(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の有核細胞に由来し、該細胞より小さいマイクロベシクルを含む組成物であって、
該マイクロベシクルが、該細胞から押出法を用いて人為的に製造されることにより、細胞膜のトポロジーを維持しており、
該哺乳類の有核細胞が単核球又はマクロファージであり、
該マイクロベシクルの粒径が、１００〜３００ｎｍである、組成物。
【請求項２】
前記哺乳類の有核細胞は特異的細胞又は組織へ誘導される細胞であることを特徴とする、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記哺乳類の有核細胞は疾病の治療用又は診断用物質を発現する細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記哺乳類の有核細胞は形質転換された細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記マイクロベシクルの膜は前記哺乳類の有核細胞の細胞膜以外の成分をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記細胞膜以外の成分がシクロデキストリン又はポリエチレングリコールであることを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記マイクロベシクルの膜成分が化学的に変形されたことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
哺乳類の有核細胞に由来し、該細胞よりその大きさが小さく、疾病の治療用又は診断用物質が負荷されたマイクロベシクルを含む、薬学的組成物であって、
該マイクロベシクルが、該細胞から押出法を用いて人為的に製造されることにより、細胞膜のトポロジーを維持しており、
該哺乳類の有核細胞が単核球又はマクロファージであり、
該マイクロベシクルの粒径が、１００〜３００ｎｍである、薬学的組成物。
【請求項９】
前記治療用及び／又は診断用物質は前記有核細胞に由来するものであることを特徴とする、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記哺乳類の有核細胞は前記治療用又は診断用物質が発現するように形質転換された有核細胞であることを特徴とする、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記治療用又は診断用物質は前記有核細胞以外の外部から注入されたものであることを特徴とする、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
疾病の治療用又は診断用物質が負荷された哺乳類の有核細胞由来マイクロベシクルの製造方法であって、細胞膜のトポロジーを維持しているマイクロベシクルを製造するために、該マイクロベシクルが該細胞から人為的に製造される、下記の段階を含む方法：
（ａ）哺乳類の有核細胞を含む懸濁液から押出法を用いてマイクロベシクルを製造する段階；
（ｂ）前記懸濁液から製造されたマイクロベシクルを分離する段階；及び
（ｃ）前記分離されたマイクロベシクルを含む懸濁液に治療用又は診断用物質を添加して培養する段階、
ここで、該哺乳類の有核細胞が単核球又はマクロファージであり、
該マイクロベシクルの粒径が、１００〜３００ｎｍである。
【請求項１３】
疾病の治療用又は診断用物質が負荷された哺乳類の有核細胞マイクロベシクルの製造方法であって、細胞膜のトポロジーを維持しているマイクロベシクルを製造するために、該マイクロベシクルが該細胞から人為的に製造される、下記の段階を含む方法：
（ａ）哺乳類の有核細胞を含む懸濁液に疾病の治療用又は診断用物質を添加して培養させ、前記哺乳類の有核細胞に前記治療用又は診断用物質を負荷させる段階；及び
（ｂ）前記治療用又は診断用物質が負荷された哺乳類の有核細胞を含む懸濁液から押出法を用いてマイクロベシクルを製造する段階、
ここで、該哺乳類の有核細胞が単核球又はマクロファージであり、
該マイクロベシクルの粒径が、１００〜３００ｎｍである。
【請求項１４】
疾病の治療用又は診断用物質が負荷された哺乳類の有核細胞由来マイクロベシクルの製造方法であって、細胞膜のトポロジーを維持しているマイクロベシクルを製造するために、該マイクロベシクルが該細胞から人為的に製造される、下記の段階を含む方法：
（ａ）哺乳類の有核細胞を含む懸濁液に治療用又は診断用物質を添加して前記哺乳類の有核細胞と治療用又は診断用物質を含む混合懸濁液を得る段階；及び
（ｂ）前記混合懸濁液から押出法を用いてマイクロベシクルを製造する段階、
ここで、該哺乳類の有核細胞が単核球又はマクロファージであり、
該マイクロベシクルの粒径が、１００〜３００ｎｍである。
【請求項１５】
哺乳類の有核細胞に由来し、前記細胞より大きさが小さく、疾病の診断に必要なプライマー、プローブ、アンチセンス核酸又は抗体が負荷されたマイクロベシクルを含む、疾病診断用キットであって、
該マイクロベシクルが、該細胞から押出法を用いて人為的に製造されることにより、細胞膜のトポロジーを維持しており、
該哺乳類の有核細胞が単核球又はマクロファージであり、
該マイクロベシクルの粒径が、１００〜３００ｎｍである、疾病診断用キット、
【請求項１６】
哺乳類の有核細胞に由来し、該細胞より小さいマイクロベシクルを含む組成物であって、
該マイクロベシクルが、該細胞から人為的に製造されることにより、細胞膜のトポロジーを維持しており、
該哺乳類の有核細胞が単核球又はマクロファージであり、
該マイクロベシクルの粒径が、１００〜３００ｎｍである、組成物、
【請求項１７】
前記哺乳類の有核細胞は特異的細胞又は組織へ誘導される細胞であることを特徴とする、請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
前記哺乳類の有核細胞は疾病の治療用又は診断用物質を発現する細胞であることを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記哺乳類の有核細胞は形質転換された細胞であることを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
前記マイクロベシクルの膜は前記哺乳類の有核細胞の細胞膜以外の成分をさらに含むことを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２１】
前記細胞膜以外の成分がシクロデキストリン又はポリエチレングリコールであることを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２２】
前記マイクロベシクルの膜成分が化学的に変形されたことを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２３】
哺乳類の有核細胞に由来し、該細胞よりその大きさが小さく、疾病の治療用又は診断用物質が負荷されたマイクロベシクルを含む、薬学的組成物であって、
該マイクロベシクルが、該細胞から人為的に製造されることにより、細胞膜のトポロジーを維持しており、
該哺乳類の有核細胞が単核球又はマクロファージであり、
該マイクロベシクルの粒径が、１００〜３００ｎｍである、薬学的組成物。
【請求項２４】
前記治療用及び／又は診断用物質は前記有核細胞に由来するものであることを特徴とする、請求項２３に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
前記哺乳類の有核細胞は前記治療用又は診断用物質が発現するように形質転換された有核細胞であることを特徴とする、請求項２３に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
前記治療用又は診断用物質は前記有核細胞以外の外部から注入されたものであることを特徴とする、請求項２３に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
哺乳類の有核細胞に由来し、前記細胞より大きさが小さく、疾病の診断に必要なプライマー、プローブ、アンチセンス核酸又は抗体が負荷されたマイクロベシクルを含む、疾病診断用キットであって、
該マイクロベシクルが、該細胞から人為的に製造されることにより、細胞膜のトポロジーを維持しており、
該哺乳類の有核細胞が単核球又はマクロファージであり、
該マイクロベシクルの粒径が、１００〜３００ｎｍである、疾病診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類の有核細胞に由来するマイクロベシクル(microvesicles)、及びそのマイクロベシクルを用いて治療用及び／又は診断用物質を伝達する方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
疾病の治療のために薬物を個体に投与する場合、投与される薬物が標的位置へ伝達されてその効果を発揮することを助けるために、薬物伝達システム（Drug Delivery System、ＤＤＳ）が使用できる。薬物が生体に吸収又は利用される速度があまり遅くて吸収されなかった薬物があまり速く体外へ消失する場合には、薬物の放出速度を遅らせる薬物伝達システムが採用される。副作用の激しい薬物を使用する場合には、必要な組織又は細胞へのみ薬物を伝達する必要がある。例えば、癌治療のための抗癌剤の中には、癌細胞だけでなく、正常細胞に対しても強い毒性を示すものが多い。この場合、癌細胞又は癌組織にのみ抗癌剤を伝達することができれば、癌治療過程における患者の苦痛及び不便を減らすことができる。
【０００３】
１９６０年代に最初使用されて以来、リポソームが薬物伝達システムとして広く研究されてきた。例えば、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）などのポリマーをリポソームと接合(conjugation)して、薬物を内包したリポソームが血液から容易に除去されないようにして薬物の血中での循環半減期(circulatory half-life)を増加させたステルスリポソーム(stealth liposome)が開発された。この方法で抗癌剤としてのドキソルビシン(doxorubicin)を伝達するドキシル（ＤＯＸＩＬ）が商用化された。ところが、リポソームとステルスリポソームは、特定の細胞を認識する能力がないため、特定の細胞又は特定の組織へ薬物を伝達する目的では使用することができない。特定の標的に結合できるように単一標的抗体などを接合したリポソームも開発されているが、未だ臨床試験を通過して商用化されたものはない。
【０００４】
人工的に合成した脂質からなるリポソームの代わりに、自然的な細胞膜を用いた伝達システムが開発されている。薬物を含む培養液で培養される形質転換微生物が分泌するベシクルを薬物伝達に利用する方法が公開された（特許文献１、“Compositions and methods for targeted in vitro and in vivo drug delivery to mammalian cells via bacterially derived intact minicells”）。ところが、バクテリア細胞膜成分からなるベシクルには、グラム陰性菌の場合は脂質多糖類(lipopolysaccharides)などが含まれているため、体内に投与したとき、人体における免疫反応などの多様な副作用をもたらすおそれがある。これとは異なり、ヒトの赤血球細胞膜を用いた伝達システムも公開された（特許文献２、“Cell and sub-cell methods for imaging and therapy”）。血中での寿命が１２０日の赤血球細胞膜からなるベシクルに、医療用映像を得るための造影剤(image contrasting agent)又は放射線治療のための補助剤として用いられる金属粒子、金属イオンを入れてこれらを血中で長らく維持させることができる。しかし、赤血球細胞は、特定の細胞又は特定の組織を認識する能力がないため、特定の細胞又は特定の組織へ薬物を伝達する目的では使用することができない。また、赤血球細胞は、核がなくて形質転換が不可能なので、特定の細胞又は組織を認識するタンパク質を細胞膜の表面に発現させることもできない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２００５／０７８９５４
【特許文献２】米国特許公開第２００７／０２４３１３７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明者は、上述した従来技術の問題点を解決するために研究した結果、形質転換可能な哺乳類の有核細胞に由来するマイクロベシクルを用いて治療及び／又は診断のための物質を特定の細胞又は組織などの標的に効果的に伝達することができることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
よって、本発明の目的は、哺乳類の有核細胞に由来するマイクロベシクルを含む組成物、疾病の治療用及び／又は診断用物質が負荷(loading)された前記マイクロベシクルを含む薬学的組成物、前記マイクロベシクルを用いて物質を特定の標的に伝達する方法、前記マイクロベシクルを含む治療用又は診断用物質伝達システム、及び前記マイクロベシクルを含むキットなどを提供することにある。
【０００８】
ところが、本発明が解決しようとする技術的課題は上述した課題に限定されず、上述していない別の課題は以下の記載から当業者に明確に理解できるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一側面は、哺乳類の有核細胞に由来し且つ前記細胞より小さいマイクロベシクルを含む組成物を提供する。
【００１０】
本発明で使用される哺乳類の有核細胞は、特異的細胞又は組織への誘導が可能な細胞、疾病の治療用又は診断用物質を発現する細胞などを含む。また、前記哺乳類の有核細胞は、特異的細胞又は組織へ誘導されるように形質転換された細胞、疾病の治療用及び／又は診断用物質が発現するように形質転換された細胞などを含む。
【００１１】
本発明のマイクロベシクルは、哺乳類の有核細胞を含む懸濁液から、押出、超音波分解、細胞溶解、均質化、冷凍−解凍、電気穿孔、機械的分解及び化学物質処理よりなる群から選ばれた方法を用いて製造することができる。
【００１２】
本発明の他の側面は、哺乳類の有核細胞に由来し、前記細胞より小さく、疾病の治療用又は診断用物質が負荷されたマイクロベシクルを含む、薬学的組成物を提供する。
【００１３】
本発明の別の側面は、哺乳類の有核細胞から自然的に分泌され、前記細胞より小さく、疾病の治療用又は診断用物質が負荷されたシェディング(shedding)マイクロベシクルを含む、薬学的組成物を提供する。
【００１４】
前記治療用及び／又は診断用物質は、前記有核細胞に由来するもの及び細胞の外部から注入されたものなどを含む。
【００１５】
前記治療及び／又は診断のための多様な物質は、本発明のマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルに下記の方法を用いて負荷することができる。
【００１６】
第一、治療及び／又は診断のための多様な物質を既に負荷した細胞からマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを製造する。例えば、治療及び／又は診断のための多様な物質を培養液に含ませて細胞を培養すると、前記物質の負荷された細胞を得ることができ、或いは電気穿孔法で細胞に物質を負荷することができる。また、このような細胞から自然的に分泌されるシェディングマイクロベシクル、又は超音波分解、押出、機械的分解などの方法で製造したマイクロベシクルには、前記物質が負荷されている。
【００１７】
第二、マイクロベシクルの製造過程で前記物質をマイクロベシクルに負荷する。例えば、細胞の含まれた溶液に前記物質を添加した後、細胞より大きさが小さいフィルターに通過させる押出法でマイクロベシクルを製造すると、マイクロベシクルに前記物質が負荷される。
【００１８】
第三、シェディングマイクロベシクル又はマイクロベシクルを製造した後、前記物質を負荷することができる。例えば、多様な物質を懸濁液に含ませてマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルと培養し、或いは既に製造したシェディングマイクロベシクル又はマイクロベシクルに物質を電気穿孔法で負荷することができる。
【００１９】
ところが、本発明で使用できる物質をマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルに負荷する方法は、前述した例に限定されるものではない。
【００２０】
本発明の別の側面は、哺乳類の有核細胞に由来し且つ前記細胞より小さいマイクロベシクルを含む、疾病の治療用又は診断用物質伝達用組成物を提供する。
【００２１】
本発明の別の側面は、哺乳類の有核細胞に由来し且つ前記細胞より小さいシェディングマイクロベシクルを含む、疾病の治療用又は診断用物質伝達用組成物を提供する。
【００２２】
本発明の別の側面は、哺乳類の有核細胞に由来し且つ前記細胞より小さいマイクロベシクルを含む、疾病の治療用又は診断用物質伝達システムを提供する。
【００２３】
本発明の別の側面は、哺乳類の有核細胞に由来し且つ前記細胞より小さいシェディングマイクロベシクルを含む、疾病の治療用又は診断用物質伝達システムを提供する。
【００２４】
本発明の別の側面は、疾病の治療用又は診断用物質が負荷された哺乳類の有核細胞由来マイクロベシクルの製造方法であって、下記の段階を含む方法を提供する：哺乳類の有核細胞を含む懸濁液から、押出、超音波分解、細胞溶解、均質化、冷凍−解凍、電気穿孔、機械的分解及び化学物質処理よりなる群から選ばれた方法を用いてマイクロベシクルを製造する段階；前記懸濁液から製造されたマイクロベシクルを分離する段階；及び前記分離されたマイクロベシクルを含む懸濁液に治療用又は診断用物質を添加して培養する段階。
【００２５】
本発明の別の側面は、疾病の治療用又は診断用物質が負荷された哺乳類の有核細胞由来マイクロベシクルの製造方法であって、下記の段階を含む方法を提供する：哺乳類の有核細胞を含む懸濁液に疾病の治療用又は診断用物質を添加して培養させ、前記哺乳類の有核細胞に前記治療用又は診断用物質を負荷させる段階；及び前記治療用又は診断用物質が負荷された哺乳類の有核細胞を含む懸濁液から、押出、超音波分解、細胞溶解、均質化、冷凍−解凍、電気穿孔、機械的分解及び化学物質処理よりなる群から選ばれた方法を用いてマイクロベシクルを製造する段階。
【００２６】
本発明の別の側面は、疾病の治療用又は診断用物質が負荷された哺乳類の有核細胞由来マイクロベシクルの製造方法であって、下記の段階を含む方法を提供する：哺乳類の有核細胞を含む懸濁液に治療用又は診断用物質を添加して、前記哺乳類の有核細胞と治療用又は診断用物質を含む混合懸濁液を得る段階；及び前記混合懸濁液から、押出、超音波分解、細胞溶解、均質化、冷凍−解凍、電気穿孔、機械的分解、及び化学物質処理よりなる群から選ばれた方法を用いてマイクロベシクルを製造する段階。
【００２７】
本発明の別の側面は、疾病の治療用又は診断用物質が負荷された哺乳類の有核細胞由来シェディングマイクロベシクルの製造方法であって、下記の段階を含む方法を提供する：哺乳類の有核細胞を含む懸濁液からシェディングマイクロベシクルを分離する段階；及び前記分離されたシェディングマイクロベシクルを含む懸濁液に治療用又は診断用物質を添加して培養する段階。
【００２８】
本発明の別の側面は、疾病の治療用又は診断用物質が負荷された哺乳類の有核細胞由来シェディングマイクロベシクルの製造方法であって、下記の段階を含む方法を提供する：哺乳類の有核細胞を含む懸濁液に疾病の治療用又は診断用物質を添加して培養させ、前記哺乳類の有核細胞に前記治療用又は診断用物質を負荷させる段階；及び前記培養液から、前記治療用又は診断用物質が負荷されたシェディングマイクロベシクルを分離する段階。
【００２９】
本発明の別の側面は、哺乳類の有核細胞に由来し、前記細胞より大きさが小さく、疾病の治療用又は診断用物質が負荷されたマイクロベシクルを使用することを含む、疾病の治療用又は診断用物質を特異的細胞又は組織に伝達する方法を提供する。
【００３０】
本発明の別の側面は、哺乳類の有核細胞に由来し、前記細胞より大きさが小さく、疾病の治療用又は診断用物質が負荷されたシェディングマイクロベシクルを使用することを含む、疾病の治療用又は診断用物質を特異的細胞又は組織に伝達する方法を提供する。
【００３１】
本発明の別の側面は、哺乳類の有核細胞に由来し、前記細胞より大きさが小さく、疾病の治療用又は診断用物質が負荷されたマイクロベシクルを用いて、前記治療用又は診断用物質を特異的細胞又は組織に伝達することを含む、疾病の治療又は診断方法を提供する。
【００３２】
本発明の別の側面は、哺乳類の有核細胞に由来し、前記細胞より大きさが小さく、疾病の治療用又は診断用物質が負荷されたシェディングマイクロベシクルを用いて、前記治療用又は診断用物質を特異的細胞又は組織に伝達することを含む、疾病の治療又は診断方法を提供する。
【００３３】
本発明の別の側面は、哺乳類の有核細胞に由来し、前記細胞より大きさが小さく、疾病の診断に必要なプライマー、プローブ、アンチセンス核酸又は抗体が負荷されたマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを含む、疾病診断用キットを提供する。
【発明の効果】
【００３４】
本発明に係る前記治療及び／又は診断用物質が負荷された哺乳類の有核細胞由来マイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを使用することにより、目標の細胞又は組織に主に治療用及び／又は診断用物質を伝達し、他所への治療用及び／又は診断用物質の伝達を抑制すると、薬物等の治療用物質の副作用を減らして疾病の治療過程における患者の苦痛及び不便を減らすことができ、特異的細胞又は特異的組織にのみ薬物を伝達することにより治療効能を増加させることができ、特に転移癌のように既存の抗癌治療方法では治療が難しい場合に少ない副作用で効果的に転移癌を治療することができ、目標の細胞又は組織にのみ診断用物質が伝達されるようにすることにより、疾病に関連した細胞又は組織を容易に診断することができる。
【００３５】
また、哺乳類の有核細胞が発現する標的誘導物質、治療用物質又は診断用物質は単一物質の精製過程なしでマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルの表面及び／又は内部に負荷することができ、負荷された物質は本来の機能を効果的に行うことができる。
【００３６】
また、疾病の治療用及び／又は診断用物質が負荷された本発明の哺乳類有核細胞由来マイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクル及びその製造方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで治療及び／又は診断用、又は実験用として使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】哺乳類有核細胞又は形質転換された哺乳類有核細胞から、マイクロベシクル、及び標的誘導物質、治療用物質、診断用物質などの多様な物質が負荷されたマイクロベシクルを製造する方法を示す模式図である。
【図２】押出法で製造した哺乳類の有核細胞由来マイクロベシクルの透過電子顕微鏡写真である。
【図３】押出法で製造した哺乳類の有核細胞由来マイクロベシクルの大きさを示すグラフである。
【図４】単核球細胞、押出法で製造したマイクロベシクル、及び超音波分解法で製造したマイクロベシクルの膜タンパク質のトポロジーを示す図である。
【図５】シクロデキストリンが含まれたマイクロベシクルの大きさを示すグラフである。
【図６】ポリエチレングリコールが含まれたマイクロベシクルの大きさを示すグラフである。
【図７】細胞由来ｍｉＲＮＡ負荷マイクロベシクルを標的細胞に処理した後、ｍｉＲＮＡの伝達効果を確認した図である。
【図８】血管内皮細胞由来ＶＥＧＦ受容体を負荷したマイクロベシクルを用いてＶＥＧＦとの結合能力を確認したグラフである。
【図９】ＶＥＧＦ受容体を形質転換を介して負荷した細胞由来マイクロベシクルを用いてＶＥＧＦとの結合能力を確認したグラフである。
【図１０】ＩＣＡＭ−１を形質転換を介して負荷した細胞由来マイクロベシクルを用いて免疫細胞と血管内皮細胞との結合を阻害することを示すグラフである。
【図１１】ドキソルビシンが負荷された押出法マイクロベシクルの製造の際に使用されたドキソルビシンの濃度に対する、負荷されたドキソルビシンの量を示すグラフである。
【図１２】ドキソルビシンが負荷され且つ押出法で製造した有核細胞由来マイクロベシクルの透過電子顕微鏡写真である。
【図１３】ドキソルビシン−マイクロベシクルに負荷されたドキソルビシンを示す写真である。
【図１４】酸化鉄が負荷された有核細胞由来マイクロベシクルの製造結果を示す写真である。
【図１５】有核細胞由来マイクロベシクルを用いてＧＦＰ遺伝子を細胞へ伝達した結果を示す写真である。
【図１６】有核細胞由来マイクロベシクルを用いてＲＦＰ遺伝子を細胞へ伝達した結果を示す写真である。
【図１７】有核細胞由来マイクロベシクルを用いてナノパーティクルＱ−ｄｏｔを細胞へ伝達した結果を示す写真である。
【図１８】有核細胞由来マイクロベシクルを細胞に伝達した結果を示す写真である。
【図１９】有核細胞由来マイクロベシクルを用いてタンパク質ＲＮａｓｅ Ａを細胞へ伝達した結果を示す写真である。
【図２０】有核細胞由来マイクロベシクルを用いて抗炎症薬物を伝達した後、ＴＮＦ−αとＩＬ−６の分泌を測定したグラフである。
【図２１】有核細胞由来のドキソルビシン負荷マイクロベシクルを用いて、ＴＮＦ−αを処理したＨＵＶＥＣ細胞へ特異的にドキソルビシンを伝達した結果を示す写真である。
【図２２】有核細胞由来のドキソルビシン負荷マイクロベシクルを用いて、ＴＮＦ−αを処理したＨＵＶＥＣ細胞へ特異的にドキソルビシンを伝達した結果を示すグラフである。
【図２３】有核細胞由来のドキソルビシン負荷マイクロベシクルを用いて、ＴＮＦ−αを処理したＨＵＶＥＣ細胞へ特異的にアポトーシス効果を示すグラフである。
【図２４】有核細胞由来マイクロベシクルを用いて多様な薬物を伝達することができ、アポトーシスを引き起こすことができることを示す結果である。
【図２５】有核細胞由来ドキソルビシン−マイクロベシクルがＩＣＡＭ−１を過発現する細胞及び発現しない細胞における効果を示すグラフである。
【図２６】有核細胞由来のドキソルビシン負荷マイクロベシクルが分裂する細胞にのみ作用することを示す写真である。
【図２７】有核細胞由来のドキソルビシン負荷マイクロベシクルを投与する場合、マウスにおける癌の成長が阻害されることを示す結果である。
【図２８】有核細胞由来のドキソルビシン負荷マイクロベシクルを処理した後、癌組織における血管マーカーＣＤ３１の領域を示すグラフである。
【図２９】有核細胞由来のドキソルビシン負荷マイクロベシクルを処理した後、癌組織における、分裂する細胞マーカーであるＰＨ−３で染色された細胞の数を示すグラフである。
【図３０】有核細胞由来のドキソルビシン負荷マイクロベシクルを用いて癌組織へドキソルビシンが伝達されることを示す写真である。
【図３１】有核細胞由来のドキソルビシン負荷マイクロベシクルとドキソルビシンをマウスに入れた後、脾臓と心臓に存在するドキソルビシンを示す写真である。
【図３２】ドキソルビシン負荷マイクロベシクルとドキソルビシンの濃度による癌組織の成長を示すグラフである。
【図３３】ドキソルビシン負荷マイクロベシクルとドキソルビシンを処理したときのマウスの体重を測定したグラフである。
【図３４】ドキソルビシン負荷マイクロベシクルとドキソルビシンを処理したときのマウスの血中の白血球数を測定したグラフである。
【図３５】マイクロベシクルが作用するにあたり膜タンパク質とトポロジーが重要であることを示すグラフである。
【図３６】多様な薬物の負荷されたマイクロベシクルが癌組織の成長を阻害することを示すグラフである。
【図３７】ゲムシタビンとカルボプラチンを負荷したマイクロベシクルがヒト肺癌細胞の成長を阻害することを示すグラフである。
【図３８】ドキソルビシン負荷マイクロベシクルを処理した後、肺に転移される黒色腫の数を測定して示すグラフである。
【図３９】黒色腫のあるマウスにドキシルビシン負荷マイクロベシクルを処理した後、マウスの生存率を示すグラフである。
【図４０】骨髄由来マイクロベシクルが骨髄組織にターゲッティングされることを示す図である。
【図４１】骨髄由来マイクロベシクルを用いてドキソルビシンを骨髄組織へ伝達することができることを示すグラフである。
【図４２】ＩＣＡＭ−１を形質転換して負荷した有核細胞由来マイクロベシクルを用いて単核球に細胞特異的薬物を伝達した結果を示すグラフである。
【図４３】サイトカラシンＤを処理した単核球細胞から得たシェディングマイクロベシクルの透過電子顕微鏡写真である。
【図４４】ナノ粒子としての量子ドットが負荷されたシェディングマイクロベシクルの透過電子顕微鏡写真である。
【図４５】単核球由来シェディングマイクロベシクルを用いてドキソルビシンを細胞特異的に伝達してアポトーシスを誘導したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、哺乳類の有核細胞に由来し且つ前記細胞より小さいマイクロベシクルを含む、組成物を提供する。
【００３９】
本発明で使用される哺乳類の有核細胞は、単核球(monocyte)、マクロファージ(macrophage)、樹枝状細胞(dendritic cell)及び幹細胞(stem cell)よりなる群から選択できるが、これに限定されるものではない。また、前記哺乳類の有核細胞は、幹細胞から分化した細胞よりなる群から選ばれたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００４０】
本発明の「マイクロベシクル」は、哺乳類の有核細胞から人為的に製造されたベシクルであって、自然的に分泌される「シェディングマイクロベシクル」とは区別される。本発明の「マイクロベシクル」は、由来した細胞の細胞膜成分からなる脂質二重膜によって内部と外部が区分され、細胞の細胞膜脂質及び細胞膜タンパク質、核酸、並びに細胞成分などを持っており、元来細胞より大きさが小さいものを意味するが、これに限定されるものではない。
【００４１】
一方、シェディングマイクロベシクルは、細胞が自然的に分泌するベシクルであって、由来する細胞の細胞膜細分からなる脂質二重膜によって内部と外部が区分され、細胞の細胞膜脂質及び細胞膜タンパク質、核酸並びに細胞成分を持っており、元来細胞より大きさが小さいものを意味する。
【００４２】
本発明のマイクロベシクルは、哺乳類の有核細胞を含む懸濁液から、押出、超音波分解、細胞溶解、均質化、冷凍−解凍、電気穿孔、機械的分解及び化学物質処理よりなる群から選ばれた方法を用いて製造することができるが、これに限定されるものではない。
【００４３】
本発明の一具現例において、前記マイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルの膜が前記哺乳類の有核細胞の細胞膜以外の成分をさらに含むことができる。
【００４４】
前記細胞膜以外の成分として、標的誘導物質(targeting molecule)、標的細胞との細胞膜融合に必要な物質(fusogen)、シクロデキストリン(cyclodextrin)、ポリエチレングリコールなどを含むことができる。また、前記細胞膜以外の成分は、多様な方法によって追加でき、細胞膜の化学的変形などを含む。
【００４５】
例えば、前記マイクロベシクルの膜成分がチオール基（−ＳＨ）又はアミン基（−ＮＨ２）を用いた化学的方法で変形し、或いは前記マイクロベシクルにポリエチレングリコールを化学的に結合させることにより前記マイクロベシクルの膜成分が化学的に変形したものであってもよい。
【００４６】
本発明のマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルの製造の際に、前記マイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルの膜成分を化学的に変形させる段階をさらに含むことができる。
【００４７】
本発明の別の側面は、哺乳類の有核細胞に由来し、前記細胞よりその大きさが小さく、疾病の治療用又は診断用物質が負荷されたマイクロベシクルを含む、薬学的組成物を提供する。
【００４８】
本発明で使用される哺乳類の有核細胞は、特異的細胞又は組織などへの誘導が可能な細胞や、疾病の治療用又は診断用物質を発現する細胞などを含む。
【００４９】
また、本発明の哺乳類の有核細胞は形質転換された細胞を含む。具体的に、前記形質転換された細胞は治療、診断、標的誘導物質、又は標的細胞との細胞膜融合に必要な物質を発現するように形質転換された細胞；及びこれらの２つ以上の組み合わせからなる形質転換された細胞を含むが、これに限定されるものではない。
【００５０】
前記哺乳類の有核細胞は物質処理又は遺伝子導入によって形質転換されたものであってもよく、２回以上形質転換されたものであってもよい。
【００５１】
前記本発明の一具現例において、前記哺乳類の有核細胞は一つ以上の特定タンパク質の発現を抑制するように形質転換されたものであってもよい。
【００５２】
前記本発明の一具現例において、前記哺乳類の有核細胞は細胞接合分子、抗体、標的誘導タンパク質、細胞膜融合タンパク質自体、及びこれらの融合タンパク質よりなる群から選ばれる一つ以上を発現するように形質転換されたものであってもよい。
【００５３】
本発明の別の側面は、哺乳類の有核細胞に由来し、前記細胞よりその大きさが小さく、疾病の治療用又は診断用物質が負荷されたシェディングマイクロベシクルを含む、薬学的組成物を提供する。
【００５４】
本発明のマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルに負荷する物質は、特に限定されず、例えば、治療用及び／又は診断用物質であってもよく、前記哺乳類の有核細胞又は形質転換された有核細胞が発現している物質であってもよい。必要に応じては、前記哺乳類の有核細胞に由来せずに細胞の外部から用意された物質を負荷してもよいが、これに限定されない。すなわち、前記治療用及び／又は診断用物質は前記有核細胞に由来するもの、及び細胞の外部から注入されたものなどを含む。また、負荷される物質は１つでも、２つ以上でもよい。
【００５５】
本発明の別の具現例において、前記マイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルは、サイトカイン、成長因子、抗体、標的誘導タンパク質、細胞膜融合タンパク質自体、及びこれらの融合タンパク質よりなる群から選ばれる一つ以上を発現する細胞、又は発現するように形質転換された細胞から用意できるが、これに限定されない。また、前記物質をマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルの表面に物理、化学、及び／又は生物学的方法で負荷することができるが、これに限定されない。
【００５６】
細胞に存在しない治療及び／又は診断のための多様な物質をマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルに次の様々な方法で負荷することができる。
【００５７】
第一、治療又は診断のための多様な物質を既に負荷した細胞からマイクロベシクルを製造する。例えば、治療及び診断のための多様な物質を培養液に含ませて細胞を培養すると、前記物質の負荷された細胞を得ることができ、或いは電気穿孔法で細胞に物質を負荷することができる。このような細胞から自然的に分泌されるシェディングマイクロベシクル、又は超音波分解、押出、機械的分解などの方法で製造したマイクロベシクルには、前記物質が負荷されている。
【００５８】
第二、マイクロベシクルの製造過程で前記物質をマイクロベシクルに負荷する。例えば細胞の含まされた溶液に前記物質を添加した後、細胞より大きさが小さいフィルターに通過させる押出法でマイクロベシクルを製造すると、マイクロベシクルに前記物質が負荷される。
【００５９】
第三、シェディングマイクロベシクル又はマイクロベシクルを製造した後、前記物質を負荷することができる。例えば、多様な物質を懸濁液に含ませてマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルと培養し、或いは電気穿孔法で既に製造したシェディングマイクロベシクル又はマイクロベシクルに物質を負荷することができる。
【００６０】
ところが、本発明で使用できる物質をマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルに負荷する方法は、これらの例に限定されるものではない。
【００６１】
本発明に使用される治療用及び／又は診断用物質は、抗癌剤、抗炎症剤、血管新生阻害剤(angiogenesis inhibitor)、ペプチド(peptide)、タンパク質(protein)、毒素(toxin)、核酸(nucleic acid)、ビーズ(bead)、マイクロ粒子(microparticle)及びナノ粒子(nanoparticle)よりなる群から選ばれる一つ以上でありうるが、これに限定されるものではない。
【００６２】
前記核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー(aptamer)、ＬＮＡ(locked nucleic acid)、ＰＮＡ(peptide nucleic acid)、及びモルホリノ(morpholino)よりなる群から選ばれたものでありうるが、これに限定されるものではない。
【００６３】
前記ナノ粒子は、酸化鉄、金、炭素ナノチューブ又は磁気ビーズ(magnetic bead)を含むナノ粒子でありうるが、これに限定されるものではない。
【００６４】
本発明の一具現例において、前記治療用及び／又は診断用物質は蛍光を放出する物質でありうるが、これに限定されるものではない。例えば、前記蛍光を放出する物質が蛍光タンパク質又は量子ドット（quantum dot、Ｑｄｏｔ）であってもよい。
【００６５】
前記本発明の別の具現例において、前記治療用及び／又は診断用物質が一つ以上の抗癌剤でありうる。
【００６６】
本発明のマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルは、特定の細胞又は組織などへの誘導が可能なベシクルを含む。前記特異的組織は血管、癌又は炎症組織でありうるが、これに限定されるものではない。
【００６７】
本発明における「癌」とは、正常なアポトーシスの均衡が破れる場合、細胞が過多増殖し、周辺組織に浸潤しうる特徴を持つ疾病群をいう。肺癌、喉頭癌、胃癌、大腸／直腸癌、肝癌、胆嚢癌、膵臓癌、乳癌、子宮頚部癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌などの上皮細胞などに由来する癌腫(carcinoma)、骨癌、筋肉癌、脂肪癌、繊維細胞癌などの結合組織細胞に由来する肉腫(sarcoma)、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫などの造血細胞に由来する血液癌、神経組織に発生する腫瘍などよりなる群から本発明が治療しようとする標的が選択できるが、これに限定されるものではない。
【００６８】
本発明における「血管疾患」は、血管内或いは血管壁に代謝性、感染性、毒性又は免疫性原因によって血管内或いは血管壁に障害が発生する疾患群である。動脈硬化症（或いは粥状硬化症）、挟心症、急性心筋梗塞、脳卒中、血管性痴呆、その他の虚血性血管疾患などの代謝性血管疾患、敗血症、播種性血管内凝固(disseminated intravascular coagulation)、血栓／塞栓症、血管炎、糸球体腎炎、急性呼吸不全症候群、肺気腫などの感染性、毒性、又は免疫性血管疾患などよりなる群から、本発明が治療しようとする標的が選択できるが、これに限定されるものではない。
【００６９】
本発明における「炎症」は、体液が組織細胞の間に増加して現れる浮腫、血管拡張による充血、発熱物質と血管拡張による発熱、アラキドン酸代謝産物による疼痛現象などの症状又は症候として現われ、時間によって急性炎症、亜急性炎症、慢性炎症に分類することができ、病態生理によって感染性、アレルギー性、自己免疫性、毒性、代謝性、外傷性炎症疾患に分類することができる。鼻炎、副鼻腔炎、中耳炎、鼻咽喉炎、喉頭炎、気管支炎、喘息、慢性閉鎖性肺疾患、気管支拡張症、細気管支炎、肺炎、肺線維化などの呼吸器系炎症疾患、口腔炎、食道炎、胃炎、消化性潰瘍、過敏成長症候群、炎症性腸疾患、胆嚢炎、胆道炎、膵臓炎、肝炎などの消化器系炎症疾患、アトピー皮膚炎、乾癬などの皮膚炎症疾患、心内膜炎、心筋炎、心嚢炎、血管炎、動脈硬化症、敗血症などの心血管系炎症疾患、甲状腺炎、副甲状腺炎、糖尿病などの内分泌系炎症疾患、糸球体腎炎、腎症、間質性腎炎、睾丸炎、卵巣炎、子宮内膜炎、膣炎などの泌尿生殖系炎症疾患、リウマチ性関節炎、脊椎関節病症、骨関節炎、痛風、全身性紅斑性狼瘡、全身性硬化症、筋病症、シェーグレン症候群、ベーチェット病、抗リン脂質症候群などの筋骨格系炎症疾患、血管性痴呆、アルツハイマー病、退行性脳疾患、うつ病、精神分裂症などの脳精神系炎症疾患などよりなる群から、本発明が治療しようとする標的が選択できるが、これに限定されるものではない。
【００７０】
本発明における前記薬学的組成物は、前記抗癌剤、抗炎症剤、血管新生阻害剤、ペプチド、タンパク質、毒素、核酸、ビーズ、マイクロ粒子及びナノ粒子のうちの少なくとも１種の有効成分以外に、薬学的に許容される担体、すなわち食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、シクロデキストリン、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、リポソーム及びこれらの成分のうち少なくとも１種を混合して使用することができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液など他の通常の添加剤をさらに含むことができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び／又は潤滑剤をさらに添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒又は錠剤に製剤化することができる。ひいては、当該技術分野における適正の方法、或いはＲｅｍｉｎｇｔｏｎの文献(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)に開示されている方法を用いて、各成分に応じて好ましく製剤化することができる。本発明の薬学的組成物は、剤形には特に限定はないが、注射剤又は吸入剤に製剤化することが好ましい。
【００７１】
本発明の薬学的組成物の投与方法は、特に限定されるものではないが、目的の方法によって静脈内、皮下、腹腔内、吸入又は局所適用などのように非経口投与又は経口投与することができる。投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度などによってその範囲が異なる。１日投与量は、治療を必要とする個体に投与されることにより、軽減した疾病状態に対する治療に充分な本発明の治療用物質の量を意味する。治療用物質の効果的な量は、特定の化合物、疾病の状態及びその深刻度、治療を必要とする個体によって異なり、当業者によって通常的に決定できる。非制限的例として、本発明に係る組成物の人体に対する投与量は患者の年齢、体重、性別、投与形態、健康状態及び疾患の程度によって異なり、体重７０ｋｇの成人患者を基準に、一般的には０．１〜１０００ｍｇ／日、好ましくは１〜５００ｍｇ／日であり、一定の時間間隔で１日１回〜数回に分割して投与してもよい。
【００７２】
本発明における「個体」とは、癌、血管疾患又は炎症疾患の治療を必要とする対象を意味し、より具体的にはヒト又は非ヒトの霊長類、マウス(mouse)、ラット(rat)、犬、猫、馬及び牛などの哺乳類を意味する。
【００７３】
本発明の別の側面は、本発明に係るマイクロベシクルを含む、疾病の治療用及び／又は診断用物質伝達用組成物を提供する。
【００７４】
前記組成物は、疾病治療用及び／又は診断用物質を組織又は細胞特異的に伝達することを可能とする。
【００７５】
本発明の別の側面は、本発明に係るマイクロベシクルを含む、疾病の治療用及び／又は診断用物質伝達システムを提供する。
【００７６】
本発明の別の側面は、哺乳類の有核細胞に由来し且つ前記細胞より小さいシェディングマイクロベシクルを含む、治療用又は診断用物質伝達用組成物を提供する。
【００７７】
本発明の別の側面は、前記哺乳類の有核細胞に由来するシェディングマイクロベシクルを含む、疾病の治療用又は診断用物質伝達システムを提供する。
【００７８】
本発明の別の側面は、疾病の治療用又は診断用物質が負荷された前記哺乳類有核細胞由来マイクロベシクルの製造方法を提供する。
【００７９】
前記本発明に係る製造方法の一具現例は、下記の段階を含む：哺乳類の有核細胞を含む懸濁液から、押出、超音波分解、細胞溶解、均質化、冷凍−解凍、電気穿孔、機械的分解、及び化学物質処理よりなる群から選ばれた方法を用いて、マイクロベシクルを製造する段階、前記懸濁液から製造されたマイクロベシクルを分離する段階、及び前記分離されたマイクロベシクルを含む懸濁液に治療用又は診断用物質を添加して培養する段階。
【００８０】
前記本発明に係る製造方法の別の具現例は、下記の段階を含む：哺乳類の有核細胞を含む懸濁液に疾病の治療用又は診断用物質を添加して培養させ、前記哺乳類の有核細胞に前記治療用又は診断用物質を負荷させる段階、及び前記治療用又は診断用物質が負荷された哺乳類の有核細胞を含む懸濁液から、押出、超音波分解、細胞溶解、均質化、冷凍−解凍、電気穿孔、機械的分解及び化学物質処理よりなる群から選ばれた方法を用いて、マイクロベシクルを製造する段階。
【００８１】
前記本発明に係る製造方法の別の具現例は、下記の段階を含む：哺乳類の有核細胞を含む懸濁液に治療用又は診断用物質を添加して、前記哺乳類の有核細胞と治療用又は診断用物質を含む混合懸濁液を得る段階、及び前記混合懸濁液から押出、超音波分解、細胞溶解、均質化、冷凍−解凍、電気穿孔、機械的分解及び化学物質処理よりなる群から選ばれた方法を用いてマイクロベシクルを製造する段階。
【００８２】
本発明の別の側面は、疾病の治療用又は診断用物質が負荷された前記哺乳類有核細胞由来シェディングマイクロベシクルの製造方法を提供する。
【００８３】
前記本発明に係る製造方法の一具現例は、下記の段階を含む：哺乳類の有核細胞を含む懸濁液からシェディングマイクロベシクルを分離する段階、及び前記分離されたシェディングマイクロベシクルを含む懸濁液に治療用又は診断用物質を添加して培養する段階。
【００８４】
前記本発明に係る製造方法の別の具現例は、下記段階を含む：哺乳類の有核細胞を含む懸濁液に疾病の治療用又は診断用物質を添加して培養させ、前記哺乳類の有核細胞に前記治療用又は診断用物質を負荷させる段階、及び前記培養液から前記治療用又は診断用物質の負荷されたシェディングマイクロベシクルを分離する段階。
【００８５】
前記治療用及び／又は診断用物質が負荷されたマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルの製造方法は、前記処理によって製造されたマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを含む懸濁液から前記治療用及び／又は診断用物質の負荷されたマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを分離する段階をさらに含むことができる。
【００８６】
前記分離段階は、密度勾配(density gradient)、超遠心分離(ultracentrifugation)、濾過(filtration)、透析(dialysis)及び自由流動電気移動法(free-flow electrophoresis)よりなる群から選ばれた方法を用いて行われてもよい。
【００８７】
前記本発明の製造方法は、前記マイクロベシクルの膜に前記原形質体の細胞膜以外の成分を追加する段階をさらに含んでもよい。前記追加される成分はシクロデキストリン及びポリエチレングリコールを含む。
【００８８】
また、前記本発明の製造方法は、マイクロベシクルの膜成分を化学的に変形させる段階をさらに含んでもよい。前記化学的変形方法は前述したとおりである。
【００８９】
また、前記本発明の製造方法は、前記哺乳類の有核細胞の細胞膜と比較してトポロジーが変形された膜を有するマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを除去する段階をさらに含むことができる。
【００９０】
本発明の別の側面は、哺乳類の有核細胞に由来し、前記細胞より大きさが小さく、疾病の治療用又は診断用物質が負荷された前記本発明のマイクロベシクルを使用することを含む、治療用又は診断用物質を特異的細胞又は組織に伝達する方法を提供する。すなわち、本発明のマイクロベシクルを用いて疾病の治療用又は診断用物質を標的細胞又は組織へ伝達することが可能である。
【００９１】
前記本発明の一具現例において、２種以上の前記治療用又は診断用物質を特異的細胞又は組織に伝達することができる。
【００９２】
例えば、前記マイクロベシクルに２種以上の前記治療用又は診断用物質が共に負荷されているものを用いて、２種以上の前記治療用又は診断用物質を伝達することができる。
【００９３】
前記本発明の別の具現例において、１種の前記治療用又は診断用物質が負荷されたマイクロベシクル、２種以上の前記治療用又は診断用物質が負荷されたマイクロベシクル、及びこれらの組み合わせよりなる群から選ばれた２つ以上のマイクロベシクルを用いて前記治療用又は診断用物質を伝達することができる。例えば、前記２つ以上のマイクロベシクルを同時に投与することができる。
【００９４】
前記本発明の別の具現例において、１種の前記治療用間又は診断用物質が負荷されたマイクロベシクル、２種以上の前記治療用又は診断用物質が負荷されたマイクロベシクル、及びこれらの組み合わせよりなる群から選ばれた２つ以上のマイクロベシクルを順次投与して前記治療用又は診断用物質を伝達することができる。
【００９５】
また、本発明は、疾病の治療用及び／又は診断用物質が負荷された哺乳類有核細胞由来シェディングマイクロベシクルを使用することを含む、治療用又は診断用物質を特異的細胞又は組織に伝達する方法を提供する。
【００９６】
本発明の別の側面は、哺乳類の有核細胞に由来し、前記細胞より大きさが小さく、疾病の治療用又は診断用物質が負荷された前記本発明のマイクロベシクルを用いて、前記治療用又は診断用物質を特異的細胞又は組織に伝達することを含む、疾病の治療又は診断方法を提供する。
【００９７】
本発明の別の側面は、哺乳類の有核細胞に由来し、前記細胞より大きさが小さく、疾病の治療用又は診断用物質が負荷されたシェディングマイクロベシクルを用いて、前記治療用又は診断用物質を特異的細胞又は組織に伝達することを含む、疾病の治療又は診断方法を提供する。
【００９８】
本発明の別の側面は、哺乳類の有核細胞に由来し、前記細胞より大きさが小さく、疾病の診断に必要なプライマー、プローブ、アンチセンス核酸又は抗体が負荷されたマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを含む、疾病診断用キットを提供する。
【００９９】
［マイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを用いた物質の伝達］
本発明では、特定の組織へ誘導される細胞に由来するマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを使用し、或いは標的タンパク質を発現した形質転換細胞に由来するマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを使用することができる。これに加えて、前記細胞と形質転換細胞に細胞膜融合物質が発現するように形質転換された細胞に由来するマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを使用することができる。
【０１００】
血液に存在する人体免疫体系の単核球、単核球に由来するマクロファージ、樹枝状細胞及び幹細胞などは癌組織及び炎症組織へ誘導されることが知られている。したがって、単核球、マクロファージ、樹枝状細胞及び幹細胞などの細胞膜からなるマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルは、癌組織及び炎症組織へ誘導される。特定の細胞又は組織に特異的に発現した基質に選択的に結合するタンパク質を発現するように形質転換させた細胞に由来するマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルは、特定の細胞又は組織へ誘導される。よって、本発明では、このような細胞からマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを製造し、マイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルに治療又は診断のための物質を負荷して当該物質を標的とした細胞、組織又は血液に伝達する。
【０１０１】
単核球、マクロファージ、樹枝状細胞及び幹細胞などが特定の組織へ誘導されるとき、細胞膜に存在する多様な細胞膜タンパク質(plasma membrane protein)が関与する。例えば、単核球細胞の表面にはＬＦＡ−１(leukocyte function-associated antigen-1)、Ｍａｃ−１(macrophage-1 antigen)などのインテグリン(integrin)を含む多様な細胞接合分子(cell adhesion molecule)が存在する。これらの細胞接合分子は血管細胞の表面に存在するＩＣＡＭ−１(intercellular adhesion molecule-1)、ＶＣＡＭ−１(vascular cell adhesion molecule-1)などの細胞接合分子と結合することができる。単核球は、ＬＦＡ−１などの細胞接合分子を用いて、血管細胞の表面に発現したＩＣＡＭ−１などの細胞膜タンパク質と相互作用し、血管内皮細胞を通過して炎症組織及び癌組織へ誘導される。
【０１０２】
細胞を形質転換して癌又は組織特異的細胞膜タンパク質を細胞の表面に発現させ、血管、癌組織及び炎症組織を含む多様な組織へ誘導することができる。例えば、乳癌組織の細胞表面にはＥＲＢＢ２細胞膜タンパク質が過多発現する。Ｔ細胞に存在するＴ細胞受容体（T-cell receptor、ＴＣＲ）の形質転換を介して癌細胞特異的伝達が可能である。ＴＣＲの細胞外部部分に、ＥＲＢＢ２タンパク質を認知することが可能な抗体と細胞内部部分にＴＣＲの細胞内信号伝達が可能なＣＤ３ζ(zeta)タンパク質とを融合した融合タンパク質を発現させるように形質転換したＴ細胞は、乳癌組織へ誘導される。また、大腸癌、膵臓癌、肺癌などで過多発現する癌胚芽抗原（carcinoembryonic antigen、ＣＥＡ）を認知する抗体とＣＤ３ζタンパク質とを融合した融合タンパク質を発現させるように形質転換したＴ細胞は、大腸癌、膵臓癌及び肺癌組織へ誘導される。
【０１０３】
特定の組織又は細胞へ誘導される細胞自体を用いて特定の標的に薬物を伝達する目的に利用しようとすれば、伝達しようとする物質のために細胞が大きく影響を受けることがある。例えば、ドキソルビシンは、毒性があまり強いため、伝達を担当する細胞が死ぬ問題がある。
【０１０４】
細胞全体を利用せず、細胞に由来するマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを使用すれば、この問題を回避することができる。細胞に由来するマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルは、細胞膜タンパク質などの細胞膜成分が元来細胞と類似又は事実上同一なので、元来細胞が標的する同一の特定組織又は細胞に誘導される。必要な場合、マイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを製造する過程で核酸分解酵素などを添加して、治療用又は診断用物質の伝達に必要がない核酸などをマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルの内部で除去することができる。
【０１０５】
［マイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクル及びその製造］
本発明において、「マイクロベシクル」は、哺乳類の有核細胞から人為的に製造されたベシクルであって、由来する細胞の細胞膜成分からなる脂質二重膜によって内部と外部が区分され、細胞の細胞膜脂質及び細胞膜タンパク質、核酸、並びに細胞成分を持っており、元来細胞より大きさが小さいことを意味するが、これに限定されるものではない。本発明において、シェディングマイクロベシクルとは、細胞が自然的に分泌するベシクルであって、由来する細胞の細胞膜成分からなる脂質二重膜によって内部と外部が区分され、細胞の細胞脂質及び細胞膜タンパク質、核酸、並びに細胞成分を持っている元来細胞より大きさが小さいことをいう。
【０１０６】
細胞から製造されるマイクロベシクルは、既存のリポソームのように多様な大きさに容易に製造することができ、伝達しようとする多様な治療用又は診断用物質を容易に負荷させることができるため、１種又は多種の物質を伝達することができるので、単独治療、併合治療、診断だけでなく、診断及び治療の２つの目的で使用する診断−治療(theragnosis, pharmacodiagnosis)に利用することができる。この際、伝達しようとする多様な物質は、マイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルに内包(encapsulated)されてマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルの二重膜の内側に存在してもよく、細胞膜タンパク質のように前記物質の全部又は一部がマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルの二重膜に埋め込まれ或いは組み込まれていてもよく、マイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルの表面に結合されていてもよい。
【０１０７】
また、癌の血管を介して癌組織にある物質が伝達されるとき、一般的に１００ｎｍ以上の物質はＥＰＲ(enhanced permeability and retention)効果によって癌組織に長らく止まることができる。よって、１００ｎｍより大きいマイクロベシクルに負荷された薬物は、癌組織に止まることが可能な時間が長くて薬物の効果を極大化することができるため、診断及び治療に有用である。また、肺組織は、その構造上、粒径１μｍ以下の粒子のみが吸入を介して肺胞まで伝達できるので、粒径１μｍ以下のマイクロベシクルに喘息などの治療のための炎症抑制剤などの物質を負荷して肺組織に効果的に薬物を伝達することができる。このようにマイクロベシクルの大きさは、診断用及び治療用物質が必要な組織に応じて多様な大きさに製造できる。好ましくは、本発明のマイクロベシクルの大きさは１０ｎｍ以上１０μｍ以下であってもよい。
【０１０８】
本発明のマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルに治療用及び／又は診断用物質を負荷して「個体」に投与するために、自己由来細胞から製造したマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを使用することができる。他の個体に由来する細胞を使用すると、主組織適合性複合体（major histocompatibility complex、ＭＨＣ）の差異により免疫反応を誘発することができる。ところが、自己由来細胞から製造したマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルはこのような免疫反応を誘発しない。自己由来細胞を使用する代わりに、ＭＨＣが適合な他家由来細胞を用いて、免疫反応の誘発を回避することもできる。また、他の個体に由来する細胞を用いて製造したマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルも、免疫反応問題がなければ使用可能である。マイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルが免疫反応を起こす場合にも、免疫抑制剤と共に使用することもできる。
【０１０９】
本発明において、全ての細胞からマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを製造することができ、例えば、特定の細胞又は組織などの標的へ誘導されるように形質転換可能な哺乳類の有核細胞から製造できる。例えば、試験管内細胞(in vitro cell)としては単核球、マクロファージ、樹枝状細胞及び間葉幹細胞を含む試験管内で培養可能な全ての細胞を用いることができ、生体内細胞(in vivo cell)としては単核球、マクロファージ、樹枝状細胞、骨髄由来間葉幹細胞、脂肪由来間葉幹細胞及びその他の幹細胞、癌組織又は炎症組織から採取した細胞又は組織に由来する細胞などを用いることができる。
【０１１０】
特定の組織へ物質を伝達するために、特定の組織に誘導される細胞又は形質転換した細胞に由来するマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを使用することができる。例えば、単核球、マクロファージ、樹枝状細胞及び幹細胞などから製造したマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルは、癌組織又は炎症組織へ誘導される。特定の組織へ誘導されるタンパク質を過多発現し或いは非特異的(non-specific)誘導に関与するタンパク質の発現を減少させた又はこれらを組み合わせた形質転換細胞に由来するマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルは、癌組織又は炎症組織へ効果的に誘導される。
【０１１１】
細胞の形質転換は、細胞に刺激を与えてタンパク質などの物質の発現を増加又は変化させる方法と、遺伝子導入によってタンパク質の発現を増加又は抑制させる方法であって、当業界における通常の方法を使用することができる。細胞に特定の刺激を与えてタンパク質発現の変化を誘導することができる。例えば、ヒト臍帯静脈内皮細胞（human umbilical vein endothelial cell、ＨＵＶＥＣ）にＴＮＦ−αを処理すると、細胞膜にＩＣＡＭ−１の発現が増加する[J. Exp. Med. 177; 1277-1286 (1993)]。単核球にＰＭＡ(phorbol 12-myristate 13-acetate)を処理すると、細胞膜タンパク質ＬＦＡ−１が活性化(activation)される[J. Exp. Med. 163; 1132-1149 (1986)]。遺伝子導入による細胞の形質転換を介して特定のタンパク質を発現或いは抑制させることができる。特定のタンパク質の発現を増加させる方法は、プラスミド(plasmid)ＤＮＡ、ＲＮＡ又はウィルス(virus)[PNAS. 90 (18); 8392-8396 (1993)]を利用することができ、リン酸カルシウム沈澱法(calcium phosphate precipitation)[Current Protocols in Cell Biology 20.3.1-20.3.8 (2003)]、リポフェクタミン誘導（lipofectamine  mediated）[PNAS. 84 (21); 7413-7417 (1987)]、電気穿孔（electroporation）[Nucleic Acids Research. 15 (3) 1311-1326 (1987)]、微量注射法（microinjection）[Mol Cell Biol. 2(9); 1145-1154 (1982)]、超音波誘導(ultrasound  mediated)[Human Gene Therapy. 7(11); 1339-1346 (1996)]などの方法だけではく、一般的に知られている全ての方法を使用することができる。
【０１１２】
癌細胞、癌組織、血管又は炎症組織などに特異的に結合することが可能なタンパク質又は抗体を細胞の表面に直接発現させ或いは融合タンパク質として発現させ、この細胞からマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを製造することができる。また、治療用及び／又は診断用物質を発現する細胞、又は発現するように形質転換された細胞からマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを製造することができる。また、前記組み合わせ物質が発現する細胞、又は発現するように形質転換された細胞からもマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを製造することもできる。特定のタンパク質の発現を抑制させるために、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡなどを用いることができる。ある細胞に由来するマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルが２種の標的へ誘導される場合、その細胞で１種又は多種の特定タンパク質の発現を抑制させて１つの標的への誘導を減少させて物質伝達の特異性を高めることができる。或いは、２回以上形質転換した細胞を使用することもできる。例えば、１次形質転換した細胞を２次形質転換して使用してもよい。
【０１１３】
単核球、マクロファージ、樹枝状細胞及び幹細胞などの細胞が自然的に分泌するシェディングマイクロベシクルを分離して使用することができる。前記治療用又は診断用物質を負荷した細胞から分泌されるシェディングマイクロベシクルを分離することもでき、シェディングマイクロベシクルを分離した後でシェディングマイクロベシクルに物質を負荷することもできる。サイトカラシンＤ(cytochalasin D)、ＬＰＡ(lysophosphatidic acid)、トロンビン(thrombin)、ＡＴＰ(adenosine triphosphate)又はＫＣｌなどの物質を処理して、細胞から自然的に分泌されるシェディングマイクロベシクルの分泌を促進することができる。サイトカラシンＤを処理する場合、細胞表面のアクチン(actin)の構造を変化させて細胞膜からのシェディングマイクロベシクルの分泌を促進する。細胞を培養する懸濁液の流れなどにおいて、細胞と懸濁液が相対的に動くようにして、シェディングマイクロベシクルの形成をさらに促進することもできる。ところが、本発明の製造方法はこれらに限定されるものではない。
【０１１４】
本発明に係る前記マイクロベシクルは多様な機械的、電気的、化学的方法でも製造できる。浸透圧を用いた細胞溶解、電気穿孔(electroporation)、超音波分解(sonication)、均質化(homogenization)、洗剤(detergent)処理、冷凍−解凍(freeze-thaw)、押出(extrusion)、機械的分解、化学的物質処理などの方法を使用することができるが、本発明の製造方法はこれらに限定されるものではない。例えば、細胞入りの溶液に金属、セラミック、又は充分に固いプラスチックボールを入れた後、揺らして細胞を機械的方法で分解することもできる。押し出してマイクロベシクルを製造する場合には、孔径が大きいフィルターから小さいフィルターへ細胞含有溶液を順次通過させ、細胞を適正大きさに粉砕することができる。例えば、孔径が１０μｍ→５μｍ→１μｍの順に小さくなる３つのフィルターを順次用いて、マイクロベシクルを製造することができる。
【０１１５】
［治療用又は診断用物質］
本発明では、細胞又は形質転換された哺乳類の有核細胞が発現している物質を使用し、必要に応じて、前記哺乳類の有核細胞に由来せず且つ細胞の外部で用意された物質を使用することができるが、これらに限定されるものではない。
【０１１６】
本発明において、マイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルに負荷することが可能な哺乳類有核細胞由来前記治療用又は診断用物質としては、当業界で通常使用されるタンパク質又はペプチド、核酸、脂質及び細胞代謝産物などを多様な種類の物質が制限なく使用できる。
【０１１７】
前記タンパク質又はペプチドは、ＶＥＧＦ(vascular endothelial growth factor)、ＥＧＦ(epidermal growth factor)などの成長因子、ＩＬ−１、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０などのサイトカイン(cytokine)類、各種抗体治療剤、受容体、蛍光タンパク質及び多様なペプチド又はタンパク質を制限なく使用することができる。前記タンパク質又はペプチドは、細胞内に発現してもよく、細胞膜にディスプレイ(display)されてもよく、全体又は活性を示す部位が単独で又は融合タンパク質の形で発現してもよい。特に、マイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルの表面に負荷されたタンパク質又はペプチドは、単独で存在する場合より局所濃度(local concentration)が高いため、単独で存在する場合より活性が高いことがよく知られている。このようなタンパク質又はペプチドは、リガンドとして作用して細胞への信号伝達を行うことができ、或いは多様なリガンドの機能を阻害するのに利用することができるが、これらの例に限定されるものではない。
【０１１８】
本発明に係る前記マイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルに負荷することが可能な核酸として、ＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、センスＲＮＡを使用することができるが、これらに限定されるものではない。このような核酸はセンス効果、アンチセンス効果、ＲＮＡ干渉及びタンパク質の機能阻害などの目的で利用できる。
【０１１９】
本発明において、前記哺乳類有核細胞に由来しないマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルに含ませることが可能な治療用又は診断用物質としては、当業界で通常使用される抗癌剤、抗炎症剤、血管新生阻害剤、ペプチド、タンパク質、毒素、核酸、ビーズ、マイクロ粒子及びナノ粒子などの多様な種類の物質が制限なく使用できる。
【０１２０】
前記抗癌剤は、癌の成長及び転移を抑制させるために使用される全ての薬剤を総称し、大部分の抗癌剤は癌細胞のＤＮＡの複製、転写、翻訳過程を遮断する。本発明の治療用物質として使用できる抗癌剤の種類は特に限定されない。抗癌剤は、抗癌剤選択の際に考慮すべき一般的な条件、例えば癌細胞の種類、抗癌剤の吸収速度（治療期間と抗癌剤の投与経路）、腫瘍の位置、腫瘍の大きさなどに応じて選択できる。前記本発明で使用できる抗癌剤は、ＤＮＡアルキル剤(DNA alkylating agent)としてのメクロレタミン(mechlorethamine)、クロラムブシル (chlorambucil)、フェニルアラニン(phenylalanine)、マスタード(mustard)、シクロホスファミド(cyclophosphamide)、イホスファミド(ifosfamide)、カルムスチン(carmustine、ＢＣＮＵ)、ロムスチン(lomustine、ＣＣＮＵ)、ストレプトゾトシン(streptozotocin)、ブスルファン(busulfan)、チオテパ(thiotepa)、シスプラチン(cisplatin)及びカルボプラチン(carboplatin)などが使用でき、抗癌抗生剤(anti-cancer antibiotics)としてのダクチノマイシン(dactinomycin)（アクチノマイシンＤ(actinomycin D)）、ドキソルビシン(doxorubicin：adriamycin（アドリアマイシン）)、エピルビシン(epirubicin)、イダルビシン(idarubicin)、ミトキサントロン(mitoxantrone)、プリカマイシン(plicamycin)、マイトマイシン(mitomycin)及びＣブレオマイシン(C Bleomycin)などが使用でき、植物アルカロイド(plant alkaloid)としてのビンクリスチン(vincristine)、ビンブラスチン(vinblastine)、パクリタキセル(paclitaxel)、ドセタキセル(docetaxel)、ダウノルビシン(daunorubicin)、タクソール(taxol)、オンコビン(oncovin)、プレドニゾン(prednisone)、シスプラチン(cisplatin)、ハーセプチン(herceptin)、リツキシマブ(rituximab)、エトポシド(etoposide)、テニポシド(teniposide)、トポテカン(topotecan)及びイリドデカン(iridotecan)などよりなる群から選択できる。また、当業界で通常使用される放射性物質を用いることもできる。ところが、本発明で使用できる抗癌剤はこれらの例に限定されるものではない。
【０１２１】
また、本発明のマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルに負荷できる抗炎症剤は、デキサメタゾン(dexamethasone)、インドメタシン(indomethacin)、イブプロフェン(ibuprofen)、プロピオン酸クロベタゾール(clobetasol propionate)、酢酸ジフロラゾン(diflorasone diacetate)、プロピオン酸ハロベタゾール(halobetasol propionate)、アムシノニド(amcinonide)、フルオシノニド(fluocinonide)、フランカルボン酸モメタゾン(mometasone furoate)、デスオキシメタゾン(desoximetasone)、ジクロフェナク(diclofenac)及びピロキシカム(piroxicam)などよりなる群から選択できるが、本発明で使用できる抗炎症剤はこれらの例に限定されるものではない。
【０１２２】
前記血管新生阻害剤は、既存の血管から新しい血管が作られる過程を抑制するために使用される全ての薬剤を総称し、大部分の血管新生阻害剤は癌の成長と転移を抑制し、炎症反応を抑制することができる。本発明の治療用物質として使用できる血管新生阻害剤の種類は特に限定されない。
【０１２３】
本発明に係る前記マイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルに治療用又は診断用物質としてタンパク質又はペプチドを含ませることができる。例えば、後述する実施例で使用したＲＮａｓｅ Ａだけでなく、ＶＥＧＦ、ＥＧＦなどの成長因子、ＩＬ−１、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０などのサイトカイン類、各種抗体治療剤、多様なペプチド又はタンパク質、ＤＮａｓｅ以外に、癌の成長と転移を抑制し且つ炎症反応を抑制することが可能な多様なタンパク質及びペプチドを制限なく使用することができる。
【０１２４】
本発明に係る前記マイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルに治療用又は診断用物質として毒素を含ませることができる。毒素は、多様な生物体に由来するものであって、体内に吸収されたときに毒性を示しうるものを総称する。この毒素を介してアポトーシスを誘導することができる。本発明の治療用物質として使用できる毒素の種類は特に限定されない。
【０１２５】
本発明において、蛍光タンパク質を暗号化(encode)する核酸又は多様な蛍光物質を負荷したマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを診断に利用することができる。特定の細胞又は組織を標的とするマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルに、蛍光タンパク質を暗号化しているプラスミドＤＮＡを負荷し、これを生体に注入すると、その標的細胞又は組織の存在を、蛍光タンパク質から放出される蛍光信号から分かることができる。また、特定の細胞又は組織を標的とするマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルに、蛍光放出量子ドットを含む多様な蛍光物質を含ませ、これを生体に注入すると、その標的細胞又は組織の存在を蛍光信号から分かることができる。特定の標的細胞又は組織から発生する蛍光を診断に利用することができる。アポトーシスを誘導する蛍光放出量子ドットは治療目的でも利用することができる。
【０１２６】
マイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルに負荷することが可能な他の治療用又は診断用物質の例として、蛍光物質以外に、他のマイクロ粒子又はナノ粒子を使用することができる。酸化鉄、金、炭素ナノチューブなどのマイクロ粒子又はナノ粒子を使用することができるが、これらに限定されるものではない。磁気ビーズなどのビーズをマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルに負荷して使用することもできる。酸化鉄などの磁性粒子は磁気共鳴映像（ＭＲＩ）を得る造影剤として利用できる。ナノ粒子に結合した核酸、ナノ粒子に結合したタンパク質なども使用することができ、診断に有用な放射性物質も使用することができる。
【０１２７】
本発明に係る前記マイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを用いて２種以上の物質を伝達することができる。例えば、２種以上の物質を同時に負荷したマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを用いて２種以上の物質を伝達することができる。また、１種又は２種以上の物質が負荷されたマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを複数個使用して、２種以上の物質を伝達することができる。例えば、３種の物質を伝達する場合、各物質を含む第１、第２、第３マイクロベシクルを製造して使用することができる。第１、第２物質を含む第４マイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルと、第３物質を含む第５マイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを用意し、第４、第５マイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを用いて３種の物質を伝達することができる。第１、第２、第３マイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを同時に投与することもでき、順次投与することもできる。第４、第５マイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを同時に投与することもでき、順次投与することもできる。
【０１２８】
マイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを他の分子又は他の細胞構成成分から分離するために、密度勾配、超遠心分離、濾過、透析及び自由流動電気移動法などの方法を使用することができるが、本発明の前記選別方法はこれらに限定されるものではない。
【０１２９】
密度勾配は密度の異なる物質を区分するときに最も多用される方法であって、本発明のマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルは、自由分子(free molecule)などと密度が区分されるため、密度勾配を介して分離することができる。この方法の具体的な例としては、フィコール(Ficoll)、グリセロール(Glycerol)、スクロース(Sucrose)、オプティプレップ（OptiPrepTM）などの密度勾配を使用することができるが、本発明の密度選別方法がこれらに限定されるものではない。例えば、治療及び診断のための分子が負荷されたマイクロベシクルと、前記分子が負荷されていないマイクロベシクルとの密度が異なる性質を用いて、２つのマイクロベシクルを分離することができる。密度勾配は遠心分離又は電気泳動(electophoresis)などと共に使用することができる。マイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを選別するために、ゲル濾過(gel filtration)又は限外濾過(ultrafiltration)を使用することもできる。大きさの小さい分子を除去するために、濾過の代わりに透析を使用することができる。この他にも、自由流動電気移動法を使用することもできる。
【０１３０】
目的に応じて大きさが一定の範囲にあるマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを選別して使用することができる。マイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルの大きさを選別する段階は、治療用又は診断用物質をマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルに負荷する段階より先に行ってもよく、同時に行ってもよく、後で行ってもよい。
【０１３１】
本発明において、細胞膜の構成成分の一部が改質されたマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを製造して使用することもできる。例えば、別途用意した融合タンパク質と細胞との混合液からマイクロベシクルを製造し、融合タンパク質が表面に露出されたマイクロベシクルを用意することができる。マイクロベシクルの表面にポリエチレングリコールを結合させてステルス−マイクロベシクルを製造することができる。また、マイクロベシクルにシクロデキストリンを添加する場合、不特異的ターゲッティングを減少させることができる。シクロデキストリンは、水溶性と脂溶性を同時に持っている物質であって、マイクロベシクルの表面に付いて脂質間の不特異的結合を阻害することができる。化学的にマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクルを改質して使用することもできる。例えば、細胞膜の表面にシステインを含むタンパク質の部分が露出された細胞からマイクロベシクルを製造した後、システインのチオール基に化学的な方法で様々な分子を結合させてマイクロベシクルを改質することができる。また、細胞膜タンパク質に存在するアミン基に化学的な方法で多様な分子を結合させて改質することもできる。
【０１３２】
本発明において、前記治療用及び／又は診断用物質が負荷されたマイクロベシクル又はシェディングマイクロベシクル及びその製造方法は、特定物質の特定細胞又は組織などへの伝達のために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏにて治療及び／又は診断用、又は実験用として使用できる。例えば、酵素又は前記治療用及び／又は診断用物質が負荷された哺乳類の有核細胞由来マイクロベシクル及びその製造方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験用として使用でき、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を介してｉｎ ｖｉｖｏにて治療可能な形態に細胞を変形する用途としても使用することができるが、これに限定されるものではない。
【０１３３】
図１に本発明の一具現例に係るマイクロベシクルの製造過程と、診断及び治療用物質を負荷したマイクロベシクルの製造過程を図式的に示す。
【０１３４】
図２の透過電子顕微鏡（transmission electron microscope、ＴＥＭ）イメージより分かるように、実施例１の方法によって単核球から押出法で製造したマイクロベシクルは、脂質二重層からなっており、１００〜２００ｎｍの大きさを有し、略球状をしている。
【０１３５】
動的光散乱（dynamic light scattering、ＤＬＳ）粒度分析器を用いて実施例１の押出法でマイクロベシクルの大きさを測定した結果を図３に示す。マイクロベシクルは、２００〜３００ｎｍの大きさ及び２５０ｎｍの平均粒径を有する。図２のＴＥＭイメージで測定したものとほぼ一致する。
【０１３６】
実施例１の方法によって単核球から押出法で製造したマイクロベシクルの膜が元来細胞膜と同じトポロジーを維持していることを次の方法で確認した。実施例１の方法によって単核球から押出法で製造したマイクロベシクルと、実施例２の方法によって単核球から超音波分解方法で製造したマイクロベシクルをトリプシン（trypsin）で処理し、細胞膜タンパク質のうちマイクロベシクルの外部に露出された領域を消化(digestion)させた。その後、高温で処理してトリプシンを変性させた後、マイクロベシクルを溶解(lysis)させて膜の内部と外部のタンパク質を全て溶液に露出させ、細胞膜タンパク質のうちＬＦＡ−１の細胞外領域を認知する抗体と、細胞内部の細胞質に存在するタンパク質としてのβ−アクチン（beta-actin）を認知する抗体で処理した結果を図４に示した。「＋」で表示したものはトリプシンを処理した結果を示し、「−」で表示したものはトリプシンで処理していない結果を示す。押出法で製造した後、トリプシンで処理したマイクロベシクルにおいて、ＬＦＡ−１の細胞外領域は消えるが、β−アクチンの量は減少しなかった。もし細胞膜の一部でも内外が入れ替わって一部のＬＦＡ−１の細胞外領域がマイクロベシクルの内部に向かえば、これはトリプシンによって消化されないため、抗体反応を誘発しなければならない。しかし、ＬＦＡ−１抗体反応が現れなかったため、存在していたＬＦＡ−１の細胞外領域は全てマイクロベシクルの外部に向かっていたことが分かる。これから押出法で製造したマイクロベシクルの場合、ＬＦＡ−１以外の他の細胞膜タンパク質も、同様に元来細胞膜から細胞の外部に向かった部分が全てマイクロベシクルの外部に向かっていることを椎論することができ、これはマイクロベシクル膜が元来細胞膜と同一のトポロジーを維持していることを意味する。
【０１３７】
図４を参照すると、押出法で製造したマイクロベシクルとは異なり、超音波分解方法で製造したマイクロベシクルの場合は、トリプシンで消化した後、ＬＦＡ−１抗体反応信号が現れた。これより分かるように、超音波分解方法でマイクロベシクルを製造する場合、細胞膜タンパク質のトポロジーが変わったマイクロベシクルも一部存在する。
【０１３８】
細胞膜のトポロジーが変わる方法でマイクロベシクルを製造した後、目的に応じて、元来細胞の細胞膜とトポロジーが同じマイクロベシクルのみを選択して使用することができる。細胞膜タンパク質のうち、細胞質ドメイン(cytoplasmic domain)を認知する抗体などの物質を用いて、この細胞質ドメインが外部に露出されたマイクロベシクルを除去することができる。このようにすると、細胞膜の内外が入れ替わったマイクロベシクルは除去され、残ったマイクロベシクルの外部には元来細胞の細胞膜の外部に露出された細胞膜タンパク質のみが存在する。
【０１３９】
図４３はサイトカラシンＤの処理後、細胞から自然的に分泌されるシェディングマイクロベシクルのＴＥＭイメージである。
【０１４０】
以下、本発明の理解を助けるために好適な実施例を提示する。ところが、以下の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。
【実施例】
【０１４１】
実施例１：押出法によるマイクロベシクルの製造
図１は哺乳類の有核細胞又は形質転換された哺乳類の有核細胞からマイクロベシクルと標的誘導物質、治療用物質、診断用物質などの多様な物質が負荷されたマイクロベシクルを製造する方法を図式的に示す。
【０１４２】
図１に示した模式図によって単核球又はマクロファージからマイクロベシクルを製造した。図１において押出法と密度勾配の方法を使用した。
【０１４３】
単核球としてのＵ９３７細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１５９３．２）又はマクロファージ細胞Ｒａｗ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＴＩＢ−７１）を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度でＰＢＳ(phosphate buffered saline)溶液３ｍＬに懸濁(resuspension)した。前記懸濁液を孔径１０μｍのメンブレインフィルター(membrane filter)に３回通過させた後、孔径５μｍのメンブレインフィルターに３回通過させ、次いで孔径１μｍのメンブレインフィルターに３回通過させた。容量５ｍＬの超遠心分離チューブ(ultracentrifuge tube)にそれぞれ５０％オプティプレップ１ｍＬ、５％オプティプレップ１ｍＬ、メンブレインフィルターを通過した細胞懸濁液３ｍＬを順次入れた。その後、１００，０００×ｇで２時間超遠心分離(ultracentrifugation)を行った。５０％オプティプレップと５％オプティプレップとの間の層でマイクロベシクルを得た。
【０１４４】
実施例２：超音波分解法によるマイクロベシクルの製造
図１に示した模式図によって単核球又はマクロファージからマイクロベシクルを製造した。図１において超音波分解と密度勾配の方法を使用した。
【０１４５】
単核球又はマクロファージを２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度でＰＢＳ溶液３ｍＬに懸濁した。Ｃｙｃｌｅ０．５とａｍｐｌｉｔｕｔｅ５０の条件で超音波発生器（ＵＰ４００ｓ、Ｈｅｉｌｓｃｈｅｒ）によって３０回超音波分解を行った後、さらに水槽式超音波発生器(water bath sonicator)で３０分間超音波分解を行った。容量５ｍＬの超遠心分離チューブにそれぞれ５０％オプティプレップ１ｍＬ、５％オプティプレップ１ｍＬ、超音波分解した細胞懸濁液３ｍＬを順次入れた。その後、１００，０００×ｇで２時間超遠心分離を行った。５０％オプティプレップと５％オプティプレップとの間の層でマイクロベシクルを得た。
【０１４６】
実施例３：単核球由来マイクロベシクルの特性分析
実施例１の方法によって単核球で製造したマイクロベシクルをグロー放電炭素コート銅グリッド(glow-discharged carbon-coated copper grid)で３分間吸着させた。前記グリッドを蒸留水で洗浄した後、２％酢酸ウラニル（uranylacetate）で１分間染色(staining)した。ＪＥＭ１０１(Jeol, Japan)電子顕微鏡で観察した結果を図２に示す。
【０１４７】
図２の透過電子顕微鏡のイメージに示すように、単核球から押出法で製造したマイクロベシクルは、脂質二重層からなっており、１００〜２００ｎｍの大きさを有し、大略球状をしている。
【０１４８】
実施例１の方法によって単核球から製造したマイクロベシクルを５μｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ１ｍＬに希釈(dilution)した。マイクロベシクル入りのＰＢＳ１ｍＬをキュベット(cuvette)に入れて動的光散乱粒度分析器で分析し、その結果を図３に示した。図３に示すように、マイクロベシクルは２００〜３００ｎｍの大きさ及び２５０ｎｍの平均粒径を有するものと確認された。
【０１４９】
実施例１の方法によって単核球から押出法で製造したマイクロベシクル、実施例２の方法によって単核球から超音波分解方法で製造したマイクロベシクル、及び単核球細胞をそれぞれ５μｇ用意した後、トリプシン０．５μｇを３７℃で２０分間処理した。トリプシンを処理したものと、トリプシンを処理していないものにそれぞれ５×ローティング染色剤（loading dye、２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％ ＳＤＳ、０．５％ブロモフェノールブルー、５０％グリセロール）を最終的に１×となるように仕込み、１００℃で５分間処理した。８％ポリアクリルアミドゲル（polyacrylamide  gel）を用意し、サンプルを負荷した。８０Ｖで２時間電気泳動した後、４００ｍＡで２時間タンパク質をＰＶＤＦ(polyvinylidene fluoride)メンブレインでトランスファー（transfer）した。スキムミルク(skim milk)をＰＢＳに３％となるように溶かした後、メンブレインを当該溶液で２時間ブロッキング(blocking)した。ＬＦＡ−１とβ−アクチン抗体を４℃で１２時間処理した。ＰＢＳで２回洗浄した後、それぞれペルオキシダーゼ(peroxidase)が付いている二次抗体を室温で１時間処理した。ＰＢＳで３０分間洗浄した後、ＥＣＬ（enhanced chemiluminescence、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏ．Ｎｏ．ＲＰＮ２１０６）基質(substrate)で確認して図４に示した。「＋」で表示したものはトリプシンを処理した結果を示し、「−」で表示したものはトリプシンを処理していない結果を示す。
【０１５０】
図４に示すように、押出法で製造した後、トリプシンで処理したマイクロベシクルと細胞では、細胞膜タンパク質ＬＦＡ−１の細胞外領域は消えるが、β−アクチンの量は減らないものと確認された。もし細胞膜の一部でも内外が入れ替わって一部のＬＦＡ−１の細胞外領域がマイクロベシクルの内部に向かえば、これはトリプシンによって分解されないため、抗体反応を誘発しなければならない。しかし、トリプシンを処理したマイクロベシクルと細胞では、ＬＦＡ−１抗体反応が現れなかったため、存在していたＬＦＡ−１の細胞外領域はマイクロベシクルの外部に向かっていることが分かる。
【０１５１】
前記結果より、押出法で製造したマイクロベシクルの場合、ＬＦＡ−１以外の他の細胞膜タンパク質も同様に、元来細胞膜から細胞の外部に向かった部分が全てマイクロベシクルの外部に向かっていることを推論することができ、これはマイクロベシクル膜が細胞の細胞膜と同一のトポロジーを維持していることを意味する。
【０１５２】
また、図４に示すように、押出法で製造したマイクロベシクルとは異なり、超音波分解方法で製造したマイクロベシクルの場合は、トリプシンで分解した後、ＬＦＡ−１抗体反応信号が現れた。前記結果より分かるように、超音波分解方法でマイクロベシクルを製造する場合、細胞膜タンパク質のトポロジーが変わったマイクロベシクルも一部存在する。
【０１５３】
実施例４：シクロデキストリンを含むマイクロベシクルの製造
実施例１の方法によって単核球から製造したマイクロベシクルを用意した。１μＭの濃度でシクロデキストリンを仕込み、室温で１時間保管した。サンプルを５μｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ１ｍＬに希釈した。マイクロベシクル入りのＰＢＳ１ｍＬをキュベットに入れて動的光散乱粒度分析器で分析し、その結果を図５に示す。
【０１５４】
図５に示すように、シクロデキストリンのないマイクロベシクルの大きさは約１００ｎｍであり、シクロデキストリンの含まれたマイクロベシクルの大きさは約２００ｎｍであると確認された。前記結果より、シクロデキストリンを入れる場合、マイクロベシクルの膜周囲にシクロデキストリンが添加されて大きさが大きくなったことを予測することができる。
【０１５５】
実施例５：ポリエチレングリコールを含むマイクロベシクルの製造
実施例１の方法によって単核球から製造したマイクロベシクルを用意した。１μＭの濃度でコレステロール−ポリエチレングリコールを入れ、室温で１時間保管した。サンプルを５μｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ１ｍＬに希釈した。マイクロベシクル入りのＰＢＳ１ｍＬをキュベットに入れて動的光散乱粒度分析器で分析し、その結果を図６に示す。
【０１５６】
図６に示すように、ポリエチレングリコールのないマイクロベシクルの大きさは約１００ｎｍであり、ポリエチレングリコール含有マイクロベシクルの大きさは約９０ｎｍであった。前記結果より、ポリエチレングリコールを入れる場合、マイクロベシクルの膜脂質の間にポリエチレングリコールが添加されて大きさが小さくなったことを確認した。
【０１５７】
実施例６：細胞由来ｍｉＲＮＡを負荷したマイクロベシクルの製造及びｍｉＲＮＡの細胞内伝達
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の一種であるｍｉＲ１２５を発現しているヒト神経膠芽腫(human glioblastoma)細胞としてのＡ１７２細胞と、発現しないＡ１７２細胞を用意した。各細胞から実施例１と同様の方法でマイクロベシクルを製造した。ｍｉＲ１２５を発現する細胞に由来するマイクロベシクルはｍｉＲ１２５を負荷しているものと予想した。
【０１５８】
ｍｉＲ１２５の負荷を確認するために、次の実験を行った。ｍｉＲ１２５のターゲットｍＲＮＡのいずれか一つがＥＧＦ受容体としてのＥＲＢＢ２であると知られている[J.Biol.Chem.282; 1479-1486 (2007)]。したがって、ＥＧＦ信号伝達の阻害程度を確認した。
【０１５９】
ヒト非小細胞肺癌株としてのＡ５４９細胞を６ウェルプレートに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように接種した後、１２時間培養した。１２時間の後、それぞれｍｉＲ１２５が負荷されたマイクロベシクルと、ｍｉＲ１２５が負荷されていないマイクロベシクル１０μｇ／ｍＬの濃度で１時間処理し、培養液を取り替えた後、２４時間培養した。２４時間の後、培養液を血清（serum）のない培地で取り替え、１２時間培養した。１２時間の後、各細胞にＥＧＦを１００ｎｇ／ｍＬの濃度で１０分間処理した。１０分の後、Ａ５４９細胞をＭ−ＰＥＲ(pierce)溶液で溶解して細胞全体タンパク質(whole cell lysate)を得た。
【０１６０】
得た細胞全体タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、それぞれｐ−Ｅｒｋ(phosphor-Erk)とＥｒｋ抗体で確認した。ウェスタンブロット(Western blotting)結果を図７に示す。図７に示すように、ＥＧＦを処理する場合、ｐ−Ｅｒｋの発現が増加した。しかし、ｍｉＲ１２５が負荷されたマイクロベシクルを処理した場合、ｐ−Ｅｒｋが観察されなかった。
【０１６１】
前記結果より、ｍｉＲ１２５が負荷されたマイクロベシクルを処理する場合、細胞においてｍｉＲ１２５が作用してＥＧＦ受容体としてのＥＲＢＢ２の発現が減少し、それによりＥＧＦ信号伝達が阻害されたと類推することができる。
【０１６２】
前記結果は、細胞由来物質をマイクロベシクルに負荷することができ、負荷された物質を伝達することができることを意味する。
【０１６３】
実施例７：ＶＥＧＦ受容体が負荷された細胞由来マイクロベシクルを用いたＶＥＧＦの結合
実施例１と同様の方法によって血管内皮細胞ＨＵＶＥＣからマイクロベシクルを製造した。血管内皮細胞ＨＵＶＥＣはＶＥＧＦ受容体を表面に発現しているので、ＨＵＶＥＣに由来するマイクロベシクルもＶＥＧＦ受容体を有するものと予想した。
【０１６４】
ＶＥＧＦ受容体を形質転換した細胞からマイクロベシクルを得るために、ＶＥＧＦ受容体ｃＤＮＡが入っているｐＣＥＰ４ベクターをマウス細胞のＰＴ６７細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１２２８４）にリポフェクタミン(Lipofectamin)を用いて形質転換した。細胞は２５０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｏ．１０６８７０１０）抗生剤条件で培養した。実施例１と同様の方法によってＶＥＧＦ受容体を負荷した細胞からマイクロベシクルを製造した。
【０１６５】
９６ウェルプレートを用意し、ウェルプレートにそれぞれ０、１２．５、２５ｎｇとなるようにそれぞれのマイクロベシクルを仕込み、４℃で１２時間以上保管してコートした。１％ＢＳＡ／ＰＢＳを１００μＬ入れて１時間固定した。１時間の後、ビオチンが付いているＶＥＧＦを１００ｎｇ／ｍＬとなるように入れ、２時間培養した。１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄した後、ストレプトアビジン−ＰＯＤで２０分間培養し、ＢＭ−ＰＯＤ基質を入れて発色を誘導した。
【０１６６】
図８及び図９は発色の後にＲＬＵ値を表示したものである。図８は血管内皮細胞由来マイクロベシクルの結果であり、図９はＶＥＧＦ受容体が形質転換されて負荷された細胞由来マイクロベシクルの結果である。ＲＬＵ値はマイクロベシクルに付いているＶＥＧＦの相対的な値を示す。図８に示すように、血管内皮細胞に由来するマイクロベシクルは、ＶＥＧＦと結合(binding)して高いＲＬＵ値を示すことを確認した。また、図９に示すように、ＶＥＧＦ受容体を形質転換して負荷した細胞由来マイクロベシクルもＶＥＧＦと結合して高いＲＬＵ値を示すことを確認した。
【０１６７】
前記結果より分かるように、ＶＥＧＦ受容体はマイクロベシクルの表面に負荷されて水溶液に存在するＶＥＧＦと結合することができ、ＶＥＧＦ受容体が負荷されたマイクロベシクルをＶＥＧＦ機能阻害剤として使用することができる。
【０１６８】
実施例８：ＩＣＡＭ−１を負荷した細胞由来マイクロベシクルを用いた免疫細胞結合阻害
センスＩＣＡＭ−１ ｃＤＮＡとアンチセンスＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡを得るために、ヒト前立腺癌細胞株としてのＰＣ３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１４３５）の全体ＲＮＡを使用した。センスプライマー（primer）としての５’−ＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＧＣＴＡＴ−ＧＧＣＴＣＣＣＡＧＣＡ−３’とアンチセンスプライマーとしての５’−ＧＣＴＡＧＧＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＡ−ＧＧＴＴＣＡＧＧＧＡＧＧＣＧ−３’を用いて逆転写ＰＣＲ（reverse  transcription  PCR）を介してそれぞれＩＣＡＭ−１センス、アンチセンスｃＤＮＡを得た。１．６ｋｂの大きさを有するＩＣＡＭ−１ ｃＤＮＡはアガロスゲル（agarose）泳動によって分離した。分離したｃＤＮＡは制限酵素（restriction  enzyme）Ｂａｍ ＨＩで切断し、プラスミドｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｏ．Ｖ０４４５０）もＢａｍＨＩで切断した後、接合酵素（ligase）を処理してｐＣＥＰ４とＩＣＡＭ−１ ｃＤＮＡとが接合されるようにした。それぞれセンスＩＣＡＭ−１とアンチセンスＩＣＡＭ−１ ｃＤＮＡが入っているｐＣＥＰ４ベクターをヒト線維芽細胞腫としてのＨＴ１０８０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ−１２）にＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（transfection  reagent）Ｒｏｃｈｅ Ｎｏ．１８１５０９１）を用いて形質転換した。これらの細胞は２５０μｇ／ｍＬのハイグロマイシン（hygromycin）Ｂ抗生剤条件で培養した。
【０１６９】
センスＩＣＡＭ−１ ｃＤＮＡで形質転換してＩＣＡＭ−１を負荷したＨＴ１０８０細胞、及びアンチセンスＩＣＡＭ−１を形質転換してＩＣＡＭ−１の負荷を減少させたＨＴ１０８０から実施例１の方法によってマイクロベシクルを製造した。
【０１７０】
ヒト血管内皮細胞ＨＵＶＥＣを臍帯(umbilical cord)から得た[J. Clin. Invest.52; 2745-2756 (1973)]。９６ウェルプレートに０．１％ゼラチンをコートした後、ＨＵＶＥＣを１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの量だけ接種した後、１２時間培養した。１０ｎｇ／ｍＬとなるようにＴＮＦ(Tumor Necrosis Factor)−α（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｏ．２１０ＴＡ）を入れたものと入れていないＨＵＶＥＣを１６時間培養した。ＨＵＶＥＣにＴＮＦ−αを処理すると、細胞が活性化（activation）されて細胞膜にＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎなどの細胞接合分子の発現が増加して、単核球及びマクロファージに存在するＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１などの細胞接合分子と結合して単核球及びマクロファージと血管内皮細胞が結合することができるようにする。
【０１７１】
単核球細胞としてのＵ９３７細胞に５μＭのセルトラッカーを入れ、３０分間緑色蛍光で染色し、緑色を帯びる単核球を用意した。９６ウェルプレートをＰＢＳで洗浄した後、５×１０４個の緑色蛍光で染色された単核球と共に、それぞれ０、１、５、２５μｇ／ｍＬとなるようにＩＣＡＭ−１を負荷したマイクロベシクル又はＩＣＡＭ−１を除去したマイクロベシクルを入れ、１時間培養した。１時間の後、培養液を捨て、ＰＢＳで洗浄した。蛍光顕微鏡で、血管内皮細胞ＨＵＶＥＣに結合した緑色蛍光の単核球を観察し、単核球の数を測定して図１０に示す。
【０１７２】
図１０の白色バーはＩＣＡＭ−１のセンス形質転換細胞に由来し、ＩＣＡＭ−１を負荷したマイクロベシクルを処理した実験群で緑色の単核球を測定して示すグラフであり、図１０の黒色バーはＩＣＡＭ−１のアンチセンス形質転換細胞に由来し、ＩＣＡＭ−１を除去したマイクロベシクルを処理した実験群で緑色の単核球を測定して示すグラフである。図１０の横軸はＴＮＦ−αを処理したＨＵＶＥＣ細胞に結合した単核球の数を１００％とし、これと比較して百分率で示したものである。ＴＮＦ−αを処理する場合、ＨＵＶＥＣで多様な細胞接合分子が発現し、免疫細胞としての単核球の結合を促進する。ＴＮＦ−αを処理していないＨＵＶＥＣには結合した単核球が殆どないが、ＴＮＦ−αを処理する場合、結合した単核球が増加することを確認することができる。
【０１７３】
図１０から確認できるように、ＩＣＡＭ−１を負荷したマイクロベシクルの濃度が高くなるにつれて、血管内皮細胞に結合する単核球が減少することが分かる。しかし、ＩＣＡＭ−１のないマイクロベシクルは単核球の結合を阻害しなかった。
【０１７４】
前記結果より分かるように、ＩＣＡＭ−１を負荷したマイクロベシクルは単核球が細胞接合分子との相互作用によって血管内皮細胞に結合することを阻害する。
【０１７５】
実施例９：抗癌薬物が負荷されたマイクロベシクルの製造
図１に示した模式図に従い、単核球又はマクロファージからマイクロベシクルを製造した。図１において押出法と密度勾配の方法を使用し、押出段階で抗癌薬物を投与して薬物を負荷した。
【０１７６】
単核球又はマクロファージを５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度でＰＢＳ溶液３ｍＬに懸濁した。前記懸濁溶液に抗癌薬物としてのドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ、Ｎｏ．Ｄ１５１５）をそれぞれ０、１００、２００、４００μｇ／ｍＬの濃度で添加し、よく混ぜた。前記溶液を孔径１０μｍのメンブレインフィルターに３回通過させた後、孔径５μｍのメンブレインフィルターに３回通過させ、次いで孔径１μｍのメンブレインフィルターに３回通過させた。容量５ｍＬの超遠心分離チューブにそれぞれ５０％オプティトレップ１ｍＬ、５％オプティトレップ１ｍＬ、メンブレインフィルターを通過した細胞懸濁液３ｍＬを順次入れた。その後、１００，０００×ｇで２時間超遠心分離を行った。５０％オプティプレップと５％オプティトレップとの間の層で、ドキソルビシンが負荷されたマイクロベシクルを得た。
【０１７７】
ＰＢＳを用いてそれぞれ０、５、１０、２０、４０μｇ／ｍＬの濃度で希釈したドキソルビシン溶液３００μＬを用意し、それぞれ異なる濃度のドキソルビシンを用いて押出法によって製造されたドキソルビシン負荷マイクロベシクルを、１００μｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ３００μＬ用意した。９６ウェルプレートに各サンプルを１００μＬずつ３個のウェルに入れた。Ｗａｌｌａｃ １４２０ ＶＩＣＴＯＲ ｐｌａｔｅ−ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）機械でｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ波長４８８ｎｍ、ｅｍｉｓｓｉｏｎ波長５３０ｎｍにおける値を得た。ドキソルビシン溶液の値を用いてスタンダードカーブ(standard curve)を描いた後、マイクロベシクルに入ったドキソルビシンの量を定量して図１１に示す。
【０１７８】
図１１はタンパク質量１μｇのマイクロベシクルに負荷されたドキソルビシンの量を示すグラフである。１００、２００、４００μｇ／ｍＬのドキソルビシンを使用する場合、それぞれ約５０ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇのドキソルビシンがマイクロベシクルに負荷されることを確認した。
【０１７９】
下記の全実施例において、ドキソルビシンが負荷されたマイクロベシクルは４００μｇ／ｍＬのドキソルビシンを用いて製造した。
【０１８０】
実施例１０：抗癌薬物が負荷されたマイクロベシクルの特性分析
実施例９と同様の方法で単核球から製造したマイクロベシクルをグロー放電炭素コート銅グリッドで３分間吸着させた。前記グリッドを蒸留水で洗浄した後、２％酢酸ウラニルで１分間染色した。ＪＥＭ１０１電子顕微鏡で観察し、その結果を図１２に示す。
【０１８１】
図１２の透過電子顕微鏡のイメージに示すように、単核球から押出法で製造したマイクロベシクルは、脂質二重層からなっており、１００〜２００ｎｍの大きさを有し、大略球状をしている。
【０１８２】
実施例９と同様の方法によって単核球から製造したマイクロベシクルを５μｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ１ｍＬに希釈した。マイクロベシクル入りのＰＢＳ１ｍＬをキュベットに入れ、動的光散乱粒度分析器で分析した結果、マイクロベシクルは１００〜３００ｎｍの大きさ及び２５９ｎｍの平均粒径を有すると確認された。前記結果より、抗癌薬物が負荷されていないマイクロベシクルと大きさが同一であることが分かる。
【０１８３】
実施例１及び９から得られた、ドキソルビシンが負荷されたマイクロベシクル、及びドキソルビシンが負荷されていないマイクロベシクルをそれぞれ５μＭのＤｉＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｎｏ．Ｖ２２８８６）と３０分間培養した。ＤｉＯは、脂質に付着することができ、緑色蛍光を示す物質である、ＤｉＯで標識したマイクロベシクルを２０μｇ／ｍＬとなるようにした後、カバーガラス(cover  glass)に５０μＬを点滴した。４℃で１２時間保管し、マイクロベシクルがカバーガラスにコートされるようにした。カバーガラスをスライドガラス（slide  glass）に付けた後、蛍光顕微鏡で観察した。マイクロベシクルはＤｉＯの緑色蛍光で観察し、ドキソルビシンは自体の赤色蛍光で観察し、その結果を図１３に示す。
【０１８４】
図１３はドキソルビシンが負荷されていないマイクロベシクル及びドキソルビシンが負荷されたマイクロベシクルの蛍光イメージである。図１３に示すように、ドキソルビシンが負荷されていないマイクロベシクルは、ＤｉＯで標識されて緑色蛍光を示すが、ドキソルビシンの赤色蛍光は見えないことが分かる。これに対し、ドキソルビシンが負荷されたマイクロベシクルは緑色蛍光だけでなく、ドキソルビシンの赤色蛍光まで現れることを確認し、緑色蛍光と赤色蛍光とが同じ位置にあることにより、ドキソルビシンがマイクロベシクルに負荷されたことを確認した。
【０１８５】
実施例１１：酸化鉄が負荷されたマイクロベシクルの製造
図１に示した模式図に従い、単核球又はマクロファージからマイクロベシクルを製造した。図１において押出法と密度勾配の方法を使用し、細胞水準で物質を負荷した。
【０１８６】
マクロファージを細胞培養プレートに８０％程度満ちるように培養し、酸化鉄ナノ粒子(iron oxide nanoparticle)を５０μｇ／ｍＬとなるように入れた後、２４時間培養した。２４時間の後、マクロファージをスクラッパー(scrapper)で分離し、ＰＢＳに懸濁した。実施例１と同様の方法で押出法とオプティプレップを実施し、酸化鉄が負荷されたマイクロベシクルを得た。
【０１８７】
図１４は酸化鉄が負荷されたマイクロベシクルのＴＥＭイメージである。図１４において、マイクロベシクルの内部は黒色で示される。これは黒色の酸化鉄が負荷された結果である。図１４に示すように、マイクロベシクルの内部に電子密度の高い酸化鉄が負荷されていることを確認した。
【０１８８】
前記結果より、マイクロベシクルに酸化鉄を負荷することができることが明らかである。
【０１８９】
実施例１２：単核球由来マイクロベシクルを用いた遺伝子の伝達
実施例９の方法においてドキソルビシン溶液を添加する段階を省略し、電気穿孔法で緑色蛍光タンパク質プラスミド（Green Fluorescence Protein、ＧＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｎｏ．６０８５−１）又は赤色蛍光タンパク質プラスミド（Red Fluorescence Protein、ＲＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｎｏ．６３２４６５）を注入した単核球を用いて、ＧＦＰ又はＲＦＰが負荷されたマイクロベシクルを製造して使用した。
【０１９０】
ＩＣＡＭ−１センス形質転換されたＨＴ１０８０細胞を２４ウェルプレートに１×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように接種した後、１２時間培養した。ＧＦＰ又はＲＦＰが負荷されたマイクロベシクルを２０μｇ／ｍＬとなるように細胞に２４時間処理した。２４時間の後、ＰＢＳで洗浄した後に、培地５００μＬを仕込み、４８時間培養した後、細胞を共焦点顕微鏡で観察して図１５及び図１６のイメージを得た。ＤＩＣ(differential interference contrast)イメージは、共焦点顕微鏡上で光の干渉現象を用いて観察した。ホスト染料(Hoechst dye)はＤＡＰＩ(4’,6’-diamidino-2-phenylindole hydrochloride)波長で、ＧＦＰはＦＩＴＣ(fluorescein isothiocyanate)波長で、ＲＦＰはＲｈｏｄａｍｉｎｅ波長で観察した。
【０１９１】
図１５はＧＦＰを伝達した細胞を示し、図１６はＲＦＰを伝達した細胞を示す。図１５及び図１６に示すように、ＧＦＰの緑色蛍光とＲＦＰの赤色蛍光が細胞の細胞質(cytosol)部分で発現したことが確認された。
【０１９２】
前記結果は、マイクロベシクルが遺伝子を効果的に細胞へ伝達することを意味する。
【０１９３】
実施例１３：単核球由来マイクロベシクルを用いたナノ粒子の伝達
単核球を５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようにＰＢＳに入れ、５μＭとなるようにＤｉＩ（1,1'-dioctadecyl-3,3,3'3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｎｏ．Ｖ２２８８５）染色剤を入れた。３０分間３７℃で培養した後、５００×ｇで単核球を遠心分離し、Ｑｄｏｔ ７０５を電気穿孔法で注入した。ドキソルビシン溶液を添加する段階を省略した実施例９の方法で、前記単核球からマイクロベシクルを製造して使用した。これと同時に、前記Ｑｄｏｔ ７０５のないマイクロベシクルも実施例１と同様の方法によって製造した。
【０１９４】
２４ウェルプレートに、０．１％ゼラチンがコートされたカバーガラスを入れ、ＩＣＡＭ−１センス形質転換されたＨＴ１０８０細胞を１×１０４接種し、１２時間培養した。前記Ｑｄｏｔ ７０５が負荷されたマイクロベシクル、又はＱｄｏｔ ７０５が負荷されていないマイクロベシクルを２０μｇ／ｍＬとなるように細胞に２４時間処理した。２４時間の後、ＰＢＳで洗浄し、カバーガラスを４％パラホルムアルデヒドに１０分間固定した。カバーガラスをスライドガラスに付けた後、共焦点顕微鏡上で細胞を観察して図１７及び図１８のイメージを得た。Ｑｄｏｔ ７０５は、ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ波長６００ｎｍ、ｅｍｉｓｓｉｏｎ波長７０５ｎｍを持っており、Ｃｙ７波長で蛍光を観察した後、青色の人為的な色相(pseudo color)で表示した。マイクロベシクルは、ＤｉＩで標識されており、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ波長で赤色蛍光を観察した。ＤＩＣイメージは共焦点顕微鏡上で光の干渉現象を用いて観察した。
【０１９５】
図１７はＱｄｏｔ ７０５が負荷されたマイクロベシクルを処理した結果であり、図１８はＱｄｏｔ ７０５が負荷されていないマイクロベシクルを処理した結果である。
【０１９６】
図１７において、細胞の内部に存在する赤色蛍光はマイクロベシクルを示し、青色はＱｄｏｔ ７０５を示す。これにより、マイクロベシクルとこれに負荷されたＱｄｏｔ ７０５が効果的に細胞へ伝達されたことが分かる。図１７のＤＩＣイメージにおいて、矢印で表示した部分は細胞が死滅して溶解しているものであり、図１８のＱｄｏｔ ７０５が負荷されていないマイクロベシクルを処理したイメージと比較すれば、伝達されたＱｄｏｔ ７０５によってアポトーシスが誘導されたことが分かる。
【０１９７】
実施例１４：単核球由来マイクロベシクルを用いたタンパク質の伝達
実施例９の方法においてドキソルビシン溶液を添加する段階を省略し、電気穿孔法でＲＮＡ分解酵素Ａ（ＲＮａｓｅ Ａ、Ｓｉｇｍａ、Ｎｏ．Ｒ４８７５）を注入した単核球を用いて、ＲＮａｓｅ Ａが負荷されたマイクロベシクルを製造して使用した。
【０１９８】
２４ウェルプレートに、ＩＣＡＭ−１センス形質転換されたＨＴ１０８０細胞を１×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように接種し、１２時間培養した。前記ＲＮａｓｅ Ａが負荷されたマイクロベシクルを０、２０、５０μｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ処理した後、３０分間３７℃で培養した。ＰＢＳで洗浄した後、３０分間３７℃で培養した。ＰＢＳで洗浄した後、１０％ ＦＢＳ／ＭＥＭ培地に入れた後に、２４時間培養した。２４時間の後、ＰＢＳで洗浄し、しかる後に、１μＭのカルセインＡＭ染色剤（calcein AM dye、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｎｏ．Ｃ３０９９）と２μＭのエチジウムホモダイマー−１染色剤（ethideium hjomodimer-1 dye、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｎｏ．Ｅ１１６９）を入れた後、３０分間培養した。細胞の内部に存在するエステラーゼ（esterase）という酵素によって、カルセインＡＭは緑色蛍光を示すカルセインに（calcein）変換される。カルセインは、生きている細胞の細胞膜を通過することができないので、生きている細胞の内部で濃縮されて緑色蛍光信号を発生する。ところが、死んだ細胞の場合は、カルセインが細胞膜を容易に通過するので、カルセインの蛍光信号から細胞を観察することができない。核酸と結合して赤色蛍光を示すエチジウムホモダイマー−１は、生きている細胞の細胞膜を通過することができないが、死んだ細胞の細胞膜は容易に通過することができる。よって、生きている細胞はエチジウムホモダイマー−１で染色することができないが、死んだ細胞は容易に染色して観察することができる。蛍光色の異なる前記２つの染色剤を用いて、生きている細胞と死んだ細胞を容易に区分することができる。前記方法によって蛍光顕微鏡を用いて、生きている細胞と死んだ細胞を観察した結果を図１９に示す。
【０１９９】
図１９に示すように、ＲＮａｓｅ Ａの負荷されたマイクロベシクルが高い濃度でアポトーシスをさらに多く誘導することが確認した。その結果は、マイクロベシクルを介してＲＮａｓｅ Ａが細胞に伝達されたことを意味する。
【０２００】
実施例１５：マクロファージ細胞由来マイクロベシクルを用いた抗炎症薬物伝達及び炎症反応の抑制
マクロファージを５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度でＰＢＳ溶液に懸濁し、ドキソルビシン溶液の代わりに抗炎症薬物としてのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ、Ｎｏ．Ｄ２９１５）４００μｇ／ｍＬ溶液を用いて、実施例９と同様の方法によって、デキサメタゾンが負荷されたマイクロベシクルを得た。
【０２０１】
炎症抑制効果を調べるために、免疫反応を誘発したマクロファージを、デキサメタゾンが負荷されたマイクロベシクルで処理し、マクロファージが分泌する炎症関連サイトカインとしてのＴＮＦ−αとＩＬ−６の量をそれぞれＥＬＩＳＡ方法で測定した。
【０２０２】
マクロファージにＬＰＳ(lipopolysaccharide)を１０ｎｇ／ｍＬで６時間処理して炎症反応を誘導した。対照群ではＬＰＳのみを処理し、実験群ではＬＰＳ処理と同時にマイクロベシクルを１０μｇ／ｍＬとなるように処理した。６時間の後、細胞の条件培地を得、５００×ｇで５分間遠心分離した。ＴＮＦ−αとＩＬ−６抗体がコートされた９６ウェルプレートを用意し、ウェルプレートに１％ＢＳＡ／ＰＢＳを１００μＬ入れて１時間固定(blocking)した。得た条件培地をそれぞれ１／１０希釈、１／２希釈にして仕込み、室温で２時間培養した後、それぞれビオチン（biotin）が付いているＴＮＦ−α、ＩＬ−６に対する捕捉抗体(capturing antibody)で２時間培養した。１％ ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄した後、ストレプトアビジン−ＰＯＤ(streptavidin-POD)で２０分間培養し、ＢＭ−ＰＯＤ基質を入れて発色を誘導した。
【０２０３】
図２０は発色の後にＲＬＵ(relative light units)値を表示したものである。ＲＬＵ値はＴＮＦ−αとＩＬ−６サイトカインの相対的な量を示す。グラフにおいて、黒色バーはＴＮＦ−αの値を示し、白色バーはＩＬ−６の値を示す。グラフにおいて、「−」はＬＰＳを処理していないものであり、「＋」はＬＰＳを１０ｎｇ／ｍＬの濃度で処理して炎症反応を誘導したものである。
【０２０４】
図２０に示すように、ＬＰＳを処理しない場合には炎症反応がなくてＴＮＦ−αとＩＬ−６の分泌が殆どないが、ＬＰＳを処理する場合には炎症反応が現れてＴＮＦ−αとＩＬ−６の分泌が増加するものと確認された。また、ＬＰＳとデキサメタゾンが負荷されたマイクロベシクルを同時に処理した場合には、サイトカインの分泌を示すＲＬＵ値が著しく低かった。前記結果より、デキサメタゾンが負荷されたマイクロベシクルはＬＰＳによる炎症性サイトカインの増加を効果的に抑制したことが分かる。
【０２０５】
実施例１６：単核球由来マイクロベシクルを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ薬物伝達及び細胞特異的伝達
【０２０６】
２４ウェルプレートに、０．１％ゼラチンがコートされたカバーガラスを入れ、カバーグラス上にＨＵＶＥＣを１×１０４の量だけ接種した後、２４ウェルプレートで１２時間培養した。１０ｎｇ／ｍＬとなるようにＴＮＦ−αを入れたものと、ＴＮＦ−αを入れていないＨＵＶＥＣを１６時間培養した。前述したように、ＨＵＶＥＣにＴＮＦ−αを処理すると、細胞が活性化されて細胞膜にＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎなどの細胞接合分子の発現が増加し、単核球及びマクロファージに存在するＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１などの細胞接合分子と結合して単核球及びマクロファージと血管内皮細胞とが結合できるようにする。
【０２０７】
ＰＢＳで洗浄した後、培地５００μＬを入れ、５μｇ／ｍＬの濃度で実施例９の方法によって単核球から製造したマイクロベシクルとして、抗癌物質のドキソルビシンが負荷されたマイクロベシクルを添加して処理した後、１時間培養した。ＰＢＳで洗浄した後、血清のない培地５００μＬを入れ、セルトラッカー（CellTracker、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｎｏ．Ｃ２９２５）溶液を５μＭとなるように入れた後、３０分間培養した。
【０２０８】
ＰＢＳで洗浄した後、血清のある培地を５００μＬ入れ、さらに３０分間培養した。カバーガラスを４％パラホルムアルデヒド（paraformaldehyde）５００μＬに入れ、室温で１０分間固定した後、共焦点顕微鏡(confocal microscope)上で観察し、その結果を図２１に示す。
【０２０９】
図２１に示すように、ＴＮＦ−αを処理したＨＵＶＥＣでドキソルビシンの赤色蛍光信号が、細胞を染色した緑色蛍光信号と同じ位置に存在していることを確認した。前記結果より、前記マイクロベシクルに負荷された抗癌物質としてのドキソルビシンが前記ＨＵＶＥＣ細胞の核に伝達されたことが分かる。これとは異なり、ＴＮＦ−αを処理していないＨＵＶＥＣではドキソルビシンが観察されなかった。
【０２１０】
顕微鏡では少数の細胞のみを観察することができるため、ＦＡＣＳ(fluorescence activated cell sorting)方法で、多数の細胞に含まれたドキソルビシンの量を測定した。
【０２１１】
実施例９の方法によって、ドキソルビシンが負荷されたマイクロベシクルを単核球から製造した。また、実施例１の方法によって、ドキソルビシンが負荷されていないマイクロベシクルを単核球から製造した。
【０２１２】
ヒト血管細胞ＨＵＶＥＣを、０．１％ゼラチンがコートされた２４ウェルプレートに１×１０４となるように接種した後、１２時間培養した。１０ｎｇ／ｍＬとなるようにＴＮＦ−αを入れ、１６時間培養した。ＰＢＳで洗浄した後、培地５００μＬを入れ、５μｇ／ｍＬの濃度で、用意したドキソルビシンの負荷されたマイクロベシクルとドキソルビシンの負荷されていないマイクロベシクルをそれぞれ処理した後、１時間培養した。ＰＢＳ溶液で洗浄した後、１×ＴＥ(trypsin-EDTA)バッファを１００μＬ仕込み、３７℃で５分間培養して細胞を取り外した。ＰＢＳを２００μＬ添加した後、ＦＡＣＳ方法で分析し、その結果を図２２に示す。
【０２１３】
図２２において、横軸の「ｒｅｄ」はドキソルビシンの蛍光信号強度(fluorescent intensity)を示す相対的な値であり、縦軸の「ｃｏｕｎｔｓ」は細胞の数を示す。また、紫色のグラフはドキソルビシンが負荷されていないマイクロベシクルを細胞に処理して培養した後、細胞で発生する赤色蛍光信号強度による細胞数を表示したものであり、青色のグラフはドキソルビシンが負荷されたマイクロベシクルを細胞に処理した後、細胞で発生する赤色蛍光信号強度による細胞数を表示したものである。
【０２１４】
図２２に示すように、ドキソルビシンが負荷されていないマイクロベシクルのみを処理したものの赤色蛍光信号値は１．１×１０１程度であり、ドキソルビシンが負荷されたマイクロベシクルを処理したものの赤色蛍光信号値は１．２×１０２程度である。前記結果より、ドキソルビシンが負荷されたマイクロベシクルを処理する場合、細胞においてドキソルビシンの蛍光値がマイクロベシクルのみを処理したときより１０倍以上増加したことが分かり、結論的にマイクロベシクルの負荷されたドキソルビシンが細胞へ伝達されたことが明らかである。
【０２１５】
２４ウェルプレートに０．１％ゼラチンをコートし、ヒト血管細胞ＨＵＶＥＣを３×１０４ となるように接種した後、９６ウェルプレートで１２時間培養した。１０ｎｇ／ｍＬとなるようにＴＮＦ−αを入れたグループとＴＮＦ−αを入れていないグループを用意し、１６時間培養した。ＰＢＳで洗浄した後、培地１００μＬを仕込み、それぞれ０、１、２、５μｇ／ｍＬ濃度で実施例６の方法によって単核球から製造したドキソルビシン−マイクロベシクルを処理した後、２０分間培養した。ＰＢＳで洗浄した後、培地５００μＬを入れ、２４時間培養した。２４時間の後、ＰＢＳで洗浄した後、１μＭのカルセインＡＭ染色剤を入れ、生きている細胞を染色した。蛍光顕微鏡を用いて写真を撮り、生きている細胞の個数を測定した。
【０２１６】
図２３はこの写真において染色された細胞の個数を測定した結果を示すものである。図２３において、縦軸の「ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔ」は生きている細胞の個数を示す。
【０２１７】
図２３に示すように、ＴＮＦ−αを処理したＨＵＶＥＣはマイクロベシクル濃度依存的にアポトーシスが起こり、ＴＮＦ−αを処理していない細胞はアポトーシスが殆ど誘導されないことが分かる。
【０２１８】
前記結果より、マイクロベシクルに負荷されたドキソルビシンによってアポトーシスが誘導され、このようなアポトーシス効果はＴＮＦ−αを処理した細胞、すなわち活性化された細胞でさらに高く現れたことを確認した。
【０２１９】
２４ウェルプレートに０．１％ゼラインをコートし、ヒト血管細胞ＨＵＶＥＣを３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように接種した後、９６ウェルプレートで１２時間培養した。１０ｎｇ／ｍＬとなるようにＴＮＦ−αを入れたグループとＴＮＦ−αを入れていないグループを用意し、１６時間培養した。ＰＢＳで洗浄した後、培地１００μＬを入れ、それぞれ０、１、２、５μｇ／ｍＬの濃度で実施例９の方法によってドキソルビシンの代わりにそれぞれ５−フルオロウラシル(5-fluorouracil)、ゲムシタビン(gemcitabine)、カルボプラチン(carboplatin)を用いて単核球から製造したマイクロベシクルを処理した後、２０分間培養した。ＰＢＳで洗浄した後、培地５００μＬを仕込み、２４時間培養した。２４時間の後、ＰＢＳで洗浄した後、１μＭのカルセインＡＭ染色剤を入れ、生きている細胞を染色した。蛍光顕微鏡を用いて写真を撮り、生きている細胞の個数を測定した。
【０２２０】
図２４は写真において染色された細胞の個数を測定した結果を示すものであり、縦軸の「ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔ」は生きている細胞の個数を示す。
【０２２１】
図２４に示すように、多様な薬物を負荷した単核球由来マイクロベシクルも、ＴＮＦ−αを処理したＨＵＶＥＣでマイクロベシクル濃度依存的にアポトーシスが起こり、ＴＮＦ−αを処理していない細胞はアポトーシスが殆ど誘導されないことが分かる。
【０２２２】
細胞接合分子が単核球由来マイクロベシクルの活性に重要であることを確認するために、細胞接合分子のうち、ＩＣＡＭ−１を過発現しているＩＣＡＭ−１センス形質転換されたＨＴ１０８０細胞と、ＩＣＡＭ−１を発現しないＩＣＡＭ−１アンチセンス形質転換されたＨＴ１０８０細胞を用意した。
【０２２３】
実施例９の方法によって単核球から製造したマイクロベシクルを０．１、０．５、１μｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ処理した後、３０分間３７℃で培養した。ＰＢＳで洗浄した後、培地を入れ、２４時間培養した。２４時間の後、ＰＢＳで洗浄した後、１μＭのカルセインＡＭ染色剤を入れ、生きている細胞を染色した。蛍光顕微鏡を用いて写真を撮り、生きている細胞の個数を測定した。
【０２２４】
図２５は写真において染色された細胞の個数を測定した結果を示す。
【０２２５】
図２５に示すように、ＩＣＡＭ−１が発現していないＨＴ１０８０に比べて、ＩＣＡＭ−１が多く発現しているＨＴ１０８０細胞でアポトーシスが一層さらに多く誘導されることが分かる。前記結果は、単核球に由来するマイクロベシクルの表面には単核球細胞と同様にＬＦＡ−１タンパク質が露出されており、ＬＦＡ−１はＩＣＡＭ−１と特異的に結合することができるため、単核球由来マイクロベシクルがこのような特異的結合を介してＩＣＡＭ−１の過発現したＨＴ１０８０細胞にさらに多く伝達されたことを意味する。
【０２２６】
結論的に、単核球に由来し且つ抗癌薬物が負荷されたマイクロベシクルに存在するＬＦＡ−１などの細胞接合分子は、ＩＣＡＭ−１などの細胞接合分子を表面に発現している細胞と特異的に結合することができ、負荷された抗癌薬物を細胞に伝達してアポトーシスを起こすおそれがあることが明白である。
【０２２７】
実施例１７：単核球由来マイクロベシクルを用いた分裂細胞毒性の誘導
直径３５ｍｍの細胞培養プレートに０．１％ゼラチンをコートし、ヒト血管細胞ＨＵＶＥＣを１×１０５となるように接種した後、１２時間培養して細胞が満ちるように(confluent)した。細胞が満ちた後、２００ｐ ｔｉｐを用いてスクラッチ(scratch)を与え、１０ｎｇ／ｍＬとなるようにＴＮＦ−αを入れ、６時間培養して細胞を成長させた。
【０２２８】
ＰＢＳで洗浄した後、培地１ｍＬを入れ、５μｇ／ｍＬの濃度で実施例９の方法によって単核球から製造したマイクロベシクルを処理した後、２０分間培養した。ＰＢＳで洗浄した後、培地１ｍＬを入れて２４時間培養した。２４時間の後、ＰＢＳで洗浄した後、１μＭのカルセインＡＭ染色剤を入れ、生きている細胞を染色した。蛍光顕微鏡を用いて写真を撮り、その結果を図２６に示した。
【０２２９】
図２６において、緑色は生きている細胞を示し、赤色線はスクラッチが生じた部分を示す。ＨＵＶＥＣはコンフルエント(confluent)になれば、接触阻止(contact inhibition)によってそれ以上細胞が分裂しない。ところが、スクラッチを与えて空間が生ずると、空の空間に細胞が分裂及び移動する。
【０２３０】
図２６に示すように、何にも処理していないグループではスクラッチが生じた部位に細胞が分裂及び移動をして緑色で満ちていることを確認した。しかし、ドキソルビシンが負荷されたマイクロベシクルを処理する場合、スクラッチが生じた部位に細胞がないことを確認した。また、スクラッチがなく、コンフルエント(confluent)な部位ではマイクロベシクルを処理しても何らの影響もなかった。前記結果より、ドキソルビシンが負荷されたマイクロベシクルは分裂する細胞にのみ特異的に作用することが分かる。
【０２３１】
実施例１８：マイクロファージ由来ドキソルビシン負荷マイクロベシクルを用いたｉｎ ｖｉｖｏ癌死滅誘導
マウス大腸癌２６細胞株(mouse colon 26 cell line)１×１０６細胞[Cancer Res. 57; 1625-1629 (1997)]をマウスの皮膚下に注射し、５日間培養した。
【０２３２】
実施例１の方法によって押出法でマクロファージから、ドキソルビシンが負荷されていないマイクロベシクルを製造した。実施例９の方法によって押出法で、ドキソルビシン４００μｇ／ｍＬ溶液に懸濁されたマクロファージから、３μｇのドキソルビシンが負荷されたマイクロベシクル（ドキソルビシン−マイクロベシクル）を製造した。
【０２３３】
５日後、ＰＢＳ、１０μｇのマイクロベシクルを含むＰＢＳ溶液（マイクロベシクル）、０．６μｇのドキソルビシンが負荷された押出法マイクロベシクルを２μｇ含むＰＢＳ溶液（ドキソルビシン−マイクロベシクル（２））、３μｇのドキソルビシンが負荷された押出法マイクロベシクルを１０μｇ含むＰＢＳ溶液（ドキソルビシン−マイクロベシクル（１０））１００μＬを各実験群別に１０匹ずつのマウスに一日に１回ずつ尾静脈を介して注射し、二日に１回ずつ癌組織の大きさを測定した。癌組織の体積は最も長い長さｌとこれに垂直な長さｓを測定してｖ＝ｌｓ２／２の式で計算した。
【０２３４】
前記大腸癌細胞を皮下接種した後、癌組織の大きさを測定した結果を図２７に示す。
【０２３５】
図２７に示すように、ドキソルビシンが負荷された押出法マイクロベシクルを毎日１０μｇずつ注射した場合、癌組織の成長が最も遅かった。しかし、ドキソルビシンのないマイクロベシクルは癌組織の成長に何らの影響もなかった。
【０２３６】
前記結果は、マイクロベシクルによって抗癌薬物のドキソルビシンが癌組織へ伝達され、ドキソルビシンによって抗癌効果が示されたことを意味する。
【０２３７】
実施例１９：マクロファージ由来ドキソルビシン負荷マイクロベシクルを用いたｉｎ ｖｉｖｏ癌死滅メカニズム
実施例１８で実験したマウスから採取した癌組織のうち、ＰＢＳ、ドキソルビシンを負荷したマイクロベシクルを処理した癌組織を４％パラホルムアルデヒドに浸して２４時間固定した。固定した癌組織を７０％エタノール（ethanol）に１時間ずつ１回、９５％エタノールに１時間ずつ４回、１００％エタノールに１時間ずつ３回、１００％キシレン(xylen)に１時間ずつ３回浸して脱水反応(dehydration)をさせた。その後、パラフィン(paraffin)に入れて固定した。パラフィンで固定された癌組織を４μｍの厚さに切断し、スライドガラスに付着させた。付着した組織を６０℃で１時間保管してパラフィンを溶かした。溶かした組織を１００％キシレンに１分ずつ３回、１００％エタノールに１分ずつ４回、９５％エタノールに１分ずつ３回、最後に流れる水に５分間保管して水和反応（hydration）を行った。
【０２３８】
水和反応済みの組織に免疫組織化学法(immunohistochemistry)を行った。免疫組織化学法のために、組織を１０ｍＭクエン酸ナトリウム（sodium  citrate、Ｓｉｇｍａ、Ｎｏ．Ｓ４６４１）バッファに入れ、５分ずつ３回電子レンジを用いて抗原賦活化(antigen retrieval)を行った。組織を流れる水に入れて冷やした後、５％ウマ血清と０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を入れたＴＢＳ(tris buffered saline)を仕込み、２時間ブロッキングした。５％ウマ血清（horse  serum）と０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を入れたＴＢＳに、血管マーカーＣＤ３１を認知する抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、Ｎｏ．ＳＣ１５０６）を１：２００の比率で入れ、４℃で１２時間保管した。０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を入れたＴＢＳで３回洗浄した後、緑色蛍光を帯びるＡｌｅｘａ４８８が付いている二次抗体を室温で１時間処理した。０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を入れたＴＢＳで３回洗浄した後、ホスト染色剤を５μＭとなるように仕込み、さらに１０分間染色した。ＴＢＳで５回洗浄した後、カバーガラスをスライドガラスに付け、共焦点顕微鏡上で観察し、写真における緑色染色部分の領域を測定した。
【０２３９】
図２８は写真における血管部位を定量化したグラフである。図２８において、縦軸は写真における緑色部分（ＣＤ３１ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｒｅａ）の領域を示し、緑色領域は血管を示す。総１０枚の写真で血管を定量し、図２８に示すように、マイクロベシクル濃度依存的に血管が減少することを確認した。
【０２４０】
血管破壊による癌細胞の分裂減少を確認するために、水和反応済みの組織に対して免疫組織化学法を行った。免疫組織化学法のために、組織を１０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファに入れ、５分ずつ３回電子レンジを用いて抗原賦活化を行った。組織を流れる水に入れて冷やした後、５％ウマ血清と０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を入れたＴＢＳを仕込み、２時間ブロッキングした。５％ウマ血清と０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を入れたＴＢＳに細胞分裂マーカーとしてのリン酸−ヒストン−３(phosphor-histone 3、ＰＨ−３)を認知する抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ、Ｎｏ．０６−５７０）を１：２００の比率で仕込み、４℃で１２時間保管した。０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を入れたＴＢＳで３回洗浄した後、緑色蛍光を帯びるＡｌｅｘａ４８８が付いている二次抗体を室温で１時間処理した。０．０２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を入れたＴＢＳで３回洗浄した後、ホスト染色剤を５μＭとなるように仕込み、さらに１０分間染色した。ＴＢＳで５回洗浄した後、カバーガラスをスライドガラスに付け、共焦点顕微鏡上で観察した。
【０２４１】
図２９は写真において分裂する細胞を測定したグラフである。図２９において、縦軸は写真において緑色を帯びる、分裂する細胞（ＰＨ３ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌ）の個数を示す。総１０枚の写真で細胞を数えた。図２９に示すように、マイクロベシクル濃度依存的に分裂する細胞が減少することを確認した。
【０２４２】
前記結果をまとめると、ドキソルビシン負荷マイクロベシクルは、癌組織の血管細胞の破壊を誘導し、それにより癌細胞の分裂が減少したことが明白である。
【０２４３】
実施例２０：マクロファージ由来ドキソルビシン負荷マイクロベシクルを用いたｉｎ ｖｉｖｏ癌組織血管へのドキソルビシン伝達の確認
前記実施例１８で使用したマウス大腸癌２６細胞株１×１０６細胞をマウスの皮膚下に注射し、５日間培養した。
【０２４４】
実施例９の方法によって押出法で、ドキソルビシン４００μｇ／ｍＬ溶液に懸濁されたマクロファージから、３μｇのドキソルビシンが負荷されたマイクロベシクル（ドキソルビシン−マイクロベシクル）を製造した。
【０２４５】
１０日の後、ＰＢＳ、１００μｇの押出法マイクロベシクルを含むＰＢＳ溶液（ドキソルビシン−マイクロベシクル）、３０μｇのドキソルビシンを含むＰＢＳ溶液１００μＬを各１匹のマウスの尾静脈に注射した。
【０２４６】
６時間の後、マウスから癌組織、脾臓（spleen）、心臓（heart）を摘出し、４％パラホルムアルデヒドに浸して２４時間固定した。固定した組織を７０％エタノールに１時間ずつ１回、９５％エタノールに１時間ずつ４回、１００％エタノールに１時間ずつ３回、１００％キシレンに１時間ずつ３回浸して脱水反応させた。その後、パラフィンに入れて固定した。パラフィンで固定された組織を４μｍの厚さに切断し、スライドガラスに付着させた。付着した組織を６０℃で１時間保管してパラフィンを溶かした。溶かした組織を１００％キシレンに１分ずつ３回、１００％エタノールに１分ずつ４回、９５％エタノールに１分ずつ３回、最後に流れる水に５分間保管して水和反応を行った。
【０２４７】
各組織に伝達されたドキソルビシンを確認するために、水和反応済みの組織に対して免疫組織化学法を行った。免疫組織化学法のために、組織を１０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファに入れ、５分ずつ３回電子レンジを用いて抗原賦活化を行った。組織を流れる水に入れて冷やした後、５％ウマ血清と０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を入れたＴＢＳを仕込み、２時間ブロッキングした。５％ウマ血清と０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を入れたＴＢＳに、血管マーカーＣＤ３１を認知する抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、Ｎｏ．ＳＣ１５０６）を１：２００の比率で入れ、４℃で１２時間保管した。０．０２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を入れたＴＢＳで３回洗浄した後、緑色蛍光を帯びるＡｌｅｘａ４８８が付いている二次抗体を室温で１時間処理した。ＴＢＳで５回洗浄した後、カバーガラスをスライドガラスに付け、共焦点顕微鏡上で観察した。
【０２４８】
図３０は癌組織で観察した写真であり、図３１は脾臓と心臓で観察した写真である。図３０及び図３１において、緑色は血管を示し、赤色はドキソルビシンを示す。
【０２４９】
図３０に示すように、ドキソルビシンがマイクロベシクルに負荷されているときにのみ癌血管へ伝達され、ドキソルビシン自体では癌血管へ伝達されないことが分かる。
【０２５０】
前記結果より、マクロファージマイクロベシクルに負荷されたドキソルビシンは癌組織の血管細胞へ伝達されることが明らかである。
【０２５１】
図３１に示すように、ドキソルビシン自体を処理する場合、マウスの心臓へ多量のドキソルビシンが伝達されるが、マイクロベシクルに負荷される場合、心臓へ伝達されるドキソルビシンが減少することを確認した。
【０２５２】
前記結果は、ドキソルビシンによって現れる心臓毒性がマイクロベシクルを介して解決できることを意味する。
【０２５３】
実施例２１：マクロファージ由来ドキソルビシン負荷マイクロベシクルを用いたｉｎ ｖｉｖｏ癌死滅誘導及びドキソルビシンとの比較
前記実施例１８で使用したマウス大腸癌２６細胞株１×１０６細胞をマウスの皮膚下に注射し、５日間培養した。
【０２５４】
実施例９の方法によって押出法で、ドキソルビシン４００μｇ／ｍＬ溶液に懸濁されたマクロファージから、３μｇのドキソルビシンが負荷されたマイクロベシクル（ドキソルビシン−マイクロベシクル）を製造した。
【０２５５】
５日の後、ＰＢＳ、３μｇのドキソルビシンが負荷された押出法マイクロベシクル１０μｇを含むＰＢＳ溶液（ドキソルビシン−マイクロベシクル）、各３μｇ、１５μｇ、６０μｇのドキソルビシンを含むＰＢＳ溶液１００μＬを各実験群別に５匹ずつのマウスの 尾静脈に一日に１回ずつ注射し、二日に１回ずつ癌組織の大きさを測定した。癌組織の体積は最も長い長さｌとこれに垂直な長さｓを測定し、ｖ＝ｌｓ２／２の式で計算した。
【０２５６】
前記大腸癌細胞を皮下接種した後、癌組織の大きさを測定した結果を図３２に示す。ドキソルビシンが負荷された押出法マイクロベシクルを毎日１０μｇずつ注射した場合、癌組織の成長が最も遅かった。ドキソルビシンが負荷された押出法マイクロベシクルと類似な効果を示すドキソルビシンは６０μｇであった。この量はマイクロベシクルに負荷されたドキソルビシンより２０倍高い濃度である。
【０２５７】
図３３は各条件当たり５匹のマウスの体重を測定して示すグラフである。
【０２５８】
図３３に示すように、ドキソルビシンが負荷されたマイクロベシクルを毎日１０μｇずつ注射したマウスの体重はＰＢＳ対照群のそれと比較して有意な変化がなかった。しかし、６０μｇのドキソルビシンを注射したマウスの体重は有意に減少した。
【０２５９】
ケタミン：ランプン：ＰＢＳを１：３：６の比率で混ぜた麻酔剤１５０μＬをマウスの腹腔に投与して麻酔させた後、心臓から血液を採取し、凝固防止用チューブに入れた。血液１０μＬと１％ＨＣｌ９０μＬとを混ぜた後、室温で７分間保管した。血球計算機に１０μＬ仕込み、白く光る細胞の個数を数えた。
【０２６０】
図３４は血液に存在する白血球の数をこの方法で測定した結果を示す。
【０２６１】
図３４に示すように、ドキソルビシンが負荷されたマイクロベシクルを毎日１０μｇずつ注射したマウスの白血球の数が減少しなかったが、６０μｇのドキソルビシンを注射したマウスの白血球は対照群より５０％以上減少した。
【０２６２】
前記結果は、マイクロベシクルを介してドキソルビシンの副作用を減らすことができることを意味する。
【０２６３】
実施例２２：マクロファージ由来ドキソルビシン負荷マイクロベシクルを用いたｉｎ ｖｉｖｏ癌死滅誘導及び膜タンパク質の重要性の確認
前記実施例１８で使用したマウス大腸癌２６細胞株１×１０６細胞をマウスの皮膚下に注射し、５日間培養した。
【０２６４】
実施例９の方法によって押出法で、ドキソルビシン４００μｇ／ｍＬ溶液に懸濁されたマクロファージから、３μｇのドキソルビシンが負荷されたマイクロベシクル（ドキソルビシン−押出法マイクロベシクル）を製造した。ドキソルビシンが負荷されたマイクロベシクルにトリプシンを処理して膜タンパク質を除去したマイクロベシクル（ドキソルビシン−押出法マイクロベシクル（Ｔ））を用意し、また、ドキソルビシンが負荷された超音波分解マイクロベシクル（ドキソルビシン−超音波分解マイクロベシクル）を用意した。
【０２６５】
５日の後、ＰＢＳ、３μｇのドキソルビシンが負荷された押出法マイクロベシクル１０μｇを含むＰＢＳ溶液、トリプシンを処理した後に得たドキソルビシンが負荷された押出法マイクロベシクル１０μｇを含むＰＢＳ溶液、３．６μｇのドキソルビシンが負荷された超音波分解マイクロベシクル１０μｇを含むＰＢＳ溶液１００μＬを各実験群別に５匹ずつのマウスに一日に１回ずつ尾静脈を介して注射し、二日に１回ずつ癌組織の大きさを測定した。癌組織の体積は最も長い長さｌとこれに垂直な長さｓを測定し、ｖ＝ｌｓ２／２の式で計算した。
【０２６６】
前記大腸癌細胞を皮下接種した後、癌組織の大きさを測定した結果を図３５に示す。
【０２６７】
図３５に示すように、ドキソルビシンが負荷された押出法マイクロベシクルを毎日１０μｇずつ注射した場合、癌組織の成長が最も遅かった。しかし、膜タンパク質が除去したトリプシン処理マイクロベシクル、及び膜タンパク質のトポロジーが変わった超音波分解マイクロベシクルは癌組織の成長に大きい影響がなかった。
【０２６８】
前記結果は、マイクロベシクルが作用するにあたり、膜タンパク質と膜タンパク質のトポロジーが重要であることを意味する。
【０２６９】
実施例２３：マクロファージ由来抗癌薬物負荷マイクロベシクルを用いたｉｎ ｖｉｖｏ癌死滅誘導
実施例９の方法でドキソルビシン溶液の代わりに５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、カルボプラチン、ＥＧＣＧ(Epigallocatechin gallate)溶液を用いてマクロファージから、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン、カルボプラチン、ＥＧＣＧが負荷されたマイクロベシクルを製造して使用した。
【０２７０】
前記実施例１８で使用したマウス大腸癌２６細胞株１×１０６細胞をマウスの皮膚下に注射し、５日間培養した。５日後、５−フルオロウラシルが負荷されたマイクロベシクル１５μｇを含むＰＢＳ溶液、それぞれゲムシタビン、カルボプラチン、ＥＧＣＧが負荷されたマイクロベシクル１０μｇを含むＰＢＳ溶液１００μＬを一日に１回ずつマウスの尾静脈に注射し、二日に１回ずつ癌組織の大きさを測定した。癌組織の体積は最も長い長さｌとこれに垂直な長さｓを測定し、ｖ＝ｌｓ２／２の式で計算した。
【０２７１】
前記大腸癌細胞を皮下接種した後、癌組織の大きさを測定した結果を図３６に示す。図３６に示すように、各薬物が負荷されたマイクロベシクルを毎日注射した場合、癌組織の成長が遅いものと確認された。
【０２７２】
前記結果より、マイクロベシクルに多様な薬物を負荷することができ、各薬物の抗癌効果があることを確認した。
【０２７３】
実施例２４：マクロファージ由来抗癌薬物負荷マイクロベシクルを用いたｉｎ ｖｉｖｏ異種移植（xenograft）肺癌死滅の誘導
ヒト肺癌細胞株Ａ５４９細胞２×１０６個をマトリゲル(matrigel)と混ぜてヌード（NUDE）マウスの皮膚下に注射し、２５日間培養した。
【０２７４】
実施例９の方法によってドキソルビシンの代わりにゲムシタビンとカルボプラチンを用いて、マクロファージから、ゲムシタビンとカルボプラチンが同時に負荷されたマイクロベシクルを製造した。
【０２７５】
２５日後、ＰＢＳ、薬物が負荷された押出法マイクロベシクル５μｇを含むＰＢＳ溶液、薬物が負荷された押出法マイクロベシクル２０μｇを含むＰＢＳ溶液１００μＬを各実験群別に５匹ずつのマウス二日に１回ずつ尾静脈を介して注射し、二日に１回ずつ癌組織の大きさを測定した。癌組織の体積は最も長い長さｌとこれに垂直な長さｓを測定し、ｖ＝ｌｓ２／２の式で計算した。
【０２７６】
前記肺癌細胞を皮下接種した後、癌組織の大きさを測定した結果を図３７に示す。図３７に示すように、薬物が負荷された押出法マイクロベシクルを二日に１回２０μｇずつ注射した場合、癌組織の成長が最も遅いものと確認された。
【０２７７】
前記結果より、抗癌薬物負荷マイクロベシクルを用いて、ヒト癌細胞株異種移植癌組織に対しても抗癌効果があることを確認した。
【０２７８】
実施例２５：マクロファージ由来ドキソルビシン負荷マイクロベシクルを用いたｉｎ ｖｉｖｏ癌転移抑制
マウス黒色腫細胞株Ｂ１６ＢＬ６細胞２×１０５細胞をＢＮＸマウスに尾静脈を介して注射し、３日間培養した。
【０２７９】
実施例９の方法によって押出法で、ドキソルビシン４００μｇ／ｍＬ溶液に懸濁されたマクロファージから、３μｇのドキソルビシンが負荷されたマイクロベシクルを製造した。
【０２８０】
３日後、ＰＢＳ、０．６μｇのドキソルビシンが負荷された押出法マイクロベシクル２μｇを含むＰＢＳ溶液（ドキソルビシン−マイクロベシクル（２））、３μｇのドキソルビシンが負荷された押出法マイクロベシクル１０μｇを含むＰＢＳ溶液（ドキソルビシン−マイクロベシクル（１０））１００μＬを各実験群別に５匹ずつのマウスに一日に１回ずつ尾静脈を介して注射した。
【０２８１】
図３８は各条件当たり５匹のマウスから、肺へ転移された黒色腫の個数を測定して示すグラフである。図３８に示すように、ドキソルビシンが負荷されたマイクロベシクルを毎日１０μｇずつ注射したマウスから、肺へ転移された黒色腫が最も小さいものと確認された。本実験は２回行った。
【０２８２】
１０匹のマウスを用いて黒色腫を投与し、ドキソルビシンが負荷されたマイクロベシクルを入れてマウスの生存率を確認した。
【０２８３】
図３９はマウスの生存率を示すグラフである。図３９に示すように、ドキソルビシンが負荷されたマイクロベシクル１０μｇを投与する場合、マウスの生存率がＰＢＳ対照群に比べて増加することを確認した。
【０２８４】
前記結果より、ドキソルビシン負荷マイクロベシクルを投与する場合、転移癌の成長を阻害することができることが明らかである。
【０２８５】
実施例２６：骨髄組織由来マイクロベシクルの製造及び薬物の伝達
マウスの骨髄（bone  marrow）を得るために、マウスから後足の骨を取り出した後、骨に付いている筋肉塊を除去し、純粋に骨のみを分離した。１ｍＬの注射器を用いて、骨の中に入っている骨髄組織細胞を取り出した。５００×ｇで遠心分離して骨髄組織細胞を得た。赤血球を除去するために、ＲＢＣ ｌｙｓｉｓバッファ（０．１５Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ、ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）に細胞を入れ、室温で１０分間保管した。５００×ｇで遠心分離した後、ＰＢＳに細胞を懸濁した。前記懸濁液から実施例１の方法でマイクロベシクルを製造した。
【０２８６】
骨髄から得たマイクロベシクルが骨髄にターゲッティングされることを示すために、次の実験を行った。マイクロベシクルを５μＭのＤｉＩと３０分間培養した。ＤｉＩは赤い蛍光を示す染色物質である。ＤｉＩ標識されたマイクロベシクルをマウスの尾静脈に注射した。６時間後、マウスから骨髄細胞を採取した。採取した骨髄細胞から赤血球を除去し、残った細胞をＦＡＣＳで分析した。
【０２８７】
図４０はＦＡＣＳの分析結果を示す。マイクロベシクルを注射していないマウスを対照群とした。図４０に示すように、マイクロベシクルを注射しない場合、ＤｉＩ信号が２×１０１以上の細胞は１．０１％であるが、マイクロベシクルを注射したマウスは２．４７％であって約２．５倍増加することを確認した。
【０２８８】
前記結果は、骨髄に由来するマイクロベシクルは、骨髄にターゲッティングされることを意味する。
【０２８９】
骨髄由来マイクロベシクルを用いてドキソルビシンを骨髄へ伝達できることを示すために、骨髄由来細胞を用いて実施例９の方法で、ドキソルビシンが負荷されたマイクロベシクルを製造した。
【０２９０】
マウスにそれぞれ、ＰＢＳ、８０μｇのマイクロベシクル、２４μｇのドキソルビシン、２４μｇのドキソルビシンが負荷された８０μｇのドキソルビシン−マイクロベシクルを含むＰＢＳ溶液１００μＬをマウスの尾静脈に注射した。６時間後、各マウスから骨髄細胞を得、骨髄にあるドキソルビシンの量を計算した。ドキソルビシンの量は、蛍光を用いて実施例１０の方法で測定し、各マウスから得た骨髄のタンパク質を測定して正規化(normalize)した。
【０２９１】
図４１は各グループ当たり３匹のマウスから得た骨髄における１μｇのタンパク質の量に対するドキソルビシンの量を示す。図４１に示すように、ＰＢＳ対照群では１μｇのタンパク質の量に約２０μｇのドキソルビシンがあるものと測定された。これとは異なり、ドキソルビシン−マイクロベシクルを投与したマウスの骨髄では約２８μｇのドキソルビシンが測定された。
【０２９２】
前記結果は、骨髄由来マイクロベシクルを用いて骨髄へドキソルビシンを伝達することができることを意味する。ドキソルビシン−マイクロベシクルに負荷された同量のドキソルビシンは骨髄へ伝達される量がマイクロベシクルに比べて著しく少なかった。
【０２９３】
実施例２７：形質転換細胞を用いた細胞特異的伝達
ＩＣＡＭ−１アンチセンス形質転換されたＨＴ１０８０細胞とＩＣＡＭ−１センス形質転換されたＨＴ１０８０細胞から、ドキソルビシンが負荷されたマイクロベシクルを実施例９の方法で製造した。ＩＣＡＭ−１アンチセンス形質転換されたＨＴ１０８０細胞由来マイクロベシクルはＩＣＡＭ−１が負荷されないが、ＩＣＡＭ−１センス形質転換されたＨＴ１０８０細胞由来マイクロベシクルはＩＣＡＭ−１が負荷されている。
【０２９４】
単核球としてのＵ９３７細胞の１×１０５ｃｅｌｌを２４ウェルプレートに５００μＬの培地に接種した後、ＨＴ２とＨＴ３細胞から得たマイクロベシクルを０、０．２、０．５、１μｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ処理し、２４時間培養した。２４時間後、細胞溶液５０μＬを９６ウェルプレートに仕込み、トリパンブルー(trypan  blue)溶液５０μＬを入れた。生きている細胞ではトリパンブルーがさらに細胞外に分泌されるため、生きている細胞はトリパンブルーで染色されない。混合された溶液１０μＬを血球計算機(hemocytometer)に入れ、光学顕微鏡でトリパンブルーのない細胞の個数を数えた。
【０２９５】
図４２は各実験群の細胞数を測定して示すグラフである。図４２に示すように、ＩＣＡＭ−１センス形質転換されたＨＴ１０８０細胞由来マイクロベシクルと、ＩＣＡＭ−１アンチセンス形質転換されたＨＴ１０８０細胞由来マイクロベシクルとを比較したとき、単核球のＬＦＡ−１と結合することが可能なＩＣＡＭ−１が発現したＩＣＡＭ−１センス形質転換されたＨＴ１０８０細胞由来マイクロベシクルが単核球としてのＵ９３７細胞のアポトーシスを一層さらに多く誘導することが分かる。
【０２９６】
前記結果より、形質転換を介してターゲッティング物質を負荷した細胞由来マイクロベシクルを用いて細胞特異的伝達が可能であることが明らかである。
【０２９７】
実施例２８：単核球由来シェディングマイクロベシクルの分離精製及び薬物負荷
単核球細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で１０ｍＬ用意し、１０μＭのサイトカラシンＤ（Ｓｉｇｍａ、Ｎｏ．Ｃ８２７３）を処理した細胞と、前記サイトカラシンＤを処理していない細胞を２４時間培養した。条件培地(conditioned medium)を５００×ｇで１０分間遠心分離し、得られた上層培養液を８００×ｇで１０分間２回遠心分離した。この過程で得られた上層培養液を１００，０００×ｇで２時間超遠心分離した。沈殿物をＰＢＳで懸濁してマイクロベシクルを得た。
【０２９８】
図４３はサイトカラシンＤを処理した細胞から得たシェディングマイクロベシクルの透過電子顕微鏡写真である。
【０２９９】
図４３に示すように、得られたシェディングマイクロベシクルは約５０〜１００ｎｍの大きさを有することを確認することができる。
【０３００】
サイトカラシンＤを処理せずに得たシェディングマイクロベシクルと、サイトカラシンＤを処理した後に得たシェディングマイクロベシクルにそれぞれ４００μｇ／ｍＬの濃度でドキソルビシンを入れた後、４℃で１２時間培養した。１２時間の後、培養液を１００，０００×ｇで２時間超遠心分離した。沈殿物をＰＢＳで懸濁してドキソルビシン負荷シェディングマイクロベシクルを得た。
【０３０１】
実施例２９：ナノ粒子が負荷されたシェディングマイクロベシクルの分離及び精製
ヒト子宮頚部癌細胞株としてのＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ−２）を１×１０７ｃｅｌｌｓとなるように１５０ｍｍのプレートに接種し、プレート内で癌細胞が８０％まで満ちるように用意した。カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）が接合されたＱｄｏｔ ７０５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｎｏ．Ｑ２１３６１ＭＰ）を５ｎＭの濃度で無血清培地２０ｍＬに混ぜた後、癌細胞と共に２４時間培養した。前記Ｑｄｏｔを処理する前に、ＰＢＳを用いて、既存の培地で培養していた細胞をよく洗浄した後、Ｑｄｏｔを含む培地を処理した。２４時間後、条件培地を回収した後、細胞残屑(cell debris)を除去するために、８００×ｇで１０分間遠心分離を行い、連続的に３０００×ｇで１０分間遠心分離を行った。細胞残屑の除去された細胞上層液２０ｍＬを、１０ｋＤａ以上の大きさのみを集める遠心分離フィルター装備を用いて３０００×ｇで３ｍＬとなるまで遠心分離を行った。容量５ｍＬの超遠心分離チューブに下方からそれぞれ５０％オプティプレップ１ｍＬ、５％オプティプレップ１ｍＬ、及び濃縮された３ｍＬの条件培地を順次入れた。その後、１００，０００×ｇで２時間超遠心分離した。５０％オプティプレップと５％オプティプレップとの間の層で、Ｑｄｏｔが負荷されたシェディングマイクロベシクルを得た。
【０３０２】
図４４はＱｄｏｔが負荷されたシェディングマイクロベシクルのＴＥＭイメージである。Ｑｄｏｔは電子密度が高いため、ＴＥＭイメージ上で黒色の点として示される。図４４に示すように、Ｑｄｏｔは大部分マイクロベシクルと同一の位置に位置していることを確認することができ、これによりシェディングマイクロベシクルに量子ドットなどのナノ粒子を負荷することができることを確認した。
【０３０３】
実施例３０：単核球由来ドキソルビシン負荷シェディングマイクロベシクルを用いた薬物の細胞特異的伝達
２４ウェルプレートに０．１％ゼラチンのコートされたカバーガラスを入れ、カバーガラス上にヒト血管細胞としてのＨＵＶＥＣ細胞を３×１０４の量だけ接種した後、２４ウェルプレートで１２時間培養した。１０ｎｇ／ｍＬとなるようにＴＮＦ−αを入れ、１６時間培養した。ＰＢＳで洗浄した後、培地５００μＬを入れ、５μｇ／ｍＬの濃度で、実施例２７の方法によって分離した、 単核球由来ドキソルビシンが負荷されたシェディングマイクロベシクルを処理した後、２０分間培養した。ＰＢＳで洗浄した後、無血清培地５００μＬを入れ、セルトラッカー溶液を５μＭとなるように入れた後、３０分間培養した。ＰＢＳで洗浄した後、血清のある培地を５００μＬ仕込み、さらに３０分間培養した。カバーガラスを４％パラホルムアルデヒド５００μＬに仕込み、室温を１０分間保管した。カバーガラスをスライドガラスに付けた後、蛍光顕微鏡上で観察した。
【０３０４】
図４５は生きている細胞を測定して示すグラフである。図４５に示すように、ドキソルビシンが負荷された、サイトカラシンＤを処理せずに得たシェディングマイクロベシクル、及びサイトカラシンＤを処理した後に得たシェディングマイクロベシクルの両方ともはアポトーシスを誘導したことが分かる。
【０３０５】
前記結果より、ＴＮＦ−αを処理したＨＵＶＥＣ細胞におけるアポトーシス効果がさらに高いため、ドキソルビシン負荷シェディングマイクロベシクルが正常細胞より癌細胞のアポトーシスを選択的にさらに多く誘導することを予想することができる。
【０３０６】
前述した本発明の説明は例示のためのものである。本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、本発明の技術的思想又は必須的な特徴を変更することなく、他の具体的な形態で容易に変形可能であることを理解することができるであろう。よって、上述した実施例は全ての面で例示的なものに過ぎず、限定的なものではないと理解されるべきである。
【産業上の利用可能性】
【０３０７】
本発明に係る前記治療用及び／又は診断用物質が負荷された哺乳類の有核細胞由来マイクロベシクルを使用することにより、目標の細胞又は組織にのみ前記薬物を効果的に伝達することができ、これにより治療用物質の副作用を減らして疾病の治療過程における患者の苦痛及び不便を減らすことができる。また、目標の細胞又は組織にのみ診断用物質が伝達されるようにすることにより、疾病に関連した細胞又は組織を容易に診断することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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