６６、配列番号：１７０および配列番号：１７４からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされる軽鎖可変領域配列を含む。
【００２４】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２０９、配列番号：２１１、配列番号：２１３、配列番号：２１７、配列番号：２１９、配列番号：２２１、配列番号：２２３、配列番号：２２５および配列番号：２２７の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２２９、配列番号：２３１、配列番号：２３３および配列番号：２３７の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：２１１、配列番号：２１９および配列番号：２２１の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列と、配列番号：２３１の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列とを含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：２０９、配列番号：２２３、配列番号：２２５および配列番号：２２７の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列と、配列番号：２２９の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列とを含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：２１３の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列と、配列番号：２３３の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列とを含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：２１７の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列と、配列番号：２３７の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列とを含む。
【００２５】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２１０、配列番号：２１２、配列番号：２１４、配列番号：２１８、配列番号：２２０、配列番号：２２２、配列番号：２２４、配列番号：２２６および配列番号：２２８の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２１０、配列番号：２１２、配列番号：２１４、配列番号：２１８、配列番号：２２０、配列番号：２２２、配列番号：２２４、配列番号：２２６および配列番号：２２８の群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２３０、配列番号：２３２、配列番号：２３４および配列番号：２３８の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２３０、配列番号：２３２、配列番号：２３４および配列番号：２３８の群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。
【００２６】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５７又は配列番号：２６１の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５９又は配列番号：２７１の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列を含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５７又は配列番号：２６１の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号：２５９又は配列番号：２７１の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。
【００２７】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５８又は配列番号：２６２の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５８又は配列番号：２６２のポリヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２６０又は配列番号：２７２の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２６０又は配列番号：２７２のポリヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域配列を含む。
【００２８】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５１又は配列番号：２５５の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５３又は配列番号：２６５の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列を含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５１又は配列番号：２５５の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列と、配列番号：２５３又は配列番号：２６５の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列とを含む。
【００２９】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５２又は配列番号：２５６の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５２又は配列番号：２５６のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５４又は配列番号：２６６と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５４又は配列番号：２６６のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。
【００３０】
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは少なくとも一のエフェクタ部分を含み、このエフェクタ部分はサイトカインである。特定の実施態様において、エフェクタ部分は、インターロイキン２(ＩＬ-２)、顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子(ＧＭ-ＣＳＦ)、インターフェロン-α(ＩＮＦ-α)、インターロイキン-１２(ＩＬ-１２)、インターロイキン-８(ＩＬ-８)、マクロファージ炎症性タンパク質−１α(ＭＩＰ-１α)、マクロファージ炎症性タンパク質−１β(ＭＩＰ-１β)およびトランスフォーミング増殖因子-β(ＴＧＦ-β)からなる群から選択されるサイトカインである。他の実施態様では、少なくとも一の抗原結合部分は、フィブロネクチンの外ドメインＢ(ＥＤＢ)、テネイシンのＡ１ドメイン(ＴＮＣ-Ａ１)、テネイシンのＡ2ドメイン(ＴＮＣ-Ａ2)、線維芽細胞活性化タンパク質(ＦＡＰ)；及び、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(ＭＣＳＰ)といった抗原決定基の何れか一に特異的である。
【００３１】
他の実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、コントロールエフェクタ部分に対するよりも、少なくともおよそ１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５又は１０倍大きい解離定数(ＫＤ)で、エフェクタ部分レセプターと結合する。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、投与期間の終わりに、インビボでの腫瘍体積の増加を少なくともおよそ１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％阻害する。他の実施態様では、コントロールエフェクタ部分又は「ダイアボディ」イムノコンジュゲート分子のエフェクタ部分と比較して、必要とする哺乳動物に投与されたとき、イムノコンジュゲートは悪性腫瘍を有する哺乳動物の生存を少なくともおよそ１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％延長する。
【００３２】
本発明の別の態様は、本発明のイムノコンジュゲート又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む発現ベクターに関する。
本発明の別の態様は、本発明のイムノコンジュゲート又はその断片を発現する宿主細胞に関する。 
本発明の別の態様は、本発明のイムノコンジュゲート又はその断片の製造方法に関し、この方法は、本発明のイムノコンジュゲート又はその断片をコードする発現ベクターにて形質転換した宿主細胞を、同発現に適切な条件下で培養することを含む。
【００３３】
本発明の別の態様は、活性化されたＴリンパ球細胞の増殖および分化を促進する方法に関し、活性化されたＴリンパ球細胞を本発明のイムノコンジュゲートの有効量と接触させることを含む。
本発明の別の態様は、活性化されたＢリンパ球細胞の増殖および分化を促進する方法に関し、活性化されたＢリンパ球細胞を本発明のイムノコンジュゲートの有効量と接触させることを含む。
本発明の別の態様は、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞の増殖および分化を促進する方法に関し、ＮＫ細胞を本発明のイムノコンジュゲートの有効量と接触させることを含む。
本発明の別の態様は、顆粒球、単球又は樹状細胞の増殖および分化を促進する方法に関し、顆粒球、単球又は樹状細胞を本発明のイムノコンジュゲートの有効量と接触させることを含む。
本発明の別の態様は、細胞障害性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)の分化を促進する方法に関し、Ｔリンパ球細胞を本発明のイムノコンジュゲートの有効量と接触させることを含む。
本発明の別の態様は、ウイルス複製を阻害する方法に関し、ウイルス感染している細胞を本発明のイムノコンジュゲートの有効量と接触させることを含む。
本発明の他の態様は、主要組織適合性複合体Ｉ(ＭＨＣ Ｉ)の発現を上方制御する方法に関し、標的細胞を本発明のイムノコンジュゲートの有効量と接触させることを含む。
本発明の別の態様は、細胞死を誘導する方法に関し、標的細胞を本発明のイムノコンジュゲートの有効量を投与することを含む。
本発明の別の態様は、標的細胞の走化性を誘導する方法に関し、標的細胞に本発明のイムノコンジュゲートの有効量を投与することを含む。
本発明の別の態様は、個体の疾患を治療する方法に関し、個体に本発明のイムノコンジュゲートと薬学的担体とを含む組成物の治療上有効量を投与する工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】様々なイムノコンジュゲート融合形態の概略図。図１のすべてのコンストラクトは、（抗原結合部分において）２つの抗体ｓｃＦｖ断片と、（エフェクタ部分として）それに連結される１つ又は２つのサイトカイン分子とを含む。パネルＡからＥは、抗原結合部分およびエフェクタ部分の異なる結合性およびストイキオメトリを示す。パネルＡは「ダイアボディ」−ＩＬ-２融合を表す。この「ダイアボディ」は２つの同一ポリペプチド鎖から非共有結合的に集積する。パネルＢは、サイトカインにそのカルボキシ末端で融合するＦａｂ分子の重鎖を含み、そのサイトカインが次に第二Ｆａｂ重鎖にそのカルボキシ末端で融合しているイムノコンジュゲートを示す。軽鎖は重鎖Ｆａｂ−サイトカイン−重鎖Ｆａｂポリペプチドと同時に発現され、イムノコンジュゲートを形成する。あるいは、２つの軽鎖がサイトカインに融合してもよく、重鎖が同時に発現される。パネルＣにおいて、２つのＦａｂ重鎖は互いに直接融合する。サイトカインは、アミノ末端ペプチド結合を第二抗原結合部分重鎖と共有する。パネルＤおよびＥに示すように、パネルＢおよびＣの２つの分子形態が変化して、Ｆａｂ鎖がｓｃＦｖ断片に置換される。
【図２】２つの抗原結合部分と少なくとも一又は複数のエフェクタ部分を含む更なるイムノコンジュゲートの概略図。パネルＡは、ＩｇＧ ＣＨ３ドメインにそのカルボキシ末端で融合したＦａｂ分子を示す。共有結合性抗原結合部分ホモ二量体化を達成するために、人工的なジスルフィド結合を、ＩｇＧ ＣＨ３ドメインのカルボキシ末端に導入してよい（パネルＡ内の右のイムノコンジュゲート）。パネルＡに示すＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインは、免疫グロブリンＥ ＣＨ４ドメインと置換されうる。パネルＡのＦａｂ部分は、パネルＢのｓｃＦｖ断片に置換される。パネルＣのイムノコンジュゲートでは、天然のＩｇＧヒンジは、Ｆａｂ分子に対してＣ末端融合した。ヒンジのカルボキシ末端領域がＩｇＧヒンジ領域に対してＣ末端融合する定常ドメインの集積に際していくつかの幾何学的な制約を課し得たので、人工的なリンカーはヒンジのカルボキシ終末領域とＩｇＧ ＣＨ３ドメインのアミノ末端との間に導入されてよい。パネルＤに示すように、ヒンジ領域は、また、ｓｃＦｖ断片と免疫グロブリン定常ドメインとの間に導入されてよい。パネルＡからＤでは、ＩｇＧ１ ＣＨ３又はＩｇＥ ＣＨ４ドメインを用いて、コンストラクトをホモ二量体化する。パネルＥは、ＣＨ１／Ｃκヘテロ二量体化相互作用により二量体化が達成されるイムノコンジュゲートを表す。パネルＤのイムノコンジュゲートは、イムノコンジュゲートにつき１又は２のサイトカインを有してよい。
【図３】腫瘍間質に特異的な２つの異なるインターロイキン-２イムノコンジュゲート分子形態を用いた有効性実験の結果を示す。Ｆ９奇形癌腫を、１２９ＳｖＥｖマウスに皮下注入し、カリパスを用いて腫瘍サイズを測定した。２つの異なる濃度の「ダイアボディ」−ＩＬ-２分子を、Ｆａｂ−インターロイキン-２−Ｆａｂ（Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ）イムノコンジュゲートと比較した。この濃度はおよその数のイムノコンジュゲート分子を表す。図３において、Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートは「Ｆａｂ−Ｌ１９」と表示し、コンジュゲートしていないインターロイキン２コントロールは「Ｕｎｃｏｎｊ  ｒＩＬ-２」と表示し、「ダイアボディ」−ＩＬ-２分子は「ダイアボディ」と表示する。フィブロネクチンの外ドメインＢ（ＥＤＢ）に対するＬ１９抗体を用いて、ダイアボディおよびＦａｂ−Ｌ１９イムノコンジュゲートに抗原結合部分を生成した。マウスに注入したイムノコンジュゲートの量（μｇ）は図の説明に示す。
【図４】腫瘍間質に特異的な２つの異なるインターロイキン-２イムノコンジュゲート分子形態を用いた生存実験の結果を示す。ヒト胃腫瘍細胞株ＬＳ１７４Ｔを、ＳＣＩＤ−ベージュマウスの脾臓内に注入した。図４において、Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートは「Ｆａｂ−Ｌ１９」と表示し、コンジュゲートしていないインターロイキン２コントロールは「Ｕｎｃｏｎｊ  ｒＩＬ-２」と表示し、「ダイアボディ」−ＩＬ-２分子は「ダイアボディ」と表示する。抗ＥＤＢ抗体であるＬ１９を用いて、ダイアボディおよびＦａｂ−Ｌ１９イムノコンジュゲートに抗原結合部分を生成した。マウスに注入したイムノコンジュゲートの量（μｇ）は図の説明に示し、この量は同じ数のイムノコンジュゲート分子を表す。
【図５】１００×および４００×拡大率のヒト子宮組織の免疫組織化学画像を示す。実施例３に記述される方法によって生成される２Ｂ１０可変領域は、ヒトのテネイシンのＡ２ドメイン（ＴＮＣ−Ａ２）と結合する。Ｆａｂ断片の２Ｂ１０可変領域はＦＬＡＧ断片に融合させた（ＳＨＤ２Ｂ１０−ＦＬＡＧ）。健康及び癌性のヒト子宮組織試料を、免疫組織化学的染色のために調製した。その後、試料をＳＨＤ２Ｂ１０−ＦＬＡＧ  Ｆａｂ断片と共にインキュベートした。次いで、試料を洗浄し、ＦＬＡＧエピトープに特異的な蛍光抗体と共にインキュベートした。癌性組織試料は、健康な組織試料と比較して、ＴＮＣ−Ａ２のより高い発現レベルを表した。
【図６】免疫蛍光表面積の％として、様々なヒト組織試料におけるＴＮＣ−Ａ２の発現レベルを示す。健康な個体および癌患者からの様々なヒト組織試料を、図５にて説明したように、ＳＨＤ２Ｂ１０−ＦＬＡＧ  Ｆａｂ断片と共にインキュベートした。
【図７】免疫蛍光表面積の％として、様々なヒト組織試料における線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）の発現レベルを示す。健康な個体および癌患者からの様々なヒト組織試料を、ＦＡＰ（Ａｂｃａｍ）に対する市販の抗体と共にインキュベートした。グラフ上の各々の棒の下部分はＦＡＰの腫瘍発現を表すのに対して、グラフ上の各々の棒の上部分は正常なＦＡＰ発現を表す。
【図８】公知のＩｇＧ抗体であるＬ１９のＥＤＢに対する親和性を示すＢＩＡＣＯＲＥデータを示す。
【図９】ＥＤＢに特異的なＦａｂ−ＩＬ-２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの親和性を示すＢＩＡＣＯＲＥデータを示す。イムノコンジュゲートのＦａｂ断片はＬ１９抗体から得た。
【図１０】ＥＤＢに特異的な「ダイアボディ」−ＩＬ２融合タンパク質の親和性を示すＢＩＡＣＯＲＥデータを示す。ダイアボディｓｃＦｖ断片はＬ１９抗体から得た。「ダイアボディ」−ＩＬ２融合タンパク質は、ｓｃＦｖ断片とＩＬ-２分子との間に位置する８アミノ酸リンカーを含む。
【図１１】ＥＤＢに特異的な「ダイアボディ」−ＩＬ２融合タンパク質の親和性を示すＢＩＡＣＯＲＥデータを示す。ダイアボディｓｃＦｖ断片はＬ１９抗体から得た。「ダイアボディ」−ＩＬ２融合タンパク質は、ｓｃＦｖ断片とＩＬ-２分子との間に１２アミノ酸リンカーを含む。
【図１２】固定したテネイシンのドメインＡ１（ＴＮＣ−Ａ１）に対する公知のＩｇＧ抗体であるＦ１６の親和性を示すＢＩＡＣＯＲＥデータを示す。また図１２は、ＴＮＣ−Ａ１に対するＦ１６抗体のＦａｂ断片の親和性を示すＢＩＡＣＯＲＥデータを示す。Ｆ１６  ＩｇＧおよびＦａｂ分子について算出した解離定数（ＫＤ）を図に示す。
【図１３】固定したＩＬ-２レセプターに対するＩＬ-２の親和性を示すＢＩＡＣＯＲＥデータを示す。ＩＬ-２Ｒのβおよびγ鎖のヘテロ二量体化は、Merchant, A.M. et al., Nat. Biotech. 16:677-681 (1998)に記載されるように、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分の「ノブ−イントゥ−ホール」変異体にそれぞれの鎖を融合させることによって達成した。ＢＩＡＣＯＲＥデータから算出したＫＤ値を図に示す。
【図１４】ＴＮＣ−Ａ１およびＩＬ-２レセプターに対する「ダイアボディ」−ＩＬ-２融合タンパク質の親和性を示すＢＩＡＣＯＲＥデータを示す。ダイアボディのｓｃＦｖ分子はＦ１６抗体から得られる。ＢＩＡＣＯＲＥデータから算出したＫＤ値を図に示す。
【図１５】ＴＮＣ−Ａ１およびＩＬ-２レセプターに対するＦａｂ−ＩＬ-２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの親和性を示すＢＩＡＣＯＲＥデータを示す。イムノコンジュゲートのＦａｂ分子はＦ１６抗体から得た。ＢＩＡＣＯＲＥデータから算出したＫＤ値を図に示す。
【図１６】ＴＮＣ−Ａ１およびＩＬ-２レセプターに対するｓｃＦｖ−ＩＬ-２−ｓｃＦｖイムノコンジュゲートの親和性を示すＢＩＡＣＯＲＥデータを示す。イムノコンジュゲートのｓｃＦｖ分子はＦ１６抗体から得た。ＢＩＡＣＯＲＥデータから算出したＫＤ値を図に示す。
【図１７】図１２−１６に示されるＢＩＡＣＯＲＥ研究から得られるＫＤ値の概要表である。
【図１８】フィブロネクチンのＥＤＢドメインを標的とする「ダイアボディ」−ＩＬ-２分子を、テネイシンＣのＡ２ドメインを標的とするＦａｂ−インターロイキン-２−Ｆａｂイムノコンジュゲート（配列番号：３及び７それぞれの重鎖および軽鎖の可変領域を含む「Ｆａｂ−ＳＨ２Ｂ１０」と表示する）と比較する有効性実験の結果を示す。図１８では、コンジュゲートしていないインターロイキン-２コントロールを「Ｕｎｃｏｎｊ  ｒＩＬ-２」と表示し、「ダイアボディ」−ＩＬ-２分子を「Ｌ１９ダイアボディ」と表示する。抗ＥＤＢ抗体であるＬ１９を用いて、ダイアボディイムノコンジュゲートの抗原結合部分を生成した。奇形癌腫細胞株Ｆ９を、１２９系統の免疫適格マウスの皮下に注入した。マウスに注入したイムノコンジュゲートの量（μｇ）を図の説明文に示す。６日目に治療を始め、実験１１日目までに合計５回の注入を行った。
【図１９】抗ＦＡＰ又は抗テネイシンＣ、Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲート（３Ｆ２、３Ｄ９、４Ｂ３（抗ＦＡＰ）、２Ｆ１１および２Ｂ１０コンストラクト（抗テネイシンＣ）のＶＨおよびＶＬ配列を使用して生成した）によるＮＫ−９２細胞の増殖の誘導を、コンジュゲートしていないヒトＩＬ-２と比較して示す。２日間インキュベートした後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏシステムを使用して細胞増殖を測定した。
【図２０】様々なインターロイキン−１２含有イムノコンジュゲートによるＩＦＮ−γ産生の誘導を、コンジュゲートしていないサイトカイン、又はＩＬ−１２のｐ３５およびｐ４０ドメインを別々の分子に含有するイムノコンジュゲートと比較して測定しているＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。パネルＡは、フィブロネクチンコートプレート上での結果を示す。パネルＢは、溶液での結果を示す。
【図２１】親和性成熟抗ＦＡＰ  Ｆａｂ断片の、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースの動態解析を示す。処理した動態学的データセットは、ヒト（ｈｕ）  ＦＡＰ（Ａ）およびネズミ科（ｍｕ）  ＦＡＰ（Ｂ）に結合するクローン１９Ｇ１、ｈｕＦＡＰ（Ｃ）及びｍｕＦＡＰ（Ｄ）に結合するクローン２０Ｇ８、そしてｈｕＦＡＰ（Ｅ）およびｍｕＦＡＰ（Ｆ）に結合するクローン４Ｂ９について示す。なめらかな線は、１：１相互作用モデルへのデータの広範囲フィッティングを表す。
【図２２】親和性成熟抗ＦＡＰ  Ｆａｂ断片のＳＰＲベースの動態解析を示す。処理した動態学的データセットは、ｈｕＦＡＰ（Ａ）およびｍｕＦＡＰ（Ｂ）に結合するクローン５Ｂ８、ｈｕＦＡＰ（Ｃ）及びｍｕＦＡＰ（Ｄ）に結合するクローン５Ｆ１、そしてｈｕＦＡＰ（Ｅ）およびｍｕＦＡＰ（Ｆ）に結合するクローン１４Ｂ３について示す。なめらかな線は、１：１相互作用モデルへのデータの広範囲フィッティングを表す。
【図２３】親和性成熟抗ＦＡＰ  Ｆａｂ断片のＳＰＲベースの動態解析を示す。処理した動態学的データセットは、ｈｕＦＡＰ（Ａ）およびｍｕＦＡＰ（Ｂ）に結合するクローン１６Ｆ１、ｈｕＦＡＰ（Ｃ）及びｍｕＦＡＰ（Ｄ）に結合するクローン１６Ｆ８、そしてｈｕＦＡＰ（Ｅ）およびｍｕＦＡＰ（Ｆ）に結合するクローンＯ３Ｃ９について示す。なめらかな線は、１：１相互作用モデルへのデータの広範囲フィッティングを表す。
【図２４】親和性成熟抗ＦＡＰ  Ｆａｂ断片のＳＰＲベースの動態解析を示す。処理した動態学的データセットは、ｈｕＦＡＰ（Ａ）およびｍｕＦＡＰ（Ｂ）に結合するクローンＯ２Ｄ７、ｈｕＦＡＰ（Ｃ）、ｍｕＦＡＰ（Ｄ）及びｃｙｎｏＦＡＰ（Ｅ）に結合するクローン２８Ｈ１、そしてｈｕＦＡＰ（Ｆ）、ｍｕＦＡＰ（Ｇ）及びｃｙｎｏＦＡＰ（Ｈ）に結合するクローン２２Ａ３について示す。なめらかな線は、１：１相互作用モデルへのデータの広範囲フィッティングを表す。
【図２５】親和性成熟抗ＦＡＰ  Ｆａｂ断片のＳＰＲベースの動態解析を示す。処理した動態学的データセットは、ｈｕＦＡＰ（Ａ）、ｍｕＦＡＰ（Ｂ）及びｃｙｎｏＦＡＰ（Ｃ）に結合するクローン２９Ｂ１１、及びｈｕＦＡＰ（Ｄ）、ｍｕＦＡＰ（Ｅ）及びｃｙｎｏＦＡＰ（Ｆ）に結合するクローン２３Ｃ１０について示す。なめらかな線は、１：１相互作用モデルへのデータの広範囲フィッティングを表す。
【図２６】ヒト（ｈｕ）  ＴＮＣ  Ａ２に結合する、親和性成熟抗ＴＮＣ  Ａ２  Ｆａｂ断片のＳＰＲベースの動態解析を示す。処理した動態学的データセットは、クローン２Ｂ１０＿Ｃ３Ｂ６（Ａ）、クローン２Ｂ１０＿６Ａ１２（Ｂ）、クローン２Ｂ１０＿Ｃ３Ａ６（Ｃ）、クローン２Ｂ１０＿Ｏ７Ｄ８（Ｄ）、クローン２Ｂ１０＿Ｏ１Ｆ７（Ｅ）、及びクローン２Ｂ１０＿６Ｈ１０（Ｆ）について示す。なめらかな線は、１：１相互作用モデルへのデータの広範囲フィッティングを表す。
【図２７】３Ｆ２ベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂの精製のために行われる３つの精製工程の概要を示す。
【図２８】３Ｆ２ベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ（ＡおよびＢ）の精製の結果、４Ｇ８ベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ（ＣおよびＤ）の精製の結果を示す。（Ａ、Ｃ）  精製手順中のの分画及び最終産物を含む４−１２％ビス−トリスおよび３−８％トリス  アセテートＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（Ｂ、Ｄ）  ３つの精製工程後の分析用サイズ排除クロマトグラフィ。
【図２９】２Ｂ１０  Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの精製の結果を示す。（Ａ）  精製手順中の分画および最終産物を含む４−１２％ビス-トリスＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（Ｂ）  ３つの精製工程後の分析用サイズ排除クロマトグラフィ。
【図３０】抗フィブロネクチンＥＤＢ Ｌ１９ベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂの安定性評価を示す。Ｌ１９ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂは、２０ｍＭ ヒスチジンＨＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に６．３ｍｇ／ｍｌの濃度で調製し、室温及び４℃で４週間貯蔵した。試料は、(ペレット前沈殿物質に遠心分離した後)ＵＶ分光測定により濃度(Ａ)を、分析的サイズ排除クロマトグラフィにより凝集(Ｂ)を毎週分析した。
【図３１】ヒト、ネズミ科およびカニクイザル（ｃｙｎｏ）のＦＡＰおよびヒトＩＬ-２レセプター-β／γ（ＩＬ２Ｒ  ｂｇ）に対する、ＦＡＰ標的化３Ｆ２ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの、表面プラズモン共鳴によって測定した、ＳＰＲベースの動態解析を示す。なめらかな線は、１:１相互作用モデルへのデータの広範囲フィッティングを表す。
【図３２】ヒト、ネズミ科およびカニクイザル（ｃｙｎｏ）のＦＡＰに対する、ＦＡＰ標的化４Ｇ８ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの、表面プラズモン共鳴によって測定した、ＳＰＲベースの動態解析を示す。なめらかな線は、１:１相互作用モデルへのデータの広範囲フィッティングを表す。
【図３３】ヒト及びネズミ科のＩＬ-２レセプター-β／γ及びα鎖に対する、ＦＡＰ標的化４Ｇ８ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクトの、表面プラズモン共鳴によって測定した、ＳＰＲベースの動態解析を示す。なめらかな線は、二状態反応モデル(two-state-reaction model)へのデータの広範囲フィッティングを表す。
【図３４】ヒト、ネズミ科およびカニクイザル（ｃｙｎｏ）のＦＡＰおよびヒトＩＬ-２レセプター-β／γ（ＩＬ２Ｒ ｂｇ）に対する、ＦＡＰ標的化３Ｄ９ Ｆａｂ−ＩＬ2−Ｆａｂコンストラクトの、表面プラズモン共鳴によって測定した、ＳＰＲベースの動態解析を示す。なめらかな線は、１:１相互作用モデルへのデータの広範囲フィッティングを表す。
【図３５】ヒト、ネズミ科およびカニクイザル（ｃｙｎｏ）のキメラＴＮＣ Ａ２融合タンパク質およびヒトＩＬ-２レセプター-β／γ（ＩＬ２Ｒ ｂｇ）に対する、ＴＮＣ Ａ２標的化２Ｂ１０ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクトの、表面プラズモン共鳴によって測定した、ＳＰＲベースの動態解析を示す。なめらかな線は、１:１相互作用モデルへのデータの広範囲フィッティングを表す。
【図３６】ＮＫ９２細胞の増殖を誘導する際の、ＴＮＣ Ａ２を認識する（２Ｂ１０）又はＦＡＰを認識する（３Ｆ２および４Ｇ８）標的化ＩＬ-２ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの有効性を、ＩＬ-２（プロリュウキン）およびフィブロネクチン-ＥＤＢを認識するＬ１９ダイアボディと比較して示す。ダイアボディは２つのＩＬ-２エフェクタ部分を有するのに対して、Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクトはただ１つのＩＬ-２エフェクタ部分を有するので、ｘ軸はＩＬ-２分子の数に規準化した。２日間インキュベートした後、細胞増殖をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏシステムを使用して測定した。
【図３７】溶液中での、ヒトＰＢＭＣからの（Ａ）ＣＤ５６＋ＮＫ細胞、（Ｂ）ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ１２７＋ヘルパーＴ細胞、（Ｃ）ＣＤ３＋、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞および（Ｄ）ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）を含む異なるエフェクタ細胞群上のＦＡＰを認識するＦＡＰ標的化４Ｇ８ベースのＩＬ-２ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートとインキュベートした後の、ＩＬ-２媒介性ＩＬ-２レセプターシグナル伝達の結果としての、ＳＴＡＴ５リン酸化の誘導を示す。
【図３８】イムノコンジュゲートが溶液中に存在する場合又はマイクロタイタープレート上にコートしたＦＡＰ又はＴＮＣ Ａ２により固定されている場合の、ＮＫ９２細胞のＩＦＮ−γ放出および増殖を誘導する際の、ＴＮＣ Ａ１（２Ｆ１１）、ＴＮＣ  Ａ２（２Ｂ１０）又はＦＡＰ（３Ｆ２、４Ｂ３および３Ｄ９）を認識する標的化ＩＬ-２ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの有効性を、ＩＬ-２と比較して示す。
【図３９】腫瘍間質に特異的な２つの異なるＩＬ-２イムノコンジュゲート分子形態を用いた生存実験の結果を示す。ヒト大腸腫瘍細胞株ＬＳ１７４Ｔを、ＳＣＩＤマウスの脾臓内に注入した。ＴＮＣ Ａ２標的化２Ｂ１０ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートを「ＳＨ２Ｂ１０」と表示し、コンジュゲートしていないＩＬ-２コントロールを「プロリュウキン」と表示し、フィブロネクチンＥＤＢ標的化ダイアボディ−ＩＬ-２分子を「ダイアボディ」と表示する。マウスに注入したイムノコンジュゲートの量（μｇ）は図の説明文に示し、同じ数のイムノコンジュゲート分子を表す。
【図４０】腫瘍間質に特異的な２つの異なるＩＬ-２イムノコンジュゲート分子形態を用いた生存実験の結果を示す。ヒト腎臓細胞株ＡＣＨＮをＳＣＩＤマウスの腎臓内に注入した。ＦＡＰ標的化３Ｆ２又は４Ｇ８  Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートを「ＦＡＰ３Ｆ２」および「ＦＡＰ４Ｇ８」と表示し、コンジュゲートしていないＩＬ-２コントロールを「プロリュウキン」と表示し、フィブロネクチンＥＤＢ標的化ダイアボディ−ＩＬ-２を「ダイアボディ」と表示する。マウスに注入したイムノコンジュゲートの量（μｇ）は図の説明文に示し、同じ数のイムノコンジュゲート分子を表す。
【図４１】腫瘍間質に特異的な２つの異なるＩＬ-２イムノコンジュゲート分子形態を用いた生存実験の結果を示す。ヒトＮＳＣＬＣ細胞株Ａ５４９をＳＣＩＤマウスの静脈内に注入した。ＴＮＣ Ａ２標的化２Ｂ１０ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートを「２Ｂ１０」と表示し、フィブロネクチンＥＤＢ標的化ダイアボディ−ＩＬ-２分子を「ダイアボディ」と表示する。マウスに注入したイムノコンジュゲートの量（μｇ）は図の説明文に示し、同じ数のイムノコンジュゲート分子を表す。
【図４２】ＦａｂとしてＬ１９（フイブロネクチン外部ドメイン-Ｂ結合体）を有するＦａｂ−ＧＭ−ＣＳＦ−Ｆａｂイムノコンジュゲートの精製手順の概略（Ａ）と、精製したＦａｂ−ＧＭ−ＣＳＦ−ＦａｂイムノコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元、非還元）（Ｂ）を示す。
【図４３】ＴＦ−１細胞上のＧＭ−ＣＳＦおよびＦａｂとしてＬ１９（フイブロネクチン外部ドメイン−Ｂ結合体）を有する精製したＦａｂ−ＧＭ−ＣＳＦ−Ｆａｂイムノコンジュゲートの作用を比較した、ＧＭ−ＣＳＦ依存性増殖アッセイの結果を示す。
【図４４】Ｆａｂとして４Ｇ８（ＦＡＰ結合体）を有するＦａｂ−ＩＬ１２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの精製手順の概略（Ａ）と、精製したＦａｂ−ＩＬ１２−ＦａｂイムノコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元、非還元）（Ｂ）を示す。
【図４５】健康なドナーの新鮮ヒト血液から単離したＰＢＭＣを用いて、ＩＬ−１２およびＦａｂとして４Ｇ８（ＦＡＰ結合体）を有する精製したＦａｂ−ＩＬ１２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの作用を比較して、ＩＬ−１２誘導ＩＦＮ-γ放出を試験するアッセイの結果を示す。
【図４６】ＦａｂとしてＬ１９（フイブロネクチン外部ドメイン-Ｂ結合体）を有するＦａｂ−ＩＦＮα２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの精製手順の概略（Ａ）と、精製したＦａｂ−ＩＦＮα２−ＦａｂイムノコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元、非還元）（Ｂ）を示す。
【図４７】ＩＦＮ−α（ＲｏｆｅｒｏｎＡ, Roche）およびＦａｂとしてＬ１９（フイブロネクチン外部ドメイン-Ｂ結合体）を有する精製したＦａｂ−ＩＦＮα２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの作用を比較して、（Ａ）ジャーカットＴ細胞及び（Ｂ）Ａ５４９腫瘍細胞のＩＦＮα誘導性増殖阻害を試験するアッセイの結果を示す。
【図４８】ＭＣＳＰ標的化ＭＨＬＧベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ精製の溶出プロフィル（Ａ）と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ ビス-トリス ミニゲル, Invitrogen、ＭＯＰＳランニングバッファ、還元及び非還元）による同じＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂの分析的特徴付けの結果（Ｂ）を示す。
【図４９】ＭＣＳＰ標的化ＭＨＬＧ１ベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ精製の溶出プロフィル（Ａ）と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ビス-トリス ミニゲル, Invitrogen、ＭＯＰＳランニングバッファ、還元及び非還元）による同じＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂの分析的特徴付けの結果（Ｂ）を示す。
【図５０】ＩＬ-２飢餓ＮＫ９２細胞を用いた、Ｆａｂとして４Ｇ８（ＦＡＰ結合体）を有する精製したＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートと、ＦａｂとしてＭＨＬＧ  ＫＶ９（ＭＣＳＰ結合体）を有する精製したＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの作用を比較して、ＩＬ-２誘導性ＩＦＮ−γ放出を試験するアッセイの結果を示す。
【図５１】ＩＬ-２飢餓ＮＫ９２細胞を用いた、Ｆａｂとして４Ｇ８（ＦＡＰ結合体）を有する精製したＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートと、ＦａｂとしてＭＨＬＧ１  ＫＶ９（ＭＣＳＰ結合体）を有する精製したＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの作用を比較して、ＩＬ-２誘導性ＩＦＮ−γ放出を試験するアッセイの結果を示す。
【図５２】フローサイトメトリによって定まる、Ｃｏｌｏ３８細胞へのＭＣＳＰ標的化ＭＨＬＧ１  ＫＶ９  Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの結合を示す。二次抗体のみ又は細胞のみをネガティブコントロールとした。
【図５３】Ｆａｂとして２Ｂ１０（ＴＮＣ Ａ２結合体）を有する２Ｂ１０ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの精製手順の概要（Ａ）と、精製した２Ｂ１０  Ｆａｂ−ＩＬ２−ＦａｂイムノコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元、非還元）（Ｂ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
（発明の詳細な説明）
定義
特に定めのない限り、本明細書中で使用するすべての技術的及び科学的な用語は、概して、当業者が共通して理解するものと同じ意味を有する。一般に、本明細書中で用いられる命名法や、後述する細胞培養、分子遺伝学、核酸化学およびハイブリダイゼーションの実験手順は、よく知られているものであり、当分野で共通して用いられるものである。標準的な技術および手順は、概して、本文全体にわたって示される当分野及び様々な一般的参考書の従来の方法に従って実施される(一般に、出典明記によってここに援用されるSambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照)。
【００３６】
ここで使用しているように、用語「イムノコンジュゲート」は、少なくとも一つのエフェクタ部分および少なくとも一つの抗原結合部分を含むポリペプチド分子を指す。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、少なくとも一つの単鎖エフェクタ部分および少なくとも２の抗原結合部分を含む。本願明細書において記述されるように、抗原結合分子は相互作用の、そして、様々な配位の多様によってエフェクタ部分に取り付けられてもよい。
【００３７】
ここで使用しているように、用語「エフェクタ部分」はポリペプチド、例えばタンパク質又は糖タンパク質を指す。そして、それはシグナル伝達又は他の細胞経路で細胞性活性に、例えば、影響する。したがって、本発明のエフェクタ部分は、エフェクタ部分のための一つ以上のレセプターをもつ細胞の応答を調整するために細胞膜の外側からシグナルを伝えるレセプター媒介性シグナル伝達と関係していてもよい。一実施態様では、エフェクタ部分は、エフェクタ部分のための一つ以上のレセプターをもつ細胞の細胞障害反応を誘発してもよい。他の実施態様では、エフェクタ部分は、エフェクタ部分のための一つ以上のレセプターをもつ細胞の増殖反応を誘発してもよい。他の実施態様では、エフェクタ部分は、エフェクタ部分のためのレセプターをもつ細胞の分化を誘発してもよい。他の実施態様では、エフェクタ部分は、エフェクタ部分のためのレセプターをもつ細胞の内在性細胞性タンパク質の発現(すなわち上方制御又はダウンレギュレート)を変えてもよい。エフェクタ部分の非限定的な例には、サイトカイン、増殖因子、ホルモン類、酵素、基質、補助因子を含む。エフェクタ部分は、イムノコンジュゲートを形成するために、様々な配位の抗原結合部分と関係していてもよい。
【００３８】
ここで使用しているように、用語「サイトカイン」は、生物学的であるか細胞性機能又は方法(例えば免疫、炎症および造血)を媒介および／または制御する分子を指す。本願明細書において使用する用語「サイトカイン」には、「リンホカイン」、「ケモカイン」、「モノカイン」及び「インターロイキン」が含まれる。有用なサイトカインの例には、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βが含まれるが、これに限定されるものではない。
【００３９】
ここで使用しているように、用語「単鎖」は、ペプチド結合によって線形に結合されるアミノ酸モノマを含んでなっている分子を指す。一実施態様では、エフェクタ部分は、単鎖エフェクタ部分である。単鎖エフェクタ部分の非限定的な例には、サイトカイン、増殖因子、ホルモン類、酵素、基質、補助因子が含まれる。エフェクタ部分がサイトカインであり、興味があるサイトカインが天然で多量体として通常提供されるときに、多量体のサイトカインの各サブユニットはエフェクタ部分の単鎖によって順次コードされる。したがって、有用な単鎖エフェクタ部分の非限定的な例には、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βが含まれる。
【００４０】
ここで使用しているように、用語「コントロールエフェクタ部分」は、コンジュゲートしていないエフェクタ部分を指す。例えば、本発明のＩＬ−２イムノコンジュゲートをコントロールエフェクタ部分と比較した場合、コントロールエフェクタ部分はフリーな、コンジュゲートしていないＩＬ−２である。同様に、例えば、本発明のＩＬ−１２イムノコンジュゲートをコントロールエフェクタ部分と比較した場合、コントロールエフェクタ部分はフリーな、コンジュゲートしていないＩＬ−１２（例えば、ｐ４０およびｐ３５サブユニットがジスルフィド結合（一又は複数）だけを共有するヘテロダイマタンパク質として存在する）である。
【００４１】
ここで使用しているように、用語「エフェクタ部分レセプター」は、エフェクタ部分に特異的に結合が可能なポリペプチド分子を指す。例えば、ＩＬ−２がエフェクタ部分であるとき、ＩＬ−２(例えばイムノコンジュゲートを含んでなっているＩＬ−２)と結合するエフェクタ部分レセプターはＩＬ−２レセプターである。同様に、例えば、ＩＬ-１２がイムノコンジュゲートのエフェクタ部分であるとき、エフェクタ部分レセプターはＩＬ−12レセプターである。エフェクタ部分が特異的に複数のレセプターと結合するとき、エフェクタ部分と特異的に結合するすべてのレセプターはそのエフェクタ部分のための「エフェクタ部分レセプター」である。
【００４２】
ここで使用しているように、用語「抗原結合部分」は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一実施態様では、抗原結合部分は、標的部位、例えば特定のタイプの腫瘍細胞又は抗原決定基をもつ腫瘍間質に付着される実体(例えばエフェクタ部分又は第二抗原結合部分)に向かうことが可能である。さらに本願明細書において定められるように、抗原結合部分には抗体およびその断片が含まれる。「特異的に結合する」とは、結合が抗原について選択的であり、不必要な又は非特異的相互作用と区別されうることを意味する。一実施態様では、さらに本願明細書において定められ、従来技術において知られているように、イムノコンジュゲートは定常領域を有する少なくとも１、一般的に２又はより多くの抗原結合部分を含む。有用な重鎖定常領域は、５のアイソタイプ：α, δ, ε, γ又はμを含む。有用な軽鎖定常領域は、２のアイソタイプ：κおよびλを含む。
【００４３】
ここで使用しているように、用語「抗原決定基」は「抗原」および「エピトープ」と同義で、抗原結合部分が結合するポリペプチド高分子上の部位(例えばアミノ酸の隣接する範囲又は非連続アミノ酸の異なる領域から成り立つ立体配置的配位)を指し、抗原結合部分-抗原複合体を形成する。
【００４４】
ここで使用しているように、他の抗原結合部分およびエフェクタ部分が存在しない場合、用語「コントロール抗原結合部分」は抗原結合部分を指す。例えば、本発明のＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートをコントロール抗原結合部分と比較した場合、コントロール抗原結合部分は遊離したＦａｂである。そのとき、Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートおよび遊離したＦａｂ分子両方は同じ抗原決定基と特異的に結合しうる。
ここで使用しているように、抗原結合部分、エフェクター部分などに関して用語「第一」及び「第二」は、一より多くのタイプの部分がある場合に、便宜上区別するために用いる。これらの用語の使用は、特記しない限り、イムノコンジュゲートの特別な順番又は方向を指すためのものではない。
【００４５】
当分野において使用され、および／または許容される１つの用語の２つ以上の定義が存在する場合には、本明細書で使用される用語の定義は、明白に反対のことが言及されない限り、全てのこのような意味を含むことが意図される。特定の例は、重鎖と軽鎖の両方のポリペプチドの可変領域中に見いだされる不連続抗原組み合わせ部位を説明するための用語「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）の使用である。この特定の領域は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)およびChothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)によって記載されており、これらは参照により本明細書に援用され、ここでこの定義は、互いに対して比較した場合に、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。それにも関わらず、抗体またはその改変体のＣＤＲをいうためのいずれの定義の適用も、本明細書で定義され、および使用される用語の範囲内にあることが意図される。上記に引用した参考文献の各々によって定義されたＣＤＲを含む適切なアミノ酸残基は、比較として表１において以下に記載される。特定のＣＤＲを含む正確な残基の番号は、ＣＤＲの配列およびサイズに依存して変化する。当業者は、抗体の可変領域のアミノ酸配列が与えられると、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを慣用的に決定することができる。
【００４６】
【表１】
0005764127.tif 000002
【００４７】
Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体に適用可能である可変ドメイン配列についての番号付けを定義した。当業者は、配列それ自体を超えたいかなる実験データにも頼ることなく、任意の可変ドメインに「Ｋａｂａｔ番号付け」のこのシステムを明白に割り当てることができる。本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」とは、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)によって示される番号付けシステムをいう。他に特定されない限り、本発明の抗原結合部分中の特定のアミノ酸残基の位置の番号付けはＫａｂａｔ番号付けシステムに従う。配列表の配列(すなわち、配列番号：３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９６、９７、など)は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされていない。しかしながら、配列表の配列の番号付けをカバット番号付けに置き換えることは当分野の通常の技術の範囲内である。
【００４８】
イムノコンジュゲート
イムノコンジュゲートは、少なくとも１つのエフェクタ部分と少なくとも１つの抗原結合部分を含んでなるポリペプチド分子である。一実施態様では、エフェクタ部分は単鎖エフェクタ部分である。一実施態様では、イムノコンジュゲートは少なくとも２つの抗原結合部分を含む。イムノコンジュゲートの抗原結合部分およびエフェクタ部分には、本明細書中上記および下記ならびに添付の図面において詳述するものが含まれる。イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、様々な標的分子（例えば、腫瘍細胞または腫瘍間質上で発現されるタンパク質分子上の抗原決定基）に対するものであってよい。抗原結合部分の非限定的な例を本明細書で述べる。一実施態様では、少なくとも１つの抗原結合部分は、本明細書中以下の表５に示す１つまたは複数のポリペプチドの１つの抗原決定基に対するものである。本発明のイムノコンジュゲートは、典型的には以下の特性の１つまたは複数を示す：特に同じ抗原決定基を標的とし、同じエフェクタ部分を担持する、異なる立体配置の公知のイムノコンジュゲートと比較して、作用の高い特異性、低い毒性および／または改善された安定性。
【００４９】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、少なくとも１つの第一エフェクタ部分と少なくとも１つの第一および第二抗原結合部分を含む。好ましい実施態様では、第一エフェクタ部分は単鎖エフェクタ部分である。好ましい実施態様では、第一および第二抗原結合部分は、ＦｖおよびＦａｂからなる群より独立して選択される。特定の実施態様では、第一エフェクタ部分は、第一抗原結合部分とアミノ末端またはカルボキシ末端ペプチド結合を共有しており、第二抗原結合部分は、ｉ）第一エフェクタ部分またはｉｉ）第一抗原結合部分のいずれかとアミノ末端またはカルボキシ末端ペプチド結合を共有している。別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、基本的に第一単鎖エフェクタ部分と第一および第二抗原結合部分からなる。
【００５０】
一実施態様では、第一エフェクタ部分は、第一抗原結合部分とカルボキシ末端ペプチド結合を共有しており、さらに第二抗原結合部分とアミノ末端ペプチド結合を共有している。別の実施態様では、第一抗原結合部分は、第一エフェクタ部分、好ましくは単鎖エフェクタ部分とカルボキシ末端ペプチド結合を共有しており、さらに第二抗原結合部分とアミノ末端ペプチド結合を共有している。別の実施態様では、第一抗原結合部分は、第一エフェクタ部分、好ましくは単鎖エフェクタ部分とアミノ末端ペプチド結合を共有しており、さらに第二抗原結合部分とカルボキシ末端ペプチド結合を共有している。
【００５１】
一実施態様では、エフェクタ部分、好ましくは単鎖エフェクタ部分は、第一重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有しており、さらに第二重鎖可変領域とアミノ末端ペプチド結合を共有している。別の実施態様では、エフェクタ部分、好ましくは単鎖エフェクタ部分は、第一軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有しており、さらに第二軽鎖可変領域とアミノ末端ペプチド結合を共有している。別の実施態様では、第一重鎖または軽鎖可変領域は、カルボキシ末端ペプチド結合によって第一エフェクタ部分、好ましくは単鎖エフェクタ部分に連結されており、さらにアミノ末端ペプチド結合によって第二重鎖または軽鎖可変領域に連結されている。別の実施態様では、第一重鎖または軽鎖可変領域は、アミノ末端ペプチド結合によって第一エフェクタ部分、好ましくは単鎖エフェクタ部分に連結されており、さらにカルボキシ末端ペプチド結合によって第二重鎖または軽鎖可変領域に連結されている。
【００５２】
一実施態様では、エフェクタ部分、好ましくは単鎖エフェクタ部分は、第一Ｆａｂ重鎖または軽鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有しており、さらに第二Ｆａｂ重鎖または軽鎖とアミノ末端ペプチド結合を共有している。別の実施態様では、第一Ｆａｂ重鎖または軽鎖は、第一単鎖エフェクタ部分とカルボキシ末端ペプチド結合を共有しており、さらに第二Ｆａｂ重鎖または軽鎖とアミノ末端ペプチド結合を共有している。他の実施態様では、第一Ｆａｂ重鎖または軽鎖は、第一単鎖エフェクタ部分とアミノ末端ペプチド結合を共有しており、さらに第二Ｆａｂ重鎖または軽鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有している。
【００５３】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、１つまたは複数のｓｃＦｖ分子へのアミノ末端ペプチド結合を共有している少なくとも１つの第一エフェクタ部分を含み、そしてこのとき第一エフェクタ部分は、１つまたは複数のｓｃＦｖ分子とカルボキシ末端ペプチド結合をさらに共有している。好ましい実施態様では、エフェクタ部分は単鎖エフェクタ部分である。
【００５４】
別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、少なくとも１つの第一エフェクタ部分、好ましくは単鎖エフェクタ部分と、第一および第二抗原結合部分を含んでなり、このとき各々の抗原結合部分は、ｓｃＦｖ分子を含み、そのカルボキシ末端アミノ酸が免疫グロブリン定常ドメインを含む定常領域に連結されており、そしてこのとき第一抗原結合部分は、その定常領域カルボキシ末端アミノ酸で第一エフェクタ部分のアミノ末端アミノ酸に連結されており、そしてこのとき第一および第二抗原結合部分は少なくとも１つのジスルフィド結合により共有結合されている。好ましい実施態様では、定常領域は、ＩｇＧ  ＣＨ１、ＩｇＧ  ＣＨ２、ＩｇＧ  ＣＨ３、ＩｇＧ  Ｃκ、ＩｇＧ  ＣλおよびＩｇＥ  ＣＨ４ドメインからなる群より独立して選択される。一実施態様では、第一抗原結合部分の免疫グロブリンドメインは、ジスルフィド結合により第二抗原結合部分の免疫グロブリンドメインに共有結合されている。一実施態様では、少なくとも１つのジスルフィド結合は、第一および第二抗原結合部分の免疫グロブリンドメインのカルボキシ末端に位置する。別の実施態様では、少なくとも１つのジスルフィド結合は、第一および第二抗原結合部分の免疫グロブリンドメインのアミノ末端に位置する。別の実施態様では、少なくとも２つのジスルフィド結合は、第一および第二抗原結合部分の免疫グロブリンドメインのアミノ末端に位置する。
【００５５】
特定の実施態様では、イムノコンジュゲートは、第一および第二抗原結合部分を含み、その各々がそのカルボキシ末端アミノ酸でＩｇＧ  ＣＨ１ドメインを含む定常領域に連結されたｓｃＦｖ分子を含んでおり、このとき第一抗原結合部分は、その定常領域カルボキシ末端アミノ酸で第一エフェクタ部分、好ましくは単鎖エフェクタ部分のアミノ末端アミノ酸に連結されており、そしてこのとき第一および第二抗原結合部分は少なくとも１つのジスルフィド結合により共有結合されている。イムノコンジュゲートの第二抗原結合部分は、そのカルボキシ末端アミノ酸で第二エフェクタ部分のアミノ末端アミノ酸にさらに連結されていてもよい。一実施態様では、第二エフェクタ部分は単鎖エフェクタ部分である。
【００５６】
特定の実施態様では、イムノコンジュゲートは第一および第二抗原結合部分を含み、その各々がそのカルボキシ末端アミノ酸でＩｇＧ  Ｃκドメインを含む定常領域に連結されたｓｃＦｖ分子を含んでおり、このとき第一抗原結合部分は、その定常領域カルボキシ末端アミノ酸で第一エフェクタ部分、好ましくは単鎖エフェクタ部分のアミノ末端アミノ酸に連結されており、そしてこのとき第一および第二抗原結合部分は少なくとも１つのジスルフィド結合により共有結合されている。イムノコンジュゲートの第二抗原結合部分は、そのカルボキシ末端アミノ酸で第二エフェクタ部分のアミノ末端アミノ酸にさらに連結されていてもよい。一実施態様では、第二エフェクタ部分は単鎖エフェクタ部分である。
【００５７】
別の特定の実施態様では、イムノコンジュゲートは第一および第二抗原結合部分を含み、その各々がそのカルボキシ末端アミノ酸でＩｇＥ  ＣＨ４ドメインを含む定常領域に連結されたｓｃＦｖ分子を含んでおり、このとき第一抗原結合部分は、その定常領域カルボキシ末端アミノ酸で第一エフェクタ部分、好ましくは単鎖エフェクタ部分のアミノ末端アミノ酸に連結されており、そしてこのとき第一および第二抗原結合部分は少なくとも１つのジスルフィド結合により共有結合されている。イムノコンジュゲートの第二抗原結合部分は、そのカルボキシ末端アミノ酸で第二エフェクタ部分のアミノ末端アミノ酸にさらに連結されていてもよい。一実施態様では、第二エフェクタ部分は単鎖エフェクタ部分である。
【００５８】
別の特定の実施態様では、イムノコンジュゲートは第一および第二抗原結合部分を含み、その各々がそのカルボキシ末端アミノ酸でＩｇＥ  ＣＨ３ドメインに連結されたｓｃＦｖ分子を含んでおり、このとき第一抗原結合部分は、そのカルボキシ末端アミノ酸で第一エフェクタ部分、好ましくは単鎖エフェクタ部分のアミノ末端アミノ酸に連結されており、そしてこのとき第一および第二抗原結合部分は少なくとも１つのジスルフィド結合により共有結合されている。イムノコンジュゲートの第二抗原結合部分は、そのカルボキシ末端アミノ酸で第二エフェクタ部分のアミノ末端アミノ酸にさらに連結されていてもよい。一実施態様では、第二エフェクタ部分は単鎖エフェクタ部分である。
【００５９】
別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、第一および第二エフェクタ部分ならびに第一および第二抗原結合部分を含んでなり、このとき抗原結合部分の各々は、その重鎖または軽鎖カルボキシ末端アミノ酸でＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインに連結されたＦａｂ分子を含み、そしてこのときＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインの各々は、そのそれぞれのカルボキシ末端アミノ酸でエフェクタ部分の１つに含まれるアミノ末端アミノ酸に連結されており、そしてこのとき第一および第二抗原結合部分は少なくとも１つのジスルフィド結合により共有結合されている。好ましい実施態様では、第一および／または第二エフェクタ部分は単鎖エフェクタ部分である。さらなる実施態様では、抗原結合部分のＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインはジスルフィド結合によって連結されていてもよい。別の実施態様では、少なくとも１つのジスルフィド結合は、第一および第二抗原結合部分のＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのカルボキシ末端に位置する。別の実施態様では、少なくとも１つのジスルフィド結合は、第一および第二抗原結合部分のＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのアミノ末端に位置する。別の実施態様では、少なくとも２つのジスルフィド結合は、第一および第二抗原結合部分のＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのアミノ末端に位置する。
【００６０】
別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、エフェクタ部分と抗原結合部分との間に位置する１つまたは複数のタンパク質分解切断部位を含む。イムノコンジュゲートの成分（例えば抗原結合部分および／またはエフェクタ部分）は、直接連結されていてもよくまたは本明細書で述べるもしくは当分野で公知の様々なリンカー（例えば、１つもしくは複数のアミノ酸、典型的にはおよそ２〜１０個のアミノ酸を含むペプチドリンカー）を介して連結されていてもよい。
【００６１】
特定の実施態様では、イムノコンジュゲートは、特に公知のイムノコンジュゲート製剤と比較して、溶液中で改善された安定性を有する。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、対照抗原結合部分に対するよりも少なくともおよそ２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５倍低い解離定数（ＫＤ）で抗原決定基に結合する。より特定の実施態様では、イムノコンジュゲートは、対照抗原結合部分に対するよりもおよそ１０倍低いＫＤで抗原決定基に結合する。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、およそ１０ｎＭより低い、およそ１ｎＭより低い、またはおよそ０．１ｎＭより低いＫＤで抗原決定基に結合する。
【００６２】
別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、公知のイムノコンジュゲート製剤と比較して優れた安全性プロファイルを有する。イムノコンジュゲートは、好ましくはより少なくかつより軽度の副作用、例えば毒性、非腫瘍細胞の破壊等を誘発する。副作用の低減は、エフェクタ部分レセプターに対する本発明のイムノコンジュゲートの低い結合親和性に起因すると考えられる。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、対照エフェクタ部分に対するよりも少なくともおよそ２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５倍大きいＫＤでエフェクタ部分レセプターに結合する。より特定の実施態様では、イムノコンジュゲートは、対照エフェクタ部分に対するよりもおよそ２倍大きいＫＤでエフェクタ部分レセプターに結合する。別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、対照エフェクタ部分に対するよりもおよそ１０倍大きいＫＤでエフェクタ部分レセプターに結合する。別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、「ダイアボディ」イムノコンジュゲート分子の対応するエフェクタ部分に対するよりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍大きいＫＤでエフェクタ部分レセプターに結合する。別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、「ダイアボディ」イムノコンジュゲートの対応するエフェクタ部分に対するよりもおよそ１０倍大きい解離定数ＫＤでエフェクタ部分レセプターに結合する。
【００６３】
別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、特に公知のイムノコンジュゲート製剤と比較して、優れた効果を有する。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、インビボで腫瘍体積の増加をより一層阻害することができおよび／または悪性腫瘍を有する哺乳動物の生存をより一層延長することができる。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、およそ少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０日の投与期間の終わりまでに、インビボでの腫瘍体積の増加を少なくともおよそ１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％阻害する。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、１３日の投与期間の終わりまでに、インビボでの腫瘍体積の増加を少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％阻害する。別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、対照エフェクタ部分と比較して、必要とする哺乳動物に投与されたとき、悪性腫瘍を有する哺乳動物の生存を少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％延長する。別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、対照エフェクタ部分と比較して、必要とする哺乳動物に投与されたとき、悪性腫瘍を有する哺乳動物の生存を少なくとも３０％、３２％または３５％延長する。別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、対照エフェクタ部分と比較して、必要とする哺乳動物に投与されたとき、悪性腫瘍を有する哺乳動物の生存をおよそ３０％延長する。別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、「ダイアボディ」イムノコンジュゲート分子のエフェクタ部分と比較して、必要とする哺乳動物に投与されたとき、悪性腫瘍を有する哺乳動物の生存を少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％延長する。別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、「ダイアボディ」イムノコンジュゲート分子のエフェクタ部分と比較して、必要とする哺乳動物に投与されたとき、悪性腫瘍を有する哺乳動物の生存を少なくとも３０％、３２％または３５％延長する。別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、「ダイアボディ」イムノコンジュゲート分子のエフェクタ部分と比較して、必要とする哺乳動物に投与されたとき、悪性腫瘍を有する哺乳動物の生存をおよそ３０％延長する。別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、対照エフェクタ部分または「ダイアボディ」イムノコンジュゲート分子のエフェクタ部分と比較して、悪性腫瘍を有する哺乳動物の生存をおよそ５％、１０％または１５％延長する。
【００６４】
抗原結合部分
本発明のイムノコンジュゲートの抗原結合部分は、一般に、特定の抗原決定基に結合するポリペプチド分子であり、それが付着している実体（例えばエフェクタ部分または第二抗原結合部分）を標的部位、例えば抗原決定基を担持する特定のタイプの腫瘍細胞または腫瘍間質に向かわせることができる。イムノコンジュゲートは、例えば、腫瘍細胞の表面上で、ウイルス感染細胞の表面上で、他の疾患細胞の表面上で、血清中に遊離して、および／または細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中で認められる抗原決定基に結合することができる。
【００６５】
腫瘍抗原の非限定的な例には、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびその免疫原性エピトープＣＡＰ−１およびＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）およびその免疫原性エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２およびＰＳＡ−３、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞レセプター／ＣＤ３−ζ鎖、腫瘍抗原のＭＡＧＥファミリー（例えばＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｃ４、ＭＡＧＥ−Ｃ５）、腫瘍抗原のＧＡＧＥファミリー（例えばＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−９）、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α−フェトプロテイン、Ｅカドヘリン、αカテニン、βカテニンおよびγカテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００  Ｐｍｅｌ１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、大腸腺腫症タンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇイディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド、ヒトパピローマウイルスタンパクなどのウイルス産物、腫瘍抗原のＳｍａｄファミリー、ｌｍｐ−１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶコード核抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ４０）、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１およびＣＴ−７、ならびにｃ−ｅｒｂＢ−２が含まれる。
【００６６】
ウイルス抗原の非限定的な例には、インフルエンザウイルス血球凝集素、エプスタイン−バーウイルスＬＭＰ−１、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、ＨＩＶ  ｇｐ１６０およびＨＩＶ  ｇｐ１２０が含まれる。
ＥＣＭ抗原の非限定的な例には、シンデカン、ヘパラナーゼ、インテグリン、オステオポンチン、リンク、カドヘリン、ラミニン、ラミニン型ＥＧＦ、レクチン、フィブロネクチン、ノッチ、テナシンおよびマトリキシンが含まれる。
【００６７】
本発明のイムノコンジュゲートは、細胞表面抗原の以下の特定の非限定的な例に結合することができる：ＦＡＰ、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ２（Ｔ細胞表面抗原）、ＣＤ３（ＴＣＲに関連するヘテロ多量体）、ＣＤ２２（Ｂ細胞レセプター）、ＣＤ２３（低親和性ＩｇＥレセプター）、ＣＤ２５（ＩＬ−２レセプターのα鎖）、ＣＤ３０（サイトカインレセプター）、ＣＤ３３（骨髄性細胞表面抗原）、ＣＤ４０（腫瘍壊死因子レセプター）、ＩＬ−６Ｒ（ＩＬ６レセプター）、ＣＤ２０、ＭＣＳＰおよびＰＤＧＦβＲ（β血小板由来増殖因子レセプター）。
【００６８】
一実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは２つ以上の抗原結合部分を含み、このときこれらの抗原結合部分の各々は同じ抗原決定基に特異的に結合する。別の実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは２つ以上の抗原結合部分を含み、このときこれらの抗原結合部分の各々は異なる抗原決定基に特異的に結合する。
【００６９】
抗原結合部分は、抗原決定基への特異的結合を保持する任意のタイプの抗体またはそのフラグメントであってよい。抗体フラグメントには、ＶＨフラグメント、ＶＬフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆｖフラグメント、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディおよびテトラボディが含まれるが、これらに限定されない（例えば、Ｈｕｄｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｏｕｒｉａｕ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）を参照）。
【００７０】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）に特異的な少なくとも１つ、典型的には２つ以上の抗原結合部分を含む。別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、ＥＤＢのエピトープへの結合についてモノクローナル抗体Ｌ１９と競合することができる少なくとも１つ、典型的には２つ以上の抗原結合部分を含む。例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ２００７／１２８５６３  Ａ１号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照。さらに別の実施態様では、イムノコンジュゲートはポリペプチド配列を含み、このときＬ１９モノクローナル抗体に由来する第一Ｆａｂ重鎖がＩＬ−２分子とカルボキシ末端ペプチド結合を共有しており、このＩＬ−２分子は、順番にＬ１９モノクローナル抗体に由来する第二Ｆａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する。さらに別の実施態様では、イムノコンジュゲートはポリペプチド配列を含み、このときＬ１９モノクローナル抗体に由来する第一Ｆａｂ重鎖がＩＬ−１２分子とカルボキシ末端ペプチド結合を共有しており、このＩＬ−１２分子は、順番にＬ１９モノクローナル抗体に由来する第二Ｆａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する。さらに別の実施態様では、イムノコンジュゲートはポリペプチド配列を含み、このときＬ１９モノクローナル抗体に由来する第一Ｆａｂ重鎖がＩＦＮα分子とカルボキシ末端ペプチド結合を共有しており、このＩＦＮα分子が、順番にＬ１９モノクローナル抗体に由来する第二Ｆａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する。さらに別の実施態様では、イムノコンジュゲートはポリペプチド配列を含み、このときＬ１９モノクローナル抗体に由来する第一Ｆａｂ重鎖がＧＭ−ＣＳＦ分子とカルボキシ末端ペプチド結合を共有しており、このＧＭ−ＣＳＦ分子が、順番にＬ１９モノクローナル抗体に由来する第二Ｆａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する。さらなる実施態様では、イムノコンジュゲートはポリペプチド配列を含み、このときＬ１９モノクローナル抗体に由来する第一ｓｃＦｖがＩＬ−２分子とカルボキシ末端ペプチド結合を共有しており、このＩＬ−２分子が、順番にＬ１９モノクローナル抗体に由来する第二ｓｃＦｖとカルボキシ末端ペプチド結合を共有する。より特定の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：９５のポリペプチド配列または機能性を保持するその変異体を含む。別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、Ｌ１９モノクローナル抗体に由来するＦａｂ軽鎖を含む。より特定の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：９６または機能性を保持するその変異体と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチド配列を含む。さらに別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：９５および配列番号：９６または機能性を保持するその変異体と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である２つのポリペプチド配列を含む。より特定の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１０４または機能性を保持するその変異体と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチド配列を含む。さらに別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１０４および配列番号：９６または機能性を保持するその変異体と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である２つのポリペプチド配列を含む。より特定の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１０５または機能性を保持するその変異体と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチド配列を含む。さらに別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１０５および配列番号：９６または機能性を保持するその変異体と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である２つのポリペプチド配列を含む。より特定の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１０６または機能性を保持するその変異体と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチド配列を含む。さらに別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１０６および配列番号：９６または機能性を保持するその変異体と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である２つのポリペプチド配列を含む。より特定の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１０７または機能性を保持するその変異体と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチド配列を含む。さらに別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１０７および配列番号：９６または機能性を保持するその変異体と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチド配列を含む。別の特定の実施態様では、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合により、共有結合されている。
【００７１】
一実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、テネイシン(ＴＮＣ-Ａ１)のＡ１ドメインに特異的である少なくとも１、一般的に２以上の抗原結合部分を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、ＴＮＣ−Ａ１のエピトープへの結合についてモノクローナル抗体Ｆ１６と競合しうる、少なくとも１、一般的に２以上の抗原結合部分を含む。国際出願公報２００７／１２８５６３Ａ１（本願明細書全体にに引用したものとする）参照。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、テネイシン（ＴＮＣ−Ａ１又はＴＮＣ−Ａ４又はＴＮＣ−Ａ１／Ａ４）のＡ１及び／又はＡ４ドメインに特異的である少なくとも１、一般的に２以上の抗原結合部分を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、テネイシンのＡ１ドメインに特異的な第一Ｆａｂ重鎖がカルボキシ終末ペプチド結合をＩＬ−２分子、ＩＬ−１２分子、ＩＦＮα分子又はＧＭ−ＣＳＦ分子と共有し、次にカルボキシ終末ペプチド結合をテネイシンのＡ１ドメインに特異的な第二Ｆａｂ重鎖と共有する、ポリペプチド配列を含む。さらに他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、テネイシンのＡ１ドメインに特異的な第一Ｆａｂ重鎖がカルボキシ終末ペプチド結合をＩＬ−１２分子と共有し、次にカルボキシ終末ペプチド結合をテネイシンのＡ１ドメインに特異的な第二Ｆａｂ重鎖と共有する、ポリペプチド配列を含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートは、テネイシンのＡ１ドメインに特異的な第一ｓｃＦｖがカルボキシ終末ペプチド結合をＩＬ−２分子と共有し、次にカルボキシ終末ペプチド結合をテネイシンのＡ１ドメインに特異的な第二ｓｃＦｖと共有する、ポリペプチド配列を含む。特定の実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：１３又は配列番号：１５と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域、又は機能性を保持するその改変体を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：９又は配列番号：１１と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域、又は機能性を保持するその改変体を含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：１３又は配列番号：１５と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域、又は機能性を保持するその改変体と、配列番号：９又は配列番号：１１と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域、又は機能性を保持するその改変体とを含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の重鎖可変領域配列は、配列番号：１４又は配列番号：１６と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。他の実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分重鎖可変領域配列は、配列番号：１４又は配列番号：１６のポリヌクレオチド配列によってコー���される。一実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の軽鎖可変領域配列は、配列番号：１０又は配列番号：１２と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。他の実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分軽鎖可変領域配列は、配列番号：１０又は配列番号：１２のポリヌクレオチド配列によってコードされる。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：９９と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列、又は機能性を保持するその改変体を含む。他の実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：１００又は配列番号：２１５と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するその改変体を含む。他の実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：１０１又は配列番号：２３５と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するその改変体を含む。さらなる実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：１００及び配列番号：１０１と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である２つのポリペプチド配列、又は機能性を保持するそれら改変体を含む。他の実施態様において、本願発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２１５及び配列番号：２３５と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である２つのポリペプチド配列、又は機能性を保持するその改変体を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１２と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１２のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１３又は配列番号：２１６と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１３又は配列番号：２１６のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１４又は配列番号：２３６と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：１１４又は配列番号：２３６のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。
【００７２】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、テネイシンのＡ2ドメイン(ＴＮＣ-Ａ2)に特異的な少なくとも１、一般的に２以上の抗原結合部分を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートはテネイシンのＡ2ドメインに特異的な第一Ｆａｂ重鎖がカルボキシ終末ペプチド結合をＩＬ−２分子、ＩＬ−12分子、ＩＦＮα分子又はＧＭ−ＣＳＦ分子と共有し、次にカルボキシ終末ペプチド結合をテネイシンのＡ2ドメインに特異的な第二Ｆａｂ重鎖と共有する、ポリペプチド配列を含む。さらに他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、テネイシンのＡ2ドメインに特異的な第一Ｆａｂ重鎖がカルボキシ終末ペプチド結合をＩＬ−２分子と共有し、次にカルボキシ終末ペプチド結合をテネイシンのＡ2ドメインに特異的な第二Ｆａｂ重鎖と共有する、ポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：７、配列番号：１７９、配列番号：１８３、配列番号：１８７、配列番号：１９１、配列番号：１９５、配列番号：１９９、配列番号：２０３および配列番号：２０７の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその改変体を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７７、配列番号：１８１、配列番号：１８５、配列番号：１８９、配列番号：１９３、配列番号：１９７、配列番号：２０１および配列番号：２０５の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその改変体を含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：７、配列番号：１７９、配列番号：１８３、配列番号：１８７、配列番号：１９１、配列番号：１９５、配列番号：１９９、配列番号：２０３および配列番号：２０７の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその改変体と、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：１７７、配列番号：１８１、配列番号：１８５、配列番号：１８９、配列番号：１９３、配列番号：１９７、配列番号：２０１および配列番号：２０５の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその改変体とを含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の重鎖可変領域配列は、配列番号：８、配列番号：１８０、配列番号：１８４、配列番号：１８８、配列番号：１９２、配列番号：１９６、配列番号：２００、配列番号：２０４および配列番号：２０８の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。他の実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分重鎖可変領域配列は、配列番号：��、配列番号：１８０、配列番号：１８４、配列番号：１８８、配列番号：１９２、配列番号：１９６、配列番号：２００、配列番号：２０４および配列番号：２０８の群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされる。一実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の軽鎖可変領域配列は、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：１７８、配列番号：１８２、配列番号：１８６、配列番号：１９０、配列番号：１９４、配列番号：１９８、配列番号：２０２および配列番号：２０６の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。他の実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の軽鎖可変領域配列は、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：１７８、配列番号：１８２、配列番号：１８６、配列番号：１９０、配列番号：１９４、配列番号：１９８、配列番号：２０２および配列番号：２０６の群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされる。一実施態様では、本願発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２３９、配列番号：２４１および配列番号：２４３の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するその改変体を含む。他の実施態様では、本願発明のコンジュゲートは、配列番号：２４５、配列番号：２４７および配列番号：２４９の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するその改変体を含む。さらなる実施態様において、本願発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２３９、配列番号：２４１および配列番号：２４３の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するその改変体と、配列番号：２４５、配列番号：２４７および配列番号：２４９の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するその改変体とを含む。他の実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２４１と配列番号：２４５又は配列番号：２４７と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である２つのポリペプチド配列、又は機能性を保持するその改変体を含む。他の実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２４３と配列番号：２４５と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である２つのポリペプチド配列、又は機能性を保持するその改変体を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２４０、配列番号：２４２および配列番号：２４４の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９��％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２４０、配列番号：２４２および配列番号：２４４の群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２４６、配列番号：２４８および配列番号：２５０の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２４６、配列番号：２４８および配列番号：２５０の群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。
【００７３】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、線維芽細胞活性化タンパク質(ＦＡＰ)に特異的な少なくとも１、一般的に２以上の抗原結合部分を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、ＦＡＰに特異的な第一Ｆａｂ重鎖がカルボキシ終末ペプチド結合をＩＬ−２分子、ＩＬ−１２分子、ＩＦＮα分子又はＧＭ−ＣＳＦ分子と共有し、次にカルボキシ終末ペプチド結合をＦＡＰに特異的な第二Ｆａｂ重鎖と共有する、ポリペプチド配列を含む。さらに他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、ＦＡＰに特異的な第一Ｆａｂ重鎖がカルボキシ終末ペプチド結合をＩＬ−２分子と共有し、次にカルボキシ終末ペプチド結合をＦＡＰに特異的な第二Ｆａｂ重鎖と共有する、ポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：２１、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：３１、配列番号：３５、配列番号：３９、配列番号：４３、配列番号：４７、配列番号：５１、配列番号：６９、配列番号：７３、配列番号：７７、配列番号：８１、配列番号：８５、配列番号：８９、配列番号：９３、配列番号：１２３、配列番号：１２７、配列番号：１３１、配列番号：１３５、配列番号：１３９、配列番号：１４３、配列番号：１４７、配列番号：１５１、配列番号：１５５、配列番号：１５９、配列番号：１６３、配列番号：１６７、配列番号：１７１および配列番号：１７５からなる群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその改変体を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２３、配列番号：２９、配列番号：３３、配列番号：３７、配列番号：４１、配列番号：４５、配列番号：４９、配列番号：６７、配列番号：７１、配列番号：７５、配列番号：７９、配列番号：８３、配列番号：８７、配列番号：９１、配列番号：１２１、配列番号：１２５、配列番号：１２９、配列番号：１３３、配列番号：１３７、配列番号：１４１、配列番号：１４５、配列番号：１４９、配列番号：１５３、配列番号：１５７、配列番号：１６１、配列番号：１６５、配列番号：１６９および配列番号：１７３からなる群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその改変体を含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：２１、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：３１、配列番号：３５、配列番号：３９、配列番号：４３、配列番号：４７、配列番号：５１、配列番号：６９、配列番号：７３、配列番号：７７、配列番号：８１、配列番号：８５、配列番号：８９、配列番号：９３、配列番号：１２３、配列番号：１２７、配列番号：１３１、配列番号：１３５、配列番号：１３９、配列番号：１４３、配列番号：１４７、配列番号：１５１、配列番号：１５５、配列番号：１５９、配列番号：１６３、配列番号：１６７、配列番号：１７１および配列番号：１７５からなる群から選��される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその改変体と、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２３、配列番号：２９、配列番号：３３、配列番号：３７、配列番号：４１、配列番号：４５、配列番号：４９、配列番号：６７、配列番号：７１、配列番号：７５、配列番号：７９、配列番号：８３、配列番号：８７、配列番号：９１、配列番号：１２１、配列番号：１２５、配列番号：１２９、配列番号：１３３、配列番号：１３７、配列番号：１４１、配列番号：１４５、配列番号：１４９、配列番号：１５３、配列番号：１５７、配列番号：１６１、配列番号：１６５、配列番号：１６９および配列番号：１７３からなる群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその改変体とを含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の重鎖可変領域配列は、配列番号：２２、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３２、配列番号：３６、配列番号：４０、配列番号：４４、配列番号：４８、配列番号：５２、配列番号：７０、配列番号：７４、配列番号：７８、配列番号：８２、配列番号：８６、配列番号：９０、配列番号：９４、配列番号：１２４、配列番号：１２８、配列番号：１３２、配列番号：１３６、配列番号：１４０、配列番号：１４４、配列番号：１４８、配列番号：１５２、配列番号：１５６、配列番号：１６０、配列番号：１６４、配列番号：１６８、配列番号：１７２および配列番号：１７６からなる群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。他の実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の重鎖可変領域配列は、配列番号：２２、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３２、配列番号：３６、配列番号：４０、配列番号：４４、配列番号：４８、配列番号：５２、配列番号：７０、配列番号：７４、配列番号：７８、配列番号：８２、配列番号：８６、配列番号：９０、配列番号：９４、配列番号：１２４、配列番号：１２８、配列番号：１３２、配列番号：１３６、配列番号：１４０、配列番号：１４４、配列番号：１４８、配列番号：１５２、配列番号：１５６、配列番号：１６０、配列番号：１６４、配列番号：１６８、配列番号：１７２および配列番号：１７６からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされる。一実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の軽鎖可変領域配列は、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２４、配列番号：３０、配列番号：３４、配列番号：３８、配列番号：４２、配列番号：４６、配列番号：５０、配列番号：６８、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：８０、配列番号：８４、配列番号：８８、配列番号：９２、配列番号：１２２、配列番号：１２６、配列番号：１３０、配列番号：１３４、配列番号：１３８、配列番号：１４２、配列番号：１４６、配列番号：１５０、配列��号：１５４、配列番号：１５８、配列番号：１６２、配列番号：１６６、配列番号：１７０および配列番号：１７４からなる群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。他の実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の軽鎖可変領域配列は、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２４、配列番号：３０、配列番号：３４、配列番号：３８、配列番号：４２、配列番号：４６、配列番号：５０、配列番号：６８、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：８０、配列番号：８４、配列番号：８８、配列番号：９２、配列番号：１２２、配列番号：１２６、配列番号：１３０、配列番号：１３４、配列番号：１３８、配列番号：１４２、配列番号：１４６、配列番号：１５０、配列番号：１５４、配列番号：１５８、配列番号：１６２、配列番号：１６６、配列番号：１７０および配列番号：１７４からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされる。一実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２０９、配列番号：２１１、配列番号：２１３、配列番号：２１７、配列番号：２１９、配列番号：２２１、配列番号：２２３、配列番号：２２５および配列番号：２２７の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するその改変体を含む。他の実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２２９、配列番号：２３１、配列番号：２３３および配列番号：２３７の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するその改変体を含む。さらなる実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２１１、配列番号：２１９および配列番号：２２１の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するその改変体と、配列番号：２３１の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するその改変体とを含む。さらなる実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２０９、配列番号：２２３、配列番号：２２５および配列番号：２２７の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するその改変体と、配列番号：２２９の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するその改変体とを含む。さらなる実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２１３及び配列番号：２３３と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９��％、９８％、９９％又は１００％同一である２つのポリペプチド配列、又は機能性を保持するそれら改変体を含む。さらなる実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２１７及び配列番号：２３７と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である２つのポリペプチド配列、又は機能性を保持するそれら改変体を含む。他の実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２２１及び配列番号：２３１と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である２つのポリペプチド配列、又は機能性を保持するそれら改変体を含む。他の実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２２３及び配列番号：２２９と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である２つのポリペプチド配列、又は機能性を保持するそれら改変体を含む。他の実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２２５及び配列番号：２２９と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である２つのポリペプチド配列、又は機能性を保持するそれら改変体を含む。他の実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２２７及び配列番号：２２９と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である２つのポリペプチド配列、又は機能性を保持するそれら改変体を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２１０、配列番号：２１２、配列番号：２１４、配列番号：２１８、配列番号：２２０、配列番号：２２２、配列番号：２２４、配列番号：２２６および配列番号：２２８の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲ
ートは、配列番号：２１０、配列番号：２１２、配列番号：２１４、配列番号：２１８、配列番号：２２０、配列番号：２２２、配列番号：２２４、配列番号：２２６および配列番号：２２８の群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２３０、配列番号：２３２、配列番号：２３４および配列番号：２３８の群から選択される配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２３０、配列番号：２３２、配列番号：２３４および配列番号：２３８の群から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。
【００７４】
一実施態様では、イムノコンジュゲートは、メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(ＭＣＳＰ)に特異的な少なくとも１、一般的に２以上の抗原結合部分を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、ＭＣＳＰに特異的な第一Ｆａｂ重鎖がカルボキシ終末ペプチド結合をＩＬ−２分子、ＩＬ−１２分子、ＩＦＮα分子又はＧＭ−ＣＳＦ分子と共有し、次にカルボキシ終末ペプチド結合をＭＣＳＰに特異的な第二Ｆａｂ重鎖と共有する、ポリペプチド配列を含む。さらに他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、ＭＣＳＰに特異的な第一Ｆａｂ重鎖がカルボキシ終末ペプチド結合をＩＬ−２分子と共有し、次にカルボキシ終末ペプチド結合をＭＣＳＰに特異的な第二Ｆａｂ重鎖と共有する、ポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：２５７又は配列番号：２６１の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその改変体を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：２５９又は配列番号：２７１の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその改変体を含む。さらなる実施態様において、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：２５７又は配列番号：２６１の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその改変体と、配列番号：２５９又は配列番号：２７１の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその改変体とを含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：２５７の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号：２５９の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分は、配列番号：２６１の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列と、配列番号：２５９の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列とを含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の重鎖可変領域配列は、配列番号：２５８又は配列番号：２６２の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５８又は配列番号：２６２のポリヌクレオチド配列によってコードされる。一実施態様では、イムノ��ンジュゲートの抗原結合部分の軽鎖可変領域配列は、配列番号：２６０又は配列番号：２７２の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。他の実施態様では、イムノコンジュゲートの抗原結合部分の軽鎖可変領域配列は、配列番号：２６０又は配列番号：２７２のポリヌクレオチド配列によってコードされる。一実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２５１又は配列番号：２５５と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するその改変体を含む。他の実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２５３又は配列番号：２６５と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するその改変体を含む。さらなる実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２５１又は配列番号：２５５と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するその改変体と、配列番号：２５３又は配列番号：２６５と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するその改変体とを含む。他の実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２５１と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するその改変体と、配列番号：２５３と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するその改変体とを含む。他の実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートは、配列番号：２５５と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するその改変体と、配列番号：２５３と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリペプチド配列、又は機能性を保持するその改変体とを含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５２又は配列番号：２５６の配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５２又は配列番号：２５６のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。一実施態様では、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５４又は配列番号：２６６と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。他の実施態様で��、イムノコンジュゲートは、配列番号：２５４又は配列番号：２６６のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。
【００７５】
一実施態様では、抗原結合部分は、抗原決定基に結合することができる少なくとも１つの可変領域を含む。本発明において有用な非限定的可変領域は、マウス、霊長類またはヒト起源のものであってよい。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体に由来してよい。ヒトモノクローナル抗体の作製のためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１−３００５（１９８４）およびＢｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）によって記述されている。ヒト可変領域はまた、免疫化後、内因性免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体のレパートリーを生産することができるトランスジェニック動物（例えばマウス）によって作製してもよい。例えば、キメラおよび生殖細胞系突然変異体マウスにおける抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記述されている。そのような生殖細胞系突然変異体マウスへのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原投与後ヒト抗体の産生を生じさせる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）を参照。
【００７６】
あるいは、ファージディスプレイを用いて、例えば免疫化していないドナーからの、免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからインビトロでヒト抗体およびヒト可変領域を作製することができる（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０））。この技術の一例では、抗体Ｖドメイン遺伝子をＭ１３またはｆｄなどの糸状バクテリオファージの主要なまたは重要でないコートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングし、機能的抗体フラグメントとしてファージ粒子の表面に提示させる。
糸状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するので、抗体／抗体フラグメントの機能的特性に基づく選択も、それらの特性を示す抗体／抗体フラグメントをコードする遺伝子の選択をもたらす。したがって、ファージはＢ細胞の特性の一部を模倣する。ファージディスプレイは様々な形式で実施することができる。ファージディスプレイ形式の総説については、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７（１９９１）を参照。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源をファージディスプレイのために使用することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎらは、免疫化マウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリから抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照。免疫化していないヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、抗原（自己抗原を含む）の多様なアレイに対する抗体を、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記述された技術に基本的に従って単離することができる。天然の免疫応答では、抗体遺伝子は高い割合で突然変異を蓄積する（体細胞超突然変異）。導入された変化の一部はより高い親和性を与え、高親和性の表面免疫グロブリンを提示するＢ細胞が、その後の抗原投与の間に選択的に複製され、分化される。この天然の過程は、「チェーンシャッフリング」として知られる技術を用いることによって模倣することができる。Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．１０：７７９−７８３（１９９２）を参照。この方法では、ファージディスプレイによって得られる「一次」ヒト抗体または可変領域の親和性を、重鎖および軽鎖Ｖ領域遺伝子を免疫化していないドナーから得られたＶドメイン遺伝子の天然に生じる変異体のレパートリー（レパートリー）で連続的に置き換えることによって改善することができる。この技術は、ｎＭ範囲の親和性を有する抗体および可変領域の作製を可能にする。非常に大きなファージ抗体レパートリーを作製するための方法は、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６（１９９３）に記述されており、そのような大きなファージライブラリからの高親和性ヒト抗体の直接の単離は、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．１２０：８８５−８９６（１９９３）に報告されている。遺伝子シャッフリングはまた、げっ歯動物抗体からヒト抗体および可変領域を誘導するために使用することもでき、この場合ヒト抗体または可変領域は、出発げっ歯動物抗体または可変領域と類似の親和性および特異性を有する。「エピトープインプリンティング」とも称されるこの方法によれば、ファージディスプレイ技術によって得られたげっ歯動物抗体の重鎖または軽鎖Ｖドメイン遺伝子をヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置き換えて、げっ歯動物−ヒトのキメラを創製する。抗原での選択により、機能的抗原結合部位を回復することができるヒト可変領域の単離がもたらされる、すなわちエピトープがパートナーの選択を支配（インプ���ント）する。この工程を反復して残りのげっ歯動物Ｖドメインを置き換えたとき、ヒト抗体が得られる（ＰＣＴ公報ＷＯ９３／０６２１３号を参照）。げっ歯動物抗体の伝統的なヒト化とは異なり、エピトープインプリンティング技術は、げっ歯動物起源のフレームワークまたはＣＤＲ残基を全く有さない完全なヒト抗体または可変領域を提供する。
使用できる可変領域はまた、霊長類化もしくはヒト化されているマウス可変領域配列またはヒト化されている霊長類可変領域配列を含む。本明細書で使用される「ヒト化」という用語は非ヒト抗体、例えばマウス抗体に由来する抗原結合部分可変領域を指し、その非ヒト抗体は親分子の抗原結合特性を保持するまたは実質的に保持するが、ヒトにおいてより低い免疫原性を示す。これは、（ａ）重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性または抗体機能を保持するために重要なもの）を保持しつつまたは保持せずに、非ヒトＣＤＲだけをヒトフレームワーク領域に移植することおよび（ｂ）非ヒト可変領域を表面残基の置換によってヒト様部分で「覆うこと（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」を含む様々な方法によって達成しうる。そのような方法は、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．，２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．，３１（３）：１６９−２１７（１９９４）によって開示されており、これらはすべて、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。抗体の重鎖および軽鎖可変領域の各々には、一般に３つの相補性決定領域またはＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）が存在し、これらは、抗体の重鎖および軽鎖可変ドメインの各々において４つのフレームワークサブ領域（すなわちＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）によって隣接されている：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。ヒト化可変領域を有する抗体の考察は、中でも特に、米国特許第６，６３２，９２７号および米国特許出願公開第２００３／０１７５２６９号に見出すことができ、これらはどちらも、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７７】
同様に、本明細書で使用される「霊長類化」という用語は非霊長類抗体、例えばマウス抗体に由来する抗原結合部分可変領域を指し、その非霊長類抗体は親分子の抗原結合特性を保持するまたは実質的に保持するが、霊長類においてより低い免疫原性を示す。
ヒト化抗原結合部分を作製する際に、重鎖および軽鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減するために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法によれば、げっ歯動物抗原結合部分の可変領域の配列を公知のヒト可変領域配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に、げっ歯動物の配列に最も近いヒト配列をヒト化抗原結合部分のためのヒトフレームワーク領域（ＦＲ）として受け入れる（Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７））。ヒトフレームワーク配列を選択する別の方法は、完全なげっ歯動物フレームワークの各個々のサブ領域（すなわちＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）または個々のサブ領域の何らかの組合せ（例えばＦＲ１とＦＲ２）の配列を、そのフレームワークサブ領域に対応する公知のヒト可変領域配列のライブラリ（例えばＫａｂａｔ番号付けによって決定される）に対して比較し、げっ歯動物の配列と最も近い各々のサブ領域または組合せについてのヒト配列を選択することである（米国特許出願公開第２００３／００４０６０６Ａ１号）。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗原結合部分のために使用してもよい（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３））。
一般に、本発明のイムノコンジュゲートの抗原結合部分は、特定の抗原決定基に対する高い親和性および他の有益な生物学的特性を保持する。したがって、ヒト化可変領域は、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用して親配列および様々な概念上のヒト化生成物を解析することによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは市販されており、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン可変領域配列の推定三次元立体配座構造を例示し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の精査により、候補免疫グロブリン可変領域配列の機能における残基の考えられる役割の分析、すなわち候補可変領域配列がその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このようにして、標的抗原に対する親和性増大などの所望抗原結合部分特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント配列およびインポート配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、超可変領域残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに直接かつ最も実質的に関与する。
別の実施態様では、本発明の抗原結合分子を、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号に開示されている方法に従って増強された結合親和性を有するように操作する。エフェクタ部分レセプターまたは特定の抗原決定基のいずれかに結合する本発明のイムノコンジュゲートの能力は、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）または当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｔ１００システムで解析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ．Ｊ．１７：３２３−３２９（２０００））および伝統的な結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｒ．Ｐ．，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｓ．２８：２１７−２２９（２００２））のいずれかによって測定することができる。
【００７８】
エフェクタ部分
本発明において使用するためのエフェクタ部分は、一般に、例えばシグナル伝達経路を介して、細胞活性に影響を及ぼすポリペプチドである。したがって、本発明のイムノコンジュゲートのエフェクタ部分は、細胞膜の外側からの応答を調節するシグナルを細胞内に伝達するレセプター媒介性シグナル伝達に関連してもよい。例えば、イムノコンジュゲートのエフェクタ部分はサイトカインであってよい。特定の実施態様では、エフェクタ部分は本明細書で定義される単鎖エフェクタ部分である。一実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートの１つまたは複数のエフェクタ部分、典型的には単鎖エフェクタ部分は、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−αおよびＩＬ−１２からなる群より選択されるサイトカインである。別の実施態様では、イムノコンジュゲートの１つまたは複数の単鎖エフェクタ部分は、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＴＧＦ−βからなる群より選択されるサイトカインである。
一実施態様では、イムノコンジュゲートのエフェクタ部分、好ましくは単鎖エフェクタ部分はＩＬ−２である。特定の実施態様では、ＩＬ−２エフェクタ部分は、以下からなる群より選択される細胞応答の１つまたは複数を誘発することができる：活性化Ｔリンパ球の増殖、活性化Ｔリンパ球の分化、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）活性、活性化Ｂ細胞の増殖、活性化Ｂ細胞の分化、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖、ＮＫ細胞の分化、およびＮＫ／リンパ球活性化キラー（ＬＡＫ）抗腫瘍細胞毒性。一実施態様では、イムノコンジュゲートのエフェクタ部分、好ましくは単鎖エフェクタ部分はＧＭ−ＣＳＦである。特定の実施態様では、ＧＭ−ＣＳＦエフェクタ部分は、顆粒球、単球または樹状細胞の増殖および／または分化を誘発することができる。一実施態様では、イムノコンジュゲートのエフェクタ部分、好ましくは単鎖エフェクタ部分はＩＦＮ−αである。特定の実施態様では、ＩＦＮ−αエフェクタ部分は、以下からなる群より選択される細胞応答の１つまたは複数を誘発することができる：ウイルス感染細胞におけるウイルス複製の阻害および主要組織適合遺伝子複合体Ｉ（ＭＨＣ  Ｉ）の発現の上方調節。別の特定の実施態様では、ＩＦＮ−αエフェクタ部分は腫瘍細胞の増殖を阻害することができる。一実施態様では、イムノコンジュゲートのエフェクタ部分、好ましくは単鎖エフェクタ部分はＩＬ−１２である。特定の実施態様では、ＩＬ−１２エフェクタ部分は、以下からなる群より選択される細胞応答の１つまたは複数を誘発することができる：ＮＫ細胞の増殖、ＮＫ細胞の分化、Ｔ細胞の増殖およびＴ細胞の分化。一実施態様では、イムノコンジュゲートのエフェクタ部分、好ましくは単鎖エフェクタ部分はＩＬ−８である。特定の実施態様では、ＩＬ−８エフェクタ部分は、好中球の走化性を誘発することができる。一実施態様では、イムノコンジュゲートのエフェクタ部分、好ましくは単鎖エフェクタ部分はＭＩＰ−１αである。特定の実施態様では、ＭＩＰ−１αエフェクタ部分は、単球およびＴリンパ球の走化性を誘発することができる。一実施態様では、イムノコンジュゲートのエフェクタ部分、好ましくは単鎖エフェクタ部分はＭＩＰ−１βである。特定の実施態様では、ＭＩＰ−１βエフェクタ部分は、単球およびＴリンパ球の走化性を誘発することができる。一実施態様では、イムノコンジュゲートのエフェクタ部分、好ましくは単鎖エフェクタ部分はＴＧＦ−βである。特定の実施態様では、ＴＧＦ−βエフェクタ部分は、以下からなる群より選択される細胞応答の１つまたは複数を誘発することができる：単球の走化性、マクロファージの走化性、活性化マクロファージにおけるＩＬ−１の発現の上方調節および活性化Ｂ細胞におけるＩｇＡの発現の上方調節。
【００７９】
イムノコンジュゲートポリペプチドおよびポリヌクレオチド
本発明のイムノコンジュゲートは、ポリペプチドおよびそのフラグメントを含んでなる。本明細書で使用される、「ポリペプチド」という用語は、単一の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を包含することが意図されており、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直鎖状に連結された単量体（アミノ酸）からなる分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の１つまたは複数の鎖を指し、生成物の特定の長さを意味しない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２以上のアミノ酸の１つもしくは複数の鎖を指すために使用される任意の他の用語は「ポリペプチド」の定義に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりにまたはこれらの用語のいずれかと交換可能に使用されてよい。「ポリペプチド」という用語はまた、限定されることなく、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、または非天然に生じるアミノ酸による修飾を含む、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことも意図されている。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来してもよくまたは組換え技術によって生産されてもよいが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるとは限らない。ポリペプチドは、化学合成による方法を含む、任意の方法で生成されてよい。
本発明のポリペプチドは、およそ３つ以上、５つ以上、１０個以上、２０個以上、２５個以上、５０個以上、７５個以上、１００個以上、２００個以上、５００個以上、１，０００個以上、または２，０００個以上のアミノ酸の大きさであってよい。ポリペプチドは、定義された三次元構造を有しうるが、必ずしもそのような構造を有するとは限らない。定義された三次元構造を有するポリペプチドは、折りたたまれていると称され、定義された三次元構造を有さないが、むしろ多くの異なる立体配座を取ることができるポリペプチドは、ほどけていると称される。
「単離された」ポリペプチドもしくは変異体またはその誘導体により、その天然環境中にないポリペプチドが意図される。特定のレベルの精製は必要ではない。例えば、単離されたポリペプチドはその天然または自然環境から取り出されていてよい。組換えによって生産されるポリペプチドおよび宿主細胞において発現されるタンパク質は、任意の適切な技術によって分離されている、分画されている、または部分的もしくは実質的に精製されている天然または組換えポリペプチドと同様に、本発明の目的のために単離されているとみなされる。
また、前記ポリペプチドの誘導体、類似体または変異体およびそれらの任意の組合せも本発明のポリペプチドとして含まれる。本発明のポリペプチドに言及するときの「変異体」、「誘導体」および「類似体」という用語には、対応する天然ポリペプチドの生物学的特性、抗原性特性および免疫原性特性の少なくとも一部を保持する任意のポリペプチドが含まれる。本発明のポリペプチドの変異体には、アミノ酸置換、欠失または挿入による変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。変異体は、天然に生じてもよくまたは非天然に生じてもよい。非天然に生じる変異体は、当分野で公知の突然変異誘発技術を用いて生成されうる。変異体ポリペプチドは、保存的もしくは非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を含んでもよい。本発明のポリペプチドの誘導体は、天然ポリペプチドでは認められない付加的な特徴を示すように変化しているポリペプチドである。その例には融合タンパク質が含まれる。変異体ポリペプチドはまた、本明細書では「ポリペプチド類似体」とも称されうる。本明細書で使用される、ポリペプチドの「誘導体」は、機能的側鎖基の反応によって化学的に誘導体化された１つまたは複数の残基を有する対象ポリペプチドを指す。２０種の標準的なアミノ酸の１または複数の天然に生じるアミノ酸誘導体を含有するペプチドも、「誘導体」として含まれる。例えば、プロリンを４−ヒドロキシプロリンで置換してもよく；リシンを５−ヒドロキシリシンで置換してもよく；ヒスチジンを３−メチルヒスチジンで置換してもよく；セリンをホモセリンで置換してもよく；およびリシンをオルニチンで置換してもよい。
あるいは、遺伝暗号の「重複性（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）」を利用することによってこれらの同じまたは類似ポリペプチドをコードする組換え変異体を合成または選択することができる。プラスミドもしくはウイルスベクターへのクローニングまたは特定の原核生物系もしくは真核生物系における発現を最適化するために、様々な制限部位を生じさせるサイレント変化などの、様々なコドン置換を導入してもよい。ポリヌクレオチド配列における突然変異は、ポリペプチドまたはポリペプチドの任意の部分の特性を改変するためにポリペプチドに付加された他のペプチドのドメインに反映されて、リガンド結合親和性、鎖間親和性または分解／代謝回転速度などの特徴を変化させうる。
好ましくは、アミノ酸「置換」は、１つのアミノ酸を類似の構造および／または化学特性を有する別のアミノ酸で置換すること、すなわち保存的アミノ酸置換の結果である。「保存的」アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の類似性に基づいて実施しうる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる；極性の中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる；正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが含まれる；そして負に荷電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。「挿入」または「欠失」は、好ましくはおよそ１〜およそ２０個のアミノ酸、より好ましくは１〜１０個のアミノ酸の範囲内である。許容される変異は、組換えＤＮＡ技術を用いてポリペプチド分子中にアミノ酸の挿入、欠失または置換を体系的に作製し、生じた組換え変異体を活性に関して検定することによって実験的に決定されうる。
【００８０】
本発明の問い合わせアミノ酸配列と少なくとも、例えば９５％「同一」のアミノ酸配列を有するポリペプチドにより、対象ポリペプチドのアミノ酸配列が、対象ポリペプチド配列が問い合わせアミノ酸配列の各１００個のアミノ酸につき５つまでのアミノ酸の変化を含んでもよいことを除き、問い合わせ配列と同一であることが意図される。言い換えると、問い合わせアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、対象配列中の５％までのアミノ酸残基が挿入、欠失されるかまたは別のアミノ酸で置換されてもよい。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端の位置で、または参照配列中の残基の間に個別にもしくは参照配列中の１もしくは複数の連続する基において散在して、これらの末端位置の間の任意の位置で生じてもよい。
実際に、任意の特定のポリペプチドが参照ポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータプログラムを用いて慣例的に決定することができる。グローバル配列アラインメントとも称される、問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最良の全体的一致を決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いて決定することができる。配列アラインメントにおいては、問い合わせ配列および対象配列はどちらもヌクレオチド配列であるかまたはどちらもアミノ酸配列であるかのいずれかである。前記グローバル配列アラインメントの結果は同一性パーセントである。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アラインメントにおいて使用される好ましいパラメータは以下のとおりである：マトリックス＝ＰＡＭ  ０、ｋ−タプル＝２、ミスマッチペナルティ＝１、結合ペナルティ＝２０、ランダム化グループ長＝０、カットオフスコア＝１、ウィンドウサイズ＝配列長、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウィンドウサイズ＝５００または対象アミノ酸配列の長さのどちらか短い方。
対象配列が、内部欠失のためではなく、Ｎ末端欠失またはＣ末端欠失のために問い合わせ配列よりも短い場合、結果に対して手作業で補正を行わねばならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが全体的同一性パーセントを計算するときに対象配列のＮ末端およびＣ末端の切断を考慮しないためである。問い合わせ配列と比較して、Ｎ末端またはＣ末端で切断されている対象配列については、対応する対象残基と一致／整列しない、対象配列のＮ末端およびＣ末端にある問い合わせ配列の残基の数を問い合わせ配列の全塩基のパーセントとして計算することによって同一性パーセントを補正する。残基が一致／整列しているか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果によって決定される。次いで、このパーセンテージを、特定のパラメータを用いて上記ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算された同一性パ−セントから差し引いて、最終的な同一性パ−セントスコアを導く。この最終的な同一性パーセントスコアが、本発明の目的のために使用されるものである。問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端およびＣ末端側の残基のみを、同一性パーセントスコアを手作業で調整する目的のために考慮する。すなわち、対象配列の最も遠いＮ末端およびＣ末端残基の外側の問い合わせ残基位置のみである。
例えば、９０アミノ酸残基の対象配列を、同一性パーセントを決定するために１００残基の問い合わせ配列と整列する。欠失が対象配列のＮ末端に生じており、それゆえ、ＦＡＳＴＤＢアラインメントはＮ末端の最初の１０残基の一致／整列を示さない。１０の対合しない残基は配列の１０％を占め（一致しないＮ末端およびＣ末端の残基数／問い合わせ配列中の残基の総数）、したがってＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算された同一性パーセントスコアから１０％を差し引く。残りの９０残基が完全に一致している場合、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例では、９０残基の対象配列を１００残基の問い合わせ配列と比較する。今回は欠失が内部欠失であるので、問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端の残基は存在しない。この場合は、ＦＡＳＴＤＢによって計算された同一性パーセントは手作業で補正しない。再び、ＦＡＳＴＤＢアラインメントにおいて示された、問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外側の残基位置のみを手作業で補正する。他の手作業での補正は、本発明の目的のためには行わない。
本発明のポリペプチドには、その機能的フラグメントまたは変異体を包含する、表３および４に示す配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるものが含まれる。本発明はまた、保存的アミノ酸置換を有する表３または４の配列を含むポリペプチドも包含する。
本発明のポリペプチドは単一ポリヌクレオチドによってコードされてよい。あるいは、本発明のポリペプチドは複数の（例えば２つ以上の）ポリヌクレオチドによってコードされてもよく、そのためポリペプチドは共発現される。複数のポリヌクレオチドから共発現されるポリペプチドは、例えばジスルフィド結合または他の手段によって結合して機能的イムノコンジュゲートを形成してもよい。例えば、抗原結合部分の重鎖部分は、抗原結合部分の軽鎖部分とエフェクタ部分を含むイムノコンジュゲートの部分とは別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。共発現されたとき、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと結合して抗原結合部分を形成する。あるいは、別の例では、抗原結合部分の軽鎖部分は、抗原結合部分の重鎖部分とエフェクタ部分を含むイムノコンジュゲートの部分とは別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。
本発明のイムノコンジュゲートおよびそのフラグメントは、一般にポリヌクレオチドによってコードされる。「ポリヌクレオチド」という用語は、単一の核酸ならびに複数の核酸を包含することが意図されており、単離された核酸分子または構築物、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合または非従来型結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）において認められるようなアミド結合）を含んでよい。「核酸」という用語は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の１つまたは複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントを指す。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドにより、その天然環境から取り出されている核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡが意図される。例えば、ベクター中に含有される治療用ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のためには単離されているとみなされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞中に維持される組換えポリヌクレオチドまたは溶液中の（部分的または実質的に）精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離されたＲＮＡ分子には、本発明のインビボまたはインビトロＲＮＡ転写産物、ならびに本明細書で開示されるペスチウイルスベクターのプラス鎖およびマイナス鎖形態ならびに二本鎖形態が含まれる。
【００８１】
本発明による単離されたポリヌクレオチドまたは核酸には、合成によって生産されるそのような分子がさらに含まれる。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位または転写ターミネーターなどの調節エレメントであってもよく、または前記調節エレメントを含んでもよい。
本明細書で使用される、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の部分である。「終結コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合は、コード領域の一部とみなしてもよく、しかし、いかなる隣接配列も、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’および３’非翻訳領域等はコード領域の一部ではない。本発明の２以上のコード領域が単一ポリヌクレオチド構築物中に、例えば単一ベクター上に存在してもよく、または別々のポリヌクレオチド構築物中に、例えば別々の（異なる）ベクター上に存在してもよい。さらに、いかなるベクターも、単一コード領域を含んでもよく、または２つ以上のコード領域を含んでもよい、例えば、本発明のベクターは１つまたは複数のポリタンパク質をコードしてもよく、これらは、翻訳後にまたは翻訳と同時にタンパク質分解切断によって最終的なタンパク質に分離される。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチドまたは核酸は、本発明のイムノコンジュゲートまたはその変異体もしくは誘導体をコードする第一または第二核酸に融合したまたは融合していない、異種コード領域をコードしてもよい。異種コード領域には、限定されることなく、分泌シグナルペプチドまたは異種機能性ドメインなどの特殊なエレメントまたはモチーフが含まれる。
特定の実施態様では、ポリヌクレオチドまたは核酸はＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、１つまたは複数のコード領域と作動可能に連結されたプロモーターおよび／または他の転写もしくは翻訳制御エレメントを含んでよい。作動可能な連結とは、遺伝子産物、例えばポリペプチドについてのコード領域が、遺伝子産物の発現を調節配列の影響下または制御下に置くように１つまたは複数の調節配列と連結されている場合である。２つのＤＮＡフラグメント（例えばポリペプチドコード領域およびそれに連結されたプロモーター）は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、および２つのＤＮＡフラグメントの間の連結の性質が遺伝子産物の発現を指令する発現調節配列の能力を妨げないまたはＤＮＡ鋳型が転写される能力を妨げない場合、「作動可能に連結されて」いる。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがポリペプチドをコードする核酸の転写を生じさせることができる場合、その核酸に作動可能に連結されている。プロモーターは、あらかじめ定められた細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を指令する細胞特異的プロモーターであってよい。プロモーター以外の他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサーおよび転写終結シグナルは、細胞特異的転写を指令するポリヌクレオチドと作動可能に連結されていてよい。適切なプロモーターおよび他の転写制御領域は本明細書で開示される。
様々な転写制御領域が当業者に公知である。これらには、限定されることなく、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス（例えばイントロンＡと連結した前初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（例えば初期プロモーター）およびレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス）由来のプロモーターおよびエンハンサーセグメントが含まれる。他の転写制御領域には、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギβ−グロビンなどの脊椎動物遺伝子に由来するもの、ならびに真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列が含まれる。さらなる適切な転写制御領域には、組織特異的プロモーターおよびエンハンサーならびにリンホカイン誘導性プロモーター（例えばインターフェロンまたはインターロイキンによって誘導されるプロモーター）が含まれる。
同様に、様々な翻訳制御エレメントが当業者に公知である。これらには、リボソーム結合部位、翻訳開始および終止コドン、ならびにウイルス系に由来するエレメント（特にＣＩＴＥ配列とも称される、内部リボソーム進入部位またはＩＲＥＳ）が含まれるが、これらに限定されない。
他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態の、ＲＮＡである。本発明のＲＮＡは一本鎖または二本鎖であってよい。
【００８２】
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指令する、分泌またはシグナルペプチドをコードする付加的なコード領域と連結されていてもよい。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、粗面小胞体を横切る成長中のタンパク質鎖のエクスポートが開始されるとすぐに成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、一般に、完全なまたは「完全長」のポリペプチドから切断されて分泌されたまたは「成熟」形態のポリペプチドを生成する、ポリペプチドのＮ末端に融合したシグナルペプチドを有することを認識する。特定の実施態様では、天然のシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖のシグナルペプチド、または自身と作動可能に連結されたポリペプチドの分泌を指令する能力を保持する配列の機能的誘導体を使用する。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチドまたはその機能的誘導体を使用してもよい。例えば、野生型リーダー配列をヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置き換えてもよい。
「発現カセット」という用語は、標的細胞における特定の核酸の転写を可能にする一連の特殊な核酸エレメントを用いて、組換えまたは合成によって生成されるポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルスまたは核酸フラグメントに組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、配列の中でも特に、転写される核酸配列およびプロモーターを含む。一実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明のイムノコンジュゲートまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含む。
「発現ベクター」という用語は「発現構築物」と同義であり、それが作動可能に連結されている特定の遺伝子を標的細胞に導入し、標的細胞におけるその発現を指令するために使用されるＤＮＡ分子を指す。本発明の発現ベクターは発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞の内部に入るとすぐに、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子またはタンパク質が細胞の転写および／または翻訳機構によって生成される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明のイムノコンジュゲートまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含んでなる。
「人工」という用語は、合成または非宿主細胞由来の組成物、例えば化学合成されたオリゴヌクレオチドを指す。
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば９５％「同一」のヌクレオチド配列を有する核酸またはポリヌクレオチドにより、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドにつき５までの点突然変異を含んでもよいことを除き、参照配列と同一であることが意図される。言い換えると、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列中の５％までのヌクレオチドが欠失されるかもしくは別のヌクレオチドで置換されてもよく、または参照配列中の全ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてもよい。
実際に、任意の特定の核酸分子またはポリペプチドが、本発明のヌクレオチド配列またはポリペプチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータプログラムを用いて慣例的に決定することができる。グローバル配列アラインメントとも称される、問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最良の全体的一致を決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いて決定することができる。配列アラインメントにおいては、問い合わせ配列および対象配列はどちらもＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵをＴに変換することによって比較できる。前記グローバル配列アラインメントの結果は同一性パーセントである。同一性パーセントを計算するためにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢアラインメントにおいて使用される好ましいパラメータは以下のとおりである：マトリックス＝ユニタリー、ｋ−タプル＝４、ミスマッチペナルティ＝１、結合ペナルティ＝３０、ランダム化グループ長＝０、カットオフスコア＝１、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウィンドウサイズ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さのどちらか短い方。
対象配列が、内部欠失のためではなく、５’または３’欠失のために問い合わせ配列よりも短い場合、結果に対して手作業で補正を行わねばならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが同一性パーセントを計算するときに対象配列の５’および３’切断を考慮しないためである。問い合わせ配列と比較して、５’または３’末端で切断されている対象配列については、一致／整列しない、対象配列の５’および３’にある問い合わせ配列の塩基の数を、問い合わせ配列の全塩基のパーセントとして計算することによって同一性パーセントを補正する。ヌクレオチドが一致／整列しているか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果によって決定される。次いで、このパーセンテージを、特定のパラメータを用いて上記ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算された同一性パ−セントから差し引いて、最終的な同一性パ−セントスコアを導く。この補正されたスコアが、本発明の目的のために使用されるものである。問い合わせ配列と一致／整列しない、ＦＡＳＴＤＢアラインメントによって示される、対象配列の５’および３’塩基の外側の塩基のみを、同一性パーセントスコアを手作業で調整する目的のために計算する。
例えば、９０塩基の対象配列を、同一性パーセントを決定するために１００塩基の問い合わせ配列と整列する。欠失が対象配列の５’末端に生じており、それゆえ、ＦＡＳＴＤＢアラインメントは５’末端の最初の１０塩基の一致／整列を示さない。１０の対合しない塩基は配列の１０％を占め（一致しない５’および３’末端の塩基数／問い合わせ配列中の塩基の総数）、したがってＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算された同一性パーセントスコアから１０％を差し引く。残りの９０塩基が完全に一致している場合、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例では、９０塩基の対象配列を１００塩基の問い合わせ配列と比較する。今回は欠失が内部欠失であるので、問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列の５’または３’の塩基は存在しない。この場合は、ＦＡＳＴＤＢによって計算された同一性パーセントは手作業で補正しない。再び、問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列の５’および３’の塩基のみを手作業で補正する。他の手作業での補正は、本発明の目的のためには行わない。
本発明のポリヌクレオチドには、その機能的フラグメントまたは変異体を包含する、以下の表６および８に示す配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるものが含まれる。ポリヌクレオチドは、イムノコンジュゲート全体をコードする単一ポリヌクレオチドとしてまたは共発現される複数の（例えば２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現されてもよい。共発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えばジスルフィド結合または他の手段によって結合して機能的イムノコンジュゲートを形成してもよい。例えば、抗原結合部分の重鎖部分は、抗原結合部分の軽鎖部分とエフェクタ部分を含むイムノコンジュゲートの部分とは別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。共発現されたとき、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと結合して抗原結合部分を形成する。あるいは、別の例では、抗原結合部分の軽鎖部分は、抗原結合部分の重鎖部分とエフェクタ部分を含むイムノコンジュゲートの部分とは別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。
【００８３】
特定の実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、少なくとも１つのエフェクタ部分、好ましくは単鎖エフェクタ部分と、少なくとも１つ、好ましくは２つ以上の抗原結合部分を含むイムノコンジュゲートのフラグメントをコードし、このとき第一エフェクタ部分は、第一抗原結合部分とアミノ末端またはカルボキシ末端ペプチド結合を共有しており、第二抗原結合部分は、第一エフェクタ部分または第一抗原結合部分のいずれかとアミノ末端またはカルボキシ末端ペプチド結合を共有している。好ましい実施態様では、抗原結合部分は、ＦｖおよびＦａｂからなる群より独立して選択される。別の特定の実施態様では、ポリヌクレオチドは、抗原結合部分の２つに含まれる重鎖とエフェクタ部分の１つをコードする。別の特定の実施態様では、ポリヌクレオチドは、抗原結合部分の２つに含まれる軽鎖とエフェクタ部分の１つをコードする。別の特定の実施態様では、ポリヌクレオチドは、抗原結合部分の１つからの１本の軽鎖、第二抗原結合部分からの１本の重鎖およびエフェクタ部分の１つをコードする。
別の特定の実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドはイムノコンジュゲートのフラグメントをコードし、このときポリヌクレオチドは、２つのＦａｂ分子の重鎖とエフェクタ部分、好ましくは単鎖エフェクタ部分をコードする。別の特定の実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドはイムノコンジュゲートのフラグメントをコードし、このときポリヌクレオチドは、２つのＦａｂ分子の軽鎖とエフェクタ部分、好ましくは単鎖エフェクタ部分をコードする。別の特定の実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドはイムノコンジュゲートのフラグメントをコードし、このときポリヌクレオチドは、１つのＦａｂ分子の重鎖、第二Ｆａｂ分子の軽鎖およびエフェクタ部分、好ましくは単鎖エフェクタ部分をコードする。
一実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、そのアミノ末端およびカルボキシ末端アミノ酸で１つまたは複数のｓｃＦｖ分子に連結された、少なくとも１つのエフェクタ部分、好ましくは単鎖エフェクタ部分を含むイムノコンジュゲートをコードする。
一実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、少なくとも１つのエフェクタ部分、好ましくは単鎖エフェクタ部分と、少なくとも第一および第二抗原結合部分を含むイムノコンジュゲートフラグメントをコードし、このとき抗原結合部分の各々はｓｃＦｖ分子を含み、そのカルボキシ末端アミノ酸がＩｇＧ１  ＣＨ１、ＩｇＧ  ＣκおよびＩｇＥ  ＣＨ４からなる群より独立して選択される免疫グロブリン定常ドメインを含む定常領域に連結されており、そしてこのとき抗原結合部分の１つは、その定常領域カルボキシ末端アミノ酸でエフェクタ部分の１つに含まれるアミノ末端アミノ酸に連結されており、そしてこのとき第一および第二抗原結合部分はジスルフィド結合により共有結合されている。さらなる実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、抗原結合部分の１つとエフェクタ部分、好ましくは単鎖エフェクタ部分をコードする。
一実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、第一および第二エフェクタ部分と２つの抗原結合部分を含むイムノコンジュゲートフラグメントをコードし、このとき抗原結合部分の各々はｓｃＦｖ分子を含み、そのカルボキシ末端アミノ酸が免疫グロブリン定常ドメインを含む定常領域に連結されており、そしてこのとき抗原結合部分の１つは、その定常領域カルボキシ末端アミノ酸でエフェクタ部分の１つに含まれるアミノ末端アミノ酸に連結されており、そしてこのとき第二抗原結合部分は、その定常領域カルボキシ末端アミノ酸で第二エフェクタ部分のアミノ末端アミノ酸に連結されており、そしてこのとき第一および第二抗原結合部分はジスルフィド結合により共有結合されている。好ましい実施態様では、第一および／または第二エフェクタ部分は単鎖エフェクタ部分である。好ましい実施態様では、定常ドメインは、ＩｇＧ１  ＣＨ１、ＩｇＧ  ＣκおよびＩｇＥ  ＣＨ４からなる群より独立して選択される。さらなる実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、抗原結合部分の１つとエフェクタ部分の１つをコードする。
一実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、少なくとも１のエフェクタ部分、好ましくは単鎖エフェクタ部分と、少なくとも第一および第二抗原結合部分を含むイムノコンジュゲートフラグメントをコードし、このとき抗原結合部分の各々はｓｃＦｖ分子を含み、そのカルボキシ末端アミノ酸がＩｇＧ  ＣＨ３ドメインに連結されており、そしてこのとき抗原結合部分の１つは、そのカルボキシ末端アミノ酸でエフェクタ部分の１つに含まれるアミノ末端アミノ酸に連結されており、そしてこのとき第一および第二抗原結合部分はジスルフィド結合により共有結合されている。さらなる実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、抗原結合部分の１つとエフェクタ部分、好ましくは単鎖エフェクタ部分をコードする。
一実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、２つのエフェクタ部分と２つの抗原結合部分を含むイムノコンジュゲートフラグメントをコードし、このとき抗原結合部分の各々はｓｃＦｖ分子を含み、そのカルボキシ末端アミノ酸がＩｇＧ  ＣＨ３ドメインに連結されており、そしてこのとき抗原結合部分の１つは、そのカルボキシ末端アミノ酸でエフェクタ部分の１つに含まれるアミノ末端アミノ酸に連結されており、そしてこのとき第二抗原結合部分は、そのカルボキシ末端アミノ酸で第二エフェクタ部分のアミノ末端アミノ酸に連結されており、そしてこのとき第一および第二抗原結合部分はジスルフィド結合により共有結合されている。好ましい実施態様では、第一および／または第二エフェクタ部分は単鎖エフェクタ部分である。さらなる実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、抗原結合部分の１つとエフェクタ部分の１つ、好ましくは単鎖エフェクタ部分をコードする。
一実施態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、２つのエフェクタ部分と２つの抗原結合部分を含むイムノコンジュゲートフラグメントをコードし、このとき抗原結合部分の各々はＦａｂ分子を含み、その重鎖または軽鎖カルボキシ末端アミノ酸がＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインに連結されており、そしてこのときＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインの各々は、そのカルボキシ末端アミノ酸でエフェクタ部分の１つに含まれるアミノ末端アミノ酸に連結されており、そしてこのとき第一および第二抗原結合部分はジスルフィド結合により共有結合されている。好ましい実施態様では、第一および／または第二エフェクタ部分は単鎖エフェクタ部分である。さらなる実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、抗原結合部分の１つに含まれる重鎖可変領域と前記エフェクタ部分の１つ、好ましくは単鎖エフェクタ部分をコードする配列を含む。さらに別の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、抗原結合部分の１つに含まれる軽鎖可変領域とエフェクタ部分の１つ、好ましくは単鎖エフェクタ部分をコードする配列を含む。
別の実施態様では、本発明は、イムノコンジュゲートまたはそのフラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、このときポリヌクレオチドは、以下の表３に示す可変領域配列をコードする配列を含む。別の実施態様では、本発明は、イムノコンジュゲートまたはそのフラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、このときポリヌクレオチドは、表４に示すポリペプチド配列をコードする配列を含む。別の実施態様では、本発明はさらに、イムノコンジュゲートまたはそのフラグメントをコードする単離された核酸に関し、このとき核酸は、以下の表６および８に示すヌクレオチド配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を含む。別の実施態様では、本発明は、イムノコンジュゲートまたはそのフラグメントをコードする単離された核酸に関し、このとき核酸は、表６および８に示す核酸配列を含む。別の実施態様では、本発明は、イムノコンジュゲートまたはそのフラグメントをコードする単離された核酸に関し、このとき核酸は、表３のアミノ酸配列と少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である可変領域配列をコードする配列を含む。別の実施態様では、本発明は、イムノコンジュゲートまたはそのフラグメントをコードする単離された核酸に関し、このとき核酸は、表４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリペプチド配列をコードする配列を含む。本発明は、イムノコンジュゲートまたはそのフラグメントをコードする単離された核酸を包含し、このとき核酸は、保存的アミノ酸置換を有する表３の可変領域配列をコードする配列を含む。本発明はまた、本発明のイムノコンジュゲートまたはそのフラグメントをコードする単離された核酸を包含し、このとき核酸は、保存的アミノ酸置換を有する表４のポリペプチド配列をコードする配列を含む。
【００８４】
【表２−０１】
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【表２−０２】
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【００８５】
【表３−０１】
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【表３−０２】
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【表３−０３】
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【表３−０４】
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【表３−０５】
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【００８６】
【表４−０１】
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【表４−０２】
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【表４−０３】
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【表４−０４】
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【表４−０５】
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【表４−０６】
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【表４−０７】
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【表４−０８】
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【表４−０９】
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【００８７】
【表５】
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【００８８】
【表６−０１】
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【表６−０２】
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【表６−０３】
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【表６−０４】
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【表６−０５】
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【表６−０６】
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【表６−０７】
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【表６−０８】
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【表６−０９】
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【表６−１０】
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【表６−１１】
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【表６−１２】
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【表６−１３】
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【表６−１４】
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【００８９】
【表７−０１】
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【表７−０２】
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【表７−０３】
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【００９０】
【表８−０１】
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【表８−０２】
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【表８−０３】
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【表８−０４】
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【表８−０５】
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【表８−０６】
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【表８−０７】
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【表８−０８】
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【表８−０９】
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【表８−１０】
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【表８−１１】
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【表８−１２】
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【表８−１３】
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【表８−１４】
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【表８−１５】
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【表８−１６】
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【表８−１７】
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【表８−１８】
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【表８−１９】
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【表８−２０】
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【表８−２１】
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【表８−２２】
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【表８−２３】
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【表８−２４】
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【表８−２５】
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【表８−２６】
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【００９１】
宿主細胞 
本明細書で使用する、「宿主細胞」なる用語は、本発明のイムノコンジュゲートないしはその断片を生成するために操作され得る任意の種の細胞系を指す。一実施態様では、宿主細胞は、イムノコンジュゲートフラグメントを産生させるように操作される。宿主細胞は、数例を挙げれば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞ないしハイブリドーマ細胞、酵母菌、昆虫細胞、細菌細胞および植物細胞などの培養細胞、例えば哺乳類の培養細胞などがあるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養された植物又は動物組織も含まれる。一実施態様では、本発明の宿主細胞は、本発明のイムノコンジュゲートないしはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。本発明の宿主細胞は真核生物でも原核生物でもよい。
【００９２】
イムノコンジュゲートポリペプチド及びそのフラグメントの精製
本発明のイムノコンジュゲートないしそのフラグメントは、当分野で公知の技術、例えば高性能液体クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィなどによって精製されてよい。特定のタンパク質を精製するために使用する実際の条件は、総電荷、疎水性、親水性などのような因子にある程度依存しており、当分野の技術者にとって明らかである。
親和性クロマトグラフィ精製のために、プロテインＡ又はプロテインＧを有するマトリクスが使われてよい。あるいは、親和性クロマトグラフィ精製のために、イムノコンジュゲートの単鎖エフェクタ部分を特異的に結合する任意の抗体が用いられてもよい。抗体の産生のために、ウサギ、マウス、ラットなどに限らず様々な宿主動物が、本発明のイムノコンジュゲートないしその断片による注射によって免疫化されてよい。イムノコンジュゲートは、側鎖官能基に付着した側鎖官能基又はリンカーによって、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)などの適切な担体に付着されてよい。様々なアジュバントは、宿主種に応じて免疫応答を増やすために用いてよく、フロイント(完全及び不完全)、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、 キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ(カルメット-ゲラン桿菌)およびコリネバクテリウム・パルバムなどの潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれる。したがって、一実施態様は、本発明のイムノコンジュゲートの製造方法であって、本発明のイムノコンジュゲートないしそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞を、同発現に適切な条件下で培養することを含む方法を含む。
【００９３】
イムノコンジュゲートの使用方法 
本発明のイムノコンジュゲートは、特定の抗原決定基を標的化し、標的及び感作した細胞での様々な細胞性応答を誘発するために有用である。本発明のイムノコンジュゲートは診断試薬としても有用である。抗原決定基へのイムノコンジュゲートの結合は、エフェクタ部分に特異的な二次抗体を用いて容易に検出されうる。一実施態様では、二次抗体およびイムノコンジュゲートにより、細胞又は組織表面に位置する抗原決定基へのイムノコンジュゲートの結合の検出が容易になる。
いくつかの実施態様において、本発明のイムノコンジュゲートの有効量が細胞に投与される。他の実施態様では、本発明のイムノコンジュゲートの治療上有効量が疾患の治療のために個体に投与される。本明細書中で用いる「有効量」なる用語は、投与される細胞又は組織での生理学的変化を生じさせるために必要である本発明のイムノコンジュゲートの量として定める。本明細書中で用いる「治療上有効量」なる用語は、疾患の副作用を除去、低減、遅延、最小化又は予防する本発明のイムノコンジュゲートの量として定める。
【００９４】
本発明のイムノコンジュゲートは、そのまま又は医薬組成物の形で被検体に投与されてよい。一実施態様では、疾患は増殖性疾患、例えば癌である。癌などの増殖性疾患の非限定的な例には、膀胱癌、脳癌、頭頸部癌、膵癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、大腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃癌、前立腺癌、血液癌、皮膚癌、扁平上皮癌、骨癌、及び腎臓癌が含まれる。本発明のイムノコンジュゲートを使用して治療されうる他の細胞増殖性疾患には、腹部、骨、胸部、消化系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸領域および泌尿生殖系に位置する新生物が含まれるがこれらに限定されるものではない。また、前癌状態ないし病変および癌の転移も含まれる。同様に、他の細胞増殖性疾患もまた、本発明のイムノコンジュゲートによって治療されてよい。このような細胞増殖性疾患の例には、上記の器官系に位置する腫瘍形成のほかに、高ガンマグロブリン血症、リンパ増殖性疾患、パラプロテイン血症、紫斑病、サルコイドーシス、セザリー症候群、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織球増殖症、および他の任意の細胞増殖性疾患が含まれるがこれらに限定されない。他の実施態様では、疾患は、自己免疫状態、移植拒絶反応、外傷後免疫応答および感染症（例えばＨＩＶ）に関連がある。より具体的には、イムノコンジュゲートは、リンパ腫、自己免疫状態、移植拒絶反応、移植片対宿主病、乏血および脳卒中を含む免疫細胞媒介性疾患に関与する細胞を除去する際に使われてよい。当業者は、多くの場合、イムノコンジュゲートは治癒ではなく、部分的な利益を示すものであることを理解する。いくつかの実施態様において、いくつかの利点を有する生理学的変化も治療上の利益であると考慮される。ゆえに、いくつかの実施態様では、生理学的変化を提供するイムノコンジュゲートの量は、「有効量」又は「治療上有効量」とみなされる。治療を必要とする被検体、患者又は個体は一般的に哺乳動物、より具体的にはヒトである。
【００９５】
投与の組成物、製剤、用量および手段
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体に溶解又は分散した一又は複数のイムノコンジュゲートの有効量を含む。「薬学的又は薬理学的に許容可能」なる表現は、必要に応じて例えばヒトなどの動物に投与したときに、有害な、アレルギー的な又は他の予期しない反応を生じない分子及び組成物を指す。出典明記によってここに援用されるRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990によって例示されるように、少なくとも一のイムノコンジュゲートおよび場合によって更なる活性成分を含有する薬学的組成物の調製は、本開示内容を考慮して当業者に知られるであろう。さらに、動物(例えばヒト)の投与のためには、調製物が、ＦＤＡの生物学的基準又は他国の関係当局の要請に応じて、無菌性、発熱原性、一般的な安全性および純度基準を満たさなければならないと理解されるであろう。
本明細書中で使用する「薬学的に許容可能な担体」には、当分野の技術者に知られるように(例えば、出典明記によってここに援用されるRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329を参照)、任意及びすべての、溶媒、バッファ、分散培地、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤(例えば抗菌剤、抗真菌剤)、等張剤、吸収遅延剤、塩類、防腐剤、薬剤、薬剤安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、分解剤、潤滑剤、甘味料、香料、色素、このような材料およびこれらの組合せが含まれる。従来のいずれかの担体が活性成分に適合しない場合を除き、治療的又は薬学的な組成物の使用が考慮される。
【００９６】
イムノコンジュゲートは、固形、液体又はエアゾール形態で投与されるか否か、注入としての投与経路のために無菌である必要があるか否かに応じて、異なる種類の担体を含んでよい。本発明は、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹膜内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、脾臓内に、腎臓内に、胸膜内に、気管内に、鼻腔内に、硝子体内に、膣内に、直腸内に、局所的に、腫瘍内に、筋内に、腹膜内に、皮下に、結膜下に、小胞内に、粘膜に、心膜内に、臍内に、眼内に、口腔内に、局所的に、局所性に、吸入（例えば噴霧吸入）によって、注射によって、注入によって、持続性点滴によって、標的細胞を直接浸す局所性灌流によって、カテーテルによって、洗浄によって、クリームで、または、脂質組成物（例えばリポソーム）で、あるいは、当分野の技術者に知られる他の方法又は任意の組合せによって(例えば、出典明記によってここに援用されるRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990を参照)投与されうる。非経口投与、特に静脈内注射は、本発明のイムノコンジュゲートなどのポリペプチド分子を投与するために最も一般的に使われる。
被検体に投与される本発明の組成物の実際の用量は、体重、状態の重症度、治療さる疾患の種類、以前の又は同時の治療的介入、患者の特発性及び投与の手段などの物理的及び生理学的要因によって測定されてよい。投与に対して責任がある実務者は、いずれにしても、組成物中の活性成分(一又は複数)の濃度、及び個々の被検体に適した用量(一又は複数)を決定する。
【００９７】
ある実施態様では、薬学的組成物は、例えば、少なくともおよそ０．１％の本発明のイムノコンジュゲートを含んでよい。他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、ユニットの重量のおよそ２％〜７５％、又はおよそ２５％〜およそ６０％、例えばそこから導き出せる任意の範囲を含んでよい。他の非限定的な例では、また、用量は、およそ１マイクログラム／ｋｇ／体重、およそ５マイクログラム／ｋｇ／体重、およそ１０マイクログラム／ｋｇ／体重、およそ５０マイクログラム／ｋｇ／体重、およそ１００マイクログラム／ｋｇ／体重、およそ２００マイクログラム／ｋｇ／体重、およそ３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、およそ５００マイクログラム／ｋｇ／体重、およそ１ミリグラム／ｋｇ／体重、およそ５ミリグラム／ｋｇ／体重、およそ１０ミリグラム／ｋｇ／体重、およそ５０ミリグラム／ｋｇ／体重、およそ１００ミリグラム／ｋｇ／体重、およそ２００ミリグラム／ｋｇ／体重、およそ３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、およそ５００ミリグラム／ｋｇ／体重から、およそ１０００ｍｇ／ｋｇ／体重、又はそれ以上、及びそこから導き出せる任意の範囲を含んでよい。ここで列挙した数から導き出せる範囲の非限定的な例では、およそ５ｍｇ／ｋｇ／体重からおよそ１００ｍｇ／ｋｇ／体重、およそ５マイクログラム／ｋｇ／体重からおよそ５００ミリグラム／ｋｇ／体重などの範囲が、上記の数に基づいて投与されうる。
【００９８】
いずれにせよ、組成物は、一又は複数の構成成分の酸化を遅延させるために、様々な抗酸化剤を含んでよい。さらに、微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤のような防腐剤によってもたらされ得、限定するものではないが、パラベン(例えばメチルパラベン、プロピルパラベン)、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール又はその組合せが含まれる。
イムノコンジュゲートは、遊離塩基、中和又は塩の形態の組成物に調製されてよい。薬学的に許容可能な塩類には、酸添加塩類、例えばタンパク質組成物の遊離アミノ基にて形成されるもの、又は、例えば塩酸又はリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸又はマンデル酸などの有機酸にて形成されるものが含まれる。また、遊離カルボキシ基にて形成された塩類は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は水酸化第二鉄などの無機塩基、または、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン又はプロカインなどの有機塩基から得られうる。
組成物が液体状態である実施態様において、担体は、水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど)、脂質(例えばトリグリセライド、植物油、リポソーム)およびこれらの組合せを含むがこれらに限定しない、溶媒又は分散培地であってよい。例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、例えば液体ポリオール又は脂質などの担体中での分散による必要粒子径の維持によって、例えばヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤の使用によって、又はこれらの方法の組合せによって、適切な流動性が維持されうる。多くの場合、生理的に許容可能なｐＨ値を維持するために、例えば糖質、塩化ナトリウム又はこれらの組合せなどの等張剤、および／または緩衝剤を含めることが好ましい。
【００９９】
他の実施態様では、本発明において点眼、鼻溶液又は噴霧、エアゾール又は吸入器を使用してもよい。このような組成物は、標的組織の種類と適合するように一般に設計される。非限定的な例において、鼻溶液は通常、点滴又は噴霧で鼻通路に投与されるように設計された水溶液である。多くの点で鼻分泌物と類似するように鼻溶液が調製されているので、正常な線毛作用が維持される。ゆえに、いくつかの実施態様では、水溶性の鼻溶液は、通常、等張又はわずかに緩衝し、およそ５．５からおよそ６．５のｐＨを維持する。さらに、必要であれば、眼科用薬剤、薬剤又は適切な薬剤安定剤に使用されるものと類似する抗菌性防腐剤が、製剤に含まれてよい。例えば、様々な市販の鼻調製物が知られており、抗生物質又は抗ヒスタミン剤などの薬剤を含む。 
ある実施態様では、イムノコンジュゲートは、経口摂取などの経路により投与されるように調製される。これらの実施態様では、固形組成物は、例えば、溶液、懸濁液、エマルジョン類、錠剤、ピル、カプセル(例えば硬質又は軟質な殻で覆われたゼラチンカプセル)、徐放性製剤、頬側組成物、トローチ、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェーハ又はその組合せを含んでよい。口腔用組成物は、食物摂取により直接取り込まれてよい。経口投与のための好適な担体は、不活性希釈剤、吸収可能な食用の担体又はこれらの組合せを含む。本発明の他の態様において、口腔組成物はシロップ又はエリキシル剤として調製されてよい。シロップ又はエリキシル剤は、例えば、少なくとも一の活性剤、甘味料、防腐剤、香料、色素、防腐剤又はこれらの組合せを含んでよい。
【０１００】
ある実施態様では、口腔組成物は、一又は複数の結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、香料およびこれらの組合せを含んでよい。ある実施態様では、組成物は、結合剤、例えばトラガカント、アカシア、コーンスターチ、ゼラチン又はこれらの組合せ；賦形剤、例えば二リン酸カルシウム、マンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム又はこれらの組合せ；崩壊剤、例えばトウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉、アルギン酸又はこれらの組合せ；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム；甘味料、例えばスクロース、ラクトース、サッカリン又はこれらの組合せ；香料、例えばセイヨウハッカ、ウィンターグリーン油、サクランボ香料、オレンジ香料など；又は前記のこれらの組合せの、一又は複数を含んでよい。投薬単位の形態がカプセルである場合、上記のタイプの材料に加えて、液体担体などの担体を含んでよい。様々な他の材料は、コーティングとして、あるいは投薬単位の物理的な形態を変更するために用いてよい。例えば、錠剤、ピル剤又はカプセル剤はシェラック、糖もしくはその両方でコーティングされてよい。
他の投与様式に適切である他の製剤には坐薬が含まれる。坐薬は、直腸、膣又は尿道への挿入のために、通常投薬用の、様々な重量および形状の固形投薬形態である。挿入の後、坐薬は、軟化、融解又は腔体液に溶解する。一般に、坐薬のための従来の担体には、例えば、ポリアルキレングリコール、トリグリセライド又はこれらの組合せが含まれる。ある実施態様では、坐薬は、例えばおよそ０．５％〜およそ１０％、好ましくはおよそ１％〜およそ２％の範囲の活性成分を含有する混合物から形成されてよい。
【０１０１】
無菌の注射用溶液は、必要であれば先に列挙した様々な他の成分と共に、適切な溶媒中に必要な量の本発明のイムノコンジュゲートを含めて、その後フィルター滅菌することによって調製される。一般に、分散物は、基本的な分散培地及び／又は他の成分を含む滅菌ベヒクル中に様々な滅菌した活性成分を含ませることによって調製される。無菌の注射用溶液、懸濁液又はエマルジョンの調製のための無菌粉末の場合、調製の好適な方法は、予めフィルター滅菌した液体培地から活性成分と任意の他の所望の成分の粉末を得る、真空乾燥又は凍結乾燥技術である。液体培地は、必要に応じて最適に緩衝し、液体希釈液をまず十分な食塩又はグルコースにて注射の前に等張にする。ＤＭＳＯを溶媒として使用して、極めて迅速に浸透させ、小さい領域に高濃度の活性剤を運搬させる場合、直接注射のための高濃度組成物の調製も考慮される。
組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の混入作用を防がなくてはならない。周知のことだが、エンドトキシン汚染は最小限安全なレベル、例えば０．５ｎｇ／ｍｇ未満のタンパク質に保たれなければならない。
特定の実施態様において、注射可能な組成物の長期にわたる吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン又はこれらの組合せを組成物に使用することによって達成されうる。
本発明のイムノコンジュゲートを含む医薬組成物は、従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠生成、水簸、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥工程によって製造しうる。医薬組成物は、タンパク質を医薬的に使用できる製剤に加工することを容易にする１つまたは複数の生理的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または助剤を用いて従来の方法で製剤化しうる。適切な製剤は、選択される投与の経路に依存する。
局所投与用には、本発明のイムノコンジュゲートを、当分野で周知のように溶液、ゲル、軟膏、クリーム、懸濁液等として製剤化しうる。
全身投与用製剤には、注射、例えば皮下、静脈内、筋肉内、髄腔内または腹腔内注射による投与のために設計されたもの、ならびに経皮、経粘膜、吸入、経口または肺内投与のために設計されたものが含まれる。
注射用には、本発明のイムノコンジュゲートを水溶液、好ましくはハンクス液、リンガー液または生理食塩水緩衝液などの生理学的に適合性の緩衝液中で製剤化しうる。溶液は、懸濁化剤、安定剤および／または分散剤などの製剤化剤を含んでもよい。
あるいは、イムノコンジュゲートは、使用前に適切なビヒクル、例えば滅菌発熱性物質除去蒸留水で構成するための粉末形態であってもよい。
経粘膜投与のためには、透過すべき関門に適した浸透剤を製剤中で使用する。そのような浸透剤は一般に当分野において公知である。
経口投与用には、イムノコンジュゲートを当分野で周知の医薬的に許容される担体と組み合わせることによって容易に製剤化することができる。そのような担体により、本発明のイムノコンジュゲートを、治療される患者の経口摂取のために錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤等に製剤化することが可能となる。例えば粉末、カプセルおよび錠剤などの経口固体製剤に関して、適切な賦形剤には、充填剤、例えば糖類、例えばラクトース、スクロース、マンニトールおよびソルビトール；セルロース調製物、例えばトウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）；造粒剤；ならびに結合剤が含まれるる。所望する場合は、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩を添加してもよい。
所望する場合は、固体投与形態は、標準的な技術を用いて糖被覆または腸溶性被覆してもよい。
例えば懸濁液、エリキシルおよび溶液などの経口液体製剤については、適切な担体、賦形剤または希釈剤には、水、グリコール、油、アルコール等が含まれる。加えて、着香剤、防腐剤、着色剤等を添加してもよい。
口腔投与用には、イムノコンジュゲートは、従来の方法で製剤化される錠剤、トローチ剤等の形態を取りうる。
吸入による投与のためには、本発明による使用のためのイムノコンジュゲートは、適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスを使用して、加圧パックまたはネブライザーからのエアゾールスプレーの形態で好都合に送達される。加圧エアゾールの場合、投薬単位は、所定量を送達するバルブを設けることによって決定されうる。吸入器またはインサフレーターで使用するためのゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、イムノコンジュゲートとラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物を含有して製剤化されうる。
イムノコンジュゲートはまた、例えばカカオバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤用基剤を含有する、坐剤または停留浣腸剤などの直腸または膣用組成物に製剤化してもよい。
先に述べた製剤に加えて、イムノコンジュゲートはまた、デポー剤として製剤化してもよい。そのような長時間作用性製剤は、埋め込み（例えば皮下もしくは筋肉内）によってまたは筋肉内注射によって投与されうる。したがって、例えば、イムノコンジュゲートは、適切なポリマーもしくは疎水性材料（例えば許容される油中の乳剤として）またはイオン交換樹脂を用いて、あるいは難溶性の誘導体として、例えば難溶性の塩として製剤化してもよい。
あるいは、他の医薬送達システムを用いてもよい。リポソームおよびエマルジョンは、本発明のイムノコンジュゲートを送達するために使用しうる送達媒体の周知の例である。ジメチルスルホキシドなどの特定の有機溶媒も使用しうるが、通常は毒性がより大きいという難点がある。加えて、持続放出システム、例えば治療薬を含有する固体ポリマーの半透性マトリックスを使用してイムノコンジュゲートを送達してもよい。様々な持続放出性材料が確立されており、当業者に周知である。持続放出性カプセルは、その化学的性質に依存して、数週間から１００日間にわたってイムノコンジュゲートを放出しうる。イムノコンジュゲートの化学的性質および生物学的安定性に依存して、イムノコンジュゲートの安定化のために付加的な方策を用いてもよい。
本発明のイムノコンジュゲートは荷電した側鎖または末端を含んでもよいので、それらは、上述した製剤のいずれかに遊離酸もしくは塩基としてまたは医薬的に許容される塩として含まれてもよい。医薬的に許容される塩は、遊離塩基の生物学的活性を実質的に保持し、無機酸との反応によって調製される塩である。医薬的な塩は、水性および他のプロトン性溶媒中で対応する遊離塩基形態よりも可溶性である傾向がある。
本発明のイムノコンジュゲートは、意図される目的を達成するのに有効な量で一般に使用される。疾患状態を治療または予防する用途のために、本発明のイムノコンジュゲートまたはその医薬組成物は、治療有効量で投与または適用される。治療有効量は、症状を改善もしくは予防するため、または治療されている患者の生存を延長させるために有効な量である。治療有効量の決定は、特に本明細書で提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
全身投与に関しては、治療有効用量は最初にインビトロアッセイから推定することができる。例えば、用量は、細胞培養物において測定されたＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するように動物モデルにおいて策定されうる。そのような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
初期投薬量も、当分野で周知の技術を用いてインビボデータ、例えば動物モデルから推定することができる。当業者は、動物データに基づいてヒトへの投与を容易に最適化することができる。
投薬量および間隔は、治療効果を維持するのに十分なイムノコンジュゲートの血漿レベルを与えるように個別に調整されうる。注射による投与のための通常の患者投薬量は、およそ０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的にはおよそ０．５〜１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療上有効な血清レベルは、複数回用量を毎日投与することによって達成されうる。
局所投与または選択的摂取の場合は、イムノコンジュゲートの有効局所濃度は血漿濃度に関連しないことがある。当業者は、過度の実験を必要とせずに治療上有効な局所投薬量を最適化することができる。
投与されるイムノコンジュゲートの量は、言うまでもなく、治療される被験者、被験者の体重、疾患の重症度、投与の方法および処方する医師の判断に依存する。
治療は、症状が検出可能な間または症状が検出不能である場合でも、間欠的に反復してよい。治療は、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて提供されうる。自己免疫疾患の場合には、本発明のイムノコンジュゲートと組み合わせて使用しうる薬剤には、ステロイド系および非ステロイド系抗炎症薬が含まれるが、これらに限定されない。
毒性
本明細書で述べるイムノコンジュゲートの治療有効用量は、一般に実質的な毒性を引き起こすことなく治療上の利益を提供する。イムノコンジュゲートの毒性は、細胞培養物または実験動物における標準的な医薬的手順によって、例えば、ＬＤ５０（母集団の５０％に対して致死的な用量）またはＬＤ１００（母集団の１００％に対して致死的な用量）を測定することによって決定できる。毒性と治療効果との間の用量比が治療指数である。一実施態様では、イムノコンジュゲートは高い治療指数を示す。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、例えばヒトにおける使用のために、毒性ではない用量範囲を策定するのに使用できる。本明細書で述べるイムノコンジュゲートの投薬量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性を有さない有効用量を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、使用される剤形および利用される投与経路に依存してこの範囲内で変化させうる。正確な製剤、投与経路および用量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択されうる（例えば、Ｆｉｎｇｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５，Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｈ．１，ｐ．１を参照）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
他の薬剤および治療
処置の治療上の効果を改善するために他の薬剤を本発明と組み合わせて使用しうることが企図される。これらの付加的な薬剤には、免疫調節剤、細胞表面レセプターおよびＧＡＰ結合の上方調節に影響を及ぼす薬剤、細胞増殖抑制剤および分化剤、細胞接着の阻害剤、またはアポトーシス誘導物質に対する過剰増殖性細胞の感受性を増大させる薬剤が含まれる。免疫調節剤には、腫瘍壊死因子、インターフェロンα、βおよびγ；ＩＬ−２および他のサイトカイン；Ｆ４２Ｋおよび他のサイトカイン類似体；またはＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳおよび他のケモカインが含まれる。Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド、ＤＲ４またはＤＲ５／ＴＲＡＩＬなどの細胞表面レセプターまたはそのリガンドの上方調節は、過剰増殖性細胞に対するオートクラインまたはパラクライン作用を確立することによって本発明のアポトーシス誘導能を増強することがさらに企図される。ＧＡＰ結合の数を増加させることによる細胞内シグナル伝達の増大は、隣接する過剰増殖性細胞集団への抗過剰増殖作用を増大させる。他の実施態様では、治療の抗過剰増殖効果を改善するために細胞増殖抑制剤または分化剤を本発明と組み合わせて使用することができる。細胞接着の阻害剤は本発明の効果を改善すると企図される。細胞接着阻害剤の例は、局所接着キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤およびロバスタチンである。抗体Ｃ２２５などの、アポトーシスに対する過剰増殖性細胞の感受性を増大させる他の物質を、治療効果を改善するために本発明と組み合わせて使用できることがさらに企図される。
ホルモン療法も、本発明と併用してまたは先に述べた任意の他の癌療法と組み合わせて使用しうる。ホルモンの使用は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌または子宮頚癌などの特定の癌の治療において、テストステロンまたはエストロゲンなどの特定のホルモンのレベルを低下させるまたは作用をブロックするために利用しうる。この治療はしばしば、治療の選択肢としてまたは転移の危険性を低減するために、少なくとも１つの他の癌療法と組み合わせて使用される。
本発明のイムノコンジュゲートはまた、化学療法、放射線療法または他の免疫療法と併用して投与されうる。そのような併用療法のための抗癌薬は、例えば、微小管破壊剤（例えばビンブラスチンまたはビンクリスチンなどのビンカアルカロイド類、ドセタキセルまたはパクリタキセルなどのタキサン類、イクサベピロンなどのエポチロン類）、代謝拮抗薬（例えばメトトレキサートまたはアミノプテリンなどの葉酸代謝拮抗薬、フルダラビン、６−メルカプトプリンまたは６−チオグアニンなどの抗プリン薬、５−フルオロウラシル、カペシタビンまたはゲムシタビンなどの抗ピリミジン薬、ヒドロキシ尿素）、トポイソメラーゼ阻害薬（例えばカンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、またはエトポシドなどのポドフィロトキシン）、ＤＮＡインターカレーター（例えばドキソルビシン、ダウノルビシン、アクチノマイシン、ブレオマイシン）、アルキル化薬（例えばシクロホスファミド、クロラムブシルと、カルムスチンまたはニムスチンなどのニトロソ尿素、ストレプトゾシン、ブスルファン、シスプラチン、オキサリプラチン、トリエチレンメラミン、デカルバジン）、ホルモン療法（例えば糖質コルチコイド、タモキシフェンなどのアロマターゼ阻害薬、フルタミドなどの抗アンドロゲン薬、ロイプロリドなどの性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）類似体）、抗生物質、キナーゼ阻害薬（例えばエルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ）、受容体拮抗薬（例えば発癌および腫瘍増殖を促進することが公知の細胞表面レセプターを標的とする抗体）、酵素阻害薬（例えばサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害薬）、アミノ酸除去酵素（例えばアスパラギナーゼ）、ロイコボリン、レチノイド、腫瘍細胞アポトーシスの活性化薬、および抗血管新生薬の群から選択されうる。
【実施例】
【０１０２】
実施例１
まずサイトカインの抗体媒介性運搬がHarvill E.T., and Morrison S.L. Immunotech. 1(2): 95-105 (1995)により行う場合、コンストラクトは腫瘍抗原ターゲッティングのための２つの抗原結合部分と、リンパ球活性化を誘導するための２つのサイトカイン部分を有するものとした（ＩＬ-２分子はＩｇＧ３の各重鎖Ｃ末端に融合する）。サイトカインの親和性は一般的にそのレセプターに対して高い。２つのサイトカインユニットを保持する分子は、結合活性（または多結合価）効果のために、サイトカインレセプターに対してさらに高い親和性を有しうる。ゆえに、このような分子は、腫瘍へのターゲティングが起こる前でさえも、血流のリンパ球を容易に活性化することができる。この効果は患者には望ましくない。対照的に、ただ１つのサイトカイン部分と２以上のターゲッティングドメインを保持するイムノコンジュゲート分子は、循環中のリンパ球を活性化する可能性が低く、腫瘍に全イムノコンジュゲート分子を方向付けすることができ、この腫瘍でリンパ球活性化が低速度で起こりうる。ゆえに、図１および２に示す分子をインターロイキン２（ＩＬ-２）を用いてモデルサイトカインとして構築した。図に示すように、生成したすべての分子は、腫瘍抗原に対して二価であって、ＩＬ-２サイトカインに対して二価又は一価である。抗原に対する親和性を、例としてＬ１９抗体を用いて２つの異なるイムノコンジュゲート形態について比較した。対照として、この抗体を、ヒトＩｇＧ１形態、ダイアボディ形態（図１Ａ）およびＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ融合（図１Ｂ）にクローニングした。ＶＨとＶＬとの間のリンカーペプチドを８又は１２のアミノ酸長となるように、ダイアボディ内で１つの可変性を試験した。フィブロネクチンの精製した抗原外ドメインＢ（ＥＤＢ）をＢＩＡＣＯＲＥチップ上に固定し、抗体融合コンストラクトを親和性測定のために可溶性分析物として用いた。図８から１１にこの実験の結果を示す。ＩｇＧは、二価の結合事象の理想的な例であった。ここで、２６０ｐＭの親和定数を観察した。Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ融合コンストラクトは３１０ｐＭの親和性となった。これはＩｇＧと本質的に同一である。ダイアボディの２つの変異体（図１０および１１に示す）はそれぞれ２７０ｐＭおよび３６０ｐＭの親和性を測定した。ゆえに、これらコンストラクトのすべては抗原に対して類似の親和性を有する。抗原およびＩＬ-２レセプターに対する親和性は、Ｆ１６抗体配列に基づいた類似のコンストラクトを用いて行った(Brack, S.S. et al., Clin. Canc. Res. 12(10): 3200-3208 (2006))。図１２は、ＴＮＣ−Ａ１ドメインがＢＩＡＣＯＲＥチップに固定されている場合の、Ｆ１６ ＩｇＧおよびその対応する一価性Ｆａｂ断片のＢＩＡＣＯＲＥセンサグラムを示す。これら特定の実験条件下で、ＩｇＧ分子は２．６ｎＭの親和定数を示し、Ｆａｂ分子は５０ｎＭの親和定数を示した。ここで、二価性に起因する親和性の増加は２０倍である。ダイアボディ、Ｆａｂ−ＩＬ２−ＦａｂおよびｓｃＦｖ−ＩＬ２−ｓｃＦｖイムノコンジュゲートは、それぞれ５ｎＭ、４．８ｎＭおよび１２ｎＭの抗原に対する親和性を示した。ゆえに、これらコンストラクトのすべては、Ｆａｂ断片の一価のものよりもＩｇＧ分子の二価の特性に非常に���似する、対抗原親和性を有する。
【０１０３】
ＩＬ-２レセプターに対する親和性に注目した場合、違いはより顕著であった。ＩＬ-２レセプター結合能を調べるために、ヘテロダイマーＩＬ-２レセプターの発現を可能にするツールを作製した。ＩＬ-２レセプターのβ鎖は、「ノブ−イントゥ−ホール」技術を用いてヘテロ二量体化（Ｆｃ（ノブ））するように操作したＦｃ分子に融合した(Merchant, A.M. et al., Nat. Biotech. 16:677-681 (1998))。次いで、ＩＬ-２レセプターのγ鎖をＦｃ（ホール）変異体に融合し、Ｆｃ（ノブ）と二量体化させた。その後このヘテロ二量体Ｆｃ−融合タンパク質を、ＩＬ-２／ＩＬ-２レセプター相互作用を分析するための基質として用いた。図１３は、固定したＩＬ-２レセプターを用いた、分析物として市販のＩＬ-２（プロリュウキン）のＢＩＡＣＯＲＥセンサグラムを示す。およそ０．５ｎＭの測定された親和性は既に公になっている値の通りである。ＩＬ-２レセプターに対する様々なコンストラクトの親和性を図１７にまとめる。観察された重要な結果は、サイトカインに関して二価であるダイアボディ（Ｆ１６ ｄｉａ ＩＬ２）と、ただ１つのＩＬ-２部分を保持するＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ分子との間に違いがあった。ダイアボディは二価であり、ＩＬ-２は一価であるが、ダイアボディのＩＬ-２レセプター結合親和性（０．８ｎＭ）は、コンジュゲートしていないＩＬ-２（プロリュウキン）の親和性（０．５ｎＭ）と同等であった。Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ融合はダイアボディと比較しておよそ１０分の１のＩＬ-２レセプター結合親和性を有しており、それは図１９に示すようにＮＫ９２細胞の増殖を誘導する能力が低減していたことに現れていた。
【０１０４】
実施例２
一般的なＦａｂライブラリの構築
Ｆａｂ形態の一般的な抗体ライブラリを、以下のＶ−ドメイン組合せを用いてヒト生殖細胞系遺伝子に基づいて構築した。ＤＰ４７−３ライブラリのためにＶＨ３＿２３重鎖とＶｋ３＿２０κ軽鎖、ＤＰ８８−３ライブラリのためにＶＨ１＿６９重鎖とＶｋ１＿１７κ軽鎖。表２を参照。両ライブラリは、軽鎖（Ｌ３）のＣＤＲ３および重鎖（Ｈ３）のＣＤＲ３においてランダム化し、スプライシング バイ オーバーラッピング エクステンション（ＳＯＥ）ＰＣＲによって１ライブラリにつき３つのフラグメントから集めた。フラグメント１は、ランダム化したＬ３を含む抗体遺伝子の５’末端を含み、フラグメント２は、Ｌ３からＨ３に拡がる中央の定常フラグメントであるのに対し、フラグメント３はランダム化したＨ３と抗体遺伝子の３’部位を含む。
以下のプライマーの組合せを用いて、ＤＰ４７−３ライブラリのためのライブラリフラグメントを生成した。フラグメント１（ＬＭＢ３−ＬｉｂＬ１ｂ＿ｎｅｗ）、フラグメント２（ＭＳ６３−ＭＳ６４）、フラグメント３（Ｌｉｂ２Ｈ−ｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）。表９を参照。以下のプライマーの組合せを用いて、ＤＰ８８−３ライブラリのためのライブラリフラグメントを生成した。フラグメント１（ＬＭＢ３−ＲＪＨ＿ＬＩＢ３）、フラグメント２（ＲＪＨ３１−ＲＪＨ３２）及びフラグメント３（ＬＩＢ８８＿２−ｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）。表１０を参照。
【０１０５】
【表９】
0005764127.tif 000063
【表１０】
0005764127.tif 000064
【０１０６】
ライブラリフラグメント生成のためのＰＣＲプロトコールは以下の通りとした。９４℃で５分の初期変性と、９４℃で１分、５８℃で１分および７２℃で１分を２５サイクルと、７２℃で１０分間の最終伸長。アセンブリＰＣＲのために、等モル比率の３フラグメントを鋳型として用いた。アセンブリＰＣＲプロトコールは以下の通りとした。９４℃で３分の初期変性と、９４℃で３０秒、５８℃で１分および７２℃で２分を５サイクル。この段階で、フラグメント１−３の外側の配列に相補的プライマーを加え、７２℃で１０分間の最終伸長の前に、さらに２０サイクル行った。十分な量の完全長ランダム化Ｆａｂコンストラクトをアセンブリした後、Ｆａｂコンストラクトを、同じように処理したアクセプタファジミドベクターと共に、ＤＰ４７−３ライブラリのためにＮｃｏＩ／ＮｏｔＩにて、そして、ＤＰ８８−３ライブラリのためにＮｃｏＩ／ＮｈｅＩにて消化した。ＤＰ４７−３ライブラリのために、２２．８μｇのＦａｂライブラリを１６．２μｇのファジミドベクターにてライゲートした。ＤＰ８８−３ライブラリのために、３０．６μｇのＦａｂライブラリを３０．６μｇのファジミドベクターにてライゲートした。
精製したライゲーションは、それぞれＤＰ４７−３ライブラリに６８の形質転換体、ＤＰ８８−３ライブラリに６４の形質転換体を用いて、ＤＰ４７−３に４．２の１０１０、ＤＰ８８−３に３．３×１０９のサイズの最終ライブラリを得た。
Ｆａｂライブラリを表出するファジミド粒子をレスキューし、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製して選別に用いた。
【０１０７】
実施例３
抗ＴＮＣ Ａ２クローン２Ｂ１０の選別
ａｖｉ-タグおよび６×ｈｉｓ-タグの５'サブクローニングを行ったヒトＴＮＣ−Ａ２を発現する大腸菌に対して選別を行った。表５の配列番号：５７を参照。抗原は、発現の際にインビボでビオチン化された。選別は、以下のプロトコールに従って溶液中で行った。（ｉ）全量１ｍｌ中で０．５時間のおよそ１０１２ファジミド粒子のライブラリＤＰ８８-３と１００ｎＭのビオチン化ヒトＴＮＣ Ａ２との結合、（ｉｉ）５．４×１０７ストレプトアビジンコート磁気ビーズを１０分間添加することによるビオチン化ヒトＴＮＣ−Ａ２と付着したファージの捕捉、（ｉｉｉ）１ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０にて５回および１ｍｌのＰＢＳにて５回によるビーズの洗浄、（ｉｖ）１ｍｌの１００ｍＭ ＴＥＡ(トリエチルアミン)を１０分間添加することによるファージ粒子の溶出と、５００μｌの１Ｍ トリス／ＨＣｌ ｐＨ７．４の添加による中和、及び（ｖ）対数期大腸菌ＴＧ１細胞の再感染、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３による感染、およびその後の選別ラウンドに用いるためのファジミド粒子のその後のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿。
１００ｎＭの一定の抗原濃度を用いて３ラウンド以上選別を行った。ラウンド２では、ストレプトアビジンビーズの代わりにニュートラアビジンプレート上で抗原：ファージ複合体の捕捉を行った。以下のようなＥＬＩＳＡによって特定の結合体を識別した。１００μｌの１００ｎＭ ビオチン化ヒトＴＮＣ-Ａ２をニュートラアビジンプレートの各ウェルにコートした。
Ｆａｂ含有細菌上清物を添加し、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を用いてそれらのＦｌａｇ-タグにより結合Ｆａｂを検出した。識別したら、クローン２Ｂ１０を０．５リットルの培養体積で細菌を用いて発現させ、親和性精製し、ＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ１００を用いたＳＰＲ-分析によってさらに特徴付けした。表３の配列番号：３および７を参照。
【０１０８】
実施例４
抗ＴＮＣ Ａ１／Ａ４クローン２Ｆ１１の選別
ａｖｉ-タグおよび６×ｈｉｓ-タグの５'サブクローニングを行ったヒトＴＮＣ−Ａ１を発現する大腸菌に対して選別を行った。表５の配列番号：５９を参照。抗原は、発現の際にインビボでビオチン化された。選別は、以下のプロトコールに従って溶液中で行った。（i）全量１ｍｌ中で０．５時間のおよそ１０１２ファジミド粒子のライブラリＤＰ４７−３と１００ｎＭのビオチン化ヒトＴＮＣ Ａ１との結合、（ii）５．４×１０７ストレプトアビジンコート磁気ビーズを１０分間添加することによるビオチン化ヒトＴＮＣ−Ａ１と付着したファージの捕捉、（iii）１ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０にて５回および１ｍｌのＰＢＳにて５回によるビーズの洗浄、（iv）１ｍｌの１００ｍＭ ＴＥＡ(トリエチルアミン)を１０分間添加することによるファージ粒子の溶出と、５００μｌの１Ｍ トリス／ＨＣｌ ｐＨ７．４の添加による中和、及び（v）対数期大腸菌ＴＧ１細胞の再感染、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３による感染、およびその後の選別ラウンドに用いるためのファジミド粒子のその後のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿。
１００ｎＭの一定の抗原濃度を用いて３ラウンド以上選別を行った。ラウンド２では、ストレプトアビジンビーズの代わりにニュートラアビジンプレート上で抗原：ファージ複合体の捕捉を行った。
抗原のタグを認識する望ましくないクローンと競合させるために、すべての結合反応物に、カルボキシ終末ａｖｉ-タグおよび６×ｈｉｓ-タグを含む１００ｎＭ 非ビオチン化ヒトＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを添加した。
【０１０９】
第一スクリーニング工程では、以下のＥＬＩＳＡによって特定の結合体を識別した。１００μｌの１００ｎＭ ビオチン化ヒトＴＮＣ-Ａ１をニュートラアビジンプレートの各ウェルにコートした。Ｆａｂ含有細菌上清物を添加し、ヒトＴＮＣ−Ａ１に特異的に結合したＦａｂを、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を用いてそれらのＦｌａｇ-タグにより検出した。 
第二スクリーニング工程では、交差反応性を決定するために、抗原としてネズミ科ＴＮＣ−Ａ１、ヒトＴＮＣ−Ａ４およびｍｕＴＮＣ−Ａ４を用いて上記のＥＬＩＳＡを繰り返した。すべての抗原は、そのＣ末端に同じａｖｉ-タグおよび６×ｈｉｓ-タグをを含み、インビボでビオチン化された。表５の配列番号：５０および６１を参照。
識別したら、クローン２Ｆ１１を０．５リットルの培養体積で細菌を用いて発現させ、親和性精製し、ＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ１００を用いたＳＰＲ-分析によってさらに特徴付けした。表３の配列番号：９および１３を参照。
【０１１０】
実施例５
抗ＦＡＰクローンの選別（一次選別）
ポリ-リジン及び６×ｈｉｓ-タグの上流にクローニングしたヒト又はネズミ科の線維芽細胞活性化タンパク質(ＦＡＰ)の外部ドメインに対して選別を行った。表５の配列番号：５３および５５を参照。選別の前に、選別のラウンドに応じて、１０μｇ／ｍｌ又は５μｇ／ｍｌの濃度の抗原をイムノチューブにコートした。選別は、以下のプロトコールに従って行った。（i）およそ１０１２ファジミド粒子のライブラリＤＰ４７-３の、固定したヒト又はネズミ科ＦＡＰへの２時間の結合、（ii）５ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０にて５回及び５ｍｌのＰＢＳにて５回によるイムノチューブの洗浄、（iii）１ｍｌの１００ｍＭ ＴＥＡ(トリエチルアミン)を１０分間添加することによるファージ粒子の溶出と、５００μｌの１Ｍ トリス／ＨＣｌ ｐＨ７．４の添加による中和、及び（iv）対数期大腸菌ＴＧ１細胞の再感染、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３による感染、およびその後の選別ラウンドに用いるためのファジミド粒子のその後のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿。
選別は、ヒトＦＡＰの抗原濃度減少しながら、最終選別ラウンドでは場合によっては５ｕｇ／ｍｌのネズミ科ＦＡＰを使用して、３又は４ラウンド以上行った。特異的な結合体を、バックグラウンドの５倍の高さのシグナルと定義し、ＥＬＩＳＡによって識別した。ＮＵＮＣマキシソーププレートを１０ｕｇ／ｍｌのヒト又はネズミ科ＦＡＰにてコートし、その後Ｆａｂ含有細菌上清物の添加、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を用いたそれらのＦｌａｇ-タグによる特異的結合Ｆａｂの検出を行った。
ＥＬＩＳＡポジティブクローンを、９６ウェルフォーマット中で１ｍｌの培養物として細菌を用いて発現させ、上清物をＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ１００を用いた動態学的スクリーニング実験に用いた。
【０１１１】
実施例６
抗ＦＡＰ親和性成熟ライブラリの構築
３つの親和性成熟ライブラリは、一次抗ＦＡＰ選別から予め選択した抗体に基づいて構築した。より正確に言うと、それらは、（i）抗ヒトＦＡＰクローン２Ｄ９（ライブラリａ．ｍ．ＦＡＰ２Ｄ９）（表３の配列番号：６７および６９を参照）、（ii）抗ネズミ科ＦＡＰクローン４Ｂ８（ライブラリａ．ｍ．ＦＡＰ４Ｂ８）（表３の配列番号：７１および７３を参照）、および（iii）交差反応性クローン７Ａ１、１３Ｂ２、１３Ｃ２、１３Ｅ８、１４Ｃ１０および１７Ａ１１（ライブラリａ．ｍ．ＦＡＰプール）（７Ａ１の可変領域配列に対応する表３の配列番号：７５および７７；１３Ｃ２の可変領域配列に対応する表３の配列番号：７９および８１；１３Ｅ８の可変領域配列に対応する配列番号：８３および８５；１４Ｃ１０の可変領域配列に対応する配列番号：８７および８９；そして、１７Ａ１１の可変領域配列に対応する配列番号：９１および９３）に基づいている。
これら各ライブラリは、軽鎖（Ｌ１／Ｌ２）のＣＤＲ１およびＣＤＲ２又は重鎖（Ｈ１／Ｈ２）のＣＤＲ１およびＣＤＲ２の何れかをランダム化している２つのサブライブラリからなる。これらサブライブラリは形質転換でプールした。これら各サブライブラリは、増幅およびアセンブリの４つの連続した工程により構築した。
Ｌ１／Ｌ２ライブラリでは、増幅およびアセンブリプロトコールには、（i）フラグメント１（ＬＭＢ３−ＤＰＫ２２＿ＣＤＲ１＿ｒａｎｄ＿ｂａ＿ｏｐｔ）およびフラグメント２（ＤＰＫ２２＿ＣＤＲ１＿ｆｏ−ＤＰＫ２２＿Ｃｋ＿ＢｓｉＷＩ＿ｂａ）の増幅；（ii）  外側のプライマーＬＭＢ３とＤＰＫ２２＿Ｃｋ＿ＢｓｉＷＩ＿ｂａを用いてフラグメント１及び２をアセンブリし、フラグメント３のための鋳型の作製；（iii）フラグメント３（ＬＭＢ３−ＤＰＫ２２＿ＣＤＲ２＿ｒａｎｄ＿ｂａ）およびフラグメント４（ＤＰＫ２２＿ＣＤＲ２＿ｆｏ−ＤＰＫ２２＿Ｃｋ＿ＢｓｉＷＩ＿ｂａ）の増幅；及び、（iv）上記と同じ外側のプライマーを用いたフラグメント３および４の最終アセンブリが含まれる。プライマー配列については表１１を参照のこと。
【０１１２】
【表１１】
0005764127.tif 000065
【０１１３】
Ｈ１／Ｈ２ライブラリでは、増幅およびアセンブリプロトコールには、（i）フラグメント１（ＲＪＨ５３−ＤＰ４７＿ＣＤＲ１＿ｒａｎｄ＿ｂａ＿ｏｐｔ）とフラグメント２（ＤＰ４７＿ＣＤＲ１＿ｆｏ−ＭＳ５２）の増幅；（ii）外側のプライマーＲＪＨ５３とＭＳ５２を用いてフラグメント１及び２をアセンブリし、フラグメント３のための鋳型の作製；（iii）フラグメント３（ＲＪＨ５３−ＤＰ４７＿ＣＤＲ２＿ｒａｎｄ＿ｂａ）およびフラグメント４（ＤＰ４７＿ＣＤＲ２＿ｆｏ−ＭＳ５２）の増幅；及び、（iv）上記と同じ外側のプライマーを用いたフラグメント３および４の最終アセンブリが含まれる。プライマー配列については表１２を参照。
【表１２】
0005764127.tif 000066
【０１１４】
最終アセンブリ生成物は、クローン２Ｄ９、４Ｂ８又はクローン７Ａ１、１３Ｂ２、１３Ｃ２、１３Ｅ８、１４Ｃ１０および１７Ａ１１の等モル混合物のプラスミド調製に基づく同様に処理したアクセプタベクターと共に、ａ.ｍ.ＦＡＰ２Ｄ９およびａ.ｍ.ＦＡＰ４Ｂ８のＬ１／Ｌ２サブライブラリではＮｃｏＩ／ＢｓｉＷＩにて、ａ.ｍ.ＦＡＰ２Ｄ９及びａ.ｍ.ＦＡＰ４Ｂ８のＨ１／Ｈ２サブライブラリではＭｕｎＩおよびＮｈｅＩにて、並びに、ａ.ｍ.ＦＡＰｐｏｏｌのＬ１／Ｌ２ライブラリではＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩにて、そしてａ.ｍ.ＦＡＰプールのＨ１／Ｈ２ライブラリではＢｓｐＥＩ／ＰｓｔＩにてそれぞれ消化した。以下の量の消化したランダム化(部分的)Ｖ−ドメインおよび消化したアクセプタベクター(一又は複数)を、それぞれのライブラリのためにライゲートした。(μｇのＶ-ドメイン／μｇのベクター)：ａ.ｍ.ＦＡＰ２Ｄ９ Ｌ１／Ｌ２サブライブラリ(５．７／２１．５)、ａ.ｍ.ＦＡＰ２Ｄ９ Ｈ１／Ｈ２サブライブラリ(４．１／１５．５)、ａ.ｍ.ＦＡＰ４Ｂ８ Ｌ１／Ｌ２サブライブラリ(６．５／２４．５)、ａ.ｍ.ＦＡＰ４Ｂ８ Ｈ１／Ｈ２サブライブラリ(５．７／２１．５)、ａ.ｍ.ＦＡＰプールＬ１／Ｌ２サブライブラリ(４．４／２０)、ａ.ｍ.ＦＡＰプールＨ１／Ｈ２サブライブラリ(３．４／１５．５)。
Ｌ１／Ｌ２およびＨ１／Ｈ２サブライブラリの精製したライゲートをプールし、３つ各々の親和性成熟ライブラリのために６０の形質転換体に用い、ａ.ｍ.ＦＡＰ２Ｄ９には６．２×１０９、ａ.ｍ.ＦＡＰ４Ｂ８には９．９×１０９およびａ.ｍ.ＦＡＰプールには２．２×１０９のサイズの最終ライブラリを得た。
これらＦａｂライブラリを表出するファジミド粒子をレスキューし、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製にて精製し、二次選別に用いた。
【０１１５】
実施例７
親和性成熟抗ＦＡＰクローンの選別
ポリ-リジン及び６×ｈｉｓ-タグの５'にクローニングしたヒト又はネズミ科の線維芽細胞活性化タンパク質(ＦＡＰ)の外部ドメインに対して選別を行った。表５の配列番号：５３および５５を参照。選別の前に、選別のラウンドに応じて、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ又は０．２μｇ／ｍｌの濃度の抗原をイムノチューブにコートした。選別は、以下のプロトコールに従って行った。(ｉ) およそ１０１２ファジミド粒子のライブラリａ.ｍ.ＦＡＰ２Ｄ９、ａ.ｍ.ＦＡＰ４Ｂ８又はａ.ｍ.ＦＡＰプールの、固定したヒト又はネズミ科ＦＡＰへの２時間の結合、(ii) （ライブラリと選別ラウンドに応じて）５ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０にて５回及び５ｍｌのＰＢＳにて５回によるイムノチューブの洗浄、(iii) １ｍｌの１００ｍＭ ＴＥＡ(トリエチルアミン)を１０分間添加することによるファージ粒子の溶出と、５００μｌの１Ｍ トリス／ＨＣｌ ｐＨ７．４の添加による中和、及び(v) 対数期大腸菌ＴＧ１細胞の再感染、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３による感染、およびその後の選別ラウンドに用いるためのファジミド粒子のその後のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿。
選別は２ラウンド以上行い、３つのライブラリ各々について個々に条件を調整した。具体的には、選別パラメータは、ａ.ｍ.ＦＡＰ２Ｄ９(ラウンド１では５μｇ／ｍＬのヒトＦＡＰと合計２０回の洗浄、ラウンド２では１μｇ／ｍＬのヒトＦＡＰと合計３０回の洗浄)、ａ.ｍ.ＦＡＰ４Ｂ８(ラウンド１では１μｇ／ｍＬのネズミ科ＦＡＰと合計３０回の洗浄、ラウンド２では０．２μｇ／ｍＬのヒトＦＡＰと合計４０回の洗浄)、およびａ.ｍ.ＦＡＰプール(ラウンド１では５μｇ／ｍＬのヒトＦＡＰと合計３０回の洗浄、ラウンド２では５μｇ／ｍＬのネズミ科ＦＡＰと合計３０回の洗浄)とした。特異的な結合体を、バックグラウンドの５倍の高さのシグナルと定義し、ＥＬＩＳＡによって識別した。ＮＵＮＣマキシソーププレートを１μｇ／ｍｌ又は０．２μｇ／ｍｌのヒト又はネズミ科ＦＡＰにてコートし、その後Ｆａｂ含有細菌上清物の添加、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を用いたそれらのＦｌａｇ-タグによる特異的結合Ｆａｂの検出を行った。
ＥＬＩＳＡポジティブクローンを、９６ウェルフォーマット中で１ｍｌの培養物として細菌を用いて発現させ、上清物をＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ１００を用いた動態学的スクリーニング実験に用いた。
【０１１６】
実施例８
異なる形態の標的化ＩＬ-２の有効性研究
有効性実験は、腫瘍間質に特異的な２つの異なるインターロイキン-２イムノコンジュゲート分子形態を使用して実施した。Ｆ９奇形癌腫を、１２９ＳｖＥｖマウスに皮下注入し、カリパスを用いて腫瘍サイズを測定した。２つの異なる濃度の「ダイアボディ」−ＩＬ-２分子を、Ｆａｂ−インターロイキン-２−Ｆａｂ(Ｆａｂ−ＩＬ２-Ｆａｂ)イムノコンジュゲートと比較した。この濃度はおよその数のイムノコンジュゲート分子を表す。結果を図３に示す。Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートは、有意な腫瘍成長阻害を示し、２つの異なる濃度のダイアボディ形態及びコントロールよりも良好である。 
また、腫瘍間質に特異的な２つの異なるインターロイキン-２イムノコンジュゲート分子形態にて処理したマウスの生存を試験した。ヒト胃腫瘍細胞株ＬＳ１７４Ｔを、ＳＣＩＤ−ベージュマウスの脾臓内に注入した。２つの異なる濃度の「ダイアボディ」−ＩＬ-２分子を、Ｆａｂ−ＩＬ-２−Ｆａｂイムノコンジュゲートと比較した。この濃度はおよその数のイムノコンジュゲート分子を表す。結果を図４に示す。Ｆａｂ−ＩＬ-２−ａｂ形態は、ダイアボディ形態およびコントロールと比較して高い割合の生存を示した。
【０１１７】
実施例９
組換えＤＮＡ技術
Sambrook, J. etal., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されるように、標準的な方法を用いてＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は製造業者の指示に従って用いた。
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242に示されている。 
【０１１８】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は二本鎖配列決定法にて測定した。
【０１１９】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、自動化した遺伝子合成により合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲ生成物からＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ社(Regensburg, Germany)により調製した。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位が隣接している遺伝子セグメントを、ｐＧＡ18(ａｍｐＲ)プラスミドにクローニングした。プラスミドＤＮＡを形質転換細菌から精製し、ＵＶ分光法にて濃度を測定した。サブクローニングした遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントを適切な制限部位にて消化し、各発現ベクターにサブクローニングした。すべてのコンストラクトは、真核細胞内の分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする５'末端ＤＮＡ配列にて消化した。表１３および１４はそれぞれ、それらをコードする例示的なリーダーペプチドとポリヌクレオチド配列を示す。
【０１２０】
【表１３】
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【表１４】
0005764127.tif 000068
【０１２１】
イムノコンジュゲートの調製
結果として生じたＤＮＡ配列を、哺乳動物発現ベクター（軽鎖のために１つ、重鎖／融合タンパク質のために１つ）内の、ＭＰＳＶプロモーターの制御下かつ合成ポリＡ部位の上流にサブクローニングした。各ベクターはＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を持っている。
下記の実施例に適したイムノコンジュゲートは、リン酸カルシウム-形質移入を使用して、哺乳動物発現ベクターにて指数関数的に増殖するＨＥＫ２９３-ＥＢＮＡ細胞を同時形質移入して生産した。あるいは、懸濁液中で増殖するＨＥＫ２９３細胞にポリエチレンイミン(ＰＥＩ)によって発現ベクターを形質移入するか、又は安定して形質移入されたＣＨＯ細胞プールを用いた。３Ｆ２および４Ｇ８ベースのＦＡＰ標的化Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクトは、プロテインＡマトリクスを用いた親和性クロマトグラフィによって精製されうるのに対して、２Ｂ１０ベースのＴＮＣ Ａ２標的化Ｆａｂ−ＩＬ２−ＦａｂコンストラクトはプロテインＧマトリクスの親和性クロマトグラフィによって精製しなければならない。
【０１２２】
簡単に言うと、ＴＮＣ Ａ２標的化２Ｂ１０ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂは、一アフィニティ工程(プロテインＧ)の後にサイズ排除クロマトグラフィ(Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００, GE Healthcare)を行って上清から精製した。プロテインＧカラムは２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム ｐＨ７．５に平衡化し、上清をロードし、カラムを２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５にて洗浄した。Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂは８．８ｍＭ 蟻酸ｐＨ３にて溶出した。溶出した分画をプールし、最終製剤バッファ：２５ｍＭ リン酸カリウム、１２５ｍＭ 塩化ナトリウム、１００ｍＭ グリシンｐＨ６．７にサイズ排除クロマトグラフィによって精製した。図５３は、精製および分析の例示的な結果を示す。
ＦＡＰ標的化３Ｆ２ Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂ又は４Ｇ８ Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂは、一アフィニティ工程(プロテインＡ)の後にサイズ排除クロマトグラフィ(Superdex 200, GE Healthcare)からなる同様の方法によって精製した。プロテインＡカラムは２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウムｐＨ７．５に平衡化し、上清をロードし、カラムを２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．５にて洗浄した後に、１３．３ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ５．４５にて洗浄した。場合によって３度目に１０ｍＭ ＭＥＳ、５０ｍＭ 塩化ナトリウムｐＨ５にて洗浄した。Ｆａｂ-ＩＬ2-Ｆａｂは、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、１００ｍＭ グリシン、ｐＨ３にて溶出した。溶出した分画をプールし、最終製剤バッファ：２５ｍＭ リン酸カリウム、１２５ｍＭ 塩化ナトリウム、１００ｍＭ グリシンｐＨ６．７にサイズ排除クロマトグラフィによって精製した。
【０１２３】
実施例１０
更なる抗ＦＡＰ親和性成熟ライブラリ(クローン３Ｆ２、３Ｄ９、４Ｇ８、４Ｂ３および２Ｃ６に基づく)の構築
抗ＦＡＰ抗体の第一親和性成熟キャンペーンから予め選択した交差反応性の抗体、すなわち、クローン３Ｆ２、３Ｄ９、４Ｇ８、４Ｂ３及び２Ｃ６を基礎として、さらに４つの親和性成熟ライブラリを構築した(３Ｆ２の可変領域配列に対応する表３の配列番号：１７および２１；３Ｄ９の可変領域配列に対応する表３の配列番号：２３および２５；４Ｂ３の可変領域配列に対応する表３の配列番号：３３および３５；２Ｃ６の可変領域配列に対応する表３の配列番号：４１および４３)。より正確に言うと、４つのライブラリは、１)抗ＦＡＰクローン３Ｆ２、４Ｇ８および４Ｂ３(可変重鎖のＣＤＲ１および２においてランダム化したＶＨライブラリ、すなわちＨ１／Ｈ２ライブラリ)、２)抗ＦＡＰクローン３Ｄ９および２Ｃ６(可変軽鎖のＣＤＲ１および２においてランダム化したＶＬライブラリ、すなわちＬ１／Ｌ２ライブラリ)、３)抗ＦＡＰクローン３Ｆ２(軽鎖のＣＤＲ３にソフトランダム化を持つＬ３ライブラリ、すなわちＬ３ライブラリ)および４)抗ＦＡＰクローン３Ｆ２(重鎖のＣＤＲ３にソフトランダム化を持つＨ３ライブラリ、すなわちＨ３ライブラリ)に基づく。それぞれＬ１／Ｌ２およびＨ１／Ｈ２ライブラリには、抗ＦＡＰ抗体の第一親和性成熟キャンペーンで概説したのと全く同じように、最初の２つのライブラリを構築した。これに対して、クローン３Ｆ２に基づくＬ３およびＨ３親和性成熟ライブラリには、２つの新規なプライマーを用いて、親のクローンのＬ３(ＡＭ＿３Ｆ２＿ＤＰＫ２２＿Ｌ３＿ｂａ：CACTTTGGTCCCCTGGCCGAACGT CGGGGGAAGCA TAATACCCTGCTGACAGTAATACACTGC、下線を付した塩基は６０％が所定の塩基で４０％が混合物Ｎ(４つのヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧおよびＴの混合物)である)、及びＨ３(ＡＭ＿３Ｆ２＿ＤＰ４７＿Ｈ３＿ｆｏ：GGCCGTATATTACTGTGCG AAA GGG TGG TTT GGT GGT TTT AAC TACTGGGGCCAAGGAAC、下線を付した塩基は６０％が所定の塩基で４０％が混合物Ｎであり、イタリック体の塩基は６０％が所定の塩基で４０％がＧ、並びにイタリック体の下線を付した塩基は６０％が所定の塩基で４０％が混合物Ｋ(２つのヌクレオチドＧおよびＴの混合物)である)にソフトランダム化を導入した。ライブラリサイズは以下のようになった。Ｈ１／Ｈ２ライブラリ(１．１３×１０１０)、Ｌ１／Ｌ２ライブラリ(５．６×１０９)、Ｌ３ライブラリ(２．３×１０１０)およびＨ３ライブラリ(２．６４×１０１０)。
【０１２４】
実施例１１
親和性成熟抗ＦＡＰクローンの選別
６×リジンおよび６×ｈｉｓタグの上流にクローニングしたヒト及びネズミ科の線維芽細胞活性化タンパク質(ＦＡＰ)の外部ドメインに対して選別を行った(表５の配列番号：５３および５５を参照)。ライブラリ及び選別のラウンドに応じて、１μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ又は０．０２μｇ／ｍｌの濃度の抗原をイムノチューブにコートした。抗ＦＡＰ抗体の第一親和性成熟キャンペーンについて記述したように、選別およびＥＬＩＳＡベースのスクリーニングを行った。二次スクリーニングはＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６バイオセンサ(Biorad)を使用して行い、動態学的速度定数および親和性を同じ計測器上で親和性精製したＦａｂ調製物を分析して決定した。以下の親和性成熟クローンを識別した。１９Ｇ１(表３の配列番号：１２１および１２３を参照)、２０Ｇ８(表３の配列番号：１２５および１２７を参照)、４Ｂ９(表３の配列番号：１２９および１３１を参照)、５Ｂ８(表３の配列番号：１３３および１３５を参照)、５Ｆ１(表３の配列番号：１３７および１３９を参照)、１４Ｂ３(表３の配列番号：１４１および１４３を参照)、１６Ｆ１(表３の配列番号：１４５および１４７を参照)、１６Ｆ８(表３の配列番号：１４９および１５１を参照)、Ｏ３Ｃ９(表３の配列番号：１５３および１５５を参照)、２２Ａ３(表３の配列番号：１６５および１６７を参照)、及び２９Ｂ１１(表３の配列番号：１６９および１７１を参照)(これらすべてのクローンはＨ１／Ｈ２ライブラリから選択し、親のクローン３Ｆ２から得た)、Ｏ２Ｄ７(表３の配列番号：１５７および１５９を参照)(親のクローン３Ｆ２に基づいてＬ３ライブラリから選択した)、及び２８Ｈ１(表３の配列番号：１６１および１６３を参照)および２３Ｃ１０(表３の配列番号：１７３および１７５を参照)(これら２つのクローンはＨ１／Ｈ２ライブラリから選択し、親のクローン４Ｇ８から得た)。
図２１−２５は、ＦＡＰに対する選択した親和性成熟Ｆａｂの表面プラズモン共鳴を示し、表１５は各々の親和性を示す。選択したＦａｂは、ｐＭからｎＭの高親和性範囲を持ち、選択したクローンについて測定したように、ヒト(ｈｕ)及びネズミ科(ｍｕ)ＦＡＰ並びにカニクイザル(ｃｙｎｏ)ＦＡＰについて交差反応性である。親和性成熟した抗ＦＡＰ ＦａｂをＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ形態に変換した。結合の特異性は、ＨＥＫ２９３又はＣＨＯ細胞に発現される、ＦＡＰに非常にホモログなＤＰＰＩＶへ結合しないことから示される。
【０１２５】
【表１５】
0005764127.tif 000069
【０１２６】
実施例１２
抗ＴＮＣ Ａ２親和性成熟ライブラリの構築(クローン２Ｂ１０に基づく)
親和性成熟ライブラリは、一次ＴＮＣ Ａ２選別から予め選択した抗体に基づいて構築した。より正確に言うと、それは、親のクローン２Ｂ１０に基づいており、２つのサブライブラリからなる。１) 軽鎖(Ｌ１／Ｌ２)のＣＤＲ１およびＣＤＲ２をランダム化したＶＬサブライブラリ、及び２) 重鎖(Ｈ１／Ｈ２)のＣＤＲ１およびＣＤＲ２をランダム化したＶＨサブライブラリ。これらのサブライブラリは形質転換によりプールした。これら各サブライブラリは、増幅およびアセンブリの４つの連続した工程により構築した。Ｌ１／Ｌ２ライブラリでは、１)フラグメント１(ＬＭＢ３−ＡＭ＿Ｖｋ１Ａ３０＿Ｌ１＿ｂａ)およびフラグメント２(ＲＪＨ５０(Ｖｋ１Ａ３０＿Ｌ１／Ｌ２＿ｆｏ)−ＲＪＨ５１(Ｖｋ１Ａ３０＿ＢｓｉＷＩ＿ｂａ))の増殖、２) 外側のプライマーＬＭＢ３およびＲＪＨ５１(Ｖｋ１Ａ３０＿ＢｓｉＷＩ＿ｂａ)を用いてフラグメント１および２をアセンブリし、鋳型を作製、３)フラグメント３(ＬＭＢ３−ＡＭ＿Ｖｋ１Ａ３０＿Ｌ２＿ｂａ及びフラグメント４(ＲＪＨ５２(Ｖｋ１Ａ３０＿Ｌ２／Ｌ３)−ＲＪＨ５１(Ｖｋ１Ａ３０＿ＢｓｉＷＩ＿ｂａ))の増幅、そして、４)上記と同じ外側のプライマーを用いてフラグメント３および４の最終アセンブリ。Ｈ１／Ｈ２ライブラリでは、１)フラグメント１(ＲＪＨ５３−ＡＭ＿ＤＰ８８＿Ｈ１＿ｂａ＿ｏｐｔ)およびフラグメント２(ＲＪＨ５４(ＤＰ８８＿Ｈ１／Ｈ２＿ｆｏ)−ＭＳ５２)の増殖、２)外側のプライマーＲＪＨ５３およびＭＳ５２を用いてフラグメント１および２のをアセンブリし、鋳型を作製、３)フラグメント３(ＲＪＨ５３−ＡＭ＿ＤＰ８８＿Ｈ２＿ｂａ)およびフラグメント４(ＲＪＨ５５(ＤＰ８８＿Ｈ２Ｈ３＿ｆｏ)−ＭＳ５２)の増幅、そして、４)上記と同じ外側のプライマーを用いてフラグメント３および４の最終アセンブリ。最終アセンブリ生成物は、ＶＬサブライブラリについてはＮｃｏＩ／ＢｓｉＷＩ、そしてＶＨサブライブラリについてはＭｕｎＩ及びＮｈｅＩ消化し、同様に消化したアクセプタベクターにクローニングした。ライブラリサイズは１．１６×１０１０の独立したクローンとなった。
【０１２７】
【表１６】
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【表１７】
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【０１２８】
実施例１３
親和性成熟した抗ＴＮＣ Ａ２クローンの選別
ａｖｉ-タグおよび６×ｈｉｓ-タグの上流にクローニングしたヒトＴＮＣ Ａ２を発現する大腸菌に対して選別を行った(表５の配列番号：５７を参照)。抗原は、発現の際にインビボでビオチン化された。１００から２ｎＭのヒトＴＮＣ Ａ２の漸減濃度を用いて、一次ＴＮＣ Ａ２選別について記述したように、溶液中で選別を行った。ＥＬＩＳＡによる親和性成熟クローンの識別の後、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６バイオセンサ(Biorad)を用いて二次スクリーニングを行い、動態学的速度定数および親和性を同じ計測器上で親和性精製したＦａｂ調製物を分析して決定した。以下の親和性成熟クローンが識別された。２Ｂ１０＿Ｏ１Ｆ７(表３の配列番号：２０１および２０３を参照)、２Ｂ１０＿６Ｈ１０(表３の配列番号：２０５および２０７を参照)、２Ｂ１０＿Ｃ３Ａ６(表３の配列番号：１８５および１８７を参照)、２Ｂ１０＿Ｄ１Ａ２(表３の配列番号：１８９および１９１を参照)、及び２Ｂ１０＿Ｏ７Ｄ８(表３の配列番号：１９７および１９９を参照)(これらすべてはＶＬサブライブラリから得た)、並びに２Ｂ１０＿Ｃ３Ｂ６(表３の配列番号：１７７および１７９を参照)および２Ｂ１０＿６Ａ１２(表３の配列番号：１８１および１８３を参照)(これら２つのクローンはＶＨサブライブラリから得た)。さらに、クローン２Ｂ１０＿Ｄ１Ａ２では、Ｖ３２Ｄ変異体を生成した(カバット番号付けに従う)(表３の配列番号：１９３および１９５を参照)。
図２６は、ＴＮＣ Ａ２に対する選択した親和性成熟Ｆａｂの表面プラズモン共鳴を示し、表１８は各々の親和性を示す。選択したＦａｂはｐＭの高親和性範囲を持つ。
【表１８】
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【０１２９】
実施例１４
２Ｂ１０、３Ｆ２および４Ｇ８ベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクトの精製
２Ｂ１０、３Ｆ２および４Ｇ８ベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクトのために他の精製法(実施例９に記載のものに加えて)を開発した。３Ｆ２および４Ｇ８ベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクトは、プロテインＡマトリクスを使用した親和性クロマトグラフィ(例えばＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ)にて精製されうるが、２Ｂ１０ベースのＦａｂ−ＩＬ２−ＦａｂコンストラクトはプロテインＧマトリクス上での親和性クロマトグラフィによって精製しなければいけない。精製手順は以下の４つの工程に基づく。
１．ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ又はプロテインＧによる親和性クロマトグラフィ
２．レトロウイルス不活性を維持する低ｐＨ
３．ＤＮＡを除去するための、陰イオン交換クロマトグラフィ−ＣａｐｔｏＱクロマトグラフィ
４．凝集物を除去するための、陽イオン交換クロマトグラフィ−ＳＰセファロースＦＦクロマトグラフィ
あるいは、小規模で凝集物を除去するために、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムのサイズ排除クロマトグラフィ(GE Healthcare)を用いることもできる。
【０１３０】
精製手順の例は以降、３Ｆ２ベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂついて示す。第一工程では、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地(Invitrogen)中の一過性ＰＥＩ−形質移入ＨＥＫ２９３細胞の上清をｐＨ７に調整し、ＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡカラム(GE Healthcare)に加え、１００ｍＭ ＮａＰＯ４、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７にて洗浄し、そして、８．８ｍＭ ナトリウムギ酸塩、ｐＨ３にて溶出した。選択した分画は、洗浄バッファに交換し、ＣａｐｔｏＱカラム(GE Healthcare)に加え、１０ｍＭ ＮａＰＯ４、４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５にて洗浄し、２Ｍ ＮａＣｌにて溶出した。フロースルーをｐＨ５に調整し、ＳＰセファロースＦＦカラム(GE Healthcare)に加え、２５ｍＭ 酢酸ナトリウム、２５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５にて洗浄し、２５ｍＭ 酢酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５にて溶出した。分画は最終製剤バッファに交換した。図２７は精製手順の概要を示す。
精製した３Ｆ２ベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂは精製後純粋であり(図２８Ａ)、凝集物を含んでいなかった(図２８Ｂ)。記述した精製手順は４Ｇ８ベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂにも応用した。４Ｇ８ベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂは３Ｆ２ベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂと同様な動態であった。精製した材料は精製の後純粋であり、凝集物を含んでいなかった(図２８Ｃ−Ｄ)。
【０１３１】
Ｆａｂフラグメントとして２Ｂ１０(ＴＮＣ Ａ２結合体)を有するＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ形態についても精製を行った。第一工程では、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地(Invitrogen)中の一過性ＰＥＩ−形質移入ＨＥＫ２９３細胞の上清をｐＨ７に調整し、プロテインＧカラム(GE Healthcare)に加え、１００ｍＭ ＮａＰＯ４、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７にて洗浄し、そして、８．８ｍＭ ナトリウムギ酸塩、ｐＨ３にて溶出した。選択した分画は、洗浄バッファに交換し、ＣａｐｔｏＱカラム(GE Healthcare)に加え、１０ｍＭ ＮａＰＯ４、４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５にて洗浄し、２Ｍ ＮａＣｌにて溶出した。フロースルーをｐＨ５に調整し、ＳＰセファロースＦＦカラム(GE Healthcare)に加え、２５ｍＭ 酢酸ナトリウム、２５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５にて洗浄し、２５ｍＭ 酢酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５にて溶出した。分画は最終製剤バッファに交換した。
図２９は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ(NuPAGE Novex ビス-トリス ミニゲル, Invitrogen, ＭＯＰＳランニングバッファ, 還元及び非還元)による生成物の分析的特徴付け(Ａ)、及び３つ各々の精製工程後の生成物の分析的サイズ排除クロマトグラフィ(Ｂ)を示す。最終生成物中に２．３％の凝集物が検出された。
【０１３２】
実施例１５  安定性試験
Ｆａｂフラグメントとしてフィブロネクチン外ドメインＢ結合体Ｌ１９を有するＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ形態について安定性試験を行った。安定性試験のために、Ｆａｂ−ＩＬ２−ＦａｂコンストラクトをプロテインＡ親和性クロマトグラフィによって精製し、ｐＨ３で溶出した後、記載したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム(GE Healthcare)によるサイズ排除クロマトグラフィを行った。３つの異なるバッファを試験し、２０ｍＭ ヒスチジンＨＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０を適切なバッファとした。その後、Ｌ19 Ｆａｂ-ＩＬ2-Ｆａｂは、６．３ｍｇ／ｍｌの濃度で２０ｍＭ ヒスチジンＨＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中に調製し、室温及び４℃で４週間保存した。図３０は例示的な安定性データを示す。プローブは、ＵＶ分光法により濃度を(図３０Ａ)(ペレット前の沈殿物質に遠心分離した後)、そして、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムによる分析的サイズ排除クロマトグラフィにより凝集内容を(図３０Ｂ)毎週分析した。結果は、コンストラクトが６ｍｇ／ｍｌの濃度で４℃又は室温で２８日間保存されたとき、並びに凍結／解凍を繰り返した後にも、凝集も分解も起こらなかったことを示す。これらのデータは、Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ形態が非常に安定であり、ＩｇＧ抗体に値する動態であることを示す。
【０１３３】
実施例１６  表面プラスモン共鳴(Ｂｉａｃｏｒｅ)によるＦＡＰ標的化Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ結合親和性
３つのＦＡＰ標的化Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクト、３Ｆ２ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ、４Ｇ８ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂおよび３Ｄ９ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂの結合親和性を、表面プラズモン共鳴にて測定した。
ＦＡＰ結合を測定するため、ＦＡＰを固定した抗Ｈｉｓ抗体(ペンタＨｉｓ、Ｑｉａｇｅｎ＃３４６６０)にて捕捉し、コンストラクトを分析物として用いた。分析の温度は２５℃とし、Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂコンストラクトを１０ｎＭから３．２ｐＭまで１:５に希釈した。以下の測定値パラメータを用いた。会合時間 １８０秒、解離 ９００秒、流速 ９０μｌ／分。チップは、６０秒間、１０ｍＭ グリシンｐＨ２にて再生した。曲線を１：１モデルにフィッティングし、ＫＤ値(Ｒｍａｘ局所、ＲＩ＝０)を求めた。 
ＩＬ-２レセプター(ＩＬ-２Ｒ)鎖の親和性を決定するために、ＩＬ-２Ｒのβおよびγ鎖(ｂ／ｇ；ノブ-イントゥ-ホール コンストラクト)又はα鎖(ａ)をチップに固定し、Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクトを分析物として用いた。分析の温度は２５℃とした。Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂコンストラクト３Ｆ２及び３Ｄ９を２５ｎＭから０．７８ｎＭまで１:２に希釈し、以下の測定値パラメータを用いた。会合時間 １００秒、解離 １８０秒、流速９０μｌ／分。２０秒間、１０ｍＭ グリシンｐＨ１．５にて再生した。Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂコンストラクト４Ｇ８は、１００ｎＭから３．１２５ｎＭに希釈し、以下の測定値パラメータを用いた。会合時間 １８０秒、解離 １８０秒、流速４０μｌ／分。３０秒間、３Ｍ ＭｇＣｌ２による再生。
表１９は、３Ｆ２ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ、４Ｇ８ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂおよび３Ｄ９ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの結合親和性の概要を示す。親和性のピコモル値はＢｉａｃｏｒｅの検出限界に達する。図３１−３４は、それぞれＢｉａｃｏｒｅセンサグラムおよび親和性を示す。
【表１９】
0005764127.tif 000073
【０１３４】
実施例１７
表面プラズモン共鳴(Ｂｉａｃｏｒｅ)によるＴＮＣ Ａ２標的化Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂ結合親和性
ＴＮＣ Ａ２結合を決定するために、ビオチン化抗原(ＴＮＣ ｆｎ５−Ａ１−Ａ２−Ａ３ドメイン、融合、大腸菌で発現、ｆｎ５およびＡ３ドメインは常にヒト起源であるのに対して、Ａ１およびＡ２ドメインはヒト、ネズミ科又はカニクイザルである)をストレプトアビジンチップ上に固定し、イムノコンジュゲートコンストラクトを分析物として用いた。分析の温度は２５℃とした。Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂは２５ｎＭから０．３９ｎＭの１:２希釈し、以下の測定値パラメータを用いた。会合時間 １８０秒、解離 １８０秒、流速５０μｌ／分。６０秒間、１０ｍＭ グリシンｐＨ１．５による再生。曲線を１：１モデルにフィッティングし、ＫＤ値を求めた。ネガティブコントロールとして、ＨＥＫ細胞で生産されるＴＮＣドメイン１から８を用いた(ＴＮＣ１-８ＨＥＫ)。
ＩＬ-２レセプター(ＩＬ-２Ｒ)β及びγ鎖(ｂ／ｇ；ノブ-イントゥ-ホール コンストラクト)の親和性を測定するために、ＩＬ-２Ｒコンストラクトをチップに固定し、Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートを分析物として用いた。分析の温度は２５℃とした。Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂイムノコンジュゲートは２５ｎＭから０．７８ｎＭの１:２希釈し、以下の測定値パラメータを用いた。会合時間 １００秒、解離 １８０秒、流速９０μｌ／分。２０秒間、１０ｍＭ グリシンｐＨ１．５にて再生を行った。Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂコンストラクトは、１００ｎＭから３．１２５ｎＭに希釈し、以下の測定値パラメータを用いた。会合時間 １８０秒、解離 １８０秒、流速４０μｌ／分。３０秒間、３Ｍ ＭｇＣｌ２による再生。表２０は２Ｂ１０ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの結合親和性の概要を示し、図３５は各々のＢｉａｃｏｒｅセンサグラムおよび親和性を示す。
【０１３５】
【表２０】
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【０１３６】
実施例１８
標的化ＩＬ-２ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートによる生物学的活性アッセイ
標的化ＩＬ-２ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの生物活性は、ＩＬ-２(プロリュウキン)と比較して、いくつかの細胞アッセイにおいて調査した。
【０１３７】
ＮＫ９２細胞の増殖の誘導 
ＴＮＣ Ａ２(２Ｂ１０)又はＦＡＰ(３Ｆ２および４Ｇ８)を認識する標的化ＩＬ-２ Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂ分子は、フィブロネクチン-ＥＤＢを認識するＩＬ-２(プロリュウキン)およびＩＬ-２ Ｌ１９ ダイアボディと比較して、ＮＫ９２細胞の増殖を誘導する能力について調べた。
２μｇ／ｍｌのヒトテネイシン、ＦＡＰ又はフィブロネクチンを９６ウェル平底ＥＬＩＳＡプレートに４℃で終夜かけてコートした。プレートをブロックした後、Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクト又はダイアボディをプレートに滴定し、結合のために室温(ＲＴ)で９０分間インキュベートした。結合していないコンストラクトを取り除くために集中的に洗浄した後、ＩＬ-２飢餓ＮＫ９２細胞(１００００細胞／ウェル)を加えた。ポジティブコントロールとして、プロリュウキンをいくつかのウェルの溶液中に加えた。細胞は、加湿インキュベーター(５％ＣＯ２)中で３７℃で２日間インキュベートし、細胞を溶解して、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏキット(Promega)を用いてＡＴＰ測定値によって増殖を決定した。
図３６の結果は、すべてのＦａｂ−ＩＬ２−ＦａｂコンストラクトがＮＫ９２細胞上のＩＬ-２Ｒシグナル伝達を活性化し、それらの増殖を刺激することが可能であったことを示す。シグナル伝達に必要なＩＬ-２Ｒβ／γヘテロ二量体の結合親和性が低減しているので、細胞成長を誘導する作用は、ＩＬ-２(プロリュウキン)と比較しておよそ１０分の１以下に低減した。しかしながら、高用量での全体の有効性は維持され、ＩＬ-２(プロリュウキン)と同等であった。
【０１３８】
ＳＴＡＴ５リン酸化の誘導
更なる試験において、発明者等は、溶液中で、ヒトＰＢＭＣからの、Ａ) ＣＤ５６＋ＮＫ細胞、Ｂ) ＣＤ４＋ＣＤ２５-ＣＤ１２７＋ヘルパーＴ細胞、Ｃ) ＣＤ３＋, ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞およびＤ) ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋調節Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)を含む異なるエフェクター細胞群上の、ＦＡＰを認識するＩＬ-２ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ分子(４Ｇ８に基づく)と共にインキュベートした後のＩＬ-２媒介性ＩＬ-２Ｒシグナル伝達の結果としてのＳＴＡＴ５リン酸化の誘導を試験した。
提供者の指示に従って、健康なドナーの血液から単離したＰＢＭＣを、固定／透過、及び抗ホスホＳＴＡＴ５抗体(Becton Dickinson)にて染色する前に、異なる濃度のプロリュウキン又はＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂにて２０分間処理した。リン酸化したＳＴＡＴ５並びにＦＯＸＰ３の細胞内染色の後、フローサイトメトリ(ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ)によって異なるサブ集団を決定するために、表面マーカー(ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５６およびＣＤ１２７)を染色した。
図３７の結果は図３６の所見を裏付けるものであり、４Ｇ８ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクトが様々なＩＬ-２Ｒポジティブエフェクター細胞上のＩＬ-２Ｒシグナル伝達を活性化し、ＩＬ-２Ｒ下流のシグナル伝達およびＳＴＡＴ５リン酸化を誘導することが可能であったことを示す。シグナル伝達に必要なＩＬ-２Ｒβ／γヘテロ二量体に対する結合親和性が低減していたので、ＳＴＡＴ５リン酸化を誘導する作用は、ＩＬ-２(プロリュウキン)と比較しておよそ１０分の１以下に低減していた。しかしながら、高用量での全体の有効性は維持され、ＩＬ-２(プロリュウキン)と同等であった。
【０１３９】
溶液中及び固定によるＩＦＮ-γ放出および増殖誘導
更なる試験では、発明者等は、標的化ＩＬ-２イムノコンジュゲートが結合し、腫瘍細胞又は腫瘍間質上に固定され、そして、エフェクター細胞を活性化しうる腫瘍で生じる状況を再現することを目的とした。このために、発明者等は、溶液中で、ＮＫ９２細胞によるＩＦＮ-γ放出アッセイ並びにイムノコンジュゲートによる増殖アッセイを行うか、あるいは、発明者等は、ＴＮＣ又はＦＡＰ抗原にてマイクロタイタープレートをコートして、標的化ＩＬ-２イムノコンジュゲートをＴＮＣ又はＦＡＰへの結合によって固定した。
２μｇ／ｍｌのヒトテネイシン又はＦＡＰを９６ウェル平底ＥＬＩＳＡプレートに４℃で終夜かけてコートした。プレートをブロックした後に、Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクトをプレートに滴定し、結合のためにＲＴで９０分間インキュベートした。結合していないコンストラクトを除去するために集中的に洗浄した後、ＩＬ-２飢餓ＮＫ９２細胞(１００００細胞／ウェル)を加えた。ポジティブコントロールとして、プロリュウキンをいくつかのウェルの溶液中に加えた。増殖を測定するために、細胞は、加湿インキュベーター(５％ＣＯ２)中で３７℃で２日間インキュベートし、細胞を溶解して、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏキット(Promega)を用いてＡＴＰ測定値によって増殖を決定した。ＩＦＮ-γの放出は、Becton DickinsonのヒトＩＦＮ-γＥＬＩＳＡキットにて細胞の上清中でＦａｂ−ＩＬ-２−Ｆａｂと共に２４時間インキュベートした後に、異なる手法で測定した。
この結果は、ＦＡＰ、ＴＮＣ Ａ１又はＴＮＣ Ａ２を標的とするすべてのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクトが、ＮＫ９２細胞上のＩＬ-２Ｒシグナル伝達を活性化し、その細胞の増殖(図３８Ａ)並びに溶液中に存在する場合にはＩＦＮ-γ分泌(図３８Ｃ)を誘導したことを裏付けるものであった。シグナル伝達に必要なＩＬ-２Ｒβ／γヘテロ二量体の結合親和性が低減しているので、ＩＦＮ-γ放出を誘導する作用は、ＩＬ-２(プロリュウキン)と比較しておよそ１０分の１以下に低減した。しかしながら、高用量での全体の有効性は維持され、ＩＬ-２(プロリュウキン)と同等であった。マイクロタイタープレートをＦＡＰ又はＴＮＣにてコートし、コンストラクトをプレートに固定した場合、ＦＡＰ、ＴＮＣ Ａ１又はＴＮＣ Ａ２を標的とするすべてのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクトは、ＮＫ９２細胞上のＩＬ-２Ｒシグナル伝達を活性化して、細胞成長(図３８Ｂ)およびＩＦＮ-γ放出(図３８Ｄ)を誘導することが依然として可能であった。溶液中で行ったアッセイと比較して、コーティングしてないＩＬ-２(プロリュウキン)と固定したＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクトとの間の有効性の相違は一桁大きかったが、高用量での有効性は維持されており、ＩＬ-２(プロリュウキン)と同等であった。
これらのデータは、全身の曝露は低いが、機能を媒介する疾患の部位に集積する標的化イムノコンジュゲートを生成するというコンセプトを強く支持する。
以下の実施例では、発明者等は、これらのインビトロ特性が異種移植片モデルにおいてインビボで優れた有効性を示すか否かを調べた。
【０１４０】
実施例１９  ヒト腫瘍細胞株の異種移植片におけるＦＡＰ及びＴＮＣ Ａ２に対する標的化Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートのインビボ有効性
いくつかの異種移植片モデルにおいて、ＦＡＰおよびＴＮＣ Ａ２に対する標的化Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂイムノコンジュゲートをそれらの抗腫瘍有効性について試験した。
【０１４１】
ＬＳ１７４Ｔ異種移植片モデル
ＴＮＣ Ａ２標的化２Ｂ１０ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートは、ＳＣＩＤマウスの脾臓内に注入したヒト結腸直腸ＬＳ１７４Ｔ細胞株において試験した。
元々はＥＣＡＣＣ(細胞培養物の欧州保存機関)から入手したＬＳ１７４Ｔ細胞(ヒト大腸カルシノーマ細胞)を増殖させた後Ｇｌｙｃａｒｔ内部細胞貯蔵所に寄託した。ＬＳ１７４Ｔは、１０％ＦＣＳ(PAA Laboratories, Austria)、１％Ｇｌｕｔａｍａｘおよび１％ＭＥＭ非必須アミノ酸(Sigma)を含有するＭＥＭ イーグルズ培地中で培養した。細胞は、５％ＣＯ２下、水飽和した空気中、３７℃で培養した。脾臓内注入には、９２．８％の生存度のインビトロ１５継代物を用いた。麻酔したＳＣＩＤ／ベージュマウスの左腹部に小さな切り傷を付けた。５０マイクロリットル(ＡｉｍＶ培地中３×１０６のＬＳ１７４Ｔ細胞)の細胞懸濁液を、腹壁を貫いて脾臓の莢膜直下に注入した。鉗子を用いて創傷を閉じた。
雌ＳＣＩＤマウス(実験開始時８−９週齢、Taconics, Denmarkから購入)は、預託ガイドライン(GV-Solas; Felasa; TierschG)に従って、１２時間明所／１２時間暗所の１日周期の特定病原体除去条件下で維持した。実験研究プロトコールは審査を受け、地方自治(Ｐ２００８０１６)に承認された。到着後、新しい環境に慣れさせるため、また観察のために動物を１週間維持した。継続的な健康管理を定期的に行った。
試験０日目にマウスの脾臓内に、３×１０６のＬＳ１７４Ｔ細胞を注入し、ランダム化し、計量した。腫瘍細胞注入の１週間後に、マウスに、ＴＮＣ Ａ２標的化２Ｂ１０ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ(Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ−ＳＨ２Ｂ１０)、フイブロネクチン-ＥＤＢ標的化Ｌ１９ ＩＬ-２−ダイアボディ又はプロリュウキンを、週２回、３週間静脈注射した。
すべてのマウスに、２００μｌの適切な溶液を静脈注射した。ベヒクル群のマウスにはＰＢＳを注射し、治療群にはＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクト、ダイアボディ又はプロリュウキンを注射した。２００μｌにつき適切な量のイムノコンジュゲートを得るために、必要に応じて原液をＰＢＳにて希釈した。
図３９は、ＴＮＣ Ａ２標的化２Ｂ１０ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートが、フィブロネクチン-ＥＤＢを標的とするネイキッドＩＬ-２(プロリュウキン)およびＩＬ-２ダイアボディ分子と比較して、生存中位値の向上において優れた有効性を示したことを示す。
【０１４２】
【表２１】
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【０１４３】
ＡＣＨＮ異種移植片モデル
ＦＡＰ標的化３Ｆ２又は４Ｇ８ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートは、ＳＣＩＤマウスの腎臓内に注入したヒト腎臓細胞株ＡＣＨＮにおいて試験した。
元々はＡＴＣＣ(米国培養細胞系統保存機関)から入手したＡＣＨＮ細胞(ヒト腎臓腺癌細胞)を増殖させた後Ｇｌｙｃａｒｔ内部細胞貯蔵所に寄託した。ＡＣＨＮは１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で培養した。細胞は、５％ＣＯ２下、水飽和した空気中、３７℃で培養した。腎臓内注入には、９７．７％の生存度のインビトロ９継代物を用いた。麻酔したＳＣＩＤマウスの右腹部かつ腹膜壁に小さい切り傷(２ｃｍ)を付けた。５０μｌ(ＡｉｍＶ培地中１×１０６のＡＣＨＮ細胞)の細胞懸濁液を腎臓内の２ｍｍの莢膜に注入した。鉗子を用いて創傷を閉じた。
雌ＳＣＩＤマウス(実験開始時８−９週齢、Charles River, Sulzfeld, Germanyから購入)は、預託ガイドライン(GV-Solas; Felasa; TierschG)に従って、１２時間明所／１２時間暗所の１日周期の特定病原体除去条件下で維持した。実験研究プロトコールは審査を受け、地方自治(Ｐ２００８０１６)に承認された。到着後、新しい環境に慣れさせるため、また観察のために動物を１週間維持した。継続的な健康管理を定期的に行った。
試験０日目にマウスの腎臓内に、１×１０６のＡＣＨＮ細胞を注入し、ランダム化し、計量したた。腫瘍細胞注入の１週間後に、マウスに、プロリュウキン、Ｌ１９ ＩＬ-２  ダイアボディ又はＦＡＰ標的化４Ｇ８又は３Ｆ２ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートを、週２回、３週間静脈注射した。
すべてのマウスに、２００μｌの適切な溶液を静脈注射した。ベヒクル群のマウスにはＰＢＳを注射し、治療群にはプロリュウキン、Ｌ１９ ＩＬ-２ダイアボディ又はＦＡＰ標的化４Ｇ８又は３Ｆ２ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートを注射した。２００μｌにつき適切な量のイムノコンジュゲートを得るために、必要に応じて原液をＰＢＳにて希釈した。
図４０は、ＦＡＰ標的化３Ｆ２及び４Ｇ８ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートが、フィブロネクチン-ＥＤＢを標的とするネイキッドＩＬ-２(プロリュウキン)およびＩＬ-２ダイアボディ分子と比較して、生存中位値の向上において優れた有効性を示したことを示す。ネズミ科ＦＡＰに高い親和性を有する４Ｇ８ベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂが、３Ｆ２ベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂより優れた有効性を示した。
【０１４４】
【表２２】
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【０１４５】
Ａ５４９異種移植片モデル
ＴＮＣ Ａ２標的化２Ｂ１０ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートは、ＳＣＩＤ−ヒトＦｃγＲＩＩＩトランスジェニックマウスに静脈注射したヒトＮＳＣＬＣ細胞株Ａ５４９において試験した。
元々はＡＴＣＣ(ＣＣＬ−１８５)から入手したＡ５４９非小細胞肺カルシノーマ細胞を増殖させた後Ｇｌｙｃａｒｔ内部細胞貯蔵所に寄託した。腫瘍細胞株は通常通り、１０％ＦＣＳ(Gibco)を含むＤＭＥＭ中、５％ＣＯ２下、水飽和した空気中、３７℃で培養した。９８％の生存度の２継代物を移植に用いた。１動物につき２×１０６細胞を、２００μｌのＡｉｍＶ細胞培養培地(Gibco)に含め尾静脈へ注入した。
雌ＳＣＩＤ−ＦｃγＲＩＩＩマウス(ＧＬＹＣＡＲＴ-ＲＣＣ)(実験開始時８−９週齢、RCC, Switzerlandで交配)は、預託ガイドライン(GV-Solas; Felasa; TierschG)に従って、１２時間明所／１２時間暗所の１日周期の特定病原体除去条件下で維持した。実験研究プロトコールは審査を受け、地方自治(Ｐ２００８０１６)に承認された。到着後、新しい環境に慣れさせるため、また観察のために動物を１週間維持した。継続的な健康管理を定期的に行った。
試験０日目にマウスの静脈内に５×１０６のＡ５４９細胞を注入し、ランダム化し、計量した。腫瘍細胞注射の１週後に、マウスに、２Ｂ１０ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ又はＬ１９ ＩＬ-２ダイアボディを、週２回、３週間静脈注射した。
すべてのマウスに、２００μｌの適切な溶液を静脈注射した。ベヒクル群のマウスにはＰＢＳを注射し、治療群には２Ｂ１０ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂコンストラクト又はＬ１９ ＩＬ-２ダイアボディを注射した。２００μｌにつき適切な量のイムノコンジュゲートを得るために、必要に応じて原液をＰＢＳにて希釈した。
図４１は、ＴＮＣ Ａ２標的化２Ｂ１０ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートが、フィブロネクチン-ＥＤＢを標的とするＩＬ-２ダイアボディ分子と比較して、生存中位値の向上において優れた有効性を示したことを示す。
【０１４６】
【表２３】
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【０１４７】
実施例２０  標的化ＧＭ−ＣＳＦ Ｆａｂ−ＧＭ−ＣＳＦ−Ｆａｂイムノコンジュゲートの精製
ＦａｂフラグメントとしてＬ１９(フイブロネクチン外ドメイン-Ｂ結合体)を有するＦａｂ−ＧＭ−ＣＳＦ−Ｆａｂイムノコンジュゲートの最初の精製は、一過性形質移入ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞の上清から行った。簡単に言うと、Ｆａｂ−ＧＭ−ＣＳＦ−Ｆａｂは、プロテインＡの後にサイズ排除クロマトグラフィによって精製した。プロテインＡカラムは、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウムｐＨ７．５に平衡化した。上清をロードし、カラムを、始め２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ  ７．５にて、その後、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．５にて洗浄した。標的化ＧＭ−ＣＳＦを、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、１００ｍＭ グリシンｐＨ３にて溶出し、その後中和した。製剤化のために、以下のバッファを用いた。２５ｍＭ リン酸カリウム、１２５ｍＭ 塩化ナトリウム、１００ｍＭ グリシンｐＨ６．７。
図４２は、精製の溶出特性及び、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  ビス-トリス ミニゲル, Invitrogen, ＭＯＰＳランニングバッファ、還元及び非還元)による生成物の分析的特徴付けの結果を示す。収率は４．８ｍｇ／Ｌであった。
【０１４８】
実施例２１
標的化ＧＭ-ＣＳＦ Ｆａｂ-ＧＭ-ＣＳＦ-Ｆａｂイムノコンジュゲートによる生物学的活性アッセイ
続いて、ＦａｂとしてＬ１９(フイブロネクチン外ドメイン-Ｂ結合体)を有する精製したＦａｂ−ＧＭ-ＣＳＦ−Ｆａｂイムノコンジュゲートを、ＧＭ-ＣＳＦ依存性増殖アッセイにおいて分析した。簡単に言うと、ＧＭ-ＣＳＦ依存的に増殖するＴＦ−１細胞を、終夜をかけて飢餓状態にした後、９６ウェル平底プレート中１００００細胞／ウェルで播いた。ヒト組換えＧＭ−ＣＳＦ(Miltenyi #130-093-862)又はＦａｂ−ＧＭ-ＣＳＦ−Ｆａｂイムノコンジュゲートは、溶液中の細胞へ滴定した。５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中で３７℃で２日間増殖させた後、細胞を溶解し、ＡＴＰ内容物をPromegaのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイにて測定した。ＧＭ-ＣＳＦ未処置の細胞を計算のために０％の成長とした。図４３の結果は、Ｆａｂ−ＧＭ-ＣＳＦ−ＦａｂイムノコンジュゲートがＴＦ−１細胞の増殖を強力に誘導したことを示す。
【０１４９】
実施例２２  標的化ＩＬ−１２ Ｆａｂ−ＩＬ１２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの精製
Ｆａｂフラグメントとして４Ｇ８(ＦＡＰ結合体)を有するＦａｂ−ＩＬ１２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの最初の精製は、一過性形質移入ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞の上清から行った。簡単に言うと、Ｆａｂ−ＩＬ１２−Ｆａｂは、プロテインＡの後にサイズ排除クロマトグラフィによって精製した。プロテインＡカラムは、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウムｐＨ７．５に平衡化した。上清をロードし、カラムを、始め２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．５にて洗浄した。２回目の洗浄は、１３．３ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ５．４５にて行った。１０ｍＭ ＭＥＳ、５０ｍＭ 塩化ナトリウムｐＨ５による３回目の洗浄の後、標的化ＩＬ-１２は、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、１００ｍＭ グリシン、ｐＨ３にて溶出し、その後中和した。製剤化のために、以下のバッファを用いた。２５ｍＭ リン酸カリウム、１２５ｍＭ 塩化ナトリウム、１００ｍＭ グリシンｐＨ６．７。
図４４は、精製の溶出特性及び、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  ビス-トリス ミニゲル, Invitrogen, ＭＯＰＳランニングバッファ、還元及び非還元)による生成物の分析的特徴付けの結果を示す。収率は４３ｍｇ／Ｌであった。
【０１５０】
実施例２３
標的化ＩＬ-１２ Ｆａｂ-ＩＬ１２-Ｆａｂイムノコンジュゲートによる生物学的活性アッセイ
続いて、Ｆａｂとして４Ｇ８(ＦＡＰ結合体)を有する精製したＦａｂ−ＩＬ１２−Ｆａｂイムノコンジュゲートを、健康なドナーのヒト新鮮血液から単離したＰＢＭＣを用いて、ＩＬ−１２および精製した４Ｇ８ Ｆａｂ−ＩＬ１２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの効果と比較して、ＩＬ−１２誘導性ＩＦＮ-γ放出について分析した。
簡単に言うと、ＰＢＭＣを、健康なドナーのヒト新鮮血液から単離し、ＡＩＭ Ｖ培地の９６ウェルＵ底プレート(１.５×１０５細胞／ウェル)に播いた。一定濃度の１０ｎｇ／ｍｌのｈｕＩＬ-２(Peprotech)をすべてのウェルに加えた。Ｆａｂ−ＩＬ１２−Ｆａｂコンストラクトは培地で希釈し、ＰＢＭＣへ滴定した。Becton DickinsonのｈｕＩＦＮ-γＥＬＩＳＡキットＩＩ(＃550612)を用いて、およそ２０時間後に上清を採集し、ＩＦＮ-γ濃度を決定した。
図４５の結果は、選択した量のヒト(ｈｕ)ＩＬ-２単独並びにＩＬ-１２単独は、ヒトＰＢＭＣによるＩＦＮ-γ放出を有意に誘導できなかったのに対して、両サイトカインの組合せはＰＢＭＣによるＩＦＮ-γ放出を有意に引き起こした(Ａ)。Ｆａｂ−ＩＬ−１２−Ｆａｂコンストラクトは、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ-２の存在下で、濃度依存的な様式でヒトＰＢＭＣによるＩＦＮ-γ放出を誘導した(Ｂ)。
【０１５１】
実施例２４
標的化ＩＦＮ-α Ｆａｂ−ＩＦＮα２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの精製
ＦａｂフラグメントとしてＬ１９(フイブロネクチン外ドメイン-Ｂ結合体)を有するＦａｂ−ＩＦＮα２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの最初の精製は、一過性形質移入ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞の上清から行った。簡単に言うと、Ｆａｂ−ＩＦＮα２−Ｆａｂは、プロテインＡの後にサイズ排除クロマトグラフィによって精製した。プロテインＡカラムは、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウムｐＨ７．５に平衡化した。上清をロードし、カラムを、始め２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５にて、その後、２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．５にて洗浄した。Ｆａｂ−ＩＦＮα2−Ｆａｂを、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、１００ｍＭ グリシンｐＨ３にて溶出し、その後中和した。製剤化のために、以下のバッファを用いた。２５ｍＭ リン酸カリウム、１２５ｍＭ 塩化ナトリウム、１００ｍＭ グリシンｐＨ６．７。
図４６は、精製の溶出特性及び、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  ビス-トリス ミニゲル, Invitrogen, ＭＯＰＳランニングバッファ、還元及び非還元)による生成物の分析的特徴付けの結果を示す。収量は８．４ｍｇ／Ｌであった。
【０１５２】
実施例２５
ＩＦＮ-α Ｆａｂ-ＩＦＮα２-Ｆａｂイムノコンジュゲートによる生物学的活性アッセイ
続いて、ＦａｂとしてＬ１９(フイブロネクチン外ドメイン-Ｂ結合体)を有する精製したＦａｂ−ＩＦＮα２−Ｆａｂイムノコンジュゲートを、ＩＦＮ-α(Ｒｏｆｅｒｏｎ Ａ、Ｒｏｃｈｅ)及び精製したＬ１９ Ｆａｂ-ＩＦＮα２-Ｆａｂイムノコンジュゲートの作用と比較して、ジャーカットＴ細胞及びＡ５４９腫瘍細胞のＩＦＮα誘導性増殖阻害について分析した。簡単に言うと、ＩＦＮ-α誘導性増殖阻害を受けやすいＡ５４９およびジャーカットＴ細胞を、９６ウェル平底プレートに５０００細胞／ウェル(Ａ５４９)又は１００００細胞／ウェル(ジャーカット)となるように播いた。適切な細胞培養培地でのＲｏｆｅｒｏｎ Ａ(Roche)又はＦａｂ−ＩＦＮα２−Ｆａｂの希釈物を溶液中の細胞へ滴定した。５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中で３７℃で２日間増殖させた後、細胞を溶解し、ＡＴＰ内容物をPromegaのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイにて測定した。ＩＦＮ-α未処置の細胞を計算のために０％の成長とした。
図４７の結果は、Ｆａｂ−ＩＦＮα２−Ｆａｂコンストラクトが、ＩＦＮ-α(Ｒｏｆｅｒｏｎ Ａ)に相当する濃度依存的な様式で、Ａ)ジャーカットＴ細胞及びＢ)Ａ５４９細胞の増殖を阻害したことを示す。
【０１５３】
実施例２６  ＭＣＳＰ標的化Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートの調製
ヒト化抗ＭＣＳＰ ＭＨＬＧ抗体は、出典明記によって全体の内容がここに援用される国際公開２００６／１００５８２(特に実施例１を参照)に記載されるように生成し、Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ形態(配列番号：２５５、２５６、２６１、２６２を参照)に変換した。
ヒト化抗ＭＣＳＰ ＭＨＬＧ１抗体は以下の通りに生成した。抗ＭＣＳＰ抗体２２５．２８のネズミ科アミノ酸配列(軽鎖および重鎖は下記を参照)は、一まとまりのヒト生殖細胞系抗体Ｖ遺伝子と整列配置し、配列同一性および相同性に従って分類した。
225.28 軽鎖；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＣＡＡ65007(配列番号２６７)：
DIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVDTNVAWYQQKPGQSPEPLLFSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPLTFGGGTKLEIK
225.28 重鎖；利用可能なＧｅｎＢａｎｋ寄託番号なし(配列番号２６８)：
QVKLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVVSGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWIAEIRLKSNNFGRYYAESVKGRFTISRDDSKSSAYLQMINLRAEDTGIYYCTSYGNYVGHYFDHWGQGTTVTVSS
【０１５４】
潜在的アクセプター配列は、全体的に高い相同性と、すでにあるアクセプター配列の正しい標準的な残基の存在に基づいて選択した。ヒト生殖細胞系配列ＩＧＨＶ３-１５(ＩＭＧＴ寄託番号Ｘ９２２１６)を重鎖のアクセプターとし、配列ＩＧＫＶ１-９(ＩＭＧＴ寄託番号Ｚ０００１３)を軽鎖に選択した。ヒト化コンストラクトは、軽鎖ではＭ−ＫＶ１(配列番号：２６３、２６４、２６９、２７０参照)、７(配列番号：２６５、２６６、２７１、２７２)および９(配列番号：２５３、２５４、２５９、２６０)と記し、重鎖ではＭＨＬＧ１(配列番号：２５１、２５２、２５７、２５８参照)と記した。
それらの設計した抗体配列の遺伝子は、従来のＰＣＲ技術によって生成し、発現プラスミドの構築のためにヒトＩｇＧ１およびκ定常ドメインに融合させた。 
抗体は、ＨＥＫ又はＣＨＯのような哺乳類の細胞培養系においてＩｇＧとして又はＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ融合タンパク質として発現させ、プロテインＡおよびサイズ排除クロマトグラフィを経て精製した。軽鎖変異体Ｍ−ＫＶ１およびＭ−ＫＶ７の結合データを比較すると、カバット位置４６のプロリン残基は抗原への機能的結合に必須であることが明らかとなった。２つの異なる手法を用いて以下のアミノ酸の存在を確認した。Ａ）いわゆる復帰突然変異がＩＧＫＶ１-９のヒトフレームワークに導入された。そして、Ｂ）復帰突然変異の存在を避けるために、全フレームワーク２領域(カバット位置３５−４９)が、ＧｅｎＢａｎｋ登録事項ＡＡＡ１７５７４のヒト抗体の対応する領域によって交換された。この抗体は位置４６のプロリン残基を天然に有する。
【０１５５】
ＭＣＳＰ標的化ＭＨＬＧ又はＭＨＬＧ１ ＫＶ９ Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂは、一アフィニティ工程(プロテインＡ)の後にサイズ排除クロマトグラフィ(Superdex 200, GE Healthcare)からなる前記(実施例９)の方法によって精製した。プロテインＡカラムは２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウムｐＨ７．５に平衡化し、上清をロードし、カラムを２０ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．５にて洗浄した後に、１３．３ｍＭ リン酸ナトリウム、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、５００ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ５．４５にて洗浄した。場合によって３度目に１０ｍＭ ＭＥＳ、５０ｍＭ 塩化ナトリウムｐＨ５にて洗浄した。Ｆａｂ-ＩＬ2-Ｆａｂは、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、１００ｍＭ グリシン、ｐＨ３にて溶出した。溶出した分画をプールし、最終製剤バッファ：２５ｍＭ リン酸カリウム、１２５ｍＭ 塩化ナトリウム、１００ｍＭ グリシンｐＨ６．７にサイズ排除クロマトグラフィによって精製した。
図４８(ＭＨＬＧ Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂについて)及び図４９(ＭＨＬＧ１ Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂについて)は、精製の溶出特性(Ａ)と、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ(ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ビス-トリス ミニゲル、Invitrogen、ＭＯＰＳランニングバッファ、還元及び非還元)によるＭＣＳＰ標的化ＭＨＬＧ又はＭＨＬＧ１ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂの分析的特徴付けの結果(Ｂ)を示す。
【０１５６】
実施例２７
ＭＣＳＰ標的化Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートによる生物学的活性アッセイ
続いて、ＦａｂとしてＭＨＬＧ ＫＶ９又はＭＨＬＧ１ ＫＶ９(ＭＣＳＰ結合体)を有する精製したＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートを、ＮＫ９２細胞上で、精製した４Ｇ８ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂ(ＦＡＰ結合体)およびＭＨＬＧ又はＭＨＬＧ１ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂの作用と比較して、ＩＬ-２誘導性ＩＦＮ-γ放出について分析した。
ＩＬ-２飢餓ＮＫ９２細胞(予めＩＬ-２抜きで２時間インキュベートしたもの)を、ＮＫ細胞培地(ＭＥＭａ＋１０％ＦＣＳ＋１０％ウマ血清＋０．１ｍＭ ２‐メルカプトエタノール＋０．２ｍＭ イノシトール＋０．０２ｍＭ 葉酸)の９６ウェルＵ底プレート(１０５細胞／ウェル)に播いた。ＭＣＳＰ標的化Ｆａｂ−ＩＬ-２−ＦａｂイムノコンジュゲートはＮＫ細胞培地に希釈し、ＦＡＰ標的化４Ｇ８ベースのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートと直接比較して、ＮＫ９２細胞へ滴定した。２２から２４時間後に上清を採集し、Becton DickinsonのヒトＩＦＮ-γＥＬＩＳＡキットＩＩ(＃550612)を用いてＩＦＮ-γ濃度を決定した。
図５０(ＭＨＬＧ ＫＶ９  Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂについて)および図５１(ＭＨＬＧ１ ＫＶ９ Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂについて)の結果は、ＭＣＳＰ又はＦＡＰに標的化したすべてのＦａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートが、濃度依存するが用いた抗原結合部分には依存しないで、ＮＫ９２細胞内のＩＦＮ-γ分泌を同程度に誘導したことを示す。
【０１５７】
実施例２８
ＭＣＳＰ標的化ＭＨＬＧ１ ＫＶ９ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートによる細胞結合アッセイ
精製したＭＣＳＰ標的化ＭＨＬＧ１-ＫＶ９ Ｆａｂ−ＩＬ２−Ｆａｂイムノコンジュゲートは、ヒトＭＣＳＰ発現Ｃｏｌｏ３８メラノーマ細胞への結合についてフローサイトメトリによって試した。簡単に言うと、細胞を採取し、計数して、生存度について調べた。細胞は、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中に１．１１２×１０６(生存)細胞／ｍｌに調整し、丸底９６ウェルプレートに１８０μｌ／ウェル(２０００００細胞／ウェル)に等分した。２０μｌの(異なる希釈物の)ＭＨＬＧ１ ＫＶ９ Ｆａｂ-ＩＬ２-Ｆａｂ免疫サイトカインを細胞含有ウェルに添加し、４℃で３０分間インキュベートした。その後細胞を遠心分離(４分、４００×ｇ)にて回収し、１５０μｌ／ウェルのＰＢＳ／０．１％ＢＳＡにて洗浄し、再懸濁し、１２μｌ／ウェルの二次抗体(ＦＩＴＣ-コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ(ａｂ’)２フラグメントヤギ抗ヒトＦ(ａｂ’)２(Jackson Immuno Research Lab #109-096-097)と共に４℃で３０分間インキュベートし、１．５ｍｌの水およびグリセロール＝原液の１:１混合物に溶解し、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡに１:２０で希釈した。続いて細胞を１５０μｌ／ウェルのＰＢＳ／０．１％ＢＳＡにて洗浄した後、ＰＢＳの洗浄工程を行い、遠心分離(４分、４００×ｇ)にて回収し、プロピジウムヨウ素(ＰＩ)を含む２００μｌ／ウェルのＰＢＳ／０．１％ＢＳＡに再懸濁した。ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ機器(Software FACS Diva)を使用して測定を行った。結果を図５２に示す。ここでは、ＭＣＳＰ標的化ＭＨＬＧ１ ＫＶ９ Ｆａｂ−ＩＬ２−ＦａｂイムノコンジュゲートがＣｏｌｏ３８細胞に用量依存的に非常に良く結合したことが示される。
【０１５８】
概要及び要約の項ではなく詳細な説明の項は特許請求の範囲を理解するために用いられるものと解する。発明者(一又は複数)によって意図されるように、概要および要約の項はすべてではないが一又は複数の本発明の例示的実施態様を記載するものであり、ゆえに、いかなる形であれ本発明および添付の請求の範囲を制限するものではない。
本発明は、その特定の機能および関連性の実施を例示する機能的な構成要素と共に先に記載されている。これらの機能的構成要素の境界は、記載の便宜上、本明細書中で任意に定めている。その特定の機能および関連性が適切に実行される限りにおいて、境界の定義は変わりうる。
特定の実施態様の先の記載は、本発明の全体的な本質を十分に明らかにしているので、他者は当分野の技術内の知識を用いて、過度な実験を要することなく、また本発明の全体的な概念から逸脱することなく、その特定の実施態様を多様な用途に、容易に変更及び／又は応用することができる。したがって、本明細書に提示される教示および手引きに基づいた、このような応用および変更は、意図する範囲内であり、開示さた実施態様と均等な範囲内のものである。本明細書中の表現又は用語は説明のためのものであって限定するものではなく、本明細書中の用語又は表現は教示及び手引きを考慮して当業者に解釈されるものであることは理解できるであろう。
本発明の幅および範囲は、上記いずれかの例示的な実施態様によって限定されるものではなく、以降の特許請求の範囲及びその同等な記載に従ってのみ定義されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0005764127.tif 000084
【図８】
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【図９】
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【図１０】
0005764127.tif 000087
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【配列表】
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