(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖タンパク質及び／又は糖鎖を有するその断片、前記糖鎖末端に位置する検出しようとする糖残基と親和性を有する検出用レクチン、及び、前記糖残基を含む少なくとも１個の糖残基の欠損によって露出する糖残基と親和性を有する競合用レクチン又は前記糖残基に付加した前記糖残基とは異なる糖残基と親和性を有する競合用レクチンを混在反応させ、反応した検出用レクチンを検出することを含む、糖タンパク質の検出方法。
【請求項２】
前記糖鎖が複合型糖鎖又はＯ結合型糖鎖である、請求項１に記載の糖タンパク質の検出方法。
【請求項３】
前記糖タンパク質は、ハプトグロビン、トランスフェリン、γ−グルタミルトランスペプチターゼ（γ−ＧＴＰ）、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、α１−酸性糖タンパク質、αフェトプロテイン、フィブリノーゲン、ｈＣＧ（ヒト胎盤絨毛性性腺刺激ホルモン）、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、及びＰＳＡ（前立腺特異抗原）からなる群から選ばれる一種である、請求項１又は２に記載の糖タンパク質の検出方法。
【請求項４】
前記糖タンパク質及び／又は糖鎖を有するその断片は、担体に固定化されている、請求項１〜３のいずれかに記載の糖タンパク質の検出方法。
【請求項５】
前記糖タンパク質及び／又は糖鎖を有するその断片は、その抗体を介して前記担体に固定化されている、請求項４に記載の糖タンパク質の検出方法。
【請求項６】
前記検出用レクチンは、標識されている、請求項１〜５のいずれかに記載の糖タンパク質の検出方法。
【請求項７】
さらに、前記検出しようとする糖残基の全糖鎖又は糖タンパク質に対する付加率又は欠損率を求めることを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の糖タンパク質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖タンパク質の検出方法に関し、より詳細には、糖タンパク質の糖鎖構造の微量の変化を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、その半数以上が翻訳後に糖鎖修飾を受けている。タンパク質への糖鎖の結合様式は、アスパラギン残基のアミド基に結合するＮ結合型糖鎖及びセリン又はスレオニン残基のヒドロキシル基に結合するＯ結合型糖鎖に分けられる。いずれの糖鎖構造も、タンパク質の活性、細胞間相互作用、接着等に重要な役割を果たしている。
【０００３】
糖タンパク質に付加する糖鎖の種類とその数は、通常、一定である。この糖鎖構造の変化が疾患と関連することが数多く報告されている。例えば、Ｌｉｓａ  Ｒ．Ｆｏｄｅｒｏらは、アルツハイマー疾患（ＡＤ）の患者から採取した髄液中（ＣＳＦ）糖タンパク質をシアル酸結合性の小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）で染色すると、その染色強度が有意に低下することを報告した（非特許文献１）。これは、ＡＤ患者から採取したＣＳＦ糖タンパク質はシアル酸付加率が有意に低下していることを意味する。彼らは、ＷＧＡ結合性糖タンパク質がアルツハイマー疾患を診断するため有用なバイオマーカーになると示唆する。
【０００４】
トランスフェリン（Ｔｆ）は、６７９個のアミノ酸を有するポリペプチド鎖からなり、そして、４１３番目と６１１番目のアスパラギン酸残基が末端シアル酸を有する二個の分岐状糖鎖でＮ−グリコシル化されている糖タンパク質である。Ｔｆには、５７０番目のアミノ酸残基がプロリンであるＴｆＣ１と、それがセリンで置換されたＴｆＣ２という多型が存在する。Ｓｕｓａｎ  Ｊ．  ｖａｎ  Ｒｅｎｓｂｕｒｇらは、ＴｆＣ１Ｃ２のヘテロ接合体の遺伝子型を持つＡＤ患者は、６個のシアル酸を有するＴｆの相対強度が、ＴｆＣ１Ｃ１ホモ接合体の遺伝子型を持つ患者よりも有意に減少していることを報告した（非特許文献２）。
【０００５】
Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ．Ｍらは、ＡＤ病患者のＣＳＦ糖タンパク質を、ＷＧＡを用いたレクチンブロット法で解析したところ、シアル酸を４個及び３個持ったトランスフェリンが増加し、逆に２個及び１個持ったものが減少していることを報告した（非特許文献３）。
【０００６】
シアル酸量の変化は、ＡＤ以外にも、心臓血管疾患、アルコール依存症、糖尿病等ついて観察されている。
【０００７】
Ｒ．Ｂ．Ｐａｒｅｋｈらは、関節リウマチ患者の血清中ＩｇＧの末端ガラクトースの付加率が減少し、末端にＮ−アセチルグルコサミンを持つ糖鎖の割合が増加することを報告している（非特許文献４）。ガラクトース欠損は、ＩｇＧの重要な生理機能である補体の活性化やＦｃ受容体への結合能を著しく損なう。
【０００８】
糖タンパク質が有する糖鎖中のシアル酸やガラクトースの量的変化で疾患を検出及び診断するための研究開発が行われている。例えば、ＷＯ２００８／０２９８８６（アルツハイマーの診断キット、診断マーカー及び病態指標の検出方法、特許文献１）には、哺乳動物から得た髄液試料に対して、シアル酸数の異なる糖鎖の付加したトランスフェリンを定量的に検出する工程と、３又は４のシアル酸を有する糖鎖の付加したトランスフェリンに対する、１又は２のシアル酸を有する糖鎖の付加したトランスフェリンの量比を算出する工程とを含む、アルツハイマー病の検出方法が開示されている。この発明では、トランスフェリン中の３又は４個のシアル酸を有する糖鎖の増加量、又は１又は２個のシアル酸を有する糖鎖の減少量が、等電点電気泳動等で測定される。
【０００９】
特開２００６−３１７２１０（血清糖タンパク質をバイオマーカーとするアルツハイマー病の診断方法、特許文献２）には、ヒト由来の試料に含まれる、α２，６シアル酸含有糖タンパク質を検出又は測定することを含む、アルツハイマー病の診断方法が開示される。この発明では、α２，６シアル酸を含有するハプトグロビンの増加が、レクチンブロット等により測定される。
【００１０】
特開２０１０−１２１９８０（糖鎖バイオマーカーによる特発性正常圧水頭症の診断、特許文献３）には、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を糖鎖構造の末端に持つトランスフェリン−１の量を測定することを含む、特発性正常圧水頭症の検査方法が開示される。健常者の血清中に存在するトランスフェリン−２は、末端にＳｉａ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−という糖鎖構造を持っている。一方、患者のものは、アシアロ−アガラクト構造、すなわち、末端にＧｌｃＮＡｃ−の糖鎖構造を持つ。この発明では、トランスフェリン−１が、ウエスタンブロット、レクチンＥＬＩＳＡ等で測定される。
【００１１】
特開２０１１−４７８４６（前立腺癌の診断法、特許文献４）には、血液中のハプトグロビン糖鎖のα２−６シアル酸量を指標とする、前立腺癌の判定方法が開示される。この発明では、ハプトグロビン中のα２−６シアル酸量の増加が、表面プラズモン共鳴法等で測定される。
【００１２】
特許２９４５０７５（リウマチ患者のＩｇＧ上のガラクトース欠損を測定する方法、特許文献５）には、プロテインＡ又はプロテインＧと、ヒト血漿あるいは血清を反応させ、ＩｇＧを特異的に結合した、結合したＩｇＧに存在する糖鎖構造を標識ガラクトース欠損糖鎖認識レクチンで標識し、ＩｇＧ上のガラクトース欠損を検出することからなるリウマチ患者のＩｇＧ上のガラストーク欠損を測定する方法が開示される。この発明では、ＩｇＧのガラクトース欠損糖鎖が、レクチン染色で測定される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｌｉｓａ  Ｒ．Ｆｏｄｅｒｏ，ｅｔ．ａｌ．，Ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｒｅ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，７９，１０２２−１０２６
【非特許文献２】Ｓｕｓａｎ  Ｊ．  ｖａｎ  Ｒｅｎｓｂｕｒｇ  ｅｔ．  ａｌ．，５−ａｎｄ６−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｂｒａｉｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｖｏｌ．１９，Ｎｏｓ１／２，８９−９６，２００４
【非特許文献３】谷口美也子，アルツハイマー型認知証の新規バイオマーカー；糖鎖修飾に注目して（Ａ  ｎｅｗ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｉｅｓｅ；  Ａｌｔｅｒｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ），  第１７回中・四国老年期認知症研究会（平成２３年４月１８日開催）要旨集
【非特許文献４】Ｐａｒｅｋｈ，  Ｒ．Ｂ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｏｆ  ｔｏｔａｌ  ｓｅｒｕｍ  ＩｇＧ，Ｎａｔｕｒｅ，３１６，４５２−４５７，  １９８５
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】ＷＯ２００８／０２９８８６
【特許文献２】特開２００６−３１７２１０
【特許文献３】特開２０１０−１２１９８０
【特許文献４】特開２０１１−４７８４６
【特許文献５】特許２９４５０７５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
レクチンは、シアル酸、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン等の糖残基に親和性を示すタンパク質の総称である。今まで、特定の糖残基に親和性を有する植物や動物由来のレクチンが数多く発見されている。
【００１６】
レクチンを用いた酵素免疫測定法（レクチンＥＬＩＳＡ）は、Ｌｅｃｔｉｎｓ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．Ｊ．著、ＵＰＳＴＡＴＥ  ＢＯＯＫＳ刊行、Ｍａｃｅｄｏｎ，  ＮＹ，  Ｕ．Ｓ．Ａ．）、特開平１０−３１１８３２、特開平０８−２８５８５３、特開０７−３２５０８３等に記載される公知の糖鎖分析手法である。レクチンＥＬＩＳＡは、多数の検体を同時に測定できる、糖鎖を比較的簡便に測定することができる、という長所を有する。
【００１７】
しかし、従来のレクチンＥＬＩＳＡは、本明細書の比較例が示すように、糖タンパク質の糖鎖構造の微量の変化を検出するには不十分である。現状のレクチンＥＬＩＳＡで糖鎖量の変化と関連するような疾患を早期に精度高く診断することは困難である。
【００１８】
そこで、本発明は、糖タンパク質の糖鎖構造の微量の変化を精度高く検出できる糖タンパク質の検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、上記課題を鋭意検討した結果、糖鎖の糖残基に親和性を有する検出用レクチンと、その糖残基の近傍に位置する糖残基に親和性を有する競合用レクチンとが混在する系で糖残基を測定することにより、上記課題を解決できることを見出した。すなわち、本発明は、糖タンパク質及び／又は糖鎖を有するその断片、前記糖鎖末端に位置する検出しようとする糖残基と親和性を有する検出用レクチン、及び、前記糖残基を含む少なくとも１個の糖残基の欠損によって露出する糖残基と親和性を有する競合用レクチン又は前記糖残基に付加した前記糖残基とは異なる糖残基と親和性を有する競合用レクチンを反応させ、反応した検出用レクチンを検出することを含む、糖タンパク質の検出方法を提供する。本明細書において、糖タンパク質は、糖鎖を有するタンパク質を意味し、そして糖鎖を有するその断片は、糖鎖を有するペプチド、及び糖鎖自体を含む意味で使用する。糖タンパク質の糖鎖をその糖残基を認識するレクチン１種類で検出することは公知である。しかし、本発明のように、競合用レクチンと検出用レクチンとを混在させた系で糖残基を検出することは新規である。
【００２０】
前記糖鎖は、特に複合型糖鎖又はＯ結合型糖鎖である。
【００２１】
前記糖タンパク質は、例えばハプトグロビン、トランスフェリン、γ−グルタミルトランスペプチターゼ（γ−ＧＴＰ）、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、α１−酸性糖タンパク質、αフェトプロテイン、フィブリノーゲン、ｈＣＧ（ヒト胎盤絨毛性性腺刺激ホルモン）、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、及びＰＳＡ（前立腺特異抗原）からなる群から選ばれる一種である。
【００２２】
前記糖タンパク質及び／又は糖鎖を有するその断片は、担体に固定化されていてもよい。
【００２３】
前記糖タンパク質及び／又は糖鎖を有するその断片は、その抗体を介して前記担体に固定化されていることが好ましい。
【００２４】
前記検出用レクチンは、標識されていることが好ましい。
【００２５】
上記検出方法は、さらに、前記検出しようとする糖残基の全糖鎖に対する付加率又は欠損率を求めることを含むことが好ましい。
【００２６】
本発明は、また、糖タンパク質及び／又は糖鎖を有するその断片、前記糖鎖末端に位置する検出しようとする糖残基と親和性を有する検出用レクチン、及び、前記糖残基を含む少なくとも１個の糖残基の欠損によって露出する糖残基と親和性を有する競合用レクチン又は前記糖残基に付加した前記糖残基とは異なる糖残基と親和性を有する競合用レクチンを含む、糖鎖変化と関連する疾患の診断薬又は診断薬キットを提供する。
【００２７】
前記疾患は、例えばアルツハイマー病、慢性関節リウマチ、特発性正常圧水頭症、肝癌、前立腺癌、心臓血管疾患、アルコール依存症、及び糖尿病からなる群から選らばれる少なくとも一種である。
【００２８】
本発明は、また、糖タンパク質及び／又は糖鎖を有するその断片、前記糖鎖末端に位置する検出しようとする糖残基と親和性を有する検出用レクチン、及び、前記糖残基を含む少なくとも１個の糖残基の欠損によって露出する糖残基と親和性を有する競合用レクチン又は前記糖残基に付加した前記糖残基とは異なる糖残基と親和性を有する競合用レクチンを含む、糖鎖変化と関連する疾患の研究用試薬又は研究用キットを提供する。
【００２９】
前記疾患は、例えばアルツハイマー病、慢性関節リウマチ、特発性正常圧水頭症、肝癌、前立腺癌、心臓血管疾患、アルコール依存症又は糖尿病である。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の糖タンパク質の検出方法によれば、糖残基量の微量の変化を検出することができ、従来のレクチンＥＬＩＳＡと比べて分析精度が向上する。特に、糖鎖付加率の高い糖タンパク質の糖鎖の微量の変化が判別可能となる。これは、糖タンパク質から糖残基が欠損又は付加することによって異常や疾患が誘起される場合に疾患や異常の早期発見につながる。本発明によって微量の糖鎖変化が解析可能になるので、本発明が疾患の発症機構の解明、治療や予防に関する医学や生化学の研究に役立つことも大いに期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】検出用レクチンとしてのＢｉｏｔｉｎ−ＳＮＡと、競合用レクチンとしてのＥＣＡ（実施例１）、ＭＣＬ（実施例２）又はＢＰＬ（実施例３）とが混在する系、あるいは競合用レクチンが非混在の系（比較例１）において、シアル酸率の異なるトランスフェリンを検出したときの吸光度の変化を示すグラフである。競合用レクチンが非混在の比較例１では、トランスフェリンのシアル酸率が低い場合、シアル酸率に依存して吸光度が増大する。しかし、シアル酸率が７３％以上と高くなると、吸光度はほぼ一定となる。一方、検出用レクチンと競合するガラクトース結合レクチンが混在する実施例１〜３では、シアル酸率７３％以上であっても、シアル酸率に依存して吸光度が増加している。
【図２】検出用レクチンとしてのＢｉｏｔｉｎ−ＳＳＡと、競合用レクチンとしてのＥＣＡとが混在する系（実施例４）あるいは、競合用レクチンが非混在の系（比較例４）において、シアル酸率が７３％及び９１％のトランスフェリンをそれぞれ検出したときの吸光度を示すグラフである。競合用レクチンが非混在の比較例４では、シアル酸率９１％と７３％のトランスフェリンの吸光度に有意差が見られない。一方、検出用レクチンに競合するガラクトース結合レクチンが混在する実施例４では、吸光度に有意差が見られた（ｐ＜０．０１）。
【図３】検出用レクチンとしてのＢｉｏｔｉｎ−ＳＳＡと、競合用レクチンとしてのＥＣＡ（実施例５）、ＭＣＬ（実施例６）又はＢＰＬ（実施例７）とが混在する系、あるいは競合用レクチンが非混在の系（比較例５）において、シアル酸率の異なるハプトグロビンを検出したときの吸光度を示すグラフである。競合用レクチンが非混在の比較例５では、シアル酸率１００％と８５％のハプトグロビンの吸光度に有意差が見られない。一方、検出用レクチンと競合するガラクトース結合レクチン（ＥＣＡ、ＭＣＬ又はＢＰＬ）を混在させた実施例５〜７では、吸光度に有意差が見られた（Ｐ＜０．０１）。
【図４】検出用レクチンとしてのＢｉｏｔｉｎ−ＥＣＡと、競合用レクチンとしてのＧＳＬ−ＩＩとが混在する系（実施例８）、あるいは競合用レクチンが非混在の系（比較例８）において、ガラクトース率が異なるトランスフェリンを検出したときの吸光度を示すグラフである。競合用レクチンが非混在の比較例８では、ガラクトース率が８２％と７５％のトランスフェリンの吸光度に有意差が見られない。一方、検出用レクチンと競合するＮ−アセチルグルコサミン結合レクチン（ＧＳＬ−ＩＩ）を混在させた実施例８では、吸光度に有意差が見られた（Ｐ＜０．０１）。
【図５】検出用レクチンとしてのＢｉｏｔｉｎ−ＥＣＡと、競合用レクチンとしてのＳＳＡとが混在する系（実施例９）、あるいは競合用レクチンが非混在の系（比較例１０）において、シアル酸率が異なるトランスフェリンを検出したときの吸光度を示すグラフである。競合用レクチンが非混在の比較例１０では、シアル酸率が０％と７％のトランスフェリンの吸光度に有意差が見られない。一方、検出用レクチンと競合するシアル酸結合レクチン（ＳＳＡ）を混在させた実施例９では、吸光度に有意差が見られた（Ｐ＜０．０１）。
【図６】検出用レクチンとしてのＢｉｏｔｉｎ−ＳＳＡと、競合用レクチンとしてのＢＰＬとが混在する系（実施例１０）、あるいは競合用レクチンが非混在の系（比較例１１）において、シアル酸率が異なるムチンを検出したときの吸光度を示すグラフである。競合用レクチンが非混在の比較例１１では、シアル酸率が１００％と８１％のトランスフェリンの吸光度に有意差が見られない。一方、検出用レクチンと競合するガラクトース結合レクチン（ＢＰＬ）を混在させた実施例１０では、吸光度に有意差が見られた（Ｐ＜０．０１）。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下に、本発明の一実施の形態を詳細に説明する。本発明の糖タンパク質の検出方法は、糖タンパク質及び／又は糖鎖を有するその断片（以下、単に「糖タンパク質等」ということがある）、前記糖鎖末端に位置する検出しようとする糖残基と親和性を有する検出用レクチン、及び、前記糖残基を含む少なくとも１個の糖残基の欠損によって露出する糖残基と親和性を有する競合用レクチン又は前記糖残基に付加した前記糖残基とは異なる糖残基と親和性を有する競合用レクチンを反応させ、反応した検出用レクチンを検出することを含む。
【００３３】
本発明の検出対象となる糖鎖には、Ｎ結合型糖鎖及びＯ結合型糖鎖が含まれる。Ｎ結合型糖鎖には、下記式：
【化１】
0005808583.tif 000002
〔式中、Ｍａｎはマンノース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン、Ｆｕｃはフコースを意味する〕
で示されるコア構造に、シアル酸、ガラクトース及びＮ−アセチルグルコサミンで構成される側鎖（Ｎ−アセチルラクトサミン構造、ポリＮ−アセチルラクトサミン構造）が１〜６本付加した複合型糖鎖、前記コア構造にマンノースのみにより構成されるオリゴ糖が付加された高マンノース型糖鎖、並びに複合型と高マンノース型とが混成した混成型糖鎖が含まれる。
【００３４】
本発明は、特に複合型糖鎖の検出に向いている。複合型糖鎖を有する糖タンパク質の例を以下に示す。
【００３５】
下記式：
【化２】
0005808583.tif 000003
〔式中、Ｍａｎはマンノース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン、Ｇａｌはガラクトース、Ｎｅｕ５ＡｃはＮ―アセチルノイラミン酸を意味する〕
を有するトランスフェリン（ヒト）。
【００３６】
下記式：
【化３】
0005808583.tif 000004
〔式中、Ｍａｎはマンノース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン、Ｇａｌはガラクトース、Ｎｅｕ５ＡｃはＮ―アセチルノイラミン酸を意味する〕
を有するハプトグロビン（ヒト）。
【００３７】
下記式：
【化４】
0005808583.tif 000005
〔式中、Ｍａｎはマンノース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン、Ｇａｌはガラクトース、Ｆｕｃはフコースを意味する〕
を有するＩｇＧ（ヒト）。
【００３８】
本発明は、Ｏ結合型糖鎖の検出にも向いている。Ｏ結合型糖鎖を有する糖タンパク質の例を以下に示す。下記式：
【化５】
0005808583.tif 000006
〔式中、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミン、Ｇａｌはガラクトース、Ｆｕｃはフコース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを意味する〕
を有するムチン（ブタ）。
【００３９】
下記式：
【化６】
0005808583.tif 000007
〔式中、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミン、Ｇａｌはガラクトース、Ｆｕｃはフコース、Ｎｅｕ５ＡｃはＮ―アセチルノイラミン酸、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを意味する〕
を有するムチン（ウシ）。
【００４０】
本発明の検出対象となる糖残基には、シアル酸、ガラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、フコース等が含まれる。これらの糖残基は、健常者が通常有する糖鎖構造に対して付加するものであっても、又は欠損するものでもあってもよい。
【００４１】
糖タンパク質は、糖タンパク質の糖鎖構造の変化と疾患や異常との関係が示唆されるものが好ましい。そのような例には、ハプトグロビン、トランスフェリン、γ−グルタミルトランスペプチターゼ（γ−ＧＴＰ）、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、α１−酸性糖タンパク質、αフェトプロテイン、フィブリノーゲン、ｈＣＧ（ヒト胎盤絨毛性性腺刺激ホルモン）、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）等が挙げられる。
【００４２】
糖タンパク質の出所は、特に限定されない。例えば、血液、血漿、血清、涙、唾液、体液、乳汁、尿、細胞の培養上清、形質転換動物からの分泌物等が挙げられる。
【００４３】
本発明の検出方法に供する試料は、糖タンパク質以外に、その断片であっても糖鎖を有する限り、使用可能である。そのような断片には、糖ペプチドや糖鎖自体が挙げられる。その場合、糖タンパク質を、予め糖ペプチドや糖鎖の状態に加工してから使用する。
【００４４】
前記糖タンパク質等は、必ずしも固定化する必要はないが、固定化する方が好ましい。糖タンパク質を固定化するための担体は、例えばガラス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、メタアクリレート、ラテックス、アガロース、セルロース、デキストラン、デンプン、デキストリン、シリカゲル、多孔性セラミックス等の素材できたビーズ、ディスク、スティック、チューブ、マイクロタイタープレート、マイクロセンサーチップ、マイクロアレイ等が挙げられる。
【００４５】
前記糖タンパク質等の担体への固定化方法は、物理的吸着、共有結合、架橋等の汎用の方法を特に制限なく使用可能である。
【００４６】
前記糖タンパク質等は、その抗体を介して担体に固定化されていてもよい。抗体の由来は限定されない。抗体には、ヒト、マウス、ウサギ等の哺乳動物に抗原としての糖タンパク質を免疫することにより得られる抗血清や腹水液、並びにこれらを塩析、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー等の汎用の方法で精製したポリクローナル抗体が含まれる。さらに、抗体には、ヒトや動物の血清等から調製したタンパク質で免疫されたマウスの抗体産生リンパ細胞とミエローマ細胞とを融合させることによって、該糖タンパク質を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得、次いで該ハイブリドーマ又はそれに由来する細胞株を培養し、その培養物から採取されるモノクローナル抗体が含まれる。汎用の糖タンパク質については、その抗体が試薬として販売されており、本発明ではそれらを制限なく使用可能である。
【００４７】
抗体は、抗体分子自体でよく、また、抗体を酵素処理して得られるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等の抗原認識部位を含む活性フラグメントでもよい。
【００４８】
上記の抗体等が検出用レクチンや競合用レクチンと反応する糖鎖を有する場合は、適宜、抗体から糖鎖を除去する。糖鎖を持たない抗体を取得するには、モノクローナル抗体をノイラミニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、Ｎ−グリカナーゼ等の糖鎖分解酵素で処理する、抗体のＦｃ部をペプシン、パパイン等のタンパク質分解酵素により限定加水分解する、過ヨウ素酸水溶液で糖鎖構造を酸化分解する、ハイブリドーマ又はハイブリドーマ由来の動物細胞の培地に糖鎖合成阻害剤を添加して培養する方法が挙げられる。
【００４９】
上記抗体の担体への固定化方法は、物理的吸着、共有結合、架橋等の汎用の方法を特に制限なく使用可能である。糖タンパク質に対する抗体（例えば抗トランスフェリン抗体）の溶液を担体に添加することにより、担体に抗体を結合させる。
【００５０】
抗体の結合した担体に糖タンパク質等の溶液を添加することにより、糖タンパク質を抗原−抗体反応で結合させる。
【００５１】
本発明で使用する検出用レクチンとは、糖タンパク質の糖鎖末端に位置する検出しようとする糖残基と親和性を有するレクチンを意味する。
【００５２】
競合用レクチンとは、前記糖残基を含む少なくとも１個の糖残基の欠損によって露出する糖残基と親和性を有するレクチン、又は前記糖残基に付加した前記糖残基とは異なる糖残基と親和性を有するレクチンを意味する。競合用レクチンは、糖鎖変化と関連する疾患等に応じて決まる。例えば、特発性正常圧水頭症患者から採取したトランスフェリンに結合する糖鎖は、シアル酸とガラクトースの２個の糖残基の欠損によって、Ｎ−アセチルグルコサミン残基が露出している。
【００５３】
検出用及び競合用レクチンの親和性を、赤血球凝集を阻害する糖の最小阻害濃度で表すと、通常１００ｍＭ以下、好ましくは１０ｍＭ以下である。最小阻害濃度とは、糖が凝集反応を阻止するために要する最小濃度を意味する。最小阻害濃度が小さいほど、レクチンに対する親和性が高いことを示す。赤血球凝集反応阻害試験法は、特許４５１４１６３（フコースα１→６特異的レクチン）に記載されている方法で行うことができる。特許４５１４１６３を参照のためにここに編入する。
【００５４】
シアル酸に親和性を有するレクチンの例として、ニホンニワトコレクチン（ＳＳＡ）、セイヨウニワトコレクチン（ＳＮＡ）、イヌエンジュレクチン（ＭＡＭ）、ヤナギマツタケレクチン（ＡＣＧ）、キカラスウリレクチン（ＴＪＡ−Ｉ）、ムジナタケレクチン（ＰＶＬ）、コムギ胚芽レクチン（ＷＧＡ）等が挙げられる。好ましくは、ニホンニワトコレクチン（ＳＳＡ）、セイヨウニワトコレクチン（ＳＮＡ）、及びキカラスウリレクチン（ＴＪＡ−Ｉ）である。
【００５５】
ガラクトースに親和性を有するレクチンの例としては、デイゴマメレクチン（ＥＣＡ）、ニガウリレクチン（ＭＣＬ）、ムラサキモクワンジュレクチン（ＢＰＬ）、ヒママメレクチン（ＲＣＡ１２０）、ピーナッツレクチン（ＰＮＡ）が挙げられる。好ましくは、デイゴマメレクチン（ＥＣＡ）、ニガウリレクチン（ＭＣＬ）、及びムラサキモクワンジュレクチン（ＢＰＬ）である。
【００５６】
マンノースに親和性を有するレクチンの例としては、レンズマメレクチン（ＬＣＡ）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、及びエンドウマメレクチン（ＰＳＡ）が挙げられる。
【００５７】
Ｎ−アセチルグルコサミンに親和性を有するレクチンの例としては、バンデリアマメレクチン−ＩＩ（ＧＳＬ−ＩＩ）、ムジナタケレクチン（ＰＶＬ）、及びコムギ胚芽レクチン（ＷＧＡ）が挙げられる。好ましくは、バンデリアマメレクチン−ＩＩ（ＧＳＬ−ＩＩ）である。
【００５８】
フコースと親和性を有するレクチンとして、ハリエニシダレクチン（ＵＥＡ−１）、ミヤコグサレクチン（ＬＴＡ）、レンズマメレクチン（ＬＣＡ）、エンドウマメレクチン（ＰＳＡ）、ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）、ラッパスイセンレクチン（ＮＰＡ）、ソラマメレクチン（ＶＦＡ）、麹菌レクチン（ＡＯＬ）、及びツチスギタケレクチン（ＰＴＬ）が挙げられる。
【００５９】
シアル酸欠損を測定する組み合わせとして、検出用レクチンにシアル酸と親和性を有するレクチン、競合用レクチンにガラクトースと親和性を有するレクチンが好ましい。シアル酸付加を測定する組み合わせとして、検出用レクチンにガラクトースと親和性を有するレクチン、競合用レクチンにシアル酸と親和性を有するレクチンが好ましい。また、ガラクトース欠損を測定する組み合わせとして、検出用レクチンにガラクトースと親和性を有するレクチン、競合用レクチンにＮ−アセチルグルコサミンと親和性を有するレクチンが好ましい。
【００６０】
検出用レクチンは、当分野で公知の標識手段で標識されていることが好ましい。標識手段の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ等の酵素、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンＢイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ローダミン、ＣｙＤｙｅ等の蛍光化合物、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ等の放射性物質、金ゾル、銀ゾル、白金ゾル等の金属コロイド、顔料で着色されたポリスチレンラッテクス等の合成ラテックス、ビオチンやジゴキシゲニンを挙げることができる。
【００６１】
標識手段が酵素の場合、酵素活性を測定するために発色基質が用いられる。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の基質としては３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）、２，２’−アジノジ−［３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸］２アンモニウム塩−Ｈ２Ｏ２、５−アミノサリチル酸−Ｈ２Ｏ２、又はｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）−Ｈ２Ｏ２、アルカリフォスターゼの基質としてはｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）又は４−メチルウンベリフェリルホスフェート、そしてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としてはｏ−ニトロフェノール−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを挙げることができる。
【００６２】
標識手段は、常法により検出用レクチンへ結合することができる。特に、標識をアビジン又はストレプトアビジン−ビオチン系を介して結合することは、感度が高くなる点で好ましい。
【００６３】
固定化された糖タンパク質、検出用レクチン及び競合用レクチンを反応させるために、検出用レクチン及び競合用レクチンを混在させた系に糖タンパク質を曝す。糖タンパク質と検出用レクチン又は競合用レクチンとの反応順序に特に限定はない。すなわち、同時に反応させても、任意の順序で反応させてもよい。好ましくは、固定化された糖タンパク質と競合用レクチンとを反応させた後、検出用レクチンを反応させる。
【００６４】
上記反応の後、検出用レクチンを検出することにより、糖タンパク質の糖鎖量を測定する。検出用レクチンの検出方法は、特に限定されず、当業者に周知の方法で使用することができる。検出方法の例としては、レクチンＥＬＩＳＡ、レクチン染色のように酵素等の発色や発光、蛍光を検出する方法、糖鎖アレイ、レクチンアレイのようにエバネッセント波を検出する方法、水晶発振子マイクロバランス法や表面プラズモン共鳴法のように質量変化を検出する方法等を挙げることができる。表面プラズモン共鳴法は、担体に固定化した糖タンパク質量、及び、糖タンパク質に結合した検出レクチン量を多段階法で同時に測定できるので利便である。
【００６５】
標識した検出レクチンの標識物量（吸光度等）等で表わした糖鎖量は、標準試料のものと対比することによって、その変化を察知することができる。例えば、検体の糖タンパク質濃度を一定値に調整すると、検出レクチンの測定結果は糖タンパク質に付加した特定の糖鎖量の変化を反映することになる。糖タンパク質の糖鎖量を健常者と患者との間で比較することにより、糖鎖変化に関連する疾患を従来よりも高い精度で診断できる。
【００６６】
糖残基量の変化率（糖付加や糖欠損の度合い）を定量化することは、糖鎖変化と関連する疾患の診断、治療及び予防、研究等に大いに役立つ。糖の付加率を求めるには、予め、糖鎖末端の全位置に目的とする糖残基が付加した参照試料（例えば、健常者の糖タンパク質や市販又は合成した試薬）の全糖残基量を本発明の検出方法で測定する。糖残基量を、標識した検出レクチンの標識物量（吸光度等）で表わす。次いで、未知試料の糖残基量を本発明の検出方法で測定する。未知試料で測定された糖残基量を全糖残基量で除した値が糖付加率となる。糖付加率を１から減じたものが糖欠損率となる。
【００６７】
糖鎖量の変化率は、測定試料の糖タンパク質量に対する糖鎖量の比で表してもよい。まず、糖タンパク質の量を吸光度、酵素結合免疫吸着法、ブラッドフォード法、ローリー法等で求めておく。
【００６８】
糖付加率又は糖欠損率の導出に検量線を使用することは、測定作業の効率化の点で有利である。予め、目的糖残基量が既知で、糖残基量の異なる複数の標準試料を、本発明の検出方法で測定し、目的糖残基量と検出レクチンの標識物量（吸光度等）との関係を求め、検量線を作成しておく。目的糖残基量が未知の試料の標識物量（吸光度等）を本発明の検出方法で求め、標識物量を前記検量線に当てはめる。
【００６９】
本発明は、また、糖タンパク質及び／又は糖鎖を有するその断片、前記糖鎖末端に位置する検出しようとする糖残基と親和性を有する検出用レクチン、及び、前記糖残基を含む少なくとも１個の糖残基の欠損によって露出する糖残基と親和性を有する競合用レクチン又は前記糖残基に付加した前記糖残基とは異なる糖残基と親和性を有する競合用レクチンを含む、糖鎖変化と関連する疾患の診断薬又は診断薬キット、あるいは、研究用試薬又は研究用キットを提供する。
【００７０】
上記診断薬又は診断薬キットあるいは研究用試薬又は研究用キットには、適宜、標識用化合物、酵素とその発色基質、放射性同位元素、発光物質、蛍光物質、着色物質、標準タンパク質、緩衝液、溶解剤、洗浄剤、反応停止剤、プレート等の診断薬キットに使われるに公知のものを含む。
【００７１】
糖鎖変化と関連する疾患は、特に限定されない。例えば、シアル酸残基の関与が指摘される疾患の例としては、アルツハイマー病、心臓血管疾患、アルコール依存症、ＩｇＡ腎症、肝癌、前立腺癌、卵巣癌、心筋梗塞、繊維症、膵炎、糖尿病、糖タンパク質糖鎖転移不全症等がある。ガラクトース残基の関与が指摘される疾患の例としては、慢性関節リウマチ、肝癌等がある。Ｎ−アセチルグルコサミン残基の関与が指摘される疾患の例としては、特発性正常圧水頭症、肝癌等がある。
【実施例】
【００７２】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
〔実施例１〜３、比較例１〜３〕シアル酸率の異なる糖鎖を有するトランスフェリンの判別（１）
実施例１〜３では、マイクロタイタープレートに固相化したシアル酸率の異なるトランスフェリンを、検出用レクチン及び競合用レクチン（表２に示すガラクトース結合レクチン）が混在する系で検出した。比較例１では、前記トランスフェリンを検出用レクチンのみが存在する系で検出した。比較例２〜３では、検出用レクチン及び非競合用レクチン（表２に示すマンノース結合レクチン）が混在する系で検出した。具体的な手順を以下に示す。
【００７３】
１．レクチンの準備
ビオチン標識ニホンニワトコレクチン（Ｂｉｏｔｉｎ−ＳＳＡ）、レンズマメレクチン（ＬＣＡ）、デイゴマメレクチン（ＥＣＡ）及びコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）は（株）Ｊ−オイルミルズ製を使用し、キカラスウリレクチン−Ｉ（ＴＪＡ−Ｉ）を生化学バイオビジネス社より、そしてニガウリレクチン（ＭＣＬ）をシグマ社より購入した。
【００７４】
セイヨウニワトコレクチン（ＳＮＡ）を、Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ  ＷＦ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１９８４、２２１、１６３−９に記載の精製方法に従って得た。ムラサキモクワンジュレクチン（ＢＰＬ）を、Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｋ，，ｅｔ．ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９１、２８１、２５８−６２に記載の精製方法に従って得た。
【００７５】
上記ＳＮＡ及びＴＪＡ−Ｉのビオチニル化を、Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．Ｊ．Ｌｅｃｔｉｎｓ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ（ＩＳＢＮ：０３８７５６２１１７／０−３８７−５６２１１−７）Ｐ．１４２に記載の方法に従って行った。ビオチン標識したＳＮＡ及びＴＪＡ−Ｉを、それぞれＢｉｏｔｉｎ−ＳＮＡ及びＢｉｏｔｉｎ−ＴＪＡ−Ｉと略す。
【００７６】
２．シアル酸率の異なるトランスフェリンの調製
ヒト由来トランスフェリン（シグマ社製）を、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で２ｍｇ／ｍｌになるように溶解した後、ここにＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来のノイラミニダーゼ（和光純薬社製）を５ｍＵ／ｍｇトランスフェリンになるように添加した。溶液を３７℃の水浴で保温し、時間０分、１分、２分、５分、１５分又は１８時間後に一部をサンプリングした後、１００℃で１分間加熱して酵素反応を停止した。ノイラミニダーゼ未添加の試料は、水浴で保温せずに１００℃で１分間加熱し、ノイラミニダーゼ未処理とした。
【００７７】
上記で得たトランスフェリン溶液をそれぞれ等電点電気泳動（Ｐｈａｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  ：ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）をかけて、シアル酸数の異なるトランスフェリンに分離した。分離したトランスフェリンをタンパク染色後、デンシトメーター（アトー社製）で染色強度を測定した。ノイラミニダーゼ未処理のトランスフェリンのシアル酸量を１００％として、染色強度から算出されたシアル酸量をトランスフェリンのシアル酸率（％）とした。ノイラミニダーゼ処理時間とシアル酸率との関係を表１に示す。上記シアル酸率の異なるトランスフェリンを、使用時まで冷凍保存した。
【００７８】
【表１】
0005808583.tif 000008
【００７９】
３．レクチンＥＬＩＳＡ
シアル酸率の異なるトランスフェリンを０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）に濃度５μｇ／ｍｌにて添加した溶液５０μｌを、マイクロタイタープレート（ヌンク社製）のウエルに添加した。マイクロタイタープレートを３７℃で２時間、放置した後、２５０μｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で１回、洗浄した。ＢＳＡ（牛血清アルブミン、シグマ社製）２ｇをリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）１９８ｍｌに溶解して得た１％ＢＳＡ溶液（以下、「１％ＢＳＡ−ＰＢＳ」と略す）を１５０μｌ添加して、３７℃で２時間おくことによりブロッキングを行った。
【００８０】
Ｔｗｅｅｎ２０（ナカライテスク社製）１ｇをＰＢＳ２０００ｍｌに添加した溶液（以下、「ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０」と略す）２５０μｌでウエルを３回洗浄後、前記ガラクトース結合レクチン又は前記マンノース結合レクチンを濃度１ｍｇ／ｍｌにて含有する１％ＢＳＡ−ＰＢＳを４０μｌ添加して、室温で１時間放置した。
【００８１】
前記検出用レクチンを濃度１２．５μｇ／ｍｌにて含有する１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１０μｌ添加し、室温で１時間放置した。ウエルを２５０μｌのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ベクター社製）を濃度１μｇ／ｍｌにて含有する１％ＢＳＡ−ＰＢＳを５０μｌ添加して、室温で１時間放置した。ウエルを２５０μｌのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄後、ＴＭＢ試薬（ＫＰＬ社製）５０μｌを添加した。室温で５分放置後、１Ｍ  リン酸を５０μｌ添加して反応を停止した。マイクロプレートリーダー（製品名：ＰＯＷＥＲＳＣＡＮ（登録商標）ＨＴ、ＤＳファーマバイオメディカル社製）で波長４５０ｎｍの吸光度で測定した。
【００８２】
検出用レクチンとしてのＢｉｏｔｉｎ−ＳＮＡに競合用レクチンとしてのＥＣＡ（実施例１）、ＭＣＬ（実施例２）又はＢＰＬ（実施例３）が混在する系において、シアル酸率の異なるトランスフェリンを検出したときの吸光度の変化を図１に示す。また、競合用レクチンが非混在（比較例１）の系の吸光度の変化も図１に示す。
【００８３】
図１において、検出用レクチンのみが存在する比較例１では、トランスフェリンのシアル酸率が低い場合は、シアル酸率に依存して吸光度が増大する。しかし、シアル酸率が７３％以上となると、吸光度はほぼ一定となる。すなわち、競合用レクチンが非混在の系では、シアル酸率が７３％以上のトランスフェリンのシアル酸率の違いを区別できない。一方、検出用レクチンと競合するガラクトース結合レクチンが混在する実施例１〜３では、シアル酸率７３％以上であっても、シアル酸率に依存して吸光度が増加している。検出用レクチンと競合するレクチンが存在する実施例１〜３では、シアル酸率が高いトランスフェリンのシアル酸率の違いを容易に区別できる。
【００８４】
シアル酸率が９１％及び７３％のトランスフェリンの吸光度比（ＯＤ９１％／ＯＤ７３％）を、測定３回の平均値と標準偏差で表２に示す。さらに、それぞれの検出用レクチンにおいて、比較例１との有意差検定（ｔ検定）の結果を示す。表中、＊＊はｐ＜０．０１を意味し、そして＊はｐ＜０．０５を意味する。
【００８５】
【表２】
0005808583.tif 000009
【００８６】
表２で、比較例１〜３の吸光度比は１に近い。一方、実施例１〜３の吸光度比は、１よりも有意に増大している。このことから、検出用レクチンに競合するレクチンを混在させた実施例のみで、トランスフェリンのシアル酸率の変化、特に高いシアル酸率での差を判別しやすくなることが実証された。
【００８７】
〔実施例４、比較例４〕シアル酸率の異なる糖鎖を有するトランスフェリンの判別（２）
シアル酸率の異なるトランスフェリンを、抗体を介して固相化する以外は、実施例１と同様の手順で、トランスフェリンを競合用レクチン及び検出用レクチンが混在する系で反応させた。比較例４では、競合用レクチンが非混在の系で反応させた。以下に、具体的な手順を示す。
【００８８】
１．レクチンＥＬＩＳＡ
抗ヒトトランスフェリン抗体（ＬＮＭ社製）を０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）に濃度５μｇ／ｍｌにて溶かした溶液を５０μｌ、マイクロタイタープレート（ヌンク社製）のウエルに添加し、４℃で一晩、固相化させた。次いで、ブロッキングを実施例１と同様に行った。
【００８９】
固相化マイクロタイタープレートのウエルを、２５０μｌのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で３回、洗浄した。シアル酸率の異なるトランスフェリンを濃度４μｇ／ｍｌにて含有する１％ＢＳＡ−ＰＢＳを５０μｌ添加し、室温で１時間保温した。
【００９０】
ウエルを２５０μｌのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で３回、洗浄後、ＥＣＡを濃度１ｍｇ／ｍｌにて含有する１％ＢＳＡ−ＰＢＳを４０μｌ添加し、室温で１時間保温した。更に、Ｂｉｏｔｉｎ−ＳＳＡを濃度１２．５μｇ／ｍｌにて含有する１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１０μｌ添加し、室温で１時間反応させた。ＨＲＰ反応と発色を実施例１と同様に行った。
【００９１】
検出用レクチンに競合用レクチンとしてのＥＣＡが混在する系において、シアル酸率が７３％及び９１％のトランスフェリンをそれぞれ検出したときの吸光度を図２に示す。また、競合用レクチンが非混在の系（比較例４）の吸光度も図２に示す。吸光度の有意差検定を行った。＊＊は、Ｐ＜０．０１を意味する。
【００９２】
図２に示すとおり、競合用レクチンが非混在で反応させた比較例４では、シアル酸率９１％と７３％のトランスフェリンの吸光度に有意差が見られない。一方、検出用レクチンに競合するガラクトース結合レクチンが混在する実施例４では、吸光度に有意差が見られた（ｐ＜０．０１）。本発明によれば、トランスフェリンを、抗体を介して固相化した場合でも、高シアル酸率のトランスフェリン同士を判別できることが判明した。
【００９３】
〔実施例５〜７、比較例５〜７〕シアル酸率の異なる糖鎖を有するハプトグロビンの判別
実施例５〜７では、マイクロタイタープレートに固相化したシアル酸率の異なるハプトグロビンを、検出用レクチン及び競合用レクチン（表４に示すガラクトース結合レクチン）が混在する系で検出した。比較例５では、前記ハプトグロビンを検出用レクチンのみで競合用レクチンが非混在の系で検出した。比較例６〜７では、検出用レクチン及び非競合用レクチン（表４に示すマンノース結合レクチン）が混在する系で検出した。以下に、具体的な手順を示す。
【００９４】
１．シアル酸率の異なるハプトグロビンの調製
ヒト由来ハプトグロビン（ＢＩＯＤＥＳＩＧＮ社製）を、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に２ｍｇ／ｍｌになるように溶解した後、ここにＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ由来のノイラミニダーゼ（ナカライテスク社製）を０．５ｍＵ／ｍｇハプトグロビンになるように添加した。溶液を３７℃の水浴で保温し、時間０分又は３０分にサンプリングした後、１０倍量の２０ｍＭ炭酸ナトリウム溶液を加えて酵素反応を停止した。ノイラミニダーゼ未添加の試料は、水浴で保温せずに１０倍量の２０ｍＭ炭酸ナトリウム溶液を加えてノイラミニダーゼ未処理とした。
【００９５】
上記で得たハプトグロビンの単糖組成分析を、ＡＢＥＥ糖組成分析キット  プラスＳ（（株）Ｊ−オイルミルズ製）を用いて行った。ノイラミニダーゼ未処理のハプトグロビンのシアル酸量を１００％として、ノイラミニダーゼ処理のハプトグロビンのシアル酸率（％）として算出した。ノイラミニダーゼ処理時間とシアル酸率との関係を表３に示す。上記シアル酸率の異なるハプトグロビンを使用時まで冷凍保存した。
【００９６】
【表３】
0005808583.tif 000010
【００９７】
２．レクチンＥＬＩＳＡ
シアル酸率の異なるハプトグロビンを０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）に濃度５μｇ／ｍｌにて添加した溶液を５０μｌ、マイクロタイタープレート（ヌンク社製）に添加し、４℃で一晩、固相化させた。次いで、ブロッキングを実施例１と同様に行った。
【００９８】
２５０μｌのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０でウエルを３回洗浄後、前記ガラクトース結合レクチン又は前記マンノース結合レクチンを濃度１ｍｇ／ｍｌにて含有する１％ＢＳＡ−ＰＢＳを４０μｌ添加し、室温で１時間放置した。
【００９９】
前記検出用レクチンを濃度１２．５μｇ／ｍｌにて含有する１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１０μｌ添加し、室温で１時間放置した。ＨＲＰ反応と発色を実施例１と同様に行った。
【０１００】
検出用レクチンとしてのＢｉｏｔｉｎ−ＳＳＡに競合用レクチンとしてのＥＣＡ（実施例５）、ＭＣＬ（実施例６）又はＢＰＬ（実施例７）が混在する系において、シアル酸率の異なるハプトグロビンを検出したときの吸光度を図３に示す。また、検出用レクチンのみで競合用レクチンが非混在の系（比較例５）の吸光度も図３に示す。シアル酸率１００％と８５％のハプトグロビンの吸光度の有意差検定を行った。＊＊は、Ｐ＜０．０１を意味する。
【０１０１】
図３において、検出用レクチンのみで競合用レクチンが非混在の比較例５では、シアル酸率１００％と８５％のハプトグロビンの吸光度に有意差が見られない。一方、検出用レクチンと競合するガラクトース結合レクチン（ＥＣＡ、ＭＣＬ又はＢＰＬ）を混在させた実施例５〜７では、吸光度に有意差が見られた（Ｐ＜０．０１）。以上のことから、本発明は、トランスフェリンだけでなく、ハプトグロビンのシアル酸量の判別にも応用できることが実証された。
【０１０２】
シアル酸付加率１００％と８５％のハプトグロビンの吸光度比（ＯＤ１００％／ＯＤ８５％）を、測定３回の平均値と標準偏差で表４に示す。さらに、比較例５に対する有意差検定（ｔ検定）の結果を示す。表中、＊＊はｐ＜０．０１を意味し、そして＊はｐ＜０．０５を意味する。
【０１０３】
【表４】
0005808583.tif 000011
【０１０４】
表４で、比較例５〜７の吸光度比は１に近い。一方、実施例５〜７の吸光度比は、１よりも有意に増大している。このことから、ハプトグロビンは、トランスフェリンと同様に、検出用レクチンに競合するレクチンを混在させた実施例のみで、ハプトグロビンのシアル酸率の変化、特に高いシアル酸率での差を判別しやすくなることが実証された。
【０１０５】
〔実施例８、比較例８〜９〕ガラクトース率の異なる糖鎖を有するトランスフェリンの判別
マイクロタイタープレートに固相化したガラクトース率の異なるトランスフェリンを、検出用レクチンに競合用レクチン（表６に示すＮ−アセチルグルコサミン結合レクチン）が混在する系で検出した。比較例８では、前記トランスフェリンを検出用レクチンのみで競合用レクチンが非混在の系で検出した。比較例９では、検出用レクチン及び非競合用レクチン（表６に示すマンノース結合レクチン）が混在する系で検出した。具体的な手順を以下に示す。
【０１０６】
１．試薬の準備
ビオチン標識デイゴマメレクチン（Ｂｉｏｔｉｎ−ＥＣＡ）は（株）Ｊ−オイルミルズ製を使用した。バンデリアマメレクチン−ＩＩ（ＧＳＬ−ＩＩ）をＤｅｌｍｏｔｔｅ  ＦＭ，ｅｔ．ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８０、１１２、２１９−２３に記載の精製方法に従って得た。
【０１０７】
２．ガラクトース率の異なるトランスフェリンの調製
ヒト由来トランスフェリン（シグマ社製）を、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に２ｍｇ／ｍｌになるように溶解した後、ここにＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来ノイラミニダーゼ（和光純薬社製）を１０ｍＵ／ｍｇトランスフェリンになるように添加した。この溶液を３７℃で一晩保温した。
【０１０８】
次に、連鎖球菌由来β−ガラクトシダーゼ（生化学バイオビジネス社製）を０．５  ｍＵ／ｍｇトランスフェリンになるように添加した。溶液を３７℃の水浴で保温し、１分又は８分後に一部をサンプリングした後、等量の２０ｍＭ炭酸ナトリウム溶液を添加して酵素反応を停止した。β−ガラクトシダーゼ未添加の試料は、水浴で保温せずに等量の２０ｍＭ炭酸ナトリウム溶液を添加してβ−ガラクトシダーゼ未処理とした。
【０１０９】
ガラクトース率の異なるトランスフェリンの単糖組成分析を、ＡＢＥＥ糖組成分析キット  プラスＳ（（株）Ｊ−オイルミルズ製）を用いて行った。β−ガラクトシダーゼ未処理のトランスフェリンのガラクトース量を１００％として、β−ガラクトシダーゼ処理のトランスフェリンのガラクトース率（％）を算出した。β−ガラクトシダーゼ処理時間とガラクトース率との関係を表５に示す。上記ガラクトース率の異なるトランスフェリンを使用時まで冷凍保存した。
【０１１０】
【表５】
0005808583.tif 000012
【０１１１】
３．レクチンＥＬＩＳＡ
ガラクトース率の異なるトランスフェリンを０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）に濃度５μｇ／ｍｌにて添加した溶液を５０μｌ、マイクロタイタープレート（ヌンク社製）に添加し、４℃で一晩、固相化させた。次いで、ブロッキングを実施例１と同様に行った。
【０１１２】
２５０μｌのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０でウエルを３回洗浄後、前記Ｎ−アセチルグルコサミン結合レクチン又は前記マンノース結合レクチンを濃度１ｍｇ／ｍｌにて含有する１％ＢＳＡ−ＰＢＳを４０μｌ添加し、室温で１時間放置した。
【０１１３】
Ｂｉｏｔｉｎ−ＥＣＡを濃度５μｇ／ｍｌにて含有する１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１０μｌ添加し、室温で１時間保温した。ＨＲＰ反応と発色を実施例１と同様に行った。
【０１１４】
検出用レクチンとしてのＢｉｏｔｉｎ−ＥＣＡに競合用レクチンとしてのＧＳＬ−ＩＩが混在する系において、ガラクトース率が異なるトランスフェリンを検出したときの吸光度を図４に示す。また、検出用レクチンのみで競合用レクチンが非混在の系（比較例８）の吸光度も図４に示す。ガラクトース率が８２％と７５％のトランスフェリンの吸光度の有意差検定を行った。＊＊は、Ｐ＜０．０１を意味する。
【０１１５】
図４において、検出用レクチンのみで競合用レクチンが非混在の系である比較例８では、ガラクトース率が８２％と７５％のトランスフェリンの吸光度に有意差が見られない。一方、検出用レクチンと競合するＮ−アセチルグルコサミン結合レクチン（ＧＳＬ−ＩＩ）を混在させた実施例８では、吸光度に有意差が見られた（Ｐ＜０．０１）。以上のことから、本発明は、トランスフェリンのシアル酸だけでなく、ガラクトース量の判別にも応用できることが実証された。
【０１１６】
ガラクトース率が８２％と７５％のトランスフェリンの吸光度比（ＯＤ８２％／ＯＤ７５％）を、３回の平均値と標準偏差で表６に示す。さらに、比較例８との有意差検定（ｔ検定）の結果を示す。表中、＊＊はｐ＜０．０１を意味する。
【０１１７】
【表６】
0005808583.tif 000013
【０１１８】
表６で、比較例８〜９の吸光度比は１に近い。一方、実施例８の吸光度比は１よりも有意に増大している。このことから、トランスフェリンのガラクトース率の判別は、シアル酸率と同様に、検出用レクチンと競合するレクチンを混在させることで容易になることが実証された。
【０１１９】
〔実施例９、比較例１０〕シアル酸率の異なる糖鎖を有するトランスフェリンの判別（３）
マイクロタイタープレートに固相化したシアル酸率の異なるトランスフェリンを、検出用レクチンとしてのガラクトース結合レクチンに競合用レクチンとしてのシアル酸結合レクチンが混在する系で検出した。比較例１０では、前記トランスフェリンを検出用レクチンのみで競合用レクチンが非混在の系で検出した。具体的な手順を以下に示す。
【０１２０】
１．試薬の準備
ニホンニワトコレクチン（ＳＳＡ）は（株）Ｊ−オイルミルズ製を使用した。
【０１２１】
２．シアル酸率の異なるトランスフェリンの調製
ヒト由来トランスフェリン（シグマ社製）を、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で２ｍｇ／ｍｌになるように溶解した後、ここにＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ由来のノイラミニダーゼ（ナカライテスク社製）を５ｍＵ／ｍｇトランスフェリンになるように添加した。溶液を３７℃の水浴で３時間又は２０時間で一部をサンプリングした後、１０倍量の０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）を加え、酵素反応を停止した。ノイラミニダーゼ未添加の試料は、水浴で保温せずに１０倍量の０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）を加えノイラミニダーゼ未処理とした。
【０１２２】
シアル酸率の異なるトランスフェリンの単糖組成分析を、ＡＢＥＥ糖組成分析キット  プラスＳ（（株）Ｊ−オイルミルズ製）を用いて行った。ノイラミニダーゼ未処理のトランスフェリンのシアル酸量を１００％として、ノイラミニダーゼ処理のトランスフェリンのシアル酸率（％）を算出した。ノイラミニダーゼ処理時間とシアル酸率との関係を表７に示す。上記シアル酸率の異なるトランスフェリンを使用時まで冷凍保存した。
【０１２３】
【表７】
0005808583.tif 000014
【０１２４】
３．レクチンＥＬＩＳＡ
シアル酸率の異なるトランスフェリンを０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）に濃度５μｇ／ｍｌにて添加した溶液を５０μｌ、マイクロタイタープレート（ヌンク社製）に添加し、３７℃で２時間、固相化させた。次いで、ブロッキングを実施例１と同様に行った。
【０１２５】
２５０μｌのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０でウエルを３回洗浄後、前記ニホンニワトコレクチン（ＳＳＡ）を濃度０．１３ｍｇ／ｍｌにて含有する１％ＢＳＡ−ＰＢＳを４０μｌ添加し、室温で１時間放置した。
【０１２６】
Ｂｉｏｔｉｎ−ＥＣＡを濃度３μｇ／ｍｌにて含有する１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１０μｌ添加し、室温で１時間保温した。ＨＲＰ反応と発色を実施例１と同様に行った。
【０１２７】
検出用レクチンとしてのＢｉｏｔｉｎ−ＥＣＡに競合用レクチンとしてのＳＳＡが混在する系において、シアル酸率が異なるトランスフェリンを検出したときの吸光度を図５に示す。また、検出用レクチンのみで競合用レクチンが非混在の系（比較例１０）の吸光度も図５に示す。シアル酸率が０％と７％のトランスフェリンの吸光度の有意差検定を行った。＊＊は、Ｐ＜０．０１を意味する。
【０１２８】
図５において、検出用レクチンのみで競合用レクチンが非混在の系である比較例１０では、シアル酸率が０％と７％のトランスフェリンの吸光度に有意差が見られない。一方、検出用レクチンに競合用レクチンでのニホンニワトコレクチン（ＳＳＡ）を混在させた実施例９では、吸光度に有意差が見られた（Ｐ＜０．０１）。本発明の方法によりシアル酸率が０％と７％のトランスフェリンを区別できることは、本発明がシアル酸の微量な欠損だけでなく、微量な増加の判別にも応用できることを証明する。
【０１２９】
〔実施例１０、比較例１１〕シアル酸率の異なる糖鎖を有するムチンの判別
実施例１０では、マイクロタイタープレートに固相化したシアル酸率の異なるムチンを、検出用レクチン（シアル酸結合レクチン）に競合用レクチン（ガラクトース結合レクチン）が混在する系で検出した。比較例１１では、前記ムチンを検出用レクチンのみで競合用レクチンが非混在の系で検出した。以下に、具体的な手順を示す。
【０１３０】
１．シアル酸率の異なるムチンの調製
ムチン（ブタ胃由来  シグマ社製）を、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に２ｍｇ／ｍｌになるように溶解した後、ここにＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来ノイラミニダーゼ（和光純薬社製）を０．１ｍＵ／ｍｇムチンになるように添加した。溶液を３７℃で１７時間保温した。ノイラミニダーゼ未添加の試料も同様の処理を行い、これをノイラミニダーゼ未処理とした。
【０１３１】
上記で得たムチンのグリコシド結合型シアル酸を、生化学実験講座４  糖質の化学  下巻  Ｐ．３８２に記載の方法に従って定量した。ノイラミニダーゼ未処理のムチンのシアル酸量を１００％として、ノイラミニダーゼ処理のムチンのシアル酸率（％）を算出した。ノイラミニダーゼ処理とシアル酸率との関係を表８に示す。
【０１３２】
【表８】
0005808583.tif 000015
【０１３３】
２．レクチンＥＬＩＳＡ
シアル酸率の異なるムチンを０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）に濃度１０μｇ／ｍｌにて添加した溶液を５０μｌ、マイクロタイタープレート（ヌンク社製）に添加し、３７℃で２時間固相化させた。次いで、ブロッキングを実施例１と同様に行った。
【０１３４】
２５０μｌのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０でウエルを３回洗浄後、ＢＰＬを濃度０．２５ｍｇ／ｍｌにて含有する１％ＢＳＡ−ＰＢＳを４０μｌ添加し、室温で１時間放置した。更に、Ｂｉｏｔｉｎ−ＳＳＡを濃度１２．５μｇ／ｍｌにて含有する１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１０μｌ添加し、室温で１時間反応させた。ＨＲＰ反応と発色を実施例１と同様に行った。
【０１３５】
検出用レクチンとしてのＢｉｏｔｉｎ−ＳＳＡに競合用レクチンとしてのＢＰＬ（実施例１０）が混在する系において、シアル酸率の異なるムチンを検出したときの吸光度を図６に示す。また、検出用レクチンのみで競合用レクチンが非混在の系（比較例１１）の吸光度も図６に示す。シアル酸率１００％と８１％のムチンの吸光度の有意差検定を行った。＊＊は、Ｐ＜０．０１を意味する。
【０１３６】
図６において、検出用レクチンのみで競合用レクチンが非混在の比較例１１では、シアル酸率１００％と８１％のムチンの吸光度に有意差が見られない。一方、検出用レクチンと競合するガラクトース結合レクチン（ＢＰＬ）を混在させた実施例１０では、吸光度に有意差が見られた（Ｐ＜０．０１）。以上のことから、本発明は、Ｎ結合型糖鎖だけでなく、Ｏ結合型糖鎖のシアル酸量の判別にも応用できることが実証された。
【図１】
0005808583.tif 000016
【図２】
0005808583.tif 000017
【図３】
0005808583.tif 000018
【図４】
0005808583.tif 000019
【図５】
0005808583.tif 000020
【図６】
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