(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基を塩基として有するヌクレオチドと、２−アミノ−６−（２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基又は２−アミノ−６−（２−チアゾリル）−９Ｈ−プリン−９−イル基とが塩基対を形成している、核酸。
【請求項２】
転写、逆転写又は翻訳の工程で、塩基対を形成している、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基を塩基として有するヌクレオチドがＤＮＡの一部であり、そして、前記２−アミノ−６−（２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基又は２−アミノ−６−（２−チアゾリル）−９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドがＲＮＡの一部である、請求項１又は２に記載の核酸。
【請求項４】
２−アミノ−６−（２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基又は２−アミノ−６−（２−チアゾリル）−９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸を調製する方法であって、
２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型として転写、逆転写又は複製を行い、前記２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基を有するヌクレオチドの相補的な位置に、２−アミノ−６−（２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基又は２−アミノ−６−（２−チアゾリル）−９Ｈ−プリン−９−イル基を有するヌクレオチドを組み込む
ことを含む、前記調製方法。
【請求項５】
鋳型において、前記２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基を塩基として有するヌクレオチドが２個以上存在する、請求項４に記載の調製方法。
【請求項６】
ｉ）  ２−アミノ−６−（２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基又は２−アミノ−６−（２−チアゾリル）−９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチド
並びに、
ｉｉ）  ５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドであって、前記塩基の５位に、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシテトラメチルローダミン（６−ＴＡＭＲＡ）、  ５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホン酸（ＤＡＮＳＹＬ）、５−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（５−ＨＥＸ）、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（６−ＨＥＸ）、５−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（５−ＴＥＴ）、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（６−ＴＥＴ）、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（５−ＲＯＸ）、及び６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（６−ＲＯＸ）からなるグループから選択される蛍光色素が、直接又はリンカーを介して結合している、前記ヌクレオチド
を、同一の鎖上に含む核酸を調製する方法であって、
ｉｉｉ）  ２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基を塩基として有するヌクレオチド
並びに
ｉｖ）  ２−アミノ−６−（２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基又は２−アミノ−６−（２−チアゾリル）−９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチド
を含む核酸を鋳型として転写、逆転写又は複製を行い、前記ｉｉｉ）のヌクレオチドの相補的な位置に、前記ｉ）のヌクレオチドを組み込み、そして、前記ｉｖ）のヌクレオチドの相補的な位置に、前記ｉｉ）のヌクレオチドを組み込む
ことを含む、前記調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規人工塩基対に基づく核酸及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体高分子である核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）は、生命活動に必要となる膨大な量の遺伝情報を、僅か４種類の塩基の組合せからなる配列として記録している。また、核酸は自分自身を鋳型としてＤＮＡポリメラーゼにより自己複製し、さらにＲＮＡポリメラーゼによる転写、リボソームによる翻訳というプロセスを介して、ＤＮＡからＤＮＡへ、ＤＮＡからＲＮＡへ、ＲＮＡからタンパク質へと遺伝情報を伝達する。この遺伝情報の複製と伝達を可能としているのは排他的な塩基対形成（Ａ・Ｔ／Ｕ、Ｇ・Ｃ）のルールである。また、核酸は、多様な高次構造を形成して様々な機能を発揮する。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏセレクション法によって、アプタマーやリボザイムの機能を有する新規核酸がこれまでに多数見つかってきたこともその一つである。
【０００３】
しかし、２０種類のアミノ酸からなるタンパク質に比べて、天然の核酸には４種類の塩基（２種類の塩基対）しかないという事実は、核酸の化学的・物理的多様性に限界を与えている。たとえば、生体中のｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ等の機能性ＲＮＡは自分自身の構造を安定化したりＲＮＡ・ＲＮＡ間、ＲＮＡ・タンパク質問相互作用を安定化するために、様々な修飾塩基を利用している。従って、新規機能性核酸の開発において、新たな塩基（対）のレパートリーを増やすことは大変有益であると考えられる。
【０００４】
核酸のさらなる機能拡張をめざして、非天然型塩基をもつヌクレオシド又はヌクレオチドの創製への取り組みが行われている。核酸に修飾塩基（もしくは非天然型塩基）を導入する手法として、１）化学合成により直接導入する方法、２）核酸合成酵素により導入する方法が考えられる。１）の場合は、アミダイトユニットの安定性や塩基部分の適当な保護基が存在すること等化学合成上の問題の解決が必要である。また、これらの問題が解決されれば様々な非天然型塩基を位置選択的に導入できるが、その核酸の増幅は困難であり、長鎖長の核酸の合成も難しくなる。２）の場合は、もし、基質が酵素に認識され、人工塩基対間で相補的に複製、転写されれば、その核酸の増幅・調製が可能となるが、そのような基質や塩基対（非天然型ヌクレオチド）も開発途中である。
【０００５】
非天然型人工塩基対の研究の背景
天然の二本鎖ＤＮＡ中のＡとＴ及びＧとＣは、それぞれ特異的な水素結合を介して互いに「排他的」な塩基対を形成している。非天然型塩基対の研究は塩基間の水素結合を利用した組み合わせや塩基の疎水性を利用した組み合わせ等が知られているが、複製、転写、翻訳の工程全てにおいて天然型塩基対に拮抗し得るものは見出されていない。このような状況において複製、転写、翻訳の少なくとも一工程において天然型塩基対に拮抗し得る非天然型塩基対は特異的な有用性を持つものである。
【０００６】
最近の非天然型の非水素結合塩基対の研究により、複製における効率的で適合したヌクレオチドの取り込みのために、対合塩基間の水素結合は絶対的に必要なものではなく、その代わり、塩基間の形状の相補性が複製において重要な役割を果たすことが、証明されてきた（非特許文献５−６）。よって、非水素結合塩基対は、新規なバイオテクノロジーを創造するための、遺伝子アルファベットおよびコードの拡張のための潜在的な候補である（非特許文献７−９）。
【０００７】
一方、転写に関しては、ＲＮＡポリメラーゼによって高い選択性および効率で認識される非水素結合塩基対は、まだ報告されていない。具体的には、本発明者は、これまでに２−アミノ−６−(２−チエニル)−９Ｈ−プリン−９−イル基（ｓ）と２−オキソ−(１Ｈ)ピリジン−３−イル基（ｙ）との組み合わせによる水素結合の相互作用を介した（ｓ−ｙ）塩基対を開発し、試験管内で非天然型アミノ酸を部位特異的に含むタンパク質の合成に成功している（特許文献１、非特許文献１４）。
【０００８】
さらに、特許文献３は、２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン−９−イル基（ｖ）と２−オキソ−(１Ｈ)ピリジン−３−イル基（ｙ）との組み合わせによる（ｖ−ｙ）塩基対を開示している（特許文献３）。
【０００９】
なおｓの核酸塩基対としては天然型４塩基、（ｓ−ｙ）の他、（ｓ−ｚ）（ｚは、２−オキソ−１，３−ジヒドロイミダゾール−１−イル基を意味する）、（ｓ−５位置換ｙ）が、本発明前に報告されていた。これらの（ｓ−ｙ）、（ｓ−ｚ）、（ｓ−５位置換ｙ）の非天然型の塩基対は全て水素結合相互作用を含むものである（特許文献２、非特許文献１３−１５）。
【００１０】
しかしながら、これらの非天然型塩基対のうち（ｓ−ｙ）と（ｓ−5位置換ｙ）は、ｙをＤＮＡ鋳型としてｓをＲＮＡへ挿入する転写工程については、選択性が高くなく、また、（ｓ−ｚ）は、選択性は高いが、必ずしも高収率ではなかった。
【００１１】
【化１】
0005649018.tif 000002
一方、２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基（Ｐａ）は、天然型４塩基のほか９−メチルイミダゾ［（４，５）−ｂ］ピリジン（Ｑ）と非水素結合塩基対を形成しうることが（Ｐａ−Ｑ）で報告されている（非特許文献９）。
【００１２】
【化２】
0005649018.tif 000003
【００１３】
しかしながら、上記非水素結合塩基対もＤＮＡポリメラーゼによる翻訳、又は、逆転写酵素によるＤＮＡ合成が報告されているのみであり、ＲＮＡポリメラーゼによる認識については知られていない。Ｔ７様ＲＮＡポリメラーゼの単一サブユニットは、構造およびメカニズムの点においてＤＮＡポリメラーゼに類似するが（非特許文献１６−１７）、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ複合体の最近の構造解析によって、ＲＮＡポリメラーゼとＤＮＡポリメラーゼ間の相違が明らかにされた（非特許文献１７−１８）。転写では、入ってくる基質が鋳型中の塩基と「開いた」コンフォメーションで塩基対を形成し、そして、形成された塩基対は、「開いた」コンフォメーションから「閉じた」コンフォメーションに遷移する間、維持される（非特許文献１８）。しかしながら、複製では、「閉じた」コンフォメーションへの遷移の後に塩基対形成が開始される。このことから、転写では複製の場合よりも、対合する塩基間の水素結合が重要であると考えられ、そして、非水素結合塩基対が転写において機能しうるか、という問題が生じる。
【００１４】
非天然型塩基によって仲介される特異的な転写が可能になれば、促進された機能性を有する新規なＲＮＡ分子を創造し、そして、遺伝子コードが拡張されることとなる（非特許文献１−４）。
【００１５】
ＲＮＡへの蛍光プローブの導入
最近、ＲＮＡ医療の関心が高まる中で、ＲＮＡ中への蛍光プローブの導入は、ＲＮＡの蛍光標識化法、そして、ＲＮＡの複雑な高次構造を解析するための重要なテクノロジーの１つになっている。後者の構造解析用の蛍光プローブとしては、蛍光性の塩基（２−アミノプリンなど）をもつヌクレオチドを利用する方法が従来から用いられている。この点、上述した２−アミノ−６−(２−チエニル)−９Ｈ−プリン−９−イル基（ｓ）は蛍光塩基であり、これを塩基として含むヌクレオチドは強い蛍光特性を有する。従って、ｓを塩基として含むヌクレオチドをＲＮＡ中の任意の部位に導入することができれば、有用な蛍光プローブの調製が可能となる。
【００１６】
しかし、これらの蛍光性塩基を有するヌクレオチドを転写によりＲＮＡに導入するための公知の方法は、収率の面で必ずしも十分なものではなかった。従って、ｓなどの蛍光性塩基を有するヌクレオチドを、転写によりＲＮＡ中に部位特異的に導入することは実質的にできなかったため、長鎖ＲＮＡの高次構造の解析は難しかった。
【００１７】
転写で蛍光プローブをＲＮＡ中に導入する方法が開発されれば、溶液中でのＲＮＡの構造のダイナミックスを調べることが可能になる。さらに、この手法は、ＲＮＡを利用した医薬品の開発にも役立つ。そこで、不可能であると考えられている長鎖ＲＮＡ中への蛍光プローブの導入を可能とする方法の確立が重要となる。これにより、生体内の機能性ＲＮＡの構造解析、ならびに、他分子との複合体の構造解析に供する新たな手法の開発が可能になる。
【００１８】
複製、転写、翻訳の工程全てにおいて天然型塩基対に拮抗し得る非天然型の塩基であって、かつ、蛍光特性を付与する塩基を有するヌクレオチドを核酸へ導入するための、新規な人工塩基対の開発が希求される。
【特許文献１】ＷＯ２００１／００５８０１
【特許文献２】ＷＯ２００４／００７７１３
【特許文献３】ＷＯ２００５／０２６１８７
【非特許文献１】Ｂｅｎｎｅｒ，  Ｓ．  Ａ．，  Ｂｕｒｇｓｔａｌｌｅｒ，  Ｐ．，  Ｂａｔｔｅｒｓｂｙ，  Ｔ．  Ｒ．  ＆  Ｊｕｒｃｚｙｋ，  Ｓ．  ｉｎ  Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｗｏｒｌｄ  （ｅｄｓ  Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ，  Ｒ．  Ｆ．，  Ｃｅｃｈ，  Ｔ．  Ｒ．  ＆  Ａｔｋｉｎｓ，  Ｊ．  Ｆ．）  １６３−１８１  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９９）．
【非特許文献２】Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，  Ｄ．  Ｅ．  Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒｓ  ｃｏｎｔｉｎｕｅ  ｔｏ  ｅｖｏｌｖｅ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  １１，  １８−２０  （２００４）．
【非特許文献３】Ｗａｎｇ，  Ｌ．  ＆  Ｓｃｈｕｌｔｚ，  Ｐ．  Ｇ．  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ．  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １−１１  （２００２）．
【非特許文献４】Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，  Ｔ．  Ｌ．，  ｄｅ  Ｃｒｅｃｙ−Ｌａｇａｒｄ，  Ｖ．  ＆  Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，  Ｐ．  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７３，  １４７−１７６  （２００４）．
【非特許文献５】Ｍｏｒａｌｅｓ，  Ｊ．  Ｃ．  ＆  Ｋｏｏｌ，  Ｅ．  Ｔ．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｎｏｎ−ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｓｈａｐｅ  ａｎａｌｏｇｓ．  Ｎａｔ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ５，  ９５０−９５４  （１９９８）．
【非特許文献６】Ｋｏｏｌ，  Ｅ．  Ｔ．  Ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｂｏｎｄｉｎｇ，  ｂａｓｅ  ｓｔａｃｋｉｎｇ，  ａｎｄ  ｓｔｅｒｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  ３０，  １−２２  （２００１）．
【非特許文献７】ＭｃＭｉｎｎ，  Ｄ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｆｆｏｒｔｓ  ｔｏｗａｒｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｌｐｈａｂｅｔ：  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｔａｂｌｅ，  ｓｅｌｆ−ｐａｉｒｉｎｇ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｂａｓｅ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２１，  １１５８５−１１５８６  （１９９９）．
【非特許文献８】Ｗｕ，Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｆｆｏｒｔｓ  ｔｏｗａｒｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｌｐｈａｂｅｔ：  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｂａｓｅ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２２，  ７６２１−７６３２  （２０００）．
【非特許文献９】Ｍｉｔｓｕｉ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｗｉｔｈ  ｓｈａｐｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｙｒｒｏｌｅ−２−ｃａｒｂａｌｄｅｈｙｄｅ  ａｎｄ  ９−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏ［（４，５）−ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２５，  ５２９８−５３０７  （２００３）．
【非特許文献１０】Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉ，  Ｊ．  Ａ．，  Ｋｒａｕｃｈ，  Ｔ．，  Ｍｏｒｏｎｅｙ，  Ｓ．  Ｅ．  ＆  Ｂｅｎｎｅｒ，  Ｓ．  Ａ．  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｉｎｔｏ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｅｘｔｅｎｄｓ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｌｐｈａｂｅｔ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３４３，  ３３−３７  （１９９０）．
【非特許文献１１】Ｓｗｉｔｚｅｒ，  Ｃ．  Ｙ．，  Ｍｏｒｏｎｅｙ，  Ｓ．  Ｅ．  ＆  Ｂｅｎｎｅｒ，  Ｓ．  Ａ．  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｉｓｏｃｙｔｉｄｉｎｅ  ａｎｄ  ｉｓｏｇｕａｎｏｓｉｎｅ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２，  １０４８９−１０４９６  （１９９３）．
【非特許文献１２】Ｔｏｒ，  Ｙ．  ＆  Ｄｅｒｖａｎ，  Ｐ．  Ｂ．    Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ｂａｓｅ，  Ｎ６−（６−ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌ）ｉｓｏｇｕａｎｏｓｉｎｅ，  ｉｎｔｏ  ＲＮＡ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１５，  ４４６１−４４６７  （１９９３）．
【非特許文献１３】Ｏｈｔｓｕｋｉ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒｓ  ｆｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９８，  ４９２２−４９２５  （２００１）．
【非特許文献１４】Ｈｉｒａｏ，  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｆｏｒ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０，  １７７−１８２  （２００２）．
【非特許文献１５】Ｈｉｒａｏ，  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｔｗｏ−ｕｎｎａｔｕｒａｌ−ｂａｓｅ−ｐａｉｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏｗａｒｄ  ｔｈｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２６，  １１３２９８−１１３３０５  （２００４）．
【非特許文献１６】Ｃｈｅｅｔｈａｍ，  Ｇ．  Ｍ．，  Ｊｅｒｕｚａｌｍｉ，  Ｄ．  ＆  Ｓｔｅｉｔｚ，  Ｔ．  Ａ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ａｎ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３９９，  ８０−８３  （１９９９）．
【非特許文献１７】Ｙｉｎ，  Ｙ．  Ｗ．  ＆  Ｓｔｅｉｔｚ，  Ｔ．  Ａ．  Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．  Ｃｅｌｌ  １１６，  ３９３−４０４  （２００４）．
【非特許文献１８】Ｔｅｍｉａｋｏｖ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．  Ｃｅｌｌ  １１６，  ３８１−３９１  （２００４）．
【非特許文献１９】Ｈｉｒａｏ，  Ｉ．，  Ｆｕｊｉｗａｒａ，  Ｔ．，  Ｋｉｍｏｔｏ，  Ｍ．  ＆  Ｙｏｋｏｙａｍａ，  Ｓ．  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ２−  ａｎｄ  ６−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｐｕｒｉｎｅｓ  ａｎｄ  ２−ｏｘｏ（１Ｈ）ｐｙｒｉｄｉｎｅ  ｆｏｒ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｌｐｈａｂｅｔ．  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．  １４，  ４８８７−４８９０  （２００４）．
【非特許文献２０】Ｊｏｖｉｎｅ，  Ｌ．，  Ｄｊｏｒｄｊｅｖｉｃ，  Ｓ．  ＆  Ｒｈｏｄｅｓ，  Ｄ．  Ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｔＲＮＡ  ａｔ  ２．０  Å  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ：  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｂｙ  Ｍｇ２＋  ｉｎ  １５−ｙｅａｒ  ｏｌｄ  ｃｒｙｓｔａｌｓ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３０１，  ４０１−４１４  （２０００）．
【非特許文献２１】Ｌａｗ，  Ｓ．  Ｍ．，  Ｅｒｉｔｊａ，  Ｒ．，  Ｇｏｏｄｍａｎ，  Ｍ．  Ｆ．  ＆  Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ，  Ｋ．  Ｊ．  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  ａｎｄ  ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ２−ａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５，  １２３２９−１２３３７  （１９９６）．
【非特許文献２２】Ｈｏｌｚ，  Ｂ．，  Ｋｌｉｍａｓａｕｓｋａｓ，  Ｓ．，  Ｓｅｒｖａ，  Ｓ．  ＆  Ｗｅｉｎｈｏｌｄ，  Ｅ．  ２−Ａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ  ａｓ  ａ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｂａｓｅ  ｆｌｉｐｐｉｎｇ  ｂｙ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２６，  １０７６−１０８３  （１９９８）．
【非特許文献２３】Ｒｉｓｔ，  Ｍ．  Ｊ．  ＆  Ｍａｒｉｎｏ，  Ｊ．  Ｐ．  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ＲＮＡ  ｋｉｓｓｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｎａｌｙｚｅｄ  ｕｓｉｎｇ  ２−ａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２９，  ２４０１−２４０８  （２００１）．
【非特許文献２４】Ｂａｉｎ，  Ｊ．  Ｄ．，  Ｓｗｉｔｚｅｒ，  Ｃ．，  Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ，  Ａ．  Ｒ．  ＆  Ｂｅｎｎｅｒ，  Ｓ．  Ａ．  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｎ−ｓｔａｎｄａｒｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３５６，  ５３７−５３９  （１９９２）．
【非特許文献２５】Ｌｕｄｗｉｇ，  Ｊ．  ＆  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，  Ｆ．  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ５’−Ｏ−（１−ｔｈｉｏｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ），  ５’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ  ａｎｄ  ２’，３’−ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ２−ｃｈｌｏｒｏ−４Ｈ−１，３，２−ｂｅｎｚｏｄｉｏｘａｐｈｏｓｐｈｏｒｉｎ−４−ｏｎｅ．  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ５４，  ６３１−６３５  （１９８９）．
【非特許文献２６】Ｆｒｕｇｉｅｒ，  Ｍ．，  Ｈｅｌｍ，  Ｍ．，  Ｆｅｌｄｅｎ，  Ｂ．，  Ｇｉｅｇｅ，  Ｒ．  ＆  Ｆｌｏｒｅｎｔｚ，  Ｃ．  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｕｔｓｉｄｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｓｅｔｓ  ａｒｅ  ｎｏｔ  ｎｅｕｔｒａｌ  ｆｏｒ  ｔＲＮＡ  ａｍｉｎｏａｃｙｌａｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３，  １１６０５−１１６１０  （１９９８）．
【非特許文献２７】Ｋａｏ，  Ｃ．，  Ｒｕｄｉｓｓｅｒ，  Ｓ．  ＆  Ｚｈｅｎｇ，  Ｍ．  Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅ  ＲＮＡｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ３’  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３，  ２０１−２０５  （２００１）．
【非特許文献２８】Ｍｉｔｓｕｉ，Ｔ．，  Ｋｉｍｏｔｏ，Ｍ．，  Ｓａｔｏ，Ａ．，  Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｓ．  ＆  Ｈｉｒａｏ，  Ｉ．，  Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１３，  ４５１５−４５１８  （２００３）
【非特許文献２９】Ｆｕｊｉｗａｒａ，  Ｔ．，  Ｋｉｍｏｔｏ，  Ｍ．，  Ｓｕｇｉｙａｍａ，  Ｈ．，  Ｈｉｒａｏ，  Ｉ．  ＆  Ｙｏｋｏｙａｍａ，  Ｓ．，  Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１１，  ２２２１−２２２３  （２００１）
【非特許文献３０】Ｍｉｔｓｕｉ，  Ｔ．，  Ｋｉｍｏｔｏ，  Ｍ．，  Ｈａｒａｄａ，  Ｙ．，  Ｙｏｋｏｙａｍａ，  Ｓ．  ＆  Ｈｉｒａｏ，  Ｉ．，  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２７，  ８６５２−８６５８  （２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、新規人工塩基対に基づく核酸を提供することを目的とする。具体的には、本発明の核酸は、置換された若しくは無置換の２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基を塩基として有するヌクレオチドと、６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドとが塩基対を形成している。
【００２０】
限定されるわけではないが、本発明の核酸は好ましくは、前記置換された若しくは無置換の２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基が、
Ａ１）２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基；
Ａ２）２−ホルミル−４−（１−プロピン−１−イル）−１Ｈ−ピロール−１−イル基； 
Ａ３）２−ホルミル−４−メチル−１Ｈ−ピロール−１−イル基；及び
Ａ４）２−ホルミル−４−エチニル−１Ｈ−ピロール−１−イル基
からなるグループから選択され、そして
前記６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基が、
Ｂ１）２−アミノ−６−（２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基；
Ｂ２）６−（２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基；
Ｂ３）２−アミノ−６−（４−メチル−２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基；
Ｂ４）６−（４−メチル−２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基；
Ｂ５）２−アミノ−６−（５−メチル−２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基；
Ｂ６）６−（５−メチル−２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基；
Ｂ７）２−アミノ−６−（２−チアゾリル）−９Ｈ−プリン−９−イル基；
Ｂ８）６−（２−チアゾリル）−９Ｈ−プリン−９−イル基；
Ｂ９）２−アミノ−６−（４−メチル−２−チアゾリル）−９Ｈ−プリン−９−イル基；
Ｂ１０）６−（４−メチル−２−チアゾリル）−９Ｈ−プリン−９−イル基；
Ｂ１１）２−アミノ−６−（５−メチル−２−チアゾリル）−９Ｈ−プリン−９−イル基；及び
Ｂ１２）６−（５−メチル−２−チアゾリル）−９Ｈ−プリン−９−イル基
からなるグループから選択される。
【００２１】
本発明の核酸は、好ましくは転写、逆転写、複製又は翻訳の工程で、塩基対を形成している。
本発明はまた、６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸を調製する方法を提供する。本発明の調製方法は、置換された若しくは無置換の２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型として転写、逆転写又は複製を行い、前記置換された若しくは無置換の２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基を有するヌクレオチドの相補的な位置に、６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を有するヌクレオチドを組み込む、ことを含む。
【００２２】
本発明はさらに、上記本発明の方法によって調製された、前記６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸を提供することを目的とする。
【００２３】
本発明はさらにまた、本発明の核酸における、前記６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む局部領域の立体構造の解析方法を提供することを目的とする。本発明の解析方法は、前記６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチド中の、塩基に由来する蛍光強度を、温度変化やイオン（例えば、マグネシウム）濃度などの変化等、環境を変えることにより測定することを含む。
【００２４】
本発明の解析方法は、一態様において、前記６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチド中の、塩基に由来する蛍光強度が、温度の上昇に伴い実質的に上昇する場合には、生体内温度下で、前記ヌクレオチドは立体配座において周囲に存在するヌクレオチドと積み重なっていると判断し、そして、蛍光強度が温度の上昇に伴い実質的に低下又は上昇しない場合には、生体内温度下で、前記ヌクレオチドは外部に暴露していると判断する。
【００２５】
本発明はまた、核酸の二本鎖形成の検出方法を提供することを目的とする。本発明の検出方法は、
Ｉ）  ｉ）本発明の核酸の調製方法によって調製された、前記６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸、と、
ｉｉ）５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドであって、前記塩基の５位に、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシテトラメチルローダミン（６−ＴＡＭＲＡ）、  ５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホン酸（ＤＡＮＳＹＬ）、５−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（５−ＨＥＸ）、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（６−ＨＥＸ）、５−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（５−ＴＥＴ）、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（６−ＴＥＴ）、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（５−ＲＯＸ）、及び６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（６−ＲＯＸ）からなるグループから選択される蛍光色素が、直接又はリンカーを介して結合している前記ヌクレオチド、を含む核酸、とをハイブリダイズさせ、そして、
ＩＩ）  蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む。
【００２６】
本発明はさらに、
ｉ）  ６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチド
並びに、
ｉｉ）  ５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドであって、前記塩基の５位に、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシテトラメチルローダミン（６−ＴＡＭＲＡ）、  ５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホン酸（ＤＡＮＳＹＬ）、５−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（５−ＨＥＸ）、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（６−ＨＥＸ）、５−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（５−ＴＥＴ）、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（６−ＴＥＴ）、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（５−ＲＯＸ）、及び６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（６−ＲＯＸ）からなるグループから選択される蛍光色素が、直接又はリンカーを介して結合している、前記ヌクレオチド
を、同一の鎖上に含む核酸を調製する方法を提供することを目的とする。本発明の調製方法は、
ｉｉｉ）  置換された若しくは無置換の２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基を塩基として有するヌクレオチド
並びに
ｉｖ）  ６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチド
を含む核酸を鋳型として転写、逆転写又は複製を行い、前記ｉｉｉ）のヌクレオチドの相補的な位置に、前記ｉ）のヌクレオチドを組み込み、そして、前記ｉｖ）のヌクレオチドの相補的な位置に、前記ｉｉ）のヌクレオチドを組み込む
ことを含む。
【００２７】
本発明はさらにまた、上記方法によって調製された核酸も提供する。
本発明はまた、６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドと５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドとを、同一の鎖上に含む、本発明の核酸のステム−ループ（ヘアピン）構造形成の検出方法を提供することを含む。本発明の検出方法は、
１）  本発明の核酸において、ｉ）のヌクレオチドと、ｉｉ）のヌクレオチドとをハイブリダイズさせ、そして、
２）  蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明者らは、上記問題解決のために、以前に自分たちが開発したいくつかの非天然型の塩基を組み合わせることによって構築される塩基対を研究した。その結果、２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン−９−イル（ｓ）（非特許文献１３、１４）と２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル（Ｐａ）（非特許文献９）（図１Ａ）の組み合わせが、転写において高度な選択性および効率を示すことを見出した。即ち、ＰａヌクレオチドをＤＮＡの鋳型に挿入しＲＮＡへの転写反応を行うと、生成するＲＮＡ中の、鋳型ＤＮＡのＰａの相補的な位置に選択的にかつ高収率でｓが導入されることを発見し、本発明を想到した。
【００２９】
基質ｓはＴ７  ＲＮＡ  ポリメラーゼによって、ＤＮＡ鋳型から生成されるＲＮＡにおいて、鋳型中のＰａの相補的な位置に部位特異的に挿入することができる。プリン塩基であるｓは、水素結合を可能とする置換基（１位の水素受容基と２位の水素供与のアミノ基）を有する。しかし、Ｐａは対合表面にそのような親水性の基を有しない。本発明者らは、Ｐａ塩基のホルミル基中の酸素は、二本鎖ＤＮＡの小溝（ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ）に向かい、ポリメラーゼと相互作用していて、塩基対形成における水素受容基としては働いていないことを見出している（非特許文献９）。本発明において、ｓ−Ｐａ対は有意な水素結合相互作用を有しないが、５員環塩基Ｐａはｓと形状相補性を共有すると考えられる。
【００３０】
本発明の人工塩基対に基づく核酸
よって、本発明はその一態様において、置換された若しくは無置換の２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基を塩基として有するヌクレオチドと、６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドとが塩基対を形成している、核酸を提供する。
【００３１】
本発明における「ヌクレオシド」とは、核酸塩基と糖の還元基とがグリコシド結合によって結合した配糖体化合物を意味する。なお、「核酸塩基」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、及びこれら塩基の誘導体も含む概念である。「誘導体」の種類は特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、置換された若しくは無置換の２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基に相当する塩基や、６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基に相当する塩基、などが挙げられる。「ヌクレオチド」は、前記ヌクレオシドの糖部分が、リン酸とエステルをつくっている化合物をいう。より好ましくは、一、二、又は三リン酸エステルである。ヌクレオシド又はヌクレオチドの糖部分はリボフラノシル、２’−デオキシリボフラノシル、あるいはハロゲンなどの置換基を２’位に有する２’−置換リボフラノシルであってもよく、また、リン酸部分は、チオリン酸であってもよい。つまり、糖部分及びリン酸部分は、公知のヌクレオシド、ヌクレオチド、あるいはこれらの誘導体にみられる構成をとっていればよい。糖部分がリボフラノシルであるリボヌクレオチドはＲＮＡの構成成分となり、デオキシリボフラノシルであるデオキシリボヌクレオチドはＤＮＡの構成成分となる。
【００３２】
本発明の「置換された若しくは無置換の２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基」は、以下の一般式で表される構造を有する。
【００３３】
【化３】
0005649018.tif 000004
【００３４】
ここにおいて、ピロール環の４位のＲは、水素であるか、あるいは、置換された若しくは無置換のＣ１−Ｃ３アルキル基、置換された若しくは無置換のＣ２−Ｃ３アルケニル基、又は置換された若しくは無置換のＣ２−Ｃ３アルキニル基から選択される置換基によって置換されていてもよい。上記アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基等は、さらに、低級アルキル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、アミノ基、アルキルアミノ基、及び芳香族複素環からなるグループより独立して選択される一つまたはそれより多くの基で置換されていてもよい。本発明の置換された若しくは無置換の２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基を、本明細書において文脈により、「Ｐａ」又は「Ｐａ類似体」と呼称する。
【００３５】
限定されるわけではないが、前記置換された若しくは無置換の２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基は、
Ａ１）２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基（Ｐａ）；
Ａ２）２−ホルミル−４−（１−プロピン−１−イル）−１Ｈ−ピロール−１−イル基； 
Ａ３）２−ホルミル−４−メチル−１Ｈ−ピロール−１−イル基；及び
Ａ４）２−ホルミル−４−エチニル−１Ｈ−ピロール−１−イル基
からなるグループから選択されてもよい。より好ましくは、２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基である。
【００３６】
本発明の「置換された若しくは無置換の２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基」（「Ｐａ」又は「Ｐａ類似体」）を有するヌクレオシド、ヌクレオチドは、公知の方法を用いて合成することが可能である。その出発原料である例えば、ピロール−２−カルボアルデヒドは、例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ社  ［１００３−２９−８］、Ｍｅｒｃｋ社  ［８０７５７４］から購入することができる。また、Ｐａ誘導体は、基本的にＰａから誘導することによって合成できる。例えば、Ｐａの４位にプロピンを導入した誘導体は、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１３，ｐ．４５１５−４５１８（２００３）（非特許文献２８）に記載されている。
【００３７】
本発明の「６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基」は、以下の一般式で表される構造を有する。
【００３８】
【化４】
0005649018.tif 000005
【００３９】
［ここにおいて、
Ｒ１は、水素又はアミノ基であり、
Ｒ２は、置換された又は無置換の２−チエニル基又は２−チアゾリル基である。］
Ｒ２のチエニル基又はチアゾリル基は、無置換であるかあるいは、４位及び／又は５位が、メチル基、アミノ基、ニトロ基及びヒドロキシ基からなるグループより独立して選択される一つまたはそれより多くの基で置換されていてもよい。本発明の６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基のうち、Ｒ２が置換された又は無置換の２−チエニル基のものを、本明細書において文脈により、「ｓ」又は「ｓ類似体」と呼称する。本発明の６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基のうち、Ｒ２が置換された又は無置換の２−チアゾリル基のものを、本明細書において文脈により、「ｖ」又は「ｖ類似体」と呼称する。
【００４０】
限定されるわけではないが、前記６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基は、
Ｂ１）２−アミノ−６−（２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基（ｓ）；
Ｂ２）６−（２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基（ｓ’）；
Ｂ３）２−アミノ−６−（４−メチル−２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基；
Ｂ４）６−（４−メチル−２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基；
Ｂ５）２−アミノ−６−（５−メチル−２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基；
Ｂ６）６−（５−メチル−２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基；
Ｂ７）２−アミノ−６−（２−チアゾリル）−９Ｈ−プリン−９−イル基（ｖ）；
Ｂ８）６−（２−チアゾリル）−９Ｈ−プリン−９−イル基；
Ｂ９）２−アミノ−６−（４−メチル−２−チアゾリル）−９Ｈ−プリン−９−イル基；
Ｂ１０）６−（４−メチル−２−チアゾリル）−９Ｈ−プリン−９−イル基；
Ｂ１１）２−アミノ−６−（５−メチル−２−チアゾリル）−９Ｈ−プリン−９−イル基；及び
Ｂ１２）６−（５−メチル−２−チアゾリル）−９Ｈ−プリン−９−イル基
からなるグループから選択されてもよい。より好ましくは、２−アミノ−６−（２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基である。
【００４１】
上記塩基のうち、Ｂ１）は、「ｓ」であり、Ｂ２）ないしＢ６）は「ｓ類似体」である。また、Ｂ７）は、「ｖ」であり、Ｂ８）ないしＢ１２）は「ｖ類似体」である。
さらにより好ましくは、前記置換された若しくは無置換の２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基が、２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基であり、そして、前記６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基が、２−アミノ−６−（２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基である。
【００４２】
本発明の「６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基」、及びこれを含むヌクレオシド、ヌクレオチドは、公知の方法を用いて合成することが可能である。具体的には例えば、本明細書の実施例１には、２−Ｎ−フェノキシアセチル−６−（２−チエニル）−９−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−１−β−Ｄ−リボフラノシル）プリンから、２−アミノ−６−（２−チエニル）−９−（１−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン  ５’−三リン酸（ｓＴＰ）を合成する方法を開示した。
【００４３】
またｓの合成は、例えば、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１１，ｐ．２２２１−２２２３（２００１）（非特許文献２９）の第２頁の第二段落に記載されている。また、ｖの合成は、例えば特許文献３の段落００２６、００２７、図５−６等に開示されている。あるいは、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２７，p.８６５２−８６５８（２００５）（非特許文献３０）の第２頁の右側の段落に開示されている。
【００４４】
ｓ、ｖ以外の、本発明の「６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基」を有するヌクレオシド、ヌクレオチドも、ｓ又はｖのいずれかの合成方法と同様の方法を用いて合成することができる。例えば、フランを結合したo は、ｓと同様の合成法で合成可能である（非特許文献２９）。
【００４５】
本発明は、置換された若しくは無置換の２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基を塩基として有するヌクレオチドと、６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドとが塩基対を形成している、核酸を提供する。本明細書において「核酸」とは、１より多くのヌクレオチドが、５’→３’の方向に結合した核酸鎖の分子を意味する。本発明の核酸は、一本鎖又は二本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡを含む。二本鎖は、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ、又はＤＮＡ／ＲＮＡであってもよい。また、ＤＮＡには、ＲＮＡを鋳型として逆転写してなるｃＤＮＡも含まれる。あるいは、核酸は３本鎖、４本鎖等も形成しうる。
【００４６】
本発明者らは、核酸のさらなる機能拡張をめざして、非天然型塩基をもつヌクレオシド又はヌクレオチドの創製へ取り組んだ。新たに開発された人工塩基対の態様として、置換された若しくは無置換の２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基を塩基（例：Ｐａ）として有するヌクレオチドと、６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基（例：ｓ）として有するヌクレオチドとの塩基対が含まれる。（図１）。これにより特に、Ｐａを含むＤＮＡ鋳型を用いたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによる転写において、ＲＮＡへのｓの特異的取り込みが可能となった。
【００４７】
ｓおよびＰａ間では有意な水素結合相互作用が存在しないにもかかわらず（非水素結合ｓ−Ｐａ対）、転写におけるｓ−Ｐａ対合の効率および選択性は、天然の塩基対合のそれと同程度に高いものである。このｓ−Ｐａ対は、先に開発された親水性ｓ−ｚ対よりも高い効率を示す。ｓ及びＰａの相補的な形状は互いに適合するが、天然のプリン類及びピリミジン類の形状とは相違する。この特異的な立体化学的適合が、天然塩基との非規範的対合を排除し、その結果、転写の際にｓ−Ｐａの高い選択性が得られると考えられる。このように、形状−相補性は転写、及び複製における特異的な塩基対合に重要な役割を果たす。
【００４８】
本発明の、置換された若しくは無置換の２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基を塩基として有するヌクレオチドと、６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドとは、異なる２本の核酸上に存在して塩基対により二本鎖を形成しうる。あるいは、両ヌクレオチドは同一の一本の核酸上に存在してもよい。この場合、塩基対により、一本鎖はループ構造を形成してもよい。
【００４９】
本発明の置換された若しくは無置換の２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基を塩基として有するヌクレオチド、あるいは６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドは、転写、複製又は逆転写反応により、ＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸に取り込むことが可能である。あるいは、天然型塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチドと同様に、化学合成によってＤＮＡ又はＲＮＡに取り込んでもよい。
【００５０】
転写、複製又は逆転写反応は公知の方法に従って行うことが可能である。限定されるわけではないが、例えば、転写反応はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ等）、複製反応は、クレノウフラグメント（ＫＦ）、逆転写反応はＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＸＬ  （ＡＭＶ−ＲＴ）（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用することが可能である。複製反応は、反応中に本発明のヌクレオチドが除去されてしまうのを防ぐために、例えば、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性をもたないＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ  ＴａｑＴＭ）を用いて、置換された若しくは無置換の２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含むプライマーによる鋳型ＤＮＡのＰＣＲ増幅も可能である。
【００５１】
限定されるわけではないが、本発明の核酸は一態様において、核酸の転写、逆転写、複製又は翻訳の工程で、塩基対を形成している。本発明の核酸が、転写工程で塩基対を形成している場合、前記置換された若しくは無置換の２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基を塩基として有するヌクレオチドがＤＮＡの一部であり、そして、前記６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドがＲＮＡの一部でありうる。
【００５２】
核酸の調製方法
本発明はまた、６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸を調製する方法を提供する。本発明の調製方法は、置換された若しくは無置換の２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型として転写、逆転写又は複製を行い、前記置換された若しくは無置換の２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基を有するヌクレオチドの相補的な位置に、６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を有するヌクレオチドを組み込む、ことを含む。
【００５３】
２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基を有するヌクレオチド、並びに６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を有するヌクレオチドの定義については、本明細書の「本発明の人工塩基対に基づく核酸」の項目において前述した通りである。
【００５４】
本明細書中の実施例１−２でも明らかにされたように、鋳型中に置換された若しくは無置換の２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基を塩基として有するヌクレオチドが２つまたはそれ以上連続して存在する場合でも、転写反応は進行し、相補的な位置に６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドが取り込まれる。よって、本発明の方法により従来不可能であった、非天然型塩基ｓが２つ又はそれより多く隣接して配置されるＤＮＡ及びＲＮＡの作成も可能となった。よって、本発明の調製方法は、一態様において、鋳型において、前記置換された若しくは無置換の２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基を塩基として有するヌクレオチドが２個以上存在する。
【００５５】
本発明はさらに、上記本発明の方法によって調製された、前記６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸を提供することを目的とする。
【００５６】
本発明のヌクレオチドが組み込まれた核酸は、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡ、リボザイム又はアプタマーとして使用されうる。アンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡとは、ある特定の遺伝子の発現を抑えるＤＮＡ又はＲＮＡである。標的とする遺伝子配列（センス鎖）の全長又は部分配列に対して相補的という意味で名付けられた。人為的に遺伝子発現を調節する手法として使用されうる。本発明のヌクレオチドが組み込まれたアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡは、非天然型塩基を含むため標的に対する相補性が天然型塩基のみを使用した場合と比較して異なるものを創製しうる。リボザイムは、ＲＮＡを構成成分とする触媒の総称である。アプタマーは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏセレクション法によって得られた、タンパク質等の特定の分子に結合する機能を有する核酸である
また、本発明の、ヌクレオチドが組み込まれた核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）（例えば、ｍＲＮＡ、合成ＲＮＡ）は、タンパク質、ペプチドの全体又は一部をコードするものであってもよい。本発明の核酸は遺伝子断片やプローブなどとして使用されうる。天然の遺伝子の一部又は全部を本発明の核酸で置換した態様、天然の遺伝子に本発明のヌクレオチドを１個又はそれより多く付加したもの、又はこれらを組み合わせたものも本発明に包含される。
【００５７】
さらにまた、本発明の非天然型塩基を有するヌクレオチドが組み込まれた核酸は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、ＲＮＡｉ）においても利用可能である。ＲＮＡ干渉は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によってその配列特異的にｍＲＮＡが分解され、その結果遺伝子の発現が抑制される現象である。ＲＮＡ干渉の典型的な例としては、ｄｓＲＮＡは、ＲＮａｓｅＩＩＩファミリーに属するダイサー（Ｄｉｃｅｒ）により、３’末端の側に２塩基程度のオーバーハングを有する約２１塩基−２３塩基のｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）にプロセッシングされる。ｓｉＲＮＡはＲＩＳＣと呼ばれるｓｉＲＮＡ−蛋白質複合体に取り込まれ、配列特異的にｍＲＮＡを分解する。ＲＮＡ干渉は、哺乳動物（ヒト、マウス等）、線虫、植物、ショウジョウバエ、菌類などの広範な生物種間で保存されている現象であることが示されている。本発明の非天然型塩基を有するヌクレオチドが組み込まれた核酸は、ＲＮＡ干渉におけるｓｉＲＮＡとして、または分解を受けるｍＲＮＡの一部として利用可能である。
【００５８】
また、本発明のヌクレオチドを含む新たなコドンを設計することが可能である。前述したように、鋳型中に置換された若しくは無置換の２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基を塩基（例えば、Ｐａ）として有するヌクレオチドが２つまたはそれ以上連続して存在する場合でも、転写反応は進行し、相補的な位置に６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチド（例えば、ｓ）が取り込まれる。よって、本発明の方法により従来不可能であった、非天然型塩基ｓが２つ又はそれより多く隣接して配置されるＤＮＡ及びＲＮＡの作成が可能である。よって、ｓを３つ含むコドン（ｓｓｓ）、ｓを２つ含むコドン（例えば、ｓｓＡ、Ｇｓｓ、ｓＧｓ）、ｓを１つ含むコドン（例えば、ｓＡＧ、ＣｓＴ、ＡＧｓ）を設計することができる。新たなコドンは、天然型のアミノ酸をコードさせることもできるし、また、非天然型のアミノ酸をコードさせることもできる。このように、本発明は新規な非天然型人工塩基を提供するのみならず、本発明のヌクレオチドを含む新たなコドンの設計による、全く新しい遺伝暗号の設計を可能とするものであり、新たな遺伝暗号の世界を提供するものである。
【００５９】
さらに、本発明の新たなコドンに応じたｔＲＮＡ系を設計することにより、非常に多くのアミノ酸を利用可能とする新たなタンパク質合成システムを設計することができる。利用可能なアミノ酸はリボソームにおけるタンパク質合成酵素系で利用できるものであればよい。従って、本発明は前記本発明のコドンを用いた新たなタンパク質合成システムを提供する。本発明のタンパク質合成システムによれば、所望の位置のコドンの核酸を本発明の核酸によって効率よく置換、又はコドンの所望の位置へ本発明の核酸を導入することにより、所望の非天然型のアミノ酸を含有するタンパク質の製造が可能となる。
【００６０】
立体構造の解析方法
６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチド（例えば、ｓ）は蛍光塩基であり、これを塩基として含むヌクレオチドは強い蛍光特性を有する。
【００６１】
具体的には、６位に芳香族複素環などを結合させて電子共役系を広げたプリン誘導体は蛍光特性がでやすい。さらに、限定されるわけではないが、従来から２−アミノプリンは蛍光特性を有することがわかっている。よって、限定されるわけではないが、特に６位に芳香族複素環が結合しており、かつ２位にアミノ基を有するプリンは強い蛍光特性を示す。特に、ｓ、ｓ’及びｖは好ましい蛍光塩基である。従来技術に対して、蛍光色素を結合した第５番目の塩基を人工塩基対を介して、転写により核酸中の特定部位に導入できれば、核酸の標識、そして、それによる核酸の解析、検出が非常に簡便になる。本発明ではＰａ−ｓという人工塩基対を用いて、これを可能にした。
【００６２】
本発明者らは、蛍光性の人工塩基ｓをプローブとして、酵母ｔＲＮＡＰｈｅを部位特異的に蛍光標識し、標識部位、温度およびＭｇ２＋濃度に応じた、特有の蛍光プロフィールを得た（実施例３）。さらに、蛍光プロフィールを同一のｓ標識された酵母ｔＲＮＡＰｈｅに対するＵＶプロフィールと比較した。その結果、以下のことが判明した。
【００６３】
第一にｓを含む各ｔＲＮＡ転写産物のＵＶ吸収スペクトルの変化から求めた融解温度（Ｔｍ値）は、天然のｔＲＮＡ転写産物のＵＶ吸収スペクトルの変化から求めた融解温度（Ｔｍ値）と同じくらいの高さであった。このことはこれらの位置におけるｓによる置換は、ｔＲＮＡ構造全体を有意に不安定化しないことを示唆している。
【００６４】
第二に、特定の位置にｓを含む各ｔＲＮＡは、局部構造特性を反映する、蛍光強度の特徴的な変化を表示した。すなわちｔＲＮＡの高次構造において、ｓが近隣の塩基と積み重なっている場合は蛍光強度が弱く、積み重なり（ｓｔａｃｋｉｎｇ）の程度が減少するに従い蛍光強度が増加した。この発見は、ＲＮＡの特定の位置にｓを導入し、例えば温度変化に伴う蛍光強度の変化を測定することにより、高次構造中におけるそのｓの積み重なりの状態を把握することが可能なことを示している。そこで、ｓを含むＲＮＡの用途として、当該ＲＮＡの高次構造の新規な解析方法が提供される。
【００６５】
より具体的には、Ｍｇ２＋（２及び５ｍＭ）の存在下における、酵母ｔＲＮＡＰｈｅのｓ蛍光プロフィールは、明確に２つのグループに分類された。低温度でグループ１（ｔＲＮＡ  １６ｓ、１７ｓ及び４７ｓ）によって放射されるｓ蛍光の強度は、グループ２（ＲＮＡ  ３６ｓ、５７ｓ及び５９ｓ）によって放射される強度よりも、１．７−３．４倍大きかった。温度が上昇すると、グループ１によって放出される大きな強度は減少し、逆に、グループ２による強度は上昇した。これらの結果は、グループ１のｓ塩基は生理学的温度で溶液中に露出しており、そして、温度の上昇による折り畳み構造の変性に伴い、ｓ塩基の他の塩基との非特異的な相互作用が高まることを示唆している。対照的に、グループ２の塩基は、低温下では折り畳み構造において近隣の塩基が積み重なっており、そして、温度の上昇によって塩基積み重ねが徐々に変性する。この推論は、ｔＲＮＡの結晶構造中の各部位における元来の塩基の配座（図４）（非特許文献２０）と極めてよく一致する。さらに、グループ１の蛍光強度は、生理学的温度において、Ｍｇ２＋の添加によって劇的に上昇する。このことは、Ｍｇ２＋存在下でｔＲＮＡが活性型のＬ字型構造を形成し、これらの位置における塩基が外側に配置されることを示唆している。
【００６６】
第三に、蛍光プロフィールから得られるＴｍ値は、ＵＶ融解プロフィールから得られるＴｍ値と比較して、ｔＲＮＡ構造中の各局部構造の安定性を反映した。
例えば、ｔＲＮＡ  ３６ｓの蛍光プロフィールから得られるＴｍ値は、ＵＶプロフィールから得られるＴｍ値よりも高かった。このことは、全ｔＲＮＡ構造の安定性に比べてアンチコドン  ステム−ループがより高い安定性を有することを示唆している。対照的に、ｔＲＮＡ１６ｓ及び１７ｓの低い安定性（蛍光プロフィールから得られる低いＴｍ値）は、Ｄループを含む部分構造は、ｔＲＮＡ構造全体の脆弱な部分の可能性があることを示唆している。よって、各ｓ標識体の蛍光プロフィールから得られるＴｍ値を、ＵＶ融解プロフィールから得られるＴｍ値と比較することにより、ｓ標識された局部構造の安定性の高さを判別することができる。
【００６７】
このように、ｓ標識を利用した部位特異的な蛍光プローブ化は、三次元ＲＮＡ分子の局部構造特徴を研究するための有力なツールとなりうる。
よって、本発明は、本発明の核酸における、前記６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む局部領域の立体構造の解析方法を提供することを目的とする。本発明の解析方法は、前記６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチド中の、塩基に由来する蛍光強度をいろいろな環境下（温度変化、イオン濃度（例えば、マグネシウム）の変化など）で測定することを含む。
【００６８】
本発明の解析方法は、一態様において、前記６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチド中の、塩基に由来する蛍光強度が、温度の上昇に伴い実質的に上昇する場合には、生体内温度下で、前記ヌクレオチドは立体配座において周囲に存在するヌクレオチドと積み重なっていると判断し、そして、蛍光強度が温度の上昇に伴い実質的に低下又は上昇しない場合には、生体内温度下で、前記ヌクレオチドは外部に暴露していると判断する。
【００６９】
「生体内温度」とは、各生体が自然の条件下で生息している場合の体内の温度を意味し、生体の種類に応じて変化する、例えば、ヒトの場合は約３５．０℃ないし約３９．０℃であり、ウシの場合は、約３６．７℃ないし約３９．３℃、マウスの場合は、約３５．０℃ないし約３９．０℃、イヌの場合は、約３７．９℃ないし約３９．９℃、ブタの場合は、約３８．７℃ないし約３９．８℃である。
【００７０】
「ヌクレオチドが立体配座において周囲に存在するヌクレオチドと積み重なっている」とは、より具体的には、２つ以上の塩基が好ましくは約５Å以内で積み重なった状態(スタッキング)を意味する。
【００７１】
「ヌクレオチドが外部に暴露している」とは、より具体的には、塩基部分が他の塩基とスタッキングしていない（好ましくは約５Å以上離れた）状態、あるいは、消光性の塩基と十分にはなれている状態を意味する。
【００７２】
蛍光強度は、好ましくは、前記６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基の種類に応じた最大の蛍光特性を示す特定の波長で測定する。例えば、Ｂ１）２−アミノ−６−（２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基（ｓ）は、最大励起波長である３５２ｎｍで励起すると、４３４ｎｍを中心とする蛍光波長を示す。同様に、Ｂ２）６−（２−チエニル）−９Ｈ−プリン−９−イル基（ｓ’）は、３２５ｎｍで励起すると３８１ｎｍを中心とする蛍光波長を示し、Ｂ７）２−アミノ−６−（２−チアゾリル）−９Ｈ−プリン−９−イル基（ｖ）は、３６３ｎｍで励起すると４６１ｎｍを中心とする蛍光波長を示す。
【００７３】
「蛍光強度が温度の上昇に伴い実質的に上昇する」とは、例えば温度が２０℃から９０℃まで上昇した場合に、蛍光強度が上昇することが確認できること（例えば１．１倍以上）を意味する。蛍光強度の上昇の割合が大きいほど、生体内温度下で、その蛍光性の塩基が立体配座において周囲に存在する、より多くのヌクレオチドと、及び／又は、より近距離で積み重なっていることを示す。
【００７４】
「蛍光強度が温度の上昇に伴い実質的に低下又は上昇しない場合」とは、例えば温度が２０℃から９０℃まで上昇した場合に蛍光強度が変化しない又は低下することが確認できること（例えば、１０％以上減少）を意味する。蛍光強度の低下の割合が大きいほど、生体内温度下で、その蛍光性の塩基が孤立して存在していて、その部分の核酸の構造が特定の構造を取っていないということを示す。
【００７５】
核酸の二本鎖形成の検出方法
本発明はさらに、本発明の核酸の調製方法によって調製された、前記６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸の別の利用態様の１つである、核酸の二本鎖形成の検出方法を提供する。本発明の検出方法は、
Ｉ）  ｉ）本発明の核酸の調製方法によって調製された、前記６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸、と、
ｉｉ）５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドであって、前記塩基の５位に、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシテトラメチルローダミン（６−ＴＡＭＲＡ）、  ５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホン酸（ＤＡＮＳＹＬ）、５−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（５−ＨＥＸ）、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（６−ＨＥＸ）、５−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（５−ＴＥＴ）、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（６−ＴＥＴ）、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（５−ＲＯＸ）、及び６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（６−ＲＯＸ）からなるグループから選択される蛍光色素が、直接又はリンカーを介して結合している前記ヌクレオチド、を含む核酸、とをハイブリダイズさせ、そして、
ＩＩ）  蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む。
【００７６】
本発明の核酸の二本鎖形成の検出方法は、６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸、と、蛍光色素によって５位が置換された、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸とのハイブリダイズによる蛍光スペクトルの変化を利用するものである。特許文献１、２、非特許文献３０等に記載されているように、６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基（例えばｓ、ｖ）と、２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基（ｙ）は塩基対合を形成しうる。なお、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドの合成方法等については、本明細書中に別途詳述する。
【００７７】
６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基の蛍光と、これとは別の特性を有する蛍光色素で置換された５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基の蛍光が各核酸分子に存在する場合に、核酸の二本鎖が形成され蛍光同士が物理的に近傍に存在すると、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）が生じて蛍光スペクトルが変化する。本発明の検出方法は、核酸の二本鎖の形成をＦＲＥＴによる蛍光スペクトルの変化の測定によって検出するものである。
【００７８】
「蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）」は、ある蛍光分子から他の分子へ、共鳴により励起エネルギーが移動する現象を意味する。エネルギーを与える分子はドナー（供与体）、受け取る分子はアクセプター（受容体）と呼ばれる。ＦＲＥＴが生じると、エネルギーを失ったドナーは基底状態に戻り、同時にエネルギーを受け取ったアクセプターは励起状態となる。従って、ドナーの蛍光は弱まり、アクセプターが蛍光分子であればその蛍光が観察される。アクセプターが消光分子であれば、ドナーが単独の場合には観察されていた蛍光がＦＲＥＴにより観察されなくなる。ＦＲＥＴによるタンパク質の検出、核酸の検出の一般的な方法は公知であり、例えば、ＲＮＡアプタマーに２種類のＦＲＥＴを起こす色素を導入して、標的タンパク質を検出する方法（Ｊｈａｖｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）や、ヘアピン型核酸を利用した相補鎖核酸の検出法（Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６)が知られている。その他、ＦＲＥＴに関しては、Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１及びＫｌｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１に概説されている。
【００７９】
ＦＲＥＴが生じるためには、以下の３条件を満たす必要がある。ｉ）ドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルの重なりがあること。スペクトルの重なり範囲は大きい方が望ましいが、必ずしも完全に重なっている必要はない。ドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルが３０％以上重なっていることが好ましく、５０％重なっていることがより好ましい。ｉｉ）ドナーとアクセプターが物理的に近距離に存在すること。ＦＲＥＴが５０％の確率で生じる距離は３ｎｍないし６ｎｍと考えられており、ＦＲＥＴの効率はこの距離の変化に対して敏感に変化する。例えば、核酸が二本鎖を形成した場合に、蛍光特性を有する６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドに対し、これとは別の特性を有する蛍光色素で置換された５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドが近接し、両者の距離が好ましくは１０ｎｍ以内、より好ましくは６ｎｍ以内、最も好ましくは３ｎｍ以内である場合に蛍光スペクトルの変化が検出可能である。ｉｉｉ）ドナーとアクセプターの相対的な向きが適切であること。
【００８０】
本発明の検出方法の一態様において、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸は、塩基の５位に、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）又は６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）がリンカーを介して結合している、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸である。
【００８１】
前述したように、例えばｓは３５３ｎｍの最大励起波長、そして、最大励起波長である３５２ｎｍで励起すると、４３４ｎｍを中心とする波長を示す。一方、ＦＡＭは、ＦＡＭの吸収極大波長は４９３ｎｍ、蛍光極大波長は５２２ｎｍである。３５３ｎｍの波長で励起した場合、ｓを有するヌクレオチドは４３４ｎｍを中心とする波長を示す。これに対し、ＦＡＭで置換された５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチド（例えば、ＦＡＭ−ｙ）がｓに近接すると、ｓからの蛍光を吸収し、蛍光極大波長が５２２ｎｍの蛍光スペクトルを示すようになる。即ち、３５３ｎｍの波長で励起した場合に、４３４ｎｍの蛍光スペクトルが減少し、５２２ｎｍの蛍光スペクトルが増加するほど、ｓに対してＦＡＭ−ｙが近接していること、即ち、ｓを含む核酸とＦＡＭ−ｙを含む核酸とのハイブリダイゼーションにより核酸の二本鎖が形成されていることを検出することができる。
【００８２】
５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチド
５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドにおいて、５位に蛍光色素は、直接又はリンカーを介して結合している。これらの標識ヌクレオシド又はヌクレオチドについては、本発明者の先行する特許出願（特願２００４−３２４２７１、２００４年１１月８日出願、未公開）に詳述されている。
【００８３】
蛍光色素は、公知の蛍光色素を利用可能であるが、好ましくは、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシテトラメチルローダミン（６−ＴＡＭＲＡ）、５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホン酸（ＤＡＮＳＹＬ）、５−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（５−ＨＥＸ）、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（６−ＨＥＸ）、５−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（５−ＴＥＴ）、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（６−ＴＥＴ）、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（５−ＲＯＸ）、及び６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（６−ＲＯＸ）からなるグループから選択される。フルオレセイン及びローダミンは、一般的に開環型及びスピロ型の二通りで表記される。これらの蛍光色素については、例えば Ｔｕｓｃｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｍｉｓｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｇｉｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；及び、Ｃｈｅｈａｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９;に詳述されている。
【００８４】
例えば、ＦＡＭの吸収極大波長は４９３ｎｍ、蛍光極大波長は５２２ｎｍである。また、ＴＡＭＲＡの吸収極大波長は５５３ｎｍ、蛍光極大波長は５７８ｎｍである。ＤＡＮＳＹＬの吸収極大波長は３３５ｎｍ、蛍光極大波長は５１８ｎｍである。ＨＥＸの吸収極大波長は５３５ｎｍ、蛍光極大波長は５５６ｎｍである。ＴＥＴの吸収極大波長は５２１ｎｍ、蛍光極大波長は５３６ｎｍである。５−ＲＯＸの吸収極大波長は５６７ｎｍ、蛍光極大波長は５９１ｎｍである。６−ＲＯＸの吸収極大波長は５７０ｎｍ、蛍光極大波長は５９０ｎｍである。
【００８５】
５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドは、５位置換基として蛍光分子を有するため、蛍光分子の種類に応じて、核酸の検出を行うことが可能である。よって、標識核酸として当該核酸と相互作用する物質検出のプローブとして使用されうる。また、各蛍光色素によって蛍光色が異なるため、多重染色に使用することも可能である。
【００８６】
蛍光色素は、２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基の５位に直接結合させても、あるいはリンカーを介して結合させてもよい。リンカーの種類は特に限定されず、当業者は適宜採用可能である。リンカーは限定されるわけではないが、好ましくは、下記の化学式Ｉ−ＩＩＩ：
【００８７】
【化５】
0005649018.tif 000006
［式Ｉ中、ｎは１ないし５の整数から選択される］
【００８８】
【化６】
0005649018.tif 000007
［式ＩＩ中、ｍ及びｌは、１ないし５の整数から各々独立に選択される］
及び
【００８９】
【化７】
0005649018.tif 000008
【００９０】
からなるグループから選択される
５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドの合成法は、特に限定されることはない。３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２（１Ｈ）−オンに、先ず５位に置換基を導入し、次いで、三リン酸を導入してもよい。あるいは、３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２（１Ｈ）−オンに、先ず三リン酸を導入し、次いで、置換基を導入してもよい。特に、大きな基を導入する場合、先ず、５位にアミノプロピニル基等を導入し、これに活性化した置換基を結合させてもよい。
【００９１】
あるいは、蛍光色素による、２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドの修飾は、単独のヌクレオチド合成時ではなく、当該ヌクレオチドを含む核酸を転写等によって合成した後に行うことも可能である。
【００９２】
５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基は、６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基と、２箇所で水素結合を生じる。５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基は、立体構造上、天然型プリン塩基Ａ（アデニン）及びＧ（グアニン）とは塩基対を形成できない。そして、６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基は立体障害のため、天然型Ｔ（チミン）、Ｕ（ウラシル）及びＣ（シトシン）とは塩基対を形成できない。よって、６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基（例えばｓ、ｖ）と、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基は、特異的に塩基対を形成しうる。
【００９３】
５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドは、転写、複製又は逆転写反応により、ＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸に取り込むことが可能である。具体的には、６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸、例えば、ｓあるいはｖを含む鋳型ＤＮＡを用いてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応を行うと、２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基の基質（例えば、ｙＴＰ）が部位特異的に、ｓあるいはｖに相補して、ＲＮＡ中に取り込まれる。ｙは、その５位を化学的に修飾することができるので、種々の機能性のｙ誘導体をＲＮＡ中の特定の部位に取り込ませることが出来る。
【００９４】
あるいは、天然型塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチドと同様に、化学合成によってＤＮＡ又はＲＮＡに取り込んでもよい。
同一の鎖上に２種類の人工塩基を含む核酸を調製する方法
本発明はさらに、
ｉ）  ６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチド
並びに、
ｉｉ）  ５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドであって、前記塩基の５位に、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシテトラメチルローダミン（６−ＴＡＭＲＡ）、  ５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホン酸（ＤＡＮＳＹＬ）、５−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（５−ＨＥＸ）、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（６−ＨＥＸ）、５−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（５−ＴＥＴ）、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（６−ＴＥＴ）、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（５−ＲＯＸ）、及び６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（６−ＲＯＸ）からなるグループから選択される蛍光色素が、直接又はリンカーを介して結合している、前記ヌクレオチド
を、同一の鎖上に含む核酸を調製する方法を提供することを目的とする。本発明の調製方法は、
ｉｉｉ）  置換された若しくは無置換の２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基を塩基として有するヌクレオチド
並びに
ｉｖ）  ６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチド
を含む核酸を鋳型として転写、逆転写又は複製を行い、前記ｉｉｉ）のヌクレオチドの相補的な位置に、前記ｉ）のヌクレオチドを組み込み、そして、前記ｉｖ）のヌクレオチドの相補的な位置に、前記ｉｉ）のヌクレオチドを組み込む
ことを含む。
【００９５】
本発明の上記調製方法は、置換された若しくは無置換の２−ホルミル−１Ｈ−ピロール−１−イル基を塩基として有するヌクレオチドを鋳型とした場合の、６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドの取り込みと、６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドを鋳型とした場合の、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドの取り込みを組み合わせて利用したものである。
【００９６】
本発明はさらにまた、上記方法によって調製された
ｉ）  ６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチド
並びに、
ｉｉ）  ５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドであって、前記塩基の５位に、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシテトラメチルローダミン（６−ＴＡＭＲＡ）、  ５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホン酸（ＤＡＮＳＹＬ）、５−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（５−ＨＥＸ）、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（６−ＨＥＸ）、５−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（５−ＴＥＴ）、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（６−ＴＥＴ）、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（５−ＲＯＸ）、及び６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（６−ＲＯＸ）からなるグループから選択される蛍光色素が、直接又はリンカーを介して結合している、前記ヌクレオチド
を、同一の鎖上に含む核酸も提供する。
【００９７】
本発明の上記核酸は、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡ、リボザイム又はアプタマーとして利用可能である。さらに、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、ＲＮＡｉ）においても利用可能である。
【００９８】
本明細書中の実施例４では、Ｐａ及びｖを含むＤＮＡを鋳型として転写を行い、ｓとｙ、あるいは、ｓとＦＡＭ−ｙを同一鎖上に含むＲＮＡを作成した。
核酸のステム−ループ（ヘアピン）構造形成の検出方法
本発明はまた、６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドと５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドとを同一の鎖上に含む、本発明の核酸のステム−ループ（ヘアピン）構造形成の検出方法を提供することを含む。本発明の検出方法は、
１）  本発明の核酸において、ｉ）のヌクレオチドと、ｉｉ）のヌクレオチドとをハイブリダイズさせ、そして、
２）  蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む。
【００９９】
本発明の核酸のステム−ループ（ヘアピン）構造形成の検出方法は、「核酸の二本鎖形成の検出方法」の項目で上述したＦＥＲＴを利用するものである、即ち、６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基の蛍光と、これとは別の特性を有する蛍光色素で置換された５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基の蛍光が、「同一分子内に」存在する場合に、ステム−ループ（ヘアピン）構造が形成され蛍光同士が物理的に近傍に存在すると、ＦＲＥＴが生じて蛍光スペクトルが変化する。本発明の検出方法は、核酸のステム−ループ（ヘアピン）構造の形成をＦＲＥＴによる蛍光スペクトルの変化の測定によって検出するものである。
【０１００】
核酸のステム−ループ（ヘアピン）構造の形成をＦＲＥＴによる蛍光スペクトルの変化は、別個の二本の核酸同士で二本鎖が形成される場合の蛍光スペクトルの変化と同様に観察することができる。
【０１０１】
本発明の好ましい一態様において、核酸のステム−ループ（ヘアピン）構造は、６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドと５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドとを同一の鎖上に含む、本発明の核酸が、分子内でｓとＦＡＭ−yを含む自己相補の配列がステムを作ることにより形成される。このように、核酸分子内のｓとＦＡＭ−ｙをプローブにして両者間のＦＲＥＴの効率を測定することにより、ステム−ループ構造などの核酸の高次構造を知ることが出来る。
【０１０２】
さらに、別の標的分子が結合した場合のみにステム−ループ（ヘアピン）構造を形成するような核酸分子を設計すれば、蛍光スペクトルの変化を利用して、その標的分子を検出するシステムを作ることが出来る。したがって、本発明は、リアルタイム分子間相互作用検出システム、リアルタイム分子内構造変化の検出システム、モレキュラービーコン、ＦＲＥＴの効率を利用した分子間距離の推定等に利用可能である。標的分子としては、ＤＮＡ，ＲＮＡ、タンパク質等が含まれる。
【０１０３】
本明細書中の実施例４では、ｓとＦＡＭ−ｙを同一鎖上に含むＲＮＡについて、ｓとＦＡＭ−ｙ間のＦＲＥＴを調べた。本明細書中の実施例４では、３５０ｎｍでｓを励起した場合に、ステム−ループ構造を形成させてｓとＦＡＭ−ｙの間で塩基対が作られた場合と、相補鎖ＲＮＡを加えて分子間での二本鎖構造を形成させてｓとＦＡＭ−ｙが離れた場合の、いずれにおいてもＦＲＥＴが観測されて、ＦＡＭ−ｙ由来の５２１ｎｍ付近の蛍光が現れた。しかしながら、ｓとＦＡＭ−yを導入した断片のｓの蛍光強度（図１２ｂおよびｃの実線のスペクトルの４４０ｎｍ付近の強度）とその対照のｓとｙを導入した断片のｓの蛍光強度（図１２ｂおよびｃの破線のスペクトルの４４０ｎｍ付近の強度）を比較すると、ステム−ループ構造を形成している場合のほうが、顕著にｓの蛍光強度が減少した。ステム−ループ構造中のｓとＦＡＭ−ｙの距離は８−１０Åであり、二本鎖構造中のｓとＦＡＭ−ｙの距離は６５−６７Åに広がる。したがって、ｓとＦＡＭ−ｙの距離が近づいた場合に、両者間のＦＲＥＴの効率が上がっている。
【０１０４】
６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドを、２個以上隣接して含む核酸
６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドを２個以上隣接して含む核酸もまた、本発明の範囲内である。
【０１０５】
前記核酸において、６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドが２個以上同一の鎖上に隣接することにより、隣接した人工塩基の間で自己消光が生じるため、９Ｈ−プリン−９−イル基の蛍光強度が、９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドが隣接しない場合と比較して、有意に減少する（図１３ｃおよびｄを参照）。一方、９Ｈ−プリン−９−イル基の間で自己消光が生じていても、蛍光色素によって５位が置換された、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基とのハイブリダイズにより、９Ｈ−プリン−９−イル基と蛍光色素との間のＦＲＥＴを観察することができる（図１４ｃおよびｄを参照）。さらに、６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドを２個以上隣接して含む核酸においては、９Ｈ−プリン−９−イル基の蛍光強度が減少している、すなわちバックグラウンド蛍光が低いため、蛍光色素との間のＦＲＥＴを効率よく観察することができる（図１５を参照）。すなわち、６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドを２個以上隣接して含む自己消光プローブを使用する本発明のＦＲＥＴ系は、蛍光ドナーのバックグラウンドを低く抑えることができるため、大量のドナープローブの存在下においても蛍光アクセプターを含有する相補鎖の検出が可能である点で特に有用である。
【０１０６】
６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドを２個以上隣接して含む核酸は、上述した核酸の二本鎖形成の検出方法や核酸のステム−ループまたはヘアピン構造形成の検出方法に使用することができる。
【０１０７】
６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドを２個以上隣接して含む核酸において、隣接して含まれる６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドの数は、２個以上であれば特に限定されないが、好ましくは、２ないし１０個、２ないし５個、２ないし３個、最も好ましくは２個である。
【０１０８】
６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドを２個以上隣接して含む核酸は、本発明の核酸の調製方法、または公知の化学合成によって製造することが可能であるが、これらに限定されない。
【発明の効果】
【０１０９】
本発明によって、非天然型塩基の新たな塩基対合Ｐａ−ｓが見出されたことから、転写においても、対合する塩基間の形状の相補性が重要であることが示唆された（非特許文献５−６）。これにより、従来困難と考えられていた転写においても、６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドの取り込みが可能となった。
【０１１０】
本発明の方法は、所望の位置にｓを有すＲＮＡを得る方法として従来知られている、（１）化学的ＲＮＡ合成法、（２）ｙヌクレオチドを有する鋳型ＤＮＡの転写反応、（３）２−オキソ−１，３−ジヒドロ−イミダゾール−１−イル基を有するヌクレオチド（ｚ）を有する鋳型ＤＮＡの転写反応よりも有意に高収率である。
【０１１１】
従来の２−アミノプリンヌクレオチド類（非特許文献２１−２３）のような慣用された蛍光プローブは、転写によってＲＮＡに部位特異的に取り込まれることができないため、特に、長鎖ＲＮＡ分子で使用することが困難であった。即ち、従来法では、２−アミノプリンのヌクレオチド誘導体を化学合成によりＲＮＡ中に導入していたが、ＲＮＡの化学合成法では、長鎖のＲＮＡ（５０ヌクレオチド以上）を合成することは難しく、その操作も煩雑で時間がかかっていた。その結果、従来法は、限定的な利用に限られていた。
【０１１２】
これに対し、本発明では、蛍光特性を有する６位置換された９Ｈ−プリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドの、ＲＮＡへの部位特異的取り込みが可能となった。本発明では、鋳型となるＤＮＡを化学合成する必要があるが、ＤＮＡの化学合成は、ＲＮＡよりも長鎖長（１５０ヌクレオチド程度）の合成が可能であり、また、化学合成したＤＮＡを酵素を用いて結合させることも出来る。これにより特に、従来の蛍光プローブ法では不可能であった長鎖ＲＮＡの分析が可能になった。これは、大きなＲＮＡ分子内における特定された位置における局部配座変化の動態の研究のための、強力な道具となりうる。本発明の実施例３では、実際にｔＲＮＡ内の局部の高次構造（スタッキング）の解析が行われた。
【０１１３】
また、現在、ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉など、生体内の新たな機能が数多く見つかり、これらの現象を利用した医薬品の開発も進んでいる。しかし、それらのＲＮＡ分子の生体内での挙動を調べる手法は、それほど多くは無い。したがって、本蛍光プローブ法は、生体内のＲＮＡの解析、ならびに、ＲＮＡ医薬品の生体内での働きを調べる良い方法になる。
【０１１４】
さらに、本発明で新たに明らかにされたｓ−Ｐａ塩基対は、翻訳によってタンパク質にアミノ酸類似体を部位特異的に取り込ませることを可能にするため、遺伝子コードの拡張に実用的に使用しうる（非特許文献１５）。
【実施例】
【０１１５】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１１６】
実施例１  ｓ−Ｐａ塩基対合を利用したＴ７転写
本実施例では、ｓ−Ｐａ塩基対合を利用してＴ７転写を行った。
１）試薬、溶媒等
試薬及び溶媒は、標準的な供給業者から購入し、さらに精製することなく使用した。エレクトロスプレイ−イオン化マススペクトル（ＥＳＩ−ＭＳ）は、Ｗａｔｅｒｓ  ＺＭＤ  ４０００  ＬＣ／ＭＳシステム上に記録した。ＤＮＡ鋳型は、Ｐａ（非特許文献９）及び天然塩基のホスホルアミド類を用いて、自動ＤＮＡ合成機（ｍｏｄｅｌ３９２，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって化学合成した。ゲル電気泳動によってオリゴヌクレオチドを精製した。
【０１１７】
２）２−アミノ−６−（２−チエニル）−９−（１−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン  ５’−三リン酸（ｓＴＰ）の合成
２−Ｎ−フェノキシアセチル−６−（２−チエニル）−９−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−１−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（５７ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）（非特許文献２９）をピリジン中に溶解し、そして真空下で溶媒を留去し、試料中の水分を共沸除去した。残渣をピリジン（１００μｌ）及びジオキサン（３００μｌ）中に溶解した。次いで、２−クロロ−４Ｈ−１，２，３−ベンゾジオキサホスフォリン−４−オン(０．１１ｍｍｏｌ)の１Ｍジオキサン溶液（１００μｌ）を添加した（非特許文献２５）。１０分後、この溶液に０．５Ｍ  ビス(トリブチルアンモニウム)ピロリン酸(０．１５ｍｍｏｌ)のＤＭＦ溶液（３００μｌ）とトリ−ｎ−ブチルアミン(１００μｌ)をすばやく加えた。その反応混合物を室温で１０分間かき混ぜた。次いで、１％ヨウ素溶液（ピリジン／水（９８：２、ｖ／ｖ）溶液、２ｍｌ）を加えた。１５分後、５％ＮａＨＳＯ３水溶液（１５０μｌ）、次いで、５ｍｌの水を反応溶液に加えた。
【０１１８】
溶液を室温で３０分間攪拌し、次いで、濃アンモニア水（２０ｍｌ）を加えた。５５℃で１２時間、アンモノリシスを行った。溶液を真空下で濃縮し、そして産物をＤＥＡＥセファデックス（Ａ−２５）カラムクロマトグラフィー（５０ｍＭないし１Ｍ  ＴＥＡＢの直線勾配によって溶出した）によって、そして次いで、Ｃ１８−ＨＰＬＣ（１００ｍＭ  酢酸トリエチルアンモニウム中の０％ないし３０％ＣＨ３ＣＮの勾配によって溶出した）（Ｅｉｃｈｏｒｏｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＳｙｎｃｈｒｏｐａｋ  ＲＰＰを伴うＧｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣ精製システム）によって精製し、ｓＴＰを得た。
【０１１９】
【化８】
0005649018.tif 000009
【０１２０】
３）Ｔ７転写のための鋳型の調製
化学合成されたＤＮＡ鋳型（１７−ｍｅｒ  ＲＮＡ合成のための、１０μＭの３５−ｍｅｒのコード鎖及び２１−ｍｅｒの非コード鎖）を、１０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝溶液中で、９５℃で加熱し、その後、４℃まで徐冷して、アニーリングした。
【０１２１】
４）Ｔ７転写（１７−ｍｅｒＲＮＡ）
２４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ ｍＭ  スペルミジン、５ ｍＭ  ＤＴＴ、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）緩衝溶液（２０μｌ）中、１ｍＭ天然ＮＴＰｓ、若しくは１ｍＭ  ｓＴＰ、２μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＧＴＰ、２μＭ鋳型及び５０単位のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ、Ｋｙｏｔｏ）の存在下で転写を行った。［γ−３２Ｐ］ＧＴＰの使用により、転写産物は５’末端のみ標識され、これにより収率を求めた。３７℃での３時間のインキュベーションの後、１０Ｍ尿素及び０．０５％ＢＰＢを含む色素溶液（２０μｌ）を加えることにより反応を止めた。混合物を７５℃で３時間加熱し、２０％ポリアクリルアミド−７Ｍ尿素ゲル上で産物を分析した。
【０１２２】
５）結果
本実施例では、基質としてｓ（ｓＴＰ）、および、非天然塩基が転写産物中の１３−１５番目に相当する相補的な部位に位置する、１つ若しくは２つのＰａ塩基を含むＤＮＡ鋳型を用いて、転写を行った。図２Ａに実験スキームを示す。図２Ａにおいて、１７−ｍｅｒ  ＲＮＡ合成のための１０μＭの３５−ｍｅｒのコード鎖及び２１−ｍｅｒの非コード鎖の配列、並びに１７−ｍｅｒ  ＲＮＡ転写産物の塩基配列は下記の通りである。
【０１２３】
鋳型相補鎖  （配列番号１）
５’−ａｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇ−３’
鋳型鎖  （配列番号２）
３’−ｔａｔｔａｔｇｃｔｇａｇｔｇａｔａｔｃｃｃｔｃｇａａｇｇｇａｎｎｎｔｃ−５’
１７−ｍｅｒＲＮＡ転写産物  （配列番号３）
５’−ｇｇｇａｇｃｕｕｃｃｃｕｎｎｎａｇ−３’
本発明者らはまた、対照として、イミダゾリン−２−オン（ｚ）（図１Ｂ）を含む別のＤＮＡ鋳型も調べた（図１Ｂ）；ｚは、Ｔ７転写によるＲＮＡへのｓの部位特異的挿入のためのよい鋳型塩基であるが、転写効率は、天然の転写と比較して効率が低い。ｓ−ｚ対は塩基間に２つの水素結合が形成される可能性があるが、その形はｓ−Ｐａ対に類似する。
【０１２４】
これらの鋳型を用いて３時間転写を行い、［γ−３２Ｐ］ＧＴＰで５’末端を標識した転写産物をゲル上で分析した結果を、図２Ｂに示す。具体的には、図２Ｂは、１つまたは２つのＰａ又はｚ塩基を含む鋳型を用いて、天然型ＮＴＰ（１ｍＭ、Ｎ＝Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｕ）とｓＴＰ（１ｍＭ）を加えて行った転写の産物のゲル電気泳動の結果である。転写産物は、［γ−３２Ｐ］ＧＴＰでその５’末端を標識されている。各転写産物の相対収率は、天然型塩基のみからなる鋳型からの転写産物を１００％として、それとの比較によって決定した。各収率は３−４データセットからの平均をとった。
【０１２５】
図２Ｂに示すように、Ｐａを１つ含む鋳型ＤＮＡからの全長（１７−ｍｅｒ）の転写産物（１つのｓ塩基を含む）の相対収率は９２％であり（図２Ｂ、レーン１、Ｎ１＝Ｐａ）、これはｚを１つ含む鋳型ＤＮＡからの転写の収率（３５％）（図２Ｂ、レーン４）よりも高く、そして、天然型のみの鋳型（Ｎ１＝Ｃ）とＮＴＰを用いた転写の収率（図２Ｂ、レーン８）と同じくらい高かった。２つのＰａ塩基を含む鋳型を用いた転写では、その相対収率は、天然型の転写（図２Ｂ、レーン８）と比較して低いものの、全長の産物が得られた（図２Ｂ、レーン２及び３）。対照的に、２つのｚを含む鋳型を用いた転写では、全長の転写物が得られなかった（図２Ｂ、レーン５及び６）。
【０１２６】
実施例２  Ｔ７転写産物（１７−ｍｅｒ ＲＮＡ）中のヌクレオチドの組成分析
本実施例では、転写におけるｓ−Ｐａ塩基対の選択性を調べるために、Ｐａ、ｚ及び天然の鋳型からの転写で得られる全長(１７−ｍｅｒ)の転写物中のヌクレオチドの組成分析を行った。転写物を［α−３２Ｐ］ＵＴＰ、［α−３２Ｐ］ＡＴＰ又は［α−３２Ｐ］ＧＴＰのどれかで内部標識し、この転写産物をＲＮａｓｅ  Ｔ２でヌクレオシド３’リン酸体にまで完全に分解した。得られた標識ヌクレオチドを２Ｄ−ＴＬＣで分析し（図３）、そして各ヌクレオシド３’−一リン酸のスポットを定量した（表１）。
【０１２７】
具体的には、２４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  スペルミジン、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液（２０μｌ）中、１０ｍＭ  ＧＭＰ、１ｍＭ  天然型ＮＴＰ（１ｍＭ、Ｎ＝Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｕ）、０、１若しくは３ｍＭ  ｓＴＰ、２μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＵＴＰ、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ若しくは［γ−３２Ｐ］ＧＴＰ（アマーシャム）、２μＭ鋳型ＤＮＡ、及び５０単位のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）（非特許文献１４、１５）の存在下で転写を行った。３時間、３７℃でインキュベーション後、色素溶液を加えて転写を終了させた。
【０１２８】
この混合物を７５℃で３時間加熱し、そして次いで、１５％ポリアクリルアミド−７Ｍ尿素ゲルで電気泳動した。全長の産物をゲルから溶出し、そして、これに０．０５Ａ２６０ユニットの大腸菌由来のｔＲＮＡを加えて、産物をエタノール沈殿させた。転写産物を、１５ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中、０．０７５Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ  Ｔ２で、３７℃、２時間消化した。この処理により、転写産物はＲＮａｓｅ  Ｔ２でヌクレオシド３’−一リン酸にまで完全に分解された。消化産物を、Ｍｅｒｃｋ  ＨＰＴＬＣプレート（１００×１００ｍｍ）（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた２Ｄ−ＴＬＣによって分析した。使用した展開溶剤は、１次元目がイソ酪酸／ＮＨ４ＯＨ／Ｈ２Ｏ（６６：１：３３  ｖ／ｖ／ｖ）、そして、２次元目がイソプロピルアルコール／ＨＣｌ／Ｈ２Ｏ（７０：１５：１５  ｖ／ｖ／ｖ）であった。ＴＬＣプレート上の産物をバイオイメージングアナライザーで分析した。各スポットの定量は３−９のデータセットから平均化した。
【０１２９】
結果を図３に示す。さらに、各ヌクレオシド３’−一リン酸を定量した結果を表１にまとめた。
表１  Ｔ７転写産物のヌクレオチド組成分析
【０１３０】
【表１】
0005649018.tif 000010
【０１３１】
ａ：  図２に示した転写産物のＵ（エントリー１−８）、Ａ（エントリー９−１２）、又はＧ（エントリー１３−１６）の５’側に取り込まれたヌクレオチドの組成
ｂ：  値は、下記の式を用いて決定された：
（各ヌクレオチドの放射活性）／［全てのヌクレオチド３’−一リン酸］×（［α−３２Ｐ］ＮＴＰの５’側のヌクレオチドの総数］
ｃ：  各ヌクレオチドの理論的な数は、角型括弧書きで示す。
【０１３２】
ｄ：  標準偏差は、括弧書きで示す。
ｅ：  検出されず
図３及び表１に示した結果より、１つのＰａ塩基を含む鋳型を用いた場合では、高い選択性でＲＮＡ中へのｓの取り込みが確認された。図３では、Ｐａを含む鋳型を用いて［γ−３２Ｐ］ＵＴＰで標識した場合にのみ、標識されたｓ−ヌクレオシド３’−一リン酸が２Ｄ−ＴＬＣ上で観察された。さらに、表１に示されたように、鋳型ＤＮＡ中のＰａに相補してＲＮＡ中に取り込まれたｓの選択性（９７％）（表１、エントリー１）は、ｓ−ｚ塩基対での場合の選択性（表１、エントリー２）、又は天然型塩基対のみでの転写の選択性と同じくらい高く（表１、エントリー３及び５）、そして、鋳型中の天然型の塩基に相補した間違ったｓＴＰの取り込みは観察されなかった（表１、エントリー４及び６）。２つのＰａ塩基を含む鋳型を用いた転写の場合、１番目の位置におけるｓの取り込みの選択性は十分に高かったが（９５％）、２番目の位置におけるｓの取り込みの選択性は８４−８７％程度であった。しかし、ｓＴＰの濃度を上げる（３ｍＭ）ことによって、この選択性はある程度（８９−９３％）改善された。従って、ＲＮＡ中へのｓの部位特異的取り込みに用いる鋳型塩基として、Ｐａはｚよりも優れており、そして、この結果は、非水素結合性の塩基対も転写において機能しうることを示唆している。
【０１３３】
実施例３  １６ｓ、１７ｓ、３６ｓ、４７ｓ、５７ｓ及び５９ｓ  ｔＲＮＡの調製及びその蛍光スペクトル及びＵＶ融解曲線
１）１６ｓ、１７ｓ、３６ｓ、４７ｓ、５７ｓ及び５９ｓ  ｔＲＮＡの調製
蛍光プローブとしてのｓ塩基の有用性を示すために、本発明者らは、ｓを酵母由来のｔＲＮＡＰｈｅの特定の部位に取り込ませ、そしてｔＲＮＡの各部位におけるｓの蛍光特性をいろいろな条件下で分析することにより、ｔＲＮＡの高次構造を調べた。ｓ塩基の蛍光は、近隣の塩基による塩基積み重ね（ｓｔａｃｋｉｎｇ）によって消光されるため、ＲＮＡ分子中のｓの周囲の局部構造についての情報が得られる。
【０１３４】
本発明者らは、ｔＲＮＡ中の６箇所のそれぞれにｓを導入した：具体的には、Ｄ−ループ中の１６番目又は１７番目（ｔＲＮＡ  １６ｓ又は１７ｓ）、アンチコドン中の３６番目（ｔＲＮＡ  ３６ｓ）、エキストラループ中の４７番目（ｔＲＮＡ  ４７ｓ）、並びにＴΨＣループ中の５７又は５９番目（ｔＲＮＡ  ５７ｓ又は５９ｓ）である。それぞれの部位のｓは、ｔＲＮＡ中の他の塩基と塩基対を形成しない部位に導入されている（図４）。
【０１３５】
ｓを含む酵母ｔＲＮＡＰｈｅ分子を調製するための各鋳型の配列（ＲＮＡ合成のための５μＭの９４−ｍｅｒの鋳型鎖ＤＮＡ及びその相補鎖のＤＮＡ）は、以下の表２の通りである（配列番号４−１１）。
【０１３６】
【表２】
0005649018.tif 000011
【０１３７】
ＲＮＡ合成のための５μＭの９４−ｍｅｒの鋳型ＤＮＡ及びその相補鎖ＤＮＡの配列
この配列では、Ｃ２−Ｇ７１塩基対はＧ２−Ｃ７１（非特許文献２６）で置換されている。鋳型鎖ＤＮＡの５’末端の２つのヌクレオシド（Ｇ及びＴ）は、２'−Ｏ−メチルリボヌクレオシドで置換することにより、目的とする産物よりも長くなってしまう鋳型非依存の転写産物の生成を抑えている（非特許文献２７）。
【０１３８】
ＲＮＡ合成のための９４−ｍｅｒの鋳型ＤＮＡ及び鋳型の相補鎖ＤＮＡの調製は、実施例１の「３）Ｔ７転写のための鋳型の調製」の項目で記載したのと同様に行った。
図４−６に、酵母由来のｔＲＮＡＰｈｅ中のｓの導入部位及びｔＲＮＡの構造（非特許文献２０）を示す。図４は、オリジナルなｔＲＮＡの２次構造である。ｓで置換された塩基は○で囲んである。波線は塩基−塩基相互作用を示す。ボックスで囲んだＧ−Ｃ塩基対はオリジナルのｔＲＮＡ中ではＣ−Ｇ塩基対であるが、この置換ではｔＲＮＡの高次構造（非特許文献２６）は有意に変わっていない。
【０１３９】
図５は天然型のｔＲＮＡの３次構造であり、図６Ａ−Ｃが、ｓが取り込まれる各部位の拡大図を示す。濃い色の塩基（群）はｓと置換されていて、これは薄い色の塩基（群）と積み重なっている。そして、球（黄色）は、ｔＲＮＡ中のＭｇ2＋をあらわす。図中の塩基は天然型のｔＲＮＡにおいて修飾されている塩基を示すが、括弧内に記載された塩基は転写産物における塩基を示している。
【０１４０】
それぞれの部位にｓが導入されたｔＲＮＡ転写産物は、Ｐａを含む鋳型ＤＮＡを用いて、１ｍＭ  ｓＴＰと天然型ＮＴＰｓの存在下で、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによって調製された。具体的には先ず、２４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  スペルミジン、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液中、１０ｍＭ  ＧＭＰ、１ｍＭ  天然型ＮＴＰｓ、１ｍＭ  ｓＴＰ、０．５μＭ鋳型ＤＮＡ、及び２．５Ｕ／μｌ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの存在下で、転写を行った。３７℃で６時間インキュベーションし、１．７５倍量の色素溶液を加えて転写を終了させた。この溶液を７５℃で３分加熱し、そして、１０％ポリアクリルアミド−７Ｍ  尿素ゲルで電気泳動した。全長の産物をゲルから溶出し、そして、エタノールで沈殿した。４５０μｌの１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８）中に産物を溶かし、７５℃で５分間インキュベートした。
【０１４１】
次いで、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−１０  フィルター（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて、緩衝溶液をＴｍ測定用の緩衝液（５０ｍＭ  カコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．２）及び５０ｍＭ  ＫＣｌを含む）に交換した。２６０ｎｍの吸光度によってｔＲＮＡの量を決定した。そして、蛍光及びＵＶ融解測定のために、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２又は５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むＴｍ緩衝液中に１μＭ  ｔＲＮＡを含むように溶液を調製した。
【０１４２】
２）蛍光スペクトル及びＵＶ融解曲線
ｓを特定の部位に含む各ｔＲＮＡの蛍光スペクトル及びＵＶ溶解曲線を、２０から９０℃までの範囲で、０．５℃／分の加熱速度で、各々、ＦＰ−６５００分光蛍光計（ＪＡＳＣＯ）、及びＵＶ−２４５０分光光度計（ＳＨＩＭＡＤＺＵ）を用いて記録した。
【０１４３】
ｓ塩基は２つの励起最大（２９９及び３５２ｎｍ）を有する、図７Ａは、ｓのリボヌクレオシド（１μＭ）の励起及び蛍光スペクトルを示す。図７Ａから明らかなように、ｓは、４３４ｎｍを中心とする蛍光スペクトルを示し、その蛍光の量子収率はｐＨ７．０で０．４１であった。図７Ｂ及びＣは、３５２ｎｍでの励起による（Ｂ）ｔＲＮＡ  ４７ｓ（１μＭ）の蛍光スペクトル；及び（Ｃ）ｔＲＮＡ  ５７ｓ（１μＭ）の蛍光スペクトルを示す。蛍光スペクトルは、５０ｍＭ  カコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、及び０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ中、２０℃において測定した。
【０１４４】
本実施例では、５０ｍＭ  カコジル酸ナトリウム、５０ｍＭ  ＫＣｌ、及び０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ又は、ＥＤＴＡを除いて２ｍＭ若しくは５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を加えた溶液中、（３５２ｎｍを中心に３ｎｍのスペクトルバンド幅で励起された）ｓの４３４ｎｍでの蛍光強度及び２６０ｎｍでのＵＶ吸収を測定して、各ｔＲＮＡ転写産物（１μＭ）の熱力学的融解プロフィールを調べた。
【０１４５】
溶媒分子との衝突によるｓの蛍光の消光は、温度が高くなるほど生じやすくなる（図８Ａ）。そこで、各ｔＲＮＡ転写産物の蛍光強度の温度依存変化を、ｓのヌクレオシドモノマーによって規格化した。蛍光強度の温度依存変化によって求められるｔＲＮＡの融解温度は、ＩＧＯＲ  Ｐｒｏソフトウェア（ＷａｖｅＭｅｔｒｉｃｓ．Ｉｎｃ．）を用いて計算した。具体的には、図８は、（Ａ）ｓのリボヌクレオシドの蛍光強度の温度依存による変化、及び（Ｂ）ｓのリボヌクレオシドの蛍光強度の温度依存による変化を補正したｔＲＮＡ  ３６ｓの蛍光強度の温度依存性を示す。ｔＲＮＡ転写産物の蛍光強度は、等式：Ｙｃｔ＝Ｙｔ／（Ｒｔ／Ｒ２０）によって補正された。ここにおいて、Ｙｃｔは、ｔ℃での各ｔＲＮＡの補正された強度であり、Ｙｔは、ｔ℃での各ｔＲＮＡの実測された蛍光強度であり、Ｒｔは、ｔ℃でのｓのリボヌクレオシドの蛍光強度であり、そして、Ｒ２０は、２０℃でのｓのリボヌクレオシドの蛍光強度である。
【０１４６】
３）結果
１６ｓ、１７ｓ、３６ｓ、４７ｓ、５７ｓ及び５９ｓ  ｔＲＮＡの、４３４ｎｍでの蛍光強度の温度依存変化によって得られる融解曲線（実線）及び２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収の変化によって得られる融解曲線（波線）を図９に示す。
【０１４７】
先ず、第一にｓを含む各ｔＲＮＡ転写産物のＵＶ融解温度（２ｍＭ  ＭｇＣｌ２中、６４．６−６６．４℃）は天然のｔＲＮＡ転写産物の融解温度（２ｍＭ  ＭｇＣｌ２中、６５．５℃）と同じくらいの高さであった。このことは、これらの部位をｓで置換しても、ｔＲＮＡの構造は有意に不安定化されないことを示唆している。
【０１４８】
第二に、特定の位置にｓを含む各ｔＲＮＡは、局部構造の特性を反映する特徴的な蛍光強度の変化を表示した。Ｍｇ２＋（２及び５ｍＭ）の存在下におけるｓの蛍光特性は、明確に２つのグループに分類される：１つは、ｔＲＮＡ  １６ｓ、１７ｓ及び４７ｓを含み（グループ１）、そしてもう一方は、ｔＲＮＡ  ３６ｓ、５７ｓ及び５９ｓを含む（グループ２）。２ｍＭ又は５ｍＭ  Ｍｇ２＋の存在下では、低温度でのグループ１のｓの蛍光強度は、グループ２のｓの蛍光強度よりも、１．７−３．４倍大きかった。グループ１の大きなｓの蛍光強度は、温度が上昇すると減少するが、グループ２によるｓの蛍光強度は温度の上昇とともに大きくなった。
【０１４９】
これらの結果は、１６、１７又は４７番目のｓ塩基は生理学的温度で溶液中に露出しており、そして、温度の上昇によるｔＲＮＡの変性に伴い、ｓ塩基と他の塩基との非特異的な相互作用が高まることを示唆している。対照的に、３６、５７又は５９番目のｓ塩基は、低温下ではＬ字型構造を形成したｔＲＮＡ中で近隣の塩基と積み重なっており、そして、温度の上昇によって徐々にｔＲＮＡが変性し、ｓと隣接する塩基との積み重なり構造が壊れる。これらの推測は、Ｘ線結晶構造解析によるｔＲＮＡのＬ字型構造中の各部位における元来の塩基の配置（図４）（非特許文献２０）と極めてよく一致する。ｔＲＮＡ  １６ｓ、１７ｓ及び４７ｓの蛍光強度は、生理学的温度において、Ｍｇ２＋の添加によって劇的に上昇する。このことは、Ｍｇ２＋のｔＲＮＡへの結合によって、ｔＲＮＡがＬ字型構造を形成し、その結果、これらの位置における塩基が溶液中に露出される位置に配置されることが示唆している。
【０１５０】
第三に、蛍光プロフィールから得られるＴｍ値は、ＵＶ融解プロフィールから得られるＴｍ値と比較して、ｔＲＮＡ構造中の各局部構造の安定性を反映している。表３に、特定部位にｓを含む酵母由来のｔＲＮＡＰｈｅの蛍光及びＵＶプロフィールから得られた融解温度（Ｔｍ）を示す。
【０１５１】
表３  特定部位にｓを含む酵母由来のｔＲＮＡＰｈｅの蛍光及びＵＶプロフィールから得られた融解温度（Ｔｍ）
【０１５２】
【表３】
0005649018.tif 000012
【０１５３】
蛍光及びＵＶプロフィールは、５０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．２）及び５０ｍＭ  ＫＣｌ中、ＭｇＣｌ２共存下あるいは非共存下で、各ｔＲＮＡ転写産物（１μＭ）を用いて得られた。各融解温度は、ＩｇｏｒＰｒｏソフトウェア（ＷａｖｅＭｅｔｒｉｃｓ．  Ｉｎｃ．）を用いることによって計算された。ｎ．ｃ．計算されず。
【０１５４】
例えば、ｔＲＮＡ  ３６ｓの蛍光プロフィールから得られるＴｍ値（２ｍＭ  ＭｇＣｌ２中、６９．５℃）は、ＵＶプロフィールから得られるＴｍ値（２ｍＭ  ＭｇＣｌ２中、６５．２℃）よりも高かった。このことは、ｔＲＮＡの全体構造の安定性に比べてアンチコドン  ステム−ループがより高い安定性を有することを示唆している。対照的に、ｔＲＮＡ１６ｓ（２ｍＭ  ＭｇＣｌ２中、５８．０℃）及び１７ｓ（２ｍＭ  ＭｇＣｌ２中、５９．６℃）の低い安定性は、Ｄループを含む部分構造は、ｔＲＮＡ構造全体の脆弱な部分であることを示唆している。
【０１５５】
実施例４  人工塩基ｓとＦＡＭ−ｙを含むＲＮＡ鎖のＦＲＥＴ実験
ｓ−Ｐａ塩基対を転写に用いることにより、蛍光性の人工塩基ｓをＲＮＡ中に効率よく導入することが出来るようになった。このｓ−Ｐａ塩基対を、本発明者らが既に開発しているｖ−ｙ塩基対と組み合わせることにより、１本のＲＮＡ中にｓとｙ、あるいは、ｓと５位を修飾したｙを、それぞれ任意の位置に導入することができる。特に、ＦＡＭを導入したｙを利用することにより、ｓとＦＡＭ−ｙの間でＦＲＥＴを観察することができる。
【０１５６】
本実施例では、いろいろな部位にＰａとｖを導入した転写用の鋳型ＤＮＡを化学合成し、これらの鋳型とｓとｙ、あるいはＦＡＭ−ｙのそれぞれの基質（ｓＴＰ、ｙＴＰ、ＦＡＭ−ｙＴＰ）を用いて転写を行った。
【０１５７】
Ｔ７  ＲＮＡ  ポリメラーゼによる転写反応
（ｓとｙを部位特異的に含むＲＮＡ  ３９−ｍｅｒの解析）．
二本鎖の鋳型ＤＮＡ（５μＭ）のアニーリング操作は、１０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）中で行われた（温度条件：９５℃で３分間加熱後、−０．１℃／秒の勾配で４℃まで徐冷）。Ｔ７転写反応は、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  スペルミジン、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．０１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＧＴＰ、１ｍＭ  ＮＴＰｓ、０−１ｍＭ  ｓＴＰ、０−１ｍＭ  ｙＴＰ、０．５μＭ  鋳型ＤＮＡ、および５０ｕｎｉｔｓのＴ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）を含む反応溶液（全量  ２０μｌ）で行った。３７℃、３時間反応を行った後、１０Ｍ  尿素を含む電気泳動用色素溶液を等量（２０μｌ）加えて反応を停止させた。この溶液を７５℃で３分間加熱後、１５％  ポリアクリルアミド−７Ｍ  尿素ゲルで電気泳動を行い、転写物をバイオイメージアナライザーで解析した（図１０）。
【０１５８】
Ｔ７  ＲＮＡ  ポリメラーゼによる転写反応生成物の塩基組成分析
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応を、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  スペルミジン、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．０１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２μＣｉ［α−３２Ｐ］ＡＴＰまたは２μＣｉ［α−３２Ｐ］ＧＴＰまたは２μＣｉ［α−３２Ｐ］ＣＴＰまたは２μＣｉ［α−３２Ｐ］ＵＴＰ、１ｍＭ  ＮＴＰｓ、０−１ｍＭ  ｓＴＰ、０−１ｍＭ  ｙＴＰ、０．５μＭ  鋳型ＤＮＡ、および５０ｕｎｉｔｓのＴ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）を含む反応溶液で行った。転写物を、１５％  ポリアクリルアミド−７Ｍ  尿素ゲルによる電気泳動により精製し、ゲルからの溶出を行った後、ｔＲＮＡ（０．０５  ＯＤ）を加えてエタノール沈殿を行い回収した。このサンプルを滅菌水１０μｌに溶解し、溶液（８．５μｌ）を用いてＲＮａｓｅＴ２による完全分解反応を行った。溶液（８．５μｌ）にＲＮａｓｅ  Ｔ２（１．５μｌ，０．５Ｕ／μｌ）を加えて、３７℃で２時間反応を行った。この溶液の一部をＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ，１０ｃｍｘ１０ｃｍ）にスポットし、二次元展開を行った。展開液として、一次元目はイソ酪酸：濃アンモニア水：水＝６６：１：３３（ｖ／ｖ／ｖ）、二次元目は２−プロパノール：塩酸：水＝６５：１０：２５（ｖ／ｖ／ｖ）を用いた。展開後のスポットをバイオイメージアナライザーで検出し、解析を行った（図１１、表４）。
【０１５９】
Ｔ７  ＲＮＡ  ポリメラーゼによる転写反応
（ｓとｙ、もしくはｓとＦＡＭ−ｙを部位特異的に含むＲＮＡ  ３９−ｍｅｒの調製）．
Ｔ７転写反応は、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  スペルミジン、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．０１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭ  ＮＴＰｓ、１ｍＭ  ｓＴＰ、１ｍＭ  ｙＴＰまたは１ｍＭ  ＦＡＭ−ｙＴＰ、０．５μＭ  鋳型ＤＮＡ、および１２５ｕｎｉｔｓのＴ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）を含む反応溶液（全量５０μl）で行った。３７℃、６時間反応を行った後、ＤＮａｓｅ  Ｉ溶液を加えて、３７℃で１５分間保温することで鋳型ＤＮＡを分解した。１０Ｍ  尿素を含む電気泳動用色素溶液を等量（５０μl）加えて反応を停止させた後、反応溶液を７５℃で３分間加熱してから、１５％  ポリアクリルアミド−７Ｍ  尿素ゲルで電気泳動を行い、目的の転写物３９−ｍｅｒを精製した。ゲルから滅菌水で溶出した後、エタノール沈澱を行い、転写物を回収し、ＵＶ吸収から目的の転写物ＲＮＡ  ３９−ｍｅｒの濃度を決定した。
【０１６０】
蛍光スペクトル測定
ｓとｙ、もしくはｓとＦＡＭ−ｙを部位特異的に含むＲＮＡ  ３９−ｍｅｒ（０．２μＭ）を用いて、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ中での蛍光スペクトルを２０℃で測定した。測定前のＲＮＡサンプルのアニーリング操作では、ＲＮＡ  ３９−ｍｅｒ（０．２μＭ）を含む溶液、およびＲＮＡ  ３９−ｍｅｒとその３９−ｍｅｒに相補的な配列を持つ相補性ＲＮＡ  ４２−ｍｅｒ（０．４μＭ）を含む溶液を７５℃で３分間加熱した後、−０．１℃／３秒の勾配で４℃まで徐冷を行った。アニーリング操作を行ったサンプルは、４℃で保管され、測定時は、サンプルを測定セルに移してから２０℃に２分以上放置した後にスペクトル走査（３６０−６５０ｎｍ）を開始した。蛍光測定（励起波長３５０ｎｍ）には、３ｘ３ｍｍセルを用い、レスポンス  ０．５ｓ、走査速度  ２０００ｎｍ／分、感度はマニュアル設定でＰＭＴ  ５００Ｖに固定、スリットバンド幅は５ｎｍに固定してスペクトル測定を行った（図１２）。
【０１６１】
結果
図１０は、ｖ−ｙ塩基対とｓ−Ｐａ塩基対を用いた転写によるＲＮＡへのｙとｓの部位特異的導入の戦略と転写産物のポリアクリルアミド電気泳動の結果を示す。
【０１６２】
詳細には、図１０ａに鋳型ＤＮＡの配列と転写反応の条件を示した（配列中でＰａは、Ｐで示している）。転写物（Ｂｈｐ２−１，Ｂｈｐ２−２，Ｂｈｐ２−３）をポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べると（図１０ｂ）、ｓＴＰとｙＴＰをどちらも加えた転写で、転写物の量が多くなった。そこで、ｓとｙが選択的にＲＮＡ中に取り込まれているかどうかを調べるために、α位に放射性のリンを導入した［α−３２Ｐ］ＡＴＰ，［α−３２Ｐ］ＧＴＰ，［α−３２Ｐ］ＣＴＰ，［α−３２Ｐ］ＵＴＰのそれぞれの基質を別々に加えて転写を行い、放射性標識された転写物をＲＮａｓｅ  Ｔ２でヌクレオシド  ３’−一リン酸に加水分解し、リン酸が放射性標識されているヌクレオシド  ３’−一リン酸を２次元のＴＬＣで分析し、転写物のヌクレオチド組成を調べた（図１１）。
【０１６３】
この方法では、放射性の基質が取り込まれると、その５’側のヌクレオチドが２次元のＴＬＣ上で検出できる。たとえば、図１１ｂには、Ｂｈｐ２−１の２次元ＴＬＣの結果を示した。Ｂｈｐ２−１では、ｙがＡの５’側に、また、ｓがＧの５’側にそれぞれあるので、もし、鋳型上のｖに相補してｙが、また、Ｐａに相補してｓが、それぞれ選択的にＲＮＡ中に取り込まれていれば、［α−３２Ｐ］ＡＴＰで標識した転写物の２次元ＴＬＣにはｙｐ（ｙのヌクレオシド  ３’−一リン酸）のスポットが現れ、また、［α−３２Ｐ］ＧＴＰ，で標識した転写物では、ｓｐ（ｓのヌクレオシド  ３’−一リン酸）のスポットが現れることになる。実際に、図１１ｂでは、それぞれのＴＬＣ上に期待されるスポットが現れている。また、［α−３２Ｐ］ＣＴＰ，あるいは、［α−３２Ｐ］ＵＴＰで標識した転写物では、ｙｐとｓｐのどちらのスポットも認められないことから、鋳型上の天然型塩基に相補してそれぞれの人工塩基が間違って取り込まれていないこともわかった。さらに、２次元ＴＬＣ上のそれぞれのスポットを定量し、その結果を表４に示した。
【０１６４】
【表４】
0005649018.tif 000013
【０１６５】
ａ：  図１１に示された、Ａ（エントリー１，２及び９−１１）、Ｇ（エントリー３，４及び１２−１４）、Ｃ（エントリー５及び６）又はＵ（エントリー７及び８）の５’隣りに取り込まれたヌクレオチドの組成
ｂ：  値は、下記の式を用いて決定された：
（各ヌクレオチドの放射活性）／［全てのヌクレオチド（３’−一リン酸）］×（［α−３２Ｐ］ＮＴＰの５’隣りのヌクレオチドの総数］
ｃ：  各ヌクレオチドの理論的な数は、角型括弧書きで示す。
【０１６６】
ｄ：  標準偏差は、括弧書きで示す。
ｅ：  検出されず
転写では、ｙＴＰの量を０．５ｍＭと１ｍＭで行った結果を示してある。エントリー１−８の結果は、全て、理論値（カッコ内の数値）と良く一致している。エントリー９−１４では、天然型塩基のみの鋳型ＤＮＡを用いた場合についての結果であるが、エントリー１０において、１ｍＭのｙＴＰを用いた場合にわずかにｙｐが天然型の鋳型塩基に相補して取り込まれていることがわかった。したがって、転写におけるｙＴＰの量は、０．５ｍＭのほうが良い。以上の結果から、ｓ−Ｐａ塩基対とｖ−ｙ塩基対を組み合わせて転写を行うことにより、１本のＲＮＡ中にｓとｙをそれぞれ選択的に導入できることがわかった。
【０１６７】
そこで、ｙの基質に代えて、ｙの５位にＦＡＭを結合した基質（ＦＡＭ−ｙＴＰ）とｓＴＰを用いて、Ｂｈｐ２−１の転写を行い、転写物をゲル電気泳動で精製し、その蛍光特性を調べた。Ｂｈｐ２−１は、単独ではヘアピン型の構造を形成し、ｓとＦＡＭ−ｙが塩基対を形成する位置に配置されるので、両者でＦＲＥＴが観測される。そして、このＲＮＡの相補鎖のＲＮＡを加えると二本鎖構造を形成し、ｓとＦＡＭ−ｙが離れ、ＦＲＥＴの効率が低下する。この二本鎖構造のＲＮＡの蛍光スペクトルを図１２ｂに、また、ヘアピン型のＲＮＡの蛍光スペクトルを図１２ｃに示した（実線）。それぞれの蛍光スペクトルは、ｓとｙを導入したＲＮＡのスペクトルと比較している（破線：このＲＮＡでは、ＦＲＥＴが起こらず、ｓの蛍光スペクトルを示すコントロールとなる）。どちらも、３５０ｎｍでｓを励起しているが、ＦＲＥＴが観測されて、ＦＡＭ−ｙの５２１ｎｍ付近の蛍光が現れている。しかし、ヘアピン型のＲＮＡのほうが、ＦＡＭ−ｙの蛍光強度が強く、また、コントロール（破線）と比較したｓの消光も顕著である。
【０１６８】
この結果から、ｓとＦＡＭ−ｙの両者の距離に相関してＦＲＥＴが観測されることがわかった。したがって、ｓとＦＡＭ−ｙをＲＮＡ中のいろいろな部位に導入し、両者のＦＲＥＴの効率を測定することにより、両者間の距離を見積もることができ、ＲＮＡの構造解析に役立たせることができる。従来のＸ線結晶構造解析やＮＭＲによる構造解析では、静的なＲＮＡの構造に関する情報しか得ることが出来なかったが、本手法で、溶液中のＲＮＡの構造変化のダイナミクスを知ることが可能になる。
【０１６９】
実施例５  核酸二重鎖におけるｓまたはｖとＦＡＭ−ｙの人工塩基対のＦＲＥＴ実験
ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖において、蛍光性の人工塩基である２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン−９−イル基または２−アミノ−６−（チアゾリル）プリン−９−イル基（以下、本実施例においてそれぞれｓまたはｖと称する）、およびフルオロフォアを連結した２−オキソ−（１Ｈ）ピリジン−３−イル基（以下、本実施例においてｙと称する）の間でＦＲＥＴ実験を行った。ｓまたはｖの発光スペクトルは、ＦＡＭが連結した５−（３−アミノ−１−プロピニル）−ｙ（ＦＡＭ−ｙＴＰ）またはＦＡＭが連結した５−［３−（６−アミノヘキサンアミド）−１−プロピニル］−ｙ（ＦＡＭ−ｈｘ−ｙＴＰ）であるヌクレオチド誘導体の吸収スペクトルと重なった（図１３ａ）。よって、ＤＮＡフラグメント中のｓまたはｖは蛍光ドナーとして作用し、そして相補的なＲＮＡフラグメント中のＦＡＭ−ｙまたはＦＡＭ−ｈｘ−ｙは蛍光アクセプターとして作用する。
【０１７０】
人工塩基ｓまたはｖを含むＤＮＡの合成
人工塩基ｓまたはｖを含むＤＮＡは、例えば、国際公開ＷＯ  ０１／０５８０１号または国際公開ＷＯ  ２００５／０２６１８７号に記載の方法に従って、人工塩基ｓまたはｖを含むヌクレオチドのシアノエチルホスホロアミダイト誘導体を用いて、当該技術分野に周知のＤＮＡ化学合成法により合成した。化学的に合成された３５ｍｅｒのＤＮＡの配列は、５’−ＣＡＮ１Ｎ２Ｎ３ＣＴＣＧＧＧＡＴＴＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＴ−３’（配列番号２０；ここで、Ｎ１Ｎ２Ｎ３が；ＣＴｓまたはＣＴｖのＤＮＡをそれぞれＤＮＡ３５ｓ１またはＤＮＡ３５ｖ１；ＣｓｓまたはＣｖｖのＤＮＡをそれぞれＤＮＡ３５ｓ２ａまたはＤＮＡ３５ｖ２ａ；ｓＴｓまたはｖＴｖのＤＮＡをそれぞれＤＮＡ３５ｓ２ｂまたはＤＮＡ３５ｖ２ｂ；と称する）とした。得られたＤＮＡはゲル電気泳動によって精製した。
【０１７１】
ＦＡＭ−ｙまたはＦＡＭ−ｈｘ−ｙを含むＲＮＡの調製
ＦＡＭ−ｙまたはＦＡＭ−ｈｘ−ｙをＮ’の位置で含有する１７ｍｅｒのＲＮＡ（５’−ＧＧＧＡＡＵＣＣＣＧＡＧＮ’ＡＧＵＧ−３’：配列番号２１）を、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよびＦＡＭ−ｙまたはＦＡＭ−ｈｘ−ｙの基質（ＦＡＭ−ｙＴＰまたはＦＡＭ−ｈｘ−ｙＴＰ）を用いてＴ７転写により調製した。鋳型（コード鎖としてＤＮＡ３５ｖ１、非コード鎖として５’−ＡＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’（配列番号２２）をそれぞれ１０μＭ）を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）および１０ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝溶液中で、９５℃で加熱し、その後、４℃まで徐冷して、アニーリングした。転写反応は、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  スペルミジン、５ｍＭ  ＤＴＴ、および０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む緩衝溶液中、１ｍＭ  天然ＮＴＰｓ、１ｍＭ  ＦＡＭ−ｙＴＰまたはＦＡＭ−ｈｘ−ｙＴＰ、２μＭ  鋳型、および２．５ユニット／μＬ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）の存在下で行った。３７℃で３時間インキュベーションした後、１０Ｍ  尿素および０．０５％  ＢＰＢを含有する色素溶液を等量加えることにより反応を止めた。反応混合物は７５℃で３分間加熱し、そして１７−ｍｅｒの転写物をゲル電気泳動により精製した。
【０１７２】
蛍光スペクトル測定
蛍光スペクトルは１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液中で測定した。発光スペクトルはｓについて３５０ｎｍ、ｖについて３６０ｎｍの励起波長で記録した。発光のスペクトルバンドパスは５ｎｍであった。
【０１７３】
ＦＡＭ−ｙまたはＦＡＭ−ｈｘ−ｙを部位特異的に含む１７−ｍｅｒ  ＲＮＡを、１個または２個のｓまたはｖ塩基を部位特異的に含む３５−ｍｅｒ  ＤＮＡ（ＤＮＡ３５ｓ１、３５ｓ２ａ、３５ｓ２ｂ、３５ｖ１、３５ｖ２ａ、および３５ｖ２ｂ）とハイブリダイズさせ、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖の発光スペクトルを、異なる温度（２０および７０℃）で測定した。
【０１７４】
結果
共鳴エネルギー転移は、ｓまたはｖの低蛍光状態からＦＡＭ−ｙまたはＦＡＭ−ｈｘ−ｙの高蛍光状態の間で観察された。ＤＮＡ３５ｓ１またはＤＮＡ３５ｖ１が、ＦＡＭ−ｙまたはＦＡＭ−ｈｘ−ｙを部位特異的に含む１７−ｍｅｒ  ＲＮＡと２０℃で二本鎖を形成したときにＦＲＥＴが生じ、そして７０℃で二本鎖が変性したときにＦＲＥＴは有意に減少した（図１４ａおよびｂ）。加えて、ＤＮＡ３５ｓ２ａおよびＤＮＡ３５ｖ２ａと、ＦＡＭ−ｙまたはＦＡＭ−ｈｘ−ｙを部位特異的に含むＲＮＡとの二本鎖においても、ＦＲＥＴが効率よく生じた（図１４ｃおよびｄ）。
【０１７５】
興味深いことに、二つの隣接した人工塩基を含むＤＮＡ３５ｓ２ａまたはＤＮＡ３５ｖ２ａの一本鎖の蛍光強度は有意に減少する一方、１つのＴで隔てられた二つの人工塩基を含むＤＮＡ３５ｓ２ｂまたはＤＮＡ３５ｖ２ｂの一本鎖の蛍光強度の有意な減少は観察さなかった（図１３ｃおよびｄ）。ＤＮＡ３５ｓ２ａまたはＤＮＡ３５ｖ２ａの一本鎖の蛍光強度の減少は、二つの隣接した人工塩基の間での自己消光によって起こるものである。
【０１７６】
二つの隣接した人工塩基の間での自己消光が起こるＤＮＡ３５ｓ２ａまたはＤＮＡ３５ｖ２ａとの二本鎖形成によっても、１７−ｍｅｒ  ＲＮＡの強いＦＡＭ蛍光が観察されたので、自己消光プローブを用いるこのＦＲＥＴ系は、標的の鎖に対して過剰量のプローブの使用を容易にする。１７−ｍｅｒ  ＲＮＡに対して１つの人工塩基を含むＤＮＡ３５ｓ１およびＤＮＡ３５ｖ１を１０モル等量用いた場合、共鳴エネルギー転移は、それぞれ、ＤＮＡ３５ｓ１およびＤＮＡ３５ｖ１のバックグラウンド蛍光によって完全に隠れてしまった（図１５ａおよびｂ）。対照的に、１７−ｍｅｒ  ＲＮＡに対して隣接する二つの人工塩基を含むＤＮＡ３５ｓ２ａおよびＤＮＡ３５ｖ２ａを１０モル等量用いた場合は、それぞれのｓｓ−およびｖｖ−含有ＤＮＡおよびＦＡＭ含有ＲＮＡの間のＦＲＥＴがはっきりと観察された（図１５ｃおよびｄ）。したがって、隣接する二つの人工塩基を含む自己消光プローブを使用するＦＲＥＴ系は、蛍光ドナーのバックグラウンドを減少させつつ、ＦＲＥＴ現象を観察することができるため、大量のドナープローブの存在下においても蛍光アクセプターを含む相補鎖の検出が可能である。また、大量の自己消光ＤＮＡプローブは、相補的な蛍光アクセプター鎖との二本鎖形成を容易にするため、ＦＲＥＴ効率を増加させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１７７】
【図１】図１は、非天然型ｓ−Ｐａ（Ａ）塩基対及びｓ−ｚ（Ｂ）塩基対を示す。
【図２】図２は、ｓ−Ｐａ塩基対によって媒介されるＴ７転写の実験スキーム及び、転写産物のゲル電気泳動の結果を示す。図２Ａ：実験スキーム  図２Ｂ：１つまたは２つのＰａ又はｚ塩基を含む鋳型ＤＮＡを用いて、天然型ＮＴＰｓ（１ｍＭ）とｓＴＰ（１ｍＭ）を加えた場合の転写産物のゲル電気泳動。転写産物は、［γ−３２Ｐ］ＧＴＰでその５’末端を標識された。各転写産物の相対収率は、全て天然型塩基からなる鋳型からの転写産物の収率との比較によって決定し、各収率は３−４データセットから平均化した。
【図３】図３は、転写産物（１７−ｍｅｒ）のヌクレアーゼ消化から得られた標識リボヌクレオシド３’−一リン酸の２Ｄ−ＴＬＣ分析を示す。転写産物を［α−３２Ｐ］ＮＴＰで内部標識し、１ｍＭ  ｓＴＰの存在下で転写された１７−ｍｅｒ断片からの二次元ＴＬＣである。中パネルは鋳型ＤＮＡ中のＮ１Ｎ２Ｎ３がＰａＡＣであり、右パネルはＮ１Ｎ２Ｎ３がＣＡＣである。
【図４】図４は、酵母由来のｔＲＮＡＰｈｅ中へのｓの導入部位及びｔＲＮＡの構造（非特許文献２０）を示す。図４はオリジナルのｔＲＮＡ転写産物の２次構造である。ｓで置換された場所は○で囲んである。波線は３次構造の塩基−塩基相互作用を示す。ボックスで囲んだＧ−Ｃ対はオリジナルのＣ−Ｇ対から変更されているが、この変位はオリジナルのｔＲＮＡ構造（非特許文献２６）を有意には変えない。
【図５】図５は、酵母由来のｔＲＮＡＰｈｅ中へのｓの導入部位及びｔＲＮＡの構造（非特許文献２０）を示す。図５は原型のｔＲＮＡ転写産物の３次構造である。
【図６】図６Ａ−Ｃは、酵母由来のｔＲＮＡＰｈｅ中へのｓの導入部位を含む領域の拡大図である。濃い色の塩基（群）はｓと置換される部位で、この塩基は薄い色の塩基（群）と積み重なっており、そして、球（黄色）はＭｇ２＋を表す。図中の塩基は修飾された塩基を示すが、括弧内に記載された塩基はオリジナルな転写産物中の塩基に相当する。
【図７】図７Ａは、ｓのリボヌクレオシド（１μＭ）の励起及び蛍光スペクトルを示す。黒丸実線は、３５２ｎｍでの励起による蛍光スペクトルを示す。白丸波線は、４３４ｎｍでの励起による蛍光スペクトルを示す。  図７Ｂ及びＣは、３５２ｎｍでの励起による（Ｂ）ｔＲＮＡ  ４７ｓ（１μＭ）の蛍光スペクトル；及び（Ｃ）ｔＲＮＡ  ５７ｓ（１μＭ）の蛍光スペクトルを示す。蛍光スペクトルは、５０ｍＭ  カコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、及び０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ中、２０℃において測定した。（Ｂ）において、黒丸実線、白丸波線、及び×印実線は、ｔＲＮＡ４７ｓの各々０ｍM  Ｍｇ２＋、２ｍＭ  Ｍｇ２＋及び５ｍＭ  Ｍｇ２＋存在下における蛍光スペクトルを示す。（Ｃ）において、黒丸実線、白丸波線、及び×印実線は、ｔＲＮＡ５７ｓの各々０ｍM  Ｍｇ２＋、２ｍＭ  Ｍｇ２＋及び５ｍＭ  Ｍｇ２＋存在下における蛍光スペクトルを示す。
【図８】図８は、（Ａ）ｓリボヌクレオシドの蛍光強度の温度依存性、及び（Ｂ）ｓのリボヌクレオシドでｔＲＮＡ  ３６ｓの蛍光強度を補正した例を示す。ｔＲＮＡ転写産物の蛍光強度は、等式：Ｙｃｔ＝Ｙｔ／（Ｒｔ／Ｒ２０）によって補正された。ここにおいて、Ｙｃｔは、ｔ℃での各ｔＲＮＡの補正された強度であり、Ｙｔは、ｔ℃での各ｔＲＮＡの測定された蛍光強度であり、Ｒｔは、ｔ℃でのｓのリボヌクレオシドの観察された蛍光強度であり、そして、Ｒ２０は、２０℃でのｓのリボヌクレオシドの観察された蛍光強度である。
【図９】図９は、種々の位置においてｓを含むｔＲＮＡの、４３４ｎｍでの蛍光強度の変化によって得られる溶解曲線（実線）及び２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収の変化によって得られる溶解曲線（波線）を示す。太い（黒）実線、中くらいの（青）実線、細い実線（赤）の実線は、各々０ｍM  Ｍｇ２＋、２ｍＭ  Ｍｇ２＋及び５ｍＭ  Ｍｇ２＋存在下における４３４ｎｍでの蛍光強度の変化によって得られる融解曲線である。太い（黒）波線、中くらいの（青）波線及び細い実線（赤）の波線は、各々０ｍM  Ｍｇ２＋、２ｍＭ  Ｍｇ２＋及び５ｍＭ  Ｍｇ２＋存在下における２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収の変化によって得られる融解曲線である。
【図１０】図１０は、ｖ−ｙ塩基対とｓ−Ｐａ塩基対を用いた転写によるＲＮＡへのｙとｓの部位特異的導入の方法と転写産物のポリアクリルアミド電気泳動の結果を示す。図１０ａにおいて、配列中のＰは、人工塩基Ｐａを示している。
【図１１】図１１は、ｖ−ｙ塩基対とｓ−Ｐａ塩基対を用いた転写により調製された転写産物（Ｂｈｐ２−１）のヌクレオチド組成の分析の結果を示す。図１１ｂにおける、各スポットの定量は、表４にまとめた。
【図１２】図１２は、人工塩基ｓとｙ若しくはＦＡＭ−ｙを導入したＲＮＡ（Ｂｈｐ２−１）の蛍光測定の結果を示す。図１２ｂは、Ｂｈｐ２−１が相補性ＲＮＡと二本鎖を形成している場合の蛍光スペクトルを示す。図１２ｃは、Ｂｈｐ２−１が１本鎖のままヘアピン構造を形成している場合の結果を示す。図１２ｂ及び図１２ｃのいずれの場合も、実線は、位置１３にＦＡＭ−ｙ、位置３６にｓを有するＢｈｐ２−１の結果である。波線は、位置１３にｙ、位置３６にｓを有するＢｈｐ２−１の結果である
【図１３】図１３ａは、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中におけるｓデオキシリボヌクレオシド（細い線）およびＦＡＭ−ｙＴＰ（太線）の蛍光（ｆｌｕ、黒線）および吸収（ａｂｓ、破線）スペクトルである。図１３ｂは、ＦＲＥＴ実験のスキームである。非天然塩基は、ｓまたｖについて励起させたとき（λｅｘ）、低蛍光状態を黒丸で、高蛍光状態を白丸で示した。図１３ｃおよびｄは、ｓ塩基を含有する（ｃ：ＤＮＡ３５ｓ１、ＤＮＡ３５ｓ２ａ、およびＤＮＡ３５ｓ２ｂ）およびｖ塩基を含有する（ｃ：ＤＮＡ３５ｖ１、ＤＮＡ３５ｖ２ａ、およびＤＮＡ３５ｖ２ｂ）一本鎖ＤＮＡの定常状態蛍光発光スペクトルである。
【図１４】図１４は、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖の定常状態蛍光発光スペクトルを示す。３５−ｍｅｒ  ＤＮＡのそれぞれ（ａ，ＤＮＡ３５ｓ１；ｂ，ＤＮＡ３５ｖ１；ｃ，ＤＮＡ３５ｓ２ａ；ｄ，ＤＮＡ３５ｖ２ａ；ｅ，ＤＮＡ３５ｓ２ｂ；ｆ，ＤＮＡ３５ｖ２ｂ）を、ＦＡＭ−ｙ（白丸および黒丸）またはＦＡＭ−ｈｘ−ｙ（白三角または黒三角）を含む１７−ｍｅｒ  ＲＮＡとハイブリダイズさせた。白丸および白三角は２０℃、黒丸および黒三角は７０℃でのスペクトルである。
【図１５】図１５は、人工塩基を含むＤＮＡプローブを過剰量用いた場合のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖の定常状態蛍光発光スペクトルを示す。３５−ｍｅｒ  ＤＮＡのそれぞれ（１μＭ）（ａ，ＤＮＡ３５ｓ１；ｂ，ＤＮＡ３５ｖ１；ｃ，ＤＮＡ３５ｓ２ａ；ｄ，ＤＮＡ３５ｖ２ａ）を、ＦＡＭ−ｙ（白丸および黒丸）またはＦＡＭ−ｈｘ−ｙ（白三角および黒丸）を含む１７−ｍｅｒ  ＲＮＡ（１００ｎＭ）とハイブリダイズさせた。白丸および白三角は２０℃、黒丸および黒三角は７０℃でのスペクトルである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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