(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
固定され膜透過処理が施された細胞内における、リボ核酸分子の第１の標的配列に対するプローブ処理方法であって、
前記細胞を少なくとも１２種類の重複しない第１の組の核酸ハイブリダイゼーションプローブを過剰に含有するハイブリダイゼーション溶液に浸すステップと、
未結合のプローブを除去するために、前記固定された細胞を洗浄するステップと、
前記洗浄された細胞内の標識のスポットを検出するステップとを含み、
前記プローブは、ヌクレオチド７−４０個の長さで、かつ、第１の色の同一の第１の検出可能な標識１個だけで標識された前記第１の標的配列に相補的である核酸配列を含むことを特徴とする、プローブ処理方法。
【請求項２】
前記第１の組のプローブは、ヌクレオチド１５−３０個の長さで標的配列に相補的な配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の組のプローブは、少なくとも２４種類のプローブを含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の組のプローブは、少なくとも３０種類のプローブを含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の検出可能な標識は、蛍光標識であることを特徴とする、請求項１又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の組のプローブはすべて、３’末端が蛍光色素で標識されることを特徴とする、請求項１又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記検出するステップは、蛍光顕微鏡を用いて画像化するステップを含むことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記検出するステップは、前記第１の検出可能な標識のスポットを表示するために、固定化され洗浄された前記細胞を画像化するステップと、前記スポットを強調するために画像を処理するステップと、前記スポットの数が閾値に反応しない強度閾値を用いて強調されたスポットを解析するステップとを含むことを特徴とする、請求項１又は７に記載の方法。
【請求項９】
３次元線形ラプラシアン・オブ・ガウシアンフィルターを用いて前記画像をフィルタリングすることにより、前記画像が処理されることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ハイブリダイゼーション溶液は、少なくとも１２種類の重複しない第２の組の核酸ハイブリダイゼーションプローブを過剰に含有し、該第２の組の核酸ハイブリダイゼーションプローブは、ヌクレオチド７−４０個の長さで、かつ、前記第１の検出可能な標識と識別可能である同一の第２の検出可能な標識で標識される第２の標的配列に相補的である配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
試験化合物が細胞内のメッセンジャーＲＮＡ分子の第１の標的配列の分布又は量に影響を与えるかどうかを確認する検定方法であり、該検定方法は、
前記試験化合物を用いて、応答が起こるのに十分な期間、細胞を培養するステップと、
該細胞に透過処理を施すステップと、
透過処理を施した前記細胞を少なくとも１２種類の重複しない第１の組の核酸ハイブリダイゼーションプローブを過剰に含有するハイブリダイゼーション溶液に浸すステップと、
未結合のプローブを除去するために、前記細胞を洗浄するステップと、
前記第１の検出可能な標識の量又は分布を検出するステップと、
該量又は分布を、同様の処理を施されるが、前記試験化合物を用いない対照から得られる量又は分布と比較するステップとを含み、
前記核酸ハイブリダイゼーションプローブは、ヌクレオチド７−４０個の長さで、かつ、同一の第１の検出可能な標識１個だけで標識される前記第１の標的配列に相補的である配列を含むことを特徴とする、検定方法。
【請求項１２】
前記第１の組のプローブは、ヌクレオチド１５−３０個の長さで標的配列に相補的な配列を有することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の組のプローブは、少なくとも２４種類のプローブを含むことを特徴とする、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の検出可能な標識は、蛍光標識であることを特徴とする、請求項１１ないし１３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の組のプローブはすべて、３’末端が蛍光色素で標識されることを特徴とする、請求項１１ないし１４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６】
前記検出するステップは、前記分布を強調するために処理するステップと、解析が閾値に反応しない強度閾値を用いて前記強調された分布を解析するステップとを含むことを特徴とする、請求項１１ないし１５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１７】
前記ハイブリダイゼーション溶液は、少なくとも１２種類の重複しない第２の組の核酸ハイブリダイゼーションプローブを過剰に含有し、該第２の組の核酸ハイブリダイゼーションプローブは、ヌクレオチド７−４０個の長さで、かつ、前記第１の検出可能な標識と識別可能である同一の第２の検出可能な標識で標識された第２の標的配列に相補的である配列を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記検出するステップは、遺伝子発現プロファイルを得るために、メッセンジャーＲＮＡ単一分子に対応するスポットを計数することを含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、核酸配列の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
先行出願との関係
本出願は、その全体が引用により本明細書に取り込まれる、２００８年９月１０日出願の米国仮出願第６１／１９１，７２４号を基礎とする優先権を主張する。
【０００３】
個々の細胞での遺伝子発現が細胞集団の平均的な挙動から著しくかけ離れていることが、より一層明白になってきたため、個々の細胞でのｍＲＮＡコピー数の正確な整数の計測値を提供する新たな方法が必要とされている。ｍＲＮＡ局在は、活性遺伝子の空間配置を制限するために、細胞がしばしば用いるため、理想的には、かかる方法は、さらに前記ｍＲＮＡの細胞内局在も明らかにできることが望ましい。
【０００４】
ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションとその後の顕微鏡による分析は、遺伝子発現を研究するための十分に確立された手段である。第１世代のｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションは、放射性プローブを用いて実施された。初期の改良には、発色反応又は蛍光反応を触媒する酵素とプローブとを結合させることが含まれる。しかしながら、前記反応の生成物は、プローブから拡散する小さな分子か、沈殿物であるため、標的分子の位置を正確には決定することができなかった。反対に、少数の蛍光色素で直接標識されたプローブは、空間分解能を保持するが、達成可能な検出感度は比較的低い。
【０００５】
ロバート・シンガーらは、ｍＲＭＡ単一分子の検出を可能にするのに感度が十分であるだけでなく、標的のごく近傍にシグナルを限定する、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法を開発した。彼らは、ヌクレオチド約５０個の長さで、５個の蛍光色素原子団で標識された、５種類のオリゴヌクレオチドプローブをそれぞれのｍＲＮＡ標的と同時に雑種形成させた。筆者らは単一分子感度について説得力のある証明を行い、他のグループは前記プローブを用いて成果を挙げたものの、このシステムは広まらなかった。その理由の１つは、強く標識されたオリゴヌクレオチドの合成及び精製が難しいためである。蛍光色素原子団は、合成中に、オリゴヌクレオチド中に取り込まれた第１級アミノ基を介して導入されるのが通常である。複数のアミノ基が同一のオリゴヌクレオチドに取り込まれるとき、アミノ基の一部は、アミノ基転移などの副反応のために失われる。蛍光色素と、残存したアミノ基とのカップリングは、非効率であり、複数回の連続したカップリング反応が必要で、全ての設計部位が蛍光色素と結合したオリゴヌクレオチドを、一部の蛍光色素と結合したオリゴヌクレオチドから精製することは難しい。また、同一のオリゴヌクレオチドにある種の蛍光色素が複数コピー存在するとき、該蛍光色素は互いに相互作用し、該オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性を変え、著しい自己消光を示す。各プローブに、付着部位として機能する末端アミノ基が１個しかない場合、これらの問題は解消する。
【０００６】
強く標識された少数のプローブを使用することに伴う別の問題は、標的に結合していない全てのプローブで、蛍光のかなりの部分が消失するけれども、全ての非特異的結合事象がバックグラウンドを増加させることである。このことは、各標的ｍＲＮＡに結合するプローブ数の分布が広がることにつながる。例えば、Ｆｅｍｉｎｏらは、単一のｍＲＮＡを標的とする５種類の蛍光プローブを用いたとき、観測される蛍光スポットの大部分は、１個又は２個のプローブしか存在しないことを示す強度を有すると推測した。非特許文献１。個々のプローブの検出が、本当に標的ｍＲＮＡとの結合に起因するのか、あるいは、非特異的な結合に起因するのかを決定することができないため、前記蛍光スポットをｍＲＮＡ分子として明確に同定することが難しくなる。こうした「２値化（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｉｎｇ）」の問題は、個々の細胞でのｍＲＮＡ数の信頼性のある計測値をかかる方法が提供するうえで制約となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｆｅｍｉｎｏ，Ａ．Ｍ．、Ｆａｙ，Ｆ．Ｓ．、Ｆｏｇａｒｔｙ，Ｋ．及びＳｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｈ．ら、Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｉｎ  ｓｉｔｕ.、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０，５８５−５９０（１９９８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
よって、個々の細胞でのｍＲＮＡ数の信頼性のある計測値を提供する改良された方法の必要性と、容易に合成及び精製されるプローブの必要性とは、依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、同一の蛍光色素のようなもの１個だけで蛍光標識された、多種類の核酸ハイブリダイゼーションプローブを用いて、固定され、膜透過処理が施された細胞内の、例えばｍＲＮＡ分子等のＲＮＡ分子のような核酸単一分子を検出する方法を提供する。驚いたことに、同一の蛍光色素で全て標識された、少なくとも３０種類、好ましくは４０−６０種類、より好ましくは４８種類の異なるプローブを、同時にｍＲＮＡ分子の標的配列と雑種形成させる場合には、多種類のプローブの蛍光の総和から検出可能な蛍光スポットが生じることを本件の発明者らは発見した。前記プローブは、重複しない、すなわち、各プローブが雑種形成する標的配列の領域は、ユニークである（すなわち、重複していない）。選択された、ある標的配列のための３０種類又はそれ以上が１組のプローブが、互いに隣接して雑種形成するか、あるいは、隣接しない、すなわち、前記プローブのいずれとも相補性のない、１個から１００個又はそれ以上までのヌクレオチドの前記標的配列の部分をはさんで、雑種形成するように設計される。よって１つの局面では本発明は、例えば、固定され膜透過処理が施された細胞内における、ｍＲＮＡ分子のような核酸分子の標的配列に対するプローブ処理（ｐｒｏｂｉｎｇ）方法であって、前記細胞を少なくとも３０種類の過剰の核酸ハイブリダイゼーションプローブに浸すステップと、未結合のプローブを除去するために、前記固定された細胞を洗浄するステップと、前記プローブからの蛍光を検出するステップとを含み、前記標的配列は、ヌクレオチド１５−１００個で、少なくとも３０種類の重複しないプローブ結合領域を含み、前記プローブのそれぞれは同一の蛍光標識１個だけで標識され、かつ、前記プローブのそれぞれは前記標的配列の異なるプローブ結合領域に相補的である核酸配列を含む、前記プローブ処理方法を提供する。
【００１０】
本発明で有用なプローブは、ＤＮＡか、ＲＮＡか、ＤＮＡ及びＲＮＡの混合物かの場合がある。前記プローブは、非天然ヌクレオチドを含む場合があり、ヌクレオチド間に非天然結合を含む場合がある。プローブの結合親和性を向上させる非天然ヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを含む。平均的な結合親和性を有する典型的なＤＮＡ又はＲＮＡプローブについては、本発明で有用なプローブの長さがヌクレオチド１５−４０個である。ＤＮＡプローブ及びＲＮＡプローブの好ましい長さはヌクレオチド１５−２０個であり、より好ましくはヌクレオチド１７−２５個であり、さらに好ましくはヌクレオチド１７−２２個である。本件の発明者らは、ヌクレオチド約２０個の長さとなるように前記プローブを構築した。プローブの結合親和性を向上させる手段を含む場合、前記プローブは、当業者には理解できるとおり、ヌクレオチド７個まで短い場合がある。蛍光色素は、プローブのあらゆる部位に結合することができ、蛍光色素がプローブの一端に結合してもよく、好ましくは、３’末端に結合してもよいが、これらに限定されない。前記プローブは、一般的には、１マイクロリットル当り０．２−１ナノグラムの範囲で、前記多種類のプローブを過剰に含有するハイブリダイゼーション溶液中に含まれる場合がある。プローブ含有溶液に細胞が浸漬されるように、細胞を覆い、濡らすのに十分な量の溶液が添加される。
【００１１】
単一のｍＲＮＡ分子の２個又は３個以上の標的配列か、異なるｍＲＮＡ分子の１個又は２個以上の配列かのいずれかの複数のｍＲＮＡ標的配列について、単一細胞が同時にプローブ処理される場合がある。また、２組以上のプローブを用いて、あるｍＲＮＡ分子の１個の標的配列がプローブ処理される場合があるが、ここで、前記の組はそれぞれ識別可能な１種類の蛍光色素で標識され、該蛍光色素は識別可能である。例えば、ある遺伝子配列をプローブ処理するとき、該遺伝子配列の特定の部位を標的配列としてプローブ処理するために、緑色で標識された少なくとも３０種類のプローブを用い、前記遺伝子配列の別の部位を標的配列としてプローブ処理するために、赤色で標識された少なくとも３０種類のプローブを用いることができる。複数の標的それぞれのために、１種類以上の色を使用することは、本発明の高度に多重化されたプローブ処理方法における、色分けスキームの使用を可能にする。
【００１２】
本発明の方法は、単に、標的配列を表す１個又はそれ以上のスポットが存在するかどうかを確認することのみを含む場合がある。また、本発明による方法は、特定のｍＲＮＡ種に対応する特定の色のスポットを計数することを含む。２種類以上のｍＲＮＡを検出することが必要なとき、識別可能な蛍光色素で標識されたプローブの異なる組が、同一のハイブリダイゼーション混合液で用いられる場合がある。ｍＲＮＡのそれぞれの種についての遺伝子発現プロファイルは、異なる色のスポットを計数することにより構成される。
【００１３】
スポットは、顕微鏡を用いる方法により検出される。広視野蛍光顕微鏡で十分であるため、共焦点顕微鏡を用いる必要はない。標的配列を確実に示すスポットと、バックグラウンド蛍光又は非特異的な結合を示している可能性のある不鮮明なスポットとを識別するために、本発明による方法は検出を含む。この実施態様では、前記検出は、３次元線形ラプラシアン・オブ・ガウシアンフィルター（Ｌａｐｌａｃｉａｎ  ｏｆ  Ｇａｕｓｓｉａｎ  ｆｉｌｔｅｒ）を用いて画像をフィルタリングするステップと、検出閾値を適用するステップとを含む。前記フィルターで処理された画像で、０から最大画素強度までの範囲である閾値全てについて、スポットの数を３次元でプロットする場合、検出されるスポットの数が、閾値に反応しない領域を示す広いプラトーが存在する。したがって、前記方法は、スポットの数をプロットするステップと、プラトー領域の境界を測定するステップと、好ましくは該領域内で、閾値を選択するステップとをさらに含む。
【００１４】
他の局面では、本発明は、細胞内のｍＲＮＡ単一分子の検出を可能にする、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションのための複数組のプローブを含む。前記プローブは、分子それぞれが、蛍光顕微鏡で微細な蛍光スポットとして確認できるほど強い蛍光を発するようにする。
【００１５】
顕微鏡の画像から、細胞内の全てのｍＲＮＡ分子を同定し、計数するためのコンピュータープログラムが用いられる場合がある。上述の複数組のプローブを用いて実施されたｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションは、正確、かつ、簡便な遺伝子発現分析と、病原体と癌等の病状との検出とを可能にする。
【００１６】
よって、他の局面では、標的配列の細胞内分布又は量を変える化合物のスクリーニング方法が提供される。前記方法は、試験化合物を用いて、応答が起こるのに十分な期間、細胞を培養するステップと、前記標識配列の分布パターン又は量を検出するステップと、該量又は分布を、同一の処理を施されるが、前記試験化合物で培養されない対照細胞に含まれる標的ｍＲＮＡの量又は分布と比較するステップとを含む。
【００１７】
さらに他の局面では、本発明は、コンピューターで読み取り可能な媒体であって、２次元蛍光画像の３次元スタックを得るための指示と、３次元フィルターを用いて、前記３次元スタックをフィルタリングするための指示と、複数の強度閾値それぞれについて、フィルタリングした前記３次元スタックでの３次元スポットの総数を計数するための指示と、該総数が計数された強度閾値に対する３次元スポットの前記総数のプロットにおける、プラトー領域の代表的な最適強度閾値を得るための指示と、前記３次元スタックで検出された蛍光粒子の代表的な数として、前記最適閾値で得られる３次元スポットの前記総数を用いるための指示とを含む、媒体を提供する。
【００１８】
また本発明は、一般的には、前記１組のプローブと、前記コンピューターで読み取り可能な媒体とを含むキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ｍＲＮＡ単一分子での、ユニーク配列及び反復配列の同時検出を示す図。図１Ａは、使用された構成の模式図。ＧＦＰコード配列検出用の４８種類のプローブはＡｌｅｘａ−５９４で標識され、３’−ＵＴＲでの縦列反復検出用の４種類の異なるプローブはＴＭＲで標識された。図１Ｂは、ＧＦＰコード領域プローブに対応するＡｌｅｘａ−５９４チャネル（左）及びＵＴＲプローブに対応するＴＭＲチャネル（右）それぞれに含まれる、ＣＨＯ細胞の蛍光画像の１組のＺ−スタックの最大強度マージを示す図。図１Ｃは、コンピューターで、ＧＦＰｍＲＮＡ粒子を同定したことを表す赤色の円と、ＵＴＲ粒子を表す緑色の円と、共局在粒子を表す黄色の円とを用いて、赤色（ＧＦＰ）及び緑色（ＵＴＲ）の四角で囲まれた図１Ｂの画像の擬似色マージを示す図。目盛尺は、すべて長さ５μｍである。
【図２】共局在スポットの強度分析図。ＧＦＰ標的プローブ（Ａｌｅｘａ５９４チャネル，ｙ軸）及び多重ＵＴＲ標的プローブ（ＴＭＲチャネル，ｘ軸）に対応するスポット強度は、コンピューターで同定されたスポット領域での最大強度から、前記スポット周辺の環状領域の平均強度を減算することにより算出された。欄外のヒストグラムは、ＧＦＰスポット強度（右）の分布及びＵＴＲスポット強度（上）の分布を示す。
【図３】異なる数のプローブを用いたときの方法の感度を示すグラフ。図３Ａは、選択されたプローブの数に応じた、（スポット周辺の環状領域の平均バックグラウンドを減算したスポット内の最大強度として定義される）スポット強度を示すグラフ。１２種類及び２４種類のプローブに対する強度は、スポットが容易に識別できないという点でアーチファクトであり、同定されたスポットは、より明るい方にバイアスがかかった。図３Ｂは、異なる数のプローブについて、０から（１に規格化された）フィルタリングされた画像の最大強度までの範囲で、フィルタリングされた画像を閾値に応じてプロットする２値化の際に確認されたスポットの数（すなわち、連結成分）を示すグラフ。灰色の線は、図３Ａの分析で使用された閾値を示す。
【図４】ＦｅｍｉｎｏらのｍＲＮＡ検出法（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９８）との比較を示す図。図４Ａは、１個だけで標識された４８種類のプローブを用いる本明細書で説明された方法（左）と、４５ｂｐプローブが、それぞれ５個の蛍光色素を含み、チャイニーズハムスター卵巣細胞で外来遺伝子から発現した標的ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲで３２回反復する配列エレメントを標的とするＦｅｍｉｎｏらの方法とを示す模式図。図４Ｂは、１個だけで標識された４８種類のプローブを用いるか、５個の蛍光色素で標識された１種類の４５ｂｐプローブを用いるかしたときのスポット強度の比較を示す棒グラフ。誤差棒は、１標準偏差を表す。
【図５】ｍＲＮＡスポットのコンピューターによる同定を示す図。図５Ａは、デキサメタゾンで誘導されたＡ５４９細胞内のＦＫＢＰ５  ｍＲＮＡ粒子を画像化することにより得られた未加工画像データ（最大強度マージ）。図５Ｂは、スポットを強調するために、未加工データをラプラシアン・オブ・ガウシアンフィルターで処理することにより得られた画像（最大マージ）。図５Ｃは、図５Ｂからフィルター処理された画像を２値化することにより確認されたスポットの数（すなわち、連結成分）を、０から（１に規格化された）フィルター処理された画像の最大強度までの範囲の閾値に応じてプロットしたグラフ。図５Ｄは、図５Ｃの灰色の線で表される閾値を用いた結果を、各々無作為に色分けされた異なるスポットで示す画像。目盛尺は、すべて長さ５μｍである。
【図６】哺乳類細胞内の３種類の異なるｍＲＮＡ単一分子の画像化を同時に示す図。図６Ａ−図６Ｃは、デキサメタゾンで処理されていない同一の組のＡ５４９細胞内のＦＬＪ１１１２７  ｍＲＮＡ粒子と、Ｃｏｘ−２  ｍＲＮＡ粒子と、ＦＫＢＰ５  ｍＲＮＡ粒子とを示す画像。図６Ｄ−図６Ｆは、２４ｎＭのデキサメタゾンで８時間処理された細胞内のＦＬＪ１１１２７粒子と、Ｃｏｘ−２粒子と、ＦＫＢＰ５粒子とを示す画像。図６Ｇは、ＦＩＳＨとリアルタイムＲＴ−ＰＣＲとで測定された３個の遺伝子全ての誘導倍率を示すグラフであり、補足情報に記載されるように、ＦＩＳＨについて、誤差棒はブートストラッピングにより得られ、ＲＴＰＣＲについて、誤差棒は反復により得られた。画像は全て、紫色の核ＤＡＰＩ対比染色により細胞の範囲を測定した蛍光画像のｚ−スタックの最大マージであり、目盛尺はすべて長さ５μｍである。
【図７】蛍光スポットのにじみ（ｂｌｅｅｄｔｈｒｏｕｇｈ）を測定した図。図７Ａは、ＴＭＲフィルターチャネルと、Ａｌｅｘａ  ５９４フィルターチャネルと、Ｃｙ５フィルターチャネルとを通して確認される、ＴＭＲで標識されたＦＬＪ１１１２７  ｍＲＮＡスポットの画像。画像内の線に対応する蛍光強度の線走査（ｌｉｎｅｓｃａｎ）は、下に掲載されており、異なる線走査が、ｚの増加（０．２５μｍ間隔）に対応する。緑色の線走査は、画像それ自体に表されているｚ−スライスに対応する。Ａｌｅｘａ  ５９４で標識されたＣｏｘ−２  ｍＲＮＡスポット（図７Ｂ）と、Ｃｙ５で標識されたＦＫＢＰ５  ｍＲＮＡ粒子（図７Ｃ）とについて、同様の分析が実施された。線走査強度測定の結果は全て、カメラバックグラウンドが減算されているが、任意の蛍光単位（ＡＵ）０ないし２００の範囲内である。
【図８】脱酸素剤がＣｙ５の光安定性を増加させることを示す図。図８Ａは、ＴＭＲ結合プローブを用いて標識されたＦＬＪ１１１２７  ｍＲＮＡの数についての最大スポット蛍光の平均を、ＴＭＲに対して特異的なフィルターを用いて、２秒間露光（２  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｘｐｏｓｕｒｅｓ）の数に応じてプロットした図。酸素除去システムがある場合（青色）と、ない場合（赤色）とで得られた画像から曲線が得られた。２秒間露光でのＡｌｅｘａ−５９４結合プローブで標識されたＣｏｘ−２  ｍＲＮＡについて（図８Ｂ）と、２．５秒間露光でのＣｙ５結合プローブで標識されたＦＫＢＰ５  ｍＲＮＡについて（図８Ｃ）とで、同様の分析が実施された。図８Ｄは、酸素除去抗退色システムがある場合と、ない場合とでの、ＴＭＲ結合プローブと、Ａｌｅｘａ−５９４結合プローブと、Ｃｙ５結合プローブと（図８Ａ−図８Ｃ）についての１回の露光当りの退色率（１回の露光当りの蛍光消失の割合の単位）を示す図。前記退色率は、各粒子の減衰曲線を指数関数にフィッティングし、フィッティングされた減衰定数の平均を加算することにより算出された。誤差棒は、１標準偏差に対応する。各実験条件について最小限６個の粒子が選択された。
【図９】線虫（Ｃ．エレガンス）とキイロショウジョウバエ（Ｄ．メラノガスター）とでのｍＲＮＡ局在の画像化。図９Ａは、Ｃ．エレガンスの初期胚（〜１００細胞期）でのｅｌｔ−２  ｍＲＮＡ分子（赤色）を示す図であり、核はＤＡＰＩで対比染色（青色）された。図９Ｂは、Ｃ．エレガンスのＬ１幼虫でのｅｌｔ−２  ｍＲＮＡ分子を示す図。青色の四角内に、腸管（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｋ）が見える単一の焦点面が示される。図９Ｃは、キイロショウジョウバエの３齢幼虫の成虫羽原基内でのｄｐｐ及びエングレイルド（ｅｎｇｒａｉｌｅｄ）発現の模式図。図９Ｄは、コンピューターにより同定されたｄｐｐ  ｍＲＮＡ分子（薄青色の円）と、免疫蛍光により検出されたエングレイルド発現（紺青色）との局在を表す画像。図９Ｅは、強調されたｄｐｐ  ｍＲＮＡ分子（薄青色）と、免疫蛍光により検出されたエングレイルドタンパク質発現（紺青色）とを含む画像。図９Ｂの枠で囲まれた部分を除いて、全てのイメージは、蛍光画像のｚ−スタックの最大マージであり、目盛尺はすべて長さ５μｍである。
【図１０】酵母及びニューロン内のｍＲＭＡ単一分子の画像化。図１０Ａ及び図１０Ｂは、紫色の核ＤＡＰＩ対比染色で、未処理の細胞（図１０Ａ）と、０．４Ｍ  ＮａＣｌで１０分間塩ショック（ｓａｌｔ  ｓｈｏｃｋ）に曝露された細胞（図１０Ｂ）とでのＳＴＬ１  ｍＲＮＡ粒子を示す図。図１０Ｃは、ニューロンの解離培養でのラット海馬ニューロン内のβ−アクチンｍＲＮＡ（緑色）と、Ｍａｐ２  ｍＲＮＡ（赤色）との発現を示す図。図１０Ｄは、図１０Ｃの赤色四角で囲まれる樹上突起部分の拡大対比画像。目盛尺は、すべて長さ５μｍである。
【図１１】本発明で用いられる標的配列及びプローブのアライメント図。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、一定の原理に基づいた２値化の戦略を用い、細胞内に存在する全ての標的ｍＲＮＡ分子を正確かつ、明確に同定するとともに、計数することができる画像解析アルゴリズムの開発と部分的に関連する。このアプローチの簡便さとロバスト性とは、同一細胞内の異なる３種類のｍＲＮＡの信頼できる検出を可能にする。本件の発明者らは、厳密な基準を用いて、本方法が、広い範囲の細胞タイプとモデル生物種とにわたって、極めて特異的な単一ｍＲＮＡの画像化を可能にすることを実証した。
【００２１】
本件の発明者らは、末端が標識された多数の異なる同一のより小さな標的用のプローブを合成するために、９６穴ＤＮＡ合成装置を利用できるという利点を生かした。少なくとも３０種類、好ましくは少なくとも４０種類、より好ましくは約４８種類（ハイスループットＤＮＡ合成で使用される９６穴プレートの半数）又はそれ以上が１個だけで標識された１組のプローブが同一のｍＲＮＡ分子と結合するとき、該プローブは、該ｍＲＮＡが広視野顕微鏡を用いる方法での回折限界のスポットとして確認できるほど十分な蛍光を発するようにすることを、得られた結果は示す。非特異的部位は１種類又は数種類のプローブとだけ結合し、拡散されたシグナルを発生させるが、真の標的は全て又は大多数のプローブと結合し、各ｍＲＮＡ分子について、明らかに検出可能なスポットを発生させる。
【００２２】
また、本件の発明者らは、一定の原理に基づいた２値化の戦略を用い、細胞内に存在する全ての標的ｍＲＮＡ分子を正確かつ明確に同定し、計数することができる画像解析アルゴリズムを開発した。このアプローチの簡便さとロバスト性とは、同一細胞内の異なる３種類のｍＲＮＡの信頼できる検出を可能にする。本件の発明者らは、厳密な基準を用いて、本方法が、広い範囲の細胞タイプとモデル生物種とにわたって、極めて特異的な単一のｍＲＮＡの画像化を可能にすることを実証する。
【００２３】
したがって、１個だけで標識された４８種類又はそれ以上のオリゴヌクレオチドプローブはｍＲＮＡ単一分子の検出を可能にする。前記ｍＲＮＡ分子は、標準的な広視野顕微鏡の設定で容易に検出され得る、回折限界のスポットとして視覚化された。本発明のスポット検出画像処理アルゴリズムを用いると、スポットは正確に計数する上で十分に、鮮明であった。本件の発明者らは、個々の細胞内の異なる３種類のｍＲＮＡ分子の定量的な計数値を得た。かかる分析は、多種類のモデル生物にわたる、さらに、より低発現の遺伝子の正確な多重遺伝子発現プロファイリングを容易にする。
【００２４】
本発明で開示されたシステムの特異性の根拠は、大多数又は全てのプローブが所望の標的ｍＲＮＡと結合し、粒子のシグナルを発生させるのに対し、細胞内の他の部分にある非特異的結合部位は、より少数のプローブ分子と結合し、スポット計数アルゴリズムが無視する拡散シグナルを発生させることである。この点は、デンドリマーのように強く標識されたプローブを用いる他のｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法を超える、本発明の重要な長所を強調する。全てのプローブ分子が検出可能な場合、非特異的結合事象はそれぞれ偽陽性の結果をもたらし、プローブが結合していないｍＲＮＡはいずれも偽陰性の結果をもたらす。しかし、プローブの数が増加するにつれ、偽陰性及び偽陽性の尤度は減少し、一般的に、ハイブリダイゼーションの効率が一定のとき、異なるプローブの種類を増加させると、１分子当りに結合するプローブの分布が狭くなる。プローブの種類の増加が、任意に選択された閾値に依存しない、ロバストなスポット検出をもたらすことを本発明による画像分析は示した。この事実は、細胞１個当たりのｍＲＮＡの数を正確に計数するために極めて重要であり、本発明の方法の重要な特徴である。
【００２５】
これに関連し、１組のプローブの設計における因子となる可能性があるものは、ハイブリダイゼーション親和性の均一性である。オリゴヌクレオチド親和性は、主にＧＣ含量比により支配されるので、本件の発明者らは、均一性が最適化された総ＧＣ含量を有する１組のプローブを設計するためのコンピュータープログラムを開発した。前記コンピュータープログラムは、公衆が入手できる。
【００２６】
また実用的な観点からも、本発明の方法は、時間及び費用の点で、従来のｍＲＮＡ単一分子のＦＩＳＨ法を超える大きな利益をもたらす。合成技術の進歩により研究者は、３’アミノ基修飾剤（ａｍｉｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）を含む多数のオリゴヌクレオチドを容易かつ安価に入手することができる。前記オリゴヌクレオチドは、その後、プールされ、結合され、一斉に精製されるので、複数回のカップリングと、多重に標識されたプローブの生成に必要となる精製とに伴う手間が著しく減少する。本発明によりもたらされる簡便性及び費用効果は、多数の異なるｍＲＮＡの検出を含む遺伝子レベルの研究を促進する。さらに、ハイブリダイゼーションの手順は柔軟に応用できるので、免疫蛍光のような他の標準的な方法との併用が可能になる。
【００２７】
他の実施態様では、蛍光色素はＤＮＡの自動合成時にプローブ中に取り込まれる場合がある。
【００２８】
個々の細胞内のｍＲＮＡ数を定量化する他の方法は、単一細胞ＲＴ−ＰＣＲと、デジタルＲＴ−ＰＣＲとを含む。前記方法に関する問題の１つは、微小流体装置又はロボット装置の使用を必要とする多数の個々の反応を組み立てることに関する実用的な困難性である。さらに前記方法は、標的が、ほんの数個の分子であるとき、指数関数的増幅での確率的変動に関する問題に悩まされる。このような確率的挙動は、確率的な力に左右され、単一細胞の遺伝子発現の分析を困難にする。さらに前記方法は、空間的なｍＲＮＡ局在に関するいかなる情報も提供しない。
【００２９】
本発明のｍＲＮＡ単一分子の検出方法の簡便性と、用途の幅広さとを考慮すると、前記方法は種々の研究に適している。個々の細胞内の正確なｍＲＮＡ計数値を得ることにより、異なる条件での発現の差異と、細胞間の遺伝子発現の変動性とを正確に測定できる。単一細胞内の個々のｍＲＮＡの定量的かつ空間的な測定結果が得られることにより、本発明の方法は、システム生物学、細胞生物学、神経生物学及び発生生物学における多くの研究に役立つ。
【００３０】
したがって本発明の方法は、スクリーニング検定法を含むが、これに限定されない、多数の検定法に使用される場合がある。１の実施態様では前記スクリーニング検定法は、試験化合物がメッセンジャーリボ核酸分子（ｍＲＮＡ）の標的配列の分布又は量に影響を与えるかどうかを確認するものであり、該標的配列は、ヌクレオチド１５−１００個で、少なくとも３０種類の重複しない細胞内のプローブ結合領域を含む。前記検定法は、一般的には、試験化合物を用いて、応答が起こるのに十分な期間、細胞を培養するステップと、該細胞に透過処理を施すステップと、前記細胞を少なくとも３０種類の過剰の核酸ハイブリダイゼーションプローブに浸すステップと、未結合のプローブを除去するために、前記固定された細胞を洗浄するステップと、前記プローブからの蛍光の量又は分布を検出するステップと、該量又は分布を、上記の処理を施されるが、前記試験化合物で培養されない対照細胞から得られる量又は分布とそれぞれ比較するステップとを含み、前記プローブのそれぞれは同一の蛍光標識１個だけで標識され、かつ、前記プローブのそれぞれは前記標的配列の異なるプローブ結合領域に相補的である核酸配列を含む。
【００３１】
適当な試験化合物の候補は、（例えば、抗体又はナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ）の）ペプチド系化合物と、ＲＮＡ干渉剤（すなわち、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）と、低分子とを含むが、これらに限定されない。前記化合物は全て、当該技術分野で公知の方法により生成される場合がある。例えば、Ｎａｉｔｏ（米国特許出願公開第２００８０１１３３５１号明細書）及びＫｈｖｏｒｏｖａ（米国特許出願公開第２００７００３１８４４号明細書）が、活性ＲＮＡ干渉化合物の選択方法を提供する。また、抗体は、ハイブリドーマの使用と、モノクローナル抗体の選択と、ファージ・ディスプレイ・ライブラリーの使用と、抗体のヒト型化と、これらに類するものとを含む既知の技術により調製される場合がある。
【００３２】
低分子化合物は、適当なライブラリーのスクリーニングから選択される場合がある。１つの局面では、低分子ライブラリーは当該技術分野で周知慣例の方法により合成される。例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ及びＥｌｌｍａｎ、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，９６，５５５−６００（１９９６）と、Ｓｈｉｐｐｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４巻，１１８３３−１１８３８頁（１９９７年１０月）と、コンビナトリアルライブラリーの設計及び評価−原理、ソフトウェアツール及び創薬での活用、Ｇｈｏｓｅ及びＶｉｓｗａｎａｄｈａｎ（編）、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ（２００１）とを参照せよ。また例えば、ＮＩＨ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙを含む多数の供給源のいずれかから低分子ライブラリーが得られる。更なる供給源には、純粋な天然物の低分子ライブラリーであるＭＥＧＡｂｏｌｉｔｅ（登録商標）及び半合成天然類似物の低分子ライブラリーであるＮａｔＤｉｖｅｒｓｅ（商標）が入手できるＡｎａｌｙｔｉＣｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＧｍｂＨ（ポツダム、ドイツ）と、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ.（モスクワ、ロシア連邦）と、Ｐｒａｅｃｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ウォルサム、マサチューセッツ州）とが含まれる。
【００３３】
更なる局面では、本発明は上記で説明される２値化アルゴリズムを実行するソフトウェアを提供する。よって１の実施態様では、コンピューターで読み取り可能な媒体であって、２次元蛍光画像の３次元スタックを得るための指示と、３次元フィルターを用いて、前記３次元スタックをフィルタリングするための指示と、複数の強度閾値それぞれについて、フィルタリングした前記３次元スタックでの３次元スポットの総数を計数するための指示と、該総数が計数された強度閾値に対する３次元スポットの前記総数のプロットにおける、プラトー領域の代表的な最適強度閾値を得るための指示と、前記３次元スタックで検出された蛍光粒子の代表的な数として、前記最適閾値で得られる３次元スポットの前記総数を用いるための指示とを含む、媒体を提供する。
【００３４】
１の実施態様では、前記２値化は３次元線形ラプラシアン・オブ・ガウシアンフィルターを用いて達成される。
【００３５】
他の局面では、キットが提供される。前記キットは、上記のような２値化アルゴリズムを実行するコンピューターで読み取り可能な媒体と、予め選択された標的配列に対する１組のプローブとを含む。また、本発明の方法に関連して記載される前記プローブは、本発明の前記キットにも適している。
【００３６】
本発明の方法による具体的な実施態様は、以下の実施例に記載される。これら実施例は、例示に過ぎず、本明細書の開示内容を限定する意図はない。
【実施例１】
【００３７】
材料及び方法
この章で説明される手順は、特記がない限り、全ての実施例に適用される。
【００３８】
プローブの設計
プローブの組は、少なくとも４８種類のオリゴヌクレオチドからなるように設計され、該オリゴヌクレオチドは、それぞれ、長さがヌクレオチド１７個から２２個までのばらつきがあり、３’アミノ基修飾剤（ａｍｉｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）を含む（ＦＫＢＰ５  ｍＲＮＡは６３種類のオリゴヌクレオチドを用いて、ＦＬＪ１１１２７  ｍＲＮＡは５３種類のオリゴヌクレオチドを用いて、Ｍａｐ２  ｍＲＮＡは、７２種類のオリゴヌクレオチドを用いて、それぞれ標識された）。また、前記オリゴヌクレオチドのＧＣ含量は、できるだけ４５％近くに設定された。前記オリゴヌクレオチドは、プールされ、１回の反応で蛍光色素と結合され、その後、未結合のオリゴヌクレオチドと未反応の蛍光色素とはＨＰＬＣ精製により除去された。
【００３９】
蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション
ＦＩＳＨに備え、サンプルは全て、３．７％ホルムアルデヒドで固定され、エタノールで透過処理が施された。Ｆｅｍｉｎｏらにより概要が示されたのと同様の緩衝剤及び条件を用いてハイブリダイゼーションが実施されたが、重要な相違点は、使用するホルムアミドの量を１０％まで減少させることにより、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーをより低下させることである。最適なシグナルを発生する前記プローブの濃度は、経験的に決定された。
【００４０】
画像化及びデータ解析
全ての画像は標準的な広視野蛍光顕微鏡を用いて取得された。コンピューターによる検出と、粒子の計数とは、粒子のシグナルを強調するために設計された線形フィルターを用いて実施された。
【実施例２】
【００４１】
同一のｍＲＮＡ分子に存在する反復配列及びユニーク配列のプローブ処理
単一の蛍光色素原子団で標識された小さなオリゴヌクレオチドプローブを用いたとき、プローブ結合配列の３２−９６回の縦列コピーを含むように改変されたｍＲＮＡ単一分子が、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションで検出可能であることを本件の発明者らは明らかにした。また、回折限界のスポットを直接計数することにより得られたｍＲＮＡコピー数の平均を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより得られた標的分子の数の計数値と関連付けることを含む多数の異なる手法を用いて、画像内の個々のスポットがｍＲＭＡ単一分子を表すことを発明者らは証明した。したがって、多数の異なるプローブを使用し、該プローブが、それぞれ、天然ｍＲＮＡの明確に異なる領域を標的とする場合、改変された遺伝子を用いることなしに、単一分子感度を得ることが可能となるであろう。
【００４２】
この仮説の最初のテストとして、本件の発明者らは、緑色蛍光タンパク質をエンコードし、３’−ＵＴＲでヌクレオチド８０個が３２回縦列反復する配列を有するｍＲＮＡを生成するドキシサイクリン制御遺伝子を構築した後、改変された前記遺伝子がチャイニーズハムスター卵巣細胞株のゲノムに安定に組み込まれた。前記遺伝子から発現するｍＲＮＡは、前記コード配列のユニーク領域にそれぞれ相補的な４８種類の異なるオリゴヌクレオチドと、反復モチーフにそれぞれ相補配列を有する４種類のオリゴヌクレオチドの組（合計で１２８個のプローブが結合した）とで、同時に標識された（図１Ａ）。前記コード配列に特異的なプローブの組の各オリゴヌクレオチドは、単一のＡｌｅｘａ−５９４蛍光色素で標識され、前記反復配列に特異的な１組のオリゴヌクレオチドはそれぞれ、単一のテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）蛍光色素で標識された。以下に記載するように、適当なフィルターセットを使用することにより、ＴＭＲ蛍光色素から発せられる蛍光はＡｌｅｘａ−５９４チャネルでは検出されず、Ａｌｅｘａ−５９４蛍光色素から発せられる蛍光はＴＭＲチャネルでは検出されないことが保証された。
【００４３】
かかるプローブを用いてＦＩＳＨを実施したところ、直径約０．２５マイクロメートルの多数の「粒子」が、ＴＭＲチャネル及びＡｌｅｘａ−５９４チャネルの両方で視覚化されることを、本件の発明者らは発見した（図１Ｂ）。前記粒子をＧＦＰコード配列プローブ（ＴＭＲ）で標識されるものか、ＵＴＲ特異的プローブ（Ａｌｅｘａ−５９４）で標識されるものか、ＧＦＰコード配列プローブ及びＵＴＲ特異的プローブで標識されるものかに分類する（次の章で説明される）画像処理プログラムを用いて、前記粒子はコンピューターにより同定された（図１Ｃ）。図１Ｃに示された粒子と同様の４個の視野内の粒子の種類及び位置を同定すると、ＧＦＰコード配列特異的プローブに対応する総数５９９個の粒子と、ＵＴＲ特異的プローブに対応する総数５６５個の粒子とが計数された。かかる粒子のうち、「ＵＴＲ粒子」の８５％は「ＧＦＰ粒子」と共局在であったのに対し、ＧＦＰ粒子の８１％はＵＴＲ粒子と共局在であった。すでに確立された縦列反復検出法により、粒子間での高い共局在が検出され、１個だけで標識された４８種類の異なるオリゴヌクレオチドで同時にプローブ処理することにより検出された粒子は、内在性転写産物を検出するために１個だけで標識された多種類のプローブを使用することが妥当であることを実証した。共局在を示さなかった一部の粒子は、自然にｍＲＮＡが分解する過程で、コード配列か、３’−ＵＴＲかのいずれかを失ったｍＲＮＡに対応する可能性が高い。
【００４４】
また本件の発明者らは、ＴＭＲチャネル及びＡｌｅｘａ−５９４チャネルでの共局在スポットの蛍光強度を解析することで、該スポット強度が単峰型分布を示すことを見出し（図２）、検出された粒子は多数のｍＲＮＡからなる群ではなく、むしろ単一分子であると主張した。前記スポット強度は、２種類のチャネル間で強い相関を示した（図３）。前記２種類のチャネル間でクロストークは存在しないため、スポット強度の変動は（異なるプローブの組で相関が見られなかったと推測される）プローブハイブリダイゼーションでの不規則な変動によるものではなく、むしろｍＲＮＡの一体又はアクセス可能性のような、両方のプローブに等しく影響を及ぼす他の因子によることを、この事実は示している。
【００４５】
また本件の発明者らは、最初の１２種類か、２４種類か、３６種類か、４８種類全てかのプローブを１組として用いて、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションを実施することにより、プローブの数に応じてシグナル強度がどのように異なるかを研究した。この特定の標的ｍＲＮＡに対して、強度は減少するが、より少ない種類のプローブで粒子が検出され得ることがわかった（図３Ａ）。しかし、（以下で詳細に説明される）自動スポット検出アルゴリズムは、４８種類のプローブを用いることで、広範な閾値にわたり同じ数のスポットを検出し、特に有効に機能した（図３Ｂと、以下のさらなる説明とを参照せよ）。本件の発明者らは、わずか３０種類のプローブを用いて明瞭なｍＲＮＡのシグナルを得たが、ロバストなシグナルに必要なプローブの数は標的配列に依存する可能性が高い。５個の蛍光色素で標識され、遺伝子の３’−ＵＴＲで３２回反復する配列と相補的な、長さ４５ｂｐのオリゴヌクレオチドを用いて、ｍＲＮＡ１個当たり蛍光色素が１６０個結合する可能性があるＦｅｍｉｎｏらの方法（図４Ａ）と本発明の方法を比較したとき、本発明の方法はＦｅｍｉｎｏらの方法より少数の蛍光色素を使用したにも関わらず、感度は少なくとも同程度であることが示されており、バックグラウンドに対するシグナルはどちらの方法でもほぼ同じであることがわかった（図４Ｂ）。
【００４６】
さらに、レポーター遺伝子がないＣＨＯ細胞はシグナルを全く発しなかったのに対し、ドキシサイクリンの添加により発現が止まるレポーター遺伝子があるＣＨＯ細胞は、ほんの数個の細胞でだけｍＲＮＡ粒子を生じさせるので、観察されるシグナルが特異的であることを示した。
【実施例３】
【００４７】
コンピューターによるスポット検出用アルゴリズム
多数のｍＲＮＡ分子を確実に同定するために、本件の発明者らは、蛍光画像の３次元スタック内のスポットを確認するためのコンピューターによる半自動アルゴリズムを開発した。スポット検出に関する問題点の１つは、細胞自家蛍光と、低レベルの非特異的プローブハイブリダイゼーションとに起因する不均一なバックグラウンドである。かかる問題を解決するために、本件の発明者らは、わずかに変動するバックグラウンドを除去しながら、適当な大きさ及び形のスポット様シグナルを強調するように設計された３次元線形ラプラシアン・オブ・ガウシアンフィルターを用いて、画像スタックをフィルター処理した（図５Ａ及び図５Ｂ）。前記アルゴリズムの次のステップでは、発明者らは、前記スポットを規定するために、フィルターで処理された画像に閾値を適用した。閾値を合理的に選択するために、前記フィルターで処理された画像で、０から最大画素強度までの範囲の閾値全てについて、３次元でのスポットの数が計数された。発明者らが粒子の数を閾値に応じてプロットしたとき、検出された粒子の数が選択された特定の閾値に全く反応しない領域を示す広いプラトーが存在した（図５Ｃ）。前記領域で閾値が選択されるとき、検出された前記スポットは目で確認されるスポットと非常によく一致することから、スポット検出アルゴリズムの有効性が実証された（図５Ｄ）。
【実施例４】
【００４８】
３種類の異なるｍＲＮＡ種の遺伝子発現プロファイリング
本発明の方法は、個々の細胞内の多種類のｍＲＭＡ単一分子の同時検出に使用される可能性がある。かかる可能性を実証するために、ヒト癌細胞株Ａ５４９内のＦＫ５０６結合タンパク質５（ＦＫＢＰ５）と、Ｃｏｘ−２と、ＦＬＪ１１１２７とをコードする３種類のｍＲＮＡに特異的な数種類のプローブを、本件の発明者らは設計した。前記数種類のプローブは、スペクトルが区別できる蛍光色素Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ  ５９４及びＴＭＲにそれぞれ結合された。同時に全３種類のプローブを用いてＦＩＳＨを実施すると、個々のスポットが３種類の異なる蛍光チャネルで視覚化され（図６Ａ−図６Ｆ）、強度解析により、蛍光スポットは他のチャネルへとにじみ出さないことがわかった（図７）。
【００４９】
本発明のｍＲＮＡ検出法が特異的かつ定量的であることを実証するために、細胞透過性グルココルチコイドであるデキサメタゾンを用いて細胞を培養したところ、この特定の細胞株では、ＦＫＢＰ５及びＦＬＪ１１２７の発現を上向き調節したのに対し、Ｃｏｘ−２の発現をわずかに下向き調節した。ＦＩＳＨと本明細書で開示されるスポット検出アルゴリズムとを併用して測定されたＦＫＢＰ５  ｍＲＮＡ及びＦＬＪ１１２７  ｍＲＮＡの平均数は増加するのに対し、Ｃｏｘ−２  ｍＲＮＡの平均数は減少することを、本件の発明者らは発見した（図６Ａ−図６Ｃと、図６Ｄ−図６Ｆとを比較）。前記平均値は同一サンプルで実施された前記遺伝子の誘導倍率及び抑制倍率のＲＴ−ＰＣＲ測定値とよく一致したことから、前記蛍光スポットは適当なｍＲＮＡであり、該ｍＲＮＡ分子の大多数（図６Ｇ）は本発明の方法により検出されることが実証された。さらに、この事実は、正確な遺伝子発現定量化のためのスポット検出法の有効性を実証する。
【００５０】
多種類のｍＲＮＡの同時画像化で発生する技術的課題は、特にＣｙ５の場合、蛍光色素が光に不安定であることであった。単一細胞内のｍＲＮＡ分子を全て画像化するためには、各画像に対し１−３秒間露光及び大口径対物レンズを用いて、各視野に対し１０ないし３０個の「ｚ軸断面」画像が必要であった。ＴＭＲと（少し弱いが）Ａｌｅｘａ−５９４とだけは比較的長時間の強い露光に耐えることができたが、例えばＣｙ５はかかる条件下では光に対して非常に不安定であった（図８）。本問題を解消するために、本件の発明者らは、蛍光色素の光安定性がより高い特別な封入剤を使用した。本方法はＹｉｌｄｉｚらの方法をわずかに修正して適用された。本封入剤では、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ及びグルコースの混合物が前記封入剤から酸素分子を酵素的に除去することにより、蛍光色素を破壊する酸素依存性の光開始経路（ｌｉｇｈｔ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  ｐａｔｈｗａｙｓ）を抑制する。前記酵素の使用は、Ｃｙ５の光安定性を１０倍と劇的に向上させたが、ＴＭＲ及びＡｌｅｘａ−５９４の画像化には悪影響を及ぼさないことから、３色の画像化を実施するときの複数のｚ軸断面の取得が容易になった。
【実施例５】
【００５１】
多種類のモデル生物種及び細胞タイプ内のｍＲＮＡの検出
ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションの標準的な用途の１つは、発生段階でのｍＲＮＡ局在の検出である。本件の発明者らは、広く研究された２種類の発生システムである線虫、シノラブディス・エレガンス及びショウジョウバエ、ドロソフィラ・メラノガスターにおいて本発明の方法の有効性を試験した。前記線虫では、本件の発明者らは、線虫の胚が４５細胞期に発生した後でのみ線虫の腸だけで発現される、転写因子ｅｌｔ−２遺伝子からｍＲＮＡを検出するためのプローブを構築した。前記プローブの組を胚及び幼虫の両方とハイブリダイゼーションさせると、該胚及び幼虫（図９Ｂ）の両方の腸の領域内（図９Ａ）だけでｅｌｔ−２  ｍＲＮＡ分子が存在することがわかった。しかし、発現が開始する既知のタイミングと一致して、ｅｌｔ−２  ｍＲＮＡは４５細胞期より発達した胚の腸でだけ検出されたことから、本発明の方法の特異性が再び強調された。さらに、初期の段階で、ほんの数個の転写産物が検出されたことから、本発明の方法は複雑な組織内の少数の翻訳さえも検出できるほど感度が高いことがわかった。
【００５２】
前記ショウジョウバエでは、遺伝子発現の局在化の最もよく研究された例の１つが、羽成虫原基の発生で生じる。ショウジョウバエ幼虫の羽原基は注目すべき遺伝子発現パターンの組を示し、該遺伝子発現パターンの１つはヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）タンパク質及びエングレイルド（ｅｎｇｒａｉｌｅｄ）タンパク質の勾配に対応するｄｐｐ遺伝子発現の１本の縞の形成である。特に、ｄｐｐ  ｍＲＮＡ合成を負に調節するエングレイルドは前記羽原基の後方部で高く、前記羽原基の前方部で低い。同様に、ｄｐｐ  ｍＲＮＡ合成を正に調節するヘッジホッグは前記羽原基の後方部で高く、前記羽原基の前方部で低い。しかし、ヘッジホッグのレベルがｄｐｐを活性化するのに十分高いが、エングレイルドを活性化するほど高くはない前記後方部及び前方部の間の領域が存在し、その結果、１本の狭い縞状にｄｐｐ  ｍＲＮＡが合成される（図９Ｃ）。
【００５３】
ｄｐｐ  ｍＲＮＡ合成の前記狭い縞が画像化されるかどうかを調べるために、本件の発明者らはｄｐｐ  ｍＲＮＡに対して１個だけで標識された数種類のプローブの組を構築し、３齢幼虫から単離された成虫羽原基でｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションを実施した。また本ｉｎ  ｓｉｔｕ手段は、（青色で表示された）エングレイルドタンパク質に対する免疫蛍光と併用された。図９Ｄはアルゴリズムで同定された前記ｍＲＮＡ分子の局在が青色の円として表示される全体の画像であり、図９ＥはｍＲＮＡシグナルを強調した前記画像の拡大部分である。ｍＲＮＡ分子がエングレイルド発現の領域の前縁部でだけ見られることを前記画像は示しており、再度、検出の特異性が確認された。
【００５４】
また、本件の発明者らは、ＳＴＬ１遺伝子からの転写産物を標的とする１組のプローブを設計することにより、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）において本発明の方法を試験した。ＳＴＬ１は、増殖培地への塩の添加により発現が著しく上向き調節される多数の酵母遺伝子のうちの１つである。ショックに曝露されない細胞はＳＴＬ１  ｍＲＮＡ分子を実質的に含まないのに対し（図１０Ａ）、１０分間０．４Ｍで塩ショックに曝露された細胞は多数のＳＴＬ１  ｍＲＮＡ分子を含有こと（図１０Ｂ）がわかった。
【００５５】
ｍＲＮＡ局在が広く研究されている他の細胞タイプは、ニューロンである。本システムにおける本発明の方法の有効性を示すために、本件の発明者らは培養された海馬ニューロン内のβ−アクチン  ｍＲＮＡとＭａｐ２  ｍＲＮＡとを画像化した。図１０Ｃは、（ＴＭＲで標識された）β−アクチンプローブの組と、（Ａｌｅｘａ−５９４で標識され）異なる色のＭａｐ２プローブの組とが、単一分子分解能で標的を画像化及び識別するために使用され得ることを示す。かかるｍＲＮＡのうち少数は、樹状突起の遠位領域へと移動する（図１０Ｄ）。粒子の計数値は、７９１個のβ−アクチン  ｍＲＮＡ分子のうち１４％が樹状突起に局在したのに対し、１４０個のＭａｐ２  ｍＲＮＡ分子のうち３７％が樹状突起に局在したことを示し、この結果は既に報告された分布と同様である。
【００５６】
本明細書で引用された特許文献及び非特許文献の全ては、本発明に関連する当業者の技術水準を示す。前記文献は、個々の文献が明確に個々に引用により取り込まれるように示されるのと同一の範囲で、本明細書に全体として引用により取り込まれる。
【００５７】
参考文献
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４．  Ｌｅｖｓｋｙ，Ｊ．Ｍ．及びＳｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｈ．、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ｐａｓｔ，ｐｒｅｓｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ．、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１６，２８３３−２８３８（２００３）
５．  Ｔａｕｔｚ，Ｄ．及びＰｆｅｉｆｌｅ，Ｃ．、Ａ  ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＲＮＡｓ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｅｍｂｒｙｏｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ｈｕｎｃｈｂａｃｋ．、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ  ９８，８１−８５（１９８９）
６．  Ｒａａｐ，Ａ．Ｋ．ら、Ｕｌｔｒａ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ＦＩＳＨ  ｕｓｉｎｇ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｔｉｎ−  ｏｒ  ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ  ｔｙｒａｍｉｄｅｓ．、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ４，５２９−５３４（１９９５）
７．  Ｆｅｍｉｎｏ，Ａ．Ｍ．、Ｆａｙ，Ｆ．Ｓ．、Ｆｏｇａｒｔｙ，Ｋ．及びＳｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｈ．ら、Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｉｎ  ｓｉｔｕ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０，５８５−５９０（１９９８）
８．  Ｔｓｏｋａｓ，Ｐ．ら、Ｌｏｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ａ  ｒａｐｉｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｌＡ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｔｅ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ．、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２５，５８３３−５８４３（２００５）
９．  Ｍａａｍａｒ，Ｈ．、Ｒａｊ，Ａ及びＤｕｂｎａｕ，Ｄ．、Ｎｏｉｓｅ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｃｅｌｌ  ｆａｔｅ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１７，５２６−５２９（２００７）
１０．  Ｆｅｍｉｎｏ，Ａ．Ｍ．、Ｆｏｇａｒｔｙ，Ｋ．、Ｌｉｆｓｈｉｔｚ，Ｌ．Ｍ．、Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｗ．及びＳｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｈ．、Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３６１，２４５−３０４（２００３）
１１．  Ｒａｎｄｏｌｐｈ，Ｊ．Ｂ．及びＷａｇｇｏｎｅｒ，Ａ．Ｓ．、Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｙ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅｓ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５，２９２３−２９２９（１９９７）
１２．  Ｓｉｎｄｅｌａｒ，Ｌ．Ｅ．及びＪａｋｌｅｖｉｃ，Ｊ．Ｍ．、Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｍｕｌｔｉｃｈａｎｎｅｌ  ｆｏｒｍａｔ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２３，９８２−９８７（１９９５）
１３．  Ｖａｒｇａｓ，Ｄ．Ｙ．、Ｒａｊ，Ａ．、Ｍａｒｒａｓ，Ｓ．Ａ．、Ｋｒａｍｅｒ，Ｆ．Ｒ．及びＴｙａｇｉ，Ｓ．、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｕｓ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０２，１７００８−１７０１３（２００５）
１４．  Ｒａｊ，Ａ．、Ｐｅｓｋｉｎ，Ｃ．Ｓ．、Ｔｒａｎｃｈｉｎａ，Ｄ．、Ｖａｒｇａｓ，Ｄ．Ｙ．及びＴｙａｇｉ，Ｓ．、Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  ｍＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ  ４，ｅ３０９（２００６）
１５．  Ｇａｒｎｅａｕ，Ｎ．Ｌ．、Ｗｉｌｕｓｚ，Ｊ．及びＷｉｌｕｓｚ，Ｃ．Ｊ．、Ｔｈｅ  ｈｉｇｈｗａｙｓ  ａｎｄ  ｂｙｗａｙｓ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｄｅｃａｙ．、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８，１１３−１２６（２００７）
１６．  Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｒ．Ｃ．、Ｗｏｏｄｓ，Ｒ．Ｅ．及びＥｄｄｉｎｓ，Ｓ．Ｌ．、Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍａｔｌａｂ．、（Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ，Ｕｐｐｅｒ  Ｓａｄｄｌｅ  Ｒｉｖｅｒ，ＮＪ；２００４）
１７．  Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｃ．ら、Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ（ＣｈＩＰ）  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅｓ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０１，１５６０３−１５６０８（２００４）
１８．  Ｙｉｌｄｉｚ，Ａ．ら、Ｍｙｏｓｉｎ  Ｖ  ｗａｌｋｓ  ｈａｎｄ−ｏｖｅｒ−ｈａｎｄ：ｓｉｎｇｌｅ  ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｗｉｔｈ  １．５−ｎｍ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００，２０６１−２０６５（２００３）
１９．  Ｂｅｎｓｏｎ，Ｄ．Ｍ．、Ｂｒｙａｎ，Ｊ．、Ｐｌａｎｔ，Ａ．Ｌ．、Ｇｏｔｔｏ，Ａ．Ｍ．Ｊｒ．及びＳｍｉｔｈ，Ｌ．Ｃ．、Ｄｉｇｉｔａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ｓｐａｔｉａｌ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ  ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔｓ  ｉｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｃｅｌｌｓ．、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １００，１３０９−１３２３（１９８５）
２０．  Ｌｅｃｕｙｅｒ，Ｅ．ら、Ｇｌｏｂａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｐｒｏｍｉｎｅｎｔ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｃｅｌｌ  １３１，１７４−１８７（２００７）
２１．  Ｆｕｋｕｓｈｉｇｅ，Ｔ．、Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｍ．Ｇ．及びＭｃＧｈｅｅ，Ｊ．Ｄ．、Ｔｈｅ  ＧＡＴＡ−ｆａｃｔｏｒ  ｅｌｔ−２  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ．、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １９８，２８６−３０２（１９９８）
２２．  Ｓａｎｉｃｏｌａ，Ｍ．、Ｓｅｋｅｌｓｋｙ，Ｊ．、Ｅｌｓｏｎ，Ｓ．及びＧｅｌｂａｒｔ，Ｗ．Ｍ．、Ｄｒａｗｉｎｇ  ａ  ｓｔｒｉｐｅ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｉｍａｇｉｎａｌ  ｄｉｓｋｓ：ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ  ａｎｄ  ｐａｔｃｈｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｅｎｇｒａｉｌｅｄ．、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３９，７４５−７５６（１９９５）
２３．  Ｒｅｐ，Ｍ．、Ｋｒａｎｔｚ，Ｍ．、Ｔｈｅｖｅｌｅｉｎ，Ｊ．Ｍ．及びＨｏｈｍａｎｎ，Ｓ．、Ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｔｏ  ｏｓｍｏｔｉｃ  ｓｈｏｃｋ．  Ｈｏｔｌｐ  ａｎｄ  Ｍｓｎ２ｐ／Ｍｓｎ４ｐ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｐａｔｈｗａｙｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｅｎｅｓ．、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５，８２９０−８３００（２０００）
２４．  Ｔｉｒｕｃｈｉｎａｐａｌｌｉ，Ｄ．Ｍ．ら、Ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｚｉｐｃｏｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １  ａｎｄ  ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ  ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｅｓ  ａｎｄ  ｓｐｉｎｅｓ  ｏｆ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ．、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２３，３２５１−３２６１（２００３）
２５．  Ｂｌｉｃｈｅｎｂｅｒｇ，Ａ．ら、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ＭＡＰ２  ｍＲＮＡｓ．、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １９，８８１８−８８２９（１９９９）
２６．  Ｗａｒｒｅｎ，Ｌ．、Ｂｒｙｄｅｒ，Ｄ．、Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｉ．Ｌ．及びＱｕａｋｅ，Ｓ．Ｒ．、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｂｙ  ｄｉｇｉｔａｌ  ＲＴ−ＰＣＲ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０３，１７８０７−１７８１２（２００６）
【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１１−６】
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【図１１−７】
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【図１１−８】
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【図１１−９】
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【図１１−１０】
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【図１１−１１】
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【図１１−１２】
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【図１１−１３】
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【図１１−１４】
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【図１１−１５】
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【図１１−１６】
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【図１１−１７】
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【図１１−１８】
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【図１１−１９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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