(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖アルコール誘導体としてＤ−Ｇｌｕｃａｌ（下式（１））、もしくはデオキシ糖誘導体として２，３−Ｄｉｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｈｅｘｏｓｅ（ＤＥＨ、下式（２））、またはＡｌｋｙｌ  ２，３−ｄｉｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｈｅｘｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＡＤＥＨ、下式（５））を有効成分として、血管内皮細胞の増殖を阻害しないことを特徴とする管腔形成抑制剤（ただし、ＤＥＨ（下式（２））の癌治療剤の用途を除く）。
【化１０】
0005649358.tif 000011
（式（５）で、Ｒは炭素数１〜５のアルキル基を表す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デオキシ糖誘導体、または糖アルコール誘導体を有効成分とする、血管内皮細胞の管腔形成抑制剤に関する。更に詳しくは、デオキシ糖誘導体、または糖アルコール誘導体を有効成分として、血管内皮細胞の増殖を実質的に阻害しないことを特徴とする管腔形成抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、新しい血管が形成される現象である。血管形成において血管を構築する血管内皮細胞の増殖と、遊走と、血管内皮細胞による管腔の形成が主要な役割を果たしている。そのため、血管新生阻害剤の評価は、血管内皮細胞の増殖と遊走と管腔形成に対する阻害剤の作用を観察することで行われている。血管新生は組織の発達や創傷治癒過程などの正常な生命活動の他に、関節リウマチ、糖尿病網膜症、癌の増殖や転移の際などにおいても活発化し、疾患の進行に深くかかわっている。したがって、このような病的な血管新生を阻害することが、前述の疾患の治療につながることから、血管新生に関連した治療薬の研究開発が多くの企業等で行われてきた。（非特許文献１参照）
【０００３】
血管新生を阻害する物質としては、アバスチン、インターフェロンα、マリマスタット、ネオバスタット、サリドマイド、ＴＮＰ−４７０など多くの化合物が報告されている（非特許文献１、２参照）。しかし、副作用の問題や、病的な血管新生だけを選択的に阻害することが難しいなどの問題があり、新たな血管新生阻害剤候補の開発が強く求められている。
血管新生阻害剤候補の開発において、単糖やデオキシ糖による血管新生に対する効果が検討された。単糖やデオキシ糖などの糖質は生体内に広く存在し様々な生命現象に関与していることから、血管新生に対して何らかの作用を及ぼすものと期待された。
【０００４】
まず、２−デオキシ−Ｄ−リボースは、チミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）による血管新生の活性を有するが、その立体異性体である２−デオキシ−Ｌ−リボース、２−デオキシ−Ｌ−リボースのヒドロキシル基のメチル化および／またはアシル化誘導体、並びに２−デオキシ−Ｄ−リボースのヒドロキシル基のメチル化および／またはアシル化誘導体が、血管内皮細胞の遊走実験と、マウスでの血管新生阻害実験により血管新生阻害剤であることが開示された（特許文献１参照）。
【０００５】
一方、多数の希少糖、単糖について血管内皮細胞の増殖や管腔形成に及ぼす効果を検討した結果、Ｄ−アロース、Ｄ−マンノース、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、３−デオキシ−Ｄ−グルコース、Ｌ−ソルボース、２−デオキシ−Ｄ−リボースと２−デオキシ−Ｌ−リボースに血管内皮細胞の増殖抑制が見られた。管腔形成の抑制は、Ｄ−アロース、Ｄ−アルトロース、Ｄ−グロース、Ｄ−タロース、Ｌ−アロース、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、３−デオキシ−Ｄ−グルコース、Ｄ−リボース、Ｌ−リボース、２−デオキシ−Ｄ−リボースと２−デオキシ−Ｌ−リボースに認められた。（２−デオキシ−Ｄ−リボースの効果が前記の特許文献１と一致しないが理由は不明である。）Ｄ−アロース、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、３−デオキシ−Ｄ−グルコース、２−デオキシ−Ｄ−リボースと２−デオキシ−Ｌ−リボースは、増殖と管腔形成の両方の阻害作用を有していた。これらの結果から血管新生阻害作用という生理活性発現の原因は、Ｄ−グルコースの２位や３位の水酸基の不在にあると考えられた。（特許文献２、非特許文献３参照）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ０２／０５１４２３号パンフレット
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００５／１１５４０８号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｒ．Ｋ．ジェイン、Ｐ．Ｆ．カルメリ「血管新生の科学」、別冊日経サイエンス１３９（ポストゲノム時代の医療革新）、ｐ１００−１０７（２００２年）
【非特許文献２】荒井雅吉、小林資正「血管新生を標的とする新しい抗がん剤」、化学６３（１０）、７２−７３（２００８）
【非特許文献３】塚本郁子「希少糖の話」、薬剤学６７（５）、３１４−３２２（２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、デオキシ糖誘導体、または糖アルコール誘導体を有効成分として、血管内皮細胞の増殖を実質的に阻害しないことを特徴とする管腔形成抑制剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、単糖の六員環に結合する１つの水酸基を不在としたデオキシ糖よりも、２つの水酸基を不在とした六員環構造を有するデオキシ糖誘導体、または糖アルコール誘導体の方が更に強い血管新生阻害作用を示す可能性があると着想し、Ｄ−Ｇｌｕｃａｌ（下式（１））と、２，３−Ｄｉｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｈｅｘｏｓｅ（ＤＥＨ、下式（２））、Ｍｅｔｈｙｌ  ２，３−ｄｉｄｅｏｘｙ−α−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｈｅｘｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＭＤＥＨ、下式（３））、および１，５−Ａｎｈｙｄｒｏ−２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏ−ｈｅｘｉｔｏｌ（ＡＤＡＨ、下式（４））について、血管内皮細胞の増殖と管腔形成に及ぼす効果を調べたところ、最後のＡＤＡＨは管腔形成も細胞増殖も阻害しなかったのに対して、前３者は驚くべきことに血管内皮細胞による管腔形成を阻害するが、血管内皮細胞の増殖を実質的に阻害しないことを見出して、本発明を完成するに至った。
【００１０】
【化１】
0005649358.tif 000002
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の通りの管腔形成抑制剤を提供するものである。
（１）  デオキシ糖誘導体、または１，５−Ａｎｈｙｄｒｏ−２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏ−ｈｅｘｉｔｏｌ（ＡＤＡＨ、下式（４））を除く糖アルコール誘導体を有効成分として、血管内皮細胞の増殖を実質的に阻害しないことを特徴とする管腔形成抑制剤。
（２）  糖アルコール誘導体がＤ−Ｇｌｕｃａｌ（下式（１））である、もしくはデオキシ糖誘導体が２，３−Ｄｉｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｈｅｘｏｓｅ（ＤＥＨ、下式（２））、またはＡｌｋｙｌ  ２，３−ｄｉｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｈｅｘｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＡＤＥＨ、下式（５））である、（１）に記載の管腔形成抑制剤。
【００１２】
【化２】
0005649358.tif 000003
（式（５）で、Ｒは炭素数1〜５のアルキル基を表す。）
【発明の効果】
【００１３】
本発明の管腔形成抑制剤は、血管内皮細胞による管腔形成を阻害するが、血管内皮細胞の増殖を阻害しないことから、細胞毒性のない血管新生阻害剤として有用である可能性が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例の管腔形成アッセイの結果（１０日間培養後の管腔面積の相対値）を示す棒グラフ。
【図２】実施例の増殖アッセイの結果（添加４８時間後の細胞数の相対値）を示す棒グラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の管腔形成抑制剤は、デオキシ糖誘導体、または１，５−Ａｎｈｙｄｒｏ−２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏ−ｈｅｘｉｔｏｌ（ＡＤＡＨ）を除く糖アルコール誘導体を有効成分とする。好ましくは、糖アルコール誘導体としてＤ−Ｇｌｕｃａｌ、もしくはデオキシ糖誘導体として２，３−Ｄｉｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｈｅｘｏｓｅ（ＤＥＨ）、またはＡｌｋｙｌ  ２，３−ｄｉｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｈｅｘｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＡＤＥＨ）を有効成分とする。ＡＤＥＨのアルキル基は、炭素数１〜５が好ましく、炭素数１（メチル基）が特に好ましい。炭素数が６以上では、溶解性が悪くなり好ましくない。
【００１６】
Ｄ−Ｇｌｕｃａｌは、試薬として市販されている（シグマ−アルドリッチ、４６４０５８）。２，３−Ｄｉｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｈｅｘｏｓｅ（ＤＥＨ）は、Ｓ．Ｙ−Ｋ．Ｔａｍ  ａｎｄ  Ｂ．Ｆｒａｓｅｒ−Ｒｅｉｄ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４５（１），２９−４３（１９７５）に記載の方法により合成することができる。Ｍｅｔｈｙｌ  ２，３−ｄｉｄｅｏｘｙ−α−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｈｅｘｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＭＤＥＨ）を含むＡｌｋｙｌ  ２，３−ｄｉｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｈｅｘｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＡＤＥＨ）は、Ｓ．Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｓｅｒｂ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６６（８），４９９−５０５（２００１）に記載の方法により合成できる。また、これらは公知の合成方法を組合せた別の方法により合成することも可能である。
【００１７】
なお、前記の特許文献２、非特許文献３に記載された希少糖、単糖のうち、増殖抑制効果を有さないが管腔形成阻害効果を有するものとして、Ｄ−アルトロース、Ｄ−グロース、Ｄ−タロース、Ｌ−アロース、Ｄ−リボース、Ｌ−リボースが記載されている。前４つはアルドヘキソースであり、後２つはアルドペントースであるから、これらはデオキシ糖でも糖アルコールでもない。従って本発明は、特許文献２、非特許文献３には開示されていないし、これらの記載から容易に発明できるものでもないと考える。
【００１８】
本発明において管腔形成を評価する方法に用いる血管内皮細胞としては、例えば、ヒト、ウシ、マウス、ラット由来の血管内皮細胞が挙げられる。さらに詳しくは、例えば、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞、ウシ大動脈内皮細胞、マウス脳内皮細胞、ラット肝類洞内皮細胞が挙げられる。臍帯静脈内皮細胞、及びその他の血管内皮細胞の単離および培養方法は、当業者によく知られており、いずれの方法を用いて得られたものであってもよい。また、臍帯静脈血管内皮細胞由来の培養細胞は市販されており、これを用いるのが簡便である。本発明において管腔形成アッセイには、例えば、２％のウシ胎児血清を添加した市販の内皮細胞増殖培地中で、継代培養した臍帯由来血管内皮細胞が好適に用いられ、採取した後、３〜８代の細胞が特に好適に用いられる。
【００１９】
本発明の管腔形成抑制剤は、血管新生を伴う疾患、例えば糖尿病性網膜症、又は加齢黄斑変性症による視力低下および失明、固形腫瘍の増殖、慢性関節リューマチの特に関節腔内におけるパンヌス形成、関節症における滑膜の増殖等の疾患、又は乾癬等病的血管新生を伴う疾患などの予防および治療において、甘味料、調味料、食品添加物、食品素材、飲食品、健康飲食品、医薬品・医薬部外品および飼料として利用できる可能性がある。
予防剤または治療剤は、これらのみで用いるほか、一般的賦形剤、安定剤、保存剤、結合剤、崩壊剤等の適当な添加剤を配合し、液剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、散剤、錠剤等の適宜な剤型を選んで製剤し、経口的あるいは経腸的に投与することができる。
【００２０】
本発明を飼料として用いる場合、家畜、家禽、その他蜜蜂、蚕、魚などの飼育動物のための飼料であって、本発明のデオキシ糖誘導体、または１，５−Ａｎｈｙｄｒｏ−２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏ−ｈｅｘｉｔｏｌ（ＡＤＡＨ）を除く糖アルコール誘導体（以下、「本発明の誘導体」と略す。）を配合した組成物が本発明の誘導体として飲食品中の炭水化物量（糖質量）に対して０．１〜５０重量％となるように配合されていることを特徴とする。このような飼料を家畜、家禽、その他蜜蜂、蚕、魚などの飼育動物のための飼料動物に投与した場合、肥満傾向が緩和される。したがって、本発明の飼料は、ペットの肥満防止、糖尿病防止や、脂肪付の少ない肉を持つ食用獣肉を得るために有用な飼料である。
【００２１】
甘味料、調味料、食品添加物、食品素材、飲食品、健康飲食品、医薬品・医薬部外品および飼料に、本発明の誘導体を配合した組成物の形態で含有せしめる方法は、その製品が完成するまでの工程で本発明の誘導体として０．１重量％以上、望ましくは０．５重量％以上含有せしめればよく、例えば、混和、混捏、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、晶析、固化などの公知の方法が適宜選ばれる。
【００２２】
本発明の誘導体を配合した組成物において、本発明の誘導体は、組成物中に０．１〜５０重量％含まれるように配合されている。好ましくは０．５〜３０重量％、より好ましくは１〜１０重量％である。組成物中において、本発明の誘導体が０．１重量％未満だと、血糖値の急上昇の抑制作用が充分ではない。また、組成物中において、本発明の誘導体が５０重量％を越えると、経済的な意味で好ましくない。
【００２３】
本発明のデオキシ糖誘導体、または１，５−Ａｎｈｙｄｒｏ−２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏ−ｈｅｘｉｔｏｌ（ＡＤＡＨ）を除く糖アルコール誘導体、あるいはその薬理的に許容される塩、又は／及び水和物（以下、「本発明の化合物」と略す。）の製剤についてさらに詳細に説明する。
【００２４】
本発明の化合物の剤型としては、有効成分を医学的に許容される担体、賦形剤、滑沢剤、結合剤等の添加物を含有する種々の形態、例えば水または各種の輸液用製剤に溶解させた液剤、散剤、顆粒剤、錠剤、注射剤、坐剤、又は外用製剤等が、公知の製剤技術により製造できる。本発明の化合物を人体用の医薬として使用する場合にその投与量は、一般的には、成人の経口一日量として０．１−１００ｍｇ、通常０．１−１０ｍｇが適当で、漸減していくのが好ましいことがある。前記の１日量は、１日に１回、又は適当な間隔をおいて１日２もしくは３回に分けて、あるいは食前、食後あるいは食事とともに投与することが可能である。注射による投与の場合は通常経口の１／５量が適当であるが、必要に応じて漸減あるいは漸増することができる。また、病巣局所に投与する場合、例えば関節腔内、又は眼球内等に投与する場合はさらに投与量を減ずることができ、全身に対する作用を減弱させ、有効に用いることが可能である。またその投与量は、患者の症状、年齢、又は体重等により適宜増減してもよい。
【００２５】
本発明の化合物を注射で投与する場合、水性注射剤、水性懸濁注射剤、脂肪乳剤、又はリポソーム注射剤等が可能である。水性注射剤、又は水性懸濁注射剤においては、本発明の化合物を、精製水と混合し、必要に応じて水溶性あるいは水膨潤性高分子、ｐＨ調整剤、界面活性剤、浸透圧調整剤、防腐剤、又は保存剤などを加え、混合して、必要に応じて加熱しながら溶解乃至懸濁させ、滅菌して注射剤容器に充填密封し、水性注射剤、又は水性懸濁注射剤とする。水性注射剤は、静脈内、皮下、筋肉内、皮内、又は関節腔内等に投与することができる。また、水性懸濁注射剤は皮下、筋肉内、皮内、又は関節腔内等に服用することができる。また経口でも投与することができる。
【００２６】
水溶性あるいは水膨潤性高分子としては、ゼラチン、セルロース誘導体、アクリル酸誘導体、ポビドン、マクロゴール、ポリアミノ酸誘導体、又は多糖体類が好ましく、ゼラチン類では精製ゼラチンが好ましく、セルロース誘導体では、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース２９１０、ヒドロキシプロピルメチルセルロース２２０８、ヒドロキシプロピルメチルセルロース２９０６、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロースナトリウム、アクリル酸誘導体として、アミノアクリルメタアクリレートコポリマー、メタアクリル酸コポリマー、ポリアミノ酸誘導体としては、ポリリジン、ポリグルタミン酸が好ましい。多糖体としては、ヒアルロン酸、デキストラン、又はデキストリンが特に好ましい。水溶性あるいは水膨潤性高分子の添加量は、エスクレチン、その誘導体、あるいはその薬理的に許容される塩の性質、量、並びに水溶性あるいは水膨潤性高分子の性質、分子量、適用部位によって異なるが概ね製剤全量に対し、０．０１％乃至１０％の範囲で使用可能である。
【００２７】
ｐＨ調整剤には、人体に無害な酸あるいはアルカリが用いられ、界面活性剤には、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤が用いられる。また、浸透圧調整剤には、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が、防腐剤にはパラベン類が、保存剤にはアスコルビン酸や亜硫酸塩類が例示される。これらの使用量は、特に限定はないが、その作用がそれぞれ発揮できる範囲で用いることができる。また、必要に応じ塩酸プロカイン等の局所麻酔剤、ベンジルアルコール等の無痛化剤、キレート剤、緩衝剤、あるいは水溶性有機溶剤等を加えてもよい。
【００２８】
脂肪乳剤は、適当な油脂に乳化剤と本発明の化合物を配合し、精製水を加えて、必要に応じて水溶性あるいは水膨潤性高分子、ｐＨ調整剤、界面活性剤、浸透圧調整剤、防腐剤、又は保存剤などを加え、適当な乳化装置で乳化し、滅菌して注射剤容器に充填密封することによって調製される。
【００２９】
本発明の化合物を主剤とする経口用製剤の剤型としては、例えば錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤や、溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤、又は油性ないし水性の懸濁液等を投与法に応じ適当な製剤を選択し、通常の賦形剤、滑沢剤、結合剤等の添加物と共に、公知の製剤技術により製造できる。
【００３０】
固形製剤としては活性化合物とともに製剤学上許容されている添加物を含み、例えば充填剤類や増量剤類、結合剤類、崩壊剤類、溶解促進剤類、湿潤剤類、又は潤滑剤類等を必要に応じて選択して混合し、製剤化することができる。
また外用製剤として溶液剤、懸濁液、乳濁液、軟膏、ゲル、クリーム、ローション、及びスプレー等を例示できる。
【００３１】
医薬品・医薬部外品や食品等の開発において最も重要で大きなハードルは、本発明の化合物の安全性の検証である。変異原性、生分解度試験および３種類の急性毒性試験（経口急性毒性試験、皮膚一次刺激試験、眼一次刺激試験）が、最も基本的な安全性試験として定められている。本発明の化合物は、安全であろうとの予想はできるものの、きちんとした検証が今後必要である。
以下に記載する実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこの実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３２】
＜Ｄ−ｇｌｕｃａｌの合成＞
Ｔｒｉ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃａｌ（１．１８ｇ、４．２８ｍｍｏｌ）をメタノール（１００ｍｌ）に溶解し０℃に冷却した。この溶液に２８％ナトリウムメトキシド―メタノール溶液（１１３μｌ）をメタノール（２０ｍｌ）に溶かした溶液を加え、室温まで温度を上げた。５時間３０分撹拌したのち、陽イオン交換樹脂を用いて中和し、反応液をろ過した。ろ液を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１５：１）、引き続きゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０，メタノール溶出）により精製し、式（１）で示されるＤ−ｇｌｕｃａｌ（３１２．４ｍｇ、５０％）を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）δ：６．２５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１，６．２Ｈｚ），４．６４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７，６．２Ｈｚ），４．０７（ｔｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１，６．９Ｈｚ），３．６７−３．７７（ｍ，３Ｈ），３．５１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，８．９Ｈｚ）．
【００３３】
【化３】
0005649358.tif 000004
【００３４】
＜２，３−Ｄｉｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｈｅｘｏｓｅ（ＤＥＨ）の合成＞
式（６）で示される化合物（１．４５３７ｇ、５．９０ｍｍｏｌ；Ｊ．Ｓｅｒｂ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００１年、６６巻、ｐ．４９９−５０５）を無水酢酸（１００ｍｌ）に溶解し０℃に冷却した。この溶液に４％濃硫酸―無水酢酸溶液（３．５ml）を加えた。１時間撹拌したのち、反応液を酢酸エチルで抽出した。有機層を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液の順に洗浄し、無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥した。ろ過、溶媒を留去したのち、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）で精製し、式（７）で示される化合物（６３１．１ｍｇ、４０％）を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：６．１２−６．１７（ｍ，１Ｈ，Ｈ−１α），５．７９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７，８．９Ｈｚ，Ｈ−１β），４．８０（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝４．８，１１．０Ｈｚ，Ｈ−４α），４．６８（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝４．８，９．６Ｈｚ，Ｈ−４β），４．２７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８，１２．４Ｈｚ，Ｈ−６α），４．２０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，１２．４Ｈｚ，Ｈ−６β），４．１５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１，１２．４，Ｈ−６β），４．１０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１，１２．４Ｈｚ，Ｈ−６α），３．９６−４．０３（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５α），３．４７−３．５２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５β），２．２０−２．３１（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３β），２．１２，２．１１，２．１０，２．０８，２．０６，２．０５（ｓ×６，ＣＨ3×６），１．７２−１．８０（ｍ，３Ｈ，Ｈ−２α，２β，３α），１．４５−１．５５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３β）．
【００３５】
【化４】
0005649358.tif 000005
【化５】
0005649358.tif 000006
【００３６】
式（７）で示される化合物（６７０ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）をメタノール（７０ml）に溶解し０℃に冷却した。この溶液に２８％ナトリウムメトキシド―メタノール溶液（１１３μｌ）をメタノール（２０ｍｌ）に溶かした溶液を加え、室温まで温度を上げた。１９時間３０分撹拌したのち、陽イオン交換樹脂を用いて中和し、反応液をろ過した。ろ液を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝４０：１）、引き続きゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０，メタノール溶出）により精製し、式（２）で示されるＤＥＨ（２０９．１ｍｇ、５６％）を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ：４．９０−５．２２（ｍ，１Ｈ），３．９１−４．２０（ｍ，１Ｈ），３．３２−３．９０（ｍ，３Ｈ），１．６７−２．０９（ｍ，４Ｈ）．
【００３７】
【化６】
0005649358.tif 000007
【００３８】
＜Ｍｅｔｈｙｌ  ２，３−ｄｉｄｅｏｘｙ−α−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｈｅｘｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＭＤＥＨ）の合成＞
式（３）のＭＤＥＨは、Ｓ．Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓｅｒｂ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６６（８）,４９９−５０５（２００１）に記載の方法に従って、Ｔｒｉ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃａｌ（２．７２ｇ、９．９９ｍｍｏｌ）から９２６．５ｍｇ（収率３１％）を合成した。
1Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ：４．６３−４．６７（ｍ，１Ｈ），３．７９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７，１１．７Ｈｚ），３．６５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．２，１１．７Ｈｚ），３．３９−３．５０（ｍ，２Ｈ），３．３５（ｓ，３Ｈ），１．６６−１．８５（ｍ，４Ｈ）．
【００３９】
【化７】
0005649358.tif 000008
【００４０】
＜１，５−Ａｎｈｙｄｒｏ−２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏ−ｈｅｘｉｔｏｌ（ＡＤＡＨ）の合成＞
Ｔｒｉ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃａｌ（１．０２４０ｇ、３．７６ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（６０ｍｌ）へ、１０ｗｔ％パラジウム／活性炭（７０９．４ｍｇ）をエタノール（１２ｍｌ）に懸濁させた溶液を加え、水素を充てんさせた。室温で２７時間撹拌したのち、反応液をろ過した。ろ液を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）で精製し、式（８）で示される化合物（８７５．８ｍｇ、８５％）を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：４．９４−５．０１（ｍ，２Ｈ），４．２４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，１２．４Ｈｚ），４．１０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１，１２．４Ｈｚ），４．０４（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．４，４．８，１１．７Ｈｚ），４．４８−４．５６（ｍ，２Ｈ），２．１０（ｓ，３Ｈ），２．０７−２．１４（ｍ，１Ｈ），２．０５（ｓ，３Ｈ），２．０４（ｓ，３Ｈ），１．７７−１．８７（ｍ，１Ｈ）． 
【００４１】
【化８】
0005649358.tif 000009
【００４２】
式（８）で示される化合物（８６５．３ｍｇ、３．１５ｍｍｏｌ）をメタノール（３２ｍｌ）に溶解し０℃に冷却した。この溶液に２８％ナトリウムメトキシド−メタノール溶液（４０μｌ）を加え、室温まで温度を上げた。２時間３０分撹拌したのち、陽イオン交換樹脂を用いて中和し、反応液をろ過した。ろ液を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１）、引き続きゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０，メタノール溶出）により精製し、式（４）で示されるＡＤＡＨ（１．０５９１ｇ、９１％）を得た。
1Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ：３．９１（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．４，４．８，１１．７Ｈｚ），３．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１，１１．７Ｈｚ），３．６２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，１１．７Ｈｚ），３．４７−３．５４（ｍ，１Ｈ），３．４０−３．４６（ｍ，１Ｈ），３．２７−３．３３（ｍ，１Ｈ），３．０９−３．１８（ｍ，２Ｈ），１．８５−１．９２（ｍ，１Ｈ），１．５４−１．６３（ｍ，１Ｈ）．
【００４３】
【化９】
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【００４４】
＜材料＞
ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）、ヒト繊維芽細胞、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、ＨｕＭｅｄｉａ  ＥＧ２、ＨｕＭｅｄｉａ  ＥＢ２、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子−Ａ）、血管新生キット、およびＣＤ３１用管腔染色キットは、クラボー（株）（大阪、日本）から購入した。セルカウンティングキット８は、（株）同仁化学研究所（熊本、日本）から提供された。
【００４５】
＜管腔形成アッセイ＞
血管新生キットを用いて、ＨＵＶＥＣをヒト繊維芽細胞と２４ウェルプレート中で１０日間、培養培地４５０μＬと添加物５０μＬでインキュベートした。培地交換は、３日毎に添加物とともに行った。１０日後、ＨＵＶＥＣを、ＣＤ３１用管腔染色キットのマウス抗ヒトＣＤ３１、ヤギ抗マウスＩｇＧ ＡｌｋＰコンジュゲート、塩化ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−３‘−インドリルフォスファターゼ ｐ−トルイジン塩（ＢＣＩＰ）を用いて染色した。形成した管腔の面積をＩｍａｇｅＪプログラムで測定した。
【００４６】
添加物は、最終濃度の１０倍の濃度で生理食塩水溶液とし、これを１／１０容キット付属の培地に添加して管腔形成用培地を調製した。キット付属の培地のみで形成された管腔面積をコントロールに相対面積を計算し、添加物濃度０（＝生理食塩水１０％）の値（ほとんど「１」である）との間で有意差検定した。
【００４７】
図１に示すように、管腔面積はＶＥＧＦで約２倍に増加したが、ＡＤＡＨではコントロールとほぼ同等であった。一方、ＭＤＥＨ、Ｄ−ｇｌｕｃａｌ、ＤＥＨでは濃度依存的に管腔面積が減少した。よって、ＡＤＡＨは管腔形成を阻害しないが、ＭＤＥＨ、Ｄ−ｇｌｕｃａｌ、ＤＥＨは管腔形成の阻害作用があり、特にＤＥＨが強く阻害することがわかった。（図１参照）
【００４８】
＜増殖アッセイ＞
ＨＵＶＥＣは、湿潤の大気圧下、ＣＯ2（５％）、３７℃で、組織培養フラスコ中で増殖した。ＨｕＭｅｄｉａ  ＥＧ２を維持培地として使用した。アッセイにおいて、ＨＵＶＥＣは、ゼラチンコートした９６ウェルプレートに、維持培地１００μＬ中、典型的には３０００細胞／ウェルで播種した。播種の後、プレートを２４時間インキュベートして細胞を付着させて、それから維持培地をアッセイ培地に交換した。アッセイ培地は、２％熱不活性化ＦＢＳ添加ＨｕＭｅｄｉａ  ＥＢ２を９０μＬと塩含有添加物１０μＬとからなる。ＨｕＭｅｄｉａ  ＥＢ２の成分は、ＨｕＭｅｄｉａ  ＥＧ２とほとんど同じであるが、ＦＢＳ、成長因子や抗生物質を含んでいない。３〜８代の間の細胞を、アッセイに使用した。
【００４９】
増殖アッセイは、添加物の添加４８時間後、セルカウンティングキット８を用いて行った。［２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフォ−フェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、１Ｎａ塩］（５ ｍＭ）、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウム メチル硫酸（０．２ｍＭ）およびＮａＣｌ（１５０ｍＭ）を含む溶液１０μLを各ウェルに添加して、１２０分後に４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（イムノミニＮＪ−２３００、システムインスツルメンツ（株）、日本）で測定した。
【００５０】
添加物は最終濃度の１０倍の濃度で生理食塩水溶液とし、これを１／１０容、分析用培地に添加した。分析用培地のみで培養したウェルの吸光度をコントロールに相対値を計算した。
【００５１】
図２に示すように、細胞数はＶＥＧＦでコントロールよりも増加したが、ＡＤＡＨ、ＭＤＥＨ、Ｄ−ｇｌｕｃａｌ、ＤＥＨは濃度が高くなってもコントロールとほぼ同等であり、これらは細胞増殖をほとんど阻害しないことがわかった。ｔ−ｔｅｓｔで、ＶＥＧＦだけがｐ＜０．０１で有意差があった。（図２参照）
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明の管腔形成抑制剤は、血管新生を伴う疾患、例えば糖尿病性網膜症、又は加齢黄斑変性症による視力低下および失明、固形腫瘍の増殖、慢性関節リューマチの特に関節腔内におけるパンヌス形成、関節症における滑膜の増殖等の疾患、又は乾癬等病的血管新生を伴う疾患などの予防および治療に用いることができる、甘味料、調味料、食品添加物、食品素材、飲食品、健康飲食品、医薬品・医薬部外品および飼料として利用できる可能性がある。特に、血管新生を標的とする新しい治療薬として、癌などの疾病治療や予防に有効であることが期待され、新しい医薬品として利用できる可能性がある。
【図１】
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【図２】
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