(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユーカリプタス属植物の代謝産物であって、高速液体クロマトグラフタンデム質量分析法において、
液体クロマトグラフィーでのアセトニトリルの時間的な連続濃度勾配を0分3％〜6.3分70％で形成させたときに下記表１で示す保持時間で分離され、かつ
質量分析でのプリカーサーイオン及びプロダクトイオンの質量電荷比が下記表１で示す
値で特定されるマーカーNo.1〜5で示されるいずれか一のユーカリプタス属植物のホウ素充足度判定用マーカー。
【表１】
0005737098.tif 000006
【請求項２】
ユーカリプタス属又はその雑種の植物体におけるホウ素の充足度を判定する方法であって、
ユーカリプタス属の種又はその雑種である被検植物の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出する抽出工程、
前記抽出工程で得られた抽出物中に含まれる請求項１に記載の少なくとも一のホウ素充足度判定用マーカーの蓄積量を測定する測定工程、
前記測定工程で得られた蓄積量に基づいて、前記被検植物におけるホウ素の充足度を判定する判定工程
を含む、前記方法。
【請求項３】
前記判定工程において、ホウ素の充足度を、被検植物と、ホウ素欠乏状態のユーカリプタス属の種又はその雑種である対照植物のそれぞれから得られるホウ素充足度判定用マーカーの蓄積量の比較したときに、被検植物におけるホウ素充足度判定用マーカーの蓄積量が対照植物における蓄積量以上あるときには、その被検植物におけるホウ素が不足状態にあると判定する、請求項２に記載の判定方法。
【請求項４】
請求項２又は３に記載の判定方法を用いて、その判定結果に基づいてユーカリプタス属の種又はその雑種である被検植物を植栽する土地へのホウ素の施肥を決定するホウ素施肥方法。
【請求項５】
判定結果でホウ素が不足状態にあると判定された場合には、その被検植物へのホウ素施肥量を判定直前の量よりも増やす、請求項４に記載のホウ素施肥方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物におけるホウ素の充足状態を判定するためのマーカー及びそれを用いたホウ素充足度判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の栄養素としては、三大栄養素と呼ばれる窒素、リン及びカリウムが最もよく知られているが、その他にも植物の生育上必須の栄養素として、多数の微量元素が知られている。そのような微量元素の一つにホウ素がある。
【０００３】
ホウ素は、植物においてリグニンやペクチンの形成や糖の移行に関係する元素と考えられており、必要量は少ないものの、その欠乏は、植物の分裂組織や形成層に異常を引き起こすことが知られている。したがって、根端や茎頂を中心とした植物の正常な生長には、ホウ素を必要時に過不足なく適切に与えることが極めて重要となってくる。
【０００４】
東南アジア等の多雨地域等では、土中のホウ素が降雨によって流出するため、ホウ素の欠乏による植物の生長不良が農林業上の大きな問題となっている。一般に、ホウ素が不足又は欠乏すると、新芽が枯死する、根が短くなる、樹高が低い、葉の数が少ない等の諸症状が現れることが知られている。したがって、植物にこのような外的症状が生じる土地では、ホウ素を施肥する等の対策をとる必要がある。
【０００５】
しかし、前記地域では、植物の生長不良がホウ素以外の様々な要因によっても引き起こされるため、植物の外的症状のみからその原因がホウ素の欠乏であると判断することは難しい。それ故、植物におけるホウ素の充足度を正確に判定できる技術があれば、その結果に応じて適切なホウ素の施肥を行うことが可能となり、植物の生長をより促進させることができる。
【０００６】
従来、農林業分野でのホウ素充足度管理は、土壌中のホウ素量を測定する方法（非特許文献１）によって行われてきた。ところが、ホウ素を含む各種栄養素の取り込みは、一般に土壌中の水分が媒介するため、その取り込み量は、土壌中の水分量に大きく影響されることとなる。それ故、この方法は、土壌という間接的な場におけるホウ素含有量を測定する方法であって、植物が実質的に利用可能なホウ素を測定するものではない。したがって、その土壌で生育する植物において、ホウ素が充足しているのか欠乏しているのかを正確に反映しているとは言えず、普遍的に利用できる方法とは言い難い。
【０００７】
上記のように、これまで植物のホウ素充足度を正確かつ客観的に判断できる方法は、知られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】財団法人  日本土壌協会  土壌機能モニタリング調査のための土壌、水質及び植物体分析法
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、環境要因等に影響されることなく、植物におけるホウ素の充足・不足状態を反映するホウ素充足度判定用マーカーを開発し、提供することである。
【００１０】
また、前記ホウ素充足度判定用マーカーを用いて、植物におけるホウ素の充足・不足状態を判定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために、本発明者らは、植物の代謝産物に着目し、植物におけるホウ素の充足度に依存して量的に変化する代謝産物を見出した。また、その代謝産物の植物体における蓄積量に基づいて、植物におけるホウ素の充足・不足状態を正確に判定できることが明らかとなった。本発明は、当該知見に基づくものであり、すなわち以下を提供する。
【００１２】
（１）植物の代謝産物であって、高速液体クロマトグラフタンデム質量分析において、液体クロマトグラフィーでのアセトニトリルの時間的な連続濃度勾配を0分3％〜6.3分70％で形成させたときに下記表１で示す保持時間で分離され、かつ質量分析におけるプリカーサーイオン及びプロダクトイオンの質量電荷比が下記表１で示す値で特定されるマーカーNo.1〜5で示されるいずれか一の植物のホウ素充足度判定用マーカー。
【表１】
0005737098.tif 000002
（２）前記植物がユーカリプタス属である、（１）に記載のマーカー。
（３）植物体におけるホウ素の充足度を判定する方法であって、被検植物の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出する抽出工程、前記抽出工程で得られた抽出物中に含まれる（１）に記載の少なくとも一のホウ素充足度判定用マーカーの蓄積量を測定する測定工程、前記測定工程で得られた蓄積量に基づいて、前記被検植物におけるホウ素の充足度を判定する判定工程を含む前記方法。
（４）前記判定工程において、ホウ素の充足度を、被検植物とホウ素欠乏状態の対照植物のそれぞれから得られるホウ素充足度判定用マーカーの蓄積量を比較したときに、被検植物における蓄積量が対照植物における蓄積量以上あるときには、その被検植物におけるホウ素が不足状態にあると判定する、（３）に記載の判定方法。
（５）被検植物がユーカリプタス属の種又はその雑種である、（３）又は（４）に記載の判定方法。
（６）（３）〜（５）のいずれかに記載の判定方法を用いて、その判定結果に基づいて被検植物を植栽する土地へのホウ素の施肥を決定するホウ素施肥方法。
（７）判定結果でホウ素が不足状態にあると判定された場合には、その被検植物へのホウ素施肥量を判定直前の量よりも増やす、（６）に記載のホウ素施肥方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の植物のホウ素充足度判定用マーカーによれば、他要因に影響されることなく、植物のホウ素充足状態を正確に判定することができるマーカーを提供できる。
【００１４】
本発明の植物のホウ素充足度判定方法によれば、本発明の植物のホウ素充足度判定用マーカーを用いることによって、被検植物におけるホウ素の充足状態を他要因に影響されることなく正確に判定することができる。
【００１５】
本発明のホウ素施肥決定方法によれば、前記本発明のホウ素充足度判定方法によって得られた結果から検査に供した植物に、ホウ素を適切な量で施肥することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ホウ素欠乏区及びホウ素充足区における植栽１年目のユーカリプタス属雑種（カマルドレンシス×ユーロフィラ）の樹高を示した図である。ホウ素欠乏区では、ホウ素の欠乏により植物の成長が有意に阻害されていることがわかる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
１．ホウ素充足度判定用マーカー
本発明の第１の実施形態は、植物のホウ素充足度判定用マーカー（以下、本明細書においては、しばしば単に「マーカー」と略して表記する）である。本発明のマーカーは、植物におけるホウ素の充足度に依存して量的に変化する植物由来の代謝産物である。具体的には、上記表１においてマーカーNo.1〜5で示される物質をいう。
【００１８】
本明細書において「植物」とは、コケ植物、シダ植物及び種子植物をいう。好ましくは種子植物である。種子植物の場合、裸子植物若しくは被子植物、又は草本類若しくは木本類は問わない。好ましくは被子植物、より好ましくはフトモモ科植物、さらに好ましくはユーカリプタス属の植物である。例えば、ユーカリプタス・カマルドレンシス、ユーカリプタス・デグルプタ、ユーカリプタス・グランディス、ユーカリプタス・ユーロフィラ、ユーカリプタス・ペリータ、ユーカリプタス・グロブラス、ユーカリプタス・ブラシアーナ、ユーカリプタス・テレティコンティス又はそれらの雑種、例えば、ユーカリプタス・カマルドレンシスとユーカリプタス・デグルプタの雑種（以降、「カマルドレンシス×デグルプタ」とする）、ユーカリプタス・カマルドレンシスとユーカリプタス・ユーロフィラの雑種（以降、「カマルドレンシス×ユーロフィラ」とする）、ユーカリプタス・ペリータとユーカリプタス・ブラシアーナの雑種、又はユーカリプタス・ペリータとユーカリプタス・カマルドレンシスの雑種が挙げられる。
【００１９】
本明細書において「植物におけるホウ素の充足度」とは、ホウ素がその植物の生育上必要な量に達しているか否かの程度をいう。例えば、植物におけるホウ素の充足度が低い場合には、その植物体におけるホウ素量が生育上必要な量に達していないこと、すなわち、その植物においてホウ素が不足状態又は欠乏状態にあることを意味する。また、植物におけるホウ素の充足度が高い場合には、その植物体におけるホウ素量が生育上必要な量に達していること、すなわち、その植物においてホウ素が充足状態にあることを意味する。本明細書において、ホウ素の充足度が高いか低いかの判定基準は、本発明のマーカーの蓄積量に基づいて決定される。これについては、後述するホウ素充足度判定方法の判定工程で詳述するため、ここではその説明を省略する。
【００２０】
本明細書において「代謝産物」とは、植物において、呼吸に代表される異化代謝又は光合成に代表される同化代謝によって生じる全ての物質をいう。例えば、タンパク質（酵素を含む）、低分子化合物（植物ホルモン、ポリフェノール、糖、アミノ酸、ヌクレオチドを含む）が挙げられる。水溶性、脂溶性は、問わない。
【００２１】
上記代謝産物のうち、本発明のホウ素充足度判定用マーカーは、高速液体クロマトグラフタンデム質量分析において、液体クロマトグラフィーでのアセトニトリルの時間的な連続濃度勾配を0分3％〜6.3分70％で形成させたときに表１で示す保持時間で分離され、かつ質量分析におけるプリカーサーイオン及びプロダクトイオンの質量電荷比が表１で示す値で特定されるマーカーNo.1〜5で示される物質である。より具体的には、後述する実施例２の測定条件で特定される物質である。
【００２２】
「高速液体クロマトグラフタンデム質量分析」（以下「LC-MS/MS分析」と略記する）とは、液体クロマトグラフィー（LC： liquid chromatography；以下「LC」と略記する）（通常は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC：High performance liquid chromatography；以下「HPLC」と略記する）を使用する）と２つの質量分析計が直列に連結された装置を用いる質量分析法（MS：Mass Spectrometry）である（Kachlickiet al., J Mass Spectrom J Mass Spectrom. (2008) 43(5):572-586）。LC-MS/MS装置では、LCで所定の保持時間に分離された試料が、特定の質量電荷比を有するイオンのみ通過可能な１つめのMS（Q1）でプリカーサーイオンにイオン化された後、Q2で代謝産物が高電圧によって分解され、プロダクトイオンが発生する。続く２つめのMS（Q3）で特定の質量電荷比を有するプロダクトイオンのみが通過し、検出器にて検出される。それ故、化学構造が同定されていない代謝産物であっても、LCでの試料分離条件、及び分解前と分解後の通過可能なイオンの質量電荷比を予め設定しておくことで、試料中に含まれるその代謝産物を特定することができる。
【００２３】
本発明における「アセトニトリルの時間的な連続濃度勾配」とは、LCの溶媒であるアセトニトリルの、所定時間内における連続的な濃度勾配をいう。具体的には、0分時の濃度が3％であり、6.3分時の濃度が70％であり、その間の時間に対する濃度が連続的な傾斜を形成する濃度勾配をいう。
【００２４】
以上のように、本発明の各ホウ素充足度判定用マーカーは、LC-MS/MS分析を用いて、前記時間的な連続濃度勾配を形成したアセトニトリルと共に試料をカラム内に流通させ、表１に記載のそれぞれの保持時間で分離した代謝物を、質量分析器で分析した場合、プリカーサーイオンとプロダクトイオンが表１に記載の質量電荷比を示す物質として特定し、その存在を確認し、さらに定量することができる。
【００２５】
なお、表１のマーカーNo.1〜5で示す本実施形態のマーカーは、後述する実施例１で示すように、いずれも植物体中の蓄積量がホウ素量の減少に伴って増加する、すなわち、ホウ素の不足又は欠乏によって、被検植物内での発現、合成、又は分泌若しくは放出の量が増加する、性質を有する代謝産物である。
【００２６】
２．ホウ素充足度判定方法
本発明の第２の実施形態は、植物におけるホウ素充足度判定方法である。本発明の方法は、抽出工程、測定工程、及び判定工程を必須の工程として含むことを特徴とする。以下、各工程について、具体的に説明をする。
【００２７】
２−１.抽出工程
「抽出工程」とは、被検植物の全部又は一部から代謝産物を含む抽出物を抽出する工程である。
【００２８】
本明細書において「被検植物」とは、ホウ素の充足度を判定するために本発明のホウ素充足度判定方法に供される植物であって、任意の環境下で育成された植物である。
【００２９】
本明細書において「被検植物の全部」とは、被検植物の植物体を構成する全ての部分をいう。また、「被検植物の一部」とは、被検植物の植物体を構成する器官（例えば、根部、茎部、葉部、花部、又は胞子若しくは種子等）、前記器官を構成する形態的及び／若しくは機能的に分化した細胞群である組織、又は前記組織を構成する細胞をいう。当該一部は、被検植物のいずれの部位を用いてもよいが、好ましくは葉部である。これは、入手が容易であり、被検植物に与える負荷が比較的小さく、植物体の中でも代謝産物を最も多く含有していることから、第１実施形態のホウ素充足度判定用マーカーを包含している可能性が高いためである。
【００３０】
本明細書において「抽出物」とは、複数の代謝産物を包含する植物抽出物、通常は、植物抽出液をいう。前述のように、本発明の代謝産物は、水溶性及び脂溶性を問わないことから、抽出物の抽出に用いる溶媒は、水溶液又は有機溶媒（例えば、低級アルコール、エーテル、クロロホルム、酢酸エチルエステル、キシレン等）のいずれであってもよい。
【００３１】
被検植物から抽出物を抽出する方法は、被検植物から代謝産物を抽出できる方法であれば特に限定しない。例えば、水溶性の代謝産物を得る場合には、植物体を必要に応じて粉砕等した後、加水し、所定の期間浸漬及び／又は圧搾した後、ろ過してろ液を回収するか又は遠心分離後の上清を回収すればよい。また脂溶性の代謝産物を得る場合には、植物体を必要に応じて粉砕等した後、メタノール等の有機溶媒に所定の期間浸漬した後、ろ過してろ液を回収するか又は遠心分離後の上清を回収すればよい。これらの抽出方法の詳細については、当該分野で公知の技術を用いることができる。例えば、文献名（Iijima et al., The Plant Journal (2008)54,949-962, Suzuki et al., Phytochemistry (2008) 69, 99-111）に記載の方法を参照すればよい。
【００３２】
なお、本発明のホウ素充足度判定方法において、後述する判定工程において、ホウ素の充足度を被検植物と対照植物のそれぞれから得られるマーカーの蓄積量の比較によって判定する場合には、本工程において、被検植物と共に対照植物からも抽出物を抽出しておくことが望ましい。この場合、対照植物は、被検植物と同一種又は同一雑種であって、ホウ素を欠いた欠乏状態にあることを前提とする。本発明のマーカーは、ホウ素量以外の他の諸条件、例えば、生育気象条件（例えば、気温、日照時間、湿度）、土壌条件、時間的条件（例えば、生育期間、生育時期）及びその植物の健康状態による影響を受けないか、ほとんど影響されないことから、これらの諸条件は、被検植物と対照植物と必ずしも同一である必要はないが、より正確性の高い結果を得るためには、ホウ素量以外の各条件が可能な限り同一であることが好ましい。また、個体の一部から抽出物を抽出する場合、その一部は、被検植物と対照植物間で同一部分を用いることが好ましい。例えば、抽出物を被検植物の葉から抽出する場合、対照植物の抽出物も同様に葉から抽出することが好ましい。
【００３３】
２−２．測定工程
「測定工程」とは、前記抽出工程で得られた抽出物中に含まれるマーカーの蓄積量を測定する工程である。
【００３４】
本工程で測定するマーカーは、前記第１実施形態に記載した5つのマーカーの少なくとも一つであって、いずれかを任意に選択すればよい。２以上５以下の複数のマーカーの使用は、本発明の判定方法における判定結果の信頼性を高める上でも好ましい。
【００３５】
本明細書において「蓄積量」とは、抽出工程で得られた抽出物中における特定のマーカーの量である。この量は、濃度、イオン強度、吸光度又は蛍光強度のような相対量であってもよく、また所定量の抽出物中に包含されるマーカーの重量又は容量のような絶対量であってもよい。
【００３６】
抽出物中に含まれるマーカーの蓄積量を測定する方法は、抽出物から特定の代謝産物を検出及び定量できる方法であれば特に限定はしない。例えば、質量分析法、抗原抗体反応を応用した方法及び電気泳動法等を用いて検出及び定量することができる。
【００３７】
質量分析法は、高速液体クロマトグラフ質量分析法（LC-MS）、高速液体クロマトグラフタンデム質量分析法（LC-MS/MS）、ガスクロマトグラフ質量分析法（GC-MS）、ガスクロマトグラフタンデム質量分析法（GC-MS/MS）、キャピラリー電気泳動質量分析法（CE-MS）及びICP質量分析法（ICP-MS）を含む。
【００３８】
抗原抗体反応を応用した方法は、それぞれのマーカーを特異的に認識する抗体を用いて、ELISA（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）法、表面プラズモン共鳴（SPR）法、又は水晶振動子マイクロバランス（QCM）法を利用することができる。
【００３９】
また、分析する代謝産物がタンパク質である場合、電気泳動法として、例えば、二次元電気泳動法を利用することができる。
【００４０】
上記分析法は、いずれも当該分野に公知の技術であって、それらの方法に準じて行えばよい。例えば、文献名（Yoko Iijima et al., The Plant Journal (2008)54,949-962, Masami Hirai et al. Proc Natl Acad Sci USA(2004) 101(27) 10205-10210, Shigeru Sato et al., The Plant Journal (2004) 40(1)151-163, Motoyuki Shimizu et al., Proteomics (2005) 5,3919-3931）を参照すればよい。
【００４１】
第１実施形態に記載のマーカーは、その化学構造が未同定であるが、第１実施形態に記載のようにLC-MS/MS分析によって特定できることから、抽出物中に含まれるその蓄積量は、少なくともLC-MS/MS分析を用いることで測定可能である。例えば、抽出物中に含まれるマーカーNo.1の蓄積量を測定するには、LCにおいてアセトニトリルを、0分時の濃度が3％であり、6.3分時の濃度が70％であり、その間の時間に対して連続的な濃度勾配を形成するようにカラム内に抽出物と共に流入し、2.37分で分離された物質を、Q1におけるプリカーサーイオンの質量電荷比を499.2に、Q3におけるプロダクトイオンの質量電荷比を499.2に、それぞれ設定したタンデム質量分析器に通すことによって、抽出物中にマーカーNo.1が存在していれば、検出器でそれを特異的に検出、定量することができる。
【００４２】
２−３．判定工程
「判定工程」とは、前記測定工程で得られたマーカーの蓄積量に基づいて、前記被検植物におけるホウ素の充足度が高いか低いかを判定する工程である。「マーカーの蓄積量に基づいて」とは、マーカーの蓄積量をホウ素の充足度の判定に利用することを意味する。
【００４３】
ホウ素充足度の判定基準は、マーカーの蓄積量を利用したものであれば、特に限定はしない。例えば、マーカーを選択する際に設定した値又は得られた値を基準値として判定基準に用いてもよいし、対照植物におけるマーカーの蓄積量を判定基準としてもよい。
【００４４】
ここで「基準値」とは、表１に示すマーカーをホウ素充足度判別用マーカーとして選択する際に得られた又は使用したLC-MS分析におけるイオン強度値である。
【００４５】
本発明のマーカーは、後述の実施例１に記載するように、被検植物と同一の植物種をホウ素充足区とホウ素欠乏区とで水耕栽培し、両区のそれぞれの個体から得られた代謝産物の蓄積量を比較した際に、下記表２に示すように、ホウ素充足区の個体における蓄積量が、イオン強度で、1/1.5倍以下のイオン強度を有する代謝産物を選択したものである。すなわち、表１及び２において、マーカーNo.1〜5で示すマーカーは、植物体におけるその蓄積量がホウ素量の減少に伴って増加する性質の代謝産物である。これらのマーカーのホウ素欠乏区の個体におけるその蓄積量は、表２に示すように、イオン強度で、マーカーNo.1では0.50±0.19、マーカーNo.2では0.78±0.34、マーカーNo.3では1.96±0.84、マーカーNo.4では3.89±1.14、及びマーカーNo.5では5.47±1.32であったことから、それぞれのイオン強度の1/1.5倍に相当する値、具体的には、マーカーNo.1では0.33±0.19、マーカーNo.2では0.52±0.34、マーカーNo.3では1.31±0.84、マーカーNo.4では2.59±1.14、及びマーカーNo.5では3.66±1.32を基準値とすることができる。
【００４６】
したがって、マーカーNo.1〜5では、判定方法として、被検植物で得られたその蓄積量が、イオン強度で、上記基準値以下である場合には、その被検植物におけるホウ素の充足度は高いと判定することができ、逆に上記基準値を上回る場合には、その被検植物におけるホウ素の充足度は低いと判定することができる。
【００４７】
また、ホウ素充足区の個体におけるマーカーNo.1〜5の蓄積量が、イオン強度で、それぞれ0.00±0.00、0.02±0.02、0.01±0.01、0.01±0.01、及び0.07±0.24であったことから、この値をより厳密な基準値としてもよい。この場合、被検植物で得られたそのマーカーの蓄積量が、イオン強度で、上記基準値以下である場合には、その被検植物におけるホウ素の充足度は高いと判定とし、逆に上記基準値を上回る場合には、その被検植物におけるホウ素の充足度は低いと判定とすることもできる。
【００４８】
なお、上記基準値を判定工程に用いる場合、LC-MS分析で分析したマーカーの蓄積量の値にはサンプル間で若干の誤差を生じる可能性があるため、それぞれのマーカーの蓄積量を内部標準物質（例えば、(-)Epicatechin）の蓄積量で除算することにより標準化することが望ましい。
【００４９】
また、対照植物におけるマーカーの蓄積量を判定基準とする場合は、本発明のマーカーに関して、被検植物の抽出物中の蓄積量と対照植物における抽出物中の蓄積量とを比較し、その結果に基づいて被検植物におけるホウ素の充足度を判定すればよい。ここでいう「対照植物」とは、被検植物と同一種又は同一雑種で、かつ同程度の成長状態を有する植物であって、ホウ素を生育上必要最小限量で付与したホウ素充足個体、又はホウ素を欠いたホウ素欠乏個体等が挙げられる。ただし、本発明の５つのマーカーは、上記のように、いずれもホウ素充足個体ではほとんど蓄積が認められない代謝物である。したがって、対照個体としては、ホウ素欠乏個体であることが好ましい。
【００５０】
対照植物におけるマーカーの蓄積量を判定基準とする場合、前記抽出工程と測定工程は、対照植物と被検植物で同時期に同一条件下で行うことが好ましい。あるいは、対照植物に対して様々な条件下で抽出工程と測定工程を行い、得られたマーカーの蓄積量を予めデータベース化して保存しておき、本工程において、ホウ素以外の諸条件が被検植物と可能な限り合致する対照植物マーカーの蓄積量を選択して利用してもよい。
【００５１】
対照植物におけるマーカーの蓄積量を判定基準として被検植物のホウ素充足度を判定する場合、具体的な判定方法は、制限はしない。例えば、対照植物がホウ素を欠いたホウ素欠乏個体又は植物の生長上必要最小限量を下回るホウ素量を有するホウ素不足個体である場合、被検植物と対照植物における当該マーカーの蓄積量に統計学的に有意な量的差異が見られるか否かを検証し、有意な差があれば被検植物におけるホウ素が充足状態にあると判定することもできる。「統計学的に有意」とは、両者のマーカー蓄積量の差異を統計学的に処理したときに、有意な差があることをいう。統計学的処理の検定方法は、有意性の有無を判断可能な公知の検定方法を適宜使用すればよく、特に限定しない。例えば、スチューデントｔ検定法、多重比較検定法を用いることができる。具体的には、例えば、危険率（有意水準）が5％、1％又は0.1％より小さい場合が挙げられる。
【００５２】
本発明のマーカーは、いずれも植物のホウ素量と反比例関係にあることから、統計学的に有意な量的差異の具体例としては、対照植物におけるマーカー蓄積量が、イオン強度で、ホウ素欠乏状態の対照植物におけるそれの1/1.5倍以下、好ましくは1/2倍以下、より好ましくは1/2.5倍以下のイオン強度を有する場合が挙げられる。
【００５３】
本方法によれば、被検植物におけるホウ素栄養状態を、他要因に影響されることなく正確に判定することができる。
【００５４】
本方法によれば、植物のホウ素充足度から、その植物を植栽している植栽地におけるホウ素の、植物が実質的に利用可能な量の多寡を知ることができる。
【００５５】
本方法によれば、特定の土地に自生する植物を用いて、そのホウ素の充足度を判定することによって、植栽地として利用する前にその土地のホウ素の充足度を見極めることができる。
【００５６】
３．ホウ素施肥方法
本発明の第３の実施形態は、ホウ素施肥方法である。本方法は、前記第２実施形態のホウ素充足度判定方法を用いて、その判定結果に基づいて被検植物を植栽する土地へのホウ素施肥を決定する方法である。
【００５７】
ホウ素を施肥するか否かの決定は、第２実施形態のホウ素充足度判定方法での判定結果に基づいて適宜行えばよい。例えば、被検植物のホウ素充足度が不足状態にあると判定された場合には、その被検植物が植栽されている土地に施肥するホウ素をホウ素充足度判定方法に供する直前に施肥していた量よりも増やすか、又はホウ素を施肥していなかった場合には、施肥するようにすればよい。また、被検植物のホウ素充足度が充足状態にあると判定された場合には、その被検植物が植栽されている土地に施肥するホウ素量をホウ素充足度判定方法に供する直前に施肥していた量で維持すればよい。
【００５８】
施肥するホウ素は、当該分野で公知の状態で施肥すればよい。例えば、ホウ酸、又は硼砂のようなホウ酸塩として施肥することができる。
【００５９】
本方法によれば、被検植物が生育する土地にホウ素を施肥すべきか否か、及びどの程度の量で施肥すればよいかを決定することができる。また、それによって、植物のホウ素の不足又は欠乏状態を回避又は解消させて、植物の成長状態を維持又は改善することが可能となる。その結果、植物の生産量や生産効率を高めることもできるようになる。
【実施例】
【００６０】
＜実施例１：ホウ素充足度判定用マーカーの選択＞
（材料）
2つの試験区(ホウ素充足区、及びホウ素欠乏区)で約3ヶ月間、水耕栽培を行ったユーカリプタス属の雑種クローン（カマルドレンシス×デグルプタ）24個体を用いた。両試験区での栽培条件は、ホウ素充足区では、液体培地中に生育上必要最小限量（1.5mg/L）のホウ素が含まれており、ホウ素欠乏区では、液体培地中のホウ素量が０であることを除いて、全て同一としている。
【００６１】
なお、ホウ素欠乏区のクローンでは、新芽が枯死する、根が短くなる、葉の数が少ない、樹高が低い等、ホウ素欠乏に特徴的な成長阻害が認められた。
【００６２】
（方法）
１．葉のサンプリング
上記のホウ素充足区、ホウ素欠乏区の各ユーカリプタス個体について、ハサミで葉柄部分から葉を切り取った。採取した葉の主脈部分を取り除き、残りを50℃で一晩乾燥させた。
【００６３】
２．抽出物の抽出
乾燥重量で約30mgの前記各個体をセフロックチューブに入れた。直径5mmのジルコニアボール（東ソー）をチューブに加え、Tissue Lyser II（キアゲン）で葉サンプルを25Hzにて30秒間振動させて粉砕した。続いて、チューブに抽出液（水：メタノール：クロロホルム=1:2.5:1(v:v:v)、5 mg/mL (-)Epicatechinを内部標準物質として含む）を1mL加え、Tissue Lyser IIを用いて25 Hzで120秒間振動させて抽出した。得られた抽出液を12000×gで10分間遠心分離した後、上清約0.9mLに水0.4mLを加えて、12000×gで10分間遠心分離し、上層（水メタノール層）と下層（クロロホルム層）に分離した。続いて、上層をMillex-LG（ミリポア)を用いてろ過し、ろ液を回収した。
【００６４】
３．LC-MS分析
得られたろ液のうち10μLを以下の条件でLC-MS分析に供した。具体的な分析方法については、各使用機器に添付の使用説明書に従った。
【００６５】
３-１．液体クロマトグラフィー（LC）条件
・使用機器：UFLC (島津製作所)
・溶離液A：0.1%ギ酸（和光）入り  水クロマトグラフィー用リクロゾルブ 
・溶離液B: 0.1%ギ酸（和光）入り  アセトニトリルLC/MS用ハイパーグレードリクロゾルブ 
・カラム：TSKgel ODS-100V  3.0x 750mm 粒子3μm（東ソー）
・ガードカラム： TSKguardgel ODS-100V, 粒子5μm（東ソー）
・カラム温度：40℃
・流速：0.5 mL/min
・時間連続濃度勾配（タイムスケジュールグラジュエント）B%
0分：3％〜10分：97％
【００６６】
３−２．MS条件
・使用機器：3200QTRAP 
・Mass range: 100-1000
・イオン化方法：ESI-Positive
・スキャンモード：Enhanced Mass Scan 
・スキャン速度：4000 amu/sec
・解析ソフトウェア：Analyst 1.4.2 
【００６７】
３−３．MSMS条件
・使用機器：3200QTRAP 
・Mass range: 50-1000
・イオン化方法：ESI-Positive
・スキャンモード：Enhanced Product Ion Scan 
・スキャン速度：4000 amu/sec
・解析ソフトウェア：Analyst 1.4.2 
【００６８】
３−４．アライメント条件
・代謝産物データのアライメント：Marker ViewTM 1.2 Software
・溶出時間許容誤差：1分
・Mass 許容誤差：25ppm
・Intensity threshold: 10,000
【００６９】
４．ホウ素充足度判定用マーカーの選択
前記LC-MS/MS分析で得られた代謝産物の中から、GeneSpring MS(アジレントテクノロジー社)のVolcano Plotにより、蓄積量的にホウ素充足度を示す代謝産物を選択した。具体的には、代謝産物の蓄積量をホウ素充足区の個体とホウ素欠乏区の個体の間で比較した時に、充足区個体における蓄積量がイオン強度で欠乏区個体におけるそれの1.5倍以上の代謝産物、又は1/1.5倍以下の代謝産物をホウ素充足度判定用マーカーとして選択した。
【００７０】
なお、いずれの代謝産物もホウ素量に応じて植物体内で変動する物質であるが、前者は、植物体におけるその蓄積量がホウ素量の増加に伴って増加する、言わばホウ素量と比例関係にあるマーカーであり、逆に後者は、植物体におけるその蓄積量がホウ素量の増加に伴って減少する、言わばホウ素量と反比例関係にあるマーカーといえる。
【００７１】
（結果）
選択の結果、表２及び３に示す５つの代謝産物（マーカーNo.1〜5）が得られた。表２は、ホウ素欠乏区の個体とホウ素充足区の個体間での代謝産物の蓄積量の比較結果を、また表３は、得られたそれぞれのマーカーをLC-MS/MS分析で特定するためのLC保持時間、プリカーサーイオン及びプロダクトイオンの質量電荷比を示している。
【００７２】
【表２】
0005737098.tif 000003
【００７３】
【表３】
0005737098.tif 000004
【００７４】
この表に示すように、マーカーNo.1〜5は、いずれも欠乏区個体で蓄積しているが、充足区個体ではほとんど認められず、充足区個体における蓄積量がイオン強度で欠乏区個体におけるそれの1/1.5倍以下に分類される代謝産物であることが明らかとなった。すなわち、本発明のマーカーNo.1〜5の代謝産物は、ホウ素量と反比例関係にある性質のマーカーであった。
【００７５】
＜実施例２：ホウ素充足度判定方法を用いた被検植物のホウ素充足度の判定＞
複雑な環境要因が影響していると考えられる植林地現場において、実施例１とは異なるユーカリ樹種サンプルに対して、本発明のホウ素充足度判定方法を用いて、実際に正確なホウ素充足度の判定が可能であるかを検証した。
【００７６】
（材料）
ラオス植林地にある2ヶ所の試験地（試験地A、及び試験地B）に植栽された0.8年目のユーカリプタスの雑種（カマルドレンシス×ユーロフィラ）をサンプルに用いた。この2試験地では、それぞれにホウ素の施肥区・無施肥区を設定しており、試験区A及びBからホウ素施肥個体とホウ素無施肥個体のそれぞれを用いた。なお、両試験区とも、ホウ素無施肥区では、個体に典型的なホウ素不足症状（新芽の枯死、葉の数が少ない等）が認められた。
【００７７】
（方法）
１．葉のサンプリング
上記両試験区のホウ素施肥区、ホウ素無施肥区における各個体の葉をハサミで葉柄部分から切り取った。採取した葉の主脈部分を取り除き、残りを50℃で一晩乾燥させた。
【００７８】
２．抽出物の抽出
実施例１に記載の方法に準じて行った。
【００７９】
３．LC-MS/MS分析
得られたろ液のうち10μLを以下の分析条件にてLC-MS/MS分析に供した。具体的な分析方法については、各使用機器に添付の使用説明書に従った。
【００８０】
３−１．液体クロマトグラフィー（LC）条件
・使用機器：UFLC (島津製作所)
・溶離液A：0.1%ギ酸（和光）入り  水クロマトグラフィー用リクロゾルブ 
・溶離液B: 0.1%ギ酸（和光）入り  アセトニトリルLC/MS用ハイパーグレードリクロゾルブ 
・カラム：TSKgel ODS-100V  3.0x 750mm 粒子3μm（東ソー）
・ガードカラム： TSKguardgel ODS-100V, 粒子5μm（東ソー）
・カラム温度：40℃
・流速：1.0 ml/min
・時間連続濃度勾配（タイムスケジュールグラジュエント）B%
0分：3％〜6.3分：70％
【００８１】
３−２．MS条件
・使用機器：3200QTRAP 
・スキャンモード：Multiple Reaction Monitoring
・イオン化方法：ESI-Positive
・スキャン速度：4000 amu/sec
・解析ソフトウェア：Analyst 1.4.2 
・Target Mass: 
No.1: Q1: m/z: 499.2, Q3: m/z: 499.2  RT =2.4
No.2: Q1: m/z: 497.2, Q3: m/z: 497.2  RT =3.5
No.3: Q1: m/z: 475.1, Q3: m/z: 313.2  RT =4.8
No.4: Q1: m/z: 461.2, Q3: m/z: 299.2  RT =4.7
No.5: Q1: m/z: 673.6, Q3: m/z: 673.6  RT =4.5
No.6: Q1: m/z: 291.2, Q3: m/z: 139.1  RT =2.6 
ここで、No.6は、内部標準物質(-)Epicatechinである。
また、Q1及びQ3は、各マーカーの質量電荷比データ(m/z)、RTは保持時間(分)を示す。
【００８２】
４．データの標準化)  
質量分析装置の場合、マーカーの蓄積量は、同一サンプルであっても分析ごとに若干異なるため標準化が必要となる。ここでは、各種マーカーの蓄積量を内部標準物質（(-)Epicatechin）の蓄積量で除算することにより標準化した。
【００８３】
５.判別分析
試験地Aのホウ素施肥区サンプルと無施肥区サンプルから得られた代謝物データを、判別分析用のトレーニングデータセット、すなわち、ベースとなるテキストサンプルとし、被検サンプルとなる試験地Bのサンプル（合計52検体）のホウ素の充足状態、不足状態を、表１で示した全てのマーカーのプロファイルに基づき判定した。判定方法は以下の条件で行った。
【００８４】
・判定アルゴリズム：K最近傍法
クラスのラベルが付加された訓練事例が与えられているクラス分類の場合：分類したい事例から近い方から順にk個の事例を見つける．これらk個の事例のうち、最も多数をしめるクラスに分類する手法。
・マーカー: ホウ素充足度判定用マーカー5種
・トレーニングデータセット：ラオス植林地内の試験地Aに設定したホウ素施肥区サンプル（ホウ素充足個体）及びホウ素無施肥区サンプル（ホウ素不足個体）から得られたマーカーのプロファイル
・被検サンプルデータ：ラオス植林地内の試験地Bに設定したホウ素施肥試験サンプル52検体（ホウ素施肥区サンプル27検体、ホウ素施無肥区サンプル25検体）の各々から得たマーカーのプロファイル
【００８５】
（結果）
結果を図１及び表４に示す。
試験地Bのホウ素施肥区27検体のホウ素充足度を判定したところ、全検体が、全てのマーカーにおいて充足状態にあるという判定結果が得られた。ホウ素施肥区の検体は、ホウ素充足個体であることから、本発明の判定方法により、判定結果と実条件とが一致する正答が得られたことになる。
【００８６】
一方、ホウ素無施肥区25検体の判別分析したところ、4個体において充足状態にあるという判定が出たものの、21検体ではホウ素が不足状態にあるという判定結果が得られた。ホウ素無施肥区の検体は、ホウ素不足個体であることから、本発明の判定方法により、約92.3%の正答が得られたことになる。
【００８７】
以上のように、本発明のマーカーを用いたホウ素充足度判定方法によれば、複雑な環境要因が影響していると考えられる植林地現場サンプルに対しても、正答率90％を超える高い判定精度でその土地で生育する植物のホウ素充足度の判定ができることが立証された。
【００８８】
また、前述のように実施例１と実施例２とでは、実験に用いた植物種が異なる。本発明のマーカーは、実施例１に記載の植物種から分離された代謝産物であるが、本実施例において、異なる植物種にも有効であることが明らかとなり、マーカーの一般性も立証された。
【００８９】
【表４】
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【図１】
0005737098.tif 000007