(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＳＭＺに、２００８年７月２９日に、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３１、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３２、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３３、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３４、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３５、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３６、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３７、及びＤＳＭ  ＡＣＣ２９３８からなる群より選択されるアクセッション番号下で寄託されたハイブリドーマ細胞株。
【請求項２】
ＤＳＭＺに、２００８年７月２９日に、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３１、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３２、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３３、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３４、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３５、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３６、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３７、及びＤＳＭ  ＡＣＣ２９３８からなる群より選択されるアクセッション番号下で寄託されたハイブリドーマ細胞株により分泌されるモノクローナル抗体、又はクロ―ディン１細胞外ドメインに結合するその生物学的に活性なフラグメント。
【請求項３】
モノクローナル抗体又は生物学的に活性なフラグメントが、クローディン１の最初の細胞外ループ中の保存されたモチーフＷ（３０）−ＧＬＷ（５１）−Ｃ（５４）−Ｃ（６４）の保存に強く依存しているエピトープに結合する、請求項２記載のモノクローナル抗体又はその生物学的に活性なフラグメント。
【請求項４】
モノクローナル抗体又はその生物学的に活性なフラグメントが、齧歯類のクローディン１に結合しないが、非ヒト霊長類のクローディン１に結合する、請求項２又は請求項３記載のモノクローナル抗体又はその生物学的に活性なフラグメント。
【請求項５】
モノクローナル抗体が、ヒト化、脱免疫化、又はキメラである、請求項２〜４のいずれか１項記載のモノクローナル抗体又はその生物学的に活性なフラグメント。
【請求項６】
モノクローナル抗体が、ヒト化、脱免疫化、又はキメラであり、分泌されるモノクローナル抗体に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）又はその部分を含む、請求項２〜４のいずれか１項記載のモノクローナル抗体又はその生物学的に活性なフラグメント。
【請求項７】
モノクローナル抗体又はそのフラグメントが、ＨＣＶ許容細胞株へのＨＣＶエンベロープ糖タンパク質Ｅ２又は感染力ビリオンの結合を阻害する、請求項２〜６のいずれか１項記載のモノクローナル抗体又はその生物学的に活性なフラグメント。
【請求項８】
モノクローナル抗体又はそのフラグメントが、ＣＤ８１クローディン１会合を阻害する、請求項２〜７のいずれか１項記載のモノクローナル抗体又はその生物学的に活性なフラグメント。
【請求項９】
モノクローナル抗体又はそのフラグメントが、ＨＣＶ細胞間伝達及びウイルス拡散を阻害する、請求項２〜８のいずれか１項記載のモノクローナル抗体又はその生物学的に活性なフラグメント。
【請求項１０】
請求項２〜９のいずれか１項記載のモノクローナル抗体又はその生物学的に活性なフラグメントを含む分子。
【請求項１１】
モノクローナル抗体、又はそのフラグメントが、検出可能な成分又は治療用薬剤に結合している、請求項１０記載の分子。
【請求項１２】
細胞のＨＣＶ感染を予防するための、請求項２〜９のいずれか１項記載のモノクローナル抗体又はその生物学的に活性なフラグメント又は請求項１０又は１１記載の分子。
【請求項１３】
被験者においてＨＣＶ感染又はＨＣＶ関連疾患を予防又は処置するための、請求項２〜９のいずれか１項記載のモノクローナル抗体又はその生物学的に活性なフラグメント又は請求項１０又は１１記載の分子。
【請求項１４】
慢性ＨＣＶ感染を制御するための、請求項１３記載のモノクローナル抗体又はその生物学的に活性なフラグメント。
【請求項１５】
ＨＣＶに慢性的に感染された患者に存在する全疑似種集団による感染を阻害するための、請求項１３記載のモノクローナル抗体又はその生物学的に活性なフラグメント。
【請求項１６】
ＨＣＶ感染が、遺伝子型１、遺伝子型２、遺伝子型３、遺伝子型４、遺伝子型５、及び遺伝子型６からなる群より選択される遺伝子型のＨＣＶに起因する、請求項１３〜１４のいずれか１項記載のモノクローナル抗体又はその生物学的に活性なフラグメント。
【請求項１７】
ＨＣＶ感染が、サブタイプ１ａ、サブタイプ１ｂ、サブタイプ２ａ、サブタイプ２ｂ、サブタイプ２ｃ、サブタイプ３ａ、サブタイプ４ａ−ｆ、サブタイプ５ａ、及びサブタイプ６ａからなる群より選択されるサブタイプのＨＣＶに起因する、請求項１６記載のモノクローナル抗体又はその生物学的に活性なフラグメント。
【請求項１８】
肝臓移植患者においてＨＣＶ再感染及び再発を予防するための、請求項２〜９のいずれか１項記載のモノクローナル抗体又はその生物学的に活性なフラグメント、又は請求項１０又は１１記載の分子。
【請求項１９】
有効量の請求項２〜９のいずれか１項記載のモノクローナル抗体又はその生物学的に活性なフラグメントあるいは請求項１０又は１１記載の分子、及び少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体又は賦形剤を含む医薬的組成物。
【請求項２０】
少なくとも１つの抗ウイルス薬剤との組み合わせでの使用のために適応された請求項１９記載の医薬的組成物。
【請求項２１】
少なくとも１つの抗ウイルス薬剤をさらに含む、請求項１９記載の医薬的組成物。
【請求項２２】
抗ウイルス薬剤が、インターフェロン、リバビリン、抗Ｃ型肝炎ウイルスモノクローナル抗体、抗Ｃ型肝炎ウイルスポリクローナル抗体、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、ＩＲＥＳ阻害剤、ヘリカーゼ阻害剤、アンチセンス化合物、リボザイム、及びその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項２０又は請求項２１記載の医薬的組成物。
【請求項２３】
請求項２〜９のいずれか１項記載のモノクローナル抗体又はその生物学的に活性なフラグメントあるいは請求項１０又は１１記載の分子を含む薬学的キット。
【請求項２４】
モノクローナル抗体又はそのフラグメントが検出可能な成分に結合している、請求項２〜９のいずれか１項記載のモノクローナル抗体又はその生物学的に活性なフラグメントを含む、生物学的サンプルにおいてクロ―ディン１を検出するためのキット。
【請求項２５】
モノクローナル抗体又はそのフラグメントが検出可能な成分に結合している、請求項１０又は１１の分子を含む、生物学的サンプルにおいてクロ―ディン１を検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００８年９月２５日に出願された欧州特許出願ＥＰ  ０８  ３０５  ５９７．０に対する優先権を主張する。この欧州特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の背景
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は主な世界的健康問題であり、全世界で推定１．５〜２億人が感染している（欧州連合内での少なくとも５００万の感染者を含む）（Pawlotsky, 2004）。世界保健機構によると、３００〜４００万の新たな感染が毎年生じている。感染はしばしば無症候である。しかし、ＨＣＶ感染者の大部分が慢性感染を発生する（Hoofnagle, 2002; Lauer, 2001; Seeff, 1995）。慢性ＨＣＶ感染は、重大な肝臓疾患（線維症及び脂肪症を含む）を招くことが多い（Chisari, 2005）。慢性ＨＣＶ感染患者の約２０%が肝硬変を発生し、その症例の５%が肝細胞癌に進行する（Hoofnagle, 2002）。
【０００３】
慢性ＨＣＶ感染は、肝臓移植の主要な適応である（Seeff, 2002）。残念なことに、肝臓移植はＣ型肝炎のための療法ではない；ウイルスの再発は不変の問題であり、移植片喪失の主要な原因である（Brown, 2005）。ＨＣＶを防ぐ利用可能なワクチンはない。現在の治療は、リバビリン及び／又はインターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）（２つの非特異的抗ウイルス薬剤）の投与を含む。ペグ化ＩＦＮ−α及びリバビリンの併用処置を使用してウイルスの永続的除去が、慢性Ｃ型肝炎患者の約５０%において達成される。しかし、多数の患者が、併用処置の成分の１つに対して禁忌を示し、処置を許容できず、ＩＦＮ治療に対して全く応答しない、又は、投与を止めた場合に再発が認められる。限定された効力及び実質的な副作用（例えば好中球減少、溶血性貧血、及び重度の抑鬱など）に加えて、現在の抗ウイルス治療は、また、高費用という特徴をもつ。
【０００４】
最近まで、ＨＣＶ感染に対するより効果的な治療薬の開発は、ＨＣＶ複製を支持する細胞培養システムの欠如により妨げられてきた。現在細胞培養における感染性ＨＣＶの急速な産生が、日本の劇症Ｃ型肝炎（ＪＦＨ−１）患者の血液に由来する固有のＨＣＶゲノムを使用して達成されている（Wakita, 2005; Lindenbach, 2005; Zhong, 2005）。細胞培養において感染性粒子を放出するＨＣＶ（ＨＣＶｃｃ）のＪＦＨ−１株の能力及びレトロウイルスＨＣＶ擬似粒子（ＨＣＶｐｐ）の開発（Bartosch, 2003; Hsu, 2003）は、ＨＣＶの侵入及び複製の機構に関する試験を可能にしており、潜在的な治療標的生体分子の同定に導いている。
【０００５】
ＨＣＶは、フラビウイルス科のＨｅｐａｃｉｖｉｔｕｓ属に分類されるプラス鎖ＲＮＡウイルスである。ＨＣＶゲノムの主なオープンリーディングフレームの翻訳は、約３０００アミノ酸長のポリタンパク質の産生をもたらし、それは翻訳と同時に及び翻訳後に細胞及びウイルスのプロテアーゼの協調作用により少なくとも１０の熟成タンパク質（２つのエンベロープ糖タンパク質（Ｅ１及びＥ２）を含む）に切断される。ＨＣＶは、肝細胞表面の分子又は受容体に付着することにより感染を開始する。現在の証拠は、少なくとも４つの宿主細胞分子がインビトロでのＨＣＶ侵入のために重要であることを示唆する：テトラスパニン  ＣＤ８１（Pileri, 1998）、スカベンジャー受容体クラスＢＩ型（ＳＢ−ＲＩ）（Zeisel, 2007; Bartosch, 2003; Grove, 2007; Kapadia, 2007; Scarselli, 2002）、オクルディン（Ploss, 2009）及びクローディン１（ＣＬＤＮ１）、内在性膜タンパク質及びタイトジャンクションストランドの成分（Evans, 2007）。ＨＣＶ糖タンパク質は、ＣＤ８１及びＳＲ−ＢＩと直接的に相互作用することが報告されている（Cocquerel, 2006）。突然変異誘発及びＣＬＤＮ１のタグ付きバージョンを用いた抗体遮断試験は、最初の細胞外ループがＨＣＶとの相互作用に関与することを示唆する（Evans, 2007）。しかし、受容体の各々が果たす正確な役割は不明である。
【０００６】
ＨＣＶについてのこれらの受容体又は共受容体の同定によって、ＨＣＶ感染の予防及び／又は処置のための薬物候補としての治療用及び予防用薬剤の開発のための新たな道が開かれている。このように、例えば、Ｎｉｃｏｓｉａ及び共同研究者は、ＳＲ−ＢＩに対するＨＣＶ  Ｅ２結合を阻害し、肝細胞癌細胞のＨＣＶｃｃ感染を用量依存的な様式で効率的に遮断する天然ヒトＳＲ−ＢＩに対するモノクローナル抗体を作製している（Catanese, 2007；  ＷＯ  ２００６／００５４６５）。欧州特許出願ＥＰ  １  ２５６  ３４８は、ＨＣＶ  Ｅ２及びＣＤ８１の結合を阻害する抗ウイルス効果を有する物質（例、抗体、タンパク質、硫酸化ポリサッカリド及び低分子化合物）を開示する。国際特許出願ＷＯ  ２００７／１３０６４６には、クローディン１とのＨＣＶ相互作用に干渉し、それによりＨＣＶ感染を予防する薬剤を特定するためのインビトロ、細胞ベースのアッセイが記載される。ＨＣＶに対する新規の治療アプローチの開発は優先順位の高い課題であるため、これらの試験は推奨されている。なぜなら、それらは、感受性細胞中へのＨＣＶ侵入に影響を与える薬剤が、現在のＨＣＶ治療に対する効果的で安全な代替物を構成しうることを実証するからである。
【０００７】
発明の概要
本発明は、ＨＣＶ感染及びＨＣＶ関連疾患の予防及び／又は処置のための標的化システム及び戦略に関する。特に、本発明は、クローディン１（ＨＣＶの公知の受容体）の細胞外ドメインに結合することにより、ＨＣＶ宿主細胞相互作用に干渉する抗体に関する。理論により拘束されることを望まないが、細胞表面上でのクローディン１の細胞外ドメインに対するそのような抗体の結合は、細胞中へのＨＣＶ侵入を阻害又は遮断し、それにより細胞のＨＣＶ感染を予防すると考えられる。出願者らは、抗クローディン抗体が、検出可能なクローディン−Ｅ２相互作用の非存在においてＨＣＶ許容細胞株へのエンベロープ糖タンパク質Ｅ２及びビリオンの結合が阻害されることを示している。出願者らは、抗体が、細胞表面とのエンベロープ糖タンパク質Ｅ２会合を低下させ、ＣＤ８１−クローディン１相互作用を破壊することによりＨＣＶ感染力を中和することを実証している。抗体は、ＨＣＶ感染（急性又は慢性ＨＣＶ感染）及びＨＣＶ関連疾患又は障害（例、肝炎、肝硬変、及び肝細胞癌及び肝臓移植）の予防的又は治療的処置において使用することができる。抗体（例えば細胞中へのＨＣＶ侵入を阻害する本明細書に提供する抗体など）は、抗ウイルス治療として特に魅力的である。ＨＣＶ侵入の阻害剤は原形質膜を通過する又は細胞内で修飾される必要がない。また、ウイルス侵入がウイルス膜及び細胞膜の保存構造により媒介されるため、ウイルス侵入の抗体阻害剤は非常に強力で、ウイルス耐性の発生を起こしにくいであろう。
【０００８】
より具体的には、一態様において、本発明は、ヒトクローディン１の細胞外ドメインに特異的に結合するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を提供する。特に、本出願者らは、そのようなハイブリドーマ細胞株の８つをＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkuturen GmbH, Inhoffenstrase 7 B, 38124 Braunschweig, Germany）に、２００８年７月２９日に寄託している。それらには、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３１、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３２、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３３、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３４、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３５、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３６、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３７、及びＤＳＭ  ＡＣＣ２９３８が与えられていた。寄託は、特許手続きを目的とする微生物の寄託の国際認識に関するブダペスト条約の条項に従ってなされた（ブダペスト条約）。
【０００９】
別の態様において、本発明は、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３１、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３２、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３３、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３４、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３５、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３６、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３７、及びＤＳＭ  ＡＣＣ２９３８で寄託されたハイブリドーマ細胞株のいずれか１つにより分泌されるモノクローナル抗体を提供する。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養物から単離及び／又は精製してもしなくてもよい。特定の実施態様において、モノクローナル抗体は、ｒＩｇＧ２ａ重（Ｈ）鎖及びカッパ軽（Ｌ）鎖アイソタイプの免疫グロブリンである。他の実施態様において、モノクローナル抗体は、ｒＩｇＧ２ｂ重（Ｈ）鎖及びカッパ軽（Ｌ）鎖アイソタイプの免疫グロブリンである。
【００１０】
出願者らが実証する通り、寄託されたハイブリドーマ細胞株により分泌されるモノクローナル抗体は、ヒトクローディン１の細胞外ドメインに特異的に結合し、インビトロでＨＣＶ感染を効率的に阻害する。本発明は、また、本発明のモノクローナル抗体の任意の生物学的に活性なフラグメント、即ち、ＨＣＶ宿主細胞相互作用に干渉する、及び／又はヒトクローディン１の細胞外ドメインに特異的に結合する、及び／又はＨＣＶ感受性細胞中へのＨＣＶ侵入を阻害もしくは遮断する、及び／又は感受性細胞のＨＣＶ感染を低下もしくは予防するモノクローナル抗体の能力を保持する任意のフラグメント又は部分を包含する。
【００１１】
より一般的には、本発明は、本発明の抗クローディン１モノクローナル抗体又はそのフラグメント（キメラ抗体、ヒト化抗体、脱免疫化抗体を含む）及びハイブリドーマ細胞株により分泌される本発明の抗クローディン１モノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖可変領域の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体由来分子（分子、例えばＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｓｃ抗体（単鎖抗体）、ダイアボディ、個々の抗体軽単鎖、個々の抗体重鎖、抗体鎖と他の分子の間のキメラ融合物など）、及び抗体コンジュゲート、例えば診断用薬剤（検出可能成分）又は治療用薬剤にコンジュゲートされた抗体を、これらの抗体関連分子が、それが「由来」する本発明のモノクローナル抗体の少なくとも１つの生物学的に関連する特性を保持する限り、包含する。生物学的に関連する特性は、ＨＣＶ宿主細胞相互作用に干渉する、ヒトクローディン１の細胞外ドメインに特異的に結合する、ＨＣＶ感受性細胞中へのＨＣＶ侵入を阻害もしくは遮断する、及び／又は感受性細胞のＨＣＶ感染を低下もしくは予防する能力でありうる。特定の好ましい実施態様において、本発明のモノクローナル抗体の生物学的に活性なフラグメントは、ヒトクローディン１の細胞外ドメインに特異的に結合する。
【００１２】
出願者らは、寄託されたハイブリドーマ細胞株により分泌されるモノクローナル抗体が、ヒトクローディン１の最初の細胞外ループ中の保存モチーフにおける突然変異により強く影響を受けるエピトープを認識することを示している。このモチーフはＷ（３０）−ＧＬＷ（５１）−Ｃ（５４）−Ｃ（６４）である。結果的に、特定の実施態様において、本発明のモノクローナル抗体、又はその生物学的に活性なフラグメントは、クローディン１の最初の細胞外ループ中の保存モチーフＷ（３０）−ＧＬＷ（５１）−Ｃ（５４）−Ｃ（６４）構造に依存しているエピトープを認識する。
【００１３】
同様に、出願者らは、寄託されたハイブリドーマ細胞株により分泌されるモノクローナル抗体が、マウスクローディン１と交差反応しないが、しかし、非ヒト霊長類カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）におけるそのオルソログと交差反応することを示している。従って、特定の実施態様において、本発明のモノクローナル抗体、又はその生物学的に活性なフラグメントは、齧歯類のクローディン１に結合しないが、しかし、非ヒト霊長類のクローディン１に結合する。
【００１４】
一般的に、本発明の抗体は、ＨＣＶ許容細胞株に対するエンベロープ糖タンパク質Ｅ２又は感染力ビリオンの結合を阻害し；ＣＤ８１−クローディン１の会合を阻害する。
【００１５】
本発明のモノクローナル抗体及び抗体関連分子は、種々の予防的及び治療的処置において適用を見い出すことができる。したがって、別の態様において、本発明のモノクローナル及び抗体関連分子は；細胞（例、感受性細胞又は感受性細胞の集団）のＨＣＶ感染を予防するため；被験者においてＨＣＶ感染又はＨＣＶ関連疾患を予防又は処置するため；慢性ＨＣＶ感染を制御するため；及び肝臓移植患者においてＨＣＶの再発を予防するために提供される。ＨＣＶ感染は、遺伝子型１、遺伝子型２、遺伝子型３、遺伝子型４、遺伝子型５、及び遺伝子型６からなる群より選択される遺伝子型、又はより具体的には、サブタイプ１ａ、サブタイプ１ｂ、サブタイプ２ａ、サブタイプ２ｂ、サブタイプ２ｃ、サブタイプ３ａ、サブタイプ４ａ−ｆ、サブタイプ５ａ、及びサブタイプ６ａからなる群より選択されるサブタイプのＨＣＶに起因しうる。
【００１６】
関連する態様において、本発明は、ＨＣＶとの接触によるＨＣＶに感染する感受性細胞の可能性を低下させる方法を提供し、感受性細胞と有効量の本発明の抗体又は抗体関連分子を接触させることを含む。また、ＨＣＶとの接触による被験者の感受性細胞がＨＣＶに感染する可能性を低下させる方法が提供され、被験者に有効量の本発明の抗体又は抗体関連分子を投与することを含む。本発明は、また、それを必要とする被験者においてＨＣＶ感染又はＨＣＶ関連疾患（例、肝臓疾患又は病理）を処置又は予防する方法を提供し、被験者に有効量の本発明のモノクローナル抗体又は抗体関連分子を投与することを含む。本発明は、また、それを必要とする被験者において慢性ＨＣＶ感染を制御する方法を提供し、被験者に有効量の本発明のモノクローナル抗体又は抗体関連分子を投与することを含む。
【００１７】
また、肝臓移植患者におけるＨＣＶの再発を予防する方法が提供され、患者に有効量の本発明のモノクローナル抗体又は抗体関連分子を投与することを含む。本発明の抗体又は抗体関連分子の被験者への投与は、任意の適した経路（例えば、非経口、エアゾル、経口、及び局所経路を含む）によってもよい。本発明のモノクローナル抗体又は抗体関連分子は、単独で又は治療用薬剤（例えば抗ウイルス薬剤など）と組み合わせて投与してもよい。
【００１８】
本発明のモノクローナル抗体及び抗体関連分子は、それ自体で又は医薬的組成物として投与してもよい。したがって、別の態様において、本発明は、ＨＣＶ感染及びＨＣＶ関連疾患の処置及び／又は予防のための医薬、医薬的組成物、又は薬学的キットの製造のための本発明のモノクローナル抗体又は抗体関連分子の使用を提供する。
【００１９】
関連する態様において、本発明は、有効量の本発明のモノクローナル抗体又は抗体関連分子及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含む医薬的組成物を提供する。特定の実施態様において、医薬的組成物は、追加の治療用薬剤（例えば抗ウイルス薬剤など）との併用の投与に適応される。他の実施態様において、医薬的組成物は、追加の治療用薬剤（例えば抗ウイルス薬剤など）をさらに含む。本発明の方法及び医薬的組成物における使用に適した抗ウイルス薬剤は、限定はされないが、インターフェロン（例、インターフェロン−アルファ、ペグ化インターフェロン−アルファ）、リバビリン、抗ＨＣＶ（モノクローナル又はポリクローナル）抗体、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、ＩＲＥＳ阻害剤、ヘリカーゼ阻害剤、アンチセンス化合物、リボザイム、及びその任意の組み合わせを含む。
【００２０】
検出可能な成分にコンジュゲートされた場合、本発明のモノクローナル抗体又は抗体関連分子は、種々の非治療的方法において、例えば特定の疾患（例えば癌など）の診断及び／又は予後において適用を見い出すことができる。実際に、クローディン１の発現レベルは、様々な癌のための有用な診断又は予後マーカーに有用であると実証されている。したがって、別の態様において、本発明は、特定の癌の診断及び／又は予後のための組成物又はキットの製造のための本発明のモノクローナル抗体又は抗体関連分子の使用を提供する。
【００２１】
関連する態様において、本発明は、抗体−クローディン１複合体が生物学的サンプル中に存在する抗体とクローディン１の間で形成することを可能にする時間及び条件下で生物学的サンプルと本発明の抗体を接触させることを含む、生物学的サンプル中でのクローディン１の検出；及び形成された任意の抗体−クローディン１複合体の存在の検出（及び／又は定量化）のための方法を提供する。そのような方法において使用される本発明の抗体（又は抗体関連分子）は、好ましくは、検出可能な成分にコンジュゲートされる。特定の実施態様において、生物学的サンプルは、被験者から、例えば、癌が疑われる被験者から得られる。診断又は予後は、例えば、健康な被験者から得られた生物学的サンプルについて同一の条件下で得られた結果との比較後、形成された抗体−クローディン１複合体の存在、非存在、又は量に基づいて提供されうる。
【００２２】
本発明のこれらの及び他の目的、利点、及び特性は、以下の好ましい実施態様の詳細な説明を読んだ当業者には明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】図１は、ＣＨＯ細胞において発現するＣＬＤＮ−１へのラット抗ヒトＣＬＤＮ−１血清の特異的結合を例示する２つのグラフの組である。ＣＬＤＮ−１外部ドメインループに対する抗ＣＬＤＮ−１ポリクローナル血清は、ヒトＣＬＤＮ−１  ｃＤＮＡを持つプラスミドを使用したウィスターラットの遺伝子免疫により産生された（実施例１を参照のこと）。ＣＨＯ細胞を、ｐｃＤＮＡ−ＣＬＤＮ−１又はコントロールベクター（ｐｃＤＮＡ）を用いてトランスフェクトした。ラット抗ヒトＣＬＤＮ−１ポリクローナル血清及びＰＥコンジュゲート抗ラットＩｇＧとインキュベートされたＣＬＤＮ−１又はコントロールトランスフェクト非透過性化ＣＨＯ細胞のフローサイトメトリーによって、抗ＣＬＤＮ−１抗体とヒトＣＬＤＮ−１との特異的な相互作用が実証された（図１Ｂ）。対照的に、相互作用は、コントロールベクターを用いてトランスフェクトされ、抗ＣＬＤＮ−１血清とインキュベートされたＣＨＯ細胞において観察されなかった（図１Ａ）。
【図１Ｂ】図１は、ＣＨＯ細胞において発現するＣＬＤＮ−１へのラット抗ヒトＣＬＤＮ−１血清の特異的結合を例示する２つのグラフの組である。ＣＬＤＮ−１外部ドメインループに対する抗ＣＬＤＮ−１ポリクローナル血清は、ヒトＣＬＤＮ−１  ｃＤＮＡを持つプラスミドを使用したウィスターラットの遺伝子免疫により産生された（実施例１を参照のこと）。ＣＨＯ細胞を、ｐｃＤＮＡ−ＣＬＤＮ−１又はコントロールベクター（ｐｃＤＮＡ）を用いてトランスフェクトした。ラット抗ヒトＣＬＤＮ−１ポリクローナル血清及びＰＥコンジュゲート抗ラットＩｇＧとインキュベートされたＣＬＤＮ−１又はコントロールトランスフェクト非透過性化ＣＨＯ細胞のフローサイトメトリーによって、抗ＣＬＤＮ−１抗体とヒトＣＬＤＮ−１との特異的な相互作用が実証された（図１Ｂ）。対照的に、相互作用は、コントロールベクターを用いてトランスフェクトされ、抗ＣＬＤＮ−１血清とインキュベートされたＣＨＯ細胞において観察されなかった（図１Ａ）。
【図２Ａ】図２は、Ｈｕｈ７．５．１ヒト肝細胞癌細胞（図２Ａ）、ヒト肝細胞（図２Ｂ）上での抗ＣＬＤＮ−１抗体とＣＬＤＮ−１外部ドメインとの相互作用を実証する３つのグラフの組である。ＣＬＤＮ−１の細胞表面発現を、ラット抗ヒトＣＬＤＮ−１血清又はコントロール免疫前血清を使用したフローサイトメトリーにより決定した（実施例１を参照のこと）。それぞれの細胞表面分子の細胞表面発現に対応するヒストグラム（白曲線）を、適切なアイソタイプコントロールとインキュベートされた細胞のヒストグラム（灰色影付き曲線）に重ねる。ラット抗ヒトＣＬＤＮ−１血清は、ヒト肝細胞癌Ｈｕｈ７．５．１細胞、及びヒト初代肝細胞の細胞表面上でＣＬＤＮ−１を特異的に検出した。
【図２Ｂ】図２は、Ｈｕｈ７．５．１ヒト肝細胞癌細胞（図２Ａ）、ヒト肝細胞（図２Ｂ）上での抗ＣＬＤＮ−１抗体とＣＬＤＮ−１外部ドメインとの相互作用を実証する３つのグラフの組である。ＣＬＤＮ−１の細胞表面発現を、ラット抗ヒトＣＬＤＮ−１血清又はコントロール免疫前血清を使用したフローサイトメトリーにより決定した（実施例１を参照のこと）。それぞれの細胞表面分子の細胞表面発現に対応するヒストグラム（白曲線）を、適切なアイソタイプコントロールとインキュベートされた細胞のヒストグラム（灰色影付き曲線）に重ねる。ラット抗ヒトＣＬＤＮ−１血清は、ヒト肝細胞癌Ｈｕｈ７．５．１細胞、及びヒト初代肝細胞の細胞表面上でＣＬＤＮ−１を特異的に検出した。
【図３Ａ】図３は、Ｃａｃｏ２（Ａ）細胞及びＨｕｈ７．５．１（Ｂ）細胞におけるＣＬＤＮ１発現を示す免疫蛍光画像の組である。図３Ａ及び図３Ｂの下パネルはそれぞれＣａｃｏ２細胞及びＨｕｈ７．５．１細胞を示し、それらは、ＣＬＤＮ１外部ドメインに対する抗ＣＬＤＮ１ポリクローナル抗体（「抗ＣＬＤＮ１  ｐＡｂ」）、及び細胞内Ｃ末端ドメインに対する市販の抗ＣＬＤＮ１抗体（「抗ＣＬＤＮ１  ｍＡｂ」）を使用してＣＬＤＮ１について、ならびにＤＡＰＩを使用して核について、実施例１に記載する通りに染色した。コントロールを図３Ａ及び図３Ｂの上パネルに示し、そこではＣａｃｏ２細胞及びＨｕｈ７．５．１細胞をそれぞれラットポリクローナルＩｇＧ（「コントロールｐＡｂ」）、マウスモノクローナルＩｇＧ（「コントロールｍＡｂ」）、及びＤＡＰＩとインキュベートした。スケールバーは１０μmを表す。
【図３Ｂ】図３は、Ｃａｃｏ２（Ａ）細胞及びＨｕｈ７．５．１（Ｂ）細胞におけるＣＬＤＮ１発現を示す免疫蛍光画像の組である。図３Ａ及び図３Ｂの下パネルはそれぞれＣａｃｏ２細胞及びＨｕｈ７．５．１細胞を示し、それらは、ＣＬＤＮ１外部ドメインに対する抗ＣＬＤＮ１ポリクローナル抗体（「抗ＣＬＤＮ１  ｐＡｂ」）、及び細胞内Ｃ末端ドメインに対する市販の抗ＣＬＤＮ１抗体（「抗ＣＬＤＮ１  ｍＡｂ」）を使用してＣＬＤＮ１について、ならびにＤＡＰＩを使用して核について、実施例１に記載する通りに染色した。コントロールを図３Ａ及び図３Ｂの上パネルに示し、そこではＣａｃｏ２細胞及びＨｕｈ７．５．１細胞をそれぞれラットポリクローナルＩｇＧ（「コントロールｐＡｂ」）、マウスモノクローナルＩｇＧ（「コントロールｍＡｂ」）、及びＤＡＰＩとインキュベートした。スケールバーは１０μmを表す。
【図４Ａ】図４は、抗ＣＬＤＮ−１抗体（ラットポリクローナル抗ＣＬＤＮ−１抗血清）によるＨＣＶ感染（Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃ感染）の阻害を示す２つのグラフの組である。図４Ａは、ＪＣ１  ＨＣＶｃｃを用いた３７℃で３時間にわたる感染前に、抗ＣＬＤＮ−１ラット血清（希釈１／５０）又はコントロール血清（「汎ラット」）と３７℃で１時間プレインキュベートされたＨｕｈ７．５．１細胞について得られた結果を示す。ＨＣＶ感染を、感染から７２時間後の感染Ｈｕｈ７．５．１細胞のライセート中でのＨＣＶ  ＲＮＡ定量化により評価した。全ＲＮＡを単離し、ＨＣＶ  ＲＮＡをｐＲＴ−ＰＣＲにより定量化した。図４Ｂは、精製された抗ＣＬＤＮ−１免疫グロブリンによるＪｃ１  ＨＣＶｃｃ感染の阻害を示す。抗ＣＬＤＮ−１  ＩｇＧを、実施例１に記載する通り、血清Ｎｏ．  ２から精製し、Ｈｕｈ７．５．１細胞に加えた（ＣＴＲＬ−コントロールＩｇＧ）。ＨＣＶ感染を、上に記載する通り、ＨＣＶ  ＲＮＡ定量化により評価した。結果を、少なくとも２つの独立した実験からの１つで、２連での決定から平均%  ＨＣＶｃｃ感染力±ＳＤとして表す。
【図４Ｂ】図４は、抗ＣＬＤＮ−１抗体（ラットポリクローナル抗ＣＬＤＮ−１抗血清）によるＨＣＶ感染（Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃ感染）の阻害を示す２つのグラフの組である。図４Ａは、ＪＣ１  ＨＣＶｃｃを用いた３７℃で３時間にわたる感染前に、抗ＣＬＤＮ−１ラット血清（希釈１／５０）又はコントロール血清（「汎ラット」）と３７℃で１時間プレインキュベートされたＨｕｈ７．５．１細胞について得られた結果を示す。ＨＣＶ感染を、感染から７２時間後の感染Ｈｕｈ７．５．１細胞のライセート中でのＨＣＶ  ＲＮＡ定量化により評価した。全ＲＮＡを単離し、ＨＣＶ  ＲＮＡをｐＲＴ−ＰＣＲにより定量化した。図４Ｂは、精製された抗ＣＬＤＮ−１免疫グロブリンによるＪｃ１  ＨＣＶｃｃ感染の阻害を示す。抗ＣＬＤＮ−１  ＩｇＧを、実施例１に記載する通り、血清Ｎｏ．  ２から精製し、Ｈｕｈ７．５．１細胞に加えた（ＣＴＲＬ−コントロールＩｇＧ）。ＨＣＶ感染を、上に記載する通り、ＨＣＶ  ＲＮＡ定量化により評価した。結果を、少なくとも２つの独立した実験からの１つで、２連での決定から平均%  ＨＣＶｃｃ感染力±ＳＤとして表す。
【図５Ａ】図５（Ａ）は、抗ＳＲ−ＢＩ抗体、抗ＣＤ８１抗体、及び抗ＣＬＤＮ１抗体によるＬｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃ感染の用量依存的な阻害を示す。ＨＣＶ感染を準最大に遮断した抗体濃度の使用によって、相加効果又は相乗効果の観察が可能になった。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、Ｌｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃを用いた３７℃で４時間にわたる感染前に、抗ＣＤ８１  ｍＡｂ（０．１及び０．０５μg/mL）、コントロールマウスｍＡｂ（ｍＩｇＧ：０．１及び０．０５μg/mL）、ラット抗ＳＲ−ＢＩ血清（１／２００、１／４００、及び１／８００）、ラット抗ＣＬＤＮ１血清（１／１００、１／２００、１／４００）、又はコントロールラット免疫前血清（ＣＴＲＬ：１／２００）と３７℃で１時間プレインキュベートした。ＨＣＶ感染を、感染から４８時間後のルシフェラーゼ活性の測定により評価した。データを、抗体の非存在におけるパーセントＬｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃ感染力として表す。２連で実施された４つの独立した実験での平均値±ＳＤを示す。図５（Ｂ）〜（Ｄ）は、ＨＣＶｃｃ侵入の阻害における抗ＳＲ−ＢＩ抗体、抗ＣＤ８１抗体、及び抗ＣＬＤＮ１抗体の相加効果を示す４つのグラフの組である。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、Ｌｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃを用いた３７℃で４時間にわたる感染前に、ラット抗ＳＲ−ＢＩ（１／４００、１／８００）、ラット抗ＣＬＤＮ１（１／２００、１／４００）、及びマウス抗ＣＤ８１（０．０５、０．１μg/mL）と単独で（黒色バー）又は組み合わせで（灰色バー）３７℃で１時間プレインキュベートした。ＨＣＶｃｃ感染を（Ａ）に記載する通りに評価した。データを、抗体の非存在におけるパーセントＬｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃ感染力として表す。２連で実施された４つの独立した実験での平均値±ＳＤを示す。
【図５Ｂ】図５（Ａ）は、抗ＳＲ−ＢＩ抗体、抗ＣＤ８１抗体、及び抗ＣＬＤＮ１抗体によるＬｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃ感染の用量依存的な阻害を示す。ＨＣＶ感染を準最大に遮断した抗体濃度の使用によって、相加効果又は相乗効果の観察が可能になった。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、Ｌｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃを用いた３７℃で４時間にわたる感染前に、抗ＣＤ８１  ｍＡｂ（０．１及び０．０５μg/mL）、コントロールマウスｍＡｂ（ｍＩｇＧ：０．１及び０．０５μg/mL）、ラット抗ＳＲ−ＢＩ血清（１／２００、１／４００、及び１／８００）、ラット抗ＣＬＤＮ１血清（１／１００、１／２００、１／４００）、又はコントロールラット免疫前血清（ＣＴＲＬ：１／２００）と３７℃で１時間プレインキュベートした。ＨＣＶ感染を、感染から４８時間後のルシフェラーゼ活性の測定により評価した。データを、抗体の非存在におけるパーセントＬｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃ感染力として表す。２連で実施された４つの独立した実験での平均値±ＳＤを示す。図５（Ｂ）〜（Ｄ）は、ＨＣＶｃｃ侵入の阻害における抗ＳＲ−ＢＩ抗体、抗ＣＤ８１抗体、及び抗ＣＬＤＮ１抗体の相加効果を示す４つのグラフの組である。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、Ｌｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃを用いた３７℃で４時間にわたる感染前に、ラット抗ＳＲ−ＢＩ（１／４００、１／８００）、ラット抗ＣＬＤＮ１（１／２００、１／４００）、及びマウス抗ＣＤ８１（０．０５、０．１μg/mL）と単独で（黒色バー）又は組み合わせで（灰色バー）３７℃で１時間プレインキュベートした。ＨＣＶｃｃ感染を（Ａ）に記載する通りに評価した。データを、抗体の非存在におけるパーセントＬｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃ感染力として表す。２連で実施された４つの独立した実験での平均値±ＳＤを示す。
【図５Ｃ】図５（Ａ）は、抗ＳＲ−ＢＩ抗体、抗ＣＤ８１抗体、及び抗ＣＬＤＮ１抗体によるＬｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃ感染の用量依存的な阻害を示す。ＨＣＶ感染を準最大に遮断した抗体濃度の使用によって、相加効果又は相乗効果の観察が可能になった。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、Ｌｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃを用いた３７℃で４時間にわたる感染前に、抗ＣＤ８１  ｍＡｂ（０．１及び０．０５μg/mL）、コントロールマウスｍＡｂ（ｍＩｇＧ：０．１及び０．０５μg/mL）、ラット抗ＳＲ−ＢＩ血清（１／２００、１／４００、及び１／８００）、ラット抗ＣＬＤＮ１血清（１／１００、１／２００、１／４００）、又はコントロールラット免疫前血清（ＣＴＲＬ：１／２００）と３７℃で１時間プレインキュベートした。ＨＣＶ感染を、感染から４８時間後のルシフェラーゼ活性の測定により評価した。データを、抗体の非存在におけるパーセントＬｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃ感染力として表す。２連で実施された４つの独立した実験での平均値±ＳＤを示す。図５（Ｂ）〜（Ｄ）は、ＨＣＶｃｃ侵入の阻害における抗ＳＲ−ＢＩ抗体、抗ＣＤ８１抗体、及び抗ＣＬＤＮ１抗体の相加効果を示す４つのグラフの組である。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、Ｌｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃを用いた３７℃で４時間にわたる感染前に、ラット抗ＳＲ−ＢＩ（１／４００、１／８００）、ラット抗ＣＬＤＮ１（１／２００、１／４００）、及びマウス抗ＣＤ８１（０．０５、０．１μg/mL）と単独で（黒色バー）又は組み合わせで（灰色バー）３７℃で１時間プレインキュベートした。ＨＣＶｃｃ感染を（Ａ）に記載する通りに評価した。データを、抗体の非存在におけるパーセントＬｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃ感染力として表す。２連で実施された４つの独立した実験での平均値±ＳＤを示す。
【図５Ｄ】図５（Ａ）は、抗ＳＲ−ＢＩ抗体、抗ＣＤ８１抗体、及び抗ＣＬＤＮ１抗体によるＬｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃ感染の用量依存的な阻害を示す。ＨＣＶ感染を準最大に遮断した抗体濃度の使用によって、相加効果又は相乗効果の観察が可能になった。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、Ｌｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃを用いた３７℃で４時間にわたる感染前に、抗ＣＤ８１  ｍＡｂ（０．１及び０．０５μg/mL）、コントロールマウスｍＡｂ（ｍＩｇＧ：０．１及び０．０５μg/mL）、ラット抗ＳＲ−ＢＩ血清（１／２００、１／４００、及び１／８００）、ラット抗ＣＬＤＮ１血清（１／１００、１／２００、１／４００）、又はコントロールラット免疫前血清（ＣＴＲＬ：１／２００）と３７℃で１時間プレインキュベートした。ＨＣＶ感染を、感染から４８時間後のルシフェラーゼ活性の測定により評価した。データを、抗体の非存在におけるパーセントＬｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃ感染力として表す。２連で実施された４つの独立した実験での平均値±ＳＤを示す。図５（Ｂ）〜（Ｄ）は、ＨＣＶｃｃ侵入の阻害における抗ＳＲ−ＢＩ抗体、抗ＣＤ８１抗体、及び抗ＣＬＤＮ１抗体の相加効果を示す４つのグラフの組である。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、Ｌｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃを用いた３７℃で４時間にわたる感染前に、ラット抗ＳＲ−ＢＩ（１／４００、１／８００）、ラット抗ＣＬＤＮ１（１／２００、１／４００）、及びマウス抗ＣＤ８１（０．０５、０．１μg/mL）と単独で（黒色バー）又は組み合わせで（灰色バー）３７℃で１時間プレインキュベートした。ＨＣＶｃｃ感染を（Ａ）に記載する通りに評価した。データを、抗体の非存在におけるパーセントＬｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃ感染力として表す。２連で実施された４つの独立した実験での平均値±ＳＤを示す。
【図５Ｅ】図５（Ａ）は、抗ＳＲ−ＢＩ抗体、抗ＣＤ８１抗体、及び抗ＣＬＤＮ１抗体によるＬｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃ感染の用量依存的な阻害を示す。ＨＣＶ感染を準最大に遮断した抗体濃度の使用によって、相加効果又は相乗効果の観察が可能になった。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、Ｌｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃを用いた３７℃で４時間にわたる感染前に、抗ＣＤ８１  ｍＡｂ（０．１及び０．０５μg/mL）、コントロールマウスｍＡｂ（ｍＩｇＧ：０．１及び０．０５μg/mL）、ラット抗ＳＲ−ＢＩ血清（１／２００、１／４００、及び１／８００）、ラット抗ＣＬＤＮ１血清（１／１００、１／２００、１／４００）、又はコントロールラット免疫前血清（ＣＴＲＬ：１／２００）と３７℃で１時間プレインキュベートした。ＨＣＶ感染を、感染から４８時間後のルシフェラーゼ活性の測定により評価した。データを、抗体の非存在におけるパーセントＬｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃ感染力として表す。２連で実施された４つの独立した実験での平均値±ＳＤを示す。図５（Ｂ）〜（Ｄ）は、ＨＣＶｃｃ侵入の阻害における抗ＳＲ−ＢＩ抗体、抗ＣＤ８１抗体、及び抗ＣＬＤＮ１抗体の相加効果を示す４つのグラフの組である。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、Ｌｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃを用いた３７℃で４時間にわたる感染前に、ラット抗ＳＲ−ＢＩ（１／４００、１／８００）、ラット抗ＣＬＤＮ１（１／２００、１／４００）、及びマウス抗ＣＤ８１（０．０５、０．１μg/mL）と単独で（黒色バー）又は組み合わせで（灰色バー）３７℃で１時間プレインキュベートした。ＨＣＶｃｃ感染を（Ａ）に記載する通りに評価した。データを、抗体の非存在におけるパーセントＬｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃ感染力として表す。２連で実施された４つの独立した実験での平均値±ＳＤを示す。
【図６Ａ】図６（Ｂ）は、抗ＣＤ８１  ｍＡｂ（■）、ラット抗ＳＲ−ＢＩ血清（◆）、ラット抗ＣＬＤＮ１血清（▲）、又はコントロールラット血清（△）によるヒト肝細胞癌細胞中へのＨＣＶｃｃ侵入の阻害の動態を示す。ラット抗ＣＬＤＮ１血清（１／１００）、ラット抗ＳＲ−ＢＩ血清（１／１００）、ラットコントロール血清（１／１００）、又は抗ＣＤ８１モノクローナル抗体（５μg/mL）によるＨｕｈ７．５．１細胞中へのＬｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃ侵入の阻害を、図６（Ａ）に提示する実験準備の概略図において示す通りに実施した。ウイルスが標的細胞に結合した後、細胞を洗浄し、阻害剤を３７℃で１２０分間にわたり２０分毎に加えて侵入を可能にした。破線は、阻害剤が存在する時間間隔を示す。ルシフェラーゼ活性を４８時間後に決定し、同じ方法（しかし、阻害剤の添加なし）で実施されたコントロール感染と比較して表す。（Ｂ）における結果を、抗体の非存在におけるパーセントＬｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃ感染力として表す。２連で実施された３つの実験からの１つでの平均値±ＳＤを示す。
【図６Ｂ】図６（Ｂ）は、抗ＣＤ８１  ｍＡｂ（■）、ラット抗ＳＲ−ＢＩ血清（◆）、ラット抗ＣＬＤＮ１血清（▲）、又はコントロールラット血清（△）によるヒト肝細胞癌細胞中へのＨＣＶｃｃ侵入の阻害の動態を示す。ラット抗ＣＬＤＮ１血清（１／１００）、ラット抗ＳＲ−ＢＩ血清（１／１００）、ラットコントロール血清（１／１００）、又は抗ＣＤ８１モノクローナル抗体（５μg/mL）によるＨｕｈ７．５．１細胞中へのＬｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃ侵入の阻害を、図６（Ａ）に提示する実験準備の概略図において示す通りに実施した。ウイルスが標的細胞に結合した後、細胞を洗浄し、阻害剤を３７℃で１２０分間にわたり２０分毎に加えて侵入を可能にした。破線は、阻害剤が存在する時間間隔を示す。ルシフェラーゼ活性を４８時間後に決定し、同じ方法（しかし、阻害剤の添加なし）で実施されたコントロール感染と比較して表す。（Ｂ）における結果を、抗体の非存在におけるパーセントＬｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃ感染力として表す。２連で実施された３つの実験からの１つでの平均値±ＳＤを示す。
【図７】図７は、ヒトクローディン１に対して免疫化された５匹のラットから得られた血清についてのフローサイトメトリー分析での結果を示す５つのグラフの組である（実施例２に記載される）。黒色曲線はヒトクローディン１発現ベクターを用いて、赤色曲線は無関係なｃＤＮＡを用いて、一過性にトランスフェクトされた哺乳動物細胞（ＢＯＳＣ２３）での結果を示す。黒色曲線の右へのシフトは陽性を示す。抗体は、ＰＥ標識された抗ラットＩｇＧ抗体（ＦＬ２）を用いて検出された。
【図８】図８は、抗ＣＬＤＮ−１抗体（その名前はｘ軸上に示される）を含むハイブリドーマ上清を用いた、組換え感染性ＨＣＶ（ＨＣＶｃｃ  Ｌｕｃ−Ｊｃ１）との感染の阻害の分析での結果を示すグラフである。ハイブリドーマ上清は、実施例２に記載する通りに得られた。結果を、（ＰＢＳ＝１００%の存在において感染させた）ハイブリドーマ上清の存在又は非存在におけるパーセントＨＣＶｃｃ  Ｌｕｃ−Ｊｃ１感染として表す。ＯＭ−３Ｅ５、ＯＭ−６Ｄ９、ＯＭ−７Ｃ１１、ＯＭ−４Ａ４、ＯＭ−６Ｅ１、ＯＭ−７Ｄ３、ＯＭ−７Ｄ４、ＯＭ−７Ｃ８、及びＯＭ−８Ａ９はＨＣＶ感染の顕著な阻害を示し、ＯＭ−５Ａ１、ＯＭ−６Ｇ１０、及びＯＭ−５Ａ８は効果を示さなかった。ネガティブコントロールは非感染細胞に対応する。
【図９Ａ】図９（Ａ）は、ヒトクローディン１に対して免疫化されたラットから集めたリンパ球から得られたモノクローナル抗体上清についてのフローサイトメトリー分析での結果を示す８つのグラフの組である（実施例２に記載される）。黒色曲線はヒトクローディン１発現ベクター（ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６−ＣＬＤＮ１）を用いて、赤色曲線は無関係なｃＤＮＡ（ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６）を用いて、一過性にトランスフェクトされた哺乳動物細胞での結果を示す。黒色曲線の右へのシフトは陽性を示す。抗体は、ＰＥ標識された抗ラットＩｇＧ抗体（ＦＬ２）を用いて検出された。ｘ軸及びｙ軸は、それぞれ平均蛍光強度及び染色細胞の相対数を示す。図９（Ｂ）は、フローサイトメトリーにより試験されたトランスフェクトＣＨＯ細胞の細胞表面上に発現されるＣＬＤＮ１に対する６つのモノクローナル抗ヒトＣＬＤＮ１抗体の特異的結合を示すグラフである。ＣＨＯ細胞を、ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６−ＣＬＤＮ１（ストライプバー）又はコントロールベクター（ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６；黒色バー）を用いてトランスフェクトした。図９（Ｃ）は、Ｈｕｈ７．５．１肝細胞癌細胞及び初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）ならびにネガティブコントロールとしてのＢＯＳＣ２３細胞上で細胞表面に発現されるＣＬＤＮ１に対する６つのモノクローナル抗体の結合を示すグラフである。結果を、２連で実施された各々の実験について算出された平均相対蛍光強度（ＲＦＵ）として示す。図９（Ｄ）は、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体による生きた非透過性化Ｈｕｈ７．５．１細胞上の細胞表面ＣＬＤＮ１の画像を示す。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、ラットアイソタイプコントロール抗体又は抗ＣＬＤＮ１  ＯＭ−７Ｄ３−Ａ３抗体（１０μg/mL）、Ｃｙ５コンジュゲート抗ラット二次抗体とインキュベートし、実施例２に記載する通りに分析した。細胞核を、ＤＡＰＩを用いて染色した。図９（Ｅ）は、フローサイトメトリーにより試験された初代カニクイザル肝細胞上の細胞表面に発現されるＣＬＤＮ１に対する６つのモノクローナル抗体の結合を示すグラフである。
【図９Ｂ】図９（Ａ）は、ヒトクローディン１に対して免疫化されたラットから集めたリンパ球から得られたモノクローナル抗体上清についてのフローサイトメトリー分析での結果を示す８つのグラフの組である（実施例２に記載される）。黒色曲線はヒトクローディン１発現ベクター（ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６−ＣＬＤＮ１）を用いて、赤色曲線は無関係なｃＤＮＡ（ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６）を用いて、一過性にトランスフェクトされた哺乳動物細胞での結果を示す。黒色曲線の右へのシフトは陽性を示す。抗体は、ＰＥ標識された抗ラットＩｇＧ抗体（ＦＬ２）を用いて検出された。ｘ軸及びｙ軸は、それぞれ平均蛍光強度及び染色細胞の相対数を示す。図９（Ｂ）は、フローサイトメトリーにより試験されたトランスフェクトＣＨＯ細胞の細胞表面上に発現されるＣＬＤＮ１に対する６つのモノクローナル抗ヒトＣＬＤＮ１抗体の特異的結合を示すグラフである。ＣＨＯ細胞を、ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６−ＣＬＤＮ１（ストライプバー）又はコントロールベクター（ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６；黒色バー）を用いてトランスフェクトした。図９（Ｃ）は、Ｈｕｈ７．５．１肝細胞癌細胞及び初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）ならびにネガティブコントロールとしてのＢＯＳＣ２３細胞上で細胞表面に発現されるＣＬＤＮ１に対する６つのモノクローナル抗体の結合を示すグラフである。結果を、２連で実施された各々の実験について算出された平均相対蛍光強度（ＲＦＵ）として示す。図９（Ｄ）は、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体による生きた非透過性化Ｈｕｈ７．５．１細胞上の細胞表面ＣＬＤＮ１の画像を示す。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、ラットアイソタイプコントロール抗体又は抗ＣＬＤＮ１  ＯＭ−７Ｄ３−Ａ３抗体（１０μg/mL）、Ｃｙ５コンジュゲート抗ラット二次抗体とインキュベートし、実施例２に記載する通りに分析した。細胞核を、ＤＡＰＩを用いて染色した。図９（Ｅ）は、フローサイトメトリーにより試験された初代カニクイザル肝細胞上の細胞表面に発現されるＣＬＤＮ１に対する６つのモノクローナル抗体の結合を示すグラフである。
【図９Ｃ】図９（Ａ）は、ヒトクローディン１に対して免疫化されたラットから集めたリンパ球から得られたモノクローナル抗体上清についてのフローサイトメトリー分析での結果を示す８つのグラフの組である（実施例２に記載される）。黒色曲線はヒトクローディン１発現ベクター（ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６−ＣＬＤＮ１）を用いて、赤色曲線は無関係なｃＤＮＡ（ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６）を用いて、一過性にトランスフェクトされた哺乳動物細胞での結果を示す。黒色曲線の右へのシフトは陽性を示す。抗体は、ＰＥ標識された抗ラットＩｇＧ抗体（ＦＬ２）を用いて検出された。ｘ軸及びｙ軸は、それぞれ平均蛍光強度及び染色細胞の相対数を示す。図９（Ｂ）は、フローサイトメトリーにより試験されたトランスフェクトＣＨＯ細胞の細胞表面上に発現されるＣＬＤＮ１に対する６つのモノクローナル抗ヒトＣＬＤＮ１抗体の特異的結合を示すグラフである。ＣＨＯ細胞を、ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６−ＣＬＤＮ１（ストライプバー）又はコントロールベクター（ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６；黒色バー）を用いてトランスフェクトした。図９（Ｃ）は、Ｈｕｈ７．５．１肝細胞癌細胞及び初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）ならびにネガティブコントロールとしてのＢＯＳＣ２３細胞上で細胞表面に発現されるＣＬＤＮ１に対する６つのモノクローナル抗体の結合を示すグラフである。結果を、２連で実施された各々の実験について算出された平均相対蛍光強度（ＲＦＵ）として示す。図９（Ｄ）は、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体による生きた非透過性化Ｈｕｈ７．５．１細胞上の細胞表面ＣＬＤＮ１の画像を示す。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、ラットアイソタイプコントロール抗体又は抗ＣＬＤＮ１  ＯＭ−７Ｄ３−Ａ３抗体（１０μg/mL）、Ｃｙ５コンジュゲート抗ラット二次抗体とインキュベートし、実施例２に記載する通りに分析した。細胞核を、ＤＡＰＩを用いて染色した。図９（Ｅ）は、フローサイトメトリーにより試験された初代カニクイザル肝細胞上の細胞表面に発現されるＣＬＤＮ１に対する６つのモノクローナル抗体の結合を示すグラフである。
【図９Ｄ】図９（Ａ）は、ヒトクローディン１に対して免疫化されたラットから集めたリンパ球から得られたモノクローナル抗体上清についてのフローサイトメトリー分析での結果を示す８つのグラフの組である（実施例２に記載される）。黒色曲線はヒトクローディン１発現ベクター（ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６−ＣＬＤＮ１）を用いて、赤色曲線は無関係なｃＤＮＡ（ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６）を用いて、一過性にトランスフェクトされた哺乳動物細胞での結果を示す。黒色曲線の右へのシフトは陽性を示す。抗体は、ＰＥ標識された抗ラットＩｇＧ抗体（ＦＬ２）を用いて検出された。ｘ軸及びｙ軸は、それぞれ平均蛍光強度及び染色細胞の相対数を示す。図９（Ｂ）は、フローサイトメトリーにより試験されたトランスフェクトＣＨＯ細胞の細胞表面上に発現されるＣＬＤＮ１に対する６つのモノクローナル抗ヒトＣＬＤＮ１抗体の特異的結合を示すグラフである。ＣＨＯ細胞を、ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６−ＣＬＤＮ１（ストライプバー）又はコントロールベクター（ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６；黒色バー）を用いてトランスフェクトした。図９（Ｃ）は、Ｈｕｈ７．５．１肝細胞癌細胞及び初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）ならびにネガティブコントロールとしてのＢＯＳＣ２３細胞上で細胞表面に発現されるＣＬＤＮ１に対する６つのモノクローナル抗体の結合を示すグラフである。結果を、２連で実施された各々の実験について算出された平均相対蛍光強度（ＲＦＵ）として示す。図９（Ｄ）は、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体による生きた非透過性化Ｈｕｈ７．５．１細胞上の細胞表面ＣＬＤＮ１の画像を示す。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、ラットアイソタイプコントロール抗体又は抗ＣＬＤＮ１  ＯＭ−７Ｄ３−Ａ３抗体（１０μg/mL）、Ｃｙ５コンジュゲート抗ラット二次抗体とインキュベートし、実施例２に記載する通りに分析した。細胞核を、ＤＡＰＩを用いて染色した。図９（Ｅ）は、フローサイトメトリーにより試験された初代カニクイザル肝細胞上の細胞表面に発現されるＣＬＤＮ１に対する６つのモノクローナル抗体の結合を示すグラフである。
【図９Ｅ】図９（Ａ）は、ヒトクローディン１に対して免疫化されたラットから集めたリンパ球から得られたモノクローナル抗体上清についてのフローサイトメトリー分析での結果を示す８つのグラフの組である（実施例２に記載される）。黒色曲線はヒトクローディン１発現ベクター（ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６−ＣＬＤＮ１）を用いて、赤色曲線は無関係なｃＤＮＡ（ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６）を用いて、一過性にトランスフェクトされた哺乳動物細胞での結果を示す。黒色曲線の右へのシフトは陽性を示す。抗体は、ＰＥ標識された抗ラットＩｇＧ抗体（ＦＬ２）を用いて検出された。ｘ軸及びｙ軸は、それぞれ平均蛍光強度及び染色細胞の相対数を示す。図９（Ｂ）は、フローサイトメトリーにより試験されたトランスフェクトＣＨＯ細胞の細胞表面上に発現されるＣＬＤＮ１に対する６つのモノクローナル抗ヒトＣＬＤＮ１抗体の特異的結合を示すグラフである。ＣＨＯ細胞を、ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６−ＣＬＤＮ１（ストライプバー）又はコントロールベクター（ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６；黒色バー）を用いてトランスフェクトした。図９（Ｃ）は、Ｈｕｈ７．５．１肝細胞癌細胞及び初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）ならびにネガティブコントロールとしてのＢＯＳＣ２３細胞上で細胞表面に発現されるＣＬＤＮ１に対する６つのモノクローナル抗体の結合を示すグラフである。結果を、２連で実施された各々の実験について算出された平均相対蛍光強度（ＲＦＵ）として示す。図９（Ｄ）は、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体による生きた非透過性化Ｈｕｈ７．５．１細胞上の細胞表面ＣＬＤＮ１の画像を示す。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、ラットアイソタイプコントロール抗体又は抗ＣＬＤＮ１  ＯＭ−７Ｄ３−Ａ３抗体（１０μg/mL）、Ｃｙ５コンジュゲート抗ラット二次抗体とインキュベートし、実施例２に記載する通りに分析した。細胞核を、ＤＡＰＩを用いて染色した。図９（Ｅ）は、フローサイトメトリーにより試験された初代カニクイザル肝細胞上の細胞表面に発現されるＣＬＤＮ１に対する６つのモノクローナル抗体の結合を示すグラフである。
【図１０Ａ】図１０は、ＨＣＶ許容細胞株Ｈｕｈ７．５．１に対する抗ＣＬＤＮ１  ｍＡｂの結合特性を示す２つのグラフの組である。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、実施例２に記載する通りに、濃度を増加させた抗ＣＬＤＮ１  ＭＡｂとインキュベートした。ＭＡｂ結合は、ＰＥコンジュゲート抗ラットＩｇＧ  ｍＡｂを使用したフローサイトメトリーにより明らかになった。コントロールとして、アイソタイプを一致させたヒトＩｇＧ２を使用した。
【図１０Ｂ】図１０は、ＨＣＶ許容細胞株Ｈｕｈ７．５．１に対する抗ＣＬＤＮ１  ｍＡｂの結合特性を示す２つのグラフの組である。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、実施例２に記載する通りに、濃度を増加させた抗ＣＬＤＮ１  ＭＡｂとインキュベートした。ＭＡｂ結合は、ＰＥコンジュゲート抗ラットＩｇＧ  ｍＡｂを使用したフローサイトメトリーにより明らかになった。コントロールとして、アイソタイプを一致させたヒトＩｇＧ２を使用した。
【図１１Ａ】図１１は、ＨＣＶ遺伝子型２ａ  Ｊ６株（Ｌｕｃ−Ｊｃ１）及び遺伝子型１ｂ  Ｃｏｎ１株（Ｌｕｃ−Ｃｏｎ１）の構造タンパク質を含む感染力ビリオンを使用した抗ＣＬＤＮ１抗体によるＨＣＶｃｃ感染の用量依存的な阻害を示すグラフである。（Ａ）Ｈｕｈ７．５．１細胞を、Ｌｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃ（遺伝子型２ａ）との感染前に、３７℃で１時間にわたり濃度を増加させたラット抗ＣＬＤＮ１抗体又はアイソタイプコントロール抗体（ＣＴＲＬ  ＩｇＩ）とプレインキュベートし、（Ｂ）Ｈｕｈ７．５．１細胞を、３７℃で４時間にわたるＨＣＶｃｃ  Ｌｕｃ−Ｃｏｎ１とのインキュベーション前に、ラット抗ＣＬＤＮ１（１０μg/μLの抗体ＯＭ６Ｅ１−Ｂ５；ＯＭ−７Ｄ３−Ｂ３；ＯＭ−８Ａ９−Ａ３）、抗ＣＤ８１（１０μg/μL）もしくはアイソタイプコントロール抗体（ＣＴＲＬ  ＩｇＧ；１０μg/μL）と又は抗体（ＣＴＲＬ）の非存在においてプレインキュベートした。ＨＣＶｃｃ  Ｌｕｃ−Ｃｏｎ１は、遺伝子型１ｂ株Ｃｏｎ１のＨＣＶ構造タンパク質を含む。ＨＣＶ感染を、実施例２に記載する通りに、感染から４８時間後にルシフェラーゼ活性の測定により評価した。３連で実施された代表的な実験からの平均値±ＳＤを示す。
【図１１Ｂ】図１１は、ＨＣＶ遺伝子型２ａ  Ｊ６株（Ｌｕｃ−Ｊｃ１）及び遺伝子型１ｂ  Ｃｏｎ１株（Ｌｕｃ−Ｃｏｎ１）の構造タンパク質を含む感染力ビリオンを使用した抗ＣＬＤＮ１抗体によるＨＣＶｃｃ感染の用量依存的な阻害を示すグラフである。（Ａ）Ｈｕｈ７．５．１細胞を、Ｌｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃ（遺伝子型２ａ）との感染前に、３７℃で１時間にわたり濃度を増加させたラット抗ＣＬＤＮ１抗体又はアイソタイプコントロール抗体（ＣＴＲＬ  ＩｇＩ）とプレインキュベートし、（Ｂ）Ｈｕｈ７．５．１細胞を、３７℃で４時間にわたるＨＣＶｃｃ  Ｌｕｃ−Ｃｏｎ１とのインキュベーション前に、ラット抗ＣＬＤＮ１（１０μg/μLの抗体ＯＭ６Ｅ１−Ｂ５；ＯＭ−７Ｄ３−Ｂ３；ＯＭ−８Ａ９−Ａ３）、抗ＣＤ８１（１０μg/μL）もしくはアイソタイプコントロール抗体（ＣＴＲＬ  ＩｇＧ；１０μg/μL）と又は抗体（ＣＴＲＬ）の非存在においてプレインキュベートした。ＨＣＶｃｃ  Ｌｕｃ−Ｃｏｎ１は、遺伝子型１ｂ株Ｃｏｎ１のＨＣＶ構造タンパク質を含む。ＨＣＶ感染を、実施例２に記載する通りに、感染から４８時間後にルシフェラーゼ活性の測定により評価した。３連で実施された代表的な実験からの平均値±ＳＤを示す。
【図１２】図１２は、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体が、主なＨＣＶ遺伝子型に由来するエンベロープ糖タンパク質を持つＨＣＶｐｐを交差中和することを示すグラフの組である。株Ｈ７７（遺伝子型１ａ）、ＨＣＶ−Ｊ（遺伝子型１ｂ）、ＪＦＨ１（遺伝子型２ａ）、ＵＫＮ３ａ１．２８（遺伝子型３）、ＵＫＮ４ａ２１．１６（遺伝子型４）、ＵＫＮ５．１４．４（遺伝子型５）、及びＵＫＮ６．５．３４０（遺伝子型６）のエンベロープ糖タンパク質を持つＭＬＶベースのＨＣＶｐｐの異なる株。ＶＳＶ擬似粒子をコントロールとして使用した。ＨＣＶｐｐ及びＶＳＶｐｐを、実施例２に記載する通りに作製した。Ｈｕｈ７細胞を、３７℃で４時間にわたるＨＣＶｐｐ又はＶＳＶｐｐとの感染前に、濃度を増加させたラット抗ＣＬＤＮ１抗体又はラットアイソタイプコントロール抗体と３７℃で１時間にわたりプレインキュベートした。ＨＣＶｐｐ及びＶＳＶ感染を、実施例２に記載する通りに、感染から７２時間後にルシフェラーゼ活性の測定により評価した。３連で実施された代表的な実験からの平均値±ＳＤを示す。
【図１３Ａ】図１３は、初代ヒト肝細胞におけるＨＣＶｐｐ感染の阻害を示すグラフの組である。株ＨＣＶ  Ｈ７７（遺伝子型１ａ）、ＨＣＶ−Ｊ（遺伝子型１ｂ）、ＪＦＨ−１（遺伝子型２ａ）、ＵＫＮ３Ａ．１．２８（遺伝子型３）のエンベロープ糖タンパク質を持つＨＩＶベースのＨＣＶｐｐを実施例２に記載する通りに作製した。初代ヒト肝細胞を、３７℃で４時間にわたるＨＣＶｐｐとの感染前に、３７℃で１時間にわたりラット抗ＣＬＤＮ１抗体又はラットアイソタイプコントロール抗体（１０μg/mL）とプレインキュベートした。ＨＣＶｐｐ感染を、実施例２に記載する通りに、感染から７２時間後にルシフェラーゼ活性の測定により評価した。３連で実施された代表的な実験からの平均値±ＳＤを示す。
【図１３Ｂ】図１３は、初代ヒト肝細胞におけるＨＣＶｐｐ感染の阻害を示すグラフの組である。株ＨＣＶ  Ｈ７７（遺伝子型１ａ）、ＨＣＶ−Ｊ（遺伝子型１ｂ）、ＪＦＨ−１（遺伝子型２ａ）、ＵＫＮ３Ａ．１．２８（遺伝子型３）のエンベロープ糖タンパク質を持つＨＩＶベースのＨＣＶｐｐを実施例２に記載する通りに作製した。初代ヒト肝細胞を、３７℃で４時間にわたるＨＣＶｐｐとの感染前に、３７℃で１時間にわたりラット抗ＣＬＤＮ１抗体又はラットアイソタイプコントロール抗体（１０μg/mL）とプレインキュベートした。ＨＣＶｐｐ感染を、実施例２に記載する通りに、感染から７２時間後にルシフェラーゼ活性の測定により評価した。３連で実施された代表的な実験からの平均値±ＳＤを示す。
【図１３Ｃ】図１３は、初代ヒト肝細胞におけるＨＣＶｐｐ感染の阻害を示すグラフの組である。株ＨＣＶ  Ｈ７７（遺伝子型１ａ）、ＨＣＶ−Ｊ（遺伝子型１ｂ）、ＪＦＨ−１（遺伝子型２ａ）、ＵＫＮ３Ａ．１．２８（遺伝子型３）のエンベロープ糖タンパク質を持つＨＩＶベースのＨＣＶｐｐを実施例２に記載する通りに作製した。初代ヒト肝細胞を、３７℃で４時間にわたるＨＣＶｐｐとの感染前に、３７℃で１時間にわたりラット抗ＣＬＤＮ１抗体又はラットアイソタイプコントロール抗体（１０μg/mL）とプレインキュベートした。ＨＣＶｐｐ感染を、実施例２に記載する通りに、感染から７２時間後にルシフェラーゼ活性の測定により評価した。３連で実施された代表的な実験からの平均値±ＳＤを示す。
【図１３Ｄ】図１３は、初代ヒト肝細胞におけるＨＣＶｐｐ感染の阻害を示すグラフの組である。株ＨＣＶ  Ｈ７７（遺伝子型１ａ）、ＨＣＶ−Ｊ（遺伝子型１ｂ）、ＪＦＨ−１（遺伝子型２ａ）、ＵＫＮ３Ａ．１．２８（遺伝子型３）のエンベロープ糖タンパク質を持つＨＩＶベースのＨＣＶｐｐを実施例２に記載する通りに作製した。初代ヒト肝細胞を、３７℃で４時間にわたるＨＣＶｐｐとの感染前に、３７℃で１時間にわたりラット抗ＣＬＤＮ１抗体又はラットアイソタイプコントロール抗体（１０μg/mL）とプレインキュベートした。ＨＣＶｐｐ感染を、実施例２に記載する通りに、感染から７２時間後にルシフェラーゼ活性の測定により評価した。３連で実施された代表的な実験からの平均値±ＳＤを示す。
【図１４Ａ】図１４は、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体が、慢性ＨＣＶ感染を伴う２人の個々の患者においてＨＣＶ疑似種による感染を交差中和することを示す（実施例２を参照のこと）。図１４（Ａ）は、ＨＶＲ１配列のアライメントに基づく最初のＨＣＶ感染患者におけるＶＪ、ＶＩ、ＶＫ（サブタイプ１ｂ）と呼ばれる３つのバリアントの相対分布を示す。エンベロープ糖タンパク質の選択ドメインの推定アミノ酸を右に示す。アミノ酸変化を赤色の太文字で示す。図１４（Ｂ）〜（Ｃ）は、Ｈｕｈ７．５．１細胞（Ｂ）及び初代ヒト肝細胞（Ｃ）における抗ＣＬＤＮ１  ＯＭ−７Ｄ３（２５μg/mL）によるこの患者におけるウイルス疑似種のエンベロープ糖タンパク質を持つＨＣＶｐｐの感染の阻害を示す２つのグラフの組である。図１４（Ｄ）は、完全Ｅ１Ｅ２配列のアライメントに基づく慢性ＨＣＶ感染を伴う２番目の患者におけるバリアント（ＶＡ−ＶＹと呼ぶ；サブタイプ１ｂ）の相対分布を示す。図１４（Ｅ）〜（Ｆ）は、慢性Ｃ型肝炎を伴う２番目の患者のウイルス疑似種のエンベロープ糖タンパク質を持つＨＣＶｐｐによるＨｕｈ７．５．１細胞の感染（Ｄ）及び抗ＣＬＤＮ１  ＯＭ−７Ｄ３（２５μg/mL）によるその中和（Ｅ）を示す２つのグラフの組である。ＨＣＶｐｐの感染を、実施例２に記載する通りに分析した。抗ＣＬＤＮ１抗体による中和を、検出可能な感染力をもつ疑似種に由来するＨＣＶｐｐについてだけ評価した。終止コドンを含むウイルスバリアントを星印により示す。３連で実施された代表的な実験からの平均値±ＳＤを示す。ＮＤ  −  行わず；ＣＴＲＬ  ＩｇＧ  −  ラットアイソタイプコントロール抗体。
【図１４Ｂ】図１４は、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体が、慢性ＨＣＶ感染を伴う２人の個々の患者においてＨＣＶ疑似種による感染を交差中和することを示す（実施例２を参照のこと）。図１４（Ａ）は、ＨＶＲ１配列のアライメントに基づく最初のＨＣＶ感染患者におけるＶＪ、ＶＩ、ＶＫ（サブタイプ１ｂ）と呼ばれる３つのバリアントの相対分布を示す。エンベロープ糖タンパク質の選択ドメインの推定アミノ酸を右に示す。アミノ酸変化を赤色の太文字で示す。図１４（Ｂ）〜（Ｃ）は、Ｈｕｈ７．５．１細胞（Ｂ）及び初代ヒト肝細胞（Ｃ）における抗ＣＬＤＮ１  ＯＭ−７Ｄ３（２５μg/mL）によるこの患者におけるウイルス疑似種のエンベロープ糖タンパク質を持つＨＣＶｐｐの感染の阻害を示す２つのグラフの組である。図１４（Ｄ）は、完全Ｅ１Ｅ２配列のアライメントに基づく慢性ＨＣＶ感染を伴う２番目の患者におけるバリアント（ＶＡ−ＶＹと呼ぶ；サブタイプ１ｂ）の相対分布を示す。図１４（Ｅ）〜（Ｆ）は、慢性Ｃ型肝炎を伴う２番目の患者のウイルス疑似種のエンベロープ糖タンパク質を持つＨＣＶｐｐによるＨｕｈ７．５．１細胞の感染（Ｄ）及び抗ＣＬＤＮ１  ＯＭ−７Ｄ３（２５μg/mL）によるその中和（Ｅ）を示す２つのグラフの組である。ＨＣＶｐｐの感染を、実施例２に記載する通りに分析した。抗ＣＬＤＮ１抗体による中和を、検出可能な感染力をもつ疑似種に由来するＨＣＶｐｐについてだけ評価した。終止コドンを含むウイルスバリアントを星印により示す。３連で実施された代表的な実験からの平均値±ＳＤを示す。ＮＤ  −  行わず；ＣＴＲＬ  ＩｇＧ  −  ラットアイソタイプコントロール抗体。
【図１４Ｃ】図１４は、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体が、慢性ＨＣＶ感染を伴う２人の個々の患者においてＨＣＶ疑似種による感染を交差中和することを示す（実施例２を参照のこと）。図１４（Ａ）は、ＨＶＲ１配列のアライメントに基づく最初のＨＣＶ感染患者におけるＶＪ、ＶＩ、ＶＫ（サブタイプ１ｂ）と呼ばれる３つのバリアントの相対分布を示す。エンベロープ糖タンパク質の選択ドメインの推定アミノ酸を右に示す。アミノ酸変化を赤色の太文字で示す。図１４（Ｂ）〜（Ｃ）は、Ｈｕｈ７．５．１細胞（Ｂ）及び初代ヒト肝細胞（Ｃ）における抗ＣＬＤＮ１  ＯＭ−７Ｄ３（２５μg/mL）によるこの患者におけるウイルス疑似種のエンベロープ糖タンパク質を持つＨＣＶｐｐの感染の阻害を示す２つのグラフの組である。図１４（Ｄ）は、完全Ｅ１Ｅ２配列のアライメントに基づく慢性ＨＣＶ感染を伴う２番目の患者におけるバリアント（ＶＡ−ＶＹと呼ぶ；サブタイプ１ｂ）の相対分布を示す。図１４（Ｅ）〜（Ｆ）は、慢性Ｃ型肝炎を伴う２番目の患者のウイルス疑似種のエンベロープ糖タンパク質を持つＨＣＶｐｐによるＨｕｈ７．５．１細胞の感染（Ｄ）及び抗ＣＬＤＮ１  ＯＭ−７Ｄ３（２５μg/mL）によるその中和（Ｅ）を示す２つのグラフの組である。ＨＣＶｐｐの感染を、実施例２に記載する通りに分析した。抗ＣＬＤＮ１抗体による中和を、検出可能な感染力をもつ疑似種に由来するＨＣＶｐｐについてだけ評価した。終止コドンを含むウイルスバリアントを星印により示す。３連で実施された代表的な実験からの平均値±ＳＤを示す。ＮＤ  −  行わず；ＣＴＲＬ  ＩｇＧ  −  ラットアイソタイプコントロール抗体。
【図１４Ｄ】図１４は、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体が、慢性ＨＣＶ感染を伴う２人の個々の患者においてＨＣＶ疑似種による感染を交差中和することを示す（実施例２を参照のこと）。図１４（Ａ）は、ＨＶＲ１配列のアライメントに基づく最初のＨＣＶ感染患者におけるＶＪ、ＶＩ、ＶＫ（サブタイプ１ｂ）と呼ばれる３つのバリアントの相対分布を示す。エンベロープ糖タンパク質の選択ドメインの推定アミノ酸を右に示す。アミノ酸変化を赤色の太文字で示す。図１４（Ｂ）〜（Ｃ）は、Ｈｕｈ７．５．１細胞（Ｂ）及び初代ヒト肝細胞（Ｃ）における抗ＣＬＤＮ１  ＯＭ−７Ｄ３（２５μg/mL）によるこの患者におけるウイルス疑似種のエンベロープ糖タンパク質を持つＨＣＶｐｐの感染の阻害を示す２つのグラフの組である。図１４（Ｄ）は、完全Ｅ１Ｅ２配列のアライメントに基づく慢性ＨＣＶ感染を伴う２番目の患者におけるバリアント（ＶＡ−ＶＹと呼ぶ；サブタイプ１ｂ）の相対分布を示す。図１４（Ｅ）〜（Ｆ）は、慢性Ｃ型肝炎を伴う２番目の患者のウイルス疑似種のエンベロープ糖タンパク質を持つＨＣＶｐｐによるＨｕｈ７．５．１細胞の感染（Ｄ）及び抗ＣＬＤＮ１  ＯＭ−７Ｄ３（２５μg/mL）によるその中和（Ｅ）を示す２つのグラフの組である。ＨＣＶｐｐの感染を、実施例２に記載する通りに分析した。抗ＣＬＤＮ１抗体による中和を、検出可能な感染力をもつ疑似種に由来するＨＣＶｐｐについてだけ評価した。終止コドンを含むウイルスバリアントを星印により示す。３連で実施された代表的な実験からの平均値±ＳＤを示す。ＮＤ  −  行わず；ＣＴＲＬ  ＩｇＧ  −  ラットアイソタイプコントロール抗体。
【図１４Ｅ】図１４は、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体が、慢性ＨＣＶ感染を伴う２人の個々の患者においてＨＣＶ疑似種による感染を交差中和することを示す（実施例２を参照のこと）。図１４（Ａ）は、ＨＶＲ１配列のアライメントに基づく最初のＨＣＶ感染患者におけるＶＪ、ＶＩ、ＶＫ（サブタイプ１ｂ）と呼ばれる３つのバリアントの相対分布を示す。エンベロープ糖タンパク質の選択ドメインの推定アミノ酸を右に示す。アミノ酸変化を赤色の太文字で示す。図１４（Ｂ）〜（Ｃ）は、Ｈｕｈ７．５．１細胞（Ｂ）及び初代ヒト肝細胞（Ｃ）における抗ＣＬＤＮ１  ＯＭ−７Ｄ３（２５μg/mL）によるこの患者におけるウイルス疑似種のエンベロープ糖タンパク質を持つＨＣＶｐｐの感染の阻害を示す２つのグラフの組である。図１４（Ｄ）は、完全Ｅ１Ｅ２配列のアライメントに基づく慢性ＨＣＶ感染を伴う２番目の患者におけるバリアント（ＶＡ−ＶＹと呼ぶ；サブタイプ１ｂ）の相対分布を示す。図１４（Ｅ）〜（Ｆ）は、慢性Ｃ型肝炎を伴う２番目の患者のウイルス疑似種のエンベロープ糖タンパク質を持つＨＣＶｐｐによるＨｕｈ７．５．１細胞の感染（Ｄ）及び抗ＣＬＤＮ１  ＯＭ−７Ｄ３（２５μg/mL）によるその中和（Ｅ）を示す２つのグラフの組である。ＨＣＶｐｐの感染を、実施例２に記載する通りに分析した。抗ＣＬＤＮ１抗体による中和を、検出可能な感染力をもつ疑似種に由来するＨＣＶｐｐについてだけ評価した。終止コドンを含むウイルスバリアントを星印により示す。３連で実施された代表的な実験からの平均値±ＳＤを示す。ＮＤ  −  行わず；ＣＴＲＬ  ＩｇＧ  −  ラットアイソタイプコントロール抗体。
【図１４Ｆ】図１４は、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体が、慢性ＨＣＶ感染を伴う２人の個々の患者においてＨＣＶ疑似種による感染を交差中和することを示す（実施例２を参照のこと）。図１４（Ａ）は、ＨＶＲ１配列のアライメントに基づく最初のＨＣＶ感染患者におけるＶＪ、ＶＩ、ＶＫ（サブタイプ１ｂ）と呼ばれる３つのバリアントの相対分布を示す。エンベロープ糖タンパク質の選択ドメインの推定アミノ酸を右に示す。アミノ酸変化を赤色の太文字で示す。図１４（Ｂ）〜（Ｃ）は、Ｈｕｈ７．５．１細胞（Ｂ）及び初代ヒト肝細胞（Ｃ）における抗ＣＬＤＮ１  ＯＭ−７Ｄ３（２５μg/mL）によるこの患者におけるウイルス疑似種のエンベロープ糖タンパク質を持つＨＣＶｐｐの感染の阻害を示す２つのグラフの組である。図１４（Ｄ）は、完全Ｅ１Ｅ２配列のアライメントに基づく慢性ＨＣＶ感染を伴う２番目の患者におけるバリアント（ＶＡ−ＶＹと呼ぶ；サブタイプ１ｂ）の相対分布を示す。図１４（Ｅ）〜（Ｆ）は、慢性Ｃ型肝炎を伴う２番目の患者のウイルス疑似種のエンベロープ糖タンパク質を持つＨＣＶｐｐによるＨｕｈ７．５．１細胞の感染（Ｄ）及び抗ＣＬＤＮ１  ＯＭ−７Ｄ３（２５μg/mL）によるその中和（Ｅ）を示す２つのグラフの組である。ＨＣＶｐｐの感染を、実施例２に記載する通りに分析した。抗ＣＬＤＮ１抗体による中和を、検出可能な感染力をもつ疑似種に由来するＨＣＶｐｐについてだけ評価した。終止コドンを含むウイルスバリアントを星印により示す。３連で実施された代表的な実験からの平均値±ＳＤを示す。ＮＤ  −  行わず；ＣＴＲＬ  ＩｇＧ  −  ラットアイソタイプコントロール抗体。
【図１５Ａ】図１５は、宿主の中和応答及び肝臓移植片の再感染を回避した患者からのエンベロープ糖タンパク質を持つＨＣＶｐｐのＨＣＶ感染の予防を示す２つのグラフの組である。宿主の中和応答及び肝臓移植片の再感染（ＨＣＶサブタイプ１ｂ）を回避した３人の異なる患者からのエンベロープ糖タンパク質を持つＨＣＶｐｐ（ＶＤ、ＶＨ、ＶＫと呼ばれる株）を、実施例２に記載する通りに作製した。ＨＣＶｐｐ感染の予防を、３７℃で４時間にわたるＨＣＶｐｐとの感染前に、抗ＣＬＤＮ１抗体ＯＭ−７Ｄ３（２５μg/ml）又は抗ＣＤ８１抗体又はアイソタイプコントロール（ＣＴＲＬ）抗体（２５μg/ml）を用いて３７℃で１時間にわたり初代ヒト肝細胞をプレインキュベートすることにより評価した。感染を、実施例２に記載する通りに分析した。３連で実施された代表的な実験からの平均値±ＳＤを示す。
【図１５Ｂ】図１５は、宿主の中和応答及び肝臓移植片の再感染を回避した患者からのエンベロープ糖タンパク質を持つＨＣＶｐｐのＨＣＶ感染の予防を示す２つのグラフの組である。宿主の中和応答及び肝臓移植片の再感染（ＨＣＶサブタイプ１ｂ）を回避した３人の異なる患者からのエンベロープ糖タンパク質を持つＨＣＶｐｐ（ＶＤ、ＶＨ、ＶＫと呼ばれる株）を、実施例２に記載する通りに作製した。ＨＣＶｐｐ感染の予防を、３７℃で４時間にわたるＨＣＶｐｐとの感染前に、抗ＣＬＤＮ１抗体ＯＭ−７Ｄ３（２５μg/ml）又は抗ＣＤ８１抗体又はアイソタイプコントロール（ＣＴＲＬ）抗体（２５μg/ml）を用いて３７℃で１時間にわたり初代ヒト肝細胞をプレインキュベートすることにより評価した。感染を、実施例２に記載する通りに分析した。３連で実施された代表的な実験からの平均値±ＳＤを示す。
【図１６Ａ】図１６は、Ｈｕｈ７．５．１細胞及び初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）における抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体の毒性の欠如を示すグラフの組である。細胞に対する細胞毒性効果を、ＭＴＴの代謝により３連で評価した。Ｈｕｈ７．５．１細胞（Ａ）及び３人の異なるドナーからの初代ヒト肝細胞（Ｂ〜Ｄ）を、ラットモノクローナル抗体、抗ＣＬＤＮ１  ＯＭ−７Ｄ３−Ｂ３（１０μg/ml）、フラボピリドール（１０μM）、又は化合物Ｃ（２０μM）と４８時間にわたりインキュベートし、ＭＴＴ代謝により分析した。相対的細胞生存率を、模擬インキュベートされた初代ヒト肝細胞又はＨｕｈ７．５．１細胞（＝１００%）との比較で評価した。（Ｄ）化合物Ｃ（０．０１〜１００μM）、抗ＣＬＤＮ１  ＯＭ−７Ｄ３抗体（０．０１〜１００μM）、又はアイソタイプコントロール抗体を増加用量で初代ヒト肝細胞に加え、毒性をパネル（Ｂ）及び（Ｃ）に記載する通りに評価した。
【図１６Ｂ】図１６は、Ｈｕｈ７．５．１細胞及び初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）における抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体の毒性の欠如を示すグラフの組である。細胞に対する細胞毒性効果を、ＭＴＴの代謝により３連で評価した。Ｈｕｈ７．５．１細胞（Ａ）及び３人の異なるドナーからの初代ヒト肝細胞（Ｂ〜Ｄ）を、ラットモノクローナル抗体、抗ＣＬＤＮ１  ＯＭ−７Ｄ３−Ｂ３（１０μg/ml）、フラボピリドール（１０μM）、又は化合物Ｃ（２０μM）と４８時間にわたりインキュベートし、ＭＴＴ代謝により分析した。相対的細胞生存率を、模擬インキュベートされた初代ヒト肝細胞又はＨｕｈ７．５．１細胞（＝１００%）との比較で評価した。（Ｄ）化合物Ｃ（０．０１〜１００μM）、抗ＣＬＤＮ１  ＯＭ−７Ｄ３抗体（０．０１〜１００μM）、又はアイソタイプコントロール抗体を増加用量で初代ヒト肝細胞に加え、毒性をパネル（Ｂ）及び（Ｃ）に記載する通りに評価した。
【図１６Ｃ】図１６は、Ｈｕｈ７．５．１細胞及び初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）における抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体の毒性の欠如を示すグラフの組である。細胞に対する細胞毒性効果を、ＭＴＴの代謝により３連で評価した。Ｈｕｈ７．５．１細胞（Ａ）及び３人の異なるドナーからの初代ヒト肝細胞（Ｂ〜Ｄ）を、ラットモノクローナル抗体、抗ＣＬＤＮ１  ＯＭ−７Ｄ３−Ｂ３（１０μg/ml）、フラボピリドール（１０μM）、又は化合物Ｃ（２０μM）と４８時間にわたりインキュベートし、ＭＴＴ代謝により分析した。相対的細胞生存率を、模擬インキュベートされた初代ヒト肝細胞又はＨｕｈ７．５．１細胞（＝１００%）との比較で評価した。（Ｄ）化合物Ｃ（０．０１〜１００μM）、抗ＣＬＤＮ１  ＯＭ−７Ｄ３抗体（０．０１〜１００μM）、又はアイソタイプコントロール抗体を増加用量で初代ヒト肝細胞に加え、毒性をパネル（Ｂ）及び（Ｃ）に記載する通りに評価した。
【図１６Ｄ】図１６は、Ｈｕｈ７．５．１細胞及び初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）における抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体の毒性の欠如を示すグラフの組である。細胞に対する細胞毒性効果を、ＭＴＴの代謝により３連で評価した。Ｈｕｈ７．５．１細胞（Ａ）及び３人の異なるドナーからの初代ヒト肝細胞（Ｂ〜Ｄ）を、ラットモノクローナル抗体、抗ＣＬＤＮ１  ＯＭ−７Ｄ３−Ｂ３（１０μg/ml）、フラボピリドール（１０μM）、又は化合物Ｃ（２０μM）と４８時間にわたりインキュベートし、ＭＴＴ代謝により分析した。相対的細胞生存率を、模擬インキュベートされた初代ヒト肝細胞又はＨｕｈ７．５．１細胞（＝１００%）との比較で評価した。（Ｄ）化合物Ｃ（０．０１〜１００μM）、抗ＣＬＤＮ１  ＯＭ−７Ｄ３抗体（０．０１〜１００μM）、又はアイソタイプコントロール抗体を増加用量で初代ヒト肝細胞に加え、毒性をパネル（Ｂ）及び（Ｃ）に記載する通りに評価した。
【図１７Ａ】図１７は、結合及び感染試験における２つの抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体の交差競合を示すグラフの組である。図１７（Ａ）：抗ＣＬＤＮ１  ＭＡｂの間での競合を、細胞ベースのＥＬＩＳＡを使用して測定した。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、０．１μg/mLのビオチン化抗ＣＬＤＮ１  ｍＡｂ（ＯＭ−８Ａ９−Ａ３  −  上パネル又はＯＭ−７Ｄ３−Ｂ３  −  下パネル）を用いて、競合物として濃度を増加させた非標識抗ＣＬＤＮ１  ＭＡｂと一緒にインキュベートした。ＰＢＳ中での細胞の洗浄に続き、ビオチン化抗体の結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼを用いて標識されたストレプトアビジンとのインキュベーションにより検出した。結合を、相対的蛍光強度（ＲＦＵ）として測定した。アイソタイプを一致させたコントロール（ネガティブコントロールｍＡｂ）の存在における結合の測定により決定された曲線を、競合抗体の存在において決定された曲線と比較した。図１７（Ｂ）：抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体の全パネル間での交差競合。交差競合を、パネルＡに示す通りに、０．１μg/mLのビオチン化抗ＣＬＤＮ１  ｍＡｂ（ｘ軸に示す）及び１０μg/mlの競合非標識抗ＣＬＤＮ１又はアイソタイプコントロールｍＡｂ（無関係コントロール抗体）（ｙ軸に示す）を使用して分析した。ビオチン化抗ＣＬＤＮ１  ｍＡｂの結合は、アイソタイプコントロール抗体の存在においてだけ生じた。図１７（Ｃ）：感染試験における抗体の交差競合。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、実施例２に記載する通りに、Ｌｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃとの感染前に、ラット抗ＣＬＤＮ１抗体又はアイソタイプコントロール抗体を用いて３７℃で１時間にわたりプレインキュベートした。交差競合を試験するために、低濃度の抗ＣＬＤＮ１  ｍＡｂ（０．５μg/ml）をＨＣＶ感染の前に同時に加えた。ＨＣＶ感染を準最大に遮断した抗体濃度の使用によって、相加効果又は相乗効果の観察が可能になった。抗体の組み合わせの効果を「＋」（最終濃度１μg/ml）（ストライプバー）により示す。
【図１７Ｂ】図１７は、結合及び感染試験における２つの抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体の交差競合を示すグラフの組である。図１７（Ａ）：抗ＣＬＤＮ１  ＭＡｂの間での競合を、細胞ベースのＥＬＩＳＡを使用して測定した。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、０．１μg/mLのビオチン化抗ＣＬＤＮ１  ｍＡｂ（ＯＭ−８Ａ９−Ａ３  −  上パネル又はＯＭ−７Ｄ３−Ｂ３  −  下パネル）を用いて、競合物として濃度を増加させた非標識抗ＣＬＤＮ１  ＭＡｂと一緒にインキュベートした。ＰＢＳ中での細胞の洗浄に続き、ビオチン化抗体の結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼを用いて標識されたストレプトアビジンとのインキュベーションにより検出した。結合を、相対的蛍光強度（ＲＦＵ）として測定した。アイソタイプを一致させたコントロール（ネガティブコントロールｍＡｂ）の存在における結合の測定により決定された曲線を、競合抗体の存在において決定された曲線と比較した。図１７（Ｂ）：抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体の全パネル間での交差競合。交差競合を、パネルＡに示す通りに、０．１μg/mLのビオチン化抗ＣＬＤＮ１  ｍＡｂ（ｘ軸に示す）及び１０μg/mlの競合非標識抗ＣＬＤＮ１又はアイソタイプコントロールｍＡｂ（無関係コントロール抗体）（ｙ軸に示す）を使用して分析した。ビオチン化抗ＣＬＤＮ１  ｍＡｂの結合は、アイソタイプコントロール抗体の存在においてだけ生じた。図１７（Ｃ）：感染試験における抗体の交差競合。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、実施例２に記載する通りに、Ｌｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃとの感染前に、ラット抗ＣＬＤＮ１抗体又はアイソタイプコントロール抗体を用いて３７℃で１時間にわたりプレインキュベートした。交差競合を試験するために、低濃度の抗ＣＬＤＮ１  ｍＡｂ（０．５μg/ml）をＨＣＶ感染の前に同時に加えた。ＨＣＶ感染を準最大に遮断した抗体濃度の使用によって、相加効果又は相乗効果の観察が可能になった。抗体の組み合わせの効果を「＋」（最終濃度１μg/ml）（ストライプバー）により示す。
【図１７Ｃ】図１７は、結合及び感染試験における２つの抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体の交差競合を示すグラフの組である。図１７（Ａ）：抗ＣＬＤＮ１  ＭＡｂの間での競合を、細胞ベースのＥＬＩＳＡを使用して測定した。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、０．１μg/mLのビオチン化抗ＣＬＤＮ１  ｍＡｂ（ＯＭ−８Ａ９−Ａ３  −  上パネル又はＯＭ−７Ｄ３−Ｂ３  −  下パネル）を用いて、競合物として濃度を増加させた非標識抗ＣＬＤＮ１  ＭＡｂと一緒にインキュベートした。ＰＢＳ中での細胞の洗浄に続き、ビオチン化抗体の結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼを用いて標識されたストレプトアビジンとのインキュベーションにより検出した。結合を、相対的蛍光強度（ＲＦＵ）として測定した。アイソタイプを一致させたコントロール（ネガティブコントロールｍＡｂ）の存在における結合の測定により決定された曲線を、競合抗体の存在において決定された曲線と比較した。図１７（Ｂ）：抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体の全パネル間での交差競合。交差競合を、パネルＡに示す通りに、０．１μg/mLのビオチン化抗ＣＬＤＮ１  ｍＡｂ（ｘ軸に示す）及び１０μg/mlの競合非標識抗ＣＬＤＮ１又はアイソタイプコントロールｍＡｂ（無関係コントロール抗体）（ｙ軸に示す）を使用して分析した。ビオチン化抗ＣＬＤＮ１  ｍＡｂの結合は、アイソタイプコントロール抗体の存在においてだけ生じた。図１７（Ｃ）：感染試験における抗体の交差競合。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、実施例２に記載する通りに、Ｌｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃとの感染前に、ラット抗ＣＬＤＮ１抗体又はアイソタイプコントロール抗体を用いて３７℃で１時間にわたりプレインキュベートした。交差競合を試験するために、低濃度の抗ＣＬＤＮ１  ｍＡｂ（０．５μg/ml）をＨＣＶ感染の前に同時に加えた。ＨＣＶ感染を準最大に遮断した抗体濃度の使用によって、相加効果又は相乗効果の観察が可能になった。抗体の組み合わせの効果を「＋」（最終濃度１μg/ml）（ストライプバー）により示す。
【図１８Ａ】図１８は、モノクローナル抗ＣＬＤＮ１抗体が、高度に保存されたクローディンモチーフ：Ｗ（３０）−ＧＬＷ（５１）−Ｃ（５４）−Ｃ（６４）の保存に強く依存しているエピトープに結合することを示すグラフの組である。抗体結合は、実施例２に記載する通りに、野生型ＣＬＤＮ１又はｘ軸上に示した定義された突然変異を含む、ＣＬＤＮ１をコードするｐＱＣＸＩＮ−ｈクローディン１プラスミドを使用して実施された。突然変異ＣＬＤＮ１に対するモノクローナル抗ＣＬＤＮ１抗体（ＯＭ−７Ｄ３−Ｂ３（Ａ）及びＯＭ−８Ａ９−Ａ３（Ｂ））の結合を、野生型ＣＬＤＮ１への結合との比較で示す（黒色バー）。一過性にトランスフェクトされたＢｏｓｃ細胞における野生型及び突然変異ＣＬＤＮ１の適切な発現を、ＨＡタグ発現レベルのフローサイトメトリー分析により確認し、ＨＡタグが存在しない突然変異体Ｉ３２Ａ以外の抗ＨＡ抗体（オープンバー）及びＣＬＤＮ１の発現を評価した。野生型ＣＬＤＮ１のＨＡと比較した、突然変異体ＣＬＤＮ１のＨＡに対する抗ＨＡ抗体の結合を、突然変異体ＣＬＤＮ１（オープンバー）の発現についての内部標準として示す。
【図１８Ｂ】図１８は、モノクローナル抗ＣＬＤＮ１抗体が、高度に保存されたクローディンモチーフ：Ｗ（３０）−ＧＬＷ（５１）−Ｃ（５４）−Ｃ（６４）の保存に強く依存しているエピトープに結合することを示すグラフの組である。抗体結合は、実施例２に記載する通りに、野生型ＣＬＤＮ１又はｘ軸上に示した定義された突然変異を含む、ＣＬＤＮ１をコードするｐＱＣＸＩＮ−ｈクローディン１プラスミドを使用して実施された。突然変異ＣＬＤＮ１に対するモノクローナル抗ＣＬＤＮ１抗体（ＯＭ−７Ｄ３−Ｂ３（Ａ）及びＯＭ−８Ａ９−Ａ３（Ｂ））の結合を、野生型ＣＬＤＮ１への結合との比較で示す（黒色バー）。一過性にトランスフェクトされたＢｏｓｃ細胞における野生型及び突然変異ＣＬＤＮ１の適切な発現を、ＨＡタグ発現レベルのフローサイトメトリー分析により確認し、ＨＡタグが存在しない突然変異体Ｉ３２Ａ以外の抗ＨＡ抗体（オープンバー）及びＣＬＤＮ１の発現を評価した。野生型ＣＬＤＮ１のＨＡと比較した、突然変異体ＣＬＤＮ１のＨＡに対する抗ＨＡ抗体の結合を、突然変異体ＣＬＤＮ１（オープンバー）の発現についての内部標準として示す。
【図１９】図１９は、フローサイトメトリーにより試験されたヒトＨｕｈ７．５．１肝細胞癌細胞及びマウスＨｅｐａ１．６肝細胞癌細胞上でのＣＬＤＮ１の細胞表面発現に対する６つのモノクローナル抗体の結合を示すグラフである。結果を平均相対蛍光として示し、各実験を２連で実施した。抗ＣＤ８１モノクローナル抗体をポジティブコントロールとして使用した。
【図２０Ａ】図２０は、抗ＣＬＤＮ１抗体による許容細胞株へのＥ２結合の用量依存的な阻害を示すグラフの組である。（Ａ）許容Ｈｕｈ７．５．１細胞への組換えＥ２糖タンパク質の結合。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、１／１００希釈したコントロールラット免疫前血清（ＣＴＲＬ：左パネル）又はラット抗ＣＬＤＮ１抗体（右パネル）を用いて室温で１時間にわたりプレインキュベートした。Ｅ２の結合をフローサイトメトリーにより検出した。抗体及びＥ２（ＰＢＳ）の非存在においてインキュベートされた細胞は、ネガティブコントロール（ＮＣ  −  明るい影付きヒストグラム）としての役割を果たした。代表的な実験を示す。（Ｂ）許容Ｈｕｈ７．５．１細胞への組換えＥ２糖タンパク質の結合。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、ラット抗ＣＤ８１抗体、ラット抗ＳＲ−ＢＩ抗体、及びラット抗ＣＬＤＮ１抗体、又はコントロールラット免疫前血清（全て１／１００希釈した）を用いて室温で１時間にわたりプレインキュベートした。Ｅ２への結合をフローサイトメトリーにより検出した。結果を、抗体の非存在（ＰＢＳ）におけるパーセントＥ２結合として表す。２連で実施された４つの独立した実験での平均値±ＳＤを示す。（Ｃ）抗ＣＬＤＮ１によるＨｕｈ７．５．１細胞へのＥ２結合の用量依存的な阻害。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、異なる希釈のポリクローナルラット抗ＣＬＤＮ１（灰色四角）抗体又はコントロールラット免疫前血清（黒色ひし形）用いてプレインキュベートした。結果を、抗体の非存在におけるパーセントＥ２結合として表す。２連で実施された４つの独立した実験での平均値±ＳＤを示す。（Ｄ）許容Ｈｕｈ７．５．１細胞への組換えＥ１糖タンパク質の結合。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、ヘパリン、マウス抗ＣＤ８１（ＪＳ−８１；５μg/mL）、コントロール（ＣＴＲＬ）マウスＩｇＧ（５μg/mL）、ラット抗ＣＬＤＮ１（１／１００）、ラット免疫前血清（１／１００）を用いて室温で１時間にわたりプレインキュベートした。Ｅ１の結合をフローサイトメトリーにより検出した。結果を、抗体の非存在（ＰＢＳ）におけるパーセントＥ１結合として表す。２連で実施された２つの独立した実験での平均値±ＳＤを示す。結果を、抗体の非存在（ＰＢＳ）におけるパーセントＥ２結合として表す。２連で実施された２つの独立した実験での平均値±ＳＤを示す。＊＊＊Ｐ＜０．０００１（ｔ検定）。（Ｅ）許容Ｈｕｈ７．５．１細胞へのＨＣＶｃｃの結合。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、勾配超遠心を使用して細胞培養上清から部分的に精製されたＨＣＶｃｃ（Ｊｃ１株）とのインキュベーション前に、ヘパリン、ラット抗ＣＬＤＮ１、ラット抗ＳＲ−ＢＩ、又はコントロールラット免疫前血清（ＰＩ）（全て１／１００希釈）を用いて室温で１時間にわたりプレインキュベートした。ＨＣＶｃｃとのインキュベーションに続き、非結合ＨＣＶｃｃを、ＰＢＳを用いた細胞の洗浄により除去した。ＨＣＶｃｃの結合を、次に、細胞結合ＨＣＶ  ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより定量化した。それをｙ軸上に示す。
【図２０Ｂ】図２０は、抗ＣＬＤＮ１抗体による許容細胞株へのＥ２結合の用量依存的な阻害を示すグラフの組である。（Ａ）許容Ｈｕｈ７．５．１細胞への組換えＥ２糖タンパク質の結合。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、１／１００希釈したコントロールラット免疫前血清（ＣＴＲＬ：左パネル）又はラット抗ＣＬＤＮ１抗体（右パネル）を用いて室温で１時間にわたりプレインキュベートした。Ｅ２の結合をフローサイトメトリーにより検出した。抗体及びＥ２（ＰＢＳ）の非存在においてインキュベートされた細胞は、ネガティブコントロール（ＮＣ  −  明るい影付きヒストグラム）としての役割を果たした。代表的な実験を示す。（Ｂ）許容Ｈｕｈ７．５．１細胞への組換えＥ２糖タンパク質の結合。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、ラット抗ＣＤ８１抗体、ラット抗ＳＲ−ＢＩ抗体、及びラット抗ＣＬＤＮ１抗体、又はコントロールラット免疫前血清（全て１／１００希釈した）を用いて室温で１時間にわたりプレインキュベートした。Ｅ２への結合をフローサイトメトリーにより検出した。結果を、抗体の非存在（ＰＢＳ）におけるパーセントＥ２結合として表す。２連で実施された４つの独立した実験での平均値±ＳＤを示す。（Ｃ）抗ＣＬＤＮ１によるＨｕｈ７．５．１細胞へのＥ２結合の用量依存的な阻害。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、異なる希釈のポリクローナルラット抗ＣＬＤＮ１（灰色四角）抗体又はコントロールラット免疫前血清（黒色ひし形）用いてプレインキュベートした。結果を、抗体の非存在におけるパーセントＥ２結合として表す。２連で実施された４つの独立した実験での平均値±ＳＤを示す。（Ｄ）許容Ｈｕｈ７．５．１細胞への組換えＥ１糖タンパク質の結合。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、ヘパリン、マウス抗ＣＤ８１（ＪＳ−８１；５μg/mL）、コントロール（ＣＴＲＬ）マウスＩｇＧ（５μg/mL）、ラット抗ＣＬＤＮ１（１／１００）、ラット免疫前血清（１／１００）を用いて室温で１時間にわたりプレインキュベートした。Ｅ１の結合をフローサイトメトリーにより検出した。結果を、抗体の非存在（ＰＢＳ）におけるパーセントＥ１結合として表す。２連で実施された２つの独立した実験での平均値±ＳＤを示す。結果を、抗体の非存在（ＰＢＳ）におけるパーセントＥ２結合として表す。２連で実施された２つの独立した実験での平均値±ＳＤを示す。＊＊＊Ｐ＜０．０００１（ｔ検定）。（Ｅ）許容Ｈｕｈ７．５．１細胞へのＨＣＶｃｃの結合。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、勾配超遠心を使用して細胞培養上清から部分的に精製されたＨＣＶｃｃ（Ｊｃ１株）とのインキュベーション前に、ヘパリン、ラット抗ＣＬＤＮ１、ラット抗ＳＲ−ＢＩ、又はコントロールラット免疫前血清（ＰＩ）（全て１／１００希釈）を用いて室温で１時間にわたりプレインキュベートした。ＨＣＶｃｃとのインキュベーションに続き、非結合ＨＣＶｃｃを、ＰＢＳを用いた細胞の洗浄により除去した。ＨＣＶｃｃの結合を、次に、細胞結合ＨＣＶ  ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより定量化した。それをｙ軸上に示す。
【図２０Ｃ】図２０は、抗ＣＬＤＮ１抗体による許容細胞株へのＥ２結合の用量依存的な阻害を示すグラフの組である。（Ａ）許容Ｈｕｈ７．５．１細胞への組換えＥ２糖タンパク質の結合。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、１／１００希釈したコントロールラット免疫前血清（ＣＴＲＬ：左パネル）又はラット抗ＣＬＤＮ１抗体（右パネル）を用いて室温で１時間にわたりプレインキュベートした。Ｅ２の結合をフローサイトメトリーにより検出した。抗体及びＥ２（ＰＢＳ）の非存在においてインキュベートされた細胞は、ネガティブコントロール（ＮＣ  −  明るい影付きヒストグラム）としての役割を果たした。代表的な実験を示す。（Ｂ）許容Ｈｕｈ７．５．１細胞への組換えＥ２糖タンパク質の結合。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、ラット抗ＣＤ８１抗体、ラット抗ＳＲ−ＢＩ抗体、及びラット抗ＣＬＤＮ１抗体、又はコントロールラット免疫前血清（全て１／１００希釈した）を用いて室温で１時間にわたりプレインキュベートした。Ｅ２への結合をフローサイトメトリーにより検出した。結果を、抗体の非存在（ＰＢＳ）におけるパーセントＥ２結合として表す。２連で実施された４つの独立した実験での平均値±ＳＤを示す。（Ｃ）抗ＣＬＤＮ１によるＨｕｈ７．５．１細胞へのＥ２結合の用量依存的な阻害。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、異なる希釈のポリクローナルラット抗ＣＬＤＮ１（灰色四角）抗体又はコントロールラット免疫前血清（黒色ひし形）用いてプレインキュベートした。結果を、抗体の非存在におけるパーセントＥ２結合として表す。２連で実施された４つの独立した実験での平均値±ＳＤを示す。（Ｄ）許容Ｈｕｈ７．５．１細胞への組換えＥ１糖タンパク質の結合。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、ヘパリン、マウス抗ＣＤ８１（ＪＳ−８１；５μg/mL）、コントロール（ＣＴＲＬ）マウスＩｇＧ（５μg/mL）、ラット抗ＣＬＤＮ１（１／１００）、ラット免疫前血清（１／１００）を用いて室温で１時間にわたりプレインキュベートした。Ｅ１の結合をフローサイトメトリーにより検出した。結果を、抗体の非存在（ＰＢＳ）におけるパーセントＥ１結合として表す。２連で実施された２つの独立した実験での平均値±ＳＤを示す。結果を、抗体の非存在（ＰＢＳ）におけるパーセントＥ２結合として表す。２連で実施された２つの独立した実験での平均値±ＳＤを示す。＊＊＊Ｐ＜０．０００１（ｔ検定）。（Ｅ）許容Ｈｕｈ７．５．１細胞へのＨＣＶｃｃの結合。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、勾配超遠心を使用して細胞培養上清から部分的に精製されたＨＣＶｃｃ（Ｊｃ１株）とのインキュベーション前に、ヘパリン、ラット抗ＣＬＤＮ１、ラット抗ＳＲ−ＢＩ、又はコントロールラット免疫前血清（ＰＩ）（全て１／１００希釈）を用いて室温で１時間にわたりプレインキュベートした。ＨＣＶｃｃとのインキュベーションに続き、非結合ＨＣＶｃｃを、ＰＢＳを用いた細胞の洗浄により除去した。ＨＣＶｃｃの結合を、次に、細胞結合ＨＣＶ  ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより定量化した。それをｙ軸上に示す。
【図２０Ｄ】図２０は、抗ＣＬＤＮ１抗体による許容細胞株へのＥ２結合の用量依存的な阻害を示すグラフの組である。（Ａ）許容Ｈｕｈ７．５．１細胞への組換えＥ２糖タンパク質の結合。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、１／１００希釈したコントロールラット免疫前血清（ＣＴＲＬ：左パネル）又はラット抗ＣＬＤＮ１抗体（右パネル）を用いて室温で１時間にわたりプレインキュベートした。Ｅ２の結合をフローサイトメトリーにより検出した。抗体及びＥ２（ＰＢＳ）の非存在においてインキュベートされた細胞は、ネガティブコントロール（ＮＣ  −  明るい影付きヒストグラム）としての役割を果たした。代表的な実験を示す。（Ｂ）許容Ｈｕｈ７．５．１細胞への組換えＥ２糖タンパク質の結合。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、ラット抗ＣＤ８１抗体、ラット抗ＳＲ−ＢＩ抗体、及びラット抗ＣＬＤＮ１抗体、又はコントロールラット免疫前血清（全て１／１００希釈した）を用いて室温で１時間にわたりプレインキュベートした。Ｅ２への結合をフローサイトメトリーにより検出した。結果を、抗体の非存在（ＰＢＳ）におけるパーセントＥ２結合として表す。２連で実施された４つの独立した実験での平均値±ＳＤを示す。（Ｃ）抗ＣＬＤＮ１によるＨｕｈ７．５．１細胞へのＥ２結合の用量依存的な阻害。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、異なる希釈のポリクローナルラット抗ＣＬＤＮ１（灰色四角）抗体又はコントロールラット免疫前血清（黒色ひし形）用いてプレインキュベートした。結果を、抗体の非存在におけるパーセントＥ２結合として表す。２連で実施された４つの独立した実験での平均値±ＳＤを示す。（Ｄ）許容Ｈｕｈ７．５．１細胞への組換えＥ１糖タンパク質の結合。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、ヘパリン、マウス抗ＣＤ８１（ＪＳ−８１；５μg/mL）、コントロール（ＣＴＲＬ）マウスＩｇＧ（５μg/mL）、ラット抗ＣＬＤＮ１（１／１００）、ラット免疫前血清（１／１００）を用いて室温で１時間にわたりプレインキュベートした。Ｅ１の結合をフローサイトメトリーにより検出した。結果を、抗体の非存在（ＰＢＳ）におけるパーセントＥ１結合として表す。２連で実施された２つの独立した実験での平均値±ＳＤを示す。結果を、抗体の非存在（ＰＢＳ）におけるパーセントＥ２結合として表す。２連で実施された２つの独立した実験での平均値±ＳＤを示す。＊＊＊Ｐ＜０．０００１（ｔ検定）。（Ｅ）許容Ｈｕｈ７．５．１細胞へのＨＣＶｃｃの結合。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、勾配超遠心を使用して細胞培養上清から部分的に精製されたＨＣＶｃｃ（Ｊｃ１株）とのインキュベーション前に、ヘパリン、ラット抗ＣＬＤＮ１、ラット抗ＳＲ−ＢＩ、又はコントロールラット免疫前血清（ＰＩ）（全て１／１００希釈）を用いて室温で１時間にわたりプレインキュベートした。ＨＣＶｃｃとのインキュベーションに続き、非結合ＨＣＶｃｃを、ＰＢＳを用いた細胞の洗浄により除去した。ＨＣＶｃｃの結合を、次に、細胞結合ＨＣＶ  ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより定量化した。それをｙ軸上に示す。
【図２０Ｅ】図２０は、抗ＣＬＤＮ１抗体による許容細胞株へのＥ２結合の用量依存的な阻害を示すグラフの組である。（Ａ）許容Ｈｕｈ７．５．１細胞への組換えＥ２糖タンパク質の結合。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、１／１００希釈したコントロールラット免疫前血清（ＣＴＲＬ：左パネル）又はラット抗ＣＬＤＮ１抗体（右パネル）を用いて室温で１時間にわたりプレインキュベートした。Ｅ２の結合をフローサイトメトリーにより検出した。抗体及びＥ２（ＰＢＳ）の非存在においてインキュベートされた細胞は、ネガティブコントロール（ＮＣ  −  明るい影付きヒストグラム）としての役割を果たした。代表的な実験を示す。（Ｂ）許容Ｈｕｈ７．５．１細胞への組換えＥ２糖タンパク質の結合。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、ラット抗ＣＤ８１抗体、ラット抗ＳＲ−ＢＩ抗体、及びラット抗ＣＬＤＮ１抗体、又はコントロールラット免疫前血清（全て１／１００希釈した）を用いて室温で１時間にわたりプレインキュベートした。Ｅ２への結合をフローサイトメトリーにより検出した。結果を、抗体の非存在（ＰＢＳ）におけるパーセントＥ２結合として表す。２連で実施された４つの独立した実験での平均値±ＳＤを示す。（Ｃ）抗ＣＬＤＮ１によるＨｕｈ７．５．１細胞へのＥ２結合の用量依存的な阻害。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、異なる希釈のポリクローナルラット抗ＣＬＤＮ１（灰色四角）抗体又はコントロールラット免疫前血清（黒色ひし形）用いてプレインキュベートした。結果を、抗体の非存在におけるパーセントＥ２結合として表す。２連で実施された４つの独立した実験での平均値±ＳＤを示す。（Ｄ）許容Ｈｕｈ７．５．１細胞への組換えＥ１糖タンパク質の結合。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、ヘパリン、マウス抗ＣＤ８１（ＪＳ−８１；５μg/mL）、コントロール（ＣＴＲＬ）マウスＩｇＧ（５μg/mL）、ラット抗ＣＬＤＮ１（１／１００）、ラット免疫前血清（１／１００）を用いて室温で１時間にわたりプレインキュベートした。Ｅ１の結合をフローサイトメトリーにより検出した。結果を、抗体の非存在（ＰＢＳ）におけるパーセントＥ１結合として表す。２連で実施された２つの独立した実験での平均値±ＳＤを示す。結果を、抗体の非存在（ＰＢＳ）におけるパーセントＥ２結合として表す。２連で実施された２つの独立した実験での平均値±ＳＤを示す。＊＊＊Ｐ＜０．０００１（ｔ検定）。（Ｅ）許容Ｈｕｈ７．５．１細胞へのＨＣＶｃｃの結合。Ｈｕｈ７．５．１細胞を、勾配超遠心を使用して細胞培養上清から部分的に精製されたＨＣＶｃｃ（Ｊｃ１株）とのインキュベーション前に、ヘパリン、ラット抗ＣＬＤＮ１、ラット抗ＳＲ−ＢＩ、又はコントロールラット免疫前血清（ＰＩ）（全て１／１００希釈）を用いて室温で１時間にわたりプレインキュベートした。ＨＣＶｃｃとのインキュベーションに続き、非結合ＨＣＶｃｃを、ＰＢＳを用いた細胞の洗浄により除去した。ＨＣＶｃｃの結合を、次に、細胞結合ＨＣＶ  ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより定量化した。それをｙ軸上に示す。
【図２１Ａ】図２１は、ＣＤ８１及びＳＲ−ＢＩを発現するＣＨＯ細胞（しかし、ＣＬＤＮ１を発現する細胞ではない）へのエンベロープ糖タンパク質Ｅ２の細胞結合を示すグラフの組である。（Ａ）トランスフェクトＣＨＯ細胞におけるヒト侵入因子の発現。ＣＨＯ細胞を、実施例３に記載する通りに、ヒトＣＬＤＮ１、ＳＲ−ＢＩ、又はＣＤ８１をコードする発現プラスミドを用いてトランスフェクトした。トランスフェクトＣＨＯ細胞を、ラットコントロール（ＣＴＲＬ）、ラット抗ＣＬＤＮ１（左パネル）、ラット抗ＳＲ−ＢＩ（中央パネル）、又はマウスコントロールＩｇＧ及び抗ＣＤ８１（ＪＳ−８１；右パネル）を使用したフローサイトメトリーにより分析した。（Ｂ）ヒトＨＣＶ侵入因子を発現するＣＨＯ細胞へのエンベロープ糖タンパク質Ｅ２の結合。ＣＨＯ細胞を、示す通りに、ヒトＣＬＤＮ１、ＳＲ−ＢＩ、又はＣＤ８１をコードする個々の発現プラスミドを用いてトランスフェクトした。細胞のＥ２結合をフローサイトメトリーにより分析した。２連で実施された代表的な実験を示す。
【図２１Ｂ】図２１は、ＣＤ８１及びＳＲ−ＢＩを発現するＣＨＯ細胞（しかし、ＣＬＤＮ１を発現する細胞ではない）へのエンベロープ糖タンパク質Ｅ２の細胞結合を示すグラフの組である。（Ａ）トランスフェクトＣＨＯ細胞におけるヒト侵入因子の発現。ＣＨＯ細胞を、実施例３に記載する通りに、ヒトＣＬＤＮ１、ＳＲ−ＢＩ、又はＣＤ８１をコードする発現プラスミドを用いてトランスフェクトした。トランスフェクトＣＨＯ細胞を、ラットコントロール（ＣＴＲＬ）、ラット抗ＣＬＤＮ１（左パネル）、ラット抗ＳＲ−ＢＩ（中央パネル）、又はマウスコントロールＩｇＧ及び抗ＣＤ８１（ＪＳ−８１；右パネル）を使用したフローサイトメトリーにより分析した。（Ｂ）ヒトＨＣＶ侵入因子を発現するＣＨＯ細胞へのエンベロープ糖タンパク質Ｅ２の結合。ＣＨＯ細胞を、示す通りに、ヒトＣＬＤＮ１、ＳＲ−ＢＩ、又はＣＤ８１をコードする個々の発現プラスミドを用いてトランスフェクトした。細胞のＥ２結合をフローサイトメトリーにより分析した。２連で実施された代表的な実験を示す。
【図２２】図２２は、ＦＲＥＴ分析を使用したＣＤ８１−ＣＬＤＮ１共受容体会合の抗ＣＬＤＮ１阻害を示す２つのグラフの組である。コトランスフェクトされ、ＡｃＧＦＰ，ＣＤ８１及びＤｓＲＥＤ．ＣＤ８１、ＡｃＧＦＰ．ＣＬＤＮ１及びＤｓＲＥＤ．ＣＤ８１、又はＡｃＧＦＰ．ＣＬＤＮ１及びＤｓＲＥＤ．ＣＬＤＮ１を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ガラスカバーガラス上に播種し、免疫前血清又は抗ＣＬＤＮ１血清を用いて１時間にわたり処理した。細胞を固定し、レーザースキャン共焦点顕微鏡により画像化し、ＡｃＧＦＰドナータンパク質とＤｓＲＥＤアクセプタータンパク質の間でのＦＲＥＴを測定した。パーセントＦＲＥＴを、１０個の細胞での原形質膜で分析されたピクセルの総数と比較したＦＲＥＴを示す。ピクセルの頻度として定義し、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＜０．０１（ｔ検定）。未処理細胞及び抗ＣＬＤＮ１処理細胞における細胞内（黒色）及び原形質膜（白色）の位置でのＡｃＧＦＰ．ＣＬＤＮ１及びＤｓＲＥＤ．ＣＬＤＮ１を定量化し、各位置でのＣＬＤＮ１のパーセントを決定した。
【図２３Ａ】図２３は、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体によるＨＣＶ細胞間伝達の阻害を示すグラフの組である。Ｊｃ１を電気穿孔したＨｕｈ７．５．１産生細胞を、２４時間にわたりＨｕｈ７．５  ＧＦＰ＋レシピエント細胞と、抗体の非存在において（Ａ）又はＨＣＶ無細胞伝達を遮断する抗ＣＤ８１（１０mg/mL）抗体の存在において（Ｂ）又はＨＣＶ無細胞伝達及び細胞間伝達を遮断する抗ＣＤ８１及び抗ＣＬＤＮ１の存在において（Ｃ）同時培養した。各パネルにおいて、下の象限は非感染細胞を含む（左下はＧＦＰ−ＨＣＶ−細胞を、右下はＧＦＰ＋ＨＣＶ−細胞を表す）；左上はＧＦＰ−ＨＣＶ＋感染産生細胞を表す；及び右上は新たに感染されたＧＦＰ＋ＨＣＶ＋レシピエント細胞を表す。ドットプロットにおいて、ＦＬ１の高さ（ＦＬ１−Ｈ）はＧＦＰの蛍光強度を表し、ＦＬ２の高さ（ＦＬ２−Ｈ）は抗コア抗体／ＰＥ（Ａ−Ｃ）の蛍光強度を表す。異なる処理下のＧＦＰ＋ＨＣＶ＋レシピエント細胞の相対頻度を（Ｄ）に描写する。代表的な実験の結果を示す。ラットアイソタイプコントロール抗体を用いた細胞のインキュベーションは、ＨＣＶ感染のレベルに対して影響を有さないことが示された（データ示さず）。
【図２３Ｂ】図２３は、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体によるＨＣＶ細胞間伝達の阻害を示すグラフの組である。Ｊｃ１を電気穿孔したＨｕｈ７．５．１産生細胞を、２４時間にわたりＨｕｈ７．５  ＧＦＰ＋レシピエント細胞と、抗体の非存在において（Ａ）又はＨＣＶ無細胞伝達を遮断する抗ＣＤ８１（１０mg/mL）抗体の存在において（Ｂ）又はＨＣＶ無細胞伝達及び細胞間伝達を遮断する抗ＣＤ８１及び抗ＣＬＤＮ１の存在において（Ｃ）同時培養した。各パネルにおいて、下の象限は非感染細胞を含む（左下はＧＦＰ−ＨＣＶ−細胞を、右下はＧＦＰ＋ＨＣＶ−細胞を表す）；左上はＧＦＰ−ＨＣＶ＋感染産生細胞を表す；及び右上は新たに感染されたＧＦＰ＋ＨＣＶ＋レシピエント細胞を表す。ドットプロットにおいて、ＦＬ１の高さ（ＦＬ１−Ｈ）はＧＦＰの蛍光強度を表し、ＦＬ２の高さ（ＦＬ２−Ｈ）は抗コア抗体／ＰＥ（Ａ−Ｃ）の蛍光強度を表す。異なる処理下のＧＦＰ＋ＨＣＶ＋レシピエント細胞の相対頻度を（Ｄ）に描写する。代表的な実験の結果を示す。ラットアイソタイプコントロール抗体を用いた細胞のインキュベーションは、ＨＣＶ感染のレベルに対して影響を有さないことが示された（データ示さず）。
【図２３Ｃ】図２３は、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体によるＨＣＶ細胞間伝達の阻害を示すグラフの組である。Ｊｃ１を電気穿孔したＨｕｈ７．５．１産生細胞を、２４時間にわたりＨｕｈ７．５  ＧＦＰ＋レシピエント細胞と、抗体の非存在において（Ａ）又はＨＣＶ無細胞伝達を遮断する抗ＣＤ８１（１０mg/mL）抗体の存在において（Ｂ）又はＨＣＶ無細胞伝達及び細胞間伝達を遮断する抗ＣＤ８１及び抗ＣＬＤＮ１の存在において（Ｃ）同時培養した。各パネルにおいて、下の象限は非感染細胞を含む（左下はＧＦＰ−ＨＣＶ−細胞を、右下はＧＦＰ＋ＨＣＶ−細胞を表す）；左上はＧＦＰ−ＨＣＶ＋感染産生細胞を表す；及び右上は新たに感染されたＧＦＰ＋ＨＣＶ＋レシピエント細胞を表す。ドットプロットにおいて、ＦＬ１の高さ（ＦＬ１−Ｈ）はＧＦＰの蛍光強度を表し、ＦＬ２の高さ（ＦＬ２−Ｈ）は抗コア抗体／ＰＥ（Ａ−Ｃ）の蛍光強度を表す。異なる処理下のＧＦＰ＋ＨＣＶ＋レシピエント細胞の相対頻度を（Ｄ）に描写する。代表的な実験の結果を示す。ラットアイソタイプコントロール抗体を用いた細胞のインキュベーションは、ＨＣＶ感染のレベルに対して影響を有さないことが示された（データ示さず）。
【図２３Ｄ】図２３は、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体によるＨＣＶ細胞間伝達の阻害を示すグラフの組である。Ｊｃ１を電気穿孔したＨｕｈ７．５．１産生細胞を、２４時間にわたりＨｕｈ７．５  ＧＦＰ＋レシピエント細胞と、抗体の非存在において（Ａ）又はＨＣＶ無細胞伝達を遮断する抗ＣＤ８１（１０mg/mL）抗体の存在において（Ｂ）又はＨＣＶ無細胞伝達及び細胞間伝達を遮断する抗ＣＤ８１及び抗ＣＬＤＮ１の存在において（Ｃ）同時培養した。各パネルにおいて、下の象限は非感染細胞を含む（左下はＧＦＰ−ＨＣＶ−細胞を、右下はＧＦＰ＋ＨＣＶ−細胞を表す）；左上はＧＦＰ−ＨＣＶ＋感染産生細胞を表す；及び右上は新たに感染されたＧＦＰ＋ＨＣＶ＋レシピエント細胞を表す。ドットプロットにおいて、ＦＬ１の高さ（ＦＬ１−Ｈ）はＧＦＰの蛍光強度を表し、ＦＬ２の高さ（ＦＬ２−Ｈ）は抗コア抗体／ＰＥ（Ａ−Ｃ）の蛍光強度を表す。異なる処理下のＧＦＰ＋ＨＣＶ＋レシピエント細胞の相対頻度を（Ｄ）に描写する。代表的な実験の結果を示す。ラットアイソタイプコントロール抗体を用いた細胞のインキュベーションは、ＨＣＶ感染のレベルに対して影響を有さないことが示された（データ示さず）。
【図２４】図２４は、感染後に加えられた抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体（７Ｄ３）によるＨＣＶ感染の阻害を示すグラフである。Ｈｕｈ７．５．１細胞をＨＣＶｃｃ  Ｌｕｃ−Ｊｃ１を用いて感染させた。感染から４時間後、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体（７Ｄ３）又はラットアイソタイプコントロールモノクローナル抗体（５０μg/mL）を細胞に加えた。ＨＣＶ感染を、ルシフェラーゼレポーター発現により感染から３、５、７、及び９日後に定量化し、ウイルス負荷（Ｌｏｇ１０  ＲＬＵ）として描写した。培養液を２日毎に変え、新鮮抗体（５０μg/mL）の交換を伴った。このアッセイにおけるウイルス負荷の陽性検出のための閾値は、８００ＲＬＵである（点線）。代表的な実験の結果を示す。値は２連での平均値である。略語：ＲＬＵ−相対光単位。
【００２４】
定義
本明細書を通して、以下のパラグラフにおいて定義されるいくつかの用語を用いる。
【００２５】
本明細書で使用する「被験者」という用語は、ヒト又は別の哺乳動物（例、霊長類、イヌ、ネコ、ヤギ、ウマ、ブタ、マウス、ラット、ウサギなど）を指し、それらはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の宿主でありうるが、しかし、ウイルスに感染している場合としていない場合があり、及び／又はＨＣＶ関連疾患を患う場合と患わない場合がある。非ヒト被険者はトランスジェニック又はそうでなければ改変動物でありうる。本発明の多くの実施態様において、被験者はヒトである。そのような実施態様において、被験者はしばしば「個体」といわれる。「個体」という用語は特定の年齢を意味せず、そのため新生児、小児、十代の若者、及び成人を包含する。
【００２６】
本明細書で使用する「ＨＣＶ」という用語は、任意の主なＨＣＶ遺伝子型、サブタイプ、単離株及び／又は疑似種を指す。ＨＣＶ遺伝子型は、限定はされないが、遺伝子型１、２、３、４、５、及び６を含む；ＨＣＶサブタイプは、限定はされないが、サブタイプ１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、２ｃ、３ａ、４ａ−ｆ、５ａ、及び６ａを含む。
【００２７】
「ＨＣＶに罹患した」又は「ＨＣＶに感染した」という用語は、本明細書において互換的に使用される。被験者を指して使用される場合、それらは、ＨＣＶにより感染された少なくとも１つの細胞を有する被験者を指す。「ＨＣＶ感染」という用語は、標的細胞中へのＨＣＶ遺伝情報の導入（例えば標的細胞膜とＨＣＶ又はＨＣＶエンベロープ糖タンパク質陽性細胞との融合などによる）を指す。
【００２８】
「ＨＣＶ関連疾患（ＨＣＶ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ）」及び「ＨＣＶ関連疾患（ＨＣＶ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ）」という用語は、本明細書において互換的に使用される。それらは、ＨＣＶと関連する及び／又は直接的もしくは間接的に引き起こされることが周知である又は疑われる任意の疾患又は障害を指す。ＨＣＶ関連（ＨＣＶ−ｒｅｌａｔｅｄ）（又はＨＣＶ関連（ＨＣＶ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ））疾患は、限定はされないが、多種多様な肝臓疾患、例えば急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、及び肝細胞癌の無症状性キャリア状態などを含む。この用語は、感染が臨床的に明らかになるか否かにかかわらず、任意のＨＣＶ感染の症状及び副作用（潜在性、持続性、及び無症状性の感染を含む）を含む。
【００２９】
「処置」という用語を本明細書において使用し、（１）疾患又は状態（例、ＨＣＶ感染又はＨＣＶ関連疾患）の発症を遅延又は予防する；（２）疾患又は状態の症状の進行、増悪、又は悪化を減速又は停止する；（３）疾患又は状態の症状の寛解をもたらす；あるいは（４）疾患又は状態を治癒することを目的とする方法又はプロセスを特徴付ける。処置を、予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）又は予防的（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ）作用のために、疾患又は状態の発症前に施してもよい。あるいは又は加えて、処置を、治療作用のために、疾患又は状態の開始後に施してもよい。
【００３０】
「医薬的組成物」は、本明細書において、有効量の本発明の少なくとも１つの抗体（又はそのフラグメント）、及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含んでいると定義される。
【００３１】
本明細書で使用する「有効量」という用語は、その意図する目的（例、細胞、組織、系、又は被験者における所望の生物学的又は医薬的応答）を満たすために十分である化合物、薬剤、抗体、又は組成物の任意の量を指す。例えば、本発明の特定の実施態様において、目的は以下でありうる：ＨＣＶ感染を予防し、ＨＣＶ関連疾患の発症を予防し、ＨＣＶ関連疾患（例、慢性Ｃ型肝炎、肝硬変など）の症状の進行、増悪、又は悪化を減速、軽減、又は停止すること；疾患の症状の寛解をもたらすこと、又はＨＣＶ関連疾患を治癒すること。
【００３２】
「薬学的に許容可能な担体又は賦形剤」という用語は、活性成分の生物学的活性の有効性に干渉せず、それが投与される濃度で宿主に対して過度の毒性がない担体媒質を指す。この用語は、溶剤、分散剤、媒質、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤、ならびに吸着遅延剤などを含む。薬学的活性物質のためのそのような媒質及び薬剤の使用は、当技術分野において周知である（例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences", E. W. Martin, 18th Ed., 1990, Mack Publishing Co.: Easton, PAを参照のこと。それはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。
【００３３】
「抗体」という用語は、本明細書で使用される通り、特定のエピトープに結合する任意の免疫グロブリン（即ち、インタクトな免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の活性部分など）を指す。この用語は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を包含する。特異的結合能力を保持する全ての派生物及びそのフラグメントもこの用語に含まれる。この用語は、また、免疫グロブリン結合ドメインと相同である又はほとんど相同である結合ドメインを有する任意のタンパク質を対象とする。これらのタンパク質は、天然に由来しうる、又は部分的もしくは全体的に合成的に産生されうる。
【００３４】
「特異的結合」という用語は、抗体を指して使用された場合、所定の抗原に対する抗体結合を指す。典型的には、抗体は、少なくとも１×１０7M-1の親和性で結合し、非特異的抗原（例、ＢＳＡ、カゼイン）への結合のための親和性よりも少なくとも２倍大きい親和性で所定の抗原に結合する。
【００３５】
「ヒトクローディン１又はヒトＣＬＤＮ１」という用語は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０６６９２４に示される配列を有するタンパク質、又はＨＣＶ許容ヒト集団において一般に見いだされる任意の天然バリアントを指す。クローディン１の「細胞外ドメイン」又は「外部ドメイン」という用語は、細胞外空間（即ち、細胞外の空間）に延びるクローディン１配列の領域を指す。
【００３６】
「感受性細胞」及び「ＨＣＶ感受性細胞」という用語は、互換的に使用される。それらは、ＨＣＶに感染されうる任意の細胞を指す。感受性細胞は、限定されないが、肝臓細胞又は肝細胞、初代細胞、肝細胞癌細胞、ＣａＣｏ２細胞、樹状細胞、胎盤細胞、子宮内膜細胞、リンパ節細胞、リンパ球様細胞（Ｂ及びＴ細胞）、末梢血単核球、及び単球／マクロファージを含む。
【００３７】
「ＨＣＶ感染を予防、阻害、又は遮断する」という用語は、本発明の抗体又は抗体関連分子を指して使用される場合、感受性細胞又は感受性細胞集団中に導入されたＨＣＶ遺伝情報の量を、抗体又は抗体関連分子の非存在において導入されたであろう量と比較し、低下させることを意味する。
【００３８】
「単離された」という用語は、本明細書においてタンパク質又はポリペプチドを指して使用される通り、その由来又は操作によって、それが天然で会合する又はそれが最初に得られた時に会合している成分の少なくとも一部から分離されるタンパク質又はポリペプチドを意味する。「単離された」とは、代わりに又は追加で、目的のタンパク質又はポリペプチドが、人の手により作製又は合成されることを意味する。
【００３９】
「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」という用語は、本明細書において互換的に使用され、種々の長さの、それらの中性（非荷電）形態又は塩のいずれか、及び未修飾又はグリコシル化、側鎖酸化、もしくはリン酸化により修飾されたアミノ酸配列を指す。特定の実施態様において、アミノ酸配列は、全長の天然タンパク質である。他の実施態様において、アミノ酸配列は、全長タンパク質のより小さなフラグメントである。さらに他の実施態様において、アミノ酸配列を、アミノ酸側鎖に結合された追加の置換基（例えばグリコシル単位、脂質、又は無機イオン（例えばリン酸など）など）、ならびに鎖の化学変換に関連する修飾（例えばスルフヒドリル基の酸化など）により修飾する。このように、「タンパク質」という用語（又はその等価の用語）は、全長の天然タンパク質のアミノ酸配列、又はそのフラグメント（その特定の特性を有意に変化させない修飾に供する）を含むことを意図する。特に、「タンパク質」という用語は、タンパク質アイソフォーム、即ち、同じ遺伝子によりコードされるが、しかし、ｐＩもしくはＭＷ又はその両方において異なるバリアントを包含する。そのようなアイソフォームは、それらのアミノ酸配列（例、対立遺伝子変異、選択的スプライシング、又は限定タンパク質分解）において異なりうるが、又は代わりに、異なる翻訳後修飾（例、グリコシル化、アシル化、リン酸化）から生じうる。
【００４０】
「アナログ」という用語は、本明細書においてタンパク質を指して使用される通り、タンパク質と類似の又は同一の機能を持つポリペプチドを指すが、しかし、必ずしも、タンパク質のアミノ酸配列と類似もしくは同一であるアミノ酸配列又はタンパク質のものと類似もしくは同一である構造を含む必要はない。好ましくは、本発明に関連して、タンパク質アナログは、少なくとも３０%、より好ましくは少なくとも３５%、４０%、４５%、５０%、５５%、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９５%、又は９９%タンパク質のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有する。
【００４１】
「フラグメント」という用語又は「部分」という用語は、本明細書においてタンパク質を指して使用される通り、タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも５つの連続アミノ酸残基（好ましくは、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０又はそれ以上のアミノ酸残基）のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。タンパク質のフラグメントは、そのタンパク質の機能活性を持つ場合と持たない場合がある。
【００４２】
「生物学的に活性」という用語は、本明細書においてタンパク質のバリアント、アナログ、又はフラグメントを特徴付けるために使用される通り、そのタンパク質と類似の又は同一の特性を示すのに十分なタンパク質とのアミノ酸配列同一性又は相同性を共有する分子を指す。例えば、本発明の多くの実施態様において、本発明の抗体の生物学的に活性なフラグメントは、クローディン１の細胞外ドメインに結合する抗体の能力を保持するフラグメントである。
【００４３】
「相同」（又は「相同性」）という用語は、本明細書において使用する通り、「同一性」という用語と同義であり、２つのポリペプチド分子間又は２つの核酸分子間での配列類似性を指す。両方の比較配列中での位置が同じ塩基又は同じアミノ酸残基により占められる場合、それぞれ分子はその位置で相同である。２つの配列間での相同性のパーセントは、２つの配列により共有される一致する又は相同な位置の数を、比較された位置の数により割り、１００を掛けたものに対応する。一般的に、比較は、２つの配列を整列させ、最大相同性を与える場合になされる。相同アミノ酸配列は、同一の又は類似のアミノ酸配列を共有する。類似の残基は、参照配列中の対応するアミノ酸残基についての保存的置換されるか、又はその「許される点突然変異」である。参照配列中の残基の「保存的置換」は、対応する参照残基と物理的又は機能的に類似する、例えば、類似のサイズ、形状、電荷、化学特性（共有結合又は水素結合を形成する能力を含む）などを有する置換である。特に好ましい保存的置換は、Dayhoff et al.（"Atlas of Protein Sequence and Structure", 1978, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, DC, Suppl. 3, 22: 354-352）により記載される「許容される点突然変異」について定められた基準を満たすものである。
【００４４】
「標識された」、「検出可能な薬剤を用いて標識された」、及び「検出可能な成分を用いて標識された」という用語は、本明細書において互換的に使用される。これらの用語は、要素（例、抗体）を、例えば、別の要素（例、抗原）へ結合させた後、可視化することができることを明記するために使用する。好ましくは、検出可能な薬剤又は成分を選択し、それによって、測定することでき、その強度が結合要素の量に関連するシグナルが生成されるようにする。タンパク質及びポリペプチド（抗体を含む）を標識するための方法が、当技術分野において周知である。標識ポリペプチドを、標識の取り込み又はそれへのコンジュゲートにより調製することができる。標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、もしくは化学的な手段、又は任意の他の適した手段により直接的又は間接的に検出可能である。適した検出可能な薬剤は、限定はされないが、種々のリガンド、放射性核種、蛍光染料、化学発光剤、微粒子、酵素、比色標識、磁気標識、及びハプテンを含む。
【００４５】
「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」及び「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、本明細書において数を指すために使用される通り、一般的に、別に記載されない又はそうでなければ文脈から明らかではない限り（そのような数が可能な値の１００%を超えうる場合を除く）、その数のいずれかの方向で（その数より大きい又は小さい）１０%の範囲内に入る数を含む。
【００４６】
特定の好ましい実施態様に関する詳細な説明
上記の通り、本発明は、ＨＣＶ宿主細胞の相互作用に干渉することによりＨＣＶ感染を予防するモノクローナル抗体及びそのようなモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を提供する。
【００４７】
Ｉ  −  ハイブリドーマ及び抗クロ―ディン１モノクローナル抗体
以下の実施例のセクションにおいて示す通り、本出願者らは、全長ＣＬＤＮ１遺伝子を含む発現ベクターを使用した遺伝子免疫により、ヒトクローディン１の細胞外ドメインに対するポリクローナル抗体を作製している。このようにして作製されたポリクローナル抗体が、ＨＣＶｃｃ及びＨＣＶｐｐベースのシステムを使用して、ＨＣＶ感染を効率的に阻害することが見いだされた（実施例１を参照のこと）。これらの有望な結果の観点から、出願者らは、ラットの遺伝子免疫及びスクリーニング方法を使用し、ヒトクロ―ディン１の細胞外ドメインに特異的に結合し、ＨＣＶ感染を効率的に阻害するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を生成している（実施例２を参照のこと）。
【００４８】
Ａ．ハイブリドーマ細胞株及び抗クローディン１モノクローナル抗体
したがって、本発明は、ヒトクロ―ディン１の細胞外ドメインに、特に、Ｗ（３０）−ＧＬＷ（５１）−Ｃ（５４）−Ｃ（６４）（クロ―ディン１の最初の細胞外ループに位置付けられる保存モチーフ）に特異的に結合するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を提供する。より具体的には、本発明は、実施例２に記載される通りに遺伝子免疫により生成されたそのようなハイブリドーマ細胞株の８つを提供する（Ｌｏｈｒｍａｎｎ，  ２００３）。これらのハイブリドーマ細胞株（ＯＭ−４Ａ４−Ｄ４、ＯＭ−７Ｃ８−Ａ８、ＯＭ−６Ｄ９−Ａ６、ＯＭ−７Ｄ４−Ｃ１、ＯＭ−６Ｅ１−Ｂ５、ＯＭ−３Ｅ５−Ｂ６、ＯＭ−８Ａ９−Ａ３、及びＯＭ−７Ｄ３−Ｂ３と呼ばれる）は、２００８年７月２９日にＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkuturen GmbH, Inhoffenstrase 7 B, 38124 Braunschweig, Germany）にそれぞれアクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３１、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３２、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３３、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３４、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３５、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３６、ＤＳＭ  ＡＣＣ２９３７、及びＤＳＭ  ＡＣＣ２９３８で寄託された。
【００４９】
また、本発明により、これらのハイブリドーマ細胞株のいずれか１つにより分泌されるモノクローナル抗体が提供される。ハイブリドーマ培養物からのモノクローナル抗体の産生及び単離のための方法は、当技術分野において周知である。ハイブリドーマ細胞を、標準方法を使用し、適した培養液（例えばＤ−ＭＥＭ培地及びＲＰＭＩ−１６４０培地など）において増殖させる。抗クローディン１モノクローナル抗体を、ハイブリドーマ細胞培養物から、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（例えばプロテインＡカラム、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、又はこれらの方法の任意の適した組み合わせなど）により回収及び精製することができる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）も精製のために用いることができる。
【００５０】
本発明のハイブリドーマ細胞株により分泌される抗クローディン１モノクローナル抗体の各々は、ｒＩｇＧ２ｂ重（Ｈ）鎖及びカッパ軽（Ｌ）鎖アイソタイプの免疫グロブリン又はｒＩｇＧ２ａ重（Ｈ）鎖及びカッパ軽（Ｌ）鎖アイソタイプの免疫グロブリンであると決定された。しかし、本発明のモノクローナル抗体は、より一般的には、本発明のハイブリドーマ細胞株（又は誘導化細胞株）により分泌され、ヒトクローディン１の細胞外ドメインに特異的に結合する任意のモノクローナル抗体（又はそのフラグメント）を含む。任意の理論により拘束されることを望まないが、感受性細胞上でのクロ―ディン１の細胞外ドメインへのモノクローナル抗体の結合が、ＨＣＶ−宿主細胞の相互作用に干渉し、それにより、ＨＣＶが細胞中に侵入し、その細胞に感染することを予防、阻害、又は遮断すると考えられる。
【００５１】
本明細書に記載されるハイブリドーマを抗体の供給源として使用する代わりに、モノクローナル抗体を、当技術分野において公知の任意の他の適した方法により調製してもよい。例えば、本発明の抗クロ―ディン１モノクローナル抗体を、組換えＤＮＡ方法により調製してもよい。これらの方法は、一般的に、所望の抗体をコードする遺伝子の単離、適したベクター中への遺伝子の導入、及び細胞培養システムにおける大量発現を含む。所望のモノクローナル抗体をコードする遺伝子又はＤＮＡは、従来の手順を使用して（例、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離及び配列決定されうる。本明細書において提供するハイブリドーマ細胞株は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源としての役割を果たす。モノクローナル抗体の組換え産生のための適した宿主細胞は、限定はされないが、適切な哺乳動物の宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、又はＣＶ１など）を含む。適した発現プラスミドは、限定はされないが、ｐｃＤＮＡ３．１  Ｚｅｏ、ｐＩＮＤ（ＳＰ１）、ｐＲＥＰ８（全てInvitrogen, Carlsboad, CA, USAから市販されている）などを含む。抗体遺伝子は、ウイルスベクター又はレトロウイルスベクター（ＭＬＶベースのベクター、ワクシニアウイルスベースのベクターなどを含む）を介して発現されうる。本発明の抗体は、単鎖抗体として発現させてもよい。組換え産生されたモノクローナル抗体の単離及び精製は、上に記載した通りに実施してもよい。
【００５２】
Ｂ．抗体フラグメント
特定の実施態様において、本発明のモノクローナル抗体をその天然形態で使用する。他の実施態様において、それは（例、酵素切断又は他の適した方法を介して）切断され、免疫グロブリンのフラグメント又は部分、特に、生物学的に活性であるフラグメント又は部分を提供しうる。本発明のモノクローナル抗体の生物学的に活性なフラグメント又は部分は、ＨＣＶ−宿主細胞の相互作用に干渉し、及び／又はヒトクロ―ディン１の細胞外ドメインに特異的に結合し、及び／又は感受性細胞中へのＨＣＶ侵入を阻害又は遮断し、及び／又は感受性細胞のＨＣＶ感染を低下もしくは予防するモノクローナル抗体の能力を保持したフラグメント又は部分を含む。本明細書に記載される本発明のモノクローナル抗体の生物学的に活性なフラグメント又は部分が、本発明により包含される。
【００５３】
本発明のモノクローナル抗体の生物学的に活性なフラグメント又は部分は、抗体のＦａｂフラグメント又は部分、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又は部分、可変ドメイン、あるいは１つ又は複数のＣＤＲ（相補性決定領域）でありうる。あるいは、本発明のモノクローナル抗体の生物学的に活性なフラグメント又は部分は、抗体タンパク質のカルボキシル部分又は末端に由来し、Ｆｃフラグメント、Ｆｄフラグメント、又はＦｖフラグメントを含んでもよい。
【００５４】
本発明の抗体フラグメントは、当技術分野において公知の任意の適した方法（限定はされないが、酵素切断（例、インタクトな抗体のタンパク質分解消化））により又は合成もしくは組換え技術により産生してもよい。Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、及びＳｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）抗体フラグメントは、例えば、哺乳動物の宿主細胞又は大腸菌において及びそれらから発現及び分泌させることができる。抗体は、種々の切断形態で、１つ又は複数の終止コドンが天然終止部位の上流に導入されている抗体遺伝子を使用して産生することもできる。抗体の種々の部分を従来技術により化学的に一緒に結合させることができ、又は遺伝子操作技術を使用して隣接タンパク質として調製することができる。
【００５５】
Ｃ．融合タンパク質
本発明の抗体（又はそのフラグメント）を、改変形態、例えば融合タンパク質（即ち、ポリペプチド要素に連結された免疫グロブリン分子又は部分）などとして産生してもよい。好ましくは、本発明の融合タンパク質は、ヒトクローディン１の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体の結合能力を保持する。本発明のモノクローナル抗体、又はそのフラグメントに融合されるポリペプチド要素を、結果として得られる融合タンパク質に多くの有利な特性のいずれかを付与するように選択してもよい。例えば、ポリペプチド要素は、組換え融合タンパク質の増加発現を提供するように選択してもよい。あるいは又は加えて、ポリペプチド要素は、例えば、親和性精製におけるリガンドとして作用することにより、融合タンパク質の精製を容易にしうる。タンパク質分解切断部位を組換えタンパク質に加えて、所望の配列が、最終的に、精製後にポリペプチド要素から分離できるようにしてもよい。ポリペプチド要素は、また、安定性が目標である場合、融合タンパク質に改善された安定性を付与するように選択してもよい。適したポリペプチド要素の例は、例えば、結果として得られる融合タンパク質のニッケルキレートカラム上での容易な精製を可能にするポリヒスチジンタグを含む。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＢ結合タンパク質、又はプロテインＡは、適したポリペプチド要素の他の例である。
【００５６】
意図される使用に依存して、本発明の抗体を再操作して、安定性、溶解性、インビボでの半減期、又は追加の標的に結合する能力を最適化してもよい。特性におけるこれらの変化のいずれか又は全てを達成するための遺伝子操作アプローチならびに化学修飾が、当技術分野において周知である。例えば、抗体の定常領域の付加、除去、及び／又は改変が、治療的に投与された抗体のバイオアベイラビリティ、分布、及び半減期において特に重要な役割を果たすことが公知である。抗体のＦｃ又は定常領域（エフェクター機能を媒介する）により決定される抗体のクラス及びサブクラス（存在する場合）が、重要な追加の特性を与える。このように、再構成、再設計、又はそうでなければ変えられた定常ドメインを有する抗クローディン１抗体が、本発明により包含される。
【００５７】
本発明の追加の融合タンパク質を、当技術分野において周知のＤＮＡシャッフリングの技術を通じて生成してもよい（例えば、米国特許第５，６０５，７９３号；第５，８１１，２３８号；第５，８３０，７２１号；第５，８３４，２５２号；及び第５，８３７，４５８号を参照のこと）。ＤＮＡシャッフリングを用いて、抗体又はそのフラグメントの活性を調節し、例えば、より高い親和性及びより低い解離速度を有する抗体を得てもよい。そのような方法において、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを、組換え前に、エラープローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入、又は他の方法によるランダム突然変異誘発により改変してもよい。あるいは、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドの１つ又は複数の部分を、１つ又は複数の異種分子の１つ又は複数の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、フラグメントなどと組換えてもよい。
【００５８】
あるいは、本発明の抗体を、例えば、二特異的又は多特異的抗体を産生するために別の抗体に連結してもよい。例えば、本発明の抗クローディン１モノクローナル抗体、又はその生物学的に活性なフラグメントを、感受性細胞上でＨＣＶの別の受容体（例えばＣＤ８１及びＳＲ−ＢＩなど）に特異的に結合する抗体（又はそのフラグメント）に連結してもよい。二特異的又は多特異的抗体を産生するための方法が、当技術分野において公知であり、例えば、還元性ジスルフィド結合又は非還元性チオエーテル結合を介した架橋を含む化学合成、及び組換え方法を含む。
【００５９】
Ｄ．キメラ／ヒト化又は脱免疫化抗体
本発明の抗クローディン１モノクローナル抗体は、「ヒト化」することもできる：齧歯類抗体とヒト配列の間での配列差を、個々の残基の部位特異的突然変異誘発によるヒト配列中の残基とは異なる残基を置換することにより又は全領域の移植により又は化学合成により最小化することができる。ヒト化抗体は、組換え方法を使用して産生することもできる。抗体のヒト化形態において、ＣＤＲ領域外のアミノ酸の一部、大半、又は全てが、ヒト免疫グロブリン分子からのアミノ酸を用いて置換されるのに対し、１つ又は複数のＣＤＲ領域内の一部、大半、又は全てのアミノ酸が不変である。アミノ酸の小さな付加、欠失、挿入、置換、又は修飾が、それらが、結果として得られる抗体がヒトクロ―ディン１の細胞外ドメインに結合する能力を抑止しない限り、許容可能である。適したヒト「置換」免疫グロブリン分子は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ分子、及びそのフラグメントを含む。あるいは、齧歯類抗体に存在するＴ細胞エピトープを突然変異（脱免疫化）により改変して、ヒトにおける治療目的のために適用することができる非免疫原性齧歯類抗体を生成することができる（www.accurobio.comを参照のこと）。
【００６０】
Ｅ．抗体コンジュゲート
本発明のモノクローナル抗体、又はその生物学的に活性なバリアントもしくはフラグメントを、１つ又は複数の他の分子要素に（例、化学結合、遺伝子融合、非共有結合的会合、又は別の方法により）機能的に連結してもよい。そのような改変抗体（又はコンジュゲート）の調製のための方法は、当技術分野において公知である（例えば、"Affinity Techniques. Enzyme Purification: Part B", Methods in Enzymol., 1974, Vol. 34, W. B. Jakoby and M. Wilneck (Eds.), Academic Press: New York, NY;及びM. Wilchek and E. A. Bayer, Anal. Biochem., 1988, 171: 1-32を参照のこと）。好ましくは、分子要素は、結果として得られるコンジュゲートの結合特性に干渉しない抗体分子上の位置、即ち、ヒトクローディン１の細胞外ドメインへの抗体の特異的結合に関与しない位置で結合される。
【００６１】
特定の実施態様において、抗体分子及び分子要素を、互いに共有結合的に直接連結する。直接的な共有結合は、連結（例えばアミド、エステル、炭素−炭素、ジスルフィド、カルバメート、エーテル、チオエーテル、尿素、アミン、又はカーボネート結合など）を介しうる。共有結合は、抗体及び分子要素上に存在する官能基を利用することにより達成することができる。活性化薬剤（例えばカルボジイミドなど）を使用して、直接結合を形成することができる。他の実施態様において、抗体分子及び分子要素を、リンカー基を介して互いに共有結合的に連結する。これは、当技術分野において周知の多種多様な安定した二官能性薬剤（ホモ官能性及びヘテロ官能性リンカーを含む）のいずれかを使用することにより達成することができる。
【００６２】
特定の実施態様において、本発明の抗体（又はその生物学的に活性なフラグメント）を治療成分にコンジュゲートさせる。多種多様な治療成分のいずれかが本発明の実施における使用のために適しうるが、限定はされないが、細胞毒素（例、細胞増殖抑制剤又は細胞破壊剤）、治療用薬剤、及び放射性金属イオン（例、アルファ放射体及び大環状キレーター（例えばＤＯＴＡなど）に結合したアルファ放射体）を含む。細胞毒素又は細胞毒性薬剤は、細胞に有害な任意の薬剤を含む。例は、限定されないが、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ、及びピューロマイシンならびにそのフラグメント、バリアント、又はホモログを含む。治療用薬剤は、限定はされないが、代謝拮抗剤（例、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、ダカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アルキル化剤（例、メクロレタミン、  チオテパ（ｔｈｉｏｅｐａ）、クロランブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシスジクロロジアンミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）、シスプラチン、アントラサイクリン（例、ダウノルビシン及びドキソルビシン）、抗生物質（例、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン）、及び抗有糸分裂剤（例、ビンクリスチン及びビンブラスチン）を含む。結果として得られる抗体コンジュゲートは、ＨＣＶ感染に関連する肝臓癌の処置において適用を見いだしうる（以下を参照のこと）。
【００６３】
他の治療成分は、所望の生物学的活性を持つタンパク質又はポリペプチドを含む。そのようなタンパク質は、限定はされないが、毒素（例、アブリン、リシンＡ、アルファ毒素、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素、サポリン、モモルジン、ゲロニン、ポークウィード抗ウイルスタンパク質、アルファ−サルシン、及びコレラ毒素）；タンパク質、例えば腫瘍壊死因子、アルファ−インターフェロン、ベータ−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲンアクチベーターなど；アポトーシス薬剤（例、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β）又は、生体応答修飾因子（例、リンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、又は他の増殖因子）を含む。
【００６４】
あるいは又は追加で、本発明の抗体（又はその生物学的に活性なフラグメント）を検出可能な薬剤にコンジュゲートしてもよい。多種多様な検出可能薬剤のいずれかが本発明の実施における使用のために適しうるが、限定はされないが、種々のリガンド、放射性核種（例、３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉなど）、蛍光色素（例、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｅｒｉｎ）、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、及びフルオレスカミン）、化学発光薬剤（例、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、及びエクオリン）、微粒子（例えば、量子ドット、ナノ結晶、蛍光体など）、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて使用される酵素、即ち、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼなど）、比色標識、磁気標識、及びビオチン、ジゴキシゲニン（ｄｉｏｘｉｇｅｎｉｎ）又は他のハプテン、及び抗血清又はモノクローナル抗体を利用可能であるタンパク質を含む。結果として得られる検出可能な抗体を、診断及び／又は予後予測方法において使用してもよい（以下を参照のこと）。
【００６５】
本発明の抗体（又はその生物学的に活性なフラグメント）にコンジュゲートさせることができる他の分子要素は、限定はされないが、直鎖又は分岐親水性ポリマー基、脂肪酸基、又は脂肪酸エステル基を含む。
【００６６】
このように、本明細書に記載するハイブリドーマ細胞株により分泌される抗クローディン１モノクローナル抗体、及びその任意の生物学的に活性なバリアント又はフラグメントに加えて、本発明は、また、本発明の抗クローディン１モノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖のいずれかの可変領域からの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むキメラ抗体、ヒト化抗体、及び抗体由来分子（分子、例えばＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆａｂｃフラグメント、Ｓｃ抗体（単鎖抗体）、ダイアボディ、個々の抗体軽単鎖、個々の抗体重鎖、抗体鎖と他の分子の間のキメラ融合体、及び抗体コンジュゲート、例えば診断用又は治療用薬剤にコンジュゲートされた抗体などを含む）を包含する。本発明により包含される全てのこれらの抗体及び抗体関連分子は、ヒトクローディン１の細胞外ドメインに特異的に結合する。
【００６７】
Ｆ．本発明のモノクローナル抗体及び関連分子の活性及び特異性
実施例２に記載する本発明の抗クローディン１モノクローナル抗体の各々が、本明細書に提供するハイブリドーマ細胞株から産生され、Ｈｕｈ７．５．１細胞のＨＣＶｃｃ感染を阻害する能力について選択された。当業者により理解される通り、本発明の他の抗体及び抗体関連分子のＨＣＶ感染阻害効果もＨＣＶｃｃ感染システムを使用して評価されうる。ＨＣＶ感染に対する抗体及び抗体関連分子の阻害効果が、あるいは又は加えて、当技術分野において公知のレトロウイルスＨＣＶ偽型粒子（ＨＣＶｐｐ）を使用して評価されうる。好ましくは、本発明の抗体又は抗体関連分子は、用量依存的な様式でＨＣＶｃｃ又はＨＣＶｐｐによる感受性細胞のＨＣＶ感染を阻害することが示されるであろう。
【００６８】
本発明の抗体及び試薬の特異性をテストするために使用することができる他の方法は、限定はされないが、フローサイトメトリー分析、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡ、及び抗体によるリガンド／受容体結合に関する結合阻害アッセイを含む。これらの方法を、抗体を産生するハイブリドーマからの上清をテストするために、単離／精製抗体の活性をテストするために、及び／又は改変抗体（抗体関連分子）の活性をテストするために使用することができる。結合特異性テストを、細胞のパネル、例えば、ヒト細胞、限定はされないが、肝臓細胞株（例えば、Ｈｕｈ７、Ｈｅｐ３ｂ、又はＨｅｐＧ２など）、胚性腎細胞（２９３Ｔ）、線維芽細胞（ＨｅＬａ細胞）、Ｂ細胞、Ｔ細胞（例、Ｍｏｌｔ−４、Ｓｕｐ−ＴＩ、又はＨｕｔ−７８）、単球細胞（ＴＨＰ−Ｉ）、星状細胞（Ｕ８７）、肝細胞癌細胞（ＰＬＣ／ＰＲＦ：５）、又は他の肝細胞型（例、肝臓腺癌ＳｋＨｅｐＩ、ヒト末梢血細胞、及びその種々の分画サブタイプ（リンパ球及び単球又は他の細胞株（ＣａＣｏ２細胞を含む））に対する抗体又は抗体関連分子を使用して実施してもよい。フローサイトメトリー分析によって、種々の細胞型でのクローディン１についての抗体又は抗体関連分子の結合特異性を明らかにすることができる。非ヒト哺乳動物からの細胞も、そのようなアッセイに使用してもよい。
【００６９】
そのようなアッセイを使用して、ＩＣ５０値を、本発明の抗体及び抗体関連分子について決定してもよい。これらの値は、ウイルス感染能の５０%阻害のために要求される抗体又は抗体関連分子の濃度を示し、有意で重要な定量基準を提供し、異なる抗体及び抗体関連分子の感染阻害活性の比較を可能にする。
【００７０】
実施例２に記載する本発明の抗クローディン１モノクローナル抗体は、全ての主な遺伝子型ならびに２人の慢性ＨＣＶ感染患者からの全疑似種集団の全ての分離株からのＨＣＶ感染を強力に交差中和することが見出されている。主なＨＣＶ遺伝子型からの及び個々の患者の疑似種の分離株からのＨＣＶ感染を交差中和する本発明の他の抗体及び抗体関連分子の能力を、任意の適した方法を使用して、例えば、特定のＨＣＶ遺伝子型からのＨＣＶエンベロープ糖タンパク質を持つＨＣＶ偽型粒子（ＨＣＶｐｐ）、又はＨＣＶに慢性感染した個々の患者からのＨＣＶエンベロープ糖タンパク質を持つＨＣＶｐｐを使用することにより評価してもよい（実施例２に記載する）。好ましくは、本発明の抗体又は抗体関連分子が、主なＨＣＶ遺伝子型からの及びＨＣＶ感染患者の疑似種からのＨＣＶ感染を用量依存的な様式で阻害することが示されるであろう。
【００７１】
同様に、本発明の抗体又は抗体関連分子が、齧歯類のクローディン１（例えばマウスクローディン１など）と交差反応しないが、しかし、非ヒト霊長類のクローディン１（例えばカニクイザルクローディン１など）に特異的に結合することが示されている。
【００７２】
ＩＩ  −  ＨＣＶ感染及びＨＣＶ関連疾患の処置又は予防
Ａ．効能
本発明の抗クローディン１抗体を治療的及び予防的方法において使用して、ＨＣＶ感染を処置及び／又は予防し、あるいは肝臓疾患又はＨＣＶ感受性細胞（例えば肝臓細胞、リンパ球様細胞、又は単球／マクロファージなど）に影響を与える病理学的状態を処置及び／又は予防してもよい。本発明の抗クローディン１抗体は、細胞表面上でクローディン１の細胞外ドメインに結合することによりＨＣＶ−宿主細胞の相互作用に干渉し、それにより細胞中へのＨＣＶ侵入及び／又は細胞のＨＣＶ感染を低下、阻害、遮断、又は予防する。
【００７３】
本発明の処置の方法は、本発明の抗体又は本発明の抗体を含む医薬的組成物を使用して達成されうる（以下を参照のこと）。これらの方法は、一般的に、有効量の少なくとも１つの本発明の抗クローディン１抗体又はその医薬的組成物の、それを必要とする被験者への投与を含む。投与は、当業者に公知の方法のいずれかを使用して実施されうる。特に、抗体又は組成物は、種々の経路（限定はされないが、エアゾル、非経口、経口、又は局所経路を含む）により投与されうる。
【００７４】
一般的に、本発明の抗体又は組成物を、有効量、即ち、その意図する目的を満たすために十分な量で投与する。投与される抗体又は医薬的組成物の正確な量は、被験者間で、処置される被験者の年齢、性別、体重、及び全体的な健康状態、所望の生物学的又は医学的応答（例、ＨＣＶ感染の予防又はＨＣＶ関連肝臓疾患の処置）などに依存して変更しても良い。多くの実施態様において、有効量は、ＨＣＶが被験者の感受性細胞に侵入すること及び／又は被験者の細胞に感染することを阻害又は予防し、それによりＨＣＶ感染を予防し、肝臓疾患又は別のＨＣＶ関連病理を被験者において処置又は予防する量である。
【００７５】
本発明の抗体及び組成物を、種々の治療的又は予防的方法において使用してもよい。特に、本発明は、肝臓疾患又は病理を被験者において処置又は予防するための方法を提供し、それは被験者に有効量の本発明の抗体（又はその組成物）を投与することを含み、それはＨＣＶが被験者の細胞に侵入又は感染することを阻害し、それにより肝臓疾患又は病理を被験者において処置又は予防する。肝臓疾患又は病理は、ＨＣＶ感染に関連する肝臓の炎症、肝線維症、肝硬変、及び／又は肝細胞癌（即ち、肝臓癌）でありうる。
【００７６】
本発明は、また、ＨＣＶ関連疾患又は状態（肝臓疾患を含む）を被験者において処置又は予防するための方法を提供し、それは被験者に有効量の本発明の抗体（又はその組成物）を投与することを含み、それはＨＣＶが被験者の細胞に侵入又は感染することを阻害し、それによりＨＣＶ関連疾患又は状態を被験者において処置又は予防する。本発明の特定の実施態様において、抗体又は組成物を急性Ｃ型肝炎と診断された被験者に投与する。本発明の他の実施態様において、抗体又は組成物を慢性Ｃ型肝炎と診断された被験者に投与する。
【００７７】
そのような方法に従った本発明の抗体又は組成物の投与は、個体に認められる症状（限定はされないが、急性Ｃ型肝炎の症状、例えば食欲減少、疲労、腹痛、黄疸、そう痒、及びインフルエンザ様症状など；慢性Ｃ型肝炎の症状、例えば疲労、顕著な体重減少、インフルエンザ様症状、筋肉痛、関節痛、間欠性微熱、そう痒、睡眠障害、腹痛、食欲変化、嘔気、下痢、消化不良、認知変化、抑うつ、頭痛、及び気分変動など；肝硬変の症状、例えば腹水症、挫傷及び出血傾向、骨痛、静脈瘤（特に胃及び食道における）、脂肪下痢、黄疸及び肝性脳症など；ならびにＨＣＶに関連する肝外発現の症状、例えば甲状腺炎、晩発性皮膚ポルフィリン症、クリオグロブリン血症、糸球体腎炎、乾燥症候群、血小板減少症、扁平苔癬、糖尿病、及びＢ細胞リンパ増殖疾患などを含む）の少なくとも１つの寛解をもたらしうる。
【００７８】
あるいは又は加えて、そのような方法に従った本発明の抗体又は組成物の投与は、ＨＣＶ感染又はＨＣＶ関連疾患の進行を減速、低下、停止、又は軽減する、あるいは感染又は疾患が見られなくなるまで進行を戻すことができる。そのような方法に従った本発明の抗体又は組成物の投与は、また、ウイルス感染数の低下、感染力ウイルス粒子数の低下、及び／又はウイルス感染細胞数の低下をもたらしうる。
【００７９】
本発明に従った処置の効果を、ＨＣＶ感染及び／又は肝臓疾患の診断のための当技術分野において公知のアッセイのいずれかを使用してモニターしてもよい。そのようなアッセイは、限定はされないが、血清学的血液テスト、アルブミン、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、及びガンマグルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）の１つ又は複数を測定するための肝機能テスト、ならびに異なる技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、転写介在増幅（ＴＭＡ）、又は分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）などを使用した分子核酸テストを含む。
【００８０】
本発明の抗体及び組成物は、また、免疫治療において使用してもよい。したがって、本発明は、ＨＣＶとの接触による感受性細胞がＨＣＶに感染する可能性を低下させる方法を提供する。この方法は、感受性細胞を、ＨＣＶが感受性細胞に侵入又は感染することを阻害する有効量の本発明の抗体又は組成物と接触させることを含み、ＨＣＶとの接触による細胞がＨＣＶに感染する可能性を低下させる。本発明は、また、ＨＣＶとの接触による被験者の感受性細胞がＨＣＶに感染する可能性を低下させる方法を提供する。この方法において、感受性細胞を本発明の抗体又は組成物と接触させることは、抗体又は組成物を被験者に投与することにより実施してもよい。
【００８１】
感受性細胞又は被験者がＨＣＶに感染する可能性を低下させることは、ＨＣＶとの接触による感受性細胞又は被験者がＨＣＶに感染する確率を減少させることを意味する。この減少は、任意の有意な量、例えば、少なくとも２倍の減少、２倍を超える減少、少なくとも１０倍の減少、１０倍を超える減少、少なくとも１００倍の減少、又は１００倍を超える減少でありうる。
【００８２】
特定の実施態様において、被験者は、本発明の抗体又は組成物の投与前にＨＣＶに感染している。他の実施態様において、被験者は、本発明の抗体又は組成物の投与前にＨＣＶに感染していない。さらに他の実施態様において、被験者はＨＣＶに感染していないが、しかし、暴露されている。特定の実施態様において、被験者はＨＩＶ又はＨＢＶに感染しうる。
【００８３】
例えば、本発明の方法を使用して、肝臓移植による被験者の感受性細胞がＨＣＶに感染する可能性を低下させることができる。既に上で述べた通り、罹患肝臓がＨＣＶ感染患者から摘出された場合、血清ウイルスレベルが急落する。しかし、健康な肝臓移植片を受けた後、ウイルスレベルがリバウンドし、数日以内に移植前レベルを超える可能性がある（Powers, 2006）。肝細胞の表面上でクローディン１の外部ドメインに結合する本発明の抗体の投与は、肝臓移植患者に有効であり、それにより細胞中へのＨＣＶ侵入を低下、阻害、遮断、又は予防しうる。投与は、肝臓移植前、肝臓移植の間、及び／又は肝臓移植後に実施してもよい。
【００８４】
本発明の抗体又は組成物の投与が有効な他の被険者は、限定はされないが、ＨＣＶ感染した母親から生まれた乳児（特に、母親もＨＩＶ陽性である場合）；ＨＣＶ汚染血液又は血液汚染した医療機器に接触してきた医療従業者；薬物を注射又はそうでなければ投与するための器具を共有することによりＨＣＶに暴露されてきた薬物使用者；ならびに不適切な感染予防により刺青、耳／ボディーピアス、及び針治療を通じてＨＣＶに暴露されてきた人々を含む。
【００８５】
本発明の抗体又は組成物の投与が有効な他の被険者は、限定はされないが、ＨＣＶ疾患進行の速度を増加させることが知られている１つ又は複数の因子を示す被険者を含む。そのような因子は、特に、年齢、性別（男性は、一般的に、女性よりも速い疾患進行を示す）、アルコール消費、ＨＩＶ同時感染（疾患進行速度を顕著に増加させる）、及び脂肪肝を含む。
【００８６】
特定の実施態様において、本発明の抗体又は組成物は、本発明の処置の方法に従って単独で投与される。他の実施態様において、本発明の抗体又は組成物は、少なくとも１つの追加の治療用薬剤と組み合わせて投与される。本発明の抗体又は組成物は、治療用薬剤の投与前、治療用薬剤と同時に、及び／又は治療用薬剤の投与後に投与されうる。
【００８７】
本発明の抗体又は組成物との組み合わせで投与されうる治療用薬剤は、ＨＣＶ感染、又はＨＣＶ関連疾患もしくは状態の処置又は予防において有益な効果を有することが知られている多種多様な生物学的に活性な化合物の中から選択されうる。そのような薬剤は、特に、抗ウイルス薬剤を含み、限定はされないが、インターフェロン（例、インターフェロンアルファ、ペグ化インターフェロンアルファ）、リバビリン、抗ＨＣＶ（モノクローナル又はポリクローナル）抗体、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、ＩＲＥＳ阻害剤、ヘリカーゼ阻害剤、アンチセンス化合物、リボザイム、及びその任意の組み合わせを含む。
【００８８】
Ｂ．投与
本発明の抗体を、（場合により、１つ又は複数の適切な薬学的に許容可能な担体又は賦形剤との製剤化後）、所望の投与量で、それを必要とする被験者に任意の適した経路により投与することができる。種々の送達システムが知られており、本発明の抗体を投与するために使用することができる（錠剤、カプセル、注射溶液、リポソーム中のカプセル化、微粒子、マイクロカプセルなどを含む）。投与の方法は、限定はされないが、経皮、皮内、筋肉内、腹腔内、病巣内、静脈内、皮下、鼻腔内、肺、硬膜外、眼内、及び経口経路を含む。本発明の抗体又は組成物は、任意の簡便な又は他の適切な経路により、例えば、注入又はボーラス注射により、上皮内膜又は皮膚粘膜内膜（例、経口、粘膜、直腸、及び腸粘膜など）を通じた吸収により投与してもよい。投与は全身的又は局所的でありうる。非経口投与は、優先的に患者の肝臓に対して行われ、例えば肝動脈への又は胆管中へのカテーテル法などによりうる。当業者により理解される通り、本発明の抗体が追加の治療用薬剤との組み合わせで投与される実施態様において、抗体及び治療用薬剤は同じ経路（例、静脈内）により又は異なる経路（例、静脈内及び経口）により投与されうる。
【００８９】
Ｃ．投与量
本発明の本発明の抗体（又は組成物）の投与は、送達される量が意図される目的のために効果的であるような投与量でありうる。投与経路、製剤化、及び投与量は、所望の治療効果、処置されるＨＣＶ関連状態の重症度（既に存在する場合）、任意の感染の存在、患者の年齢、性別、体重、及び全体的な健康状態ならびに使用される抗体又は組成物の効力、バイオアベイラビリティ、及びインビボでの半減期、併用治療の使用（又は未使用）、及び他の臨床因子に依存しうる。これらの因子は、治療の経過において主治医により容易に決定可能である。あるいは又は加えて、投与量は、動物モデル（例、チンパンジー又はマウス）を使用した試験から決定することができる。これらの又は他の方法に基づいて用量を調整して、最大効力を達成することは、当技術分野において周知であり、熟練の医師の能力の範囲内である。試験が本発明のモノクローナル抗体を使用して行なわれるにつれて、さらなる情報が、処置の適切な投与量レベル及び期間に関して得られるであろう。
【００９０】
本発明の処置は、単回用量又は複数回用量からなりうる。このように、本発明の抗体、又はその組成物の投与は、特定の期間にわたり一定である、又は定期的である、及び特定の間隔、例えば、１時間、１日、週（又は他の複数日間隔で）、月、年（例、時間放出形態で）毎でありうる。あるいは、送達は、所与の期間の間に複数回（例、１週間に２回又はそれ以上；１ヶ月に２回又はそれ以上など）行うことができる。送達は、期間にわたる持続的送達（例、静脈内送達）でありうる。
【００９１】
一般的に、投与されるモノクローナル抗体の量は、好ましくは、被験者の体重あたり約１ng/kg〜約１００mg/kg、例えば、約１００ng/kg〜約５０mg/kg；又は約１μg/kg〜約１０mg/kg；又は約１００μg/kg〜約１mg/kgの範囲でありうる。
【００９２】
ＩＩＩ  −  医薬的組成物
上で述べた通り、本発明の抗クローディン１抗体（及び関連分子）は、それ自体で又は医薬的組成物として投与されうる。したがって、本発明は、本明細書に記載する有効量の本発明の抗体及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含む医薬的組成物を提供する。特定の実施態様において、組成物は、１つ又は複数の追加の生物学的に活性な薬剤をさらに含む。
【００９３】
本発明の抗体及び医薬的の組成物は、所望の予防的及び／又は治療的効果を達成するために効果的な任意の量で、及び任意の投与経路を使用して投与されうる。最適な医薬的製剤は、投与の経路及び所望の投与量に依存して変更できる。そのような製剤は、投与される活性成分の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、及びインビボでの浄化速度に影響を与えうる。
【００９４】
本発明の医薬的組成物は、投与の容易さ及び投与量の均一性のために投与単位形態で製剤化してもよい。「単位投与形態」という表現は、本明細書で使用される通り、処置される患者のための本発明の抗クローディン１抗体の物理的に分離した単位を指す。しかし、組成物の全１日投与量が、適切な医学的判断の範囲内で主治医により決定されうることが理解されるであろう。
【００９５】
Ａ．製剤化
注射用調製物、例えば、無菌注射用水又は油性懸濁剤を、公知の技術分野に従い、適した分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を使用して製剤化してもよい。無菌注射用調製物は、また、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤又は溶剤の、例えば、２，３−ブタンジオール溶液としての無菌注射用溶液、懸濁液、又はエマルジョンでありうる。使用できる許容可能な賦形剤及び溶剤の内、水リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、及び等張塩化ナトリウム溶液がある。また、無菌の固定油が、溶剤又は懸濁媒質として慣習的に用いられる。この目的のために、任意の無菌固定油を用いることができる（合成モノ又はジグリセリドを含む）。脂肪酸、例えばオレイン酸なども注射用製剤の調製において使用してもよい。無菌液体担体は、非経口投与のための無菌液体形態の組成物において有用である。
【００９６】
注射用製剤を、例えば、細菌保持フィルターでのろ過により、又は使用前に滅菌水もしくは他の無菌注射用媒質に溶解もしくは分散することができる無菌固形組成物の形態で滅菌薬剤を取り込ませることにより滅菌することができる。無菌の溶液又は懸濁液である液体の医薬的組成物は、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下注射により投与することができる。注入は、一回又は段階的注入によりうる。必要又は所望である場合、組成物は、注入の部位で疼痛を和らげるための局部麻酔薬を含んでもよい。
【００９７】
活性成分（本明細書において本発明の抗クローディン１抗体）の効果を持続させるために、皮下又は筋肉内注射からの成分の吸収を減速させることがしばしば望ましい。非経口投与された活性成分の吸収を遅延させることは、成分を油ビヒクル中に溶解又は懸濁させることにより達成されうる。注射用デポー形態が、生分解性ポリマー（例えばポリラクチド−ポリグリコリドなど）中で活性成分のミクロカプセル化マトリックスを形成することにより作られる。活性成分とポリマーの比率及び用いられる特定のポリマーの性質に依存して、成分放出の速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例は、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）を含む。デポー注射用製剤は、また、身体組織と適合性があるリポソーム又はマイクロエマルジョン中に活性成分を捕捉することにより調製することができる。
【００９８】
経口投与のための液体投与形態は、限定はされないが、薬学的に許容可能なエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶剤、懸濁剤、シロップ、エリキシル、及び加圧組成物を含む。抗クローディン１抗体に加えて、液体投与形態は、当技術分野において一般に使用される不活性な希釈剤、例えば、水又は他の溶剤、可溶化剤及び乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、及びソルビタン脂肪酸エステル、ならびにその混合物を含みうる。不活性な希釈剤の他、経口組成物は、また、アジュバント、例えば湿潤剤、懸濁剤、保存剤、甘味剤、香味剤、及び香料剤、増粘剤、着色剤、粘性調整剤、安定剤、又は浸透圧調整剤などを含みうる。経口投与のための適した液体担体の例は、水（潜在的に上記の添加剤、例、セルロース誘導体、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース溶液などを含む）、アルコール（一価アルコール及び多価アルコール、例えばグリコールなどを含む）及びそれらの誘導体、ならびに油（例、分画されたヤシ油及びラッカセイ油）を含む。加圧組成物については、液体担体はハロゲン化炭化水素又は他の薬学的に許容可能な噴霧剤でありうる。
【００９９】
経口投与のための固形投与形態は、例えば、カプセル、錠剤、丸剤、粉末剤、及び果粒剤を含む。そのような固形投与形態において、本発明の抗クローディン１抗体を、少なくとも１つの不活性な、生理学的に許容可能な賦形剤又は担体、例えばクエン酸ナトリウム又はリン酸カルシウム及び以下の１つ又は複数と混合してもよい：（ａ）充填剤又は増量剤、例えばデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール（ｍａｎｎｉｔａｌ）、及びケイ酸など；（ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、及びアカシアなど；（ｃ）保湿剤、例えばグリセロールなど；（ｄ）崩壊剤、例えば寒天−寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプン又はタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウムなど；（ｅ）溶液遅延剤、例えばパラフィンなど；吸収促進剤、例えば四級アンモニウム化合物など；（ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコール及びグリセロールモノステアレートなど；（ｈ）吸収剤、例えばカオリン及びベントナイト粘土など；ならびに（ｉ）潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びその混合物など。固形製剤のために適した他の賦形剤は、表面修飾剤、例えば非イオン性及び陰イオン性表面修飾剤を含む。表面修飾剤の代表的な例は、限定はされないが、ポロキサマー１８８、塩化ベンザルコニウム、ステアリン酸カルシウム、セトステアリルアルコール、セトマクロゴール乳化ワックス、ソルビタンエステル、コロイド状二酸化ケイ素、リン酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、ケイ酸アルミウニムマグネシウム、及びトリエタノールアミンを含む。カプセル、錠剤、及び丸剤の場合において、投与形態は、また、緩衝剤を含んでもよい。
【０１００】
類似の型の固形組成物を、ラクトース又は乳糖などならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用した軟質及び硬質ゼラチンカプセルの充填剤として用いてもよい。錠剤、糖衣丸、カプセル、丸剤、及び果粒剤の固形投与形態は、コーティング及びシェル、例えば腸溶コーティング、放出制御コーティング、及び医薬製剤の技術分野において周知の他のコーティングを用いて調製することができる。それらは、場合により、乳白剤を含んでもよく、また、組成物であることもでき、それらが、活性成分だけを、又は好ましくは、腸管の特定の部分において、場合により、遅延様式で放出するようにする。使用することができる包埋組成物の例は、ポリマー物質及びワックスを含む。
【０１０１】
特定の実施態様において、処置を必要とする部位（例、肝臓）に局所的に本発明の組成物を投与することが望まれうる。これは、例えば、限定はされないが、外科手術（例、肝臓移植）中での局所注入により、局所適用、注射により、カテーテルを用いて、坐剤を用いて、あるいは皮膚パッチ又はステント又は他のインプラントを使用して達成されうる。
【０１０２】
局所投与のために、組成物は、好ましくは、担体（例えば水、グリセロール、アルコール、プロピレングリコール、脂肪アルコール、トリグリセリド、脂肪酸エステル、又は鉱油など）を含むことができるゲル、軟膏、ローション、又はクリームとして製剤化される。他の局所担体は、液化石油、パルミチン酸イソプロピル、ポリエチレングリコール、エタノール（９５%）、ポリオキシエチレンモノラウレート水溶液（５%）、又はラウリル硫酸ナトリウム水溶液（５%）を含む。他の材料、例えば抗酸化剤、保湿剤、粘性安定剤、及び類似の薬剤などを必要に応じて加えてもよい。
【０１０３】
また、特定の実例において、本発明の組成物を、皮膚の上、中、又は下に置いた経皮デバイス内に配置してもよい。そのようなデバイスは、受動的又は能動的な放出機構により活性成分を放出するパッチ、インプラント、及び注射を含む。経皮投与は、身体の表面から上皮組織及び粘膜組織などの体内の管内膜までの全ての投与を含む。そのような投与は、ローション、クリーム、フォーム、パッチ、懸濁剤、溶剤、及び坐剤（直腸及び膣）中に本組成物を使用して行ってもよい。
【０１０４】
経皮投与は、活性成分（即ち、本発明の抗クローディン１抗体）及び皮膚に非毒性である担体を含む経皮パッチの使用を通じて達成されうるが、皮膚を介した血流中への全身吸収のために成分の送達を可能にする。担体は、任意の数の形態、例えばクリーム及び軟膏、ペースト、ゲル、閉塞デバイスなどを取りうる。クリーム及び軟膏は、水中油型又は油中水型のいずれかの粘性液体又は半固形エマルジョンでありうる。活性成分を含む石油又は親水性石油中に分散された吸収性粉末剤からなるペーストが適しうる。種々の閉塞デバイスを使用して、血流中に活性成分を放出してもよい（例えば担体を伴う又は伴わない活性成分を含むレザバーを覆う半透膜、又は活性成分を含むマトリクスなど）。
【０１０５】
坐剤製剤は、従来の材料（カカオ脂、坐剤の融解点を変えるためのワックスの添加を伴う又は伴わない、及びグリセリンを含む）から作られうる。水溶性の坐剤の基剤（例えば種々の分子量のポリエチレングリコールなど）も使用してもよい。
【０１０６】
本発明の医薬的組成物が、ＨＣＶ感受性細胞がＨＣＶに感染することを予防するための「ワクチン」として使用される場合、医薬的組成物は、当技術分野において公知のワクチン担体、例えばサイログロブリン、アルブミン、破傷風トキソイド、及びポリアミノ酸（例えばＤ−リジン及びＤ−グルタミン酸のポリマーなど）をさらに含みうる。ワクチンは、また、周知のアジュバント、例えば、不完全フロイントアジュバント、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、モノホスホリル脂質Ａ（MPL、GlaxoSmithKline）、サポニン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、モンタニド、ビタミンＡ、ならびに生分解性油、例えばスクアレン及び／又はトコフェロール、Ｑｕｉｌ  Ａ、Ｒｉｂｉ  Ｄｅｔｏｘ、ＣＲＬ−１００５、Ｌ−１２１、及びその組み合わせなどから調製される種々の油中水型エマルジョンなどのいずれかを含んでもよい。
【０１０７】
種々の製剤を作製するための材料及び方法は、当技術分野において公知であり、対象発明を実施するために適応してもよい。抗体の送達のために適した製剤は、例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences", E. W. Martin, 18th Ed., 1990, Mack Publishing Co.: Easton, PA.に見出すことができる。
【０１０８】
Ｂ．追加の生物学的に活性な薬剤
特定の実施態様において、本発明の抗クローディン１抗体は、本発明の医薬的組成物における唯一の活性成分である。他の実施態様において、医薬的組成物は、１つ又は複数の生物学的に活性な薬剤をさらに含む。適した生物学的に活性な薬剤の例は、限定はされないが、ワクチンアジュバント及び治療用薬剤、例えば抗ウイルス薬剤（上記）、抗炎症剤、免疫調節剤、鎮痛剤、抗微生物剤、抗菌剤、抗生物質、抗酸化剤、防腐剤、及びその組み合わせなどを含む。
【０１０９】
そのような医薬的組成物中では、抗クローディン１抗体及び追加の治療用薬剤を、抗クローディン１抗体及び治療用薬剤の同時、別々、又は連続投与のために１つ又は複数の調製物において組み合わせてもよい。より具体的には、本発明の組成物を、抗体及び治療用薬剤を一緒に又は互いに独立して投与することができるような方法で製剤化してもよい。例えば、抗クローディン１抗体及び治療用薬剤を、単一の組成物中で一緒に製剤化することができる。あるいは、それらを別々に保持（例、異なる組成物及び／又は容器中で）及び投与してもよい。
【０１１０】
Ｃ．キットの薬学的パック
別の態様において、本発明は、本発明の医薬的組成物の１つ又は複数の成分を含む１つ又は複数の容器（例、バイアル、アンプル、テストチューブ、フラスコ、又はボトル）を含む薬学的パック又はキットを提供し、本発明の抗クローディン１抗体の投与を可能にする。
【０１１１】
薬学的パック又はキットの異なる成分は、固形（例、凍結乾燥）又は液体形態で供給されてもよい。各々の成分は、一般的に、そのそれぞれの容器中での一定分量として適する又は濃縮形態で提供される。薬学的パック又はキットは、凍結乾燥成分の再構成のための媒質を含んでもよい。キットの個々の容器は、好ましくは、商業販売のために密封されている。
【０１１２】
特定の実施態様において、薬学的パック又はキットは、１つ又は複数の追加の治療的薬剤（例、上記の１つ又は複数の抗ウイルス薬剤）を含む。場合により、容器に関連する通知又は添付文書が、薬学的又は生物学的製品の製造、使用、又は販売を規制する政府機関により規定される形式でありうるが、その通知は、ヒト投与のための製造、使用、又は販売の機関による認可を反映する。添付文書の通知は、本明細書に開示する処置の方法に従った医薬的組成物の使用のための説明書を含みうる。
【０１１３】
認証標識（例、バーコード、ラジオ周波、ＩＤタグなど）がキット中又は上に存在しうる。認証標識を使用して、例えば、品質管理、在庫管理、ワークステーションの間での追跡移動などの目的のためのキットを独自に特定することができる。
【０１１４】
ＩＶ  −  抗クローディン１モノクローナル抗体の非治療的使用
本発明の抗体、例えば、本明細書で提供されるハイブリドーマ細胞株により産生される抗クローディン１モノクローナル抗体を、種々の非治療適用、例えば精製、スクリーニング、及び診断方法などにおいて用いてもよい。
【０１１５】
Ａ．精製方法
このように、本発明の抗体を親和性精製薬剤として使用してもよい。本願において、本発明の抗体を、当技術分野において周知の方法を使用して、固相（例えばセファデックス樹脂又はろ紙など）上に固定化する。固定化抗体を、精製されるヒトクローディン１（又はそのフラグメント）を含むサンプルと接触させ、その後、支持体を、固定化抗体に結合しているクローディン１タンパク質を除くサンプル中の実質的に全ての材料を除去する適した溶剤を用いて洗浄する。最後に、支持体を、抗体からクローディン１タンパク質を放出させる別の適した溶剤を用いて洗浄する。
【０１１６】
Ｂ．スクリーニング方法
本発明の抗クローディン１抗体を、また、競合結合アッセイに基づく薬物スクリーニング方法において使用してもよい。そのような方法は、本発明の抗体が結合する細胞への結合について、サンプル中の試験化合物（例、試験抗体）と既知の量の本発明の抗クローディン１モノクローナル抗体の間での競合結合を可能にし、及び結合した既知のモノクローナル抗体の量を測定する工程を含みうる。本発明のモノクローナル抗体を、適切に、例えば、酵素標識、化学発光標識、又は蛍光標識を用いて標識する。
【０１１７】
Ｃ．診断方法
本発明の抗クローディン１抗体は、また、例えば、特定の細胞、組織、又は血清におけるクローディン１の発現を検出することにより、診断及び／又は予後アッセイにおいて、特に異なる癌の診断及び／又は予後のために有用でありうる。このように、例えば、クローディン１の減少発現が、病期ＩＩ期癌における大腸癌再発の強い予測因子及び不良な患者生存率を示している（Resnick, 2005）；クローディン１の増加発現は、子宮頸部上皮内新生物の検出のための良好な診断マーカーであり（Sobel, 2005）、及び子宮頸部扁平上皮細胞の悪性形質転換についての有用な診断マーカーであることが報告されている（Lee, 2005）；クローディン１の減少発現は、前立腺癌における高い腫瘍悪性度及び生化学的な疾患再発と相関する（Sheeban, 2007）；クローディン１の減少発現は、乳癌の再発状態及び悪性の可能性と相関することが実証されている（Morohashi, 2007）。
【０１１８】
本発明の診断及び／又は予後アッセイは、一般的に、患者から得られた生物学的サンプルを本発明の抗クロ―ディン１抗体と、抗体−クローディン１複合体が生物学的サンプル中に存在する抗体とクローディン１の間で形成することを可能にする時間及び条件下で接触させること；及び形成された任意の抗体−クローディン１複合体の存在又は非存在を検出すること（及び／又は定量化すること）を含む。決定された存在又は量を、所与の症状（例、癌）の存在の指標として使用してもよい。特定の方法において、測定された量を、健康な被験者から（又は有意な数の健康な被険者から得られた一連の生物学的サンプルから）得られた生物学的サンプルについてと同じ条件下で形成される抗体−クローディン１複合体の量と比較する。
【０１１９】
これらの方法は、任意の型の生物学的サンプルの試験に適用してもよい。適した生物学的サンプルの例は、限定はされないが、全血、尿、血清、血漿、唾液、関節液、精液、リンパ液、脳脊髄液、腹水ならびに子宮頸管、尿管（ｕｒｅｔｒａｌ）、直腸、及び腟のサンプルを含む。生物学的サンプルは、組織の切片（例、乳房生検サンプル）、凍結切片、公知の診断、処置、及び／又は治療履歴を伴う保存サンプルを含みうる。生物学的サンプルは、任意の非侵襲的な手段、例えば、被験者から血液を採取すること、又は細針吸引又は生検を使用することにより回収してもよい。
【０１２０】
診断方法は、限定的なサンプルの処理を伴わない又は伴う生物学的サンプルで実施してもよい。あるいは、それらは生物学的サンプルの処理後に実施されうる。生物学的サンプルの処理は、以下の１つ又は複数を含んでもよい：ろ過、蒸留、遠心、抽出、濃縮、希釈、精製、干渉成分の不活化、試薬の添加など。例えば、診断の方法は、生物学的サンプルから調製したタンパク質抽出物で実施してもよい。タンパク質抽出の方法は、当技術分野において周知である。
【０１２１】
上に記載する診断方法において、抗体−クローディン１複合体の検出は、任意の適した方法により行ってもよい（例えば、E. Harlow and A. Lane, "Antibodies: A Laboratories Manual", 1988, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NYを参照のこと）。例えば、抗体−クローディン１複合体の検出は、イムノアッセイを使用して実施してもよい。広範囲のイムノアッセイ技術を利用可能である（ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、及び免疫蛍光、免疫沈降など。イムノアッセイは当技術分野において周知である。そのようなアッセイを行うための方法ならびに実際の適用及び手順がテキストにまとめられている（例えば、P. Tijssen, In: Practice and theory of enzyme immunoassays, eds. R. H. Burdon and v. P. H. Knippenberg, Elsevier, Amsterdam (1990), pp.221-278ならびにMethods in Enzymology, Eds.S.P.Colowick et al.., Academic Pressの種々の巻、免疫学的検出方法を扱っており、特に７０、７３、７４、８４、９２、及び１２１巻）。イムノアッセイは競合的又は非競合的でありうる。
【０１２２】
特定の実施態様において、本発明の抗体は、固体担体又は支持体の表面に共有結合的に又は不活性に結合されることにより固定化される。固体支持体は、抗体を操作可能に固定させることができる当技術分野において公知の任意の固体支持体である；「操作可能固定させる」は、固定抗体とクローディン１の細胞外ドメインの間での複合体の形成を可能にする様式で固定化されている抗体を指す。適した担体又は支持体材料の例は、限定はされないが、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、デキストラン、セファデックス、セファロース、カルボキシメチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、塩化ビニル、ポリプロピレン、斑糲岩、磁気、イオン交換樹脂、ガラス、ポリアミン−メチル−ビニル−エーテル−マレイン酸コポリマー、アミノ酸コポリマー、エチレン−マレイン酸コポリマー、ナイロン、シルクなどを含む。固体担体又は支持体の表面上での抗体の固定化は、当技術分野における周知の方法を使用し、架橋、共有結合、又は物理吸着を含みうる。固体担体又は支持体は、ビーズ、粒子、マイクロプレートウェル、アレイ、キュベット、チューブ、膜、又はイムノアッセイの条件に適した任意の他の形状の形態でありうる。特定の実施態様において、固体担体又は支持体への抗原の固定化は、当技術分野において周知のウエスタンブロッティング（又はイムノブロット）と呼ばれるプロセスにおいて、ゲル電気泳動、それに続く膜（典型的にはニトロセルロース又はＰＶＤＦ）へのトランスファーを含む。
【０１２３】
Ｄ．診断用キット
本発明は、また、上に記載したスクリーニング又は診断方法を行うために有用である、少なくとも１つの本発明の抗クローディン１モノクローナル抗体を含む材料を含むキットを提供する。好ましくは、キットは、所定量の試薬の組み合わせと、方法の１つを実施するための使用説明書を含む。抗体が酵素を用いて標識される実施態様において、キットは、酵素に必要な基質及び補助因子を含む（例、検出可能な発色団又はフルオロフォアを提供する基質前駆体）。また、他の添加剤が含まれうる。例えば安定剤、緩衝剤（例、遮断緩衝剤又は溶解緩衝剤）などである。種々の試薬の相対量は広く変動して、アッセイの感受性を実質的に最適化する試薬の溶液濃度を提供しうる。特に、試薬は、乾燥粉末として、通常、凍結乾燥されて（溶解時に適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含む）提供してもよい。抗体は、基質表面（例、ビーズ、アレイなど）上で固定化される場合とされない場合がある。キットは、また、医薬品又は生物学的産物の製造、使用、又は販売を規制する政府機関により規定された形態での通知を含みうる。
【０１２４】
実施例
以下の実施例は、本発明を作成し、実行する好ましい様式の一部を記載する。しかし、実施例が例示目的だけのためであり、本発明の範囲を限定することを意味しないことを理解すべきである。さらに、実施例における記載が過去時制で提示されない場合、テキストは、明細書の残りの部分のように、実験が実際に実施されたこと又はデータが実際に得られたことを示唆することを意図しない。
【０１２５】
ポリクローナル抗血清について以下で報告された結果の一部が、15th International Symposium on Hepatitis C Virus and Related Viruses（San Antonio, Texas, USA, 5-9 October, 2008）で提示され、S. Krieger et al.による"Production of anti-claudin1 antibodies potently inhibiting HCV infection reveals that Claudin-1 is required for an entry step closely linked to SR-BI and CD81"と表題の付けられた要約においてまとめられている。他の結果が、S. Krieger et al., "Inhibition of hepatitis C virus infection by anti-Claudin antibodies is mediated by inhibition of E2-CD81-CLDN1 association"に提示されており、それは２００９年８月に公開のために提出されており、ならびに、S. Krieger et al., "Monoclonal anti-claudin-1 antibodies for prevention and treatment of hepatitis C virus infection"が２００９年１０月に公開のために提出される。
【０１２６】
実施例１：ヒトクローディン１に対するポリクローナル抗体
材料及び方法
細胞。    本試験において使用されたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＢＯＳＣ２３細胞、Ｈｕｈ７．５．１肝細胞癌細胞が記載されている（Barth, 2005; Barth, 2003; Bartosch, 2003; Blight, 2002）。ＢＯＳＣ２３細胞は、内因性ＣＬＤＮ１を発現しないＨＥＫ２９３由来のエコトロピックパッケージング細胞である（Pear, 1993）。初代ヒト肝細胞が、David, 1998（その全体が参照により本明細書に組み入れられる）により記載された通りに単離及び培養された。
【０１２７】
抗ＣＬＤＮ１ポリクローナル抗体の産生。    ヒトクローディン１の細胞外ループに対する抗体を、全長ヒトＣＬＤＮ−１  ｃＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ  ＣＬＤＮ−１）を含むｐｃＣＭＶＳｐｏｒｔ  ６発現ベクターを使用したウィスターラットの遺伝子免疫により産生した。簡単に述べると、動物は、ｐｃＤＮＡ  ＣＬＤＮ−１の５回の投与を２週間間隔で皮内に受けた。免疫前のコントロール血清を、免疫化前に出血させた同じ動物から回収した。産生された抗ＣＬＤＮ−１ポリクローナル血清の特異性を分析するために、ＢＯＳＣ２３細胞又はＣＨＯ細胞を、ｐｃＤＮＡ（コントロールベクター）又はｐｃＤＮＡ  ＣＬＤＮ−１を用いて、製造者のプロトコールに従って、リポソーム媒介性の遺伝子移入（Lipofectamine; Invitrogen, Karlsruhe, Germany）を使用してトランスフェクトした。ＢＯＳＣ２３細胞又はＣＨＯ細胞を、次に、抗ＣＬＤＮ−１ポリクローナル血清又は免疫前コントロール血清とインキュベートし、以前に記載された通りに（Barth, 2005）、フローサイトメトリーにより細胞表面ＣＬＤＮ−１発現について分析した。
【０１２８】
免疫蛍光による抗ＣＬＤＮ１ポリクローナル抗体の特徴付け。    Ｃａｃｏ２細胞及びＨｕｈ７．５．１細胞をガラスカバースリップ上に播種し、ＰＢＳ中の３%パラホルムアルデヒドを用いて２０分間にわたり固定し、ＣＬＤＮ１外部ドメインに対する抗ＣＬＤＮ１抗体（即ち、本発明のポリクローナル抗体、「抗ＣＬＤＮ１  ｐＡｂ」、５０μg/mLのラット抗ＣＬＤＮ１  ＩｇＧ）、細胞内Ｃ末端ドメインに対する抗ＣＬＤＮ１抗体（「抗ＣＬＤＮ１  ｍＡｂ」、クローン１Ｃ５−Ｄ９、Abnova）を使用してＣＬＤＮ１について、及びＤＡＰＩ（４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール）を使用して核について染色した。コントロールラットポリクローナルＩｇＧ（「コントロールｐＡｂ」）及びマウスモノクローナルＩｇＧ（「コントロールｍＡｂ」）をコントロールとして使用した。結合した一次抗体を、抗ラットＣｙ５及び抗マウスAlexa Fluor（登録商標）488二次抗体ならびにZeiss Axio Observer顕微鏡（Carl Zeiss S.A.S, Le Pecq, France）を使用して可視化した。
【０１２９】
組換えＨＣＶの産生及び感染アッセイ。    プラスミドｐＦＫ−Ｊｃ１（Pietschmann, 2006）は、全長ＨＣＶ  ＪＦＨ１  ｃＤＮＡ又はＨ６ＣＦ及びＪＦＨ１セグメントからなるキメラＨＣＶゲノム（Ｊｃ１と名付けられる）をコードする。インビトロでのＨＣＶ  ＲＮＡ合成及びＲＮＡトランスフェクションを、記載される通りに行った（Wakita, 2005）。トランスフェクト細胞からの培養上清を、以前に記載された通りに、Amicon Ultra 15（Millipore, Billerica, MA, USA）を使用して精製及び濃縮し、直接使用した、又は４℃もしくは−８０℃で保存した。ウイルスを、少数の小さな改変を伴うＨｕｈ７．５．１細胞での限界希釈アッセイを使用することにより滴定し、ＴＣＩＤ５０（５０%組織培養感染量）をLindenbach, 2005により記載される方法に基づき算出した。Ｈｕｈ７．５．１細胞を抗ＣＬＤＮ−１又はコントロール血清（濃度５μg/mL〜１００μg/mLで開始する）と混合し、３７℃で１時間プレインキュベートした。ＨＣＶｃｃを加え、３７℃で１６時間インキュベートした。上清を除去し、細胞を３７℃で７２時間にわたり通常の培地中でインキュベートし、ＨＣＶ感染を、記載された通りに、細胞内ＨＣＶ  ＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲにより決定した。抗体媒介性の中和を、特異的感染力により評価した。
【０１３０】
レトロウイルスＨＣＶ疑似粒子の産生及びＨＣＶｐｐ感染の抗体媒介性阻害。    Ｈ７７株又は他の株及びＶＳＶｐｐからのエンベロープタンパク質を持つＨＣＶｐｐを、記載された通りに生成した（Bartosch, 2003）。エンベロープ糖タンパク質を持たないＨＣＶｐｐ（コントロールｐｐ）が、ネガティブコントロールとしての役割を果たした。抗体媒介性中和の試験のために、Ｈｕｈ７．５．１細胞を、感染アッセイの前日に、９６ウェルプレートにおいて密度０．５×１０４個細胞／ウェルで播種した。Ｈｕｈ７．５．１細胞を抗ＣＬＤＮ−１又はコントロール血清（１／２０希釈で開始する）と混合し、３７℃で１時間プレインキュベートした。上清を除去し、細胞を、通常の培地中で、３７℃で７２時間インキュベートした。ＨＣＶ侵入を、記載された通りに、ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現の分析により決定した。抗体媒介性の中和を、抗クロ―ディン１血清又は免疫前血清の存在におけるＨＣＶｐｐの特異的感染力により評価した。
【０１３１】
結果
クローディン１を発現するＢＯＳＣ２３細胞又はＣＨＯ細胞上で発現されたクローディン１の細胞外ループに対するポリクローナル抗体の産生。    ＨＣＶ感染の開始におけるＣＬＤＮ−１の機能的役割を評価するために、ＣＬＤＮ−１の細胞外ループに対するラットポリクローナル抗ＣＬＤＮ−１血清を、最初に、上に記載する通りに、遺伝子免疫により生成した。免疫化の完了に続き、抗体を、非透過性化トランスフェクトＢＯＳＣ２３細胞又はＣＨＯ細胞の細胞表面上に発現されるヒトＣＬＤＮ−１へ結合する能力について選択した。図１に示す通り、ヒトＣＬＤＮ−１を発現するＣＨＯ細胞とラットポリクローナル抗ＣＬＤＮ−１抗体とのインキュベーションによって、血清とＣＬＤＮ−１の細胞外外部ドメインとの特異的の相互作用がもたらされた（図１Ｂ）。対照的に、相互作用は、ｐｃＤＮＡ３．１コントロールベクターを用いてトランスフェクトされ、ラット抗ＣＬＤＮ−１血清とインキュベートされたＣＨＯ細胞において又はヒトｃＤＮＡを発現するヒトＣＬＤＮ−１とインキュベートされ、ラット免疫前血清とインキュベートされたＣＨＯ細胞において見られなかった（図１Ａ）。
【０１３２】
抗ヒトＣＬＤＮ−１がＨＣＶ感染に感受性の細胞上のＣＬＤＮ−１を認識するか否かを試験するため、ヒト肝細胞及びＨｕｈ７．５．１肝細胞癌細胞を血清とインキュベートし、フローサイトメトリーにより分析した。図２に示す通り、ヒトＨｕｈ７．５．１細胞（図２Ａ）及びヒト肝細胞（図２Ｂ）とラットポリクローナル抗ＣＬＤＮ−１抗体とのインキュベーションによって、抗体がＨＣＶ標的細胞（ヒト肝細胞を含む）上で発現されたＣＬＤＮ−１を認識することが実証された。まとめると、これらのデータは、遺伝子免疫により産生された抗ＣＬＤＮ１ポリクローナル抗体が、ヒト肝細胞ならびにヒト肝細胞癌細胞上で発現されたヒトＣＬＤＮ１の外部ドメインに結合することを実証する。
【０１３３】
免疫蛍光による抗ＣＬＤＮ−１ポリクローナル抗体の特徴付け。    免疫蛍光により得られた結果を図３に提示する。それらは、予測された通り、結合した抗ＣＬＤＮ１ポリクローナル抗体が、細胞表面に局在化することを実証する。
【０１３４】
抗ＣＬＤＮ−１ポリクローナル抗体によるＨＣＶ感染の阻害。    ＨＣＶ感染におけるＣＬＤＮ−１の役割を評価するために、Ｈｕｈ７．５．１細胞のＪＦＨ１  ＨＣＶｃｃ感染を、ＣＬＤＮ−１細胞外ループのエピトープに対する抗ＣＬＤＮ−１抗体の存在において試験した。図４Ａは、抗ＣＬＤＮ−１ラット血清が濃度１００μg/mLで８０%を上回りＪＣ１  ＨＣＶｃｃ感染を阻害したことを示す。対照的に、コントロール免疫前血清はＨＣＶｃｃ感染に対する効果を示さなかった（図４Ａ）。まとめると、これらのデータは、ＣＬＤＮ１外部ドメインに対する抗体がＨＣＶ感染を効率的に阻害することを実証する。
【０１３５】
ＪＦＨ１  ＨＣＶｃｃ感染の阻害が、実際に、抗ＣＬＤＮ−１抗体により媒介されたことを確認するために、ＩｇＧをラット抗ＣＬＤＮ−１血清から及びコントロール血清から精製した。図４Ｂに示す通り、抗クローディン１精製ＩｇＧが、抗ＣＬＤＮ−１血清と類似の様式で、Ｈｕｈ７．５．１細胞のＨＣＶｃｃ感染を顕著に阻害した。対照的に、免疫前血清から精製されたコントロールＩｇＧ（１００μg/mL）は、ＨＣＶｃｃ感染を阻害しなかった（図４Ｂ）。これらデータは、抗ＣＬＤＮ−１血清の阻害効果が、抗ＣＬＤＮ１抗体により媒介されるが、血清中に存在する他の物質（例えばＣＬＤＮ−１機能に潜在的に干渉するＣＬＤＮ−１リガンドなど）により媒介されないことを明らかに実証する。
【０１３６】
さらに、ＨＣＶ感染に対する精製抗クローディン１抗体の阻害効果が、レトロウイルスＨＣＶ偽型粒子（ＨＣＶｐｐ）を使用して確認された。抗クローディン１抗体（しかし、コントロール抗体ではない）は、用量依存的な様式でＨＣＶｐｐによるＨｕｈ７細胞の感染を阻害した（データ示さず）。
【０１３７】
結論として、これらの結果は、抗クローディン１ポリクローナル抗体が、ＨＣＶ感染を効率的に阻害することを実証する。
【０１３８】
上に記載する通りに得られた抗ＣＤ８１モノクローナル抗体、ラット抗ＳＲ−ＢＩ血清、及びラット抗ＣＬＤＮ１血清を使用して、出願者らは、ＣＬＤＮ１及びＣＤ８１、又はＣＬＤＮ１及びＳＲ−ＢＩ、又はＣＬＤＮ１、ＣＤ８１及びＳＲ−ＢＩの遮断が、各侵入因子の単独の遮断よりも強力にＨＣＶｃｃ感染を阻害したことを示している（図５（Ａ）〜（Ｄ）を参照のこと）。まとめると、これらのデータは、ＣＬＤＮ１がＣＤ８１及びＳＲ−ＢＩと協同でＨＣＶ侵入を媒介することを示唆する。抗ＣＤ８１モノクローナル抗体、ラット抗ＳＲ−ＢＩ血清、及びラット抗ＣＬＤＮ１血清が、Ｈｕｈ７．５．１細胞のＨＣＶｃｃ感染を類似の動態で阻害することも見いだされ、ＣＬＤＮ１、ＳＲ−ＢＩ、及びＣＤ８１がＨｕｈ７．５．１細胞におけるＨＣＶ侵入プロセスの間にほとんど同時に作用することを示唆する（図６を参照のこと）。
【０１３９】
実施例２：抗クローディン１モノクローナル抗体
材料及び方法
細胞株及び初代肝細胞。    ヒトＨｕｈ７（Steinmann, 2004）、Ｈｕｈ７．５．１（Zhong, 2005）、２９３Ｔ（Pestka, 2007）、ＢＯＳＣ２３（Pear, 1993）、ハムスターＣＨＯ（Barth, 2005）、及びマウスＨｅｐａ１．６細胞（Steinmann, 2004）の培養が以前に記載されている。初代ヒト及びマウス肝細胞が、記載された通りに、単離及び培養された（Codran, 2006; Lan, 2008; Zeisel, 2007）。初代カニクイザル肝細胞をPRIMACYT Cell Culture Technology GmbH, Germanyから購入した。
【０１４０】
初代ヒト肝細胞に対する抗ＣＬＤＮ１  Ｍａｂの結合及び交差競合分析。    Ｈｕｈ７．５．１細胞又は初代ヒトもしくはカニクイザル肝細胞（２×１０５個細胞／ウェル）を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）−３%ウシ胎児血清（ＦＣＳ）中、濃度を増加させた抗ＣＬＤＮ１  ｍＡｂを用いて室温で３０分間インキュベートした。ＭＡｂ結合を、ＰＥコンジュゲート抗ラットＩｇＧ  ｍＡｂ（Southern Biotechnology Associates）とのインキュベーションにより明らかにした。コントロールとして、アイソタイプを一致させたラットＩｇＧ２ｂ（Genovac）を使用した。ＦＡＣＳ捕捉及び分析を、FACScan（Beckton Dickinson）及びCellQuestソフトウェアを用いて実施した。抗ＣＬＤＮ１  ＭＡｂの間の競合を、細胞ベースのＥＬＩＳＡにより測定した。Ｈｕｈ７．５．１ヒト肝細胞癌細胞（２×１０５個細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに播種した。ウェルをブロッキング後、細胞を、０．１μg/mLのビオチン化抗ＣＬＤＮ１  ＭＡｂを用いて、競合物として濃度を増加させた非標識抗ＣＬＤＮ１  ＭＡｂと一緒に６０分間インキュベートした。ＰＢＳ中での細胞の洗浄に続き、ビオチン化抗体の結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＢＤ）を用いて標識されたストレプトアビジンとのインキュベーションにより検出した。結合を、洗浄及びＡｍｐｌｅｘ赤色試薬を用いた展開後、相対的蛍光単位（５９０nm）として測定した。アイソタイプを一致させたコントロールの存在における結合の測定により決定された曲線を、競合抗体の存在において決定された曲線と比較した。ビオチン標識を、製造者の推奨に従ってSulfo-NHS-LC-Biotin（Thermo Scientific）を使用して実施した。
【０１４１】
細胞表面ＣＬＤＮ１の画像試験。    Ｈｕｈ７．５．１生細胞を、ラットアイソタイプコントロール又はラット抗ＣＬＤＮ１  ＯＭ−７Ｄ３−Ｂ３（１０μg/mL）及びＣｙ５コンジュゲート抗ラット二次抗体（１／３００；Jackson Immunoresearch）と、透過化試薬の非存在においてインキュベートした。染色に続き、細胞を固定し、マウントし、Leica LSR2 CLSM（IGBMC Imaging Center, Illkirch, France）を使用して観察した。
【０１４２】
抗ＣＬＤＮ１  ＭＡｂにより標的化されるエピトープのマッピング。    エピトープマッピングを、部位特異的突然変異誘発（Cukierman, 2009）により導入された定義された突然変異を含む野生型ＣＬＤＮ１又はＣＬＤＮ１をコードするｐＱＣＸＩＮ−ｈクローディン１プラスミドを使用して実施した。これらのＣＬＤＮ１−突然変異プラスミドは、Tanya Dragic博士（Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, New York）によりご厚意で提供された。野生型及び突然変異ＣＬＤＮ１は細胞質内Ｎ末端赤血球凝集素（ＨＡ）タグを含み、トランスフェクション効率及びタンパク質発現の定量化を可能にする（Cukierman, 2009）。突然変異ＣＬＤＮ１に対する抗ＣＬＤＮ１  ＭＡｂの結合を試験するために、ＣＬＤＮ１陰性ＢＯＳＣ２３細胞を、ＣＬＤＮ１発現コンストラクトを用いて一過性にトランスフェクトした（０．０５μg  ＤＮＡ；Lipofectamine）。４８時間後、ｐＱＣＸＩＮ−ｈクローディン１プラスミドを用いて一過性にトランスフェクトされたＢＯＳＣ２３細胞へのモノクローナル抗体ＯＭ−７Ｄ３−Ｂ３又はＯＭ−８Ａ９−Ａ３の結合をフローサイトメトリーにより決定した。抗ＨＡ抗体を使用したＨＡタグ発現のフローサイトメトリー定量化が、内部標準の役割を果たした。トランスフェクト細胞を、細胞質内ＨＡタグ発現の分析のためにCytoperm/Cytofix（ＢＤ）を用いて透過性化した、又は抗ＣＬＤＮ１突然変異ＣＬＤＮ１相互作用の分析のために未処理にした。ＦＡＣＳ分析のために、トランスフェクト細胞を、抗ＣＬＤＮ１  ｍＡｂ又は抗ＨＡ（Covance）と３０分間インキュベートし、続いてフィコエリトリンを用いて標識した１０μg/mLの抗ラットＩｇＧ  ｍＡｂ（抗ＣＬＤＮ１用）又は１０μg/mLの抗マウスＩｇＧ  ｍＡｂ（抗ＨＡ用）とインキュベートした。
【０１４３】
ＨＣＶｃｃ産生及び感染。    ＨＣＶｃｃ（Ｊｃ１、Ｌｕｃ−Ｊｃ１、Ｌｕｃ−Ｃｏｎ１株）を以前に記載された通りに生成した（Haberstroh, 2008; Koutsoudakis, 2006; Pietschmann, 2006; Wakita, 2005; and Zeisel, 2007）。感染実験のために、Ｈｕｈ７．５．１細胞を４８ウェル組織培養プレート中に密度２×１０４個細胞／ウェルで播種した。細胞を、抗体の存在又は非存在において３７℃で１時間プレインキュベートし、次に、Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃ又はＬｕｃ−Ｊｃ１  ＨＣＶｃｃを用いて３７℃で４時間にわたり感染させた。４８時間後、ＨＣＶ感染を、細胞ライセートにおいて、細胞内ＨＣＶ  ＲＮＡの定量化により、以前に記載された通りに、ＲＴ−ＰＣＲ又はルシフェラーゼ活性を使用して分析した（Haberstroh, 2008; Koutsoudakis, 2006; Tscherne, 2006;及びZeisel, 2007）。
【０１４４】
ＨＣＶ疑似粒子（ＨＣＶｐｐ）産生及び感染。    ＭＬＶ又はＨＩＶベースのＨＣＶｐｐ（Ｈ７７、ＨＣＶ−Ｊ、ＪＦＨ−１、ＵＫＮ３Ａ．１．２８、ＵＫＮ４Ａ．２１．１６、ＵＫＮ５．１４．４、ＵＫＮ６．５．３４０、ＶＩ、ＶＪ、ＶＤ、ＶＨ、ＶＫ、及びＶＡ−ＶＹ）及びＶＳＶｐｐを記載された通りに産生した（Lavilette, 2005; Bartosch, 2003; Pietschmann, 2006; Zeisel, 2007; Fafi-Kremer, 2009）。感染実験のために、ＨＥＫ２９３Ｔ、２９３Ｔ／ＣＬＤＮ１＋、及びＨｕｈ７．５細胞を、以前に記載された通りに、動態実験の前日に２４ウェルプレート中にプレーティングした（Haberstroh, 2008）。７２時間後、細胞を溶解させ、ＨＣＶｐｐ侵入を、以前に記載された通りに、ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現の定量化により分析した（Koutsoudakis, 2006）。
【０１４５】
毒性アッセイ。    細胞に対する細胞毒性効果を、３−（４，５−ジメチルチアゾール（ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｙｌ）−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を代謝する能力を分析することにより３連で評価した（Mosmann, 1983）。３つの異なるドナーからのＨｕｈ７．５．１細胞及び初代ヒト肝細胞を、ラットモノクローナル抗体、抗ＣＬＤＮ１  ＯＭ−７Ｄ３−Ｂ３（０．０１〜１００μg/mL）、フラボピリドール（１０μM，  Sigma）、又は化合物Ｃ（０．０１〜１００μM，  Sigma）とインキュベートした。ＭＴＴの最終濃度は０．６mg/mLであった。細胞により産生されたホルマザン結晶を可溶化し、記載された通りに測定した（Mosmann, 1983）。
【０１４６】
統計分析。    結果を平均±標準偏差（ＳＤ）として表わした。統計分析を、スチューデントｔ検定を使用して実施し、Ｐ値＜０．０５を統計学的に有意であると見なした。
【０１４７】
結果
細胞表面ＣＬＤＮ１の細胞外ドメインに特異的なモノクローナル抗体の産生。    ５匹のラットを、哺乳動物発現ベクター中の全長ヒトクローディン１ｃＤＮＡ（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿０２１１０１）を用いて、他で要約されている（Lohrmann, 2003、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）Genovac GmbHにより使用される標準的な遺伝子免疫プロトコールを適用して免疫化し、スクリーニングは独国特許ＤＥ  １９８  ５２  ８００（その全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載されるGenovacシステムに基づいた。簡単に述べると、このスクリーニングのために、血清及びハイブリドーマ上清を、抗体が生成する標的を発現するタグ付きｃＤＮＡコンストラクトを用いてトランスフェクトされた哺乳動物細胞に対してテストする。ＤＮＡベクターを、結果として得られるタンパク質が分泌され、一時的に原形質膜に結合するように設計する。これによって、フローサイトメトリー又は細胞ベースのＥＬＩＳＡを使用した細胞ベースのスクリーニングアッセイが可能になる。
【０１４８】
いくつかのＤＮＡ追加免疫に続き、動物を屠殺し、血清及びリンパ球を個々の動物から回収した。各動物からの血清を、哺乳動物細胞中へのクローディン１  ｃＤＮＡの一過性トランスフェクションに続き、ヒトクローディン１タンパク質の認識についてフローサイトメトリーによりテストした（図７）。
【０１４９】
ラット３からのリンパ球を除去し、標準的なＰＥＧ条件を使用してＳＰ２／０／Ａｇ１４マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｕｍｂｅｒ：  ＣＲＬ−１５８１）と融合させ、結果として得られるハイブリドーマを標準的な選択条件下で９６ウェルプレートにプレーティングした（例えば、E. Harlow and D. Lane, in "Antibodies, A Laboratory Manual", Chapter 6, 1988, Cold Spring Harborを参照のこと）。２週間後、ハイブリドーマ上清を、細胞ベースのＥＬＩＳＡにおいて、クローディン１  ｃＤＮＡを用いて一過性にトランスフェクトされた哺乳動物細胞及びネガティブ発現コントロールとして無関係なｃＤＮＡを用いてトランスフェクトされた細胞に対してテストした。この前選択によって、２４ウェルプレート、それに続いて６ウェルプレート上での拡大のために移された陽性ハイブリドーマの同定が可能になり、それらの上清を、細胞ベースのＥＬＩＳＡのために使用されるものと同じ陽性及び陰性ｃＤＮＡコンストラクトを用いて一過性にトランスフェクトされた哺乳動物細胞に対するフローサイトメトリーにより再テストした。
【０１５０】
抗ＣＬＤＮ−１抗体を含むハイブリドーマ上清による組換え感染性ＨＣＶ（ＨＣＶｃｃ  Ｌｕｃ−Ｊｃ１）を用いた感染の阻害の分析を次に実施した。より具体的には、Ｈｕｈ７細胞を、抗体を含む１００μLのハイブリドーマ上清と３７℃で１時間インキュベートした。次に、感染性ＨＣＶｃｃ（ＴＣＩＤ１０５/mL；ルシフェラーゼレポーターエレメントを含むＬｕｃ−Ｊｃ１株に由来する）を３７℃で３時間加えた。上清を次に除去し、新鮮培地（ＤＭＥＭ、１０%ＦＢＳ）と交換した。２又は３日間後、ウイルス感染を、細胞ライセートにおけるルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現により定量化した（Zeisel, 2007）。得られた結果を、ハイブリドーマ上清の存在又は非存在におけるパーセントＨＣＶｃｃ  Ｌｕｃ−Ｊｃ１感染として表わし（ＰＢＳの存在における感染＝１００%）、図８に提示する。この図で見ることができる通り、ＯＭ−３Ｅ５、ＯＭ−６Ｄ９、ＯＭ−７Ｃ１１、ＯＭ−４Ａ４、ＯＭ−６Ｅ１、ＯＭ−７Ｄ３、ＯＭ−７Ｄ４、ＯＭ−７Ｃ８、及びＯＭ−８Ａ９がＨＣＶ感染の顕著な阻害を示したのに対し、ＯＭ−５Ａ１、ＯＭ−６Ｇ１０、及びＯＭ−５Ａ８は効果を示さなかった。
【０１５１】
それらの遮断活性の分析に続き、母クローンＯＭ−３Ｅ５、ＯＭ−６Ｄ９、ＯＭ−７Ｃ１１、ＯＭ−４Ａ４、ＯＭ−６Ｅ１、ＯＭ−７Ｄ３、ＯＭ−７Ｄ４、ＯＭ−７Ｃ８、及びＯＭ−８Ａ９を、半固形培地にそれらをプレーティングし、結果として得られるサブクローンコロニーを選び、それらを９６ウェルプレート中に移すことによりサブクローニングした（ＯＭ７Ｃ１１によって遮断活性は明らかになったが、これが抗体の非効率的な生産体であったため、それはサブクローニングしなかった）。結果として得られるサブクローンを選び、トランスフェクトされた非透過性化ヒトＢＯＳＣ２３ならびにトランスフェクトされたハムスターＣＨＯ細胞の細胞表面上に発現されるヒトＣＬＤＮ１に結合する能力について再テストした。ヒトＢＯＳＣ２３細胞は、内因性ＣＬＤＮ１を発現しないＨＥＫ２９３由来のエコトロピックパッケージング細胞（Pear, 1993）である（データ示さず）。これらの分析での結果を図９に提示する。以下のサブクローンを選択した：ＯＭ−３Ｅ５−Ｂ６、ＯＭ−６Ｄ９−Ａ６、ＯＭ−４Ａ４−Ｄ４、ＯＭ−６Ｅ１−Ｂ５、ＯＭ−７Ｄ３−Ｂ３、ＯＭ−７Ｄ４−Ｃ１、ＯＭ−７Ｃ８−Ａ８、及びＯＭ−８Ａ９−Ａ３。
【０１５２】
ヒトＣＬＤＮ１を発現するＢＯＳＣ２３及びＣＨＯ細胞とラットモノクローナル抗ヒトＣＬＤＮ１抗体とのインキュベーションは、ヒトＣＬＤＮ１との特異的な相互作用をもたらした（図９Ａ及び図９Ｂ）。
【０１５３】
抗ヒトＣＬＤＮ１抗体がＨＣＶ許容Ｈｕｈ７．５．１細胞及び初代ヒト肝細胞の細胞表面上のＣＬＤＮ１の細胞外ループに結合するか否かを試験するために、細胞を抗ＣＬＤＮ１抗体とインキュベートし、透過化試薬の非存在においてフローサイトメトリーにより分析した。モノクローナル抗ＣＬＤＮ１抗体を用いた天然ヒトＨｕｈ７．５．１肝細胞癌細胞及びヒト肝細胞の陽性染色によって、これらの抗体が初代肝細胞及びＨＣＶ許容細胞株の細胞表面上に発現されるＣＬＤＮ１に結合することが実証された（図９Ｃ）。対照的に、染色は、抗ＣＬＤＮ  ｍＡｂとインキュベートされたヒトＣＬＤＮ１欠損ＢＯＳＣ２３細胞（図９Ａ）又はアイソタイプコントロール抗体とインキュベートされたＨｕｈ７．５．１、ＣＨＯ／ＣＬＤＮ＋細胞、もしくは初代ヒト肝細胞（図９Ｂ）について観察されなかった。モノクローナル抗体による天然細胞表面ＣＬＤＮ１の染色が、また、生きた非透過性化Ｈｕｈ７．５．１細胞での免疫蛍光により確認された（図９Ｄ）。まとめると、これらのデータは、遺伝子免疫により産生されたモノクローナル抗ＣＬＤＮ１抗体が、ＨＣＶ許容細胞株及びヒト肝細胞の細胞表面上に発現される天然ＣＬＤＮ１の細胞外ループに特異的に結合することを実証する。
【０１５４】
抗ヒトＣＬＤＮ１抗体がマウスＣＬＤＮ１と交差反応するか否かを研究するために、マウス肝臓由来細胞株で発現されるマウスＣＬＤＮ１へのｍＡｂの結合を試験した。興味深いことに、モノクローナル抗ＣＬＤＮ１抗体は、マウス肝細胞癌細胞株Ｈｅｐａ１．６上に発現されるマウスＣＬＤＮ１と相互作用しなかった。さらに、図９に示す通り、抗ＣＬＤＮ１抗体は、ハムスター細胞株ＣＨＯを染色しなかった。これらの知見は、抗ヒトＣＬＤＮ１抗体とマウス又はハムスターＣＬＤＮ１の細胞外ループとの交差反応性を示唆しない（図９及び図１９）。対照的に、ラットモノクローナル抗ＣＬＤＮ１は、非ヒト霊長類カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の初代肝細胞との交差反応性を示した（図９Ｅ）。これらのデータは、抗体により標的化されるエピトープが霊長類の間で保存されているが、しかし、齧歯類（例えばマウス又はハムスターなど）において異なることを示唆する。
【０１５５】
各サブクローンを凍結させ、一部を無血清ＩＳＦ−１培地（Biochrom AG、カタログ番号：９０６１−０１）中で拡大した。抗体をプロテインＧカラム上で精製し、それらの濃度をＰＢＳ緩衝液中で決定した。アイソタイプを、各クローンについて、BD-Pharmingen（カタログ番号：５５７０８１）からの市販ＥＬＩＳＡテストを使用して決定した。軽鎖の性質も、同じ市販のＥＬＩＳＡキットを使用して決定した。これらの分析での結果を下の表１に示す。
【０１５６】
【表１】
0005698137.tif 000002
【０１５７】
ＨＣＶ許容細胞及び初代ヒト肝細胞への抗ＣＬＤＮ１  ｍＡｂの結合特性の特徴付け。    ＨＣＶ許容細胞及び初代ヒト肝細胞への抗ＣＤＬＮ１  ｍＡｂの結合特性を、フローサイトメトリーにより特徴付けた。図１０に示す通り、Ｈｕｈ７．５．１細胞への結合についての測定された半飽和濃度は、それが抗体の見かけ上のＫＤに対応し、以下の通りであった：７Ｄ３−Ｂ３    ４nM；７Ｄ４−Ｃ１    ５nM；８Ａ９−Ａ３    ２nM；４Ａ４−Ｄ４  ９nM、６Ｄ９−Ａ６  ８nM、６Ｅ１−Ｂ５  ３nM、７Ｃ８−Ａ８  ７nM（図１０Ａ）。類似の半分飽和濃度及び抗体の見掛け上のＫＤが、初代ヒト肝細胞への抗体結合について得られた（データ示さず）。これらの結果は、抗ＣＤＬＮ１抗体が、ＨＣＶ許容細胞株及びヒト肝細胞に高親和性を伴い結合することを実証する。
【０１５８】
抗ＣＬＤＮ１抗体による全ての主な遺伝子型のＨＣＶ分離株と個々の疑似種との交差中和。    遺伝子免疫により産生される抗体がＨＣＶ感染を阻害することが可能であったか否かを研究するために、Ｈｕｈ７．５．１細胞を、抗ＣＬＤＮ１又はアイソタイプコントロール抗体の存在においてキメラＪ６／ＣＦ−ＪＦＨ１ホタルルシフェラーゼレポーターウイルスＬｕｃ−Ｊ１（Koutsoudakis, 2006）を用いて感染させた。図１１は、モノクローナル抗ＣＬＤＮ１抗体がＬｕｃ−Ｊｃ１及びＬｕｃ−Ｃｏｎ１ウイルスによるＨｕｈ７．５．１細胞のＨＣＶ感染を用量依存的な様式で阻害したのに対し、アイソタイプコントロール抗体が阻害効果を有さなかったことを示す。まとめると、これらのデータは、ＣＬＤＮ１細胞外ループに対する抗体がＨＣＶ感染を阻害することを実証する。抗ＣＬＤＮ１抗体が全ての主な遺伝子型からのＨＣＶ感染を交差中和することが可能であったか否かを検証するために、ＨＣＶ遺伝子型１−６からのＨＣＶエンベロープ糖タンパク質を持つＨＣＶ偽型粒子（ＨＣＶｐｐ）の侵入に対する抗体の影響を分析した。図１２に示す通り、モノクローナル抗ＣＬＤＮ１抗体は効率的及び用量依存的に遺伝子型１−６からのＨＣＶｐｐによるＨｕｈ７．５．１細胞の感染を阻害し、ＨＣＶ感染の阻害についてのＩＣ５０は０．１〜５μg/mLの範囲であった。類似の結果が、初代ヒト肝細胞の感染で見出された（図１３）。
【０１５９】
抗ウイルス剤及び免疫抑制戦略の開発での主な課題は、ウイルスの高い変異性である。ＨＣＶは非常に高い複製速度を有し、エラー確率の高いウイルスポリメラーゼによって「疑似種」と呼ばれる少数のウイルスバリアントが急速に産生され、それは体液性及び細胞性免疫応答対象外となりうる（Aurora, 2009; Farci, 2006; Ray, 2005; Uebelhoer, 2008）。これらのバリアントは感染宿主において一定の免疫圧力の影響を受け、選択的プロセッシングは、免疫認識を免れる又は抗ウイルス治療に耐性を付与することができる最も適したウイルスによるウイルス疑似種の優性に導く。
【０１６０】
抗ＣＬＤＮ１抗体が個々の患者において疑似種の集団を効率的に阻害したか否かを検証するために、ＨＣＶに慢性的に感染した２人の個々の患者のエンベロープ糖タンパク質をクローン化し、配列決定し、発現させた。図１４に示す通り、抗ＣＬＤＮ１抗体は、２人の個々の患者からの疑似種からのエンベロープ糖タンパク質を持つＨＣＶｐｐのＨＣＶ感染を広く中和した。これらのデータは、抗ＣＬＤＮ１抗体が、全ての主な遺伝子型ならびに個々の患者の疑似種集団での単離株のＨＣＶ感染を交差中和することを実証する。
【０１６１】
ＨＣＶ疑似種宿主中和抗体を回避したウイルス株の中和及び肝臓移植片の再感染。    慢性ＨＣＶ感染に起因する末期肝臓疾患は、肝臓移植を行う主要な原因である。宿主免疫応答からのウイルス回避のため及び予防的な抗ウイルス戦略がないため、移植片の再感染は普遍的であり、肝臓疾患が急速に進行する特徴が見られる。初代ヒト肝細胞及び肝臓移植を受けているＨＣＶ感染患者に由来するウイルスエンベロープ糖タンパク質を持つレトロウイルスＨＣＶ偽型を使用し、出願者らは、増強したウイルス侵入及び抗体媒介性中和からの回避が、肝臓移植片のＨＣＶ再感染の間でのウイルスバリアントの選択のための重要な決定要因であることを以前に実証している（Fafi-Kremer, 2009、発表のために提出）。
【０１６２】
本試験において、肝臓移植及びＨＣＶ再感染を受けている患者からのエンベロープ糖タンパク質を提示するＨＣＶｐｐを使用し、抗ＣＬＤＮ１抗体が、宿主中和応答を回避し、肝臓移植片の再感染をもたらしたウイルス分離株との初代ヒト肝細胞の感染を阻害することができるか否かを評価した。この目的を達成するために、出願者らは、移植及び肝臓移植片の再感染の間に選択されたＨＣＶ株（ＨＣＶ株、ＶＤ、ＶＨ、ＶＫ）からのエンベロープ糖タンパク質が持つＨＣＶｐｐの侵入に対する抗ＣＬＤＮ１抗体の効果を試験している。図１５に示す通り、抗ＣＬＤＮ１抗体との細胞のプレインキュベーションによって、初代ヒト肝細胞において患者由来のＨＣＶｐｐの侵入が顕著に阻害された。これらのデータは、抗ＣＬＤＮ１が、肝臓移植片に再感染する患者由来の単離株でのＨＣＶ侵入を特異的に阻害することを明らかに実証する。
【０１６３】
ＭＴＴテストに基づく細胞生存分析を実施し、抗ＣＬＤＮ１抗体の潜在的な毒性効果を検証した。毒性効果は、ＭＴＴテストに基づく細胞生存の並列分析において、高用量の抗ＣＬＤＮ１でさえ検出されなかった（図１６）。対照的に、化合物Ｃ（既知の毒性を有する十分に特徴付けられたＡＭＰＫ阻害剤）は、容易に検出可能な毒性をもたらした（図１６）。
【０１６４】
モノクローナル抗ＣＬＤＮ１抗体の結合は、ＣＬＤＮ１細胞外ループ中の高度に保存されたモチーフＷ（３０）−ＧＬＷ（５１）−Ｃ（５４）−Ｃ（６４）の保存に依存している。    最後に、出願者らは、モノクローナル抗ＣＤＬＮ１抗体により標的化されるエピトープのマッピングを目指した。交差競合実験を、６つのモノクローナル抗体を使用して実施し、抗ＣＬＤＮ１  ＭＡｂが類似の又は異なる、無関係なエピトープを認識するか否かを研究した。Ｈｕｈ７．５．１細胞への標識されたＯＭ−８Ａ９−Ａ３又はＯＭ−７Ｄ３−Ｂ３の結合を、濃度を増加させたコントロールアイソタイプ一致ＩｇＧ又は抗ＣＬＤＮ１  ｍＡｂのいずれかとのプレインキュベーション後に測定した。全ての抗ＣＬＤＮ１  ｍＡｂとの同時インキュベーションによって、細胞表面に提示される抗ＣＬＤＮ１への８Ａ９−Ａ３の結合がほぼ８０%低下したが、コントロールＩｇＧはＨｕｈ７．５．１細胞の認識を低下させなかった（図１７Ａ）。類似の結果が、ＯＭ−８Ａ９−Ａ３又はＯＭ−７Ｄ３−Ｂ３だけでなく、飽和濃度の阻害ｍＡｂを使用して実証された全ての標識ＯＭ  ｍＡｂについて得られた（図１７Ｂ）。結合アッセイで得られた結果を、感染実験において交差競合試験を実施することにより確認した。図１７Ｃに示される通り、異なる抗ＣＬＤＮ１抗体の組み合わせは、ＨＣＶ感染の阻害の大きさに対して顕著な相加又は相乗効果を示さなかった。結合試験において得られた結果を確認することに加えて、これらの結果は、全て６つの抗ＣＤＬＮ１抗体が、ＣＬＤＮ１細胞外ループ上で類似の又は密接に関連するモチーフを認識することを示唆する。モノクローナル抗体の２つに関する暫定的なシークエンシングデータは、しかし、それらが重鎖及び軽鎖の両方についての配列において変動することを示す（データ示さず）。
【０１６５】
Cukiermanと共同研究者（Cukierman, 2009）により記載される６つのモノクローナル抗体とＣＬＤＮ１突然変異体のパネルとの相互作用を、抗体により標的化されるモチーフをさらに定義するために試験した。アラニンスキャニング突然変異誘発アプローチを使用して、Cukiermanと共同研究者は、６つの異なるサブタイプから選び出されたＨＣＶ単離株の侵入のために重要であるＣＬＤＮ１の最初の細胞外ループにおいて、７つの残基を同定した。重要な残基の大半が、モチーフＷ（３０）−ＧＬＷ（５１）−Ｃ（５４）−Ｃ（６４）に属し、それは全てのヒトクローディンの間で高度に保存されている（Cukierman, 2009）。野生型及び突然変異ＣＬＤＮ１分子を発現する一過性にトランスフェクトされたＢＯＳＣ２３細胞を使用して、出願者らは、ＣＬＤＮ１の位置３０、３５、４９、５０、５１、５４、及び６４でのアラニンによるアミノ酸残基の置換によって、モノクローナル抗体ＯＭ−７Ｄ３−Ｂ３の結合が劇的に低下したのに対し、他の突然変異は抗体の相互作用に影響を与えなかったことを実証した（図１８Ａ）。
【０１６６】
以前の試験では、残基Ｉ３２が侵入のために重要であり（Evans, 2007）、近位のＤ３８残基がウイルス侵入のために等しく重要であることが示されている（Cukierman, 2009）。興味深いことに、これらの残基の突然変異誘発によって、依然として、抗ＣＬＤＮ１抗体の部分的な結合が可能であった（図１８）。これらの残基が、抗ＣＬＤＮ１−ＣＬＤＮ１相互作用のためにそれほど重要でない役割を果たすことを示唆する。さらに、突然変異ＣＬＤＮ１への抗ＣＬＤＮ１結合の分析によって、残基Ｙ３５が、モノクローナル抗ＣＬＤＮ１抗体により認識される可能性があることが実証される（図１８Ａ及びＢ）。一過性にトランスフェクトされたＢＯＳＣ２３細胞おける野生型及び突然変異ＣＬＤＮ１の適切な発現を、ＨＡタグが不在である突然変異Ｉ３２Ａを除き（図１８ＡＢ）、ＨＡタグ発現レベル及び抗ＨＡ抗体（図１８ＡＢ）のフローサイトメトリー分析により確認し、ＣＬＤＮ１の発現を、非突然変異ＣＬＤＮ１Ｃ末端ドメインに対する無関係抗体を使用したＦＡＣＳ分析により評価した（突然変異Ｉ３２Ａ：データ示さず）。類似のパターンが、抗体ＯＭ−８Ａ９−Ａ３で観察された（図１８Ｂ）。これらの結果は、ｍＡｂが、ＨＣＶ侵入のために必須の共同残基（ｃｏ−ｒｅｓｉｄｕｅ）として同定されているＷ（３０）−ＧＬＷ（５１）−Ｃ（５４）−Ｃ（６４）モチーフにより影響を受ける立体構造に依存的なエピトープを認識することを示唆する（Cukierman, 2009）。
【０１６７】
考察
初めて、モノクローナル抗体が、クローディン１の細胞外ループに対して生成されており、全ての主な遺伝子型からのＨＣＶ感染を強力に交差中和する。認識は、ヒトＣＬＤＮ１細胞外ループ１のモチーフＷ（３０）−ＧＬＷ（５１）−Ｃ（５４）−Ｃ（６４）の保存に強く依存している。このモチーフがエピトープを表すか否か、又は認識に影響を与える突然変異がこのエピトープの喪失又はマスキングに導く立体構造変化を起こすか否かが、決定されないままである。抗ＣＬＤＮ１抗体は、肝臓移植の間にＨＣＶ再感染を受けた４人の患者からの患者由来のエンベロープ糖タンパク質を持つＨＣＶｐｐを使用して、肝臓移植の間に選択された個々の患者におけるＨＣＶ分離株の侵入ならびに主なＨＣＶバリアントの侵入を交差阻害する。
【０１６８】
ウイルスを標的化する現在の進化する抗ウイルス治療での主な制限は、ウイルス耐性の急速な発生である。抗ウイルス剤及び免疫予防戦略の開発での主な課題は、ウイルスの高い変異性である。ＨＣＶは非常に高い複製速度を有し、エラー確率の高いウイルスポリメラーゼによって「疑似種」と呼ばれる少数のウイルスバリアントが急速に産生され、それは体液性及び細胞性免疫応答をしのぐことができ、従来の抗ウイルス治療にウイルス耐性を付与するウイルス単離株をもたらしうる（Aurora, 2009）。必須の宿主因子を標的化することは、相補的な代替物を表わしうる。ウイルス回避が生じる場合、それは異なる機構及びウイルス因子からなりうる。抗ＣＬＤＮ１抗体が個々の患者において全ての遺伝子型及び疑似種のウイルス分離株のＨＣＶ感染を同様に阻害するという事実は、抗ＣＬＤＮ１抗体に対して耐性である既存のバリアント又は遺伝子型の非存在を示唆する。
【０１６９】
ＨＣＶ感染を効率的に交差中和する抗ＣＬＤＮ１抗体を開発することにより、出願者らは、新規の抗ウイルス戦略のための標的としてＣＬＤＮ１についての概念証明を実証していた。ＨＣＶ侵入はウイルス宿主相互作用の第一段階及び宿主中和応答の主な標的であるため、それはＨＣＶプロテアーゼ及びポリメラーゼの阻害剤を用いて細胞内複製事象を遮断する持続的な効果を補完しうる抗ウイルス治療のための有望な標的を表す（Stamataki, 2008; Timpe and McKeating, 2008; Zeisel, 2008）。他のウイルス感染、例えばＨＩＶ（Este and Telenti, 2007）などのための侵入阻害剤の臨床開発での成功は、治療又は予防標的としてのウイルス侵入段階の関連性を明確にする。
【０１７０】
モノクローナル抗体の重要な適用は、肝臓移植に続くＨＣＶ再感染の予防でありうる。肝臓移植（ＬＴ）での主な現在の制限は、移植片の普遍的なＨＣＶ再感染、それに続くＨＣＶ誘発性肝臓疾患の急速な進行である（Brown, 2005）。再感染の予防のための予防戦略が欠けており、インターフェロンベースの抗ウイルス治療がＬＴレシピエントにおける効力及び認容性を限定してきた（Brown, 2005）。宿主免疫応答からのウイルス回避のため及び予防的な抗ウイルス戦略がないための非存在に起因し、移植片の再感染は普遍的であり、肝臓疾患が急速に進行する特徴が見られる（Brown, 2005）。初代ヒト肝細胞及び肝臓移植を受けているＨＣＶ感染患者に由来するウイルスエンベロープ糖タンパク質を持つレトロウイルスＨＣＶ偽型を使用し、出願者らの１つのチームは、増強したウイルス侵入及び抗体媒介性中和からの回避が、肝臓移植片のＨＣＶ再感染の間でのウイルスバリアントの選択のための重要な決定要因であることを以前に実証している（Fafi-Kremer, 2009、発表のために提出）。
【０１７１】
本試験において、出願者らは、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体が、肝臓移植の間に宿主細胞免疫応答を回避した単離株による初代ヒト肝細胞のＨＣＶ感染を効率的に阻害したことを示している。抗ＣＬＤＮ１抗体を交差中和することにより患者の中和応答を回避したウイルスバリアントの効率的な中和は、ＨＣＶ侵入が、移植片の再感染を予防する抗ウイルス戦略のための実行可能な標的であることを実証する。この知見は、ＨＣＶ感染についてのヒト化マウスモデルにおける最近の試験によりさらに裏付けられ、モノクローナル抗Ｅ２抗体及び抗ＣＤ８１抗体が遺伝的に異なるＨＣＶ単離株を中和し、異種ＨＣＶ疑似種の攻撃に対して保護することが可能であることを実証する（Meuleman, 2008; Law, 2008）。このように、モノクローナル交差中和抗ＣＬＤＮ１抗体の投与が、抗ウイルス治療の併用にかかわらず、移植された肝臓のＨＣＶ再感染を予防するための実行可能で有望な選択肢を提供しうる。
【０１７２】
ＨＣＶ感染の予防又は処置のための抗受容体抗体の使用についての潜在的な制限は、毒性でありうる。宿主細胞因子が、ウイルス侵入の機構に関連付けられうる重要な機能を有する。このように、ＨＣＶ侵入因子に結合する抗体が、受容体の機能又は発現を変えて、副作用を招きうる。興味深いことに、毒性効果は、ＭＴＴテストに基づく細胞生存の並列分析において高用量の抗ＣＬＤＮ１でさえ検出されなかった（図１６）。この点に関して、出願者らが、ポリクローナル抗ＣＬＤＮ１抗血清が極性化ＨｅｐＧ２肝細胞癌細胞においてタイトジャンクションの透過性及び完全性に対して効果を有さなかったことを以前に実証していることを指摘することが重要である（Krieger, 2009、投稿中）。さらなる試験がインビボでの毒性を検証するために必要とされるが、ＨＣＶ許容細胞及びヒト肝細胞における出願者らにより実施されたパイロット毒性試験が、抗ＣＬＤＮ１抗体が十分に許容されうることを示唆する。
【０１７３】
モノクローナル抗ＣＬＤＮ１抗体によるＨＣＶ感染の中和の機構は何か？    ＣＬＤＮはタイトジャンクションの重要な成分であり、４つの膜貫通ドメイン、２つの細胞外ループ及び１つの細胞内ループ、ならびにＮ及びＣ末端細胞質ドメインを伴うテトラスパニントポロジーを有する（Van Itallie and Anderson, 2006）。ＣＬＤＮ１細胞外ループ１（ＥＬ１）がＨＣＶ侵入のために要求され（Evans, 2007）、バリア機能に関与し、極性化細胞の間での孔形成に寄与する（Krause, 2008）ことが示されている。非極性化ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における突然変異誘発試験によって、細胞間接触でのＣＬＤＮ１濃縮がＨＣＶ侵入のために重要でありうることが実証されている（Cukierman, 2009）。種々の画像化及び生化学的技術を使用し、いくつかの研究室で、ＣＬＤＮ１がＣＤ８１と会合することを報告している。出願者らの実験室での最近のデータでは、ＣＬＤＮ１が、ＨＣＶ  Ｅ２、ＣＤ８１、及びＣＬＤＮ１を含むウイルス／共受容体複合体を形成することによりＨＣＶ侵入を媒介することが示され、それはウイルス侵入のために要求される（実施例３を参照のこと）。出願者らは、抗ＣＬＤＮ１抗体が、細胞表面とのＥ２会合を低下させ、ＣＤ８１−ＣＬＤＮ１相互作用を破壊することによりＨＣＶ感染力を中和することをさらに実証した（実施例３を参照のこと）。
【０１７４】
興味深いことに、阻害の大きさは、ＨＣＶｃｃ（図１１）及びＨＣＶｐｐ（図１２）を用いたＨｕｈ７．５．１細胞の感染と類似すると思われたのに対し、ＨＣＶｐｐ感染の阻害の大きさは、Ｈｕｈ７．５．１細胞と比較し、初代ヒト肝細胞においてより著しいと思われた（図１３〜１５及びデータ示さず）。これは、受容体又は共受容体複合体の発現が、非極性化Ｈｕｈ７肝細胞癌細胞株と比較し、部分的に極性化した初代ヒト肝細胞において異なりうるという事実に起因しうる。
【０１７５】
交差競合抗体結合及び感染試験によって、モノクローナル抗体が密接に関連するエピトープドメインを標的化することが明らかに示された（図１７）。十分に特徴付けられたＣＬＤＮ１変異体のパネルを使用して、出願者らは、ＣＬＤＮ１  ＥＬ１の位置３０、３５、４９、５０、５１、５４、及び６４でのアラニンによるアミノ酸の置換によって、ＣＬＤＮ１へのモノクローナル抗体ＯＭ−７Ｄ３−Ｂ３の結合が劇的に低下したのに対し、抗体と他の変異体との相互作用が、全く影響を与えなかった又はより小さな程度で影響を与えたことが実証された（図１９）。
【０１７６】
これらのデータは、ｍＡｂがＣＬＤＮ１  ＥＬ１のＷ（３０）−ＧＬＷ（５１）−Ｃ（５４）−Ｃ（６４）を含むアミノ酸残基のクラスター内に存在するエピトープ又は構造変化を通じて喪失又はマスクされうるエピトープのいずれかを認識することを示唆する。前者の場合において、これらの保存アミノ酸が構造的に一緒にグループ化されないため、認識されたエピトープが立体構造に依存的である可能性が高い。この仮説は、ＣＬＤＮ１  ＥＬ１のアミノ酸をコードする直鎖ペプチドとの抗体のプレインキュベーションが、感染の抗体媒介性阻害を逆転させることができなかったとの知見によりさらに裏付けられる（データ示さず）。さらに、遺伝子免疫により産生された抗ＣＬＤＮ１抗体が、ＥＬＩＳＡにおける抗原としての直鎖ＣＬＤＮ１ペプチドとの容易に検出可能な相互作用を示さなかった（データ示さず）。
【０１７７】
ＣＬＤＮ１の最初の細胞外ループ中のモノクローナル抗体により標的化される同定された残基が、６つの異なるサブタイプから選び出されたＨＣＶ単離株の侵入のために重要であることが示されている（Cukierman, 2009）。このエピトープを標的化するモノクローナル抗ＣＬＤＮ１抗体が６つの異なる単離株からのＨＣＶ単離株の侵入を効率的に交差中和するという事実は、ＨＣＶ侵入のためのこれらのＣＬＤＮ１残基の関連性をさらに明確にする。これらの残基のアラニン置換がＣＬＤＮ１細胞表面発現を損なわなかったことを指摘することが重要である（Cukierman, 2009）。同じアプローチにより産生されたポリクローナル抗体が、ウイルス／共受容体複合体（ＨＣＶ  Ｅ２、ＣＤ８１、及びＣＬＤＮ１を含む）を破壊することが示されているため（実施例３）、ＥＬ１中の標的化アミノ酸残基がウイルス侵入のために必須であるＥ２−ＣＤ８１−ＣＬＤＮ１共受容体複合体の形成のために重要な役割を果たすことが考えられる。さらなる試験が、この問題を検証するために進行中である。
【０１７８】
結論として、ＣＬＤＮ１  ＥＬ１におけるＷ（３０）−ＧＬＷ（５１）−Ｃ（５４）−Ｃ（６４）モチーフの保存に依存しているモノクローナル抗体が産生されており、それはＨＣＶ感染を交差中和する。これらの結果は、ＨＣＶ侵入のために重要であり、抗体がＨＣＶ感染を遮断するために接近可能であるＣＬＤＮ１  ＥＬ１における残基を定める。最後に、データは、モノクローナル抗ＣＬＤＮ１抗体を使用してＣＬＤＮ１  ＥＬ１を標的化することが、原発性のＨＣＶ感染（例えば肝臓移植後など）を予防するための新規抗ウイルスアプローチを構成し、また、慢性感染患者においてウイルス拡散を抑制しうることを示唆する。
【０１７９】
実施例３：抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体の作用の機構
材料及び方法
細胞株。    実施例２に記載。ＨＥＫ２９３Ｔ／ＣＬＤＮ１＋細胞（クローンＩＩＩＡ６）を、ＣＬＤＮ１  ｃＤＮＡをコードするｐｃＤＮＡ３．１を用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の安定的トランスフェクションにより得た。
【０１８０】
抗体。    実施例２に記載。また、ポリクローナルラット抗ＳＲ−ＢＩ又はＣＤ８１抗体を、記載された通りに、遺伝子免疫により得た（Zeisel, 2007）。Ｒ−フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗ラットＩｇＧはJackson ImmunoResearch Laboratoriesから、マウスＩｇＧはCaltagから、マウス抗ＣＤ８１（ＪＳ−８１）はBD Biosciencesから購入した。
【０１８１】
ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質及び感染力ビリオンの細胞結合。    Ｃ末端切断エンベロープ糖タンパク質Ｅ１及びＥ２の産生及び標的細胞への結合が記載されている（Haberstroh, 2008; Dreux, 2009）。Ｅ２侵入因子相互作用の試験のために、ＣＨＯ細胞を、ＳＲ−ＢＩ；ＣＤ８１又はＣＬＤＮ１  をコードするｐｃＤＮＡ３ベースの発現ベクターを用いて一過性にトランスフェクトした（Barth, 2005）。侵入因子の発現を、抗受容体抗体を使用したフローサイトメトリーにより、以前に記載された通りに評価した（Barth, 2005）。抗受容体抗体の存在におけるエンベロープ糖タンパク質結合の試験のために、Ｈｕｈ７．５．１細胞（Zhong, 2005）を１時間にわたり室温でラット抗ＳＲ−ＢＩ、抗ＣＬＤＮ１、及び抗ＣＤ８１血清（１／１００）又はマウス抗ヒトＣＤ８１抗体（ＪＳ−８１、５μg/mL）もしくはコントロール抗体（１／１００又は５μg/mL）を用いてプレインキュベートした。組換えＥ２（３０μLの濃縮細胞培養上清）又はＥ１（１０μg/mL）を室温で１時間にわたり細胞に加えた。ＰＢＳを用いた洗浄に続き、結合したエンベロープ糖タンパク質を、フローサイトメトリーならびにヒト抗Ｅ１（ＩＧＨ５２６；Haberstroh, 2008）又はマウス抗Ｈｉｓ（RGS-His, Qiagen）及びＰＥコンジュゲート二次抗体（Dreux, 2009; Barth, 2008）を使用して検出した。許容Ｈｕｈ７．５．１細胞へのＨＣＶｃｃの結合の試験のために、Ｈｕｈ７．５．１細胞を、勾配超遠心を使用して細胞培養上清から部分的に精製されたＨＣＶｃｃ（Ｊｃ１株）とのインキュベーション前に、ヘパリン、ラット抗ＣＬＤＮ１、ラット抗ＳＲ−ＢＩ、又はコントロールラット免疫前血清（ＰＩ）（全てを１／１００希釈）と１時間にわたり室温でプレインキュベートした。ＨＣＶｃｃとのインキュベーションに続き、非結合ＨＣＶｃｃを、ＰＢＳを用いた細胞の洗浄により除去した。ＨＣＶｃｃの結合を、次に、Ploss et al.(2009)により記載された通りに、細胞結合ＨＣＶ  ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより定量化した。
【０１８２】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用した受容体会合。    ＣＤ８１及びＣＬＤＮ１のホモタイプ及びヘテロタイプ相互作用を、記載された通りに分析した（Harris, 2008; Mee, 2009）。簡単に述べると、ＡｃＧＦＰ及びＤｓＲＥＤタグ付きＣＤ８１及びＣＬＤＮ１を発現するために導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ガラスカバースリップ上で増殖させ、氷冷メチルアルコール中で固定した。細胞をZeiss meta head LSCMで画像化し、顕微鏡設定を各蛍光タンパク質が最も高い信号対ノイズ比を得るために最適化した。ＦＲＥＴ分析のために、ＡｃＧＦＰ蛍光強度をモニターしながら経時的なＤｓＲＥＤフルオロフォアの逐次的光退色を必要とするＦＲＥＴの逐次的アクセプター光退色方法を使用した（Harris, 2008）。バックグラウンド及びクロストークの補正後、ＤｓＲＥＤ光退色に続くＡｃＧＦＰ強度の任意の増加がタンパク質の間でのＦＲＥＴに起因し、１０nm未満の距離を意味する。パーセントＦＲＥＴは、細胞の原形質膜で分析したピクセルの総数を上回るＦＲＥＴを表示するピクセルの数と定義される（Harris, 2008）。原形質膜でのＡｃＧＦＰ及びＤｓＲＥＤタグ付きＣＤ８１及びＣＬＤＮ１の強度（任意の蛍光強度／ピクセル）は５００〜１０００回測定／細胞を提供する。１０個の細胞からのデータを標準化し、局在化発現を算出した。
【０１８３】
結果
抗ＣＬＤＮ１は、ＣＬＤＮ１−Ｅ２相互作用の非存在においてＨＣＶ許容細胞へのエンベロープ糖タンパク質Ｅ２及び感染力ビリオンの結合を阻害する。    抗ＣＬＤＮ１抗体が、許容細胞株へのＥ２結合に干渉できたか否かを研究するために、結合試験を、抗受容体又はコントロール抗体の存在において組換えＥ１及びＥ２糖タンパク質を使用して実施した。図２０Ｂに示す通り、抗ＣＤ８１、抗ＣＤ８１、及び抗ＳＲ−ＢＩ、及び抗ＣＬＤＮ１抗体が、Ｈｕｈ７．５．１細胞へのＥ２の結合を阻害した。対照的に、免疫前又は無関係なコントロール血清は、効果を示さなかった（図２０Ａ−Ｃ）。興味深いことに、Ｈｕｈ７．５．１細胞へのＥ２結合の阻害の大きさ（図２０Ｃ）が、ＨＣＶ感染の阻害の大きさと相関し、Ｅ２細胞表面相互作用の結合の阻害が、抗ＣＬＤＮ１抗体の中和活性のための作用機構を提供することを示唆する。感染力ビリオンについてのこれらの観察の関連性を、ＨＣＶｃｃを使用した結合試験によりさらに確認した（図２０Ｅ）。対照的に、Ｅ１結合は抗ＣＬＤＮ１により影響を受けなかった（図２０Ｄ）。
【０１８４】
許容細胞株へのＥ２結合の抗体阻害が、Ｅ２とのＣＬＤＮ１相互作用に起因したか否かを試験するために、出願者らは、ＣＬＤＮ１が組換え切断糖タンパク質Ｅ２に結合することができるか否かを研究してきた。この問題を検証するために、ＣＨＯ細胞を操作し、ヒトＣＬＤＮ１、ＳＲ−ＢＩ、又はＣＤ８１を発現させた（図２１Ａ）。ヒトＣＤ８１又はヒトＳＲ−ＢＩの細胞表面発現がＣＨＯ細胞へのＥ２結合を付与したのに対して（図２１Ｂ）、ＣＬＤＮ１発現は効果を示さなかった（図２１Ｂ）。これらのデータは、ＣＬＤＮ１が直接ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質Ｅ２と相互作用しないこと、及びＥ２細胞表面相互作用の抗体遮断が間接的な機構により媒介されることを示唆する。
【０１８５】
抗ＣＬＤＮ１抗体がＣＬＤＮ１−ＣＤ８１共受容体会合を阻害する。    抗ＣＬＤＮ１抗体が、直接的なＣＬＤＮ１−Ｅ２相互作用の非存在においてＨＣＶ許容細胞へのＥ２結合を阻害するため（図２１Ｂ）、出願者らは、抗ＣＬＤＮ１抗体がＣＤ８１−ＣＬＤＮ１共受容体複合体に干渉すると仮定している。抗ＣＬＤＮ１抗体がＣＬＤＮ１−ＣＤ８１会合を変化させるか否かを評価するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトし、Ａｃ−ＧＦＰ−ＣＤ８１及びＤｓＲＥＤ−ＣＤ８１又はＡｃＧＦＰ−ＣＬＤＮ１及びＤｓＲＥＤ−ＣＤ８１又はＡｃＧＦＰ−ＣＬＤＮ１及びＤｓＲＥＤ−ＣＬＤＮ１を発現させ、免疫前及び抗ＣＬＤＮ１血清（１／１００及び１／４００）とインキュベートし、共受容体相互作用をＦＲＥＴにより分析した。図２２に示す通り、抗ＣＬＤＮ１抗体が、ＣＤ８１とＣＬＤＮ１の間でのＦＲＥＴを用量依存的な様式で有意に低下させた。細胞とコントロール血清とのプレインキュベーションは、ＣＤ８１−ＣＬＤＮ１共受容体相互作用を修飾しなかった。ＣＤ８１−ＣＬＤＮ１共受容体相互作用の阻害は、抗ＣＬＤＮ１血清とのプレインキュベーションに続くＣＤ８１−ＣＤ８１とＣＬＤＮ１−ＣＬＤＮ１の間での不変ＦＲＥＴにより示される通り、特異的であった。まとめると、これらのデータは、抗ＣＬＤＮ１抗体がＣＤ８１−ＣＬＤＮ１ヘテロダイマー会合に干渉することを示唆する。
【０１８６】
考察
ＣＬＤＮ１はＨＣＶ侵入を付与する必須の補助因子である。しかし、複数段階の侵入プロセスにおけるＣＬＤＮ１の正確な役割は、十分には理解されていないままである。ヒトＨＣＶ侵入因子を発現するトランスフェクトＣＨＯ細胞を使用して、出願者らは、ＣＤ８１及びＳＲ−ＢＩとは対照的に、ＣＬＤＮ１が細胞表面でエンベロープ糖タンパク質Ｅ２と直接的に相互作用しないことを実証している。ＣＤ８１−ＣＬＤＮ１共受容体会合を試験するためにＦＲＥＴベースシステムを使用して、本発明の抗ＣＬＤＮ１抗体を中和することによって、ＣＤ８１−ＣＬＤＮ１  ＦＲＥＴが特異的に妨害されることが示された（図２２）。
【０１８７】
これらデータは、ＣＬＤＮ１を標的化する抗体が、細胞表面とのＥ２会合を低下させ、ＣＤ８１−ＣＬＤＮ１相互作用を低下させることにより、ＨＣＶ感染力を中和することを示唆する。ＣＤ８１−ＣＬＤＮ１共受容体複合体が、ＨＣＶ侵入のために重要であり、ＣＬＤＮ１がＥ２相互作用を介したＨＣＶ粒子とのＣＤ８１会合を増強しうる。それらは、また、Ｅ２−ＣＤ８１−ＣＬＤＮ１相互作用を標的化する抗ウイルス戦略に新たな手段を提供する。
【０１８８】
実施例４：抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体は、感染後に加えられた場合、ＨＣＶ細胞間伝達を阻害し、ウイルス拡散を遮断する。
材料及び方法
細胞間伝達アッセイ。    Ｈｕｈ７．５．１細胞がF.Chisari博士（The Scripps Research Institute, USA; Zhong, 2005）により提供され、記載された通りに培養した（Zeisel, 2007; Barth, 2008; Dimitrova, 2008）。Ｈｕｈ７  ＧＦＰ細胞は、Patel博士（University of Glasgow, UK; Witteveldt, 2009）により提供された。Ｈｕｈ７由来細胞株が、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を有するレトロウイルスベクターを用いた導入、それに続く３００μg  Ｇ４１８/mLを添加された培地中での選択により得られていた（Witteveldt, 2009）。ＨＣＶの細胞間伝達を検出するために、新たに電気穿孔されたＨｕｈ７．５．１細胞を播種し、２４時間インキュベートし、培地を用いて洗浄し、残りの細胞表面結合ＨＣＶを除去し１０μg/mLの抗ＣＬＤＮ１抗体を伴うＥＧＦＰ発現レシピエント細胞を加えた。同時培養された細胞を、ＦＡＣＳ分析のために、コンフルエントまで増殖させ、トリプシン処理し、１%パラホルムアルデヒドを用いて固定し、０．１%サポニンを用いて透過性化した。細胞を、ＦＡＣＳ分析のために、マウス抗コア抗体、それに続きフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート二次抗体を使用して、ＳＲ−ＢＩについて以前に記載された通りに（Barth, 2006; Barth, 2008）染色した。
【０１８９】
結果及び考察
一般的に、ウイルスは、宿主内で、２つの機構（無細胞ビリオンの放出及び感染細胞と非感染性細胞の間での直接的な移動を含む）により拡散することができる。直接的な細胞間移動が、無細胞拡散よりも急速で効率的であると考えられる。なぜなら、それによって、ウイルスライフサイクルにおける律速の初期階段（例えばビリオン結合など）が取り除かれるからである。さらに、ウイルス感染力の細胞間移動によって、ウイルスが免疫応答の要素（例えば中和抗体など）を免れることが可能になりうる。
【０１９０】
最近の試験では、肝細胞癌細胞のＨＣＶ感染が細胞間接触により増強される感染が限定的な領域をもたらすことが示されており、隣接細胞の間の伝達を局在化することを示唆する。実際に、標識された生産細胞又はレシピエント細胞を使用し、２つの研究室が、ＨＣＶが無細胞ウイルス感染及び細胞間での直接移動の両方によりインビトロで伝達されうることを実証しており、後者は中和抗体を免れるための新規経路を提供する（Timpe, 2008; Witteveldt, 2009）。
【０１９１】
細胞間伝達を阻害する抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体の能力を評価するために、ＨＣＶ細胞間伝達アッセイを、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する標識レシピエント細胞に基づいて確立した。このアッセイにおいて、ＨＣＶ生産細胞を、抗受容体抗体の存在又は非存在においてＧＦＰ標識レシピエント細胞と同時培養する。抗ＣＤ８１抗体を用いて無細胞ウイルス伝達を遮断することにより（Timpe, 2008; Witteveldt, 2009）、このアッセイによって、ＦＡＣＳ分析においてＨＣＶ＋、ＧＦＰ＋レシピエント細胞を定量化し、細胞間伝達に対する抗ウイルス剤の特異的な効果を試験することが可能になる。
【０１９２】
抗体（又はコントロール抗体）の非存在における生産細胞及びレシピエント細胞の２４時間の同時培養後、全ての細胞の４３．６%がＨＣＶ＋ＧＦＰ＋レシピエント細胞に対応する（図２３Ａ）。抗ＣＤ８１抗体により無細胞伝達を遮断する場合（図２３Ｂ）、ＨＣＶ  ＧＦＰ＋レシピエント細胞の数は６．２０%に減少した。これらの細胞は、細胞間伝達のみにより感染された細胞に対応し、２つの他の研究室（Timpe, 2008; Witteveltd, 2009）及び出願者らの研究室（Baumert、未発表の観察結果）により以前に示された通りである。図２３Ｃに示す通り、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体は、ＨＣＶ＋、ＧＦＰ＋レシピエント細胞の数を顕著に低下させた。抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体７Ｄ３の添加によって、ＨＣＶ感染ＧＦＰ＋レシピエント細胞のパーセントが６．２０%から２．９８%に低下し、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体が細胞間伝達による感染を５０%超低下させることができたことを示唆する。対照的に、アイソタイプコントロール抗体は効果を示さなかった（データ示さず）。これらの結果は、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体がＨＣＶ細胞間伝達を阻害することを示す。
【０１９３】
感染力組織培養システムにおけるウイルス拡散についてのこの知見の関連性を確認するために、出願者らは、Ｈｕｈ７．５．１細胞における時間経過実験を実施している。ウイルス拡散に対するモノクローナル抗ＣＬＤＮ１抗体の効果を試験するために、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体ＯＭ−７Ｄ３を、無細胞ウイルスを用いた細胞の感染後４時間に加えた。図２４に示す通り、抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体は、ウイルス拡散を効率的に阻害した。アイソタイプコントロール抗体を用いた感染後のＨｕｈ７．５．１細胞のインキュベーションが、７日間の期間にわたりウイルス負荷の時間依存的な増加をもたらし（＞１０６相対的光強度）、感染後での抗ＣＬＤＮ１の添加が検出限界（約１０３相対的光強度）に近い低レベルのウイルス負荷をもたらした。これらのデータは、感染力細胞培養システムにおけるウイルス拡散の細胞間伝達に対する抗ＣＬＤＮ１抗体の効果の関連性をさらに示し、本発明の抗ＣＬＤＮ１モノクローナル抗体がＨＣＶ感染の予防だけでなく、しかし、慢性ウイルス感染の制御においても有用でありうることを示唆する。
【０１９４】
【表２】
0005698137.tif 000003
0005698137.tif 000004
0005698137.tif 000005
【０１９５】
他の実施態様
本発明の他の実施態様は、本明細書に開示する本発明の明細書又は実施の考察から当業者には明らかであろう。明細書及び実施例は、例示的であるとだけ見なされることを意図し、本発明の真の範囲は以下の請求項により示される。
【図９Ｅ】
0005698137.tif 000006
【図１４Ａ】
0005698137.tif 000007
【図２３Ａ】
0005698137.tif 000008
【図２３Ｂ】
0005698137.tif 000009
【図２３Ｃ】
0005698137.tif 000010
【図１Ａ】
0005698137.tif 000011
【図１Ｂ】
0005698137.tif 000012
【図２Ａ】
0005698137.tif 000013
【図２Ｂ】
0005698137.tif 000014
【図３Ａ】
0005698137.tif 000015
【図３Ｂ】
0005698137.tif 000016
【図４Ａ】
0005698137.tif 000017
【図４Ｂ】
0005698137.tif 000018
【図５Ａ】
0005698137.tif 000019
【図５Ｂ】
0005698137.tif 000020
【図５Ｃ】
0005698137.tif 000021
【図５Ｄ】
0005698137.tif 000022
【図５Ｅ】
0005698137.tif 000023
【図６Ａ】
0005698137.tif 000024
【図６Ｂ】
0005698137.tif 000025
【図７】
0005698137.tif 000026
【図８】
0005698137.tif 000027
【図９Ａ】
0005698137.tif 000028
【図９Ｂ】
0005698137.tif 000029
【図９Ｃ】
0005698137.tif 000030
【図９Ｄ】
0005698137.tif 000031
【図１０Ａ】
0005698137.tif 000032
【図１０Ｂ】
0005698137.tif 000033
【図１１Ａ】
0005698137.tif 000034
【図１１Ｂ】
0005698137.tif 000035
【図１２】
0005698137.tif 000036
【図１３Ａ】
0005698137.tif 000037
【図１３Ｂ】
0005698137.tif 000038
【図１３Ｃ】
0005698137.tif 000039
【図１３Ｄ】
0005698137.tif 000040
【図１４Ｂ】
0005698137.tif 000041
【図１４Ｃ】
0005698137.tif 000042
【図１４Ｄ】
0005698137.tif 000043
【図１４Ｅ】
0005698137.tif 000044
【図１４Ｆ】
0005698137.tif 000045
【図１５Ａ】
0005698137.tif 000046
【図１５Ｂ】
0005698137.tif 000047
【図１６Ａ】
0005698137.tif 000048
【図１６Ｂ】
0005698137.tif 000049
【図１６Ｃ】
0005698137.tif 000050
【図１６Ｄ】
0005698137.tif 000051
【図１７Ａ】
0005698137.tif 000052
【図１７Ｂ】
0005698137.tif 000053
【図１７Ｃ】
0005698137.tif 000054
【図１８Ａ】
0005698137.tif 000055
【図１８Ｂ】
0005698137.tif 000056
【図１９】
0005698137.tif 000057
【図２０Ａ】
0005698137.tif 000058
【図２０Ｂ】
0005698137.tif 000059
【図２０Ｃ】
0005698137.tif 000060
【図２０Ｄ】
0005698137.tif 000061
【図２０Ｅ】
0005698137.tif 000062
【図２１Ａ】
0005698137.tif 000063
【図２１Ｂ】
0005698137.tif 000064
【図２２】
0005698137.tif 000065
【図２３Ｄ】
0005698137.tif 000066
【図２４】
0005698137.tif 000067
【配列表】
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