(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
山薬（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ Ｒｈｉｚｏｍａ）とウチワドコロ（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ｎｉｐｐｏｎｉｃａ）の山薬：ウチワドコロ＝３．５：１（ｗ／ｗ）の混合物の生薬抽出物を有効成分とし、薬学的に許容可能な担体を含むことを特徴とする、糖尿病性末梢神経病症の予防または治療用医薬組成物。
【請求項２】
糖尿病性末梢神経病症は、神経細胞の萎縮、変性及び死滅を含む群から選択された少なくとも一つの原因による疾患であることを特徴とする、請求項１に記載の糖尿病性末梢神経病症の予防または治療用医薬組成物。
【請求項３】
糖尿病性末梢神経病症は、焼きつくような痛み、刺すような痛み、疼痛、締め付けられるような痛み、触覚、振動覚または温度覚の感覚喪失、及びこれらの組合せを含む群から選択された症状を示すことを特徴とする、請求項１に記載の糖尿病性末梢神経病症の予防または治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、山薬(Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ Ｒｈｉｚｏｍａ)とウチワドコロ(Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ｎｉｐｐｏｎｉｃａ)の山薬：ウチワドコロ＝３.５：１（ｗ／ｗ）混合物の生薬抽出物を含有する糖尿病性末梢神経病症の予防及び治療用組成物に関する。
【０００２】
［確認事項］
本研究は、大韓民国知識経済省戦略的Ｒ＆Ｄ企画局（ＯＳＰ）のＧｌｏｂａｌ  Ｌｅａｄｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒａｍに支援された（Ｎｏ．１００３９３０３）。  
【背景技術】
【０００３】
糖尿病は、その発病率が全世界的に急速に増加している疾病として、世界保健機構(ＷＨＯ)は、２００８年糖尿病を病んでいる患者の数が約１億８千万名程度であると推算しており、その数は、２０３０年まで２倍に増加すると予想されている。これによって、糖尿病による経済的、社会的費用負担が徐々に増えており、糖尿病に随伴されるさまざまな余病による致死率も増加している。しかし、厳格な血糖の調節により病気の進行を阻むか疾病の進行速度を落とすことができるので、生活習慣の変化と適切な治療により血糖を一定に維持することが重要な方法と考えられている。
【０００４】
糖尿病は、先進国において神経病症の原因として一番よく知られた疾病である。糖尿病性末梢神経病症は、糖尿病により誘発された末梢神経系の機能異常による症状を示す用語である。これは糖尿病でよく見られる合併症である。
【０００５】
糖尿病性末梢神経病症は、糖尿病患者の生活の質を低下させて、患者死亡率を高める最大の原因である。糖尿病患者において糖尿病性末梢神経病症の有病率は患者の年齢と糖尿病を病んだ期間に従って増加する。糖尿病性末梢神経病症は、１型糖尿患者と２型糖尿患者の両方ともに現われるが、１型糖尿病患者(２２.７％)よりは２型糖尿病患者(３２.１％)において、その有病率が一層高い(Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃａｒｅ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｖｏｌｕｍｅ １，Ｉｓｓｕｅ ３，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００７，Ｐａｇｅｓ １２９−１３４ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ ａｍｏｎｇ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｙｐｅ １ ａｎｄ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎ Ｆｒａｎｃｅ，Ｉｔａｌｙ，Ｓｐａｉｎ，ａｎｄ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ)。
【０００６】
糖尿病患者の約１０％程度は持続的な痛みを訴えており、このような痛みは自発的であるかあるいは刺激により誘導されることもある。苦痛は悪化されて不治性になることもある。このような糖尿病性末梢神経病症による痛みは、通常、夜に一層ひどくなり、焼きつくような痛み、刺すような痛み、疼痛、締め付けられるような痛み等であると表現される。また、糖尿病性神経病症の痛みは、手よりは足において確かに感じられる。急激な痛みは体重の減少や憂鬱病などへ続くこともある(Ｐａｉｎ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌｕｍｅ ８ Ｎｕｍｂｅｒ Ｓ２ ２００７，Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ Ｐａｉｎ：Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ)。
【０００７】
糖尿病性末梢神経病症は、筋力測定、触覚、温度覚、振動覚の測定、そして末梢皮膚の血流速度測定、神経伝導度の測定により診断される。現在、糖尿病性末梢神経病症の治療では、血糖の調節と病因論的治療、対症的治療が行われている。高血糖と神経病症進行の相関関係はよく確立され、血糖調節をしない糖尿病患者における糖尿病性末梢神経病症の高い有病率を述べた多くの研究により明らかにされているから、血糖の調節は糖尿病性末梢神経病症の基本的な予防/治療方法として認識されている(Ｎ Ｅｎｇｌ J Ｍｅｄ １９９３;３２９:９７７−８６，Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ)。
【０００８】
糖尿病性神経病症の代表的な病因論的治療剤では、アルファリポ酸、アルドース還元酵素阻害剤とガンマリノレン酸がある。抗酸化剤であるα−リポ酸(チオクト酸)は、神経細胞死をもたらす高血糖により誘発された酸化的ストレスを減少させることで糖尿病性神経病症の病因を遮断する。アルドース還元酵素阻害剤(Ａｌｄｏｓｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ)は、神経細胞内のブドウ糖がポリオール経路に入ることを阻止して神経細胞に損傷をもたらすソルビトール(ｓｏｒｂｉｔｏｌ)の蓄積を抑制することで糖尿病性神経病症の進行を遮断する。しかし、これらの大部分は副作用と効果不足などの理由により開発段階で中断された。現在、エパルレスタット(Ｅｐａｌｒｅｓｔａｔ)だけが日本で使われている。γ−リノレン酸(γ−Ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ)は、神経膜の構成成分であり、神経細胞で血流の恒常性維持に重要な役割を果たすプロスタグランジンＥの構成成分として、糖尿病性神経病症のいくつかの症状の改善効果を示した(ＢＭＪ. ２００７ Ｊｕｌ １４;３３５(７６１０)：８７. Ｅｐｕｂ ２００７ Ｊｕｎ １１，Ｒｅｖｉｅｗ. Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ ｐａｉｎｆｕｌ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ：ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ)。
【０００９】
糖尿病性神経病症の痛みを緩和する対症的治療剤には、三環系抗憂鬱剤(ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔｓ)、抗痙攣剤、選択的セロトニン再吸収抑制剤(ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ ｒｅｕｐｔａｋｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ)、局所カプサイシンなどがある。三環系抗憂鬱剤(ＴＣＡ)は、中枢神経系のセロトニンとノルエピネフリンの再吸収を抑制して痛みの伝達を抑制し、内因性エンドルフィンの作用を強化させることで痛みを緩和する。抗痙攣剤、選択的セロトニン再吸収抑制剤は、三環系抗憂鬱剤処方が適合ではない患者に２次的な選択薬物として使われている。局所カプサイシンは、痛みを伴う感覚異常(ｄｙｓｅｓｔｈｅｓｉａ)に有効であることが知られており、ｔｙｐｅ−Ｃ侵害受容線維(ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ ｆｉｂｅｒｓ)からの神経ペプチドであるサブスタンスＰ(ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ)の遊離を誘発し、かつサブスタンスＰ(ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ)の補充(ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｍｅｎｔ)を抑制して、末梢の痛みシグナルの伝導と伝播を遮断して痛みを緩和する。
【００１０】
しかし、糖尿病性末梢神経病症は、その病因と症状が非常に多様なので患者を適切に治療する治療法を探しにくい。臨床では糖尿病性末梢神経病症の根本的な治療よりは、痛みの緩和と病気の進行を抑制する対症的治療法が主に行われている。従って、糖尿病により破壊された神経の再生を通じた糖尿病性末梢神経病症を治療する治療法の必要性が増大している。ニューロンの再生を促進する機能を有する神経成長因子が、糖尿病性末梢神経病症の治療の強力な候補として浮上している。
【００１１】
多くの先の研究結果は、糖尿病個体において、神経成長因子(ＮＧＦ)の生合成とニューロンでの逆行性輸送が減少することを示しており、これらが糖尿病性末梢神経病症の病因の一つであることが知られている。健康人の皮膚で神経成長因子は、基底角質細胞で生産されて神経のｔｒｋＡという受容体を通じて作用する。一方、糖尿病患者の皮膚角質細胞では、より低量の神経成長因子が観察され、このような減少は、感覚神経纎維不全と関連することが知られている(Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｏｂｅｓ Ｍｅｔａｂ. ２００８ Ｆｅｂ;１０(２):９９−１０８. Ｅｐｕｂ ２００７ Ｊｕｎ ２６，Ｒｅｖｉｅｗ. Ｄｉａｂｅｔｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ: ｎｅｗ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ)。
【００１２】
糖尿病性末梢神経病症を誘発させた動物に神経成長因子を投与した場合、糖尿病性末梢神経病症による痛みと症状を緩和したという先行研究の結果があった。これに基いて糖尿病性神経病症患者を対象とした臨床実験も実施された。無作為偽薬比較第２相臨床試験の結果、組み換えヒト神経成長因子を６ヶ月間、３回／週投与した糖尿病性末梢神経病症患者は、神経病症の症状と痛みが緩和された。しかし、４８週にわたった無作為偽薬比較第３相臨床試験は、投薬部位の痛みの副作用と非有意な効果により、有意に効果的ではなかった。それで、外部神経成長因子の投薬ではない内因性神経成長因子の生合成を促進させる後続研究が進められている(Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ. １９９９ Ａｕｇ ３０;１０７(２Ｂ):３４Ｓ−４２Ｓ，Ｒｅｖｉｅｗ. Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ)。
【００１３】
山薬(Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ Ｒｈｉｚｏｍａ)は、ヤマノイモ科(Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ)に属する植物のナガイモ(Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ｂａｔａｔａｓ Ｄｅｃａｉｓｎｅ)またはヤマノイモ(Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｔｈｕｎｂｅｒｇ)の周皮を除いた根茎(担根体)として、そのまま使用するか、または蒸して乾かして使用する。この植物はステロール型サポニン(ｄｉｏｓｃｉｎ)、アラントイン(ａｌｌａｎｔｏｉｎ) などを含んでいる。
【００１４】
ウチワドコロは、つる性多年草であるウチワドコロ(Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ｎｉｐｐｏｎｉｃａ Ｍａｋｉｎｏ)の根茎として、ジオスシン(ｄｉｏｓｃｉｎ)とプロサポゲンＡ(ｐｒｏｓａｐｏｇｅｎ Ａ)、プロサポゲンＣ(ｐｒｏｓａｐｏｇｅｎ Ｃ)など、種々のステロール型サポニンを含んでいる。
【００１５】
生薬剤において、これら生薬は、単独で、または他の生薬と組み合わせて使われて来た。これらの二つの生薬組合せ抽出物の糖尿病性末梢神経病症と関連された医学的効果に関する先行文献は、報告されたことがない。
【００１６】
大韓民国登録特許第８５４６２１号公報には、ウチワドコロ、カエデドコロ、ナガイモ、ヤマノイモ及びオニドコロからなる群より選択される抽出物を含む末梢神経病症の予防及び治療用組成物が提供され、前記組成物が神経突起の成長を誘導すると共に内因性神経成長因子の分泌を増加させることで、末梢神経病症の予防及び治療に効果的であることを明らかにしている。
【００１７】
本発明者らは、前記大韓民国登録特許第８５４６２１号公報に記載されたウチワドコロ、カエデドコロ、ナガイモ、ヤマノイモ及びオニドコロの中から選択された植物の抽出物が、有意性ある神経突起の成長を誘導すると共に、内因性神経成長因子の分泌量を増加させる効果があることを確認した。驚くべきことに、本発明者らは、動物モデル実験を通じて、各単独または組み合わせの抽出物が、神経突起の成長及び内因性神経成長因子の分泌においてほとんど同じ効果を有するにもかかわらず、特定比の山薬とウチワドコロの抽出物が、血漿及び唾液腺などの生体内の神経成長因子(ＮＧＦ)量を高度に著しく増加させること、及び、熱及び機械的刺激に対し高度に感受的な糖尿病性神経病症により誘発される痛みを緩和することにより、糖尿病性末梢神経病症に対する相乗的な治療効果を奏することを見出し、本発明を完成した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
従って、本発明は上述したような従来技術の問題点を解決するためになされたもので、その目的は、大韓民国登録特許第８５４６２１号公報に記載された生薬材の中で、糖尿病により２次的に発生する糖尿病性末梢神経病症を治療することができる生体内神経成長因子(ＮＧＦ)の含量を著しく増加させる活性を示す生薬組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記生薬組成物を有効成分とする糖尿病性末梢神経病症の予防及び治療に有用な医薬組成物及び健康機能食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の目的は、山薬(Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ Ｒｈｉｚｏｍａ)：ウチワドコロ(Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ｎｉｐｐｏｎｉｃａ)＝３.５：１（ｗ／ｗ）の混合物から調製された生薬抽出物を含有する糖尿病性末梢神経病症の予防及び治療用組成物、及び健康機能食品を提供することにより達成される。
【００２０】
一側面として、本発明は、山薬とウチワドコロ生薬の混合抽出物を提供する。より具体的には、本発明により提供される生薬抽出物は、山薬(Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ Ｒｈｉｚｏｍａ)及びウチワドコロ(Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ｎｉｐｐｏｎｉｃａ)を３.５：１（ｗ／ｗ）の重量比で含む混合物から得られる。
【００２１】
本発明の生薬抽出物は、乾燥された山薬とウチワドコロの混合物から、５０％エタノール中、室温で４８時冷浸した後、真空下濃縮することにより調製することができる。詳しくは、山薬及びウチワドコロを洗浄、乾燥、切断し、山薬：ウチワドコロ＝３.５：１（ｗ／ｗ）で混合し、生薬混合物を５倍重量の５０％エタノール中にて、室温で４８時間１回冷浸し、次いで減圧濃縮する。
【００２２】
また、他の側面として、本発明は、山薬：ウチワドコロ＝３.５：１（ｗ／ｗ）の混合物の生薬抽出物を有効成分とし、薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とともに含む、糖尿病性末梢神経病症の予防及び治療用組成物を提供する。
【００２３】
本発明の組成物は、山薬：ウチワドコロ＝３.５：１の混合物の生薬抽出物を、組成物総重量に対して０.０１〜８０重量％、好ましくは１〜５０重量％含む。
【００２４】
糖尿病性神経病症が、触覚、振動覚、温度覚等の感覚喪失、 焼きつくような痛み、刺すような痛み、疼痛、締め付けられるような痛みなどの痛みを含むことは、当業者に明らかである。
【００２５】
本発明の山薬：ウチワドコロ＝３.５：１（ｗ／ｗ）の混合物の生薬抽出物に基く組成物は、適切な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含むことができる。
【００２６】
本発明の組成物に使用できる担体、賦形剤または希釈剤の例は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸、ゼラチン、カルシウム、リン酸塩、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、マイクロクリスタリンセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油を含む。
【００２７】
また、本発明の組成物は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾールなどの経口型剤形、局所製剤、坐剤または滅菌注射溶液に剤形化することができる。本発明の医薬組成物は、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤とともに製剤化することができる。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、本発明の生薬複合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、酸化カルシウム(ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ)、スクロース(ｓｕｃｒｏｓｅ)、ラクトース(ｌａｃｔｏｓｅ)、ゼラチンなどを混ぜて製剤化することができる。また、単純な賦形剤の他に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤を使用してもよい。経口投与用液状製剤は、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などを含む。単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に多様な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。また、本発明の医薬組成物は、非経口経路で投与されることができる。そのために、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤及び坐剤などを使用することができる。非水性溶剤及び懸濁剤には、注射可能なプロピレングリコール (ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ)、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのようなエステルなどを使用することができる。坐剤の基剤には、ウィテップゾール(ｗｉｔｅｐｓｏｌ)、マクロゴール、ツイン(ｔｗｅｅｎ)６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが含まれる。
【００２８】
さらに別の側面として、本発明は、糖尿病性末梢神経病症治療剤の製造のための山薬：ウチワドコロ＝３.５：１（ｗ／ｗ）の混合物の生薬抽出物の使用を提供する。
【００２９】
また、さらに別の側面として、本発明は、山薬：ウチワドコロ＝３.５：１（ｗ／ｗ）の混合物の生薬抽出物を含む医薬組成物を、治療的に有効な量で哺乳動物に投与することを特徴とする、糖尿病性神経病症の治療方法を提供する。
【００３０】
山薬：ウチワドコロ＝３.５：１（ｗ／ｗ）の混合物の生薬抽出物を含む医薬組成物の投与量は、年齢、性別、体重、患者の健康状態、食事、投与時間、投与方法、排泄率等を含む多様な要因によって変動し得る。一般的に、本発明の医薬組成物は、０.０１〜１０ｇ/ｋｇの量、好ましくは１〜５ｇ/ｋｇの量を、一日１回〜数回に分けて投与することができる。しかし、当業者において前記投与量は、いずれの面でも本発明の範囲を限定するものではない。
【００３１】
本発明の山薬：ウチワドコロ＝３.５：１（ｗ／ｗ）の混合物の生薬抽出物を含有する医薬組成物は、ラット、マウス、家畜、人間等の哺乳動物に様々な経路で投与され得る。投与の全経路は予想されるもので、例えば、経口、直腸内、静脈内、筋肉内、皮下、子宮内膜または脳血管内投与され得る。
【００３２】
山薬：ウチワドコロ＝３.５：１の重量比（ｗ／ｗ）の混合物の生薬抽出物は、毒性及び副作用がほとんどないので、糖尿病性神経症の予防目的で、長期間にわたり安全に摂取され得る。
【００３３】
本発明では、山薬：ウチワドコロ＝３.５：１（ｗ／ｗ）の混合物の生薬抽出物の生体内神経成長因子の含量増加能及び糖尿病性末梢神経病症の症状緩和能を評価するため、生体内実験を実施した。健康動物モデル及び糖尿病性神経病症の病態動物モデルの各々でのデータは、本発明による特定割合の生薬混合物の抽出物が、単独生薬または他の重量比の生薬混合物の抽出物に比べて、相乗的な治療効果を有することを示した。
【００３４】
また、本発明は、山薬：ウチワドコロ＝３.５：１（ｗ／ｗ）の混合物の生薬抽出物、及び食品学的に許容可能な食品添加剤を含む、糖尿病性神経病症の予防及び改善のための健康機能食品を提供する。
【００３５】
ここで用いる「健康機能食品」なる語は、食品医薬品安全庁告示２００４−１２号に従い、人体に対する機能性及び安全性が認められた健康機能食品原料または成分に関する規定目録集に収載された健康食品のように、大韓民国の「２００２年健康機能食品に関する法律」に定義される食品を含む。
【００３６】
詳しくは、本発明は、山薬：ウチワドコロ＝３.５：１の混合物の生薬抽出物と、食品学的に許容可能な食品添加剤を含む、糖尿病性神経病症の予防及び改善のための健康機能食品を提供する。
【００３７】
本発明の山薬：ウチワドコロ＝３.５：１の混合物の生薬抽出物を含む組成物は、糖尿病性神経病症の症状緩和のための薬物、食品及び飲料などに多様に利用されることができる。本発明の生薬抽出物を添加することができる食品には、各種食品類、例えば、飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤、健康補助食品類などがある。薬物に使用するためには、前記生薬抽出物は、丸剤、粉末、顆粒、錠剤、カプセルまたは液状の形態で使用することができる。
【００３８】
固形食品に適用される時、食品または飲料内の前記生薬抽出物の量は、一般的に本発明の健康食品組成物の場合、食品全重量の０.１〜１５重量％、好ましくは０.２〜１０重量％で使用され得る。健康飲料組成物の場合、前記生薬抽出物は、１００ｍＬを基準として０.１〜３０ｇ、好ましくは０.２〜５ｇの割合で添加することができる。
【００３９】
本発明の健康飲料組成物は、特定比の必須成分である前記生薬抽出物を含有することの他に、液体成分には特別な制限はない。通常の飲料と同様に、さまざまな香味剤、天然炭水化物またはその他添加剤をさらに含むことができる。
【００４０】
上述した天然炭水化物の例には、ブドウ糖、果糖などの単糖類、マルトース、スクロースなどの二糖類、デキストリン、シクロデキストリンなどの多糖類及びキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールがある。上述以外の香味剤として、天然香味剤(タウマチン、ステビア抽出物(例えば、レバウディオサイドＡ、グリシルリジン))及び合成香味剤(サッカリン、アスパルテームなど)を有用に使用することができる。天然炭水化物の割合は、本発明の液体健康飲料組成物１００ｍＬ当たり一般的に約１〜２０ｇ、好ましくは約５〜１２ｇである。
【００４１】
前記以外に本発明の組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物(電解質)、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び充填剤(チーズ、チョコレートなど)、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使われる炭酸化剤などを含有することができる。その他に、本発明の組成物は、天然果物ジュース及び果物ジュース飲料及び野菜飲料に使用するため、果肉を含むことができる。このような添加剤は、単独でまたは組み合わせて使用することができる。このような添加剤の割合はあまり重要ではないが、本発明の組成物１００重量部当たり０〜約２０重量部の範囲で選択されることが一般的である。
【発明の効果】
【００４２】
本発明の山薬：ウチワドコロ＝３.５：１（ｗ／ｗ）の混合物の生薬抽出物は、山薬またはウチワドコロの単独抽出物、山薬とウチワドコロの他の重量比の混合物に比べて、生体内神経成長因子(ＮＧＦ：Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ)含量増加、神経細胞の増殖と神経突起形成促進効果及び認知能力向上効果において、有意に高い相乗効果を示すので、糖尿病性末梢神経病症の治療及び予防のための医薬組成物及び健康機能食品で使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、１型糖尿病マウスの坐骨神経に及ぼす実施例１の抽出物の影響を示す電子顕微鏡写真である。
【図２】図２は、１型糖尿病ラットの坐骨神経に及ぼす実施例１の抽出物の影響を示す電子顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
以下、実施例及び実験例により本発明を詳細に説明する。下記実施例及び実験例は本発明を例示するものであり、本発明の内容が下記実施例及び実験例に限定されるものではない。
【００４５】
＜実施例１＞ 
本発明による山薬とウチワドコロ混合生薬抽出物の製造
韓国京東市場の漢方薬材商で乾燥された山薬(Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ Ｒｈｉｚｏｍａ)とウチワドコロ(Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ｎｉｐｐｏｎｉｃａ)を購入した。不純物を除去してカッターで粉砕し、山薬：ウチワドコロ＝３.５：１の重量比で混合した。２ｋｇの混合物に１０Ｌの５０％エタノール水溶液を添加して、室温で４８時間撹拌しながらインキュベートした。濾過により生薬混合物を除去し、濾液は減圧濃縮した後、凍結乾燥して混合生薬抽出物(粗抽出物)を得て、実施例１を製造した(表１参照)。
【００４６】
【表１】
0005763224.tif 000002
【００４７】
＜比較例１＞ 
山薬抽出物の製造
２ｋｇの混合物の代りに山薬２ｋｇを使用したこと以外は、実施例１と同一な方法で製造して、山薬抽出物(粗抽出物)を製造した(表２参照)。
＜比較例２＞
ウチワドコロ抽出物の製造
２ｋｇの混合物の代りにウチワドコロ２ｋｇを使用したこと以外は、実施例１と同じ方法で山薬抽出物(粗抽出物)を製造した(表２参照)。
【００４８】
【表２】
0005763224.tif 000003
【００４９】
＜比較例３〜比較例１０＞
山薬及びウチワドコロの混合生薬粗抽出物の製造
前記実施例１で使われた山薬及びウチワドコロと同一の生薬を実験に使用した。カッターで粉砕した状態の山薬とウチワドコロを各々表３に記載したように混合した。各混合物２ｋｇに１０Ｌの５０％エタノール水溶液を添加して、室温で４８時間撹拌しながらインキュベートした。生薬混合物は濾過により除去し、濾液は減圧濃縮した後、凍結乾燥して混合生薬抽出物(粗抽出物)を得た。
【００５０】
【表３】
0005763224.tif 000004
【００５１】
＜実験例１＞
生体内神経成長因子の含量評価のための正常ラットモデル実験
実施例１の５０％エタノール粗抽出物を使用して、生体内神経成長因子の分泌を誘導するかを評価した(Ｏ.Ａｒｒｉｅｔａ ａｎｄ Ｊ.Ｓｏｔｅｌｏ ｅｔ ａｌ., Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｍｉｃｅ. Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ(２００５) ３５)。
【００５２】
２５〜３０ｇの雄性ＩＣＲラットを温度２２〜２４℃、相対湿度６０〜８０％の状態で標準食餌と水を供給して、１週間順化飼育した。ラットを体重を基準にグループ分けした。ガバペンチン(Ｇａｂａｐｅｎｔｉｎ)１００ｍｇ/ｋｇを陽性対照群とし、上記抽出物の決められた量を経口投与して、１６時間後に採血後、ラットを屠殺して唾液腺を採取した。
採取した血液は、１０,０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して血漿を得た後、ＥＬＩＳＡ法により血漿内神経成長因子の含量を測定した(ＡＢＳ ４５０ｎｍ)。坐骨神経及び唾液腺は、重量を測定した後、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、２％ ＢＳＡ、４ｍＭ ＥＤＴＡ、２.０％ Ｔｒｔｉｏｎ   Ｘ−１００、０.０２％ ｓｏｄｉｕｍ ａｚｉｄｅ、０.１ｍｇ/ｍＬ ｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａ、５ｍｇ/ｍＬ ａｐｒｏｔｏｎｉｎ、０.５ｍｇ/ｍＬ ａｎｔｉｐａｉｎ、１６７ｍｇ/ｍＬ ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、５.２ｍｇ/ｍＬ ＰＭＳＦを含む溶液を重量に応じて加えた後、ホモジナイズした。その後、１Ｎ ＨＣｌを １μＬ/５０μＬで入れた後、酸化のために１５分間放置し、１Ｎ ＮａＯＨを１μＬ/５０μＬで入れて中和させた。１０,０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清液を採取した。その後、血漿と同様にＥＬＩＳＡ法により坐骨神経及び唾液腺内に存在する神経成長因子の含量を測定した。
実験データは、血漿神経成長因子の含量については下記表４に示し、坐骨神経内の神経成長因子の含量については表５に示し、唾液腺内の神経成長因子の含量については下記表６に示した。
【００５３】
【表４】
0005763224.tif 000005
【００５４】
前記表４から分かるように、同量を投与した結果、山薬とウチワドコロの単独抽出物である比較例１及び比較例２、山薬とウチワドコロの混合物の抽出物である比較例３〜比較例１０は、コントロールと同程度の血漿内神経成長因子分泌を誘導することが認められた。対照的に、実施例１の抽出物では、山薬、ウチワドコロの単独抽出物、山薬とウチワドコロの他の重量比の混合物の抽出物より、血漿内神経成長因子を増加させた。
血漿は神経成長因子が分泌されてから目標臓器に移動する経路であるので、血漿内神経成長因子含量の増加は、神経成長因子の分泌が促進されたことを意味する。従って、本発明の山薬：ウチワドコロ＝３.５：１（ｗ／ｗ）の混合物の抽出物は、山薬またはウチワドコロの単独抽出物、山薬とウチワドコロの他の重量比の混合物の抽出物に比べて、神経成長因子の分泌を促進し、生体内の神経成長因子(ＮＧＦ：Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ)量を有意に増加させることができる。
【００５５】
【表５】
0005763224.tif 000006
【００５６】
前記表５から分かるように同量を投与した結果、山薬とウチワドコロの単独抽出物である比較例１及び比較例２、山薬とウチワドコロの混合物の抽出物である比較例３〜比較例１０は、坐骨神経において、コントロールと同程度の神経成長因子分泌を誘導することが認められた。対照的に、実施例１の抽出物では、山薬、ウチワドコロの単独抽出物、山薬とウチワドコロの他の重量比の混合物の抽出物より、坐骨神経の神経成長因子を増加させた。
従って、本発明の山薬：ウチワドコロ＝３.５：１の混合物の抽出物は、血液内へのＮＧＦの分泌を誘導することができるので、目標臓器である坐骨神経内の神経成長因子(ＮＧＦ：Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ)量を有意に増加させることができる。
【００５７】
【表６】
0005763224.tif 000007
【００５８】
前記表６から分かるように、同量を投与した場合、山薬とウチワドコロの単独抽出物である比較例１及び比較例２は、コントロールに比べて、唾液腺の神経成長因子量を２〜３％だけ増加させただけであったが、比較例３〜比較例１０の山薬とウチワドコロの混合物の抽出物は、陽性対照群のガバペンチンと同程度か少ない量の唾液腺神経成長因子の分泌を誘導した。対照的に、本発明の実施例１の抽出物により、唾液腺神経成長因子量は３３.５％増加した。それゆえ、本発明の抽出物は、山薬とウチワドコロの単独抽出物、山薬とウチワドコロの他の重量比の混合物の抽出物に比べて、唾液腺神経成長因子量を有意に増加させた。唾液腺は、神経成長因子の供給源として機能するため、唾液腺の神経成長因子含量の増加は、神経成長因子の生成が促進されたことを意味する。
【００５９】
従って、本発明の山薬：ウチワドコロ＝３.５：１（ｗ／ｗ）の混合物の生薬抽出物は、生体内の神経成長因子(ＮＧＦ：Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ)量を有意に上昇させることができる。
また、生体内の神経成長因子量の有意な上昇能により、本発明の山薬：ウチワドコロ＝３.５：１（ｗ／ｗ）の混合物の生薬抽出物は、糖尿病性末梢神経病症の治療及び予防のための医薬組成物及び健康機能食品に使用されることができる。
【００６０】
＜実験例２＞
ストレプトゾトシンで１型糖尿病が誘発されたＳＤ雄性ラット(ＳＤ ｍａｌｅ ｒａｔ)を利用した痛み、神経成長因子分泌及び神経変性に対する効果評価実験
実施例１の山薬：ウチワドコロ＝３.５：１の混合物の抽出物、及び比較例１〜比較例１０の抽出物を使用して、１型糖尿病ＳＤ雄性ラットモデルにおける痛み、生体内の神経成長因子含量及び神経変性程度に対する効果を評価した。
【００６１】
２２０〜２５０ｇの雄性ＳＤラットを、温度２２〜２４℃、湿度６０〜８０％の状態で標準食餌と水を供給して、１週間順化飼育した。生理食塩水に溶かしたストレプトゾトシン５０ｍｇ／ｋｇを１回静脈投与して１型糖尿病を誘発させた。糖尿病を誘発させてから４週後に、血糖値を基準にグループ分けした。α−Ｌｉｐｏｉｃ ａｃｉｄ ５０ｍｇ/ｋｇとＧａｂａｐｅｎｔｉｎ １００ｍｇ/ｋｇを陽性対照群として、決められた量の上記抽出物を１日１回、８週間経口投与した。その後、ラットを屠殺して坐骨神経及び唾液腺を採取した。坐骨神経及び唾液腺は、実験例１と同様に処理した後、ＥＬＩＳＡ法により神経成長因子の含量を測定した。その結果を表７に示した。
【００６２】
前記抽出物の糖尿病性神経病症による痛み緩和効果を測定した。ストレプトゾトシン誘導糖尿病ラットを分離して、α−Ｌｉｐｏｉｃ ａｃｉｄ ５０ｍｇ/ｋｇとＧａｂａｐｅｎｔｉｎ１００ｍｇ/ｋｇを陽性対照群とし、決められた量の抽出物を１日１回１４週間経口投与した。Ｒａｎｄａｌｌ−Ｓｅｌｌｉｔｏ法を使用して後足における圧痛反応閾値を測定した。テールフリック(ｔａｉｌ−ｆｌｉｃｋ)テストで、テールにおける熱刺激に対する痛み反応潜伏時間を測定した。その結果を表８に示した。糖尿病性神経病症の発病とともに進行する神経の変性程度を測定するため、各群のラットから採取した坐骨神経をホルマリンで固定した後、標本を作って電子顕微鏡で神経細胞の髄鞘の大きさと厚さを測定して、その結果を表９に示した。
【００６３】
【表７】
0005763224.tif 000008
【００６４】
前記表７から分かるように、総量で同量を投与した結果、山薬とウチワドコロの単独抽出物である比較例１及び比較例２、山薬とウチワドコロの混合物の抽出物である比較例３〜比較例１０に比べて、実施例１の抽出物は、坐骨神経と唾液腺内の神経成長因子含量を有意に増加させた。
従って、本発明の山薬：ウチワドコロ＝３.５：１の混合物の生薬抽出物は、１型糖尿病動物でも生体内の目標臓器(坐骨神経、唾液腺)において、神経成長因子含量の有意な増加を誘導することが立証された。
【００６５】
【表８】
0005763224.tif 000009
【００６６】
前記表８から分かるように、総量で同量を投与した結果、山薬とウチワドコロの単独抽出物である比較例１及び比較例２、山薬とウチワドコロの混合物の抽出物である比較例３〜比較例１０に比べて、実施例１の抽出物は、圧痛閾値及び圧反射までの潜伏時間を有意に増加させた。
機械的刺激に対する閾値の増加は痛みに対する閾値の増加を意味し、テールフリックテスト(ｔａｉｌ ｆｌｉｃｋ ｔｅｓｔ)における痛み反応までの潜伏時間の増加も、熱刺激に対する閾値の増加に相当するから、痛みに対する緩和効果を示す。
従って、本発明の山薬とウチワドコロの山薬：ウチワドコロ＝３.５：１の重量比で混合された生薬抽出物は、１型糖尿病による末梢神経病症の症状である痛みの相乗的な緩和効果を示した。
【００６７】
【表９】
0005763224.tif 000010
【００６８】
表９のデータから明らかなように、コントロールでミエリン鞘(ｍｙｅｌｉｎ ｓｈｅａｔｈ)の大きさとミエリン鞘の厚さが減少した結果は、糖尿病性神経病症により坐骨神経が損傷または変性されたことを示す。実施例１の抽出物を投与した場合、ラットミエリン鞘の大きさと厚さの双方が増加したことが認められた。
それゆえ、本発明の抽出物は、目標臓器において、組織学的な側面でも神経再生を上昇させ、神経変性を緩和することができる。
本発明の抽出物は、１型糖尿病でも、糖尿病性末梢神経病症の治療及び予防効果において有意な相乗効果を示すことができるので、医薬組成物に使用され得る。
【００６９】
＜実験例３＞
ストレプトゾトシンで１型糖尿が誘発されたＩＣＲ雄性マウス(ＩＣＲ ｍａｌｅ ｍｏｕｓｅ)を用いた痛み、神経成長因子の分泌及び神経変性に対する効果評価実験
実施例１で調製された山薬：ウチワドコロ＝３.５：１の混合物の生薬抽出物を使用して、１型糖尿病ＩＣＲ雄性マウスモデルにおける痛み、生体内の神経成長因子の含量変化及び神経変性程度に対する効果を評価した。
【００７０】
２０〜３０ｇの雄性ＩＣＲマウスを、温度２２〜２４℃、湿度６０〜８０％の状態で標準食餌と水を供給して、１週間順化飼育した。生理食塩水に溶かしたストレプトゾトシン２００ｍｇ／ｋｇを１回静脈投与し、１型糖尿病を誘発させた。糖尿病を誘発させてから４週後に、血糖を基準にグループ分けした。α−Ｌｉｐｏｉｃ ａｃｉｄ ５０ｍｇ/ｋｇとＧａｂａｐｅｎｔｉｎ １００ｍｇ/ｋｇを陽性対照群として、決められた量の上記で調製した抽出物を１日１回、１４週間経口投与した。糖尿病性神経病症による痛み緩和効果を測定するため、各群のマウスを５８℃のホットプレート(ｈｏｔ ｐｌａｔｅ)に乗せた後、熱刺激に対して足裏に痛みを感じて飛び上がる時までの潜伏時間を測定し、熱刺激に対する痛覚過敏の程度を測定した。結果は表１０に示した。
その後、マウスを屠殺して坐骨神経及び唾液腺を採取した。坐骨神経及び唾液腺は、実験例１と同様に処理した後、ＥＬＩＳＡ法により神経成長因子の含量を測定した。その結果を表１１に示した。
【００７１】
また、糖尿病性神経病症の発病とともに進行する神経の変性の程度を測定するため、各群のマウスから採取した坐骨神経をホルマリンで固定した後、標本を作って電子顕微鏡で神経細胞の髄鞘の大きさと厚さを測定し、その結果を表１２に示した。
【００７２】
【表１０】
0005763224.tif 000011
【００７３】
ホットプレート上での痛み反応までの潜伏時間の増加は、熱刺激に対する痛み閾値の増加を反映し、痛みが減少されたことを示す。前記表１０から分かるように、山薬とウチワドコロの単独抽出物である比較例１及び比較例２、山薬とウチワドコロの混合物の抽出物である比較例３〜比較例１０に比べて、実施例１の抽出物は、ホットプレート上での痛み反応までの潜伏時間を有意に増加させた。これは本発明による生薬組成物は、糖尿病性末梢神経病症の症状である痛みの有意な緩和効果を有することを示す。
【００７４】
【表１１】
0005763224.tif 000012
【００７５】
前記表１１から分かるように、山薬とウチワドコロの単独抽出物である比較例１及び比較例２、山薬とウチワドコロの混合物の抽出物である比較例３〜比較例１０に比べて、実施例１の生薬抽出物は、坐骨神経と唾液腺内の神経成長因子の含量を有意に増加させた。
従って、本発明の山薬：ウチワドコロ＝３.５：１の混合物の生薬抽出物は、１型糖尿病ＳＤラット(ＳＤ ｒａｔ)モデルだけではなく、１型糖尿病ＩＣＲマウス(ＩＣＲ ｍｏｕｓｅ)においても、生体内の目標臓器(坐骨神経、唾液腺)で神経成長因子の有意な増加を誘導することが立証された。
【００７６】
【表１２】
0005763224.tif 000013
【００７７】
表１２のデータから、コントロールでミエリン鞘(ｍｙｅｌｉｎ ｓｈｅａｔｈ)の大きさとミエリン鞘の厚さが減少し、糖尿病性神経病症により坐骨神経が損傷または変性されたことが示された。実施例１の抽出物を投与した場合、ミエリン鞘の大きさと厚さが増加したことが認められた。
本発明の抽出物は、１型糖尿病ＳＤラット(ＳＤ ｒａｔ)モデルだけではなく、１型糖尿病ＩＣＲマウス(ＩＣＲ ｍｏｕｓｅ)でも、神経の変性を改善することができ、組織学的側面においても、目標臓器で神経再生を増加させることができる。
従って、本発明の生薬抽出物は、１型糖尿病から誘発される糖尿病性末梢神経病症の治療及び予防において相乗的効果を示すことができるので、医薬組成物に使用され得る。
【００７８】
＜実験例４＞
遺伝的に２型糖尿病が誘発される遺伝子変形雄性マウス(ｄｂ/ｄｂ ｍａｌｅ ｍｏｕｓｅ)を使用した痛み、神経成長因子の含量変化に対する効果評価実験
実施例１で調製された山薬：ウチワドコロ＝３.５：１の混合物の生薬抽出物を使用して、２型糖尿病ｄｂ/ｄｂ雄性マウスモデルにおける痛み及び生体内の神経成長因子含量に対する効果を評価した。
【００７９】
４０〜４５ｇの雄性ｄｂ/ｄｂマウスを、温度２２〜２４℃、相対湿度６０〜８０％の状態で標準食餌と水を供給して、１週間順化飼育した。９週齢になる日に血糖を測定して糖尿病誘発個体を選別した。２型糖尿病が誘発された個体は、４週後に血糖を基準に分離した。α−Ｌｉｐｏｉｃ ａｃｉｄ ５０ｍｇ／ｋｇとＧａｂａｐｅｎｔｉｎ １００ｍｇ／ｋｇを陽性対照群として、決められた量の抽出物を１日１回、１２週間経口投与した。糖尿病性神経病症による痛み緩和効果を測定するために、各群のマウスを５８℃のホットプレートに乗せた後、熱刺激に対して足裏に痛みを感じて飛び上がる時までの潜伏時間を測定して、熱刺激に対する痛覚過敏の程度を測定した。結果は表１３に示した。
その後、マウスを屠殺して坐骨神経を採取した。坐骨神経は、実験例１と同様に処理した後、ＥＬＩＳＡ法により神経成長因子の含量を測定した。その結果を表１４に示した。
【００８０】
【表１３】
0005763224.tif 000014
【００８１】
前記表１３から分かるように、山薬とウチワドコロの単独抽出物である比較例１及び比較例２、山薬とウチワドコロの混合物の抽出物である比較例３〜比較例１０に比べ、実施例１の抽出物は、ホットプレート上での痛み反応までの潜伏時間を有意に増加させた。これは、本発明による生薬組成物が、糖尿病性末梢神経病症の症状である痛みの有意な緩和効果を有することを示す。
【００８２】
【表１４】
0005763224.tif 000015
【００８３】
前記表１４から分かるように、山薬とウチワドコロの単独抽出物である比較例１及び比較例２、山薬とウチワドコロの混合物の抽出物である比較例３〜比較例１０に比べて、実施例１の抽出物は、坐骨神経内の神経成長因子の含量を有意に増加させた。
本発明の山薬：ウチワドコロ＝３.５：１の混合物の生薬抽出物は、２型糖尿病でも生体内目標臓器において、神経成長因子の含量増加を有意に誘導することが立証された。
従って、本発明の生薬抽出物は、生体内神経成長因子の含量を有意に増加させることで、１型または２型糖尿病により誘発される糖尿病性末梢神経病症の治療及び予防のための医薬組成物及び健康機能食品で使用され得る。
【００８４】
＜実験例５＞
Ｃ６ラットグリオーマ(Ｃ６ Ｒａｔ Ｇｌｉｏｍａ)細胞とＰＣ１２神経細胞を用いた神経成長因子の生成及び神経細胞の増殖誘導活性試験
実施例１で調製した山薬：ウチワドコロ＝３.５：１（ｗ／ｗ）の混合物の生薬抽出物を使用して、ラットグリオーマ(ｒａｔ ｇｌｉｏｍａ)細胞であるＣ６細胞における神経成長因子の生成、ラット神経細胞であるＰＣ１２細胞の増殖誘導能を評価した。
【００８５】
抽出物の神経成長因子の生成誘導能を評価するために、Ｃ６グリオーマセル(Ｃ６ ｇｌｉｏｍａ ｃｅｌｌ)を各プレート(ｐｌａｔｅ)のウェルに同一密度で接種して、２４時間培養した。細胞をＰＢＳで洗浄した後、実施例１、または比較例１〜比較例１０の生薬抽出物を、各々５０μｇ/ｍＬあるいは２５０μｇ/ｍＬ添加した新鮮な培養培地に交換した後、４８時間培養した。４８時間後、培養培地内に含有される神経成長因子量をＥＬＩＳＡ法より定量的に分析した。結果は表１５に示した。
【００８６】
また、神経細胞の増殖誘導能の評価試験に用いるために、ＰＣ１２神経細胞を各プレートのウェルに同一密度で接種して２４時間培養した。細胞をＰＢＳで洗浄した後、実施例１または比較例１〜比較例１０の生薬抽出物、またはＮＧＦを加えた培養培地に交換して、４８時間培養した。ＭＴＳ法により細胞増殖度を測定して表１６に示した。
【００８７】
【表１５】
0005763224.tif 000016
【００８８】
前記表１５から分かるように、実施例１の抽出物は、比較例１及び比較例２(山薬とウチワドコロの単独抽出物)、比較例３〜比較例１０(山薬とウチワドコロの他の重量比の混合物の抽出物)より、Ｃ６細胞における神経成長因子量を有意に増加させた。
従って、山薬：ウチワドコロ＝３.５：１の混合物の生薬抽出物は、神経成長因子の生成促進を最大限に誘導することが立証された。
【００８９】
【表１６】
0005763224.tif 000017
【００９０】
前記表１６から分かるように、実施例１の抽出物は、比較例１及び比較例２(山薬とウチワドコロの単独抽出物)、比較例３〜比較例１０(山薬とウチワドコロの他の重量比の混合物の抽出物)より、神経細胞であるＰＣ１２細胞の増殖を有意に増加させた。
従って、本発明の山薬：ウチワドコロ＝３.５：１の混合物の生薬抽出物は、神経細胞の増殖に有意な効果を有することが立証された。
【００９１】
＜実験例６＞
ＰＣ１２神経細胞における神経成長因子受容体のリン酸化実験
実施例１で調製された山薬：ウチワドコロ＝３.５：１の混合物の生薬抽出物を使用して、ＰＣ１２ラット神経細胞における神経成長因子ＮＧＦ受容体のリン酸化促進能を評価した。
【００９２】
本試験で使用するために、ＰＣ１２神経細胞を各プレートのウェルに同一密度で接種して２４時間培養した。細胞をＰＢＳで洗浄した後、実施例１、比較例１〜比較例１０又はＮＧＦを加えた培養培地にて、４８時間培養した。その後、ウエスタンブロット法(Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ)を用いてリン酸化されたＴｒｋＡ(神経成長因子受容体)バンド(ｂａｎｄ)を検出し、検出したバンドの濃さに基いて、リン酸化されたＴｒｋＡを定量分析した。その結果は表１７に示した。
【００９３】
神経成長因子のシグナリングは、神経成長因子がその受容体(Ｔｒｋ−Ａ)に結合して開始し、その結果、神経成長因子受容体はリン酸化される。従って、神経成長因子受容体のリン酸化量の増加は、神経成長因子シグナリング経路が増幅されることを意味する。
【００９４】
下記表１７のデータから分かるように、実施例１の抽出物は、比較例１及び比較例２(山薬とウチワドコロの単独抽出物)、比較例３〜比較例１０(山薬とウチワドコロの他の重量比の混合物の抽出物)より、神経成長因子受容体のリン酸化の有意な増加を誘導した。
【００９５】
【表１７】
0005763224.tif 000018
【００９６】
＜実験例７＞
ラット由来ＤＲＧ神経細胞における神経突起形成促進活性の評価実験
実施例１で調製した山薬：ウチワドコロ＝３.５：１の混合物の生薬抽出物を使用して、ラットの胎児から得たＤＲＧ(Ｄｏｒｓａｌ ｒｏｏｔ ｇａｎｇｌｉｏｎ)神経細胞の神経突起形成促進活性を評価した。
【００９７】
本試験で使用するために、ＤＲＧ神経細胞を各プレートのウェルに同一密度で接種して２４時間培養した。その後、細胞をＰＢＳで洗浄した後、実施例１又は比較例１〜比較例１０とＮＧＦの組合せ物の存在下又は非存在下に、培養培地中にて４８時間培養した。顕微鏡で各群の細胞を観察して、生育した神経突起が占める面積を測定した。測定値の平均値を表１８に示した。
【００９８】
神経突起面積の増加は、細胞の神経突起形成が促進されたことを意味する。下記表１８から分かるように、実施例１の抽出物は、比較例１及び比較例２(山薬とウチワドコロの単独抽出物)、または比較例３〜比較例１０(山薬とウチワドコロの他の重量比の混合物の抽出物)より、神経突起面積を有意に増加させた。
【００９９】
【表１８】
0005763224.tif 000019
【０１００】
前記実験例１〜実験例７を総合すれば、実施例１は、比較例１及び比較例２(山薬とウチワドコロの単独抽出物)、比較例３〜比較例１０(山薬とウチワドコロの他の重量比の混合物の抽出物)に比べて、有意な生体内神経成長因子の含量増加、神経細胞の増殖と神経突起形成促進効果、糖尿病性神経病症による痛症緩和効果及び組織学的神経変性の予防(神経再生促進)効果を示すことで、糖尿病性末梢神経病症の治療及び予防のための医薬組成物及び健康機能食品で使用され得る。
【０１０１】
以下、本発明の山薬とウチワドコロの生薬抽出物を含む組成物の処方例を説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、それを具体的に説明するものである。
【０１０２】
処方例１．注射製剤の製造
実施例１の抽出物.............................. ..１００ｍｇ
メタ重亜硫酸ナトリウム..........................  .３.０ｍｇ
メチルパラベン...............................  ....０.８ｍｇ
プロピルパラベン...............................  ..０.１ｍｇ
注射用滅菌蒸溜水.................................  適量
前記成分を混合し、通常の方法で２ｍＬにした後、２ｍＬ容量のアンプルに充填して滅菌し、注射剤を製造する。
【０１０３】
処方例２．錠剤の製造
実施例１の抽出物.................................２００ｍｇ
乳糖.............................................１００ｍｇ
澱粉.............................................１００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム..........................適量
前記成分を混合し、通常の錠剤の製造方法により打錠して、錠剤を製造する。
【０１０４】
処方例３．カプセル剤の製造
実施例１の抽出物.............................. ..１００ｍｇ
乳糖.............................................５０ｍｇ
澱粉.............................................５０ｍｇ
タルク......................................... ...２ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム..........................適量 
前記成分を混合し、通常のカプセル剤の製造方法によってゼラチンカプセルに充填して、カプセル剤を製造する。
【０１０５】
処方例４．液剤の製造
実施例１のエタノール抽出物.......................１０００ｍｇ
砂糖.............................................２０ｇ
異性化糖...  ....................................２０ｇ
レモン香料.......................................適量
精製水を加えて全容量.............................１００ｍＬ
前記成分を通常の液剤の製造方法によって混合して１００ｍＬの茶色ボトルに充填し、滅菌して液剤を製造する。
【０１０６】
以上、本発明の説明ははあくまでも例示に過ぎず、本発明が属する技術の分野における通常の知識を有する者であれば、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で、様々な置換、変形及び変更が可能であるので、上述した実施例及び添付された図面に限定されるものではない。
【図１】
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【図２】
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