(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＥＲ２活性を調節する化合物に対する細胞の感受性を決定する方法であって：
（ａ）前記細胞を前記化合物と接触させる工程；
（ｂ）前記細胞を溶解させて細胞抽出物を生成する工程；
（ｃ）前記細胞から生成された細胞抽出物中のＨＥＲ２及びｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルを決定する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）で決定されたＨＥＲ２及びｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルを、前記化合物を用いて処理された化合物感受性細胞中のＨＥＲ２及びｐ９５ＨＥＲ２の第１参照活性化レベル及び前記化合物を用いて処理された化合物耐性細胞中のＨＥＲ２及びｐ９５ＨＥＲ２の第２参照活性化レベルと比較する工程；を含み、
ＨＥＲ２及びｐ９５ＨＥＲ２の前記第１参照活性化レベルと比較して同様の又はより低い前記細胞抽出物中のＨＥＲ２及びｐ９５ＨＥＲ２活性化のレベルの存在が、前記細胞が前記化合物に対して感受性であることを示し、
ＨＥＲ２及びｐ９５ＨＥＲ２の前記第２参照活性化レベルと比較して同様の又はより高い前記細胞抽出物中のＨＥＲ２及びｐ９５ＨＥＲ２活性化のレベルの存在が、前記細胞が前記化合物に対して耐性であることを示す、方法。
【請求項２】
前記化合物がＨＥＲ２活性を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物がモノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体がトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））、ペルツズマブ（２Ｃ４）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記チロシンキナーゼ阻害剤がゲフィチニブ、エルロチニブ、ピリチニブ、カネルチニブ、ラパチニブ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物感受性細胞がＢＴ−４７４細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物耐性細胞中のＨＥＲ２活性化のレベルが前記化合物感受性細胞中のＨＥＲ２活性化のレベルより少なくとも２〜３倍高い、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物耐性細胞中のｐ９５ＨＥＲ２活性化レベルが前記化合物感受性細胞中のｐ９５ＨＥＲ２活性化のレベルより少なくとも５倍高い、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＨＥＲ２及びｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルがＨＥＲ２及びｐ９５ＨＥＲ２のリン酸化レベルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞抽出物中の追加のシグナル伝達分子１種又は２種以上の活性化レベルを決定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記追加のシグナル伝達分子１種又は２種以上がＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＭＥＫ、ＰＴＥＮ、ＳＧＫ３、４Ｅ−ＢＰ１、ＥＲＫ２（ＭＡＰＫ１）、ＥＲＫ１（ＭＡＰＫ３）、ＰＤＫ１、Ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＧＳＫ−３β、Ｓｈｃ、ＩＧＦ−１Ｒ、ｃ−ＭＥＴ、ｃ−ＫＩＴ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、受容体二量体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物耐性細胞中のＨＥＲ３の第２参照活性化レベルと比較して同様の又はより高い前記細胞抽出物中のＨＥＲ３活性化のレベルの存在が、前記細胞が前記化合物に対して耐性であることを示す、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物耐性細胞中のＨＥＲ３活性化のレベルが前記化合物感受性細胞中のＨＥＲ３活性化のレベルより少なくとも２〜３倍高い、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物耐性細胞中のＰＩ３Ｋの第２参照活性化レベルと比較してより高い前記細胞抽出物中のＰＩ３Ｋ活性化レベルの存在が、前記細胞が前記化合物に対して感受性でないことを示す、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記受容体二量体がｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体、ＨＥＲ２／ＨＥＲ２ホモ二量体、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体、ＨＥＲ１／ＨＥＲ２ヘテロ二量体、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物耐性細胞中のｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体の第２参照活性化レベルと比較してより高い前記細胞抽出物中のｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体活性化レベルの存在が、前記細胞が前記化合物に対して感受性でないことを示す、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が腫瘍細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記腫瘍細胞が循環腫瘍細胞、又は腫瘍から得られた微細針吸引液（ＦＮＡ）細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記腫瘍細胞が乳癌細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が試料から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記試料が乳癌を有する被験者から得られる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記試料が全血、血清、血漿、又は腫瘍組織試料である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｄ）で得られた比較の結果を読み取り可能なフォーマットでユーザーに提供する工程（ｅ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
工程（ｃ）のＨＥＲ２及びｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルを決定する工程がリン酸化ＨＥＲ２及びリン酸化ｐ９５ＨＥＲ２に特異的な抗体を用いて前記細胞抽出物中のＨＥＲ２及びｐ９５ＨＥＲ２のリン酸化レベルを検出する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ｃ）のＨＥＲ２の活性化レベルの決定が、以下の段階：
（ｉ）細胞抽出物をＨＥＲ２に特異的な捕捉抗体の希釈系列とインキュベートして複数の捕捉された受容体を形成する段階であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に拘束されている段階；
（ｉｉ）前記複数の捕捉された受容体をＨＥＲ２に特異的な活性化状態非依存性抗体及び活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートして複数の検出可能な捕捉された受容体を形成する段階であって、
前記活性化状態非依存性抗体が促進成分を用いて標識化されており、前記活性化状態依存性抗体がシグナル増幅対の第１のメンバーを用いて標識化されており、そして前記促進成分が前記シグナル増幅対の第１のメンバーへチャネリングして該メンバーと反応する酸化剤を生成する段階；
（ｉｉｉ）前記複数の検出可能な捕捉された受容体を前記シグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして増幅シグナルを生成する段階；及び
（ｉｖ）前記シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する段階；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
工程（ｃ）のｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルの決定が、以下の段階：
（ｉ）前記細胞抽出物を、全長ＨＥＲ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズとインキュベートする段階；
（ｉｉ）前記細胞抽出物から前記複数のビーズを除去し、それによって全長ＨＥＲ２を除去して、全長ＨＥＲ２を含まない細胞抽出物を形成する段階；
（ｉｉｉ）前記全長ＨＥＲ２を含まない細胞抽出物を全長ＨＥＲ２の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域に特異的な捕捉抗体の希釈系列とインキュベートして複数の捕捉された受容体を形成する段階であって、前記捕捉抗体が固体支持体に拘束されている段階；
（ｉｖ）前記複数の捕捉された受容体を、全長ＨＥＲ２のＩＣＤ結合領域に特異的な活性化状態非依存性抗体及び活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートして、複数の検出可能な捕捉された受容体を形成する段階であって、
前記活性化状態非依存性抗体が促進成分を用いて標識化されており、前記活性化状態依存性抗体がシグナル増幅対の第１のメンバーを用いて標識化されており、そして前記促進成分が前記シグナル増幅対の第１のメンバーへチャネリングして該メンバーと反応する酸化剤を生成する段階；
（ｖ）前記複数の検出可能な捕捉された受容体を、前記シグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして、増幅シグナルを生成する段階；及び
（ｖｉ）前記シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する段階；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
ＥＣＤ結合領域に特異的な複数のビーズがストレプトアビジン−ビオチン対を含んでおり、ストレプトアビジンがビーズに結合しており、ビオチンが抗体に結合している、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体が全長ＨＥＲ２のＥＣＤ結合領域に特異的である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記支持体がガラス、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜、繊維束、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記捕捉抗体がアドレス可能なアレイにおける固体支持体上に拘束されている、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記活性化状態非依存性抗体が前記促進成分を用いて直接的に標識化されている、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記活性化状態依存性抗体が前記シグナル増幅対の第１のメンバーを用いて直接的に標識化されている、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記活性化状態依存性抗体が、該活性化状態依存性抗体にコンジュゲートされた結合対の第１のメンバーと前記シグナル増幅対の第１のメンバーにコンジュゲートされた結合対の第２のメンバーとの間の結合を介して、前記シグナル増幅対の第１のメンバーを用いて標識化されている、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記結合対の第１のメンバーがビオチンである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記結合対の第２のメンバーがストレプトアビジンである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記促進成分がグルコースオキシダーゼである、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項３７】
前記グルコースオキシダーゼ及び前記活性化状態非依存性抗体がスルフヒドリル活性化デキストラン分子にコンジュゲートされている、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記スルフヒドリル活性化デキストラン分子が分子量約５００ｋＤａを有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記酸化剤が過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記シグナル増幅対の第１のメンバーがペルオキシダーゼである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記シグナル増幅対の第２のメンバーがチラミド試薬である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記チラミド試薬がビオチン−チラミドである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記増幅シグナルが、活性化チラミドを生成する、前記ビオチン−チラミドのペルオキシダーゼ酸化によって生成される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記活性化チラミドが直接的に検出される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記活性化チラミドがシグナル検出性試薬の添加により検出される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記シグナル検出性試薬がストレプトアビジン標識化フルオロフォアである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記シグナル検出性試薬がストレプトアビジン標識化ペルオキシダーゼと発色試薬との組み合わせである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記発色試薬が３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記化合物耐性細胞がＢＴ／Ｒ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞抽出物中のＨＥＲ２及び／又はｐ９５ＨＥＲ２の発現レベルを決定する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５２】
前記化合物感受性細胞中のＨＥＲ３の第１参照活性化レベルと比較して同様の又はより低い前記細胞抽出物中のＨＥＲ３活性化のレベルの存在が、前記細胞が前記化合物に対して感受性であることを示す、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
《関連出願の相互参照》
本出願は、２００９年５月１４日に出願された米国特許仮出願第６１／１７８，４５８号、２００９年５月２２日に出願された米国特許仮出願第６１／１８０，７８７号、２００９年６月１５日に出願された米国特許仮出願第６１／１８７，２４６号、２００９年６月２４日に出願された米国特許仮出願第６１／２２８，５２２号、２００９年８月２０日に出願された米国特許仮出願第６１／２３５，６４６号、２００９年９月１１日に出願された米国特許仮出願第６１／２４１，８０４号、２００９年１１月１９日に出願された米国特許仮出願第６１／２６２，８５６号、及び、２００９年１１月３０日に出願された米国特許仮出願第６１／２６５，２２７号についての優先権を主張し、これらの開示内容は、あらゆる目的のためにこれらの全体が参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
《発明の背景》
細胞内のシグナル伝達のプロセスは、少数の例を挙げると細胞の分裂及び死、代謝、免疫細胞活性化、神経伝達、並びに感覚的知覚を含む様々な生物学的機能に関与している。従って、細胞内の正常シグナル伝達の混乱は、糖尿病、心疾患、自己免疫、及び癌などの多数の疾患状態を引き起こす可能性がある。
【０００３】
１つの充分に特徴付けられたシグナル伝達経路は、細胞内における上皮成長因子（ＥＧＦ）から細胞増殖促進へシグナルを伝達することに関与するＭＡＰキナーゼ経路である（国際公開第２００９／１０８６３７号パンフレットの図１参照、この開示内容はあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＥＧＦは、ＥＧＦの結合によって活性化される上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）である膜貫通受容体結合チロシンキナーゼに結合する。ＥＧＦのＥＧＦＲへの結合は、受容体の細胞質ドメインであるチロシンキナーゼ活性を活性化する。このキナーゼ活性化の１つの結果は、チロシン残基上でのＥＧＦＲの自己リン酸化である。活性化されたＥＧＦＲ上のリン酸化チロシン残基は、ＧＲＢ２などのアダプタータンパク質を含有するＳＨ２ドメインの結合のためのドッキング部位を提供する。アダプターとしてのその機能において、ＧＲＢ２は、ＧＲＢ２上のＳＨ３ドメインによって、グアニンヌクレオチド交換因子であるＳＯＳへさらに結合する。複合体ＥＧＦＲ−ＧＲＢ２−ＳＯＳの形成は、ＲａｓからのＧＤＰの除去を促進するグアニンヌクレオチド交換因子のＳＯＳ活性化をもたらす。ＧＤＰが除去されると、ＲａｓはＧＴＰに結合し、活性化されるようになる。
【０００４】
活性化後、Ｒａｓは、セリン／トレオニン特異的プロテインキナーゼであるＲＡＦキナーゼに結合して、そのプロテインキナーゼ活性を活性化する。その後には、細胞増殖を導くプロテインキナーゼカスケードの活性化が続く。概略を述べると、ＲＡＦキナーゼは次に、別のセリン／トレオニンキナーゼであるＭＥＫをリン酸化して活性化する。活性化されたＭＥＫは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）をリン酸化して活性化する。ＭＡＰＫによる別のリン酸化の標的には、４０ＳリボソームプロテインＳ６キナーゼ（ＲＳＫ）がある。ＭＡＰＫによるＲＳＫのリン酸化は、ＲＳＫの活性化を生じさせ、これは順にリボソームプロテインＳ６をリン酸化する。ＭＡＰＫの別の公知の標的は、様々な癌において変異している、細胞増殖のために重要な遺伝子である癌原遺伝子ｃ−Ｍｙｃである。ＭＡＰＫは別のプロテインキナーゼであるＭＮＫもリン酸化して活性化するが、これは順に転写因子であるＣＲＥＢをリン酸化する。間接的には、ＭＡＰＫは細胞増殖に関係しているさらに別の転写因子をコードするＦｏｓ遺伝子の転写も調節する。このような転写因子のレベル及び活性を変化させることによって、ＭＡＰＫは、ＥＧＦから、細胞周期の進行のために重要である遺伝子の変更された転写へオリジナルの細胞外シグナルを伝達する。
【０００５】
シグナル伝達経路が細胞増殖において果たす中心的な役割を考慮すると、細胞増殖経路の異常な活性化を生じさせるシグナル伝達成分における突然変異及び他の変化の結果として多数の癌が発生することは驚くには当たらない。例えば、ＥＧＦＲの過剰発現若しくは活動過剰は、多形神経膠芽腫、結腸癌及び肺癌を含む多数の癌と関連付けられてきた。これは肺癌のためのゲフィチニブ及びエルロチニブ、並びに結腸癌のためのセツキシマブを含む、ＥＧＦＲに向けられた抗癌療法薬の開発を促進してきた。
【０００６】
セツキシマブは、ＥＧＦＲの細胞外リガンド結合ドメインに結合するモノクローナル抗体阻害剤の一例であり、そこでＥＧＦＲチロシンキナーゼを活性化するリガンドの結合を妨害する。これとは対照的に、ゲフィチニブ及びエルロチニブは、細胞内に局在するＥＧＦＲチロシンキナーゼを阻害する低分子である。キナーゼ活性の非存在下では、ＥＧＦＲは、ＧＲＢ２などの下流アダプタータンパク質の結合の前提条件である、チロシン残基での自己リン酸化を受けることができない。成長のためにこの経路に依存する細胞内のシグナル伝達カスケードを停止させることによって、腫瘍の増殖及び移動が低減される。
【０００７】
さらに、他の試験は、ヒト黒色腫の約７０％及びこれより低い割合の他の腫瘍が、ＭＡＰＫ経路の持続性の活性化をもたらすＲａｆ遺伝子における点変異（Ｖ５９９Ｅ）を有することを証明している（例えば、Davies et al., Nature, 417:949-954 (2002)参照）。このような結果は、特定のシグナル伝達経路における突然変異が特定のタイプの腫瘍に特徴的であることがあり、そしてこのような特異的な、変化したシグナル伝達経路が、化学療法的介入にとって有望な標的となる可能性のあることを示唆している。
【０００８】
様々な癌治療、とりわけ癌化学療法が、細胞増殖又は細胞死の各々に関与する細胞シグナル伝達経路を遮断又は活性化することによって直接的又は間接的に機能することができることを前提に、特定形態の癌における所定のシグナル伝達経路の活性は、様々な癌治療の有効性についての優れたインジケータとして機能することができる。従って、本発明は、他の要求を満たすことに加えて、個別患者にとって有望な抗癌療法の有効性を評価するための方法を提供する。従って、本発明は、医師が患者ごとに適切な用量及び適切な時点で適合する癌療法を選択することを支援するための方法を提供する。
【０００９】
《発明の概要》
本発明は、腫瘍細胞（例えば、乳房腫瘍の循環細胞）中のシグナル伝達経路の成分の状態（例えば、発現及び／又は活性化レベル）を検出するための組成物及び方法を提供する。本発明の実施から得られるシグナル伝達経路の成分の発現及び／又は活性化状態に関する情報は、癌の診断、予後診断、及び癌治療の設計に用いることができる。
【００１０】
特定の側面において、本発明は、特定の癌がＨＥＲ２調節性化合物（例えば、ＨＥＲ２阻害剤）に対して有利に反応することができるか又は反応する可能性があるか否かを決定又は予測することを可能にする分子マーカー（バイオマーカー）を提供する。本明細書に記載のように、意外にも、ＨＥＲ２及びｐ９５ＨＥＲ２などのＨＥＲ２経路中のバイオマーカーは、ＨＥＲ２活性を調節する化合物（例えば、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤など）に対する乳癌細胞などの細胞の感受性を決定し又は予測するのにとりわけ有用であることが見出された。
【００１１】
１つの側面において、本発明は、ＨＥＲ２活性を調節する化合物に対する細胞の感受性を決定又は予測する方法であって：
（ａ）細胞を前記化合物と接触させる工程；
（ｂ）前記細胞を溶解させて細胞抽出物を生成する工程；
（ｃ）前記細胞抽出物中のＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分１種又は２種以上の発現及び／又は活性化（例えば、リン酸化）レベルを決定する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）で決定されたＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分１種又は２種以上の発現及び／又は活性化レベルをＨＥＲ２シグナル伝達経路の該成分１種又は２種以上の参照の発現及び／又は活性化レベルと比較する工程；を含み、
工程（ｃ）で決定されたＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分１種又は２種以上の発現及び／又は活性化レベルとＨＥＲ２シグナル伝達経路の該成分１種又は２種以上の参照の発現及び／又は活性化レベルとの差異が、前記細胞が前記化合物に対して感受性であるか又は耐性であるか（すなわち、感受性でない）ということを示す、方法を提供する。
【００１２】
好ましい側面において、本発明は、ＨＥＲ２活性を調節する化合物に対する細胞の感受性を決定し又は予測する方法であって、
（ａ）細胞を前記化合物と接触させる工程；
（ｂ）前記細胞を溶解させて細胞抽出物を生成する工程；
（ｃ）前記細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルを決定する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）で決定されたＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルをＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルと比較する工程；を含み、
ＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルと比較してより高い前記細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルの存在が、前記細胞が前記化合物に対して感受性でない（すなわち、耐性である）ことを示す、方法を提供する。
【００１３】
或る実施形態において、本発明の方法はＨＥＲ２活性を調節する化合物に対する細胞の感受性を決定又は予測することを補助又は支援するのに有用であることができる。他の実施形態において、本発明の方法は、ＨＥＲ２活性を調節する化合物に対する細胞の感受性の決定又は予測を改善するのに有用であることができる。
【００１４】
別の側面において、本発明は、ＨＥＲ２活性を調節する化合物に対する腫瘍の応答を予測する方法であって：
（ａ）腫瘍から得られた細胞を前記化合物と接触させる工程；
（ｂ）前記細胞を溶解させて細胞抽出物を生成する工程；
（ｃ）前記細胞抽出物中のＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分１種又は２種以上の発現及び／又は活性化（例えば、リン酸化）レベルを決定する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）で決定されたＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分１種又は２種以上の発現及び／又は活性化レベルをＨＥＲ２シグナル伝達経路の該成分１種又は２種以上の参照の発現及び／又は活性化レベルと比較する工程；を含み、
工程（ｃ）で決定されたＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分１種又は２種以上の発現及び／又は活性化レベルとＨＥＲ２シグナル伝達経路の該成分１種又は２種以上の参照の発現及び／又は活性化レベルとの差異が、前記腫瘍が前記化合物に対して応答する可能性を有する又は有しない（例えば、前記腫瘍が前記化合物に対する応答の増加又は減少の可能性を有する）ことを示す、方法を提供する。
【００１５】
好ましい側面において、本発明は、ＨＥＲ２活性を調節する化合物に対する腫瘍の応答を予測する方法であって：
（ａ）腫瘍から得られた細胞を前記化合物と接触させる工程；
（ｂ）前記細胞を溶解させて細胞抽出物を生成する工程；
（ｃ）前記細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルを決定する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）で決定されたＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルをＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルと比較する工程；を含み、
ＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルと比較してより高い前記細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルの存在が、前記腫瘍が前記化合物に対して応答する可能性を有しない（例えば、前記腫瘍が前記化合物に対する応答の減少の可能性を有する）ことを示す、方法を提供する。
【００１６】
或る実施形態において、本発明の方法は、ＨＥＲ２活性を調節する化合物に対する腫瘍の応答を予測することを補助又は支援するのに有用であることができる。他の実施形態において、本発明の方法は、ＨＥＲ２活性を調節する化合物に対する腫瘍の応答の予測を改善するのに有用であることができる。
【００１７】
なお別の側面において、本発明は、腫瘍を有しかつＨＥＲ２活性を調節する化合物を用いた療法を受ける被験者における、該化合物を用いた療法に対する応答を監視する方法であって、
（ａ）腫瘍から得られた細胞を溶解させて細胞抽出物を生成する工程；
（ｂ）前記細胞抽出物中のＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分１種又は２種以上の発現及び／又は活性化（例えば、リン酸化）レベルを決定する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で決定されたＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分１種又は２種以上の発現及び／又は活性化レベルをＨＥＲ２シグナル伝達経路の該成分１種又は２種以上の参照の発現及び／又は活性化レベルと比較する工程；を含み、
工程（ｂ）で決定されたＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分１種又は２種以上の発現及び／又は活性化レベルとＨＥＲ２シグナル伝達経路の該成分１種又は２種以上の参照の発現及び／又は活性化レベルとの差異が、前記化合物を用いた療法を継続すべきか又は調整すべきか（例えば、化合物の現在の用量を維持する、化合物の今後の用量を変更する、又は代わりの抗癌剤を選択する）を示す、方法を提供する。
【００１８】
好ましい側面において、本発明は、腫瘍を有しかつＨＥＲ２活性を調節する化合物を用いた療法を受ける被験者における、該化合物を用いた療法に対する応答を監視する方法であって、
（ａ）腫瘍から得られた細胞を溶解させて細胞抽出物を生成する工程；
（ｂ）前記細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルを決定する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で決定されたＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルをＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルと比較する工程；を含み、
ＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルと比較してより高い前記細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルの存在が、前記化合物を用いた療法を調整すべきである（例えば、化合物の今後の用量を変更する又は代わりの抗癌剤を選択する）ことを示す、方法を提供する。
【００１９】
或る実施形態において、本発明の方法は、ＨＥＲ２活性を調節する化合物を用いた治療に対する応答を監視することを補助又は支援するのに有用であることができる。他の実施形態において、本発明の方法は、ＨＥＲ２活性を調節する化合物を用いた療法に対する応答の予後診断を提供するのに有用であることができる。
【００２０】
更なる側面において、本発明は、初期ＨＥＲ２陰性の原発性乳房腫瘍を有する被験者のＨＥＲ２状態を監視する方法であって、
循環細胞中の活性化ＨＥＲ２の存在を検出することによって被験者から得られた固形腫瘍の循環細胞のＨＥＲ２状態を決定する工程を含み、前記循環細胞中の活性化ＨＥＲ２の存在が被験者のＨＥＲ２陰性状態からＨＥＲ２陽性状態への転換を示す、方法を提供する。
【００２１】
或る実施形態において、本発明の方法は、初期ＨＥＲ２陰性の原発性乳房腫瘍を有する被験者のＨＥＲ２状態を監視することを補助又は支援するのに有用であることができる。他の実施形態において、本発明の方法は、固形腫瘍の循環細胞中の被験者のＨＥＲ２状態を決定することによって初期ＨＥＲ２陰性の原発性乳房腫瘍を有する被験者の予後診断を提供するのに有用であることができる。
【００２２】
追加的な側面において、本発明は、乳房腫瘍の治療に適した抗癌剤を選択する方法であって：
（ａ）腫瘍の微細針吸引液（ＦＮＡ）試料から得られた細胞を抗癌剤と接触させる工程：
（ｂ）前記細胞を溶解させて細胞抽出物を生成する工程；
（ｃ）前記細胞抽出物中のシグナル伝達分子１種又は２種以上の発現及び／又は活性化レベルを決定する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）で決定されたシグナル伝達分子１種又は２種以上の発現及び／又は活性化レベルを該シグナル伝達分子１種又は２種以上の参照の発現及び／又は活性化レベルと比較する工程；を含み、
工程（ｃ）で決定されたシグナル伝達分子１種又は２種以上の発現及び／又は活性化レベルと該シグナル伝達分子１種又は２種以上の参照の発現及び／又は活性化レベルとの差異が、前記抗癌剤が前記乳房腫瘍の治療に適しているか又は適していないかを示す、方法を提供する。
【００２３】
或る実施形態において、本発明の方法は、乳房腫瘍の治療に適した抗癌剤の選択を補助又は支援するのに有用であることができる。他の実施形態において、本発明の方法は、乳房腫瘍の治療に適した抗癌剤の選択を改善するのに有用であることができる。
【００２４】
本発明の他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な記載及び図面から当業者に明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】採取した全血試料からのＣＴＣの単離の典型的な試料処理フローチャートを示す。
【００２６】
【図２】全ての癌試料についてのＶｅｒｉｄｅｘ ＣＴＣ計数の結果を示す。左欄：「ＢＣ」＝乳癌；「ＯＣ１」又は「ＯＣ２」＝他の癌タイプ；「３」＝ステージ３の癌；「４」＝ステージ４の癌。データは５回の再試験患者を含む。＊＊＝Ｖｅｒｉｄｅｘ計数。
【００２７】
【図３】本明細書に記載した近接アッセイを用いてＣＴＣ陽性試料において観察されたＨＥＲ１及びＨＥＲ２リン酸化の要約を示す。
【００２８】
【図４】本明細書に記載した近接アッセイを用いてｐＨＥＲ１及びｐＨＥＲ２を検出するための単細胞感度を示す。
【００２９】
【図５】様々な程度のＥｒｂＢ−ＲＴＫ発現を有する細胞系を用いた種々のタイプの乳癌に対する異種移植片−ＦＮＡモデルを示す。
【００３０】
【図６】本明細書で記載した近接アッセイを用いて検出されたＨＥＲ２受容体の活性化が腫瘍ＩＨＣスコアと一致した、凍結組織−ＦＮＡモデルを示す。「未知」＝最初のＩＨＣ状態を有しない試料。
【００３１】
【図７】図７（左）は、既知又は未知のＨＥＲ２ ＩＨＣ状態を有する乳癌組織及び正常組織からのＦＮＡ試料中の活性化ＨＥＲ１及びＨＥＲ２のレベルの要約を示す。図７（右）は、未知のＨＥＲ２ ＩＨＣ状態を有するＦＮＡ試料中のｐＥＧＦＲ及びｐＨＥＲ２レベルのグラフによる図解を示す。
【００３２】
【図８】高いＩＨＣスコアを有するＦＮＡ試料中のｐＨＥＲ２レベルの滴定分析を示す。
【００３３】
【図９】一連の希釈の４つの異なる捕捉抗体濃度を用いた、２つの異なる時点でのＦＮＡ試料中のｐＥＧＦＲ及びｐＨＥＲ２の検出を示す。
【００３４】
【図１０】疾患管理の様々な段階における療法誘導診断及び療法監視を示す。とりわけ、この図は、本発明の方法を用いて特定の患者に対する適切な乳癌療法を選択することに関して臨床実践に影響を及ぼす複数のポイントを示す。
【００３５】
【図１１】本明細書に記載の近接アッセイを用いてｐＨＥＲ１及びｐＨＥＲ２を検出するための単細胞感度を示す。
【００３６】
【図１２】凍結組織由来のＦＮＡを用いた近接アッセイ結果とＩＨＣとの相関関係を示す。
【００３７】
【図１３】図１３（上部）は、既知のＨＥＲ２ ＩＨＣ状態を有するＦＮＡ試料由来の活性化ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、ＳＨＣ、及びｐ９５のレベルを示す「ヒートマップ」を示す。図１３（下部）は、既知のＨＥＲ２ ＩＨＣ状態を有するＦＮＡ試料のサブセット中のトータルＨＥＲ２及びｐ９５レベルのウェスタンブロット分析を示す。
【００３８】
【図１４】ＨＥＲ２陰性原発性腫瘍（ＩＨＣによる）からのＨＥＲ２陽性ＣＴＣへの転換（本明細書に記載の近接アッセイを用いて検出）を示す。
【００３９】
【図１５】ＩＨＣ画像（Ｖｅｒｉｄｅｘ）によるＣＴＣ中のＨＥＲ２発現の確認を示す。
【００４０】
【図１６】図１６（上部）は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）処理したＢＴ／Ｒ細胞及びＢＴ４７４細胞中のリン酸化ＨＥＲ２レベル及びトータルＨＥＲ２レベルを示す。図１６（下部）は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）処理したＢＴ／Ｒ細胞及びＢＴ４７４細胞中のリン酸化ＨＥＲ２レベル及びトータルＨＥＲ２レベルのウェスタンブロット分析を示す。
【００４１】
【図１７】ＢＴ４７４細胞とＢＴ／Ｒ細胞との間に活性化ｐ９５レベルの有意な差があったこと及びＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）処理を用いたＢＴ４７４細胞とＢＴ／Ｒ細胞のいずれにもホスホ−ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、及びＳＨＣの減少があったことを示す。
【００４２】
【図１８】Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）処理を用いたＢＴ４７４細胞においてＨＥＲ２のリン酸化の阻害があったことを示す。
【００４３】
【図１９】Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）の非存在下でのＢＴ４７４細胞中のＥｒｂＢ経路の模式図を示す。図中のグレースケールの濃淡は活性化のレベルを示す（より濃いグレーはより高い活性化レベルを表す）。
【００４４】
【図２０】Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）処理を用いたＢＴ４７４細胞中のＥｒｂＢ経路の調節の模式図を示す。図中のグレースケールの濃淡は活性化のレベルを示す（より濃いグレーはより高い活性化レベルを表す）。
【００４５】
【図２１】Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）の非存在下でのＢＴ／Ｒ細胞中のＥｒｂＢ経路の模式図を示す。図中のグレースケールの濃淡は活性化のレベルを示す（より濃いグレーはより高い活性化レベルを表す）。
【００４６】
【図２２】Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）処理を用いたＢＴ／Ｒ細胞中のＥｒｂＢ経路の調節の模式図を示す。図中のグレースケールの濃淡は活性化のレベルを示す（より濃いグレーはより高い活性化レベルを表す）。
【００４７】
【図２３】トータル及びリン酸化ＨＥＲ１レベル並びにトータル及びリン酸化ＨＥＲ２レベルを分析するための典型的なスライドフォーマットのアレイデザインを示す。
【００４８】
【図２４】リン酸化ＨＥＲ１を検出するための本発明の典型的な協調的近接イムノアッセイ（ＣＯＰＩＡ）の模式図を示す。
【００４９】
【図２５】トータル及び活性化全長ＨＥＲ２並びにトータル及び活性化切断（truncated）ＨＥＲ２の検出を示す。
【００５０】
【図２６】トータル及びリン酸化ｐ９５の検出を示す。
【００５１】
【図２７】Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）を用いた処理が耐性であって感受性ではない細胞中の全長及び切断ＨＥＲ２の活性化レベルを増加させることを示す。トータルＨＥＲ２（Ａ）及びリン酸化ＨＥＲ２（Ｃ）並びにトータルｐＨＥＲ２（Ｂ）及びリン酸化ｐＨＥＲ２（Ｄ）の発現について細胞溶解物を分析した。
【００５２】
【図２８】Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）を用いた処理及び様々な時間における感受性（ＢＴ４７４）細胞及び耐性（ＢＴ／Ｒ）細胞中のＨＥＲ３及びＰＩ３Ｋの活性化のレベルを示す。
【００５３】
【図２９】目的のシグナル伝達物質のトータルレベル及びリン酸化レベルを検出するための典型的な近接アッセイフォーマットの模式図を示す。
【００５４】
【図３０】活性化ＨＥＲ２（ｐＨＥＲ２）、発現ＨＥＲ２（ｔＨＥＲ２）、及びＣＫのレベルの分布を示す。
【００５５】
【図３１】０８Ｏｎｃ０２コホートについてのＣＴＣ−ＨＥＲ２状態転換を示す。
【００５６】
【図３２】０８Ｏｎｃ０２ ＢＣＡ患者についてのコ−メット（co-met）及び処理評価を示す。ｐＨＥＲ２及びｔＨＥＲ２の両方についてＨＥＲ２状態転換を示す。６週間及び１２週間時点での処理評価も要約する。
【００５７】
【図３３】ＣＯＰＩＡ及びＦＩＳＨによる機能的ＨＥＲ２プロファイリングを示す。（＊ＣＵ／１０細胞）
【００５８】
【図３４】原発性乳癌（ＢＣＡ）組織中のｐ９５ＨＥＲ２発現及び活性化を示す。
【００５９】
【図３５】ＩＨＣ対ＣＯＰＩＡによって決定されたＨＥＲ２発現状態の間の相関を示す。ＩＨＣ法とＩＰ−ウェスタン法との間で不一致のＨＥＲ２状態を有する試料は赤色で同定される。
【００６０】
【図３６】不一致の試料中のＨＥＲ２発現状態を確認するために実施されたＩＰ−ウェスタン分析を示す。ＩＨＣとＣＯＰＩＡとの間で不一致のＨＥＲ２状態を有する試料をさらにＩＰ−ウェスタンによりＨＥＲ２発現について調査した。試料のサブセットを示す。ＨＥＲ２−ＩＨＣ陽性試料も対照として用いた。
【００６１】
【図３７】ＣＯＰＩＡによる機能的経路プロファイリングの例を示す。
【００６２】
【図３８】実施例１１に記載の試験に用いたマイクロアレイスライドフォーマットを示す。
【００６３】
【図３９】転移性乳癌を有する患者から得られたＦＮＡ試料についての経路プロファイリングの例を提供する。
【００６４】
【図４０】転移性乳癌を有する患者から得られたＦＮＡ試料についての経路プロファイリングの第２の例を提供する。
【００６５】
【図４１】転移性乳癌を有する患者から得られたＦＮＡ試料についての経路プロファイリングの第３の例を提供する。
【００６６】
【図４２】転移性乳癌を有する患者から得られたＦＮＡ試料についての経路プロファイリングの第４の例を提供する。
【００６７】
【図４３】転移性乳癌を有する患者から得られたＦＮＡ試料についての経路プロファイリングの第５の例を提供する。
【００６８】
【図４４】転移性乳癌を有する患者から得られたＦＮＡ試料についての経路プロファイリングの第６の例を提供する。
【００６９】
【図４５】転移性乳癌を有する患者から得られたＦＮＡ試料についての経路プロファイリングの第７の例を提供する。
【００７０】
【図４６】転移性乳癌を有する患者から得られたＦＮＡ試料についての経路プロファイリングの第８の例を提供する。
【００７１】
【図４７】（ａ）それぞれＭＤＡ−ＭＢ４６８及びＳＫＢｒ３中の単細胞の感度レベルでのＨＥＲ１及びＨＥＲ２の活性化；（ｂ）１レーン当たりトータルタンパク質１２μｇ（約４０００細胞）から生成されたウェスタンブロットデータ；（ｃ）ｐＨＥＲ1（リン酸化ＨＥＲ１）又はｐＨＥＲ２（リン酸化ＨＥＲ２）に対し２０％シグナル飽和（又は１２０００ＲＦＵ）を検出するのに必要な細胞数を用いて低いＲＴＫ発現（ＲＦＵ／細胞）を伴う細胞の１細胞当たりのＲＴＫ活性化を計算した；（ｄ）異種移植片を種々の程度のＥｒｂＢ−ＲＴＫ発現を伴う細胞系：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５及びＢＴ４７４から得た；（ｅ）２６例のステージＩＩ〜ＩＩＩ凍結ＢＣＡ（１２例のＨＥＲ２−ＩＨＣ ３＋、７例のＨＥＲ２−ＩＨＣ １＋、７例のＨＥＲ２−ＩＨＣ −）及び４例の正常隣接組織由来の組織試料をＨＥＲ２／ＨＥＲ１発現及び活性化について分析した；（ｆ）トータルＨＥＲ２発現及びＨＥＲ２リン酸化についての２６例のＢＣＡ試料の散布図。
【００７２】
【図４８】（ａ）各スライドについて、細胞系ＭＤ−４６８（ＨＥＲ１陽性）細胞及びＳＫＢｒ３（ＨＥＲ２陽性）細胞の溶解物から、連続的に希釈された細胞溶解物からなる標準曲線を作成した；（ｂ）ｐＨＥＲ１及びｐＨＥＲ２の両方について検出限界（ＬＯＤ）値が１ＣＵより低いことが決定された；（ｃ）ＨＥＲ２発現及び活性化について分析された２７例の乳癌試料の全てを表に示す。
【００７３】
【図４９】データ整理（data reduction）及びデータ解析の方法の概要を提供する。
【００７４】
【図５０】（ａ）標準曲線及び（ｂ）１の分析物についての計算を示す。
【００７５】
国際公開第２００９／１０８６３７号パンフレットからの図表は、あらゆる目的のためにこれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７６】
《発明の詳細な記載》
Ｉ．序論
上述したように、細胞増殖に関与するシグナル伝達経路の活性化及び細胞死に関与する経路の非活性化は、多数の様々なタイプの癌を特性付ける分子的特徴の限定的でない例である。多くの場合において、特定のシグナル伝達経路の活性、及びそれらの成分は、所定のタイプの癌に対する分子シグニチャーとして機能することができる。このような活性化された成分は、治療介入に対して有用な標的をさらに提供することができる。従って、治療前、治療中、及び治療後の癌細胞内での特定シグナル伝達系の活性レベルに関する知見は、採用するべき適切な治療経過を選択するために用いることができる高度に重要な情報を医師に提供する。さらに、治療が進行するにつれて癌細胞内で活性になるシグナル伝達経路の持続的監視は、医師に治療の有効性に関する追加の情報を提供して、例えば、同じ又は別のシグナル伝達経路のいずれかを活性化する別の異常を通して癌細胞が治療に対して耐性になった場合に、医師に特定の治療コースを持続するか、又は別の治療ラインへ切り替えるかを促すことができる。
【００７７】
従って、本発明は、特異的な多重の高スループットアッセイにおいて固形腫瘍の腫瘍組織又は希少循環細胞などの腫瘍外細胞中での複数の無秩序のシグナル伝達分子の発現及び／又は活性化状態を検出するための方法及び組成物を提供する。本発明は、無秩序なシグナル伝達経路をダウンレギュレート又は活動停止させるために適切な療法（単剤又は薬物の組み合わせ）を選択するための方法及び組成物も提供する。このように、本発明を用いることによって、癌患者に合わせた個別の療法の設計を促進することができる。
【００７８】
単細胞のレベルでのシグナル伝達経路の活性の決定を通して循環中の腫瘍細胞を検出及び同定する能力は、本発明の重要な利点である。腫瘍細胞は、「微小転移」（播種性腫瘍細胞）としての様々な初期段階の癌を有する患者の血液中に見出されることが多く、転移性癌においても見出される。血液中の腫瘍細胞の数は、腫瘍のステージ及びタイプに依存するであろう。生検は典型的には原発性腫瘍において入手され、大部分の転移性腫瘍では生検が行われないので、このような腫瘍試料の分子分析を行うことは極めて困難である。腫瘍転移中には、大多数の侵攻性腫瘍細胞は原発性腫瘍を離れ、血液系及びリンパ系を通って移動し、遠隔部位に達する。このように、血液由来の循環腫瘍細胞は、腫瘍細胞の最も侵攻性で均質な集団を表す。しかしながら、血液中の転移性腫瘍細胞の数は、極めて少ないことが多く、血液１ｍＬ当たり１個〜数千個まで様々である。このような希少細胞中のシグナル伝達経路を単離してアッセイし、この情報をより効果的な癌治療に向けて適用する能力は、本発明の１つの目的である。
【００７９】
或る実施形態において、本発明の多重の高スループットイムノアッセイは、固形腫瘍の循環細胞中のシグナル伝達分子１種又は２種以上の活性化状態を単細胞レベルで検出することができる。実際に、ＥＧＦＲなどのシグナル伝達分子を、約１００ゼプトモルの感度及び約１００ゼプトモル〜約１００フェムトモルの線形ダイナミックレンジで検出することができる。従って、希少循環細胞中の複数のシグナル伝達物質の活性化状態の単細胞的検出は、癌の予後診断及び診断並びに個別の標的化療法の設計を促進する。
【００８０】
希少循環細胞には、固形腫瘍から転移又は微小転移している固形腫瘍の循環細胞が含まれる。循環腫瘍細胞、癌幹細胞、及び、腫瘍へ移動している（例えば、化学走化性による）細胞、例えば、循環内皮前駆細胞、循環内皮細胞、循環前血管新生骨髄性細胞、及び循環樹状細胞は、固形腫瘍と関連付けられた循環細胞の一部の例である。
【００８１】
目的のシグナル伝達分子を、典型的には循環細胞を単離した直後に、好ましくは約２４、６、又は１時間以内、及びより好ましくは約３０、１５、又は５分間以内に抽出して、それらのインサイチュ（in situ）活性化状態を保持する。単離した細胞は、さらに、通常はナノモル〜ミクロモル濃度の成長因子１種又は２種以上と約１〜３０分間にわたりインキュベートして、シグナル伝達分子の活性化を復活させ又は刺激することができる（例えば、Irish et al., Cell, 118:217-228 (2004)参照）。
【００８２】
本明細書でより詳細に説明するように、個別患者に対して有望な抗癌療法を評価するために、単離した細胞を様々な量の抗癌剤１種又は２種以上とインキュベートすることができる。次いで、成長因子刺激を数分間（例えば、約１〜５分間）又は数時間（例えば、約１〜６時間）にわたり実施することができる。抗癌剤を用いた及び用いないシグナル伝達経路の活性化の差異は、各個別患者に対する適正用量での適切な癌療法の選択に役立つことができる。循環細胞を抗癌剤治療中の患者試料から単離し、成長因子１種又は２種以上を用いて刺激することにより、療法の変更を実施すべきかどうかを決定することもできる。従って、本発明の方法は、有利なことに、医師が患者ごとに適切な時点で適切な用量の適切な抗癌剤を提供することを支援する。
【００８３】
乳癌に関連して、現行の試験選択肢は不十分であるが、それは乳癌患者における原発性腫瘍及び転移性腫瘍の両方の治療が、疾患の初期ステージの間に採取された生検試料からの１回限りの診断に基づいているからである。詳細には、乳癌の初期及び転移ステージの両方についての治療介入は、転移癌患者からの生検試料の入手が実行不可能であるために、疾患の初期ステージに採取された生検試料からの初期診断のみに基づいている。しかしながら、乳房腫瘍は、時間及び治療の関数として進展する（evolving）ので、乳房腫瘍の時間的監視は乳癌患者の最適な管理のために極めて重要である。例えば、受容体チロシンキナーゼのＥｒｂＢ（ＨＥＲ）ファミリーの１つ又は２つ以上の活性化状態における変化は、再発時の治療選択に影響を及ぼす可能性がある。実際に、原発性癌と転移性癌との間のＨＥＲ２状態における不一致は、全乳癌患者の３７％までがＨＥＲ２陰性の原発性腫瘍からＨＥＲ２陽性の転移性癌へ変化するために、一般的である。さらに、患者はＨＥＲ１／２活性化によってホルモン療法に対する初めからの耐性を有し又は獲得耐性を発生することがある。或る場合には、患者は、ｐ９５ＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞の存在によってＥｒｂＢ標的化療法への初めからの耐性を有し又は獲得耐性を発生することがある。結果として、現行技術は感受性及び特異性を欠いており、療法下の患者を監視するためには用いることができず、そして個別治療決定を誘導するための経路プロファイリングを利用しないので、医師が適切な時点で適切な癌療法を処方することを支援するアッセイに対する満たされていない臨床的要求が存在する。
【００８４】
現在利用できる乳癌検査の選択肢とは対照的に、本発明の方法は、血液及び／又は微細針吸引液（ＦＮＡ）に由来する循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）などの試料を用いて固形乳房腫瘍の「リアルタイム生検」を提供することによって、疾患の全ステージを通して乳癌患者を監視することを可能にする。限定的でない例として、本明細書に記載した乳癌アッセイは、疾患の初期ステージにおいて患者の乳癌の初期診断に用いることができる。適切な癌療法の選択は、本明細書に記載したアッセイを用いて、抗癌剤を用いて及び用いないで特異的シグナル伝達経路の発現及び／又は活性化状態をプロファイリングすることによって誘導される。有利には、本発明の方法は、疾患の任意の段階に採取され、本明細書に記載したアッセイを用いて分析される試料に基づいて治療的介入を行うことができるので、疾患の進行又は退行を監視するためにも用いることができる。従って、乳癌の初期及び転移ステージに対する適切な癌療法の選択は、リアルタイム診断及び特異的シグナル伝達経路分子の発現及び／又は活性化状態の分析によって誘導される。
【００８５】
有利なことに、本発明の方法は、癌管理における重要な問題に対処し、乳癌患者に対してより高度の標準治療を提供できるように作られているが、それは前記方法が（１）高められた感度を提供する（例えば、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２などのトータル及びリン酸化シグナル伝達分子を検出するために単細胞検出を達成することができる）、（２）高められた特異性を提供する（例えば、３抗体近接アッセイはトータル及びリン酸化シグナル伝達分子を検出するための特異性を高める）、（３）経路プロファイリングを可能にする（例えば、特異的シグナル伝達分子の発現及び／又は活性化状態を患者由来のＣＴＣ及びＦＮＡ中で検出できる）、及び（４）患者試料を入手することに伴うあらゆる問題を排除する（例えば、アッセイは少数の腫瘍細胞で実施することができる）からである。本明細書に記載したアッセイではあらゆる試料を使用できるが、ＣＴＣは最も侵攻性の腫瘍細胞を表し、各腫瘍はＣＴＣを遊離させることが知られており、遺残腫瘍又は入手が困難な転移性腫瘍の唯一の供給源であることができ、そしてそれらは血中に見出されるので、特に有用である。従って、本発明の方法は、乳房腫瘍組織の連続サンプリングによって、時間及び療法の関数として腫瘍細胞内で生ずる変化に関する有用な情報を得ることを可能にし、そして急速に進展する癌経路シグニチャーを監視するための手段を医師に提供することを可能にする。
【００８６】
これらをまとめると、本発明の組成物及び方法は有利には、多重化された、抗体に基づく近接アッセイを用いて、容易に入手可能な腫瘍細胞についての経路プロファイリングを実施することによって標的化療法から最も利益が得られると考えられる癌患者（例えば、乳癌患者）の正確な予測、選択、及び監視を提供する。
【００８７】
ＩＩ．定義
本明細書で使用する場合に、以下の用語は、他に特に規定しない限り、それらに与えられた意味を有する。
【００８８】
用語「癌」は、異常細胞の制御されない増殖を特徴とする疾患クラスの任意のメンバーを含むことを意図する。この用語は、悪性、良性、軟組織、若しくは固形、又は転移前及び転移後癌を含むあらゆるステージ及びグレードの癌のいずれであると特徴付けられようと、あらゆる公知の癌及び腫瘍状態を含む。様々な癌のタイプの例として、乳癌；肺癌（例えば、非小細胞肺癌）；結腸直腸癌、消化管間質腫瘍、消化管カルチノイド腫瘍、結腸癌、直腸癌、肛門癌、胆管癌、小腸癌、及び胃癌などの消化器及び消化管癌；食道癌；胆嚢癌；肝臓癌；膵臓癌；虫垂癌；卵巣癌；腎臓癌（例えば、腎細胞癌）；中枢神経系の癌；皮膚癌；リンパ腫；絨毛腫；頭頸部癌；骨原性肉腫；並びに血液癌を挙げることができるがそれらに限定されない。本明細書で使用する「腫瘍」は、癌性細胞（cancerous cell）１個又は２個以上を含む。１つの実施形態では、乳房腫瘍は、浸潤性若しくは非浸潤性の乳管癌又は小葉癌を有する被験者に由来する。別の実施形態では、乳房腫瘍は、再発性又は転移性乳癌を有する患者に由来する。
【００８９】
用語「分析物」には、目的の任意の分子、典型的にはその存在、量（発現レベル）、活性化状態、及び／又は同一性が決定されるポリペプチドなどの高分子が含まれる。所定の場合には、分析物は、例えば、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）シグナル伝達経路の成分などのシグナル伝達分子である。
【００９０】
用語「シグナル伝達分子」又は「シグナル伝達物質」は、それにより細胞が細胞外シグナル又は刺激を応答に転換するプロセスであって、典型的には細胞の内部での順序付けられた生化学反応の順序を含むプロセスを実施するタンパク質及び他の分子を含む。シグナル伝達分子の例として、受容体チロシンキナーゼ、例えば、ＥＧＦＲ（例えば、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１／ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ４／ＥｒｂＢ４）、ＶＥＧＦＲ１／ＦＬＴ１、ＶＥＧＦＲ２／ＦＬＫ１／ＫＤＲ、ＶＥＧＦＲ３／ＦＬＴ４、ＦＬＴ３／ＦＬＫ２、ＰＤＧＦＲ（例えば、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ）、ｃ−ＫＩＴ／ＳＣＦＲ、ＩＮＳＲ（インスリン受容体）、ＩＧＦ−ＩＲ、ＩＧＦ−ＩＩＲ、ＩＲＲ（インスリン受容体関連受容体）、ＣＳＦ−１Ｒ、ＦＧＦＲ１−４、ＨＧＦＲ１−２、ＣＣＫ４、ＴＲＫ Ａ−Ｃ、ｃ−ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＥＰＨＡ１−８、ＥＰＨＢ１−６、ＡＸＬ、ＭＥＲ、ＴＹＲＯ３、ＴＩＥ１−２、ＴＥＫ、ＲＹＫ、ＤＤＲ１−２、ＲＥＴ、ｃ−ＲＯＳ、Ｖ−カドヘリン、ＬＴＫ（白血球チロシンキナーゼ）、ＡＬＫ（未分化リンパ腫キナーゼ）、ＲＯＲ１−２、ＭＵＳＫ、ＡＡＴＹＫ１−３、及びＲＴＫ１０６；受容体チロシンキナーゼの切断形、例えば、欠損（missing）アミノ末端細胞外ドメインを有する切断ＨＥＲ２受容体（例えば、ｐ９５ＥｒｂＢ２（ｐ９５ｍ）、ｐ１１０、ｐ９５ｃ、ｐ９５ｎなど）；受容体チロシンキナーゼ二量体（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ２、ＨＥＲ２／ＨＥＲ２、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ１／ＨＥＲ２、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ２／ＨＥＲ４など）；非受容体チロシンキナーゼ、例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｓｒｃ、Ｆｒｋ、Ｂｔｋ、Ｃｓｋ、Ａｂｌ、Ｚａｐ７０、Ｆｅｓ／Ｆｐｓ、Ｆａｋ、Ｊａｋ、Ａｃｋ、及びＬＩＭＫ；チロシンキナーゼシグナル伝達カスケード成分、例えば、ＡＫＴ（例えば、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３）、ＭＥＫ（ＭＡＰ２Ｋ１）、ＥＲＫ２（ＭＡＰＫ１）、ＥＲＫ１（ＭＡＰＫ３）、ＰＩ３Ｋ（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ１１０）、ＰＩＫ３Ｒ１（ｐ８５））、ＰＤＫ１、ＰＤＫ２、ホスファターゼ及びテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、ＳＧＫ３、４Ｅ−ＢＰ１、Ｐ７０Ｓ６Ｋ（例えば、ｐ７０Ｓ６キナーゼスプライスバリアントアルファＩ）、タンパク質チロシンホスファターゼ（例えば、ＰＴＰ１Ｂ、ＰＴＰＮ１３、ＢＤＰ１など）、ＲＡＦ、ＰＬＡ２、ＭＥＫＫ、ＪＮＫＫ、ＪＮＫ、ｐ３８、Ｓｈｃ（ｐ６６）、Ｒａｓ（例えば、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ）、Ｒｈｏ、Ｒａｃ１、Ｃｄｃ４２、ＰＬＣ、ＰＫＣ、ｐ５３、サイクリンＤ１、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ホスファチジルイノシトール４，５−ビスホスフェート（ＰＩＰ２）、ホスファチジルイノシトール３，４，５−トリホスフェート（ＰＩＰ３）、ｍＴＯＲ、ＢＡＤ、ｐ２１、ｐ２７、ＲＯＣＫ、ＩＰ３、ＴＳＰ−１、ＮＯＳ、ＧＳＫ−３β、ＲＳＫ１−３、ＪＮＫ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｒｂ、ＣＲＥＢ、Ｋｉ６７、及びパキシリン；核ホルモン受容体、例えば、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、アンドロゲン受容体、グルココルチコイド受容体、鉱質コルチコイド��容体、ビタミンＡ受容体、ビタミンＤ受容体、レチノイド受容体、甲状腺ホルモン受容体、及びオーファン受容体；それぞれ、乳癌−１（ＡＩＢ１）及び核受容体コリプレッサー１（ＮＣＯＲ）内で増幅されるような核受容体コアクチベーター及びリプレッサー；並びにそれらの組み合わせを挙げることができるがそれらに限定されない。
【００９１】
用語「ＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分」には、ＨＥＲ２の上流リガンド、ＨＥＲ２の結合パートナー、及び／又はＨＥＲ２を介して調節される下流エフェクタ分子のいずれか１種又は２種以上が含まれる。ＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分の例として、ヘレグリン（heregulin）、ＨＥＲ１／ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ４／ＥｒｂＢ４，ＡＫＴ（例えば、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３）、ＭＥＫ（ＭＡＰ２Ｋ１）、ＥＲＫ２（ＭＡＰＫ１）、ＥＲＫ１（ＭＡＰＫ３）、ＰＩ３Ｋ（例えば、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ１１０）、ＰＩＫ３Ｒ１（ｐ８５））、ＰＤＫ１、ＰＤＫ２、ＰＴＥＮ、ＳＧＫ３、４Ｅ−ＢＰ１、Ｐ７０Ｓ６Ｋ（例えば、スプライスバリアントアルファＩ）、タンパク質チロシンホスファターゼ（例えば、ＰＴＰ１Ｂ、ＰＴＰＮ１３、ＢＤＰ１など）、ＨＥＲ２二量体（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ２、ＨＥＲ２／ＨＥＲ２、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ１／ＨＥＲ２、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ２／ＨＥＲ４など）、ＧＳＫ−３β、ＰＩＰ２、ＰＩＰ３、ｐ２７及びそれらの組み合わせを挙げることができるがそれらに限定されない。
【００９２】
用語「活性化状態」は、ＨＥＲ２シグナル伝達経路成分などの特定のシグナル伝達分子が活性化されているか否かを意味する。同様に、用語「活性化レベル」は、ＨＥＲ２シグナル伝達経路成分などの特定のシグナル伝達分子がどの程度活性化されているかを意味する。活性化状態は典型的には、シグナル伝達分子１種又は２種以上のリン酸化、ユビキチン化、及び／又は複合体形成状態に対応する。活性化状態の限定的でない例（括弧内に列挙）として：ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ、リン酸化（ｐ−）ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ：Ｓｈｃ、ユビキチン化（ｕ−）ＥＧＦＲ、ｐ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ＥｒｂＢ２（ｐ−ＥｒｂＢ２、ｐ９５ＨＥＲ２（切断ＥｒｂＢ２）、ｐ−ｐ９５ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ２：Ｓｈｃ、ＥｒｂＢ２：ＰＩ３Ｋ、ＥｒｂＢ２：ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ４）；ＥｒｂＢ３（ｐ−ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ３：ＰＩ３Ｋ、ｐ−ＥｒｂＢ３：ＰＩ３Ｋ、ＥｒｂＢ３：Ｓｈｃ）；ＥｒｂＢ４（ｐ−ＥｒｂＢ４、ＥｒｂＢ４：Ｓｈｃ）；ｃ−ＭＥＴ（ｐ−ｃ−ＭＥＴ）；ＡＫＴ１（ｐ−ＡＫＴ１）；ＡＫＴ２（ｐ−ＡＫＴ２）；ＡＫＴ３（ｐ−ＡＫＴ３）；ＰＴＥＮ（ｐ−ＰＴＥＮ）；Ｐ７０Ｓ６Ｋ（ｐ−Ｐ７０Ｓ６Ｋ）；ＭＥＫ（ｐ−ＭＥＫ）；ＥＲＫ１（ｐ−ＥＲＫ１）；ＥＲＫ２（ｐ−ＥＲＫ２）；ＰＤＫ１（ｐ−ＰＤＫ１）；ＰＤＫ２（ｐ−ＰＤＫ２）；ＳＧＫ３（ｐ−ＳＧＫ３）；４Ｅ−ＢＰ１（ｐ−４Ｅ−ＢＰ１）；ＰＩＫ３Ｒ１（ｐ−ＰＩＫ３Ｒ１）；ｃ−ＫＩＴ（ｐ−ｃ−ＫＩＴ）；ＥＲ（ｐ−ＥＲ）；ＩＧＦ−１Ｒ（ｐ−ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦ−１Ｒ：ＩＲＳ、ＩＲＳ：ＰＩ３Ｋ、ｐ−ＩＲＳ、ＩＧＦ−１Ｒ：ＰＩ３Ｋ）；ＩＮＳＲ（ｐ−ＩＮＳＲ）；ＦＬＴ３（ｐ−ＦＬＴ３）；ＨＧＦＲ１（ｐ−ＨＧＦＲ１）；ＨＧＦＲ２（ｐ−ＨＧＦＲ２）；ＲＥＴ（ｐ−ＲＥＴ）；ＰＤＧＦＲＡ（ｐ−ＰＤＧＦＲＡ）；ＰＤＧＦＲＢ（ｐ−ＰＤＧＦＲＢ）；ＶＥＧＦＲ１（ｐ−ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ１：ＰＬＣγ、ＶＥＧＦＲ１：Ｓｒｃ）；ＶＥＧＦＲ２（ｐ−ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ２：ＰＬCγ、ＶＥＧＦＲ２：Ｓｒｃ、ＶＥＧＦＲ２：ヘパリンスルフェート、ＶＥＧＦＲ２：ＶＥ−カドヘリン）；ＶＥＧＦＲ３（ｐ−ＶＥＧＦＲ３）；ＦＧＦＲ１（ｐ−ＦＧＦＲ１）；ＦＧＦＲ２（ｐ−ＦＧＦＲ２）；ＦＧＦＲ３（ｐ−ＦＧＦＲ３）；ＦＧＦＲ４（ｐ−ＦＧＦＲ４）；ＴＩＥｌ（ｐ−ＴＩＥｌ）；ＴＩＥ２（ｐ−ＴＩＥ２）；ＥＰＨＡ（ｐ−ＥＰＨＡ）；ＥＰＨＢ（ｐ−ＥＰＨＢ）；ＧＳＫ−３β（ｐ−ＧＳＫ−３β）；ＮＦＫＢ（ｐ−ＮＦＫＢ）、ＩＫＢ（ｐ−ＩＫＢ、ｐ−Ｐ６５：ＩＫＢ）；ＢＡＤ（ｐ−ＢＡＤ、ＢＡＤ：１４−３−３）；ｍＴＯＲ（ｐ−ｍＴＯＲ）；Ｒｓｋ−１（ｐ−Ｒｓｋ−１）；Ｊｎｋ（ｐ−Ｊｎｋ）；Ｐ３８（ｐ−Ｐ３８）；ＳＴＡＴ３（ｐ−ＳＴＡＴ３）；Ｆａｋ（ｐ−Ｆａｋ）；Ｒｂ（ｐ−Ｒｂ）；Ｋｉ６７；ｐ５３（ｐ−ｐ５３）；ＣＲＥＢ（ｐ−ＣＲＥＢ）；ｃ−Ｊｕｎ（ｐ−ｃ−Ｊｕｎ）；ｃ−Ｓｒｃ（ｐ−ｃ−Ｓｒｃ）；及びパキシリン（ｐ−パキシリン）を挙げることができる。
【００９３】
本明細書で使用する用語「希釈系列」は、特定の試料（例えば、細胞溶解物）又は試薬（例えば、抗体）の一連の減少する濃度を含むことを意図する。希釈系列は、典型的には、測定された量の出発濃度の試料又は試薬を希釈液（例えば、希釈バッファ）と混合して低濃度の試料又は試薬を作成するプロセスと、所望の数の連続希釈液を得るために充分な回数にわたり前記プロセスを繰り返す工程によって生成される。試料又は試薬を、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、５００、又は１，０００倍に連続的に希釈して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０の減少濃度の試料又は試薬を含む希釈系列を生成することができる。例えば、出発濃度１ｍｇ／ｍＬの捕捉抗体試薬の２倍連続希釈を含む希釈系列は、或る量の前記出発濃度の捕捉抗体を等量の希釈バッファと混合して０．５ｍｇ／ｍＬ濃度の捕捉抗体を作成することと、該プロセスを繰り返して０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．１２５ｍｇ／ｍＬ、０．０６２５ｍｇ／ｍＬ、０．０３２５ｍｇ／ｍＬなどの捕捉抗体濃度を得ることによって生成することができる。
【００９４】
本明細書で使用する用語「優れたダイナミックレンジ」とは、１個という少ない細胞内又は数千個という多数の細胞内で特異的分析物を検出するアッセイの能力を意味する。例えば、本明細書に記載したイムノアッセイは、有利には希釈系列の捕捉抗体濃度を用いて約１〜１０，０００細胞（例えば、約１、５、１０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００、７５０、１，０００、２，５００、５，０００、７，５００、若しくは１０，０００細胞）中で目的の特定シグナル伝達分子を検出するので、優れたダイナミックレンジを有する。
【００９５】
本明細書で使用する用語「循環細胞」は、固形腫瘍から転移した又は微小転移したいずれかである腫瘍外細胞を含む。循環細胞の例として、循環腫瘍細胞、癌幹細胞、及び／又は腫瘍へ移動中である細胞（例えば、循環内皮前駆細胞、循環内皮細胞、循環前血管新生骨髄性細胞、循環樹状細胞など）を挙げることができるがそれらに限定されない。循環細胞を含有する患者試料は、任意の入手可能な体液（例えば、全血、血清、血漿、痰、気管支洗浄液、尿、乳頭吸引液、リンパ液、唾液、微細針吸引液など）から得ることができる。所定の場合には、全血試料は、血漿又は血清分画及び細胞分画（すなわち、細胞ペレット）に分離される。細胞分画は、典型的には、赤血球、白血球、及び／又は固形腫瘍の循環細胞、例えば、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、循環内皮細胞（ＣＥＣ）、循環内皮前駆細胞（ＣＥＰＣ）、癌幹細胞（ＣＳＣ）、リンパ節の播種性腫瘍細胞、及びそれらの組み合わせを含有する。血漿又は血清分画は、通常は、特に、固形腫瘍の循環細胞によって遊離される核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）及びタンパク質を含有する。
【００９６】
循環細胞を、典型的には、例えば、免疫磁気分離法（例えば、Racila et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:4589-4594 (1998)；Bilkenroth et al., Int. J. Cancer, 92:577-582 (2001)参照）、Ｉｍｍｕｎｉｃｏｎ社（ペンシルバニア州ハンティントン・バレー）によるＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（商標）システム、マイクロ流体分離法（例えば、Mohamed et al., IEEE Trans. Nanobiosci., 3:251-256 (2004)；Lin et al., Abstract No. 5147, 97th AACR Annual Meeting, Washington, D.C. (2006)参照）、ＦＡＣＳ（例えば、Mancuso et al., Blood, 97:3658-3661 (2001)参照）、密度勾配遠心分離法（例えば、Baker et al., Clin. Cancer Res., 13:4865-4871 (2003)参照）、及び枯渇法（例えば、Meye et al., Int. J. Oncol., 21:521-530 (2002)参照）を含む１つ又は２つ以上の分離方法を用いて患者試料から単離する。
【００９７】
本明細書で使用する用語「試料」は、患者から得られる任意の生物学的検体を含む。試料として、限定的でなく、全血、血漿、血清、赤血球、白血球（例えば、末梢血単核球）、乳管洗浄液、乳頭吸引液、リンパ液（例えば、リンパ節の播種性腫瘍細胞）、骨髄吸引液、唾液、尿、便（すなわち大便）、痰、気管支洗浄液、涙液、微細針吸引液（例えば、乳輪周囲の無作為微細針吸引により採取）、任意の他の体液、腫瘍の生検（例えば、針生検）又はリンパ節の生検（例えば、センチネルリンパ節生検）などの組織試料（例えば、腫瘍組織）、並びにそれらの細胞抽出物を挙げることができる。或る実施形態において、試料は、全血又は血漿、血清、若しくは細胞ペレットなどの全血の分画成分である。好ましい実施形態において、当業者に公知である任意の技術を用いて全血又はその細胞分画から固形腫瘍の循環細胞を単離することによって試料を入手する。他の実施形態において、試料は、例えば、乳房の固形腫瘍由来の、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織試料である。
【００９８】
「生検」は、診断的又は予後診断的評価のために組織試料を取り出す工程及び組織検体自体を意味する。当分野において公知の任意の生検技術を、本発明の方法及び組成物に適用することができる。適用される生検技術は、一般には、他の因子の中でも特に、評価すべき組織タイプ並びに腫瘍の大きさ及びタイプ（すなわち、固形又は浮遊型（すなわち、血液又は腹水））に依存するであろう。代表的な生検技術には、切除生検、切開生検、針生検（例えば、コア針生検、微細針吸引生検など）、外科生検、及び骨髄生検が含まれる。生検技術は、例えば、Harrison’s Principles of Internal Medicine, Kasper, et al., eds., 16th ed., 2005, Chapter 70及び Part V全体において考察されている。当業者であれば、所定の組織試料中で癌性及び／又は前癌性細胞を同定するために生検技術を実施できることを理解されよう。
【００９９】
用語「被験者」又は「患者」又は「個人」は、典型的にはヒトを含むが、例えば、他の霊長類、齧歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ブタなどの他の動物も含むことができる。
【０１００】
「アレイ」又は「マイクロアレイ」は、例えば、ガラス（例えば、ガラススライド）、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ（例えば、磁気ビーズ、ポリスチレンビーズなど）、紙、膜（例えば、ナイロン、ニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）など）、繊維束、又は任意の他の適切な基材などの固体支持体上に固定化又は拘束された（restrained）個別のセット及び／又は希釈系列の捕捉抗体を含む。捕捉抗体は、一般に共有又は非共有相互作用（例えば、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、双極子間結合）を介して固体支持体上に固定化又は拘束される。所定の場合には、捕捉抗体は、固体支持体に結合した捕捉剤と相互作用する捕捉タグを含む。本明細書に記載のアッセイにおいて使用されるアレイは、典型的には、異なる既知／アドレス可能な場所において固体支持体の表面に結合している複数の異なる捕捉抗体及び／又は捕捉抗体濃度を含む。
【０１０１】
用語「捕捉抗体」は、細胞抽出物などの試料中の目的の分析物１種又は２種以上に特異的である（すなわち、結合し、それによって結合され、又は一緒に複合体を形成する）固定化された抗体を含むことを意図している。特定の実施形態において、捕捉抗体は、アレイ内の固体支持体上に拘束される。固体支持体上で様々なシグナル伝達分子のいずれかを固定化するのに適切な捕捉抗体は、Ｕｐｓｔａｔｅ社（カリフォルニア州テメキュラ）、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社（カリフォルニア州カマリロ）、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（マサチューセッツ州ダンバーズ）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ミネソタ州ミネアポリス）、Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ社（カリフォルニア州フレモント）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（カリフォルニア州サンタクルーズ）、Ｓｉｇｍａ社（ミズーリ州セントルイス）、及びＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（カリフォルニア州サンノゼ）から入手することができる。
【０１０２】
本明細書で使用する用語「検出抗体」は、試料中の目的の分析物１種又は２種以上に特異的である（すなわち、結合し、それによって結合され、又は一緒に複合体を形成する）検出可能な標識を含む抗体を含む。この用語は、目的の分析物１種又は２種以上に特異的である抗体を含み、該抗体を検出可能な標識を含む別の種に結合させることができる。検出可能な標識の例として、ビオチン／ストレプトアビジン標識、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）標識、化学的反応性の標識、蛍光標識、酵素標識、放射活性標識、及びそれらの組み合わせを挙げることができるがそれらに限定されない。様々なシグナル伝達分子のいずれかの活性化状態及び／又は全量を検出するのに適切な検出抗体は、Ｕｐｓｔａｔｅ社（カリフォルニア州テメキュラ）、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社（カリフォルニア州カマリロ）、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（マサチューセッツ州ダンバーズ）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ミネソタ州ミネアポリス）、Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ社（カリフォルニア州フレモント）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（カリフォルニア州サンタクルーズ）、Ｓｉｇｍａ社（ミズーリ州セントルイス）、及びＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（カリフォルニア州サンノゼ）から入手することができる。限定的でない例として、ＥＧＦＲ、ｃ−ＫＩＴ、ｃ−Ｓｒｃ、ＦＬＫ−１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＡＫＴ、ＭＡＰＫ、ＰＴＥＮ、Ｒａｆ、及びＭＥＫなどのシグナル伝達分子の様々なリン酸化形に対するリン特異的抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から入手することができる。
【０１０３】
用語「活性化状態依存性抗体」は、試料中の目的の分析物１種又は２種以上の特定の活性化状態に特異的である（すなわち、結合し、それによって結合され、又は一緒に複合体を形成する）検出抗体を含む。好ましい実施形態において、活性化状態依存性抗体は、シグナル伝達分子１種又は２種以上などの分析物１種又は２種以上のリン酸化、ユビキチン化、及び／又は複合体形成状態を検出する。或る実施形態において、受容体チロシンキナーゼのＥＧＦＲファミリーのメンバーのリン酸化及び／又はＥＧＦＲファミリーメンバー間のヘテロ二量体複合体の形成を、活性化状態依存性抗体を用いて検出する。特定の実施形態において、活性化状態依存性抗体は、以下のシグナル伝達分子１種又は２種以上におけるリン酸化の１つ又は２つ以上の部位（ヒトタンパク質配列中のアミノ酸の位置に対応するリン酸化部位）を検出するのに有用である：ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１／ＥｒｂＢ１（例えば、チロシン（Ｙ）１０６８）；ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２（例えば、Ｙ１２４８）；ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３（例えば、Ｙ１２８９）；ＥｒｂＢ４／ＨＥＲ４（例えば、Ｙ１２８４）；ＳＧＫ３（例えば、トレオニン（Ｔ）２５６及び／又はセリン（Ｓ）４２２）；４Ｅ−ＢＰ１（例えば、Ｔ７０）；ＥＲＫ１（例えば、Ｔ２０２及び／又はＹ２０４）；ＥＲＫ２（例えば、Ｔ２０２）；ＭＥＫ（例えば、Ｓ２１７及び／又はＳ２２１）；ＰＩＫ３Ｒ１（例えば、Ｙ６８８）；ＰＤＫ１（例えば、Ｓ２４１）；Ｐ７０Ｓ６Ｋ（例えば、Ｔ２２９、Ｔ３８９、及び／又はＳ４２１）；ｃ−ＭＥＴ（例えば、Ｙ１３４９）；ＰＴＥＮ（例えば、Ｓ３８０）；ＡＫＴ１（例えば、Ｓ４７３及び／又はＴ３０８）；ＡＫＴ２（例えば、Ｓ４７４及び／又はＴ３０９）；ＡＫＴ３（例えば、Ｓ４７２及び／又はＴ３０５）；ＧＳＫ−３β（例えば、Ｓ９）；ＮＦＫＢ（例えば、Ｓ５３６）；ＩＫＢ（例えば、Ｓ３２）；ＢＡＤ（例えば、Ｓ１１２及び／又はＳ１３６）；ｍＴＯＲ（例えば、Ｓ２４４８）；Ｒｓｋ−１（例えば、Ｔ３５７及び／又はＳ３６３）；Ｊｎｋ（例えば、Ｔ１８３及び／又はＹ１８５）；Ｐ３８（例えば、Ｔ１８０及び／又はＹ１８２）；ＳＴＡＴ３（例えば、Ｙ７０５及び／又はＳ７２７）；ＦＡＫ（例えば、Ｙ５７６）；Ｒｂ（例えば、Ｓ２４９、Ｔ２５２、及び／又はＳ７８０）；ｐ５３（例えば、Ｓ３９２及び／又はＳ２０）；ＣＲＥＢ（例えば、Ｓ１３３）；ｃ−Ｊｕｎ（例えば、Ｓ６３）；ｃ−Ｓｒｃ（例えば、Ｙ４１６）；及びパキシリン（例えば、Ｙ１１８）。
【０１０４】
用語「活性化状態非依存性抗体」は、それらの活性化状態とは無関係に試料中の目的の分析物１種又は２種以上に特異的である（すなわち、結合し、それによって結合され、又は一緒に複合体を形成する）検出抗体を含む。例えば、活性化状態非依存性抗体は、例えばシグナル伝達分子１種又は２種以上などの分析物１種又は２種以上のリン酸化形及び非リン酸化形の両方を検出することができる。
【０１０５】
用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡなどの一本鎖形又は二本鎖形のいずれかにあるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びそれらのポリマーを含む。核酸には、合成、天然型、及び非天然型である、並びに参照核酸と同様の結合特性を有する、公知のヌクレオチドアナログ又は修飾バックボーン残基若しくは結合を含有する核酸が含まれる。このようなアナログの例として、限定的でなく、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、及びペプチド−核酸（ＰＮＡ）を挙げることができる。特に限定しない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有する天然ヌクレオチドの公知のアナログを含有する核酸を包含する。他に特に規定しない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に修飾されたそれらの変異体及び相補的配列を黙示的に並びに指示された配列を明示的に含む。
【０１０６】
用語「オリゴヌクレオチド」は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、及び／又はそれらの模倣剤の、一本鎖オリゴマー若しくはポリマーを意味する。所定の場合に、オリゴヌクレオチドは、天然型（すなわち、未修飾）核酸塩基、糖、及びインターヌクレオシド（バックボーン）結合から構成される。所定の他の場合には、オリゴヌクレオチドは、修飾された核酸塩基、糖、及び／又はインターヌクレオシド結合を含む。
【０１０７】
本明細書で使用する用語「ミスマッチモチーフ」若しくは「ミスマッチ領域」は、その相補的配列に対して１００％相補性を有していないオリゴヌクレオチドの一部分を意味する。オリゴヌクレオチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、又は７以上のミスマッチ領域を有していることができる。ミスマッチ領域は隣接していることができ、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３以上のヌクレオチドによって分離されていることができる。ミスマッチモチーフ又は領域は、単一のヌクレオチドを含んでいることができ、又は２、３、４、５、又は６以上のヌクレオチドを含んでいることができる。
【０１０８】
語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、オリゴヌクレオチドがその相補性配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる状況では異なるであろう。長い配列は、詳細には高温でハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広汎なガイドは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays” (1993)に見出される。一般に、規定のイオン強度ｐＨで特異的配列に対して熱融点（Ｔｍ）より約５〜１０℃低くなるようにストリンジェントな条件を選択する。Ｔｍは、標的に相補的であるプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度（規定のイオン強度、ｐＨ、及び核酸濃度下で）である（標的配列が過剰に存在するとき、Ｔｍにおいて、プローブの５０％は平衡状態で占められる）。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成することもできる。選択的又は特異的ハイブリダイゼーションに対して、陽性シグナルは、バックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。
【０１０９】
用語「実質的に同一」又は「実質的同一性」は、核酸が２種又は３種以上のある状況において、配列比較アルゴリズムを用いて又は手動アラインメント及び目視検査によって測定されるように比較窓若しくは指定領域にわたって最大対応について比較及びアライメントした場合に、同一であるか又は同一であると規定されるパーセンテージのヌクレオチド（すなわち、規定領域にわたって少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の同一性）を有する２種又は３種以上の配列又はサブシーケンスを意味する。この定義は、その状況が示す場合は、配列の補体（complement）も意味する。好ましくは、実質的同一性は、長さが少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、又は１００ヌクレオチドである領域にわたって存在する。
【０１１０】
用語「インキュベートする」は、「接触させる」及び「曝露させる」と同義的に使用され、他に規定しない限り任意の特定の時間又は温度要件を意味しない。
【０１１１】
《実施形態の説明》
本発明は、本明細書に記載したような特異的な多重の高スループット近接アッセイなどのアッセイを用いて腫瘍組織に由来する腫瘍細胞又は固形腫瘍の循環細胞中でのシグナル伝達経路の成分の状態（例えば、発現及び／又は活性化レベル）を検出するための方法及び組成物を提供する。本発明は、１つ又は２つ以上の無秩序なシグナル伝達経路をダウンレギュレート又は活動停止させるのに適切な療法を選択するための方法及び組成物も提供する。このように、本発明の所定の実施形態を用いて、所定の患者の腫瘍におけるトータル及び活性化されたシグナル伝達タンパク質の収集によって提供される特定分子シグニチャーに基づいて各個人の療法の設計を促進することができる。
【０１１２】
特定の側面において、本発明は、特定の癌がＨＥＲ２調節性化合物（例えば、ＨＥＲ２阻害剤）に対して有利に反応することができるか又は反応する可能性を有するか否かの決定又は予測を可能とする分子マーカー（バイオマーカー）を提供する。特定の実施形態において、ＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分（例えば、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ１、及び／又はＳＨＣ）１種又は２種以上の活性化のレベルを測定することは、ＨＥＲ２活性を調節する化合物（例えば、モノクローナル抗体、例えば、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））、チロシンキナーゼ阻害剤など）に対する乳癌細胞（例えば、単離された循環腫瘍細胞、微細針吸引液（ＦＮＡ）細胞など）などの細胞の感受性を決定し又は予測するのにとりわけ有用である。
【０１１３】
或る側面において、本発明は、ＨＥＲ２活性を調節する化合物に対する細胞の感受性を決定し又は予測する方法であって：
（ａ）細胞を前記化合物と接触させる工程；
（ｂ）前記細胞を溶解させて細胞抽出物を生成する工程；
（ｃ）前記細胞抽出物中のＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分１種又は２種以上の発現及び／又は活性化（例えば、リン酸化）レベルを決定する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）で決定されたＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分１種又は２種以上の発現及び／又は活性化レベルをＨＥＲ２シグナル伝達経路の該成分１種又は２種以上の参照の発現及び／又は活性化レベルと比較する工程；を含み、
工程（ｃ）で決定されたＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分１種又は２種以上の発現及び／又は活性化レベルとＨＥＲ２シグナル伝達経路の該成分１種又は２種以上の参照の発現及び／又は活性化レベルとの差異が、前記細胞が前記化合物に対して感受性であるか又は耐性であるか（すなわち、感受性でない）ということを示す、方法を提供する。
【０１１４】
好ましい側面において、本発明は、ＨＥＲ２活性を調節する化合物に対する細胞の感受性を決定し又は予測する方法であって：
（ａ）細胞を前記化合物と接触させる工程；
（ｂ）前記細胞を溶解させて細胞抽出物を生成する工程；
（ｃ）前記細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルを決定する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）で決定されたＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルをＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルと比較する工程；を含み、
ＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルと比較してより高い前記細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルの存在が、前記細胞が前記化合物に対して感受性でない（すなわち、耐性である）ことを示す、方法を提供する。
【０１１５】
インサイチュ活性化状態を保存するために、典型的には、細胞が単離された直後に、好ましくは９６、７２、４８、２４、６、又は１時間以内に、より好ましくは３０、１５、又は５分間以内にＨＥＲ２経路成分などのシグナル伝達タンパク質を抽出する。単離した細胞は、通常ナノモル〜ミクロモル濃度の成長因子と約１〜３０分間にわたりインキュベートして、シグナル伝達物質の活性化を復活させ又は刺激することができる（例えば、Irish et al., Cell, 118:217-228 (2004)参照）。刺激性成長因子として、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ヘレグリン（ＨＲＧ）、ＴＧＦ−α、ＰＩＧＦ、アンジオポエチン（Ａｎｇ）、ＮＲＧ１、ＰＧＦ、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、サイトカインなどを挙げることができる。ＨＥＲ２活性を調節する化合物（例えば、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、例えば、トラスツズマブ）に対する単離した細胞の感受性を評価するために、成長因子の刺激の前、間、及び／又は後に、単離した細胞を様々な用量の化合物とインキュベートすることができる。成長因子の刺激は、数分間又は数時間（例えば、約１〜５分間から約１〜６時間）にわたり実施することができる。単離、ＨＥＲ２調節性化合物を用いた処理、及び／又は成長因子刺激の後に、当分野において公知の任意の技術を用いて細胞を溶解させ、ＨＥＲ２経路成分などのシグナル伝達タンパク質を抽出する。好ましくは、細胞溶解を、成長因子刺激後約１〜３６０分間の間に、及びより好ましくは２つの異なる時間間隔：（１）成長因子刺激の約１〜５分間後；及び（２）成長因子刺激後約３０〜１８０分間で、開始する。代わりに、溶解物を、使用まで−８０℃で保存することができる。
【０１１６】
ＨＥＲ２活性を調節する化合物の限定的でない例として、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。好ましい実施形態において、ＨＥＲ２調節性化合物は、ＨＥＲ２活性を阻害し及び／又はＨＥＲ２シグナル伝達をブロックし、例えば、ＨＥＲ２阻害剤である。ＨＥＲ２阻害剤の例として、モノクローナル抗体、例えば、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））及びペルツズマブ（２Ｃ４）；小分子チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（商標））、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（商標））、ピリチニブ（pilitinib）、ＣＰ−６５４５７７、ＣＰ−７２４７１４、カネルチニブ（ＣＩ １０３３）、ＨＫＩ−２７２、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６；Ｔｙｋｅｒｂ（商標））、ＰＫＩ−１６６、ＡＥＥ７８８、ＢＭＳ−５９９６２６、ＨＫＩ−３５７、ＢＩＢＷ ２９９２、ＡＲＲＹ−３３４５４３、ＪＮＪ−２６４８３３２７、及びＪＮＪ−２６４８３３２７；並びにそれらの組み合わせを挙げることができるがそれらに限定されない。他の実施形態において、ＨＥＲ２調節性化合物は、ＨＥＲ２経路を活性化し、例えば、ＨＥＲ２活性化剤である。
【０１１７】
或る実施形態において、ＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分（例えば、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ１、ＳＨＣなど）１種又は２種以上の参照の発現又は活性化レベルは、前記化合物（例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））を用いて処理された前記化合物に感受性の細胞（例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）感受性細胞）から得られる。或る実施形態において、前記化合物に感受性の細胞（すなわち、化合物感受性細胞）は、ＢＴ−４７４細胞、ＳＫＢＲ３細胞、ＮＨ２７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞、ＵＡＣＣ−８１２細胞、ＵＡＣＣ−８９３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞、ＳＵＭ１９０細胞、ＳＵＭ２２５細胞、Ｎ８７細胞、ＯＥ１９細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。例えば、Tseng et al., Mol. Pharmacol., 70:1534-41 (2006)；Wainberg et al., Clin. Cancer Res., 16:1509-19 (2010)；Emlet et al., Mol. Cancer Ther., 6:2664-74 (2007)；Konecny et al., Cancer Res., 66:1630-9 (2006)を参照されたい。或る場合に、存在する細胞又は細胞系（例えば、化合物耐性細胞又は細胞系）から化合物感受性細胞を遺伝子組み換えして前記化合物に感受性である細胞又は細胞系を形成する（例えば、前記細胞又は細胞系において前記化合物により調節されるＨＥＲ２シグナル伝達経路成分（例えば、ＨＥＲ２）を発現させることによる）。好ましくは、化合物感受性細胞は、ＢＴ−４７４細胞などのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）感受性細胞である。
【０１１８】
他の実施形態において、ＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分（例えば、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ１、ＳＨＣなど）１種又は２種以上の参照の発現又は活性化レベルは、前記化合物（例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））を用いて処理された前記化合物に耐性の細胞（例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）耐性細胞）から得られる。或る実施形態において、前記化合物に耐性である細胞（すなわち、化合物耐性細胞）は、ＢＴ／Ｒ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＳＫＢＲ３／ＩＧＦ−１Ｒ細胞、ＪＩＭＴ−１細胞、ＢＴ−４７４／ＨＲ２０細胞、ＳＫＢＲ３／Ｐ２細胞、ＮＨ２９細胞、ＮＨ４７細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＭＣＦ−７／７１３細胞、ＭＣＦ−７／ＨＥＲ２Δ１６細胞、ＺＲ−７５−１細胞、ＢＴ２０細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞、Ｔ４７Ｄ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞、ＣＡＭＡ１細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７細胞、ＥＦＭ１９２Ａ細胞、ＫＰＬ１細胞、ＥＦＭ１９細胞、ＣＡＬ５１細胞、ＮＵＧＣ３細胞、ＮＵＧＣ４細胞、ＦＵ９７細胞、ＳＮＵ１６細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。例えば、Tseng et al., Mol. Pharmacol., 70:1534-41 (2006)；Wainberg et al., Clin. Cancer Res., 16:1509-19 (2010)；Emlet et al., Mol. Cancer Ther., 6:2664-74 (2007)；Konecny et al., Cancer Res., 66:1630-9 (2006)を参照されたい。或る場合に、存在する細胞又は細胞系（例えば、化合物感受性細胞又は細胞系）から化合物耐性細胞を遺伝子組み換えして前記化合物に耐性である細胞又は細胞系を形成する（例えば、前記細胞又は細胞系において前記化合物により調節されるＨＥＲ２シグナル伝達経路成分（例えば、ＨＥＲ２）をノックアウトすることによる）。好ましくは、化合物耐性細胞は、ＢＴ／Ｒ細胞などのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）耐性細胞である。
【０１１９】
更なる実施形態において、ＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分（例えば、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ１、ＳＨＣなど）１種又は２種以上の参照の発現又は活性化レベルは、前記化合物（例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））を用いた処理がされていない、腫瘍細胞などの細胞から得られる。或る場合に、前記腫瘍細胞は患者試料から得られた乳癌細胞である。他の場合に、前記腫瘍細胞は患者試料から得られた胃癌細胞である。更なる場合に、前記腫瘍細胞は、その原発性起源が乳癌細胞又は胃癌細胞のいずれかである転移性腫瘍細胞である。特定の実施形態において、前記化合物を用いた処理がされていない細胞は、細胞抽出物を生成するために用いられる単離細胞（例えば、調査すべき被検細胞）が得られる試料と同じ試料から得られる。
【０１２０】
或る実施形態において、発現又は活性化レベルが、前記化合物を用いて処理された化合物感受性細胞（例えば、ＢＴ−４７４細胞）中の、前記化合物を用いて処理された化合物耐性細胞（例えば、ＢＴ／Ｒ細胞）中の、又は前記化合物を用いた処理がされていない細胞（例えば、患者試料から得られた乳癌細胞、胃癌細胞、又はＨＥＲ２発現性腫瘍細胞などの腫瘍細胞）中の、対応するＨＥＲ２シグナル伝達経路成分の参照の発現又は活性化レベルより少なくとも約１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又は１００倍高い（例えば、約１．５〜３、２〜３、２〜４、２〜５、２〜１０、２〜２０、２〜５０、３〜５、３〜１０、３〜２０、３〜５０、４〜５、４〜１０、４〜２０、４〜５０、５〜１０、５〜１５、５〜２０、又は５〜５０倍高い）場合に、ＨＥＲ２シグナル伝達経路成分（例えば、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ１、ＳＨＣなど）のより高い発現又は活性化レベルが細胞抽出物中に存在していると考えられる。
【０１２１】
他の実施形態において、発現又は活性化レベルが、前記化合物を用いて処理された化合物感受性細胞（例えば、ＢＴ−４７４細胞）中の、前記化合物を用いて処理された化合物耐性細胞（例えば、ＢＴ／Ｒ細胞）中の、又は前記化合物を用いた処理がされていない細胞（例えば、患者試料から得られた乳癌細胞、胃癌細胞、又はＨＥＲ２発現性腫瘍細胞などの腫瘍細胞）中の、対応するＨＥＲ２シグナル伝達経路成分の参照の発現又は活性化レベルより少なくとも約１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又は１００倍低い（例えば、約１．５〜３、２〜３、２〜４、２〜５、２〜１０、２〜２０、２〜５０、３〜５、３〜１０、３〜２０、３〜５０、４〜５、４〜１０、４〜２０、４〜５０、５〜１０、５〜１５、５〜２０、又は５〜５０倍低い）場合に、ＨＥＲ２シグナル伝達経路成分（例えば、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ１、ＳＨＣなど）のより低い発現又は活性化レベルが細胞抽出物中に存在していると考えられる。
【０１２２】
或る実施形態において、化合物感受性細胞中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルと比較してより高い細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２活性化レベルの存在は、前記細胞（例えば、細胞抽出物が生成された被検細胞）が前記化合物に対して感受性ではない（すなわち、耐性である）ことを示す。他の実施形態では、化合物感受性細胞中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルと比較して同程度の又はより低い細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２活性化レベルの存在は、前記細胞（例えば、細胞抽出物が生成された被検細胞）が前記化合物に対して感受性である（すなわち、耐性ではない）ことを示す。１つの実施形態において、細胞抽出物中のＨＥＲ２活性化レベルは、化合物感受性細胞（例えば、ＢＴ−４７４細胞）中のＨＥＲ２の参照の活性化レベルより少なくとも２〜３倍高い。別の実施形態において、細胞抽出物中のｐ９５ＨＥＲ２活性化レベルは、化合物感受性細胞（例えば、ＢＴ−４７４細胞）中のｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルより少なくとも５倍高い。
【０１２３】
或る実施形態において、化合物耐性細胞中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルと比較してより低い、細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルの存在は、前記細胞（例えば、細胞抽出物が生成された被検細胞）が前記化合物に対して感受性である（すなわち、耐性ではない）ことを示す。他の実施形態において、化合物耐性細胞中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルと比較して同程度の又はより高い細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２活性化レベルの存在は、前記細胞（例えば、細胞抽出物が生成された被検細胞）が前記化合物に対して感受性ではない（すなわち、耐性である）ことを示す。
【０１２４】
或る実施形態において、前記化合物を用いた処理がされていない細胞（例えば、患者試料から得られた乳癌細胞、胃癌細胞、又はＨＥＲ２発現性腫瘍細胞などの腫瘍細胞）中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルと比較してより低い細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２活性化レベルの存在は、前記細胞（例えば、細胞抽出物が生成された被検細胞）が前記化合物に対して感受性である（すなわち、耐性ではない）ことを示す。他の実施形態において、前記化合物を用いた処理がされていない細胞中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルと比較して同程度の又はより高い細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２活性化レベルの存在は、前記細胞（例えば、細胞抽出物が生成された被検細胞）が前記化合物に対して感受性ではない（すなわち、耐性である）ことを示す。
【０１２５】
或る実施形態において、本発明の方法は、細胞抽出物中のＨＥＲ２及びｐ９５ＨＥＲ２の両方の活性化レベルを決定する工程を含む。特定の実施形態において、ＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルはＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２のリン酸化レベルを含む。
【０１２６】
或る他の実施形態において、本発明の方法は、細胞抽出物中の追加のシグナル伝達分子１種又は２種以上の活性化レベルを決定する工程をさらに含む。追加のシグナル伝達分子の限定的でない例として、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＭＥＫ、ＰＴＥＮ、ＳＧＫ３、４Ｅ−ＢＰ１、ＥＲＫ２（ＭＡＰＫ１）、ＥＲＫ１（ＭＡＰＫ３）、ＰＤＫ１、Ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＧＳＫ−３β、ＳＨＣ、ＩＧＦ−１Ｒ、ｃ−ＭＥＴ、ｃ−ＫＩＴ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、受容体二量体（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体、ＨＥＲ２／ＨＥＲ２ホモ二量体、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体、ＨＥＲ１／ＨＥＲ２ヘテロ二量体、及び／又はＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体)、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。特定の実施形態において、前記追加のシグナル伝達分子１種又は２種以上の活性化レベルはこのような分子のリン酸化レベルを含む。更なる実施形態において、本発明の方法は、細胞抽出物中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、及び／又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体１種又は２種以上とともにＨＥＲ２及び／又はｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルを決定する工程を含む。
【０１２７】
或る実施形態において、本発明の方法はさらに又は代わりに、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、及び／又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体１種又は２種以上の活性化レベルを決定する工程を含む。所定の場合には、化合物感受性細胞中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の参照の活性化レベルと比較してより高い細胞抽出物中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の活性化レベルの存在は、前記細胞（例えば、細胞抽出物が生成された被検細胞）が前記化合物に対して感受性ではない（すなわち、耐性である）ことを示す。他の場合には、化合物感受性細胞中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の参照の活性化レベルと比較して同程度の又はより低い細胞抽出物中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の活性化レベルの存在は、前記細胞（例えば、細胞抽出物が生成された被検細胞）が前記化合物に対して感受性である（すなわち、耐性ではない）ことを示す。１つの実施形態において、細胞抽出物中のＨＥＲ３の活性化レベルは、化合物感受性細胞（例えば、ＢＴ−４７４細胞）中のＨＥＲ３の参照の活性化レベルより少なくとも２〜３倍高い。
【０１２８】
所定の場合には、化合物耐性細胞中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の参照の活性化レベルと比較してより低い細胞抽出物中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の活性化レベルの存在は、前記細胞（例えば、細胞抽出物が生成された被検細胞）が前記化合物に対して感受性である（すなわち、耐性ではない）ことを示す。他の場合には、化合物耐性細胞中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の参照の活性化レベルと比較して同程度の又はより高い細胞抽出物中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の活性化レベルの存在は、前記細胞（例えば、細胞抽出物が生成された被検細胞）が前記化合物に対して感受性ではない（すなわち、耐性である）ことを示す。
【０１２９】
或る場合に、前記化合物を用いた処理がされていない細胞（例えば、患者試料から得られた乳癌細胞、胃癌細胞、又はＨＥＲ２発現性腫瘍細胞などの腫瘍細胞）中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の参照の活性化レベルと比較してより低い細胞抽出物中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の活性化レベルの存在は、前記細胞（例えば、細胞抽出物が生成された被検細胞）が前記化合物に対して感受性である（すなわち、耐性ではない）ことを示す。他の場合には、前記化合物を用いた処理がされていない細胞中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の参照の活性化レベルと比較して同程度の又はより高い細胞抽出物中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の活性化レベルの存在は、前記細胞（例えば、細胞抽出物が生成された被検細胞）が前記化合物に対して感受性ではない（すなわち、耐性である）ことを示す。
【０１３０】
或る実施形態において、細胞（例えば、細胞抽出物が生成される被検細胞）は、乳癌細胞、胃癌細胞、及び／又はＨＥＲ２発現性腫瘍細胞などの腫瘍細胞である。所定の場合には、前記腫瘍細胞は、腫瘍から得られた微細針吸引液（ＦＮＡ）細胞又は循環腫瘍細胞である。他の実施形態において、細胞（例えば、細胞抽出物が生成される被検細胞）は、例えば、乳癌又は胃癌患者から、得られる試料から単離される。限定的でない試料の例として、例えば、全血、血清、血漿、乳管洗浄液、乳頭吸引液、リンパ液、骨髄吸引液、尿、唾液、及び／又は微細針吸引液（ＦＮＡ）試料などの体液試料を挙げることができる。特定の実施形態では、試料は全血、血清、血漿、及び／又は乳房若しくは胃腫瘍組織又はＨＥＲ２発現性腫瘍組織などの腫瘍組織試料を含む。
【０１３１】
所定の場合に、本発明の方法は、読み取り可能なフォーマットでユーザー（例えば、腫瘍医又は一般開業医などの医師）に工程（ｄ）で得られた比較の結果を提供する工程（ｅ）をさらに含んでいることができる。或る場合には、本発明の方法は、工程（ｄ）で得られた比較の結果を医師、例えば、腫瘍医又は一般開業医に送り又は報告する工程をさらに含んでいることができる。他の場合には、本発明の方法は、コンピュータデータベースに又は、例えば、研究室で、情報を保存するための他の適切な機械若しくはデバイスに工程（ｄ）で得られた比較の結果を記録又は保存する工程をさらに含んでいることができる。
【０１３２】
或る実施形態において、工程（ｃ）においてＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分（例えば、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ１、及び／又はＳＨＣ）１種又は２種以上の活性化レベルを決定する工程は、検出すべきＨＥＲ２シグナル伝達経路の各成分のリン酸化形に特異的な抗体を用いて細胞抽出物中のＨＥＲ２シグナル伝達経路成分１種又は２種以上のリン酸化レベルを検出する工程を含む。
【０１３３】
リン酸化レベル及び／又は状態は様々な技術のいずれかを用いて決定することができる。例えば、リン酸化形のタンパク質を特異的に認識する抗体を用いたイムノアッセイによってリン酸化タンパク質を検出することができることが当分野において周知である（例えば、Lin et al., Br. J. Cancer, 93:1372-1381 (2005)参照）。イムノアッセイには一般にイムノブロッティング（例えば、ウェスタンブロッティング）、ＲＩＡ、及びＥＬＩＳＡが含まれる。さらに特異的なタイプのイムノアッセイには、抗原捕捉／抗原競合、抗体捕捉／抗原競合、２抗体サンドイッチ、抗体捕捉／抗体過剰、及び抗体捕捉／抗原過剰が含まれる。抗体の製造方法は、本明細書に及びHarlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USAに記載されている。ホスホ特異的（phospho-specifc）抗体は新規に製造することができ又は商業的若しくは非商業的供給源から入手することができる。［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ又は［γ−３３Ｐ］ＡＴＰ形の放射性ホスフェートを用いて細胞を代謝的に標識化することによってもリン酸化レベル及び／又は状態を決定することができる。リン酸化タンパク質は放射性になるので、シンチレーション測定、ラジオグラフィー（radiography）などによって追跡可能及び定量化可能となる（例えば、Wang et al., J. Biol. Chem., 253:7605-7608 (1978)参照）。例えば、代謝的に標識化されたタンパク質を、細胞から抽出し、ゲル電気泳動によって分離し、膜に移し、特定のＨＥＲ２シグナル伝達経路成分に特異的な抗体を用いてプローブしそしてオートラジオグラフィーに付して３２Ｐ又は３３Ｐを検出することができる。代わりに、膜への移動及び抗体によるプロービングの前にゲルをオートラジオグラフィーに付すことができる。
【０１３４】
特定の実施形態において、本明細書に記載のように例えば単一の検出アッセイすなわち近接二重検出アッセイ（例えば、協調的近接イムノアッセイ（COllaborative Proximity ImmunoAssay）（ＣＯＰＩＡ）などのイムノアッセイを用いて、工程（ｃ）におけるＨＥＲ２シグナル伝達経路成分（例えば、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ１、及び／又はＳＨＣ）１種又は２種以上の活性化（例えば、リン酸化）レベル及び／又は状態を検出する。
【０１３５】
或る実施形態では、工程（ｃ）においてＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分（例えば、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３など）１種又は２種以上の活性化（例えば、リン酸化）レベルを決定は、以下の段階：
（ｉ）細胞抽出物を希釈系列の捕捉抗体（例えば、ＨＥＲ２に特異的な捕捉抗体）とインキュベートして（例えば、接触させて）複数の捕捉された分析物（例えば、捕捉された受容体）を形成する段階であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に拘束されている（例えば、そのことによって細胞抽出物中に存在する分析物を、該分析物と捕捉抗体とを含む捕捉された分析物の複合体に変換する）段階；
（ｉｉ）前記複数の捕捉された分析物（例えば、捕捉された受容体）を対応する分析物に特異的な活性化状態依存性抗体（例えば、ＨＥＲ２に特異的な活性化状態依存性抗体）を含む検出抗体とインキュベートして（例えば、接触させて）複数の検出可能な捕捉された分析物（例えば、検出可能な捕捉された受容体）を形成する（例えば、前記捕捉された分析物の複合体を、前記捕捉された分析物と活性化状態依存性抗体とを含む検出可能な捕捉された分析物の複合体に変換する）段階；
（ｉｉｉ）前記複数の検出可能な捕捉された分析物（例えば、検出可能な捕捉された受容体）をシグナル増幅対の第１及び第２のメンバーとインキュベートして（例えば、接触させて）増幅シグナルを生成する段階；及び
（ｉｖ）前記シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する段階；を含む。
【０１３６】
所定の他の実施形態において、工程（ｃ）においてＨＥＲ２シグナル伝達経路の切断受容体（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２）１種又は２種以上の活性化（例えば、リン酸化）レベルを決定は、以下の段階：
（ｉ）細胞抽出物を、全長受容体（例えば、全長ＨＥＲ２）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズとインキュベートする（接触させる）段階；
（ｉｉ）前記細胞抽出物から前記複数のビーズを除去し、それによって前記全長受容体（例えば、全長ＨＥＲ２）を除去して、該全長受容体（例えば、全長ＨＥＲ２）を含まない細胞抽出物を形成する（例えば、前記細胞抽出物を特異的な全長受容体又は全長受容体のファミリーを含まない細胞抽出物に変換する）段階；
（ｉｉｉ）前記全長受容体（例えば、全長ＨＥＲ２）を含まない前記細胞抽出物を、該全長受容体（例えば、全長ＨＥＲ２）の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域に特異的な捕捉抗体の希釈系列とインキュベートして（例えば、接触させて）複数の捕捉された切断受容体を形成する段階であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に拘束されている（例えば、そのことによって全長受容体枯渇（depleted）細胞抽出物中に存在する前記切断受容体を切断受容体と捕捉抗体との複合体に変換する）段階；
（ｉｖ）前記複数の捕捉された切断受容体を、前記全長受容体（例えば、全長ＨＥＲ２）のＩＣＤ結合領域に特異的な活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートして（例えば、接触させて）複数の検出可能な捕捉された切断受容体を形成する（例えば、捕捉された切断受容体の前記複合体を、前記捕捉された切断受容体と活性化状態依存性抗体とを含む検出可能な捕捉された切断受容体の複合体に変換する）段階；
（ｖ）前記複数の検出可能な捕捉された切断受容体を、シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーとインキュベートして（例えば、接触させて）増幅シグナルを生成する段階；及び
（ｖｉ）前記シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する段階；を含む。
【０１３７】
或る場合において、活性化状態依存性抗体は、結合対の第１のメンバー（例えば、ビオチン）を含む。他の場合には、シグナル増幅対の第１のメンバー（例えば、ＨＲＰなどのペルオキシダーゼ）は、結合対の第２のメンバー（例えば、ストレプトアビジン）を含む。所定の場合には、シグナル増幅対の第２のメンバーは、例えば、チラミド試薬（例えば、ビオチン−チラミド）であることができる。好ましくは、増幅シグナルは、活性化チラミドを生成する（例えば、ビオチン−チラミドを活性化チラミドに変換する）ビオチン−チラミドのペルオキシダーゼ酸化によって生成される。活性化チラミドは、例えば、シグナル検出性試薬を添加すると、直接的に又は間接的に検出することができる。前記シグナル検出性試薬の限定的でない例として、ストレプトアビジン標識化フルオロフォア及びストレプトアビジン標識化ペルオキシダーゼと、例えば、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などの発色試薬との組み合わせを挙げることができる。
【０１３８】
前記切断受容体は、典型的には、全長受容体の断片であり、細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域を全長受容体と共有する。所定の実施形態では、全長受容体は、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域を含む。いかなる特定の理論にもとらわれることなく、切断受容体は、全長受容体のＥＣＤのタンパク質分解プロセッシングによって、又は、膜貫通ドメインの前、内、又は後に位置するメチオニン残基からの翻訳の代替的開始により生じて、例えば、短縮ＥＣＤを有する切断受容体又は膜関連若しくは細胞質ＩＣＤ断片を含む切断受容体を形成することができる。
【０１３９】
所定の好ましい実施形態において、切断受容体はｐ９５ＨＥＲ２であり、対応する全長受容体はＨＥＲ２である。しかし当業者であれば、切断タンパク質を検出するための本明細書に記載した方法は、ＥＧＦＲ Ｖ１１１変異体（膠芽細胞腫、結腸直腸癌などに関係する）、他の切断受容体チロシンキナーゼ、カスパーゼなどを含むがそれらに限定されない多数の様々なタンパク質に適用できることを理解するであろう。あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００９／１０８６３７号パンフレットの実施例１２は、優れたダイナミックレンジを有する多重で高スループットの単一検出マイクロアレイＥＬＩＳＡを用いて細胞中のｐ９５ＨＥＲ２などの切断受容体を検出するための、本発明のアッセイ方法の典型的な実施形態を提供している。
【０１４０】
或る実施形態において、ＥＣＤ結合領域に特異的な複数のビーズはストレプトアビジン−ビオチン対を含み、ここでストレプトアビジンはビーズに結合しており、ビオチンは抗体に結合している。所定の場合に、抗体は、全長受容体（例えば、全長ＨＥＲ２）のＥＣＤ結合領域に特異的である。
【０１４１】
或る実施形態において、各捕捉抗体の希釈系列は、一連の減少する捕捉抗体濃度を含む。所定の場合には、捕捉抗体を連続的に少なくとも２倍（例えば、２、５、１０、２０、５０、１００、５００、又は１０００倍）に希釈してアレイ上にスポットされる減少する捕捉抗体濃度の或るセット数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５又は２５を超える）を含む希釈系列を生成する。好ましくは、それぞれの捕捉抗体希釈液を少なくとも２、３、４、５、又は６回反復してアレイ上にスポットする。
【０１４２】
他の実施形態において、固体支持体は、ガラス（例えば、ガラススライド）、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜（例えば、ナイロン、ニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）など）、繊維束、又は任意の他の適切な基材を含む。好ましい実施形態において、捕捉抗体は、例えば、Ｗｈａｔｍａｎ社（ニュージャージー州フローラムパーク）から商業的に入手することができるＦＡＳＴ（商標）スライドなどの、ニトロセルロースポリマーでコーティングされたガラススライド上に（例えば、共有結合性又は非共有結合性相互作用によって）拘束される。
【０１４３】
或る実施形態において、工程（ｃ）においてＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分（例えば、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３など）１種又は２種以上の活性化レベル（例えば、リン酸化）を決定は、以下の段階：
（ｉ）細胞抽出物を捕捉抗体の希釈系列（例えば、ＨＥＲ２に特異的な捕捉抗体）とインキュベートして（例えば、接触させて）複数の捕捉された分析物（例えば、捕捉された受容体）を形成する段階であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に拘束されている（例えば、そのことによって細胞抽出物中に存在する分析物を該分析物と捕捉抗体とを含む捕捉された分析物の複合体に変換する）段階；
（ｉｉ）前記複数の捕捉された分析物（例えば、捕捉された受容体）を、対応する分析物に特異的な活性化状態非依存性抗体（例えば、ＨＥＲ２に特異的な活性化状態非依存性抗体）及び対応する分析物に特異的な活性化状態依存性抗体（例えば、ＨＥＲ２に特異的な活性化状態依存性抗体）を含む検出抗体とインキュベートして（例えば、接触させて）、複数の検出可能な捕捉された分析物（例えば、検出可能な捕捉された受容体）を形成する（例えば、捕捉された分析物の複合体を、捕捉された分析物及び検出抗体を含む検出可能な捕捉された分析物の複合体に変換する）段階であって、
前記活性化状態非依存性抗体が促進成分を用いて標識化されており、前記活性化状態依存性抗体がシグナル増幅対の第１のメンバーを用いて標識化されており、そして前記促進成分が前記シグナル増幅対の第１のメンバーへチャネリングして該メンバーと反応する酸化剤を生成する段階；
（ｉｉｉ）前記複数の検出可能な捕捉された分析物（例えば、検出可能な捕捉された受容体）を前記シグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして（例えば、接触させて）増幅シグナルを生成する段階；及び
（ｉｖ）前記シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する段階；を含む。
【０１４４】
所定の他の実施形態において、工程（ｃ）においてＨＥＲ２シグナル伝達経路の切断受容体（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２）１種又は２種以上の活性化レベル（例えば、リン酸化）を決定は、以下の段階：
（ｉ）細胞抽出物を、全長受容体（例えば、全長ＨＥＲ２）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズとインキュベートする（例えば、接触させる）段階；
（ｉｉ）前記細胞抽出物から前記複数のビーズを除去し、それによって前記全長受容体（例えば、全長ＨＥＲ２）を除去して、該全長受容体（例えば、全長ＨＥＲ２）を含まない細胞抽出物を形成する（例えば、前記細胞抽出物を、特異的な全長受容体又は全長受容体のファミリーを含まない細胞抽出物に変換する）段階；
（ｉｉｉ）前記全長受容体（例えば、全長ＨＥＲ２）を含まない細胞抽出物を前記全長受容体（例えば、全長ＨＥＲ２）の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域に特異的な複数の捕捉抗体とインキュベートして（例えば、接触させて）複数の捕捉された切断受容体を形成する段階であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に拘束されている（例えば、そのことによって全長受容体枯渇細胞抽出物中に存在する前記切断受容体を切断受容体と捕捉抗体との複合体に変換する）段階；
（ｉｖ）前記複数の捕捉された切断受容体を、前記全長受容体（例えば、全長ＨＥＲ２）のＩＣＤ結合領域に特異的な活性化状態非依存性抗体及び活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートして（例えば、接触させて）、複数の検出可能な捕捉された切断受容体を形成する（例えば、捕捉された切断受容体の前記複合体を、前記捕捉された切断受容体及び検出抗体を含む検出可能な捕捉された切断受容体の複合体に変換する）段階であって、
前記活性化状態非依存性抗体が促進成分を用いて標識化されており、前記活性化状態依存性抗体がシグナル増幅対の第１のメンバーを用いて標識化されており、そして前記促進成分がシグナル増幅対の第１のメンバーへチャネリングして該メンバーと反応する酸化剤を生成する段階；
（ｖ）前記複数の検出可能な捕捉された切断受容体を、前記シグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして（例えば、接触させて）、増幅シグナルを生成する段階；及び
（ｖｉ）前記シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する段階；を含む。
【０１４５】
活性化状態非依存性抗体は、促進成分を用いて直接的に標識化することができ、又は促進成分を用いて、例えば、該活性化状態非依存性抗体にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドと該促進成分にコンジュゲートされた相補的オリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションによって、間接的に標識化することができる。同様に、活性化状態依存性抗体は、シグナル増幅対の第１のメンバーを用いて直接的に標識化することができ、又はシグナル増幅対の第１のメンバーを用いて、例えば、該活性化状態依存性抗体にコンジュゲートされた結合対の第１のメンバーと該シグナル増幅対の第１のメンバーにコンジュゲートされた結合対の第２のメンバーとの間の結合によって、間接的に標識化することができる。所定の場合に、結合対の第１のメンバーはビオチンであり、結合対の第２のメンバーはストレプトアビジン又はニュートラビジンなどのアビジンである。
【０１４６】
或る実施形態において、促進成分は、例えば、グルコースオキシダーゼであることができる。所定の場合には、グルコースオキシダーゼ及び活性化状態非依存性抗体を、例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００９／１０８６３７号パンフレットの実施例１６〜１７に記載したように、スルフヒドリル活性化デキストラン分子にコンジュゲートさせることができる。スルフヒドリル活性化デキストラン分子は、典型的には、約５００ｋＤａ（例えば、約２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、又は７５０ｋＤａ）の分子量を有する。他の実施形態では、酸化剤は、例えば、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）であることができる。さらに他の実施形態では、シグナル増幅対の第１のメンバーは、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などのペルオキシダーゼであることができる。更なる実施形態では、シグナル増幅対の第２のメンバーは、例えば、チラミド試薬（例えば、ビオチン−チラミド）であることができる。好ましくは、増幅シグナルは、活性化チラミドを生成する（例えば、ビオチン−チラミドを活性化チラミドに変換する）ビオチン−チラミドのペルオキシダーゼ酸化によって生成される。活性化チラミドは、直接的に検出することができるか、又は、例えば、シグナル検出性試薬の添加により間接的に検出することができる。シグナル検出性試薬の限定的でない例として、ストレプトアビジン標識化フルオロフォア、及びストレプトアビジン標識化ペルオキシダーゼと、例えば、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などの発色試薬との組み合わせを挙げることができる。
【０１４７】
所定の場合には、西洋ワサビペルオキシダーゼ及び活性化状態依存性抗体は、スルフヒドリル活性化デキストラン分子にコンジュゲートさせることができる。スルフヒドリル活性化デキストラン分子は、典型的には、約７０ｋＤａ（例えば、約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００ｋＤａ）の分子量を有している。
【０１４８】
切断受容体は、典型的には全長受容体の断片であり、細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域を全長受容体と共有する。所定の実施形態では、全長受容体は、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域を含む。いかなる特定の理論にもとらわれることなく、切断受容体は、全長受容体のＥＣＤのタンパク質分解プロセッシングによって、又は、膜貫通ドメインの前、内、又は後に位置するメチオニン残基からの翻訳の代替的開始により生じて、例えば、短縮ＥＣＤを有する切断受容体又は膜関連若しくは細胞質ＩＣＤ断片を含む切断受容体を形成することができる。
【０１４９】
所定の好ましい実施形態において、切断受容体はｐ９５ＨＥＲ２であり、対応する全長受容体はＨＥＲ２である。しかしながら、当業者であれば、切断タンパク質を検出するための本明細書に記載した方法は、ＥＧＦＲ Ｖ１１１変異体（膠芽細胞腫、結腸直腸癌などに関係する）、他の切断受容体チロシンキナーゼ、カスパーゼなどを含むがそれらに限定されない多数の様々なタンパク質に適用できることを理解するであろう。あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００９／１０８６３７号パンフレットの実施例１２は、優れたダイナミックレンジを有する多重で高スループットの近接二重検出マイクロアレイＥＬＩＳＡを用いて細胞中のｐ９５ＨＥＲ２などの切断受容体を検出するための、本発明のアッセイ方法の典型的な実施形態を提供している。
【０１５０】
或る実施形態において、ＥＣＤ結合領域に特異的な複数のビーズはストレプトアビジン−ビオチン対を含み、ここでストレプトアビジンはビーズに結合しており、ビオチンは抗体に結合している。所定の場合には、抗体は、全長受容体（例えば、全長ＨＥＲ２）のＥＣＤ結合領域に特異的である。
【０１５１】
或る実施形態において、各捕捉抗体の希釈系列は、一連の減少する捕捉抗体濃度を含む。所定の場合には、捕捉抗体を連続的に少なくとも２倍（例えば、２、５、１０、２０、５０、１００、５００、又は１０００倍）に希釈してアレイ上にスポットされる減少する捕捉抗体濃度の或るセット数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５又は２５を超える）を含む希釈系列を生成する。好ましくは、それぞれの捕捉抗体希釈液を少なくとも２、３、４、５、又は６回反復してアレイ上にスポットする。
【０１５２】
他の実施形態において、固体支持体は、ガラス（例えば、ガラススライド）、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜（例えば、ナイロン、ニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）など）、繊維束、又は任意の他の適切な基材を含む。好ましい実施形態において、捕捉抗体は、例えば、Ｗｈａｔｍａｎ社（ニュージャージー州フローラムパーク）から商業的に入手することができるＦＡＳＴ（商標）スライドなどの、ニトロセルロースポリマーでコーティングされたガラススライド上に（例えば、共有結合性又は非共有結合性相互作用によって）拘束される。
【０１５３】
別の側面において、本発明は、ＨＥＲ２活性を調節する化合物に対する腫瘍の応答を予測する方法であって：
（ａ）腫瘍から得られた細胞を前記化合物と接触させる工程；
（ｂ）前記細胞を溶解させて細胞抽出物を生成する工程；
（ｃ）前記細胞抽出物中のＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分１種又は２種以上の発現及び／又は活性化（例えば、リン酸化）レベルを決定する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）で決定されたＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分１種又は２種以上の発現及び／又は活性化レベルをＨＥＲ２シグナル伝達経路の該成分１種又は２種以上の参照の発現及び／又は活性化レベルと比較する工程；を含み、
工程（ｃ）で決定されたＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分１種又は２種以上の発現及び／又は活性化レベルとＨＥＲ２シグナル伝達経路の該成分１種又は２種以上の参照の発現及び／又は活性化レベルとの差異が、前記腫瘍が前記化合物に応答する可能性を有する又は有しない（例えば、前記腫瘍が前記化合物に対する応答の増加の又は減少の可能性を有する）ことを示す、方法を提供する。
【０１５４】
好ましい側面において、本発明は、ＨＥＲ２活性を調節する化合物に対する腫瘍の応答を予測する方法であって：
（ａ）腫瘍から得られた細胞を前記化合物と接触させる工程；
（ｂ）前記細胞を溶解させて細胞抽出物を生成する工程；
（ｃ）前記細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルを決定する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）で決定されたＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルをＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルと比較する工程、を含み、
ＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルと比較してより高い前記細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルの存在が、前記腫瘍が前記化合物に応答する可能性を有しない（例えば、前記腫瘍が前記化合物に対する応答の減少の可能性を有する）ことを示す、方法を提供する。
【０１５５】
ＨＥＲ２活性を調節する化合物の限定的でない例として、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。好ましい実施形態において、ＨＥＲ２調節性化合物は、ＨＥＲ２活性を阻害し及び／又はＨＥＲ２シグナル伝達をブロックし、例えば、ＨＥＲ２阻害剤である。ＨＥＲ２阻害剤の例として、モノクローナル抗体、例えば、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））及びペルツズマブ（２Ｃ４）；小分子チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（商標））、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（商標））、ピリチニブ、ＣＰ−６５４５７７、ＣＰ−７２４７１４、カネルチニブ（ＣＩ １０３３）、ＨＫＩ−２７２、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６；Ｔｙｋｅｒｂ（商標））、ＰＫＩ−１６６、ＡＥＥ７８８、ＢＭＳ−５９９６２６、ＨＫＩ−３５７、ＢＩＢＷ ２９９２、ＡＲＲＹ−３３４５４３、ＪＮＪ−２６４８３３２７、及びＪＮＪ−２６４８３３２７；並びにそれらの組み合わせを挙げることができるがそれらに限定されない。他の実施形態において、ＨＥＲ２調節性化合物は、ＨＥＲ２経路を活性化し、例えば、ＨＥＲ２活性化剤である。
【０１５６】
或る実施形態において、ＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分（例えば、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ１、ＳＨＣなど）１種又は２種以上の参照の発現又は活性化レベルは、前記化合物（例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））を用いて処理される前記化合物に感受性の細胞（例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）感受性細胞）から得られる。或る実施形態において、前記化合物に感受性の細胞（すなわち、化合物感受性細胞）は、ＢＴ−４７４細胞、ＳＫＢＲ３細胞、ＮＨ２７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞、ＵＡＣＣ−８１２細胞、ＵＡＣＣ−８９３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞、ＳＵＭ１９０細胞、ＳＵＭ２２５細胞、Ｎ８７細胞、ＯＥ１９細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。或る場合に、存在する細胞又は細胞系（例えば、化合物耐性細胞又は細胞系）から化合物感受性細胞を遺伝子組み換えして前記化合物に感受性である細胞又は細胞系を形成する（例えば、前記細胞又は細胞系において前記化合物により調節されるＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分（例えば、ＨＥＲ２）を発現させることによる）。好ましくは、化合物感受性細胞は、ＢＴ−４７４細胞などのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）感受性細胞である。
【０１５７】
他の実施形態において、ＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分（例えば、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ１、ＳＨＣなど）１種又は２種以上の参照の発現又は活性化レベルは、前記化合物（例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））を用いて処理される前記化合物に耐性の細胞（例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）耐性細胞）から得られる。或る実施形態において、前記化合物に耐性である細胞（すなわち、化合物耐性細胞）は、ＢＴ／Ｒ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＳＫＢＲ３／ＩＧＦ−１Ｒ細胞、ＪＩＭＴ−１細胞、ＢＴ−４７４／ＨＲ２０細胞、ＳＫＢＲ３／Ｐ２細胞、ＮＨ２９細胞、ＮＨ４７細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＭＣＦ−７／７１３細胞、ＭＣＦ−７／ＨＥＲ２Δ１６細胞、ＺＲ−７５−１細胞、ＢＴ２０細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞、Ｔ４７Ｄ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞、ＣＡＭＡ１細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７細胞、ＥＦＭ１９２Ａ細胞、ＫＰＬ１細胞、ＥＦＭ１９細胞、ＣＡＬ５１細胞、ＮＵＧＣ３細胞、ＮＵＧＣ４細胞、ＦＵ９７細胞、ＳＮＵ１６細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。或る場合に、存在する細胞又は細胞系（例えば、化合物感受性細胞又は細胞系）から化合物耐性細胞を遺伝子組み換えして前記化合物に耐性である細胞又は細胞系を形成する（例えば、前記細胞又は細胞系において前記化合物により調節されるＨＥＲ２シグナル伝達経路成分（例えば、ＨＥＲ２）をノックアウトすることによる）。好ましくは、化合物耐性細胞は、ＢＴ／Ｒ細胞などのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）耐性細胞である。
【０１５８】
更なる実施形態において、ＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分（例えば、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ１、ＳＨＣなど）１種又は２種以上の参照の発現又は活性化レベルは、前記化合物（例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））を用いた処理がされてない細胞（例えば、患者試料から得られた乳癌細胞、胃癌細胞、又はＨＥＲ２発現性腫瘍細胞などの腫瘍細胞）から得られる。特定の実施形態において、前記化合物を用いた処理がされていない細胞は、細胞抽出物を生成するために用いられる単離細胞（例えば、調査すべき被検細胞）が得られる試料と同じ試料から得られる。
【０１５９】
所定の実施形態において、発現又は活性化レベルが、前記化合物を用いて処理された化合物感受性細胞（例えば、ＢＴ−４７４細胞）中の、前記化合物を用いて処理された化合物耐性細胞（例えば、ＢＴ／Ｒ細胞）中の、又は前記化合物を用いた処理がされていない細胞（例えば、患者試料から得られた乳癌細胞、胃癌細胞、又はＨＥＲ２発現性腫瘍細胞などの腫瘍細胞）中の、対応するＨＥＲ２シグナル伝達経路成分の参照の発現又は活性化レベルより少なくとも約１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又は１００倍高い（例えば、約１．５〜３、２〜３、２〜４、２〜５、２〜１０、２〜２０、２〜５０、３〜５、３〜１０、３〜２０、３〜５０、４〜５、４〜１０、４〜２０、４〜５０、５〜１０、５〜１５、５〜２０、又は５〜５０倍高い）場合に、ＨＥＲ２シグナル伝達経路成分（例えば、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ１、ＳＨＣなど）のより高い発現又は活性化レベルが細胞抽出物中に存在していると考えられる。
【０１６０】
他の実施形態において、発現又は活性化レベルが、前記化合物を用いて処理された化合物感受性細胞（例えば、ＢＴ−４７４細胞）中の、前記化合物を用いて処理された化合物耐性細胞（例えば、ＢＴ／Ｒ細胞）中の、又は前記化合物を用いた処理がされていない細胞（例えば、患者試料から得られた乳癌細胞、胃癌細胞、又はＨＥＲ２発現性腫瘍細胞などの腫瘍細胞）中の、対応するＨＥＲ２シグナル伝達経路成分の参照の発現又は活性化レベルより少なくとも約１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又は１００倍低い（例えば、約１．５〜３、２〜３、２〜４、２〜５、２〜１０、２〜２０、２〜５０、３〜５、３〜１０、３〜２０、３〜５０、４〜５、４〜１０、４〜２０、４〜５０、５〜１０、５〜１５、５〜２０、又は５〜５０倍低い）場合に、ＨＥＲ２シグナル伝達経路成分（例えば、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ１、ＳＨＣなど）のより低い発現又は活性化レベルが細胞抽出物中に存在していると考えられる。
【０１６１】
或る実施形態において、化合物感受性細胞中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルと比較してより高い細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２活性化レベルの存在は、腫瘍（例えば、乳房腫瘍又は胃腫瘍）が前記化合物に応答する可能性を有しない（例えば、腫瘍が前記化合物に対する応答の減少の可能性を有する）ことを示す。他の実施形態では、化合物感受性細胞中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルと比較して同程度の又はより低い細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２活性化レベルの存在は、腫瘍（例えば、乳房腫瘍又は胃腫瘍）が前記化合物に応答する可能性を有する（例えば、腫瘍が前記化合物に対する応答の増加の可能性を有する）ことを示す。１つの実施形態において、細胞抽出物中のＨＥＲ２活性化レベルは、化合物感受性細胞（例えば、ＢＴ−４７４細胞）中のＨＥＲ２の参照の活性化レベルより少なくとも２〜３倍高い。別の実施形態において、細胞抽出物中のｐ９５ＨＥＲ２活性化レベルは、化合物感受性細胞（例えば、ＢＴ−４７４細胞）中のｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルより少なくとも５倍高い。
【０１６２】
或る実施形態において、化合物耐性細胞中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルと比較してより低い細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２活性化レベルの存在は、腫瘍（例えば、乳房腫瘍又は胃腫瘍）が前記化合物に応答する可能性を有する（例えば、腫瘍が前記化合物に対する応答の増加の可能性を有する）ことを示す。他の実施形態では、化合物耐性細胞中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルと比較して同程度の又はより高い細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２活性化レベルの存在は、腫瘍（例えば、乳房腫瘍又は胃腫瘍）が前記化合物に対して応答する可能性を有しない（例えば、腫瘍が前記化合物に対する応答の減少の可能性を有する）ことを示す。
【０１６３】
或る実施形態において、前記化合物を用いた処理がされていない細胞（例えば、患者試料から得られた乳癌細胞、胃癌細胞、又はＨＥＲ２発現性腫瘍細胞などの腫瘍細胞）中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルと比較してより低い細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２活性化レベルの存在は、該腫瘍（例えば、乳房腫瘍又は胃腫瘍）が前記化合物に対して応答する可能性を有する（例えば、腫瘍が前記化合物に対する応答の増加の可能性を有する）ことを示す。他の実施形態では、前記化合物を用いた処理がされていない細胞中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルと比較して同程度の又はより高い細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２活性化レベルの存在は、腫瘍（例えば、乳房腫瘍又は胃腫瘍）が前記化合物に対して応答する可能性を有しない（例えば、腫瘍が前記化合物に対する応答の減少の可能性を有する）ことを示す。
【０１６４】
或る実施形態において、本発明の方法は、細胞抽出物中のＨＥＲ２及びｐ９５ＨＥＲ２の両方の活性化レベルを決定する工程を含む。特定の実施形態において、ＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルはＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２のリン酸化レベルを含む。
【０１６５】
或る他の実施形態において、本発明の方法は、細胞抽出物中の追加のシグナル伝達分子１種又は２種以上の活性化レベルを決定する工程をさらに含む。追加のシグナル伝達分子の限定的でない例として、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＭＥＫ、ＰＴＥＮ、ＳＧＫ３、４Ｅ−ＢＰ１、ＥＲＫ２（ＭＡＰＫ１）、ＥＲＫ１（ＭＡＰＫ３）、ＰＤＫ１、Ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＧＳＫ−３β、ＳＨＣ、ＩＧＦ−１Ｒ、ｃ−ＭＥＴ、ｃ−ＫＩＴ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、受容体二量体（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体、ＨＥＲ２／ＨＥＲ２ホモ二量体、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体、ＨＥＲ１／ＨＥＲ２ヘテロ二量体、及び／又はＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体)、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。特定の実施形態では、前記追加のシグナル伝達分子１種又は２種以上の活性化レベルはこのような分子のリン酸化レベルを含む。更なる実施形態において、本発明の方法は、細胞抽出物中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、及び／又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体１種又は２種以上とともにＨＥＲ２及び／又はｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルを決定する工程を含む。
【０１６６】
或る実施形態において、本発明の方法はさらに又は代わりに、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、及び／又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体１種又は２種以上の活性化レベルを決定する工程を含む。所定の場合には、化合物感受性細胞中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の参照の活性化レベルと比較してより高い細胞抽出物中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の活性化レベルの存在は、腫瘍（例えば、乳房腫瘍又は胃腫瘍）が前記化合物に対して応答する可能性を有しない（例えば、腫瘍が前記化合物に対する応答の減少の可能性を有する）ことを示す。他の場合には、化合物感受性細胞中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の参照の活性化レベルと比較して同程度の又はより低い細胞抽出物中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の活性化レベルの存在は、腫瘍（例えば、乳房腫瘍又は胃腫瘍）が前記化合物に対して応答する可能性を有する（例えば、腫瘍が前記化合物に対する応答の増加の可能性を有する）ことを示す。１つの実施形態において、細胞抽出物中のＨＥＲ３の活性化レベルは、化合物感受性細胞（例えば、ＢＴ−４７４細胞）中のＨＥＲ３の参照の活性化レベルより少なくとも２〜３倍高い。
【０１６７】
所定の場合には、化合物耐性細胞中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の参照の活性化レベルと比較してより低い細胞抽出物中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の活性化レベルの存在は、腫瘍（例えば、乳房腫瘍又は胃腫瘍）が前記化合物に対して応答する可能性を有する（例えば、腫瘍が前記化合物に対する応答の増加の可能性を有する）ことを示す。他の場合には、化合物耐性細胞中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の参照の活性化レベルと比較して同程度の又はより高い細胞抽出物中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の活性化レベルの存在は、腫瘍（例えば、乳房腫瘍又は胃腫瘍）が前記化合物に対して応答する可能性を有しない（例えば、腫瘍が前記化合物に対する応答の減少の可能性を有する）ことを示す。
【０１６８】
或る場合に、前記化合物を用いた処理がされていない細胞（例えば、患者試料から得られた乳癌細胞、胃癌細胞、又はＨＥＲ２発現性腫瘍細胞などの腫瘍細胞）中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の参照の活性化レベルと比較してより低い細胞抽出物中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の活性化レベルの存在は、腫瘍（例えば、乳房腫瘍又は胃腫瘍）が前記化合物に対して応答する可能性を有する（例えば、腫瘍が前記化合物に対する応答の増加の可能性を有する）ことを示す。他の場合には、前記化合物を用いた処理がされていない細胞中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の参照の活性化レベルと比較して同程度の又はより高い細胞抽出物中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の活性化レベルの存在は、腫瘍（例えば、乳房腫瘍又は胃腫瘍）が前記化合物に対して応答する可能性を有しない（例えば、腫瘍が前記化合物に対する応答の減少の可能性を有する）ことを示す。
【０１６９】
或る実施形態において、細胞（例えば、細胞抽出物が生成される被検細胞）は、乳癌細胞、胃癌細胞、及び／又はＨＥＲ２発現性腫瘍細胞などの腫瘍細胞である。所定の場合には、前記腫瘍細胞は、腫瘍から得られた微細針吸引液（ＦＮＡ）細胞又は循環腫瘍細胞である。他の実施形態では、細胞（例えば、細胞抽出物が生成される被検細胞）は、例えば、乳癌又は胃癌患者から、得られる試料から単離される。限定的でない試料の例として、例えば、全血、血清、血漿、乳管洗浄液、乳頭吸引液、リンパ液、骨髄吸引液、尿、唾液、及び／又は微細針吸引液（ＦＮＡ）試料などの体液試料を挙げることができる。特定の実施形態では、試料は全血、血清、血漿、及び／又は乳房若しくは胃腫瘍組織又はＨＥＲ２発現性腫瘍組織などの腫瘍組織試料を含む。
【０１７０】
所定の場合に、本発明の方法は、読み取り可能なフォーマットでユーザー（例えば、腫瘍医又は一般開業医などの医師）に工程（ｄ）で得られた比較の結果を提供する工程（ｅ）をさらに含んでいることができる。或る場合には、本発明の方法は、工程（ｄ）で得られた比較の結果を医師、例えば、腫瘍医又は一般開業医に送り又は報告する工程をさらに含んでいることができる。他の場合に、本発明の方法は、コンピュータデータベースに又は、例えば、研究室で、情報を保存するための他の適切な機械若しくはデバイスに工程（ｄ）で得られた比較の結果を記録又は保存する工程をさらに含んでいることができる。
【０１７１】
或る実施形態において、工程（ｃ）においてＨＥＲ２シグナル伝達経路成分（例えば、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ１、及び／又はＳＨＣ）１種又は２種以上の活性化レベルを決定する工程は、検出すべきＨＥＲ２シグナル伝達経路の各成分のリン酸化形に特異的な抗体を用いて細胞抽出物中のＨＥＲ２シグナル伝達経路成分１種又は２種以上のリン酸化レベルを検出することを含む。
【０１７２】
活性化（例えば、リン酸化）レベル及び／又は状態は様々な技術のいずれかを用いて決定することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載のように単一の検出アッセイすなわち近接二重検出アッセイ（例えば、協調的近接イムノアッセイ（ＣＯＰＩＡ））などのイムノアッセイを用いて、工程（ｃ）におけるＨＥＲ２シグナル伝達経路成分（例えば、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ１、及び／又はＳＨＣ）１種又は２種以上の活性化（例えば、リン酸化）レベル及び／又は状態を検出する。
【０１７３】
なお別の側面において、本発明は、腫瘍を有しかつＨＥＲ２活性を調節する化合物を用いた療法を受ける被験者における、該化合物を用いた療法に対する応答を監視する方法であって、
（ａ）腫瘍から得られた細胞を溶解させて細胞抽出物を生成する工程；
（ｂ）前記細胞抽出物中のＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分１種又は２種以上の発現及び／又は活性化（例えば、リン酸化）レベルを決定する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で決定されたＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分１種又は２種以上の発現及び／又は活性化レベルをＨＥＲ２シグナル伝達経路の該成分１種又は２種以上の参照の発現及び／又は活性化レベルと比較する工程；を含み、
工程（ｂ）で決定されたＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分１種又は２種以上の発現及び／又は活性化レベルとＨＥＲ２シグナル伝達経路の該成分１種又は２種以上の参照の発現及び／又は活性化レベルとの差異が、前記化合物を用いた療法を継続すべきか又は調整すべきか（例えば、化合物の現在の用量を維持する、化合物の今後の用量を変更する、又は代わりの抗癌剤を選択する）を示す、方法を提供する。
【０１７４】
好ましい側面において、本発明は、腫瘍を有しかつＨＥＲ２活性を調節する化合物を用いた療法を受ける被験者における、該化合物を用いた療法に対する応答を監視する方法であって、
（ａ）腫瘍から得られた細胞を溶解させて細胞抽出物を生成する工程；
（ｂ）前記細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルを決定する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で決定されたＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルをＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルと比較する工程；を含み、
ＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルと比較してより高い前記細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルの存在が、前記化合物を用いた療法を調整すべきである（例えば、化合物の今後の用量を変更する又は代わりの抗癌剤を選択する）ことを示す、方法を提供する。
【０１７５】
ＨＥＲ２活性を調節する化合物の限定的でない例として、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。好ましい実施形態において、ＨＥＲ２調節性化合物は、ＨＥＲ２活性を阻害し及び／又はＨＥＲ２シグナル伝達をブロックし、例えば、ＨＥＲ２阻害剤である。ＨＥＲ２阻害剤の例として、モノクローナル抗体、例えば、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））及びペルツズマブ（２Ｃ４）；小分子チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（商標））、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（商標））、ピリチニブ、ＣＰ−６５４５７７、ＣＰ−７２４７１４、カネルチニブ（ＣＩ １０３３）、ＨＫＩ−２７２、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６；Ｔｙｋｅｒｂ（商標））、ＰＫＩ−１６６、ＡＥＥ７８８、ＢＭＳ−５９９６２６、ＨＫＩ−３５７、ＢＩＢＷ ２９９２、ＡＲＲＹ−３３４５４３、ＪＮＪ−２６４８３３２７、及びＪＮＪ−２６４８３３２７；及びそれらの組み合わせを挙げることができるがそれらに限定されない。他の実施形態において、ＨＥＲ２調節性化合物は、ＨＥＲ２経路を活性化し、例えば、ＨＥＲ２活性化剤である。
【０１７６】
或る実施形態において、ＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分（例えば、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ１、ＳＨＣなど）１種又は２種以上の参照の発現又は活性化レベルは、前記化合物（例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））を用いて処理される前記化合物に感受性の細胞（例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）感受性細胞）から得られる。或る実施形態において、前記化合物に感受性の細胞（すなわち、化合物感受性細胞）は、ＢＴ−４７４細胞、ＳＫＢＲ３細胞、ＮＨ２７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞、ＵＡＣＣ−８１２細胞、ＵＡＣＣ−８９３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞、ＳＵＭ１９０細胞、ＳＵＭ２２５細胞、Ｎ８７細胞、ＯＥ１９細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。或る場合に、存在する細胞又は細胞系（例えば、化合物耐性細胞又は細胞系）から化合物感受性細胞を遺伝子組み換えして前記化合物に感受性である細胞又は細胞系を形成する（例えば、前記細胞又は細胞系において前記化合物により調節されるＨＥＲ２シグナル伝達経路成分（例えば、ＨＥＲ２）を発現させることによる）。好ましくは、化合物感受性細胞は、ＢＴ−４７４細胞などのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）感受性細胞である。
【０１７７】
他の実施形態において、ＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分（例えば、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ１、ＳＨＣなど）１種又は２種以上の参照の発現又は活性化レベルは、前記化合物（例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））を用いて処理される前記化合物に耐性の細胞（例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）耐性細胞）から得られる。或る実施形態において、前記化合物に耐性である細胞（すなわち、化合物耐性細胞）は、ＢＴ／Ｒ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＳＫＢＲ３／ＩＧＦ−１Ｒ細胞、ＪＩＭＴ−１細胞、ＢＴ−４７４／ＨＲ２０細胞、ＳＫＢＲ３／Ｐ２細胞、ＮＨ２９細胞、ＮＨ４７細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＭＣＦ−７／７１３細胞、ＭＣＦ−７／ＨＥＲ２Δ１６細胞、ＺＲ−７５−１細胞、ＢＴ２０細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞、Ｔ４７Ｄ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞、ＣＡＭＡ１細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７細胞、ＥＦＭ１９２Ａ細胞、ＫＰＬ１細胞、ＥＦＭ１９細胞、ＣＡＬ５１細胞、ＮＵＧＣ３細胞、ＮＵＧＣ４細胞、ＦＵ９７細胞、ＳＮＵ１６細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。或る場合に、存在する細胞又は細胞系（例えば、化合物感受性細胞又は細胞系）から化合物耐性細胞を遺伝子組み換えして前記化合物に耐性である細胞又は細胞系を形成する（例えば、前記細胞又は細胞系において前記化合物により調節されるＨＥＲ２シグナル伝達経路成分（例えば、ＨＥＲ２）をノックアウトすることによる）。好ましくは、化合物耐性細胞は、ＢＴ／Ｒ細胞などのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）耐性細胞である。
【０１７８】
更なる実施形態において、ＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分（例えば、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ１、ＳＨＣなど）１種又は２種以上の参照の発現又は活性化レベルは、前記化合物（例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））を用いた処理がされていない細胞（例えば、患者試料から得られた乳癌細胞、胃癌細胞、又はＨＥＲ２発現性腫瘍細胞などの腫瘍細胞）から得られる。特定の実施形態において、前記化合物を用いた処理がされていない細胞は、細胞抽出物を生成するために用いられる単離細胞（例えば、調査すべき被検細胞）が得られる試料と同じ試料から得られる。
【０１７９】
或る実施形態において、発現又は活性化レベルが、前記化合物を用いて処理された化合物感受性細胞（例えば、ＢＴ−４７４細胞）中の、前記化合物を用いて処理された化合物耐性細胞（例えば、ＢＴ／Ｒ細胞）中の、又は前記化合物を用いた処理がされていない細胞（例えば、患者試料から得られた乳癌細胞、胃癌細胞、又はＨＥＲ２発現性腫瘍細胞などの腫瘍細胞）中の、対応するＨＥＲ２シグナル伝達経路成分の参照の発現又は活性化レベルより少なくとも約１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又は１００倍高い（例えば、約１．５〜３、２〜３、２〜４、２〜５、２〜１０、２〜２０、２〜５０、３〜５、３〜１０、３〜２０、３〜５０、４〜５、４〜１０、４〜２０、４〜５０、５〜１０、５〜１５、５〜２０、又は５〜５０倍高い）場合に、ＨＥＲ２シグナル伝達経路成分（例えば、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ１、ＳＨＣなど）のより高い発現又は活性化レベルが細胞抽出物中に存在していると考えられる。
【０１８０】
他の実施形態において、発現又は活性化レベルが、前記化合物を用いて処理された化合物感受性細胞（例えば、ＢＴ−４７４細胞）中の、前記化合物を用いて処理された化合物耐性細胞（例えば、ＢＴ／Ｒ細胞）中の、又は前記化合物を用いた処理がされていない細胞（例えば、患者試料から得られた乳癌細胞、胃癌細胞、又はＨＥＲ２発現性腫瘍細胞などの腫瘍細胞）中の、対応するＨＥＲ２シグナル伝達経路成分の参照の発現又は活性化レベルより少なくとも約１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又は１００倍低い（例えば、約１．５〜３、２〜３、２〜４、２〜５、２〜１０、２〜２０、２〜５０、３〜５、３〜１０、３〜２０、３〜５０、４〜５、４〜１０、４〜２０、４〜５０、５〜１０、５〜１５、５〜２０、又は５〜５０倍低い）場合に、ＨＥＲ２シグナル伝達経路成分（例えば、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ１、ＳＨＣなど）のより低い発現又は活性化レベルが細胞抽出物中に存在していると考えられる。
【０１８１】
或る実施形態において、化合物感受性細胞中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルと比較してより高い細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２活性化レベルの存在は、前記化合物を用いた療法を調整すべきである（例えば、今後の用量を増加又は減少させることによって前記化合物の今後の用量を変更し又は代わりの抗癌剤を選択する）ことを示す。他の実施形態では、化合物感受性細胞中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルと比較して同程度の又はより低い細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２活性化レベルの存在は、前記化合物を用いた療法を継続すべきである（例えば、化合物の現在の用量を維持する）ことを示す。１つの実施形態において、細胞抽出物中のＨＥＲ２活性化レベルは、化合物感受性細胞（例えば、ＢＴ−４７４細胞）中のＨＥＲ２の参照の活性化レベルより少なくとも２〜３倍高い。別の実施形態において、細胞抽出物中のｐ９５ＨＥＲ２活性化レベルは、化合物感受性細胞（例えば、ＢＴ−４７４細胞）中のｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルより少なくとも５倍高い。
【０１８２】
或る実施形態において、化合物耐性細胞中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルと比較してより低い細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルの存在は、前記化合物を用いた療法を継続すべきである（例えば、化合物の現在の用量を維持する）ことを示す。他の実施形態では、化合物耐性細胞中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルと比較して同程度の又はより高い細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２活性化レベルの存在は、前記化合物を用いた療法を調整すべきである（例えば、今後の用量を増加又は減少させることによって前記化合物の今後の用量を変更し又は代わりの抗癌剤を選択する）ことを示す。
【０１８３】
或る実施形態において、前記化合物を用いた処理がされていない細胞（例えば、患者試料から得られた乳癌細胞、胃癌細胞、又はＨＥＲ２発現性腫瘍細胞などの腫瘍細胞）中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルと比較してより低い細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２活性化レベルの存在は、前記化合物を用いた療法を継続すべきである（例えば、化合物の現在の用量を維持する）ことを示す。他の実施形態では、前記化合物を用いた処理がされていない細胞中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の参照の活性化レベルと比較して同程度の又はより高い細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２活性化レベルの存在は、前記化合物を用いた療法を調整すべきである（例えば、今後の用量を増加又は減少させることによって前記化合物の今後の用量を変更し又は代わりの抗癌剤を選択する）ことを示す。
【０１８４】
或る実施形態において、本発明の方法は、細胞抽出物中のＨＥＲ２及びｐ９５ＨＥＲ２の両方の活性化レベルを決定する工程を含む。特定の実施形態において、ＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルはＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２のリン酸化レベルを含む。
【０１８５】
或る他の実施形態において、本発明の方法はさらに、細胞抽出物中の追加のシグナル伝達分子１種又は２種以上の活性化レベルを決定する工程を含む。追加のシグナル伝達分子の限定的でない例として、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＭＥＫ、ＰＴＥＮ、ＳＧＫ３、４Ｅ−ＢＰ１、ＥＲＫ２（ＭＡＰＫ１）、ＥＲＫ１（ＭＡＰＫ３）、ＰＤＫ１、Ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＧＳＫ−３β、ＳＨＣ、ＩＧＦ−１Ｒ、ｃ−ＭＥＴ、ｃ−ＫＩＴ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、受容体二量体（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体、ＨＥＲ２／ＨＥＲ２ホモ二量体、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体、ＨＥＲ１／ＨＥＲ２ヘテロ二量体、及び／又はＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体)、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。特定の実施形態では、前記追加のシグナル伝達分子１種又は２種以上の活性化レベルはこのような分子のリン酸化レベルを含む。更なる実施形態において、本発明の方法は、細胞抽出物中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、及び／又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体１種又は２種以上とともにＨＥＲ２及び／又はｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルを決定する工程を含む。
【０１８６】
或る実施形態において、本発明の方法はさらに又は代わりに、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、及び／又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体１種又は２種以上の活性化レベルを決定する工程を含む。所定の場合には、化合物感受性細胞中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の参照の活性化レベルと比較してより高い細胞抽出物中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の活性化レベルの存在は、前記化合物を用いた療法を調整すべきである（例えば、今後の用量を増加又は減少させることによって前記化合物の今後の用量を変更し又は代わりの抗癌剤を選択する）ことを示す。他の場合には、化合物感受性細胞中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の参照の活性化レベルと比較して同程度の又はより低い細胞抽出物中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の活性化レベルの存在は、前記化合物を用いた療法を継続すべきである（例えば、化合物の現在の用量を維持する）ことを示す。１つの実施形態において、細胞抽出物中のＨＥＲ３の活性化レベルは、化合物感受性細胞（例えば、ＢＴ−４７４細胞）中のＨＥＲ３の参照の活性化レベルより少なくとも２〜３倍高い。
【０１８７】
所定の場合には、化合物耐性細胞中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の参照の活性化レベルと比較してより低い細胞抽出物中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の活性化レベルの存在は、前記化合物を用いた療法を継続すべきである（例えば、化合物の現在の用量を維持する）ことを示す。他の場合には、化合物耐性細胞中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の参照の活性化レベルと比較して同程度の又はより高い細胞抽出物中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の活性化レベルの存在は、前記化合物を用いた療法を調整すべきである（例えば、今後の用量を増加又は減少させることによって前記化合物の今後の用量を変更し又は代わりの抗癌剤を選択する）ことを示す。
【０１８８】
或る場合に、前記化合物を用いた処理がされていない細胞（例えば、患者試料から得られた乳癌細胞、胃癌細胞、又はＨＥＲ２発現性腫瘍細胞などの腫瘍細胞）中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の参照の活性化レベルと比較してより低い細胞抽出物中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の活性化レベルの存在は、前記化合物を用いた療法を継続すべきである（例えば、化合物の現在の用量を維持する）ことを示す。他の場合には、前記化合物を用いた処理がされていない細胞中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の参照の活性化レベルと比較して同程度の又はより高い細胞抽出物中のＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、又はｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体の活性化レベルの存在は、前記化合物を用いた療法を調整すべきである（例えば、今後の用量を増加又は減少させることによって前記化合物の今後の用量を変更し又は代わりの抗癌剤を選択する）ことを示す。
【０１８９】
或る実施形態において、細胞（細胞抽出物が生成される被検細胞）は、乳癌細胞、胃癌細胞、及び／又はＨＥＲ２発現性腫瘍細胞などの腫瘍細胞である。所定の場合には、前記腫瘍細胞は、腫瘍から得られた微細針吸引液（ＦＮＡ）細胞又は循環腫瘍細胞である。他の実施形態において、細胞（細胞抽出物が生成される被検細胞）は、例えば、乳癌又は胃癌患者から得られる試料から単離される。限定的でない試料の例として、例えば、全血、血清、血漿、乳管洗浄液、乳頭吸引液、リンパ液、骨髄吸引液、尿、唾液、及び／又は微細針吸引液（ＦＮＡ）試料などの体液試料を挙げることができる。特定の実施形態において、試料は全血、血清、血漿、及び／又は乳房若しくは胃腫瘍組織又はＨＥＲ２発現性腫瘍組織などの腫瘍組織試料を含む。
【０１９０】
所定の場合には、本発明の方法は、読み取り可能なフォーマットでユーザー（例えば、腫瘍医又は一般開業医などの医師）に工程（ｃ）で得られた比較の結果を提供する工程（ｄ）をさらに含んでいることができる。或る場合に、本発明の方法は、工程（ｃ）で得られた比較の結果を医師、例えば、腫瘍医又は一般開業医に送り又は報告する工程をさらに含んでいることができる。他の場合には、本発明の方法は、コンピュータデータベースに又は、例えば、研究室で、情報を保存するための他の適切な機械若しくはデバイスに工程（ｃ）で得られた比較の結果を記録又は保存する工程をさらに含んでいることができる。
【０１９１】
或る実施形態において、工程（ｂ）においてＨＥＲ２シグナル伝達経路成分（例えば、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ１、及び／又はＳＨＣ）１種又は２種以上の活性化レベルを決定する工程は、検出すべきＨＥＲ２シグナル伝達経路の各成分のリン酸化形に特異的な抗体を用いて細胞抽出物中のＨＥＲ２シグナル伝達経路成分１種又は２種以上のリン酸化レベルを検出する工程を含む。
【０１９２】
活性化（例えば、リン酸化）レベル及び／又は状態は様々な技術のいずれかを用いて決定することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載のように単一の検出アッセイすなわち近接二重検出アッセイ（例えば、協調的近接イムノアッセイ（ＣＯＰＩＡ））などのイムノアッセイを用いて、工程（ｂ）におけるＨＥＲ２シグナル伝達経路成分（例えば、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ１、及び／又はＳＨＣ）１種又は２種以上の活性化（例えば、リン酸化）レベル及び／又は状態を検出する。
【０１９３】
更なる側面において、本発明は、初期ＨＥＲ２陰性の原発性乳房腫瘍を有する被験者のＨＥＲ２状態を監視する方法であって、
循環細胞中の活性化ＨＥＲ２の存在を検出することによって被験者から得られた固形腫瘍の循環細胞のＨＥＲ２状態を決定する工程を含み、前記循環細胞中の活性化ＨＥＲ２の存在が被験者のＨＥＲ２陰性状態からＨＥＲ２陽性状態への転換を示す、方法を提供する。
【０１９４】
１つの実施形態において、被験者（例えば、ヒト）は転移性乳癌を有する。別の実施形態において、固体腫瘍の循環細胞は、循環腫瘍細胞、循環内皮細胞、循環内皮前駆細胞、癌幹細胞、播種性腫瘍細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。更なる実施形態において、循環細胞のＨＥＲ２状態を決定する前に原発性乳房腫瘍のＨＥＲ２状態を決定する。
【０１９５】
所定の実施形態において、循環細胞中の活性化ＨＥＲ２の存在は、ＨＥＲ２活性を調節する化合物を用いた処理に対する被験者の応答と関連付けられる。ＨＥＲ２活性を調節する化合物の限定的でない例として、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。好ましい実施形態において、ＨＥＲ２調節性化合物は、ＨＥＲ２活性を阻害し及び／又はＨＥＲ２シグナル伝達をブロックし、例えば、ＨＥＲ２阻害剤である。ＨＥＲ２阻害剤の例として、モノクローナル抗体、例えば、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））及びペルツズマブ（２Ｃ４）；小分子チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（商標））、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（商標））、ピリチニブ、ＣＰ−６５４５７７、ＣＰ−７２４７１４、カネルチニブ（ＣＩ １０３３）、ＨＫＩ−２７２、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６；Ｔｙｋｅｒｂ（商標））、ＰＫＩ−１６６、ＡＥＥ７８８、ＢＭＳ−５９９６２６、ＨＫＩ−３５７、ＢＩＢＷ ２９９２、ＡＲＲＹ−３３４５４３、ＪＮＪ−２６４８３３２７、及びＪＮＪ−２６４８３３２７；並びにそれらの組み合わせを挙げることができるがそれらに限定されない。他の実施形態において、ＨＥＲ２調節性化合物は、ＨＥＲ２経路を活性化し、例えば、ＨＥＲ２活性化剤である。
【０１９６】
或る実施形態において、本発明の方法は、乳癌腫瘍の細胞が単離される乳房腫瘍を有する被験者から試料を得る工程をさらに含んでいることができる。試料は、ＨＥＲ２調節性化合物を用いた処理の前に及び／又はＨＥＲ２調節性化合物の投与後に（例えば、癌治療過程の全期間を通じて任意のときに）乳癌被験者から得ることができる。適切な試料として、全血、血清、血漿、及びそれらの組み合わせを挙げることができるがそれらに限定されない。１つの好ましい実施形態において、試料は全血試料である。この実施形態において、全血試料から乳房腫瘍の循環細胞を単離することができる。ＨＥＲ２調節性化合物を用いた処理を受けなかった被験者から単離細胞を得る場合、適当な条件下にインビトロで該単離細胞をＨＥＲ２調節性化合物の１つ又は混合物（cocktail）とインキュベートすることができる。
【０１９７】
当分野で公知の任意の技術によって、例えば、免疫磁気分離法、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ、マイクロ流体分離法、ＦＡＣＳ、密度勾配遠心分離法、及び枯渇法によって、試料から乳房腫瘍の循環細胞を単離することができる。循環細胞などの単離細胞を溶解させ、それによって当分野で公知の任意の技術により単離細胞を細胞抽出物に変換することができる。
【０１９８】
他の実施形態において、本発明の方法は、固形腫瘍の循環細胞中の（例えば、循環細胞の溶解から生成された細胞抽出物中の）追加のシグナル伝達分子１種又は２種以上の状態（例えば、活性化レベル又は状態）を決定する工程をさらに含む。追加のシグナル伝達分子の限定的でない例として、ＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分、例えば、ｐ９５ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＭＥＫ、ＰＴＥＮ、ＳＧＫ３、４Ｅ−ＢＰ１、ＥＲＫ２（ＭＡＰＫ１）、ＥＲＫ１（ＭＡＰＫ３）、ＰＤＫ１、Ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＧＳＫ−３β、ＳＨＣ、ＩＧＦ−１Ｒ、ｃ−ＭＥＴ、ｃ−ＫＩＴ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、受容体二量体（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体、ＨＥＲ２／ＨＥＲ２ホモ二量体、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体、ＨＥＲ１／ＨＥＲ２へテロ二量体、及び／又はＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体）、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。特定の実施形態において、ＨＥＲ２及び／又は追加のシグナル伝達分子１種又は２種以上の活性化レベルはこのような分子のリン酸化レベルを含む。
【０１９９】
活性化（例えば、リン酸化）レベル及び／又は状態は様々な技術のいずれかを用いて決定することができる。或る実施形態において、固形腫瘍の循環細胞中のＨＥＲ２の活性化（例えば、リン酸化）レベル及び／又は状態は本明細書に記載のように単一の検出アッセイすなわち近接二重検出アッセイ（例えば、協調的近接イムノアッセイ（ＣＯＰＩＡ））などのイムノアッセイを用いて検出される。
【０２００】
特定の実施形態において、活性化ＨＥＲ２の存在は、以下の工程：
（ｉ）循環細胞の細胞抽出物を希釈系列のＨＥＲ２に特異的な捕捉抗体とインキュベートして複数の捕捉された分析物を形成する工程であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に拘束されている工程；
（ｉｉ）前記複数の捕捉された分析物をＨＥＲ２に特異的な活性化状態非依存性抗体及び活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートして複数の検出可能な捕捉された分析物を形成する工程であって、
前記活性化状態非依存性抗体が促進成分を用いて標識化されており、前記活性化状態依存性抗体がシグナル増幅対の第１のメンバーを用いて標識化されており、そして前記促進成分が前記シグナル増幅対の第１のメンバーへチャネリングして該メンバーと反応する酸化剤を生成する工程；
（ｉｉｉ）前記複数の検出可能な捕捉された分析物を前記シグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして増幅シグナルを生成する工程；及び
（ｉｖ）前記シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程；を含むイムノアッセイを用いて検出される。
【０２０１】
所定の場合には、本発明の方法は、読み取り可能なフォーマットでユーザー（例えば、腫瘍医又は一般開業医などの医師）にＨＥＲ２状態決定の結果を提供する工程をさらに含んでいることができる。或る場合に、本発明の方法は、ＨＥＲ２状態決定の結果を医師、例えば、腫瘍医又は一般開業医に送り又は報告する工程をさらに含んでいることができる。他の場合には、本発明の方法は、コンピュータデータベースに又は、例えば、研究室で、情報を保存するための他の適切な機械若しくはデバイスにＨＥＲ２状態決定の結果を記録又は保存する工程をさらに含んでいることができる。
【０２０２】
追加的な側面において、本発明は、乳房腫瘍の治療に適した抗癌剤を選択する方法であって：
（ａ）腫瘍の微細針吸引液（ＦＮＡ）試料から得られた細胞を抗癌剤と接触させる工程：
（ｂ）前記細胞を溶解させて細胞抽出物を生成する工程；
（ｃ）前記細胞抽出物中のシグナル伝達分子１種又は２種以上の発現及び／又は活性化レベルを決定する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）で決定されたシグナル伝達分子１種又は２種以上の発現及び／又は活性化レベルを該シグナル伝達分子１種又は２種以上の参照の発現及び／又は活性化レベルと比較する工程；を含み、
工程（ｃ）で決定されたシグナル伝達分子１種又は２種以上の発現及び／又は活性化レベルと該シグナル伝達分子１種又は２種以上の参照の発現及び／又は活性化レベルとの差異が、前記抗癌剤が乳房腫瘍の治療に適しているか又は適していないかを示す、方法を提供する。
【０２０３】
特定の実施形態において、乳房腫瘍の治療に適した抗癌剤を選択する方法は、
（ａ）腫瘍の微細針吸引液（ＦＮＡ）試料から得られた細胞を抗癌剤と接触させる工程：
（ｂ）前記細胞を溶解させて細胞抽出物を生成する工程；
（ｃ）前記細胞抽出物中のシグナル伝達分子１種又は２種以上の活性化レベルを決定する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）で決定されたシグナル伝達分子１種又は２種以上の活性化レベルを前記抗癌剤の非存在下に生成された該シグナル伝達分子１種又は２種以上の参照の発現及び／又は活性化レベルと比較する工程；を含み、
前記シグナル伝達分子１種又は２種以上の参照の活性化レベルと比較して実質的に低下した細胞抽出物中の該シグナル伝達分子１種又は２種以上の活性化レベルの存在は、前記抗癌剤が乳房腫瘍の治療に適していることを示す。
【０２０４】
或る実施形態において、シグナル伝達分子の活性化レベルは、該シグナル伝達分子が抗癌剤の非存在下におけるより少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％低く活性化される場合に、抗癌剤の存在下で「実質的に低減」されると考えられる。他の実施形態において、（１）抗癌剤を用いない場合のシグナル伝達分子の高い又は強い活性化から抗癌剤を用いた場合のシグナル伝達分子の中間の、弱い、低い、又は極めて弱い活性化への変化がある場合に、又は（２）抗癌剤を用いない場合のシグナル伝達分子の中間の活性化から抗癌剤を用いた場合のシグナル伝達分子の弱い、低い、又は極めて弱い活性化への変化がある場合に、シグナル伝達分子の活性化レベルは抗癌剤の存在下で「実質的に低減」されると考えられる。
【０２０５】
１つの実施形態において、ＦＮＡ試料は転移性乳癌を有する被験者（例えば、ヒト）から得られる。別の実施形態において、本発明の方法は、抗癌剤が乳癌腫瘍の治療に適していると同定される場合に該乳癌剤を投与する工程をさらに含む。
【０２０６】
或る実施形態において、抗癌剤は、癌細胞中の活性化されたシグナル伝達経路成分の機能を妨げる薬剤を含む。このような薬剤の限定的でない例として、以下の表１に列挙した薬剤を挙げることができる。
【表１】
0005718319.tif 000002
0005718319.tif 000003
【０２０７】
所定の実施形態において、抗癌剤は、抗シグナル伝達剤（すなわち、細胞増殖抑制薬）、例えば、モノクローナル抗体若しくはチロシンキナーゼ阻害剤；抗増殖剤；化学療法剤（すなわち、細胞毒性薬）；ホルモン療法剤；放射線療法剤；ワクチン；及び／又は癌性細胞などの異常な細胞の制御されない増殖を低減又は阻害する能力を有する任意の他の化合物を含む。或る実施形態において、化学療法剤少なくとも１種と組み合わせた１種又は２種以上の抗シグナル伝達剤、抗増殖剤、及び／又はホルモン療法剤を用いて単離された細胞を処理する。
【０２０８】
本発明において使用するのに適切な抗シグナル伝達剤の例として、限定的でなく、モノクローナル抗体、例えば、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））、ペルツズマブ（２Ｃ４）、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（商標））、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（商標））、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標））、ゲムツズマブ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（商標））、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（商品名））、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（商標））、及びトシツモマブ（ＢＥＸＸＡＲ（商標））；チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（商標））、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（商標））、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（商標））、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６；Ｔｙｋｅｒｂ（商標））、カネルチニブ（ＣＩ １０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６；Ｎｅｘａｖａｒ（商標））、イマチニブメシレート（Ｇｌｅｅｖｅｃ（商標））、レフルノミド（ＳＵ１０１）、バンデタニブ（ＺＡＣＴＩＭＡ（商品名）；ＺＤ６４７４）、ピリチニブ、ＣＰ−６５４５７７、ＣＰ−７２４７１４、ＨＫＩ−２７２、ＰＫＩ−１６６、ＡＥＥ７８８、ＢＭＳ−５９９６２６、ＨＫＩ−３５７、ＢＩＢＷ ２９９２、ＡＲＲＹ−３３４５４３、ＪＮＪ−２６４８３３２７、及びＪＮＪ−２６４８３３２７；並びにそれらの組み合わせを挙げることができる。
【０２０９】
典型的な抗増殖剤として、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、シロリムス（ラパマイシン）、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９）、及びエベロリムス（ＲＡＤ００１）；ＡＫＴ阻害剤、例えば、１Ｌ６−ヒドロキシメチル−ｃｈｉｒｏ−イノシトール−２−（Ｒ）−２−Ｏ−メチル−３−Ｏ−オクタデシル−ｓｎ−グリセロカーボネート、９−メトキシ−２−メチルエリプチシニウムアセテート、１，３−ジヒドロ−１−（１−（（４−（６−フェニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｇ］キノキサリン−７−イル）フェニル）メチル）−４−ピペリジニル）−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン、１０−（４’−（Ｎ−ジエチルアミノ）ブチル）−２−クロロフェノキサジン、３−ホルミルクロモンチオセミカルバゾン（Ｃｕ（ＩＩ）Ｃｌ２複合体）、ＡＰＩ−２、プロトオンコジーンＴＣＬ１のアミノ酸１０〜２４に由来する１５−ｍｅｒペプチド（Hiromura et al., J. Biol. Chem., 279:53407-53418 (2004)、ＫＰ３７２−１、及びKozikowski et al., J. Am. Chem. Soc., 125:1144-1145 (2003)及びKau et al., Cancer Cell, 4:463-476 (2003)に記載の化合物；並びにそれらの組み合わせを挙げることができる。
【０２１０】
化学療法剤の限定的でない例として、白金に基づく薬剤（例えば、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、スピロプラチン、イプロプラチン、サトラプラチンなど）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イフォスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファラン、メクロレタミン、ウラムスチン、チオテパ、ニトロソウレアなど）、代謝拮抗薬（例えば、５−フルオロウラシル、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキセート、ロイコボリン、カペシタビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（商標））、ペメトレキセド（ＡＬＩＭＴＡ（商標））、ラルチトレキセドなど）、植物アルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、ポドフィロトキシン、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（商標））、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（商標））など）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、イリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドホスフェート、テニポシドなど）、抗腫瘍抗生物質（例えば、ドキソルビシン、アドリアマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシンなど）、それらの薬学的に許容することのできる塩、それらの立体異性体、それらの誘導体、それらのアナログ、並びにそれらの組み合わせを挙げることができる。
【０２１１】
ホルモン療法剤の例として、限定的でなく、アロマターゼ阻害剤（例えば、アミノグルテチミド、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（商標））、レトロゾール（Ｆｅｍａｒａ（商標））、ボロゾール、エキセメスタン（Ａｒｏｍａｓｉｎ（商標））、４−アンドロステン−３，６，１７−トリオン（６−ＯＸＯ）、１，４，６−アンドロスタトリエン−３，１７−ジオン（ＡＴＤ）、フォルメスタン（Ｌｅｎｔａｒｏｎ（商標））など）、選択的エストロゲン受容体調節剤（例えば、バゼドキシフェン、クロミフェン、フルベストラント、ラソフォキシフェン、ラロキシフェン、タモキシフェン、トレミフェンなど）、ステロイド剤（例えば、デキサメタゾン）、フィナステリド、及びゴセレリンなどのゴナドトロピン放出性ホルモンアゴニスト（ＧｎＲＨ）、それらの薬学的に許容することのできる塩、それらの立体異性体、それらの誘導体、それらのアナログ、並びにそれらの組み合わせを挙げることができる。
【０２１２】
本発明において有用な癌ワクチンの限定的でない例として、Ａｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ社からのＡＮＹＡＲＡ、Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社からのＤＣＶａｘ−ＬＢ、ＩＤＭ Ｐｈａｒｍａ社からのＥＰ−２１０１、Ｐｈａｒｍｅｘａ社からのＧＶ１００１、Ｉｄｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社からのＩＯ−２０５５、Ｉｎｔｒｏｇｅｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社からのＩＮＧＮ２２５及びＢｉｏｍｉｒａ／Ｍｅｒｃｋ社からのＳｔｉｍｕｖａｘを挙げることができる。
【０２１３】
放射線療法剤の例として、限定的でなく、腫瘍抗原に向けられた抗体に場合によりコンジュゲートされていることがある、例えば４７Ｓｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、８９Ｓｒ、８６Ｙ、８７Ｙ、９０Ｙ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１１７ｍＳｎ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、及び２１２Ｂｉなどの放射性核種を挙げることができる。
【０２１４】
本発明を用いて調査することができるシグナル伝達分子及び経路の限定的でない例として表２に示すものを挙げることができる。
【表２】
0005718319.tif 000004
0005718319.tif 000005
【０２１５】
細胞抽出物中の調査することができるシグナル伝達分子の限定的でない例として、限定的でなく、受容体チロシンキナーゼ、非受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼシグナル伝達カスケード成分、核ホルモン受容体、核受容体コアクチベーター、核受容体リプレッサー、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。所定の場合に、複数のシグナル伝達分子は、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、ＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）、ＰＩ３Ｋ、ＳＨＣ、Ｒａｆ、ＳＲＣ、ＭＥＫ、ＮＦｋＢ−ＩｋＢ、ｍＴＯＲ、ＰＩ３Ｋ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＥＰＨ−Ａ、ＥＰＨ−Ｂ、ＥＰＨ−Ｃ、ＥＰＨ−Ｄ、ｃ−ＭＥＴ、ＦＧＦＲ、ｃ−ＫＩＴ、ＦＬＴ−３、ＴＩＥ−１、ＴＩＥ−２、ｃ−ＦＭＳ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、Ａｂｌ、ＦＴＬ３、ＲＥＴ、ＨＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＲ、ＰＲ、ＮＣＯＲ、ＡＩＢ１、ＡＫＴ、ＥＲＫ２（ＭＡＰＫ１）、ＥＲＫ１（ＭＡＰＫ３）、ＰＤＫ１、ＰＤＫ２、ＰＴＥＮ、ＳＧＫ３、４Ｅ−ＢＰ１、Ｐ７０Ｓ６Ｋ、タンパク質チロシンホスファターゼ（例えば、ＰＴＰ１Ｂ、ＰＴＰＮ１３、ＢＤＰ１など）、受容体二量体、ＧＳＫ−３β、ＰＩＰ２、ＰＩＰ３、ｐ２７、及びそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態において、シグナル伝達分子１種又は２種以上は、ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ１、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３、ｃ−ＭＥＴ、ＩＧＦ−１Ｒ、ｃ−ＫＩＴ、ＰＩ３Ｋ、ＳＨＣ、ＶＥＧＦＲ、又はそれらの組み合わせを含む。
【０２１６】
全発現及び活性化（例えば、リン酸化）レベル及び／又は状態は、様々な技術のいずれかを用いて決定することができる。所定の場合に、ＦＮＡ試料中のシグナル伝達分子の発現及び／又は活性化（例えば、リン酸化）レベル及び／又は状態は、本明細書に記載のように単一の検出アッセイすなわち近接二重検出アッセイ（例えば、協調的近接イムノアッセイ（ＣＯＰＩＡ））などのイムノアッセイを用いて検出される。
【０２１７】
特定の実施形態において、活性化されたシグナル伝達分子の存在は、以下の工程：
（ｉ）ＦＮＡ細胞の細胞抽出物を複数の希釈系列のシグナル伝達分子１種又は２種以上に特異的な捕捉抗体とインキュベートして複数の捕捉されたシグナル伝達分子を形成する工程であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に拘束されている工程；
（ｉｉ）前記複数の捕捉されたシグナル伝達分子を、対応するシグナル伝達分子に特異的な複数の活性化状態依存性抗体及び活性化状態非依存性抗体を含む複数の検出抗体とインキュベートして複数の検出可能な捕捉されたシグナル伝達分子を形成する工程であって、
前記活性化状態非依存性抗体が促進成分を用いて標識化されており、前記活性化状態依存性抗体がシグナル増幅対の第１のメンバーを用いて標識化されており、そして前記促進成分が前記シグナル増幅対の第１のメンバーへチャネリングして該メンバーと反応する酸化剤を生成する工程；
（ｉｉｉ）前記複数の検出可能な捕捉されたシグナル伝達分子を前記シグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして増幅シグナルを生成する工程；及び
（ｉｖ）前記シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程；を含むイムノアッセイを用いて検出される。
【０２１８】
所定の場合に、本発明の方法は、読み取り可能なフォーマットでユーザー（例えば、腫瘍医又は一般開業医などの医師）に工程（ｄ）で得られた比較の結果を提供する工程（ｅ）をさらに含んでいることができる。或る場合に、本発明の方法は、工程（ｄ）で得られた比較の結果を医師、例えば、腫瘍医又は一般開業医に送り又は報告する工程をさらに含んでいることができる。他の場合に、本発明の方法は、コンピュータデータベースに又は、例えば、研究室で、情報を保存するための他の適切な機械若しくはデバイスに工程（ｄ）で得られた比較の結果を記録又は保存する工程をさらに含んでいることができる。
【０２１９】
ＩＶ．乳癌
乳癌は、肺癌、胃癌、肝臓癌、及び結腸癌に続く、世界中の癌死亡の５番目に最も一般的な原因である。２００５年には、乳癌のために世界中で５０２，０００人が死亡した。世界中の女性の間で、乳癌は癌死亡の最も一般的な原因となっている。米国では、乳癌は、肺癌及び結腸癌に続く、癌死の３番目に最も一般的な原因である。２００７年には、米国内で乳癌が原因で４０，０００人を超える人が亡くなっている。米国の女性の間で、乳癌は最も一般的な癌であり、癌死の２番目に最も一般的な原因である。実際に、米国の女性は８人に１人が生涯に浸潤性乳癌を発症する可能性がありそして３３人に１人が乳癌により死亡する可能性がある。世界中の乳癌の症例数は１９７０年代以降に有意に増加してきており、一部には西洋世界における現代のライフスタイルに原因があるとされる現象である。乳房は男性及び女性において同一組織から構成されているので、あまり一般的ではないが、乳癌は男性においても発生する。
【０２２０】
分類
乳癌は、各々、下記の基準に基づく４つの異なる分類スキームを用いて説明することができる：
１．病理学。病理学者は、その組織学的外観及び他の基準に基づいて各腫瘍を分類することができる。乳癌の最も一般的な病理学的タイプは、浸潤性乳管癌及び浸潤性小葉癌である。
２．腫瘍のグレード。組織学的グレードは、病理学者が顕微鏡下で決定することができる。高分化型（低グレード）の腫瘍は正常組織に似ている。低分化型（高グレード）の腫瘍は組織化されていない細胞から構成され、正常組織のようには見えない。中分化型（中グレード）腫瘍は、その中間のどこかにある。
３．タンパク質及び遺伝子発現の状態。乳癌は、例えば、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、及びＨｅｒ２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２などのシグナル伝達分子の発現及び／又は活性化について試験することができる。本明細書に記載したように、所定の腫瘍の発現のプロファイルはその予後診断の予測に役立ち、腫瘍医が最も適切な治療を選択する際の支援をする。
４．腫瘍のステージ。乳癌は、ＴＮＭ分類方式に従ってステージ分けすることができる：
ａ．腫瘍。浸潤癌の存否、浸潤癌の寸法、及び乳房の外側の（例えば、乳房の皮膚又は下部の筋肉若しくは胸郭への）浸潤の存否に依存する５つの値（Ｔｉｓ、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、又はＴ４）。
ｂ．リンパ節。リンパ節内の転移性沈着物の数、大きさ、及び位置に依存する４つの値（Ｎ０、Ｎ１、Ｎ２、又はＮ３）。
ｃ．転移。リンパ節以外の転移（例えば、骨、脳、肺などへのいわゆる遠隔転移）の存否に依存する２つの値（Ｍ０又はＭ１）。
【０２２１】
病理学
病理学に関して、ＷＨＯ（世界保健機関）の乳房腫瘍の分類は、以下の組織学的タイプを規定している：
１．浸潤性乳癌、例えば、浸潤性乳管癌（例えば、基底細胞様癌、混合型癌、多形癌、破骨巨細胞を有する癌、絨毛癌性の特徴を有する癌、黒色性の特徴を有する癌）、浸潤性小葉癌、管状腺癌、浸潤性篩状癌、髄様癌、粘液性癌、及び豊富なムチンを伴うその他の腫瘍（例えば、粘液性癌、嚢胞腺癌及び円柱細胞粘液性癌、印環細胞癌）、神経内分泌腫瘍（例えば、固形神経内分泌癌（乳房のカルチノイド）、非定型カルチノイド腫瘍、小細胞／燕麦細胞癌、大細胞神経内分泌癌）、浸潤性乳頭状癌、浸潤性微小乳頭状癌、アポクリン腺癌、化生性癌（例えば、混合上皮／間葉性化生性癌又は純粋上皮化生性癌、例えば、扁平上皮細胞癌、紡錘細胞化生を伴う腺癌、腺扁平上皮癌、及び粘液性類表皮癌）、脂質リッチ癌、分泌性乳癌、膨大細胞癌、腺様嚢胞癌、腺房細胞癌、グリコーゲンリッチ明細胞癌、皮脂腺癌、炎症性乳癌、及び両側乳癌；
２．前駆病変、例えば、小葉新生物（例えば、非浸潤性小葉癌）、乳管内増殖性病変（例えば、通常の乳管過形成、扁平上皮過形成、非定型乳管過形成、非浸潤性乳管癌）、微小浸潤癌、及び管内乳頭新生物（例えば、中枢性乳頭腫、末梢性乳頭腫、非定型乳頭腫、管内乳頭癌、嚢胞内乳頭癌、良性上皮性病変）；
３．良性上皮性病変、例えば、変形（例えば、硬化性腺疾患、アポクリン腺疾患、閉塞性腺症、微小乳腺腺症、腺筋上皮性腺疾患）を含む腺疾患、放射状瘢痕／複合硬化性病変、及び腺腫（例えば、管状腺腫、乳汁分泌性腺腫、アポクリン腺腫、多形腺腫、管状腺腫）；
４．筋上皮病変、例えば、筋上皮症、腺筋上皮腺症、腺筋上皮腫、及び悪性筋上皮腫；
５．間葉腫、例えば、肉腫、血管腫、血管腫症、血管周囲細胞腫、偽血管腫性間質過形成、筋繊維芽細胞腫、線維腫症（侵攻性）、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍、脂肪腫（例えば、血管脂肪腫）、顆粒細胞腫、神経線維腫、神経鞘腫、血管肉腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋腫、及び平滑筋肉腫；
６．線維上皮腫瘍、例えば、線維腺腫、葉状腫瘍（例えば、良性、境界型、悪性）、低グレード乳管周囲間質性肉腫、及び乳房過誤腫；
７．乳頭の腫瘍、例えば、乳頭腺腫、乳頭の汗管腺腫、及び乳頭のパジェット病；
８．悪性リンパ腫；
９．転移性腫瘍；並びに
１０．男性乳房の腫瘍、例えば、女性化乳房及び非浸潤性又は浸潤性の癌。
【０２２２】
乳管癌は、女性における乳癌の最も一般的なタイプであり、乳房の乳管内での癌細胞の発達を意味する。乳管癌は、２つの形態：浸潤性の悪性新生物である浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）；及び非浸潤性新生物である非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）に分けられる。ＩＤＣは、浸潤性乳癌の中で最も一般的な形態である。ＩＤＣは、乳癌のあらゆるタイプの約８０％を占める。マンモグラフィでは、ＩＤＣは、通常は辺縁から放射状に広がる微細なスパイクを有する塊として視認される。理学的検査では、通常この塊は、良性乳房病変よりはるかに硬く又は締まっているように感じられる。顕微鏡検査では、癌性細胞は、周囲の正常組織に浸潤して取って代わる。ＤＣＩＳは、女性における非浸潤性乳癌の中で最も一般的なタイプである。スクリーニング用マンモグラフィがより普及していくにつれて、ＤＣＩＳは、最も一般的に診断される乳房条件の１つとなってきた。ＤＣＩＳは、「ステージゼロ」乳癌と呼ばれることが多い。ＤＣＩＳは、通常はマンモグラムを通して微小石灰化として知られる極めて小さなカルシウム片として発見される。しかし、微小石灰化の全部が、生検によって確認されなければならないＤＣＩＳの存在を示す訳ではない。ＤＣＩＳは、多病巣性であることがあり、治療は、クリアな周辺部を残して、異常な乳管要素全部を切除することを目指す。切除後、治療は局所放射線療法を含むことが多い。適切な治療を行うと、ＤＣＩＳは、浸潤性癌に発達する可能性が低い。放射線を伴う外科的切除は、ＤＣＩＳが再発する、又は浸潤性乳癌が発生するリスクを低下させる。
【０２２３】
浸潤性小葉癌（ＩＬＣ）は、小葉内で始まり、周囲乳房組織に広がるタイプの乳癌である。初期段階で治療されないと、ＩＬＣは、子宮又は卵巣などの身体の他の部分内に移動する可能性がある。ＩＬＣは、全乳癌症例の約１０〜１５％を占める、浸潤性乳癌の２番目に最も一般的なタイプである。ＩＬＣは、通常は乳頭の上方で腕に向かう区間である乳房領域の一般的肥厚化を特徴とする。ＩＬＣは、マンモグラム上に現れる可能性が低い。ＩＬＣが現れる場合は、ＩＬＣは辺縁から放射状に広がる微細なスパイクを有する塊として現れ、又はもう一方の乳房に比較して非対称に見えることがある。
【０２２４】
療法
乳癌では、重要なシグナル伝達成分における多数の変化が証明されてきた。これらには：活性化を生じさせるＥＧＦＲ突然変異；ｃＭｅｔなどの他の受容体チロシンキナーゼの活性化；ＨＥＲ２及びＨＥＲ３の活性化又はＨＥＲ２の増幅を伴うＥＧＦＲ活性化；ＰＩ３Ｋ突然変異を伴うＥＧＦＲ活性化；ＰＴＥＮ枯渇（deletion）を伴うＥＧＦＲ活性化；及びＲａｓ突然変異を伴うＥＧＦＲ活性化が含まれる。シグナル伝達経路の種々の成分における様々な変化は、様々な形態の化学療法の標的とされてきた。
【０２２５】
同時に、血管新生と呼ばれるプロセスである腫瘍細胞への新規な血管の形成を標的とすることができる。ＶＥＧＦは、新規な血管の形成のために必須である内皮細胞生存因子である。従って、ＶＥＧＦ媒介血管新生の調節のための１つのアプローチは、ＶＥＧＦタンパク質自体又はＶＥＧＦＲに対して向けられた抗体を使用することである。ＶＥＧＦに対する組換えヒト化モノクローナル抗体であるベバシズマブは、化学療法と相乗的に作用し、結腸直腸癌、乳癌、及び肺癌を有する患者における生存率を改善させることが証明されている。
【０２２６】
すべての内分泌療法は、固有の方法でエストロゲン受容体（ＥＲ）機能を遮断するように設計されている。例えば、タモキシフェンなどの選択的エストロゲン受容体調節因子（ＳＥＲＭ）はＥＲに結合してその活性を部分的に遮断する。卵巣切除、黄体形成ホルモン放出性ホルモンアゴニスト、並びに、アロマターゼ阻害剤、例えば、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（商標））、レトロゾール（Ｆｅｍａｒａ（商標））及びエキセメスタン（Ａｒｏｍａｓｉｎ（商標））は、エストロゲンのレベルを低下させ、ＥＲのリガンド誘発性活性化を阻害する。理想的なＳＥＲＭは、乳房及び子宮内で抗エストロゲンとして、並びに骨格系、心血管系、及び中枢神経系、並びに消化管及び膣内での部分的エストロゲンアゴニストとして機能するはずである。
【０２２７】
フルベストラントなどのステロイド性抗エストロゲンは、ＥＲとより緊密に結合するので、その機能を完全に遮断し、受容体分解を誘導する。
【０２２８】
選択的エストロゲン受容体（ＥＲ）調節因子であるタモキシフェンは、ＥＲ陽性乳癌の治療のために最も広く使用されている薬剤である。タモキシフェンのアジュバント療法試験は、再発及び死亡率の確率において４０％〜５０％の減少を示す。タモキシフェンはさらに、転移性疾患を有する患者の３０％〜５０％において一時的緩解を与え、さらに乳癌の予防においても有効である。
【０２２９】
アロマターゼ阻害剤は、乳癌を有する閉経後女性の治療において看護の標準となっているが、閉経前女性においては依然としてタモキシフェンが標準である。アロマターゼ阻害剤はタモキシフェンよりわずかに有効性が高いことがあるが、アロマターゼ阻害剤は、アジュバント療法に対しこれらの薬剤を用いて順々に実証づけられたその利点に鑑み、そして転移性疾患において役割を有し続けるであろうことに鑑みて、依然として重要な薬剤である。
【０２３０】
耐性
タモキシフェンに対する初めからの耐性（初期療法に非応答；一次耐性）及び獲得耐性（療法に対する初期応答を示した後の疾患再発若しくは進行；二次耐性）は、重要な問題である。結果として、腫瘍生物学及び耐性のメカニズムの理解は、重要な臨床上の意味を与えることができる。
【０２３１】
ＥＲ／ＰＲ生物学：ＥＲ及びＰＲは、それらがリガンドに結合した場合に核内の転写因子として機能する核ホルモン受容体である。ＥＲ及びＰＲは、類似の構造を有し、ＤＮＡ結合ドメイン、二量体化ドメイン、ホルモン結合ドメイン、及び幾つかの転写活性化ドメインを含む。ＥＲ陽性、ＰＲ陰性腫瘍を有する患者と比較して、ＥＲ陽性、ＰＲ陽性腫瘍を有する患者では、再発に対するリスクのより大きな低減が認められた。
【０２３２】
ＥＲ機能：ＥＲに結合するホルモンは、リン酸化を介してタンパク質を活性化し、熱ショックタンパク質９０などのシャペロンタンパク質を解離させ、その構造を変化させる。ホルモン結合（「活性化」）ＥＲは、次に別の受容体と二量体化し、該二量体は、エストロゲン応答遺伝子のプロモータ内に存在するエストロゲン応答エレメント（特異的ＤＮＡ配列）に結合する。プロモータ結合ＥＲ二量体は、エストロゲン応答遺伝子の転写に影響を及ぼすように協調的に作用する乳癌１内で増幅されるような共調節タンパク質（ＡＩＢ１又はＳＲＣ３）と複合体を形成する。典型的には、コアクチベーターは受容体がエストロゲンに結合するとＥＲに結合するが、コリプレッサーはＥＲがタモキシフェンに結合する場合に結合する。ＡＩＢ１は乳癌の６５％において過剰発現し、対応する遺伝子は５％において増幅される。高レベルのＡＩＢ１は、エストロゲンアゴニスト活性を高める（例えば、アロマターゼ阻害剤を用いて治療する）ことによってＳＥＲＭ耐性に寄与することができる。ＥＲ二量体はまた、ＮＣＯＲなどのコリプレッサータンパク質と複合体を形成して、所定の遺伝子（例えば、ＨＯＸＢ１３）の遺伝子発現をダウンレギュレートする。
【０２３３】
成長因子シグナル伝達ネットワーク内の数種のキナーゼは、リガンド非依存性活性化と呼ばれるプロセスにおいてＥＲを活性化することもできる。高いＥｒｂＢファミリー活性（例えば、高いＨＥＲ２又はＨＥＲ１活性）などの所定の条件下で、ＥＲはＡＩＢ１とのタモキシフェン複合体に結合し、タモキシフェンのエストロゲンアゴニスト活性を増加させた（例えば、キナーゼ阻害剤と一緒にフルベストラント又はアロマターゼ阻害剤を用いて治療）。
【０２３４】
この非核ＥＲ作用又は膜開始ステロイドシグナル伝達（ＭＩＳＳ）は、エストロゲンの添加後数分間以内に生ずる。タモキシフェンなどのＳＥＲＭは、膜ＥＲを活性化することもできる。これらの受容体は、骨細胞、神経細胞、子宮細胞、脂肪細胞、及び内皮細胞中で見出されている。エストロゲンが膜ＥＲ機能を活性化するメカニズムは、解明され始めている。インスリン様成長因子１受容体、ＰＩ３Ｋのｐ８５調節サブユニット、Ｓｒｃ、及び様々な成長因子チロシンキナーゼ受容体へＥＲを直接的に結合させることのできるタンパク質であるＳｈｃなどの様々な膜シグナル伝達分子とＥＲとの間の直接的な相互作用が観察されてきた。エストロゲンによるこれらの経路の活性化は、ＡＫＴ及びＭＡＰＫの活性化を介して強力な細胞生存及び細胞増殖性シグナルを送り出す。さらに、これらのキナーゼは、ＥＲ及びその共調節因子をリン酸化して、核ＥＲシグナル伝達を強化することができる。これらのタンパク質のリン酸化は、タモキシフェン及び他のＳＥＲＭのエストロゲンアゴニスト様活性を増加させることもできる。
【０２３５】
純粋な抗エストロゲン剤であるフルベストラントは、同じ方法では膜ＥＲを活性化しない；しかしながら、タモキシフェンなどのＳＥＲＭは、エストロゲンと同様にして膜ＥＲを活性化する。ＥＲの膜作用は、その核活性と同様に、細胞、受容体サブタイプ、及びリガンドに特異的であることがあり、また、例えば、ＥｒｂＢ１又はＨＥＲ２を過剰発現する乳癌において、はるかにより顕著である成長因子シグナル伝達環境によって影響を受けることもある。タモキシフェン及び他のＳＥＲＭによるＥＲのＭＩＳＳ活性の刺激は、ＨＥＲ２過剰発現腫瘍において時々観察されるこれらの薬剤への耐性を部分的に説明することができる。
【０２３６】
核及び形質膜と関連するＥＲ機能（膜開始ステロイドシグナル伝達；ＭＩＳＳ）に加えて、ＥＲは、他の経路分子とコンジュゲートしてその後の腫瘍進行を促進する。この分子クロストークは、アロマターゼ阻害剤を用いると最良に治療できるが、ＳＥＲＭではできない。
【０２３７】
ＥＲは、少なくとも２つの主要機能を有する。ＥＲは、エストロゲン調節遺伝子の転写因子として及び核内の他の転写因子のコアクチベーターとして機能する。ＥＲはまた、細胞質内及び形質膜内で成長因子シグナル伝達を活性化するようにも機能する。一部の乳房腫瘍、特にＨＥＲ２増幅などの高活性の成長因子シグナル伝達経路を有する乳房腫瘍では、エストロゲンが成長因子シグナル伝達を活性化し、成長因子シグナル伝達経路がさらにＥＲを活性化するという悪循環が確立される。そのような腫瘍内のエストロゲンは、腫瘍進行において重要な複数の経路を活性化することによって支配的な因子となると予測されるであろう。この分子クロストークは、乳癌を治療するための重要な意味を有する。１つの例として、アロマターゼ阻害剤を用いたエストロゲン欠乏（estrogen-deprivation）療法は、ＥＲの核開始ステロイドシグナル伝達及びＭＩＳＳ活性の両方を停止させることによってＨＥＲ２増幅腫瘍においてＳＥＲＭより有効となるはずである。
【０２３８】
転移性疾患
乳房腫瘍の３分の２又はそれ以上は、増殖に関してエストロゲン依存性である。転移性乳癌の治療には、多数のエストロゲン遮断剤を使用することができる。しかしながら、これらの薬剤に対する治療応答は予測できず、エストロゲン又はプロゲステロンに対する受容体を有する転移性乳癌を有する患者の約３分の１は、ホルモン療法から利益を得られない。転移性乳癌を有する患者のほぼ全ては、ホルモン受容体が未だ存在するという事実にもかかわらず、最終的にはホルモン療法に対して耐性になる。
【０２３９】
療法の選択は、シグナル伝達経路の活性化又は腫瘍生物学のより良い理解に基づいて決定される。特定の実施形態において、本発明は、有利なことに、診断的／予後診断的チップと共にアッセイ方法を提供して、腫瘍医が個別の患者に対して最良の治療を決定するのを支援する。
【０２４０】
Ｖ．抗体アッセイの構築
所定の側面において、乳癌細胞などの腫瘍細胞の細胞抽出物中のシグナル伝達分子（例えば、ＨＥＲ２シグナル伝達経路成分）１種又は２種以上（例えば、複数種）の発現レベル及び／又は活性化状態は、固体支持体上に拘束された希釈系列の捕捉抗体を含む抗体に基づくアレイを用いて検出される。これらのアレイは、典型的には、種々のアドレス可能な場所において固体支持体の表面に結合している或る範囲の捕捉抗体濃度の複数の異なる捕捉抗体を含む。
【０２４１】
１つの特定の実施形態において、本発明は、固体支持体上に拘束された複数の希釈系列の捕捉抗体を含む優れたダイナミックレンジを有するアドレス可能なアレイであって、それぞれの希釈系列における捕捉抗体がシグナル伝達経路の成分及び他の標的タンパク質に対応する分析物１種又は２種以上に特異的であるアレイを提供する。種々の側面において、この実施形態は、特定の腫瘍の特性を示すシグナル伝達経路、例えば、乳癌細胞において活性であるシグナル伝達経路（例えば、ＨＥＲ２経路）の成分を含むアレイを含む。このように、本発明は、癌を引き起こす潜在的な発現又は活性化の欠損を伴う目的の各シグナル伝達分子又は他のタンパク質が単一のアレイ又はチップ上に表現されることにおいて有利に実施することができる。或る側面において、特定の腫瘍細胞中で活性な所定のシグナル伝達経路の成分は、情報が細胞内のシグナル伝達経路を通してリレーされる順序に対応する直線的順序で配列される。このような配列の例は、本明細書に記載するが、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００９／１０８６３７号パンフレットの図５〜９にも示されている。特定の腫瘍細胞中で活性な所定のシグナル伝達経路の成分１種又は２種以上に特異的な捕捉抗体を、無作為にプリントして任意の表面に関連した人為的結果を最小にすることもできる。
【０２４２】
固体支持体は、タンパク質を固定化するのに適切な任意の基材を含むことができる。固体支持体の例として、ガラス（例えば、ガラススライド）、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜、繊維束、ゲル、金属、セラミックなどを挙げることができるがそれらに限定されない。ナイロン（Ｂｉｏｔｒａｎｓ（商品名）、ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社（カリフォルニア州コスタメサ）；Ｚｅｔａ−Ｐｒｏｂｅ（商標）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（カリフォルニア州ハーキュリーズ））、ニトロセルロース（Ｐｒｏｔｒａｎ（商標）、Ｗｈａｔｍａｎ社（ニュージャージー州フローラムパーク））、及びＰＶＤＦ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（商品名）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社（マサチューセッツ州ビルリカ））などの膜は、本発明のアレイにおける固体支持体として使用するのに適切である。好ましくは、捕捉抗体は、例えば、Ｗｈａｔｍａｎ社（ニュージャージー州フローラムパーク）から商業的に入手することができるＦＡＳＴ（商標）スライドなどのニトロセルロースポリマーでコーティングされたガラススライド上に拘束される。
【０２４３】
固体支持体の望ましい特定の側面には、大量の捕捉抗体と結合する能力及び最小の変性で捕捉抗体と結合する能力が含まれる。別の適切な側面は、固体支持体が、捕捉抗体を含有する抗体溶液が前記支持体に適用される場合に最小の「ウィッキング（wicking）」を示すことである。最小のウィッキングを有する固体支持体は、前記支持体に適用された捕捉抗体溶液の小アリコートが固定化された捕捉抗体の小さな規定スポットを生じさせることを可能にする。
【０２４４】
捕捉抗体は、典型的には、共有結合性又は非共有結合性相互作用（例えば、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、双極子間結合）を介して固体支持体上に直接的又は間接的に（例えば、捕捉タグを介して）拘束される。或る実施形態では、標準架橋方法及び条件を用いるホモ二官能性又はヘテロ二官能性架橋剤を用いて前記固体支持体へ捕捉抗体が共有結合される。適切な架橋剤は、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（イリノイ州ロックフォード）などの販売業者から商業的に入手することができる。
【０２４５】
本発明において使用するのに適切なアレイを生成するための方法として、タンパク質又は核酸アレイを構築するために用いられる任意の技術を挙げることができるがそれらに限定されない。或る実施形態では、捕捉抗体は、典型的にはスプリットピン、ブラントピン、又はインクジェットプリンティングを備えたロボットプリンターである、マイクロスポッターを用いてアレイ上にスポットされる。本明細書に記載した抗体アレイをプリントするのに適切なロボットシステムとして、ＣｈｉｐＭａｋｅｒ２スプリットピン（ＴｅｌｅＣｈｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社；カリフォルニア州サニーベール）を備えるＰｉｘＳｙｓ ５０００ロボット（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；カリフォルニア州アーヴィン）並びにＢｉｏＲｏｂｉｃｓ社（マサチューセッツ州ウォバーン）及びＰａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社（コネチカット州メリデン）から入手することができる他のロボットプリンターを挙げることができる。好ましくは、各捕捉抗体希釈液を少なくとも２、３、４、５、又は６回反復してアレイ上にスポットする。
【０２４６】
本発明において使用するのに適切なアレイを生成するための別の方法は、支持体上に規定容量の液体を引き出すのに有効な条件下で固体支持体上にキャピラリーディスペンサを接触させることによって、それぞれの選択されたアレイ位置に既知容量の捕捉抗体希釈液を分注する工程を含み、それぞれの選択されたアレイ位置において選択された捕捉抗体希釈液を用いてこのプロセスが繰り返されて完全なアレイを作成する。前記方法は、複数のこのようなアレイを形成する際に実施することができるが、ここで溶液堆積工程は複数の各固体支持体上の選択された位置にそれぞれ反復サイクルで適用される。このような方法の詳細な説明は、例えば、米国特許第５，８０７，５２２号明細書の中に見出すことができる。
【０２４７】
所定の場合には、紙にプリントするためのデバイスを用いて抗体アレイを生成することができる。例えば、デスクトップ型ジェットプリンターのプリントヘッド内に所望の捕捉抗体希釈液を充填して適切な固体支持体上にプリントすることができる（例えば、Silzel et al., Clin. Chem., 44:2036-2043 (1998)参照）。
【０２４８】
或る実施形態において、固体支持体上に生成されたアレイは、少なくとも約５スポット／ｃｍ２、及び好ましくは、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００又は９０００、又は１０，０００スポット／ｃｍ２の密度を有する。
【０２４９】
所定の場合に、固体支持体上のスポットは各々、異なる捕捉抗体を表す。所定の他の場合に、固体支持体上の複数のスポットは、例えば、一連の減少する捕捉抗体濃度を含む希釈系列として、同一の捕捉抗体を表す。
【０２５０】
固体支持体上に抗体アレイを調製及び構築するための方法の追加の例は、米国特許第６，１９７，５９９号明細書、第６，７７７，２３９号明細書、第６，７８０，５８２号明細書、第６，８９７，０７３号明細書、第７，１７９，６３８号明細書、及び第７，１９２，７２０号明細書；米国特許出願公開第２００６０１１５８１０号明細書、第２００６０２６３８３７号明細書、第２００６０２９２６８０号明細書、及び第２００７００５４３２６号明細書；並びにVarnum et al., Methods Mol. Biol., 264:161-172 (2004)に記載されている。
【０２５１】
抗体アレイを走査する方法は当分野において公知であり、そしてその方法として、限定的でなく、タンパク質又は核酸アレイを走査するために用いられる任意の技術を挙げることができる。本発明において使用するのに適切なマイクロアレイスキャナーは、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社（マサチューセッツ州ボストン）、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（カリフォルニア州パロアルト）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ社（ワシントン州イサクアー）、ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ社（マサチューセッツ州ビルリカ）、及びＡｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社（カリフォルニア州ユニオンシティ）から入手することができる。限定的でない例として、蛍光検出用のＧＳＩ ＳｃａｎＡｒｒａｙ３０００を、定量に対してＩｍａＧｅｎｅソフトウエアとともに使用することができる。
【０２５２】
ＶＩ．単一の検出アッセイ
一部の実施形態において、腫瘍細胞などの細胞の細胞抽出物中の目的の特定の分析物（例えば、ＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分などのシグナル伝達分子）の発現及び／又は活性化レベルを検出するためのアッセイは、優れたダイナミックレンジを有する多重で高スループットの２抗体アッセイである。限定的でない例として、前記アッセイにおいて使用される２つの抗体は：（１）分析物に特異的な捕捉抗体；及び（２）前記分析物の活性化形に特異的な検出抗体（すなわち、活性化状態依存性抗体）を含んでいることができる。活性化状態依存性抗体は、例えば、前記分析物のリン酸化、ユビキチン化、及び／又は複合体形成状態を検出することができる。代わりに、検出抗体は、細胞抽出物中の前記分析物の総量を検出する、活性化状態非依存性抗体を含む。
【０２５３】
１つの特定の実施形態において、目的の分析物の発現又は活性化レベルを検出するための２抗体アッセイは、以下の工程：
（ｉ）細胞抽出物を１つ又は複数の希釈系列の捕捉抗体とインキュベートして複数の捕捉された分析物を形成する工程；
（ｉｉ）前記複数の捕捉された分析物を対応する分析物に特異的な検出抗体とインキュベートして複数の検出可能な捕捉された分析物を形成する工程であって、前記検出抗体が前記分析物の活性化（例えば、リン酸化）レベルを検出するための活性化状態依存性抗体又は前記分析物の発現レベル（例えば、総量）を検出するための活性化状態非依存性抗体を含む工程；
（ｉｉｉ）前記複数の検出可能な捕捉された分析物をシグナル増幅対の第１及び第２のメンバーとインキュベートして増幅シグナルを生成する工程；及び
（ｉｖ）前記シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程；を含む。
【０２５４】
本明細書に記載した２抗体アッセイは、典型的には、種々のアドレス可能な位置において固体支持体の表面に結合している或る範囲の捕捉抗体濃度の複数の種々の捕捉抗体を含む、抗体に基づくアレイである。本発明において使用するのに適切な固体支持体の例は、前記に記載されている。
【０２５５】
捕捉抗体及び検出抗体を、好ましくは、分析物結合に関するそれらの間の競合を最小化するように選択する（すなわち、捕捉抗体及び検出抗体の両方は、それらの対応するシグナル伝達分子に同時に結合することができる）。
【０２５６】
１つの実施形態において、検出抗体は結合対の第１のメンバー（例えば、ビオチン）を含み、シグナル増幅対の第１のメンバーは前記結合対の第２メンバー（例えば、ストレプトアビジン）を含む。結合対メンバーを、当分野において周知の方法を用いて、検出抗体に又はシグナル増幅対の第１のメンバーに直接的又は間接的に結合させることができる。所定の場合に、シグナル増幅対の第１メンバーはペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、カタラーゼ、クロロペルオキシダーゼ、チトクロームｃペルオキシダーゼ、好酸球ペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、甲状腺ペルオキシダーゼ、脱ヨード酵素など）であり、シグナル増幅対の第２メンバーはチラミド試薬（例えば、ビオチン−チラミド）である。これらの場合に、増幅シグナルは、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の存在下において活性化チラミドを生成する、チラミド試薬のペルオキシダーゼ酸化によって生成される。
【０２５７】
活性化チラミドは、直接的に検出されるか、又は、例えば、ストレプトアビジン標識化フルオロフォア又はストレプトアビジン標識化ペルオキシダーゼと発色試薬との組み合わせなどのシグナル検出性試薬の添加により検出される。本発明において使用するのに適切なフルオロフォアの例として、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）ダイ（例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）５５５）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（商品名）；ローダミン、テキサスレッド、テトラローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ＣｙＤｙｅ（商品名）フルオル（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５）などを挙げることができるがそれらに限定されない。ストレプトアビジン標識を、当分野において周知の方法を用いてフルオロフォア又はペルオキシダーゼに直接的又は間接的に結合させることができる。本発明において使用するのに適切な発色試薬の限定的でない例として、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、４−クロロ−１−ナフトール（４ＣＮ）、及び／又はポルフィリノーゲンを挙げることができる。
【０２５８】
本明細書に記載した２抗体アッセイを実施するための典型的なプロトコールは、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００９／１０８６３７号パンフレットの実施例３に与えられている。
【０２５９】
２抗体アプローチの別の実施形態において、本発明は、切断受容体の発現又は活性化レベルを検出する方法であって、以下の工程：
（ｉ）細胞抽出物を、全長受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズとインキュベートする工程；
（ｉｉ）前記細胞抽出物から前記複数のビーズを除去し、それによって前記全長受容体を除去して該全長受容体を含まない細胞抽出物を形成する工程；
（ｉｉｉ）前記全長受容体を含まない前記細胞抽出物を、該全長受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域に特異的な希釈系列の１つ又は複数の捕捉抗体とインキュベートして、複数の捕捉された切断受容体を形成する工程；
（ｉｖ）前記複数の捕捉された切断受容体を、前記全長受容体のＩＣＤ結合領域に特異的な検出抗体とインキュベートして、複数の検出可能な捕捉された切断受容体を形成する工程であって、前記検出抗体が前記切断受容体の活性化（例えば、リン酸化）レベルを検出するための活性化状態依存性抗体又は前記切断受容体の発現レベル（例えば、総量）を検出するための活性化状態非依存性抗体を含む工程；
（ｖ）前記複数の検出可能な捕捉された切断受容体を、シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーとインキュベートして、増幅シグナルを生成する工程；及び
（ｖｉ）前記シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された増幅シグナルを検出する工程、を含む方法を提供する。
【０２６０】
所定の実施形態において、切断受容体はｐ９５ＨＥＲ２であり、全長受容体はＨＥＲ２である。所定の他の実施形態において、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズはストレプトアビジン−ビオチン対を含み、ここでビオチンは前記ビーズに結合しており、そしてビオチンは抗体に結合している（例えば、前記抗体は前記全長受容体のＥＣＤ結合領域に特異的である）。
【０２６１】
あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００９／１０８６３７号パンフレットの図１４Ａは、目的の受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に向けられた抗体でコーティングされたビーズが全長受容体（例えば、ＨＥＲ２）に結合するが、切断受容体（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２）には結合しないので、アッセイからあらゆる全長受容体が除去されることを示している。国際公開第２００９／１０８６３７号パンフレットの図１４Ｂは、切断受容体（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２）がいったん捕捉抗体に結合すれば、全長受容体（例えば、ＨＥＲ２）の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）に特異的な検出抗体によって検出できることを示している。検出抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に直接的にコンジュゲートさせることができる。次いで、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）を実施して、検出すべきシグナルを生成することができる。切断受容体（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２）の発現レベル又は活性化状態を調査して、例えば、その総濃度又はそのリン酸化状態、ユビキチン化状態、及び／又は複合体形成状態を決定することができる。
【０２６２】
別の実施形態において、本発明は、前記の２抗体アッセイを実施するためのキットであって、以下：（ａ）固体支持体上に拘束された希釈系列の１つ又は複数の捕捉抗体；及び（ｂ）１つ又は複数の検出抗体（例えば、活性化状態非依存性抗体及び／又は活性化状態依存性抗体）を含むキットを提供する。或る場合には、前記キットは、腫瘍細胞などの細胞の１つ又は複数のシグナル伝達分子の発現レベル及び／又は活性化状態を検出するキットの使用方法の説明書をさらに含んでいることができる。前記キットはまた、本発明の固有の方法を実施することに関して前記の追加の試薬のいずれか、例えば、シグナル増幅対の第１及び第２のメンバー、チラミドシグナル増幅試薬、洗浄バッファなども含んでいることができる。
【０２６３】
ＶＩＩ．近接二重検出アッセイ
或る実施形態において、腫瘍細胞などの細胞の細胞抽出物中の目的の特定の分析物（例えば、ＨＥＲ２シグナル伝達経路の成分などのシグナル伝達分子）の発現及び／又は活性化レベルを検出するためのアッセイは、優れたダイナミックレンジを有する多重で高スループットの近接（すなわち、３抗体）アッセイである。限定的でない例として、前記近接アッセイにおいて使用される３つの抗体は：（１）分析物に特異的な捕捉抗体；（２）分析物の活性化形に特異的な検出抗体（すなわち、活性化状態依存性抗体）；及び（３）分析物の総量を検出する検出抗体（すなわち、活性化状態非依存性抗体）を含むことができる。活性化状態依存性抗体は、例えば、分析物のリン酸化、ユビキチン化、及び／又は複合体形成状態を検出することができる。活性化状態非依存性抗体は、分析物の総量を検出することができる。
【０２６４】
１つの特定の実施形態において、目的の分析物の活性化レベル又は状態を検出するための近接アッセイは、以下の工程：
（ｉ）細胞抽出物を１つ又は複数の希釈系列の捕捉抗体とインキュベートして複数の捕捉された分析物を形成する工程；
（ｉｉ）前記複数の捕捉された分析物を、対応する分析物に特異的な１つ又は複数の活性化状態非依存性抗体及び１つ又は複数の活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートして、複数の検出可能な捕捉された分析物を形成する工程であって、前記活性化状態非依存性抗体が促進成分を用いて標識化されており、前記活性化状態依存性抗体がシグナル増幅対の第１のメンバーを用いて標識化されており、そして前記促進成分が前記シグナル増幅対の第１のメンバーへチャネリングして該メンバーと反応する酸化剤を生成する工程；
（ｉｉｉ）前記複数の検出可能な捕捉された分析物を前記シグナル増幅対の第２メンバーとインキュベートして増幅シグナルを生成する工程；及び
（ｉｖ）前記シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程；を含む。
【０２６５】
別の特定の実施形態において、切断受容体である目的の分析物の活性化レベル又は状態を検出するための近接アッセイは、以下の工程：
（ｉ）細胞抽出物を、全長受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズとインキュベートする工程；
（ｉｉ）前記細胞抽出物から前記複数のビーズを除去し、それによって前記全長受容体を除去して該全長受容体を含まない細胞抽出物を形成する工程；
（ｉｉｉ）前記全長受容体を含まない前記細胞抽出物を、前記全長受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域に特異的な１つ又は複数の捕捉抗体とインキュベートして、複数の捕捉された切断受容体を形成する工程；
（ｉｖ）前記複数の捕捉された切断受容体を、前記全長受容体のＩＣＤ結合領域に特異的な１つ又は複数の活性化状態非依存性抗体及び１つ又は複数の活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートして、複数の検出可能な捕捉された切断受容体を形成する工程であって、
前記活性化状態非依存性抗体が促進成分を用いて標識化されており、前記活性化状態依存性抗体がシグナル増幅対の第１のメンバーを用いて標識化されており、そして前記促進成分がシグナル増幅対の第１のメンバーへチャネリングして該メンバーと反応する酸化剤を生成する工程；
（ｖ）前記複数の検出可能な捕捉された切断受容体を、シグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして、増幅シグナルを生成する工程；及び
（ｖｉ）前記シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された増幅シグナルを検出する工程；を含む。
【０２６６】
所定の実施形態において、前記切断受容体はｐ９５ＨＥＲ２であり、そして全長受容体はＨＥＲ２である。所定の他の実施形態において、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズはストレプトアビジン−ビオチン対を含み、ここでビオチンはビーズに結合しており、そしてビオチンは抗体に結合している（例えば、ここで抗体は全長受容体のＥＣＤ結合領域に特異的である）。
【０２６７】
代わりの実施形態において、活性化状態依存性抗体は促進成分を用いて標識化することができ、そして活性化状態非依存性抗体はシグナル増幅対の第１のメンバーを用いて標識化することができる。
【０２６８】
別の限定的でない例として、近接アッセイに用いられる３つの抗体は、以下：（１）分析物に特異的な捕捉抗体；（２）分析物の総量を検出する特異的な第１の検出抗体（すなわち、第１の活性化状態非依存性抗体）；及び（３）分析物の総量を検出する第２の検出抗体（すなわち、第２の活性化状態非依存性抗体）、を含んでいることができる。好ましい実施形態では、第１及び第２の活性化状態非依存性抗体は、分析物上の異なる（例えば、他と全く別な）エピトープを認識する。
【０２６９】
１つの特定の実施形態において、目的の分析物の発現レベルを検出するための近接アッセイは、以下の工程：
（ｉ）細胞抽出物を１つ又は複数の希釈系列の捕捉抗体とインキュベートして、複数の捕捉された分析物を形成する工程；
（ｉｉ）前記複数の捕捉された分析物を、対応する分析物に特異的な１つ又は複数の第１及び第２の活性化状態非依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートして、複数の検出可能な捕捉された分析物を形成する工程であって、
前記第１の活性化状態非依存性抗体が促進成分を用いて標識化されており、前記第２の活性化状態非依存性抗体がシグナル増幅対の第１のメンバーを用いて標識化されており、そして前記促進成分が前記シグナル増幅対の第１のメンバーへチャネリングして該メンバーと反応する酸化剤を生成する工程；
（ｉｉｉ）前記複数の検出可能な捕捉された分析物を前記シグナル増幅対の第２メンバーとインキュベートして増幅シグナルを生成する工程；及び
（ｉｖ）前記シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程；を含む。
【０２７０】
別の特定の実施形態において、切断受容体である目的の分析物の発現レベルを検出するための近接アッセイは、以下の工程：
（ｉ）細胞抽出物を、全長受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズとインキュベートする工程；
（ｉｉ）前記細胞抽出物から前記複数のビーズを除去し、それによって前記全長受容体を除去して該全長受容体を含まない細胞抽出物を形成する工程；
（ｉｉｉ）前記全長受容体を含まない前記細胞抽出物を、該全長受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域に特異的な１つ又は複数の捕捉抗体とインキュベートして、複数の捕捉された切断受容体を形成する工程；
（ｉｖ）前記複数の捕捉された切断受容体を、前記全長受容体のＩＣＤ結合領域に特異的な１つ又は複数の第１及び第２の活性化状態非依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートして、複数の検出可能な捕捉された切断受容体を形成する工程であって、
前記第１の活性化状態非依存性抗体が促進成分を用いて標識化されており、前記第２の活性化状態非依存性抗体がシグナル増幅対の第１のメンバーを用いて標識化されており、そして前記促進成分がシグナル増幅対の第１のメンバーへチャネリングして該メンバーと反応する酸化剤を生成する工程；
（ｖ）前記複数の検出可能な捕捉された切断受容体をシグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして増幅シグナルを生成する工程；及び
（ｖｉ）前記シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された増幅シグナルを検出する工程、を含む。
【０２７１】
所定の実施形態において、前記切断受容体はｐ９５ＨＥＲ２であり、そして全長受容体はＨＥＲ２である。所定の他の実施形態において、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズはストレプトアビジン−ビオチン対を含み、ここでビオチンは前記ビーズに結合しており、そしてビオチンは抗体に結合している（例えば、前記抗体は前記全長受容体のＥＣＤ結合領域に特異的である）。
【０２７２】
代わりの実施形態において、前記第１の活性化状態非依存性抗体はシグナル増幅対の第１のメンバーを用いて標識化することができ、そして前記第２の活性化状態非依存性抗体は促進成分を用いて標識化することができる。
【０２７３】
本明細書に記載した近接アッセイは、典型的には、種々のアドレス可能な位置において固体支持体の表面に結合している或る範囲の捕捉抗体濃度の１つ又は複数の種々の捕捉抗体を含む、抗体に基づくアッセイである。本発明において使用するのに適切な固体支持体の例は、前記に記載されている。
【０２７４】
捕捉抗体、活性状態非依存性抗体、及び活性化状態依存性抗体を、好ましくは、分析物結合に関するそれらの間の競合を最小化するように選択する（すなわち、全ての抗体は、それらの対応するシグナル伝達分子に同時に結合することができる）。
【０２７５】
或る実施形態において、分析物１種又は２種以上の活性化レベルを検出するための活性化状態非依存性抗体、又は、代わりに、分析物１種又は２種以上の発現レベルを検出するための第１の活性化状態非依存性抗体は、検出可能な成分をさらに含む。このような場合に、前記検出可能な成分の量は、細胞抽出物中の分析物１種又は２種以上の量と相関的である。検出可能な成分の例として、蛍光標識、化学的に反応性の標識、酵素標識、放射活性標識などを挙げることができるがそれらに限定されない。好ましくは、検出可能な成分は、フルオロフォア、例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）ダイ（例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（商品名）；ローダミン、テキサスレッド、テトラローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ＣｙＤｙｅ（商品名）フルオル（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５）である。検出可能な成分は、当分野において周知の方法を用いて活性化状態非依存性抗体に直接的又は間接的に結合させることができる。
【０２７６】
所定の場合に、分析物１種又は２種以上の活性化レベルを検出するための活性化状態非依存性抗体、又は、代わりに、分析物１種又は２種以上の発現レベルを検出するための第１の活性化状態非依存性抗体を、促進成分を用いて直接的に標識化する。促進成分を、当分野において周知の方法を用いて活性化状態非依存性抗体に結合させることができる。本発明において使用するのに適した促進成分として、該促進成分に近接した（すなわち、空間的に近接する又は近い）別の分子へチャネリングして（すなわち、該分子へ方向付けられて）該分子と反応する（すなわち、結合する、それによって結合される、又は一緒に複合体を形成する）酸化剤を生成することができる任意の分子を挙げることができる。促進成分の例として、限定的でなく、グルコースオキシダーゼ又は電子受容体として分子酸素（Ｏ２）を含む酸化／還元反応を触媒する任意の他の酵素などの酵素、及びメチレンブルー、ローズベンガル、ポルフィリン、スクアレート染料、フタロシアニンなどの光増感剤を挙げることができる。酸化剤の限定的でない例として、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、一重項酸素、及び酸化／還元反応において酸素原子を移動させ又は電子を獲得する任意の他の化合物を挙げることができる。好ましくは、適切な基質（例えば、グルコース、光など）の存在下で、促進成分（例えば、グルコースオキシダーゼ、光増感剤など）は、２つの成分が相互に近接している場合に、シグナル増幅対の第１のメンバー（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、保護基によって保護されたハプテン、酵素阻害剤へのチオエーテル結合によって不活性化された酵素など）へチャネリングして該第１のメンバーと反応する酸化剤（例えば、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、一重項酸素など）を生成する。
【０２７７】
所定の他の場合に、分析物１種又は２種以上の活性化レベルを検出するための活性化状態非依存性抗体、又は、代わりに、分析物１種又は２種以上の発現レベルを検出するための第１の活性化状態非依存性抗体を、活性化状態非依存性抗体にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドリンカーと促進成分にコンジュゲートされた相補的オリゴヌクレオチドリンカーとの間のハイブリダイゼーションを介して促進成分を用いて間接的に標識化する。オリゴヌクレオチドリンカーを、当分野において周知の方法を用いて促進成分又は活性化状態非依存性抗体に結合することができる。或る実施形態において、促進成分にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドリンカーは、活性化状態非依存性抗体にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドリンカーに対して１００％の相補性を有する。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドリンカー対は、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションする際に、少なくとも１、２、３、４、５、６以上のミスマッチ領域を含む。当業者であれば、異なる分析物に特異的な活性化状態非依存性抗体を、同一のオリゴヌクレオチドリンカー又は異なるオリゴヌクレオチドリンカーのいずれかにコンジュゲートさせることができることを理解されよう。
【０２７８】
促進成分又は活性化状態非依存性抗体にコンジュゲートするオリゴヌクレオチドリンカーの長さは、様々であることができる。一般に、リンカー配列は、長さが少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、又は１００ヌクレオチドであることができる。典型的には、結合のためのランダム核酸配列が生成される。限定的でない例として、オリゴヌクレオチドリンカーのライブラリーは、３つの別個の隣接するドメイン：スペーサードメイン；シグニチャードメイン；及びコンジュゲーションドメインを有するように設計することができる。好ましくは、オリゴヌクレオチドリンカーは、それらがコンジュゲートされる促進成分又は活性化状態非依存性抗体の機能を破壊することなく効率的に結合するように設計される。
【０２７９】
オリゴヌクレオチドリンカー配列は、様々なアッセイ条件下で任意の二次構造形成を防止し又は最小にするように設計することができる。典型的には、リンカー内の各セグメントについて融解温度を注意深く監視して、全アッセイ手順においてそれらが関与できるようにする。一般には、リンカー配列のセグメントの融解温度の範囲は、１〜１０℃である。規定されたイオン濃度下で融解温度、二次構造、及びヘアピン構造を決定するためのコンピュータアルゴリズム（例えば、ＯＬＩＧＯ ６．０）を用いて、各リンカー内の３つの異なるドメインそれぞれを分析することができる。その全結合配列を、それらの構造的特徴付け及び他のコンジュゲートされるオリゴヌクレオチドリンカー配列に対するそれらの相補性についても、例えば、それらがストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で相補的なオリゴヌクレオチドリンカーにハイブリダイズするか否かについても分析することができる。
【０２８０】
オリゴヌクレオチドリンカーのスペーサー領域は、オリゴヌクレオチド架橋部位からのコンジュゲートドメインの適切な分離を与える。コンジュゲートドメインは、相補的オリゴヌクレオチドリンカー配列で標識化された分子を核酸ハイブリダイゼーションによってコンジュゲーションドメインへ結合させるように機能する。核酸媒介ハイブリダイゼーションは、抗体−分析物（すなわち、抗原）複合体形成の前後のいずれかで実施することができるので、より柔軟性のあるアッセイフォーマットを提供することができる。多数の直接的抗体コンジュゲーション方法と異なり、抗体又は他の分子への比較的に小さなオリゴヌクレオチドの結合は、標的分析物に対する抗体の特異的親和性又はコンジュゲートされた分子の機能に与える影響を最小にする。
【０２８１】
或る実施形態において、オリゴヌクレオチドリンカーのシグニチャー配列ドメインは、複合多重化タンパク質アッセイに用いることができる。異なるシグニチャー配列を有するオリゴヌクレオチドリンカーと複数の抗体とをコンジュゲートさせることができる。多重イムノアッセイにおいて、適切なプローブで標識化されたレポーターオリゴヌクレオチド配列を用いて、多重アッセイフォーマットにおける抗体とそれらの抗原との間の交差反応性を検出することができる。
【０２８２】
オリゴヌクレオチドリンカーを、幾つかの異なる方法を用いて抗体又は他の分子にコンジュゲートすることができる。例えば、５’又は３’末端上のチオール基を用いてオリゴヌクレオチドリンカーを合成することができる。還元剤（例えば、ＴＣＥＰ−ＨＣｌ）を用いてチオール基を脱保護することができ、生じたリンカーを脱塩スピンカラムを用いることによって精製することができる。得られた脱保護オリゴヌクレオチドリンカーを、ＳＭＣＣなどのヘテロ二官能性架橋剤を用いて抗体又は他のタイプのタンパク質の第一アミンにコンジュゲートすることができる。代わりに、水溶性カルボジイミドＥＤＣを用いてオリゴヌクレオチド上の５’−リン酸基を処理してリン酸エステルを形成しそして引き続いてアミン含有分子に結合することができる。所定の場合に、３’−リボース残基上のジオールをアルデヒド基へ酸化し、次いで還元的アミノ化を用いて抗体又は他のタイプのタンパク質のアミン基にコンジュゲートすることができる。所定の他の場合に、オリゴヌクレオチドリンカーを、３’又は５’末端上でのビオチン修飾により合成し、ストレプトアビジン標識化分子へコンジュゲートすることができる。
【０２８３】
オリゴヌクレオチドリンカーは、当分野において公知である様々な技術のいずれか、例えば、Usman et al., J. Am. Chem. Soc., 109:7845 (1987)；Scaringe et al., Nucl. Acids Res., 18:5433 (1990)；Wincott et al., Nucl. Acids Res., 23:2677-2684 (1995)；及びWincott et al., Methods Mol. Bio., 74:59 (1997)に記載されている技術を用いて合成することができる。一般に、オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、５’末端におけるジメトキシトリチル及び３’末端におけるホスホルアミジットなどの共通の核酸保護基及び結合基を利用する。オリゴヌクレオチド合成に適切な試薬、核酸脱保護の方法、及び核酸精製の方法は、当業者には公知である。
【０２８４】
所定の場合に、分析物１種又は２種以上の活性化レベルを検出するための活性化状態依存性抗体又は、代わりに、分析物１種又は２種以上の発現レベルを検出するための第２の活性化状態非依存性抗体を、シグナル増幅対の第１のメンバーを用いて直接的に標識化する。当分野において周知の方法を用いて、活性化レベルを検出するために活性化状態依存性抗体に又は発現レベルを検出するために第２の活性化状態非依存性抗体にシグナル増幅対のメンバーを結合させることができる。所定の他の場合に、活性化状態依存性抗体又は第２の活性化状態非依存性抗体にコンジュゲートされた結合対の第１のメンバーとシグナル増幅対の第１のメンバーにコンジュゲートされた結合対の第２のメンバーとの間の結合を介してシグナル増幅対の第１のメンバーを用いて活性化状態依存性抗体又は第２の活性化状態非依存性抗体を直接的に標識化する。当分野において周知の方法を用いてシグナル増幅対のメンバー又は活性化状態依存性抗体若しくは第２の活性化状態非依存性抗体に結合対メンバー（例えば、ビオチン／ストレプトアビジン）を結合することができる。シグナル増幅対のメンバーの例として、ペルオキシダーゼ、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、カタラーゼ、クロロペルオキシダーゼ、チトクロームｃペルオキシダーゼ、好酸球ペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、甲状腺ペルオキシダーゼ、脱ヨード酵素などを挙げることができるがそれらに限定されない。シグナル増幅対のメンバーの他の例として、保護基によって保護されたハプテン及び酵素阻害剤へのチオエーテル結合によって不活性化された酵素を挙げることができる。
【０２８５】
近接チャネリングの１つの例において、促進成分はグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）であり、シグナル増幅対の第１のメンバーは西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。ＧＯをグルコースなどの基質と接触させると、ＧＯは酸化剤（すなわち、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２））を生成する。ＨＲＰがＧＯに対してチャネリング近接内にあると、ＧＯによって生成されたＨ２Ｏ２は、ＨＲＰへチャネリングしＨＲＰと複合体化してＨＲＰ−Ｈ２Ｏ２複合体を形成し、該複合体はシグナル増幅対の第２のメンバー（例えば、ルミノール若しくはイソルミノールなどの化学発光基質又はチラミド（例えば、ビオチン−チラミド）、ホモバニリン酸、若しくは４−ヒドロキシフェニル酢酸などの蛍光発生性基質）の存在下で増幅シグナルを生成する。近接アッセイにおいてＧＯ及びＨＲＰを使用する方法は、例えば、Langry et al., U.S. Dept. of Energy Report No. UCRL-ID-136797 (1999)に記載されている。ビオチン−チラミドをシグナル増幅対の第２メンバーとして用いる場合、ＨＲＰ−Ｈ２Ｏ２複合体はチラミドを酸化して、近くの求核性残基に共有的に結合する反応性チラミド基を生成する。活性化されたチラミドは、直接的に検出されるか、又は、例えば、ストレプトアビジン標識化フルオロフォア若しくはストレプトアビジン標識化ペルオキシダーゼと発色試薬との組み合わせなどのシグナル検出性試薬の添加により検出される。本発明において用いるのに適切なフルオロフォアの例として、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）ダイ（例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）５５５）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（商品名）；ローダミン、テキサスレッド、テトラローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ＣｙＤｙｅ（商品名）フルオル（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５）などを挙げることができるがそれらに限定されない。当分野において周知の方法を用いてフルオロフォア又はペルオキシダーゼに直接的又は間接的にストレプトアビジン標識を結合することができる。本発明において用いるのに適切な発色試薬の限定的でない例として、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、４−クロロ−１−ナフトール（４ＣＮ）、及び／又はポルフィリノーゲンを挙げることができる。
【０２８６】
近接チャネリングの別の例において、促進成分は光増感剤であり、シグナル増幅対の第１のメンバーは特異的結合パートナー（例えば、リガンド、抗体など）へのハプテンの結合を防止する保護基を用いて保護されている複数のハプテンを用いて標識化された大分子である。例えば、シグナル増幅対のメンバーは、保護されたビオチン、クマリン、及び／又はフルオレセイン分子で標識化されたデキストラン分子であることができる。適切な保護基として、フェノキシ−、アナリノ−、オレフィン−、チオエーテル−、及びセレノエーテル−保護基が含まれるがそれらに限定されない。本発明の近接アッセイにおいて使用するのに適切な追加の光増感剤及び保護されたハプテン分子は、米国特許第５，８０７，６７５号明細書に記載されている。光増感剤は光で励起されると、酸化剤（すなわち、一重項酸素）を生成する。ハプテン分子が光増感剤に対してチャネリング近接内に存在する場合は、光増感剤によって生成された一重項酸素は、ハプテンの保護基上のチオエーテルへチャネリングし、そして該チオエーテルと反応してカルボニル基（ケトン又はアルデヒド）及びスルフィン酸を生じて、ハプテンから保護基を遊離させる。次いで、この保護されていないハプテンは、前記シグナル増幅対の第２のメンバー（例えば、検出可能なシグナルを生成することができる特異的結合パートナー）へ特異的に結合するのに利用することができる。例えば、ハプテンがビオチンである場合は、特異的結合パートナーは酵素標識化されたストレプトアビジンであることができる。典型的な酵素として、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＨＲＰなどを挙げることができる。洗浄して未結合の試薬を除去した後、酵素の検出可能な（例えば、蛍光、化学発光、発色性などの）基質を添加することによって検出可能なシグナルを生成し、そして当分野において公知の適切な方法及び計測手段を用いてこれを検出することができる。代わりに、チラミドシグナル増幅を用いて検出可能なシグナルを増幅し、そして活性化されたチラミドを直接的に検出し又は前記のようにシグナル検出性試薬の添加により検出することができる。
【０２８７】
近接チャネリングの更に別の例において、促進成分は光増感剤であり、そしてシグナル増幅対の第１のメンバーは酵素−阻害剤複合体である。酵素及び阻害剤（例えば、ホスホン酸で標識化されたデキストラン）を、開裂可能なリンカー（例えば、チオエーテル）によって一緒に結合する。光増感剤は光で励起されると、酸化剤（すなわち、一重項酸素）を生成する。酵素−阻害剤複合体が光増感剤に対してチャネリング近接内に存在する場合、前記光増感剤によって生成された一重項酸素は、開裂可能なリンカーへチャネリングされて該リンカーと反応し、酵素から阻害剤を遊離させ、それにより酵素を活性化する。酵素基質を添加して検出可能なシグナルを生成するか、又は代わりに、増幅試薬を添加して増幅シグナルを生成する。
【０２８８】
近接チャネリングの更なる例において、促進成分はＨＲＰであり、シグナル増幅対の第１のメンバーは前記のように保護されたハプテン又は酵素−阻害剤複合体であり、そして保護基はｐ−アルコキシフェノールを含む。フェニレンジアミン及びＨ２Ｏ２の添加は、保護されたハプテン又は酵素−阻害剤複合体にチャネリングしｐ−アルコキシフェノール保護基と反応して露出されたハプテン又は反応性酵素を生ずる、反応性フェニレンジイミンを生成する。増幅シグナルは、前記のように生成及び検出される（例えば、米国特許第５，５３２，１３８号明細書及び第５，４４５，９４４号明細書参照）。
【０２８９】
本明細書に記載した近接アッセイを実施するための典型的なプロトコールは、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００９／１０８６３７号パンフレットの実施例４に提供されている。
【０２９０】
別の実施形態において、本発明は、前記の近接アッセイを実施するためのキットであって、以下：（ａ）固体支持体上に拘束された希釈系列の１つ又は複数の捕捉抗体；及び（ｂ）１つ又は複数の検出抗体（例えば、活性化レベルを検出するための活性化状態非依存性抗体及び活性化状態依存性抗体の組み合わせ及び／又は発現レベルを検出するための第１及び第２の活性化状態非依存性抗体の組み合わせ）を含むキットを提供する。或る場合に、本発明のキットは、腫瘍細胞などの細胞の１つ又は複数のシグナル伝達分子の発現及び／又は活性化状態を検出するためのキットの使用方法についての説明書をさらに含んでいることができる。本発明のキットは、例えば、シグナル増幅対の第１及び第２のメンバー、チラミドシグナル増幅試薬、促進成分の基質、洗浄バッファなどの、本発明の特定の方法を実施することに関連して前記の追加の試薬のいずれかをさらに含んでいることもできる。
【０２９１】
ＶＩＩＩ．抗体の製造
本発明による腫瘍細胞などの細胞中のシグナル伝達分子（例えば、ＨＥＲ２シグナル伝達経路成分）の発現及び／又は活性化レベルを分析するための未だ商業的に入手することができない抗体の生成及び選択は、幾つかの方法によって達成することができる。例えば、１つの方法は、当分野において公知のタンパク質発現及び精製方法を用いて目的のポリペプチド（すなわち、抗原）を発現及び／又は精製する方法であり、一方、別の方法は当分野において公知の固相ペプチド合成法を用いて目的のポリペプチドを合成する方法である。例えば、Guide to Protein Purification, Murray P. Deutcher, ed., Meth. Enzymol., Vol. 182 (1990)；Solid Phase Peptide Synthesis, Greg B. Fields, ed., Meth. Enzymol., Vol. 289 (1997)；Kiso et al., Chem. Pharm. Bull., 38:1192-99 (1990)；Mostafavi et al., Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids, 1:255-60, (1995)；及びFujiwara et al., Chem. Pharm. Bull., 44:1326-31 (1996)を参照されたい。精製又は合成されたポリペプチドは、次に、例えば、マウス又はウサギに注射して、ポリクローナル又はモノクローナル抗体を生成することができる。当業者であれば、例えば、Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988)に記載されているように、抗体を製造するために多くの方法が利用できることを認識しているであろう。当業者であれば、抗体を模倣する（例えば、抗体の機能的結合領域を保持する）Ｆａｂ断片又は結合断片も様々な方法によって遺伝情報から調製できることも理解しているであろう。例えば、Antibody Engineering:  A Practical Approach, Borrebaeck, Ed., Oxford University Press, Oxford (1995)；及びHuse et al., J. Immunol., 149:3914-3920 (1992)を参照されたい。
【０２９２】
さらに、多くの刊行物は、選択された標的抗原に結合するためのポリペプチドのライブラリーを生成及びスクリーニングするファージディスプレイ技術の使用を報告している（例えば、Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378-6382 (1990)；Devlin et al., Science, 249:404-406 (1990)；Scott et al., Science, 249:386-388 (1990)；及びＬａｄｎｅｒら、米国特許第５，５７１，６９８号明細書参照）。ファージディスプレイ法の基本的概念は、ファージＤＮＡによってコードされたポリペプチドと標的抗原との間の物理的会合の確立である。この物理的会合は、ポリペプチドをコードするファージゲノムを取り囲むカプシドの一部としてポリペプチドをディスプレイする、ファージ粒子によって提供される。ポリペプチドとそれらの遺伝子材料との間の物理的会合の確立は、種々のポリペプチドを有する極めて多数のファージの同時マススクリーニングを可能にする。標的抗原に対して親和性を有するポリペプチドをディスプレイするファージは標的抗原に結合し、これらのファージは標的抗原に対する親和性スクリーニングによって濃縮される（enriched）。これらのファージからディスプレイされたポリペプチドの同一性を、それらの各ゲノムから決定することができる。これらの方法を使用すると、所望の標的抗原に対する結合親和性を有すると同定されたポリペプチドを、常用手段によって大量に合成することができる（例えば、米国特許第６，０５７，０９８号明細書参照）。
【０２９３】
次いで、これらの方法によって生成される抗体を、目的の精製ポリペプチド抗原との親和性及び特異性に対する最初のスクリーニングによって、及び必要に応じて、その結果を、結合から排除されることが望ましい他のポリペプチド抗原を有する抗体の親和性及び特異性と比較することによって選択することができる。スクリーニング法は、マイクロタイタープレートの個々のウェル内での精製ポリペプチド抗原の固定化を含んでいることができる。次いで、潜在的な抗体又は抗体群を含有する溶液を、各マイクロタイターウェル内に配置し、約３０分間〜２時間にわたりインキュベートする。次いで、このマイクロタイターウェルを洗浄し、標識化された二次抗体（例えば、産生された抗体がマウス抗体であればアルカリホスファターゼにコンジュゲートされた抗マウス抗体）をウエルに添加し、約３０分間にわたりインキュベートした後に洗浄する。基質をウェルに添加すると、固定化されたポリペプチド抗原に対する抗体が存在する場合は、呈色反応が現れるであろう。
【０２９４】
次いで、このように同定された抗体を、親和性及び特異性についてさらに分析することができる。標的タンパク質に対するイムノアッセイの開発において、精製された標的タンパク質は、選択された抗体を用いてイムノアッセイの感受性及び特異性を判断するための標準として機能する。様々な抗体の結合親和性は相異することがあり、例えば、所定の抗体の組み合わせが相互に立体的に干渉することがあるので、抗体のアッセイ性能は、その抗体の絶対的な親和性及び特異性より重要な尺度となることがある。
【０２９５】
当業者であれば、抗体又は結合断片を生成し並びに目的の様々なポリペプチドに対する親和性及び特異性についてスクリーニング及び選択する際に多くのアプローチを採用することができるが、これらのアプローチが本発明の範囲を変化させるものではないことを理解されよう。
【０２９６】
Ａ．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、目的のポリペプチド及びアジュバントの複数回の皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射によって動物において産生される。二官能性剤又は誘導体化剤を用いて、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシ・チログロブリン、又はダイズトリプシン阻害剤などの、免疫されるべき種において免疫原性であるタンパク質担体へ、目的のポリペプチドをコンジュゲートするのが有用であることがある。二官能性剤又は誘導体化剤の限定的でない例として、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介するコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介するコンジュゲーション）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、及びＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ及びＲ１は異なるアルキル基である）を挙げることができる。
【０２９７】
例えば、１００μｇ（ウサギに対して）又は５μｇ（マウスに対して）の抗原又はコンジュゲートを３容量のフロイント完全アジュバントと一緒にしてその溶液を動物の複数の部位に皮下的に注射することによって、目的のポリペプチド又はその免疫原性コンジュゲート若しくは誘導体に対して動物を免疫する。１カ月後、複数部位での皮下注射によってフロイント完全アジュバント中最初の量の約１／５〜１／１０のポリペプチド又はコンジュゲートを用いて動物を追加免疫する。７〜１４日後に、動物から採血し、抗体力価についてその血清をアッセイする。一般には、力価が安定状態に達するまで動物を追加免疫する。好ましくは、同一のポリペプチドのコンジュゲートを用いて動物を追加免疫するが、異なる免疫原性タンパク質に対する及び／又は異なる架橋試薬を介したコンジュゲーションを用いることができる。コンジュゲートは、融合タンパク質として組換え細胞培養において作成することもできる。所定の場合には、ミョウバンなどの凝集剤を用いて免疫応答を強化することができる。
【０２９８】
Ｂ．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、一般には、実質的に均質な抗体の集団から得られ、すなわち、少量で存在することがある可能性のある天然型変異を除いて前記集団を含む個別の抗体は同一である。このように、修飾語句「モノクローナル」は、抗体の性質が個々別々の抗体の混合物ではないことを示している。例えば、モノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)に記載されたハイブリドーマ法を用いて又は当分野において公知の任意の組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書参照）によって作成することができる。
【０２９９】
ハイブリドーマ法において、マウス又は他の適切な宿主動物（例えば、ハムスター）を前記のように免疫して、免疫に用いられる目的のポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生する又は産生することができるリンパ球を誘発する。代わりに、リンパ球をインビトロで免疫する。次いで、免疫されたリンパ球をポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いてリンパ球骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成する（例えば、Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp. 59-103 (1986)参照）。このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親骨髄腫細胞の成長又は生存を阻害する物質１種又は２種以上を好ましくは含有する適切な培地中に播種して増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）を欠く場合には、ハイブリドーマ細胞のための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防止する、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含んでいるであろう。
【０３００】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定的な高レベルの産生を支持し、及び／又はＨＡＴ培地などの培地に感受性である骨髄腫細胞である。ヒトモノクローナル抗体の産生に対しこのような好ましい骨髄腫細胞系の例として、ＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍から誘導されたマウス骨髄腫系（Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ；カリフォルニア州サンディエゴから入手できる）などのマウス骨髄腫系、ＳＰ−２又はＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション；メリーランド州ロックビルから入手できる）、及びヒト骨髄腫又はマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系（例えば、Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)；及びBrodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 51-63 (1987)参照）を挙げることができるがそれらに限定されない。
【０３０１】
目的のポリペプチドに対するモノクローナル抗体の産生のためにハイブリドーマ細胞が増殖する培地をアッセイすることができる。好ましくは、免疫沈降法によって又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）若しくは酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイによって、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を決定する。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、the Scatchard analysis of Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)を用いて決定することができる。
【０３０２】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限定希釈法によってサブクローニングし、標準的方法によって増殖させることができる（例えば、Goding, Monoclonal Antibodies:  Principles and Practice, Academic Press, pp. 59-103 (1986)参照）。この目的のために適切な培地として、例えば、Ｄ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地を挙げることができる。さらに、ハイブリドーマ細胞を、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖することができる。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体を、例えば、タンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動法、透析法、又はアフィニティークロマトグラフィーなどの常用の抗体精製方法によって培地、腹水液、又は血清から分離することができる。
【０３０３】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常用の方法を用いて（例えば、マウス抗体のＨ鎖及びＬ鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離しシーケンシングすることができる。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として機能する。単離後に、ＤＮＡを発現ベクター中に配置し、次いでこの発現ベクターを他の場合には抗体を産生しない大腸菌（E.coli）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞などの宿主細胞中にトランスフェクトしてこの組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を誘導することができる。例えば、Skerra et al., Curr. Opin. Immunol., 5:256-262 (1993)；及びPluckthun, Immunol Rev., 130:151-188 (1992)を参照されたい。例えば、相同性マウス配列に代えてヒトＨ鎖及びＬ鎖定常ドメインをコードする配列に置換することによって（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書；及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)参照）、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列の全部若しくは一部を共有的に結合させることによって、ＤＮＡを修飾することもできる。
【０３０４】
更なる実施形態において、例えば、McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)；Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)；及びMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)に記載された技術を用いて生成された抗体ファージライブラリーからモノクローナル抗体又は抗体断片を単離することができる。チェーンシャッフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）ヒトモノクローナル抗体の産生は、Marks et al., BioTechnology, 10:779-783 (1992)に記載されている。極めて大きなファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染及びインビボ組換えの使用は、Waterhouse et al., Nuc. Acids Res., 21:2265-2266 (1993)に記載されている。このように、これらの技術は、モノクローナル抗体を生成するための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な代替法である。
【０３０５】
Ｃ．ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当分野において公知である。好ましくは、ヒト化抗体は、非ヒトである起源から導入されたアミノ酸残基１個又は２個以上を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「インポート」残基と呼ばれることが多く、典型的には「インポート」可変ドメインから取られる。ヒト化は、本質的には、非ヒト抗体の超可変性領域配列をヒト抗体の対応する配列に置換することによって実施することができる。例えば、Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)；及びVerhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)を参照されたい。従って、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書参照）であって、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ない配列が非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は一般にヒト抗体であって、一部の超可変性領域残基及び可能な一部のフレームワーク領域（ＦＲ）残基が齧歯類抗体の類似部位由来の残基によって置換される。
【０３０６】
本明細書に記載したヒト化抗体を作成するのに用いられるＬ鎖及びＨ鎖両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を減少させるために重要な検討事項である。いわゆる「ベストフィット」法によれば、公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対して齧歯類抗体の可変ドメインの配列をスクリーニングする。次いで、齧歯類の配列に最も近いヒト配列をヒト化抗体のためのヒトＦＲとして許容する（例えば、Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993)；及びChothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)参照）。別の方法は、Ｌ鎖又はＨ鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のＦＲを用いる。数種の異なるヒト化抗体に対して同一のＦＲを用いることができる（例えば、Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；及びPresta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)参照）。
【０３０７】
抗原に対する高親和性及びその他の好適な生物学的特性を保有する抗体をヒト化することもまた重要である。この目標を達成するために、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを用いて親配列及び様々な概念的ヒト化生成物を分析するプロセスによってヒト化抗体を調製することができる。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に利用可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の考え得る三次元立体配座構造を図解し表示するコンピュータプログラムを利用することができる。これらの表示を検査することにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち、前記候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析が可能となる。このようにして、標的抗原に対する増大した親和性などの所望の抗体特性が達成されるように、レシピエント配列及びインポート配列からＦＲ残基を選択し組み合わせることができる。一般に、超可変領域残基は、抗原結合に影響を与えることに直接的かつ特異的に関与する。
【０３０８】
本発明によれば、様々な形態のヒト化抗体が意図される。例えば、ヒト化抗体は、Ｆａｂ断片などの抗体断片であることができる。代わりに、ヒト化抗体は、インタクトなＩｇＡ、ＩｇＧ、又はＩｇＭ抗体などのインタクト抗体であることができる。
【０３０９】
Ｄ．ヒト抗体
ヒト化の代替法として、ヒト抗体を生成することができる。或る実施形態において、免疫によって、内因性免疫グロブリンを産生することなくヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することができる。例えば、キメラマウス及び生殖系列突然変異マウスにおける抗体Ｈ鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合欠失は内因性抗体産生の完全な阻害を生じさせると記載されている。このような生殖系列突然変異マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原チャレンジに基づくヒト抗体の産生をもたらす。例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggermann et al., Year in Immun., 7:33 (1993)；並びに米国特許第５，５９１，６６９号明細書、第５，５８９，３６９号明細書、及び第５，５４５，８０７号明細書を参照されたい。
【０３１０】
代わりに、ファージディスプレイ技術（例えば、McCafferty et al., Nature, 348:552-553 (1990)参照）を用いて、非免疫化ドナーに由来する免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーを使用し、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を生成することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３又はｆｄなどの繊維状バクテリオファージの主要又は微量コートタンパク質遺伝子のいずれかの中にインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上に機能的抗体断片として提示される。繊維状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するので、抗体の機能的特性に基づいた選択は、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択も生じさせる。このように、ファージは、Ｂ細胞の特性の一部を模倣する。ファージディスプレイは、例えば、Johnson et al., Curr. Opin. Struct. Biol., 3:564-571 (1993)に記載されたように様々なフォーマットで実施することができる。Ｖ遺伝子セグメントの幾つかの供給源をファージディスプレイに使用することができる。例えば、Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)を参照されたい。非免疫化ヒトドナー由来のＶ遺伝子の一レパートリーを構築することができ、様々な抗原アレイ（自己抗原を含む）に対する抗体を、Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)；Griffith et al., EMBO J., 12:725-734 (1993)；並びに米国特許第５，５６５，３３２号明細書及び第５，５７３，９０５号明細書に記載された技術に本質的に従って単離することができる。
【０３１１】
所定の場合には、例えば、米国特許第５，５６７，６１０号明細書及び第５，２２９，２７５号明細書に記載されたように、インビトロ活性化Ｂ細胞によってヒト抗体を生成することができる。
【０３１２】
Ｅ．抗体断片
抗体断片の生成について、様々な技術が開発されてきた。伝統的には、インタクト抗体のタンパク質分解によってこれらの断片を得た（例えば、Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Meth., 24:107-117 (1992)；及びBrennan et al., Science, 229:81 (1985)参照）。しかしながら、今や、組換え宿主細胞を用いてこれらの断片を直接的に生成することができる。例えば、前記の抗体ファージライブラリーから抗体断片を単離することができる。代わりに、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌細胞から直接的に回収し、化学的に結合させてＦ（ａｂ’）２断片を形成することができる（例えば、Carter et al., BioTechnology, 10:163-167 (1992)参照）。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ’）２断片を、組換え宿主細胞培養物から直接的に単離することができる。抗体断片を生成するための他の技術は、当業者には明白であろう。他の実施形態において、好適な抗体は、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。例えば、国際公開第９３／１６１８５号パンフレット；並びに米国特許第５，５７１，８９４号明細書及び第５，５８７，４５８号明細書を参照されたい。抗体断片は、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号明細書に記載されたような線状抗体であることもできる。このような線状抗体断片は、単一特異的又は二重特異的であることができる。
【０３１３】
Ｆ．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。典型的な二重特異性抗体は、目的の同一のポリペプチドの２つの異なるエピトープに結合することができる。他の二重特異性抗体は、目的のポリペプチドに対する結合部位を追加の抗原１種又は２種以上に対する結合部位と組み合わせることができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。
【０３１４】
二重特異性抗体の作成方法は、当分野において公知である。全長二重特異性抗体の伝統的な作成は、２つの免疫グロブリンＨ鎖−Ｌ鎖対の共発現に基づいており、ここで前記２つの鎖は異なる特異性を有する（例えば、Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)参照）。免疫グロブリンＨ鎖及びＬ鎖の無作為組合せのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ（quadroma））は１０個の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、そのうちの１つだけが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製を、通常はアフィニティークロマトグラフィーによって実施する。同様の方法は、国際公開第９３／０８８２９号パンフレット及びTraunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
【０３１５】
異なるアプローチによれば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）を、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合する。この融合は、好ましくはヒンジ領域、ＣＨ２領域、及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリンＨ鎖定常ドメインを用いる。Ｌ鎖結合に必要な部位を含有する第１Ｈ鎖定常領域（ＣＨ１）が融合の少なくとも１つに存在することが好ましい。免疫グロブリンＨ鎖融合をコードするＤＮＡ、及び、所望であれば、免疫グロブリンＬ鎖を、別個の発現ベクター内に挿入し、適切な宿主生物内に同時トランスフェクトする。これにより、構築に使用される不等比率の３つのポリペプチド鎖が最適の収率を与える場合の実施形態において、３つのポリペプチド断片の相互比率を調整するのに大きな柔軟性が与えられる。しかしながら、等しい比率の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現がより高い収率を生じさせる場合、又は比率が特に有意ではない場合は、２つ又は３つ全てのポリペプチド鎖をコードする配列を１つの発現ベクターに挿入することができる。
【０３１６】
このアプローチの好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、一方のアーム中の第１の結合特異性を備えるハイブリッド免疫グロブリンＨ鎖、及び他方のアーム中の（第２の結合特異性を与える）ハイブリッド免疫グロブリンＨ鎖−Ｌ鎖対から構成される。二重特異性分子の半分にのみ免疫グロブリンＬ鎖が存在することで容易な分離方法が提供されるので、この非対称構造は望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせからの所望の二重特異性化合物の分離を促進する。例えば、国際公開第９４／０４６９０号パンフレット及びSuresh et al., Meth. Enzymol., 121:210 (1986)を参照されたい。
【０３１７】
米国特許第５，７３１，１６８号明細書に記載された別のアプローチによれば、抗体分子対の間の境界面を操作して、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の百分率を最大化することができる。好ましい境界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法において、第１の抗体分子の境界面から小さいアミノ酸側鎖１つ又は２つ以上を、より大きい側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）に置き換える。大きいアミノ酸側鎖をより小さいアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）に置き換えることによって第２抗体分子の境界面上に、前記の大きい側鎖と同一又は同様のサイズの代償的な「空洞（cavities）」を作成する。これにより、ホモ二量体などの他の望ましくない最終生成物に比してヘテロ二量体の収率を増加させる機構が提供される。
【０３１８】
二重特異性抗体は、架橋抗体又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体の一方をアビジンに、他方をビオチンに結合させることができる。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋法を用いて作成することができる。適切な架橋剤及び架橋技術は、当分野において周知であり、例えば、米国特許第４，６７６，９８０号明細書に開示されている。
【０３１９】
抗体断片から二重特異性抗体を生成するのに適切な技術も当分野において公知である。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を用いて調製することができる。所定の場合には、インタクト抗体をタンパク質分解により切断してＦ（ａｂ’）２断片を生成する方法によって二重特異性抗体を生成することができる（例えば、Brennan et al., Science, 229:81 (1985)参照）。これらの断片をジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、隣接ジチオールを安定化させ分子間ジスルフィド形成を防止する。次いで、生成したＦａｂ’断片をチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に転換する。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つを、メルカプトエチルアミンを用いた還元によってＦａｂ’−チオールへ再転換し、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成する。
【０３２０】
或る実施形態では、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を、大腸菌から直接的に回収し化学的に結合させて二重特異性抗体を形成することができる。例えば、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子を、Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)に記載された方法によって生成することができる。各Ｆａｂ’断片を大腸菌から別個に分泌させ、インビトロでの指向性（directed）化学結合に付して二重特異性抗体を形成する。
【０３２１】
組換え細胞培養物から直接的に二重特異性抗体断片を作成し及び単離するための様々な技術も記載されてきた。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて生成されてきた。例えば、Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-1553 (1992)を参照されたい。遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分にＦｏｓタンパク質及びＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを結合した。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、次いで再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法は、抗体ホモ二量体の生成にも利用することができる。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)に記載された「ディアボディ（diabody）」技術は、二重特異性抗体断片を作成するための代替的機構を提供している。該断片は、同一鎖上で２つのドメイン間の対合を行うことができないほど短いリンカーによってＬ鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結されたＨ鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、１つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは、別の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと対合することを余儀なくされ、それによって２つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を用いることにより二重特異性抗体断片を作成する別の戦略が、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)に記載されている。
【０３２２】
３以上の結合価（valencies）を有する抗体も意図している。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。例えば、Tutt et al., J. Immunol., 147:60 (1991)を参照されたい。
【０３２３】
Ｇ．抗体精製
組み換え技術を使用すると、抗体を、単離された宿主細胞内で、宿主細胞の細胞周辺腔内で産生させることができ、又は宿主細胞から培地中へ直接分泌させることができる。抗体を細胞内で産生させる場合に、最初に微粒子破片を、例えば、遠心分離又は限外濾過によって除去する。Carter et al., BioTech., 10:163-167 (1992)は、大腸菌の細胞周辺腔内に分泌される抗体を単離する方法を記載している。簡単に説明すると、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間にわたり細胞ペーストを溶かす。遠心分離によって細胞破片を取り除くことができる。抗体が培地中に分泌される場合、一般には、例えば、Ａｍｉｃｏｎ社又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ社製の限外濾過装置である商業的に入手することができるタンパク質濃縮フィルターを用いて、そのような発現系由来の上澄を濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記工程のいずれかに含めてタンパク質分解を阻害することができ、そして抗生物質を含めて外来性汚染菌の増殖を防止することができる。
【０３２４】
細胞から調製された抗体組成物を、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができる。プロテインＡの親和性リガンドとしての適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種類及びアイソタイプに依存する。プロテインＡを用いて、ヒトγ１Ｈ鎖、ヒトγ２Ｈ鎖、又はヒトγ４Ｈ鎖に基づく抗体を精製することができる（例えば、Lindmark et al., J. Immunol. Meth., 62:1-13 (1983)参照）。プロテインＧは、全てのマウスのアイソタイプ及びヒトγ３に対して推奨される（例えば、Guss et al., EMBO J., 5:1567-1575 (1986)参照）。親和性リガンドが結合するマトリックスは、多くの場合にアガロースであるが、他のマトリックスも利用することができる。制御された細孔ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースを用いて達成することができる場合より高い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合は、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商品名）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社；ニュージャージー州フィリップスバーグ）が精製に有用である。他のタンパク質精製技術、例えば、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商品名）上のクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上のクロマトグラフィー（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿も回収すべき抗体に応じて利用することができる。
【０３２５】
任意の予備精製工程の後、目的の抗体及び夾雑物を含む混合物を、ｐＨ約２．５〜４．５の溶出バッファを用い、好ましくは低塩濃度（例えば、塩約０〜０．２５Ｍ）で実施される、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに付することができる。
【０３２６】
当業者であれば、抗体に類似する機能を有する任意の結合分子、例えば、試料中の目的の分析物１種又は２種以上に特異的である結合分子又は結合パートナーも、本発明の方法及び組成物において使用することができることを理解されよう。適切な抗体様分子の例として、ドメイン抗体、ユニボディ、ナノボディ、サメ抗原反応性タンパク質、アビマー、アドネクチン、アンチカルム（anticalm）、親和性リガンド、フィロマー（phylomer）、アプタマー、アフィボディ、トリネクチンなどを挙げることができるがそれらに限定されない。
【０３２７】
ＩＸ．投与方法
本発明の方法によれば、本明細書に記載したＨＥＲ２調節性化合物及び他の抗癌剤（まとめて「抗癌剤」）を、当分野において公知の任意の簡便手段によって被験者に投与する。本発明の方法を用いて、ＨＥＲ２調節性化合物などの抗癌剤又は抗癌剤の組み合わせを用いた治療に対する細胞（例えば、腫瘍細胞）の感受性を決定又は予測することができる。本発明の方法を用いて、ＨＥＲ２調節性化合物などの抗癌剤又は抗癌剤の組み合わせを用いた治療に対する腫瘍（例えば、乳房腫瘍）の応答を決定、予測、同定、及び／又は監視することもできる。さらに、本発明の方法を用いて、被験者における腫瘍（例えば、乳房腫瘍）の治療に対して適切なＨＥＲ２調節性化合物などの抗癌剤又は抗癌剤の組み合わせを選択することができる。当業者であれば、本明細書に記載した抗癌剤を単独で、又は、通常の化学療法、放射線療法、ホルモン療法、免疫療法、及び／又は手術との併用療法アプローチの一部として投与することができることを理解されよう。
【０３２８】
所定の実施形態において、抗癌剤は、モノクローナル抗体又はチロシンキナーゼ阻害剤などの抗シグナル伝達剤（すなわち、細胞増殖抑制薬）；抗増殖剤；化学療法剤（すなわち、細胞毒性薬）；ホルモン療法剤；放射線療法剤；ワクチン；及び／又は癌性細胞などの異常な細胞の制御されない増殖を低減又は阻害する能力を有する任意の他の化合物を含む。或る実施形態では、化学療法薬少なくとも１種との併用により１種又は２種以上の抗シグナル伝達剤、抗増殖剤、及び／又はホルモン療法剤を用いて被験者を治療する。典型的なモノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、抗増殖剤、化学療法剤、ホルモン療法剤、放射線療法剤、及びワクチンは前記に記載されている。
【０３２９】
特定の実施形態において、抗癌剤はモノクローナル抗体を含むＨＥＲ２活性を調節する化合物１種又は２種以上、チロシンキナーゼ阻害剤、及びそれらの組み合わせを含む。ＨＥＲ２調節性化合物の限定的でない例として、モノクローナル抗体、例えば、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））及びペルツズマブ（２Ｃ４）；小分子チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（商標））、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（商標））、ピリチニブ、ＣＰ−６５４５７７、ＣＰ−７２４７１４、カネルチニブ（ＣＩ １０３３）、ＨＫＩ−２７２、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６；Ｔｙｋｅｒｂ（商標））、ＰＫＩ−１６６、ＡＥＥ７８８、ＢＭＳ−５９９６２６、ＨＫＩ−３５７、ＢＩＢＷ ２９９２、ＡＲＲＹ−３３４５４３、ＪＮＪ−２６４８３３２７、及びＪＮＪ−２６４８３３２７；並びにそれらの組み合わせを挙げることができるがそれらに限定されない。所定の実施形態において、ＨＥＲ２調節性化合物を、本明細書に記載した又は当業者に公知の他の抗癌剤１種又は２種以上と併用して用いることができる。
【０３３０】
或る実施形態において、本明細書に記載の抗癌剤は、通常の免疫療法剤と同時投与することができ、該免疫療法剤として、免疫賦活剤（例えば、カルメット・ゲラン桿菌（Bacillus Calmette-Guerin）（ＢＣＧ）、レバミゾール、インターロイキン−２、α−インターフェロンなど）、免疫毒素（例えば、抗ＣＤ３３モノクローナル抗体−カリケアマイシンコンジュゲート、抗ＣＤ２２モノクローナル抗体−シュードモナス外毒素コンジュゲートなど）、及び放射免疫療法（例えば、１１１Ｉｎ、９０Ｙ、又は１３１Ｉなどにコンジュゲートされた抗ＣＤ２０モノクローナル抗体）を挙げることができるが、それらに限定されない。
【０３３１】
抗癌剤を、必要に応じて適切な医薬賦形剤を用いて投与することができ、許容された投与様式のいずれかによって実施することができる。従って、投与は、例えば、経口、経頬（buccal）、舌下、経歯肉、経口蓋、静脈内、局所、皮下、経皮的、経皮性、筋肉内、関節内、非経口、動脈内、皮内、心室内、頭蓋内、腹腔内、膀胱内、髄腔内（intrathecal）、病巣内、鼻腔内、直腸的、膣的、又は吸入によるものであることができる。「同時投与する」とは、抗癌剤が第２薬（例えば、別の抗癌剤、抗癌剤療法に関連した副作用を減少させるために有用な薬剤、放射線療法剤、ホルモン療法剤、免疫療法剤など）の投与と同時に、その投与直前に、又はその投与直後に投与されることを意味する。
【０３３２】
治療的有効量の抗癌剤を反復して、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８回、又は９回以上反復して投与することができ、又は、その量を連続注入によって投与することができる。投与は、固形、半固形、凍結乾燥粉末、又は液体の剤形、例えば、錠剤、丸剤、ペレット剤、カプセル剤、粉末剤、液剤、懸濁剤、油剤、坐剤、停留浣腸剤、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、ゲル剤、エアロゾル剤、フォーム剤などの剤形であることができ、好ましくは、正確な用量の単一の投与に適した単位剤形であることができる。
【０３３３】
本明細書で使用する用語「単位剤形」とは、ヒト被験者及び他の哺乳動物に対する単位投与量として適切な物理的に分離した単位を指し、各単位は所望の作用発現、寛容性、及び／又は治療効果を生ずるように計算された予定量の抗癌剤を適切な医薬賦形剤と共に含む（例えば、アンプル）。さらに、より濃縮した剤形を調製することができ、次に該濃縮剤形からより希釈した単位剤形を製造することができる。このように、より濃縮した剤形は、実質的により多量の抗癌剤、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍、又は１１倍以上の量の抗癌剤を含有する。
【０３３４】
このような剤形の調製方法は、当業者には公知である（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)参照）。剤形は、典型的には、通常の医薬担体又は医薬賦形剤を含み、さらに、他の薬剤、担体、アジュバント、希釈剤、組織浸透促進剤、可溶化剤などを含んでいることができる。適切な賦形剤を、当分野において周知の方法によって、特定の剤形及び投与経路に合わせて作成することができる（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences、上記参照）。
【０３３５】
適切な賦形剤の例として、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、生理食塩液、シロップ、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びポリアクリル酸、例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ、例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９４１、Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９８０、Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９８１などを挙げることができるがそれらに限定されない。剤形は、さらに、潤滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱油；湿潤剤；乳化剤；懸濁剤；保存剤、例えば、メチル−ヒドロキシ−ベンゾエート、エチル−ヒドロキシ−ベンゾエート、及びプロピル−ヒドロキシ−ベンゾエート（すなわち、パラベン）；ｐＨ調整剤、例えば、無機及び有機の酸及び塩基；甘味剤；並びに香味剤を含んでいることができる。剤形は、生分解性ポリマービーズ、デキストラン、及びシクロデキストリン包接複合体も含んでいることができる。
【０３３６】
経口投与に対する治療有効量は、錠剤、カプセル剤、油剤、懸濁剤、液剤、シロップ、スプレー、ロゼンジ、粉末剤、及び持続放出性製剤の形態であることができる。経口投与に対して適切な賦形剤として、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウムなどを挙げることができる。
【０３３７】
或る実施形態において、治療有効量は、丸剤、錠剤、又はカプセル剤の形態を取り、従って、その剤形は、抗癌剤と共に、以下：希釈剤、例えば、ラクトース、スクロース、リン酸二カルシウムなど；崩壊剤、例えば、デンプン又はその誘導体；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムなど；及び結合剤、例えば、デンプン、アカシアガム、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、セルロース及びそれらの誘導体、の任意のものを含んでいることができる。抗癌剤は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）担体中に配置される（disposed）坐剤中に、配合することもできる。
【０３３８】
抗癌剤及び場合により薬剤学的に許容することのできるアジュバント１種又は２種以上を、例えば、生理食塩水（例えば、塩化ナトリウム０．９ｗ／ｖ％）、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどの担体中に溶解又は分散させて、例えば、経口投与、局所投与、又は静脈内投与のための液剤又は懸濁剤を形成することにより、液体剤形を製造することができる。抗癌剤は停留浣腸中に配合することもできる。
【０３３９】
局所投与に対して、治療有効量は、油剤、ローション剤、ゲル剤、フォーム剤、クリーム剤、ジェリー剤、液剤、懸濁剤、軟膏剤、及び経皮パッチの形態であることができる。吸入による投与に対して、抗癌剤を、乾燥粉末として又はネブライザーを介する液体形態で送達することができる。非経口投与に対して、治療有効量は、滅菌された注射溶液及び滅菌包装された粉末剤の形態であることができる。好ましくは、注射溶液をｐＨ約４．５〜約７．５で製剤化する。
【０３４０】
治療有効量を凍結乾燥形態で提供することもできる。このような剤形は、投与前の再構成のために、緩衝剤、例えば、炭酸水素塩を含んでいることができ、又は、例えば、水、を用いた再構成のために凍結乾燥剤形に緩衝剤を含めることができる。凍結乾燥剤形は、適切な血管収縮剤、例えば、エピネフリンをさらに含んでいることができる。凍結乾燥剤形は、再構成された剤形を被験者に直ちに投与することができるように、場合により再構成のための緩衝剤と組み合わせて包装された注射器により提供することができる。
【０３４１】
所定の療法レジメンの有効性を評価するために周期的な時間間隔で被験者を監視することもできる。例えば、所定のシグナル伝達分子の活性化状態は、本明細書に記載した抗癌剤１種又は２種以上を用いた治療の治療効果に基づいて変化することがある。被験者を監視して、個別化されたアプローチにおける所定の薬剤又は治療の応答を評価しそれらの効果を理解することができる。さらに、特定の抗癌剤又は抗癌剤の組み合わせに対して初期には応答する被験者が、その薬剤又は薬剤の組み合わせに対して無反応性となるがあり、このことはこれらの被験者が獲得薬剤耐性を生じたことを示している。これらの被験者の現在の療法を中止し、本発明の方法に従って彼らに代わりの療法を処方することができる。
【０３４２】
所定の側面において、本明細書に記載した方法を、例えば、リンパ節陰性疾患を有する女性の様々な集団における乳癌の予後診断及び／又は再発の可能性を予測する遺伝子発現マーカーのパネルと共に使用することができる。これらの遺伝子パネルは、再発を経験する可能性が低く、従って、アジュバント化学療法から利益を得る可能性が低い女性を同定するのに有用であることができる。これらの発現パネルを用いて、無疾患生存率及び全体的生存率（disease-free and overall survival）の結果に悪影響を与えずに、安全にアジュバント化学療法を回避することができる女性を同定することができる。適切なシステムとして、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｅａｌｔｈ社からの２１遺伝子パネルであるＯｎｃｏｔｙｐｅ ＤＸ（商品名）；Ａｇｅｎｄｉａ社からの７０遺伝子パネルであるＭａｍｍａＰｒｉｎｔ（商標）；及びＶｅｒｉｄｅｘ社からの７６遺伝子パネルを挙げることができるがそれらに限定されない。
【０３４３】
さらに、所定の他の側面において、本明細書に記載した方法を、原発性不明癌（ＣＵＰ）に対して最初の腫瘍を同定する遺伝子発現マーカーのパネルと共に使用することができる。これらの遺伝子パネルは、初期に乳癌と診断された女性に与えられた療法と一致する療法から利益を得られると考えられる転移性癌を有する女性を同定するのに有用であることができる。適切なシステムとして、９２の遺伝子を測定して３９の腫瘍タイプに対する原発性起源部位を同定するＲＴ−ＰＣＲベース発現アッセイであるＡｖｉａｒａ ＣａｎｃｅｒＴＹＰＥ ＩＤアッセイ；及びマイクロアレイ上で１，６００超の遺伝子の発現を測定して１５の既知の組織タイプのものに対して腫瘍の遺伝子発現「シグニチャー」を比較するＰａｔｈｗｏｒｋ（商標）Ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｏｒｉｇｉｎ Ｔｅｓｔを挙げることができるがそれらに限定されない。
【０３４４】
Ｘ．実施例
以下の実施例を、特許請求の範囲に記載の本発明を限定するためではなく例示するために提供する。
【０３４５】
国際公開第２００９／１０８６３７号パンフレットの実施例が、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０３４６】
実施例１．磁気捕捉及び高感度イムノアッセイを用いた癌患者における循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の検出、計数、及び特徴付け
この実施例は、癌患者から単離したＣＴＣを用いて本明細書に記載した近接アッセイの妥当性確認を行った臨床試料について実施した試験を説明する。
【０３４７】
この試験において登録に含める基準は以下の通りであった：（１）１８歳より上；（２）組織学的に確認された固形腫瘍（ステージ３ｂ又は４）；及び（３）ＬＮステージングＮ１、Ｎ２、又はＮ３を有するステージ３ｂの乳癌又は肺癌。この試験において登録から除外する基準は以下の通りであった：（１）１８歳又はそれ未満；（２）転移を有しない；（３）前立腺癌又は黒色腫の診断；（４）過去５年以内に他の癌の前病歴；及び（６）ＬＮステージングＮＸ又はＮＯを有するステージ３ｂ乳癌又は肺癌。
【０３４８】
静脈穿刺により全血２０ｍＬを以下のように採取した：（１）ＣｅｌｌＳａｖｅ検体保存チューブ（CellSave Preservation Tube）中に１０ｍＬ；及び（２）ＥＤＴＡ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒチューブ中に１０ｍＬ。試料を、採取した日に周囲温度でＦｅｄＥｘにより発送した。症例報告フォームは、年齢、性別、民族性、癌タイプ、現在及び前の療法、付随の薬物（medication）、及び有害事象を含んでいた。乳癌患者については、ＥＲ、ＰＲ，及びＨＥＲ２状態もそこに含めた。
【０３４９】
１００例の癌タイプ（乳癌を有する３５例を含む）に対応する全体で１２１例の患者及び２５例の対照をこの試験に登録した。患者の人口統計を表３〜表４に示す。
【表３】
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【表４】
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【０３５０】
図１は、採取した全血試料からＣＴＣを単離するための典型的な試料処理フローチャートを示す。図２は、全ての癌試料についてのＶｅｒｉｄｅｘ ＣＴＣ計数結果を示す。とりわけ、ＣＴＣについて陽性の患者数は癌の後期ステージ（ステージ４対ステージ３の癌）において増加した。図３は、本明細書に記載した近接アッセイを用いて乳癌患者及び他の癌タイプ由来のＣＴＣ陽性試料において観察されたＨＥＲ１及びＨＥＲ２の要約を提供する。
【０３５１】
実施例２．ＥｒｂＢファミリー受容体チロシンキナーゼの活性化を検出するための新規方法
要約
単細胞レベル感度でＥｒｂＢファミリー受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）におけるリン酸化事象を特異的に検出することができる新規技術を開発した。この多重されたタンパク質マイクロアレイプラットホームは、特有の「三重抗体−酵素チャネリング」免疫複合体の形成を利用する。この原理を、限られた数の以下の標的細胞：（１）患者の全血中に見出された癌細胞（循環腫瘍細胞、ＣＴＣ）；及び（２）患者の微細針吸引液（ＦＮＡ）試料中に見出された癌細胞、を有する２つの乳癌モデル系に適用した。この例は、ＣＴＣモデル系における単細胞の感度レベルでの、及び様々な異種移植片腫瘍だけでなく様々な程度のＥｒｂＢ−ＲＴＫ発現を有する凍結乳癌組織を用いた転移性ＦＮＡ（ｍＦＮＡ）モデル系における、ＨＥＲ１及びＨＥＲ２（ｐＨＥＲ１及びｐＨＥＲ２）の活性化の首尾よい検出を説明する。
【０３５２】
序論
腫瘍組織の分析に基づく原発性乳癌と遠隔転移との間のＨＥＲ−２遺伝子状態の関係をいくつかの群により分析した（１〜６）。原発性腫瘍組織中の療法標的の発現は、遠隔腫瘍部位における発現と異なっていることがあり、そして経時的にその相異が現れることがある。治療と関連した又は一部の患者における疾患の自然経過による、経時的な標的発現の低下は、標的に向けられた薬剤の効果に影響を与えることがあり、それを確実にタイムリーに知ることができれば、患者の治療の管理に有用であることができよう。さらに、原発性腫瘍中のＨＥＲ−２遺伝子状態と対応するＣＴＣ中のＨＥＲ−２遺伝子状態との間の良好な一致は、試料を同期的に（synchronously）得た場合にのみ示されるという癌の「進展（evolution）」の動的性質が最近の研究において示された：初期ＨＥＲ−２陰性原発性腫瘍を有する２４例の再発患者由来のＣＴＣは、２４例の患者の９例（３７％）がそのＣＴＣ中にＨＥＲ−２増幅を獲得したことを示した（７）。
【０３５３】
ｍＦＮＡ試料を用いて器官型及び部位特異的な転移性腫瘍プロファイルを提供することができ、一方、ＣＴＣを用いて、癌が進行し及び治療が継続され又は修正されるのに伴う腫瘍の変化を検出することができるであろう。従って、ＦＮＡによる腫瘍組織の連続的なサンプリングは、時間及び療法の関数として腫瘍の変化を監視するのに重要であることができる。ヒト腫瘍の１回通過（single-passage）ＦＮＡ由来のＲＴＫの信頼性ある機能的状態を得ることは、有効な治療決定を導くのに不可欠な情報を提供する重要な技術的進歩であろう。ＦＮＡは最小限の侵襲性であるので、連続的な腫瘍サンプリングとしてより許容性を有する。さらに、この方法を用いて取り出された細胞を腫瘍から取り出して数分間以内に処理することができるので；ＦＮＡ検体のプロテオミクス・プロファイルはインビボのプロファイルに極めて近似していると予想される。
【０３５４】
本発明のアッセイは、多重化された近接媒介性協調的イムノアッセイフォーマットを含み、限定量の試料を処理するのに極めて有用であり、そして有利なことに、連続的に採取されたＣＴＣ及びｍＦＮＡ腫瘍試料についてのキナーゼ及び他のシグナル伝達経路分子の発現／活性化プロファイリングを提供する。
【０３５５】
方法
多重化近接アッセイ：所定の実施形態において、本発明のアッセイは、（１）多重化タンパク質マイクロアレイプラットフォームと（２）三重抗体−酵素チャネリングシグナル増幅法との組み合わせに基づいている。マイクロアレイプラットフォームは、多数のマーカーを収容するのに必要な拡張性だけでなく商業的に展開するのに必要なスケーラビリティを提供する。特異性を保存しながら超高感度を与える三重抗体−酵素アプローチにより特有かつ新規の設計を提供する：（１）マイクロアレイ表面上に連続希釈によりプリントされた標的特異的な抗体によって、選択された標的を捕捉する。次いで、このフォーマットは、結合した各標的タンパク質ごとに引き続きのチャネリング事象のために酵素と結合した２つの追加の検出子（detector）−抗体の共局在性を必要とする（例えば、図２４参照）。（２）捕捉抗体による最初の標的結合と捕捉された標的分子上の交替（alternate）エピトープを認識するグルコースオキシダーゼ（ＧＯ、ＴＯＮ１０５／分間）コンジュゲート抗体の二次結合とによって形成される免疫複合体はＧＯ基質であるグルコースの存在下にＨ２Ｏ２を生成することができる。（３）次いで、捕捉された標的上のリン酸化ペプチドに結合する西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、ＴＯＮ１０４／分間）とコンジュゲートされたホスホ−ペプチド特異的抗体によって、標的特異的なＨ２Ｏ２の局所的流入が利用されることで、標的特異的なシグナルが増幅される。リン酸化された標的の検出のための特異性は、３つの異なるタイプの抗体の同時結合の要件を前提として、協調的免疫検出及び増幅プロセスにより大きく高められる。本発明の方法により、わずか〜２〜３×１０４というリン酸化事象の検出及び定量化がルーチン的に達成され、このことはその検出を「単」細胞レベルに導く。さらに、この協調的イムノアッセイの構成をタンパク質相互作用及び活性化を調査するのに適用することができる。
【０３５６】
スライドプリンティング：捕捉抗体を、界面活性剤（detergent）を用いて１×ＰＢＳ中に希釈した。接触型マイクロアレイプリンター（Ｇｅｎｅｔｉｘ社）を用いて、１６パッドのニトロセルロースＦＡＳＴスライド（Ｗｈａｔｍａｎ社）上にプリントした。スポット径は約１７５μｍであり、プリントしたスライドを４℃の乾燥チャンバー内で保持した。
【０３５７】
ＦＮＡ：凍結した乳癌組織はＰｒｏｔｅｏＧｅｎｅｘ社の製品であった。患者は全て、ステージＩＩ又はＩＩＩの乳管癌を有する白人であった。Ｇ２３ニードルを用いて凍結腫瘍組織に５〜１０回通すことによってＦＮＡ試料を採取した。採取したＦＮＡを１００μＬ溶解バッファ中に溶かしそして得られた試料を近接アッセイを実施するまで−８０℃で保存した。
【０３５８】
異種移植片腫瘍：ＭＤＡ−ＭＢ４３５、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、及びＢＴ４７４のヒト乳癌細胞系をヌードマウスに皮下注射した。腫瘍容量が大きさ４００ｍｍ３に達した時に、Ｇ２３ニードルを用いてＦＮＡ試料を採取した。採取したＦＮＡ試料を上記のように処理した。
【０３５９】
結果
感度：本発明者らは、複数の細胞系（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、Ａ４３１、ＢＴ−４７４、及びＳＫＢｒ−３細胞系）中のＨＥＲ１及びＨＥＲ２の活性化及び発現を単細胞の感度レベルで検出した。これらの細胞系は、それらの細胞膜上で１細胞当たり全ＲＴＫ〜１×１０６を発現するが、全ＲＴＫのサブセットだけがリン酸化されており、このようなリン酸化は経路活性化に必要とされる。ＳＫＢＲ−３細胞はＨＥＲ２の増幅により自発的なＨＥＲ２活性化を有するので、ＳＫＢＲ−３細胞は陽性対照の参照を提供する。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞はＨＥＲ１リン酸化を誘導するためにはＥＧＦ（ＴＧＦａ）を用いて刺激されることが必要であり、刺激前後のＤＡ−ＭＢ−４６８細胞のシグニチャーを陰性対照及び陽性対照として用いることができる。ＤＡ−ＭＢ−４６８は刺激前には限界的（marginal）ＨＥＲ１活性化を有するが、両方の細胞系はそれらの活性化されたＲＴＫの約１０％でピークに達する（１細胞当たり〜１×１０５リン酸化事象）。本発明者らのフォーマットは、図４に示したように、本発明者らが単細胞感度で１０５より少ない活性化事象を検出することを可能にした。
【０３６０】
異種移植片−ＦＮＡ：ｍＦＮＡ試料における本発明者らのアッセイの可能な用途を示すために、本発明者らは、図５に示したように、様々な程度のＥｒｂＢ−ＲＴＫ発現を有する細胞系（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、及びＢＴ４７４）を用いて種々のタイプの乳癌に対する異種移植片モデルをまず開発した。本発明者らは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片−ＦＮＡ中に低レベルのｐＨＥＲ２及びｐＨＥＲ１を、ＢＴ４７４異種移植片から得られたＦＮＡ中に有意レベルのｐＨＥＲ２を、そしてＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片から得られたＦＮＡ中に極めて低いＨＥＲ１及びＨＥＲ２活性化を検出した。異種移植片−ＦＮＡモデル系からの本発明者らの知見はドライバー細胞系ＨＥＲ２プロファイルと一致し、このことは本発明の方法を用いて、最小限の侵襲的方法から得られる試料、例えば、乳癌及び他のタイプの転移性癌のＣＴＣ及びＦＮＡ中のＥｒｂＢ受容体の活性化を検出することができるということを示している。
【０３６１】
凍結組織−ＦＮＡ：本発明者らのアッセイフォーマットの有用性をさらに証明するために、本発明者らは、２９例のステージＩＩ又はＩＩＩの凍結乳管癌（１４例は既知のＨＥＲ２ ＩＨＣ状態を有する）からＧ２３ニードルを用いてＦＮＡ試料を採取した。本発明者らのアッセイによって検出されたＨＥＲ２受容体の活性化は腫瘍ＩＨＣスコアと一致する（図６）。本発明者らは、原発性腫瘍において高いＩＨＣスコア（３＋）を有する４例の患者を把握している。彼らは皆、高いＨＥＲ２活性を有している。興味深いことに、４例の患者のうち１例はＥＧＦＲ及びＨＥＲ２受容体の両方の活性が高い。このことは、ＴＫＩ阻害剤の療法がＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）単独より効果的である可能性を示している。
【０３６２】
図７（左）は、既知又は未知のＨＥＲ２ ＩＨＣ状態を有する乳癌組織由来のＦＮＡ試料及び正常組織中の活性化されたＨＥＲ１レベル及びＨＥＲ２レベルの要約を提供する。図７（右）は、未知ＨＥＲ２ ＩＨＣ状態を有するＦＮＡ試料中のｐＥＧＦＲレベル及びｐＨＥＲ２レベルの図解を提供する。図８は、高いＩＨＣスコア（３＋）を有するＦＮＡ試料（試料ＩＤ番号０１２８５５Ｔ２及び０１２８９７Ｔ２）中のｐＨＥＲ２レベルの滴定分析を示す。図９は、連続希釈の４つの異なる捕捉抗体濃度を用いた２つの異なる時点におけるＦＮＡ試料中のｐＥＧＦＲ及びｐＨＥＲ２の検出を示す。
【０３６３】
結論
希少ＣＴＣに対する使用を可能にする感度でＥｒｂＢファミリー受容体中のリン酸化を特異的に検出することができる新規の技術を開発した。ＣＴＣの連続的サンプリングにおけるキナーゼ及び他のシグナル伝達経路分子の発現／活性化プロファイリングは、時間及び療法の関数として腫瘍細胞中に生ずる変化についての有用な情報を提供する。この療法誘導診断を、図１０に示したように、疾患管理の様々な段階で用いることができる。その比類なき感度及び特異性のため、本発明者らのアプローチは、希少循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）中のＥｒｂＢファミリー受容体中のリン酸化事象を検出するのに適用することができる。ＣＴＣ及びＦＮＡ試料中のＨＥＲ１及びＨＥＲ２活性化を同定することによって、本発明の方法は、標的化治療手段の初期選択に対してだけでなく、それぞれの患者において急速に「進展する」癌シグニチャーに対するその後の監視においても、指針を提供することができる。
【０３６４】
従って、本発明の多重化近接ベース協調的イムノアッセイプラットフォームは、超感度及び特異性をもってＣＴＣ及びｍＦＮＡなどの限られた試料について有用な臨床情報を提供して、腫瘍医が「個人的」癌プロファイル変化に従ってそれぞれの患者に対する疾患治療選択肢を調整することを補助又は支援する。
【０３６５】
参考文献
１．Tanner M, Ja¨rvinen P, and Isola J.  Amplification of HER-2/neu and Topoisomerase IIa in Primary and Metastatic Breast Cancer. Cancer  Research 61, 5345-5348. 2001
【０３６６】
２．Tapia C, Savic S, Wagner U,  Rene Schonegg R, Hedvika Novotny H, Grilli B,  Herzog M, Barascud A, Zlobec I, Cathomas G, Terracciano L, Feichter G, Bubendorf L.  HER2 gene status in primary breast cancers and matched distant metastases. Breast Cancer Research 9, R31. 2007
【０３６７】
３．Lear-Kaul K, Yoon H, Kleinschmidt-DeMasters BK, McGavran L, Singh M.  HER-2/neu Status in Breast Cancer Metastases to the Central Nervous System. Arch Pathol Lab Med, 127, 1451-1457. 2003
【０３６８】
４．Simmons C, Miller N, Geddie W, Gianfelice D, Oldfield M, Draitsaries G, Clemons M.  Does confirmatory tumor biopsy alter the management of breast cancer patients with distant metastases? Ann of Oncology, doi:10.1093/ annonc/ mdp028, 2009
【０３６９】
５．Fabi A, Benedetto A, Metro G, Melucci E, Vici P, Nistico C, Fussillo M, Cognetti F, Mottolese M.  Changes in HER2 overexpression between primary tumor and autologous metastases: Correlations with clinical and biological features
【０３７０】
６．Meng S, Tripathy D, Shete S, Ashfaw R, Saboorian H, Haley B, Frenkel E, Euhus D, Leitch M, Osborne C, Clifford E, Perkens S, Beitsch P, Khan A, Morrison L, Herlyn D, Terstappen LW, Lane N, Wang J, Urh J.  uPAR and HER-2 gene status in individual breast cancer cells from blood and tissues. PNAS 103:17361-4, 2006
【０３７１】
７．Meng S, Tripathy D, Shete S, Ashfaw R, Haley B, Perkins S, Beitsch P, Khan A, Euhus D, Osborne C, Frenkel E, Hoover S, Leitch M, Clifford E, Vitetta E, Morrison L, Herlyn D, Terstappen L, Flemming T, Fehm T, Tucker R, Lane N, Wang J, Uhr J.  HER-2 gene amplification can be acquired as breast cancer progresses. PNAS 101:9393-8. 2004
【０３７２】
実施例３．近接媒介性マイクロアレイイムノアッセイを用いた転移性腫瘍における循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）中の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のプロファイリング
要約
ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２の異常な活性化は様々なタイプの癌進行に結び付けられており、そして原発性腫瘍とＣＴＣとの間の発現状態の変化は有意な頻度で生ずると報告されている。連続的に採取されたＣＴＣ中のＥＧＦＲ／ＨＥＲ２リン酸化を検出する方法は全体的な疾患プロファイル変化への有用な洞察を提供することができるので、個々の患者に対する療法の組み合わせにより良い選択に導くことができる。標的分子におけるリン酸化を検出するために、三重抗体−酵素チャネリング多重化タンパク質マイクロアレイプラットフォームを開発した。それは、標的タンパク質がマイクロアレイ表面上に捕捉されると２つの検出子の酵素コンジュゲート抗体の共局在性により特有な免疫複合体が形成されることを利用する。近接した２つの検出子の酵素の間のチャネリング事象は、単細胞レベル感度でのＲＴＫのプロファイリングを可能にした。臨床試料について本発明の方法の妥当性確認をするために、様々な療法レジメンにおける転移性疾患を有する２７例の乳癌患者由来のＣＴＣを分析した。本発明の多重化された近接媒介性イムノアッセイは、様々な癌患者から単離されたＣＴＣ中のＲＴＫの増幅及び活性を首尾よく検出した。増幅及び活性化したＨＥＲ２を伴うＣＴＣを、ＨＥＲ２陰性原発性腫瘍を有する１７例の乳癌患者のうち５例（２９％）で見出した。転移性ステージにおいて見出されるＣＴＣは最も侵攻性の侵入細胞集団を表すので、連続的なＣＴＣプロファイリングはより良好な療法選択／調整及び疾患監視に導くことができる。
【０３７３】
序論
固形腫瘍を有する患者の血液中の癌細胞の検出を報告する多数の研究がある。転移性乳癌を有する患者における第一選択療法の開始前の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の検出は、無進行生存率（progression free survival）及び全体的生存率を高度に予測する（１〜３）。乳癌において、腫瘍組織の分析に基づいた、原発性乳癌と遠隔転移との間のＨＥＲ−２遺伝子状態の関係は多くの研究において記載されている（４〜１０）。原発性腫瘍組織中での療法標的の発現は遠隔腫瘍部位における発現と異なっていることがあり、その相異は経時的に現れることがある。標的発現の変化は治療の効果に影響を与えることがあり、そしてその変化を確実にタイムリーに知ることができれば、療法を誘導するのに用いることができよう。それらは連続的な腫瘍生検より容易に患者から得ることができるので、ＣＴＣ（転移部位から採取されるＦＮＡ試料と同様に）を用いてこれらの変化を監視することができる。本明細書に記載の多重化近接ベースイムノアッセイを用いてＣＴＣ中のＥｒｂＢファミリー受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２の発現及び活性化レベルをプロファイルする。
【０３７４】
方法
多重化近接アッセイ：所定の実施形態において、本発明のアッセイは、（１）多重化タンパク質マイクロアレイプラットフォームを（２）三重抗体−酵素チャネリングシグナル増幅法と組み合わせて基礎とする。特異性を保存しながら超高感度を与える三重抗体−酵素アプローチにより特有かつ新規な設計を提供する：（１）マイクロアレイ表面上に連続希釈によりプリントされた標的特異的な抗体によって、選択された標的を捕捉する。このフォーマットは、酵素と結合した２つの追加の検出子−抗体の共局在性を必要とする（例えば、図２４参照）。（２）捕捉抗体による最初の標的結合と捕捉された標的分子上の交替エピトープを認識するグルコースオキシダーゼ（ＧＯ、ＴＯＮ１０５／分間）コンジュゲート抗体の二次結合とによって形成される免疫複合体はＧＯ基質であるグルコースの存在下にＨ２Ｏ２を生成する。（３）次いで、捕捉された標的に結合する西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートされたホスホ−ペプチド特異的抗体によって、標的特異的なＨ２Ｏ２の局所的流入が利用される。リン酸化された標的の検出のための特異性は、３つの異なる抗体の同時結合の要件によって大きく高められる。本発明の方法により、わずか〜２〜３×１０４というリン酸化事象の検出及び定量化がルーチン的に達成され、このことはその検出を「単」細胞レベルに導く。 
【０３７５】
スライドプリンティング：接触型マイクロアレイプリンター（Ｇｅｎｅｔｉｘ社）を用いて、１６パッドのニトロセルロースＦＡＳＴスライド（Ｗｈａｔｍａｎ社）上にプリントした。
【０３７６】
ＦＮＡ：凍結した乳癌組織はＰｒｏｔｅｏＧｅｎｅｘ社の製品であった。患者は全て、ステージＩＩ又はＩＩＩの乳管癌を有する白人であった。Ｇ２３ニードルを用いて凍結腫瘍組織に５〜１０回通すことによってＦＮＡ試料を採取した。採取したＦＮＡを溶かしそして近接アッセイを実施するまで−８０℃で保存した。
【０３７７】
ＣＴＣ：ＣＴＣ−Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（Ｖｅｒｉｄｅｘ社）を用いて抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体でコーティングされた磁性粒子により癌患者の全血からＣＴＣを単離した。濃縮ＣＴＣを活性化し、溶解させ、そしてアッセイの実施まで−８０℃で保存した。
【０３７８】
結果
感度：
本発明者らは、細胞系Ａ４３１及びＳＫＢＲ−３において単細胞の感度レベルでＥＧＦＲ及びＨＥＲ２の活性化及び発現を検出した。これらの細胞系は、それらの細胞膜上で１細胞当たり全ＲＴＫ〜１×１０６を発現するが、全ＲＴＫのサブセットだけがリン酸化されており、このようなリン酸化は経路活性化に必要とされる。両方の細胞系はそれらの活性化されたＲＴＫの約１０％でピークに達する（１細胞当たり〜１×１０５リン酸化事象）。本発明者らのフォーマットは、図１１に示したように、本発明者らが単細胞感度で１０５より少ない活性化事象を検出することを可能にした。
【０３７９】
凍結組織ＦＮＡ：本発明者らのアッセイフォーマットの有用性をさらに証明するために、本発明者らは、２９例のステージＩＩ又はＩＩＩの凍結乳管癌（１４例は既知のＨＥＲ２−ＩＨＣ状態を有する）からＧ２３ニードルを用いてＦＮＡ試料を採取した。本発明者らのアッセイによって検出されたＨＥＲ２受容体の発現及び活性化は腫瘍ＩＨＣスコアと一致する（図１２）。本発明者らは、４例の患者が原発性腫瘍において高いＩＨＣスコア（３＋）を有していることを知っており、この４例の患者は皆、ＨＥＲ２の高い発現及び高い活性化を有している。興味深いことに、ＨＥＲ２発現（＋１ ＩＨＣ）を有するＥＲ陽性患者の２０％はかなりの量の活性化ＨＥＲ２を有する。このことは、ホルモン療法に対して耐性の患者において意味を有していることができよう。
【０３８０】
図１３（上部）は、既知のＨＥＲ２ ＩＨＣ状態を有する１２例のＦＮＡ試料由来のリン酸化ＥｒｂＢ受容体（ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びｐ９５）、ＰＩ３Ｋ、及びＳＨＣのレベルを説明する「ヒートマップ」を示す。この図に示されたデータは、近接アッセイフォーマットにより検出されたＨＥＲ２受容体の活性化が原発性腫瘍ＩＨＣスコアと一致することを確証する。図１３（下部）は、既知のＨＥＲ２ ＩＨＣ状態を有するＦＮＡ試料のサブセット中のトータルＨＥＲ２及びｐ９５レベルのウェスタンブロット分析を示す。
【０３８１】
ＣＴＣ：転移性癌を有する患者の血液からＣＴＣを単離した。とりわけ、２７例の転移性乳癌患者及び６０例の健常なボランティアの全血に由来するＣＴＣを、ＥＧＲＦ（ＨＥＲ１）及びＨＥＲ２発現及び活性化について分析した。原発性腫瘍において陰性ＨＥＲ２発現であってかつＣＴＣにおいてＨＥＲ２陽性への転換を有する乳癌患者の数を図１４に示す。重要なことには、ＨＥＲ２陰性原発性腫瘍を有する患者の２９％が増幅されかつ活性化されたＨＥＲ２を伴うＣＴＣを有していた。図１５は、ＩＨＣ画像法（Ｖｅｒｉｄｅｘ社）によるＣＴＣ中のＨＥＲ２の発現の確認を示している。
【０３８２】
検出の限界：６０例の健常な対照の試験に基づいて、トータル及びリン酸化ＨＥＲ１及びトータル及びリン酸化ＨＥＲ２について検出の下限（ＬＯＤ）及び定量化の下限（ＬＬＯＱ）を決定した。既知レベルのＨＥＲ１又はＨＥＲ２及び刺激後のリン酸化度を発現する細胞系を用いて作成された標準曲線からの計算に基づく算出単位（computed unit）（ＣＵ）によるデータを表５に示す。
【表５】
0005718319.tif 000008
【０３８３】
結論
比類なき感度及び特異性を有する新規な技術は、癌患者から単離したＣＴＣ中のＥｒｂＢ ＲＴＫの活性化を首尾よく検出した。活性化ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２を単細胞感度で検出した。凍結乳癌組織由来のＦＮＡ試料の試験は、報告されたＨＥＲ２状態（ＩＨＣ）と本発明者らの近接アッセイを用いた結果との間での一致を示した。ＣＴＣの連続的サンプリングにおけるキナーゼ及び他のシグナル伝達経路分子の発現／活性化プロファイリングは、時間及び療法の関数としての腫瘍細胞中に生ずる変化についての有用な情報を提供する。この方法は、適切量であるが限られた量の試料、例えば、ＣＴＣ、転移性ＦＮＡ、気管支洗浄液などを分析することにより、標的化治療手段の初期選択に対してだけでなく、それぞれの患者において急速に「進展する」癌シグニチャーに対するその後の監視においても、指針を提供することができる。
【０３８４】
重要なことには、本発明の方法は、ＨＥＲ２などの所定のＥｒｂＢ ＲＴＫの活性化及び／又は発現状態に関して原発性腫瘍とＣＴＣとの間で変化が生じた患者の同定を可能にする。例えば、活性化ＨＥＲ２を有するＣＴＣがＨＥＲ２陰性原発性腫瘍を有する転移性乳癌患者の２９％に見出されたが、このことは、ＨＥＲ２陰性原発性腫瘍のＨＥＲ２陽性ＣＴＣへの転換を検出しそして治療決定（例えば、ＨＥＲ２陽性ＣＴＣの検出に基づくＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）療法）を誘導する上で本明細書に記載した方法の有用性を示している。転移性ステージにおいて見出されるＣＴＣは最も侵攻性の侵入細胞集団を表すので、連続的なＣＴＣプロファイリングはより良好な療法選択／調整及び疾患監視に導くことができる。
【０３８５】
参考文献
１．Cristofanilli M. Budd GT, Ellis MJ, Stopeck A, Matera J, Miller MC, Reuben JM, Doyle GV, Allard WJ, Terstappen LW, Hayes DF.  Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N Engl J Med 351:781-91, 2004
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２．Riethdorf S, Fritsche H, Muller V, Rau T, Schindlbeck C, Rack B, Janni W, Coith C, Beck K, Janickje F, Jackson S, Gornet T, Cristofanilli M, Pantel K.  Detection of circulating tumor cells in peripheral blood of patients with metastatic breast cancer: a validation study of the CellSearch system. Clin Cancer Res 13:920-8, 2007
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３．Cristofanilli M, Broglio KR, Guarneri V, Jackson S, Fritsche HA, Islam R, Dawood S, Reuben JM, Kaum SW, Lara JM, Krishnamurthy S, Ueno NT, Hortobagyi GN, Valero V.  Circulating tumor cells in metastatic breast cancer: biologic staging beyond tumor burden. Clin Breast Cancer 7:471-9, 2007
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４．Tanner M, Ja¨rvinen P, and Isola J.  Amplification of HER-2/neu and Topoisomerase IIa in Primary and Metastatic Breast Cancer. Cancer  Research 61, 5345-5348. 2001
【０３８９】
５．Tapia C, Savic S, Wagner U, Rene Schonegg R, Hedvika Novotny H, Grilli B, Herzog M, Barascud A, Zlobec I, Cathomas G, Terracciano L, Feichter G, Bubendorf L.  HER2 gene status in primary breast cancers and matched distant  metastases. Breast Cancer Research 9,  R31. 2007
【０３９０】
６．Lear-Kaul K, Yoon H, Kleinschmidt-DeMasters BK, McGavran L, Singh M.  HER-2/neu Status in Breast Cancer Metastases to the Central Nervous System. Arch Pathol Lab Med, 127, 1451-1457. 2003
【０３９１】
７．Simmons C, Miller N, Geddie W, Gianfelice D, Oldfield M, Draitsaries G, Clemons M.  Does confirmatory tumor biopsy alter the management of breast cancer patients with distant metastases? Ann of Oncology, doi:10.1093/ annonc/ mdp028, 2009
【０３９２】
８．Fabi A, Benedetto A, Metro G, Melucci E, Vici P, Nistico C, Fussillo M, Cognetti F, Mottolese M.  Changes in HER2 overexpression between primary tumor and autologous metastases: Correlations with clinical and biological features
【０３９３】
９．Meng S, Tripathy D, Shete S, Ashfaw R, Saboorian H, Haley B, Frenkel E, Euhus D, Leitch M, Osborne C, Clifford E, Perkens S, Beitsch P, Khan A, Morrison L, Herlyn D, Terstappen LW, Lane N, Wang J, Urh J.  uPAR and HER-2 gene status in individual breast cancer cells from blood and tissues. PNAS 103:17361-4, 2006
【０３９４】
１０．Meng S, Tripathy D, Shete S, Ashfaw R, Haley B, Perkins S, Beitsch P, Khan A, Euhus D, Osborne C, Frenkel E, Hoover S, Leitch M, Clifford E, Vitetta E, Morrison L, Herlyn D, Terstappen L, Flemming T, Fehm T, Tucker R, Lane N, Wang J, Uhr J.  HER-2 gene amplification can be acquired as breast cancer progresses. PNAS 101:9393-8. 2004
【０３９５】
１１．Pusztai L, Ayers M,  Stec J, Clark E, Hess K, Stivers D, Damokosh A, Sneige N, Buchholz TA, Esteva FJ, Arun B, Cristofanilli M, Booser D, Rosales M, Valero V, Adams C, Hortobagyi GN, and Symmans FW.  Gene Expression Profiles Obtained from Fine-Needle Aspirations of Breast Cancer Reliably Identify Routine Prognostic Markers and Reveal Large-Scale Molecular Differences between Estrogen-negative and Estrogen-positive Tumors. Clinical Cancer Research, Vol. 9, 2406-2415, July 2003
【０３９６】
実施例４．Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）感受性及び耐性細胞中のＥｒｂＢファミリー受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）活性化の分析
本例は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）感受性細胞及びＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）耐性細胞中のＥｒｂＢ活性化及び二量体形成の分析を示す。とりわけ、本例は、活性化ｐ９５／ＨＥＲ３ヘテロ二量体の増加したレベルがＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）に対する耐性と関連付けられることを示す。本例は、高レベルの活性化ｐ９５及びＨＥＲ２がＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）耐性細胞中に存在することも示す。最後に、本例は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）感受性細胞が低レベルの活性化ｐ９５、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びＰＩ３Ｋを有することを示す。従って、活性化ｐ９５／ＨＥＲ３ヘテロ二量体レベル及び／又は活性化ｐ９５、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及び／又はＰＩ３Ｋレベルにおける何らかの変化の存否を検出することによって、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）治療の有効性を評価し及び最適化することができる。この方法は、有利なことに、より事実に通じた療法選択／調整及び疾患監視に導く。
【０３９７】
Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）耐性細胞系（ＢＴ／Ｒ）：ＢＴ−４７４細胞から細胞をクローニングした。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）はＢＴ／Ｒ細胞中のＨＥＲ２リン酸化及び細胞増殖を阻害しない。ＢＴ／Ｒ細胞及びＢＴ−４７４細胞試料を、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）１００μｇ／ｍＬを用いて２、８、及び２４時間処理した。これらの細胞を溶解させ、ＢＣＡタンパク質アッセイによってタンパク質濃度を決定した。
【０３９８】
図１６は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）処理におけるＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）感受性ＢＴ４７４細胞では、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）処理を行わないＢＴ４７４細胞と比較して、ＨＥＲ２のリン酸化の有意な阻害があったことを示す。図１６は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）耐性ＢＴ／Ｒ細胞がＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）処理においてＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）感受性ＢＴ４７４細胞と比較して有意に高いＨＥＲ２の活性化を示したことも示している。図１６はさらに、ＢＴ４７４細胞及びＢＴ／Ｒ細胞の両方についてＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）処理を行わない同じ細胞と比較して、トータルＨＥＲ２レベルにおいて穏やかな減少があったことを示す。
【０３９９】
図１７は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）耐性ＢＴ／Ｒ細胞がＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）処理においてＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）感受性ＢＴ４７４細胞と比較して有意に高いｐ９５ＨＥＲ２の活性化を示したことを示している。図１７は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）耐性ＢＴ／Ｒ細胞がＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）処理においてＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）感受性ＢＴ４７４細胞と比較してＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びＰＩ３Ｋの増加した活性化を示したことも示す。図１８は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）を用いて処理されたＢＴ４７４細胞及びＢＴ／Ｒ細胞の両方におけるＨＥＲ１、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、及びＳＨＣの発現を示す。
【０４００】
図１９は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）の非存在下でのＢＴ４７４細胞におけるＥｒｂＢ経路の模式図を示す。ＨＥＲ２／ＨＥＲ２二量体及びＨＥＲ２／ＨＥＲ３二量体を検出した。ＨＥＲ１／ＨＥＲ２二量体は極めて弱かった。ｐ９５／ＨＥＲ３二量体はＢＴ／Ｒ細胞中より３〜４倍弱かった。
【０４０１】
図２０は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）処理を用いたＢＴ４７４細胞におけるＥｒｂＢ経路調節の模式図を示す。ＨＥＲ２／ＨＥＲ２二量体及びＨＥＲ２／ＨＥＲ３二量体はダウンレギュレートされた。ｐ９５／ＨＥＲ３レベルには変化がなかった。
【０４０２】
図２１は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）の非存在下でのＢＴ／Ｒ細胞におけるＥｒｂＢ経路の模式図を示す。ＨＥＲ２／ＨＥＲ２二量体及びＨＥＲ２／ＨＥＲ３二量体はＢＴ４７４細胞中より２〜３倍強かった。ＨＥＲ１／ＨＥＲ２二量体は弱いシグナルを与えた。ｐ９５／ＨＥＲ３はＢＴ４７４細胞中より〜３倍強かった。
【０４０３】
図２２は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）処理を用いたＢＴ／Ｒ細胞におけるＥｒｂＢ経路調節の模式図を示す。ＨＥＲ２／ＨＥＲ２二量体は２時間の時点で増加し、その後で減少した。ＨＥＲ２／ＨＥＲ３二量体はダウンレギュレートされた。ＨＥＲ１／ＨＥＲ２二量体はダウンレギュレートされた。ｐ９５／ＨＥＲ３は増加し、その後に安定化した。
【０４０４】
実施例５．典型的な近接アッセイスライドフォーマット
本例は、本発明の近接アッセイの１つの好ましい実施形態を説明する。この実施形態の近接アッセイは、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）及び／又は組織試料（例えば、ＦＮＡ）中の標的タンパク質の発現及び活性化を測定する抗体−マイクロアレイをベースとしたプラットフォームを用いる。この近接アッセイは、ＨＥＲ１及びＨＥＲ２のリン酸化の程度を分析することによってタンパク質発現のレベル及び活性化の状態を分析する。或る場合に、この実施形態の近接アッセイは、ＣＴＣ−Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（Ｖｅｒｉｄｅｘ社）を用いて抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体でコーティングされた磁性粒子により全血約７．５ｍＬから単離されたＣＴＣを用いる。次いで、単離されたＣＴＣを成長因子（例えば、ＥＧＦ＋ヘレグリン）で刺激した後、その後のＥｒｂＢ経路発現／活性化に対する免疫分析を行うことができる。
【０４０５】
所定の場合には、この実施形態の近接アッセイはスライドフォーマットを用いそして複数の標準物質及び対照を含む。図２３は、トータル及びリン酸化ＨＥＲ１及びＨＥＲ２レベルを分析するための典型的なスライドフォーマットのアレイデザインを示す。各スライド上には１６のパッドがあり、各パッド上には３００スポット用の場所が備えられている。接触型マイクロアレイプリンターを用いて１６パッドニトロセルローススライド上にプリントした。各スポットは、追跡用染料及び連続希釈により三連にプリントされた特異的捕捉抗体（Ａｂ）又は対照のいずれかを含んでいる。捕捉Ａｂを１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、及び０．２５ｍｇ／ｍＬでプリントした。トータル及びホスホ（Phospho）両方のアッセイにおけるオリエンテーション参照として精製ＩｇＧをプリントした。試薬対照としてＢＳＡ−ホスホをプリントした。分析キャリブレーション反応を８パッド上で及び内部品質管理反応を２パッド上で実施する。各スライドで、４つまでの未知患者試料の処理を行うことができる。トータルの標的タンパク質又はリン酸化された活性化タンパク質の発現を、目的のタンパク質を発現する陽性の細胞系由来の希釈溶解物の標準曲線からの計算に基づく単位である、算出単位（ＣＵ）により報告することができる。それぞれの試料に対して２つの別個のスライドを用い；一方のスライドを全血から単離された細胞中の標的タンパク質の発現を検出するために（「全アッセイスライド」）そして他方を標的タンパク質活性化の程度を検出するリン酸化の検出に（「ホスホアッセイスライド」）用いる。
【０４０６】
この実施形態において、患者及び正常対照個体からの全血をＥＴＤＡチューブに採取する。採血の間のあらゆる皮膚細胞汚染を防ぐために、本発明者らの方法では、採取した最初の血液３ｍＬを廃棄する（又はＣＴＣ計数及びＣｅｌｌＳｅａｒｃｈキットを用いた可視的免疫染色のためにＣｅｌｌＳａｖｅチューブに採取する）ことを明記している。次いで、２つの追加のＥＤＴＡチューブを用いてそれぞれのチューブに全血７．５ｍＬを採取する。次いで、自動化磁性細胞分離装置（Ｖｅｒｉｄｅｘ ＡｕｔｏＰｒｅｐ）を用いてそれぞれのチューブからＣＴＣを単離する。次いで、濃縮された試料を合して、成長因子を用いて刺激する。次いで、活性化された細胞を溶解させ、すぐに処理するか又はその後の免疫分析のために−８０℃で保存する。
【０４０７】
刺激された細胞の溶解物中のタンパク質標的をイムノ−マイクロアレイ表面上の捕捉抗体とインキュベートすることにより、この実施形態の近接アッセイを開始する。細胞溶解物中のあらゆるＨＥＲ１又はＨＥＲ２ ＲＴＫはそれらの対応する捕捉抗体に結合し、引き続いて２つの追加の検出子抗体によって固有の免疫複合体が形成される。検出子抗体の１つはグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）にコンジュゲートされておりグルコースの存在下でＨ２Ｏ２を発生する。第２のＨＲＰコンジュゲート検出子抗体が前記免疫複合体内で近接して結合すると、陽性シグナルが生成される。引き続いてのチラミド媒介性シグナル増幅プロセスはアッセイの感度を高める。３つの特異的Ａｂが異なるエピトープに同時に結合することによりタンパク質検出の特異性が高められ、そして感度は増幅によって単細胞ほどの高感度となることができる。図２４は、リン酸化ＨＥＲ１を検出するための典型的な近接アッセイの模式図を示す。
【０４０８】
本明細書に記載したマイクロアレイプラットフォームは多重化の利益を提供する。アッセイを拡大する能力は、限られた利用可能な試料から複数の受容体及びシグナル伝達分子の測定を行うハイコンテンツな分析を可能にする。マイクロアレイはスケーラブルであり、臨床的に有用な診断アッセイに必要なスループットを達成する潜在能力を有している。
【０４０９】
実施例６．マイクロアレイイムノアッセイを用いたＨＥＲ２受容体及び他の受容体チロシンキナーゼの切断形の検出
ＨＥＲ２過剰発現性の乳癌は予後不良であり、ＨＥＲ２標的化モノクローナル抗体療法に対して耐性であることが多い。初めからの耐性又は獲得耐性のメカニズムの１つは、アミノ末端細胞外ドメインを消失している切断ＨＥＲ２受容体であるｐ９５ＨＥＲ２の発現である。ヘテロ二量体を形成する潜在能力を有する様々な形態のＨＥＲ２受容体及び他の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を原発性腫瘍及び転移性腫瘍におけるヘテロ二量体の発現レベル及び活性化の程度についてプロファイリングする方法は、変化する疾患原因への有用な洞察を提供する。
【０４１０】
方法：本明細書に記載した技術はＥｒｂＢファミリーＲＴＫ中のリン酸化事象を特異的に検出することができる。多重化タンパク質マイクロアレイプラットフォームは、標的タンパク質がマイクロアレイ表面上に捕捉されると２つの検出子の酵素コンジュゲート抗体の共局在性を要件として特有な免疫複合体が形成されることを利用する。近接した２つの検出子酵素（グルコースオキシダーゼ及び西洋ワサビペルオキシダーゼ）間のチャネリング事象は極限感度でのＲＴＫのプロファイリングを可能にした。分析上の特異性は、３つの異なる抗体の同時結合の要件を前提として大きく高められる。検出子抗体の異なる配置は切断された標的（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２）のその正常のカウンターパート（例えば、ＨＥＲ２）からの区別された検出を可能にする。様々なＥＲ／ＰＲ／ＨＥＲ２状態を有する乳癌患者（ステージＩＩ〜ＩＶ）から採取された２４０例のＦＮＡ試料を用いたシグナル伝達経路分子の発現及び活性化についての首尾よいプロファイリングを本明細書に記載する。
【０４１１】
Ｇ２３ゲージニードルを用いて採取したＦＮＡ試料を、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、Ｓｈｃ及びＩＧＦ−１Ｒを含む様々なＲＴＫの発現及び活性化状態について分析した。その結果は、以下を示す：
▼原発性ＨＥＲ２−ＩＨＣ状態とＨＥＲ２発現との間の１００％一致
▼ＨＥＲ２陽性（ＨＥＲ２：３＋及び２＋でＦＩＳＨ＋）患者の４０％を超える患者における様々な程度のｐ９５ＨＥＲ２の存在
▼ｐ９５ＨＥＲ２発現体の〜５０％は活性化ｐ９５ＨＥＲ２を有していた
▼ＨＥＲ２陽性試料の２５％は或るレベルのＨＥＲ１活性化も有していた
▼ＨＥＲ２陰性（ＨＥＲ２：２＋でＦＩＳＦ−、１＋及び０）試料もＨＥＲ２発現と１００％一致したが、それらの多くは低いが有意なレベルのＨＥＲ２及びＨＥＲ１活性化を示した。
これらの知見を適切な標的化治療手段の選択に用いることができる。
【０４１２】
考察：多重化イムノ−マイクロアレイを用いて、様々なＥＲ／ＰＲ／ＨＥＲ２状態を有する固有の乳癌患者から採取された２４０例のＦＮＡ試料中のｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ２、他のＲＴＫ（ＨＥＲ３、ＨＥＲ１、ＩＧＦ−１Ｒ、ＳＨＣ、及びＰＩ３Ｋを含む）の発現及びリン酸化を検出した。拡大された経路パネルを用いて様々な転移部位の腫瘍をプロファイルすることができることにより、それらの様々な転移潜在能力についての情報を与えることができた；従って、最小限の侵襲的な１回通過のｍＦＮＡ試料を用いて、疾患プロファイルが変化するにつれてそれに合わせた療法を選択することができる。
【０４１３】
実施例７．治療的意味としての循環腫瘍細胞を用いた再発性乳癌患者のＥｒｂＢ経路についてのプロファイリング
ＨＥＲ２は上皮成長因子受容体ファミリーにおける４つの膜貫通受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の１つであり、ＨＥＲ２陽性表現型はＨＥＲ２遺伝子増幅を伴う侵攻性サブタイプの乳癌と関連付けられてきた。ＩＨＣ又はＦＩＳＨ分析により乳癌の約１５〜２０％がＨＥＲ２陽性であると考えられる。再発転移性疾患に見出される循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）と原発性腫瘍との間のＨＥＲ２発現状態の変化は有意な頻度で生ずることが報告されている。連続的に採取されたＣＴＣ中のＨＥＲ２発現及びリン酸化を検出する方法は全体的な疾患プロファイル変化への有用な洞察を提供することができ、従って個々の患者に対する療法の組み合わせのより良い選択に導くことができる。
【０４１４】
方法：標的分子におけるリン酸化を検出するために、三重抗体−酵素チャネリング多重化タンパク質マイクロアレイプラットフォームを開発した。標的タンパク質がマイクロアレイ表面上に捕捉されると２つの検出子の酵素コンジュゲート抗体の共局在性を介した免疫複合体が形成されることによって典型的な高いアッセイ特異性を達成した。近接した２つの検出子の酵素間のチャネリング事象は、単細胞レベル感度でのＲＴＫのプロファイリングを可能にした。臨床試料について本発明の方法の妥当性確認をするために、様々な療法レジメンによる７７例の乳癌患者由来のＣＴＣを、該患者の治療過程に沿って様々な時点で分析した。
【０４１５】
結果：７７例の転移性癌患者及び６０例の健常ボランティアの全血由来のＣＴＣを、ＨＥＲ２発現及び活性について分析した。再発性疾患について有意なＨＥＲ２状態転換が観察された。原発性腫瘍で陰性のＨＥＲ２発現を有する患者の２９％が単離されたＣＴＣ中でＨＥＲ２増幅を示した。原発性ＨＥＲ２陰性疾患を有する患者の５２％に、リン酸化ＨＥＲ２受容体が見出された。近接媒介性イムノアッセイを用いたアッセイ感度及び特異性の向上は、単離されたＣＴＣをリガンドを用いて刺激した場合のＨＥＲ２活性化（増幅を有しない場合でさえ）の検出を可能にした。
【０４１６】
考察：本発明の多重化された近接媒介性イムノアッセイは、再発性乳癌患者から単離されたＣＴＣ中でＨＥＲ２ ＲＴＫの発現及びその活性化の程度を首尾よく検出した。転移性ステージで見出されたＣＴＣは最も侵攻性かつ浸潤性の細胞集団を表しており、連続的ＣＴＣプロファイリングは、ＲＴＫ標的化療法として適切なキナーゼ阻害剤を選択することができる選択肢がある場合に、より良好な療法選択／調整及び疾患／治療監視に導く。有意な数の患者はＣＴＣ中にＨＥＲ２増幅を獲得したが、再発転移性疾患においては実質的により高率のＣＴＣ−ＨＥＲ２活性化が見出された。本発明の特有の三重抗体媒介性イムノマイクロアレイ分析はＣＴＣ−ＨＥＲ２の単細胞レベルのプロファイリングを可能にした。この原理をさらに、他のシグナル伝達経路分子の発現／活性化をプロファイリングするのに適用する。連続的に採取されたＣＴＣをプロファイリングできることにより、時間及び療法の関数として腫瘍細胞中に生ずる変化についての有用な情報が提供される。本発明の方法は、標的化治療手段の初期選択に対してだけでなく、それぞれの患者において急速に「進展する」癌シグニチャーに対するその後の監視においても、指針を提供することができる。
【０４１７】
実施例８．イムノ−マイクロアレイをベースとした経路分析を用いるＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）耐性の特徴付け
背景：ＨＥＲ２過剰発現性の乳癌は予後不良であり、ＨＥＲ２標的化モノクローナル抗体療法に対して耐性であることが多い。初めからの耐性又は獲得耐性のメカニズムの１つは、ｐ９５ＨＥＲ２の発現によるもの及び／又はＥｒｂＢ受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ファミリーの他のメンバーとのヘテロ二量体を形成することによるものである。癌細胞はシグナル伝達経路の重複性も利用し、ＩＧＦ−１Ｒなどの非ＥｒｂＢ ＲＴＫとヘテロ二量体を形成する。この例は、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体療法に対する様々な感受性を有するＨＥＲ２増幅細胞系を用いてＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）耐性のメカニズムの特徴付けを説明する。ＨＥＲ２増幅を伴う乳癌をさらに他の経路分子についてサブプロファイリングして最も効果的な標的化薬剤を同定するべきである。
【０４１８】
方法：ＥｒｂＢファミリーＲＴＫ（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びＨＥＲ１）、それに続く下流の経路分子（例えば、Ｓｈｃ及びＰＩ３Ｋ）、及び非ＥｒｂＢ ＲＴＫ（例えば、ＩＧＦ−１Ｒ）における発現レベル及びリン酸化度を特異的に検出することができる新規の技術を開発した。この多重化タンパク質マイクロアレイプラットフォームは、標的タンパク質がマイクロアレイ表面上に捕捉されると２つの検出子の酵素コンジュゲート抗体の共局在性を要件として特有な免疫複合体が形成されることを用いる。近接した２つの検出子の酵素（グルコースオキシダーゼ及び西洋ワサビペルオキシダーゼ）の間のチャネリング事象は、極限感度でのＲＴＫのプロファイリングを可能にする。３つの異なる抗体の同時結合の要件を前提として分析特異性が大きく高められる。検出子抗体の異なる配置は、切断された標的（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２）のその正常のカウンターパート（例えば、ＨＥＲ２）からの特異的な検出を可能にする。この例は、ＨＥＲ２標的化モノクローナル抗体療法に対して様々な感受性を有するＨＥＲ２増幅細胞におけるＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）処理による、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ、Ｓｈｃ、及びＩＧＦ−１Ｒを含む、ｐ９５ＨＥＲ２に関連した（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体）及び関連しないシグナル伝達経路分子の特異的なパターンを説明する。
【０４１９】
結果：
●Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）耐性ＢＴ４７４細胞は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）で処理された際にＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）感受性細胞集団より約５倍強いｐ９５ＨＥＲ２媒介性経路活性化を示した。
●Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）耐性細胞集団において、２〜３倍高いレベルのリン酸化ＨＥＲ２及びＨＥＲ３のほかに、弱いＨＥＲ１活性化も見出された。
●Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）処理は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）感受性細胞においてＨＥＲ２及びＨＥＲ３ ＲＴＫの間でリン酸化レベルを低下させた。
【０４２０】
考察：多重化イムノマイクロアレイを用いて、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ２、ヘテロ二量体を形成する潜在能力を有する他のＲＴＫ（ＨＥＲ３、ＨＥＲ１、及びＩＧＦ−１Ｒを含む）、及び下流経路分子（Ｓｈｃ及びＰＩ３Ｋを含む）の発現及びリン酸化を検出した。本発明の多重化イムノマイクロアレイは、その固有の三重イムノアッセイフォーマットにより極めて高い特異性及び感度を有しているので、限られた量の試料（例えば、ＣＴＣ及びＦＮＡ）に対して用いることができる特有の潜在能力を有している。連続的に採取した試料を可能性のある標的化薬剤を用いて処理することができ、そして処理後の経路分析を行って、このような処理の有効性のレベルへの機構的な洞察を提供することができた。このプラットフォームは、最も効果的な療法を選択し及び施された療法を監視するための関連する臨床情報を提供する。
【０４２１】
実施例９．Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）耐性の特徴付け
ＨＥＲ２の全長及び切断形（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２）におけるリン酸化事象を特異的に検出することができる新規の技術を開発した。ここで、本発明者らは、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体療法に対して様々な感受性を有するＨＥＲ２増幅細胞系を用いて、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）耐性のメカニズムの特徴付けを報告する。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）処理におけるＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）感受性及びＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）耐性のＨＥＲ２増幅細胞中のｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びＰＩ３Ｋの特異的な活性化パターンを報告する。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）耐性ＢＴ４７４細胞は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）を用いた処理においてＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）感受性細胞より有意に高いｐ９５ＨＥＲ２のリン酸化を示したが、トータルＨＥＲ２及びｐ９５ＨＥＲ２の発現は感受性細胞及び耐性細胞のいずれでも減少した。活性化ｐ９５ＨＥＲ２の発現などの耐性の潜在的メカニズム及び経路活性化の分析を用いて、特定の患者を最も利すると考えられる標的化療法を選択し及び経時的に療法に対する応答を監視する。
【０４２２】
ＨＥＲ２は乳癌の約２５％で過剰発現されており、その過剰発現は予後不良と関連付けられる。ＨＥＲ２標的化モノクローナルＡｂ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））を用いた標的化療法は、実質的な臨床的利益を提供する。しかしながら、ＨＥＲ２過剰発現性乳癌を有する多くの患者は初めからの耐性のために応答しないか又は経時的にＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）に対する耐性を獲得する。ＩＧＦ−１Ｒの活性化、ｃ−ＭＥＴの活性化、及びＰＴＥＮの不活性化又は低下を含む、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）耐性についての多数の潜在的メカニズムが記載されてきた。耐性の別の潜在的メカニズムは、細胞外ドメインを欠くがキナーゼ活性を有するＨＥＲ２受容体の切断形の発現である。ｐ９５ＨＥＲ２として知られる切断ＨＥＲ２はＨＥＲ２を過剰発現する乳癌の約３０％で発現される（Scaltriti 2007）。ｐ９５はＨＥＲ３をヘテロ二量体化することができ、ヘレグリンを用いた活性化はｐ９５ＨＥＲ２リン酸化を誘導する。チロシンキナーゼ阻害剤によってｐ９５の活性化を阻害することができるがＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）によっては阻害されない（Xia 2004）。原発性乳房腫瘍組織中の高いレベルのｐ９５の存在は、ＨＥＲ２陽性乳癌患者のサブセットを悪い結果に対してマークする、強力な予後診断因子であることが示された（Saez 2006）。ここで、本発明者らは、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体療法に対する様々な感受性を有するＨＥＲ２増幅細胞系を用いたＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）耐性のメカニズムの特徴付けを報告する。
【０４２３】
方法
ＥｒｂＢファミリーＲＴＫ（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びＨＥＲ１）、それに続く下流の経路分子（例えば、ＰＩ３Ｋ）、及び非ＥｒｂＢ ＲＴＫ（例えば、ＩＧＦ−１Ｒ及びｃ−ＭＥＴ）における発現レベル及びリン酸化度を特異的に検出することができる新規の技術を開発した。
１．マイクロアレイ表面上に連続希釈によりプリントされた標的特異的抗体によって選択された標的を捕捉する。このフォーマットは、２つの追加の検出子−酵素結合抗体の共局在性を利用することができる（図２４に図示）。
２．捕捉抗体による最初の標的結合及び捕捉された標的分子上の交替エピトープを認識するグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）コンジュゲート抗体の二次結合により形成された免疫複合体は、ＧＯ基質であるグルコースの存在下にＨ２Ｏ２を生成することができる。
３．次いで、前記捕捉された標的に結合する西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしたホスホ−ペプチド特異的抗体により標的特異的なＨ２Ｏ２の局所的流入が利用される。３つの異なる抗体の同時結合の要件によってリン酸化標的の検出に対する特異性が大きく高められる。この方法により、わずか〜２〜３×１０４というリン酸化事象の検出及び定量化がルーチン的に達成される。
●スライドプリンティング：非接触型マイクロアレイプリンター（Ｇｅｓｉｍ社）を用いて１６パッドのニトロセルロースＦＡＳＴスライド（Ｗｈａｔｍａｎ社）上にプリントした。
【０４２４】
図２５は、トータル及び活性化全長及び切断ＨＥＲ２の検出を示す。ＢＴ４７４細胞溶解物を、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）又は細胞内ドメイン（ＩＣＤ）に対するＡｂを用いて免疫沈降させた後、ホスホチロシン又はＩＣＤのいずれかに対するＡｂを用いてウェスタンブロットした。
【０４２５】
図２６は、トータル及びリン酸化ｐ９５の検出を示す。細胞外ＨＥＲ２エピトープ（ＥＣＤ）及び細胞内ＨＥＲ２エピトープ（ＩＣＤ１、ＣＤ２、及びＩＣＤ３）に対する捕捉抗体をプリントした。表示した数の細胞を有するＢＴ４７４細胞溶解物を試験し、トータル及び活性化ｐ９５ＨＥＲ２の発現を決定した。結果は、１０〜５０細胞の感度を実証している。
【０４２６】
図２７は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）を用いた処理が耐性細胞において全長及び切断ＨＥＲ２の活性化レベルを増加させるが感受性細胞においては増加させないことを示している。感受性（ＢＴ４７４）細胞及び耐性（ＢＴ／Ｒ）細胞を様々な時間にわたりＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）を用いて処理しそして溶解させた。細胞溶解物を、トータルＨＥＲ２（Ａ）及びリン酸化ＨＥＲ２（Ｃ）の発現について並びに全ｐ９５ＨＥＲ２（Ｂ）及びリン酸化ｐ９５ＨＥＲ２（Ｄ）の発現について分析した。
【０４２７】
図２８は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）を用いた処理並びに様々な時点における感受性（ＢＴ４７４）細胞及び耐性（ＢＴ／Ｒ）細胞中のＨＥＲ３及びＰＩ３Ｋの活性化レベルを示す。
【０４２８】
要約
全長及び切断ＨＥＲ２を、高感度多重イムノアッセイにより分析した。
【０４２９】
Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）耐性ＢＴ４７４細胞は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）を用いた処理においてＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）感受性細胞より有意に高いｐ９５ＨＥＲ２のリン酸化を示した。
【０４３０】
トータルＨＥＲ２及びトータルｐ９５ＨＥＲ２の発現は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）を用いて処理された感受性細胞及び耐性細胞のいずれにおいても減少した。
【０４３１】
Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）を用いて処理された細胞中のＨＥＲ３及びＰＩ３Ｋリン酸化は、早期時点では耐性細胞でより高いが、後の時点では感受性細胞及び耐性細胞中の活性化されたＨＥＲ３及びＰＩ３Ｋのレベルは同様である。
【０４３２】
ＩＧＦ−１Ｒ及びｃ−ＭＥＴの発現及びリン酸化レベルは感受性及び耐性ＢＴ４７４細胞で同等であった。
【０４３３】
このアッセイは、その高い特異性及び感度により、限られた試料中の全長及び切断ＨＥＲ２を検出することができ、そして循環腫瘍細胞及び微細針吸引液に対して用いることができる能力を有している。活性化ｐ９５ＨＥＲ２の発現などの耐性の潜在的メカニズム及び経路活性化の分析を用いて、特定の患者を最も利すると考えられる標的化療法を選択することができる。連続的に採取された試料の分析は、標的化治療の有効性のレベルへの洞察を提供することができ、そして医師が経時的に患者の療法を調整することができるようにする。
【０４３４】
実施例１０．再発性乳癌における循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）中のＨＥＲ２及び他の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の過剰発現及び活性化の検出の療法的意味
要約
ＨＥＲ２は上皮成長因子受容体ファミリーにおける４つの膜貫通ＲＴＫの１つであり、ＨＥＲ２陽性表現型はＨＥＲ２遺伝子増幅を伴う侵攻性サブタイプの乳癌と関連付けられてきた。ＩＨＣ又はＦＩＳＨ分析により乳癌の約１５〜２０％がＨＥＲ２陽性であると考えられる。最近において、再発転移性疾患に見出される原発性腫瘍とＣＴＣとの間のＨＥＲ２発現状態の変化は有意な頻度で生ずることが報告されている。連続的に採取されたＣＴＣ中のＨＥＲ２の機能的プロファイリングは全体的な疾患プロファイル変化への有用な洞察を提供することができるので、個々の患者に対する療法のより良い選択に導くことができる。治療過程の間の複数の時点で２つのコホート内の５１例の転移性癌患者及び６０例の健常ボランティアから採取した全血をＣＴＣ−ＨＥＲ２発現及び活性化について分析した。本発明者らは、再発性疾患について有意なＨＥＲ２状態の転換を観察した。原発性腫瘍においてＨＥＲ２陰性状態を有する患者の約３０％が、単離されたＣＴＣ中でＨＥＲ２過剰発現を示した。リン酸化ＨＥＲ２受容体を、原発性ＨＥＲ２陰性疾患を有する患者の５３〜６０％に見出した。
【０４３５】
序論
原発性腫瘍を調べて標的化療法に対する潜在的な応答性を決定することが治療の標準になってきている。しかしながら、標的発現、活性化及び下流細胞のシグナル伝達タンパク質の完全な特徴付けはめったに行われない。初期診断から転移性疾患の再発までの時間枠の間の腫瘍細胞集団におけるＲＴＫ発現パターンの変化は事実上全く評価されていない。原発性腫瘍中のＨＥＲ２遺伝子状態と対応するＣＴＣ中のＨＥＲ２遺伝子状態との間の良好な一致は、試料を同期的に得た場合に報告された。しかしながら、初期ＨＥＲ２陰性の原発性腫瘍を有する再発患者由来のＣＴＣはＨＥＲ２増幅を獲得することがあり（１）、このことは疾患管理を変更するのに充分な有意性の原発性病変と転移性病変との間の実質的な不一致を示している。原発性部位と転移部位との間のＨＥＲ２過剰発現における有意な不一致は乳癌においてＩＨＣを用いて報告されており（２）、そしてＣＴＣ中の獲得されたＨＥＲ２遺伝子増幅は別のグループにより確認された（３）。この疾患プロファイル変化は、細胞シグナル伝達のパターンを経時的に進展させる多くの癌の異種の腫瘍細胞集団への療法上の及び他の圧力（therapeutic and other pressures）によるものであることがある。
【０４３６】
多重化近接アッセイ：協調的近接イムノアッセイ（ＣＯＰＩＡ）は、三重抗体−酵素チャネリングシグナル増幅法と組み合わせた多重化タンパク質マイクロアレイプラットフォームに基づく。この特有かつ新規の設計は、特異性を保存しながら超高感度を与える三重抗体酵素アプローチにより提供される：（１）マイクロアレイ表面上に連続希釈によりプリントされた標的特異的抗体によって、選択された標的を捕捉する。このフォーマットは、２つの追加の検出子−酵素結合抗体の共局在性を要件とする（図２９に示す）。（２）捕捉抗体による最初の標的結合と捕捉された標的分子上の交替エピトープを認識するグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）コンジュゲート抗体の二次結合とによって形成された免疫複合体はＧＯ基質であるグルコースの存在下でＨ２Ｏ２を生成することができる。（３）次いで、捕捉された標的に結合する、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートされたホスホペプチド特異的抗体によって、標的特異的なＨ２Ｏ２の局所的流入が利用される。リン酸化された標的の検出のための特異性は、３つの異なる抗体の同時結合の要件によって大きく高められる。この方法により、わずか２〜３×１０４というリン酸化事象の検出及び定量化がルーチン的に達成され、このことはその検出を「単」細胞レベルに導く。典型的なスライド構成を図２９に示す。
【０４３７】
０７Ｏｎｃ０１コホート：局所性リンパ節又は遠隔転移を伴う組織学的に確認された固形癌を有する患者（ステージ３ｂ又は４）。ステージ３ｂ乳癌を有する患者は局所リンパ節ステージングＮ１、Ｎ２、又はＮ３を有していた。患者らの治療状態を問わず試料を採取した。
【０４３８】
０８Ｏｎｃ０２コホート：侵攻性で、転移ステージＩＶと評価できる乳癌を有する患者であって、全身治療を開始しようとしている患者。両方のコホートにおける疾患の程度は、主治医（primary physician）による理学的検査及び画像診断によって決定された。用いられた試験は以下の１つ又は２つ以上を含んでいることができる：骨スキャン、ＰＥＴ／ＣＴスキャン、腹部のＣＴ、胸部Ｘ線検査及び／又は内臓転移に対する胸部ＣＴ、ソノグラム及び／又は軟部組織疾患に対するＭＲＩ。
【０４３９】
結果
正常血液試料に基づいて参照値を設けた。活性化ＨＥＲ２（ｐＨＥＲ２）、発現ＨＥＲ２（ｔＨＥＲ２）、及びＣＫのレベルの分布を図３０に要約する。
【０４４０】
ｔ検定と同様のノンパラメトリック検定である、両側ウィルコクソン順位和検定（two-sided Wilcoxon rank sum test）を用いてｐ値を計算した。全ての比較は、統計的有意差（ｐ＜０．０１）を示す。ｐＨＥＲ２及びｔＨＥＲ２状態を決定するために、バックグランドを減算し、ＣＫ発現レベルに基づいてシグナルを重み付けした。各患者のＣＴＣ中のＨＥＲ２状態の転換を表６に要約する。経過観察過程の間の０８Ｏｎｃ０２コホート中のＨＥＲ２状態変換を図３１に示す。コ−メット及び治療評価を図３２に示す。
【表６】
0005718319.tif 000009
【０４４１】
ＣＴＣモデル系でＣＴＣ−ＨＥＲ２ ＦＩＳＨ分析を行った。全血中にスパイクされた細胞を免疫磁気的に単離しＨＥＲ２状態について分析した。対応するＣＯＰＩＡに基づく機能的ＨＥＲ２プロファイリングを図３３に要約する。
【０４４２】
要約
本例は、乳癌患者から単離したＣＴＣ中のＨＥＲ２の活性化を首尾よく検出する比類なき感度及び特異性を持った新規の技術を説明する。転移性乳癌患者由来のＣＴＣの分析により、ＨＥＲ２陰性原発性腫瘍を有する患者の〜６０％は活性化ＨＥＲ２を伴うＣＴＣを有していた一方で、〜３０％だけがＨＥＲ２の過剰発現を示したことが示された。活性化ＨＥＲ２及びＨＥＲ２の過剰発現を有する患者数が処理の１２週間にわたり増加した。ＣＯＰＩＡ対ＦＩＳＨによるＣＴＣの機能的プロファイリングを相関させた。ＢＣＡ患者におけるＣＴＣのＨＥＲ２状態の分析に対してＣＯＰＩＡとＦＩＳＨとの間の評価相関を行うことができる。
【０４４３】
ＣＴＣの連続的サンプリングにおけるキナーゼ及び他のシグナル伝達経路分子の発現／活性化プロファイリングをＣＯＰＩＡプラットフォームを用いて行うことができ、そしてこれは時間及び療法の関数として腫瘍細胞中に生ずる変化について有用な情報を提供する。この方法は、標的化治療手段の初期選択に対してだけでなく、各患者において急速に「進展する」癌シグニチャーに対するその後の監視においても、指針を提供する。本発明者らのＨＥＲ２転換の知見は、異種の原発性腫瘍細胞集団内でのＨＥＲ２陽性細胞のクローン選択又は過剰発現に対する遺伝的能力（すなわち、遺伝子増幅）の獲得によるものであることができる。ＨＥＲ２転換の背後のメカニズムを問わず、ＣＴＣ中のＨＥＲ２の存在は臨床的注意を要する。
【０４４４】
参考文献
１．Meng S, Tripathy D, Shete S, Ashfaw R, Haley B, Perkins S, Beitsch P, Khan A, Euhus D, Osborne C, Frenkel E, Hoover S, Leitch M, Clifford E, Vitetta E, Morrison L, Herlyn D, Terstappen L, Flemming T, Fehm T, Tucker R, Lane N, Wang J, Uhr J. HER-2 gene amplification can be acquired as breast cancer progresses. PNAS 101:9393-8, 2004
【０４４５】
２．Zidan J, Dashkovsky I, Stayerman C, Basher W, Cozacov C, Hadary A. Comparison of HER-2 overexpression in primary breast cancer and metastatic sites and its effect on biological targeting therapy of metastatic disease. Br J Cancer 93:552-6, 2005
【０４４６】
３．Hayes DF, Walker TM, Singh B, Vitetta ES, Uhr JW, Gross S, Rao C, Doyle GV, Terstappen LW. Monitoring expression of HER-2 on circulating epithelial cells in patients with advanced breast cancer. Int J Oncol 21:1111-7, 2002
【０４４７】
実施例１１．乳癌における活性化及び全ｐ９５ＨＥＲ２及び他の受容体チロシンキナーゼの発生率（prevalence）
要約
ＨＥＲ２過剰発現性乳癌（ＢＣＡ）は予後不良であり、ＨＥＲ２標的化モノクローナル抗体療法に対して耐性であることが多い。初めからの耐性又は獲得耐性のメカニズムの１つは、集合的にｐ９５ＨＥＲ２と呼ぶ、アミノ末端細胞外ドメインを消失している様々な形態の切断ＨＥＲ２受容体の発現である。原発性腫瘍及び転移性腫瘍におけるトランス活性化潜在能力を有する様々な形態のＨＥＲ２受容体及び他の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）をプロファイリングする方法は、変化する疾患原因への有用な洞察を与えることができる。本例は、１１０例の凍結原発性乳癌組織及び様々なＥＲ／ＰＲ／ＨＥＲ２状態を有する乳癌患者の転移部位から採取された８例のＦＮＡ試料におけるシグナル伝達経路タンパク質の発現及び活性化に対するパネルの首尾よいプロファイリングを記載する。
【０４４８】
序論
トラスツズマブ耐性についてのいくつかのメカニズムが報告されている。最初に、他のメカニズムの中でもとりわけ、他のＲＴＫ（例えば、ＩＧＦ１−Ｒ）の活性化及び切断形のＨＥＲ２の蓄積が多く報告されている。とりわけ、集合的にｐ９５ＨＥＲ２として知られる、ＨＥＲ２のアミノ末端切断カルボキシル末端断片は、ＨＥＲ２発現性乳癌細胞系及び腫瘍中に頻繁に見出される。様々なシグナル伝達経路間のクロストーク及びフィードバックループは所定の療法的圧力下に腫瘍に対する回避メカニズムを提供し又は経路依存（pathway addiction）は「経路ネットワーク分析」を行う包括的診断ツールを必要とする。いくつかの選択されたバイオマーカーに対して実施される現行のＩＨＣ／ＦＩＳＨに基づく技術から得られる臨床情報に基づいてなされる治療決定は、急速に進展する異種疾患を有する患者を治療するには効果的ではない。さらに、現在の技術はそれらの技術が「静的かつ限定された」情報を提供できるに過ぎないので限定されているだけでなく、相当量の組織も必要としている。充分量の試料を得ることは全くチャレンジングなことであったと言え、リアルタイムの疾患監視は不可能に近い。本明細書に記載した特有なアッセイプラットフォームは限られた試料量で多重分析を行うことができる、極めて分析的な特異性を提供する。検出子である抗体の異なる配置は、切断標的（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２）のその全長カウンターパート（例えば、ＨＥＲ２）からの特異的な検出を可能にする。この研究において、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３、及びＩＧＦ１Ｒ並びに下流シグナル伝達タンパク質ＰＩ３Ｋ、Ｓｈｃ、及びｃ−ＭＥＴの機能的状態（発現及び活性化）を分析した。
【０４４９】
方法
多重化近接アッセイ：協調的近接イムノアッセイ（ＣＯＰＩＡ）は、三重抗体−酵素チャネリングシグナル増幅法と組み合わせた多重化タンパク質マイクロアレイプラットフォームに基づく。この特有かつ新規の設計は、特異性を保存しながら超高感度を与える三重抗体酵素アプローチにより提供される：（１）マイクロアレイ表面上に連続希釈によりプリントされた標的特異的抗体によって、選択された標的を捕捉する。このフォーマットは、２つの追加の検出子−酵素結合抗体の共局在性を要件とする（図２９に示す）。（２）捕捉抗体による最初の標的結合と捕捉された標的分子上の交替エピトープを認識するグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）コンジュゲート抗体の二次結合とによって形成される免疫複合体はＧＯ基質であるグルコースの存在下でＨ２Ｏ２を生成することができる。（３）次いで、捕捉された標的に結合する、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートされたホスホペプチド特異的抗体によって、標的特異的なＨ２Ｏ２の局所的流入が利用される。
【０４５０】
リン酸化された標的の検出のための特異性は、３つの異なる抗体の同時結合の要件を通じて大きく高められる。本発明の方法により、わずか〜２〜３×１０４というリン酸化事象の検出及び定量化がルーチン的に達成され、このことはその検出を「単」細胞レベルに導く。
【０４５１】
凍結組織：凍結乳癌組織は、ステージＩＩ又はＩＩＩの乳管癌を有する白人の患者由来であった。採取された組織試料を溶解させ近接アッセイの実施まで−８０℃で保存した。
【０４５２】
臨床試料：侵攻性で、転移ステージＩＩＩＢ、及び／又はステージＩＶと測定することができる乳癌を有する患者であって、全身療法を開始しようとしている患者からＦＮＡ試料を採取した。患者は、ＥＣＯＧパフォーマンス状態０〜２（注：ＥＣＯＧ３＝起きている時間の５０％を超える時間がベッド又は椅子に限られ、限定されたセルフケアだけを行うことができる）を有する、組織学的に又は細胞学的に確認される浸潤性乳癌を有しているはずである。全患者が、生検に従う疾患の遠隔転移部位を有していた。Ｇ２３ゲージニードルを用いてＦＮＡ試料を採取し、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ＰＩ３Ｋ、及びＳｈｃを含む様々なＲＴＫ及び下流シグナル伝達分子の発現及び活性化状態について分析した。ＦＮＡ試料を、採取場所で「ＰｒｏｔｅｉｎＬａｔｅｒ」細胞溶解バッファを用いて直ちに処理した後に発送した。
【０４５３】
結果
１１０例の原発性ＢＣＡ組織中のｐ９５ＨＥＲ２の存在：様々なＨＥＲ２発現状態を有するＢＣＡ組織中のｐ９５ＨＥＲ２の発現を図３４（Ａ）に示す。様々なレベルのｐ９５ＨＥＲ２を有する試料中のｐ９５ＨＥＲ２リン酸化レベルを図３４（Ｂ）に示す。点の色はＩＨＣにより決定されたＨＥＲ２状態を表す。
【０４５４】
ＩＨＣとＣＯＰＩＡとの間の比較：図３５は、ＩＨＣ又は／及びＦＩＳＨ対ＣＯＰＩＡにより決定されたＨＥＲ２発現状態の間の相関を示す。２つの方法の間には約１５％の不一致があった。ＩＰ−ウェスタン分析を行って図３６に示したように不一致の試料におけるＨＥＲ２発現状態を確認した。ＣＯＰＩＡにより決定されたＨＥＲ２状態はＩＰ−ウェスタン分析との１００％相関を示した。ＩＨＣ／ＦＩＳＨにより決定されたＨＥＲ２状態の間の高いレベルの相違は、以前に多くのグループによって報告されているが、手順／判定上の変動又は腫瘍の不均一性によるものではないかと考えられる。
【０４５５】
拡大された経路分析：ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、及びＣＫのほかに、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３，ＩＧＦ１−Ｒ、ｃ−ＭＥＴ、ｃ−ＫＩＴ、ＰＩ３Ｋ、及びＳｈｃについて他の経路タンパク質の発現レベル及び活性化程度を分析した。
【０４５６】
図３７は、ＣＯＰＩＡによる機能的経路プロファイリングの例を提供する。ケース１においては、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３の両方が高く発現されているが、ＨＥＲ２だけが活性化されている。ケース２は、極めて高いレベルのＨＥＲ１、及び多少有意なレベルのＨＥＲ２及びＨＥＲ３を有するが、有意な活性化はなんら示さない。ケース３は多少のＨＥＲ２の発現を示すが、ＨＥＲ２シグナルをＣＫシグナルと比較した場合に、この患者においてＨＥＲ２は過剰発現（又は増幅）されていないことを明確に示す。ケース４のＨＥＲ２発現では、ＨＥＲ２とＣＫとの間の比がケース３より有意に高いので、ＨＥＲ２の過剰発現がよく現れている。
【０４５７】
凍結組織試料において観察される活性化レベルは、手術後の組織処理における変動のためベースラインとなるインビボ機能的プロファイルを表さないかもしれない。経路タンパク質のインビボ機能的プロファイルを監視するには、採集された試料の即時の処理が望ましい。「ＰｒｏｔｅｉｎＬａｔｅｒ」はＦＮＡ手順後の即時の試料処理に適している。
【０４５８】
ＢＣＡ ＦＮＡ分析：ＢＣＡ患者の転移部位からＦＮＡ試料を採取した。単離された細胞をすぐに「ＰｒｏｔｅｉｎＬａｔｅｒ」中に溶解させ、その後の機能的経路プロファイリングのために発送した。この研究の１つの目的は、標的化阻害剤に応答するであろう患者を同定することであった。別の目的は、標的化剤の組み合わせから利益を得るであろう患者を同定することであった。ＦＮＡ試料を、治療の前又は1週間の治療休みの間に採取した。
【０４５９】
ＦＮＡ試料から得られた細胞抽出物を、以下のシグナル伝達物質の発現及び活性化状態について分析した：ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ１、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３、ｃ−Ｍｅｔ、ＩＧＦ−１Ｒ、ｃ−Ｋｉｔ、ＰＩ３Ｋ、及びＳｈｃ。ＩｇＧ及びＣＫを対照として用いた。図３８は、この試験に用いたマイクロアレイスライドフォーマットを示す。異なるスライド上でトータル及びリン酸化ｐ９５ＨＥＲ２レベルを検出した。その活性化及び／又は発現状態を検出することができる追加のシグナル伝達物質として、Ａｋｔ（Ｓｅｒ ４７３）、Ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔ２２９）、Ｅｒｋ２（Ｔ２０２／Ｙ２０４）、ＲＳＫ（Ｔ３５９／Ｓ３６３）、Ｓｔａｔ３（Ｙ７０５）、及びそれらの組み合わせを挙げることができるがそれらに限定されない。或る実施形態では、ＦＮＡ試料を２つの異なる濃度で分析して定量的な発現レベル及び活性化程度を提供することができる。
【０４６０】
本明細書に記載したＣＯＰＩＡプラットフォームを用いたＦＮＡ試料に関する機能的経路プロファイリングは、細胞数、受容体発現、及び受容体活性化を高い正確性で得ることができる定量的な方法であるので、とりわけ有利である。図３９〜４６は、転移性乳癌を有する患者から得られたＦＮＡ試料に関する経路プロファイリングの例を提供する。各図中の表は、相対光単位（ＲＬＵ）で各マーカーのトータル及びリン酸化レベルの定量化を提供する。以下の表７は、これらのＦＮＡ試料中に検出された特定のシグナル伝達物質の発現及び活性化状態の要約を提供し、そして推奨される治療コースも提供する。
【表７】
0005718319.tif 000010
【０４６１】
要約
ＢＣＡ患者から得られた原発性凍結組織及び転移部位から採取されたＦＮＡについて実施された多重化ＣＯＰＩＡ経路プロファイリングは以下を示した：
●原発性ＨＥＲ２−ＩＨＣ状態とＣＯＰＩＡ−ＨＥＲ２発現分析との間の一致８５．５％
●ＨＥＲ２陽性（ＨＥＲ２：３＋及び２＋でＦＩＳＨ＋）患者の４０％を超える患者に有意なｐ９５ＨＥＲ２の存在、及び他の組織学（histology）ＨＥＲ２−ＩＨＣが０２＋（ＦＩＳＨ−）／１＋／０の一部の組織に検出可能レベルの存在
●ｐ９５ＨＥＲ２発現体の５０％超は活性化ｐ９５ＨＥＲ２を有していた。
●ＨＥＲ２陽性試料の２５％は他のＲＴＫ発現及び／又は活性化も有していた。
【０４６２】
これらの結果は、ＲＴＫ発現及びシグナル伝達経路活性化における不均一性を示し、適切な標的化療法の選択に対する潜在的な意味を強調している。
【０４６３】
実施例１２．乳癌患者における複数のシグナル経路タンパク質の機能的プロファイリング
協調的近接イムノアッセイ（ＣＯＰＩＡ）は、２つの検出子−抗体の共局在性を必要とする特有の免疫複合体の形成を利用する多重化タンパク質マイクロアレイプラットフォームである。この検出子−抗体は、対応するチャネリング酵素であるグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）及び西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートされている。標的タンパク質が捕捉抗体に結合されると、近接したＧＯとＨＲＰとの間のチャネリング事象が極感度での標的タンパク質のプロファイリングを可能にする。ＣＯＰＩＡは、シグナル生成／増幅に対して標的特異的近接内での複数の実体を必要とするので、極めて高い分析的特異性を実現する。ＣＯＰＩＡをそれぞれの特異的標的タンパク質に対して構成して、切断標的（例えば、ｐ９５ＨＥＲ２）をその正常のカウンターパート（例えば、全長ＨＥＲ２）から特異的なに検出することもできる。ＣＯＰＩＡを適用して、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＩＧＦ１−Ｒ、ｃ−ＭＥＴ、ＰＩ３Ｋ、Ｓｈｃ、ＶＥＧＦＲ、ｐａｎＣＫ、及びシグナル伝達経路における他の標的の発現及び活性化のレベルを調査した。
【０４６４】
本例は、様々な原発性組織学（histology）を有するＢＣＡ患者から得られた２５０例の凍結組織及び様々なＥＲ／ＰＲ／ＨＥＲ２状態を有する進行性ＢＣＡ患者の転移部位から採取された５０例の微細針吸引液（ＦＮＡ）試料（ｍＦＮＡ）中の複数のタンパク質に対する機能的経路シグニチャーを説明する。原発性ＨＥＲ２−ＩＨＣ状態とＣＯＰＩＡ−ＨＥＲ２発現分析との間に高い一致があった。有意レベルのｐ９５ＨＥＲ２がＨＥＲ２陽性（ＨＥＲ２：３＋及び２＋でＦＩＳＨ＋）患者の４０％超で観察されたが、ＩＨＣ−ＨＥＲ２陰性（２＋でＦＩＳＨ−／１＋／０）を有する一部の試料組織において低いレベルであるが検出可能なレベルも観察された。ｐ９５ＨＥＲ２発現体の５０％超は活性化ｐ９５ＨＥＲ２を有しており、そしてＨＥＲ２陽性試料の２５％超はＨＥＲ１、ＨＥＲ３、ＩＧＦ１−Ｒ並びに他のＲＴＫ及び伝達タンパク質の発現及び／又は活性化も有していた。疾患プロファイルは再発乳癌において変化することが多いので、本明細書に記載した特有のアッセイフォーマットを用いることにより、進展する疾患から得られる限られた試料に基づいて有用な臨床情報を提供して腫瘍医が患者の「個人的」癌プロファイル変化に従ってそれぞれの患者に対する疾患治療選択肢を調整するのを補助することができる。拡大された経路パネルを用いて様々な転移部位における腫瘍をプロファイルする能力を有することにより、腫瘍の特異的な転移潜在能力についての情報が提供されるので；最小限の侵襲的な１回通過のｍＦＮＡ試料を用いて治療選択肢をそれに応じて調整することができる。
【０４６５】
実施例１３．転移性乳癌（ＭＢＣ）を有する患者における微細針吸引液（ＦＮＡ）のＨＥＲ２機能的プロファイリングの特徴付け
背景：協調的近接イムノアッセイ（ＣＯＰＩＡ）は、２つの検出子−抗体の共局在性を要件とする特有の免疫複合体の形成を利用する多重化タンパク質マイクロアレイプラットフォームである。この検出子−抗体は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、p９５ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＩＧＦ１−Ｒ、ｃ−ＭＥＴ、ＰＩ３Ｋ、Ｓｈｃ、ＶＥＧＦＲ、ＣＫ、及び他のシグナル伝達タンパク質の発現及び活性化プロファイリングに対して近接媒介性シグナル生成／増幅のための対応するチャネリング酵素とコンジュゲートされている。本例は、この新規技術を用いた、ＭＢＣ患者由来の微細針吸引液（ＦＮＡ）生検試料におけるＨＥＲ２発現及び活性化プロファイリングを示す。
【０４６６】
方法：侵攻性のステージＩＩＩＢ／ＩＶ乳癌を有する女性患者（Ｎ＝２５、ベースライン年齢４２±１３歳）から転移部位からＦＮＡ試料を採取した。ＩＨＣ染色による様々な臨床的原発性ＥＰ／ＰＲ／ＨＥＲ２状態を有する患者をこの試験に許容した。原発性腫瘍試料のＥＰ／ＰＲ／ＨＥＲ２状態をローカルサイトによって得た。ＦＮＡ試料についてＣＯＰＩＡを用いてＨＥＲ２及び他のシグナル伝達タンパク質（ＳＴＰ）の発現及び活性化状態を測定した。
【０４６７】
結果：最初の１０例の患者のＦＮＡ試料からのデータは、５例（５０％）がＨＥＲ２活性化（ｐＨＥＲ２＋）、２例（２０％）がＨＥＲ２過剰発現（ｔＨＥＲ２＋）、ｐＨＥＲ２＋及びｐ９５ＨＥＲ２過剰発現であることを示した。１０例のＦＮＡ試料中７例は、様々なｐＨＥＲ２レベルを有して弱レベルから中程度レベルのｔＨＥＲ２を発現した。ＨＥＲ２状態（発現／活性化）は１例の患者で陰性であった。ＦＮＡからのＣＯＰＩＡ誘導データと原発性腫瘍ＩＨＣとの間の一致を評価する予定である。さらに、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３、ＩＧＦ１−Ｒ、及びｃ−ＭＥＴを含む他のＳＴＰの過剰発現及び／又は活性化を、ＣＯＰＩＡを用いてコホート全体において測定する予定である。
【０４６８】
結論：ＣＯＰＩＡアッセイを用いてＦＮＡ検体におけるＳＴＰの発現及び活性化を定量化することができる。これらの結果により、再発乳癌患者における治療決定についての情報を与えるという有用性が見出される。
【０４６９】
実施例１４．転移性乳癌（ＭＢＣ）を有する患者における経時的なＨＥＲ２機能的プロファイリングの変化
背景：ＨＥＲ２過剰発現／増幅を有する乳癌患者は、再発までのより短い期間及びより短い無病生存率（disease-free survival）及び全生存率（overall survival）と関連付けられる。乳癌の１５〜２０％はＩＨＣ又はＦＩＳＨによればＨＥＲ２陽性である。原発性腫瘍と転移性腫瘍との間でＨＥＲ２状態の変化が起こることが報告されており、これを評価することは治療的な影響を及ぼすであろう。本例は、連続的に採取された循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）におけるＭＢＣ患者の経時的ＨＥＲ２状態の変換を示す。
【０４７０】
方法：ＩＨＣ染色によって決定された、様々な原発性ＥＲ／ＰＲ／ＨＥＲ２状態のステージＩＩＩＢ〜ＩＶ ＭＢＣを有する５０例の女性患者（ベースライン年齢５７±１３歳）を登録し１４週まで経過観察し、そこで前記患者は患者らの医師の裁量によって様々なＭＢＣ療法を受けた。相互に５〜７週間離れた３回の試験来院時に、ＣＴＣの単離のために全血試料を採取した。Ｖｅｒｉｄｅｘ法を用いて連続的なＣＴＣを計数し、新規の多重化マイクロアレイ（協調的近接イムノアッセイ、ＣＯＰＩＡ）を用いてＨＥＲ１、ＨＥＲ２、及びＣＫの発現及びリン酸化（活性化）について試験した。このプラットフォームは、高レベルの感度及び特異性でシグナル伝達経路の標的タンパク質のプロファイリングができるように開発されている。２回目及び３回目の来院時に、Ｘ線検査による腫瘍評価を行った。
【０４７１】
結果：原発性ＩＨＣ−ＨＥＲ２陰性乳房腫瘍の中で、新たな治療を開始する前のＣＴＣにおいて３０％がＨＥＲ２過剰発現（ｔＨＥＲ２＋）され、そして５６％がＨＥＲ２活性化（ｐＨＥＲ２＋）されていた。３７％の患者にＣＴＣ≧５が観察され、そしてＣＫレベルは細胞数（cell counts）と相関していた。検出ＣＴＣを有しない又はＣＴＣ＜５を有する患者は予測できないレベルのＣＫを有していたが、それらの患者のそれぞれ３１％及び４７％のＣＴＣにおいてＨＥＲ２発現又は活性化が検出された。ＣＴＣ≧５を有する患者の８７％がＩＨＣ−ＨＥＲ２陰性原発性腫瘍を有しており、１５例の患者からの１１例（７３％）はＥＲ／ＰＲ陽性であった。ＣＴＣ≧５を有する患者の１３％はＩＨＣ−ＨＥＲ２陽性の原発性腫瘍を有しており、全てはＥＲ／ＰＲ陰性であった。
【０４７２】
結論：ＣＯＰＩＡを用いてＣＴＣにおけるＨＥＲ２状態を測定することができる。ＭＢＣを有する患者におけるＨＥＲ２機能的プロファイリングの経時的変化が観察された。従って、本例は、予後診断及び診断プロファイリングに対する組織の潜在的供給源としてのＣＴＣの価値を説明している。
【０４７３】
実施例１５．乳癌における切断ＨＥＲ２発現及び活性化の分析
背景：ＨＥＲ２過剰発現性乳癌は予後不良であり、ＨＥＲ２標的化モノクローナル抗体療法に対して耐性であることが多い。初めからの耐性又は獲得耐性のメカニズムの１つは、侵攻性疾患、不良予後及びＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）に対する応答の欠如と臨床的に関連付けられるｐ９５ＨＥＲ２の発現である。ｐ９５ＨＥＲ２に関する臨床試験は、その発現及び活性化を正確に測定する高い感度及び特異性のアッセイが欠如しているため限定されている。
【０４７４】
方法：受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の発現及びリン酸化を特異的に検出することができる新規の技術（ＣＯＰＩＡアッセイ）を用いて全長ＨＥＲ２からｐ９５ＨＥＲ２を特異的に検出した。この多重化タンパク質マイクロアレイプラットフォームは、近接した場合に高感度でＲＴＫのプロファイリングを可能にする２つの検出子である酵素コンジュゲート抗体の共局在性を要件とする。このアッセイを用いて、本発明者らは、２２９例の凍結乳癌組織（ステージＩＩ〜ＩＶ）におけるｐ９５ＨＥＲ２並びにＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＩＧＦ１−Ｒ、ｃ−ＭＥＴ、ＰＩ３Ｋ、Ｓｈｃ、ＶＥＧＦＲ、及びＣＫを含む他の主要な腫瘍形成性経路の発現及び活性化を分析した。ＨＥＲ２、ｐ９５ＨＥＲ２、及びＰＩ３Ｋの発現及び活性化を、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）耐性細胞及び感受性ＢＴ４７４細胞においても測定した。
【０４７５】
結果：本例は、ＩＨＣによって決定されかつＣＯＰＩＡによって試験された、凍結原発性乳癌組織におけるＨＥＲ２及びｐ９５ＨＥＲ２発現及び活性化の首尾よいプロファイリングを説明する。ＩＨＣ３＋試料の約５０％は活性化ｐ９５ＨＥＲ２を有していた。ＩＨＣ２＋、１＋及び陰性のサブセットにおけるｐ９５ＨＥＲ２の発現及び活性化のレベルは劇的に低かったが、一部の組織では有意なままであった。試験した１０のマーカーの全てがシグナル経路の多様な活性化及び不均一性を示した。本発明者らの前臨床試験において、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）耐性ＢＴ４７４細胞は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）処理においてＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）感受性ＢＴ４７４細胞と比較してｐ９５ＨＥＲ２、全長ＨＥＲ２、及びＰＩ３Ｋの有意に高い活性化を示した。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）処理の最初の２４時間の間に、ＨＥＲ３の増加した活性化が観察された。
【０４７６】
結論：高感度及び高い特異性のｐ９５ＨＥＲ２ ＣＯＰＩＡアッセイは、微細針吸引液又はコア生検などの少量の腫瘍試料において全長ＨＥＲ２並びにトータル及び活性化ｐ９５ＨＥＲ２の正確な検出を可能とする。ｐ９５ＨＥＲ２の定量化はＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）に最も応答する可能性のある患者を選択することを可能にした。ＣＯＰＩＡアッセイは、同じ試料において複数のキナーゼを同時に検出することを可能にし、このことはｐ９５ＨＥＲ２に関連したＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）耐性のメカニズムを明らかにする。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）治療に対する臨床的応答者及び非応答者におけるｐ９５ＨＥＲ２発現及び活性化を測定することができる。従って、経時的なｐ９５ＨＥＲ２発現及び活性化の変化が治療に関連したものであるか又は疾患の自然過程によるものであるかの分析は、個々の患者に対する療法のより効果的な選択及び調整を可能にする。
【０４７７】
実施例１６．協調的近接イムノアッセイ（ＣＯＰＩＡ）による受容体チロシンキナーゼの発現及び活性化プロファイリング
本例は、抗体−マイクロアレイプラットフォーム上での特有の免疫複合体の形成の更なる説明を提供する。１つの実施形態において、検出子抗体の一方はグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）にコンジュゲートされており、そして他方は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＬＰ）にコンジュゲートされている。免疫複合体が首尾よく形成されるとシグナルが生成されそして捕捉された標的タンパク質上で共局在化されたＧＯとＨＲＰとの間の酵素チャネリングにより前記シグナルが増幅されることを前提として、アッセイの特異性及び感度が高められる。この方法を適用して癌試料中の関連するバイオマーカーの発現及びリン酸化をプロファイリングすることができる。この方法は潜在的な治療応答を予測するのに有用であるので、標的化療法のより良好な初期選択及びその後の監視に導く。
【０４７８】
本明細書に記載したイムノアッセイは、シグナル伝達タンパク質の機能的プロファイリング及び癌細胞におけるプロファイル変化を監視する能力を提供する。この方法は、疾患原因全体への有用な洞察を提供する。この方法は、単細胞レベルでＥｒｂＢファミリー受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）におけるリン酸化事象を特異的に検出する。
【０４７９】
序論
正常組織及び異常組織における遺伝子発現の複数標的の評価は、多くの疾患の病態生理学の理解を広げた。ｍＲＮＡプロファイリングは有用な生物学的情報を与えることができるが、その臨床的潜在能力は転写後の欠陥（defects）に対する複数の原因により限定されることがある。これらの限定にもかかわらず、基礎的研究及びトランスレーショナルリサーチにおいてなされた進歩により、癌などの複合疾患に対する臨床用途へのゲノム技術の導入がもたらされ、このようにして新たなゲノムベースの患者管理の道が敷かれた（Paik, S. et al., N. Engl. J. Med. 351, 2819-26 (2004)；Paik, S. et al., J. Cln. Oncol. 24, 3726-3734 (2006)）。配列特異的標的増幅方法に基づく分子テクノロジーの鋭敏な感度及び特異性により多重化ゲノム分析は成熟した。対照的に、プロテオームに基づく方法はまだ、実用的な多重化フォーマットまで開発が進んでいない。大部分の現在のタンパク質ベースの適用は、伝統的な免疫組織化学（ＩＨＣ）原理に基づいており、相当量の試料を必要とする。プロテオーム技術のより首尾よい臨床適用に、より良好な感度及び特異性が待たれている。より重要なことには、タンパク質の活性化（リン酸化）状態が細胞機能へのそれらタンパク質の影響を反映しているので、プロテオーム診断プラットフォームはタンパク質発現のレベル及びタンパク質活性化の程度を識別できなければならない。
【０４８０】
治療及び予後結果に対するプロテオーム評価を行う上で最も広く用いられる適用の１つは、ＩＨＣを用いた乳癌（ＢＣＡ）患者におけるヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）タンパク質発現の検出によるものであった。しかしながら、この方法は、分析感度、標的特異性、多重化能力、及び画像解釈の主観性に伴う技術的制限を有している（Gown, A.M., Mod. Pathol. 21, S8-S15 (2008)；Rhodes, A. et al., J. Clin. Pathol. 53, 125-130 (2000)）。さらに、別々の研究室で実施されたＨＥＲ２試験の結果の間に有意レベルの不一致があることが報告されている（Reddy, J.C. et al., Clin. Breast Cancer 7, 153-7 (2006)）。それゆえに、ＩＨＣに基づく結果が曖昧である場合に、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）技術を現在用いてＨＥＲ２遺伝子増幅を検出している。両方の技術を段階的に使用して、ＢＣＡ患者に対するＨＥＲ２標的化治療である、トラスツズマブに対する患者の適格性を決定する（Cuadros, M. and Villegas, M., Appl. Immun. Mol. Morph. 17, 1-7 (2009)）。現行アッセイ法の一層の制限は、標的タンパク質の活性化状態を決定することができないことである。
【０４８１】
浸潤性ＢＣＡ患者の２０％〜２５％は過剰発現されたＨＥＲ２ ＲＴＫを示す（Slamon, D.J. et al., Science, 235, 177-82 (1987)）。ＨＥＲ２の過剰発現は細胞増殖及び疾患進行を引き起こし、ＨＥＲ２陽性ＢＣＡは高い再発率及び低下した生存率を有する（Slamon, D.J. et al., Science, 235, 177-82 (1987)）。ＨＥＲ２状態は療法選択に対して必須であるので、ＢＣＡ患者のＨＥＲ２状態を決定することは不可欠である（Cuadros, M. and Villegas, M., Appl. Immun. Mol. Morph. 17, 1-7 (2009)；Slamon, D.J. et al., Science, 235, 177-82 (1987)）。しかしながら、ＨＥＲ２陽性患者の約５０％だけが初期にトラスツズマブ補完治療に応答し、そしてこれらの患者のサブセットは劇的な初期の応答を示した後に固有の耐性を示すか又は最終的に耐性を発現する（Nahta, R. and Esteva, F.J., Breast Cancer Res. 8, 215-27 (2006)）。ＨＥＲ２−ＩＨＣ及びＨＥＲ２−ＦＩＳＨは予備的な患者選択に有用であるが、それらのいずれの試験も応答性の患者と非応答性の患者とを識別することはできない。従って、ＨＥＲ２陽性患者がＨＥＲ２標的化剤に対して応答することを識別する信頼性ある方法の開発が急務である。このような試験は、ＨＥＲ２タンパク質の機能的状態をその潜在的なヘテロ二量体パートナーのプロファイルと共に決定し、それにより最も効果的な療法選択肢の合理的な選択における極めて重要な情報を提供することができるものでなければならない。
【０４８２】
腫瘍は極めて不均一であるので、原発性部位の細胞は再発疾患における腫瘍細胞のプロファイルを反映していないことがある。療法を導くための腫瘍細胞のより関連性のある供給源は再発疾患の転移であると考えられる。腫瘍細胞の代替的供給源は、侵攻性疾患を有する患者において腫瘍細胞の小さなサブ集団が見出される場合には血液である（Cristofonilli, M. et al., N. Engl. J. Med. 351, 781-91 (2004)；Hayes, D.F. et al., Clin. Cancer Res.12, 4218-4224 (2006)；Pachmann, K. et al., J. Clin. Oncol. 28, 1208-1215 (2008)）。血液中の腫瘍細胞の数は、腫瘍のステージ及びタイプに依存しており、血液１ｍＬ当たり検出せずから数千個の細胞まで変化する（Cristofonilli, M. et al., N. Engl. J. Med. 351, 781-91 (2004); Hayes, D.F. et al., Clin. Cancer Res. 12, 4218-4224 (2006); Pachmann, K. et al., J. Clin. Oncol.28, 1208-1215 (2008); Nagrath, S. et al., Nature 450, 1235-1239 (2007)）。
【０４８３】
結果
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、超高感度かつ超高特異性を有し、約１００ゼプトモル（又は標的分子１×１０４〜１×１０５）の分析感度を有する単細胞レベルで複数のシグナル伝達タンパク質の活性化状態を検出することができる、協調的近接イムノアッセイ（ＣＯＰＩＡ、図２４）を用いて、転移性癌患者について非侵襲的な「リアルタイム生検」を実施する機会を提供する。本明細書に記載したように、ＣＯＰＩＡを用いて様々な癌細胞系、異種移植片、凍結腫瘍組織、及びＢＣＡ患者から単離されたＣＴＣ中のＨＥＲ１及びＨＥＲ２の発現及びリン酸化を定量化することができる。
【０４８４】
図２４をみると、標的タンパク質の活性化状態を検出するのに用いられる、標的特異的複合体を形成する抗体の個々の成分が示されている。捕捉抗体及び検出抗体の間の競合が最小となるように捕捉抗体及び検出抗体を選択する（すなわち、全ての抗体が同時にシグナル伝達分子上のそれら抗体に対応するエピトープに結合する）。標的分子と例えば連続希釈によりプリントされたそれらの対応する捕捉抗体との間の相互作用によって特異性の第１歩が達成される。活性化状態非依存性検出子抗体をチャネリング成分、例えば、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）とコンジュゲートさせ、活性化状態依存性検出子抗体をシグナル増幅成分、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いて標識化する。
【０４８５】
図４７（ａ）は、それぞれ、ＭＤＡ−ＭＢ４６８及びＳＫＢｒ３中の単細胞の感度レベルでのＨＥＲ１及びＨＥＲ２の活性化を示す。これらの細胞系は、１細胞当たりそれらの細胞膜上で約１〜２×１０６ＨＥＲ１又はＨＥＲ２ ＲＴＫを発現する。細胞数３、１、０．３及び陰性対照のマイクロアレイスライド画像を細胞滴定曲線の上に示す。ＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞をＥＧＦで処理してＨＥＲ１ ＲＴＫをリン酸化したが、一方で、ＨＥＲ２ ＲＴＫはＳＫＢＲ３細胞中で自発的にリン酸化される。それぞれのパッド上の細胞量は連続希釈により生成した。捕捉抗体を、１．０ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．２５ｍｇ／ｍＬ及び０．１２５ｍｇ／ｍＬの連続希釈により三連で１スポット当たり５００ｐＬでプリントした。
【０４８６】
図４７（ｂ）に示したウェスタンブロットを１レーン当たり全タンパク質１２μｇ（約４０００細胞）から生成した。各細胞系におけるドミナントなＲＴＫ発現レベルをＥＧＦ又はＨＲＧ刺激の前後で決定した。ホスホ−チロシン特異的抗体を用いてＨＥＲ１又はＨＥＲ２のリン酸化度を検出した。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８におけるＨＥＲ１に対する刺激の前後間の差は、成長因子刺激によるリン酸化度についての情報を提供する。
【０４８７】
図４７（ｃ）に示すように、ｐＨＥＲ１（リン酸化ＨＥＲ１）又はｐＨＥＲ２（リン酸化ＨＥＲ２）に対して２０％シグナル飽和（又は１２０００ＲＦＵ）を検出するのに必要な細胞数を用いて、低いＲＴＫ発現を有する細胞について１細胞当たりのＲＴＫ活性化を計算した（ＲＦＵ／細胞）。各細胞系において検出不能なシグナルを、表中でＮＤとして示した。ＭＤＡ ＭＢ ４６８細胞は、ＥＧＦで刺激された場合ｐＨＥＲ２は検出不能であったが、〜９９２．５ＲＦＵ／細胞レベルのｐＨＥＲ１を有している。Ｔ４７Ｄ細胞は１細胞当たり実質的に低レベルのＨＥＲ１及びＨＥＲ２を発現するが、１０２細胞を分析した場合には有意レベルのＲＴＫリン酸化を検出しており、これらの細胞をＥＧＦ又はＨＲＧで刺激した場合に特異的な活性化パターンを生じた。
【０４８８】
図４７（ｄ）に示すように、様々な程度のＥｒｂＢ−ＲＴＫ発現を有する細胞系：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５及びＢＴ４７４から異種移植片を得た（Imai, Y. et al., Cancer Res. 42, 4394-4398；Filmus, J., et al., Mol. Cell Bio. 7, 251-7 (1987); Uherek, C. et al., Blood. 100, 1265-73 (2002)）。Dragowska, W.H. et al., Mol. Cancer Res. 2, 606-619 (2004)）。本発明者らは、ＭＤ−ＭＢ−２３１異種移植片中に低レベルのｐＨＥＲ−１及びｐＨＥＲ−２を、ＢＴ４７４異種移植片から得られたＦＮＡ試料中に高レベルのｐＨＥＲ２及び有意レベルのｐＨＥＲ１（増幅されたＨＥＲ−２との共発現による）を検出した。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片から得られたＦＮＡ中に極めて低いＨＥＲ−１及びＨＥＲ−２活性化を検出した。
【０４８９】
図４７（ｅ）に示すように、２６例のステージＩＩ〜ＩＩＩの凍結ＢＣＡ（１２例のＨＥＲ２−ＩＨＣ ３＋、７例のＨＥＲ２−ＩＨＣ １＋、７例のＨＥＲ２−ＩＨＣ −）及び４例の正常の隣接組織を、ＨＥＲ２／ＨＥＲ１発現及び活性化について分析した。高いＩＨＣスコア（３＋）を有する全ての原発性腫瘍試料は高レベルのＨＥＲ−２発現を有し、高い活性化度のＨＥＲ−２を示した。本発明者らのアッセイによって検出されたＨＥＲ２受容体の発現及び活性化は腫瘍ＩＨＣスコアと一致する。全てのＲＴＫ分析について、全タンパク質１００ｎｇからＲＦＵ値を生成した。ホスホ−ＲＴＫ分析について、全タンパク質５００ｎｇからＲＦＵ値を生成した。ＨＥＲ２発現及び活性化の陽性対照としてＢＴ４７４細胞を用いた。
【０４９０】
図４７（ｆ）は、トータルＨＥＲ２発現及びＨＥＲ２リン酸化について２６例のＢＣＡ試料の撒布図を示す。４例の正常な隣接腫瘍試料は全て、ＨＥＲ１発現がないことを示した。
【０４９１】
図４８（ａ）に注目すると、各スライドについて、細胞系ＭＤ−４６８（ＨＥＲ１陽性）細胞及びＳＫＢｒ３（ＨＥＲ２陽性）細胞の溶解物から、連続希釈された細胞溶解物からの標準曲線を作成した。ＨＥＲ１及び／又はＨＥＲ２発現レベル及びリン酸化度を正確に決定する定量的情報を得るように各スライドを設定した。標準曲線を作成するために全体で７パッド（連続希釈によるパッド１、２、３、４、１１、１３及び１４）を用いた。各スライドは２つの品質管理（パッド５及び６）と共にバッファ対照パッドを有していた。各スライドにおいて試料を４パッド（パッド７、８、９、１０）上でアッセイした。
【０４９２】
図４８（ｂ）において、ｐＨＥＲ１及びｐＨＥＲ２の両方に対して検出限界（ＬＯＤ）値を１ＣＵ未満であるように決定した。ｔＨＥＲ２及びｔＣＫについて１細胞に近い感度（near 1 cell sensitivity）を観察した。それぞれの分析物に対するＬＯＤを、バッファ対照値の平均濃度＋２標準偏差として計算する。図４８（ｃ）は、ＨＥＲ２発現及び活性化について分析された全２７例の乳癌試料を表中に示す。原発性ＨＥＲ２−ＩＨＣ陰性状態を有する転移性乳癌患者から１７例の血液試料を得た。初期ＨＥＲ２−ＩＨＣ陰性試料の５９％（１０／１７）までが、その患者らのＣＴＣ中にＨＥＲ２活性化の証拠を示した（網掛け部分）。原発性ＨＥＲ２陰性状態を有する転移性乳癌患者から得られた１７例の血液試料のうち７例（網掛け部分）（４１％）に、ＨＥＲ２発現を有するＣＴＣを見出した。ＨＥＲ２発現及びリン酸化のレベルをＣＵ単位で示す。
【０４９３】
ＣＯＰＩＡの前臨床性能
本発明者らは既知レベルのＨＥＲ１及びＨＥＲ２ ＲＴＫ発現を有する組織培養細胞系を用いてマイクロアレイフォーマット上でＣＯＰＩＡの実行可能性を実証した。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を用いて上皮成長因子（ＥＧＦ）刺激後のＨＥＲ１発現レベル及びＨＥＲ１活性化度を分析し、そしてＳＫＢＲ３細胞を用いてタンパク質過剰発現によるＨＥＲ２発現及びＨＥＲ２活性化のレベルを検出した。様々なレベルのＨＥＲ１及びＨＥＲ２を発現するＢＴ４７４細胞及びＴ４７Ｄ細胞並びに他のＥｒｂＢ ＲＴＫファミリー構成員を用いて、本発明者らのアッセイ法の分析的特異性を示した。
【０４９４】
分析感度
本発明者らは、それぞれ、ＭＤＡ−ＭＢ４６８及びＳＫＢＲ３において単細胞の感度レベルでＨＥＲ１及びＨＥＲ２の活性化及び発現を検出した（図４７ａ）。これらの細胞系は、他者によりＥｒｂＢ ＲＴＫ発現について充分に特徴付けされている（Uherek, C. et al., Blood, 100, 1265-1273 (2002)；Dragowska, W.H. et al., Mol. Cancer Res. 2, 606-619 (2004)；Harari, D. and Yarden, Y., Oncogene 19, 6102-6114 (2000)；Riethdorf, S. et al. Clin. Cancer Res. 13, 920-28 (2007)）。これらの細胞系はそれらの細胞膜上で約１〜２×１０６のＨＥＲ１又はＨＥＲ２ ＲＴＫを発現する。しかしながら、発現されたＲＴＫのサブセットだけが成長因子（ＨＥＲ１）を用いて処理され又は過剰発現された場合にリン酸化され、このようなリン酸化レベルは下流経路活性化に適切かつ充分である（Dragowska, W.H. et al., Mol. Cancer Res. 2, 606-619 (2004)）。ＨＥＲ２過剰発現性ＳＫＢＲ−３細胞は構成的な（constitutive）ＨＥＲ２活性化を有するが、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞は非リン酸化状態で存在しそしてＨＥＲ１リン酸化を導くにはＥＧＦにより刺激される必要がある（Dragowska, W.H. et al., Mol. Cancer Res. 2, 606-619 (2004)；Cristofanilli, M. et al., Clin. Breast Cancer 7,471-89 (2007)）。ＥＧＦ（ホモ二量体化又はヘテロ二量体化による直接的ＨＥＲ１刺激）又はヘレグリン（ＨＧＲ、ＨＥＲ３とのヘテロ二量体を介する間接的刺激）のいずれかにより媒介されるＨＥＲ１及びＨＥＲ２の特異的な活性化は、図４７ｂに示したように様々なレベルのＥｒｂＢファミリーＲＴＫ発現を発現する細胞系をもたらす。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞は刺激前に少しのＨＥＲ１活性化を示すが、ＥＧＦ結合するとＨＥＲ１リン酸化を示す（図４７ａ及び図４７ｂ）。典型的には、高度に発現されたＲＴＫの２〜１０％だけが活性化され（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞又はＳＫＢｒ３細胞につき約２×１０４〜１×１０５のリン酸化事象）、そしてこれは細胞増殖に充分である（Dragowska, W.H. et al., Mol. Cancer Res. 2, 606-619 (2004)）。本発明のアッセイフォーマットは本発明者らが約１０４活性化事象を検出することを可能にし、このようにして単細胞感度を形成した（図４７ａ）。
【０４９５】
分析特異性
このＣＯＰＩＡフォーマットは、捕捉抗体に加えて各標的タンパク質への２検出子抗体の結合事象を要件とするので、その分析特異性は極めて高かった。様々なＲＴＫレベルを有する複数の細胞系について実施された比較試験に基づいて、このアッセイフォーマットの分析的特異性が９９．９９％を超えることが見出された（図４７ｃ）。極めて低量のＨＥＲ２を発現するＭＢ４６８細胞を用いた場合、１アッセイにつき〜１０００細胞を用いるのはＨＥＲ２捕捉部位において任意のシグナルを検出するには不充分（ＮＤ）であった。ｐＨＥＲ２は検出不能であったが、ＭＤＡ ＭＢ ４６８細胞はＥＧＦで刺激された場合に〜９９２．５ＲＦＵ／細胞レベルのｐＨＥＲ１を有する。Ｔ４７Ｄ細胞は１細胞当たり実質的に低いレベルのＨＥＲ１及びＨＥＲ２を発現するが、１０２個の細胞を分析した場合には有意レベルのＲＴＫリン酸化が検出され、そしてこれらの細胞をＥＧＦ又はＨＲＧのいずれかで刺激した場合には特異的な活性化パターンが生じた。Ｔ４７Ｄ細胞はＨＥＲ１より有意に高いレベルのＨＥＲ３を発現するので、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３へテロ二量体化形成を介してＨＲＧで細胞を活性化した場合により高いＨＥＲ２活性化が観察された。ＨＲＧ処理はこの細胞集団においてＨＥＲ１活性化を誘導しなかったが、このことはアッセイ特異性を実証している。他方で、Ｔ４７Ｄ細胞のＥＧＦ処理は、ＨＲＧ媒介性の活性化より低いレベルであるが、ＨＥＲ１−ＨＥＲ２ヘテロ二量体化を介してＨＥＲ１及びＨＥＲ２両方の活性化をもたらした。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞溶解物中の検出不能なｐＨＥＲ２及びＥＧＦ処理されたＳＫＢｒ３細胞中のｐＨＥＲ２より実質的に低レベルのｐＨＥＲ１（図４７ｃ）はこのアッセイの特異性を実証した。近接依存性酵素チャネリング方法の高い特異性は共通の標的上での複数の検出子−抗体結合事象を要件とする特有の構成に基づいている。従って、複数の検出子及び捕捉抗体の共局在化を要件とするこのＣＯＰＩＡフォーマットは複合経路の多重化分析に対する理想的なプラットフォームである。
【０４９６】
異種移植片
ＣＯＰＩＡを用いて、異種移植片動物から微細針吸引（ＦＮＡ）法によって得られた腫瘍組織中のＨＥＲ１及びＨＥＲ２をプロファイリングした。様々なＥｒｂＢ−ＲＴＫ発現度を有する細胞系（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５及びＢＴ４７４）から、異種移植片を得た（Imai, Y. et al., Cancer Res., 42, 4394-4398；Filmus, J. et al., Mol. Cell Bio. 7, 251-7 (1987)；Uherek, C. et al., Blood 100, 1265-73 (2002)；Dragowska, W.H. et al., Mol. Cancer Res. 2, 606-619 (2004)）。本発明者らはＭＤ−ＭＢ−２３１異種移植片において低レベルのｐＨＥＲ１及びｐＨＥＲ２を、ＢＴ４７４異種移植片から得られたＦＮＡ試料において高レベルのｐＨＥＲ２及び有意レベルのｐＨＥＲ１（増幅ＨＥＲ２との共発現による）を検出した。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片から得られたＦＮＡにおいて極めて低いＨＥＲ１及びＨＥＲ２活性化を検出した（ＧＩＧ．２ｄ）。異種移植片−ＦＮＡモデル系からの本発明者らの知見は親細胞系のＨＥＲ２プロファイルと一致しており、このことは本発明の方法を用いて最小限の侵襲性ＦＮＡ法から得られる試料においてＥｒｂＢ受容体の活性化を検出することができることを実証している。
【０４９７】
ＣＯＰＩＡの臨床的性能
凍結組織
さらにＣＯＰＩＡの臨床的有用性を実証するために、本発明者らはＦＮＡ法により２６例のステージＩＩ〜ＩＩＩの凍結ＢＣＡ及び４例の正常隣接組織から組織試料を採取した。高いＩＨＣスコア（３＋）を有する全ての原発性腫瘍試料は高レベルのＨＥＲ２発現を有しかつ高いＨＥＲ２活性化度を示した。１２例のＨＥＲ２−ＩＨＣ陽性試料のうち２例（２６１３５及び２００１３）は他のＨＥＲ２−ＩＨＣ陽性試料より低いトータルＨＥＲ２シグナルを有していたが、それらは両方ともＨＥＲ２陰性試料より実質的に高いシグナルを有していた。全てのＩＨＣ−ＨＥＲ２陽性試料は有意レベルのｐＨＥＲ２シグナルを示した。本発明者らのアッセイによって検出されたＨＥＲ２の発現及び活性化は原発性腫瘍ＩＨＣスコアと一致する（図４７ｅ及び図４７ｆ）。興味深いことに、１２例の原発性ＨＥＲ２−ＩＨＣ陽性患者のうち２例は検出可能な全ＨＥＲ１を有して（１２８５５）又は検出可能な全ＨＥＲ１を有しないで（１２８９５）有意量のｐＨＥＲ１も示した。この観察は、両方のＲＴＫを標的とすることができるチロシンキナーゼ阻害剤の療法がＨＥＲ２ ＲＴＫを単独に標的とする療法よりこのプロファイルを有する患者に対してより効果的である可能性があることを示唆する。検出不能の又は低レベルの原発性ＨＥＲ２−ＩＨＣを有する組織は全て低レベルのＨＥＲ２発現を示したが、一部の試料は低いが有意レベルのＨＥＲ２活性化を示しており、このことはホルモン療法に耐性の患者において意味を有していることができた。
【０４９８】
循環腫瘍細胞
最近になって、転移性癌患者の血液中に見出されるＣＴＣは、非侵襲的に、時間に関連のある腫瘍の評価を行う機会を提供することから、大きな注目を集めてきた（Cristofonilli, M. et al., N. Engl. J. Med. 351, 781-91 (2004)；Hayes, D.F. et al., Clin. Cancer Res. 12, 4218-4224 (2006)；Pachmann, K. et al., J. Clin. Oncol. 28, 1208-1215 (2008)；Riethdorf, S. et al. Clin. Cancer Res. 13, 920-28 (2007); Cristofanilli, M. et al., Clin. Breast Cancer 7,471-89 (2007)）。転移性癌患者に見出されるＣＴＣを調査するＣＯＰＩＡの能力を調べるためには」、この技術が鋭敏であり、特異的であり、再現性があり、標準化されており、そして臨床結果と関連していることが実証されなければならない。ＲＦＵ値は細胞の単位当たりの情報を提供しないので、経路発現／活性化プロファイリングに対する分析的評価を既知のＨＥＲ１及びＨＥＲ２発現を有する標準的な細胞系を用いて行った。ＲＦＵ値を算出単位（ＣＵ）に変換するアルゴリズムである、細胞系対照に基づく標準的機能単位を開発した。各スライドについて、連続希釈した細胞溶解物からなる標準曲線を、図４８ａに示したように細胞系ＭＤ−４６８（ＨＥＲ１陽性）及びＳＫＢｒ３（ＨＥＲ２陽性）の溶解物から作成した。ＨＥＲ１及び／又はＨＥＲ２発現レベル及びリン酸化度、並びにサイトケラチン（ＣＫ）のレベルを正確に決定するべき定量的情報を得るように各スライドを構成した。ｐＨＥＲ１（リン酸化ＨＥＲ１）及びｐＨＥＲ２（リン酸化ＨＥＲ２）の両方に対して１ＣＵ未満となるように検出限界（ＬＯＤ）値を決定した（図４８ｂ）。１に近い細胞感度がＨＥＲ２及びＣＫについて観察された。ＣＫレベルは概してＣＴＣの量と相関するが、ＣＴＣは様々なＣＫレベルを有する（１００のＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞は９．７ＣＵ未満を示しそして１０のＳＫＢｒ３細胞は６．１ＣＵを示した）。ＣＫ発現量における変化に加えて、発現されるＣＫのタイプも異なる組織起源の腫瘍ごとに変化する（Rakha, E.A. et al., J. Clin. Oncol. 26, 2568-2581 (2008)）。従って、ＣＫ値は単離されたＣＴＣに対して絶対的な定量的参照として働かないことがあるが、療法経過に沿って同じ患者から或る期間にわたり採取された試料に対する腫瘍負荷インジケーターとしてＣＫ値を用いることができる。マルチＰＭＴゲイン設定でスライドを走査し、そして各設定での標準曲線の勾配を決定した。標準曲線から計算された値に比例してＣＵ計算結果を重み付けし、低い勾配には小さい重みを与えた。
【０４９９】
２７例の癌患者及び６０例の健常ボランティアからそれぞれ１つの、全体で８７例の全血試料を分析した。健常対象被験者由来の６０例の試料から得られたデータに基づいてアッセイの参照値を決定した。分析した２７例の癌試料の中で、１７例の血液試料を、原発性ＨＥＲ２−ＩＨＣ陰性状態を有する転移性乳癌患者から得た。ＨＥＲ２発現又は活性化を有する試料を図４８ｃに示す。初期ＨＥＲ２−ＩＨＣ陰性試料の５９％（１０／１７）までがそれらのＣＴＣにおいてＨＥＲ２活性化の証拠を示した。原発性ＨＥＲ２陰性状態を有する転移性乳癌患者から得られた１７例の血液試料のうち７例（４１％）にＨＥＲ２発現を有するＣＴＣが見出された。ここで、本発明者らは、原発性ＨＥＲ２陰性乳癌患者由来のＣＴＣの１８％（３／１７）において明確なＨＥＲ２過剰発現を有していなくともＨＥＲ２活性化を検出することができた。原発性ＨＥＲ２陽性腫瘍を有する再発ＢＣＡ患者から採取した６０％のＣＴＣ試料（６／１０）は、なおＨＥＲ２発現を示した。なおトラスツズマブ療法を継続中の原発性ＩＨＣ−ＨＥＲ２＋（ＩＨＣ／ＦＩＳＨによる）患者におけるｐＨＥＲ２レベルは有意であったが、ＣＴＣがＨＥＲ２陽性状態を得たという証拠を示した原発性ＩＨＣ−ＨＥＲ２陰性患者より幾分か低かった。極めて高いＨＥＲ２発現（１９．４ＣＵ）を有する患者Ａ０２−０２８はｐＨＥＲ２レベル６．３ＣＵを示した。この患者のｐＨＥＲ２／ＨＥＲ２シグナル比は０．３２（６．３／１９．４）であり、これは刺激されていないＢＴ４７４タイプの細胞の典型的ｐＨＥＲ２／ＨＥＲ２比（２５％）よりわずかに高い。ＳＫＢｒ３細胞はＨＥＲ２のより高い基礎レベルリン酸化度を有している（図４８ｃ）。
【０５００】
考察
ＲＴＫ及び下流細胞シグナルタンパク質は、腫瘍学において治療的介入の主要な標的である。標的化療法に対する潜在的な応答性を決定するために原発性腫瘍を調べることは治療の標準になっている。しかしながら、標的発現、活性化及び下流細胞のシグナル伝達タンパク質の完全な特徴付けはめったに行われない。初期診断から転移性疾患の再発までの時間枠の間の腫瘍細胞集団におけるＲＴＫ発現のパターン変化は事実上全く評価されていない。Meng et al.による最近の研究は、試料を同期的に得た場合にのみ原発性腫瘍中のＨＥＲ２遺伝子状態と対応するＣＴＣ中のＨＥＲ２遺伝子状態との間での良好な一致を示した。しかしながら、初期ＨＥＲ２陰性原発性腫瘍を有する２４例の再発患者由来のＣＴＣは、２４例の患者のうち９例（３７％）がそれらの患者のＣＴＣにおいてＨＥＲ２増幅を獲得した（Meng, S. et al., PNAS 101, 9393-98 (2004)）。この研究は、疾患管理を変更するのに充分な有意性の原発性病変と転移性病変との間の不一致を実証した。原発性部位と転移性部位との間のＨＥＲ２過剰発現の有意な不一致が乳癌においてＩＨＣを用いて報告されており（Zidan, J. et al., Br. J. Cancer 93, 552-556 (2005)）、そしてＣＴＣ中の獲得ＨＥＲ２遺伝子増幅が別のグループによって確認された（Hayes, D.F. et al., Int. J. Oncol. 21, 1111-1117 (2002)）。この疾患プロファイル変化は、細胞シグナル伝達のパターンを経時的に進展させる多くの癌の異種の腫瘍細胞集団への療法上の及び他の圧力によるものであることがある。本発明者らが見出したＨＥＲ２転換は、異種の原発性腫瘍細胞集団内でのＨＥＲ２陽性細胞のクローン選択又は過剰発現に対する遺伝的能力の獲得によるものであることができる。ＨＥＲ転換の背後のメカニズムを問わず、ＣＴＣ中のＨＥＲ２の存在は臨床的注意を要する。
【０５０１】
ＣＯＰＩＡは、標的タンパク質がマイクロアレイ表面上に捕捉されると２つの検出子の酵素コンジュゲート抗体の共局在性を要件として特有な免疫複合体が形成されることを利用する。高い代謝回転数（ＧＯについて１０５／分間及びＨＲＰについて１０４／分間）を有する近接した２つの検出子酵素間のチャネリング事象は、高感度でのＲＴＫ発現及び活性化のプロファイリングを可能にする（Klapper, M.H. and Hackett, D.P., J. Biol. Chem. 238, 3736-3742 (1963)；Gibson, Q.H. et al., J. Biol. Chem. 239, 3927-3934 (1964)）。３つの異なる抗体の同時結合の要件を前提として分析特異性が大きく高められる。この多重化ＣＯＰＩＡは、ＦＮＡなどの限られた数の腫瘍細胞を有する血液又は他の供給源から単離された希少ＣＴＣを用いて療法進行の或る期間にわたる監視を促進することができる。この新規の方法を適用して、単一試料からトランス活性化潜在能力を有する他のＲＴＫ及びそれに続く下流の細胞シグナル伝達タンパク質の発現及び活性化を定量化することができる。標的タンパク質活性化状態を定量化する能力は、シグナル伝達タンパク質の単なる発現を超えた追加的な評価を可能にし、潜在的にはさらに様々な標的化療法の有用性を予測することを可能にする。さらにまた、特異的なシグナル生成に対して複数の結合抗体の要件があることにより、追加の標的に特異的なアッセイ成分を最小限の中断（disruption）で多重化フォーマットに加えることができる。本発明者らは、少なくともＩＧＦ１−Ｒ、ｃ−ＭＥＴ、ｃ−ＫＩＴ、ＨＥＲ３、及びｐ９５ＨＥＲ２について一桁数の細胞レベルでのタンパク質発現及び活性化の検出を実証した。
【０５０２】
転移性乳癌を有する患者において第一選択療法の開始前に幾らかでもＣＴＣの検出があれば、検出ＣＴＣを有しない患者と比べて、無進行生存率及び全体的生存率が悪くなると予測される（Slamon, D.J. et al., Science, 235, 177-82 (1987); Cristofonilli, M. et al., N. Engl. J. Med. 351, 781-91 (2004)）。転移性患者におけるＣＴＣの意味はまだ知られていないが、治療過程の間にＣＴＣのプロファイル変化を監視する感度の良い方法を持つことは患者のその後の経過への洞察を与えることができる。このことは、単純な計数を超えてＣＴＣに基づく療法監視の価値を大きく高めるであろう。関連したリガンドを用いて単離ＣＴＣを処理することができるので、本発明の技術は潜在的な転移部位への経路におけるＣＴＣに対する「活性化潜在能力（activation potential）」を提供することができる。原発性乳癌と同期的遠隔転移との間のＨＥＲ２遺伝子状態の関係は、幾つかのグループによっては一致していると、また他のグループによっては全く異なると報告されているので（Zidan, J. et al., Br. J. Cancer 93, 552-556 (2005); Tanner, M. et al., Cancer Res. 61, 5345-5348 (2001); Tapia, C. et al., Breast Cancer Res. 9, R31-39 (2007); Grupka, N.L. et al.Arch. Pathol. Lab Med. 128, 974-979 (2004)）、原発性病変及び転移性病変とＣＴＣ中のＲＴＫ状態との間の発現関係を決定することは重要である。
【０５０３】
用いられたＣＴＣ単離方法にかかわらず、濃縮されたＣＴＣ試料は一般に少なくとも１０４又はそれより多い混入した血液細胞を含む。非ＣＴＣに関連した遺伝子シグニチャーはより量が多い（magnitudes higher）ので遺伝子発現分析を行うことは実際的ではないであろう。本発明者らのアッセイは、特異的な対応するエピトープに対する結合パートナー同士が近接している場合にシグナルを生成するので、多量の非標的バックグランド細胞集団中に存在する希少細胞を調査する現実的な臨床手段を提供する。ＲＴＫ及びそれに続く下流シグナル伝達経路タンパク質の発現及び活性化パターンが初期精密検査から疾患再発まで変化することを考慮すれば、医師はこのような変化をプロファイリングすることができる非侵襲的な「リアルタイム生検」及び或る期間にわたる評価から利益を受けることができる。これらの変化プロファイルに合わせて治療介入をより合理的に行うことができる。さらに、このようなアッセイを用いて新規の標的化療法の開発を促進することができる。
【０５０４】
方法
多重化マイクロアレイプリンティング
ニトロセルロースポリマーでコーティングされたガラススライド（ＦＡＳＴ（商標）、Ｗｈａｔｍａｎ社、ニュージャージー州フローラムパーク）の表面上に捕捉抗体をプリントした。接触型マイクロアレイプリンター（ＱＡｒｒａｙ、Ｇｅｎｅｔｉｘ社）を用いて、界面活性剤で１×ＰＢＳ中に希釈した捕捉抗体をプリントした。スポット径は約１７５μｍであり、プリントしたスライドを４℃の乾燥チャンバー内で保持した。各スポットは追跡用染料及び連続希釈により三連にプリントされた特異的捕捉抗体（Ａｂ）又は対照のいずれかを含んでいる。捕捉Ａｂ約５００ｐＬを、各スポットごとに連続希釈により１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、及び０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度で（図４８ａ）（図４７ａのスライドについては０．１２５ｍｇ／ｍＬを追加して）三連にプリントした。精製マウスＩｇＧを陰性対照としてプリントした。分析的キャリブレーション反応を８パッド上で及び内部品質管理反応を２パッド上で実施した。各スライドで、４つまでの未知患者試料の処理を行うことができる。
【０５０５】
抗体コンジュゲート及び精製
標的特異的抗体及び対応する検出子酵素を二官能性架橋剤であるスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）で活性化し、デキストランに結合させて抗体−デキストラン−酵素ポリマーコンジュゲートを作成した。サイズ排除カラムを用いてＨＰＬＣによってコンジュゲートを精製した。精製されたコンジュゲート中の抗体活性を競合的ＥＬＩＳＡによって検出しそして各検出子酵素に特異的な機能的アッセイによって酵素活性を検出した。
【０５０６】
細胞系試料
ＳＫＢｒ３、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、Ｔ４７Ｄ及びＢＴ４７４細胞系をＡＴＣＣから入手した。１００ｍｍ組織培養プレート中の下記の増殖培地で３７℃において５％ＣＯ２中で細胞を増殖させた：ＳＫＢｒ３ マッコイ５Ａ培地１０％ＦＢＳ含有、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８：ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、ＢＴ４７４：ＤＭＥＭ、１０Ｂ ＦＢＳ、Ｔ４７Ｄ：ＲＰＭＩ １６４０、１０％ＦＢＳ、０．２Ｕ／ｍＬウシインスリン。７０〜８０％集密度の細胞を穏やかな剥離法（detachment process）（トリプシン処理＋引き続きの不活性化）によって集菌し引き続いて計数を行いそして１×ＰＢＳで洗浄した。血清不含増殖培地中の１００μＭ ＥＧＦ若しくは２０μＭヘレグリンβ又はそれら両方を用いて細胞刺激を５分間実施した。刺激した細胞を１×ＰＢＳで洗浄し次いで溶解させ（溶解バッファ：５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００及び２００ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４）そして氷上に３０分間保持した。
【０５０７】
臨床的血液試料
ＩＲＢ認定プロトコルに従って、癌患者並びに対照健常個体から臨床的血液試料を採取した。全ての試料の使用についてインフォームドコンセントを得た。各臨床検体を２４時間以内にＰｒｏｍｅｔｈｅｕｓ社に発送し、同日に試料を処理し、そして得られた溶解物を−８０℃で保存した。全ての全血試料は成人被験者から採取した（＞１８歳〜＜８８歳）。試料はカリフォルニア州の複数のＣＲＯサイトから得た。ＲＥＣＩＳＴ（固形腫瘍における応答評価基準）基準に沿ったケア医療プラクティスの現行標準に従い全ての癌患者を診断した。
【０５０８】
血液試料採取時の患者の療法状態を問わず、局所性リンパ節又は遠隔転移（ステージＩＩＩｂ又はＩＶ）を伴う組織学的に確認された乳癌を有する患者から全血試料（Ｎ＝２７）を得た。ステージＩＩＩｂ乳癌を有する患者は局所リンパ節ステージングＮ１、Ｎ２、又はＮ３を有していた。標準的方法（例えば、全身的骨スキャン、ＣＴスキャン、ＰＥＴスキャンなど）を用いて転移性病変を確認した。登録された患者から静脈穿刺により２つのＥＤＴＡ含有チューブ（パープルトップチューブ）中に全血試料を採取した。採取された血液試料を採取日に周囲温度で発送した。各患者の同定をコード化して患者の匿名性を維持した。
【０５０９】
癌又は他の重篤な慢性疾患の前歴を除外するための詳細な医療履歴及び血圧及び脈拍数測定を含む簡単な身体検査によって評価した１８歳〜７５歳の間の正常個体から健常ボランティア由来の対照血液試料（Ｎ＝６０）を採取した。
【０５１０】
組織試料採取
凍結乳癌組織を購入した（ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｅｘ社、カリフォルニア州及びＩＬＳ  Ｂｉｏ社、メリーランド州）。患者は全てステージＩＩ又はＩＩＩの乳管癌を有する白人であった。一部の試料についてはＨＥＲ２ ＩＨＣ状態が提供された。室温に平衡化された凍結組織に真空シリンジに取り付けられた２３ゲージ針を５〜１０回通すことによる、又は凍結組織のスライシングによるＦＮＡ法を介して腫瘍組織を採取した。１００μＬ溶解バッファ中にＦＮＡ組織試料を溶解させた。氷上で３０分間インキュベートした後、溶解させた試料を遠心処理し、そして得られた溶解物の上澄を−８０℃で保存した。ヌードマウスに皮下注射することによりヒト乳癌細胞系（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＢＴ４７４）を用いて異種移植片モデルを構築した。腫瘍の大きさが４００ｍｍ３に達したときに、真空シリンジに取り付けられた２３ゲージ針を各腫瘍に５回通すことにより組織試料を採取した。採取した試料を１００μＬ溶解バッファ中に溶解させた。氷上で３０分間インキュベートした後、溶解させた試料を遠心処理しそして得られた溶解物の上澄を−８０℃で保存した。
【０５１１】
ＣＴＣ試料
ＣＴＣ評価のために末梢血を採取した。１０ｍＬ真空ＥＤＴＡチューブに血液試料７．５ｍＬを引いて採取した。試料を室温で維持し、一晩で郵送し、そして採取の２４時間以内に処理した。全てのＣＴＣ評価は患者の臨床状態の知見なしに実施した。上皮細胞接着分子に対する抗体にコンジュゲートされた強磁性流体を用い前記したプロトコルに従って免疫磁気的ＣＴＣ単離のためにＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｖｅｒｉｄｅｘ ＬＬＣ社、ニュージャージー州、ラリタン）を用いた（Fehm, T. et al., Clin. Cancer Res. 8, 2073-84 (2002)）。血液から濃縮したＣＴＣを前記のように刺激した。
【０５１２】
ＣＯＰＩＡ
スライドを、室温（ＲＴ）で又はＯ／Ｎ、４℃で１時間にわたりＷｈａｔｍａｎ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ８０μＬでブロックする前に、最初にＴＢＳＴ（５０ｍＭトリス／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／０．１％ツイーン２０、ｐＨ７．２〜７．４）で２回リンスした。ブロッキング過程の後、スライドをＴＢＳＴで２回洗浄した。８０μＬの希釈バッファ（２％ＢＳＡ／０．１％トリトンＸ−１００／ＴＢＳ、ｐＨ７．２〜７．４中の連続希釈された細胞溶解物対照をスライド上での標準用に指定されたニトロセルロースパッドに添加し、室温で１時間インキュベートした。臨床試料も同様にして８０μＬ反応体積中でインキュベートした。このインキュベーションの後、スライドを毎回３分間で、４回洗浄した。８０μＬの反応バッファ中に検出子抗体（２％ＢＳＡ／０．１％トリトンＸ−１００／ＴＢＳ中のリン酸化ＲＴＫ特異的抗体−デキストラン−ＨＲＰ、ＨＥＲ１特異的抗体−デキストラン−ＧＯ，及びＨＥＲ２特異的抗体−デキストラン−ＧＯ）を添加し室温で２時間インキュベートした。ＴＢＳＴを用いた洗浄により結合していない二次検出子抗体を除去した。活性化状態非依存性抗体はチャネリング酵素ＧＯとコンジュゲートされており、そして活性化状態依存性抗体はシグナル増幅成分ＨＲＰで標識化されていた。ＧＯがグルコースなどの基質と共に供給されると、ＧＯは過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を生成する。ＨＲＰがＧＯに対して適切な近接内にあるとき、Ｈ２Ｏ２はＨＲＰにチャネリングされそこで安定な複合体を形成する。ＨＲＰ−Ｈ２Ｏ２複合体は、近傍の求核性残基に共有結合する反応性チラミド基を生成するチラミドなどの蛍光発生基質を用いて増幅シグナルを生成する。本発明者らのアッセイにおいて、ビオチン−チラミド（エタノール中４００μｇ／ｍＬ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）の５０ｍＭグルコース／ＰＢＳ中５μｇ／ｍＬの８０μＬを各パッド上に添加し、暗中で１５分間インキュベートした。次いで、スライドのＴＢＳＴを用いた３分間の洗浄を４回行った。ストレプトアビジン（ＳＡ）標識化フルオロフォアなどのシグナル検出性試薬の添加により活性化チラミドを検出した。２％ＢＳＡ／０．１％トリトン／ＴＢＳ中０．５μｇ／ｍＬ（１：４０００希釈）のＳＡ−Ａｌｅｘａ６４７（ＰＢＳ中、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）８０μＬ、４０分間。インキュベーションの完了後、スライドをＴＢＳＴで４回洗浄した。次いで、スライドを完全に乾燥させ、マイクロアレイスキャナーによる走査まで暗中に保持した。
【０５１３】
ウェスタンブロッティング
各細胞系についての細胞溶解物を１回使い切りのバイアル中にアリコートした。それらのＢＣＡアッセイ結果によってタンパク質濃度を決定した。β−メルカプトエタノール含有試料バッファを用いて試料を調製し、５分間の煮沸及び室温までの冷却後に、タンパク質分子量ラダーの横に並んだＮｕＰａｇｅ４〜１２％ゲル上に試料をロードした。電気泳動の完了後に、ゲル中で分離したタンパク質をニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州）に移した。膜を洗浄し、５％ミクロブロットでブロックし、そしてＮＢＴ／ＢＣＩＰを用いた検出工程の前に一次抗体次いで二次抗体とインキュベートした。
【０５１４】
データ解析
各スライドを３つの光電子増倍管（ＰＭＴ）ゲイン設定で走査することにより感度を改善し飽和の影響を低減した。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウエアをスポット検知及びシグナル定量化に用いた。各スポットに対する識別子をＧｅｎｅＰｉｘ Ａｒｒａｙ Ｌｉｓｔ （．ｇａｌ）ファイルからインポートした。スライド上の各臨床試料について同定されない試験特定番号（de-identified study specific number）を得られたデータセットに組み込んだ。
【０５１５】
三連にプリントされた反復試験スポットに対してバックグランド補正シグナル強度を平均化した。それぞれの試薬ブランクの相対蛍光値を各試料から減算した。幾つかの品質基準を用いて、スポット・フットプリントにおける制限、スポット反復試験の変動係数、全体的パッドバックグランド及び試薬ブランクの強度を含む一層の分析からデータをフィルターにかけた。
【０５１６】
各アッセイに対して、細胞系ＭＤ−４６８（ＨＥＲ１陽性）及びＳＫＢｒ３（ＨＥＲ２陽性）から調製した連続希釈細胞溶解物の７つの濃度からＳ字状（sigmoidal）標準曲線を作成した。シグナル強度対ｌｏｇ濃度誘導単位ＣＵ（算出単位）の関数として各曲線をプロットした。非線形回帰によってデータを５パラメータ方程式（５ＰＬ）にフィットさせ（Ritz, C. and Streibig, J. C., J. Statistical Software, 12, 1-22 (2005)）、同時に捕捉抗体の３つの希釈全てをフィットさせた。オープンソース統計ソフトウエアパッケージであるＲを用いてフィッティングを行った（Development Core Team, R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org.R (2008)）。数学的モデルの過剰パラメータ化を避けそれによって正確度を改善するために、４つのパラメータを制限する（constrained）と同時に、各希釈の個々の変曲点を求めた。このプロセスを各ＰＭＴゲイン設定４５、５０及び６０に対して反復した。これにより、捕捉抗体の３つの希釈及び３つのＰＭＴ走査から、アッセイごとに生成された９つの標準曲線を得た。アッセイに組み込まれた冗長性（built-in redundancy）は、標準曲線のフィットが０．９５未満のＲ２を有する場合に希釈／走査の組み合わせ１つ又は２つ以上が除去されることを可能にすることによってそれに続く予測を改善した。データ整理及びデータ解析の方法の概要を図４９に記載し、作成された標準曲線を図５０ａに示す。
【０５１７】
ＣＵ計算（標準曲線に基づく）−それぞれの標準曲線（３つの捕捉抗体希釈及び３つのＰＭＴゲイン設定走査）からの個々の予測を結合して単一の最終予測とした。各予測に対して、標準曲線上の点の勾配を計算した。この勾配はｘ軸上のｌｏｇ単位を用いて取られたものであり、すなわち、勾配の分母の単位はｌｏｇ算出単位（ＣＵ）である。次に、予測の加重平均を計算するが、ここで加重値を前記勾配から決定した。具体的には、加重値を合計し、そして各点に全体の勾配によってその勾配を割ったものと等しい加重値を与えた。１つの分析物についてのこの計算を図５０ｂに一例として示す。既知の対照について予測に対する各アッセイの妥当性確認をした。
【０５１８】
本明細書に引用した全ての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願がそれぞれ参照することにより組み込まれることを明確に及び個別に示されていたかのように、本明細書に参照することにより組み込まれる。理解を明確にする目的で例示及び実施例により本発明を或る程度詳細に記載してきたが、本発明の教示に照らせば、特許請求の範囲に記載の精神又は範囲から逸脱することなしに所定の変更又は修飾をなすことができることは当業者に容易に明白であろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７ａ】
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【図４７ｂ】
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【図４７ｃ】
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【図４７ｄ】
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【図４７ｅ】
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【図４７ｆ】
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【図４８ａ】
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【図４８ｂ】
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【図４８ｃ】
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【図４９】
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【図５０】
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