(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性溶媒に親和性を有するポリエチレングリコール系生体適合性高分子を接合した分岐ポリエチレンイミン、およびナノ粒子の表面に親和性を有するポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＰＤＯＰＡ）を含むポリエチレンイミン‐グラフト‐（ポリエチレングリコール；ポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）によって水性溶媒中に分散および安定化した酸化鉄ナノ粒子を含み、前記ポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＰＤＯＰＡ）は、Ｌ‐ＤＯＰＡ（Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）のＮ‐カルボキシ無水物から合成したＬ‐ＰＤＯＰＡ、Ｄ‐ＤＯＰＡ（Ｄ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）のＮ‐カルボキシ無水物から合成したＤ‐ＰＤＯＰＡ、およびＬ，Ｄ‐ＤＯＰＡのＮ‐カルボキシ無水物から合成したＬ，Ｄ‐ＰＤＯＰＡから選択されることを特徴とする、リンパ節造影剤。
【請求項２】
前記酸化鉄ナノ粒子は、直径が１〜２５ｎｍであることを特徴とする、請求項１に記載のリンパ節造影剤。
【請求項３】
前記水性溶媒中に分散した酸化鉄ナノ粒子は、流体力学的直径が３〜１００ｎｍであることを特徴とする、請求項１又は２に記載のリンパ節造影剤。
【請求項４】
前記ポリエチレングリコールは、数平均分子量が３００〜５０，０００であり、その一端にヒドロキシル基またはカルボキシル基を有していることを特徴とする、請求項１から３の何れか一項に記載のリンパ節造影剤。
【請求項５】
前記分岐ポリエチレンイミンは、数平均分子量が１００〜１０，１００であることを特徴とする、請求項１から４の何れか一項に記載のリンパ節造影剤。
【請求項６】
前記ポリエチレンイミン‐グラフト‐（ポリエチレングリコール；ポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）は、
下記構造（Ａ）で表されるポリエチレングリコールユニットと、
分岐ポリエチレンイミンユニットと、
下記構造（Ｃ）で表されるポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンユニットと、を含むことを特徴とする、請求項１から５の何れか一項に記載のリンパ節造影剤。
0005799161.tif 000023
（Ａ）
［ａは、２〜１２００の範囲である。］
0005799161.tif 000024
（Ｃ）
［ｄの範囲は、１〜１００である。］
【請求項７】
投与前のリンパ節のＭＲＩシグナルと、投与後のリンパ節のＭＲＩシグナルの強度変化または強度差を用いてリンパ節を造影するために用いることを特徴とする、請求項１から６の何れか一項に記載のリンパ節造影剤。
【請求項８】
静脈注射によって投与されることを特徴とする、請求項１から７の何れか一項に記載のリンパ節造影剤。
【請求項９】
前記リンパ節のＭＲＩシグナルの強度変化は、Ｔ２シグナル強度の変化を基準とする、請求項７又は８に記載のリンパ節造影剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イガイ類接着タンパク質模倣共重合体により、水性溶媒中に分散安定化した酸化鉄ナノ粒子を含むリンパ節造影のための造影剤、これを用いてリンパ節を造影する方法およびリンパ節の癌を診断する方法に関する。より詳細には、前記イガイ類接着タンパク質模倣共重合体は、ポリエチレンイミン‐グラフト‐（ポリエチレングリコール；ポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）（ＰＥＩ-グラフト-（ＰＥＧ；ＰＤＯＰＡ））である。前記グラフトポリマーは、２つの部分で構成されており、１つは、水性溶媒に親和性を有するポリエチレングリコールをベースとした生体適合性高分子を接合したポリエチレンイミン（時々、polyethyleneglycol grafted polyethyleneimineと省略）を含み、もう１つは、ナノ粒子の表面に親和性を有するポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＰＤＯＰＡ）である。本発明は、前記イガイ類接着タンパク質模倣共重合体で酸化鉄粒子の表面を改変させ、水に分散させて調製したコロイド溶液を含むリンパ節造影のための造影剤およびこれを用いてリンパ節を造影する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノ粒子は、ナノ‐電子融合技術、バイオイメージング技術、医学分野などの様々な分野に応用されている。特に、超常磁性酸化鉄ナノ粒子は、磁気共鳴映像（ＭＲＩ）の造影剤、細胞治療、温熱療法、ドラッグデリバリー、細胞分離、核酸調製など多数の生命‐医学分野において用いられている。
【０００３】
ナノ粒子を生命‐医学分野に応用するための最も重要な要件は、第一に、高品質のナノ粒子を確保することと、生体溶媒においてナノ粒子が優れた分散度および分散安定性を有することである。ここで、高品質のナノ粒子は、i）粒子サイズの均一性、ii）粒子サイズ調節の容易性、iii）粒子の結晶性、およびiv）粒子形状の調節可能性などで把握することができる。
【０００４】
しかし、現在商用化しているナノ粒子は、ほとんどが水性系での合成または気状での合成過程を経て取得し、このような過程により取得したナノ粒子は均一な粒子形状を有することが難しく、結晶性に劣る場合がほとんどである。また、均一なサイズのナノ粒子を製造することが容易でなく、そのサイズを調節することもまた難しい。
【０００５】
近年、多数の研究者らは、従来水性系で合成したナノ粒子に比べて比較的高品質、即ち均一なサイズと結晶性を有する金属酸化物ナノ粒子を有機系で合成する新しい方法を開発した。
【０００６】
このように有機溶媒内でナノ粒子を合成する場合、ナノ粒子の均一性とそのサイズが合成過程中に有機添加剤による安定化過程により調節されることがある。結果、ナノ粒子の表面の状態は有機添加剤の疎水性の影響を受けるため、金属酸化物ナノ粒子は疎水性有機溶媒には容易に分散されるが、水には容易に分散されず、水に分散した場合には分散状態が十分な安定性を有しない。
【０００７】
このような有機溶媒内で調製されたナノ粒子の表面の疎水性は、水における安定した分散を妨害するため、生命‐医学分野で使用するには問題がある。そのため、このような応用分野に適用するために、ナノ粒子の表面を親水性に改質し、水性溶媒中に均質に分散するために好適な状態にするための生体適合性分散安定化剤の開発が要求されている。それだけでなく、このような生体適合性分散安定化剤を使用して分散状態を安定的に維持するナノ粒子分散コロイド溶液の開発が要求されている。
【０００８】
ナノ粒子を水性系に分散するための従来技術に係る方法として、薄い厚さのシリカ層を用いる方法が、近年、学会誌［Journal of American Chemical Society，２００５，１２７，４９９０］に発表された。この論文では、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（polyoxyethylene nonylphenyl ether）をシクロヘキサン溶液に導入、混合してマイクロミセル乳化液滴を形成した後、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）のゾル‐ゲル反応を誘導して、ナノ粒子をシリカ層で被覆して水に分散した。前記文献では、有機溶媒内で調製されたナノ粒子を水に分散するために、ナノ粒子の外部に親水性を有するシリカ層をコーティングする過程が開示されており、ここで用いられたマイクロエマルション（micro emulsion）によるシリカコーティング法では一回の工程で被覆できるナノ粒子の量が極めて少ないため、結果、一回の工程で製造できるナノ粒子コロイドの量が極めて少ないという問題点がある。また、一回の工程で製造できるナノ粒子コロイドの量またはポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルなどの量によってマイクロエマルションの条件が変化するため、必要とするシリカ層の厚さを微細に調節することが難しく、シリカ層の内部に含まれたナノ粒子の数も変化するため、コーティングされた粒子の均一性を得ることが難しいという問題もある。また、このような従来技術は、シリカ層によりナノ粒子を安定化させる場合、シリカ表面のシラン官能基が十分に安定した状態ではないため、互いに反応してシリカで被覆された状態で水に分散したナノ粒子が時間が経つにつれて互いに結合して凝集する問題が生じ、長時間に亘る分散物の貯蔵安定性（storage stability）を確保することが難しいという問題点がある。
【０００９】
近年、ホスフィンオキサイド（phosphine oxide）とポリエチレングリコールからなる高分子を用いてナノ粒子を水に分散する方法が米国化学会誌（Journal of American Chemical Society，２００５，１２７，４５５６）に発表された。ポリエチレングリコールを１，２‐ビスジクロロホスフィノエタン（１，２‐bis（dichlorophosphino）ethane）と反応させてポリエチレングリコール同士が互いに連結した高分子を合成した後、これを疎水性溶媒に分散しているナノ粒子と配位子交換する方法を用いてナノ粒子を分散安定化させ、これを水に均一に分散させる方法について開示されている。この方法は比較的簡単な調製方法を用いており、配位子交換法を用いてナノ粒子を水に分散させるが、リン（Ｐ）原子が容易にホスホリル基に酸化するため、アルゴンや窒素を用いた不活性雰囲気状態で被覆用高分子を合成しなければならないという問題がある。また、前記高分子が架橋されているため、ＤＮＡ、ＲＮＡ、モノクローナル抗体またはその他の機能性タンパク質のような生体内の機能性配位子を結合させるための官能基（functional group）の導入が容易でないという問題点が依然として存在する。
【００１０】
近年、科学者らは、イガイ類を生体接着剤の潜在的な原材料として鋭意研究した。イガイ類は、塩度、湿度、潮流、乱流、波などを特徴とする海洋環境で自ら水中接着できるように機能的に分化した接着剤を生産して分泌する。これらの脚部から分泌した繊維束で構成された足糸（thread）を用いて水中で物質の表面に強く接着する。それぞれの繊維末端には耐水性接着剤からなるプラーク（plaque）があり、濡れた固体の表面に接着することができる。このような足糸タンパク質は、ポリフェノール酸化剤（polyphenol oxidase）を用いてチロシン（tyrosine）基をヒドロキシル化（hydroxylation）して得られるアミノ酸である３，４‐ジヒドロキシフェニル‐Ｌ‐アラニン（ＤＯＰＡ）を多量含有する。ＤＯＰＡの側枝にある３，４‐ジヒドロキシフェニル（カテコール）は親水性表面と極めて強い水素結合をなすことができ、金属イオン、金属酸化物（Ｆｅ３＋、Ｍｎ３＋）、半金属（シリコーン）などと強い結合をなすことができる。
【００１１】
癌の予後と治療において転移性癌の発生有無は決定的な影響を及ぼす。転移性癌の発生有無はリンパ節の転移有無により判断し、現在、リンパ節を手術的な方法で切除してリンパ節の転移性癌の発生有無を診断している。しかし、これは侵襲的方法であり、患者と医者に多くの困難を与えている。非侵襲的方法としてＣＴ、ＭＲＩ、ＰＥＴを用いて転移性癌の発生有無を観察することができるが、通常、癌の大きさが５ｍｍ以上になったときに見つけることができる。したがって、より小さいサイズの転移性癌を非侵襲的に診断できる方法が必要である。
【００１２】
酸化鉄ナノ粒子を生体に投与し、リンパ節に酸化鉄が沈積されるイメージを用いて転移性癌を観察する方法が開示されている（Mukesh G. Harisinghani, M.D., Jelle Barentsz, M.D., Ph.D., Peter F. Hahn, M.D., Ph.D., Willem M. Deserno, M.D., Shahin Tabatabaei, M.D., Christine Hulsbergen van de Kaa, M.D., Ph.D., Jean de la Rosette, M.D., Ph.D., and Ralph Weissleder, M.D., Ph.D., N Engl J Med ２００３;３４８：２４９１‐２４９９）。これらによれば、酸化鉄ナノ粒子を親水性物質で水性系に安定化させてから生体に投与し、所定時間後に正常リンパ節組織と癌が発生したリンパ節組織を磁気共鳴映像で観察して、その差から癌の発生有無を診断することができた。この方法を用いてＡＭＡＧ社（米国）製のＣＯＭＢＩＤＥＸ（登録商標）というリンパ節造影目的のＭＲＩ造影剤を開発した。しかし、生体内投与後、副作用が生じたり選択性などに優れず、広く使用されていない。したがって、副作用が少なく、選択性に優れたリンパ節造影目的の酸化鉄系造影剤を開発する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Journal of American Chemical Society，２００５，１２７，４９９０
【非特許文献２】Journal of American Chemical Society，２００５，１２７，４５５６
【非特許文献３】Mukesh G. Harisinghani, M.D., Jelle Barentsz, M.D., Ph.D., Peter F. Hahn, M.D., Ph.D., Willem M. Deserno, M.D., Shahin Tabatabaei, M.D., Christine Hulsbergen van de Kaa, M.D., Ph.D., Jean de la Rosette, M.D., Ph.D., and Ralph Weissleder, M.D., Ph.D., N Engl J Med ２００３;３４８：２４９１‐２４９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明者らは、前記従来技術の問題点を解消し、ナノ粒子を水性系に分散させるために鋭意研究した結果、ナノ粒子の表面を親水性に改質させることができる生体適合性分散安定化剤を完成し、これを用いることにより、ナノ粒子を水性系に分散し、安定化させて生命‐医学分野に応用できることを見出した。また、本発明の生体適合性分散安定化剤によって分散し、安定化するナノ粒子は、量子ドット（quantum dot；Q‐Dot）発光素子などのナノ‐電子融合技術分野、磁気共鳴映像造影剤などのバイオイメージング分野、細胞治療などの組織工学分野、温熱療法、ドラッグデリバリーなどの生命‐医学分野に応用することができることを見出した。
【００１５】
本発明の目的は、単純な工程により様々なナノ粒子の表面を親水性に改質させることにより、水性溶媒中での分散を安定化させて生命‐医学分野に応用できる、イガイ類タンパク質を模倣した共重合体を用いて分散し、安定化した酸化鉄ナノ粒子を含むリンパ節造影のための造影剤を提供することにある。
【００１６】
本発明の他の目的は、前記造影剤を用いてリンパ節を造影する方法を提供することにある。
【００１７】
本発明の他の目的は、前記造影剤を用いてリンパ節癌を診断する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、イガイ類接着タンパク質模倣共重合体によって水性媒質に分散し、安定化した酸化鉄ナノ粒子を含むリンパ節造影のための造影剤、これを用いてリンパ節を造影する方法およびリンパ節癌を診断する方法に関する。より詳細には、前記イガイ類接着タンパク質模倣共重合体は、水性溶媒に親和性を有するポリエチレングリコール系生体適合性高分子を接合したポリエチレンイミンとナノ粒子の表面に親和性を有するポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＰＤＯＰＡ）を含むポリエチレンイミン‐グラフト‐（ポリエチレングリコール；ポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）（ＰＥＩ-グラフト-（ＰＥＧ；ＰＤＯＰＡ））である。また、本発明は、前記イガイ類接着タンパク質模倣共重合体により酸化鉄粒子の表面を改変させ、水に分散させて調製したコロイド溶液を含むリンパ節造影のための造影剤、これを用いてリンパ節を造影する方法および前記造影剤を使用してリンパ節癌を診断する方法に関する。
【００１９】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００２０】
本発明で使用されるイガイ類接着タンパク質模倣共重合体は、水性溶媒に親和性を有するポリエチレングリコール系生体適合性高分子を接合したポリエチレンイミンとナノ粒子の表面に親和性を有するポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＰＤＯＰＡ）を含むポリエチレンイミン‐グラフト‐（ポリエチレングリコール；ポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）（ＰＥＩ-グラフト-（ＰＥＧ；ＰＤＯＰＡ））であり、イガイ類接着アミノ酸、すなわち３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）を含む。
【００２１】
前記ポリエチレンイミン‐グラフト‐（ポリエチレングリコール；ポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）を調製するために、先ず、ポリエチレングリコールおよびポリエチレンイミンを共有結合してポリエチレンイミン‐グラフト‐ポリエチレングリコールを形成する。前記形成された産物は、生体適合性高分子開始剤（macroinitiator）として使用される。
【００２２】
前記ポリエチレングリコールは、数平均分子量が３００〜５０，０００のポリエチレングリコールであり、その一端にヒドロキシル基またはカルボキシル基を有している。本発明の一実施例において、前記ポリエチレングリコールとして一方の末端がメトキシ基で置換されたメトキシポリエチレングリコールを使用した。
【００２３】
前記ポリエチレンイミンは、毒性がないと知られた分岐ポリエチレンイミンであり、数平均分子量が１００〜１０，１００のもの、好ましくは１００〜２０００のものを使用することができる。一方、前記分岐ポリエチレンイミンの数平均分子量が１００未満の場合には、本発明により生成された共重合体が有用な生理活性物質と容易に結合することができず、数平均分子量が１０，１００以上の場合には腎臓を介して体内から体外に排出することが難しいという問題点がある。したがって、本発明では、前記ポリエチレンイミンの分子量が前記範囲内であることが好ましい。
【００２４】
本発明に使用されているポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＰＤＯＰＡ）は、単分子である３，４‐ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）の縮合高分子である。その繰り返しユニットはアミド結合で連結されている。繰り返しユニット数は１〜１００の範囲である。カルボジイミド媒介反応（carbodiimide‐mediated reaction）、対称無水物法（symmetrical anhydride method）、混合無水物法（mixed anhydride method）、活性エステル法（an active ester method）、アジド法（an azide method）、アシルクロリド法（an acyl‐chloride method）およびＮ‐カルボキシ無水物法（Ｎ‐carboxy anhydride method）など、固体状および液体状の様々なカップリングにより高分子合成をなす。前記所定方法によって合成されたポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＰＤＯＰＡ）のみを限定するものではない。本発明に使用されるポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＰＤＯＰＡ）は、上述のいくつかの方法により調製してよいが、Ｎ‐カルボキシ無水物法（Ｎ‐carboxy anhydride method）によって調製されることが好ましい。
【００２５】
本発明で使用されるポリエチレンイミン‐グラフト‐（ポリエチレングリコール；ポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）は、下記構造（Ａ）で表されるポリエチレングリコールユニットと、下記構造（Ｂ）で表されるポリエチレンイミンユニットと、下記構造（Ｃ）で表されるポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＰＤＯＰＡ）ユニットと、を含む。
【００２６】
0005799161.tif 000002
（Ａ）
【００２７】
［ａは、２〜１２００の範囲である。］
【００２８】
0005799161.tif 000003
（Ｂ）
【００２９】
［Ａは、分岐ポリエチレンイミンであり、ｘは、１〜１００の範囲である。］
【００３０】
0005799161.tif 000004
（Ｃ）
【００３１】
［ｄは、１〜１００の範囲である。］
【００３２】
前記ポリエチレンイミンユニット（Ｂ）は、具体的に、下記構造で表されることができる。
【００３３】
0005799161.tif 000005
【００３４】
［ｂおよびｃは、それぞれ１〜１００の範囲であり、好ましくは、１〜３０の範囲である。］
【００３５】
本発明で使用されるポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＰＤＯＰＡ）は、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）のＮ‐カルボキシ無水物（ＮＣＡ）から合成されるものであり、前記ＤＯＰＡは、イガイ類接着アミノ酸の一種、好ましくはＬ‐ＤＯＰＡ（Ｌ‐３，４‐ジヒドロキシフェニルアラニン）およびＤ‐ＤＯＰＡ（Ｄ‐３，４‐ジヒドロキシフェニルアラニン）から選択される少なくとも一つである。前記ＰＤＯＰＡは、Ｌ‐ＤＯＰＡ（Ｌ‐３，４‐ジヒドロキシフェニルアラニン）のＮ‐カルボキシ無水物（ＮＣＡ）から合成したＬ‐ＰＤＯＰＡ、Ｄ‐ＤＯＰＡ（Ｄ‐３，４‐ジヒドロキシフェニルアラニン）のＮ‐カルボキシ無水物（ＮＣＡ）から合成したＤ‐ＰＤＯＰＡおよびＬ，Ｄ‐ＤＯＰＡ（Ｌ，Ｄ‐３，４‐ジヒドロキシフェニルアラニン）のＮ‐カルボキシ無水物（ＮＣＡ）から合成したＬ，Ｄ‐ＰＤＯＰＡからなる群から選択されることができる。
【００３６】
また、前記イガイ類接着タンパク質模倣共重合体であるポリエチレンイミン‐グラフト‐（ポリエチレングリコール；ポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）は、下記の工程により製造される。
【００３７】
（ａ）親水性高分子であるポリエチレングリコールおよびポリエチレンイミンを共有結合させてポリエチレンイミン‐グラフト‐ポリエチレングリコールを形成する工程；（ｂ）３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）のヒドロキシル基を保護した後、トリホスゲン触媒存在下で３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンＮ‐カルボキシ無水物（ＤＯＰＡ−ＮＣＡ）を合成する工程；（ｃ）前記工程（ａ）で形成されたポリエチレンイミン‐グラフト‐ポリエチレングリコールおよび前記工程（ｂ）で合成された３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンＮ‐カルボキシ無水物（ＤＯＰＡ−ＮＣＡ）を有機溶媒内で反応させてポリエチレンイミン‐グラフト‐（ポリエチレングリコール；ポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）を調製する工程。
【００３８】
前記工程（ａ）は、イガイ類タンパク質模倣共重合体を製造するための生体適合性高分子開始剤（biocompatible macroinitiator）を調製する工程であり、工程（ａ）におけるポリエチレングリコールとポリエチレンイミンの共有結合は、ジシクロヘキシルカルボジイミド（dicyclohexylcarbodiimide；ＤＣＣ）／Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ‐Hydroxysuccinimide；ＮＨＳ）、またはヘキサメチレンジイソシアネート（Hexamethylene diisocyanate；ＨＭＤＩ）を用いて行うことができ、前記ＤＣＣおよびＮＨＳはメトキシ末端とカルボキシル基末端をそれぞれ有するポリエチレングリコールでカルボキシル基を活性化させてポリエチレンイミンの第一級アミンと反応してペプチド共有結合を形成する。また、前記ＨＭＤＩは、メトキシ末端を有するポリエチレングリコールのヒドロキシル基を活性化させてポリエチレンイミンの第一級アミンと結合する機能を果たす。ＨＭＤＩにより活性化したポリエチレングリコールとポリエチレンイミンの共有結合は、前記二つの高分子を共有結合できる反応であれば何れも使用することができる。また、本発明の一実施例では、ＤＣＣ／ＮＨＳで活性化したポリエチレングリコールおよびポリエチレンイミンをクロロホルムにそれぞれ溶解した後、ポリエチレングリコール溶液をポリエチレンイミン溶液に一滴ずつ滴下して二つの高分子を共有結合し、以降反応が終了すると、反応液を濃縮してからジエチルエーテルに沈殿することによりポリエチレングリコールとポリエチレンイミンが共有結合したポリエチレンイミン‐グラフト‐ポリエチレングリコールを産生する。前記ＤＣＣ／ＮＨＳによって活性化したポリエチレングリコールの構造および前記活性化したポリエチレングリコールと分岐ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の共有結合構造を下記に示した。
【００３９】
0005799161.tif 000006
【００４０】
［前記式中、ａは、２〜１２００の範囲である。］
【００４１】
＜ポリエチレングリコールの活性化（ＰＥＧ‐ＮＨＳ）＞
【００４２】
0005799161.tif 000007
【００４３】
［前記式中、ａは、２〜１２００の範囲である。］
【００４４】
＜ポリエチレンイミン‐グラフト‐ポリエチレングリコール（ＰＥＩ‐ｇｒａｆｔ‐ＰＥＧ）＞
【００４５】
前記工程（ｂ）の３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンＮ‐カルボキシ無水物（ＤＯＰＡ−ＮＣＡ）の合成は、イガイ類接着アミノ酸であるＬ‐ＤＯＰＡ（Ｌ‐３，４‐ジヒドロキシフェニルアラニン）およびＤ‐ＤＯＰＡ（Ｄ‐３，４‐ジヒドロキシフェニルアラニン）から選択される少なくとも一つを出発物質として、当業界に公知されたアミノ酸Ｎ‐カルボキシ無水物（ＮＣＡ）の調製方法に従って調製することができ、好ましくは、適した溶媒で前記イガイ類接着アミノ酸（Ｄ‐ＤＯＰＡ、Ｌ‐ＤＯＰＡまたはＬ，Ｄ‐ＤＯＰＡ）をトリホスゲン触媒存在下で反応させることにより調製することができる。
【００４６】
本発明の一実施例では、下記に示されたように、無水酢酸と塩酸を用いてＤＯＰＡを酢酸に溶解した後、Ｌ‐ＤＯＰＡのヒドロキシル基をアセチル化させて保護した（ＡＣ）２‐ＤＯＰＡを合成した後に、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）有機溶媒内でトリホスゲン（Triphosgene）を用いてＤＯＰＡのＮ‐カルボキシ無水物（ＮＣＡ）を合成する［下記参照］。
【００４７】
0005799161.tif 000008
【００４８】
＜３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンＮ‐カルボキシ無水物（ＤＯＰＡ−ＮＣＡ）の反応式＞
【００４９】
前記工程（ｃ）のポリエチレンイミン‐グラフト‐（ポリエチレングリコール；ポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）の調製は、前記工程（ａ）で形成されたポリエチレンイミン‐グラフト‐ポリエチレングリコールおよび前記工程（ｂ）で合成された３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンＮ‐カルボキシ無水物（ＤＯＰＡ−ＮＣＡ）を有機溶媒内で多重開始（multi‐initiation）して重合反応させることで行われるものであり、前記共重合体内のポリＤＯＰＡは、ポリエチレンイミン‐グラフト‐ポリエチレングリコールに存在する第一級アミンが多重開始剤として機能して３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンＮ‐カルボキシ無水物（ＤＯＰＡ−ＮＣＡ）の重合を誘導することにより合成され、このような過程を経てポリエチレンイミン‐グラフト‐ポリエチレングリコールに合成したポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＰＤＯＰＡ）が結合することにより、最終産物であるポリエチレンイミン‐グラフト‐（ポリエチレングリコール；ポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）になる。
【００５０】
前記工程（ｃ）において生体模倣型の接合部位として使用される３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンＮ‐カルボキシ無水物（ＤＯＰＡ−ＮＣＡ）の添加量を調節する場合、本発明に係る共重合体の接合力および疎水性を調節することができる。好ましくは、ポリエチレンイミン‐グラフト‐ポリエチレングリコールおよび３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンＮ‐カルボキシ無水物（ＤＯＰＡ−ＮＣＡ）のモル比は１：１〜１：５０の範囲であり、前記範囲から外れると、イガイ類接着タンパク質模倣共重合体の疎水性が強くなるか接合力が弱くなる問題点がある。
【００５１】
前記工程（ｃ）の有機溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、およびクロロホルム（ＣｌＣＨ３）から選択される少なくとも一つを含む。
【００５２】
前記工程（ｃ）における重合過程が終了した後、（ｄ）ポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＰＤＯＰＡ）のヒドロキシル保護基を脱保護化する工程をさらに含むことができる。本発明の一実施例では、前記ポリエチレンイミン‐グラフト‐（ポリエチレングリコール；ポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）の重合過程が終了した後、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に分散してから適量のピペリジン（piperidine）を添加してアセチル基で保護されたＤＯＰＡのヒドロキシル基を脱アセチル化することにより、下記構造のポリエチレンイミン‐グラフト‐（ポリエチレングリコール；ポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）になる。
【００５３】
0005799161.tif 000009
【００５４】
［前記式中、ａは、２〜１２００の範囲であり、ｄおよびｄ´は、互いに独立して１〜１００の範囲である。］
【００５５】
＜ポリエチレンイミン‐グラフト‐（ポリエチレングリコール；ポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）（ＰＥＩ‐ｇｒａｆｔ‐（ＰＥＧ;ＰＤＯＰＡ）＞
【００５６】
本発明で使用されるポリエチレンイミン‐グラフト‐（ポリエチレングリコール；ポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）は、イガイ類接着タンパク質模倣型生体適合性高分子からなり、かつポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンを含む生体適合性の分岐型分散安定化剤としてナノ粒子を水性溶媒中に分散させることで安定化するために使用されることができる。
【００５７】
前記ナノ粒子は、金属、金属酸化物、金属合金、有機高分子、無機高分子からなり、１００ｎｍ以下の大きさを有する。より具体的には、酸化鉄、コバルトフェライト（ＣｏＦｅ２Ｏ４）、マンガンフェライト（ＭｎＦｅ２Ｏ４）、鉄‐白金合金（Ｆｅ‐Ｐｔ  ａｌｌｏｙ）、コバルト‐白金合金（Ｃｏ‐Ｐｔ  ａｌｌｏｙ）、コバルト（Ｃｏ）、セレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）、テルル化カドミウム（ＣｄＴｅ）、セレン化カドミウム／硫化亜鉛コア／シェル（ＣｄＳｅ／ＺｎＳ  ｃｏｒｅ／ｓｈｅｌｌ）、セレン化カドミウム／セレン化亜鉛コア／シェル（ＣｄＳｅ／ＺｎＳｅ  ｃｏｒｅ／ｓｈｅｌｌ）、セレン化カドミウム／硫化カドミウムコア／シェル（ＣｄＳｅ／ＣｄＳ  ｃｏｒｅ／ｓｈｅｌｌ）、テルル化カドミウム／硫化亜鉛コア／シェル（ＣｄＴｅ／ＺｎＳ  ｃｏｒｅ／ｓｈｅｌｌ）、テルル化カドミウム／セレン化亜鉛コア／シェル（ＣｄＴｅ／ＺｎＳｅ  ｃｏｒｅ／ｓｈｅｌｌ）、テルル化カドミウム／硫化カドミウムコア／シェル（ＣｄＴｅ／ＣｄＳ  ｃｏｒｅ／ｓｈｅｌｌ）、テルル化カドミウム／セレン化カドミウムコア／シェル（ＣｄＴｅ／ＣｄＳｅ  ｃｏｒｅ／ｓｈｅｌｌ）、硫化亜鉛（ＺｎＳ）、硫化カドミウム（ＣｄＳ）、ひ化インジウム（ＩｎＡｓ）、リン化インジウム（ＩｎＰ）、ひ化インジウム／リン化インジウムコア／シェル（ＩｎＡｓ／ＩｎＰ  ｃｏｒｅ／ｓｈｅｌｌ）、ひ化インジウム／セレン化カドミウムコア／シェル（ＩｎＡｓ／ＣｄＳｅ  ｃｏｒｅ／ｓｈｅｌｌ）、ひ化インジウム／硫化亜鉛コア／シェル（ＩｎＡｓ／ＺｎＳ  ｃｏｒｅ／ｓｈｅｌｌ）、ひ化インジウム／セレン化亜鉛コア／シェル（ＩｎＡｓ／ＺｎＳｅ  ｃｏｒｅ／ｓｈｅｌｌ）、リン化インジウム／セレン化カドミウムコア／シェル（ＩｎＰ／ＣｄＳｅ  ｃｏｒｅ／ｓｈｅｌｌ）、リン化インジウム／硫化亜鉛コア／シェル（ＩｎＰ／ＺｎＳ  ｃｏｒｅ／ｓｈｅｌｌ）、リン化インジウム／セレン化亜鉛コア／シェル（ＩｎＰ／ＺｎＳｅ  ｃｏｒｅ／ｓｈｅｌｌ）、金（Ａｕ）、パラジウム（Ｐｄ）、白金（Ｐｔ）、ポリスチレンおよびテフロンからなる群から選択される少なくとも一つである。
【００５８】
前記酸化鉄には、ＦｅＯ、Ｆｅ３Ｏ４（マグネタイト）、α‐Ｆｅ２Ｏ３、β‐Ｆｅ２Ｏ３、γ‐Ｆｅ２Ｏ３（マグヘマイト）、ε‐Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ（ＯＨ）２、Ｆｅ（ＯＨ）３、α‐ＦｅＯＯＨ、β‐ＦｅＯＯＨ、γ‐ＦｅＯＯＨ、δ‐ＦｅＯＯＨ、Ｆｅ５ＨＯ８・Ｈ２Ｏ、５Ｆｅ２Ｏ３・Ｈ２Ｏ、ＦｅＯＯＨ・０．４Ｈ２Ｏ、Ｆｅ８Ｏ８（ＯＨ）６（ＳＯ）・ｎＨ２Ｏ、Ｆｅ１６Ｏ１６（ＯＨ・ＳＯ４）１２‐１３・１０‐１２Ｈ２Ｏなどが含まれる。より好ましくは、このうち、Ｆｅ３Ｏ４（マグネタイト）またはγ‐Ｆｅ２Ｏ３（マグヘマイト）またはＦｅ３Ｏ４（マグネタイト）とγ‐Ｆｅ２Ｏ３（マグヘマイト）の混合物を使用することができる。
【００５９】
本発明で使用する酸化鉄の直径（core diameter）は、好ましくは１ｎｍ〜２５ｎｍである。酸化鉄の直径は、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ：Transmission Electron Microscopy）で観察することができる。酸化鉄の直径が１ｎｍより小さい場合にはＭＲ  Ｔ２造影効果が小さく、酸化鉄の直径が２５ｎｍより大きい場合にはフェリ磁性を帯びるためＭＲＩに使用することができない。
【００６０】
ポリエチレンイミン‐グラフト‐（ポリエチレングリコール；ポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）で水性溶媒中に安定化した酸化鉄ナノ粒子の流体力学的直径（hydrodynamic diameter）は、好ましくは３ｎｍ〜１００ｎｍである。流体力学的直径は、水に分散させた状態で動的光散乱法（ＤＬＳ：Dynamic Light Scattering）で測定することができる。流体力学的直径が３ｎｍより小さい場合には生体に投与した親水化された酸化鉄ナノ粒子がリンパ節に沈積される前に生体から排出されやすく、流体力学的直径が１００ｎｍより大きい場合には生体に投与した親水化された酸化鉄ナノ粒子が生体内免疫系（大食細胞など）によって過度に速く除去されるためリンパ節に沈積されにくい。
【００６１】
本発明のリンパ節造影方法は、前記イガイ類接着タンパク質模倣共重合体で酸化鉄粒子の表面を改変させ、水に分散させて調製したコロイド溶液を含むリンパ節造影のための造影剤の投与前後のリンパ節のＭＲＩシグナルの強度変化または強度差を利用する。前記リンパ節のＭＲＩシグナルの強度変化はＴ２シグナル変化を基準として知ることができる。
【００６２】
本発明において、磁気共鳴映像（ＭＲＩ）法で造影効果を極大化するために使用する造影剤（Contrast agent）を投与する方法としては、静脈注射（intravenous injection）、経口投与などが挙げられる。この方法のうちリンパ節に酸化鉄を最大に沈積するためには静脈注射法が好適である。
【００６３】
前記様々なナノ粒子の中でも前記のイガイ類接着タンパク質模倣共重合体によって分散安定化した酸化鉄ナノ粒子を用いて生体内ＭＲＩ造影を行った場合、リンパ節におけるＴ２シグナル減衰比が８０％以上になり、リンパ節転移性癌の診断に有用となると考えられる。
【００６４】
他の特徴および様相は、後述する詳細な説明、図面、および請求項により明らかになる。
【発明の効果】
【００６５】
本発明で使用されるイガイ類接着タンパク質模倣共重合体は、多重開始重合により形成されたポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＰＤＯＰＡ）を有しており、これにより１分子当たり少なくとも１ユニットのＤＯＰＡが存在して親水性表面と強い結合力を有している。また、正電荷を帯びることにより、負電荷を帯びるナノ粒子の表面に追加の静電結合力を提供し、分岐ポリエチレンイミンの分岐に親水性を有する多数のポリエチレングリコール分子が結合されており、親水性および立体効果により高い水性分散安定性を提供する。したがって、本発明のようにイガイ類接着タンパク質模倣共重合体によって水性溶媒中に分散安定化した酸化鉄ナノ粒子コロイドおよびこれを含むリンパ節造影のための造影剤およびこれを用いてリンパ節を造影する方法は、優れた生体内造影結果を示し、これによってリンパ節転移性癌の診断に有用となると判断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本発明で使用されるイガイ類接着タンパク質模倣共重合体の化学的構造およびナノ粒子の安定化を示す図である。
【図２】調製例１の＜１‐６＞で調製されたＰＥＩ‐ｇｒａｆｔ‐（ＰＥＧ;ＰＤＯＰＡ５）の１Ｈ‐ＮＭＲ（ｉｎ  ＤＭＳＯ）分析結果を示す図である。
【図３】調製例１の＜１‐６＞で調製されたＰＥＩ‐ｇｒａｆｔ‐（ＰＥＧ;ＰＤＯＰＡ５）の１Ｈ‐ＮＭＲ（ｉｎ  ＣＤＣｌ３）分析結果を示す図である。
【図４】調製例１の＜１‐６＞で調製されたＰＥＩ‐ｇｒａｆｔ‐（ＰＥＧ;ＰＤＯＰＡ１５）の１Ｈ‐ＮＭＲ（ｉｎ  ＤＭＳＯ）分析結果を示す図である。
【図５】調製例１の＜１‐６＞で調製されたＰＥＩ‐ｇｒａｆｔ‐（ＰＥＧ;ＰＤＯＰＡ１５）の１Ｈ‐ＮＭＲ（ｉｎ  ＣＤＣｌ３）分析結果を示す図である。
【図６】実施例１におけるコロイド溶液の鉄濃度によるＨｅｐ  Ｇ２細胞生存力を示す図である。
【図７】実施例２における造影剤（ＰＤＩＥ１）投与前後のヌードマウスのＴ２シグナル測定結果の映像である。
【図８】実施例２における造影剤（ＰＤＩＥ２）投与前後のヌードマウスのＴ２シグナル測定結果の映像である。
【図９】実施例２における造影剤（ＰＤＩＥ３）投与前後のヌードマウスのＴ２シグナル測定結果の映像である。
【図１０】実施例２における造影剤（ＰＤＩＥ４）投与前後のヌードマウスのＴ２シグナル測定結果の映像である。
【図１１】実施例２における造影剤投与前後のＴ２シグナルの減衰効果を示すグラフである。
【図１２】安定化する前に分散していた酸化鉄ナノ粒子（ａ：１１ｎｍ）とイガイ類接着タンパク質模倣共重合体（ＭＩＬ２）の使用によって安定化して水に分散した酸化鉄ナノ粒子コロイド（ｂ：１１ｎｍ）の透過電子顕微鏡（transmission electron microscopy、ＴＥＭ）写真と、動的光散乱分析（ＤＬＳ）装置を用いたイガイ類接着タンパク質模倣共重合体の使用により水に安定的に分散した酸化鉄ナノ粒子コロイドの流体力学的直径※（ｃ）を示す図である（※流体力学的直径（ＨＤ；Hydrodynamic Diameter）：水に分散した状態で分散安定化物質を含む直径であり、水性系に分散した状態で動的光散乱分析（ＤＬＳ；Dynamic Light Scattering）装置（Malvern社製、Zetasizer Nano ZS）により測定された数平均直径である。）。
【図１３】酸化鉄ナノ粒子とイガイ類接着タンパク質模倣共重合体で改変されて水に分散安定化した鉄酸化物ナノ粒子コロイドの安定性を様々なｐＨとイオン濃度で実験した結果を示す図である。動的光散乱分析（ＤＬＳ）装置を用いて流体力学的直径（ＨＤ：Hydrodynamic Diameter）を測定および比較して結果（ＭＩＬ０（◆）、ＭＩＬ１（▲）、ＭＩＬ２（○））を得た。
【図１４】実施例４でウサギ転移性癌モデルに造影剤の投与前／後のウサギのＴ２シグナル測定結果（ａ：造影剤投与前、ｂ：造影剤投与後）および組織検査結果（ｃ）を示す図である。図に（＋）で示した部分は、映像診断結果、癌と診断されたリンパ節であり、（‐）で示した部分は、映像診断結果、正常と診断された部分である。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
以下、本発明の構成要素と技術的特徴を以下の実施例を参照してより詳細に説明する。しかし、下記の実施例は本発明を詳細に説明するためのものであって、本発明の構成要素の技術的範囲を実施例に例示したものなどで限定するためのものではない。さらに、前記技術の当業者は本発明の根本的な概念とその実行を容易に修正するか変更することができる。
【００６８】
ここで、代表的な実施例については添付の図面を参照して詳細に説明する。
【００６９】
Ｌ‐３，４‐ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ‐ＤＯＰＡ）、ＰＥＧ‐ＯＨ（５，０００Ｄａ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ，Ｎ´‐ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、無水酢酸、氷酢酸、メチレンクロライド（ＭＣ）およびクロロホルムをシグマケミカル社（Sigma Chemical Company（St．Louis、MO））から購入し、ＰＥＩ（１，８００Ｄａ（ＰＥＩ１，８００））はアルファエイサー（Alfa Aesar）から購入し、使用する前に４０℃で４８時間真空乾燥した。
【００７０】
［調製例１］イガイ類接着タンパク質模倣共重合体の合成
【００７１】
0005799161.tif 000010
【００７２】
0005799161.tif 000011
【００７３】
0005799161.tif 000012
【００７４】
＜１‐１＞ポリエチレングリコールの活性化
【００７５】
＜１‐１‐１＞ジシクロヘキシルカルボジイミド／Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド（ＤＣＣ／ＮＨＳ）の利用
【００７６】
還流凝縮器を設置した後、メトキシポリエチレングリコールカルボキシル（ＰＥＧ‐ＣＯＯＨ、５０００）（１０ｇ）を２５０ｍｌのフラスコを用いてメチレンクロライド（ＣＨＣｌ２）（５０ｍｌ）に溶解した。次に、Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド（０．５２ｇ）とジシクロヘキシルカルボジイミド（０．７４ｇ）を添加してから常温で２０時間反応させた。ジシクロヘキシル尿素を濾過過程を経て除去した後、ジエチルエーテル（diethylether）に沈殿させることにより活性化状態のポリエチレングリコール（ＰＥＧ‐ＮＨＳ）を取得した。（収率＝８７％）１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ４．１（ｂ,‐ＣＯ‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐Ｏ‐）、３．５‐３．８（ｍ,‐ＣＨ２ＣＨ２Ｏ‐）、２．８（ｂ,‐ＣＯ‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐ＣＯ‐）、１．８（ｂ,‐ＣＯ‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐Ｏ‐）、１．２（ｂ,‐ＣＯ‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐Ｏ‐）。
【００７７】
＜１‐１‐２＞ヘキサメチレンジイソシアネート（ＨＤＭＩ）の利用
【００７８】
還流凝縮器を設置した後、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ‐ＯＨ）（１５．２３ｇ）を１００ｍｌのフラスコを用いてクロロホルム（ＣＨＣｌ３）（１５ｍｌ）に溶解した。次に、ヘキサメチレンジイソシアネート（Hexamethylene diisocyanate；ＨＭＤＩ）（６０ｍｌ）で処理を施した後、２４時間反応させてポリマーを調製した。反応が終了すると、前記ポリマーを石油エーテルに沈殿させて精製し、石油エーテル（４００ｍｌ）で３回洗浄した後、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）（２０ｍｌ）にまた溶解した。次に、石油エーテル（５００ｍｌ）にまた沈殿させて精製した。前記のような過程を１０回繰り返して行った後、真空乾燥により活性化状態のポリエチレングリコールを取得した（収率＝８０％）。
【００７９】
＜１‐２＞ポリエチレングリコールとポリエチレンイミンの共有結合体（ＰＥＩ‐ｇｒａｆｔ‐ＰＥＧ）の形成
【００８０】
前記実施例＜１‐１＞で取得した活性化状態のポリエチレングリコール（ＰＥＧ‐ＮＨＳ、２ｇ）をクロロホルム（２００ｍｌ）に溶解した。次に、ポリエチレンイミン（Alfa Aesar、１８００Ｄａ、０．５ｇ）をクロロホルム（５０ｍｌ）に溶解した後、これに前記ポリエチレングリコールを溶解した溶液を一滴ずつ滴下することにより、ポリエチレングリコールとポリエチレンイミンの共有結合反応を行った。この際、前記反応は２４時間行い、反応終了後、真空濃縮装置を用いて総体積が３０ｍｌになるように濃縮した後、ジエチルエーテル（diethylether）に沈殿させることにより、ポリエチレンイミン‐グラフト‐ポリエチレングリコール（ＰＥＩ‐ｇｒａｆｔ‐ＰＥＧ）を取得した。（収率=８５％）１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）。測定（‐ＣＨ２ＣＨ２Ｏ‐ of ＰＥＧ at３．５‐３．８ｐｐｍ and ‐ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ‐ of ＰＥＩ at２．５‐３．２ｐｐｍ）は、ＰＥＩ‐ｇｒａｆｔ‐ＰＥＧのＭｎが約４１，８００Ｄａであることを示す。各ＰＥＩ‐ｇｒａｆｔ‐ＰＥＧは、ほとんど８（以下、ＰＥＧ８‐ｇｒａｆｔ‐ＰＥＩ１とする）を有していると推測した。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ３．５‐３．８（ｍ，‐ＣＨ２ＣＨ２Ｏ‐）、３．３（ｓ，ＣＨ３Ｏ‐）、２．５‐３．２（ｍ，‐ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ‐）。
【００８１】
＜１‐３＞ＤＯＰＡアミノ酸のヒドロキシル基の保護
【００８２】
Ｌ‐ＤＯＰＡ（３ｇ）を氷酢酸（１００ｍｌ）に浮遊させてから乾燥した塩酸気体を常温で５時間パージ（purging）した。無水酢酸（３ｍｌ）を添加した後、常温で１時間３０分間反応させてから無水酢酸３ｍｌを添加した後、６０℃のオイルバスで３０分間反応させた。次に、真空濃縮装置で濃縮した後、エタノールを添加して未反応の無水酢酸を除去してからジエチルエーテル（diethylether）に沈殿させることによりヒドロキシル基が保護されたＤＯＰＡアミノ酸（ＤＯＰＡ（Ａｃ）２）を取得した。（収率＝８０％）１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ６．７‐６．９（ｍ，‐Ｃ６Ｈ３（ＯＨ）２）、４．０（ｍ，Ｃ６Ｈ３（ＯＨ）２‐ＣＨ２‐ＣＨ（Ｎ‐）‐Ｃ（Ｏ）Ｎ‐）、３．２（ｍ，Ｃ６Ｈ３（ＯＨ）２‐ＣＨ２‐ＣＨ‐）、２．４（ｓ，ＣＨ３（ＣＯ）‐）。
【００８３】
＜１‐４＞ＤＯＰＡアミノ酸Ｎ‐カルボキシ無水物（ＤＯＰＡ‐ＮＣＡ）の合成
【００８４】
ＴＨＦ（５０ｍｌ）に前記調製例＜１‐３＞で合成したヒドロキシル基が保護されたＤＯＰＡアミノ酸（０．５ｇ）およびトリホスゲン（triphosgene）（０．５ｇ）を分散させた後、オイルバスで６０℃の温度で反応させた。次に、ヘキサン（８００ｍｌ）に沈殿させた後、またＴＨＦ（５０ｍｌ）に溶解してからヘキサンに沈殿させた。このような過程を３回繰り返して行い、精製後、真空乾燥機で乾燥させてＤＯＰＡＮ‐カルボキシ無水物（ＤＯＰＡ（ＡＣ２）‐ＮＣＡ）を取得した。（収率＝６５％）１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ６．２‐６．９（ｍ，‐Ｃ６Ｈ３（ＯＨ）２）、４．３（ｔ，‐ＮＨＣＨＣＯ‐）、３．７（ｍ，Ｃ６Ｈ３（ＯＨ）２‐ＣＨ２‐ＣＨ（Ｎ‐）‐Ｃ（Ｏ）Ｎ‐）、３．３（ｍ，Ｃ６Ｈ３（ＯＨ）２‐ＣＨ２‐ＣＨ‐）、２．４（ｓ，ＣＨ３（ＣＯ）‐）。
【００８５】
＜１‐５＞ポリエチレンイミン‐グラフト‐（ポリエチレングリコール；ポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）（ＰＥＩ‐ｇｒａｆｔ‐（ＰＥＧ;ＰＤＯＰＡ））の合成
【００８６】
前記調製例＜１‐２＞で調製したポリエチレンイミン‐グラフト‐ポリエチレングリコール（ＰＥＩ‐ｇｒａｆｔ‐ＰＥＧ）（０．５ｇ）を＜１‐４＞で調製したＤＯＰＡＮ‐カルボキシ無水物（ＤＯＰＡ（ＡＣ２）‐ＮＣＡ）と異なるモル比（それぞれ１:５および１:１５）で用いて、ＴＨＦ溶媒でそれぞれ反応させてポリエチレンイミン‐グラフト‐（ポリエチレングリコール；ポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）を合成した（収率、モル比１:５＝８５％、モル比１:１５＝８７％）。
【００８７】
＜１‐６＞ポリエチレンイミン‐グラフト‐（ポリエチレングリコール；ポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）の脱保護化
【００８８】
前記調製例＜１‐５＞で合成したポリエチレンイミン‐グラフト‐（ポリエチレングリコール；ポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）（０．５ｇ）をＤＭＦ（３０ｍｌ）に溶解した後、ピペリジン（piperidine）（８ｍｌ）を添加してから１５分間反応させた後、ジエチルエーテル（diethylether）に沈殿させることによりＤＯＰＡのヒドロキシル保護基が脱保護化したポリエチレンイミン‐グラフト‐（ポリエチレングリコール；ポリ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）を取得した（収率、モル比１：５=８０％［図２および図３］、モル比１：１５=８１％［図４および図５］）。
【００８９】
下記の表１は本発明に係るイガイ類接着タンパク質模倣共重合体の構造および特性分析に関するものであり、１Ｈ‐ＮＭＲ、ＵＶ‐Ｖｉｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、蛍光標識物質を用いて高分子共重合体の構造および特性を分析した。
【００９０】
【表１】
0005799161.tif 000013
【００９１】
［調製例２］イガイ類接着タンパク質模倣共重合体で安定化した鉄酸化物ナノ粒子の調製
【００９２】
有機溶媒で合成し、オレイン酸（oleic acid）で安定化した磁性ナノ粒子（Ｆｅ３Ｏ４）１０ｍｇとイガイ類接着タンパク質模倣共重合体（ＭＩＬ１およびＭＩＬ２各々）６０ｍｇを１０ｍｌのクロロホルム（ＣＨＣｌ３）に分散させて常温で３０分間攪拌した。クロロホルム（ＣＨＣｌ３）を蒸発させて蒸留水を添加してから分散した結果物を２００ｎｍのシリンジフィルター（ＭＣＥ syringe filter、Fisher Scientific）で濾過した。未反応の安定化剤を除去するために遠心分離した後、スピンフィルター（Millipore、１０Ｋ  ＮＭＷＬ、１００００×ｇ、１０ｍｉｎ）を用いて３〜５回繰り返して濾過した後、結果物をｐＨ７の水性系（０．０１Ｍ ＰＢＳ：Phosphate Buffered Saline水溶液）に分散した。
【００９３】
［実施例１］イガイ類接着タンパク質模倣共重合体で安定化させた鉄酸化物ナノ粒子コロイド溶液の細胞生存力実験
【００９４】
調製例１と調製例２に提示された方法により下記表２のような物性を有するイガイ類接着タンパク質模倣共重合体で安定化した鉄酸化物を水に分散させてコロイド溶液を調製した。
【００９５】
【表２】
0005799161.tif 000014
【００９６】
表２の分散安定化した鉄酸化物ナノ粒子にＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）粉末を０．０１Ｍの濃度になるように添加し、生体適用可能性をテストするために、Ｈｅｐ  Ｇ２細胞に対して生存力実験（ＭＴＴ assay）を行った。
【００９７】
＜１‐１＞試料の準備
【００９８】
前記ＰＢＳが含まれたＰＤ１とＰＤ２を０．２μｍの滅菌シリンジフィルターを通過させた後、誘導結合プラズマ‐原子放射分光法（ＩＣＰ‐ＡＥＳ：Inductively Coupled Plasma‐Atomic Emission Spectroscopy）を用いて濃度を測定した。濃度を測定したＰＤ１とＰＤ２をそれぞれ２００μＬずつ分取して培地（ＤＭＥＭ：Dulbeco"s Modified Eagle"s Medium ８９％、Pluronic Ｆ‐１２７ １０％、ＡＡ：antibiotic‐antimycotic １％）２００μＬと混合した後にこれを０番試料として、それぞれの溶液３５０μＬと培地３５０μＬを混合して１番試料とし、各１番試料３５０μＬと培地３５０μＬを混合して２番試料と名付けた。このように最初の濃度の１／２ずつ希釈してＰＤ１、ＰＤ２それぞれ１〜９番の９個の試料を調製し、１０番試料はＰＤ１とＰＤ２のない培地１００％の試料を準備した。対照群として、ＰＢＳ溶液を前記過程と同様にしてＰＤ１、ＰＤ２と同じ個数の対照群を準備した（表３参照）。
【００９９】
【表３】
0005799161.tif 000015
【０１００】
＜１‐２＞細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）培養および準備
【０１０１】
Ｈｅｐ  Ｇ２細胞を継代培養して増殖させた後、９６ウェルプレートに１００，０００セル／ウェルになるように満たした。この際、９６ウェルのうち周部以外の残り６０ウェルのみを用いた。Ｈｅｐ  Ｇ２細胞がウェルプレートの底部に付着されるように３７℃で２４時間培養した。
【０１０２】
＜１‐３＞試料の添加
【０１０３】
＜１‐２＞で準備したＨｅｐ  Ｇ２が培養されたウェルプレートから培地を除去した。培地が除去されたウェルプレートの各ウェルに表３に示されている前記＜１‐１＞で準備したＰＤ１、ＰＤ２、対照群の各１番から１０番の試料を１００μＬずつ投入した。この際、各試料と対照群を３倍数で準備した。試料を投入した後、３７℃で２４時間培養した。
【０１０４】
＜１‐４＞細胞生存力実験（ＭＴＴ実験）
【０１０５】
ＭＴＴ実験は代謝作用が活性化した細胞によって黄色のテトラゾリウム塩ＭＴＴ試薬が紫色のホルマザン結晶に変わる原理を用いて細胞生存力を測定する実験である。
【０１０６】
実験１時間前に生存力実験に使用するＭＴＴ（３‐（４，５‐dimethylthiazol‐２‐yl）‐２，５‐diphenyl‐２Ｈ‐tetrazolium bromide）試薬を３７℃の水槽で溶解した。前記＜１‐３＞で準備した９６ウェルプレートの試料と対照群が投入された各ウェルにＭＴＴ試薬を各２０μＬずつ添加した。この際、光に露出しないように注意する。代謝作用が活性化した細胞を確認するためにＭＴＴ試薬を添加した後、３７℃で４時間培養した。培養後、紫色のホルマザン結晶を溶解するために可溶化溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加し、３７℃で２４時間培養した。培養後、マイクロプレートリーダー（microplate reader、Molecular Devices社製、Spectra Max １９０）を用いて５５０ｎｍと６９０ｎｍでの光学密度値を測定し、これを用いて細胞生存力を計算した。細胞生存力は以下の［数１］で計算する。
【０１０７】
【数１】
0005799161.tif 000016
【０１０８】
ＯＤｉ，５５０：試料が注入されたｉ番ウェルプレートの５５０ｎｍでの光学密度値
【０１０９】
ＯＤｉ，６９０：試料が注入されたｉ番ウェルプレートの６９０ｎｍでの光学密度値
【０１１０】
ＯＤＳｉ，５５０：対照群のｉ番ウェルプレートの５５０ｎｍでの光学密度値
【０１１１】
ＯＤＳｉ，６９０：対照群のｉ番ウェルプレートの６９０ｎｍでの光学密度値
【０１１２】
図６は細胞生存力実験の結果をグラフで示したものである。通常、細胞生存力実験において±２０％は誤差範囲とみなす。本実施例の結果は、実験した濃度区間のほとんどにおいて８０％以上の細胞生存力を示すことを確認することができる。
【０１１３】
本結果は、イガイ類接着タンパク質模倣共重合体で安定化させた鉄酸化物ナノ粒子の細胞毒性がないということを意味し、生体内の利用にも安全であることを証明するものである。
【０１１４】
［実施例２］イガイ類接着タンパク質模倣共重合体で安定化させた鉄酸化物ナノ粒子コロイド溶液を含む造影剤の生体内磁気共鳴映像の性能測定
【０１１５】
実施例１に提示された方法により下記表４のような物性を有するイガイ類接着タンパク質模倣共重合体で安定化した鉄酸化物ナノ粒子コロイド溶液を調製した。
【０１１６】
【表４】
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【０１１７】
表４の分散安定化した鉄酸化物ナノ粒子コロイド溶液にＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）を添加して造影剤を調製し、これらの磁気共鳴映像用造影剤としての使用可能性を評価するために磁気共鳴映像診断機（Ｔｒｉｏ ３．０Ｔ、Ｓｉｍｅｎｓ）でループコイル（Loop coil）を用いて生体内Ｔ２造影性能を評価した。
【０１１８】
生体内造影性能評価は、正常状態のヌードマウス（Balb／nude）を用いて行い、ヌードマウスの体重は３０ｇであった。マウスに麻酔をかけた後、磁気共鳴映像診断機に水平に投入して断面を観察した。ヌードマウスの磁気共鳴映像は、造影剤の注入前、および造影剤注入２４時間後に測定して造影剤の注入前後のリンパ節を観察比較した。コロイド溶液にＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）粉末を０．０１Ｍの濃度になるように添加して造影剤を調製した。鉄濃度をＩＣＰ‐ＡＥＳを介して分析し、マウスの重量を考慮した投与量（表４）を計算して造影剤の総体積が５００μＬになるように準備した。造影剤はマウスの尾静脈より投与した。
【０１１９】
生体内Ｔ２イメージング性能測定はSimens社製のＴ２Ｍｅ３ｄパルスシーケンスを使用し、具体的なパラメーターは次のとおりである。
【０１２０】
ＴＲ（repetition time）＝４０．０ｍｓｅｃ、ＴＥ（echo time）＝２２．０ｍｓｅｃ、ＦＯＶ＝４９ｍｍ×７０ｍｍ、Matrix size＝２５６×１８０、slice thickness＝０．６ｍｍ、number of acquisition＝６
【０１２１】
図７〜図１０は前記の条件で得た生体内磁気共鳴映像の一部を示すものである。
【０１２２】
調製した造影剤のＴ２減衰効果を定量的に評価するために最もよく見えるリンパ節である鼡径（inguinal）リンパ節と上腕（brachial）リンパ節の一断面を選定してリンパ節の変色した部分をＲＯＩ（Region of Interest）として選択し、シグナル強度を分析した。取得した磁気共鳴映像の全体的なシグナル強度が測定する度に変化するため、シグナル強度の絶対値（Ｓ；signal intensity）で造影性能を評価するには無理があり、鼡径リンパ節は右後脚の筋肉、上腕リンパ節は右前脚の筋肉を対照群（Ｎ：noise）とし、相対的シグナル強度（ＳＮＲ：Siganal to Noise Ratio）を求めた。
【０１２３】
造影剤の使用前後のＳＮＲを比較してＴ２シグナル減衰比（ΔＲ２）を計算し、これを図１１のグラフで示した。以下の数２はＴ２シグナル減衰比（ΔＲ２）を計算する方法である。
【０１２４】
【数２】
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【０１２５】
図７〜図１０を参照すると、ヌードマウスのリンパ節が造影剤の投与後に黒く変色することを確認することができる。下記表５と表６には、それぞれ鼡径リンパ節と上腕リンパ節の造影剤試料の投与前後の相対的シグナル強度（ＳＮＲ）とシグナル減衰比（ΔＲ２）を示している。図１１には造影剤試料の投与前後の相対的シグナル強度（ＳＮＲ）を示している。投与後には投与前より明らかなシグナル減衰を示すことが分かり、これを利用すればリンパ節の癌存在の把握に有用となることができる。
【０１２６】
【表５】
0005799161.tif 000019
【０１２７】
【表６】
0005799161.tif 000020
【０１２８】
［実施例３］イガイ類接着タンパク質模倣共重合体で安定化した鉄酸化物ナノ粒子コロイド溶液の安定性測定
【０１２９】
鉄酸化物ナノ粒子の透過電子顕微鏡（Transmission Electron Microscopy）写真（ａ：１１ｎｍ）とイガイ類タンパク質模倣共重合体（ＭＩＬ２）で水に分散した酸化鉄ナノ粒子コロイド（ｂ）の透過電子顕微鏡（Transmission Electron Microscopy）写真が図１２に示されている。
【０１３０】
図１２の透過電子顕微鏡写真は本発明の方法により製造されたイガイ類接着タンパク質模倣共重合体を使用して水に安定的に分散した酸化鉄ナノ粒子が共重合体の添加前に疎水性溶媒に溶解されている酸化鉄ナノ粒子の形状と大きさが同一であることが分かる。イガイ類接着タンパク質模倣共重合体（ＭＩＬ２）で水に分散した酸化鉄ナノ粒子コロイドの流体力学的直径を図１２に示した。酸化鉄ナノ粒子コロイドの流体力学的直径は動的光散乱法により測定した数平均流体力学的直径で均一性を示すことを確認することができる。
【０１３１】
図１３はイガイ類接着タンパク質模倣共重合体を使用して水性溶媒中で安定的に分散した酸化鉄ナノ粒子コロイドの安定性を様々なｐＨ（ａ）およびイオン濃度（ｂ）で確認した結果を示している。動的光散乱法により流体力学的直径を様々なｐＨとイオン濃度で測定した。イガイ類接着タンパク質模倣共重合体を使用して水性溶媒中で安定的に分散した酸化鉄ナノ粒子コロイド（ＭＩＬ１（▲）、ＭＩＬ２（○））は、イガイ類接着タンパク質模倣共重合体を適用していない酸化鉄ナノ粒子（ＭＩＬ０（◆））より様々な濃度とｐＨで安定していることが分かる。
【０１３２】
［実施例４］イガイ類接着タンパク質模倣共重合体で安定化させた鉄酸化物（Ｆｅ３Ｏ４）ナノ粒子コロイド溶液を含む造影剤を用いた生体内転移性癌診断
【０１３３】
実施例１と実施例２に提示された方法により下記表７のような物性を有するイガイ類接着タンパク質模倣共重合体で安定化した鉄酸化物（Ｆｅ３Ｏ４）ナノ粒子コロイド溶液を調製した。
【０１３４】
【表７】
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【０１３５】
前記表７のコロイド溶液を注射用生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）を用いて希釈し、鉄濃度をＩＣＰ‐ＡＥＳにより分析してウサギの重量を考慮した投与量（表７）を計算し、濃度が６２４０ｐｐｍ、総体積が５ｍＬになるように造影剤を準備した。造影剤はウサギの耳介静脈より投与した。実験のためにニュージーランドの白ウサギ１２匹の腸骨（iliac）リンパ節にＶＸ２癌細胞を発現させて転移性癌モデルを樹立して用いて造影剤の性能評価を行った。
【０１３６】
転移性癌が発現したウサギの体重は３ｋｇであり、麻酔をかけた後、磁気共鳴映像診断機（Ｔｒｉｏ ３．０Ｔ、Simens、knee coil使用）に水平に投入して断面を観察した。ウサギの磁気共鳴映像は造影剤の注入前、および造影剤注入２４時間後に測定し、造影剤の注入前後の腸骨リンパ節を観察比較して転移性癌を診断した。磁気共鳴映像診断の正確性を確認するために、磁気共鳴映像診断後に腸骨リンパ節に対する生体検査を行った。生体検査は、腸骨リンパ節を切除して切片を作った後、Ｈ＆Ｅ stainingを行って組織検査を行った。磁気共鳴映像と組織検査は映像医学科の専門医が確認して転移性癌有無を診断した。
【０１３７】
ウサギ転移性癌モデルにおいて造影剤の性能評価のために使用した磁気共鳴映像装置の具体的なパラメーターは次のとおりである。
【０１３８】
ＴＲ（repetition time）＝６．２ｍｓｅｃ、ＴＥ（echo time）＝２．４ｍｓｅｃ、ＦＯＶ＝１４５ｍｍ×１４５ｍｍ、Matrix size、＝１２９×１５４、slice thickness＝６．０ｍｍ、number of acquisition＝１
【０１３９】
【表８】
0005799161.tif 000022
【０１４０】
表８と図１４にウサギ転移性癌モデルによりイガイ類接着タンパク質模倣共重合体で安定化させた鉄酸化物（Ｆｅ３Ｏ４）ナノ粒子コロイド溶液を含む造影剤の生体内転移性癌診断評価結果を表記した。表８は１２匹のウサギ転移性癌モデルの磁気共鳴映像を用いた診断と組織検査結果から得られた癌転移リンパ節の数と正常リンパ節の数を表記した。診断結果、造影剤の敏感度と特異度がそれぞれ１００％を示した。図１４は１２匹のウサギ転移性癌モデルのうち００２番ウサギの造影剤の投与前後の磁気共鳴映像と組織検査結果イメージを示すものである。（＋）で示した部分は、映像診断結果、転移性癌と診断したリンパ節であり、（‐）で示した部分は、映像診断結果、正常（転移性癌が発現されていない）と診断したリンパ節である。
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
本発明のイガイ類接着タンパク質模倣共重合体は、分子内に多数のＤＯＰＡユニットを有している。ＤＯＰＡは無機ナノ粒子と相互作用を行ってナノ粒子の表面に強い結合を示す。さらに、前記共重合体は正電荷であり、負電荷を有しているナノ粒子の表面と強い静電結合を行う。親水性の特徴を有している多数のＰＥＧ分子が分岐ＰＥＩと結合して立体的効果と親水性の特徴により高い水溶液の分散安定化をなす。表面のＰＥＧが酸化鉄ナノ粒子を長時間生体内循環させた後、多数の酸化鉄粒子がリンパ節に到逹することになる。Ｔ２ＭＲのイメージを良好にするために、リンパ節はできるだけ多くのナノ粒子を取らなければならない。したがって、酸化鉄ナノ粒子が長時間生体内で循環することが重要である。
【０１４２】
イガイ類接着タンパク質模倣共重合体によって変形された酸化鉄は、正常のリンパ節は暗く、転移性癌になったリンパ節はより暗くないように示す。結果、イガイ類接着タンパク質模倣共重合体によって、変形された酸化鉄はリンパ節造影のための造影剤およびこれを用いてリンパ節を造影する方法について優れた潜在性を有している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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