(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核性生産細胞株中にタンパク質を生産するにあたり、
ａ）機能的遺伝子座を含む人工染色体の骨格を提供する工程、
ｂ）前記タンパク質をコードする核酸を前記骨格中に組み換えて、異種のプロモーターを含有する発現ベクターを作製する工程、
ｃ）前記発現ベクターを真核性宿主細胞株中にランダムに導入して、真核性発現細胞株を得る工程、その際、少なくとも５コピーの前記人工染色体が、前記宿主細胞の染色体中に安定に組み込まれる、
ｄ）前記発現細胞株を培養して、前記タンパク質を生産する工程、及び
ｅ）前記タンパク質を単離する工程
を含む生産方法。
【請求項２】
前記組み換えが、相同組み換え又はインテグラーゼ媒介したカセット交換から選択される、組み換え技術を用いて実施される請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ベクターの少なくとも１０〜５００コピーが、前記宿主細胞株中に組み込まれる、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
分泌タンパク質が生産される、請求項１から３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記分泌タンパク質が、シグナルペプチドを含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記分泌タンパク質が、血清タンパク質（免疫グロブリン、免疫グロブリン断片又は誘導体を含む）、アルブミン、血液因子、ポリペプチドホルモン、サイトカイン、ケモカイン、酵素及び成長因子、及びこの誘導体からなる群から選択される、請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
前記人工染色体が、細菌、バクテリオファージ、酵母又は哺乳類由来である、請求項１から６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記人工染色体が、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣ及びコスミドからなる群から選択される、請求項１から７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記ベクターが、オープンクロマチン形成のための調節要素を含む、請求項１から８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記ベクターが、アバンダントタンパク質の座を含む、請求項１から９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記ベクターが、哺乳類又は昆虫起源の座を含む、請求項１から１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
分泌タンパク質をコードする遺伝子を含む人工染色体及び異種のプロモーターを基礎とする、請求項１から１１のいずれか１項記載の方法における使用のためのベクター。
【請求項１３】
請求項１２記載の安定に組み込まれたベクターを含む宿主細胞の染色体。
【請求項１４】
アロゲニック座を含むベクターを宿す、請求項１から１１のいずれか１項記載の方法における使用のためのトランスジェニック生産細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類宿主細胞株中でタンパク質を生産する方法に関する。
【０００２】
哺乳類細胞システムにおける組み換えタンパク質生産は、バイオテクノロジーにおいて重要なトピックである。組み換えタンパク質の生産における重要の工程の１つは、興味がもたれるタンパク質を高レベルに発現する細胞の作製及び細胞分裂周期及び時間にわたり安定な発現を有するこの単一細胞クローンの単離である（Wurm, F. M. Nature Biotechnology 22, 1393-1398 (2004)）。産業規模での細胞培養において分泌されたタンパク質の高い収量を、安定に、安全に、信頼性を有しつつ、かつ再現可能に発現する細胞株の作製方法について要求がある。この要求は特に、製薬学的産業により療法のために開発されかつ生産された生物学的製剤（biologicals）の増加する量とともに増加している。
【０００３】
一般に、これはプロモーター、興味のもたれる遺伝子及び選択可能なマーカーを含む発現ベクターの、確立された生産細胞株の染色体ＤＮＡ中へのランダムなゲノム組み込みにより達成される。
【０００４】
しばしば使用される生産細胞株は、哺乳類又は昆虫の細胞由来である。細胞株は、無期限に（indefinitely）与えられた適した新鮮培地及び空間で増殖する、永続的に確立された細胞培養物である。細胞株（Cell line）は、これらがハイフリック限定（Hayflick L. (1965) 「The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains.」、Exp. Cell Res. 37 (3): 614-636）を逃れており、かつ、不死化している点で、細胞系列（cell strain）とは異なる。確立された生産細胞株の例は、ＣＨＯ、ＮＳ０、ＣＯＳ、又はＳｆ９細胞、又はヒト細胞株、例えばＰｅｒＣ−６及びＨＥＫ２９３である。
【０００５】
哺乳類細胞並びに細胞株の遺伝子エンジニアリングのためには、通常プラスミドがベクターとして使用される。プラスミドは、染色体ＤＮＡとは別個の非染色体ＤＮＡ分子であり、これは、細菌中の染色体ＤＮＡとは独立して複製できる。多くの場合に、これは環状であり、かつ二重鎖である。増殖する哺乳類細胞においては、このプラスミドは、宿主細胞のゲノム中へのランダム組み込み後に宿主細胞中で無期限に維持されることができ、かつ、興味のもたれる遺伝子／生成物、一般的にはタンパク質の生産を、そのプロモーターを介して生じることができる。
【０００６】
この遺伝子エンジニアリングの方法は単純でかつ直接的であるが、これは再現性がない。この種のベクターからのタンパク質の発現は、この組み込み部位の周囲のクロマチンにより大幅に影響され、これは時間にわたりサイレンス発現する傾向がある（Wurm, F. M. Nature Biotechnology 22, 1393-1398 (2004)）。このことは、適したクローンの選択を、冗長な、かつ時間を消費する手順にする。
【０００７】
幾つかの戦略が、この隣接するクロマチンの位置的な作用を克服するために開発されている。例えば、このベクターに隣接する「アンチ−リプレッサー」要素が使用されているか、又はベクターが、オープンクロマチンを有する染色体座中に特異的に組み込まれている（Kwaks, T. H. et al. Nature Biotechnology 21, 553-558 (2003), Huang, Y. et al. Journal of Immunological Methods 322, 28-39 (2007)）。
【０００８】
人工染色体が、トランスジェニックな宿主、例えば動物又は植物を提供するためにこの分野において使用されている。
【０００９】
WO2002/097059A2は、部位特異的な、組み換え−指向したＤＮＡ組み込みのために利用可能な部位を含むようにエンジニアリングされている人工染色体を説明し、これは特にトランスジェニック動物のエンジニアリングのために有用である。
【００１０】
US2008/0060093A1は、自律的ミニ染色体で形質転換された植物の作製方法を開示する。
【００１１】
Moralli et al (EMBO reports 2006 VoI 7 (9) 911-918) は、発現及び相補性研究のための遺伝子輸送システムとして使用されるべきヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクターを開示する。
【００１２】
適したタンパク質発現ベクターの開発は、真核細胞株中の組み換えタンパク質生産における１つの重要な工程を構成する。細胞培養における組み換えタンパク質生産のためには、一般的には以下の特徴を示すベクターが求められている：
１）発現は、このゲノム中の組み込み部位とは独立してなくてはならない、
２）発現は、組み込まれた導入遺伝子（transgene）のコピー数と相関しなくてはならない、
３）発現は、時間にわたり維持されなくてはならない、及び
４）この発現レベルは高くなくてはならない。
【００１３】
本発明の課題は、安定な細胞クローンの作製が真核性生産細胞株において組み換えタンパク質生産を改善することを可能にする方法及びベクターを提供することである。
【００１４】
この課題は、本発明の主題により解決された。
【００１５】
本発明によれば、真核細胞株中にタンパク質を生産するにあたり、
ａ）人工染色体の骨格を提供する工程、
ｂ）前記タンパク質をコードする核酸を前記骨格中に組み換えて、発現ベクターを作製する工程、
ｃ）前記発現ベクターを真核性宿主細胞株中に導入して、真核性発現細胞株を得る工程、
ｄ）前記発現細胞株を培養して、前記タンパク質を生産する工程、及び
ｅ）前記タンパク質を単離する工程
を含む生産方法が提供される。
【００１６】
このようにして、本発明により使用される発現細胞株は、人工染色体を基礎とする組み込まれた発現ベクターを有する。
【００１７】
本発明により使用される細胞株は、無期限に与えられた適当な新鮮培地及び空間で増殖し、したがって不死化している、永続的に確立された細胞培養物として理解される。以下では、本発明により使用される細胞株は、「宿主細胞株」又は「宿主細胞」とも呼ばれる。
【００１８】
本発明による方法は、特に、外来核酸配列を含む人工染色体コンストラクト及びこれらコンストラクトをタンパク質、例えば分泌タンパク質のｅｘ  ｖｉｖｏ生産のために使用する方法に関する。
【００１９】
本発明によれば、人工染色体は、組み換えタンパク質の大規模生産のために生産細胞株において使用されてよい。この人工染色体は好ましくは、細菌由来であり、例えば細菌人工染色体であり、「ＢＡＣ」とも呼ばれ、例えば、Ｆプラスミドからの要素を有するか、又はＰ１プラスミドからの要素を有する人工染色体であり、これは「ＰＡＣ」と呼ばれる。人工染色体は、例えば「コスミド」の場合には、バクテリオファージからの要素を有することもできる。本発明により好ましく使用される更なる人工染色体は、酵母由来であり、例えば酵母人工染色体であり、これは「ＹＡＣ」とも呼ばれ、そして、哺乳類由来であり、例えば哺乳類人工染色体であり、これは「ＭＡＣ」とも呼ばれ、例えばヒト由来であり、ヒト人工染色体、「ＨＡＣ」と呼ばれる。
【００２０】
これら人工染色体は、これらがＤＮＡ増幅のために使用されるそれぞれの細胞において細胞分裂にわたり複製及び保存のために必要とされる複製起点配列を含む共通点を有する。コスミド、ＢＡＣｓ及びＰＡＣｓは、細菌からの複製起点を有し、ＹＡＣｓは酵母からの複製起点を有し、ＭＡＣｓは哺乳類細胞の複製起点を有し、ＨＡＣｓはヒト細胞の複製起点を有する。加えて、本発明により使用される人工染色体は、選択マーカー、通常は抗生物質抵抗性を有してよく、これにより、人工染色体を有する細胞の選択が可能になる。
【００２１】
これら人工染色体は、それぞれの生物において複製及び維持を担い、かつ、大きいゲノムＤＮＡ断片を安定に維持することができる染色体由来の要素を含むベクターである。これら大きいゲノムＤＮＡ断片は通常は、コスミドについては３０〜５０ｋｂ、ＰＡＣｓ及びＢＡＣｓについては５０〜３５０ｋｂ、ＹＡＣｓについては１００〜３０００ｋｂ、そしてＭＡＣｓ及びＨＡＣｓについては＞１０００ｋｂの範囲内にある。
【００２２】
好ましい一実施態様によれば、本発明により使用される人工染色体は、ＢＡＣ、ＹＡＣ、ＰＡＣ及びコスミドからなる群から選択され、この群は「微生物人工染色体」とも呼ばれる。この微生物人工染色体は通常は、最大で５０００ｋｂｐの小染色体である。本発明による人工染色体のサイズは好ましくは１００〜３５０ｋｂｐであるが、しかし、３５０ｋｂｐよりも大きいこともできる。
【００２３】
本発明により使用される好ましい人工染色体骨格は、細菌、バクテリオファージ又は酵母起源である。これらは、微生物人工染色体と一緒に極めて類似のベクター特徴を有すると考慮されることができるが、しかし挿入されたＤＮＡ座については異なる容量を有する。その他に、ＢＡＣ、コスミド、ＰＡＣ、ＹＡＣ由来の人工染色体、また同様に、哺乳類（ＭＡＣ）又はヒト（ＨＡＣ）由来の人工染色体も使用されてよい。ＢＡＣ骨格としては、Ｒｏｓａ２６ＢＡＣコンストラクトが好ましくは本発明により使用される。またオープンクロマチンとして考慮される他の座、例えば、ｂ−アクチン、Ｇａｐｄｈ、Ｈｐｒｔ、リボソームタンパク質も使用されてよい。
【００２４】
本発明により使用される人工染色体の付加的要素は、ＤＮＡ含有遺伝子座の大断片の要素である。これら遺伝子座は、好ましく、かつ、それぞれの真核性生産細胞株中に人工染色体が導入された後に機能的である。これら遺伝子座は、クロマチン構造及び転写因子に対するアクセス性を調節する要素、及びこの転写レベルを決定する要素、例えばエンハンサー及びプロモーター配列を、興味をもたれる遺伝子産物の発現のために含む。
【００２５】
人工染色体においては、これらの前述した要素のいくつかが、ＤＮＡの適当な増幅のためにだけ要求される。これら要素は、複製起点であり、かつ、例えば細菌及び酵母における選択のためのマーカー遺伝子、例えば抗生物質抵抗性である。このようにして、これら要素を有する人工染色体の一部が骨格と呼ばれる。
【００２６】
人工染色体は、大きい、ＤＮＡベースのベクターであり、これは、複雑なゲノムマッピング及び分析のためにＤＮＡライブラリーの構築において広く使用されている。ＢＡＣｓは、大規模配列決定プロジェクト、例えばヒトゲノムプロジェクトにおいて、生物のゲノムの配列決定のため使用されている。この生物のＤＮＡの短い小片は、ＢＡＣｓにおいてインサートとして増幅され、次いで配列決定される。最後に、この配列決定された部分は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏにおいて再配列され、この生物のゲノム配列を生じる。
【００２７】
ＢＡＣｓは、トランスジェニックマウスの作製のための大ベクターとしても使用されている（Giraldo, P. & Montoliu, L. Transgenic research 10, 83-103 (2001)）。この例において、このマウスの初代細胞は、ＢＡＣにおいてこのそれぞれの座を介して調節される興味をもたれる遺伝子を発現する。
【００２８】
人工染色体が、改善された特性を有する真核性発現細胞株の生産において使用されることができることが判明した。例えば、意外なことに、本発明によるＢＡＣベースのベクターが、真核性細胞株をトランスフェクションするために、そして、高度に効率的に細胞培養において細胞株において組み換えタンパク質を発現するために、適用されることができることが実証された。本発明の好ましい一実施態様によれば、本発明によるＢＡＣベースのベクターは、ヒトのＩｇＧ１の定常領域の断片を生産するために使用された。慣用ベクターを用いて又はＢＡＣベースのベクターを用いて作製されたバルクＨＥＫ２９３細胞培養物の直接的比較は、このＢＡＣベースのベクターが意外なことに、このタンパク質収量を１０倍だけ改善したことを示した。ＢＡＣベースのベクターを宿す安定な細胞クローンの更なる分析は、このタンパク質生産が、組み込まれたＢＡＣコピーの数に直接的に比例し、かつ、このタンパク質生産が３０代後にさえ安定であることを示した。
【００２９】
本発明によれば、したがって、分泌タンパク質及びポリペプチドの発現を概して改善することが可能であり、特に、通常大規模での生産を伴う、組み換えタンパク質の工業的生産の目的のために改善することが可能であり、これは例えば、少なくとも１リットルの発酵体積、より好ましくは少なくとも５リットルを使用して行われ、より一層好ましい発酵は少なくとも１００リットルの発酵ブロスを使用して実施される。発酵は好ましくは、バッチ又は連続発酵技術を用いて使用される。
【００３０】
分泌タンパク質は、タンパク質又はポリペプチドであって、真核性宿主細胞からその細胞外環境へと生産及び分泌されるものである。通常、これはシグナルペプチドにより支持され、これは、短い、例えば２〜１００アミノ酸長のペプチド配列であってタンパク質の翻訳後の輸送を指示するものと理解される。シグナルペプチドは一般的には、生産細胞から分泌されるタンパク質の生産のために使用される。これらシグナルペプチドは通常は、成熟した分泌されたタンパク質を形成するために切断される。分泌されたタンパク質を生じるシグナルペプチドの一例は、「ＭＥＬＧＬＳＷＩＦＬＬＡＩＬＫＧＶＱＣ」であり、これはヒトのカッパ軽鎖について見出される（Felgenhauer,M., Kohl,J. and Ruker,F; Nucleotide sequences of the cDNAs encoding the V-regions of H- and L-chains of a human monoclonal antibody specific to HIV-1 -gp41 ; Nucleic Acids Res. 18 (16), 4927 (1990)）。シグナルペプチドは、ターゲッティングシグナル、シグナル配列、トランジットペプチド、又は局在シグナルとも呼ばれてよい。
【００３１】
シグナルペプチドのアミノ酸配列は、タンパク質（これは、細胞質で合成される）を特定のオルガネラ、例えば核、ミトコンドリアマトリックス、小胞体、クロロプラスト、アポプラスト及びペルオキシソームへと指向させる。発現ベクターにおいて使用されるシグナルペプチドは通常は、タンパク質が輸送された後にシグナルペプチダーゼによりタンパク質から切断される。
【００３２】
本発明によるベクターはこのようにして、分泌タンパク質をコードしてよい遺伝子を含む人工染色体を基礎とし、好ましくはシグナルペプチドを、例えば分泌タンパク質との関連において利用する。このシグナルペプチドは好ましくは、発現すると分泌タンパク質から切断され、かつ、細胞培養上清中へと輸送する。
【００３３】
本発明による方法は、好ましくは、血清タンパク質（免疫グロブリン、免疫グロブリン断片又は誘導体）、アルブミン、血液因子、ポリペプチドホルモン、サイトカイン、ケモカイン、酵素及び成長因子、及びこの誘導体からなる群から選択される組み換えタンパク質を提供するために使用される。
【００３４】
誘導体は、分泌タンパク質を起源とするか又はこれに類似する、ポリペプチドの、任意の断片、コンジュゲート、融合体、核酸又はホモログを含む。
【００３５】
本発明によるタンパク質の生産のために、この発現細胞株は、タンパク質を生産するために培養され、そして、このタンパク質は単離される。したがって、この分野で使用される単離又は分離方法が利用されてよく、これは例えば、定量的にこの生成物を単離するためのクロマトグラフィによる分離方法である。
【００３６】
真核性宿主細胞として、必要な場合に、真核性タンパク質グリコシル化を提供してよい任意の宿主細胞が使用される。好ましくは哺乳類又は昆虫の単一細胞又は細胞株のヒト、霊長類、マウス、ハムスター細胞が使用される。好ましい例は、ＨＥＫ細胞、例えばＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳ０細胞、マウスリンパ芽球細胞、ＰｅｒＣ６、又はＳｆ９細胞である。
【００３７】
前記組み換えタンパク質をコードする核酸は好ましくは、人工染色体骨格遺伝子と、組み換え技術、例えば相同組み換え又はカセット交換により組み換えられ、例えばこれはインテグラーゼにより媒介され、例えばφＣ３１インテグラーゼ媒介カセット交換である。
【００３８】
本発明によるベクターは好ましくは、宿主細胞の染色体、好ましくは哺乳類又は昆虫の染色体、より好ましくはヒト、マウス又はハムスター起源の染色体中に安定に組み込まれて、トランスジェニック宿主を提供する。
【００３９】
本発明によるトランスジェニック細胞株は、単一細胞、安定な単一細胞クローンとして、細胞株又は類似物として提供される。しかし、本発明は、トランスジェニックヒトを明示的に除外する。好ましくはこのトランスジェニック宿主細胞は、その染色体の遺伝子マップ内にベクターを、通常は、アバンダントに発現される遺伝子又はタンパク質（アバンダントタンパク質とも呼ばれる）の座と関連して又はこの中に直接的に連結されて、宿す。
【００４０】
アバンダントタンパク質は、本願明細書においては、宿主細胞によりｍＲＮＡ及びポリペプチドのレベルで高度に発現されるタンパク質、例えばリボソームタンパク質、細胞骨格タンパク質及びＤＮＡ合成のためのタンパク質、例えばＤＮＡポリメラーゼであると理解される。このようなアバンダントタンパク質は通常は、宿主細胞により高度に発現される天然タンパク質である。アバンダントタンパク質の座の使用は通常は、高度に、人工染色体によりコードされる分泌タンパク質の安定な発現を容易にする。やはり、この座が哺乳類又は昆虫の起源であることが好ましい。
【００４１】
この選択された座は好ましくは、オープンクロマチン形成又はタンパク質発現一般のために調節要素を含む。特に、抗凝縮（anticondensation）エンハンサーが、天然のエンハンサーとしてこの座中に含まれる要素を介して、又は、外因性の、異種の（heterologous）又は合成の調節要素（これは発現クロマチン構造を提供する）を介して、利用されることが好ましい。これにより、この座は転写因子に対してアクセス可能である。
【００４２】
この「オープンクロマチン」又は「活性クロマチン」又は「真正クロマチン」領域は、構造変化に供されることができ、このことは凝縮が少なくかつ高度に転写される構造を生じる。真正クロマチンの形成は、クロマチン媒介された遺伝子調節の根底をなす機構を提示すると考えられており、遺伝子を活性状態に維持し、このことは、タンパク質発現のために設計された人工染色体を基礎とするベクターを獲得するために好ましい。
【００４３】
遺伝学及び進化計算（evolutionary computation）の分野においては、座は、１又は複数の遺伝子により占められてよい染色体上の固定された位置として理解される。タンパク質の座は、前記タンパク質の少なくとも一部での発現に捧げられる遺伝子位置であると理解される。所定の座でのＤＮＡ配列の変異体は、トランスジェニック染色体と呼ばれる。特定のゲノムのために知られている座の順序立ったリストは、遺伝子マップと呼ばれる。
【００４４】
好ましくは、本発明により使用される座は、生産細胞株の配列に由来する。例えば、哺乳類宿主のためには、哺乳類タンパク質の座（哺乳類座とも呼ばれる）が使用される。昆虫細胞のためには、昆虫タンパク質の座が好ましくは使用され、これは昆虫座とも呼ばれる。好ましくはヒト又はマウスの座が本発明によれば利用される。例示的な座は、Ｒｏｓａ２６又はアバンダントに発現されかつ本質的な遺伝子の座、例えば、β−アクチン及び細胞骨格の他のタンパク質並びにリボソームタンパク質である。
【００４５】
アロゲニックな座を提供する、宿主細胞と同じタイプ又は種の座を使用することがより一層好ましい。例えば、哺乳類座は、哺乳類宿主細胞生産のためのベクター中に組み込まれ、例えば、本発明によるベクター中に組み込まれるヒトの座は、ヒト細胞株中に導入される。このアロゲニックなシステムは好ましくは、ヒトタンパク質の生産のために使用される。更に好ましいのは、マウスの座を有するベクターが好ましくはマウスの宿主細胞株中に組み込まれ、ハムスターの座を有するベクターが好ましくはハムスターの宿主細胞株中に組み込まれ、そして、昆虫の座を有するベクターが昆虫の細胞株中に組み込まれることである。
【００４６】
本発明により使用される調節要素は、好ましくはプロモーターを含み、これは、天然の座において含まれる天然のプロモーターであるか、又は、異種の要素、例えば真核性及び／又は原核性プロモーターであり、又は二重（dual）プロモーターさえも使用されてよい。例示的なプロモーターは、ジェネリックなものであり、好ましくはＣＭＶ、Ｃａｇｇｓ、Ｔｋ（チミジンキナーゼ）、ユビキチンＣ又はＥＦ２であり、これはトランスフェクションのために一般に使用される。この人工プロモーターの他に天然のプロモーター、例えばβ−アクチン又はリボソームタンパク質も使用されることができる。好ましくは強力プロモーター（strong promoter）が選択される。
【００４７】
この収量を改善するために１より多いコピー、好ましくは少なくとも２のコピー、より好ましくは少なくとも３のコピー、より一層好ましくは少なくとも５又は１０コピーの人工染色体を宿主細胞中に導入することが好ましいことが証明されており、５０までのコピーが好ましくは宿主細胞中に組み込まれてよい。しかしながら、より多数の、５００までのコピーの人工染色体を利用することさえも、特に、このタンパク質を発現するために１より多い座が利用される場合には有利であってよい。ゲノム中の人工染色体の組み込まれたコピーのこの増加した数は、興味のもたられる遺伝子の増加した発現と直接的に相関し、このようにして、このそれぞれのコードされたタンパク質の増加した収量と相関する。これは、ノックイン戦略の使用に比較して明白な改善であり、ここでは、興味のもたれる遺伝子は、１又は２のコピーの、宿主細胞株の染色体の座中に、人工染色体の使用なしに挿入される。
【００４８】
このようにして、本発明による人工染色体の使用は、高収量のタンパク質発現を支持する。本発明によるこの生産方法は好ましくは、少なくとも１ｐｇ／細胞／日、好ましくは少なくとも３、５、１０、３０、５０ｐｇ／細胞／日の、１００ｐｇ／細胞／日までの収量を提供する。この収量は、適した増幅により前記宿主細胞の密度が増加すると改善されてよい。
【００４９】
本発明によるクローンが、複数の継代後にさえ安定にタンパク質を生産することが判明した。意外なことに、この収量は顕著に減少せず、すなわち、１０、２０又は３０継代の後でさえ３０％以下であることが示され、このようにして安定な発現システムを実証する。
【００５０】
本発明によるベクターは、慣用の発現ユニットと組み合わせた組み換えタンパク質生産を容易にするための発現道具として、又は好ましくは自体で完全な発現ユニットとして提供されてよい。このようにして、本発明によるベクターが、周囲のクロマチンによる影響なしに、安定な細胞株における人工染色体のランダム組み込みを可能にするために遺伝子の調節要素を宿すことが好ましい。
【００５１】
特定の一実施態様において、本発明によるベクターは、安定なタンパク質発現を提供するための全ての調節要素を含む完全な発現ユニットとして提供される。このようにして、本発明によるベクターは、染色体組み込みとは無関係に宿主細胞中に導入されてよい。
【００５２】
例えば、本発明によるＢＡＣベースのベクターが、慣用のベクターと比較した場合に明白な利点を提供することが判明した。このことは、高レベルの発現、例えば少なくとも１０倍の発現を提供し、かつ、このことは、不所望なクロマチン作用によりあまり影響されず、このようにして、興味のもたれるタンパク質を高レベルで発現する単一細胞クローンの単離を簡易にする。更に、人工染色体を基礎とするベクターは、内因性調節要素を利用することができ、このようにして、長期間培養における発現のサイレンス化を回避する。
【００５３】
本発明による人工染色体、特に小人工染色体、例えば微生物人工染色体、例えばＢＡＣを基礎とするベクターの使用は、ノックイン戦略の利点全てを提供する。さらに、これらベクターは、高コピー数でもって宿主ゲノム中に組み込まれることができ、その一方で、ノックインベクターは多くとも１又は２のコピーとして組み込まれる。このベクターの発現は組み込まれたコピーの数に比例しており、このようにして、人工染色体を基礎とするベクターは、ノックイン戦略よりもより高い発現レベルを提供する。さらに、本発明による安定な細胞株の作製は、特にＢＡＣを基礎とするベクターの使用の場合に、ノックイン戦略に比較して、単純なプロセスでありかつ時間の消費が少ない。上述のとおり、慣用のベクターを使用する、興味のもたれる遺伝子の発現は、不所望なクロマチン作用に高度に供せられる。この問題を克服するために、慣用のベクターは、クロマチンアイソレーターと呼ばれる短いＤＮＡ配列により隣接される。クロマチンアイソレーターと考えられるＤＮＡ要素の長いリストが存在し、例えば、座コントロール領域（ocus control region）、マトリックスアタッチメント要素、アンチリプレッサー要素、遍在的クロマチン要素（ubiquitous chromatin element）、境界要素（boundary element）、その他である（Wurm, F. M. Nature Biotechnology 22, 1393-1398 (2004)）。これら全ての要素は、変動可能な成功率でもって慣用のベクターにおいて使用されている。これらクロマチンアイソレーターは、その本当のゲノムの文脈から使用される短いＤＮＡ配列であり、このため、真のクロマチン環境を提供しない。
【００５４】
他方では、特定の座（vg Rosa 26）を含む、本発明により使用される人工染色体を基礎とするベクターは、定義によればクロマチンユニットである。これらは、全てでなければ、大抵の、定義された座のクロマチン調節要素をこの本当の内在性ゲノムの文脈において含む。このようにして、本発明により使用されるベクターは、クロマチンアイソレーターだけでもって隣接される慣用のベクターに比較して、より良好なクロマチン調節又は環境を提供する。好ましい一実施態様によれば、本発明による方法はクロマチンアイソレーターを使用しない。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１Ａ】図１Ａは、タンパク質生産のために使用されるコンストラクトの図示を示す。ＣＡＧＧＳ  Ｆｃは、ＣＡＧＧＳプロモーター、この後にＩｇＧ１遺伝子のＦｃ領域が続くシグナルペプチド、ＩＲＥＳ−ｅＹＦＰ−ＳＶ４０  ポリＡレポーター要素及びＰＧＫネオマイシンカセットを含む慣用の発現ベクターである。Ｒｏｓａ  ２６  ＢＡＣ ＣＡＧＧＳ Ｆｃコンストラクトは、Ｒｏｓａ２６座を含むＢＡＣ中にＣＡＧＧＳ  Ｆｃを組み換えることにより作製された。ＣＡＧＧＳ  Ｆｃベクターは、１００ｋｂ上流及び下流の配列でもってＲｏｓａ２６座のアンチセンス転写物のエキソン２中に配置されている。
【図１Ｂ】図１Ｂは、慣用のベクター及びＢＡＣベースのベクターの間のタンパク質生産における効力の比較を示す。このＦｃ収量は、ＣＡＧＧＳ  Ｆｃ及びＲｏｓａ２６  ＢＡＣ ＣＡＧＧＳ Ｆｃベクターでもって作製されたＨＥＫ２９３バルク培養物（bulk culture）（細胞プール）中で分析された。このＣＡＧＧＳ  Ｆｃベクターは、０．５ｐｇ／細胞／日の収量を生じ、その一方で、このＢＡＣベースのベクターは５．７ｐｇ／細胞／日の収量を生じた。測定をトリプリケートで実施した。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、タンパク質生産及び組み込まれたＢＡＣ導入遺伝子コピーの間の相関を示す。１２個の単一クローンの分析は、Ｒｏｓａ  ２６  ＢＡＣ ＣＡＧＧＳ Ｆｃベクターについて１〜５５の範囲のコピー数をＦｃ収量５．５〜３０ｐｇ／細胞／日でもって示した。このタンパク質生産は、ＢＡＣ導入遺伝子コピー数に直接的に比例していた。
【図１Ｄ】図１Ｄは、培養継代の間にタンパク質生産が安定に維持されることを示す。１代及び３０代で測定したＦｃタンパク質の収量を、Ｒｏｓａ２６  ＢＡＣ ＣＡＧＧＳ Ｆｃ培養物から単離した６つのサブクローンにおいて測定した。明らかな差異は見出されなかった。エラーバーは、標準偏差を示す。
【００５６】
本発明は更に、以下の実施例により説明される。
【００５７】
実施例１：ヒトＦｃの発現
組み換えタンパク質の生産におけるＢＡＣｓの効力を試験するために、我々は、２つの発現ベクターを作製した：ＣＡＧＧＳ  Ｆｃベクターは、ＣＡＧＧＳプロモーター（Niwa, H., Yamamura, K. & Miyazaki, J.. Gene 108, 193-199 (1991)）、興味をもたれる遺伝子（Ｆｃ）としてのヒトＩｇＧ１のＦｃ断片（すなわち、ヒンジ、ＣH２及びＣH３）が後に続くシグナルペプチド、ＩＲＥＳ／ｅＹＦＰレポーター及びＰＧＫ−ネオマイシンカセットからなる。第２のベクター、Ｒｏｓａ２６  ＢＡＣ ＣＡＧＧＳ Ｆｃは、ＣＡＧＧＳ  Ｆｃベクターからなり、これは、Ｒｏｓａ２６座を含むＢＡＣ骨格中に組み換えされている（図１Ａ）。
【００５８】
ＨＥＫ２９３細胞は、このＣＡＧＧＳ  Ｆｃ及びＲｏｓａ  ２６  ＢＡＣ ＣＡＧＧＳ Ｆｃベクターでトランスフェクションされていた。Ｇ４１８選択の１４日後に、２つのバルク培養物（細胞プール）がＣＡＧＧＳ  Ｆｃ及びＲｏｓａ２６  ＢＡＣ ＣＡＧＧＳ Ｆｃのために確立された。この上清中のＦｃタンパク質生産の分析は、０．５及び５．７ｐｇ／細胞／日の収量をＣＡＧＧＳ  Ｆｃ及びＲｏｓａ  ２６  ＢＡＣ ＣＡＧＧＳ Ｆｃバルク（細胞プール）培養物中でそれぞれ示し（図１Ｂ）、このことは、ＢＡＣベースのベクターの使用がタンパク質生産を実質的に改善することを実証する。
【００５９】
次に我々は、導入遺伝子コピーの数及びＦｃタンパク質収量の間の相関を分析した。１２個のサブクローンを、導入遺伝子の１〜５５コピーを宿すＲｏｓａ２６  ＢＡＣ ＣＡＧＧＳ Ｆｃ培養物から確立した。これら培養物の上清におけるタンパク質収量は、導入遺伝子コピー数と相関し、かつ、５．５〜３０ｐｇ／細胞／日の範囲に及んだ（図１Ｃ）。このＢＡＣベクターのコピー数とタンパク質生産の間の相関係数Ｒ2は０．８８であった。このことは、このタンパク質生産が、ＢＡＣベースの発現ベクターを使用する場合に、組み込まれた導入遺伝子のコピー数に比例することを示唆する。
【００６０】
最後に、我々は、時間にわたる長期間タンパク質生産及び増加する継代数を調査した。Ｒｏｓａ２６  ＢＡＣ ＣＡＧＧＳ Ｆｃ培養物からの６個のサブクローンを、３０代にわたり成長させ、タンパク質生産を分析した。このＦｃタンパク質の収量は、１代から３０代へと有意に減少せず（図１Ｄ）、このことは、ＢＡＣベースのベクターが時間にわたる組み換えタンパク質の安定な生産を提供することを示す。
【００６１】
この研究において、我々は、発現ユニットを遮断するためにＲｏｓａ２６座を含むＢＡＣを使用した（ＣＡＧＧＳ  Ｆｃ）。このアプローチでもって、我々は、ＢＡＣを基礎とするベクターが、組み換えタンパク質生産について慣用ベクターよりもより良好な結果を生じることを示した。組み換えタンパク質生産のためのＢＡＣベースのベクターの更なる改善は、生産者細胞において高度に活性がある内在性／天然プロモーターの使用を含んでよい。例えば、ＨＥＫ２９３細胞の転写プロファイリングは、リボソームタンパク質をコードするＲｐｌ２３ａ遺伝子の強力な発現レベルを同定した。したがって、ＨＥＫ２９３細胞におけるＲｐｌ２３ａを含むＢＡＣの使用は組み換えタンパク質生産を更に改善してよい。
【００６２】
材料及び方法
プラスミド及び細胞培養
このＣＡＧＧＳ  Ｆｃ発現ベクターを、慣用のクローニング法により組立て、２つのａｔｔＢ部位により隣接されている（ｐｈｉＣ３１  インテグラーゼ認識部位）。Ｒｏｓａ２６  ＢＡＣ ＣＡＧＧＳ Ｆｃ  ＢＡＣベクターを、以前説明されているように作製した（Blaas, L., Musteanu, M., Zenz, R., Eferl, R. & Casanova, E. BioTechniques 43, 659-660, 662, 664 (2007)）。簡単にいうと、このＣＡＧＧＳ  Ｆｃベクターを、Ｒｏｓａ２６アンチセンス転写物のエキソン２中へのｐｈｉＣ３１１媒介したカセット交換を使用して、Ｒｏｓａ２６座を含むＢＡＣ中に組み換えた。
【００６３】
このバルク培養物を確立するために、２４μｇのＣＡＧＧＳ  Ｆｃ及びＲｏｓａ２６  ＢＡＣ ＣＡＧＧＳ Ｆｃ  ＢＡＣベクターをＮｏｔＩを用いて線形にし、リポフェクタミン２０００（Invitrogen）を使用してＨＥＫ２９３中にトランスフェクションした。トランスフェクション２日後に、Ｇ４１８（８００μｇ／ｍｌ）をこの培地（ＤＭＥＭ高グルコース、１０％ＦＣＳ、グルタミン、ピルベート及び可欠アミノ酸で補給してある）に添加した。選択を１４日間にわたり実施した。この後で、培養物をＧ４１８の非存在下で成長させ、このバルク培養物中のＦｃタンパク質生産を１週間後に測定した。
【００６４】
このＦｃタンパク質は、クロマトグラフィ法により単離されることができた。
【００６５】
Ｆｃタンパク質決定
５×１０5細胞を２ｍｌの培地中の６ｍｌのウェルプレートの各単独ウェル中に播種した。播種７２時間後に、このＦｃタンパク質濃度を、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して上清中で測定した。ＥＬＩＳＡのために、ヒツジ抗−ヒト−ＩｇＧ（Ｆｃ特異的）Ｆ（ａｂ′）２断片（Sigma I-3391）を、１μｇ／ｍｌでMaxisorpプレートのマイクロウェルに一晩４℃で吸着させ、この後に５％ＢＳＡ（ＰＢＳ中）で１ｈ２５℃でブロッキングした。洗浄後に、この試料及び標準それぞれを、希釈系列においてこのブロッキングしたマイクロウェルに添加し、１ｈ２５℃でインキュベーションした。このプレートを洗浄し、結合したＦｃをタンパク質Ａ  ＨＲＰ（SIGMA P-8651）（ＰＢＳ／ＢＳＡ中に１：７００００で希釈されている）により検出し、この後にＴＭＢ基質溶液（Sigma T0446）で染色した。このＥＬＩＳＡを、４５０ｎｍで、参照波長３６０ｎｍでもって測定した。
【００６６】
Ｒｏｓａ２６  ＢＡＣ ＣＡＧＧＳ Ｆｃコピー数分析
Ｒｏｓａ２６  ＢＡＣ ＣＡＧＧＳ Ｆｃ培養物からの安定なサブクローンを、ｅＹＦＰ  ＦＡＣＳ選別を使用して確立した。単一細胞クローン中の導入遺伝子のコピー数を、テンプレートとしてゲノムＤＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲにより定量化した。Ｒｏｓａ２６  ＢＡＣを、オリゴ（oligos）ＲｏｓａＦ  ５′  ＴＣＴＴＧＴＣＣＴＴＴＴＡＣＣＴＣＣＣＴＴＧＴＡ（配列番号１）ＲｏｓａＲ  ５′  ＧＡＡＣＡＴＡＴＴＣＡＡＡＡＣＡＣＣＡＧＧＡＴＴＴ（配列番号２）を用いて増幅した。これらオリゴは、ＢＡＣ及び内在性ＲＯＳＡ２６座を認識する。このβ−アクチン座をオリゴ、アクチンＦ５′  ＴＣＡＴＧＴＴＴＧＡＧＡＣＣＴＴＣＡＡＣＡＣＣ（配列番号３）及びアクチンＲ５′  ＧＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＧＧＴＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＧＴ（配列番号４）を内部コントロールとして増幅した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【配列表】
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