(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原表示細胞自体及び抗原表示細胞を含む組織を磁気共鳴映像で特異的に可視化させることができるカルボン酸−マンナンでコーティングされた超常磁性ナノ粒子ＭＲＩ造影剤であって、前記カルボン酸−マンナンが、マンナンにアルデヒド基を導入してアルデヒド−マンナンを合成し、前記アルデヒド−マンナンを用いてそれを酸化させることによってカルボキシル基が導入されたカルボン酸−マンナンであることを特徴とするＭＲＩ造影剤。
【請求項２】
前記抗原表示細胞が、樹状細胞、大食細胞、Ｂ−細胞であることを特徴とする請求項１記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項３】
リンパ節への癌転移診断に活用できることを特徴とする請求項１記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項４】
敗血症診断に活用できることを特徴とする請求項１記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項５】
前記カルボン酸−マンナンが、全体を構成するマンノ−スの１０モル％以上がカルボキシル化されていることを特徴とする請求項１記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項６】
前記超常磁性ナノ粒子が、酸化鉄であることを特徴とする請求項１記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項７】
前記酸化鉄が、マグネタイト（magnetite，Ｆｅ３Ｏ４）またはマグヘマイト（maghemite，Ｆｅ２Ｏ３）であることを特徴とする請求項６記載のＭＲＩ造影剤。
【請求項８】
Ａ）超常磁性ナノ粒子を合成する工程と、
Ｂ）マンナンにアルデヒド基を導入してアルデヒド−マンナンを合成する工程と、
Ｃ）前記アルデヒド−マンナンを用いてそれを酸化させることでカルボキシル基が導入されたカルボン酸−マンナンを製造する工程、及び
Ｄ）前記製造されたカルボン酸−マンナンで前記合成された超常磁性ナノ粒子をコーティングする工程とを含む、ＭＲＩ造影剤製造方法。
【請求項９】
請求項８によって製造される、カルボン酸−マンナンでコーティングされた超常磁性ナノ粒子ＭＲＩ造影剤。
【請求項１０】
造影剤が、リンパ節への癌転移診断に活用され得ることを特徴とする請求項９記載のカルボン酸−マンナンでコーティングされた超常磁性ナノ粒子ＭＲＩ造影剤。
【請求項１１】
造影剤が、敗血症診断に活用され得ることを特徴とする請求項９記載のカルボン酸−マンナンでコーティングされた超常磁性ナノ粒子ＭＲＩ造影剤。
【請求項１２】
前記カルボン酸−マンナンが、全体を構成するマンノ−スの１０モル％以上がカルボキシル化されていることを特徴とする請求項９記載のカルボン酸−マンナンでコーティングされた超常磁性ナノ粒子ＭＲＩ造影剤。
【請求項１３】
前記超常磁性ナノ粒子が、酸化鉄であることを特徴とする請求項９記載のカルボン酸−マンナンでコーティングされた超常磁性ナノ粒子ＭＲＩ造影剤。
【請求項１４】
前記酸化鉄が、マグネタイト（magnetite，Ｆｅ３Ｏ４）またはマグヘマイト（maghemite，Ｆｅ２Ｏ３）であることを特徴とする請求項１３記載のカルボン酸−マンナンにコーティングされた超常磁性ナノ粒子ＭＲＩ造影剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁気共鳴映像（magnetic resonance imaging；ＭＲＩ）造影剤（contrast agent）に関するもので、特に抗原表示細胞（antigen presenting cell）に特異的に流入して抗原表示細胞自体と抗原表示細胞を有した組織を特異的に磁気共鳴映像を通じて可視化できるＭＲＩ造影剤に関するものである。より詳細にはカルボキシル基が導入されたマンナン（mannan）でコーティングされた超常磁性（superparamagnetic）ＭＲＩ造影剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
代表的な断層撮影映像技術である磁気共鳴映像は、非侵襲的に３次元映像を得ることができる方法であり、コントラストと空間解像度（spatial resolution）に優れていて疾病の診断のために広く使用されている。
【０００３】
ＭＲＩ造影剤は、生体内注入（injection）後、強力な外部磁場と高周波エネルギーによって発生するＴ１、Ｔ２緩和時間（relaxation time）の変化から生じる差を感知して、正常組織と非正常組織のコントラストを増強させることによって、局所部位の解剖学的あるいは機能的領域に対する映像化を可能にする化学物質で、一般的にＭＲＩ造影剤は常磁性（paramagnetic）造影剤と超常磁性造影剤に区分される（非特許文献１）。
【０００４】
常磁性造影剤は、生体毒性がひどくてｍＭ水準のみの映像が可能であるので、μＭ水準の高感度映像が可能な超常磁性造影剤に対する関心が常磁性造影剤より高い（非特許文献２、３）。
【０００５】
臨床に広く用いられる超常磁性造影剤は、マグネタイト（magnetite、Ｆｅ３Ｏ４）またはマグヘマイト（maghemite，Ｆｅ２Ｏ３）のような酸化鉄（superparamagnetic iron oxide，ＳＰＩＯ）に代表される超常磁性ナノ粒子を基盤に製造される。これらは、数十ナノメートル以下の大きさを有する均一な粒子の安定したコロイド形態である酸化鉄溶液（ferrofluid）に調製して体内に投入される。
【０００６】
純粋な超常磁性酸化鉄粒子は、（１）疎水性ながら体積対表面積の比が大きいので粒子間に疎水性相互作用（hydrophobic interaction）が強くてそれによって凝集がよく起きてクラスタ（cluster）を形成して、（２）安定性が低くて本来の構造が変化して磁気的な特性が変わりやすくて、（３）生体環境に露出するようになると、早く生分解が起き得、（４）純粋な酸化鉄自体だけでは毒性があって人体に有害である。したがって、このような問題を改善して前記超常磁性ナノ粒子を含む酸化鉄溶液の安定性を改善させるためには粒子の表面改質が求められている。
【０００７】
表面改質には、多様な高分子のコーティングが活用されていて、デキストラン（dextran）やデキストランの誘導体で表面コーティングされているものなどが商用化されている。従来のコーティングする高分子としては、デキストラン系統の外にもポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの合成高分子（非特許文献４、５）や、ゼラチン（Gelatin）、キトサン（Chitosan）、プルラン（Pullulan）などの天然高分子（非特許文献６、７）が用いられたりする。
【０００８】
一方、マンナンの場合はあまり多く用いられていないが、表面改質（コーティング）にマンナンの使用が開示されていたりして（特許文献１及び２）、本発明者らもマンナンを活用したことがある（特許文献３）。特許文献１で開示しているマンナンの活用目的は、通常の高分子コーティングの目的と同様、酸化鉄コロイド（colloid）の体内安定性の向上であり、特許文献２での目的も通常の高分子コーティングの目的と同様に造影剤溶液（suspension）の安定性を向上させるためである。特許文献３では、高分子コーティングで期待することができる一般的な効果に加えて、マンノ−ス（mannose）特異受容体によるターゲティングの目的も有している。しかし、このようなマンナンの使用は、マンナンによる生体毒性の危険性が提議されたりして生体内循環系（circulation system）での消失（trap）が問題になってきた。したがって、より生体に相応しいすなわち、毒性がずっと低く生体内の半減期が長い形態のマンナンの開発及びそれをコーティングしたＭＲＩ造影剤の開発が重要であると言える。
【０００９】
また他の面では、ＭＲＩで抗原表示細胞または抗原表示細胞を多量に有する組織を特異的に照映増強できれば、その臨床的活用度を高められる。通常癌組織や敗血症（sepsis）などの感染部位では、抗原表示細胞が多量に存在するようになる。特定部位での抗原表示細胞の多量存在は、該当の部分で異常症状が発生したことを示すものである。したがって、このような抗原表示細胞の異常な増加を診断することができる診断技術の開発は、臨床的活用性を考慮する時、重要であると言える。
【００１０】
本明細書全体にわたって多数の論文及び特許文献を参照し、その引用はカッコ内に表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、それ全体として本明細書に参照として挿入され、本発明が属する技術分野の水準と本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国登録特許第5,262,176号
【特許文献２】米国登録特許第5,462,053号
【特許文献３】韓国登録特許第10-0949465号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Eur.Radiol.2001年,第11卷,p.2319
【非特許文献２】Nano Lett.2006年,第6卷,p.2427
【非特許文献３】Nat.Med.2007年,第13卷,p.95
【非特許文献４】J.Mater.Chem.2002年,第12卷,p.3654-3659
【非特許文献５】J.Colloid Interface Sci.2004年,第278卷,p.353-360
【非特許文献６】J.Colloid Interface Sci.2005年,第283卷,p.446-451
【非特許文献７】J.Magn.Magn.Mater.2005年,第293卷,p.20-27
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、本発明はこのような従来技術の問題点と以前から要請されてきた技術的課題を解決することを目的とする。
【００１４】
本発明の目的は、体内安定性及び安全性に優れ抗原表示細胞または抗原表示細胞が含まれた組織の特異的照映増強性能を有するＭＲＩ造影剤を提供し、さらにそれの製造方法を提供することである。
【００１５】
また他の本発明の目的は、リンパ節への癌転移診断に活用することができるＭＲＩ造影剤を提供することである。
【００１６】
また他の本発明の目的は、敗血症診断に活用することができるＭＲＩ造影剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
前記のような課題を解決するために、本発明者らは、既存のマンナンでコーティングされたＭＲＩ造影剤の短所を克服するために、マンナンにカルボキシル基を導入してそれをＭＲＩ造影剤のコーティング物質に使用すれば、毒性も低めることができるし体内半減期も増加させることができると予想し、カルボキシル基を十分にマンナンに導入することができる技術を開発し、そのように製造したカルボキシル基を導入したマンナンでコーティングされたＭＲＩ造影剤が、マンナンでコーティングされたＭＲＩ造影剤に比べてその使用が安全であることを確認して本発明を完成した。
【００１８】
したがって、本発明は体内安定性及び安全性に優れ抗原表示細胞または抗原表示細胞が含まれた組織の特異的照映増強性能を有するカルボキシル基を導入したマンナンでコーティングされた超常磁性ナノ粒子であるＭＲＩ造影剤及びその製造方法を提供する。
【００１９】
前記超常磁性ナノ粒子の磁性物質は、マンガン酸化物（ＭｎＯ）、マンガンフェライト（ＭｎＦｅ２Ｏ４）、鉄−白金合金（Ｆｅ−Ｐｔ alloy）、コバルト−白金合金（Ｃｏ−Ｐｔ alloy）及びコバルト（Ｃｏ）など多様に選択され得るが、マグネタイト（magnetite、Ｆｅ３Ｏ４）またはマグヘマイト（maghemite、Ｆｅ２Ｏ３）のような酸化鉄（superparamagnetic iron oxide、ＳＰＩＯ）が最も好ましい。
【００２０】
前記抗原表示細胞では、樹状細胞（dendritic cell）、大食細胞（macrophage）、Ｂ−細胞（B-cell）など多様な種類を挙げられるが、マンノ−ス受容体を有した細胞が好ましい対象であり、特に大食細胞が好ましい。
【００２１】
本発明のＭＲＩ造影剤が活用され得る代表的な例としては、癌診断であり、特にリンパ節への癌転移診断が好ましい。また、本発明のＭＲＩ造影剤は、炎症関連の診断にも活用することができ、特に敗血症の診断が好ましい。
【００２２】
本発明は、また、
Ａ）超常磁性ナノ粒子を合成する工程と、
Ｂ）マンナンにアルデヒド基を導入してアルデヒド−マンナンを合成する工程と、
Ｃ）前記アルデヒド−マンナンを用いてそれを酸化させることによってカルボキシル基が導入されたカルボン酸−マンナンを製造する工程、及び
Ｄ）前記製造されたカルボン酸−マンナンで前記合成された超常磁性ナノ粒子をコーティングする工程とを含むカルボキシル基が導されたマンナンでコーティングされた抗原表示細胞または抗原表示細胞を含んだ組織の照映増強ＭＲＩ造影剤の製造方法に関するものである。
【００２３】
前記でアルデヒド−マンナンは、アルデヒド基が導入されたマンナンを指称し、カルボン酸−マンナンはカルボキシル基が導入されたマンナンを指称する。
【００２４】
本発明者らは、マンナンにカルボキシル基を導入するために多様な方法を適用してみたが、他の方法では十分な程度のカルボキシル基の導入が難しく、本発明で開示したアルデヒド−マンナンを経る方法を通じて十分な程度のカルボキシル基の導入が可能だった（全体マンノ−スの１０モル％がカルボキシル化する）。したがって、本発明の特徴は、カルボキシル基が導入されたマンナンでコーティングされたＭＲＩ造影剤を提供する点と、前記カルボキシル基が導入されたマンナンの製造においてアルデヒド−マンナンを中間体に用いた点である。
【発明の効果】
【００２５】
高い程度にカルボキシル基が導入されたマンナン（mannan）でコーティングされた超常磁性（superparamagnetic）ＭＲＩ造影剤は、優れた体内安定性（stability）及び低い生体毒性を提供することができ、抗原表示細胞に特異的に流入し得て抗原表示細胞及び抗原表示細胞を含んだ組織を特異的に可視化することができる。このような抗原表示細胞及び抗原表示細胞を含んだ組織を特異的に可視化することができ、体内安定性に優れたＭＲＩ造影剤は、乳癌、大腸癌、胃癌などの初期リンパ節への転移（metastasis）を効果的に探知するのに用いることができ、また敗血症を早期診断する目的でも活用することができる。
【００２６】
癌のリンパ節転移有無を正確に診断することは、癌治療と患者の予後を決定するにおいて非常に重要であり、敗血症の早期診断は説明する必要もなく重要であるといえる。リンパ節への癌の転移を探知するためには、現在ＰＥＴ−ＣＴ（Positron Emission Tomography and Computed Tomography）を多く使用しているが、ＭＲＩはＰＥＴ−ＣＴに比べて放射能被爆に対する危険がなくて空間分解能が優れているので、初期の微細転移を判定することが容易であるという長所がある。
【００２７】
敗血症は、現在ＥＬＩＳＡ（Enzyme-linked immunosorbent assay）のような診断検査法を通じて主に診断が行われ、多くの診断時間が必要となる短所がある。敗血症は、死亡率が非常に高いので早期診断が必須である。本発明を敗血症診断に活用する場合、診断の迅速性と容易性を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明のアルデヒド−マンナンの合成を示した図である。
【図２】本発明のカルボン酸−マンナンの合成を示した図である。
【図３】本発明によって製造されたアルデヒド−マンナン及びカルボン酸−マンナンのフーリエ変換赤外線分光器分析結果である。図で「Mannan−ＣＨＯ」はアルデヒド−マンナンを示し、「Mannan−ＣＯＯＨ」はカルボン酸−マンナンを示す。
【図４】本発明による酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮｓ）の製造方法を示した手順図である。
【図５】本発明によって製造されたカルボン酸−マンナンがコーティングされたＳＰＩＯＮｓのトータル光散乱測定機分析結果である。
【図６】腹膜大食細胞を用いた細胞内流入を調査したプルシアンブルー染色結果である。写真で、青色部分と茶色部分は鉄が導入された部分を示し、赤い部分は核を示す。１０００倍拡大写真である。
【図７】腹膜大食細胞を用いた細胞内流入を調査したMR phantom imaging結果である。エッペンチューブ中間部分に細胞が存在している。
【図８】リンパ節を用いたプルシアンブルー染色結果である。写真で青色部分は、鉄が導入された部分を示す。
【図９】磁気共鳴映像比較結果で、実際の撮影写真である。
【図１０】磁気共鳴映像比較結果で、信号強度比である。信号強度比は、隣接した筋肉に対するリンパ節の相対的信号強度の比である。
【図１１】ＬＰＳ処理した細胞及び正常細胞間で、本発明によって製造されたカルボン酸−マンナンがコーティングされたＳＰＩＯＮｓの流入程度の差を示した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
上述したように、本発明は高い程度のカルボキシル基が導入されたマンナンでコーティングされた体内安定性に優れ、毒性が非常に低くなった超常磁性ＭＲＩ造影剤を提供するものである。
【００３０】
以下、本発明の内容をより詳細に説明するが、該当の技術分野の熟練した当業者なら本発明の思想及び領域から逸脱しない範囲内で本発明を多様に修正及び変更することができることを理解することができるであろう。
【００３１】
以下、実施例を通じて本発明をより具体的に説明するが、これら実施例は本発明を例示するだけであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるのではない。
【００３２】
実施例１：カルボン酸−マンナンの製造
実施例１−１：アルデヒド−マンナンの合成
４００ｍｇのマンナンを１６ｍｌの蒸留水に溶解した。そこに、０．１Ｍ  ＮａＩＯ４水溶液９ｍｌ（マンノ−スに対して０．４当量）をゆっくり添加して４℃の条件で光を遮断したまま一時間反応させた。反応を終結させるためにグリセロール（マンノ−スに対して０．８当量）を添加して、３０分間撹拌した。生成物を透析膜（ＭＷＣＯ１，０００）に移して蒸留水に対して４℃の条件で一日透析した後、凍結乾燥して３９３ｍｇの白色固体であるアルデヒド−マンナンを得た。全体過程が図１に提示されている。
【００３３】
実施例１−２：カルボン酸−マンナンの合成
３７０ｍｇのアルデヒド−マンナンを２０ｍｌの蒸留水に溶解した。この溶液を氷が満たされた水槽に入れてそこに過酸化水素（Ｈ２Ｏ２；マンノ−スに対して１．２当量）を添加した。そこに３ｍｌの０．５Ｍ  ＮａＣｌＯ２（マンノ−スに対して１．２当量）をゆっくり添加して、ｐＨを５に合わせた。以後、氷水槽を除去して継続して撹拌しながら、ＮａＯＨを用いて反応物のｐＨを５に維持させた。ｐＨがこれ以上変わらない時、生成物のｐＨを９に合わせた後、透析膜（ＭＷＣＯ  １、０００）を用いて蒸留水に対して４℃の条件で一日透析して精製した後、凍結乾燥させた。その結果、３５１ｍｇの白色固体であるカルボン酸−マンナンを得た。生成されたカルボン酸−マンナンを対象に、１Ｍ  ＨＣｌを用いて導入したカルボキシル基の量を定量した結果、マンノ−スの約１３モル％のカルボキシル基が導入されたことを確認することができた。全体過程が図２に提示されている。カルボキシル基の導入は、通常の方法であるフーリエ変換赤外線分光器（Fourier transform infrared spectrometer;Nicolet Magna 550 series II spectrometer,Midac,Atlanta,GA，米国）を用いて分析し、その結果を図３に示す。図３の結果から、カルボキシル基の導入による特徴的ピークが示されることを確認することができる。
【００３４】
実施例２：超常磁性酸化鉄ナノ粒子の製造
まず、超常磁性酸化鉄ナノ粒子（Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles；ＳＰＩＯＮｓ）を製造するために、塩基性溶液（ＮＨ４ＯＨ）でＦｅ２＋とＦｅ３＋イオンを還元させてＳＰＩＯＮｓを沈澱させた。具体的に、塩化鉄（ＩＩＩ）（ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ）２  モルと塩化鉄（ＩＩ）（ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）１モルを蒸留水７０ｍｌに添加して混合水溶液を調製した。前記混合水溶液を激しく撹拌しながらアンモニア水溶液７ｍｌを添加した。ここで、黒い沈殿物が形成されるが、前記沈殿物を永久磁石を用いて固定させながらｐＨが１０から７に落ちるまで蒸留水で何回洗浄した。このようにして、ｐＨ７になった沈殿物のみを集めた。
【００３５】
前記沈殿物に２Ｍの硝酸（ＨＮＯ３）溶液２０ｍｌと０．３５Ｍの硝酸第２鉄（Ｆｅ（ＮＯ３）３・９Ｈ２Ｏ）水溶液３０ｍｌを加えて１時間還流（reflux）して酸化させた。酸化によって形成された茶色の懸濁液を２日間０．０１Ｍの硝酸に対して透析してＳＰＩＯＮｓ保存溶液（stock solution）を製造して、それを４℃で保管した（図４参照）。
【００３６】
実施例３：カルボン酸−マンナンでコーティングされた超常磁性酸化鉄ナノ粒子の製造
前記ＳＰＩＯＮｓ保存溶液を６．２５ｍｇ／ｍｌになるように蒸留水で希釈した。このように準備した希釈液を、４℃で撹拌する。一方、その間に１７．５ｍｇのカルボン酸−マンナンを２００μｌの蒸留水に溶解してカルボン酸−マンナン溶液を準備する。カルボン酸−マンナン溶液の準備が完了すると、前に準備したＳＰＩＯＮｓ保存溶液の希釈液から８００μｌを取ってそこにカルボン酸−マンナン溶液を４℃で撹拌しながらゆっくり一滴ずつ添加する。添加が完了すれば、それを４℃で一晩中撹拌する。最終的にＮＨ４ＯＨを少量入れてｐＨを７に合わせる。最後に、ＮａＣｌを０．９％になるように添加してイオン強度を合わせる。このように調製された溶液をカルボン酸−マンナンがコーティングされた超常磁性酸化鉄ナノ粒子（すなわち、ＭＲＩ造影剤）溶液に使用した。
【００３７】
対照物質にマンナンがコーティングされたＳＰＩＯＮｓ、デキストランがコーティングされたＳＰＩＯＮｓ及びＰＶＡ（ポリビニルアルコール）がコーティングされたＳＰＩＯＮｓも製造したが、すべての過程はカルボン酸−マンナンがコーティングされたＳＰＩＯＮｓの製造過程と同一であった。
【００３８】
実施例４：カルボン酸−マンナンがコーティングされたＳＰＩＯＮｓの特性分析
実施例４−１：カルボン酸−マンナンがコーティングされたＳＰＩＯＮｓの大きさ分布図測定
本発明によって製造されたカルボン酸−マンナンがコーティングされたＳＰＩＯＮｓの大きさと分布を測定するため、散乱角が９０度に調節されたトータル光散乱測定機（electrophoretic light scattering spectrophotometer,ELS8000,Otsuka Electronics,大阪、日本）を用いて２５℃で測定した。前記トータル光散乱測定機分析のための試料は、カルボン酸−マンナンがコーティングされたＳＰＩＯＮｓを蒸留水に入れた後、超音波処理をして準備した。図５の分析結果から分かるように均一に分布した粒子が生成されたことが分かり、粒子の大きさの平均は３４．１ｎｍだった。
【００３９】
実施例４−２：ゼータ電位の測定
カルボン酸−マンナンがコーティングされたＳＰＩＯＮｓのゼータ電位（液体の中に浮遊するコロイド粒子の表面帯電量の程度を示す指標であり、shear boundaryとbulk solutionとの電位差）を通常の方法によって測定し、その結果、−３１．６９ｍＶと測定された。このゼータ電位数値で、カルボン酸−マンナンがコーティングされたＳＰＩＯＮｓが通常的コロイド基準で安定した状態を維持することを確認することができた。
【００４０】
実施例５：対照物質との比較
実施例５−１：マンナンがコーティングされたＳＰＩＯＮｓとの毒性学的比較
カルボン酸−マンナンでコーティングされたＳＰＩＯＮｓとマンナンでコーティングされたＳＰＩＯＮｓの毒性学的比較を実施した。通常の単回静脈投与試験を通じて比較した。試験は、化学研究院付設安全性評価研究所で実施した。具体的に、７週齢のＩＣＲマウス（群当り雄と雌各５匹使用）にカルボン酸−マンナンでコーティングされたＳＰＩＯＮｓとマンナンでコーティングされたＳＰＩＯＮｓを２０、４０及び８０ｍｇ  Ｆｅ／ｋｇの用量で単回静脈投与した後１５日間一般症状を観察、死亡動物の観察及び体重測定を実施して、１５日目に剖検を実施して内部臓器の異常有無などを観察した。
【００４１】
マンナンでコーティングされたＳＰＩＯＮｓを投与した場合、２０ｍｇ  Ｆｅ／ｋｇ以上の用量で死亡動物の発生が一部発見され、活動性低下、不規則呼吸、伏臥胃及び下腹部汚染の一般症状が観察された。これを根拠にマンナンでコーティングされたＳＰＩＯＮｓの雄と雌マウスでの半数致死量は、二つの場合ともに約４４ｍｇ  Ｆｅ／ｋｇと算出された。一方、カルボン酸−マンナンでコーティングされたＳＰＩＯＮｓを投与した場合、雄と雌すべての試験群で試験物質投与と係わる死亡が観察されなかったし、肉眼的な剖検所見も特別異常な事項がなかった。したがって、カルボン酸−マンナンでコーティングされたＳＰＩＯＮｓのマウスでの半数致死量は、８０ｍｇ  Ｆｅ／ｋｇを上回ることが示された。
【００４２】
以上の結果から、カルボン酸−マンナンでコーティングされたＳＰＩＯＮｓが、マンナンでコーティングされたＳＰＩＯＮｓに比べてずっと安全なＭＲＩ造影剤であることを確認することができた。
【００４３】
実施例５−２：抗原表示細胞内への流入測定
抗原表示細胞または抗原表示細胞が多量に含まれた組織をＭＲＩ照映の対象にするためには、使用したＭＲＩ造影剤が抗原表示細胞に効果的に流入しなければならないしまたそれが特異的であるなら好ましい。これを確認するために、次の実験を実施した。
【００４４】
まず、カルボン酸−マンナンでコーティングされたＳＰＩＯＮｓの抗原表示細胞内への流入効率を調査してみた。抗原表示細胞のモデル細胞には、腹膜大食細胞（peritoneal macrophage）を選定した。Ｂａｌｂ／Ｃマウスから分離した腹膜大食細胞をカルボン酸−マンナンでコーティングされたＳＰＩＯＮｓが添加された培地状態で３時間培養した。培養後、通常のプルシアンブルー染色（Prussian blue staining）を実施してカルボン酸−マンナンでコーティングされたＳＰＩＯＮｓの細胞内への流入程度を観察した。プルシアンブルー染色法は、鉄イオンがフェロシアン化合物と反応して鉄フェロシアン化合物を生成する原理を応用した染色法であり、この染色法で鉄イオンの分布を確認することができる。その結果を図６に提示している。図６の結果から細胞内でカルボン酸−マンナンでコーティングされたＳＰＩＯＮｓが効果的に流入していることを確認することができ、この結果からカルボン酸−マンナンでコーティングされたＳＰＩＯＮｓが、抗原表示細胞または抗原表示細胞が多量に含まれた組織を対象に活用され得ることが分かった。このような細胞内への流入は、細胞内取込作用（endocytosis）で説明することができる。
【００４５】
追加実験で他のＭＲＩ造影剤と抗原表示細胞内への流入効率を比較してみた。この実験では、前の実験で毒性が確認されたマンナンがコーティングされたＳＰＩＯＮｓは排除した。比較対象のＭＲＩ造影剤には、デキストラン-coated ＳＰＩＯＮ及びＰＶＡ−coated ＳＰＩＯＮを選定した。この実験でも抗原表示細胞のモデル細胞には、腹膜大食細胞を選定した。Ｂａｌｂ／Ｃマウスから分離した腹膜大食細胞を、カルボン酸−マンナンでコーティングされたＳＰＩＯＮｓ，デキストラン-coated ＳＰＩＯＮ及びＰＶＡ−coated ＳＰＩＯＮがそれぞれ添加された培地状態で３時間及び２４時間培養した。培養後、２×１０５細胞を５％ゼラチンに固定させた後、それをエッペンチューブに入れた後、遠心分離を実施した。遠心分離後、MR phantom imagingを通じて細胞内への流入程度を分析した。その結果を図７に提示している。図７の結果から、ＳＰＩＯＮｓが流入すればするほど黒く示されるが、カルボン酸−マンナンでコーティングされたＳＰＩＯＮｓの場合が、ずっと早く細胞内に流入することを確認することができた。この結果から、カルボン酸−マンナンでコーティングされたＳＰＩＯＮｓが他ＭＲＩ造影剤と比較して抗原表示細胞または抗原表示細胞が多量に含まれた組織を対象にして、ＭＲＩ造影剤としてより優れていることを確認することができた。
【００４６】
実施例５−３：組織内の抗原表示細胞内への流入測定
カルボン酸−マンナンでコーティングされたＳＰＩＯＮｓの、抗原表示細胞を含んだ組織をターゲットにしたＭＲＩ造影剤としての活用可能性を調査するために、実際組織内の抗原表示細胞内への流入効率を、他のＭＲＩ造影剤と比較調査した。抗原表示細胞のモデル細胞では、大食細胞を選定し、モデル組織に大食細胞が多いリンパ節組織を選定した。各ＭＲＩ造影剤を注入後、プルシアンブルー染色で流入程度を測定した。具体的に、各ＭＲＩ造影剤を注入後、リンパ節組織を摘出して摘出したリンパ節を４％のホルマリン溶液１ｍｌに浸しておいた後、それをパラフィン中に固定させて染色のために切開した。リンパ節のスライスを１０％のフェロシアン化カリウム及び２０％のＨＣｌで２０分間染色し、染色したスライスは光学顕微鏡で観察した。酸化鉄粒子は、青い点で示される。その結果を、図８に示す。図８の結果から分かるように、カルボン酸−マンナンでコーティングされたＳＰＩＯＮｓは、他のＭＲＩ造影剤に比べてリンパ節内によく分布していた。このことから、カルボン酸−マンナンでコーティングされたＳＰＩＯＮｓを造影剤として注入する場合、組織内の抗原表示細胞にも効果的に流入し得ることを確認することができ、このことから抗原表示細胞が含まれた組織を対象にしたＭＲＩ造影剤として活用可能であることを確認することができた。
【００４７】
実施例６：リンパ節への癌転移診断への活用
カルボン酸−マンナンでコーティングされたＳＰＩＯＮｓを、既存に知られたＭＲＩ造影剤であるデキストラン-coated ＳＰＩＯＮ及びＰＶＡ−coated ＳＰＩＯＮとリンパ節への癌転移診断を目的としたＭＲＩ撮影において、その性能を比較してみた。リンパ節癌転移を有した実験動物当り１ｍｇの鉄イオンになるように各造影剤を投与した後、リンパ節をＭＲＩして比較した。和順全南大病院の動物用コイル（4 channel phased array rat head coil,Rapid Biomedical mdh,Rimpar，ドイツ）を用いた３Ｔ  ＭＲスキャナ（Siemens Medical System,Elegan，ドイツ）を使用してターボスピンエコー（Turbo-spin echo;TSE)T2-weighted(repetition time ms/echo time ms of 3,200/86, flip angle 150゜,echo train length of 18,56mm field of view,2mm section thickness,0.2-mm intersection gap,320×320 matrix,8 NEX）ＭＲＩを実施した。その結果は図９及び図１０に提示されている。
【００４８】
図９の結果から対照群の場合の磁気共鳴映像よりカルボン酸−マンナンでコーティングされたＳＰＩＯＮｓが注入された場合の磁気共鳴映像が、時間が経つにつれてより暗くなることを確認することができた。これを通じて、カルボン酸−マンナンでコーティングされたＳＰＩＯＮｓは、投与後、相当に早い時間内に組織間のコントラスト差を提供することができ、効果的なリンパ節癌転移診断用ＭＲＩ造影剤であることを確認することができた。図１０の信号強度比の結果は、隣接した筋肉に対するリンパ節の相対的信号強度の比を示した結果であり、筋肉よりリンパ節にカルボン酸−マンナンでコーティングされたＳＰＩＯＮｓがより効果的に流入して、それによって相対的信号強度比が優れていることを確認することができる。
【００４９】
以上の結果は、本発明のカルボン酸−マンナンでコーティングされたＳＰＩＯＮｓが抗原表示細胞を有する組織を可視化する目的でのＭＲＩ造影剤として活用できることはもちろん、リンパ節への癌転移診断目的のＭＲＩ造影剤としても効果的に活用することができることを確認することができる。すなわち、本発明のＭＲＩ造影剤は、乳癌、大腸癌、胃癌などの初期リンパ節への転移を効果的に探知することに用いられ得ることを確認することができた。
【００５０】
実施例７：敗血症診断への活用
本発明のＭＲＩ造影剤が、敗血症を早期診断する目的にも活用することができるかどうか調べた。敗血症は、バクテリアの感染によって誘発される疾患で、バクテリアに感染する場合感染部位はバクテリアのリポポリサッカライド（ＬＰＳ）に反応して大食細胞を多量生成する。このように生成された大食細胞を容易に確認することができれば、敗血症の程度を簡便に確認することができる。実験は、次のように実施した。下記の実験では、カルボン酸−マンナンでコーティングされたＳＰＯＩＮｓがＬＰＳに露出して活性化した大食細胞内でどのくらい効率的に流入されるかを調べることにした。
【００５１】
腹膜大食細胞の一部をＬＰＳで処理して、敗血症と同じ状態の細胞を作った。このようにＬＰＳ処理した腹膜大食細胞と、なにも処理していない腹膜大食細胞をそれぞれカルボン酸−マンナンでコーティングされたＳＰＯＩＮｓを含んだ培地で３時間培養した。培養後、各細胞に対して通常のプルシアンブルー染色を実施して、カルボン酸−マンナンでコーティングされたＳＰＯＩＮｓの細胞内への流入程度を観察した。その結果が図１１に提示されている。図１１の結果から分かるように、敗血症状態の細胞であるといえるＬＰＳ処理された細胞において、なにも処理していない正常細胞に比べてカルボン酸−マンナンでコーティングされたＳＰＯＩＮｓの流入が顕著に増加する結果を確認することができた。この結果から、本発明のＭＲＩ造影剤が敗血症の早期診断目的でも活用することができることを確認することができた。
【００５２】
以上で、本発明の特定部分を詳しく記述したが、当業界の通常の知識を有した者において、このような具体的な技術は、単に好ましい具現例であるだけで、それに本発明の範囲が制限されるのではない点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付された請求項とその等価物によって定義されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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