(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・プランタラムCJLP133(Lactobacillus plantarum CJLP133) KCTC 11403BP。
【請求項２】
ラクトバチルス・プランタラムCJLP133(Lactobacillus plantarum CJLP133) KCTC 11403BPを含む腸疾患の予防または治療用組成物。
【請求項３】
ラクトバチルス・プランタラムCJLP133(Lactobacillus plantarum CJLP133) KCTC 11403BPを含む免疫増強用組成物。
【請求項４】
Th2反応過剰によるTh1/Th2不均衡に誘発される免疫疾患の予防または治療用であることを特徴とする請求項3に記載の組成物。
【請求項５】
前記免疫疾患は、アレルギー性疾患、アトピー、および自家免疫疾患で構成された群から選択されることを特徴とする請求項4に記載の組成物。
【請求項６】
医薬品であることを特徴とする請求項2から5のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
健康食品であることを特徴とする請求項2から5のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
飼料または飼料添加剤であることを特徴とする請求項2から5のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
化粧品であることを特徴とする請求項2から5のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)及びこれを含む組成物に係り、より具体的には腸疾患及び免疫疾患の予防／治療に有用な新規なラクトバチルス・プランタラム及びこれを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
キムチのような伝統発酵食品に豊富に存在する乳酸菌は、人体の消化系に共生しながら繊維質及び複合蛋白質を分解して重要な栄養成分を作る役割を担っている。このように人を含んだ動物の胃腸管内で宿主の腸内微生物環境を改善して宿主の健康に有益な影響を与える生きている微生物を通称してプロバイオティクス(probiotics)という。プロバイオティクスとして効果があるためには経口で摂取して小腸に到達して腸表面に付着して維持されなければならないので、基本的に耐酸性、耐胆汁酸性、及び腸上皮細胞付着能力が優秀でなければならない。
【０００３】
キムチのような伝統発酵食品で発見される代表的なプロバイオティクスとしてラクトバチルス属(Lactobacillus sp.)乳酸菌がある。ラクトバチルス属微生物は、同形または異形発酵をする乳酸桿菌として人を含んだ動物の腸管及び乳製品や野菜の発酵過程でよく見ることができる。ラクトバチルス属微生物は、腸内pHを酸性に維持して大腸菌(E. coli)やクロストリジュウム(Clostridium)のような有害菌の繁殖を抑制して下痢と便秘を改善するだけでなく、ビタミン合成、抗癌作用、血清コレステロール低下などの役割をすることが知られている。乳酸桿菌によって生産されるアシドフィリンは、疫痢菌、サルモネラ菌、葡萄状球菌、大腸菌などの成長を阻害することが知られている。また、下痢原因菌の増殖を抑制して腸内菌叢を正常化することで下痢を改善する作用をする(非特許文献1及び非特許文献2)。
【０００４】
ラクトバチルス属微生物の前記特性を利用して生菌剤および家畜飼料を開発しようとする研究が活発に進行している。家畜の細菌性下痢病は、増体率減少と死亡率増大を誘発する。したがって、これを予防して家畜の生産を高めようとして飼料に抗生剤を添加することが一般的に広く行われてきた。しかし、抗生物質に対する耐性菌の出現と畜産物内の残留抗生物質などの問題のために飼料内抗生物質の使用を規制して有機的な家畜飼養法が推奨されている (特許文献1)(非特許文献3)。
【０００５】
また、ラクトバチルス属乳酸菌は、免疫増強効果を持つことでも知られている。最近全世界的に環境汚染とインスタントフード摂取の増加などの影響で予測される免疫調節異常と関連したアレルギー及びアトピー疾患が急激に増加していて、韓国でも同じようにこのような疾患が増加傾向にある。最近ヨーロッパでは乳酸菌を経口投与して病気を治療する微生物治療(bacteriotheraphy)の一環として乳酸菌で病の症状を緩和したり改善する努力が進められている。ラクトバチルス・ラムノサス GG(Lactobacillus rhamnosus GG)を乳児に投与したところアトピー発生が半分に減少し(非特許文献4)、すでにアトピー湿疹が進行中の子供にラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)とラクトバチルス・ロイテリ(L.reuteri)を投与すると、湿疹部位及び程度が減少するという報告がある(非特許文献5)。
【０００６】
このような乳酸菌の免疫増強効果に対するメカニズムに対してずっと研究が進行されていて、具体的なメカニズムに対してはまだ明確に明らかになることはなかったが、今のところ経口的に流入して腸内で棲息することで腸管免疫系に影響を及ぼすと考えられている。例えば、ヨーグルトを介した乳酸菌摂取はPeyer's patchのリンパ球の抗菌活性を増加させることが知られていて、実験動物及び人を対象に実行された一部研究によれば乳酸菌は、IgAの反応を強化させるといわれている。また、乳酸菌は、先天免疫及び適応免疫の両方に影響を及ぼす。腸管免疫系の先天免疫反応(innate immunity)では病原菌を死滅させることで感染に対抗して健康を維持する役割をすると知られている。適応免疫(adaptive immunity)では抗原を分解してTリンパ球に提示する役割をするマクロファージを活性化して多様なサイトカインおよびインターロイキンIL-12、IL-18の生産を増加させ、乳酸菌細胞壁構成成分中一部がマクロファージでNF-κB、STAT信号伝達を活性化させることによってサイトカインの生産が増加することが知られている。また、乳酸菌は、専門的な抗原提示細胞としてリンパ節及び消化器系の粘膜にたくさん存在する樹状細胞でIL-12、IL-18、TNF-αの産生を増加させるのはもちろんMHC class II及びB7-2とともにTリンパ球を活性化させる表面分子の発現も増加させることが知られている(非特許文献6)。
【０００７】
Tリンパ球は、適応免疫の中心になる細胞であり、適応免疫は、細胞性免疫のTh1反応と抗体性免疫のTh2反応に分けることができる。Th1及びTh2それぞれの反応で抗原提示細胞(Antigen Presenting Cell)が生産するサイトカインが互いに違っており、Th1反応では、IL-12、IL-18、インターフェロン(IFN)生産が優勢でTh2反応では、PGE2、IL-4、IL-10生産が優勢である。このようなTh1反応及びTh2反応は、適切な均衡が成り立つべきで、均衡がこわれると各種免疫疾患が現れるといわれている。Th1細胞は、主に感染症と戦う反面Th2細胞は、主にアレルギーと炎症性反応に関与する。これらが正常に作用する時にはTh2細胞は、ほこり及びその他願わない物質から身体を保護するが、万一、これら細胞が過度な活性を現わすとIgE抗体生産が増加して人体に威嚇にならなかった蛋白質(例:花粉、食物など)にアレルギー反応を誘発させる。したがって、Th1反応とTh2反応は、必ず均衡を維持するべきで、万一、この中の一つが過剰または不足すれば病気が誘発される。また、続くストレスによってコルチゾールが持続的に遊離すればTh1反応が低下してTh2反応が増加することになって、癌、アトピー、アレルギー及び自家免疫疾患が誘発される(非特許文献7)。
【０００８】
In vivo実験によれば乳酸菌は、Tリンパ球でTh1サイトカインのIFN-γの生成を増加させて、Th2サイトカインのIL-4、IL-5生成を抑制するという(非特許文献8)。また、他の実験でもTh2反応動物モデルの卵アルブミン(Ovalbumin)を投与してTh2反応に偏向したマウス(ovalbumin-primed mice)に乳酸菌を経口投与した時脾臟細胞(splenocyte)でIFN-γが増加し、IL-4、IL-5およびIgEが減少し卵アルブミン(Ovalbumin)を投与してTh2反応に偏向したマウスから摘出した脾臟細胞を乳酸菌と共に培養した時にもサイトカインおよびIgEの変化が経口投与実験と同様である。しかし、Tリンパ球だけを乳酸菌と培養した時IFN-γ生成が有意に増加しなかったのでTリンパ球のIFN-γ生成には、マクロファージ、樹状細胞のような抗原提示細胞が必ず必要であると考えられる(非特許文献9)。一方IL-12およびIL-18は、Th0リンパ球をTh1リンパ球に分化させるのに重要なサイトカインとしてマクロファージまたは樹状細胞で生成されて、脾臟細胞またはマクロファージ培養時乳酸菌で処理すれば濃度依存的にIL-12、IL-18およびIFN-αなどの生成が増加すると知られている。このように乳酸菌は、マクロファージでIL-12、IL-18およびIFN-αなどの生成を増加させるのでTh1細胞への分化を促進してこれらのIFN-γ生成を誘導するので、Th2が優勢な状況でTh1/Th2均衡を合わせる作用をする(非特許文献6)。したがって、乳酸菌は、Th2反応過剰によるTh1/Th2不均衡に誘発される癌、アトピー、アレルギー、および自家免疫疾患を予防または治療するのに役に立つと知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】韓国特許出願公開第1998-78358号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Michael and Philippe, Probiotics and prebiotics: Ef fects on diarrhea, The journal of nutrition, Volume 137, March 2007, pages 803S-811S
【非特許文献２】Roberfroid, Prebiotics and probiotics: Are they funct ional foods、American journal of clinical nutrition, Volume 71, June 2000, pages 1682S-1687S
【非特許文献３】McEwen and Fedorka-Cray, Antimicrobial use and resis tance in animals, Clinical infectious Diseases, Volume 34, June 2002, pages S93-S106
【非特許文献４】Kalliomaki et. al. 、Probiotics in primary prevention of atopic disease: a randomized place bo-controlled trial、Lancet、Volume 357、April 2001、pages 1076-1079
【非特許文献５】Rosenfeldt et. al.、Effect o f probiotic Lactobacillus strains in children with atopic dermatitis、Dermatologic and ocular dis eases、Volume 111、February 2003、pages 389-395
【非特許文献６】Cross et. al.、Anti-allergy properties of fermented f oods: an important immunoregulatory mechanism of lactic acid bacteria、 International Immu nopharmacology、Volume 1、May 2001, pages 891-901
【非特許文献７】Elenkov and Chrousos、 Stress hormones、 Th1/Th2 pat terns、pro/anti-inflammatory cytokines and susceptibility to disease、T rends in Endocrinology and Metabolism、Volume 10、November 1999、pages 359-368
【非特許文献８】Matsuzaki et. al.、The effect of oral feeding of Lact obacillus casei strain Shirota on immunoglobulin E production in mice、Journal of Dairy Science、Volume 81、January 1998、pages 48-53
【非特許文献９】Kato et. al.、Lactic acid bacterium potently induces the production of interleu kin-12 and interferon-gamma by mouse splenoc ytes、International Journal of Immunopharmacology、Volume 21、February 1999, pages 121-131
【非特許文献１０】Miraglia et. al、Immune dysregulation in atopic dermati  tis、Allergy and Asthma Proceedings、Volume 27、November-December 2006、pages 451-455
【非特許文献１１】Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed.、1995)
【非特許文献１２】Kim et. al.、Le uconostoc inhae sp. nov.、a lactic acid bacterium isolated from kimchi, International Journal of Systematic and Evolutional Microbiology、Volume53、July 2003、pages 1123-1126
【非特許文献１３】Kim et. al.、Leucon ostoc kimchii sp. nov.、a new s pecies from kimchi. International Journal of Systematic and Evolutional Microbiology,Volume50,September 2000,pages 1915-1919
【非特許文献１４】Kobayashi et. al.、Studies on biological character istics of Lactobacillus: II. Tolerance of the multiple antibiotic resis tance strain,L. casei PSR3002, to artificial digestive fl uids. Japan J ournal of Microbiology. Volume 29、July 1974、pages 691- 697)
【非特許文献１５】Casey et. al.、Isolation and cha racterization of anti-Salm onella lactic acid bacteria from the porcine ga strointestinal tract、Letters in A pplied Microbiology. Volume 39、2004、pages431-438)
【非特許文献１６】Kim et. al.、Probiotic properties of Lactobacillus and Bifidobacterium strains isolated from p orcine gastrointestinal tract、Applied Microbiology and Biotechnolog y、Volume 74、April 2007、pages 1103-1111
【非特許文献１７】Hirano et. al.、The effect of Lactobacillus rhamnosus on enterohemorrhagic Escherichia coli infection of human intestinal cells in vitro、Microbiology and Immunolog y、Volume 47、2003、pages 405-109
【非特許文献１８】Fujiwara et. al. A double-blind trial of Lactobac illus para casei strain KW3110 administration for immunomodulation in p atients with pollen allergy、Allergology International、2005、volume 54、pages 143 - 149
【非特許文献１９】Fujiwara et. al.、The anti-allergic effects of la cti cacid bacteria are strain dependent and mediated by effects on both Th1/Th2 cytokine expression and balance、International Archives of Allergy and I mmunology、2004、Volume135、pages 205-215
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、従来開示されている乳酸菌に比べてTh2反応過剰によるTh1/Th2不均衡を調節する効果が非常に優秀な新しい乳酸菌を開発するために研究した結果、伝統発酵食品から新規なラクトバチルス属乳酸菌菌株を分離、同定して本発明を完成することになった。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、プロバイオティクスとしての基本性質の耐酸性、耐胆汁酸性、腸上皮細胞付着能が優秀なだけでなく、免疫増強効果、特にTh2反応過剰によるTh1/Th2不均衡を調節する効果が優秀な新規なラクトバチルス属乳酸菌菌株を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、前記新規なラクトバチルス属乳酸菌菌株を含む腸疾患の予防または治療用組成物を提供することである。
【００１４】
本発明のまた他の目的は、前記新規なラクトバチルス属乳酸菌菌株を含む免疫増強用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記目的を達成するために、本発明は、ラクトバチルス・プランタラムCJLP 133(Lactobacillus plantarumCJLP133)(寄託機関:生命工学研究院遺伝子銀行 、寄託日時:2008.10.16、受託番号:KCTC 11403BP)を提供する。
【００１６】
また、本発明は、前記ラクトバチルス・プランタラムCJLP133を含む腸疾患の予防または治療用組成物を提供する。
【００１７】
また、本発明は、ラクトバチルス・プランタラムCJLP133を含む免疫増強用 組成物を提供する。
【００１８】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００１９】
本発明によるラクトバチルス・プランタラムCJLP133(Lactobacillus plantar umCJLP133)は、伝統発酵食品から分離および同定されたラクトバチルス・プランタラムの新規な菌株であることを特徴とする。前記伝統発酵食品には、キム チ、野菜発酵物、味噌、醤油、清麹醤または塩辛などがあるが、これに限定されるのではない。
【００２０】
本発明のラクトバチルス・プランタラムCJLP133は、微生物の同定および分類 のための16S rRNA塩基配列分析の結果、ラクトバチルス・プランタラム標準菌株(L actobacillus plantarum NBRC15891T、GenBank accession number AB326351)と 最も高い相同性(99.9%)を現わしてラクトバチルス・プランタラムと最も高い 分子系統学的関係を見せた。したがって、前記微生物をラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)と同定して、ラクトバチルス・プランタラムCJLP133と命名し、生命工学研究院遺伝子銀行に2008年10月16日 付で寄託した(受託番号KCTC 11403BP)。ラクトバチルス・プランタラムCJLP  133の16S rRNA遺伝子の塩基配列は、本明細書末尾の配列表SEQ  ID NO.1に示す。
【００２１】
本発明のラクトバチルス・プランタラムCJLP133は、グラム陽性菌であり好気 的条件と嫌気的条件で成長が可能な通性嫌気性(facultive anaerobe)であ り胞子を形成しないで運動性がなくて細胞の形態は、桿菌である。
【００２２】
ラクトバチルス・プランタラムCJLP133のより具体的な形態および生理学的 特性は、当該技術分野の通常の方法により分析した結果下記の表1と同じであ ることが分かった。
【表１】
0005718917.tif 000002
【００２３】
0005718917.tif 000003
【００２４】
本発明のラクトバチルス・プランタラム CJLP133は、長期間安定的に保存 するためには水にグリセロール成分を一定量混合して作った保管溶液に菌体を入れて-70℃で保管したり滅菌された10%脱脂乳に懸濁して凍結乾燥すること が好ましい。
【００２５】
また、本発明のラクトバチルス・プランタラム CJLP133は、プロバイオティクスとして乳酸菌の一般的な整腸効果および免疫増強効果を持つ。
【００２６】
本発明において、'プロバイオティクス(probiotics)'は、人を含んだ動物の 胃腸管内で宿主の腸内微生物環境を改善して宿主の健康に有益な影響を与える生きている微生物という意味で理解される。プロバイオティクスは、プロバイオティク活性を持って生きている微生物で、単一または複合菌株として人や動物 に乾燥された細胞形態や発酵産物形態で給与される場合、宿主の腸内菌叢に有 益な影響を及ぼすことができる。このようなプロバイオティク微生物であるた めには一番目で、胃液と胆汁での影響を少なく受けながら胃を通過して腸で生 存でき、腸内に定着して生存が可能であって宿主の腸内菌叢に有益な影響を及ぼすべきである。したがって、胃酸に対する耐酸性、胆汁酸に対する耐胆汁酸性および腸上皮細胞に対する付着性を持たなければならな い。二番目で、プロバイオティク微生物であるためには、微生物の安全性に問 題があってはならなくて、これと関連しては一般的にゼラチン液化反応検査、フェニルアラニンデアミナーゼ検査、アンモニア生成検査、溶血性実験検査などが遂行される。本発明によるラクトバチルス・プランタラムCJLP133は、 優秀な耐酸性、胆汁酸に対する耐胆汁酸性及び腸上皮細胞に対する付着性を 持つだけでなく、ゼラチン液化反応検査、フェニルアラニンデアミナーゼ検査およびアンモニア生成検査で陰性を示し、溶血性実験検査では病原性と関係がないと判定されるα-溶血であって安全なことが分かった。
【００２７】
本発明によるラクトバチルス・プランタラムCJLP133は 、耐酸性、耐胆 汁酸性および腸皮細胞付着性が非常に優秀で整腸効果が予想される。したがっ て、本発明は、他の側面において、ラクトバチルス・プランタラムCJLP133 を含む腸疾患の予防または治療用組成物を提供する。
【００２８】
前記本発明による微生物を含む腸疾患の予防または治療用組成物は、人を含 んだ哺乳動物の腸疾患の予防または治療に利用され、哺乳動物には好ましくは牛、馬、 豚のような家畜が含まれる。前記'腸疾患'では腸危害細菌感染および炎症性腸疾患を全部含んで、例えば病原性微生物(大腸菌、サルモネラ、クロストリジウムなど)による感染性下痢、胃腸炎、炎症性腸疾患、神経性腸炎症候群、 小腸微生物過成長症、腸急性下痢などを含むが、これに限定されるのではない。前記腸疾患治療用組成物に含まれるラクトバチルス・プランタラムCJLP  133は、生菌体または死菌体として存在することもできるが、生菌体として存在することが好ましい。一般的に生菌体は、腸内細菌叢の異常発酵によって引 き起こされる諸般症状を治療して改善する効果があって人および動物に投与すれば腸内の消化管壁に密集、定着して有害菌が定着できないようにする作用をしながら、乳酸を生成して腸内のpHを低くして有害細菌が増殖できないようにする。また、投与された生菌体は、バクテリオシン(bacteriocin)と過酸化物を生成して有害細菌の増殖を抑制して栄養分の吸収を担当する腸絨毛の活動を助ける。この他にも、栄養素の吸収と利用を助ける物質を生成して、動物において飼料要求率を改善させて、病原菌が生成する毒性物質を中和する物質を生成したりもする。
【００２９】
前記本発明の腸疾患の予防または治療用組成物の投与方法は、特に限定され るのではないが、経口で投与することが好ましい。投与量は、腸疾患の種類、 疾患の程度、年齢、性別、人種、治療または予防目的などにより変わるが、一般的に成人を基準として一日に1千万細胞〜1000億細胞を投与することができる。
【００３０】
また、本発明のラクトバチルス・プランタラムCJLP133は、整腸効果その 他にも従来の乳酸菌に比べて顕著に優秀な免疫増強効果を持つ。ラクトバチルス・プランタラムCJLP133は、脾臟細胞でTh1反応を誘導する IL-12の生成を増加させて、Th2反応を誘導するIL-4の生成を抑制する。また、抗原提示細胞としてT細胞免疫反応を調節するマクロファージおよび樹状細 胞のような免疫調節に関連した細胞を刺激してTh0リンパ球のTh1リンパ球への分化を誘導するサイトカインの生成を促進させてTh2反応の過剰による Th1/ Th2不均衡を調節できる免疫調節力があると確認された。ラクトバチルス・ プランタラムCJLP133の免疫増強効果に対してより具体的に説明すれば次の ようになる。
【００３１】
ラクトバチルス・プランタラムCJLP133は、陰性対照群に比べて、卵アルブミン(OVA)を投与してTh2反応に偏向したマウスの脾臟細胞(spleenocyt e)を処 理した時Th1反応誘導サイトカインのIL-12を7.3 - 9.5倍高く生成し、Th2反応誘導サイトカインのIL-4の生成を3.2 - 12.1%水準で抑制した。こ れは他の典型的な乳酸菌Lactobacillus rhamnosusGG(KCTC5033)、Lactobacillus casei (KCTC 3109) 、Lactobacillus sakei CJLS118(KCTC13416)に比べて顕 著に 優秀だと確認された。したがって、ラクトバチルス・プランタラムCJ L P133は、Th2反応を抑制してTh1反応を促進して、Th2反応の過剰によるTh1/ Th2不均衡を調節する免疫調節力があるといえる。
【００３２】
また、ラクトバチルス・プランタラムCJLP133(Lactobacillus plantarum   CJLP133)でマクロファージ細胞株RAW264.7および樹状細胞JAWS IIを処理した 結果、乳酸菌数が増加するということによってマクロファージ細胞株を刺激して免疫反応を増強させるということが確認された。マクロファージ細胞株RAW264.7と樹状細胞株JAWS IIをラクトバチルス・プランタラムCJLP133で処理し た結果、Th1分化誘導サイトカインIL-12、IL-18の生成を促 進してTh1分化誘 導抑制サイトカインのIL-10はIL-12の生成量に比べて相対的に少なく生成す ることによって、Th1分化誘導を促進すると確認された。したがって、このような実験結果からもラクトバチルス・プランタラムCJLP133は、Th2反応を抑制 してTh1反応を促進して、Th2反応の過剰によるTh1/Th2不均衡を調節する免疫調節力があるといえる。
【００３３】
IL-4は、Th2細胞に由来して特異的に細胞免疫反応の中枢的な役割をし、Th1細胞のサイトカインのIL-12の生産を抑制する抗炎症性サイトカイン(ant i-inflammatory cytokine)機能を持つ。近ごろアトピー皮膚炎患者の末梢血液 と皮膚病変にはIL-4、IL-5等を主に生産するTh2細胞が相対的に増加するとい う事実が知られている(非特許文献10)。したがって、Th2反応過剰によるTh1/Th2の不均衡は、アトピーのような疾患を誘発する。また、既に記載されたように、Th1反応とTh2反応の中の一つが過剰または不足すれば病気が引き起こされて、Th1反応が低下してTh2反応が増加すると、癌、アトピー、アレルギーおよび自家免疫疾患が引き起こされると知られている(非特許文献7)。したがって、本発明によるラクトバチルス・プランタラムCJLP133は、免疫調節と関連したTh1細胞、Th2細胞、マクロファージおよび樹状細胞が生産するサイトカインを調節してTh2反応過剰によるTh1/Th2の不均衡を調節することによって、アトピー、アレルギーのような病気に対し効果的に作用する可能性があることを期待できるだけでなく、癌および自家免疫疾患の予防または治療にも効果があることと期待される。
【００３４】
したがって、本発明は、他の側面において、ラクトバチルス・プランタラムCJLP133を含む免疫増強用組成物を提供する。本発明による免疫増強用組 成物は、ラクトバチルス・プランタラムCJLP133が乳酸菌として前記従来技 術で説明したことのような一般的な乳酸菌の免疫増強作用効果によって免疫増強効果がある。特に、本発明による前記免疫増強用組成物は、下記実施例で立 証されるようにラクトバチルス・プランタラムCJLP133がTh1反応の促進効 果を持ってTh2反応過剰によるTh1/Th2の不均衡を調節する効果があるので、Th2反応過剰によるTh1/Th2の不均衡に誘発される疾患の予防または治療に効果がある。したがって、本発明による前記免疫増強用組成物は、アトピー、ア レルギー、癌および自家免疫疾患の予防または治療に効果的に使われることができる。前記自家免疫疾患は喘息、枯草熱などを含むが、これに限定される のではない。
【００３５】
前記本発明の免疫増強用組成物の投与方法は、特に限定されるのではないが、経口で投与することが好ましい。投与量は、免疫増強が必要な疾患の種類、 疾患の程度、年齢、性別、人種、治療または予防目的などにより変われるが、一般的に成人を基準として一日に1千万細胞〜1000億細胞を投与することができる。
【００３６】
前記本発明によるラクトバチルス・プランタラムCJLP133を含む腸疾患の 予防または治療用組成物および免疫増強用組成物は、安全性が立証された乳酸 菌を含むので副作用などの憂慮なしで医薬品、食品、化粧品、飼料、または飼料添加剤として利用されることができる。
【００３７】
前記本発明による組成物が医薬品として利用される場合には、当該技術分野 に開示されている通常の薬剤学的剤形で製剤化されることができる。前記医薬 品は、好ましくは経口剤形で製剤化されるし、例えば液剤、懸濁剤、散剤、顆 粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤またはエキス剤のような経口投与用剤形で製 剤化されることができる。
【００３８】
前記それぞれの剤形で製剤化するとき、それぞれの剤形の製造に必要な薬剤学的に 許容可能な担体または添加剤を付加して製造することができる。代表的な経口投与用剤形で製剤化するとき前記担体として希釈剤、滑澤剤、結合剤 、崩解剤、甘 美剤、安定剤および防腐剤の1種以上を選択して使えるし、添加剤では香料、ビタミン類および抗酸化剤の1種以上を選択して使うことができる。
【００３９】
前記担体および添加剤は、薬剤学的に許容可能であるものは全部可能で、具 体的に希釈剤では乳糖、とうもろこし澱粉、大豆油、微晶質セルロース、また はマンニトール、滑澤剤ではステアリン酸マグネシウムまたはタルク、結合剤 ではポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルセルロースが 好ましい。また、崩解剤ではカルボキシメチルセルロースカルシウム、澱粉グリコール酸ナトリウム、ポラクリリンカリウムまたはクロスポビドン、甘美剤では白糖、果糖、ソルビトール、または、アスパルテーム、安定剤で はカルボキシメチルセルロースナトリウム、β-シクロデキストリン、白斑、またはキサンタンゴム、防腐剤ではパラオキシ安息香酸メチル、 パラオキシ安息香酸プロピル、または、ソルビン酸カリウムが好ましい。
【００４０】
また、前記成分その他にも公知の添加剤として味覚を良くするために、梅の実香 り、レモン香り、パイナップル香り、ハーブ香りなどの天然香料、天然果汁、クロロフィリン、フラボノイドなどの天然色素、果糖、蜂蜜、糖アルコール、砂 糖のような甘美成分、または、枸櫞酸、枸櫞酸ナトリウムのような酸味剤を混合 して使うこともできる。
【００４１】
このような製剤化方法および製剤化時必要な担体および添加剤に対しては非特許文献11に詳細に記載されている 。
【００４２】
前記本発明による組成物は、食品として利用されることができる。前記食品 は健康機能食品だけでなく、人間が広く通常的に毎日摂取する一般的な食品を含む。健康機能食品として利用される場合、食品学的に許容可能な担体または添加剤とともに当該技術分野で知られている通常の健康機能食品の剤形で製剤化されることができる。前記健康機能食品は、例えば酸剤、顆 粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ剤、液剤、エキス剤、茶、ジェリー、または飲み物などで製造されることができる。前記食品 学的に許容可能な担体または添加剤は、製造しようと思う剤形の製造に当該技術分野で使用可能であることが知られている任意の担体または添加剤が利用されることができる。
【００４３】
前記本発明による組成物は、アトピーの予防または治療効果を持つので、化 粧品として利用されることもできる。前記本発明による組成物が化粧品とし て利用される場合には当該化粧品技術分野で知られている通常の剤形の多様な化粧品で製造されることができる。前記それぞれの剤形で製剤化詩、それ ぞれの剤形の製造に必要な化粧品の製造に許容可能な担体または添加剤を付加して製造することができる。
【００４４】
前記本発明による組成物は、飼料添加剤または、飼料として利用されること ができる。
【００４５】
飼料添加剤として利用される場合、前記組成物は、20ないし90%高濃縮液や粉 末または顆粒形態で製造されることができる。前記飼料添加剤は、枸櫞酸、フマル酸、アジピン酸、乳酸、リンゴ酸などの有機酸や燐酸ナトリウム、燐酸カリウム、酸性ピロ燐酸塩、 ポリ燐酸塩(縮合燐酸塩)等の燐酸塩や、ポリフェノール、カテキン、α-トコフェロール、ローズマリー抽出物、ビタミンC、緑茶抽出物、甘草抽出物、キトサン、タンニン酸、フィチン酸などの天然抗酸化剤の一つまたは一つ以上を追加で含むことができる。飼料として利用される場合、前記組成物は、通常の飼料形態で製剤化されるし、通常の飼料成分を共に含むことができる。
【００４６】
前記飼料添加剤および飼料は、穀物、例えば粉砕または破砕されたコムギ、 燕麦、麦、とうもろこしおよび米;植物性蛋白質飼料、例えばアブラナ、豆、 およびひまわりを主成分とする飼料;動物性蛋白質飼料、例えば血分、肉粉、 骨粉および魚粉;糖分および乳製品、例えば各種粉乳および乳状粉末で成り立つ乾燥成分などをさらに含めるし、その他にも栄養補充剤、消化および吸収向上剤、成長促進剤などをさらに含むことができる。
【００４７】
前記飼料添加剤は、動物に単独で投与したり食用担体中で他の飼料添加剤と 組み合わせて投与することもできる。また、前記飼料添加剤は、トップドレッシングとしてまたはこれらを動物飼料に直接混合したりまたは飼料と別途の経口剤形で容易に動物に投与することができる。前記飼料添加剤を動物飼料と別 に投与する場合、当該技術分野に良く知られた通り薬剤学的に許容可能な食用担体と組み合わせて、直ちに放出または徐放性剤形で製造することができる。 このような食用担体は、固体または液体、例えばとうもろこし澱粉、ラクトー ス、スクロース、豆フレーク、落花生油、オリーブ油、胡麻油およびプロピレ ングリコールでありうる。固体担体が使われる場合、飼料添加剤は、錠剤、カプセル剤、散剤、トローチ剤または含糖錠剤または、未分散性形態のトップドレッシングでありうる。液体担体が使われる場合、飼料添加剤は、ゼラチン軟 質カプセル剤、またはシロップ剤や懸濁液、エマルジョン剤、または溶液剤の剤形でありうる。
【００４８】
前記飼料は、動物の食餌欲求を充足させるのに通常的に使われる任意の蛋白 質-含有有機穀粉を含むことができる。このような蛋白質-含有穀粉は、通常的 にとうもろこし、豆穀粉、またはとうもろこし/豆穀粉ミックスで主に構成されている。
【００４９】
また、前記飼料添加剤および飼料は、補助剤、例えば保存剤、安定化剤、湿 潤剤または乳化剤、溶液促進剤などを含有することができる。前記飼料添加剤 は、浸透、噴霧または、混合して動物の飼料に添加して利用されることができる。
【００５０】
本発明の飼料または飼料添加剤は、哺乳類、家禽および魚類を含む多数の動物食餌に適用することができる。前記哺乳類として豚、牛、羊、ヤギ、実験用 齧齒動物および実験用齧齒動物それだけでなく、愛玩動物(例:犬、猫)等に使 えるし、前記家禽類として鶏、七面鳥、鴨、ガチョウ、キジおよびウズラなど にも使用できて、前記魚類として鱒などに利用されるが、これに限定されるの ではない。
【発明の効果】
【００５１】
既に記載したように、本発明による新規乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムCJLP133は、プロバイオティクスとして耐酸性、耐胆汁酸性および腸上 皮細胞付着性が非常に優秀で整腸効果を持って、Th1反応を促進する効果があ ってＴｈ２反応過剰によるTh1/Th2の不均衡を調節する効果がある。したがって、本発明による新規乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムCJLP133は、腸疾患治療用組成物および免疫増強用組成物として利用されるし、特にTh2反応過剰によるTh1/Th2の不均衡に誘発される疾患の予防または治療に効果的だ。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図1は、ラクトバチルス・プランタラムCJLP113の耐酸性実験結 果を示すグラ フである。
【図２】図2は、ラクトバチルス・プランタラムCJLP133の耐胆汁酸性実験 結果を示すグラフである。
【図３】図3は、ラクトバチルス・プランタラムCJLP133の腸上皮細胞付着 能実験結果を示すグラフである。
【図４】図4は、ラクトバチルス・プランタラムCJLP133菌株で、卵アルブミンを投与してTh2反応に偏向したマウスの脾臟細胞を処理した後Th1反応 誘導サイトカインのIL-12の濃度を測定した結果を他の乳酸菌と比較して示すグ ラフである。
【図５】図5は、ラクトバチルス・プランタラムCJLP133菌株で、卵アルブミンを投与してTh2反応に偏向したマウスの脾臟細胞を処理した後Th2反応 誘導サイトカインのIL-4の濃度を測定した結果を他の乳酸菌と比較して示すグラフである。
【図６】図6は、ラクトバチルス・プランタラムCJLP 133菌株でマクロファ ージ細胞株RAW264.7を処理した後、IL-12およびIL- 10の濃度をELISAで測定 した結果を他の乳酸菌と比較して示すグラフである。
【図７】図7は、ラクトバチルス・プランタラムCJLP133菌株で樹状細胞細 胞株JAWS IIを処理した後、IL-12およびIL-10の濃度をELISAで測定した結果を他の乳酸菌と比較して示すグラフである。
【図８】図8は、ラクトバチルス・プランタラムCJLP133菌株でマクロファ ージ細胞株RAW264.7を処理した後、IL-12p40およびIL-18 mRNAの発現をRT-PCRで測定した結果を他の乳酸菌と比較して示すグラフである。
【図９】図9は、ラクトバチルス・プランタラムCJLP133菌株で樹状細胞細胞株JAWS IIを処理した後、IL-12p40およびIL-18 mRNAの発現をRT-PCRで測定した結果を他の乳酸菌と比較して示すグラフである。
【図１０ａ】図10aは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した皮膚の皮膚厚さを測定した結果を示すグラフである。
【図１０ｂ】図10bは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した皮膚の炎症組織内リンパ球の蓄積程度を光学顕微鏡で観察した結果を撮影した写真である。
【図１１ａ】図11aは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した皮膚の好酸性(eosinophil)の細胞数を測定した結果を 示すグラフである。
【図１１ｂ】図11bは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した皮膚の好酸性(eosinophil)の浸潤程度を光学顕微鏡で観察した結果を撮影した写真である。
【図１２ａ】図12aは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した皮膚の肥満細胞の細胞数を測定した結果を示すグラフである。
【図１２ｂ】図12bは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した皮膚の肥満細胞の浸潤程度を光学顕微鏡で観察した結果を撮影した写真である。
【図１３ａ】図13aは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した皮膚の神経繊維個数を測定した結果を示すグラフである。
【図１３ｂ】図13bは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した皮膚の神経繊維の浸透程度を光学顕微鏡で観察した結果を撮影した写真である。
【図１４ａ】図14aは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した腋窩リンパ節を撮影した写真である。
【図１４ｂ】図14bは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した脾臟を撮影した写真である。
【図１５ａ】図15aは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した腋窩リンパ節の総細胞数をカウンティンした結果を 示すグラフである。
【図１５ｂ】図15bは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した脾臟の総細胞数をカウンティンした結果を示すグラフである。
【図１６ａ】図16aは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した腋窩リンパ節のT-細胞細胞数をカウンティンした結果を示すグラフである。
【図１６ｂ】図16bは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した脾臟のT-細胞細胞数をカウンティンした結果を示すグラフである。
【図１７ａ】図17aは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した腋窩リンパ節のB-細胞細胞数をカウンティンした結果を示すグラフである。
【図１７ｂ】図17bは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した脾臟のB-細胞細胞数をカウンティンした結果を示すグラフである。
【図１８ａ】図18aは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を 投与した後摘出した腋窩リンパ節で得られた単一細胞浮遊液に家ホコリダニ 抽出物を加えて培養後IL-12の量をELISA方法で測定した結果を示すグラフである。
【図１８ｂ】図18bは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を 投与した後摘出した脾臟で得られた単一細胞浮遊液に家ホコリダニ抽出物を 加えて培養後IL-12の量をELISA方法で測定した結果を示すグラフである。
【図１９ａ】図19aは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した腋窩リンパ節で得られた単一細胞富裕額に家ホコリダニ抽出物を加えて培養後IFN-γの量をELISA方法で測定した結果を示すグラフである。
【図１９ｂ】図19bは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した脾臟で得られた単一細胞富裕額に家ホコリダニ抽出物を加えて培養後IFN-γの量をELISA方法で測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
以下、本発明を下記実施例によってより一層具体的に説明する。しかし、これら実施例は本発明に対する理解を助けるためのものだけであり、どんな意味でも本発明の範囲がこれらによって制限されるのではない。
【００５４】
実施例1:微生物ラクトバチルス・プランタラムCJLP133菌株の分離および同定
キムチから分離したラクトバチルス・プランタラムCJLP133菌株を1.5%寒天が含まれたMRS固体培地(Difco,USA)に塗抹して37℃で24時間培養し た後、純粋分離したことが確認された集落を白金耳(loop)で取ってMRS液体培地(Difco,USA)で37℃ 18-24時間培養した。
【００５５】
その次に、CJLP133菌株の形態および生理学的特性をKimなど(非特許文献12)の方法とAPI50CH およびAPI50CHLキット(バイオメリオ社製品)を使って決 めた。その結果確認されたCJLP133菌株の形態および生理学的特性を前記表1 に整理した。
【００５６】
また、乳酸菌同定および分類のための16S rRNA遺伝子の塩基配列を分析した 。16S rRNA遺伝子の塩基配列決定および分析は、Kimなど(非特許文献13)の方 法を使った。その結果確認されたCJLP133の16SrRNA遺伝子の塩基配列は、配列表に記載した(SEQ ID NO:1) 。
【００５７】
ラクトバチルス・プランタラムCJLP133菌株は、16S rRNA塩基配列分析結 果ラクトバチルス・プランタラム標準菌株(Lactobacillus plantarum NBRC 1589 1T、GenBank accession number AB326351)と最も高い相同性(99.9%)を現わ し、ラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarm)と同定され、ラクトバチルス・プランタラムCJLP133と命名し、生命工学研究院遺 伝子銀行に2008年10月16日付で寄託した(受託番号KCTC 11403BP)。
【００５８】
実施例2: ラクトバチルス・プランタラムCJLP133菌株の人工胃液での耐酸性実験および人工胆汁での耐胆汁性実験
人工胃液での耐酸性実験は、Kobayashiなど(非特許文献14)の実験を変形し て製造した人工胃液を使って進行し、具体的に人工胃液は、MRS液体培地を 1N HCl で pH 2.5になるように調整してペブシンを1000 ユニット/mlにな るように添加した後滅菌して製造した。
【００５９】
前記実施例1で分離および同定されたラクトバチルス・プランタラムC J LP133をMRS液体培地で37℃、 18時間の間培養した菌体を遠心分離して乳酸菌を沈殿させてまた滅菌食塩水(0.85%NaCl)で2回洗浄した後菌体懸濁液を対照群培地と人工胃液に各々約107 cfu/ml水準で接種させて37℃で培養しなが ら接種後0および3時間後に生存菌数を測定した。総菌数は、KH2PO4、Na2HPO、L-システイン、HCl、Tween80等が含まれた燐酸緩衝液(pH6.8)で10倍希釈して測定した。
【００６０】
人工胆汁での耐胆汁性実験は、Caseyなど(非特許文献15)の方法により進行し、前記耐酸性評価で使われたMRS液体培地に雄牛胆汁を0.3%添加した後、前記耐酸性評価方法と同じ方法で乳酸菌接種後0時間、12時間、24時間後 に生存菌数を測定した。
【００６１】
前記耐酸性評価および耐胆汁酸性評価で典型的な乳酸菌のLactobacillusc asei(KCTC 3109)、Lactobacillus sakeiCJLS118(KCTC 13416)、およびLactobaill us rhamnosus GG(KCTC 5033)に対しても同一に比較実験を遂行した。
【００６２】
その結果を図1および図2に示した。図1はラクトバチルス・プランタラムC J LP133の耐酸性実験結果を示したグラフである。図2はラクトバチルス・プランタラムC J LP133の耐胆汁酸性実験結果を示したグラフである。
【００６３】
図1および図2の結果によれば、ラクトバチルス・プランタラムC J LP133は、比較実験した他の乳酸菌に比べて同等以上の耐酸性および耐胆汁酸性を持つことが明らかになった。これは本発明による新規菌株が体内で胃液の影響を受けないで腸まで到達することができるし腸内では胆汁の影響を受けないで生 存する可能性があることを示す。
【００６４】
実施例3:ラクトバチルス・プランタラムC J LP133菌株の腸上皮細胞に対する付着能実験
腸上皮細胞付着能試験のための動物細胞としてHT-29を韓国細胞株銀行(KCLB)で譲り受けて使い、実験方法は、キムなど(非特許文献16)とHiranoなど(非特許文献17)の方法を使った。
【００６５】
HT-29細胞は、熱非活性化された10%牛胎児血清(FBS)、1% L-グルタミン、ペ ニシリンG (100IU/mL)、そしてストレプトマイシン(100 mg/mL)が添加されたR PMI1640(Gibco、USA)培地を利用して5% CO2存在下で37℃で培養させた。付着 能実験と付着抑制能実験のためにHT-29細胞は、ウェル当り1.0×105細胞/mLの数になるように24ウェル-プレートに播き、隔日で培地を交換して完全に単一層(monolayer)を形成する時まで培養して実験に使った。完全単一層を形成したHT-29細胞は、25℃のPBS緩衝溶液を利用して5回洗浄して抗生剤が添加されなかったRPMI1640培地0.5 mLを添加した。
【００６６】
ラクトバチルス・プランタラムC J LP133は、各々約1.0×109 cfu/mLの濃度 になるようにRPMIに懸濁した後前記ウェルプレートに接種して5% CO2存在下 で37℃で2時間の間培養を実施した。培養が完了した後付着しなかった乳酸菌 の除去と洗浄による付着能力を確認するために3分ずつ200rpmの速度で攪拌し ながらPBS緩衝溶液を使って3回洗浄を実施した。洗浄が完了した後0.2%ト リプシン-EDTAを加えて付着している細胞を引き離してペプトン(peptone)数を利用して連続希釈法でMRS-寒天(agar)に平板塗抹して37℃で24時間の間 培養して菌数を測定した。
【００６７】
別に、一部付着確認のために70%アルコールに一日程度漬けて完全殺菌されたカバーグラスをシャーレ底に付着させた後HT-29細胞を培養して上と同量の乳酸菌を添加して実験した。洗浄によって洗い流されていかないでHT-29細胞に付着した乳酸菌株は、乾燥した後Gram染色をして光学顕微鏡で 観察して、菌数を測定した。Lactobacillus sakei CJLS118(KCTC13416)、およ びLactoba illus rhamnosusGG(KCTC 5033)に対しても同一に比較実験を遂行し た。
【００６８】
その結果を図3に示した。図3は、ラクトバチルス・プランタラムCJLP133の腸上皮細胞付着能実験結果を示すグラフである。
【００６９】
図3の結果によれば、ラクトバチルス・プランタラムCJLP133は、プロバオ ティクス菌株として商業的に良く知られたLactobacillus rhamnosusGG(KCTC 5033) とLactobacillus sakeiCJLS118(KCTC13416)に比べて24時間経過後腸上皮細胞 付着能が優秀なことが明らかになった。特にLactobacillus sakeiCJLS118 (KCTC13416)に比べて腸上皮細胞付着能が顕著に高いことが分かった。このよ うな結果は本発明による新規菌株が腸上皮細胞に付着して腸内環境を改善する 可能性があることを示す。
【００７０】
実施例4:ラクトバチルス・プランタラムC J LP133菌株の安全性評価
前記実施例1で分離した菌株の安全性を評価するために韓国バイオベンチャ ー協会団体標準で提示した安全性評価試験法により溶血現象検査、ゼラチン液化反応検査、有害代謝産物(アンモニア)生成確認、フェニルアラニンデアミナーゼ検査を遂行した。
【００７１】
その結果を下記表2に示した。
【表２】
0005718917.tif 000004
【００７２】
前記結果によれば、ラクトバチルス・プランタラムC J LP133(Lactobacill us plantarum CJLP133)は、ゼラチン液化反応、有害代謝産物(アンモニア)生成 、フェニルアラニンデアミナーゼ生成に対して陰性であり、溶血現象検査では病原 性と関係がないと判定されるα-溶血が確認された。したがって、ラクトバチルス・プランタラムC J LP133は、人体に投与できる安全な菌株であることが確認された。
【００７３】
実施例5:マウス脾臟細胞処理後IL-12生成促進力評価
ラクトバチルス・プランタラムC J LP133(Lactobacillus plantarum CJLP 133)菌株で、卵アルブミンを投与してTh2反応に偏向したマウスの脾臟細胞を処理した時のTh1反応誘導サイトカインのIL-12生成促進力を評価するために、Fujiw araなど(非特許文献18)とFujiwaraなど(非特許文献19)を参考にして次のよ うに実験を行った。
【００７４】
免疫化(immunization)は、6週令の雌Balb/cマウス5匹を購入して、alumhy droxide(Sigma) 13 mg/mL溶液1.538 mL、卵アルブミン10 mgおよびPBS 0.4615 mlとよく混合して常温で20分間反応させた混合液をマウス当たり0.2 mL(1 mg OVA+2mg alum)ずつ腹腔に注射し、同じ量を6日目にまた腹腔に注射し てブースト(boosting)した。マウスを13日目犠牲させて脾臟を摘出し、これから得られた脾臟細胞(splenocyte)100μｌ(4x106細胞/mL)と試験対象菌 の死菌50μｌと卵アルブミン50μｌ(4mg/Ml)を細胞培養ウェルプレー ト(cell c ulture well plate)に加えてDMEM-10培地中で7日間10% CO2培養器で培養した 。7日間培養した後、上清液を取ってIL-12 ELISAキットでアッセイ(Biosou rce)を遂行してIL-12の濃度を測定した。
【００７５】
前記試験対象菌の死菌は、次のように獲得した。
【００７６】
試験対象菌は、MRS液体培地(Difco)に接種して37℃で24時間培養し、13,000rpmで1分間遠心分離して得た菌体を生理食塩水で2回洗浄後菌体だけを取った。回収された菌体は動物細胞株接種試験のために原培養液体積と同一体積の滅菌蒸溜水で100℃で10分間加熱し、13,000rpmで1分間遠心分離をし た後回収してDMEM培地に適当量希釈して細胞株培養液体積基準として50μg/Mlと5μg/Mlの濃度の菌体になるようにした。試験対象菌としてラクトバチルス・プランタラムC J LP133を使い、Lactobaillus rhamnosus GG(KCTC 5033)、Lactobacillus casei(KCTC 3109)、Lactobacillus sakei CJLS118(KCTC 13416)に対しても同じ実験を遂行してその結果を比較した。
【００７７】
前記IL-12 ELISAキットを利用したIL-12アッセイ(assay)は、IL-12 ELISA キットに提供された指示事項により実験を進行し、ELISA readerで測定され たO.D.値を測定してキットに提供されたIL-12対照サンプルに対する検量式に よりIL-12生成量を換算した。そのようにして、得られた測定結果を図4に示した。
【００７８】
図4は、ラクトバチルス・プランタラムC J LP133菌株で、卵アルブミンを投与 してTh2反応に偏向したマウスの脾臟細胞を処理した後、Th1反応誘導サイトカインのIL-12の濃度を測定した結果を他の乳酸菌と比較して示したグラ フである 。
【００７９】
図4の結果によれば、ラクトバチルス・プランタラムC J LP133は 、Th1反 応誘導サイトカインのIL-12の生成を他の乳酸菌に比べて顕著に促進させるこ とが明らかになった。したがって、本発明によるラクトバチルス・プランタラムC J LP133は、Th2反応に偏向したマウスでTh1反応を効果的に誘導する ということを確認することができた。
【００８０】
実施例6:マウス 脾臟細胞処理後IL-4生成抑制力評価
ラクトバチルス・プランタラムC J LP133(Lactobacillus plantarum CJLP 133)菌株で、卵アルブミンを投与してTh2反応に偏向したマウスの脾臟細胞を処理した時、Th2反応誘導サイトカインのIL-4の生成抑制効果を確認するために、前記実施例5の方法でIL-12キットの代わりにIL-4キット(Biosource)を使うこ とだけ違って残りの条件は同一に実験を進行した。そのようにして測定した結果を図5に示した。
【００８１】
図5は、ラクトバチルス・プランタラムC J LP133菌株で、卵アルブミンを投 与してTh2反応に偏向したマウスの脾臟細胞を処理した後、Th2反応誘導サイトカインのIL-4の濃度を測定した結果を他の乳酸菌と比較して示したグラフで ある。 
図5に示した結果によれば、ラクトバチルス・プランタラムC J LP133は、 Th2反応誘導サイトカインのIL-4サイトカインを抑制することによってTh2反 応に偏向したマウス脾臟細胞でTh2反応に対する抑制効果があるということを 確認することができた。
【００８２】
実施例7: マクロファージおよび 樹状細胞における、Th1リンパ球分化誘導サイトカインIL-12p40およびIL-18の発現と、Th1リンパ球分化抑制サイトカインのIL-10発現確認実験
マクロファージおよび樹状細胞のような抗原提示細胞(antigen presenting c ell,APC)は、IL-12およびIL-18を生成してTh0リンパ球からTh1リンパ球への分化 を誘導し、他の一方ではIL-10を生成してTh1リンパ球の分化誘導を抑制する。本発明による乳酸菌がマクロファージおよび樹状細胞のIL-12、IL-10、 IL-18の生成に及ぼす影響を評価するために次のような実験を遂行した。
【００８３】
試験対象菌をマクロファージ細胞株のRAW264.7に5×107/mL濃度で加えて 37℃、10% CO2培養を48時間の間遂行した後培地を取ってELISA方法でIL-12 p40およびIL-10の濃度を測定した。また、樹状細胞細胞株のJAWS IIにも同じ 方法で試験対象菌を接種および培養した後培地を取ってIL-12p40およびIL-10 の生成量を測定した。
【００８４】
前記試験対象菌としてラクトバチルス・プランタラムC J LP133を使い、陽の対照群としてリポポルリサカライドを使い、Lactobaillus rhamnosus GG(KCTC 5033)、Lactobacillus casei(KCTC 3109)、Lactobacillus sakei CJLS118(KCTC 13416)に対しても同じ実験を遂行してその結果を比較した。
【００８５】
前記ELISA方法による濃度測定は、IL-12の濃度を測定できるIL-12p40キッ ト(BD Biosciences、USA)およびIL-10の濃度を測定できるIL-10キット(BD Bios ciences、USA)を利用して製造会社の指針により遂行した。そのようにして、測 定されたそれぞれの結果を図6および図7に示した。
【００８６】
図6は、ラクトバチルス・プランタラムC J LP133菌株でマクロファージ細 胞株RAW264.7を処理した後、IL-12およびIL-10の濃度をELISAで測定した結 果を他の乳酸菌と比較して示したグラフである。
【００８７】
図7は、ラクトバチルス・プランタラムC J LP133菌株で樹状細胞細胞株J AWS IIを処理した後、IL-12およびIL-10の濃度をELISAで測定した結果を他の 乳酸菌と比較して示したグラフである。
【００８８】
図6および7の結果によれば、ラクトバチルス・プランタラムC J LP133は 、Th1分化誘導サイトカインのIL-12サイトカインを生成させて、Th1分化抑抑 制サイトカインIL-10の生成は、IL-12に比べて顕著に少なく生成させること を確認できるし、他の乳酸菌に比べてIL-12の生成を顕著に増加させるということが分かる。
【００８９】
また、遺伝子水準(level)でのIL-12およびIL-18の生成を確認するために試 験対象菌をマクロファージ細胞株のRAW264.7に5×107/mL濃度で加えて、 37℃、10% CO2培養を6時間の間遂行した後総RNAを抽出してRT-PCR方法でIL-12 とIL-18 mRNAの生成量を測定した。樹状細胞細胞株のJAWS IIにも同じ方法で 試験対象菌を接種および培養した後RNAを抽出してRT-PCR方法でIL-12とIL- 18mRNAの生成量を測定した。
【００９０】
そのようにして、測定されたそれぞれの結果を図8および図9に示した。
【００９１】
図8は、ラクトバチルス・プランタラムC J LP133菌株でマクロファージ細 胞株RAW264.7を処理した後、IL-12p40およびIL-18mRNAの発現をRT-PCRで測 定した結果を他の乳酸菌と比較して示したグラフである。
【００９２】
図9は、ラクトバチルス・プランタラムC J LP133菌株で樹状細胞細胞株JA WS IIを処理した後、IL-12p40およびIL-18mRNAの発現をRT-PCRで測定した結果を他の乳酸菌と比較して示したグラフである。
【００９３】
図8および9の結果によれば、ラクトバチルス・プランタラムC J LP133は 、Th1分化誘導抑制のIL-12およびIL-18の生成を指示するmRNAの生成を促進 させるということが分かり、特にIL-12 mRNAの発現促進において他の乳酸菌 に比べて顕著に優秀だと確認された。
【００９４】
実施例8: ラクトバチルス・プランタラムC J LP133菌株のアトピー性皮膚疾患に対するin vivo試験
1)実験動物飼育および実験群分類
4周齢の雌NC/Ngaマウスを購入して1週間安定化させた後乳酸菌菌株の経口投与を始めた。飼育環境は24±2℃、明暗周期は12時間間隔を維持して飼料は抗生剤が添加されなかった粉末飼料を使った。乳酸菌を粉末飼料に等しく混合して10週の間マウスが摂取するようにし (1×1010cfu/匹)、乳酸菌投与後6週目から5週の間Biostar AD(Biostir,Japan)軟膏を塗布してアトピーを誘発させた。実験群はアトピーを誘発しない非誘導群(non-induction group)、アトピーを誘発した対照群(control group)、アトピーを誘発して乳酸菌菌株を投与した実験群で分けて各群ごとにマウスを8匹ずつ使用した(表3)。乳酸菌では従来開示された典型的な乳酸菌のLactobacillus sakei CJLS118(KCTC 1341 6)、Lactobacillus rhamnosus GG(KCTC 5033)、本発明の出願人が開発した菌株CJL P55(KCTC 11401BP)、CJLP56(KCTC 11402BP)、CJLP136(KCTC 11404BP)および本発明による菌株CJLP133(KCTC 11403BP)を対象にした。
【表３】
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【００９５】
2)アトピー誘発
NC/Ngaマウスの背中側、耳殻上部分まで剃毛器で最大限剃毛と剃毛クリー ムを利用して毛を完全に除去した。塗布部位に4%SDS水溶液を噴霧して皮膚の脂肪成分を除去して約1時間の間完全に乾燥させた後平たく広いスティックを利用してBiostir AD軟膏(Biostir、Japan)100 mgを背中側、耳殻の部分に均 一に塗布した。Biostir AD軟膏塗布は週2回で5週間合計10回実施した。
【００９６】
3)組織染色
アトピー皮膚炎では反復される炎症反応により皮膚の厚さが増加してリンパ球、単核球、好酸球(eosinophil)、肥満細胞など主要免疫細胞が組織内にたくさん浸潤して炎症反応を起こすだけでなく神経繊維が非正常的に表皮層まで拡張されてかゆみ症が誘発されると知られている。したがって、アトピー誘発マウスの皮膚を摘出して前記免疫細胞および神経細胞の数をカウントして観察した。
【００９７】
5週間のアトピー誘発後マウスを処分して背中皮膚を摘出してAccustain f ormalin-free fixative溶液で組織を固定した後パラフィンブロック(paraffin block)を製作した。5μm厚さで薄く切った後ヘマトキシリン/エオシン(hematoxylin/eosin)染色を施行して皮膚(表皮+真皮)厚さの変化を観察して炎症組織内リンパ球の蓄積程度を光学顕微鏡下2×2mm範囲で観察した。また、肥満細胞(mast cell)確認のためにトルイジンブルー(toluidine blue)で染色し、好 酸球(eosinophil)確認のためにコンゴーレッド(Congo red)で染色して光学顕 微鏡下2×2mm範囲で観察して表皮から筋肉組織の間の皮膚に存在する肥満細胞または好酸球細胞数をカウントした。皮膚組織内神経繊維の侵入を免疫組織染色で確認するために先立って固定させた組織に神経繊維を認識するanti-protein gene product(PGP9.5)抗体を反応させて続いてbiotin-conjugated goat a nti-rabbit抗体およびperoxidase-conjugated streptavidinを順に反応させ てペルオキシダーゼ酵素反応で発色させた。
【００９８】
その結果を図10ないし図13に示した。
【００９９】
図10aは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した皮膚の皮膚厚さを測定した結果を示すグラフである。
【０１００】
図10bは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した皮膚での炎症組織内リンパ球の蓄積程度を光学顕微鏡で観察した結果を撮影した写真である。
【０１０１】
図11aは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した皮膚での好酸球の細胞数を測定した結果を 示すグラフである。
【０１０２】
図11bは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した皮膚での好酸球の浸潤程度を光学顕微鏡で観察した結果を撮影した写真である。
【０１０３】
図12aは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した皮膚での肥満細胞の細胞数を測定した結果を示すグラフである。
【０１０４】
図12bは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した皮膚での肥満細胞の浸潤程度を光学顕微鏡で観察した結果を撮影した写真である。
【０１０５】
図13aは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した皮膚での神経繊維個数を測定した結果を示すグラフである。
【０１０６】
図13bは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した皮膚での神経繊維の浸潤程度を光学顕微鏡で観察した結果を撮影した写真である。
【０１０７】
前記結果によれば、アトピーを誘発したNC/Ngaマウスの大部分の実験群で100μm程度の皮膚厚さが現れる反面CJLP133投与群では半分水準の50μmの厚 さを維持すると確認され (図10a)、リンパ球および単核球の浸潤を観察した時対照群(control)およびGG群で数多くの免疫細胞が紫色で染色されて現れたが、CJLP133投与群では顕著に少ない数の免疫細胞が観察された(図10b)。
【０１０８】
炎症組織内好酸球と肥満細胞の浸潤を確認した結果、アトピー誘発時(対照群)非誘導(non-induction)群より好酸球と肥満細胞の数が増加したが、CJLP133を投与した群では対照群および他の乳酸菌投与群に比べて好酸球と肥満細胞の数が顕著に少ないことが分かった(図11aおよび12a)。実際染色写真でも対照群とGG投与群で多数の青藍色好酸球、赤褐色肥満細胞が各々観察される反 面CJLP133投与群では少ない数の好酸球および肥満細胞が観察された(図11bお よび図12b)。
【０１０９】
免疫組織染色方法で神経繊維の浸透を確認した結果非誘導群では神経繊維の浸透が観察されなかったが対照群では茶色の神経繊維が多数現れ (図13a)、乳酸菌を投与した群では皮膚に浸透した神経繊維の個数が減少し、特にCJLP55、CJLP133、CJLP136投与群で神経繊維の個数が顕著に少なく現れた(図13b)。
【０１１０】
4)腋窩リンパ節および脾臟細胞組成確認
腋窩リンパ節 (ALN)は慢性アトピー疾患動物モデルで重要な役割をする免疫器官として、一部深刻な慢性アトピー患者の場合 腋窩リンパ節の大きさが増 加したという報告があり、家ホコリダニで誘発されたアトピー動物モデルNC/Ngaマウスの場合多くの研究報告で腋窩リンパ節を直接的な標的リンパ節に 定めて観察している。したがって本研究では5週の間のアトピー誘発後腋窩リンパ節はもちろん主要免疫器官の脾臟を摘出して大きさおよび細胞組成の変化を観 察した。
【０１１１】
5週間のアトピー誘発後マウスを急殺して腋窩リンパ節(axillary lymph nod e)と脾臟を摘出して大きさを比較した後、赤血球を除去して各組織の単細 胞浮遊液を得た。FACSチューブ当り1×106細胞になるように分注して各々抗-Thy1.2-F ITC、抗-CD19-FITC、抗-F4/80-FITC、抗-CD11c-FITC抗体で染色してFACS分析 してTリンパ球およびBリンパ球組成を確認した。その結果を図14ないし図 17に示した。
【０１１２】
図14aは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した腋窩リンパ節を撮影した写真である。
【０１１３】
図14bは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した脾臟を撮影した写真である。
【０１１４】
図15aは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した腋窩リンパ節での総細胞数をカウントした結果を 示すグラフである。
【０１１５】
図15bは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した脾臟での総細胞数をカウントした結果を示すグラフである。
【０１１６】
図16aは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した腋窩リンパ節でのT-細胞細胞数をカウントした結果を示すグラフである。
【０１１７】
図16bは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した脾臟でのT-細胞細胞数をカウントした結果を示すグラフである。
【０１１８】
図17aは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した腋窩リンパ節でのB-細胞細胞数をカウントした結果を示すグラフである。
【０１１９】
図17bは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した脾臟でのB-細胞細胞数をカウントした結果を示すグラフである。
【０１２０】
前記結果によれば、腋窩リンパ節はアトピー疾患を誘発した対照群で大き さが増加し、GG投与群でも対照群と類似の大きさで観察されたが、CJLP55、CJLP56、CJLP133、CJLP136、およびCJLS118それぞれの投与群では腋窩リンパ節の大きさが対照群よりは小さいと確認された(図14a)。脾臟の場合、実験 群による大きい差が殆どなかった(図14b)。腋窩リンパ節で細胞を分離して 細胞数を測定した結果非誘導群に比べて対照群では4.5倍以上細胞数が増加したことが確認され、CJLP55、CJLP133、CJLP136投与群の場合、対照群に比べて細胞数が有意に減少した(図15a)。脾臟の場合、大きさと同じように 細胞数で大きい変化がなかった(図15b)。
【０１２１】
腋窩リンパ節と脾臟でのTリンパ球およびBリンパ球を各々染色してFAC S分 析法で確認した結果によれば、腋窩リンパ節 でTリンパ球とBリンパ球の場合 、アトピーを誘発した対照群で5倍程度細胞数が増加し、CJLP55、CJLP56、CJLP133、CJLP136投与群で対照群に比べて全部統計的に有意に細胞数が減少したことが明らかになり、特にCJLP133投与群が違う乳酸菌投与群より顕著に減少することが明らかになった(図16aおよび17a)。脾臟のTリンパ 球とBリンパ球細胞数は大きく変化がなかった(図16bおよび17b) 。
【０１２２】
5)腋窩リンパ節細胞と脾臟細胞のサイトカイン生成能
マクロファージで主に生成されるIL-12はThOリンパ球をTh1リンパ球に分化誘導して、Th1リンパ球で生成されるIFN-γはマクロファージを活性化させるだけでなくTh2リンパ球の分化と活性を抑制するので、IL-12およびIFN-γ生成量の変化を測定した。
【０１２３】
前記4)腋窩リンパ節および脾臟細胞組成確認 実験で腋窩リンパ節および脾臟細胞から得た各組織の単細胞浮遊液 を24ウェル-プレートに各5×106 細 胞ずつ分注して家ホコリダニ(Dermatophagoides farinae body、Dfb)抽出物を 最終濃度10μg/mlになるように入れた。37℃で48時間培養後上層液を取ってIFN-γおよびIL-12生成量をELISA方法で測定した。その結果を図18 および図19に示した。
【０１２４】
図18aは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘 出した腋窩リンパ節で得られた単細胞浮遊液に家ホコリダニ抽出物を加えて 培養後IL-12の量をELISA方法で測定した結果を示すグラフである。
【０１２５】
図18bは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘 出した脾臟で得られた単細胞浮遊液に家ホコリダニ抽出物を加えて培養後 IL-12の量をELISA方法で測定した結果を示すグラフである。
【０１２６】
図19aは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した腋窩リンパ節で得られた単細胞浮遊液に家ホコリダニ抽出物を加えて培養後IFN-γの量をELISA方法で測定した結果を示すグラフである。
【０１２７】
図19bは、アトピー皮膚炎を誘発したNC/Ngaマウスに乳酸菌を投与した後摘出した脾臟で得られた単細胞浮遊液に家ホコリダニ抽出物を加えて培養後IFN-γの量をELISA方法で測定した結果を示すグラフである。
【０１２８】
前記結果によれば、CJLP133投与群が対照群に比べて腋窩リンパ節および 脾臟でIL-12の生成量が顕著に増加し (図18)、IFN-γの生成量もまた、 顕著に増加することが明らかになった(図19)。それだけでなく、他の公知の乳酸菌に比べてもIFN-γおよびIL-12生成量の増加が顕著にさらに高いことが 分かった。
【０１２９】
前記1)ないし5)の実験結果を総合してみれば、CJLP55、CJLP56、CJLP133、CJLP136投与群全部がアトピー性皮膚炎の症状を改善する効果を示して、特にCJLP133投与群はその効果が優れて腋窩リンパ節の大きさおよび腋窩リンパ節 での細胞数、皮膚炎症組織での免疫細胞浸潤および神経細胞浸透、Th1/Th2サイトウカイン均衡など細胞および分子的効果の点で従来の乳酸菌に比べてアトピ ー 皮膚炎に対する効果が顕著に優秀だと確認された。
【０１３０】
実施例9: ラクトバチルス・プランタラムC J LP133(Lactobacillus plantarum CJLP133)を含む生菌剤製造
前記実施例1で同定されたプロバイオティクスとしてのラクトバチルス・プランタラムCJLP133(Lactobacillus plantarum CJLP133)を医薬品、食品、飼料、飼料 添加剤、または化粧品の原料で適用するために大量生産してこれを凍結乾燥して生菌剤化した。
【０１３１】
菌の生産のためにMRS液体培地(Difco)で25% NaOH溶液を使ってpHを6.0で 調節しながら37℃で約18時間培養をして遠心分離を遂行して菌体を回収した。回収した菌体はデキストリン5%と脱脂牛乳10%を凍結保護剤として使って-40℃で凍結後37℃で乾燥した菌体をミキサーで砕いて粉体化した。粉体化した生菌は目標にする菌数に合わせて保管をするために適当量の葡萄糖、乳糖、脱脂 牛乳などと同じ賦形剤と混合して密封されるアルミニウムパウチに入れて包装 した。
【０１３２】
このように製造された生菌剤は飼料に原料で使われる穀物粉と混合して飼料 用生菌剤で活用したり、担体または添加剤などを混合して錠剤、カプセルなど の医薬品、健康機能食品用生菌剤で活用したり、化粧品に使われる原料に一定 量を混合することによって医薬品、食品、飼料、化粧品など多様な分野に当該技術分野で通常の方法により活用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【配列表】
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