(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質に結合するヒト化抗体又はその抗原結合断片であって、配列番号：１０、配列番号：１３、及び配列番号：１８からなる群から選択される可変重鎖ドメインと、配列番号：１９の可変軽鎖ドメインとを含むヒト化抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
可変重鎖ドメインが配列番号：１３の配列を含む、請求項１に記載のヒト化抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
その抗原結合断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、及びダイアボディからなる群から選択される請求項１のヒト化抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
請求項１のヒト化抗体又はその抗原結合断片の可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインをコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸。
【請求項５】
請求項４のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでなる核酸。
【請求項６】
請求項４の核酸を含むベクター。
【請求項７】
ベクターが可変重鎖ドメイン及び／又は可変軽鎖ドメインをコードする核酸に作用可能に結合した発現コントロール配列を更に含む請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
請求項６のベクターを含む組換え細胞。
【請求項９】
細胞が真核生物細胞である請求項８に記載の組換え細胞。
【請求項１０】
真核生物細胞がＣＨＯ細胞である請求項９に記載の組換え細胞。
【請求項１１】
ヒト化抗体又はその抗原結合断片を製造する方法であって、請求項４の核酸を含む組換え細胞を、コードされる可変重鎖ドメイン及び／又は可変軽鎖ドメインが細胞によって発現されるように増殖させ；発現されたヒト化抗体又はその抗原結合断片を回収することを含んでなる方法。
【請求項１２】
回収したヒト化抗体又はその抗原結合断片を単離し、及び／又は精製することを更に含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１のヒト化抗体又はその抗原結合断片と薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含有する薬学的組成物。
【請求項１４】
請求項１のヒト化抗体又はその抗原結合断片と、該ヒト化抗体又はその抗原結合断片を投与するための指示書を含んでなるキット。
【請求項１５】
ヒトにおけるＣ型肝炎ウイルス感染を治療又は予防するための医薬であって、請求項１のヒト化抗体又はその抗原結合断片の有効量を含む医薬。
【請求項１６】
その抗原結合断片が、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、及びダイアボディからなる群から選択される請求項１５に記載の医薬。
【請求項１７】
Ｃ型肝炎ウイルス感染が急性Ｃ型肝炎ウイルス感染である請求項１５に記載の医薬。
【請求項１８】
Ｃ型肝炎ウイルス感染が慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染である請求項１５に記載の医薬。
【請求項１９】
Ｃ型肝炎ウイルス感染の治療がウイルス負荷を低減させることを含む請求項１５に記載の医薬。
【請求項２０】
第二治療剤を投与することを更に含む請求項１５に記載の医薬。
【請求項２１】
Ｃ型肝炎ウイルスに対して請求項１のヒト化抗体又はその抗原結合断片の中和活性の効能を改善又は亢進させる薬剤を同定するためのアッセイ方法であって、
（ａ）試験される薬剤に上記ヒト化抗体又はその抗原結合断片を接触させ；
（ｂ）該薬剤がＣ型肝炎の感染力を中和するヒト化抗体又はその抗原結合断片の効能を改善又は亢進させるかどうかを決定する
工程を含むアッセイ方法。
【請求項２２】
試料中のＣ型肝炎ウイルスの存在又は不在を決定する方法であって、請求項１のヒト化抗体又はその抗原結合断片の使用を含む方法。
【請求項２３】
請求項１のヒト化抗体又はその抗原結合断片に患者の試料を接触させる工程を含む請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ヒトにおけるＣ型肝炎ウイルス感染を治療又は予防するための薬学的組成物の製造における、請求項１のヒト化抗体又はその抗原結合断片の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願とのクロスリファレンス
この出願は、出典明示によりその全体がここに援用される２００７年１２月１７日出願の米国仮出願第６１／００６０６６号の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
この発明は、親マウスモノクローナル抗体のＨＣＶ感染に対する広い範囲の阻害効果を保持する治療用ヒト化抗体及びその断片とその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＨＣＶは、フラビウイルス科に属する陽性一本鎖ＲＮＡウイルスである。それは非Ａ型非Ｂ型ウイルス肝炎の主要な原因である。ＨＣＶはおよそ２億人の人々が感染しており、現在の推定によれば、３百万もの人々が毎年新たに感染していることが示唆されている。感染者のおよそ８０％がウイルスの除去に失敗し；慢性の感染により、重篤の慢性肝疾患、肝硬変及び肝細胞癌になる場合がしばしばある。慢性感染に対する現在の治療法は効果的ではなく、予防及び治療ワクチンを開発するという急を要する必要性が存在している。
ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのエラープローン性とインビボでの高い複製率のために、ＨＣＶは高度の遺伝的変動を示す。ＨＣＶは６種の遺伝学的に区別される遺伝子型に分類でき、ヌクレオチドレベルでそれぞれおよそ３０％及び１５％異なる少なくとも７０のサブタイプに更に細分類される。ワクチン開発のための重要な挑戦は、ウイルス遺伝子型及びサブタイプに保存されている保護エピトープを同定することである。この問題は中和反応の自然の標的であるエンベロープタンパク質が最も可変性のタンパク質の二つであるという事実によって複雑化されている。
【０００４】
エンベロープタンパク質Ｅｌ及びＥ２は、細胞結合及び移入の原因である。それらは、Ｎ末端外部ドメインとＣ末端疎水性膜アンカーを有するＮ結合グリコシル化膜貫通タンパク質である。インビトロの発現実験では、Ｅ１及びＥ２タンパク質が非共有結合ヘテロ二量体を形成することは示され、これがウイルス表面上の機能的複合体であることが提案されている。効率的な培養系がないため、ウイルス移入の正確な機構は知られていない。とは言うものの、単離された一次肝細胞及び細胞株への移入には細胞表面レセプターＣＤ８１及びスカベンジャーレセプタークラスＢ１型（ＳＲ−Ｂ１）との相互作用を必要とするが、これらのレセプターだけではウイルス移入を可能にするには十分ではないとの多くの証拠がある。
現在の証拠から、細胞媒介性免疫が急性感染におけるウイルス複製のクリアランス及び制御において中心をなすことが示唆される。しかしながら、動物感染のような感染の代替モデル及び細胞及びレセプター結合アッセイは急性及び慢性双方の感染における抗体の潜在的な役割にハイライトを当てた。驚くことではないが、中和抗体はリニアエピトープと立体構造的エピトープの双方を認識する。広い中和能力を示す抗体の大部分はＥ２内の立体構造的エピトープに対するものである。保存された立体構造的エピトープを認識する抗体の誘導はワクチン設計に極めて関連しているが、可変領域は免疫優性であると思われるので、これは困難である可能性が高い。一つの免疫優性リニアエピトープはＥ２の第一の高頻度可変領域内に存在する（ＨＶＲ１）。保存されたＨＶＲ１ミモトープの使用が制限された特異性の問題を解消するために提案されているが、このアプローチが成功するかどうかはまだ分からない。
【０００５】
ＨＶＲ１の直ぐ下流の領域は多くのエピトープを含んでいる。残基４１２−４２３を包含し、モノクローナル抗体ＡＰ３３によって定まる一つのエピトープは、ＣＤ８１と、可溶型Ｅ２、Ｅ１Ｅ２及びウイルス様粒子を含むＥ２のある範囲の提示の間の相互作用を阻害する。Owsianka A.等 J Gen Virol 82:1877-83 (2001)。
国際公開第２００６／１００４４９号は、ＡＰ３３と命名されたモノクローナル抗体がＨＣＶの６つの既知の遺伝子型１−６の各々に結合しそれを中和することができることを教示している。従って、ＡＰ３３が標的とするエピトープはＨＣＶの遺伝子型１−６の全てと交差反応性であることが推定され、それが抗ＨＣＶリガンドの標的で、また抗ＨＣＶ抗体を生産するための免疫原であることを示している。
ＡＰ３３はマウス抗体であり、よって複数投与に対して治療的に使用される場合、ヒト患者においてヒト抗マウス抗原反応（ＨＡＭＡ）を生じせしめる可能性がある。従って、ＡＰ３３の交差反応性を共有するがヒト患者において減少した抗原性を有する抗体に対する必要性が存在している。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ＨＣＶ感染に対して広範囲の阻害効果を保持する改善された治療的ヒト化抗体に関する。ＡＰ３３のヒト化は技術的に問題があることが示され、ヒト化ＡＰ３３の生産が次の開発に至った。
ＡＰ３３モノクローナル抗体のヒト化中に、本発明者等は、ヒト化可変軽鎖ドメインの乏しい発現レベルに関する問題に遭遇した。マウス軽鎖にはヒトオルソログが存在しない。Ｌ１ループはヒトカッパ鎖に一致させることができず、これは通常はヒト化過程の重要な成分である。潜在的なスプライシング部位変異の除去及びリーダー配列の交換のような可変軽鎖ドメインに対する幾つかの修飾にも拘わらず、これらの修飾の何れも、たとえかかる修飾が過去では発現レベルの改善に効果的であると報告されていてもバックグラウンドを越える発現レベルの回復には効果的ではなかった。驚いたことに、発明者等は、ここでＲＫ２ｂと命名された可変軽鎖ドメインを最終的に同定したが、これはよく発現するだけでなく、良好な軽鎖結合活性も有している。
【０００７】
本発明者等はまた４７位におけるＷの保持がヒト化可変重鎖ドメインの最適な活性のために必要であることを発見した。これは、マウス（キメラ）抗体において４７位のアミノ酸がＷ（ヒト残基）かＹ（マウス残基）かどうかは重要であるとは思われないので、驚くべきことである。ヒト化可変重鎖ドメインでは、４７位のアミノ酸は最適な活性のためにはＷでなければならない。直接比較すると、他の重要なフレームワーク残基の全て、つまり、副尺及び正準残基は、最適な活性のためにはマウスドナー残基に変異される必要がある。
本発明者等は、ここに記載のヒト化抗体はＨＣＶ感染の阻害についてＡＰ３３と少なくとも同じほど効果的であることを驚いたことに更に発見した。通常は、抗体がヒト化されると、ＣＤＲを囲む環境を形成するマウスフレームワークのヒトフレームワークとの置換のために活性の低下が予想される。しかしながら、本発明では、マウスフレームワークの置換は活性の増加を生じた。有利には、本発明の抗体はヒト化に伴う利点（例えばヒト患者において免疫原性を低減させる）を有しているばかりでなく、ＨＣＶ種に対する交差反応性を中和させるという広域特性を保持している。
【０００８】
従って、第一の態様では、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：１９、又は配列番号：２０の何れかに記載のアミノ酸配列を含む又はそれからなるヒト化ＡＰ３３抗体の可変軽鎖ドメインが提供される。ある実施態様では、ヒト化ＡＰ３３抗体の可変軽鎖ドメインはＣ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質に結合する。
第二の態様では、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む又はそれからなるヒト化ＡＰ３３抗体の可変重鎖ドメインが提供される。配列番号３は、ヒトフレームワークに移植されたマウスＣＤＲを表す。有利には、ヒトフレームワークは、マウスゲノム中の等価な位置に一致させるために、その位置３０、４８、６７、７１、７８及び９４の一又は複数での逆突然変異によって修飾される。
適切には、アミノ酸変異は置換、例えばＳ３０Ｔ、Ｉ４８Ｍ、Ｖ６７Ｉ、Ｖ７１Ｒ、Ｆ７８Ｙ及びＲ９４Ｌである。上記において、マウス残基は二番目に、ヒト残基は最初に表される；よって、ヒト化手順において、残基３０は元のＡＰ３３フレームワークではＴであり、用いられるヒトフレームワークではＳであり、逆突然変異されたヒト化抗体フレームワークではＴである。
【０００９】
ある実施態様では、可変重鎖ドメイン配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、又は配列番号：１８の何れかに記載のアミノ酸配列を含む又はそれからなる。ある実施態様では、ヒト化ＡＰ３３抗体の可変重鎖ドメインはＣ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質に結合する。
第三の態様では、発明の第一の態様に記載された可変軽鎖ドメインを含むヒト化抗体又はヒト化抗体断片が提供される。
ある実施態様では、可変軽鎖ドメインを含むヒト化抗体又はヒト化抗体断片はＣ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質に結合する。ある実施態様では、ヒト化抗体断片は抗原結合断片である。
第四の態様では、本発明の第二の態様の可変重鎖ドメインを含むヒト化抗体又はヒト化抗体断片が提供される。ある実施態様では、可変重鎖ドメインを含むヒト化抗体又はヒト化抗体断片はＣ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質に結合する。ある実施態様では、ヒト化抗体断片は抗原結合断片である。
【００１０】
第五の態様では、軽鎖と重鎖を含むヒト化抗体又はヒト化抗体断片が提供され、ここで軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域は上の第一及び第二の態様に定義された通りである。ある実施態様では、軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域を含むヒト化抗体又はヒト化抗体断片はＣ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質に結合する。ある実施態様では、そのヒト化抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、及びダイアボディからなる群から選択される。ある実施態様では、ヒト化抗体断片は抗原結合断片である。
第六の態様では、可変軽鎖ドメインをコードする核酸配列が提供される。
適切には、可変軽鎖ドメインをコードする核酸配列は、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：３９、又は配列番号：４０の何れかに記載の配列を含む又はそれからなる。
第七の態様では、可変重鎖ドメインをコードする核酸配列が提供される。
適切には、可変重鎖ドメインは、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、又は配列番号：３８の何れかに記載の配列を含む又はそれからなる。
【００１１】
第八の態様では、ここに記載のヒト化抗体又はヒト化抗体断片をコードする核酸又はアミノ酸配列が提供される。
第九の態様では、ここに記載の核酸配列に相補的な核酸配列が提供される。
第十の態様では、ここに記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能な核酸配列が提供される。
第十一の態様では、ここに記載の核酸配列を含むコンストラクト又はベクターが提供される。ある実施態様では、ベクターは、可変重鎖領域及び／又は可変軽鎖領域をコードする核酸に作用可能に連結された発現コントロール配列を更に含む。適切には、上記ベクターは発現ベクターである。ある実施態様では、第十一の態様のコンストラクト又はベクターを含む組換え細胞が提供される。ある実施態様では、細胞は真核生物細胞である。ある実施態様では、真核生物細胞はＣＨＯ細胞である。
【００１２】
第十二の態様では、ここに記載の可変重鎖をコードするアミノ酸配列が提供される。
第十三の態様では、ここに記載のヒト化抗体又はヒト化抗体断片をコードするアミノ酸配列が提供される。
第十四の態様では、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９，又は配列番号：２０の何れかに記載の配列を含むアミノ酸配列が提供される。
【００１３】
第十五の態様では、（ａ）（ｉ）先の態様に記載の可変軽鎖ドメインをコードする第一発現ベクターと可変重鎖ドメインをコードする第二発現ベクターか；（ｉｉ）先の態様に記載の可変軽鎖ドメインと可変重鎖ドメインの双方をコードする単一の発現ベクターの何れかで形質転換された宿主細胞を提供し；（ｂ）各鎖が発現される条件下で上記宿主細胞を培養し；（ｃ）場合によっては発現された鎖を組み立てて形成されるヒト化抗体を単離する工程を含む、ヒト化抗体の調製方法が提供される。
ある実施態様では、第八の態様の核酸を含む組換え細胞を、コードされた可変重鎖領域及び／又は可変軽鎖領域が細胞によって発現されるように増殖させ；発現されたヒト化抗体又はその抗原結合断片を回収することを含む、ヒト化抗体又はその抗原結合断片を製造する方法が提供される。ある実施態様では、該方法は、回収されたヒト化抗体又はその抗原結合断片を単離し、及び／又は精製することを更に含む。
【００１４】
第十六の態様では、この方法によって得られた又は得ることができるヒト化抗体が提供される。
第十七の態様では、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤と、活性成分として、ここに記載されたヒト化抗体又はヒト化抗体断片を含有する薬学的組成物が提供される。
第十八の態様では、ここに記載のヒト化抗体又はヒト化抗体断片又は薬学的組成物の使用を含むＣ型肝炎ウイルス感染の治療及び／又は予防のための方法が提供される。ある実施態様では、Ｃ型肝炎ウイルス感染は急性Ｃ型肝炎ウイルス感染である。ある実施態様では、Ｃ型肝炎ウイルス感染は慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染である。ある実施態様では、Ｃ型肝炎ウイルス感染の治療は、ウイルス負荷及び／又はウイルス力価を低減させることを含む。ある実施態様では、該方法は第二の治療剤を投与することを更に含む。
適切には、Ｃ型肝炎ウイルス感染の治療及び／又は予防のための方法は、有効量のヒト化抗体又はそのヒト化抗体又は薬学的組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む。
【００１５】
第十九の態様では、患者におけるＣ型肝炎ウイルス感染の治療及び／又は予防に使用されるヒト化抗体又はその断片又は薬学的組成物が提供される。ある実施態様では、Ｃ型肝炎ウイルス感染は急性Ｃ型肝炎ウイルス感染である。ある実施態様では、Ｃ型肝炎ウイルス感染は慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染である。ある実施態様では、Ｃ型肝炎ウイルス感染の治療における使用は、ウイルス負荷及び／又はウイルス力価の低減を含む。
第二十の態様では、患者におけるＣ型肝炎ウイルス感染の治療及び／又は予防のための組成物の製造におけるヒト化抗体又はその断片又は薬学的組成物の使用が提供される。ある実施態様では、Ｃ型肝炎ウイルス感染は急性Ｃ型肝炎ウイルス感染である。ある実施態様では、Ｃ型肝炎ウイルス感染は慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染である。ある実施態様では、Ｃ型肝炎ウイルス感染の治療は、ウイルス負荷及び／又はウイルス力価の低減を含む。ある実施態様では、使用は、第二の治療剤を投与することを更に含む。
【００１６】
第二十一の態様では、（ａ）ヒト化抗体又はその断片を提供し；（ｂ）上記ヒト化抗体又はその断片を試験される薬剤に接触させ；（ｃ）Ｃ型肝炎ウイルスの感染力の中和におけるヒト化抗体又はその断片の効果を改善又は亢進するかどうかを決定する工程を含む、Ｃ型肝炎ウイルスに対するヒト化抗体又はその断片の中和活性の効果を改善又は亢進する薬剤を同定するためのアッセイ方法が提供される。
ある実施態様では、Ｃ型肝炎ウイルスに対してヒト化抗体又はその抗原結合断片の中和活性の効果を改善又は亢進する薬剤を同定するためのアッセイ方法であって、（ａ）上記ヒト化抗体又はその抗原結合断片を試験される薬剤と接触させ、（ｂ）該薬剤がＣ型肝炎の感染性を中和するヒト化抗体又はその抗原結合断片の効果を改善又は亢進するかどうかを決定する工程を含む方法がここに提供される。ある実施態様では、該薬剤は適切なコントロールと比較してＣ型肝炎ウイルスの感染力を中和するヒト化抗体又はその抗原結合断片の効果を改善又は亢進する。ある実施態様では、適切なコントロールは、薬剤の不存在下でのヒト化抗体又はその断片である。
【００１７】
第二十二の態様では、この方法によって得られた又は得ることができる薬剤が提供される。
第二十三の態様では、試料中におけるＣ型肝炎ウイルスの存在を決定するための方法であって、ここに記載のヒト化抗体又はヒト化抗体断片の使用を含む方法がまた提供される。
適切には、該方法は、患者からの試料をヒト化抗体又はヒト化抗体断片に接触させる工程を含む。ある実施態様では、該方法は適切なコントロールと比較することを更に含む。ある実施態様では、適切なコントロールは、ＨＣＶを認識しない抗体である。ある実施態様では、適切なコントロールはＨＣＶを含んでいることが知られている試料である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１はＡＰ３３ミモトープＨ６へのヒト化及びキメラ抗体の結合を示す。ヒト化重鎖及び軽鎖に対するキメラ抗体の相対的結合性を比較するために、ＣＯＳ７細胞に一連のキメラ及びヒト化重鎖及び軽鎖コンストラクトを形質移入し、上清を用いてミモトープＨ６への結合を比較した。キメラ（Ｖｈ／Ｖｌ）及びヒト化抗体ＲＨｂ−ｈ／ＲＫ２ｂｃ及びＲＨＡ／ＲＫ２ｂｃ又はヒト化及びキメラ抗体ＲＨＡ／Ｖｌ、ＲＨｂ−ｈ／Ｖｌ又はＶｈ／ＲＫ２ｂｃの混合物に対するミモトープペプチドＨ６の結合をＥＬＩＳＡによって測定した。
【図２】図２はペプチドＨ６に対するＡＰ３３ＲＨＩの結合を示す。重鎖界面残基Ｑ３９がペプチドＨ６への最適以下の結合の原因であるかどうかを決定するために、ヒト化重鎖ＲＨＩ（Ｑ３９Ｋ）の結合をＥＬＩＳＡによって測定した。ＣＯＳ７細胞に一連のキメラ及びＲＨＩ重鎖及びＲＫ２ｂ軽鎖コンストラクトを形質移入し、上清を用いてミモトープＨ６への結合を比較した。キメラ（Ｖｈ／Ｖｌ）及びヒト化抗体ＲＨｂ−ｈ、ＲＨＩ／ＲＫ２ｂｃ及びヒト化及びキメラ抗体ＲＨＦＶｌ又はＲＨｂ−ｈ／Ｖｌの混合物へのミモトープペプチドＨ６の結合をＥＬＩＳＡによって測定した。
【図３】図３Ａ−ＢはＥ２ペプチドへのキメラ及びヒト化抗体の結合を示す。ヒト化抗体ＲＨｂ−ｈ／Ｖｌへのキメラ抗体の相対的結合性を比較するために、ＣＯＳ７細胞に一連のキメラ及びヒト化抗体コンストラクトを形質移入した。抗体上清にＥＬＩＳＡを施し、表５に記載のペプチドに対する結合を比較した。
【図４】図４はＨ６ペプチドに対するＲＫ２変異体の結合を示す。ヒト化軽鎖ＲＫ２が機能するのに必要な変異の最小数を、軽鎖ＲＫ２、ＲＫ２ｂ、及びＲＫ２ｃとのＲＨｂ−ｇの結合を比較することによって決定した。キメラ抗体Ｖｈ／Ｖｌを、過去の実験に対するコンパレータとして含めた。ＣＯＳ７細胞に一連のキメラ及びヒト化抗体コンストラクトを形質移入した。Ｅ２ペプチドに対する抗体上清の結合（表５）をＥＬＩＳＡによって測定した。
【図５】図５Ａ−Ｉは、ヒト化重鎖ＶＣ変異体に対するＥ２ペプチドの結合を示す。ヒト化重鎖ＲＨｂ−ｈが機能するのに必要な変異の最小数を、逆突然変異させられた重鎖ＲＨ−Ｂ、ＲＨ−Ｃ、ＲＨ−Ｄ、ＲＨ−Ｅ、ＲＨ−Ｆ、ＲＨ−Ｇ及びＲＨ−ＨとのＲＨｂ−ｈの結合を比較することによって決定した。キメラ抗体Ｖｈ／Ｖｌを過去の実験に対するコンパレータとして含め、ヒト化軽鎖ＲＫ２ｂｃを使用して全てのヒト化重鎖と対形成させた。ＣＯＳ７細胞に一連のキメラ及びヒト化抗体コンストラクトを形質移入した。Ｅ２ペプチドに対する抗体上清の結合（表５）をＥＬＩＳＡによって測定した。
【図６】図６Ａ−Ｅは、正規化されたデータを使用するＥ２ペプチドへのヒト化抗体ＶＣ変異体の結合の比較を示す。図５のデータを、各データセットをＨ６結合の割合として正規化することによって更に解析し、各遺伝子型を一緒にグループ化した。
【図７】図７Ａ−Ｅは、ヒト化ＡＰ３３抗体がＨＣＶｐｐ感染を阻害することを示している。広範な遺伝子型から誘導されたＨＣＶｐｐのキメラＡＰ３３又はヒト化抗体の中和。Ｈｕｈ−７細胞の感染前に、ＨＣＶｐｐを異なった濃度の精製キメラＡＰ３３又はヒト化抗体と共に３７℃で１時間プレインキュベートした。抗体の中和活性を感染力価の阻害割合として表す。
【図８】図８Ａ−Ｂは、遺伝子型５由来のＨＣＶｐｐのキメラＡＰ３３又はヒト化抗体による中和を示す。ＨＣＶｐｐを、Ｈｕｈ−７細胞の感染前に異なった濃度の精製キメラＡＰ３３又はヒト化抗体と共に３７℃で１時間プレインキュベートした。抗体の中和活性は感染力価の阻害パーセントとして表される。二つの別個の実験からの結果を示す。
【図９】図９はＡＰ３３のＣＤＲの上面図を示すＡＰ３３の分子モデルを示す。透明なＣｏｎｎｏｌｌｙ面は褐色の親油性領域を示す。Ｖｅｒｎｉｅｒ及びｃａｎｏｎｉｃａｌ残基はテーパーのスティックとして示される。図は上からＣＤＲを見下ろしている。ループＨｌ、Ｈ２、Ｌ３、及びＬｌは共同して親油性である谷形状の構造を形成する。
【図１０】図１０はＡＰ３３のＣＤＲの底面図を示すＡＰ３３の分子モデルを示す。透明なＣｏｎｎｏｌｌｙ面は褐色の親油性領域を示す。Ｖｅｒｎｉｅｒ及びｃａｎｏｎｉｃａｌ残基はテーパースティックとして示される。
【図１１】図１１Ａ−Ｅは、ＡＰ３３変異体Ｙ４７Ｆ及びＹ４７ＷのＥ２ペプチドへの結合を示す。ＡＰ３３のキメラ重鎖の変異残基Ｙ４７の影響。表５に示されるＥ２ペプチドの結合を使用して、野生型重鎖ＡＰ３と変異体Ｙ４７Ｆ及びＹ４７Ｗを比較した。ＣＯＳ７細胞に一連のキメラ及び変異体抗体コンストラクトを形質移入した。Ｅ２ペプチドに対する抗体上清の結合をＥＬＩＳＡによって測定した。データは、各データセットをＨ６結合のパーセントとして正規化し、各遺伝子型をグループ化することによって操作した。
【図１２】図１２はＡＰ３３変異体Ｙ４７Ｆ及びＹ４７ＷによるＨＣＶｐｐ感染の阻害を示している。１ａ遺伝子型から誘導されたＨＣＶｐｐのキメラＡＰ３３又はヒト化抗体による中和。Ｈｕｈ−７細胞の感染前に、ＨＣＶｐｐを、異なった濃度の精製キメラＡＰ３３又はヒト化抗体と共に３７℃で１時間プレインキュベートした。抗体の中和活性は感染力価の阻害パーセントとして表される。
【図１３】図１３（６１／００６０６６の表７に既出）は、ドナー配列とのＡＰ３３  Ｈ及びＬ鎖中のＶｅｒｎｉｅｒ、Ｃａｎｏｎｉｃａｌ及び界面残基の比較を示す。「’Ｖｅｒｎ／ＣＤＲ」は、ｖｅｒｎｉｅｒ残基（ｖ）及びＣＤＲ（−＝＝＝−）を示す。淡い灰色の強調部分はＣＤＲを示す。白いテキストで黒い強調部分は、ＶＣＩ残基を示す。太字のテキストで暗灰色の強調部分は、ＡＰ３３及びＳ６７８２６、Ｘ６１１２５、ＡＢ０６４１３３、ＡＢ０６４０７２及びＡＹ６８５２７に見出されたＶＣＩ残基間の差を示す。
【図１４】図１４（６１／００６０６６の表８に既出）はＡＰ３３ＶＨ及び選択されたヒトＶＨ遺伝子中のＶＣＩ残基の比較を示す。２０のヒトＶＨ配列が最善のＶＣＩスコアを持ち、ＡＰ３３ＶＨと比較してマッチしたＣＤＲ１及び２サイズを有する。「．」はＡＰ３３ＶＨ中のものと同一の残基を示す。白のテキストで黒の強調部分は、潜在的なドナーフレームワークが異なる部位を示している。ＶＣＩ／ＦＷスコアは、ＡＰ３３ＶＨと同一のＶＣＲ又はＦＷ残基の数を示している。淡い灰色の強調部分、太字テキストの暗灰色の強調部分、及び太字テキストの非強調部分は、それぞれ非保存的、保存的、及び許容可能なｃａｎｏｎｉｃａｌ代替残基を示す。
【図１５】図１５（６１／００６０６６の表９に既出）は、選択されたＶＨタンパク質配列とのＡＰ３３ＶＨの比較を示す。これは図１４におけるように２０のヒトＶＨ配列の比較である。灰色の強調部分はＰｒｏ残基を示す。太字テキストの暗灰色の強調部分はＣｙｓ残基を示す。
【図１６】図１６（６１／００６０６６の表１０に既出）は最善の４つのヒトＶＨ配列のＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントを示す。白テキストでの黒の強調部分はＣＤＲを示しており、灰色の強調部分及び暗灰色の強調部分で太字テキストの部分はＣＤＲの外側のドナー候補間の差を示している。
【図１７】図１７Ａ−Ｂ（６１／００６０６６の表１１に既出）はＡＰ３３ＲＨＡリーダー選択とＳｉｇｎａｌＰの結果をＶＨ４−５９リーダー及びＳ６７８２６ＦＷ１［１４］と共に示す。
【図１８】図１８Ａ−Ｂ（６１／００６０６６の表１２に既出）はＡＰ３３ＲＨＡタンパク質及びＤＮＡ配列の生成を示す。図１８ＡはＡＰ３３ＲＨＡタンパク質配列移植を示し、図１８ＢはＡＰ３３ＲＨＡＤＮＡ配列移植を示す。暗灰色の強調部分で太字のテキストはＣＤＲを示す。
【図１９】図１９（６１／００６０６６の表１４に既出）はＡＰ３３ＲＨＡのＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。淡い灰色ボックスは潜在的スプライス部位を取り除くヌクレオチド変化を示す。
【図２０】図２０（６１／００６０６６の表１５に既出）は、生殖系列ヒトＶＫ遺伝子、ＡＰ３３ＶＫのＶ遺伝子セグメントのみ及びヒト生殖系列遺伝子とのＡＰ３３ＶＫ比較を示す。ヒト生殖系列Ｖ遺伝子とのＡＰ３３ＶＫの比較は、このＣＤＲ１長が如何なるヒトＶＫ遺伝子によっても表されないことを示している。ヒト生殖系列κ遺伝子は同じサイズのＣＤＲ１ループを有していない。ＣＤＲ１ループは黒の強調部分と白のテキストで示される。強調された及び／又は太字の残基は、短いＣＤＲ１ループを持つＶ遺伝子の保存プロリンと長いループのものの間の差を強調している。
【図２１】図２１（６１／００６０６６の表１６に既出）は、同じＣＤＲ１サイズを有するヒトＶＫのＶＣＩスコアを示す。データベースに見出されたマッチしたｃａｎｏｎｉｃａｌループ長を持つ６のみの「ヒト」ＶＫ配列がファージ又はヒト化抗体であった。「．」はＡＰ３３ＶＫ中のものと同一の残基を示す。ＶＣＩ／ＦＷスコアはＡＰ３３ＶＫと同一のＶＣＩ又はＦＷ残基の数を示している。ＡＰ３３Ｋ中の白文字の黒色強調部分は非保存残基を示している。
【図２２】図２２（６１／００６０６６の表１７に既出）は高ＶＣＩスコアを持つヒトＶＫ（異なったＣＤＲ１長を含む）を示す。２０のヒトＶＫ配列が最善のＶＣＩスコアを持ち、ＡＰ３３ＶＨと比較してマッチしたＣＤＲ２サイズを有する。「．」はＡＰ３３ＶＫ中のものと同一の残基を示す。ＶＣＩ／ＦＷスコアは、ＡＰ３３ＶＫと同一のＶＣＲ又はＦＷ残基の数を示している。ＡＰ−３３Ｋ中の白文字で黒の強調部分は、潜在的なドナーフレームワークが異なる部位を示している。
【図２３Ａ】図２３Ａ（６１／００６０６６の表１８Ａに既出）は、非マッチＣＤＲ１サイズのＡＰ３３ＶＫ及びヒトＶＫ配列を示す。Ｃｙｓ、Ｐｒｏ及びＣＤＲは、それぞれ太字テキストでの暗灰色の強調部分、白テキストでの黒色強調部分、及び淡い灰色の強調部分によって示される。
【図２３Ｂ】図２３Ｂ（６１／００６０６６の表１８Ｂに既出）は非マッチＣＤＲ１サイズのヒト配列とＡＰ３３ＶＫのＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントを示す。ＡＰ３３との残基の同一性は破線で示され、灰色はＣＤＲとその長さの差を強調する。白テキストでの黒色強調部分はＶＣＩ残基の差を示し、太字テキストの灰色はＸ６１１２５又はＡＹ６８５２７９中の非保存的変化である。Ｘ６１１２５のＦＷ４ ＫＬＥＩＮは非常に希で、シークエンシングアーチファクトである可能性があり、ＫＬＥＩＫでありうる。ＡＰ３３中のＫＬＥＩＫは共通のモチーフである。
【図２４】図２４（６１／００６０６６の表１９に既出）は、長いＣＤＲ１を有するＡＰ３３ＶＫ及び非ＶＫ４ヒトＶＫ配列のＶＣＩを示す。２０のヒトＶＫ非ＶＫ４配列が最善のＶＣＩスコアを有し、ＡＰ３３ＶＫと比較してマッチしたＣＤＲ２サイズと長いＣＤＲ１を有する。ＶＣＩ／ＦＷスコアは、ＡＰ３３ＶＫと同一のＶＣＩ又はＦＷ残基の数を示している。
【図２５】図２５（６１／００６０６６の表２０に既出）は、大きなＣＤＲ１を有するＡＰ３３ＶＫ及びヒトＶＫ非ＶＫ４配列を示す。Ｃｙｓ、Ｐｒｏ及びＣＤＲは、それぞれ太字のテキストで暗灰色の強調、白いテキストで黒の強調、及び淡い灰色の強調によって示す。
【図２６】図２６（６１／００６０６６の表２１に既出）は、大きなＣＤＲ１を有するＡＰ３３ＶＫ及び非ＶＫ４ヒト配列のＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントを示す。ＡＰ３３ＶＫと同一の残基は破線によって示されている。上の７つの配列において、保存的変化及び非保存的変化は暗灰色である。ＣＤＲは淡い灰色である。
【図２７】図２７（６１／００６０６６の表２２に既出）は、ヒトフレームワークＸ６１１２５及びＡＹ６８５２７９を使用するＡＰ３３ＲＫＡの設計を示す。予想されたシグナルプロテアーゼ切断はＶＫＩＶ−Ｂ３リーダーとＸ６１１２５−ＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＴＣｃＧＧｃＧＣＣＡＧＡＴＧＴを持つ［２０］を生じる。
【図２８】図２８（６１／００６０６６の表２３に既出）は、予想されたシグナルプロテアーゼ切断［２１］で、ＶＫＩ−０１２／０２リーダー及びＡＹ６８５２７９−ＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣＣＴＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＴＣｃＧＧｃＧＣＣＡＧＡＴＧＴを持つ結果を生じる。
【図２９】図２９（６１／００６０６６の表２４に既出）は予想されたシグナルプロテアーゼ切断結果［２２］をＶＫＩＩ−Ａ１７リーダーとＡＢ０６４１３３ＦＷｌと共に示す。
【図３０】図３０Ａ及びＢ（６１／００６０６６の表２５に既出）はＡＰ３３ＲＫＡ配列の生成を示す。図３０ＡはＡＰ３３ＲＫＡタンパク質配列移植を示す。図３０ＢはＡＰ３３ＲＫＡ ＤＮＡ配列移植をＶＫＩＶＢ３リーダーと共に示す。ＣＤＲを強調する。
【図３１】図３１Ａ−Ｂ（６１／００６０６６の表２６に既出）はＡＰ３３ＲＫ２配列の生成を示す。図３１ＡはＡＰ３３ＲＫ２タンパク質配列移植を示す。図３１ＢはＡＰ３３ＲＫ２ ＤＮＡ配列の生成を示す。ＣＤＲを強調する。
【図３２】図３２Ａ−Ｂ（６１／００６０６６の表２７に既出）はＡＰ３３ＲＫ３配列の生成を示す。図３２ＡはＡＰ３３ＲＫ３タンパク質配列移植を示す。図３２ＢはＡＰ３３ＲＫ３ ＤＮＡ配列生成を示す。ＣＤＲを強調する。
【図３３】図３３（６１／００６０６６の表２８に既出）はＡＰ３３ＲＫ４ ＤＮＡ配列生成を示す。ＣＤＲを強調する。
【図３４】図３４Ａ−Ｄ（６１／００６０６６の表２９に既出）は、リーダーと共にＡＰ３３ＲＫＡ、ＡＰ３３ＲＫ２、ＡＰ３３ＲＫ３、及びＡＰ３３ＲＫ４ ＤＮＡ配列を示す。ＣＤＲを強調する。
【図３５】図３５（６１／００６０６６の表３０に既出）は、リーダーと共にＡＰ３３ＲＫＡのＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。淡い灰色のボックスは、潜在的スプライス部位又は望まれないＢａｍＨＩ部位を除去するために変化させられたヌクレオチドを表す。
【図３６】図３６（６１／００６０６６の表３１に既出）は、リーダーと共にＡＰ３３ＲＫ２のＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。淡い灰色のボックスは、潜在的スプライス部位又は望まれないＢａｍＨＩ部位を除去するために変化させられたヌクレオチドを表す。
【図３７】図３７（６１／００６０６６の表３２に既出）は、ＡＰ３３ＲＫ３コンストラクトのＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。ＮＢ ＡＰ３３ＲＬＢは逆突然変異させられた二つのＶＣＩを有している。スプライス部位はこれによっては生成されない。
【図３８】図３８（６１／００６０６６の表３３に既出）はＡＰ３３ＲＫ４コンストラクトのＤＮＡ及びタンパク質配列を示す。
【図３９】図３９Ａは感染パーセントで測定されたＣｏｎ１ ＨＣＶｐｐのＡＰ３３及びＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ中和を示す。図３９Ｂは、感染パーセントで測定されたＪ６ＨＣＶｐｐのＡＰ３３及びＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ中和を示す。図３９Ｃは、Ｃｏｎ１及びＪ６ＨＣＶｐｐを使用するＡＰ３３及びＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂのＥＣ５０（μｇ／ｍｌ）を示す。
【図４０】図４０Ａは感染パーセントで測定されたＣｏｎ１ＨＣＶｃｃのＡＰ３３及びＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ中和を示す。図４０Ｂは、感染パーセントで測定されたＪ６ＨＣＶｃｃのＡＰ３３及びＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ中和を示す。図４０Ｃは、Ｃｏｎ１及びＪ６ＨＣＶｃｃを使用するＡＰ３３及びＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂのＥＣ５０（μｇ／ｍｌ）を示す。
【図４１】図４１ＡはＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ及び１０％の正常なヒト血清（ＮＨＳ）又は慢性ＨＣＶ感染患者からの血清（ＣＨＣＨＳ−１及びＣＨＣＨＣ−２）の存在下でＣｏｎ１ ＨＣＶｐｐを使用する中和アッセイの結果を示す。図４１Ｂは、吸光度（Ａ４５０）によって測定した、ＧＴＩｂ（Ｃｏｎ１）ＥｌＥ２形質移入２９３Ｔ細胞からの可溶化物を使用するＥＬＩＳＡによるＣｏｎ１ ＨＣＶ ＥｌＥ２反応性抗体に対するＮＨＳ、ＣＨＣＨＳ−１、ＣＨＣＨＳ−２、及びＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂの結合レベルを示している。
【図４２Ａ】表８のヒト化抗体可変鎖のアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。
【図４２Ｂ】表８のヒト化抗体可変鎖のアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。
【図４２Ｃ】表８のヒト化抗体可変鎖のアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。
【図４２Ｄ】表８のヒト化抗体可変鎖のアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。
【図４２Ｅ】表８のヒト化抗体可変鎖のアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。
【図４２Ｆ】表８のヒト化抗体可変鎖のアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。
【図４２Ｇ】表８のヒト化抗体可変鎖のアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
抗体
抗体は全て免疫グロブリン折り畳みに基づいて様々な構造を有する天然に生じる免疫グロブリン分子である。例えば、ＩｇＧ抗体、例えばＡＰ３３は、機能的抗体を形成するためにジスフフィド結合している２つの「重」鎖と２つの「軽」鎖を有している。各重鎖と軽鎖自体は「定常」（Ｃ）及び「可変」（Ｖ）領域を含む。Ｖ領域は抗体の抗原結合特異性を決定する一方、Ｃ領域は免疫エフェクターとの非抗原特異的相互作用において構造的サポートを与え機能する。抗体又は抗体の抗原結合断片の抗原結合特異性は、抗体又はその断片が特定の抗原に特異的に結合する能力である。
抗体の抗原結合特異性は、Ｖ領域の構造的特性によって決定される。可変性は可変ドメインの１１０アミノ酸スパンに均一に分布はしていない。代わりに、Ｖ領域は、それぞれ９−１２アミノ酸長である「高頻度可変領域」と呼ばれる極端に可変性の短い領域によって分離された１５−３０のアミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲｓ）と呼ばれる相対的に不変の伸展からなる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ４つのＦＲ領域を含み、多くの場合、βシート構造に連結し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する３つのＣＤＲによって連結されたβシート配置になっている。各鎖の高頻度可変領域はＦＲ領域に極めて近接して保持されており、他の鎖の高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に関与している（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）。定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合には直接には関与しないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。
【００２０】
ある実施態様では、高頻度可変領域は抗原結合の起因となるアミノ酸残基である。高頻度可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えばＶＬ中のおよそ残基２４−３４（Ｌｌ）、５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）の付近と、ＶＨ中のおよそ３１−３５Ｂ（Ｈｌ）、５０−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）の付近(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) 及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基（例えば、ＶＬ中の残基２６−３２（Ｌｌ）、５０−５２（Ｌ２）及び９１−９６（Ｌ３）とＶＨ中の２６−３２（Ｈｌ）、５２Ａ−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）(Chothia及びLesk J. MoI. Biol. 196:901-917 (1987))を含みうる。
【００２１】
各Ｖ領域は典型的には３つの相補性決定領域（それぞれが「高頻度可変ループ」を含む「ＣＤＲ」）と４つのフレームワーク領域を含む。特定の所望の抗原に対して実質的な親和性で結合するのに必要とされる最少の構造単位である抗原結合部位は、従って３つのＣＤＲと、適切な高次構造でＣＤＲを保持し提示するためにそれらの間に散在した少なくとも３つ、好ましくは４つのフレームワーク領域を含むであろう。古典的な４本鎖抗体、例えばＡＰ３３は、ＶＨ及びＶＬドメインが協働して定める抗原結合部位を有している。ある種の抗体、例えばラクダ及びサメ抗体は、軽鎖を欠き、重鎖のみによって形成される結合部位に依存する。結合部位が重鎖又は軽差によって形成され、ＶＨとＶＬの間に協働がない単一ドメイン操作免疫グロブリンを調製することができる。
本明細書と特許請求の範囲を通して、特に明記しない限りは、免疫グロブリン重鎖の定常ドメイン中の残基の番号付けは、ここに出典を明示して援用するKabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のＥＵインデックスのものである。「KabatのＥＵインデックス」とはヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを意味する。配列又は他の番号付けシステムを特に示さない限りは、Ｖ領域内の残基はKabat番号付けに従って番号付けをする。
【００２２】
ここに記載される抗体又は抗体断片は単離され、又はどの程度でも精製されうる。ここで使用される場合、「単離された」は、抗体又は抗体断片がその天然の環境から取り除かれたことを意味する。ある実施態様では、その自然環境の汚染成分は、抗体の診断又は治療への使用を妨害しうる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。ある実施態様では、抗体は、(１)ローリー(Lowry)法により定量して、９５重量％の抗体より多くなるほど、最も好ましくは９９重量％より多くなるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも１５の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように充分な程度まで精製される。抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一の精製工程により調製されるであろう。
「精製された」とは、抗体又は抗体断片の純度が増加し、その天然の環境で存在するよりもより純粋な形態で存在するようになった、及び／又は最初に合成された及び／又は実験室条件下で増幅されたことを意味する。純度は相対的な用語であり、必ずしも絶対純度を意味するものではない。
【００２３】
抗体「エフェクター機能」は抗体のＦｃ領域(天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域)に帰因するその生物学的活性を意味する。抗体エフェクター機能の例は、Ｃｌｑ結合及び補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞媒介細胞傷害(ＡＤＣＣ)；食作用；細胞表面レセプターのダウンレギュレーション(例えばＢ細胞レセプター)；及びＢ細胞活性化を含む。
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」又は「ＡＤＣＣ」は、ある種の細胞傷害性細胞(例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ)上に存在するＦｃレセプター(ＦｃＲ)に結合した分泌Ｉｇがこれらの細胞傷害性エフェクター細胞を抗原担持標的細胞に特異的に結合させ、ついで細胞毒で標的細胞を死滅せしめる細胞毒性の一形態を意味する。抗体は細胞傷害性細胞を「備え」、かかる死滅化に絶対的に必要とされる。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血性細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch及びKinet, Annu.Rev.Immunol., 9:457-92(1991)の４６４頁の表３に要約されている。対象分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、米国特許第５５００３６２号又は第５８２１３３７号又は米国特許第６７３７０５６（Presta）に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイが実施されうる。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。あるいは、又は付加的に、対象分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等 PNAS(USA), 95:652-656(1998)に開示されたような動物モデルにおいて、インビボで評価されてもよい。
【００２４】
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。好ましくは、その細胞が少なくともＦｃγＲIIIを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は例えば血液のような天然源から単離されうる。
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを表す。好ましいＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。更に、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(γレセプター)に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含むものであり、これらのレセプターの対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲＩＩレセプターは、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化レセプター」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害レセプター」）を含み、それらは、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する。阻害レセプターＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース阻害モチーフ(ＩＴＩＭ)を有する(Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234(1997)の概説を参照)。ＦｃＲはRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994)；及びde Haas等, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)において概説されている。将来同定されるものも含む他のＦｃＲもここにおける「ＦｃＲ」なる用語によって包含される。該用語はまた胎児への母性ＩｇＧの移動(Guyer等, J. Immumol. 117:587 (1976)及びKim等, J. Immunol. 24:249 (1994))、免疫グロブリンのホメオスタシスの調節の原因である新生児レセプターＦｃＲｎもまた含む。
【００２５】
国際公開第００／４２０７２号(Presta)にＦｃＲへの結合を向上または減弱させた抗体変異型が述べられている。この特許公開の内容はここに出典明記により具体的に組み込まれる。Shields等 J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照のこと。
ＦｃＲｎへの結合親和性について、一実施態様では、抗体のＥＣ５０又は見かけのＫｄ(ｐＨ６．０での)は≦１００ｎＭ、より好ましくは≦１０ｎＭである。ＦｃγＲIII(Ｆ１５８；すなわち低親和性アイソタイプ)への増加した結合親和性について、一実施態様では、ＥＣ５０又は見かけのＫｄは≦１０ｎＭであり、ＦｃγＲIII(Ｖ１５８；高親和性)について、ＥＣ５０又は見かけのＫｄは≦３ｎＭであった。ＦｃＲｎへの結合の測定方法は知られており(例えばGhetie 1997, Hinton 2004を参照)、以下に記載される。インビボでのヒトＦｃＲｎへの結合とヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス又は形質転換ヒト細胞株、又はＦｃ変異形ポリペプチドを投与された霊長類においてアッセイすることができる。ある実施態様では、ここに記載のヒト化抗体は、ＩｇＧ Ｆｃ内にアミノ酸変異を更に含んでおり、野生型ＩｇＧ Ｆｃを有する抗体よりも少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１２５倍、更により好ましくは少なくとも１５０倍から約１７０倍に亢進したヒトＦｃＲｎへの結合親和性を示す。
【００２６】
「補体依存性細胞傷害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的細胞を溶解することを意味する。古典的な補体経路の活性化は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、その同族抗原と結合した(適切なサブクラスの)抗体に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているようにして実施することができる。
Ｆｃ領域アミノ酸配列を変更してＣ１ｑ結合能力が増大又は減少したポリペプチド変異体は、米国特許第６１９４５５１号及び国際公開第９９／５１６４２号に記載されている。それらの特許文献の内容は、出典明示によって特にここに援用する。またIdusogie 等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)を参照のこと。
ここで使用される場合、ここでの値又はパラメータについての「約」という記載は、その値又はパラメータ自体に関する変動を含む（また記述する）。例えば、「約Ｘ」との記載は「Ｘ」の記載を含む。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ｏｒ」及び「ｔｈｅ」には、明らかな別の記載がない限り複数形も含まれる。ここに記載の発明の態様及び変形例には、態様及び変形例「からなる」及び／又は「から本質的になる」が含まれる。
【００２７】
ヒト化抗体
本発明はＡＰ３３に基づくヒト化抗ＨＣＶ抗体を提供する。一般に、該抗体は少なくとも３つの認識可能なＣＤＲ又は高頻度可変ループと、少なくとも３つ、好ましくは４つのフレームワーク領域を含み、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質に結合する能力を保持している。該抗体はまた軽鎖定常領域及び／又は重鎖定常領域、好ましくは双方を含む。
「ヒト化抗体」なる用語は、少なくとも一つのヒト化抗体鎖（つまり、少なくとも一つのヒト化軽鎖又は重鎖−例えば少なくとも一つのヒト化可変軽鎖又は可変重鎖）を含む抗体を意味する。
【００２８】
「ヒト化抗体鎖」（つまり、「ヒト化免疫グロブリン軽鎖」又は「ヒト化免疫グロブリン重鎖」）なる用語は、（実質的に）アクセプターヒト抗体からの可変フレームワーク領域及び実質的に非ヒトドナー抗体（例えばマウス抗体）からの相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば少なくとも一つのＣＤＲ、好ましくは２つのＣＤＲ、より好ましくは３つのＣＤＲ）を含む可変領域を有し、場合によってはヒト由来の定常領域（例えば軽鎖の場合には少なくとも一つの定常領域又はその一部と、重鎖の場合は好ましくは３つの定常領域）を更に含む抗体鎖（つまりそれぞれ軽鎖又は重鎖）を意味する。また、アクセプターフレームワークの一又は複数の残基は結合親和性を増大させるためにドナーフレームワーク中に存在する残基に一致するように変異されうる。
【００２９】
「ヒト化可変領域」（例えば「ヒト化軽鎖可変領域」又は「ヒト化重鎖可変領域」）なり用語は、実質的にヒト抗体からの可変フレームワーク領域と実質的に非ヒト抗体からの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変領域を意味する。
非ヒトドナー抗体は、ＡＰ３３と命名されたモノクローナル抗体であるか又はそれから誘導される。ＡＰ３３モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマは、European Collection of Cell Culturesでのブタペスト条約下での寄託対象である(ECACC, CAMR Porton Down, Salisbury, Wiltshire. SP4 9JG; 寄託日：２００６年１月２７日；受託番号０５１２２１０１)。
【００３０】
ヒト化抗体はマウス又はキメラ抗体よりも免疫原性が少ない。キメラ抗体は、ヒト定常領域に結合した非ヒト抗体可変領域の全体を含む抗体である。よって、キメラ抗体では、可変領域は非ヒトドナー由来であり、定常領域はヒトである。キメラ抗体とそれらを作製する方法は例えばProc. Natl. Acad. ScL USA, 81: 6841-6855 (1984)に記載されている。ろれらはマウスモノクローナル抗体よりも免疫原性が少ない場合があるが、キメラ抗体の投与には、抗体の非ヒト部分に対するヒト免疫応答（ＨＡＭＡ）が伴う。キメラ抗体はまたヒト補体を活性化させＡＤＣＣを媒介する能力のような適当な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共に適当な抗原結合特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子をスプライシングすることによって生産されうる。一例は異なったアイソタイプのものとのＦｃ領域の置換である。
【００３１】
ヒト化抗体は、ヒト「アクセプター」抗体からのフレームワーク領域に結合した非ヒト「ドナー」抗体からのＣＤＲを含む抗体であるＣＤＲ移植抗体を含む。一般に、ＣＤＲ移植抗体は、非ヒトドナー由来のものよりもヒトアクセプターヒト抗体由来の可変領域（フレームワーク）配列を含むので、キメラ抗体よりもよりヒト抗体配列を含む。よって、例えば、本発明のＣＤＲ移植ヒト化抗体は、ヒト抗体のフレームワーク領域（例えばヒト抗体のＦＲ−１、ＦＲ−２、又はＦＲ−３）又は場合によってはヒト抗体の全フレームワーク領域の殆ど又は全て由来の連続アミノ酸配列（例えば約５以上、１０以上、又は更には１５以上の連続アミノ酸残基）を含む重鎖を含みうる。ＣＤＲ移植抗体とそれらを製造するための方法はNature, 321: 522-525 (1986)に記載されている。ヒト化抗体を生産するために使用できる方法はまた例えば米国特許第５７２１３６７号及び同第６１８０３７７号に記載されている。
【００３２】
ある実施態様では、ヒト化抗体はレシピエントの高頻度可変領域残基が、マウス、ラット、ウサギ、又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント又はアクセプター抗体)である。ある実施態様では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの変更は結合親和性のような抗体の性能を更に洗練するためになされる。ある実施態様では、ヒト化抗体は、ＦＲ領域は結合親和性を改善する一又は複数のアミノ酸置換を含みうるが、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリン配列のものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものに対応する少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ある実施態様では、ＦＲ中のこれらアミノ酸置換の数はＨ鎖において６以下であり、Ｌ鎖において３以下である。ある実施態様では、ヒト化抗体は、また免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含むであろう。更なる詳細は、Jones等, Nature 321:522-525 (1986)；Reichmann等, Nature 332:323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
【００３３】
ＣＤＲ移植抗体は、ＣＤＲ環境の破壊のため結合活性の喪失を被りうる。これを部分的に是正するために、ＣＤＲ移植に、抗原結合活性を回復させるために設計されたフレームワーク領域への変異を補充しうる。例えば欧州特許出願公開第０２３９４００号を参照のこと。
ヒト化抗体は、ある種の溶媒暴露アミノ酸残基を置換してその免疫原性を減少させ又はその機能を亢進するように操作されたヒト化抗体である「ベニヤ(veneered)抗体」でありうる。ベニヤ化は非ヒトフレームワーク領域中の溶媒暴露残基を同定し、それらの少なくとも一つをヒトフレームワーク領域からの対応する表面残基と置換することを含みうる。ベニヤ化は任意の適切な操作技術によって達成することができる。
【００３４】
ヒト化抗体は異種抗体でありうる。異種抗体は互いに結合された二以上の抗体又は抗体結合断片（Ｆａｂ）であり、各抗体又は断片は異なった特異性を有している。
抗体、ヒト化抗体、ヒト操作抗体、及びその調製方法についての詳細は、Antibody Engineering, Springer, New York, NY, 2001に見出すことができる。抗体のヒト化に対する更なる詳細は例えばQueen等, Proc. Natl. Acad. ScL USA 86:10029-10033 (1989)、米国特許第５５３０１０１号、米国特許第５５８５０８９号、米国特許第５６９３７６１号、米国特許第５６９３７６２号、国際公開第９０／０７８６１号、及び米国特許第５２２５５３９号にまとめられている。
【００３５】
一実施態様では、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：１９、又は配列番号：２０の何れかに記載のアミノ酸配列を含むヒト化ＡＰ３３抗体の可変軽鎖ドメインが提供される。
他の実施態様では、配列番号３の位置３０、４８、６７、７１、７８及び９４にアミノ酸変異を含むヒト化ＡＰ３３抗体の可変重鎖ドメインが提供される。
アミノ酸変異は、一又は複数のアミノ酸残基の置換によって得ることができる。ある状況では、欠失又は挿入が許容されうる。変異は、例えば部位特異的突然変異誘発のような標準的な技術を使用して実施することができる。
適切には、アミノ酸変異は置換である。
他の実施態様では、可変重鎖ドメインは従って配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、又は配列番号：１８の何れかに記載のアミノ酸配列を含む。
【００３６】
可変軽鎖ドメインを含むヒト化抗体又はヒト化抗体断片もまた提供される。
可変重鎖ドメインを含むヒト化抗体又はヒト化抗体断片もまた提供される。
軽鎖及び重鎖を含み、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域がここに定義された通りであるヒト化抗体又はヒト化抗体断片がまた提供される。
ある実施態様では、ヒト化抗体又はその断片は、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、及び配列番号：１８からなる群から選択された可変重鎖ドメインと、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：１９、及び配列番号：２０からなる群から選択された可変軽鎖ドメインを含む。
【００３７】
ある実施態様では、可変重鎖ドメインは、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、及び配列番号：１８からなる群から選択され、可変軽鎖ドメインは配列番号：６である。ある実施態様では、可変重鎖ドメインは、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、及び配列番号：１８からなる群から選択され、可変軽鎖ドメインは配列番号：７である。ある実施態様では、可変重鎖ドメインは、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、及び配列番号：１８からなる群から選択され、可変軽鎖ドメインは配列番号：１９である。ある実施態様では、可変重鎖ドメインは配列番号：１３であり、可変軽鎖ドメインは配列番号：１９である。ある実施態様では、可変重鎖ドメインは、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、及び配列番号：１８からなる群から選択され、可変軽鎖ドメインは配列番号：２０である。
【００３８】
ある実施態様では、ここに記載のヒト化抗体又はその断片はＨＣＶに結合する。ある実施態様では、ヒト化抗体又はその断片は、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質、可溶型ＨＣＶ Ｅ２タンパク質、又はＨＣＶ Ｅｌタンパク質及びＨＣＶ Ｅ２タンパク質のヘテロ二量体に結合可能である。ある実施態様では、ヒト化抗体又はその断片はＨＣＶ Ｅ２タンパク質に結合する。ある実施態様では、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質は、遺伝子型１（例えば、遺伝子型Ｉａ及び遺伝子型Ｉｂ）、遺伝子型２（例えば、遺伝子型２ａ、遺伝子型２ｂ、遺伝子型２ｃ）、遺伝子型３（例えば、遺伝子型３ａ）、遺伝子型４、遺伝子型５、及び遺伝子型６からなる群から選択されるＨＣＶ遺伝子型の一又は複数由来である。ある実施態様では、ヒト化抗体又はその断片はＣＤ８１とのＨＣＶ Ｅ２タンパク質の相互作用を阻害する。ある実施態様では、ヒト化抗体又はその断片は細胞中へのＨＣＶの移入を防止及び／又は阻害する。ある実施態様では、細胞は肝臓細胞、例えば、肝細胞である。
【００３９】
ある実施態様では、ヒト化抗体又はその断片は、１−１００ｎＭの結合親和性でもって可溶型ＨＣＶ Ｅ２タンパク質に結合する。ある実施態様では、結合親和性は、１−１０ｎＭ、１０−５０ｎＭ、又は５０−１００ｎＭの何れかのおよその間である。ある実施態様では、結合親和性は約５ｎＭ又は約５０ｎＭである。ある実施態様では、ヒト化抗体又はその断片は、１−１００ｎＭの間の結合親和性でもってＨＣＶ Ｅ１／ＨＣＶ Ｅ２ヘテロ二量体に結合する。ある実施態様では、結合親和性は１−１０ｎＭ、１０−５０ｎＭ、又は５０−１００ｎＭの何れかのおよその間である。ある実施態様では、結合親和性は約５ｎＭ又は約５０ｎＭである。ある実施態様では、抗体の結合親和性は、例えばMunson等, Anal. Biochem., 107:220 (1980)に記載のスキャッチャード解析によって決定することができる。
【００４０】
ある実施態様では、ここに記載のヒト化抗体又はその断片はＨＣＶ感染を阻害する。ある実施態様では、ここに記載のヒト化抗体又はその断片はＨＣＶ偽粒子（ＨＣＶｐｐ）感染を阻害する。適切には、ここに記載のヒト化抗体は、ＨＣＶ偽粒子感染を阻害可能であり、ここで、ＨＣＶｐｐ中和アッセイによって判断される上記ヒト化抗体の存在下での感染力価のＩＣ５０は、遺伝子型１（１ａＨ７７ ２０）に対しては少なくとも約０．０３２であり；遺伝子型１（１Ａ２０．８）に対しては少なくとも約１．６であり；遺伝子型１（１Ｂ５．２３）に対しては少なくとも約０．９であり；遺伝子型２（２Ｂｌ．１）に対しては少なくとも約３であり；遺伝子型３ａ（Ｆ４／２−３５）に対しては少なくとも約０．４１であり；遺伝子型４（４．２１．１６）に対しては少なくとも約０．４１であり；遺伝子型６（６．５．８）に対しては少なくとも約０．４１であり；遺伝子型５（５．１５．１１）に対しては少なくとも０．０５３である。ある実施態様では、ここに記載のヒト化抗体又はその断片はＨＣＶ偽粒子感染を阻害することができ、ここで、ＨＣＶｐｐ中和アッセイによって判断される上記ヒト化抗体の存在下での感染力価のＩＣ５０は、遺伝子型１（ＩａＨ７７ ２０）に対して約０．４１未満、約０．１３７未満、又は約０．３２未満、遺伝子型１（１Ａ２０．８）に対して約１．６、遺伝子型１（１Ｂ５．２３）に対して約０．９、遺伝子型２（２Ｂｌ．１）に対して約３、遺伝子型２（２ａＪＦＨｌ）に対して約０．６４、遺伝子型２（２Ａ２．４）に対して約０．５１、遺伝子型３（３ａＦ４／２−３５）に対して約０．４１未満、遺伝子型４（４．２１．１６）に対して約０．４１未満、遺伝子型５（５．１５．１１）に対して約０．０５３、又は遺伝子型６（６．５．８）に対して約０．４１未満の何れかである。
【００４１】
ある実施態様では、ここに記載のヒト化抗体はＨＣＶｐｐ感染を阻害することができ、ここでＨＣＶｐｐ中和アッセイによって判断される上記ヒト化抗体の存在下での感染力価のＥＣ５０は、遺伝子型Ｉｂに対して少なくとも約０．５１１であり、遺伝子型２ａに対して少なくとも約０．７９３である。
適切には、ＨＣＶｐｐ中和アッセイによって判断される上記ヒト化抗体の存在下での感染力価のＩＣ９０は、遺伝子型１（ＩａＨ７７ ２０）に対して少なくとも約０．６であり；遺伝子型１（１Ａ２０．８）に対して少なくとも約１５であり；遺伝子型１（１Ｂ５．２３）に対して少なくとも約８．３であり；遺伝子型２（２Ｂｌ．１）に対して少なくとも約１５であり；遺伝子型３ａ（Ｄ４／２−３５）に対して少なくとも約２．１５であり；遺伝子型４（４．２１．１６）に対して少なくとも約０．９２であり；遺伝子型６（６．５．８）に対して少なくとも約１．８であり；遺伝子型５（５．１５．１１）に対して少なくとも０．８２である。ある実施態様では、ここに記載のヒト化抗体又はその断片はＨＣＶ偽粒子感染を阻害することができ、ここで、ＨＣＶｐｐ中和アッセイによって判断される上記ヒト化抗体の存在下での感染力価のＩＣ９０は、遺伝子型１（ＩａＨ７７ ２０）に対して約０．４１、約２．４、又は約０．６未満であり、遺伝子型１（１Ａ２０．８）に対して約１５未満であり、遺伝子型１（１Ｂ５．２３）に対して約８．３未満であり、遺伝子型２（２Ｂｌ．１）に対して約１５より大きく、遺伝子型２（２ａＪＦＨｌ）に対して約７より大きく、遺伝子型２（２Ａ２．４）に対して約０．５１より大きく、遺伝子型３（３ａＦ４／２−３５）に対して約０．４１未満であり、遺伝子型４（４．２１．１６）に対して約６未満であり、遺伝子型５（５．１５．１１）に対して約０．８２未満であり、又は遺伝子型６（６．５．８）に対して約１．８未満の何れかである。
【００４２】
ある実施態様では、ここに記載のヒト化抗体又はその断片は組換え細胞培養誘導ＨＣＶ（ＨＣＶｃｃ）感染を阻害する。ある実施態様では、ここに記載のヒト化抗体は、ＨＣＶｃｃ感染を阻害することができ、ここで、ＨＣＶｐｐ中和アッセイによって判断される上記ヒト化抗体の存在下での感染力価のＥＣ５０は、遺伝子型Ｉｂに対して少なくとも約０．７２であり、又は遺伝子型２ａに対して少なくとも約１．７である。
ある実施態様では、ヒト化抗体又はその断片は上記特性の一又は複数を示す。
【００４３】
抗体工学
抗体の改変のための幾つかの技術は当該分野で知られている。一般に、抗体は、ドナー（非ヒト）抗体由来のＣＤＲをアクセプター（ヒト）抗体フレームワークに移すことによって免疫原性が少なくされる；この手順はＣＤＲ移植又はヒト化として知られている。この手順の不利な点は、ドナー及びアクセプターフレームワーク間の差異の結果として、結合活性が損なわれるか又は失われる場合があることである。更に、ある量の免疫原性はＣＤＲ自体によって保持されうる。ベニヤ化、表面再構成(resurfacing)、ＳＤＲ移送及び脱免疫を含む様々な相補的及び代替的技術がこれらの問題に対処するために提案されている。
ある実施態様では、ここに記載のヒト化抗体は、非ヒトのソースからそれに導入された一又は複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「移入」残基と呼ばれ、これは典型的には「移入」可変ドメインに由来する。ヒト化は、本質的にヒト抗体の対応する配列を高頻度可変領域配列で置換することにより、Winter及び共同研究者(Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Reichmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239: 1534-1536 (1988))の方法に従って実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４８１６５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかの高頻度可変領域残基と、場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位由来の残基によって置換されたヒト抗体である。
【００４４】
ヒト化抗体の作製に使用されるヒト可変ドメインの選択は、軽鎖及び重鎖何れも、抗体をヒトの治療用途を意図する場合、抗原性及びＨＡＭＡ応答（ヒト抗マウス抗体）を減らすために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法によれば、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。齧歯類の配列に最も近いヒトＶドメイン配列を同定し、その中のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）をヒト化抗体に受け入れる(Sims等 J. Immunol. 151:2296(1993)；Chothia等 J. Mol. Biol. 196:901(1987))。別の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列から得られた特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを数種の異なるヒト化抗体に使用することができる(Carter等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285(1992)；Presta等 J. Immunol., 151:2623(1993))。
【００４５】
抗体は、抗原に対する高い親和性及びその他の望ましい生物学的特性を保持してヒト化されることが更に重要である。この目的を達成するために、好ましい方法では、親の配列及びヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列及び様々な概念上のヒト化産物を分析するプロセスにより、ヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当業者に周知である。選択された候補免疫グロブリン配列の可能な三次元立体配置的構造を図解し表示するコンピュータプログラムが利用可能である。このような表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列が機能する際に残基が果たすと思われる役割を分析することができ、つまり候補免疫グロブリンのその抗原に対する結合能に影響する残基を分析することができる。このようにして、レシピエント及び移入配列からＦＲ残基を選択して組み合わせることにより、所望の抗体特性、例えば標的抗原に対する親和性の増大を達成することができる。一般に、高頻度可変領域残基は、抗原の結合への影響に直接的且つ最も実質的に関わっている。
抗体ヒト化は、例えば、欧州特許出願公開第４６０１６７号、欧州特許出願公開第６８２０４０号、米国特許第５５３０１０１号、米国特許第５５８５０８９号、米国特許第５６９３７６１号、米国特許第５６９３７６２号、米国特許第５７６６８８６号、米国特許第５８２１３３７号、米国特許第５８５９２０５号、米国特許第５８８６１５２号、米国特許第５８８７２９３号、米国特許第５９５５３５８号、米国特許第６０５４２９７及びＵＳ６１８０３７０に記載されている。これらの方法は全て、抗原結合特異性を付与する原因のアミノ酸残基がヒト抗体可変領域のフレームワーク領域内に組み込まれるように抗体の可変領域を再設計することを含む。
【００４６】
ある場合、非ヒト抗体の免疫原性部分はヒト抗体由来の残基によって置き換えられる（例えば米国特許第５７１２１２０号）。あるいは、抗体可変ドメインの表面上の残基を非ヒト可変ドメインを「表面再構成」するためにヒト抗体由来の残基によって置き換えることができる（例えば米国特許第５６３９６４１号）。表面再構成はPadlan（1991, 欧州特許出願公開第０５１９５９６号）によって示唆され、「ベニヤ化」とも呼ばれる。この手順において、第一の（ＣＤＲのソース−ドナーの等価物）抗体の溶媒露出残基を第二の（「アクセプター」）抗体由来の残基によって置き換えられる。典型的には、第二抗体はヒト抗体である。溶媒隔絶残基、ＣＤＲ、ドメイン間接触残基、及びＣＤＲに直ぐに隣接する残基は全て第一の抗体におけるように残る。この方策は、完全な抗原結合活性を補助しうる第一抗体からの充填及び界面相互作用の全てを保持しながら第二抗体の表面を模倣するものである。これは、Ｂ細胞エピトープの数を減少させなければならず、（幾らかのＴエピトープをまた減少させ、低い免疫原性に至らしめる。
【００４７】
溶媒露出残基は、抗体の高分解能構造の検査によって同定される。ヒト化に関連しうる抗体の他の領域：ＣＤＲと接触し、マウス及びヒト抗体間で異なる埋もれた残基（齧歯類残基が使用される場合）；双方のドメインに対してＣＤＲの近くに位置し抗原結合に所定の役割を果たしうるＮ末端領域；長い距離でさえう役割を担っている場合がまたある静電気的相互作用。置換される表面残基の選択は、第一の抗体可変ドメインと第二の種由来の利用可能な配列のもの（個々か又はコンセンサス配列）の間の相同性一致によって決定される。
米国特許第５６３９６４１号及び欧州特許出願公開第０５９２１０６Ａ１号は表面再構成の代替法を記載している。ここで、第二の種のものに改変されなければならない溶媒露出残基がＰａｄｌａｎのものと類似の手順を使用するが、各位置に対して平均的な到達性を得る多数の構造を解析して、同定される。あるレベルを越える到達性を有する残基を調べ、抗体が使用される種からの抗体からのものと変えられる。置換される残基の選択は、全体の相同性を有する抗体から又は溶媒露出残基のみを考慮して最も高い相同性を持つ抗体からでありうる。
【００４８】
国際公開第９３／１７１０５号及び米国特許第５７６６６８６号に記載されたヒト化法は、ヒト等価物に通常は安全に改変されうる低リスクの残基を同定する。これらの残基は溶媒露出性の傾向があり、よって、溶媒露出残基だけが変更されれば、この方法は表面再構成法に類似するものになるであろう。
表面再構成又はベニヤ化抗体を提供する正味の効果を有する２つの更なる手順が記載されている；欧州特許出願公開第０４３８３１０Ａ１号及び欧州特許出願公開第０５１９５９６Ａ１号を参照のこと。
更なる技術は、免疫応答に対するＴの助けが利用できないか低減され、導入された抗体に対して最小の免疫応答を導くようにＴ細胞エピトープを同定し除去する（「デトープ(detope)」と呼ばれる）ことを探求している（米国特許第５７１２１２０号；欧州特許出願公開第０６９９７５５Ａ２号）。Ｂ細胞エピトープがこの方法で無効にされる。
【００４９】
抗体ヒト化技術はまた「Antibody Engineering」(Kontermann及びDhubel編), 40章 p567-592 (O'Brien及びJones)に教唆されている。
ある実施態様では、ヒト化抗体は、免疫コンジュゲートを生産するために一又は複数の細胞傷害剤と場合によってはコンジュゲートされる抗体断片、例えばＦａｂでありうる。あるいは、ヒト化抗体は完全長抗体、例えば完全長ＩｇＧｌ抗体でありうる。
【００５０】
抗体断片
本発明の範囲内としてまた考えられるものは、選択された標的に結合可能な抗体断片−例えばヒト化抗体断片−で、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄＡｂｓ、キメラ、ＣＤＲ移植、及びヒト化抗体を含む操作された抗体、ファージディスプレイ又は代替技術を使用して製造された人工的に選択された抗体である。小断片、例えばｄＡｂｓ、Ｆｖ、及びＳｃＦｖは、その小さいサイズとその結果としての優れた組織分布のために診断及び治療用途に有利な性質を有している。
ある実施態様では、抗体断片は、完全長抗体の一部、一般にはその抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【００５１】
ある実施態様では、「Ｆｖ」は、完全な抗原-認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この断片は、密接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域ドメインの二量体からなる。これら２つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を付与する６つの高頻度可変ループ(Ｈ及びＬ鎖から、それぞれ３つのループ)が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
ある実施態様では、ここに記載のヒト化抗体の断片が提供される。ある実施態様では、ヒト化抗体断片は抗原結合断片である。ある実施態様では、ヒト化抗体の抗原結合断片はＨＣＶに結合する。ある実施態様では、ヒト化抗体の抗原結合断片は、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質、可溶型ＨＣＶ Ｅ２タンパク質、又はＨＣＶ Ｅｌタンパク質とＨＣＶ Ｅ２タンパク質のヘテロ二量体に結合可能である。ある実施態様では、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質は、遺伝子型１（例えば、遺伝子型Ｉａ及び遺伝子型Ｉｂ）、遺伝子型２（例えば、遺伝子型２ａ、遺伝子型２ｂ、遺伝子型２ｃ）、遺伝子型３（例えば、遺伝子型３ａ）、遺伝子型４、遺伝子型５、及び遺伝子型６からなる群から選択されるＨＣＶ遺伝子型の一又は複数からのものである。
【００５２】
典型的には、これらの断片は、少なくとも１０７、より典型的には１０８又は１０９の親和性での抗原への特異的結合性を示す。ある実施態様では、ヒト化抗体断片は、１−１００ｎＭの結合親和性で可溶型ＨＣＶ Ｅ２タンパク質に結合する。ある実施態様では、結合親和性は、１−１０ｎＭ、１０−５０ｎＭ、又は５０−１００ｎＭの何れかのおおよその間である。ある実施態様では、結合親和性は約５ｎＭ又は約５０ｎＭである。ある実施態様では、ヒト化抗体又はその断片は、１−１００ｎＭの結合親和性でＨＣＶ Ｅｌ／ＨＣＶ Ｅ２ヘテロ二量体に結合する。ある実施態様では、結合親和性は１−１０ｎＭ、１０−５０ｎＭ、又は５０−１００ｎＭの何れかのおおよその間である。ある実施態様では、結合親和性は約５ｎＭ又は約５０ｎＭである。ある実施態様では、抗体の結合親和性は、例えばMunson等, Anal. Biochem., 107:220 (1980)に記載されたスキャッチャード解析によって決定することができる。
ある実施態様では、これらの断片はここに記載のＡＰ３３モノクローナル抗体又はヒト化抗体と同じＨＣＶ中和活性を（実質的に）示す。ヒト化抗体断片は、別個の重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、及びＦｖを含む。断片は組換えＤＮＡ技術又はインタクトな免疫グロブリンの酵素的又は化学的分離によって生産される。
【００５３】
ある実施態様では、ヒト化抗体断片は機能的断片である。ここに記載のヒト化抗体の「機能的断片」、例えばヒト化ＡＰ３３抗体の機能的断片は、それらが誘導されるインタクトな完全長分子と実質的に同じ親和性でもってＨＣＶへの結合を保持し、ここに記載のもののようなインビトロ又はインビボアッセイで測定して生物学的活性を示す断片である。ある実施態様では、機能的断片は、ＨＣＶｐｐ及び／又はＨＣＶｃｃ中和アッセイによって示されるようにＨＣＶを中和し、及び／又は阻害する。ある実施態様では、ヒト化抗体断片はＣＤ８１とのＨＣＶ Ｅ２タンパク質の相互作用を防止し及び／又は阻害する。ある実施態様では、ヒト化抗体断片は細胞中へのＨＣＶの移入を防止及び／又は阻害する。ある実施態様では、細胞は肝臓細胞、例えば、肝細胞である。
【００５４】
様々な技術が抗体断片の生産のために開発されている。伝統的には、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク分解消化を介して誘導された（例えばMorimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992)；及びBrennan等, Science, 229:81 (1985)を参照）。しかしながら、これらの断片は今は組換え宿主細胞によって直接生産されうる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片は全て大腸菌中で発現され、分泌され得、よって多量のこれらの断片の容易な生産が可能になる。抗体断片は上で検討した抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は大腸菌から直接回収され得、化学的にカップリングされてＦ（ａｂ’）２断片を形成する(Carter等, Bio/Technology 10:163-167 (1992))。他のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ’）２断片は組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含む増加したインビボ半減期を持つＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は米国特許第５８６９０４６号に記載されている。抗体断片の生産のための他の技術は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択される抗体は一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。Ｆｖ及びｓＦｖは接触領域を欠くインタクトな結合部位を有する唯一の種である；よって、それらはインビボ使用での減少した非特異的結合に適している。sFv融合タンパク質はsFvのアミノ又はカルボキシ末端の何れかでエフェクタータンパク質の融合体を生じるように構築されうる。上掲のAntibody Engineering, Borrebaeck編を参照のこと。例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているように、抗体断片はまた「直鎖状抗体」でありうる。かかる直鎖状抗体断片は単一特異性又は二重特異性でありうる。抗原結合抗体断片は、インタクトな免疫グロブリンの酵素的又は化学的分離によって生産されうる。断片はまた組換えＤＮＡ技術によって生産することができる（例えば、King等, 1992 Biochem. J. 281, 317-323；Carter等, 1992 Biotechnology 10, 163-167）。選択された断片をコードする核酸セグメントは、関連した制限酵素での完全長コード化配列の消化によって、又は新規合成によって生産される。
【００５５】
例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、Harlow及びLane (1988 "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY)に記載されたもののような標準方法を使用してｐＨ３．０−３．５でのペプシンでのタンパク分解消化によってＩｇＧ分子から得ることができる。
Ｆａｂ断片は、制限された還元によりＦ（ａｂ’）２断片から、又は還元剤の存在下でのパパインでの消化によって全抗体から得ることができる。
ヒト化抗体は当業者に明らかな多くの方法で特徴付けることができる。これらには、ＥＬＩＳＡのような技術によるその濃度の、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる抗体純度の、物理的測定が含まれる。また、ポリペプチドの効能は、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴法（例えばＢＩＡｃｏｒｅ）又は免疫蛍光アッセイのように、溶液中又は固相系においてＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質への分子の結合を検出することによって、決定されうる。より特定的には、ポリペプチドの中和能は、例えばＨＣＶｐｐ及びＨＣＶｃｃ中和アッセイのような、ここに記載のようなＨＣＶｐｐ中和アッセイにおいて６つの既知の遺伝子型を表すＨＣＶ試料に対して試験することができる。
【００５６】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＨＣＶの２つの異なるエピトープに結合しうる。他のこのような抗体では他のタンパク質に対する結合部位とＨＣＶ結合部位とが結合しうる。二重特異性抗体はまた細胞に細胞傷害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はＨＣＶ結合アーム及び細胞傷害剤(例えば、サポリン、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は完全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
国際公開第９６／１６６７３号には、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体が記載されており、米国特許第５８３７２３４号には、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩ抗体が開示されている。二重特異性抗ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体は国際公開第９８／０２４６３号に示されている。米国特許第５８２１３３７号は、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＣＤ３抗体を教示するものである。
【００５７】
二重特異性抗体を作製する方法は当該分野において既知である。二重特異性抗体の伝統的な組換え産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの重鎖は異なる特異性を持っている(Millstein等, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker等, EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。好ましくは、該融合は、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが好ましい。免疫グロブリン重鎖の融合体と、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、コンストラクトに使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、２又は３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【００５８】
このアプローチ法の好ましい実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
米国特許第５７３１１６８号に記載されている他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第一抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第二の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【００５９】
二特異性抗体は架橋又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの一方の抗体がアビジンと結合し、他方はビオチンと結合しうる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせること(米国特許第４６７６９８０号)及びＨＩＶ感染の治療(国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／００３７３号及び欧州特許出願公開第０３０８９号)への用途が提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は任意の簡便な架橋方法によって作製できる。適切な架橋剤は当該分野において周知であり、多くの架橋法と共に米国特許第４６７６９８０号に記されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) はインタクトな抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。生産された二重特異性抗体は酵素の選択的固定化のための薬剤として使用することができる。
【００６０】
最近の進歩により大腸菌からＦａｂ'-ＳＨ断片を直接回収することが容易となっており、これにより化学的にカップリングされて二重特異性抗体を形成する。Shalaby 等, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)は、完全なヒト化二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の産生について記述している。各々のＦａｂ'断片は大腸菌から別々に分泌されて、インビトロで化学的にカップリングされて、二重特異性抗体を形成する。従って、形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞及び正常ヒトＴ細胞に結合するだけでなく、ヒト乳房腫瘍の標的に対するヒト細胞毒性リンパ球の溶解活性を引き起こすことができた。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelny等, J.Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させた。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成した。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作製する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片の作製方策もまた報告されている。Gruber等, J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照のこと。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J. Immunol. 147:60(1991)。
【００６１】
多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び／又は異化)されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(ＩｇＭクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオでは、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここでの好ましい多価抗体は３から約８（しかし好ましくは４つ）の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖(好ましくは２つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖は２又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖はＶＤ１-(Ｘ１)ｎ-ＶＤ２-(Ｘ２)ｎ-Ｆｃを有し、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖の一つであり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＨ-ＣＨ１-可動性リンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖を有し得る。ここでの多価抗体は、好ましくは少なくとも２つ(好ましくは４つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドを更に有する。ここでの多価抗体は、例えば約２から約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを含む。ここで考えられる軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを含み、場合によってはＣＬドメインを更に含む。
【００６２】
他のアミノ酸配列修飾
ここに記載されたＨＣＶ結合抗体のアミノ酸配列の修飾を考える。例えば、抗体の結合親和性及び／又は生物学的特性を向上させることができれば望ましい。ヒト化ＡＰ３３抗体のような抗ＨＣＶ抗体のアミノ酸配列変異体は、抗ＨＣＶ抗体の核酸に適切なヌクレオチド変化を導入して、又はペプチド合成により調製されうる。そのような修飾は、抗ＨＣＶ抗体のアミノ酸配列内の残基の、例えば、欠失型、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望する特徴を有していれば、欠失、挿入及び置換をどのように組合せてもよい。またアミノ酸変化はグリコシル化部位の数又は位置のような、抗ＨＣＶ抗体の翻訳後プロセスを変化させうる。
突然変異誘発に好ましい位置である抗ＨＣＶ抗体のある残基又は領域の同定に有益な方法は、Cunningham及びWells Science, 244:1081-1085(1989)に開示されているように「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的となる残基又は残基の組が同定され(例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなどの荷電した残基)、中性の、又は負に荷電したアミノ酸(最も好ましくはアラニン又はポリアラニン)で置換され、アミノ酸のＨＣＶ抗原との相互作用に影響を与える。ついで、置換に対する機能的感受性を示しているそれらアミノ酸位置を、置換の部位において、又は置換の部位のために、更なる又は他の変異体を導入することにより精製する。このように、アミノ酸配列変異体を導入する部位は予め決定されるが、突然変異自体の性質は予め決定される必要はない。例えば、与えられた部位における突然変異のパーフォーマンスを分析するために、標的コドン又は領域においてａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を実施し、発現した抗ＨＣＶ抗体変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
【００６３】
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００以上の残基を有するポリペプチドまでの長さに亘るアミノ末端融合及び／又はカルボキシ末端融合、並びに単一又は複数アミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を持つ抗ＨＣＶ抗体又は細胞傷害性ポリペプチドに融合した抗体が含まれる。抗ＨＣＶ抗体分子の他の挿入変異体には、抗体の血清半減期を増加させるポリペプチド又は(例えばＡＤＥＰＴのための)酵素への抗ＨＣＶ抗体のＮ末端又はＣ末端の融合が含まれる。
他のタイプの変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗ＨＣＶ抗体中に異なった残基により置換される少なくとも一のアミノ酸残基を有する。置換突然変異について関心ある部位は高度可変領域を含むが、ＦＲ改変もまた考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」と題して以下の表に示す。そのような置換が生物学的活性の変化をもたらすならば、表中に「例示的置換」と名前を付けた、又はアミノ酸クラスに関連して以下に更に記載されるより実質的な変化が、導入され得、産物がスクリーニングされうる。
【００６４】
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【００６５】
抗体の生物学的性質における実質的修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩の維持についてのその効果が有意に異なる置換を選択することにより達成される。アミノ酸は、その側鎖の特性の類似性に従ってグループ化することができる(A. L. Lehninger, in Biochemistry, 2版, pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975))：
（１）無極性：Ａｌａ（Ａ），Ｖａｌ（Ｖ），Ｌｅｕ（Ｌ），Ｉｌｅ（Ｉ），Ｐｒｏ（Ｐ），Ｐｈｅ（Ｆ），Ｔｒｐ（Ｗ），Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）無電荷極性：Ｇｌｙ（Ｇ），Ｓｅｒ（Ｓ），Ｔｈｒ（Ｔ），Ｃｙｓ（Ｃ），Ｔｙｒ（Ｙ），Ａｓｎ（Ｎ），Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ），Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ），Ａｒｇ（Ｒ），Ｈｉｓ（Ｈ）
【００６６】
別法では、天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
【００６７】
抗ＨＣＶ抗体の適切な高次構造を維持することに関与していない任意のシステイン残基も、一般的には、セリンと置換して、分子の酸化的安定性を改善し、異常な架橋を防いでもよい。逆に、システイン結合をその抗体に付加して、その安定性を改善してもよい(特に抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合)。
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体（例えばヒト化抗体）の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的に、更なる発展のために選択され、得られた変異体は、それらが作製された親抗体と比較して改善された生物学的特性を有している。そのような置換変異体を作製する簡便な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性成熟を含む。簡潔に言えば、幾つかの高頻度可変領域部位(例えば６−７部位)を変異させて各部位においてあらゆる可能なアミノ酸置換を生成させる。このようにして生成された抗体変異体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物としてディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体とＨＣＶの間の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体がひとたび生成されると、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択することができる。
【００６８】
抗体のアミノ酸変異体の他の型は、抗体の元のグリコシル化パターンを変更する。ヒト化抗体又はその断片は非アミノ酸部分を含みうる。例えば、ヒト化抗体又はその断片はグリコシル化されうる。かかるグリコシル化は宿主細胞又は宿主生物中でのヒト化抗体又はその断片の発現中に天然に生じうるか、又はヒト介入から生じる慎重な修飾でありうる。変更とは、抗体に見い出される一又は複数の糖鎖部分の欠失、及び／又は抗体に存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。
抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン(ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸)のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの糖類のうち一つが結合することを意味するが、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた用いることができる。
【００６９】
グリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列(Ｎ結合グリコシル化部位のもの)を含むように変化させることによって簡便に達成される。該変化は、元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(Ｏ-結合グリコシル化部位の場合)。
アミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該分野で知られた様々な方法によって調製される。これらの方法は、限定するものではないが、天然源からの単離(天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合)又は初期に調製された変異体もしくは抗ＨＣＶ抗体の非変異体バージョンのオリゴヌクレオチド媒介(又は部位特異的)突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製を含む。
エフェクター機能に関して、例えば抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞傷害性(ＡＤＣＣ)及び／又は補体依存性細胞傷害性(ＣＤＣ)を向上させるために、本発明の抗体を修飾することが望ましい場合がある。これは、抗体のＦｃ領域に一又は複数のアミノ酸置換を導入することで達成されうる。あるいは又は加えて、Ｆｃ領域にシステイン残基を導入することによってこの領域での鎖間のジスルフィド結合形成が起こりうる。このようにして生成されたホモ二量体抗体は改善された内部移行能及び／又は増加した補体媒介細胞死滅及び抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有しうる。Caron等, J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照のこと。抗腫瘍活性が亢進されたホモ二量体抗体もまたWolff等, Cancer Research 53:2560-2565 (1993)に記載されているようなヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製されうる。あるいは、抗体を二重Ｆｃ領域を持つように操作して、それによって補体媒介性溶解及びＡＤＣＣ能を亢進した。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照。
米国特許出願公開第２００６／００６７９３０号に記載されているように、抗体の血清半減期を増大させるために、アミノ酸改変を抗体中に行うことができる。
【００７０】
他の抗体修飾
抗体の他の修飾がここで考察される。例えば、抗体は様々な非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン類、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーに結合されうる。また抗体は、例えばコアセルベーション法又は界面重合により調製されたマイクロカプセル(例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセル）にコロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションに捕捉することができる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16版, Osol A.編(1980)に開示されている。
加えてもしくはあるいは、ヒト化抗体又はその断片に他の化学修飾を施してもよい。一つのそのような望ましい修飾は一又は複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分の付加である。ペグ化はインビボで様々な抗体断片の半減期を有意に増大させることが示されている(Chapman 2002 Adv. Drug Delivery Rev. 54, 531-545)。しかしながら、抗体断片の無作為のペグ化は抗原に対する断片の結合親和性に非常に致命的な影響を持ちうる。これを避けるためには、ペグ化をヒト化抗体又はその断片の特定の標的残基に限定することが望ましい(Knight等, 2004 Platelets 15, 409-418及び上掲のChapmanを参照)。
【００７１】
所望の性質を持つ抗体のスクリーニング
ある種の生物学的特徴を有する抗体は実験実施例に記載のようにして選択することができる。
興味ある抗体が結合するＨＣＶ Ｅ２タンパク質上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするためには、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow及びDavid Lane (1988)に記載されたもののような常套的な交差ブロックアッセイを実施することができる。このアッセイは、試験抗体が本発明の抗ＨＣＶ Ｅ２抗体と同じ部位又はエピトープに結合するかどうかを決定するために使用することができる。あるいは、又は加えて、エピトープマッピングを当該分野で知られている方法によって実施することができる。例えば、抗体配列を例えばアラニンスキャニングによって変異誘発させ接触残基を同定することができる。変異体抗体は正しい折り畳みを確実にするためにポリクローナル抗体との結合について最初に試験される。異なった方法では、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質の異なった領域に対応するペプチドを、 試験抗体又は試験抗体群及び特徴付けられた又は既知のエピトープの抗体との競合アッセイで使用することができる。
【００７２】
ある実施態様では、抗体はまたＨＣＶ感染を中和するその能力についてスクリーニングすることができる。ある実施態様では、ＨＣＶ感染の中和はここに記載されたＨＣＶ偽型粒子（ＨＣＶｐｐ）中和アッセイに基づいている。ＨＣＶｐｐはレトロウイルス又はレンチウイルスコア粒子に組み込まれた未修飾のＨＣＶエンベロープ糖タンパク質からなる。ＨＣＶｐｐはＨＣＶエンベロープタンパク質依存式で肝細胞腫細胞株及び肝細胞に感染する。ＨＣＶｐｐ内にパッケージされたマーカー遺伝子の存在により、抗体媒介性中和の迅速で信頼性のある決定が可能になる。ある実施態様では、ＨＣＶ感染の中和は、ここに記載のヒト肝細胞腫細胞株に感染する組換え細胞培養誘導ＨＣＶ（ＨＣＶｃｃ）中和アッセイに基づいている。
【００７３】
ＩＩ．ポリヌクレオチド
本発明はまたポリヌクレオチドを提供する。ここで交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体、又はＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによりポリマー中に取り込まれうる任意の基質でありうる。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含みうる。もし存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組立ての前後に付与されうる。
例えば、ポリヌクレオチドは、軽鎖又は重鎖のような全免疫グロブリン分子鎖をコードしうる。完全な重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）ばかりでなく重鎖定常領域（ＣＨ）を含み、これは典型的には３つの定常ドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３；及び「ヒンジ」領域を含む。ある状況では、定常領域の存在が望ましい。例えば、抗体がＨＣＶ感染細胞を死滅させることが望まれる場合、完全な定常領域の存在は補体を活性化させために望ましい。しかしながら、他の状況では、完全な定常領域の存在は望ましくない場合がある。
【００７４】
ポリヌクレオチドは可変軽鎖及び／又は可変重鎖をコードしうる。
ポリヌクレオチドによってコードされうる他のポリペプチドは、抗原結合抗体断片、例えば単一ドメイン抗体（「ｄＡｂｓ」）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２及び「ミニボディ」を含む。ミニボディは（典型的には）ＣＨ１及びＣＫ又はＣＬドメインが切り取られた二価抗体断片である。ミニボディは一般的な抗体より小さいので、それらは臨床／診断用途では良好な組織浸透を達成するはずであるが、ｄＡｂｓのような一価抗体断片よりも高い結合親和性を保持しなければならない二価である。従って、内容が矛盾しない限り、ここで使用される「抗体」なる用語は抗体分子全体ばかりでなく、上で検討したタイプの抗原結合抗体断片もまた包含する。
コードされたポリペプチドは典型的にはＡＰ３３のものと同一又は実質的に同一のＣＤＲ配列を有している一方、フレームワーク領域はヒト由来であるＡＰ３３のものとは異なる。よって、本発明のポリヌクレオチドは、ＡＰ３３の重鎖及び／又は軽鎖（適切な場合）に対してここに記載された重鎖及び／又は軽鎖可変領域を有するポリペプチドを好ましくはコードする。コードされるポリペプチドが部分的な又は完全な重鎖及び／又は軽鎖定常領域を含む場合、これはまた有利にはヒト由来のものである。
好ましくは、コードされるポリペプチドのフレームワーク領域の少なくとも一つ、最も好ましくはフレームワーク領域の各々は、ヒト化抗体の結合活性を増加させるために、ＡＰ３３のものとより類似するようにするヒトアクセプターに対するアミノ酸置換を含む。
【００７５】
好ましくは、コードされたポリペプチド中に存在する各フレームワークは、対応するヒトアクセプターフレームワークに対して少なくとも一つのアミノ酸置換を含む。よって、例えば、フレームワーク領域は、アクセプターフレームワーク領域に対して、全体で３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５のアミノ酸置換を含みうる。有利には、変異は、マウスＡＰ３３フレームワーク内の等価な位置に存在する残基に一致させるための逆突然変異である。好ましくは、６の逆突然変異が重鎖及び軽鎖の一においてなされる。
適切には、本発明のポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドは、単離され、及び／又は精製されうる。ある実施態様では、ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドは、単離されたポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドである。単離されたなる用語は、分子がその通常の又は自然の環境から除去され又は分離されており、又はそれがその通常の又は自然の環境では存在しないような形で製造されたことを示すものである。ある実施態様では、ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドは精製されたポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドである。精製されたという用語は、少なくとも幾らかの汚染分子又は物質が除去されたことを示すものである。
【００７６】
適切には、ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドは、関連したポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドが組成物中に存在する支配的な（つまり最も豊富な）ポリヌクレオチド又はポリペプチドを構成するように、実質的に精製される。
本発明は従ってここに記載された重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードする挿入断片を含む組換え核酸を用いる。定義では、そのような核酸は、コード化一本鎖核酸、上記コード化核酸とそれに対する相補的核酸からなる二重鎖核酸、又はこれらの相補的（一本鎖）核酸自体を含む。
修飾はまたＡＰ３３抗体の重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインの外側に作製することもできる。そのような変異体核酸は、一又は複数のヌクレオチドが同じアミノ酸をコードする新しいコドンを有する他のヌクレオチドによって置き換えられるサイレント変異でありうる。そのような変異体配列は縮重配列でありうる。縮重配列は元々コードされていたアミノ酸配列の変化を生じないで他のヌクレオチドによって限られない数のヌクレオチドが置き換えられる点で遺伝暗号の意味内で変性される。そのような縮重配列は、重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインの最適な発現を得るために特定の宿主、特に酵母、最近又は哺乳動物細胞によって好まれるその異なった制限部位及び／又は特定のコドンの頻度のために有用でありうる。
【００７７】
配列同一性又は配列相同性
本発明は、ここに定義された特定の性質を有するポリペプチドのアミノ酸配列又はそのようなポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列と配列同一性又は配列相同性の度合いを有する配列（以下「相同配列」と称す）の使用を包含する。ここで、「ホモログ」なる用語は、対象のアミノ酸配列及び対象のヌクレオチド配列とある相同性を有しているものを意味する。ここで、「相同性」なる用語は、「同一性」と等しくできる。
相同のアミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列は機能的活性を保持し及び／又は抗体の活性を亢進するポリペプチドを提供し及び／又はコードしなければならない。
【００７８】
本文脈では、相同配列は、対象配列と少なくとも７５、８５、又は９０％同一であり、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一でありうるアミノ酸配列を含むものである。典型的には、相同体は対象アミノ酸配列と同じ活性部位等を含むであろう。相同性は類似性（つまり、類似の化学的性質／機能を有しているアミノ酸残基）によってもまた考慮されうるが、本発明の文脈では、配列同一性によって相同性を表現するのが好ましい。
本文脈において、相同配列は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（対象配列）と少なくとも７５、８５、又は９０％同一であり、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一でありうるヌクレオチド配列を含むものである。典型的には、相同体は対象配列と活性部位等をコードする同じ配列を含むであろう。相同性は類似性（つまり、類似の化学的性質／機能を有しているアミノ酸残基）によってもまた考慮されうるが、本発明の文脈では、配列同一性によって相同性を表現するのが好ましい。
【００７９】
相同性の比較は、目によって、又はより普通には直ぐに利用できる配列比較プログラムを用いて実施されうる。これら市販のコンピュータプログラムは二以上の配列間の相同性％を計算できる。
相同性％は近接配列にわたって計算されうる。つまり、一つの配列が他の配列と整列され、一配列中の各アミノ酸を、他の配列中の対応するアミノ酸と、一時に一残基で、直接比較する。これは「ギャップなし」アラインメントと呼ばれる。典型的には、そのようなギャップなしのアラインメントは比較的短い数の残基に対してのみ実施される。
【００８０】
これは非常に簡単で一貫した方法であるが、何か同一の配列対において、例えば一つの挿入又は欠失が次のアミノ酸残基をアラインメントから外れるようにし、よって全体のアラインメントが実施される場合に相同性％に大きな減少を潜在的に生じせしめることを考慮することに失敗している。従って、殆どの配列比較法は、過度に全体の相同性スコアにペナルティを課さないで可能な挿入及び欠失を考慮する最適なアラインメントをつくるように設計される。これは、局所的相同性を最大にすることを試みるために配列アラインメント中に「ギャップ」を挿入することによって達成される。
【００８１】
しかしながら、これらのより複雑な方法は、同じ数の同一のアミノ酸に対して、−二つの比較した配列間での高い関連性を反映する−できる限り少ないギャップの配列アラインメントが多くのギャップのものよりも高いスコアを達成するように、アラインメントで生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てる。ギャップの存在に対して相対的に高いコストを、ギャップ内にそれぞれの続く残基に小さいペナルティを負担させる「アフィンギャップコスト」が典型的には使用される。これは最も一般的に使用されるギャップスコアシステムである。高いギャップペナルティはもちろんより少ないギャップの最適化されたアラインメントをつくり出す。殆どのアラインメントプログラムはギャップペナルティを変更することを許容している。しかしながら、配列比較のためにそのようなソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を使用するのが好ましい。
【００８２】
従って、最大の相同性％の計算は、先ずギャップペナルティを考慮に入れて、最適なアラインメントをつくり出すことを必要とする。そのようなアラインメントを実施するための適切なコンピュータプログラムはＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ (Invitrogen Corp.)である。配列比較を実施することができるソフトウェアの例は、限定されるものではないが、例えばＢＬＡＳＴパッケージ(Ausubel等, (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 4版 - 18章参照)、ＢＬＡＳＴ２ (FEMS Microbiol Lett 174(2): 247-50 (1999)；FEMS Microbiol Lett 177(1): 187-8(1999)を参照)、ＦＡＳＴＡ(Altschul等, J. MoI. Biol. 403-410 (1990))及びＡｌｉｇｎＸを含む。少なくともＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２及びＦＡＳＴＡはオフライン及びオンラインサーチに利用できる(Ausubel等, (1999) 7-58から7-60頁参照)。 
【００８３】
最終の相同性％は、同一性の面から測定することができるが、アラインメント法自体は典型的には全てか無かの対比較に基づいてはいない。その代わりに、化学的類似性又は進化的距離に基づく各ペアワイズ比較にスコアを割り当てるスケール化した類似性スコアマトリックスが一般に使用される。一般的に使用されるそのようなマトリックスの一例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス−ＢＬＡＳＴプログラムスーツのデフォルトマトリックスである。Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩプログラムは、公的なデフォルト値か又は供給されるならばあつらえられたシンボル比較表（更なる詳細は使用者用マニュアルを参照）の何れかを一般に使用する。幾つかの応用では、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩパッケージに対するデフォルト値を使用することが好ましい。
【００８４】
あるいは、相同性パーセントは、ＣＬＵＳＴＡＬに類似のアルゴリズムに基づいてＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ(Invitrogen Corp.)における多重アラインメント特性を使用して計算することができる(Higgins DG & Sharp PM, Gene 73(1), 237-244 (1988))。
ひとたびソフトウェアが最適なアラインメントをつくり出したならば、相同性％、好ましくは配列同一性％を計算することができる。ソフトウェアは典型的には配列比較の一部としてこれを実施し、数値結果を生成する。
配列同一性を決定する場合にギャップペナルティが使用されるならば、好ましくは次のパラメータがペアワイズアラインメントに使用される。表２を参照のこと。
0005763344.tif 000003
【００８５】
一実施態様では、ＣＬＵＳＴＡＬは上で定義されたようなギャップペナルティ及びギャップ伸長を用いて使用することができる。
適切には、ヌクレオチド配列に関する同一性の度合いは、少なくとも２０の近接ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０の近接ヌクレオチド、好ましくは少なくとも４０の近接ヌクレオチド、好ましくは少なくとも５０の近接ヌクレオチド、好ましくは少なくとも６０の近接ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１００の近接ヌクレオチドに対して決定される。
適切には、ヌクレオチド配列に関する同一性の度合いは、配列全体に対して決定される。
【００８６】
ハイブリダイゼーション
更なる態様では、ここに記載されたヌクレオチド配列にハイブリダイズ（例えば特異的にハイブリダイズ）可能な核酸配列が提供される。
ここで使用される「ハイブリダイゼーション」なる用語は、「核酸のストランドが塩基対形成を通して相補的ストランドと一緒になるプロセスを含む。ハイブリダイゼーションの条件は、Berger及びKimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, 152, Academic Press, San Diego CA)に教示されているように、核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づいており、以下に説明される定まった「ストリンジェンシー」を付与する。
最大のストリンジェンシーは典型的には約５℃以下のＴｍで生じ；高ストリンジェンシーは約５℃から１０℃以下のＴｍ；中程度のストリンジェンシーは約１０℃から２０℃以下のＴｍ；及び低ストリンジェンシーは約２０℃から２５℃以下のＴｍである。当業者には理解されるように、最大のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは同一のヌクレオチド配列を同定し又は検出するために使用することができる一方、中程度の（又は低い）ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは類似の又は関連した配列を同定し又は検出するために使用することができる。
【００８７】
適切には、ここに記載のヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能な核酸配列は、ここに記載のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下（例えば、５０℃及び０．２×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ,０．０１５Ｍ Ｎａ３シトレート ｐＨ７．０｝でハイブリダイズ可能な配列である。
適切には、ここに提示されたヌクレオチド配列に高ストリンジェントな条件下（例えば、６５℃及び０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ,０．０１５Ｍ Ｎａ３シトレート ｐＨ７．０｝でハイブリダイズ可能な核酸配列である。
【００８８】
本発明はまた本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能な配列に相補的であるヌクレオチド配列（ここに提示されたものの相補的配列を含む）に関する。
また本発明の範囲内に含まれるものは、中程度から最大のストリンジェンシーの条件下でここに提示されたヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列である。
【００８９】
ＩＩＩ．組換え抗体の発現
また提供されるものは、ヒト化ＡＰ３３抗体のようなここに記載された抗ＨＣＶ抗体及びその断片をコードする単離された核酸、該核酸を含むベクター及び宿主細胞、及び該抗体の生産のための組換え技術である。ここに記載の抗体は組換え発現によって生産することができる。
ここに記載された軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸を場合によっては定常領域に結合させ、発現ベクター中に挿入する。軽鎖及び重鎖を、同じ又は異なった発現ベクター中でクローニングすることができる。免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡセグメントを、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする発現ベクター中の制御配列に作用可能に連結させる。発現制御配列は、限定しないが、プロモーター（例えば、天然に付随するか異種性のプロモーター）、シグナル配列、エンハンサーエレメント、及び転写終結配列を含む。
適切には、発現制御配列は、真核生物宿主細胞（例えば、ＣＯＳ細胞−例えばＣＯＳ７細胞−又はＣＨＯ細胞）を形質転換し又は形質移入することができるベクター中の真核生物プロモーター系である。ベクターが適切な宿主中にひとたび導入されたならば、宿主がヌクレオチド配列の高レベルの発現、及び交差反応抗体の収集と精製に適した条件下に維持される。
これらの発現ベクターはエピソームとして又は宿主染色体ＤＮＡの一体部分として宿主生物中で典型的に複製可能である。
【００９０】
選択遺伝子成分−一般に、発現ベクターは、典型的には、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にするために選択可能マーカー（例えばアンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性又はネオマイシン耐性）を含む（例えば、Itakura等, 米国特許第４７０４３６２号を参照）。ある実施態様では、選択遺伝子は、（ａ）例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、又はテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、（ｂ）栄養要求性欠陥を補い、又は（ｃ）例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択スキームの一例では、宿主細胞の増殖を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換される細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、ヒト化ＡＰ３３抗体のようなここに記載の抗ＨＣＶ抗体をコードする核酸の捕捉にコンピテントな細胞の同定を可能にするもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。
【００９１】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Ｍｔｘ)を含む培地において形質転換体の全てを培養することで最初に同定される。野生型ＤＨＦＲが用いられる場合に適切な宿主細胞はＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞株（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ−９０９６）である。
あるいは、ここに記載の抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲ遺伝子、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)のような他の選択可能マーカーと共に形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーに対する選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照のこと。
【００９２】
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である(Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979))。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で増殖する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。酵母宿主細胞ゲノムにｔｒｐ１破壊が存在することは、ついでトリプトファンの不存在下における増殖による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母株(ＡＴＣＣ２０６２２あるいは３８６２６)は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
また、１．６μｍの円形プラスミドｐＫＤ１由来のベクターは、クルイヴェロマイシス(Kluyveromyces)酵母の形質転換に用いることができる。あるいは、組換え仔ウシキモシンの大規模生産のための発現系がＫ.ラクティス(lactis)に対して報告されている。Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)。クルイヴェロマイシスの工業的な菌株による組換え体成熟ヒト血清アルブミンの分泌のための安定した複数コピー発現ベクターもまた開示されている。Fleer 等, Bio/Technology,9:968-975 (1991)。
【００９３】
シグナル配列成分−  ここに記載の抗ＨＣＶ抗体、例えばヒト化ＡＰ３３抗体は、組換え的に直接ばかりでなく、好ましくはシグナル配列又は成熟タンパク質又はポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種ポリペプチドとの融合体ポリペプチドとしても生産することができる。好ましく選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセシングされる（つまり、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、１ｐｐ、又は熱安定エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列と置換できる。酵母の分泌では、天然シグナル配列を、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（サッカロミセス(Saccharomyces)及びクルベロマイセス(Kluyveromyces)α因子イーダー）、又は酸ホスファターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス(C. albicans)グルコアミラーゼリーダー、又は国際公開第９０／１３６４６号に記載のシグナルによって置換されうる。哺乳動物細胞発現では、哺乳動物シグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。
そのような前駆体領域のＤＮＡを、ヒト化ＡＰ３３抗体のようなここに記載の抗ＨＣＶ抗体をコードするＤＮＡに読み枠を一致させてライゲートさせる。
【００９４】
複製起点−  発現ベクターとクローニングベクターは共にベクターが一又は複数の選択された宿主細胞で複製するようにする核酸配列を含んでいる。一般に、クローニングベクターでは、この配列は、ベクターを宿主染色体ＤＮＡとは独立に複製させるものであり、複製起点又は自己複製配列を含む。そのような配列は様々な細菌、酵母、及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点は殆どのグラム陰性細菌に適しており、２μプラスミド起点は酵母に対して適しており、様々なウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）が哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製起点成分は哺乳動物発現ベクターには必要ではない（ＳＶ４０起点はただそれが初期プロモーターを含んでいるので典型的に使用されうる）。
【００９５】
プロモーター成分−  発現及びクローニングベクターは宿主生物によって認識されヒト化ＡＰ３３抗体のようなここに記載の抗体をコードする核酸に作用可能に結合しているプロモーターを通常含む。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、βラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターを含む。しかし、他の既知の細菌プロモーターも好適である。細菌系で使用するプロモータもまた抗ＨＣＶ抗体をコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(Ｓ.Ｄ.)配列を含むであろう。
真核生物に対してのプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ２５から３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から７０から８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルでありうるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクター中に適切に挿入される。
【００９６】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ又は他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
増殖条件によって制御される転写の更なる利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-ホスフェートデヒドロゲナーゼに対するプロモーター領域、及びマルトース及びガラクトース利用の原因である酵素である。酵母発現に使用する適したベクター及びプロモーターは欧州特許出願公開第７３６５７号に更に記載されている。酵母エンハンサーもまた酵母プロモーターと共に有利に使用される。
【００９７】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからのヒト化ＡＰ３３抗体のようなここに記載の抗ＨＣＶ抗体の転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、最も好ましくはサルウィルス４０(ＳＶ４０)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、又は異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合性である限り、調節されうる。
ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を更に含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現させる系が、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の変形例は米国特許第４６０１９７８号に開示されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞中でのヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyes等, Nature, 297：598-601(1982)を参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
【００９８】
エンハンサーエレメント成分−  より高等の真核生物によるヒトＡＰ３３抗体のようなここに記載の抗ＨＣＶ抗体をコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のためのエンハンサーエレメントについては、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、ＨＣＶ結合抗体コード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされうるが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【００９９】
転写終結成分
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、また転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に入手できる。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
ポリヌクレオチド配列（例えば、可変重鎖及び／又は可変軽鎖コード化配列及び任意成分の発現制御配列）を含むベクターは、細胞宿主のタイプに応じて変わるよく知られた方法によって宿主細胞に移入されうる。例えば、塩化カルシウム形質移入が一般に原核生物宿主に対して利用され、リン酸カルシウム処理、電気穿孔法、リポフェクション、微粒子銃又はウイルスベースの形質移入が他の細胞宿主に対して使用されうる。一般にはSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2版, 1989)を参照。哺乳動物細胞を形質転換させるために使用される他の方法は、the use of ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、電気穿孔法、及びマイクロインジェクションの使用を含む（一般には、上掲のSambrook等を参照）。トランスジェニック動物の生産に対しては、導入遺伝子を受精した卵母細胞中に微量注入することができ、又は胚性幹細胞のゲノム中に導入することができ、かかる細胞の核を除核した卵母細胞中に移すことができる。
【０１００】
重鎖及び軽鎖を別個の発現ベクターにクローニングしたとき、ベクターを同時形質移入して発現させ、インタクトな免疫グロブリンのアセンブリを得る。ひとたび発現されると、全抗体、個々の軽鎖及び重鎖、又は他の免疫グロブリン形態を、硫酸アンモニウム沈降、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ精製、ゲル電気泳動等(一般的にはScopes, Protein Purification (Springer- Verlag, N.Y., (1982)を参照)を含む当該分野の標準的な手順に従って精製することができる。少なくとも約９０から９５％の均一性の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８から９９％又はそれ以上の均一性が、薬学的用途のため、最も好ましい。
【０１０１】
コンストラクト
本発明はここに記載のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトを更に提供する。
典型的には、コンストラクトは、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの適切な宿主中における発現を可能にする発現ベクターである。コンストラクトは、例えば次のものの一又は複数を含みうる：宿主中で活性なプロモーター；一又は複数の調節配列、例えばエンハンサー；複製起点；及びマーカー、好ましくは選択可能マーカー。宿主は真核生物又は原核生物宿主でありうるが、真核生物（特に哺乳動物）宿主が好ましいであろう。適切なプロモーターの選択は明らかに使用される宿主細胞にある程度依存するが、ヒトウイルス、例えばＨＳＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ等からのプロモーターを含みうる。数多くのプロモーターが当業者に知られている。
コンストラクトは、３つの軽鎖高頻度可変ループ又は３つの重鎖高頻度可変ループを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含みうる。あるいは、ポリヌクレオチドは、３つの重鎖高頻度可変ループ及び適切な長さの適切に可動性のリンカーによって結合させられた３つの軽鎖高頻度可変ループを含むポリペプチドをコードしうる。他の可能性は、単一のコンストラクトが軽鎖ループを含むものと重鎖ループを含むものの２つの別個のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含みうることである。別個のポリペプチドは独立に発現され得るか又は単一の共通のオペロンの一部を形成しうる。
【０１０２】
コンストラクトは、一又は複数の調節特性、例えばエンハンサー、複製起点、及び一又は複数のマーカー（選択可能等）を含みうる。コンストラクトは、プラスミド、酵母人工染色体、酵母ミニ染色体の形態を取り得、又はウイルス、特に弱毒ウイルス又はヒトに対して非病原性の類似物のゲノムの全て又は一部に組み込まれうる。
コンストラクトは、哺乳動物、好ましくはヒトの患者に安全に投与するために簡便に製剤化されうる。典型的には、それらは複数のアリコートで提供され、各アリコートは少なくとも一の正常な成人ヒト患者の効果的な免疫化のために十分なコンストラクトを含む。
コンストラクトは液体又は固形形態で提供され得、好ましくは、使用前に滅菌された水が典型的には再水和させられる凍結乾燥粉末として提供される。
コンストラクトは、コンストラクトの投与に応じて（例えば特異的抗体力価によって測定して）患者の免疫応答を増大させる効果を有するアジュバント又は他の成分と共に製剤化されうる。
【０１０３】
ベクター
「ベクター」なる用語は発現ベクター及び形質転換ベクター及びシャトルベクターを含む。
「発現ベクター」なる用語はインビボ又はインビトロ発現可能なコンストラクトを意味する。
「形質転換ベクター」なる用語は、該種のものであり得、又は異なった種のものでありうる一実体から他の実体に移され得るコンストラクトを意味する。コンストラクトがある種から他の種へ移され得る場合、例えば大腸菌プラスミドから細菌、例えばバシラス属に移される場合、形質転換ベクターはしばしば「シャトルベクター」と呼ばれる。それは大腸菌プラスミドから植物のアグロバクテリウムへ移すことができるコンストラクトでさえありうる。
【０１０４】
ベクターは、本発明で包含されるポリペプチドの発現をもたらすために以下の記載の適切な宿主細胞中に形質転換されうる。よって、更なる態様では、本発明は、本発明で使用されるポリペプチドを調製するための方法であって、上に記載の発現ベクターで形質転換され又はそれが形質移入された宿主細胞を、ポリペプチドをコードするコード配列のベクターによる発現がもたらされる条件下で培養し、発現されたポリペプチドを回収することを含む方法を提供する。
ベクターは、例えば複製起点、場合によっては上記ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター及び場合によってはプロモーターの制御因子を有するプラスミド、ウイルス又はファージベクターでありうる。
ベクターは当該分野でよく知られている一又は複数の選択可能なマーカー遺伝子を含みうる。
【０１０５】
宿主細胞
本発明は、ここに記載のポリヌクレオチド又はコンストラクトを含む宿主細胞−例えばインビトロ宿主細胞−を更に提供する。宿主細胞は、例えば細菌、酵母又は他の真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、又は哺乳動物細胞でありうる。
本発明は、本発明に係るポリペプチドを製造するように遺伝子操作されたトランスジェニック多細胞宿主生物をまた提供する。生物は例えばトランスジェニック哺乳類生物（例えばトランスジェニックヤギ又はマウス株）でありうる。
【０１０６】
大腸菌は使用することができる一原核生物宿主である。他の微生物宿主は、桿菌、例えばバチルス・スブチリス、及び他の腸内細菌科、例えばサルモネラ、セラチア、及び様々なシュードモナス種を含む。これらの原核生物宿主には、典型的には宿主細胞と適合性がある発現制御配列（例えば複製起点）を含む発現ベクターを作製することができる。また、任意の数の様々なよく知られたプロモーターが存在し、例えばラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、βラクタマーゼプロモーター、又はファージλからのプロモーター系ある。典型的には、プロモーターは、場合によってはオペレーター配列と共に発現を制御し、転写及び翻訳を開始させ完了させるためのリボソーム結合部位配列等を有する。
他の微生物、例えば酵母を発現に使用することができる。サッカロミセスは好ましい酵母宿主であり、発現制御配列(例えば、プロモーター)、複製起点、終結配列等を所望に応じて有する適切なベクターを含む。典型的なプロモーターは、３-ホスホグリセリン酸キナーゼ及び他の解糖酵素を含む。誘導性酵母プロモーターは、とりわけ、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソチトクロムC、及びマルトース及びガラクトース利用の原因の酵素を含む。
【０１０７】
微生物に加えて、哺乳動物組織細胞培養をまた用いて、ここに記載のヒト化抗体又はその断片を発現し、生産することができ、ある場合には好ましい（Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987)を参照）。ある実施態様に対しては、真核生物細胞（例えば、ＣＯＳ７細胞)が好ましいが、これは異種タンパク質（例えばインタクトな免疫グロブリン）を分泌可能な多くの適切な宿主細胞株が当該分野で開発されているためであり、ＣＨＯ細胞株、様々なＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、好ましくはミエローマ細胞株、又は形質転換されたＢ細胞又はハイブリドーマを含む。
ある実施態様では、宿主細胞は脊椎動物宿主細胞である。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株(ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１)；ヒト胚腎臓株(２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977))；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub等, P roc. Natl. Acad. ScL USA 77:4216 (1980)）又はＣＨＯ−ＤＰ−１２株；マウスのセルトリ細胞(ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))；サル腎細胞 (ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザル腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞(ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８, ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞(ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。
【０１０８】
あるいは、抗体コード化配列を導入遺伝子中に取り込み、トランスジェニック動物のゲノム内に導入し、続いてトランスジェニック動物の乳中で発現させることができる（例えばDeboer等, 米国特許第５７４１９５７号、Rosen, 米国特許第５３０４４８９号、及びMeade等, 米国特許第５８４９９９２号を参照)。適切な導入遺伝子は、カゼイン又はβラクトグロブリンのような乳腺特異的遺伝子由来のエンハンサー及びプロモーターに作用可能に連結した軽鎖及び／又は重鎖のコード配列を含む。
あるいは、ここに記載の抗体はトランスジェニック植物（例えばタバコ、トウモロコシ、ダイズ及びアルファルファ）において生産することができる。改善された「植物抗体」ベクター(Hendy等(1999) J. Immunol. Methods 231:137-146)及び形質転換性作物種の増加と組み合わさった精製方策が、かかる方法を、ヒト及び動物の治療法のためばかりでなく、工業的用途（例えば触媒抗体）のために組換え体免疫グロブリンを生産する実際的で効果的な手段にした。更に、植物生産抗体は安全で効果的であることが示され、動物誘導材料の使用を回避する。更に、植物及び哺乳動物細胞生産抗体のグリコシル化パターンの差は抗原結合又は特異性に殆ど又は全く影響を持たない。また、毒性又はＨＡＭＡは、植物由来の分泌性二量体ＩｇＡ抗体の局所経口投与を受ける患者には観察されなかった(Larrick等 (1998) Res. Immunol. 149:603-608を参照)。
【０１０９】
完全長抗体、抗体断片、及び抗体融合タンパク質は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされていない場合、例えば治療用抗体が細胞傷害剤（例えば毒素）にコンジュゲートされ、免疫コンジュゲート自体が腫瘍細胞破壊に効果を示す場合、細菌中で生産することができる。完全長抗体はより大なる循環半減期を有している。大腸菌中での生産は速く、より費用効率が高い。細菌中での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、発現及び分泌を最適化するための翻訳開始領域（ＴＩＲ）及びシグナル配列を記載している米国特許第5648237号(Carter等)、米国特許第5789199号(JoIy等)、及び米国特許第5840523号(Simmons等)（これらの特許は出典明示によりここに援用される）を参照のこと。発現後、抗体は可溶型画分の大腸菌細胞ペーストから単離され、アイソタイプに応じて例えばプロテインＡ又はＧカラムを通して精製することができる。最終の精製は、例えばＣＨＯ細胞中で発現された抗体を精製するためのプロセスと同様に実施することができる。
ヒト化ＡＰ３３抗体のようなグリコシル化抗ＨＣＶ抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。数多くのバキュロウイルス株及び変異株及びスポドプテラ・フルギペルダ（イモムシ）、ネッタイシマカ（蚊）、ヒトスジシマカ（蚊）、キイロショウジョウバエ（ショウジョウバエ）、及びカイコのような宿主からの対応する許容可能な昆虫宿主細胞が同定されている。形質移入のための様々なウイルス株が公的に入手でき、例えば、オートグラファ・カルフォニカＮＰＶのＬ−１変異株及びカイコＮＰＶのＢｍ−５株であり、かかるウイルスを、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質移入のために、本発明に係るここでのウイルスとして使用することができる。
【０１１０】
抗体の精製
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔に生産され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生産される場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。Carter等, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌された抗体の単離方法を記載している。簡単に述べると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム(ｐＨ３．５)、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド(ＰＭＳＦ)の存在下で約３０分間解凍する。細胞細片は遠心分離で除去できる。抗体が培地に分泌される場合、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はミリポアＰｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の増殖を防止してもよい。
【０１１１】
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる(Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986))。アフィニティーリガンドが結合されるマトリックスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成できるものより早い流量及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー(例えばポリアスパラギン酸カラム)、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される抗体に応じて利用可能である。
予備的精製工程に続いて、興味ある抗体及び汚染物質を含む混合液に、ｐＨ約２．５−４．５、好ましくは低塩濃度(例えば約０−０．２５Ｍ塩)の溶出緩衝液を用いて低ｐＨ疎水性作用クロマトグラフィーを施すことができる。
【０１１２】
ＩＶ．抗体コンジュゲート
抗体は細胞傷害剤、例えば毒素又は放射性同位体とコンジュゲートされうる。ある実施態様では、毒素はカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウリスタチンＥ及びその類似体又は誘導体が好ましい。
好ましい薬剤／毒素には、ＤＮＡ阻害剤、微小管重合化又は脱重合化阻害剤及び代謝阻害剤を含む。細胞傷害性剤の好ましいクラスには、例えば、酵素阻害剤、例としてジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、及びチミジル酸合成酵素阻害剤、ＤＮＡ干渉物質、ＤＮＡ切断物質、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリンファミリー薬剤、ビンカ剤、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞傷害性ヌクレオシド、プテリジンファミリー剤、ジイネネス(diynenes)、ポドフィロトキシン、及び分化誘導物質を含む。好ましい薬剤／毒素には、ＤＮＡ阻害剤、微小管重合化または脱重合化阻害剤及び代謝阻害剤を含む。細胞傷害性剤の好ましいものには、例えば、酵素阻害剤、例としてジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、及びチミジル酸合成酵素阻害剤、ＤＮＡ干渉物質、ＤＮＡ切断物質、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリンファミリー剤、ビンカ剤、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞傷害性ヌクレオシド、プテリジンファミリー剤、ジイネネス(diynenes)、ポドフィロトキシン、及び分化誘導物質を含む。そのクラスの特に有用なメンバーには、例としてメトトレキセート、メトプテリン(methopterin)、ジクロロメトトレキセート(dichloromethotrexate)、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、ロイロシン(leurosine)、ロイロシデイン(leurosideine)、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、Ｎ−（５，５−ジアセトキシペンチル）ドキソルビシン、モルフォリノ−ドキソルビシン、１−（２−クロエチル）−１，２−ジメタンスルホニルヒドラジド、Ｎ８−アセチルスペルミジン、アミノプテリンメトプテリン、エスペラマイシン、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、アクチノマイシン、ブレオマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシン及びポドフィロトキシン誘導体、例としてエトポシド又はエトポシドリン酸塩、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール、タキソテレ、レチノイン酸、酪酸、Ｎ８−アセチルスペルミジン、カンプトテシン、カリケアマイシン、ブリオスタチン、セファロスタチン、アンサマイトシン、アクトシン、メイタンシノイド、例としてＤＭ−１、メイタンシン、メイタンシノール、Ｎ−デスメチル−４，５−デセポキシメイタンシノイド、Ｃ−１９−デクロロメイタンシノイド、Ｃ−２０−ヒドロキシメイタンシノール、Ｃ−２０−デメトキシメイタンシノール、Ｃ−９−ＳＨメイタンシノール、Ｃ−１４−アルコキシメチルメイタンシノール、Ｃ−１４−ヒドロキシまたはアセチルオキシメチルメイタンシノール、Ｃ−１５−ヒドロキシ／アセチルオキシメイタンシノール、Ｃ−１５−メトキシメイタンシノール、Ｃ−１８−Ｎ−デメチルメイタンシノール及び４，５−デオキシメイタンシノール、アウリスタチン、例としてアウリスタチンＥ、Ｍ、ＰＨＥ及びＰＥ；ドロスタチン、例としてドロスタチンＡ、ドロスタチンＢ、ドロスタチンＣ、ドロスタチンＤ、ドロスタチンＥ（２０−エピ及び１１−エピ）、ドロスタチンＧ、ドロスタチンＨ、ドロスタチンＩ、ドロスタチン１、ドロスタチン２、ドロスタチン３、ドロスタチン４、ドロスタチン５、ドロスタチン６、ドロスタチン���、ドロスタチン８、ドロスタチン９、ドロスタチン１０、ｄｅｏ−ドロスタチン１０、ドロスタチン１１、ドロスタチン１２、ドロスタチン１３、ドロスタチン１４、ドロスタチン１５、ドロスタチン１６、ドロスタチン１７、及びドロスタチン１８；セファロスタチン、例としてセファロスタチン１、セファロスタチン２、セファロスタチン３、セファロスタチン４、セファロスタチン５、セファロスタチン６、セファロスタチン７、２５’−エピ−セファロスタチン７、２０−エピ−セファロスタチン７、セファロスタチン８、セファロスタチン９、セファロスタチン１０、セファロスタチン１１、セファロスタチン１２、セファロスタチン１３、セファロスタチン１４、セファロスタチン１５、セファロスタチン１６、セファロスタチン１７、セファロスタチン１８、及びセファロスタチン１９を含む。
【０１１３】
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４１３７２３０号；同４２４８８７０号；同４２５６７４６号；同４２６０６０８号；同４２６５８１４号；同４２９４７５７号；同４３０７０１６号；同４３０８２６８号；同４３０８２６９号；同４３０９４２８号；同４３１３９４６号；同４３１５９２９号；同４３１７８２１号；同４３２２３４８号；同４３３１５９８号；同４３６１６５０号；同４３６４８６６号；同４４２４２１９号；同４４５０２５４号；同４３６２６６３号；及び同４３７１５３３号に開示されており、その開示は出典を明示してここに援用する。
【０１１４】
メイタンシン及びメイタンシノイドは、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体と結合している。メイタンシノイドを含む免疫コンジュゲート及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第５２０８０２０号、同５４１６０６４号、欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号に開示されており、その開示は出典を明示してここに援用する。Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞毒性を有することが見出されており、インビボ腫瘍増殖アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chari等, Cancer Research, 52:127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ-２／ｎｅｕオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ.１に結合している免疫コンジュゲートが記載されている。
例えば米国特許第５２０８０２０号又は欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号、及びChari等 Cancer Research 52: 127-131 (1992)に開示されたものを含む、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するための多くの連結基が存在している。連結基は、上記特許に開示されたジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、光不安定基、ペプチダーゼ不安定基、又はエステラーゼ不安定基を含み、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。
【０１１５】
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシレート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミデートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737[1978])及びジスルフィド結合をもたらすＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノエート(ＳＰＰ)が含まれる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、一般的なカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。好ましい実施態様では、結合はメイタンシノール又はメイタンシノール類似体のＣ-３位で形成される。
【０１１６】
興味ある他の免疫コンジュゲートには、一又は複数のカリケアマイシン分子にコンジュゲートされたヒト化ＡＰ３３抗体のような抗ＨＣＶ抗体が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブピコモル濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じせしめうる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号(全てAmerican Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方とも、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって、抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞傷害効果が大きく向上する。
【０１１７】
放射性同位元素
ＨＣＶ感染細胞を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含んでいてもよい。放射性コンジュゲートした抗ＨＣＶ抗体の生産のために様々な放射性同位元素が利用される。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位元素が含まれる。コンジュゲートが診断用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばＴｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)イメージング(磁気共鳴イメージング、ｍｒｉとしても知られている)用のスピン標識、例えばまたヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射又は他の標識は、既知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるうるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばＴｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。ＩＯＤＯＧＥＮ法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
【０１１８】
抗体と細胞傷害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと。リンカーは細胞中の細胞傷害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」でありうる。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号)が使用され得る。
【０１１９】
Ｖ．薬学的組成物
本発明において有用な薬学的組成物は治療的に有効な量のヒト化抗体又はその断片と薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤（その組合せを含む）を含有しうる。
薬学的組成物はヒト及び獣医用医薬でのヒト又は動物への使用のためのものであり、典型的には薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤の任意の一又は複数を含む。治療用途のための許容可能な担体又は希釈剤は製薬分野でよく知られており、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)に記載されている。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、ヒスチジン及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料(例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質複合体)；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１２０】
薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤の選択は、投与の意図された経路及び標準的薬学的実務に関して選択することができる。薬学的組成物は、担体、賦形剤又は希釈剤として、−又はこれらに加えて−、任意の適切なバインダー、滑剤、懸濁剤、コート剤又は可溶化剤を含みうる。
保存料、安定化剤、染料及び更には香味料を薬学的組成物に提供することができる。保存料の例は、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルを含む。抗酸化剤及び懸濁剤をまた使用してもよい。
異なったデリバリー系に依存して異なった組成物／製剤条件がありうる。例を挙げると、本発明において有用な薬学的組成物は、製剤化されて、ミニポンプを使用して又は粘膜経路によって、例えば鼻用スプレー又は吸入のためのエアゾールとして又は摂取可能な溶液として、又は組成物が注射可能な形態に製剤化される非経口的に、例えばデリバリーでは、静脈内、筋肉内又は皮下経路によって投与されうる。あるいは、製剤は多数の経路によって投与されるように設計されうる。
【０１２１】
ヒト化抗体又はその断片
ヒト化抗体又はその断片はシクロデキストリンとの併用でまた使用されうる。シクロデキストリンは薬剤分子と封入及び非封入複合体を形成することが知られている。薬剤−シクロデキストリン複合体の形成は、溶解度、解離速度、生物学的利用能及び／又は薬剤分子の安定性特性を改変しうる。薬剤−シクロデキストリン複合体は殆どの投薬形態及び投与経路に対して一般に有用である。薬剤との複合体化を行わしめる代替法として、シクロデキストリンを補助添加剤として、例えば担体、希釈剤又は可溶化剤として使用することができる。α、β、及びγシクロデキストリンが最も一般的に使用されており、適切な例は国際公開第９１／１１１７２号、国際公開第９４／０２５１８号及び国際公開第９８／５５１４８号に記載されている。
薬学的組成物はまた所望されるならばリポソーム、ミクロスフィア、又は他のポリマーマトリックス中に導入することもできる。例えばリン脂質又は他の脂質からなるリポソームは、作製及び投与が比較的簡単な非毒性で、生理学的に許容可能で、代謝可能な担体である。
【０１２２】
また活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されるマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)に、あるいはマクロエマルションに捕捉させうる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A.編 (1980)に開示されている。
徐放性調合物を調製してもよい。徐放性調合物の適切な例は、アンタゴニストを含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリックスを含み、そのマトリックスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチルメタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ-グルタミン酸とγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸が含まれる。
【０１２３】
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
ヒト化抗体又はその断片は、治療されている患者においてインサイツでさえ調製されうる。この点、上記ヒト化抗体又はその断片をコードするヌクレオチド配列は、上記タンパク質が上記ヌクレオチド配列から発現されるように非ウイルス技術（例えば、リポソームの使用により）及び／又はウイルス技術（例えば、レトロウイルスベクターの使用によって）送達されうる。
薬学的組成物はここに記載の方法の何れかにおいて使用されうる。
薬学的組成物は、ＨＣＶ感染の発症を予防し又は低減／減少させるためにＨＣＶに感染しやすい患者（例えばヒト）に使用されうる。
【０１２４】
薬学的組成物は、ＨＣＶに既に感染した患者（例えばヒト）に、つまりＨＣＶ感染を治療するために、使用されうる。かかる治療は、肝臓移植を受ける感染患者を含む急性又は慢性感染者である患者からのウイルスの排除を容易にしうる。
よって、更なる態様では、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス感染の治療及び／又は予防のための方法であって、ヒト化抗体又はヒト化抗体断片又は薬学的組成物の使用を含む方法を提供する。適切には、有効量のヒト化抗体又はそのヒト化抗体又は薬学的組成物が患者に投与される。ある実施態様では、ヒト化抗体又はヒト化抗体断片は、限定するものではないが、ＨＣＶ感染の一又は複数の症状又はＨＣＶ感染の側面を寛解させることを含む有益な臨床結果を生じるために治療的に有効量で投与される。ある実施態様では、ヒト化抗体又はヒト化抗体断片は、ＨＣＶのウイルス力価及び／又はウイルス負荷を低減させるために治療的に有効な量で投与される。
【０１２５】
患者におけるＣ型肝炎ウイルス感染の治療及び／又は予防に使用されるヒト化抗体又はその断片又は薬学的組成物がまた提供される。
患者におけるＣ型肝炎ウイルス感染の治療及び／又は予防のための組成物の製造におけるヒト化抗体又はその断片又は薬学的組成物の使用がまた提供される。
抗体は、例えば免疫血清の形態で投与され得、又はより好ましくは精製された組換え又はモノクローナル抗体でありうる。所望の特異性を有する血清又はモノクローナル抗体を製造する方法は常套的であり、当業者にはよく知られている。当業者であれば、抗体を、例えば注射、挿管、座剤を介して、経口的又は局所的（その後者は受動的でありうる）、雇えば抗体を含む軟膏又は粉剤の直接的適用、又は例えば鼻用スプレー又は吸入剤を使用する能動的なもの含む様々な経路で投与することができることは分かる。抗体はまた望まれるならば組成物の一成分が適切な噴霧剤である局所スプレーとして投与することもできる。
【０１２６】
ここに記載のヒト化抗体及びその断片は、既知の方法に従って、例えば静脈内投与により、例えば、ボーラスとして又は所定の時間にわたる連続注入によって、皮下、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、関節内、滑液嚢内、くも膜下腔内、又は吸入経路で、一般には静脈内又は皮下投与によって、投与することができる。
好ましくは、投与される抗体は実質的に精製される（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判断して、好ましくは少なくとも９５％の均一性、より好ましくは少なくとも９７％の均一性、最も好ましくは少なくとも９８％の均一性）。
適切には、受動免疫治療法は、簡便には、ここに記載のヒト化抗体又はその断片の投与、及び／又は他の抗ウイルス治療化合物との併用での抗体の投与を含みうる。最近、このような受動免疫法はＨＩＶ感染を安全に治療するために使用されている（Armbruster等, J. Antimicrob. Chemother. 54, 915-920 (2004)；Stiegler及びKatinger, J. Antimicrob. Chemother. 51, 757-759 (2003)）。
【０１２７】
本発明の能動又は受動免疫法は、上述のコンセンサスペプチドエピトープのものに対して幾つかのアミノ酸差異を含む非常に希な変異体分離株（例えば以下のＵＫＮ５．１４．４によって実証されているもの）を除いて、ＨＣＶの遺伝子型１−６の何れかのウイルスでの感染に対して個体を保護又は治療することを可能にするはずである。
ある実施態様では、ヒト化抗体又はその断片は第二の治療剤との併用で投与されうる。ある実施態様では、第二の治療剤は抗ウイルス剤である。ある実施態様では、ヒト化抗体又はその断片は、第二の治療剤と組み合わされて、それと連続して、それと同時に、それと逐次的に、それとローテーションされて、又はそれと間欠的に投与される。ある実施態様では、ヒト化抗体又はその断片と第二の治療剤の併用投与は、ＨＣＶの一又は複数の症状を寛解させ、ウイルス力価及び／又はウイルス負荷を低減させ、及び／又は抑制し、及び／又はヒト化抗体又はその断片又は第二治療剤単独での治療よりもＨＣＶを予防する。
【０１２８】
ＶＩ．診断
また更なる態様では、試料中のＨＣＶの存在を決定し又は検出するための診断試験装置及び方法が提供される。該装置は、試薬として、ここに記載の一又は複数のヒト化抗体又はその断片を含みうる。抗体は例えば固形担体（例えばマイクロタイターアッセイプレート、又は特定の支持体）に固定され得、試料（例えば血液又は血清試料又は他の臨床検体−例えば肝臓生検）からＨＣＶ粒子を「捕捉する」ように機能する。捕捉されたウイルス粒子はついで例えば捕捉ウイルス粒子に結合する更なる標識試薬を添加することによって検出されうる。簡便には、アッセイはＥＬＩＳＡ、特にサンドウィッチタイプのＥＬＩＳＡの形態を採りうるが、免疫クロマトグラフィー又はディップスティックタイプアッセイを含む任意の他のアッセイ形態も原理的には採用できる（例えばラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロット）。
診断目的に対しては、ここに記載のヒト化抗体又はその断片は標識されても又は未標識でもよい。未標識抗体は他の標識抗体（第二抗体）との併用で使用できる。あるいは、抗体は直接標識されうる。広範囲の標識を用いることができ、例えば放射性核種、蛍光、酵素、酵素基質、酵素共因子、酵素阻害剤、リガンド（特にハプテン）等である。数多くのタイプのイムノアッセイが利用でき、当業者によく知られている。
【０１２９】
ここに記載のヒト化抗体又はその断片は遺伝子型１−６の何れかからのＨＣＶに結合できるので、アッセイ装置及び対応する方法はこれらの遺伝子型の何れか由来のＨＣＶを試料中に検出することができるはずである。
ある実施態様では、試料はコントロール試料と比較される。ある実施態様では、コントロール試料は、ＨＣＶに感染していることが知られている個体からのものである。ある実施態様では、個体は、遺伝子型１（例えば、遺伝子型Ｉａ及び遺伝子型Ｉｂ）、遺伝子型２（例えば、遺伝子型２ａ、遺伝子型２ｂ、遺伝子型２ｃ）、遺伝子型３（例えば、遺伝子型３ａ）、遺伝子型４、遺伝子型５、及び遺伝子型６からなる群から選択される一又は複数のＨＣＶ遺伝子型に感染していることが知られている。ある実施態様では、コントロール試料はＨＣＶに感染していないことが知られている個体からのものである。
【０１３０】
ある実施態様では、記載された治療方法の何れも、ここに記載のヒト化抗体又はその断片の何れかによる試料中のＨＣＶの決定又は検出に基づいている。ここで使用される場合、「に基づく」は、（１）ここに記載の患者の特性を評価し、決定し、又は測定すること（及び好ましくは治療を受けるのに適した対象を選択すること）と；（２）ここに記載の治療を投与することを含む。
ある実施態様では、ヒト化抗体又はその断片での治療に適した又は適していない（不適である）個体を同定する方法が提供される。
【０１３１】
薬剤
更なる態様では、ここに記載のヒト化抗体又はその断片の中和活性の効能を改善又は亢進する薬剤を同定するためのアッセイ方法が提供される。
ここに提供されるものは、Ｃ型肝炎ウイルスに対するヒト化抗体又はその断片の中和活性の効能を改善又は亢進する薬剤を同定するためのアッセイであって、（ａ）試験される薬剤に上記ヒト化抗体又はその抗原結合断片を接触させ；（ｂ）薬剤がＣ型肝炎ウイルスの感染力を中和するヒト化抗体又はその断片の効能を改善又は亢進するかどうかを決定する工程を含むアッセイである。
ある実施態様では、Ｃ型肝炎ウイルスに対するヒト化抗体又はその断片の中和活性の効能を改善又は亢進する薬剤の能力をコントロールと比較する。ある実施態様では、コントロールは、薬剤の不存在下でのヒト化抗体又はその断片である。ある実施態様では、コントロールは、プラシーボ、例えば水、生理食塩水、砂糖水等とのヒト化抗体又はその断片である。
【０１３２】
ここで使用される場合、「薬剤」なる用語は、単一の物質であり得、又は物質の組合せでありうる。
薬剤は、有機化合物又は他の化学物質でありうる。薬剤は、天然であれ人工であれ、任意の適した供給源から得ることができるか、それによって生産される化合物でありうる。薬剤はアミノ酸分子、ポリペプチド、又はその化学的誘導体、又はそれらの組合せでありうる。薬剤は更にはポリヌクレオチド分子であり得、これはセンス又はアンチセンス分子でありうる。薬剤は抗体でさえありうる。
薬剤は、ペプチド、並びに他の化合物、例えば小有機分子を含みうる化合物のライブラリーから設計され又は得られうる。
【０１３３】
例を挙げると、薬剤は天然の物質、生物学的巨大分子、又は細菌、真菌、又は動物（特に哺乳動物）細胞又は組織から作製された抽出物、有機又は無機分子、合成薬剤、半合成薬剤、構造又は機能模倣剤、ペプチド、ペプチド模倣薬、誘導体化剤、全タンパク質から切断されたペプチド、又は合成的に（例えば例を挙げると、ペプチド合成機を使用するか、組換え技術又はその組合せによって）合成されたペプチド、組換え体薬剤、抗体、天然又は非天然薬剤、融合タンパク質又はその等価物及びその変異体、誘導体又は組合せでありうる。
【０１３４】
典型的には、薬剤は有機化合物であろう。典型的には、有機化合物は二以上のヒドロカルビル基を含む。ここで、「ヒドロカルビル基」なる用語は、少なくともCとHを含み、一又は複数の他の適切な置換基を含んでいてもよい基を意味する。かかる置換基の例は、ハロ−、アルコキシ−、ニトロ−、アルキル基、環状基等を含みうる。置換基が環状基である可能性に加えて、置換基の組合せが環状基を形成しうる。ヒドロカルビル基が一を越えるＣを含んでいるなら、その炭素は必ずしも互いに結合している必要はない。例えば、炭素の少なくとも２つは適切な元素又は基を介して結合しうる。よって、ヒドロカルビル基はヘテロ原子を含みうる。適切なヘテロ原子は当業者に明らかであり、例えば硫黄、窒素及び酸素を含む。ある用途では、好ましくは、薬剤は少なくとも一つの環状基を含む。環状基は多環式基、例えば非縮合多環式基でありうる。ある用途では、薬剤は他のヒドロカルビル基に結合した上記環状基の少なくとも一つを含む。
薬剤はハロ基を含みうる。ここで、「ハロ」はフルオロ、クロロ、ブロモ又はヨードを意味する。
薬剤は、非分岐又は分岐鎖でありうる、アルキル、アルコキシ、アルキレン及びアルケニレン基の一又は複数を含みうる。
【０１３５】
ＶＩＩ．治療用途
ヒト化抗ＨＣＶ抗体及びその断片又はこれを含有する薬学的組成物は、ＨＣＶ感染の低減、排除又は阻害に有用であり、少なくとも部分的にＨＣＶ感染によって特徴付けられる任意の病理症状を治療するために使用することができる。ヒト化抗体及びその断片及び／又は薬学的組成物は、ＨＣＶ感染を治療するために使用することができるヒト化抗体及びその断片及び／又は薬学的組成物はＨＣＶ感染を予防するために方法においてもまた使用することができる。
「Ｃ型肝炎ウイルス」又は「ＨＣＶ」なる用語は当該分野でよく理解されており、フラビウイルス科のヘパシウイルス属のメンバーであるウイルスを意味する。ＨＣＶは陽性ストランドＲＮＡゲノムを持つおよそ５５−６５ｎｍ直径の脂質エンベロープウイルスである。Ｃ型肝炎ウイルス種は各遺伝子型内に幾つかのサブタイプを有する６つの遺伝子型（１−６）に分類される。ある実施態様では、患者は遺伝子型１（例えば、遺伝子型Ｉａ及び遺伝子型Ｉｂ）、遺伝子型２（例えば、遺伝子型２ａ、遺伝子型２ｂ、遺伝子型２ｃ）、遺伝子型３（例えば、遺伝子型３ａ）、遺伝子型４、遺伝子型５、及び遺伝子型６からなる群から選択される一又は複数のＨＣＶ遺伝子型に感染する。北米では、遺伝子型Ｉａが支配的で、１ｂ、２ａ、２ｂ、及び３ａが続く。欧州では、遺伝子型１ｂが支配的で、２ａ、２ａ、２ｂ、２ｃ、及び３ａが続く。遺伝子型４及び５はほぼもっぱらアフリカで見出される。
【０１３６】
ここに提供されるものは、有効量のここに記載のヒト化抗体断片を投与することを含むヒトのＣ型肝炎ウイルス感染を治療する方法である。ある実施態様では、「治療」又は「治療する」は、臨床結果を含む有益な又は望ましい結果を得るためのアプローチである。この発明の目的に対して、益な又は望ましい臨床結果は、限定されないが、次のものの一又は複数を含む：疾患から生じる一又は複数の症状の減少、疾患の程度の減少、疾患の安定化（例えば、疾患の悪化の防止又は遅延化）、疾患の進行の遅延化又は減速化、疾患状態の寛解、疾患を治療するために必要とされる一又は複数の他の医薬の用量の減少、及び／又は生活の質の増加。
【０１３７】
ある実施態様では、ここに記載のヒト化抗ＨＣＶ抗体及びその断片又はこれを含有する薬学的組成物は急性ＨＣＶ感染の治療方法において有用である。ある実施態様では、急性ＨＣＶ感染の治療は、急性ＨＣＶ感染を減少させ、除去し、又は阻害することを含む。ここで使用される「急性Ｃ型肝炎ウイルス感染」又は「急性ＨＣＶ感染」なる用語は、ＨＣＶ感染後の最初の６ヶ月を意味する。ある実施態様では、急性ＨＣＶ感染の患者は如何なる症状も発しない（つまり、急性ＨＣＶ感染の症状がない）。急性ＨＣＶ感染の患者の６０％から７０％は、急性期の間、症状を発しない。ある実施態様では、急性ＨＣＶ感染の患者は症状を発する。ある実施態様では、ここに記載の治療方法は、急性ＨＣＶ感染の一又は複数の症状を寛解（例えば発症の低減、期間の低減、重篤度の低減又は減少）させる。急性期症状を経験しない少数の患者では、症状は一般に穏やかで非特異的であり、希にしかＣ型肝炎の特定の診断に至らない。急性Ｃ型肝炎感染の症状は、食欲減少、疲労、腹痛、黄疸、痒み、及びインフルエンザ様症状を含む。ある実施態様では、急性ＨＣＶ感染の患者は遺伝子型１のＨＣＶに感染する。遺伝子型１の急性ＨＣＶインジェクション中の治療は慢性感染に必要とされる治療時間の半分で９０％を越える成功率を有している。
【０１３８】
ある実施態様では、ここに記載のヒト化抗ＨＣＶ抗体及びその断片又はこれを含有する薬学的組成物は、慢性ＨＣＶ感染を治療する方法においｔれ有用である。ある実施態様では、慢性ＨＣＶ感染の治療は、慢性ＨＣＶ感染の低減、除去、又は阻害を含む。ここで使用される「慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染」又は「慢性ＨＣＶ感染」なる用語は、６ヶ月を越えて続いているＨＣＶ感染を意味する。ある実施態様では、ここに記載の治療方法は、慢性ＨＣＶ感染の一又は複数の症状を寛解（例えば発生率の低減、期間の低減、重篤度の低減又は減少）させる。慢性ＨＣＶ感染の症状には、疲労、顕著な体重減少、インフルエンザ様症状、筋肉痛、関節痛、間欠低悪性度発熱、痒み、睡眠障害、腹痛（特に右上腹部）、食欲変化、嘔気、下痢、胃腸障害、認知変化、鬱病、頭痛、及び気分変動が含まれる。ひとたび慢性ＨＣＶが肝硬変に進行したならば、減少した肝機能又は増加した肝循環圧（門脈圧亢進症として知られる症状）の何れかによって引き起こされる徴候及び症状が現れうる。肝硬変の可能な徴候及び症状には、腹水、挫傷及び出血傾向、骨痛、静脈瘤（特に胃及び食道のもの）、脂肪便（脂肪便症）、黄疸、及び肝性脳症として知られる認知障害症候群が含まれる。ある実施態様では、慢性ＨＣＶ感染は肝細胞癌（ＨＣＣ）となりうる。慢性ＨＣＶ感染は更に慢性活動性ＨＣＶ感染及び慢性遷延性ＨＣＶ感染の二つのタイプ（その何れか又は双方がここに提供される治療方法に含まれる）に分けることができる。慢性活動性ＨＣＶ感染は肝臓に活動性損傷を生じるＨＣＶである。慢性遷延性ＨＣＶ感染は、前に存在している損傷は存在しうるけれども肝臓に現在は損傷を生じない慢性ＨＣＶ感染である。
【０１３９】
ある実施態様では、ヒト化抗体又はその断片を、肝移植術の前、同時、又はその後にＨＣＶ感染患者に投与することができる。
何れかの治療方法の幾つかの実施態様では、ここに記載のヒト化抗ＨＣＶ抗体及びその断片又はこれを含有する薬学的組成物は、ＨＣＶ感染の一又は複数の側面を抑制することを含む治療方法において有用である。ある実施態様では、ＨＣＶ感染は慢性ＨＣＶ感染である。ある実施態様では、ＨＣＶ感染は急性ＨＣＶ感染である。ある実施態様では、ここに記載の方法は、ＨＣＶ不随の研究室所見（例えば、血液中のＡＬＡＴ、ＡＳＴ、及びＧＧＴＰレベル）、ウイルス複製、ウイルス力価、ウイルス負荷、又はウイルス血症を抑制する。
【０１４０】
ある実施態様では、ここに記載の方法はウイルス力価を抑制又は低減する。「ウイルス力価」は当該分野で知られており、与えられた生物学的試料中のウイルスの量を示す。ある実施態様では、ここに記載の方法はウイルス血症を抑制又は低減する。「ウイルス血症」は当該分野では血流中のウイルスの存在及び／又は血液又は血清試料中のウイルス力価として知られている。ある実施態様では、ここに記載の方法は、ウイルス負荷を抑制し又は低減する。「ウイルス負荷」はヒトの血液中におけるＣ型肝炎ウイルスの量を意味する。Ｃ型肝炎ウイルス負荷試験（ウイルスＲＮＡ試験又はＨＣＶ ＲＮＡ試験として知られている）の結果は通常、国際単位／ｍＬ（ＩＵ／ｍＬ）又はＲＮＡコピー／ｍＬとして表される。１００万ＩＵ／ｍＬ以上のＣ型肝炎ウイルス負荷の患者は高ウイルス負荷を有していると考えられる。ウイルス量（例えば、ウイルス力価又はウイルス負荷）は、限定するものではないが、ウイルス核酸の量、ウイルス粒子の存在、複製単位（ＲＵ）、プラーク形成単位（ＰＦＵ）を含む様々な測定によって示される。一般に、血液及び尿のような流体試料では、ウイルス量は、ミリリットルのような単位流体当たりで決定される。組織試料のような固形試料では、ウイルスの量は、グラムのような重量単位当たりで決定される。ウイルスの量を決定するための方法は当該分野で知られており、またここに記載される。
【０１４１】
ある実施態様では、ここに記載のヒト化抗体及びその断片及び／又は薬学的組成物で治療された患者には急速なＨＣＶ感染進行のリスクがある。ＨＣＶ疾患進行の速度に影響を及ぼすことが報告されている因子には、年齢（年齢の増加により速い進行が伴う）、性別（男性では女性よりも疾患進行が速い）、飲酒量（疾患進行の増加速度を伴う）、ＨＩＶ同時感染（顕著に増加した速度の疾患進行を伴う）、及び脂肪肝（肝細胞中の脂肪の存在が疾患進行の増加速度に関連している）が含まれる。
何れかの方法の幾つかの実施態様では、患者は抗ＨＣＶ抗体をつくる。ある実施態様では、抗ＨＣＶ抗体は検出可能であり、例えば抗ＨＣＶ抗体はＥＬＩＳＡによって検出可能である。ある実施態様では、患者によって生産される抗ＨＣＶ抗体は中和抗体である。ある実施態様では、患者によって生産される抗ＨＣＶ抗体は非中和抗体である。
【０１４２】
ここに記載されたヒト化抗体及びその断片及び／又は薬学的組成物はまたＨＣＶ感染を予防するための方法で使用することができる。ある実施態様では、ヒト化抗体及びその断片及び／又は薬学的組成物は、ＨＣＶに感染しやすい患者においてＨＣＶ感染を予防するための方法で使用することができる。ある実施態様では、ヒト化抗体及びその断片及び／又は薬学的組成物は、またＨＣＶに暴露され又は潜在的に暴露される患者においてＨＣＶ感染を予防するための方法で使用することができる。ＨＣＶへの「暴露」とは、ＨＣＶ感染を生じうるＨＣＶとの遭遇又は潜在的な遭遇を示す。一般に、.暴露された患者は、ＨＣＶが伝染しうる経路によってＨＣＶに暴露されている患者である。ある実施態様では、患者は、ＨＣＶ感染の患者の血液あるいはＨＣＶに感染したか又は感染していない患者の血液（つまり、血液暴露のＨＣＶ感染状態が未知）に暴露されるか又は潜在的に暴露されている。ＨＣＶはしばしば血液から血液の接触によって伝染する。ある実施態様では、患者は、限定しないが、血液製剤（例えば、輸血)、「針刺し」事故、薬剤針の共有、コカインドラッグ、性交渉の相手、医原性メディカル又は歯科暴露、ボディピアッシング及び刺青に使用される針、又は母親がＨＣＶ感染の子供によって、ＨＣＶに暴露され又は潜在的に暴露されている。予防方法のある実施態様では、ここに記載のヒト化抗体及びその断片は投与される。ＨＣＶへの暴露又は潜在的暴露のとき、又は約一日、一週間、又は一ヶ月の何れか以内に投与される。
【０１４３】
ここに記載の方法の何れかのある実施態様では、患者はヒト又はチンパンジーである。ある実施態様では、患者はヒトである。ＨＣＶはヒトとチンパンジーのみに感染する。
ここに記載の方法の何れかのある実施態様では、該方法は、ヒト化抗体又はその断片を第二治療剤と組み合わせて投与することを含む。ある実施態様では、第二治療剤は抗ウイルス治療剤である。ある実施態様では、該方法は、ヒト化抗体又はその断片をは、第二の治療剤と組み合わせて、それと連続して、それと同時に、それと逐次的に、それとローテーションで、又はそれと間欠的に投与することを含む。ある実施態様では、該方法は、ヒト化抗体又はその断片と第二の治療剤の組合せを投与することを含み、ＨＣＶの一又は複数の症状を寛解させ、ウイルス力価及び／又はウイルス負荷を低減させ、及び／又は抑制し、及び／又はヒト化抗体又はその断片又は第二治療剤単独での治療よりもＨＣＶを予防する。
【０１４４】
何れかの方法の幾つかの実施態様では、ヒト化抗体又はその断片は、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、及び配列番号：１８からなる群から選択される可変重鎖ドメインと、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：１９、及び配列番号：２０からなる群から選択される可変軽鎖ドメインを含む。ある実施態様では、ヒト化抗体の断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、及びダイアボディからなる群から選択される。ある実施態様では、ヒト化抗体又はその断片はＨＣＶに結合する。ある実施態様では、ヒト化抗体又はその断片は、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質、可溶型ＨＣＶ Ｅ２タンパク質、又はＨＣＶ Ｅｌタンパク質及びＨＣＶ Ｅ２タンパク質のヘテロ二量体に結合可能である。ある実施態様では、ヒト化抗体又はその断片はＨＣＶ Ｅ２タンパク質に結合する。ある実施態様では、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質は、遺伝子型１（例えば、遺伝子型Ｉａ及び遺伝子型Ｉｂ）、遺伝子型２（例えば、遺伝子型２ａ、遺伝子型２ｂ、遺伝子型２ｃ）、遺伝子型３（例えば、遺伝子型３ａ）、遺伝子型４、遺伝子型５、及び遺伝子型６からなる群から選択されるＨＣＶ遺伝子型の一又は複数からのものである。ある実施態様では、ヒト化抗体又はその断片は、ＣＤ８１とのＨＣＶ Ｅ２タンパク質の相互作用を阻害する。ある実施態様では、ヒト化抗体又はその断片は、細胞中へのＨＣＶの進入を防止し及び／又は阻害する。ある実施態様では、細胞は肝臓細胞、例えば、肝細胞である。
【０１４５】
ＶＩＩＩ．治療経過のモニタリング
ＨＣＶ感染に罹っているか又は罹りやすい患者において治療をモニターする方法、つまり患者に投与されている治療の経過をモニターするための方法がまた提供される。該方法は、症状のある患者についての治療的処置と症状のない患者に対する予防的処置の双方をモニターするために使用することができる。特に、該方法は受動免疫をモニター（例えば投与された抗体のレベルを測定）するために有用である。
幾つかの方法は、所定投薬量の薬剤を投与する前に、患者における例えばＨＣＶ感染のレベル又はプロファイルのベースライン値を決定し、これを治療後のプロファイル又はレベルの値と比較することを含む。簡便には、ＨＣＶ感染のレベル又はプロファイルは、ここに記載のヒト化抗体又はその断片を用いて決定することができる。レベル又はプロファイルにおける有意な増加（つまり、かかる測定の平均からの一標準偏差として表される同じ試料の反復測定における実験的誤差の典型的な差よりも大きい）はポジティブな治療結果（つまり、薬剤の投与が所望の応答を達成したこと）を示している。免疫応答の値が有意には変化しないか又は減少しないならば、ネガティブな治療結果が示される。
【０１４６】
ＩＸ．臨床試験
単一用量の第Ｉ相試験を、患者、好ましくはヒトにおけるここに記載のその断片又はそれを含有する薬学的組成物の安全性を決定するために実施することができる。ヒト化抗体又はその断片は、異なった患者に、推定される効能レベルの約０．０１から始めて、有効なマウス投薬量の約１０倍のレベルに達するまで３の倍数ずつ増加させて、投与される。
治療効果を決定するために第ＩＩ相試験を更に実施することができる。ＨＣＶ感染の患者が選択される。他の選択基準は、患者が試験期間中、生存する見込みがあり、妨害しうる同時投与の医薬の使用のような複雑化させる問題を含んでいないことである。疾患進行は患者の血液プロファイルを使用してモニターすることができる。ベースライン測定に続いて、患者は治療を受け始める。患者は無作為化され、ヒト化抗体又はその断片又はプラシーボの何れかで盲検態様で処置される。効果は、プラシーボ群に対しての処置群におけるＨＣＶ感染の進行の有意な減少によって決定される。
【０１４７】
Ｘ．キット及び製造品
選択された抗原の存在又は細胞活性からの保護又はその検出において抗体と共に使用されるキットがまた供給されうる。よって、単独で、又は所望の細胞型に対して特異的な更なる抗体と併用されて、通常は容器中に凍結乾燥形態で、ヒト化抗体又はその断片が提供されうる。
標識又は毒素にコンジュゲートされうるか、又は未コンジュゲートの抗体が、バッファー、例えばトリス、リン酸塩、炭酸塩等、安定剤、殺生物剤、不活性タンパク質、例えば血清アルブミン等と共にキットに含められる。一般に、これらの材料は抗体の量に基づいて少なくとも約５重量％で存在し、通常は再び抗体濃度に基づいて少なくとも約０．００１重量％の全量で存在する。しばしば、活性成分を希釈するために不活性な増量剤又は賦形剤を含めることが望ましく、ここで、賦形剤は全組成物の約１から９９重量％で存在しうる。
本発明はまた診断キット、例えば研究、検出及び／又は診断キットを提供する。かかるキットは典型的にはここに記載のヒト化抗体又はその断片を含む。適切には、抗体が標識されるか、又は二次標識試薬がキットに含められる。好ましくは、キットには、例えばインビボイメージングアッセイを実施するための、意図された用途を実施するための指示書がラベリングされる。
【０１４８】
ある実施態様では、キットは、パッケージ挿入物を含む。パッケージ挿入物とは、治療製品の市販パッケージに常套的に含められる指示書を意味し、適応症、使用法、用量、投与法、禁忌及び／又はそのような治療製品の使用に関する注意に関する情報を含む。一実施態様では、パッケージ挿入物は、組成物がＨＣＶ感染を治療するために使用されることを示している。ある実施態様では、パッケージ挿入物は、ここに記載の治療、予防、又は診断の方法の何れかにヒト化抗体又はその断片を使用するための指示書を提供する。
ここで提供されるものは、ここに記載のヒト化抗体又はその断片を含む製造品である。ある実施態様では、製造品は、容器と該容器上に又はそれに付随したラベル又はパッケージ挿入物を含む。適切な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、症状を診断するのに有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。また、製造品は更に注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液などの製薬的に許容されるバッファーを含む第二の容器を具備してもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０１４９】
ＸＩ．一般的組換えＤＮＡ法技術
本発明は、別段の記載がない限り、一般的な化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学を用い、これは当業者の能力内にある。例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch,及びT. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ２版, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel, F. M.等. (1995及び定期補遺; Current Protocols in Molecular Biology, 9, 13, 及び16章, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)；B. Roe, J. Crabtree,及びA. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Ir1 Press; 及び、D. M. J. Lilley及びJ. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Pressを参照のこと。これらの一般的テキストの各々は出典明示によりここに援用される。
【０１５０】
本発明は、本発明の実施に際して当業者を補助するものを意味し、本発明の範囲の限定を決して意図するものではない実施例によって更に説明される。
【実施例】
【０１５１】
本発明の純粋な例示であることを意図し、よって本発明を限定するものと決して考えるべきではない実施例がまた上で検討された発明の態様及び実施態様を記載し詳述する。上記実施例及び詳細な記載は例証のために提供されるもので、限定のためではない。
【０１５２】
実施例１
材料と方法
ヒト化Ｖ遺伝子のクローニング
重鎖Ｖ領域（実施例２を参照）を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａｌ制限酵素部位を介してｐＧｌＤ２００中にクローニングした。同様に、軽鎖Ｖ領域を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ部位を介してｐＫＮ１００中にクローニングした。ｐＧ１Ｄ２００ベクターを、マルチコア（Ｐｒｏｍｅｇａ）制限消化バッファー中の２０単位のＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａｌを用いて３７℃で２時間、５μｇのＤＮＡを消化させることによってライゲーションのために調製した。ついで、１単位のエビアルカリホスファターゼを３７℃で３０分加え、６５℃で２０分間不活性化した。ついで、ベクター調製物を製造者の指示書に従ってＱｉａｑｕｉｃｋ（Ｑｉａｇｅｎ）カラムで精製した。ベクターを５０μｌに溶離させた。同様に、ｐＫＮ１００ベクターを、バッファーＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中の２０単位のＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩを用いて３７℃で１時間、５μｇのＤＮＡを消化させることによって調製した。ＤＮＡをエビアルカリホスファターゼで処理し、上述のようにして精製した。変異体Ｖ領域を含むＶ領域ＤＮＡは、ベクターｐＧＡ４又はｐＧＡｌでＧＥＮＡＲＴから供給された。挿入断片ＤＮＡ（およそ４ｕｇ）を上述のようにして消化させ、重鎖及び軽鎖断片をゲル電気泳動によってベクターから精製した。適切なバンドをゲルから切除し、Ｑｉａｑｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、製造者の指示書に従って５０μｌで溶離させた。ライゲーションは、１×リガーゼバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）及び１０単位のリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中の１又は３μｌの挿入断片ＤＮＡと１μｌのベクターを混合することによって実施した。反応を１４℃で一晩インキュベートし、２．５μｌを５０μｌのＤＨ５αコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換するために使用した。
【０１５３】
部位特異的突然変異誘発
キメラ重鎖変異体ＡＰ３３ Ｙ４７Ｗ及びＹ４７Ｆを除いて、部位特異的突然変異誘発はＧＥＮＥＡＲＴ社に外部委託することによって実施した。キメラ重鎖突然変異誘発は次のオリゴヌクレオチドを使用して実施した：
AP33_Y47F_F: AATAAACTTGAGTTCATGGGATACATAAGT
AP33_Y47F_R: ACTTATGTATCCCATGAACTCAAGTTTATT
AP33_Y47W_F: GAATAAACTTGAGTGGATGGGATACATAAG
AP33_Y47W_R: CTTATGTATCCCATCCACTCAAGTTTATTC。
【０１５４】
突然変異誘発ＰＣＲ反応は、２０ｎｇのＶＨ．ｐＧｌＤ２００（キメラ重鎖コンストラクト）及びＩｘ Ｆｕｓｉｏｎマスターミックス（ＮＥＢ）と組み合わせて、０．５マイクロモル濃度の最終濃度でオリゴヌクレオチドを使用した。ＰＣＲ条件は、９８℃で３０秒間、ついで１２サイクルの９８℃で１０秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で２分１５秒間であった。ＰＣＲ反応が完了したところで、２０単位のＤｐｎＩを３７℃で１時間、各ＰＣＲ反応に加えた。２μｌのＰＣＲ消化混合物を用いて、５０μｌのＸＬ−Ｉブルーコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換した。
組換えキメラ及びヒト化重鎖ＲＨＡ、ＲＨｂｃｄｅｆｇｈ（ＲＨｂ−ｈ）及びヒト化軽鎖ＲＫＡ及びＲＫ２ｂｃを、抗体発現ベクターｐＧｌＤ２００及びｐＫＮＩＯＯ中にそれぞれクローニングした。プラスミドＤＮＡを、適切なＱｉａｇｅｎプラスミド精製キットを使用して調製した。
【０１５５】
電気穿孔法
Ｃｏｓ７細胞を増殖させ、トランスフェクション前の日に１：３に分割した。対数期Ｃｏｓ７細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１０７細胞／ｍｌで再懸濁させ、７００μｌの細胞を電気穿孔キュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中に分注した。それぞれ５μｇの重鎖及び軽鎖コンストラクトを細胞と混合し、１．９ＫＶ及び２５μＦで電気穿孔した。細胞を室温に１０分間放置して回収し、１０ｃｍ２組織培養プレート上のＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）／１０％ＦＣＳ／ペニシリン５００Ｕ／ｍｌ／ストレプトマイシン５００μｇ／ｍｌを含む８ｍｌのＤＭＥＭに加えた。上清を３日後に収集し、抗体濃度をＥＬＩＳＡによって分析した。
【０１５６】
ＩｇＧ１ ＥＬＩＳＡ
Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを０．４μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体で被覆し、４℃で１ヶ月以上保存した。使用前に、プレートを、ＰＢＳ／０．０２％のＴｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）で３回洗浄した後、ＰＢＳ／０．０２％のＴｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）／０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡでブロックした。プレートを前のようにして洗浄し、試料上清を、倍希釈を使用して所定の濃度範囲にわたって添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを前のようにして洗浄し、１：５０００希釈でヤギ抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートした。プレートを前のようにして洗浄した後、１５０μＬのＫブルーワン−ステップ基質（Ｎｅｏｇｅｎ）を加えた。１０分後、反応を、５０μＬのレッドストップ溶液（Ｎｅｏｇｅｎ）を用いて停止させ、光学密度を６５５ｎｍで測定した。
【０１５７】
ペプチドＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ）をストレプトアバジン（Ｓｉｇｍａ Ｓ０６７７）（１００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭのクエン酸ｐＨ５．０中ｌ０μｇ／ｍｌ、ｌ００μｌ／ウェルｌ）で被覆し、１ヶ月まで４℃で保存した。使用前に、プレートを、ＰＢＳ／０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、３７℃で１時間、２００μｌのＰＢＳ／２％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）でブロックした。ついで、プレートを前のようにして洗浄し、１００μｌのペプチド（ＳＥＣバッファー中０．５μｇ／ｍｌ）を３７℃で１時間添加した。全ペプチドはビオチン化リンカー配列ＧＳＧＫ−ビオチンを含んでいた。プレートを前のようにして洗浄し、１００μｌの抗体上清をＳＥＣバッファー中で連続２倍希釈して加え、１時間インキュベートした。プレートを前のようにして洗浄し、１：５０００希釈（ｌ００μｌ／ウェル）のＨＲＰコンジュゲート抗ヒトκ抗体（Ｓｉｇｍａ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。プレートを前のようにして洗浄し、１５０μｌのＴＭＢワンステップＫ−ブルー基質（Ｎｅｏｇｅｎ）を１０分加え、室温で暗所に保存した。反応を５０μｌのレッドストップ（Ｎｅｏｇｅｎ）で停止させた。光学密度を６５５ｎｍで測定した。
【０１５８】
ＨＣＶｐｐ感染アッセイのための抗体の調製
ＨＣＶｐｐ実験を実施するために、ＣＯＳ７細胞トランスフェクション上清からの抗体を精製し、プロテインＡ精製によって濃縮した。各キメラ又はヒト化抗体に対して、Ｐｒｏｓｅｐ−ｖＡビーズ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を再懸濁させ、４００μｌを１０ｍｌの使い捨てクロマトグラフィーカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）に加え、２０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。ＣＯＳ７トランスフェクション上清（およそ１５０ｍｌ）を重力流下でカラムに加えた。ついで、カラムをＰＢＳ（２０ｍｌ）で洗浄し、０．５ｍｌのＩｍｍｕｎｏｐｕｒｅ ＩｇＧ溶離バッファー（Ｐｉｅｒｃｅ）で溶離させた。溶離物を２０μｌの１Ｍのトリス／ＨＣＬ（ｐＨ７．６）で中和させ、３リットルのＰＢＳ中０．５ｍｌのＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｓｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ）で４℃で一晩透析した。
【０１５９】
ＨＣＶ偽粒子感染アッセイ
遺伝子型１、２、３、４、及び６に対するＨＣＶｐｐを、ＨＣＶ糖タンパク質配列。ＭＬＶ ｇａｇ−ｐｏｌ及びルシフェラーゼレポーターをコードするプラスミドをＨＥＫ細胞に形質移入することによって作製し、ついで条件培地を濃縮し、２０％スクロースのクッションを通して超遠心分離によって部分的に精製した。Owsianka A.等, J Virol 79: 11095-104 (2005)を参照。遺伝子型５に対するＨＣＶｐｐを、遺伝子型５偽粒子の感染性に悪影響を与えたので、スクロース勾配を通しての部分的な精製工程を省いたことを除いて、同様にして作製した。細胞培養培地中での各抗体の３倍希釈をＨＣＶｐｐと混合し、抗体／ＨＣＶｐｐ混合物を３７℃で１時間インキュベートし、ついで３組のウェル中のヒトｈｅｐａｔｏｍａＨｕｈ−７標的細胞に加えた。３７℃での４時間のインキュベーション後に、接種材料を除去し、新鮮培地で置き換えた。３日後、細胞を可溶化し、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。複数のウェルを、抗体の不存在下でＨＣＶｐｐに感染させ、全ての結果をこの「抗体なし」コントロールのパーセントとして表す。次の実験で使用したＨＣＶの遺伝子型を表３に示す。
【０１６０】
0005763344.tif 000004
【０１６１】
ＡＰ３３分子モデリング
ＲＣＳＢタンパク質データバンク中においてＡＰ３３に対して最も近いＶＨ及びＶＫ構造は、それぞれ１ＤＱＤ＿Ｈ（８４％同一性）及び１ＥＧＪ＿Ｌ（９１％同一性）であった。１ＤＱＤ＿Ｈ ＶＨ及び１ＥＧＪ＿Ｌ ＶＫ構造を単一のテンプレート構造中に組み合わせた。ＡＰ３３配列（表４）を、組み合わせたテンプレート配列とアラインさせた。重鎖及びκ軽鎖ＣＤＲ長は、Ｈ３ループを除いてＡＰ３３のものと同一であった。ＡＰ３３のホモロジーモデルは、Ｍｏｄｅｌｅｒソフトウェアを使用し、この組み合わせたテンプレートに基づいて生成させた。Fiser A.等, Protein Sci 9:1753-73 (2000)；Fiser A.及びSali A., Methods Enzymol 374:461-91 (2003)；及びSali A.及びBlundell TL., J MoI Biol 234:779-815 (1993)を参照のこと。
【０１６２】
0005763344.tif 000005
【０１６３】
結果
ＨＣＶは６の遺伝子型に属していると記載されているが、更にサブ遺伝子型に細分される。感染した個体は最初の感染から由来した一群の変異遺伝子型を有している。ＡＰ３３が結合するＨＣＶタンパク質Ｅ２タンパク質の領域が通常はＨＣＶ遺伝子型の間で保存され、ＡＰ３３抗体が交差遺伝子型特異性を示している。従って、ヒト化ＡＰ３３が種交差反応性を保持することを確保することが重要であった。
ヒト化抗体を試験する最も効果的な方法は、Ｈｕｈ−７細胞のＨＣＶ偽粒子感染のブロッキングを示すＡＰ３３(Yagnik A.T.等, Proteins 40:355-66 (2000))を用いて実施された実験を複製することであった。しかしながら、偽粒子感染研究は、ヒト化プロセス中に生成される多数の変異体に適用されるならば、ロジスティックな問題を引き起こしたであろう比較的多量の抗体を必要とした。従って、ペプチドＥＬＩＳＡ解析を用いて、様々なＨＣＶ遺伝子型に対して抗体変異体の初期スクリーニングを実施した。
【０１６４】
Ｄ３ペプチドは、ＨＣＶ遺伝子型の間に保存されているとして、Anonymous, J Viral Hepatology 6:35-47 (1999)によって同定された配列である；ペプチドＢｌ、Ｃｌ、Ｈ３及びＧ３は、代替のＨＣＶ遺伝子型変異体を表し、ペプチドＨ６はファージディスプレイによって同定されたＡＰ３３に対するミモトープである。これらのペプチドの各々は、ヒト化の成功を測定するためのプローブとして使用した。配列を表５に示す。
0005763344.tif 000006
【０１６５】
実施例２−ＡＰ３３ＲＨＡに対するヒトＶＨフレームワークの選択
ＡＰ３３ＶＨのＶｅｒｎｉｅｒ、Ｃａｎｏｎｉｃａｌ及びＶＬ界面残基（ＶＣＩ残基）と最も高い同一性を有し、同じサイズのＣＤＲ１及び２を有するヒトＶＨ配列を図１４に示し、最適なドナーフレームワークを選択するために使用する。Foote J.及びWinter G., J MoI Biol 224:487-99 (1992)及びChothia C.等, JMoI Biol 186:651-63 (1985)を参照のこと。FW同一性スコアをまた示す。Ａ０３９０７、Ｄｌ．３マウス抗リゾチームＶＨを除いて、ヒト化抗体、マウス抗体又はｓｃＦｖである配列をまた省いた。界面残基は、ＣＤＲから離れて埋められる傾向がある一方、Ｖｅｒｎｉｅｒ及びＣａｎｏｎｉｃａｌ残基はＣＤＲに近くなる傾向がある。
全体的ＶＣＩ同一性に関して、Ｕ８６５２５が最も高いスコアを有していた（ＶＣＩスコアに対して１７のうち１４と、フレームワークに対して８６のうち８０）（図１４）。上の１８のヒト配列は全て１４のＶＣＩスコアを有している一方、フレームワークのスコアは８６のうち６１以下から変化した。マウス抗体配列と比較したときに最も保存性が少なかったＶＣＩ残基の差は７１位と９４位（Ｋａｂａｔ番号付け）でであった。
【０１６６】
完全なヒトＶＨ配列（図１５及び１６）の解析は、Ｕ８６５２５、Ｓ６７８２６、４２０７１、４２０６９、４２０６８、Ｓ６７８２７がＦＷにおいて希なＣｙｓ又はＰｒｏ残基を有していなかったことを示した。しかしながら、Ｕ８６５２５はＳ６７８２６よりもより非保存的な残基差を含んでいた（つまり、残基２３、４０、８１、及び９２：図１６の番号付けを使用）。従って、ＣＬＬリンパ腫の患者から取り出されたＳ６７８２６抗体ＶＨ（Mierau R.等, Rheumatol Int 12:23-31 (1992)）を、ドナーマウスＡＰ３３ ＶＨ ＣＤＲに対するフレームワークアクセプターとして作用するものとして選択して、ＡＰ３３ＲＨＡを生産した。図１３はＡＰ３３ＨとＳ５６８２７の間の比較を示す。
【０１６７】
実施例３−ＡＰ３３ＲＨＡのためのリーダー配列の選択
最初のヒト化は、ＡＰ３３ＶＨからアクセプターＳ６７８２６ Ｋａｂａｔ ＦＷ１、２、３、４へのＫａｂａｔ ＣＤＲ１、２及び３の移植である（図１８）。この配列は、Ｓ６７８２６と最も近い配列同一性を有している生殖系列遺伝子ＶＨ４−５９からのシグナルペプチドの付加を必要とする（図１７）。我々は、このリーダー（図１７）が、Ｓ６７８２６ＦＷｌ配列に先行する場合シグナルペプチダーゼで切断することを確認するためにＳｉｇｎａｌＰ(Foote J.及びWinter G., J MoI Biol 224:487-99 (1992)) (V2.0.b2)サーバーを使用した。図１８は、ＡＰ３３ＣＤＲをヒトＦＷ中に挿入することによってＡＰ３３ＲＨＡタンパク質とＤＮＡ配列を生成することを示している。そのリーダーを含むＡＰ３３ＲＨＡのＤＮＡ配列を以下に示す（６１／００６０６６の表１３に既出）：
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ＡＰ３３ＲＨＡのリーダーを伴うＤＮＡ配列。イタリックの大文字テキストはリーダー配列を示し、小文字テキストはＦＷを示し、大文字太字はＣＤＲ配列を示す。
ＶＨ４−５９シグナルペプチドを含むＡＰ３３ＲＨＡの完全なタンパク質及びＤＮＡ配列は図１９に示す。
【０１６８】
実施例４−ＡＰ３３ＲＫＡ及びＡＰ３３ＲＫ２のためのヒトＶＫフレームワークの選択
ＡＰ３３Ｋとのヒト生殖系列ＶＫ遺伝子の比較により、ＣＤＲ１に対して同じｃａｎｏｎｉｃａｌループ長を持つものがないことが明らかになった（図２０）。ヒト軽鎖遺伝子の我々のデータベースから正しいＣＤＲ１ループ長を持つと同定された配列は、ヒト化抗体か又はｓｃＦｖｓであった（図２１）。マッチしないＣＤＲ１長を持つがマッチするＣＤＲ２／３長を持ち、Ｖｅｒｎｉｅｒ、Ｃａｎｏｎｉｃａｌ及びＶＨ界面残基でのＡＰ３３ＶＫと最も高い同一性（ＶＣＩスコア）を有するヒトＶＫ配列を選択し、ＡＰ３３ＶＫに対するＦＷ同一性のそのスコアと共に図２２に示す。ヒト化抗体、マウス抗体又はｓｃＦｖである配列は省略した。
図２３ＡはＡＰ３３ＶＫに最もマッチするヒトＶＫの完全配列を示す。これらの配列のＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントを図２３Ｂに示し、保存された残基を示す。ＡＰ３３，にマッチするヒトｃａｎｏｎｉｃａｌＣＤＲ１ループ長がないため、我々は異なったループＣＤＲ１長の２つのヒトフレームワークを選択する。配列Ｘ６１１２５(Chothia C.等, J Mol Biol 186:651-63 (1985))は最も高いＶＣＩスコアを有し、ＣＤＲｌの２残基はＡＰ３３より長く、８０位はアラニンで、ＡＰ３３ＶＫにマッチする。このため、我々はこの配列をＡＰ３３ＲＫＡを生産するための第一ドナーフレームワークとして選択する。ＡＹ６８５２７９(Ghosh S.等, J Immunol 174:2860-9 (2005))はＡＰ３３より短いＣＤＲ１の４−残基を有し、８０位は生殖系列ファミリーに典型的なプロリンである。加えて、ＡＹ６８５２７９は高いＶＣＩ及びフレームワークスコアを有し、その配列には希なプロリン又はシステイン残基がない。これらの基準下で、ＡＹ６８５２７９を、ＡＰ３３ＲＫ２を生産するための第二フレームワークドナーとして選択した。
【０１６９】
実施例５−ＡＰ３３ＲＫＡ及びＡＰ３３ＲＫ２のためのリーダー配列の選択
Ｘ６１１２５に対する最も近いヒト生殖系列ＶＫ遺伝子はＶＫＩＶ−Ｂ３であり、これは、リーダー配列の自然の選択であろう。Ｘ６１１２６のＦＷ１と近接するこのリーダーを用いた予測的ＳｉｇｎａｌＰアルゴリズム(Nielsen H.等, Protein Eng. 10: 1-6 (1997))の使用は、シグナルプロテアーゼ切断が正しい位置でなければならないことを示している（図２７）。同様に、ＡＹ６８５２７９に最も近い生殖系列遺伝子はＶＫＩ−０１２／０２である。再び、ＡＹ６８５２７９のＦＷ１に近接する場合、ＶＫＩ−０１２／０２のリーダー配列は正しく切断されることが予測される（図２８）。
【０１７０】
実施例６−ＡＰ３３ＲＫＡ、ＡＰ３３ＲＫ２、ＡＰ３３ＲＫ３及びＡＰ３３ＲＫ４配列の生成
Ｘ６１１２５１のＦＷ１、２、３及び４間へのＡＰ３３ＶＫ ＣＤＲのタンパク質及びＤＮＡ配列の挿入を、Ｂ３リーダーのＤＮＡ配列と共に（ＡＰ３３ＲＫＡ）、図３０に示す。ＡＹ６８５２７９のＦＷ１、２、３及び４中へのＡＰ３３ＶＫ ＣＤＲのタンパク質及びＤＮＡ配列の挿入を、ＶＫＩ−０１２／０２のＤＮＡ配列と共に、図３１に示す。完全なＡＰ３３ＲＫＡ及びＡＰ３３ＲＫ２配列をその結合した各リーダー配列と共に図３４−３６に示す。
二つの更なる軽鎖フレームワークを、それぞれヒト化κ軽鎖ＲＫ３及びＲＫ４になったヒト配列ＡＢ０６４１３３及びＡＢ０６４０７２に基づいて試験した。ＡＢ０６４１３３の選択は図２４−２６及び２９に示す。ＶＣＩ残基は図１３に記載される一方、ＲＫ３及びＲＫ４双方に対するタンパク質及びＤＮＡ配列を図３２−３４及び３７−３８に示す。ＲＫ３が選択されたが、それはそれが異なった生殖系列ファミリー、つまりＶκ５由来であるからである。ＡＢ０６４０７２は、組換え抗体コンストラクトに使用される場合、歴史的には発現が乏しいものであったＫａｂａｔ ＶＫＩＶサブグループのメンバーであったけれども、この特定のヒトフレームワーク配列はヒト化抗体の一部の場合、我々の手ではよく発現することが過去に示されている。
【０１７１】
実施例７−組換え重鎖及び軽鎖の発現
組換え抗体Ｖ領域をＣｏｓ７細胞の一過性形質転換によって発現させた。キメラＡＰ３３重鎖又は軽鎖ＤＮＡコンストラクトをポジティブなコントロールとして使用し、適切なヒト化抗体コンストラクト鎖を同時形質移入した。最初は、未変異のＲＨＡ及びＲＨｂ−ｈ（全ての７の非保存ｖｅｒｎｉｅｒ領域ＶＣ逆突然変異）及びＲＫＡｂｄ及びＲＫ２ｂｃを試験した。ＲＫ２ｂｃは逆変異される共に衝突するＶＣ残基を有している。軽鎖ＲＫＡは置換された２つの残基を有していた；ＶＣ残基Ｙ３６Ｆ、及びＡｓｎは１０７位で非常に希であるので、Ｌｙｓでまた置き換えられた（ＲＫＡｂｄ）。ＲＫＡｂｄ発現は非常に低く、実行可能な実験及び市販レベル以下であったことが留意された（表９）。続く実験では、表６に示されるように、ＲＫＡｂｄに潜在的なスプライス部位変異Ｇ３８０Ｃを除去し、リーダーＢ３からＬＩ１（我々の経験から他の軽鎖遺伝子において効果的に作用した）へリーダー配列を交換することを含む修飾がなされた。また、他の者は、アミノ酸置換Ｄ９ＳがＶＫＩＶ遺伝子の発現のレスキューに効果的であったことを報告した。Saldanha J.W.等 JMoI Biol Immunol 5391(22436):487709-99719 (1992)を参照のこと。これらの修飾の何れもバックグラウンドを越える発現レベルを回復させるのに効果的ではなかった。
【０１７２】
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更に、代替軽鎖コンストラクトＲＫ３及びＲＫ４はまた極めて低い発現レベルを示している（表９）。ＲＫ２のみがヒト化抗体を生産するのに適したレベルで発現されうる。
【０１７３】
実施例８−Ｅ２ペプチドに対するＲＨｂ−ｈ／ＲＫ２ｂｃの結合
Ｃｏｓ７形質移入からの上清を用いて、ヒト化抗体ＲＨｂ−ｈ／ＲＫ２ｂｃの結合をキメラ抗体と比較した。図１を参照のこと。
Ｈ６ミモトープへの抗体結合の結果は、ＲＨＡ内に導入されるｖｅｒｎｉｅｒ領域(Foote J.及びWinter G., JMoI Biol 224:487-99 (1992))及びcanonical残基 (Chothia C.等, J Mol Biol 186:651-63 (1985), 及びChothia C.等, Nature 342:877-83 (1989))が結合に必要であることを示唆している。抗体ＲＨｂ−ｈ／Ｖ１のＨ６ペプチド結合はキメラ抗体（Ｖｈ／Ｖ１）ポジティブコントロールに最も近く、完全にヒト化されたＲＨｂ−ｈ／ＲＫ２ｂｃ抗体よりも良好であり、ヒト化軽鎖がキメラ軽鎖ほど良くないことを示唆している。これは、キメラ軽鎖ＲＨＡ／Ｖ１と比較された場合、ＲＨＡ／ＲＫ２ｂｃの特に乏しい結合によって強調される。
この実験からの結論は、重鎖ＲＨｂ−ｈが抗原結合に重要なＡＰ３３ＶＨにおける構造的特徴の多くを保持しているが、ヒト化軽鎖はそれほど良好ではないことである。しかしながら、同じＬ１ループ長を持つマウス軽鎖遺伝子のヒトオルソログの欠如はヒト化に対する潜在的な問題と予測された
【０１７４】
実施例９−ヒト化重鎖界面残基Ｑ３９によって媒介される重鎖及び軽鎖間の界面は最適以下の結合の原因ではない
軽鎖の乏しい機能のための一つの説明は、重鎖及び軽鎖間の界面残基が不適合であったことである。Chothia C.等, J MoI Biol 186:651- 63 (1985)を参照。３９位の界面グルタミン残基をマウス均等物、つまりＲＨｂ−ｈのリジンに逆突然変異させ、新しい重鎖をＲＨＩとした。
ＲＫ２ｂｃ又はキメラ軽鎖との対をなしたＲＨＩの結合はＨ６ペプチドへの結合の改善に失敗し、界面残基Ｑ３９Ｋが図２に示される最適以下の結合の原因ではないことを示唆している。
【０１７５】
実施例１０−ある範囲のＥ２ペプチドへのＲＨｂ−ｈの結合
異なったＨＣＶ遺伝子型へのヒト化抗体の結合を推定するために、表５に示したペプチドをある範囲のＥ２変異体のための代用物として使用した。キメラ軽鎖Ｖ１と対となったＲＨｂ−ｈのペプチド結合を図３Ｂに示す。結果は、ヒト化重鎖がある範囲のペプチドに結合するが、図３Ａに示されたキメラ抗体Ｖｈ／Ｖｌほど効果的ではないことを示している確かに、ヒト化抗体はペプチドＢｌには結合しないようである。結果は、重鎖における未保存ｃａｎｏｎｉｃａｌ及びｖｅｒｎｉｅｒ領域残基の置換は完全な範囲のペプチド抗原結合を保持するには不十分であったことを示している。
【０１７６】
変異体ＡＰ３３エピトープを有するペプチドが保存された変化を有しており、例えばＢｌがＧｌｎをＡｓｎに置換し、ペプチドＣ２及びＧ３がＩｌｅからＶａｌへ置換されていることに留意することは興味深い。これらの小さい残基への保存的変化はエピトープの収縮を表しうる。これは、ＡＰ３３及びヒト化抗体上の抗原接触残基が変更されてそれらにより大なる到達距離を付与するという可能性を生じる。この効果は、短いエピトープ残基を含みＡＰ３３への弱い結合を示すＨＣＶ遺伝子型への抗体の結合を亢進させることでありうる。ヒト化抗体はＢ１ペプチドへの結合に失敗するが、この配列はＨＣＶの感染分離体に見出されていないことに留意することがまた重要である。
【０１７７】
実施例１１−ＲＫ２への最小の変異の同定
未保存で、ＲＫ２軽鎖において変異された（変異ｂ（Ｙ３６Ｆ）及び変異ｃ（Ｇ６８Ｒ））ものは２のＶＣ残基のみであった。各ＶＣ変異をヒト等価残基Ｙ３６及びＧ６８に逆変異させた。結果（図４）は、変異ｂは軽鎖活性に必須であるが、変異ｃはそうではないことを示している。
【０１７８】
実施例１２−重鎖ヒト化に必要な最小数のＶＣ変化の同定
ＲＨｂ−ｈヒト化に必要な最小数のＶＣ変異残基を同定するために、表７及び８に示すように、各変異ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈを元のヒト配列に逆変異させた。また図４２Ａ−Ｇを参照のこと。
0005763344.tif 000010
0005763344.tif 000011
【０１７９】
変異の効果は、異なった型のヒト化抗体の表５に記載したペプチドへの結合を比較することによって評価した。結果を図５に示し、Ｈ６への最大結合の割合として各データセットを表すことによって正規化した。抗体ＲＨ−Ｆからの結果は、ＶＣ変異Ｆ（Ｖ７１Ｒ）の不存在が抗体の結合に有意に影響を及ぼしたことを示唆している。従って、ヒトからマウス配列への全ての他のＶＣ変異が存在しているにも拘わらず、７１位のアルギニンは最適な結合のために執拗である。結合を検出することができた全ての場合において、ＲＨ−Ｆはペプチドにより弱く結合した。しかしながら、逆変異された変異体によるペプチドＧ３への結合はまた元の変異Ｓ３０Ｔ（ｂ）、Ｉ４８Ｍ（ｄ）及びＶ６７Ｉ（ｅ）が結合親和性のために重要であることを特定した。変異Ｆ７８Ｙ（ｇ）及びＲ９４Ｌ（ｈ）は本質的に区別できず（ＲＨｂ−ｈ標準と比較した場合、逆変異されたときにほんの僅かだけ少ない結合を示す）、ペプチド結合に重要であるとは思われなかった。しかしながら、抗体型ＲＨ−Ｃは、ＲＨｂ−ｈを含む全ての他の変異体に対してペプチドＧ３及びＣ２への結合の増加を生じた（図６）。この場合、変異ｃ（Ｗ４７Ｙ）は存在せず、ヒトトリプトファン残基は保持されている（しかしＶＣ変異Ｓ３０Ｔ、Ｉ４８Ｍ、Ｖ６７Ｉ、Ｖ７１Ｒ、Ｆ７８Ｙ、及びＲ９４Ｌは存在している）。これを元に、重鎖変異体ＲＨ−Ｃを含むヒト化抗体を選択してＨＣＶｐｐアッセイで試験し、ＲＨｂ−ｈと比較した。ヒト化抗体ＲＨ−Ｈ（ここでは、変異ｈ（Ｒ９４Ｌ）は存在しない）をまたＨＣＶｐｐアッセイでの試験に含めた。Ｒ９４Ｌ変異は、Ｈ３ループを支持するｃａｎｏｎｉｃａｌ及びｖｅｒｎｉｅｒ領域残基であり、我々は、Ｈ３ループの破壊がＨＣＶｐｐ感染の阻害に悪影響を及ぼしたかどうかを決定することを希望した。これらの重鎖をヒト化軽鎖変異体ＲＫ２ｂと同時発現させた。
【０１８０】
実施例１３−ＨＣＶ偽粒子感染アッセイ
３つのヒト化抗体をＨＣＶｐｐ感染アッセイにおいて試験した。全てのヒト化重鎖は軽鎖ＲＫ２ｂと対形成させた。ペプチド結合データは、重鎖ＲＨｂ−ｈ、ＲＨ−Ｃ及びＲＨ−Ｈの間に殆ど差を示唆しなかったが、図７及び８に示されたデータは、ＲＨ−ＣがＨＣＶｐｐ感染の最善のインヒビターであることを示唆していた。ＲＨ−Ｃ抗体は、ＨＣＶｐｐ感染の阻害についてポジティブコントロールキメラＡＰ３３と少なくとも同様に効果的であったが、他のヒト化抗体ＲＨｂ−ｈ及びＲＨ−Ｈは有意に効果が少なかった。４つの実験に対するＩＣ５０及びＩＣ９０は表３に示され、ヒト化抗体が全ての遺伝子型にわたってキメラ抗体のものと非常に類似したＩＣ５０及びＩＣ９０値を示すことを示している。
【０１８１】
この結果は、ＲＨ−Ｃにおける逆突然変異の位置（つまり、残基位置４７）がｖｅｒｎｉｅｒ残基及び界面残基の双方であり、元のヒトＦＷ中に見出されるトリプトファン残基が重鎖と軽鎖の間の界面を改善するか、又はＨ２ループを良好に支持するか、又は双方をなしうることを示唆している（図９及び１０）ので、予想できない。また、トリプトファン残基は図９に同定された親油性領域を増大しえ、おそらくは結合に寄与する。
ＡＰ３３エピトープ中に存在するトリプトファン残基は、ＡＰ３３結合にとって重要であることが示されている。Tarr A.W.等, Hepatology 43:592-601 (2006)を参照のこと。マウス重鎖残基Ｙ４７の位置は、ヒト化抗体において変異されているｖｅｒｎｉｅｒ及びｃａｎｏｎｉｃａｌ残基の位置をまた示している図１０に示されている。Ｙ４７残基はＣＤＲの親油性領域の直ぐ下にあり、Ｙ４７Ｗ変異が親油性領域のベースのギャップを満たすのを補助するというのが合理的な仮説である。
【０１８２】
Ｙ４７Ｗ変異によって媒介される改善された結合の性質を解明するのに役立つ一つの方法は抗体Ｅ２結合の動態解析である。しかしながら、我々は、ＲＨ−Ｃ及びＥ２タンパク質環の相互作用の動態解析を実施することができなかった。ＨＣＶ Ｅ２タンパク質は精製されると凝集体を形成する。不幸にも、これまで利用できなかった単量体Ｅ２タンパク質が抗体に対する結合親和性を測定するために必要である。
ペプチド解析からのデータは、重鎖型ＲＨ−Ｇ及びＲＨ−Ｈの結合間には非常に僅かな差があることを示唆している。ＨＣＶ偽粒子実験においてＲＨ−Ｃと組み合わせてこれらの型を試験することは興味深い。これらの残基はそれぞれＨ２及びＨ３ループを支持するのを助けるかもしれないので、結合と阻害についてポジティブな効果がありうることはもっともらしい。
【０１８３】
実施例１４−キメラ変異体ＡＰ３３ Ｙ４７Ｆ及びＹ４７Ｗの分析
結合への残基Ｙ４７の寄与を更に調査するために、２つのキメラ重鎖変異体Ｙ４７Ｗ及びＹ４７Ｆを作製した。これら双方の変異体はキメラ軽鎖、Ｖ１と関連して発現しており、ＨＣＶｐｐ感染アッセイ及びペプチド結合においてＡＰ３３と比較した。ペプチド結合実験からのデータ（図１１）は、残基チロシン４７をフェニルアラニン又はトリプトファンとの置換によってより疎水性にすることにより、ある種のＥ２ペプチド、特にペプチドＢ１（遺伝子型２ａ）に対する結合を改善しうることを示唆している。しかしながら、図１２に示される遺伝子型Ｉａ（分離体１ａＨ７７．２０由来）に対するＨＣＶｐｐ感染アッセイで抗体が使用される場合、Ｙ４７Ｗ又はＹ４７Ｆ変異による阻害の亢進はなかった。従って、様々な遺伝子型についてＡＰ３３中のＹ４７Ｗ変異が一般に感染阻害の抗体力価を改善しうるかどうかを決定するためにＨＣＶｐｐ感染アッセイを実施する必要があるが、ＲＨ−Ｃにおける改善されたＹ４７Ｗ変異がヒト化に特異的であることが結論されうる。
【０１８４】
実施例１５  材料と方法
次の材料と方法を実施例１５Ａ−Ｃに記載の実験に対して使用した。
バキュロウイルス発現された可溶型Ｅ２（ｓＥ２）の生産
ｓＥ２発現：可溶型Ｅ２（ｓＥ２）を、過去に記載されたようにして、アミノ酸６６１で切断して膜貫通ドメインを欠失させることによって（ｓＥ２６６１）、生産した。Roccasecca, R.等, J Virol 77:1856-67 (2003)参照。ｓＥ２６６１をバキュロウイルストランスファーベクター中にクローニングし、ＢａｃＰａｋ６線形化ウイルスＤＮＡ(BD Clontech)と同時形質移入し、接着Ｓｆ−９昆虫細胞中に入れ、２７℃でＥＳＦ９２１  タンパク質を含まない培地(Expression Systems, LLC)中で培養した。得られたウイルスストックを、大規模なタンパク質生産に使用する前に標準的なバキュロウイルス法を使用して２回増幅させた。製造はWave(TM)バイオリアクター(GE Bioscience)中で行った。１０リットルのＴ．ｎｉ Ｐｒｏ細胞(Expression Systems, LLC)培養物を２×１０６細胞／ｍＬまで増殖させ、５０ｍＬの上記のようにして調製されたウイルスストックに感染させた。上清を３０００ｘｇで１５分遠心分離することによって感染後４８時間で収集し、精製前に、０．２μＭのフィルターを通して濾過した。
【０１８５】
ｓＥ２精製：１０Ｌのバキュロウイルス上清を５０ｍＬのニッケル−ＮＴＡ樹脂と共にバッチ化した。ＰＢＳ＋０．３ＭのＮａＣｌ中２５０ｍＭのイミダゾールを用いて、ＨＩＳタグ可溶型Ｅ２を樹脂から溶離させた。溶離物を２０ｍＭの酢酸Ｎａ，ｐＨ５．０中に希釈し、３４ｍＬのＳｐＦＦカチオン交換カラムに充填し、タンパク質を０．３ＭのＮａＣｌを含む酢酸塩バッファーで溶離させた。ついで、溶離物をＰＢＳ＋０．１５ＭのＮａＣｌ中の２４ｍＬのＳ２００ゲル濾過カラムに充填し、ＰＢＳバッファー中に透析した。質量分析を使用するSource Decayでは、Ｎ末端は分泌タンパク質の予想されたＮ末端に一致していた。
【０１８６】
ＨＣＶ Ｅ２に対するＡＰ３３／ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ親和性の決定
ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ：ＢＩＡｃｏｒｅ Ａｌ００機器での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定を用いて、抗体に対する可溶型Ｅ２（ｓＥ２）の結合に対する親和性を決定した。抗ヒトＦｃセンサーチップ表面上でのヒト化抗体の捕捉後に変動濃度のｓＥ２を注入する形式を用いた。抗ヒトＦｃ抗体は、製造者によって示唆されたように、アミン化学を使用してセンサーチップ表面に共有的に結合させた。ヒト化抗体は、３０μＬ／分の流量で６０μＬの０．５μｇ／ｍＬ溶液を注入することによって捕捉した。ｓＥ２溶液の６０μＬの注入に対してセンサーグラムを集め、４８０ｓの間解離をモニターした。センサーチップ表面は、１５μＬのアリコートの３ＭのＭｇＣ１２の注入によって再生し、捕捉抗体からの抗体−抗原複合体の解離が生じた。測定は、２倍の増分で１．５６ｎＭから５０ｎＭの範囲のｓＥ２濃度で繰り返した。全ての測定は、捕捉抗Ｅ２抗体のない参照フローセルからのデータのリアルタイムの減算を含んでいた。バッファー単独の注入に対するセンサーグラムもまた減算した。流通バッファーはＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２で、温度は２５℃であった。これらのデータは、動態定数を決定するために製造者によって提供されるソフトウェアを使用して、１：１のラングミュア結合モデルで解析した。
【０１８７】
スッキャッチャード解析：
２９３Ｔ細胞の表面に発現されたＥ１Ｅ２ヘテロ二量体の一部としてのＨＣＶ Ｅ２に対するＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂの親和性を放射性リガンド細胞結合アッセイを使用して決定した。抗ＨＣＶ抗体のＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ及びＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ Ｆａｂを、Ｉｏｄｏｇｅｎ法を使用してヨウ素化した。放射性標識抗ＨＣＶ抗体を、ＮＡＰ−５カラムを使用するゲル濾過によって遊離の１２５Ｉ−Ｎａから精製した。精製したＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ及びＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ Ｆａｂ抗体は、それぞれ１７．９６μＣｉ／μｇ及び５５．２１μＣｉ／μｇの比活性を有していた。固定濃度のヨウ素化抗体と減少濃度の連続希釈未標識抗体を含む５０μＬ容積の競合反応混合物を、９６ウェルプレート中に配した。２９３Ｔ細胞に製造者の推奨に従ってＦｕｇｅｎｅ６形質移入試薬（Ｒｏｃｈｅ）を形質移入した。細胞に最終容積２５ｍＬの補充栄養無しのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｉｂｃｏ）中、２５μｇ／ｍＬのプラスミドプラス１００μＬのＦｕｇｅｎｅ６試薬を形質移入した。形質移入後４８時間でＳｉｇｍａ細胞解離バッファーを使用して細胞をプレートから剥がし、結合バッファー（２％のＦＢＳ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．２、及び２ｍＭのアジ化ナトリウムを含む５０：５０のＤＭＥＭ／Ｆ１２）で洗浄し、０．２ｍＬの結合バッファー中２×１０５細胞の適切な密度で、５０μＬの競合反応混合物に加えた。細胞を含む各競合反応物中のヨウ素化抗体の最終濃度は、ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂに対して〜２００ｐＭ、ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ Ｆａｂに対して〜５００ｐＭであり、細胞を含む競合反応物中の未標識抗体の最終濃度は変動し、５００ｎＭで始まった後、１０通りの濃度に対して１：２倍で減少する。細胞を含む競合反応物を室温で２時間インキュベートした。各濃度の未標識抗体に対する細胞を含む競合反応物を３組でアッセイした。インキュベーション後、競合反応物をＭｉｌｌｉｐｏｒｅマルチスクリーンフィルタープレートに移し、結合したヨウ素化抗体から遊離物を分離するために結合バッファーで４×洗浄した。フィルターをＷａｌｌａｃ Ｗｉｚａｒｄ １４７０ガンマカウンター(PerkinElmer Life and Analytical Sciences Inc.)でカウントした。結合データを、抗体の結合親和性を決定するためにＭｕｎｓｏｎ及びＲｏｂａｒｄのフィッティングアルゴリズム(Munson, P. J., 及びD. Rodbard, Anal Biochem 107:220-39 (1980))を使用するＮｅｗＬｉｇａｎｄソフトウェア(Genentech)を使用して評価した。
【０１８８】
感染細胞培養ＨＣＶ（ＨＣＶｃｃ）の生産
完全長ＨＣＶｃｃゲノムをコードするプラスミドの生産：Ｊｃ１（Ｊ６／Ｃ３）及びＣｏｎ１／Ｃ３に対する完全長ＨＣＶゲノムを、ＮＣＢＩデータベースに記載された（Ｊ６）、ＪＦＨ−１及びＣｏｎ１のＤＮＡ配列［それぞれＨＣ−Ｊ６（ＣＨ）（クローンｐＪ６ＣＦ）、Ｃｏｎ１及びＪＦＨ−１に対して登録番号ＡＦ１７７０３６、ＡＪ２３８７９９及びＡＢ０４７６３９］を使用して、Gene Oracle Inc. (Mountain View, CA)に外部委託することによって化学的に合成した。ＪＦＨ−Ｉ ＮＳ２−ＮＳ５Ｂ領域に融合したＪ６及びＣｏｎ１構造領域（コア−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２の一部）をコードするキメラＨＣＶｃｃウイルスは過去に記載されたようにして生産した(Pietschmann, T.等, P roc Natl Acad Sci U S A 103:7408-13 (2006))。Ｃｏｎｌ／Ｃ３−ネオＨＣＶｃｃを作製するために、５’−未翻訳領域(UTR)を含み、ネオマイシン耐性遺伝子及び脳心筋炎ウイルス配列内リボソーム進入部位(EMCV IRES)エレメントが続き、ＥｃｏＲＩ及びＰｍｅＩ制限部位が隣接するＤＮＡ断片をGene Oracle Inc. (Mountain View, CA)に外部委託して化学的に合成した。Ｃｏｎ１／Ｃ３−ネオＨＣＶｃｃをコードするプラスミドは、ＥｃｏＲＩ及びＰｍｅ１での消化によって生産した。Ｊｃ１（Ｊ６／Ｃ３）及びＣｏｎ１／Ｃ３−ネオＤＮＡ断片の双方を、独特なＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩ制限部位を使用してｐＵＣ１９ベクター中にライゲートさせ、ｐＵＣ−Ｊｃ１及びｐＵＣ−Ｃｏｎ１／Ｃ３−ネオを生産した。
【０１８９】
インビトロ転写反応：ｐＵＣ−Ｊｃ１及びｐＵＣ−Ｃｏｎ１／Ｃ３−ネオプラスミドを、ＨＣＶゲノムの３’末端に位置するＸｂａＩで消化させた。３０μｇのｐＵＣ−Ｊｃ１及びｐＵＣ−Ｃｏｎ１／Ｃ３−ネオを、３００μｌの最終容積中の２０Ｕ ＸｂａＩを使用して３７℃で一晩消化させた。次の日、ＲＮＡを、過去に記載されているように、酸フェノールを使用して抽出した。Kapadia, S. B.等 J Virol 81:374-83 (2007)。インビトロ転写反応は、製造者の推奨に従って、Ｔ７ Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して実施した。ＨＣＶ ＲＮＡを、過去に記載されているようにして、フェノール／クロロホルム及びエタノール沈殿を使用して抽出した。Kapadia, S. B.等, J Virol 81:374-83 (2007))を参照。ＲＮＡを−７０℃で保存した。
【０１９０】
ＨＣＶｃｃストックの生成：Ｈｕｈ−７．５細胞を、３７℃で５％ＣＯ２の雰囲気下で、完全ダルベッコ変法イーグル培地（ｃ−ＤＭＥＭ）（１０％の仔ウシ血清［ＦＢＳ］、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、及び０．１ｍＭの非必須アミノ酸を補充した）中で培養した。形質移入の日に、細胞をトリプシン処理し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）で２回洗浄し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中に１０７細胞／ｍｌの最終濃度で再懸濁させた。４００μｌの細胞（４×１０６細胞）プラス１０μｇのインビトロで転写されたＪｃ１又はＣｏｎ１／Ｃ３−ネオＲＮＡを０．４ｃｍの電気穿孔キュベット（ＢｉｏＲａｄ）に加えた。電気穿孔は、次のパラメータを使用し、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して実施した：０．２７ｋＶ、１００オーム及び９５０μＦ。キュベットを室温で１０分間インキュベートして、ｃ−ＤＭＥＭを含む一つのＴ１６２フラスコ中に細胞を移す前に細胞を回復させた。細胞をトリプシン処理し、培養が要求される培養密度の８０−９０％に達したときに分割した。形質移入から３日後に上清を収集し、清澄にし、感染ウイルス力価を、過去に記載されたようにＴＣＩＤ５０計算法を使用して測定した。Lindenbach, B. D.等, Science 309:623-6 (2005)を参照のこと。上清を一定分量に分け、−７０℃で保存した。
【０１９１】
ＨＣＶ偽粒子（ＨＣＶｐｐ）の生産
プラスミド：ＨＣＶ遺伝子型Ｉａ（Ｈ７７）、Ｉｂ（Ｃｏｎ１）及び２ａ（Ｊ６）由来のＥ１及びＥ２糖タンパク質を発現するプラスミドを、幾分か変更して過去に記載されたようにして生産した(Hsu, M.等, Proc Natl Acad Sci U S A 100:7271-6 (2003))。簡潔に述べるとＥ１及びＥ２をコードする（そしてＨＣＶコアのＣ末端からのシグナルペプチドを含む）領域をｐＲＫ哺乳動物発現ベクター中にクローニングし、発現プラスミドｐＲＫ−Ｈ７７、ｐＲＫ−Ｃｏｎ１及びｐＲＫ−Ｊ６をそれぞれ生産した。Δ８．９パッケージングプラスミドは元々はＧｒｅｇ Ｈａｎｎｏｎ(Cold Spring Harbor Labs)／Ｄａｖｉｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ(Cal Tech)からジェネンテックが獲得したものである。Zufferey等, Nature Biotechnology 15:871-875 (1997)を参照のこと。ＦＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ｄｓＲＥＤプラスミドは、修飾されたｐＦＵＧＷプラスミドであり、Cold Spring Harbor LabsのＧｒｅｇ Ｈａｎｎｏｎからジェネンテックが得たもので、それぞれＨＣＭＶプロモーター及びＩＲＥＳエレメントによって駆動されるホタルルシフェラーゼ及びＤｓＲｅｄをコードする。
【０１９２】
ＨＣＶｐｐは、若干の変更をして過去に記載されたようにして(Bartosch, B.等, J Exp Med 197:633-42 (2003))、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で生産した。簡潔に述べると、２．５×１０６の２９３Ｔ細胞を１０−ｃｍプレート中に前の日に播種した。次の日に、細胞に、製造者の推奨に従ってリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＦＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＤｓＲｅｄプラスミド（５μｇ）、Δ８．９トランスファーベクター（１０μｇ）及びｐＲＫ−Ｈ７７、ｐＲＫ−Ｃｏｎ１又はｐＲＫ−Ｊ６プラスミド（１μｇ）を同時形質移入した。形質移入から６時間後に、ＯｐｔｉＭＥＭ培地(Invitrogen, Gibco)をｃ−ＤＭＥＭで置換した。形質移入から２日後に、上清を収集し、清澄にし、更に超遠心分離（３０００ｒｐｍで５分）によって精製し、感染力アッセイにおいて使用した。５×１０３のＨｕｈ−７．５細胞を白壁の９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に播種した。次の日に、細胞に適当な希釈のＨＣＶｐｐを形質導入した。感染から７２時間後に、細胞を１×溶解バッファーに溶解させ、ルシフェラーゼ活性をＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、製造者の推奨に従って測定した。
【０１９３】
ＨＣＶ Ｅ２への抗体結合を決定するためのＥＬＩＳＡアッセイ
Ｅ２可溶化物の調製：リポフェクタミン２０００を製造者の推奨に従って使用して、２９３Ｔ細胞に１０μｇのｐＲＫ−Ｈ７７、ｐＲＫ−Ｃｏｎ１又はｐＲＫ−Ｊ６プラスミドプラスミドを一過性に形質移入した。形質移入から４８時間後に、細胞をＰＢＳで洗浄した後、１μＬの溶解バッファー（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．４；１５０ｍＭのＮａＣｌ；１ｍＭのＥＤＴＡ；０．５％のＮＰ−４０；２０ｍＭのヨードアセトアミド）に可溶化させた。可溶化物を４℃で２０分間振とうさせながらインキュベートし、５分間遠心分離した。ついで清澄にした上清を用いてＥＬＩＳＡプレートを被覆した。
【０１９４】
ＨＣＶ Ｅ２ ＥＬＩＳＡ：ＥＬＩＳＡアッセイを過去に記載されたようにして実施した。Owsianka, A.等, J Virol 79:11095-104 (2005)を参照。簡潔に述べると、９６ウェルＩｍｍｕｌｏｎ２プレートに、１００μＬのＰＢＳ中の０．２５μｇ／ウェルのスノードロップ(Galanthus nivalis) レクチン(GNA, Sigma)を被覆し、室温で一晩インキュベートした。次の日に、プレートを、０．０２％のＴｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳで３×洗浄し、ＰＢＳＴに希釈した細胞可溶化物で被覆し、室温で２時間インキュベートした。慢性ＨＣＶ感染患者の血清の希釈物を２％の脱脂粉乳／ＰＢＳＴに希釈し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴでの３×洗浄後、１００μＬ／ウェルの抗ヒトＨＲＰ結合二次抗体をＰＢＳＴ中１：１０００の希釈で加え、室温で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで６×洗浄し、暗所においてウェルを室温で３０分、１００μＬのＴＭＢの基質と共にインキュベートした。反応を、５０μＬ／ウェルの０．５ＭのＨ２ＳＯ４を加えることによって停止させ、Ａ４５０をＳｙｎｅｒｇｙ２プレートリーダー(BioTek Instruments)を使用して測定した。
【０１９５】
ＨＣＶｃｃ感染アッセイ
９６ウェルプレートでの感染では、５×１０３Ｈｕｈ−７．５細胞／ウェルを播種した。次の日に、細胞を感染効率（ＭＯＩ）＝０．３Ｊｃ１又はＣｏｎ１／Ｃ３−ネオＨＣＶｃｃに感染させた。ＨＣＶｃｃを中和する抗体を同定するために、抗体をｃ−ＤＭＥＭ中で１５０μｇ／ｍｌまで希釈し、７つの３倍希釈の抗体を別の９６ウェルプレートにおいて作製した。ＨＣＶｃｃ及び抗体希釈物を組合せ、ナイーブなＨｕｈ−７．５細胞の接種前に３７℃で１時間プレインキュベートした。感染から３日後に全ＲＮＡを収集し、ＨＣＶ ＲＮＡ複製（ＨＣＶ／ＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡの比として測定）を、以下に記載のＲＴ−ｑＰＣＲを使用して決定した。
【０１９６】
ＨＣＶ感染の定量
ＨＣＶｃｃ ＲＮＡ複製：９６ウェルプレートで実施された実験では、全ＲＮＡを、製造者の指示書に従って、ＳＶ９６全ＲＮＡ単離システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して抽出した。各ウェルからのＲＮＡを１００μＬのＲＮａｓｅフリー水中に溶離させ、４μＬのＲＮＡを、Ｔａｑｍａｎ逆転写試薬キット(Applied Biosystems)を使用して逆転写させた。ＲＴ−ｑＰＣＲを、ＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックス(Applied Biosystems)を使用し、２５μＬの反応物中に５μＬのｃＤＮＡを使用して実施した。全ての反応において、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現を、増幅効率及び正規化のための内部内在性コントロールとして決定した。ＨＣＶ及びＧＡＰＤＨに対するプライマー及びプローブは次の通りである：
GT1bセンスプライマー, 5' -CTGCGGAACCGGTGAGTACA-S' ; 
GT1b アンチセンスプライマー, 5' -TGCACGGTCTACGAGACCTCC-S' ; 
GT1bプローブ, 6FAM-ACCCGGTCGTCCTGGCAATTCC-MGBNFQ;
GT2aセンスプライマー, 5'-CTTCACGCAGAAAGCGCCTA;
GT2aアンチセンスプライマー, 5' -CAAGCACCCTATCAGGCAGT-S';
GT2aプローブ, 6FAM-TATGAGTGTCGTACAGCCTC-MGBNFQ;
GAPDHセンスプライマー, 5' -GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-S';
GAPDHアンチセンスプライマー, 5' -GAAGATGGTGATGGGATTTC-S';
GAPDHプローブ, VIC-ATGACCCCTTCA TTGACCTC-MGBNFQ。
蛍光は７５００ＨＴリアルタイムＰＣＲ機器(Applied Biosystems, CA)を使用してモニターした。
【０１９７】
感染ＨＣＶｃｃの滴定：感染細胞の上清中に存在する感染ＨＣＶｃｃを過去に記載されているようにして測定した。Lindenbach, B. D.等, Science 309:623-6 (2005)を参照のこと。簡潔に述べると、滴定を、ポリ−Ｌ−リジン被覆９６ウェルプレート中で５×１０３のＨｕｈ−７．５細胞を播種することによって実施した。次の日に、細胞を最終容積の１００μＬ中の１０倍希釈の上清と共に接種した。３日後、細胞をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで固定し、過去に記載されたようにして(Kapadia, S. B.等, J Virol 81:374-83 (2007))抗ＨＣＶコア抗体，Ｃ７−５０（Ａｂｅａｍ）を用いて免疫染色した。力価は過去に記載されたようにしてＲｅｅｄ及びＭｕｅｎｃｈの方法に従って計算した。Lindenbach, B. D.等, Science 309:623-6(2005)を参照。
【０１９８】
ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ媒介中和に対する慢性的にＨＣＶ感染した患者からの血清の効果
慢性ＨＣＶ感染患者からの血清がインビトロでのＨＣＶ感染のＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ媒介中和をアンタゴナイズしたかどうかを決定するために、ＨＣＶｐｐ系を使用して中和アッセイを実施した。ＨＣＶｐｐを、１０％の仔ウシ血清（ＦＢＳ）、１０％の正常なヒト血清（ＮＨＳ）、又は１０％の慢性ＨＣＶ感染患者からの血清（ＣＨＣＨＳ−１、２及び３）の何れかの存在下で３７℃で１時間、異なった濃度のＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂと共にインキュベートした。９６ウェルプレートに播種されたＨｕｈ−７．５細胞をＨＣＶｐｐ：抗体混合物を用いて接種した。４時間の形質導入後、培地を、１０％のＦＢＳ黄ラスアッセイの残りのための栄養補助剤を含むｃ−ＤＭＥＭと置き換えた。３日後、細胞を可溶化し、ルシフェラーゼ活性を、上述のようにして測定した。抗ＨＣＶ Ｅ１／Ｅ２抗体のレベルを上述のようにしてＥＬＩＳＡを使用して決定した。
【０１９９】
実施例１５Ａ：ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂによるＨＣＶｃｃ及びＨＣＶｐｐの中和
ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂがＨＣＶ侵入及び感染を阻害するかどうかを決定するために、中和アッセイを、ＨＣＶｐｐ及びＨＣＶｃｃの双方を使用してＨｕｈ−７．５細胞において実施した。ＡＰ３３をコントロールとして使用した。ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂによるＨＣＶ侵入の特異的阻害を同定するために、ＧＴＩｂ（Ｃｏｎ１）又はＧＴ２ａ（Ｊ６）からのＥ１Ｅ２配列を含むＨＣＶｐｐをＡＰ３３又はＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂの存在下でインキュベートした。ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂはＣｏｎ１及びＪ６ＨＣＶｐｐ侵入を均等に阻害した（それぞれＣｏｎ１及びＪ６ ＨＣＶｐｐに対してＥＣ５０＝０．５１１μｇ／ｍＬ及び０．７９３μｇ／ｍＬ）。図３９Ａ−Ｃを参照のこと。また、双方のＨＣＶｐｐ遺伝子型のＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ中和はＡＰ３３で見られたものに匹敵していた（それぞれＣｏｎ１及びＪ６ＨＣＶｐｐに対して、ＥＣ５０＝１．４１７μｇ／ｍＬ及び２．０６６μｇ／ｍＬ）（図３９Ａ−Ｃ）。
ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂが感染細胞培養ウイルス（ＨＣＶｃｃ）を中和したかどうかを決定するために、同様の中和アッセイを、ＡＰ３３及びＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂを用いて実施した。ＡＰ３３は、複数の遺伝子型からのＥ１Ｅ２配列を含むＨＣＶｐｐについて過去に記載されたものに匹敵するレベルまでＣｏｎ１及びＪ６ ＨＣＶｃｃの双方を阻害した（Owsianka, A.等, J Virol 79: 11095-104 (2005)）。ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂはＡＰ３３に匹敵するレベルまでＣｏｎ１ ＨＣＶｃｃ感染を阻害する一方（図４０Ａ及びＣ）、ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂはＡＰ３３よりも少なくとも〜４．７倍良好にＪ６ ＨＣＶｃｃを阻害した（図４０Ｂ−Ｃ）。
【０２００】
実施例１５Ｂ：Ｅ２に対する抗ＨＣＶ Ｅ２抗体の親和性の測定
更なる実験において、可溶型Ｅ２（ｓＥ２）に対するＡＰ３３及びＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂの親和性をＢＩＡｃｏｒｅアッセイによって決定した。ＡＰ３３とＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂは共に同様の親和性でｓＥ２に結合した（ＡＰ３３に対して〜５−８ｎＭ、ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂに対して〜３．８ｎＭ）。それに対して、各抗体のＦａｂ断片は〜５０ｎＭの親和性でｓＥ２に結合した。ｓＥ２タンパク質の結合に加えて、２９３Ｔ細胞の表面上に発現されたＥ１Ｅ２ヘテロ二量体へのＡＰ３３及びＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂの結合を決定した。Ｅ１Ｅ２をコードするプラスミドが形質移入された２９３Ｔ細胞はその細胞表面に機能的Ｅ１Ｅ２ヘテロ二量体を発現することが知られているので、スキャッチャード解析を実施して、ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ及びＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂＦａｂの親和性を決定した。細胞表面に発現されたＥ２に対するＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ及びＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ Ｆａｂの親和性（それぞれ〜５及び〜５０ｎＭ）は、上述のＢＩＡｃｏｒｅアッセイでｓＥ２で見られたものに匹敵していた。表１０を参照のこと。
0005763344.tif 000012
【０２０１】
実施例１５Ｃ：慢性ＨＣＶ感染患者からの血清はＫＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂ媒介中和をアンタゴナイズしない
抗ＨＣＶ抗体を含む慢性患者の血清がＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂの中和能をアンタゴナイズできるかどうかを決定するために、中和アッセイを、１０％の正常なヒト血清（ＮＨＳ）又は慢性ＨＣＶ感染患者からの血清（ＣＨＣＨＳ−１及び−２）の存在下でＣｏｎ１ＨＣＶｐｐを使用して実施した。ＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂは、ヒト血清の供給源に拘わらず匹敵できるレベルまでＨＣＶ感染を阻害した（図４１Ａ）。これらの慢性ＨＣＶ感染患者の血清が遺伝子型１ｂに対する抗体を含んでいるかどうかを決定するために、ＧＴ１ｂ（Ｃｏｎ１）Ｅ１Ｅ２感染２９３Ｔ細胞からの可溶化物を使用してＥＬＩＳＡアッセイを実施した。１０μｇ／ｍＬの濃度で始めて３倍希釈のＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂをコントロールとして使用した。Ｅ２への結合はＮＨＳでは検出されなかったが、用量依存的結合は双方の慢性ＨＣＶ感染患者の血清で検出されており、それらがＣｏｎ１ ＨＣＶ ＥｌＥ２−反応性抗体を含んでいたことを示唆している。図４１Ｂを参照。これらの結果は、抗ＨＣＶ抗体は患者の血清中に存在しているが、インビトロでＨＣＶを中和するＲＨ−Ｃ／ＲＫ２ｂの能力を妨害しないことを示唆している。
【０２０２】
文献
1. Anonymous, J Viral Hepatology 6:35-47 (1999)。
2. Yagnik AT等, Proteins 40:355-66 (2000)。
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4. Patel A.H.等, J Gen Virol 81:2873-83 (2000)。 
5. Owsianka A.等, J Virol 79:11095-104 (2005)。 
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7. Fiser A.及びSali A., Methods Enzymol 374:461-91 (2003)。 
8. Sali A.及びBlundell T.L., JMoI Biol 234:779-815 (1993)。 
9. Saldanha J.W.等, JMoI Biol Immunol 5391(22436):487709-99719 (1992)。 
10. Foote J.及びWinter G., JMoI Biol 224:487-99 (1992)。 
11. Chothia C.等, J MoI Biol 186:651-63 (1985)。 
12. Chothia C.等, Nature 342:877-83 (1989)。 
13. Tarr A. W.等, Hepatology 43:592-601 (2006)。 
14. Mierau R.等, Rheumatol Int 12:23-31 (1992)。 
15. Ghosh S.等, J Immunol 174:2860-9 (2005)。 
16. Nielsen H.等, Protein Eng. 10:1-6 (1997)。 
【０２０３】
上記明細書において述べた全ての刊行物はここに出典明示により援用する。本発明の記載された方法及びシステムの様々な変更及び変形は、発明の範囲と精神から逸脱しない範囲で当業者には明らかであろう。本発明を特定の好ましい実施態様に関連して説明したが、請求項記載の発明はかかる特定の実施態様に不当に限定されるべきではないことは理解されなければならない。確かに、分子生物学又は関連分野の当業者に明らかである発明の実施形態の様々な変更は次の特許請求の範囲内に入るものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４２Ｄ】
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【図４２Ｅ】
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【図４２Ｆ】
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【図４２Ｇ】
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【配列表】
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