(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲル状マイクロドロップ組成物であって、
高分子マトリックスと、
前記高分子マトリックス中に抗体を分泌する単一の抗体産生細胞と、
第１の光学的に検出可能な信号を発生する第１のリポータ粒子と、
前記第１の光学的に検出可能な信号と区別できる、第２の光学的に検出可能な信号を発生する第２のリポータ粒子と、を含み、
前記抗体産生細胞ならびに前記第１および第２のリポータ粒子は、前記高分子マトリックスによって被包され、第１および第２のリポータ粒子の１つと局在される光学的に検出可能な信号の変化が、前記抗体が第１および第２のリポータ粒子の１つに結合していることを示す、組成物。
【請求項２】
前記ゲル状マイクロドロップは、少なくとも５つの第１のリポータ粒子と、少なくとも５つの第２のリポータ粒子と、を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第１および第２のリポータ粒子は、第１および第２の細胞である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記第１および第２の細胞は、それぞれ、前記第１および第２の光学的に検出可能な信号を生成するフルオロフォアを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記第１および第２の細胞は、前記第１および第２の光学的に検出可能な信号を生成する蛍光タンパク質を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記蛍光タンパク質は、前記蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結される誘導性プロモータとを含む、発現カセットによってコードされる、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
スクリーニング方法であって、
前記抗体産生細胞を含有しない対照ゲル状マイクロドロップ組成物に比して、請求項１に記載のゲル状マイクロドロップ組成物の前記第１および第２のリポータ粒子のうちの１つと局在化される、光学的に検出可能な信号の変化を検出し、それによって前記抗体が第１および第２のリポータ粒子の１つに結合していることを示すステップを含む、方法。
【請求項８】
前記方法は、前記第１または第２の光学的に検出可能な信号に対する前記抗体の作用を検出するステップを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記方法は、第３の光学的に検出可能な標識を用いて、前記抗体を標識化するステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記変化は、前記抗体によって生成される前記第３の光学的に検出可能な信号の、前記第１または第２のリポータ粒子との共局在であり、前記抗体が前記第１または第２のリポータ粒子に結合することを示す、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１または第２のリポータ粒子は、第３の光学的に検出可能な信号を生成し、前記変化は、前記第３の光学的に検出可能な信号における変化である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法は、蛍光顕微鏡を使用して行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体を同定するステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載のゲル状マイクロドロップ組成物を生成するための方法であって、
ａ）ｉ．高分子の単量体と、
ｉｉ．抗体を分泌する細胞と、
ｉｉｉ．第１の光学的に検出可能な信号を発生する第１のリポータ粒子と、
ｉｖ．前記第１の光学的に検出可能な信号と区別できる第２の光学的に検出可能な信号を発生する第２のリポータ粒子と、を混合して、細胞含有組成物を生成するステップと、
ｂ）前記細胞含有組成物の液滴を作製するステップと、
ｃ）前記液滴の単量体を重合するステップと、を含む、方法。
【請求項１５】
前記第１および第２のリポータ粒子が細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法は、前記液滴中で前記細胞を培養するステップを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１および第２のリポータ粒子がビーズである、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（相互参照）
本特許出願は、２００８年３月４日に提出された米国仮出願第６１／０３３，４６１号の利益を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
本開示の特定の態様は、ゲル状マイクロドロップ組成物、および生物学的に活性な化合物を同定するためのスクリーニング方法におけるそれらの使用に関する。
【発明の概要】
【０００３】
ゲル状マイクロドロップ組成物を提供する。特定の実施形態において、ゲル状マイクロドロップ組成物は、高分子マトリックスと、高分子マトリックス中にエフェクタ分子を放出するエフェクタ粒子と、第１の光学的に検出可能な信号を発生する第１のリポータ粒子と、第１の光学的に検出可能な信号と区別できる第２の光学的に検出可能な信号を発生する第２のリポータ粒子とを含有し、エフェクタ粒子、ならびに該第１および第２のリポータ粒子は、高分子マトリックスによって被包される。ゲル状マイクロドロップ組成物を採用するスクリーニング方法、およびゲル状マイクロドロップ組成物を作製する方法も開示する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】本マイクロドロップ組成物およびその使用方法の特定の態様を概略的に図示する。
【図２】アガロースマイクロドロップ内の複数の粒子タイプを示す、４つの画像パネルを示す。パネル１、青色チャネル；パネル２、緑色チャネル；パネル３、赤色チャネル；パネル４、明視野。
【図３】複数のリポータとのエフェクタ細胞の共被包を示す、３つの画像パネルを示す。パネル１、明視野；パネル２、赤色チャネル；パネル３、青色チャネル。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
（定義）
「判断する」、「測定する」、「評価する」、「査定する」、および「検定する」という用語は、本明細書において、測定の任意の形態を指すように同義的に使用され、要素が存在するか否かの判断を含む。これらの用語は、定量および／または定性測定法の双方を含む。査定とは、相対的または絶対的であってもよい。「〜の存在を判断する」とは、存在する何かの量を判断する、ならびにそれが存在するか不在かを判断することを含む。
【０００６】
「接触する」という用語は、引き合わせる、または一緒にすることを意味する。これにより、第１の項目は、２つの項目が、例えば、互いに触れることによって、または同一溶液中で混合されることによって引き合される、または一緒にされる時、第２の項目と接触する。
【０００７】
「光学的に検出可能な信号」という句は、例えば、光学顕微鏡、分光光度計、蛍光顕微鏡、蛍光試料読取装置または蛍光標示式細胞分取器、３Ｄ断層撮影機、カメラ等の光検出器によって検出され得る光信号を指す。
「蛍光タンパク質」という用語は、発現が、タンパク質によって生成される蛍光信号の存在により検出され得るタンパク質を意味する。蛍光信号は、例えば、タンパク質が、特定の光波長によって励起されることが可能であり、検出可能な別の光波長を発生させる時、タンパク質によって生成される。
【０００８】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書において同義的に使用され、コードされたおよびコードされていないアミノ酸、化学的にまたは生化学的に修飾された、もしくは誘導体化されたアミノ酸、ならびに修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る、任意の長さのアミノ酸の高分子形態を指す。用語は、異種アミノ酸配列を伴う融合タンパク質、異種および相同リーダー配列を伴う融合、Ｎ末端メチオニン残基を伴うまたは伴わない融合；免疫学的にタグ付けされたタンパク質；例えば、融合パートナーとして、蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等を含む、検出可能な融合タンパク質を伴う融合タンパク質等を含む融合タンパク質を含むが、これに限定されない。ポリペプチドは、任意の大きさであってもよく、「ペプチド」という用語は、長さが８〜５０残基（例えば、８〜２０残基）であるポリペプチドを指す。
「核酸」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、単一鎖または二重鎖およびそれらの化学的修飾を包含する。「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において、同義的に使用される。
【０００９】
「作動可能に連結される」という用語は、１つの機能が他によって影響されるような単一核酸断片上の核酸配列の関連を指す。例えば、プロモータは、コード配列の発現に影響を与えることが可能である時、コード配列と作動可能に連結される（すなわち、コード配列は、プロモータの転写制御下にある）。「非連結」とは、関連する遺伝的要素が互いと密接に関連せず、１つの機能が他に影響を与えないことを指す。
本明細書で使用する際、「画像化」という用語は、ゲル状マイクロドロップから発生する光学的に検出可能な信号の存在を検出する方法を指す。画像化は、ゲル状マイクロドロップの２Ｄならびに３Ｄ画像を提供するために使用されてもよい。
プロモータに関して、「誘発される」という用語は、下流核酸配列の転写開始、ならびに非誘発状態と比較して、既に転写された下流核酸配列の転写速度の増加の双方を包含するように意図される。
【００１０】
「構築物」という用語は、特定のヌクレオチド配列の発現目的のために生成された、組換え核酸配列、一般的には、組換えＤＮＡを指すか、または他の組換えヌクレオチド配列の構築に使用される。構築物は、ベクターまたはゲノムに存在する場合がある。
「組換え」という用語は、宿主細胞で自然に発生しないポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。組換え分子は、自然に発生しない方法で一緒に連結される２つ以上の自然に発生する配列を含んでもよい。組換え細胞は、組換えポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む。
「選択マーカ」という用語は、導入された核酸またはベクターを含むこれらの宿主の選択を容易にさせる宿主で発現できるタンパク質を指す。選択マーカの例は、抗菌物質（例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、またはクロラムフェニコール）に抵抗性を与えるタンパク質、宿主細胞への栄養効果等、代謝効果を与えるタンパク質、ならびに細胞に機能性または表現型効果（例えば、細胞分裂）を与えるタンパク質を含むが、これに限定されない。
【００１１】
「発現」という用語は、本明細書で使用する際、ポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づき生成されるプロセスを指す。プロセスは、転写および翻訳の双方を含む。
核酸配列を細胞内に挿入するという状況における「導入される」という用語は、「形質移入」、または「形質転換」、または「形質導入」を指し、核酸配列の真核細胞または原核細胞への組み込みへの言及を含み、該核酸配列は、細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、色素体、またはミトコンドリアＤＮＡ）へ組み込まれてもよい、自主的なレプリコンへ変換されてもよい、または過渡的に発現（例えば、形質転換されたｍＲＮＡ）されてもよい。
【００１２】
「候補物質」という用語は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ遺伝子、遺伝子産物、ポリペプチド、抗体、例えば、大きさが最大２５００ダルトン（Ｄａ）の小分子、および他の化合物を指す。
「コード配列」という用語は、一度転写されたおよび翻訳された核酸配列が、適切な調節要素の制御下に設置される時、例えば、生体内でタンパク質を生成することを指す。本明細書で使用する際、コード配列は、連続性ＯＲＦを有してもよい、またはイントロンもしくは非コード配列の存在によって中断されるＯＲＦを有する場合がある。本実施形態において、非コード配列は、成熟ｍＲＮＡを生成するように、前駆体ＲＮＡからスプライスされる。
【００１３】
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書において、同義的に使用される。これらの用語は、当該技術分野の当事者に良く理解されており、抗体に特異的に結合する１つ以上のポリペプチドから成るタンパク質を指す。抗体の一形態は、抗体の基本的な構造単位を構成する。本形態は四量体であり、各対が１つの軽鎖と１つの重鎖を有する、同一の２対の抗体鎖から成る。各対において、軽鎖および重鎖可変領域は、共に、抗原への結合に関与し、定常領域は、抗体エフェクタ機能に関与する。
認識される免疫グロブリンポリペプチドは、カッパおよびラムダ軽鎖ならびにアルファ、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、イプシロン、およびミュー重鎖または他種の同等物を含む。（約２５ｋＤａまたは約２１４アミノ酸の）完全長免疫グロブリン「軽鎖」は、ＮＨ２末端の約１１０アミノ酸の可変領域、およびＣＯＯＨ末端のカッパまたはラムダ定常領域を含む。（約５０ｋＤａまたは約４４６アミノ酸の）完全長免疫グロブリン「重鎖」は、同様に、（約１１６アミノ酸の）可変領域および前述の重鎖定常領域の１つ、例えば、（約３３０アミノ酸の）ガンマを含む。
【００１４】
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、任意のアイソタイプの抗体または免疫グロブリン、これに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖおよびＦｄ断片を含む抗原への特異的な結合を維持する抗体の断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、ならびに抗体および非抗体タンパク質の抗原結合部分を含む、融合タンパク質を含む。抗体は、例えば、放射性同位体、検出可能な産物を発生する酵素、蛍光タンパク質等を用いて、検出可能に標識化されてもよい。抗体は、例えば、ビオチン等の特異的な結合対のメンバ（ビオチン−アビジン特異的結合対のメンバ）等、他の部分にさらに接合されてもよい。抗体は、また、これに限定されないが、ポリスチレンプレートまたはビーズ等を含む、固体支持体に結合されてもよい。また、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２および／または抗原およびモノクローナル抗体への特異的な結合を維持する他の抗体断片も、該用語に包含される。
【００１５】
抗体は、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂおよび（Ｆａｂ’）２ならびに二機能性（すなわち、二重特異性）ハイブリッド抗体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，１０５（１９８７））を含む様々な他の形態、および単鎖（例えば、参照により本明細書に援用される、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５，５８７９−５８８３（１９８８）およびＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６（１９８８）。（概して、Ｈｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｎ．Ｙ．，２ｎｄ  ｅｄ．（１９８４）、およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｏｄ，Ｎａｔｕｒｅ，３２３，１５−１６（１９８６）を参照のこと）に存在する場合がある。
【００１６】
免疫グロブリン軽鎖または重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる、３つの超可変領域によって中断される「フレームワーク領域（ＦＲ）」から成る。フレームワーク領域およびＣＤＲｓの範囲は、正確に画定される（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，  Ｅ．Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９９１）を参照のこと）。本明細書に記載される全ての抗体アミノ酸配列の番号付けは、Ｋａｂａｔシステムに従う。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、比較的、種属内で温存される。抗体のフレームワーク領域、つまり、構成物軽鎖および重鎖の組み合わされるフレームワーク領域は、ＣＤＲを位置付け、アライメントすることを補助する。ＣＤＲは、主に、抗原のエピトープへの結合に関与する。
【００１７】
キメラ抗体は、軽鎖および重鎖遺伝子が、典型的に、遺伝子操作によって、異なる種属に属する抗体可変および定常領域遺伝子から構築された抗体である。例えば、ウサギのモノクローナル抗体からの遺伝子の可変断片は、ガンマ１およびガンマ３等のヒト定常断片に連結されてもよい。治療的キメラ抗体の一例は、ウサギの抗体からの可変または抗原結合ドメイン、および他の哺乳類種が使用されてもよいが、ヒト抗体からの定常またはエフェクタドメイン（例えば、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託受託番号ＣＲＬ９６８８の細胞により作製された抗Ｔａｃキメラ抗体）で構成されるハイブリッドタンパク質である。
【００１８】
本明細書で使用する際、「ヒト化抗体」または「ヒト化免疫グロブリン」という用語は、ヒト抗体からの、対応して位置付けられたアミノ酸と置換された、（例えば、フレームワーク領域、定常領域、またはＣＤＲの）１つ以上のアミノ酸を含むヒト以外（例えば、マウスまたはウサギ）の抗体を指す。一般的に、ヒト化抗体は、ヒト以外の変種の同一の抗体と比較して、ヒト宿主において、低下した免疫反応を生成する。
本発明の方法によって設計および生成されるヒト化抗体は、抗原結合または他の抗体機能に実質的に影響がない、さらなる保存アミノ酸置換を有することを理解されたい。保存置換により、以下の群からのもの等の組み合わせは意図される：ｇｌｙ、ａｌａ；ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ；ａｓｐ、ｇｌｕ；ａｓｎ、ｇｌｎ；ｓｅｒ、ｔｈｒ；ｌｙｓ、ａｒｇ；およびｐｈｅ、ｔｙｒ。同一群に存在しないアミノ酸は、「実質的に異なる」アミノ酸である。
【００１９】
「特異的結合」という用語は、異なる分析物の均一混合物に存在する特定の分析物に優先的に結合する抗体の能力を指す。特定の実施形態において、特異的結合相互作用は、試料における望ましい分析物と望ましくない分析物との間で区別され、いくつかの実施形態において、約１０以上から１００倍以上（例えば、約１０００倍または１０，０００倍以上）である。
特定の実施形態において、捕捉物質／分析物複合体で特異的に結合する時、捕捉物質と分析物との間の親和性は、１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、または約１０−１２Ｍ未満もしくは以下のＫＤ（解離定数）により特徴付けされる。
【００２０】
本明細書で使用する際、「単離される」という用語は、試薬が精製前に結合する他の構成要素を少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、および少なくともさらに９９％含まない対象試薬を指す。
【００２１】
（例示的な実施形態の説明）
本発明がさらに説明される前に、本発明は、説明される特定の実施形態に制限されず、したがって、当然ながら、変形されてもよいことを理解されたい。また、本発明の目的は、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるため、本明細書で使用する用語は、単に、特定の実施形態を説明するための目的であり、制限することを意図しないことも理解されたい。
値の範囲が提供される場合、特に文脈で明確に記載されない限り、下限の１０分の１単位に至るその値の上限と下限との間の各中間値、および任意の他の状態値またはその状態値における中間値は、本発明内に包含されることを理解されたい。
【００２２】
特に定義されない限り、本明細書で使用する全ての専門用語および科学用語は、本発明に属する分野の当事者に通常理解される、同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似するまたは同等の任意の方法および材料が、本発明の実施またはテストに使用され得るが、好適な方法および材料は、ここに説明される。本明細書に記述される全ての刊行物は、引用される刊行物に関連する方法および／材料を開示し、説明するために、参照により本明細書に援用される。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される際、単数形「ａ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は、特に文脈で明確に記載されない限り、複数の対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「ａ  ｃｅｌｌ」は複数の細胞を含み、「ａ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ａｇｅｎｔ」の対象は、１つ以上の候補物質および当該技術分野の当事者に既知のその等価物の対象等を含む。特許請求の範囲は、あらゆる任意の要素を排除するように作成され得ることをさらに留意されたい。このように、本記述は、特許請求の範囲の要素に関連する「ｓｏｌｅｌｙ」、「ｏｎｌｙ」等のような非包括的用語の使用、または「否定的」制限の使用の先行詞としての役割を果たすように意図される。
【００２３】
本明細書に記載される刊行物は、単に、本出願の提出日前の開示において提供される。本明細書において、本開示が、従来の発明に基づくこのような刊行物に先行する権利が与えられない是認として解釈されるものではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行日と異なる場合があり、これは、個別に確認される必要がある場合がある。
本明細書で引用される全ての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が、参照により援用されるために具体的かつ個別に示されるように、参照により本明細書に援用され、引用される刊行物に関連する方法および／または材料を開示し、説明するために、参照により本明細書に援用される。任意の刊行物の引用は、出願日前の開示においてであり、本発明が従来の発明のこのような刊行物に先行する権利が与えられない是認として解釈されるものではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行日と異なる場合があり、これは、個別に確認される必要がある場合がある。
【００２４】
本開示の解釈において、当該技術分野の当事者には明らかであるように、本明細書に説明および図示される各個々の実施形態は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、任意の他のいくつかの実施形態から容易に区別され、またそれらと併用されてもよい、独立した構成要素および特徴を有する。任意の引用される方法は、引用される事象の順序で、または論理的に可能な任意の他の順序で実施され得る。
【００２５】
ゲル状マイクロドロップ組成物
上述のように、ゲル状マイクロドロップ組成物を提供する。特定の実施形態において、ゲル状マイクロドロップ組成物は、高分子マトリックスと、高分子マトリックス中にエフェクタ分子を放出するエフェクタ粒子と、第１の光学的に検出可能な信号を発生させる第１のリポータ粒子と、第１の光学的に検出可能な信号から識別可能な第２の光学的に検出可能な信号を発生する第２のリポータ粒子とを含み、該エフェクタ粒子ならびに第１および第２リポータ粒子は、高分子マトリックスによって包含される。ゲル状マイクロドロップ組成物を利用するスクリーニングの方法、およびゲル状マイクロドロップ組成物を作製する方法も開示する。
【００２６】
図１を参照すると、対象とするゲル状マイクロドロップ組成物１は、包含高分子マトリックス３と、エフェクタ粒子５と、第１のリポータ粒子９と、第２のリポータ粒子１１とを含む。図１に示すように、エフェクタ粒子５は、高分子マトリックス中にエフェクタ分子７（「Ｙ」）を放出する。上述のように、第１のリポータ粒子９は、第１の光学的に検出可能な信号（「Ｒ」）を発生し、第２のリポータ粒子１１は、第１の光学的に検出可能な信号から識別可能である（すなわち、独自に検出可能）第２の光学的に検出可能な信号（「Ｇ」）を発生する。以下により詳細に説明するように、第１および第２のリポータ粒子は、エフェクタ分子の生物学的活性の読み出しを提供する。図１に示す実施形態において、エフェクタ分子７の放出は、エフェクタ粒子を含まない対照ゲル状マイクロドロップと比べ、第１および第２のリポータ粒子の１つと局在する光学的に検出可能な信号を変化させる。例えば、図１に示すように、エフェクタ分子７の放出は、変化した光学的に検出可能な信号を生成するように、変化した第１のリポータ粒子１３を生成する。変化した光学的に検出可能な信号は、例えば、ａ）第３の光学的に検出可能な信号を用いてリポータ粒子の表面に結合されるエフェクタ分子の標識化、ｂ）リポータ粒子が細胞の場合、リポータ粒子により生成されたリポータタンパク質の発現の増加または低下、もしくは局在の変化、またはｃ）リポータ粒子が細胞の場合、リポータ粒子による色素の取り込みの増加に起因してもよい。以下により詳細に説明するように、リポータ粒子は、異なる光学的に検出可能な信号を生成するためだけでなく、１つのリポータ粒子が、他のリポータ粒子において正または負の対照のいずれかとして作用するために、異なる。例えば、第１のリポータ粒子は、その表面に第１の抗原を含んでもよく、第２のリポータ粒子は、その表面に第２の抗原を含んでもよく、エフェクタ分子は第１のリポータ粒子に結合するが、第２のリポータ粒子には結合せず、これは、エフェクタ分子が、第１のリポータ粒子の表面の抗原に対して特異的であることを示唆する。特定の場合において、対象とするマイクロドロップ組成物に、わずか１つのエフェクタ粒子しか存在しない場合と、第１および第２のリポータ粒子のそれぞれの複数（例えば、５〜１０等の５〜１００の範囲）が存在する場合とがある。他の実施形態において、対象とするマイクロドロップ組成物に、１つ以上のエフェクタ粒子が存在する場合と、第１および第２のリポータ粒子のそれぞれの複数が存在する場合とがある。特定の場合において、例えば、マイクロドロップ組成物における第１および第２のリポータ粒子のそれぞれのエフェクタ粒子間の比は、例えば、少なくとも１：５、１：１０、または１：２０であってもよい。
【００２７】
以下に詳細に説明するように、エフェクタ粒子は、例えば、ビーズまたは細胞であってもよい。エフェクタ粒子は、光学的に検出可能な信号を生成する必要がない。しかしながら、特定の実施形態において、エフェクタ粒子は、その存在が検出されるように、光学的に検出可能な信号を生成してもよい。
エフェクタ分子は、例えば、ポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ等のオリゴヌクレオチド）、ポリペプチド（例えば、ポリペプチドの細胞内への取り込みを促進する配列に連結されてもよい、もしくはされなくてもよいペプチド）、小分子（大きさが最大２５００ダルトン）、または抗体等の、任意の種類の分子であってもよい。
【００２８】
対象とするゲル状マイクロドロップは、例えば、大きさが５０μｍ〜１００μｍ、例えば、大きさが１００μｍ〜３００μｍ等の、１０μｍ〜１０００μｍの範囲であってもよい。
特定の実施形態において、対象とするマイクロドロップは、マイクロドロップのライブラリのメンバであってもよく、該ライブラリの各マイクロドロップは、異なるエフェクタ粒子（すなわち、異なるエフェクタ粒子が異なるエフェクタ分子を生成するように）と、同じ第１および第２のリポータ粒子とを含む。このようなマイクロドロップのライブラリは、各メンバのマイクロドロップが異なるエフェクタ粒子を含み、異なるエフェクタ粒子が異なるエフェクタ分子を生成する、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも１，０００、少なくとも１０，０００、または少なくとも１００，０００から最大１００万以上のメンバを含んでもよい。特定の実施形態において、マイクロドロップライブラリのメンバは、単一容器中にマイクロドロップの混合物として含まれてもよい。他の実施形態において、マイクロドロップライブラリは、マイクロタイタープレートのウェル等、複数の異なる容器に存在してもよく、各容器は、少なくとも、１から最大１０，０００（例えば、５〜１００、または１０〜５０）のマイクロドロップを含む。これらの実施形態において、単一容器中のマイクロドロップは、約１，０００〜１００，０００マイクロドロップ／ｍｌの密度で存在してもよく、マイクロドロップの沈殿を防止する培地中で懸濁されてもよい。代替的に、マイクロドロップは、遠心分離もしくは単一層のウェルの底に沈殿され得るか、または、高密度アレイが望まれる時は、複数層に沈殿できる。多くの場合において、マイクロドロップは、埋没粒子の組成物と混合可能である流体または培地に浸漬される。例えば、生細胞が粒子として使用される場合、適切な成長培地への浸漬は、細胞生存率を保持するために必要な場合がある。一実施形態において、マイクロドロップは、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．５で懸濁される。マイクロドロップが生細胞を含む特定の実施形態において、マイクロドロップは、細胞の長期生存を可能にする培地中で懸濁されてもよい。
【００２９】
エフェクタ粒子
上述のように、エフェクタ粒子は、例えば、細胞またはビーズであってもよい。エフェクタ粒子が細胞エフェクタ粒子の場合、エフェクタ分子は、細胞により分泌されたポリペプチド、すなわち、エフェクタポリペプチドであってもよい。特定の実施形態において、マイクロドロップのライブラリの異なるメンバは、該マイクロドロップライブラリの各メンバが、平均して１つのエフェクタ粒子を含み、ライブラリの各エフェクタ粒子が、異なるポリペプチドを生成する、異なるエフェクタポリペプチドを分泌する細胞を含んでもよい。
【００３０】
細胞エフェクタ粒子
例示的な一実施形態において、エフェクタ分子は、細胞により分泌されたポリペプチドであってもよい。ポリペプチドは、任意の配列（例えば、ランダム配列、またはｃＤＮＡによってコードされてもよい）、任意の長さ（例えば、１０〜１，０００の範囲、またはそれ以上のアミノ酸）、任意の供給源（例えば、哺乳類または細菌起源）であってもよい。特定の実施形態において、細胞ライブラリを作製するように、発現ライブラリ（すなわち、ポリペプチドの発現および分泌を提供する発現ベクターのライブラリ）を細胞の集団に導入することによって作製されてもよい。
【００３１】
このような発現ライブラリ、例えば、ｃＤＮＡ発現ライブラリ、ｃＤＮＡ断片発現ライブラリ、ランダムペプチドライブラリ、ファージ提示ライブラリは、当該技術分野において良く知られており（上のＡｕｓｕｂｅｌおよびＳａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）、これらの構造は、ここで詳細に説明しない。一実施形態において、ポリペプチドは、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現カセットを使用して、エフェクタ細胞で発現される。適切なプロモータ（例えば、誘導性プロモータ）、転写終結コドン、エンハンサー、翻訳開始信号、翻訳エンハンサーを含む発現カセットは、当該技術分野において良く知られており、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ，（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９５）、およびＳａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）に記載されている。適切なプロモータは、Ｄｉｊｋｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８５）４：７６１に記載されるようなＳＶ４０要素；Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８２）７９：６７７７に記載されるようなラウス肉腫ウイルスに由来する転写調節要素；Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ（１９８５）４１：５２１に記載されるようなヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＬＴＲに由来する転写調節要素；ｈｓｐ７０プロモータ（Ｌｅｖｙ−Ｈｏｌｔｚｍａｎ，Ｒ．ａｎｄ  Ｉ．Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９９５）１２６３：９６−９８）Ｐｒｅｓｎａｉｌ，Ｊ．Ｋ．  ａｎｄ  Ｍ．Ａ．Ｈｏｙ，（Ｅｘｐ．Ａｐｐｌ．Ａｃａｒｏｌ．（１９９４）１８：３０１−３０８））等を含む。加えて、発現カセットは、宿主細胞からのポリペプチドの分泌を提供するように操作されてもよい。このように、発現カセットは、信号ペプチドがポリペプチドを細胞の分泌経路へ導く、信号ペプチド（または分泌信号として知られる）およびポリペプチドを含む融合タンパク質をコードしてもよい。哺乳類、真菌および細菌細胞を含む、任意の様々な異なる細胞で使用するのに適切な信号ペプチドは、良く知られている。
【００３２】
発現カセットは、線形であるか、または選択可能なマーカをさらに含んでもよい環状ベクターに包含されてもよい。適切なベクター、例えば、ウイルスおよびプラスミドベクター、および選択可能なマーカは、当該技術分野において良く知られており、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ，（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９５）およびＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）に記載されている。様々な異なる遺伝子は、選択可能なマーカとして採用されており、選択可能なマーカとして対象ベクターに採用される特定の遺伝子は、主に、便宜上の問題で選択される。既知の選択可能なマーカは、チミジンキナーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＣＡＤ、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、アスパラギンシンテターゼ遺伝子、例えば、ｔｅｔｒ、ａｍｐｒ、Ｃｍｒまたはｃａｔ等の抗生物質抵抗性遺伝子、ｋａｎｒもしくはｎｅｏｒ（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子等を含む。ベクターは、宿主細胞ゲノムへの組み込みを提供してもよい、または宿主細胞ゲノムから自律的であってもよい。
【００３３】
発現カセットは、ウイルス感染、接合、プロトプラスト融合、電気穿孔、粒子ガン技法、リン酸カルシウム沈降法、直接微量注入法、ウイルスベクター送達等を含む、様々な方法を使用して宿主細胞中に導入されてもよい。方法の選択は、概して、形質転換される細胞の種類および形質転換が行われる環境（すなわち、生体外）に依存する。これらの方法の一般的な説明は、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９５に見出すことができる。いくつかの実施形態において、リポフェクタミンおよびカルシウム介在遺伝子導入技術が使用される。環状核酸を導入するための方法も、当該技術分野において良く知られており、上のＡｕｓｕｂｅｌに記載される。
【００３４】
一実施形態において、エフェクタポリペプチドは、抗体産生細胞により分泌される抗体であってもよい。このような細胞は、Ｂリンパ球、またはプラズマ細胞を含む、その後代等の哺乳類免疫反応に関与し、通常、宿主動物の免疫システムによって「自然に対」となった免疫グロブリン重鎖および軽鎖を生成する。これらの細胞は、抗体を分泌する（抗体分泌細胞）か、または細胞環境内に分泌せずに細胞の表面に抗体を保持するかのいずれかであってもよい。抗体を発現するハイブリドーマ細胞も、抗体産生細胞という用語に包含される。
【００３５】
抗体産生細胞は、選択された抗原で免疫化されていない、選択された抗原で免疫化された、または疾患もしくは状態の結果として抗原に対して免疫反応を展開した動物から得てもよい。動物は、免疫反応を発生するのに適した、当該技術分野に良く知られる任意の技法を使用して、選択された抗原で免疫化されてもよい（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ（ｅｄ．），Ｖｏｌ  ４，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９８６を参照のこと）。本説明の内容内において、「選択された抗原」という句は、特に、タンパク質、炭水化物、無機または有機分子、酵素のプロセスで中間体に類似する遷移状態類似体、核酸、癌細胞、細胞抽出物を含む細胞、生または弱毒ウイルスを含む病原体、細菌等を含む、抗体が作製される任意の物質を含む。当該技術分野の当事者に理解されるように、低い免疫原性である抗原は、免疫反応を増大するためにアジュバントもしくはハプテン（例えば、完全もしくは不完全フロイントアジュバント）、またはスカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）等の担体を伴ってもよい。
【００３６】
ヒト、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、またはブタ等の特定の哺乳類、ならびにニワトリおよびシチメンチョウ等の鳥類の多くの温血動物は、抗体産生細胞を得るために使用されてもよい。動物を免疫化するための手順は、当該技術分野において良く知られており、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ，．（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｆｉｒｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８８）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）に記載されている。抗体産生細胞は、また、選択された疾患または状態の過程中に細胞を生成した対象から得てもよい。例えば、リウマチ関節炎等の原因不明の疾患を持つヒトからの抗体産生細胞が得られ、疾患プロセスに影響する、または疾患原因に関与する病原体もしくは体成分の同定を導き得る抗体を同定するための取り組みに使用されてもよい。同様に、抗体産生細胞は、マラリアまたはＡＩＤＳ等の既知の病原体による疾患を有する対象から得てもよい。これらの抗体産生細胞は、血液、リンパ節、骨髄、ならびに他の疾患または正常組織に由来してもよい。抗体産生細胞は、また、ヘパリンまたはＥＤＴＡ等の抗凝血物質を用いて採取された血液から調製されてもよい。抗体産生細胞は、ヒコール−ハイパック法を用いた遠心分離等の標準手法を使用して、赤血球および多形体からさらに単離されてもよい（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓｕｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。抗体産生細胞は、また、ＥＤＴＡの存在下で、コラゲナーゼおよびトリプシン等の酵素を用いた解離によって、リンパ節または腫瘍等の個体組織から調製されてもよい。
【００３７】
抗体産生細胞は、また、生体外免疫等の培養技術によって得てもよい。このような方法の例は、Ｒｅａｄｉｎｇ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（２１：１８−３３  Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ，Ｈ．Ｈ．ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ（ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．；１９８６）に記載される。つまり、脾臓もしくはリンパ節細胞、または抹消血単核細胞の懸濁物等の、抗体産生細胞源は、１０％のウシ胎児血清を用いたＲＰＭＩ１６４０および抗体の発現が望まれる物質源の培地で培養される。本培地は、抗体形成の活性化およびリポ多糖またはその誘導体等の増殖を強化することで知られる物質量、または他のアジュバントもしくはＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−ガンマ等のサイトカインを用いてさらに補填されてもよい。免疫原性を強化するために、選択された抗原は、例えば、ビオチン−アビジンの使用等の従来の技術により、脾臓細胞等の細胞の表面に結合されてもよい。
【００３８】
抗体産生細胞を含有する適切な動物が同定または生成されると、脾臓、リンパ節、または骨髄組織は、典型的には、除去され、抗体産生細胞の細胞懸濁物が、当該技術分野に既知の技術を使用して調製される。いくつかの実施形態において、本懸濁物は、単一細胞懸濁物であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ，．（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｆｉｒｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８８）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）等、当該技術分野において良く知られる調製技術である。
【００３９】
抗体産生細胞は、他の細胞と比べた抗体形成細胞の大きさまたは密度に基づく方法による単一細胞懸濁物で補強されてもよい。密度により細胞を単離するためのパーコール法の使用の例は、ｖａｎ  Ｍｏｕｒｉｋ  ａｎｄ  Ｗ．Ｐ．Ｚｅｉｚｌｍａｋｅｒ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１２１：１７４−１８２  （Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ，Ｈ．Ｈ．ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ（ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）に記載されている。ウシ血清アルブミン溶液の密度変化の勾配も、密度により細胞を単離するために使用され得る（Ｎ．Ｍｏａｖ  ａｎｄ  Ｔ．Ｎ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１０５：１５１２，１９７０を参照のこと、Ｒａｉｄ，Ｄ．Ｊ．ｉｎ  ＳＥＬＥＣＴＥＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｂ．Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓ．Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ．），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８７も参照のこと）。Ｃａｒｒｏｌｌ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ２００５  ２９６：１７１−８）Ｂｏ(・・)ｏ(・・)ｈｍ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ２００５  ３０７：１３−２３）、Ｃａｒｒｏｌｌ（Ｅｘｐｅｒｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ２００４  ４：１８２１−９）も、抗体産生細胞を単離するための方法を記載している。抗体産生細胞も、他の方法を使用して、補強および平板培養されてもよい。例示的な抗体産生細胞補強方法は、例えば、細胞を標識化された抗ウサギＩｇＧとインキュベートし、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ  ＳＥ細胞選別機（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して標識化された細胞を選別することにより、ウサギの脾臓、骨髄、リンパ節、または他のリンパ器官から得た細胞集団のフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）の実施を含む。多くの実施形態において、単一または単一に近い抗体産生細胞は、マイクロタイタープレートに沈積される。ＦＡＣＳシステムが採用される場合、選別された細胞は、補強後、マイクロタイタープレートに直接沈積されてもよい。補強されない細胞、または上述の任意の方法によって補強された細胞は、単一細胞沈積を確実にするために、限界希釈でマイクロタイタープレートに沈積されてもよい（Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ，．  （Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｆｉｒｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８８）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）。
【００４０】
或る実施形態において、抗体産生細胞は、抗体産生細胞によって発現した抗体の親和性に基づき、さらに選択されても、されなくてもよい。このように、特定の場合において、抗体産生細胞は、補強後、直接使用されてもよく、抗体産生細胞によって発現した抗体の反応性または特異性に基づき、任意のさらなる精製または選択が行われなくてもよい。いくつかの実施形態において、抗体産生細胞は、抗体産生細胞の抗体が結合する抗原（すなわち、タンパク質、病原、ペプチド、細胞、細胞抽出物、核酸、炭水化物等）がスクリーニング前に判断されないため、「未知」の特異性である。
次いで、任意に、抗体産生細胞を、沈積された後に、当該技術分野の当事者に既知の方法により、培養する（すなわち、細胞の少なくとも１つ、少なくとも５つ、または少なくとも１０以上の細胞分裂を支持する培地での成長）（例えば、国際特許第ＷＯ０１／５５２１６号を参照のこと）。このように、マイクロドロップ組成物は、単一の抗体産生細胞の後代から得てもよい。しかしながら、特定の実施形態において、抗体産生細胞は、マイクロドロップに使用される前に培養されない。
マイクロドロップのエフェクタ細胞は、哺乳類、細菌、真菌、植物、鳥類、魚類、両生類、および爬虫類の細胞を含む、任意の細胞種類であってもよい。
【００４１】
ビーズエフェクタ粒子
別の例示的な実施形態において、エフェクタ粒子は、エフェクタ分子が切断可能リンカーを介してビーズに連結されてもよい、ビーズである。リンカーを切断する状態にエフェクタ粒子を曝露すると、エフェクタ分子は、ビーズから放出され、リポータ粒子に拡散できる。
【００４２】
ビーズは、大きさが２０ｎＭ〜２００μＭ以上の範囲であり得、ポリスチレンから作製されてもよいが、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリビニルトルエン（ＰＶＴ）、スチレン／ブタジエン（Ｓ／Ｂ）共重合体、スチレン／ビニルトルエン（Ｓ／ＶＴ）等の他の材料も使用される。密度は、１．０１〜１．５０ｇ／ｍｌの範囲であり得る。ビーズは、表面上に様々な化学官能基を表すように作製され得る。使用される反応基は、通常、カルボキシル、アミノ、アルデヒド、ヒドロキシ、エポキシ、およびクロロメチルを含む（例えば、米国特許第４，２１７，３３８号、第５，３２６，６９２号、第５，７８６，２１９号、第４，７１７，６５５号、第７，４４５，８４４５号、第５７３，９０９号、および第６，０２３，５４０号を参照のこと）。他の種類のリンカーがこれらの反応基に結合される。上述のビーズは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｓ、およびＰｏｌｙｍｉｃｒｏｓｈｐｅｒｅｓ，Ｉｎｃを含む、多数の供給源から商業的に得ることができる。
【００４３】
ビーズエフェクタ粒子は、ビーズの表面に切断可能に連結される（すなわち、間接的または直接的に、切断可能に結合する）捕捉物質を含んでもよい。いくつかの実施形態において、捕捉物質は、切断可能なリンカーを介して基質に結合される。
対象とするエフェクタビーズに採用される切断可能リンカーは、求電子的に切断可能なリンカー、求核的に切断可能なリンカー、光切断可能なリンカー、金属切断可能なリンカー、電解的に切断可能なリンカー、および還元および酸化条件下で切断可能なリンカーを含む。このようなリンカーは、Ｇｕｉｌｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０００  １０００：２０９１−２１５７）に非常に詳細に記載されており、該開示は、その全体が参照により援用される。
【００４４】
適切な切断可能部位は、以下を含むが、これらに限定されない：エステル、特にコハク酸（例えば、アンモニアまたはトリメチルアミンにより切断可能）、四級アンモニウム塩（例えば、ジイソプロピルアミンにより切断可能）、およびウレタン（水性水酸化ナトリウムにより切断可能）等の塩基切断可能部位；ベンジルアルコール誘導体（トリフルオロ酢酸を使用して切断可能）、テイコプラニンアグリコン（トリフルオロ酢酸、次に塩基により切断可能）、アセタールおよびチオアセタール（これもトリフルオロ酢酸を使用して切断可能）、チオエーテル（例えば、ＨＦまたはクレゾールにより切断可能）、スルホニル（トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、チオアニソール等により切断可能）等の酸切断可能部位；フタルアミド（置換ヒドラジンにより切断可能）、エステル（例えば、三塩化アルミニウムにより切断可能）等の求核切断可能部位；およびワインレブアミド（水素化リチウムアルミニウムにより切断可能）；およびホスホロチオエート（銀または水銀イオンにより切断可能）およびジイソプロピルジアルコキシリル（フッ化物イオンにより切断可能）を含む、他の種類の化学的に切断可能な部位。他の切断可能な部位は、当該技術分野に精通する者には明らかであるが、関連文献およびテキストに記載される（例えば、Ｂｒｏｗｎ（１９９７）Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ４（３）；２１６−２３７）。
【００４５】
或る実施形態において、光切断可能リンカー（例えば、ＵＶ切断可能リンカー）が採用されてもよい。対象とするセンサで使用する適切な光切断可能リンカーは、上のＧｕｉｌｌｉｅｒらに記載されるように、オルソ−ニトロベンジルベースのリンカー、フェナシルリンカー、アルコキシベンゾインリンカー、クロムアレーン複合体リンカー、ＮｐＳＳＭｐａｃｔリンカー、およびピバロイルグリコールリンカーを含む。
【００４６】
当該技術分野で既知のように、分子は、概して、順番に、以下の特徴を有する連結剤（例えば、適切なオルソ−ニトロベンジルベースの連結剤）を使用して基質に係留され得る：基質に連結するためのタグ、スペーサ部分、切断可能リンカー、および反応基。タグは、例えば、ビオチン基等、または基質とリンカーとの間に共有結合を生成するように、適切な部位（例えば、アルコール、アミノ求核剤、チオール求核剤、または基質の表面上のシラン基）と反応できる反応部分（例えば、カルボキシ基、アミノ基、ハロ基、トシレート基、メシレート基、反応性ヒドロキシル基、または金属酸化物）等、親和性タグであってもよい。スペーサは、例えば、３〜１２個の炭素原子（例えば、５−アミノカプロン酸）を含有する非反応性アルキル鎖を含有してもよく、切断可能なリンカーは、適切な化学的性質を含有するように選択されてもよい（上を参照）。反応基は、概して、エフェクタ分子と反応し、その間に共有結合を形成する。反応基は、捕捉物質において、特定の化学基と選択的に反応する。
【００４７】
適切な反応基は、（スルフヒドリル反応性である）ハロゲン、（アミノ反応性である）Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）−炭酸、および（ヒドロキシ反応性である）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイトを含み、いくつかの他の反応基は、当該技術分野において既知であり、本発明に容易に採用されてもよい。
【００４８】
特定の実施形態において、分子の「本来の」形態、すなわち、切断可能なリンカーに連結される前の、同じ分子の構造と相同な分子構造を有する分子を放出する切断可能に結合されるエフェクタ分子を、結合部で切断することが望まれる。これらの実施形態において、光切断可能なオルソ−ニトロベンジルＮＨＳ連結剤が採用されてもよい。これらの実施形態において、分子の少なくとも１つのアミノ基（ＮＨ２）は、リンカーおよび捕捉物質が、ＵＶ切断可能な結合を介して共有結合的に連結される分子を生成するように、連結剤のＮＨＳ基と反応する。本分子をＵＶ光に曝すと、ＵＶ切断可能な結合が切断され、分子（元のアミノ基を有する）が放出される。放出された分子は、連結剤と反応した捕捉物質と相同な分子構造を有する。例示的な光切断可能なオルソ−ニトロベンジルＮＨＳリンカーは、ＵＶ光によって切断されてもよい。
【００４９】
対象とする方法に採用される例示的な連結剤は、上のＧｕｉｌｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ、およびＯｌｅｊｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１９９８  ２９１：１３５−１５４）に記載されており、さらに、米国特許第６，０２７，８９０号、Ｏｌｅｊｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，９２：７５９０−９４）、Ｏｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００２  ７４：４７０２−４７０８）、Ｂａｉ  ｅｔ  ａｌ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００４  ３２：５３５−５４１）、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００２  ７４：４２５９−４２６８）、およびＳａｎｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ（Ｃｈｅｍ  Ｍａｔｅｒ．１９９８  １０：１５１０−２０）に記載されており、Ａｍｂｅｒｇｅｎ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；ＮＨＳ−ＰＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ）、Ｌｉｎｋ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｅｌｌｓｈｉｌｌ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ；ＰＩＥＲＣＥ  ＥＺ−ＬＩＮＫ（商標）ＮＨＳ−ＰＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ）、およびＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から購入可能である。
【００５０】
当該技術分野の当事者に認識されるように、エフェクタ分子は、予め作製され（例えば、機械によって合成されるか、または組換え法によって作製される）、次いでリンカーに結合され得る。代替的に、既に共有結合的にリンカーに結合される捕捉物質は、合成法（例えば、機械を使用して）を使用して作製されてもよい。
【００５１】
一実施形態において、ＮＨＳおよびオルソ−ニトロベンジル基含有ビオチニル化結合剤は、ｐＨ７〜９で、一級アミン基含有エフェクタ分子（例えば、ポリペプチドまたはアミノ化核酸）と組み合わされる。アミンは、求核攻撃によりＮＨＳ基と反応し、反応の副産物であるＮ−ヒドロキシサクシンイミドが放出される。得られたビオチニル化光切断可能リンカー含有エフェクタ分子は、不確定に、−２０℃で、光および湿気から保護される、ＤＭＦまたはＤＭＳＯで保管される。
【００５２】
ビオチニル化光切断可能リンカー含有エフェクタ分子は、穏やかに攪拌しながら、結合緩衝液中で、ストレプトアビジンまたはアビジンで被覆され、適切な時間量（例えば、１５〜３０分）でインキュベートされたビーズと接触されてもよい。ビオチニル化光切断可能リンカー含有エフェクタ分子は、これによって、ストレプトアビジンに結合するようになる。結合エフェクタ分子は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）または他の適切な緩衝液で洗浄され、次いで、ビーズを採用してもよい。
【００５３】
非ビオチニル化連結剤は、基質およびリンカーの両方の反応性官能性部分を介して、ビーズに結合されてもよい。連結剤の反応性部分（例えば、アミノ基、スルフィド基等）は、基質と非ビオチニル化光切断可能リンカー含有エフェクタ分子との間に共有結合を生成するように、ビーズの表面上の適切な部位（例えば、カルボン酸基、反応性ハロゲン等）と反応し得る。次いで、結合エフェクタ分子を伴うビーズを採用してもよい。
切断可能な結合捕捉物質は、例えば、１．２ｍＷ／ｃｍ２等の適切な輝度で、例えば、３６５ｎｍ等の３００〜３７０ｎｍ波長の光に基質を曝露することによって、基質から切断されてもよい。
【００５４】
代替的な実施形態において、光酸発生剤（ＰＡＧ）材料が、切断剤として採用されてもよい。このようなＰＡＧは、当該技術分野において既知であり（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈのワールドワイドウェブサイトを参照のこと）、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドトリフルオロメタンスルホン酸、２−ナフチルジフェニルスルホニウムトリフレート、ビス（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）ヨードニウムパーフルオロ−１−ブタンスルホン酸、ビス（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）ヨードニウム−トルエンスルホン酸、ビス（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）ヨードニウムトリフルオロメタンスルホン酸、（４−ブロモフェニル）ジフェニルスルホニウムトリフルオロメタンスルホン酸、（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメトキシナフチル）−ジフェニルスルホニウムトリフレート、およびその他多くを含む。本実施形態において、ＰＡＧは、センサの流量ストリームに存在してもよい（例えば、試料と混合される）。ＵＶ光が、本流量ストリームの領域（すなわち、局所化領域）に向けられる時、プロトンは照射領域内に生成され、領域のｐＨは下がる。領域に存在する任意のｐＨ感応材料（例えば、感応性エステルまたはｐＨ感応結合）は、修正（すなわち、切断、加水分解、結合破壊）の対象であろう。例えば、ＰＡＧにより生成された光誘発酸発生は、このような結合によってビーズに結合されたエフェクタ分子を放出するように、エステル結合を切断するのに十分である。
【００５５】
さらなる実施形態において、エフェクタ分子は、電解的に切断可能なリンカーを通して基質に結合されてもよい。この場合、エフェクタ分子は、電解手段を介して放出され得る。酸切断可能リンカーは、また、ｐＨの変更によって切断されてもよい。このような方法を実施するためのガイダンスは、Ｄｏｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ４，２００３，ａ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，，ＩＮ）から容易に適用される。
エフェクタ分子は、合成、半合成、自然に発生する無機および有機分子を含む、任意の分子であってもよい。候補物質は、合成または天然化合物の多数のライブラリで見出されるものを含む。例えば、合成化合物ライブラリは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ，Ｃｏｒｎｗａｌｌ，ＵＫ）、ＣｏｍＧｅｎｅｘ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、およびＭｉｃｒｏＳｏｕｒｃｅ（Ｎｅｗ  Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＣＴ）から商業的に入手可能である。代替的に、細菌、真菌、植物および動物止抽出物の形態での天然化合物のライブラリは、Ｐａｎ  Ｌａｂｓ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）から入手可能であるか、または容易に生成可能である。
【００５６】
候補物質は、５０以上、約２，５００Ｄａ未満の分子量を有する小有機または無機化合物であってもよい。候補物質は、タンパク質、特に水素結合との構造的相互作用に必要な官能基を含んでもよく、少なくとも、アミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基を含んでもよく、少なくとも２つの官能化学基を含有してもよい。候補物質は、周期性炭素または複素環構造および／または１つ以上の上述の官能基と置換される芳香族もしくはポリ芳香族構造を含んでもよい。候補物質は、また、ペプチド、糖類、脂酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体、またはそれらの組み合わせを含む、生体分子に見出される。
【００５７】
候補物質は、合成または天然化合物のライブラリを含む広範な供給源から得られる。例えば、ランダム化オリゴペプチドの発現を含む、広範な有機化合物および生体分子のランダムおよび指向性合成のための、多数の手段が利用可能である。代替的に、細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形態での天然化合物のライブラリは、入手可能であるか、または容易に生成可能である。加えて、天然または合成的に生成されたライブラリおよび化合物は、従来の化学、物理的および生化学的手段を通して容易に修正され、組み合わせライブラリを生成するように使用されてもよい。既知の薬理学的作用物質は、構造類似体を生成するように、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド付加等の指向性、またはランダム化学修正に供されてもよい。新規潜在的治療剤も、合理的な薬剤設計、またはコンピュータモデル等の方法を使用して作製されてもよい。
【００５８】
リポータ粒子
上述のように、対象とするマイクロドロップの第１および第２リポータ粒子は、スペクトル識別可能な信号を生成し、異なる分子を少なくとも１つ含有するため、１つのリポータ粒子は、エフェクタ分子の作用が特異であるかを判断するための、他の粒子の正または負の対照となる。上述のように、第１および第２のリポータ粒子は、例えば、ビーズまたは細胞であってもよい。
第１および第２のリポータ粒子がビーズである場合、例えば、量子点等の他の標識化システムが採用さるが、識別可能な蛍光色素を使用して標識化されてもよい。
【００５９】
ビーズは、様々な有機または蛍光色素を用いて着色され得る。色素分子は、ビーズ表面に付着され得るか、より一般的には、粒子の内側に捕捉され、表面を生体分子の付着に利用できるようにしておく。（例えば、上の多くの引用文献、Ｋａｌｌａｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２００２  ２０  １２２７−１２３７、Ｆｕｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９７  １７４９−１７５６、およびＴｈｅ  Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ  Ｌａｔｅｘ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  Ｒ．Ｍａｕｓｓｅｒを参照のこと）適切な色素は、例えば、キサンテン色素、フルオレセインイソチオシアン酸（ＦＩＴＣ）等のフルオロセインおよびローダミン色素、６カルボキシフルオレセイン（一般的に、略語ＦＡＭおよびＦで知られる）、６カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、６カルボキシ４’，５’ジクロロ２’，  ７’ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥまたはＪ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチル６カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡまたはＴ）、６カルボキシＸローダミン（ＲＯＸまたはＲ）、５カルボキシローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ５またはＧ５）、６カルボキシローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ６またはＧ６）、およびローダミン１１０；例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５およびＣｙ７色素等のシアニン色素；例えば、ウンベリフェロン等のクマリン；例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８等のベンズイミド色素；例えば、テキサスレッドのフェナントリジン；エチジウム色素；アクリジン色素；カルバゾール色素；フェノキサジン色素；ポルフィリン色素；ポリメチン色素、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５等のシアニン色素；ＢＯＤＩＰＹ色素およびキノリン色素を含む。幾つかの用途で一般的に使用される対象の特定のフルオロフォアは、ピレン、クマリン、ジエチルアミノクマリン、ＦＡＭ、フルオレセインクロロトリアジニル、Ｒ１１０、エオシン、ＪＯＥ、Ｒ６Ｇ、テトラメチルローダミン、ＴＡＭＲＡ、リサミン、ＲＯＸ、ナフトフルオレセイン、テキサスレッド、ナフトフルオレセイン、Ｃｙ３、およびＣｙ５等を含む。
【００６０】
対象とする方法に有用な適切な識別可能な蛍光標識対は、Ｃｙ−３およびＣｙ−５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、Ｑｕａｓａｒ５７０およびＱｕａｓａｒ６７０（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎｏｖａｔｏ  ＣＡ）、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５５５およびＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、ＢＯＤＩＰＹ  Ｖ−１００２およびＢＯＤＩＰＹ  Ｖ１００５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、ＰＯＰＯ−３およびＴＯＴＯ−３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、およびＰＯＰＲＯ３  ＴＯＰＲＯ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を含む。さらなる適切な識別可能で検出可能な標識は、Ｋｒｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｎ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：１１４−２９，２００２）に見出されてもよい。ビーズは、また、蛍光タンパク質を使用して標識化されてもよい。
【００６１】
第１および第２リポータビーズは、それぞれ、第１および第２のリポータビーズがそれに結合する異なる部分を有する、リポータビーズに結合される部分、例えば、タンパク質を含有してもよい。一実施形態において、リポータビーズの１つは、例えば、エフェクタ分子が第１のポリペプチド等を結合してもよい部分等、標的部分を含有するが、リポータビーズの他は、例えば、エフェクタ分子が第１のポリペプチドと異なる第２のポリペプチドを結合しない部分等、対照部分を含有する。つまり、第１のリポータビーズは、エフェクタ分子に結合してもよい、表面結合標的部分を有してもよいが、第２のリポータビーズは、第２のリポータビーズが第１のリポータビーズの対照となる、エフェクタ分子に結合しない、表面結合標的部分を含有してもよい。第２のレポータビーズではなく、第１のリポータビーズへのエフェクタ分子の結合は、エフェクタ分子が第１のリポータビーズに存在する部分に特異的に結合することを示唆する。例として図示するが、１つのレポータ粒子は、その表面に標的タンパク質を有してもよく、他は、タンパク質の変異体を含有してもよく、以下により詳細に説明されるように、２つのリポータ粒子は、例えば、変異体タンパク質よりむしろ標的タンパク質に結合する抗体等、エフェクタ分子のスクリーニングに使用されてもよい。
【００６２】
或る場合において、リポータ粒子の１つは、上述のように、抗体産生細胞を生成する動物を免疫化するために使用される抗原を含有してもよい。本実施形態において、マイクロドロップは、ポリペプチドにより免疫化された動物から得た抗体産生細胞と、どちらかがポリペプチドを含有する第１および第２のリポータ粒子とを含有してもよい。他のリポータ粒子ではなく、ポリペプチドを含有するリポータ粒子への抗体産生細胞により生成された抗体の結合は、抗体がポリペプチドに特異的に結合することを示唆する。
【００６３】
他の実施形態において、リポータ粒子は、生細胞であってもよく、この場合、識別可能な任意の検出可能な信号が、例えば、ａ）マイクロドロップの製造前に、細胞に充填される識別可能な生存色素、ｂ）細胞により差次的に発現される細胞表面マーカの差次的標識化、ｃ）細胞により生成された識別可能なリポータタンパク質、またはｄ）形質転換ビーズ、量子点、もしくは金属粒子からであってもよい。これらの粒子は、顕微鏡を介して各細胞内で検出されて解読され、これによって、報告される細胞の混合された集団における細胞の種類を明らかにする。
【００６４】
一実施形態において、識別可能なリポータタンパク質が採用されてもよく、該リポータタンパク質は、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、または蛍光輝度を強化することにより得られるＥＣＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＲＦＰ、ＥＢＦＰの変異体を含む、それらの任意の変異体からであってもよい。このようなリポータタンパク質は、例えば、オワンクラゲ、イソギンチャク、ウミエラ、またはウミシイタケＧＦＰの蛍光タンパク質由来であってもよく、該タンパク質はよく知られている。代替的に、ルシフェラーゼファミリータンパク質に基づく誘導体は、最も一般的には、ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）およびウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）であるが、顕微鏡画像化環境で検出可能である発光信号を生成できる。別の実施形態において、リポータ遺伝子は、直接、蛍光または発光信号を生成しないが、むしろ、酵素的に、非蛍光基質を蛍光産物に変換する。一般的に使用される酵素は、Ｂ−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、Ｂ−グルクロニダーゼ、Ｂ−ラクタマーゼ、クロラムフェニコロールアセチル基転移酵素を含む。蛍光および発光検出のための多彩な基質は、商業的に入手可能である（Ｓｉｇｍａ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。リポータタンパク質は、構成または誘導性プロモータに操作可能に連結される核酸によってコードされてもよい。一実施形態において、また、以下により詳細に説明されるように、エフェクタ分子によるリポータタンパク質の発現の変化は、エフェクタ分子が誘導性プロモータの発現を調節することを示唆する場合、リポータタンパク質の発現は、誘導性プロモータによって引き起こされる。別の実施形態において、融合タンパク質がリポータタンパク質領域と、細胞タンパク質からの領域とを含有する場合、リポータは、融合タンパク質として生成されてもよい。
【００６５】
別の実施形態において、検出分子は、外来性であり、アッセイの過程でリポータ細胞に添加され、外来遺伝子の発現を必要としない。これらの検出素子は、生細胞内に自由に通過する小分子であってもよく、細胞の生理的状態によって、検出可能な産物に変換されても、されなくてもよい。例としては、１）カスパーゼによる切断時に蛍光になるクマリンの誘導体で、アポトーシス状態を示すＡＦＣ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、２）細胞内カルシウム増加の検出のため、および細胞活性化を示すＦｕｒａ−２、３）細胞増殖検出のための蛍光ヌクレオチド類似体、４）ＤＮＡ結合時のみに蛍光を発し、ＤＮＡ含有量および細胞増殖の測定にも使用されるＳＹＴＯ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。膜透過性分子に加え、抗体等の巨大分子は、標識化され、特定の細胞状態と相関する細胞表面リポータのプローブとして使用され、例えば、抗アネキシンＶは、アポトーシス状態前のプローブに使用され得、存在する抗フィブロネクチンは、ケモタキシスのプローブとして使用され、細胞外マトリックスにおいてフィブロネクチンを検出する。抗体プローブは、例えば、増殖、活性、およびｃｄｃ６タンパク質、ＨｕＲ、およびＤサイクリンを含む細胞周期調節の細胞内マーカを検出するためにも使用され得る。細胞内標的に向けられる巨大分子プローブの使用は、リポータ細胞の透過処理を必要とする。
【００６６】
上述のリポータビーズにおいて、第１および第２の細胞リポータ粒子は、ある意味、それぞれ異なってもよいため、エフェクタ分子の特異性は、細胞リポータ粒子を比較することにより評価され得る。例えば、一実施形態において、リポータ細胞の１つは、他の細胞が欠損する、細胞表面リポータを含有してもよく、受容体のシグナル形質導入下流と特異的に相互作用するか、またはそれを調節するエフェクタ分子の同定を可能にする。細胞表面リポータとしては、ＧＤ２、ＥＧＦ−Ｒ、ＣＥＡ、ＣＤ５２、ＣＤ２０、Ｌｙｍ−１、ＣＤ６、補体活性化受容体（ＣＡＲ）、ＥＧＰ４０、ＶＥＧＦ、腫瘍関連糖タンパク質ＴＡＧ−７２ＡＦＰ（アルファ−フェトタンパク質）、ＢＬｙＳ（ＴＮＦおよびＡＰＯＬ関連リガンド）、ＣＡ１２５（癌抗原１２５）、ＣＥＡ（癌胎児抗原）、ＣＤ２（Ｔ−細胞表面抗原）、ＣＤ３（ＴＣＲと関連するヘテロ多量体）、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ（インテグリンアルファ−Ｌ）、ＣＤ１４（単球分化抗原）、ＣＤ２０、ＣＤ２２（Ｂ−細胞受容体）、ＣＤ２３（低親和性ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２５（ＩＬ−２受容体アルファ鎖）、ＣＤ３０（サイトカイン受容体）、ＣＤ３３（骨髄細胞表面抗原）、ＣＤ４０（腫瘍壊死因子受容体）、ＣＤ４４ｖ６（白血球の媒介付着）、ＣＤ５２（ＣＡＭＰＡＴＨ−１）、ＣＤ８０（ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の共刺激分子）、補助構成要素  Ｃ５、ＣＴＬＡ、ＥＧＦＲ、エオタキシン（サイトカインＡ１１）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＲ１０、ＨＬＡクラスＩＩ、ＩｇＥ、ＧＰｉｉｂ／ｉｉｉａ（インテグリン）、インテグリンａＶβ３、インテグリンａ４β１およびａ４β７、インテグリンβ２、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６Ｒ（ＩＬ６受容体）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）、ルイスＹ、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１８、ＮＣＡＭ（神経性細胞接着分子）、癌胎児性フィブロネクチン、ＰＤＧＦβＲ（ベータ血小板誘発成長因子受容体）、ＰＭＳＡ、腎癌抗原Ｇ２５０、ＲＳＶ、Ｅ−セレクチン、ＴＧＦｂｅｔａ１、ＴＧＦｂｅｔａ２、ＴＮＦα、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ６、ＶＡＰ−１（血管接着タンパク質１）、およびＶＥＧＦ等のものが挙げられる。
【００６７】
別の実施形態において、リポータ細胞の１つは、他のリポータ細胞が欠損する転写因子を含有してもよく、これによって、そのプロモータを特異的に調節するエフェクタ分子が同定されることを可能にする。別の実施形態において、エフェクタ分子による唯一１つのプロモータの活性が、エフェクタ分子がそのプロモータを特異的に調節することを示唆する場合、第１および第２のリポータ細胞は、異なるプロモータの連結される認識可能な蛍光リポータタンパク質を含有してもよい。別の実施形態において、第１のリポータ細胞は、分解がエフェクタ粒子により生成されるプロテアーゼ阻害因子によって阻止されなければ、蛍光タンパク質を分解できるプロテアーゼを同時発現する。
【００６８】
高分子マトリックスは、例えば、アガロース（Ｗｅａｖｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９１  ２：２３４−２４７に記載のとおり）、ガラゲナン、アルギン酸、アルギン酸−ポリリジン、コラーゲン、植物由来ガム、セルロースもしくはその誘導体（例えば、メチルセルロース）、ゼラチン、キトサン、またはＫｌｅｉｎｍａｎ（米国特許第４，８２９，０００号）に記載されるように、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）であってもよい。適切な合成ヒドロゲルは、ポリビニルアルコール、エチレン−ビニルアルコールのブロック共重合体、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム、塩化ビニル−メチル−トリベンジルアンモニウム、およびポリホスファゼン（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１２，ｐｐ．７８３２−７８３３（１９９０））を含む。Ｐｏｗｅｌｌ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１９９０  ８：３３３−３３７）は、抗体を使用して、マイクロドロップ中のタンパク質を検出するための方法を提供する。
【００６９】
一般的な用語において、対象とするゲル状マイクロドロップは、ａ）粒子含有組成物を生成するように、上述のように、エフェクタ粒子、第１のリポータ粒子、および第２のリポータ粒子と高分子の単量体を混合することにより、ｂ）粒子含有組成物の液滴を作製することにより、およびｃ）液滴の単量体を重合することにより作製されてもよい。関連する組成物を生成するための方法は、米国特許第４，３９９，２１９号、第４，４０１，７５５号、第４，４０９，３３１号、第４，６４３，９６８号、第４，６４７，５３６号、第４，８０１，５２９号、第４，９５９，３０１号、第６，４２６，０８８号、第６，５８６，１７６号、第６，８０６，０５８号、第７，０１１，９５７号、第７，２９７，５３８号、および第７，４８２，１５２号、ならびにＢｏｇｅｎ（Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ２００１  １６０：５−１０）、Ｄｅｍｉｒｃｉ（Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ  ２００７  ７：１１３９−４５）Ｅｄｄ（Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ  ２００８  ８：１２６２−４）、Ｇｉｆｔ（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９６  １４：８８４−７）、Ｇｉｆｔ（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ２０００  ３９：２４３−９）、Ｇｏｇｕｅｎ（Ｎａｔｕｒｅ  １９９３  ３６３：１８９−９０）、Ｇｒａｙ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９５  １８２：  １５５−６３、Ｌｉｎｇ（Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ  ２００７  ７：７５６−６２）、Ｍａｃｉｓ（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００７  １６１：８８−９５）、Ｐｏｗｅｌｌ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９０  ８：３３３−７）、Ｕｌｕｄａｇ（Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２０００  ４２：２９−６４）、Ｗｅａｖｅｒ（Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９７  ３：５８３−５）Ｗｅａｖｅｒ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９１  ９：８７３−７）およびＺｅｎｇｌｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００２  ９９：１５６８１−６）に記載されており、これらの文献は、これらの方法の開示において、本明細書に援用される。これらの文献に記載される方法は、本明細書の使用において、容易に適用され得る。
【００７０】
上述のように、対象とするマイクロドロップは、単一エフェクタ粒子および複数のリポータ粒子を含有してもよい。エフェクタおよびリポータ粒子の数は、Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．およびＷｅａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９１  ９：８７３−８７７）に記載されるように、ポアソン統計によって管理されてもよい。乳化プロセス中、粒子は、新生マイクロドロップ中にランダムに分散される。実質的に全ての粒子がマイクロドロップに埋め込まれるため、粒子の数がマイクロドロップの数を超えても、各マイクロドロップは、平均して、＞１粒子を含有してもよい。同様に、マイクロドロップの数が粒子の数を超える場合、各マイクロドロップは、平均して、＜１粒子を含有してもよい。概して、本明細書に記載されるいくつかの方法において、本構成は、受容体粒子／細胞に作用してもよい単一の種類のエフェクタ分子を生成し、したがって、複数の種類のエフェクタ分子がマイクロドロップに存在する場合よりも、より解釈可能である結果を生じるため、マイクロドロップ当り正確に１つのエフェクタ粒子を有することが望ましい。いくつかの場合、マイクロドロップは、経時的な成長を可能にするエフェクタ細胞を含有してもよく、結果として、マイクロドロップ当り複数のエフェクタ細胞をもたらす。この場合、細胞は、元がクローンであり、したがって、一種類のエフェクタ分子のみを生成する。リポータ粒子に関して、一方で、各マイクロドロップ内に含有される各種類の複数メンバを有することが望ましい。マイクロドロップ当り５〜２０のリポータ粒子が、エフェクタ分子作用の統計的に有意な読出しには理想的であり得る。マイクロドロップの様々な粒子／細胞の種類の正しい充填は、顕微鏡によって確認され得る。
【００７１】
スクリーニングの方法
対象とするマイクロドロップを用いるスクリーニングの方法を提供する。一般的な用語において、スクリーニング方法とは、同じエフェクタ粒子を含有しない対照ゲル状マイクロドロップと比べ、対象とするゲル状マイクロドロップ組成物の第１および第２のリポータ粒子の１つと局在される光学的に検出可能な信号の変化の検出に関与する。特定の実施形態において、該方法は、第１または第２の光学的に検出可能な信号の１つへのエフェクタ分子の作用の検出に関与する。他の実施形態において、該方法は、第１および第２の光学的に検出可能な信号と区別でき、リポータ粒子の１つと局在される、第３の光学的に検出可能な信号へのエフェクタ分子の作用の検出に関与してもよい。第３の光学的に検出可能な信号は、例えば、ａ）（例えば、変化が、第１または第２のリポータ粒子との標識化されたエフェクタ分子によって生成される第３の光学的に検出可能な信号の共局在であり、エフェクタ分子が、第１または第２のリポータ粒子の１つと結合することを示唆する場合）、第３の光学的に検出可能な信号を用いた、エフェクタ分子を標識化することによって、またはｂ）（例えば、変化が、細胞によって生成された蛍光リポータタンパク質の発現もしくは局在の変更、または細胞によって取り込まれた蛍光色素の増加である場合）、細胞リポータ粒子のリポータによって、生成されてもよい。つまり、変化は、リポータ粒子の１つとの第３の光学的に検出可能な信号の共局在として、（特定の実施形態において、抗体が、リポータ粒子に結合されることを示唆してもよい）リポータ粒子の１つまたは両方と局在される第３の光学的に検出可能な信号の変化として、または変化が、信号の増加、信号の減少、信号の細胞レベル下の分布の変化、信号領域の増大または減少等であってもよい場合の、第１または第２の光学的に検出可能な信号の変化として検出されてもよい。
【００７２】
或る場合において、リポータ粒子へのエフェクタ分子の結合は、例えば、エフェクタ分子を認識する標識化された抗体を使用して検出されてもよい。例えば、エフェクタ分子が第１の動物種（例えば、マウス）からの抗体である場合、リポータ粒子へのマウス抗体の結合は、別の動物種（例えば、ヤギ）からの標識化された抗体を使用して検出されてもよい。このように、一実施形態において、スクリーニング方法は、標識化された抗体が第３の信号を発生し、該第３の信号が第１および第２の信号と区別できる場合、エフェクタ分子に特異的に結合する標識化された抗体を使用してエフェクタ分子の結合を検出することをさらに含む。
【００７３】
特定の実施形態において、マイクロドロップのリポータ細胞は、生理的反応を促す条件に曝されてもよく、マイクロドロップは、エフェクタ粒子が反応を誘発するか変化させるかを判断するためにアッセイされる。例示的な一実施形態において、条件は、例えば、アポトーシス経路を強化する（例えば、受容体が１つのリポータ粒子に存在するが、他には存在しない場合）、受容体のリガンド、または化合物もしくは薬物の付加であってもよい。他の実施形態において、マイクロドロップは、リポータ細胞で増殖作用を生成するエフェクタをスクリーニングしてもよく、したがって、条件は、栄養分および成長因子等の培地で、構成要素の補助を必要とする場合がある。他の実施形態において、マイクロドロップは、既知のシグナル伝達経路への阻害作用を生成するエフェクタをスクリーニングしてもよい。このような場合、条件は、マイクロドロップを完全反応を誘発するために必要な全ての構成要素に曝露し、完全反応の生成に失敗したリポータ細胞含有マイクロドロップをスクリーニングすることであってもよい。
【００７４】
特定の実施形態において、ライブラリの個々のマイクロドロップは、（例えば、ＤＡＰＩ、フルオロセイン、およびローダミン、または蛍光マーカが使用されるいずれかに三重帯域フィルタを使用することによって等）検出される信号に適切な帯域フィルタを使用する蛍光顕微鏡を使用して評価されてもよい。特定の実施形態において、該方法は、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）を採用する、または採用しない。特定の場合において、リポータ粒子からの信号を特定のマイクロドロップに関連付けすることが重要である場合があり、このように、特定の実施形態において、位相または明視野像のオーバーレイが、各マイクロドロップの境界を画定するために使用される。他の実施形態において、エフェクタ機能の稀なプロファイルのために、多数のマイクロドロップ（＞１０００万）をスクリーニングすることが望ましい。このような場合において、単一色チャネル（例えば、第３の信号のチャネル）で、低倍率で一次画像化を実施した後、選択された位置のみで、高倍率および全色チャネルで、二次画像化を実施することが必要である場合がある。
【００７５】
特定の実施形態において、マイクロドロップは任意に区分され、各個別のリポータ粒子が分析され得るように、マイクロドロップの画像は再構築されてもよい。特定の場合において、これは、ｚ軸情報の維持と、３Ｄ画像としてマイクロドロップの分析を必要とするか、または、マイクロドロップの各粒子の最適な焦点を有する単一２Ｄ画像を発生するように画像の積み重ねの平坦化を必要としてもよい。これらの操作を実施し、必要な測定を収集するための画像化ツールは、様々な供給源から商業的に入手可能なソフトウエアパッケージの形態で存在する。特定の場合において、異なるエフェクタ粒子を含有するマイクロドロップのリポータ粒子を比較して、信号に大きな差異があるかを判断するために、第１のリポータ粒子から得られた結果は、第２のリポータ粒子から得られた結果と比較されてもよい。
【００７６】
いくつかの実施形態、および上述において、ライブラリのマイクロドロップは、複数の容器および容器のそれぞれが複数のマイクロドロップを含有する、異なる容器に存在する場合がある。一実施例において、マイクロドロップは、マイクロタイタープレート中に存在してもよい。これらの実施形態において、個別の容器のマイクロドロップが分析されてもよく、容器中の各マイクロドロップの位置は、例えば、生体活性エフェクタ分子を生成するエフェクタ粒子を含有するマイクロドロップ等の、個別のマイクロドロップが同定され、後に回収され得るように、記録されてもよい。
【００７７】
特定の実施形態において、マイクロドロップのライブラリは、生体活性エフェクタ分子を生成するエフェクタ粒子を含有するマイクロドロップを同定するように、上に概説する方法を使用してスクリーニングされる。生体活性エフェクタ分子を生成するマイクロドロップエフェクタ粒子の同定は、例えば、粒子がビーズの場合、光学バーコードを同定することによって、または単離されたマイクロドロップからのエフェクタ粒子を分析することによって判断されてもよい。一実施形態において、マイクロドロップ中の生体活性エフェクタ分子の同定は、マイクロドロップを回収し、例えば、ＰＣＲによって、リポータ粒子の光学信号に変化を生じる分泌タンパク質をコードする核酸を増幅することによって判断されてもよい。特定の実施形態において、指標細胞は、一部が、例えば、ＰＣＲによって、またはｃＤＮＡクローン化によって、生化学または分子手段のいずれかを使用してエフェクタ分子を同性するために使用され得る細胞培養を生成するように単離および培養されてもよい。
【００７８】
画像化環境からの選択されたマイクロドロップの同定および回収という観点において、コンピュータ誘導アドレス指定システムが、所望のマイクロドロップのｘｙｚ空間での正確な位置を判断するため、および該マイクロドロップのライブビデオ視覚化のために採用されてもよい。これらの条件下で、マイクロドロップは、手動分注器またはロボット制御微調整装置を用いて物理的に単離され、別のウェルに移動され得る。一実施形態において、単離されたマイクロドロップは、単一エフェクタ細胞（例えば、Ｂリンパ球）を含有し、ｍＲＮＡは、本単一細胞から単離され、ｃＤＮＡが調製される。本ｃＤＮＡは、対象とするエフェクタ分子をコードする遺伝子（例えば、免疫グロブリン領域）を増幅するＰＣＲ反応のテンプレートとなる。別の実施形態において、単離されたマイクロドロップは、被包された細胞を放出するために、（例えば、アガラーゼを用いて）溶解され、ＰＣＲが上述のように実施され得た後の限られた時間期間の間、エフェクタ細胞の生存率および成長を促進するように条件が満たされる。別の実施形態において、不確定に、エフェクタ細胞の生存率および成長を促進するように条件が満たされる。別の実施形態において、エフェクタ細胞は、不死化型（例えば、ハイブリドーマ）であるため、単離されたマイクロドロップが溶解され、エフェクタ細胞が放出される時に、不確定に成長する。
【００７９】
例示的な一実施形態において、エフェクタ粒子は、各ビーズが異なる候補物質に連結され、第１および第２のリポータ粒子が、異なるプロモータを使用して生成される識別可能な蛍光タンパク質を含有する細胞である、異なる候補物質に接続可能に連結されるビーズである。候補物質はエフェクタ粒子から切断され、単一マイクロドロップ内で、第２のリポータの蛍光タンパク質ではなく、第１のリポータ粒子での蛍光タンパク質の誘発は、エフェクタ粒子によって生成された候補物質が、第１のリポータタンパク質の発現を促進するプロモータを特異的に誘発することを示唆する。
【００８０】
別の例示的な実施形態において、エフェクタ粒子は、各ビーズが異なる候補物質に連結され、第１および第２のリポータ粒子が、同じプロモータを使用して生成される識別可能な蛍光タンパク質を含有する細胞である、異なる候補物質に接続可能に連結されるビーズである。リポータは、第１のリポータ細胞が特定の受容体を含有し、第２のリポータ細胞がその受容体を含有しないという点で異なる。リポータ細胞は、他のリポータタンパク質から識別可能である、第３のリポータタンパク質の発現のための構築物も含有する。候補物質はエフェクタ粒子から切断可能であり、単一マイクロドロップ内で、第１リポータ粒子のみとの第３の蛍光タンパク質の共局在は、エフェクタ粒子によって生成される候補物質が、第３のリポータタンパク質の発現を促進するプロモータを特異的に誘発することを示唆する。
【００８１】
さらなる例示的な実施形態において、エフェクタ粒子は、抗体産生細胞であり、リポータ粒子は、識別可能に標識化されたビーズである。第１のリポータ粒子は、その表面に結合される特定のリポータを含有するが、第２のリポータ粒子はそれを含有しない。第１リポータ粒子のみとの抗体の共局在は、抗体が受容体に結合することを示唆する。
【００８２】
別の例示的な実施形態において、エフェクタ粒子は、抗体産生細胞であり、リポータ粒子は、細胞によって発現されるリポータタンパク質により識別可能に標識化される細胞である。第１のリポータ細胞は、アポトーシスに関連する表面結合受容体（例えば、ＦＡＳ受容体またはＴＮＦＲ）を含有するが、第２のリポータ細胞はそれを含有しない。マイクロドロップは、生存色素（例えば、ＨＯ３４２）を用いてインキュベートされ、第１のリポータ細胞によって取り込まれた色素の増加は、抗体産生細胞によって生成された抗体が受容体との相互作用を介してアポトーシスを誘発することを示唆する。代替的な実施形態において、マイクロドロップは、アポトーシスに関連する表面結合受容体（例えば、可溶性ＦＡＳリガンド、またはＴＮＦα）のリガンドの存在下で、生存色素（例えば、ＨＯ３４２）を用いてインキュベートされ、第１のリポータ細胞によって取り込まれた色素の減少は、抗体産生細胞によって生成された抗体がアポトーシスを阻害することを示唆する。さらに、ＰＩまたは７−ＡＡＤ等の色素は、色素排除によって無傷膜を依然として有する初期のアポトーシス細胞から、膜統合を欠損した後期アポトーシスまたは壊死細胞を区別するために採用されてもよい。これらのアッセイは、任意の受容体および任意の表現型とともに使用するために容易に適合することができる。
【００８３】
生体活性受容体は、同定されると、試験され、研究および医薬での実際の用途に使用され得る。具体的には、記載される組成物および方法は、例えば、遺伝子発現、アポトーシス、信号形質導入、受容体の活性化、細胞分裂、脱顆粒、または任意の他の検出可能な細胞表現型を変化させるエフェクタ分子を同定するために使用され得る。
【実施例】
【００８４】
以下の実施例は、具体的な実施形態および本発明の態様を例証し、さらに図示するために提供され、その範囲を制限するものではない。
【００８５】
実施例１
多構成要素ゲル状マイクロドロップの組成物の管理
３７℃で、１インチの攪拌棒を用いて、２０００ｒｐｍで３０ｍｌのビーカー中で１６ｍｌのジメチルポリシオロキサン（２００ｃＳｔ，Ｓｉｇｍａ）を攪拌することによって、Ｇｒａｙ  ｅｔ  ａｌ（ＪＩＭ  １９９５）に記載されるプロトコルに従い、マイクロドロップを作製した。攪拌中、３７℃で、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）および２％の低ゲル化点アガロース（Ｓｉｇｍａ  Ｔｙｐｅ  ＩＸ）中の粒子の６００μｌ懸濁液を添加し、乳濁液を作製した。２分間攪拌した後、攪拌を２分間継続しながら、乳濁液を氷上で冷却した。本ステップは、マイクロドロップを凝固させる。次いで、５０ｍｌの三角管の２０ｍｌのＰＢＳ上に乳濁液を上塗りし、１０分間、１０００ｒｐｍで遠心分離した。これらの条件下で、マイクロドロップを管の底でペレット状にし、ＰＢＳで、２回、再洗浄する。次いで、マイクロドロップを、１ｍｌのＰＢＳで再懸濁し、分析のため、チャンバスライドまたはマイクロウェルに移動する。
【００８６】
５×１０５赤色ビーズ、１×１０５青色ビーズ、および２×１０４緑色ビーズを用いて、マイクロドロップを上述のように調製した。全ビーズの大きさは６μｍであった。マイクロドロップは、明視野顕微鏡により判断されるように、平均すると約１５０μｍの直径であった。図２に示す全画像は、Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩ６０００顕微鏡で捕捉した。３つの蛍光チャネル（赤、緑、および青）のそれぞれのＺスタックを収集し、平坦化し、グレースケール画像として表示した。画像は、予想されたビーズ比でマイクロドロップの組成物を示唆する。
【００８７】
実施例２
単一のエフェクタおよび複数のリポータを含有するマイクロドロップ
２×１０４ハイブリドーマ細胞、１×１０５赤色ビーズ、および１×１０５青色ビーズを用いて、実施例１で記載するように、マイクロドロップを調製した。図３に示す全ての画像は、Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩ６０００顕微鏡で捕捉した同じ視野である。赤および緑蛍光チャネルのｚスタックを収集し、平坦化し、グレースケール画像として表示した。明視野ｚスタックも収集され、図３．１、図３．２、および３．３に示す単一ハイブリドーマ細胞を含有するスライスは、それぞれ、リポータ１を表す、赤色チャネル上の３つの共被包ビーズ、およびリポータ２を表す、青色ビーズ上の７つの共被包ビーズを示す。
【００８８】
実施例３
マイクロドロップ内の抗体特異性アッセイの例証
ヒトカッパ免疫グロブリン軽鎖を結合することで知られる抗体を生成する、マウスハイブリドーマであるクローン１４１ＰＦ１１（ＡＴＣＣ）を、２つのリポータビーズ種類と共に、マイクロドロップに共被包する。リポータ１は、４．０μｍ赤色ポリスチレンビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｆ８８５８）を精製したヒト軽鎖（Ｓｉｇｍａ，Ｋ３３８８）で被覆することにより調製され、リポータ２は、精製したヒトラムダ鎖（Ｓｉｇｍａ，Ｌ０６６５）で被覆される青色４．０μｍポリスチレン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｆ８８５４）ビーズである。マイクロドロップを２時間、組織培養培地中で、３７℃でインキュベートし、ハイブリドーマから抗体を分泌させ、リポータに結合する。マイクロドロップを洗浄し、抗体を検出し、ヤギ抗マウスＦＩＴＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｆ−２７６１）を１時間で２０μｇ／ｍｌのマイクロドロップ懸濁液を添加する。マイクロドロップを洗浄し、画像化のため、マイクロウェルに設置する。ハイブリドーマ１４１ＰＦ１１から分泌された抗体は、リポータ２ではなく、リポータ１に結合する。本結合事象は、ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＦＩＴＣ）ポリクローナル抗体によって検出される。本ハイブリドーマを含有するマイクロドロップは、青色および緑色信号の共局在と比べ、赤色および緑色信号の強化された共局在によって区別される。カッパ鎖ではなく、ラムダに結合する抗体を生成し、上述のように同じマイクロドロップ調製および条件に従う、別のハイブリドーマであるクローンＨＰ６０５４（ＡＴＣＣ）は、赤色ではなく青色ビーズとの緑色信号の共局在を示す。カッパともラムダとも結合しない抗体を生成する、第３のハイブリドーマは、いずれのビーズ種類との緑色信号の共局在を示さない。
【００８９】
実施例４
新規種におけるアイソタイプ特異的モノクローナル抗体の生成
ヒトカッパ鎖でニワトリを免疫化する。２週間後、抗原で追加免疫する。４日後、１０００万の末梢血リンパ球を単離し、実施例３で記載するように、リポータビーズを用いてマイクロドロップに共被包する。ヤギ抗ニワトリＩｇ（ＦＩＴＣ）を用いてマイクロドロップをインキュベートし、背景より上の有意な任意の緑色信号を低倍率でスクリーニングする。これらの位置を記録し、リポータビーズ上の共局在を解析するために高倍率下で再画像化する。所望の抗カッパプロファイル（赤色＋緑色共局在のみ）を生成するリンパ球を含有するマイクロドロップを、手動分注器を用いて画像化プレートから除去し、新しいウェルに移動する。ゲル状マトリックスをアガラーゼを用いて溶解し、解放されたリンパ球を適切なニワトリサイトカインの存在下で、１〜２週間、培養した。これらの培養した細胞からｃＤＮＡを作製し、Ｖ遺伝子をＰＣＲにより増幅し、発現ベクターにクローン化する。プラスミドＤＮＡをＣＨＯ細胞に形質移入し、組換え抗体を発現させ、精製し、ヒトカッパ鎖と反応することを確認する。
【００９０】
実施例５
脾臓胚中心細胞からのモノクローナル抗体の生成
１ｍｇのヒトカッパ軽鎖の静脈注射により、ニワトリを免疫化する。６日後、脾臓を採取し、５ｍｌの氷冷組織培養培地を含むプラスチックのペトリ皿に胚中心を単離する。微細なピンセットを使用して、脾臓部から脾膜をそっと剥離し、髄組織を周囲培地に引き出す。次いで、動脈骨組みおよび関連する胚中心を採取して、Ｂ細胞を得る。実施例３に記載するように、リポータビーズを用いて、Ｂ細胞をマイクロドロップに共被包し、ニワトリＢ細胞の増殖を誘発するＣＤ４０Ｌ等のサイトカインの存在下で、１０日間、成長させる。次いで、ヤギ抗ニワトリＩｇ（ＦＩＴＣ）を用いて、マイクロドロップをインキュベートし、背景より上の有意な任意の緑色信号を低倍率でスクリーニングする。所望の抗カッパプロファイル（赤色＋緑色共局在のみ）を生成するリンパ球を含有するマイクロドロップを、手動分注器を用いて画像化プレートから除去する。これらの選択されたエフェクタ細胞からｃＤＮＡを作製し、それらのＶ遺伝子をＰＣＲにより増幅し、次いで発現ベクターにクローン化する。プラスミドＤＮＡをＣＨＯ細胞に形質移入し、組換え抗体を発現させ、精製し、ヒトカッパ鎖と反応することを確認する。
【００９１】
実施例６
アポトーシス標的に対するアゴニスト抗体の同定
アポトーシス経路の誘発に関与することで知られるタンパク質である、精製された組換えＤＲ４（デスレセプタ４、またはＴＲＡＩＬ−Ｒ１）を用いて、ニワトリを免疫化する。特定の腫瘍由来細胞株において、ＤＲ４は、天然リガンド、ＴＲＡＩＬを通して、または該リガンドを模倣する抗体を通して係合され得る。ＤＲ４免疫化ニワトリからのリンパ球は、リポータ１、ヒトリンパ種細胞株Ｂ９、およびリポータ２、正常ヒト血管内皮細胞（ＶＥＣ）を用いて共被包される。リポータ１およびリポータ２は、それぞれ、赤色および青色生存色素を用いて標識化される。明るい蛍光緑に染色する細胞不透過色素であるＳＹＴＯＸ色素を含有する培地で、ＤＮＡをインキュベートする。非アポトーシス細胞は色素を吸収しないが、アポトーシス細胞は色素を吸収する。したがって、癌細胞で選択的にアポトーシスを誘発する、所望の作用を有する抗体は、リポータ１と共局在する緑色信号を発生するが、リポータ２は発生しない。このようなマイクロドロップからの抗体遺伝子は、実施例４のように回収される。
【００９２】
実施例７
新規標的に対する生理活性抗体の同定
リンパ腫細胞株Ｂ９の全細胞または膜画分を用いて、ウサギを免疫化する。アポトーシスアッセイに基づくマイクロドロップを実施例６のように実施する。アポトーシス促進性抗体を回収し、標的細胞表面分子を同定する。
【００９３】
実施例８
ＧＰＣＲに対するアゴニスト抗体
ニワトリを免疫化するために、ドーパミン受容体ＤＲＤ１を過剰発現する形質移入２９３細胞を使用し、リポータ細胞を用いて免疫化したリンパ球を共被包するように生成した。リポータ１は、ＤＲＤ１およびＣＲＥ反応性要素に作動可能に連結されるＧＦＰ遺伝子を発現する２９３細胞である。リポータ２は、同じＧＦＰを含有するが、ＤＲＤ１を発現しない２９３細胞である。リポータ１および２は、それぞれ、赤色および青色生存色素によって区別される。ＤＲＤ１受容体が活性化される時、信号形質導入は、ＧＦＰ導入遺伝子を含む、ＣＲＥ連結遺伝子を最終的に活性化する、アルファ−ｓ  Ｇタンパク質サブユニットを通して生じる。したがって、ＤＤＲ１の特異的アゴニストとして作用する抗体が生成される時、リポータ１は、緑色蛍光を発生し、リポータ２は、緑色チャネルで暗い。異なる機構を通して信号伝達できる非ＤＤＲ１抗体の場合において、リポータ１および２の双方が、緑色蛍光を発生する。非反応性抗体は、いずれのリポータにおいても緑色信号を生成しない。
【００９４】
実施例９
細菌性発現セクレトームライブラリ
神経幹細胞から単離されるヒト遺伝子のライブラリは、ニューロンの成長を促進できる新規因子を発見する目的で、大腸菌発現ベクターにクローン化される。本ライブラリのメンバは、マイクロドロップ当り＜１細菌細胞で、微小マイクロドロップ（例えば３０μｍ）中に植え付けられる。マイクロドロップを細菌成長培地中に設置し、各マイクロドロップを内に小さなコロニーを形成するように拡大させる。これらのマイクロドロップは、これで、リポータ１として赤色生存色素で充填される非分裂神経細胞、およびリポータ２として青色色素で充填される非分裂線維芽細胞を含有するより大きなマイクロドロップのエフェクタ粒子として使用される。マイクロドロップは、ＦＩＴＣ−ｄＮＴＰの存在下で、哺乳類細胞培養培地で培養される。マイクロドロップは、青色および緑色ではなく、赤色および緑色信号の共局在をスクリーニングする。このようなプロファイルは、潜在的な神経特異的成長因子が、共被包細菌コロニーによって生成されることを示唆する。本コロニーを回収し、発現遺伝子を特徴付けする。
【符号の説明】
【００９５】
１：ゲル状マイクロドロップ組成物
３：高分子マトリックス
５：エフェクタ粒子
７：エフェクタ分子
９：第１のリポータ粒子
１１：第２のリポータ粒子
１３：変化した第１のリポータ粒子１３
【図１】
0005737707.tif 000002
【図２】
0005737707.tif 000003
【図３】
0005737707.tif 000004