(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジャポニカ種米およびインディカ種米のイネまたはそれに由来する組織、あるいはそれらの加工品の識別法であって、
被験ゲノムＤＮＡにおいて、ｍＰｉｎｇ挿入部位の遺伝的多型に基づいて、イネまたはそれに由来する組織、あるいはそれらの加工品がジャポニカ種米またはインディカ種米であるかを識別することを含み、
ｍＰｉｎｇ挿入部位が、第６染色体中に見出される３番目のｍＰｉｎｇ挿入部位、または／および第１２染色体中に見出される１番目のｍＰｉｎｇ挿入部位である、識別法。 
【請求項２】
前記ｍＰｉｎｇ挿入部位の遺伝的多型として、前記ｍＰｉｎｇ挿入部位のいずれも確認された場合に、イネまたはそれに由来する組織、あるいはそれらの加工品が、ジャポニカ種米のものであると識別する、請求項１記載の識別法。 
【請求項３】
前記ｍＰｉｎｇ挿入部位の遺伝的多型として、前記ｍＰｉｎｇ挿入部位のいずれも確認されなかった場合に、イネまたはそれに由来する組織、あるいはそれらの加工品が、インディカ種米のものであると識別する、請求項１記載の識別法。 
【請求項４】
以下からなる群より選ばれるプライマーの組合せを含む、イネにおけるｍＰｉｎｇ挿入部位の有無を検出し得る２以上のプライマーを用いる、請求項１〜３のいずれか一項記載の識別法：
１ａ）配列番号１に示される塩基配列における１〜２２８５番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第１のプライマー、および配列番号１に示される塩基配列における２７１６〜５０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第２のプライマーの組合せ；
１ｂ）配列番号１に示される塩基配列における１〜２２８５番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第１のプライマー、および配列番号１に示される塩基配列における２７１６〜５０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ；
１ｃ）配列番号１に示される塩基配列における１〜２２８５番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第１のプライマー、および配列番号１に示される塩基配列における２２８６〜２７１５番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第２のプライマーの組合せ；
１ｄ）配列番号１に示される塩基配列における１〜２２８５番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第１のプライマー、および配列番号１に示される塩基配列における２２８６〜２７１５番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ；
１ｅ）配列番号１に示される塩基配列における２２８６〜２７１５番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第１のプライマー、および配列番号１に示される塩基配列における２７１６〜５０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第２のプライマーの組合せ；
１ｆ）配列番号１に示される塩基配列における２２８６〜２７１５番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第１のプライマー、および配列番号１に示される塩基配列における２７１６〜５０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ；
２ａ）配列番号２に示される塩基配列における１〜２２８５番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第１のプライマー、および配列番号２に示される塩基配列における２７１６〜５０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第２のプライマーの組合せ；
２ｂ）配列番号２に示される塩基配列における１〜２２８５番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第１のプライマー、および配列番号２に示される塩基配列における２７１６〜５０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ；
２ｃ）配列番号２に示される塩基配列における１〜２２８５番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第１のプライマー、および配列番号２に示される塩基配列における２２８６〜２７１５番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第２のプライマーの組合せ；
２ｄ）配列番号２に示される塩基配列における１〜２２８５番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第１のプライマー、および配列番号２に示される塩基配列における２２８６〜２７１５番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ；
２ｅ）配列番号２に示される塩基配列における２２８６〜２７１５番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第１のプライマー、および配列番号２に示される塩基配列における２７１６〜５０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第２のプライマーの組合せ；
２ｆ）配列番号２に示される塩基配列における２２８６〜２７１５番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第１のプライマー、および配列番号２に示される塩基配列における２７１６〜５０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ、
であり、
ここで、前記少なくとも一部の塩基配列が、１５個以上のヌクレオチド残基からなり、
前記その均等な塩基配列が、１５個以上のヌクレオチド残基からなり、かつイネの品種間における塩基配列のバリエーションに対応する。
【請求項５】
請求項４記載の１ａ）〜１ｆ）のいずれか１つのプライマーの組合せ、および請求項４記載の２ａ）〜２ｆ）のいずれか１つのプライマーの組合せを含む、２以上のプライマーのセットを用いる、請求項４記載の識別法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、国産および外国産のイネまたはそれに由来する組織（例、国産米・外国産米）、あるいはそれらの加工品の識別法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
２００８年、本来非食用として売却された事故米穀が、食用として転売される「事故米不正転売事件」が発覚した。この事件では、主にミニマムアクセス米として輸入された外国産米が事故米穀として販売されていた。したがって、米を加工原料とする食品関連企業では、品質保証のため、外国産米を簡易に検出する技術を必要としている。また、事件を受けて、米の原産地（国）表示を義務化する米トレーサビリティ制度が導入されることとなり、それを実効力あるものとするためにも国産米・外国産米の識別技術が必要である。
【０００３】
従来の技術では、ＲＡＰＤ−ＳＴＳ法（特許文献１、２）、ＳＮＰ法（特許文献３、４）、ＳＳＲ法（特許文献５〜７）などを利用して米の品種を識別することを目的に技術開発が行われてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−０９５５８９
【特許文献２】特開２００５−０７３６５５
【特許文献３】特開２００４−２４８６３５
【特許文献４】特開２００９−２１９４９８
【特許文献５】特開平１０−０５７０７３
【特許文献６】特開２００４−０６５２５１
【特許文献７】特開２００７−０３７４６８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来は、あらかじめ基準となる品種群の分析データの蓄積を行い、検査対象の結果をそのデータベースに照合することによって品種が識別されていた。そのため、外国産米を識別するには、基準となる品種を数多く収集・分析することが必要であるが、そもそも外国産米では品種の概念が曖昧な場合も多く、また我が国に輸入される米を網羅することは困難である。さらに、従来技術は分析対象が単一の品種である場合には効果を発揮するが、２品種以上が混在した試料や、わずかに外国産米が混入した試料では、分析結果が複雑になり識別が困難となる。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、国産米と外国産米の品種を簡便に識別する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意検討した結果、国産米と外国産米の品種を高度に識別し得る、ゲノム上の２種のヌクレオチド領域（トランスポゾンの一種であるｍＰｉｎｇの挿入部位）を同定することに成功した。また、かかる領域を同定することにより、国産米と外国産米の品種を識別する方法などを開発することに成功し、本願発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、被験ゲノムＤＮＡにおいて、ｍＰｉｎｇ挿入部位の遺伝的多型に基づいて、イネまたはそれに由来する組織、あるいはそれらの加工品が国産または外国産であるかを識別する、国産および外国産のイネまたはそれに由来する組織、あるいはそれらの加工品の識別法、ならびにイネにおけるｍＰｉｎｇ挿入部位の有無を検出し得る２以上のプライマーおよびそのセットを提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明では、国産のイネに特異的なｍＰｉｎｇ挿入部位の解析によって、国産品種と外国産品種を大きく大別するための手法を提供する。従来技術のように品種自体を同定するのではないため、品種データの蓄積は必要でない。また、たった２種のＤＮＡマーカーの簡便な分析により、国産品種と外国産品種とを高度に識別できる。さらに、複数品種の混合サンプルの場合にも、外国産米の混入を容易に検出することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、国産のイネに特異的である、第６染色体中に見出される３番目のｍＰｉｎｇ挿入部位（６−３）を検出するためのプライマー対のタイプを示す図である。
【図２】図２は、国産のイネに特異的である、第１２染色体中に見出される１番目のｍＰｉｎｇ挿入部位（１２−１）を検出するためのプライマー対のタイプを示す図である。
【図３】図３は、国産のイネの一品種である日本晴のｍＰｉｎｇ挿入部位（６−３）周辺（第６染色体：３００９６２５５〜３０１０１２５４）の塩基配列（５０００ｂｐ）を示す図である。ボックス部分は、ｍＰｉｎｇ挿入部位（６−３）を示し、下線を付記した部分は、実施例で用いられたプライマーの位置を示す（図４も同様）。なお、染色体上の位置は、ＭＳＵ  Ｒｉｃｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ６．１（ｈｔｔｐ：／／ｒｉｃｅ．ｐｌａｎｔｂｉｏｌｏｇｙ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）に従っている（図４も同様）。
【図４】図４は、国産のイネの一品種である日本晴のｍＰｉｎｇ挿入部位（１２−１）周辺（第１２染色体：８３６３１９〜８４１３１８）の塩基配列（５０００ｂｐ）を示す図である。
【図５】図５は、２種のマーカーを用いた日本（１６種）、タイ（１８種）およびベトナム（１３種）のイネの品種の分析結果を示す図である。日本のイネの品種：左から順に（１）日本晴；（２）コシヒカリ；（３）ひとめぼれ；（４）ヒノヒカリ；（５）あきたこまち；（６）はえぬき；（７）キヌヒカリ；（８）きらら３９７；（９）ななつぼし；（１０）つがるロマン；（１１）ほしのゆめ；（１２）まっしぐら；（１３）あさひの夢；（１４）あいちのかおり；（１５）夢つくし；（１６）こしいぶき。タイのイネの品種：左から順に（１’）ＲＤ６；（２’）ＲＤ２１；（３’）Ｋｈａｏ  Ｔａｈ  Ｈａｎｇ  １７；（４’）Ｊｅｋ  Ｃｈｕｅｙ；（５’）Ｓｏｗ  Ｈａｉ；、（６’）Ｋｈａｏ  Ｄａｗｋ  Ｍａｌｉ  １０５；（７’）ＣＮＴ１；（８’）ＲＤ８；（９’）Ｌｅｎａｎｇ  Ｐｒａ  Ｔｅｗ  １２３；（１０’）Ｃｈａｉｎａｔ  １；（１１’）Ｓｕｐｈａｎｂｕｒｉ  １；（１２’）Ｓｕｐｈａｎｂｕｒｉ  ２；（１３’）名称不明の品種（１）；（１４’）名称不明の品種（２）；（１５’）名称不明の品種（３）；（１６’）名称不明の品種（４）；（１７’）名称不明の品種（５）；（１８’）ＴＨ。ベトナムのイネの品種：左から順に（１’’）Ｐ４；（２’’）Ｔａｍ  Ａｐ  Ｂｅ；（３’’）Ｂａｃ  Ｈｕｏｎｇ；（４’’）Ｔａｍ  Ｘｏａｎ；（５’’）ＩＲ６４；、（６’’）Ａｉ６４；（７’’）Ｘ２１；（８’’）Ｑ５；（９’’）Ｃ７０；（１０’’）Ｋｈａｎｇ  Ｄａｎ；（１１’’）ＸＩ２３；（１２’’）１０８ＡＶ；（１３’’）ＩＲ３５２。１品種の例外（＊）を除いて、日本品種では、サイズの大きなＤＮＡ（Ｌ）の増幅が認められ、タイ・ベトナム品種では、サイズの小さなＤＮＡ（Ｓ）の増幅が認められる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、国産および外国産のイネまたはそれに由来する組織、あるいはそれらの加工品（以下、必要に応じて、「イネ等」と省略する）の識別法を提供する。
【００１２】
一実施形態では、本発明は、国産および外国産のイネの識別法に関する。本発明において、「イネ」とは、成長した植物体および未熟な植物体（例、苗）のみならず、枯れた植物体である稲わらをも意味するものとする。イネとしては、国産のイネおよび外国産のイネが挙げられる。
【００１３】
国産のイネは、ジャポニカ種のイネであり得る。このような国産のイネの品種としては、例えば、てんたかく、てんこもり、とがおとめ、にこまる、あいちのかおり、なつしずか、はなの舞い、アケボノ、朝日、吉備の華、ちゅらひかり、農林４８号、あきろまん、中生新千本、ホウレイ、広島21号（こいもみじ）、あきたこまち、でわひかり、たかねみのり、めんこいな、淡雪こまち、なすひかり、ゴロピカリ、さわぴかり、コシヒカリ、ハナエチゼン、フクヒカリ、イクヒカリ、あきさかり、キヌヒカリ、どんとこい、きぬむすめ、晴るる、せとのにじ、ヒノヒカリ、まいひかり、さきひかり、きらり宮崎、夢しずく、天使の詩、さがびより、たんぼの夢、レイホウ、日本晴、秋の詩、レーク６５、ゆめおうみ、吟おうみ、祝、雄山錦、誉富士、ひだほまれ、雄町、八反錦1号、八反（八反３５号）、千本錦、こいおまち、秋田酒こまち、とちぎ酒１４、舞風、山田錦、兵庫夢錦、兵庫北錦、神の舞、佐香錦、改良雄町、西都の雫、はなかぐら、さがの華、玉栄、吟吹雪、総の舞、とみちから、らいちょうもち、新大正糯、ひみこもち、するがもち、峰の雪もち、たかやまもち、ヤシロモチ 、マンゲツモチ、たつこもち、きぬのはだ、モチミノリ、タンチョウモチ、カグラモチ、はりまもち、ヤマフクモチ、ミコトモチ、ミヤタマモチ、ヒヨクモチ、ヒデコモチ、滋賀羽二重糯、ハクトモチ、鈴原糯、ヒメノモチ、ユメヒカリ、おおいた１１、ちば２８号（ふさこがね）、ふさおとめ、ヤマヒカリ、おまちかね、ヤマホウシ、いわてっこ、どんぴしゃり、かけはし、愛のゆめ、松山三井、森のくまさん、くまさんの力、あきまさり、あきげしき、いただき、ゆめひたち、オオセト、さぬきよいまい、あいちのかおりＳＢＬ、あさひの夢、大地の風、ミネアサヒ、チヨニシキ、祭り晴、みねはるか、つや姫、はえぬき、里のゆき、秋晴、きらりん、天竜乙女、ナツヒカリ、南国そだち、黄金錦、さわかおり、アキツホ、土佐錦、はなさつま、あきほなみ、彩南月、夢はやと、みえのゆめ、みえのえみ、ひとめぼれ、ササニシキ、まなむすめ、トヨニシキ、たきたて、やまのしずく、ゆきむすび、ななつぼし、きらら３９７、ほしのゆめ、ふっくりんこ、ゆめぴりか、大地の星、あやひめ、ほしまる、ゆきひかり、ふくみらい、まいひめ、つがるロマン、まっしぐら、むつほまれ、ねばりゆき、どまんなか、アキヒカリ、ミルキークイーン、おぼろづき、あきさやか、露葉風、吟ぎんが、ぎんおとめ、ひたち錦、若水、夢山水、出羽燦々、出羽の里、美山錦、ひとごこち、金紋錦、しらかば錦、もち美人、カグヤモチ、ココノエモチ、恵糯、喜寿糯、こゆきもち、でわのもち、ユキミモチ、アネコモチ、もちひかり、モリモリモチ、さつま雪もち、さとじまん、ミルキープリンセス、萌えみのり、スノーパール、夢つくし、つくしろまん、元気つくし、つやおとめ、夢一献、ハツシモ岐阜ＳＬ、ハツシモ、こしいぶき、ゆきん子舞、ゆきの精、越路早生、トドロキワセ、なごりゆき、朝の光、彩のかがやき、彩のほほえみ、彩のみのり、能登ひかり、ほほほの穂、ゆめみづほ、吟の夢、神の穂、蔵の華、吟風、彗星、夢の香、華吹雪、華想い、五百万石、越淡麗、さけ武蔵、石川酒５２号、みやこがねもち、はくちょうもち、風の子も��、しろくまもち、式部糯、朝紫、夕やけもち、紫こぼし、わたぼうし、こがねもち、白山もち、新羽二重糯が挙げられる。なお、これらの２４０品種は、日本の米の流通量の９９．４％を占める。国産のイネとしては、上記以外にも、国産のイネに挿入されているｍＰｉｎｇ挿入部位を検出できるものが存在し得る。
【００１４】
外国産のイネは、インディカ種のイネであり得る。このような外国産のイネとしては、例えば、東南アジア産のイネが挙げられる。東南アジア産のイネとしては、例えば、タイ産のイネ、およびベトナム産のイネが挙げられる。タイ産のイネの品種としては、例えば、ＲＤ６、ＲＤ２１、Ｋｈａｏ  Ｔａｈ  Ｈａｎｇ  １７、Ｊｅｋ  Ｃｈｕｅｙ、Ｓｏｗ  Ｈａｉ、Ｋｈａｏ  Ｄａｗｋ  Ｍａｌｉ  １０５、ＣＮＴ１、ＲＤ８、Ｌｅｎａｎｇ  Ｐｒａ  Ｔｅｗ  １２３、Ｃｈａｉｎａｔ  １、Ｓｕｐｈａｎｂｕｒｉ  １、Ｓｕｐｈａｎｂｕｒｉ  ２、ＴＨが挙げられる。ベトナム産のイネの品種としては、例えば、Ｐ４、Ｔａｍ  Ａｐ  Ｂｅ、Ｂａｃ  Ｈｕｏｎｇ、Ｔａｍ  Ｘｏａｎ、ＩＲ６４、Ａｉ６４、Ｘ２１、Ｑ５、Ｃ７０、Ｋｈａｎｇ  Ｄａｎ、ＸＩ２３、１０８ＡＶ、ＩＲ３５２が挙げられる。なお、外国産のイネとしては、上記以外にも、国産のイネに挿入されているｍＰｉｎｇ挿入部位を検出できないものが存在し得る。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、国産および外国産のイネに由来する組織の識別法に関する。本発明において、「イネに由来する組織」とは、イネの植物体の一部を意味するものとし、例えば、茎、葉、根部、米（即ち、イネ種子）が挙げられる。米は、玄米または精米のいずれであってもよい。米としてはまた、うるち米、もち米、醸造用米が挙げられる。うるち米、もち米、醸造用米の品種は、表２〜４の記載より明らかである。
【００１６】
さらに別の実施形態では、本発明は、国産および外国産のイネまたはそれに由来する組織の加工品の識別法に関する。本発明において、イネまたはそれに由来する組織の「加工品」とは、イネまたはそれに由来する組織（例、米）を含む加工物であって、本発明により使用され得るイネＤＮＡを抽出できるものである限り特に限定されない。このような加工品としては、例えば、米の加工品（例、炊飯米、加工米飯、みそ、米菓、米穀粉、包装もち、ビーフン、玄米茶、米粉パン、米粉麺、日本酒、ビール）、稲わらの加工品（例、飼料、敷料、床敷、民芸品）が挙げられる。本方法では、加工品自体が、国産または外国産のイネまたはそれに由来する組織から作成されているか否か、あるいは加工品に含まれる材料または成分が、国産または外国産のイネまたはそれに由来する組織に由来するか否かが識別され得る。
【００１７】
本発明の識別法は、被験ゲノムＤＮＡにおいて、国産のイネに特異的なｍＰｉｎｇ挿入部位の遺伝的多型に基づいて、イネまたはそれに由来する組織、あるいはそれらの加工品が国産または外国産であるかを識別することを含む。
【００１８】
本発明の識別法で利用される、国産のイネに特異的なｍＰｉｎｇ挿入部位は、国産のイネで高度に保存されている、第６染色体中に見出される３番目のｍＰｉｎｇ挿入部位（６−３）、および第１２染色体中に見出される１番目のｍＰｉｎｇ挿入部位（１２−１）である。ｍＰｉｎｇは、数あるトランスポゾンの一種であり、国産米の一品種である日本晴のゲノム配列中には、全５０箇所のｍＰｉｎｇ挿入部位が見出されている（表１を参照）。
【００１９】
本発明において、「第６染色体中に見出される３番目のｍＰｉｎｇ挿入部位」とは、日本米の一品種である日本晴を基準とした場合に、第６染色体の５’末端から数えて３番目に見出されるｍＰｉｎｇ挿入部位をいう。より具体的には、日本晴では、第６染色体中に見出される３番目のｍＰｉｎｇ挿入部位は、ＭＳＵ  Ｒｉｃｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ６．１（ｈｔｔｐ：／／ｒｉｃｅ．ｐｌａｎｔｂｉｏｌｏｇｙ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）に従うと、第６染色体の３００９８５４０〜３００９８９６９番目のヌクレオチド残基に対応する。第６染色体中に見出される３番目のｍＰｉｎｇ挿入部位は、表６に記載されるように、２３６品種の国産米（表２〜４に記載される２４０品種のうち、雄山錦、ひだほまれ、ヒメノモチ、白山もちの４品種を除く）で確認されている。第６染色体中に見出される３番目のｍＰｉｎｇ挿入部位は、本明細書中において、「６−３」（または単に「６」）と略記される場合がある。
【００２０】
本発明において、「第１２染色体中に見出される１番目のｍＰｉｎｇ挿入部位」とは、日本米の一品種である日本晴を基準とした場合に、第１２染色体の５’末端から数えて１番目に見出されるｍＰｉｎｇ挿入部位をいう。より具体的には、日本晴では、第１２染色体中に見出される１番目のｍＰｉｎｇ挿入部位は、ＭＳＵ  Ｒｉｃｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ６．１（ｈｔｔｐ：／／ｒｉｃｅ．ｐｌａｎｔｂｉｏｌｏｇｙ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）に従うと、第１２染色体の８３８６０４〜８３９０３３番目のヌクレオチド残基に対応する。第１２染色体中に見出される１番目のｍＰｉｎｇ挿入部位は、表６に記載されるように、２３１品種の国産米（表２〜４に記載される２４０品種のうち、あきろまん、中生新千本、ヤシロモチ、ハクトモチ、土佐錦、喜寿糯、さつま雪もち、なごりゆき、彗星の９品種を除く）で確認されている。第１２染色体中に見出される１番目のｍＰｉｎｇ挿入部位は、本明細書中において、「１２−１」（または単に「１２」）と略記される場合がある。
【００２１】
本発明の識別法で利用される、国産のイネに特異的なｍＰｉｎｇ挿入部位は、６−３および１２−１のいずれか１つでもよいが、６−３および１２−１の２つでもよい。
【００２２】
本発明の識別法では、上述したｍＰｉｎｇ挿入部位の遺伝的多型として、上述したｍＰｉｎｇ挿入部位が確認された場合に、イネ等が国産のものである（または外国産のものではない）と識別され得る。具体的には、上述したｍＰｉｎｇ挿入部位として、６−３の存在が確認された場合、または１２−１の存在が確認された場合に、イネ等が国産のものであると識別してもよいが、好ましくは、６−３および１２−１の双方の存在が確認された場合に、イネ等が国産のものであると識別される。
【００２３】
一方、上述したｍＰｉｎｇ挿入部位の遺伝的多型として、上述したｍＰｉｎｇ挿入部位が確認されなかった場合に、イネまたはそれに由来する組織、あるいはそれらの加工品が、外国産のものである（または国産のものではない）と識別され得る。具体的には、上述したｍＰｉｎｇ挿入部位として、６−３の存在が確認されなかった場合、または１２−１の存在が確認されなかった場合に、イネ等が外国産のものであると識別してもよいが、好ましくは、６−３および１２−１の双方の存在が確認されなかった場合に、イネ等が外国産のものであると識別される。
【００２４】
具体的には、本発明の識別法は、被験ゲノムＤＮＡにおいて、国産のイネに特異的なｍＰｉｎｇ挿入部位の有無を検出することにより、国産および外国産のイネ等を識別することによって達成される。被験ゲノムＤＮＡは、イネ等（例、米）から自体公知の方法によって調製できる。具体的には、国産および外国産のイネ等（例、国産米および外国産米）の識別は、ａ）イネに由来する組織（例、米）あるいはイネまたはイネに由来する組織の加工品からイネのゲノムＤＮＡを抽出し、次いで、ｂ）ＤＮＡ解析法により、国産のイネに特異的なｍＰｉｎｇ挿入部位の有無を検出し、次いで、ｃ）国産のイネに特異的なｍＰｉｎｇ挿入部位の有無に基づいて、イネ等が国産のものであるか、または外国産のものであるかを識別することにより、行われる。識別はまた、標品を併用することにより、被験物および標品との間において、ＤＮＡ解析法による国産のイネに特異的なｍＰｉｎｇ挿入部位の検出の有無または／および検出プロフィールの概要を比較することにより行なわれてもよい。標品は、任意のイネの品種であり特に限定されないが、例えば、基準品種である日本晴、ならびに被験物と同じ品種であることが疑われる特定の品種が挙げられる。本発明の識別法は、例えば、国産米の検出、外国産米の混入の検出などに有用である。
【００２５】
本発明の識別法では、イネ等の識別において、遺伝子増幅法（例、ＰＣＲ、ＬＡＭＰ、ＩＣＡＮ）等のＤＮＡ解析法が用いられる。本発明はまた、このような用途に使用できる、国産のイネに特異的なｍＰｉｎｇ挿入部位の有無を検出し得る２以上のプライマーを提供する。なお、本発明において、「２以上のプライマー」とは、特定の１つの領域を検出するための２以上のプライマーの組合せを意味する。アッセイに必要なプライマーの数は、用いられる遺伝子増幅法の種類によっても異なり得るので、プライマー数は適宜調整できる。以下、国産のイネに特異的なｍＰｉｎｇ挿入部位を増幅するための２以上のプライマーの代表例について、詳述する。
【００２６】
１）第６染色体中に見出される３番目のｍＰｉｎｇ挿入部位（６−３）
６−３のｍＰｉｎｇ挿入部位は、配列番号１に示される塩基配列（６−３のｍＰｉｎｇ挿入部位周辺の塩基配列）において、２２８６〜２７１５番目のヌクレオチド残基からなる領域に存在する（図３）。したがって、６−３のｍＰｉｎｇ挿入部位を検出するための２以上のプライマーとして、本領域の上流部位（センス鎖またはアンチセンス鎖）に対応する第１のプライマー、および本領域の下流部位（アンチセンス鎖またはセンス鎖）に対応する第２のプライマーの組合せ（トランスポゾンの有無に応じてサイズの異なる増幅産物を得ることにより、トランスポゾンの有無を検出し得るプライマーの組合せ）、ならびに本領域の上流部位（センス鎖またはアンチセンス鎖）、または本領域の下流部位（アンチセンス鎖またはセンス鎖）に対応する第１のプライマー、および本領域（センス鎖またはアンチセンス鎖）に対応する第２のプライマーの組合せ（増幅の有無によりｍＰｉｎｇ挿入部位の有無を検出し得るプライマーの組合せ）を用いることができる。このような２以上のプライマーとしては、例えば、以下が挙げられる（例、図１を参照）：
１ａ）配列番号１に示される塩基配列における１〜２２８５番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第１のプライマー、および配列番号１に示される塩基配列における２７１６〜５０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第２のプライマーの組合せ；
１ｂ）配列番号１に示される塩基配列における１〜２２８５番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第１のプライマー、および配列番号１に示される塩基配列における２７１６〜５０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ；
１ｃ）配列番号１に示される塩基配列における１〜２２８５番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第１のプライマー、および配列番号１に示される塩基配列における２２８６〜２７１５番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第２のプライマーの組合せ；
１ｄ）配列番号１に示される塩基配列における１〜２２８５番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第１のプライマー、および配列番号１に示される塩基配列における２２８６〜２７１５番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ；
１ｅ）配列番号１に示される塩基配列における２２８６〜２７１５番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第１のプライマー、および配列番号１に示される塩基配列における２７１６〜５０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第２のプライマーの組合せ；
１ｆ）配列番号１に示される塩基配列における２２８６〜２７１５番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第１のプライマー、および配列番号１に示される塩基配列における２７１６〜５０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ。
【００２７】
２）第１２染色体中に見出される１番目のｍＰｉｎｇ挿入部位（１２−１）
１２−１のｍＰｉｎｇ挿入部位は、配列番号２に示される塩基配列（１２−１のｍＰｉｎｇ挿入部位周辺の塩基配列）において、２２８６〜２７１５番目のヌクレオチド残基からなる領域に存在する（図４）。したがって、１２−１のｍＰｉｎｇ挿入部位を検出するための２以上のプライマーとして、本領域の上流部位（センス鎖またはアンチセンス鎖）に対応する第１のプライマー、および本領域の下流部位（アンチセンス鎖またはセンス鎖）に対応する第２のプライマーの組合せ（トランスポゾンの有無に応じてサイズの異なる増幅産物を得ることにより、トランスポゾンの有無を検出し得るプライマーの組合せ）、ならびに本領域の上流部位（センス鎖またはアンチセンス鎖）、または本領域の下流部位（アンチセンス鎖またはセンス鎖）に対応する第１のプライマー、および本領域（センス鎖またはアンチセンス鎖）に対応する第２のプライマーの組合せ（増幅の有無によりｍＰｉｎｇ挿入部位の有無を検出し得るプライマーの組合せ）を用いることができる。このような２以上のプライマーとしては、例えば、以下が挙げられる（例、図２を参照）：
２ａ）配列番号２に示される塩基配列における１〜２２８５番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第１のプライマー、および配列番号２に示される塩基配列における２７１６〜５０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第２のプライマーの組合せ；
２ｂ）配列番号２に示される塩基配列における１〜２２８５番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第１のプライマー、および配列番号２に示される塩基配列における２７１６〜５０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ；
２ｃ）配列番号２に示される塩基配列における１〜２２８５番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第１のプライマー、および配列番号２に示される塩基配列における２２８６〜２７１５番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第２のプライマーの組合せ；
２ｄ）配列番号２に示される塩基配列における１〜２２８５番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第１のプライマー、および配列番号２に示される塩基配列における２２８６〜２７１５番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ；
２ｅ）配列番号２に示される塩基配列における２２８６〜２７１５番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第１のプライマー、および配列番号２に示される塩基配列における２７１６〜５０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第２のプライマーの組合せ；
２ｆ）配列番号２に示される塩基配列における２２８６〜２７１５番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列の相補配列を有する第１のプライマー、および配列番号２に示される塩基配列における２７１６〜５０００番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列またはその均等な塩基配列を有する第２のプライマーの組合せ。
【００２８】
上述した「均等な塩基配列」は、イネの品種間における塩基配列のバリエーションに対応する塩基配列であり得る。したがって、所定の塩基配列（例、配列番号Ｘに示される塩基配列においてＹ〜Ｚ番目の塩基配列の少なくとも一部の塩基配列）に均等な塩基配列は、所定の塩基配列において数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１、２または３個）の塩基の修飾（例、置換、欠失、挿入、付加）を含む塩基配列であり得る。このような均等な塩基配列は、当該技術分野における当業者にとって明らかであり、イネの品種の遺伝子情報を登録しているデータベースを参照することにより、あるいはイネの品種における上記６−３および１２−１の領域周辺の塩基配列を解読することにより、決定できる。
【００２９】
プライマーを構成するヌクレオチド残基（標的部位にアニーリングする相補部分のヌクレオチド残基）の数は、プライマーが標的部位にアニーリングして、目的産物を特異的に増幅できる限り特に限定されず、例えば、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、または２０個以上であってもよい。また、プライマーを構成するヌクレオチド残基の数は、例えば、５０個以下、４０個以下、または３０個以下であってもよい。
【００３０】
プライマーは、増幅産物の検出のため、蛍光物質で標識されていてもよい。このような蛍光物質としては、例えば、６−ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、ＰＥＴが挙げられる。
【００３１】
増幅産物のサイズは、測定機器において、測定対象であるｍＰｉｎｇ挿入部位を検出できるようなサイズである限り特に限定されない。例えば、増幅産物の下限サイズ（例、ｍＰｉｎｇ挿入部位を検出可能な増幅産物のサイズの下限値）は、例えば、５０ｂｐ以上、１００ｂｐ以上、１５０ｂｐ以上、２００ｂｐ以上であってもよい。増幅産物の上限サイズ（例、ｍＰｉｎｇ挿入部位を検出可能な増幅産物のサイズの上限値）は、特に限定されないが、アッセイの簡便化等（例、ＰＣＲ等による増幅時間の短縮、ゲル電気泳動時間の短縮）の観点から、例えば、５０００ｂｐ以下、４５００ｂｐ以下、４０００ｂｐ以下、３５００ｂｐ以下、３０００ｂｐ以下、２５００ｂｐ以下、２０００ｂｐ以下、１５００ｂｐ以下、１０００ｂｐ以下、９００ｂｐ以下、８００ｂｐ以下、７００ｂｐ、６００ｂｐ以下、５００ｂｐ以下であってもよい。したがって、２以上のプライマーは、このような長さの増幅産物が増幅されるように、このような長さで離れている２つの領域に対して設計されてもよい。
【００３２】
上述したように、本発明の識別法は、イネ等の識別において、遺伝子増幅法等のＤＮＡ解析法を利用することにより達成できるが、本発明はまた、このような用途に使用できる、上記１ａ）〜１ｆ）のいずれか１つのプライマーの組合せ、および上記の２ａ）〜２ｆ）のいずれか１つのプライマーの組合せを含む、２以上のプライマーのセット（例、４以上のプライマーの組合せ）を提供する。本発明の知見なしに、上述した２以上のプライマーを２つ組み合せる動機付けは、従来存在しない。本発明の試薬に含まれる２以上のプライマーは、異なる蛍光色を発する別々の蛍光物質により標識されたものであってもよい。
【００３３】
以下に、本発明を詳細に説明するが、本実施例により本発明が限定されるものではない。
【実施例】
【００３４】
実施例１：米を用いた国産米のゲノムＤＮＡにおけるトランスポゾンｍＰｉｎｇの解析
ｍＰｉｎｇは、ＭＩＴＥ（ｍｉｎｉａｔｕｒｅ  ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ  ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）と呼ばれるクラスのトランスポゾンの１種であり、ＭＩＴＥとして初めてイネにおいて転移活性を有していることが報告された。ｍＰｉｎｇは、日本晴とコシヒカリといった近代に育種された品種間でも挿入多型が存在することが報告されていることから、ｍＰｉｎｇの挿入多型が近縁な国産米の品種間の識別に利用可能であると推測された。そこで、国産米の一品種である日本晴における全５０箇所のｍＰｉｎｇ挿入部位が、他の国産米（全２４０品種：表２〜４を参照）でも保存されているか否かについて網羅的に検討した。なお、表２〜４に記載される２４０品種の国産米は全てジャポニカ種であり、これらの２４０品種は、日本の米の流通量の９９．４％を占める。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
【表２】
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【００３７】
【表３】
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【００３８】
【表４】
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【００３９】
具体的には、国産米におけるｍＰｉｎｇ挿入部位の保存性の解析は、日本晴におけるｍＰｉｎｇ挿入部位の上流部位および下流部位に対するプライマー対を設計し、このプライマー対を用いて定法によりＰＣＲを行い、得られた増幅産物のサイズに基づいて行った。ＰＣＲにおけるテンプレートとしては、米から定法により抽出したゲノムＤＮＡを用いた。得られた増幅産物のサイズが大きい場合（Ｌ）は、解析領域内にｍＰｉｎｇ挿入部位が存在することを示す。一方、得られた増幅産物のサイズが小さい場合（Ｓ）は、解析領域内にｍＰｉｎｇ挿入部位が存在しないことを示す。結果を、以下の表５に示す。
【００４０】
【表５】
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【００４１】
その結果、国産米の品種の識別のためのＤＮＡマーカーとしてｍＰｉｎｇ挿入部位が使用できるかどうかを調べるという当初の目的とは異なっていたが、６−３および１２−１のｍＰｉｎｇ挿入部位が、他のｍＰｉｎｇ挿入部位に比し、国産米の品種間で極めて高度に保存されていることが見出された（表５、および図５における「日本」のレーンを参照）。６−３および１２−１のｍＰｉｎｇ挿入部位について、国産米の２４０品種の分析結果の詳細を、表６に示す。また、６−３および１２−１のｍＰｉｎｇ挿入部位の有無の確認のために用いたプライマー対の詳細を、以下の表７に示す。
【００４２】
【表６】
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【００４３】
【表７】
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【００４４】
実施例２：米を用いた外国産米のゲノムＤＮＡにおけるｍＰｉｎｇ挿入部位の有無の解析
次いで、国産米の品種間で極めて高度に保存されている６−３および１２−１のｍＰｉｎｇ挿入部位が、外国産米（全３１品種：１８品種のタイ米＋１３品種のベトナム米：表８を参照）でも保存されているかどうかについて検討した。なお、表８に記載される３１品種の外国産米は全てインディカ種である。
【００４５】
【表８】
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【００４６】
具体的には、外国産米におけるｍＰｉｎｇ挿入部位の保存性の解析は、実施例１と同様に、日本晴におけるｍＰｉｎｇ挿入部位の上流部位および下流部位に対するプライマー対を設計し、このプライマー対を用いて定法によりＰＣＲを行い、得られた増幅産物のサイズに基づいて行った（用いたプライマー対の詳細は、表７を参照）。ＰＣＲにおけるテンプレートとしては、米から定法により抽出したゲノムＤＮＡを用いた。結果を、以下の表９に示す。
【００４７】
【表９】
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【００４８】
その結果、外国産米では、６−３および１２−１のｍＰｉｎｇ挿入部位が、一例（タイ米の一品種についての１２−１）を除き、保存されていなかった（表９、および図５における「タイ」および「ベトナム」のレーンを参照）。
以上より、国産米の品種間で極めて高度に保存されている６−３および１２−１のｍＰｉｎｇ挿入部位が、国産米・外国産米の品種の識別のためのＤＮＡマーカーとして優れることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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