(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有する単離されたペプチドであって、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、１、３、４、１６、１７、３０、３１、３４、３６、３７、４０、４１、４５、４９、５５、５７、または６１より選択されるアミノ酸配列からなる、単離されたペプチド。
【請求項２】
１個または２個のアミノ酸が置換されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、１、３、４、１６、および１７からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドであって、前記置換が以下の特徴の一方または両方である、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有する単離されたペプチド：
（ａ）Ｎ末端から２番目のアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、およびトリプトファンの群より選択される；ならびに
（ｂ）Ｃ末端のアミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、およびメチオニンの群より選択される。
【請求項３】
１個または２個のアミノ酸が置換されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、３１、３４、３６、３７、４０、４１、４５、４９、５５、５７、および６１からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドであって、前記置換が以下の特徴の一方または両方である、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有する単離されたペプチド：
（ａ）Ｎ末端から２番目のアミノ酸が、ロイシンおよびメチオニンの群より選択される；ならびに
（ｂ）Ｃ末端のアミノ酸が、バリンおよびロイシンの群より選択される。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項記載の１種もしくは複数種のペプチド、または請求項４記載の１種もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む、ＣＴＬを誘導するための剤。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項記載の１種もしくは複数種のペプチド、または請求項４記載の１種もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む、がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防のための薬学的な剤。
【請求項７】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２である対象に投与するために製剤化される、請求項６記載の薬学的な剤。
【請求項８】
以下より選択される段階を含む、ＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）をインビトロで誘導するための方法：
（ａ）ＡＰＣを請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチドとインビトロで接触させる段階；および
（ｂ）請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階。
【請求項９】
以下より選択される段階を含む、ＣＴＬをインビトロで誘導するための方法：
（ａ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣと共培養する段階；および
（ｂ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームと共培養する段階。
【請求項１０】
ＨＬＡ抗原と請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する単離されたＡＰＣ。
【請求項１１】
請求項８記載の方法によって誘導される、請求項１０記載のＡＰＣ。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか一項記載の任意のペプチドを標的とする単離されたＣＴＬ。
【請求項１３】
請求項９記載の方法によって誘導される、請求項１２記載のＣＴＬ。
【請求項１４】
対象においてがんに対する免疫応答を誘導するための剤であって、請求項１〜３のいずれか一項記載のペプチド、または該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む剤。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれか一項記載の１種もしくは複数種のペプチド、または請求項４記載の１種もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む、抗原提示細胞誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００８年１２月５日に出願された米国仮特許出願第６１／２００，９６２号および２００９年３月９日に出願された米国仮特許出願第６１／２０９，７０４号の恩典を主張し、それらの内容の全体は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、生物科学の分野、より具体的にはがん治療の分野に関連する。特に本発明は、がんワクチンとして極めて有効な新規ペプチド、ならびに腫瘍を治療および予防するための薬物に関連する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子上に見出される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来のエピトープペプチドを認識し、その後、腫瘍細胞を殺傷することが実証されている。ＴＡＡの最初の例としてメラノーマ抗原（ＭＡＧＥ）ファミリーが発見されて以来、他の多くのＴＡＡが、主に免疫学的アプローチによって発見されている（Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80（非特許文献１）;Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9（非特許文献２）)。これらのＴＡＡのいくつかは、現在、免疫療法の標的として臨床開発の過程にある。
【０００４】
強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導し得る新規ＴＡＡの同定により、様々な種類のがんに対するペプチドワクチン接種戦略のさらなる発展および臨床的適用が保証される（Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55（非特許文献３）;Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42（非特許文献４）;Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9（非特許文献５）;van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14（非特許文献６）;Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8（非特許文献７）;Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72（非特許文献８）;Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66（非特許文献９）;Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94（非特許文献１０））。これまでに、これらの腫瘍関連抗原由来ペプチドを用いた臨床試験がいくつか報告されている。残念ながらこれまでのところ、これらのがんワクチン試験では低い客観的奏功率しか観察されていない（Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80（非特許文献１１）;Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42（非特許文献１２）;Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15（非特許文献１３））。
【０００５】
がん細胞の増殖および生存に不可欠なＴＡＡは、免疫療法の標的として適している。というのは、そのようなＴＡＡを用いることで、治療によって誘発される免疫選択の結果としてのＴＡＡの欠失、変異、または下方制御に起因し得るがん細胞の免疫回避の詳説されているリスクを、最小限に抑えられ得るという理由による。
【０００６】
２３，０４０個の遺伝子を含むゲノム全域にわたるｃＤＮＡマイクロアレイを用いる遺伝子発現プロファイルを通して、ＷＤＲＰＵＨは肝細胞癌において上方制御される新規ＷＤリピートタンパク質として同定された（Silva et al., Neoplasia 2005 Apr;7(4):348-55（非特許文献１４）、ＷＯ２００３／１０４２７６（特許文献１））。ＷＤリピート含有タンパク質は、シグナル伝達、ＲＮＡプロセシング（Bjorn et al., Mol Cell Biol. 1989 Sep;9(9):3698-709（非特許文献１５））、細胞骨格の再構築（Vaisman et al., Mol Gen Genet. 1995 Apr 20;247(2):123-36（非特許文献１６））、小胞輸送の調節（Pryer et al., J Cell Biol. 1993 Feb;120(4):865-75（非特許文献１７））、および細胞分裂（Feldman et al., Cell. 1997 Oct 17;91(2):221-30（非特許文献１８））を含む広範囲の生理学的機能において重要な役割を果たすことが報告されている。ノーザンブロット解析から、ＷＤＲＰＵＨは肝細胞癌の大多数において有意に高レベルで過剰発現しているが、精巣を除く正常器官では発現していないことが実証された。さらに、ｓｉＲＮＡによってＷＤＲＰＵＨ発現を抑制すると、ヒト肝細胞癌細胞株の増殖が有意に阻害されることが示された（Silva et al., Neoplasia 2005 Apr;7(4):348-55（非特許文献１４）、ＷＯ２００３／１０４２７６（特許文献１））。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２００３／１０４２７６
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80
【非特許文献２】Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9
【非特許文献３】Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20) 1442-55
【非特許文献４】Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13), 3134-42
【非特許文献５】Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9
【非特許文献６】van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14
【非特許文献７】Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8
【非特許文献８】Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72
【非特許文献９】Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66
【非特許文献１０】Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94
【非特許文献１１】Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80
【非特許文献１２】Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42
【非特許文献１３】Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15
【非特許文献１４】Silva et al., Neoplasia 2005 Apr;7(4):348-55
【非特許文献１５】Bjorn et al., Mol Cell Biol. 1989 Sep;9(9):3698-709
【非特許文献１６】Vaisman et al., Mol Gen Genet. 1995 Apr 20;247(2):123-36
【非特許文献１７】Pryer et al., J Cell Biol. 1993 Feb;120(4):865-75
【非特許文献１８】Feldman et al., Cell. 1997 Oct 17;91(2):221-30
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、免疫療法の適切な標的の発見に一部基づいている。ＴＡＡは概して免疫系により「自己」として認識され、従って生得的な免疫原性を有さない場合が多いため、適切な標的を発見することは極めて重要である。上記のように、ＷＤＲＰＵＨ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１４５０５４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）の遺伝子によってコードされるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）が肝細胞癌のがん組織において上方制御されると明らかになったことを認識すると、ＷＤＲＰＵＨは免疫療法の候補標的である。
【００１０】
本発明は、ＷＤＲＰＵＨに特異的なＣＴＬを誘導する能力を有する、ＷＤＲＰＵＨの遺伝子産物の特異的エピトープペプチドの同定に、少なくとも一部基づいている。以下に詳述するように、健常ドナーから得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＷＤＲＰＵＨ由来のＨＬＡ−Ａ＊２４０２またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１結合候補ペプチドを用いて刺激した。その後、各候補ペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２陽性標的細胞に対する特異的細胞傷害性を有するＣＴＬ株を樹立した。これらの結果から、該ペプチドが、ＷＤＲＰＵＨを表面上に発現している細胞に対して強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得るＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープペプチドであることが実証された。さらに、このことから、ＷＤＲＰＵＨは免疫原性が強く、そのエピトープは腫瘍免疫療法の有効な標的であることが示された。
【００１１】
従って、ＷＤＲＰＵＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）またはＷＤＲＰＵＨの断片からなる、ＨＬＡ抗原に結合する単離されたペプチドを提供することは、本発明の目的である。そのようなペプチドはＣＴＬ誘導能を有すると予測され、ＣＴＬをエクスビボで誘導するために、または肝細胞癌などのがんに対する免疫応答を誘導する目的で対象に投与するために用いることができる。該ペプチドは、好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、１６、１７、３０、３１、３４、３６、３７、４０、４１、４５、４９、５５、５７、および６１の中より選択されるアミノ酸配列からなる、強力なＣＴＬ誘導能を示すノナペプチドまたはデカペプチドであってよい。
【００１２】
加えて、本発明は、改変ペプチドが元のＣＴＬ誘導能を保持する限り、１個、２個、またはそれ以上のアミノ酸が置換、挿入、欠失、または付加されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、１６、１７、３０、３１、３４、３６、３７、４０、４１、４５、４９、５５、５７、および６１のアミノ酸配列を有する改変ペプチドを意図する。
【００１３】
本発明のペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供することは、本発明のさらなる目的である。これらのポリヌクレオチドは、ＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導するために、または本発明のペプチドに対する、従って最終的にはがんに対する免疫応答を誘導する目的で対象に投与するために用いることができる。
【００１４】
対象に投与された場合、本発明のペプチドはＡＰＣの表面上に提示され、その後、各ペプチドを標的とするＣＴＬを誘導する。従って、ＣＴＬを誘導するための、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかを含む剤を提供することは、本発明の目的である。本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかを含むこれらの剤は、肝細胞癌などのがんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防のために用いることができる。従って、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかを含む、がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防のための薬学的な剤を提供することは、本発明のさらに別の目的である。本発明の剤または薬学的な剤は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドの代わりに、またはこれに加えて、本発明のペプチドのいずれかを提示するＡＰＣまたはエキソソームを、有効成分として含んでもよい。
【００１５】
本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドは、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣを誘導する能力を有する。例えば、対象由来のＡＰＣを本発明のペプチドと接触させるか、または本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入することによって、誘導を達成することができる。そのようなＡＰＣは標的ペプチドに対して高いＣＴＬ誘導能を有し、がん免疫療法に有用である。従って、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導するための方法、および該方法によって得られるＡＰＣを提供することは、本発明のさらなる目的である。
【００１６】
ＣＤ８陽性細胞を、本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣもしくはエキソソームと共培養する段階、または本発明のペプチドに結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをＴ細胞に導入する段階を含む、ＣＴＬを誘導するための方法を提供することは、本発明のさらに別の目的である。該方法によって得られるＣＴＬは、肝細胞癌などのがんを治療および／または予防するのに有用である。従って、本発明の方法のいずれかによって得られるＣＴＬを提供することは、本発明のさらなる目的である。
【００１７】
本発明のＷＤＲＰＵＨポリペプチド、ＷＤＲＰＵＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＷＤＲＰＵＨポリペプチドを提示するエキソソームまたはＡＰＣのいずれかを含む剤を投与する段階を含む、がんに対する免疫応答を誘導するための方法を提供することは、本発明の別の目的である。
【００１８】
本発明は、がん、特に肝細胞癌を含むがこれに限定されない、ＷＤＲＰＵＨの過剰発現に関連する任意の疾患への適用に使用される。
【００１９】
前述の本発明の概要および以下の詳細な説明はいずれも例示的な態様であり、本発明または本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。
[本発明1001]
ＨＬＡ抗原に結合し、かつ細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有する単離されたペプチドであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：64のアミノ酸配列からなるか、またはその断片である、単離されたペプチド。
[本発明1002]
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ24またはＨＬＡ−Ａ2である、本発明1001の単離されたペプチド。
[本発明1003]
ノナペプチドまたはデカペプチドである、本発明1001または1002の単離されたペプチド。
[本発明1004]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：2、1、3、4、16、17、30、31、34、36、37、40、41、45、49、55、57、および61からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1001〜1003のいずれかの単離されたペプチド。
[本発明1005]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：2、1、3、4、16、17、30、31、34、36、37、40、41、45、49、55、57、および61からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる単離されたペプチドであって、1個、2個、または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されている、本発明1004の単離されたペプチド。
[本発明1006]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1、2、3、4、16、および17からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドであって、ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ24である場合に、以下の特徴の一方または両方を有する、本発明1005のペプチド：
（ａ）Ｎ末端から2番目のアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、およびトリプトファンの群より選択される；ならびに
（ｂ）Ｃ末端のアミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、およびメチオニンの群より選択される。
[本発明1007]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：30、31、34、36、37、40、41、45、49、55、57、および61からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドであって、ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ2である場合に、以下の特徴の一方または両方を有する、本発明1005のペプチド：
（ａ）Ｎ末端から2番目のアミノ酸が、ロイシンおよびメチオニンの群より選択される；ならびに
（ｂ）Ｃ末端のアミノ酸が、バリンおよびロイシンの群より選択される。
[本発明1008]
本発明1001〜1007のいずれかのペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1009]
本発明1001〜1007のいずれかの1種もしくは複数種のペプチド、または本発明1008の1種もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む、ＣＴＬを誘導するための剤。
[本発明1010]
本発明1001〜1007のいずれかの1種もしくは複数種のペプチド、または本発明1008の1種もしくは複数種のポリヌクレオチドを含む、がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防のための薬学的な剤。
[本発明1011]
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ24またはＨＬＡ−Ａ2である対象に投与するために製剤化される、本発明1010の薬学的な剤。
[本発明1012]
以下より選択される段階を含む、ＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導するための方法：
（ａ）ＡＰＣを本発明1001〜1007のいずれかのペプチドとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階；および
（ｂ）本発明1001〜1007のいずれかのペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階。
[本発明1013]
以下より選択される段階を含む、ＣＴＬを誘導するための方法：
（ａ）ＣＤ8陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と本発明1001〜1007のいずれかのペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣと共培養する段階；
（ｂ）ＣＤ8陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡ抗原と本発明1001〜1007のいずれかのペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームと共培養する段階；および
（ｃ）本発明1001〜1007のいずれかのペプチドに結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをＴ細胞に導入する段階。
[本発明1014]
ＨＬＡ抗原と本発明1001〜1007のいずれかのペプチドとの複合体を自身の表面上に提示する単離されたＡＰＣ。
[本発明1015]
本発明1012の方法によって誘導される、本発明1014のＡＰＣ。
[本発明1016]
本発明1001〜1007のいずれかの任意のペプチドを標的とする単離されたＣＴＬ。
[本発明1017]
本発明1013の方法によって誘導される、本発明1016のＣＴＬ。
[本発明1018]
本発明1001〜1007のいずれかのペプチド、免疫学的に活性のあるその断片、または該ペプチドもしくは該断片をコードするポリヌクレオチドを含む剤を対象に投与する段階を含む、対象においてがんに対する免疫応答を誘導する方法。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
本発明の様々な局面および適用は、以下の図面の簡単な説明ならびに本発明の詳細な説明およびその好ましい態様を考慮することで、当業者に明白となるであろう。
【図１】図１は、ＷＤＲＰＵＨ由来のペプチドを用いて誘導したＣＴＬにおけるＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す一連の写真を含む。ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−９−４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）で刺激したウェル番号＃３および＃６中のＣＴＬ（ａ）、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−９−３１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）で刺激したウェル番号＃８中のＣＴＬ（ｂ）、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−９−５０９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激したウェル番号＃２および＃６中のＣＴＬ（ｃ）、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−９−３３９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）で刺激したウェル番号＃１、＃２、および＃５中のＣＴＬ（ｄ）、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−１０−４０９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）で刺激したウェル番号＃２、＃３、＃４、＃６、＃７、および＃８中のＣＴＬ（ｅ）、ならびにＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−１０−４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）で刺激したウェル番号＃５、＃６、および＃８中のＣＴＬ（ｆ）は、それぞれ対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した。長方形の囲みで示したウェル中の細胞を増殖させて、ＣＴＬ株を樹立した。図中、「＋」はウェル中の細胞に適切なペプチドをパルスしたことを示し、「−」は細胞にいずれのペプチドもパルスしなかったことを示す。
【図２】図２は、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイによる、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−９−４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）（ａ）、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−９−３１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）（ｂ）、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−９−５０９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）（ｃ）、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−９−３３９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）（ｄ）、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−１０−４０９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）（ｅ）、およびＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−１０−４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）（ｆ）で刺激したＣＴＬ株のＩＦＮ−γ産生を示す一連の折れ線グラフを含む。各ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬ株は、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した。図中、「＋」はウェル中の細胞に適切なペプチドをパルスしたことを示し、「−」は細胞にいずれのペプチドもパルスしなかったことを示す。
【図３】図３は、ＷＤＲＰＵＨおよびＨＬＡ−Ａ＊２４０２を外因的に発現している標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性を示す折れ線グラフから構成される。ＨＬＡ−Ａ＊２４０２のみまたは全長ＷＤＲＰＵＨ遺伝子のみをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した。ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−９−３１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を用いて樹立されたＣＴＬ株は、ＷＤＲＰＵＨおよびＨＬＡ−Ａ＊２４０２の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞に対して特異的ＣＴＬ活性を示した（黒菱形）。対照的に、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２（三角形）またはＷＤＲＰＵＨ（丸）のいずれかを発現する標的細胞に対しては、有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。
【図４−１】図４ａ〜ｈは、ＷＤＲＰＵＨ由来のペプチドを用いて誘導したＣＴＬにおけるＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す一連の写真を含む。ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−９−３９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）で刺激したウェル番号＃２および＃７中のＣＴＬ（ａ）、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−９−４０７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）で刺激したウェル番号＃２中のＣＴＬ（ｂ）、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−９−２８８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）で刺激したウェル番号＃３中のＣＴＬ（ｃ）、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−９−２３７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）で刺激したウェル番号＃６中のＣＴＬ（ｄ）、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−９−５４３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）で刺激したウェル番号＃４中のＣＴＬ（ｅ）、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−１０−５７０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）で刺激したウェル番号＃４中のＣＴＬ（ｆ）、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−１０−２６３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）で刺激したウェル番号＃２および＃８中のＣＴＬ（ｇ）、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−１０−７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）で刺激したウェル番号＃５中のＣＴＬ（ｈ）は、それぞれ対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した。長方形の囲みで示したウェル中の細胞を増殖させて、ＣＴＬ株を樹立した。図中、「＋」はウェル中の細胞に適切なペプチドをパルスしたことを示し、「−」は細胞にいずれのペプチドもパルスしなかったことを示す。
【図４−２】図４ｉ〜ｌは、ＷＤＲＰＵＨ由来のペプチドを用いて誘導したＣＴＬにおけるＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す一連の写真を含む。ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−１０−１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）で刺激したウェル番号＃２中のＣＴＬ（ｉ）、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−１０−４１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５）で刺激したウェル番号＃６中のＣＴＬ（ｊ）、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−１０−２８７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）で刺激したウェル番号＃７中のＣＴＬ（ｋ）、およびＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−１０−２６５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１）で刺激したウェル番号＃６中のＣＴＬ（ｌ）は、それぞれ対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した。長方形の囲みで示したウェル中の細胞を増殖させて、ＣＴＬ株を樹立した。図中、「＋」はウェル中の細胞に適切なペプチドをパルスしたことを示し、「−」は細胞にいずれのペプチドもパルスしなかったことを示す。
【図５】図５ａおよびｂは、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイによって検出した、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０（ａ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４（ｂ）で刺激したＣＴＬ株のＩＦＮ−γ産生を示す折れ線グラフから構成される。各ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬ株は、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した。図中、「＋」はウェル中の細胞に適切なペプチドをパルスしたことを示し、「−」は細胞にいずれのペプチドもパルスしなかったことを示す。図５ｃおよび５ｄは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０（ｃ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４（ｄ）で刺激したＣＴＬ株から限界希釈により樹立されたＣＴＬクローンのＩＦＮ−γ産生を示す。本明細書に示した結果から、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０（ｃ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４（ｄ）による刺激によって樹立されたＣＴＬクローンは、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示したことが実証される。図中、「＋」はウェル中の細胞にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０（ｃ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４（ｄ）をパルスしたことを示し、「−」は細胞にいずれのペプチドもパルスしなかったことを示す。図５ｅは、ＷＤＲＰＵＨおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を外因的に発現している標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性を示す折れ線グラフから構成される。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１のみまたは全長ＷＤＲＰＵＨ遺伝子のみをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した。ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−９−２８８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）を用いて樹立されたＣＴＬクローンは、ＷＤＲＰＵＨおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞に対して特異的ＣＴＬ活性を示した（黒菱形）。対照的に、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１（三角形）またはＷＤＲＰＵＨ（丸）のいずれかを発現している標的細胞に対しては、有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
態様の説明
本発明の態様を実施または試験するにあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似のまたは同等な任意の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料をここに記載する。しかしながら、本材料および方法について記載する前に、本明細書に記載の特定の大きさ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコール等は慣行的な実験法および最適化に従って変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。本記載に使用する専門用語は特定の型または態様のみを説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも、同様に理解されるべきである。
【００２２】
本明細書において言及される各出版物、特許、または特許出願の開示は、その全体が参照により本明細書に明確に組み入れられる。しかしながら、本明細書中のいかなるものも、本発明が先の発明によるそのような開示に先行する権利を与えられないことを承認するものとしては解釈されるべきではない。
【００２３】
矛盾する場合には、定義を含め、本明細書が優先される。加えて、材料、方法、および実施例は単に例示であり、限定することを意図しない。
【００２４】
Ｉ．定義
本明細書で用いる「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単語は、他に特記しない限り「少なくとも１つ」を意味する。
【００２５】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、１個または複数個のアミノ酸残基が、修飾された残基であるか、または対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体などの非天然残基であるアミノ酸ポリマーと、天然アミノ酸ポリマーとに適用される。
【００２６】
本明細書で用いる「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、および細胞内で翻訳後に修飾されたアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造（水素、カルボキシ基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素）を有するが、修飾されたＲ基または修飾された骨格を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。「アミノ酸模倣体」という語句は、一般的なアミノ酸とは異なる構造を有するが、同様の機能を有する化合物を指す。
【００２７】
アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）の推奨する、一般に公知の３文字表記または１文字表記により参照されてもよい。
【００２８】
「ポリヌクレオチド」、「遺伝子」、「ヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、他に特記しない限り本明細書において互換的に用いられる。
【００２９】
他に定義しない限り、「がん」という用語はＷＤＲＰＵＨ遺伝子を過剰発現しているがんを指し、その例には、肝細胞癌が含まれるが、これに限定されない。
【００３０】
他に定義しない限り、「細胞傷害性Ｔリンパ球」、「細胞傷害性Ｔ細胞」、および「ＣＴＬ」という用語は本明細書において互換的に用いられ、他に特記しない限り、非自己細胞（例えば、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞）を認識すること、およびそのような細胞の死滅を誘導することができるＴリンパ球のサブグループを指す。
【００３１】
他に定義しない限り、「ＨＬＡ−Ａ２」という用語は、ＨＬＡ−Ａ０２０１またはＨＬＡ−Ａ０２０６などの亜型を含む。
【００３２】
他に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。
【００３３】
ＩＩ．ペプチド
ＷＤＲＰＵＨ由来のペプチドが、ＣＴＬによって認識される抗原として機能することを実証するために、ＷＤＲＰＵＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）由来のペプチドを解析して、それらが、一般的に見られるＨＬＡ対立遺伝子であるＨＬＡ−Ａ２４拘束性の抗原エピトープであるかどうかを決定した（Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996；Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995；Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994）。ＷＤＲＰＵＨ由来のＨＬＡ−Ａ２４結合ペプチドの候補を、ＨＬＡ−Ａ２４に対するそれらの結合親和性に基づいて同定した。以下のペプチドが候補ペプチドである：
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−９−４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−９−３１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−９−５０９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−９−３３９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−１０−４０９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、および
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−１０−４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）。
【００３４】
ＷＤＲＰＵＨ由来のＨＬＡ−Ａ０２結合ペプチドの候補を、ＨＬＡ−Ａ０２に対するそれらの結合親和性に基づいて同定した。以下のペプチドが候補ペプチドである：
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−９−３９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−９−４０７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−９−２８８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−９−２３７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−９−５４３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−１０−５７０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−１０−２６３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−１０−７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−１０−１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−１０−４１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−１０−２８７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）、および
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−１０−２６５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１）。
【００３５】
樹立されたこれらのＣＴＬは、各ペプチドをパルスした標的細胞に対して強力な特異的ＣＴＬ活性を示す。本明細書におけるこれらの結果から、ＷＤＲＰＵＨがＣＴＬによって認識される抗原であること、および前記ペプチドがＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２拘束性のＷＤＲＰＵＨのエピトープペプチドであり得ることが実証される。
【００３６】
ＷＤＲＰＵＨ遺伝子は、肝細胞癌などのがん細胞で過剰発現しており、かつほとんどの正常器官では発現していないため、これは免疫療法のための優れた標的である。従って本発明は、ＣＴＬに認識されるＷＤＲＰＵＨのエピトープに相当するノナペプチド（アミノ酸残基９個からなるペプチド）およびデカペプチド（アミノ酸残基１０個からなるペプチド）を提供する。本発明のペプチドの特に好ましい例には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、１６、１７、３０、３１、３４、３６、３７、４０、４１、４５、４９、５５、５７、および６１の中より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドが含まれる。
【００３７】
一般的に、インターネット上で現在利用可能なソフトウェアプログラム、例えばParker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75に記載されているソフトウェアプログラムなどを用いて、インシリコで様々なペプチドとＨＬＡ抗原との間の結合親和性を算出することができる。例えばParker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75;およびKuzushima K et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81を参照すると、ＨＬＡ抗原との結合親和性を測定することができる。結合親和性を決定するための方法は、例えばJournal of Immunological Methods, 1995, 185: 181-190、Protein Science, 2000, 9: 1838-1846に記載されている。それゆえ、そのようなソフトウェアプログラムを用いて、ＨＬＡ抗原との高い結合親和性を有するＷＤＲＰＵＨ断片を選択することができる。従って本発明は、そのような公知のプログラムを用いて同定された、ＨＬＡ抗原と結合する、ＷＤＲＰＵＨ由来の任意の断片からなるペプチドを包含する。さらに、本ペプチドは全長ＷＤＲＰＵＨからなってもよい。
【００３８】
本発明のペプチドには、結果として生じるペプチドがそのＣＴＬ誘導能を保持する限り、付加的なアミノ酸残基を隣接させることができる。本発明のペプチドに隣接する特定のアミノ酸残基は、それらが元のペプチドのＣＴＬ誘導能を損なわない限り、任意の種類のアミノ酸から構成され得る。従って本発明は、ＨＬＡ抗原への結合能を有し、かつＷＤＲＰＵＨ由来のアミノ酸配列を含むペプチドもまた提供する。そのようなペプチドは、典型的には約４０アミノ酸未満であり、約２０アミノ酸未満である場合が多く、通常は約１５アミノ酸未満である。
【００３９】
一般的に、あるペプチド中の１個、２個、またはそれ以上のアミノ酸の改変は、該ペプチドの機能に影響を及ぼさず、場合によっては元のタンパク質の所望の機能を増強することさえある。実際に、改変ペプチド（すなわち、元の参照配列と比較して、１個、２個、または数個のアミノ酸残基が改変された（すなわち、置換、欠失、付加、または挿入された）アミノ酸配列から構成されるペプチド）は、元のペプチドの生物活性を保持することが知られている（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6;Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500;Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13）。従って、１つの態様において、本発明のペプチドは、ＣＴＬ誘導能、ならびに１個、２個、またはさらにそれ以上のアミノ酸が付加、挿入、欠失、および／または置換されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、１６、１７、３０、３１、３４、３６、３７、４０、４１、４５、４９、５５、５７および６１の中より選択されるアミノ酸配列の双方を有してよい。
【００４０】
当業者は、単一のアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を変更する、アミノ酸配列に対する個々の置換が、元のアミノ酸側鎖の特性の保存をもたらす傾向があることを認識する。従って、それらはしばしば「保存的置換」または「保存的改変」と称され、この場合、タンパク質の変化により元のタンパク質と類似の機能を有する改変タンパク質が生じる。機能的に類似しているアミノ酸を提示する保存的置換の表は、当技術分野において周知である。保存するのが望ましいアミノ酸側鎖の特性の例には、例えば、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、ならびに以下の官能基または特徴を共通して有する側鎖が含まれる：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基含有側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子含有側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミド含有側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基含有側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；ならびに芳香族含有側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。加えて、以下の８群はそれぞれ、相互に保存的置換であるとして当技術分野で認められるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins 1984を参照されたい）。
【００４１】
このような保存的改変ペプチドもまた、本発明のペプチドと見なされる。しかしながら、本発明のペプチドはこれらに限定されず、改変ペプチドが元のペプチドのＣＴＬ誘導能を保持する限り、非保存的な改変を含み得る。さらに、改変ペプチドは、ＷＤＲＰＵＨの多型バリアント、種間相同体、および対立遺伝子のＣＴＬ誘導可能なペプチドを排除しない。
【００４２】
必要なＣＴＬ誘導能を保持するために、少数の（例えば、１個、２個、または数個の）またはわずかな割合のアミノ酸を改変する（挿入、欠失、付加、および／または置換する）ことができる。本明細書において、「数個」という用語は、５個またはそれ未満のアミノ酸、例えば４個、３個またはそれ未満を意味する。改変するアミノ酸の割合は、好ましくは２０％もしくはそれ未満、より好ましくは１５％もしくはそれ未満、さらにより好ましくは１０％もしくはそれ未満、または１〜５％である。
【００４３】
さらに、ペプチドにアミノ酸残基を置換、挿入、欠失、および／または付加して、改善された結合親和性を有する改変ペプチドを得ることができる。免疫療法との関連で用いられた場合、本発明のペプチドは、好ましくはＨＬＡ抗原との複合体として、細胞またはエキソソームの表面上に提示されるべきである。天然に提示されるペプチドに加えて、ＨＬＡ抗原への結合によって提示されるペプチドの配列の規則性は既知であるため（J Immunol 1994, 152: 3913;Immunogenetics 1995, 41: 178;J Immunol 1994, 155: 4307）、そのような規則性に基づいた改変を本発明の免疫原性ペプチドに導入することができる。例えば、ＨＬＡ−Ａ２４結合を増大させるためには、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、もしくはトリプトファンで置換されたＮ末端から２番目のアミノ酸を置換すること、および／またはＣ末端のアミノ酸をフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、もしくはメチオニンで置換することが望ましい場合がある。従って、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、１６および１７のアミノ酸配列のＮ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニン、もしくはトリプトファンで置換されている、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、１６および１７のアミノ酸配列のＣ末端がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、もしくはメチオニンで置換されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、１６および１７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドは、本発明によって包含される。一方、高いＨＬＡ−Ａ２結合親和性を有するペプチドは、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシンもしくはメチオニンで置換されており、かつＣ末端のアミノ酸がバリンもしくはロイシンで置換されている。従って、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシンもしくはメチオニンで置換されている、および／またはＣ末端がバリンもしくはロイシンで置換されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、３１、３４、３６、３７、４０、４１、４５、４９、５５、５７および６１のアミノ酸配列を有するペプチドは、本発明によって包含される。末端のアミノ酸においてだけでなく、ペプチドの潜在的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）認識の部位においても、置換を導入することができる。いくつかの研究は、例えばＣＡＰ１、ｐ５３（264-272）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（369-377）、またはｇｐ１００（209-217）など、アミノ酸置換がされたペプチドが元のものと同等であるかまたはより優れたものであり得ることを実証している（Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997、T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1;168(3):1338-47.、S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206、およびS. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314）。
【００４４】
本発明はまた、記載したペプチドのＮ末端および／またはＣ末端への１個、２個または数個のアミノ酸の付加を意図する。高いＨＬＡ抗原結合親和性を有し、かつＣＴＬ誘導能を保持するそのような改変ペプチドもまた、本発明に包含される。
【００４５】
しかしながら、ペプチド配列が、異なる機能を有する内因性または外因性のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一である場合、自己免疫障害および／または特定の物質に対するアレルギー症状などの副作用が誘発される可能性がある。従って、ペプチドの配列が別のタンパク質のアミノ酸配列と一致する状況を回避するために、第一に、利用可能なデータベースを用いて相同性検索を行うことが好ましい。相同性検索から、対象ペプチドと比較して１個または２個のアミノ酸が異なるペプチドさえも存在しないことが明らかになった場合には、前記副作用のいかなる危険も伴わずに、ＨＬＡ抗原とのその結合親和性を増大させるため、および／またはそのＣＴＬ誘導能を増大させるために、該対象ペプチドを改変することができる。
【００４６】
上記のようにＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性を有するペプチドは、非常に効果的であると予測されるが、指標としての高い結合親和性の存在に従って選択された候補ペプチドを、ＣＴＬ誘導能の存在についてさらに調べる。本明細書において「ＣＴＬ誘導能」という語句は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に提示された場合に、ＣＴＬを誘導するペプチドの能力を示す。さらに、「ＣＴＬ誘導能」は、ＣＴＬ活性化を誘導する、ＣＴＬ増殖を誘導する、ＣＴＬによる標的細胞の溶解を促進する、およびＣＴＬのＩＦＮ−γ産生を増加させる、ペプチドの能力を含む。
【００４７】
ＣＴＬ誘導能の確認は、ヒトＭＨＣ抗原を保有するＡＰＣ（例えば、Ｂリンパ球、マクロファージ、および樹状細胞（ＤＣ））、またはより具体的にはヒト末梢血単核白血球由来のＤＣを誘導し、ペプチドによる刺激の後、ＣＤ８陽性細胞と混合し、その後、標的細胞に対してＣＴＬによって産生および放出されたＩＦＮ−γを測定することにより、達成される。反応系として、ヒトＨＬＡ抗原を発現するように作製されたトランスジェニック動物（例えば、BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) responseに記載されているもの）を用いることができる。例えば、標的細胞を５１Ｃｒ等で放射標識することが可能であり、標的細胞から放出された放射能から細胞傷害活性を算出することができる。あるいは、固定化したペプチドを保有するＡＰＣの存在下で、ＣＴＬによって産生かつ放出されたＩＦＮ−γを測定し、抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体を用いて培地上の阻害領域を可視化することによって、ＣＴＬ誘導能を評価することができる。
【００４８】
上記のようにペプチドのＣＴＬ誘導能を調べた結果、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、１６、１７、３０、３１、３４、３６、３７、４０、４１、４５、４９、５５、５７、および６１の中より選択されるアミノ酸配列を有するノナペプチドまたはデカペプチドが、ＨＬＡ抗原に対する高い結合親和性に加えて、特に高いＣＴＬ誘導能を示すことが見出された。従って、これらのペプチドは、本発明の好ましい態様として例証される。
【００４９】
さらに、相同性解析の結果から、これらのペプチドが、任意の他の公知のヒト遺伝子産物に由来するペプチドと有意な相同性を有していないことが示された。このことは、免疫療法において本発明のペプチドを使用することによって、未知または望ましくない免疫応答が生じる可能性が低いことを意味する。従って、この局面からもまた、これらのペプチドはがん患者においてＷＤＲＰＵＨに対する免疫を誘発するのに好ましい。よって、本発明の特に好ましいペプチドには、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、１６、１７、３０、３１、３４、３６、３７、４０、４１、４５、４９、５５、５７、および６１の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドが含まれる。
【００５０】
上記の改変に加えて、本発明のペプチドはまた、得られたペプチドが元のペプチドの必要なＣＴＬ誘導能を保持する限り、他のペプチドに連結させることもできる。適切なペプチドの例には、本発明のペプチド、または他のＴＡＡに由来するＣＴＬ誘導性ペプチドが含まれるが、これらに限定されない。ペプチド間に配置すべきリンカーは当技術分野で周知であり、これには例えばＡＡＹ（P. M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26）、ＡＡＡ、ＮＫＲＫ（R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 7308-7315）、およびＫ（S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-1476、K. S. Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168: 5709-5715）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５１】
さらに、本発明のペプチドはまた、得られたペプチドが元のペプチドの必要なＣＴＬ誘導能を保持する限り、他の物質に連結させることもできる。適切な物質の例には、修飾によって元のペプチドの生物活性が損なわれないという条件で、ペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然および合成のポリマー等が含まれるが、これらに限定されない。ペプチドは、修飾によって元のペプチドの生物活性が損なわれないという条件で、糖鎖付加、側鎖酸化、またはリン酸化等のような修飾を含み得る。このような種類の修飾を行って、付加的な機能（例えば、標的化機能および送達機能）を付与すること、またはポリペプチドを安定化することができる。例えば、ポリペプチドのインビボ安定性を高めるために、Ｄ−アミノ酸、アミノ酸模倣体、または非天然アミノ酸を導入することが当技術分野で知られており、この概念を本発明のポリペプチドにも適合させることができる。ポリペプチドの安定性は、いくつかの方法でアッセイすることができる。例えば、ペプチダーゼ、ならびにヒトの血漿および血清などの様々な生物学的媒質を用いて、安定性を試験することができる（例えば、Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302を参照されたい）。
【００５２】
上記したように、１個、２個、または数個のアミノ酸残基の置換、挿入、欠失、および／または付加により改変されているが、元のペプチドと比較して同じかまたはそれよりも高い活性をなお有するペプチドをスクリーニングまたは選択することが可能である。従って、本発明はまた、元のペプチドと比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有する改変ペプチドをスクリーニングまたは選択するための方法を提供する。例えば、そのような方法は以下の段階から構成され得る：
ａ：置換、欠失、挿入、および／または付加により、本発明のペプチド中の少なくとも１個のアミノ酸残基を改変する段階；
ｂ：改変ペプチドの活性を測定する段階；ならびに
ｃ：元のペプチドと比較して同じかまたはそれよりも高い活性を有すると決定されたペプチドを選択する段階。
【００５３】
本明細書において、段階ｂで測定すべき活性は、ＭＨＣ結合活性、ＡＰＣもしくはＣＴＬ誘導能、および／または細胞傷害活性であってよい。
【００５４】
本明細書において、本発明のペプチドは「ＷＤＲＰＵＨペプチド」または「ＷＤＲＰＵＨポリペプチド」と記載することもできる。
【００５５】
ＩＩＩ．ＷＤＲＰＵＨペプチドの調製
周知の技法を用いて、本発明のペプチドを調製することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術または化学合成を用いて、ペプチドを合成的に調製することができる。本発明のペプチドは、個々に、または２つもしくはそれ以上のペプチドから構成されるより長いポリペプチドとして、合成することができる。その後ペプチドを単離すること、すなわち他の天然の宿主細胞タンパク質およびそれらの断片、または他の任意の化学物質を実質的に含まないように、精製または単離することができる。
【００５６】
選択されたアミノ酸配列に基づいた化学合成によって、本発明のペプチドを得ることができる。該合成に適合させることのできる従来のペプチド合成法の例には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：
（ｉ）Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；
（ｉｉ）The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976；
（ｉｉｉ）Peptide Synthesis （日本語）, Maruzen Co., 1975；
（ｉｖ）Basics and Experiment of Peptide Synthesis （日本語）, Maruzen Co., 1985；
（ｖ）Development of Pharmaceuticals (second volume) （日本語）, Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991；
（ｖｉ）ＷＯ９９／６７２８８；および
（ｖｉｉ）Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, 「Solid Phase Peptide Synthesis」, Academic Press, New York, 1980, 100-118。
【００５７】
あるいは、ペプチドを作製するための任意の公知の遺伝子工学的方法（例えば、Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51;Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62）を適合させて、本発明のペプチドを得ることができる。例えば、最初に、発現可能な形態で（例えば、プロモーター配列に相当する調節配列の下流に）目的のペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する適切なベクターを調製し、適切な宿主細胞に入れて形質転換する。次いで、該宿主細胞を培養して、関心対象のペプチドを産生させる。インビトロ翻訳系を適合させて、ペプチドをインビトロで作製することもできる。
【００５８】
ＩＶ．ポリヌクレオチド
本発明はまた、前述の本発明のペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。これらは、天然ＷＤＲＰＵＨ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ_１４５６９７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４））由来のポリヌクレオチド、およびその保存的に改変されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。本明細書において「保存的に改変されたヌクレオチド配列」という語句は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、数多くの機能的に同一な核酸が任意の特定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸のアラニンをコードする。従って、あるコドンによってアラニンが指定されるあらゆる位置において、コードされるポリペプチドを変化させることなく、該コドンを記載された対応するコドンのいずれかに変更することができる。このような核酸の変異は「サイレント変異」であり、保存的に改変された変異の一種である。ペプチドをコードする本明細書中のあらゆる核酸配列は、該核酸の可能なあらゆるサイレント変異をも表す。核酸中の各コドン（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変して、機能的に同一な分子を得ることができることを、当業者は認識するであろう。従って、ペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、公開した各配列において非明示的に記載されている。
【００５９】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの誘導体から構成され得る。ＤＮＡはＡ、Ｔ、Ｃ、およびＧなどの塩基から適切に構成され、ＲＮＡではＴはＵに置き換えられる。
【００６０】
本発明のポリヌクレオチドは、介在するアミノ酸配列を間に伴って、または伴わずに、本発明の複数のペプチドをコードし得る。例えば、介在するアミノ酸配列は、ポリヌクレオチドまたは翻訳されたペプチドの切断部位（例えば、酵素認識配列）を提供し得る。さらに、ポリヌクレオチドは、本発明のペプチドをコードするコード配列に対する任意の付加的配列を含み得る。例えば、ポリヌクレオチドは、ペプチドの発現に必要な調節配列を含む組換えポリヌクレオチドであってよく、またはマーカー遺伝子等を有する発現ベクター（プラスミド）であってもよい。一般に、例えばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いる従来の組換え技法によりポリヌクレオチドを操作することによって、そのような組換えポリヌクレオチドを調製することができる。
【００６１】
組換え技法および化学合成技法の両方を用いて、本発明のポリヌクレオチドを作製することができる。例えば、適切なベクター内に挿入することによってポリヌクレオチドを作製することができ、これはコンピテント細胞にトランスフェクトした場合に発現され得る。あるいは、ＰＣＲ技法または適切な宿主内での発現を用いて、ポリヌクレオチドを増幅することができる（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989を参照されたい）。あるいは、Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311;Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5に記載されているような固相技法を用いて、ポリヌクレオチドを合成することができる。
【００６２】
Ｖ．エキソソーム
本発明は、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との間で形成された複合体を自身の表面上に提示する、エキソソームと称される細胞内小胞をさらに提供する。エキソソームは、例えば公表特許公報特表平１１−５１０５０７号およびＷＯ９９／０３４９９に詳述されている方法を用いることによって調製することができ、治療および／または予防の対象となる患者から得られたＡＰＣを用いて調製することができる。本発明のエキソソームは、本発明のペプチドと同様の様式で、ワクチンとして接種することができる。
【００６３】
前記複合体中に含まれるＨＬＡ抗原の型は、治療および／または予防を必要とする対象のものと一致しなければならない。例えば日本人集団では、ＨＬＡ−Ａ２４およびＨＬＡ−Ａ２、特にＨＬＡ−Ａ２４０２およびＨＬＡ−Ａ０２０１またはＨＬＡ−Ａ０２０６がよく見られ、従って日本人患者の治療に適していると考えられる。日本人および白人の間で高発現しているＡ２４型またはＡ２型の使用は、有効な結果を得るのに好ましく、Ａ２４０２、Ａ０２０１またはＡ０２０６などの亜型もまた使用される。典型的には、臨床では、治療を必要とする患者のＨＬＡ抗原の型があらかじめ調べられ、これにより、特定の抗原に対して高レベルの結合親和性を有する、または抗原提示によるＣＴＬ誘導能を有するペプチドの適切な選択が可能となる。さらに、高い結合親和性およびＣＴＬ誘導能の両方を有するペプチドを取得するために、天然のＷＤＲＰＵＨの部分ペプチドのアミノ酸配列に基づいて、１個、２個、または数個のアミノ酸の置換、挿入、欠失および／または付加を行うことができる。
【００６４】
本発明のエキソソームについてＡ２４型ＨＬＡ抗原を用いる場合、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、１６および１７の中より選択される配列を有するペプチドが用いられる。あるいは、本発明のエキソソームについてＡ２型ＨＬＡ抗原を用いる場合、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、３１、３４、３６、３７、４０、４１、４５、４９、５５、５７および６１のいずれか1つの配列を有するペプチドが用いられる。
【００６５】
ＶＩ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）
本発明はまた、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの間で形成された複合体を自身の表面上に提示する単離されたＡＰＣを提供する。ＡＰＣは、治療および／または予防の対象となる患者に由来してよく、かつ、単独で、または本発明のペプチド、エキソソーム、もしくはＣＴＬを含む他の薬物と組み合わせて、ワクチンとして投与することができる。
【００６６】
前記ＡＰＣは、特定の種類の細胞に限定されず、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られているＤＣ、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および活性化Ｔ細胞を含む。ＤＣは、ＡＰＣの中で最も強力なＣＴＬ誘導作用を有する代表的なＡＰＣであるため、ＤＣは本発明のＡＰＣとして使用される。
【００６７】
例えば、本発明のＡＰＣは、末梢血単球からＤＣを誘導し、次にそれらをインビトロ、エクスビボ、またはインビボで本発明のペプチドと接触させる（で刺激する）ことによって得ることができる。「ＡＰＣを誘導する」という語句は、細胞を本発明のペプチドまたは本発明のペプチドをコードするヌクレオチドと接触させて（で刺激して）、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの間で形成された複合体を細胞表面上に提示させることを含む。本発明のペプチドを対象に投与した場合、本発明のペプチドを提示するＡＰＣが該対象の体内で誘導される。従って、本発明のＡＰＣは、本発明のペプチドを対象に投与した後、該対象からＡＰＣを回収することによって得ることができる。あるいは、本発明のＡＰＣは、対象から回収されたＡＰＣを本発明のペプチドと接触させることによって得ることができる。
【００６８】
対象においてがんに対する免疫応答を誘導するために、本発明のＡＰＣを単独で、または本発明のペプチド、エキソソーム、もしくはＣＴＬを含む他の薬物と組み合わせて、対象に投与することができる。例えば、エクスビボ投与は以下の段階を含み得る：
ａ：第１の対象からＡＰＣを回収する段階；
ｂ：段階ａのＡＰＣを前記ペプチドと接触させる段階；および
ｃ：該ペプチドを負荷した段階ｂのＡＰＣを第２の対象に投与する段階。
【００６９】
第１の対象と第２の対象は同一の個体であってよく、または異なる個体であってもよい。段階ｂによって得られたＡＰＣは、肝細胞癌を含むがんを治療および／または予防するためのワクチンとして投与することができる。加えて、本発明は、抗原提示細胞を誘導する薬学的組成物を製造するための方法または工程を提供し、ここで、該方法は、薬学的に許容される担体と共に本発明のペプチドを混合または製剤化する段階を含む。
【００７０】
本発明の１つの局面によると、ＡＰＣは高レベルのＣＴＬ誘導能を有する。「高レベルのＣＴＬ誘導能」という用語において、高レベルとは、ペプチドと接触させていないＡＰＣ、またはＣＴＬを誘導することができないペプチドと接触させたＡＰＣにより達成されるレベルと比較したものである。高レベルのＣＴＬ誘導能を有するそのようなＡＰＣは、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子をインビトロでＡＰＣに導入する段階を含む方法および上述の方法によって、調製することができる。導入する遺伝子は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態であってよい。導入のための方法の例には、特に限定されることなく、当分野において従来より実施される様々な方法が含まれ、例えばリポフェクション、エレクトロポレーション、およびリン酸カルシウム法などを用いることができる。より具体的には、Cancer Res 1996, 56: 5672-7;J Immunol 1998, 161: 5607-13;J Exp Med 1996, 184: 465-72；公表特許公報第２０００−５０９２８１号に記載されているように、それを実施することができる。遺伝子をＡＰＣに導入することによって、遺伝子は細胞内で転写、翻訳等を受け、次いで、得られたタンパク質は処理され、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩによって提示経路を経て提示される。
【００７１】
ＶＩＩ．細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）
本発明のペプチドのいずれかに対して誘導されたＣＴＬは、インビボでがん細胞を標的とする免疫応答を増強させるため、ペプチド自体と同様の様式でワクチンとして用いることができる。従って本発明はまた、本ペプチドのいずれかによって特異的に誘導または活性化された、単離されたＣＴＬを提供する。
【００７２】
そのようなＣＴＬは、（１）本発明のペプチドを対象に投与し、該対象からＣＴＬを回収すること；（２）対象由来のＡＰＣおよびＣＤ８陽性細胞もしくは末梢血単核白血球をインビトロで本発明のペプチドと接触させた（で刺激した）後、ＣＴＬを単離すること；（３）ＣＤ８陽性細胞もしくは末梢血単核白血球を、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するＡＰＣもしくはエキソソームとインビトロで接触させた後、ＣＴＬを単離すること；または（４）本発明のペプチドに結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットポリペプチドをコードする遺伝子をＴ細胞に導入することによって、得ることができる。ＡＰＣまたはエキソソームは上述の方法によって調製することができ、（４）の方法は以下の「ＶＩＩＩ． Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」の章において詳述する。
【００７３】
本発明のペプチドを提示するＡＰＣによる刺激によって誘導された本発明のＣＴＬは、治療および／または予防の対象となる患者に由来してよく、かつ、単独で投与すること、または効果を調節する目的で本発明のペプチドもしくはエキソソームを含む他の薬物と組み合わせて投与することができる。得られたＣＴＬは、本発明のペプチド、例えば誘導に用いた同一のペプチドを提示する標的細胞に対して特異的に作用する。標的細胞は、ＷＤＲＰＵＨを内因的に発現している細胞、例えば肝細胞癌、またはＷＤＲＰＵＨ遺伝子をトランスフェクトされた細胞であってよく、かつ、本発明のペプチドによる刺激によって該ペプチドを細胞表面上に提示する細胞もまた、活性化されたＣＴＬの攻撃の標的となり得る。
【００７４】
ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
本発明はまた、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のサブユニットを形成し得るポリペプチドをコードする核酸を含む組成物、およびそれを用いる方法を提供する。ＴＣＲサブユニットは、本発明の特定のペプチドを提示する腫瘍細胞に対する特異性をＴ細胞に付与するＴＣＲを形成する能力を有する。当技術分野における公知の方法を用いることによって、本発明の１種または複数種のペプチドで誘導されたＣＴＬのＴＣＲサブユニットとしてα鎖およびβ鎖の核酸を同定することができる（ＷＯ２００７／０３２２５５、およびMorgan et al., J Immunol, 171, 3288 (2003)）。例えば、ＰＣＲ法はＴＣＲを解析するのに好ましい。解析のためのＰＣＲプライマーは、例えば、５’側プライマーとしての５’−Ｒプライマー
0005764823.tif 000002
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５）、および、３’側プライマーとしての、ＴＣＲα鎖Ｃ領域に特異的な３−ＴＲａ−Ｃプライマー
0005764823.tif 000003
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）、ＴＣＲβ鎖Ｃ１領域に特異的な３−ＴＲｂ−Ｃ１プライマー
0005764823.tif 000004
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７）または、ＴＣＲβ鎖Ｃ２領域に特異的な３−ＴＲβ−Ｃ２プライマー
0005764823.tif 000005
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８）であり得るが、これらに限定されない。ＴＣＲ誘導体は、ＷＤＲＰＵＨペプチドを提示する標的細胞と高い結合力で結合することができ、かつ任意で、ＷＤＲＰＵＨペプチドを提示する標的細胞の効率的な殺傷をインビボおよびインビトロで媒介することができる。
【００７５】
ＴＣＲサブユニットをコードする核酸を、適切なベクター、例えばレトロウイルスベクターに組み込むことができる。これらのベクターは、当技術分野において周知である。該核酸またはそれらを有用に含むベクターを、Ｔ細胞、例えば患者由来のＴ細胞に導入することができる。有利には、本発明は、患者自身のＴ細胞（または別の哺乳動物のＴ細胞）の迅速な改変により、優れたがん細胞殺傷特性を有する改変Ｔ細胞を迅速かつ容易に作製することを可能にする、汎用の組成物を提供する。
【００７６】
特異的ＴＣＲとは、ＴＣＲがＴ細胞の表面上に存在する場合に、本発明のペプチドとＨＬＡ分子との複合体を特異的に認識して、標的細胞に対する特異的活性をＴ細胞に付与し得る受容体である。上記複合体の特異的認識は任意の公知の方法によって確認することができ、好ましい方法には、例えば、ＨＬＡ分子および本発明のペプチドを用いる四量体解析、ならびにＥＬＩＳＰＯＴアッセイが含まれる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行うことにより、細胞表面上にＴＣＲを発現しているＴ細胞がＴＣＲによって細胞を認識すること、およびシグナルが細胞内で伝達されることを確認することができる。上記の複合体がＴ細胞表面上に存在する場合に、該複合体がＴ細胞に細胞傷害活性を付与し得るという確認もまた、公知の方法によって行うことができる。好ましい方法には、例えば、クロム放出アッセイなどのＨＬＡ陽性標的細胞に対する細胞傷害活性の測定が含まれる。また本発明は、ＨＬＡ−Ａ２との関連で、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、１６、および１７のＷＤＲＰＵＨペプチドに、ならびに同様にＨＬＡ−Ａ２４との関連で、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、３１、３４、３６、３７、４０、４１、４５、４９、５５、５７、および６１のペプチドに結合するＴＣＲサブユニットポリペプチドをコードする核酸を形質導入することによって調製されるＣＴＬを提供する。形質導入されたＣＴＬは、インビボでがん細胞にホーミングすることができ、周知の培養法によってインビトロで増殖させることができる（例えば、Kawakami et al., J Immunol., 142, 3452-3461 (1989)）。本発明のＣＴＬを用いて、治療または予防を必要としている患者におけるがんの治療または予防に有用な免疫原性組成物を形成することができる（ＷＯ２００６／０３１２２１）。
【００７７】
予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患による死亡率または罹患率の負荷を軽減させる任意の行為を含む。予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、「第一次、第二次、および第三次の予防レベルで」行われ得る。第一次の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患の発生を回避するのに対し、第二次および第三次レベルの予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患の進行および症状の出現を予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）することに加え、機能を回復させ、かつ疾患関連の合併症を減少させることによって、既存の疾患の悪影響を低下させることを目的とした行為を包含する。あるいは、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、特定の障害の重症度を軽減すること、例えば腫瘍の増殖および転移を減少させること、血管形成を減少させることを目的とした広範囲の予防的治療を含む。
【００７８】
がんの治療および／もしくは予防、ならびに／または術後のその再発の予防は、以下の段階、例えばがん細胞の外科的除去、がん性細胞の成長の阻害、腫瘍の退行または退縮、寛解の誘導およびがんの発生の抑制、腫瘍の退縮、ならびに転移の低減または阻害などの段階のいずれかを含む。がんの効果的な治療および／または予防は、死亡率を減少させ、がんを有する個体の予後を改善し、血中の腫瘍マーカーのレベルを低下させ、かつがんに伴う検出可能な症状を軽減する。例えば、症状の軽減または改善は効果的な治療および／または予防を構成し、ならびにそのような症状の軽減または改善は、１０％、２０％、３０％、もしくはそれ以上の軽減または安定した疾患状態の維持を含む。
【００７９】
ＩＸ．薬学的な剤または組成物
ＷＤＲＰＵＨの発現は、正常組織と比較して肝細胞癌において特異的に上昇する（上方制御される）ため（Silva et al., Neoplasia 2005 Apr;7(4):348-55）、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを、がんもしくは腫瘍の治療および／もしくは予防のために、ならびに／または術後のその再発の予防に用いることができる。従って本発明は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドの１種または複数種を有効成分として含む、がんもしくは腫瘍の治療および／もしくは予防のための、ならびに／または術後のその再発の予防のための薬学的な剤または組成物を提供する。あるいは、薬学的な剤または組成物として用いるために、本発明のペプチドを、前述のエキソソームまたはＡＰＣなどの細胞のいずれかの表面上に発現させることができる。加えて、本発明のペプチドのいずれかを標的とする前述のＣＴＬもまた、本薬学的な剤または組成物の有効成分として用いることができる。
【００８０】
別の態様において、本発明はまた、がんまたは腫瘍を治療または予防するための薬学的な組成物または剤の製造における、以下の中より選択される有効成分の使用を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明のＣＴＬ。
【００８１】
あるいは、本発明はさらに、がんまたは腫瘍の治療または予防において用いるための、以下の中より選択される有効成分を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明のＣＴＬ。
【００８２】
あるいは、本発明はさらに、がんまたは腫瘍を治療または予防するための薬学的な組成物または剤を製造するための方法または工程であって、有効成分として以下の中より選択される有効成分と共に、薬学的にまたは生理学的に許容される担体を製剤化する段階を含む、方法または工程を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明のＣＴＬ。
【００８３】
別の態様において、本発明はまた、がんまたは腫瘍を治療または予防するための薬学的な組成物または剤を製造するための方法または工程であって、以下の中より選択される有効成分を薬学的にまたは生理学的に許容される担体と混合する段階を含む、方法または工程を提供する：
（ａ）本発明のペプチド；
（ｂ）本明細書に開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードする核酸；
（ｃ）本発明のペプチドを自身の表面上に提示するＡＰＣまたはエキソソーム；および
（ｄ）本発明のＣＴＬ。
【００８４】
あるいは、本発明の薬学的な組成物または剤は、がんまたは腫瘍の予防および術後のその再発の予防のいずれかまたは双方に用いることができる。
【００８５】
本発明の薬学的な剤または組成物は、ワクチンとして使用される。本発明の文脈において、「ワクチン」（「免疫原性組成物」とも称される）という語句は、動物に接種した際に、抗腫瘍免疫を誘導する機能を有する物質を指す。
【００８６】
本発明の薬学的な剤または組成物は、ヒト、ならびに非限定的にマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、サル、ヒヒ、およびチンパンジー、特に商業的に重要な動物または家畜を含む任意の他の哺乳動物を含む、対象または患者において、がんもしくは腫瘍を治療および／もしくは予防するため、ならびに／または術後のその再発を予防するために用いることができる。
【００８７】
本発明により、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、１６、１７、３０、３１、３４、３６、３７、４０、４１、４５、４９、５５、５７および６１の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドは、それぞれ、強力かつ特異的な免疫応答を誘導し得るＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープペプチドまたは候補であることが判明している。従って、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、１６、１７、３０、３１、３４、３６、３７、４０、４１、４５、４９、５５、５７および６１のアミノ酸配列を有するこれらのペプチドのいずれかを含む本薬学的な剤は、ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２である対象に投与するのに特に適している。特に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、１６および１７のアミノ酸配列を有するペプチドを含有する剤は、ＨＬＡ−Ａ２４型の対象に投与するのに適しており、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、３１、３４、３６、３７、４０、４１、４５、４９、５５、５７および６１のアミノ酸配列を有するペプチドを含有する剤は、ＨＬＡ−Ａ２型の対象に投与するのに適している。同じことが、これらのペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド（すなわち本発明のポリヌクレオチド）を含む薬学的な剤および組成物にも当てはまる。
【００８８】
本発明の薬学的な剤または組成物によって治療されるがんまたは腫瘍は限定されず、これには、ＷＤＲＰＵＨが関与するすべての種類のがんまたは腫瘍、例えば肝細胞癌が含まれる。
【００８９】
本薬学的な剤または組成物は、前述の有効成分に加えて、がん性細胞に対するＣＴＬを誘導する能力を有するその他のペプチド、該その他のペプチドをコードするその他のポリヌクレオチド、該その他のペプチドを提示するその他の細胞等を含み得る。本明細書において、がん性細胞に対するＣＴＬを誘導する能力を有するその他のペプチドは、がん特異的抗原（例えば、同定されたＴＡＡ）によって例証されるが、これに限定されない。
【００９０】
必要に応じて、本発明の薬学的な剤または組成物は、例えば本発明のペプチドのいずれかといった有効成分の抗腫瘍効果をその他の治療物質が阻害しない限り、有効成分として該その他の治療物質を任意に含み得る。例えば、製剤は、抗炎症剤、鎮痛剤、化学療法剤等を含み得る。医薬自体に他の治療物質を含めることに加えて、本発明の医薬を、１つまたは複数の他の薬理学的な剤と連続してまたは同時に投与することもできる。医薬および薬理学的な剤の量は、例えば、使用される薬理学的な剤の種類、治療する疾患、ならびに投与のスケジュールおよび投与経路に依存する。
【００９１】
本明細書において特に言及される成分に加えて、本発明の薬学的な剤または組成物は、問題の製剤の種類を考慮して、当技術分野において慣例的な他の剤も含み得ることが理解されるべきである。
【００９２】
本発明の１つの態様において、本薬学的な剤または組成物を、例えばがんのような治療されるべき疾患の病態を治療するのに有用な材料を含む製品およびキットに含めることができる。該製品は、ラベルを貼った、本薬学的な剤のいずれかの容器を含み得る。適切な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。該容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。容器上のラベルには、剤または組成物が、疾患の１つまたは複数の状態の治療または予防のために用いられることが示されるべきである。ラベルはまた、投与等に関する指示も示し得る。
【００９３】
上記の容器に加えて、本発明の薬学的な剤または組成物を含むキットは、任意で、薬学的に許容される希釈剤を収容した第２の容器をさらに含み得る。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、シリンジ、および、使用説明書を備えた添付文書を含む、商業上および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
【００９４】
必要に応じて、有効成分を含む１つまたは複数の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置にて、薬学的な剤または組成物を提供することができる。該パックは、例えば、ブリスターパックのように金属またはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、投与に関する指示書が添付され得る。
【００９５】
（１）有効成分としてペプチドを含む薬学的な剤または組成物
本発明のペプチドは、薬学的な剤もしくは組成物として直接投与することができ、または必要であれば、従来の製剤方法によって製剤化される。後者の場合、本発明のペプチドに加えて、薬物に通常用いられる担体、賦形剤等が特定の制限なく適宜含まれ得る。そのような担体の例は、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液等である。さらに、薬学的な剤または組成物は、必要に応じて、安定剤、懸濁液、保存剤、界面活性剤等を含み得る。本発明の薬学的な剤または組成物は、抗がん目的に用いることができる。
【００９６】
インビボでＣＴＬを誘導するために、本発明のペプチドを、本発明のペプチドの２種またはそれ以上から構成される組み合わせとして調製することができる。ペプチドの組み合わせはカクテルの形態をとってよく、または標準的な技法を用いて互いにコンジュゲートしてもよい。例えば、該ペプチドを化学的に結合させても、または単一の融合ポリペプチド配列として発現させてもよい。組み合わせにおけるペプチドは、同一であっても異なっていてもよい。本発明のペプチドを投与することによって、該ペプチドはＨＬＡ抗原によってＡＰＣ上に高密度で提示され、次いで、提示されたペプチドと該ＨＬＡ抗原との間で形成された複合体に対して特異的に反応するＣＴＬが誘導される。あるいは、対象由来のＡＰＣ（例えば、ＤＣ）を本発明のペプチドで刺激することによって得られ得る、本発明のペプチドのいずれかを自身の細胞表面上に提示するＡＰＣを対象に投与してもよく、結果として、対象においてＣＴＬが誘導され、がん細胞に対する攻撃性を増大させることができる。
【００９７】
有効成分として本発明のペプチドを含む、がんまたは腫瘍の治療および／または予防のための薬学的な剤または組成物は、効率的に細胞性免疫を確立することが知られているアジュバントもまた含み得る。あるいは、薬学的な剤または組成物は、他の有効成分と共に投与することができ、または顆粒内への製剤化によって投与することもできる。アジュバントとは、免疫学的活性を有するタンパク質と共に（または連続して）投与した場合に、該タンパク質に対する免疫応答を増強させる化合物を指す。本明細書において意図されるアジュバントには、文献（Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89）に記載されているものが含まれる。適切なアジュバントの例には、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバン、コレラ毒素、サルモネラ毒素等が含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】
さらに、リポソーム製剤、直径数マイクロメートルのビーズにペプチドが結合している顆粒製剤、およびペプチドに脂質が結合している製剤を好都合に用いてもよい。
【００９９】
いくつかの態様において、本発明の薬学的な剤または組成物は、ＣＴＬを刺激する（ｐｒｉｍｅ）成分をさらに含み得る。脂質は、ウイルス抗原に対してインビボでＣＴＬを刺激し得る剤として同定された。例えば、パルミチン酸残基をリジン残基のεアミノ基およびαアミノ基に付着させ、次に本発明のペプチドに連結させることができる。次いで、脂質付加したペプチドを、ミセルもしくは粒子の状態で直接投与すること、リポソーム中に取り込ませること、またはアジュバント中に乳化させることができる。ＣＴＬ応答の脂質による刺激の別の例として、適切なペプチドに共有結合している場合、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リポタンパク質を用いてＣＴＬを刺激することができる（例えば、Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4を参照されたい）。
【０１００】
投与方法は、経口、皮内、皮下、静脈内注射等、および全身投与または標的部位の近傍への局所投与であってよい。投与は、単回投与によって行うこともできるし、または複数回投与によって強化することもできる。本発明のペプチドの用量を、治療する疾患、患者の年齢、体重、投与方法等に従って適切に調節することができ、これは通常０.００１ ｍｇ〜１０００ ｍｇ、例えば０.００１ ｍｇ〜１０００ ｍｇ、例えば０.１ ｍｇ〜１０ ｍｇであり、数日から数ヶ月に１度投与することができる。当業者は、好適な用量を適切に選択することができる。
【０１０１】
（２）有効成分としてポリヌクレオチドを含む薬学的な剤または組成物
本発明の薬学的な剤または組成物はまた、本明細書に開示するペプチドをコードする核酸を発現可能な形態で含み得る。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、ポリヌクレオチドが、細胞内に導入された場合に、抗腫瘍免疫を誘導するポリペプチドとしてインビボで発現され得ることを意味する。例示的な態様において、関心対象のポリヌクレオチドの核酸配列は、該ポリヌクレオチドの発現に必要な調節エレメントを含む。ポリヌクレオチドには、標的細胞のゲノム中への安定的な組み込みが達成されるように、必要なものを備えさせることができる（相同組換えカセットベクターの説明に関しては、例えばThomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい）。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8；米国特許第５,５８０,８５９号；第５,５８９,４６６号；第５,８０４,５６６号；第５,７３９,１１８号；第５,７３６,５２４号；第５,６７９,６４７号；およびＷＯ９８／０４７２０を参照されたい。ＤＮＡに基づく送達技術の例には、「裸のＤＮＡ」、促進された（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性（「遺伝子銃」）または圧力媒介性の送達が含まれる（例えば、米国特許第５,９２２,６８７号を参照されたい）。
【０１０２】
ウイルスベクターまたは細菌ベクターによって、本発明のペプチドを発現させることもできる。発現ベクターの例には、ワクシニアウイルスまたは鶏痘ウイルスなどの弱毒化ウイルス宿主が含まれる。このアプローチは、例えば、ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとして、ワクシニアウイルスの使用を伴う。宿主内に導入すると、組換えワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、それによって免疫応答を誘発する。免疫化プロトコールに有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば米国特許第４,７２２,８４８号に記載されている。別のベクターはＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記載されている。治療的投与または免疫化に有用である多種多様な他のベクター、例えばアデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）ベクター、無毒化炭疽毒素ベクター等が明らかであろう。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71;Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806;Hipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。
【０１０３】
ポリヌクレオチドの対象内への送達は、直接的であってもよいし（この場合、ポリヌクレオチドを保有するベクターに対象を直接曝露する）、または間接的であってもよい（この場合、まずインビトロで細胞を関心対象のポリヌクレオチドで形質転換し、次いで該細胞を対象内に移植する）。これら２つのアプローチはそれぞれ、インビボおよびエクスビボの遺伝子治療として公知である。
【０１０４】
遺伝子治療の方法の一般的な総説に関しては、Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505;Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95;Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96;Mulligan, Science 1993, 260: 926-32;Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217;Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215を参照されたい。本発明にも用いることのできる、組換えＤＮＡ技術の分野において一般に公知の方法は、eds. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993;およびKrieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990に記載されている。
【０１０５】
投与方法は、経口、皮内、皮下、静脈内注射等であってよく、全身投与または標的部位の近傍への局所投与が用いられる。投与は、単回投与によって行うこともできるし、または複数回投与によって強化することもできる。適切な担体中のポリヌクレオチドの用量、または本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換した細胞の用量を、治療する疾患、患者の年齢、体重、投与方法等に従って適切に調節することができ、これは通常０.００１ ｍｇ〜１０００ ｍｇ、例えば０.００１ ｍｇ〜１０００ ｍｇ、例えば０.１ ｍｇ〜１０ ｍｇであり、数日に１度〜数ヶ月に１度投与することができる。当業者は、好適な用量を適切に選択することができる。
【０１０６】
Ｘ．ペプチド、エキソソーム、ＡＰＣ、およびＣＴＬを用いる方法
ＡＰＣおよびＣＴＬを誘導するために、本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドを用いることができる。ＣＴＬを誘導するために、本発明のエキソソームおよびＡＰＣを用いることもできる。ペプチド、ポリヌクレオチド、エキソソーム、およびＡＰＣは、任意の他の化合物がそれらのＣＴＬ誘導能を阻害しない限り、該化合物と組み合わせて用いることができる。従って、前述の本発明の薬学的な剤または組成物のいずれかをＣＴＬを誘導するために用いることができ、それに加えて、前記ペプチドおよびポリヌクレオチドを含むものを、以下に議論されるように、ＡＰＣを誘導するために用いることもできる。
【０１０７】
（１）抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導する方法
本発明は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを用いて、高いＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導する方法を提供する。
本発明の方法は、ＡＰＣを本発明のペプチドとインビトロ、エクスビボ、またはインビボで接触させる段階を含む。例えば、ＡＰＣを該ペプチドとエクスビボで接触させる方法は、以下の段階を含み得る：
ａ：対象からＡＰＣを回収する段階；および
ｂ：段階ａのＡＰＣを前記ペプチドと接触させる段階。
【０１０８】
前記ＡＰＣは特定の種類の細胞に限定されず、これには、リンパ球によって認識されるように自身の細胞表面上にタンパク質性抗原を提示することが知られているＤＣ、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および活性化Ｔ細胞が含まれる。ＤＣはＡＰＣの中で最も強力なＣＴＬ誘導能を有するため、ＤＣを用い得ることが好ましい。本発明の任意のペプチドを単独で、または本発明の他のペプチドと共に用いることができる。
【０１０９】
あるいは、本発明のペプチドをＡＰＣとインビボで接触させ、結果として対象の体内で高いＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導するように、本発明のペプチドを対象に投与することによって、ＡＰＣを誘導することができる。従って、本発明はまた、ＡＰＣを誘導するために本発明のペプチドを対象に投与することを意図する。別の方法として、本発明のポリヌクレオチドを発現可能な形態で対象に投与して、本発明のペプチドを発現させ、該ペプチドをＡＰＣとインビボで接触させてもよい。本発明のペプチドの投与と同様に、高いＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣが該対象の体内で誘導される。従って、本発明はまた、ＡＰＣを誘導するために本発明のポリヌクレオチドを対象に投与することを意図する。「発現可能な形態」という語句の説明については、「ＩＸ．薬学的な剤 （２）有効成分としてポリヌクレオチドを含む薬学的な剤」の章を参照されたい。
【０１１０】
さらに、本発明はまた、ＣＴＬ誘導能を有するＡＰＣを誘導するために、本発明のポリペプチドをＡＰＣに導入することを意図する。例えば、本方法は以下の段階を含み得る：
ａ：対象からＡＰＣを回収する段階；および
ｂ：本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを、回収したＡＰＣに導入する段階。
段階ｂは、「ＶＩ．抗原提示細胞」の章に上記したように行うことができる。
【０１１１】
（２）ＣＴＬを誘導する方法
さらに本発明は、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、またはエキソソームもしくはＡＰＣを用いてＣＴＬを誘導するための方法を提供する。
本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ＡＰＣ、またはエキソソームを対象に投与すると、該対象の体内でＣＴＬが誘導されて、がん細胞を標的とする免疫応答が強化される。従って、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、ＡＰＣ、またはエキソソームを対象に投与する段階を含み得る、ＣＴＬを誘導するための方法を提供することは、本発明の別の目的である。
あるいは、ＣＴＬをエクスビボで誘導することもでき、誘導後に活性化ＣＴＬを対象に戻してもよい。例えば、本方法は以下の段階を含み得る：
ａ：対象からＡＰＣを回収する段階；
ｂ：段階ａのＡＰＣを本発明のペプチドと接触させる段階；および
ｃ：段階ｂのＡＰＣをＣＤ８陽性細胞と共培養する段階。
【０１１２】
上記の段階ｃにおいてＣＤ８陽性細胞と共培養するＡＰＣは、「ＶＩ．抗原提示細胞」の章で上記したように、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入することによって調製することもできるが、これに限定されず、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に効率的に提示する任意のＡＰＣを本方法に用いることができる。
そのようなＡＰＣの代わりに、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームを用いてもよい。すなわち、ＣＴＬを誘導するための本発明の方法は、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を自身の表面上に提示するエキソソームを共培養する段階を含み得る。そのようなエキソソームは、「Ｖ．エキソソーム」の章で上記した方法によって調製することができる。
さらに、本発明のペプチドに結合するＴＣＲサブユニットをコードするポリヌクレオチドをＣＤ８陽性細胞に導入することによって、ＣＴＬを誘導することができる。そのような形質導入は、「ＶＩＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」の章で上記したように行うことができる。
【０１１３】
（３）免疫応答を誘導する方法
本発明はさらに、対象においてがんに対する免疫応答を誘導するための方法を提供する。本方法は、以下を含む本発明のワクチンの投与を含む：
（ａ）本発明の１種もしくは複数種のペプチド、または免疫学的に活性のあるその断片；
（ｂ）（ａ）のペプチドもしくは免疫学的に活性のある断片をコードする１種もしくは複数種のポリヌクレオチド；
（ｃ）本発明の１種もしくは複数種の単離されたＣＴＬ；または
（ｄ）本発明の１種もしくは複数種の単離された抗原提示細胞。
【０１１４】
本発明において、ＷＤＲＰＵＨを過剰発現しているがんをこれらの有効成分を用いて治療することができる。従って、該有効成分を含むワクチンまたは薬学的組成物を投与する前に、治療すべきがん細胞または組織におけるＷＤＲＰＵＨの発現レベルが同じ器官の正常細胞と比較して増強されているかどうかを確認することが好ましい。従って１つの態様において、本発明は、以下の段階を含み得る、ＷＤＲＰＵＨを発現しているがんを治療するための方法を提供する：
ｉ）治療すべきがんを有する対象から得られたがん細胞または組織において、ＷＤＲＰＵＨの発現レベルを決定する段階；
ｉｉ）ＷＤＲＰＵＨの発現レベルを正常対照と比較する段階；および
ｉｉｉ）上記の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分を、正常対照と比較してＷＤＲＰＵＨを過剰発現しているがんを有する対象に投与する段階。
【０１１５】
あるいは、本発明はまた、ＷＤＲＰＵＨを過剰発現しているがんを有する対象への投与において用いるための、上記の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含むワクチンまたは薬学的組成物を提供する。換言すれば、本発明はさらに、対象由来のがん細胞または組織におけるＷＤＲＰＵＨの発現レベルを決定する段階を含み得る、本発明のＷＤＲＰＵＨポリペプチドを用いて治療すべき対象を同定するための方法であって、該レベルが該遺伝子の正常対照レベルと比較して上昇していることにより、対象が本発明のＷＤＲＰＵＨポリペプチドを用いて治療され得るがんを有することが示される、方法を提供する。本発明のがんを治療する方法を、以下でより詳細に説明する。
本方法によって治療すべき対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えばヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１６】
本発明に従って、対象から得られたがん細胞または組織におけるＷＤＲＰＵＨの発現レベルを決定する。発現レベルは、当技術分野で公知の方法を用いて、転写（核酸）産物レベルで決定することができる。例えば、ＷＤＲＰＵＨのｍＲＮＡを、ハイブリダイゼーション法（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション）によってプローブを用いて定量することができる。検出は、チップまたはアレイ上で行うことができる。アレイの使用は、ＷＤＲＰＵＨの発現レベルを検出するのに好ましい。当業者は、ＷＤＲＰＵＨの配列情報を使用して、そのようなプローブを調製することができる。例えば、ＷＤＲＰＵＨのｃＤＮＡをプローブとして用いることができる。必要に応じて、プローブを、色素、蛍光物質、および同位体などの適切な標識を用いて標識してもよく、該遺伝子の発現レベルをハイブリダイズした標識の強度として検出してもよい。
さらに、プライマーを用いて、増幅に基づく検出法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）により、ＷＤＲＰＵＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）の転写産物を定量してもよい。そのようなプライマーもまた、該遺伝子の入手可能な配列情報に基づいて調製することができる。
【０１１７】
具体的には、本方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下、中程度にストリンジェントな条件下、または低ストリンジェントな条件下で、ＷＤＲＰＵＨのｍＲＮＡとハイブリダイズする。本明細書で使用する「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが、その他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列に依存し、異なる状況下では異なる。より長い配列の特異的なハイブリダイゼーションは、より短い配列よりも高い温度で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、平衡状態で、標的配列に相補的なプローブの５０％が標的配列とハイブリダイズする（規定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度における）温度である。標的配列は一般に過剰に存在するため、Ｔｍでは、平衡状態でプローブの５０％が占有される。典型的には、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ７．０〜８．３において塩濃度が約１．０ Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には約０．０１〜１．０ Ｍのナトリウムイオン（または他の塩）であり、かつ温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に関しては少なくとも約３０℃、およびより長いプローブまたはプライマーに関しては少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成してもよい。
【０１１８】
あるいは、本発明の診断のために翻訳産物を検出することもできる。例えば、ＷＤＲＰＵＨタンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）の量を決定することができる。翻訳産物としてタンパク質の量を決定するための方法には、該タンパク質を特異的に認識する抗体を用いる免疫測定法が含まれる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片または改変抗体がＷＤＲＰＵＨタンパク質への結合能を保持する限り、抗体の任意の断片または改変物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）を検出に用いることもできる。タンパク質を検出するためのこれらの種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、本発明において任意の方法を使用して、そのような抗体およびその等価物を調製することができる。ＷＤＲＰＵＨ遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出する別の方法として、ＷＤＲＰＵＨタンパク質に対する抗体を用いた免疫組織化学的解析により、染色強度を観察してもよい。すなわち、強力な染色が観察されることにより、該タンパク質の存在の増加が示され、それと同時にＷＤＲＰＵＨ遺伝子の高い発現レベルが示される。
【０１１９】
がん細胞におけるＷＤＲＰＵＨ遺伝子を含む標的遺伝子の発現レベルは、それが、対応する標的遺伝子の対照レベルから例えば１０％、２５％、もしくは５０％増加しているか、または１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、もしくはそれ以上まで増加している場合に、増加していると見なすことができる。
対照レベルは、疾患状態（がん性であるかまたは非がん性であるか）がわかっている対象から予め回収し保存しておいた試料を用いることにより、がん細胞と同時に決定することができる。加えて、治療すべきがんを有する器官の非がん性領域から得られた正常細胞を、正常対照として用いてもよい。あるいは、対照レベルは、疾患状態がわかっている対象由来の試料中のＷＤＲＰＵＨ遺伝子の予め決定された発現レベルを解析することによって得られた結果に基づいて、統計的方法により決定してもよい。さらに、対照レベルは、以前に試験された細胞に由来する発現パターンのデータベースであってもよい。
【０１２０】
さらに、本発明の１つの局面に従って、生物学的試料中のＷＤＲＰＵＨ遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から決定される複数の対照レベルと比較することもできる。対象由来の生物学的試料の組織型と類似の組織型に由来する参照試料から決定された対照レベルを用いることが好ましい。さらに、疾患状態が判明している集団におけるＷＤＲＰＵＨ遺伝子の発現レベルの基準値を用いることが好ましい。基準値は、当技術分野において公知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均値 ＋／− ２ Ｓ．Ｄ．または平均値 ＋／− ３ Ｓ．Ｄ．の範囲を、基準値として用いることができる。
本発明との関連において、非がん性であるとわかっている生物学的試料から決定された対照レベルは「正常対照レベル」と称される。一方、対照レベルががん性の生物学的試料から決定される場合、これは「がん性対照レベル」と称される。
ＷＤＲＰＵＨ遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比較して増加しているか、またはがん性対照レベルと類似している場合、対象は治療すべきがんを有すると診断され得る。
【０１２１】
本発明はまた、本発明のＷＤＲＰＵＨポリペプチドを用いて治療され得るがんに罹患している対象を決定するためのキットを提供し、このキットはまた、がん免疫療法の有効性を評価および／またはモニターするのにも有用であり得る。好ましくは、がんは肝細胞癌である。より具体的には、キットは、好ましくは、対象由来のがん細胞におけるＷＤＲＰＵＨ遺伝子の発現を検出するための少なくとも１つの試薬を含み、該試薬は以下の群より選択され得る：
（ａ）ＷＤＲＰＵＨ遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＷＤＲＰＵＨタンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）ＷＤＲＰＵＨタンパク質の生物学的活性を検出するための試薬。
ＷＤＲＰＵＨ遺伝子のｍＲＮＡを検出するのに適した試薬には、ＷＤＲＰＵＨ ｍＲＮＡの一部に対する相補的配列を有するオリゴヌクレオチドなどの、ＷＤＲＰＵＨ ｍＲＮＡに特異的に結合するか、またはＷＤＲＰＵＨ ｍＲＮＡを特異的に同定する核酸が含まれる。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、ＷＤＲＰＵＨ ｍＲＮＡに特異的なプライマーおよびプローブによって例証される。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、当技術分野において周知の方法に基づいて調製することができる。必要に応じて、ＷＤＲＰＵＨ ｍＲＮＡを検出するための試薬を固体マトリックス上に固定化することができる。さらに、ＷＤＲＰＵＨ ｍＲＮＡを検出するための２つ以上の試薬をキットに含めることもできる。
【０１２２】
一方、ＷＤＲＰＵＨタンパク質を検出するのに適した試薬には、ＷＤＲＰＵＨタンパク質に対する抗体が含まれる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。さらに、断片または改変抗体がＷＤＲＰＵＨタンパク質への結合能を保持する限り、抗体の任意の断片または改変物（例えば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）を試薬として用いることができる。タンパク質を検出するためのこれらの種類の抗体を調製する方法は、当技術分野において周知であり、本発明において任意の方法を使用して、そのような抗体およびその等価物を調製することができる。さらに、直接連結または間接標識技法により、抗体をシグナル生成分子で標識することができる。標識、ならびに抗体を標識する方法およびその標的に対する抗体の結合を検出する方法は当技術分野において周知であり、任意の標識および方法を本発明のために使用することができる。さらに、ＷＤＲＰＵＨタンパク質を検出するための２つ以上の試薬をキットに含めることもできる。
【０１２３】
キットは、前述の試薬のうちの２つ以上を含み得る。例えば、がんに罹患しているまたは罹患していない対象から得られた組織試料は、有用な対照試薬として役立ち得る。本発明のキットは、緩衝液、希釈液、フィルター、注射針、シリンジ、および使用説明書を備えた添付文書（例えば、書面、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ等）を含む、商業上および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。これらの試薬などは、ラベルを貼った容器中に保持され得る。適切な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。
【０１２４】
本発明の１つの態様として、試薬がＷＤＲＰＵＨ ｍＲＮＡに対するプローブである場合には、該試薬を多孔性ストリップなどの固体マトリックス上に固定化して、少なくとも１つの検出部位を形成させることができる。多孔性ストリップの測定または検出領域は、それぞれが核酸（プローブ）を含む複数の部位を含み得る。テストストリップはまた、陰性および／または陽性対照用の部位を含み得る。あるいは、対照部位は、テストストリップとは別のストリップ上に位置してもよい。任意で、異なる検出部位は異なる量の固定化された核酸を含んでよい、すなわち、第１検出部位にはより大量を、およびその後の部位にはより少量を含んでよい。試験試料を添加すると、検出可能なシグナルを呈する部位の数により、試料中に存在するＷＤＲＰＵＨ ｍＲＮＡの量の定量的指標が提供される。検出部位は、適切に検出することができる任意の形状で構成することができ、典型的には、テストストリップ幅にわたるバーまたはドットの形状である。
本発明のキットは、陽性対照試料またはＷＤＲＰＵＨ標準試料をさらに含み得る。本発明の陽性対照試料は、ＷＤＲＰＵＨ陽性試料を回収することによって調製することができ、次にそれらのＷＤＲＰＵＨレベルをアッセイする。あるいは、精製ＷＤＲＰＵＨタンパク質またはポリヌクレオチドを、ＷＤＲＰＵＨを発現していない細胞に添加して、陽性試料またはＷＤＲＰＵＨ標準を形成してもよい。本発明において、精製ＷＤＲＰＵＨは組換えタンパク質であってよい。陽性対照試料のＷＤＲＰＵＨレベルは、例えばカットオフ値よりも高い。
【０１２５】
以下の実施例は、本発明を例証し、当業者がそれを作製および使用するのを補助するために提供される。実施例は、いかなる形であれ他の方法で本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１２６】
材料および方法
細胞株
ＨＬＡ−Ａ２４陽性ヒトＢリンパ球をエプスタイン・バーウイルスで形質転換することによって、Ａ２４リンパ芽球様細胞株（Ａ２４ＬＣＬ）を樹立した。Ｔ２（ＨＬＡ−Ａ２）、アフリカミドリザル腎細胞株であるＣＯＳ７は、ＡＴＣＣから購入した。
【０１２７】
ＷＤＲＰＵＨ由来のペプチドの候補選択
ＨＬＡ−Ａ*２４０２およびＨＬＡ−Ａ*０２０１分子に結合するＷＤＲＰＵＨ由来の９−ｍｅｒおよび１０−ｍｅｒのペプチドを、結合予測ソフトウェア「ＢＩＭＡＳ」（http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind）（Parker et al.(J Immunol 1994, 152(1): 163-75)、Kuzushima et al.(Blood 2001, 98(6): 1872-81)）を用いて予測した。これらのペプチドを、標準的な固相合成法に従ってＳｉｇｍａ（札幌、日本）またはＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｉｎｃ．（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸ）によって合成し、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。該ペプチドの純度（＞９０％）および同一性を、それぞれ分析用ＨＰＬＣおよび質量分析によって測定した。ペプチドをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に２０ ｍｇ／ｍｌで溶解し、−８０℃で保存した。
【０１２８】
インビトロでのＣＴＬ誘導
単球由来の樹状細胞（ＤＣ）を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用いて、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）上に提示されたペプチドに対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘導した。他所に記載されているように、ＤＣをインビトロで作製した（Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8）。具体的には、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）溶液によって健常なボランティア（ＨＬＡ−Ａ*２４０２陽性およびＨＬＡ−Ａ*０２０１陽性）から単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、プラスチック製の組織培養ディッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）へ付着させることによって分離し、それらを単球画分として濃縮した。２％の加熱非働化した自己血清（ＡＳ）を含むＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、１０００ Ｕ／ｍｌの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）および１０００ Ｕ／ｍｌのインターロイキン（ＩＬ）−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）の存在下で、単球が濃縮した集団を培養した。培養７日後、サイトカインで誘導したＤＣに、ＡＩＭ−Ｖ培地中で３時間、３７℃にて、３ マイクログラム／ｍｌのβ２−ミクログロブリンの存在下で２０ マイクログラム／ｍｌの各合成ペプチドをパルスした。作製した細胞は、その細胞表面上に、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＨＬＡクラスＩＩなどのＤＣ関連分子を発現しているようであった（データは示さず）。
【０１２９】
次いで、ペプチドパルスしたこれらのＤＣを、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）（３０ マイクログラム／ｍｌで３０分間）またはＸ線照射（２０Ｇｙ）で不活化し、ＣＤ８ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｄｙｎａｌ）を用いた陽性選択によって得られた自己ＣＤ８＋ Ｔ細胞と１：２０の比率で混合した。これらの培養物を４８ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に準備した；各ウェルは、０．５ ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／２％ ＡＳ培地中に、１．５×１０４個のペプチドパルスしたＤＣ、３×１０５個のＣＤ８＋ Ｔ細胞、および１０ ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を含んだ。３日後、これらの培養物に、ＩＬ−２（ＣＨＩＲＯＮ）を最終濃度２０ ＩＵ／ｍｌまで補充した。７日目および１４日目に、ペプチドパルスした自己ＤＣで該Ｔ細胞をさらに刺激した。該ＤＣは上記と同じステップに従って、毎回調製した。２１日目に、３回目のペプチド刺激後、ペプチドパルスしたＡ２４ＬＣＬまたはＴ２細胞に対してＣＴＬを試験した（Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86; Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【０１３０】
ＣＴＬ増殖手順
Riddellら(Walter EA et al., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): 1038-44;Riddell SR et al., Nat Med 1996 Feb, 2(2): 216-23)によって記載されている方法と類似の方法を用いて、ＣＴＬを培養液中で増殖させた。４０ ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下で、マイトマイシンＣによって不活化した２種類のヒトＢリンパ芽球様細胞株と共に、合計５×１０４個のＣＴＬを２５ ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／５％ ＡＳ培地中に懸濁した。培養開始１日後に、１２０ ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を該培養物に添加した。５、８、および１１日目に、３０ ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む新たなＡＩＭ−Ｖ／５％ ＡＳ培地を、該培養物に供給した（Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9;Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7;Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86;Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9;Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【０１３１】
ＣＴＬクローンの樹立
９６丸底マイクロタイタープレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）において０．３個、１個、および３個のＣＴＬ／ウェルとなるように、希釈を行った。ＣＴＬを、１×１０４個細胞／ウェルの２種類のヒトＢリンパ芽球様細胞株、３０ ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体、および１２５ Ｕ／ｍｌのＩＬ−２と共に、合計１５０μｌ／ウェルの５％ＡＳ含有ＡＩＭ−Ｖ培地中で培養した。１０日後、５０μｌ／ウェルのＩＬ−２を、１２５ Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の最終濃度に到達するように培地に添加した。１４日目にＣＴＬ活性を試験し、上記と同じ方法を用いてＣＴＬクローンを増殖させた(Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86；Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9；Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506)。
【０１３２】
特異的ＣＴＬ活性
特異的ＣＴＬ活性を調べるために、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイおよびＩＦＮ−γ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行った。具体的には、ペプチドパルスしたＡ２４ＬＣＬ（１×１０４／ウェル）またはＴ２（１×１０４個／ウェル）を刺激細胞として調製した。４８ウェル中の培養細胞を応答細胞として使用した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイは、製造業者の推奨する手順に従って行った。
【０１３３】
プラスミドのトランスフェクション
標的遺伝子、ＨＬＡ−Ａ２４、およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１のオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。標的遺伝子およびＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１のＰＣＲ増幅産物をｐＩＲＥＳベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．、カタログ番号６３１６０５）にクローニングした。製造業者の推奨する手順に従ってリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、標的遺伝子およびＨＬＡ−Ａ２４のヌル細胞株であるＣＯＳ７に前記プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションから２日後、トランスフェクトした細胞をベルセン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で収集し、ＣＴＬ活性アッセイのための標的細胞（５×１０４個細胞／ウェル）として使用した。
【０１３４】
結果
ＷＤＲＰＵＨ由来のＨＬＡ−Ａ２４およびＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドの予測
表１は、ＷＤＲＰＵＨのＨＬＡ−Ａ２４結合ペプチドを、結合親和性の高い順に示す。潜在的なＨＬＡ−Ａ２４結合能を有する合計２５種類のペプチドを選択し、エピトープペプチドを決定するために調べた（表１）。表２は、ＷＤＲＰＵＨのＨＬＡ−Ａ２結合性の９ｍｅｒおよび１０ｍｅｒペプチドを、結合親和性の高い順に示す。潜在的なＨＬＡ−Ａ２結合能を有する合計３７種類のペプチドを選択し、エピトープペプチドを決定するために調べた（表２）。
【０１３５】
（表１）ＢＩＭＡＳによって予測されたＷＤＲＰＵＨ由来のＨＬＡ−Ａ２４結合ペプチド
0005764823.tif 000006
開始位置は、ＷＤＲＰＵＨのＮ末端からのアミノ酸残基の数を示す。
結合スコアは「ＢＩＭＡＳ」から導き出している。
【０１３６】
（表２）ＢＩＭＡＳによって予測されたＷＤＲＰＵＨ由来のＨＬＡ−Ａ２結合ペプチド
0005764823.tif 000007
開始位置は、ＷＤＲＰＵＨのＮ末端からのアミノ酸残基の数を示す。
結合スコアは「ＢＩＭＡＳ」から導き出している。
【０１３７】
ＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性のＷＤＲＰＵＨ由来の予測ペプチドを用いたＣＴＬの誘導、およびＷＤＲＰＵＨ由来ペプチドで刺激したＣＴＬ株の樹立
ＷＤＲＰＵＨ由来のこれらのペプチドに対するＣＴＬを、「材料および方法」に記載したプロトコールに従って作製した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、ペプチド特異的なＣＴＬ活性を測定した（図１ａ〜ｆ）。それにより、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−９−４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）で刺激した＃３および＃６（ａ）、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−９−３１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）で刺激した＃８（ｂ）、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−９−５０９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）で刺激した＃２および＃６（ｃ）、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−９−３３９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）で刺激した＃１、＃２、および＃５（ｄ）、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−１０−４０９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）で刺激した＃２、＃３、＃４、＃６、＃７、および＃８（ｅ）、ならびにＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−１０−４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）で刺激した＃５、＃６、および＃８（ｆ）が、対照ウェルと比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示すことが示された。
【０１３８】
さらに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で刺激した陽性ウェル番号＃６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で刺激した陽性ウェル番号＃８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で刺激した陽性ウェル番号＃２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で刺激した陽性ウェル番号＃５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で刺激した陽性ウェル番号＃４、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７で刺激した陽性ウェル番号＃６中の細胞を増殖させ、ＣＴＬ株として樹立した。これらのＣＴＬ株のＣＴＬ活性を、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した（図２ａ〜ｆ）。すべてのＣＴＬ株が、ペプチドをパルスしなかった標的細胞と比較して、対応するペプチドをパルスした標的細胞に対して強力なＩＦＮ−γ産生を示した。一方、表１に示した他のペプチドはＨＬＡ−Ａ＊２４０２との結合活性を有すると予測された事実にもかかわらず、該ペプチドによる刺激によってＣＴＬ株は樹立され得なかった（データは示さず）。結果として、ＷＤＲＰＵＨ由来の６種のペプチドが、強力なＣＴＬ株を誘導し得るペプチドとしてスクリーニングされた。
【０１３９】
ＷＤＲＰＵＨおよびＨＬＡ−Ａ＊２４０２を外因的に発現している標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性
本発明のペプチドに対して産生された樹立ＣＴＬ株を、ＷＤＲＰＵＨおよびＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子を内因的に発現している標的細胞を認識する能力について調べた。全長ＷＤＲＰＵＨおよびＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子遺伝子の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞（ＷＤＲＰＵＨおよびＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子を外因的に発現している標的細胞の特定のモデル）に対する特異的ＣＴＬ活性を、対応するペプチドによって産生されたＣＴＬ株をエフェクター細胞として用いて試験した。全長ＷＤＲＰＵＨまたはＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子のいずれかをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した。図３において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で刺激したＣＴＬは、ＷＤＲＰＵＨおよびＨＬＡ−Ａ＊２４０２の両方を発現しているＣＯＳ７細胞に対して強力なＣＴＬ活性を示した。対照的に、対照に対しては有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。従ってこれらのデータにより、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−９−３１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）が天然で処理され、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子と共に標的細胞の表面上に提示され、ＣＴＬによって認識されたことが明確に実証される。これらの結果から、ＷＤＲＰＵＨに由来するこのペプチドが、ＷＤＲＰＵＨを発現している腫瘍を有する患者に対してがんワクチンとして適用できる可能性があることが示された。
【０１４０】
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性のＷＤＲＰＵＨ由来の予測ペプチドを用いたＣＴＬの誘導
ＷＤＲＰＵＨ由来のペプチドを認識するＣＴＬを、「材料および方法」に記載したプロトコールに従って作製した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、ペプチド特異的なＣＴＬ活性を測定した（図４ａ〜ｌ）。ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−９−３９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）で刺激したウェル番号＃２および＃７（ａ）、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−９−４０７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）で刺激した＃２（ｂ）、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−９−２８８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）で刺激した＃３（ｃ）、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−９−２３７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）で刺激した＃６（ｄ）、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−９−５４３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）で刺激した＃４（ｅ）、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−１０−５７０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）で刺激した＃４（ｆ）、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−１０−２６３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）で刺激した＃２および＃８（ｇ）、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−１０−７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）で刺激した＃５（ｈ）、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−１０−１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）で刺激した＃２（ｉ）、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−１０−４１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５）で刺激した＃６（ｊ）、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−１０−２８７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）で刺激した＃７（ｋ）、ならびにＷＤＲＰＵＨ−Ａ２−１０−２６５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１）で刺激した＃６（ｌ）が、対照ウェルと比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示した。一方、表２に示した他のペプチドはＨＬＡ−Ａ＊０２０１との結合活性を有すると予測された事実にもかかわらず、これらのペプチドによる刺激によって強力なＩＦＮ−γ産生は検出され得なかった（データは示さず）。
【０１４１】
ＷＤＲＰＵＨ特異的ペプチドに対するＣＴＬ株およびクローンの樹立
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０で刺激したウェル番号＃７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４で刺激したウェル番号＃３中の、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによってペプチド特異的ＣＴＬ活性を示した細胞を増殖させ、ＣＴＬ株として樹立した。これらのＣＴＬ株のＣＴＬ活性を、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した（図５ａおよびｂ）。両方のＣＴＬ株が、ペプチドをパルスしなかった標的細胞と比較して、対応するペプチドをパルスした標的細胞に対して強力なＩＦＮ−γ産生を示した。さらに、ＣＴＬ株から限界希釈することによりＣＴＬクローンを樹立し、対応するペプチドをパルスした標的細胞に対するＣＴＬクローンからのＩＦＮ−γ産生を、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。図５ｃおよびｄにおいて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４で刺激したＣＴＬクローンからの強力なＩＦＮ−γ産生が示される。
【０１４２】
ＷＤＲＰＵＨおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１を外因的に発現している標的細胞に対する特異的ＣＴＬ活性
本発明のペプチドに対して産生された樹立ＣＴＬクローンを、ＷＤＲＰＵＨおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を内因的に発現している標的細胞を認識する能力について調べた。全長ＷＤＲＰＵＨおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子遺伝子の両方をトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞（ＷＤＲＰＵＨおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子を外因的に発現している標的細胞の特定のモデル）に対する特異的ＣＴＬ活性を、対応するペプチドによって産生されたＣＴＬ株をエフェクター細胞として用いて試験した。全長ＷＤＲＰＵＨまたはＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子のいずれかをトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した。図５ｅにおいて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４で刺激したＣＴＬは、ＷＤＲＰＵＨおよびＨＬＡ−Ａ＊０２０１の両方を発現しているＣＯＳ７細胞に対して強力なＣＴＬ活性を示した。対照的に、対照に対しては有意な特異的ＣＴＬ活性は検出されなかった。これらのデータにより、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ０２−９−２８８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）が内因的に処理され、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子と共に標的細胞の表面上に提示され、ＣＴＬによって認識されたことが明確に実証される。これらの結果から、ＷＤＲＰＵＨ−Ａ０２−９−２８８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）が、ＷＤＲＰＵＨを発現している腫瘍を有する患者に対してがんワクチンとして適用できる可能性があることが示された。
【０１４３】
抗原ペプチドの相同性解析
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−９−４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−９−３１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−９−５０９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−９−３３９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−１０−４０９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−１０−４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ０２−９−３９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ０２−９−４０７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ０２−９−２８８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ０２−９−２３７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ０２−９−５４３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ０２−１０−５７０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ０２−１０−２６３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ０２−１０−７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ０２−１０−１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ０２−１０−４１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ０２−１０−２８７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）、および
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ０２−１０−２６５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１）
で刺激したＣＴＬは、有意でかつ特異的なＣＴＬ活性を示した。この結果は、これらのペプチド配列が、ヒト免疫系を感作することが知られている他の分子に由来するペプチドと相同であるという事実に起因する可能性がある。
【０１４４】
この可能性を排除するため、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）をクエリーとして用いて、これらのペプチド配列に対して相同性解析を行ったが、有意な相同性を有する配列は認められなかった。相同性解析の結果から、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−９−４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−９−３１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−９−５０９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−９−３３９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−１０−４０９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ２４−１０−４０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ０２−９−３９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ０２−９−４０７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ０２−９−２８８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ０２−９−２３７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ０２−９−５４３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ０２−１０−５７０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ０２−１０−２６３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ０２−１０−７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ０２−１０−１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ０２−１０−４１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５）、
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ０２−１０−２８７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）、および
ＷＤＲＰＵＨ−Ａ０２−１０−２６５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１）
の配列は固有のものであり、従って、本発明者らの知る限りでは、これらの分子が、ある非関連分子に対して意図しない免疫学的応答を引き起こす可能性はほとんどないことが示される。
【０１４５】
結論として、新規なＨＬＡ−Ａ２４およびＡ２エピトープペプチドが同定され、がん免疫療法に適用可能であることが実証された。
【０１４６】
産業上の利用可能性
本発明は、新規ＴＡＡ、特に強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導し、肝細胞癌などのがんのタイプに対する適用可能性を有する、ＷＤＲＰＵＨ由来の新規ＴＡＡについて記載する。このようなＴＡＡは、がんにおけるペプチドワクチン接種戦略の臨床的応用のさらなる発展を保証する。
【０１４７】
本発明は、詳細にかつその特定の態様に関して記載されているが、前述の説明は本質的に例示的かつ説明的なものであって、本発明およびその好ましい態様を説明することを意図していることが理解されるべきである。ルーチンな実験を通して、当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更および修正がなされ得ることを容易に認識するであろう。従って、本発明は、上記の説明によってではなく、添付の特許請求の範囲およびそれらの同等物によって規定されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【配列表】
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