(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染、敗血症、化学療法、照射、毒性化学物質に起因して、またはいずれかの医薬の副作用として発症する、患者における好中球減少症を処置または予防するための、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８またはこれらの混合物からなる群から選択される物質を含む組成物。
【請求項２】
前記好中球減少症を処置または予防することは、好中球が細胞死を経る糖尿病患者における皮膚潰瘍、または皮膚における低酸素条件および好中球機能障害およびアポトーシスと関連する末梢動脈疾患を有する患者において発症する皮膚潰瘍を処置または予防することを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記好中球減少症を処置または予防することは、悪性腫瘍の処置の過程、原子力プラントでの事故または核兵器の使用で起こる、骨髄系細胞の照射によって誘導される損傷を処置または予防することを含む、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
哺乳動物における好中球減少症の処置または予防のためのキットであって、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の組成物と、必要に応じて試薬および／または取扱説明書とを含むことを特徴とする、キット。
【請求項５】
前記組成物は、検出可能な標識を含むか、または検出可能な標識に結合して検出可能な複合体を形成することができる、請求項４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セリンプロテアーゼの阻害剤である治療用化合物、その医薬組成物およびヒトまたは動物の体の処置におけるその使用に関する。より具体的には、本発明は、好中球減少症の処置のための方法であって、必要とする対象（被投与者）への、治療上有効量のセリンプロテアーゼ阻害剤の投与を含む、方法に関する。本発明は、（１）遺伝子治療のために行われる骨髄細胞の形質移入の間および後、（２）造血の再構成のために行われる血液幹細胞動員（ｂｌｏｏｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）の間、ならびに（３）遺伝子治療のための造血の再構成のため、または好中球の注入による好中球減少症の処置のための、骨髄系の細胞の注入の間の骨髄系細胞のアポトーシスの予防をも含む。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、セリンプロテアーゼの阻害剤である化合物の使用に関する。プロテアーゼまたはタンパク質分解酵素は、細菌およびウイルスから哺乳動物までの生物に必須である。プロテアーゼは、ペプチド結合を加水分解することによって、タンパク質を消化および分解する。セリンプロテアーゼ（ＥＣ．３．４．２１）は、活性部位に、主に活性セリン残基に、共通の特徴を有する。触媒残基Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｓｅｒの同一の空間配置を有するが、タンパク質骨格が全く異なる、キモトリプシン／トリプシン／エラスターゼ様セリンプロテアーゼおよびスブチリシン様セリンプロテアーゼという２種類の主要なセリンプロテアーゼが存在する。しかしながら、セリンプロテアーゼの２０を超えるファミリー（Ｓ１〜Ｓ２７）が同定されており、それらは、構造的類似性および他の機能的証拠に基づいて、ＳＡ、ＳＢ、ＳＣ、ＳＥ、ＳＦおよびＳＧの６つのクラスにグループ分けされる。キモトリプシン／トリプシン／エラスターゼ様セリンプロテアーゼのファミリーは、２つのクラスに細分されてきた。「大きい」クラス（約２３０残基）には、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カリクレイン、およびトロンビンなどの哺乳類の酵素がほとんど含まれる。「小さい」クラス（約１９０残基）には細菌酵素が含まれる。
【０００３】
触媒残基Ｈｉｓ、ＡｓｐおよびＳｅｒは、基質のＣ末側または「プライム」側においてＳ１’、Ｓ２’、Ｓ３’などと呼ばれる基質アミノ酸側鎖残基結合ポケットに隣接し、Ｎ末側においてＳ１、Ｓ２、Ｓ３などに隣接する。この命名法は、非特許文献１および非特許文献２に記載されているとおりである。キモトリプシン／トリプシン／エラスターゼ様セリンプロテアーゼは、非特許文献３に記載されるようにＳ１ポケットに存在する残基によってさらに細分することもできる。キモトリプシン様（Ｓ１ポケットにおけるＧｌｙ−２２６、Ｓｅｒ−１８９、およびＧｌｙ−２１６）、トリプシン様（Ｓ１ポケットにおけるＧｌｙ−２２６、Ａｓｐ−１８９、およびＧｌｙ−２１６）およびエラスターゼ様（Ｓ１ポケットにおけるＶａｌ−２２６およびＴｈｒ−２１６）に細分される（残基の付番は標準キモトリプシン付番に対応）。トリプシン様セリンプロテアーゼは、ＬｙｓまたはＡｒｇのいずれかをＳ１ポケットに配置する基質を選択する。
【０００４】
セリンプロテアーゼは、キモトリプシン付番法において１９５位置に存在する特に反応性のＳｅｒ残基を特徴とする共通の触媒メカニズムを有する。セリンプロテアーゼの例としては、トリプシン、トリプターゼ、キモトリプシン、エラスターゼ、トロンビン、プラスミン、カリクレイン、補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）Ｃｌ、先体プロテアーゼ（ａｃｒｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）、リソソームプロテアーゼ、コクナーゼ、α−溶菌プロテアーゼ、プロテアーゼＡ、プロテアーゼＢ、セリンカルボキシペプチダーゼπ、スブチリシン、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）、Ｖｉｌａ因子、ＩＸａ因子およびＸａ因子が挙げられる。セリンプロテアーゼは長年にわたって広範囲に研究されており、実に様々な生理学的プロセスの調節に関与するため、薬物標的として盛んに研究が行われている。
【０００５】
セリンプロテアーゼが関与するプロセスとしては、凝固、フィブリン溶解、受精、発育、悪性腫瘍、神経筋パターニング（ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ）、および炎症が挙げられる。これらの化合物は、種々の循環プロテアーゼおよび組織内で活性化または放出されるプロテアーゼを阻害することが周知である。また、セリンプロテアーゼ阻害剤は、接着、遊走、フリーラジカル生成およびアポトーシスなどの重要な細胞プロセスを阻害することも知られている。さらに、動物実験によって、静脈内投与したセリンプロテアーゼ阻害剤、バリアントまたはセリンプロテアーゼ阻害剤を発現する細胞は組織損傷を防止することが示されている。
【０００６】
セリンプロテアーゼ阻害剤は、腫瘍学、血液学、神経学、呼吸器学、免疫学、炎症および感染症などの実に様々な臨床分野において、疾患の処置で有益に使用される潜在的可能性を有すると予想されてきた。セリンプロテアーゼ阻害剤は、血栓性疾患、喘息、肺気腫、硬変症、関節炎、細胞腫、黒色腫、再狭窄、アテローマ、外傷、ショックおよび再灌流傷害の処置においても有益である可能性がある。有用な総説は、非特許文献４に見出される。セリンプロテアーゼ阻害剤は、特許文献１および特許文献２ならびに特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７および特許文献８に開示されている。
【０００７】
白血球減少症は、約４．０×１０９細胞／Ｌ未満への総白血球数の減少を指す。通常は、この低下は、多形核好中球（ＰＭＮ）の数の減少の結果であり（好中球減少症）、その数は、通常は２．０×１０９細胞／Ｌ未満、そしてしばしば１．０×１０９細胞／Ｌ未満である。好中球減少症は、ウイルス感染症（例えば、インフルエンザ、麻疹、肝炎ウイルス、水痘、デング熱および黄熱、ＨＩＶ）から、または粟粒結核症および敗血症を含めた重症の細菌感染から生じる可能性がある。さらには、好中球減少症は、照射、または例えば、悪性疾患もしくは血管炎および自己免疫疾患の化学療法で使用される薬物を用いた処置が原因で発症する。薬物誘発性好中球減少症の例は、スルホンアミド、抗甲状腺薬、抗ヒスタミン薬、抗菌薬、フェノチアジンならびに種々の鎮痛剤、鎮静剤および消炎剤または種々の毒性化学物質である。感染病原体、薬物および毒性化学物質または抗体による細胞死の誘導は、骨髄の中の好中球および／またはその前駆体細胞に影響を及ぼす可能性がある。骨髄系の細胞に対する抗体は、全身性エリテマトーデスまたは若年性関節リウマチなどの免疫介在性疾患で見られる。上記のすべてに加えて、先天性好中球減少症の種々の形態が記載されてきた。好中球減少症は、循環中のＰＭＮの損傷から生じるだけでなく、感染病原体、薬物、照射および毒性化学物質による、または細胞分裂の緩慢化、ＤＮＡ鎖の複製の遮断、ＲＮＡ形成または紡錘体の微小管の崩壊に起因する骨髄中の幹細胞および有糸分裂細胞の損傷からも生じる。
【０００８】
例えば血液の重大な悪性腫瘍、固形腫瘍または細胞腫のための化学療法に起因する好中球減少症は、感染による著しい罹患率および死亡率を伴う、損なわれた宿主応答を導く。例えば、シクロホスファミド、メトトレキセートおよびフルオロウラシルを用いる早期の乳癌の化学療法は、敗血症を有する患者の３０％において、好中球減少性事象を生じ、さらなる抗癌処置の遅延または用量減少が必要となる。２０〜３０％の用量減少は、より低い完全奏効率、およびリンパ腫を有する患者の生存の短縮または無再発性生存の悪化に関連づけられてきた。好中球減少性敗血症に対する抗菌療法の改善にもかかわらず、毎年、骨髄毒性化学療法を受ける患者のおよそ５％が、感染に関連する合併症のために死亡している。
【０００９】
例えば遺伝子治療のため、または好中球の注入液の調製のための好中球およびその前駆体細胞の生体外での取り扱いには、骨髄系細胞のアポトーシスの誘導に起因して、細胞死の増加が伴う。
【００１０】
好中球減少症の処置のために使用される現在の薬剤としては、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびペグ化されたＧ−ＣＳＦとしてポリエチレングリコールに接合されたＧ−ＣＳＦが挙げられる。好中球減少症のリスクを低下させることにおける上記の承認された薬剤の利用能およびかなりの有効性にもかかわらず、好中球減少症の合併症は、腫瘍学において重要な問題のままである。まれに脾臓の破裂、しかしより頻繁には脾臓体積の増大、肺でのガス交換の障害、ならびに急性の外傷性発作および心筋梗塞の単独症例が、末梢血幹細胞を収集するためにＧ−ＣＳＦを投与される健康なドナーにおいて観察された。Ｇ−ＣＳＦが骨髄異形成症候群および急性骨髄性白血病を引き起こすというエビデンスは、あまり明らかではなく、さらなる将来の長期の研究で分析される必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／０１０００８９号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４／０１８０３７１号明細書
【特許文献３】米国特許第６，７８４，１８２号明細書
【特許文献４】米国特許第６，６５６，９１１号明細書
【特許文献５】米国特許第６，６５６，９１０号明細書
【特許文献６】米国特許第６，６０８，１７５号明細書
【特許文献７】米国特許第６，５３４，４９５号明細書
【特許文献８】米国特許第６，４７２，３９３号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｏｌｄｉｎｇ、Ａｌａｎ  Ｆｅｒｓｈｔ、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９９年、４０−４３頁
【非特許文献２】Ｂｒｉｋら、Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００３年、第１巻、５−１４頁
【非特許文献３】Ｃａｒｌ  ＢｒａｎｄｅｎおよびＪｏｈｎ  Ｔｏｏｚｅ、「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ、１９９１年、２３１−２４１頁
【非特許文献４】Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ、２００２年、第１２巻、第８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
これらのアプローチは有望であるが、好中球減少症の処置のための改善された治療的、予防的または診断的アプローチのニーズがある。本発明は、好中球減少症の処置、診断または予防のための改善された信頼性の高い方法であって、必要とする対象への、治療上有効量のセリンプロテアーゼ阻害剤の投与を含む、方法を提供する。
【００１４】
これらおよび他の目的は、上記の記載から明らかであろうが、それらが本発明によって成し遂げられた。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、好中球減少症に罹患している患者の処置または予防のための方法であって、必要とする患者への、治療上有効量のセリンプロテアーゼ阻害剤の投与を含む方法に関する。好ましくは、このセリンプロテアーゼ阻害剤はカリクレイン阻害剤であり、好ましくはこのカリクレイン阻害剤は、ｈＫ２、ｈＫ３、ｈＫ４、ｈＫ５、ｈＫ６、ｈＫ７、ｈＫ８、ｈＫ９、ｈＫ１０、ｈＫ１１、ｈＫ１２、ｈＫ１３、ｈＫ１４、ｈＫ１５阻害剤またはこれらの混合物から選択される。最も好ましくは、このカリクレイン阻害剤は、ｈＫ２、ｈＫ４、ｈＫ１１、ｈＫ５、ｈＫ１４阻害剤またはこれらの混合物から選択される。さらにより好ましくは、このカリクレイン阻害剤はｈＫ２阻害剤である。好ましくは、このセリンプロテアーゼ阻害剤は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８またはこれらの混合物を含む群から選択される。
【００１６】
感染、敗血症、化学療法、照射、毒性化学物質に起因して、またはいずれかの医薬の副作用として発症する、患者における好中球減少症を処置または予防する方法における使用のためのセリンプロテアーゼ阻害剤も開示される。好ましくは、好中球の数および／または活性化状態は低下している。このセリンプロテアーゼ阻害剤は、好中球が細胞死を経る糖尿病患者における皮膚潰瘍、または皮膚における低酸素条件および好中球機能障害およびアポトーシスと関連する末梢動脈疾患を有する患者において発症する皮膚潰瘍を処置または予防する方法における使用のためのものでもある。また、このセリンプロテアーゼ阻害剤は、悪性腫瘍の処置の過程、原子力プラントでの事故または核兵器の使用で起こる、骨髄系細胞の照射によって誘導される損傷を処置または予防する方法における使用のためのものでもある。好ましくは、このセリンプロテアーゼ阻害剤はカリクレイン阻害剤であり、好ましくはこのカリクレイン阻害剤は、ｈＫ２、ｈＫ３、ｈＫ４、ｈＫ５、ｈＫ６、ｈＫ７、ｈＫ８、ｈＫ９、ｈＫ１０、ｈＫ１１、ｈＫ１２、ｈＫ１３、ｈＫ１４、ｈＫ１５阻害剤またはこれらの混合物から選択される。好ましくは、このセリンプロテアーゼ阻害剤は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８またはこれらの混合物を含む群から選択される。
【００１７】
・好中球減少症もしくは骨髄系の遺伝的障害を有する患者への骨髄系細胞注入に先立つ遺伝子治療のために分子操作を行うために、
・または、好中球減少症もしくは好中球の機能障害を有する患者への注入のために、好中球およびそれらの骨髄前駆体を使用するために、
好中球およびそれらの骨髄前駆体の生体外で調製における使用のためのセリンプロテアーゼ阻害剤がさらに開示される。好ましくは、このセリンプロテアーゼ阻害剤は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８またはこれらの混合物を含む群から選択される。
【００１８】
本発明はさらに、患者の骨髄系細胞のアポトーシスの予防のための方法であって、
（１）遺伝子治療のために行われる骨髄細胞の形質移入の間および後、
（２）造血の再構成のために行われる血液幹細胞動員の間、および／または
（３）遺伝子治療のための造血の再構成のため、または好中球の注入による好中球減少症の処置のための、骨髄系の細胞の注入の間の、
必要とする前記患者への、治療上有効量のセリンプロテアーゼ阻害剤の投与を含む、方法を提供する。好ましくは、このセリンプロテアーゼ阻害剤は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８またはこれらの混合物を含む群から選択される。
【００１９】
また本発明は、哺乳動物における好中球減少症の診断、予後診断、予防または処置のためのキットであって、セリンプロテアーゼ阻害剤と、必要に応じて試薬および／または取扱説明書とを含むことを特徴とする、キットも提供する。好ましくは、このセリンプロテアーゼ阻害剤は、検出可能な標識を含むか、または検出可能な標識に結合して検出可能な複合体を形成することができる。また好ましくは、このセリンプロテアーゼ阻害剤はカリクレイン阻害剤であり、好ましくは、このカリクレイン阻害剤は、ｈＫ２、ｈＫ３、ｈＫ４、ｈＫ５、ｈＫ６、ｈＫ７、ｈＫ８、ｈＫ９、ｈＫ１０、ｈＫ１１、ｈＫ１２、ｈＫ１３、ｈＫ１４、ｈＫ１５阻害剤またはこれらの混合物から選択される。好ましくは、このセリンプロテアーゼ阻害剤は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８またはこれらの混合物を含む群から選択される。
【００２０】
他の目的および利点は、以下の説明のための図面、および添付の特許請求の範囲を参照して進められる、以下の詳細な説明の精査から、当業者には明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１ａ】プロテアーゼ阻害剤ＭＤＰＫ６７ｂとともにインキュベーションした際の好中球およびＴ細胞のアネキシン−Ｖ染色。示すように６μＭ〜６０μＭの範囲の濃度のＭＤＰＫ６７ｂ、または対照としてのＰＢＳとともに、２４または４８時間細胞をインキュベーションした。アネキシンＶ染色およびＦＡＣＳ分析によって、アポトーシスを評価した。示された白血球ポピュレーションは、前方散乱光／側方散乱光ＦＡＣＳドットプロットにおける（好中球）またはＣＤ３に対する陽性染色法による（Ｔ細胞）それらの外観に基づいてゲーティングされた（ｇａｔｅｄ）。
【図１ｂ】プロテアーゼ阻害剤ＭＤＰＫ６７ｂまたはＭＤＯＫＧ９（ＯＫＤＧ９）とともにインキュベーションした際の好中球のアネキシン−Ｖ染色。示されたように６０μＭ（希釈１）〜６０ｐＭ（希釈７）の範囲のＭＤＰＫ６７ｂまたはＭＤＯＫＧ９濃度とともに、好中球を１８時間インキュベーションした。上に概略を示したようにして、アポトーシスを評価した。
【図２】ＭＤＰＫ６７ｂ処置された好中球のアネキシン−Ｖ染色を通した種々の細胞培養条件の比較を示す。好中球は、示された濃度のＭＤＰＫ６７ｂとともに培養された。ＭＤＰＫ６７ｂを含まないＰＢＳが対照としての役割を果たした。５×１０６／ｍｌ（高密度）または３×１０５／ｍｌ（低密度）のいずれかで好中球をプレーティングし（１００μｌ／ウェル）、アネキシンＶ染色およびＦＡＣＳ分析によって、好中球のアポトーシスを評価した。ＲＰＭＩ  １０％  ＦＣＳの代わりの無血清培地（Ｘ−Ｖｉｖｏ  １５）中での５×１０６／ｍｌの好中球の培養が、並行して評価された。
【図３ａ】チロシンキナーゼ阻害剤によるＭＤＰＫ６７ｂ媒介性好中球保護の復帰を示す。培養された好中球のＣＤ１６およびＣＤ１１ｂのレベルに対するＭＤＰＫ６７ｂの効果。好中球は、示された濃度のＭＤＰＫ６７ｂとともに培養され、高レベルのＣＤ１６またはＣＤ１１ｂを発現する好中球の百分率はＦＡＣＳによって評価された。代表的なＦＡＣＳプロットを示す。
【図３ｂ】チロシンキナーゼ阻害剤によるＭＤＰＫ６７ｂ媒介性好中球保護の復帰を示す。ＰＰ２による、ＣＤ１６およびＣＤ１１ｂ好中球レベルに対するＭＤＰＫ６７ｂの効果の復帰。好中球は、Ｓｒｃチロシンキナーゼ阻害剤ＰＰ２（最終濃度１０μＭ）の存在下または不存在下で、示された濃度のＭＤＰＫ６７ｂとともに培養された。ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１６を高く発現する好中球のアポトーシスおよび相対頻度は、ＦＡＣＳ分析によって測定された。
【図４】好中球の生体外アポトーシスに対するＧ−ＣＳＦの効果を示す。好中球は、示された濃度のＧ−ＣＳＦとともに培養され、好中球アポトーシス（ａ）およびＣＤ１６発現の下方制御（ｂ）は、ＦＡＣＳによって分析された。（ｃ）好中球は、ＭＤＰＫ６７ｂ（０．６μＭ）および滴定された量のＧ−ＣＳＦ（濃度は示されるとおり）とともに培養された。培地およびＰＢＳ（ＭＤＰＫ６７ｂを含まない）の中で培養された好中球は、対照としての役割を果たした。
【図５】ＭＤＰＫ６７ｂおよびエトポシドで処置した好中球のアネキシン−ＶおよびＣＤ１６染色を示す。（ａ）ＭＤＰＫ６７ｂおよびエトポシドで処置した好中球のアネキシン−Ｖ染色。エトポシド（１２５μｇ／ｍｌ）を加えたＭＤＰＫ６７ｂ（６μＭ）、エトポシド単独またはＰＢＳとともに、細胞を１８時間インキュベーションした。アネキシンＶ染色およびＦＡＣＳ分析によって、アポトーシスを評価した。関連する白血球ポピュレーションは、前方散乱光または側方散乱光ＦＡＣＳドットプロットにおけるそれらの外観に基づいてゲーティングされた。（ｂ）低ＭＤＰＫ６７ｂおよび増加するエトポシド濃度で処置された好中球のアネキシン−Ｖ染色。細胞は、ＭＤＰＫ６７ｂ（０．０６μＭ）単独、または示すとおりの増加する濃度のエトポシド（μｇ／ｍｌ単位）を加えたＭＤＰＫ６７ｂ（０．０６μＭ）またはＰＢＳとともに、１８時間インキュベーションされた。アネキシンＶ染色によって、アポトーシスを評価し、ＦＡＣＳ分析を上記のようにして行った。（ｃ）ＭＤＰＫ６７ｂおよびエトポシドで処置した好中球のＣＤ１６染色。細胞は、ＭＤＰＫ６７ｂ（０．０６μＭ）単独、または示すとおりの増加する濃度のエトポシド（μｇ／ｍｌ単位）を加えたＭＤＰＫ６７ｂ（０．０６μＭ）またはＰＢＳとともに、１８時間インキュベーションされた。ＣＤ１６を高く発現する好中球の百分率は、ＦＡＣＳ分析によって評価された。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
キモトリプシンスーパーファミリー（ｔ−ＰＡ、プラスミン、ｕ−ＰＡが挙げられる）のセリンプロテアーゼおよび血液凝固カスケードのプロテアーゼのいくつかは、セリンプロテアーゼ触媒ドメインに加え、それらの活性の調節に部分的に関与する他の構造ドメインを含む巨大分子である（Ｂａｒｒｅｔｔ，１９８６；Ｇｅｒａｒｄら、１９８６；Ｂｌａｓｉら、１９８６）。
【００２３】
重要なセリンプロテアーゼは、トリプシン、トリプターゼ、トロンビン、カリクレイン、Ｘａ因子などのトリプシン様酵素である。セリンプロテアーゼ標的は、血液凝固：補体媒介溶菌、免疫反応、炎症、痛覚、糸球体腎炎、膵炎、癌、受胎抑制、細菌感染およびウイルス成熟などのプロセスに関連づけられる。特定の標的に対して高い特異性を有するセリンプロテアーゼを阻害することにより、宿主に対して大きな影響を与えうる生体内の多くの生物学的プロセスを阻害することができる。
【００２４】
セリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）は、ウイルス、植物およびヒトを含む様々な生物に由来する１００を超えるタンパク質をすでに含むスーパーファミリーを構成する様々なタンパク質グループを含む。セルピンは５億年以上前に発生し、阻害機能を有するタンパク質および非阻害機能を有するタンパク質に系統発生学的に分かれた（ＨｕｎｔおよびＤａｙｈｏｆｆ、１９８０）。オボアルブミンなどの非阻害性セルピンは、プロテアーゼ阻害活性を欠く（Ｒｅｍｏｌｄ−Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ、１９９３）。セルピンファミリーのメンバーの主要な機能は、過剰発現したセリンプロテイナーゼ活性を無効化することであると思われる（Ｐｏｔｅｍｐａら、１９９４）。セルピンは、細胞外のマトリクスのリモデリング、炎症反応の調節および細胞遊走においてある役割を果たす（Ｐｏｔｅｍｐａら、１９９４）。
【００２５】
セリンプロテアーゼ阻害剤は、ウシ膵臓トリプシン阻害剤（クニッツ）ファミリー（基本プロテアーゼ阻害剤としても知られる）（Ｋｅｔｃｈａｍら、１９７８）；Ｋａｚａｌファミリー；ストレプトマイセススブチリシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）阻害剤ファミリー；セルピンファミリー；ダイズトリプシン阻害剤（クニッツ）ファミリー；ジャガイモ阻害剤ファミリー；Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋファミリーに分類される（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉら、１９８０；Ｒｅａｄら、１９８６；Ｌａｓｋｏｗｓｋｉら、１９８７）。このセルピンファミリーに属するセリンプロテアーゼ阻害剤には、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤ＰＡＩ−１、ＰＡＩ−２、ＰＡＩ−３、Ｃｌエステラーゼ阻害剤、α−２−抗プラスミン、コントラプシン、α１−アンチトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ、プロテアーゼネキシンＩ、α１−アンチキモトリプシン、プロテインＣ阻害剤、ヘパリンコファクターＩＩおよび成長ホルモン調節タンパク質が含まれる（Ｃａｒｒｅｌｌら、１９８７；Ｓｏｍｍｅｒら、１９８７；Ｓｕｚｕｋｉら、１９８７；Ｓｔｕｍｐら、１９８６）。
【００２６】
セリンプロテアーゼ阻害剤の多くは広い特異性を有し、血液凝固セリンプロテアーゼなどのプロテアーゼのキモトリプシンスーパーファミリーおよびセリンプロテアーゼのストレプトマイセススブチリシンスーパーファミリーの両方を阻害することができる（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉら、１９８０）。セルピンによるセリンプロテアーゼの阻害は、Ｔｒａｖｉｓら（１９８３）、Ｃａｒｒｅｌｌら（１９８５）、Ｓｐｒｅｎｇｅｒｓら（１９８７）に概説されている。ＢＰＴＩ、Ｋａｚａｌ、ＳＳＩ、ダイズトリプシン、ジャガイモ阻害剤ファミリーの完全な阻害剤のいくつか、およびセルピンα−１−アンチトリプシンの切断型の結晶学的データが得られている（Ｒｅａｄら、１９８６）。これらのセリンプロテアーゼ阻害剤は様々なサイズと配列を有するタンパク質だが、これまでに研究された完全な阻害剤は、同族のセリンプロテアーゼの活性部位の認識配列を含む分子の表面から延びる特有のループ（反応性部位ループと呼ばれる）を有する点で共通している（Ｌｅｖｉｎら、１９８３）。異なるセリンプロテアーゼ阻害剤におけるループの構造類似性は顕著である（Ｐａｐａｍｏｋｏｓら、１９８２）。各阻害剤の特異性は、セリンプロテアーゼによる阻害剤の潜在的開裂部位に近いアミノ末端であるアミノ酸の同一性によって主として決定されると考えられる。このアミノ酸（Ｐｉ部位残基として知られる）は、セリンプロテアーゼの活性部位におけるセリンとアシル結合を形成すると考えられている（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉら、１９８０）。セルピンが阻害機能を有するか否かは、コード領域のカルボキシ末端近傍の反応性部位ループのヒンジ領域に位置するコンセンサス配列に強く依存する。反応性部位ループの外では、異なるファミリーに属するセリンプロテアーゼ阻害剤は、一般に、構造的な関連性を有していない。ただし、Ｋａｚａｌファミリーおよびストレプトマイセススブチリシンファミリーの阻害剤は多少の構造および配列類似性を示す。
【００２７】
本発明の理解を容易にするために、本願明細書で使用する場合、以下の定義が与えられる。
【００２８】
「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、「少なくとも１つの」または「１以上の」を意味する。
【００２９】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、通常は内包する（ｉｎｃｌｕｄｅ）と同義で使用し、１または複数の特性（特徴）または成分（要素）が存在することを意味する。
【００３０】
本願明細書において使用する「タンパク質」、「ポリペプチド」、「ポリペプチドの」、「ペプチド」、「ペプチドの」、「ペプチド鎖」という用語は、本願明細書において互換的に使用され、隣接する残基のα−アミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合によって結合した連続するアミノ酸残基を意味する。
【００３１】
「アミノ酸残基」は、当業者に公知の任意のアミノ酸残基を意味する。「アミノ酸残基」という用語は、天然アミノ酸（例えば、３文字コードを使用すると、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌなど）ならびに稀アミノ酸および／または合成アミノ酸およびそれらの誘導体（例えば、Ａａｄ、Ａｂｕ、Ａｃｐ、Ａｈｅ、Ａｉｂ、Ａｐｍ、Ｄｂｕ、Ｄｅｓ、Ｄｐｍ、Ｈｙｌ、ＭｃＬｙｓ、ＭｃＶａｌ、Ｎｖａなど）を含む。
【００３２】
アミノ酸残基またはその誘導体は、異性体（特にキラル異性体、例えばＬ−アイソフォームまたはＤ−アイソフォーム）であってもよい。
【００３３】
「アミノ酸誘導体」という用語は、当業者に公知の任意のアミノ酸誘導体を意味する。例えば、「アミノ酸誘導体」という用語は、さらなる側鎖（アルキル側鎖など）および／またはヘテロ原子置換を有する天然アミノ酸から誘導される残基を含む。
【００３４】
「断片」は、基質の活性部位の各配列とアミノ酸の長さの少なくとも４０％を共有する配列を意味する。これらの配列は、当該配列が由来する本来の配列と同一の特性を有する限り使用することができる。好ましくは、これらの配列は、基質の活性部位の各配列とアミノ酸の長さの７０％超、より好ましくは８０％超、特に好ましくは９０％超を共有する。
【００３５】
また、本発明は、基質の活性部位の配列のバリアントを含む。「バリアント」という用語は、本来の配列のポリペプチドと多少異なるアミノ酸配列（本来の配列と保存的アミノ酸置換において異なるアミノ酸配列）を有するポリペプチドを意味し、１以上のアミノ酸が同一の特性および配座的役割を有する別のアミノ酸によって置換されている。アミノ酸配列のバリアントは、本来のアミノ酸配列内の所定の位置に置換、欠失および／または挿入を有する。保存的アミノ酸置換とは、以下の５つのグループの１つにおける置換と定義される。
Ｉ．非極性またはわずかに極性を有する低分子量の脂肪族残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ
ＩＩ．極性を有する正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ
ＩＩＩ．極性を有する負に荷電した残基およびそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ
ＩＶ．高分子量の芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ
Ｖ．高分子量で非極性の脂肪族残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ。
【００３６】
「カリクレイン」という用語は、腺性または組織カリクレインに関連する。腺性または組織カリクレインは、高い基質特異性ならびに様々な組織と体液中における発現性を有するセリンプロテアーゼのサブファミリーである。「カリクレイン」という用語は、大量のプロテアーゼ酵素が膵分離株において発見された１９３０年代に初めて文献において使用された（ギリシア語で膵は「Ｋａｌｌｉｋｒｅａｓ」である）（Ｋｒａｕｔら、１９３０、Ｗｅｒｌｅ、１９３４）。現代では、カリクレイン酵素は、分子量、基質特異性、免疫学的特徴、遺伝子構造および放出されるキニンの種類が著しく異なる２つの群、血漿カリクレインおよび組織カリクレインに分類されている。カリクレインは、１５種類の相同性を有する単鎖分泌セリンエンドペプチダーゼ（約２５〜３０ｋＤａ）のファミリーを含み、少なくとも６つの哺乳類目の種に相同分子種が存在する。これらのカリクレインは、ｈＫ２、ｈＫ３、ｈＫ４、ｈＫ５、ｈＫ６、ｈＫ７、ｈＫ８、ｈＫ９、ｈＫ１０、ｈＫ１１、ｈＫ１２、ｈＫ１３、ｈＫ１４、およびｈＫ１５である。好ましくは、カリクレインはｈＫ２、ｈＫ４、ｈＫ１１、およびｈＫ１４である。
【００３７】
本願明細書で使用する場合の「抗体」は、抗原による刺激後に免疫系のＢ細胞によって産生される、一群の血漿タンパク質を指す。哺乳動物（すなわち、ヒト）抗体は、Ｉｇ  Ｇ、Ｍ、Ａ、ＥまたはＤのクラスの免疫グロブリンである。本発明の目的のために使用される用語「抗体」としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、内部移行抗体（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、中和抗体、抗イディオタイプ抗体、免疫学的に活性な断片またはその誘導体、免疫学的活性を有する組み換えタンパク質、およびカリクレインまたは膜アンカー型セリンプロテアーゼに結合する免疫複合体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
用語「癌」および「癌性の」は、典型的には未制御の細胞増殖によって特徴付けられる哺乳動物における生理的状態を指すか、または記述する。
【００３９】
本願明細書において使用する「疾患」は、感染、遺伝的欠損または環境ストレスなどの様々な原因によって生じる生物の一部、臓器または全身の病的状態を意味し、識別可能な一群の徴候または症状によって特徴付けられる。
【００４０】
処置対象となる「哺乳動物」とは、ヒト、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、サルなどの家畜および動物園の動物、競技動物またはペットなどの哺乳動物に分類されるあらゆる動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００４１】
「処置」という用語は、治療処置と予防または再発防止の両方を意味する。処置を必要とする者には、すでに疾患を有する者および疾患を予防すべき者が含まれる。そのため、本発明で処置すべき哺乳動物は、疾患を有すると診断されたか、疾患にかかりやすいまたは感染しやすい可能性がある。
【００４２】
「対象」という用語は、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物の患者を意味し、本発明に係る方法を使用して検査または処置することが望ましい個体を含む。ただし、「患者」とは、症状または疾患が存在していることを必ずしも意味するものではないと理解されたい。
【００４３】
「薬学的に許容できる」とは、生理的に許容でき、ヒトに投与した際に異常亢進や眩暈感などのアレルギー性または同様な有害反応を通常は生じさせない分子および組成物を意味する。
【００４４】
本願明細書において使用する「プロテアーゼ」という用語は、分子を認識し、分子中の活性化配列に開裂させる酵素を意味する。プロテアーゼは、内部ペプチド結合を開裂させるエンドペプチダーゼであってもよい。あるいは、プロテアーゼは、ポリペプチドまたはタンパク質分子のＮ末端またはＣ末端からペプチド結合を加水分解するエキソペプチダーゼであってもよい。プロテアーゼは立体配座に折り畳まれ、活性化配列を受容し、開裂させる触媒部位を形成する。
【００４５】
「阻害剤」とは、好ましくはカリクレインまたはセリンプロテアーゼに結合することによって、カリクレインまたはセリンプロテアーゼの機能を特異的に阻害するポリペプチドまたは化合物を意味する。
【００４６】
「反応性セルピンループ」または「反応性部位ループ」またはＲＳＬとは、セルピンに見られ、推定標的プロテアーゼとの相互作用に関係する、露出されたフレキシブルな反応性部位ループを意味する。切断性結合のアミノ酸側の残基から、その結合から離れるに従って、残基は慣用的にＰ１、Ｐ２、Ｐ３などと呼ばれる。切断性結合に続く残基はＰ１’、Ｐ２’、Ｐ３’などと呼ばれる。通常、ＲＳＬは６〜１２個のアミノ酸残基で構成される。
【００４７】
本発明に係る「セリンプロテアーゼ」またはセルピンは、α１−アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）、プロテインＣ阻害剤（ＰＣＩ）、α１−プロテイナーゼ（ＡＡＴ）、ヒトα１−アンチトリプシン関連タンパク質前駆体（ＡＴＲ）、α２プラスミン阻害剤（ＡＡＰ）、ヒトアンチトロンビンＩＩＩ前駆体（ＡＴＩＩＩ）、プロテアーゼ阻害剤１０（ＰＩ１０）、ヒトコラーゲン結合タンパク質２前駆体（ＣＢＰ２）、プロテアーゼ阻害剤７（ＰＩ７）、プロテアーゼ阻害剤ｌｅｕｓｅｒｐｉｎ  ２（ＨＬＳ２）、ヒト血漿プロテアーゼＣ１阻害剤（Ｃ１  ＩＮＨ）、単核細胞／好中球エラスターゼ阻害剤（Ｍ／ＮＥＩ）、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤３（ＰＡＩ３）、プロテアーゼ阻害剤４（ＰＩ４）、プロテアーゼ阻害剤５（ＰＩ５）、プロテアーゼ阻害剤１２（ＰＩ１２）、ヒト内皮プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１前駆体（ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ）（ＰＡＩ−１）、ヒト胎盤プラスミノーゲン活性化因子阻害剤２（ＰＡＩ２）、ヒト色素上皮由来因子前駆体（ＰＥＤＦ）、プロテアーゼ阻害剤６（ＰＩ６）、プロテアーゼ阻害剤８（ＰＩ８）、プロテアーゼ阻害剤９（ＰＩ９）、ヒト扁平上皮癌抗原１（ＳＣＣＡ−１）、ヒト扁平上皮癌抗原２（ＳＣＣＡ−２）、Ｔ４結合グロブリン（ＴＢＧ）、Ｍｅｇｓｉｎ、プロテアーゼ阻害剤１４（ＰＩ１４）、それらのフラグメント、それらの分子キメラ、それらの組み合わせおよび／またはそれらのバリアントを含む群から選択することができる。
【００４８】
これらのセルピン類のほとんどは異なる名称を有するため、出願人は、それらの詳細をまとめる表を下記に提示する：
【００４９】
【表１】
0005667094.tif 000002
【００５０】
有利には、本発明のセリンプロテアーゼ阻害剤はセリンプロテアーゼトリプシン様酵素、好ましくはカリクレイン阻害剤であってもよい。本発明のカリクレイン阻害剤は、ｈＫ２、ｈＫ３、ｈＫ４、ｈＫ５、ｈＫ６、ｈＫ７、ｈＫ８、ｈＫ９、ｈＫ１０、ｈＫ１１、ｈＫ１２、ｈＫ１３、ｈＫ１４、またはｈＫ１５阻害剤から選択される。好ましくは、カリクレイン阻害剤はｈＫ２、ｈＫ４、ｈＫ１１、ｈＫ５およびｈＫ１４阻害剤から選択される。より好ましくは、カリクレイン阻害剤はｈＫ２阻害剤である。
【００５１】
セルピン配列であって、このセルピン配列の反応性セルピンループＰ６−Ｐ６’が、カリクレイン、その生物活性のある断片、そのキメラ分子、これらの組み合わせおよび／またはこれらのバリアントに特異的な少なくとも１つの基質活性部位配列を含むセルピン配列を含むカリクレインの組み換え型阻害剤タンパク質は、本発明によって包含される。このカリクレインに特異的な少なくとも１つの基質活性部位配列は、国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００１０４０（ローザンヌ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌａｕｓａｎｎｅ））に開示される、ファージディスプレイ法によるランダムペンタペプチドライブラリーを使用してカリクレインによって選択される基質ペプチドである。
【００５２】
特に、カリクレイン阻害剤がｈＫ２阻害剤である場合には、阻害剤は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００１０４０号に開示されている阻害剤から選択することができる。国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００１０４０号の開示内容はこの参照によってその全体を本願明細書に援用する。好ましくは、本発明のカリクレイン阻害剤は、ＭＤ８２０、ＭＤ６２、ＭＤ６１、ＭＤ６７、ＭＤＣＩを含む群から選択することができる。最も好ましくは、この阻害剤はＭＤ６２またはＭＤ６１であり、さらにより好ましくはこの阻害剤はＭＤＰＫ６７ｂである。本願は、阻害性ポリペプチド配列と、プロテアーゼに特異的な基質−酵素相互作用部位の少なくとも１つのポリペプチド配列と、を含むプロテアーゼのキメラの阻害剤タンパク質、およびプロテアーゼのキメラの阻害剤タンパク質を製造するための方法を開示する。好ましくは、本発明のセリンプロテアーゼ阻害剤をコードする精製され単離されたＤＮＡ配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１５を含む群から選択される。最も好ましくは、本発明のセリンプロテアーゼ阻害剤をコードする精製され単離されたＤＮＡ配列は配列番号１５である。本発明に係るセリンプロテアーゼ阻害剤の一例として、本願発明者らは、驚くべきことに、以下の表ＩＩに示すプロテアーゼｈＫ２に特異的な６種類の６つの新しいキメラの阻害剤タンパク質を見出した。
【００５３】
【表２】
0005667094.tif 000003
【００５４】
これらの阻害剤タンパク質は、このセルピンの特異性を変更するために、キモトリプシン、肥満細胞キマーゼ、カテプシンＧ、前立腺カリクレインｈＫ２、ＰＳＡ（ｈＫ３）などの多くのヒト酵素を阻害することが知られているα１−アンチキモトリプシンのＲＳＬ（ｒＡＣＴ）を修飾することによって得た。国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００１０４０号に記載されているようにファージディスプレイ技術によって酵素ｈＫ２の基質として選択されるペプチド配列は、ＲＳＬの切断性結合および近傍のアミノ酸残基の代わりとして使用されている。組み換え型阻害剤は細菌中で製造され、アフィニティークロマトグラフィーによって精製されていた。
【００５５】
加えて、本願発明者らは、ｒＡＣＴＷＴのＲＳＬ構造に位置する残基Ｐ３〜Ｐ３’をプロテインＣ阻害剤（ＰＣＩ）のＲＳＬをコードする基質ペンタペプチドによって置換することにより、カリクレインｈＫ２およびｈＫ３を阻害することができるキメラの阻害剤（ＭＤＣＩ）を製造できることを見出した。
【００５６】
カリクレイン阻害剤がｈＫ１４阻害剤である場合には、阻害剤は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００５／０００５０４号に開示されている阻害剤から選択することができる。国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００５／０００５０４号の開示内容はこの参照によってその全体を本願明細書に援用する。好ましくは、この組み換え型阻害剤は、ＡＡＴＧ１、ＡＡＴＧ１Ｇ、ＡＡＴＣ１１、ＡＡＴＣ１１Ｇ、ＡＡＴＥ５、ＡＡＴＥ８、ＡＡＴＦ１１、ＡＡＴＦ３、ＡＡＴＧ９、ＡＣＴＧ１、ＡＣＴＧ１Ｇ、ＡＣＴＣ１１、ＡＣＴＣ１１Ｇ、ＡＣＴＥ５、ＡＣＴＥ８、ＡＣＴＦ１１、ＡＣＴＦ３、ＡＣＴＧ９（配列番号１７）、ＡＣＴＧ１Ｖ、およびＡＣＴＣ１１Ｄを含む群から選択することができる。好ましくは、ｈＫ１４プロテアーゼの阻害剤タンパク質は、ＡＡＴＧ１、ＡＡＴＧ１Ｇ、ＡＡＴＣ１１、ＡＡＴＣ１１Ｇ、ＡＡＴＥ５、ＡＡＴＥ８、ＡＡＴＦ３、ＡＡＴＧ９、ＡＣＴＧ１Ｇ、ＡＣＴＣ１１、ＡＣＴＣ１１Ｇ、ＡＣＴＥ５、ＡＣＴＥ８、ＡＧＴＦ１１、ＡＣＴＦ３、ＡＣＴＧ９（配列番号１８）、ＡＣＴＧ１Ｖ、またはＡＣＴＣ１１Ｄである。本願は、阻害性ポリペプチド配列と、ｈＫ１４プロテアーゼに特異的な基質−酵素相互作用部位の少なくともポリペプチド配列とを有するｈＫ１４プロテアーゼのキメラの阻害剤タンパク質を開示する。ここで、ｈＫ１４プロテアーゼのこのキメラの阻害剤タンパク質は、生理的条件下において、
ｉ）少なくとも４時間のインキュベーション後における１１．７以下の阻害化学量論（ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｙ  ｏｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ（ＳＩ））と、
ｉｉ）少なくとも７５００Ｍ−１ｓ−１の会合速度（Ｋａ）と、
ｉｉｉ）少なくとも３０分間のインキュベーション後における１００％の阻害活性と、
を有する。
【００５７】
加えて、セルピンによるシステインプロテアーゼの阻害については今では数多く報告されているため、プロテアーゼ阻害剤の阻害性ポリペプチド配列はシステインプロテアーゼから選択することもできる（Ｇｅｔｔｉｎｓ  Ｐ．Ｇ．Ｗ．、２００２、「Ｓｅｒｐｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ、１０２、４７５１−４８０３）。例としては、セルピン扁平上皮癌抗原１によるカテプシンＫ、Ｌ、Ｓの阻害、α１−アンチキモトリプシンによる前ホルモンチオールプロテナーゼの阻害、ウイルス性セルピンｃｒｍＡによるカスパーゼ１（インターロイキン１β変換酵素）、カスパーゼ３、カスパーゼ８を含むカスパーゼファミリーのメンバーの阻害ならびにヒトセルピンＰＩ９によるカスパーゼ１、４、８を含むカスパーゼファミリーのメンバーの阻害が挙げられる。
【００５８】
セリンプロテアーゼ阻害剤、抗体、ペプタボディおよびそれらの生物活性のある断片の混合物も本発明によって企図される。
【００５９】
本発明に係る抗体は、カリクレインまたはセリンプロテアーゼに選択的に結合することができ、非標的ポリペプチドには結合しないであろう（または弱く結合するであろう）。本発明に係る抗体は、天然に存在するカリクレインまたはセリンプロテアーゼに、またはその組み換え体ポリペプチドにも結合することができる。本発明の抗体は、細胞によって発現されるカリクレインまたはセリンプロテアーゼに結合することができ、この細胞によって発現されるカリクレインまたはセリンプロテアーゼには、細胞表面型、膜結合型、細胞質型または分泌型が挙げられる。それらは、細胞質型、膜貫通型を含めたカリクレインまたはセリンプロテアーゼ上の１以上のドメイン、および／または細胞外ドメイン（１つまたは複数）にも結合することができる。あるいは、それらは、未変性の形態および／または変性された形態のカリクレインまたはセリンプロテアーゼのいずれにも結合することができる。
【００６０】
抗体が指向するカリクレインまたはセリンプロテアーゼの領域またはエピトープは、意図された用途に応じて変わることができるということは、当業者は理解する。
【００６１】
本発明に係る抗体は、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、および／または細胞外ドメイン、またはいずれのそれらの部分（その断片または誘導体など）を含めて、カリクレインまたはセリンプロテアーゼのいずれの部分も認識および結合できる。
【００６２】
本発明に係る抗体は、免疫原として使用されるカリクレインまたはセリンプロテアーゼなどの免疫原上の異なるエピトープに対する異なる抗体の集団を含むポリクローナル製剤であってもよい。
【００６３】
ポリクローナル抗体は、当該技術分野で周知の方法によって製造することができる。一般に、いずれの抗体（例えば、モノクローナル、ポリクローナルなど）も、単離されたカリクレインまたはセリンプロテアーゼ、または断片を免疫原として使用して産生させることができる。加えて、免疫原は、Ｖ５、Ｈｉｓ、マルトース結合タンパク質、ＧＳＴ、またはヒトＩｇに融合される標的ポリペプチドのすべてまたは一部分を含めた融合タンパク質であってもよい。例えば、ポリクローナル抗体は、かつて、例えばマルトース結合タンパク質に融合されたヒトヘプシンの細胞外ドメインを有する融合タンパク質を使用して産生された（Ｙ  Ｋａｚａｍａら、１９９５  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０：６６−７２）。本発明に係る抗体は、カリクレインまたはセリンプロテアーゼ上に存在する特異的抗原部位に結合するモノクローナル抗体であってもよい。
【００６４】
免疫原を調製するためおよび動物を免疫化するための方法は、当該技術分野で周知である（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ  １９７５  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７；Ｂｒｏｗｎら、１９８１  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２７：５３９−４６；Ｂｒｏｗｎら、１９８０  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５５：４９８０−８３；Ｙｅｈら、１９７６  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７６：２９２７−３１；Ｙｅｈら、１９８２  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２９：２６９−７５；Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２；Ｃｏｌｅら、１９８５  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、７７−９６頁；米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１  Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｍａｒｋｓら、１９９１  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２２：５８１−５９７）。
【００６５】
また本発明は、カリクレイン阻害剤および／またはセリンプロテアーゼ阻害剤がペプタボディの形態にある場合も想定した。国際公開第９８／１８９４３号パンフレット（Ｋａｊａｖａら）および国際公開第２００４０８７７６６号パンフレット（ローザンヌ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ  ｄｅ  Ｌａｕｓａｎｎｅ））（これらは参照によりその全体を本願明細書に援用したものとする）に開示される「ペプタボディ（Ｐｅｐｔａｂｏｄｙ）」は、異常な細胞シグナルを誘導するために多量体化の概念を使用する高アヴィディティ分子である。この多量体化ドメインは、ヒンジ領域またはスペーサ（好ましくは、ヒトＩｇＡ由来の１９のアミノ酸を含有する）に融合されている、ヒト軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）の一部分と、受容体（リガンド）に結合することができるドメイン（結合ドメイン）とからなる。ペプタボディ分子の概念によって、高レベルのカリクレインマーカーおよびセリンプロテアーゼを発現する細胞または組織上での強固な結合が可能になる。「デカボディ（Ｄｅｃａｂｏｄｙ）」は、デカボディが１０本のアームおよび従って１０の結合ドメインを有するという違いはあるが、同じ原理で構築される。
【００６６】
通常、本発明に係る疾患は、感染、敗血症、照射、化学療法、薬物の副作用または毒性化学物質の作用に起因して減少することにより、多形核白血球、好中球の数が問題となる疾患である。
【００６７】
本発明は、好中球の細胞死を防止し、これにより好中球の細胞充実性および機能を回復するための、糖尿病性皮膚潰瘍におけるカリクレイン阻害剤の局所的付与を含む。
【００６８】
また本発明は、遺伝子治療用に分子操作を実施するため、または患者への注入液用に好中球およびその骨髄前駆体を使用するための、好中球およびその骨髄前駆体の調製のための、カリクレイン阻害剤またはセリンプロテアーゼ阻害剤の生体外での使用も包含する。
【００６９】
本発明は、幹細胞または骨髄前駆体細胞または好中球輸血を投与されている患者を、カリクレイン阻害剤またはセリンプロテアーゼ阻害剤を用いて処置することを包含する。
【００７０】
本発明は、任意に１以上の薬学的に許容できる担体と組み合わせて、本願明細書に記載されるカリクレイン阻害剤および／またはセリンプロテアーゼ阻害剤を活性薬剤として含む医薬組成物に関する。
【００７１】
好ましくは、医薬組成物としての、本発明に係る組成物は、適切な経路を介して、通常は経口的にまたは血流もしくはＣＳＦへの注射によって、または皮下にまたは注目する部位に、もしくはその部位の近くに直接、処置を必要とする患者に投与されることになる。
【００７２】
好ましくは、本発明に係る組成物は、骨髄細胞、骨髄系細胞および好中球の注入液用に調製される注入溶液に添加されてもよい。
【００７３】
別の実施形態によれば、本発明の組成物は、遺伝子治療のための骨髄細胞および好中球の生体外操作で、または細胞を保存するための細胞凍結で使用される溶液に添加されてもよい。
【００７４】
さらなる実施形態によれば、本発明の組成物は、糖尿病性皮膚潰瘍または虚血性皮膚潰瘍において、皮膚に局所的に付与されてもよい。
【００７５】
正確な投与量は、組成物の用途（予防または処置）、組成物の正確な特性およびカリクレイン阻害剤またはセリンプロテアーゼ阻害剤に結合した検出可能または機能的な標識の特性などの多くの要因に応じて決定される。
【００７６】
本発明に係る医薬組成物は、活性物質としての薬学的有効量の当該組成物と、必要に応じて薬学的に許容できる担体、希釈剤および助剤と、を含む。
【００７７】
「薬学的有効量」とは、ヒトまたは動物に投与した場合に検出可能な薬理学的および／または生理学的な作用を引き起こす化学物質または化合物を意味する。
【００７８】
本願明細書に記載されるカリクレイン阻害剤および／またはセリンプロテアーゼ阻害剤の投薬単位の薬学的有効量は、通常は処置対象の患者の体重１ｋｇあたり０．００１ｎｇ〜１００μｇの範囲である。
【００７９】
医薬組成物は、１以上の薬学的に許容できる担体、希釈剤および助剤を含むことができる。活性化合物の薬学的に使用可能な製剤への処理を容易にする許容しうる担体、希釈剤、助剤は、採用される投与量および濃度において対象に無毒であり、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、その他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸やメチオニンなどの酸化防止剤；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；ｍ−クレゾール）；低分子量（約１０未満の残基）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、イムノグロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンなどの単糖類、二糖類、その他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（Ｚｎ蛋白錯体など）；および／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン界面活性剤が例として挙げられる。医薬組成物は全身または局所的に投与することができる。例えば、このような組成物は、皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、経皮的、口腔内投与などの非経口投与、埋込型装置による投与によって投与することができるし、または蠕動手段による投与によって送達されてもよい。本願明細書に記載される医薬組成物は、生体吸収性マトリクスに組み込むか、含浸させることができ、マトリクスはマトリクスの懸濁液、ゲルまたは固形支持体の形態で投与される。また、マトリクスは、バイオポリマーから構成されてもよい。
【００８０】
徐放製剤を調製することもできる。徐放製剤の好適な例としては、抗体を含有する固体の疎水性ポリマーの半透過性基材が挙げられ、半透過性基材はフィルムまたはマイクロカプセルなどの成形品である。徐放基材の例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）など）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸と［γ］Ｌ−グルタミン酸エチルのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸リュープロリドからなる注入可能な小球体）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。生体内投与に使用する製剤は無菌状態としなければならない。例えば、無菌濾過膜による濾過によって容易に無菌状態とすることができる。
【００８１】
本発明に係る組成物の適切な投与量は、対象（被投与者）の年令、性別、健康状態、体重、もしあれば同時処置の種類、所望の効果の性質に依存することになるということは理解される。
【００８２】
適切な投与形態は、疾患、阻害剤、投与方法に応じて異なる。例えば、錠剤、カプセル、トローチ、歯科用軟膏、坐剤、吸入剤、溶液、軟膏、非経口デポーが挙げられる。
【００８３】
また、（例えば阻害剤の）アミノ酸のアミノ酸修飾は本発明に包含されるため、これは、阻害剤を非水溶性マトリクスまたはその他の高分子担体に架橋させたり、溶解性、吸着性、血液脳関門透過性を改良したりすることに対して有用な場合がある。そのような修飾は当該技術分野で周知であり、ペプチドなどのあらゆる起こりうる望ましくない副作用を排除または抑制することができる。
【００８４】
通常、本発明のセリンプロテアーゼ阻害剤またはカリクレイン阻害剤は、検出可能な標識を含んでもよく、検出可能な標識に結合して検出可能な複合体を形成してもよい。
【００８５】
「検出可能な標識」とは、診断のための検出可能な分子または検出部位、例えば特定の結合特性を有する酵素またはペプチド（ストレプトアビジンまたは西洋ワサビペルオキシダーゼなど）である。検出部位は、同族の特定の検出可能部位（標識アビジンなど）に結合することによって検出することができるビオチンなどの化学部位をさらに含む。
【００８６】
好ましくは、検出可能な標識は、蛍光標識ならびにＭＲＩ−ＣＴ撮像に対して当該技術分野で通常使用される標識を含む。多くの蛍光材料が公知であり、標識として利用することができる。例としては、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッド、ＡＭＣＡブルー、ルシファーイエローが挙げられる。
【００８７】
本発明のカリクレイン阻害剤またはセリンプロテアーゼ阻害剤は、放射性標識（例えば、同位体３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２１Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、２１１Ａｔ、１９８Ａｕ、６７Ｃｕ、２２５Ａｃ、２１３ｂｕ、９９Ｔｃ、１８６Ｒｅ）を検出部位と担持することができる。放射性標識を使用する場合には、公知の現在利用可能な計数法を使用して特定の結合材料を同定・定量することができる。標識が酵素である場合には、当該技術分野で公知の現在利用できる比色、分光光度法、蛍光分光光度法、電流測定または気体定量法のいずれかによって検出することができる。
【００８８】
生体内撮像の場合には、本発明の標識は、放射性同位体ではなく、造影剤（特に限定されないが、磁気共鳴造影剤など）に結合させることができる。キレート化剤の例としては、ＥＤＴＡ、ポルフィリン、ポリアミンクラウンエーテル、ポリオキシムが挙げられる。常磁性イオンの例としては、ガドリニウム、鉄、マンガン、レニウム、ユウロピウム、ランタン、ホルミウム、エルビウムが挙げられる。
【００８９】
本発明の別の主題は、哺乳動物における好中球減少症の診断、予後診断、予防または処置のためのキットであって、本発明の組成物と、必要に応じて試薬および／または取扱説明書と、を含むキットを提供することにある。本発明のキットは、例えば、化学療法剤、抗表皮成長因子受容体抗体、放射免疫治療薬、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される抗癌剤を含む別々の医薬品剤形をさらに含んでもよい。
【００９０】
一般に、キットは、容器と、容器上または容器内に設けられたラベルまたは包装挿入物を含む。適切な容器としては、瓶、バイアル、注射器などが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの各種材料で形成することができる。容器は、状態を処置するために有効な組成物を保持し、無菌アクセス口（例えば、容器は静脈注射用溶液バッグまたは皮下注射針を貫通させることができるストッパーを有するバイアルであってもよい）を有することができる。ラベルまたは包装挿入物は、組成物が好中球減少症などの選択された症状を処置するために使用されることを表示する。
【００９１】
あるいはまたはさらに、キットは、静菌剤注射用蒸留水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液などの薬学的に許容できるバッファーを含む第２（第３）の容器を含むことができる。製品は、その他のバッファー、希釈剤、フィルタ、針、注射器などの市販またはユーザーの見地から望ましいその他の材料をさらに含むことができる。
【００９２】
また、本発明は、本発明の組成物の、哺乳動物における好中球減少症の診断、予後診断、予防または処置のための生体外および生体内試験システムの開発と標準化における薬理学ツールとしての使用を開示する。
【００９３】
また、本発明は、組織試料における好中球減少症の診断、予後診断、予防または処置のための検出分析方法であって、その組織試料を本発明の組成物と接触させること、検出された標識の量を検出・測定すること、この量をその組織試料における好中球減少症の有無に相関させることを含む方法を包含する。
【００９４】
当業者には、具体的に説明した実施形態以外に本発明を容易に変更および変形することができることは明らかであろう。本発明は、本発明の趣旨および基本的な特徴から逸脱しないすべてのそのような変更および変形を含むということを理解されたい。また、本発明は、本願明細書において参照または例示したすべての工程、特徴、組成物および化合物を個々または一括して含み、複数の工程または特徴のすべての組み合わせを含む。従って、本願の開示は例示した態様に限定されるものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって示され、均等物の意味および範囲に含まれるあらゆる変形は本発明の範囲に含まれる。
【００９５】
本願明細書において各種参考文献を引用しているが、各参考文献の内容は各参照によってその全体を本願明細書に援用するものとする。
【００９６】
上記説明は以下の実施例を参照することによりさらに十分に理解されるだろう。ただし、以下の実施例は本発明を実施する方法の例示に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００９７】
好中球細胞生存に対するＭＤＰＫ６７Ｂの生体外効果
生体外での好中球の生存率を評価するために、健康なドナーからの末梢血を赤血球溶解し、好中球または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離した。ＲＰＭＩ  １０％ＦＣＳの中での培養は、特段の記載がない限り９６穴のマイクロタイタープレート（５×１０５細胞／ウェル）で行った。アポトーシス好中球またはＰＢＭＣの百分率を、蛍光アネキシンＶ−タンパク質結合の結合、またはＦＡＣＳ（蛍光発色セルソーター）分析によるＣＤ１１ｂまたはＣＤ１６細胞表面発現の測定に基づいて評価した。
【００９８】
実施例１：ＭＤＰＫ６７ｂは、生体外で用量依存的に好中球のアポトーシスを減少させたが、Ｔ細胞生存に対しては有意な効果はない。
図１：プロテアーゼ阻害剤ＭＤＰＫ６７ｂおよびＭＤ０ＫＧ９とともにインキュベーションした際の好中球およびＴ細胞のアネキシン−Ｖ染色。
図１ａ：ＭＤＰＫ６７ｂとともにインキュベーションした際の好中球およびＴ細胞のアネキシン−Ｖ染色。
示すように６μＭ〜６０μＭの範囲の濃度のＭＤＰＫ６７ｂ、または対照としてのＰＢＳとともに、２４または４８時間細胞をインキュベーションした。アネキシンＶ染色およびＦＡＣＳ分析によって、アポトーシスを評価した。示した白血球ポピュレーションは、前方散乱光／側方散乱光ＦＡＣＳドットプロットにおける（好中球）またはＣＤ３に対する陽性染色法による（Ｔ細胞）それらの外観に基づいてゲーティングした。
図１ｂ：ＭＤＰＫ６７ｂまたはＭＤＯＫＧ９（ＯＫＤＧ９）とともにインキュベーションした際の好中球のアネキシン−Ｖ染色。
示したように６０μＭ（希釈１）〜６０ｐＭ（希釈７）の範囲のＭＤＰＫ６７ｂまたはＭＤＯＫＧ９濃度とともに、好中球を１８時間インキュベーションした。上に概略を示したようにして、アポトーシスを評価した。
結論：６０μＭ〜０．６μＭの範囲の用量のＭＤＰＫ６７ｂは好中球のアポトーシスを阻害する。ＭＤＯＫＧ９は、好中球がアポトーシスに誘導されることから保護するという同様の効果を有する。この効果は好中球に特異的であり、ＭＤＰＫ６７Ｂは、単球またはリンパ球のアポトーシスを阻害しなかった。
【００９９】
実施例２：アポトーシスに対する、好中球のＭＤＰＫ６７ｂ介在性保護は、培養条件に依存しない。
図２：ＭＤＰＫ６７ｂ処置された好中球のアネキシン−Ｖ染色を通した種々の細胞培養条件の比較。
好中球を、示した濃度のＭＤＰＫ６７ｂとともに培養した。ＭＤＰＫ６７ｂを含まないＰＢＳが対照としての役割を果たした。５×１０６／ｍｌ（高密度）または３×１０５／ｍｌ（低密度）のいずれかで好中球をプレーティングし（１００μｌ／ウェル）、アネキシンＶ染色およびＦＡＣＳ分析によって、好中球のアポトーシスを評価した。ＲＰＭＩ  １０％  ＦＣＳの代わりの無血清培地（Ｘ−Ｖｉｖｏ  １５）中での５×１０６／ｍｌの好中球の培養を、並行して評価した。
結論：ＭＤＰＫ６７ｂは、増殖培地中の細胞密度および血清の有無によらずに、生体外で好中球のアポトーシスを阻害する。
【０１００】
実施例３：Ｓｒｃチロシンキナーゼ阻害剤ＰＰ２は、ＭＤＰＫ６７ｂが媒介する好中球のアポトーシスの減少を逆転させる。
図３：チロシンキナーゼ阻害剤によるＭＤＰＫ６７ｂ媒介性好中球保護の復帰。
図３ａ：培養された好中球のＣＤ１６およびＣＤ１１ｂのレベルに対するＭＤＰＫ６７ｂの効果。好中球を、示した濃度のＭＤＰＫ６７ｂとともに培養し、高レベルのＣＤ１６またはＣＤ１１ｂを発現する好中球の百分率をＦＡＣＳによって評価した。代表的なＦＡＣＳプロットを示す。
図３ｂ：ＰＰ２による、ＣＤ１６およびＣＤ１１ｂ好中球レベルに対するＭＤＰＫ６７ｂの効果の復帰。好中球を、Ｓｒｃチロシンキナーゼ阻害剤ＰＰ２（最終濃度１０μＭ）の存在下または不存在下で、示した濃度のＭＤＰＫ６７ｂとともに培養した。ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１６を高く発現する好中球のアポトーシスおよび相対頻度を、ＦＡＣＳ分析によって測定した。
結論：ＭＤＰＫ６７ｂは、ＣＤ１６およびＣＤ１１ｂを高レベルで発現する好中球の頻度（これは、アポトーシスの減少と関連する）を用量依存的に増加させる。ＭＤＰＫ６７ｂの存在下でのＣＤ１１ｂを高く発現する好中球の頻度の増加およびアポトーシスの減少は、Ｓｒｃチロシンキナーゼ阻害剤ＰＰ２の存在下で逆転させることができる。細胞内シグナル伝達経路を遮断する他のキナーゼ阻害剤（ＰＩ３Ｋ阻害剤Ｌｙ２９４００２およびＥＲＫ阻害剤ＰＤ９８０５９が挙げられる）で、同様の効果を観察した。
【０１０１】
実施例４：アポトーシスからの好中球の保護においてＧ−ＣＳＦと比較した、ＭＤＰＫ６７ｂの優れた効果
図４：好中球の生体外アポトーシスに対するＧ−ＣＳＦの効果。
好中球を、示した濃度のＧ−ＣＳＦとともに培養し、好中球アポトーシス（ａ）およびＣＤ１６発現の下方制御（ｂ）を、ＦＡＣＳによって分析した。（ｃ）好中球は、ＭＤＰＫ６７ｂ（０．６μＭ）および滴定された量のＧ−ＣＳＦ（濃度は示すとおり）とともに培養した。培地およびＰＢＳ（ＭＤＰＫ６７ｂを含まない）の中で培養した好中球は、対照としての役割を果たした。
結論：好中球アポトーシスに対するＭＤＰＫ６７ｂの効果は、単独では好中球アポトーシスに対する軽度の防御効果しか有しないＧ−ＣＳＦによっては影響されない。
【０１０２】
実施例５：ＭＤＰＫ６７ｂは、細胞増殖抑制剤誘発の好中球のアポトーシスを低下させる
図５：ＭＤＰＫ６７ｂおよびエトポシドで処置した好中球のアネキシン−ＶおよびＣＤ１６染色。
図５ａ：ＭＤＰＫ６７ｂおよびエトポシドで処置した好中球のアネキシン−Ｖ染色。
エトポシド（１２５μｇ／ｍｌ）を加えたＭＤＰＫ６７ｂ（６μＭ）、エトポシド単独またはＰＢＳとともに、細胞を１８時間インキュベーションした。アネキシンＶ染色およびＦＡＣＳ分析によって、アポトーシスを評価した。関連する白血球ポピュレーションは、前方散乱光または側方散乱光ＦＡＣＳドットプロットにおけるそれらの外観に基づいてゲーティングした。
図５ｂ：低ＭＤＰＫ６７ｂおよび増加するエトポシド濃度で処置された好中球のアネキシン−Ｖ染色。
細胞を、ＭＤＰＫ６７ｂ（０．０６μＭ）単独、または示すとおりの増加する濃度のエトポシド（μｇ／ｍｌ単位）を加えたＭＤＰＫ６７ｂ（０．０６μＭ）またはＰＢＳとともに、１８時間インキュベーションした。アネキシンＶ染色によって、アポトーシスを評価し、ＦＡＣＳ分析を上記のようにして行った。
図５ｃ：ＭＤＰＫ６７ｂおよびエトポシドで処置した好中球のＣＤ１６染色。
細胞を、ＭＤＰＫ６７ｂ（０．０６μＭ）単独、または示すとおりの増加する濃度のエトポシド（μｇ／ｍｌ単位）を加えたＭＤＰＫ６７ｂ（０．０６μＭ）またはＰＢＳとともに、１８時間インキュベーションした。ＣＤ１６を高く発現する好中球の百分率を、ＦＡＣＳ分析によって評価した。
結論：細胞増殖抑制剤であるエトポシドの高用量（１２５μｇ／ｍｌまで）でさえ、部分的にしかＭＤＰＫ６７ｂのアポトーシス低下効果を遮断しない。
【０１０３】
実施例６：白血病細胞株ならびにドナー由来の単核細胞および好中球細胞におけるＫＬＫ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。
物質および方法：
ＤＵ−１４５、ＰＣ−３、Ｔ４７Ｄ、ＯＶＣＡＲ−３、ＨＬ−６０、ＴＨＰ１およびＵ９３７細胞株を、１０％不活性化ウシ胎仔血清を含む適切な標準的な培地の中で培養し、５％  ＣＯ２とともに３７℃でインキュベーションした。単核細胞および好中球細胞を単離した。トリゾール試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）およびＰｕｒｅＬｉｎｋ  Ｍｉｃｒｏ−ｔｏ−Ｍｉｄｉ  キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して上記細胞から全ＲＮＡを抽出し、２μｇの全ＲＮＡを、製造業者の取扱説明書に従って、２０μｌ反応液の中でＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡへと逆転写した。各カリクレインに特異的プライマーおよび対照としてのアクチンプライマーを使用してＰＣＲ反応を行った。すべてのプライマーは、すでに文献に記載されていた（Ｈａｒｖｅｙ  ＴＪら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２０００年１２月１日；２７５（４８）：３７３９７−４０６）。Ｙｏｕｓｅｆ  ＧＭら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００１年１月５日；２７６（１）：５３−６１。Ｙｏｕｓｅｆ  ＧＭら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００１年４月１５日；６１（８）：３４２５−３１）。ＰＣＲ反応によっては、ＤＵ−１４５、ＰＣ−３、Ｔ４７Ｄ、ＯＶＣＡＲ−３を含めた異なる細胞株から単離したＲＮＡを、ＫＬＫ発現についての陽性対照として使用した（Ｈａｒｖｅｙ  ＴＪら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２０００年１２月１日；２７５（４８）：３７３９７−４０６）。
循環条件は、主にＨａｒｖｅｙ  ＴＪら（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２０００年１２月１日；２７５（４８）：３７３９７−４０６）によって記載されているとおり、標的遺伝子に依存していた。ＰＣＲ混合物を２％アガロースゲル上で電気泳動にかけ、臭化エチジウム染色によって可視化した。示したところでは、予想されるサイズのＤＮＡバンドを、電気泳動後に第２の２％アガロースゲルから切り取り、回収したＤＮＡを配列決定した。
【０１０４】
ＲＴ−ＰＣＲによるＫＬＫ増幅のために使用したプライマー；
【表３】
0005667094.tif 000004
【０１０５】
結果：
表２：白血病細胞株ならびにドナー由来の単核細胞および好中球細胞におけるＲＴ−ＰＣＲ分析によって得た１５のＫＬＫ遺伝子の発現パターン。使用した以下の記号は、以下の内容を表す：＋＋、中／高発現；＋、低発現；（１）予想されるサイズのＰＣＲ産物を配列決定し、正しい配列であることを確認した。
【０１０６】
【表４】
0005667094.tif 000005
【０１０７】
結論：
白血病細胞株および単離されたヒト血液細胞におけるＫＬＫ発現レベルのＲＴ−ＰＣＲ分析は、複数のＫＬＫが発現されるということ、および異なる細胞はＫＬＫプロテアーゼファミリーについて非常に多様な発現パターンを有するということを示した。ＫＬＫ発現レベルのこのような差は、記載した好中球細胞におけるアポトーシスに対する保護のような、これらの細胞の生体外培養物に対してカリクレイン阻害剤が有する異なる効果に関与している可能性がある。
【０１０８】
配列表
【表５】
0005667094.tif 000006
【０１０９】
【表６】
0005667094.tif 000007
イタリック体：開始コドンＡＴＧ
太字：Ｈｉｓ−タグ
下線：ＤＮＡ突然変異
下線および灰色：ＲＳＬ突然変異をコードするＤＮＡ配列。
【０１１０】
【表７】
0005667094.tif 000008
【０１１１】
【表８】
0005667094.tif 000009
イタリック体：開始コドンＡＴＧ
太字：Ｈｉｓ−タグ
下線：ＤＮＡ突然変異
下線および灰色：ＲＳＬ突然変異をコードするＤＮＡ配列。
【０１１２】
【表９】
0005667094.tif 000010
【０１１３】
【表１０】
0005667094.tif 000011
イタリック体：開始コドンＡＴＧ
太字：Ｈｉｓ−タグ
下線：ＤＮＡ突然変異
下線および灰色：ＲＳＬ突然変異をコードするＤＮＡ配列。
【０１１４】
【表１１】
0005667094.tif 000012
【０１１５】
【表１２】
0005667094.tif 000013
イタリック体：開始コドンＡＴＧ
太字：Ｈｉｓ−タグ
下線：ＤＮＡ突然変異
下線および灰色：ＲＳＬ突然変異をコードするＤＮＡ配列。
【０１１６】
【表１３】
0005667094.tif 000014
【０１１７】
【表１４】
0005667094.tif 000015
イタリック体：開始コドンＡＴＧ
太字：Ｈｉｓ−タグ
下線：ＤＮＡ突然変異
下線および灰色：ＲＳＬ突然変異をコードするＤＮＡ配列。
【０１１８】
【表１５】
0005667094.tif 000016
【０１１９】
【表１６】
0005667094.tif 000017
イタリック体：開始コドンＡＴＧ
太字：Ｈｉｓ−タグ
下線：ＤＮＡ突然変異
下線および灰色：ＲＳＬ突然変異をコードするＤＮＡ配列。
【０１２０】
【表１７】
0005667094.tif 000018
【０１２１】
【表１８】
0005667094.tif 000019
【０１２２】
【表１９】
0005667094.tif 000020
【０１２３】
【表２０】
0005667094.tif 000021
イタリック体：開始コドンＡＴＧ
太字：Ｈｉｓ−タグ
下線：ＤＮＡ突然変異
下線および灰色：ＲＳＬ突然変異をコードするＤＮＡ配列。
【０１２４】
【表２１】
0005667094.tif 000022
イタリック体および太字：開始コドンＡＴＧ
太字および下線：Ｈｉｓ−タグ
下線：ＤＮＡ突然変異（付加コドン）
下線および灰色：ＲＳＬ突然変異をコードするＤＮＡ配列。
【０１２５】
【表２２】
0005667094.tif 000023
イタリック体および太字：開始メチオニン
太字および下線：Ｈｉｓ−タグ
下線：アミノ酸突然変異（付加）
下線および灰色：ＲＳＬ突然変異。
【図１ａ】
0005667094.tif 000024
【図１ｂ】
0005667094.tif 000025
【図２】
0005667094.tif 000026
【図３ａ】
0005667094.tif 000027
【図３ｂ】
0005667094.tif 000028
【図４】
0005667094.tif 000029
【図５】
0005667094.tif 000030
【配列表】
0005667094000001.app