(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
CNCMに番号I-3689で寄託された株であることを特徴とする、抗菌特性及び免疫調節特性を有するラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ株。
【請求項２】
CNCM I-3689株の変異誘発又は遺伝子形質転換の工程を含んでなることを特徴とする、抗菌特性及び／又は免疫調節特性を有するラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ株を得る方法。
【請求項３】
細胞画分が請求項１に記載のラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ株から得られることを特徴とする、抗菌特性及び／又は免疫調節特性を有する細胞画分を得る方法。
【請求項４】
細胞画分がDNA調製物、細菌壁調製物、培養上清及び該上清の画分からなる群より選択されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項３及び４のいずれか１項に記載の方法により細胞画分を得て、該画分を組成物に組み込むことを含んでなる、抗菌特性及び免疫調節特性を有する組成物を得る方法。
【請求項６】
製品が食品であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載のラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ株又は請求項３及び４のいずれか１項に記載の方法に従って得られる細胞画分を含んでなる組成物。
【請求項８】
食品であることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
医薬品として使用するための請求項１に記載のラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ株。
【請求項１０】
医薬品が細菌感染の治療に使用されるものであることを特徴とする請求項９に記載の医薬品として使用するためのラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ株。
【請求項１１】
医薬品が抗炎症薬であることを特徴とする請求項９に記載の医薬品として使用するためのラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ株。
【請求項１２】
サルモネラ・エンテリティディス感染又はリステリア・モノサイトゲネス感染の治療における使用のためのCNCMに番号I-3689で寄託されたラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ株又は請求項３又は４に記載の方法に従って得られた細胞画分。
【請求項１３】
細胞画分がDNA調製物、細菌壁調製物、培養上清及び該上清の画分からなる群より選択されることを特徴とする請求項１２に記載の細胞画分。
【請求項１４】
サルモネラ・エンテリティディス又はリステリア・モノサイトゲネスの培養における成長を阻害するための、CNCMに番号I-3689で寄託されたラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ株又は請求項３又は４に記載の方法に従って得られた細胞画分の使用。
【請求項１５】
細胞画分がDNA調製物、細菌壁調製物、培養上清及び該上清の画分からなる群より選択されることを特徴とする請求項１４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌特性及び免疫調節特性を有する新規なラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)株に関する。
【背景技術】
【０００２】
発酵食料品、特に乳製品中に存在する或る種の微生物の、健康への有益効果について非常に多くの科学的研究が報告されている。これら微生物は、通常、「プロバイオティクス」と呼ばれる。現在、一般に受け容れられている定義によると、プロバイオティクスとは、「適切な量で消費されたとき、宿主の健康への有益効果を有する生存微生物」である(FAO/WHO report on evaluation of health and nutritional properties of probiotics in food, including powder milk containing live lactic acid bacteria(生存乳酸菌含有粉乳を含む食物中のプロバイオティクスの健康上及び栄養上の性質の評価に関するFAO/WHO報告)；アルゼンチン、コルドバ；2001年10月１〜４日)。
【０００３】
プロバイオティクス細菌を含有する食品の消費により、特に腸内細菌叢の再平衡化を通じて、健康に対して好ましい効果が生じ、感染に対する抵抗性が改善し、免疫応答が調節され得ることが示されている。
ヒトの食物中に用いられるプロバイオティクス微生物は、一般に、ラクトバチルス属及びビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属、特にはラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ種(このうちの或る種の株は特許出願EP0794707に記載されている)に主に属する乳酸菌である。
【０００４】
しかし、健康への有益効果は、同じ属の細菌全てに広く共通するものではなく、同じ種の細菌にさえ広く共通するものではない。このような効果は、最も一般的には、或る株にのみ生じる。加えて、観察される効果は、同じ種であるものも含めプロバイオティクス株ごとに質的及び／又は量的に変動することがある。
【０００５】
或る微生物がプロバイオティクスとして有用であり得る可能性があるとみなすことができるためには、以下の基準の少なくとも１つ、理想的には幾つかを充足しなければならない：
−  腸内細菌叢に存在し得る病原性微生物に関して阻害活性を示す。この活性は、腸細胞に接着することにより該病原体の接着を排除するか若しくは低減させる能力、又は病原体を阻害する物質を産生する能力、又はこれら２つの特徴の組合せのいずれかに起因する可能性がある；
−  免疫調節特性、特に免疫刺激特性及び／又は抗炎症特性を示す。
【０００６】
加えて、この微生物を乳製品に組み込むことを意図する場合、該微生物は、乳で十分な成長を示すことが好ましい。
最後に、微生物は、腸に到達して腸環境で生存することが可能であるために、該微生物が組み込まれる食料品の製造及び貯蔵の間、そして消費者によるこの食料品の摂取後にも、良好な生存能力を維持するべきである。
【０００７】
しかし、「プロバイオティクス」の現在の定義に相当するために、生存能力は必須であるが、プロバイオティクス株に関連する有益効果の幾つかは、生存細菌の非存在下でさえ得ることができ、或る細菌画分又は培養上清の活性画分に帰し得ることが示されていることに留意すべきである。例えば、PCT出願WO2004093898は、CNCM I-2219株の培養上清の分画により得られる免疫調節性調製物について記載している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、今回、上記の基準を充足するラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイの新規株を単離することに成功した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の主題は、ブダペスト条約に従ってCNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, Paris)に、2006年11月９日、番号I-3689で寄託された、この新規株である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【発明を実施するための形態】
【００１１】
CNCM I-3689株は以下の特徴を有する：
−  形態：グラム陽性微生物(小さく薄い桿菌、単独又は小さな鎖状)
−  以下の糖類の発酵(api 50 CHストリップ-API MRS培地で、37℃にて48時間で得られた結果)：リボース、ガラクトース、D-グルコース、D-フルクトース、D-マンノース、マンニトール、N-アセチルグルコサミン、アルブチン、セロビオース、マルトース、ラクトース、トレハロース、メレチトース、D-ツラノース、D-タガトース、グルコネート
−  配列番号２のヌクレオチド配列により表される反復配列を含有する、配列番号１の配列の単一CRISPR遺伝子座の存在。
【００１２】
加えて、この株は、培養中の病原性微生物(特に、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、サルモネラ・エンテリティディス(Salmonella enteritidis)及びリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes))の成長を阻害する強い能力をもたらす抗菌特性を有する。
CNCM I-3689株はまた、免疫調節特性、特に抗炎症特性を有する。
【００１３】
本発明の主題はまた、CNCM I-3689株の変異誘発又は遺伝子形質転換により得ることができるラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ株を包含する。これらは、CNCM I-3689株の内因性遺伝子の１又は複数が、例えば代謝特性(例えばこの株が糖類を代謝する能力、腸通過に対する耐性、酸性に対する耐性、後酸性化(post-acidification)又は代謝産物の生成)の幾つかを改変するように、変異された株であり得る。これらはまた、CNCM I-3689株を(例えば、該株に更なる生理学的特徴を付与すること、又は該株により投与することが望ましい治療上の又はワクチンとして興味対象のタンパク質を発現することを可能にする)１又は複数の興味対象の遺伝子で遺伝子形質転換することにより生じた株であり得る。
【００１４】
これら株は、CNCM I-3689株から、ラクトバチルスのランダム変異誘発又は部位特異的変異誘発及び遺伝子形質転換のための従来技術、例えばGuryら(Arch Microbiol., 182, 337-45, 2004)又はVelezら(Appl Environ Microbiol., 73, 3595-3604, 2007)により記載される技術、或いは「ゲノムシャッフリング」として知られる技術(Patnaikら Nat Biotechnol, 20, 707-12, 2002；Wang Y.ら, J Biotechnol., 129, 510-15, 2007)によって得ることができる。これら株は、特に配列番号１の配列のCRISPR遺伝子座を有する。
【００１５】
本発明の主題はまた、CNCM I-3689株の変異誘発又は遺伝子形質転換の工程を含んでなる、抗菌特性及び／又は免疫調節特性を有するラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ株を得るための方法である。
【００１６】
本発明の主題はまた、本発明に従ってラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ株から、抗菌特性及び／又は免疫調節特性を有する細胞画分を得るための方法である。これら細胞画分は、特に、DNA調製物又は該株の培養物から得られる細胞壁調製物である。これらはまた、培養上清又はこれら培養上清の画分であり得る。
【００１７】
本発明の主題はまた、本発明によるラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ株又は該株から得られる細胞画分を含んでなる組成物である。
これら組成物は、特に、本発明によるラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ株と１又は複数の他の乳酸菌株(所望によりプロバイオティクス株)とを組み合わせた乳酸発酵素であり得る。乳酸菌株の例としては、ラクトバチルス・ブルガリカス(Lactobacillus bulgaricus)株及びストレプトコッカス・テルモフィラス(Streptococcus thermophilus)株が挙げられる。
【００１８】
これらはまた、本発明によるラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ株又は該株から得られる細胞画分を含んでなる食品(特に乳製品)、医薬品又は化粧品であり得る。
前記株は、生存細菌の形態で存在する場合、製品１グラム当たり少なくとも105cfu、有利には１グラム当たり少なくとも106cfu、より有利には１グラム当たり少なくとも107cfu、更により有利には１グラム当たり少なくとも108cfuの割合で存在することが好ましい。
【００１９】
本発明は、CNCM I-3689株の抗菌、免疫調節及び抗感染特性、並びにこの株の分子型決定を説明する実施例に言及する下記の更なる説明から、より明確に理解される。
【実施例】
【００２０】
実施例１：CNCM I-3689株の特性と既知のプロバイオティクス株の特性との比較
CNCM I-3689株の特性を、プロバイオティクス特性が知られる種々の従来株の特性と比較した。
これら株のリストを下記表Ｉに示す。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
１−抗菌活性
抗菌活性の研究は３つの標的病原性細菌に対して行った：エシェリキア・コリE1392-75-2A、サルモネラ・エンテリティディスNIZO B1241及びリステリア・モノサイトゲネス4B。乳酸菌をペトリ皿にて２つの異なる培地中で培養した：Elliker培地(Ellikerら, J. Dairy Sci., 39, 1611-1612, 1956)及びTGE培地(トリプトン-グルコース-肉エキス)。
【００２３】
ペトリ皿を37℃にて細菌コロニーが出現するまでインキュベートする。ビフィドバクテリウム培養は嫌気性条件下で行った。次いで、BHI(ブレインハートインフュージョン)培地及び病原体を含有する寒天の層をペトリ皿の表面に注ぐ。ペトリ皿を再び37℃にて24時間インキュベートする。次いで、乳酸菌の各コロニーの周囲で病原体阻害領域の直径を測定する。スコア１は１〜３mmの直径に相当する。スコア２は４〜６mmの直径に相当する。スコア３は６mmより大きい直径に相当する。各実験は各株について独立して３回行った。
【００２４】
各実験で標的病原体について得られたスコアを加えて、各乳酸菌についての抗菌活性の合計スコアを得た。
結果を下記表IIに示す。
これら結果は、試験した株のうち、CNCM I-3689株が、ATCC55544株と共に、最高の抗菌活性を有するものであることを示す。
【００２５】
【表２】
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【００２６】
２−免疫調節
IL-10/IL-12比を測定することにより、種々の乳酸菌の免疫調節特性を評価した。
健常個体から得られたヒト血液サンプルを、PBS-CA(Gibco)で１:２の比に希釈し、Ficoll(Gibco)グラジエントを用いて精製した。20℃にて400×ｇで30分間の遠心分離後、PBMC(末梢血単核細胞)を採取した。次いで、３回の洗浄工程を行い、その後PBMCを、１％のウシ胎仔血清、１％のL-グルタミン(Gibco)及び150μg/mlのゲンタマイシン(Gibco)を補充したRPMI培養培地(Gibco)中に再懸濁した。顕微鏡下でPBMCを計数し、２×106細胞/mlの濃度に調整した後、24ウェル細胞培養プレート(Corning, Inc.)中１mlのアリコートに分配した。
【００２７】
ラクトバチルス株はMRS培地(de Manら, J. Appl. Bacteriol. 23, 130-135, 1960)中で培養し、ビフィドバクテリウム株は0.03％のL-システイン(Sigma)を補充したMRS培地中、嫌気条件下で培養した。全ての株を37℃でインキュベートした。静止期で細菌の増殖を停止させ、次いで細菌を洗浄し、20％グリセロールを含有するPBS中、３MacFarlan単位の濃度で再懸濁した。
容量10μlの細菌調製物を、PBMCを含有するプレートの各ウェルに加えた(細菌：細胞比10:１)。プレートを５％CO2を含有する雰囲気下37℃にて24時間インキュベートした。次いで、上清を取り出し、2000rpmで遠心分離し、-20℃で保存した。
【００２８】
既知の免疫調節特性を有するコントロールの細菌株を検査に含めた。細菌を含まないPBS-20％グリセロールもまたネガティブコントロールとして用いた。実験は、３つの異なるドナーに由来するPBMCで各株について行った。
サイトカインの発現は市販キット(Pharmingen, BD Biosciences)を用いELISAアッセイにより測定した。２つのサイトカインを調べた：IL-10及びIL-12。
試験した各株について、IL-10/IL-12比の平均を算出した。これら結果を下記表IIIに示す。
【００２９】
【表３】
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【００３０】
これら結果は、CNCM I-3689株がこのモデルにおいて相当な抗炎症特性を示すことを示している。試験した参照株のいずれもこのような良好な特性を示さない。
図１は、上記で決定した抗病原体スコア(任意単位)の関数としての各細菌株のIL-10/IL-12比を示す。この図は、CNCM I-3689株が試験した他の株とどのくらい異なるかを示している。
【００３１】
３−腸のストレスに関する生存
腸ストレスの条件を反映するインビトロモデルを用いた。
乳酸菌の培養物を、酵母エキスを補充した乳中に調製する。培養は、種に応じて24〜48時間インキュベートする(培養の静止期まで)。
【００３２】
ブタ胆汁酸塩(3.3g/l)及びNaHCO3炭酸塩緩衝液(16.5g/l)から構成される人工腸液を調製する。pHは6.3に調整する。１mlのこの腸液を、100μlの細菌培養物に加える。次いで、培養物を５時間インキュベートする。次に、ストレスの前後の細菌個体群をペトリ皿上で評価する。
【００３３】
値は以下のように表す：
腸ストレス ＝ log (cfu ５時間/cfu ０時間)。
cfu X分は、Ｘ分間のインキュベーション後のコロニー形成単位(CFU)として表される細菌の濃度である。
【００３４】
腸ストレスについて、値が-0.5を超えると生存は良好であり、値が-0.5〜-1.5の間であると生存は中程度に良好であり、値が-1.5より小さいと生存は悪い。
結果を下記表IVに示す。
【００３５】
【表４】
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【００３６】
４−結論
上記表II、III及びIVに示す結果は、試験した種々の株のうち、CNCM I-3689株が、相当な抗菌特性及び相当な抗炎症特性の両方を有し、加えて腸ストレスに対する非常に良好な抵抗特性を伴う唯一のものであることを示している。
【００３７】
実施例２：乳でのCNCM I-3689株の成長
CNCM I-3689株の乳での成長特性を以下のプロトコルを用いて試験した。
−  水に脱脂粉乳を加えて再構成した脱脂乳から作られた培地に、CNCM I-3689株を接種した(5.6×106cfu/g又は1.1×107cfu/g)。
−  成長培地のpHを連続的にモニターすることにより、成長に関連するこの株の発酵活性を測定する。
【００３８】
結果を図２に示すグラフで説明する。
これら結果は、CNCM I-3689株が、乳で効率的に成長できること、よってこの株を発酵乳製品の製造に使用できることを示している。
【００３９】
実施例３：CNCM I-3689株の分子型決定
多くの原核微生物が１又は複数のCRISPR遺伝子座−「Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats」(Jansenら, 2002, OMICS, Vol. 6, No. 1, 23-33)の頭文字−を有する。CRISPR遺伝子座は、略20〜40塩基対の独特な配列(可変配列(「スペーサー」)と呼ばれる)により分離された略21〜37塩基対(bp)の非連続反復配列(又はDR)により特徴付けられる。細菌株ごとに、下記に関する差異が観察され得る：
【００４０】
−  CRISPR遺伝子座の数、
−  ゲノム中のCRISPR遺伝子座の位置、
−  反復配列の数、及び／又は
−  可変配列の性質及び／又はサイズ。
【００４１】
１−CNCM I-3689株のCRISPR遺伝子座の同定
CNCM I-3689株を配列決定した。ERGOTMソフトウェアシリーズを用いるゲノム解析により、この株における単一CRISPR遺伝子座を同定することができる。この遺伝子座(サイズ3323bp)は、ORF RDBK00370の20塩基対下流に位置する。そのゲノムDNA配列は、配列番号１の配列により表される。これは、ATCC 334株(ラクトバチルス・カゼイ)のCRISPR遺伝子座のものと同一である反復単位(GTTTTCCCCGCACATGCGGGGGTGATCC；配列番号２)及び54の可変配列(スペーサー)で構成される。
【００４２】
２−CNCM I-3689株に特異的なPCR増幅プライマーの構築
幾つかのオリゴヌクレオチドプライマー対を、CNCM I-3689株のCRISPR遺伝子座の可変配列に基づいて規定した。CNCM I-3689株に対する特異性を検証するために、これらプライマーを幾つかの細菌株についてPCR増幅により試験した。
【００４３】
一対のプライマーは下記のものを有する：
−  プライマーOFF2486(CTCAACAGGATAAGTGCCAC；配列番号３)、CRISPR遺伝子座の33番目の可変配列に位置する(2049〜2068位)；TM = 60℃；
−  プライマーOFF2488(GGTTGGCTGGGTTTAACGC；配列番号４)、CRISPR遺伝子座の37番目の可変配列に位置する(2093〜2110位)；TM = 60℃。
PCR条件は下記のものである：
【００４４】
【表５】
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【００４５】
CNCM I-3689株からのPCR産物の予測されるサイズは263bpである。
プライマー対OFF2486/OFF2488をCNCM I-3689株及び他の異なる18のラクトバチルス・カゼイ株(CNCM I-1518株及びATCC 334株を含む)について試験した。CNCM I-1518株及びATCC 334株はネガティブコントロールを表す。なぜならば、前記プライマーは、上記のPCR条件下で、これら株のゲノムDNA配列にハイブリダイズできないからである。
【００４６】
結果は、図３に提示するPCR増幅産物のアガロースゲル電気泳動によって示す。図で、「121」はCNCM I-3689株を表し、「001」はCNCM I-1518株を表し、「S3」〜「S18」はそれぞれ16の異なるラクトバチルス・カゼイ株を表し、「SL」は分子量マーカー(SmartLadder；Eurogentec)を表す。
これら結果は、プライマー対OFF2486/OFF2488が確かにCNCM I-3689株に特異的であることを示している。なぜならば、予測されたサイズ(すなわち、約260bp)のPCR増幅産物がこの株についてのみ得られたからである。
【図３】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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