(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応基Ｘを備えた光硬化性樹脂を用いて、光造形法により任意の立体的構造を持つポリマー構造体を構成し、
次いで前記ポリマー構造体を、前記反応基Ｘと結合する反応基Ｘ’を備えると共に任意の金属を含有する金属含有ナノ粒子の水性媒体溶液又は水性媒体分散液である金属複合化処理液中に浸漬して、ポリマー構造体上の反応基Ｘと金属含有ナノ粒子上の反応基Ｘ’とを結合させることにより、
ポリマー構造体上に金属含有層を形成することを特徴とする、３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体の製造方法。
【請求項２】
反応基Ｙを備えた光硬化性樹脂を用いて、光造形法により任意の立体的構造を持つ第１部材を形成する第１部材形成工程と、前記第１部材を包含する領域に反応基Ｚを備えた光硬化性樹脂を位置させて、光造形法により、任意の立体的構造を持つと共に第１部材に接続する第２部材を形成する第２部材形成工程とを含むことにより、前記第１部材と第２部材が包含された一体的成形品であるポリマー構造体を構成し、
次いで前記ポリマー構造体を、（１）前記反応基Ｙとは特異的に結合するが前記反応基Ｚとは結合しない反応基Ｙ’を備えると共に金属Ａを含有する金属含有ナノ粒子の水性媒体溶液又は水性媒体分散液である第１金属複合化処理液と、（２）前記反応基Ｚとは特異的に結合するが前記反応基Ｙとは結合しない反応基Ｚ’を備えると共に金属Ｂを含有する金属含有ナノ粒子の水性媒体溶液又は水性媒体分散液である第２金属複合化処理液に順不同でそれぞれ浸漬して、あるいは前記第１金属複合化処理液と第２金属複合化処理液との混合液に浸漬して、反応基Ｙと反応基Ｙ’、反応基Ｚと反応基Ｚ’をそれぞれ特異的に結合させることにより、
ポリマー構造体の第１部材に金属Ａを含有する金属含有層を形成し、第２部材に金属Ｂを含有する金属含有層を形成することを特徴とする、３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体の製造方法。
【請求項３】
反応基Ｙを備えた光硬化性樹脂を用いて、光造形法により任意の立体的構造を持つ第１部材を形成する第１部材形成工程と、前記第１部材を包含する領域に反応基Ｚを備えた光硬化性樹脂を位置させて、光造形法により、任意の立体的構造を持つと共に第１部材に接続する第２部材を形成する第２部材形成工程とを含むことにより、前記第１部材と第２部材が包含された一体的成形品であるポリマー構造体を構成し、
次いで前記ポリマー構造体を、（３）前記反応基Ｙとは特異的に結合するが前記反応基Ｚとは結合しない反応基Ｙ’を備えると共に任意の金属を含有する金属含有ナノ粒子の水性媒体溶液又は水性媒体分散液である第３金属複合化処理液に浸漬して、もしくは、（４）前記反応基Ｚとは特異的に結合するが前記反応基Ｙとは結合しない反応基Ｚ’を備えると共に任意の金属を含有する金属含有ナノ粒子の水性媒体溶液又は水性媒体分散液である第４金属複合化処理液に浸漬して、反応基Ｙと反応基Ｙ’、もしくは、反応基Ｚと反応基Ｚ’のいずれか一方の組合わせに係る反応基を特異的に結合させることにより、
ポリマー構造体の第１部材もしくは第２部材のいずれか一方のみに金属含有層を形成することを特徴とする、３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体の製造方法。
【請求項４】
前記光造形法で用いる照射光が、光硬化性樹脂中の照射領域において多光子吸収を発生させる照射光であることを特徴とする、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体の製造方法。
【請求項５】
前記光硬化性樹脂が備える反応基Ｘ、Ｙ、Ｚ及び前記金属含有ナノ粒子が備える反応基Ｘ‘、Ｙ’、Ｚ’の内の１以上の反応基が、水性媒体溶液又は水性媒体分散液中で加水分解によって脱離する保護基によって保護されていることを特徴とする、請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体の製造方法。
【請求項６】
前記金属含有ナノ粒子に含有される金属が、金、銀及び磁性体金属から選ばれる１種又は２種以上の金属であることを特徴とする請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体の製造方法。
【請求項７】
前記光造形法によるポリマー構造体の構成過程、及び水性媒体溶液又は水性媒体分散液中での反応基の結合反応が、０℃〜４０℃の温度範囲内で行われ、及び／又は、ｐＨ７〜９のｐＨ範囲内で行われることを特徴とする、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体の製造方法。
【請求項８】
光硬化性樹脂からなり任意の立体的構造を持つ第１部材と、光硬化性樹脂からなり任意の立体的構造を持つ第２部材とを包含した一体的成形品であるポリマー構造体であって、
前記第１部材には金属Ａを含有する金属含有ナノ粒子が層状に結合してなる金属含有層が形成されており、
前記第２部材には金属Ｂを含有する金属含有ナノ粒子が層状に結合してなる金属含有層が形成されている、
ことを特徴とする、３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体。
【請求項９】
反応基Ｙを備えた光硬化性樹脂からなり任意の立体的構造を持つ第１部材と、反応基Ｚを備えた光硬化性樹脂からなり任意の立体的構造を持つ第２部材とを包含した一体的成形品であるポリマー構造体であって、
前記第１部材には、前記反応基Ｙと特異的に結合する反応基Ｙ’を備えると共に金属Ａを含有する金属含有ナノ粒子が、反応基Ｙと反応基Ｙ’との結合に基づいて結合することにより、金属Ａを含有する金属含有層が形成されており、及び、
前記第２部材には、前記反応基Ｚと特異的に結合する反応基Ｚ’を備えると共に金属Ｂを含有する金属含有ナノ粒子が、反応基Ｚと反応基Ｚ’との結合に基づいて結合することにより、金属Ｂを含有する金属含有層が形成されている、
ことを特徴とする、３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体。
【請求項１０】
光硬化性樹脂からなり任意の立体的構造を持つ第１部材と、光硬化性樹脂からなり任意の立体的構造を持つ第２部材とを包含した一体的成形品であるポリマー構造体であって、
前記第１部材、第２部材のいずれか一方のみに金属含有ナノ粒子が層状に結合してなる金属含有層が形成されている、
ことを特徴とする、３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体。
【請求項１１】
反応基Ｙを備えた光硬化性樹脂からなり任意の立体的構造を持つ第１部材と、反応基Ｚを備えた光硬化性樹脂からなり任意の立体的構造を持つ第２部材とを包含した一体的成形品であるポリマー構造体であって、
前記第１部材には、前記反応基Ｙと特異的に結合する反応基Ｙ’を備えると共に任意の金属を含有する金属含有ナノ粒子が、反応基Ｙと反応基Ｙ’との結合に基づいて結合することにより、金属を含有する金属含有層が形成されており、もしくは、
前記第２部材には、前記反応基Ｚと特異的に結合する反応基Ｚ’を備えると共に任意の金属を含有する金属含有ナノ粒子が、反応基Ｚと反応基Ｚ’との結合に基づいて結合することにより、金属を含有する金属含有層が形成されている、
ことを特徴とする、３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体。
【請求項１２】
細胞膜穿孔用ナノニードルであって、
請求項８〜請求項１１のいずれか一項に記載の３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体で構成されており、かつ
前記細胞膜穿孔用ナノニードルのニードル先端部に、前記金属含有層が形成されている、
細胞膜穿孔用ナノニードル。
【請求項１３】
請求項１２に記載の細胞膜穿孔用ナノニードルの前記ニードル先端部へのレーザー光の照射により衝撃波及び／又はキャビテーションバブルを発生させて、前記ニードル先端部で細胞膜に穿孔する、細胞膜の穿孔方法。
【請求項１４】
少なくとも１つの薬品充填用部位と搬送用部位から構成されるドラッグデリバリー用デバイスであって、
請求項８〜請求項１１のいずれか一項に記載の３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体で構成されており、かつ
前記搬送用部位に、磁性体金属を含有する前記金属含有層が形成されている、
ドラッグデリバリー用デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体及びその製造方法に関する。更に詳細には、本発明は、全長が１００ｎｍ〜１００μｍ程度の構造体である細胞や生体分子の操作デバイス、体内薬物送達デバイス等の作製に簡便かつ好適に用いることができる３次元ポリマー−金属複合構造体の製造方法と、この方法によって形成された３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリマーを用いて形成された微細な３次元構造体、即ち３次元ポリマーマイクロ構造体が、例えば細胞膜穿孔用ナノニードルや、その他の細胞や生体分子の操作デバイス、あるいは体内薬物送達デバイスとして利用されている。そして、このような３次元ポリマーマイクロ構造体においては、多様な目的から、構造体の全部又は一部を金属複合化することが試みられている。
【０００３】
従来、ポリマーと金属との複合微細構造デバイスを形成する技術として、例えば下記の非特許文献１に開示されるように、基板上に形成したフォトレジスト等のポリマー層の上に、マスクを通してスパッタリングや蒸着、めっきによって金属層を形成し、その後に、化学的溶解や集束イオンビーム等により構造体を切り出す手法がある。
【０００４】
一方、これとは異なる手法として、例えば下記の特許文献１、２、あるいは非特許文献２に開示されるように、２光子吸収によるマイクロ光造形法と無電解めっきを併用する手法も知られている。２光子吸収によるマイクロ光造形法では、ある波長のフェムト秒パルスレーザーを、その半分程度の波長の光で硬化する特性を有する光硬化性樹脂中に集光し、焦点中心部のみで２光子吸収を誘起し、直径１００ｎｍ程度の範囲内でポリマーを硬化させる。この集光点を光硬化性樹脂中で３次元的に走査することで、任意の３次元ポリマー構造体を形成できる。
【０００５】
特許文献１、２及び非特許文献２では、更に、このポリマー構造体に予め電子供与体を添加し、あるいはポリマー構造体の形成後に還元剤に浸漬し、その後に無電解めっき浴に浸漬することにより、ポリマー構造体上に金属膜を析出させる手法が示されている。又、電子供与体を添加した光硬化性樹脂と、電子供与体無添加の光硬化性樹脂とを部位毎に使い分けて複合構造を形成し、その後に無電解めっき浴に浸漬することで、ポリマー構造体の特定部位にのみ金属膜を形成する手法も示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−２５３３５４号公報。
【特許文献２】特開２００７−６９４０６号公報。
【０００７】
【非特許文献１】Dan Sameoto, See-HoTsang, M. Parameswaran, “Polymer MEMS processing for multi-userapplications”Sensors and ActuatorsA: Physical 134(2007), pp.457-464。
【非特許文献２】Richard A. Farrer,Christopher N. LaFratta, Linji Li,Julie Praino, Michael J. Naughton, Bahaa E.A. Saleh, Malvin C. Teich, andJohn T. Fourkas,“Selective Functionalization of 3-D PolymerMicrostructures”J. Am. Chem. Soc.,2006, 128, pp.1796-1797。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、上記非特許文献１に開示するプロセスでは多数の工程が必要であり、成膜や露光、切り出しに用いる装置も大型であるため、設置スペース、コストが増大するという問題点があった。又、このプロセスは平面基板にしか適用できず、任意の立体的構造を持つ３次元構造体を形成できないという問題もあった。
【０００９】
次に、上記特許文献１、２及び非特許文献２に開示する方法では無電解めっきを用いるので、加温雰囲気中で酸あるいはアルカリ溶液に構造体を浸漬しなければならない。従って、細胞や生体分子の操作デバイス、あるいは薬物送達デバイス作製のために、光硬化性樹脂中に核酸やタンパク等の生体分子を混合して構造体を形成する場合、これらの生体分子を変性させてしまうという問題があった。更に、金属膜が形成された部位と金属膜が形成されていない部位とを有するポリマー構造体を作製可能であるとは言え、光硬化性樹脂中に電子供与体を添加しているか否かによって金属膜形成の可否が決まるため、ポリマー構造体の部位毎に異なる種類の金属膜を形成することはできないという課題があった。
【００１０】
そこで本発明は、常温・常圧下で少ない工程数により簡易に実施できる製造方法であって、任意の立体的構造を持つポリマー−金属複合構造体を製造でき、しかも金属複合化の過程において生体分子を変性させることがない３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体の製造方法を提供することを、解決すべき第１の課題とする。
【００１１】
更に本発明は、３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体上の任意の部位ごとに異種金属の含有層を形成できる製造方法を提供することを、解決すべき第２の課題とする。
【００１２】
更に本発明は、３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体上の任意の部位のみに金属の含有層を形成できる製造方法を提供することを、解決すべき第３の課題とする。
【００１３】
更に本発明は、これらの製造方法の結果物である有用な３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体を提供することを、解決すべき第４の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（第１発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１発明の構成は、反応基Ｘを備えた光硬化性樹脂を用いて、光造形法により任意の立体的構造を持つ微細なポリマー構造体を構成し、
次いで前記ポリマー構造体を、前記反応基Ｘと結合する反応基Ｘ’を備えると共に任意の金属を含有する金属含有ナノ粒子の水性媒体溶液又は水性媒体分散液である金属複合化処理液中に浸漬して、ポリマー構造体上の反応基Ｘと金属含有ナノ粒子上の反応基Ｘ’とを結合させることにより、
ポリマー構造体上に金属含有層を形成する、３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体の製造方法である。
【００１５】
（第２発明の構成）
上記課題を解決するための本願第２発明の構成は、反応基Ｙを備えた光硬化性樹脂を用いて、光造形法により任意の立体的構造を持つ微細な第１部材を形成する第１部材形成工程と、前記第１部材を包含する領域に反応基Ｚを備えた光硬化性樹脂を位置させて、光造形法により、任意の立体的構造を持つと共に第１部材に接続する微細な第２部材を形成する第２部材形成工程とを含むことにより、前記第１部材と第２部材が包含された一体的成形品である微細なポリマー構造体を構成し、
次いで前記ポリマー構造体を、（１）前記反応基Ｙとは特異的に結合するが前記反応基Ｚとは結合しない反応基Ｙ’を備えると共に金属Ａを含有する金属含有ナノ粒子の水性媒体溶液又は水性媒体分散液である第１金属複合化処理液と、（２）前記反応基Ｚとは特異的に結合するが前記反応基Ｙとは結合しない反応基Ｚ’を備えると共に金属Ｂを含有する金属含有ナノ粒子の水性媒体溶液又は水性媒体分散液である第２金属複合化処理液に順不同でそれぞれ浸漬して、あるいは前記第１金属複合化処理液と第２金属複合化処理液との混合液に浸漬して、反応基Ｙと反応基Ｙ’、反応基Ｚと反応基Ｚ’をそれぞれ特異的に結合させることにより、
ポリマー構造体の第１部材に金属Ａを含有する金属含有層を形成し、第２部材に金属Ｂを含有する金属含有層を形成する、３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体の製造方法である。
【００１６】
（第３発明の構成）
上記課題を解決するための本願第３発明の構成は、反応基Ｙを備えた光硬化性樹脂を用いて、光造形法により任意の立体的構造を持つ微細な第１部材を形成する第１部材形成工程と、前記第１部材を包含する領域に反応基Ｚを備えた光硬化性樹脂を位置させて、光造形法により、任意の立体的構造を持つと共に第１部材に接続する微細な第２部材を形成する第２部材形成工程とを含むことにより、前記第１部材と第２部材が包含された一体的成形品である微細なポリマー構造体を構成し、
次いで前記ポリマー構造体を、（３）前記反応基Ｙとは特異的に結合するが前記反応基Ｚとは結合しない反応基Ｙ’を備えると共に任意の金属を含有する金属含有ナノ粒子の水性媒体溶液又は水性媒体分散液である第３金属複合化処理液に浸漬して、もしくは、（４）前記反応基Ｚとは特異的に結合するが前記反応基Ｙとは結合しない反応基Ｚ’を備えると共に任意の金属を含有する金属含有ナノ粒子の水性媒体溶液又は水性媒体分散液である第４金属複合化処理液に浸漬して、反応基Ｙと反応基Ｙ’、もしくは、反応基Ｚと反応基Ｚ’のいずれか一方の組合わせに係る反応基を特異的に結合させることにより、
ポリマー構造体の第１部材もしくは第２部材のいずれか一方のみに金属含有層を形成する、３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体の製造方法である。
【００１７】
（第４発明の構成）
上記課題を解決するための本願第４発明の構成は、前記第１発明〜第３発明のいずれかにおいて、前記光造形法で用いる照射光が、光硬化性樹脂中の照射領域において多光子吸収を発生させる照射光である、３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体の製造方法である。
【００１８】
（第５発明の構成）
上記課題を解決するための本願第５発明の構成は、前記第１発明〜第４発明のいずれかにおいて、前記光硬化性樹脂が備える反応基Ｘ、Ｙ、Ｚ及び前記金属含有ナノ粒子が備える反応基Ｘ‘、Ｙ’、Ｚ’の内の１以上の反応基が、水性媒体溶液又は水性媒体分散液中で加水分解によって脱離する保護基によって保護されている、３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体の製造方法である。
【００１９】
（第６発明の構成）
上記課題を解決するための本願第６発明の構成は、前記第１発明〜第５発明のいずれかにおいて、前記金属含有ナノ粒子に含有される金属が、金、銀及び磁性体金属から選ばれる１種又は２種以上の金属である、３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体の製造方法である。
【００２０】
（第７発明の構成）
上記課題を解決するための本願第７発明の構成は、前記第１発明〜第６発明のいずれかにおいて、光造形法によるポリマー構造体の構成過程、及び水性媒体溶液又は水性媒体分散液中での反応基の結合反応が０℃〜４０℃の温度範囲内で行われ、及び／又は、ｐＨ７〜９のｐＨ範囲内で行われる、３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体の製造方法である。
【００２１】
（第８発明の構成）
上記課題を解決するための本願第８発明の構成は、下記の（５）〜（８）のいずれかに該当する、３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体である。
【００２２】
（５）光硬化性樹脂からなり任意の立体的構造を持つ微細な第１部材と、光硬化性樹脂からなり任意の立体的構造を持つ微細な第２部材とを包含した一体的成形品である微細なポリマー構造体であって、
前記第１部材には金属Ａを含有する金属含有層が形成されており、
前記第２部材には金属Ｂを含有する金属含有層が形成されている。
【００２３】
（６）反応基Ｙを備えた光硬化性樹脂からなり任意の立体的構造を持つ微細な第１部材と、反応基Ｚを備えた光硬化性樹脂からなり任意の立体的構造を持つ微細な第２部材とを包含した一体的成形品である微細なポリマー構造体であって、
前記第１部材には、前記反応基Ｙと特異的に結合する反応基Ｙ’を備えると共に金属Ａを含有する金属含有ナノ粒子が、反応基Ｙと反応基Ｙ’との結合に基づいて結合することにより、金属Ａを含有する金属含有層が形成されており、及び、
前記第２部材には、前記反応基Ｚと特異的に結合する反応基Ｚ’を備えると共に金属Ｂを含有する金属含有ナノ粒子が、反応基Ｚと反応基Ｚ’との結合に基づいて結合することにより、金属Ｂを含有する金属含有層が形成されている。
【００２４】
（７）光硬化性樹脂からなり任意の立体的構造を持つ微細な第１部材と、光硬化性樹脂からなり任意の立体的構造を持つ微細な第２部材とを包含した一体的成形品である微細なポリマー構造体であって、
前記第１部材、第２部材のいずれか一方のみに金属含有層が形成されている。
【００２５】
（８）反応基Ｙを備えた光硬化性樹脂からなり任意の立体的構造を持つ微細な第１部材と、反応基Ｚを備えた光硬化性樹脂からなり任意の立体的構造を持つ微細な第２部材とを包含した一体的成形品である微細なポリマー構造体であって、
前記第１部材には、前記反応基Ｙと特異的に結合する反応基Ｙ’を備えると共に任意の金属を含有する金属含有ナノ粒子が、反応基Ｙと反応基Ｙ’との結合に基づいて結合することにより、金属を含有する金属含有層が形成されており、もしくは、
前記第２部材には、前記反応基Ｚと特異的に結合する反応基Ｚ’を備えると共に任意の金属を含有する金属含有ナノ粒子が、反応基Ｚと反応基Ｚ’との結合に基づいて結合することにより、金属を含有する金属含有層が形成されている。
【発明の効果】
【００２６】
第１発明〜第７発明によれば、常温・常圧下で少ない工程数により簡易に実施できる製造方法であって、任意の立体的構造を持つポリマー−金属複合構造体を製造でき、しかも金属複合化の過程において生体分子を変性させることがない３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体の製造方法を提供することができる。
【００２７】
第２発明によれば、３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体上の任意の部位ごとに異種金属の含有層を形成することができる。
【００２８】
第３発明によれば、３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体上の任意の部位のみに金属含有層を形成することができる。なお、第３発明においては、第１部材と第２部材とを包含した一体的成形品である微細なポリマー構造体を原料体として構成した後、この原料体を第３金属複合化処理液と第４金属複合化処理液のいずれに浸漬するかを選択することによって、金属含有層を第１部材上に形成するか、第２部材上に形成するかを自在に選択できるという原料体のユティリティ上の利点がある。
【００２９】
第４発明によれば、任意形状の３次元ポリマー構造体を１００ｎｍ以下の分解能で作製することができる。
【００３０】
第５発明によれば、光造形において、光硬化性樹脂が備える反応基Ｘ、Ｙ、Ｚあるいは金属含有ナノ粒子が備える反応基Ｘ‘、Ｙ’、Ｚ’が３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体の製造前に無駄に消費されることを防ぐことができる。
【００３１】
第６発明によれば、金、銀及び磁性体金属から選ばれる１種又は２種以上の金属を含有する金属含有層を備えた３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体を提供できる。例えば、３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体が細胞膜穿孔用ナノニードルである場合、そのニードル先端部に金や銀の金属含有層を形成すれば、ニードル先端部へのレーザー光の照射により衝撃波やキャビテーションバブルを発生させ、細胞膜穿孔を容易かつ確実にすることができる。更に、３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体が、体内や液中で移動可能なドラッグデリバリー用デバイスであって、少なくとも１つの薬品充填用部位と搬送用部位から構成される場合、その搬送用部位に磁性体金属を含有する金属含有層を形成すれば、外部からの磁気力によって、このデバイスを容易かつ確実に体内あるいは液中で移動させることができる。
【００３２】
本発明では、第７発明のように、３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体の製造プロセスを非常にマイルドな条件で実施可能であるため、光硬化性樹脂に生体分子が含まれる場合においても、生体分子の変性を抑えることができる。なお、「光硬化性樹脂に生体分子が含まれる場合」とは、例えば、３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体を、細胞膜に穿孔し細胞内の目的物質を採取するデバイスとして構成する場合に、ＤＮＡや抗原タンパク等の生体分子を予め光硬化性樹脂に含ませておき、当該生体分子を目的物質の捕捉剤として利用する場合等が例示される。
【００３３】
第８発明によれば、第１発明〜第７発明に係る製造方法の結果物である有用な３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体が提供される。即ち、任意の形状の微細なポリマー構造体と金属含有層からなる３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体を効率よく実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明に係る製造方法の一実施例のプロセスを示す。
【図２】反応基の保護基による保護の一具体例を示す。
【図３】金属含有ナノ粒子の一具体例を示す。
【図４】金属含有層の形成を確認する光学顕微鏡観察像である。
【図５】金属含有層の形成を確認する走査電子顕微鏡観察像である。
【図６】３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体を用いたデバイスの一具体例の使用状態を示す。
【符号の説明】
【００３５】
１            基板
２            光硬化性樹脂
３            第１部材
４            光硬化性樹脂
５            第２部材
６            溶液
７            金属含有層
８            ３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体
９            金属複合化ナノニードル
１０          ポリマー構造体
１１          ニードル先端部
１２          金属含有層
１３          細胞
１４          細胞膜
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
次に、本発明を実施するための形態を、その最良の形態を含めて説明する。
【００３７】
〔３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体の製造方法〕
本発明に係る３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体の製造方法は、以下の第１の製造方法〜第３の製造方法を包含する。これらの製造方法に関連する「光硬化性樹脂」、「光造型法」、「ポリマー構造体」、「金属複合化処理液」、「金属含有ナノ粒子」、「金属含有層の形成」の各概念については、詳しくは後述する。
【００３８】
（第１の製造方法）
３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体の第１の製造方法は、要するに微細なポリマー構造体を構成し、そのポリマー構造体上に金属含有層を形成する方法である。
【００３９】
この第１の製造方法の内容をより具体的に述べれば、反応基Ｘを備えた光硬化性樹脂を用いて、光造形法により任意の立体的構造を持つ微細なポリマー構造体を構成し、
次いで前記ポリマー構造体を、前記反応基Ｘと結合する反応基Ｘ’を備えると共に任意の金属を含有する金属含有ナノ粒子の水性媒体溶液又は水性媒体分散液である金属複合化処理液中に浸漬して、ポリマー構造体上の反応基Ｘと金属含有ナノ粒子上の反応基Ｘ’とを結合させることにより、
ポリマー構造体上に金属含有層を形成する、３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体の製造方法である。
【００４０】
上記の第１の製造方法において、ポリマー構造体が持つ「立体的構造」とは、要するに３次元の空間的構造を持つ限りにおいて限定されず、例えば球状、ブロック状、棒状、ニードル状等の立体的構造の他、リング状、コイル状、筒状、又はこれらの形状単位が複合された複雑形状の立体的構造も含まれ、更に、非常に薄い板状又はシート状の構造でも実質的に厚さを持つ限りにおいて包含される。この点は、後述の第２及び第３の製造方法においても同様である。なお、第２及び第３の製造方法における第１部材、第２部材の「立体的構造」も同上の概念である。
【００４１】
又、第１の製造方法において、「水性媒体」とは、水からなる溶媒を言い、あるいは、水と親水性溶媒との混合溶媒であって親水性溶媒の混合比がタンパク質等の生体分子を変性させない程度に低い溶媒を言う。この点も、後述の第２及び第３の製造方法において同様である。
【００４２】
更に、第１の製造方法において、好ましくは、光造形法によるポリマー構造体の構成過程、及び水性媒体溶液又は水性媒体分散液中での反応基の結合反応を、０℃〜４０℃の温度範囲内で行い、及び／又は、ｐＨ７〜９のｐＨ範囲内で行うことができる。この点も、後述の第２及び第３の製造方法において同様である。
【００４３】
（第２の製造方法）
３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体の第２の製造方法は、要するに第１部材と第２部材を包含する一体的成形品である微細なポリマー構造体を構成し、その第１部材には金属Ａを含有する金属含有層を形成し、第２部材には前記金属Ａとは異なる金属Ｂを含有する金属含有層を形成する方法である。
【００４４】
この第２の製造方法の内容をより具体的に述べれば、反応基Ｙを備えた光硬化性樹脂を用いて、光造形法により任意の立体的構造を持つ微細な第１部材を形成する第１部材形成工程と、前記第１部材を包含する領域に前記反応基Ｙとは異なる反応基Ｚを備えた光硬化性樹脂を位置させて、光造形法により、任意の立体的構造を持つと共に第１部材に接続する微細な第２部材を形成する第２部材形成工程とを含むことにより、前記第１部材と第２部材が包含された一体的成形品である微細なポリマー構造体を構成し、
次いで前記ポリマー構造体を、（１）前記反応基Ｙとは特異的に結合するが前記反応基Ｚとは結合しない反応基Ｙ’を備えると共に金属Ａを含有する金属含有ナノ粒子の水性媒体溶液又は水性媒体分散液である第１金属複合化処理液と、（２）前記反応基Ｚとは特異的に結合するが前記反応基Ｙとは結合しない反応基Ｚ’を備えると共に金属Ｂを含有する金属含有ナノ粒子の水性媒体溶液又は水性媒体分散液である第２金属複合化処理液に順不同でそれぞれ浸漬して、あるいは前記第１金属複合化処理液と第２金属複合化処理液との混合液に浸漬して、反応基Ｙと反応基Ｙ’、反応基Ｚと反応基Ｚ’をそれぞれ特異的に結合させることにより、
ポリマー構造体の第１部材に金属Ａを含有する金属含有層を形成し、第２部材に金属Ｂを含有する金属含有層を形成する、３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体の製造方法である。
【００４５】
上記の第２の製造方法において、「第１部材を包含する領域に反応基Ｚを備えた光硬化性樹脂を位置させる」とは、（ａ）反応基Ｚを備えた未硬化の光硬化性樹脂中に既に形成された第１部材を浸す形態、あるいは（ｂ）既に形成された第１部材の一部に接触する状態で反応基Ｚを備えた未硬化の光硬化性樹脂を位置させる形態、等を言う。この点は、後述の第３の製造方法において同様である。
又、第２の製造方法において、「第１部材と第２部材が包含された一体的成形品」とは、（ａ）それぞれ一定の形状の第１部材と第２部材が一定の位置関係で直接に接合された状態にある成形品、（ｂ）それぞれ一定の形状の第１部材と第２部材が、両者の中間に他の部材を介在させた状態で接合された状態にある成形品、（ｃ）それぞれ一定の形状の第１部材と第２部材が、直接に接合されることなく、それらの一部又は全部が基材である他の部材に埋設されている状態、等を言う。この点も、後述の第３の製造方法において同様である。
【００４６】
（第３の製造方法）
３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体の第３の製造方法は、要するに第１部材と第２部材を包含する一体的成形品である微細なポリマー構造体を構成し、その第１部材もしくは第２部材のいずれか一方のみに金属含有層を形成する方法である。
【００４７】
この第３の製造方法の内容をより具体的に述べれば、反応基Ｙを備えた光硬化性樹脂を用いて、光造形法により任意の立体的構造を持つ微細な第１部材を形成する第１部材形成工程と、前記第１部材を包含する領域に前記反応基Ｙとは異なる反応基Ｚを備えた光硬化性樹脂を位置させて、光造形法により、任意の立体的構造を持つと共に第１部材に接続する微細な第２部材を形成する第２部材形成工程とを含むことにより、前記第１部材と第２部材が包含された一体的成形品である微細なポリマー構造体を構成し、
次いで前記ポリマー構造体を、（３）前記反応基Ｙとは特異的に結合するが前記反応基Ｚとは結合しない反応基Ｙ’を備えると共に任意の金属を含有する金属含有ナノ粒子の水性媒体溶液又は水性媒体分散液である第３金属複合化処理液に浸漬して、もしくは、（４）前記反応基Ｚとは特異的に結合するが前記反応基Ｙとは結合しない反応基Ｚ’を備えると共に任意の金属を含有する金属含有ナノ粒子の水性媒体溶液又は水性媒体分散液である第４金属複合化処理液に浸漬して、反応基Ｙと反応基Ｙ’、もしくは、反応基Ｚと反応基Ｚ’のいずれか一方の組合わせに係る反応基を特異的に結合させることにより、
ポリマー構造体の第１部材もしくは第２部材のいずれか一方のみに金属含有層を形成する、３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体の製造方法である。
【００４８】
〔光硬化性樹脂〕
光硬化性樹脂とは、未硬化状態では液体であるが、紫外線や可視光線等の光を照射することにより重合が開始され、硬化する樹脂のことを言う。
【００４９】
一般的に、光硬化性樹脂は、液状のモノマーあるいはオリゴマーに、光重合開始剤、希釈剤、停止剤、光吸収剤、フィラー等を混合したものである。このようなモノマーあるいはオリゴマーとしては、ウレタンアクリレ−ト系、エポキシアクリレ−ト系、アクリレ−ト系、エポキシ系、ビニルエーテル系、オキセタン系が挙げられる。
【００５０】
本発明において用いる光硬化性樹脂の種類は限定されないが、後述の実施形態において示すように、微細構造体を作成するため、硬化収縮の少ないエポキシ系あるいはオキセタン系であって、フィラー等の光散乱性微粒子を含まない光硬化性樹脂を用いることが好ましい。
【００５１】
〔光造形法〕
光造形法とは、液状の光硬化性樹脂に光を照射して硬化させることにより、３次元構造体を作製する手法である。３次元構造体における任意の形状・構造を形成する手法は限定されないが、一般的には、液状の光硬化性樹脂に光を照射して硬化させ、硬化部分の上に新たな液状の樹脂を積層して順次硬化させていくことで、任意の３次元構造体を作製する手法が挙げられる。又、後述のように、多光子吸収の利用等によって積層工程を省く手法も挙げられる。
【００５２】
光造形法は、更に詳細には、光吸収の様式と、光の走査手法と、光硬化性樹脂の積層手法によって区別される。
【００５３】
光吸収の様式による分類としては緑〜紫外領域の波長の１光子を吸収して硬化するタイプが一般的であるが、例えば特開２００１−１５８０５０号公報に示されるように、赤外領域のパルスレーザーを照射することにより同時に２個以上の多光子吸収を発生させ、波長以下の微小な分解能で硬化させる多光子吸収マイクロ光造形法もある。
【００５４】
光の走査手法による分類としては、集光した点状の光をガルバノミラーや音響光学素子を用いて走査して硬化させる手法、マスクシートや、液晶フィルター、デジタルミラーデバイスにより、平面的に光のパターンを作り出し、面的に露光して硬化させる手法がある。
【００５５】
光硬化性樹脂の積層手法としては、樹脂の液面が雰囲気中に露出している自由液面法と、樹脂の液面上に光透過性の薄板を配置して液面を均一に保つ規制液面法と、多光子吸収の利用などによって焦点以外の部分での硬化を抑制することにより積層工程を省く手法に分類される。
【００５６】
本発明においては上記いずれの手法も用いることができるが、後述の実施形態では、極めて微細なデバイスを効率的に作成するため、光吸収の様式として多光子吸収を利用し、積層工程を省く手法を実施した。
【００５７】
〔金属含有ナノ粒子〕
金属含有ナノ粒子は、例えば外径が１ｎｍ〜１μｍ程度の微細な金属粒子を含有し、かつ、ポリマー構造体を構成する光硬化性樹脂が備える反応基と特異的に結合する反応基を備える。従って金属含有ナノ粒子は、通常、金属粒子と、これに結合した有機分子（あるいは金属粒子を内包したポリマー粒子）からなり、この有機分子あるいはポリマー粒子が、光硬化性樹脂の備える反応基と特異的に結合する反応基を備える。
【００５８】
金属粒子を構成する金属の種類は限定されないが、金、銀、磁性体金属が好ましく例示される。前記した第２の製造方法では、金属Ａを含有する金属含有ナノ粒子と、金属Ａとは異なる金属Ｂを含有する金属含有ナノ粒子が併用される。
【００５９】
〔金属含有層の形成〕
第１の製造方法〜第３の製造方法においては、金属複合化処理液中で、ポリマー構造体上に（あるいは、ポリマー構造体の第１部材、及び／又は、第２部材上に）、金属含有ナノ粒子が層状に結合してなる金属含有層が形成される。従って、金属含有層は表面コーティング層の状態で形成される。
【００６０】
光硬化性樹脂が備える反応基と、金属含有ナノ粒子が備える反応基とは、互いに特異的に結合する反応基である必要がある。このように特異的な結合性を有する反応基の組合わせとしては、周知あるいは公知の組合わせに係るものを任意に採用できるが、例えば、スルホン酸基、カルボキシル基、チオール基、リン酸基等の酸性基と、アミノ基、イミノ基、マレイミド基等の塩基性基との組合わせが挙げられる。又、アミノ基とイソチオシアネート基との組合わせ、アミノ基とＮＨＳ基との組合わせ、チオール基とマレイミド基との組合わせ、ビオチンとアビジンとの組合わせ、ビオチンとストレプトアビジンとの組合わせ、ＤＮＡと相補的ＤＮＡとの組合わせ、等も例示できる。
【００６１】
第２の製造方法や第３の製造方法においては、第１部材を金属複合化処理するための金属含有ナノ粒子には、第１部材を構成する光硬化性樹脂が備える反応基Ｙと特異的に結合するが、第２部材を構成する光硬化性樹脂が備える反応基Ｚとは結合しない反応基Ｙ’を備えさせる必要がある。又、第２部材を金属複合化処理するための金属含有ナノ粒子には、上記Ｙ’とは逆の結合特性を有する反応基Ｚ’を備えさせる必要がある。
【００６２】
このような関係を満たす反応基の組合わせとしては、周知あるいは公知の組合わせに係るものを任意に採用できるが、例えば下記の群を挙げることができる。
【００６３】
反応基Ｙ又はＹ’は、（アミノ基，イソチオシアネート基）、（アミノ基,ＮＨＳ基）、（チオール基,マレイミド基）、(ビオチン,アビジン)、（ビオチン,ストレプトアビジン）、（ＤＮＡ，相補的ＤＮＡ）からなる組合わせの群より選ばれる。更に反応基Ｚ又はＺ’は、前記の群のうち、反応基Ｙ／Ｙ’として選ばれた組合わせとは異なる組合わせから選ばれる。但し、反応基Ｙ又はＹ’がアミノ基である場合には、反応基Ｚ及びＺ’の組合わせにはアミノ基を含むことはできない。また、反応基Ｙ又はＹ’がビオチンである場合には、反応基Ｚ及びＺ’の組合わせにはビオチンを含むことはできない。更にまた、反応基Ｙ及びＹ’がＤＮＡと相補的ＤＮＡの組み合わせであり、かつ、反応基Ｚ及びＺ’もＤＮＡと相補的ＤＮＡの組み合わせである場合には、反応基Ｙと反応基Ｚ及び、反応基Ｙと反応基Ｚ’のいずれも、異なる配列でなければならない。
【００６４】
〔３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体〕
本発明の３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体は、下記の（５）〜（８）のいずれかに該当するものである。特に、（５）及び（６）の３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体が好ましい。
【００６５】
（５）光硬化性樹脂からなり任意の立体的構造を持つ微細な第１部材と、光硬化性樹脂からなり任意の立体的構造を持つ微細な第２部材とを包含した一体的成形品である微細なポリマー構造体であって、
前記第１部材には金属Ａを含有する金属含有層が形成されており、
前記第２部材には金属Ｂを含有する金属含有層が形成されている。
【００６６】
（６）反応基Ｙを備えた光硬化性樹脂からなり任意の立体的構造を持つ微細な第１部材と、反応基Ｚを備えた光硬化性樹脂からなり任意の立体的構造を持つ微細な第２部材とを包含した一体的成形品である微細なポリマー構造体であって、
前記第１部材には、前記反応基Ｙと特異的に結合する反応基Ｙ’を備えると共に金属Ａを含有する金属含有ナノ粒子が、反応基Ｙと反応基Ｙ’との結合に基づいて結合することにより、金属Ａを含有する金属含有層が形成されており、及び、
前記第２部材には、前記反応基Ｚと特異的に結合する反応基Ｚ’を備えると共に金属Ｂを含有する金属含有ナノ粒子が、反応基Ｚと反応基Ｚ’との結合に基づいて結合することにより、金属Ｂを含有する金属含有層が形成されている。
【００６７】
（７）光硬化性樹脂からなり任意の立体的構造を持つ微細な第１部材と、光硬化性樹脂からなり任意の立体的構造を持つ微細な第２部材とを包含した一体的成形品である微細なポリマー構造体であって、
前記第１部材、第２部材のいずれか一方のみに金属含有層が形成されている。
【００６８】
（８）反応基Ｙを備えた光硬化性樹脂からなり任意の立体的構造を持つ微細な第１部材と、反応基Ｚを備えた光硬化性樹脂からなり任意の立体的構造を持つ微細な第２部材とを包含した一体的成形品である微細なポリマー構造体であって、
前記第１部材には、前記反応基Ｙと特異的に結合する反応基Ｙ’を備えると共に任意の金属を含有する金属含有ナノ粒子が、反応基Ｙと反応基Ｙ’との結合に基づいて結合することにより、金属を含有する金属含有層が形成されており、もしくは、
前記第２部材には、前記反応基Ｚと特異的に結合する反応基Ｚ’を備えると共に任意の金属を含有する金属含有ナノ粒子が、反応基Ｚと反応基Ｚ’との結合に基づいて結合することにより、金属を含有する金属含有層が形成されている。
【００６９】
〔３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体利用デバイス〕
３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体として利用できる具体的デバイスの種類は限定されないが、一例として、細胞膜穿孔用ナノニードルのニードル先端部を、前記した金属含有層の形成によって、金や銀等の金属と複合化したデバイスを挙げることができる。このデバイスは、ニードル先端部へのレーザー光の照射により衝撃波やキャビテーションバブルを発生させて、細胞膜穿孔が容易かつ確実になると考えられる。又、他の一例として、ＤＮＡや抗原タンパク等の生体分子を予め光硬化性樹脂に含ませておき、細胞膜に穿孔し細胞内の目的物質を採取するデバイスとして構成した３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体において、当該生体分子を目的物質の捕捉剤として利用する場合が挙げられる。更に他の一例として、３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体が体内や液中で移動可能なドラッグデリバリー用デバイスであって、少なくとも１つの薬品充填用部位と搬送用部位から構成され、その搬送用部位に磁性体金属を含有する金属含有層を形成したデバイスを挙げることができる。このデバイスは、体内あるいは液中で、外部からの磁気力によって、容易かつ確実に、例えば一定の標的へ移動させることができる。
【実施例】
【００７０】
以下に本発明の実施形態例及び実施例を説明する。本発明の技術的範囲は、以下の実施形態例及び実施例によって限定されない。
【００７１】
〔実施形態例〕
図１に、本発明の実施形態の一例のフローチャートを示す。
【００７２】
はじめに、基板１の上に、反応基Ａを有する未硬化の光硬化性樹脂２を載置し、光造形法（例えば多光子吸収を利用した光造形法）により、光硬化性樹脂２中で構造体の第１部材３を形成する。未硬化の光硬化性樹脂２を洗浄した後、反応基Ａを有しない未硬化の光硬化性樹脂４を第１部材３を包含するように載置し、光造形法（例えば多光子吸収を利用した光造形法）により第１部材３に接続する第２部材５を形成して、第１部材３と第２部材５からなるポリマー構造体を得る。
【００７３】
未硬化の光硬化性樹脂４を洗浄した後、反応基Ａと特異的に結合する反応基Ａ’を備えた有機分子鎖を有する金属含有ナノ粒子の溶液６に上記のポリマー構造体を浸漬することにより、第１部材３上の反応基Ａと金属含有ナノ粒子上の反応基Ａ’が結合し、第１部材３上に金属含有層７が形成される。このような金属含有層７は、第２部材５上には形成されない。余分な溶液６を洗浄した後、ポリマー構造体を基板から取り外し、３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体８を得る。
【００７４】
〔実施例１〕
本実施例では、２光子吸収を利用したマイクロ光造形と、金ナノ粒子を用いる。
【００７５】
まず、ガラス基板（厚さ０．１５ｍｍ）上に光硬化性樹脂液（SCR710、ディーメック）を載置し、下方から対物レンズで集光した中心波長７５６ｎｍのフェムト秒レーザー（Tsunami、スペクトラフィジクス）を液中に照射し、ガルバノミラーにより、焦点を走査して構造体の第１の部位を形成する。
【００７６】
次に、未硬化樹脂をエーテルとエタノールにより除去、洗浄し、アミノ基を含有する光硬化性樹脂を前記、第１の部位を包含するようにガラス基板上に載置し、２光子吸収を利用したマイクロ光造形により、第２の部位を形成する。
【００７７】
アミノ基を含有する光硬化性樹脂は、光硬化性樹脂（SCR710）に、図２に示すシランカップリング剤（KBE-9103、信越化学）を１５重量％で配合したものである。KBE-9103はアミノ基が保護されたシラン化合物である．この保護されたアミノ基は，このままでは１級アミンとしての性質を示さないため光造形中も安定であるが、水と接触すると極めて容易に加水分解し、ケトン化合物が脱離することにより、活性な１級アミンを生成する。
【００７８】
形成した第２の部位の表面に金含有層を形成するために、構造体をエーテルとエタノールで戦場後、水に浸漬して、アミノ基の保護基を脱離させ、図３に示すMono-Sulfo-NHS-NANOGOLD（Nanoprobes）水溶液に浸漬する。本試薬は、直径１．４ｎｍの金ナノ粒子にsulfo-N-ヒドロキシスクシンイミド（sulfo-NHS）基が修飾されたものである。sulfo-NHS基はアミノ基とｐＨ７．５−８．２の水溶液中で容易に反応し、結合する。
【００７９】
金ナノ粒子が結合したことを確認するために、銀増感剤を用いた。銀増感反応では、金を核として銀が生成され、銀が生成した部分は光学顕微鏡で観察すると黒い点として確認できる。図４に銀増感反応前後の構造体の光学観察像を示す。アミノ基を含有しない部位は増感前１と増感後２の色の変化が乏しいが、アミノ基を含有した部位は増感前３に対して増感後４には銀増感特有の濃い黒色を呈しており、アミノ基を含有した部位に特異的に金粒子が生成していることを示している。
【００８０】
また，図５には、銀増感前後の構造体表面の走査電子顕微鏡画像を示す。アミノ基を含有しない部位では、増感前１と増感後２の表面にほとんど変化がみられないが、アミノ基を含有する部位は、増感前３は滑らかな表面をしているのに対して、増感後４は粒子が表面全体を覆っている。これは、金粒子を核として析出した銀粒子と考えられる。
【００８１】
以上の結果から、本実施形態では、光造形によって作製された３次元ポリマーマイクロ構造体上の任意部位に、簡便かつ温和な工程で、金含有層を形成することができることを示した。
【００８２】
〔実施例２〕
本実施例は、３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体を用いたデバイスの一具体例である金属複合化ナノニードルの使用状態を示す。
【００８３】
図６に示すデバイスである金属複合化ナノニードル９は、本発明の手法により一定の形状に構成された微細なポリマー構造体１０におけるニードル先端部１１に、金又は銀のような金属を含有する金属含有層１２を形成したものである。
【００８４】
このデバイスでは、ニードル先端部１１へのレーザー光の照射により、衝撃波やキャビテーションバブル（図６において、星型形状のような小図形により象徴的に示す）を発生させて、細胞１３の細胞膜１４に対する穿孔が容易かつ確実になると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明によって、常温・常圧下で少ない工程数により簡易に実施できる製造方法であって、任意の立体的構造を持つポリマー−金属複合構造体を製造でき、しかも金属複合化の過程において生体分子を変性させることがない３次元ポリマー−金属複合マイクロ構造体の製造方法が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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