(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）抗原に特異的に結合する抗体の２本の修飾された重鎖であって、
修飾は、各重鎖のＶＨが前記抗体のＶＬにより置換され、前記修飾された重鎖がＦｃ部分のそのＣＨドメインを介してお互いに会合していることを意味する、
重鎖；
ｂ）該抗原に特異的に結合する抗体の、２本の修飾された重鎖であって、
修飾は、各重鎖のＣＨ１が前記抗体のＣＬにより置換され、前記修飾された重鎖がＦｃ部分のそのＣＨ３ドメインを介してお互いに会合していることを意味する、
重鎖を含み、
かつ、ａ）の重鎖のＶＬドメインはｂ）の重鎖のＶＨドメインと会合しており、かつａ）の重鎖のＣＨ１ドメインはｂ）の重鎖のＣＬドメインと会合している、抗原結合タンパク質。
【請求項２】
ａ）の修飾された重鎖のＦｃ部分のＣＨ３ドメイン及びｂ）の修飾された重鎖のＦｃ部分のＣＨ３ドメインは同じアイソタイプであることを特徴とする、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３】
ａ）の修飾された重鎖のＦｃ部分のＣＨ２とＣＨ３ドメイン及びｂ）の修飾された重鎖のＦｃ部分のＣＨ２とＣＨ３ドメインは同じアイソタイプであることを特徴とする、請求項２に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項４】
ａ）の修飾された重鎖のＦｃ部分のＣＨ２とＣＨ３ドメイン及びｂ）の修飾された重鎖のＦｃ部分のＣＨ２とＣＨ３ドメインはＩｇＧのアイソタイプであることを特徴とする、請求項３に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項５】
ａ）の修飾された重鎖のＦｃ部分のＣＨ２とＣＨ３ドメイン及びｂ）の修飾された重鎖のＦｃ部分のＣＨ２とＣＨ３ドメインはＩｇＧ１のアイソタイプであることを特徴とする、請求項４に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項６】
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む２本の修飾された重鎖；及び
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含む２本の修飾された重鎖；
ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む２本の修飾された重鎖；及び
ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含む２本の修飾された重鎖；又は
ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含む２本の修飾された重鎖；及び
ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を含む２本の修飾された重鎖；
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項７】
ａ）の２本の修飾された重鎖、
又はｂ）の２本の修飾された重鎖のどちらかは、
アミノ酸置換、Ｓ３６４Ｇ，Ｌ３６８Ｆ，Ｄ３９９Ｋ及びＫ４０９Ｄにより更に修飾される（ここでアミノ酸の位置はＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けられる）ことを特徴とする、請求項５に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項８】
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む２本の修飾された重鎖；及び
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含む２本の修飾された重鎖を含み、
ここでａ）の２本の修飾された重鎖、
又はｂ）の２本の修飾された重鎖のどちらかは、
アミノ酸置換、Ｓ３６４Ｇ，Ｌ３６８Ｆ，Ｄ３９９Ｋ及びＫ４０９Ｄにより更に修飾され（ここでアミノ酸の位置はＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けられる）；
ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む２本の修飾された重鎖；及び
ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含む２本の修飾された重鎖を含み
ここでａ）の２本の修飾された重鎖、
又はｂ）の２本の修飾された重鎖のどちらかは、
アミノ酸置換、Ｓ３６４Ｇ，Ｌ３６８Ｆ，Ｄ３９９Ｋ及びＫ４０９Ｄにより更に修飾され（ここでアミノ酸の位置はＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けられる）；
又は
ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含む２本の修飾された重鎖；及び
ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を含む２本の修飾された重鎖を含み、
ここでａ）の２本の修飾された重鎖、
又はｂ）の２本の修飾された重鎖のどちらかは、
アミノ酸置換、Ｓ３６４Ｇ，Ｌ３６８Ｆ，Ｄ３９９Ｋ及びＫ４０９Ｄにより更に修飾される（ここでアミノ酸の位置はＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けられる）ことを特徴とする、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項９】
ａ）の修飾された重鎖のＦｃ部分のＣＨ３ドメイン及びｂ）の修飾された重鎖のＦｃ部分のＣＨ３ドメインは異なるアイソタイプであることを特徴とする、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１０】
ａ）の修飾された重鎖のＦｃ部分のＣＨ３ドメインはＩｇＧ１のアイソタイプであり；
及びｂ）の修飾された重鎖のＦｃ部分のＣＨ３ドメインはＩｇＡのアイソタイプであることを特徴とする、請求項９に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１１】
ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含む２本の修飾された重鎖；及び
ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含む２本の修飾された重鎖を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１２】
ａ）の修飾された重鎖のＦｃ部分のＣＨ２とＣＨ３ドメインはＩｇＧ１のアイソタイプであり；
及びｂ）の修飾された重鎖のＦｃ部分のＣＨ２とＣＨ３ドメインはＩｇＡのアイソタイプであることを特徴とする、請求項１０に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１３】
ａ）及びｂ）のＦｃ部分のＣＨ２ドメインはＩｇＧ１のアイソタイプであり、抗原結合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１のアイソタイプのＡｓｎ２９７でオリゴ糖（糖）の総量の８０％以下のフコースの量でアフコシル化されていることを特徴とする、請求項１から１１に記載の一価抗原結合タンパク質。
【請求項１４】
請求項１から１３に記載の抗原結合タンパク質を含む、薬学的組成物。
【請求項１５】
ａ）請求項１から１３に記載の抗原結合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターで宿主細胞を形質転換し、
ｂ）前記抗原結合タンパク質分子の合成を許容する条件下で宿主細胞を培養し；及び
ｃ）前記培養物から前記抗原結合タンパク質分子を回収する工程を含む、請求項１から１３に記載の抗原結合タンパク質の調製のための方法。
【請求項１６】
請求項１から１３に記載の抗原結合タンパク質をコードする核酸。
【請求項１７】
請求項１６に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載のベクターを含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、２つのＦｃ部分を含む抗原結合タンパク質、それらの生産のための方法、前記抗原結合タンパク質を含有する薬学的組成物、及びそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
この２０年間の間に、単一特異的又は多重特異的のどちらか、一価又は多価のどちらかの様々な操作型抗体の誘導体が開発され、評価されてきた（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（２００５）１１２６−１１３６；Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｎ．，ａｎｄ Ｌｅｇｅｒ Ｏ．，Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ７４（２００７）３−１４を参照）。
【０００３】
米国特許第２００４／００３３５６１号は、重鎖と修飾型重鎖の共発現による単価モノボディの産生とそのＤＮＡに関する。しかし、発現の間に、かなりの量の望まれないホモダイマーが副産物として形成され、ホモダイマーとヘテロダイマーが同一又は類似の分子量を有するため、所望のヘテロダイマー性モノボディから分離することは困難である。国際公開第２００７／０４８０３７号は、米国特許出願公開第２００４／００３３５６１号のヘテロダイマー性モノボディに対応するが、分離することが困難なホモダイマー性副産物からヘテロダイマーの精製を容易にするために、重鎖に結合したタグ付き部分を有し得る一価のＩｇＧに関する。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、
ａ）抗原に特異的に結合する抗体の２本の修飾型重鎖であって、各重鎖のＶＨは前記抗体のＶＬにより置換され、前記修飾型重鎖はＦｃ部分のそのＣＨドメインを介してお互いに会合している前記抗体の２本の修飾型重鎖；
ｂ）前記抗体の２本の修飾型重鎖であって、各重鎖のＣＨ１は前記抗体のＣＬにより置換され、前記修飾型重鎖はＦｃ部分のそのＣＨドメインを介してお互いに会合している前記抗体の２本の修飾型重鎖を含み、
かつ、ａ）の重鎖のＶＬドメインはｂ）の重鎖のＶＨドメインと会合しており、かつａ）の重鎖のＣＨ１ドメインはｂ）の重鎖のＣＬドメインと会合している、抗原結合タンパク質を含む。
【０００５】
一実施態様において、本発明による抗原結合タンパク質は、
ａ）の修飾型重鎖のＦｃ部分のＣＨ３ドメイン及びｂ）の修飾型重鎖のＦｃ部分のＣＨ３ドメインは同じアイソタイプであることを特徴とする。
【０００６】
一実施態様において、本発明による抗原結合タンパク質は、
ａ）の修飾型重鎖のＦｃ部分のＣＨ２とＣＨ３ドメイン及びｂ）の修飾型重鎖のＦｃ部分のＣＨ２とＣＨ３ドメインは同じアイソタイプであることを特徴とする。
【０００７】
一実施態様において、本発明による抗原結合タンパク質は、
ａ）の修飾型重鎖のＦｃ部分のＣＨ２とＣＨ３ドメイン及びｂ）の修飾型重鎖のＦｃ部分のＣＨ２とＣＨ３ドメインはＩｇＧのアイソタイプであることを特徴とする。
【０００８】
一実施態様において、本発明による抗原結合タンパク質は、
ａ）の修飾型重鎖のＦｃ部分のＣＨ２とＣＨ３ドメイン及びｂ）の修飾型重鎖のＦｃ部分のＣＨ２とＣＨ３ドメインはＩｇＧ１のアイソタイプであることを特徴とする。
【０００９】
一実施態様において、本発明による抗原結合タンパク質は、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む２本の修飾型重鎖；及び
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含む２本の修飾型重鎖；
ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む２本の修飾型重鎖；及び
ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含む２本の修飾型重鎖；又は
ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含む２本の修飾型重鎖；及び
ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を含む２本の修飾型重鎖；
を含むことを特徴とする。
【００１０】
一実施態様において、本発明による抗原結合タンパク質は、
ａ）の２本の修飾型重鎖、
又はｂ）の２本の修飾型重鎖のどちらか、
は、アミノ酸置換、Ｓ３６４Ｇ，Ｌ３６８Ｆ，Ｄ３９９Ｋ及びＫ４０９Ｄにより更に修飾される（ここでアミノ酸の位置はＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けられる）ことを特徴とする。
【００１１】
一実施態様において、本発明による抗原結合タンパク質は、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む２本の修飾型重鎖；及び
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含む２本の修飾型重鎖；
ここでａ）の２本の修飾型重鎖、
又はｂ）の２本の修飾型重鎖のどちらか、
は、アミノ酸置換、Ｓ３６４Ｇ，Ｌ３６８Ｆ，Ｄ３９９Ｋ及びＫ４０９Ｄにより更に修飾され（ここでアミノ酸の位置はＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けられる）；
ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む２本の修飾型重鎖；及び
ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含む２本の修飾型重鎖；
ここでａ）の２本の修飾型重鎖、
又はｂ）の２本の修飾型重鎖のどちらか、
は、アミノ酸置換、Ｓ３６４Ｇ，Ｌ３６８Ｆ，Ｄ３９９Ｋ及びＫ４０９Ｄにより更に修飾され（ここでアミノ酸の位置はＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けられる）；
又は
ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含む２本の修飾型重鎖；及び
ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を含む２本の修飾型重鎖；
ここでａ）の２本の修飾型重鎖、
又はｂ）の２本の修飾型重鎖のどちらか、
は、アミノ酸置換、Ｓ３６４Ｇ，Ｌ３６８Ｆ，Ｄ３９９Ｋ及びＫ４０９Ｄにより更に修飾される（ここでアミノ酸の位置はＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けられる）ことを特徴とする。
【００１２】
一実施態様において、本発明による抗原結合タンパク質は、
ａ）の修飾型重鎖のＦｃ部分のＣＨ３ドメイン及びｂ）の修飾型重鎖のＦｃ部分のＣＨ３ドメインは異なるアイソタイプであることを特徴とする。
【００１３】
一実施態様において、本発明による抗原結合タンパク質は、
ａ）の修飾型重鎖のＦｃ部分のＣＨ３ドメインはＩｇＧ１のアイソタイプであり；
及びｂ）の修飾型重鎖のＦｃ部分のＣＨ３ドメインはＩｇＡのアイソタイプであることを特徴とする。
【００１４】
一実施態様において、本発明による抗原結合タンパク質は、
ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含む２本の修飾型重鎖；及び
ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含む２本の修飾型重鎖を含むことを特徴とする。
【００１５】
一実施態様において、本発明による抗原結合タンパク質は、
ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む２本の修飾型重鎖；及び
ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む２本の修飾型重鎖を含むことを特徴とする。
【００１６】
一実施態様において、本発明による抗原結合タンパク質は、
ａ）の修飾型重鎖のＦｃ部分のＣＨ２とＣＨ３ドメインはＩｇＧ１のアイソタイプであり；
及びｂ）の修飾型重鎖のＦｃ部分のＣＨ２とＣＨ３ドメインはＩｇＡのアイソタイプであることを特徴とする。
【００１７】
一実施態様において、本発明による抗原結合タンパク質は、ａ）及びｂ）のＦｃ部分のＣＨ２ドメインはＩｇＧ１のアイソタイプであり、抗原結合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１のアイソタイプのＡｓｎ２９７でオリゴ糖（糖類）の総量の８０％以下（好ましくは６５％から５％）のフコースの量でアフコシル化されていることを特徴とする。
【００１８】
本発明は、
ａ）本発明による抗原結合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターを持つ宿主細胞を形質転換し
ｂ）前記抗原結合タンパク質分子の合成を許容する条件下で宿主細胞を培養し；及び
ｃ）前記培養物から前記抗原結合タンパク質分子を回収する
工程を含む、本発明による抗原結合タンパク質の調製のための方法を含む。
【００１９】
本発明は、本発明による抗原結合タンパク質をコードする核酸を更に含む。
【００２０】
本発明は、本発明による抗原結合タンパク質をコードする核酸を含むベクターを更に含む。
【００２１】
本発明は前記ベクターを含む宿主細胞を更に含む。
【００２２】
本発明は、組成物、好ましくは本発明による抗原結合タンパク質の薬学的又は診断用の組成物を更に含む。
【００２３】
本発明は、本発明による抗原結合タンパク質を含む薬学的組成物を更に含む。
【００２４】
本発明は、本発明による抗原結合タンパク質の治療的有効量を患者に投与することにより特徴付けられる、治療法を必要としている患者の治療のための方法を更に含む。
【００２５】
今や本発明による抗原結合タンパク質は、生物学的又は薬学的活性（例えば親抗体に比較して増強したＡＤＣＣ）など価値ある特徴を有することが見いだされている。それらは例えば癌などの疾患の治療のために使用することができる。本発明による抗原結合タンパク質は、更にその上高く価値ある薬物動態特性（例えばＡＵＣ０−ｉｎｆ，ＣｍａｘまたはＣ０など）を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ−Ｂ】Ａ）ＣＨ１−ＣＬ交差を持つ、本発明による抗原結合タンパク質の模式的な構造（ＭｏＡｂダイマーと略）。Ｂ）主要副産物の模式図−ＣＨ１−ＣＬ交差を持つ一価抗体モノマー（ＭｏＡｂ）（ＭｏＡｂと略）。
【図１Ｃ】Ｃ）２本の修飾型重鎖ａとｂの会合：２本の異なる鎖（ａとｂ）のヘテロ二量体化は、直接一価の抗体Ｂをもたらす（経路２）。２本の同じ鎖（ａとａ及びｂとｂ）のホモ二量体化は、会合して「ＭｏＡｂ−二量体」Ａを形成することができる予想中間体ａａ及びｂｂをもたらす。ＣＨ３−ＣＨ３の接触の修飾は、生成物Ａ（ＭｏＡｂ−二量体）とＢ（ＭｏＡｂ）の分布に影響を与えうる。ヘテロニ量体化に有利にはたらく修飾（例えばｋｎｏｂｓ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅｓ）は、経路２を介して化合物Ｂの相対量を増加させるであろうが、同一鎖間の誘引性相互作用を維持するが異なる鎖の反発をもたらす修飾（例えば異なるアイソタイプから取られたａとｂのＣＨ３ドメイン）は、経路１を支持し、よってＡの量を増加させるであろう。白：軽鎖ドメイン。破線：重鎖ドメイン。
【図２】ＭｏＡｂ−二量体 ｃ−Ｍｅｔ（５Ｄ５ ＭｏＡｂ−二量体（「ＣＨ３−ｗｔ」））の生化学的特徴付け（ＣＨ３−ｗｔは、未変化の野生型ＣＨ３ドメインを指す）。（Ａ）プロテインＡで精製した抗体はスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００ ２６／６０カラムで分離された。（Ｂ）ピーク画分（１、２、３）はプールされ、非還元条件下及び還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供された。ポリアクリルアミドゲルはクマシーブルー色素で染色した。個々のピークは、ＭｏＡｂ（３），ＭｏＡｂ−二量体（２）及び高分子量の凝集体（１）に対応する。
【図３】ＭｏＡｂ−二量体 ＩＧＦ−１Ｒ（ＩＧＦ−１Ｒ ＡＫ１８ ＭｏＡｂ−二量体（「ＣＨ３−ｗｔ」））の生化学的特徴付け（ＣＨ３−ｗｔは、未変化の野生型ＣＨ３ドメインを指す）。（Ａ）プロテインＡで精製した抗体はスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００ ２６／６０カラムで分離された。（Ｂ）ピーク画分（１、２）はプールされ、非還元条件下及び還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供された。ポリアクリルアミドゲルはクマシーブルー色素で染色した。個々のピークは、ＭｏＡｂ（２）及びＭｏＡｂ−二量体（１）に対応する。Ｃ）ピーク画分１，２の分子量は、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによって調べられた。
【図４】Ｈｅｒ３ ２０５ ＭｏＡｂ−二量体（「ＣＨ３ｗｔ」）の生化学的特徴付け（ＣＨ３−ｗｔは、未変化の野生型ＣＨ３ドメインを指す）。（Ａ）プロテインＡで精製した抗体はスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００ ２６／６０カラムで分離された。（Ｂ）ピーク画分（１、２）はプールされ、非還元条件下及び還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供された。ポリアクリルアミドゲルはクマシーブルー色素で染色した。個々のピークは、ＭｏＡｂ（３），ＭｏＡｂ−二量体（２）及び高分子量の凝集体（１）に対応する。
【図５】ＩＧＦ−１Ｒ結合親和性を分析するために適用された表面プラズモン共鳴アッセイの模式絵。抗ヒトＩｇＧ抗体（ＪＩＲ１０９−００５−０９８）をＣＭ５バイオセンサーチップの表面に固定し、その後ＭｏＡｂ又はＭｏＡｂダイマー抗体を捕捉した。組換えＩＧＦ−１Ｒエクトドメインのさらなる注入で、ＭｏＡｂ分子及びＭｏＡｂ−二量体分子中の抗原結合部位の機能を確認した。
【図６】フローサイトメトリー解析による、ＭｏＡｂ−二量体（ＩＧＦ−１Ｒ ＡＫ１８ ＭｏＡｂ−二量体（「ＣＨ３−ｗｔ」）（Ｂ）及び親抗体Ｍａｂ ＩＧＦ−１Ｒ（Ａ）のＡ５４９細胞に対する細胞性結合。Ａ５４９細胞を標識した抗体の希釈系列と共にインキュベートした。結合した抗体はＦｃ−結合二次フルオロフォア結合抗体を用いて可視化した。
【図７】ＩＧＦ１Ｒ Ｍａｂの非糖鎖操作型（ｎｏｎ−ｇｅ）及び糖鎖操作型（ｇｅ）、及び非糖鎖操作型ＩＧＦ−１Ｒ ＭｏＡｂ−二量体（ＩＧＦ１Ｒ ＡＫ１８ ＭｏＡｂ−二量体（「ＣＨ３−ｗｔ」））によるＡＤＣＣアッセイ。ドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、非糖鎖操作型（ｎｏｎ−ｇｅ）ＩＧＦ１Ｒ Ｍａｂ（１），糖鎖操作型（ｇｅ）ＩＧＦ１Ｒ Ｍａｂ（２）及び非糖鎖操作型（ｎｏｎ−ｇｅ）ＩＧＦ１Ｒ ＡＫ１８ ＭｏＡｂ−二量体（「ＣＨ３−ｗｔ」）（３）の存在下で、前立腺癌細胞（ＤＵ１４５）と共にインキュベートした。
【図８】ＩＧＦ−１Ｒの内部移行は、ＩＧＦ−１Ｒ ＩｇＧ１（Ｍａｂ ＩＧＦ−１Ｒ）抗体及びＩＧＦ−１Ｒ ＭｏＡｂ−二量体（ＩＧＦ１Ｒ ＡＫ１８ ＭｏＡｂ−二量体（「ＣＨ３−ｗｔ」））とのインキュベーション後に、ＨＴ２９細胞で評価された。グラフは、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイ手順で測定した、抗体露光時の総ＩＧＦ−１Ｒレベルを示す。
【図９】ＩＧＦ−１Ｒの自己リン酸化を、１０ｎＭのＩＧＦ−１の存在下で、ＩＧＦ−１Ｒ ＩｇＧ１抗体とＩＧＦ−１Ｒ ＭｏＡｂ−二量体（ＩＧＦ１Ｒ ＡＫ１８ ＭｏＡｂ−二量体（「ＣＨ３−ｗｔ」））と共に３Ｔ３−ＩＧＦ−１Ｒ細胞をインキュベートした後で評価した。グラフは、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイ手順で測定した、抗体露光時のリン酸化ＩＧＦ−１Ｒレベルを示す。
【図１０】得られたＭｏＡｂ−二量体（＝本発明による抗原結合タンパク質）対ＭｏＡｂ−単量体（＝一価の副産物）のＨＰＬＣにより測定された比率の解析。野生型ＣＨ３（ＣＨ３−ｗｔ）ドメインと修飾型ＣＨ３ドメインを持つ異なる抗体が一過性に発現され、二量体対単量体の比率が決定された。
【図１１】非還元条件下で脱グリコシル化後のＩＧＦ−１ＲのＭｏＡｂ二量体（ＳＥＣ分画１）のＥＳＩ−ＭＳスペクトル
【図１２】脱グリコシル化及び還元後のＩＧＦ−１ＲのＭｏＡｂ二量体（ＳＥＣ分画１）のＥＳＩ−ＭＳスペクトル発明の詳細な記載
【００２７】
本発明は、
ａ）抗原に特異的に結合する抗体の２本の修飾型重鎖であって、各重鎖のＶＨは前記抗体のＶＬにより置換され、前記修飾型重鎖はＦｃ部分のそのＣＨドメインを介してお互いに会合している前記抗体の２本の修飾型重鎖；
ｂ）前記抗体の２本の修飾型重鎖であって、各重鎖のＣＨ１は前記抗体のＣＬにより置換され、前記修飾型重鎖はＦｃ部分のそのＣＨドメインを介してお互いに会合している前記抗体の２本の修飾型重鎖を含み、
かつ、ａ）の重鎖のＶＬドメインはｂ）の重鎖のＶＨドメインと会合しており、かつａ）の重鎖のＣＨ１ドメインはｂ）の重鎖のＣＬドメインと会合している、抗原結合タンパク質を含む。
【００２８】
一実施態様において、本発明による抗原結合タンパク質は、
ａ）の修飾型重鎖のＦｃ部分のＣＨ３ドメイン及びｂ）の修飾型重鎖のＦｃ部分のＣＨ３ドメインは同じアイソタイプであることを特徴とする。
【００２９】
一実施態様において、本発明による抗原結合タンパク質は、
ａ）の修飾型重鎖のＦｃ部分のＣＨ２とＣＨ３ドメイン及びｂ）の修飾型重鎖のＦｃ部分のＣＨ２とＣＨ３ドメインは同じアイソタイプであることを特徴とする。
【００３０】
一実施態様において、本発明による抗原結合タンパク質は、
ａ）の修飾型重鎖のＦｃ部分のＣＨ２とＣＨ３ドメイン及びｂ）の修飾型重鎖のＦｃ部分のＣＨ２とＣＨ３ドメインはＩｇＧのアイソタイプであることを特徴とする。
【００３１】
一実施態様において、本発明による抗原結合タンパク質は、
ａ）の修飾型重鎖のＦｃ部分のＣＨ２とＣＨ３ドメイン及びｂ）の修飾型重鎖のＦｃ部分のＣＨ２とＣＨ３ドメインはＩｇＧ１のアイソタイプであることを特徴とする。
【００３２】
一実施態様において、本発明による抗原結合タンパク質は、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む２本の修飾型重鎖；及び  
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含む２本の修飾型重鎖；  
ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む２本の修飾型重鎖；及び  
ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含む２本の修飾型重鎖；又は
ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含む２本の修飾型重鎖；及び
ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を含む２本の修飾型重鎖；
を含むことを特徴とする。
【００３３】
本発明による抗原結合タンパク質の収率を向上させるために（つまり、ＭｏＡｂ単量体に対するＭｏＡｂ二量体の比率を向上させるために（実施例９を参照））、ａ）のＩｇＧ１のＣＨ３ドメインは、ａ）のＩｇＧ１のＣＨ３ドメインとｂ）の天然の（ｗｔ）ＩｇＧ１のＣＨ３ドメインが異なるように、変異により更に修飾されることが可能である。修飾／変異は、同一鎖間の誘引性相互作用を維持するが異なる鎖の反発をもたらすような方式で行われなければならない（図１Ｃを参照）。
【００３４】
一実施態様において、本発明による抗原結合タンパク質は、
ａ）の２本の修飾型重鎖、
又はｂ）の２本の修飾型重鎖のどちらかは、
アミノ酸置換、Ｓ３６４Ｇ，Ｌ３６８Ｆ，Ｄ３９９Ｋ及びＫ４０９Ｄにより更に修飾される（ここでアミノ酸の位置はＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けられる）ことを特徴とする。
【００３５】
ＫａｂａｔのＥＵ番号付けシステムは、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載されている。
【００３６】
一実施態様において、本発明による抗原結合タンパク質は、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む２本の修飾型重鎖；及び
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含む２本の修飾型重鎖；
ここでａ）の２本の修飾型重鎖、
又はｂ）の２本の修飾型重鎖のどちらかは、
アミノ酸置換、Ｓ３６４Ｇ，Ｌ３６８Ｆ，Ｄ３９９Ｋ及びＫ４０９Ｄにより更に修飾され（ここでアミノ酸の位置はＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けられる）；
ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む２本の修飾型重鎖；及び
ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含む２本の修飾型重鎖；
ここでａ）の２本の修飾型重鎖、
又はｂ）の２本の修飾型重鎖のどちらかは、
アミノ酸置換、Ｓ３６４Ｇ，Ｌ３６８Ｆ，Ｄ３９９Ｋ及びＫ４０９Ｄにより更に修飾され（ここでアミノ酸の位置はＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けられる）；
又は
ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含む２本の修飾型重鎖；及び
ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を含む２本の修飾型重鎖；
ここでａ）の２本の修飾型重鎖、
又はｂ）の２本の修飾型重鎖のどちらかは、
アミノ酸置換、Ｓ３６４Ｇ，Ｌ３６８Ｆ，Ｄ３９９Ｋ及びＫ４０９Ｄにより更に修飾される（ここでアミノ酸の位置はＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けられる）ことを特徴とする。
【００３７】
本発明による抗原結合タンパク質の収量を改善するため別の可能性として（すなわち、ＭｏＡｂ単量体に対するＭｏＡｂ二量体の比率を向上させるために（実施例９を参照）））、ａ）とｂ）のＣＨ３ドメインが異なるアイソタイプから取られた。従って、同一鎖間の誘引性相互作用は維持されるが、異なる鎖は反発される。
【００３８】
従って、一実施態様において、本発明による抗原結合タンパク質は、
ａ）の修飾型重鎖のＦｃ部分のＣＨ３ドメイン及びｂ）の修飾型重鎖のＦｃ部分のＣＨ３ドメインは異なるアイソタイプであることを特徴とする。
【００３９】
一実施態様において、本発明による抗原結合タンパク質は、
ａ）の修飾型重鎖のＦｃ部分のＣＨ３ドメインはＩｇＧのアイソタイプであり；
及びｂ）の修飾型重鎖のＦｃ部分のＣＨ３ドメインはＩｇＡのアイソタイプであることを特徴とする。
【００４０】
一実施態様において、本発明による抗原結合タンパク質は、
ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含む２本の修飾型重鎖；及び
ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含む２本の修飾型重鎖を特徴とする。
【００４１】
一実施態様において、本発明による抗原結合タンパク質は、
ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む２本の修飾型重鎖；及び
ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む２本の修飾型重鎖を含むことを特徴とする。
【００４２】
一実施態様において、本発明による抗原結合タンパク質は、
ａ）の修飾型重鎖のＦｃ部分のＣＨ２とＣＨ３ドメインはＩｇＧ１のアイソタイプであり；
及びｂ）の修飾型重鎖のＦｃ部分のＣＨ２とＣＨ３ドメインはＩｇＡ１のアイソタイプであることを特徴とする。
【００４３】
一実施態様において、本発明による抗原結合タンパク質は、ａ）及びｂ）のＦｃ部分のＣＨ２ドメインはＩｇＧ１のアイソタイプであり、抗原結合タンパク質は、ヒトＩｇＧ１のアイソタイプのＡｓｎ２９７でオリゴ糖（糖）の総量の８０％以下のフコースの量でアフコシル化されていることを特徴とする。
【００４４】
本明細書で使用される用語「抗体」は、２本の抗体重鎖と２本の抗体軽鎖からなる全長抗体を意味する（図１を参照）。全長抗体の重鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体の定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）、抗体のヒンジ領域（ＨＲ）、抗体の重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び抗体の重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）からなるポリペプチドで、ＶＨ−ＣＨ１−ＨＲ−ＣＨ２−ＣＨ３と略記され；及びクラスＩｇＥの抗体の場合において任意で抗体の重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）を含む。好ましくは、全長抗体の重鎖は、Ｎ−末端からＣ−末端方向にＶＨ、ＣＨ１、ＨＲ、ＣＨ２及びＣＨ３からなるポリペプチドである。全長抗体の軽鎖は、Ｎ−末端からＣ−末端方向に、抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及び抗体の軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）からなるポリペプチドであり、ＶＬ−ＣＬと略記する。抗体の軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）は、κ（カッパ）またはλ（ラムダ）とすることができる。抗体鎖は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメイン間（すなわち、軽鎖および重鎖の間）のポリペプチド間及び完全長抗体の重鎖のヒンジ領域の間のジスルフィド結合を介して一緒に連結されている。典型的な全長抗体の例は、ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１及びＩｇＧ２），ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤ，及びＩｇＥなどの天然抗体である。本発明による抗体は、単一種、例えばヒト由来であり得、又はそれらはキメラ化抗体或いはヒト化抗体であり得る。本発明による抗体は、各々がＶＨとＶＬの対により形成される２つの抗原結合部位を含み、その両方が同一の（第一の）抗原に特異的に結合する。
【００４５】
これらの全長抗体から、本発明の抗原結合タンパク質は、
ａ）抗原に特異的に結合する抗体の２本の重鎖を、各重鎖のＶＨドメインを前記抗体のＶＬドメインにより置換することにより修飾し；
ｂ）前記抗体の２本の重鎖を、各重鎖のＣＨ１ドメインを前記抗体のＣＬドメインにより置換することにより修飾することにより得られる。
【００４６】
抗体又は抗原結合タンパク質の「Ｆｃ部分」は、抗原に対する抗体の結合に直接関与していないが、ａ）（修飾型）抗体鎖のお互いの（例えばそれらのＣＨ３ドメインを介した）会合、及びｂ）様々なエフェクター機能を担っている。「抗体のＦｃ部分」は当業者に良く知られており、抗体のパパイン切断に基づいて定義される。重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体又は免疫グロブリンは、クラス：ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧ及びＩｇＭ，に分けられ、これらの幾つかはサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に更に分けられる。重鎖の定常領域に従って、免疫グロブリンの異なるクラスは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。
【００４７】
５つのタイプの哺乳類の抗体重鎖があり、ギリシャ文字によりα、δ、ε、γ及びμと表わされる（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ．Ａ．，Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，第５版，Ｇａｒｌａｎｄ出版（２００１））。存在する重鎖のタイプは抗体のクラスを定義し；これらの鎖は、それぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体に見いだされる（Ｒｈｏａｄｅｓ，Ｒ．Ａ．，ａｎｄ Ｐｆｌａｎｚｅｒ，Ｒ．Ｇ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，第４版，Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｌｅａｒｎｉｎｇ（２００２））。異なる重鎖は、大きさと組成が異なり；αとγは約４５０個のアミノ酸を含むが、一方μとεは約５５０個のアミノ酸を有している。
各重鎖は、２つの領域、定常領域及び可変領域を有する。定常領域は、同じアイソタイプの全ての抗体では同一であるが、異なるアイソタイプの抗体では異なっている。重鎖γ、α、δは、３つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３（一列で）から成る定常領域、及び柔軟性を追加するためのヒンジ領域を有しており（Ｗｏｏｆ，Ｊ．，ａｎｄ Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４（２００４）８９−９９）；重鎖μとεは４つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４から成る定常領域を有している（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ．Ａ．，Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．，第５版，Ｇａｒｌａｎｄ出版（２００１））。重鎖の可変領域は異なるＢ細胞により産生される抗体においては異なるが、単一のＢ細胞又はＢ細胞クローンによって産生された全ての抗体については同じである。各重鎖の可変領域は、約１１０アミノ酸長であり、単一の抗体ドメインからなる。
【００４８】
「Ｆｃ部分のＣＨドメイン」は、抗体の重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び抗体の重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）、及びクラスＩｇＥの抗体の場合において任意で抗体の重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）である。
【００４９】
用語「前記修飾型重鎖はＦｃ部分のそのＣＨドメインを介してお互いに会合している」とは、例えば鎖間イオン性相互作用、ファンデルワールス相互作用、または水素結合を介した、２本の修飾型重鎖の互いの抗体重鎖定常ドメイン（ＣＨ）、例えば両方の鎖の互いの２つのＣＨ３ドメインの鎖間ドメイン対形成を言う。一実施態様において、前記修飾型重鎖は、Ｆｃ部分の少なくともそのＣＨ３ドメインを介して（そして任意で（存在する場合には）そのＣＨ２ドメインとＣＨ４ドメインを介して）互いに会合する。
【００５０】
用語「ａ）の重鎖のＶＬドメインはｂ）の重鎖のＶＨドメインと会合しており、かつａ）の重鎖のＣＨ１ドメインはｂ）の重鎖のＣＬドメインと会合している」は、例えば天然抗体（ＶＬ／ＶＨ及びＣＨ１／ＣＬ）において見いだされるように、例えば鎖間イオン性相互作用、ファンデルワールス相互作用、または水素結合を介した、前記抗体ドメインのドメイン対形成（常にａ）の一つ及びｂ）の一つ）を言う。（図１Ａを参照）。
【００５１】
本発明による「抗原結合タンパク質」は、２つの抗原結合部位を含み、二価である。本明細書で使用される用語「結合部位」又は「抗原結合部位」は、リガンド（例えば抗原又はその抗原断片）が実際に結合し、抗体分子又はその断片（例えばＦａｂ断片）に由来する、本発明に係る抗原結合タンパク質の領域を意味する。本発明による抗原結合部位は、抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、及び抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【００５２】
所望の抗原に特異的に結合する抗原結合部位（すなわちＶＨ／ＶＬの対合）は、ａ）抗原に対する既知の抗体から由来するか又はとりわけ抗原タンパク質又はその核酸又はその断片を用いたデノボ免疫法により、又はファージディスプレイにより得られた新規抗体又は抗体断片に由来することが可能である。
【００５３】
本発明の抗原結合タンパク質の抗原結合部位は、抗原に対する結合部位の親和性に対して様々な程度で関与する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）領域を含む。３つの重鎖可変ドメインのＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）と３つの軽鎖可変ドメインのＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）がある。ＣＤＲ及びフレームワーク領域（ＦＲ）の程度は、それらの領域がアミノ酸配列間のばらつきに応じて定義されているアミノ酸配列のコンパイルされたデータベースと比較することによって決定される。
【００５４】
抗体の特異性は、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識を指す。天然の抗体は、例えば、単一特異性である。二重特異性抗体は、２つの異なる抗原結合特異性を有する抗体である。本発明による抗原結合タンパク質は、少なくとも単一特異性であり、具体的にはそれぞれの抗原のエピトープに結合する。
【００５５】
現在の明細書内で使用される用語「価」は、抗体分子において指定された数の結合部位の存在を意味する。天然の抗体は、例えば２つの結合部位を有し２価である。また、本発明による抗原結合タンパク質は少なくとも二価である。
【００５６】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、単一アミノ酸組成物の抗体分子の調製物を意味する。
【００５７】
用語「キメラ抗体」は、通常は組換えＤＮＡ技術によって調製される、一つの起源又は種に由来する可変領域、即ち結合領域、及び異なる起源又は種に由来する少なくとも定常領域を含む抗体を指す。マウス可変領域及びヒト定常領域を含むキメラ抗体が好ましい。本発明に包含される「キメラ抗体」の他の好ましい形態は、特にＣ１ｑの結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）の結合に関して、本発明に係る特性を生成するために、定常領域が元の抗体のものから修飾または変更されたものである。そのような「キメラ」抗体はまた「クラススイッチ抗体」と称される。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメント及び免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントを含む、発現された免疫グロブリン遺伝子の生成物である。キメラ抗体を生産するための方法は、今は当該技術分野においてよく知られている一般的な組換えＤＮＡ及び遺伝子トランスフェクション技術を含む。（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１（１９８４）６８５１−６８５５；米国特許第５２０２２３８号及び第５２０４２４４号を参照のこと）。
【００５８】
用語「ヒト化抗体」は、フレームワーク又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、親免疫グロブリンのものと比較して、異なる特異性の免疫グロブリンのＣＤＲを含むように修飾された抗体を意味する。好ましい実施態様では、マウスＣＤＲが、「ヒト化抗体」を調製するためのヒト抗体のフレームワーク領域に移植される。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２（１９８８）３２３−３２７；及びＮｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１４（１９８５）２６８−２７０を参照。特に好ましいＣＤＲは、キメラ抗体について上記のように抗原を認識する配列を表すものに対応する。本発明に包含される「ヒト化抗体」の別の形態は、特にＣ１ｑの結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）の結合に関して、本発明に係る特性を生成するために、定常領域が元の抗体のものから更に修飾または変更されたものである。
【００５９】
本明細書で使用される用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列から由来する可変及び定常領域を有する抗体を含むことを意図している。ヒト抗体は従来技術でよく知られている（ｖａｎ Ｄｉｊｋ，Ｍ．Ａ．及びｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５（２００１）３６８−３７４）。またヒト抗体は、免疫時に、内在性免疫グロブリン産生の欠損下において、ヒト抗体の選択、又は全レパートリーを生成可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）で産生可能である。このような生殖系列変異マウスにおける、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移動により、抗原曝露でヒト抗体が産生される（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（１９９３）２５５１−２５５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６２（１９９３）２５５−２５８；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（１９９３）３３−４０を参照）。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーで産生することができる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．，ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７（１９９２）３８１−３８８；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２（１９９１）５８１−５９７）。ヒトモノクローナル抗体の調製について、ＣｏｌｅらとＢｏｅｒｎｅｒらの技術も利用可能である（Ｃｏｌｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；及びＢｏｅｒｎｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１９９１）８６−９５）。本発明に係るキメラ及びヒト化抗体について既に述べたように、本発明で使用される「ヒト化抗体」はまた、とりわけＣ１ｑ結合及び／又はＦｃＲ結合に関して、例えば「クラススイッチ」即ちＦｃ部分の変化又は変異（例えばＩｇＧ１からＩｇＧ４および／またはＩｇＧ１／ＩｇＧ４変異）によって、本発明に係る特性を生み出すために、定常領域で修飾された抗体を含む。
【００６０】
本発明で使用される場合、用語「組換えヒト抗体」は、宿主細胞に形質移入された組換え発現ベクターを使用して発現したヒト免疫グロブリン遺伝子又は抗体用にトランスジェニックである動物（例えばマウス）から、又はＮＳ０又はＣＨＯ細胞等の宿主細胞から単離された抗体等、組換え手段により調製、発現、生成又は単離された全てのヒト抗体を含むことを意図している。このような組換えヒト抗体は、再配列された形態で、可変及び定常領域を有する。本発明の組換えヒト抗体は、インビボ体細胞突然変異を受ける。よって、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ及びＶＬ配列から誘導され、関連しているが、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在しないであろう配列である。
【００６１】
本明細書で使用される「可変ドメイン」（軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ））は、抗体を抗原に結合させることに直接関与する軽鎖及び重鎖の対のそれぞれを示す。可変軽鎖及び重鎖のドメインは、同じ一般構造を有し、各ドメインは、配列が広く保存され、３個の「高頻度可変領域」（又は相補性決定領域、ＣＤＲ）によって連結される、４個のフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域は、βシートコンフォメーションをとり、ＣＤＲは、βシート構造を連結するループを形成しうる。各鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域によって三次元構造に保持され、もう一方の鎖由来のＣＤＲと共に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明に係る抗体の結合特異性／親和性に特に重要な役割を果たし、よって本発明の更なる目的を提供する。
【００６２】
用語「超可変領域」又は「抗体の抗原−結合部分」とは、本明細書において使用される場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含んでなる。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、本明細書において定義されるように超可変領域残基以外のそれらの可変ドメイン領域である。従って、抗体の軽鎖及び重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含んでなる。各々の鎖上のＣＤＲはそのようなフレームワークアミノ酸により分離される。特に、重鎖のＣＤＲ３は、ほとんど抗原結合に寄与する領域である。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）の標準的な定義に従って決定される。
【００６３】
本明細書において使用される場合、用語「結合」又は「特異的に結合」とは、インビトロにおけるアッセイ、好ましくは精製した野生型抗原を用いたプラズモン共鳴アッセイ（ＢＩＡｃｏｒｅ、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）における抗体のエピトープへの抗原結合タンパク質の結合を指す。結合の親和性は、用語ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体結合に関する速度定数）、ｋＤ（解離定数）、及びＫＤ（ｋＤ／ｋａ）によって定義される。結合又は特異的に結合は、１０−８ｍｏｌ／ｌ以下（例えば１０−８Ｍから１０−１３ｍｏｌ／ｌ）、好ましくは１０−９Ｍから１０−１３ｍｏｌ／ｌの結合親和性（ＫＤ）を意味する。従って、本発明による抗原タンパク質は、１０−８ｍｏｌ／ｌ以下（例えば１０−８Ｍから１０−１３ｍｏｌ／ｌ）、好ましくは１０−９Ｍから１０−１３ｍｏｌ／ｌの結合親和性（ＫＤ）で、特異的である各抗原に対して特異的に結合している。
【００６４】
ＦｃγＲＩＩＩへの抗体の結合は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）により探索され得る。結合の親和性は、用語ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体結合に関する速度定数）、ｋＤ（解離定数）、及びＫＤ（ｋＤ／ｋａ）によって定義される。
【００６５】
用語「エピトープ」とは、抗原結合タンパク質に対して特異的に結合できるいずれかのポリペプチド決定基を包含する。ある実施態様においては、エピトープ決定基は、分子、例えばアミノ酸、糖側鎖、ホスホリン又はスルホニルなどの化学的活性表面群を包含し、そしてある実施態様においては、特定の三次元構造特性及び／又は比電荷特性を有することができる。エピトープは、抗原結合タンパク質により結合される抗原の領域である。
【００６６】
ある実施態様においては、抗体は、それがタンパク質及び／又は高分子の複合混合物中でその標的抗原を選択的に認識する場合、抗原を特異的に結合すると言われる。
【００６７】
用語「定常領域」は、本明細書中で使用される場合、可変領域以外の抗体のドメインの和を意味する。定常領域は、抗原の結合に直接的にかかわらないが、様々なエフェクター機能を示す。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、抗体は以下のクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭに分類され、そしてそのいくつか、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２などは、サブクラスに更に分類されることもできる。異なった抗体クラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。全部で５つの抗体クラスで見ることができる軽鎖定常領域（ＣＬ）は、κ（カッパ）及びλ（ラムダ）と呼ばれる。
【００６８】
用語「ヒト起源由来の定常領域」は、本願で使用される場合、アイソタイプＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，又はＩｇＧ４のヒト抗体の定常重鎖領域及び／又は定常軽鎖カッパ又はラムダ領域を意味する。そのような定常領域は、当技術分野の現状において周知であり、例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．によって説明されている（例えばＪｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．ａｎｄ Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（２０００）２１４−２１８；Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７２（１９７５）２７８５−２７８８を参照のこと）。
【００６９】
用語「補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）」は、ほとんどのＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ領域への補体因子Ｃ１ｑの結合により開始されるプロセスを示す。抗体へのＣ１ｑの結合は、いわゆる結合部位での、明確なタンパク質−タンパク質相互作用によって生じる。このようなＦｃ部分の結合部位は最先端の技術で知られている（上記参照）。このようなＦｃ部分の結合部位は、例えば、アミノ酸Ｌ２３４，Ｌ２３５，Ｄ２７０，Ｎ２９７，Ｅ３１８，Ｋ３２０，Ｋ３２２，Ｐ３３１，及びＰ３２９により特徴付けられている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．ＡのＥＵ指標に従い番号付け）。通常、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３の抗体は、Ｃ１ｑ及びＣ３結合を含む補体活性を示すが、ＩｇＧ４は補体系を活性化させず、Ｃ１ｑ及び／又はＣ３に結合しない。
【００７０】
ＩｇＧ４サブクラスの抗体はＦｃ受容体（ＦｃγＲＩＩＩａ）結合の減少を示すが、別のＩｇＧサブクラスの抗体は強い結合を示す。しかしながら、Ｐｒｏ２３８，Ａｓｐ２６５，Ａｓｐ２７０，Ａｓｎ２９７（Ｆｃ糖鎖の喪失）、Ｐｒｏ３２９，Ｌｅｕ２３４，Ｌｅｕ２３５，Ｇｌｙ２３６，Ｇｌｙ２３７，Ｉｌｅ２５３，Ｓｅｒ２５４，Ｌｙｓ２８８，Ｔｈｒ３０７，Ｇｌｎ３１１，Ａｓｎ４３４，及びＨｉｓ４３５は、変更される場合には、Ｆｃ受容体結合の減少も与える残基である（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１−６６０４；Ｌｕｎｄ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．９（１９９５）１１５−１１９；Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６（１９９５）３１９−３２４；欧州特許第０３０７４３４号）。
【００７１】
一実施態様では、本発明の抗体は、ＩｇＧ１抗体に比較してＦｃＲ結合が減少しており、その全長親抗体は、Ｓ２２８、Ｌ２３４、Ｌ２３５、および／またはＤ２６５に変異を有するＩｇＧ１又はＩｇＧ２サブクラス又はＩｇＧ４サブクラスのＦｃＲ結合に関連し、及び／又はＰＶＡ２３６変異を含む。一実施態様において、全長親抗体の変異は、Ｓ２２８Ｐ，Ｌ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ，Ｌ２３５Ｅ及び／又はＰＶＡ２３６である。別の実施態様において、全長親抗体の変異は、ＩｇＧ４のＳ２２８ＰとＬ２３５Ｅ及びＩｇＧ１のＬ２３４ＡとＬ２３５Ａにある。
【００７２】
抗体の定常領域は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）及びＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）に直接関与している。補体活性（ＣＤＣ）は、ほとんどのＩｇＧ抗体サブクラスの定常領域に対する補体因子Ｃ１ｑの結合により開始される。抗体へのＣ１ｑの結合は、いわゆる結合部位での、明確なタンパク質−タンパク質相互作用によって生じる。このような定常領域結合部位は、当技術分野において公知であり、例えばＬｕｋａｓ，Ｔ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７（１９８１）２５５５−２５６０；Ｂｕｎｋｈｏｕｓｅ，Ｒ．ａｎｄ Ｃｏｂｒａ，Ｊ．Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６（１９７９）９０７−９１７；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２８８（１９８０）３３８−３４４；Ｔｈｏｍａｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７（２０００）９９５−１００４；Ｉｄｉｏｃｉｅｓ，Ｅ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（２０００）４１７８−４１８４；Ｈｅａｒｅｒ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２００１）１２１６１−１２１６８；Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６（１９９５）３１９−３２４；及び欧州特許第０３０７４３４合により記載される。このような結合部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１及びＰ３２９である（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載されるＫａｂａｔのＥＵ指標に従い番号付け）。
【００７３】
用語「抗体依存性細胞傷害性性（ＡＤＣＣ）」は、エフェクター細胞の存在下、本発明の抗体によるヒト標的細胞の溶解を意味する。ＡＤＣＣは、エフェクター細胞の存在下、例えば新鮮に単離されたＰＢＭＣ又はバフィーコートからの精製エフェクター細胞、例えば単球又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は永続的に増殖するＮＫ細胞株の存在下で本発明の抗体で抗原発現細胞の調製物を処理することにより好ましくは測定される。
【００７４】
驚くべきことに、本発明に係る抗原結合タンパク質は、その親完全抗体に比較して、特により高い抗体濃度の領域でＡＤＣＣの特性の増強を示すことが見いだされている。これらの改善されたＡＤＣＣ効果は、糖鎖工学のようなＦｃ部分の更なる修飾無しで達成される。
【００７５】
従って、一実施態様において、本発明に係る抗原結合タンパク質は、その親完全抗体と比較してＡＤＣＣが増強されている（実施例４で説明されるように測定）。
【００７６】
哺乳類では、ラムダ（λ）とカッパ（κ）と呼ばれる軽鎖の２種類のみが存在する。軽鎖は２つの連続したドメインを有する：一つの定常ドメインＣＬ及び一つの可変ドメインＶＬ。軽鎖のおおよその長さは２１１から２１７アミノ酸である。好ましくは、軽鎖はカッパ（κ）軽鎖であり、定常ドメインＣＬは好ましくはカッパ（κ）軽鎖（定常ドメインＣκ）から由来する。
【００７７】
モノクローナル抗体の細胞媒介性エフェクター機能は、Ｕｍａｎａ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１９９９）１７６−１８０、及び米国特許第６，６０２，６８４号に記載されるように、例えば、それらのオリゴ糖成分を操作によって更に強化することができる。ＩｇＧ１型抗体は、最も一般的に使用される治療用抗体であり、各ＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７で、保存されたＮ−結合型糖鎖付加部位を持つ糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に付着した２つの複雑な二分岐オリゴ糖は、ＣＨ２ドメインの間に埋葬され、ポリペプチド骨格との広範な接触を形成し、そしてそれらの存在は、例えば抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などのエフェクター機能を媒介するために抗体にとって必須である（Ｌｉｆｅｌｙ，Ｍ．，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５（１９９５）８１３−８２２；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１６３（１９９８）５９−７６；Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．，ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．，Ｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（１９９７）２６−３２）。Ｕｍａｎａ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１９９９）１７６−１８０及び国際公開第９９／５４３４２号は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において、二分オリゴ糖の形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（「ＧＮＴＩＩＩ」）の過剰発現が、抗体のインビトロＡＤＣＣ活性を有意に増加させることを示した。Ａｓｎ２９７の糖鎖の変化またはその除去は、ＦｃγＲととＣ１ｑの結合にも影響を及ぼす（Ｕｍａｎａ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１９９９）１７６−１８０；Ｄａｖｉｅｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７４（２００１）２８８−２９４；Ｍｉｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）４５５３９−４５５４７；Ｒａｄａｅｖ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）１６４７８−１６４８３；Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１−６６０４；Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（２００２）２６７３３−２６７４０；Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｌ．，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２６３（２００２）１３３−１４７）。
【００７８】
本発明の一実施態様では、本発明による抗原結合タンパク質は、ａ）とｂ）のＦｃ部分のＣＨ２ドメインはＩｇＧ１のアイソタイプであり、抗原タンパク質は、Ａｓｎ２９７で、オリゴ糖（糖類）の総量の８０％以下のフコースの量でアフコシル化されていることを特徴とする。
【００７９】
一実施態様において、抗原タンパク質は、Ａｓｎ２９７で、オリゴ糖（糖類）の総量の６５％から５％のフコースの量でアフコシル化されている。
【００８０】
用語「アフコシル化抗原タンパク質」は、Ａｓｎ２９７でのフコース残基のレベルが減少し、Ｆｃ領域でグリコシル化のパターンが変化した、ＩｇＧ１又はＩｇＧ３のアイソタイプ（好ましくは、ＩｇＧ１のアイソタイプ）の抗原結合タンパク質を指す。ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３のグリコシル化は、コアフコシル化された二分岐複合オリゴ糖のグリコシル化が最大２つのＧａｌ残基で終結している場合、Ａｓｎ２９７で生じる。これらの構造は、末端Ｇａｌ残基の量に応じて、Ｇ０、Ｇ１（α１，６又はα１，３）、又はＧ２グリカン残基と命名される（Ｒａｊｕ，Ｔ．Ｓ．，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔ．１（２００３）４４−５３）。抗体のＦｃ部分のＣＨＯ型グリコシル化は、例えば、Ｒｏｕｔｉｅｒ，Ｆ．Ｈ．，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．１４（１９９７）２０１−２０７により記載されている。非糖修飾されたＣＨＯ宿主細胞で組換え的に発現している抗体は、通常、少なくとも８５％の量で、Ａｓｎ２９７でフコシル化されている。本明細書で使用される場合、用語「抗原タンパク質」は、そのグリコシル化パターンでフコースを持たない抗原タンパク質を含む。抗体における典型的なグリコシル化残基の位置は、ＥＵ番号付けシステムに従って位置２９７のアスパラギンであることが一般に知られている（「Ａｓｎ２９７」）。
【００８１】
従って、本発明によるアフコシル化抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ３のアイソタイプの（好ましくはＩｇＧ１のアイソタイプの）抗原結合部分を意味し、ここでＡｓｎ２９７でのフコースの量はオリゴ糖（糖類）の総量の８０％以下（例えば８０％から１％）である（Ｆｃ領域のオリゴ糖（糖類）の少なくとも２０％以上がＡｓｎ２９７でアフコシル化されていることを意味する）。一実施態様において、フコースの量は、Ａｓｎ２９７でＦｃ領域のオリゴ糖の６５％以下であり（例えば６５％から１％）、一実施態様では６５％から５％であり、一実施態様では４０％から２０％である。本発明によれば、「フコースの量」は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により測定され平均値として計算される（フコースの量を決定する詳細な手順については、例えば国際公開第２００８／０７７５４６号を参照）、Ａｓｎ２９７に結合した全オリゴ糖（例えば複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造）の総和に関連した、オリゴ糖（糖類）鎖内のＡｓｎ２９７での前記オリゴ糖（フコース）の量を意味する。更に、一実施態様では、Ｆｃ領域のオリゴ糖が二分されている。本発明によるアフコシル化抗原結合タンパク質は、Ｆｃ領域でオリゴ糖を部分的にフコシル化するのに十分な量で、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも一の核酸を発現するために、糖修飾型宿主細胞で発現することができる。一実施態様において、ＧｎＴＩＩＩ活性を有するポリペプチドは融合ポリペプチドである。あるいは、宿主細胞のα１、６−フコシルトランスフェラーゼ活性を、糖鎖修飾型宿主細胞を生成するために、米国特許第６９４６２９２号に従って減少させるか又は排除することができる。抗原結合タンパク質のフコシル化の量は、例えば、発酵条件（例えば発酵時間）によって又はフコシル化した量が異なる少なくとも二つの抗原結合タンパク質の組み合わせによっての何れかにより、予め決定することができる。アフコシル化抗原結合タンパク質を産生するためのそうした方法は、国際公開第２００５／０４４８５９，国際公開第２００４／０６５５４０号，国際公開第２００７／０３１８７５号，Ｕｍａｎａ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１９９９）１７６−１８０，国際公開第９９／１５４３４２号，国際公開第２００５／０１８５７２号，国際公開第２００６／１１６２６０号，国際公開第２００６／１１４７００号，国際公開第２００５／０１１７３５号，国際公開第２００５／０２７９６６号，国際公開第９７／０２８２６７号，米国特許出願公開第２００６／０１３４７０９号，米国特許出願公開第２００５／００５４０４８号，米国特許出願公開第２００５／０１５２８９４号、国際公開第２００３／０３５８３５号，国際公開第２０００／０６１７３９号に記載されている。本発明によれば、これらの糖鎖操作型抗原結合タンパク質は、（親抗原結合タンパク質と比較して）ＡＤＣＣが増加している。本発明に係るアフコシル化抗原結合タンパク質を得る他の糖鎖工学の方法は、例えばＮｉｗａ，Ｒ．．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３０６（２００５）１５１−１６０；Ｓｈｉｎｋａｗａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ��Ｃｈｅｍ，２７８（２００３）３４６６−３４７３；国際公開第０３／０５５９９３号又は米国特許出願公開第２００５／０２４９７２２号に記載されている。
【００８２】
従って、本発明の一態様は、Ａｓｎ２９７でのオリゴ糖（糖類）の総量の６０％以下（例えば６０％から１％）のフコースの量を持つ、ＩｇＧ１のアイソタイプ又はＩｇＧ３のアイソタイプである（好ましくはＩｇＧ１のアイソタイプである）本発明に係るアフコシル化抗原結合タンパク質である。
【００８３】
従って、本発明の一態様は、癌の治療のため、Ａｓｎ２９７でのオリゴ糖（糖類）の総量の６０％以下（例えば６０％から１％）のフコースの量を持つ、ＩｇＧ１のアイソタイプ又はＩｇＧ３のアイソタイプである（好ましくはＩｇＧ１のアイソタイプである）本発明に係るアフコシル化抗原結合タンパク質である。
【００８４】
本発明の別の一態様は、癌の治療のための医薬の製造用に、Ａｓｎ２９７でのオリゴ糖（糖類）の総量の６０％以下のフコースの量を持つ、ＩｇＧ１のアイソタイプ又はＩｇＧ３のアイソタイプである（好ましくはＩｇＧ１のアイソタイプである）本発明に係るアフコシル化抗原結合タンパク質である。
【００８５】
一実施態様において、フコースの量は、Ａｓｎ２９７で、オリゴ糖（糖類）の総量の６０％から２０％の間である一実施態様において、フコースの量は、Ａｓｎ２９７で、オリゴ糖（糖類）の総量の６０％から４０％の間である一実施態様において、フコースの量は、Ａｓｎ２９７で、オリゴ糖（糖類）の総量の０％の間である。
【００８６】
「ＥＵ番号付けシステム」又は「ＥＵ指標」は、免疫グロブリン重鎖定常領域の残基を参照するときに通常使用される（例えばＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に報告されたＥＵ指標は参照により本明細書に明示的に援用される）。
【００８７】
「糖鎖がＣＨＯ細胞で組換え的に発現した抗体のＡｓｎ２９７に結合したＮ−結合グリカンの特徴を示す」なる用語は、本発明の全長親抗体のＡｓｎ２９７の糖鎖が、フコース残基を除き、未修飾のＣＨＯ細胞で発現した同様の抗体のもの、例えば国際公開第２００６／１０３１００号で報告されているものと同様の構造及び糖残基配列を有することを示す。
【００８８】
この出願で使用される「ＮＧＮＡ」なる用語は、糖残基Ｎ−グリコシル−ノイラミン酸を示す。
【００８９】
ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３のグリコシル化は、コアフコシル化された二分岐複合オリゴ糖のグリコシル化が最大２つのＧａｌ残基で終結している場合、Ａｓｎ２９７で生じる。ＩｇＧ１又はＩｇＧ３のサブクラスのヒト定常重鎖領域は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１），及びＢｒｕｅｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６（１９８７）１３５１−１３６１；Ｌｏｖｅ，Ｔ．，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８（１９８９）５１５−５２７により詳しく報告されている。これらの構造は、末端Ｇａｌ残基の量に応じて、Ｇ０、Ｇ１（α−１，６−又はα−１，３−）、又はＧ２グリカン残基と命名される（Ｒａｊｕ，Ｔ．，Ｓ．，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔ．１（２００３）４４−５３）。抗体のＦｃ部分のＣＨＯ型グリコシル化は、例えば、Ｒｏｕｔｉｅｒ，Ｆ．Ｈ．，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．１４（１９９７）２０１−２０７により記載されている。非糖修飾されたＣＨＯ宿主細胞で組換えにより発現している抗体は、通常、少なくとも８５％の量で、Ａｓｎ２９７でフコシル化されている。全長親抗体の修飾されたオリゴ糖は、ハイブリッド又は複合体であり得る。好ましくは二分された、還元され／フコシル化されていないオリゴ糖はハイブリッドである。別の実施態様において、還元され／フコシル化されていないオリゴ糖は複合体である。
【００９０】
本発明によれば、「フコースの量」は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により測定され平均値として計算される、Ａｓｎ２９７に結合した全糖鎖構造（例えば複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造）の総和に関連した、Ａｓｎ２９７での前記糖の量を意味する。フコースの量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより、Ｎ−グリコシダーゼＦ処理した試料（例えば、複合体、ハイブリッド、及びオリゴ及び高マンノース構造のそれぞれ）において同定された全ての糖構造に関連したフコース含有構造の割合である。
【００９１】
本発明に係る抗体は、組換え手段によって生成される。従って、本発明の一態様は、本発明による抗体をコードする核酸であり、更なる態様は、本発明による抗体をコードする前記核酸を含む細胞である。組換えによる産生のための方法が広く先端技術で知られており、原核細胞および真核細胞におけるタンパク質の発現を含み、その後の抗体の単離、及び通常は薬学的に許容される純度までの精製を伴う。宿主細胞で前述のように抗体を発現するために、それぞれの修飾された軽鎖と重鎖が、標準的な方法により発現ベクターに挿入される。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、酵母、または大腸菌細胞などの適当な原核生物または真核生物宿主細胞中で行われ、抗体は細胞（上清または溶解後の細胞）から回収される。抗体の組換えによる生成のための一般的な方法は、最新技術分野において周知であり、例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｓ．Ｃ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１７（１９９９）１８３−２０２；Ｇｅｉｓｓｅ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．８（１９９６）２７１−２８２；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２０００）１５１−１６１；Ｗｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ｇ．，Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．４８（１９９８）８７０−８８０の総説に記載されている。
【００９２】
本発明による抗原結合タンパク質は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーなどによって培養培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡおよびＲＮＡは容易に単離され、従来の手順を用いて配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、ＤＮＡとＲＮＡの供給源として機能することができる。一度単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに挿入することができ、これらは次いで、本来ならば免疫グロブリンタンパク質を生成しないＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、またはミエローマ細胞などの宿主細胞中にトランスフェクトされ、宿主細胞中で組換えモノクローナル抗体の合成を得る。
抗原結合タンパク質のアミノ酸配列変異体（又は変異体）は、抗体のＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することによって、またはヌクレオチド合成によって調製される。しかしながら、そのような修飾は、例えば、ごく限られた範囲で上述したように行うことができる。例えば、修飾は、例えば、ＩｇＧのアイソタイプおよび抗原結合など上述したような抗体の特性を変化させないが、組換えによる生成収率、タンパク質安定性を改善したり、精製を容易にすることができる。
【００９３】
本出願で使用される用語「宿主細胞」は、本発明に係る抗体を生成するように操作することができる細胞性システムの任意の種類を意味する。一実施態様において、ＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ細胞が宿主細胞として使用される。本明細書で使用される場合、「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」は互換的に使用され、すべてのそのような名称は子孫を含む。よって、「形質転換体」及び「形質転換細胞」なる用語には、初代被験体細胞、及び移動の回数に関係なくそこから得られた培養物も含まれる。また、全ての子孫は、意図的なまたは不慮の突然変異により、ＤＮＡ量において、厳密には同一でない可能性もあると理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされた場合、同じ機能又は生物活性を有する変異子孫も含まれる。
【００９４】
ＮＳ０細胞における発現は、例えば、Ｂａｒｎｅｓ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２（２０００）１０９−１２３；Ｂａｒｎｅｓ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．７３（２００１）２６１−２７０により説明される。一過性発現は、例えばＤｕｒｏｃｈｅｒ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３０（２００２）Ｅ９により説明される。可変ドメインのクローニングは、Ｏｒｌａｎｄｉ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６（１９８９）３８３３−３８３７；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９（１９９２）４２８５−４２８９；及びＮｏｒｄｅｒｈａｕｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０４（１９９７）７７−８７により説明される。好適な一過性発現系（ＨＥＫ２９３）は、Ｓｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｅ．−Ｊ．，ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｋ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３０（１９９９）７１−８３及びＳｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｅ．−Ｊ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９４（１９９６）１９１−１９９により説明される。
【００９５】
原核生物に適している制御配列は、例えば、プロモーター、必要に応じてオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサーおよびポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。
【００９６】
核酸は、それは、他の核酸配列と機能的な関係で配置されたとき、「操作可能に連結」されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに操作可能に連結されている；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合、コード配列に操作可能に連結されている；またはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に操作可能に連結されている。一般に、「操作可能に連結した」とは、連結しているＤＮＡ配列は連続しており、分泌リーダーの場合には、リーディング・フレームにあり連続している。しかし、エンハンサーは連続している必要はない。連結は、好都合な制限部位での連結反応によって達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーは、従来の慣例に従って使用される。
【００９７】
抗原結合タンパク質の精製は、細胞成分または他の汚染物質、例えば他の細胞の核酸又はタンパク質（例えば図１Ｂの副産物）を、アルカリ／ＳＤＳ処理、塩化セシウムバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当該技術分野で周知のその他を含む標準的な技術によって除去するために行われる（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，編,Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）を参照）。タンパク質精製のために異なる方法、例えば微生物のタンパク質による親和性クロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ又はプロテインＧ親和性クロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば陽イオン交換（カルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換（アミノエチル樹脂）および混合モード交換）、チオフィリック吸着（β−メルカプトエタノール及び他のＳＨリガンドによるなど）、疎水性相互作用又は芳香族吸着クロマトグラフィー（フェニル−セファロース、アザアレノフィリック樹脂、又はｍ−アミノフェニルボロン酸によるなど）、金属キレート親和性クロマトグラフィー（Ｎｉ（ＩＩ）−及びＣｕ（ＩＩ）親和性材料によるなど）、サイズ排除クロマトグラフィー、及び電気泳動的方法（例えばゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動など）が十分に確立され広範に使用されている（Ｖｉｊａｙａｌａｋｓｈｍｉ，Ｍ．Ａ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７５（１９９８）９３−１０２）。精製の一例は、実施例１とそれの対応する図に記載されている。
【００９８】
本発明の一つの態様は、本発明に係る抗原結合タンパク質を含む薬学的組成物である。本発明の別の態様は、薬学的組成物の製造のための、本発明に係る抗原結合タンパク質の使用である。本発明の更なる態様は、本発明に係る抗原結合タンパク質を含む薬学的組成物の製造のための方法である。別の態様において、本発明は、例えば、薬学的担体と共に調製される本発明に係る抗原結合タンパク質を含む薬学的組成物を含む組成物を提供する。
【００９９】
本発明の一実施態様は、癌の治療のための、本発明に係る抗原結合タンパク質である。
【０１００】
本発明の別の態様は、癌の治療のための前記薬学的組成物である。
【０１０１】
本発明の一実施態様は、癌の治療において使用のための、本発明に係る抗原結合タンパク質である。
【０１０２】
本発明の別の態様は、癌の治療のための医薬の製造のための、本発明に係る抗原結合タンパク質の使用である。
【０１０３】
本発明の別の態様は、治療を必要とする患者に、本発明に係る抗原結合タンパク質を投与することによる、癌に罹患している患者の治療方法である。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、「薬学的担体」には、任意及び全ての溶媒、分散用媒体、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延化剤で、生理学的に適合性であるものが含まれる。好ましくは、担体は静脈内、筋肉内、大脳内、皮下、非経口、脊髄、又は表皮投与（例えば、注射又は注入による）に適している。
【０１０５】
本発明の薬学的組成物は、当該技術で知られているの種々の方法で投与することができる。当業者に理解されているように、投与の経路及び／又は方式は、所望する結果に応じて変えられるであろう。投与のある種の経路により、本発明の化合物を投与するため、その不活性化を防止するための物質で化合物をコーティングする、又はその不活性化を防止するための物質と化合物とを一緒に投与する必要があるかもしれない。例えば、化合物は適切な担体、例えばリポソーム、又は希釈剤において、被験者に投与されてもよい。薬学的に許容可能な希釈剤には、生理食塩水又は水性緩衝液が含まれる。薬学的担体には、滅菌水溶液又は分散液、及び無菌の注射可能な溶液又は分散液を即時調製するための滅菌パウダーが含まれる。薬学的に活性な物質のためのこうした媒体及び薬剤の使用は、当該技術で知られている。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、「非経口投与」及び「非経口的に投与」なる語句は、経腸及び局所投与以外の投与方式、通常は注射による投与を意味し、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内注射及び注入が含まれる。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、「癌」なる用語は、増殖性疾患、例えば、リンパ腫、リンパ性白血病、肺癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌、気管支肺胞上皮細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部又は頸部の癌、皮膚又は眼球内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、胃腸癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓又は尿管の癌、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、随芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、及びユーイング肉腫を指し、上述した任意の癌の抵抗性バージョン、又は上述した癌の一又は複数の組合せを含む。
【０１０８】
これらの組成物は、アジュバント、例えば保存料、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤をさらに含有可能である。微生物存在の防止は、上掲の滅菌手段、及び種々の抗菌及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、スコルビン酸等により確実になる。また、等張剤、例えば糖類、塩化ナトリウムなどを、組成物に含有せしめることもまた望ましい。加えて、注射可能な薬学的形態の長時間にわたる吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含有せしめることによりもたらすことができる。
【０１０９】
選択された投与経路にかかわらず、適切な水和形態、及び／又は本発明の薬学的組成物で使用される本発明の化合物は、当業者に知られている一般的な方法により、薬学的に許容可能な剤形に処方される。
【０１１０】
本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の投与レベルは、患者に対して毒性がなく、特定の患者に対する所望する治療的応答、組成物、及び投与方式を達成するのに効果的な活性成分の量が得られるように変えうる。選択された投与レベルは、使用される本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排出速度、処置時間、他の薬剤、使用される特定の組成物と組合せて使用される化合物及び／又は物質、年齢、性別、体重、状態、一般的健康状態、処置される患者の以前の病歴、及び医療でよく知られている要因を含む、種々の薬物動態学的要因に依存するであろう。
【０１１１】
組成物は滅菌されていなければならず、組成物がシリンジにより送達可能である程度に、流動的でなければならない。水に加えて、担体は、好ましくは等張の緩衝生理食塩水である。
【０１１２】
適切な流動性は、例えばレシチン等のコーティング剤を使用することにより、又は分散液の場合は必要な粒径を維持することにより、そして界面活性剤を使用することにより、維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖類、多価アルコール類、例えばマンニトール又はソルビトール、及び塩化ナトリウムを、組成物に含有せしめることが好ましい。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」は互換的に使用され、すべてのそのような名称は子孫を含む。「形質転換体」及び「形質転換細胞」なる用語には、初代の被験体細胞、及び移動の回数に関係なくそこから得られた培養物も含まれる。また、全ての子孫は、意図的なまたは不慮の突然変異により、ＤＮＡ量において、厳密には同一でない可能性もあると理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされた場合、同じ機能又は生物活性を有する変異子孫も含まれる。異なる命名が意図されるところでは、文脈から明らかであろう。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、用語「形質転換」は、宿主細胞へのベクター／核酸の転写のプロセスを指す。手ごわい細胞壁障壁が無い細胞を宿主細胞として用いる場合には、トランスフェクションは、例えば、Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｈ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（１９７８）５４６により説明されるようにリン酸カルシウム沈殿法により行われる。しかし、核注入による、又はプロトプラスト融合によるなど、細胞にＤＮＡを導入するための他の方法を用いてもよい。実質的な細胞壁構造を含む原核細胞又は細胞が使用される場合、例えばトランスフェクションの一つの方法は、Ｃｏｈｅｎ，Ｆ．Ｎ，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ６９（１９７２）７１１０）によって記述された塩化カルシウムを用いたカルシウム処理である。
【０１１５】
本明細書で使用される「発現」とは、核酸がｍＲＮＡに転写されるプロセス、及び／又は転写されたｍＲＮＡ（これも転写産物とも呼ばれる）が、その後、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物及びコードされたポリペプチドは、遺伝子産物と総称して呼ばれる。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来した場合、真核細胞における発現は、ｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【０１１６】
「ベクター」は、核酸分子で、特に自己複製し、これにより、挿入された核酸分子を宿主細胞へ及び／又は宿主細胞間で転送する。その用語は、主にＤＮＡ又はＲＮＡを細胞へ挿入するため（例えば、染色体の統合）に機能するベクター、ＤＮＡ又はＲＮＡの複製のために主に機能するベクターの複製、及びＤＮＡ又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳のために機能する発現ベクターを含む。また含まれるのは、説明したように一以上の機能を提供するベクターである。
【０１１７】
「発現ベクター」は、適当な宿主細胞に導入されると、転写されてポリペプチドに翻訳することができるポリヌクレオチドである。「発現系」は、通常、所望の発現産物を生じるために機能することができる発現ベクターからなる適切な宿主細胞を指す。
【０１１８】
以下の実施例、配列表及び図面は、本発明、添付の特許請求の範囲に記載されているの真の範囲、の理解を助けるために提供される。変更は、本発明の精神を逸脱することなく、記載された手順で行うことができることが理解される。
【０１１９】
アミノ酸配列の記述
配列番号１  ｃ−Ｍｅｔ ５Ｄ５ ＭｏＡｂ−二量体（「ＣＨ３−ｗｔ」）−修飾型重鎖  ａ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３
配列番号２  ｃ−Ｍｅｔ ５Ｄ５ ＭｏＡｂ−二量体（「ＣＨ３−ｗｔ」）−修飾型重鎖   ｂ）ＶＨ−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３
配列番号３  ＩＧＦ１Ｒ ＡＫ１８ ＭｏＡｂ−二量体（「ＣＨ３−ｗｔ」）−修飾型重鎖  ａ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３
配列番号４  ＩＧＦ１Ｒ ＡＫ１８ ＭｏＡｂ−二量体（「ＣＨ３−ｗｔ」）−修飾型重鎖  ｂ）ＶＨ−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３
配列番号５  Ｈｅｒ３ ２０５ ＭｏＡｂ−二量体（「ＣＨ３−ｗｔ」）−修飾型重鎖  ａ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３
配列番号６  Ｈｅｒ３ ２０５ ＭｏＡｂ−二量体（「ＣＨ３−ｗｔ」）−修飾型重鎖  ｂ）ＶＨ−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３
配列番号７  ＩＧＦ１Ｒ ＡＫ１８ ＭｏＡｂ−二量体（「ＣＨ３−ｗｔ」）−修飾型重鎖  ａ）ＩｇＡ−ＣＨ３を伴うＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３
配列番号８  ＩＧＦ１Ｒ ＡＫ１８ ＭｏＡｂ−二量体（「ＣＨ３−ｗｔ」）−修飾型重鎖  ｂ）ＩｇＡ−ＣＨ３ドメインを伴うＶＨ−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３
【実施例】
【０１２０】
実験手順
Ａ．材料と方法
組換えＤＮＡ技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９に既述されるように、標準的な方法がＤＮＡを操作するために使用された。分子生物学的試薬を、製造元の指示に従って使用した。
【０１２１】
ＤＮＡおよびタンパク質配列分析および配列データ管理
ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖の塩基配列に関する一般情報については次に与えられる：Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ ９１−３２４２．抗体鎖のアミノ酸はＥＵ番号付けに従って番号が付けられている（Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ６３（１９６９）７８−８５；Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ ９１−３２４２）。ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）ソフトウェアパッケージバージョン１０．２及びＩｎｆｏｍａｘ’ｓ Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅ ｓｕｉｔｅのバージョン８．０が配列の作成、マッピング、解析、注解及び図解のために使用された。
【０１２２】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、ＳｅｑｕｉＳｅｒｖｅ（Ｖａｔｅｒｓｔｅｔｔｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で行った二本鎖配列決定により決定した。
【０１２３】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、自動化された遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物から、Ｇｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により調製された。特異な制限酵素切断部位に隣接する遺伝子セグメントがｐＧＡ１８（ａｍｐＲ）プラスミドにクローニングされた。プラスミドＤＮＡを形質転換した細菌から精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニング遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。２本の抗体鎖（ＶＨ−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３及びＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）をコードするＤＮＡ配列が、隣接する５’ＨｐａＩ及び３’ＮａｅＩ制限酵素認識部位を伴って、遺伝子合成により全体の断片として調製された。ＭｏＡｂ−二量体生成物並びにＩｇＧ１部分をコードする遺伝子セグメントのＩｇＡ−ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号７）による置換を優先的にもたらす、ＣＨ３ドメインにおける点変異をコードする遺伝子セグメントが、遺伝子合成により調製された。これらのセグメントは、対応する野生型ＩｇＧ１配列の置換を可能にするユニークな制限部位が配置された。全ての構築物は、真核細胞内の分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を含み設計された。
【０１２４】
発現プラスミドの構築
ロシュ発現ベクターを、すべての抗体鎖の構築のために使用した。ベクターは、以下の要素からなる：
−  エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）の複製起点、ｏｒｉＰ、
−  大腸菌でこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８からの複製起点
−  大腸菌においてアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子、
−  ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）からの前初期エンハンサー及びプロモーター、
−  ヒト免疫グロブリン１ポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列、及び
−  固有のＨｐａＩ，ＢｃｌＩ，及びＮａｅＩ制限酵素部位。
【０１２５】
ＶＨ−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３とＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３の順の免疫グロブリン遺伝子並びに抗体鎖のＣ末端（ＣＨ３）をコードする３’領域で修飾された構築物は、遺伝子合成によって調製し、説明したようにｐＧＡ１８（ａｍｐＲ）プラスミドにクローニングした。合成ＤＮＡセグメントとロッシュ発現ベクターを運ぶｐＧ１８（ａｍｐＲ）プラスミドは、ＨｐａＩ及びＮａｅＩ又はＢｃｌＩ及びＮａｅＩの制限酵素（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）のどちらかで消化され、アガロースゲル電気泳動に供した。次いで、精製されたＤＮＡセグメントは、ロッシュ発現ベクターＨｐａＩ／ＮａｅＩ又はＢｃｌＩ／ＮａｅＩ断片に連結され、最終発現ベクターを生じた。最終の発現ベクターは、大腸菌細胞に形質転換され、発現プラスミドＤＮＡを単離し（ミニプレップ）、制限酵素分析及びＤＮＡ配列決定に供した。正しいクローンを、１５０ｍｌのＬＢ−Ａｍｐ培地中で増殖させ、再びプラスミドＤＮＡを単離し（マキシプレップ）、配列の完全性をＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１２６】
ＨＥＫ２９３細胞における免疫グロブリン変異体の一過性発現
組換え免疫グロブリン変異体は、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）の指示に従ってＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３発現システムを使用して、ヒト胎児腎臓２９３−Ｆ細胞の一過性トランスフェクションによって発現させた。簡潔には、懸濁液ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３−Ｆ細胞を３７℃／８％ＣＯ２で、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地で培養した。細胞は、トランスフェクションの当日に１−２×１０６の生存細胞／ｍｌの密度で新鮮な培地に播種した。ＤＮＡ−２９３ｆｅｃｔｉｎＴＭ複合体は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）中で、２５０ｍｌの最終トランスフェクション容積に対して、３２５μｌの２９３ｆｅｃｔｉｎＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と２５０μｇの各プラスミドＤＮＡを１：１のモル比で使用して調製した。抗体を含む細胞培養上清をトランスフェクション後７日間で３０分間１４０００ｇで遠心分離して回収し、無菌フィルター（０．２２μｍ）でろ過した。上清を精製まで−２０℃で保存した。
【０１２７】
あるいは、抗体は、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞において一過性トランスフェクションによって産生させた。抗体は、１０％の超低（Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ）ＩｇＧのＦＣＳ（ウシ胎児血清、Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、及び２５０μｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、Ｇｉｂｃｏ）中で培養された、粘着して増殖するＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞中で、それぞれの発現プラスミドの一過性共トランスフェクションにより発現された。トランスフェクション用に、ＦｕＧＥＮＥＴＭ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）が、ＤＮＡ（μｇ）に対するＦｕＧＥＮＥＴＭ試薬の比率が４：１で（３：１から６：１の範囲で）使用された。タンパク質は、等モル量比のプラスミドを用いて各プラスミドから発現させた。３日目に、細胞に、Ｌ−グルタミン４ｍＭ、グルコース［Ｓｉｇｍａ］及びＮＡＡ［Ｇｉｂｃｏ］が与えられた。細胞培養上清を含む免疫グロブリン変異体を、遠心分離によるトランスフェクション後５日から１１日まで採取し、−８０℃保存した。例えばＨＥＫ２９３細胞中でのヒト免疫グロブリンの組換え発現に関する一般情報についてはＭｅｉｓｓｎｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７５（２００１）１９７−２０３に与えられる。
【０１２８】
抗体の精製
抗体は、プロテインＡ−セファロースＴＭ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用する親和性クロマトグラフィー及びスーパーデックス２００サイズ排除クロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製された。簡潔には、無菌ろ過した細胞培養上清を、ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４，１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４，１３７ｍＭのＮａＣｌ及び２．７ｍＭのＫＣｌ，ｐＨ７．４）で平衡化したＨｉＴｒａｐプロテインＡＨＰ（５ｍｌ）カラムに適用した。非結合タンパク質は、平衡緩衝液を用いて洗浄した。抗体及び抗体変異体は、０．１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ２．８で溶出し、タンパク質を含む画分は、０．１ｍｌの１Ｍトリス、ｐＨ８．５で中和した。次いで、溶出したタンパク質画分をプールし、アミコンウルトラ遠心濾過装置（ＭＷＣＯ：３０Ｋ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で３ｍｌの体積まで濃縮し、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０で平衡化した、スーパーデックス２００ ＨｉＬｏａｄ １２０ｍｌ １６／６０又は２６／６０ゲル濾過カラムにロードした。５％未満の高分子量凝集体を含有する精製抗体を含む画分がプールされ、−８０℃で１．０ｍｇ／ｍｌの一定分量として保存した。
【０１２９】
精製タンパク質の分析
精製されたタンパク質サンプルのタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定することによって決定した。抗体の純度及び分子量は、還元剤（５ｍＭの１，４−ジチオトレイトール）の存在下及び非存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びクーマシーブリリアントブルーによる染色により分析された。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を、製造業者の説明に従って使用した（４−１２％のトリスグリシン・ゲル）。抗体サンプルの凝集体含量は、２５℃で２００ｍＭのＫＨ２ＰＯ４，２５０ｍＭのＫＣｌ，ｐＨ７．０のランニングバッファー中で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００分析的サイズ排除カラムを使用して高性能ＳＥＣにより分析された。２５μｇのタンパク質が流速０．５ｍｌ／分でカラムに注入され、５０分間にわたり均一濃度で溶出された。安定性分析のため、濃度が１ｍｇ／ｍｌの精製タンパク質が、４℃及び４０℃で７日間インキュベートされ、次いで高性能ＳＥＣ（例えばＨＰ ＳＥＣ分析（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ））により評価された。還元された免疫グロブリン変異体の鎖のアミノ酸骨格の完全性が、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）による酵素処理によるＮ−グリカンの除去後にナノエレクトロスプレーＱ−ＴＯＦ質量分析法により検証された。
【０１３０】
質量分析法
抗体の全脱グリコシル化質量を決定し、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を介して確認した。簡潔には、１００μｇの精製抗体が、１００ｍＭのＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４，ｐＨ７中で、３７℃で１２〜２４時間、最大２ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で、５０ｍＵのＮ−グリコシダーゼ Ｆ（ＰＮＧａｓｅＦ，ＰｒｏＺｙｍｅ）により脱グリコシル化され、続いてセファデックスＧ２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＨＰＬＣを介して脱塩した。それぞれの抗体鎖の質量が脱グリコシル化及び還元後にＥＳＩ−ＭＳにより決定された。簡潔には、１１５μｌ中で５０μｇの抗体が、６０μｌの１ＭのＴＣＥＰ及び５０μｌの８Ｍのグアニジン塩酸塩とインキュベートされ続いて脱塩された。全質量及び還元型抗体鎖の質量は、ＮａｎｏＭａｔｅ供給源を装備したＱ−Ｓｔａｒ Ｅｌｉｔｅ ＭＳシステム上でＥＳＩ−ＭＳを介して決定された。記録された質量範囲は、サンプルの分子量に依存する。一般に、還元された抗体に対しては、質量範囲は６００−２０００ｍ／ｚから設定され、非還元型抗体に対しては１０００−３６００ｍ／ｚから設定された。
【０１３１】
ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ
ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ（多角度レーザー光散乱によるサイズ排除クロマトグラフィー）が溶液中のタンパク質のおよその分子量を決定するために使用された。光散乱理論によれば、ＭＡＬＬＳは、分子形状又は他の推測に関係なく、巨大分子の分子量の推定を可能にする。ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳは、ＳＥＣクロマトグラフィー、続く、濃度及び散乱光感受性検出器を介した、タンパク質の、その大きさ（流体力学半径）に従った分離に基づいている。ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳは、ＳＥＣ分離が十分であるとするならば、典型的には、単量体、二量体、三量体などの間の明白な区別を可能にする正確さで分子量を生じる。
【０１３２】
この作業において、以下の機器を用いた：Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００ＨＰＬＣ；カラム：Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ １０／３００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）；溶出剤：１ｘＰＢＳ；流速：０．２５ｍＬ／分；検出器：ＯｐｔｉＬａｂ ＲＥＸ（Ｗｙａｔｔ社，Ｄｅｒｎｂａｃｈ），ＭｉｎｉＤａｗｎ Ｔｒｅｏｓ（Ｗｙａｔｔ社，Ｄｅｒｎｂａｃｈ）．分子量は、アストラソフトウェア、バージョン５．３．２．１３で計算した。５０から１５０μｇの間の量のタンパク質がカラム上にロードされ、ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）が参照タンパク質として使用された。
【０１３３】
動的光散乱（ＤＬＳ）経時変化
２０ｍＭのＨｉｓ／ＨｉｓＣｌ，１４０ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ６．０中で、約１ｍｇ／ｍＬの濃度でのサンプル（３０μＬ）が３８４ウェルフィルタープレート（０．４５μｍの細孔サイズ）を介して３８４ウェル光学プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の中へ濾過され、２０μＬのパラフィンオイル（Ｓｉｇｍａ）で覆われた。動的光散乱データは、４０℃の一定温度でＤｙｎａＰｒｏ ＤＬＳプレートリーダー（Ｗｙａｔｔ）により、５日間の期間中に繰り返し収集された。データはダイナミクスＶ６．１０（Ｗｙａｔｔ）で処理した。
【０１３４】
表面プラズモン共鳴
抗ＩＧＦ−ｌＲ抗原結合タンパク質及び抗体の結合特性はビアコア機器を使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術により分析された（Ｂｉａｃｏｒｅ，ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ）。このシステムは、分子相互作用の研究のために確立されている。それは、リガンド／分析物の結合を連続的リアルタイムで監視し、従って、様々なアッセイの設定において、会合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、及び平衡定数（ｋｄ）の決定を可能とする。ＳＰＲ−技術は、金被覆バイオセンサーチップの表面に近い屈折率の測定に基づいている。屈折率の変化は、溶液中に注入された分析物と固定化されたリガンドとの相互作用により生じた表面上の質量変化を示す。分子が表面上で固定化リガンドに結合する場合、質量は増加し、解離の場合には質量は減少する。捕捉のために、抗ヒトＩｇＧ抗体は、アミン結合化学を用いてＣＭ５バイオセンサーチップの表面上に固定化された。フローセルは、０．１ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド及び０．１Ｍの３−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル−Ｎ−エチルカルボジイミドの５μｌ／分の流速で１：１混合物により活性化した。抗ヒトＩｇＧ抗体が、酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０に１０μｇ／ｍｌで注入された。参照コントロールのフローセルは同じ方式で、ただし抗体を捕捉するかわりにヒヒクル緩衝液のみで処置された。表面は、１Ｍのエタノールアミン／ＨＣｌ ｐＨ８．５の注入によりブロックした。ＩＧＦ−１Ｒ抗体はＨＢＳ−Ｐで希釈して注入した。全ての相互作用は２５℃（標準温度）で行われた。３Ｍの塩化マグネシウムの再生溶液を５μｌ／分の流量で６０秒間注入し、各結合サイクル後、非共有性で結合した任意のタンパク質を除去した。シグナルは、１秒に１回のシグナルの割合で検出された。サンプルを、濃度を増加させて注入した。図１７は、適用されたアッセイフォーマットを示す。抗体を捕捉する密度及びＩＧＦ−１Ｒ抗体による低負荷密度が結合を強制するために選ばれた。
【０１３５】
親和性測定のため、ＰＲ機器（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００）上で標準的なアミンカップリング及びブロッキング化学によって表面に結合した抗Ｈｉｓ抗体に対するＨｉｓタグ付き受容体を捕捉することにより（Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ，Ｑｉａｇｅｎ）、ヒトＦｃｇＩＩＩａがＣＭ−５センサーチップに対して固定化された。ＦｃｇＲＩＩＩａ捕捉後、５０ｎＭのＩＧＦ１Ｒ抗体が５μＬ／分の流速で２５℃で注入された。チップはその後１０ｍＭのグリシンＨＣｌ、ｐＨ２．０溶液の６０秒のパルスで再生された。
【０１３６】
抗体依存性細胞傷害性アッセイ（ＡＤＣＣ）
抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体による抗体媒介性エフェクター機能の決定。免疫エフェクター機構を誘発する生成された抗体の能力を決定するために、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の研究が行われた。ＡＤＣＣにおける抗体の影響を調査するために、ＤＵ１４５ ＩＧＦ−ＩＲ発現細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）が、細胞インキュベーター中で３７℃で２５分間、１ｍｌあたり１μｌのＢＡＴＤＡ溶液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で標識された。その後、細胞は１０ｍｌのＲＰＭＩ−ＦＭ／ＰｅｎＳｔｒｅｐで４回洗浄し、２００×ｇで１０分間、遠沈した。最後の遠心分離工程の前に、細胞数を測定し、その後ペレットからＲＰＭＩ−ＦＭ／ＰｅｎＳｔｒｅｐ培地中に１×１０５細胞／ｍｌに細胞が希釈された。細胞を５０μｌの容量で、丸底プレートにウェル当たり５，０００個が蒔かれた。ＨｕＭＡｂ抗体が、５０μｌの細胞懸濁液に対して５０μｌの細胞培養培地の容量で、２５−０．１μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度で追加された。続いて、５０μｌのエフェクター細胞、新鮮に単離されたＰＢＭＣがＥ：Ｔの比率が２５：１で添加された。プレートを２００×ｇで１分間遠心分離し、３７℃で２時間のインキュベーション工程が続いた。インキュベーションの後、細胞は２００ｇで１０分間遠沈し、上清の２０μｌが回収され、Ｏｐｔｉｐｌａｔｅ９６−Ｆプレートに移された。ユーロピウム溶液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、室温で）２００μｌを添加し、プレートを加振台上で１５分間インキュベートした。蛍光はＰｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒからのＥｕ−ＴＤＡプロトコルを使用して、時間分割蛍光光度計（Ｖｉｃｔｏｒ ３，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で定量化される。ＡＤＣＣによる細胞溶解の規模は、それぞれの標的細胞からのＴＤＡの自発的放出に対して補正され、界面活性剤により溶解した、標的細胞からのＴＤＡ蛍光エンハンサーの最大放出の％として表される。
【０１３７】
ＩＧＦ−１Ｒ内部移行アッセイ
本発明に係る抗体及び抗原結合タンパク質のＩＧＦ−１Ｒに対する結合は、受容体の内部移行と分解を生じる。この工程は、ＩＧＦ−１Ｒを発現するＨＴ２９ ＣＲＣ細胞をＩＧＦ−１Ｒ標的抗体とインキュベートし、続いてＥＬＩＳＡにより、細胞溶解物中に残存するＩＧＦ−１Ｒタンパク質のレベルを定量化することにより監視することができる。
【０１３８】
この目的のために、１，５×１０４細胞／ウェルでのＨＴ２９細胞が、細胞の付着を可能にするために、１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ中で９６ウェルのＭＴＰ中で、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートされた。翌朝、培地を吸引し、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳで希釈されたＩＧＦ−１Ｒ抗体が、１０ｎＭから２ｐＭの濃度で、１：３の希釈工程で添加された。細胞は３７℃で１８時間、抗体とインキュベートされた。その後、培地は再び除去され、１２０μｌのＭＥＳ溶解緩衝液（２５ｍＭのＭＥＳ ｐＨ６．５＋完全）が添加された。
【０１３９】
ＥＬＩＳＡのために、９６ウェルのストレプトアビジンコーティングポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃ）が３％のＢＳＡ／ＰＢＳＴで１：２００に希釈された１００μｌのＭＡＫ＜ｈｕ ＩＧＦ−１Ｒα＞ｈｕ−１ａ−ＩｇＧ−Ｂｉ （Ｃｈ．１０）をロードされ、室温で１時間、一定の攪拌下でインキュベートした。その後、ウェルの内容物を除去し、各ウェルを２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄した。細胞溶解物の溶液１００μｌをウェル当たりに添加し、再び加振台上で室温で１時間インキュベートし、２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄した。上清の除去後に、３％のＢＳＡ／ＰＢＳＴで１：７５０希釈された、１００μｌ／ウェルのＰＡＫ＜ヒトＩＧＦ−１Ｒα＞Ｒａ−Ｃ２０−ＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＃ｓｃ−７１３）が添加され、その後上述のように同様の培養及び洗浄間隔が続いた。ＩＧＦ−１Ｒに結合した特異的な抗体を検出するために、３％のＢＳＡ／ＰＢＳＴで１：４０００希釈された、ポリクローナル西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ウサギ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＃７０７４）が、１００μｌ／ウェル添加された。それから１時間後、非結合抗体が、上述のように完全に６回洗浄することにより再び除去された。結合した抗体の定量化のため、１００μｌ／ウェルの３，３’−５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｒｏｃｈｅ，ＢＭ−Ｂｌｕｅ ＩＤ．−Ｎｒ．１１４８４２８１）が添加され、室温で３０分間インキュベートした。熱発生反応は、１ＭのＨ２ＳＯ４を２５μｌ／ウェル添加することにより最終的に停止させ、光吸収が波長４５０ｎｍで測定される。抗体で処理していない細胞が、０％下方制御のコントロールとして、溶解緩衝液がバックグランドコントロールとして使用される。
【０１４０】
ＩＧＦ−１Ｒの自己リン酸化アッセイ（ＩＧＦ−１刺激）
ＩＧＦ−１Ｒ抗体によるＩＧＦ−１Ｒ標的化はＩＧＦ−１Ｒ誘導性自己リン酸化の阻害をもたらす。我々は、野生型ＩＧＦ−１ＲのＭｏＡｂ二量体の自己リン酸化の阻害を、親のＩＧＦ−１ＲのＩｇＧ１抗体と比較して調査した。この目的のため、３Ｔ３−ＩＧＦ−１Ｒ細胞、マウス線維芽細胞株を過剰発現するヒトＩＧＦ−１Ｒを、異なる濃度のＩＧＦ−１Ｒ抗体又はＩＧＦ−１Ｒ抗原結合タンパク質の存在下で、１０ｎＭの組換えヒトＩＧＦ−１により１０分間処理した。細胞の溶解後に、リン酸化されたＩＧＦ−１Ｒタンパク質のレベルを、ヒトＩＧＦ−１Ｒ特異的捕捉抗体及びリン酸化チロシン特異的検出抗体を組み合わせて、リン酸化−ＩＧＦ−１Ｒ特異的ＥＬＩＳＡによって決定した。
【０１４１】
ＰＫ特性の決定マウスにおける単回投与の速度論
方法
動物：
ＮＭＲＩマウス、メス、摂食、化合物投与時での体重は２３−３２ｇ。
【０１４２】
研究プロトコール
１０ｍｇ／ｋｇの単回静脈注射投与のため、マウスは各々２〜３匹の動物を有する３つの群に割り当てられた。血液サンプルは、投薬後、群１からは０．５時間、１６８時間及び６７２時間で採取され、群２からは２４時間及び３３６時間で採取され、群３からは４８時間及び５０４時間で採取された。
約１００μＬの血液サンプルを眼球後部穿刺により得た。少なくとも４０μｌの血清サンプルが、室温で２．５分間の遠心分離（９３００×ｇ）により、室温で１時間後に血液から得られた。血清サンプルは遠心分離後直接凍結され、分析まで−２０℃で凍結して保存した。
【０１４３】
分析論：
マウス血清中のヒト抗体の濃度を、１％マウス血清を用いた酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で測定した。ヒトＦｃγに対するビオチン化モノクローナル抗体（ｍＡｂ＜ｈＦｃγＰＡＮ＞ＩｇＧ−Ｂｉ）を、第一工程でストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレートに結合させた。次の工程で、血清サンプル（様々な希釈で）及び参照基準がそれぞれ添加され、固定化ｍＡｂ＜ｈＦｃγＰＡＮ＞ＩｇＧ−Ｂｉに結合させた。次いで、ヒトＦｃγに対するジゴキシゲニン化モノクローナル抗体（ｍＡｂ＜ｈＦｃγＰＡＮ＞ＩｇＧ−Ｄｉｇ）が添加された。ヒト抗体は、抗Ｄｉｇ−西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体コンジュゲートを介して検出された。ＡＢＴＳ溶液を、西洋ワサビペルオキシダーゼの基質として使用した。使用される捕捉及び検出抗体の特異性は、マウスＩｇＧと交差反応せず、マウス血清サンプル中のヒト抗体の定量を可能にする。
【０１４４】
結論：
薬物動態パラメーターは、薬物動態学的評価プログラムＷｉｎＮｏｎｌｉｎＴＭ、バージョン５．２．１を使用して、非コンパートメント解析により計算された。
0005764677.tif 000002
【０１４５】
以下の薬物動態パラメーターが、ヒト抗体を評価するために使用された。
ボーラスＩＶモデルの推定初期濃度（Ｃ０）。
（Ｔｍａｘ）で発生する最大観察濃度（Ｃｍａｘ）。
最大観測濃度の時間（Ｔｍａｘ）。
濃度／時間の曲線下の面積ＡＵＣ（０−ｉｎｆ）は、時間０から無限で線形台形公式（線形補間）により算出した。
見かけの終末相半減期（Ｔ１／２）は次式から誘導した。Ｔ１／２＝ｌｎ２／λｚ．
全身クリアランス（ＣＬ）は、投与量／ＡＵＣ（０−ｉｎｆ）として算出した。
定常状態での分布容量（Ｖｓｓ）は、ＭＲＴ（０−ｉｎｆ）ｘＣＬ（ＭＲＴ（０−ｉｎｆ）として算出され、ＡＵＭＣ（０−ｉｎｆ）／ＡＵＣ（０−ｉｎｆ）として定義される。
【０１４６】
Ｂ．実施例：
実施例１：
ＭｏＡｂ−二量体抗原結合タンパク質の産生
我々は、図１Ａに示される設計原理をもとにして、ｃ−Ｍｅｔ（配列番号１及び配列番号２），ＩＧＦ−１Ｒ（配列番号３及び配列番号４）及びＨＥＲ３（配列番号５及び配列番号６）に対する本発明に係る抗原結合タンパク質を設計した。ぞれぞれの構築物は上述したようにＨＥＫ２９３細胞において一過性に発現させ、続いてプロテインＡ親和性クロマトグラフィーを介して精製し、その後サイズ排除クロマトグラフィーで精製した。図２−４は、抗原結合タンパク質の三つの異なる生産物のサイズ排除クロマトグラフィーのクロマトグラム、並びに非還元および還元条件下での対応するＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。図２のピーク３、図３のピーク２、図４のピーク３に加えて、図２のカラムピーク２，図３のカラムピーク１、図７のカラムピーク４に由来するより早期時点で溶出するタンパク質が観察された。それらの保持時間に基づいて、それらが、一価抗体（図１Ｂ，ＭｏＡｂ）の分子量の二倍体を呈していると算出され、図１Ａに係る抗原結合タンパク質（ＭｏＡｂ−二量体）に対応している。
【０１４７】
ＩＧＦ−１Ｒ抗体の２つのピーク１と２の大きさはＳＥＣ−ＭＡＬＬＳにより確認され（図３Ｃ）、実際に、ピーク１に対応するタンパク質が、一価抗体（ピーク２）の分子量のおよそ二倍の分子量を呈していることを示していた。ＭｏＡｂ−二量体の存在と単離されたタンパク質の同一性は次いで質量分析により確認した。それらの知見に基づいて、我々は図１Ａに記載されるＭｏＡｂ−二量体の構造についてのモデルを導き出した。
【０１４８】
我々は、質量分析法、還元、プロテアーゼ消化などの実験を行い、図１Ａに示される仮想的構造を確認した。
【０１４９】
ＩＧＦ１Ｒ ＡＫ１８ ＭｏＡｂ−二量体（「ＣＨ３−ｗｔ」）の安定性は、上述のように動的光散乱により研究される。簡潔には、ＩＧＦ１Ｒ ＡＫ１８ ＭｏＡｂ−二量体（「ＣＨ３−ｗｔ」）の凝集傾向が、４０℃でのＤＬＳ経時実験により評価される。
【０１５０】
実施例２：
ＩＧＦ−１Ｒ結合親和性
ＩＧＦ１Ｒ ＡＫ１８ ＭｏＡｂ−二量体（「ＣＨ３−ｗｔ」）のＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメイン結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により親の＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＩｇＧ１抗体の結合と比較した。図５は、親和性を決定するためのＳＰＲアッセイの模式図を示す。分析では、ＩＧＦ−１Ｒの結合親和性は、ＩＧＦ１Ｒ ＡＫ１８ ＭｏＡｂ−二量体（「ＣＨ３−ｗｔ」）で保持されることを示していた。
0005764677.tif 000003
【０１５１】
実施例３：
ＩＧＦ−１Ｒを発現する細胞株に対する細胞結合
ＩＧＦ−１ＲのＭｏＡｂ−二量体の細胞結合が、Ａ５４９細胞上で実証された。対数増殖期のＡ５４９細胞はａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）で切り離され、２ｘ１０ｅ５細胞を、個々の抗体のインキュベーションのために使用した。ＩＧＦ−１Ｒ抗体及びＭｏＡｂ二量体が三倍希釈系列（１００−０．０００３μｇ／ｍＬ）で追加された。結合抗体が、ヒト免疫グロブリンの定常領域に対する二次的Ａｌｅｘａ４８８結合抗体（５μｇ／ｍＬ）結合で視覚化された。死滅した細胞を７−ＡＡＤ（ＢＤ）で染色し、分析から除外した。単一細胞の蛍光強度を、ＦＡＣＳカント（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメーターで測定した。ＭｏＡｂ−二量体は、親のＩＧＦ−１Ｒ ＩｇＧ１抗体に同等の、細胞に対する非常に類似した半最大結合を示した。このことは、ＭｏＡｂ−二量体は細胞上で２本の腕で結合することができ、結合活性作用を示している。しかし、全ｍｆｉ（平均蛍光強度）は、ＭＡｂ ＩＧＦ−１ＲよりもＭｏＡｂ−二量体でより高い。これは、細胞表面上において１モルのＩＧＦ−１Ｒ当たりのより多くのＦｃ部分に起因する可能性がある。結果は図６及び以下に示される。
0005764677.tif 000004
【０１５２】
実施例４：
ＡＤＣＣ誘導
ドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、癌細胞に対する非糖鎖操作型抗体および糖鎖操作型抗体によって、エフェクター細胞の動員を測定するために使用することができる。癌細胞の溶解は、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害と相関し、ＮＫ細胞を動員する抗体の能力に比例する。この特定の設定において、ＤＵ１４５前立腺癌細胞が、それぞれの抗体の欠損下又は存在下でＰＢＭＣと、１：２５の比率（ＤＵ１４５：ＰＢＭＣ）でインキュベートされた。２時間後、上述のように細胞の溶解をＢＡＴＤＡ／ユーロピウムシステムを用いて測定した。ＡＤＣＣによる細胞溶解の規模は、それぞれの標的細胞からのＴＤＡの自発的放出に対して補正され、界面活性剤により溶解した、標的細胞からのＴＤＡ蛍光エンハンサーの最大放出の％として表される。データは、非糖鎖操作型の二価のＩＧＦ−１Ｒ ＭｏＡｂ−二量体が、非糖鎖操作型ＩＧＦ−１Ｒ抗体に比べてＡＤＣＣを誘導する点において優れていることを示している。驚くべきことに、非糖鎖操作型ＩＧＦ−１Ｒ ＭｏＡｂ−二量体は、高濃度に向かうＡＤＣＣアッセイの低下を示す糖鎖操作型ＩＧＦ−１Ｒ抗体に比較して、高濃度でＡＤＣＣを誘導する点において更に優れている。糖鎖工学の欠損下でのＭｏＡｂ−二量体による優れたＡＤＣＣの誘導は、ＦｃｇＲＩＩＩａの二価性に起因する、ＮＫ細胞上でのＦｃｇＲＩＩＩａの構築物の高い親和性（結合活性作用）により説明することができる。
【０１５３】
非糖鎖操作型ＩＧＦ１Ｒ ＭＡｂ（１）、糖鎖操作型、アフコシル化ＩＧＦ１Ｒ ＭＡｂ  （２）、及び非糖鎖操作型ＩＧＦ１Ｒ ＡＫ１８ ＭｏＡｂ−二量体（「ＣＨ３−ｗｔ」）  （３）が図７に示されており、ＭｏＡｂ−二量体ＩＧＦ１Ｒ ＡＫ１８ ＭｏＡｂ−二量体（「ＣＨ３−ｗｔ」）は、非糖鎖操作型ＩＧＦ１Ｒ ＭＡｂに比較してＡＤＣＣを改善させ、そして高濃度においては、糖鎖操作型、アフコシル化ＩＧＦ１Ｒ ＭＡｂ（２）に比べて、更に改善させていることを表している。
【０１５４】
実施例５：
ＩＧＦ−１Ｒ内部移行アッセイ
二価のＩＧＦ−１Ｒ抗体による、腫瘍細胞におけるＩＧＦ−１Ｒのターゲティングは、ＩＧＦ−１Ｒの内部移行とリソソーム分解をもたらす。我々は、ＩＧＦ−１Ｒ ＭｏＡｂ−二量体の内部移行特性を、親のＩＧＦ−１Ｒ親の抗体と比較して調査した。この目的のために、ＨＴ２９結腸癌細胞が、異なる濃度のＭｏＡｂ−二量体と親のＩＧＦ−１Ｒ抗体で１８時間処置された。細胞の溶解後、ＩＧＦ−１Ｒタンパク質の残存しているレベルがＩＧＦ−１Ｒ特異的ＥＬＩＳＡにより決定された。
【０１５５】
図８のデータは、ＭｏＡｂ−二量体によるＩＧＦ−１Ｒの内部移行は、二価の親のＩＧＦ−１Ｒ親の抗体と実質的に同一であることを示している。最大の内部移行は８２．９９ ％（ＩｇＧ１）対８３．７％（ＭｏＡｂ−二量体）であって、半最大阻害に必要な濃度は０．０２７ｎＭ（ＩｇＧ１）対０．０２７ｎＭ（ＭｏＡｂ−二量体）であった。
【０１５６】
実施例６：
ＩＧＦ−１Ｒの自己リン酸化（ＩＧＦ−１刺激）
ＩＧＦ−１Ｒ抗体によるＩＧＦ−１Ｒ標的化はＩＧＦ−１Ｒ誘導性自己リン酸化の阻害をもたらす。我々は、ＭｏＡｂ二量体ＩＧＦ−１Ｒ抗体の自己リン酸化の阻害を、親のＩＧＦ−１ＲのＩｇＧ１抗体と比較して調査した。この目的のため、３Ｔ３−ＩＧＦ−１Ｒ細胞、マウス線維芽細胞株を過剰発現するヒトＩＧＦ−１Ｒを、異なる濃度のＩＧＦ−１Ｒ抗体及び抗原結合タンパク質の存在下で、１０ｎＭの組換えヒトＩＧＦ−１により１０分間処理した。細胞の溶解後に、リン酸化されたＩＧＦ−１Ｒタンパク質のレベルを、ヒトＩＧＦ−１Ｒ特異的捕捉抗体及びリン酸化チロシン特異的検出抗体を組み合わせて、リン酸化−ＩＧＦ−１Ｒ特異的ＥＬＩＳＡによって決定した。
【０１５７】
図９のデータは、ＩＧＦ−１Ｒ ＭｏＡｂ−二量体は、ＩＧＦ−１Ｒ ＩｇＧ１の親の分子と比べて同様に又はわずかに良好に、ＩＧＦ−１誘導性自己リン酸化を阻害することができることを示している。半最大阻害に必要な濃度は、１．４４ｎＭ（親のＩＧＦ−１Ｒ ＩｇＧ１）対３．５２ｎＭ（ＭｏＡｂ−二量体），であって、観察された最大阻害は８０．３％（親のＩＧＦ−１Ｒ ＩｇＧ１）対８９．１％（ＭｏＡｂ−二量体）であった。
【０１５８】
実施例７：
ＰＫ特性の決定
本発明による抗原結合タンパク質の薬物動態学的特性を、ＮＭＲＩマウス、メス、摂食、単回投与ＰＫ試験において化合物投与時での体重が２３−３２ｇのマウスで（方法のセクションで）上述のように測定した。
【０１５９】
ＰＫ特性は続く表で与えられ、抗原結合タンパク質ＩＧＦ１Ｒ ＡＫ１８ ＭｏＡｂ−二量体（「ＣＨ３−ｗｔ」）は、親の＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＩｇＧ１抗体と比較して高く価値ある特性（例えばＡＵＣ０−ｉｎｆ，Ｃｍａｘ又はＣ０など）を持っていることを示している。
0005764677.tif 000005
【０１６０】
実施例８：
ＩＧＦ−１Ｒ ＭｏＡｂ−二量体のＥＳＩ−ＭＳ実験
ＩＧＦ−１Ｒ ＭｏＡｂ−二量体（ＩＧＦ１Ｒ ＡＫ１８ ＭｏＡｂ（「ＣＨ３−ｗｔ」））（配列番号３及び配列番号４）は一過性に発現され、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを介して精製された。調製用ＳＥＣの後で（図３Ａ参照）、抗体は、２つの別々のピーク内に溶出され、それを回収した。最初のピーク（画分１）からの分析用ＳＥＣは、約２００ｋＤａの見かけの分子量を示し、一方第２ピーク（画分２）は１００ｋＤａの分子量に対応している。異なる分子量が、副産物として区別された単量体（画分２）と所望の二量体（画分１）にそれぞれ割り当てることができた。ＳＥＣ−ＭＡＬＳは初期のＳＥＣ結果を追認し、画分２（単量体）について９９．５ｋＤａの分子量及び画分１（ニ量体）について１９３．８ｋＤａの分子量を示した。
【０１６１】
変性条件および還元条件下で２つの画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図３Ｂ参照）は、５０−６０ｋＤａの見かけの分子量の一つの主要なバンドを示す。非還元条件下で画分２は分子量が１００ｋＤａ近傍に主要なバンドを示し、画分１は、約１００−２００ｋＤａの範囲の非常に広いバンドを示している。
画分１＝１６５ｍＬ
画分２＝１９０ｍＬ
これらの初期のデータは、二量体形成を示している。
【０１６２】
画分１からの脱グリコシル化ＭｏＡｂ−二量体及び画分２のＭｏＡｂ単量体のＥＳＩ−ＭＳスペクトル（６０μｌの１Ｍ ＴＣＥＰ及び５０μｌの８Ｍグアニジン塩酸塩でインキュベートされたサンプル）は相違を示している。画分２は、質量が９８１５１Ｄａの単量体に対応する唯一のピーク系列を示すが、画分１は９８１５５Ｄａの質量（単量体）に対応する２つの主要なピーク系列及び１９６３１９Ｄａの質量（二量体）を持つ第二系列を含む２つの異なるエンベロープを示す。
0005764677.tif 000006
【０１６３】
画分１における単量体の存在は、インキュベーションの条件（６０μｌの１ＭのＴＣＥＰ及び５０μｌの８Ｍグアニジン塩酸塩とともにインキュベートされる）、及び可能性のあるＣＨ１−Ｃｋ間の開いたＳ−Ｓブリッジにより説明され得る。この場合、ＭＳ用にサンプル調製の最中に水性から酸性の有機溶媒への移行は、二量体の２つの単量体への解離を生じる場合がある。
【０１６４】
これは、ＣＥ−ＳＤＳ（ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ）分析からの結果に一致している。画分１は非還元条件下で７１％の二量体と１６％の単量体を含有する。ＳＤＳの使用は、非共有結合した鎖を分離する。画分２は非還元条件下で唯一の単量体シグナル（９８％）を示す。
【０１６５】
画分１と画分２の非還元条件下でのＭＳ測定は、構築物の正確な配列と発現を示す。画分１からのＭＳデータは、分子量が４７９６０Ｄａ及び５０２０８Ｄａの２本の異なる重鎖をほぼ等しい量で示している。これら２本の重鎖はまた、同様の強度を有する画分２で発見された。
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【０１６６】
実施例９：
ＣＨ３野生型及びＣＨ３−修飾型ＩＧＦ１Ｒ ＡＫ１８ ＭｏＡｂ−二量体抗原結合タンパク質におけるＭｏＡｂ−二量体対一価単量体の比率の分析
抗体鎖のＣＨ３ドメインの修飾は、ＭｏＡｂ−二量体及びＭｏＡｂ−単量体の比率を変えることができる。典型的には、異なる重鎖修飾は、未修飾の重鎖と一緒に又は組み合わせて、一過性にＨＥＫ２９３Ｆ細胞で発現される。比較のために、抗体を含む未修飾の重鎖を平行して一過性にトランスフェクトした。抗体を含有する上清をトランスフェクション後に第７日で回収した。抗体はプロテインＡセファロースを用いて沈殿させ、標準的なｐＨショックプロトコールでビーズから溶出した。得られた溶出液をＧ３０００ＳＷ（ＴＳＫＧｅｌ）カラムを使用してＨＰＬＣ分析にかけた。抗体比は定量化され、各ピーク下の面積を計算した。用語「ＣＨ３−ｗｔ」は、天然配列を持つＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインを指す（野生型＝ｗｔ）。
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【０１６７】
実施例１０：
糖鎖操作抗体の作製
糖鎖操作型ＭｏＡｂ抗原結合タンパク質の生成のため、ＨＨＥＫ−ＥＢＮＡ細胞を、４つのプラスミドにより、リン酸カルシウム法を用いて、トランスフェクトした。２つは抗体鎖をコードし、一つは融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現用（ＧｎＴ−ＩＩＩ発現ベクター）、及び一つはマンノシダーゼＩＩ発現用（ゴルジマンノシダーゼＩＩ発現ベクター）で、それぞれ４：４：１：１の比で。細胞を、１０％のＦＣＳを補填したＤＭＥＭ培養培地を使用してＴフラスコ中で付着単層培養として増殖させ、それらが５０及び８０％集密になったときに形質移入した。Ｔ１５０フラスコの形質移入では、ＦＣＳ（最終１０％Ｖ／Ｖで）を補填した２５ｍｌのＤＭＥＭ培養培地に形質移入の２４時間前に１５００万細胞を播種し、細胞を５％ＣＯ２大気のインキュベーターに３７℃で一晩配した。形質移入される各Ｔ１５０フラスコに対して、ＤＮＡ、ＣａＣｌ２及び水の溶液を、軽鎖及び重鎖発現ベクター間で均等に分割された９４μｇの全プラスミドベクターＤＮＡ、４６９μｌの最終容量までの水及び４６９μｌの１ＭのＣａＣｌ２溶液を混合することによって調製した。この溶液に、９３８μｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４溶液（ｐＨ７．０５）を加え、直ぐに１０秒間混合し、室温で２０秒間静置した。懸濁液を、２％のＦＣＳを補填した１０ｍｌのＤＭＥＭで希釈し、既存の培地の代わりにＴ１５０に加えた。ついで、更なる１３ｍｌの形質移入培地を加えた。細胞を約１７から２０時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、ついで培地を２５ｍｌのＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳに置換した。条件培養培地を２１０×ｇでの１５分の遠心分離によって形質移入から７日後に収集し、溶液を滅菌濾過（０．２２μｍフィルター）し、０．０１％ｗ／ｖの最終濃度のアジ化ナトリウムを加え、４℃に維持した。
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図３Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１Ａ】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図４】
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【配列表】
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