(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａβ４２、Ａβ４０およびそれらの混合物の群から選択されるターゲットポリペプチドの検出用キットであって、
（ｉ）  上記ターゲットポリペプチドを認識する第一の抗体または抗体の組合せであって、第一の抗体が、Ａβ４０およびＡβ４２のアミノ酸１〜１６内に配置されたエピトープに対して指定され、ここで第一の抗体が、固形支持体に前もって結合している、第一の抗体または抗体の組合せ、
（ii）  第一の抗体または抗体の組合せによって認識される領域以外のターゲットポリペプチドの領域を認識する、第二の抗体または抗体の組合せ、
（iii)  試薬が結合対の第一の成員に結合している第二の抗体にアフィニティーを示す上記試薬、および
（iv）  蛍光、発光または酵素タグに結合した結合対の第二の成員
を含んでなり、
ここで結合対が、
ハプテンおよび抗体、
抗原および抗体、
ビオチンおよびアビジン、
ビオチンおよびストレプトアビジン、
ビオチン類似体およびアビジン、
ビオチン類似体およびストレプトアビジン、
糖およびレクチン、
酵素および補助因子、
核酸および相補性核酸、および
核酸類似体および相補性核酸、
からなる群から選択される、キット。
【請求項２】
トレハロースの濃縮溶液で処理され、乾燥させた、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
Ａβ４０および／またはＡβ４２ペプチドを含む試料をさらに含んでなる、請求項１〜２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４】
結合対の第二の成員が酵素タグに結合している場合には、上記酵素によって検出可能な産物に転換することができる基質をさらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５】
測定または検出しようとするターゲットポリペプチドがＡβ４０、Ａβ４２またはそれらの混合物の群から選択される、試料中のポリペプチドを測定または検出するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキットの使用。
【請求項６】
試料が血液、血漿、血清またはＣＳＦの群から選択される、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
被験者における変性疾患の診断のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項８】
被験者における変性疾患の診断のための、請求項５〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
変性疾患が神経変性疾患である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
試料中のＡβ４２、Ａβ４０およびそれらの混合物の群から選択されるターゲットポリペプチドの量を測定または検出する方法であって、
（ｉ）  試料中に含まれるターゲットポリペプチドを、ターゲットポリペプチドに特異的に結合する第一の抗体または抗体の組合せで捕捉し、ここで、第一の抗体が、Ａβ４０およびＡβ４２のアミノ酸１〜１６内に配置されたエピトープに対して指定され、ここで第一の抗体が固形支持体に予め固定されており、
（ii）  段階（i）で形成した免疫複合体を、第一の抗体または抗体の組合せによって認識される領域とは異なるターゲットポリペプチドの領域を認識する第二の抗体または抗体の組合せと接触させ、
（iii)  段階（ii）で形成した複合体を、第二の抗体にアフィニティーを示しかつ結合対の第一の成員に結合している試薬と接触させ、
（iv）  段階（iii）で形成した複合体を、蛍光、発光または酵素タグに結合している結合対の第二の成員と接触させ、
（ｖ）  結合対の第二の成員に結合したタグの活性または量を検出または測定する段階を含んでなり、
ここで結合対が、
ハプテンおよび抗体、
抗原および抗体、
ビオチンおよびアビジン、
ビオチンおよびストレプトアビジン、
ビオチン類似体およびアビジン、
ビオチン類似体およびストレプトアビジン、
糖およびレクチン、
酵素および補助因子、
核酸および相補性核酸、および
核酸類似体および相補性核酸、
からなる群から選択される、方法。
【請求項１２】
第一の抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１３】
第一の抗体がモノクローナル抗体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
モノクローナル抗体が６Ｅ１０ ｍＡｂである、請求項１２に記載のキット。
【請求項１５】
モノクローナル抗体が６Ｅ１０ ｍＡｂである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
第二の抗体が、
（ｉ）  Ａβ４０と実質的交差反応を全く行うことなくＡβ４２に特異的に結合するＡβ４２ペプチドのＣ末端領域に対応するペプチドに対して調製した、ポリクローナル抗体、
（ii）  Ａβ４２と実質的交差反応を全く行うことなくＡβ４０に特異的に結合するＡβ４０ペプチドのＣ末端領域に対応するペプチドに対して調製した、ポリクローナル抗体、および
（iii)  Ａβ４０およびＡβ４２の両方のＣ末端領域を同時に認識する、抗体、および
（iv）  （ｉ）および（ii）に記載の抗体の組合せ
の群から選択される抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１７】
第二の抗体が、
（ｉ）  Ａβ４０と実質的交差反応を全く行うことなくＡβ４２に特異的に結合するＡβ４２ペプチドのＣ末端領域に対応するペプチドに対して調製した、ポリクローナル抗体、
（ii）  Ａβ４２と実質的交差反応を全く行うことなくＡβ４０に特異的に結合するＡβ４０ペプチドのＣ末端領域に対応するペプチドに対して調製した、ポリクローナル抗体、
（iii)  Ａβ４０およびＡβ４２の両方のＣ末端領域を同時に認識する、抗体、および
（iv）  （ｉ）および（ii）に記載の抗体の組合せ
の群から選択される抗体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
第二の抗体の調製に用いるＡβ４２ペプチドのＣ末端領域が、配列番号１、配列番号２の群から選択されるペプチドであるか、または第二の抗体の調製に用いるＡβ４０ペプチドのＣ末端領域が、配列番号３の群から選択されるペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１９】
第二の抗体の調製に用いるＡβ４２ペプチドのＣ末端領域が、配列番号１、配列番号２の群から選択されるペプチドであるか、または第二の抗体の調製に用いるＡβ４０ペプチドのＣ末端領域が、ペプチド配列番号３の群から選択されるペプチドである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
第一および／または第二の抗体が、それらの調製に用いられるポリペプチドの配列を含んでなるポリペプチドを用いてアフィニティー精製されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２１】
第一および／または第二の抗体が、それらの調製に用いたポリペプチドの配列を含んでなるポリペプチドを用いてアフィニティー精製されている、請求項１７および１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
第二の抗体にアフィニティーを示す試薬が、抗ＩｇＧ抗体、プロテインＡもしくはプロテインＧ、または機能的に同等なそれらの変異体の群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２３】
第二の抗体にアフィニティーを示す試薬が抗ＩｇＧ抗体、プロテインＡまたはプロテインＧ、または機能的に同等なそれらの変異体の群から選択される、請求項１７、１９および２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
結合対の第一の成員が、ビオチンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２５】
結合対の第一の成員が、ビオチンである、請求項１７、１９、２１および２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
結合対の第二の成員が、アビジン、ストレプトアビジンまたは機能的に同等なそれらの変異体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２７】
結合対の第二の成員が、アビジン、ストレプトアビジンまたは機能的に同等なそれらの変異体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
試料が血液、血漿、血清またはＣＳＦの群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２９】
生物学的試料が血液、血清、血漿およびＣＳＦの群から選択される、請求項１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５および２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
被験者の変性疾患の検出方法であって、
患者の試料中のＡβ４０またはＡβ４２の量を請求項１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７および２９のいずれか一項に記載の方法を用いて測定し、被験者の試料中の一方または両方のペプチドの濃度を、変性疾患の外観を有する健康な個体由来の試料中のペプチドまたはペプチド類の濃度に関して相関させることを含んでなる、方法。
【請求項３１】
変性疾患が神経変性疾患である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
神経変性疾患がアルツハイマー病であり、試料中の量Ａβ４０および／またはＡβ４２ペプチドが健康な個体から得た同一起源由来の生物学的試料中の上記ペプチドまたはペプチド類の量より低い場合には、被験者はアルツハイマー病に罹っていることを示す、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
Ａβ４０および／またはＡβ４２を検出しようとする試料が血漿または血清試料である、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のペプチドおよびタンパク質の検出を可能にしかつ当該技術分野の状態のアッセイより高感度を提供するイムノアッセイの分野に関する。本発明は、上記イムノアッセイを行うのに必要な構成要素を提供するキットにも関する。
【発明の背景】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、進行性で増大する記憶喪失に続いて四肢および身体機能の制御を喪失し、最終的には死にいたることを特徴とする中枢神経系の進行性の退行性疾患である。これは、６５歳の年齢を超えるヒトの１〜６％および８０歳を越えるヒトの１０〜２０％が罹っている痴呆の極めてよく見られる原因である。
【０００３】
ＡＤは、ニューロン間の細胞外空隙における老人斑が患者の脳に徐々に出現するなどの幾つかの病理学的特徴によって他の種類の痴呆と区別される。これらの斑は、主として退行神経炎およびグリア細胞で取り囲まれたアミロイドβペプチド（Ａβ）と呼ばれる４０〜４２アミノ酸ペプチドの原繊維によって形成されたアミロイド沈着物の中心コアを有する。このペプチドは、βアミロイド前駆体タンパク質（βＡＰＰ）と呼ばれる前駆体タンパク質のタンパク分解プロセシングにより生じる。βＡＰＰは、βＡＰＰをコードする遺伝子の一次転写産物の選択的スプライシングにより誘導される様々なアイソフォームとして生体に見出される。これらのアイソフォームは、主としてＢＡＰＰ−６９５、ＢＡＰＰ−７５１およびＢＡＰＰ−７７０であり、ここで数字はアミノ酸の数を表す。βＡＰＰ遺伝子はヒトでは染色体２１に見出され、その三染色体性（ダウン症候群）は患者の脳においてタンパク質の過剰発現およびアミロイド斑の早期出現を生じる(Selkoe D.J. (2001) Physiol. Rev. 81, 741-766)。βＡＰＰは膜貫通タンパク質であり、様々なタンパク分解酵素（セクレターゼ）によって処理して様々な産物を生じることができる。通常は、βＡＰＰはその細胞外領域におけるαセクレターゼによって開裂を受け、長い可溶性の分泌断片とＣ８３と呼ばれる短い膜結合断片とを生じ、後者は更にγ−セクレターゼによって更に開裂を受けてｐ３ペプチド（ｐ３４０またはｐ３４２）と５７または５９ペプチドを産生し、これは更に他のプロテアーゼによって分解される。βＡＰＰがβ−セクレターゼによって開裂されるときには、可溶性分泌断片（ｓＢＡＰＰ−β）とＣ９９断片を生じ、これはγ−セクレターゼで開裂してアミロイドペプチドＡβと膜に結合した５７または５９アミノ酸ペプチドを得ることができる(Selkoe D.J. (2001) Physiol. Rev. 81, 741-766)。
【０００４】
ＡＤは、早期発症（６０歳を未満の年齢）および後期発症（６０歳を上回る年齢）のような出現の年齢によって、家族性(familiar)ＡＤまたは散発性ＡＤのような常染色体(autosomic)優性遺伝の存在によって分類することができる。早期発症する家族性の型のＡＤは、βＡＰＰ、プレセニリン１およびプレセニリン２（それぞれ染色体２１、１４および１に配置されている）をコードする遺伝子で知られている突然変異に関連付けることができる。これらの分類は、相互に相容れないものではない。最も頻繁に見られる型は、散発性の後期発症型である。
【０００５】
臨床応用では、ＡＤの診断は、ニューロイメージング法および血液分析を用いる典型的な臨床上の特徴の存在および他の種類の痴呆の除外に基づく臨床基準を用いて行われる。これらの基準を用いると、診断上の信頼性は許容可能なものであるが、脳生験を用いて行った研究によれば、ＡＤであると診断された患者の１０〜２０％は別の疾患に罹っていた。更に、神経変性過程が進行して患者が重度の痴呆に罹っておりかつ脳の損傷が広範囲であり治療方法が限定されるときには、最新の診断方法しか行うことができない。最終的診断には、死後の脳組織の病理学的検査が必要である。
【０００６】
従って、感受性が高く特異的でありかつ年齢による認識障害を過程の初期症状と関連したものから区別し、並びにＡＤによる変化と他の変性疾患による変化とを区別することができるＡＤの早期診断のためのバイオマーカーを同定する必要がある。Growdon et al. (Neurobiol. Aging, 1998, 19:109-116)によれば、ＡＤの理想的マーカーは、下記の
−  神経病理学の基本的特徴を検出し、
−  疾患の神経病理学的に確認された症例で実証され、
−  ＡＤの検出に少なくとも８０％の感度を示し、
−  ＡＤを他の型の痴呆から区別するのに少なくとも８０％の特異性を有し、
−  信頼性が高く、再現性があり、非侵襲性であり、実施が容易であり、費用がかからない
という要件を満たすものでなければならない。
【０００７】
患者の脳またはＣＳＦに存在するバイオマーカーのレベルを検出することによるＡＤの診察方法は、従来技術で知られている。測定をＣＳＦで行う様々なバイオマーカーが報告されている。ＣＳＦは中枢神経系の細胞外間隙の組成を直接半円しており、従ってバイオマーカーとして一層高い濃度を提供する。しかしながら、ＣＳＦは腰椎穿刺(lumbar punction)によってのみ採取することができ、痴呆に罹っている患者には容易に受け容れられる日常的診断法ではないのであり、ましてや記憶障害の患者にとってはそうである。従って、身体から非侵襲的に採取することができる試料で検出することができるＡＤバイオマーカーが必要とされている。
【０００８】
従来技術で報告されておりかつ血漿で検出することができるＡＤバイオマーカーとしては、（ｉ）アミロイド斑由来のマーカー、（ii）ＡβまたはβＡＰＰに対する自己抗体、（iii）ＩＬ−６、その受容体またはｇｐｌ３０、Ｃ−反応性タンパク質、または酸化ストレス（イソプロスタン）のような炎症マーカー、（iv）脂質代謝のマーカー（ａｐｏＥ、オキシステロール）、および（ｖ）脈管疾患マーカー（ホモシステイン、リポプロテインｂ  Ｃｌｑ）が挙げられる(Scheuner D et al. (1996) Nature Med 2, 864-870)。
【０００９】
しかしながら、ＡβがＡＤ患者の脳に蓄積し、ＡＤの病因の中心的要素であることを考慮すれば、このタンパク質はＡＤバイオマーカーとして最も好適な候補であると考えられた。しかしながら、ＡβをＡＤの血漿バイオマーカーとしての使用は、血清中のＡβペプチド（Ａβ（１−４０）およびＡβ（１−４２））の濃度は極めて低いため、上記ペプチド種の信頼性のある検出を行うのに十分な感度がある分析法はない。
【００１０】
Scheuner et al (Nature Med., 1996, 2:864-870)は、プレセニリン１、プレセニリン２またはβＡＰＰの細胞外濃度が家族性(familiar)ＡＤに関連した突然変異を有する家族由来の患者で増加するかどうかを検出する目的で予備検討を行った。高レベルのＡβ１−４２（４３）がＦＡＤ関連ＰＳ１（Ｐ＜０．０００１）、ＰＳ２Ｎ１４１１（Ｐ＝０．００９）、ＡＰＰＫ６７０Ｎ，Ｍ６７１Ｌ（Ｐ＜０．０００１）およびＡＰＰＶ７１７１（１被験者）突然変異を有する被験者の血漿で観察されたが、これらの研究は血清中のＡβペプチド濃度がずっと低い散発性ＡＤの分析については確認されなかった。この文献で用いた分析キットはSuzuki, N. et al. (Science, 1994, 264:1336-1340)によって以前に報告されたＥＬＩＳＡサンドイッチ分析法であり、これは捕捉抗体とペルオキシダーゼ接合検出抗体である。
【００１１】
Ａβレベルと散発性ＡＤとの間に相関はないことが示唆されている。従って、Tamaoka A et al. (J Neural Sci, 1996, 141, 65-68)は、２８名の散発性ＡＤの患者と、４０名の別の神経学的経過の見られる痴呆の患者、および４０名の健康な対照の血漿中のＡβレベルを測定した。著者らは、Ａβ４０およびＡβ４２の血漿レベルは対照被験者と散発性ＡＤの患者とで同様であると結論した。同様な結果は、Kosaka et al.によって得られている (Neurology, (1997) 48, 741-745)。Tamaokaと協同研究者らが用いた分析法は、血漿中のＡβ１−４０の測定についてＷＯ２００７２２０１５号明細書にも記載されている。この分析法はＥＬＩＳＡサンドイッチ分析法であって、Ａβ４０およびＡβ４２ペプチドは１Ａ１０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いて固形支持体上に捕捉され、ペルオキシダーゼ接合１４Ｆ１ ｍＡｂを用いて検出される。この分析法は、１桁のｐｇ／ｍｌの範囲の感度レベルを提供する。
【００１２】
Vanderstichele H et al. (Amyloid, 2000, 7, 245-258)は、１２名の健康な対照、３９名のＡＤ患者および６名のレヴィー小体痴呆の患者、１０名の他の型の痴呆患者および９名の痴呆を示さない他の神経学的病因を有する患者のＣＳＦ、血漿および尿中のＡβ（１−４２）のレベルを測定したが、Ａβ（１−４２）レベルと診断、性別またはＭＭＳＥ結果との間には相関は見られなかった。この検討については、ＥＬＩＳＡサンドイッチ分析法に基づくＩＮＮＯＴＥＳＴ β−アミロイド（１−４２）試験が用いられ、Ａβ（１−４２）はＡβ（１−４２）のＮ末端領域を認識する２１Ｆ１２ ｍＡｂを用いて固形支持体に捕捉され、Ａβ（４２）のＣ末端領域とＨＲＰに結合したストレプトアビジンを認識するビオチン化３Ｄ６ ｍＡｂを用いて検出される。
【００１３】
Fukomotoと協同研究者ら(Arch. Neurol. 2003, 60, 958-964)は、１４６名のＡＤ患者、３７名の軽度の認識障害の患者および９６名のパーキンソン病の患者における血漿Ａβ４０およびＡβ４２レベルの様々な臨床、人口および遺伝学的変数に関する相関を検討した。これらの結果は、年齢と共に有意な増加があるが、診断、家族経歴、ＡｐｏＥ遺伝子型、またはアセチルコリンエステラーゼ阻害剤またはスタチンのような様々な薬剤による治療に関しては差はないことを示していた。測定は、Ａβのアミノ酸１１−２８を認識するｍＡｂ（ＢＮＴ７７）およびＡβ４０およびＡβ４２を特異的に認識するＨＲＰ結合ｍＡｂ（ＢＡ２７およびＢＣ０５  ｍＡｂ）を用いるＥＬＩＳＡサンドイッチ分析法を用いて行った。
【００１４】
Mehta et al. (Arch. Neural. 57, 2000, 100-105)は、７８名のＡＤ患者および６１名の健康な対照における血漿およびＣＳＦ  Ａβ４０およびＡβ４２レベルを測定し、Ａβ４０血漿レベルはＡｐｏＥ４対立遺伝子を持たない対照群よりも上記対立遺伝子を有するＡＤ患者で高く、Ａβ４２レベルはＡＤ患者と対照との間で同様であり、セックス・オ・ミニ・メンタル・ステート・検査(sex o mini mental state examination; MMSE)スコアに関しては差はなかった。測定は、捕捉抗体としての抗Ａβ  ｍＡｂ  ６Ｅ１０およびＡβ４２およびＡβ４０に特異的なペプチドに対して生じたビオチン化抗血清を用いるＥＬＩＳＡサンドイッチ分析法を用いて行った。
【００１５】
Mayeux, R. et al. (Ann Neural. 1999, 46, 412-416)は、Mehta et al. (Arch. Neural. 57, 2000, 100-105)と同じＥＬＩＳＡ分析法を用いて被験者（５３０名）のコホートおよび１８ヶ月後（３０７名の被験者）における血漿Ａβ４０およびＡβ４２レベルを測定した。上記著者らは、ＡＤを発症した被験者が検討中にＡＤを発症しなかった被験者より高いＡβ４２レベルを有することを観察した。Ａβ４２レベルは、ＡＤ診断の確定の３年後に減少した。ＡＤ表現型に関しては、差は見られなかった。
【００１６】
Lanz, T.A and Schacthter, J.B. (J. Neuroscience Methods, 2006, 157:71-81)は、Ａβペプチドの総含量またはＡβ４０およびＡβ４２ペプチドの個々の量を検出する目的で比色および蛍光ＥＬＩＳＡサンドイッチ分析法を報告している。Ａβペプチドの総量の検出には、Ａβペプチドの捕捉に６Ｅ１０  ｍＡｂを用い、次いでビオチン化４Ｇ８およびユーロピウム接合ストレプトアビジンまたはＨＲＰ−ストレプトアビジンを用いて検出する。Ａβ４０およびＡβ４２ペプチドの量の検出には、６Ｅ１０  ｍＡｂを捕捉抗体として、および断片のそれぞれに特異的なビオチン化ウサギポリクローナル抗体に続いてユーロピウム接合ストレプトアビジンまたはＨＲＰ−ストレプトアビジンを用いる。しかしながら、この方法の最低検出限界は１０ｐｇ／ｍｌであり、脳抽出物中のＡβの測定のみに用いられた。
【００１７】
ＷＯ２００７５０３５９号には、Ａβ４２の多重結合形態を検出するためのイムノアッセイであって、多重結合形態に特異的なポリクローナル抗体を用いるＡβ４２由来ペプチドの捕捉およびｍＡｂおよびＨＲＰ接合抗マウスＩｇＧを用いて結合したペプチドの量の検出を含むイムノアッセイが記載されている。しかしながら、この分析法の検出限界は、１０００〜３０００ｐＭであり、４０００ｐｇ／ｍｌに相当する。
【００１８】
ＷＯ０１６２８０１号には、コーティング抗体として３Ｄ６  ｍＡｂ抗Ｎ末端および検出のための成熟Ａβのアミノ酸１５〜２４を認識するｍＡｂを用いるＡβを測定するためのＥＬＩＳＡサンドイッチ分析法が記載されているが、１００〜２００ｐｇ／ｍｌの範囲内のＡβ濃度値の測定にのみ用いられる。
【００１９】
ＷＯ０３１５６１７号には、成熟Ａβペプチドのアミノ酸１３〜２８を認識するが、２５０〜４００ｐｇ／ｍｌの範囲の上記ペプチドの濃度のみを検出することができ、従って家族性ＡＤの血漿中のＡβの測定のみに好適である抗体を用いる血漿中のＡβ４０およびＡβ４２を測定するためのＥＬＩＳＡ分析法が記載されている。
【００２０】
ＷＯ０２４６２３７号には、捕捉抗体としてＡβ４２のアミノ酸１３〜２８に特異的なｍＡｂおよびＡβ４２ペプチドのＮ末端領域に特異的なビオチン化３Ｄ６  ｍＡｂに続いてペルオキシダーゼに接合したストレプトアビジンを用いる脳ホモジェネートの総Ａβ種（Ａβ４０およびＡβ４２）を測定するためのＥＬＩＳＡサンドイッチ分析法が記載されている。この明細書には、捕捉抗体としてＡβ４２のアミノ酸３３〜４２に特異的なｍＡｂ  ２１Ｆ１２および検出抗体としてビオチン化３Ｄ６  ｍＡｂを用いるＡβ４２特異的ＥＬＩＳＡサンドイッチ分析法も記載されている。しかしながら、これらの分析法は感度レベルが低く、総Ａβ分析法については５０ｎｇ／ｍｌであり、Ａβ４２特異的分析法については１２５ｍｇ／ｍｌであり、血漿または血清中の総ＡβまたはＡβ４２の測定には不適である。
【００２１】
ＷＯ０４１３１７２号明細書には、検出抗体としてｍＡｂ  ３Ｄ６および捕捉抗体として成熟Ａβペプチドの様々な領域に特異的なポリクローナル抗体を用いるギ酸脳抽出物およびＣＳＦ中のβ−アミロイド（１−４２）を測定するためのＥＬＩＳＡサンドイッチ分析法が記載されている。
【００２２】
しかしながら、これまでに知られている総てのＥＬＩＳＡに基づく分析法は最小検出限界が高々１桁のｐｇ／ｍｌであり、ＣＳＦ中のＡβ４０およびＡβ４２の検出並びに家族性ＡＤの患者の血漿中の上記種の検出には十分であるが、散発性ＡＤの患者の血漿中のＡβ４２の検出には不適であり、Ａβ４２血漿濃度はずっと低いのである。特に、ＩＮＮＯＴＥＳＴ  βアミロイド（１−４２）試験の最小検出限界は２０ｐｇ／ｍｌであり、家族性ＡＤの患者のＣＳＦ並びに血漿測定におけるＡβ４２の検出は可能であるが、血漿中のＡβ４２がずっと低いレベルである散発性ＡＤの患者におけるＡβ４２の検出には感度が十分でない。このキットは、ＣＳＦ中のＡβペプチドレベルの測定にしか勧められない。この提案は、ＣＳＦ中のペプチドレベルが血漿中より１００〜１０００倍高いことが示されているＩＮＮＯＴＥＳＴ  β−アミロイド（１−４２）を用いる最近の研究によっても確認されている(Lewczuk, P et al. (2004) Neurobiol. Aging 25, 273-281)。
【００２３】
もう一つの市販のキットは、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  βアミロイド（１−４０）およびβアミロイド（１−４２）キットである。これらのキットは、ペプチドを成熟ペプチドのアミノ末端に対して指定されたｍＡｂを用いて支持体に捕捉し、成熟βペプチドのＣ末端領域と反応するウサギポリクローナル抗体および抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼを用いて検出するＥＬＩＳＡサンドイッチ分析法を提供する。このキットは、製造業者によれば１０ｐｇ／ｍｌ未満の感度を有するが、１５．６−１０００ｐｇ／ｍｌの範囲のＡβ濃度の検出に用いられる。Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅキットは、血清、ＣＳＦおよび細胞培養物中のＡβペプチドの検出に製造業者によって推奨されている。しかしながら、散発性ＡＤ患者の血清中の平均Ａβ４０およびＡβ４２レベルはこれらの分析法の最小検出限界を下回っており、それらを血清中の測定に用いることはできないと思われる。
【００２４】
カナダ国特許出願（ＣＡ２５８５１４８）であって、国際特許出願ＷＯ２００６４６６４４号に対応する明細書には、最小検出限界が０．５ｐｇ／ｍｌであるＡβペプチド分析法のみが記載されている。この明細書で用いられている分析法は、電気化学発光（ＥＣＬ）サンドイッチ分析法であって、ｍＡｂ  ２１Ｆ１２（Ａβ４２のアミノ酸３３−４２を認識する）を磁性ビーズに結合させた後、Ａβ４２を含む試料中のＡβ４２ペプチドの捕捉に用い、更にルテニウム錯体に結合した３Ｄ６  ｍＡｂと接触させる方法である。次に、結合した３Ｄ６抗体の量を、電気エネルギーを加えたときにルテニウム錯体によって放射されるルミネッセンスによって検出する。この分析法を用いて、発明者らはＡβ４２標準を０．５ｐｇ／ｍｌ程度まで検出することができる。しかしながら、同じ分析法を用いてＡＤ患者および健康な対照由来の血漿試料中のＡβ４２を比較すると、２つの組の患者には有意差は見られないことから、血清中の完全なＡβ４２の量は分解によって極めて低いと結論され、最小感度レベルがｎｇ／ｍｌの範囲となる２１Ｆ１２  ｍＡｂを用いる競合ＥＬＩＳＡ分析法に変更した。
【００２５】
従って、特に、散発性ＡＤの患者の血漿で高い信頼性でＡβペプチドを検出するのに十分な感度を有する当該技術分野で知られている方法およびキットの問題点を解決するＡβ由来のペプチドを検出するための改良された免疫学的分析法およびキットが当該技術分野で求められている。
【発明の概要】
【００２６】
第一の態様では、本発明は、Ａβ４２、Ａβ４０およびそれらの混合物の群から選択されるターゲットポリペプチドの検出用キットであって、
（ｉ）  上記ターゲットポリペプチドを認識する、第一の抗体または抗体の組合せ、
（ii）  第一の抗体または抗体の組合せによって認識される領域以外のターゲットポリペプチドの領域を認識する、第二の抗体または抗体の組合せ、
（iii)  結合対の第一の成員に結合している第二の抗体にアフィニティーを示す試薬、および
（iv）  検出可能タグに結合した結合対の第二の成員
を含んでなる、キットに関する。
【００２７】
第二の態様では、本発明は、試料中のターゲットポリペプチドを測定または検出し並びに被験者の神経変性疾患の診断のための本発明のキットの使用に関する。
【００２８】
第三の態様では、本発明は、試料中のＡβ４２、Ａβ４０およびそれらの混合物の群から選択されるターゲットポリペプチドの量を測定または検出する方法であって、
（ｉ）  試料中に含まれるターゲットポリペプチドを、ターゲットポリペプチドに特異的に結合する第一の抗体または抗体の組合せで捕捉し、
（ii）  段階（ａ）で形成した免疫複合体を、第一の抗体または抗体の組合せによって認識される領域とは異なるターゲットポリペプチドの領域を認識する第二の抗体または抗体の組合せと接触させ、
（iii） 段階（ii）で形成した複合体を、第二の抗体にアフィニティーを示しかつ結合対の第一の成員に結合している試薬と接触させ、
（iv）  段階（iii）で形成した複合体を、検出可能タグに結合している結合対の第二の成員と接触させ、
（ｖ）  結合対の第二の成員に結合した検出可能タグの活性または量を検出しまたは測定する
段階を含んでなる、方法に関する。
【００２９】
第四の態様では、本発明は、被験者の変性疾患の診断方法であって、患者の試料中のＡβ４０またはＡβ４２の量を本発明による方法を用いて測定し、被験者の試料中の一方または両方のペプチドの濃度を変性疾患の外観を有する健康な個体由来の試料中のペプチドまたはペプチド類の濃度に関して相関させることを含んでなる、方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ＥＬＩＳＡサンドイッチ分析法の標準滴定曲線であって、４５０ｎｍにおける吸光度の値をＡβ４０の標準調製物の既知濃度（ｐｇ／ｍｌ）に対してプロットしたもの。
【図２】ＥＬＩＳＡサンドイッチ分析法の標準滴定曲線であって、４５０ｎｍにおける吸光度の値をＡβ４２の標準調製物の既知濃度（ｐｇ／ｍｌ）に対してプロットしたもの。
【発明の具体的な説明】
【００３１】
本発明者らは、驚くべきことに、特許請求の範囲の請求項１に記載の成分を有するキットを用いることによって、Ａβ４０およびＡβ４２のレベルを最小検出限界が０．１  ｐｇ／ｍｌで測定することができることを見出した。このキットにより、血漿濃度が極めて低く、信頼性のある測定はこれまでは可能ではなかった任意の被験者の任意の試料、特に散発性ＡＤに罹っていることが疑われる被験者の血漿中の上記分子種を高い信頼性で定量することができる。
【００３２】
従って、第一の態様では、本発明は、Ａβ４２、Ａβ４０およびそれらの混合物の群から選択されるターゲットポリペプチドの測定または検出用キットであって、
（ｉ）  上記ターゲットポリペプチドを認識する、第一の抗体または抗体の組合せ、
（ii）  第一の抗体または抗体の組合せによって認識される領域以外のターゲットポリペプチドの領域を認識する、第二の抗体または抗体の組合せ、
（iii)  結合対の第一の成員に結合している第二の抗体にアフィニティーを示す試薬、および
（iv）  検出可能タグに結合した結合対の第二の成員
を含んでなる、キットに関する。
【００３３】
任意の特定の理論によって束縛しようとするものではないが、感度の向上は検出抗体から生じるシグナルを増幅することができる試薬（iii）の使用によると思われる。
【００３４】
本明細書で用いられる「Ａβ４２」は、アミノ酸６７２−７１３（配列番号４）に対応しかつβ−およびγ−セクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク質（配列番号６）の逐次タンパク分解開裂によって生成する４２アミノ酸ペプチドに関する。
【００３５】
本明細書で用いられる「Ａβ４０」は、アミノ酸６７２−７１１（配列番号５）に対応しかつβ−およびγ−セクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク質（配列番号６）の逐次タンパク分解開裂によって生成する４０アミノ酸ペプチドに関する。
【００３６】
本発明において、第一の抗体は「捕捉抗体」と呼ばれ、この抗体は、試料からこの抗体が特異的に結合する総ての分子種を回収するのに用いられることを意味する。Ａβ４０および／またはＡβ４２に特異的な少なくとも１個の抗原結合部位を含む限り捕捉抗体として用いることができる抗体の種類に関しては、実際上制限はない。従って、捕捉抗体としての使用に好適な抗体分子としては、下記のものを包含する：
−  抗原結合可変領域並びに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含んでなる「完全な」抗体、
−  完全な抗体のパパイン消化により生じかつ単一の抗原結合部位とＣＬおよびＣＨ１領域とを含んでなる「Ｆａｂ」断片、
−  完全な抗体のペプシン消化によって生じかつ２個の抗原結合部位を含む「Ｆ（ａｂ’）２」断片、
−  「Ｆａｂ’」断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）を含みかつ１個の抗原結合部位だけを有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１個以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に小数の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。
−  「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を有する最小抗体断片である。この領域は、タイトな非共有的会合での１個の重鎖と１個の軽鎖可変ドメインとの二量体からなっている。それぞれの可変ドメインの３個の超可変領域（ＣＤＲ）が相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を画定するのは、この配置である。集合的には、６個の超可変領域は抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３個の超可変領域だけを含んでなるＦｖの半分）であっても抗原を認識して結合する能力を有するが、全結合部位よりアフィニティーは低い。
−  一本鎖ＦＶまたは「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のドメインＶＬおよびＶＨを含んでなり、これらのドメインは一本のポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、ＶＬおよびＶＨ領域は、ｓｃＦｖが抗原結合に対して所望な構造を形成できるようにするポリペプチドリンカーによって結合されている。
−  「ジアボディー」は、短すぎて同一鎖上の２個のドメインが対を形成することができないペプチドリンカーによって結合した同一ポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）上の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含んでなる。これにより、別の鎖の相補性ドメインと対が形成され、２個の官能性抗原結合部位による二量体分子の集合が促進される。
−  「二重特異性抗体」（ＢＡｂ）は、２個の異なる特異的抗原結合部位を有する単一の二価抗体（または免疫治療上有効なその断片）である。２個の抗原部位は、化学的にまたは当該技術分野で知られている遺伝子工学の方法によって互いに結合させることができる。
【００３７】
これら総ての抗体断片は、当該技術分野で知られている通常の手法を用いて、例えば、当該技術分野で知られている（複数の）アミノ酸欠失、挿入、置換、付加および／または組換え（および／または任意の他の修飾（例えば、グリコシル化およびリン酸化のような翻訳後および化学修飾）を用いることによって更に修飾することができる。免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列の基礎となるＤＮＡ配列に上記のような修飾を導入する方法は、当業者には周知であり、例えば、Sambrook et al.; 「分子クローニング: 実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版 1989年および第3版2001年を参照されたい。
【００３８】
捕捉抗体として好適な抗体としては、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方が挙げられる。ポリクローナル抗体の産生には、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、ヒト、トリなどの様々な宿主に、免疫原性を有するＡβ４０またはＡβ４２の断片に相当するペプチドを投与することによって免役することができる。宿主の種によっては、様々なアジュバントを用いて、免疫応答を増加させることができる。このようなアジュバントとしては、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのような無機ゲル、リゾレシチン、ポリアニオン、ペプチド、油エマルション、ＫＬＨおよびジニトロフェノールのような界面活性物質が挙げられるが、これらに限定されない。ヒトで用いられるアジュバントの中では、ＢＣＧ (bacilli Calmette-Guerin)およびCorynebacterium parvumが特に好ましい。抗原がペプチドである場合には、免疫を行う種において免疫原性であるタンパク質に接合させるのが有用であることがある。例えば、抗原は、二官能価または誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介して接合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介して接合）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸またはＳＯＣｌ２を用いてキーホール・リンペット・ヘモシアニン(keyhole limpet hemocyanin; KLH)、ブルー・キャリヤー(Blue Carrier; Concholepas concholepasから単離されるヘモシアニン)、ウシチログロブリンまたは大豆トリプシン阻害剤に接合させることができる。
【００３９】
モノクローナル抗体の産生には、通常の手法を用いることができる。例えば、モノクローナル抗体は、Ausubel, F. M. et al. (「分子生物学の最新のプロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」, John Wiley & Sons Inc; 輪綴版, 2003)のユニット11.4-11.11に詳細に記載されている手順を用いるKohler et al, Nature, 256:495 (1975)によって最初に報告されたハイブリドーマ法を用いて作製することができる。あるいは、モノクローナル抗体は、McCafferty et al., Nature, 348:552- 554 (1990)に記載の手法を用いて生成した抗体ファージライブラリーから組換えDNA法によって単離することができる。Clacksoii et al., Nature, 352:624-628 (1991)およびMarks et al., J. MoI. Biol, 222:581-597 (1991)には、ファージライブラリーを用いるそれぞれネズミおよびヒト抗体の単離が記載されている。下記の公表文献には、鎖シャフリング(Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992))、並びに極めて大きなファージライブラリーを構築する方法として組合せ感染およびイン・ビボ組換え(Waterhouse et al., Nucl. Acids. Res., 21 :2265-2266 (1993))による高アフィニティー(nM範囲)ヒト抗体の産生が記載されている。従って、これらの手法は、モノクローナル抗体の単離を目的とする伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法の実行可能な代替法である。
【００４０】
ポリクローナル抗体は、出血およびフィブリンクロットの除去後に免疫した宿主から得られる抗血清として直接用いることができる。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養物の上清としてまたは適当な宿主の腹膜腔にハイブリドーマを移植した後の腹水として直接用いることができる。あるいは、免疫グロブリン分子は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれでも、それらの使用前に、Ａβ４０またはＡβ４２由来のペプチドを用いるアフィニティー精製、非変性ゲル精製、ＨＰＬＣまたはＲＰ−ＨＰＬＣ、サイズ排除、プロテインＡカラムでの精製、またはこれらの手法の任意の組合せなどの通常の手段によって精製することができる。
【００４１】
好ましい態様では、捕捉抗体はＡβ４０およびＡβ４２に共通の領域を認識するので、両種を単一の抗体種で同時に捕捉することができる。原則として、Ａβ４０とＡβ４２との両方の配列に共通の領域に特異的な任意の抗体を、捕捉抗体として用いることができる。捕捉抗体によってターゲットとすることができる好ましいエピトープとしては、Ａβ４０またはＡβ４２のアミノ酸１〜１６、１〜１７、１３〜２８、１５〜２４、１〜５および１〜１１中に配置されたエピトープが挙げられる。更に好ましい態様では、捕捉抗体はＣ末端領域とは異なるＡβ４０および／またはＡβ４２の領域に対して指定される。更に一層好ましい態様では、捕捉抗体はＡβ４０およびＡβ４２ペプチドのＮ末端領域のエピトープに対して指定される。更にもう一つの好ましい態様では、捕捉抗体はモノクローナル抗体である。更に一層好ましい態様では、捕捉抗体はＡβペプチドのアミノ酸１〜１６に対応する領域を認識する。更に一層好ましい態様では、捕捉抗体として用いられるモノクローナル抗体はKim, K.S. (Neuroscience Res. Comm. 1988, 2:121- 130)に記載されている６Ｅ１０ ｍＡｂである。
【００４２】
本発明のキットの第二の成分は、第一の抗体または抗体の組合せによって認識される領域以外の異なるターゲットポリペプチドの領域を認識する抗体または抗体の組合せに相当する。本発明に関して、第二の抗体は、捕捉抗体によって保持されていた抗原の量を検出するのに用いられるので、この抗体は「検出抗体」と呼ばれる。
【００４３】
捕捉抗体の場合と同様に、検出抗体として用いることができる抗体の種類に関しては事実上制限はない。しかしながら、当業者であれば、検出抗体は、捕捉抗体によって捕捉された抗原に結合している抗体を検出することができるようにするには、（ｉ）捕捉抗体によってカバーされない抗原の領域に結合しなければならず、かつ（ii）抗原結合部位のみならず、上記抗体に高アフィニティー結合を示す試薬によって特異的に検出することができる追加領域または複数の領域をも含まなければならないことを理解するであろう。好ましくは、上記試薬が特異的に結合することができる上記追加領域は、免疫グロブリン分子の定常領域に相当する。
【００４４】
好適な検出抗体としては、完全な抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’およびＦｖ断片、一本鎖ＦＶ抗体、ジアボディー、二重特異性抗体などが挙げられ、これらの化合物は上記で定義した通りである。捕捉抗体の場合と同様に、検出抗体は、捕捉抗体について記載したのと同じ手順を用いてポリクローナルまたはモノクローナル、天然または翻訳後修飾した純粋または抗原結合分子が強化されたものであることができる。当業者であれば、検出抗体を用いるには、これを適当な作業濃度まで希釈しなければならず、かつ上記希釈物は抗体のそれぞれのバッチについて日常的に決定することができることを理解するであろう。更に、適当な作業希釈物は、抗血清を用いるか、あるいは精製ＩｇＧ画分を用いるかどうかによって異なることは明らかである。典型的な希釈物は、１／１０００、１／２０００、１／３０００、１／４０００、１／５０００、１／６０００、１／７０００、１／８０００、１／９０００、１／１００００などである。
【００４５】
好ましい態様では、検出抗体は、
（ｉ）  Ａβ４０またはＡβ４３と実質的交差反応を全く行うことなくＡβ４２に特異的に結合するＡβ４２ペプチドのＣ末端領域に対応するペプチドに対して調製した、ポリクローナル抗体、
（ii）  Ａβ４２、Ａβ３９、Ａβ３８、Ａβ４１またはＡβ４３と実質的交差反応を全く行うことなくＡβ４０に特異的に結合するＡβ４０ペプチドのＣ末端領域に対応するペプチドに対して調製した、ポリクローナル抗体、および
（iii)  Ａβ４０およびＡβ４２の両方のＣ末端領域を同時に認識する、抗体、および
（iv）  （ｉ）および（ii）に記載の抗体の組合せ
の群から選択される任意のポリクローナル抗体を含んでなる。
【００４６】
更に好ましい態様では、Ａβ４２に特異的な抗体を調製するのに用いたＡβ４２ペプチドのＣ末端領域に対応するペプチドは、配列番号１または配列番号２に記載のペプチドである。もう一つの好ましい態様では、Ａβ４０に特異的な抗体を調製するのに用いたＡβ４０ペプチドのＣ末端領域に対応するペプチドは、配列番号３に記載のペプチドである。Ａβ４０およびＡβ４２に特異的な抗体およびそれらの調製方法は、ＷＯ２００４０２４７７０号およびＷＯ２００４０９８６３１号に詳細に記載されており、上記特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。
【００４７】
当業者であれば、この方法を用いて、この方法で用いた捕捉および検出抗体の種類によってＡβ４０、Ａβ４２または両種を同時に検出することができることを理解されるであろう。
【００４８】
Ａβ４０を特異的に検出しまたは測定するには、捕捉抗体はＡβ４０（およびＡβ４２）のＮ末端領域を認識する抗体であることができ（両ペプチドは同一のＮ末端領域を有するからである）、検出抗体はＡβ４２と交差反応を全く行うことなくＡβ４０のＣ末端領域を特異的に認識する抗体であることができる。あるいは、Ａβ４０はＡβ４２と交差反応を全く行うことなくＡβ４０のＣ末端領域を認識する捕捉抗体およびＡβ４０およびＡβ４２の両方に共通であるＡβ４０の領域、好ましくはＡβ４２／Ａβ４０のＮ末端領域を認識する検出抗体を用いて特異的に検出することができる。
【００４９】
Ａβ４２を特異的に検出または測定するには、捕捉抗体はＡβ４２（およびＡβ４０）のＮ末端領域を認識する抗体であることができ（両ペプチドは同一のＮ末端領域を有するからである）、検出抗体はＡβ４０と交差反応を全く行うことなくＡβ４２のＣ末端領域を特異的に認識する抗体であることができる。あるいは、Ａβ４２はＡβ４２のＣ末端領域を認識する捕捉抗体およびＡβ４２およびＡβ４０の両方に共通であるＡβ４２の領域を認識する検出抗体を用いて特異的に検出することができる。
【００５０】
Ａβ４２およびＡβ４０を同時に検出または測定するには、捕捉抗体はＡβ４２およびＡβ４０に共通のＮ末端領域を認識する抗体であることができ、検出抗体は少なくとも２種類の抗体の組合せであることができ、第一の抗体がＡβ４０と交差反応を全く行うことなくＡβ４２のＣ末端領域を特異的に認識し、第二の抗体がＡβ４２と交差反応を全く行うことなくＡβ４０のＣ−末端領域を特異的に認識するものである。あるいは、捕捉抗体はＡβ４２およびＡβ４０に共通のＮ末端領域を認識する抗体であることができ、検出抗体はＡβ４０およびＡβ４２の両方のＣ−末端領域を認識する抗体であることができる。あるいは、Ａβ４２およびＡβ４０は、捕捉抗体としてＡβ４０と交差反応を全く行うことなくＡβ４２のＣ末端領域を特異的に認識する第一の抗体とＡβ４２と交差反応を全く行うことなくＡβ４０のＣ末端領域を特異的に認識する第二の抗体を含んでなる少なくとも２個の抗体の混合物と、Ａβ４２およびＡβ４０の両方に共通のＮ末端領域を認識する検出抗体を用いて同時に検出することができる。あるいは、Ａβ４２およびＡβ４０は、捕捉抗体として  およびＡβ４２の両方のＣ末端領域を認識する抗体と、Ａβ４２およびＡβ４０の両方に共通のＮ末端領域を認識する検出抗体とを用いて同時に検出することができる。
【００５１】
好ましい態様では、第一および／または第二の抗体または抗体の組合せは、それらの調製に用いたポリペプチドの配列を含んでなるポリペプチドを用いてアフィニティー精製した。
【００５２】
キットの第三の要素は、検出抗体にアフィニティーを示しかつ結合対の第一の成員に結合する試薬に相当する。この抗体結合試薬は抗体または抗体断片の（複数の）特定の種類、（複数の）特定のクラスおよび／または（複数の）特定のサブクラスに非共有的に結合することができる。あるいは、抗体結合試薬は、特定の抗原に特異的な抗体に非共有的に結合することができる。幾つかの態様では、抗体結合試薬は検出抗体のＦｃ領域またはＦ（ａｂ）領域に非共有的に結合する。好ましい抗体結合試薬としては、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＶ、プロテインＬ、抗Ｆｃ抗体または抗体結合断片、およびＦｃ受容体（ＦｃＲ）またはその抗体結合断片が挙げられる。検出抗体に非共有的に結合することができる抗体の非限定的例としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単一ドメイン抗体、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ′）断片、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、細胞内発現抗体、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合断片が挙げられる。Ｆｃ受容体の比限定的例としては、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡａ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、ＦｃεＲＩａ、ＦｃεＲＩξおよびＦｃγＲＩＩＩＡξが挙げられる。
【００５３】
本発明のキットの第四の要素は、検出可能タグに結合する結合対の第二の成員に相当する。好適な結合対としては、
−  ハプテンまたは抗原／抗体、例えばジゴキシンおよび抗ジゴキシン抗体、
−  ビオチンまたはビオチン類似体（例えば、アミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチン）／アビジンまたはストレプトアビジン、
−  糖／レクチン、
−  酵素および補助因子、
−  葉酸／葉酸塩、
−  タンパク質に選択的に結合する二本鎖オリゴヌクレオチド、転写因子、
−  核酸または核酸類似体／相補性核酸、
−  受容体／リガンド、例えば、ステロイドホルモン受容体／ステロイドホルモン
が挙げられる。
【００５４】
結合対の「第一」および「第二」の成員という用語は総体的なものであり、上記成員のそれぞれを結合対の第一または第二の成員として見ることができることが理解されるであろう。好ましい態様では、結合対の第一の成員はビオチンまたは機能的に同等なその変異体であり、結合対の第二の成員はアビジン、ストレプトアビジンまたは機能的に同等なその変異体である。
【００５５】
好ましい態様では、結合対の第二の成員はストレプトアビジンである。
【００５６】
好適な検出可能タグとしては、蛍光残基(例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコスリトリン、クマリン、オキサジン、レゾルフィン、シアニン、およびそれらの誘導体)、発光残基(例えば、Qdot(商品名)  Quantum Dot Corporation製ナノ粒子, パロアルト, カリフォルニア)が挙げられるが、これらに限定されない。検出可能タグが酵素である場合には、この酵素は、例えば、賦活剤、基質、増幅剤などの添加により検出可能なシグナルを生成することができなければならない。本発明の検出可能タグとして好適な酵素および対応する基質としては、下記のものを包含する：
−  アルカリホスファターゼ：
・色素産生基質：ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐ−ＮＰＰ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＰＴ）、ファストレッド（Ｆａｓｔ−Ｒｅｄ）／ナフトール−ＡＳ−ＴＳホスフェートを基剤とする基質、
・蛍光産生基質：４−メチルウンベリフェリルホスフェート（４−ＭＵＰ）、２−（５’−クロロ−２’−ホスホリルオキシフェニル）−６−クロロ−４−（３Ｈ）−キナゾリノン（ＣＰＰＣＱ）、３，６−フルオレセインジホスフェート（３，６−ＦＤＰ）、ファストブルー（Fast Blue）ＢＢ、ファストレッドＴＲ、またはファストレッドバイオレットＬＢジアゾニウム塩、
−  ペルオキシダーゼ：
・２，２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＴ）、３，３’，５，５&−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ｏ−ジアニシジン、５−アミノサリチル酸、３−ジメチルアミノ安息香酸（ＤＭＡＢ）および３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）−および３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ）を基剤とする、色素産生基質、
・蛍光産生基質：４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル酢酸、還元型フェノキサジンおよび還元型ベンゾチアジン、例えばAmplex(商標) Red試薬、Amplex UltraRedおよび還元型ジヒドロキサンテン、
−  グリコシダーゼ：
・色素産生基質：β−Ｄ−ガラクトシダーゼに対するｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（ｏ−ＮＰＧ）、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドおよび４−メチルウンベリフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＭＵＧ）、
・蛍光産生基質：レゾルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、フルオレセインジガラクトシド（ＦＤＧ）、フルオレセインジグルクロニド、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、カルボキシウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドおよびフッ素化クマリンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、
−  オキシドレダクターゼ（ルシフェラーゼ）：
・発光基質：ルシフェリン
が挙げられる。
【００５７】
好ましい態様では、検出可能タグはホースラディッシュペルオキシダーゼであり、検出試薬はTMBである。
【００５８】
好ましい態様では、キットは固形支持体をさらに含んでなる。本明細書で用いられる「支持体」または「表面」という用語は、ストリップ、棒、粒子、例えばラテックス粒子、磁性粒子、微小粒子、ビーズ、膜、マイクロタイターウェルおよびプラスチックチューブのような多数の形状のいずれか1つを有することができる多孔性または非多孔性の水不溶性材料である固相を表す。原則として、十分な量の捕捉抗体を結合することができるという条件で、任意の材料は固形支持体として好適である。従って、固相材料の選択は、所望なアッセイフォーマット性能特性(assay format performance characteristics)に基づいて決定される。固形支持体に好適な材料としては、ポリマー材料、特にセルロース材料およびセルロース由来の材料、例えば濾紙、クロマトグラフィー紙、ガラス繊維紙などの繊維含有紙、合成または修飾した天然に存在するポリマー、例えばニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリ（塩化ビニル）、ポリアクリルアミド、架橋デキストラン、アガロース、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ナイロン、ポリビニルブチレートなど単独でまたは他の材料と共同で用いられるもの、ガラス、例えば、生体ガラス、セラミック、金属などとして利用可能なガラスが挙げられる。スチレンおよびカルボキシル化スチレンまたはアミノ、ヒドロキシル、ハロなどのような他の活性基で官能化したスチレンの非架橋ポリマーが好ましい。幾つかの場合には、置換スチレンとブタジエンのようなジエンとのコポリマーが用いられる。
【００５９】
固形支持体と捕捉抗体は、別々にキットに提供してもよく、あるいは支持体は予め捕捉抗体をプレコーティングして送達することができる。この場合には、支持体は捕捉抗体の結合の後にブロッキング溶液で処理したものでよい。支持体をプレコーティングする場合には、支持体を濃縮したトレハロース溶液で処理し、乾燥させることができ、この場合には乾燥トレハロースは支持体上にハロー(halo)を形成する。乾燥トレハロースを含むこれらの支持体は非常に安定であり、４℃で暗所に保管するときには２年間まで保管することができる。
【００６０】
キットの追加要素としては、
分析を行う試料を患者から採取する手段、
ターゲットペプチドの標準曲線を作成するのに要する緩衝剤および溶液、
分析中に固形支持体を洗浄してブロッキングする緩衝剤および溶液、
固形支持体をコーティング抗体でコーティングするための緩衝剤および溶液、
検出可能タグから着色または蛍光産生シグナルを発生させるための試薬、
検出可能タグ(例えば、1N H2SO4)から着色または蛍光産生生成物の形成を停止するための試薬、
ペプチドを折り畳まれていない状態に保持するための手段(例えば、濃グアニジニウム塩酸)
Aβ40またはAβ42ペプチド、またはそれらの組合せの原液を含む試料
を挙げることができる。
【００６１】
好ましい態様では、捕捉抗体は固形支持体上に固定されている。固定は、検出を行うターゲットポリペプチドの結合の前にまたはペプチド/タンパク質が捕捉抗体に結合したときに行うことができる。いずれにせよ、固形支持体を用いる場合には、測定を行うターゲットポリペプチドを含む試料の添加前に支持体上の過剰のタンパク質結合部位をブロックするのが好都合である。好ましくは、支持体上のペプチド結合部位のブロッキングまたはクエンチングは、それぞれの結合反応の後に複合体の洗浄に用いる約０．０５％〜１０％、好ましくは１〜５％、更に好ましくは約３％の濃度の高分子化合物（例えば、ウシ血清アルブミン、脱脂粉乳、ウェスタンブロッキング試薬、カゼイン、ラクトアルブミン、オボアルブミン）を捕捉した同じ緩衝剤（例えば、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ  ８、ＰＢＳまたはＴＢＳ、場合によってはＴｗｅｅｎ  ２０を含んでなる）を用いて行う。固定した捕捉抗体を含んでなる支持体をかなり長い時間保管しなければならない場合には、支持体を濃縮したトレハロース溶液で処理して乾燥させるのが好ましく、この場合には乾燥トレハロースは支持体上にハロー(halo)を形成する。乾燥トレハロースを含むこれらの支持体は非常に安定であり、４℃で暗所に保管するときには２年間まで保管することができる。
【００６２】
本発明のキットは、キットの第一および第二の抗体構成要素によって特異的に認識されるポリペプチドを高感度で検出または測定することができる。従って、もう一つの態様では、本発明は、試料中のタンパク質またはタンパク質を検出するための本発明のキットの使用に関する。好ましい態様では、キットは、試料中のＡβ４０、Ａβ４２およびそれらの組合せの群から選択されるペプチドを検出するのに用いられる。
【００６３】
本発明で理解される「試料」としては、組織培養物、血漿、血清、唾液、精液、痰、脳脊髄液（ＣＳＦ）、涙、粘液、汗、乳、脳抽出物などのいずれかが挙げられる。好ましい態様では、試料は血漿試料である。
【００６４】
任意の試料中のＡβ４０およびＡβ４２の濃度の高感度測定を行うための本発明のキットの能力を考慮すれば、これはいずれかの細胞流体または組織のこれら２種類のペプチドのいずれかの濃度に変化が見られる任意の疾患、特に変性疾患、更に詳細には神経変性疾患の診断に用いることができる。Ａβ４０および／またはＡβ４２のレベルの変化の出現に基づいて診断することができる変性疾患の非制限的例としては、
骨減少症、骨軟化症、骨粗鬆症、オステオミエローマ、骨形成異常症、バジェット病、骨形成不全症、骨硬化症、形成不全製骨疾患、体液性高カルシウム血症性骨髄腫、多発性骨髄腫および転移後の骨低粘稠化のような骨変性疾患、
ゴーラム−スタウト症候群、関節炎性疾患、変形性関節症、関節リウマチ、乾癬性関節炎、リウマチ様疾患および骨粗鬆症のような軟骨変性疾患
筋ジストロフィー、筋萎縮症、鬱血性閉塞性肺疾患、筋消耗性症候群、筋肉減弱、悪液質のような筋変性疾患、
虚血による心細胞死、臓器移植拒絶による組織および器官の死、自家中毒による聴力喪失などの心変性疾患、
色素性網膜炎のような網膜変性疾患、
アレキサンダー病、アルパー病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調、バッテン病、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、キャナバン病、コケーン症候群、皮質基底核変性症、クロイツフェルト−ヤーコプ病、ハンチングトン病、ＨＩＶ関連性痴呆ケネディー病、クラッベ病、レヴィー小体痴呆、マチャド−ジェゼフ病（脊髄小脳性運動失調３型）、多発性硬化症、多系統萎縮症、神経ボレリア症、パーキンソン病、ペリツェーウス−メルツバッヒャー病、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病、レフサム病、ザントホフ病、シルダー病、統合失調症、シュピールマイヤー−フォークト−シェーグレン−バッテン病（バッテン病としても知られる）、脊髄小脳性運動失調、脊髄性筋萎縮症、スティール−リチャードソン−オルスゼフスキー病、背側癆のような神経系の変性疾患
が挙げられる。好ましい態様では、本発明のキットを用いて診断される神経変性疾患は、アルツハイマー病である。
【００６５】
起こり得る疾患を決定するのに必要とされるパラメーターは、絶対的Ａβ４０およびＡβ４２濃度だけでなく、これらの値の組合せから誘導されるパラメーター、例えば比Ａβ４０／Ａβ４２またはＡβ４２／Ａβ４０、総Ａβペプチドに対するＡβ４２およびＡβ４０の百分率、またはＡβ４２およびＡβ４０の濃度の和でもあることが理解されるであろう。
【００６６】
好ましい態様では、診断し得る疾患はアルツハイマー病であり、更に詳細には、健康な個体から得た同じ起源の生物学的試料中の上記ペプチドまたはペプチド類の量より低いＡβ４０および／またはＡβ４２ペプチド濃度のＡＤ患者の試料の外観に基づく散発性ＡＤである。
【００６７】
使用においては、本発明のキットにより、試料中のＡβ４２、Ａβ４０およびそれらの組合せの群から選択されるターゲットポリペプチドの量を検出するための５段階法を行うことができる。本発明のもう一つの目的である上記方法は、
試料中のＡβ４２、Ａβ４０およびそれらの混合物の群から選択されるターゲットポリペプチドの量を測定または検出する方法であって、
（ｉ）  試料中に含まれるターゲットポリペプチドを、上記ターゲットポリペプチドに特異的に結合する第一の抗体または抗体の組合せで捕捉し、
（ii）  段階(a)で形成した免疫複合体を、第一の抗体または抗体の組合せとは異なるターゲットポリペプチドの領域を認識する第二の抗体または抗体の組合せと接触させ、
（iii)  段階（ii）で形成した複合体を、第二の抗体にアフィニティーを示しかつ結合対の第一の成員に結合している試薬と接触させ、
（iv）  段階（iii）で形成した複合体を、検出可能タグに結合している結合対の第二の成員と接触させ、
（ｖ）  結合対の第二の成員に結合した検出可能タグの活性を検出する
段階を含んでなる。
【００６８】
好ましい態様では、検出されるペプチドは上記ペプチドの非オリゴマー形態に相当し、更に好ましくはＡβ４０およびＡβ４２のモノマー形態に相当する。
【００６９】
この方法のそれぞれの段階で用いられる試薬は、上記で詳細に説明した。
【００７０】
本発明による方法の第一の段階では、Ａβ４０および／またはＡβ４２ペプチドを含む試料を第一の抗体と接触させて、第一の免疫複合体を形成させる。
【００７１】
第一の結合段階を行った後に、複合体を洗浄して、元の試料に見られる捕捉抗体に結合しなかった過剰のタンパク質／ペプチドを除去することができる。本発明に関して用いることができる好ましい洗浄緩衝剤としては、場合によっては塩（例えば、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を含んでなりかつ場合によっては低濃度の洗剤（例えば、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）を含んでなる生理的に近いｐＨの任意の緩衝剤（例えば、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）が挙げられる。
【００７２】
第二段階では、捕捉抗体と試料のＡβペプチドまたはペプチド類との間で形成された複合体を次に第二の抗体と接触させて、「サンドイッチ型」免疫複合体を形成させる。
【００７３】
第二段階を行った後、免疫複合体を上記と本質的に同じ緩衝剤および手順を用いて非特異的に結合した抗体を除去することができる。
【００７４】
第三段階では、本発明の方法は、捕捉したペプチドまたはペプチド類と検出抗体との間に形成された複合体を検出抗体にアフィニティーを示しかつ結合対の第一の成員に結合する試薬と接触させることを含む。
【００７５】
第四段階では、本発明の方法は、抗体結合試薬と検出抗体との間に形成された複合体を検出可能タグに結合する結合対第二の成員と接触させることを含む。
【００７６】
本発明による方法の第五段階では、この方法は、検出可能タグの検出を含む。本発明による方法の第五段階では、この方法は、検出可能タグの検出を含む。検出可能タグの検出および/または定量はタグの性質によって変化し、当該技術分野で知られていることが理解されるであろう。完全な基質または検出可能タグが発光または色素成分を含むときには、検出はUV トランスイルミネーターで視覚観察により、またはＵＶを用いる電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ検出システム、レーザーを用いるゲルスキャナー、キセノン−アークを用いるＣＣＤカメラ検出システム、ＵＶ−トランスイルミネーターと組み合わせたポラロイドカメラ（登録商標）、並びにルミネッセンスの検出に用いられる他の様々な装置を用いることによって、行うことができる。検出可能タグが酵素であるときには、本発明による方法の第五段階は、タグで標識した免疫複合体（例えば、検出可能タグで標識した捕捉したペプチド、検出抗体および試薬）を検出可能タグとして用いる酵素の活性剤、基質または増幅剤に暴露することを含む。検出可能なシグナルを生じることができる公知の検出可能タグとしては、酵素標識した抗体が挙げられる。この目的に周知の代表的酵素としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびグリコシダーゼ、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼおよびβ−グルクロニダーゼが挙げられる。
一例として、検出抗体に特異的に結合する試薬を、ホースラディッシュペルオキシダーゼで標識することができる。捕捉残基−検出抗体−試薬複合体が形成されたならば、次に検出可能タグとして用いられる酵素の広範囲の周知の基質のいずれかを用いて検出を行うことができる。
【００７７】
もう一つの態様では、本発明は、神経変性疾患の診断方法であって、上記疾患を有することが疑われる被験者の試料におけるＡβ４０および／またはＡβ４２のレベルを測定し、上記被験者の試料中の一方および／または両方のペプチドの濃度を神経変性疾患の外観を有する健康な個体由来の試料における上記ペプチドまたはペプチド類の濃度に相関させることを含んでなる、方法に関する。
【００７８】
好ましい態様では、神経変性疾患はアルツハイマー病であって、上記試料中のペプチドＡβ４０、Ａβ４２またはそれらの組合せの量が健康な個体からの試料における上記ペプチドまたはペプチド類の量より少なければ、この被験者はアルツハイマー病に罹っていることを示している。好ましくは、測定は血漿または血清で行われる。
【００７９】
測定を行う試料と増加かつ既知濃度の測定を行う化合物を有する多数の試料とを平行して用いて、この方法の様々な段階を行うことが好ましい。Ａβ４０および／またはＡβ４２を測定しようとする場合には、それぞれのペプチドについての標準曲線を増加濃度を用いて調製しなければならない。標準曲線は、（ｉ） シグナルがターゲットペプチドの濃度と共に直線的に増加する濃度範囲を画定し、（ii） 試験試料で得たシグナルを曲線に内挿することによって試験試料中のペプチドの濃度を測定して濃度値を得るという２つの目的を行っている。本発明の分析法が高感度であることを考慮すれば、試験試料の好ましい濃度は、例えば３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、１００および２００ｐｇ／ｍｌである。標準曲線を得るのに用いた試料の濃度はそれぞれの試験基質に対して変化することが理解されるであろう。しかしながら、この分析法の直線範囲の測定は、通常の手段によって熟練実施者であれば容易に決定することができる。家族性ＡＤの患者のＣＳＦ試料並びに血清試料中のＡβ４２およびＡβ４０ペプチドの量が散発性ＡＤの患者の血清と比較して高いことを考慮すれば、本発明のキットを家族性ＡＤの患者のＣＳＦまたは血清試料のＡβペプチドの測定に用いる場合には、Ａβ４０／Ａβ４２の最終濃度が分析の直線範囲内になるようにこれらを希釈するのが好ましい。
【００８０】
下記の実施例は例示のために提供されるものであり、本発明の範囲を制限するためのものを解釈すべきではない。
【実施例】
【００８１】
実施例１
ビオチン-ストレプトアビジン増幅を有する比色ELISAサンドイッチ
感度を高めるために、シグナルをビオチン−ストレプトアビジンを用いて増幅することができる。アミロイドＡβ４０およびアミロイドＡβ４２ペプチドの両方におけるアミノ酸１−１７を認識する６Ｅ１０ ｍＡｂ捕捉抗体を用いて、プレートをコーティングした。コーティングは、１００ｍＭ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液，ｐＨ＝９．６中にて５μｇ／ｍｌの濃度で４℃で一晩行った。次いで、プレートを、ブロッキング溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ ８，０，２％  Ｔｗｅｅｎ−２０，０，５％ＢＳＡ）３００μｌを用いて振盪しながら室温にて3時間または３７℃にて２時間ブロックした。必要ならば、ブロッキング後にプレートを２０ｍｇ／ｍｌトレハロースを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８溶液１００μｌで処理することができる。トレハロースに特有の白色ハローが現れるまで、プレートを蒸発させた。このように処理したプレートは、アルミニウム箔でカバーして４℃で保持することができ、２年間安定である。
【００８２】
標準曲線の試料は、６Ｅ１０  ｍＡｂをコーティングしてトレハロースで処理したプレート上でペプチドＡβ４０およびＡβ４２の２００ｐｇ／ｍｌ貯蔵溶液から調製した。これらの溶液から、ＳＤＢで連続希釈１：２を行い、２００、１００、５０、２５、１２．５、６．２５および３．１２５ｐｇ／ｍｌの濃度を得た。それぞれの希釈または未希釈試料１００μｌをＳＤＢ（１／１．０００．０００）の希釈または未希釈で加え、４℃にて一晩（または３７℃にて２時間）インキュベーションする。
【００８３】
検出抗体（Ａβ４２ペプチドのＣ末端領域に対応するペプチドに対して調製したポリクローナル抗体またはＡβ４０ペプチドのＣ末端領域に対応するペプチドに対して調製したポリクローナル抗体、Ａβ４２またはＡβ４０を検出しようとするかどうかによって変化）をＳＤＢで希釈して加えた。１００μｌをそれぞれのウェルに加えた後、室温にて１時間インキュベーションした。
【００８４】
次いで、ビオチン標識した抗ウサギＩｇＧ抗体（ＳＩＧＭＡ）のＳＤＢ中での１／５０００希釈物１００μｌを加え、室温で振盪しながら１時間インキュベーションした。次に、ＨＲＰ結合ストレプトアビジン（ＳＩＧＭＡ製）のＳＤＢ中での１／４０００希釈物１００μｌをそれぞれのウェルに加え、室温で１時間インキュベーションした。
【００８５】
プレートを展開するため、色素産生基質ＴＭＢ(ZEU Inmunotec)１００μｌを加え、暗所で１５−３０分間インキュベーションした。停止溶液として１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４  ５０μｌをウェル当たりに加えた。４５０ｎｍでの吸光度を、プレートリーダーSynergy HT (BioTek Instruments)で読んだ。
【００８６】
それぞれの段階の間に、毎回5回のすすぎを行うように設定された自動プレート洗浄機(E1x50 Bio Tek Instruments)を用いてプレートを洗浄した。洗浄溶液は５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０および１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（使用前に濾過）を含んでいた。
【００８７】
実施例２
蛍光ＥＬＩＳＡサンドイッチ分析法
プレートを、重炭酸塩緩衝液の６Ｅ１０（５μｇ／ｍｌ）で４℃にて一晩コーティングした。次いで、プレートを室温にて振盪しながら３時間ブロックした（３００μｌ／ウェル）。次に、試験および標準曲線試料をプレートに加え、４℃にて一晩インキュベーションした。検出抗体（抗Ａβ４０または抗Ａβ４２血清）の１／４０００希釈物をそれぞれのウェルに加え、室温にて振盪しながら１時間インキュベーションした。ＦＩＴＣ結合抗−抗体の連続希釈物（希釈倍率１／１０００、１／５０００、１／１００００）を加えて、暗所にて室温で１時間インキュベーションした。蛍光は、４８５ｎｍの励起波長および５２８の発光波長を用いていた。
【００８８】
あるいは、分析は、ＥＬＩＳＡ分析の感度を高めるQuanta-Blu (PIERCE)蛍光基質を用いて行う。最大励起波長は３２５ｎｍであり、最大発光波長は４２０ｎｍである。それは、３１５−３４０  ｎｍの励起範囲および３７０−４７０ｎｍの発光範囲で検出することができる。QuantaBlu Working Solutionは、QuantaBlu Substrate Solution 9部をQuantaBlu Stable Peroxidase Solution 1部と混合することによって調製される(溶液は室温で24時間安定)。これを室温で１．５分間−９０分間インキュベーションすることができ、反応を停止してまたは停止せずに読み取ることができる（青色が生じる）。
【００８９】
プレートを、重炭酸塩緩衝液の６Ｅ１０（５μｇ／ｍｌ）で４℃にて一晩コーティングした後、室温にて振盪しながら３時間ブロックした（３００μｌ／ウェル）。次いで、下記のＡβ４２およびＡβ４０ペプチドの濃度で、様々な標準曲線を調製した。
１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１、２５および１５．６５ｐｇ／ｍｌ、
２００、１００、５０、２５、１２．５、６．２５および３．１２５ｐｇ／ｍｌ、
２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６、０．７８および０．３９ｐｇ／ｍｌ、
１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２５および０．１５６ｐｇ／ｍｌ
５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２５、０．１５６および０．０７８ｐｇ／ｍｌ、
１、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６２５、０．０３１２５および０．０１５６ｐｇ／ｍｌ。
【００９０】
検出抗体（抗Ａβ４０または抗Ａβ４２血清）を、室温にて振盪しながら１時間加える（１／４０００倍に希釈）。次に、ＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ  １／１０００を加え、室温にて振盪しながら１時間インキュベーションする。反応を発現するため、Quanta-Blue Working Solution １００μｌを加えた後、暗所にて室温で３０分、６０分および９０分間インキュベーションする。次に、３０分、６０分および９０分後に、反応を停止せずにまたはＳＴＯＰ溶液で反応を停止して、蛍光を読み取る（励起：  ３６０／４０ｎｍ；発光：  ４６０／４０ｎｍ）
【００９１】
実施例３
Ａβ４０およびＡβ４２標準曲線の調製
Ａβ４０標準曲線を調製するために、ヒトＡβ４０の凍結乾燥試料を１０μｇ／ｍｌに再構成した。貯蔵溶液から、下記の濃度（ｐｇ／ｍｌ）を含む試料を調製した：２５，０００ｐｇ／ｍｌ、２，５００ｐｇ／ｍｌ、２５ｐｇ／ｍｌ、１２．５ｐｇ／ｍｌ、６．２５ｐｇ／ｍｌ、３．１２５ｐｇ／ｍｌ、１．５６ｐｇ／ｍｌ、０．７８ｐｇ／ｍｌ。試料は、プロテアーゼ阻害剤ＡＥＢＳＦ  １  ｍＭの存在下にて調製した。次に、試料を、上記実施例に記載の方法に準じて処理した。結果を、図１に示す。
【００９２】
Ａβ４２標準曲線を調製するために、ヒトＡβ４２の凍結乾燥試料を１０μｇ／ｍｌに再構成した。貯蔵溶液から、下記の濃度（ｐｇ／ｍｌ）を含む試料を調製した：  ２５，０００ｐｇ／ｍｌ、２，５００ｐｇ／ｍｌ、２５ｐｇ／ｍｌ、１２．５ｐｇ／ｍｌ、６．２５ｐｇ／ｍｌ、３．１２５ｐｇ／ｍｌ、１．５６ｐｇ／ｍｌ、０．７８ｐｇ／ｍｌ。試料は、プロテアーゼ阻害剤ＡＥＢＳＦ  １ｍＭの存在下にて調製した。次に、試料を、上記実施例に記載の方法に準じて処理した。結果を、図２に示す。
【００９３】
実施例４
ＡＤ診断とＡβ４０／Ａβ４２レベルとの相関
Ａβ４０およびＡβ４２レベルを、上記実施例に記載のＥＬＩＳＡサンドイッチ分析法を用いて対照被験者のコホートおよびＡＤと診断された患者のコホートからの血漿試料でミニ・メンタル・ステート・検査（ＭＭＳＥ）スコアを用い、カットオフ値を２４として測定した。ｐｇ／ｍｌで表したＡβ４０およびＡβ４２の濃度を、表１に示す。
【００９４】
【表１】
0005657382.tif 000002
【００９５】
平均値を計算し、結果を表２に示す。
【００９６】
【表２】
0005657382.tif 000003
【図１】
0005657382.tif 000004
【図２】
0005657382.tif 000005
【配列表】
0005657382000001.app