(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定したポリマー粒子であって、各ポリマー粒子が、直径が５００ｎｍ〜１００μｍの範囲内のサイズを有するよう形成され、該ポリマー粒子は、
（ａ）水媒体中で１０〜９０℃の下限臨界共溶温度を示す１つ以上のポリマーである表面処理界面活性剤の存在下で行われる乳化法、拡散法及び蒸着法から選択される方法で得られるポリマー粒子であって、重合可能なアルキレングリコールアクリレートモノマーと重合可能なアルキレングリコールメタクリレートモノマーとから選択される１つ以上のモノマーの重合生成物であるか、あるいは、
（ｂ）生分解性ポリマーコアと熱応答性生体適合性コポリマーコロナを有するポリマー粒子であって、
前記コポリマーは、水媒体中で１０〜９０℃の下限臨界共溶温度を示すポリマーであり、
前記ポリマーは、重合可能なアルキレングリコールアクリレートモノマーと重合可能なアルキレングリコールメタクリレートモノマーから選択される１つ以上のモノマーの重合生成物である、
ポリマー粒子。
【請求項２】
前記ポリマーは、重合可能なアルキレングリコールアクリレートモノマーと重合可能なアルキレングリコールメタクリレートモノマーから選択される２つ以上のモノマーの重合生成物である、請求項１に記載のポリマー粒子。
【請求項３】
前記ポリマーは、重合可能なアルキレングリコールアクリレートモノマーと重合可能なアルキレングリコールメタクリレートモノマーから選択される２つ以上のモノマーの重合生成物であって、
前記重合可能なアルキレングリコールアクリレートモノマーと重合可能なアルキレングリコールメタクリレートモノマーは、ジ（エチレングリコール）−アクリレート、オリゴ（エチレングリコール）−アクリレート、ポリ（エチレングリコール）−アクリレート、ジ（エチレングリコール）−メタクリレート、オリゴ（エチレングリコール）−メタクリレート、ポリ（エチレングリコール）−メタクリレート、ポリ（プロピレングリコール）−アクリレート、及びポリ（プロピレングリコール）−メタクリレートから選択される、請求項２に記載のポリマー粒子。
【請求項４】
前記ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭＡ）とポリ（プロピレングリコール）メタクリレート（ＰＰＧＭＡ）との重合生成物である、請求項３に記載のポリマー粒子。
【請求項５】
前記ポリマー粒子は、直径が５００ｎｍ〜５μｍの安定したポリマー粒子である、請求項１〜４の何れか１項に記載のポリマー粒子。
【請求項６】
前記ポリマー粒子は、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、ポリ（乳酸）及びポリ（グリコール酸）から選択される生分解性ポリマーのバルク相又はコアを有する、請求項１から５の何れか１項に記載のポリマー粒子。
【請求項７】
前記ポリマーは、２５〜７５ｋＤａのモル質量を有し、該ポリマーの多分散性（Ｍｗ／Ｍｎ）指数は１〜２．５である、請求項１〜６の何れか１項に記載のポリマー粒子。
【請求項８】
前記ポリマー粒子は、そのバルク相又はコア内に、香味剤、芳香剤、小分子薬剤及び生物薬剤、並びに、組織成長、臓器修復及び再生医療のための緩効性成長因子およびその他の可溶性分子から選択される活性成分を含む、請求項１〜７の何れか１項に記載のポリマー粒子。
【請求項９】
放出制御用途、あるいは、細胞支持体マトリックスとして使用される、請求項１〜８の何れか１項に記載のポリマー粒子。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れか１項に記載のポリマー粒子と、生体材料とを含む生成物。
【請求項１１】
前記生体材料は細胞である、請求項１０に記載の生成物。
【請求項１２】
請求項１〜９の何れか１項に記載のポリマー粒子を含む細胞支持体マトリックス。
【請求項１３】
３７℃以下の温度で、（ｉ）細胞と、（ｉｉ）請求項１〜９の何れか１項に記載のポリマー粒子を含む、流動性懸濁液。
【請求項１４】
体温で、（ｉ）細胞と、（ｉｉ）請求項１〜９の何れか１項に記載のポリマー粒子を含む、細胞増殖を支持する空間充填型ゲル。
【請求項１５】
ポリマー粒子の調製方法であって、
前記ポリマー粒子は、安定したポリマー粒子であって、各ポリマー粒子が、直径が５００ｎｍ〜１００μｍの範囲内のサイズを有するよう形成されており、
−水媒体中で１０〜９０℃の下限臨界共溶温度を示すポリマーである１つ以上のポリマーであって、重合可能なアルキレングリコールアクリレートモノマーと重合可能なアルキレングリコールメタクリレートモノマーとから選択される１つ以上のモノマーの重合生成物であるポリマーを提供すること、及び、
−乳化法、拡散法及び蒸着法から選択される方法により、５００ｎｍ〜１００μｍの直径を有するポリマー粒子を調製するために、表面処理界面活性剤として前記ポリマーを反応混合物に添加すること、
を含む方法。
【請求項１６】
前記ポリマーは、重合可能なアルキレングリコールアクリレートモノマーと重合可能なアルキレングリコールメタクリレートモノマーから選択される２つ以上のモノマーの重合生成物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリマーは、重合可能なアルキレングリコールアクリレートモノマーと重合可能なアルキレングリコールメタクリレートモノマーから選択される２つ以上のモノマーの重合生成物であって、
前記重合可能なアルキレングリコールアクリレートモノマーと重合可能なアルキレングリコールメタクリレートモノマーは、ジ（エチレングリコール）−アクリレート、オリゴ（エチレングリコール）−アクリレート、ポリ（エチレングリコール）−アクリレート、ジ（エチレングリコール）−メタクリレート、オリゴ（エチレングリコール）−メタクリレート、ポリ（エチレングリコール）−メタクリレート、ポリ（プロピレングリコール）−アクリレート、及びポリ（プロピレングリコール）−メタクリレートから選択される、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭＡ）とポリ（プロピレングリコール）メタクリレート（ＰＰＧＭＡ）との重合生成物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリマー粒子は、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、ポリ（乳酸）及びポリ（グリコール酸）から選択される生分解性ポリマーのバルク相又はコアを有する、請求項１５〜１８の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリマーは、２５〜７５ｋＤａのモル質量を有し、該ポリマーの多分散性（Ｍｗ／Ｍｎ）指数は１〜２．５である、請求項１５〜１９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリマー粒子は、そのバルク相又はコア内に、香味剤、芳香剤、小分子薬剤及び生物薬剤、並びに、組織成長、臓器修復及び再生医療のための緩効性成長因子およびその他の可溶性分子から選択される活性成分を含む、請求項１５〜２０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２】
水媒体中で１０〜９０℃の下限臨界共溶温度を示すコポリマーであって、重合可能なアルキレングリコールアクリレートモノマーと重合可能なアルキレングリコールメタクリレートモノマーとから選択される２つ以上のモノマーの重合生成物であるコポリマーであり、
前記重合可能なアルキレングリコールアクリレートモノマーと重合可能なアルキレングリコールメタクリレートモノマーは、ジ（エチレングリコール）−アクリレート、オリゴ（エチレングリコール）−アクリレート、ポリ（エチレングリコール）−アクリレート、ジ（エチレングリコール）−メタクリレート、オリゴ（エチレングリコール）−メタクリレート、ポリ（エチレングリコール）−メタクリレート、ポリ（プロピレングリコール）−アクリレート、及びポリ（プロピレングリコール）−メタクリレートから選択される、コポリマー。
【請求項２３】
前記コポリマーは、ポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭＡ）とポリ（プロピレングリコール）メタクリレート（ＰＰＧＭＡ）との重合生成物である、請求項２２に記載のコポリマー。
【請求項２４】
前記コポリマーは、２５〜７５ｋＤａのモル質量を有し、該ポリマーの多分散性（Ｍｗ／Ｍｎ）指数は１〜２．５である、請求項２２または２３に記載のコポリマー。
【請求項２５】
水媒体中で１０〜９０℃の下限臨界共溶温度を示すコポリマーの調製方法であって、重合可能なアルキレングリコールアクリレートモノマーと重合可能なアルキレングリコールメタクリレートモノマーとから選択される２つ以上のモノマーを重合反応でのモノマーとして使用することを含み、
前記重合可能なアルキレングリコールアクリレートモノマーと重合可能なアルキレングリコールメタクリレートモノマーは、ジ（エチレングリコール）−アクリレート、オリゴ（エチレングリコール）−アクリレート、ポリ（エチレングリコール）−アクリレート、ジ（エチレングリコール）−メタクリレート、オリゴ（エチレングリコール）−メタクリレート、ポリ（エチレングリコール）−メタクリレート、ポリ（プロピレングリコール）−アクリレート、及びポリ（プロピレングリコール）−メタクリレートから選択される、方法。
【請求項２６】
使用する重合技術は、フリーラジカル法及び制御フリーラジカル法から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記モノマーは、ポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭＡ）とポリ（プロピレングリコール）メタクリレート（ＰＰＧＭＡ）である、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
乳化法、拡散法及び蒸着法から選択される方法によるポリマー粒子の調製方法であって、
表面処理界面活性剤として、請求項２２に記載のコポリマーの単一での又は組み合わせての使用を含む、方法。
【請求項２９】
３７℃以下の温度では細胞とともに分散して流動性懸濁液を形成し、体温では細胞増殖を支持する空間充填型ゲルを形成する微粒子を調製する調製方法であって、
請求項２２に記載のコポリマーの単一での又は組み合わせての使用を含む、方法。
【請求項３０】
粒子調製中に生分解性ポリマー球体の表面内に分配し、これにより、高度に制御可能なコロイド安定性及び生体材料特性を有する微粒子を生成する方法であって、
請求項２２に記載のコポリマーの単一での又は組み合わせての使用を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、安定化したポリマー粒子、及び放出制御用途での前記ポリマー粒子の使用に関する。このポリマー粒子は、細胞送達用として使用してもよく、例えば細胞支持体マトリックスとして使用してもよい。この安定したポリマー粒子は、ＬＣＳＴポリマーを使って調製される。このようなＬＣＳＴポリマー（水媒体中で１０〜９０℃の下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）を示すポリマー）及びその製造プロセスについても述べる。
【０００２】
新しい分野である再生医療は、臨床現場での使いやすさを保ちながら細胞を標的部位に送達する能力と細胞増殖を支持する能力を併せ持つ材料に依存している。担体を用いずに体内に細胞懸濁液を直接注射すれば、細胞の生存率が犠牲になると同時に、組織再生の開始条件が悪化し、非効率的である。
【０００３】
細胞送達材料は、室温で細胞と配合（ｆｏｒｍｕｌａｔｅ）可能であるが、体内に細胞と同時注入した場合は生体内原位置で凝集し、細胞を保護して組織成長を促進する多孔質ゲルを形成することが求められる。
【０００４】
熱応答性ポリマー（即ち、熱の刺激に反応して立体構造や相の変化を起こす材料）は、現在では３７℃近辺で相転移を起こす多くのポリマーが入手可能なため、組織工学の用途で特に注目されてきた。ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡｍ）は、このような種類のポリマーとして最も広く研究されてきたが、現在のところ臨床用としてＦＤＡから認可されていない。
【０００５】
あるポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキサイド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ）コポリマーは、水中で逆熱ゲル化挙動を示し、下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）を超える温度まで加熱されると半固体ゲルを形成する。また、ベースポリマーであるＰＥＯ及びＰＰＯは生体適合性であるため、医薬業界で使用されている。このような挙動を示す他の材料として、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）や、ポリ（ラクチド）−（ＰＬＡ）ブロックコポリマー（例えば、ＰＥＯ−ＰＣＬ−ＰＥＯ）が挙げられる。
【０００６】
しかし、このようなポリマーから形成されるゲルは、細胞足場／細胞送達用として使用するには機械的に不安定であるか、又は体内導入時に安定したゲルを形成するために必要な濃度が高すぎて実際の使用には向いていない。
【０００７】
このような問題は、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、第１２７巻、１６８９２−１６８９９頁（２００５）（Ｊｏｒａｌｅｍｏｎら）に記載のように、架橋性のコア又はシェルを有するミセル形成ポリマーを調製することによって解決することが試みられている。
【０００８】
応答性表面を有する安定した粒子を生成することも可能であるが、その合成は手間がかかり、また、毒物学的に受容可能であるとは見なされないモノマー又は架橋剤を必要とする。例えば、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  第２０巻、１０８０９−１０８１７頁（２００４）（Ｈａｌｅｓら）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  第１２７巻、７３０４−７３０５頁（２００５）（Ｆｕｊｉｉら）、及びＬａｎｇｍｕｉｒ  第２１巻、３８０８−３８１３頁（２００５）（Ｐｉｌｏｎら）を参照されたい。
【０００９】
表面における熱応答性ポリマーの自己集合化凝集塊（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）は、シリカ及び金粒子から調製した。Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  第３８巻、９８１３−９８２０頁（２００５）（Ｚｈａｎｇら）、及びＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  第２０６巻、１９４１−１９４６頁（２００５）（Ｋｉｍ，Ｄ．Ｊ．ら）を参照。
【００１０】
しかし、今日までのところ、生体適合性熱応答性ポリマーを表面処理して生分解性粒子を形成し、多孔性の細胞−ポリマー複合体ゲルを生成したという報告はなされていない。
本発明では、容易に調製できる新しい表面処理された「スマート」微粒子を提供する。この微粒子は、３７℃以下の温度では細胞と共に分散して流動性懸濁液を形成し、体温では細胞増殖を支持する空間充填型ゲルを形成する。このような微粒子は、新規な生体適合性熱応答性ポリマーを含む。このようなポリマーは、粒子調製中に生分解性ポリマー球体の表面に分配されることで、単純な単一工程手順で高度に制御可能なコロイド安定性と生体材料特性を有する微粒子が生成され得るよう設計される。
【００１１】
従って、本発明は、新規な生体適合性熱応答性ポリマーの合成にも関与する。具体的には、本発明は、体温より僅かに低い温度では鎖延長され且つ高い水溶性を示すが、３７℃では不溶性である、生体適合性両親媒性コポリマーの合成を提供する。上記のような特徴のため、このポリマーは、第一条件下ではコロイド粒子を安定化するが、第二条件下ではコロイド粒子を凝集する機能を有し得る。
【００１２】
生分解性ポリマーコア及び特別に設計された熱応答性生体適合性コポリマーコロナを有する表面処理された微粒子を、単純なワンポット手順で製造することができる。これらの粒子は、３７℃以下で流動性懸濁液を形成し得るが、３７℃を超えるとコポリマーコロナの鎖崩壊により可逆的に多孔性空間充填型ゲルを形成し得る。従って、これらの粒子は、３７℃未満で生体材料と混合し、その後体温で安定したカプセル化ゲルを形成し得る。この安定したカプセル化ゲルはそのゲル内で細胞増殖を支持し得る。
【００１３】
調製の容易性、スケールアップの可能性、及び制御合成により可能となるコポリマーコロナ層の幅広いバリエーションの組み合わせにより、上記システムは新しいタイプの生物学的送達媒体及び組織成長支持体として期待できる。
【００１４】
本発明は、とりわけ、スマート粒子、上記材料の製造プロセス、及び細胞支持体マトリックスとしてのスマート粒子の使用を提供する。
（発明の要旨）
本発明は、第１局面において、水媒体中で１０〜９０℃の下限臨界共溶温度を示すポリマーの調製方法を提供する。本方法は、重合可能なアルキレングリコールアクリレートモノマー及び重合可能なアルキレングリコールメタクリレートモノマーから選択される１つ以上のモノマーを重合反応のモノマーとして使用することを含む。
【００１５】
下限臨界共溶温度は、ＬＣＳＴ又は逆溶解温度関係と呼んでもよい。ＬＣＳＴは、Ｂｅｃｋｍａｎ製ＤＵ−６４０分光光度計内で１．０℃．ｍｉｎ-1で加熱することにより決定してもよい。この場合、５５０ｎｍで吸光度が急激な上昇を開始した温度をＬＣＳＴとする。
【００１６】
上記方法は、
重合可能なアルキレングリコールアクリレートモノマーと重合可能なアルキレングリコールメタクリレートモノマーから選択される１つ以上のモノマーを提供する工程と、
モノマーの重合を行い、水媒体中の下限臨界共溶温度が１０〜９０℃のポリマーを生成する工程と、を含む。
【００１７】
従って、本発明の進歩性において重要となるのは、水媒体中の下限臨界共溶温度が１０〜９０℃で変化するようなポリマーを生成するため、重合可能なアルキレングリコールアクリレートモノマーとアルキレングリコールメタクリレートモノマーを、単一で又は様々な組み合わせで使用することである。
【００１８】
重合可能なアルキレングリコールアクリレートモノマーと重合可能なアルキレングリコールメタクリレートモノマーは、ジ（エチレングリコール）−アクリレート、オリゴ（エチレングリコール）−アクリレート、ポリ（エチレングリコール）−アクリレート、ジ（エチレングリコール）−メタクリレート、オリゴ（エチレングリコール）−メタクリレート、ポリ（エチレングリコール）−メタクリレート、ポリ（プロピレングリコール）−アクリレート、及びポリ（プロピレングリコール）−メタクリレートから、単一で又は様々な組み合わせで選択されてもよい。
【００１９】
１つの実施形態では、２つのモノマーを組み合わせて使用する。即ち、得られるポリマーはコポリマーである。例えば、上記方法は、ポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭＡ）とポリ（プロピレングリコール）メタクリレート（ＰＰＧＭＡ）の重合を含み得る。１つの実施形態では、ＰＥＧＭＡのＭｎは約４７５、ＰＰＧＭＡのＭｎは約４３０であってもよい。
【００２０】
本発明の方法では、ポリマー材料を生成するために任意の重合技術を使用することができる。特に好ましいのは、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）を非限定的に含む、フリーラジカル法及び制御フリーラジカル法である。
【００２１】
生成されるポリマー中のモノマー単位の組み合わせを無作為にすること、又は制御することができることで、モノマーの任意の組み合わせで配列特異的ブロックコポリマーが製造される。
【００２２】
出発モノマー（特にそのモル質量）の選択及び重合条件を制御して、生成されるポリマーのモル質量を変化させることができる。生成されるポリマーのモル質量は、１〜１０００ｋＤａ超までの範囲で変化させることができる。好ましくは、生物医学的用途では、ポリマーのモル質量は２５〜７５ｋＤａ、多分散性（Ｍｗ／Ｍｎ）指数は１〜２．５である。
【００２３】
また、本発明は、第２局面において、第１局面の方法により得られる、水媒体中で１０〜９０℃の下限臨界共溶温度を示すポリマーを提供する。
従って、本発明は、重合可能なアルキレングリコールアクリレートモノマーと重合可能なアルキレングリコールメタクリレートモノマーから選択される１つ以上のモノマーの重合生成物である、水媒体中で１０〜９０℃の下限臨界共溶温度を示すポリマーを提供する。
【００２４】
上記ポリマーは、無作為の、又は制御された、配列特異的ブロックコポリマーであり得る。
上記ポリマーのモル質量は、１〜１０００ｋＤａ超であり得る。好ましくは、生物医学的用途では、上記ポリマーのモル質量は２５〜７５ｋＤａ、多分散性（Ｍｗ／Ｍｎ）指数は１〜２．５である。
【００２５】
上記ポリマーは、ジ（エチレングリコール）−アクリレート、オリゴ（エチレングリコール）−アクリレート、ポリ（エチレングリコール）−アクリレート、ジ（エチレングリコール）−メタクリレート、オリゴ（エチレングリコール）−メタクリレート、ポリ（エチレングリコール）−メタクリレート、ポリ（プロピレングリコール）−アクリレート、及びポリ（プロピレングリコール）−メタクリレートから、単一で又は様々な組み合わせで選択される１つ以上のモノマーの重合生成物であってもよい。
【００２６】
１つの実施形態では、上記ポリマーは、２つのモノマーの重合生成物、即ちコポリマーである。例えば、上記ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭＡ）とポリ（プロピレングリコール）メタクリレート（ＰＰＧＭＡ）の重合生成物であってもよい。１つの実施形態では、ＰＥＧＭＡのＭｎは約４７５、ＰＰＧＭＡのＭｎは約４３０であってもよい。ＰＥＧＡＭ−ＰＰＧＭＡコポリマーのＭｎは約１５，５００であってもよい。
【００２７】
本発明のポリマーは、以下においては、ＬＣＳＴポリマーと称されてもよい。
上記ポリマーは、適切には、体温直下の温度では鎖延長し高い水溶性を示すが、３７℃では不溶性である、生体適合性両親媒性コポリマーである。このように、本ポリマーは、第一条件下ではコロイド粒子を安定化するが第二条件下では粒子を凝集する機能を有し得る。
【００２８】
従って、本発明は、第３局面において、乳化法、拡散法及び蒸着法から選択される方法でポリマー粒子を調製する際の表面処理界面活性剤として、第２局面のポリマーを単一で又は組み合わせて使用することを提供する。
【００２９】
従って、本発明は、第４局面において、
−第２局面による１つ以上のポリマーを提供すること、及び
−乳化法、拡散法及び蒸着法から選択される方法でポリマー粒子を調製するための反応混合物に、表面処理界面活性剤として上記ポリマーを添加すること、
を含むポリマー粒子調製方法もさらに提供する。
【００３０】
また、本発明は、第５局面において、第４局面の方法で得られるポリマー粒子を提供する。
従って、本発明は、第２局面による１つ以上のポリマーである表面処理界面活性剤の存在下で行われる乳化法、拡散法及び蒸着法から選択される方法で得られるポリマー粒子を提供する。
【００３１】
本発明は、生分解性ポリマーコアと熱応答性生体適合性コポリマーコロナを有するポリマー粒子を提供する。この場合、本コポリマーは第２局面によるポリマーである。
本発明のポリマー粒子は、任意の有機組成物のバルク相／コアを有し得るが、特に好ましいのはポリ乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）又はその成分であるホモポリマー等の生分解性ポリマーである。従って、本発明のポリマー粒子は、ポリ乳酸−コ−グリコール酸、ポリ（乳酸）又はポリグリコール酸のバルク相／コアを有することが好ましい。
【００３２】
ＰＬＧＡを用いた乳化／拡散／蒸着合成手順中にＬＣＳＴポリマーを使用することにより、直径が１００ｎｍ〜１００μｍの安定したポリマー粒子が形成される。生物医学的用途において最も好ましい直径は、５００ｎｍ〜５μｍである。
【００３３】
従って、１つの実施形態では、ＰＬＧＡのバルク相／コアを有し、且つ第２局面による１つ以上のポリマーである表面処理界面活性剤の存在下で行われる乳化法、拡散法及び蒸着法から選択される方法により得られる、ポリマー粒子が提供される。
【００３４】
１つの実施形態では、本発明は、生分解性ポリマーコアと熱応答性生体適合性コポリマーコロナを有するポリマー粒子を提供する。この場合、生分解性ポリマーコアはＰＬＧＡであり、コポリマーはＰＥＧＭＡ及びＰＰＧＭＡの重合生成物である。
【００３５】
進歩性において重要となる局面は、水媒体中においてそのＬＣＳＴ以下でバルクポリマー粒子を立体的に安定化するがＬＣＳＴを超えると安定性の低下を示すＬＣＳＴポリマーの能力である。
【００３６】
従って、第５局面によるポリマー粒子は、第２局面のポリマーのＬＣＳＴ以下の温度では安定化するが第２局面のポリマーのＬＣＳＴを超える温度では安定性が低下するという点で、驚くべき利点を発揮する。この変化は、ＬＣＳＴポリマー及びＬＣＳＴポリマーの組み合わせとバルクポリマー粒子とを結合／解離する誘因として、利用することができる。
【００３７】
本発明は、ＬＣＳＴポリマーの立体安定性に変化を起こすために温度の変化を利用することについて主に説明されているが、ＬＣＳＴポリマーのＬＣＳＴは、粒子が存在する溶液の他の特性に従って変化し得る。例えば、ＬＣＳＴは、イオン強度、電界、ｐＨ、溶媒組成、及び共溶媒として用いられる任意の薬剤に影響され得る。ＬＣＳＴポリマーの下限臨界共溶温度を変える要因は様々であり、そのためＬＣＳＴポリマーの立体安定性が変化し、さらに第５局面のポリマー粒子の安定性が変化し得る。
【００３８】
このように、下限臨界共溶温度に影響する溶媒特性、即ち液体又は液体混合物の溶質溶解能力、の任意の変化を、ＬＣＳＴポリマー及びＬＣＳＴポリマーの組み合わせと粒子とを結合／解離する誘因として、利用することができると考えることができる。
【００３９】
従って、本発明は、溶液／懸濁液から可逆的に結合し得るポリマー粒子、及び生物医学分野における前記ポリマー粒子の用途に関する。
本発明の主な用途は、香味／芳香放出等の放出制御、及び特に生物医学分野である。ポリマー粒子バルクは、活性物質を取り込み得る。この活性物質は、生物医学的用途では、従来の薬物送達用の小分子薬剤及び生物薬剤、又は、組織成長、臓器修復及び再生医療のための緩効性成長因子およびその他の可溶性分子であろう。
【００４０】
従って、本発明のポリマー粒子は、香味剤、芳香剤、小分子薬剤及び生物薬剤、並びに、組織成長、臓器修復及び再生医療のための緩効性成長因子等の可溶性分子から選択される活性成分を含んでもよい。これらの活性成分は、適切には、ポリマー粒子バルクに取り込まれる。
【００４１】
実施された例では、粒子のバルクに取り込まれる活性物質の例として蛍光ラベルが挙げられるが、生物医学的用途では、従来の薬物送達用小分子薬剤及び生物薬剤、又は緩効性成長因子等の組織成長のための可溶性分子が挙げられよう。
【００４２】
従って、第６局面において、本発明は、放出制御用途における第５局面のポリマー粒子の使用を提供する。
上記用途は、例えば、香味放出用途、芳香放出用途、及び従来の薬物送達用途等の生物医学的用途から選択されてもよい。詳細には、上記用途は、従来の薬物送達用の小分子薬剤又は生物薬剤の放出、あるいは、組織成長、臓器修復及び再生医療のための緩効性成長因子等の可溶性分子の放出に関与してもよい。
【００４３】
粒子は、３７℃以下の温度では細胞又は他の生体材料と共に分散して流動性懸濁液を形成し、体温では細胞増殖を支持する空間充填型ゲルを形成してもよい。
従って、第７局面において、本発明は、第５局面のポリマー粒子と細胞等の生体材料を含む生成物を提供する。
【００４４】
このような生成物は、第２局面のポリマーの下限臨界共溶温度以下では分散物となる。従って、最初は流動性懸濁液として提供されてもよい。
かかる生成物を用いて、第２局面のポリマーの下限臨界共溶温度を超えた場合には細胞等の生体材料をカプセル化することができる。前記生成物は、かかる温度では、細胞等の生体材料の成長を支持する空間充填型ゲルを形成する。
【００４５】
好ましくは、第２局面のポリマーの下限臨界共溶温度は、体温直下の温度である。そうすれば、生成物は、室温では分散物となり、体温ではゲルとなる。
本質的に、粒子とともに細胞が提供される場合、粒子は細胞増殖中に細胞のための多孔性繭（ｃｏｃｏｏｎ）を形成し得る。これにより、細胞と細胞の接触を促進し組織生成の拡大を助長し得るマトリックス構造が生成される。
【００４６】
従って、本発明のポリマー粒子は、コロイド性細胞送達システムと見なすことができる。
また、本発明は、第８局面において、細胞支持体マトリックスとしての第５局面のポリマー粒子の使用を提供する。
【００４７】
また、本発明は、第９局面において、第５局面のポリマー粒子を含む細胞支持体マトリックスを提供する。
また、本発明は、第１０局面において、３７℃以下の温度で（ｉ）細胞と（ｉｉ）第５局面のポリマー粒子を含む流動性懸濁液を提供する。
【００４８】
また、本発明は、第１１局面において、体温で（ｉ）細胞と（ｉｉ）第５局面のポリマー粒子を含む細胞増殖を支持する空間充填型ゲルを提供する。
また、本発明は、３７℃以下の温度では細胞と共に分散して流動性懸濁液を形成し、体温では細胞増殖を支持する空間充填型ゲルを形成する微粒子を調製するために、第２局面のポリマーを単一で又は組み合わせて使用することを提供する。
【００４９】
また、本発明は、粒子調製中に生分解性ポリマー球体の表面に分配するために、第２局面のポリマーを単一で又は組み合わせて使用することを提供する。従って、高度に制御可能なコロイド安定性及び生体材料特性を有する微粒子が生成される。
【００５０】
図１は、本発明の概念を例示している。
図１の（ａ）は、微粒子の立体安定化の基礎をなす概念を示している。即ち、水和ＰＥＧＭＡ−コ−ＰＰＧＭＡコロナの鎖延長により、粒子間引力が支配的になることが回避される。図１の（ｂ）では、ＬＣＳＴを超えた温度では、ＰＥＧＭＡ−コ−ＰＰＧＭＡ層は崩壊してコロイド安定性が減少し、粒子間の引力相互作用により凝集している様子がわかる。
【００５１】
ＬＣＳＴ以下での粒子と細胞の分散物への本概念の拡張が図１の（ｃ）に示されている。ＬＣＳＴを超えると、図１の（ｄ）に示されているように細胞のカプセル化が生じる。
本発明において、調製が簡単で、十分に制御された熱応答性挙動を示し、且つ生体適合性及び生分解性を有する、表面処理されたスマート粒子が提供される。このような材料により、細胞送達及び組織工学の用途で数多くの可能性が提供される。
【００５２】
例えば、最初の重合でコモノマーを改質することによりＬＣＳＴポリマーの界面化学を制御して、本質的に生物模倣型の機能及び反応を追加することが可能となるであろう。これには、ＰＬＧＡ分解の調節を助ける酸塩基反応、又は細胞外マトリックスの重要な特徴を模倣する生体接着機能が含まれるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】コロイド性の細胞送達システムとして機能し得る本発明のポリマー粒子の概略図である。
【図２】熱応答性生分解性微粒子である本発明のポリマー粒子の合成及び特性を例示している。
【図３】本発明のポリマー粒子から形成されたコロイド性懸濁液及び熱可逆性ゲルの構造・プローブ分析（ｔｅｘｔｕｒｅ  ｐｒｏｂｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を示している。
【図４】本発明のポリマー粒子による生体内原位置での細胞のカプセル化、及び本発明のポリマー粒子からの組織足場の形成を示している。
【図５】本発明のＬＣＳＴポリマーであるコポリマーＰＥＧＭＡ−コ−ＰＰＧＭＡ（２５／７５）のＨ  ＮＭＲスペクトルを示している。
【図６】本発明によるＰＬＧＡ微粒子の典型的な粒径を示している。
【図７】一軸圧縮試験に使用される装置を示している。
【図８】Ａは本発明のポリマー粒子のマイクロＣＴ回転スキャン、Ｂは本発明のポリマー粒子のマイクロＣＴ再構成スキャンを示している。
【図９】様々な環境での本発明のＬＣＳＴポリマーの特徴を示している。
【図１０】本発明のＬＣＳＴポリマーであるコポリマーＰＥＧＭＡ−ＰＰＧＭＡ（２５／７５）水溶液について、ＤＬＳによって観察された相転移を示している。
【図１１】本発明によるＰＬＧＡ微粒子の２０〜４５℃のレオロジー・データを示している。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
〔発明の詳細な説明〕
本発明の実施例は、以下のように調製された。
＜材料＞
使用材料は以下の通りであった。
−ＰＬＧＡ（モル比７５／２５のラクチド／グリコリド、分子量Ｍｎ＝１２，０００、ＰＤＩ＝１．５０）をアストラゼネカ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）社から購入し、供給されている通りに使用した。
−ポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭＡ、Ｍｎ＝４７５、Ａｌｄｒｉｃｈ社製）とポリ（プロピレングリコール）メタクリレート（ＰＰＧＭＡ、Ｍｎ＝４３０、Ａｌｄｒｉｃｈ社製）の共重合により、後述するように、ポリマー（界面活性剤−コポリマー又はＬＣＳＴポリマー）ＰＥＧＭＡ−コ−ＰＰＧＭＡ（ＰＥＧＭＡ／ＰＰＧＭＡ＝２５：７５、分子量Ｍｎ＝１５，５００、ＰＤＩ＝１．６１）を調製した。
−酢酸エチル、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）及び１−ドデカンチオールは、Ａｌｄｒｉｃｈ社製の分析グレードのものであり、供給されている通りに使用した。
−臭化銅（Ｉ）（Ａｌｄｒｉｃｈ社製、９８％）及び塩化銅（Ｉ）（Ａｃｒｏｓ社製、９５％）は、いかなる可溶性の酸化種も除去するため、氷酢酸で洗浄し、濾過し、エタノールで洗浄し、乾燥した。
【００５５】
＜方法＞
１．ＬＣＳＴコポリマー：ＰＥＧＭＡ−コ−ＰＰＧＭＡの調製
ａ）従来のフリーラジカル重合
三方活栓に取り付けた丸底フラスコに、脱酸素ブタノン（ｄｅｏｘｙｇｅｎａｔｅｄ  ｂｕｔａｎｏｎｅ）（３０ｍｌ）中ＡＩＢＮ（０．９５７ｇ、６．１ミリモル）、ＰＥＧＭＡ（５．５３２ｇ、１１．６ミリモル）、ＰＰＧＭＡ（１５ｇ、３４．９ミリモル）及び１−ドデカンチオール（０．３８ｇ、１．８６ミリモル）を添加した。得られた溶液を内容物が完全に溶解するまで１０分間撹拌し、それから凍結融解サイクル（×３）とその後の窒素パージにより内容物から酸素を除去した。フラスコを油浴に浸漬し、７０℃で８時間、重合を行った。得られた溶液をアセトンで希釈し、大過剰のヘキサン中に沈殿させた。上部溶媒層を除去した後、沈殿したポリマーを真空中で乾燥し、残留溶媒を取り除いた。それから、ポリマーを脱イオン水中に溶解し、引き続いて新鮮な脱イオン水に対する透析（分画分子量：６０００）で精製した。最後に、エタノールを使った共沸蒸留で水を除去し、両親媒性コポリマーが残った。
ｂ）原子移動ラジカル重合
三方活栓に取り付けた丸底フラスコに、ＣｕＢｒ（６４．５ｍｇ、０．４４８ミリモル）、ビピリジン（１３９ｍｇ、０．８９１ミリモル）を添加し、その後窒素ライン又は真空ポンプのいずれかに接続した。真空−窒素サイクルを繰り返して酸素を除去した。フラスコが窒素で満たされたら、脱気したＰＥＧＭＡ（５．５３２ｇ、１１．６ミリモル）、ＰＰＧＭＡ（１５ｇ、３４．９ミリモル）及びブタノン（３０ｍｌ）を充填した。室温で１時間撹拌した後、ブタノン（０．４２Ｍ）中メチル  ２−ブロモプロピオネート溶液（１．１ｍＬ）を加え、所望の温度（典型的には６０℃）で１０時間重合を行った。重合の後、得られた溶液をアセトンで希釈し、シリカカラムを通過させて銅触媒を除去し、大過剰のヘキサン中に沈殿させた。上述のように、再沈殿及び透析の後、凍結乾燥を行い、さらに精製した。
２．ダンシル−コポリマーＰＥＧＭＡ−コ−ＰＰＧＭＡの調製
１ｇのＰＥＧＭＡ−コ−ＰＰＧＭＡ（Ｍｎ＝１５，５００）をＴＨＦ（１５ｍｌ）中に溶解した。得られた溶液に、トリエチルアミン（０．０１３９ｇ、０．１３７ミリモル）及び塩化ダンシル（０．０３７ｇ、０．１３７ミリモル）を加えた。その後室温で一晩、暗所で撹拌しながら反応させた。反応溶液を濾過し、その後激しく撹拌しながらヘキサン中に滴加した。その後得られた溶液を３０分間静置し、沈殿したポリマーのサンプルを収集した。３回沈殿させてポリマーを精製し、最後に真空オーブン中で、室温で乾燥した。
３．コポリマーＰＥＧＭＡ−コ−ＰＰＧＭＡでコーティングされたＰＬＧＡ微粒子の調製
乳化−蒸着−拡散法（図２に例示）によりＰＬＧＡ微粒子を調製した。典型的には、ＰＬＧＡ（２００ｍｇ）を酢酸エチル（５ｍＬ）中で溶解し、水中コポリマーＰＥＧＭＡ−コ−ＰＰＧＭＡ溶液（１０ｍＬ、２ｍｇ．ｍＬ-1）に加えた。得られた乳化液を１１０００ｒｐｍで４５秒間均質化し、第２のＰＥＧＭＡ−コ−ＰＰＧＭＡ溶液（１５ｍｌ、２ｍｇ．ｍＬ-1）に加え、さらに１１００ｒｐｍで４５秒間均質化を行った。真空中で粒子コアから有機溶媒を除去した。遠心分離（２５００ｒｐｍ）で水相から微粒子を分離し、凍結乾燥の前に水中で再懸濁した。
＜分析技術の説明＞
ｉ．下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）の決定
ＰＢＳ中ＰＥＧＭＡ−コ−ＰＰＧＭＡポリマー溶液（ｐＨ７．４、３ｍｇ．ｍＬ-1）をＢｅｃｋｍａｎ製ＤＵ−６４０分光光度計内にて１．０℃．ｍｉｎ-1で加熱した。５５０ｎｍで吸光度が急激に増加し始める温度を、コポリマーシステムのＬＣＳＴと見なした。
ｉｉ．ゲル浸透クロマトグラフィー
三重検出のゲル浸透クロマトグラフィー（ＰＬ−１２０及びＰＬ−５０、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｓ製）で、数平均分子量（Ｍｎ）、重量平均分子量（Ｍｗ）及び多分散性（Ｍｗ／Ｍｎ）を得た。カラム（３０ｃｍ  ＰＬｇｅｌ  Ｍｉｘｅｄ−Ｃ、直列で２本）をＴＨＦとともに溶出し、ポリスチレン標準で較正した。較正及び分析は全て４０℃及び流量１ｍＬ／ｍｉｎで行った。このような条件下では、全ての生成物は完全にＴＨＦ中に溶解し、背圧をほとんど又は全く観察することなく注入前に０．２μｍフィルターを通過した。
ｉｉｉ．粒径の測定
Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ及びＣｏｕｌｔｅｒ  ＬＳ  ２３０（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ製）の装置を使って、ミセル及び微粒子の粒径と分布を測定した。動的光散乱実験では、ＤＩ水（脱イオン水）中でＰＥＧＭＡ−コ−ＰＰＧＭＡ溶液（１ｍｇ．ｍＬ-1）を調製し、測定前に０．４５ｕｍの使い捨てフィルター（ＰＴＰＥ  Ａｃｒｏｄｉｓｃ  ＣＲ）を使って１２．５×１２．５ｍｍポリスチレン使い捨てキュベット中で濾過した。Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＳ２３０を用いた微粒子の粒径の測定では、不透明値（ｏｂｓｃｕｒａｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ）８％〜１２％で、サンプルをＤＩ水中で再懸濁した。
ｉｖ．一軸圧縮試験
テクスチャーアナライザー（ＴＡ  ＨＤＰｌｕｓ、Ｓｔａｂｌｅ  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）を使って周囲条件で一軸圧縮試験を行った。注射器ノズル（１ｍｌのＢＤ  Ｐｌａｓｔｉｐａｋ（登録商標））を介して２ｍｍ／ｓｅｃで注入性（Ｉｎｊｅｃｔａｂｉｌｉｔｙ）を決定した。直径４．５ｍｍの注射筒内でゲルが形成された後、３７℃で３０分間、足場の圧縮強度（湿潤時及び乾燥時）を０．０１ｍｍ／ｓｅｃで決定した。
【００５６】
図７は一軸圧縮試験で使用した装置を示している。
ｖ．走査電子顕微鏡法
ＪＥＯＬ製ＪＳＭ−６０６０ＬＶの機器を使って、走査電子顕微鏡写真を記録した。ポリマー微粒子を白金製スタブ（ｓｔｕｂｓ）上に置き、４分間スパッタリングでコーティングした。この際、複雑な回転惑星（ｐｌａｎｅｔａｒｙ）運動により、不規則な表面を均一にコーティングすることができる。
ｖｉ．細胞培養
３７℃及び５％ＣＯ2の加湿したインキュベーター内にて、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％グルタミン及び２．５ｍｇ／ｍＬアンホテリシンＢ（抗生物質／抗カビ剤溶液）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、細胞株Ｃ２Ｃ１２から細胞を培養した。２〜３日おきにＰＢＳ中０．２５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡを用いて細胞を継代培養し、使用前に再び種をまいた。顕微鏡実験では、ＰＬＧＡ微粒子をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ製バイアル管に入れ、２時間紫外線で殺菌した。Ｃ２Ｃ１２細胞をトリプシン処理し、ＤＭＥＭ中で再懸濁し、その後蛍光染料（Ｃ３４５５１、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅ  ＣＭＲＡ）を含むＤＭＥＭ中で４５分間遠心分離及び再懸濁を行った。それから、標識細胞を遠心分離し、ハンクス緩衝液（ＨＢＳＳ）に加えた。約５０００００細胞（０．２５ｍｌのＨＢＳＳ緩衝液中）をＰＬＧＡ微粒子（１５０ｍｇ）と混合した。得られた混合物を６ウェルの非組織培養プレート内にて３７℃で３０分間培養して足場を形成し、続いてＤＭＥＭを追加してさらに培養した。細胞を無菌ＰＢＳで洗浄して６ウェルの新しい非組織培養プレートに移した後、蛍光画像を得た。アラマーブルー（ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ）アッセイ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｅｕｒｏｐｅ社製）を用いて細胞生存率を評価した。
【００５７】
＜分析＞
Ａ．ＰＥＧＭＡとＰＰＧＭＡのコポリマーの特徴
上述の方法により様々なモノマー比率のポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭＡ）とポリ（プロピレングリコール）メタクリレート（ＰＰＧＭＡ）の重合によって合成された新しい生体適合性応答性ポリマーを表１に示している。
【００５８】
【表１】
0005718815.tif 000002
【００５９】
従来のフリーラジカル重合（ＦＲＰ）と原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）の両方の経路を用いて、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴｓ）を示す、くし状コポリマーを生成することができる。
【００６０】
体温でＬＣＳＴを示すポリマーに関心が持たれている。３７℃近辺のＬＣＳＴにおいて、様々なモル質量及び多分散性のＰＥＧＭＡ２５−ＰＰＧＭＡ７５コポリマーの調製に成功した。
【００６１】
ＡＴＲＰ経路での開始剤：モノマーの比率及び連鎖移動剤（ＣＴＡ）：モノマーの比率を制御することにより、モル質量の制御が可能である。一方、コモノマー比率により、幅広い温度範囲内でＬＣＳＴを調整することが可能である。
【００６２】
コポリマーＰＥＧＭＡ−コ−ＰＰＧＭＡ（２５／７５）について1ＨＮＭＲを実施し、そのスペクトルを図５に示している。
（モノマー成分が同じであるコポリマーを用いて、）分子量がポリマーのＬＣＳＴに与える効果を評価した。その結果を図９のＡに示している。図９のＢは、コポリマーＰＥＧＭＡ−コ−ＰＰＧＭＡの加熱時と冷却時のＬＣＳＴを示している。図９のＣは、ｐＨがコポリマーのＬＣＳＴに与える効果を示している。図９のＤは、ＮａＣｌ濃度がＬＣＳＴに与える効果を示している。全ての図において、ＰＥＧＭＡ−コ−ＰＰＧＭＡ（２５／７５）を使用し、コポリマーの濃度は各ケースで３ｍｇ／ｍｌであった。
【００６３】
図２の（ｉｉｉ）に、ＰＥＧＭＡxＰＰＧＭＡyコポリマーのコイルから小球への相転移を光散乱の上昇によって示している。この合成ポリマーの相転移は急激に起こっていることがわかる。
【００６４】
疎水性のＰＰＧＭＡモノマーに対する親水性のＰＥＧＭＡ成分の比率が高まると、予想通りＬＣＳＴが上昇した（表１及び図２の（ｉｉｉ）参照）。しかし、そして本用途で重要なのは、所定のＰＥＧＭＡ：ＰＰＧＭＡモル比のＬＣＳＴが、幅広いモル質量範囲で同様であったことである。
【００６５】
図２の（ｉｖ）は、ＬＣＳＴポリマーのゾル−ゲル転移を示している。ＬＣＳＴ以下では、低〜中程度のモル質量（＜３０ｋＤａ）のＰＥＧＭＡ25ＰＰＧＭＡ75コポリマーで低粘度溶液を形成した。このようなポリマーはＬＣＳＴを超えると溶液から沈殿した。
【００６６】
ＰＥＧＭＡ25ＰＰＧＭＡ75のモル質量を１６０ｋＤａまで増加すると、ＬＣＳＴを超える水中で安定したゲルが得られた。ＬＣＳＴ以下のサンプルは左側、ＬＣＳＴ超のサンプルは右側である。
【００６７】
動的光散乱で示されているように、水中約１ｍｇ．ｍＬ-1の濃度で、ＰＥＧＭＡ25ＰＰＧＭＡ75ポリマーはミセルを形成した。この際、温度がＬＣＳＴ（約３５℃）以下からＬＣＳＴ超に上昇するのに伴い、流体力学的半径はそれぞれ約１００ｎｍから３５０ｎｍに変化した。
【００６８】
図１０は、コポリマーＰＥＧＭＡ−ＰＰＧＭＡ（２５／７５）水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）についてＤＬＳで測定した、温度（ｘ軸、℃）と流体力学的半径Ｒｈ（ｙ軸）の相関関係のプロットを示している。
Ｂ．熱応答性生分解性微粒子の合成及び特性
図２の（ｉ）にはモノマーＰＥＧＭＡ及びＰＰＧＭＡが示されている。これらのモノマーは、フリーラジカル又は制御ラジカル（ＡＴＲＰ）の技術で共重合され、図２の（ｉｉ）に示すようなくし状コポリマーが生成される。
【００６９】
表面処理されたスマート粒子の調製を図２の（ｖ〜ｖｉｉｉ）に示している。ＰＥＧＭＡ−ＰＰＧＭＡコポリマーにより安定化されたポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）粒子の調製を、乳化／拡散／蒸着法により行った。具体的には、図２の（ｖ）に示すように、酢酸エチル中ＰＬＧＡ溶液を水中ＰＥＧＭＡ−コ−ＰＰＧＭＡポリマーに加えて撹拌し、乳濁液を生成する。図２の（ｖｉ）に示すように、両親媒性コポリマーは、激しく撹拌している間ＰＬＧＡを含む溶媒の小滴を安定化する。図２の（ｖｉｉ）に示すように、この有機相から溶媒を蒸着することにより、ＰＥＧＭＡ−コＰＰＧＭＡでコーティングされたＰＬＧＡ粒子が残る。図２の（ｖｉｉｉ）に示すように、これらの粒子は遠心分離により回収され、水中で再懸濁される。
【００７０】
ＰＥＧＭＡ−コ−ＰＰＧＭＡ層の表面応答の概略を図２の（ｉｘ）及び図２の（ｘ）に示している。得られた微粒子の直径は２〜４μｍであり、応答性ＬＣＳＴポリマーの表面「コロナ」が存在することがわかる。
【００７１】
これらの粒子は、水及びＰＢＳ中では安定した分散物を形成したが、光散乱で示されるように低濃度では沈殿した。図２の（ｘｉ）は、粒子がＬＣＳＴを超えると沈殿する時に生じる光散乱の減少を示している。
【００７２】
これらの粒子は、高濃度中に存在するときは、水和した自立型（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）ゲルを形成した。ＬＣＳＴより高い温度への温度変化に伴って、粒子の流動性懸濁液（左）から空間充填型ゲル（右）が形成される様子が、図２の（ｘｉｉ）に示されている。
【００７３】
走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）により、粒子の形態を確認した。粒子のＳＥＭ分析結果を図２の（ｘｉｉｉ）に示している。これは、低多分散性の球状粒子を示している。
ＰＬＧＡコア内の疎水性が「有効」であることを示すナイルレッド（ＮｉｌｅＲｅｄ）のカプセル化は、ＰＬＧＡ成分の検出を容易にした。また、顕微鏡の選択フィルターは、カプセル化された染料と表面封入ＰＥＧＭＡ−ＰＰＧＭＡ層の両方の存在を示した。
【００７４】
図２の（ｘｉｖ）に示すように、コーティングされた粒子の多層構造は、ＰＬＧＡコア内のカプセル化されたナイルレッドとともに、蛍光顕微鏡検査法（テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）発光フィルター）によって確認された。
【００７５】
ダンシル標識ＰＥＧＭＡ−ＰＰＧＭＡコポリマーの使用により、蛍光顕微鏡検査法で表面コロナを検出することができた。ダンシル標識ＰＥＧＭＡ−コ−ＰＰＧＭＡは、図２の（ｘｖ）（ＤＡＰＩ発光フィルター）に示された表面のコーティングが、図２の（ｘｖｉ）（テキサスレッド発光フィルター）に示されたＰＬＧＡコア内のカプセル化されたナイルレッドと共局在化していることを明らかにした。
【００７６】
図６は、本発明のＰＬＧＡ微粒子の典型的な粒径を示している。
図１１は、２０℃〜４５℃でのＰＬＧＡ微粒子（ＰＬＧＡ微粒子の濃度、２５％  ｗ／ｖ）のレオロジー・データを示している。
【００７７】
ＰＥＧＭＡ−コ−ＰＰＧＭＡ：ＰＬＧＡ比を変化させることにより粒径を制御することができた。即ち、ＰＬＧＡに対するＰＥＧＭＡ−コ−ＰＰＧＭＡの比率を高めることにより、ビーズを小さくし、且つ多分散性を低くすることができた。典型的な調製では、ＰＬＧＡ：ＰＥＧＭＡ−ＰＰＧＭＡ比（ｗ／ｗ）を２：１とし、直径２．４μｍの粒子を得た。変動係数は６３％で、直径が＜５μｍの粒子は＞９０％であった。ＰＬＧＡ：ＰＥＧＭＡ−ＰＰＧＭＡ比が０．４：１でも同様の粒径が得られるであろうが、ＰＬＧＡ：ＰＥＧＭＡ−コ−ＰＰＧＭＡ比が４：１を超えると粒径が６μｍを超え、その結果凝集が生じる。
【００７８】
粒子のコロイド安定性はＰＥＧＭＡ−コ−ＰＰＧＭＡコーティングの水和殻によって決まり、モル質量によって変化する。
従って、モル質量の高いポリマーは、図１に示すように、立体遮へい層のさらなる拡張により、大きな粒子のコロイド安定性を維持することができる。
Ｃ．コロイド性懸濁液及び熱可逆性ゲルの注入性及び機械的特性
ポリマー粒子から形成されたコロイド性懸濁液及び熱可逆性ゲルの注入性及び機械的特性を、テクスチャーアナライザーを使って調査した（図３）。
【００７９】
粒子の懸濁液（ＰＢＳ中６０％ｗ／ｖ）を注入するために必要な力は、緩衝液及び注射筒の動きと比べるとほんの僅かに異なることが示されている。このことは、図３のａに示されている。上のラインは粒子懸濁液、真ん中のラインは注射筒の動き、及び下のラインは緩衝液である。
【００８０】
本グラフは、空の注射器の出口が１．６ｍｍのテーパ型ノズルを介した注入のピーク力を、緩衝液及び６０％ｗ／ｗの足場用固体懸濁液と比較して示している。空の注射器は、１．１７±０．１５Ｎのピーク力を、また緩衝液の場合は１．１２５±０．１８Ｎ、粒子懸濁液の場合は２±０．０３Ｎのピーク力を必要とする。分散物のピーク注入力は、ピストンの手動操作における許容範囲内に十分おさまっている。６０％ｗ／ｗ固体懸濁液の結果の繰返し精度は、臨床医が必要とする時間尺度の範囲内に十分おさまっていることを示している。
【００８１】
図３のｂでは、湿潤時及び乾燥時の凝集粒子の力−距離曲線は、高い強度のゲルを示している。
３７℃で３０分間培養した後の湿潤時及び乾燥時のゲル強度を比較した結果、それぞれ１７Ｎ及び１９Ｎと同様の数値を示した。これは、構造形成が、短い培養期間内に生じていることを示すものである。
Ｄ．細胞の生体内原位置でのカプセル化及び組織足場の形成
方法の項目３で上述した乳化／拡散／蒸着法により調製された、本発明による表面処理された微粒子を、モデル細胞株であるＣ２Ｃ１２筋芽細胞と混合し、ＰＥＧＭＡ25ＰＰＧＭＡ75のＬＣＳＴ以下で流動性懸濁液を形成した。
【００８２】
室温で粒子とともに細胞を分散させた後、３７℃で細胞のカプセル化が生じ、安定したゲルが得られた。図４のａは、培養培地内で懸濁された前記ゲルを示している。従って、ポリマー粒子のみに関して、３７℃（即ち、ＬＣＳＴポリマーの下限臨界共溶温度より高い温度）でポリマー粒子と細胞の混合懸濁液を培養することにより、ゲルが生成された。
【００８３】
ＤＭＥＭでの１週間の培養後のゲルの顕微鏡写真が図４のｂ及び４のｃに示されている。これらのＳＥＭ画像では、ゲルの多孔性が明らかである。このことは、マイクロコンピューター断層撮影法（μＣＴ）からも明らかである。
【００８４】
図８は、ＰＬＧＡ微粒子から形成されたゲルのμＣＴ画像を示している。図８のＡはμＣＴ回転スキャン画像、図８のＢは３Ｄ再構成画像を示している。これらの画像は、細胞のカプセル化及び乾燥後のマクロ孔及び空洞を示している。
【００８５】
Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）標識を使って、多孔性マトリックス内の細胞を視覚化した。蛍光顕微鏡検査法により、非組織培養プラスチックでの対照実験（図４のｄ）と比べて、ゲル全体に細胞が均一に分布している様子が示された。ＰＥＧＭＡ−ＰＰＧＭＡでコーティングされたＰＬＧＡゲル切片内でこのようにＣ２Ｃ１２細胞をＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）で染色することにより、ゲル内の細胞生存率が高まったことが示される。
【００８６】
Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ（登録商標）染色剤を使用することにより、ゲル深部での細胞生存率が示された（図４のｅ）。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ（登録商標）染色剤を含む標識Ｃ２Ｃ１２細胞は蛍光グリーンを示し、マトリックス粒子はレッドに染色している。
【００８７】
アラマーブルー（Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ）アッセイにより、生存率及び代謝率を評価した。得られたデータが示すように、生体内原位置での熱ゲル化過程による細胞のカプセル化は、２４時間後に生存率を完全に維持したまま生じ、またこれらの細胞はこの時点で依然として成長を続けていた。アラマーブルー（Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ）アッセイのデータは図４のｆに示されている。これは、非組織培養プラスチック上のＣ２Ｃ１２細胞（ブランク）と比較して、ゲルマトリックス内及びゲルマトリックス上の細胞の生存率は同様であることを確認している。対照サンプルは、ＰＥＧＭＡ−ＰＰＧＭＡでコーティングされたＰＬＧＡゲルのみからの蛍光である。
【００８８】
顕著には、ゲル内におけるＣ２Ｃ１２細胞の全体的な生存率は、事前に形成されたＰＥＧＭＡ−コ−ＰＰＧＭＡ−ＰＬＧＡマトリックスの表面に付着させた同じ細胞と同様に高かった。従って、初期期間を通して栄養分の浸入を防ぐバリアは存在せず、細胞増殖は支持体内で起こり得ることを示している。
【図５】
0005718815.tif 000003
【図７】
0005718815.tif 000004
【図８】
0005718815.tif 000005
【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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