(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｉ
【化１】
0005657528.tif 000009
で表されるスフィンゴ脂質の生体触媒的調製方法であって、
一般式ＩＩ
【化２】
0005657528.tif 000010
で表されるリゾスフィンゴ脂質
（式中、
Ｒ１は、天然植物油または動物油をベースとする６〜３０個の炭素原子を有する天然の脂肪酸から−ＣＯＯＨを除いた基であり、
Ｒ２は、Ｈ、ホスホコリン、エタノールアミン、セリンまたは糖を表し、
Ｘは、ＣＨ＝ＣＨ、ＣＨ２−ＣＨ２またはＣＨ２−ＨＣＯＨを表す）
と、少なくとも１つのカルボキシルエステルとを、Candida antarctica由来のリパーゼＢを含む生体触媒の存在下で反応させることによる方法であり、
前記カルボキシルエステルが、少なくとも１つのカルボン酸とグリセロールとのエステルであり、ここで前記カルボン酸は、天然植物油または動物油をベースとする６〜３０個の炭素原子を有する天然の脂肪酸の群から選択されることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記リゾスフィンゴ脂質が、前記酵素反応の前に、前記リゾスフィンゴ脂質の酸付加生成物の脱プロトン化によって調製されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リゾスフィンゴ脂質の酸付加生成物の脱プロトン化と、生体触媒的調製との間に濾過ステップが行われることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記リゾスフィンゴ脂質が、生体触媒作用中に、前記リゾスフィンゴ脂質の酸付加生成物の脱プロトン化によって調製されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記リゾスフィンゴ脂質の、カルボン酸カルボキシレート、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、炭酸塩、水酸化物またはハロゲン化物が、前記リゾスフィンゴ脂質の酸付加生成物として使用されることを特徴とする、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
有機塩基または無機塩基が前記脱プロトン化に使用されることを特徴とする、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
プロトン化後に水を少しも遊離しない塩基が使用されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
アルカリ金属アルコラートが塩基として使用されることを特徴とする、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記リゾスフィンゴ脂質の酸付加生成物と塩基との間のモル比が、１０：１〜０.０５：１の範囲内であることを特徴とする、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
部分グリセリドの含量が、前駆体としての前記カルボキシルエステルの初期重量の質量を基準にして２.５％ｗ／ｗ未満であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記生体触媒の量が、前駆体の全質量を基準にして、１％（ｗ／ｗ）〜１００％（ｗ／ｗ）の範囲内で使用されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記生体触媒が回収されることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記酵素反応の開始時に、リゾスフィンゴ脂質とカルボキシルエステルとのモル比１：１０〜１０：１で反応物質が存在することを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記反応が、有機溶剤中で実施されることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
カールフィッシャー法で検出される水含量０.１００Ｍ以下として定義された無水条件下で、前記反応が実施されることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記反応開始時の前記反応物質濃度が、各反応物質について、０.０１Ｍ〜３Ｍの範囲内であることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記反応温度が、２０℃〜１３０℃の範囲内であることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記反応が、１ｂａｒ未満の圧力下で実施されることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
式Ｉの標的化合物に関連した変換が、理論的に予想される変換の８０％超であることを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
式Ｉおよび０.００１〜１９質量％の対応するＮ,Ｏ−ジアシル化生成物を含む組成物が得られることを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフィンゴ脂質の酵素的合成ならびに、リゾスフィンゴ脂質とカルボキシルエステル由来のスフィンゴ脂質を含む組成物に関し、また、こうしたスフィンゴ脂質または組成物を含む化粧製剤、皮膚用製剤または医薬製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、一般式Ｉ
【化１】
0005657528.tif 000002
で表されるスフィンゴ脂質の生体触媒的調製方法であって、
一般式ＩＩ
【化２】
0005657528.tif 000003
で表されるリゾスフィンゴ脂質を、一般式ＩＩＩａ〜ｅ
【化３】
0005657528.tif 000004
（ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＸは以下に定義の通りである）
で表される化合物を含む群から選択される少なくとも１つのカルボキシルエステルと反応させることによる調製方法に関する。
【０００３】
本スフィンゴ脂質は、化粧用および／または皮膚用有効成分として使用される。
【０００４】
Ｒ２＝Ｈである一般式Ｉのスフィンゴ脂質は、セラミドと言われ、皮膚（角質層）内に天然に存在する極性脂質である。外側の角質細胞では、セラミドは、細胞膜の主成分（脂質含量の４０〜６５％）に相当し、たとえば、透水性を調節することにより、その保護機能において中心的役割を果たす。加齢とともに、ケラチノサイトは、セラミド合成能の大部分を失い、それ故皮膚はその保護作用の一部を失い、たとえば、もはや表皮の水分喪失を完全に抑制することはできない。これは、セラミドの局所適用によって、少なくとも部分的に補うことができる（たとえば、Farwick, M. et al., Int. J. Cosm. Sci., 2007, 29(4), 319-329またはKlee, S.K. et al. Basic Clinic. Dermatol., 2007, 40, 155-165）。
【０００５】
加えて、アトピー性皮膚炎の治療における、セラミドの好ましい作用が報告されている（Kerscher, M. et al., Eur. J. Dermatol., 1991, 1, 39-43; Imokawa, G. et al., J. Soc. Cosmet. Chem. 1989, 40, 500-507）。
【０００６】
多くの先進工業諸国、特にドイツにおける人口統計推移を考慮すると、セラミドの需要はさらに増大すると予想される。
【０００７】
先行技術では、セラミドは、活性化カルボン酸誘導体を使用して、Ｒ２＝Ｈである一般式ＩＩのリゾスフィンゴ脂質、たとえば、フィトスフィンゴシン（Ｒ２＝ＨかつＸ＝ＣＨ２−ＨＣＯＨである、一般式ＩＩ）等の、ショッテン・バウマン（Schotten Baumann）類似Ｎ−アシル化によって調製される。
【０００８】
フィトスフィンゴシンは、一般に発酵起源である。
【０００９】
活性化カルボン酸は一般に、それ自体として使用されるか、またはカルボン酸からイン・シチュで調製されるかのいずれかである、塩化カルボニルである。米国特許第６４２０６０４号（Cosmoferm, NL）は、スフィンゴシン塩基を好適なカルボニルハロゲン化物と反応させることによる、幾つかのセラミドの合成について記述している。この方法の際立った不都合は、有毒な有機塩素化合物を使用する必要性がある一方で、結果として生じる最終生成物が高塩負荷であることである。さらに、極めて反応しやすいカルボニルハロゲン化物を使用する際には、かなりの量の不要な副産物の生成を予想しなければならないことは、当業者に明白である。
【００１０】
代替合成経路は、無水物によって進行する。したがって、たとえば、国際公開第９３／２００３８号パンフレット（Gist-Brocades, NL）は、フィトスフィンゴシンのＮ−アシル化用の反応性カルボン酸誘導体を得るために、カルボン酸とアルキルフェニルスルホニルクロリドから、混合無水物を塩基触媒合成することを教示している。
【００１１】
これらの経路全部に共通しているのは、反応性カルボン酸誘導体の使用に依存していることである。これに関連した不都合は、こうした物質の高い腐蝕性およびそれらの健康に対する危険性の両者であり、これにより特別の反応器システムおよび注意が必要となり、したがって、調製の複雑さが増大する。加えて、本生成物を局所適用できるためには、反応しやすく有毒な前駆体および副産物が本生成物から除去されていることが保証されなければならない。高塩負荷、ならびにそれに関連した生成物精製および廃棄物処理のための付加的な複雑さもさらに予想される。先行技術の方法のさらなる不都合は、低い前駆体濃度および生成物濃度しか得られないことであり；たとえば、国際公開第９３／２００３８号パンフレット（Gist-Brocades, NL）は、反応性かつ有毒な共試薬である、塩化ｐ−トルエンスルホニルおよびトリエチルアミンの同時使用と共に、有毒な溶剤塩化メチレン中の最大１５％（ｗ／ｖ）の前駆体溶液を記している。加えて、本生成物の純度または収量（いずれの場合にも、８０％）はいずれも満足のいくものではない。
【００１２】
さらなる不都合は、単離された脂肪酸または脂肪酸誘導体に対する制限である。脂肪酸は、天然には主にグリセリド（脂肪および油）として生じ、それから脂肪酸を最初に得なければならない。特に、非常に敏感な脂肪酸、たとえば、多価不飽和脂肪酸等を用いるのであれば、これには、副反応を避けて脂肪酸を得るために、精巧な方法が必要である。今までのところ、天然のグリセリド、たとえば、オリーブ油、ひまわり油、アマニ油、菜種油、サフラワー油、大豆油、コーンオイル、ピーナッツ油、パーム油、パーム核油、ヤシ油、ヒマシ油、ゴマ油、アボカド油、豚脂、牛脂、ニシン油、椿油、カカオバター、パンプキンシードオイル、アーモンドオイル、マンゴーバター、月見草油、ピスタチオオイル、ピーカンナッツオイル、米油、シーバックソーンオイル、マスタードオイル、黒クミンオイル、シアバター、くるみ油、キリ油、グレープシードオイル等、から出発するセラミドを調製する方法は皆無である。
【００１３】
したがって、本発明の目的は、無害かつ産業上利用することができる様式で、先行技術の不都合の少なくとも１つを克服することができる、セラミドを得る代替方法を提供することである。
【００１４】
生体触媒的に、すなわち、酵素を触媒として使用して、アミド化反応を得ることもできる。酵素の産業上の利用の概説は、たとえばLieseら（Industrial Biotransformations; Second, Completely Revised Edition, Wiley-VCH, Weinheim, 2006）に見られる。カルボン酸誘導体を合成するのに好ましい生体触媒は、加水分解酵素（E.C. 3.1.x.x）、特にリパーゼ（トリアシルグリセロール加水分解酵素、E.C. 3.1.1.3）およびエステラーゼ（E.C. 3.1.1.1）である。
【００１５】
リパーゼは、細胞の代謝における自然機能に従って、エステルの加水開裂を優先的に触媒する。しかし、エステルの縮合的生成も、文献に多数記述されている。それらの代表例は、Drauz and Waldmann (Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, A Comprehensive Handbook; Second, Completely Revised and Enlarged Edition, Vol. II, Wiley-VCH, Weinheim, 2002)、Aehle (Enzymes in Industry, Production and Applications; Second, Completely Revised Edition, Wiley-VCH, Weinheim, 2004)またはBornscheuer (Enzymes in Lipid Modification, Wiley-VCH, Weinheim, 2000)に見られる。
【００１６】
リパーゼ−触媒縮合反応における求核剤としてのアミンの使用例も、文献にある。
【００１７】
Y.-M. Xia et al., J Mol Catal B, 2004, 31,111-115は、たとえば、カンジダ・アンタークティカ（Candida antarctica (CALB)）由来のリパーゼにより触媒される反応性一級アミンを用いたラウリン酸メチルのアミド化によるＮ−ラウロイル−β−アミノプロプリオニトリルの合成について記述している。記載の方法の不都合は、基質溶液の希釈（５０ｍＭ未満）の制限に加え、僅か９４.３％までの変換という、比較的低い変換である。さらに、示された反応には、位置選択性または化学選択性は全く必要ない。
【００１８】
しかし、前駆体分子、たとえば、フィトスフィンゴシン等は、複数の反応性官能基を有する可能性があるため、本発明による反応には、このような選択性が絶対的に必要であろう。この選択性の問題は、たとえばP.Tufvesson et al.: Biotechnol.Bioeng., 2007, 97(3), 447-453により示され：エタノールアミンとカルボン酸とを用いたＣＡＬＢ−触媒による反応において、酵素触媒によるエステル化を回避する単純な選択的アミド化は不可能であった。前駆体の多回添加および蒸留による反応水の除去によってのみ、所望のアミドの濃縮を達成することが可能であった。
【００１９】
酵素的アミド化のさらなる例で、M.Nechab et al.: JOC, 2007, 72, 6918-6923は、ＣＡＬＢを使用した、（Ｒ）立体配置二級アミンの立体選択的反応について記述している。生成物の高い光学純度（＞９９％  ee）が確認されたことから、ＣＡＬＢの（Ｒ）立体配置アミンに対する強い優先傾向が示唆され、したがって、たとえばフィトスフィンゴシンは、Ｓ−立体配置であるため、この触媒で、アミン炭素原子に反応するかどうか疑わしい。加えて、やはり、非常に希釈された基質溶液（１００ｍＭ）が、高濃度（２７％ｗ（ＣＡＬＢ）／ｗ（基質））の生体触媒と同時に使用され、記載の方法の産業上の魅力を著しく制限している。
【００２０】
国際公開第９４／２６９１９号パンフレット（Gist-Brocades, NL）は、細菌リパーゼまたは哺乳リパーゼの使用とともに、カルボキシルエステルを使用するフィトスフィンゴシンの酵素的Ｎ−アシル化について記述している。細菌リパーゼおよび哺乳リパーゼ、特に、シュードモナス・アルカリゲネス（Pseudomonas alcaligenes）由来のリパーゼは、記載の方法で好ましく使用される。この方法の不都合は、特に、中程度の変換（最高７８％）を達成するだけのために、大量の生体触媒（３０〜９５％ｗ／ｗ）を必要とすることである。加えて、かなりの量の不要なＮ,Ｏ−ジアシル化生成物（最高１７％）が確認された。さらに、基質の希釈溶液のみが使用され（５９〜９３ｍＭ）、その結果として空時収量が低くなる。さらなる不都合は、基質としてフィトスフィンゴシン塩基に制限されることであり、フィトスフィンゴシンの酸付加生成物、たとえばフィトスフィンゴシンサルフェートの使用と比較して、基質価格の激増を伴う。さらに、酵母および真菌に由来するリパーゼは、触媒として不安定であることが明確に指摘されている。したがって、国際公開第９４／２６９１９号パンフレットに記述されている方法は、既存の化学的方法に代わる経済的に価値ある代替法としては除外される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
このように、先行技術の不都合を克服する、リゾスフィンゴ脂質を酵素的にアミド化する方法が引き続き必要である。
【００２２】
したがって、本発明の目的は、先行技術の方法の不都合の１つまたは複数がない方法を提供することであった。特に、その意図は、容易に入手できる前駆体を、さらには高濃度で、使用することができる方法を開発することであった。
明確に言及されていないさらなる目的は、以下の説明、実施例および特許請求の範囲の文脈から明白である。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明の目的は全く驚くべきことに、スフィンゴ脂質を調製するためのアシルドナーとして、多価アルコールの完全エステルまたは部分エステルを使用することにより達成される。
【００２４】
この種のアシルドナー、たとえば脂肪および油としての、したがって、三価アルコールグリセロールのエステルのアシルドナーは、これまでに記載されていない。
【００２５】
この主な理由は、たとえば、脂肪および油の使用に際して、反応中にかなりの量で、モノグリセリドおよびジグリセリドが蓄積することを、当業者が予想するであろうということである。このため、所望の反応は容易にできなくなるであろう；特に、予想される複雑で不明確な反応混合物は、純度が不満足な生成物をもたらし、それ故化粧用途および／または皮膚用用途におけるその使用を不可能にする。
【００２６】
加えて、モノアシルグリセリドおよびジアシルグリセリドはかなりの界面活性剤特性を示し、反応混合物の完成（working up）を紛れもなく困難にする。その上、この界面活性剤分子は、たとえば、生体触媒をその支持材から分離すること（浸出）により、酵素の活性および安定性をひどく害する可能性がある。このことは、所望の生体触媒的方法にとって二つの点で致命的であろう：第一に、浸出によって触媒が浪費されるであろう、すなわち、新たな触媒の補給がより頻繁になり、したがって、当該方法の経済的魅力が減じられるであろうことを意味する。第二に、浸出によって生成物が酵素で汚染され、特に、酵素に対するアレルギー反応の危険性のため、化粧用製剤および／または皮膚用製剤におけるその使用が不可能になる。
【００２７】
驚くべきことに、言及したモノグリセリドおよびジグリセリドは、本発明による方法の間のいかなる時点でも、顕著な量では検出されないことが分かった。油脂を使用した反応の完了後に検出可能な唯一の副産物はグリセロールであった。
したがって、本発明による方法の１つの利点は、例として上述したモノグリセリドまたはジグリセリドの不都合を回避することある。
【００２８】
本発明による方法のさらなる利点は、純粋な多価アルコール、たとえば、グリセロール等は、化粧品および皮膚科学で広く使用される溶剤に相当し、また生成物中に大量に残存できることである。代替法として、水を用いた抽出ステップによって、グリセロールを最終生成物から容易に除去することができる。
【００２９】
本発明による方法のまたさらなる利点は、脂肪および油、特に天然の脂肪および油の使用により、容易に入手できる前駆体を本方法が利用することであり、したがって、容易に入手できない（部分的）合成メチルエステル、エチルエステルおよびプロピルエステルの使用と比較して、経済的観点から明白な利点を示す。
【００３０】
本発明による方法は、比較的低い酵素濃度、たとえば使用する前駆体を基準にして１０重量％未満を実施に必要とするため、および／または当該生体触媒を何度も、たとえば少なくとも１０回、再使用できるため、経済的に価値のある方法でアミド化反応を実施できるという、さらなる利点を有する。したがって、本発明による方法のさらなる利点は、クロマトグラフィまたは分別結晶等の精巧な完成反応なしで、高純度、たとえば、有効含量＞９０％およびＮ,Ｏ−ジアシル化生成物の比率５％未満の生成物を調製することができることである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明はしたがって、一般式Ｉ
【化４】
0005657528.tif 000005
で示されるスフィンゴ脂質の生体触媒的調製方法であって、
一般式ＩＩ
【化５】
0005657528.tif 000006
で表されるリゾスフィンゴ脂質と、
一般式ＩＩＩa〜ｅ
【化６】
0005657528.tif 000007
で表される化合物を含む群から選択される少なくとも１つのカルボキシルエステルを、
酵素クラスＥ.Ｃ.３.１.１のカルボキシルエステル加水分解酵素を少なくとも１つ含む生体触媒の存在下で反応させることによる、生体触媒的調製方法に関し、
式中、Ｒ１は、互いに独立してまた場合により異なっていてもよい、場合により１つもしくは複数の多重結合および／または芳香環もしくは芳香族複素環を含んでもよく、場合により酸素原子またはエステル官能基もしくはアミド官能基が割り込んでいてもよく、また場合によりアルキル基、ヒドロキシ基、ケト基またはアミン基から選択される少なくとも１つのさらなる基で置換されていてもよい、２〜５５個の炭素原子を有する直鎖または分岐したアルキル鎖を表し、
Ｒ２は、Ｈ、ホスホコリン、エタノールアミン、セリンまたは糖を表し、
Ｘは、ＣＨ＝ＣＨ、ＣＨ２−ＣＨ２またはＣＨ２−ＨＣＯＨを表す。
【００３２】
この酵素クラスＥ.Ｃ.３.１.１のカルボキシルエステル加水分解酵素は、好ましくは菌界の生物から単離することができるもの、およびアミノ酸レベルで、菌界の生物から単離することができるものと少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、９８％または９９％相同である、酵素クラスＥ.Ｃ.３.１.１のカルボキシルエステル加水分解酵素である。
【００３３】
「アミノ酸レベルでの相同性」は、本発明の文脈で、以下、既知の方法を用いて決定することができる「アミノ酸同一性」を意味する。一般に、特定の要求を考慮に入れたアルゴリズムを用いた特別のコンピュータープログラムを使用する。同一性を決定する好ましい方法は、まず第一に比較すべき配列間の最大一致を生じさせる。同一性を決定するためのコンピュータープログラムとしては、
−GAP (Deveroy, J. et al., Nucleic Acid Research 12 (1984), page 387, Genetics Computer Group University of Wisconsin, Medicine (WI)、および
−BLASTP、BLASTNおよびFASTA (Altschul, S. et al., Journal of Molecular Biology 215 (1990), pages 403-410を含むＧＣＧプログラムパッケージなどがあるが、この限りではない。このＢＬＡＳＴプログラムは、National Centre For Biotechnology Information(ＮＣＢＩ)およびさらなるソース（BLAST handbook, Altschul S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894; Altschul S. et al.、上記）から入手できる。
【００３４】
当業者は、２つのヌクレオチド間またはアミノ酸配列間の類似性または同一性を計算するために、様々なコンピュータープログラムを利用できることを承知している。したがって、２つのアミノ酸配列間のパーセンテージ同一性は、たとえばＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comを介して得られる）のＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch （J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)）アルゴリズムによって、具体的には、ブロッサム（Blossom）６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ギャップウェイト１６、１４、１２、１０、８、６、または４および長さウェイト１、２、３、４、５、または６を使用して、決定することができる。異なるパラメータの使用は、僅かに異なる結果につながるであろうが、２つのアミノ酸配列間のパーセンテージ同一性は、全体として著しく異ならないであろうことを、当業者は理解するであろう。通常は、プリセット（ギャップウェイト：１２、長さウェイト：１）を適用し、ブロッサム６２マトリックスが使用される。
【００３５】
上述のアルゴリズムによる６０％の同一性は、本発明との関連で、６０％相同性を意味する。同じことが、より高い同一性にも当てはまる。
【００３６】
本発明による方法におけるカルボキシルエステルは、特に好ましくは、グリセロールと少なくとも１つのカルボン酸とのエステルのうち、一般式ＩＩＩａ〜ｅで表される化合物を含む群から選択され、ここで、カルボン酸は、６〜３０個の炭素原子、特に８〜２２個の炭素原子を有する、天然の植物油または動物油をベースとする天然の脂肪酸の群から選択される。天然の脂肪酸は、分岐しておらず、また偶数の炭素原子から成る。どの二重結合も、シス立体配置である。例は：カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、イソステアリン酸、ステアリン酸、１２−ヒドロキシステアリン酸、ジヒドロキシステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ペトロセリン酸、エライジン酸、アラキン酸、ベヘン酸、エルカ酸、ガドレイン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、アラキドン酸、９−または１３−ヒドロキシオクタデカジエン酸、１５−ヒドロキシエイコサテトラエン酸および一連のいわゆるα−ヒドロキシ酸である。同様にこの関連で、そのカルボン酸は、特に好ましくは、ヒドロキシ−官能化酸の重縮合生成物（たとえばポリ−１２−ヒドロキシステアリン酸またはポリリシノール酸）である。
【００３７】
本発明によれば、たとえばP. Lersch, U. Schick, Spec. Chem. Mag., 2003, 23(6), 30-31に記載の既報のフィトスフィンゴシンの場合に確立された発酵方法の結果として得られるもののような、リゾスフィンゴ脂質の酸付加生成物（酸付加塩ともよばれる）を使用することも可能である。好ましく使用されるリゾスフィンゴ脂質の酸付加生成物は、カルボン酸カルボキシレート、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、炭酸塩、水酸化物またはハロゲン化物、特に好ましくは、リゾスフィンゴ脂質の塩化物および硫酸塩である。
【００３８】
本発明による方法でリゾスフィンゴ脂質の酸付加生成物を使用するとき、リゾスフィンゴ脂質は、酵素反応の前に、リゾスフィンゴ脂質の酸付加生成物の脱プロトン化によって調製されることが好ましい。
【００３９】
こうして得られるリゾスフィンゴ脂質を、本明細書において以降、リゾスフィンゴ脂質塩基とも呼ぶ。
【００４０】
脱プロトン処理は、従来の有機溶剤中、リゾスフィンゴ脂質の酸付加生成物の溶液または懸濁液で行うことができる。使用できる溶剤の例は：パラフィン、一価または多価アルコール（たとえば：メタノール、エタノール、イソプロパノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、シクロヘキサノール、メチルシクロヘキサノール、２−ブチル−１−オクタノールおよびそれらの異性体、エチレングリコール、グリセロール、ジアセトンアルコール、イソブタノール、等々）、エーテル（ジエチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ポリエトキシレート、ポリプロポキシレートおよびコポリマー等々）、ケトン（アセトン、メチルイソブチルケトン、メチルエチルケトン、等々）、エステル（クエン酸トリエチル、クエン酸トリブチル、イソ酪酸イソブチル、酢酸イソブチル、イソノナン酸イソノニル、酢酸２−エチルヘキシル、酢酸シクロヘキシル、酢酸４−ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキシル）である。メチルイソブチルケトンまたは２−メチル−２−ブタノール等の、毒物学的に許容できる溶剤が好ましい。
【００４１】
脱プロトン化ステップは、溶剤が液体状態である反応温度で実施することができる。好ましくは、−８０℃〜＋１５０℃の間、特に好ましくは０℃〜１２０℃、極めて特に好ましくは＋２５℃〜１００℃の間の反応温度で実施される。
【００４２】
このようにして得られるリゾスフィンゴ脂質塩基の溶液は、それ自身、酵素反応に使用することもでき、予め濾過することもできる。
【００４３】
本発明のさらなる実施態様では、当業者によく知られている方法（たとえば蒸留、またはリゾスフィンゴ脂質塩基の沈殿／結晶化とその後の濾過による除去）で、脱プロトン化ステップの溶剤を除去することができる。このリゾスフィンゴ脂質塩基は場合により、たとえば沈殿または結晶化により、あるいは蒸留で溶剤を除去することにより、酵素反応の前に、単離してもよい。脱プロトン処理につながる塩が除去される濾過ステップは、リゾスフィンゴ脂質の酸付加生成物の脱プロトン化と生体触媒的調製との間に行われることが好ましい。
【００４４】
代替法として、生体触媒作用中に、リゾスフィンゴ脂質の酸付加生成物の脱プロトン化によって、リゾスフィンゴ脂質塩基を調製することができる。
【００４５】
活性化と関連した脱プロトン化は、塩基を使用することにより、好ましくは有機塩基または無機塩基を用いて、行うことができる。無機塩基として好ましく使用されるものは、水酸化物、炭酸塩、金属水素化物（たとえば：水素化リチウムアルミニウム、水素化カルシウム、水素化ナトリウム等々）、イオン交換体（たとえば、陽イオン交換体または陰イオン交換体等）であり、有機塩基としては、金属オルガニル（たとえば、ブチルリチウム等）、アルコラート、アミドおよびそれらの金属塩、たとえば、リチウムジイソプロピルアミド等である。
【００４６】
驚くべきことに、酵素反応で特に容易に反応させることができる特に高品質のリゾスフィンゴ脂質塩基は、特に、酸付加塩との反応で正式に水を少しも生成しない塩基によって提供されることが分かった。したがって、特に好ましい塩基は、その反応で、水を全く遊離しないものである。それらは、プロトン化後に水を少しも遊離しないものである。アルカリ金属アルコラートは、好ましくは塩基として使用される。これは、たとえばアルコール性溶液中に存在してもよい。ナトリウムメトキシドおよびカリウムメトキシドは特に好ましい。これらは同様に、有機溶剤中の溶液として使用することができる。
【００４７】
反応水を回避するための、したがって同様に本発明による方法で好ましい、さらなる代替法は、アルカリ金属水酸化物および／またはアルカリ土金属水酸化物を塩基として使用する際に、その反応で生成される水を結合するために、水結合性の塩、好ましくは水結合性無機塩、たとえば、Ｎａ２ＳＯ４等を使用することである。好ましくは、Ｎａ２ＳＯ４が使用される。
【００４８】
本発明によれば、本方法におけるリゾスフィンゴ脂質の酸付加生成物と塩基との間のモル比は、１０：１〜０．０５：１、好ましくは３：１〜０.２：１、特に好ましくは１.４：１〜０.６：１の範囲内であり、極めて特に好ましくは、リゾスフィンゴ脂質の酸付加生成物と塩基との間のモル比は、等モルである。
本発明による方法の結果得られる部分グリセリドの含量は、前駆体としての一般式ＩＩＩａ〜ｅのカルボキシルエステルの初期重量の質量を基準にして、好ましくは２.５％ｗ／ｗ未満、特に好ましくは１％ｗ／ｗ未満、極めて特に好ましくは０.５％ｗ／ｗ未満である。
【００４９】
本発明の特定の実施態様では、リゾスフィンゴ脂質塩基を調製するために、存在する任意の水が脱プロトン化混合物から除去される。このために使用される除水方法は、たとえば、物理的方法（たとえば蒸留、膜方法、抽出または吸着（たとえば分子篩））あるいは化学的方法（たとえば：金属水素化物および金属酸化物との反応、または、無水物、エステル等の他の反応物質との反応）等である。
【００５０】
冒頭に既述の通り、国際公開第９４／２６９１９号パンフレット（Gist-Brocades）に記載の先行技術を考慮すると、真菌リパーゼを、本発明による方法で効率よい生体触媒として使用できることは、全く驚くべきことである。
【００５１】
本発明による方法における生体触媒としては、とくに、菌界の生物から単離することができる酵素クラスＥ.Ｃ.３.１.１のカルボキシルエステル加水分解酵素、および／またはアミノ酸レベルで、菌界の生物から単離できるものと少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、９８％または９９％相同である、カルボキシルエステル加水分解酵素があり、その生物は、Aspergillus属、Bipolaris属、Candida属、Fusarium属、Geotrichum属、Humicola属、Microsporum属、Mucor属、Pichia属、Thermomyces属、Penicillium属、Rhizopus属、Rhizomucor属、Microsporum属、Mucor属、Nocardia属、Saccharomyces属、Streptomyces属、Trichosporon属、Zygosaccharomyces属の群から選択される。
【００５２】
典型的な代表は、たとえば：
Aspergillus caesiellus、A. candidus、A. carbonarius、A. carneus、A. chevalieri、A. clavatus、A. costaricaensis、A. cretensis、A. deflectus、A. flaviceps、A. flavus、A. flocculatosus、A. fumigatus、A. glaucus、A. ibericus、A. lacticoffeatus、A. lentulus、A. neobridgeri、A. nidulans、A. niger、A. niveus、A. ochraceus、A. oryzae、A. parasiticus、A. penicilloides、A. piperis、A. pseudoelegans、A. pseudofisheri、A. restrictus、A. roseoglobulus、A. sclerotioniger、A. sojae、A. steynii、A. sydowi、A. terreus、A. udagawae、A. ustus、A. versicolor、A. westerdijkiae、Bipolaris australiensis、B. hawaiiensis、B. picifera、Candida antarctica、C. cylindracea、C. lipolytica、C. rugosa、C. utilis、C. robusta、C. kefyr、C. albicans、C. glabrata、C. krusei、C. lusitaniae、C. parapsilosis、C. tropicalis、Fusarium chlamydosporum、F. coeruleum、F. dimerum、F. incarnatum、F. moniliforme F. oxysporum、F. proliferatum、F. sacchari、F. semitectum、F. solani、F. sporotrichoides、F. sub glutinans、F. tabacinum、F. verticillioides、Geotrichum candidum、G.klebahnii、Humicola fuscoatra var. Fuscoatra、H.a grisea var. Grisea、H. grisea var. Thermoidea、H. insolens、Microsporum amazonicum、M. audouinii、M. audouinii var. Langeronii、M. audouinii var. Rivalierii、M. boullardii、M. canis、M. canis var. distortum、M. cookei、M. equinum、M. ferrugineum、M. fulvum、M. gallinae、M. gypseum、M. nanum、M. persicolor、M. praecox、M. racemosum、M. vanbreuseghemii Mucor javanicus、M. pusillus、M. plumbeus、M. racemosus、M. hiemalis、Nocardia asteroides、N. brasiliensis、N. otitidiscaviarum、Penicillium aurantiogriseum、P. brevicompactum、P. chrysogenum、P. camemberti、P. digitatum、P. citrinum、P. commune、P. corylophilum、P. crustosum、P. cyclopium、P. expansum、P. funiculosum、P. glabrum、P. glaucum、P. griseofulvum、P. italicum、P. marneffei、P. nalgiovense、P. nordicum、P. notatum、P. palitans、P. purpurrescens、P. purpurogenum、P. olsonii、P. oryzae、P. roqueforti、P. variabile、P. viridicatum、P. verrucosum、Pichia acaciae、P. amylophilia、P. ciferrii、P. pastoris、P. alni、P. americana、P. amethionina、P. angophorae、P. angusta、P. anomala、P. antillensis、P. barkeri、P. besseyi、P. bimundalis、P. bispora、P. bovis、P. cactophila、P. canadensis、P. capsulata、P. caribaea、P. castillae、P. chambardii、P. delftensis、P. deserticola、P. dryadoides、P. euphorbiae、P. euphorbiiphila、P. fabianii、P. faecalis、P. farinosa、P. fermentans、P. finlandica、P. fluxuum、P. galaeiformis、P. glucozyma、P. guilliermondii、P. hampshirensis、P. haplophila、P. heedii、P. heimii、P. henricii、P. holstii、P. inositovora、P. jadinii、P. japonica、P. kluyveri、P. kodamae、P. lynferdii、P. maganishii、P. media、P. membranifaciens、P. methanolica、P. methylivoria、P. mexicana、P. meyerae、P. minuta、P. mississippiensis、P. nakasei、P. nakazawae、P. norvegensis、P. oezlemii、P. ofunaensis、P. ohmeri、P. onychis、P. opuntiae、P. petersonii、P. philodendri、P. philogaea、P. pijperi、P. pini、P. populi、P. pseudocactophila、P. quercuum、P. rabaulensis、P. rhodanensis、P. salicaria、P. scolyti、P. segobiensis、P. silvicola、P. spartinae、P. stipitis、P. strasburgensis、P. subpelliculosa、P. sydowiorum、P. tannicola、P. thermotolerans、P. toletana、P. trehalophila、P. triangularis、P. veronae、P. wickerhamii、P. xylosa、Thermomyces lanuginosa、Rhizopus arrhizus、R. delemar、R. niveus、R. oryzae、R. azygosporus、R. microsporus、R. schipperae、R. stolonifer、Rhizomucor miehei、Saccharomyces barnettii、S. bayanus、S. castellii、S. cerevisiae、S. dairenensis、S. exiguus、S. paradoxus、S. pastorianus、S. rosinii、S. servazii、S. spencoerorum、S. transvaalensis、S. unisporus、S. bailii、Streptomyces spp.、Trichosporon asahii、T. asteroides、T. beigelii、T. coremiiforme、T. cutaneum、T. faecale、T. gracile、T. inkin、T. mucoides、T. ovoides��T. pullulans、Zygosaccharomyces bisporus、Z. cidri、Z. fermantati、Z. florentinus、Z. mellis、Z. microellipsoides、Z. mrakii、Z. rouxiiである。
【００５３】
本発明による方法で特に好ましく使用されるカルボキシルエステル加水分解酵素は、Thermomyces lanuginosus（受入番号Ｏ５９９５２）由来のリパーゼ、Candida antarctica（受入番号Ｐ４１３６５）由来のリパーゼＡおよびＢならびにMucor miehei（受入番号Ｐ１９５１５）由来のリパーゼ、Humicola sp.（受入番号Ｏ５９９５２）由来のリパーゼ、Rhizomucor javanicus（受入番号Ｓ３２４９２）由来のリパーゼ、Rhizopus oryzae（受入番号Ｐ６１８７２）由来のリパーゼ、Candida rugosa（受入番号Ｐ２０２６１、Ｐ３２９４６、Ｐ３２９４７、Ｐ３２９４およびＰ３２９４９）由来のリパーゼ、Rhizopus niveus（受入番号Ｐ６１８７１）由来のリパーゼ、Penicillium camemberti（受入番号Ｐ２５２３４）由来のリパーゼ、Aspergillus niger（ＡＢＧ７３６１３、ＡＢＧ７３６１４およびＡＢＧ３７９０６）由来のリパーゼおよびPenicillium cyclopium（受入番号Ｐ６１８６９）由来のリパーゼの群から選択される酵素、ならびに、各場合において、アミノ酸レベルで、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、９８％または９９％相同のものである。相同性に関しては、前述の定義を参照することが可能である。
【００５４】
市販例および同様に本発明による方法で好ましく使用されるカルボキシルエステル加水分解酵素は、商品Lipozyme TL IM、Novozym 435、Lipozyme IM 20、Lipase SP382、Lipase SP525、Lipase SP523、(全てNovozymes A/S, Bagsvaerd, Denmarkの商品)、Chirazyme L2、Chirazyme L5、Chirazyme L8、Chirazyme L9(全てRoche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germanyの商品)、およびLipase M “Amano”、Lipase F-AP 15 “Amano”、Lipase AY “Amano”、Lipase N “Amano”、Lipase R “Amano”、Lipase A “Amano”、Lipase D “Amano”、Lipase G “Amano”(全てAmano, Japanの商品)である。
【００５５】
本生体触媒は、無水物または部分的水和物の形で好ましく使用される。本生体触媒は、固定化されるかまたは凍結乾燥物として使用することができる。固定化のために使用することができる担体は、不活性な有機担体または無機担体である。固定化型酵素に好ましく使用されるかまたは存在する不活性な担体は、粒子の少なくとも９０％が１０〜５０００μｍ、好ましくは５０〜２０００μｍの粒径を有する粒径分布を有する粒状担体である。特に使用することができる有機担体は、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリビニルスチレン、スチレン−ジビニルベンゼンコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ＰＴＦＥおよび／または他のポリマーを含むか、またはこれらから成るものである。固定化すべき酵素に応じて、特に酸性イオン交換樹脂または塩基性イオン交換樹脂、たとえばDuolite A568、Duolite XAD 761、Duolite XAD 1180、Duolite XAD 7HP、Amberlite IR 120、Amberlite IR 400、Amberlite CG 50、Amberlyst 15(全てRohm and Haasの製品)またはLewatit CNP 105およびLewatit VP OC 1600(Lanxess, Leverkusen, Germanyの製品)を、担体材料として使用することができる。使用することができる無機担体は、最新技術で周知の酸化物（oxidic）担体および／またはセラミック担体である。特に使用できる無機担体は、たとえばセライト、沸石、シリカ、細孔制御ガラス（ＣＰＧ）またはたとえば、L. Cao, “Carrier-bound Immobilized Enzymes: Principles, Application and Design”, Wiley-VCH: 2005, Weinheim, Germanyに記載されているもののような他の担体である。固定化型酵素に存在する不活性な担体または固定化型酵素の製造に使用される不活性な担体は、特に好ましくはポリビニルスチレン、ポリメタクリレートまたはポリアクリレートから成る。
【００５６】
本発明によれば、共有結合的または非共有結合的に、好ましくは非共有結合的に、粒子上に固定化することが可能である。非共有結合的固定化の場合、たとえば酵素水溶液（たとえば無機塩または洗浄剤等のさらなる成分を含んでもよい）を用いて、担体をインキュベートするかまたは含浸させる。このインキュベーション／含浸は、たとえば０℃〜５０℃、好ましくは０℃〜４０℃の温度で、実施することができる。このインキュベーション／含浸は、数分から数時間までの期間にわたって好ましく行われる。インキュベーションの進行は、従来の蛋白質測定方法で溶液中の酵素濃度を測定することにより追跡することができる。所望の程度の固定化に到達した後、好ましくは担体を水洗し、必要に応じて乾燥させる。
【００５７】
好適な生体触媒を含む全細胞を、静止細胞としてまたは乾燥型としてのいずれかで、好ましくは先行技術の方法で透過処理して、使用することも可能である。
【００５８】
本発明によれば、使用される基質に対して、０.０１〜３００％（ｗ／ｗ）の量比で、生体触媒を使用することができる。それぞれの反応条件で（特に、基質、それらの濃度、溶剤および反応温度に応じて）、好ましい質量比は、生体触媒の比活性から得られる。こうしたパラメータに応じて、生体触媒の好ましい量は、１〜９６時間、好ましくは８〜２４時間の期間内に、反応物質の完全変換を可能にする量である。生体触媒の量は、前駆体の全質量を基準にして、１〜１００％（ｗ／ｗ）および極めて特に好ましくは１〜５０％（ｗ／ｗ）、特に１〜２０％（ｗ／ｗ）の範囲で、好ましく使用される。
【００５９】
ある特定の実施態様では、この生体触媒は回収される(recovered)。
【００６０】
本発明によれば、酵素反応の開始時に、反応物質は、１：１０〜１０：１というリゾスフィンゴ脂質とカルボキシルエステルとのモル比で存在することが可能である。この関連で、用語「モル比」は、リゾスフィンゴ脂質アミンとアシルドナーカルボキシレート基とのモル比に関する。１：３〜３：１の量比が、好ましく使用される。１：１.４〜１.４：１の量比、とりわけ等モル量比が、特に好ましく使用される。
【００６１】
反応物質は、さらなる溶解剤を含まずに溶融状態で存在してもよく、有機溶剤中に溶解または懸濁されていてもよい。反応は、好ましくは有機溶剤中で実施される。特に適した溶剤は、２０〜１３０℃の範囲内の温度で、反応物質を高濃度で溶解することができるものである。特に適していると証明されている例は、たとえば、メチルイソブチルケトンまたはシクロヘキサノン等のケトン、２−ブチル−１−オクタノール、メチルシクロヘキサノール、１−メトキシ−２−プロパノール、２，３−ブタンジオール２−オクタノール、ジアセトンアルコール、２−メチル−２−ブタノール等の立体障害性二級アルコール、酢酸４−ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキシル、酢酸２−エチルヘキシル、酢酸シクロヘキシル等の立体障害性エステルならびに１，４−ジオキサン、テトラヒドロフランおよびVaronic APM（Evonik Goldschmidt GmbH、Essen、Germany）等のエーテルであるが、こうした溶剤に限定されない。不適当であると証明されている溶剤は、とりわけ生体触媒によるかなり大きい活性で変換されるエステルである。フィトスフィンゴシンを前駆体として用いて、酪酸エチルを使用した反応で、たとえば所望の生成物に加えて、かなりの量の、Ｎ−ブチリルフィトスフィンゴシンと使用したアシルドナー（たとえばステアリン酸メチル）とのエステル交換生成物を検出することができた。同じことが、酢酸ブチルの使用にも当てはまる（Ｎ−アセチルフィトスフィンゴシンとアシルドナーブチルエステルの形成）。
【００６２】
本反応は、カールフィッシャー（Karl Fischer）法で検出される含水量が０.１００Ｍ以下、０.０１０Ｍ以下および特に好ましくは最高でも０.００５Ｍとして定義された無水条件で好ましく実施される。
【００６３】
高基質濃度は、反応速度に特に有利である。変換率が高いと、生成物が高濃度になるが、驚くべきことに、変換率が高いとき、酵素活性に対して悪影響はない。酵素反応では生成物阻害が通常観察されるため、このことは当業者には驚くべきことである。加えて、驚くべきことに、非常に高い変換乃至定量的変換を達成するために、反応生成物（セラミドまたはアルコール）の１つを反応混合物から除去することが、絶対的に必要というわけではないことが分かった。当業者によく知られているLe Chatelierの原理に従えば、このことが本平衡反応に関して予想されたであろう。僅か６７〜７８％という先行技術（国際公開第９４／２６９１９号パンフレット、Gist−Brocades）の反応率が、その必要を予想させることになった。しかし、本発明によれば、より低い基質濃度でも、効率よく反応することが可能である。
【００６４】
本発明の文脈で好ましい反応開始時の反応物質濃度は、各反応物質について、０.０１Ｍ〜３Ｍの範囲内、特に０.２Ｍ〜２Ｍの範囲内、特に好ましくは０.５Ｍ〜１.０Ｍの範囲内である。
【００６５】
反応温度に関して、特に適した温度は、基質が溶剤に均質に溶解する温度であることは分かっていた。これに関連して、２０〜１３０℃の範囲内の反応温度が有利であった。とりわけ高温では、変色のため、反応混合物の注意深い脱気が必要である。しかし、驚くべきことに１００℃以下の反応温度では、この種の用心は無用であることが分かった。したがって、反応温度は、好ましくは４０〜９０℃の範囲内であり、極めて特に好ましくは、７０〜８５℃の範囲内である。
【００６６】
反応は好ましくは、１ｂａｒ未満、好ましくは０.５ｂａｒ未満、特に好ましくは０.０５ｂａｒ未満の圧力で実施される。
【００６７】
この反応は、バッチ方法（撹拌容器）で実施することもでき、または固定床反応器で連続的または半連続的に実施することもできる。高速の生体触媒失活は、とりわけバッチ方法で推定されるものであった。撹拌によって生じる機械的ストレスによる生体触媒の機械的破壊、ならびに反応物質および溶剤に起因する失活作用と対をなす生体触媒の熱失活について留意すべきである。このような作用は当業者に周知であり、また好適な救済策が文献に開示されている。したがって、たとえば生体触媒の機械的疲弊が撹拌方法で起きるのであれば、固定床を使用することにより、これを回避することが可能である。さらなる反応器は、当業者に周知であり、同様に、機械的酵素失活を回避するのに好適である。
【００６８】
さらに、エステルをアシルドナーとして使用するとき、遊離したアルコールによって生体触媒が化学的に失活されることが予想される（たとえば：Y. Yoshida et al., J. Biosci. Bioeng., 2006, 102(1), 66-68）。このような失活を回避する方法は当業者に周知であり、たとえば、蒸留による反応混合物からのアルコール除去や膜方法の使用などがある。しかし、驚くべきことに、上述の方法を使用しなくても、活性を著しく損失せずに生体触媒を何度も再使用できることが分かった。
【００６９】
特に、天然のグリセリドを使用するとき、ジグリセリドおよびモノグリセリドは、少なくとも中間体として反応混合物中に蓄積し、変換が不完全であれば、生成物がかなり汚染されることになるであろうことが予想された。さらに、上述の部分グリセリドは界面活性剤特性を有するため、生体触媒がかなり失活する可能性があることが予想された。しかし、驚くべきことに、予想される部分グリセリドが、実質的に検出されないことが分かった。反応の経過中に、ガスクリマトグラフィ分析で、最大でも微量（＜１％ｗ／ｗ）を検出することが可能であった。
【００７０】
結果として得られる生成物が、スフィンゴ脂質および高比率（全生成物の最高１９％）の対応するＮ，Ｏ−ジアシル化生成物の組成物であることは、先行技術に記載されている全ての方法に共通である。こうした組成物は、たとえば、Ｎ，Ｏ−ジアシル化生成物の比率が５％以上であるため、化粧用組成物に全く使用できない。さらに、本発明による方法では、驚くべきことに、二級アミン官能基のアミド化は、アルコール官能基の１つのエステル化より紛れもなく好ましいことが分かった。反対の挙動、特に、一級、すなわち立体的に容易に近づける、アルコール官能基の選好が予想されたであろう。先行技術（国際公開第９４／２６９１９号パンフレット、Gist−Brocades）は、類似した状況について記している：細菌リパーゼを使用し、アシルドナーがフィトスフィンゴシンより６０％モル過剰であっても、その状況で得られた反応生成物は、かなりの比率のＮ，Ｏ−ジアシル化生成物（モノジアシル化生成物とジアシル化生成物の比率＞１：５）を含んでいた。
【００７１】
それとは反対に、リゾスフィンゴ脂質より３.６倍過剰のアシルドナーを用いても、リゾスフィンゴ脂質が反応混合物中に存在する限り、顕著なジアシル化がないことを、本発明による方法で示すことが可能であった。リゾスフィンゴ脂質が完全にスフィンゴ脂質に変換されていたときに限って、緩徐なエステル化活性を検出することが可能である。リゾスフィンゴ脂質およびアシルドナーを化学量論的に使用したとき、上述の不要な副反応はほとんど認められなかった。
【００７２】
したがって本発明は、酵素反応による粗生成物としてでさえ、特に純粋なＮ−アシルフィトスフィンゴシンが得られる方法に関する。式Ｉで表される標的化合物に関連した変換は、理論的に予想される変換の好ましくは８０％超、特に好ましくは８５％超、および極めて特に好ましくは９０％超である。
【００７３】
本発明による方法はさらに、式Ｉおよび０.００１〜１９質量％、好ましくは０.００５〜１９質量％、特に好ましくは０.０１〜５質量％の、対応するＮ，Ｏ−ジアシル化生成物を含む組成物を調製するのに好適である。
【００７４】
したがって、本発明は同様に、本発明による方法を使用して調製される、式Ｉおよび０.００１〜１９質量％、好ましくは０.００５〜１９質量％、特に好ましくは０.０１〜５質量％の、対応するＮ，Ｏ−ジアシル化生成物を含む組成物に関する。
【００７５】
本発明は同様に、本発明による方法を使用して調製されるスフィンゴ脂質に関する。
【００７６】
本発明はさらに、スフィンゴ脂質を反応混合物から分離する方法に関する。スフィンゴ脂質は好都合な物理的性質を有するため、スフィンゴ脂質は結晶化／沈殿により反応溶液から容易に除去することができ、したがって、既に高い粗生成物の純度を、簡単な方法でさらに高めることができる。
【００７７】
スフィンゴ脂質および本発明による組成物は、化粧用製剤および医薬製剤の製造に特に適する。したがって本発明は同様に、本発明による少なくとも１つのスフィンゴ脂質および／または本発明による１つの組成物を含む、化粧用製剤または医薬製剤に関する。
【００７８】
本発明を、以下に詳述する実施例において例として説明するが、本発明は、実施例で言及されている実施態様に限定されることは意図されず、その適用範囲は完全な記述および特許請求の範囲から明白である。
【実施例】
【００７９】
実施例１：アシルドナーとしてのトリステアリン
トリステアリン酸グリセロール（トリステアリン）をアシルドナーとして使用して、酵素反応を実施した。８０℃で、ジオキサン１７ｇ中にフィトスフィンゴシン５.４ｇおよびトリステアリン５ｇを含む溶液に、Novozym 435  ０.５ｇを加え、大気圧下で撹拌した。試料を定期的に採取し、ガスクロマトグラフィで分析した。
【００８０】
この実験は、定性的に同じ反応経過を示すさらなるグリセリドの使用の代表であり、とりわけ、中間体部分グリセリドは検出不能であることが観察される。
【００８１】
図１から明らかなように、アシルドナーの完全変換は可能である。驚くべきことに、中間体部分グリセリド（ジステアリン酸グリセロールまたはモノステアリン酸グリセロール）はほとんど確認されないことが、ガスクロマトグラフィによる分析から明らかになった。
【００８２】
実施例２：フィトスフィンゴシンと天然油との酵素反応
いずれの場合にも、２−メチル−２−ブタノール８.５ｇに、フィトスフィンゴシン５ｇを溶解し、１当量（等モル比のフィトスフィンゴシンとカルボキシレート量）の天然油を加える。油の初期比重は、その油の鹸化価から導かれる；それから算出されるカルボキシレートの量は、バッチ数量を計算するのに役立つ。いずれの場合にも、Novozym 435  ０.７５gを加えた後、その反応混合物を８０℃、Ｎ２雰囲気で、２４時間撹拌する。次いで、この反応混合物を熱濾過し、溶剤を真空除去する。結果として生じる生成物をガスクロマトグラフィで分析する；加えて、ヨウ素価および（ハーゼン）色数を測定する。いずれの生成物でも、＞１％  ｗ／ｗの部分グリセリド類は検出されなかった。
【００８３】
【表１】
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【００８４】
実施例３：スフィンゴシンの使用
スフィンゴシン３ｇを、２−メチル−２−ブタノール５ｇに溶解し、１当量のアマニ油（鹸化価により決定されるカルボキシレートの量）を加える。Novozym 435  ０.５ｇを加えた後、この反応混合物を、８０℃、窒素雰囲気で２４時間撹拌する。次いでこの混合物を熱濾過し、溶剤を減圧除去する。このようにして得られた生成物を、ガスクロマトグラフィで分析する。検出可能な微量のモノグリセリドまたはジグリセリドを含まない９８.０％という変換が達成される。
【００８５】
実施例４：スフィンガニンの使用
スフィンガニン３ｇを２−メチル−２−ブタノール５ｇに溶解し、１当量のアマニ油（鹸化価により決定されるカルボキシレートの量）を加える。Novozym 435  ０.５ｇを加えた後、この反応混合物を、８０℃、窒素雰囲気で２４時間撹拌する。次いでこの混合物を熱濾過し、溶剤を減圧除去する。このようにして得られた生成物を、ガスクロマトグラフィで分析する。変換は９９.７％であり、検出可能な微量のモノグリセリドおよびジグリセリドを含まない。