(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞から単離され、電子顕微鏡検査によって測定した場合５０ｎｍ〜１００ｎｍの大きさを有し、心保護作用を有するエキソソーム。
【請求項２】
心筋虚血および再灌流障害のマウスもしくはブタモデルにおいて評価した場合、梗塞の大きさを縮小することができる、または、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）誘導性細胞死のインビトロアッセイにおいて評価した場合、酸化ストレスを低減することができる、請求項１に記載のエキソソーム。
【請求項３】
前記エキソソームが、
以下の１〜２５０の番号を付したタンパク質：
１．ＩＰＩ０００２１４２８  α骨格筋アクチン；２．ＩＰＩ００４１４０５７  α１骨格筋アクチンタンパク質；３．ＩＰＩ００００８６０３  大動脈平滑筋アクチン；４．ＩＰＩ０００２１４３９  細胞質アクチン１；５．ＩＰＩ０００２３００６  α心臓アクチン；６．ＩＰＩ０００２１４４０  細胞質アクチン２；７．ＩＰＩ０００２５４１６  γ腸平滑筋アクチン；８．ＩＰＩ００４７９９２５  アグリン；９．ＩＰＩ０００１５１０２  ＣＤ１６６抗原前駆体；１０．ＩＰＩ００００７４２３  酸性ロイシンリッチ核ホスホプロテイン３２ファミリー成員Ｂ；１１．ＩＰＩ００４１３３３１  ３６ｋＤａタンパク質；１２．ＩＰＩ００４１２５７７  ３４ｋＤａタンパク質；１３．ＩＰＩ００４１３５０６  ３３ｋＤａタンパク質；１４．ＩＰＩ００４１８１６９  仮説タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｐ０３１５９；１５．ＩＰＩ００００３８１５  Ｒｈｏ  ＧＤＰ解離阻害因子１；１６．ＩＰＩ００００４６５６  β２−マイクログロブリン前駆体；１７．ＩＰＩ００２１８０４２  骨形成タンパク質１前駆体のスプライスアイソフォームＢＭＰ１−５；１８．ＩＰＩ００００９０５４  骨形成タンパク質１前駆体のスプライスアイソフォームＢＭＰ１−３；１９．ＩＰＩ０００１４０２１  骨形成タンパク質１前駆体のスプライスアイソフォームＢＭＰ１−１；２０．ＩＰＩ００２１８０４０  骨形成タンパク質１前駆体のスプライスアイソフォームＢＭＰ１−４；２１．ＩＰＩ００００６９８０  タンパク質Ｃ１４ｏｒｆ１６６；２２．ＩＰＩ００２９６１６５  補体Ｃ１ｒサブコンポーネント前駆体；２３．ＩＰＩ００１５２５４０  ＯＴＴＨＵＭＰ００００００１６７４８；２４．ＩＰＩ００３０５０６４  ＣＤ４４抗原前駆体のスプライスアイソフォームＣＤ４４；２５．ＩＰＩ００２９７１６０  仮説タンパク質ＤＫＦＺｐ４５１Ｋ１９１８；２６．ＩＰＩ００２９３５３９  カドヘリン−１１前駆体のスプライスアイソフォーム２；２７．ＩＰＩ００３０４２２７  カドヘリン−１１前駆体のスプライスアイソフォーム１；２８．ＩＰＩ００３８６４７６  カドヘリン１１、２型、アイソフォーム１プレプロタンパク質；２９．ＩＰＩ０００２４０４６  カドヘリン−１３前駆体；３０．ＩＰＩ００２９００８５  神経カドヘリン前駆体；３１．ＩＰＩ０００２９７３９  補体因子Ｈ前駆体のスプライスアイソフォーム１；３２．ＩＰＩ０００１２０１１  コフィリン、非筋型アイソフォーム；３３．ＩＰＩ００００７２５７  カルシンテニン１アイソフォーム２；３４．ＩＰＩ００２１８５３９  コラーゲンα−１（ＸＩ）鎖前駆体のスプライスアイソフォームＢ；３５．ＩＰＩ００４７７３５０  ＸＩ型コラーゲンα１；３６．ＩＰＩ００３２９５７３  コラーゲンα−１（ＸＩＩ）鎖前駆体のロングスプライスアイソフォーム；３７．ＩＰＩ００２２１３８４  コラーゲンα−１（ＸＩＩ）鎖前駆体のショートスプライスアイソフォーム；３８．ＩＰＩ００４００９３５  コラーゲンα−１（ＸＶＩ）鎖前駆体；３９．ＩＰＩ００２９７６４６  コラーゲンα−１（Ｉ）鎖前駆体；４０．ＩＰＩ００１６４７５５  プレプロα２（Ｉ）コラーゲン前駆体；４１．ＩＰＩ００３０４９６２  コラーゲンα−２（Ｉ）鎖前駆体；４２．ＩＰＩ０���０２１０３３  コラーゲンα−１（ＩＩＩ）鎖前駆体；４３．ＩＰＩ００１６７０８７  ＣＯＬ３Ａ１タンパク質；４４．ＩＰＩ０００２１０３４  コラーゲンα−１（ＩＶ）鎖前駆体；４５．ＩＰＩ００４７９３２４  α２、ＩＶ型コラーゲンプレプロタンパク質；４６．ＩＰＩ００３０６３２２  コラーゲンα−２（ＩＶ）鎖前駆体；４７．ＩＰＩ００３０３３１３  コラーゲンα−１（Ｖ）鎖前駆体；４８．ＩＰＩ００４７７６１１  １８４ｋＤａタンパク質；４９．ＩＰＩ００２９３８８１  ＣＯＬ５Ａ２タンパク質；５０．ＩＰＩ０００１８２７９  コラーゲンα−３（Ｖ）鎖前駆体；５１．ＩＰＩ００２９１１３６  コラーゲンα−１（ＶＩ）鎖前駆体；５２．ＩＰＩ００３０４８４０  コラーゲンα−２（ＶＩ）鎖前駆体のスプライスアイソフォーム２Ｃ２；５３．ＩＰＩ００２２０６１３  コラーゲンα−２（ＶＩ）鎖前駆体のスプライスアイソフォーム２Ｃ２Ａ；５４．ＩＰＩ０００２２２００  α３、ＶＩ型コラーゲンアイソフォーム１前駆体；５５．ＩＰＩ０００７２９１８  α３、ＶＩ型コラーゲンアイソフォーム４前駆体；５６．ＩＰＩ００２２０７０１  コラーゲンα−３（ＶＩ）鎖前駆体のスプライスアイソフォーム２；５７．ＩＰＩ０００７２９１７  α３、ＶＩ型コラーゲンアイソフォーム３前駆体；５８．ＩＰＩ０００２１８２８  シスタチンＢ；５９．ＩＰＩ００００７７７８  ジ−Ｎ−アセチルキトビアーゼ前駆体；６０．ＩＰＩ００２９５７４１  カテプシンＢ前駆体；
６１．ＩＰＩ００２９９２１９  タンパク質ＣＹＲ６１前駆体；６２．ＩＰＩ００５１４９００  ４２ｋＤａタンパク質；６３．ＩＰＩ００３３３７７０  細胞質分裂のデディケイタータンパク質１０（Ｄｅｄｉｃａｔｏｒ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １０）に類似；６４．ＩＰＩ００４７８３３２  細胞質分裂のデディケイタータンパク質９に類似；６５．ＩＰＩ０００００８７５  伸長因子１γ；６６．ＩＰＩ００４６５２４８  α−エノラーゼ；６７．ＩＰＩ０００１３７６９  肺特異的α−エノラーゼ；６８．ＩＰＩ００２１６１７１  γ−エノラーゼ；６９．ＩＰＩ００２１８８０３  フィブリン−１前駆体のスプライスアイソフォームＢ；７０．ＩＰＩ００２９６５３７  フィブリン−１前駆体のスプライスアイソフォームＣ；７１．ＩＰＩ００３２８１１３  フィブリリン−１前駆体；７２．ＩＰＩ０００１９４３９  フィブリリン−２前駆体；７３．ＩＰＩ００３８５６４５  線維芽細胞増殖因子１７前駆体のスプライスアイソフォーム２；７４．ＩＰＩ００２１６６０２  線維芽細胞増殖因子受容体２前駆体のスプライスアイソフォーム５；７５．ＩＰＩ００２１６６０４  線維芽細胞増殖因子受容体２前駆体のスプライスアイソフォーム８；７６．ＩＰＩ０００３４０９９  仮説タンパク質ＦＬＪ２１９１８；７７．ＩＰＩ００３３３５４１  フィラミンＡ；７８．ＩＰＩ００３０２５９２  フィラミンＡ、α；７９．ＩＰＩ００３３９２２７  仮説タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｏ１１６６；８０．ＩＰＩ００４１４２８３  フィブロネクチン前駆体（ＦＮ）（寒冷不溶性グロブリン）（ＣＩＧ）、スプライスアイソフォーム３；８１．ＩＰＩ００３３９２２５  フィブロネクチン前駆体のスプライスアイソフォーム５；８２．ＩＰＩ００３３９３１９  フィブロネクチン前駆体のスプライスアイソフォーム１１；８３．ＩＰＩ００５５６６３２  フィブロネクチン前駆体のスプライスアイソフォーム１２；８４．ＩＰＩ００４１１４６２  仮説タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｂ１８１５０；８５．ＩＰＩ０００２９７２３  フォリスタチン関連タンパク質１前駆体；８６．ＩＰＩ００００５４０１  ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ５；８７．ＩＰＩ００２１９０２５  グルタレドキシン１；８８．ＩＰＩ００１７１４１１  ゴルジホスホプロテイン２；８９．ＩＰＩ０００２６３１４  ゲルゾリン前駆体；９０．ＩＰＩ００２１９７５７  グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰ；９１．ＩＰＩ０００２７５６９  ヘテロ核リボ核タンパク質Ｃ様１；９２．ＩＰＩ００００３８８１  ＨＮＲＰＦタンパク質；９３．ＩＰＩ００４４２２９４  ニューロトリミン前駆体のスプライスアイソフォーム１；９４．ＩＰＩ００００３８６５  ７１ｋＤａの熱ショックコグネイトタンパク質のスプライスアイソフォーム１；９５．ＩＰＩ０００３７０７０  ７１ｋＤａの熱ショックコグネイトタンパク質のスプライスアイソフォーム２；９６．ＩＰＩ００２２０３６２  １０ｋＤａのミトコンドリア熱ショックタンパク質；９７．ＩＰＩ０００２４２８４  基底膜特異的へパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質前駆体；９８．ＩＰＩ００２９７２８４  インスリン様増殖因子結合タンパク質２��駆体；９９．ＩＰＩ００２９７２８４  インスリン様増殖因子結合タンパク質２前駆体；１００．ＩＰＩ０００２９２３６  インスリン様増殖因子結合タンパク質５前駆体；１０１．ＩＰＩ０００２９２３６  インスリン様増殖因子結合タンパク質５前駆体；１０２．ＩＰＩ０００２９２３５  インスリン様増殖因子結合タンパク質６前駆体；１０３．ＩＰＩ０００２９２３５  インスリン様増殖因子結合タンパク質６前駆体；１０４．ＩＰＩ０００１６９１５  インスリン様増殖因子結合タンパク質７前駆体；１０５．ＩＰＩ０００１６９１５  インスリン様増殖因子結合タンパク質７前駆体；１０６．ＩＰＩ００３２８１６３  Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１タンパク質；１０７．ＩＰＩ０００２１３９６  血管内皮増殖因子受容体２前駆体；１０８．ＩＰＩ００２９８２８１  ラミニンγ１鎖前駆体；１０９．ＩＰＩ００２１９２１９  ガレクチン−１；１１０．ＩＰＩ０００２３６７３  ガレクチン−３結合タンパク質前駆体；１１１．ＩＰＩ０００２１４０５  ラミンＡ／ＣのスプライスアイソフォームＡ；１１２．ＩＰＩ００２１６９５３  ラミンＡ／ＣのスプライスアイソフォームＡδ１０；１１３．ＩＰＩ００１８０１７３  予測：トロポミオシン４に類似；１１４．ＩＰＩ００４０１６１４  予測：ＦＫＳＧ３０に類似；１１５．ＩＰＩ００３７４３９７  予測：トロポミオシン４に類似；１１６．ＩＰＩ００３７４７３２  予測：ＰＰＩＡタンパク質に類似；１１７．ＩＰＩ００４０２１０４  予測：ペプチジルプロリルイソメラーゼＡアイソフォーム１に類似；シクロフィリンＡ；ペプチジルプロ；１１８．ＩＰＩ００４５５４１５  予測：ヘテロ核リボ核タンパク質Ｃ様ｄＪ８４５Ｏ２４．４に類似；１１９．ＩＰＩ００４５４７２２  予測：ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質に類似；１２０．ＩＰＩ００４５４８５２  予測：奇形がん由来増殖因子１に類似；１２１．ＩＰＩ００００２８０２  タンパク質−リシン６−オキシダーゼ前駆体；１２２．ＩＰＩ００４１０１５２  潜伏トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質１アイソフォームＬＴＢＰ−１Ｌ；１２３．ＩＰＩ００２２０２４９  潜伏トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質、アイソフォーム１Ｌ前駆体；１２４．ＩＰＩ００２２０２４９  潜伏トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質、アイソフォーム１Ｌ前駆体；１２５．ＩＰＩ００４１０１５２  潜伏トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質１アイソフォームＬＴＢＰ−１Ｌ；１２６．ＩＰＩ０００２０９８６  ルミカン前駆体；１２７．ＩＰＩ００２９１００６  ミトコンドリアリンゴ酸デヒドロゲナーゼ前駆体；１２８．ＩＰＩ００００５７０７  マクロファージマンノース受容体２前駆体；１２９．ＩＰＩ０００２０５０１  ミオシン１１；１３０．ＩＰＩ０００１９５０２  ミオシン９；１３１．ＩＰＩ００６０４６２０  ヌクレオリン；１３２．ＩＰＩ００２２０７４０  ヌクレオフォスミンのスプライスアイソフォーム２；１３３．ＩＰＩ００２１９４４６  ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質；１３４．ＩＰＩ００２９９７３８  プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼエンハンサー１前駆体；１３５．ＩＰＩ０００１５９０２  β血小板由来増殖因���受容体前駆体；１３６．ＩＰＩ００２１６６９１  プロフィリン１；１３７．ＩＰＩ００１６９３８３  ホスホグリセリン酸キナーゼ１；１３８．ＩＰＩ００２１９５６８  精巣特異的ホスホグリセリン酸キナーゼ；１３９．ＩＰＩ００２９６１８０  ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子前駆体；１４０．ＩＰＩ００２１５９４３  プレクチン１のスプライスアイソフォーム３；１４１．ＩＰＩ００２１５９４２  プレクチン１のスプライスアイソフォーム２；１４２．ＩＰＩ０００１４８９８  プレクチン１のスプライスアイソフォーム１；１４３．ＩＰＩ００３９８７７７  プレクチン１アイソフォーム８；１４４．ＩＰＩ００３９８７７６  プレクチン１アイソフォーム７；１４５．ＩＰＩ００１８６７１１  プレクチン１アイソフォーム６；１４６．ＩＰＩ００４２００９６  プレクチン１アイソフォーム３；１４７．ＩＰＩ００３９８７７９  プレクチン１アイソフォーム１１；１４８．ＩＰＩ００３９８７７８  プレクチン１アイソフォーム１０；１４９．ＩＰＩ００３９８００２  プレクチン１アイソフォーム１；１５０．ＩＰＩ００４１９５８５  ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼＡ；１５１．ＩＰＩ００４７２７１８  ペプチジルプロリルイソメラーゼＡアイソフォーム２；１５２．ＩＰＩ０００００８７４  ペルオキシレドキシン１；１５３．ＩＰＩ０００２４９１５  ミトコンドリアペルオキシレドキシン５前駆体；１５４．ＩＰＩ００３７５３０６  ペルオキシレドキシン５前駆体、アイソフォームｂ；１５５．ＩＰＩ０００１２５０３  プロアクチベーターポリペプチド前駆体のスプライスアイソフォームＳａｐ−ｍｕ−０；１５６．ＩＰＩ００３７４１７９  プロテアソーム活性化因子サブユニット１アイソフォーム２；１５７．ＩＰＩ０００３０１５４  プロテアソーム活性化因子複合体サブユニット１；１５８．ＩＰＩ００１６８８１２  ＰＴＫ７プロテインチロシンキナーゼ７アイソフォームｄ前駆体；１５９．ＩＰＩ００４１９９４１  ＰＴＫ７プロテインチロシンキナーゼ７アイソフォームａ前駆体；１６０．ＩＰＩ００００３５９０  クイエシンＱ６、アイソフォームａ；１６１．ＩＰＩ０００１５９１６  骨由来増殖因子（フラグメント）；１６２．ＩＰＩ０００１５９１６  骨由来増殖因子；１６３．ＩＰＩ００２９８２８９  レチクロン４のスプライスアイソフォーム２；１６４．ＩＰＩ０００２１７６６  レチクロン４のスプライスアイソフォーム１；１６５．ＩＰＩ０００１３８９５  カルギザリン；１６６．ＩＰＩ０００１０４０２  仮説タンパク質；１６７．ＩＰＩ００２１８７３３  スーパーオキシドジスムターゼ；１６８．ＩＰＩ０００１４５７２  ＳＰＡＲＣ前駆体；１６９．ＩＰＩ００００５６１４  脳スペクトリンβ鎖１のロングスプライスアイソフォーム；１７０  ＩＰＩ００００８７８０  スタニオカルシン２前駆体；１７１．ＩＰＩ００３０１２８８  ＳＥＬ−ＯＢタンパク質；１７２．ＩＰＩ００２１６１３８  トランスゲリン；１７３．ＩＰＩ０００１８２１９  トランスフォーミング増殖因子β誘導性タンパク質ｉｇ−ｈ３前駆体；１７４．ＩＰＩ００３０４８６５  トランスフォーミング増殖因子β受容体ＩＩＩ；１７５．ＩＰＩ００２９６０９９  トロンボスポンジン１前駆体；１７６．ＩＰＩ０００３２２９２  メタロプロテイナーゼ阻害因子１前駆体；１７７．ＩＰＩ０００２７１６６  メタロプロテイナーゼ阻害因子２前駆体；１７８．ＩＰＩ００２２０８２８  チモシンβ４；１７９．ＩＰＩ００１８０２４０  チモシン様３；１８０．ＩＰＩ００２９９６３３  ＯＴＴＨＵＭＰ００００００３１２７０（フラグメント）；１８１．ＩＰＩ００４６５０２８  トリオースリン酸イソメラーゼ１変異体（フラグメント）；１８２．ＩＰＩ００４５１４０１  トリオースリン酸イソメラーゼスプライスアイソフォーム２；１８３．ＩＰＩ０００１０７７９  トロポミオシン４；１８４．ＩＰＩ００２１６９７５  トロポミオシンα４鎖のスプライスアイソフォーム２；１８５．ＩＰＩ００１８０６７５  チューブリンα３鎖；１８６．ＩＰＩ００２１８３４３  チューブリンα６鎖；１８７．ＩＰＩ００２１６２９８  チオレドキシン；１８８．ＩＰＩ００４７２１７５  ＣＤＮＡ  ＦＬＪ４６６７２  ｆｉｓ、クローンＴＲＡＣＨ３００９００８、チオレドキシンレダクターゼに極めて類似；１８９．ＩＰＩ００４５０４７２  ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｉ；１９０．ＩＰＩ０００１８３５２  ユビキチンカルボキシル末端加水分解酵素イソ酵素Ｌ１；１９１．ＩＰＩ０００１０２０７  ユビキチン折りたたみ修飾因子１前駆体；１９２．ＩＰＩ００２６０６３０  ＵＲＢ；１９３．ＩＰＩ０００２１２６３  １４−３−３タンパク質ζ／δ；１９４．ＩＰＩ００６４２９９１  仮説タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｆ１０１６４；１９５．ＩＰＩ００４７０９１９  仮説タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｋ０８１６４；１９６．ＩＰＩ００７１９０８８  ＶＩ型コラーゲンα１前駆体；１９７．ＩＰＩ００６５４６８５  ＳＰＡＲＣ  前駆体に類似；１９８．ＩＰＩ００６４１９６１  ＸＩＩ型コラーゲンα１；１９９．ＩＰＩ００６４５８４９  細胞外マトリックスタンパク質１；２００．ＩＰＩ００５５４７８６  チオレドキシンレダクターゼ１；２０１．ＩＰＩ００６４５０１８  ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子；２０２．ＩＰＩ００５５２３３９  メタロプロテイナーゼ１の組織阻害因子；２０３．ＩＰＩ００６４２９９７  細胞質アクチン２；２０４．ＩＰＩ００７１９７７８  アネキシンＡ２に類似；２０
５．ＩＰＩ００６４７９１５  トランスゲリン２；２０６．ＩＰＩ００５５２８１５  Ｖ型コラーゲンα１；２０７．ＩＰＩ００５５２９８１  ＣＤＮＡ  ＰＳＥＣ０２６６  ｆｉｓ、クローンＮＴ２ＲＰ３００３６４９、ホモサピエンスフィブリン１Ｄ  ｍＲＮＡに極めて類似；２０８．ＩＰＩ００１８０７７６  ２９ｋＤａタンパク質；２０９．ＩＰＩ００５５２４１６  フィラミンＡ、α；２１０．ＩＰＩ００６４０６９８  γ−腸平滑筋アクチン；２１１．ＩＰＩ００５１４５３０  α１骨格筋アクチン；２１２．ＩＰＩ００５５６４４２  インスリン様増殖因子結合タンパク質２変異体（フラグメント）；２１３．ＩＰＩ００５１３７８２  ゲルゾリン；２１４．ＩＰＩ００４７８７３１  ２９ｋＤａタンパク質；２１５．ＩＰＩ００３９６４７９  ２４ｋＤａタンパク質；２１６．ＩＰＩ００３３４６２７  ３９ｋＤａタンパク質；２１７．ＩＰＩ００５５５７６２  ＰＴＫ７プロテインチロシンキナーゼ７アイソフォーム変異体（フラグメント）；２１８．ＩＰＩ００６５８２０２  ９７ｋＤａタンパク質；２１９．ＩＰＩ００００６２７３  ＣＹＲ６１タンパク質；２２０．ＩＰＩ００７１９４０５  ＴＭＳＬ６タンパク質；２２１．ＩＰＩ００６５８０９６  チモシンβ４；２２２．ＩＰＩ００３７６１６３  ５ｋＤａタンパク質；２２３．ＩＰＩ００５５６２１７  フィブリリン１変異体（フラグメント）；２２４．ＩＰＩ００５１４８１７  ラミンＡ／Ｃに類似；２２５．ＩＰＩ００６４４０８７  プロゲリン；２２６．ＩＰＩ００６５５８１２  横紋筋肉腫抗原ＭＵ−ＲＭＳ−４０．１２；２２７．ＩＰＩ００６０４５１７  ヌクレオリンに類似；２２８．ＩＰＩ００４４４２６２  ＣＤＮＡ  ＦＬＪ４５７０６  ｆｉｓ、クローンＦＥＢＲＡ２０２８４５７、ヌクレオリンに極めて類似；２２９．ＩＰＩ００４１２４７３  タンパク質；２３０．ＩＰＩ００４１４４８９  タンパク質；２３１．ＩＰＩ００４１１４６３  タンパク質；２３２．ＩＰＩ００５５６４１５  トランスゲリン変異体（フラグメント）；２３３．ＩＰＩ００７１８８２５  カルモジュリン；２３４．ＩＰＩ００４７８１５６  １７ｋＤａタンパク質；２３５．ＩＰＩ００３８６６２１  ＣＡＬＭ３タンパク質；２３６．ＩＰＩ００６４７００１  酸性；２３７．ＩＰＩ００６４２６５０  スタニオカルシン２前駆体に類似；２３８．ＩＰＩ００６４１４７１  コラーゲン様タンパク質；２３９．ＩＰＩ００５１４６６９  ＳＨ３ドメイン結合グルタミン酸リッチタンパク質様３；２４０．ＩＰＩ００７１９４２２  トリオースリン酸イソメラーゼ（フラグメント）；２４１．ＩＰＩ００００３７３４  推定上のＳ１００カルシウム結合タンパク質Ｈ＿ＮＨ０４５６Ｎ１６．１；２４２．ＩＰＩ０００２９５７４  １１ｋＤａタンパク質；２４３．ＩＰＩ００６４１０４７  ゲルゾリン；２４４．ＩＰＩ００６４７５５６  ゲルゾリン；２４５．ＩＰＩ００６５４８２１  仮説タンパク質ＬＯＣ５４８４５アイソフォーム１；２４６．ＩＰＩ００６４７５７２  Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質３前駆体；２４７．ＩＰＩ００６３９８７９  細胞質分裂タンパク質ｓｅｐＡに類似；２４８．ＩＰＩ００６５７７４６  細胞質分裂のデディケイタータンパク質８に類似；２４９．ＩＰＩ００５５５９９３  血管内皮増殖因子受容体３変異体；および２５０．ＩＰＩ００５５２５４５  細胞質分裂のデディケイタータンパク質８、もしくは、
以下の機能未同定のタンパク質：
ＩＰＩ００６４２９９１  仮説タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｆ１０１６４；ＩＰＩ００４７０９１９  仮説タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｋ０８１６４；ＩＰＩ００６５４６８５  ＳＰＡＲＣ前駆体に類似；ＩＰＩ００７１９７７８  アネキシンＡ２に類似；ＩＰＩ００５５２９８１  ＣＤＮＡ  ＰＳＥＣ０２６６  ｆｉｓ、クローンＮＴ２ＲＰ３００３６４９、ホモサイエンスフィブリン１Ｄ  ｍＲＮＡに極めて類似；ＩＰＩ００１８０７７６  ２９ｋＤａタンパク質；ＩＰＩ００４７８７３１  ２９ｋＤａタンパク質；ＩＰＩ００３９６４７９  ２４ｋＤａタンパク質；ＩＰＩ００３３４６２７  ３９ｋＤａタンパク質；ＩＰＩ００６５８２０２  ９７ｋＤａタンパク質；ＩＰＩ００３７６１６３  ５ｋＤａタンパク質；ＩＰＩ００５１４８１７  ラミンＡ／Ｃに類似；ＩＰＩ００６４４０８７  プロゲリン；ＩＰＩ００６５５８１２  横紋筋肉腫抗原ＭＵ−ＲＭＳ−４０．１２；ＩＰＩ００６０４５１７  ヌクレオリンに類似；ＩＰＩ００４４４２６２  ＣＤＮＡ  ＦＬＪ４５７０６  ｆｉｓ、クローンＦＥＢＲＡ２０２８４５７、ヌクレオリンに極めて類似；ＩＰＩ００４１２４７３  タンパク質；ＩＰＩ００４１４４８９  タンパク質；ＩＰＩ００４１１４６３  タンパク質；ＩＰＩ００４７８１５６  １７ｋＤａ  タンパク質；ＩＰＩ００３８６６２１  ＣＡＬＭ３タンパク質；ＩＰＩ００６４７００１  酸性；ＩＰＩ００６４２６５０  スタニオカルシン２前駆体に類似；ＩＰＩ００６４１４７１  コラーゲン様タンパク質；ＩＰＩ００５１４６６９  ＳＨ３ドメイン結合グルタミン酸リッチタンパク質様３；ＩＰＩ００００３７３４  推定上のＳ１００カルシウム結合タンパク質Ｈ＿ＮＨ０４５６Ｎ１６．１；ＩＰＩ０００２９５７４  １１ｋＤａタンパク質；ＩＰＩ００６５４８２１  仮説タンパク質ＬＯＣ５４８４５アイソフォーム１；ＩＰＩ００６４７５７２  Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質３前駆体；ＩＰＩ００６３９８７９  細胞質分裂タンパク質ｓｅｐＡに類似；ＩＰＩ００６５７７４６  細胞質分裂のデディケイタータンパク質８に類似；およびＩＰＩ００５５５９９３  血管内皮増殖因子受容体３変異体、もしくは、
表５Ａおよび表５Ｂに示すタンパク質、もしくは、
ＡＣＴＡ１；ＣＯＬ５Ａ２；ＨＳＰＡ８；ＰＳＡＰ；ＡＣＴＡ２；ＣＯＬ５Ａ３；ＨＳＰＥ１；ＰＳＭＥ１；ＡＣＴＢ；ＣＯＬ６Ａ１；ＨＳＰＧ２；ＰＴＫ７；ＡＣＴＣ；ＣＯＬ６Ａ２；ＩＧＦＢＰ２；ＱＳＣＮ６；ＡＣＴＧ１；ＣＯＬ６Ａ３；ＩＧＦＢＰ５；ＲＴＮ４；ＡＣＴＧ２；ＣＳＴＢ；ＩＧＦＢＰ６；Ｓ１００Ａ１１；ＡＧＲＮ；ＣＴＢＳ；ＩＧＦＢＰ７；ＳＨ３ＢＧＲＬ３；ＡＬＣＡＭ；ＣＴＳＢ；Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１；ＳＯＤ１；ＡＮＰ３２Ｂ；ＣＹＲ６１；ＫＤＲ；ＳＰＡＲＣ；ＡＮＸＡ２；ＤＯＣＫ１０；ＬＡＭＣ１；ＳＰＴＢＮ１；ＡＲＨＧＤＩＡ；ＤＯＣＫ８；ＬＧＡＬＳ１；ＳＴＣ２；Ｂ２Ｍ；ＥＣＭ１；ＬＧＡＬＳ３ＢＰ；ＳＶＥＰ１；ＢＭＰ１；ＥＥＦ１Ｇ；ＬＭＮＡ；ＴＡＧＬＮ；Ｃ１４ｏｒｆ１６６；ＥＮＯ１；ＬＯＸ；ＴＡＧＬＮ２；Ｃ１Ｒ；ＥＮＯ１Ｂ；ＬＴＢＰ１；ＴＧＦＢＩ；ＣＡＬＭ１；ＥＮＯ２；ＬＵＭ；ＴＧＦＢＲ３；ＣＤ１０９；ＦＢＬＮ１；ＭＤＨ２；ＴＨＢＳ１；ＣＤ４４；ＦＢＮ１；ＭＲＣ２；ＴＩＭＰ１；ＣＤＨ１１；ＦＢＮ２；ＭＹＨ１１；ＴＩＭＰ２；ＣＤＨ１３；ＦＧＦ１７；ＭＹＨ９；ＴＭＳＢ４Ｘ；ＣＤＨ２；ＦＧＦＲ２；ＮＣＬ；ＴＭＳＬ３；ＣＦＨ／ＨＦ１；ＦＬＪ２１９１８；ＮＰＭ１；ＴＭＳＬ６；ＣＦＬ１；ＦＬＮＡ；ＰＢＰ；ＴＰＩ１；ＣＬＳＴＮ１；ＦＮ１；ＰＣＯＬＣＥ；ＴＰＭ４；ＣＯＬ１１Ａ１；ＦＳＴＬ１；ＰＤＧＦＲＢ；ＴＵＢＡ３；ＣＯＬ１２Ａ１；ＧＡＬＮＴ５；ＰＦＮ１；ＴＵＢＡ６；ＣＯＬ１６Ａ１；ＧＬＲＸ；ＰＧＫ１；ＴＸＮ；ＣＯＬ１Ａ１；ＧＯＬＰＨ２；ＰＧＫ２；ＴＸＮＲＤ１；ＣＯＬ１Ａ２；ＧＳＮ；ＰＬＡＵ；ＵＢＥ２Ｉ；ＣＯＬ３Ａ１；ＧＳＴＰ１；ＰＬＥＣ１；ＵＣＨＬ１；ＣＯＬ４Ａ１；ＨＮＲＰＣＬ１；ＰＰＩＡ；ＵＦＭ１；ＣＯＬ４Ａ２；ＨＮＲＰＦ；ＰＲＤＸ１；ＵＲＢ；ＣＯＬ５Ａ１；ＨＮＴ；ＰＲＤＸ５；およびＹＷＨＡＺの遺伝子産物である間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）中のタンパク質のうちの、少なくとも７０％の種類を含有する、または、
表６に示す１つもしくは複数のｍｉＲＮＡを含有する、請求項１または２に記載のエキソソーム。
【請求項４】
前記エキソソームが、（ａ）＜１００ｋＤａのタンパク質を含有する、分子量＞１００ｋＤａの複合体、（ｂ）＜３００ｋＤａのタンパク質を含有する、分子量＞３００ｋＤａの複合体、または（ｃ）分子量＞１０００ｋＤａの複合体を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のエキソソーム。
【請求項５】
前記エキソソームが、０．２μＭフィルターでのろ過および１０ｋＤａの分子量カットオフ値を有する膜での濃縮によって測定した場合、２ｎｍ〜２００ｎｍの大きさを有するか、または、レーザー回折もしくは動的光散乱によって測定した場合、１００ｎｍ未満の流体力学的半径を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のエキソソーム。
【請求項６】
前記エキソソームが、リン脂質、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、セラミド類、糖脂質、セレブロシド、ステロイド類、およびコレステロールから成る群から選択される脂質を含有する、請求項１〜５いずれか一項に記載のエキソソーム。
【請求項７】
前記エキソソームが脂質ラフトを含有する、または前記エキソソームが非イオン性界面活性剤に不溶性である、または前記エキソソームが、前記エキソソームを非イオン性界面活性剤で処理した場合、請求項４で規定される前記分子量のタンパク質が前記請求項で規定される前記分子量の複合体中に残存するエキソソームである、または前記エキソソームがシクロデキストリンに対して感受性であり、シクロデキストリンによる処理が請求項４で規定される複合体の溶解を引き起こす、請求項１〜６のいずれか一項に記載のエキソソーム。
【請求項８】
前記エキソソームがリボ核酸（ＲＮＡ）を含有する、または、前記エキソソームがＣＤ９、ＣＤ１０９およびｔｈｙ−１から成る群から選択される表面抗原を含有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のエキソソーム。
【請求項９】
前記エキソソームが１．９の吸光度比（２６０：２８０ｎｍ）を有する、請求項８に記載のエキソソーム。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のエキソソームを作製する方法であって、間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）から前記エキソソームを単離することを含み、請求項４に記載される前記分子量から選択される分子量、または請求項５に記載される前記大きさから選択される大きさ、または請求項６に記載される前記脂質から選択される脂質、または心保護作用に基づき前記エキソソームを他の成分から分離することを含む方法。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のエキソソームを作製する方法であって、
（ａ）間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）を得るステップと、
（ｂ）前記間葉系幹細胞馴化培地を、限外ろ過によって濃縮するステップと、
（ｃ）前記濃縮間葉系幹細胞馴化培地を、サイズ排除クロマトグラフィーに供するステップと、
（ｄ）動的光散乱を示すＵＶ吸収画分を選択するステップと
を含み、ステップ（ｄ）が、１１〜１３分の保持時間で溶出する画分を収集するステップを含む方法。
【請求項１２】
前記（ｂ）の限外ろ過が、＞１０００ｋＤａ膜での限外ろ過である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記（ｃ）のサイズ排除クロマトグラフィーが、ＴＳＫ−ＧｕａｒｄカラムＳＷＸＬ、６×４０ｍｍ（商標名）またはＴＳＫゲルＧ４０００−ＳＷＸＬ、７．８×３００ｍｍカラム（商標名）を使用する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記（ｄ）の動的光散乱が、２２０ｎｍにおいて検出された準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
請求項の１〜９のいずれか一項に記載のエキソソームを医薬的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と共に含有する医薬組成物。
【請求項１６】
心不全または心筋梗塞を治療する方法における使用のための、請求項１〜９のいずれか一項に記載のエキソソームまたは請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
心不全または心筋梗塞の治療のための医薬組成物の製造のための、請求項１〜９のいずれか一項に記載のエキソソームの使用。
【請求項１８】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のエキソソームを送達するための送達システムであって、エキソソームの供給源を、前記エキソソームを標的に送達するように作動し得るディスペンサーと共に含む送達システム。
【請求項１９】
エキソソームをインビトロの標的に送達する方法における、請求項１８に記載の送達システムの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発生、細胞生物学、分子生物学および遺伝学の分野に関する。より詳細には、本発明は、胚性幹細胞から間葉系幹細胞を誘導する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、分化した細胞と異なり、分裂して、自己複製するかまたは表現型的および機能的に異なる娘細胞へと分化する能力を有する（Ｋｅｌｌｅｒ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２００５；１９：１１２９−１１５５；Ｗｏｂｕｓ  ａｎｄ  Ｂｏｈｅｌｅｒ，Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．２００５；８５：６３５−６７８；Ｗｉｌｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．１９９３；２２５：９００−９１８；Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２００５；１０５：３５９−３６８）。
【０００３】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、筋骨格損傷を治療する、心臓血管疾患において心機能を改善すし、かつＧＶＨＤの重症度を改善するうえでの治療効果の実証された証拠を有する多能性幹細胞である（Ｌｅ  Ｂｌａｎｃ  ａｎｄ  Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ，２００５）。系統制限的であるが、それらは間葉細胞型、たとえば脂肪細胞、軟骨細胞および骨細胞へと分化する、限られてはいるが強固な潜在能を備え、奇形腫形成の危険度はごくわずかである。移植されたＭＳＣの宿主免疫拒絶反応は、自家移植または同種移植を通して常套的に回避される。ＭＳＣは、骨髄（ＢＭ）、脂肪組織（ａｄ）、臍帯血を含むいくつかの成体組織から単離され、エクスビボで増幅され得る。
【０００４】
間葉系幹細胞は、筋骨格組織の生体工学３，４および心疾患５，６を含む広範囲の疾患を治療するために臨床および前臨床適用において使用されてきた１，２。広範囲の疾患［Ａ１、Ａ２］、たとえば筋骨格組織の生体工学［Ａ３、Ａ４］および心疾患［Ａ５、Ａ６］におけるＧＶＨＤ［Ａ１］を治療する臨床および前臨床適用において、広いスペクトルの疾患を治療するＭＳＣの治療能力は、多くの異なる修復細胞型へと分化するそれらの潜在能に帰せられてきた。
【０００５】
しかし、それらの単離のための組織の入手可能性は依然として限られていて、危険を伴う侵襲的な手順を必要とし、ＭＳＣのエクスビボでの増幅は、かなり多大ではあるとはいえ、限界がある。しかし、移植されたＭＳＣが損傷組織または器官において治療的に適切な数で機能的修復細胞へと分化する効率は、これまで十分に記録または実証されていなかった。
【０００６】
最近の報告は、これらの修復作用の一部がＭＳＣによって分泌されるパラクリン因子によって仲介され得ることを示唆した７。これらの因子は、パラクリン機構を介して動脈形成を促進し８、腸における幹細胞陰窩を支持し９、虚血性の腎１０，１１、心筋１２〜１５および四肢組織損傷１６に対して防御し、造血を支持および維持し１７、巨核球および胞体突起の形成を支持する１８ものとして主張されている。
【発明の概要】
【０００７】
より良い品質管理と一貫性を備えた、手頃なコストの、「容易に入手可能な（ｏｆｆ−ｔｈｅ−ｓｈｅｌｆ）」ＭＳＣベースの治療選択肢に対する満たされていない必要性が存在する。これは、急性ＭＩを生じた患者における再灌流障害などの損傷に対する時間依存的防御のための必須条件である。
【０００８】
本発明の１番目の態様によれば、間葉系幹細胞により分泌される粒子であって、間葉系幹細胞の少なくとも１つの生物学的性質を含む粒子が提供される。
【０００９】
生物学的性質は、間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）の生物活性を含み得る。生物活性は心保護作用を含み得る。粒子は梗塞の大きさを縮小し得る。
【００１０】
梗塞の縮小は、心筋虚血および再灌流障害のマウスまたはブタモデルにおいて評価し得る。
【００１１】
粒子は酸化ストレスを低減し得る。酸化ストレスの低減は、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）誘導性細胞死のインビトロアッセイにおいて評価し得る。
【００１２】
粒子は小胞を含む。粒子はエキソソームを含み得る。
【００１３】
粒子は、間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）中のタンパク質の少なくとも７０％を含有し得る。タンパク質は、表Ｄ１に示すリストから選択され得るか、または表Ｄ２に示す遺伝子の遺伝子産物であり得る。
【００１４】
粒子は、分子量＞１００ｋＤａの複合体を含有し得る。分子量＞１００ｋＤａの複合体は、＜１００ｋＤａのタンパク質を含有し得る。粒子は、分子量＞３００ｋＤａの複合体を含有し得る。分子量＞１００ｋＤａの複合体は、＜３００ｋＤａのタンパク質を含有し得る。
【００１５】
粒子は、分子量＞１０００ｋＤａの複合体を含有し得る。粒子は２ｎｍ〜２００ｎｍの大きさを有し得る。粒子は５０ｎｍ〜１５０ｎｍの大きさを有し得る。粒子は５０ｎｍ〜１００ｎｍの大きさを有し得る。
【００１６】
粒子の大きさは、０．２μＭフィルターでのろ過および１０ｋＤａの分子量カットオフ値を有する膜での濃縮によって測定し得る。粒子の大きさは電子顕微鏡検査によって測定し得る。
【００１７】
粒子は、１００ｎｍ未満の流体力学的半径を含み得る。粒子は、約３０ｎｍ〜約７０ｎｍの流体力学的半径を含み得る。粒子は、約４０ｎｍ〜約６０ｎｍ、たとえば約４５ｎｍ〜約５５ｎｍであり得る。間葉系幹細胞粒子は約５０ｎｍの流体力学的半径を含み得る。流体力学的半径は、レーザー回折または動的光散乱によって測定し得る。
【００１８】
粒子は、リン脂質、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、セラミド類、糖脂質、セレブロシド、ステロイド類、コレステロールから成る群から選択される脂質を含有し得る。コレステロール−リン脂質比は０．３〜０．４（モル／モル）超であり得る。粒子は脂質ラフトを含有し得る。
【００１９】
粒子は、非イオン性界面活性剤、好ましくはＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００に不溶性であり得る。粒子は、粒子を非イオン性界面活性剤で処理した場合、特定の分子量のタンパク質が特定の分子量の複合体中に実質的に残存するような粒子であり得る。
【００２０】
粒子は、シクロデキストリン、好ましくは２０ｍＭシクロデキストリンに対して感受性であり得る。粒子は、シクロデキストリンでの処理が特定の複合体の実質的な溶解を引き起こすような粒子であり得る。
【００２１】
粒子はリボ核酸（ＲＮＡ）を含有し得る。粒子は１．９の吸光度比（２６０：２８０ｎｍ）を有し得る。粒子は、ＣＤ９、ＣＤ１０９およびｔｈｙ−１から成る群から選択される表面抗原を含有し得る。
【００２２】
本発明の２番目の態様によれば、前記請求項のいずれかに記載の粒子を作製する方法であって、間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）から粒子を単離することを含む方法が提供される。
【００２３】
この方法は、分子量、大きさ、形状、組成物または生物活性に基づき粒子を他の成分から分離することを含み得る。
【００２４】
分子量は、前記に示す分子量から選択され得る。大きさは、上記に示す大きさから選択され得る。組成物は、上記に示す組成物から選択され得る。生物活性は、上記に示す生物活性から選択され得る。
【００２５】
本発明の３番目の態様によれば、前述したような粒子を作製する方法が提供される。この方法は、間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）を得ることを含み得る。この方法は、間葉系幹細胞馴化培地を濃縮することを含み得る。間葉系幹細胞馴化培地は、＞１０００ｋＤａ膜での限外ろ過によって濃縮し得る。この方法は、濃縮した間葉系幹細胞馴化培地をサイズ排除クロマトグラフィーに供することを含み得る。ＴＳＫ  ＧｕａｒｄカラムＳＷＸＬ、６×４０ｍｍまたはＴＳＫゲルＧ４０００  ＳＷＸＬ、７．８×３００ｍｍカラムを使用し得る。この方法は、たとえば２２０ｎｍで、動的光散乱を示すＵＶ吸収画分を選択することを含み得る。動的光散乱は、準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）検出器によって検出し得る。この方法は、１１〜１３分、たとえば１２分の保持時間で溶出する画分を収集することを含み得る。
【００２６】
４番目の態様によれば、前述した粒子を医薬的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と共に含有する医薬組成物が提供される。
【００２７】
本発明の４番目の態様として、疾患を治療する方法における使用のための上記粒子または上記医薬組成物が提供される。
【００２８】
本発明の５番目の態様によれば、疾患の治療のための医薬組成物の製造のための上記粒子の使用が提供される。
【００２９】
本発明は、６番目の態様において、個体における疾患の治療の方法における上記粒子の使用を提供する。
【００３０】
疾患は、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、熱傷、ならびに糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病およびがんなどの変性疾患から成る群から選択され得る。
【００３１】
疾患は、心筋梗塞、皮膚創傷、皮膚障害、皮膚病変、皮膚炎、乾癬、コンジローム、疣贅、血管腫、ケロイド、皮膚がん、アトピー性皮膚炎、ベーチェット病、慢性肉芽腫症、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、潰瘍形成、炎症を誘導する初期損傷によって特徴づけられる病的状態、ならびに線維症および機能喪失を含む慢性組織リモデリングを導く免疫機能不全、腎虚血障害、嚢胞性線維症、副鼻腔炎および鼻炎または整形外科的疾患から成る群から選択され得る。
【００３２】
粒子は、個体における創傷治癒、瘢痕減少、骨形成、骨移植または骨髄移植を助けるために使用され得る。
【００３３】
粒子は、（ｉ）以下の１つもしくはそれ以上から選択される経路の調節：Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼによる細胞骨格調節、細胞周期、インテグリンシグナル伝達経路、ケモカインおよびサイトカインシグナル伝達経路によって媒介される炎症、ＦＧＦシグナル伝達経路、ＥＧＦ受容体シグナル伝達経路、血管新生、プラスミノーゲン活性化カスケード、血液凝固、解糖、ユビキチンプロテアソーム経路、ｄｅ  ｎｏｖｏプリン生合成、ＴＣＡ回路、フェニルアラニン生合成、ヘム生合成；（ｉｉ）以下の１つもしくはそれ以上を含む過程の調節：細胞の構造および運動性、細胞構造、細胞間情報伝達、細胞運動性、細胞接着、エンドサイトーシス、有糸分裂、エキソサイトーシス、細胞質分裂、細胞周期、免疫および防御、サイトカイン／ケモカイン媒介性免疫、マクロファージ媒介性免疫、顆粒球媒介性免疫、リガンド媒介性シグナル伝達、サイトカインおよびケモカイン媒介性シグナル伝達経路、シグナル伝達、細胞外マトリックスタンパク質媒介性シグナル伝達、増殖因子ホメオスタシス、受容体タンパク質チロシンキナーゼシグナル伝達経路、細胞接着媒介性シグナル伝達、細胞表面受容体媒介性シグナル伝達、ＪＡＫ−ＳＴＡＴカスケード、抗酸化およびフリーラジカル除去、ホメオスタシス、ストレス応答、血液凝固、発生過程、中胚葉発生、骨格発達、血管新生、筋形成、筋収縮、タンパク質の代謝と修飾、タンパク質分解、タンパク質の折りたたみ、タンパク質複合体構築、アミノ酸活性化、細胞内タンパク質輸送、他のタンパク質ターゲティングと局在化、アミノ酸代謝、タンパク質生合成、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ反応、炭水化物代謝、解糖、ペントースリン酸回路、他の多糖代謝、プリン代謝、リン酸代謝の調節、ビタミン代謝、アミノ酸生合成、プレｍＲＮＡプロセシング、翻訳調節、ｍＲＮＡスプライシング；または（ｉｉｉ）以下の１つもしくはそれ以上を含む機能の供給：シグナル伝達分子、ケモカイン、増殖因子、サイトカイン、インターロイキン、他のサイトカイン、細胞外マトリックス、細胞外マトリックス構造タンパク質、他の細胞外マトリックス、細胞外マトリックス糖タンパク質、プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、他のプロテアーゼ、プロテアーゼ阻害因子、メタロプロテアーゼ阻害因子、セリンプロテアーゼ阻害因子、オキシドレダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、シャペロン、シャペロニン、Ｈｓｐ７０ファミリーのシャペロン、他のシャペロン類、シンテターゼ、シンターゼおよびシンテターゼ、選択カルシウム結合タンパク質（ｓｅｌｅｃｔ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、他のイソメラーゼ、ＡＴＰシンターゼ、ヒドラターゼ、トランスアミナーゼ、他のリアーゼ、他の酵素調節因子、セレクト調節分子、アクチン結合細胞骨格タンパク質、細胞骨格タンパク質、非モーターアクチン結合タンパク質、アクチンおよびアクチン関連タンパク質、アネキシン、チューブリン、細胞接着分子、アクチン結合モータータンパク質、中間径フィラメント、リボ核タンパク質、リボソームタンパク質、翻訳因子、他のＲＮＡ結合タンパク質、ヒストン、カルモジュリン��連タンパク質、小胞コートタンパク質、において使用され得る。
【００３４】
本発明の７番目の態様では、粒子を送達するための送達システムであって、粒子の供給源を、粒子を標的に送達するように作動し得るディスペンサーと共に含む送達システムが提供される。
【００３５】
本発明の８番目の態様によれば、粒子を標的に送達する方法におけるそのような送達システムの使用が提供される。
【００３６】
本発明の実施は、特に指定のない限り、当業者の能力の範囲内である、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来技術を使用する。そのような技術は文献において説明されている。たとえば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋｓ  １−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｃｈ．９，１３，ａｎｄ  １６，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）；Ｂ．Ｒｏｅ，Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ，ａｎｄ  Ａ．Ｋａｈｎ，１９９６，ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｊ．Ｍ．Ｐｏｌａｋ  ａｎｄ  Ｊａｍｅｓ  Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ，１９９０，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉｒｌ  Ｐｒｅｓｓ；Ｄ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｊ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＮＯ．Ｉ  ｂｙ  Ｅｄｗａｒｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ（１９９９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−５４４−７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｂｙ  Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ (Ｅｄｉｔｏｒ），Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ （Ｅｄｉｔｏｒ）（１９８８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３１４−２），１８５５；ａｎｄ  Ｌａｂ  Ｒｅｆ：Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｅｃｉｐｅｓ，Ｒｅａｇｅｎｔｓ，ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｂｅｎｃｈ，Ｅｄｉｔｅｄ  Ｊａｎｅ  Ｒｏｓｋａｍｓ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄａ  Ｒｏｄｇｅｒｓ，２００２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−６３０−３参照。これらの一般的テキストの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】心筋梗塞の大きさ。非ＣＭ（Ａ）、ＣＭ（Ｂ）または食塩水（Ｃ）で処置したブタ心臓に関するエバンスブルー（青色）およびＴＴＣ（赤色）染色の代表的画像。左心室（ＬＶ）および危険領域（ＡＡＲ）のパーセンテージとしての心筋梗塞の大きさの数量化をそれぞれ図ＤおよびＥに示す。非ＣＭ、ｎ＝９；ＣＭ、ｎ＝９；食塩水、ｎ＝８。
【図２】局所的および全体的収縮能。非ＣＭ、ＣＭまたは食塩水で処置したブタにおける梗塞領域の心エコー検査で評価した場合の局所的収縮期壁肥厚率（Ａ）。全体的収縮能である、心エコー法での面積収縮率（ＦＡＳ）を図Ｂに示す。非ＣＭ、ｎ＝９；ＣＭ、ｎ＝９；食塩水、ｎ＝８。非ＣＭおよび食塩水に対して＊ｐ＜０．０５。
【図３】酸化ストレス。ＣＭまたは非ＣＭ中の、Ｈ２Ｏ２で処理したＣＥＭ細胞の生存能（＊ｐ＜０．０５、Ａ）。馴化培地は、Ｈ２Ｏ２によって誘導される死から細胞を保護する。酸化ストレスをインビボで評価するため、非ＣＭ（Ｂ）、ＣＭ（Ｃ）または食塩水（Ｄ）で処置したブタからの梗塞領域切片を、核酸化ストレスの産物である８−ＯＨｄＧについて染色した。８−ＯＨｄＧ陽性核の数量化を２００×倍率で評価し、図Ｅに示している。インビボでも、ＣＭは酸化ストレスを低減する。非ＣＭ、ｎ＝９；ＣＭ、ｎ＝９；食塩水、ｎ＝８。
【図４】ＴＧＦ−βシグナル伝達およびアポトーシス。非ＣＭ、ＣＭまたは食塩水で処置したブタにおけるリン酸化ＳＭＡＤ２（Ａ、Ｂ）および活性カスパーゼ３（Ｃ、Ｄ）についてのウエスタンブロット。β−チューブリンを負荷対照として評価し、各群の間でβ−チューブリンの発現に差を認めなかった（Ｅ）。非ＣＭ、ｎ＝９；ＣＭ、ｎ＝９；食塩水、ｎ＝８。
【図５】ＣＭ画分の心保護特性。食塩水、ＣＭの＜１０００ｋＤ画分または未分画ＣＭで処置したマウスにおける心筋梗塞の大きさの数量化。未分画馴化培地は、食塩水で処置した動物と比較して心筋梗塞の大きさを有意に縮小する。しかし、＜１０００ｋＤ画分は、心筋梗塞サイズを縮小せず、心保護因子が１０００ｋＤａより大きいことを示唆する。食塩水、ｎ＝１０；＜１０００ｋＤａ、ｎ＝８；未分画、ｎ＝１２。食塩水に対して＊ｐ＜０．０１。
【図６】３日間、ｈＥＳＣ−ＭＳＣ  ＨｕＥＳ９．Ｅ１細胞によって馴化した化学的に定義された培地を０．２２μフィルターでろ過した。馴化培地（ＣＭ）を、１０ｋＤの分子量（ＭＷ）カットオフ値を有する膜でろ過することによって２５倍に濃縮した。濃縮したＣＭを、次に、１００ｋＤまたは３００ｋＤのＭＷカットオフ値を有する膜を通して遠心分離し、４：１（ｖ：ｖ）のろ液対保持液比を生じた。未分画ＣＭ、ろ液および保持液の試料を５：４：１の容積比で負荷した。
【図７】１００ｋＤのＭＷカットオフ値を有する膜を通してろ過した後のろ液中の成分の同一性。ａ）ろ液中のタンパク質成分対非馴化培地（ＮＣＭ）中のタンパク質成分の比較。馴化培地（ＣＭ）、ＣＭを１００ｋＤのＭＷカットオフ値を有する膜でろ過した後のろ液（１００ｋＤろ液）およびＮＣＭをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。タンパク質バンドを視覚化するためにゲルを銀染色した；ｂ）ＣＭを１００ｋＤ−ＭＷカットオフ膜でろ過して、４：１の保持液対ろ液容積比を生じさせた。保持液、ろ液および化学的に定義された培地中の種々のタンパク質添加物、すなわちインスリン−トランスフェリン−セレノプロテイン、ＦＧＦ２、ＥＧＦおよびＰＤＧＦ  ＡＢをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。保持液とろ液を４：１の容積比で負荷した。
【図８】膜における生物学的物質の相対的大きさおよび細孔径。Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（登録商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからの別刷。
【図９】虚血／再灌流後のマウスにおける相対的ＡＡＲ。３０分間の縫合結紮による左冠状動脈（ＬＣＡ）閉塞によって心筋梗塞を誘導し、縫合を除去して再灌流を開始させた。再灌流の５分前に、マウスを未分画ＭＳＣ−ＣＭ（１０〜２２０ｎｍ）２０μｌ、＜  １００または１，０００ｋＤ画分２０μｌ、＞１０００ｋＤ保持液または食塩水４μｌの尾静脈注射で処置した。２４時間後、心臓を切除した。切除前に、ＬＣＡを再結紮し、次に大動脈を通してエバンスブルーを灌流することによって危険領域（Ａｒｅａ  Ａｔ  Ｒｉｓｋ、ＡＡＲ）を決定した。ＡＡＲは、染料によって染色されない領域と定義し、左心壁領域のパーセンテージとして表した。
【図１０】虚血／再灌流後のマウスにおける相対的梗塞サイズへの馴化培地および分画馴化培地の作用。心臓の切除後、ＴＴＣを使用して２４時間後に梗塞の大きさを評価し、ＡＡＲのパーセンテージとして表した。
【図１１】電子顕微鏡検査を用いて直径５０〜１００ｎｍの物理的実体を認めた。
【図１２】Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００による処置後のＣＭのサイズ分画。ＣＭを最終濃度０．５または１．０％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で３０分間処理し、その後１００ｋＤのＭＷカットオフ値を有する膜でろ過して分画し、４：１のろ液：保持液容積比を生じさせた。
【図１３】種々の細胞型からのエキソソームに共通する、ＭＳ／ＭＳ分析から認められたタンパク質４４。
【図１４】ＣＭ画分の心臓保護特性。食塩水、ＨＥＫ２９３馴化培地、未分画ｈＥＳＣ−ＣＭ、１００ｋＤａ、３００ｋＤａ、５００ｋＤａおよび１０００ｋＤａのＭＷＣＯでろ過したＣＭ、またはＣＭの画分を１００ｋＤａのＭＷＣＯを有する膜で５０倍に濃縮したＣＭもしくは未分画ＣＭで処置したマウスにおける心筋梗塞の大きさの数量化。
【図１５】免疫沈降法。抗ＣＤ８１または陰性対照としてマウスＩｇＧで免疫沈降させたＣＭ。免疫沈降物および上清を、ＣＤ９、Ａｌｉｘ、Ｔｓｐ−１、ピルビン酸キナーゼおよびＳＯＤ１に対する抗体を使用したウエスタンブロットハイブリダイゼーションによって分析した。
【図１６】ＣＭの超遠心分離。５００ｋＤａのＭＷＣＯを有する膜でろ過することによってＣＭを５倍に濃縮した。保持液およびろ過していないＣＭを２００，０００ｇで２時間超遠心分離した。上清とペレットをＣＤ９の存在に関してウエスタンブロット法によって分析した。レーン１〜３：種々のタンパク質濃度のＣＭ。レーン４および５：ろ過していないＣＭの超遠心分離後のペレット（Ｐ）および上清（Ｓ）。レーン６：５００ｋＤａのＭＷＣＯを有する膜でＣＭをろ過した後の保持液。レーン７〜８：保持液の超遠心分離後のペレット（Ｐ）および上清（Ｓ）。レーン９：５００ｋＤａのＭＷＣＯを有する膜でＣＭをろ過した後のろ液。
【図１７】ショ糖勾配密度での分画。ＳＷ６０Ｔｉ遠心分離管中で２２．８〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度の１４のショ糖溶液を、最も濃厚な溶液を超遠心分離管の底部にして積層することにより、ショ糖密度勾配を調製した。試料を勾配の上部に負荷し、ＳＷ６０Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．）において２００，０００×ｇ、４℃で１６時間半にわたって超遠心分離した。ショ糖勾配の上部から底部までで１３の画分を収集した。各々の画分の密度を、各画分の固定容量を計量することによって算定した。次に、画分をウエスタンブロット法によって分析し、ピルビン酸キナーゼ、ＣＤ９、ＣＤ８１およびＳＯＤ１に関してプローブした。タンパク質標準分子量マーカーを同様の勾配で分画し、ショ糖勾配の種々の画分におけるマーカーの分布を図の下部に示した。ａ）ＣＭを分画した、ｂ）ＣＭを溶解緩衝液で処理した後、ショ糖勾配で分画した。
【図１８】ＣＭのトリプシン処理。ＣＭを０、０．５、２、１０および２０分間トリプシンで消化した。部分消化したＣＭをＣＤ９およびＳＯＤ１の存在に関して分析した。
【図１９】ＣＭ中のＲＮＡの分析。（ａ、ｂ）ＭＳＣおよびＭＳＣ−ＣＭからＲＮＡを抽出した。精製ＲＮＡを変性させ、それぞれグリオキサールアガロースゲルおよび尿素−ＰＡＧＥで分離した。（ｃ）等容量のＣＭをＰＢＳ、シクロテキストリン、溶解緩衝液またはホスホリパーゼＡ２で処理した。未処理および処理ＣＭをＲＮＡに関して抽出した。ＲＮＡを尿素−ＰＡＧＥで分離した。（ｄ）ＣＭからのＲＮＡをＲＮアーゼＩＩＩで処理し、処理したＲＮＡを未処理ＲＮＡと並行して尿素−ＰＡＧＥで分離した。臭化エチジウムで染色することによってゲル中のＲＮＡを視覚化した。
【図２０】ＣＭ中のＲＮＡの密度。図４で述べたようにショ糖密度勾配平衡遠心分離でＣＭ、溶解緩衝液で前処理したＣＭおよびＲＮＡ  ＭＷ標準品を分画した後、各々の画分からＲＮＡを抽出した。ａ）各々の試料中の各画分についての相対的ＲＮＡ収率を画分番号に対してプロットした。相対的濃度を、恣意的に１００％と設定した、各勾配における最高ＲＮＡ濃度に対して基準化した。ｂ）各画分から抽出したＲＮＡを尿素−ＰＡＧＥで分離した。
【図２１】ＲＮＡはＣＤ８１＋エキソソーム中には存在しなかった。ＣＤ９も同時に沈殿させるＣＤ８１免疫沈降法を図２で述べたように実施した。免疫沈降物と上清をＲＮＡに関して抽出し、抽出物を尿素−ＰＡＧＥで分離して、臭化エチジウム染色によって視覚化した。
【図２２】ＣＭ中のｍｉＲＮＡのマイクロアレイ分析。ＭＳＣおよびＣＭからのＲＮＡ試料を、Ｓａｎｇｅｒ  ｍｉＲＢａｓｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０．１に列挙されているｍｉＲＮＡ転写産物についてのプローブを含むマイクロアレイチップにハイブリダイズした。各々のＲＮＡ試料の２つの生物学的複製物を使用してハイブリダイゼーションを実施した。ａ）１４９のｍｉＲＮＡをＭＳＣ中で検出し、６３をＣＭ中で検出した。これらのうちで、４７はＭＳＣとＣＭの両方において同様のレベルで発現された。１６はＣＭにおいて検出可能なレベルで発現されたがＭＳＣでは発現されず、一方４７はＭＳＣにおいて検出されたがＣＭでは検出されなかった。ｂ）マイクロアレイチップ上のハイブリダイゼーションシグナルに基づくガイドｍｉＲＮＡ対そのアンチガイドｍｉＲＮＡの相対的発現レベル。
【図２３】ＣＭおよびＮＣＭのＨＰＬＣ分画。ＣＭおよびＮＣＭを、ＢｉｏＳｅｐ  Ｓ４０００、７．８ｍｍ×３０ｃｍカラムを使用したＨＰＬＣで分画した。ＣＭまたはＮＣＭ中の成分を、ｐＨ７．２の１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液で溶出した。溶出モードは無勾配であり、実行時間は４０分であった。２２０ｎｍに設定した紫外可視検出器で溶離液を観測した。各々のピーク下面積％を紫外可視検出器から積分した。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、ヒトＥＳＣ由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が、分泌された直径約５０〜１００ｎｍの大型複合体を介して心保護作用を調整することの実証に基づく。そのような複合体または粒子は、それゆえ、細胞自体の代わりに、心保護作用を含む治療手段のために使用し得る。
【００３９】
実施例は、これらの複合体のプロテオーム解析を説明し、共免疫沈降するエキソソーム関連タンパク質、たとえばＣＤ８１、ＣＤ９およびＡｌｉｘの存在、ならびにそれぞれ膜結合タンパク質および膜被包タンパク質と一致する、界面活性剤感受性タンパク質分解を示す膜および細胞質タンパク質の存在を明らかにする。
【００４０】
実施例はさらに、これらの粒子または複合体の他の性質を明らかにする。本発明者らは、そのような粒子または複合体が１．０１６〜１．２１５ｇ／ｍｌのＭＷ非依存性沈降密度を有していて、この密度が膜溶解緩衝液での処理後にＭＷ依存性密度に戻ることを示す。分泌物はまた、コレステロールに富む脂質小胞中のＲＮＡ（＜３００ヌクレオチド）を含有する。ＨＰＬＣ分画および動的光散乱試験はさらに、流体力学的半径（ｒｈ）が１〜１０００ｎｍの範囲内の分泌中の唯一の検出可能な粒子が４５〜５５ｎｍのｒｈを有することを示す。
【００４１】
これらの所見は、膜脂質、たとえばコレステロール、スフィンゴミエリンおよびホスファチジルコリンの存在と共に、分泌物中の心保護性複合体がエキソソームまたは分泌された脂質小胞であることを明らかにする。
【００４２】
これらの間葉系幹細胞粒子、複合体またはエキソソームは、様々な目的、たとえば虚血、心炎症または心不全などの心疾患の治療または予防のために使用し得る。それらはまた、灌流障害後の修復のためにも使用し得る。
【００４３】
＜粒子＞
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から誘導し得る粒子を説明する。
【００４４】
粒子はいくつかの手段のいずれかによって、たとえばＭＳＣからの分泌、出芽または分散によってＭＳＣから誘導し得ると考えられる。たとえば、粒子はＭＳＣから産生、滲出、放射または放出され得る。ＭＳＣが細胞培養物中に存在する場合、粒子は細胞培養培地中に分泌され得る。
【００４５】
粒子は、特に小胞を含み得る。粒子はエキソソームを含み得る。本明細書で述べる粒子は、本明細書で述べるエキソソームの性質の１つまたはそれ以上を含み得る。
【００４６】
粒子は、小胞または脂質二重層によって制限された扁平な球体を含み得る。粒子は４０〜１００ｎｍの直径を含み得る。粒子はエンドソーム膜の内向き出芽によって形成され得る。粒子は約１．１３〜１．１９ｇ／ｍｌの密度を有し得、ショ糖勾配上を浮遊し得る。粒子は、コレステロールおよびスフィンゴミエリン、ならびにＧＭ１、ＧＭ３、フロチリンおよびｓｒｃプロテインキナーゼＬｙｎなどの脂質ラフトマーカーに関して富化され得る。粒子は、ＭＳＣまたはＭＳＣ−ＣＭに特徴的または特異的なタンパク質などの、間葉系幹細胞または間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）中に存在する１つまたはそれ以上のタンパク質を含有し得る。粒子は、ＲＮＡ、たとえばｍｉＲＮＡを含有し得る。
【００４７】
本発明者らは、ＭＳＣ中またはＭＳＣの培養によって馴化された培地中に認められる１つまたはそれ以上の遺伝子または遺伝子産物を含有する粒子を提供する。粒子は、ＭＳＣによって分泌される分子を含有し得る。そのような粒子、および特にタンパク質またはポリペプチドを含む、その中に含有される分子のいずれかの組み合わせは、たとえば疾患を治療するかまたは予防することを目的として、ＭＳＣまたはＭＳＣによって馴化された培地の活性を補足するためにまたはそれらの代わりに使用し得る。
【００４８】
粒子は、細胞骨格中に認められる細胞質タンパク質、たとえばチューブリン、アクチンおよびアクチン結合タンパク質、細胞内膜融合物および輸送体、たとえばアネキシン類およびｒａｂタンパク質、シグナル伝達タンパク質、たとえばプロテインキナーゼ、１４−３−３およびヘテロ三量体Ｇタンパク質、代謝酵素、たとえばペルオキシダーゼ、ピルビン酸キナーゼ、脂質キナーゼおよびエノラーゼ−１、ならびにテトラスパニンのファミリー、たとえばＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＣＤ８２を含有し得る。特に、粒子は１つまたはそれ以上のテトラスパニンを含有し得る。粒子はｍＲＮＡおよび／またはマイクロＲＮＡを含有し得る。
【００４９】
本明細書で使用される「粒子」という用語は、個別の実体を意味すると解釈され得る。粒子は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）から単離可能な何らかのものであり得る。粒子は、ＭＳＣまたはＭＳＣ−ＣＭの少なくとも１つの活性に関与し得る。粒子は、実質的にＭＳＣまたはＭＳＣ−ＣＭの機能の大部分またはすべてに関与し、かつそれらを実行し得る。たとえば、粒子はＭＳＣまたはＭＳＣ−ＣＭの代替物（または生物学的代替物）であり得る。
【００５０】
粒子は、ＭＳＣまたはＭＳＣ−ＣＭを使用し得る治療目的のいずれかのために使用し得る。
【００５１】
粒子は、好ましくは間葉系幹細胞の少なくとも１つの性質を有する。粒子は、生物活性などの生物学的性質を有し得る。粒子は、ＭＳＣの生物活性のいずれかを有し得る。粒子は、たとえば、ＭＳＣの治療活性または修復活性を有し得る。
【００５２】
実施例は、ＭＳＣによって馴化された培地（以下で述べるような、間葉系幹細胞馴化培地またはＭＳＣ−ＣＭなど）がＭＳＣの生物活性を含み、ＭＳＣ自体の代わりになり得ることを示す。ＭＳＣの生物学的性質または生物活性は、それゆえ、間葉系幹細胞馴化培地の生物学的性質または生物活性に一致し得る。従って、粒子は間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）の１つまたはそれ以上の生物学的性質または生物活性を含み得る。
【００５３】
＜間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）＞
間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）などの馴化細胞培養培地は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、その子孫またはそれに由来する細胞株を細胞培養培地で培養することによって入手し得る。間葉系幹細胞は、胚幹（ＥＳ）細胞コロニーを分散させることによって細胞を得ることを含む工程によって生産し得る。細胞またはその子孫を、ＦＧＦ２を含む無血清培地において共培養物なしで増殖させ得る。
【００５４】
＜間葉系幹細胞粒子＞
粒子は多くの方法で生成または単離し得る。そのような方法は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から粒子を単離することを含み得る。そのような方法は、間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）から粒子を単離することを含み得る。
【００５５】
粒子は、たとえば粒子の何らかの性質に基づき非関連成分から分離することによって単離し得る。たとえば、粒子は、分子量、大きさ、形状、組成物または生物活性に基づいて単離し得る。
【００５６】
馴化培地は、分離の間、分離の前または分離の後にろ過または濃縮し得るか、またはその両方を実施し得る。たとえば、馴化培地は膜を通して、たとえばサイズまたは分子量カットオフ値を有するものを通してろ過し得る。馴化培地は、接線分力ろ過または限外ろ過に供し得る。
【００５７】
たとえば、本明細書の別の部分の「分子量についてのアッセイ」で述べるように、適切な分子量またはサイズカットオフ値の膜によるろ過を使用し得る。
【００５８】
場合によりろ過または濃縮されたまたはその両方を実施された馴化培地は、カラムクロマトグラフィーなどのさらなる分離手段に供し得る。たとえば、様々なカラムによる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用し得る。カラムは、サイズ排除カラムまたは結合カラムであり得る。
【００５９】
粒子の１つまたはそれ以上の性質または生物活性は、間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）の分画の間にその活性を追跡するために使用し得る。一例として、光散乱、屈折率、動的光散乱または紫外可視検出器を、粒子を追跡するために使用し得る。たとえば、心保護活性などの治療活性を、分画の間の活性を追跡するために利用し得る。
【００６０】
以下の段落は、エキソソームなどの間葉系幹細胞粒子を入手し得る方法の特定例を提供する。
【００６１】
間葉系幹細胞粒子は、間葉系幹細胞を、それを馴化するための培地中で培養することによって生成し得る。間葉系幹細胞はＨｕＥＳ９．Ｅ１細胞を含み得る。培地はＤＭＥＭを含み得る。ＤＭＥＭは、フェノールレッドを含まないものであり得る。培地は、インスリン、トランスフェリンまたはセレノプロテイン（ＩＴＳ）、またはそれらの何らかの組み合わせを添加し得る。培地はＦＧＦ２を含み得る。培地はＰＤＧＦ−ＡＢを含み得る。ＦＧＦ２の濃度は約５ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２であり得る。ＰＤＧＦ−ＡＢの濃度は約５ｎｇ／ｍｌであり得る。培地は、グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシンまたはβ−メルカプトエタノール、またはそれらの何らかの組み合わせを含み得る。
【００６２】
細胞は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０日間またはそれ以上、たとえば３日間培養し得る。馴化培地は、培地から細胞を分離することによって入手し得る。馴化培地は、たとえば５００ｇで遠心分離し得る。馴化培地は、膜を通してのろ過によって濃縮し得る。膜は、＞１０００ｋＤａの膜を含み得る。馴化培地は約５０倍またはそれ以上に濃縮し得る。
【００６３】
馴化培地は、ＨＰＬＣなどの液体クロマトグラフィーに供し得る。馴化培地はサイズ排除によって分離し得る。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅなどの任意のサイズ排除マトリックスを使用し得る。一例として、ＴＳＫ  ＧｕａｒｄカラムＳＷＸＬ、６×４０ｍｍまたはＴＳＫゲルＧ４０００  ＳＷＸＬ、７．８×３００ｍｍを使用し得る。溶出緩衝液は、食塩水などの任意の生理的媒質を含み得る。溶出緩衝液は、ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する２０ｍＭリン酸緩衝液を含み得る。クロマトグラフィー系は０．５ｍｌ／分の流速で平衡させ得る。溶出モードは無勾配であり得る。溶出の進行を追跡するために２２０ｎｍのＵＶ吸光度を使用し得る。画分は、準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）検出器を使用して動的光散乱（ＤＬＳ）に関して検査し得る。
【００６４】
動的光散乱を示すことが認められた画分を保持し得る。たとえば、前述したような一般的方法によって生成され、１１〜１３分、たとえば１２分の保持時間で溶出する画分は、動的光散乱を示すことが認められる。このピークでの粒子のｒｈは約４５〜５５ｎｍである。そのような画分は、エキソソームなどの間葉系幹細胞粒子を含む。
【００６５】
＜粒子の性質＞
間葉系幹細胞の性質は、間葉系幹細胞によって馴化された培地（ＭＳＣ−ＣＭ）の性質を含み得る。そのような間葉系幹細胞馴化培地を生成する方法は、本明細書の別の部分で述べられていて、たとえば以下の実施例１で説明される。
【００６６】
性質は、生物活性などの生物学的性質を含み得る。生物活性の例としては、心保護作用、酸化ストレスの低減および梗塞の大きさの縮小を含む。
【００６７】
＜心保護作用＞
粒子は、心保護作用を含む、間葉系幹細胞および／または間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）の性質を有し得る。心保護作用は、虚血および／または再灌流の間の心機能の修復または維持を含み得る。
【００６８】
心保護作用についてのアッセイ
心保護作用は、たとえば実施例５、１０、１４および２０で述べる方法の１つまたはそれ以上を使用して検定し得る。
【００６９】
＜酸化ストレス＞
粒子は、酸化ストレスを低減する能力（または細胞保護作用）を含む、間葉系幹細胞および／または間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）の性質を有し得る。
【００７０】
酸化ストレスについてのアッセイ
酸化ストレスの低減は、たとえば過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）誘導性細胞死のインビトロアッセイを使用して検定し得る。要約すると、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）媒介性酸化ストレスをヒト白血病ＣＥＭ細胞において誘導し、細胞の生存能をトリパンブルー排除法によって観測する。ヒト白血病ＣＥＭ細胞を粒子、馴化培地または間葉系幹細胞と共に（対照として食塩水と共に）インキュベートし、５０μＭのＨ２Ｏ２で処理して、酸化ストレスを誘導する。Ｈ２Ｏ２処理の１２、２４、３６および４８時間後にトリパンブルー排除法を使用して細胞生存能を評価する。
【００７１】
酸化ストレスの低減は、ＤＮＡ酸化のインビボアッセイを用いてさらに検定し得る。インビボでの酸化ストレスも以下のようにして検定し得る。ブタを粒子、馴化培地または間葉系幹細胞で（対照として食塩水で）処置する。ブタ心臓の組織切片を得る。処置したブタと未処置ブタの組織切片における核酸化ストレスを、酸化ＤＮＡについての８−ＯＨｄＧ免疫染色によって定量する。ＤＮＡ酸化および酸化ストレスを指示する強い核染色に関して組織切片を検定する。
【００７２】
＜梗塞の大きさ＞
粒子は、梗塞の大きさを縮小する能力を含む、間葉系幹細胞および／または間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）の性質を有し得る。
【００７３】
梗塞の大きさについてのアッセイ
梗塞の大きさは、たとえば実施例６および１３で述べる方法の１つまたはそれ以上を使用して検定し得る。
【００７４】
＜粒子の分子量＞
粒子は１００ｋＤａ超の分子量を有し得る。粒子は５００ｋＤａ超の分子量を有し得る。たとえば、粒子は１０００ｋＤａ超の分子量を有し得る。
【００７５】
分子量は様々な手段によって決定し得る。原則として、分子量は、サイズ分画および関連する分子量カットオフ値を有する膜を通してのろ過によって決定し得る。粒子の大きさは、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの成分タンパク質の分離を追跡することによってまたは生物学的アッセイによって決定し得る。
【００７６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量のアッセイ
粒子は１００ｋＤａ超の分子量を有し得る。たとえば、粒子は、ろ過に供した場合、１００ｋＤａ未満の分子量を有する粒子の大部分のタンパク質が１００ｋＤａ超の分子量の保持液画分中に分離されるような粒子であり得る。同様に、５００ｋＤａのカットオフ値を有する膜でのろ過に供した場合、５００ｋＤａ未満の分子量を有する粒子の大部分のタンパク質は、５００ｋＤａ超の分子量の保持液画分中に分離され得る。これは、粒子が５００ｋＤａ超の分子量を有し得ることを指示する。
【００７７】
生物活性による分子量のアッセイ
粒子は１０００ｋＤａ以上の分子量を有し得る。たとえば、粒子は、１０００ｋＤａのカットオフ値を有する膜でのろ過に供した場合、関連する生物活性が実質的にまたは主として保持液画分中に残存するような粒子であり得る。あるいはまたは加えて、生物活性がろ液画分中に存在しなくてもよい。生物活性は、本明細書の別の部分で述べる粒子の生物活性のいずれかを含み得る。
【００７８】
梗塞の大きさによる分子量のアッセイ
たとえば、生物活性は、心筋虚血および再灌流障害の任意の適切なモデルにおいて検定される、梗塞の大きさの縮小を含み得る。たとえば、生物活性は、実施例で述べるようなマウスまたはブタモデルにおいて検定し得る。
【００７９】
要約すると、縫合結紮による３０分間の左冠状動脈（ＬＣＡ）閉塞によって心筋虚血を誘導し、縫合を除去して再灌流を開始させる。再灌流の５分前に、尾静脈を介した静脈内経路にて、粒子を含む液体（未分画ＭＳＣ−ＣＭなど）、ろ液（＜１００または１，０００ｋＤａ画分など）、保持液（＞１０００ｋＤａ保持液など）または食塩水でマウスを処置する。２４時間後、心臓を切除する。切除前に、ＬＣＡを再結紮し、次に大動脈を通してエバンスブルーを灌流することによって危険領域（ＡＡＲ）を決定する。
【００８０】
ＡＡＲは、染料によって染色されない領域と定義され、左心室壁領域のパーセンテージとして表される。エバンスブルーおよびＴＴＣを使用して２４時間後に梗塞の大きさを評価する。相対的な梗塞の大きさが、食塩水と比較して間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）および保持液（＞１０００ｋＤａなど）画分で処置した動物において有意に縮小する場合、これは、粒子が膜の関連カットオフ値より高い分子量（たとえば１０００ｋＤａ超）を有することを指示する。
【００８１】
＜粒子の大きさ＞
粒子は２ｎｍ超の大きさを有し得る。粒子は、５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍまたは５０ｎｍ超の大きさを有し得る。粒子は、１００ｎｍ超、たとえば１５０ｎｍ超の大きさを有し得る。粒子は、実質的に２００ｎｍまたはそれ以上の大きさを有し得る。
【００８２】
１または複数の粒子は、一連の大きさ、たとえば２ｎｍ〜２０ｎｍ、２ｎｍ〜５０ｎｍ、２ｎｍ〜１００ｎｍ、２ｎｍ〜１５０ｎｍまたは２ｎｍ〜２００ｎｍの大きさを有し得る。１または複数の粒子は、２０ｎｍ〜５０ｎｍ、２０ｎｍ〜１００ｎｍ、２０ｎｍ〜１５０ｎｍまたは２０ｎｍ〜２００ｎｍの大きさを有し得る。１または複数の粒子は、５０ｎｍ〜１００ｎｍ、５０ｎｍ〜１５０ｎｍまたは５０ｎｍ〜２００ｎｍの大きさを有し得る。１または複数の粒子は、１００ｎｍ〜１５０ｎｍまたは１００ｎｍ〜２００ｎｍの大きさを有し得る。１または複数の粒子は、１５０ｎｍ〜２００ｎｍの大きさを有し得る。
【００８３】
大きさは様々な手段によって測定し得る。原則として、大きさは、サイズ分画および関連するサイズカットオフ値を有する膜を通してのろ過によって測定し得る。粒子の大きさは、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの成分タンパク質の分離を追跡することによってまたは生物学的アッセイによって測定し得る。
【００８４】
大きさはまた、実施例２１で述べるように、電子顕微鏡検査によっても測定し得る。
【００８５】
大きさは流体力学的半径を含み得る。粒子の流体力学的半径は１００ｎｍ未満であり得る。粒子の流体力学的半径は、約３０ｎｍ〜約７０ｎｍであり得る。流体力学的半径は、約４０ｎｍ〜約６０ｎｍ、たとえば約４５ｎｍ〜約５５ｎｍであり得る。流体力学的半径は約５０ｎｍであり得る。
【００８６】
粒子の流体力学的半径は任意の適切な手段によって、たとえばレーザー回折または動的光散乱によって測定し得る。流体力学的半径を測定するための動的光散乱法の一例を以下の実施例３３で述べる。
【００８７】
＜組成物＞
粒子は、間葉系幹細胞によって分泌される１つまたはそれ以上のタンパク質を含有し得る。粒子は、間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）中に存在する１つまたはそれ以上のタンパク質を含有し得る。
【００８８】
たとえば、粒子は、これらのタンパク質の１０％もしくはそれ以上、２０％もしくはそれ以上、３０％もしくはそれ以上、４０％もしくはそれ以上、５０％もしくはそれ以上、６０％もしくはそれ以上、または７０％もしくはそれ以上を含有し得る。粒子は、実質的にこれらのタンパク質の約７５％を含有し得る。タンパク質は、タンパク質のリストまたは遺伝子の遺伝子産物のリストを参照することによって定義され得る。
【００８９】
タンパク質
タンパク質は、以下の表Ｄ１に示すものから選択され得る。表Ｄ１は、１〜２５０の番号を付した以下のタンパク質、ならびに以下の段落中の「機能未同定のタンパク質」を含む：
１．ＩＰＩ０００２１４２８  α骨格筋アクチン；２．ＩＰＩ００４１４０５７  α１骨格筋アクチンタンパク質；３．ＩＰＩ００００８６０３  大動脈平滑筋アクチン；４．ＩＰＩ０００２１４３９  細胞質アクチン１；５．ＩＰＩ０００２３００６  α心臓アクチン；６．ＩＰＩ０００２１４４０  細胞質アクチン２；７．ＩＰＩ０００２５４１６  γ腸平滑筋アクチン；８．ＩＰＩ００４７９９２５  アグリン；９．ＩＰＩ０００１５１０２  ＣＤ１６６抗原前駆体；１０．ＩＰＩ００００７４２３  酸性ロイシンリッチ核ホスホプロテイン３２ファミリー成員Ｂ；１１．ＩＰＩ００４１３３３１  ３６ｋＤａタンパク質；１２．ＩＰＩ００４１２５７７  ３４ｋＤａタンパク質；１３．ＩＰＩ００４１３５０６  ３３ｋＤａタンパク質；１４．ＩＰＩ００４１８１６９  仮説タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｐ０３１５９；１５．ＩＰＩ００００３８１５  Ｒｈｏ  ＧＤＰ解離阻害因子１；１６．ＩＰＩ００００４６５６  β２−マイクログロブリン前駆体；１７．ＩＰＩ００２１８０４２  骨形成タンパク質１前駆体のスプライスアイソフォームＢＭＰ１−５；１８．ＩＰＩ００００９０５４  骨形成タンパク質１前駆体のスプライスアイソフォームＢＭＰ１−３；１９．ＩＰＩ０００１４０２１  骨形成タンパク質１前駆体のスプライスアイソフォームＢＭＰ１−１；２０．ＩＰＩ００２１８０４０  骨形成タンパク質１前駆体のスプライスアイソフォームＢＭＰ１−４；２１．ＩＰＩ００００６９８０  タンパク質Ｃ１４ｏｒｆ１６６；２２．ＩＰＩ００２９６１６５  補体Ｃ１ｒサブコンポーネント前駆体；２３．ＩＰＩ００１５２５４０  ＯＴＴＨＵＭＰ００００００１６７４８；２４．ＩＰＩ００３０５０６４  ＣＤ４４抗原前駆体のスプライスアイソフォームＣＤ４４；２５．ＩＰＩ００２９７１６０  仮説タンパク質ＤＫＦＺｐ４５１Ｋ１９１８；２６．ＩＰＩ００２９３５３９  カドヘリン−１１前駆体のスプライスアイソフォーム２；２７．ＩＰＩ００３０４２２７  カドヘリン−１１前駆体のスプライスアイソフォーム１；２８．ＩＰＩ００３８６４７６  カドヘリン１１、２型、アイソフォーム１プレプロタンパク質；２９．ＩＰＩ０００２４０４６  カドヘリン−１３前駆体；
３０．ＩＰＩ００２９００８５  神経カドヘリン前駆体；３１．ＩＰＩ０００２９７３９  補体因子Ｈ前駆体のスプライスアイソフォーム１；３２．ＩＰＩ０００１２０１１  コフィリン、非筋型アイソフォーム；３３．ＩＰＩ００００７２５７  カルシンテニン１アイソフォーム２；３４．ＩＰＩ００２１８５３９  コラーゲンα−１（ＸＩ）鎖前駆体のスプライスアイソフォームＢ；３５．ＩＰＩ００４７７３５０  ＸＩ型コラーゲンα１；３６．ＩＰＩ００３２９５７３  コラーゲンα−１（ＸＩＩ）鎖前駆体のロングスプライスアイソフォーム；３７．ＩＰＩ００２２１３８４  コラーゲンα−１（ＸＩＩ）鎖前駆体のショートスプライスアイソフォーム；３８．ＩＰＩ００４００９３５  コラーゲンα−１（ＸＶＩ）鎖前駆体；３９．ＩＰＩ００２９７６４６  コラーゲンα−１（Ｉ）鎖前駆体；４０．ＩＰＩ００１６４７５５  プレプロα２（Ｉ）コラーゲン前駆体；４１．ＩＰＩ００３０４９６２  コラーゲンα−２（Ｉ）鎖前駆体；４２．ＩＰＩ０００２１０３３  コラーゲンα−１（ＩＩＩ）鎖前駆体；４３．ＩＰＩ００１６７０８７  ＣＯＬ３Ａ１タンパク質；４４．ＩＰＩ０００２１０３４  コラーゲンα−１（ＩＶ）鎖前駆体；４５．ＩＰＩ００４７９３２４  α２、ＩＶ型コラーゲンプレプロタンパク質；４６．ＩＰＩ００３０６３２２  コラーゲンα−２（ＩＶ）鎖前駆体；４７．ＩＰＩ００３０３３１３  コラーゲンα−１（Ｖ）鎖前駆体；４８．ＩＰＩ００４７７６１１  １８４ｋＤａタンパク質；４９．ＩＰＩ００２９３８８１  ＣＯＬ５Ａ２タンパク質；５０．ＩＰＩ０００１８２７９  コラーゲンα−３（Ｖ）鎖前駆体；５１．ＩＰＩ００２９１１３６  コラーゲンα−１（ＶＩ）鎖前駆体；５２．ＩＰＩ００３０４８４０  コラーゲンα−２（ＶＩ）鎖前駆体のスプライスアイソフォーム２Ｃ２；５３．ＩＰＩ００２２０６１３  コラーゲンα−２（ＶＩ）鎖前駆体のスプライスアイソフォーム２Ｃ２Ａ；５４．ＩＰＩ０００２２２００  α３、ＶＩ型コラーゲンアイソフォーム１前駆体；５５．ＩＰＩ０００７２９１８  α３、ＶＩ型コラーゲンアイソフォーム４前駆体；５６．ＩＰＩ００２２０７０１  コラーゲンα−３（ＶＩ）鎖前駆体のスプライスアイソフォーム２；５７．ＩＰＩ０００７２９１７  α３、ＶＩ型コラーゲンアイソフォーム３前駆体；５８．ＩＰＩ０００２１８２８  シスタチンＢ；５９．ＩＰＩ００００７７７８  ジ−Ｎ−アセチルキトビアーゼ前駆体；６０．ＩＰＩ００２９５７４１  カテプシンＢ前駆体；
６１．ＩＰＩ００２９９２１９  タンパク質ＣＹＲ６１前駆体；６２．ＩＰＩ００５１４９００  ４２ｋＤａタンパク質；６３．ＩＰＩ００３３３７７０  細胞質分裂のデディケイタータンパク質１０（Ｄｅｄｉｃａｔｏｒ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １０）に類似；６４．ＩＰＩ００４７８３３２  細胞質分裂のデディケイタータンパク質９に類似；６５．ＩＰＩ０００００８７５  伸長因子１γ；６６．ＩＰＩ００４６５２４８  α−エノラーゼ；６７．ＩＰＩ０００１３７６９  肺特異的α−エノラーゼ；６８．ＩＰＩ００２１６１７１  γ−エノラーゼ；６９．ＩＰＩ００２１８８０３  フィブリン−１前駆体のスプライスアイソフォームＢ；７０．ＩＰＩ００２９６５３７  フィブリン−１前駆体のスプライスアイソフォームＣ；７１．ＩＰＩ００３２８１１３  フィブリリン−１前駆体；７２．ＩＰＩ０００１９４３９  フィブリリン−２前駆体；７３．ＩＰＩ００３８５６４５  線維芽細胞増殖因子１７前駆体のスプライスアイソフォーム２；７４．ＩＰＩ００２１６６０２  線維芽細胞増殖因子受容体２前駆体のスプライスアイソフォーム５；７５．ＩＰＩ００２１６６０４  線維芽細胞増殖因子受容体２前駆体のスプライスアイソフォーム８；７６．ＩＰＩ０００３４０９９  仮説タンパク質ＦＬＪ２１９１８；７７．ＩＰＩ００３３３５４１  フィラミンＡ；７８．ＩＰＩ００３０２５９２  フィラミンＡ、α；７９．ＩＰＩ００３３９２２７  仮説タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｏ１１６６；８０．ＩＰＩ００４１４２８３  フィブロネクチン前駆体（ＦＮ）（寒冷不溶性グロブリン）（ＣＩＧ）、スプライスアイソフォーム３；８１．ＩＰＩ００３３９２２５  フィブロネクチン前駆体のスプライスアイソフォーム５；８２．ＩＰＩ００３３９３１９  フィブロネクチン前駆体のスプライスアイソフォーム１１；８３．ＩＰＩ００５５６６３２  フィブロネクチン前駆体のスプライスアイソフォーム１２；８４．ＩＰＩ００４１１４６２  仮説タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｂ１８１５０；８５．ＩＰＩ０００２９７２３  フォリスタチン関連タンパク質１前駆体；８６．ＩＰＩ００００５４０１  ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ５；８７．ＩＰＩ００２１９０２５  グルタレドキシン１；８８．ＩＰＩ００１７１４１１  ゴルジホスホプロテイン２；８９．ＩＰＩ０００２６３１４  ゲルゾリン前駆体；
９０．ＩＰＩ００２１９７５７  グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰ；９１．ＩＰＩ０００２７５６９  ヘテロ核リボ核タンパク質Ｃ様１；９２．ＩＰＩ００００３８８１  ＨＮＲＰＦタンパク質；９３．ＩＰＩ００４４２２９４  ニューロトリミン前駆体のスプライスアイソフォーム１；９４．ＩＰＩ００００３８６５  ７１ｋＤａの熱ショックコグネイトタンパク質のスプライスアイソフォーム１；９５．ＩＰＩ０００３７０７０  ７１ｋＤａの熱ショックコグネイトタンパク質のスプライスアイソフォーム２；９６．ＩＰＩ００２２０３６２  １０ｋＤａのミトコンドリア熱ショックタンパク質；９７．ＩＰＩ０００２４２８４  基底膜特異的へパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質前駆体；９８．ＩＰＩ００２９７２８４  インスリン様増殖因子結合タンパク質２前駆体；９９．ＩＰＩ００２９７２８４  インスリン様増殖因子結合タンパク質２前駆体；１００．ＩＰＩ０００２９２３６  インスリン様増殖因子結合タンパク質５前駆体；１０１．ＩＰＩ０００２９２３６  インスリン様増殖因子結合タンパク質５前駆体；１０２．ＩＰＩ０００２９２３５  インスリン様増殖因子結合タンパク質６前駆体；１０３．ＩＰＩ０００２９２３５  インスリン様増殖因子結合タンパク質６前駆体；１０４．ＩＰＩ０００１６９１５  インスリン様増殖因子結合タンパク質７前駆体；１０５．ＩＰＩ０００１６９１５  インスリン様増殖因子結合タンパク質７前駆体；１０６．ＩＰＩ００３２８１６３  Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１タンパク質；１０７．ＩＰＩ０００２１３９６  血管内皮増殖因子受容体２前駆体；１０８．ＩＰＩ００２９８２８１  ラミニンγ１鎖前駆体；１０９．ＩＰＩ００２１９２１９  ガレクチン−１；１１０．ＩＰＩ０００２３６７３  ガレクチン−３結合タンパク質前駆体；１１１．ＩＰＩ０００２１４０５  ラミンＡ／ＣのスプライスアイソフォームＡ；１１２．ＩＰＩ００２１６９５３  ラミンＡ／ＣのスプライスアイソフォームＡδ１０；１１３．ＩＰＩ００１８０１７３  予測：トロポミオシン４に類似；１１４．ＩＰＩ００４０１６１４  予測：ＦＫＳＧ３０に類似；１１５．ＩＰＩ００３７４３９７  予測：トロポミオシン４に類似；１１６．ＩＰＩ００３７４７３２  予測：ＰＰＩＡタンパク質に類似；１１７．ＩＰＩ００４０２１０４  予測：ペプチジルプロリルイソメラーゼＡアイソフォーム１に類似；シクロフィリンＡ；ペプチジルプロ；１１８．ＩＰＩ００４５５４１５  予測：ヘテロ核リボ核タンパク質Ｃ様ｄＪ８４５Ｏ２４．４に類似；１１９．ＩＰＩ００４５４７２２  予測：ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質に類似；１２０．ＩＰＩ００４５４８５２  予測：奇形がん由来増殖因子１に類似；
１２１．ＩＰＩ００００２８０２  タンパク質−リシン６−オキシダーゼ前駆体；１２２．ＩＰＩ００４１０１５２  潜伏トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質１アイソフォームＬＴＢＰ−１Ｌ；１２３．ＩＰＩ００２２０２４９  潜伏トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質、アイソフォーム１Ｌ前駆体；１２４．ＩＰＩ００２２０２４９  潜伏トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質、アイソフォーム１Ｌ前駆体；１２５．ＩＰＩ００４１０１５２  潜伏トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質１アイソフォームＬＴＢＰ−１Ｌ；１２６．ＩＰＩ０００２０９８６  ルミカン前駆体；１２７．ＩＰＩ００２９１００６  ミトコンドリアリンゴ酸デヒドロゲナーゼ前駆体；１２８．ＩＰＩ００００５７０７  マクロファージマンノース受容体２前駆体；１２９．ＩＰＩ０００２０５０１  ミオシン１１；１３０．ＩＰＩ０００１９５０２  ミオシン９；１３１．ＩＰＩ００６０４６２０  ヌクレオリン；１３２．ＩＰＩ００２２０７４０  ヌクレオフォスミンのスプライスアイソフォーム２；１３３．ＩＰＩ００２１９４４６  ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質；１３４．ＩＰＩ００２９９７３８  プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼエンハンサー１前駆体；１３５．ＩＰＩ０００１５９０２  β血小板由来増殖因子受容体前駆体；１３６．ＩＰＩ００２１６６９１  プロフィリン１；１３７．ＩＰＩ００１６９３８３  ホスホグリセリン酸キナーゼ１；１３８．ＩＰＩ００２１９５６８  精巣特異的ホスホグリセリン酸キナーゼ；１３９．ＩＰＩ００２９６１８０  ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子前駆体；１４０．ＩＰＩ００２１５９４３  プレクチン１のスプライスアイソフォーム３；１４１．ＩＰＩ００２１５９４２  プレクチン１のスプライスアイソフォーム２；１４２．ＩＰＩ０００１４８９８  プレクチン１のスプライスアイソフォーム１；１４３．ＩＰＩ００３９８７７７  プレクチン１アイソフォーム８；１４４．ＩＰＩ００３９８７７６  プレクチン１アイソフォーム７；１４５．ＩＰＩ００１８６７１１  プレクチン１アイソフォーム６；１４６．ＩＰＩ００４２００９６  プレクチン１アイソフォーム３；１４７．ＩＰＩ００３９８７７９  プレクチン１アイソフォーム１１；１４８．ＩＰＩ００３９８７７８  プレクチン１アイソフォーム１０；１４９．ＩＰＩ００３９８００２  プレクチン１アイソフォーム１；１５０．ＩＰＩ００４１９５８５  ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼＡ；
１５１．ＩＰＩ００４７２７１８  ペプチジルプロリルイソメラーゼＡアイソフォーム２；１５２．ＩＰＩ０００００８７４  ペルオキシレドキシン１；１５３．ＩＰＩ０００２４９１５  ミトコンドリアペルオキシレドキシン５前駆体；１５４．ＩＰＩ００３７５３０６  ペルオキシレドキシン５前駆体、アイソフォームｂ；１５５．ＩＰＩ０００１２５０３  プロアクチベーターポリペプチド前駆体のスプライスアイソフォームＳａｐ−ｍｕ−０；１５６．ＩＰＩ００３７４１７９  プロテアソーム活性化因子サブユニット１アイソフォーム２；１５７．ＩＰＩ０００３０１５４  プロテアソーム活性化因子複合体サブユニット１；１５８．ＩＰＩ００１６８８１２  ＰＴＫ７プロテインチロシンキナーゼ７アイソフォームｄ前駆体；１５９．ＩＰＩ００４１９９４１  ＰＴＫ７プロテインチロシンキナーゼ７アイソフォームａ前駆体；１６０．ＩＰＩ００００３５９０  クイエシンＱ６、アイソフォームａ；１６１．ＩＰＩ０００１５９１６  骨由来増殖因子（フラグメント）；１６２．ＩＰＩ０００１５９１６  骨由来増殖因子；１６３．ＩＰＩ００２９８２８９  レチクロン４のスプライスアイソフォーム２；１６４．ＩＰＩ０００２１７６６  レチクロン４のスプライスアイソフォーム１；１６５．ＩＰＩ０００１３８９５  カルギザリン；１６６．ＩＰＩ０００１０４０２  仮説タンパク質；１６７．ＩＰＩ００２１８７３３  スーパーオキシドジスムターゼ；１６８．ＩＰＩ０００１４５７２  ＳＰＡＲＣ前駆体；１６９．ＩＰＩ００００５６１４  脳スペクトリンβ鎖１のロングスプライスアイソフォーム；１７０  ＩＰＩ００００８７８０  スタニオカルシン２前駆体；１７１．ＩＰＩ００３０１２８８  ＳＥＬ−ＯＢタンパク質；１７２．ＩＰＩ００２１６１３８  トランスゲリン；１７３．ＩＰＩ０００１８２１９  トランスフォーミング増殖因子β誘導性タンパク質ｉｇ−ｈ３前駆体；１７４．ＩＰＩ００３０４８６５  トランスフォーミング増殖因子β受容体ＩＩＩ；１７５．ＩＰＩ００２９６０９９  トロンボスポンジン１前駆体；１７６．ＩＰＩ０００３２２９２  メタロプロテイナーゼ阻害因子１前駆体；１７７．ＩＰＩ０００２７１６６  メタロプロテイナーゼ阻害因子２前駆体；１７８．ＩＰＩ００２２０８２８  チモシンβ４；１７９．ＩＰＩ００１８０２４０  チモシン様３；
１８０．ＩＰＩ００２９９６３３  ＯＴＴＨＵＭＰ００００００３１２７０（フラグメント）；１８１．ＩＰＩ００４６５０２８  トリオースリン酸イソメラーゼ１変異体（フラグメント）；１８２．ＩＰＩ００４５１４０１  トリオースリン酸イソメラーゼスプライスアイソフォーム２；１８３．ＩＰＩ０００１０７７９  トロポミオシン４；１８４．ＩＰＩ００２１６９７５  トロポミオシンα４鎖のスプライスアイソフォーム２；１８５．ＩＰＩ００１８０６７５  チューブリンα３鎖；１８６．ＩＰＩ００２１８３４３  チューブリンα６鎖；１８７．ＩＰＩ００２１６２９８  チオレドキシン；１８８．ＩＰＩ００４７２１７５  ＣＤＮＡ  ＦＬＪ４６６７２  ｆｉｓ、クローンＴＲＡＣＨ３００９００８、チオレドキシンレダクターゼに極めて類似；１８９．ＩＰＩ００４５０４７２  ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｉ；１９０．ＩＰＩ０００１８３５２  ユビキチンカルボキシル末端加水分解酵素イソ酵素Ｌ１；１９１．ＩＰＩ０００１０２０７  ユビキチン折りたたみ修飾因子１前駆体；１９２．ＩＰＩ００２６０６３０  ＵＲＢ；１９３．ＩＰＩ０００２１２６３  １４−３−３タンパク質ζ／δ；１９４．ＩＰＩ００６４２９９１  仮説タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｆ１０１６４；１９５．ＩＰＩ００４７０９１９  仮説タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｋ０８１６４；１９６．ＩＰＩ００７１９０８８  ＶＩ型コラーゲンα１前駆体；１９７．ＩＰＩ００６５４６８５  ＳＰＡＲＣ  前駆体に類似；１９８．ＩＰＩ００６４１９６１  ＸＩＩ型コラーゲンα１；１９９．ＩＰＩ００６４５８４９  細胞外マトリックスタンパク質１；２００．ＩＰＩ００５５４７８６  チオレドキシンレダクターゼ１；２０１．ＩＰＩ００６４５０１８  ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子；２０２．ＩＰＩ００５５２３３９  メタロプロテイナーゼ１の組織阻害因子；２０３．ＩＰＩ００６４２９９７  細胞質アクチン２；２０４．ＩＰＩ００７１９７７８  アネキシンＡ２に類似；２０５．ＩＰＩ００６４７９１５  トランスゲリン２；２０６．ＩＰＩ００５５２８１５  Ｖ型コラーゲンα１；２０７．ＩＰＩ００５５２９８１  ＣＤＮＡ  ＰＳＥＣ０２６６  ｆｉｓ、クローンＮＴ２ＲＰ３００３６４９、ホモサピエンスフィブリン１Ｄ  ｍＲＮＡに極めて類似；２０８．ＩＰＩ００１８０７７６  ２９ｋＤａタンパク質；２０９．ＩＰＩ００５５２４１６  フィラミンＡ、α；
２１０．ＩＰＩ００６４０６９８  γ−腸平滑筋アクチン；２１１．ＩＰＩ００５１４５３０  α１骨格筋アクチン；２１２．ＩＰＩ００５５６４４２  インスリン様増殖因子結合タンパク質２変異体（フラグメント）；２１３．ＩＰＩ００５１３７８２  ゲルゾリン；２１４．ＩＰＩ００４７８７３１  ２９ｋＤａタンパク質；２１５．ＩＰＩ００３９６４７９  ２４ｋＤａタンパク質；２１６．ＩＰＩ００３３４６２７  ３９ｋＤａタンパク質；２１７．ＩＰＩ００５５５７６２  ＰＴＫ７プロテインチロシンキナーゼ７アイソフォーム変異体（フラグメント）；２１８．ＩＰＩ００６５８２０２  ９７ｋＤａタンパク質；２１９．ＩＰＩ００００６２７３  ＣＹＲ６１タンパク質；２２０．ＩＰＩ００７１９４０５  ＴＭＳＬ６タンパク質；２２１．ＩＰＩ００６５８０９６  チモシンβ４；２２２．ＩＰＩ００３７６１６３  ５ｋＤａタンパク質；２２３．ＩＰＩ００５５６２１７  フィブリリン１変異体（フラグメント）；２２４．ＩＰＩ００５１４８１７  ラミンＡ／Ｃに類似；２２５．ＩＰＩ００６４４０８７  プロゲリン；２２６．ＩＰＩ００６５５８１２  横紋筋肉腫抗原ＭＵ−ＲＭＳ−４０．１２；２２７．ＩＰＩ００６０４５１７  ヌクレオリンに類似；２２８．ＩＰＩ００４４４２６２  ＣＤＮＡ  ＦＬＪ４５７０６  ｆｉｓ、クローンＦＥＢＲＡ２０２８４５７、ヌクレオリンに極めて類似；２２９．ＩＰＩ００４１２４７３  タンパク質；２３０．ＩＰＩ００４１４４８９  タンパク質；２３１．ＩＰＩ００４１１４６３  タンパク質；２３２．ＩＰＩ００５５６４１５  トランスゲリン変異体（フラグメント）；２３３．ＩＰＩ００７１８８２５  カルモジュリン；２３４．ＩＰＩ００４７８１５６  １７ｋＤａタンパク質；２３５．ＩＰＩ００３８６６２１  ＣＡＬＭ３タンパク質；２３６．ＩＰＩ００６４７００１  酸性；２３７．ＩＰＩ００６４２６５０  スタニオカルシン２前駆体に類似；２３８．ＩＰＩ００６４１４７１  コラーゲン様タンパク質；２３９．ＩＰＩ００５１４６６９  ＳＨ３ドメイン結合グルタミン酸リッチタンパク質様３；２４０．ＩＰＩ００７１９４２２  トリオースリン酸イソメラーゼ（フラグメント）；２４１．ＩＰＩ００００３７３４  推定上のＳ１００カルシウム結合タンパク質Ｈ＿ＮＨ０４５６Ｎ１６．１；２４２．ＩＰＩ０００２９５７４  １１ｋＤａタンパク質；２４３．ＩＰＩ００６４１０４７  ゲルゾリン；２４４．ＩＰＩ００６４７５５６  ゲルゾリン；２４５．ＩＰＩ００６５４８２１  仮説タンパク質ＬＯＣ５４８４５アイソフォーム１；２４６．ＩＰＩ００６４７５７２  Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質３前駆体；２４７．ＩＰＩ００６３９８７９  細胞質分裂タンパク質ｓｅｐＡに類似；２４８．ＩＰＩ００６５７７４６  細胞質分裂のデディケイタータンパク質８に類似；２４９．ＩＰＩ００５５５９９３  血管内皮増殖因子受容体３変異体；２５０．ＩＰＩ００５５２５４５  細胞質分裂のデディケイタータンパク質８。
【００９０】
機能未同定のタンパク質：ＩＰＩ００６４２９９１  仮説タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｆ１０１６４；ＩＰＩ００４７０９１９  仮説タンパク質ＤＫＦＺｐ６８６Ｋ０８１６４；ＩＰＩ００６５４６８５  ＳＰＡＲＣ前駆体に類似；ＩＰＩ００７１９７７８  アネキシンＡ２に類似；ＩＰＩ００５５２９８１  ＣＤＮＡ  ＰＳＥＣ０２６６  ｆｉｓ、クローンＮＴ２ＲＰ３００３６４９、ホモサイエンスフィブリン１Ｄ  ｍＲＮＡに極めて類似；ＩＰＩ００１８０７７６  ２９ｋＤａタンパク質；ＩＰＩ００４７８７３１  ２９ｋＤａタンパク質；ＩＰＩ００３９６４７９  ２４ｋＤａタンパク質；ＩＰＩ００３３４６２７  ３９ｋＤａタンパク質；ＩＰＩ００６５８２０２  ９７ｋＤａタンパク質；ＩＰＩ００３７６１６３  ５ｋＤａタンパク質；ＩＰＩ００５１４８１７  ラミンＡ／Ｃに類似；ＩＰＩ００６４４０８７  プロゲリン；ＩＰＩ００６５５８１２  横紋筋肉腫抗原ＭＵ−ＲＭＳ−４０．１２；ＩＰＩ００６０４５１７  ヌクレオリンに類似；ＩＰＩ００４４４２６２  ＣＤＮＡ  ＦＬＪ４５７０６  ｆｉｓ、クローンＦＥＢＲＡ２０２８４５７、ヌクレオリンに極めて類似；ＩＰＩ００４１２４７３  タンパク質；ＩＰＩ００４１４４８９  タンパク質；ＩＰＩ００４１１４６３  タンパク質；ＩＰＩ００４７８１５６  １７ｋＤａ  タンパク質；ＩＰＩ００３８６６２１  ＣＡＬＭ３タンパク質；ＩＰＩ００６４７００１  酸性；ＩＰＩ００６４２６５０  スタニオカルシン２前駆体に類似；ＩＰＩ００６４１４７１  コラーゲン様タンパク質；ＩＰＩ００５１４６６９  ＳＨ３ドメイン結合グルタミン酸リッチタンパク質様３；ＩＰＩ００００３７３４  推定上のＳ１００カルシウム結合タンパク質Ｈ＿ＮＨ０４５６Ｎ１６．１；ＩＰＩ０００２９５７４  １１ｋＤａタンパク質；ＩＰＩ００６５４８２１  仮説タンパク質ＬＯＣ５４８４５アイソフォーム１；ＩＰＩ００６４７５７２  Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質３前駆体；ＩＰＩ００６３９８７９  細胞質分裂タンパク質ｓｅｐＡに類似；ＩＰＩ００６５７７４６  細胞質分裂のデディケイタータンパク質８に類似；ＩＰＩ００５５５９９３  血管内皮増殖因子受容体３変異体。
【００９１】
遺伝子産物
タンパク質は、以下の表Ｄ２に示す遺伝子の遺伝子産物から選択され得る。表Ｄ２は、以下の段落中の以下の遺伝子を含む：
ＡＣＴＡ１；ＣＯＬ５Ａ２；ＨＳＰＡ８；ＰＳＡＰ；ＡＣＴＡ２；ＣＯＬ５Ａ３；ＨＳＰＥ１；ＰＳＭＥ１；ＡＣＴＢ；ＣＯＬ６Ａ１；ＨＳＰＧ２；ＰＴＫ７；ＡＣＴＣ；ＣＯＬ６Ａ２；ＩＧＦＢＰ２；ＱＳＣＮ６；ＡＣＴＧ１；ＣＯＬ６Ａ３；ＩＧＦＢＰ５；ＲＴＮ４；ＡＣＴＧ２；ＣＳＴＢ；ＩＧＦＢＰ６；Ｓ１００Ａ１１；ＡＧＲＮ；ＣＴＢＳ；ＩＧＦＢＰ７；ＳＨ３ＢＧＲＬ３；ＡＬＣＡＭ；ＣＴＳＢ；Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１；ＳＯＤ１；ＡＮＰ３２Ｂ；ＣＹＲ６１；ＫＤＲ；ＳＰＡＲＣ；ＡＮＸＡ２；ＤＯＣＫ１０；ＬＡＭＣ１；ＳＰＴＢＮ１；ＡＲＨＧＤＩＡ；ＤＯＣＫ８；ＬＧＡＬＳ１；ＳＴＣ２；Ｂ２Ｍ；ＥＣＭ１；ＬＧＡＬＳ３ＢＰ；ＳＶＥＰ１；ＢＭＰ１；ＥＥＦ１Ｇ；ＬＭＮＡ；ＴＡＧＬＮ；Ｃ１４ｏｒｆ１６６；ＥＮＯ１；ＬＯＸ；ＴＡＧＬＮ２；Ｃ１Ｒ；ＥＮＯ１Ｂ；ＬＴＢＰ１；ＴＧＦＢＩ；ＣＡＬＭ１；ＥＮＯ２；ＬＵＭ；ＴＧＦＢＲ３；ＣＤ１０９；ＦＢＬＮ１；ＭＤＨ２；ＴＨＢＳ１；ＣＤ４４；ＦＢＮ１；ＭＲＣ２；ＴＩＭＰ１；ＣＤＨ１１；ＦＢＮ２；ＭＹＨ１１；ＴＩＭＰ２；ＣＤＨ１３；ＦＧＦ１７；ＭＹＨ９；ＴＭＳＢ４Ｘ；ＣＤＨ２；ＦＧＦＲ２；ＮＣＬ；ＴＭＳＬ３；ＣＦＨ／ＨＦ１；ＦＬＪ２１９１８；ＮＰＭ１；ＴＭＳＬ６；ＣＦＬ１；ＦＬＮＡ；ＰＢＰ；ＴＰＩ１；ＣＬＳＴＮ１；ＦＮ１；ＰＣＯＬＣＥ；ＴＰＭ４；ＣＯＬ１１Ａ１；ＦＳＴＬ１；ＰＤＧＦＲＢ；ＴＵＢＡ３；ＣＯＬ１２Ａ１；ＧＡＬＮＴ５；ＰＦＮ１；ＴＵＢＡ６；ＣＯＬ１６Ａ１；ＧＬＲＸ；ＰＧＫ１；ＴＸＮ；ＣＯＬ１Ａ１；ＧＯＬＰＨ２；ＰＧＫ２；ＴＸＮＲＤ１；ＣＯＬ１Ａ２；ＧＳＮ；ＰＬＡＵ；ＵＢＥ２Ｉ；ＣＯＬ３Ａ１；ＧＳＴＰ１；ＰＬＥＣ１；ＵＣＨＬ１；ＣＯＬ４Ａ１；ＨＮＲＰＣＬ１；ＰＰＩＡ；ＵＦＭ１；ＣＯＬ４Ａ２；ＨＮＲＰＦ；ＰＲＤＸ１；ＵＲＢ；ＣＯＬ５Ａ１；ＨＮＴ；ＰＲＤＸ５；ＹＷＨＡＺ。
【００９２】
５８の生物学的過程における２０１個の遺伝子
粒子は、付加的にまたは代替的に、以下の表Ｄ３に列挙する２０１個の遺伝子の遺伝子産物のいずれかを含み得る。これらの遺伝子は、その遺伝子が関与する生物学的過程によって特徴づけられる。
【００９３】
従って、粒子は、これら５８の生物学的過程のいずれかに影響を及ぼし、いずれかを制御し、調節するために使用し得る。
【００９４】
【表１Ａ】
0005718648.tif 000002
【表１Ｂ】
0005718648.tif 000003
【表１Ｃ】
0005718648.tif 000004
【表１Ｄ】
0005718648.tif 000005
【表１Ｅ】
0005718648.tif 000006
【表１Ｆ】
0005718648.tif 000007
【表１Ｇ】
0005718648.tif 000008
【表１Ｈ】
0005718648.tif 000009
【表１Ｉ】
0005718648.tif 000010
【表１Ｊ】
0005718648.tif 000011
【表１Ｋ】
0005718648.tif 000012
【００９５】
表Ｄ３．５８の生物学的過程の各々における２０１個の遺伝子のリスト（間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）の遺伝子）
【００９６】
３０の経路における２０１個の遺伝子
粒子は、付加的にまたは代替的に、以下の表Ｄ４に列挙する２０１個の遺伝子の遺伝子産物のいずれかを含み得る。これらの遺伝子は、その遺伝子が関与する経路によって特徴づけられる。
【００９７】
従って、粒子は、これら３０の経路のいずれかに影響を及ぼす、いずれかを制御するかまたは調節するために使用し得る。
【００９８】
【表２Ａ】
0005718648.tif 000013
【表２Ｂ】
0005718648.tif 000014
【表２Ｃ】
0005718648.tif 000015
【表２Ｄ】
0005718648.tif 000016
【表２Ｅ】
0005718648.tif 000017
【表２Ｆ】
0005718648.tif 000018
【表２Ｇ】
0005718648.tif 000019
【表２Ｈ】
0005718648.tif 000020
【００９９】
表Ｄ４．３０の経路の各々における２０１個の遺伝子のリスト（間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）の遺伝子）
【０１００】
５９３個の遺伝子および７９４個の遺伝子産物
粒子は、付加的にまたは代替的に、以下の表Ｄ５に列挙する５９３個の遺伝子および／または７９４個の遺伝子産物のいずれかを含み得る。
【０１０１】
従って、粒子は、遺伝子または遺伝子産物が関与する生物学的過程または経路のいずれかに影響を及ぼす、いずれかを制御するかまたは調節するために使用し得る。
【０１０２】
【表３Ａ】
0005718648.tif 000021
【表３Ｂ】
0005718648.tif 000022
表Ｄ５．間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）中の５９３個の付加的なタンパク質
【０１０３】
＜エキソソーム＞
粒子は特に小胞を含み得る。粒子はエキソソームを含み得る。
【０１０４】
実施例は、再灌流障害に対する心保護作用を付与する分泌物中の活性成分の単離を述べる。活性成分は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）によって分泌されるエキソソームを含み得る。
【０１０５】
エキソソームは、網状赤血球によって分泌されることが１９８３年に初めて記述され２１、その後様々な造血細胞、造血系または非造血系起源の腫瘍および上皮細胞を含む多くの細胞型によって分泌されることが認められた２２、後期エンドサイトーシス区画内で形成される小さな膜小胞（多小胞体）である。それらは、同じくエキソソームと命名された、ごく最近記述された「リボヌクレアーゼ複合体」２３とは異なる実体である。
【０１０６】
エキソソームは形態学的および生化学的パラメータによって定義され得る（総説参照２２、２４〜３５）。従って、本明細書で述べる粒子は、これらの形態学的または生化学的パラメータの１つまたはそれ以上を含み得る。
【０１０７】
エキソソームは、古典的には、４０〜１００ｎｍの直径を有する、脂質二重層によって制限された「受け皿状（ｓａｕｃｅｒ−ｌｉｋｅ）」小胞または扁平な球体と定義され、エンドソーム膜の内向き出芽によって形成される。すべての脂質小胞と同様に、そしてアポトーシス細胞によって放出されるタンパク質凝集体またはヌクレオソームフラグメントと異なり、エキソソームは約１．１３〜１．１９ｇ／ｍｌの密度を有し、ショ糖勾配上を浮遊する。エキソソームは、コレステロールおよびスフィンゴミエリン、ならびにＧＭ１、ＧＭ３、フロチリンおよびｓｒｃプロテインキナーゼＬｙｎなどの脂質ラフトマーカーに富み、それらの膜が脂質ラフトに富むことを示唆する。
【０１０８】
種々の細胞型および様々な種からのエキソソームの分子組成物が検討されている。一般に、エキソソームは、すべてのエキソソームに共通であると思われる遍在性タンパク質と細胞型特異的なタンパク質を含有する。また、同じ細胞型に由来するが別の種のエキソソーム中のタンパク質は高度に保存されている。遍在性エキソソーム関連タンパク質としては、細胞骨格に認められる細胞質タンパク質、たとえばチューブリン、アクチンおよびアクチン結合タンパク質、細胞内膜融合物および輸送体、たとえばアネキシン類およびｒａｂタンパク質、シグナル伝達タンパク質、たとえばプロテインキナーゼ、１４−３−３およびヘテロ三量体Ｇタンパク質、代謝酵素、たとえばペルオキシダーゼ、ピルビン酸キナーゼ、脂質キナーゼおよびエノラーゼ１、ならびにテトラスパニンのファミリー、たとえばＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＣＤ８２を含む。テトラスパニンはエキソソーム中で高度に富化されていて、大型分子複合体および膜サブドメインの組織化に関与することが公知である。
【０１０９】
エキソソーム中の細胞型特異的タンパク質の例は、ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞からのエキソソーム中のＭＨＣクラスＩＩ分子、樹状細胞由来のエキソソーム中のＣＤ８６、Ｔ細胞由来エキソソーム上のＴ細胞受容体等である。特に、エキソソームは、核、ミトコンドリア、小胞体またはゴルジ装置起源のタンパク質を含まない。また、極めて豊富な形質膜タンパク質がエキソソーム中には存在せず、それらが単に形質膜の断片ではないことを示唆する。報告されている遍在性エキソソーム関連タンパク質の多くは、ｈＥＳＣ−ＭＳＣ分泌物のプロテオームプロフィールにおいても存在する。
【０１１０】
エキソソームはまた、ｍＲＮＡおよびマイクロＲＮＡを含有することが公知であり、それらは別の細胞へと送達され得、その新しい位置で機能性であり得る３６。エキソソームの生理的機能は十分には定義されないままである。エキソソームは、古くなったタンパク質を除去し、タンパク質を再利用し、プリオンおよびウイルスなどの感染性粒子の伝播を媒介し、補体抵抗性を誘導し、免疫細胞間情報伝達を促進し、ならびに細胞シグナルを伝達するのを助けるものと考えられる１、２２、２５〜２８、３７〜４０。エキソソームはがんの治療のための免疫療法において使用されてきた３４。
【０１１１】
＜間葉系幹細胞からの粒子の使用＞
粒子は、前述したようにＭＳＣまたはＭＳＣ−ＣＭの代替物として使用し得る。特に、粒子は、ＭＳＣまたはＭＳＣ−ＣＭが現在使用されている、または将来使用され得る治療目的のいずれかのために使用し得る。
【０１１２】
本明細書で述べる方法および組成物が間葉系幹細胞からの粒子の生産を可能にすることは明白である。それゆえ、間葉系幹細胞のいかなる用途も、間葉系幹細胞からの粒子に等しく当てはまる。
【０１１３】
本明細書で述べる方法および組成物によって生産される間葉系幹細胞および分化細胞は、疾患の治療のためまたは疾患の治療のための医薬組成物の製造のために使用し得る。そのような疾患は、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、熱傷、糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病等のような変性疾患およびがんを含む、再生療法によって治療可能な疾患を含み得る。従って、ＭＳＣからの粒子はそのような疾患を治療するために使用し得る。
【０１１４】
本明細書で述べる方法および組成物によって作製されるもののような間葉系幹細胞からの粒子は、様々な商業的に重要な研究、診断および治療目的のために使用し得る。
【０１１５】
間葉系幹細胞からの粒子は、特に、疾患の治療のための医薬組成物の製造のために使用し得る。そのような疾患は、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、熱傷、糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病等のような変性疾患およびがんを含む、再生療法によって治療可能な疾患を含み得る。
【０１１６】
本明細書で述べる方法および組成物によって作製される間葉系幹細胞は、骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）と類似または同一の性質を有する。それゆえ、間葉系幹細胞およびそれらから生成される何らかの分化細胞、ならびにそれらから誘導される粒子は、ＢＭ−ＭＳＣが使用されることが公知である、またはＢＭ−ＭＳＣを使用することが可能である適用のいずれにおいても使用し得る。
【０１１７】
＜間葉系幹細胞からの粒子によって治療可能な疾患＞
ＭＳＣのプロテオームの解析は、発現されるタンパク質が３つの生物学的過程（代謝、防御応答、ならびに、脈管形成、造血および骨格発達を含む組織分化）に関与することを示す。従って、本明細書で述べるＭＳＣからの粒子は、これらの機能が役割を果たし得る、またはその修復もしくは治療がこれらの生物学的過程の１つもしくはそれ以上を含む疾患を治療するために使用し得る。同様に、単独でまたは組み合わせとして、好ましくは本明細書で述べる粒子の形態で、ＭＳＣによって発現されるタンパク質は、たとえばそのような疾患を治療するかまたは予防することを目的として、ＭＳＣまたはＭＳＣによって馴化された培地の活性を補足するためにまたはそれらの代わりに使用し得る。
【０１１８】
ＭＳＣによって発現される２０１個の遺伝子産物は、Ｊａｋ−ＳＴＡＴ、ＭＡＰＫ、Ｔｏｌｌ様受容体、ＴＧＦ−βシグナル伝達およびｍＴＯＲシグナル伝達経路などの、心臓血管生物学、骨発生および造血における重要なシグナル伝達経路を活性化することが示されている。従って、ＭＳＣ等からの粒子は、これらのシグナル伝達経路のいずれかが関与する、またはその病因がこれらのシグナル伝達経路の１つもしくはそれ以上における１つもしくはそれ以上の欠陥を含む疾患を予防するかまたは治療するために使用し得る。
【０１１９】
従って、そのような粒子は、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、熱傷、および糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病などの変性疾患、ならびにがんを治療するために使用し得る。
【０１２０】
そのような粒子はまた、心筋梗塞、皮膚創傷、皮膚障害、皮膚病変、皮膚炎、乾癬、コンジローム、疣贅、血管腫、ケロイド、皮膚がん、アトピー性皮膚炎、ベーチェット病、慢性肉芽腫症、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、潰瘍形成、炎症を誘導する初期損傷によって特徴づけられる病的状態、ならびに線維症および機能喪失を含む慢性組織リモデリングを導く免疫機能不全、腎虚血障害、嚢胞性線維症、副鼻腔炎および鼻炎または整形外科的疾患を治療するために使用し得る。
【０１２１】
粒子は、個体における創傷治癒、瘢痕減少、骨形成、骨移植または骨髄移植を助けるために使用し得る。
【０１２２】
文脈によって特に指示されない限り、「馴化培地」という用語は、ＭＳＣに暴露された細胞培養培地だけでなく、馴化培地中に存在する１つまたはそれ以上の、好ましくは実質的にすべてのポリペプチドを含む組成物を包含すると解釈されるべきである。
【０１２３】
粒子はまた、ＭＳＣによって分泌または発現されるタンパク質のいずれかのための供給源として使用し得る。本発明者らはそれゆえ、表Ｄ１〜Ｄ５のいずれかに示すポリペプチドを生産する方法であって、前述したように粒子を得ることおよび粒子からポリペプチドを単離することを含む方法を提供する。
【０１２４】
＜心疾患＞
本明細書で述べる間葉系幹細胞粒子の方法および組成物は、心疾患の治療または予防のために使用し得る。
【０１２５】
心疾患は、心臓に影響を及ぼす種々の疾患の多様性についての包括的な用語である。２００７年現在、心疾患は米国、英国、カナダおよびウェールズにおける死亡の主要原因であり、米国だけで３４秒ごとに１人を死に至らせている。心疾患は以下のいずれかを含む。
【０１２６】
冠状動脈心疾患
冠状動脈疾患は、心筋層に供給する動脈の壁内にじゅく状斑が蓄積することによって引き起こされる動脈の疾患である。狭心症（胸痛）および心筋梗塞（心臓発作）が冠状動脈心疾患の症状であり、冠状動脈心疾患によって引き起こされる病変である。４５９，０００人超のアメリカ人が毎年冠状動脈心疾患のために死亡している。英国では、年間１０１，０００例の死亡が冠状動脈心疾患によるものである。
【０１２７】
心筋症
心筋症は、何らかの理由による心筋（すなわち実際の心臓の筋肉）の機能の低下である。心筋症を有する人々は、しばしば不整脈および／または心臓性突然死の危険性がある。外因性心筋症−主たる病因が心筋自体の外部にある心筋症−が心筋症の大部分を構成する。心筋症の群を抜いて最も一般的な原因は虚血である。
【０１２８】
世界保健機関は、特定心筋症として：アルコール性心筋症、冠状動脈疾患、先天性心疾患、心臓に影響を及ぼす栄養性疾患、虚血性心筋症、高血圧性心筋症、弁膜性心筋症、炎症性心筋症を含めている。
【０１２９】
また、
全身性代謝疾患に続発する心筋症
内因性心筋症（同定可能な外部原因によるものではない心臓の筋肉の脆弱性）
拡張型心筋症（ＤＣＭ、最も一般的な形態であり、心臓移植のための主要な適応症の１つ。ＤＣＭでは、心臓（特に左室）が拡張し、ポンプ機能が低下する）
肥大型心筋症（ＨＣＭまたはＨＯＣＭ、筋節タンパク質をコードする遺伝子の様々な突然変異によって引き起こされる遺伝的障害。ＨＣＭでは、心筋が肥厚し、それが血流を閉塞させ、心臓が正しく機能するのを妨げ得る）
不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣ、心筋が線維性瘢痕組織によって置き換えられる、心臓の電気的障害から生じる。右室が一般に最も影響を受ける）
拘束型心筋症（ＲＣＭ、最も少ない心筋症である。心室の壁が堅くなるが、肥厚していないこともあり、血液による心臓の正常な充満に抵抗する）
心筋緻密化障害（左室壁が生後から正しく成長することができず、心エコー検査図で観察した場合海綿状の外観を有する）
も含まれる。
【０１３０】
心臓血管疾患
心臓血管疾患は、心臓自体および／または血管系、特に心臓に至り、かつ心臓から出ていく静脈と動脈を侵す多くの特定疾患のいずれかである。疾患の二形性に関する研究は、心臓血管疾患を有する女性は通常、血管を侵す形態に罹患しているが、男性は通常、心筋自体を侵す形態に罹患していることを示唆する。心臓血管疾患の公知のまたは関連する原因としては、糖尿病、高血圧、高ホモシステイン血症および高コレステロール血症を含む。
心臓血管疾患のタイプは、アテローム性動脈硬化症を含む。
【０１３１】
虚血性心疾患
虚血性心不全は、器官への血液供給の低下によって特徴づけられる心臓自体の疾患である。これは、酸素と養分を供給する動脈が閉塞して、心臓が十分な酸素と養分を得られず、最終的に拍動を停止する場合に起こる。
【０１３２】
心不全
うっ血性心不全（ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ（またはＣＨＦ）およびｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ  ｃａｒｄｉａｃ  ｆａｉｌｕｒｅ（ＣＣＦ））とも呼ばれる心不全は、心臓が十分な量の血液で満たされ、身体全体に十分な量の血液を送り出す能力が損なわれる、何らかの構造的または機能的心障害から生じ得る状態である。肺性心は心臓の右側部分の不全である。
【０１３３】
高血圧性心疾患
高血圧性心疾患は、高血圧、特に局所性高血圧によって引き起こされる心疾患である。高血圧性心疾患によって生じ得る状態は：左心室肥大、冠状動脈心疾患、（うっ血性）心不全、高血圧性心筋症、心律動異常、炎症性心疾患等を含む。
【０１３４】
炎症性心疾患は、心筋および／またはその周囲の組織の炎症を含む。心内膜炎は、心臓の内層である心内膜の炎症を含む。関与する最も一般的な構造は心臓弁である。炎症性心臓肥大。心筋炎は、心臓の筋部分である心筋層の炎症を含む。
【０１３５】
心臓弁膜症
心臓弁膜症は、心臓の１つまたはそれ以上の弁を侵す疾患過程である。心臓の右側部分の弁は三尖弁と肺動脈弁である。心臓の左側部分の弁は僧帽弁と大動脈弁である。大動脈弁閉塞、僧帽弁逸脱および弁膜性心筋症が含まれる。
【０１３６】
［上記の文は、Ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ．（２００９，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ３）からの出典であり、無償百科事典であるウィキペディアにおいて、２００９年２月２０日午前６時３３分にｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｔｉｔｌｅ＝Ｈｅａｒｔ＿ｄｉｓｅａｓｅ＆ｏｌｄｉｄ＝２６８２９０９２４より入手した。］
【０１３７】
＜粒子の送達＞
本明細書で述べる粒子は、任意の適切な手段によってヒトまたは動物の身体に送達し得る。
【０１３８】
本発明者らはそれゆえ、本明細書で述べる粒子を標的細胞、組織、器官、動物の身体またはヒトの身体に送達するための送達システム、および粒子を標的に送達する送達システムを使用するための方法を述べる。
【０１３９】
送達システムは、粒子を含む容器などの、粒子の供給源を含み得る。送達システムは、粒子を標的に分配するためのディスペンサーを含み得る。
【０１４０】
従って、本発明者らは、本明細書で述べる粒子の供給源を、粒子を標的に送達するために作動可能なディスペンサーと共に含む、粒子を送達するための送達システムを提供する。
【０１４１】
本発明者らはさらに、粒子を標的に送達する方法におけるそのような送達システムの使用を提供する。
【０１４２】
液体を身体に送達するための送達システムは当技術分野において公知であり、注射、外科的点滴注入（ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｄｒｉｐｓ）、米国特許第６，１３９，５２４号に述べられているようなカテーテル（灌流カテーテルを含む）、たとえば米国特許第７，１２２，０１９号に述べられているような薬剤送達カテーテルを含む。
【０１４３】
鼻内送達を含む、肺または鼻腔への送達は、当技術分野で公知のように（たとえば米国意匠特許第Ｄ５４４，９５７号に示されているように）、たとえば鼻スプレー、パッファー、吸入器等を使用して達成し得る。
【０１４４】
腎臓への送達は、米国特許第７，２４１，２７３号に記載されているような大動脈内腎送達カテーテルを使用して達成し得る。
【０１４５】
特定の送達は、最適の治療を達成するために、必要量の粒子を適切な間隔で送達するように構成可能であるべきであることは明白である。
【０１４６】
粒子は、たとえばアテローム性動脈硬化症の治療または予防のために使用し得る。この場合、粒子の灌流は、じゅく状斑を安定化するかまたは斑の炎症を低減するために静脈内経路で実施し得る。粒子は、静脈内灌流による敗血症性ショックの治療または予防のために使用し得る。
【０１４７】
粒子は、心不全の治療または予防のために使用し得る。これは、リモデリングを遅延させるかまたは心不全を遅延させるための粒子の慢性冠状動脈内または心筋内灌流によって達成し得る。粒子は、鼻内送達による肺炎症の治療または予防のために使用し得る。
【０１４８】
粒子は、皮膚病変、たとえば乾癬の治療または予防のために使用し得る。粒子の長期送達は、病変が消散するまで経皮マイクロインジェクション針を使用して実施し得る。
【０１４９】
送達方法が、粒子を送達すべき特定器官に依存することは明白であり、当業者はそれに応じて使用する手段を決定することができる。
【０１５０】
一例として、心炎症の治療では、粒子は、たとえば胸壁を通しての直接冠状動脈内注射によって心組織（すなわち心筋、心膜もしくは心内膜）に、または心筋などの組織内への直接注入または体腔に挿入されたステントまたはカテーテルからの阻害剤の持続注入のための、蛍光顕微鏡ガイダンス下での標準的な経皮カテーテルに基づく方法を使用して送達し得る。
【０１５１】
どのような種類の冠状動脈カテーテルまたは灌流カテーテルも、化合物を投与するために使用し得る。あるいは、冠状血管に設置されるステント上に粒子を被覆または含浸させてもよい。
【０１５２】
＜組織再生＞
本明細書で述べる方法および組成物によって生産される間葉系幹細胞および分化細胞、ならびにそれらから誘導される粒子はまた、その必要のあるヒト患者において組織再構築または再生のためにも使用し得る。細胞は、意図される組織部位にそれらを移植し、機能不全領域を再構築または再生することを可能にするように投与される。
【０１５３】
たとえば、本明細書で述べる方法および組成物は、幹細胞の分化を調節するために使用し得る。間葉系幹細胞および分化細胞ならびにそれらから誘導される粒子は、皮膚移植片の成長のためなどの、組織構築のために使用し得る。幹細胞分化の調節は、人工器官もしくは組織の生体工学のため、またはステントなどのプロテーゼのために使用し得る。
【０１５４】
＜がん＞
本明細書で述べる方法および組成物によって生産される間葉系幹細胞および分化細胞、ならびにそれらから誘導される粒子は、がんの治療のために使用し得る。
【０１５５】
「がん」および「がん性」という用語は、典型的には調節されない細胞増殖によって特徴づけられる、哺乳動物における生理的病変を指すまたは表す。がんの例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病を含むが、これらに限定されない。
【０１５６】
そのようながんのより詳細な例としては、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胃がん、膵がん、グリア芽細胞腫および神経線維腫症などのグリア細胞腫瘍、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん、膀胱がん、ヘパトーム、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、唾液腺がん、腎がん（ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒ，ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝がんおよび様々なタイプの頭頸部がんを含む。さらなる例は、結腸がん、乳がん、肺がんおよび前立腺がんを含む固形腫瘍がん、白血病およびリンパ種を含む造血器悪性腫瘍、ホジキン病、再生不良性貧血、皮膚がんおよび家族性腺腫性ポリポーシスである。さらなる例としては、脳腫瘍、結腸直腸腫瘍、乳房腫瘍、子宮頸部腫瘍、眼腫瘍、肝腫瘍、肺腫瘍、膵腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、皮膚腫瘍、精巣腫瘍、心生物、骨腫瘍、栄養膜腫瘍、ファローピウス管腫瘍、直腸腫瘍、結腸腫瘍、腎腫瘍、胃腫瘍および副甲状腺腫瘍を含む。乳がん、前立腺がん、膵がん、結腸直腸がん、肺がん、悪性黒色腫、白血病、リンパ腫、卵巣がん、子宮頸がんおよび胆道がんも含まれる。
【０１５７】
本明細書で述べる方法および組成物によって生産される間葉系幹細胞および分化細胞はまた、エンドスタチンおよびアンギオスタチンなどの抗がん薬または細胞傷害性薬剤または化学療法剤と組み合わせて使用し得る。たとえば、アドリアマイシン、ダウノマイシン、シスプラチナム、エトポシド、タキソール、タキソテール、およびビンクリスチンなどのアルカロイド類のような薬剤、ならびにメトトレキサートなどの代謝拮抗薬。本明細書で使用される「細胞傷害性薬剤」という用語は、細胞の機能を阻害するかまたは妨げるおよび／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位体（たとえばＩ、Ｙ、Ｐｒ）、化学療法剤、および細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的に活性な毒素などの毒素、またはそのフラグメントを包含することが意図されている。
【０１５８】
また、用語は、国際公開第９４／２２８６７号に開示される二環式アンサマイシン類；欧州特許第６００８３２号に開示される１，２−ビス（アリールアミノ）安息香酸誘導体；欧州特許第６００８３１号に開示される６，７−ジアミノ−フタラジン−１−オン誘導体；欧州特許第５１６５９８号に開示される４，５−ビス（アリールアミノ）−フタルイミド誘導体；またはＳＨ２含有基質タンパク質へのチロシンキナーゼの結合を阻害するペプチド（たとえば国際公開第９４／０７９１３号参照）などのがん遺伝子産物／チロシンキナーゼ阻害剤を含む。「化学療法剤」は、がんの治療において有用な化合物である。化学療法剤の例としては、アドリアマイシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソール、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ＶＰ−１６、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン類、ニコチンアミド、エスペラミシン類（米国特許第４，６７５，１８７号参照）、メルファランおよび他の関連するナイトロジェンマスタードおよび内分泌療薬（ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、タモキシフェン、ＬＨＲＨ拮抗薬、プロゲスチン、抗黄体ホルモン等）を含む。
【０１５９】
＜間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の入手＞
本明細書で述べる粒子は、間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）から単離または生産し得る。馴化培地および粒子の生産における使用に適するＭＳＣは、当技術分野で公知の任意の方法によって生産し得る。
【０１６０】
特に、ＭＳＣは、胚性幹（ＥＳ）細胞コロニーまたはその子孫を、共培養物なしでＦＧＦ２を含む無血清培地に分散させることによって得られる細胞を増殖させることによって生産し得る。これは以下の章において詳細に説明する。
【０１６１】
ｈＥＳＣから間葉系幹細胞（ＭＳＣ）またはＭＳＣ様細胞を得る先行技術の方法は、分化中のｈＥＳＣへのヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子のトランスフェクション（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）またはマウスＯＰ９細胞株との共培養（Ｂａｒｂｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）のいずれかを含む。これらの誘導プロトコールにおける外因性遺伝物質またはマウス細胞の使用は、腫瘍形成性または異種動物感染因子の感染の許容されない危険性を導入する。
【０１６２】
粒子は、それゆえ、分化ｈＥＳＣから類似または同一の（たとえば相同な）ＭＳＣ集団を単離するための臨床的に有用で再現可能なプロトコールの使用によって誘導されるＭＳＣから生産し得る。一般に、その方法は、胚性幹（ＥＳ）細胞コロニーを細胞に分散させることを含む。次に細胞をプレートして増殖させる。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を得るために、共培養物なしで線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）を含む無血清培地において細胞を増殖させる。
【０１６３】
それゆえ、プロトコールは、血清、マウス細胞の使用または遺伝子操作を必要とせず、より少ない操作と時間しか必要とせず、それゆえ極めて拡大縮小可能である。プロトコールは、２つの異なるｈＥＳＣ株、ＨｕＥＳ９およびＨ−１から、そして３番目の株、Ｈｅｓ−３からのＭＳＣの単離のために使用し得る。本明細書で述べる方法および組成物によって得られるヒトＥＳ細胞由来のＭＳＣ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣ）は、骨髄由来のＭＳＣ（ＢＭ−ＭＳＣ）に著しく類似する。
【０１６４】
胚性幹細胞培養物は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）培養物を含み得る。
【０１６５】
１つの実施形態では、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を生成する方法は、ｈＥＳＣをトリプシン処理し、ＦＧＦ２および場合によりＰＤＧＦ−ＡＢを添加した培地において支持細胞なしで増殖させた後、ＣＤ１０５＋ＣＤ２４−細胞に関して選別することを含む。
【０１６６】
ＦＧＦ２および場合によりＰＤＧＦ−ＡＢを添加した培地における支持細胞なしでの増殖の１週間後に、トリプシン処理したｈＥＳＣからＣＤ１０５＋、ＣＤ２４−細胞を選別することを含み得るこの方法は、少なくとも一部、たとえば実質的にすべて、またはすべての細胞が相互に類似または同一（たとえば相同）であるｈＥＳＣ−ＭＳＣ細胞培養物を生成する。
【０１６７】
この方法によって生産されるＭＳＣは、そこから粒子を単離し得る間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）を生産するために使用し得る。
【０１６８】
胚性幹細胞コロニーの離解
間葉系幹細胞を生産する１つの方法は、胚性幹細胞コロニーを細胞に分散させるかまたは離解させることを含み得る。
【０１６９】
胚性幹細胞コロニーは、ｈｕＥＳ９コロニー（Ｃｏｗａｎ  ＣＡ，Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  Ｉ，ＭｃＭａｈｏｎ  Ｊ，Ａｔｉｅｎｚａ  Ｊ，Ｗｉｔｍｙｅｒ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５０：１３５３−１３５６）またはＨ１  ＥＳＣコロニー（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ，Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ  Ｊ，Ｓｈａｐｉｒｏ  ＳＳ，Ｗａｋｎｉｔｚ  ＭＡ，Ｓｗｉｅｒｇｉｅｌ  ＪＪ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５−１１４７．）を含み得る。
【０１７０】
コロニー中の細胞は、実質的な程度に、すなわち少なくとも塊（ｃｌｕｍｐ）に離解または分散させ得る。コロニーは、コロニー中の細胞すべてが単一である、すなわちコロニーが完全に分解される程度まで離解または分散させ得る。
【０１７１】
離解は分散剤によって達成され得る。
【０１７２】
分散剤は、コロニー中の少なくとも一部の胚性幹細胞を相互から分離することができる任意のものであり得る。分散剤は、コロニー中の細胞間の接着または細胞と基質の間の接着またはその両方を分断する試薬を含み得る。分散剤はプロテアーゼを含み得る。
【０１７３】
分散剤はトリプシンを含み得る。トリプシンによる処理は、たとえば３７℃で約３分間程度持続し得る。次に細胞を中和し、遠心分離して、培地に再懸濁した後、プレートし得る。
【０１７４】
この方法は、ヒト胚性幹細胞の集密なプレートをトリプシンで分散させ、細胞をプレートすることを含み得る。
【０１７５】
離解は、以下の一連の工程：吸引、洗浄、トリプシン処理、インキュベーション、移動（ｄｉｓｌｏｄｇｉｎｇ）、クエンチング、再接種および分配の少なくとも一部を含み得る。以下のプロトコールはＨｅｄｒｉｃｋ  Ｌａｂ，ＵＣ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（ｈｔｔｐ：／／ｈｅｄｒｉｃｋｌａｂ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／Ｐｒｏｔｏｃｏｌ／ＣＯＳＣｅｌｌ．ｈｔｍｌ）からの出典である。
【０１７６】
吸引工程では、培地をフラスコなどの容器から吸引するかまたは一般には取り出す。洗浄工程では、細胞を一定容量、たとえば５〜１０ｍｌの、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋不含であり得る緩衝培地で洗浄する。たとえば、カルシウムおよびマグネシウム不含ＰＢＳで細胞を洗浄し得る。トリプシン処理工程では、緩衝液中の一定量の分散剤を容器に添加し、容器を回転させて、成長する表面を分散剤溶液で被覆する。たとえば、ハンクスＢＳＳ中のトリプシン１ｍｌをフラスコに添加し得る。
【０１７７】
インキュベーション工程では、細胞を維持温度である程度の時間放置する。たとえば、細胞を３７℃で数分間（たとえば２〜５分間）放置し得る。移動工程では、細胞を機械的作用によって、たとえばこすり取ることによってまたは手で容器の側面を強く打つことによって移動させ得る。細胞はシート状にはがれ落ちて、表面をすべり落ちるはずである。
【０１７８】
クエンチング工程では、一定容量の培地をフラスコに添加する。培地は、分散剤の作用を停止させる中和剤を含有し得る。たとえば、分散剤がトリプシンなどのプロテアーゼである場合、培地は、プロテアーゼの活性を取り除く血清タンパク質などのタンパク質を含み得る。特定例では、血清を含有する細胞培養培地３ｍｌをフラスコに添加して、合計４ｍｌにする。細胞をピペットで分注して、移動または分散させ得る。
【０１７９】
再接種工程では、細胞を新鮮培養容器に再接種し、新鮮培地を添加する。多くの再接種を種々の分割比で実施し得る。たとえば、細胞を１／１５希釈および１／５希釈で再接種し得る。特定例では、細胞１滴を２５ｃｍ２フラスコに添加し、培養物を再接種する別のフラスコに３滴を添加することによって細胞を再接種でき、次に培地７〜８ｍｌを各々に添加して、たとえば７５ｃｍ２フラスコから１／１５希釈および１／５希釈を提供する。分配工程では、どのような分割比を所望する場合も、細胞を新しい皿に分配し、培地を添加し得る。
【０１８０】
特定実施形態では、この方法は以下の工程を含む：ヒトＥＳ細胞を最初に非接着的に懸濁増殖させて、胚様体（ＥＢ）を形成する。次に５〜１０日齢のＥＢをトリプシン処理した後、ゼラチン被覆組織培養プレート上に接着細胞として塗布する。
【０１８１】
細胞培養物としての維持
離解した細胞は、細胞培養物としてプレートし、維持し得る。
【０１８２】
細胞は、培養容器またはゼラチン化プレートなどの基質上にプレートし得る。重要な点として、細胞を共培養物の存在なしで、たとえば支持細胞の不在下で成長させ、増殖させる。
【０１８３】
細胞培養中の細胞は、線維芽細胞増殖因子２（ＧＦＧ２）および場合により血小板由来増殖因子ＡＢ（ＰＤＧＦ  ＡＢ）などの１つまたはそれ以上の増殖因子を、たとえば５ｎｇ／ｍｌで添加した無血清培地で増殖させ得る。細胞培養下の細胞は、コンフルエントになった場合、トリプシンでの処理、洗浄および再プレーティングによって１：４で分割または継代培養し得る。
【０１８４】
共培養物の不在
細胞は共培養物の不在下で培養し得る。「共培養物」という用語は、共に増殖させる２またはそれ以上の異なる種類の細胞の混合物、たとえば間質支持細胞を指す。
【０１８５】
それゆえ、典型的なＥＳ細胞培養物では、培養皿の内表面は通常、分裂しないように処理されたマウス胚皮膚細胞の支持層で被覆される。支持層は、ＥＳ細胞が付着して増殖することを可能にする接着表面を提供する。加えて、支持細胞は、ＥＳ細胞の増殖のために必要な栄養素を培地中に放出する。本明細書で述べる方法および組成物では、ＥＳおよびＭＳＣ細胞をそのような共培養物の不在下で培養し得る。
【０１８６】
細胞は、単層としてまたは支持細胞の不在下で培養し得る。胚性幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を樹立するために支持細胞の不在下で培養し得る。
【０１８７】
解離または分離した胚性幹細胞は、培養基質上に直接プレートし得る。培養基質は、ペトリ皿のような組織培養容器を含み得る。容器は前処理し得る。細胞をゼラチン化組織培養プレートに塗布し、その上で増殖させ得る。
【０１８８】
ディッシュのゼラチンコートのための例示的プロトコールは以下のとおりである。蒸留水中の０．１％ゼラチンの溶液を調製し、加圧滅菌する。これを室温で保存し得る。組織培養皿の底部をゼラチン溶液で被覆し、５〜１５分間インキュベートする。ゼラチンを除去し、プレートはただちに使用可能となる。低張による溶解を防ぐため、細胞を添加する前に培地を添加すべきである。
【０１８９】
無血清培地
解離または分離した胚性幹細胞は、無血清培地を含み得る培地中で培養し得る。
【０１９０】
「無血清培地」という用語は、血清タンパク質、たとえば胎仔ウシ血清を含有しない細胞培養培地を含み得る。無血清培地は当技術分野において公知であり、たとえば米国特許第５，６３１，１５９号および同第５，６６１，０３４号に記載されている。無血清培地は、たとえばＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）より市販されている。
【０１９１】
無血清培地は、それがタンパク質、加水分解物および未知の組成物の成分を欠如し得るという点において、タンパク質不含であり得る。無血清培地は、すべての成分が公知の化学構造を有する、化学的組成の明らかな培地を含み得る。化学的組成の明らかな無血清培地は、多様性を排除する完全合成系を提供し、改善された再現性とより一貫した成績を可能にし、外因性物質による汚染の可能性を低下させるので、好都合である。
【０１９２】
無血清培地は、ノックアウトＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を含み得る。
【０１９３】
無血清培地は、血清置換培地などの１つまたはそれ以上の成分を、たとえば５％、１０％、１５％等の濃度で添加し得る。無血清培地は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）からの１０％血清置換培地を含み得るかまたは添加し得る。
【０１９４】
増殖因子
解離または分離した胚性幹細胞を培養する無血清培地は、１つまたはそれ以上の増殖因子を含有し得る。多くの増殖因子が当技術分野において公知であり、たとえばＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＦＧＦ、ＮＧＦ、エリスロポエチン、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩを含む。
【０１９５】
増殖因子は、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）を含み得る。培地はまた、血小板由来増殖因子ＡＢ（ＰＤＧＦ−ＡＢ）などの他の増殖因子を含み得る。これらの増殖因子はどちらも当技術分野において公知である。この方法は、ＦＧＦ２とＰＥＧＦ−ＡＢの両方を含有する培地で細胞を培養することを含み得る。
【０１９６】
あるいはまたは加えて、培地は、表皮増殖因子（ＥＧＦ）を含み得るかまたはさらに含み得る。ＥＧＦの使用はＭＳＣの増殖を増強し得る。ＥＧＦは、任意の適切な濃度、たとえば５〜１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで使用し得る。ＥＧＦはＰＤＧＦの代わりに使用し得る。ＥＧＦは当技術分野で周知のタンパク質であり、シンボルＥＧＦ、Ａｌｔ．Ｓｙｍｂｏｌｓ  ＵＲＧ、Ｅｎｔｒｅｚ  １９５０、ＨＵＧＯ  ３２２９、ＯＭＩＭ  １３１５３０、ＲｅｆＳｅｑ  ＮＭ＿００１９６３、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ０１１３３と称される。
【０１９７】
それゆえ、本発明者らは、（ｉ）ＦＧＦ２、（ｉｉ）ＦＧＦ２とＰＤＧＦおよび（ｉｉｉ）ＦＧＦ２とＥＧＦおよびその他の組み合わせを含有する培地の使用を開示する。
【０１９８】
ＦＧＦ２は、多くの組織および細胞型において低レベルで発現され、脳および下垂体において高濃度に達する、広域スペクトルの細胞分裂促進、血管新生および神経栄養因子である。ＦＧＦ２は、四肢発生、血管新生、創傷治癒および腫瘍増殖を含む数多くの生理的および病的過程に関係づけられてきた。ＦＧＦ２は、たとえばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）から商業的に入手し得る。
【０１９９】
血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、線維芽細胞、平滑筋および結合組織を含む広範囲の細胞型に対する強力なマイトジェンである。Ａ鎖およびＢ鎖と称される２本の鎖の二量体から成るＰＤＧＦは、ＡＡまたはＢＢホモ二量体としてまたはＡＢヘテロ二量体として存在し得る。ヒトＰＤＧＦ−ＡＢは、１３．３ｋＤａのＡ鎖と１２．２ｋＤａのＢ鎖から成る２５．５ｋＤａのホモ二量体タンパク質である。ＰＤＧＦ  ＡＢは、たとえばＰｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）から商業的に入手し得る。
【０２００】
ＦＧＦ２および場合によりＰＤＧＦ−ＡＢなどの増殖因子は、約１００ｐｇ／ｍｌ、たとえば約５００ｐｇ／ｍｌ、たとえば約１ｎｇ／ｍｌ、たとえば約２ｎｇ／ｍｌ、たとえば約３ｎｇ／ｍｌ、たとえば約４ｎｇ／ｍｌ、たとえば約５ｎｇ／ｍｌの濃度で培地中に存在し得る。一部の実施形態では、培地は約５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含有する。培地はまた、たとえば約５ｎｇ／ｍｌで、ＰＤＧＦ−ＡＢを含有し得る。
【０２０１】
細胞の分割
培養下の細胞は一般に、接触阻害が細胞の分裂および増殖の停止を生じさせる場合、集密まで増殖し続ける。そのような細胞を、次に、基質またはフラスコから解離し、「分割して（ｓｐｌｉｔ）」、組織培養培地への希釈によって二次培養または継代し、再プレートし得る。
【０２０２】
本明細書で述べる方法および組成物は、それゆえ、培養中の継代または分割を含み得る。細胞培養物中の細胞は、１：２またはそれ以上、たとえば１：３、たとえば１：４、１：５またはそれ以上の比率で分割し得る。「継代」という用語は、細胞株の集密培養物のアリコートを取り、新鮮培地に接種して、集密または飽和が得られるまで株を培養することから成る過程を表す。
【０２０３】
選択、スクリーニングまたは選別工程
方法は、間葉系幹細胞をさらに単離するかまたは選択する、選択または選別工程をさらに含み得る。
【０２０４】
選択または選別工程は、１つまたはそれ以上の表面抗原マーカーによって細胞培養物から間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を選択することを含み得る。選択または選別工程の使用は、ＭＳＣについての選別および選択特異性の厳密度をさらに高め、その上、出発物質からのｈＥＳＣなどの胚性幹細胞および他のｈＥＳＣ誘導体による汚染の可能性を潜在的に低下させる。これは、その後、奇形腫形成の危険度をさらに低下させ、本発明者らが述べるプロトコールの臨床的意義をさらに高める。
【０２０５】
抗原発現に基づく選択または選別のために多くの方法が公知であり、これらのいずれかを本明細書で述べる選択または選別工程において使用し得る。選択または選別は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって達成し得る。すなわち、当技術分野で公知のように、ＦＡＣＳは、細胞によって発現される抗原に結合して標識する、標識抗体などのレポーターに細胞を暴露することを含む。レポーターを形成するための抗体の作製およびその標識化の方法は当技術分野において公知であり、たとえばＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅに記載されている。次に細胞を、標識に基づいて細胞を相互から選別するＦＡＣＳ装置に通す。あるいはまたは加えて、磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）も細胞を選別するために使用し得る。
【０２０６】
本発明者らは、多くの候補表面抗原、たとえばＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＡＮＰＥＰ、ＩＴＧＡ４（ＣＤ４９ｄ）、ＰＤＧＦＲＡがＭＳＣに関連することは公知であるが、ＭＳＣ関連表面抗原の一部、たとえばＣＤ２９およびＣＤ４９ｅは、ｈＥＳＣなどのＥＳ細胞においても高発現され、それらの発現がＦＡＣＳ分析によって確認されることを認識している。ＭＳＣと表面抗原の関連性は、表面抗原をｈＥＳＣなどのＥＳ細胞からＭＳＣを単離するためのマーカーとみなすには十分でないと考えられる。従って、選択または選別工程は、ＭＳＣとＥＳ細胞の間で区別的に発現される抗原を使用し得る。
【０２０７】
本発明者らの方法の選択または選別工程は、抗原の発現に基づき間葉系幹細胞を陽性選択し得る。そのような抗原は、たとえば、ｈＥＳＣとｈＥＳＣＭＳＣの遺伝子発現プロフィールを比較することによって同定し得る。特定実施形態では、選択または選別は、特に以下の表Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂに示す抗原のいずれかを使用し得る。
【０２０８】
本発明者らの方法の選択または選別工程は、ＭＳＣ上で発現されるが、ｈＥＳＣなどのＥＳ細胞上では発現されないと同定される抗原の発現に基づいて間葉系幹細胞を陽性選択し得る。
【０２０９】
ＣＤ７３はＭＳＣ上で高発現されるが、ｈＥＳＣ上では高発現されない。ＣＤ７３およびＣＤ１０５はいずれも、ＭＳＣにおいて高発現される表面抗原であり、ｈＥＳＣに比べてｈＥＳＣ−ＭＳＣにおいて高発現される表面抗原の上位２０に含まれ、推定上のＭＳＣについての選択マーカーとしてのＣＤ７３またはＣＤ１０５（または両方）の使用は、分化中のｈＥＳＣによって生成される推定上のＭＳＣに関する選別において等しく有効である。
【０２１０】
あるいはまたは加えて、選択または選別工程は、ｈＥＳＣなどの胚性幹細胞（ＥＳ細胞）上で表面抗原として高発現されるが、間葉系幹細胞、たとえばｈＥＳＣ−ＭＳＣでは高発現されない表面抗原に基づいて抗原を陰性選択し得る。選択または選別は、ＭＩＢＰ、ＩＴＧＢ１ＢＰ３およびＰＯＤＸＬ、ならびにＣＤ２４などの、公知のまたはこれまでに同定されたｈＥＳＣ特異的表面抗原に基づき得る。
【０２１１】
ＦＡＣＳ解析は、ｈＥＳＣ上でのＣＤ２４の発現を確認するが、ｈＥＳＣ−ＭＳＣ上では発現を認めない。それゆえＣＤ２４は、それ自体で陰性選択もしくは選別マーカーとして、または分化中のｈＥＳＣ培養物から推定上のＭＳＣを単離するための陽性選択マーカーとしてのＣＤ１０５と組み合わせて使用し得る。
【０２１２】
［実施例］
成体骨髄に由来する間葉系幹細胞は、心臓血管疾患を治療するための最も有望な幹細胞型の１つとして浮上した（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，２００４）。自家ＭＳＣの治療作用は、心筋細胞、内皮細胞および血管平滑細胞などの多くの異なる修復または置換細胞型へと分化するそれらの潜在能に帰せられてきたが（Ｍｉｎｇｕｅｌｌ  ａｎｄ  Ｅｒｉｃｅｓ，２００６；Ｚｉｍｍｅｔ  ａｎｄ  Ｈａｒｅ，２００５）、移植したＭＳＣが損傷組織において治療的に有用な数の機能的修復細胞へと分化する効率はまだ確立されていない。
【０２１３】
最近の報告は、これらの修復作用の一部がＭＳＣによって分泌されるパラクリン因子によって媒介され得ることを示唆する（Ｃａｐｌａｎ  ａｎｄ  Ｄｅｎｎｉｓ，２００６ａ；Ｇｎｅｃｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｇｎｅｃｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｓｃｈａｆｅｒ  ａｎｄ  Ｎｏｒｔｈｏｆｆ，２００８）。このパラクリン仮説は、再生医療における幹細胞、特にＭＳＣの使用に対して根本的に異なる側面を導入する。ＭＳＣパラクリン作用の潜在的機構は、内因性再生能力、血管および動脈新生、リモデリングの減弱、ならびにアポトーシスの低減を含む。ＭＳＣの治療作用が部分的にそれらの分泌物によって媒介される場合、幹細胞に基づく治療のレパートリーはそれらの分泌因子の適用によって拡大され得る。そのようなアプローチは、潜在的に、急性ＭＩを生じた患者における再灌流障害に対する時間依存的防御のための必須条件である、「容易に入手可能な（ｏｆｆ−ｔｈｅ−ｓｈｅｌｆ）」ＭＳＣベースの治療選択肢を、手頃なコストおよび卓越した品質管理と一貫性で提供し得る。
【０２１４】
このパラクリン仮説の裏付けとして、多くの試験が、主として心臓および血管組織の成長と再生を通して、損傷した心組織を潜在的に修復し得るサイトカイン、ケモカインおよび増殖因子の存在を同定した（Ｃａｐｌａｎ  ａｎｄ  Ｄｅｎｎｉｓ，２００６ｂ；Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｈｗａｎｇ，２００５）。本発明者らは、ＭＳＣパラクリン分泌の初めての徹底したプロテオーム解析を実施することによってこの仮説をさらに裏付けた（Ｓｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。これは、ヒトＥＳＣからの高度に増幅可能な同一ＭＳＣ培養物の誘導（Ｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、および細胞を培養し、馴化培地（ＣＭ）を介して分泌物を採集するための化学的組成の明らかな培地の使用によって促進された。驚くべきことに、分泌タンパク質の多くが細胞内タンパク質であり、形質膜を越えて分泌または輸送されることは知られていない。セクレトームのコンピュータ解析は、集合的に、セクレトームが心筋虚血／再灌流（ＭＩ／Ｒ）障害などの損傷組織を修復する潜在的可能性を有することを予測した（Ｓｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【０２１５】
コンピュータ予測を試験するため、ＣＭの形態の分泌物をＭＩ／Ｒ障害のブタモデルに投与した（Ｔｉｍｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。冠状動脈の閉鎖によって引き起こされる心筋虚血において、再灌流療法は現在最も有効な治療法である。しかし、血流または再灌流を回復するための閉塞動脈の開放を含む再灌流もまた、新たに灌流された虚血組織への損傷を誘発する（Ｓａｒａｓｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。それゆえ、再灌流の時点で直ちに再灌流障害を中和できれば、再灌流療法の有効性は大きく改善し得る。ＣＭを再灌流の直後にＭＩ／Ｒ障害のブタモデルに冠状動脈内経路で送達した場合、再灌流の４時間後に早くも心筋梗塞の６０％の減少、心機能の保存および酸化ストレスの低減が存在した。これは、ＭＳＣのパラクリン分泌物が臨床的に有用な動物モデルにおいてＭＩ／Ｒ障害を改善し得ることを確認した（Ｔｉｍｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【０２１６】
しかし、分泌物がＭＩ／Ｒ障害へのこの即時作用を媒介する機構は明らかでない。この保護作用の即時性が、機構の一部として組織再生の比較的長い過程を排除することは明白である。また、分泌タンパク質の多くが細胞内タンパク質であり、容易に形質膜を横断することは知られていない。ＭＳＣのパラクリン作用をよりよく理解するため、本発明者らは、種々の分子量カットオフ値（ＭＷＣＯ）を有する膜を使用してＣＭを体系的に分画し、活性画分の組成物を同定して、プロファイリングした。本発明者らは以前に、０．２μＭ膜を通過するが１０００ｋＤａのＭＷＣＯの膜は通過しないＣＭが心保護性であることを示した（Ｔｉｍｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。しかし、１０００ｋＤａのＭＷＣＯを有する膜で部分的に濃縮したＣＭは心保護性であった。これは、心保護作用が直径５０〜１００ｎｍの大型複合体によって仲介されることを示唆した。
【０２１７】
本明細書において本発明者らは、先に報告した分泌物中のタンパク質のリストを＞７００個のタンパク質に拡大した。これらのタンパク質は、エキソソームにおいて一般的に認められる多くのタンパク質を含む。本発明者らはまた、分泌物中のＲＮＡ（＜３００ヌクレオチド）の存在を同定した。さらに、タンパク質とＲＮＡはリン脂質小胞に封入されていて、流体力学的半径（ｒｈ）が１〜１０００ｎｍの範囲内の分泌中の唯一の検出可能な粒子は、ｒｈ＝４５〜５５ｎｍであった。これらの粒子は、ＨＰＬＣ分画で単一ピークとして溶出した。合わせて考慮すると、これらの試験は、分泌物中の大きな心保護性複合体が、分泌物中の活性な心保護成分がエキソソームであるという本発明者らの仮説を導くエキソソームの独特の特徴の多くを担持することを明らかにする。
【実施例１】
【０２１８】
＜試験材料および方法：ＭＳＣ−ＣＭの調製＞
ＭＳＣの生成とＣＭの調製についてのプロトコールは以前に記述されている１５、１６。
【０２１９】
手短に述べると、化学的組成の明らかな無血清培地を、臨床的に適合するプロトコールを使用して、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）に由来するＭＳＣによって馴化する。多能性関連マーカーを発現しないがＭＳＣ様表面抗原（ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ４９ａ＋／ｅ＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１６６＋、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−）および遺伝子発現プロフィールを示す３つのポリクローナルな、核型的に安定で表現型的にＭＳＣ様の培養物を、支持細胞不含の無血清選択培地においてＨｕＥＳ９−ｈＥＳＣ株またはＨ１−ｈＥＳＣ株のいずれかからのｈＥＳＣのトリプシン処理および増殖によって生成する１５。
【０２２０】
これらの培養物の１つ、ＨｕＥＳ９．Ｅ１は、少なくとも８０の集団倍加数にわたって安定に増殖し得る。ＭＳＣ分泌物を採集するため、ｈＥＳＣ由来のＭＳＣ培養物を化学的組成の明らかな無血清培地に移して３日間培地を馴化した後、ＭＳＣ分泌物を含有する培地を収集し、遠心分離によって清澄化して、１０ｋＤａのＭＷカットオフ値の限外ろ過膜を使用して２５倍に濃縮し、２２０ｎｍフィルターでのろ過よって滅菌する。
【０２２１】
分泌性プロテオームを多次元タンパク質同定技術（ＭｕＤＰＩＴ）およびサイトカイン抗体アレイ分析によって解析し、２０１個のユニークな遺伝子産物の存在を明らかにした。コンピュータ解析は、このＣＭが潜在的な細胞保護特性を保持することを開示した１６。
【実施例２】
【０２２２】
＜試験材料および方法：動物＞
すべての実験は、実験動物資源局（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）によって作成された「実験用ブタの管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｉｇｓ）」およびＦａｃｕｌｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｕｔｒｅｃｈｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓの動物実験委員会による事前の承認に従って実施する。
【実施例３】
【０２２３】
＜試験材料および方法：試験計画＞
すべてクロピドグレル７５ｍｇ／日で３日間およびアミオダロン４００ｍｇ／日で１０日間前処置した、３０頭の雌性Ｄａｌｌａｎｄ  Ｌａｎｄｒａｃｅブタ（６０−７０ｋｇ；ＩＤＤＬＯ，Ｌｅｌｙｓｔａｄ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を、ＭＳＣ−ＣＭ、非ＣＭまたは食塩水処置に無作為に割り当てる。
【０２２４】
食塩水群は、新鮮非馴化培地の潜在的作用を評価するために加える。すべてのブタにおいて、７５分間の近位左回旋冠状動脈（ＬＣｘＣＡ）結紮およびその後４時間の再灌流によってＭＩを誘導する。７５分の虚血期間は、完全な経壁心筋梗塞を誘発せずに重篤な心筋障害を生じさせるために選択する。ＴＴＣ染色を用いた梗塞の大きさの測定が再灌流の３時間後に最も信頼し得るので１７、４時間の再灌流期間を用いる。より長い再灌流期間後には、酸化ストレス状態およびアポトーシス機構を評価することがより困難になる。
【０２２５】
処置は、ＭＳＣ−ＣＭ（１．０ｍｌ、２．０ｍｇタンパク質）、非ＣＭまたは食塩水の静脈内注入によって再灌流の開始の５分前に開始する。再灌流の直後に、追加の冠状動脈内ボーラスＭＳＣ−ＣＭ（４．０ｍｌ、８．０ｍｇタンパク質）、非ＣＭまたは食塩水を投与する。心筋梗塞の大きさと機能を再灌流の４時間後に評価する。
【実施例４】
【０２２６】
＜試験材料および方法：ＭＩおよび手術手順＞
全手術期間中、ＥＣＧ、全身動脈圧およびカプノグラムを継続的に観測する。先に記述されているような全身麻酔下で１８、胸骨正中切開を実施し、６Ｆｒのガイディングカテーテルと８Ｆｒのコンダクタンスカテーテル（ＣＤ  Ｌｅｙｃｏｍ，Ｚｏｅｔｅｒｍｅｅｒ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）のために２枚の導入シートを頸動脈に挿入する。
【０２２７】
スワン−ガンツカテーテルの遠位端を、内頸静脈を介して肺動脈に設置する。心拍出量および冠血流量を測定するためにＴｒａｎｓｏｎｉｃフロープローブ（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ，Ｉｔｈａｃａ，ＮＹ）を近位大動脈およびＬＣｘＣＡの周辺に設置し、ＰＶループについての様々な負荷条件下での機能測定を可能にするためにワイヤを下大静脈の周辺に設置する。
【０２２８】
機能測定後、１０，０００ＩＵのヘパリンを静脈内投与し、近位ＬＣｘＣＡを閉塞させるために縫合をきつく締める。心室細動が起きた場合は５０Ｊでの体内除細動を使用する。７５分間の虚血後、縫合の除去によってＬＣｘＣＡを再開放する。再灌流の直後に、ニトログリセリン（ノーリフロー現象を防ぐための０．１ｍｇ）を、ガイディングカテーテルを介してＬＣｘＣＡに注入し、次いでＭＳＣ−ＣＭ、非ＣＭまたは食塩水による冠状動脈内処置を実施する。４時間の再灌流後、最終機能測定を実施し、梗塞の大きさの分析のために心臓を外植する。
【実施例５】
【０２２９】
＜試験材料および方法：機能測定＞
左室（ＬＶ）圧および容積を、先に述べられているように１８コンダクタンスカテーテル法を使用して測定する。コンダクタンスカテーテルに由来するＬＶ圧および容積シグナルを、Ｌｅｙｃｏｍ  ＣＦＬ−５１２（ＣＤ  Ｌｅｙｃｏｍ）を用いて２５０Ｈｚのサンプリング周波数で表示し、取得する。
【０２３０】
データは、すべて呼気終末期に、人工呼吸器を切った状態で、定常状態の間および側頭大静脈閉塞の間に取得する。圧−容積ループの分析を、先に述べられているように１９カスタムソフトウエアを用いて実施する。加えて、短軸心外膜超音波像（Ｐｒｏｓｏｕｎｄ  ＳＳＤ−５０００、５−ＭＨｚプローブＵＳＴ−５２８０−５、Ａｌｏｋａ  Ｈｏｌｄｉｎｇ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＡＧ，Ｚｕｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を中乳頭筋レベルで得る。梗塞領域、遠隔領域（中隔）およびＬＶ内部領域（ＬＶｉａ）の壁厚（ＷＴ）を拡張終期（ＥＤ）および収縮終期（ＥＳ）に測定する。収縮期壁圧（ＳＷＴ）を［（ＷＴ（ＥＳ）−ＷＴ（ＥＤ））／ＷＴ（ＥＤ）］×１００％として、面積縮小率（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ａｒｅａ  ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）（ＦＡＳ）を［（ＬＶｉａ（ＥＳ）−ＬＶｉａ（ＥＤ））／ＬＶｉａ（ＥＤ）］×１００％として、および左室駆出率（ＬＶＥＦ）を［（ＥＤＶ−ＥＳＶ）／ＥＤＶ］×１００％として計算する。
【０２３１】
拡張終期心室硬度を、拡張終期圧−容積関係の線形回帰によって定量する。心エコー検査およびＰＶループを、ＭＩの前、虚血の１時間後および再灌流の４時間後に測定する。気絶心筋を誘発する（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）ため、静脈内ドブタミン注入（２．５μｇ／ｋｇ／分および５．０μｇ／ｋｇ／分）によって医薬的に誘導したストレスの間に付加的な測定を実施する。
【実施例６】
【０２３２】
＜試験材料および方法：梗塞の大きさ＞
心臓の切除の直前に、ＬＣｘＣＡ（ブタ）またはＬＣＡ（マウス）をＭＩの誘導の場合と正確に同じ位置で再結紮する。危険領域（ＡＡＲ）を描出するために冠状動脈系を通してエバンスブルー染料を注入する。
【０２３３】
次に心臓を切除し、ＬＶを単離して、心尖から心底まで５つの切片に切り分ける。生存可能心筋から梗塞組織を区別するために切片を３７℃のセーレンセン緩衝液（１３．６ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４＋１７．８ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．４）中の１％塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）において１５分間インキュベートする。
【０２３４】
すべての切片を両側から走査し、各々のスライドにおいて、デジタル面積測定ソフトウエア（Ｉｍａｇｅ  Ｊ）を使用して梗塞領域を危険領域および全領域と比較する。切片の重量についての補正後、梗塞の大きさをＡＡＲおよびＬＶのパーセンテージとして計算する。
【実施例７】
【０２３５】
＜試験材料および方法：酸化誘導性細胞死アッセイ＞
ヒト白血病ＣＥＭ細胞をＣＭまたは非ＣＭ中でインキュベートし、５０μＭのＨ２Ｏ２  で処理して酸化ストレスを誘導する。Ｈ２Ｏ２処理後１２、２４、３６および４８時間目にトリパンブルー排除を使用して細胞生存能を評価する。
【実施例８】
【０２３６】
＜試験材料および方法：免疫染色＞
虚血および再灌流領域における核酸化ストレスを、ＤＮＡに対する酸化ストレスの産物である、８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）を免疫染色することによって評価する。組織試料を４％ホルマリンに固定した後、パラフィンに包埋する。
【０２３７】
１０ｍＭクエン酸中での抗原賦活化後、組織切片を１０％正常ウマ血清と共に３０分間、０．１％ＰＢＳＡ中のマウス抗８−ＯＨｄＧ（ＯＸＩＳ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）１：２０と共に４℃で一晩、ビオチン標識ウマ抗マウス（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）１：５００と共に１時間、およびストレプトアビジン−ＨＲＰＯ＝１：１０００と共に１時間インキュベートする。
【０２３８】
最後に、切片をＨ２Ｏ２−ジアミノベンジジンと共に１０分間インキュベートする。８−ＯＨｄＧ陽性核の量を、デジタル画像顕微鏡検査ソフトウエア分析（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｍｕｅｎｓｔｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２００×の倍率で、切片当たり４つの無作為に選んだ視野において定量する。
【実施例９】
【０２３９】
＜試験材料および方法：ウエスタンブロット法＞
製造者のプロトコールに従ってＴｒｉｐｕｒｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）１ｍｌを使用してブタの虚血／再灌流領域より収集した凍結組織試料からタンパク質を単離する。ウエスタンブロット法のために、全タンパク質８μｇを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ニトロセルロースＣ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）に移して、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）−０．１％Ｔｗｅｅｎ−５％Ｐｒｏｔｉｆａｒ（Ｎｕｔｒｉｃｉａ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いてブロックする。
【０２４０】
膜を、ホスホＳＭＡＤ２については１：１０００（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、カスパーゼ３については１：１００（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、またはβ−チューブリンについては１：５０００（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）でウサギ抗体と共にインキュベートし、その後１：２０００でヤギ抗ウサギＨＲＰと共に（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）インキュベートする。化学発光基質（ＮＥＮｋ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を検出のために使用する；バンドをＧｅｌ−Ｄｏｃ１０００システム（Ｂｉｏｒａｄ，Ｖｅｅｎｅｎｄａａｌ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して解析する。
【実施例１０】
【０２４１】
＜試験材料および方法：ＭＳＣ−ＣＭの分画＞
ＭＳＣ−ＣＭを２２０ｎｍフィルターでの滅菌ろ過によって調製し、１０ｎｍフィルターを通して濃縮し、それゆえＭＳＣ−ＣＭは１０〜２２０ｎｍの成分を含有する。その後、１００ｎｍの公称細孔径を有する１０００ｋＤａのＭＷカットオフ膜（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）を通してＭＳＣ−ＣＭをろ過することによって＜１０００ｋＤａ画分を調製し、１０〜１００ｎｍの生成物を含有する画分を生成する。
【０２４２】
心保護作用を付与する培地中の因子を含有する画分（１０〜１００ｎｍまたは１００〜２２０ｎｍ）を同定するため、虚血および再灌流障害のマウスまたはブタモデルを使用する。３０分間の左冠状動脈（ＬＣＡ）閉塞によってＭＩを誘導し、その後再灌流する。再灌流の５分前に、尾静脈を介した静脈内経路により、マウスを２０μｌの未分画ＭＳＣ−ＣＭ（１０〜２２０ｎｍ）、＜１０００ｋＤａ画分（１０〜１００ｎｍ）、または食塩水で処置する。先に述べたようにエバンスブルーおよびＴＴＣを使用して２４時間後に梗塞の大きさを評価する。
【実施例１１】
【０２４３】
＜試験材料および方法：データの解析＞
データを平均±ＳＥＭとして提示する。数値を盲検的に収集し、ＳＰＳＳ１１．５においてポストホックボンフェローニ検定による一方向ＡＮＯＶＡを用いて比較する。Ｐ値＜０．０５を有意とみなす。
【実施例１２】
【０２４４】
＜結果：死亡率＞
４匹のブタが処置前に虚血の間の抗療性心室細動のために死亡し、それゆえ試験から除外している。ＣＭ（ｎ＝９）、非ＣＭ（ｎ＝９）または食塩水（ｎ＝８）で処置したすべてのブタは、フォローアップ期間も生存した。
【実施例１３】
【０２４５】
＜結果：梗塞の大きさ＞
危険領域（ＡＡＲ）ならびにＬＶと比較した梗塞の大きさは、非ＣＭおよび食塩水で処置したブタと比較して、ＭＳＣ−ＣＭで処置したブタにおいて著明に縮小した。ＭＳＣ−ＣＭ処置は、梗塞の大きさの約６０％の縮小を生じさせた。重要な点として、ＡＡＲはすべてのブタにおいて同様であり、これは、初期虚血損傷がすべてのブタにおいて同様であることを指示する（以下の表Ｅ１）。
【０２４６】
【表４】
0005718648.tif 000023
【０２４７】
表Ｅ１．血行力学的および機能的パラメータ。心エコー検査およびコンダクタンスカテーテルに基づくＬＶ圧および容積測定で決定した、非ＣＭ、ＣＭまたは食塩水で処置したブタの基線値および心筋梗塞値。ＡＡＲは危険領域を示す；ＩＳ、梗塞の大きさ；ＬＶ、左心室；ＨＲ、心拍数；ＱＬＣｘ、左回旋冠状動脈流量；ＣＯ、心拍出量；ＷＴ、壁厚；ＳＷＴ、収縮期壁肥厚；ＦＡＳ、面積縮小率；ＥＤＶ、拡張終期容積；ＥＳＶ、収縮終期容積；ＳＶ、一回拍出量；ＥＦ、駆出率；Ｅｅｓ、収縮終期弾性。非ＣＭ、ｎ＝９；ＣＭ、ｎ＝９；食塩水、ｎ＝８。基線に対して＊ｐ＜０．０５；非ＣＭに対して†ｐ＜０．０５；‡食塩水に対してｐ＜０．０５。
【実施例１４】
【０２４８】
＜結果：心機能＞
基線パラメータはすべての群において同様である（上記表Ｅ１）。虚血の間、心エコー検査での収縮期壁肥厚の負の値によって認められるように、すべての群において後外側壁が完全にジスキネジーとなった（ＳＷＴ、図２Ａ）。再灌流の４時間後、非ＣＭおよび食塩水対照の両群の再灌流された後外側壁はまだジスキネジーのままである。しかし、ＭＳＣ−ＣＭで処置したブタでは、ＳＷＴは部分的に回復した（図２Ａ）。
【０２４９】
β１アドレナリン受容体アゴニスト、ドブタミンの静脈内注入は、ＭＣＳ−ＣＭ処置ブタにおいて収縮壁肥厚をさらに増大させたが、対照群では改善が見られない。また、全体的な左室収縮機能も虚血のために低下した（図２Ｂ）。ＣＭで処置したブタでは、再灌流後に面積収縮率が上昇してほとんど基線レベルに戻り、ドブタミン注入の間に基線レベルを超えて上昇した。
【０２５０】
対照ブタでは、全体的な収縮機能は低下したままであった。心機能の改善も、ＰＶループに由来する指数から明らかになった（表Ｅ１）。左室ＥＦおよび一回拍出量は、ＣＭ処置ブタにおいて有意に高い。これは、心拍出量、平均動脈圧および心拍数などの血行力学的パラメータの改善と言い換えられた。
【０２５１】
拡張機能は、収縮終期心筋硬度の上昇によって認められるように、虚血および再灌流障害後に対照群において低下した。しかし、ＣＭ処置したブタでは、拡張機能は低下しない。
【実施例１５】
【０２５２】
＜結果：酸化ストレス＞
梗塞の大きさの縮小および機能の改善が明らかになったので、本発明者らは、虚血再灌流障害の主要原因である酸化ストレスへのＣＭおよび非ＣＭの作用を測定するために過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）誘導性細胞死のインビトロアッセイを使用した。
【０２５３】
本発明者らは、ＣＭまたは非ＣＭのいずれかの存在下でヒト白血病ＣＥＭ細胞において過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）媒介性酸化ストレスを誘導し、トリパンブルー排除によって細胞生存能を観測した。結果は、ＣＭが、非ＣＭと比較して（Ｈ２Ｏ２）が誘導する細胞生存能の喪失に対して有意に保護することを示した（ｐ＜０．０５）（図３Ａ）。
【０２５４】
ＣＭがＣＭ処置ブタの心臓においても酸化ストレスを低減するかどうかを調べるため、ＣＭ、非ＣＭまたは食塩水で処置したブタの組織切片における核酸化ストレスを、酸化ＤＮＡについての８−ＯＨｄＧ免疫染色によって定量する。ＣＭ処置ブタと比較して、ＤＮＡ酸化を指示する強い核染色が非ＣＭまたは食塩水処置ブタの切片において認められる（図３Ｂ〜Ｄ）。加えて、非ＣＭまたは食塩水処置ブタでは有意に多い陽性核も存在する（図３Ｅ）。
【０２５５】
それゆえ、ＣＭはインビトロおよびインビボで酸化ストレスに対する細胞保護作用を付与し得る。
【実施例１６】
【０２５６】
＜結果：ＴＧＦ−βシグナル伝達＞
ＭＳＣの分泌物は、ＴＧＦ−βシグナル伝達に関与する多くのタンパク質を含有した１６。ＴＧＦ−βシグナル伝達へのＣＭ処置の影響をインビボで評価するため、本発明者らは、ＣＭ処置ブタおよび対照ブタの心筋組織試料におけるリン酸化ＳＭＡＤ−２をウエスタンブロット法によって定量した。ＣＭ処置はｐＳＭＡＤ−２発現の低下を生じさせ、ＡＬＫ−５を介したＴＧＦ−βシグナル伝達が低下することを指示した（図４Ａ、Ｂ）。
【実施例１７】
【０２５７】
＜結果：アポトーシス＞
再灌流障害は、壊死よりもアポトーシスを介した細胞死を生じさせる２０〜２２。ＣＭ処置が再灌流の間のアポトーシスを低減することを確認するため、本発明者らは、アポトーシスの鍵となるメディエイターである活性カスパーゼ３のレベルをウエスタンブロット法によって定量した。ＭＳＣ−ＣＭで処置したブタでは、活性カスパーゼ３レベルは非ＣＭ対照および食塩水対照の両方に比べて低く、ＣＭがインビボでアポトーシスを阻害することを示唆する（図４Ｃ、Ｄ）。
【実施例１８】
【０２５８】
＜結果：ＭＳＣ−ＣＭ分画＞
未分画ＭＳＣ−ＣＭは１０〜２２０ｎｍの生成物を含有する。ＭＳＣ−ＣＭ内の心保護因子を同定することに近づくため、１０〜１００ｎｍにわたる大きさの生成物を含有する＜１０００ｋＤａ画分を生成する。未分画ＭＳＣ−ＣＭは心保護作用を付与するが、＜１０００ｋＤａ画分は心保護作用を付与せず（図５）、心保護因子が１００〜２２０ｎｍの範囲の大きさを有する＞１０００ｋＤａ画分中にあることを指示する。
【実施例１９】
【０２５９】
＜結果：サイズ分画は分泌タンパク質を分子量によって分離しなかった＞
馴化培地中の活性成分を同定するため、本発明者らは、種々のＭＷカットオフ値を有する膜で馴化培地をろ過することにより、馴化培地を異なるＭＷ画分にサイズ分画することを試みた。
【０２６０】
馴化培地を１００ｋＤのＭＷカットオフ値の膜でろ過して、４：１の保持液対ろ液容量比を生じさせた場合、＜１００ｋＤの大部分のタンパク質が＞１００ｋＤ画分に分離され、予想された＜１００ｋＤ画分には分離されなかった（図６）。未分画馴化培地と＞１００ｋＤ画分の両方における個々のタンパク質バンドの割合は同様である。
【０２６１】
ＭＷ＜３００ｋＤを有する大部分のタンパク質も、３００ｋＤのＭＷカットオフ値を有する膜を通過しなかった（図６）。ろ液中の主要タンパク質バンドの一部のＭＷサイズは、非馴化培地（ＮＣＭ）におけるもの、および培地中に外来性に加えたタンパク質添加物：インスリン−トランスフェリン−セレノプロテイン添加物（ＩＴＳ）、ＦＧＦ２、ＥＧＦおよびＰＤＧＦ−ＡＢと同様である（図７）。
【０２６２】
合わせて考慮するとこれらの所見は、細胞によって分泌されるタンパク質が複合体であり、これらの分泌複合体は、添加物として培地に外来性に加えた１００ｋＤタンパク質よりも大きく、１００ｋＤ未満のものは１００ｋＤのＭＷカットオフ値を有する膜で容易にろ過されることを示唆する。
【実施例２０】
【０２６３】
＜結果：ＭＷ＞１，０００ｋＤまたは直径５０〜１５０ｎｍを有するサイズ分画馴化培地における生物活性＞
推定上の分泌複合体の大きさの上限または下限を調べるため、本発明者らは、馴化培地のサイズ分画を実施し、虚血再灌流障害のマウスにおいて生物活性を試験した。馴化培地を０．２μＭフィルターでろ過し、１０ｋＤのＭＷカットオフ値を有する膜で濃縮した場合、これは、推定上の分泌複合体を２〜２００ｎｍのサイズ範囲に有効に位置づけた（図８）。
【０２６４】
このサイズ範囲をさらに狭めるため、本発明者らは、１００ｋＤまたは１０００ｋＤのＭＷカットオフ値を有する膜で馴化培地を完全にろ過することによるろ液、１０００ｋＤのＭＷカットオフ値を有する膜で馴化培地をろ過することによる保持液において生物活性が存在するかどうかを測定する。保持液の容量は注入容量の１／５である。画分を、心筋虚血（ＭＩ）および再灌流障害のマウスまたはブタモデルで試験する。
【０２６５】
このモデルにおいて、縫合結紮による３０分間の左冠状動脈（ＬＣＡ）閉塞によってＭＩを誘導し、縫合を除去して再灌流を開始させる。再灌流の５分前に、尾静脈を介して静脈内経路で、マウスを未分画ＭＳＣ−ＣＭ（１０〜２２０ｎｍ）２０μｌ、＜１００または１，０００ｋＤ画分２０μｌ、＞１０００ｋＤ保持液または食塩水４μｌで処置する。２４時間後、心臓を切除する。切除前に、ＬＣＡを再結紮し、次に大動脈にエバンスブルーを灌流することによって危険領域（ＡＡＲ）を決定する。ＡＡＲは、染料によって染色されない領域と定義し、左室壁領域のパーセンテージとして表す。先に述べたようにエバンスブルーとＴＴＣを使用して２４時間後に梗塞の大きさを評価する。
【０２６６】
すべての動物における相対的ＡＡＲは有意に異ならない（図９）。しかし、相対的な梗塞の大きさは、食塩水と比較した場合、馴化培地および＞１０００ｋＤ画分で処置した動物において有意に縮小される（それぞれｐ＝０．０１および０．０５）（図１０）。＜１００および＜１０００ｋＤ画分は生物学的に活性ではなく、推定上の活性複合体が＞１０００ｋＤであることを示唆する。しかし、複合体が＜１０００ｋＤであること、および馴化培地をフィルターに通すことが複合体を不活性化する可能性がまだ存在する。
【実施例２１】
【０２６７】
＜結果：馴化培地の電子顕微鏡検査は５０〜２００ｎｍ粒子の存在を明らかにした＞
標準的な方法を用いて馴化培地の電子顕微鏡分析を実施する。簡単に述べると、ＰＢＳ中の馴化培地をフォルムバールカーボン被覆グリッド（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ  Ｉｎｃ，Ｒｅｄｄｉｎｇ，ＣＡ，ＵＳＡ、カタログ番号０１８００Ｎ−Ｆ）に負荷し、２．５％グルタルアルデヒドに固定して、洗浄し、２％酢酸ウラニルでコントラスト強調し（ｃｏｎｔｒａｓｔｅｄ）、酢酸ウラニル（０．８％）とメチルセルロース（０．１３％）の混合物に包埋して、電子顕微鏡下で検査する。上記のサイズ分画試験と一致して、約５０〜１５０ｎｍの数多くの小胞の存在を認め、これらの小胞が分泌物中の推定上の活性複合体であることを示唆した（図１１）。
【０２６８】
仮説は、馴化培地を２００，０００×ｇで１時間超遠心し、先に述べられているように２０ＬＣ／ＬＣ−ＭＳによって検定した場合、ペレットは分泌物中に認められるタンパク質の少なくとも７０％を含んだ。
【実施例２２】
【０２６９】
＜結果：馴化培地の脂質組成＞
馴化培地の脂質組成を分析するため、馴化培地およびＮＣＭの疎水性脂質／ステロイド成分をフォルチ法によって抽出する。簡単に述べると、馴化培地またはＮＣＭ（５０ｍｌ）をクロロホルム５ｍｌおよびメタノール２ｍｌと強く混合する。有機相と水相を分離させる。底部クロロホルム層を取り出し、スピードバックによって蒸発乾固させる。
【０２７０】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のために残留物をメタノールに再溶解する。次に、ジクロロメタン／メタノール／水／エチルアミンを移動相とする順相（シリカ相）ＨＰＬＣカラムに試料を注入する。次に、溶出液をＬＴＱ−ＦＴＭＳ／Ｏｒｂｉｔｒａｐに対するナノスプレーによってオンラインでイオン化する。ＬＴＱ−ＦＴＭＳ／Ｏｒｂｉｔｒａｐは、種々の化学的性質を有する脂質／ステロイドの検出のために交互にポジティブモードとネガティブモードで作動させる。各々のＭＳスキャンの上位５の前駆体イオンをＭＳ／ＭＳスキャンによってさらに分析する。
【０２７１】
分子を、それゆえ、ＦＴＭＳとＬＴＱの組み合わせによって特徴づける。各々のタンデム質量スペクトルの前駆体質量を、最初に脂質および代謝データベースにおける候補物質に一致させる。その後、データベース中の何らかの分子に対して＜５ｐｍｍの質量誤差を有するイオンのＭＳ／ＭＳスペクトルを、公知の標準的なスペクトルまたはＭａｓｓ−Ｆｒｏｎｔｉｅｒプログラムによって予測されるスペクトルと比較する。
【０２７２】
馴化培地からのクロロホルム抽出物の質量分析は、形質膜において、およびエキソソームにおいても３５、一般的に認められる脂質、すなわちリン脂質、糖脂質およびステロイド類の存在を明らかにした。リン脂質は、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルイノシトール、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、セラミド類；セレブロシドなどの糖脂質ならびにコレステロールなどのステロイド類を含む。
【０２７３】
エキソソームは、それらの脂質膜中に脂質ラフトとして知られるミクロドメインを有することが認められた２２、２４〜３５、４１、４２。エキソソームはコレステロールに富み、それらのコレステロール−リン脂質比は一般に、形質膜で認められる０．３〜０．４（モル／モル）の比率を超える３５。これらのラフトは、低温でのＴｒｉｔｏｎＸ−１００またはＢｒｉｊ−９８などの非イオン性界面活性剤による溶解に対する抵抗性、およびコレステロールに結合するシクロデキストリンに対する感受性によって特徴づけられる。一般にＴｒｉｔｏｎＸ−１００などの界面活性剤に不溶性であり、この界面活性剤不溶性はしばしば脂質ラフトの存在を同定するために利用される。
【０２７４】
馴化培地をＴｒｉｔｏｎＸ−１００で処理した場合、分泌されたタンパク質は、膜ろ過を使用したサイズ分画実験とは無関係に複合体として分離し続け（図１２）、推定上の複合体が、脂質ラフトの存在と一致して、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００による溶解に対して抵抗性であることを示唆した４３。
【０２７５】
本発明者らは、複合体が２０ｍＭシクロデキストリンの存在下で溶解に対して感受性であるかどうかを測定する。推定上の複合体が膜内に脂質ラフトを有する場合、シクロデキストリンによるコレステロールの抽出は溶解を生じさせ、その後それらの分子サイズによってサイズ分画できるタンパク質を放出する。推定上の複合体中の脂質の相対的な定量的組成は、先に概説されているように３５クロマトグラフィーおよび質量分析法を用いて推定される。これは、脂質組成が脂質ラフトの存在を裏付け得るかどうかを決定する。
【実施例２３】
【０２７６】
＜結果：馴化培地のＲＮＡ組成＞
細胞からのＲＮＡの抽出において一般的に使用される、馴化培地のトリゾール抽出およびそれに続くイソプロパノール沈殿により、水中で１．９の２６０：２８０ｎｍ吸光度比を有するペレットが生成され、それがＲＮＡであり得ることを示唆する。
【０２７７】
これは、エキソソームがｍＲＮＡおよびマイクロＲＮＡを含有するという先の報告と一致する３６。このペレットをＲＮアーゼ活性に対する感受性に関して検定する。馴化培地も、トリゾールによる抽出の前にＲＮアーゼで処理する。これらのアッセイは、ペレットがＲＮＡであるかどうか、およびＲＮＡがエキソソームのような脂質小胞内に隔離されているのかどうかを測定する。
【０２７８】
そうである場合は、ＲＮＡの組成と機能を決定するために、マイクロアレイ、配列決定、ＲＴ−ＰＣＲおよびインビトロ翻訳アッセイなどの一般的な遺伝子発現アッセイによってＲＮＡを検定する。１５Ｎ−ロイシンを含むおよび含まない標準的な市販の網状赤血球溶解産物系を使用してＲＮＡをインビトロで翻訳する。翻訳されたタンパク質産物を質量分析法によって同定する。
【実施例２４】
【０２７９】
＜結果：プロテオームプロフィール＞
分泌物中に存在すると記述されている約７００個のタンパク質の中に（米国特許仮出願第６０／８７８，２２２号および国際特許出願第ＰＣＴ／ＳＧ２００６／０００２３２号、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ）、他のエキソソームのプロテオームにおいて一般的に存在することが認められた多くのタンパク質がある（図１３）４４。また、エキソソーム内に存在することが記述されていなかった多くのタンパク質も約７００個のタンパク質のリスト中に存在する。網羅的ではないが一部の顕著な例は、Ｔｈｙ１、Ｗｎｔ  ５ａ、Ｗｎｔ  ５ｂ、インヒビンＡ（またはアクチビンＡ）である。
【実施例２５】
【０２８０】
＜結果：表面抗原プロフィール＞
馴化培地のプロテオームプロフィールも、膜結合であることが公知のタンパク質の存在を示す。網羅的ではないが一部の顕著な例は、ＣＤ９、ＣＤ１０９、ｔｈｙ−１を含む２０。エキソソームの他の公知の表面抗原、たとえば尿中に分泌されるエキソソームの表面で認められるＣＤ２４は４５、ＭＳＣ１９またはその分泌物中２０では発現されない。
【０２８１】
加えて、これらの表面抗原の多くは細胞型特異的に発現される。合わせて考慮すると、これらの所見は、表面抗原プロフィールが異なる細胞源からのエキソソームを規定し、識別することを示唆する。これらの推定上の分泌複合体の表面抗原プロフィールを特徴づけるため、標準的な市販のビオチニル化キットを使用して馴化培地をビオチニル化する。タンパク質を標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ナイロンまたはニトロセルロースに移して、ウエスタンブロット分析における標準的なプロトコールを使用してアビジン−ペルオキシダーゼでプローブ化する。このプロトコールでは、複合体の表面に存在し、ビオチンに対して物理的にアクセス可能なタンパク質だけがビオチニル化される。複合体内に存在し、それゆえ物理的にアクセスできないタンパク質はすべてビオチニル化されない。ビオチニル化されたタンパク質はまた、アビジンアフィニティークロマトグラフィーを用いて単離され、ＬＣ／ＭＳを使用して同定される。これらのタンパク質の同一性は、ウエスタンブロット分析、免疫電子顕微鏡検査およびＭＳＣの遺伝子発現によって確認される。
【実施例２６】
【０２８２】
＜エキソソーム＞
所見に基づき、本発明者らは、馴化培地中の最小活性心保護単位がエキソソームであると仮定する。
【０２８３】
この仮説を証明するため、本発明者らは、１００ｋＤのＭＷカットオフ値の膜による膜ろ過技術を使用して馴化培地を濃縮する。次に、濃縮した馴化培地を約１５０〜２００，０００ｇで１〜２時間超遠心する。ペレットをＰＢＳに再懸濁し、５０〜１５０ｎｍのサイズ範囲の粒子の存在を確認するために電子顕微鏡検査によって分析して、そのタンパク質、脂質およびＲＮＡ含量に関して検定する。
【０２８４】
懸濁液を、馴化培地に関してコンピュータで予測される生物活性に関して検定し２０、前記および以下でそれぞれ述べるようにマウスおよびブタモデルにおいて心保護作用を試験する。
【実施例２７】
【０２８５】
＜ブタ試験についての試験計画＞
すべてクロピドグレル７５ｍｇ／日で３日間およびアミオダロン４００ｍｇ／日で１０日間前処置した、３０頭の雌性Ｄａｌｌａｎｄ  Ｌａｎｄｒａｃｅブタ（６０−７０ｋｇ；ＩＤＤＬＯ，Ｌｅｌｙｓｔａｄ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を、ＭＳＣ−ＣＭ、非ＣＭまたは食塩水処置に無作為に割り当てる。
【０２８６】
食塩水群は、新鮮非馴化培地の潜在的作用を評価するために加える。すべてのブタにおいて、７５分間の近位左回旋冠状動脈（ＬＣｘＣＡ）結紮およびその後４時間の再灌流によってＭＩを誘導する。７５分の虚血期間は、完全な経壁心筋梗塞を誘発せずに重篤な心筋障害を生じさせるために選択する。ＴＴＣ染色を用いた梗塞の大きさの測定が再灌流の３時間後に最も信頼し得るので４６、４時間の再灌流期間を用いる。
【０２８７】
より長い再灌流期間後には、酸化ストレス状態およびアポトーシス機構を評価することがより困難になる。処置は、ＭＳＣ−ＣＭ（１．０ｍｌ、２．０ｍｇタンパク質）、非ＣＭまたは食塩水の静脈内注入によって再灌流の開始の５分前に開始する。再灌流の直後に、追加の冠状動脈内ボーラスＭＳＣ−ＣＭ（４．０ｍｌ、８．０ｍｇタンパク質）、非ＣＭまたは食塩水を投与する。心筋梗塞の大きさと機能を再灌流の４時間後に評価する。
【０２８８】
心保護作用を付与する培地中の因子を同定するため、本発明者らは虚血および再灌流障害のマウスまたはブタモデルを使用した。３０分間の左冠状動脈（ＬＣＡ）閉塞によってＭＩを誘導し、その後再灌流する。再灌流の５分前に、尾静脈を介した静脈内経路により、マウスを未分画馴化培地、＜１０００ｋＤａ画分、＜５００ｋＤ画分、＜３００ｋＤ画分、＜１００ｋＤ画分、または食塩水で処置する。梗塞の大きさを翌日（再灌流の２４時間後）に評価する。
【実施例２８】
【０２８９】
＜ＭＩおよび手術手順＞
全手術期間中、ＥＣＧ、全身動脈圧およびカプノグラムを継続的に観測する。先に記述されているような全身麻酔下で４７、胸骨正中切開を実施し、６Ｆｒのガイディングカテーテルと８Ｆｒのコンダクタンスカテーテル（ＣＤ  Ｌｅｙｃｏｍ，Ｚｏｅｔｅｒｍｅｅｒ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）のために２枚の導入シートを頸動脈に挿入する。
【０２９０】
スワン−ガンツカテーテルの遠位端を、内頸静脈を介して肺動脈に設置する。心拍出量および冠血流量を測定するためにＴｒａｎｓｏｎｉｃフロープローブ（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ，Ｉｔｈａｃａ，ＮＹ）を近位大動脈およびＬＣｘＣＡの周辺に設置し、ＰＶループについての様々な負荷条件下での機能測定を可能にするためにワイヤを下大静脈の周辺に設置する。機能測定後、１０，０００ＩＵのヘパリンを静脈内投与し、近位ＬＣｘＣＡを閉塞させるために縫合をきつく締める。心室細動が起きた場合は５０Ｊでの体内除細動を使用する。７５分間の虚血後、縫合の除去によってＬＣｘＣＡを再開放する。再灌流の直後に、ニトログリセリン（ノーリフロー現象を防ぐための０．１ｍｇ）を、ガイディングカテーテルを介してＬＣｘＣＡに注入し、次いでＭＳＣ−ＣＭ、非ＣＭまたは食塩水による冠状動脈内処置を実施する。４時間の再灌流後、最終機能測定を実施し、梗塞の大きさの分析のために心臓を外植する。
【０２９１】
マウスをフェンタニル（０．０５ｍｇ／ｋｇ）、ドルミカム（５ｍｇ／ｋｇ）およびドミトール（０．５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、鈍端を有する２４ゲージの静脈内カテーテルを使用して挿管する。げっ歯動物用人工呼吸器を使用して１０５拍動／分の速度で、イソフルラン（２．５〜３％ｖ／ｖ）を添加したＯ２とＮ２Ｏ（１：２ ｖ／ｖ）の混合物によりマウスを人工的に換気する。体温を３７℃に維持するためにマウスを加熱パッド上に置く。第三肋間隙で開胸し、８−０プローレン縫合を使用して左冠状動脈（ＬＣＡ）を３０分間閉塞する。胸部を閉じ、翌日（２４時間後）、梗塞の大きさの分析のために心臓を外植する。
【実施例２９】
【０２９２】
＜機能測定＞
ＥＣＧ、動脈圧および心拍出量を２５０Ｈｚのサンプリング周波数でデジタル化し、オフライン解析のために保存する（Ｌｅｙｃｏｍ  ＣＦＬ−５１２，ＣＤ  Ｌｅｙｃｏｍ）。左心室（ＬＶ）圧および容積を、先に述べられているように４７コンダクタンスカテーテル法を使用して測定する。コンダクタンスカテーテルに由来するＬＶ圧および容積シグナルを、Ｌｅｙｃｏｍ  ＣＦＬ−５１２（ＣＤ  Ｌｅｙｃｏｍ）を用いて２５０Ｈｚのサンプリング周波数で表示し、取得する。
【０２９３】
データは、すべて呼気終末期に人工呼吸器を切って、定常状態の間および側頭大静脈閉塞の間に取得する。圧−容積ループの分析を、先に述べられているように４８カスタムソフトウエアを用いて実施する。加えて、短軸心外膜超音波像（Ｐｒｏｓｏｕｎｄ  ＳＳＤ−５０００、５−ＭＨｚプローブＵＳＴ−５２８０−５、Ａｌｏｋａ  Ｈｏｌｄｉｎｇ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＡＧ，Ｚｕｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を中乳頭筋レベルで得る。梗塞領域、遠隔領域（中隔）およびＬＶ内部領域（ＬＶｉａ）の壁厚（ＷＴ）を拡張終期（ＥＤ）および収縮終期（ＥＳ）に測定する。
【０２９４】
収縮期壁圧（ＳＷＴ）を［（ＷＴ（ＥＳ）−ＷＴ（ＥＤ））／ＷＴ（ＥＤ）］×１００％として、面積縮小率（ＦＡＳ）を［（ＬＶｉａ（ＥＳ）−ＬＶｉａ（ＥＤ））／ＬＶｉａ（ＥＤ）］×１００％として、および左室駆出率（ＬＶＥＦ）を［（ＥＤＶ−ＥＳＶ）／ＥＤＶ］×１００％として計算する。拡張終期心室硬度を、拡張終期圧−容積関係の線形回帰によって定量する。心エコー検査およびＰＶループを、ＭＩの前、虚血の１時間後および再灌流の４時間後に測定する。気絶心筋を誘発するため、静脈内ドブタミン注入（２．５μｇ／ｋｇ／分および５．０μｇ／ｋｇ／分）によって医薬的に誘導したストレスの間に付加的な測定を実施する。
【実施例３０】
【０２９５】
＜梗塞の大きさ＞
心臓の切除の直前に、ＬＣｘＣＡ（ブタ）またはＬＣＡ（マウス）をＭＩの誘導の場合と正確に同じ位置で再結紮する。危険領域（ＡＡＲ）を描出するために冠状動脈系を通してエバンスブルー染料を注入する。次に心臓を切除し、ＬＶを単離して、心尖から心底まで５つの切片に切り分ける。
【０２９６】
生存可能心筋から梗塞組織を区別するために、切片を３７℃のセーレンセン緩衝液（１３．６ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４＋１７．８ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．４）中の１％塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）において１５分間インキュベートする。
【０２９７】
すべての切片を両側から走査し、各々のスライドにおいて、デジタル面積測定ソフトウエア（Ｉｍａｇｅ  Ｊ）を使用して梗塞領域を危険領域および全領域と比較する。切片の重量についての補正後、梗塞の大きさをＡＡＲおよびＬＶのパーセンテージとして計算する。
【実施例３１】
【０２９８】
＜試験材料および方法：馴化培地の調製＞
ＨｕＥＳ９．Ｅ１細胞を先に述べられているように培養する（Ｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｓｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【０２９９】
簡単に述べると、８０％集密なＨｕＥＳ９．Ｅ１細胞をＰＢＳで３回洗浄し、インスリン、トランスフェリンおよびセレノプロテイン（ＩＴＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ（カタログ番号３１０５３，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＡＢ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）、グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン、ならびにβ−メルカプトエタノールから成る化学的組成の明らかな培地中で一晩培養する。次に培養物をＰＢＳで３回洗浄し、その後新鮮な合成培地を添加する。
【０３００】
３日後、培地を収集し、５００×ｇで遠心分離して、濃縮する。＞１００ｋＤａのＣＭ試料を、１００ｋＤａ  ＭＷＣＯのせん断力ろ過（ＴＦＦ）を用いてＣＭを５０倍に濃縮することによって調製する。他のすべての濃縮は限外ろ過膜を使用して実施する。すべてのＣＭおよび他の異なる処理をしたＣＭを、すべての手順後および保存または使用の前に０．２ミクロンでろ過する。
【実施例３２】
【０３０１】
＜試験材料および方法：ＬＣ  ＭＳ／ＭＳ分析＞
透析した馴化培地（ＣＭ）または非馴化培地（ＮＣＭ）２ｍｌ中のタンパク質を、先に述べられているように（Ｓｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）還元し、アルキル化して、トリプシン消化する。次に、消化した混合物を馴化ＳｅｐＰａｋ−Ｃ１８−ＳＰＥカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）に通すことによって試料を脱塩し、３％アセトニトリル（ＡＣＮ）（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）および０．１％ギ酸（ＦＡ）緩衝液で２回洗浄して、７０％ＡＣＮおよび０．１％ＦＡ緩衝液で溶出する。次に、溶出した試料を、真空遠心分離機において有機溶媒を除去することにより、それらの最初の容積の約１０％に乾燥させる。
【０３０２】
試料の複雑さを減じるため、ポリスルホエチルＳＣＸカラム（２００ｍｍ×４．６ｍｍ）  （ＰｏｌｙＬＣ，ＵＳＡ）を通すＨＰＬＣシステム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｊａｐａｎ）でオフラインペプチド分画を実施する。１ｍｌ／分で移動相Ａ（５ｍＭのＫＨ４ＰＯ４＋３０％アセトニトリル）および移動相Ｂ（５ｍＭのＫＨ４ＰＯ４＋３０％アセトニトリル＋３５０ｍＭのＫＣｌ）。８つの画分を収集し、真空遠心分離機で乾燥させる。分画した試料を、ナノスプレー源を取り付けたＬＴＱ−ＦＴウルトラ線形イオントラップ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）にオンラインで連結したＳｈｉｍａｄｚｕ−ＤＧＵ−２０Ａ３−Ｃ１８逆相ＨＰＬＣシステムのオートサンプラーに負荷する。注入したペプチドをＺｏｒｖａｘ３００ＳＢ−Ｃ１８富化カラム（５ｍｍ×０３ｍｍ，Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に捕捉し、ナノボアＣ１８充填カラム（７５μｍ×１００Å、Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）に溶出する。
【０３０３】
２００ｎｌ／分の流速で９０分の勾配を使用してペプチドを質量分析計に溶出する。ＦＴＭＳにおける各々のＭＳスキャンから８つの最も強いピークについてＭＳ／ＭＳスキャンを実施することにより、ＬＴＱをデータ依存モードで操作する。各々の実験について、８つのＳＣＸ画分のＭＳ／ＭＳ（ｄｔａ）スペクトルを、社内で作成した（ｈｏｍｅ−ｗｒｉｔｔｅｎ）プログラムによって単一Ｍａｓｃｏｔジェネリックファイルに組み合わせる。組み合わせたデータを、インハウス版Ｍａｓｃｏｔサーバー（バージョン２．２、Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＫ）を介してＩＰＩヒトタンパク質データベース（バージョン３．３４；６７，７５８配列）に対して検索することによりタンパク質同定を達成する。検索パラメータは、トリプシンを使用して最大で２の開裂ミス；固定修飾はシステインのカルボアミノメチル化であり、可変修飾はメチオニンの酸化である。質量誤差範囲は、ペプチド前駆体およびフラグメントイオンについてそれぞれ２０ｐｐｍおよび０．８Ｄａに設定する。タンパク質同定は、２つの異なるペプチドがホモロジースコアより大きいスコアを有することが認められた場合、正識別として容認される。
【実施例３３】
【０３０４】
＜試験材料および方法：ＨＰＬＣ分画および準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）検出器を使用した動的光散乱＞
装置の組立は、バイナリーポンプつき液体クロマトグラフィーシステム、自動注入器、サーモスタットカラムオーブン、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）からのＣｌａｓｓ  ＶＰソフトウエアによって操作される紫外可視検出器から成る。使用するクロマトグラフィーカラムは、Ｔｏｓｏｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）からのＴＳＫ−ＧｕａｒｄカラムＳＷＸＬ、６×４０ｍｍおよびＴＳＫゲルＧ４０００  ＳＷＸＬ、７．８×３００ｍｍである。以下の検出器、Ｄａｗｎ  ８（光散乱）、Ｏｐｔｉｌａｂ（屈折率）およびＱＥＬＳ（動的光散乱）を紫外可視検出器の後に直列につなぐ。最後の３つの検出器はＷｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）からであり、ＡＳＴＲＡソフトウエアによって操作される。
【０３０５】
試料の成分をサイズ排除によって分離する、すなわちより大きな分子はより小さな分子の前に溶出する。使用する溶出緩衝液は、ｐＨ７．２の１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する２０ｍＭリン酸緩衝液である。この緩衝液を、０．１μｍの細孔径でろ過し、使用前に１５分間脱ガスする。クロマトグラフィー系を、Ｄａｗｎ  ８のシグナルが約０．３の検出器電圧単位で安定化するまで０．５ｍｌ／分の流速で平衡させる。紫外可視検出器は２２０ｎｍに設定し、カラムを２５℃にオーブン平衡させる。溶出モードは無勾配で、実行時間は４０分である。注入する試料の容量は５０〜１００μｌの範囲である。他のすべてのピークに対するエキソソームピークの面積％を紫外可視検出器から積分する。流動力学的半径、ＲｈをＱＥＬＳおよびＤａｗｎ８検出器によってコンピュータ算定する。ピーク頂点の最高計数率（Ｈｚ）をＲｈとして採用する。
【０３０６】
２２０ｎｍで視覚化した分離成分のピークを、さらなる特徴づけ試験のための画分として収集する。
【実施例３４】
【０３０７】
＜試験材料および方法：ショ糖勾配密度平衡遠心分離＞
ショ糖勾配密度平衡遠心分離のために、２２．８〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度の１４のショ糖溶液を調製する。最も濃厚な溶液をＳＷ６０Ｔｉ遠心分離管（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ  ＣＡ，ＵＳＡ）の底部に積層し、続いてその次に高いショ糖濃度を積層する。ＣＭを上部に慎重に負荷した後、ＳＷ６０Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．）において２００，０００×ｇ、４℃で１６時間半にわたって超遠心する。ショ糖勾配の上部から底部までで１６の画分を収集する。微量天秤を使用してすべてのショ糖画分の密度を計算し、１３の画分に集約する。一部のＣＭについては、ＣＭを細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ，Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ，ｗｗｗ．ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ．ｃｏｍ）で前処理した後、ショ糖勾配密度平衡遠心分離機に負荷する。溶解緩衝液は、プロテアーゼ阻害剤のカクテル（Ｈａｌｔ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ，ＥＤＴＡ−Ｆｒｅｅ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ）と共に１：１の容積でＣＭに添加する。混合物を静かに振とうしながら室温で３０分間インキュベートする。
【実施例３５】
【０３０８】
＜試験材料および方法：タンパク質の定量＞
ＣＭのタンパク質濃度を、製造者の指示に従ってＮａｎｏＯｒａｎｇｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して定量する。
【実施例３６】
【０３０９】
＜試験材料および方法：ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析＞
ＣＭの全タンパク質をポリアクリルアミドゲル上で分離した後、ニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に移す。膜をブロックし、ヒトＣＤ９、ＣＤ８１、ＳＯＤ−１、ピルビン酸キナーゼ、Ａｌｉｘ、Ｔｓｐ−１に対するマウス抗体と共にインキュベートして、続いてマウス一次抗体に対するホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体と共にインキュベートする。その後、結合一次抗体を検出する、そしてそれゆえ抗原の存在を検出するための化学発光ＨＲＰ基質と共にブロットをインキュベートする。
【実施例３７】
【０３１０】
＜試験材料および方法：スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリンおよびコレステロールアッセイ＞
ＣＭの２つの独立した製剤および１００，０００×ｇ、４℃で２時間のＣＭの超遠心からのペレット中のコレステロール、スフィンゴミエリンおよびホスファチジルコリン濃度を、市販のアッセイキットを使用して測定する。コレステロールはＡｍｐｌｅｘ（登録商標）  Ｒｅｄ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ＵＳＡ）を使用して測定し、スフィンゴミエリンはＳｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）によって、およびホスファチジルコリンはＰｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）を使用して測定する。
【実施例３８】
【０３１１】
＜試験材料および方法：馴化培地の限定的トリプシン処理＞
ＣＭを、ＴｒｉｔｏｎＸもしくは溶解緩衝液によって、またはＴｒｉｔｏｎＸもしくは溶解緩衝液なしで、静かに振とうしながら４℃で３０分間処理する。処理したＣＭに、静かに振とうしながら室温で３秒から２０分間トリプシンを添加することによってタンパク質分解消化を実施させる。トリプシン阻害剤、ＰＭＳＦを使用して消化を停止させる。
【実施例３９】
【０３１２】
＜試験材料および方法：ｍｉＲＮＡマイクロアレイ分析＞
ＭＳＣからの全細胞ＲＮＡの２つの生物学的複製物およびＣＭからの分泌ＲＮＡの２つの生物学的複製物をｍｉＲＮＡマイクロアレイによって分析する。ハイブリダイゼーションおよびデータ解析はＬＬＣ（ｗｗｗ．ＬＣｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ)に委託する。チップは、Ｓａｎｇｅｒ  ｍｉＲＢａｓｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０．１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｒｆａｍ／ｍｉｒｎａ／）に列挙されているｍｉＲＮＡ転写産物についてのプローブを含んだ。
【実施例４０】
【０３１３】
＜結果：心保護性分泌物は、多タンパク質複合体を形成するエキソソーム関連タンパク質を含有する＞
活性成分を同定するため、本発明者らは先に、異なるＭＷＣＯを有する膜での限外ろ過によってＣＭを分画した。ＣＭを１０００ｋＤａのＭＷＣＯを有する膜でろ過した場合、ろ液は保護性でないことが示されている。しかし、同様の膜で約１２５倍に濃縮したＣＭは、虚血／再灌流障害のマウスモデルにおいて心保護性である。要約すると、１００ｋＤａ、３００ｋＤａ、５００ｋＤａまたは１０００ｋＤａなどの０．２μｍより小さいＭＷＣＯを有するフィルターでのろ過は心保護性ではない（図１４）が、１０００ｋＤａ膜（Ｔｉｍｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）または１００ｋＤａ膜で濃縮したＣＭは心保護性である（図１４）。これらの所見は、活性画分が、＞１０００ｋＤａのまたは５０〜１００ｎｍの直径を有する、大型複合体から成ることを示唆した。粒子のサイズ範囲に基づき、本発明者らはＣＭ中の粒子がエキソソームであると仮定した。エキソソームは、形質膜と同じ配向を有する二重脂質膜と多小胞体から形成される（Ｆｅｖｒｉｅｒ  ａｎｄ  Ｒａｐｏｓｏ，２００４；Ｋｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。それらは多くの細胞型によって産生されることが公知であり、細胞間情報伝達において重要であると考えられる。エキソソームは４０〜１００ｎｍの直径を有する。エキソソームは多くの細胞型によって分泌されることが示されていて、これらのエキソソームのタンパク質組成は細胞特異的であると思われた。しかし、ＣＤ９、ピルビン酸キナーゼおよびＡｌｉｘなどの一部のタンパク質は、エキソソームにおいて一般的に発現されると思われる（Ｓｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。本発明者らは以前に、分泌物中の約２０１個のタンパク質を同定した（Ｓｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【０３１４】
本明細書において本発明者らは、試験材料および方法の中で詳述した本発明者らのプロテオーム解析において以前に述べた方法に修正を加えることにより、リストを７９３個のタンパク質（表Ｅ２）に拡大した。７９３個のタンパク質は、ＣＤ９、ＣＤ８１、Ａｌｉｘ、ＴＳＰ−１、ＳＯＤ−１およびピルビン酸キナーゼなどのエキソソーム関連タンパク質の多くを含んだ（Ｏｌｖｅｒ  ａｎｄ  Ｖｉｄａｌ，２００７）。本発明者らは、ウエスタンブロット分析によって分泌物中のこれらのタンパク質の存在を確認した（レーン１、図１５）。ＣＤ８１、ＣＤ９およびＡｌｉｘの共免疫沈降は、それらのエキソソームとの結び付きおよび分泌物中のエキソソームの存在を裏付けた。ＴＳＰ−１、ＳＯＤ−１およびピルビン酸キナーゼはＣＤ８１と共免疫沈降せず、これらのタンパク質がＣＤ８１＋エキソソーム中に存在しないか、またはエキソソーム中には全く存在しないことを示唆した（図１５）。
【０３１５】
表２（以下）。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよび抗体アレイによって同定された７３９個のユニークな遺伝子産物のアルファベット順のリスト
【０３１６】
【表５Ａ】
0005718648.tif 000024
【表５Ｂ】
0005718648.tif 000025
【０３１７】
表Ｅ２．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよび抗体アレイによって決定したＣＭのプロテオームプロフィール。４つの独立した試料を分析した。表中の各々のタンパク質は、４つの試料のうち少なくとも３つにおいて検出された。
【０３１８】
表Ｅ２の上記タンパク質のうちで、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＬＧＡＬＳ３、ＡＬＣＡＭ、ＤＣＮ、ＳＦＲＰ１、ＧＤＦ１５、ＰＤＧＦＣ、ＰＴＸ３、ＬＴＢＰ１、ＩＧＦＢＰ２、ＧＲＥＭ１、ＩＧＦＢＰ７、ＭＩＦ、ＭＭＰ１、ＰＬＡＵ、ＩＮＨＢＡおよびＴＨＢＳ１は、ＬＣ  ＭＳ／ＭＳおよび抗体アレイによって同定された。ＰＰＩＡ、ＨＩＳＴ１Ｈ４、ＰＰＩＢ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｃ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｄ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｆ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｈ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｉ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｊ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｌ、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＡＡ３、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＡＡ４、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ａ、ＨＩＳＴ２Ｈ４Ｂ、ＨＩＳＴ４Ｈ４、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＳＤＣＢＰ、ＴＵＢＡ１Ａ、ＴＵＢＡ６、ＴＵＢＡ８、ＧＡＰＤＨ、ＴＵＢＢ、ＴＵＢＢ２Ｃ、ＴＵＢＢ３、ＴＵＢＢ４、ＴＵＢＢ６、ＴＵＢＢ８、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＡＮＸＡ１、ＨＳＰ９０Ｂ１、ＡＮＸＡ２、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ６、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＣＤ９、ＣＦＬ１、ＣＬＴＣ、ＥＮＯ１、ＰＫＭ２、ＭＳＮおよびＹＷＨＡＧは、ＬＣ  ＭＳ／ＭＳおよび培養細胞によって分泌されたエキソソームに関する少なくとも４つの試験によって同定される。ＦＧＦ１６、ＦＧＦＲＬ１、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、ＴＮＦＳＦ１２、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ１８、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１６、ＣＣＬ７、ＣＸＣＬ２、ＣＣＮ４、ＣＸＣＬ９、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＡＮＧＰＴ４、ＧＤＦ１、ＧＤＦ１１、ＳＦＲＰ４、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ８、ＤＫＫ１、ＬＴＡ、ＰＤＧＦＡ、ＬＴＢ、ＭＡＤＨ４、ＩＦＮＧ…、ＧＰＣ５、ＩＧＦ２Ｒ、ＣＨＲＤＬ１、ＧＲＮ、ＶＥＧＦＣ、ＩＬ１３、ＩＬ１５、ＥＭＬ２、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１ＲＡＰ、ＭＭＰ１０、ＩＬ２、ＧＺＭＡ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ８、ＨＧＦおよびＴＨＢＳは、抗体アレイによって同定される。残りのタンパク質はＬＣ  ＭＳ／ＭＳによって同定される。
【実施例４１】
【０３１９】
＜結果：エキソソーム関連タンパク質はリン脂質小胞に局在する＞
ＣＭ中のエキソソームの存在を確認するため、ＣＭを２００，０００ｇで２時間超遠心する。ペレット中にはエキソソーム関連タンパク質であるＣＤ９の＞２００倍の富化が存在し、上清中には検出可能なレベルのＣＤ９は存在しない（図１６）。１００，０００ｇで１時間の超遠心は、すべてのＣＤ９を沈降させるのに十分ではない（図１６）。５００ｋＤａのＭＷＣＯを有するフィルターでのＣＭのろ過およびそれに続くろ液または保持液の２００，０００ｇで２時間の遠心分離は、保持液画分中にペレットを生成した（図１６）。このペレット中では、それぞれ１９ｋＤａのＭＷを有するＣＤ９が高度に富化されている。しかし、このペレットは虚血／再灌流障害のマウスモデルにおいて全く心保護作用を付与せず、本発明者らは、これが、強くボルテックス撹拌し、ピペットで分注してペレットを再懸濁する必要があるためであると推測した。本発明者らは、ＣＤ９の画分だけが１００，０００ｇおよび２００，０００ｇで１時間の遠心で沈降し、大部分は２００，０００ｇで２時間によって沈降することを認めた。小さな画分は２００，０００ｇで４時間によって沈降した。合わせて考慮すると、これらの所見は、活性成分が超遠心によって沈降し得る比較的大きな複合体であるという本発明者らの仮説を裏付ける。
【０３２０】
エキソソーム関連タンパク質が実際にエキソソーム中、すなわちリン脂質小胞中に存在することを確認するため、ＣＭを平衡超遠心によるショ糖密度勾配で分画する。脂質小胞と同様に、エキソソームの密度は１．１３ｇ／ｍｌ−１〜１．１９ｇ／ｍｌ−１の範囲にわたり、ショ糖勾配上を浮遊する。ショ糖勾配上での浮遊は、タンパク質凝集体またはヌクレオソームフラグメントなどの汚染物質からエキソソームを容易に分離する（Ｔｈｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。次に、ショ糖勾配からの画分を勾配に沿ってＣＤ９、ＣＤ８１、Ｔｓｐ１、ＳＯＤ−１およびピルビン酸キナーゼの存在に関して分析する（図１７Ａ）。著明な特徴は、タンパク質がそれらの分子量に相関するタンパク質の予想密度に沈降しなかったことである。これらの見かけ密度が脂質小胞に含有されるタンパク質によるものであるかどうかを測定するため、ＣＭを細胞溶解緩衝液で処理した後（図１７Ｂ）、ショ糖密度勾配で分画する。細胞膜可溶化試薬によるこの前処理は、見かけ密度の各々をそれらの分子量に相関するタンパク質の予想密度に回復させた。それゆえ、エキソソーム関連タンパク質は、本発明者らのエキソソーム仮説と一致して、脂質小胞内に局在する。
【０３２１】
ＣＭ中に脂質小胞が存在することを確認するため、細胞膜の主要リン脂質であるスフィンゴミエリンおよびホスファチジルコリン、ならびにコレステロールの濃度を定量する（図１７Ｃ）。予想されるように、タンパク質μｇ当たりのこれらの脂質の相対的濃度は、非馴化培地に比べてＣＭ中でより高い。さらに、２００，０００ｇで２時間のＣＭの超遠心は脂質の濃度を有意に上昇させた（図１７Ｃ）。
【実施例４２】
【０３２２】
＜結果：エキソソームタンパク質は膜に結合しているかまたは封入されている＞
エキソソーム関連タンパク質は、ＣＤ９などの多くの公知の膜タンパク質およびＳＯＤ１などの細胞質タンパク質を含むので、本発明者らはそれゆえ、これらのタンパク質が同様に小胞の脂質膜および内腔に局在するかどうかを測定した。ＣＭを経時的に限定的トリプシン処理に供する（図１８Ａ）。ＳＯＤ１と類似のＭＷを有するＣＤ９は、ＳＯＤ１よりも比較的トリプシン消化を受けやすい。ＳＯＤ１の消化は、ＣＤ９の５０％超が消化された後でのみ認められる（図１８Ａ）。検出可能な中間体を生じなかったＳＯＤ１のトリプシン消化と異なり、ＣＤ９のトリプシン消化は３つのトリプシンペプチド中間体を生成し、ＣＤ９が異なるトリプシン感受性を備えたドメインを有することを示唆した。ＣＤ９のペプチド中間体および公知のトリプシン部位の長さに基づき、３つの感受性トリプシンペプチド中間体は膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインにマッピングされる。これは、細胞ＣＤ９の公知の細胞質外ドメインは分泌されたＣＤ９上でも同様に露出されていて、それゆえトリプシン感受性であるが、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは露出されておらず、それゆえトリプシン消化に対して比較的抵抗性であることを示唆した。合わせて考慮すると、これらの所見は、公知の膜タンパク質であるＣＤ９もエキソソームにおいて膜結合していて、細胞膜中のＣＤ９と同じ方向に配向されているが、細胞質ＳＯＤ−１は内腔に局在し、膜タンパク質の消化によって膜の完全性が損なわれた場合にのみ消化され得ることを示唆した。
【実施例４３】
【０３２３】
＜結果：ＭＳＣの分泌物中の、脂質小胞に封入されたＲＮＡの存在＞
ＲＮＡが細胞によってエキソソーム中に分泌されることは以前に報告されている（Ｓｍａｌｈｅｉｓｅｒ，２００７；Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｇｅｒｃｅｌ−Ｔａｙｌｏｒ，２００８；Ｖａｌａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ＲＮＡが心保護性分泌物中に存在するか否かを測定するため、トリゾールによってＣＭからＲＮＡを抽出し、タンパク質ｍｇ当たり５〜６μｇのＲＮＡを生成する。グリオキサール−アガロースゲル（図１９Ａ）または尿素−ＰＡＧＥ（図１９Ｂ）上で分離した場合、ＲＮＡは検出不能レベルの１８Ｓおよび２８ＳリボソームＲＮＡを含有し、大部分のＲＮＡは＜３００ヌクレオチドであった。分泌物中のＲＮＡの安定性が、タンパク質について認められたようなリン脂質小胞への封入のためであるのかどうかを測定するため、ＣＭをＲＮアーゼで処理した後、ＲＮＡを抽出する。ＲＮＡの収率およびサイズ分布は未処置ＣＭと同様であり（図１９Ｃ）、分泌されたＲＮＡがＲＮアーゼ分解から保護されることを示唆する。本発明者らは次に、ＳＤＳに基づく細胞溶解緩衝液、シクロデキストリンまたはホスホリパーゼＡ２でＣＭを処理することにより、ＲＮＡが、細胞膜に類似する、脂質膜によって保護されている可能性を試験した。４つの試薬の１つによる処理後、ＣＭをＲＮアーゼに暴露し、次にＲＮＡを抽出する。ＳＤＳに基づく細胞溶解緩衝液による前処理はＲＮＡの完全な喪失を生じさせたが、シクロデキストリンまたはホスホリパーゼＡ２による処理はＲＮＡの部分的な分解と喪失を導いた。これらの所見は、ＲＮＡが、コレステロールに富むリン脂質膜によってＲＮアーゼ活性から保護されていて、膜は、ＳＤＳに基づく細胞溶解緩衝液、脂質を溶解するＴｒｉｔｏｎＸ−１００などの界面活性剤、コレステロールをキレート化し、抽出するシクロデキストリンによって、またはホスホリパーゼＤによる分解によって容易に溶解または損傷されることを示唆した。本発明者らはまた、約７０〜１００ヌクレオチドのＲＮＡがより小さいＭＷのＲＮＡよりもＲＮアーゼＩＩＩ活性に対して感受性であることを認め、より大きなＲＮＡが二本鎖であることが示唆された（図１９Ｄ）。
【実施例４４】
【０３２４】
＜分泌ＲＮＡは小胞内に隔離されている＞
ＲＮＡは脂質小胞であることが示されているので、本発明者らは次に、ショ糖勾配平衡超遠心法を使用してこれらの小胞の浮遊密度を測定した。ＣＭ、溶解緩衝液で前処理したＣＭまたはＲＮＡ  ＭＷマーカーのセットをショ糖密度勾配に負荷し、図４ａ、ｂに示されているように超遠心する。次に勾配を１３の画分に取り、各々の画分をＲＮＡについて抽出する。分泌ＲＮＡを１．０７４〜１．１１７０ｇ／ｍｌの密度で平衡させた（図２０）。これに対し、ＲＮＡ  ＭＷマーカーは１．１１５〜１．１１７０ｇ／ｍｌの浮遊密度を示し、溶解緩衝液によるＣＭの前処理とその後の遠心分離は、分泌ＲＮＡの密度をＲＮＡ  ＭＷマーカーの密度、すなわち１．１１５〜１．１１４５ｇ／ｍｌに上昇させた（図２０Ｃ）。これらの所見は、それゆえ、ＲＮＡが脂質小胞に封入されていて、それゆえ可溶性ＲＮＡよりもはるかに低い見かけ密度を有することと一致する。溶解緩衝液によるＣＭの前処理はＲＮＡを放出させ、ＲＮＡマーカーの密度で沈降するＲＮＡを生じさせた。
【実施例４５】
【０３２５】
＜結果：ＲＮＡ含有小胞はＣＤ８１含有エキソソーム内には存在しない＞
上記に示すように、ＣＤ９、ＣＤ８１およびＡｌｉｘは抗ＣＤ８１抗体によって共免疫沈降する。本明細書において本発明者らは、ＲＮＡもＣＤ８１と免疫沈降するか否かを試験した。免疫沈降後、ＲＮＡは沈殿物中には存在せず、上清中に残存した（図２１）。それゆえ、分泌ＲＮＡはＣＤ８１＋、ＣＤ８１＋ＣＤ９＋またはＣＤ８１＋ＣＤ９＋Ａｌｉｘ＋小胞内に隔離されていない。
【実施例４６】
【０３２６】
＜結果：分泌ＲＮＡは、プレｍｉＲＮＡを含むマイクロＲＮＡを含有する＞
エキソソームはマイクロＲＮＡを含有することが報告されていて（Ｓｍａｌｈｅｉｓｅｒ，２００７；Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｇｅｒｃｅｌ−Ｔａｙｌｏｒ，２００８；Ｖａｌａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、ＣＭ中のＲＮＡの大部分は３００ヌクレオチド未満であるので、本発明者らは、マイクロアレイハイブリダイゼーションを実施することによってＭＳＣおよびそれらのＣＭからのＲＮＡをマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の存在に関して試験した。１４９個のｍｉＲＮＡがＭＳＣにおいて検出され、６３個がＣＭにおいて検出される（図２２Ａ、以下の表Ｅ３）。
【０３２７】
【表６】
0005718648.tif 000026
【０３２８】
表Ｅ３．マイクロアレイハイブリダイゼーションによって決定したＭＳＣおよびＣＭ中のｍｉＲＮＡのリスト
【０３２９】
４７個のｍｉＲＮＡはＭＳＣとＣＭの両方に存在する。これらは、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１４、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７４−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６７１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９およびｈｓａ−ｍｉＲ−４８３−５ｐである。
【０３３０】
１６個のｍｉＲＮＡがＣＭにおいて検出可能であるが、ＭＳＣ中では検出レベル以下で存在する。これらは、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３８、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９３＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２４−５ｐおよびｄｈｓａ−ｍｉＲ−１２３７である。
【０３３１】
以下のｍｉＲＮＡｓはＭＳＣ中にのみ存在する：ｈｓａ−ｍｉＲ−２４−２＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−９８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５２、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５３２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ｂ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−２＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７０８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−７４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７６６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−７６８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−７６８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５、ｈｓａ−ｍｉＲ−７６９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７７、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１２。
【０３３２】
マイクロアレイ分析はまた、ＣＭが有意のレベルのアンチガイドｍｉＲＮＡ（星印で示す）を含有することを指示した。たとえば、ＣＭ中のｌｅｔ７ｂ対ｌｅｔ７ｂ＊、ｌｅｔ７ｄ対ｌｅｔ７ｄ＊およびｍｉＲ−１９１対ｍｉＲ−１９１＊の相対的比率は、ＭＳＣ中の比率と比べてはるかに低い（図２２Ｂ）。細胞において、ステムループプレｍｉＲＮＡの切断は成熟ガイドｍｉＲＮＡおよびアンチガイドｍｉＲＮＡ＊を生成する。後者は通常、細胞内で分解される。ガイドｍｉＲＮＡ対アンチガイドｍｉＲＮＡの低い比率についての１つの可能な説明は、分泌物中のマイクロＲＮＡがプレｍｉＲＮＡであり、成熟ＲＮＡではないことである。その可能性は、７０〜１００ヌクレオチドのＲＮＡが二本鎖であるという本発明者らの所見と一致する（図１９Ｄ）。この所見を確認するため、ＲＮアーゼＩＩＩによる事前処理を実施してまたは実施せずに、ガイドｍｉＲＮＡおよびプレｍｉＲＮＡに特異的なプライマーを使用して逆転写したＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析を実施する。ＲＮアーゼＩＩＩ処理は、プレｍｉＲＮＡを分解し、それをＲＴ−ＰＣＲによって検出不能にすることによってプレｍｉＲＮＡの存在を確認する。
【実施例４７】
【０３３３】
＜心保護性分泌物は、１〜１０００ｎｍの検出可能範囲内で４５〜５５ｎｍの流体力学的半径を有する粒子だけを含有する＞
分泌物が大型複合体を含有することを確認するため、ＣＭおよびＮＣＭを最初にＨＰＬＣでのサイズ排除によって分離し（図１３）、次に２２０ｎｍの吸光度によって測定した場合の各々の溶出ピークを、準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）検出器を使用して動的光散乱（ＤＬＳ）に関して検査する。
【０３３４】
１１〜１３分の保持時間を有する１つの溶出ピークだけが動的光散乱を示し、このピークでの粒子のｒｈは約４５〜５５ｎｍである。１３〜１６分および１７〜１９分の保持時間を有するその他の溶出ピークは動的光散乱を示さなかった。ＤＬＳのｒｈ検出範囲は１〜１０００ｎｍであり、ＤＮＡαへリックスの直径は２ｎｍ、球状タンパク質は１〜１０ｎｍ、核細孔（５０ｎｍ）、大型ウイルス（１００ｎｍ）およびミトコンドリアは３μＭであるので、ＤＬＳは、それゆえ、大部分の生物学的粒子を検出することができる。
【０３３５】
心保護作用が＞１０００ｋＤａのＭＷを有する画分に関連するという本発明者らの所見に基づき、本発明者らは、１２分の保持時間の溶出ピークが活性成分であると仮定する。
【０３３６】
これを確認するため、この溶出ピークを採集し、上記および（Ｔｉｍｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）に述べられているように心筋虚血／再灌流障害のマウスモデルにおいて試験する。
【０３３７】
参考文献（実施例１〜１８を含む）
【表７Ａ】
0005718648.tif 000027
【表７Ｂ】
0005718648.tif 000028
【表７Ｃ】
0005718648.tif 000029
【０３３８】
参考文献（実施例１９〜３０を含む）
【表８Ａ】
0005718648.tif 000030
【表８Ｂ】
0005718648.tif 000031
【表８Ｃ】
0005718648.tif 000032
【表８Ｄ】
0005718648.tif 000033
【表８Ｅ】
0005718648.tif 000034
【０３３９】
参考文献（実施例３１〜４７を含む）
【表９Ａ】
0005718648.tif 000035
【表９Ｂ】
0005718648.tif 000036
【０３４０】
特許出願および特許の各々の審査の間を含む、本明細書の中で言及される特許出願および特許の各々、ならびに上記特許出願および特許の各々において引用または参照される各々の文書（「特許出願引用文書」）、ならびに特許出願および特許の各々においておよび特許出願引用文書において引用または言及される何らかの製品についての製造者の指示書またはカタログは、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、本文中で引用されるすべての文書、および本文中で引用される文書において引用または参照されるすべての文書、および本文中で引用または言及される何らかの製品についての製造者の指示書またはカタログは、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３４１】
本明細書で述べる方法および本発明のシステムの様々な修正および変更が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者には明白である。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して説明したが、特許請求される本発明はそのような特定実施形態に不当に限定されるべきではなく、それらの多くの修正および追加が本発明の範囲内で行われ得ることが了解されるべきである。実際に、分子生物学または関連分野の当業者には明白である、本発明を実施するための前述した方法の様々な修正は、特許請求の範囲内であることが意図されている。さらに、以下の従属請求項の特徴と独立請求項の特徴との様々な組み合わせが、本発明の範囲から逸脱することなく行われ得る。
【図１Ｄ】
0005718648.tif 000037
【図１Ｅ】
0005718648.tif 000038
【図２Ａ】
0005718648.tif 000039
【図２Ｂ】
0005718648.tif 000040
【図３Ａ】
0005718648.tif 000041
【図３Ｅ】
0005718648.tif 000042
【図４Ｂ】
0005718648.tif 000043
【図４Ｄ】
0005718648.tif 000044
【図５】
0005718648.tif 000045
【図９】
0005718648.tif 000046
【図１０】
0005718648.tif 000047
【図１３】
0005718648.tif 000048
【図１４】
0005718648.tif 000049
【図１Ａ】
0005718648.tif 000050
【図１Ｂ】
0005718648.tif 000051
【図１Ｃ】
0005718648.tif 000052
【図３Ｂ】
0005718648.tif 000053
【図３Ｃ】
0005718648.tif 000054
【図３Ｄ】
0005718648.tif 000055
【図４Ａ】
0005718648.tif 000056
【図４Ｃ】
0005718648.tif 000057
【図４Ｅ】
0005718648.tif 000058
【図６】
0005718648.tif 000059
【図７Ａ】
0005718648.tif 000060
【図７Ｂ】
0005718648.tif 000061
【図８】
0005718648.tif 000062
【図１１】
0005718648.tif 000063
【図１２】
0005718648.tif 000064
【図１５】
0005718648.tif 000065
【図１６】
0005718648.tif 000066
【図１７】
0005718648.tif 000067
【図１８】
0005718648.tif 000068
【図１９】
0005718648.tif 000069
【図２０】
0005718648.tif 000070
【図２１】
0005718648.tif 000071
【図２２】
0005718648.tif 000072
【図２３】
0005718648.tif 000073