(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性分子の制御放出のための医薬調合物であって、生理活性分子とポリエチレングリコールとの結合体および前記結合体と組み合わされた生分解性ポリマを含んで成り、その際、前記生分解性ポリマは、前記結合体を封入するマイクロ粒子又はナノ粒子中に配合されており、前記医薬調合物は、単相乳濁法により調製されており、かつ、前記医薬調合物は、前記ポリエチレングリコールに結合していない前記生理活性分子の調合物よりも初期放出が少ない、医薬調合物。
【請求項２】
前記生分解性ポリマが、ポリヒドロキシ酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、及びこれらのコポリマからなる群より選択される、請求項１に記載の医薬調合物。
【請求項３】
前記生分解性ポリマがポリ無水物、ポリオルトエステル、及び多糖ポリマからなる群より選択される、請求項１に記載の医薬調合物。
【請求項４】
前記生分解性ポリマがポリ乳酸及びポリグリコール酸のコポリマを含んで成る、請求項１に記載の医薬調合物。
【請求項５】
前記生理活性分子が、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、エリスロポエチン、顆粒球コロニ刺激因子、顆粒球マクロファージコロニ刺激因子、インターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン１２、アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、インシュリン、ＡＣＴＨ、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、チモシン、副甲状腺ホルモン、色素性ホルモン、ソマトメジン、黄体形成ホルモン、絨毛性性腺刺激ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、エンドルフィン、エンケファリン、ビファリン（原語：ｂｉｐｈａｌｉｎ）、プロラクチン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマ、治療遺伝子、ヘパリン、低分子量ヘパリン及び小型生理活性分子からなる群より選択される、請求項１に記載の医薬調合物。
【請求項６】
前記生理活性分子がタンパク質、ペプチド、及び低分子から成る群より選択される、請求項１に記載の医薬調合物。
【請求項７】
前記生理活性分子がインシュリンを含んで成る、請求項１に記載の医薬調合物。
【請求項８】
前記生理活性分子及び前記ポリエチレングリコールが共有結合により結合させてある、請求項１に記載の医薬調合物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願
本出願は、引用をもってその内容をここに援用することとする、２０００年１０月３１日出願の米国仮出願番６０／２４４，４９９号の標題「生理活性分子の向上した送達のための方法及び組成物」の優先権を主張するものである。
【０００２】
発明の背景
生分解性ポリマのマイクロスフィア及びナノスフィアに医薬を封入すると、薬物自体を投与したときに比較して、治療的薬物レベルの維持を長引かせることができる。処方や封入した活性分子によっては、持続的放出を最高で数ヶ月まで、延長させることもできる。しかしながら、数多くの生理活性分子、特にタンパク質は、ポリマ担体にそれらを封入するのに必要な手法により、損傷したり、不安定になる。さらに、荷電し、極性があるという多くのタンパク質の性質のために、ポリマによる薬物担体への封入の程度が制約を受け、最初に投与したときに、封入された生理活性分子の一部が急速に失われる（バースト）ことがある。生分解性ポリマ送達系への生理活性分子の封入は、患者への投与時の免疫応答を刺激するために用いられてきた（ゴムボッツ氏らの米国特許第５，９４２，２５３号を参照されたい）。場合によってはこれは望ましい結果ではあるが、治療を目的とした生理活性分子の送達が目的である場合には、これは望ましくない。このように、生分解性ポリマを用いて送達された生理活性分子の免疫系による認識を低下させることは、治療の場では有利であろう。
【０００３】
生理活性分子、特に治療タンパク質（薬物）の一箇所以上のアミノ酸側鎖に、ポリエチレングリコールなどの親水性ポリマを共有結合させて（ペギレーションとして知られるプロセス）修飾することがある（例えばデイビス氏らの米国特許第４，１７９，３３７号；ハリス氏の米国特許第５，４４６，０９０
号、デルガド氏らの米国特許第５，８８０，２５５号を参照されたい）。当業では、このような結合により分子量が見かけ上増加して、修飾された治療タンパク質の血中クリアランス速度が低下することが公知である（例えばキャンブル氏の米国特許第５，３２０，８４０号を参照されたい）が、この先行技術は、ＰＥＧ化タンパク質を用いると、免疫原性を低減できたり、又は、生分解性ポリマ薬物送達系からの放出時間が延長できることは教示していない。また該先行技術は、ＰＥＧ化により、生分解性の薬物送達系中への装薬量を、ＰＥＧ化していない薬物に比べて増加させられることを教示しておらず、また、ＰＥＧ化した成分では、ＰＥＧ化していない薬物に比べて、薬物のバーストを低減できることも教示していない。
【発明の概要】
【０００４】
発明の概要
本発明は、治療タンパク質、ペプチド及びオリゴヌクレオチドなどの生理活性分子の制御された持続性放出のための新規な製剤を提供するものである。本製剤は、例えばポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、及びこれらのコポリマなどの生分解性のポリマの組合せから形成されたマイクロ粒子又はナノ粒子に基づく。生理活性分子をポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールなどの親水性ポリマに結合させた後、調剤して固体のマイクロ粒子又はナノ粒子にすることで、放出を制御する。本制御放出製剤は、注射、吸入、鼻孔、又は経口により投与することができる。
【０００５】
従って、本発明の一部として、親水性のポリマを薬物及び治療タンパク質などの生理活性分子に結合させると、薬物担体への封入条件下における分解及び変性から保護できるという点を含め、いくつかの利点があることが発見されている。さらに、封入可能な修飾タンパク質の量が、修飾していないタンパク質に比べて増すため、総投与量を抑えることができ、患者及びメーカに双方にとって有利である。
【０００６】
加えて、本発明は、生分解性ポリマ薬物送達用担体に封入されたＰＥＧ化生理活性分子の免疫原性は、該担体中のＰＥＧ化していない生理活性分子に比べて、特に皮下もしくは筋肉内注射又は吸入又は粘膜送達（例えば経口又は鼻孔送達）したときに、低減されているという発見にも基づくものである。このような免疫原性の低減は、生分解性ポリマを経口送達に用いるという、粘膜ワクチン接種の典型的方法で、特に有利である。
【０００７】
別の局面では、本発明は、通常は胃腸管から吸収されないようなＰＥＧ化タンパク質、ペプチド、オリゴ糖及びオリゴヌクレオチドも、生分解性ポリマ系、特にナノスフィアに入れて投与すると生物学的利用能を獲得するという発見に基づくものである。ここで用いる用語「生物学的利用能のある」とは、対象への投与後に血流に入る分の生理活性分子を言う。本発明の制御放出製剤は、経口投与されたときの生理活性分子、特にここに解説するナノスフィア製剤の生物学的利用能を増加させる。例えば、ナノスフィアに封入したＰＥＧ化生理活性分子を一回、経口投与後では、血中レベルを、最長数日、維持できる。さらに、ポリエチレングリコール鎖は、ナノスフィアの形成過程において生理活性分子を分解及び変性から守り、活性物質の保持量を増加させ、「バースト」効果を低減する。
【０００８】
このように、ある好適な実施態様では、本発明は、生理活性分子の制御された持続放出と生物学的利用能増加のための医薬組成物を提供するものであり、該医薬組成物は、ナノスフィア中に封入された、ポリマ（例えばＰＥＧ）を結合させた治療薬を含む。特に好適な実施態様では、本組成物を経口投与する。
【０００９】
ある好適な実施態様では、本生理活性分子は、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、エリスロポエチン、顆粒球コロニ刺激因子、顆粒球マクロファージコロニ刺激因子、インターロイキン
１、インターロイキン ２、インターロイキン ３、インターロイキン １２、アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、インシュリン、ＡＣＴＨ、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、チモシン、副甲状腺ホルモン、色素性ホルモン、ソマトメジン、黄体形成ホルモン、絨毛性性腺刺激ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、エンドルフィン、エンケファリン、ビファリン、プロラクチン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマ、治療遺伝子、ヘパリン、低分子量ヘパリン及び小型生理活性分子からなる群より選択される。
【００１０】
従って、本発明の組成物は、治療的生理活性分子のｉｎ ｖｉｖｏ送達をいくつかの点で向上させるのに用いることができる。具体的には、本発明は、生理活性分子のｉｎ
ｖｉｖｏにおける免疫原性を低下させ、生物学的利用能を高め、持続時間を長引かせ、安定性を高め、バーストを低減し、そして制御された持続的放出を行わせるという長所を提供するものである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
Ｉ． 生理活性分子
ここで用いる「生理活性分子」という用語は、ヒト又は他の哺乳動物などの対象に投与するためのあらゆる治療タンパク質、ペプチド、多糖、核酸又は他の生物学的に活性な化合物を言う。本発明に用いるのに適した治療タンパク質には、限定はしないが、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、エリスロポエチン、顆粒球コロニ刺激因子、顆粒球マクロファージコロニ刺激因子
（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン １、インターロイキン ２、インターロイキン ３、インターロイキン １２、アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ 及びインシュリンが含まれる。
【００１２】
適した治療ペプチドには、さらに、ホルモン、例えばＡＣＴＨ、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、チモシン、副甲状腺ホルモン、色素性ホルモン、ソマトメジン、黄体形成ホルモン、絨毛性性腺刺激ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、エンドルフィン、エンケファリン、ビファリン及びプロラクチンが含まれる。
【００１３】
更なる適した治療タンパク質には、モノクローナル及びポリクローナル抗体、一本鎖抗体、他の抗体フラグメント、類似体及び誘導体が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマ及び治療遺伝子を含む治療的ポリヌクレオチドも、本発明の方法及び組成物を用いて送達できる。
【００１４】
ヘパリン及び低分子量ヘパリンなどの抗凝固性治療薬も、本発明の方法及び組成物を用いて送達できる。本発明で用いるのに適した他の治療タンパク質には、小型生理活性分子、例えば抗癌剤、例えばパクリタキセル、タキソテール、ドキソルビシン及びダウノルビシン、ビンクリスチン、シスプラチン、カルボプラチン、カンプトテシン及びカンプトテシン類似体、抗生物質、抗精神病薬、抗うつ剤、糖尿病及び心血管疾患用の小分子薬物、が含まれる。
【００１５】
ＩＩ． 親水性ポリマへの生理活性分子の結合
用語「親水性ポリマ」とは、限定はしないが、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコール及び類似の直線状及び分枝状ポリマを含め、あらゆる水溶性の直線状及び分枝状ポリマを言う。好ましくは、当該ポリマの分子量は約５００ダルトン乃至約５０，０００ダルトンの範囲であるとよい。本発明で用いる親水性ポリマは、典型的には、目的の生理活性分子にアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、リン酸基又は水酸基の官能性を介して結合するよう加えられた反応基を有する。
【００１６】
ポリエチレングリコールなど、本発明で用いる親水性ポリマは標準的なプロトコルに従って調製でき、一端をメトキシ基でキャップをし、他端を、生理活性分子上の活性基に容易に結合するよう活性化させる。例えば、米国特許第６，１１３，９０６号は、コハク酸又はカルバミン酸スクシンアミジル反応基をポリエチレングリコールに用いて、タンパク質のアミン基に反応させることを解説している。米国特許第５，４４６，０９０号は、ポリエチレングリコールのスルホン誘導体を用いて、タンパク質のスルフヒドリル基との安定な結合を形成することを解説している。米国特許第５，８８０，２５５号は、トレシル誘導体を用いてタンパク質のアミン基に反応させて、簡単で安定な二番目のアミン結合を形成することを解説している。これらの特許の内容全体を、引用をもってここに援用することとする。Ｎ−ヒドロキシスクシンアミドも、反応基として取り入れてよい。
【００１７】
ＩＩＩ． ポリマを結合させた生理活性分子のための制御放出製剤
用語「制御放出」とは、生理活性分子が本発明の薬物送達製剤で送達されるときの速度及び／又は量の制御を言う。ここでの制御放出は連続的でも、非連続的でもよく、及び／又は、線形でも、非線形でもよい。これは、所望の効果を得るために、一種類以上のポリマ組成物や装薬を用いたり、賦形剤又は分解促進剤を含有させたり、又は他の修飾物質を単独もしくは組合せもしくは連続的に投与して用いて達成できる。
【００１８】
ゼロ次又は線形の放出とは、ある時間にわたって放出される生理活性分子の量が、所望の時間枠の間の量／単位時間の関数として相対的に一定のままであることを意味すると、一般には解釈されている。多相とは、放出が二回以上の「バースト」で起きることを意味すると、一般には解釈されている。
【００１９】
Ａ． マイクロ粒子
ある実施態様では、本発明は、ポリマを結合させた生理活性分子の制御放出のために、生分解性マイクロ粒子を利用する。ここで用いる「マイクロ粒子」とは、好ましくは１．０ｍｍ未満、そしてより好ましくは１．０乃至１００．０ミクロンの直径を有する粒子を言う。マイクロ粒子には、典型的には固体の球形のマイクロ粒子であるマイクロスフィアが含まれる。またマイクロ粒子には、典型的には異なるポリマ、薬物、又は組成のコアを有する球形のマイクロ粒子であるマイクロカプセルも含まれる。
【００２０】
本発明で用いるマイクロ粒子は、当業で公知のように、制御放出製剤に用いられる多種の生分解性ポリマを用いて作製できる。適したポリマには、限定はしないが、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、及びこれらのコポリマを含むポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、及びいくつかの種類のタンパク質及び多糖ポリマが含まれる。ここで用いる用語「生体分解性」又は「生分解性」とは、約６〜８のｐＨと、約２５℃〜３８℃の温度の生理溶液に暴露したときに、所望の用途（通常はｉｎｖｉｖｏ治療法）で許容できる期間内、典型的には約５年未満、そしてより好ましくは約１年未満、で、溶解又は分解するポリマを言う。
【００２１】
好適なポリマには、身体の水性環境に暴露後に加水分解により分解するポリ（ヒドロキシ酸）、特に（ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（「ＰＬＧＡ」）が含まれる。次にこのポリマは加水分解して乳酸及びグリコール酸単量体を生じるが、これらは細胞代謝で出る通常の副産物である。ポリマの崩壊速度は数週間から１年を越える期間まで、様々であり、ポリマの分子量、ポリマ鎖中のラクチド単量体対グリコリド単量体の比や、単量体サブユニットの立体規則性（Ｌ型及びＤ型立体異性体が混合していると、ポリマの結晶性が損なわれて、ポリマの分解を促進する）に左右される。マイクロスフィアは分子量及び／又は単量体比の異なる、二種又はそれ以上の生分解性ポリマの混合体を含んでいてよい。
【００２２】
ＰＬＧＡ等々に結合させた親水性ポリマを含め、誘導体化させた生分解性ポリマも、本発明で用いるのに適する。特にマイクロスフィアを形成するには、当業で公知の多種の技術を用いることができる。これらには、例えば、一回又は二回の乳濁ステップの後に溶媒を除去する方法が含まれる。溶媒の除去は、例えば抽出、蒸発又は噴霧乾燥により、行ってよい。
【００２３】
溶媒抽出法では、水などの抽出溶媒に少なくとも部分的に可溶性の有機溶媒中にポリマを溶解させる。次に、可溶性の形か、又は微細粒子として分散させた形の生理活性分子をこのポリマ溶液に加え、この混合液を、ポリ（ビニルアルコール）などの界面活性剤を含有する水相中に分散させる。その結果得られた乳濁液を、より大きな体積の水に加えると、有機溶媒がポリマ／生理活性物質から除去されて、硬化したマイクロ粒子が形成される。
【００２４】
溶媒蒸発法では、ポリマを揮発性の有機溶媒に溶解させる。次に、可溶性の形か、又は微細な粒子として分散させた形の生理活性分子をポリマ溶液に加え、この混合液を、ポリ（ビニルアルコール）などの界面活性剤を含有する水相に懸濁させる。その結果生じた乳濁液を、有機溶媒の大半が蒸発して固体のマイクロスフィアが残るまで、攪拌する。
【００２５】
噴霧乾燥法では、塩化メチレン（例えば０．０４ｇ／ｍｌ）などの適した溶媒にポリマを溶解させる。次に、既知の量の生理活性分子（薬物）を、このポリマ溶液中に懸濁（不溶性の場合）させるか、又は同時溶解（可溶性の場合）させる。次に、この溶液又は分散液を噴霧乾燥させる。ポリマの選択に応じた形態を持つ、直径が１乃至１０ミクロンのマイクロスフィアを得ることができる。
【００２６】
相分離及びコアセルベーションや、上記の変更法など、他の公知の方法も当業で知られており、本発明に用いてよい。
【００２７】
Ｂ． ナノ粒子
別の実施態様では、本発明は、ポリマを結合させた生理活性分子の制御放出用、特に経口投与用の生分解性ナノ粒子を利用する。ここで用いる用語「ナノ粒子」とは、好ましくは直径が約２０．０ナノメートル乃至約２．０ミクロン、典型的には約１００ナノメートル乃至１．０ミクロンの粒子を言う。
【００２８】
ナノ粒子の製剤は、基本的にはマイクロ粒子に関して上述した通りに作製できるが、例外として、高速混合又は均質化を用いて、ポリマ／生理活性物質乳濁液の大きさを約２．０ミクロン未満、好ましくは約１．０ミクロン未満に低下させる。例えば、ナノ粒子を作製するのに適した技術はその開示全体を引用をもってここに援用することとするＷＯ
９７／０４７４７号に解説されている。
【実施例１】
【００２９】
実施例
Ｉ． ｌｅｕ−エンケファリンを送達するための製剤の調製及び特徴付け
実施例１ − ポリエチレングリコール結合ｌｅｕ−エンケファリン（ＰＥＧ−ｌｅｕ−エンケファリン）の調製
ポリエチレングリコールを共有結合させることで修飾されたｌｅｕ−エンケファリンを以下のように調製した：２５ｍｇのｌｅｕ−エンケファリンを、５０μＬのＴＥＡを含有する５００μＬの無水ＤＭＳＯ中に溶解させた。２５０ｍｇのｍＰＥＧ（５０００）−ＳＰＡを１．５ｍＬの無水ＤＭＳＯに溶解させ、ペプチド溶液に直接注射して加えた。反応を２時間、室温で進ませるか、又は、ペプチドの９０％を越えるものがそのＰＥＧ修飾型に転化するまで、進ませた。反応物から生成物であるｍＰＥＧ（５０００）−ｌｅｕ−エンケファリンを、ＥｔＯＨからの再結晶化（２×）で分離した。反応生成物は白色の固体であり、その９５％を越えるものがＰＥＧ化していた（ＲＰ−ＨＰＬＣによる評価）。
【実施例２】
【００３０】
実施例２ − ｌｅｕ−エンケファリンを含有する通常の（ｗ１／ｏ／ｗ２）マイクロ粒子の調製及び特徴付け
ｌｅｕ−エンケファリンを含有する通常の（ｗ１／ｏ／ｗ２）マイクロ粒子を以下のように調製した：ｌｅｕ−エンケファリンを１：９のＤＭＳＯ：ＰＢＳ混合液に溶解させて、最終濃度を３５ｍｇ／ｍｌ（そのＰＢＳ中の最大溶解度）とした。ＰＬＧＡ
（５０：５０ ラクチド：グリコリド；酸性の末端基；固有粘度 ０．１６ Ｌ／ｇ） を塩化メチレンに溶解させて、最終濃度を２００ ｍｇ／ｍＬにした。２００μＬのこのペプチド溶液を３ｍＬのポリマ溶液と１０，０００ｒｐｍで３分間均質化させて、一次（ｗ／ｏ）乳濁液を作製した。この一次乳濁液を１００
ｍＬ の ０．５％ ＰＶＡ 溶液に注ぎ入れ、７５０ ｒｐｍ で３乃至６時間、攪拌した。溶媒が蒸発してマイクロ粒子が硬化したところで、それらを濾過で採集して真空
で乾燥してから解析した。その粒子を、コア装薬量（ＣＬ）、封入効率（ＥＥ）、粒子の大きさ（ＰＳ）、及びそれらの内容物の初期放出（ＩＲ）について、以下のように特徴付けた。表１はその結果を示す。
【００３１】
マイクロスフィアのコア装薬量の測定は、１０ｍｇのマイクロスフィアを５０％アセトニトリルに溶解させた後に遠心分離して、不溶性のポリマをペレットにして行った。アリコートをＲＰ−ＨＰＬＣで解析し、５０％アセトニトリル中に調製した代表的な標準に比較した。マイクロスフィアからの最初の内容物放出は、２０ｍｇの試料を、０．０２％のＴｗｅｅｎ２０及び２５％ＥｔＯＨを含有する２ｍＬのＰＢＳ（５０ｍＭ、ｐＨ７．２）中に懸濁させて測定した。この懸濁液をボルテックスし、３７℃でインキュベートした。１時間後、数アリコートを取り出し、濾過し、放出された量をＲＰ−ＨＰＬＣで解析した。１時間目の時点でのこのような促進された放出は、ＥｔＯＨを加えないＰＢＳ中に１日後に放出された活性分子の量と、良好な相関関係にあることが示された。
【実施例３】
【００３２】
実施例３ −ＰＥＧ−ｌｅｕ−エンケファリン結合体を含有する通常の（ｗ１／ｏ／ｗ２）マイクロ粒子の調製及び特徴付け
ＰＥＧ−ｌｅｕ−エンケファリンを含有する通常のｗ１／ｏ／ｗ２マイクロ粒子を以下のように調製した：ＰＥＧ−ｌｅｕ−エンケファリンを１：９
ＤＭＳＯ：ＰＢＳ 混合液に溶解させて、最終濃度を５０ ｍｇ／ｍＬとした。ＰＬＧＡ （５０：５０ラクチド：グリコリド；酸性の末端基；固有粘度 ０．１６ Ｌ／ｇ）を塩化メチレンに溶解させて、最終濃度を２００
ｍｇ／ｍＬとした。２００μＬのペプチド溶液を３ｍＬのポリマ溶液と１０，０００ｒｐｍで３分間均質化させて、一次（ｗ／ｏ）乳濁液を作製した。この一次乳濁液を１００
ｍＬ の ０．５％ ＰＶＡ 溶液に注ぎ入れ、７５０ ｒｐｍ で３乃至６時間、攪拌した。溶媒が蒸発してマイクロ粒子が硬化したところで、それらを濾過で採集して真空乾燥してから解析した。その粒子を、コア装薬量（ＣＬ）、封入効率（ＥＥ）、粒子の大きさ（ＰＳ）、及びそれらの内容物の初期放出（ＩＲ）について、実施例２で解説したように特徴付けた。これらのデータを表１に示す。
【実施例４】
【００３３】
実施例４ − ｌｅｕ−エンケファリンを含有する単相マイクロ粒子の調製及び特徴付け
未修飾のｌｅｕ−エンケファリンを含有する単相マイクロ粒子を以下のように調製した：１０
ｍｇ のｌｅｕ−エンケファリンを、３０μＬのＴＦＡを含有する１ ｍＬ の塩化メチレンに溶解させた。次に、９０ ｍｇのＰＬＧＡ （５０：５０ ラクチド：グリコリド；ラウリル末端基；固有粘度
０．６１ Ｌ／ｇ）を有機ペプチド溶液に溶解させた。この溶液を２．５ｍＬの２．５％ＰＶＡと一緒に３分間ボルテックスして、一次（ｏ／ｗ）乳濁液を形成した。強制換気（１５分間）及び攪拌（６乃至８時間）を用いて、溶媒を蒸発させ、マイクロ粒子を硬化させた。硬化後、濾過でマイクロ粒子を採集し、真空乾燥してから解析した。コア装薬量（ＣＬ）、封入効率（ＥＥ）、粒子の大きさ（ＰＳ）、及び内容物の初期放出（ＩＲ）に関するデータを表１に示す。
【実施例５】
【００３４】
実施例５ − ＰＥＧ−ｌｅｕ−エンケファリン結合体を含有する単相マイクロ粒子の調製及び特徴付け
ＰＥＧ−ｌｅｕ−エンケファリンを含有する単相マイクロ粒子を以下のように調製した：５０ｍｇのＰＥＧ−ｌｅｕ−エンケファリン及び１５０ｍｇのＰＬＧＡ
（５０：５０ ラクチド：グリコリド；ラウリル末端基；固有粘度 ０．６１ Ｌ／ｇ） を２ｍＬの塩化メチレンに溶解させた。有機ペプチド／ポリマの溶液を５ｍＬの２．５％ＰＶＡと一緒に３分間、ボルテックスして、一次
（ｏ／ｗ）乳濁液を形成した。攪拌／真空蒸発を２時間行って有機溶媒をマイクロ粒子から取り除いた。マイクロ粒子の硬化後、濾過でそれらを採集し、 真空乾燥させてから解析した。コア装薬量（ＣＬ）、封入効率（ＥＥ）、粒子の大きさ（ＰＳ）、及び内容物の初期放出（ＩＲ）に関するデータを表１に示す。
【実施例６】
【００３５】
実施例６ − ＰＥＧ化ｌｅｕ−エンケファリンの装薬量増加
表１のデータは、ＰＥＧ５０００をｌｅｕ−エンケファリンに共有結合させると、実現可能な装薬量（ＣＬ）
が、二相乳濁技術の場合には０．０７％ から０．３６％ に、そして単相法の場合には０．３％ から３．９５％ に増加することを示す。さらにＰＥＧ化の結果、二つの方法で封入効率が大きく向上した。初期放出（「バースト」）は、単相で作製した非ＰＥＧ化ペプチドに比べ、ＰＥＧ化した方が僅かに少なく（より好ましく）、コア装薬量もＰＥＧ化ペプチドの方が１０倍を越えて多かった。コア装薬量を多くできることにより、所望の薬物用量を達成するのに患者に投与せねばならない生分解性薬物送達系の用量を少なくすることができる。
【００３６】
【表１】
0005737843.tif 000002
【００３７】
ａ理論装薬量（活性分子の重量／活性分子及びポリマの総重量）
ＣＬ コア装薬量（分離時のマイクロ粒子中の活性分子の重量％）
ＥＥ 封入効率（加工時に封入される活性分子の％）
ＰＳ 平均粒子サイズ（ＳＥＭから推定されたもの）
ＩＲ ０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０及び２５％ＥｔＯＨを含有する３７℃のＰＢＳ（５０ｍＭ、ｐＨ７．２）中のｉｎ ｖｉｔｒｏ溶解液からの１時間目の時点での初期放出
ＮＤ 検出不能
【実施例７】
【００３８】
ＩＩ． ビファリンを送達するための製剤の調製、特徴付け及び投与
実施例７ − ＰＥＧ化ビファリンの装薬量増加及びバースト低下
ビファリンは哺乳動物で鎮痛活性を持つ合成ペプチドである。それに二本のＰＥＧ２００鎖を結合させると、非ＰＥＧ化ペプチドに比べて、静脈内投与後の鎮痛作用が長引く。ビファリン及びＰＥＧ化ビファリンを、以下の例で解説するように、ＰＬＧＡマイクロスフィア封入におけるそれらの挙動について比較した。表２に示すように、ＰＥＧ化ビファリンは、非ＰＥＧ化ペプチドに比べて、高いコア装薬量、高い封入効率、及び低い初期放出レベル（バースト）を有する。
【実施例８】
【００３９】
実施例８ − ビファリンを含有する通常の（ｗ１／ｏ／ｗ２） マイクロ粒子の調製及び特徴付け
ＰＥＧ−ビファリンを含有する通常のｗ１／ｏ／ｗ２
マイクロ粒子を以下のように調製した：ビファリンを３元ＰＢＳ：ＤＭＳＯ：酢酸 （５：１：１．５） 混合液に溶解させて最終濃度を３５ ｍｇ／ｍＬとした。ＰＬＧＡ （５０：５０
ラクチド：グリコリド；酸性末端基；固有粘度０．１６ Ｌ／ｇ） を塩化メチレンに溶解させて最終濃度を２００ ｍｇ／ｍＬとした。２００μＬのペプチド溶液を３ ｍＬのポリマー溶液に１０，０００
ｒｐｍで３分間、均質化させて一次（ｗ／ｏ）乳濁液を作製した。この一次乳濁液を１００ ｍＬの０．５％ ＰＶＡ溶液に注ぎ入れて、７５０ ｒｐｍ で３時間、攪拌した。溶媒が蒸発し、マイクロ粒子が硬化した後、これらを水で洗浄し、濾過で採集し、
真空乾燥させてから解析した。コア装薬量（ＣＬ）、封入効率（ＥＥ）、粒子の大きさ（ＰＳ）、及び内容物の初期放出（ＩＲ）に関するデータを表２に示す。
【実施例９】
【００４０】
実施例９ − ＰＥＧ−ビファリン結合体を含有する通常の（ｗ１／ｏ／ｗ２） マイクロ粒子の調製及び特徴付け
ＰＥＧ−ビファリンを含有する通常のｗ１／ｏ／ｗ２
マイクロ粒子を以下のように調製した：ＰＥＧ−ビファリンをＰＢＳに溶解させて最終濃度を５０ ｍｇ／ｍＬとした。ＰＬＧＡ （５０：５０ ラクチド：グリコリド；酸性末端基；固有粘度０．１６
Ｌ／ｇ） を塩化メチレンに溶解させて最終濃度を２００ ｍｇ／ｍＬとした。２００μＬのペプチド溶液を３ ｍＬのポリマー溶液に１０，０００ ｒｐｍで３分間、均質化させて一次（ｗ／ｏ）乳濁液を作製した。この一次乳濁液を１００
ｍＬの０．５％ ＰＶＡ溶液に注ぎ入れて、７５０ ｒｐｍ で３時間、攪拌した。溶媒が蒸発し、マイクロ粒子が硬化した後、これらを水で洗浄し、濾過で採集し、 真空乾燥させてから解析した。コア装薬量（ＣＬ）、封入効率（ＥＥ）、粒子の大きさ（ＰＳ）、及び内容物の初期放出（ＩＲ）に関するデータを表２に示す。
【実施例１０】
【００４１】
実施例１０ − ビファリンを含有する単相マイクロ粒子の調製及び特徴付け
修飾されていないビファリンを含有する単相マイクロ粒子を以下のように調製した：２０
ｍｇ のビファリン及び１８０ ｍｇのＰＬＧＡ （５０：５０ラクチド：グリコリド；ラウリル末端基；固有粘度 ０．６１ Ｌ／ｇ）を２ｍＬ の１：３ 酢酸：塩化メチレン混合液に溶解させた。この油相を５ｍＬの１％ＰＶＡと一緒に３分間、ボルテックスして、一次乳濁液を作製した。この一次ｏ／ｗ乳濁液を４時間、攪拌しながら真空乾燥させて、有機溶媒を取り除いた。溶媒除去後、硬化したマイクロ粒子を濾過で採集し、蒸留脱イオン水で数回洗浄して、非特異的に結合したＰＶＡ
又はビファリンを取り除いた。最後に、このマイクロ粒子を 真空乾燥させてから解析した。コア装薬量（ＣＬ）、封入効率（ＥＥ）、粒子の大きさ（ＰＳ）、及び内容物の初期放出（ＩＲ）に関するデータを表２に示す。
【実施例１１】
【００４２】
実施例１１ − ＰＥＧ−ビファリン結合体を含有する単相マイクロ粒子の調製及び特徴付け
ＰＥＧ−ビファリンを含有する単相マイクロ粒子を以下のように調製した：１８０
ｍｇのＰＬＧＡ （５０：５０ ラクチド：グリコリド；ラウリル末端基；固有粘度０．６１ Ｌ／ｇ） 及び２０ ｍｇ のＰＥＧ−ビファリンを２ ｍＬの塩化メチレンに溶解させた。ポリマ／ペプチド溶液を５
ｍＬ の２．５％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ、８０−８５％ 加水分解済み）と一緒に３分間、ボルテックスして、一次乳濁液を作製した。この一次乳濁液（ｏ／ｗ）を４時間、攪拌しながら吸引蒸発させて、有機溶媒を取り除いた。硬化したマイクロ粒子を濾過で採集し、蒸留水で数回洗浄して、非特異的に結合したＰＶＡ
又はＰＥＧ−ビファリンを取り除いた。最後に、このマイクロ粒子を 真空乾燥させてから解析した。コア装薬量（ＣＬ）、封入効率（ＥＥ）、粒子の大きさ（ＰＳ）、及び内容物の初期放出（ＩＲ）に関するデータを表２に示す。
【実施例１２】
【００４３】
実施例１２ − 生分解性マイクロスフィアに入れたＰＥＧ化ビファリンの投与後の哺乳動物における鎮痛効果
本発明に基づいて投与されたビファリンのｉｎ ｖｉｖｏでの向上した送達を評価するためには、比較研究を以下のように行うことができる。ＰＥＧ化ビファリン
ＰＬＧＡマイクロスフィアは、実施例９で解説したように二重乳濁法で調製できる。このマイクロスフィアを、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を加えた媒質カルボキシメチルセルロース（０．５％）水溶液に懸濁させる。次に、有効量をスプラーグ−ドーリー・ラットに皮下投与して、テイル・フリックアッセイなどで鎮痛効果を測定する。マイクロスフィアに封入されたＰＥＧ−ビファリンの有する鎮痛効果は、封入されていないＰＥＧ−ビファリン・コントロール注射のそれよりも長時間、続く。この実験を、実施例１１の単相法で調製したＰＬＧＡ封入ＰＥＧ−ビファリンで繰り返しても、同様な結果を得ることができる。
【００４４】
【表２】
0005737843.tif 000003
【００４５】
ａ理論装薬量（活性分子の重量／活性分子及びポリマの総重量）
ＣＬ コア装薬量（分離時のマイクロ粒子中の活性分子の重量％）
ＥＥ 封入効率（加工時に封入される活性分子の％）
ＰＳ 平均粒子サイズ（ＳＥＭから推定されたもの）
ＩＲ ０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０及び２５％ＥｔＯＨを含有する３７℃のＰＢＳ（５０ｍＭ、ｐＨ７．２）中のｉｎ ｖｉｔｒｏ溶解液からの１時間目の時点での初期放出
ＮＤ 検出不能
【実施例１３】
【００４６】
ＩＩＩ． インシュリンを送達するための製剤の調製、特徴付け及び投与
実施例１３ − ポリエチレングリコール結合ヒトインシュリン（ＰＥＧ−インシュリン）の調製
ヒトインシュリンをポリエチレングリコールに共有結合させる修飾を以下のように行った：１１６
ｍｇ の組換えヒトインシュリンを、２００μＬのＴＥＡを含有する４ ｍＬ の無水ＤＭＳＯに溶解させた。１ ｇ の ｍＰＥＧ（５０００）−ＳＰＡを１０ ｍＬ の無水ＤＭＳＯに溶解させ、前記のインシュリン溶液に直接注射して加えた。この反応は、一晩（６乃至１０時間）、室温で続けさせるか、又は、当該タンパク質の９０％を越えるものがＰＥＧ化するまで続けさせた。未反応のＰＥＧ及びＰＥＧ化インシュリンは、Ｅｔ２Ｏ（×２）で沈殿させて分離した。その最終生成物は、顆粒状の白色の固体であり、その９５％を越えるものが（ＲＰ−ＨＰＬＣ解析によると）ＰＥＧ化していた。
【実施例１４】
【００４７】
実施例１４ ヒトインシュリンを含有する通常の（ｗ１／ｏ／ｗ２） マイクロ粒子の調製及び特徴付け
ヒトインシュリンを含有する通常の（ｗ１／ｏ／ｗ２）
マイクロ粒子を以下のように調製した：組換えヒトインシュリンをＤＭＳＯ：０．１Ｎ ＨＣｌ （１：１）に溶解させて最終濃度を５０ ｍｇ／ｍＬ とし、ＰＬＧＡ （５０：５０
ラクチド：グリコリド；ラウリル末端基；固有粘度 ０．６１ Ｌ／ｇ）を塩化メチレンに溶解させて、最終濃度を２００ ｍｇ／ｍＬとした。２００μＬの当該タンパク質溶液及び３ｍＬのポリマ溶液を１０，０００
ｒｐｍ で３分間、均質化させて一次（ｗ／ｏ）乳濁液を形成した。次に、この一次乳濁液を１００ ｍＬの ０．５％ ＰＶＡに加えて、真空下で３乃至６時間、攪拌した。有機溶媒を除去後、マイクロ粒子を濾過し、水で数回洗浄し、真空乾燥させてから解析した。表３はこのマイクロ粒子の特徴を挙げる。
【実施例１５】
【００４８】
実施例１５ − ＰＥＧ−インシュリン結合体を含有する通常の（ｗ１／ｏ／ｗ２） マイクロ粒子の調製及び特徴付け
ＰＥＧ−インシュリンを含有する通常のｗ１／ｏ／ｗ２
マイクロ粒子を以下のように調製した：ＰＥＧ−インシュリンを ＤＭＳＯ：Ｈ２Ｏ （１：２）混合液に最終濃度５０ｍｇ／ｍＬ になるように溶解させ、ＰＬＧＡ
（５０：５０ ラクチド：グリコリド；ラウリル末端基；固有粘度 ０．６１ Ｌ／ｇ）を塩化メチレンに溶解させて、最終濃度を２００ ｍｇ／ｍＬとした。 ２００μＬの当該タンパク質溶液及び３ｍＬのポリマ溶液を１０，０００
ｒｐｍ で３分間、均質化させて一次（ｗ／ｏ）乳濁液を形成した。次に、この一次乳濁液を１００ ｍＬの ０．５％ ＰＶＡに加えて、真空下で３乃至６時間、攪拌した。有機溶媒を除去後、マイクロ粒子を濾過し、水で数回洗浄し、真空乾燥させてから解析した。表３はこのマイクロ粒子の解析結果を挙げる。
【実施例１６】
【００４９】
実施例１６ − ヒトインシュリンを含有する単相マイクロ粒子の調製及び特徴付け
ヒトインシュリンを含有する単相マイクロ粒子を以下のように調製した：２０
ｍｇ の組換えヒトインシュリン（Ｚｎ２＋−インシュリン塩）を２ ｍＬの酢酸：塩化メチレン（１．４：１）混合液に溶解させた。次に１８０ ｍｇ
のＰＬＧＡ（５０：５０ ラクチド：グリコリド；ラウリル末端基；固有粘度 ０．６１ Ｌ／ｇ）をこの有機ペプチド溶液に溶解させた。この有機ペプチド／ポリマ溶液を５ｍｌの１％ＰＶＡと一緒に３分間、ボルテックスして、一次乳濁液を作製した。攪拌しながら２時間、真空乾燥させてこの有機溶媒を取り除いた。一部硬化したマイクロ粒子を１００ｍｌの水を含有するビーカに加え、さらに２時間、攪拌して、全ての有機溶媒を完全に除去した。マイクロ粒子を濾過で採集し、水で数回洗浄して、真空乾燥してから解析した。表３は、このマイクロ粒子の解析結果を挙げる。
【実施例１７】
【００５０】
実施例１７ − ＰＥＧ−インシュリン結合体を含有する単相マイクロ粒子の調製及び特徴付け
ＰＥＧ−インシュリンを含有する単相マイクロ粒子を以下のように調製した：６３
ｍｇ のＰＥＧ−インシュリン及び１３７ ｍｇ のＰＬＧＡ（５０：５０ ラクチド：グリコリド；ラウリル末端基；固有粘度 ０．６１ Ｌ／ｇ）を２ｍｌの塩化メチレンに溶解させた。この油相を５ｍＬの１％ＰＶＡと一緒に３分間、ボルテックスして、一次乳濁液を形成した。２時間真空蒸発させた後、周囲条件下で１時間攪拌して、溶媒を除去した。硬化したマイクロ粒子を濾過で採集し、水で数回洗浄してから
真空乾燥し、解析した。表３はこのマイクロ粒子の解析結果を挙げる。
【実施例１８】
【００５１】
実施例１８ − ＰＥＧ化インシュリンの装薬量及び封入効率の上昇
表３のデータは、ＰＥＧ化インシュリンにより、単相及び二重乳濁法の両方で調製したＰＬＧＡマイクロスフィア中に、より多くの装薬が可能であることを示す。さらにＰＥＧ化インシュリンは、価値の高い生物学的活性ペプチド及びタンパク質を用いるときの大きな長所である、高い封入効率を有する。
【００５２】
【表３】
0005737843.tif 000004
【００５３】
ａ理論装薬量（活性分子の重量／活性分子及びポリマの総重量）
ＣＬ コア装薬量（分離時のマイクロ粒子中の活性分子の重量％）
ＥＥ 封入効率（加工時に封入される活性分子の％）
ＰＳ 平均粒子サイズ（ＳＥＭから推定されたもの）
【実施例１９】
【００５４】
実施例１９ − ＰＬＧＡに封入されたＰＥＧ−インシュリンの血糖降下作用
ＰＥＧ−インシュリンＰＬＧＡマイクロスフィア及び当量の遊離インシュリンを正常なラットに皮下投与した。血液を定期的に抜き取り、血液凝固を阻止した。血糖値を標準的テストで測定した。表４に示すように、ＰＬＧＡマイクロスフィアに入れたＰＥＧ−インシュリンを用いると、未修飾のインシュリンで観察される値に比べ、初期血糖低下が有意に抑制された。さらに、これらのデータは、重要なことに、ＰＥＧ−インシュリン・マイクロスフィア製剤は、その薬物を生物学的に活性な形で放出し、修飾していない通常の製剤で起きる「バースト」効果もなく、ｉｎ
ｖｉｖｏ動物モデルで血糖値を効果的に抑制できたことを示している。
【００５５】
【表４】
0005737843.tif 000005
【００５６】
ａ％ＢＧＬは、提示した血糖値は、基礎値のパーセンテージに対して正規化してあることを示す。
【実施例２０】
【００５７】
ＩＶ． ＧＭ−ＣＳＦを送達するための製剤の調製及び特徴付け
実施例２０ − ポリエチレングリコールを結合させたＧＭ−ＣＳＦの調製
ＧＭ−ＣＳＦをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に以下のように共有結合させることができる：１００
ｍｇ の ＧＭ−ＣＳＦ を１０ ｍｌの ｐＨ ７．５ のリン酸緩衝液に室温で溶解させる。次に、１００ ｍｇ のトレシル−モノメトキシ−ポリエチレングリコール（分子量＝５０００
ダルトン）を加え、この混合液を１時間、攪拌する。未反応のＧＭ−ＣＳＦ画分とＰＥＧ化したＧＭ−ＣＳＦ画分を、未反応のトレシル−モノメトキシ−ポリエチレングリコールからゲル・クロマトグラフィで分離する。次に、ＰＥＧ化ＧＭ−ＣＳＦを１００
ｍＭのトリス緩衝液中に透析して濃度を５０ ｍｇ／ｍｌに調節する。
【実施例２１】
【００５８】
実施例２１ − ＰＥＧ化ＧＭ−ＣＳＦを封入したマイクロ粒子の調製
ＰＥＧ化ＧＭ−ＣＳＦを封入したマイクロ粒子は以下のように調製できる：６．０
ｇｍ の ＰＬＧＡ （５０：５０ ラクチド：グリコリド；固有粘度 ０．３５ ｌ／ｇ）を２０ｍｌの酢酸エチルに溶解させる。実施例２０の１ ｍｌのＰＥＧ化ＧＭ−ＣＳＦを加え、ホモジナイザで１０，０００ｒｐｍで高速で攪拌して、油中水乳濁液を作製する。次に、ポリマ／薬物／酢酸エチル乳濁液を１％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含有する水のポンプ流と組み合わせて、固定ミキサでポンプする。この作用によりｗ／ｏ／ｗ
乳濁液が生じ、この乳濁液を次に、１リットルの５Ｃ水に攪拌しながら加えた。２時間後、ＰＥＧ化ＧＭ−ＣＳＦを含有する硬化したＰＬＧＡマイクロスフィアを２５ミクロンのふるいで採集して乾燥させる。その結果得られるマイクロスフィアの大きさは、２５乃至２００μｍの範囲であろう。
【実施例２２】
【００５９】
実施例２２ − ＰＥＧ化ＧＭ−ＣＳＦを封入したナノ粒子の調製
ＰＥＧ化ＧＭ−ＣＳＦを封入したナノ粒子は以下のように調製できる：３．０
ｇｍのＰＬＧＡ （実施例２１と同じ材料）を５ ｍｌのジクロロメタン及び５ｍｌのアセトンに溶解させる。実施例２０のＰＥＧ化ＧＭ−ＣＳＦ を０．５ ｍｌ、加え、この混合液をホモジナイザで１０，０００ｒｐｍで攪拌する。この混合液を５％ＰＶＡを含有する２００
ｍｌ の水に加える。次にこの混合液を１５，０００ ｒｐｍ で、直径約１．０ミクロン未満のナノ粒子が形成されるのに必要な時間、均質化させる。有機溶媒を真空で取り除き、ナノスフィアを水から回収して乾燥させることができる。
【００６０】
等価物
当業者であれば、日常的な実験によって、ここに解説した本発明の具体的な実施態様の等価物を数多く、認識し、又は確認できることであろう。このような等価物は以下の請求の範囲の包含するところと、意図されている。加えて、ここに引用した全特許及び公開文献の内容全体を、引用をもってここに援用することとする。