(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Ａを有する化合物、またはこの塩もしくは水和物：
【化１】
0005667056.tif 000017
ただし、Ｒは、３−フルオロフェニル、２，４−ジフルオロフェニルおよび３，５−ジフルオロフェニルを含む群より選択され、Ｒ’は、２−フルオロエチルで置換されたトリアゾールである。
【請求項２】
さらに画像化部分(imaging moiety)を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記画像化部分(imaging moiety)は放射性標識である、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記放射性標識は１８Ｆである、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
下記式[１８Ｆ]１１を有する、請求項４に記載の化合物。
【化２】
0005667056.tif 000018
【請求項６】
請求項１に記載の化合物および１以上の別の活性成分、製薬上許容できる賦形剤、担体または希釈剤を含む、薬剤組成物。
【請求項７】
請求項２〜５のいずれか１項に記載の化合物および１以上の別の活性成分、製薬上許容できる賦形剤、担体または希釈剤を含む、薬剤組成物。
【請求項８】
分子画像化剤として使用されるための、請求項２〜５のいずれか１項に記載の化合物または請求項７に記載の薬剤組成物。
【請求項９】
前記分子画像化剤がカスパーゼ活性の可視化および定量化を目的とする、請求項８に記載の化合物または薬剤組成物。
【請求項１０】
ａ）ヒト以外の哺乳動物の細胞または組織を請求項２〜５のいずれか１項に記載の化合物または請求項７に記載の薬剤組成物と接触させ；
ｂ）前記哺乳動物の細胞または組織を検出装置の検出域に置き；
ｃ）前記被検者における前記化合物を前記検出装置で検出し；さらに
ｄ）段階ａ）、ｂ）およびｃ）を繰り返す、
ことを有する、哺乳動物の細胞または組織におけるカスパーゼ活性への試験物質の治療効果の評価方法。
【請求項１１】
カスパーゼ活性の阻害に使用される、請求項１に記載の化合物または請求項６に記載の組成物。
【請求項１２】
過剰なまたは不適切なアポトーシスによって引き起こされるまたは前記アポトーシスと関連のある疾患または障害の診断に使用される、請求項２〜５のいずれか１項に記載の化合物または請求項７に記載の組成物。
【請求項１３】
下記式３８（ただし、ｎ＝０〜６）を有する化合物。
【化３】
0005667056.tif 000019
【請求項１４】
下記式４３（ただし、ｎ＝０〜６およびｘ＝脱離基）を有する化合物。
【化４】
0005667056.tif 000020
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の化合物を使用することを有する請求項５に記載の化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なイサチン５−スルホンアミド誘導体、ならびにカスパーゼ活性およびカスパーゼ依存性アポトーシスの可視化および定量化、および治療用途における分子画像化剤(molecular imaging agent)としてのその使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスまたはプログラム細胞死（ＰＣＤ）は、最も普及している細胞死経路であり、非常に調節されたエネルギー保存メカニズムを介して進行する。健常な状態では、アポトーシスは、細胞の成長を制御し、細胞数を調節し、形態形成を容易にし、さらに有害なまたは異常な細胞を除去する際に重要な役割を果たす。このプロセスの異常調節は、癌や自己免疫疾患等の、アポトーシスの阻害に関連するもの、および神経変性疾患、血液病、ＡＩＤＳ、虚血及び同種移植の拒絶反応等の、過活動アポトーシスに関連するものなどの、多くの病状にかかわりがある。したがって、アポトーシスの可視化および定量化は、このようなアポトーシスに関連する病態生理学の診断に有用である。
【０００３】
これらの疾患の治療のための処置は、このプロセスを刺激するまたは阻害することによって、均衡のとれたアポトーシスを回復させることを目的とする。したがって、細胞や組織におけるアポトーシスの非侵襲性の画像化(imaging)は、治療的介入に対する応答の初期評価にとって非常に有益であり、病理学的なプロセスの破壊への新しい知見を提供する。悪性の成長を症状が末期になる前に確実に制御するために癌治療の有効性を初期にモニターすることは特に関心が高い。
【０００４】
細胞死を画像化するのに有用なプローブのうち、放射性標識されたアネキシンＶ(Annexin V)は最も注目を集めている１，２。しかしながら、アネキシンＶは、細胞内のものではなく、細胞外表面のものしか検出せず、負に帯電したリン脂質にのみ結合するため、アポトーシスと壊死とを区別することができない。膜相互作用プローブに関しては、数多くのジ−ダンシルシステイン(di-dansyl cysteine)およびナフチル−エチル−フルオロアニリン(naphthyl-ethyl-fluoroalanine)誘導体がアポトーシスを画像化するために開発された３，４，５。しかしながら、このような膜相互作用プローブはまた、アポトーシス性細胞に対する特異性が低く、別の試験を必要とせずにはアポトーシスと壊死とを区別することができない６。より最近では、カスパーゼと呼ばれる酵素群に結合する特定の化合物の開発への興味が高まっている。
【０００５】
カスパーゼは、アポトーシスの調節に中心的な役割を果たすシステインアスパルテートに特異的なプロテアーゼ(cysteine aspartate-specific proteases)群である。内因性のおよび外因性のシグナルネットワークは、「イニシエーター」カスパーゼ８（外因性）または９（内因性）を活性化し、さらに不活性なプロカスパーゼ３、６及び７を切断して活性のある「エクセキューショナー(executioner)」カスパーゼ３、６及び７にする。このエクセキューショナーカスパーゼは、最終的には細胞タンパク質の切断により細胞死をもたらし、これは非常に選択的にアスパラギン酸残基の右側に起こる。切断されるタンパク質としては、ＤＮＡ修復酵素（例えば、ＰＡＲＰ）、キーシグナルタンパク質(key signaling protein)（例えば、Ａｋｔ、Ｒａｓ）、核骨格タンパク質(nuclear skeletal protein)（例えば、アクチン、α−フォドリン、ラミン）および細胞サイクルレギュレーター（例えば、ｐ２７Ｋｉｐ１）がある。
【０００６】
［１３１Ｉ］ＩＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋ等の、カスパーゼのペプチド系の不可逆的阻害剤を分子画像化剤として使用することは、選択性が中程度しかなく、細胞への取り込みがインビボでの画像化には不十分であるなど、細胞透過性が低いため、不十分であった。
【０００７】
より最近では、イサチンとして知られている化学物質群が潜在的なカスパーゼ阻害剤として研究されてきた。イサチンの作用メカニズムは、活性化カスパーゼの酵素活性部位への共有結合を介したカスパーゼ３及び７との細胞内酵素−阻害剤複合体の形成がかかわっていると考えられる。イサチンのジカルボニル官能基がその作用メカニズムには必須である；この基が活性部位のシステイン残基と結合して、イサチンの求電子性のＣ−３カルボニル炭素および求核性のシステインチオレート官能基によるチオヘミケタルを形成する７。
【０００８】
高スループットスクリーンについては、Lee et al.がカスパーゼ−３の阻害剤として非ペプチドイサチンＮ−（１−メチル）−５−ニトロイサチン(N-(1-methyl)-5-nitroisatin)を同定した。構造を最適化することによって、スルホンアミド（Ｓ）−１−ベンジル−５−（２−フェノキシメチル−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン[(S)-1-benzyl-5-(2-phenoxymethyl-pyrrolidine-1-sulfonyl)isatin]（２．５ｎＭ）８（本明細書中の化合物１３を示す）が開発された。他のイサチンスルホンアミドがカスパーゼ３及び７の阻害剤として開発された９−１２。Ｋｏｐｋａ１３およびＭａｃｈ１４は、それぞれ、１８Ｆで標識された（Ｓ）−１−（４−（２−フルオロエトキシ）ベンジル）−５−［１−（２−フェノキシメチルピロリジニル）スルホニル］イサチン[18F-labeled (S)-1-(4-(2-fluoroethoxy)benzyl)-5-[1-(2-phenyoxymethylpyrrolidinyl)sulfonyl]isatin]をポジトロン放出型断層撮影（ＰＥＴ）の推定上のトレーサーとして開発し、Ｋｏｐｋａ１３は、放射性標識された類似体である［１２５Ｉ］（Ｓ）−１−（４−ヨードベンジル）−５−（２−フェノキシメチル−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン）（本明細書中の化合物１４を示す）の生物学的特性を調査した。ＷＯ  ９９／０６３６７およびＷＯ  ０１／２２９６６には、多数のイサチン誘導体およびカスパーゼの阻害のためのこれらの使用が記載される。ＷＯ  ２００６／０７４７９９、ＵＳ  ２００５／０２５０７９８およびＧＢ  １，２４０，６４８には、数多くのイサチン５−スルホンアミド誘導体およびアポトーシスの画像化剤としてのこれらの使用が記載される。しかしながら、これらの既知の化合物は、分子安定性が低い、カスパーゼ−３との親和性が比較的低いおよび親油性が高いなどの、数多くの欠点がある。分子安定性が低いと、代謝が速いため、低い信号対ノイズ比でコントラストの像に劣る。また、カスパーゼ−３との親和性が低いと、画像のコントラストが劣る。親油性が高いと、系からの排泄(system elimination)が悪く、高分子への全体的な非特異的な結合が増加してしまう。
【発明の概要】
【０００９】
したがって、分子安定性が向上し、カスパーゼ酵素に対する親和性が向上し、かつ親和性が低減した新規なイサチン誘導体を提供することが、本発明の目的である。
【００１０】
本発明の第一の態様は、下記式Ａを有する新規なイサチン５−スルホンアミド誘導体、またはこの塩、水和物もしくはプロドラッグを提供する：
【００１１】
【化１】
0005667056.tif 000002
【００１２】
ただし、Ｒは、フェニル、３−フルオロフェニル、２，４−ジフルオロフェニル、３，５−ジフルオロフェニル、置換されてもよいテトラヒドロピラン、置換されてもよいジアジンおよび置換されてもよいトリアゾールであり；Ｒ’は、置換されてもよいフェニルまたは置換されてもよいトリアゾールであり；
この際、Ｒがフェニルである場合には、Ｒ’は、置換されてもよいトリアゾールである。
【００１３】
好ましい実施形態では、Ｒは置換されてもよいトリアゾールを含み、Ｒ’は置換されてもよいフェニルを含む。他の好ましい実施形態では、Ｒは置換されてもよいフェニルを含み、Ｒ’は置換されてもよいトリアゾールを含む。
【００１４】
好ましくは、前記置換されてもよいフェニル、置換されてもよいテトラヒドロピランおよび置換されてもよいジアジンは、必要であれば、１以上の電子求引基で置換される。好ましくは、前記電子求引基は、ハロゲン、ニトロ基およびカルボン酸基またはアルデヒドまたはケトン等の他のカルボニル含有官能基からなる群より選択される。より好ましくは、前記電子求引基はハロゲンである。好ましくは、前記電子求引基はフッ素である。
【００１５】
好ましくは、置換されてもよいフェニルは２，４−ジフルオロフェニルである。
【００１６】
一実施形態では、置換されてもよいトリアゾールは、必要であれば、置換されたアルキル基で置換される。好ましくは、前記置換されたアルキル基は、ハロゲンで置換されたアルキルである。より好ましくは、前記ハロゲンで置換されたアルキルはＣ１−４のフルオロアルキルである。好ましくは、前記Ｃ１−４のフルオロアルキルは、フルオロメチル、２−フルオロエチル、３−フルオロプロピルまたは４−フルオロブチルである。最も好ましくは、前記Ｃ１−４のフルオロアルキルは２−フルオロエチルである。
【００１７】
他の実施形態では、置換されてもよいトリアゾールは、必要であれば、置換されたアルキル基で置換される。好ましくは、前記アルキルはメチルである。
【００１８】
本発明はまた、これらの光学異性体およびジアステレオ異性体などの、本発明の化合物のすべての立体異性体を含むことは当業者に理解されるであろう。本発明の化合物は、特定の光学異性体の実質的な純粋な溶液の形態でまたはラセミ混合物として存在してもよい。好ましくは、本発明の化合物は、Ｓ光学異性体の実質的な純粋な溶液として、またはＳ光学異性体から実質的に構成される溶液として存在する。好ましくは、Ｓ光学異性体およびＲ光学異性体双方を含むラセミ混合物では、Ｓ光学異性体がラセミ混合物中本発明の化合物の少なくとも５０％を構成する。より好ましくは、Ｓ光学異性体が、ラセミ混合物中本発明の化合物の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％を構成する。
【００１９】
本発明の特に好ましい化合物としては、ＲおよびＲ’が下記に規定される式Ａの化合物がある：
【００２０】
【表１−１】
0005667056.tif 000003
【００２１】
【表１−２】
0005667056.tif 000004
【００２２】
【表１−３】
0005667056.tif 000005
【００２３】
【表１−４】
0005667056.tif 000006
【００２４】
好ましくは、「塩」ということばは、酢酸、プロピオン酸、乳酸、酒石酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、マロン酸、マンデル酸、リンゴ酸、フタル酸、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、メタンスルホン酸、ナルタレンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸などの有機及び無機酸、ならびに本発明の化合物が塩基部分を含む際に同様にして既知の許容できる酸由来の塩を包含する。塩はまた、本発明の化合物がカルボン酸若しくはフェノール酸部分を含む際には、有機及び無機塩基、好ましくはアルカリ金属塩、例えば、ナトリウム、リチウム若しくはカリウム、または塩基付加塩を形成できる同様の部分から形成されてもよい。
【００２５】
本明細書中で使用される「水和物」ということばは、予め水と化学的に結合した本発明の化合物の形態を意味する。
【００２６】
本明細書中で使用される「プロドラッグ」ということばは、代謝によってインビボで本発明の化合物に変換可能な化合物を意味する。
【００２７】
本明細書中で使用される、「置換されてもよいフェニル」という表現は、必要であれば１以上の置換基が環の２、３、４、５、および６位の１以上の位置に配置されてなるフェニル基を意味する。
【００２８】
本明細書中で使用される「テトラヒドロピラン」ということばは、５つの炭素原子及び１つの酸素原子を含む飽和の６員環から構成される有機化合物を意味する。
【００２９】
本明細書中で使用される「トリアゾール」ということばは、２つの炭素原子及び３つの窒素原子を有する５員環を有する、分子式：Ｃ２ＨＮ３を有する化合物を意味する。これらの化合物としては、異性体  １，４−及び１，５で２置換された１，２，３  トリアゾールがある。
【００３０】
本明細書中で使用される「ハロゲン」ということばは、臭素、塩素、フッ素およびヨウ素を意味する。
【００３１】
本明細書中で使用される「アルキル」ということばは、脂肪族炭素化水素鎖を意味し、特記しない限り、以下に制限されないが、１、２、３、４、５または６個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖を包含する。アルキルとしては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチルなどが挙げられる。
【００３２】
本明細書中で使用される「置換されたアルキル」という表現は、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、別のヘテロ原子、芳香族またはヘテロ芳香族基ならびにポリエチレングリコール等のポリエーテル、スクシニジル(succinidyl)、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−及びポリアミドなどのスペーサー基からなる群より選択される１以上の置換基をさらに有するアルキルを意味する。
【００３３】
本明細書中で使用される「ジアジン」ということばは、分子式：Ｃ４Ｈ４Ｎ２を有する有機化合物群を意味し、各化合物は炭素原子の２個が窒素で置換されるベンゼン環を含む。これらの化合物としては、異性体  ピラジン（１，４−ジアジン）、ピリミジン（１，３−ジアジン）、およびピリダジン（１，２−ジアジン）がある。
【００３４】
本発明の化合物は、活性化カスパーゼに特異的であり、活性化カスパーゼに対して高い親和性を有する。本発明の化合物は、カスパーゼ３及び７の強力かつ選択的な阻害剤である。特に本発明の化合物は、カスパーゼ−３及びカスパーゼ−７に対する高い親和性を有する。本発明の化合物は、アポトーシス中に活性形態で発現されるのみであり、ゆえに、カスパーゼ−３および／またはカスパーゼ−７の活性はカスパーゼに依存するアポトーシスの信頼性のあるインジケータである。
【００３５】
本発明の化合物は、多くの既知のイサチン５−スルホンアミド誘導体と比べて親油性が低いため、全身で良好に除去でき、高分子への一般的な非特異的な結合が低減する。しかしながら、カスパーゼは細胞内プロテアーゼであるため、本発明の化合物は、非促進拡散によって細胞膜を通過するのに十分な親油性を有するため、細胞内外を自由に通過できる。このように、本化合物は、活性化カスパーゼ−３および／またはカスパーゼ−７を有する細胞中でのみ迅速に取り込みおよび保持を双方向に行うであろう。理想的な親油性（ＬｏｇＰとして表わされる）は、多くの他の要因に加えて、化合物が通過するのに必要な細胞タイプによって異なる。一実施形態では、親油性は１．０〜２．０の領域であることが好ましい。
【００３６】
本発明の化合物は、代謝安定性が向上し、これにより化合物が代謝され、また、場合によっては排出される速度が減少する。代謝安定性が増すと、活性化カスパーゼと結合すると、アポトーシスを受ける細胞内に本発明の化合物が蓄積される。これにより、信号対ノイズ比の高いコントラストの良好な画像が得られる。これは、細胞及び組織内のカスパーゼ活性の正確な可視化および定量化を可能にするため、分子画像化剤では好ましい。
【００３７】
好ましくは、本発明の化合物は、非処置腫瘍、心臓および脳組織では取り込みが低い。これにより、カスパーゼ活性の変化に関連する、哺乳動物組織におけるこれらの化合物の活性化カスパーゼへの結合の変化をモニターしやすくなる。
【００３８】
本発明の第二の態様は、画像化部分(imaging moiety)で標識される、本発明の第一の態様の化合物を提供する。
【００３９】
前記標識は、官能基内に画像化部分を有していても、または別の物質としての画像化部分が結合されていてもよい。
【００４０】
前記画像化部分は、検出可能なシグナルを製造できる部分を有していてもよい。このような部分としては、蛍光ラベル及び放射性ラベルがある。
【００４１】
蛍光ラベルはフルオロフォアが共有結合してなる。好ましいフルオロフォアとしては、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンの誘導体、クマリンならびにシアニン色素である、Alexa Fluors及びDyLight Fluorsがある。
【００４２】
好ましくは、本化合物はラジオアイソトープで標識される。ラジオアイソトープは本発明の化合物の分子量を実質的に増加させず、臨床的な非侵襲性イメージングに使用できるため、画像化部分としてラジオアイソトープを使用することが好ましい。
【００４３】
好ましくは、ラジオアイソトープはポジトロン放射体である。放射性同位体は、３Ｈ、１４Ｃ、１８Ｆ、１１Ｃ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９４ｍＴｃ、６６Ｇａ、６８Ｇａ、６４Ｃｕ、６１Ｃｕ、６７Ｃｕ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃ、２０１Ｔｌ、１１１Ｉｎ、８６Ｙおよび８９Ｚｒからなる群より選択されうる。
【００４４】
画像化部分をポジトロン放出型断層撮影（ＰＥＴ）を用いて画像化する場合には、放射性同位体は１８Ｆ、１１Ｃ、１２０Ｉ、１２４Ｉ、９４ｍＴｃ、６６Ｇａ、６８Ｇａ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、８６Ｙ、７５Ｂｒおよび７６Ｂｒからなる群より選択されることが好ましい。
【００４５】
画像化部分を単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）を用いて画像化する場合には、放射性同位体は１２３Ｉ、９９ｍＴｃおよび１１１Ｉｎからなる群より選択されることが好ましい。
【００４６】
好ましくは、画像化部分は１８Ｆまたは１１Ｃである。
【００４７】
好ましくは、化合物１〜１２および２９〜３４のいずれかにおいて、Ｒおよび／またはＲ’内のフッ素原子の１以上が１８Ｆである。
【００４８】
例えば、化合物６〜１２、および２９〜３６におけるように、ＲまたはＲ’での１，２，３−トリアゾール基の付加が、化合物が１８Ｆまたは１１Ｃで容易に標識できるため、さらに好ましい。
【００４９】
本発明の特に好ましい実施形態は、下記式を有する。
【００５０】
【化２】
0005667056.tif 000007
【００５１】
本発明の他の好ましい化合物は、下記一般式を有する。
【００５２】
【化３】
0005667056.tif 000008
【００５３】
本発明の第三の態様は、本発明の第一の態様に係る化合物を、必要であれば一以上の製薬上許容できる担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせてなる組成物を提供する。
【００５４】
本発明の第四の態様は、本発明の第二の態様に係る化合物を、必要であれば一以上の製薬上許容できる担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせてなる組成物を提供する。
【００５５】
本組成物はまた、一以上の別の活性剤を含んでもよい。前記別の活性剤は、本発明の化合物によって生産されるシグナルを促進する物質を含んでもよい。好ましくは、前記活性剤は、マレイン酸ジエチル（ＤＥＭ）、Ｌ−ブチオニン−（Ｓ，Ｒ）−スルホキシミン（ＢＳＯ）及びこれらの誘導体などの、細胞グルタチオンレベルを枯渇するまたは調節する化合物を含む。
【００５６】
本発明の第三または第四の態様の組成物は、既知の方法によって投与されうる。
【００５７】
本組成物は、細胞に接近できる化合物を暴露する(exposing)、インキュベートする(incubating)、接触する(touching)、結合する(associating)または作製する(making)ことによって、細胞と接触させてもよい。
【００５８】
本組成物は、経口（吸入によることを含む）、非経口、粘膜（例えば、口腔、舌下、鼻腔内）、直腸または経皮投与によって被検者に投与されてもよく、本組成物はそれに従って適用されてもよい。
【００５９】
経口投与では、本組成物は、液体または固体として、例えば、溶液、シロップ、懸濁液またはエマルジョン、錠剤、カプセル及びロゼンジとして配合できる。
【００６０】
液剤は、通常、適当な水性または非水性液状担体、例えば、水、エタノール、グリセリン、ポリエチレングリコールまたは油における、化合物またはその生理学上許容できる塩、水和物若しくはプロドラッグの懸濁液または溶液から構成されるであろう。液剤はまた、懸濁化剤、防腐剤、香料添加剤または着色剤を含んでもよい。
【００６１】
錠剤形態の組成物は、固体製剤を調製するのに一般的に使用される適当な医薬担体を用いて調製できる。このような担体の例としては、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、ラクトース、スクロース及び微結晶性セルロースが挙げられる。
【００６２】
カプセル形態の組成物は、一般的なカプセル化方法を用いて調製できる。例えば、活性成分を含む粉末、顆粒またはペレットを標準的な担体を用いて調製した後、硬質ゼラチンカプセル中に充填してもよい。または、分散液または懸濁液を適当な医薬担体、例えば、水性ゴム、セルロース、ケイ酸塩または油を用いて調製した後、前記分散液または懸濁液を軟質ゼラチンカプセル中に充填してもよい。
【００６３】
経口投与用組成物は、例えば、錠剤またはカプセルに配合物を外側コーティングすることによって、消化管を通過する際に活性成分が分解するのに対して保護するように設計されてもよい。
【００６４】
鼻腔内または経口投与用組成物は、エアロゾル、液滴、ゲル及び粉末として簡便に配合されてもよい。エアロゾル製剤は、具体的には生理学上許容できる水性または非水性溶媒における活性物質の溶液または細かい懸濁液(fine suspension)を含み、一般的に密閉容器中で滅菌形態で１回量または複数回量で提示され、これは噴霧装置と共に用いられるカートリッジまたはレフィルの形態をとってもよい。または、密閉容器は、容器の内容物が排出されたら処分されるような用途である、単回投与鼻吸入器等の単回調剤装置(unitary dispensing device)または絞り弁を備えたエアロゾルディスペンサーであってもよい。投与形態がエアロゾルディスペンサーを含む場合には、製薬上許容できる推進剤を含むであろう。エアロゾル投与形態はまたポンプ−アトマイザーの形態をとってもよい。
【００６５】
口腔または舌下投与に適する組成物としては、活性成分が糖及びアカシア、トラガカント、またはゼラチン及びグリセリン等の担体と共に配合される、錠剤、ロゼンジ及びトローチが挙げられる。
【００６６】
直腸または膣内投与用の組成物は、簡便には坐剤（ココアバター等の公知の坐剤の基剤を含む）、ペッサリー、膣錠、泡剤または浣腸剤の形態を有する。
【００６７】
経皮投与に適する組成物としては、軟膏、ゲル、パッチ及び粉体噴射剤等の噴射剤が挙げられる。
【００６８】
簡便には、本組成物は、錠剤、カプセルまたはアンプル等の単回投与形態を有する。
【００６９】
好ましくは、本発明の化合物または組成物は、非経口投与によって被検者に投与される。特に、本組成物は、静脈内、腹腔内、髄腔内、リンパ管内または筋肉内に投与されてもよい。
【００７０】
具体的な非経口組成物は、適当なｐＨ、等張性および安定性を有する滅菌した水性または非水性担体における化合物またはその生理学上許容できる塩の経口投与に許容できる溶液または懸濁液から構成される。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、乳酸加リンガー注射液等の等張ベヒクルを用いて適当な溶液を調製できる。防腐剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤および／または他の添加剤を必要であれば含んでもよい。
【００７１】
本発明の第五の態様は、分子画像化剤(molecular imaging agent)として使用されるための本発明の第一若しくは第二の態様の化合物または本発明の第三若しくは第四の態様の薬剤組成物を提供する。
【００７２】
好ましくは、前記分子画像化剤は、細胞及び組織におけるカスパーゼ活性の可視化および定量化を目的とする。好ましくは、前記分子画像化剤は、ヒトの細胞及び組織等の哺乳動物の細胞及び組織におけるカスパーゼ活性の可視化および定量化を目的とする。前記定量は、細胞または組織の放射線量、または取り込み、解離若しくは分配速度の分析を含んでもよい。
【００７３】
活性カスパーゼと複合体を形成すると、細胞及び組織内への標識化合物の取り込みおよび蓄積を画像化して、前記細胞及び組織内のカスパーゼ活性のレベルを示す。したがって、本発明の第六の態様は、
ａ）細胞または組織を本発明の第二の態様の化合物または本発明の第四の態様の組成物と接触させ；および
ｂ）カスパーゼ活性を検出する
段階を有する、カスパーゼ活性の分子画像化方法を提供する。
【００７４】
好ましくは、カスパーゼ活性の検出段階は、検出装置の検出域内に被検者をおき、前記検出装置を用いて被検者内の前記化合物を検出する段階を有する。
【００７５】
本方法は、インビトロで行われてもよい。細胞または組織の本発明の化合物または組成物との接触は、細胞または組織に接近できる化合物を暴露する(exposing)、インキュベートする(incubating)、接触する(touching)、結合する(associating)または作製する(making)ことを含んでもよい。
【００７６】
本発明の化合物または組成物が放射性標識される際には、カスパーゼ活性を適当な放射線検出装置を用いてインビトロで検出できる。前記装置としては、Packard Topcount等の、ベータカウンター、またはPackard Cobra IITMガンマカウンター(Perkin Elmer, UK)等の、ガンマカウンター、またはラジオ−ＴＬＣスキャナー(radio-TLC scanner)が挙げられる。
【００７７】
本発明の化合物または組成物が蛍光標識される場合には、前記カスパーゼ活性は、適当な蛍光読み取り装置を用いてインビトロで検出できる。このような装置としては、蛍光顕微鏡、蛍光光度計、またはPerkin Elmer Victor等の、蛍光板リーダーがある。
【００７８】
または、本方法は、インビボで行われてもよい。本化合物または本組成物を、本発明の第三および第四の態様で記載される方法によって被検者に投与されてもよい。好ましくは、本化合物は非経口で投与される。
【００７９】
本発明の化合物または組成物が放射性標識される際には、カスパーゼ活性は、放射線検出装置を用いて検出してもよい。前記放射線検出装置としては、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャナーまたは単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）スキャナーが挙げられる。好ましくは、前記放射線検出装置はポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャナーである。前記ＰＥＴスキャナーは、１８Ｆ等のポジトロンを放出するラジオアイソトープによって間接的に放出されるガンマ線の対を検出し、組織内のラジオアイソトープ濃度の３Ｄイメージを作製できる。したがって、ＰＥＴは、哺乳動物の組織内の本発明の放射性標識された化合物または組成物の位置を確認する３Ｄイメージを作製するのに使用できる。
【００８０】
本発明の化合物または組成物が蛍光標識される場合には、カスパーゼ活性は、適当な蛍光読み取り装置を用いて検出されてもよい。前記蛍光読み取り装置としては、蛍光内視鏡がある。
【００８１】
好ましくは、カスパーゼ活性は、カスパーゼ−３活性である。
【００８２】
本発明はまた、カスパーゼ活性の可視化及び定量化のための薬剤または診断組成物の製造を目的とする本発明の第二の態様の化合物の使用を提供する。
【００８３】
第六の態様の他の実施形態では、本発明の第一の態様に係る化合物または本発明の第三の態様に係る薬剤組成物は、段階（ａ）で投与されてもよい。次に、前記化合物を投与後に蛍光または放射性で標識してもよい。
【００８４】
上述したように、カスパーゼ酵素はアポトーシスをもたらし、このようなカスパーゼ活性はアポトーシスの指標として使用できる。したがって、本発明の第七の態様は、哺乳動物の細胞または組織におけるカスパーゼに依存するアポトーシスのインビボにおける画像化のための本発明の第二の態様の化合物または本発明の第四の態様の薬剤組成物の使用を提供する。
【００８５】
本方法は、
ａ）本発明の第二の態様の化合物または本発明の第四の態様の組成物を被検者に投与し；
ｂ）被検者を検出装置の検出域に置き；および
ｃ）被検者における化合物を前記検出装置で検出する、
ことを有する。
【００８６】
好ましくは、前記化合物または組成物は注射によって被検者に投与される。
【００８７】
画像化部分は、非侵襲で外部からまたは血管内放射線(intravascular radiation)検出器若しくは光検出器等の、インビボでの使用のために設計される検出器、または術中での使用のために設計される放射線検出器を用いることによって内部から検出されうる。好ましくは、画像化部分は非侵襲的に検出される。
【００８８】
一実施形態では、前記化合物は蛍光標識され、第六の態様で上記で規定されるような蛍光読み取り装置を用いて蛍光標識された化合物から放出される蛍光を測定することによって検出される。
【００８９】
第二の好ましい実施形態では、前記化合物は放射性標識され、第六の態様で上記で規定されるような放射線検出装置を用いて放射性標識された化合物から放出される放射線を測定することによって検出される。
【００９０】
好ましくは、カスパーゼ活性は、カスパーゼ−３活性である。
【００９１】
第七の態様の別の実施形態では、本発明の第一の態様に係る化合物または本発明の第三の態様に係る薬剤組成物を、段階（ａ）で投与してもよい。次に、前記化合物を投与後にインビボで蛍光または放射性で標識してもよい。
【００９２】
上述したように、多数の病気の治療のための処置は、このプロセスを刺激または阻害することによって、正常で釣り合いのとれたアポトーシスを取り戻すことを目的とする。したがって、本発明の第八の態様は、哺乳動物の細胞または組織におけるカスパーゼ活性への試験物質の治療効果を評価するための、本発明の第二の態様の化合物または本発明の第四の態様の薬剤組成物の使用を提供する。
【００９３】
本方法は、
ａ）哺乳動物の細胞または組織を本発明の第二の態様の化合物または本発明の第四の態様に係る組成物と接触させ；
ｂ）前記哺乳動物の細胞または組織を検出装置の検出域に置き：
ｃ）化合物を前記検出装置で検出し；さらに
ｄ）段階ａ）、ｂ）およびｃ）を繰り返す、
ことを有してもよい。
【００９４】
一実施形態では、前記化合物は蛍光標識され、第六の態様で上記で規定されるような蛍光読み取り装置を用いて蛍光標識された化合物から放出される蛍光を測定することによって検出される。
【００９５】
第二の好ましい実施形態では、前記化合物は放射性標識され、第六の態様で上記で規定されるような放射線検出装置を用いて放射性標識された化合物から放出される放射線を測定することによって検出される。
【００９６】
第八の態様の別の実施形態では、本発明の第一の態様に係る化合物または本発明の第三の態様に係る薬剤組成物を段階（ａ）で投与してもよい。次に、前記化合物を投与後にインビボで蛍光または放射性で標識してもよい。
【００９７】
好ましくは、本発明の方法は、インビボで行われてもよく、
ａ）本発明の第二の態様に係る化合物または本発明の第四の態様に係る組成物を被検者に投与し；
ｂ）被検者を放射線検出装置の検出域に置き；
ｃ）被検者における放射性標識された化合物から放出される放射線を前記放射線検出装置を用いて測定し；
ｄ）段階ａ）、ｂ）およびｃ）を繰り返す、
ことを有してもよい。
【００９８】
第八の態様のインビトロおよびインビボ方法双方で、段階ｄ）は、繰り返しが経時的にカスパーゼ活性の変化を追跡するのに有効である所定の間隔で行うことが好ましい。段階ｄ）の間隔は、問題になっている被検者および試験物質に適切であるべきである。ヒトでは、適当な間隔は、以下に制限されないが、１２〜２４時間、４８時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間または６週間が挙げられる。
【００９９】
各繰り返しで測定されるカスパーゼ活性を比較することによって、経時的な、カスパーゼ活性の程度及び位置の定量的な変化、およびゆえにカスパーゼに依存するアポトーシスの定量的なまたは半定量的な変化を評価できる。カスパーゼ活性の程度および位置の変化は、カスパーゼ活性の刺激または阻害によって、カスパーゼに依存するアポトーシスへの試験物質の治療効果を示しうる。本方法は、確立された薬を用いて治療のための処置に対する被検者の応答を評価するのに、および新規な薬の薬効の評価に使用できる。
【０１００】
本発明の化合物または組成物は、試験物質の前に、後にまたはと同時に投与してもよい。好ましくは、段階（ａ）〜（ｃ）は、試験物質の投与前に被検者で行われ、カスパーゼ活性の１回目の測定結果を提供する。次に、試験物質を投与し、段階（ａ）〜（ｃ）を上記したような間隔をあけた後繰り返して、カスパーゼ活性の２回目の測定結果を提供する。必要であれば、試験物質をさらに投与する前または後に、段階（ａ）〜（ｃ）をさらに繰り返して、カスパーゼ活性のさらなる測定結果を提供してもよい。
【０１０１】
好ましくは、前記化合物または組成物を注射によって被検者に投与する。
【０１０２】
試験物質は、以下に制限されないが、癌、自己免疫疾患、血液病、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、虚血、心血管疾患、神経疾患および移植拒絶反応などの病気を治療するのに使用される薬(drug)または薬剤(agent)含んでもよい。特に試験物質は、癌の処置のための化学療法薬、放射線療法薬または免疫療法薬を含んでもよい。
【０１０３】
上述したように、段階（ａ）〜（ｃ）を２回以上繰り返してもよい。好ましい一実施形態では、段階（ａ）の１回目の実施で被検者に投与される化合物は、１１Ｃで放射性標識された本発明に係る化合物である。好ましくは、前記化合物は、化合物３５および３６からなる群より選択される。次に、段階（ａ）の２回目の実施で被検者に投与される化合物は、放射性標識された画像化剤である。前記放射性標識された画像化剤は、例えば、フルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ）、３’−デオキシ−３’−１８Ｆ−フルオロチミジン（ＦＬＴ）または本発明に係る化合物であってもよい。好ましい一実施形態では、前記画像化剤は１８Ｆで標識される。本実施形態は、特に好ましい。炭素−１１（１１Ｃ）は２０分という比較的短い半減期を有する。ゆえに、１１Ｃで標識された化合物を使用することによって、２回目以降のスキャンの間のバックグランドノイズがほとんどないまたはない。これにより、より高い信号対ノイズ比、ならびにカスパーゼ活性およびカスパーゼに依存するアポトーシスのより正確な可視化及び定量化が可能になる。
【０１０４】
同様にして、本発明の第六および第七の態様に係る方法を比較的短い時間内で繰り返そうとする場合には、１１Ｃ標識された化合物、さらには１８Ｆ標識された化合物等の別の放射性標識された画像化剤を使用することによっても、２回目のスキャン中に存在するバックグランドノイズを低減して、信号対ノイズ比を高める。
【０１０５】
本発明の第九の態様は、カスパーゼ活性の阻害に使用される本発明の第一の態様に係る化合物または本発明の第三の態様に係る組成物を提供する。本方法は、有効量の本発明の第一の態様の化合物または本発明の第三の態様の組成物をこのような処置の必要のある被検者に投与することを有していてもよい。
【０１０６】
本態様はまた、カスパーゼ活性の阻害のための医薬を製造する際の本発明の第一の態様の化合物または本発明の第三の態様の組成物の使用を提供する。
【０１０７】
カスパーゼ酵素がアポトーシスをもたらすため、本発明の第九の態様はまた、アポトーシスの阻害に使用される本発明の第一の態様の化合物または本発明の第三の態様の組成物を提供する。
【０１０８】
カスパーゼ活性の阻害は、過剰のまたは不適切なアポトーシスによって引き起こされるまたは前記アポトーシスに関連する病気若しくは症状を処置するのに有効でありうる。このような病気または症状の例としては、アルツハイマー病等の神経変性疾患、血液病、肝細胞の変性、変形性関節症、ＡＩＤＳ、虚血および同種移植の拒絶反応が挙げられる。
【０１０９】
本発明の第一の態様の化合物または本発明の第三の態様の組成物は、一般的に、１日投与量レジメで被検者に投与されるであろう。例えば、１日投与量レジメは、約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ被検者の体重を必要とするかもしれない。１日投与量は、より大きな哺乳動物では、好ましくは約１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ〜５００ｍｇであり、前記化合物は１日１〜４回投与されうる。または、本発明の化合物が安定である場合には、投与量は、１週間で、１、２または３回投与されてもよい。
【０１１０】
本発明の化合物および組成物の投与の投与量、レジメおよび形式は、病気または症状および処置される個体によって異なり、かかわりのある開業医の判断に従うであろうことは理解される。
【０１１１】
本発明の第十の態様は、病態生理を診断するのに使用される本発明の第二の態様の化合物または本発明の第四の態様の組成物を提供する。特に、本発明の第二の態様の化合物または本発明の第四の態様の組成物は、以下に制限されないが、慢性心不全、急性心筋梗塞、発作、神経変性疾患、自己免疫疾患、局所性血液病、局所性ＡＩＤＳ、虚血（心虚血を含む）、および移植拒絶反応などの、過剰なまたは不適切なアポトーシスに関連する病気および疾患を診断するのに使用できる。
【０１１２】
本方法は、
ａ）哺乳動物の細胞または組織を本発明の第二の態様の化合物または本発明の第四の態様に係る組成物と接触させ；
ｂ）前記哺乳動物の細胞または組織を検出装置の検出域内に置き；
ｃ）前記検出装置を用いて前記化合物を検出して、前記哺乳動物の細胞または組織内のカスパーゼ活性の定量的な測定結果を提供し、この際、カスパーゼ活性がアポトーシスの指標である、
ことを有しうる。
【０１１３】
一実施形態では、前記化合物は蛍光標識され、第六の態様で上記で規定されるような蛍光読み取り装置を用いて蛍光標識された化合物から放出される蛍光を測定することによって検出される。
【０１１４】
第二の好ましい実施形態では、前記化合物は放射性標識され、第六の態様で上記で規定されるような放射線検出装置を用いて放射性標識された化合物から放出される放射線を測定することによって検出される。
【０１１５】
次に、好ましくは、前記測定結果を標準値と比較することによって、病態生理を診断できる。
【０１１６】
第十の態様の別の実施形態では、本発明の第一の態様に係る化合物または本発明の第三の態様に係る薬剤組成物は段階（ａ）で投与されてもよい。次に、前記化合物は投与後に蛍光標識または放射性標識されてもよい。
【０１１７】
本発明の第十一の態様は、本発明の第一の化合物の合成方法を提供する。本発明の第一の化合物は、適当な方法で調製されうる。実施例１、３及び１０に記載され、図１、２（ｉ）、２（ｉｉ）、１２、１９、２０及び２１に示されるスキームには、本発明の第一の化合物が調製される方法が示される。
【０１１８】
図１は、化合物１〜５、１０〜１２および中間体１９ａ〜ｈ、２０ａ〜ｈ、２１〜２４が調製できる方法を示す。化合物２９〜３４は類似した方法で調製される。さらなる詳細を実施例１に示される。
【０１１９】
トリアゾール基を含む本発明の化合物はまた、図２（ｉ）、図１２、及び図１９に示され、実施例１及び３に記載されるような、「クリック−ラベリング(click-labelling)」と称される方法によって製造できる。このような方法は、例えば、化合物１１、３５及び３６を作製するのに使用できる。本発明の第一の態様の化合物の製造には、非標識の化合物は、もちろん、これらの実施例に開示される放射性標識された化合物の代わりに使用されるであろう。例えば、図２（ｉ）に示され、実施例３に記載されるスキームでは、２−フルオロエチルアジド（化合物２７）が２−［１８Ｆ］フルオロエチルアジド（化合物［１８Ｆ］２７）の代わりに使用される。
【０１２０】
また、付加環化して置換トリアゾールを得ることを、Ｎ−１で官能化されたイサチンを末端アジド及び末端アルキンを有する補欠分子族と反応することによって、逆に行ってもよい（「逆クリック−ラベリング(click-labelling)」と称される方法における）。このような方法は、例えば、化合物６、７、８及び９を作製するのに使用できる。中間体１８Ｆ標識された末端アルキンの合成方法をも含む、この方法の適切な例は、図２（ｉｉ）に示され、実施例１、及びMarik, J and Sutcliffe, J. L.26, Sirion, U et al27and Li, Z. et al28に記載され、これらは参考で本明細書中に引用される。
【０１２１】
本発明の第十二の態様は、本発明の第二の態様の化合物の合成方法を提供する。本発明の第二の態様の化合物は、適当な方法で調製されうる。実施例１及び３に記載され、図１、２（ｉ）、２（ｉｉ）及び１２に示されるスキームは、本発明の第二の態様の化合物を調製されうる方法を示し、この際、標識された中間体化合物を使用する。
【０１２２】
実施例１に記載され、図１に示されるスキームは、本発明の第二の態様の化合物を調製するのに使用でき、この際、１以上の前駆体分子または中間体化合物、例えば、化合物１９ａ〜ｈ、２０ａ〜ｈおよび／または２１〜２５は標識されたＲまたはＲ’基を有する。このような方法は、例えば、標識形態の化合物１〜５、１０〜１２および２９〜３４を製造するのに使用できる。
【０１２３】
図２（ｉ）、図１２、図１９に示され、実施例１及び実施例３に記載されるスキームは、［１８Ｆ］１１、［１１Ｃ］３５おおび［１１Ｃ］３６等の、本発明の第二の態様の特定の化合物を調製する「クリック−ラベリング」方法を示す。
【０１２４】
図２（ｉｉ）に示され、実施例１に記載される「逆クリック−ラベリング」方法もまた、標識形態の化合物６、７、８及び９等の、本発明の第二の態様に係る特定の化合物を作製するのに使用できる。例えば、図２（ｉｉ）に示され、実施例１に記載されるスキームでは、３−［１８Ｆ］フルオロプロプ−１−イン[3-[18F]fluoroprop-1-yne]（化合物［１８Ｆ］２８）が３−フルオロプロプ−１−イン[3-fluoroprop-1-yne]（化合物２８）の代わりに使用される。
【０１２５】
しかしながら、実施例３に記載され、図１９に示される「クリック−ラベリング」方法には、安定した不純物が生産され、イサチン誘導体産物の特定の活性を低減するという欠点がある。実施例１０に記載され、図２０及び２１に示されるように、この欠点は、一般式３８及び４３（ただし、ｎ＝０、１、２、３、４、５または６（すなわち、ｎ＝０〜６）、ｘ＝離脱基、例えば、メシラート、トシレート、ノシレートまたは他のスルホネートエステル若しくはハライド）に示される化合物などの、保護された前駆体を用いて、イサチン誘導体、例えば、［１８Ｆ］１１を合成することによって、解消できる。
【０１２６】
【化４】
0005667056.tif 000009
【０１２７】
特に好ましい保護されたアルキン前駆体は、（Ｓ）−１−｛［１’−［１−（２−プロピニル）］−（１’２’−ジヒドロ−２’−オキソスピロ（１，３−ジオキサン−２，３’−［３Ｈ］インドール）−５’−スルホニル｝−２−（２，４−ジフルオロフェノキシメチル）−ピロリジン[(S)-1-{[1’-[1-(2-Propynyl)]-(1’2’-dihydro-2’-oxospiro(1,3-dioxane-2,3’-[3H]indol)-5’-sulfonyl}-2-(2,4-difluor ophenoxymethyl)-pyrrolidine]（化合物３９）である。このような保護されたアルキン前駆体の使用によって、Ｃ−３位置での望ましくない副反応が防止される。
【０１２８】
【化５】
0005667056.tif 000010
【０１２９】
これらの方法に加えて、本発明の第二の態様に係る化合物は、例えば、適当な錫前駆体のハロ−脱メタル化(halo-demetallation)、望ましい金属による、好ましくはイサチンに結合した適当なリガンドによるキレート化、適当なアリールまたはアルキル離脱基の存在下での［１８Ｆ］フッ素による置換によって、放射性標識されうる。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
図面
【図１】図１は、ターゲット化合物の合成の概略図である。試薬および条件は下記のとおりである：（ａ）フェノール／フッ素置換フェノール／４−テトラヒドロピラン、ＮａＨ、ＤＭＦ、８０℃、１７ｈ；（ｂ）４（３Ｈ）−ピリミドン、ＰＰｈ３、ＤＩＡＤ、ＤＣＭ、ｒｔ、４８ｈ；（ｃ）臭化プロパルギル、ＫＯＨ、ＤＭＦ、ｒｔ、１８ｈ；（ｄ）ＴＦＡ、ＤＣＭ、０℃、１ｈ；（ｅ）５−クロロスルホニルイサチン、ＴＥＡ、ＴＨＦ／ＤＣＭ、ｒｔ、１９ｈ；（ｆ）４−フルオロベンジルブロミド、Ｋ２ＣＯ３、ＤＭＦ、ｒｔ、２ｈ；（ｇ）臭化プロパルギル、Ｋ２ＣＯ３、ＤＭＦ、ｒｔ、２ｈ；（ｈ）２−フルオロエチルアジド、ＣｕＳＯ４、Ｌ−アスコルビン酸、ＤＭＦ、ｒｔ、２ｈ。
【図２−１】図２（ｉ）は、（Ｓ）−１−（２−プロピニル）−５−（２−（２，４−ジフルオロフェノキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物２５）と［１８Ｆ］フルオロエチルアジド（化合物２７）との反応による化合物［１８Ｆ］１１の合成の概略図である。化合物２６は、２−（トルエン−４−スルホニル）エチルアジドである。試薬は下記のとおりである：（ａ）［１８Ｆ］ＫＦ，Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ［２，２，２］，アセトニトリル；（ｂ）ＣｕＳＯ４、アスコルビン酸ナトリウム、リン酸緩衝液  ｐＨ６．０、化合物２５。
【図２−２】図２（ｉｉ）は、（Ｓ）−１−（アジドメチル）−５−（２−（２，４−ジフルオロフェノキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン］（化合物３７）と（３−フルオロプロプ−１−イン）（化合物２８）との反応による、化合物６  （（Ｓ）−１−［４−（２−フルオロエチル）−１Ｈ−［１，２，３］−トリアゾール−１−イル］メチル−５−（２−（２，４−ジフルオロフェノキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン）の合成の概略図である。試薬は下記のとおりである：（ａ）ＣｕＳＯ４、Ｌ−アスコルビン酸、ＤＭＦ。
【図３−１】図３は、［１８Ｆ］１１を含む反応混合物の予備ＨＰＬＣトレース（左）および分析ピーク分離（右）である。上図：放射能チャンネル；下図：２５４ｎｍでのＵＶチャンネル。
【図３−２】図３は、［１８Ｆ］１１を含む反応混合物の予備ＨＰＬＣトレース（左）および分析ピーク分離（右）である。上図：放射能チャンネル；下図：２５４ｎｍでのＵＶチャンネル。
【図４】図４は、２、１０、３０及び６０分後のＲＩＦ−１腫瘍を有するマウスにおける［１８Ｆ］１１の生体内分布を示す。データは、平均値±ＳＥＭである；ｎ＝３〜６匹マウス／時点。
【図５−１】図５は、ラジオ−ＨＰＬＣにより血漿中で評価された［１８Ｆ］１１のインビボでの代謝を示す。上左図：［１８Ｆ］１１標準；上右図：２分後の血漿；下左図：１５分後の血漿；下右図：６０分後の血漿。
【図５−２】図５は、ラジオ−ＨＰＬＣにより血漿中で評価された［１８Ｆ］１１のインビボでの代謝を示す。上左図：［１８Ｆ］１１標準；上右図：２分後の血漿；下左図：１５分後の血漿；下右図：６０分後の血漿。
【図６−１】図６は、ラジオ−ＨＰＬＣにより肝臓及び尿中で評価された［１８Ｆ］１１のインビボでの代謝を示す。上図：肝臓抽出物；下図：尿抽出物；左〜右図：それぞれ、２、１５及び６０分。
【図６−２】図６は、ラジオ−ＨＰＬＣにより肝臓及び尿中で評価された［１８Ｆ］１１のインビボでの代謝を示す。上図：肝臓抽出物；下図：尿抽出物；左〜右図：それぞれ、２、１５及び６０分。
【図６−３】図６は、ラジオ−ＨＰＬＣにより肝臓及び尿中で評価された［１８Ｆ］１１のインビボでの代謝を示す。上図：肝臓抽出物；下図：尿抽出物；左〜右図：それぞれ、２、１５及び６０分。
【図７】図７は、２、１０、３０及び６０分後の［１２５Ｉ］標識された（Ｓ）−１−（４−ヨードベンジル）−５−（２−フェノキシメチル−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（本明細書中では、化合物［１２５Ｉ］１４と称する）の生体内分布を示す。データは、平均値±ＳＥＭである；ｎ＝３匹マウス／時点。
【図８−１】図８は、ＨＰＬＣによってマウス肝臓Ｓ９画分中で評価された既知の化合物  （Ｓ）−１−（４−ヨードベンジル）−５−（２−フェノキシメチル−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物１４）、（Ｓ）−１−（４−フルオロベンジル）−５−（２−フェノキシメチル−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物１５）および１−（４−フルオロベンジル）−５−（ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物１６）のインビトロ代謝を示す。上図、左〜右図：０時での化合物１４、１５及び１６；下図、左〜右図：６０分間インキュベーション後の化合物１４、１５及び１６。
【図８−２】図８は、ＨＰＬＣによってマウス肝臓Ｓ９画分中で評価された既知の化合物  （Ｓ）−１−（４−ヨードベンジル）−５−（２−フェノキシメチル−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物１４）、（Ｓ）−１−（４−フルオロベンジル）−５−（２−フェノキシメチル−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物１５）および１−（４−フルオロベンジル）−５−（ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物１６）のインビトロ代謝を示す。上図、左〜右図：０時での化合物１４、１５及び１６；下図、左〜右図：６０分間インキュベーション後の化合物１４、１５及び１６。
【図８−３】図８は、ＨＰＬＣによってマウス肝臓Ｓ９画分中で評価された既知の化合物  （Ｓ）−１−（４−ヨードベンジル）−５−（２−フェノキシメチル−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物１４）、（Ｓ）−１−（４−フルオロベンジル）−５−（２−フェノキシメチル−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物１５）および１−（４−フルオロベンジル）−５−（ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物１６）のインビトロ代謝を示す。上図、左〜右図：０時での化合物１４、１５及び１６；下図、左〜右図：６０分間インキュベーション後の化合物１４、１５及び１６。
【図９】図９は、Ａ）１０μｇ／ｍＬ  ＣＤＤＰまたは１０μｇ／ｍＬ  ＣＨＸで２４時間処置したＲＩＦ−１細胞、Ｂ）５０μｇ／ｍＬ  ＣＤＤＰ（シスプラチン）で処置したＰＥＯ１／４細胞、Ｃ）１００μＭ  ＣＤＤＰまたは１００μＭ  ＶＰ−１６を、単独でまたは組み合わせて、処置したＬＮＭ３５細胞、における６０分後の［１８Ｆ］１１の細胞への取り込みを示す。カスパーゼ−３アッセイ（Ｃ右パネル）を、実施例で記載したようにして行った。＊スチューデントｔ−テスト(Student’s t-test)、ｐ＜０．００５。
【図１０】図１０は、ＣＤＤＰで処置したマウスにおける［１８Ｆ］１１の分布の全身矢状イメージ(whole body sagittal image)を示す。イメージは、約１００μＣｉ  ［１８Ｆ］１１を静脈内注射してから３０〜６０分で合計した。
【図１１】図１１は、１００ｍｇ／ｋｇ  シクロホスファミドで処置された３８Ｃ１８異種移植片を有するマウスにおける［１８Ｆ］１１の分布の全身矢状イメージ(whole body sagittal image)を示す。左から右へのイメージは、約１００μＣｉ  ［１８Ｆ］１１を静脈内注射してから２４時間に撮影された、軸性(axial)イメージ、冠性(coronal)イメージおよび矢状(sagittal)イメージである。
【図１２】図１２は、それぞれ、化合物３５（上図）および化合物３６（下図）の合成の概略図である。
【図１３】図１３は、ベヒクルまたはＣＤＤＰで処置されたＲＩＦ−１細胞における［１８Ｆ］１１の取り込みプロフィールを示す。データは、１ｍｇの全細胞タンパク質当たりで平均された減水補正されたカウント／分として表わされる。データは、平均値±ＳＥＭであり、３連で行われた。
【図１４】図１４は、ベヒクル（５０％ＤＭＳＯ）またはＣＤＤＰ（１０ｍｇ／ｋｇ  単回投与）で処置されたＲＩＦ−１腫瘍における［１８Ｆ］１１の取り込みを示す。放射性トレーサーを注射してから６０分での［１８Ｆ］由来の放射能レベルを分析し、血中の放射能レベルに対する割合として表わす。データは、平均値±ＳＥＭであり、ｎ＝８匹マウス／群である。
【図１５】図１５は、シクロホスファミド（ＣＰＡ、１００ｍｇ／ｋｇ）またはベヒクルで処置された腫瘍における［１８Ｆ］の生体内分布を示し、この際、カウント密度を各１９時点での興味のある各領域で平均して、興味のある領域に関する時間対放射能曲線(time versus radioactivity curve)（ＴＡＣ）を得た。
【図１６】図１６は、シクロホスファミド（ＣＰＡ、１００ｍｇ／ｋｇ）またはベヒクル（Ｖｅｈ）で処置された腫瘍における、注射してから６０分後（ＮＵＶ６０）の標準化取り込み値(Normalised Uptake Value)（ＮＵＶ）、および０〜６０分のＮＵＶの積分として算出されるＮＵＶ曲線下の面積(Area Under the NUV curve)（ＡＵＣ）のヒストグラムである。
【図１７】図１７は、ベヒクルまたはシクロホスファミドで処置された２匹の３８Ｃ１３異種移植片を有するマウスの代表的なＯＳＥＭ３Ｄ再構築［１８Ｆ］１１  ＰＥＴイメージである。丸は腫瘍を表わす。
【図１８】図１８は、カスパーゼ−３と同種のターゲットであるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ(caspase-3 cognate target poly(ADP-ribose)polymerase)（ＰＡＲＰ）に関する化合物１１（「イサチン−７」として示す）および化合物１４（「イサチン−４」として示す）の阻害活性を示す。
【図１９】図１９は、（Ｓ）−１−（２−プロピニル）−５−（２−（２，４−ジフルオロフェノキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物２５）と［１８Ｆ］フルオロエチルアジド（化合物２７）との反応による化合物［１８Ｆ］１１の合成の第２の概略図である。
【図２０】図２０は、保護されたアルキン前駆体  （Ｓ）−１−｛［１’−［１−（２−プロピニル）］−（１’２’−ジヒドロ−２’−オキソスピロ（１，３−ジオキサン−２，３’−［３Ｈ］インドール）−５’−スルホニル｝−２−（２，４−ジフルオロフェノキシメチル）−ピロリジン（化合物３９）および保護されたトリゾール  （Ｓ）−１−｛［１’−［１−（２−フルオロエチル）−１Ｈ−［１，２，３］−トリアゾール−４−イル］−（１’２’−ジヒドロ−２’−オキソスピロ（１，３−ジオキサン−２，３’−［３Ｈ］インドール）−５’−スルホニル｝−２−（２，４−ジフルオロフェノキシメチル）−ピロリジン（化合物４０）の合成に関する一般的な反応スキームである。
【図２１】図２１は、保護されたアルキン前駆体  （Ｓ）−１−｛［１’−［１−（２−プロピニル）］−（１’２’−ジヒドロ−２’−オキソスピロ（１，３−ジオキサン−２，３’−［３Ｈ］インドール）−５’−スルホニル｝−２−（２，４−ジフルオロフェノキシメチル）−ピロリジン（化合物３９）からの［１８Ｆ］１１の製造に関する具体的な放射化学反応の概略図である。
【図２２】図２２は、脱保護前の標識混合物のＨＰＬＣ分析を示す。赤：放射能チャンネル、青：２５４ｎｍでのＵＶチャンネル。残りの［１８Ｆ］フルオロエチルアジド：１．３分、標識されたイサチンアセタール(isatin acetale)：６．８分。
【図２３】図２３は、［１８Ｆ］１１の予備ＨＰＬＣを示す。上図：放射能チャンネル。１１：４５分のピークは［１８Ｆ］１１に相当する。下図：ＵＶチャンネル、２５４ｎｍ。１１：５１分のシグナルは安定した不純物である。
【図２４】図２４は、配合された［１８Ｆ］１１の分析ＨＰＬＣを示す。上図：２５４ｎｍでのＵＶチャンネル、下図：３．３分に［１８Ｆ］１１を示す放射能シグナル。
【図２５】図２５は、Ｎ−（２−プロピニル）イサチン（化合物４１）からの弱いイサチンカスパーゼ−３阻害剤であるＮ−［１−（２−フルオロエチル）−１Ｈ−［１，２，３］−トリアゾール−４−イル］イサチン（化合物４２）の合成の概略図である。
【図２６】図２６は、処置によりアポトーシスが誘導された癌細胞における［１８Ｆ］１１及び［１８Ｆ］４２の結合性を示す。（左パネル）４−ヒドロキシペルオキシシクロホスファミド  ４−ＨＣ（４−ＨＣ；１μｇ／ｍＬ；２４ｈ）で処置して、アポトーシスを誘導した３８Ｃ１３リンパ腫細胞における化学構造および［１８Ｆ］１１結合性。すべての処置およびコントロールサンプルについて、放射能データは、１ｍｇ全細胞タンパク質当たりの減衰補正されたカウントとして表わされる。（右パネル）３８Ｃ１３リンパ腫細胞における、低親和性プローブ、［１８Ｆ］４２、の結合に関する４−ＨＣの効果。
【実施例】
【０１３１】
実施例１−化合物の合成
（（Ｓ）−１−（４−フルオロベンジル）−５−（２−フェノキシメチル−ピロリジン−１−シルホニル）イサチン）をリード化合物として使用して、ターゲット化合物のライブラリーを作製した。左側のエーテル部分およびＮ−１位置で修飾をした。フッ素基を左側のフェニルエーテル基に導入して、この位置での複素環及びアルキンのトレランスを調べた。Ｎ−１位置での１，２，３トリアゾール基に対するトレランスもまた調べた。官能化ピロリジンを５−クロロスルホニルイサチンで縮合した後、炭酸カリウム／ＤＭＦを用いてイサチン窒素をアルキル化することによって図１に示されるように、ターゲット化合物を合成した。全ての必要な出発材料は市販されている、またはLee, D. et al 8, Chu, W. et al9及びKopka, K. et al13に記載されるのと同様にして製造する。
【０１３２】
４−ヒドロキシテトラヒドロピランおよび市販のフェノールをトシレート１７と反応させることによって、良好な収率でピロリジン１９ａ〜ｆを得た。４（３Ｈ）−ピリミドンを、Wipf et al.15に報告される方法の修飾を用いて（Ｓ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−２−ピロリジンメタノール（化合物１８）と結合させ、６９％の収率でピロリジン１９ｇを得た。１８を臭化プロパルギルでＯ−アルキル化することによって、６７％の収率で相当するエーテル１９ｈを得た。ＢＯＣで保護されたピロリジン１９ａ〜ｈをトリフルオロ酢酸で脱保護した後、５−クロロスルホニルイサチンと結合させることによって、並から良好な収率でスルホンアミド２０ａ〜ｈを得た。次に、塩基性条件下で２０ｂ〜ｈを４−フルオロベンジルブロミドで処理することによって、新規な化合物１〜５ならびに中間化合物２２及び２３を得、一方、２０ａ及び２０ｄを臭化プロパルギルで処理することによって、それぞれ、中間アルキン２４及び２５を得た。２−フルオロエチルアジドを各アルキン前駆体２３、２４及び２５で銅触媒による付加環化を行うことによって、新規なトリアゾール１０〜１２を調製した。いささか驚くべきことに、イサチン足場は、硫酸銅及びアスコルビン酸の存在下で９０℃で加熱すると分解し、これにより新規なトリアゾール１０〜１２の収率が悪くなった。この問題は、アルキン前駆体に対する硫酸銅濃度を５％から５０％に上げ、周囲温度で反応を行い、さらに反応時間を１時間にまで短くすることによって一部解決し、これにより、トリアゾール１０〜１２を４８〜５７％の収率で得た。
【０１３３】
化学  試薬及び溶媒は、Sigma-Aldrich(Gillingham, United Kingdom)から購入し、さらに精製することなく使用した。水酸化カリウム及び炭酸カリウムは、５酸化リンで真空デシケーター内で保存した。特記しない限り、すべての反応はアルゴン下で行われた。石油エーテルは、４０℃〜６０℃で蒸留する画分を意味する。自動化フラッシュクロマトグラフィーは、RediSep  ４ｇまたは１２ｇ  正常相シリカカートリッジ（流速  １２ｍＬ／ｍｉｎまたは２６ｍＬ／ｍｉｎ）を用いて、CombiFlash Companion machine(Companion Presearch Ltd.)で行った。マニュアルフラッシュクロマトグラフィーは、Davisil中性シリカ(neutral silica)（６０Å、６０〜２００ミクロン、Fisher Scientific, Loughborough, UK）を用いて行い、溶媒混合物は容積／容積として記載する。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルをBruker Avance 600 MHz NMR machineで得、スペクトルを残りの溶媒で参照する。結合定数（Ｊ）はヘルツ（Ｈｚ）で示す。ＧＣ−ＭＳデータは、Agilent 6890Nシステムを用いて電子イオン化下で得た。質量スペクトルは、WatersMicromass LCT Premier machineで陽極電気スプレーイオン化(positive electrospray ionisation)形式で得た。融点は、Stuart Scientific SMP1融点測定装置で毛細管中で測定し、修正しない。薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）用の溶媒混合物は容積／容積で記載し、サンプルをアルミニウムで塗布された中性シリカ板(aluminium backed neutral silica plates)（厚み  ０．２ｍｍ）(Fluka, Seelze, Germany)で発色させた。化合物１〜５、１０〜１６、２０ｂ〜ｈ及び２２〜２５の純度の分析は分析ＨＰＬＣで評価し；化合物１９ｂ〜ｈはＧＣ−ＭＳで分析した。すべての化合物の純度は９５％超であった。［１８Ｆ］フッ化物を、濃縮(enriched)［１８Ｏ］Ｈ２Ｏターゲットの１６．４ＭｅＶプロトン照射による１８Ｏ（ｐ，ｎ）１８Ｆ核反応を用いてサイクロトロン(GE PETrace)によって製造した。
【０１３４】
ＨＰＬＣ法  ａ）非放射性化合物の純度分析は、Phenomenex Luna ５０×４．６ｍｍ（３μｍ）ＨＰＬＣカラムを備えたLaura 3 software(Lablogic, Sheffield, UK)を有するAgilent 1100シリーズシステムで行い、この際、０．１Ｍ  ギ酸アンモニウム及びメタノール／アセトニトリル（１．８：１  ｖ／ｖ）の移動相、グラジエント（５０％有機相で１分；５０(R)９０％有機相で１４分；９０％有機で４分；９０(R)５０％有機相で４分）、流速  １ｍＬ／ｍｉｎ及び波長２５４ｎｍであった。
【０１３５】
ｂ）予備ラジオ−ＨＰＬＣを、Bioscan Flowcount  FC-3400 PINダイオード検出器(Lablogic)及びlinear UV-200 detector（波長  ２５４ｎｍ）を備えたBeckman System Goldで行った。Phenomenex Onyx Ｃ１８  １００×１０ｍｍ  ＨＰＬＣカラムならびに水およびメタノール／アセトニトリル（１．８：１  ｖ／ｖ）の移動相、グラジエント  ４５(R)９０％有機相で２０分および流速  ３ｍＬ／ｍｉｎであった。
【０１３６】
ｃ）分析ラジオ−ＨＰＬＣを、水およびメタノール／アセトニトリル（１．８：１  ｖ／ｖ）の移動相、グラジエント  ６０(R)９０％有機相で２０分、流速  １ｍＬ／ｍｉｎを用いて、Bioscan Flowcount FC3200  ヨウ化ナトリウム／ＰＭＴ  ガンマ線検出器(Lablogic)およびPhenomenex Luna  ５０×４．６ｍｍ（３μｍ）カラムを使用する以外は、上記と同様にして行った。
【０１３７】
既知の化合物の製造
下記化合物を確立された文献の方法に従って合成したところ、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルデータが報告された値と一致した：（Ｓ）−１−ベンジル−５−（２−フェノキシメチル−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物１３）、（Ｓ）−１−（４−ヨードベンジル）−５−（２−フェノキシメチル−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物１４）及び（Ｓ）−１−（４−フルオロベンジル）−５−（２−フェノキシメチル−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物１５）。
【０１３８】
１−（４−フルオロベンジル）−５−（ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物１６）  乾燥ＤＭＦ（８ｍＬ）における５−ピロリジン−１−スルホニルイサチン８（０．１４ｇ、０．５ｍｍｏｌ）の氷冷した攪拌溶液に、水素化ナトリウム（４０ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を添加した。３０分後、４−フルオロベンジルブロミド（０．３８ｇ、２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温まで加温した。１９時間後、オレンジ色の溶液を１０％ＮＨ４Ｃｌ水溶液（２５ｍＬ）に注ぎ、ＤＣＭで抽出した（３×１５ｍＬ）。真空中で濃縮後、残渣をジエチルエーテル（１０ｍＬ）中にとり、水で洗浄し（３×１０ｍＬ）、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。クロマトグラフィー（ジエチルエーテル／ヘキサン）によって、標題化合物をオレンジ色のゴム状物として得た（８３ｍｇ、４３％）。HRMS (ESI) = 389.0988 (M + H)+. C19H18FN2O4Sに関する算出値 389.0971. 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.05 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 7.99 (dd, J = 8.4 Hz, J = 1.5 Hz, 1 H), 7.35-7.32 (m, 2 H), 7.09-7.06 (m, 2 H), 6.91 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 4.94 (s, 2 H), 3.25-3.23 (4 H, m), 1.84-1.79 (4 H, m). TLC (UV254) Rf= 0.63 (4:1 酢酸エチル/ヘキサン). HPLC tR = 6.83 min。
【０１３９】
新規な化合物およびその中間体の製造
（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（４−フルオロフェノキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（化合物１９ｂ）  乾燥ＤＭＦ（１０ｍＬ）における４−フルオロフェノール（０．２７ｇ、２．４ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、水素化ナトリウム（鉱油における６０％ｗ／ｗ）（０．１１ｇ、２．８ｍｍｏｌ）を添加した。３０分後、乾燥ＤＭＦ（５ｍＬ）における（（Ｓ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロリジン−２−イル）トルエン−４−スルホネート８（化合物）１５（０．７１ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を添加し、この混合物を８０℃で１７時間加熱した。反応物を室温にまで冷却し、１Ｍ  ＮａＯＨ（２５ｍＬ）に注ぎ、ＤＣＭで抽出した（３×１５ｍＬ）。有機画分を合わせたものを真空中で還元し、ジエチルエーテル（２０ｍＬ）を添加した後、１Ｍ  ＮａＯＨ（１×２０ｍＬ）、水（１×２０ｍＬ）、さらにブライン（１×２０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。クロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）によって、生成物を無色の油として得た（０．３６ｇ、６１％）。HRMS (ESI) = 296.1654 (M + H)+. C16H23FNO3に関する算出値 296.1656. 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 6.97-6.93 (m, 2 H), 6.88-6.84 (m, 2 H), 4.18-4.03 (m, 2 H), 3.94-3.73 (m, 1 H), 3.46-3.32 (m, 2 H), 2.07-1.81 (m, 4 H), 1.47 (s, 9 H). TLC (UV254) Rf = 0.51 (2:1 ヘキサン/酢酸エチル)。
【０１４０】
（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル  ２−（３−フルオロフェノキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（化合物１９ｃ）  ３−フルオロフェノールを使用する以外は、１９ｂの方法に従って、１９ｃを調製した。クロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）によって、標題化合物を無色の油として得た（０．３２ｇ、５４％）。HRMS (ESI) = 296.1657 (M + H)+. C16H23FNO3に関する算出値 296.1656 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.20-7.15 (m, 1 H), 6.73-6.69 (m, 1 H), 6.65-6.59 (m, 2 H), 4.18-4.03 (m, 2 H), 3.97-3.74 (m, 1 H), 3.48-3.29 (m, 2 H), 2.05-1.79 (m, 4 H), 1.48 (s, 9 H). TLC (UV254) Rf = 0.40 (3:1 ヘキサン/酢酸エチル)。
【０１４１】
（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル  ２−（２，４−ジフルオロフェノキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（化合物１９ｄ）  ２，４−ジフルオロフェノールを使用する以外は、１９ｂの方法に従って、１９ｄを調製した。クロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）によって、標題化合物を無色の油として得た（１．９２ｇ、５８％）。HRMS (ESI) = 314.1560 (M + H)+. C16H22F2NO3に関する算出値 314.1562. 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.08-6.76 (m, 3 H), 4.21-3.87 (m, 3 H), 3.47-3.32 (m, 2 H), 2.16-1.85 (m, 4 H), 1.48 (s, 9 H). TLC (UV254) Rf = 0.51 (2:1 ヘキサン/酢酸エチル)。
【０１４２】
（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル  ２−（３，５−ジフルオロフェノキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（化合物１９ｅ）  ３，５−ジフルオロフェノールを使用する以外は、１９ｂの方法に従って、１９ｅを調製した。クロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）によって、標題化合物を無色の油として得た（０．３１ｇ、５３％）。HRMS (ESI) = 314.1563 (M + H)+. C16H22F2NO3に関する算出値 314.1562. 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 6.44-6.29 (m, 3 H), 4.11-3.98 (m, 2 H), 3.91-3.72 (m, 1 H), 3.42-3.24 (m, 2H), 1.99-1.79 (m, 4 H), 1.42 (s, 9 H). TLC (UV254) Rf= 0.56 (2:1 ヘキサン/酢酸エチル)。
【０１４３】
（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル  ２−（４−テトラヒドロピラニルオキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（化合物１９ｆ）  ４−ヒドロキシテトラヒドロピランを使用する以外は、１９ｂの方法に従って、１９ｆを調製した。クロマトグラフィー（酢酸エチル）によって、標題化合物を無色の油として得た（０．１４ｇ、２５％）。HRMS (ESI) = 286.2012 (M + H)+. C15H28NO4に関する算出値 286.2013. 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 3.97-3.83 (m, 2 H), 3.64-3.23 (m, 9 H), 1.97-1.72 (m, 5 H), 1.60-1.52 (m, 2 H), 1.46 (s, 9 H). TLC (I2) Rf = 0.62 (酢酸エチル)。
【０１４４】
（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル  ２−（ピリミジン−４−イルオキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（化合物１９ｇ）  乾燥ＤＣＭ（１０ｍＬ）におけるＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ピロリノール（０．８１ｇ、４ｍｍｏｌ）１８の攪拌溶液に、トリフェニルホスフィン（５．２４ｇ、２０ｍｍｏｌ）、さらには４（３Ｈ）−ピリミドン（０．７７ｇ、８ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を氷浴で冷却し、ＤＩＡＤ（３．２４ｇ、１６ｍｍｏｌ）を１０分間滴下した。４８時間後、ＧＣ−ＭＳでは、１８の完全な変換が示され、この反応混合物を水（３０ｍＬ）に注ぎ、有機画分を集め、水相を別のＤＣＭ（２×２０ｍＬ）で洗浄した。有機画分を合わせたものを１Ｍ  ＮａＯＨ（２×１５ｍＬ）、さらにはブライン（１×１５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。大量の溶媒を除去することによって、オレンジ色のゴム状物として得、ヘキサン／ジエチルエーテル（１：１）を添加することによって、トリフェニルホスフィンオキシドの沈殿物が形成し、これを濾別した。クロマトグラフィー（酢酸エチル）によって、目的生成物を無色の油として得た（０．７７ｇ、６９％）。HRMS (ESI) = 280.1655 (M + H)+. C14H22N3O3に関する算出値 280.1656. 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.71 (s, 1 H), 8.39 (d, J= 6 Hz, 1 H), 6,69 (d, J = 6 Hz, 1 H), 4.45-3.91 (m, 3 H), 3.40-3.33 (m, 2 H), 2.00-1.82 (m, 4 H), 1.42 (s, 9 H). TLC (UV254) Rf= 0.49 (酢酸エチル)。
【０１４５】
（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル  ２−（２−プロピニルオキシメチル）ピロリジン−１−カルボキシレート（化合物１９ｈ）  乾燥ＤＭＦ（１０ｍＬ）における１８（０．４０ｇ、２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、水酸化カリウム（０．５６ｇ、１０ｍｍｏｌ）を添加した後、臭化プロパルギル（トルエンにおいて、８０ｗｔ．％）（０．４８ｇ、４ｍｍｏｌ）を５分かけて滴下した。１８時間後、反応混合物を水（３０ｍＬ）に注ぎ、ＤＣＭで洗浄した（３×１５ｍＬ）。有機画分を合わせたものを真空中で濃縮し、残った液体をジエチルエーテル（１５ｍＬ）にとり、水（２×１０ｍＬ）、次にブライン（１×１０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。クロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）によって、目的生成物を無色の油として得た（０．３２ｇ、６７％）。HRMS (ESI) = 240.1597 (M + H)+. C13H22NO3に関する算出値 240.1594. 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 4.13 (s, 2 H), 3.96-3.88 (m, 1 H), 3.64 (dd, J = 9 Hz, J = 3.6 Hz, 1 H), 3.49-3.22 (m, 3 H), 2.40 (s, 1 H), 1.94-1.78 (m, 4 H), 1.46 (s, 9 H). TLC (I2) Rf = 0.67 (1:1 ヘキサン/酢酸エチル)。
【０１４６】
（Ｓ）−５−（２−（４−フルオロフェノキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物２０ｂ）  氷浴中で冷却した乾燥ＤＣＭ（４ｍＬ）における１９ｂ（０．１５ｇ、０．５ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、ＴＦＡ（０．６ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）を添加した。１時間後、大量の溶媒を真空中で除去し、残った残渣を乾燥ＤＣＭ（８ｍＬ）にとり、氷浴中で冷却した。次に、乾燥トリエチルアミン（１．５ｍＬ）、さらに乾燥ＴＨＦ（４ｍＬ）における５−クロロスルホニルイサチン８（０．１６ｇ、０．６５ｍｍｏｌ）を添加した後、溶液を攪拌した。１９時間後、大量の溶媒を真空中で除去し、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中に再溶解し、水（２×１０ｍＬ）、次にブライン（１×１０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。クロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）によって、目的生成物をオレンジ色の固体として得た（１０４ｍｇ、５１％）。Mp: 205-207℃. HRMS (ESI) = 405.0941 (M + H)+. C19H18FN2O5Sに関する算出値 405.0920. 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.10 (s,1 H), 8.08 (dd, J = 8.4 Hz, J = 1.8 Hz, 1 H), 8.00 (br, 1 H), 7.00 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 6.99-6.95 (m, 2 H), 6.83-6.81 (m, 2 H), 4.17 (dd, J= 9.6 Hz, J = 3.6 Hz, 1 H), 3.98-3.95 (m, 1 H), 3.91 (dd, J= 9 Hz, J = 7.8 Hz, 1 H), 3.54-3.50 (m, 1 H), 3.24-3.19 (m, 1 H), 2.10-1.99 (m, 2 H), 1.87-1.77 (m, 2 H). TLC (UV254) Rf= 0.27 (2:1 酢酸エチル/ヘキサン). HPLC tR = 7.83。
【０１４７】
（Ｓ）−５−（２−（３−フルオロフェノキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物２０ｃ）  １９ｃを使用する以外は、２０ｂの方法に従って、２０ｃを調製して、オレンジ色の固体を得た（９３ｍｇ、４６％）。Mp: 201-203℃. HRMS (ESI) = 405.0933 (M + H)+. C19H18FN2O5Sに関する算出値 405.0920. 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.14 (br, 1 H), 8.09-8.06 (m, 2 H), 7.21 (q, J = 7.2 Hz, 1 H), 7.03 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 6.67-6.62 (m, 2 H), 6.55 (dt, J = 10.8 Hz, J = 2.4 Hz, 1 H), 4.17 (dd, J = 9 Hz, J = 3 Hz, 1 H), 4.01-3.97 (m, 1 H), 3.94 (dd, J = 9 Hz, J = 7.2 Hz, 1 H), 3.54-3.50 (m, 1 H), 3.27-3.25 (m, 1 H), 2.08-1.96 (m, 2 H), 1.88-1.77 (m, 2 H). TLC (UV254) Rf = 0.36 (2:1 酢酸エチル/ヘキサン). HPLC tR = 8.27 min。
【０１４８】
（Ｓ）−５−（２−（２，４−ジフルオロフェノキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物２０ｄ）  １９ｄを使用する以外は、２０ｂの方法に従って、２０ｄを調製して、オレンジ色の固体を得た（０．８６ｇ、３４％）。Mp: 185-187℃. HRMS (ESI) = 423.0834 (M + H)+. C19H17F2N2O5Sに関する算出値 423.0826. 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.08-8.06 (m, 2 H), 7.97 (br, 1 H), 7.03 (d, J = 9 Hz, 1 H), 6.97-6.92 (m, 1 H), 6.87-6.77 (m, 2 H), 4.21 (dd, J= 8.4 Hz, J = 2.4 Hz, 1 H), 4.03-3.97 (m, 2 H), 3.56-3.52 (m, 1 H), 3.23-3.17 (m, 1 H), 2.11-2.01 (m, 2 H), 1.88-1.75 (m, 2 H). TLC (UV254) Rf = 0.46 (2:1 酢酸エチル/ヘキサン). HPLC tR = 8.12 min。
【０１４９】
（Ｓ）−５−（２−（３，５−ジフルオロフェノキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物２０ｅ）  １９ｅを使用する以外は、２０ｂの方法に従って、２０ｅを調製して、オレンジ色の固体を得た（１１２ｍｇ、５３％）。Mp: 196-198℃. HRMS (ESI) = 423.0834 (M + H)+. C19H17F2N2O5Sに関する算出値 423.0826. 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.10-8.06 (m, 2 H), 8.04 (br, 1 H), 7.05 (d, J = 8.4 Hz), 6.45-6.38 (m, 3 H), 4.18 (dd, J = 8.4 Hz, J = 2.4 Hz, 1 H), 3.99-3.92 (m, 2 H), 3.56-3.49 (m, 1 H), 3.24-3.17 (m, 1 H), 2.04-1.92 (m, 2 H), 1.86-1.77 (m, 2 H). TLC (UV254) Rf= 0.36 (2:1 酢酸エチル/ヘキサン). HPLC tR = 9.18 min。
【０１５０】
（Ｓ）−５−（２−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イルオキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物２０ｆ）  １９ｆを使用する以外は、２０ｂの方法に従って、２０ｆを調製して、オレンジ色のゴム状物を得た（６３ｍｇ、３２％）。HRMS (ESI) = 395.1282 (M + H)+. C18H23N2O6Sに関する算出値 395.1277. 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.17 (br, 1 H), 8.10-8.08 (m, 2 H), 7.07 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 3.94-3.90 (m, 2 H), 3.77-3.73 (m, 1 H), 3.70 (dd, J = 9.6 Hz, J = 3 Hz, 1 H), 3.56-3.51 (septet, J = 4.2 Hz, 1 H), 3.48-3.44 (m, 3 H), 3.13-3.11 (m, 1 H), 2.05-1.87 (m, 4 H), 1.72-1.64 (m, 2 H), 1.60-1.52 (m, 2 H).  TLC (UV254) Rf = 0.26 (4:1 酢酸エチル/ヘキサン). HPLC tR = 2.65 min。
【０１５１】
（Ｓ）−５−（２−（ピリミジン−４−イルオキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物２０ｇ）  １９ｇを使用する以外は、２０ｂの方法に従って、２０ｇを調製した。クロマトグラフィー（酢酸エチル）によって、オレンジ色のゴム状物を得た（５１ｍｇ、２７％）。HRMS (ESI) = 389.025 (M + H)+. C17H17N4O5Sに関する算出値 389.020. 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.79 (s, 1 H), 8.45 (d, J = 5.4 Hz, 1 H), 8.12 (d, J = 1.8 Hz, 1 H), 8.09 (dd, J = 8.4 Hz, J = 1.8 Hz, 1 H), 7.95 (br, 1 H), 7.03 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 6.72 (d, J = 5.4 Hz, 1 H), 4.57 (dd, J = 10.8 Hz, J = 4.8 Hz, 1 H), 4.39 (dd, J = 10.8 Hz, J=7.2 Hz, 1 H), 4.08-4.04 (m, 1 H), 3.53-3.46 (m, 1 H), 3.27-3.22 (m, 1 H), 2.01-1.93 (m, 2 H), 1.84-1.74 (m, 2 H).  TLC (UV254) Rf= 0.49 (9:1 酢酸エチル/メタノール). HPLC tR = 1.90 min。
【０１５２】
（Ｓ）−５−（２−（２−プロピニルオキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物２０ｈ）  １９ｈを使用する以外は、２０ｂの方法に従って、２０ｈを調製して、オレンジ色のゴム状物を得た（９２ｍｇ、５３％）。HRMS (ESI) = 349.0867 (M + H)+. C16H17N2O5Sに関する算出値 349.067. 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.10-8.07 (m, 2 H), 7.84 (br, 1 H), 7.04 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 4.16 (s, 2 H), 3.83-3.79 (m, 1 H), 3.72 (dd, J= 9.6 Hz, J = 3.6 Hz, 1 H), 3.54 (dd, J = 9.6 Hz, J = 3.6 Hz, 1 H), 3.45-3.43 (m, 1 H), 3.19-3.15 (m, 1 H), 2.46 (t, J= 2.4 Hz, 1 H), 1.96-1.89 (m, 2 H), 1.74-1.67 (m, 2 H). TLC (UV254) Rf = 0.28 (2:1 酢酸エチル/ヘキサン). HPLC tR =2.93 min。
【０１５３】
（Ｓ）−１−（４−フルオロベンジル）−５−（２−（４−フルオロフェノキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物２２）  乾燥ＤＭＦ（３ｍＬ）における２０ｂ（４０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、炭酸カリウム（２１ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、さらには４−フルオロベンジルブロミド（７６ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を添加した。２時間後、ＴＬＣにより、２０ｂの完全な変換が示され、この溶液を１０％ＮＨ４Ｃｌ水溶液（１０ｍＬ）に注ぎ、ＤＣＭで抽出した（３×１０ｍＬ）。有機画分を合わせたものを真空中で濃縮し、ジエチルエーテル（１０ｍＬ）中にとり、水（２×１０ｍＬ）、次にブライン（１×１０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。クロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）によって、標題化合物をオレンジ色のゴム状物として得た（３４ｍｇ、６６％）。HRMS (ESI) = 513.1306 (M + H)+. C26H23F2N2O5Sに関する算出値 513.1296.  1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.04 (d, J = 1.8 Hz, 1 H), 7.97 (dd, J = 8.4 Hz, J = 1.8 Hz, 1 H), 7.33-7.30 (m, 2 H), 7.09-7.05 (m, 2 H), 6.96-6.92 (m, 2 H), 6.86 (d, J= 8.4 Hz, 1 H), 6.81-6.77 (m, 2 H), 4.92 (d, J = 15.6, 1 H), 4.91 (d, J= 15.6, 1 H), 4.14 (dd, J = 9.6 Hz, J = 3.6 Hz, 1 H), 3.95-3.92 (m, 1 H), 3.88 (dd, J = 9.6 Hz, J = 7.2 Hz, 1 H), 3.51-3.47 (m, 1 H), 3.20-3.15 (m, 1 H), 2.06-1.93 (m, 2 H), 1.83-1.73 (m, 2 H). TLC (UV254) Rf = 0.61 (2:1 酢酸エチル/ヘキサン). HPLC tR = 12.25 min。
【０１５４】
（Ｓ）−１−（４−フルオロベンジル）−５−（２−（３−フルオロフェノキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物１）  ２０ｃを使用する以外は、２２の方法に従って、１を調製して、オレンジ色のゴム状物を得た（３１ｍｇ、６１％）。HRMS (ESI) = 513.1298 (M + H)+. C26H23F2N2O5Sに関する算出値 513.1296. 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.02 (d, J = 1.8 Hz, 1 H), 7.98 (dd,J = 8.4 Hz, J = 1.8 Hz, 1 H), 7.33-7.29 (m, 2 H), 7.18 (m, 1 H), 7.09-7.04 (m, 2 H), 6.86 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 6.66-6.62 (m, 2 H), 6.53 (dt, J = 10.8, J = 2.4 Hz, 1 H), 4.88 (s, 2 H), 4.15 (dd, J = 9.6 Hz, J = 3.6 Hz, 1 H), 3.98-3.88 (m, 2 H), 3.51-3.47 (m, 1 H), 3.23-3.18 (m, 1 H), 2.08-1.97 (m, 2 H), 1.84-1.72 (m, 2 H). TLC (UV254) Rf= 0.64 (2:1 酢酸エチル/ヘキサン). HPLC tR = 12.57 min。
【０１５５】
（Ｓ）−１−（４−フルオロベンジル）−５−（２−（２，４−ジフルオロフェノキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物２）  ２０ｄを使用する以外は、２２の方法に従って、２を調製して、オレンジ色のゴム状物を得た（３２ｍｇ、６０％）。HRMS (ESI) = 531.1204 (M + H)+. C26H22F3N2O5Sに関する算出値 531.1202. 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.03 (d, J = 1.8 Hz, 1 H), 7.98 (dd, J = 8.4 Hz, J = 1.8 Hz, 1 H), 7.33-7.30 (m, 2 H), 7.09-7.06 (m, 2 H), 6.95-6.91 (m, 1 H), 6.88 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 6.81-6.76 (m, 2 H), 4.93 (d, J = 16.2 Hz, 1 H), 4.92 (d, J = 16.2 Hz, 1 H), 4.18 (dd, J = 9 Hz, J = 3 Hz, 1 H), 4.00-3.95 (m, 2 H), 3.51-3.49 (m, 1 H), 3.21-3.17 (m, 1 H), 2.09-1.98 (m, 2 H), 1.85-1.74 (m, 2 H). TLC (UV254) Rf= 0.67 (2:1 酢酸エチル/ヘキサン). HPLC tR = 12.50 min。
【０１５６】
（Ｓ）−１−（４−フルオロベンジル）−５−（２−（３，５−ジフルオロフェノキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物３）  ２０ｅを使用する以外は、２２の方法に従って、３を調製して、オレンジ色のゴム状物を得た（３１ｍｇ、５８％）。HRMS (ESI) = 531.1213 (M + H)+. C26H22F3-N2O5Sに関する算出値 531.1202.  1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.04 (d, J = 1.8 Hz, 1 H), 7.99 (dd, J = 8.4 Hz, J = 1.8 Hz, 1 H), 7.34-7.29 (m, 2 H), 7.09-7.06 (m, 2 H), 6.90 (d, J= 8.4 Hz, 1 H), 6.44-6.38 (m, 3 H), 4.93 (s, 2 H), 4.18-4.15 (m, 1 H), 3.94-3.89 (m, 2 H), 3.51-3.48 (m, 1 H), 3.19-3.15 (m, 1 H), 2.03-1.93 (m, 2 H), 1.83-1.73 (m, 2 H). TLC (UV254) Rf = 0.64 (2:1 酢酸エチル/ヘキサン). HPLC tR = 13.00 min。
【０１５７】
（Ｓ）−１−（４−フルオロベンジル）−５−（２−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イルオキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物４）  ２０ｆを使用する以外は、２２の方法に従って、４を調製して、オレンジ色のゴム状物を得た（２６ｍｇ、５２％）。HRMS (ESI) = 503.1646 (M + H)+. C25H28FN2O6Sに関する算出値 503.1652. 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.06 (d, J = 1.8 Hz, 1 H), 8.01 (dd, J = 8.4 Hz, J = 1.8 Hz, 1 H), 7.34-7.31 (m, 2 H), 7.10-7.06 (m, 2 H), 6.91 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 4.87 (s, 2 H), 3.93-3.88 (m, 2 H), 3.73-3.70 (m, 1 H), 3.67 (dd, J = 9 Hz, J = 3 Hz, 1 H), 3.55-3.49 (m, 1 H), 3.47-3.41 (m, 4 H), 3.10-3.05 (m, 1 H), 1.97-1.85 (m, 4 H), 1.70-1.63 (m, 2 H), 1.59-1.54 (m, 2 H). TLC (UV254) Rf = 0.55 (4:1 酢酸エチル/ヘキサン). HPLC tR = 8.58 min。
【０１５８】
（Ｓ）−１−（４−フルオロベンジル）−５−（２−（ピリミジン−４−イルオキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物５）  ２０ｇを使用する以外は、２２の方法に従って、５を調製して、オレンジ色のゴム状物を得た（１２ｍｇ、２４％）。HRMS (ESI) = 497.1287 (M + H)+. C24H22FN4O5Sに関する算出値 497.1295. 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.77 (s, 1 H), 8.43 (d, J = 5.4 Hz, 1 H), 8.08 (d, J = 1.8 Hz, 1 H), 8.01 (dd, J = 8.4 Hz, J = 1.8 Hz, 1 H), 7.34-7.32 (m, 2 H), 7.09-7.06 (m, 2 H), 6.89 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 6.70 (d, J = 5.4 Hz, 1 H), 4.90 (s, 2 H), 4.55 (dd, J = 10.8 Hz, J = 4.2 Hz, 1 H), 4.37 (dd, J = 10.8 Hz, J = 7.8 Hz, 1 H), 4.05-4.01 (m, 1 H), 3.50-3.46 (m, 1 H), 3.22-3.19 (m, 1 H), 1.98-1.87 (m, 2 H), 1.81-1.72 (m, 2 H). TLC (UV254) Rf = 0.32 (2:1 酢酸エチル). HPLC tR = 7.45 min。
【０１５９】
（Ｓ）−１−（４−フルオロベンジル）−５−（２−（２−プロピニルオキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物２３）  ２０ｈを使用する以外は、２２の方法に従って、２３を調製して、オレンジ色のゴム状物を得た。酢酸エチル／ヘキサンからの再結晶化によって、目的生成物をオレンジ色の針状物として得た（９３ｍｇ、５８％）。HRMS (ESI) = 457.1236 (M + H)+. C23H22FN2O5Sに関する算出値 457.1233. 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.07 (d, J = 1.8 Hz, 1 H), 8.01 (dd, J = 8.4 Hz, J = 1.8 Hz, 1 H), 7.43-7.31 (m, 2 H), 7.09-7.04 (m, 2 H), 6.90 (d, J= 8.4 Hz, 1 H), 4.91 (s, 2 H), 4.13 (d, J= 2.4 Hz, 2 H), 3.81-3.77 (m, 1 H), 3.69 (dd, J = 9.6 Hz, J = 4.2 Hz, 1 H), 3.51 (dd, J = 9 Hz, J = 7.2 Hz, 1 H), 3.43-3.40 (m, 1 H), 3.16-3.12 (m, 1 H), 2.43 (t, J= 2.4 Hz, 1 H), 1.94-1.87 (m, 2 H), 1.75-1.66 (m, 2 H). TLC (UV254) Rf = 0.62 (2:1 酢酸エチル/ヘキサン). HPLC tR = 8.80 min。
【０１６０】
（Ｓ）−１−（２−プロピニル）−５−（２−フェノキシメチル−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物２４）  乾燥ＤＭＦ（１０ｍＬ）における（Ｓ）−５−（２−フェノキシメチル−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン２０ａ（０．３９ｇ、１ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（０．２１ｇ、１．５ｍｍｏｌ）、さらには臭化プロパルギル（トルエンにおける８０ｗｔ％）（０．１４ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を添加した。２時間後、ＴＬＣにより、２０ａの完全な変換が示され、この溶液を１０％ＮＨ４Ｃｌ水溶液（２０ｍＬ）に注ぎ、ＤＣＭで抽出した（３×１０ｍＬ）。次に、有機画分を合わせたものを真空中で還元し、残渣をジエチルエーテル（１０ｍＬ）中にとり、水（２×１０ｍＬ）、次にブライン（２×１０ｍＬ）、次にブライン（１×１０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。クロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）によって、生成物をオレンジ色のゴム状物として得た。酢酸エチル／ヘキサンからの再結晶化によって、生成物をオレンジ色の固体として得た（０．２８ｇ、６６％）。Mp: 115-117℃. HRMS (ESI) = 425.1185 (M + H)+. C22H21N2O5Sに関する算出値 425.1171. 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.12 (dd, J = 8.4 Hz, J = 1.8 Hz, 1 H), 8.05 (d, J = 1.8 Hz, 1 H), 7.25-7.21 (m, 2 H), 7.16 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 6.96-6.93 (m, 1 H), 6.81 (d, J= 9 Hz, 2 H), 4.56 (dd, J = 18 Hz, J = 2.4 Hz, 1 H), 4.53 (dd, J = 18 Hz, J = 2.4 Hz, 1 H), 4.19 (dd, J = 9.6 Hz, J = 3 Hz, 1 H), 4.07-4.01 (m, 1 H), 3.97 (dd, J = 9.6 Hz, J = 7.2 Hz, 1 H), 3.55-3.51 (m, 1 H), 3.33-3.28 (m, 1 H), 2.36 (t, J=2.4 Hz, 1 H), 2.09-1.99 (m, 2 H), 1.89-1.75 (m, 2 H). TLC (UV254) Rf = 0.54 (2:1 酢酸エチル/ヘキサン). HPLC tR = 9.00 min。
【０１６１】
（Ｓ）−１−（２−プロピニル）−５−（２−（２，４−ジフルオロフェノキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物２５）  ２０ｄを使用する以外は、２４の方法に従って、２５を調製して、オレンジ色の固体を得た（０．４８ｇ、７０％）。Mp: 101-103℃. HRMS (ESI) = 461.0976 (M + H)+. C22H19F2N2O5Sに関する算出値 461.0983. 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ  8.13 (dd, J = 8.4 Hz, J = 1.8 Hz, 1 H), 8.07 (d, J = 1.8 Hz, 1 H), 7.24 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 6.96-6.92 (m, 1 H), 6.85-6.78 (m, 2 H), 4.59 (dd, J = 18 Hz, J = 2.4 Hz, 1 H), 4.57 (dd, J = 18 Hz, J = 2.4 Hz, 1 H), 4.24-4.20 (m, 1 H), 4.03-3.98 (m, 2 H), 3.55-3.52 (m, 1 H), 3.26-3.21 (m, 1 H), 2.37 (t, J= 2.4 Hz, 1 H), 2.12-2.01 (m, 2 H), 1.88-1.76 (m, 2 H). TLC (UV254) Rf = 0.63 (2:1 酢酸エチル/ヘキサン). HPLC tR = 9.60 min。
【０１６２】
（Ｓ）−１−（（１−（２−フルオロエチル）−１Ｈ−［１，２，３］−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（２−フェノキシメチル−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物１０）  乾燥ＤＭＦ（３ｍＬ）における２４（１３８ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、水（０．２ｍＬ）における硫酸銅（３８ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、次に水（０．２ｍＬ）におけるアルコルビン酸（５３ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）、次に乾燥ＤＭＦ（１．５ｍＬ）における２−フルオロエチルアジド（３３ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をアルゴン下で攪拌し続けた。２時間後、ＴＬＣによって、反応が完了したことを示され、混合物を１０％ＮＨ４Ｃｌ水溶液（１２ｍＬ）に注ぎ、ＤＣＭで抽出し（３×１０ｍＬ）、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。クロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）によって、オレンジ色の固体を得た（２６ｍｇ、５１％）。Mp: 165-167℃. HRMS (ESI) = 514.1557 (M + H)+. C24H25FN5O5Sに関する算出値 514.1560.  1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.07 (dd, J = 8.4 Hz, J = 1.8 Hz, 1 H), 8.01 (d, J = 1.8 Hz, 1 H), 7.76 (s, 1 H), 7.47 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.23-7.19 (m, 2 H), 6.92 (t, J = 7.8 Hz, 1 H), 6.82 (d, J = 7.8 Hz, 2 H), 5.03 (d, J = 15.6 Hz, 1 H), 5.02 (d, J = 15.6 Hz, 1 H), 4.79 (dt, J = 46.2 Hz, J = 4.8 Hz, 2 H), 4.66 (dt, J = 27 Hz, J = 4.8 Hz, 2 H), 4.17 (dd, J = 9.6 Hz, J = 3.6 Hz, 1 H), 4.00-3.97 (m, 1 H), 3.93 (dd, J = 9 Hz, J = 7.2 Hz, 1 H), 3.53-3.49 (m, 1 H), 3.27-3.24 (m, 1 H), 2.08-1.97 (m, 2 H), 1.86-1.75 (m, 2 H). TLC (UV254) Rf = 0.56 (酢酸エチル). HPLC tR = 7.93 min。
【０１６３】
（Ｓ）−１−（（１−（２−フルオロエチル）−１Ｈ−［１，２，３］−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（２（２，４−ジフルオロフェノキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物１１）  ２５を使用する以外は、１０の方法に従って、１１を調製して、オレンジ色のゴム状物を得た。酢酸エチル／ヘキサンからの再結晶化によって、オレンジ色の固体を得た（９４ｍｇ，５７％）。Mp: 130-131℃. HRMS (ESI) = 550.1381 (M + H)+. C24H23F3N5O5Sに関する算出値 550.1372. 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.08 (dd, J = 8.4 Hz, J = 1.8 Hz, 1 H), 8.02 (d, J = 1.8 Hz, 1 H), 7.77 (s, 1 H), 7.52 (d, J= 8.4 Hz, 1 H), 6.95-6.91 (m, 1 H), 6.82-6.75 (m, 2 H), 5.05 (s, 2 H), 4.79 (dt, J = 46.2 Hz, J = 4.8 Hz, 2 H), 4.67 (dt, J = 26.4 Hz, J = 4.8 Hz, 2 H), 4.20 (dd, J = 9.6 Hz, J = 3 Hz, 1 H), 4.01-3.94 (m, 2 H), 3.53-3.50 (m, 1 H), 3.22-3.17 (m, 1 H), 2.10-1.98 (m, 2 H), 1.85-1.74 (m, 2 H). TLC (UV254) Rf = 0.47 (酢酸エチル). HPLC tR = 8.45 min。
【０１６４】
（Ｓ）−１−（（１−（フルオロメチル）−１Ｈ−［１，２，３］−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（２（２，４−ジフルオロフェノキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物２９）を、フルオロメチルアジドを２−フルオロエチルアジドの代わりに使用する以外は、化合物１１の方法に従って調製した。
【０１６５】
（Ｓ）−１−（（１−（３−フルオロプロピル）−１Ｈ−［１，２，３］−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（２（２，４−ジフルオロフェノキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物３０）を、３−フルオロプロピルアジドを２−フルオロエチルアジドの代わりに使用する以外は、化合物１１の方法に従って調製した。
【０１６６】
（Ｓ）−１−（（１−（４−フルオロブチル）−１Ｈ−［１，２，３］−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（２（２，４−ジフルオロフェノキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物３１）を、４−フルオロブチルアジドを２−フルオロエチルアジドの代わりに使用する以外は、化合物１１の方法に従って調製した。
【０１６７】
（Ｓ）−１−（４−フルオロベンジル）−５−（２−（１−（（２−フルオロエチル）−１Ｈ−［１，２，３］−トリアゾール−４−イル）メトキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物１２）  ２３を使用する以外は、１０の方法に従って、１２を調製して、オレンジ色のゴム状物を得た（２６ｍｇ，４８％）。HRMS (ESI) = 546.1632 (M + H)+. C25H26F2N5O5Sに関する算出値 546.1623.  1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.03 (d, J =1.8 Hz, 1 H), 8.00 (dd, J = 8.4 Hz, J = 1.8 Hz, 1 H), 7.67 (s, 1 H), 7.35-7.33 (m, 2 H), 7.08-7.05 (m, 2 H), 6.90 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 4.95 (s, 2 H), 4.81 (dt, J= 46.8 Hz, J = 4.8 Hz, 2 H), 4.67 (dt. J = 26.4 Hz, J = 4.8 Hz, 2 H), 4.62 (d, J = 12 Hz, 1 H), 4.60 (d, J = 12 Hz, 1 H), 3.81-3.78 (m, 1 H), 3.65 (dd, J = 9.6 Hz, J = 4.2 Hz, 1 H), 3.51 (dd, J = 9.6 Hz, J = 7.2 Hz, 1 H), 3.40-3.37 (m, 1 H), 3.19-3.15 (m, 1 H), 1.92-1.87 (m, 2 H), 1.72-1.66 (m, 2 H). TLC (UV254) Rf = 0.35 (酢酸エチル). HPLC tR = 6.58 min。
【０１６８】
（Ｓ）−１−（４−フルオロベンジル）−５−（２−（１−（（フルオロメチル）−１Ｈ−［１，２，３］−トリアゾール−４−イル）メトキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物３２）を、フルオロメチルアジドを２−フルオロエチルアジドの代わりに使用する以外は、化合物１２の方法に従って調製する。
【０１６９】
（Ｓ）−１−（４−フルオロベンジル）−５−（２−（（１−（３−フルオロプロピル）−１Ｈ−［１，２，３］−トリアゾール−４−イル）メトキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物３３）を、３−フルオロプロピルアジドを２−フルオロエチルアジドの代わりに使用する以外は、化合物１２の方法に従って調製する。
【０１７０】
（Ｓ）−１−（４−フルオロベンジル）−５−（２−（（１−（４−フルオロブチル）−１Ｈ−［１，２，３］−トリアゾール−４−イル）メトキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物３４）を、４−フルオロブチルアジドを２−フルオロエチルアジドの代わりに使用する以外は、化合物１２の方法に従って調製する。
【０１７１】
（Ｓ）−１−［４−（フルオロメチル）−１Ｈ−［１，２，３］−トリアゾール−１−イル］メチル−５−（２−（２，４−ジフルオロフェノキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン）（化合物６）を、（Ｓ）−１−（アジドメチル）−５−（２−（２，４−ジフルオロフェノキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン］（化合物３７）を３−フルオロプロプ−１−イン（化合物２８）と反応させることによって、図２（ｉｉ）に示されるように調製する。試薬は下記のとおりである：（ａ）ＣｕＳＯ４、Ｌ−アスコルビン酸、ＤＭＦ。［１８Ｆ］６の調製では、３−［１８Ｆ］フルオロプロプ−１−インを３−フルオロプロプ−１−インの代わりに使用する。
【０１７２】
（Ｓ）−１−［４−（２−フルオロエチル）−１Ｈ−［１，２，３］−トリアゾール−１−イル］メチル−５−（２−（２，４−ジフルオロフェノキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン）（化合物７）を、４−フルオロブチ−１−インを（３−フルオロプロプ−１−イン）の代わりに使用する以外は、化合物６の方法に従って調製する。［１８Ｆ］７の調製では、４−［１８Ｆ］フルオロブチ−１−インを３−フルオロプロプ−１−インの代わりに使用する。
【０１７３】
（Ｓ）−１−［４−（３−フルオロプロピル）−１Ｈ−［１，２，３］−トリアゾール−１−イル］メチル−５−（２−（２，４−ジフルオロフェノキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン）（化合物８）を、５−フルオロペンチ−１−インを（３−フルオロプロプ−１−イン）の代わりに使用する以外は、化合物６の方法に従って調製する。［１８Ｆ］８の調製では、５−［１８Ｆ］フルオロペンチ−１−インを３−フルオロプロプ−１−インの代わりに使用する。
【０１７４】
（Ｓ）−１−［４−（４−フルオロブチル）−１Ｈ−［１，２，３］−トリアゾール−１−イル］メチル−５−（２−（２，４−ジフルオロフェノキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン）（化合物９）を、６−フルオロヘキシ−１−インを（３−フルオロプロプ−１−イン）の代わりに使用する以外は、化合物６の方法に従って調製する。［１８Ｆ］９の調製では、６−［１８Ｆ］フルオロヘキシ−１−インを３−フルオロプロプ−１−インの代わりに使用する。
【０１７５】
化合物３５は、Ｒが前記規定と同様である化合物の一群を有する。化合物３６は、Ｒ’が前記規定と同様である化合物の一群を有する。これらの化合物は、図１２（上行＝化合物３５、下行＝化合物３６）で概略的に表わされる方法を用いて製造できる。このストラテジーは、ｉｎ  ｓｉｔｕのまたは別の反応としての、［１１Ｃ］ヨウ化メチルとアジド源との反応、次に、適当なアルキンを用いた付加環化を含む。この方法は、近年Schirrmacher, R. et al 25で報告される、より既知のクリックケミストリー(Click Chemistry)ストラテジーの修飾である。
【０１７６】
実施例２−ターゲット化合物の親油性およびカスパーゼに対する親和性の測定
カスパーゼに対するターゲット化合物の親和性  様々な活性化カスパーゼ１、３、６、７、及び８に関する、新規なフッ素化イサチン１〜５及び１０〜１２、ならびに既知のイサチン誘導体及び中間対化合物２２及び２３の親和性を、Kopka and co-workers.13に記載されるのと同様の蛍光インビトロカスパーゼ阻害アッセイによって測定した。組換えヒトカスパーゼの阻害は、蛍光性生成物、７−アミノ−４−メチルクマリン（７−ＡＭＣ）の蓄積を測定することによって評価した。
【０１７７】
組換えヒトカスパーゼ−１、−３、−６、−７、及び−８ならびにこれらのペプチドに特異的な基質は、Biomol International, UKから購入した。非放射性イサチンによる組換えカスパーゼの阻害は、蛍光性生成物、７−アミノ−４−メチルクマリン（７−ＡＭＣ）の蓄積を測定する蛍光アッセイを用いて評価した。全てのアッセイは、１ウェルあたり２００μｌの容積で９６ウェルプレートで行った。アッセイは、各カスパーゼについて以下に記載されるような適当な反応緩衝液中で３７℃で行った。カスパーゼ１では、緩衝液は、０．１％  ＣＨＡＰＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．４）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％  スクロース、及び１０μＭのペプチド基質  Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＡＭＣから構成された。カスパーゼ３について：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．４）、１０％  スクロース、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  ＣＨＡＰＳ、２ｍ，ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び１０μＭ  Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ。カスパーゼ６について：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．４）、１０％  スクロース、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  ＣＨＡＰＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び１０μＭ  Ａｃ−ＶＥＩＤ−ＡＭＣ。カスパーゼ７について：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．４）、１０％  スクロース、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  ＣＨＡＰＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０μＭ  Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ。カスパーゼ８について：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．４）、１０％  スクロース、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  ＣＨＡＰＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１０μＭ  Ａｃ−ＩＥＴＤ−ＡＭＣ。これらの緩衝液は、５００、５０、５μＭ；５００、５０、５ｎＭ；５００、５０、５ｐＭの最終濃度でＤＭＳＯ中に非放射性イサチンを含んだ；全てのウェルにおけるＤＭＳＯの最終濃度は全容積の５％であった。組換えカスパーゼを、１アッセイ当たり０．５単位で使用した（〜５００ｐｍｏｌ  変換基質／時間）。ペプチド基質以外の全ての試薬は、１０分間予めインキュベートした。次に、ペプチド基質（最終濃度  １０μＭ）を添加して、プレートをさら３０分間インキュベートした；３０分は、１０、３０、６０または９０分後に反応が経過した初期直線性研究後に選択された。３０分の時点が選択された。各コントロールウェルは、酵素以外の全ての反応成分を含んだ。７−ＡＭＣの生産量を、それぞれ、３５５ｎｍ及び４６０ｎｍの励起波長及び放出波長で蛍光マイクロプレートリーダー(Victor2; Perkin-Elmer Life sciences)で測定した。カスパーゼ活性を５０％阻害するイサチンの濃度（ＥＣ５０）を、GraphPad Prism(Version 4.0 for Windows, GraphPad Software, San Diego California USA)を用いて非直線性回帰分析によって評価した。全てのイサチンは２連で分析した；アッセイは１回繰り返した。既知の化合物１３〜１６を参考化合物として含ませた。結果を下記表１に要約する。
【０１７８】
データは、５ｐＭ〜５００μＭの範囲の９種の濃度で、それぞれ重複した、２回の操作の平均である；各酵素を５０％阻害するのに必要な薬剤濃度（ＥＣ５０）を、阻害プロフィールの非直線性回帰分析から得た。
【０１７９】
結果  本アッセイでは、既知のイサチン１３の親和性は、それぞれ、カスパーゼ３及び７に対して５９．９及び２５．３ｎＭであった。フェニルエーテルでのフッ素置換は良好に許容され、新規なイサチン１では、カスパーゼ３に対する親和性は、既知の非フッ素化フェニルエーテル１４に比べて２〜３倍増加した。２フッ素化イサチン２及び３はより強力であり、それぞれ、カスパーゼ３に対して、１２．４及び１０．４ｎＭであった。テトラヒドロピラン４では同様の親和性が見出された。既知のベンジル誘導体１５に比して４の効力の５倍の増加は、環が十分飽和であることを考えれば、驚くべきことである。ピリミジニル誘導体５におけるようなフェニルエーテルのピリミジニル基による置換により、さらに効力が増加し、カスパーゼ３及び７に対する親和性が、それぞれ、５．５及び２．３ｎＭであった。分子のいずれかの側に２−フルオロエチル−１，２，３−トリアゾールを導入することによって、効力が急増し、トリアゾール１０及び１２に関して測定されたカスパーゼ３の親和性が、それぞれ、１６．７及び１２．６ｎＭであった。フルオロエチルトリアゾール１２の効力は１〜３と同様であり、このことは基がかなりより小さな大きさでありかつ極性性がより高いことを考えると驚くべきことである。Lee8は、親水性ポケットとしてイサチン窒素周辺の結合ドメインを示し、ほとんどの基がこの位置にベンジル部分を有する。したがって、トリアゾール１０が既知のベンジル誘導体１５より４倍強力であることは非常に予想し得ないことであった。試験した化合物のうち、トリアゾール１１は、圧倒的に最も強力であり、カスパーゼ３及び７に対して、それぞれ、０．５及び２．５ｎＭの親和性を有していた。試験したすべての化合物は、カスパーゼ１、６及び８に対して低い基質であった（ＥＣ５０＞５０００ｎＭ）。
【０１８０】
Ｌｏｇ  Ｐ計算  親油性をACD/Chemsketch labs softwareから算出した。
【０１８１】
結果  結果を下記表１および１ａに示す。
【０１８２】
【表２−１】
0005667056.tif 000011
【０１８３】
【表２−２】
0005667056.tif 000012
【０１８４】
実施例３−［１８Ｆ］１１の合成
好ましくは、化合物［１８Ｆ］１１は、（Ｓ）−１−（２−プロピニル）−５−（２−（２，４−ジフルオロフェノキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物２５）を［１８Ｆ］フルオロエチルアジド（化合物２７）15, 16でクリック−ラベリング(click-labelling)することによって、製造される。トリアゾール（Ｓ）−１−（（１−（２−フルオロエチル）−１Ｈ−［１，２，３］−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（２（２，４−ジフルオロフェノキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物１１）は、図２（ｉ）及び図１９に示されるように、２−［１８Ｆ］フルオロエチルアジド（化合物２７）をアルキン前駆体である（Ｓ）−１−（２−プロピニル）−５−（２−（２，４−ジフルオロフェノキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン（化合物２５）で銅触媒による付加環化を行うことによって標識される。同様の方法を用いて、非放射性標識の化合物１１を製造でき、この際、フルオロエチルアジドを２−［１８Ｆ］フルオロエチルアジドの代わりに使用する。
【０１８５】
窒素雰囲気下で、アスコルビン酸ナトリウム（５０μｌ、８．７ｍｇ、４３．２μｍｏｌ）の緩衝液（リン酸ナトリム緩衝液、ｐＨ  ６．０、２５０ｍＭ）を、硫酸銅（ＩＩ）の水溶液（５０μｌ、１．７ｍｇ  ５水和物、７．０μｍｏｌ）を含むホイートンバイアル瓶(Wheaton vial)（１ｍＬ）に添加した。１分後、ジメチルホルムアミド（２５μｌ）におけるアルキン２５（３．０ｍｇ、６．５μｍｏｌ）の溶液、さらにアセトニトリル（１００μｌ）における蒸留［１８Ｆ］ＦＥＡ（１８５−７４０  ＭＢｑ）を添加した。この混合物を室温で３０分間放置して、水（１５μｌ）を添加した後、予備ラジオ−ＨＰＬＣにかけた。単離したＨＰＬＣ物溶液を水（５ｍＬ）で希釈し、予めエタノール（５ｍＬ）及び水（１０ｍＬ）で調整された(conditioned)ＳｅｐＰａｋ  Ｃ１８−ｌｉｇｈｔカートリッジ(Waters)にのせた。次に、このカートリッジを水（５ｍＬ）でフラッシュし、１８Ｆ−９を小画分（０．１ｍＬ）づつエタノールで溶出した。この生成物画分を、エタノール含量が１０〜１５％（ｖ／ｖ）になるようにＰＢＳで希釈した。
【０１８６】
結果  ２７をアルキン前駆体２５と共役させようとする初期の試みにより、放射性生成物の複合混合物が形成した。放射化学的収率への触媒システム、温度及びｐＨの影響をさらに調べたところ、最も高い収率が室温で得られたものの、［１８Ｆ］９は熱安定性に劣ることが分かった。リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ６．０、２５０ｍＭ）を反応混合物に添加することによって、放射化学的収率が劇的に向上したものの、調べた２つの触媒システム（銅粉末または硫酸銅／アスコルビン酸塩）では若干の相違が観察されたのみであった。最適条件は、アルキン前駆体２５に対して若干過剰な硫酸銅の存在下で室温で３０分の反応時間であることが分かった。これにより、６５±６％（ｎ＝２６、２７から減衰補正）の単離放射化学的収率で、ＨＰＬＣによる精製後の放射化学的純度が＞９９％のトリアゾール［１８Ｆ］１１が得られた。生成混合物に関する具体的なＨＰＬＣクロマトグラムを図３に示す。本方法は少量の放射能で手動で行ったので、合成終了時に低い比放射能（１．２ＧＢｑ／μｍｏｌ）しか達成しなかった。［１８Ｆ］１１の同一性を、非放射性参照化合物と一緒に溶出することによって確認した。精製［１８Ｆ］１１を、９１±６％（ｎ＝２６、減衰補正）の効率で固相抽出することによって配合した(formulate)。［１８Ｆ］１１の配合(formulation)を含む放射合成(radiosynthesis)は全体で３時間かかった。
【０１８７】
実施例４−［１８Ｆ］１１の親油性
Ｌｏｇ  Ｐ測定  Barthel et al 18の方法を用いてオクタノール−水分配係数を測定することによって、親油性を評価した。簡単にいうと、［１８Ｆ］１１（２５μＬエタノールにおける〜１８０μＣｉ）を水を用いて最終容積が１００μＬになるように希釈して、ストック溶液を得た。ストック溶液のアリコート（１０μＬ）を水（４９０μＬ）及びオクタン−１−オール(Aldrich無水グレード)（５００μＬ）に加えた。次に、この溶液を１０分間激しく振盪した後、遠心した（１３２０１ｇ、２０℃、３０分）。遠心後、水層及びオクタノール層の部分（２００μＬ）を注意深く除去し、Cobra II Auto-Gamma counter (Packard Instruments, Meriden, CT, USA)に置いて分析し、比較した。放射能を含む水で放射能を含むオクタノールを割ることによって、オクタノール−水分配係数を得た。Ｌｏｇ  Ｐを測定したところ、上記表１の脚注ｃに示されるように、１．６１であった。
【０１８８】
実施例５−［１８Ｆ］１１および［１２５Ｉ］１４の組織分布および代謝安定性
血漿及び肝臓における新規な化合物［１８Ｆ］１１及び既知の化合物［１２５Ｉ］１４の安定性を、マウスで投与した後経時的に測定した。［１８Ｆ］１１を腫瘍を有するマウスの静脈内に注射し、その組織分布を注射してから２、１５及び６０分後に所定の組織中で測定した。［１２５Ｉ］１４を腫瘍を持たないマウスの静脈内に注射し、その組織分布を注射してから２〜６０分の所定の時点で測定した。さらに、放射性トレーサーのインビボでの代謝安定性を血漿及び肝臓サンプルから、および［１８Ｆ］１１では、尿サンプル中で測定した。
【０１８９】
インビトロでのマウス肝臓Ｓ９代謝研究  肝臓Ｓ９代謝研究をAboagye et al19に記載されるのと同様にして行った。マウス肝臓を迅速に切除し、実験を通して４℃に保持した。組織を秤量し、Ultra-Thurraxホモジナイザー(IKA, Staufen, Germany)を用いて等容積の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−１５０ｍＭ  ＫＣｌ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７．４）中で均質化した。Ｓ９画分を得るために、ホモジネートを３０分間遠心（１０，０００×ｇ）して、核、ミトコンドリア及び細胞残屑を除去した。Ｓ９画分のタンパク質濃度を市販のＢＣＡタンパク質アッセイキット(Perbio Science, Cheshire, UK)によって測定した。Ｓ９画分を最長６週間−８０℃で貯蔵した。所定の非標識イサチン１４、１５、１６（１０ｍＭ、１０μＬ）を、１ｍＬの全容積で０．１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７．４）中で３７℃で６０分間、Ｓ９画分（３３．２６ｍｇ／ｍｌ、２０μＬ）及び０．５ｍＭ  ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元形態）と共にインキュベートした。コントロールインキュベーションサンプルは、イサチンを含まなかった。氷冷したアセトニトリル（２ｍＬ）を添加することによって、反応を止めた；次に、サンプルを即座にドライアイスに置いた後、抽出及びＨＰＬＣ分析を行った（下記）。
【０１９０】
インビボでの生体内分布および代謝研究  放射線誘発線維肉腫（ＲＩＦ−１）腫瘍細胞20を、５％  ＣＯ２の加湿インキュベーターで３７℃で、１０％ウシ胎児血清(BioWhittaker Europe Ltd, Verviers, Belgium)、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン及び０．２５μｇ／ｍＬ  ファンギゾン(Gibco, UK)を加えたＲＰＭＩ  １６４０培地(Invitrogen Ltd, Paisley, UK)中で維持した。すべての動物の作業は、英国の"Guidance on the Operation of Animals (Scientific Procedures) Act 1986" (HMSO, London, United Kingdom, 1990)に従って、また、実験新生組織形成における動物の愛護に関する政府の規則及びガイドライン(government regulations and guidelines on the welfare of animals in experimental neoplasia)21に完全にのっとって、認可を受けた研究者によって行われた。オスのＣ３Ｈ／ｈｅｊマウス(Harlan, Bicester, Oxfordshire, UK)の背中に５×１０５個の細胞を皮下注射することによって腫瘍を確立した。腫瘍の成長を電子キャリパー(electronic callipers)を用いて２日毎にモニターし、腫瘍の容積を式：（π／６）×Ｌ×Ｗ×Ｄ（Ｌ＝長さ、Ｗ＝幅およびＤ＝深さ）を用いて評価した。腫瘍が約１００〜１５０ｍｍ３に到達したら、［１８Ｆ］１１の生体内分布の研究のために動物を選択した；［１２５Ｉ］１４の生体内分布は腫瘍を持たないマウスで行った。
【０１９１】
リン酸緩衝液に溶解した放射能（〜０．３７ＭＢｑの［１２５Ｉ］１４または３．７ＭＢｑの［１８Ｆ］１１）  ０．０８〜０．１３ｍＬを、側静脈を介して、マウスの静脈内に注射した。注射してから所定の時点（２〜６０分）で、通常の麻酔下（イソフルオラン(isofluorane)吸入）で心穿刺による放血によってマウスを剖検した。ヘパリン化血のアリコートを直ぐに遠心（２０００ｇで５分）して、血漿を得た。組織に含まれる放射能をCobra II Auto-Gamma counter (Packard Instruments, Meriden, CT, USA)でのガンマ−カウンティングによって測定し、注射量／ｇ  組織の割合（％）（％ＩＤ／ｇ）として表わした。３匹のマウスのうちの最小値を各時点で使用した。すべての動物は未処置(treatment-naive)であった。
【０１９２】
インビボでの代謝研究もまたＣ３Ｈ／ｈｅｊマウスで行った。腫瘍を持たないマウスの静脈内に０．３７ＭＢｑの［１２５Ｉ］１４または７．４ＭＢｑの［１８Ｆ］１１を注射し、血漿を上記と同様にして得た。血漿、肝臓及び尿サンプルを液体窒素中でスナップフリーズし(snap-frozen)、分析するまで、ドライアイス上の予め秤量された(pre-weighed)シンチレーション計測用チューブ中に保持した。
【０１９３】
ＨＰＬＣ分析  抽出直前に、サンプルを解凍し、氷上に置いた。抽出では、氷冷したアセトニトリル（１．５ｍＬ）を血漿（０．２ｍＬ）に添加した；アセトニトリルを含むＳ９インキュベーションサンプル（３ｍＬ）もまた分析した。各混合物を遠心（１５４９３×ｇ、４℃、３分）し、得られた上清をロータリーエバポレーターを用いて４０℃で真空中で蒸発乾固した。肝臓サンプルは、遠心前にIKA Ultra-Turrax T-25ホモゲナイザーを用いて氷冷アセトニトリル（１．５ｍＬ）と共に均質化した。次に、残渣をＨＰＬＣ移動相（１．２ｍＬ）に再懸濁し、Minisart親水性シリンジフィルター(Minisart hydrophilic syringe filter)（０．２μｍ）(Sartorius, Goettingen, Germany)で濾過した。尿サンプルは、ＨＰＬＣ移動相で希釈し、上記と同様にして濾過した。次に、サンプル（１ｍＬ）を、γ−ＲＡＭ  モデル３  ガンマ−検出器(γ-RAM Model 3 gamma-detector)及びLauraソフトウェア(IN/US Systems inc., Florida, USA)を備えたAgilent 1100シリーズＨＰＬＣシステム(Agilent Technologies, Stockport, UK)によるラジオ−ＨＰＬＣによって分析した。
【０１９４】
固定相は、Waters μBondapak C18逆相カラム（３００×７．８ｍｍ）で構成された。［１２５Ｉ］１４の分析では、血漿及び肝臓サンプルを上記と同様にして処理し、２ｍＬ／分の流速で定組成で(in isocratic mode)流す水（０．１％  ＴＦＡ）／プロパン−１−オール（０．１％  ＴＦＡ）（３５：６５）の移動相を用いて分析した。インビトロでの代謝後の非標識の１４、１５及び１６の分析では、水（０．１％  ＴＦＡ）／プロパン−１−オール（０．１％  ＴＦＡ）から構成される移動相を、１１分で２→８０％有機相、３分で８０(R)５％有機相後、６分で５％有機相の勾配を３ｍＬ／分の流速で供給しながら、用いることによって、サンプルを分析した。［１８Ｆ］９の分析では、０．１Ｍ  ギ酸アンモニウム／１．８：１  メタノール：アセトニトリルから構成される移動相を、１分で５０％有機相、１４分で５０(R)９０％有機相、３分で９０％有機相、２分で９０(R)５０％有機相、４分で５０％有機相の勾配を３ｍＬ／分の流速で供給しながら、用いることによって、血漿、肝臓及び尿サンプルを分析した。さらに、ＨＰＬＣ注入液中に残る［１８Ｆ］９−由来の放射能に対する抽出後の血漿及び肝臓ペレットに関連する［１８Ｆ］９−由来の放射能の割合を評価するために、ＨＰＬＣ注入液の全容積を記録し、アリコート（０．１ｍＬ）を計測用に除去した。次に、０．１ｍＬアリコート及びペレット中の放射能をガンマカウンティング(gamma counting)(Packard Instruments)によって分析した。
【０１９５】
結果  図４から、［１８Ｆ］１１は迅速に組織に分布し、また迅速に排出されたことが分かる。［１８Ｆ］１１由来の放射能の高い極在化が腎臓、尿及び肝臓で見られたことから、排出の腎臓及び肝臓経路双方の重要性が示唆される。しかしながら、これらの組織でさえ、放射能の迅速な排出が見られた。重要なことに、イメージングの観点から、未処置の腫瘍、心臓及び脳での［１８Ｆ］１１の取り込みは低かった；これにより、これらの組織でのカスパーゼ活性化に関連する結合性の増加の測定が容易になるはずである。骨への取り込みが低かったことから、放射性トレーサーの脱フッ素化は存在せず、ゆえにフルオロエチルアジド部分が安定であることが示唆される。ラジオ−ＨＰＬＣ分析から、［１８Ｆ］１１は血漿及び肝臓で単一の極性代謝ピークを作成する［１２５Ｉ］１４（図５）より代謝分解に対して比較的より安定であることが示された。親化合物は６０分で血漿中に依然として存在し、主要なピークであった。これに対して、代謝産物は、すべての研究した時点で肝臓サンプルでは主要なピークであった。尿の放射能は主として代謝産物から構成された。所定の時点での血漿及び肝臓での親放射性トレーサーの割合を、見かけの抽出効率と共に、表２に要約する。すばやく減少した後は、インビボでの代謝速度は１５〜６０分の間は横ばいであるように見えた。しかしながら、血漿及び肝臓からの抽出効率はおそらく非特異的結合により経時的に減少した。また、血漿抽出後の残渣ペレットでの放射能は時間に依存して増加したことから、血漿タンパク質への結合が増加したことが示唆される。
【０１９６】
【表３】
0005667056.tif 000013
【０１９７】
図７から、［１２５Ｉ］１４は主要な器官に迅速に分布し、また迅速に排出されたことが分かる。［１２５Ｉ］１４は１０分以内に血漿から完全に排出され、この時点で肝臓で検出される放射能の＜１５％（ｎ＝３）を提示した。注射してから３０分以内に、親［１２５Ｉ］１４は肝臓で十分代謝され、この際、放射能の大部分を構成する１つの極性のある代謝産物が検出された。これらの知見と一致して、我々は、調査したすべての組織で迅速なクリアランスが観察され、１０分以降、注射された放射能の大部分は尿中に排出された。
【０１９８】
図８に示されるように、既知の非標識のイサチン１４及び１５の代謝プロフィールは同様であり、ほとんど完全な分解が６０分インキュベーション後に観察された。
【０１９９】
実施例６−４種の癌細胞系での［１８Ｆ］１１の「取り込み
細胞系および腫瘍モデル  Wolf C.R. et al.22 and Langdon S.P. et al23に記載されるのと同様にして、ヒト卵巣癌細胞系ＰＥＯ１／４を確立し、特性を明らかにした。簡単にいうと、ＰＥＯ１／４細胞は、再発粘液卵巣腺癌の患者のシスプラチン化学療法に臨床的耐性が発現する前（ＰＥＯ１）及び後（ＰＥＯ４）の、患者の悪性腹水由来であった。当初は、放射線誘発線維肉腫（ＲＩＦ−１）腫瘍細胞系の特性をTwentyman P.R. et al.20によって明らかにした。ＬＮＭ３５腫瘍細胞は、Kozaki K. et al.24に記載されるように、ヒト肺大細胞癌ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞系のリンパ行性転移性の高いサブラインである。すべての細胞系を、定常的に、５％  ＣＯ２の加湿インキュベーターで３７℃で、１０％ウシ胎児血清(BioWhittaker Europe Ltd, Verviers, Belgium)、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン及び０．２５μｇ／ｍＬ  ファンギゾン(Gibco, UK)を加えたＲＰＭＩ  １６４０培地(Invitrogen Ltd, Paisley, UK)中で維持した。
【０２００】
６〜８週齢のメスのｎｕ／ｎｕ−ＢＡＬＢ／ｃマウスまたはオスのＣ３Ｈ／ｈｅｊマウス(Harlan, Bicester, Oxfordshire, UK)の背中に、ＰＥＯ１／４（１０×１０６細胞、with v/v matrigel, BD Biosciences, Oxford, UK）、ＲＩＦ−１（５×１０５細胞）及びＬＮＭ３５（１×１０６細胞）を皮下注射することによって、インビボでの腫瘍モデルを確立した。腫瘍の成長を電子キャリパー(electronic callipers)を用いて２日毎にモニターし、腫瘍の容積を式：（π／６）×Ｌ×Ｗ×Ｄ（Ｌ＝長さ、Ｗ＝幅およびＤ＝深さ）を用いて評価した。すべての動物の作業は、英国の"Guidance on the Operation of Animals (Scientific Procedures) Act 1986" (HMSO, London, United Kingdom, 1990)に従って、また、実験新生組織形成における動物の愛護に関する政府の規則及びガイドライン(government regulations and guidelines on the welfare of animals in experimental neoplasia)に完全にのっとって、認可を受けた研究者によって行われた。
【０２０１】
インビトロでの［１８Ｆ］１１取り込みおよびカスパーゼ３活性化アッセイ  細胞を、実験の２または３日前に１２ウェルプレートに３連で播種し、所定の濃度および時間に白金由来の抗腫瘍薬であるシスプラチン、５−ＦＵ、タンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミド（ＣＨＸ）またはトポイソメラーゼ阻害剤エトポシド（ＶＰ−１６）(Sigma, UK)または対応するベヒクルで処理した。実験の日に、約１０μＣｉ／ウェルの［１８Ｆ］１１を添加して、３７℃で６０分間細胞中に蓄積させた。細胞を集め、洗浄し、４００μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。２６０μｌの各サンプルを計測用チューブに移した直後、フッ素−１８の放射能を、Packard Cobra II gamma counter (Perkin Elmer, UK)を用いて測定した。製造者(caspase-Glo 3/7 assay, Promega, UK)の指示に従って、４０μｌの各サンプルを用いて、カスパーゼ３活性化比色分析アッセイを行った。簡単にいうと、細胞を乳白色の９６ウェルプレートに移し、５０μｌのカスパーゼ−Ｇｌｏと共に３０分〜３時間インキュベートし、カスパーゼ３の酵素活性をMultiskan Luminometer (Thermo Electron, UK)を用いて測定した。全てのサンプルで、ＢＣＡプロテインアッセイ(BCA Protein assay)(Pierce, UK)を行い、データを正規化して、ＣＣＰＭＡまたはＲＬＵ(Relative Light Unit)／ｍｇ  タンパク質として表わす。
【０２０２】
インビボでの［１８Ｆ］１１生体内分布およびＰＥＴ画像化  生体内分布の研究のために、腫瘍を有するマウスを１０ｍｇ／ｋｇのシスプラチンまたはベヒクルで２４時間処置し、イソフルオラン(isofluorane)／Ｏ２／Ｎ２Ｏで麻酔し、所定の時間、約１００μＣｉの［１８Ｆ］１１を側尾静脈(lateral tail vein)に静脈内注射した。様々な組織を取り除き、秤量し、即座にフッ素−１８放射能計測するために計測用チューブに置いた。
【０２０３】
シスプラチン（１０ｍｇ／ｋｇで２４時間）またはベヒクルで処置した腫瘍を有するマウスを、小動物専用のＰＥＴスキャナー(dedicated small animal PET scanner)(quad-HIDAC; Oxford Positron Systems, Weston-on-the-Green, United Kingdom)でスキャンした。麻酔をかけた動物をサーモスタット制御のベッドに置き、スキャナー内に腹臥位にした。マウスの直腸温度が約３７℃になるように、ベッドを調節した。［１８Ｆ］１１（約１００μＣｉ）のボーラス注射液(bolus injection)を、尾静脈カニューレを介して静脈内（ｉ．ｖ．）投与し、スキャンを開始した。動的放射スキャン(dynamic emission scan)を６０分にわたってリスト形式(list-mode format)で得た。次に、画像再構築のために、得られたデータを、０．５−ｍｍ  副鼻腔撮影図(sinogram bin)および１９のタイムフレーム（０．５×０．５×０．５ｍｍ  ボクセル；４×１５、４×６０、および１１×３００秒）に分け、これを２次元のハミングフィルター(two-dimensional Hamming filter)（カットオフ  ０．６）を用いたフィルター逆投影によって行った。このようにして得られた画像データ−セットをSUN workstation (Ultra 10; SUN Microsystems, Santa Clara, CA)に移し、Analyze ソフトウェア(version 6.0; Biomedical Imaging Resource, Mayo Clinic, Rochester, MN)を用いて可視化した。注射してから０〜１分および注射してから３０〜６０分から構成される動的データの累積画像を、放射性トレーサーの取り込みの可視化のためにおよび関心のある領域(regions of interest)（ＲＯＩ）を規定するために使用した。各１９時点で各ＲＯＩについて、カウント密度を平均して、ＲＯＩに関する時間に対する放射能曲線（ＴＡＣ）を得た。腫瘍のＴＡＣを各時点で心臓のものに正規化して、正規化した取り込み値(normalized uptake value)（ＮＵＶ）を得た。筋肉の［１８Ｆ］９データを、腫瘍データを正規化するための内部入力関数として使用した。注射してから６０分でのＮＵＶ（ＮＵＶ６０）、０〜６０分のＮＵＶの積分として算出されたＮＵＶ曲線下の面積（ＡＵＣ）、およびトレーサーの分数保持(fractional retention of tracer)（ＦＲＴ）、２．５分での放射能に対する６０分での放射能を、比較に使用した。ＦＲＴは、保持される腫瘍にデリバリーされる放射性トレーサーの割合を示すという点で有用で可変である。したがって、これは腫瘍の［１８Ｆ］９の取り込みからデリバリーまでを正規化する。
【０２０４】
結果  図９に示されるように、予想とおりシスプラチン耐性卵巣癌細胞（ＰＥＯ４）以外の、全ての薬剤処置細胞は、コントロール（ベヒクル処置）に比して［１８Ｆ］９の取り込みの有意な増加を示す。さらに、薬剤処置ＬＮＭ３５での［１８Ｆ］９の取り込みの増加は、細胞内の活性カスパーゼ３量と相関し、これからＣＤＤＰ処置とＶＰ−１６処置との拮抗作用が明らかになった。
【０２０５】
表３は、ＣＤＤＰで処置したＰＥＯ１異種移植片を有するマウスの腫瘍における［１８Ｆ］９の取り込みの有意な増加を示すが、この際、ＣＤＤＰ耐性ＰＥＯ４腫瘍はコントロールと処置との間に取り込みの相違は示していない。ＰＥＯ１腫瘍を有するマウスの脾臓及び筋肉以外の、他の組織における［１８Ｆ］９の取り込みは、コントロールと処置との間に有意な差はない。
【０２０６】
【表４】
0005667056.tif 000014
【０２０７】
ＰＥＯ１、ＰＥＯ４及びＲＩＦ−１異種移植片を有するこれらのＣＤＤＰ処置マウスにおけるＰＥＴ画像（図１０）から、腫瘍における［１８Ｆ］１１の有意な取り込みが明らかになった。
【０２０８】
下記文書はすべて参考で本明細書中に引用される。
【０２０９】
実施例７−アポトーシス細胞への［１８Ｆ］１１の取り込み
ＲＩＦ−１細胞を、ベヒクル（０．１％  ＤＭＳＯ）またはｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）（cis-diamminedichloro-platinum(II))（シスプラチン）（ＣＤＤＰ）（１００μＭ）で、４８時間処置した。次に、これらの細胞を［１８Ｆ］１１と共に１時間インキュベートし、洗浄し、放射能を分析した。図１３に示されるように、細胞アッセイにより、アポトーシス細胞への［１８Ｆ］１１の取り込みが約１．５倍増加したことが示された。データは、１ｍｇ  全細胞タンパク質当たりで平均化した減衰補正したカウント／分として表わす。データは、平均値±ＳＥＭであり、３連で行った。
【０２１０】
ＲＩＦ−１腫瘍をベヒクル（５０％  ＤＭＳＯ）またはＣＤＤＰ（１０ｍｇ／ｋｇ  単回投与）で処置した。放射性トレーサーを注入してから６０分での［１８Ｆ］由来の放射能レベルを分析し、血中レベルに対する割合として表わす。図１４に示されるように、ＲＩＦ−１腫瘍を有するマウスにおけるインビボでの取り込み研究でも、ベヒクル処置したマウスに比べて処置マウスでは［１８Ｆ］１１の取り込みが約１．５倍増加した。データは、平均値±ＳＥＭであり、１群当たりｎ＝８匹マウスである。
【０２１１】
実施例８−アポトーシス画像化トレーサーとしての［１８Ｆ］１１の機能性
６〜８週齢のオスのＣ３Ｈ／ｈｅｊマウス(Harlan, Bicester, Oxfordshire, UK)の背中に３８Ｃ１３  マウスリンパ腫細胞（５０００細胞）を皮下注射することによって、腫瘍アポトーシスのインビボ実験モデルを確立した。異種移植片が約１００ｍｍ３に到達したら、マウスを、シクロホスファミド（ＣＰＡ、１００ｍｇ／ｋｇ）またはベヒクルで２４時間処置した後、小動物専用のＰＥＴスキャナー(dedicated small animal PET scanner)(Siemens Inveon PET module)でスキャンした。麻酔をかけた動物をサーモスタット制御のベッドに置き、スキャナー内に腹臥位にした。［１８Ｆ］１１（約１００μＣｉ）のボーラス注射液(bolus injection)を、尾静脈カニューレを介して静脈内（ｉ．ｖ．）投与し、スキャンを開始した。
【０２１２】
動的放射スキャン(dynamic emission scan)を６０分にわたってリスト形式(list-mode format)で得た。次に、画像再構築のために、得られたデータを、０．５−ｍｍ  副鼻腔撮影図(sinogram bin)および１９のタイムフレームに分け、これをフィルター逆投影によって行った。このようにして得られた画像データ−セットをSiemens Inveon Research Workplace softwareを用いて可視化した。動的データの累積画像を、放射性トレーサーの取り込みの可視化のためにおよび関心のある領域(regions of interest)（ＲＯＩ）を規定するために使用した。各１９時点で各ＲＯＩについて、カウント密度を平均して、ＲＯＩに関する時間に対する放射能曲線（ＴＡＣ）を得た（図１５参照）。
【０２１３】
腫瘍のＴＡＣを各時点で全身のものに正規化して、正規化した取り込み値(normalized uptake value)（ＮＵＶ）を得た。注射してから６０分でのＮＵＶ（ＮＵＶ６０）、０〜６０分のＮＵＶの積分として算出されたＮＵＶ曲線下の面積（ＡＵＣ）を比較に使用した（図１６参照）。
【０２１４】
スキャン後、様々な組織を取り除き、秤量し、即座にフッ素−１８放射能計測するために計測用チューブに置いて、［１８Ｆ］１１の生体内分布を評価した（下記表４参照）。
【０２１５】
ベヒクルまたはシクロホスファミドで処置した２匹の３８Ｃ１３異種移植片を有するマウスの代表的なＯＳＥＭ３Ｄ  再構築［１８Ｆ］１１  ＰＥＴ画像を図１７に示し、この際、丸は腫瘍を示す。
【０２１６】
表４の生体内分布の結果から、ベヒクルに比して、ＣＰＡで処置したマウスの腫瘍では、［１８Ｆ］１１の取り込みが有意に２倍増加したことが示され、これは、ＰＥＴイメージングパラメーター、腫瘍のＴＡＣ、ＮＵＶ６０及びＡＵＣから得られた半定量データによって確認された（図１５及び１６を参照）。したがって、図１５〜１７及び表４に示される生体内分布およびＰＥＴスキャンデータから、［１８Ｆ］１１によりインビボでの腫瘍のアポトーシスを検出できる可能性があることが示され、これにより、初めて、腫瘍のためのカスパーゼ−３に特異的なＰＥＴ画像化剤の使用が記載される。
【０２１７】
【表５】
0005667056.tif 000015
【０２１８】
実施例９−化合物１１の細胞活性
化合物１１の細胞活性を酵素アッセイを用いて評価し、化合物１４の細胞活性と比較した。
【０２１９】
マウス放射線誘発線維肉腫（ＲＩＦ−１）細胞を、カスパーゼ阻害剤である、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（１００μＭ）、化合物１１及び化合物１４で１５分間処理した後、４８時間、シスプラチン（１００μＭ）でアポトーシスを誘導した。Δ−ＰＡＲＰ免疫ブロットバンドは、カスパーゼ  ３の切断により得られるＰＡＲＰの内因性の８９ｋＤａの大きさの断片に相当する。α−チューブリンをローディングコントロールとして使用した。
【０２２０】
図１８に示されるように、ＲＩＦ−１細胞を、化合物１４ではなく、化合物１１と予めインキュベーションすると、シスプラチンで誘導されるアポトーシスによるカスパーゼ−３と同種のターゲットＰＡＲＰの誘導が妨害されたことから、化合物１１によるカスパーゼ−３の細胞不活性化が示唆される。
【０２２１】
薬剤により誘導されるアポトーシスの条件下で化合物１１の結合性をさらに確立するために、我々は、実施例６で上記されるのと同様にしておよび図９に示されるように、ＬＮＭ３５、ＲＩＦ−１及びＰＥＯ１／４癌細胞における放射線標識された［１８Ｆ］１１の取り込みを評価した。予想とおり、シスプラチン耐性卵巣癌細胞（ＰＥＯ４）以外の、全ての薬剤で処理された細胞は、コントロールに比べて［１８Ｆ］１１の取り込みが有意に増加した。さらに、薬剤処理したＬＮＭ３５細胞における［１８Ｆ］１１の取り込みの増加は、カスパーゼ−Ｇｌｏアッセイを用いた細胞活性カスパーゼ−３の量と相関した。
【０２２２】
実施例１０−保護前駆体を用いた［１８Ｆ］１１の合成
イサチン放射性リガンド［１８Ｆ］１１は、図２（ｉ）、図１９に及び実施例３に記載されるのと同様の２段階法を用いて合成できる。この放射性合成(radiosynthesis)の欠点には、安定した不純物の存在があり、これにより配合される生成物の比放射能が減少する（１〜４Ｃｉ／μｍｏｌ）。より根本的には、安定した不純物は、かなりの量（５〜１０μｇ／ｍＬ）で存在し、この量は臨床的進行には多すぎる値である。毒性試験を行うためにこの不純物の特性を明らかにしようと試みたが結論は得られず、安定した不純物が、「冷たい」フッ素−１９トリアゾール化合物でなく、イサチン由来であることが確認されたにとどまった。
【０２２３】
ＨＰＬＣ分析によって、不純物が放射性合成中の副反応の結果であり、アルキン前駆体中に存在する物質ではないことが確認された。イサチン分子構造の試験から、化学反応性が高い２つの部位、上記クリック化学付加環化(click chemistry cycloaddition)で使用される末端アルキン基およびカスパーゼ−３活性部位での結合に必要なＣ−３カルボニル位置のみが示された。Ｃ−３カルボニル位置に関する保護基ストラテジーを調べ、特に、下記一般式３８及び４３で示される（この際、ｎ＝０、１、２、３、４、５または６であり、ｘ＝離脱基、例えば、メシレート、トシレート、ノシレート(nosylate)、または他のスルホネートエステルまたはハライド）ような、アセタールジオキソランとしてのＣ−３カルボニル位置の保護を調べた：
【０２２４】
【化６】
0005667056.tif 000016
【０２２５】
保護アルキン、（Ｓ）−１−｛［１’−［１−（２−プロピニル）］−（１’２’−ジヒドロ−２’−オキソスピロ（１，３−ジオキサン−２，３’−［３Ｈ］インドール）−５’−スルホニル｝−２−（２，４−ジフルオロフェノキシメチル）−ピロリジン（化合物３９）、及び保護トリアゾール（化合物４０）を図２０に要約されるようにして合成した。
【０２２６】
一般的な実験の詳細は、本実施例の最初におよびSmith et al29に既に記載されている。全ての反応は、アルゴン雰囲気下で行われた。
【０２２７】
（Ｓ）−１−｛［１’−［１−（２−プロピニル）］−（１’２’−ジヒドロ−２’−オキソスピロ（１，３−ジオキサン−２，３’−［３Ｈ］インドール）−５’−スルホニル｝−２−（２，４−ジフルオロフェノキシメチル）−ピロリジン（化合物３９）を、下記方法に従って製造した。無水トルエン（６ｍＬ）における化合物２５（９２ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）の溶液に、１，３−プロパンジオール（０．３ｍＬ）及び４−トルエンスルホン酸（１０ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）を添加した。次に、形成した水を共沸蒸留によって除去しながら、この溶液を２４時間還流した。さらに、この反応混合物を、室温まで冷却して、バルク溶媒を減圧下で除去した。次に、サンプルをＤＣＭ（１０ｍＬ）に再溶解し、飽和Ｎａ２ＣＯ３（１×１０ｍＬ）、水（１×１０ｍＬ）及びブライン（１×１０ｍＬ）で洗浄した後、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。カラムクロマトグラフィー（２：１  酢酸エチル／ヘキサン）によって、目的とする生成物を第一の画分として得た（無色の油、４６ｍｇ、４４％）。HRMS (ESI) = 519.1393 (M + H)+. C25H25F2N2O6Sに関する算出値 519.1401. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ  7.90 (d, J = 1.8 Hz, 1 H), 7.87 (dd, J = 8.2 Hz, 1.8 Hz, 1 H), 7.09 (d, J = 8.2 Hz, 1 H), 7.04-6.98 (m, 1 H), 6.88-6.78 (m, 1 H), 4.93 (t, J = 12.1 Hz, 2 H), 4.45 (d, J = 2.4 Hz, 2 H), 4.32-4.27 (m, 1 H), 3.99-3.93 (m, 4 H), 3.56-3.49 (m, 1 H), 3.14-3.08 (m, 1 H), 2.43-2.37 (m, 1 H), 2.30 (t, J = 2.4 Hz, 1 H),  2.09-1.93 (m, 2 H), 1.78-1.64 (m, 3 H)。
【０２２８】
（Ｓ）−１−｛［１’−［１−（２−フルオロエチル）−１Ｈ−［１，２，３］−トリアゾール−４−イル］−（１’２’−ジヒドロ−２’−オキソスピロ（１，３−ジオキサン−２，３’−［３Ｈ］インドール）−５’−スルホニル｝−２−（２，４−ジフルオロフェノキシメチル）−ピロリジン（化合物４０）を、下記方法に従って製造した。無水トルエン（４ｍＬ）における（Ｓ）−１−（（１−（２−フルオロエチル）−１Ｈ−［１，２，３］−トリアゾール−４−イル）メチル）−５−（２（２，４−ジフルオロフェノキシメチル）−ピロリジン−１−スルホニル）イサチン）（化合物１１）（１２ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）の溶液に、１，３−プロパンジオール（０．１５ｍＬ）及び４−トルエンスルホン酸（１ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）を添加した。次に、形成した水を共沸蒸留によって除去しながら、この溶液を２４時間還流した。さらに、この反応混合物を、室温まで冷却して、バルク溶媒を減圧下で除去した。次に、サンプルをＤＣＭ（１０ｍＬ）に再溶解し、飽和Ｎａ２ＣＯ３（１×１０ｍＬ）、水（１×１０ｍＬ）及びブライン（１×１０ｍＬ）で洗浄した後、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。カラムクロマトグラフィー（４：１  酢酸エチル／ヘキサン）によって、目的とする生成物を第一の画分として得た（無色の油、７ｍｇ、５８％）。HRMS (ESI) = 519.1393 (M + H)+; C25H25F2N2O6S 519.1401に関する算出値. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ.7.84 (s, 1 H), 7.81 (d, J = 1.6 Hz, 1 H), 7.67 (s, 1 H), 7.43 (dd, J = 8.4 Hz, 1.6 Hz, 1 H), 7.04-6.98 (m, 1 H), 6.88-6.79 (m, 1 H), 4.96 (s, 1 H), 4.92 (t, J = 2.8 Hz, 2 H), 4.79 (dt, J = 46.6 Hz, 4.8 Hz, 2 H), 4.64 (dt, J = 27 Hz, 4.8 Hz, 2 H), 4.29 (dd, J = 8.4 Hz, 2.6 Hz, 1 H), 4.00-3.89 (m, 4 H), 3.53-3.48 (m, 1 H), 3.10-3.07 (m, 1 H), 2.43-2.37 (m, 1 H), 2.05-1.92 (m, 2 H), 1.75-1.65 (m, 3 H)。
【０２２９】
次に、［１８Ｆ］１１は、１以上のこれらの保護前駆体を用いて合成できる。保護アルキン前駆体３９を用いた具体的な放射化学反応を図２１に示す。このような保護アルキン前駆体を使用することによって、Ｃ−３位置での望ましく副反応を防止する。
【０２３０】
硫酸銅（ＩＩ）・６水和物（０．５１ｍｇ、２．０６μｍｏｌ、２５μＬ）の水溶液に、窒素下で、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０、２５０ｍＭ、２５μＬ）におけるアスコルビン酸ナトリウム（２．５３ｍｇ，１２．７９μｍｏｌ）、ＤＭＦ（２５μｌ）におけるアルキンアセタール前駆体（１．０ｍｇ、１．９３μｍｏｌ）（化合物３９）、及びアセトニトリル（１００μＬ）における［１８Ｆ］−フルオロエチルアジド（１．２７ｍＣｉ）（化合物２７）を添加した。この反応混合物を８０℃で３０分間加熱した（図２２参照）。塩酸（６Ｎ、１００μＬ）を添加した後、攪拌混合物をマイクロ波空洞（２ｓ、５０Ｗ、設定温度  ８０℃）を用いて加熱した。ＨＰＬＣ移動相（５０μＬ、３５％  ＭｅＣＮを用いた５０％  ＭｅＯＨ含む水）を添加した後、混合物を予備ＨＰＬＣによって精製した（図２３参照）。［１８Ｆ］１１を２４％の減衰補正した放射化学的収率（出発［１８Ｆ］−フルオロエチルアジドに対する）で単離し、ＰＢＳ／１０％ＥｔＯＨでＣ１８−ＳｅｐＰａｋ  ＳＰＳを用いて配合した。［１８Ｆ］１１と共に溶出する安定した不純物のレベルは０．８４μｇ／ｍＬであった。比放射能は０．０５Ｃｉ／μｍｏｌ（２ＧＢｑ／μｍｏｌ）であった（図２４参照）。
【０２３１】
類似の保護先駆体を用いて本発明の他の化合物を合成できることはいうまでもない。
【０２３２】
実施例１１−アポトーシス細胞への［１８Ｆ］１１及び［１８Ｆ］４２の取り込みの比較
本プロジェクトのさらなる態様は、弱いイサチンカスパーゼ−３阻害剤であるＮ−［１−（２−フルオロエチル）−１Ｈ−［１，２，３］−トリアゾール−４−イル］イサチン（化合物４２）の分析を包含する。この化合物を、図２５に示されるようにして、Ｎ−（２−プロピニル）イサチン（化合物４１）を用いて合成した。化合物［１８Ｆ］４２は、コアのイサチンフレームワークを有するため、この化合物は公知のイサチン結合形式で活性化カスパーゼ−３に結合でき、また、放射性標識トリアゾール機能性がありうる。しかしながら、［１８Ｆ］４２は、カスパーゼ−３に対する高い親和性及び選択性を付与するピロリジンスルホンアミド機能性がない。［１８Ｆ］４２を、［１８Ｆ］１１と直接比較するために、細胞取り込みアッセイで調べた。この目的は、取り込みが細胞透過性の増加の結果、アポトーシス細胞の特性、あるいはカスパーゼ−３結合の結果であるのかを決定する目的で、化合物の取り込みプロフィールを調べることである。［１８Ｆ］１１とは異なり、薬剤処置後に［１８Ｆ］４２結合性の増加はなかった（図２６参照）ことから、［１８Ｆ］１１結合はカスパーゼ３活性化によるものであるという知見が支持された。
【０２３３】
Ｎ−（２−プロピニル）イサチン（化合物４１）を、Smith et al29に記載されるのと同様にして合成した（アルキン１２及び１３）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.65-7.61 (m, 2 H), 7.19-7.12 (m, 2 H), 4.61 (s, 2 H), 2.30 (s, 1 H)。
【０２３４】
Ｎ−［１−（２−フルオロエチル）−１Ｈ−［１，２，３］−トリアゾール−４−イル］イサチン（化合物４２）を、Smith et al29に記載されるのと同様にして合成した（トリアゾール１４及び１５）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.76 (s, 1 H), 7.63-7.57 (m, 2 H), 7.34 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.13 (t, J = 3.6 Hz, 1 H), 5.03 (s, 2 H), 4.81 (dt, J = 46.8 Hz, 4.8 Hz, 2 H), 4.68 (dt, J = 27 Hz, 4.8 Hz, 2 H)。
【０２３５】
注意(N.B.)  番号の間違いにより、化合物１５及び２１は、実際同じ化合物である。
【０２３６】
参考文献
1. Lahorte et al. (2004) European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 31. 887 - 919.
2. Boersma et al. (2005) Journal of Nuclear Medicine. 46, 2035 - 2050.
3. Aloya, R. et al. (2006) アポトーシス. 11, 2089 - 2101.
4. Damianovich, M. et al. (2006) European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging.. 33, 281 - 291.
5. WO 2005/067388
6. Neuss, M. et al (2001). Cardiovascular Drugs and Therapy. 15, 507-523.
7. Lee, D. et al (2000) Journal of Biological Chemistry. 275, 16007 - 16014.
8. Lee, D. et al. (2001) Journal of Medicinal Chemistry.44, 2015-2026
9. Chu, W. et al (2005) Journal of Medicinal Chemistry. 48. 7637 - 7647
10. Chu, W. et al (2007) Journal of Medicinal Chemistry. 50. 3751 - 3755.
11. WO 2005/053752
12. Faust, A. et al (2007) Quarterly Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 51. 67 - 71
13. Kopka, K. et al (2006) Journal of Medicinal Chemistry. 49, 6704 - 6715.
14. Zhou, D. et al (2006) Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 16, 5041 - 5046.
15. WO 2006/067376
16. Glaser et al (2007) Bioconjugate Chemistry. 18. 989 - 993
17. Wipf, P. et al (2001) Tetrahedron. 57, 283 - 296.
18. Barthel, H. et al (2004) British Journal of Cancer. 90, 2232 - 2242.
19. Aboagye, E.O. et al, (1997) Biochemical Pharmacology. 54, 1217-1224.
20. Twentyman, P.R. et al.(1980) J Natl. Cancer Inst. 64, 595-604
21. Workman, P., et al (1998) British Journal of Cancer. 77, 1-10.
22. Wolf, C.R. et al. (1987) Int. J. Cancer. 39, 695-702
23. Langdon, S.P. et al (1988) Cancer Research. 48, 6166-6172
24. Kozaki, K et al (2000) Cancer Research. 60, 2535-40
25. Schirrmacher, R. et al (2008) Tet. Lett. 49, 4824 - 4827.
26. Marik, J. and Sutcliffe, J. L. (2006) Click for PET: Rapid preparation of [18F]fluoropeptides using CuIcatalyzed 1,3-dipolar cycloaddition. Tet. Lett. 47, 6681-6684
27. Sirion, U. et al, (2007) An efficient F-18 labeling method for PET study: Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition of bioactive substances and F-18-labeled compounds. Tet. Lett., 48, 3953-3957
28. Li, Z, et al. (2007) Click Chemistry for 18F-Labeling of RGD Peptides and microPET Imaging of Tumor Integrin αｖβ３ expression. Bioconjugate Chem., 18, 1987-1994.
29. Smith G. et al, (2008) Design, Synthesis and Biological Characterization of a Caspase 3/7 Selective Isatin Labeled with 2-[18F]fluoroethylazide. Journal of Medicinal Chemistry. 51. 8057-8067
【図１】
0005667056.tif 000021
【図２−１】
0005667056.tif 000022
【図２−２】
0005667056.tif 000023
【図３−１】
0005667056.tif 000024
【図３−２】
0005667056.tif 000025
【図４】
0005667056.tif 000026
【図５−１】
0005667056.tif 000027
【図５−２】
0005667056.tif 000028
【図６−１】
0005667056.tif 000029
【図６−２】
0005667056.tif 000030
【図６−３】
0005667056.tif 000031
【図７】
0005667056.tif 000032
【図８−１】
0005667056.tif 000033
【図８−２】
0005667056.tif 000034
【図８−３】
0005667056.tif 000035
【図９】
0005667056.tif 000036
【図１０】
0005667056.tif 000037
【図１１】
0005667056.tif 000038
【図１２】
0005667056.tif 000039
【図１３】
0005667056.tif 000040
【図１４】
0005667056.tif 000041
【図１５】
0005667056.tif 000042
【図１６】
0005667056.tif 000043
【図１７】
0005667056.tif 000044
【図１８】
0005667056.tif 000045
【図１９】
0005667056.tif 000046
【図２０】
0005667056.tif 000047
【図２１】
0005667056.tif 000048
【図２２】
0005667056.tif 000049
【図２３】
0005667056.tif 000050
【図２４】
0005667056.tif 000051
【図２５】
0005667056.tif 000052
【図２６】
0005667056.tif 000053