(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
羅漢果（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａｅ  ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉ）植物より抽出することができ、以下の理化学的性質：
（１）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法によるサブユニット分子量が２０，０００〜７０，０００である、
（２）ウサギ及びブタの赤血球に対して強い凝集活性を有する、
（３）シアル酸α２−６糖鎖に対して親和性を有する
を特徴とするラカンカレクチン。
【請求項２】
６’−シアリルラクトース及び６’−シアリルラクトサミンに対して、糖結合特異性を有することを特徴とする、請求項１に記載のラカンカレクチン。
【請求項３】
イムノグロブリンＭ及び前立腺特異抗原に対して糖結合特異性を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載のラカンカレクチン。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のラカンカレクチンの製造方法であって、羅漢果植物の水系媒体抽出物から採取することを特徴とする、ラカンカレクチンの製造方法。
【請求項５】
前記水系媒体抽出物を、硫酸アンモニウム沈殿及びアフィニティークロマトグラフィーにかけることを含む、請求項４に記載のラカンカカレクチンの製造方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のラカンカレクチンに糖鎖を作用させることからなる、シアル酸α２−６糖鎖の検出方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のラカンカレクチンを有効成分とする、シアル酸α２−６糖鎖を検出するための研究用試薬又は研究用判定キット。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のラカンカレクチンを有効成分とする、シアル酸α２−６糖鎖を検出するための診断薬又は診断薬キット。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のラカンカレクチンを有効成分とする、シアル酸α２−６糖鎖に対する特異的結合剤。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のラカンカレクチンを作用させることを特徴とする、シアル酸α２−６糖鎖の分別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、羅漢果植物から得ることのできる新規なレクチン、その製造方法及び用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
シアル酸は、糖鎖の末端につく酸性糖であって、生体内で、単体の他、複合糖質の構成成分として、細胞膜表面のオリゴ糖の末端に存在する。そして、細胞表層において認識、免疫等に関係している。
【０００３】
シアル酸を検出するレクチンとして、従来、日本ニワトコレクチン（ＳＳＡ）、西洋ニワトコレクチン（ＳＮＡ）、イヌエンジュレクチン（ＭＡＭ）、ヤナギマツタケレクチン（ＡＣＧ）、キカラスウリレクチン（ＴＪＡ-Ｉ）等が知られている。シアル酸特異的レクチンの種類は、他の特異性を有するレクチンと比べて非常に少ない。レクチンは糖鎖研究を行う上で非常に良いプローブであるにも関わらず、充分な種類のレクチンが備わっていないのが現状である。
【０００４】
シアル酸特異的レクチンが新規に見つかれば、その特性を利用して、シアル酸関連した疾患の同定等の用途が期待できる。例えば、特開２００５−１４５８３７（アルツハイマー病の診断方法、特許文献１）には、ヒト由来の試料に含まれるβ−セクレターゼにより切断される分泌型シアル酸転移酵素を検出又は測定することを含む、アルツハイマー病の診断方法が記載されている。特開２００６−３１７２１０（血清糖蛋白質をバイオマーカーとするアルツハイマー病の診断方法、特許文献２）には、α２，６シアル酸含有糖蛋白質を検出するためのレクチンを含む、アルツハイマー病の診断薬が記載されている。
【０００５】
様々なウイルスの感染にもシアル酸が関与していることが報告されている。例えば、インフルエンザウイルスの表面に存在するヘマグルチニン（糖タンパク質）は、感染細胞（例えばヒトの気道粘膜の細胞）表面に存在する糖タンパク質のシアル酸α２−６Ｇａｌを認識する性質を持ち、この結合を利用してウイルスが細胞へ感染することが知られている。インフルエンザウイルスが感染細胞から未感染細胞へ移動する際には、シアル酸α２−６結合を切る必要があるため、ウイルスは、酵素ノイラミニダーゼを細胞表面に持っている。
【０００６】
シアル酸の増加されるレベルは、近年、心臓血管疾患、アルコール依存症、および糖尿病等ついて観察されており、従って、シアル酸を、このような致死的な疾患を診断および検出するためのマーカーとしての研究が進みつつある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−１４５８３７
【特許文献２】特開２００６−３１７２１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、新規なシアル酸α２−６特異的レクチンとその用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題の解決に向けて鋭意研究したところ、羅漢果植物の抽出物から、シアル酸α２−６糖鎖との結合活性を有するレクチンを単離することに成功し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、羅漢果（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａｅ  ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉ）植物から抽出することができ、以下の理化学的性質：
（１）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法によるサブユニット分子量が２０,０００〜７０,０００である、
（２）ウサギ及びブタの赤血球に対して強い凝集活性を示す、
（３）シアル酸α２−６糖鎖に対して親和性を有する、
を特徴とするラカンカレクチンを提供する。
【００１０】
上記ラカンカレクチンは、特に、６’−シアリルラクトース又は６’−シアリルラクトサミンへの最小阻害濃度が、５μｇ／ｍｌ以下である。ここで、最小阻害濃度とは、糖が凝集反応を阻止するために要する最小濃度を意味する。すなわち、最小阻害濃度が小さいほど、レクチンに対する親和性が高いことを示している。
【００１１】
上記ラカンカレクチンは、特に、イムノグロブリンＭ及び前立腺特異抗原に対して親和性を有する。
【００１２】
本発明は、また、羅漢果植物の水系媒体抽出物から得ることを特徴とする、上記ラカンカレクチンの製造方法を提供する。
【００１３】
本発明のラカンカレクチンの製造方法は、ラカンカの水系媒体抽出物を、硫酸アンモニウム沈殿法などのタンパク質沈殿法及びアフィニティークロマトグラフィーに供することを含むことが好ましい。
【００１４】
本発明は、また、ラカンカレクチンに糖鎖を作用させることからなる、シアル酸α２−６糖鎖の検出方法を提供する。
【００１５】
本発明は、また、ラカンカレクチンを作用させることを特徴とする、シアル酸α２−６糖鎖の分別方法を提供する。
【００１６】
本発明は、また、ラカンカレクチンを有効成分とする、シアル酸α２−６糖鎖を検出するための研究用試薬又は研究用キットを提供する。
【００１７】
本発明は、また、ラカンカレクチンを有効成分とする、シアル酸α２−６糖鎖を検出するための診断薬又は診断薬キットを提供する。
【００１８】
本発明は、また、ラカンカレクチンを有効成分とする、シアル酸α２−６糖鎖に対する特異的結合剤を提供する。
【００１９】
本発明は、また、ラカンカレクチンを作用させることを特徴とする、シアル酸α２−６糖鎖の分別方法を提供する。
【００２０】
本発明は、また、ラカンカレクチンを含む医薬組成物を提供する。
【００２１】
本発明は、また、ラカンカレクチンを担持させた衛生用品を提供する。
【００２２】
上記衛生用品は、シアル酸α２−６糖鎖に結合性を有する病原体を遮蔽する用途に好適である。
【００２３】
前記衛生用品は、例えばマスク、空気清浄機用フィルターのいずれか一種である。
【００２４】
本発明は、また、精製したラカンカレクチンを添加した食品を提供する。
【００２５】
上記食品は、シアル酸α２−６糖鎖に結合性を有する病原体の拮抗性を有する用途に好適である。上記食品は、例えばトローチ、飴、ドロップ、ガム、茶・コーヒー・ジュース等の飲料のいずれか一種の形態である。
【発明の効果】
【００２６】
本発明のレクチンの原料となる「羅漢果植物」は、食品（飲料や甘味料）等で食経験があり、市場に多く流通している。天然由来の安全かつ入手の容易な原料からシアル酸α２−６糖鎖特異的レクチンを製造できる本発明は、利用価値が高い。新規なシアル酸α２−６糖鎖特異的レクチンの提供は、今後の糖鎖研究にとって非常に有意義である。また、シアル酸の研究は、様々な生体反応に関与していることから、それらの研究は、世界中で進められている。本発明のレクチンは、「シアル酸α２−６糖鎖」構造を特異的に見出すことができるので、多くの研究者の研究に使用されることが期待できる。
【００２７】
また、シアル酸α２−６糖鎖特異的レクチンは、シアル酸α２−６糖鎖の検出や、シアル酸α２−６糖鎖を持つ糖タンパク質の精製に利用できる。また、シアル酸α２−６糖鎖に関与する癌や疾患の診断方法にも利用可能である。また、新規な腫瘍マーカーの探索等に応用し、腫瘍マーカーの発見につなげることができる。
【００２８】
さらに、シアル酸α２−６糖鎖特異的レクチンを、インフルエンザウイルス等の病原体の感染防御方法や衛生用品にも応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】実施例１のラカンカレクチン（ＭＧＬ）の精製工程を示す図である。
【図２】実施例１のＭＧＬのアフィニティークロマトグラフィーの溶出図である。
【図３】実施例１のＭＧＬのドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果（図面代用写真）である。
【図４】実施例１のＭＧＬを用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）による糖タンパク質検出の結果である。
【図５】比較例１のＳＮＡを用いたＥＬＩＳＡによる糖タンパク質検出の結果である。
【図６】比較例２のＳＳＡを用いたＥＬＩＳＡによるタ糖タンパク質検出の結果である。
【図７】比較例３のＭＡＭを用いたＥＬＩＳＡによる糖タンパク質検出の結果である。
【図８】比較例４のＡＣＧを用いたＥＬＩＳＡによる糖タンパク質検出の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
羅漢果（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａｅ  ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉ）は、ウリ科ラカンカ属の多年生つる植物であり、中国の桂林周辺が主な産地である。ラカンカは、甘味成分を含んでおり、食材の甘味料や羅漢果茶として用いられる。日本では、主に、乾燥品が輸入されている。
【００３１】
本発明のラカンカレクチンのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）法によるサブユニット分子量は、分子量が２０，０００〜７０，０００であり、好ましくは２０，０００〜４０，０００である。ラカンカレクチンは、通常、２〜４個のサブユニットが結合した複合体としても存在することが予想される。そのような複合体も本発明の範囲に属する。なお、ＳＤＳ−PAGEによる分子量は、例えばＬａｅｍｍｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７巻，６８０頁，１９７６年）に準じて測定されるものである。
【００３２】
本発明のラカンカレクチンは、ウサギ、ヒト（Ｏ型、Ａ１型、Ａ２型、及びＢ型）、ブタ、ニワトリ、ガチョウ及びモルモットの赤血球に対して凝集活性を示す。特に、ウサギ及びブタの赤血球を強く凝集させる。
【００３３】
本発明のラカンカレクチンは、種々の糖のうち６’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトサミンに親和性を有する。特に６’−シアリルラクトース又は６’−シアリルラクトサミンへの最小阻害濃度が、５μｇ／ｍｌ以下である。
【００３４】
本発明のラカンカレクチンは、種々の糖タンパクのうち、ブタ胃ムチン、ウシ顎下腺ムチン、フェツイン、α１−酸性糖タンパク、チログロブリン、ラクトフェリン、フィブリノーゲン、イムノグロブリンＡ、α２−マクログロブリン、イムノグロブリンＭ、前立腺特異抗原に対して親和性を有する。特に、イムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）及び前立腺特異抗原（ＰＳＡ）に対して、高い親和性を有する。
【００３５】
本発明のラカンカレクチンの製造方法は、羅漢果植物の水系抽出物から公知の分離方法、精製方法等を適宜組み合わせることにより、単離することができる。原料の羅漢果の使用部位は、種子や果実である。これらは、生でも乾燥物でもよい。
【００３６】
羅漢果植物と水系媒体とから水系媒体抽出物を得る方法については、水系媒体と羅漢果の果実とを接触させることができれば特に制限はない。抽出効率の観点から、水系媒体中で羅漢果の乾燥物を粉砕して懸濁液とする方法が好ましい。また、粉砕方法としては、ミキサー、ホモジナイザー、ブレンダー、（超）音波装置、加圧型破壊装置、らい潰器具等の汎用の器具や機器を使用した粉砕方法を挙げることができる。
【００３７】
前記水系媒体としては、水、緩衝液、水と混合し得る有機溶媒と水又は緩衝液との混合物等を挙げることができる。好ましくは、緩衝液又は有機溶媒と緩衝液との混合物を用いる。上記緩衝液としては、特に制限されることなく公知の緩衝液を用いることができる。中でも、ｐＨ３〜１０の範囲に緩衝能を有するものが好ましく、ｐＨ６〜８の範囲に緩衝能を有するものがより好ましい。具体的には、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液等を挙げることができる。中でも、抽出効率の観点から、リン酸緩衝液が好ましい。前記緩衝液の塩濃度は、特に制限はないが、抽出効率と緩衝能の点から、１〜１００ｍＭであることが好ましく、５〜２０ｍＭであることがより好ましい。
【００３８】
前記緩衝液は、さらに塩類を含むことができる。例えば、リン酸緩衝液に食塩を更に加えたリン酸緩衝化生理食塩水等は、本発明における水系媒体として好ましい。
【００３９】
前記有機溶媒としては、水と混合し得る有機溶媒であれば特に制限なく用いることができる。中でも、アセトン、メタノール、エタノール、n-ブタノール、２−プロパノール及びアセトニトリルが好ましい。有機溶媒と水又は緩衝液とを混合する場合の有機溶媒の含有量としては、５〜５０質量％であることが好ましい。
【００４０】
前記抽出工程は、水系媒体と羅漢果植物との混合物から、水系媒体に対する不溶物を除去する工程を更に含むことが好ましい。不溶物の除去方法としては、濾過、遠心分離等の方法を挙げることができるが、除去効率の観点から遠心分離が好ましい。
【００４１】
前記抽出工程は、リン酸緩衝化生理食塩水中（PBS）で、ラカンカを破砕し、遠心分離によって不溶物を除去して水系媒体抽出物を得る工程であることが好ましい。または、作業効率の観点から、ラカンカを粉砕し、リン酸緩衝化生理食塩水を添加し、よく攪拌し、遠心分離によって不溶物を除去して水系媒体抽出物を得る工程であってもよい。
【００４２】
前記ラカンカレクチンの製造方法では、以下の精製手段を採用すると、一層効率的な精製が可能となる。
【００４３】
上記工程によって得られた水系媒体抽出物を、硫酸アンモニウム沈殿法によりレクチン含有画分を得て、得られたレクチン画分を、さらにアフィニティークロマトグラフィーで精製する。
【００４４】
タンパク質の沈殿方法は上記硫酸アンモニウム沈殿法に限らず、硫酸アンモニウム沈殿（塩析）、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿、アセトン沈殿、エタノール沈殿、ＴＣＡ／アセトン沈殿、酢酸アンモニウム含有メタノールによる沈殿（フェノール抽出前処理）、Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｋｉｔによる沈殿等、通常の方法を挙げることができる。
【００４５】
アフィニティークロマトグラフィーでは、シアル酸２−６を有する糖や糖タンパクを固定したカラムを使用する。例えば、シアリルラクトース、フェツイン、チログロブリンをアガロースゲルに固定化したカラムを使用する。溶出液には、ラクトース、シアリルラクトース、アンモニアや酢酸を使用する。溶出された分画のうち、例えばウサギ赤血球凝集活性画分を採取する。
【００４６】
本発明の製造方法は、前記精製工程で得られたレクチンを含む画分を透析する工程、透析処理後のレクチン溶液を限外ろ過等で濃縮する工程、及び濃縮液を凍結乾燥する工程を含んでもよい。これにより、レクチンを容易に単離することができる。透析、濃縮、凍結乾燥は、通常用いられる公知の方法によって行うことができる。上記製造方法により、ＳＤＳ−PAGEによるサブユニット分子量が２０，０００〜７０，０００のレクチンを得る。
【００４７】
本発明は、また、前記ラカンカレクチンを用いたシアル酸α２−６糖鎖の検出方法を提供する。前記ラカンカレクチンは、シアル酸α２−６糖鎖を従来よりも特異的に認識して結合できることから、シアル酸α２−６を含有する多糖類、糖脂質、糖タンパク質等の糖鎖化合物の特異的検出に好適である。
【００４８】
また、本発明のラカンカレクチンは、シアロ体（例えば６’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトサミン）への阻害濃度とアシアロ体（例えばラクトース）の最小阻害濃度の比が、通常１０倍以上、好ましくは５０倍以上、特に好ましくは１００倍以上である。したがって、本発明のラカンカレクチンは、シアロ体の検出のみならず、疾患等によってシアル酸が脱離もまた鋭敏に検出することができる。
【００４９】
また、本発明のラカンカレクチンは、シアル酸α２−６型（例えば６’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトサミン）の阻害濃度とシアル酸α２−３型（例えば３’−シアリルラクトース、３’−シアリルラクトサミン）の最小阻害濃度の比が、通常１０倍以上、好ましくは５０倍以上、特に好ましくは２００倍以上である。したがって、本発明のラカンカレクチンは、シアル酸の結合様式の違いもまた検出することができる。
【００５０】
前記検出方法に用いる前記ラカンカレクチンには、標識手段が組み込まれていてもよい。このようなレクチンを以下、標識レクチンということがある。本発明の標識レクチンは、ラカンカレクチンと標識手段とを少なくとも含み、検出可能に標識化されていることを特徴とする。
【００５１】
前記標識手段としては、特に制限なく公知の標識化方法を適用することができ、例えば、放射性同位元素による標識化、標識化合物の結合等を挙げることができる。
【００５２】
前記標識化合物としては、この用途に通常用いられるものであれば特に制限なく適用することができ、例えば、直接又は間接標識化合物、酵素、蛍光化合物等を挙げることができる。具体的には、ビオチン、ジゴキシゲニン、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ、フルオレセインイソチオシアネート、ＣｙＤｙｅ等を挙げることができる。これらの標識化合物は、常法によりレクチンと結合することができる。特に、アビジン−ビオチン又はストレプトアビジン−ビオチン系は、感度が高い点で好ましい。
【００５３】
シアル酸α２−６糖鎖の検出又は分別は、例えば固定化された前記ラカンカレクチンを用いるレクチンクロマトグラフィーによって行うことができる。レクチンクロマトグラフィーは、レクチンが糖鎖と特異的に結合する性質を利用したアフィニティークロマトグラフィーである。ＨＰＬＣと組み合わせる（ＨＰＬＡＣ）と、ハイスループットを期待することができる。
【００５４】
ラカンカレクチンを固定化する担体としては、アガロース、デキストラン、セルロース、スターチ、ポリアクリルアミド等のゲル材が一般的である。これらには、市販のものを特に制限なく使用でき、例えばセファロース４Ｂやセファロース６Ｂ（共にＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）が挙げられる。
【００５５】
レクチンクロマトグラフィーに用いる材料としては、マイクロプレートやナノウエルにレクチンを固定化したものも含まれる。
【００５６】
固定化するラカンカレクチンの濃度は、通常、０．００１〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１〜２０ｍｇ／ｍｌである。担体がアガロースゲルの場合、それをＣＮＢｒ等で活性化してからレクチンとカップリングさせる。活性化スペーサーを導入したゲルにレクチンを固定化してもよい。さらには、ホルミル基を導入したゲルにレクチンを固定化してからＮａＣＮＢＨ３で還元してもよい。また、ＮＨＳ−セファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）のような市販の活性化ゲルを使用してもよい。
【００５７】
シアル酸α２−６糖鎖の存在が疑われる試料をカラムにかけた後、洗浄と平衡化の目的で緩衝液を流す。緩衝液の一例は、モル濃度が５〜５００ｍＭ、好ましくは１０〜５００ｍＭであり、ｐＨが４．０〜１０．０、好ましくは６．０〜９．０であり、ＮａＣｌ含量が０〜０．５Ｍ、好ましくは０．１〜０．２Ｍであり、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、又は、ＭｎＣｌ２含量が０〜１０ｍＭ、好ましくは０〜５ｍＭの緩衝液である。
【００５８】
アフィニティーカラムの洗浄後、シアル酸α２−６糖鎖の溶出は、該糖鎖を有効に溶出できる中性の非変性緩衝液中で、塩化ナトリウム、ハプテン糖等の脱着剤を用いて行われる。この緩衝液は、上記と同様であってもよい。脱着剤の濃度は、好ましくは、１〜４００ｍＭ、特に好ましくは１０〜２００ｍＭ濃度である。
【００５９】
糖鎖の検出には、上記以外のクロマトグラフィー、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、レクチンチップ、レクチン染色、免疫沈降、凝集法、表面プラズモン共鳴法、電気泳動等も当業者に周知の方法で使用することができる。
【００６０】
前記糖鎖を含む検体は、特に限定されない。例えば、血液、血漿、血清、涙、唾液、体液、乳汁、尿、細胞の培養上清、形質転換動物からの分泌物等が挙げられる。
【００６１】
前記検出方法の対象であるシアル酸α２−６糖鎖を有する物質の具体例は、６’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトサミン、イムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）等が挙げられる。検出方法に作用させる糖鎖は、腫瘍マーカーが好ましい。
【００６２】
本発明の検出方法の対象は、好ましくは、シアル酸α２−６糖鎖の関与が指摘される疾患である。具体例としては、アルツハイマー病、心臓血管疾患、アルコール依存症、ＩｇＡ腎症、肝臓癌、前立腺がん、卵巣がん、心筋梗塞、繊維症、膵炎および糖尿病等が挙げられる。
【００６３】
前記ラカンカレクチンは、物理化学的性質、糖鎖への結合特異性等の生化学的性質が従来公知のレクチンと異なる新規のレクチンである。特にシアル酸α２−６糖鎖を特異的に認識することから、シアル酸α２−６糖鎖に起因する疾患の診断薬や検査試薬、シアル酸α２−６糖鎖の分離分析用特異的結合剤、免疫調節剤等として用いることができる。したがって、本発明は、前記ラカンカレクチンを有効成分とする、シアル酸α２−６糖鎖を検出するための診断薬又は診断薬キット、並びにラカンカレクチンを有効成分とする、シアル酸α２−６糖鎖に対する特異的結合剤を提供する。
【００６４】
前記診断薬又は診断薬キットは、例えばアルツハイマー病、心臓血管疾患、アルコール依存症、ＩｇＡ腎症、肝臓癌、前立腺がん、卵巣がん、心筋梗塞、繊維症、膵炎および糖尿病等を診断するのに有用である。
【００６５】
上記診断薬又は診断薬キットには、適宜、標識体、酵素とその発色基質、放射性同位元素、発光物質、蛍光物質、着色物質、緩衝液、標準タンパク、反応停止液、プレート等の通常診断薬キットに使われるに公知のものを含む。
【００６６】
本発明は、また、前記ラカンカレクチンをシアル酸α２−６糖鎖の結合媒体として用いて、シアル酸α２−６糖鎖と非シアル酸α２−６糖鎖とを分別することからなる、シアル酸α２−６糖鎖の分別方法を提供する。
【００６７】
本発明の分別方法は、例えば固定化された前記ラカンカレクチンを用いるレクチンクロマトグラフィーである。その詳細は、前記検出方法で説明したものと同様である。シアル酸α２−６糖鎖の精製を行なう場合、ラカンカレクチンを、アガロースやセルロースからなるカラム担体に官能基を介して共有結合させて親和性カラムを調製し、糖鎖試料を通す。通塔後、吸着したシアル酸α２−６糖鎖を回収する。非シアル酸α２−６糖鎖の精製を行う場合には、上記カラムに糖鎖試料を通塔する際、吸着しないで通過する糖鎖試料を回収する。
【００６８】
本発明の分別方法により精製される対象は、シアル酸α２−６糖鎖、非シアル酸α２−６糖鎖の二種類があり得る。
【００６９】
本発明は、ラカンカレクチンを含む、シアル酸α２−６糖鎖に起因する疾患を予防・治療するための医薬組成物を提供する。医薬の用途としては、シアル酸α２−６糖鎖に結合性を有する病原体の拮抗薬、感染阻害剤、予防薬、漢方薬、伝承薬が挙げられる。シアル酸α２−６糖鎖に結合性を有する病原体には、ウインフルエンザウィルスやアデノウイルスが挙げられる。例えば、これらのウイルスとラカンカレクチンとが人の喉や鼻の粘膜に拮抗的に働き、ウイルスの進入を防ぐ。
【００７０】
本発明のラカンカレクチンを、経口医薬として使用するために、液剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤などの形態に加工される。
【００７１】
本発明の医薬組成物は、薬理学上使用可能な担体、賦形剤、助剤等を本発明の効果を阻害しない範囲で添加することができる。具体的には、乳糖、ショ糖、果糖、ブドウ糖、ブドウ糖水和物、白糖、精製白糖、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、パラチノース、還元パラチノース、粉末還元麦芽糖、水アメ、カルメロース、デキストリン、トウモロコシデンプン、アルファー化デンプン、部分アルファー化デンプン、バレイショデンプン、コーンスターチ、ヒドロキシプロピルスターチ、アミノ酸、カオリン、無水ケイ酸、ケイ酸、ケイ酸アルミニウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二水素カルシウム、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、脂肪酸又はその塩、脂肪酸モノグリセリド及びジグリセリド、アルコール、植物油、オリーブ油、ダイズ油、トウモロコシ油、脂肪油、油脂、粘性パラフィン、プロピレングリコール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリンなどの担体又は賦形剤；結晶セルロース、結晶セルロース・カルメロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、カルメロースナトリウム、エチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、アルファー化デンプン、部分アルファー化デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、デキストリン、プルラン、ポリビニルピロリドン、アミノアルキルメタクリレートコポリマーＥ、アミノアルキルメタクリレートコポリマーＲＳ、メタクリル酸コポリマーＬ、メタクリル酸コポリマー、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルアルコール、アラビアゴム、アラビアゴム末、寒天、ゼラチン、白色セラック、トラガント、マクロゴールなどの結合剤；コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、合成ケイ酸アルミニウム、乾燥水酸化アルミニウムゲル、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウム、無水リン酸水素カルシウム、ロウ類、水素添加植物油、ポリエチレングリコール、軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、ステアリン酸、マクロゴール、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、含水二酸化ケイ素、ショ糖脂肪酸エステルなどの滑沢剤；潤滑剤；結晶セルロース、メチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロース、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、部分アルファー化デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、トラガントなどの崩壊剤；大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸ポリオキシル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、セスキオレイン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、ポリソルベート、モノステアリン酸グリセリン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウロマクロゴールなどの界面活性剤；乳化剤；リン酸ナトリウムなどの溶解補助剤；吸収促進剤；塩酸、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、酒石酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、乳酸などのｐＨ調整剤；天然樹脂などの光沢剤；安定化剤；酸化防止剤；保存剤；湿潤剤；着色剤；芳香剤；無痛化剤などが挙げられる。
【００７２】
本発明にラカンカレクチンを点鼻用薬剤として使用する場合、液剤、ゲル状剤、エアゾール剤等の形態をとる。その担体として、オクチルドデカノール等の高級アルコール、ミリスチン酸イソプロピル等の脂肪酸エステル、懸濁化剤等を使用することができる。
【００７３】
本発明にラカンカレクチンを軟膏剤やクリーム剤として使用する場合、担体として、ワセリン、流動パラフィン、スクワラン、セタノール、ステアリルアルコール等を使用することができる。
【００７４】
本発明のラカンカレクチンの投与量は、シアル酸α２−６糖鎖に結合性を有する病原体の拮抗薬等の用途、投与される患者の状態、投与方法等に依存し、当業者であれば適宜最適化することができる。
【００７５】
本発明は、また、ラカンカレクチンを担持させた衛生用品を提供する。空気清浄機のフィルター、マスクのカーゼ等に、活性を保持するような形態で担持することで、空気中のウイルスと拮抗し、人体等への感染を予防する。本発明のラカンカレクチンを、衛生用品としてのスプレー剤としてもよい。
【００７６】
本発明のラカンカレクチンを機能性食品として使用するために、液剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤などの形態に加工される。
【００７７】
本発明のラカンカレクチンは、トローチ、飴、ドロップ、ガム、茶、パン、米飯、スープ、惣菜、菓子、などの一般加工食品の製造時に原料に直接添加されてもよい。
【実施例】
【００７８】
以下に、実施例及び比較例を用いて本発明をより詳細に説明する。しかし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕ラカンカレクチンの製造
（１）ラカンカレクチンの製造
図１に示す精製工程に従って、ラカンカからラカンカレクチン（ＭＧＬ）を単離精製した。
【００７９】
（脱脂と抽出）
乾燥したラカンカの果実約３４ｇを粉砕機で破砕し、その粉砕物をビーカーに移し、アセトン１Ｌを加えて攪拌した。次いで、粉砕物の混合液をろ紙でろ過して、アセトン脱脂をおこなった。ろ紙上に残った粉砕物をバットに広げ、ドラフトで一晩乾燥させた。アセトン脱脂後の乾燥させた粉砕物をビーカーに移し、１０ｍＭ  リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）（以後ＰＢＳと略す）１６０ｍｌを添加した後、スターラーで一晩攪拌（７℃）することにより、抽出をおこなった。この液を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）後、上清をろ過して、ラカンカ抽出液とした。
【００８０】
（硫酸アンモニウムによる沈殿）
上記抽出液２９０ｍｌに、５１．０４ｇの硫酸アンモニウム（溶液１Ｌに対し硫酸アンモニウム１７６ｇの割合）を加えた。よく攪拌し、溶解した後、４℃  ３ｈ静置した。混合液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）後、沈殿物に純水を加えて回収し、３０％飽和硫酸アンモニウム沈殿画分とした。遠心分離後の３０％飽和硫酸アンモニウム上清画分は次の工程で使用した。
【００８１】
上記３０％飽和硫酸アンモニウム上清画分に硫酸アンモニウム１１３．９２ｇ（溶液１Ｌに対し硫酸アンモニウム３５６ｇの割合）を加えた。よく攪拌し、溶解した後、４℃  一晩静置した。混合液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）後、沈殿物に純水を加えて回収し、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｏｒｅ  １３２  ６５０  ＭＷＣＯ：６−８，０００）に入れて純水に対して透析した。透析膜から回収し、３０-80％飽和硫酸アンモニウム沈殿画分とした。
【００８２】
（アフィニティークロマトグラフィー）
上記３０-80％飽和硫酸アンモニウム沈殿画分を、ＰＢＳで平衡化したフェツイン固定化アガロースに供した。カラムをＰＢＳで洗浄後、０．２Ｍ  ラクトース／ＰＢＳと０．２Ｍアンモニアで溶出した。赤血球凝集活性（Ｈ．Ａ．）を示す画分（図２の←→部）を合一し、限外ろ過で純水に置換後、凍結乾燥した。ＭＧＬのラクトース溶出画分及びアンモニア画分を、それぞれ、０．０３ｍｇ及び０．３ｍｇ得た。
【００８３】
（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動）
ＭＧＬのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を、電気泳動装置（製品名：Ｐｈａｓｔｓｙｓｔｅｍ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて行った。以下に示すＭＧＬ及び分子量マーカーを準備し、製品プロトコール及び常法に従って電気泳動を行なった。
レーン１：  分子量マーカー（ＡＰＲＯ社）
レーン２：  ＭＧＬ（ラクトース溶出画分）  還元剤（＋）
レーン３：  ＭＧＬ（ラクトース溶出画分）  還元剤（−）
レーン４：  ＭＧＬ（アンモニア溶出画分）  還元剤（＋）
レーン５：  ＭＧＬ（アンモニア溶出画分）  還元剤（−）
レーン６：  分子量マーカー（ＡＰＲＯ社）
Ｇｅｌ：  Ｇｒａｄｉｅｎｔ１０−１５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）
Ｓａｍｐｌｅ：  １μＬ／Ｌａｎｅ
Ｓｔａｉｎ：  銀染色
【００８４】
図３に、ＭＧＬのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示す。上記の１０−１５％ゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、還元剤（＋）ではサブユニット分子量が約６０，０００、還元剤（−）ではサブユニット分子量が約３０，０００であることを確認した。
【００８５】
（赤血球凝集活性試験）
ＭＧＬに対して、表１に示す動物の赤血球を用いて、赤血球凝集活性試験を行った。結果を表１に示す。
【００８６】
【表１】
0005698588.tif 000002
【００８７】
表１に示すとおり、MGLは、ウサギ及びブタの赤血球に対して凝集活性が高いが、ウシ、ウマ及びヒツジの赤血球に対して凝集活性が低いことが判明した。
【００８８】
（糖結合特異性）
表２に示す種々の単糖、オリゴ糖及び多糖、並びに表３に示す糖タンパク質を用いた赤血球凝集反応阻害試験により、ＭＧＬの糖結合特異性を評価した。
【００８９】
９６穴Ｕ底マイクロタイタープレートに１０μＬの単糖、オリゴ糖、多糖及び糖タンパク質溶液の２倍希釈系列を作製した。あらかじめ力価４に調製しておいたレクチン溶液をそれぞれの穴に１０μＬずつ加えた。室温にて１時間静置して感作させた後、１０μＬの４％ウサギ赤血球懸濁液をそれぞれの穴に加え、さらに室温にて１時間静置した。その後、赤血球の凝集を完全に阻害する糖及び糖タンパク溶液の希釈倍率を肉眼にて判定した。阻害を示す最低濃度を最小阻害濃度とした。この最小阻害濃度が小さいほど、レクチンに対する親和性が高いことを示している。結果を表２及び３に示す。
【００９０】
比較のために、シアル酸特異的レクチンといわれている以下の市販のレクチン：
比較例１：ＳＮＡ（（株）Ｊ−オイルミルズ社内調製）、
比較例２：ＳＳＡ（生化学バイオビジネス（株）−（株）Ｊ−オイルミルズ製）、
比較例３：ＭＡＭ（生化学バイオビジネス（株）−（株）Ｊ−オイルミルズ製）、及び
比較例４：ＡＣＧ（（株）Ｊ−オイルミルズ社内調製）
を用いて、上記糖結合特異性を評価した。結果を表２及び３に示す。
【００９１】
【表２】
0005698588.tif 000003
【００９２】
【表３】
0005698588.tif 000004
【００９３】
表２及び３から、MGLは、６’−シアリルラクトース及び６’−シアリルラクトサミンのようなシアル酸α２−６糖鎖には結合するが、３’−シアリルラクトース及び３’−シアリルラクトサミンのようなシアル酸α２−３糖鎖には結合しなかった。また、糖タンパクでは、シアル酸が脱離したアシアロ体には結合しなかった。
【００９４】
（３）ＥＬＩＳＡ法による糖タンパク質の検出
ビオチン標識化した実施例１のＭＧＬ、比較例１のＳNＡ、比較例２のＳＳＡ、比較例３のＭＡＭ及び比較例４のＡＣＧを用いて、酵素免疫測定法による糖タンパク質の検出評価をおこなった。
【００９５】
表４に示す糖タンパク質と、コントロールとして糖鎖のないタンパク質であるアルブミンを０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で１ｍｇ／ｍｌ溶解して、マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ４３９４５４）に添加した後、４℃で一晩静置した。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ（以下ＰＢＳ−Ｔと略す）で３回洗浄後、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳをウェルに添加して、３７℃で１時間培養した。ＰＢＳで３回洗浄後、１％  ＢＳＡ含有ＰＢＳ−Ｔで適宜希釈したビオチン標識化レクチン溶液を、ウェルに添加して、３７℃で１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ−Ｔで希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン溶液を、ウェルに添加して３７℃で３０分間培養した。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ  （ＫＰＬ社製）を添加し、遮光して室温で１０分間反応させた。１Ｍリン酸で反応を停止し、マイクロプレートリーダー（ＭＰＲ−Ａ４ｉ  東ソー社製）で４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００９６】
測定した値から反応値（［４５０ｎｍにおける吸光度］−［プレートに固相化せず反応させたウェル（ブランク）の値］）を算出した。相対値を以下の基準で分類することにより、親和性のランク付けを行った。算出結果を表４及び図５〜８に示す。
◎：０．４以上
○：０．２以上〜０．４未満
△：０．１以上〜０．２未満
×：０〜０．１未満
【００９７】
【表４】
0005698588.tif 000005
【００９８】
表４から、MGLは、イムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）と前立腺抗原（ＰＳＡ）に強く結合した。
【図１】
0005698588.tif 000006
【図２】
0005698588.tif 000007
【図３】
0005698588.tif 000008
【図４】
0005698588.tif 000009
【図５】
0005698588.tif 000010
【図６】
0005698588.tif 000011
【図７】
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【図８】
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