(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含むダイアボディ分子であって、
（Ａ）前記第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向けて、
（ｉ）エピトープ（１）に特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）の結合領域を含むドメイン（Ａ）、
（ｉｉ）エピトープ（２）に特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）の結合領域を含むドメイン（Ｂ）、および
（ｉｉｉ）軽鎖定常領域（ＣＬ）ドメイン（Ｃ）
を含み、
前記ドメイン（Ａ）と（Ｂ）は互いに会合してエピトープ結合部位を形成することはなく、
（Ｂ）前記第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向けて、
（ｉ）前記第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）の結合領域を含むドメイン（Ｄ）、
（ｉｉ）前記第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）の結合領域を含むドメイン（Ｅ）、
（ｉｉｉ）重鎖定常領域１（ＣＨ１）ドメインまたはその一部を含むドメイン（Ｆ）、並びに、
（ｉｖ）ヒンジ領域、重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）
を含み、
前記ドメイン（Ｄ）と（Ｅ）は互いに会合してエピトープ結合部位を形成することはなく、
前記ドメイン（Ａ）と（Ｅ）は互いに会合して前記エピトープ（１）に結合する結合部位を形成し、
前記ドメイン（Ｂ）と（Ｄ）は互いに会合して前記エピトープ（２）に結合する結合部位を形成し、
前記ドメイン（Ｃ）と（Ｆ）はジスルフィド結合を介して一緒に会合し、
さらに前記ダイアボディ分子は第３のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖を含み、
（Ｃ）前記第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向けて、
（ｉ）エピトープ（３）に特異的な第３の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ３）の結合領域を含むドメイン（Ｇ）、
（ｉｉ）エピトープ（４）に特異的な第４の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ４）の結合領域を含むドメイン（Ｈ）、および、
（ｉｉｉ）軽鎖定常領域（ＣＬ）を含むドメイン（Ｉ）
を含み、
前記ドメイン（Ｇ）と（Ｈ）は互いに会合してエピトープ結合部位を形成することはなく、
（Ｄ）前記第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向けて、
（ｉ）前記エピトープ（４）に特異的な前記第４の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ４）の結合領域を含むドメイン（Ｊ）、
（ｉｉ）前記エピトープ（３）に特異的な前記第３の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ３）の結合領域を含むドメイン（Ｋ）、
（ｉｉｉ）重鎖定常領域１（ＣＨ１）を含むドメイン（Ｌ）、並びに、
（ｉｖ）ヒンジ領域、重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）
を含み、
前記ドメイン（Ｊ）と（Ｋ）は互いに会合してエプトープ結合部位を形成することはなく、
前記ドメイン（Ｇ）と（Ｋ）は互いに会合して前記エピトープ（３）に結合する結合部位を形成し、
前記ドメイン（Ｈ）と（Ｊ）は互いに会合して前記エピトープ（４）に結合する結合部位を形成し、
前記ドメイン（Ｉ）と（Ｌ）はジスルフィド結合を介して一緒に会合し、
前記第２及び第４のポリペプチド鎖の前記ヒンジ領域、前記重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び前記重鎖定常領域３（ＣＨ３）は会合してＦｃ領域を形成する、
ダイアボディ分子。
【請求項２】
前記エピトープ（１）と（３）がどちらも同一分子上に存在する、請求項１に記載のダイアボディ分子。
【請求項３】
前記エピトープ（１）と（３）が同一である、請求項１に記載のダイアボディ分子。
【請求項４】
前記エピトープ（２）と（４）がどちらも抗原分子上に存在する、請求項１に記載のダイアボディ分子。
【請求項５】
前記エピトープ（２）と（４）が同一である、請求項１に記載のダイアボディ分子。
【請求項６】
少なくとも１つのエピトープが、病原体抗原、自己免疫抗原、毒素又は薬物のエピトープである、請求項１に記載のダイアボディ分子。
【請求項７】
少なくとも１つのエピトープが、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ又はフルオレセインである、請求項１に記載のダイアボディ分子。
【請求項８】
少なくとも１つのエピトープがＣＤ３２Ｂであり、少なくとも１つのエピトープがＣＤ１６Ａである、請求項１に記載のダイアボディ分子。
【請求項９】
請求項１に記載の第１、第２、第３又は第４のポリペプチド鎖をコードする核酸分子。
【請求項１０】
請求項１に記載のダイアボディ分子からなる治療剤。
【請求項１１】
病原体抗原によって特徴づけられる疾患又は障害の治療に用いられ、前記病原体抗原に結合するエピトープ結合部位を有する、請求項１に記載のダイアボディ分子からなる治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、米国特許出願第６１／０１９，０５１号（２００８年１月４日出願）および同第６０／９４５，５２３号（２００７年６月２１日出願）（これらの出願の両方は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
１．  発明の分野
本発明は、ダイアボディ分子と、免疫疾患や癌を含む様々な疾患および障害の治療におけるその使用に関する。本発明のダイアボディ分子は、少なくとも２つのエピトープ結合部位（同一のまたは異なるエピトープを認識し得る）を形成するように結合している少なくとも２つのポリペプチド鎖を含むものである。さらに、エピトープは同一のまたは異なる分子に由来しても、同一のまたは異なる細胞上に位置してもよい。ダイアボディ分子の個々のポリペプチド鎖は、非ペプチド結合型共有結合を介して共有結合されており、例えば、各ポリペプチド鎖内に存在するシステイン残基のジスルフィド結合により共有結合されるが、これに限定されない。特定の実施形態において、本発明のダイアボディ分子は、該分子に抗体様機能性をもたせるＦｃ領域をさらに含む。
【背景技術】
【０００３】
２．  発明の背景
共有結合型ダイアボディ（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｄｉａｂｏｄｙ）の設計は一本鎖Ｆｖ構築物（ｓｃＦｖ）に基づいている（非特許文献１、その全内容を参照することにより本明細書に組み入れる）。完全な非修飾型のＩｇＧでは、ＶＬおよびＶＨドメインが別々のポリペプチド鎖、すなわち、それぞれ軽鎖と重鎖に位置している。抗体軽鎖と抗体重鎖の相互作用、特にＶＬドメインとＶＨドメインの相互作用により、該抗体のエピトープ結合部位の１つが形成される。これに対して、ｓｃＦｖ構築物では、抗体のＶＬおよびＶＨドメインが１本のポリペプチド鎖に含まれているが、これらのドメインは、機能性のエピトープ結合部位へとこれら２つのドメインが自己集合することを可能にする、十分な長さの柔軟性リンカーによって分離されている。リンカーの長さが不十分なため（約１２アミノ酸残基より短いため）、これらのドメインが自己集合できない場合には、２つのｓｃＦｖ構築物が相互作用して二価の分子を形成する（一方の鎖のＶＬが他方の鎖のＶＨと結合する）（非特許文献２）。さらに、該構築物のＣ末端にシステイン残基を付加させると、ポリペプチド鎖同士のジスルフィド結合が可能となり、生じる二量体はその二価分子の結合特性の妨害なしに安定化することがわかっている（例えば、非特許文献３参照）。さらに、特異性が異なっているＶＬおよびＶＨドメインを選択する場合には、二価であるだけでなく、二重特異性を示す分子を構築することができる。
【０００４】
二価のダイアボディは、治療や免疫診断を含めて、広範囲の用途を有する。二価にすると、様々な用途でのダイアボディの設計および工学的操作が非常にフレキシブルとなり、多量体抗原に対する結合活性の向上、異なっている抗原の架橋、両標的抗原の存在に依存する特定の細胞型への直接的なターゲッティングが可能となる。それらの増大した結合価、低い解離速度、および（約５０ｋＤａ以下の、小サイズのダイアボディの場合は）循環系からの速やかなクリアランスのため、当技術分野で知られたダイアボディ分子は腫瘍イメージングの分野においても特別に使用されている（非特許文献４）。異なっている細胞の架橋、例えば細胞傷害性Ｔ細胞の腫瘍細胞への架橋は特に重要である（非特許文献５および非特許文献６）。ダイアボディのエピトープ結合ドメインはまた、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または他の単核細胞上に発現されるＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３２もしくはＣＤ６４のような免疫エフェクター細胞の表面決定基にも向けられる。多くの研究において、エフェクター細胞の決定基、例えばＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）へのダイアボディ結合はまた、エフェクター細胞を活性化することが見出された（非特許文献６、非特許文献７）。通常、エフェクター細胞の活性化は、抗原と結合した抗体がＦｃ−ＦｃγＲ相互作用を介してエフェクター細胞に結合することによって開始される。したがって、これに関連して、本発明のダイアボディ分子は、それらがＦｃドメインを含むかどうかにかかわりなく、（例えば、当技術分野で知られたまたは本明細書に例示されたエフェクター機能アッセイ（例えば、ＡＤＣＣアッセイ）でアッセイするとき）Ｉｇ様機能を示すことができる。腫瘍細胞とエフェクター細胞を架橋させることによって、ダイアボディは腫瘍細胞のすぐ近くにエフェクター細胞を引き寄せるだけでなく、腫瘍の効果的な死滅をもたらす（例えば、Ｃａｏら、（２００３年）「Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  Ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ．  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．  ５５巻、１７１〜１９７頁を参照；その全内容を参照することにより本明細書に組み入れる）。
【０００５】
２．１  エフェクター細胞受容体および免疫系におけるその役割
伝統的な免疫機能では、抗体−抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用は、広範囲の応答をもたらし、その範囲はエフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞傷害作用、肥満細胞脱顆粒、および食作用）から免疫調節シグナル（例えば、リンパ球増殖および抗体分泌の調節）にまで及ぶ。これらの相互作用はすべて、抗体または免疫複合体のＦｃドメインが造血細胞上の特殊な細胞表面受容体と結合することにより開始される。抗体と免疫複合体により開始される細胞応答の多様性は、Ｆｃ受容体の構造上の不均一性からもたらされる。Ｆｃ受容体は、細胞内シグナル伝達を媒介すると思われる構造的に関連した抗原結合ドメインを共有する。
【０００６】
タンパク質の免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーであるＦｃγ受容体は、免疫グロブリン分子のＦｃγ部分と結合することができる表面糖タンパク質である。このファミリーの各メンバーは、Ｆｃγ受容体のα鎖上の認識ドメインを介して１以上のアイソタイプの免疫グロブリンを認識する。Ｆｃγ受容体は免疫グロブリンサブタイプに対するその特異性によって定義される。ＩｇＧに対するＦｃγ受容体はＦｃγＲと、ＩｇＥに対するものはＦｃεＲと、そしてＩｇＡに対するものはＦｃαＲと呼ばれる。様々なアクセサリー細胞が異なるアイソタイプの抗体に対するＦｃγ受容体をもち、抗体のアイソタイプが所与の応答にどのアクセサリー細胞が関わるかを決定する（Ｒａｖｅｔｃｈ  Ｊ．Ｖ．ら（１９９１年）「Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９巻、４５７〜９２頁、Ｇｅｒｂｅｒ  Ｊ．Ｓ．ら（２００１年）「Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  Ａｎｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｓｉｇｎａｌｓ  Ｏｒｉｇｉｎａｔｉｎｇ  Ｆｒｏｍ  Ｔｈｅ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｆｃｇａｍｍａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、３巻、１３１〜１３９頁、Ｂｉｌｌａｄｅａｕ  Ｄ．Ｄ．ら（２００２年）、「ＩＴＡＭｓ  Ｖｅｒｓｕｓ  ＩＴＩＭｓ：  Ｓｔｒｉｋｉｎｇ  Ａ  Ｂａｌａｎｃｅ  Ｄｕｒｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ」、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、２巻（１０９号）、１６１〜１６８１頁、Ｒａｖｅｔｃｈ  Ｊ．Ｖ．ら（２０００年）「Ｉｍｍｕｎｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９０巻、８４〜８９頁、Ｒａｖｅｔｃｈ  Ｊ．Ｖ．ら、（２００１年）「ＩｇＧ  Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９巻、２７５〜９０頁、Ｒａｖｅｔｃｈ  Ｊ．Ｖ．、（１９９４年）「Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：  Ｒｕｂｏｒ  Ｒｅｄｕｘ」、Ｃｅｌｌ、７８巻（４号）、５５３〜６０頁に論評される）。種々のＦｃγ受容体、それを発現する細胞、およびそのアイソタイプ特異性を表１にまとめてある（「免疫生物学：健康と病気における免疫系（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ）」、第４版．  １９９９年、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ／Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋから引用）。
【０００７】
Ｆｃγ受容体
このファミリーの各メンバーは、免疫グロブリン関連ドメインのＣ２セットに関係する細胞外ドメイン、１回膜貫通ドメインおよび可変長の細胞質内ドメインをもつ内在性膜糖タンパク質である。３種の公知のＦｃγＲがあり、それぞれＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）と呼ばれる。３種の受容体は異なる遺伝子によりコードされる；しかし３種のファミリーメンバー間の広範な相同性は、これらが共通の祖先から、おそらくは遺伝子複製により生じたことを示唆する。
【０００８】
ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）
ＦｃγＲＩＩタンパク質は４０ＫＤａの内在性膜糖タンパク質であり、モノマーＩｇに対して低親和性（１０６Ｍ−１）であるため複合体化したＩｇＧとだけ結合する。この受容体は、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、好中球、肥満細胞、および血小板を含めて、すべての造血細胞上に存在する最も広く発現されているＦｃγＲである。ＦｃγＲＩＩは、その免疫グロブリン結合鎖中に免疫グロブリン様領域を２つだけ有し、したがって、ＩｇＧに対してＦｃγＲＩより遥かに低い親和性を有する。３種のヒトＦｃγＲＩＩ遺伝子（ＦｃγＲＩＩ−Ａ、ＦｃγＲＩＩ−ＢおよびＦｃγＲＩＩ−Ｃ）が存在し、それらはすべて凝集体または免疫複合体のＩｇＧと結合する。
【０００９】
ＦｃγＲＩＩ−ＡとＦｃγＲＩＩ−Ｂの細胞質内ドメイン内には明確な相違があるので、受容体ライゲーションに対して２つの機能的に異種の応答を創出する。基本的な相違は、Ａアイソフォームが細胞活性化（例えば、食作用および呼吸バースト）に至る細胞内シグナル伝達を開始するのに対して、Ｂアイソフォームは抑制的シグナルを開始し、例えばＢ細胞活性化を抑制する、ことにある。
【００１０】
ＦｃγＲＩＩＩ  （ＣＤ１６）
このクラスの不均一性のため、ＦｃγＲＩＩＩのサイズはマウスおよびヒトで４０〜８０ｋＤａの範囲に及ぶ。２つのヒト遺伝子が２種の転写産物をコードしており、すなわち、内在性膜糖タンパク質のＦｃγＲＩＩＩＡと、グリコシルホスファチジル−イノシトール（ＧＰＩ）結合型のＦｃγＲＩＩＩＢとをコードする。１つのマウス遺伝子は膜貫通ヒトＦｃγＲＩＩＩＡに相同性のＦｃγＲＩＩＩをコードしている。ＦｃγＲＩＩＩは他の２つのＦｃγＲのそれぞれと構造上の特徴を共有する。ＦｃγＲＩＩと同様に、ＦｃγＲＩＩＩは低い親和性でＩｇＧと結合し、対応する２つの細胞外Ｉｇ様ドメインを含む。ＦｃγＲＩＩＩＡはマクロファージ、肥満細胞で発現され、ＮＫ細胞では唯一のＦｃγＲである。ＧＰＩ結合型のＦｃγＲＩＩＩＢは、目下、ヒト好中球でのみ発現されることが知られている。
【００１１】
ＦｃγＲを介するシグナル伝達
活性化と抑制の両方のシグナルは、ライゲーション後にＦｃγＲを介して伝達される。これらの正反対の機能は、異なる受容体アイソフォーム間の構造上の相違からもたらされる。受容体の細胞質内シグナル伝達ドメイン内の２つの異なるドメイン、すなわち、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）または免疫受容体チロシン系抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）が、この異なる応答の原因となる。これらの構造体への異なる細胞質酵素の動員が、ＦｃγＲ媒介細胞応答の結果を規定する。ＩＴＡＭ含有ＦｃγＲ複合体にはＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡが含まれるが、ＩＴＩＭ含有複合体にはＦｃγＲＩＩＢだけが含まれる。
【００１２】
ヒト好中球はＦｃγＲＩＩＡ遺伝子を発現する。免疫複合体または特異的抗体架橋を介するＦｃγＲＩＩＡクラスター形成は、ＩＴＡＭを、ＩＴＡＭリン酸化を容易にする受容体関連キナーゼとともに凝集させるように作用する。ＩＴＡＭリン酸化はＳｙｋキナーゼに対するドッキング部位として役立ち、Ｓｙｋキナーゼの活性化は下流の基質（例えば、ＰＩ３Ｋ）の活性化をもたらす。細胞活性化により前炎症性メディエーターが放出される。
【００１３】
ＦｃγＲＩＩＢ遺伝子はＢリンパ球上に発現され、その細胞外ドメインはＦｃγＲＩＩＡと９６％同一であって、識別できない様式でＩｇＧ複合体と結合する。ＦｃγＲＩＩＢの細胞質ドメイン中のＩＴＩＭの存在が、ＦｃγＲの抑制サブクラスを規定する。最近、この抑制の分子的基礎が確立された。活性化ＦｃγＲとともに結合されると、ＦｃγＲＩＩＢ中のＩＴＩＭはリン酸化されて、イノシトールポリリン酸５’−ホスファターゼ（ＳＨＩＰ）のＳＨ２ドメインを引き付け、これがホスホイノシトールメッセンジャー（ＩＴＡＭ含有ＦｃγＲ介在チロシンキナーゼ活性化の結果として放出される）を加水分解し、その結果、細胞内Ｃａ＋＋の流入を抑制する。したがって、ＦｃγＲＩＩＢの架橋は、ＦｃγＲライゲーションに対する活性化応答を消失させ、細胞応答性を抑制する。このようにしてＢ細胞活性化、Ｂ細胞増殖および抗体分泌が停止する。
【００１４】
【表１】
0005718637.tif 000002
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、「Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ’：  Ｓｍａｌｌ  Ｂｉｖａｌｅｎｔ  Ａｎｄ  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ（１９９３年）９０巻、６４４４〜６４４８頁
【非特許文献２】Ｍａｒｖｉｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  Ｔｏ  ＩｇＧ−Ｌｉｋｅ  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｓｉｎ．（２００５年）２６巻、６４９〜６５８頁
【非特許文献３】Ｏｌａｆｓｅｎら、「Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ａｎｔｉ−ＣＥＡ  Ｄｉａｂｏｄｙ  Ａｌｌｏｗｓ  Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｆｏｒ  Ｔｕｍｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｐｒｏｔ．  Ｅｎｇｒ．  Ｄｅｓ．  Ｓｅｌ．（２００４年）１７巻、２１〜２７頁
【非特許文献４】Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄら、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｔｕｍｏｕｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｂｙ  Ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ  Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｉｎ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．（１９９７年）１０巻、１２２１頁
【非特許文献５】Ｓｔａｅｒｚら、「Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｃａｎ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｉｔｅｓ  Ｆｏｒ  Ａｔｔａｃｋ  Ｂｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５年）３１４巻、６２８〜６３１頁
【非特許文献６】Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、「Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｋｉｌｌｉｎｇ  Ｏｆ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ  Ｂｙ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−Ｃｅｌｌｓ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｂｙ  Ａ  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｄｉａｂｏｄｙ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．（１９９６年）９巻、２９９〜３０５頁
【非特許文献７】Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、「Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  （ＣＥＡ）−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ｃｏｌｏｎ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｂｙ  Ａｎｔｉ−ＣＤ３  ｘ  Ａｎｔｉ−ＣＥＡ  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｂ７  ｘ  Ａｎｔｉ−ＣＥＡ  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９９年）５９巻、２９０９〜２９１６頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
３．  発明の概要
本発明は、共有結合型ダイアボディおよび／または共有結合型ダイアボディ分子、ならびに癌、自己免疫疾患、アレルギー疾患、および細菌、真菌もしくはウイルスが原因の感染症を含む各種の疾患および障害の治療におけるその使用に関する。好ましくは、本発明のダイアボディは２つの異なる細胞上の２つの異なるエピトープに結合することができ、ここにおいて、第１のエピトープは第２のエピトープとは異なる細胞型に発現されるものであり、その結果該ダイアボディはこれら２つの細胞を寄せ集めることができる。
【００１７】
一実施形態において、本発明は共有結合型二重特異性ダイアボディに関し、該ダイアボディは第１および第２のポリペプチド鎖を含み、ここで、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）の結合領域を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）の結合領域を含む第２のドメイン、および、場合により（ｉｉｉ）少なくとも１個のシステイン残基を含む第３のドメインを含み、第１および第２のドメインが共有結合で連結されているが、第１および第２のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；ここで、第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）の結合領域を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）の結合領域を含む第５のドメイン、および、場合により（ｉｉｉ）少なくとも１個のシステイン残基を含む第６のドメインを含み、第４および第５のドメインが共有結合で連結されているが、第４および第５のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は共有結合で連結されているが、該共有結合はペプチド結合ではなく；その際、第１のドメインと第５のドメインが会合して、第１のエピトープと結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成しており；第２のドメインと第４のドメインが会合して、第２のエピトープと結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成している。
【００１８】
別の実施形態において、本発明は共有結合型二重特異性ダイアボディに関し、該ダイアボディは第１および第２のポリペプチド鎖を含み、ここで、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）の結合領域を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）の結合領域を含む第２のドメイン、および（ｉｉｉ）Ｆｃドメインまたはその一部を含む第３のドメインを含み、第１および第２のドメインが共有結合で連結されているが、第１および第２のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；ここで、第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）の結合領域を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）の結合領域を含む第５のドメインを含み、第４および第５のドメインが共有結合で連結されているが、第３および第４のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は共有結合で連結されているが、該共有結合はペプチド結合ではなく；その際、第１のドメインと第５のドメインが会合して、第１のエピトープと結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成しており；第２のドメインと第４のドメインが会合して、第２のエピトープと結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成している。
【００１９】
特定の態様において、本発明はダイアボディ分子に関し、該分子は第１および第２のポリペプチド鎖を含み、ここで、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）の結合領域を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）の結合領域を含む第２のドメイン、および（ｉｉｉ）Ｆｃドメインまたはその一部を含む第３のドメインを含み、第１および第２のドメインが共有結合で連結されているが、第１および第２のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；ここで、第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）の結合領域を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）の結合領域を含む第５のドメイン、および（ｉｉｉ）少なくとも１個のシステイン残基を含む第６のドメインを含み、第４および第５のドメインが共有結合で連結されているが、第４および第５のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は共有結合で連結されているが、該共有結合はペプチド結合ではなく；その際、第１のドメインと第５のドメインが会合して、第１のエピトープと結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成しており；第２のドメインと第４のドメインが会合して、第２のエピトープと結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成している。
【００２０】
特定の実施形態において、本発明は共有結合型二重特異性ダイアボディに関し、該ダイアボディはダイアボディ分子の二量体であり、各ダイアボディ分子は第１および第２のポリペプチド鎖を含み、ここで、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）の結合領域を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）の結合領域を含む第２のドメイン、および（ｉｉｉ）Ｆｃドメインまたはその一部を含む第３のドメインを含み、第１および第２のドメインが共有結合で連結されているが、第１および第２のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；ここで、第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）の結合領域を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）の結合領域を含む第５のドメイン、および（ｉｉｉ）少なくとも１個のシステイン残基を含む第６のドメインを含み、第４および第５のドメインが共有結合で連結されているが、第４および第５のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；各ダイアボディ分子の第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は共有結合で連結されているが、該共有結合はペプチド結合ではなく；その際、各ダイアボディ分子の第１のドメインと第５のドメインが会合して、第１のエピトープと結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成しており；各ダイアボディ分子の第２のドメインと第４のドメインが会合して、第２のエピトープと結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成している。
【００２１】
さらに他の実施形態において、本発明は共有結合型四重特異性ダイアボディに関し、該ダイアボディはダイアボディ分子の二量体であり、第１のダイアボディ分子は第１および第２のポリペプチド鎖を含み、ここで、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）の結合領域を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）の結合領域を含む第２のドメイン、および（ｉｉｉ）Ｆｃドメインまたはその一部を含む第３のドメインを含み、第１および第２のドメインが共有結合で連結されているが、第１および第２のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；ここで、第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）の結合領域を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）の結合領域を含む第５のドメイン、および（ｉｉｉ）少なくとも１個のシステイン残基を含む第６のドメインを含み、第４および第５のドメインが共有結合で連結されているが、第４および第５のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は共有結合で連結されているが、該共有結合はペプチド結合ではなく；その際、第１のドメインと第５のドメインが会合して、第１のエピトープと結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成しており；第２のドメインと第４のドメインが会合して、第２のエピトープと結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成しており；そして第２のダイアボディ分子は第１および第２のポリペプチド鎖を含み、ここで、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第３のエピトープに特異的な第３の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ３）を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第４のエピトープに特異的な第４の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ４）を含む第２のドメイン、および（ｉｉｉ）Ｆｃドメインまたはその一部を含む第３のドメインを含み、第１および第２のドメインが共有結合で連結されているが、第１および第２のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；ここで、第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第４の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ４）を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第３の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ３）を含む第５のドメイン、および（ｉｉｉ）少なくとも１個のシステイン残基を含む第６のドメインを含み、第４および第５のドメインが共有結合で連結されているが、第４および第５のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は共有結合で連結されているが、該共有結合はペプチド結合ではなく；その際、第１のドメインと第５のドメインが会合して、第３のエピトープと結合する第１の結合部位（ＶＬ３）（ＶＨ３）を形成しており；第２のドメインと第４のドメインが会合して、第４のエピトープと結合する第２の結合部位（ＶＬ４）（ＶＨ４）を形成している。
【００２２】
本発明の特定の態様において、第１のエピトープ、第２のエピトープ、適宜に、第３のエピトープ、および第４のエピトープは同一であり得る。他の態様では、第１のエピトープ、第２のエピトープ、適宜に、第３のエピトープ、および第４のエピトープが他とそれぞれ異なっていてもよい。第３のエピトープの結合ドメインを含む本発明の特定の態様では、第１のエピトープと第３のエピトープが同一であり得る。第４のエピトープの結合ドメインを含む本発明の特定の態様では、第１のエピトープと第４のエピトープが同一であり得る。第３のエピトープの結合ドメインを含む本発明の特定の態様では、第２のエピトープと第３のエピトープが同一であり得る。第４のエピトープの結合ドメインを含む本発明の特定の態様では、第２のエピトープと第４のエピトープが同一であり得る。本発明の好ましい態様では、第１のエピトープと第２のエピトープは異なっている。第３のエピトープの結合ドメインと第４のエピトープの結合ドメインを含む本発明のさらに他の態様では、第３のエピトープと第４のエピトープは異なっていてよい。前述の任意の組合せは本発明に包含されることを理解すべきである。
【００２３】
本発明の特定の態様においては、ダイアボディまたはダイアボディ分子の第１のドメインと第５のドメインを同一の免疫グロブリンから誘導することができる。別の態様では、ダイアボディまたはダイアボディ分子の第２のドメインと第４のドメインを同一の免疫グロブリンから誘導することができる。さらに別の態様では、ダイアボディまたはダイアボディ分子の第１のドメインと第５のドメインを異なる免疫グロブリンから誘導することができる。さらに別の態様では、ダイアボディまたはダイアボディ分子の第２のドメインと第４のドメインを異なる免疫グロブリンから誘導することができる。前述の任意の組合せは本発明に包含されることを理解すべきである。
【００２４】
本発明の特定の態様において、ダイアボディまたはダイアボディ分子の第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖間の共有結合は、第１のポリペプチド鎖上の少なくとも１個のシステイン残基と第２のポリペプチド鎖上の少なくとも１個のシステイン残基間のジスルフィド結合を介するものであり得る。ジスルフィド結合に関与する第１または第２のポリペプチド鎖上のシステイン残基は、第１、第２、第３、第４、第５または第６のドメイン内を含めて、ポリペプチド鎖上のどこに存在してもよい。特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖上のシステイン残基は第１ドメインに、そして第２のポリペプチド鎖上のシステイン残基は第５ドメインに存在する。第１、第２、第４および第５のドメインは結合に関与する可変領域に相当する。好ましい実施形態では、第１および第２のポリペプチド鎖間のジスルフィド結合に関与するシステイン残基は、それぞれ第３および第６のドメイン内に位置づけられる。この実施形態の特定の態様では、第１のポリペプチド鎖の第３ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列によりコードされるヒトκ軽鎖のＣ末端の６アミノ酸、ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含む。この実施形態の別の態様では、第２のポリペプチド鎖の第６ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列によりコードされるヒトκ軽鎖のＣ末端の６アミノ酸、ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含む。この実施形態のさらに別の態様では、第１のポリペプチド鎖の第３ドメインは、配列番号８０のヌクレオチド配列によりコードされるヒトＩｇＧのヒンジドメインから誘導されるアミノ酸配列ＶＥＰＫＳＣ（配列番号７９）を含む。この実施形態の別の態様では、第２のポリペプチド鎖の第６ドメインは、配列番号８０のヌクレオチド配列によりコードされるヒトＩｇＧのヒンジドメインから誘導されるアミノ酸配列ＶＥＰＫＳＣ（配列番号７９）を含む。この実施形態の特定の態様では、第１のポリペプチド鎖の第３ドメインは、ヒトκ軽鎖のＣ末端の６アミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含み、そして第２のポリペプチド鎖の第６ドメインはアミノ酸配列ＶＥＰＫＳＣ（配列番号７９）を含む。この実施形態の他の態様では、第２のポリペプチド鎖の第６ドメインは、ヒトκ軽鎖のＣ末端の６アミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含み、そして第１のポリペプチド鎖の第３ドメインはアミノ酸配列ＶＥＰＫＳＣ（配列番号７９）を含む。この実施形態のさらに他の態様では、第１のポリペプチド鎖の第３ドメインは、ヒトκ軽鎖のＣ末端の６アミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含み、そして第２のポリペプチド鎖の第６ドメインはヒンジドメインを含む。この実施形態の他の態様では、第２のポリペプチド鎖の第６ドメインは、ヒトκ軽鎖のＣ末端の６アミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含み、そして第１のポリペプチド鎖の第３ドメインはヒンジドメインを含む。この実施形態のさらに他の態様では、第１のポリペプチド鎖の第３ドメインは、ヒトκ軽鎖のＣ末端の６アミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含み、そして第２のポリペプチド鎖の第６ドメインはＦｃドメインまたはその一部を含む。この実施形態のさらに他の態様では、第２のポリペプチド鎖の第６ドメインは、ヒトκ軽鎖の��末端の６アミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含み、そして第１のポリペプチド鎖の第３ドメインはＦｃドメインまたはその一部を含む。
【００２５】
他の実施形態において、ジスルフィド結合に関与する第１または第２のポリペプチド鎖上のシステイン残基は、第１のポリペプチド鎖の第１、第２または第３ドメインの外側に、そして第２のポリペプチド鎖の第４、第５または第６ドメインの外側に位置していてよい。特に、第１のポリペプチド鎖上のシステイン残基は第１ドメインのＮ末端、または第１ドメインのＣ末端に存在し得る。第１のポリペプチド鎖上のシステイン残基は第２ドメインのＮ末端、または第２ドメインのＣ末端に存在してもよい。第１のポリペプチド鎖上のシステイン残基は第３ドメインのＮ末端、または第３ドメインのＣ末端に存在してもよい。さらに、第２のポリペプチド鎖上のシステイン残基は第４ドメインのＮ末端、または第４ドメインのＣ末端に存在し得る。第２のポリペプチド鎖上のシステイン残基は第５ドメインのＮ末端、または第５ドメインのＣ末端に存在してもよい。これに応じて、第２のポリペプチド鎖上のシステイン残基は第６ドメインのＣ末端、または第６ドメインのＮ末端に存在してもよい。特定の態様では、ジスルフィド結合は第１のポリペプチド鎖上の少なくとも２個のシステイン残基と第２のポリペプチド鎖上の少なくとも２個のシステイン残基間にある。第３ドメインと第６ドメインがＦｃドメインまたはその一部を含まない特定の態様では、システイン残基が第１のポリペプチド鎖のＣ末端にあり、かつ第２のポリペプチド鎖のＣ末端にある。前述の任意の組合せは本発明に包含されることを理解すべきである。
【００２６】
上に記載した本発明の特定の実施形態においては、本発明の共有結合型ダイアボディはダイアボディ分子の二量体（各ダイアボディ分子が第１および第２のポリペプチド鎖を含む）を包含する。この実施形態のある態様では、ダイアボディ分子同士が共有結合で連結されて二量体を形成しているが、該共有結合はペプチド結合ではない。この実施形態の好ましい態様では、共有結合が二量体の各ダイアボディ分子の第１ポリペプチド鎖上にある少なくとも１個のシステイン残基間のジスルフィド結合である。本発明のさらに好ましい態様では、共有結合が二量体を形成している各ダイアボディ分子の第１ポリペプチド鎖上にある少なくとも１個のシステイン残基間のジスルフィド結合であるが、該少なくとも１個のシステイン残基が各第１ポリペプチド鎖の第３ドメインに存在する。
【００２７】
本発明のある態様においては、第１のポリペプチド鎖上の第１ドメインが第２ドメインのＮ末端にあっても、第２ドメインのＣ末端にあってもよい。第１のポリペプチド鎖上の第１ドメインは第３ドメインのＮ末端にあっても、第３ドメインのＣ末端にあってもよい。第１のポリペプチド鎖上の第２ドメインは第１ドメインのＮ末端にあっても、第１ドメインのＣ末端にあってもよい。さらに、第１のポリペプチド鎖上の第２ドメインは第３ドメインのＮ末端にあっても、第３ドメインのＣ末端にあってもよい。これに応じて、第１のポリペプチド鎖上の第３ドメインは第１ドメインのＮ末端にあっても、第１ドメインのＣ末端にあってもよい。第１のポリペプチド鎖上の第３ドメインは第２ドメインのＮ末端にあっても、第２ドメインのＣ末端にあってもよい。第２のポリペプチド鎖に関しては、第４ドメインが第５ドメインのＮ末端にあっても、第５ドメインのＣ末端にあってもよい。第４ドメインは第６ドメインのＮ末端にあっても、第６ドメインのＣ末端にあってもよい。第２のポリペプチド鎖上の第５ドメインは第４ドメインのＮ末端にあっても、第４ドメインのＣ末端にあってもよい。第２のポリペプチド鎖上の第５ドメインは第６ドメインのＮ末端にあっても、第６ドメインのＣ末端にあってもよい。これに応じて、第２のポリペプチド鎖上の第６ドメインは第４ドメインのＮ末端にあっても、第４ドメインのＣ末端にあってもよい。第２のポリペプチド鎖上の第６ドメインは第５ドメインのＮ末端にあっても、第５ドメインのＣ末端にあってもよい。前述の任意の組合せは本発明に包含されることを理解すべきである。
【００２８】
特定の実施形態において、第１ドメインと第２ドメインは第１のポリペプチド鎖上の第３ドメインのＣ末端に存在してもよいし、あるいは、第１ドメインと第２ドメインは第１のポリペプチド鎖上の第３ドメインのＮ末端に存在してもよい。第２のポリペプチド鎖に関して、第４ドメインと第５ドメインは第６ドメインのＣ末端に存在してもよいし、あるいは、第４ドメインと第５ドメインは第６ドメインのＮ末端に存在してもよい。この実施形態の特定の態様では、本発明は共有結合型二重特異性ダイアボディに関し、該ダイアボディはダイアボディ分子の二量体であり、各ダイアボディ分子は第１および第２のポリペプチド鎖を含み、ここで、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）の結合領域を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）の結合領域を含む第２のドメイン、および（ｉｉｉ）Ｆｃドメインまたはその一部を含む第３のドメインを含み、第１および第２のドメインが共有結合で連結されているが、第１および第２のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく、第３のドメインは第１ドメインと第２ドメインの両方のＮ末端側にあり；ここで、第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）の結合領域を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）の結合領域を含む第５のドメイン、および（ｉｉｉ）少なくとも１個のシステイン残基を含む第６のドメインを含み、第４および第５のドメインが共有結合で連結されているが、第４および第５のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；各ダイアボディ分子の第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は共有結合で連結されているが、該共有結合はペプチド結合ではなく；その際、各ダイアボディ分子の第１のドメインと第５のドメインが会合して、第１のエピトープと結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成しており；各ダイアボディ分子の第２のドメインと第４のドメインが会合して、第２のエピトープと結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成している。
【００２９】
さらに別の実施形態において、本発明は共有結合型四重特異性ダイアボディに関し、該ダイアボディはダイアボディ分子の二量体であり、第１のダイアボディ分子は第１および第２のポリペプチド鎖を含み、ここで、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）の結合領域を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）の結合領域を含む第２のドメイン、および（ｉｉｉ）Ｆｃドメインまたはその一部を含む第３のドメインを含み、第１および第２のドメインが共有結合で連結されているが、第１および第２のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく、第３のドメインは第１ドメインと第２ドメインの両方のＮ末端側にあり；ここで、第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）の結合領域を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）の結合領域を含む第５のドメイン、および（ｉｉｉ）少なくとも１個のシステイン残基を含む第６のドメインを含み、第４および第５のドメインが共有結合で連結されているが、第４および第５のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は共有結合で連結されているが、該共有結合はペプチド結合ではなく；その際、第１のドメインと第５のドメインが会合して、第１のエピトープと結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成しており；第２のドメインと第４のドメインが会合して、第２のエピトープと結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成しており；そして第２のダイアボディ分子は第１および第２のポリペプチド鎖を含み、ここで、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第３のエピトープに特異的な第３の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ３）を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第４のエピトープに特異的な第４の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ４）を含む第２のドメイン、および（ｉｉｉ）Ｆｃドメインまたはその一部を含む第３のドメインを含み、第１および第２のドメインが共有結合で連結されているが、第１および第２のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく、第３のドメインは第１ドメインと第２ドメインの両方のＮ末端側にあり；ここで、第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第４の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ４）を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第３の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ３）を含む第５のドメイン、および（ｉｉｉ）少なくとも１個のシステイン残基を含む第６のドメインを含み、第４および第５のドメインが共有結合で連結されているが、第４および第５のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は共有結合で連結されているが、該共有結合はペプチド結合ではなく；その際、第１のドメインと第５のドメインが会合して、第３のエピトープと結合する第１の結合部位（ＶＬ３）（ＶＨ３）を形成しており；第２のドメインと第４のドメインが会合して、第４のエピトープと結合する第２の結合部位（ＶＬ４）（ＶＨ４）を形成している。
【００３０】
上述したように、個々のポリペプチド鎖上のドメインは共有結合で連結されている。特定の態様では、第１と第２のドメイン間、第１と第３のドメイン間、第２と第３のドメイン間、第４と第５のドメイン間、第４と第６のドメイン間、および／または第５と第６のドメイン間の共有結合はペプチド結合であり得る。特に、第１と第２、および第４と第５のドメインが結合部位を形成するようには結合しない限り、第１と第２のドメイン、および第４と第５のドメインは、それぞれ第３のドメインおよび第６のドメインにより、または追加のアミノ酸残基により分離されていてもよい。アミノ酸残基の数は０、１、２、３、４、５、６、７、８または９個のアミノ酸残基であってよい。ある好ましい態様では、ドメイン間のアミノ酸残基の数が８個である。
【００３１】
本発明の特定の態様では、Ｆｃドメインを含む第１および第２のポリペプチド鎖のドメイン（すなわち、場合により、それぞれ第３および第６のドメイン）は、該ドメインがヒンジ−Ｆｃ領域を含むようにヒンジドメインをさらに含むことができる。これとは別の実施形態では、第１のポリペプチド鎖または第２のポリペプチド鎖が、Ｆｃドメインを含むことなくヒンジドメインを含むことができる。本発明で用いる重鎖、軽鎖、ヒンジ領域、Ｆｃドメイン、および／またはヒンジ−Ｆｃドメインは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭを含めて、どの免疫グロブリン型に由来するものであってもよい。好ましい態様では、免疫グロブリン型はＩｇＧまたはそのいずれかのサブタイプ、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４である。他の態様では、軽鎖および重鎖の由来となる免疫グロブリンはヒト化またはキメラ化されたものである。
【００３２】
さらに、ダイアボディまたはダイアボディ分子が結合する第１エピトープと第２エピトープ、適宜に、第３エピトープと第４エピトープは、同一の抗原に由来する異なるエピトープであっても、異なる抗原に由来する異なるエピトープであってもよい。抗原は、抗体を生成することができるどのような分子であってもよく、例えば、タンパク質、核酸、細菌毒素、細胞表面マーカー、自己免疫マーカー、ウイルスタンパク質、薬物などである。特定の態様では、ダイアボディの少なくとも１つのエピトープ結合部位は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、食細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞といった特定の細胞上の抗原に対して特異的である。
【００３３】
本実施形態の特定の態様において、ダイアボディまたはダイアボディ分子の少なくとも１つのエピトープ結合部位はＦｃ受容体に特異的であり、該Ｆｃ受容体は活性化性Ｆｃ受容体または抑制性Ｆｃ受容体であり得る。特定の態様では、Ｆｃ受容体がＦｃγ受容体であり、Ｆｃγ受容体はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩ受容体である。より好ましい態様では、ＦｃγＲＩＩＩ受容体がＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）受容体またはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６Ｂ）受容体であり、さらに好ましくは、ＦｃγＲＩＩＩ受容体がＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）受容体である。別の好ましい態様では、ＦｃγＲＩＩ受容体がＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）受容体またはＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）受容体であり、さらに好ましくは、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）受容体である。特に好ましい態様では、ダイアボディの１つの結合部位がＣＤ３２Ｂに特異的で、他の結合部位がＣＤ１６Ａに特異的である。本発明の特定の実施形態では、ダイアボディまたはダイアボディ分子の少なくとも１つのエピトープ結合部位が活性化性Ｆｃ受容体に特異的で、少なくとも１つの他の部位が抑制性Ｆｃ受容体に特異的である。この実施形態のある態様では、活性化性Ｆｃ受容体がＣＤ３２Ａで、抑制性Ｆｃ受容体がＣＤ３２Ｂである。この実施形態の他の態様では、活性化性Ｆｃ受容体がＢＣＲで、抑制性Ｆｃ受容体がＣＤ３２Ｂである。この実施形態のさらに他の態様では、活性化性Ｆｃ受容体がＩｇＥＲＩで、抑制性Ｆｃ受容体がＣＤ３２Ｂである。
【００３４】
１つのエピトープ結合部位がＣＤ１６Ａに特異的である場合には、ＶＬおよびＶＨドメインがマウス抗体３Ｇ８（この配列はクローン化されており、本明細書に示される）のＶＬおよびＶＨドメインと同一であっても、類似していてもよい。１つのエピトープ結合部位がＣＤ３２Ａに特異的である他の場合には、ＶＬおよびＶＨドメインがマウス抗体ＩＶ．３のＶＬおよびＶＨドメインと同一であっても、類似していてもよい。１つのエピトープ結合部位がＣＤ３２Ｂに特異的であるさらに他の場合には、ＶＬおよびＶＨドメインがマウス抗体２Ｂ６（この配列はクローン化されており、本明細書に示される）のＶＬおよびＶＨドメインと同一であっても、類似していてもよい。３Ｇ８、２Ｂ６およびＩＶ．３抗体のＶＬまたはＶＨドメインのいずれもが任意の組合せで使用できることを理解すべきである。本発明はまた、第１のエピトープがＣＤ３２Ｂに特異的で、第２のエピトープがＣＤ１６Ａに特異的である二重特異性ダイアボディまたはダイアボディ分子に関する。
【００３５】
他の態様においては、エピトープ結合部位が病原性抗原に特異的であってよい。本明細書で用いる病原性抗原とは、癌、感染症、自己免疫疾患をはじめとする特定の病原性疾患に関わる抗原のことである。こうして、病原性抗原は腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、または自己免疫抗原であり得る。病原性抗原の例としては、限定するものではないが、リポ多糖、ウイルス抗原（ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、呼吸器多核体ウイルス、西ナイルウイルス（例えば、Ｅ１６および／またはＥ５３抗原）、および肝炎ウイルスに由来するウイルス抗原からなる群より選択される）、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）、およびコラーゲンが挙げられる。好ましくは、病原性抗原は中和抗原である。好ましい態様において、一方のエピトープ結合部位がＣＤ１６ＡまたはＣＤ３２Ａに特異的である場合、他方のエピトープ結合部位は自己免疫抗原を除く病原性抗原に特異的である。さらに別の好ましい態様において、一方のエピトープ結合部位がＣＤ３２Ｂに特異的である場合、他方のエピトープ結合部位はいずれかの病原性抗原に特異的である。特定の実施形態では、本発明のダイアボディ分子は同一細胞上の２つの異なる抗原に結合し、例えば、一方の抗原結合部位は活性化性Ｆｃ受容体に特異的であるが、他方は抑制性Ｆｃ受容体に特異的である。他の実施形態では、ダイアボディ分子は２つの異なるウイルス中和エピトープ（例えば、西ナイルウイルスのＥ１６およびＥ５３であるが、これに限定されない）に結合する。
【００３６】
本発明のさらに別の実施形態においては、本発明のダイアボディを用いて様々な疾患や障害を治療することができる。したがって、本発明は、有効量の本発明の共有結合型ダイアボディまたはダイアボディ分子を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患または障害の治療方法に関し、該ダイアボディまたはダイアボディ分子は、少なくとも１つの結合部位が癌細胞の表面または細菌やウイルス粒子の表面に発現される抗原のような病原性抗原に特異的であり、そして少なくとも１つの他の結合部位がＦｃ受容体（例えば、ＣＤ１６Ａ）に特異的である。
【００３７】
さらに別の実施形態においては、本発明は、有効量の本発明のダイアボディまたはダイアボディ分子を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患または障害の治療方法に関し、該ダイアボディまたはダイアボディ分子は、少なくとも１つの結合部位がＣＤ３２Ｂに特異的であり、そして少なくとも１つの他の結合部位がＣＤ１６Ａに特異的である。
【００３８】
さらに別の実施形態においては、本発明は、有効量の本発明の共有結合型ダイアボディまたはダイアボディ分子を、それを必要とする患者に投与することを含む、、病原性抗原に対する免疫寛容の誘発方法に関し、該ダイアボディまたはダイアボディ分子は、少なくとも１つの結合部位がＣＤ３２Ｂに特異的であり、そして少なくとも１つの他の結合部位が該病原性抗原に特異的である。この実施形態のいくつかの態様では、病原性抗原はアレルゲンまたは免疫寛容が望まれる別の分子（例えば、移植した組織に発現されるタンパク質）であり得る。
【００３９】
さらに別の実施形態においては、本発明は、有効量の本発明の共有結合型ダイアボディまたはダイアボディ分子を、それを必要とする患者に投与することを含む、解毒方法に関し、該ダイアボディまたはダイアボディ分子は、少なくとも１つの結合部位が細胞表面マーカーに特異的であり、そして少なくとも１つの他の結合部位が毒素に特異的である。特定の態様では、投与される本発明のダイアボディは、１つの結合部位がＦｃのような細胞表面マーカーに特異的で、他の結合部位が細菌毒素または薬物に特異的であるものである。ある態様では、細胞表面マーカーは赤血球上に存在しないものである。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖からなるダイアボディ分子であって、
第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ２）を含む第２のドメイン、および（ｉｉｉ）Ｆｃドメインまたはその一部を含む第３のドメインを含んでなり、第１のドメインと第２のドメインが共有結合で連結されているが、第１のドメインと第２のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；
第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ２）を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ１）を含む第５のドメイン、および（ｉｉｉ）Ｆｃドメインを含む第６のドメインを含んでなり、第４のドメインと第５のドメインが共有結合で連結されているが、第４のドメインと第５のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；
ここにおいて、第１のドメインと第５のドメインが会合して、第１のエピトープと結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成しており；さらに、第２のドメインと第４のドメインが会合して、第２のエピトープと結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成している；
ことを特徴とする上記ダイアボディ分子。
（項目２）
第３のドメインがヒンジドメインをさらに含む、項目１に記載のダイアボディ分子。
（項目３）
第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖からなるダイアボディ分子であって、
第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ２）を含む第２のドメイン、および（ｉｉｉ）ヒンジドメインとＦｃドメインまたはその一部を含む第３のドメインを含んでなり、第１のドメインと第２のドメインが共有結合で連結されているが、第１のドメインと第２のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；
第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域
（ＶＬ２）を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ１）を含む第５のドメイン、および（ｉｉｉ）ヒト軽鎖定常ドメインのＣ末端の少なくとも２〜８アミノ酸残基のアミノ酸配列を含む第６のドメインを含んでなり、第４のドメインと第５のドメインが共有結合で連結されているが、第４のドメインと第５のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；
ここにおいて、第１のドメインと第５のドメインが会合して、第１のエピトープと結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成しており；
第２のドメインと第４のドメインが会合して、第２のエピトープと結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成している；
ことを特徴とする上記ダイアボディ分子。
（項目４）
第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖からなるダイアボディ分子であって、
第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ２）を含む第２のドメイン、および（ｉｉｉ）ヒンジドメインを含む第３のドメインを含んでなり、第１のドメインと第２のドメインが共有結合で連結されているが、第１のドメインと第２のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；
第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ２）を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ１）を含む第５のドメイン、および（ｉｉｉ）ヒト軽鎖定常ドメインのＣ末端の少なくとも２〜８アミノ酸残基のアミノ酸配列を含む第６のドメインを含んでなり、第４のドメインと第５のドメインが共有結合で連結されているが、第４のドメインと第５のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；
ここにおいて、第１のドメインと第５のドメインが会合して、第１のエピトープと結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成しており；
第２のドメインと第４のドメインが会合して、第２のエピトープと結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成している；
ことを特徴とする上記ダイアボディ分子。
（項目５）
ヒト軽鎖がヒトκ軽鎖である、項目３または４に記載のダイアボディ分子。
（項目６）
ヒト軽鎖がλ軽鎖である、項目３または４に記載のダイアボディ分子。
（項目７）
第６のドメインがＣ末端の６アミノ酸のアミノ酸配列を含み、該配列がＰｈｅＡｓｎＡｒｇＧｌｙＧｌｕＣｙｓ（配列番号２３）である、項目５に記載のダイアボディ分子。
（項目８）
第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖が、第１のポリペプチド鎖上の第１ドメインと第２ドメインの外側の少なくとも１個のシステイン残基と、第２のポリペプチド鎖上の第４ドメインと第５ドメインの外側の少なくとも１個のシステイン残基の間の少なくとも１個のジスルフィド結合を介して共有結合で連結されている、項目１、２、３または４に記載のダイアボディ分子。
（項目９）
第１のポリペプチド鎖上のシステイン残基が第３のドメインにあり、第２のポリペプチド鎖上のシステイン残基が第６のドメインにある、項目８に記載のダイアボディ分子。
（項目１０）
第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖からなるダイアボディ分子であって、
第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ２）を含む第
２のドメイン、および（ｉｉｉ）Ｆｃドメインまたはその一部を含む第３のドメインを含んでなり、第１のドメインと第２のドメインが共有結合で連結されているが、第１のドメインと第２のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；
第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ２）を含む第４のドメイン、および（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ１）を含む第５のドメインを含んでなり、第４のドメインと第５のドメインが共有結合で連結されているが、第４のドメインと第５のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；
ここにおいて、第１のドメインと第５のドメインが会合して、第１のエピトープと結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成しており；
第２のドメインと第４のドメインが会合して、第２のエピトープと結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成しており；そして
第３のドメインが第１のドメインと第２のドメインの両方のＮ末端側にある；
ことを特徴とする上記ダイアボディ分子。
（項目１１）
第３のドメインがヒンジ領域をさらに含む、項目１０に記載のダイアボディ分子。
（項目１２）
第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖が、第１のポリペプチド鎖上の第１ドメインと第２ドメインの外側の少なくとも１個のシステイン残基と、第２のポリペプチド鎖上の第４ドメインと第５ドメインの外側の少なくとも１個のシステイン残基の間の少なくとも１個のジスルフィド結合を介して共有結合で連結されている、項目１０または１１に記載のダイアボディ分子。
（項目１３）
第１のポリペプチド鎖上の上記少なくとも１個のシステイン残基が第１ドメイン、第２ドメインおよび第３ドメインのＣ末端側にあり、第２のポリペプチド鎖上の上記少なくとも１個のシステイン残基が第４ドメインおよび第５ドメインのＣ末端側にある、項目１２に記載のダイアボディ分子。
（項目１４）
上記分子が野生型第１ドメインに対して第１ドメインの少なくとも１個のアミノ酸改変と、野生型第５ドメインに対して第５ドメインの少なくとも１個のアミノ酸改変を含み、第１ドメインと第５ドメインのそれぞれにおける該少なくとも１個のアミノ酸改変がシステインによる置換を含んでなり、その結果第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖が、第１ドメイン中の置換システイン残基と第５ドメイン中の置換システイン残基の間のジスルフィド結合を介して共有結合で連結される、項目１、３または１０に記載のダイアボディ分子。
（項目１５）
Ｆｃドメインが野生型Ｆｃドメインに対してアミノ酸改変を含み、該アミノ酸改変がアラニンによる２１５位の置換を含んでなる、項目１、３または１０に記載のダイアボディ分子。
（項目１６）
上記分子が２つの単量体からなり、各単量体が第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含んでなり、該単量体同士が各単量体の第１のポリペプチド鎖の第３ドメイン中の少なくとも１個のシステイン残基間の少なくとも１個のジスルフィド結合を介して共有結合で連結される、項目３、１０または１１に記載のダイアボディ分子。
（項目１７）
第１ドメインと第４ドメインがそれぞれ第２ドメインおよび第５ドメインのＮ末端側に位置する、項目１、３または１０に記載のダイアボディ分子。
（項目１８）
第１ドメインと第４ドメインがそれぞれ第２ドメインおよび第５ドメインのＣ末端側に位置する、項目１、３または１０に記載のダイアボディ分子。
（項目１９）
第６ドメインが第４ドメインおよび第５ドメインのＣ末端側にある、項目１または２に記載のダイアボディ分子。
（項目２０）
第１および第２ドメイン間の共有結合がペプチド結合である、項目１、３、４または１０に記載のダイアボディ分子。
（項目２１）
第４および第５ドメイン間の共有結合がペプチド結合である、項目１、３、４または１０に記載のダイアボディ分子。
（項目２２）
第１および第２ドメインが０、１、２、３、４、５、６、７、８または９アミノ酸残基により分離されている、項目２０に記載のダイアボディ分子。
（項目２３）
第４および第５ドメインが０、１、２、３、４、５、６、７、８または９アミノ酸残基により分離されている、項目２１に記載のダイアボディ分子。
（項目２４）
第１および第２のポリペプチド鎖からなるダイアボディ分子であって、
第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を含む第１のドメイン、および（ｉｉ）第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ２）を含む第２のドメインを含んでなり、第１のドメインと第２のドメインが共有結合で連結されているが、第１のドメインと第２のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；
第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ２）を含む第３のドメイン、および（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ１）を含む第４のドメインを含んでなり、第３のドメインと第４のドメインが共有結合で連結されているが、第３のドメインと第４のドメインはエピトープ結合部位を形成するように会合することはなく；
ここにおいて、第１のドメインと第３のドメインが会合して、第１のエピトープと結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成しており、該エピトープ結合部位はＣＤ３２Ｂに対して特異的であり；
第２のドメインと第４のドメインが会合して、第２のエピトープと結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成しており、該エピトープ結合部位は
ＣＤ１６に対して特異的であり；そして
第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖が、第１のポリペプチド鎖上の第１ドメインと第２ドメインの外側の少なくとも１個のシステイン残基と、第２のポリペプチド鎖上の第３ドメインと第４ドメインの外側の少なくとも１個のシステイン残基の間のジスルフィド結合を介して共有結合で連結されており、第１のポリペプチド鎖上の該システイン残基は第１のポリペプチド鎖のＣ末端にはなく、また第２のポリペプチド鎖上の該システイン残基は第２のポリペプチド鎖のＣ末端にはない；
ことを特徴とする上記ダイアボディ分子。
（項目２５）
第１および第２ドメイン間の共有結合がペプチド結合である、項目２４に記載のダイアボディ分子。
（項目２６）
第３および第４ドメイン間の共有結合がペプチド結合である、項目２４に記載のダイアボディ分子。
（項目２７）
ジスルフィド結合が第１のポリペプチド鎖上の少なくとも２個のシステイン残基と第２のポリペプチド鎖上の少なくとも２個のシステイン残基の間にある、項目２４に記載のダイ
アボディ分子。
（項目２８）
第１のエピトープと第２のエピトープが異なるものである、項目１、３、４、１０または２４に記載のダイアボディ分子。
（項目２９）
第１のエピトープと第２のエピトープが同一分子に由来するエピトープである、項目２８に記載のダイアボディ分子。
（項目３０）
第１のエピトープと第２のエピトープが異なる分子に由来するエピトープである、項目２８に記載のダイアボディ分子。
（項目３１）
第１の免疫グロブリンまたは第２の免疫グロブリンがヒトまたはヒト化免疫グロブリンである、項目１、３、４、１０または２４に記載のダイアボディ分子。
（項目３２）
第１の免疫グロブリンまたは第２の免疫グロブリンがヒト免疫グロブリンであり、該ヒト免疫グロブリンがＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＧまたはＩｇＭである、項目３１に記載のダイアボディ分子。
（項目３３）
ヒト免疫グロブリンがＩｇＧであり、該ＩｇＧがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群より選択される、項目３２に記載のダイアボディ分子。
（項目３４）
ＦｃドメインがヒトＦｃドメインである、項目１、３または１０に記載のダイアボディ分子。
（項目３５）
ＦｃドメインがＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＧまたはＩｇＭのＦｃドメインである、項目３４に記載のダイアボディ分子。
（項目３６）
ＦｃドメインがＩｇＧのＦｃドメインであり、該ＩｇＧがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群より選択される、項目３５に記載のダイアボディ分子。
（項目３７）
少なくとも１つのエピトープ結合部位がＢ細胞、Ｔ細胞、食細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、または樹状細胞に対して特異的である、項目１、３、４または１０に記載のダイアボディ分子。
（項目３８）
少なくとも１つのエピトープ結合部位が細胞表面マーカーに対して特異的である、項目１、３、４または１０に記載のダイアボディ分子。
（項目３９）
細胞表面マーカーがＦｃ受容体である、項目３８に記載のダイアボディ分子。
（項目４０）
Ｆｃ受容体が活性化性Ｆｃ受容体である、項目３９に記載のダイアボディ分子。
（項目４１）
Ｆｃ受容体が抑制性Ｆｃ受容体である、項目３９に記載のダイアボディ分子。
（項目４２）
Ｆｃ受容体がＦｃγ受容体である、項目３９に記載のダイアボディ分子。
（項目４３）
Ｆｃγ受容体がＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩ受容体である、項目４２に記載のダイアボディ分子。
（項目４４）
Ｆｃγ受容体がＦｃγＲＩＩＩ受容体であり、該ＦｃγＲＩＩＩ受容体がＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）受容体またはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６Ｂ）受容体である、項目４３
に記載のダイアボディ分子。
（項目４５）
ＦｃγＲＩＩＩ受容体がＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）受容体である、項目４４に記載のダイアボディ分子。
（項目４６）
第１のエピトープ結合部位を構成するＶＬ１領域とＶＨ１領域が第１の免疫グロブリンに由来し、該免疫グロブリンが抗体３Ｇ８である、項目４２に記載のダイアボディ分子。
（項目４７）
第２のエピトープ結合部位を構成するＶＬ１領域とＶＨ１領域が第２の免疫グロブリンに由来し、該免疫グロブリンが抗体３Ｇ８である、項目２４に記載のダイアボディ分子。
（項目４８）
抗体３Ｇ８がヒト化されている、項目４６に記載のダイアボディ分子。
（項目４９）
抗体３Ｇ８がヒト化されている、項目４７に記載のダイアボディ分子。
（項目５０）
ＶＬ１領域が配列番号７３のアミノ酸配列を含み、ＶＨ１領域が配列番号７１のアミノ酸配列を含む、項目４８に記載のダイアボディ分子。
（項目５１）
ＶＬ１領域が配列番号７３のアミノ酸配列を含み、ＶＨ１領域が配列番号７１のアミノ酸配列を含む、項目４９に記載のダイアボディ分子。
（項目５２）
Ｆｃγ受容体がＦｃγＲＩＩ受容体であり、該ＦｃγＲＩＩ受容体がＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）受容体またはＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）受容体である、項目４３に記載のダイアボディ分子。
（項目５３）
ＦｃγＲＩＩ受容体がＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）受容体である、項目５２に記載のダイアボディ分子。
（項目５４）
第１のエピトープ結合部位を構成するＶＬ１領域とＶＨ１領域が第１の免疫グロブリンに由来し、該免疫グロブリンが抗体ＩＶ．３である、項目５３に記載のダイアボディ分子。（項目５５）
抗体ＩＶ．３がヒト化されている、項目５４に記載のダイアボディ分子。
（項目５６）
ＦｃγＲＩＩ受容体がＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）受容体である、項目５３に記載のダイアボディ分子。
（項目５７）
第１のエピトープ結合部位を構成するＶＬ１領域とＶＨ１領域が第１の免疫グロブリンに由来し、該免疫グロブリンが抗体２Ｂ６である、項目５６に記載のダイアボディ分子。
（項目５８）
第１のエピトープ結合部位を構成するＶＬ１領域とＶＨ１領域が第１の免疫グロブリンに由来し、該免疫グロブリンが抗体２Ｂ６である、項目２４に記載のダイアボディ分子。
（項目５９）
抗体２Ｂ６がヒト化されている、項目５７に記載のダイアボディ分子。
（項目６０）
抗体２Ｂ６がヒト化されている、項目５８に記載のダイアボディ分子。
（項目６１）
ＶＬ１領域が配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３のアミノ酸配列を含み、ＶＨ１領域が配列番号４０のアミノ酸配列を含む、項目５９に記載のダイアボディ分子。
（項目６２）
ＶＬ１領域が配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３のアミノ酸配列を含み、ＶＨ１
領域が配列番号４０のアミノ酸配列を含む、項目６０に記載のダイアボディ分子。
（項目６３）
ＶＬ１領域が野生型２Ｂ６
ＶＬ１領域に対してアミノ酸改変を含み、該アミノ酸改変がシステインによる１０５位の置換からなり、かつＶＨ１領域が野生型２Ｂ６
ＶＨ１領域に対してアミノ酸改変を含み、該アミノ酸改変がシステインによる４４位の置換からなる、項目５９に記載のダイアボディ分子。
（項目６４）
ＶＬ１領域が野生型２Ｂ６
ＶＬ１領域に対してアミノ酸改変を含み、該アミノ酸改変がシステインによる１０５位の置換からなり、かつＶＨ１領域が野生型２Ｂ６
ＶＨ１領域に対してアミノ酸改変を含み、該アミノ酸改変がシステインによる４４位の置換からなる、項目６０に記載のダイアボディ分子。
（項目６５）
第２のエピトープ結合部位が病原性抗原に対して特異的である、項目４２に記載のダイアボディ分子。
（項目６６）
病原性抗原が腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原または自己免疫抗原である、項目６５に記載のダイアボディ分子。
（項目６７）
病原性抗原が細菌抗原である、項目６６に記載のダイアボディ分子。
（項目６８）
細菌抗原がリポ多糖である、項目６７に記載のダイアボディ分子。
（項目６９）
病原性抗原がウイルス抗原である、項目６６に記載のダイアボディ分子。
（項目７０）
ウイルス抗原がヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルスおよび肝炎ウイルスに由来する抗原からなる群より選択される、項目６９に記載のダイアボディ分子。
（項目７１）
病原性抗原が自己免疫抗原である、項目６６に記載のダイアボディ分子。
（項目７２）
自己免疫抗原がＤＮＡ、ＲＮＡおよびコラーゲンからなる群より選択される、項目７１に記載のダイアボディ分子。
（項目７３）
第２のエピトープ結合部位が毒素に対して特異的である、項目３８に記載のダイアボディ分子。
（項目７４）
第２のエピトープ結合部位が薬物に対して特異的である、項目３８に記載のダイアボディ分子。
（項目７５）
第２のエピトープ結合部位が毒素に対して特異的である、項目３９に記載のダイアボディ分子。
（項目７６）
第２のエピトープ結合部位が薬物に対して特異的である、項目３９に記載のダイアボディ分子。
（項目７７）
第１のエピトープ結合部位がＣＤ３２Ｂに特異的で、第２のエピトープ結合部位がＣＤ１６Ａに特異的である、項目１に記載のダイアボディ分子。
（項目７８）
第１のエピトープ結合部位がＣＤ１６Ａに特異的で、第２のエピトープ結合部位がＣＤ３２Ｂに特異的である、項目３に記載のダイアボディ分子。
（項目７９）
第１のエピトープ結合部位がＣＤ１６Ａに特異的で、第２のエピトープ結合部位がＣＤ３２Ｂに特異的である、項目４に記載のダイアボディ分子。
（項目８０）
第１のエピトープ結合部位がＣＤ３２Ｂに特異的で、第２のエピトープ結合部位がＣＤ１６Ａに特異的である、項目１０に記載のダイアボディ分子。
（項目８１）
第１のエピトープ結合部位がＣＤ３２Ｂに特異的で、第２のエピトープ結合部位がＣＤ１６Ａに特異的である、項目１１に記載のダイアボディ分子。
（項目８２）
第１のエピトープ結合部位がＣＤ３２Ｂに特異的で、第２のエピトープ結合部位がＣＤ１６Ａに特異的である、項目２４に記載のダイアボディ分子。
（項目８３）
第１のポリペプチド鎖が配列番号１４のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖が配列番号１５のアミノ酸配列を含む、項目７７に記載のダイアボディ分子。
（項目８４）
第１のポリペプチド鎖が配列番号１８のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖が配列番号１６のアミノ酸配列を含む、項目７８に記載のダイアボディ分子。
（項目８５）
第１のポリペプチド鎖が配列番号１９のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖が配列番号９のアミノ酸配列を含む、項目８１に記載のダイアボディ分子。
（項目８６）
第１のポリペプチド鎖が配列番号２０のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖が配列番号９のアミノ酸配列を含む、項目８０に記載のダイアボディ分子。
（項目８７）
第１のポリペプチド鎖が配列番号９のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖が配列番号１１のアミノ酸配列を含む、項目８２に記載のダイアボディ分子。
（項目８８）
第１のポリペプチド鎖が配列番号１１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖が配列番号９のアミノ酸配列を含む、項目８２に記載のダイアボディ分子。
（項目８９）
第３のドメインが変異型Ｆｃ領域を含み、該変異型Ｆｃ領域が野生型Ｆｃ領域に対して少なくとも１つのアミノ酸改変を含んでなる、項目１、３、４または
１０に記載のダイアボディ分子。
（項目９０）
上記改変がＦｃ領域とＦｃ受容体間の結合親和性を改変させる、項目８９に記載のダイアボディ分子。
（項目９１）
上記改変がＦｃ領域とＦｃ受容体間の結合をゼロにする、項目９０に記載のダイアボディ分子。
（項目９２）
項目１、３、４、１０または２４に記載のダイアボディ分子の第１のポリペプチド鎖または第２のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸。
（項目９３）
項目１、３、４、１０または２４に記載のダイアボディ分子の第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸。
（項目９４）
項目９２に記載の核酸を含有するベクター。
（項目９５）
項目９３に記載の核酸を含有するベクター。
（項目９６）
発現ベクターである、項目９４に記載のベクター。
（項目９７）
発現ベクターである、項目９５に記載のベクター。
（項目９８）
項目９４に記載の核酸を含有する宿主細胞。
（項目９９）
項目９５に記載の核酸を含有する宿主細胞。
（項目１００）
ダイアボディ分子の組換え生産方法であって、
ａ． 項目９８に記載の宿主細胞を、ダイアボディ分子の発現に好適な条件下に培地中で培養し、
ｂ． 該培地からダイアボディ分子を回収する、
ことを含んでなる上記方法。
（項目１０１）
ダイアボディ分子の組換え生産方法であって、
ａ． 項目９８に記載の宿主細胞を、ダイアボディ分子の発現に好適な条件下に培地中で培養し、
ｂ． 該培地からダイアボディ分子を回収する、
ことを含んでなる上記方法。
（項目１０２）
病原性抗原により特徴づけられる疾患または障害の治療方法であって、それを必要とする患者に有効量の項目６６に記載のダイアボディ分子を投与することを含んでなり、該ダイアボディ分子が該病原性抗原と結合するものである、上記方法。
（項目１０３）
上記疾患または障害が癌である、項目１０２に記載の方法。
（項目１０４）
上記疾患または障害が感染性疾患である、項目１０２に記載の方法。
（項目１０５）
病原性抗原に対する免疫寛容の誘発方法であって、それを必要とする患者に有効量の項目６６に記載のダイアボディ分子を投与することを含んでなる上記方法。
（項目１０６）
解毒方法であって、それを必要とする患者に有効量の項目７３に記載のダイアボディ分子を投与することを含んでなる上記方法。
（項目１０７）
解毒方法であって、それを必要とする患者に有効量の項目７４に記載のダイアボディ分子を投与することを含んでなる上記方法。
（項目１０８）
第１のエピトープと第２のエピトープが異なる細胞に由来するものである、項目２８に記載のダイアボディ分子。
（項目１０９）
Ｆｃドメイン部分がＣＨ２欠失部分からなる、項目１、３または１０に記載のダイアボディ分子。
（項目１１０）
Ｆｃドメイン部分がＣＨ３欠失部分からなる、項目１、３または１０に記載のダイアボディ分子。
（項目１１１）
上記分子が二量体であり、該二量体が
（ａ） 上記第１のポリペプチド鎖と上記第２のポリペプチド鎖の対からなる第１の単量体、および
（ｂ） 上記第１のポリペプチド鎖と上記第２のポリペプチド鎖の対からなる第２の単量
体、
からなり、第１および第２の単量体が各単量体の第１のポリペプチド鎖の第３ドメイン中の少なくとも１個のシステイン残基間の少なくとも１つのジスルフィド結合を介して共有結合で連結されている、項目３、１０または１１に記載のダイアボディ分子。
（項目１１２）
第１の単量体と第２の単量体が同一のものである、項目１１１に記載のダイアボディ分子。
（項目１１３）
第１の単量体と第２の単量体が異なるものである、項目１１２に記載のダイアボディ分子。
（項目１１４）
二重親和性再標的化試薬（ＤＡＲＴ）。
（項目１１５）
複数の親和性を共に連関させる、項目１１４に記載のＤＡＲＴ。
（項目１１６）
ｈｕＣＤ３２Ｂ、ｈｕＣＤ１６Ａ、ｈｕＣＤ１６Ｂ、ハプテン、またはフルオレセインに対する親和性を有する、項目１１４に記載のＤＡＲＴ。
（項目１１７）
患者におけるＢ細胞悪性疾患を治療する方法であって、上記患者に項目１１４から１１６のいずれかに記載の有効量のＤＡＲＴを投与することを含む、方法。
（項目１１８）
上記Ｂ細胞悪性疾患の少なくとも一部のＢ細胞が、ＣＤ２０を発現しないか、またはリツキサン（登録商標）抗ＣＤ２０抗体による治療に対して耐性となっている、項目１１７に記載の方法。
（項目１１９）
第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含むダイアボディ分子であって、
（Ａ）上記第１のポリペプチド鎖は、
（ｉ）エピトープ（１）に特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）の結合領域を含むドメイン（Ａ）、
（ｉｉ）エピトープ（２）に特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）の結合領域を含むドメイン（Ｂ）、および
（ｉｉｉ）軽鎖定常領域（ＣＬ）ドメイン（Ｃ）
を含み、
前記ドメイン（Ａ）と（Ｂ）は互いに会合してエピトープ結合部位を形成することはなく、
（Ｂ）上記第２のポリペプチド鎖は、
（ｉ）上記第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）の結合領域を含むドメイン（Ｄ）、
（ｉｉ）上記第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）の結合領域を含むドメイン（Ｅ）、
（ｉｉｉ）重鎖定常領域１（ＣＨ１）ドメインまたはその一部を含むドメイン（Ｆ）、並びに、
（ｉｖ）ヒンジ領域、重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）
を含み、
上記ドメイン（Ｄ）と（Ｅ）は互いに会合してエピトープ結合部位を形成することはなく、
上記ドメイン（Ａ）と（Ｅ）は互いに会合して上記エピトープ（１）に結合する結合部位を形成し、
上記ドメイン（Ｂ）と（Ｄ）は互いに会合して上記エピトープ（２）に結合する結合部位を形成し、
上記ドメイン（Ｃ）と（Ｆ）はジスルフィド結合を介して一緒に会合し、
さらに上記ダイアボディ分子は第３のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖を含み、
（Ｃ）上記第３のポリペプチド鎖は、
（ｉ）エピトープ（３）に特異的な第３の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ３）の結合領域を含むドメイン（Ｇ）、
（ｉｉ）エピトープ（４）に特異的な第４の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ４）の結合領域を含むドメイン（Ｈ）、および、
（ｉｉｉ）軽鎖定常領域（ＣＬ）を含むドメイン（Ｉ）
を含み、
上記ドメイン（Ｇ）と（Ｈ）は互いに会合してエピトープ結合部位を形成することはなく、
（Ｄ）上記第４のポリペプチド鎖は、
（ｉ）上記エピトープ（４）に特異的な上記第４の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ４）の結合領域を含むドメイン（Ｊ）、
（ｉｉ）上記エピトープ（３）に特異的な上記第３の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ３）の結合領域を含むドメイン（Ｋ）、
（ｉｉｉ）重鎖定常領域１（ＣＨ１）を含むドメイン（Ｌ）、並びに、
（ｉｖ）ヒンジ領域、重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）
を含み、
上記ドメイン（Ｊ）と（Ｋ）は互いに会合してエプトープ結合部位を形成することはなく、
上記ドメイン（Ｇ）と（Ｋ）は互いに会合して前記エピトープ（３）に結合する結合部位を形成し、
上記ドメイン（Ｈ）と（Ｊ）は互いに会合して上記エピトープ（４）に結合する結合部位を形成し、
上記ドメイン（Ｉ）と（Ｌ）はジスルフィド結合を介して一緒に会合し、
上記第２及び第４のポリペプチド鎖の上記ヒンジ領域、上記重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び上記重鎖定常領域３（ＣＨ３）は会合してＦｃ領域を形成する、
ダイアボディ分子。
（項目１２０）
上記ドメイン（Ａ）は上記ドメイン（Ｂ）のＮ末端側に存在し、上記ドメイン（Ｄ）は上記ドメイン（Ｅ）のＮ末端側に存在する、項目１１９に記載のダイアボディ分子。
（項目１２１）
上記エピトープ（１）と（３）がどちらも同一分子上に存在する、項目１１９又は１２０に記載のダイアボディ分子。
（項目１２２）
上記エピトープ（１）と（３）が同一である、項目１１９又は１２０に記載のダイアボディ分子。
（項目１２３）
上記エピトープ（２）と（４）がどちらも抗原分子上に存在する、項目１１９に記載のダイアボディ分子。
（項目１２４）
上記エピトープ（２）と（４）が同一である、項目１１９に記載のダイアボディ分子。
（項目１２５）
少なくとも１つのエピトープが、病原体抗原、自己免疫抗原、毒素又は薬物のエピトープである、項目１１９に記載のダイアボディ分子。
（項目１２６）
少なくとも１つのエピトープが、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ又はフルオレセインである、項目１１９に記載のダイアボディ分子。
（項目１２７）
少なくとも１つのエピトープがＣＤ３２Ｂであり、少なくとも１つのエピトープがＣＤ１６Ａである、項目１１９に記載のダイアボディ分子。
（項目１２８）
項目１１９に記載の第１、第２、第３又は第４のポリペプチド鎖をコードする核酸分子。
（項目１２９）
項目１１９に記載のダイアボディ分子からなる治療剤。
（項目１３０）
病原体抗原によって特徴づけられる疾患又は障害の治療に用いられ、前記病原体抗原に結合するエピトープ結合部位を有する、項目１１９に記載のダイアボディ分子からなる治療剤。
【００４０】
３．１  定義
特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語、表記法、その他の科学用語または専門用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解する意味を有するものとする。いくつかの場合には、通常理解される意味の用語であっても、明確さのためにおよび／または参考までに本明細書中で定義されるが、そうした定義を本明細書に含めても、当技術分野で一般的に理解されている意味に対する大きな相違を表すと必ずしも解釈されるべきでない。本発明の実施には、特に他で示さない限り、当業者が容易に想到し得る分子生物学（組換え法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、および免疫学の分野の慣用技術を利用するものとする。そうした技術は文献に詳しく説明されており、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （Ｊ．  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９９、２００１年の増刊を含む）；  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７、２００１年の増刊を含む）；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版  （Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ、２００１年）；  ＰＣＲ：  Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４年）；  Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  （Ｄ．  Ｗｉｌｄ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  ＮＹ、１９９４年）；  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  （Ｇｒｅｇ  Ｔ．  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年）；  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  （Ｒ．  Ｍａｓｓｅｙｅｆｆ、Ｗ．  Ｈ．  Ａｌｂｅｒｔ、およびＮ．  Ａ．  Ｓｔａｉｎｅｓ編、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ：  ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇｓ  ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ｍｂＨ、１９９３年）、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９９９年、ならびにＢｅａｕｃａｇｅら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２０００年）を参照されたい。
【００４１】
本明細書中で用いる「抗体」なる語は、モノクローナル、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ラクダ化抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド結合二重特異性Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、細胞内発現抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄおよび抗−抗Ｉｄ抗体を含む）、ならびに上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを意味する。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫活性フラグメント、すなわち抗原結合部位を含有する分子を含む。免疫グロブリン分子はいずれのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであってもよい。
【００４２】
本明細書中で用いる「免疫特異的に結合する」、「免疫特異的に認識する」、「特異的に結合する」、「特異的に認識する」および同様の用語は、抗原（例えば、エピトープまたは免疫複合体）と特異的に結合するが、他の分子とは特異的に結合しない分子を指す。抗原と特異的に結合する分子は、例えばイムノアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ、または当技術分野で知られた他のアッセイで測定して、より低い親和性で他のペプチドまたはポリペプチドと結合してもよい。好ましくは、抗原と特異的に結合する分子は他のタンパク質と交差反応しない。抗原と特異的に結合する分子は、例えば、イムノアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ、または当業者に知られた他の技法により同定することができる。
【００４３】
本明細書中で用いる「免疫複合体」とは、少なくとも１つの標的分子と少なくとも１つの異種Ｆｃγ領域含有ポリペプチドが互いと結合して、より大きな分子量の複合体を形成するときに生じる構造体を指す。免疫複合体の例は抗原−抗体複合体であり、これは可溶性であっても粒状（例えば、細胞表面上の抗原／抗体複合体）であってもよい。
【００４４】
本明細書中で用いる「重鎖」、「軽鎖」、「可変領域」、「フレームワーク領域」、「定常ドメイン」などの語は、免疫学分野でのそれらの通常の意味を有し、天然の免疫グロブリン中のドメインおよび合成（例えば、組換え）結合タンパク質（例えば、ヒト化抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体など）の対応するドメインを指す。天然の免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）の基本的な構造単位は、２本の軽鎖と２本の重鎖をもつ四量体であり、通常は約１５０，０００  Ｄａの糖タンパク質として発現される。各鎖のアミノ末端（「Ｎ」）部分は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸からなる可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端（「Ｃ」）部分は定常領域を規定しており、軽鎖が１つの定常ドメインを有し、重鎖が通常３つの定常ドメインとヒンジ領域を有する。したがって、ＩｇＧ分子の軽鎖の構造はｎ−ＶＬ−ＣＬ−ｃであり、ＩｇＧ重鎖の構造はｎ−ＶＨ−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−ｃ（ここでＨはヒンジ領域）である。ＩｇＧ分子の可変領域は、抗原と接触する残基を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）と、フレームワークセグメントと呼ばれる非ＣＤＲセグメントからなり、該セグメントは一般に構造を維持し、ＣＤＲループの位置を決定する（しかし、特定のフレームワーク残基が抗原と接触してもよい）。したがって、ＶＬおよびＶＨドメインは構造ｎ−ＦＲ１，  ＣＤＲ１，  ＦＲ２，  ＣＤＲ２，  ＦＲ３，  ＣＤＲ３，  ＦＲ４−ｃを有する。
【００４５】
結合タンパク質または抗体（本明細書では広範に定義される）について述べるとき、各ドメインへのアミノ酸の帰属はＫａｂａｔ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  （Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、１９８７年および１９９１年）の定義に従う。免疫グロブリンの成熟重鎖および軽鎖の可変領域由来のアミノ酸は、その鎖中のアミノ酸の位置によって指定される。Ｋａｂａｔは多数の抗体のアミノ酸配列を記載し、各サブグループにつき共通のアミノ酸配列を同定し、そして各アミノ酸に残基番号を割り当てた。Ｋａｂａｔのナンバリング方式は、問題の抗体を、保存アミノ酸を基準にしたＫａｂａｔの共通配列の１つとアライメントすることにより、彼の一覧表には含まれない抗体にまで拡張することができる。残基番号を割り当てるこの方法は、当該分野で標準的になってきており、様々な抗体（キメラやヒト化変異体を含む）において同等の位置のアミノ酸を容易に同定する。例えば、ヒト抗体軽鎖の５０位のアミノ酸は、マウス抗体軽鎖の５０位のアミノ酸と等しい位置を占めている。
【００４６】
本明細書中で用いる「重鎖」なる用語は、ＩｇＧ抗体の重鎖を特定するために使用される。完全な天然ＩｇＧでは、重鎖は免疫グロブリンドメインＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。本明細書全体を通して、ＩｇＧ重鎖中の残基の番号付けは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、ＮＨ１、ＭＤ  （１９９１年）（参照として本明細書に組み入れる）におけるようなＥＵインデックスのそれである。「ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックス」とは、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の番号付けを指す。ヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むアミノ酸配列の例を、以下に記載する図１Ａおよび１Ｂに示す。図１Ａおよび１Ｂには、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の重鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインのアミノ酸配列も示される。ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４アイソタイプのアミノ酸配列は、それぞれのヒンジ領域の最初と最後のシステイン残基（重鎖間Ｓ−Ｓ結合を形成する）を同じ位置に配置することによって、ＩｇＧ１配列とアライメントされる。ＩｇＧ２とＩｇＧ３のヒンジ領域については、すべての残基がＥＵインデックスにより番号付けされるとは限らない。
【００４７】
「ヒンジ領域」または「ヒンジドメイン」は、一般的に、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０までの広がりとして定義される。ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域のアミノ酸配列の例を図１Ａに示す（図１Ａでのアミノ酸残基はＫａｂａｔシステムに従って番号付けされる）。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、図１Ａに示すように重鎖間Ｓ−Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を同じ位置に配置することにより、ＩｇＧ１配列とアライメントさせることができる。
【００４８】
本明細書中で用いる「Ｆｃ領域」、「Ｆｃドメイン」または同様の語は、ＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を規定するために用いられる。ヒトＩｇＧ１を含むアミノ酸配列の例を図１Ｂに示す。Ｋａｂａｔシステムに従って番号付けしたとき、境界はわずかに変化し得るが、Ｆｃドメインはアミノ酸２３１から４４７まで延びている（図１Ｂでのアミノ酸残基はＫａｂａｔシステムに従って番号付けされる）。図１Ｂには、ＩｇＧアイソタイプＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のＦｃ領域のアミノ酸配列の例も示される。
【００４９】
ＩｇＧのＦｃ領域は、２つの定常ドメイン、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインは、通常、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従ってアミノ酸２３１からアミノ酸３４１まで延びている（図１Ｂ）。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインは、通常、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従ってアミノ酸３４２からアミノ酸４４７まで延びている（図１Ｂ）。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン（「Ｃγ２」ドメインとも呼ばれる）は、それがもう１つのドメインと密接に対合していないという点でユニークである。それどころか、完全な天然ＩｇＧの２つのＣＨ２ドメイン間には、２つのＮ−結合分岐糖鎖が介在している。
【００５０】
本明細書中で用いる「ＦｃγＲ結合タンパク質」、「ＦｃγＲ抗体」および「抗ＦｃγＲ抗体」という用語は互換的に用いられ、様々な免疫グロブリン様タンパク質または免疫グロブリン由来タンパク質を指す。「ＦｃγＲ結合タンパク質」はＶＬおよび／またはＶＨドメインとの相互作用を介してＦｃγＲと結合する（Ｆｃγ介在結合とは区別される）。ＦｃγＲ結合タンパク質の例としては、完全にヒトの抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体（例えば、２本の重鎖と２本の軽鎖を含む）、そのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント）、二官能性もしくは多官能性抗体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａら、（１９８７年）「Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  Ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７巻、１０５〜１１１頁参照）、一本鎖抗体（例えば、Ｂｉｒｄら、（１９８８年）「Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２巻、４２３〜２６頁参照）、融合タンパク質（例えば、ファージディスプレイ融合タンパク質）、「ミニボディ」（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号参照）、ならびにＶＬおよび／またはＶＨドメインまたはそのフラグメントを含む他の抗原結合タンパク質が挙げられる。ある態様において、ＦｃγＲＩＩＩＡ結合タンパク質は「四量体抗体」であり、すなわち、一般的に天然のＩｇＧの構造を有し、かつ可変ドメインと定常ドメインを含む（すなわち、ＶＬドメインと軽鎖定常ドメインを有する軽鎖２本およびＶＨドメインと重鎖ヒンジおよび定常ドメインを有する重鎖２本を含む）。
【００５１】
本明細書中で用いる「ＦｃγＲアンタゴニスト」および類似の用語は、ＦｃγＲの少なくとも１つの生物学的活性をアンタゴナイズする（例えば、シグナル伝達を遮断する）タンパク質および非タンパク質性物質（小分子を含む）を指す。例えば、本発明の分子はＩｇＧのＦｃγＲへの結合をブロックすることによってシグナル伝達を遮断する。
【００５２】
本明細書中で用いる、ポリペプチドまたはタンパク質に関する「誘導体」なる語は、アミノ酸残基の置換、欠失または付加の導入により改変されているアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはタンパク質を指す。本明細書中で用いる「誘導体」はまた、改変されている、すなわち、ポリペプチドまたはタンパク質への任意のタイプの分子の共有結合により改変されているポリペプチドまたはタンパク質を意味する。例えば、限定するものではないが、抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質との結合などにより改変することができる。誘導体ポリペプチドまたはタンパク質は、限定するものでないが、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などを含めて、当業者に公知の技術を用いる化学的修飾により製造することができる。さらに、誘導体ポリペプチドまたはタンパク質誘導体は、それが誘導される元のポリペプチドまたはタンパク質と同様のまたは同一の機能を保持する。
【００５３】
本明細書中で用いる、非タンパク質誘導体に関しての「誘導体」なる語は、第１の有機または無機分子の構造に基づいて形成された第２の有機または無機分子を意味する。有機分子の誘導体は、限定するものではないが、例えば、ヒドロキシル、メチル、エチル、カルボキシルまたはアミン基の付加または欠失により、改変された分子を含む。有機分子はまた、エステル化、アルキル化および／またはリン酸化されてもよい。
【００５４】
本明細書中で用いる「ダイアボディ分子」とは、２本またはそれ以上のポリペプチド鎖またはタンパク質の複合体であって、それぞれが少なくとも１つのＶＬおよびＶＨドメインまたはその断片を含み、両ドメインが単一のポリペプチド鎖内に含まれている該複合体を指す。いくつかの実施形態において、「ダイアボディ分子」にはＦｃまたはヒンジ−Ｆｃドメインを含む分子が含まれる。かかる複合体のポリペプチド鎖は同一でも異なっていてもよく、すなわち、ダイアボディ分子はホモ多量体またはヘテロ多量体であり得る。特定の態様では、「ダイアボディ分子」には二量体または四量体が含まれ、つまり前記ポリペプチド鎖が両方ともＶＬおよびＶＨドメインを含む。多量体タンパク質を構成する個々のポリペプチド鎖は、鎖間ジスルフィド結合によって多量体の少なくとも１つの他のペプチドと共有結合で連結されていてもよい。
【００５５】
本明細書中で用いる「障害」および「疾患」は、互換的に使用され、被験者の症状を意味する。特に、用語「自己免疫疾患」は「自己免疫障害」と互換的に使用され、被験者自身の細胞、組織および／または器官に対する被験者の免疫反応に起因する細胞、組織および／または器官の損傷により特徴づけられる被験者の症状を意味する。用語「炎症性疾患」は用語「炎症性障害」と互換的に使用され、炎症、好ましくは慢性炎症により特徴づけられる被験者の症状を意味する。自己免疫障害は炎症を伴っても伴わなくてもよい。さらに、炎症は自己免疫障害に起因してもしなくてもよい。したがって、ある特定の障害は自己免疫障害と炎症性障害の両方により特徴づけられてもよい。
【００５６】
本明細書中で用いる「同一のポリペプチド鎖」とは、ほぼ同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を意味し、例えば、１個またはそれ以上のアミノ酸の相違を有するポリペプチド鎖、好ましくは２つのポリペプチド鎖の活性が有意に異ならないような保存的アミノ酸置換を有するポリペプチド鎖が含まれる。
【００５７】
本明細書中で用いる「癌」なる語は、異常な無制御の細胞増殖から生じる新生物または腫瘍を意味する。本明細書中で用いる癌は、明確に白血病およびリンパ腫を含む。いくつかの実施形態において、癌は局在化したままで存在する良性腫瘍を意味する。他の実施形態において、癌は、近隣の身体構造に侵入して破壊し、離れた部位に広がる悪性疾患を意味する。いくつかの実施形態では、癌は特定の癌抗原を随伴する。
【００５８】
本明細書中で用いる「免疫調節剤」およびその変形は、宿主の免疫系をモジュレートする薬剤を意味する。ある特定の実施形態においては、免疫調節剤は免疫抑制剤である。ある特定の実施形態においては、免疫調節剤は免疫賦活剤である。免疫調節剤としては、限定するものではないが、小分子、ペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質、抗体、無機分子、ミメチック、および有機分子を含む。
【００５９】
本明細書中で用いる「エピトープ」なる語は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおいて抗原性または免疫原性を有するポリペプチドもしくはタンパク質または非タンパク質分子の断片を意味する。免疫原性を有するエピトープは、動物において抗体応答を誘発するポリペプチドまたはタンパク質の断片である。抗原性を有するエピトープは、当業者に周知の方法、例えばイムノアッセイにより確認されるような、抗体が免疫特異的に結合するポリペプチドまたはタンパク質の断片である。抗原性エピトープは必ずしも免疫原性である必要はない。
【００６０】
本明細書中で用いる「断片」または「フラグメント」とは、別のポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも５個連続したアミノ酸残基、少なくとも１０個連続したアミノ酸残基、少なくとも１５個連続したアミノ酸残基、少なくとも２０個連続したアミノ酸残基、少なくとも２５個連続したアミノ酸残基、少なくとも４０個連続したアミノ酸残基、少なくとも５０個連続したアミノ酸残基、少なくとも６０個連続したアミノ酸残基、少なくとも７０個連続したアミノ酸残基、少なくとも８０個連続したアミノ酸残基、少なくとも９０個連続したアミノ酸残基、少なくとも１００個連続したアミノ酸残基、少なくとも１２５個連続したアミノ酸残基、少なくとも１５０個連続したアミノ酸残基、少なくとも１７５個連続したアミノ酸残基、少なくとも２００個連続したアミノ酸残基、または少なくとも２５０個連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを意味する。特定の実施形態においては、ポリペプチドの断片は、そのポリペプチドの少なくとも１つの機能を保持する。
【００６１】
本明細書中で用いる「核酸」および「ヌクレオチド配列」なる語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の組合せまたはハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ分子、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡ分子の類似体を含む。このような類似体は、例えば、限定するものではないが、イノシンまたはトリチル化塩基を含むヌクレオチド類似体を用いて作製することができる。このような類似体はまた、分子に有益な属性を与える（例えば、ヌクレアーゼ耐性を付与したり、細胞膜を通過する能力を高める）改変された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含んでもよい。核酸またはヌクレオチド配列は一本鎖、または二本鎖であってもよいし、一本鎖部分と二本鎖部分の両方を含んでもよく、また、三本鎖部分を含んでもよい。しかし、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００６２】
本明細書中で用いる「治療上有効な量」、「治療に有効な量」または「治療有効量」とは、疾患または障害を治療または管理するのに十分な治療剤の量を意味する。治療上有効な量は、疾患の発症を遅延させるかまたは最小限にする（例えば、癌の拡大を遅延させるかまたは最小限にする）のに十分な治療剤の量を指すこともある。治療上有効な量は、疾患の治療または管理において治療上の利益を与える治療剤の量を意味してもよい。さらに、本発明の治療剤についての治療上有効な量は、疾患の治療または管理において治療上の利益を与える、単独でのまたは他の治療剤と組み合わせた治療剤の量を意味する。
【００６３】
本明細書中で用いる「予防剤」なる語は、障害の予防に、または障害の再発または拡大の予防に使用される薬剤を意味する。予防上有効な量は、過増殖性疾患（特に癌）の再発または拡大、または患者（限定するものではないが、過増殖性疾患の素因がある患者、例えば、遺伝的に癌の素因があるかまたは以前に発癌物質に曝された患者を含む）におけるそれらの発生を予防するのに十分な予防剤の量を意味し得る。予防上有効な量はまた、疾患の予防において予防上の利益を与える予防剤の量を意味してもよい。さらに、本発明の予防剤についての予防上有効な量は、疾患の予防において予防上の利益を与える、単独でのまたは他の薬剤と組み合わせた予防剤の量を意味する。
【００６４】
本明細書中で用いる「予防」とは、予防剤または治療剤の投与から得られる、被験者における障害の１以上の症状の再発または発症の予防を意味する。
【００６５】
本明細書中で用いる「組み合わせて」は、２種以上の予防剤および／または治療剤の使用を意味する。用語「組み合わせて」は、予防剤および／または治療剤を、障害のある被験者に投与する順序を制限するものではない。第１の予防剤または治療剤は、障害のある被験者に第２の予防剤または治療剤を投与する前（例えば５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週、２週、３週、４週、５週、６週、８週、または１２週前）に、または第２の予防剤または治療剤を投与すると同時に、または第２の予防剤または治療剤を投与した後（例えば５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週、２週、３週、４週、５週、６週、８週、または１２週後）に、投与することができる。
【００６６】
本明細書において用いられる「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域と、Ｆｃ受容体または抗原との相互作用によりもたらされる生化学的事象を意味する。エフェクター機能の例としては、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、抗体依存性食作用（ＡＤＣＰ）、および補体依存性細胞傷害作用があるが、これに限定されるものではない。エフェクター機能には、抗原結合後に作用するエフェクター機能と、抗原結合とは無関係に作用するエフェクター機能の両方が含まれる。
【００６７】
本明細書において用いられる「エフェクター細胞」は、１つ以上のＦｃ受容体を発現し、１つ以上のエフェクター機能を媒介する、免疫系の細胞を意味する。エフェクター細胞の例としては、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、血小板、Ｂ細胞、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞があるが、これらに限定されるものではなく、またエフェクター細胞は任意の生物、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサルに由来し得るが、これらに限定されるものではない。
【００６８】
本明細書中で用いる「免疫複合体と特異的に結合する」および類似の用語は、ある免疫複合体と特異的に結合するが、別の分子とは特異的に結合しない分子を意味する。免疫複合体と特異的に結合する分子は、例えばイムノアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ、または当技術分野で公知の他のアッセイで測定して、より低い親和性で他のペプチドまたはポリペプチドと結合してもよい。好ましくは、免疫複合体と特異的に結合する分子は他のタンパク質と交差反応しないものである。免疫複合体と特異的に結合する分子は、例えばイムノアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ、または当技術分野で公知の他の技法により、確認することができる。
【００６９】
本明細書中で用いる「安定な融合タンパク質」とは、当業者に知られた通常の生化学的および機能性アッセイを用いて評価したとき、製造および／または保存中に最小限ないし検出不能レベルの分解を受ける融合タンパク質を意味し、生物学的活性（例えば、ＦｃγＲとの結合）の低下なく、長期間保存することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１Ａ】ヒトＩｇＧ  ＣＨ１、ヒンジおよびＦｃ領域のアミノ酸配列を示す。図１Ａは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のヒンジドメインのアミノ酸配列を示す（ＩｇＧ１ヒンジドメイン（配列番号１）；ＩｇＧ２ヒンジドメイン（配列番号２）；ＩｇＧ３ヒンジドメイン（配列番号３）；ＩｇＧ４ヒンジドメイン（配列番号４））。図１Ａで示されたアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ  ＥＵのナンバリングシステムに従って番号を付している。アイソタイプ配列については、重鎖間のＳ−Ｓ結合を形成する各ヒンジ領域の最初と最後のシステイン残基を同一位置に配置することによって、ＩｇＧ１配列とのアライメントを行っている。
【図１Ｂ】ヒトＩｇＧ  ＣＨ１、ヒンジおよびＦｃ領域のアミノ酸配列を示す。図１Ｂは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のＦｃドメインのアミノ酸配列を示す（ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（配列番号５）；ＩｇＧ２  Ｆｃドメイン（配列番号６）；ＩｇＧ３  Ｆｃドメイン（配列番号７）；ＩｇＧ４  Ｆｃドメイン（配列番号８））。図１Ｂで示されたアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ  ＥＵのナンバリングシステムに従って番号を付している。図１Ｂでは、ＣＨ２ドメイン中の残基を＋で示し、ＣＨ３ドメイン中の残基を〜で示している。
【図２】共有結合型二機能性ダイアボディのポリペプチド鎖の模式図を示す。共有結合型二機能性ダイアボディのポリペプチドは、短いペプチドリンカーで分離された抗体ＶＬドメインおよび抗体ＶＨドメインからなる。８アミノ酸残基のリンカーは、一本鎖ポリペプチドのｓｃＦｖ構築物への自己集合を妨げており、その代わりに、異なるポリペプチド鎖のＶＬドメインおよびＶＨドメイン間の相互作用が優先する。４つの構築物を作製した（各構築物は、構築物の左側のアミノ末端「ｎ」から図の右側のカルボキシ末端「ｃ」まで記載されている）：構築物（１）（配列番号９）は、ｎ−Ｈｕ２Ｂ６のＶＬドメイン−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ３Ｇ８のＶＨドメイン−およびＣ末端配列（ＬＧＧＣ）−ｃを含み、構築物（２）（配列番号１１）は、ｎ−Ｈｕ３Ｇ８のＶＬドメイン−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ２Ｂ６のＶＨドメイン−およびＣ末端配列（ＬＧＧＣ）−ｃを含み、構築物（３）（配列番号１２）は、ｎ−Ｈｕ３Ｇ８のＶＬドメイン−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ３Ｇ８のＶＨドメイン−およびＣ末端配列（ＬＧＧＣ）−ｃを含み、構築物（４）（配列番号１３）は、ｎ−Ｈｕ２Ｂ６のＶＬドメイン−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ２Ｂ６のＶＨドメイン−およびＣ末端配列（ＬＧＧＣ）−ｃを含む。
【図３】アフィニティー精製されたダイアボディのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。アフィニティー精製されたダイアボディを還元（レーン１〜３）または非還元（レーン４〜６）条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析にかけた。標準品のおおよその分子量を（レーン３および４の間に）示している。レーン１および４はｈ３Ｇ８  ＣＭＤを、レーン２および５はｈ２Ｂ６  ＣＭＤを、レーン３および６はｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤを示す。
【図４】図４Ａは、アフィニティー精製されたダイアボディのＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）分析を示す図である。アフィニティー精製されたダイアボディをＳＥＣ分析にかけた。既知標準品、すなわち、全長ＩｇＧ（〜１５０ｋＤａ）、ＩｇＧのＦａｂフラグメント（〜５０ｋＤａ）、およびｓｃＦｖ（〜３０ｋＤａ）の溶出プロファイル。図４Ｂは、アフィニティー精製されたダイアボディのＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）分析を示す図である。アフィニティー精製されたダイアボディをＳＥＣ分析にかけた。既知標準品、すなわち、ｈ２ｂ６  ＣＭＤ、ｈ３Ｇ８  ＣＭＤおよびｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤの溶出プロファイル。
【図５】ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤのｓＣＤ３２ＢおよびｓＣＤ１６Ａとの結合を示す図である。ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤとｓＣＤ３２ＢおよびｓＣＤ１６Ａとの結合を、サンドイッチＥＬＩＳＡで分析した。ｓＣＤ３２Ｂを標的タンパク質として使用した。二次プローブは、ＨＲＰコンジュゲートｓＣＤ１６Ａとした。ＣＤ１６Ａに結合するｈ３Ｇ８  ＣＭＤを対照として使用した。
【図６】ｓＣＤ１６Ａ、ｓＣＤ３２ＢおよびｓＣＤ３２Ａとのダイアボディの結合のＢＩＡｃｏｒｅ解析を示す図である。２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤ、ｈ２Ｂ６  ＣＭＤおよびｈ３Ｇ８  ＣＭＤとｓＣＤ１６Ａ、ｓＣＤ３２ＢおよびｓＣＤ３２Ａ（陰性対照）との結合をＳＰＲ解析によって分析した。ｈ３Ｇ８  ｓｃＦｖも対照として試験した。（Ａ）  ｓＣＤ１６との結合、（Ｂ）ｓＣＤ３２Ｂとの結合、および（Ｃ）ｓＣＤ３２Ａとの結合。ダイアボディを１００ｎＭの濃度で、ｓｃＦｖを２００ｎＭの濃度で、流速５０ｍｌ／分にて６０秒間、受容体表面に投入した。
【図７】図７Ａ−Ｃは、ｓＣＤ１６Ａとのダイアボディの結合のＢＩＡｃｏｒｅ解析を示す図である。ｈ３Ｇ８  ＣＭＤおよびｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤとｓＣＤ１６Ａとの結合をＳＰＲ解析によって分析した。ｈ３Ｇ８  ｓｃＦｖも対照として試験した。（Ａ）ｈ３Ｇ８  ＣＭＤ  ｓＣＤ１６Ａとの結合；（Ｂ）ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤとｓＣＤ１６Ａとの結合；（Ｃ）ｈ３Ｇ８  ｓｃＦｖとｓＣＤ１６Ａとの結合。ダイアボディを６．２５〜２００ｎＭの濃度で、流速７０ｍｌ／分にて１８０秒間、受容体表面に投入した。図７Ｄ−Ｅは、ｓＣＤ３２Ｂとのダイアボディの結合のＢＩＡｃｏｒｅ解析を示す図である。ｈ２Ｂ６  ＣＭＤおよびｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤとｓＣＤ３２Ｂとの結合をＳＰＲ解析によって分析した。（Ｄ）ｈ２Ｂ６  ＣＭＤとｓＣＤ３２Ｂとの結合、および（Ｅ）ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤとｓＣＤ３２Ｂとの結合。ダイアボディを６．２５〜２００ｎＭの濃度で、流速７０ｍｌ／分にて１８０秒間、受容体表面に投入した。
【図８】共有結合型二重特異性ダイアボディ分子を形成するためのＶＬおよびＶＨドメインを含んだポリペプチド鎖の相互作用を示す模式図である。ＮＨ２およびＣＯＯＨは、それぞれ各ポリペプチド鎖のアミノ末端およびカルボキシ末端を表す。Ｓは、各ポリペプチド鎖のＣ末端システイン残基を表す。ＶＬおよびＶＨは、それぞれＬ鎖可変ドメインおよびＨ鎖可変ドメインを示す。点線および破線は、２つのポリペプチド鎖同士を区別するためのものであり、特に前記鎖のリンカー部分を表している。ｈ２Ｂ６  Ｆｖおよびｈ３Ｇ８  Ｆｖは、それぞれＣＤ３２ＢおよびＣＤ１６に特異的なエピトープ結合部位を示す。
【図９】共有結合型二重特異性ダイアボディのＦｃドメインを含むポリペプチド鎖の模式図を示す。本発明のダイアボディ分子のポリペプチド構築物の模式図（各構築物は、構築物の左側のアミノ末端「ｎ」から図の右側のカルボキシ末端「ｃ」まで記載されている）。構築物（５）（配列番号１４）は、ｎ−Ｈｕ２Ｂ６のＶＬドメイン−第１リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ３Ｇ８のＶＨドメイン−第２リンカー（ＬＧＧＣ）−およびヒトＩｇＧ１のＣ末端Ｆｃドメイン−ｃを含み、構築物（６）（配列番号１５）は、ｎ−Ｈｕ３Ｇ８のＶＬドメイン−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ２Ｂ６のＶＨドメイン−および第２リンカー（ＬＧＧＣ）−およびヒトＩｇＧ１のＣ末端Ｆｃドメイン−ｃを含み、構築物（７）（配列番号１６）は、ｎ−Ｈｕ２Ｂ６のＶＬドメイン−第１リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ３Ｇ８のＶＨドメイン−およびＣ末端配列（ＬＧＧＣＦＮＲＧＥＣ）（配列番号１７）−ｃを含み、構築物（８）（配列番号１８）は、ｎ−Ｈｕ３Ｇ８のＶＬドメイン−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ２Ｂ６のＶＨドメイン−および第２リンカー（ＬＧＧＣ）−およびヒトＩｇＧ１のＣ末端ヒンジ／Ｆｃドメイン（Ａ２１５Ｖのアミノ酸置換を有する）−ｃを含む。
【図１０】Ｆｃドメインを含むダイアボディ分子とｓＣＤ３２ＢおよびｓＣＤ１６Ａとの結合を示す図である。Ｆｃドメインを含むダイアボディ分子とｓＣＤ３２ＢおよびｓＣＤ１６Ａとの結合をサンドイッチＥＬＩＳＡで分析した。分析したダイアボディは、次の３つの組換え発現系により産生された：構築物１および６をそれぞれ発現するｐＭＧＸ６６９およびｐＭＧＸ６７４のコトランスフェクション、構築物２および５をそれぞれ発現するｐＭＧＸ６６７およびｐＭＧＸ６７６のコトランスフェクション、構築物５および６をそれぞれ発現するｐＭＧＸ６７６およびｐＭＧＸ６７４のコトランスフェクション。ｓＣＤ３２Ｂを標的タンパク質として用いた。第２プローブはＨＲＰコンジュゲートｓＣＤ１６Ａとした。
【図１１】二価の共有結合型ダイアボディ分子を形成するために、それぞれ１つのＦｃドメインを含む、２つのポリペプチド鎖の相互作用を示す模式図である。ＮＨ２およびＣＯＯＨは、各ポリペプチド鎖のアミノ末端およびカルボキシ末端をそれぞれ表す。Ｓは、各ポリペプチド鎖の第２リンカー配列中のシステイン残基間の少なくとも１つのジスルフィド結合を表す。ＶＬおよびＶＨは、それぞれＬ鎖可変領域およびＨ鎖可変領域を示す。点線および破線は、２つのポリペプチド鎖同士を区別するためのものであり、特に前記鎖の第１リンカー部分を表す。ＣＨ２およびＣＨ３は、ＦｃドメインのＣＨ２およびＣＨ３定常ドメインを示す。ｈ２Ｂ６  Ｆｖおよびｈ３Ｇ８  Ｆｖは、それぞれＣＤ３２ＢおよびＣＤ１６に特異的なエピトープ結合部位を示す。
【図１２】ヒンジ／Ｆｃドメインを含むダイアボディ分子のｓＣＤ３２ＢおよびｓＣＤ１６Ａに対する結合性を示す図である。Ｆｃドメインを含むダイアボディ分子とｓＣＤ３２ＢおよびｓＣＤ１６Ａとの結合については、サンドイッチＥＬＩＳＡで分析した。分析したダイアボディは、次の４つの組換え発現系により産生された：構築物１および６をそれぞれ発現するｐＭＧＸ６６９＋ｐＭＧＸ６７４のコトランスフェクション、構築物２および８をそれぞれ発現するｐＭＧＸ６６９＋ｐＭＧＸ６７８のコトランスフェクション、構築物７および６をそれぞれ発現するｐＭＧＸ６７７＋ｐＭＧＸ６７４のコトランスフェクション、構築物７および８をそれぞれ発現するｐＭＧＸ６７７＋ｐＭＧＸ６７８のコトランスフェクション。ｓＣＤ３２Ｂを標的タンパク質として使用した。第２プローブは、ＨＲＰコンジュゲートｓＣＤ１６Ａとした。
【図１３】四量体ダイアボディ分子を形成するためのポリペプチド鎖の相互作用を示す模式図である。ＮＨ２およびＣＯＯＨは、各ポリペプチド鎖のそれぞれアミノ末端およびカルボキシ末端を表す。Ｓは、Ｆｃをもつ「重い」ポリペプチド鎖の第２リンカー配列中のシステイン残基と、Ｆｃをもたない「軽い」ポリペプチド鎖のＣ末端配列中のシステイン残基間の少なくとも１つのジスルフィド結合を表す。ＶＬおよびＶＨは、それぞれＬ鎖可変ドメインおよびＨ鎖可変ドメインを示す。点線および破線は、２つのポリペプチド鎖同士を区別するためのものであり、特に前記重い鎖の第１リンカー部分または前記軽い鎖のリンカーを表す。ＣＨ２およびＣＨ３は、ＦｃドメインのＣＨ２およびＣＨ３定常ドメインを示す。ｈ２Ｂ６  Ｆｖおよびｈ３Ｇ８  Ｆｖは、それぞれＣＤ３２ＢおよびＣＤ１６に特異的なエピトープ結合部位を示す。
【図１４】共有結合型二重特異性ダイアボディを形成するＦｃドメインを含むポリペプチド鎖の模式図である。本発明のダイアボディ分子を形成するポリペプチド構築物の模式図（各構築物は、構築物の左側のアミノ末端「ｎ」から図の右側のカルボキシ末端「ｃ」まで記載されている）。構築物（９）（配列番号１９）は、ｎ−ヒトＩｇＧ１のヒンジ／Ｆｃドメイン−Ｈｕ３Ｇ８のＶＬドメイン−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ２Ｂ６のＶＨドメイン−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−およびＣ末端ＬＧＧＣ配列−ｃを含み、構築物（１０）（配列番号２０）は、ｎ−ヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン−Ｈｕ３Ｇ８のＶＬドメイン−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ２Ｂ６のＶＨドメイン−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−およびＣ末端ＬＧＧＣ配列−ｃを含み、構築物（１１）（配列番号２１）は、ｎ−Ｈｕ２Ｂ６のＶＬドメイン（Ｇ１０５Ｃ）−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ３Ｇ８のＶＨドメイン−およびＡ２１５Ｖのアミノ酸置換を有するヒトＩｇＧ１のＣ末端ヒンジ／Ｆｃドメイン−ｃを含み、構築物（１２）（配列番号２２）は、ｎ−Ｈｕ３Ｇ８のＶＬドメイン−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ２Ｂ６のＶＨドメイン（Ｇ４４Ｃ）−およびＣ末端ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）配列−ｃを含む。
【図１５】アフィニティー四量体ダイアボディのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析を示す図である。構築物１０および１、構築物９および１、構築物１１および１２を発現するベクターでコトランスフェクションされた組換え発現系によって産生されたダイアボディを、非還元的条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（Ａ）、およびヤギ抗ヒトＩｇＧ１  Ｈ＋Ｌをプローブとして用いたウェスタンブロット分析（Ｂ）にかけた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中のタンパク質をシンプリーブルーセーフステイン（Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅｓｔａｉｎ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で視覚化した。ＡおよびＢの両パネルにおいて、構築物１０および１、構築物９および１、構築物１１および１２Ａを含むダイアボディ分子は、それぞれレーン１、２、３に相当する。
【図１６】Ｆｃドメインおよび遺伝子操作によって作られた鎖間ジスルフィド結合を含むダイアボディ分子のｓＣＤ３２ＢおよびｓＣＤ１６Ａに対する結合性を示す図である。Ｆｃドメイン、および「軽い」ポリペプチド鎖と「重い」ポリペプチド鎖の間の遺伝子操作によって作られたジスルフィド結合を含むダイアボディ分子と、ｓＣＤ３２ＢおよびｓＣＤ１６Ａとの結合をサンドイッチＥＬＩＳＡでアッセイした。アッセイしたダイアボディは、次の３つの組換え発現系により産生された：それぞれ構築物１および１０を発現する系、構築物１および９を発現する系、ならびに構築物１１および１２を発現する系。ｓＣＤ３２Ｂを標的タンパク質として使用した。第２プローブはＨＲＰコンジュゲートｓＣＤ１６Ａとした。ｈ３Ｇ８の結合を対照として用いた。
【図１７】ダイアボディ分子のポリタンパク質前駆体の模式図、およびラムダ軽鎖および／またはヒンジドメインを含むポリペプチド鎖の模式図である。本発明のダイアボディ分子を形成するポリペプチド構築物の模式図（各構築物は、構築物の左側のアミノ末端「ｎ」から図の右側のカルボキシ末端「ｃ」まで記載されている）。構築物（１３）（配列番号９７）は、ｎ−３Ｇ８のＶＬドメイン−第１リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−２．４Ｇ２ＶＨのＶＨドメイン−第２リンカー（ＬＧＧＣ）−フューリン認識部位（ＲＡＫＲ（配列番号９５））−２．４Ｇ２のＶＬドメイン−第３リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）−３Ｇ８のＶＨドメイン−およびＣ末端ＬＧＧＣドメインを含み（配列番号９７をコードするヌクレオチド配列は配列番号９８に示す）、構築物（１４）（配列番号９９）は、ｎ−３Ｇ８のＶＬドメイン−第１リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−２．４Ｇ２ＶＨのＶＨドメイン−第２リンカー（ＬＧＧＣ）−フューリン認識部位（ＲＡＫＲ（配列番号９５））−ＦＭＤ（口蹄疫ウイルスプロテアーゼＣ３）部位−２．４Ｇ２のＶＬドメイン−第３リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号１０）−３Ｇ８のＶＨドメイン−およびＣ末端ＬＧＧＣドメインを含む（配列番号９９をコードするヌクレオチド配列は配列番号１００に示す）。構築物（１５）（配列番号１０１）は、ｎ−Ｈｕ２Ｂ６のＶＬドメイン−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ３Ｇ８のＶＨドメイン−およびＣ末端ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）ドメインを含む（配列番号１０１をコードするヌクレオチド配列は配列番号１０２に示す）。構築物（１６）（配列番号１０３）は、ｎ−Ｈｕ３Ｇ８のＶＬドメイン−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ２Ｂ６のＶＨドメイン−Ｃ末端ＶＥＰＫＳＣ（配列番号７９）ドメインを含む（配列番号１０３をコードするヌクレオチド配列は配列番号１０４に示す）。
【図１８】ポリタンパク質前駆体分子に由来するダイアボディ分子のｍＣＤ３２ＢおよびｓＣＤ１６Ａに対する結合性を示す図である。ポリタンパク質前駆体分子構築物１３（配列番号９７）に由来するダイアボディ分子とマウスＣＤ３２Ｂ（ｍＣＤ３２Ｂ）および可溶性ＣＤ１６Ａ（ｓＣＤ１６Ａ）との結合をサンドイッチＥＬＩＳＡで解析した。ｍＣＤ３２Ｂを標的タンパク質として用いた。第２プローブはビオチンコンジュゲートｓＣＤ１６Ａとした。
【図１９】ラムダ鎖および／またはヒンジドメインを含むダイアボディのｓＣＤ３２ＢおよびｓＣＤ１６Ａに対する結合性を示す図である。ヒトラムダ軽鎖のＣ末端に由来するドメインおよび／またはＩｇＧのヒンジドメインを含むダイアボディと、ｓＣＤ３２ＢおよびｓＣＤ１６Ａとの結合をサンドイッチＥＬＩＳＡでアッセイし、構築物１および２（図５）からなるダイアボディと比較した。アッセイしたダイアボディは、構築物１５および１６（それぞれ配列番号１０１および配列番号１０３）を発現する組換え発現系により産生された。ｓＣＤ３２Ｂを標的タンパク質として使用した。第２プローブはＨＲＰコンジュゲートｓＣＤ１６Ａとした。小点状模様のバーは構築物１５／１６の組合せ物を表し、また市松模様のバーは構築物１／２の組合せ物を表す。
【図２０】細胞表面に位置するＣＤ３２Ｂおよびフルオレセインコンジュゲート分子に対して結合した２Ｂ６／４４２０  ＤＡＲＴの模式図である。
【００７１】
ダイアグラムは、ＤＡＲＴの「万能アダプター」である抗フルオレセインアームのフレキシビリティーの他、２Ｂ６アームに代わる他の特異性を用いる可能性を示す。Ｖ領域はボックスとして示し、ＧＧＧＳＧＧＧＧリンカーは線として示し、ジスルフィド結合は二本鎖の連結として示す。一方の鎖の構成要素を青色で示す一方、他方の鎖はピンク色で示す。Ｎはアミノ末端、Ｃはカルボキシ末端、ＦＬはフルオレセイン、ＶＬは軽鎖可変領域、ＶＨは重鎖可変領域である。
【図２１】（パネルＡおよびＢ）２Ｂ６／４４２０  ＤＡＲＴがフルオレセインコンジュゲート分子に特異的に結合し、同時にＣＤ３２Ｂにも結合し得ることを示す図である。
【００７２】
（Ａ）２Ｂ６／４４２０または２Ｂ６／３Ｇ８を、ＦＩＴＣ−Ｓタンパク質でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに結合させた。２Ｂ６アームの結合および機能は、可溶性ＣＤ３２Ｂの結合の後、ＣＤ３２Ｂに対して特異的な抗体およびＨＲＰコンジュゲート検出用二次抗体により検出した。（Ｂ）２Ｂ６／４４２０または２Ｂ６／３Ｇ８を、ＨｕＩｇＧまたはＦＩＴＣ−ＨｕＩｇＧ（フルオレセインコンジュゲート）でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに結合させた。結合は、２Ｂ６  Ｆｖに対して特異的なポリクローナル血清との結合の後、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体により検出した。
【図２２】（パネルＡおよびＢ）抗ヒトＣＤ７９Ｂ抗体を用いる精製されたＢ細胞の活性化を示す図である。
【００７３】
精製されたＢ細胞は、濃度を上昇させるＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＣＤ７９Ｂ抗体であるＣＢ３．１−ＦＩＴＣ（Ａ）または同ＣＢ３．２−ＦＩＴＣ（Ｂ）と、Ｆｃ特異的ＧＡＭ  ＩｇＧのＦ（ａｂ’）２フラグメント５０μｇ／ｍｌと（ｘ軸）を用いて活性化させた。Ｂ細胞は、ＰＢＳ（白色バー）または５μｇ／ｍｌのαＦＩＴＣαＣＤ３２ＢＤＡＲＴ（黒色バー）もしくはαＣＤ１６αＣＤ３２ＢＤＡＲＴ（灰色バー）の存在下で活性化させた。反応は３連で実施し、標準偏差を計算した。
【図２３】（パネルＡおよびＢ）精製されたＢ細胞の活性化を示す図である。
【００７４】
第２の健康ドナー由来の精製されたＢ細胞を、図２２、パネルＢで説明したように活性化させた。ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ７９ｂ抗体であるＣＢ３．２−ＦＩＴＣの存在下で活性化された細胞内で増殖指数（Ａ）を測定し、非標識ＣＢ３．２抗体の存在下で活性化された細胞の増殖指数（Ｂ）と比較した。
【図２４】（上パネルおよび下パネル）ＨＣＤ１６Ａ／ＢトランスジェニックマウスにおいてＭＧＤ２６１を用いるｉｎ  ｖｉｖｏでのマウスＢ細胞枯渇を示す図である。
【００７５】
第０、３、７、１０、１４、および１７日において、ＭａｒｃｏＧｅｎｉｃｓ社製繁殖コロニーのｍＣＤ３２−／−  ｈＣＤ１６Ａ＋  Ｃ５７Ｂ１／６マウス、ｍＣＤ３２−／−  ｈＣＤ３２Ｂ＋  Ｃ５７Ｂ１／６マウス、およびｍＣＤ３２−／−  ｈＣＤ１６Ａ＋  ｈＣＤ３２Ｂ＋  Ｃ５７Ｂ１／６マウスに、ＭＧＤ２６１（１０、３、１、または０．３ｍｇ／ｋｇ）または非関連抗体（１０ｍｇ／ｋｇのｈＥ１６）を静脈内注射した。第−１９（血液採取前）、４、１１、１８、２５、および３２日において血液を採取し、ＦＡＣＳ解析にかけた。毎週３回、動物の健康および活動を記録した。上パネル：ｈ２Ｂ６−３Ｇ８およびＷＮＶ  ｍＡｂ、下パネル：ｈ２Ｂ６−３Ｇ８−ｈＣＤ１６Ａマウスまたは２Ｂ６−３Ｇ８−ｈＣＤ３２Ｂマウス、およびＷＮＶ  ｍＡｂ−ｈＣＤ１６ＡマウスまたはＷＮＶ  ｍＡｂ−ｈＣＤ３２Ｂマウス。
【図２５】ＨＣＤ１６Ａ／Ｂトランスジェニックマウスにおいて２．４Ｇ２−３Ｇ８  ＤＢを用いるｉｎ  ｖｉｖｏでのマウスＢ細胞枯渇を示す図である。
【００７６】
第０、２、４、７、９、１１、１４、１６、および１８日において、ＭａｒｃｏＧｅｎｉｃｓ社製繁殖コロニーのｍＣＤ１６−／−マウス、ｍＣＤ１６−／−  ｈＣＤ１６Ａ＋  Ｃ５７Ｂ１／６マウス、ｍＣＤ１６−／−  ｈＣＤ１６Ｂ＋マウス、およびｍＣＤ１６−／−  ｈＣＤ１６Ａ＋  ｈＣＤ１６Ｂ＋マウスに、２．４Ｇ２−３Ｇ８  ＤＢ（７５ｕｇ／匹）またはＰＢＳを腹腔内注射した。第−１０（血液採取前）、４、１１、および１８日において血液を採取し、ＦＡＣＳ解析にかけた。毎週３回、動物の健康および活動を記録した。
【図２６】ヒト腫瘍細胞株Ｒａｊｉの静脈内（ＩＶ）モデルを用いるＭＧＤ２６１の抗腫瘍活性に対する裏付けを示す図である。
【００７７】
第０日において、ＭａｒｃｏＧｅｎｉｃｓ社製繁殖コロニーで２０週齢のｍＣＤ１６−／−マウス、ｈＣＤ１６Ａ＋マウス、ＲＡＧ１−／−  Ｃ５７Ｂ１／６マウス１２匹に、５×１０６個のＲａｊｉ細胞を静脈内注射した。第６、９、１３、１６、２０、２３、２７、および３０日において、マウスはまた、２５０、２５、または２．５ｕｇのＭＧＤ２６１またはＰＢＳ（陰性対照）による腹腔内（ＩＰ）治療も受けた。次いで、マウスを毎日観察し、毎週２回体重を記録した。後肢麻痺を発症するマウスは安楽死させた。
【図２７】非哺乳動物宿主におけるＤＡＲＴ発現を示す図である。
【００７８】
ｐＥＴ２５ｂ（＋）Ｔ７−ｌａｃ＋  ３Ｇ８／３Ｇ８プラスミドによりＢＬ２１ＤＥ３細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を形質転換させ、ａｍｐ耐性コロニーを用いてブロス培地に播種した。培養物が０．５  ＯＤ６００単位に達したところで、０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加して発現を誘導した。３０℃で２時間にわたり培養物を増殖させ、無細胞培地を回収した。
【図２８】ＤＡＲＴ  ＥＬＩＳＡを示す図である。
【００７９】
９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートを用いて、ｈ３Ｇ８−ｈ３Ｇ８  ＤＡＲＴの結合ＥＬＩＳＡを実施した。反応後、ＰＢＳ−Ｔによりプレートを３回洗浄し、８０ｕｌ／ウェルのＴＭＢ基質により発色させた。５分間のインキュベーション後、４０μｌ／ウェルの１％  Ｈ２ＳＯ４により反応を停止させた。９６ウェルプレートリーダーおよびＳＯＦＴｍａｘソフトウェアを用いてＯＤ４５０ｎｍを読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ  ３．０３ソフトウェアを用いてリードアウトをプロットした。
【図２９】ＤＡＲＴにより誘導したヒトＢ細胞死  一晩にわたり、ヒトＰＢＭＣを、表示した分子と共にインキュベートした。ＦＡＣＳ解析により、ゲート設定されないＦＳＣ／ＳＳＣ総細胞集団に対するＢ細胞（ＣＤ２０＋細胞）のＰＩ＋アネキシンＶ＋細胞集団の百分率として、アポトーシスをアッセイした。
【図３０】８Ｂ５−ＣＢ３．１  ＤＡＲＴ構築物を示す図である。
【００８０】
本発明を例示するために、複数種の８Ｂ５−ＣＢ３．１  ＤＡＲＴ構築物を作製した。リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、構築物５および６、または６および７、または８および９、または９および１０によりコードされる発現プラスミドを、ＨＥＫ−２９３細胞内に同時トランスフェクトし、抗ｆｌａｇタグを伴うかまたは伴わない８Ｂ５−ＣＢ３．１  ＤＡＲＴを発現させた。３日毎に３回にわたり条件培地を回収した。次いで、ＣＤ３２Ｂアフィニティーカラムを用いて条件培地を精製した。
【図３１】８Ｂ５−ＣＢ３．１  ＤＡＲＴ  ＥＬＩＳＡを示す図である。
【００８１】
９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートを用いて、８Ｂ５−ＣＢ３．１  ＤＡＲＴ／ｃｈ８ｂ５競合ＥＬＩＳＡを実施した。反応後、ＰＢＳ−Ｔによりプレートを３回洗浄し、８０ｕｌ／ウェルのＴＭＢ基質により発色させた。５分間のインキュベーション後、４０μｌ／ウェルの１％  Ｈ２ＳＯ４により反応を停止させた。９６ウェルプレートリーダーおよびＳＯＦＴｍａｘソフトウェアを用いてＯＤ４５０ｎｍを読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ  ３．０３ソフトウェアを用いてリードアウトをプロットした。
【図３２】四価ＤＡＲＴ構造の模式図である。
【００８２】
四価ポリペプチド鎖の構築により作製されたＤＡＲＴ分子種の一般的構造を例示する。Ｉｇ様ＤＡＲＴの４個の抗原結合ドメインを、縞模様および暗灰色の楕円として示す。
【図３３】四価Ｉｇ様ＤＡＲＴを示す図である。
【００８３】
四価Ｉｇ様ＤＡＲＴのエピトープ結合部位の模式図を示す。
【図３４】ｍＣＤ３２−ｈＣＤ１６Ａの結合ＥＬＩＳＡを示す図である。
【００８４】
実施例６．１０の四価Ｉｇ様ＤＡＲＴ分子種が、対照（ｃｈ−ｍＣＤ３２  ｍＡｂ）抗体または他のＤＡＲＴ分子種よりも大きな親和性で抗原に結合することを示すＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図３５】Ｉｇ  ＤＡＲＴ分子の模式図である。
【００８５】
Ｉｇ  ＤＡＲＴ分子の模式図を示す。特異性は、影を付けた領域、パターンを付した領域、または白色領域で示し、定常領域は黒色で示し、ジスルフィド結合は黒色点線で示す。すべてのタンパク質鎖のＮ末端が図の上方に向いている一方、すべてのタンパク質鎖のＣ末端は図の下方に向いている。図Ａ〜Ｅは二重特異性であり、図Ｆ〜Ｊは三重特異性である。図ＡおよびＥは四価である。図Ｂ、Ｃ、Ｆ、Ｉ、およびＪは六価である。図Ｄ、Ｇ、およびＨは八価である。個々のドメインの詳細な説明については、図１、２、９、１４、および１７ならびにセクション３．１を参照されたい。
【発明を実施するための形態】
【００８６】
５．  好適な実施形態の説明
ダイアボディ分子の各ポリペプチド鎖は、ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含む。それらは、ドメインの自己集合が起こらないように共有結合によって連結されている。２つのポリペプチド鎖の相互作用により２つのＶＬ−ＶＨ対合が生じ、２つのエピトープ結合部位、すなわち二価の分子を形成する。ＶＨまたはＶＬドメインは、ポリペプチド鎖内のどの位置にも拘束されず、つまり、アミノ（Ｎ）末端またはカルボキシ（Ｃ）末端に制限されることはない。また前記ドメインは、互いの相対的位置に制限されることもなく、つまり、ＶＬドメインがＶＨドメインに対してＮ末端側にあってもよいし、その逆であってもよい。唯一の制限は、機能的なダイアボディを形成するために、相補的なポリペプチド鎖が利用可能であるということである。ＶＬおよびＶＨドメインが同一抗体に由来する場合、二本の相補的ポリペプチド鎖は、同一であってもよい。例えば、結合ドメインがエピトープＡに特異的な抗体に由来する場合（すなわち、結合ドメインがＶＬＡ−ＶＨＡ相互作用から形成される場合）、各ポリペプチドはＶＨＡおよびＶＬＡを含むことができる。抗体の２つのポリペプチド鎖のホモ二量体化は、２つのＶＬＡ−ＶＨＡ結合部位の形成をもたらし、結果的に二価の単一特異性抗体が生じる。ＶＬおよびＶＨドメインが異なる抗原に対して特異的な抗体に由来する場合、機能的な二重特異性ダイアボディの形成には、異なる二本のポリペプチド鎖の相互作用、すなわちヘテロ二量体の形成が必要となる。例えば、二重特異性ダイアボディの場合、１本のポリペプチド鎖はＶＬＡおよびＶＬＢから構成される。前記鎖のホモ二量体化は、結果的に、結合なしのまたは予測できない結合の、２つのＶＬＡ−ＶＨＢ結合部位の形成をもたらし得る。これに対して、２つの異なるポリペプチド鎖が、例えば組換え発現系において自由に相互作用できる場合、一方はＶＬＡおよびＶＨＢから、他方はＶＬＢおよびＶＨＡからなり、２つの異なる結合部位、すなわちＶＬＡ−ＶＨＡおよびＶＬＢ−ＶＨＢを形成することができる。すべてのダイアボディポリペプチド鎖の対に関して、２つの鎖のアライメントミスまたは結合ミス、すなわちＶＬ−ＶＬまたはＶＨ−ＶＨドメインの相互作用の可能性があり得る。しかし、機能的なダイアボディの精製は、適切に二量体化した結合部位の免疫特異性に基づいて、当該分野で公知のまたは本明細書で例示した、例えばアフィニティークロマトグラフィーといった親和性を基礎とする方法を用いることで、容易に行うことができる。
【００８７】
他の実施形態では、ダイアボディの１以上のポリペプチド鎖がＦｃドメインを含んでいる。ダイアボディ分子のポリペプチド鎖におけるＦｃドメインは、優先的に二量体を形成し、結果的に免疫グロブリン様の性質（例えばＦｃ−ＦｃγＲ相互作用）を示すダイアボディ分子の形成をもたらす。Ｆｃを含むダイアボディは、例えば、２本のポリペプチド鎖からなり、それぞれがＶＨドメイン、ＶＬドメインおよびＦｃドメインを含む二量体であってもよい。前記ポリペプチド鎖の二量体化により、非改変型二価抗体の構造とは明確に区別される構造であるにもかかわらず、Ｆｃドメインを含む二価のダイアボディが生じる（図１１）。このようなダイアボディ分子は、野生型免疫グロブリンと比較すると、例えば、血中半減期や結合特性等の変化といった表現型の変化を示し得る。他の実施形態において、Ｆｃドメインを含むダイアボディ分子は四量体であってもよい。前記四量体は、２本の「重い」ポリペプチド鎖、すなわちＶＬ、ＶＨおよびＦｃドメインからなるポリペプチド鎖と、２つの「軽い」ポリペプチド鎖、すなわちＶＬおよびＶＨからなるポリペプチド鎖を含む。前記軽い鎖および重い鎖は相互作用によって単量体を形成し、そしてこれらの単量体は、不対合状態のＦｃドメインを介して相互に作用してＩｇＧ様分子を形成する。このようなＩｇ様ダイアボディは四価であり、単一特異性、二重特異性、または四重特異性であり得る。
【００８８】
ダイアボディ分子の少なくとも２つの結合部位は、同一または異なるエピトープを認識できる。異なるエピトープは、同一抗原由来、または異なる抗原由来とすることができる。一の実施形態において、エピトープは異なる細胞由来である。他の実施形態において、エピトープは、同一細胞またはウイルス上の細胞表面抗原である。エピトープ結合部位は、抗体の作製が可能ないかなる抗原をも認識できる。例えば、タンパク質、核酸、細菌毒素、細胞表面マーカー、自己免疫マーカー、ウイルスタンパク質、薬剤等が挙げられる。具体的な態様では、ダイアボディの少なくとも１つのエピトープ結合部位は、特定の細胞、例えばＢ細胞、Ｔ細胞、貪食細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または樹状細胞上の抗原に対して特異的である。
【００８９】
ダイアボディのポリペプチド鎖の各ドメイン、すなわちＶＬ、ＶＨおよびＦＣドメインを、ペプチドリンカーによって隔てることができる。ペプチドリンカーは、０、１、２、３、４、５、６、７、８または９個のアミノ酸とすることができる。いくつかの実施形態で、アミノ酸リンカー配列は、配列番号７６の核酸配列によりコードされたＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）である。
【００９０】
いくつかの実施形態では、ダイアボディ分子の各ポリペプチド鎖が、少なくとも１個のシステイン残基を含むように作製される。このシステイン残基は、本発明の２本目のポリペプチド鎖上の少なくとも１個のシステイン残基と相互作用して、鎖間ジスルフィド結合を形成することができる。鎖間ジスルフィド結合は、ダイアボディ分子の安定化に貢献し、組換え系における発現および回収を改善することで、結果的に安定かつ一貫性のある調製物をもたらすのみならず、分離・精製された産物のｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性を改善する。前記少なくとも１個のシステイン残基は、単一のアミノ酸として、または比較的長いアミノ酸配列（例えばヒンジドメイン）の一部として、ポリペプチド鎖の任意の位置に導入することができる。具体的な実施形態では、前記少なくとも１個のシステイン残基を遺伝子操作によってポリペプチド鎖のＣ末端に存在するように設計する。いくつかの実施形態で、前記少なくとも１個のシステイン残基は、アミノ酸配列ＬＧＧＣの内部に入れて、ポリペプチド鎖に導入される。具体的な実施形態では、本発明のダイアボディ分子を構成するポリペプチド鎖のＣ末端は、アミノ酸配列ＬＧＧＣを含む。他の実施形態で、前記少なくとも１個のシステイン残基は、例えば配列番号１または配列番号４の、ヒンジドメインを構成するアミノ酸配列内部に入れて、ポリペプチド鎖に導入される。具体的な実施形態で、本発明のダイアボディ分子のポリペプチド鎖のＣ末端は、例えば配列番号１のようなＩｇＧヒンジドメインのアミノ酸配列を含む。他の実施形態で、本発明のダイアボディ分子のポリペプチド鎖のＣ末端は、ヌクレオチド配列（配列番号８０）でコードされ得るアミノ酸配列ＶＥＰＫＳＣ（配列番号７９）を含む。他の実施形態で、前記少なくとも１個のシステイン残基は、ヌクレオチド配列（配列番号７８）によってコードされ得るアミノ酸配列ＬＧＧＣＦＮＲＧＥＣ（配列番号１７）内部に入れて、ポリペプチド鎖に導入される。具体的な実施形態で、本発明のダイアボディ分子を構成するポリペプチド鎖のＣ末端は、ヌクレオチド配列（配列番号７８）によってコードされ得るアミノ酸配列ＬＧＧＣＦＮＲＧＥＣ（配列番号１７）を含む。さらなる他の実施形態で、前記少なくとも１個のシステイン残基は、ヌクレオチド配列（配列番号７７）によってコードされ得るアミノ酸配列ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）の内部に入れて、ポリペプチド鎖に導入される。具体的な実施形態で、本発明のダイアボディ分子を構成するポリペプチド鎖のＣ末端は、ヌクレオチド配列（配列番号７７）によってコードされ得るアミノ酸配列ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含む。
【００９１】
いくつかの実施形態で、ダイアボディ分子は少なくとも２本のポリペプチド鎖を含む。前記各ポリペプチド鎖はアミノ酸配列ＬＧＧＣを含み、かつ前記ＬＧＧＣ配列中のシステイン残基間のジスルフィド結合によって共有結合している。他の具体的な実施形態で、ダイアボディ分子は少なくとも２本のポリペプチド鎖を含む。うち一方は、配列ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含むが、他方はヒンジドメイン（少なくとも１個のシステイン残基を含む）を含む。ここで、前記少なくとも２本のポリペプチド鎖は、ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）中のシステイン残基とヒンジドメイン中のシステイン残基の間でジスルフィド結合によって共有結合している。具体的な態様で、ヒンジドメイン中に存在して、ジスルフィド結合に関与するシステイン残基は、Ｃｙｓ−１２８（Ｋａｂａｔ  ＥＵによる番号付け；改変されていない完全なＩｇＧ重鎖のヒンジドメインの中に位置する）である。そして、その相手方（カウンターパート）は、配列番号２３中のシステイン残基Ｃｙｓ−２１４（Ｋａｂａｔ  ＥＵによる番号付け；改変されていない完全なＩｇＧ軽鎖のＣ末端に位置する）である（Ｅｌｋａｂｅｔｚら、（２００５年）「Ｃｙｓｔｅｉｎｅｓ  Ｉｎ  ＣＨＩ  Ｕｎｄｅｒｌｉｅ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｕｎａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｉｇ  Ｈｅａｖｙ  Ｃｈａｉｎｓ」、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８０巻、１４４０２〜１４４１２頁、参照としてそのすべてを本明細書中に組み入れる）。さらなる他の実施形態では、少なくとも１個のシステイン残基を、遺伝子操作によりアミノ酸鎖のＮ末端に存在させる。さらに他の実施形態では、少なくとも１個のシステイン残基を、遺伝子操作によりダイアボディ分子のポリペプチド鎖のリンカー部分に存在させる。さらなる実施形態で、ＶＨまたはＶＬドメインは、親（操作前）のＶＨまたはＶＬドメインと比較して少なくとも１個のアミノ酸の改変を含むように遺伝子操作する。そのようなアミノ酸改変は、親のアミノ酸をシステインで置換することを含む。
【００９２】
本発明は、Ｆｃドメインまたはその一部（例えば、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメイン）を含むダイアボディ分子を包含する。Ｆｃドメインまたはその一部は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＭを含むがこれらに限定はされない、あらゆる免疫グロブリンのアイソタイプまたはアロタイプに由来するものであってもよい。Ｆｃドメイン（またはその一部）は、ＩｇＧに由来するのが好ましい実施形態である。ＩｇＧアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４、またはそれらのアロタイプであることが特に好ましい実施形態である。ある実施形態で、ダイアボディ分子はＦｃドメインを含む。このＦｃドメインは、あらゆる免疫グロブリンアイソタイプから独立に選択されたＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む（すなわち、ＦｃドメインはＩｇＧに由来するＣＨ２ドメインとＩｇＥに由来するＣＨ３ドメイン、またはＩｇＧ１に由来するＣＨ２ドメインとＩｇＧ２に由来するＣＨ３ドメイン等を含む）。前記Ｆｃドメインを、本発明のダイアボディ分子を構成するポリペプチド鎖の中に、前記ポリペプチド鎖の他のドメインまたは部分に対してどんな位置であっても、遺伝子操作で導入することができる（例えば、Ｆｃドメインもしくはその一部が、ポリペプチド鎖のＶＬおよびＶＨ両ドメインのＣ末端にあってもよく、ＶＬおよびＶＨ両ドメインのＮ末端にあってもよく、または一方のドメインのＮ末端と他方のドメインのＣ末端に（すなわち、ポリペプチド鎖の２つのドメインの間に）あってもよい）。
【００９３】
本発明はまた、ヒンジドメインを含む分子を包含する。ヒンジドメインは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＭを含むどんな免疫グロブリンのアイソタイプまたはアロタイプに由来するものであってもよい。好ましい実施形態では、ヒンジドメインはＩｇＧに由来し、そのＩｇＧアイソタイプはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４、またはそれらのアロタイプである。前記ヒンジドメインは、ダイアボディ分子がヒンジ−Ｆｃドメインを含むように、ダイアボディ分子を構成するポリペプチド鎖の中にＦｃドメインと共に、遺伝子操作で導入することができる。いくつかの実施形態で、ヒンジおよびＦｃドメインは、当該分野で公知のまたは本明細書で例示したどの免疫グロブリンアイソタイプとも無関係に選択される。他の実施形態で、ヒンジおよびＦｃドメインは、ポリペプチド鎖の少なくとも１つの他のドメイン、例えば、ＶＬドメインによって隔てられている。ヒンジドメインを、または任意でヒンジ−Ｆｃドメインを、本発明のポリペプチドの中に、前記ポリペプチド鎖の他のドメインまたは一部に対してどんな位置であっても、遺伝子操作で導入することができる。いくつかの実施形態で、本発明のポリペプチド鎖はヒンジドメインを含むが、このヒンジドメインは、Ｆｃドメインを含まないポリペプチド鎖のＣ末端に存在する。さらなる他の実施形態で、本発明のポリペプチド鎖は、ポリペプチド鎖のＣ末端に存在するヒンジ−Ｆｃドメインを含む。さらなる実施形態で、本発明のポリペプチド鎖は、ポリペプチド鎖のＮ末端に存在するヒンジ−Ｆｃドメインを含む。
【００９４】
上述したように、本発明は、それぞれのポリペプチド鎖がＶＨおよびＶＬドメインを含むポリペプチド鎖の多量体を包含する。いくつかの態様において、前記多量体のポリペプチド鎖は、さらにＦｃドメインを含む。Ｆｃドメインの二量体形成は、免疫グロブリン様の機能性、すなわちＦｃを介した機能（例えば、Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用、補体結合等）を示すダイアボディ分子の形成をもらたす。いくつかの実施形態で、各ポリペプチド鎖を構成するＶＬおよびＶＨドメインは、同一の特異性を有し、前記ダイアボディ分子は、二価であって、かつ単一特異的である。他の実施形態で、各ポリペプチド鎖を構成するＶＬおよびＶＨドメインは、異なる特異性を有し、ダイアボディは二価で、かつ二重特異的である。
【００９５】
さらに、他の実施形態で本発明のダイアボディ分子は、各ポリペプチド鎖がＶＨおよびＶＬドメインを含むポリペプチド鎖の四量体を包含する。いくつかの実施形態で、四量体の２つのポリペプチド鎖は、さらにＦｃドメインを含む。したがって、四量体は、それぞれがＶＬ、ＶＨおよびＦｃドメインからなる２本の「重い」ポリペプチド鎖と、ＶＬおよびＶＨドメインからなる２本の「軽い」ポリペプチド鎖を含む。二価単量体への「重い」鎖と「軽い」鎖の相互作用と結びついた、「重い」鎖のＦｃドメインを介した二価単量体の二量体形成は、四価の免疫グロブリン様分子の形成をもたらし得る（実施例６．２および６．３に例示）。いくつかの態様で、単量体は同一であり、四価のダイアボディ分子は、単一特異性または二重特異性である。他の態様では、単量体は異なっており、四価の分子は、二重特異性または四重特異性である。
【００９６】
上記四重特異性ダイアボディ分子の形成は、４本の異なるポリペプチド鎖の相互作用を必要とする。そのような相互作用を単細胞組換え生産系で効率的に行わせることは、鎖の潜在的なミスペアリングによる多数の変異体の存在により困難である。ミスペアリングの可能性が増加することに対する１つの解決策は、所望のポリペプチド鎖対の中に「ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ」型変異を導入することである。このような変異は、ホモ二量体形成よりもヘテロ二量体形成が好ましい。例えば、Ｆｃ−Ｆｃ相互作用に関して、アミノ酸置換（「ｋｎｏｂ」を形成する嵩高な側鎖を含むアミノ酸、例えばトリプトファンと置換することが好ましい）をＣＨ２またはＣＨ３ドメインに導入して、立体障害が同様に変異させたドメインとの相互作用を妨げるようにし、かつ立体障害がその変異型ドメインを、相補的なまたは適合する変異（すなわち「ｔｈｅ  ｈｏｌｅ」、例えばグリシンで置換する）を遺伝子操作で導入したドメインと、強制的に対合させるようにする。このような変異のセットは、ダイアボディ分子を構成するどのポリペプチド対にも遺伝子操作で導入することができ、さらに、そのような対のポリペプチド鎖のどの部分にも遺伝子操作で導入することができる。ホモ二量体形成よりもヘテロ二量体形成に有利なタンパク質操作の方法、特に免疫グロブリン様分子の操作については、当該分野でよく知られており、それらは本明細書中に包含される（Ｒｉｄｇｗａｙら、（１９９６年）「’Ｋｎｏｂｓ−Ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅｓ’  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＣＨ３  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｆｏｒ  Ｈｅａｖｙ  Ｃｈａｉｎ  Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｒ．、９巻、６１７〜６２１頁、Ａｔｗｅｌｌら，（１９９７年）、「Ｓｔａｂｌｅ  Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ  Ｆｒｏｍ  Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｏｆ  Ａ  Ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ  Ｕｓｉｎｇ  Ａ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ」、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２７０巻、２６〜３５頁、およびＸｉら、（２００５年）「Ａ  Ｎｅｗ  Ｆｏｒｍａｔ  Ｏｆ  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ：  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２９６巻、９５〜１０１頁を参照されたい；いずれの文献も参照としてそのすべてを本明細書中に組み入れる）。
【００９７】
本発明はまた、変異型Ｆｃもしくは変異型ヒンジ−Ｆｃドメイン（またはその一部）を含むダイアボディ分子を包含する。この変異型Ｆｃドメインは、比較可能な野生型Ｆｃドメインもしくは野生型ヒンジ−Ｆｃドメイン（またはその一部）と比べて、少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、置換、挿入、または欠失）を含んでいる。変異型Ｆｃドメインもしくは変異型ヒンジ−Ｆｃドメイン（またはその一部）を含む分子（例えば、抗体）は、野生型Ｆｃドメインもしくは野生型ヒンジ−Ｆｃドメイン（またはその一部）を含む分子と比べて、通常は表現型が変化している。変異型の表現型は、ＮＫ依存性またはマクロファージ依存性アッセイでアッセイしたときに、血中半減期の変化、安定性の変化、細胞性酵素に対する感受性の変化、またはエフェクター機能の変化として現れることがある。エフェクター機能を変えると確認された変異型Ｆｃドメインは、国際公開ＷＯ  ０４／０６３３５１号、米国特許出願公開２００５／００３７０００号および２００５／００６４５１４号、米国仮出願第６０／６２６，５１０号（２００４年１１月１０日出願）、第６０／６３６，６６３号（２００４年１２月１５日出願）、および第６０／７８１，５６４号（２００６年３月１０日出願）、本発明者の同時出願である米国特許出願第１１／２７１，１４０号（２００５年１１月１０日出願）および第１１／３０５，７８７号（２００５年１２月１５日出願）に開示されている。各特許文献は参照としてそのすべてが本明細書に組み込まれる。
【００９８】
本発明の二重特異性ダイアボディは、２つの分離した、異なるエピトープに同時に結合できる。いくつかの実施形態では、エピトープは同一抗原由来である。他の実施形態では、エピトープは異なる抗原由来である。少なくとも１つのエピトープ結合部位は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、または他の単核細胞で発現され、免疫エフェクター細胞上に提示される決定因子（例えば、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４等）に特異的であることが実施形態として好ましい。一の実施形態において、ダイアボディ分子は、エフェクター細胞の決定因子に結合し、また前記エフェクター細胞をも活性化する。これに関連して、本発明のダイアボディ分子は、それらがさらにＦｃドメインを含んでいるかどうかとは無関係に、Ｉｇ様の機能性を示すことができる（例えば、当該分野で公知の、または本明細書で例示した、いずれかのエフェクター機能アッセイ（例えばＡＤＣＣアッセイ）でアッセイしたとき）。いくつかの実施形態で、本発明の二重特異性ダイアボディは、腫瘍細胞上の癌抗原とエファクター細胞の決定因子の両方に結合すると同時にエフェクター細胞を活性化する。他にとり得る実施形態で、本発明の二重特異性ダイアボディまたはダイアボディ分子は、上記（背景技術の項を参照されたい）のように、同一細胞上の活性化受容体と抑制受容体に同時に結合し（例えば、ＣＤ３２ＡとＣＤ３２Ｂ、ＢＣＲとＣＤ３２Ｂ、またはＩｇＥＲＩとＣＤ３２Ｂに結合する）、それらを連結することによって、標的（例えばエフェクター）細胞の活性化を阻害することができる。本実施形態のさらなる態様において、二重特異性ダイアボディは、ウイルス上の２つの中和エピトープ（例えば、ＲＳＶエピトープ；Ｅ１６およびＥ５３のようなＷＮＶエピトープ）に同時に結合することによって、抗ウイルス性を示すことができる
いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性ダイアボディ分子は、特定の細胞型を標的とするための無比の機会を提供する。例えば、二重特異性ダイアボディまたはダイアボディ分子を、遺伝子操作して標的細胞型または標的組織型に特異な抗原のセットを認識するエピトープ結合部位の組合せを含むようにすることができる。さらに、個々の抗原の一方または両方が、他の組織および／または細胞型において別個にかなり一般的なものである場合、低親和性結合ドメインを用いて、ダイアボディまたはダイアボディ分子を構築することができる。このような低親和性結合ドメインは、治療目的のために十分な結合力でもって個々のエピトープまたは抗原に結合できないであろう。しかし、エピトープまたは抗原の両方が、単一標的細胞または組織上に存在する場合、その細胞もしくは組織に対するダイアボディまたはダイアボディ分子の結合力は、抗原１つだけを発現している細胞もしくは組織のそれと比べれば増加するであろう。このように前記細胞もしくは組織は、本発明によって効率的に標的化されるであろう。前記二重特異性分子は、たった１つの抗原に対する特異性をもつ単一特異性ダイアボディまたは抗体と比べると、前記両方の抗原を発現している細胞上の一方のまたは双方の標的抗原に対して強化された結合性を示し得る。
【００９９】
本発明のダイアボディの結合特性は、結合活性および／または１以上のＦｃγＲを介したエフェクター細胞機能（Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用を通して、またはＦｃγＲに対するダイアボディ分子の免疫特異的結合によって仲介される）を測定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能アッセイにより特徴付けされることが好ましい（セクション５．４．２および５．４．３を参照）。ＦｃγＲに対する本発明の分子（例えばダイアボディ）の親和性および結合特性を、結合ドメイン−抗原またはＦｃ−ＦｃγＲ相互作用（すなわち、それぞれ、結合ドメインへの抗原の特異的結合、またはＦｃγＲへのＦｃ領域の特異的結合）を測定するための当該分野で知られるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ法（生化学的なまたは免疫学をベースとするアッセイ法）を用いて測定することができる。前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ法には、ＥＬＩＳＡアッセイ法、表面プラズモン共鳴アッセイ法、免疫沈降アッセイ法（セクション５．４．２参照）が含まれるが、これらに限定されない。本発明の分子が（本明細書に記載され、開示されたような）ｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏベースのアッセイにおけるそれと同様の結合特性を有する実施形態が、最も好ましい。しかしながら、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏベースのアッセイでは所望の表現型を示さないが、ｉｎ  ｖｉｖｏでは所望の表現型を示す本発明の分子を排除するものではない。
【０１００】
ある実施形態では、本発明の分子を操作して、鋳型分子の匹敵する部分と比べて変化したグリコシル化パターンまたは変化したグリコフォームを含むようにすることができる。操作されたグリコフォームは、エフェクター機能を増強することを含むがそれに限定されない、様々な目的に有用であり得る。操作されたグリコフォームは、当業者に知られたどの方法ででも作ることができる。例えば、遺伝子操作されたもしくは変異型の発現株を用いる方法、１以上の酵素、例えばＤＩ  Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）との共発現による方法、各種生物もしくは各種生物由来の細胞株で本発明のダイアボディを発現させることによる方法、またはダイアボディを発現させて精製した後に糖鎖を修飾することによる方法が挙げられる。遺伝子操作されたグリコフォームを作製する方法は、当該分野では公知である。かかる方法は、Ｕｍａｎａら、（１９９９年）「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｇｌｙｃｏｆｏｒｍｓ  Ｏｆ  Ａｎ  Ａｎｔｉｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  ＩｇＧ１  Ｗｉｔｈ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ」、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１７巻、１７６〜１８０頁、Ｄａｖｉｅｓら、（２００１年）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｆ  ＧｎＴＩＩＩ  Ｉｎ  Ａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ＣＨＯ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ：  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｗｉｔｈ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｇｌｙｃｏｆｏｒｍｓ  Ｌｅａｄｓ  Ｔｏ  Ａｎ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  Ｉｎ  Ａｄｃｃ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｈｉｇｈｅｒ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｆｏｒ  Ｆｃ  Ｇａｍｍａ  ＲＩＩＩ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ７４巻、２８８〜２９４頁、Ｓｈｉｅｌｄｓら、（２００２年）「Ｌａｃｋ  Ｏｆ  Ｆｕｃｏｓｅ  Ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｎ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｃｇａｍｍａ  ＲＩＩＩ  Ａｎｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７巻、２６７３３〜２６７４０頁、Ｓｈｉｎｋａｗａら、（２００３年）「Ｔｈｅ  Ａｂｓｅｎｃｅ  Ｏｆ  Ｆｕｃｏｓｅ  Ｂｕｔ  Ｎｏｔ  Ｔｈｅ  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  Ｏｆ  Ｇａｌａｃｔｏｓｅ  Ｏｒ  Ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ  Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ  Ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｃｏｍｐｌｅｘ−Ｔｙｐｅ  Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  Ｓｈｏｗｓ  Ｔｈｅ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｏｌｅ  Ｏｆ  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８巻、３４６６〜３４７３頁、米国特許第６，６０２，６８４号；米国特許出願第１０／２７７，３７０号；米国特許出願第１０／１１３，９２９号；国際公開ＷＯ  ００／６１７３９Ａ１号；国際公開ＷＯ  ０１／２９２２４６Ａ１号；国際公開ＷＯ  ０２／３１１１４０Ａ１号；国際公開ＷＯ  ０２／３０９５４Ａ１号；ＰｏｔｉｌｌｅｇｅｎｔＴＭ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ｂｉｏｗａ，  Ｉｎｃ．  ��ｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）；ＧｌｙｃｏＭＡｂＴＭ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （ＧＬＹＣＡＲＴ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ、Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含むが、これらに限定はされない。また、上記各方法は、参照としてそのすべてを本明細書に組み入れる。例えば、国際公開ＷＯ  ０００６１７３９号；ＥＡ第０１２２９１２５号；ＵＳ第２００３０１１５６１４号；Ｏｋａｚａｋｉら、（２００４年）「Ｆｕｃｏｓｅ  Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  Ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧｌ  Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｅｎｔｈａｌｐｙ  Ａｎｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｒａｔｅ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  ＩｇＧ１  Ａｎｄ  ＦｃＧａｍｍａＲＩＩＩＡ」、ＪＭＢ、３３６巻、１２３９〜４９頁を参照されたい。これらのいずれも参照としてそのすべてを本明細書に組み入れる。
【０１０１】
さらに本発明は、本発明のダイアボディを作製するために非天然アミノ酸を組み込むことを包含する。そのような方法は当業者には公知である。例えば、天然の生合成機構を用いてタンパク質内への非天然アミノ酸の組込みを可能にする方法等がある。例えば、Ｗａｎｇら、（２００２年）「Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ」、Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍ．、１巻、１〜１１頁、Ｗａｎｇら、（２００１年）「Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ  Ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９２巻、４９８〜５００頁、ｖａｎ  Ｈｅｓｔら、（２００１年）「Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｂａｓｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，  Ｔｏｗａｒｄ  Ａ  Ｎｅｗ  Ｌｅｖｅｌ  Ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ」、Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍ．  １９巻、１８９７〜１９０４頁を参照されたい。これらはいずれも参照としてそのすべてを本明細書に組み入れる。もう１つの方法として、アミノアシルｔＲＮＡの生合成に関与する酵素に焦点を当てたものがある。例えば、Ｔａｎｇら、（２００１年）「Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｏｆ  Ａ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｃｏｉｌｅｄ−Ｃｏｉｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｌｅｕｃｉｎｅ  Ｉｎ  Ａｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｈｏｓｔ」、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１２３巻（４４号）、１１０８９〜１１０９０頁、Ｋｉｉｃｋら、（２００１年）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａｎ  Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｓｅｔ  Ｏｆ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  Ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、５０２巻（１〜２号）、２５〜３０頁、を参照されたい。これらはいずれも、参照としてそのすべてを本明細書に組み入れる。
【０１０２】
いくつかの実施形態で、本発明は、グリコシル化部位を付加または欠失することによって、本発明の分子のＶＬ、ＶＨまたはＦｃドメインを改変する方法を包含する。タンパク質の糖鎖を改変する方法は、当該分野では周知であり、本発明中に包含される。例えば米国特許第６，２１８，１４９号；欧州特許第０，３５９，０９６Ｂ１号；米国特許公開第２００２／００２８４８６号；国際公開ＷＯ  ０３／０３５８３５号；米国特許公開第２００３／０１１５６１４号；米国特許第６，２１８，１４９号；米国特許第６，４７２，５１１号を参照されたい。これらはすべて参照としてその全内容が本明細書に組み込まれる。
【０１０３】
５．１．  ダイアボディ結合ドメイン
本発明のダイアボディは、一般に免疫グロブリンまたは抗体に由来する抗原結合ドメインを含む。本発明の方法に使用する結合ドメインが由来する抗体は、鳥および動物（例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ）を含むいずれの動物起源からのものであってもよい。抗体は、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体であることが好ましい。本明細書で用いる場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、そしてヒト免疫グロブリンライブラリーもしくは合成ヒト免疫グロブリンコード配列のライブラリーから、またはヒト遺伝子由来の抗体を発現するマウスから、単離された抗体を含む。
【０１０４】
本発明は、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患もしくは感染症の治療および／または予防用に当該分野で知られるあらゆる抗体を、本発明のダイアボディの結合ドメインのソースとして使用することを意図している。既知の癌抗体の非限定的な例をセクション５．７．１に示すだけでなく、列挙した標的抗原に特異的な他の抗体、およびセクション５．６．１で列挙した癌抗原に対する抗体を示す。自己免疫疾患および炎症性疾患の治療および／または予防用の既知の抗体の非限定的な例をセクション５．７．２に示すだけでなく、列挙した標的抗原に対する抗体およびセクション５．６．１で列挙した抗原に対する抗体も示す。他の実施形態では、セクション５．６．３に列挙した感染症に関連するエピトープに対する抗体を使用することができる。いくつかの実施形態で、前記抗体は１以上のアミノ酸改変を有する変異型Ｆｃ領域を含む。当該抗体は、本発明の方法によって同定され、付与されたエフェクター機能、ならびに／または野生型Ｆｃ領域を含む匹敵する分子と比べてＦｃγＲＩＩＢに対する親和性の増強およびＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性の低減を有することがわかっている。本発明により操作され得る炎症性疾患の治療または予防に使用される抗体の非限定的例を表９に示す。また、自己免疫疾患の治療または予防に使用される抗体の非限定的例を表１０に示す。
【０１０５】
ヒトにおける抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの使用およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出アッセイを含むいくつかの使用に関しては、ヒト、キメラまたはヒト化抗体由来の可変ドメインを有するダイアボディを使用することが好ましい。完全なヒト抗体由来の可変領域は、被験者の治療のために特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いた上記のファージディスプレイ法を含む、当該分野で知られる様々な方法によって作成することができる。また、米国特許第４，４４４，８８７号および第４，７１６，１１１号；ならびに国際公開ＷＯ  ９８／４６６４５号、ＷＯ  ９８／５０４３３号、ＷＯ  ９８／２４８９３号、ＷＯ  ９８／１６６５４号、ＷＯ  ９６／３４０９６号、ＷＯ  ９６／３３７３５号およびＷＯ  ９１／１０７４１号も参照されたい。これらは、それぞれを参照としてそのすべてが本明細書に組み込まれる。
【０１０６】
ヒト化抗体は、所定の抗原に結合でき、かつヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域とヒト以外の免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するＣＤＲを含む、抗体、その変異体もしくはフラグメントをいう。ヒト化抗体は、少なくとも１つの、一般的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含むことができる。当該可変ドメインでは、ＣＤＲ領域の全部もしくは実質的に全部がヒト以外の免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）のＣＤＲ領域と一致し、また全部もしくは実質的に全部のフレームワーク領域がヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のフレームワーク領域となっている。
【０１０７】
ヒト化抗体のフレームワーク領域およびＣＤＲ領域は、親配列と正確に一致する必要はない。例えば、ドナーＣＤＲまたはコンセンサスフレームワークは、少なくとも１個の残基の置換、挿入もしくは欠失により変異誘発させて、変異誘発させた部位のＣＤＲまたはフレームワーク残基がコンセンサスまたはドナー抗体に一致しないようにすることができる。しかしながら、そのような変異を広範囲に行うことは好ましくない。一般的には、ヒト化抗体残基の少なくとも７５％、大抵は９０％以上、最も好ましくは９５％を超える残基が、親のフレームワーク領域（ＦＲ）およびＣＤＲ配列のそれと一致する。ヒト化抗体は当該分野で知られる様々な技術を用いて作ることができる。限定はしないが、そのような技術には、ＣＤＲグラフト法（欧州特許第２３９，４００号、国際公開ＷＯ  ９１／０９９６７号、ならびに米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号および第５，５８５，０８９号）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）法またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）法（欧州特許第５９２，１０６号および第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、（１９９１年）「Ａ  Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  Ｆｏｒ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ｗｈｉｌｅ  Ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ  Ｔｈｅｉｒ  Ｌｉｇａｎｄ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８巻（４／５号）、４８９〜４９８頁、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、（１９９４年）「Ｈｕｍａｎ−Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｒｅｔａｉｎ  Ｆｕｌｌ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｂｙ  Ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ  Ｎｏｎ−ＣＤＲ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７巻（６号）、８０５〜８１４頁、および  Ｒｏｇｕｓｋａら、（１９９４年）「Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１巻、９６９〜９７３頁、チェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）法（米国特許第５，５６５，３３２号）、ならびに、例えば米国特許第６，４０７，２１３号、第５，７６６，８８６号、第５，５８５，０８９号、国際公開ＷＯ  ９３１７１０５号、Ｔａｎら、（２００２年）「’Ｓｕｐｅｒｈｕｍａｎｉｚｅｄ’  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｂｙ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ  Ｇｒａｆｔｉｎｇ  Ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｏ  Ａｎ  Ａｎｔｉ−ＣＤ２８」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６９巻、１１１９〜２５頁、Ｃａｌｄａｓら、（２０００年）「Ｄｅｓｉｇｎ  Ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｏｆ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｈｅｍｉ−Ｈｕｍａｎｉｚ��ｄ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｔｈｅ  ＣＤ１８  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、１３巻、３５３〜６０頁、Ｍｏｒｅａら、（２０００年）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ：  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｆｏｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０巻、２６７〜７９頁、Ｂａｃａら、（１９９７年）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ」、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７２巻、１０６７８〜８４頁、Ｒｏｇｕｓｋａら、（１９９６年）「Ａ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｂｙ  ＣＤＲ−Ｇｒａｆｔｉｎｇ  Ａｎｄ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、９巻、８９５〜９０４頁、Ｃｏｕｔｏら、（１９９５年）「Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｗｉｔｈ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５５巻（補巻２３巻）、５９７３ｓ〜５９７７ｓ頁、Ｃｏｕｔｏら、（１９９５年）「Ａｎｔｉ−ＢＡ４６  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｃ３：  Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ａｎｄ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ａｎｄ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５５巻、１７１７〜２２頁、Ｓａｎｄｈｕ、（１９９４年）「Ａ  Ｒａｐｉｄ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｇｅｎｅ  １５０巻、４０９〜１０頁、Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、（１９９４年）「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ  Ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｄ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｖ  Ｄｏｍａｉｎｓ．  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２３５巻、９５９〜９７３頁、Ｊｏｎｅｓら、（１９８６年）「Ｒｅｐｌａｃｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ａ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｗｉｔｈ  Ｔｈｏｓｅ  Ｆｒｏｍ  Ａ  Ｍｏｕｓｅ」、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１巻、５２２〜５２５頁、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、（１９８８年）「Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２巻、３２３〜３２７頁、およびＰｒｅｓｔａ、（１９９２年）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ３巻（４号）、３９４〜３９８頁で開示された技術等が含まれる。しばしば、フレームワーク領域中のフレームワーク残基を、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換して、抗原結合性を変える、好ましくは改善することができる。これらのフレームワーク置換は、当該分野で周知の方法で同定される。��えば、ＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用をモデリングして抗原結合性に重要なフレームワーク残基を同定する方法、および配列比較により特定の位置の普通でないフレームワーク残基を同定する方法が挙げられる（例えば、Ｑｕｅｅｎらによる米国特許第５，５８５，０８９号；米国特許公開第２００４／００４９０１４号および第２００３／０２２９２０８号；米国特許第６，３５０，８６１号；第６，１８０，３７０号；第５，６９３，７６２号；第５，６９３，７６１号；第５，５８５，０８９号；および第５，５３０，１０１号、ならびにＲｉｅｃｈｍａｎｎら、（１９８８年）「Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２巻、３２３〜３２７頁を参照されたい。これらのすべては、参照としてその内容のすべてを本明細書に援用する）。
【０１０８】
最も好ましい実施形態で、ヒト化結合ドメインは、ドナーであるマウス抗体と同一のエピトープに特異的に結合する。当業者には、本発明が一般に、抗体のＣＤＲグラフト法を包含することが理解できるであろう。したがって、たとえ同一抗体クラスまたは同一抗体サブクラスであっても、ドナー抗体およびアクセプター抗体を同一種の動物由来にすることができる。しかし、より一般的には、ドナー側およびアクセプター側の抗体は、異なる種類の動物に由来する。典型的には、ドナー抗体はゲッ歯類のＭＡｂ等のヒト以外の抗体であり、アクセプター抗体はヒト抗体である。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、ドナー抗体に由来する少なくとも１つのＣＤＲがヒト抗体にグラフト化される。他の実施形態では、重鎖および／または軽鎖可変領域のそれぞれの、少なくとも２つ、好ましくは３つすべてのＣＤＲがヒト抗体にグラフト化される。ＣＤＲは、カバット（Ｋａｂａｔ）ＣＤＲ、ループＣＤＲ、またはそれらの組合せを含むことができる。いくつかの実施形態で、本発明は、少なくとも１つのＣＤＲグラフト化重鎖と少なくとも１つのＣＤＲグラフト化軽鎖を含むヒト化ＦｃγＲＩＩＢ抗体を包含する。
【０１１０】
本発明の方法で用いられるダイアボディには、修飾された誘導体、すなわち、ダイアボディへのあらゆるタイプの分子の共有結合により修飾された誘導体が含まれる。例えば、限定するつもりはないが、前記ダイアボディ誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／封鎖基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞性リガンドもしくは他のタンパク質との結合等によって改変されたダイアボディを含む。多数の化学修飾のいずれをも既知の技術によって実行することができる。当該技術は、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等を含むが、これらに限定はされない。さらに、誘導体は１以上の非古典的アミノ酸を含むことができる。
【０１１１】
キメラ抗体は、例えば非ヒト抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリンの定常領域を有する抗体のように、キメラ抗体の異なる部分が異なる免疫グロブリン分子に由来する分子のことである。キメラ抗体を作る方法は、当該分野では公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、（１９８５年）「Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａｓ  Ｐｒｏｖｉｄｅ  Ｎｏｖｅｌ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９巻、１２０２〜１２０７頁、Ｏｉら、（１９８６年）「Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４巻、２１４〜２２１頁、Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９年）「Ｈｉｇｈ−Ｌｅｖｅｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｆ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｄａｐｔｅｄ  ｃＤＮＡ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎ  Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５巻、１９１〜２０２頁、ならびに米国特許第６，３１１，４１５号、第５，８０７，７１５号、第４，８１６，５６７号および第４，８１６，３９７号を参照されたい。これらは参照としてそのすべてが本明細書に組み込まれる。  
【０１１２】
しばしば、フレームワーク領域内のフレームワーク残基を、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基と置換して、抗原結合性を変える、好ましくは改善することができる。これらのフレームワーク置換は、当該分野において周知の方法によって同定することができる。例えば、ＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用をモデリングして抗原結合性に重要なフレームワーク残基を同定する方法や、配列を比較して特定位置におけるフレームワークの普通でない残基を同定する方法が挙げられる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号；およびＲｉｅｃｈｍａｎｎら、（１９８８年）「Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２巻、３２３〜３２７頁を参照されたい。これらは、参照としてそのすべてを本明細書に組み入れる）。
【０１１３】
本発明のダイアボディの結合ドメインの由来となるモノクローナル抗体は、当該分野で知られる様々な技術を用いて調製することができる。前記技術には、ハイブリドーマ、組換え体およびファージディスプレイ技術の使用、またはそれらの組合せが含まれる。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を用いて作製することができる。前記ハイブリドーマ技術には、当該分野では公知の技術の他、例えば、ＨａｒｌｏｗらのＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２ｎｄ  ｅｄ．  １９８８年）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇらの  ｉｎ：  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、５６３〜６８１頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１年）（いずれも参照として本明細書にそのすべてを組み入れる）で教示される技術が含まれる。本明細書で使用する場合「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術を介して作製された抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、あらゆる真核生物クローン、原核生物クローンまたはファージクローンを含む単一クローンに由来する抗体を意味するのであって、それを生産する方法を意味するものではない。
【０１１４】
ハイブリドーマ技術を用いた特定の抗体を作製するためのおよびスクリーニングするための方法はルーチンなことであり、当該分野においては周知である。非限定的例では、マウスを対象の抗原またはそのような抗原を発現する細胞で免疫化することができる。例えば、抗原特異的抗体がマウス血清から検出されるように、ひとたび免疫応答が検出されるとマウス脾臓が摘出され、脾細胞が単離される。その後、その脾細胞を周知技術によって任意の適当なミエローマ細胞と融合させる。ハイブリドーマを限界希釈法により選択し、クローン化する。そのハイブリドーマクローンを、その後当該分野で既知の方法によって前記抗原に結合できる抗体を分泌する細胞に関してアッセイする。通常、高レベルの抗体を含むとされる腹水を、マウスの腹腔内に陽性ハイブリドーマクローンを接種することによって得ることができる。対象の抗原は、セクション５．８．１に記載した癌に関連する抗原、セクション５．８．２に記載した自己免疫疾患および炎症性疾患に関連する抗原、セクション５．８．３に記載した感染症に関連する抗原、ならびにセクション５．８．４に記載した毒素を含む。ただし、これらに限定はされない。
【０１１５】
抗体はまた、当該分野で知られる様々なファージディスプレイ法を用いて作製することができる。ファージディスプレイ法では、機能性抗体ドメインが、それをコードしたポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子表面上に提示される。具体的な実施形態では、前記ファージを利用して、レパートリーもしくはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えばヒトまたはマウス）から発現された抗原結合ドメイン（例えばＦａｂやＦｖ、またはジスルフィド結合安定化Ｆｖ）を提示することができる。対象の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて（例えば、標識した抗原、または固体表面もしくはビーズに結合または捕捉させた抗原を用いて）選択し、または同定することができる。これらの方法で用いられるファージは、一般にはｆｄやＭ１３を含む繊維状ファージである。抗原結合ドメインは、ファージ遺伝子ＩＩＩまたはＶＩＩＩタンパク質のどちらかに組換えで融合させたタンパク質として発現される。本発明の免疫グロブリンまたはそのフラグメントの作製に用いることのできるファージディスプレイ法の例は、以下の文献中に開示されている方法を含む。すなわち、Ｂｒｉｎｋｍａｎらによる（１９９５年）「Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｏｆ  Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｆｖ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８２巻、４１〜５０頁、Ａｍｅｓら、（１９９５年）「Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｏｆ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｆａｂｓ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ａ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｔｏ  Ｆｕｌｌ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８４巻、１７７〜１８６頁、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、（１９９４年）「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  Ｆｒｏｍ  Ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  Ｍｉｃｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｔｈｅ  Ｒｅ−Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｗｈｏｌｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ｔｈｅｓｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４巻、９５２〜９５８頁、Ｐｅｒｓｉｃら、（１９９７年）「Ａｎ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  Ａｆｔｅｒ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｆｒｏｍ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、Ｇｅｎｅ、１８７巻、９〜１８頁、Ｂｕｒｔｏｎら、（１９９４年）「Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、５７巻、１９１〜２８０頁、１９９４年、国際出願ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号；国際公開ＷＯ  ９０／０２８０９号；国際公開ＷＯ  ９１／１０７３７号；国際公開ＷＯ  ９２／０１０４７号；国際公開ＷＯ  ９２／１８６１９号；国際公開ＷＯ  ９３／１１２３６号；国際公開ＷＯ  ９５／１５９８２号；国際公開��Ｏ  ９５／２０４０１号；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；第５，２２３，４０９号；第５，４０３，４８４号；第５，５８０，７１７号；第５，４２７，９０８号；第５，７５０，７５３号；第５，８２１，０４７号；第５，５７１，６９８号；第５，４２７，９０８号；第５，５１６，６３７号；第５，７８０，２２５号；第５，６５８，７２７号；第５，７３３，７４３号および第５，９６９，１０８号である。これらの文献は、いずれも参照としてそのすべてを本明細書中に援用する。
【０１１６】
ファージディスプレイ技術を使用して、抗原に対する抗体の親和性を増大させることができる。この技術は、高親和性抗体を得るのに有用である。親和性成熟と呼ばれるこの技術は、突然変異誘発、または同種抗原を用いたＣＤＲウォーキングおよび再選択を使用して、初期抗体もしくは親抗体と比較した場合に抗原に対して、より高い親和力で結合する抗体を同定する（例えば、Ｇｌａｓｅｒらの（１９９２年）「Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｉｎ  Ａ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ａｎｔｉ−Ｔａｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１４９巻、２６０７〜２６１４頁）。を参照されたい）。単一ヌクレオチドに対してというよりもコドン全体に対しての突然変異誘発は、結果的にアミノ酸変異の半ランダム化レパートリーをもたらす。変異型クローンのプールからなるライブラリーを構築することができ、前記変異型クローンは、それぞれが１つのＣＤＲ中の単一アミノ酸の改変によって異なっており、かつ各ＣＤＲ残基に関して可能なアミノ酸置換をそれぞれ提示する変異体を含んでいる。抗原に対する結合親和性が増加した変異体は、固定した変異体と標識した抗原との接触によってスクリーニングすることができる。当該分野で知られるどんなスクリーニング方法であっても、抗原に対する結合活性が増加した変異型抗体を同定するのに使用することができる（例えば、ＥＬＩＳＡ法）（Ｗｕらの（１９９８年）「Ｓｔｅｐｗｉｓｅ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｖｉｔａｘｉｎ，  Ａｎ  Ａｌｐｈａｖ  Ｂｅｔａ３−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｍＡｂ」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９５巻、６０３７〜６０４２頁、Ｙｅｌｔｏｎら、（１９９５年）「Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｂｒ９６  Ａｎｔｉ−Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｂｙ  Ｃｏｄｏｎ−Ｂａｓｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１５５巻、１９９４〜２００４頁）。軽鎖をランダム変異させるＣＤＲウォーキングも使用できる（Ｓｃｈｉｅｒらを参照されたい（１９９６年）「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｉｃｏｍｏｌａｒ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ａｎｔｉ−Ｃ−ＥｒｂＢ−２  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  Ｂｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ」、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．、２６３巻、５５１〜５６７頁）。
【０１１７】
本発明はまた、フレームワークもしくはＣＤＲ領域に変異（例えば、１以上のアミノ酸置換）をもった、本明細書に記載したもしくは当該分野で知られるいずれかの結合ドメインのアミノ酸配列からなる結合ドメインの使用を包含する。これらの結合ドメインにおける変異は、結合ドメインのＦｃγＲＩＩＢ（これに結合ドメインが免疫特異的に結合する）に対する結合力および／または親和力を維持または増強することが好ましい。当業者に知られる標準的な技術（例えばイムノアッセイ）を使用して、特定の抗原に対する抗体の親和性をアッセイすることができる。
【０１１８】
当業者に既知の標準的な技術を使用して、抗体もしくはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列中に変異を導入することができる。そのような技術には、例えば結果的にアミノ酸置換をもたらす部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲを介した突然変異誘発等が挙げられる。誘導体は、元となった抗体もしくはそのフラグメントと比較して、１５アミノ酸未満の置換、１０アミノ酸未満の置換、５アミノ酸未満の置換、４アミノ酸未満の置換、３アミノ酸未満の置換、または２アミノ酸未満の置換を含むことが好ましい。好ましい実施形態において、誘導体は、１以上の予測される非必須アミノ酸残基での保存的アミノ酸置換を有する。
【０１１９】
５．１．１．  ＦｃγＲＩＩＢと免疫特異的に結合するエピトープ結合部位を含むダイアボディ
具体的な実施形態において、本発明のダイアボディの少なくとも１つの結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＢの少なくとも１つの活性にアゴナイズする。本発明の一の実施形態で、前記活性は、Ｂ細胞受容体を介したシグナル伝達を阻害することである。他の実施形態において、結合ドメインはＢ細胞の活性化、Ｂ細胞の増殖、抗体産生、Ｂ細胞の細胞内カルシウム流入、細胞周期の進行、またはＦｃγＲＩＩＢシグナル伝達経路における１以上の下流のシグナル伝達分子の活性を阻害する。さらなる他の実施形態で、結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＢのリン酸化またはＳＨＩＰの動員を増強する。本発明のさらなる実施形態で、結合ドメインはＢ細胞受容体を介したシグナル伝達経路でのＭＡＰキナーゼ活性またはＡｋｔ動員を阻害する。他の実施形態において、結合ドメインは、ＦｃεＲＩシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢを介した阻害にアゴナイズする。具体的な実施形態では、前記結合ドメインは、ＦｃεＲＩ誘導されたマスト細胞活性化、カルシウム動員、脱顆粒、サイトカイン産生、またはセロトニン放出を阻害する。他の実施形態で、本発明の結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＢのリン酸化を刺激し、ＳＨＩＰの動員を刺激し、ＳＨＩＰのリン酸化およびＳＨＩＰとＳｈｃとの結合を刺激し、またはＭＡＰキナーゼファミリーメンバー（例えばＥｒｋ１、Ｅｒｋ２、ＪＮＫ、ｐ３８等）の活性化を阻害する。さらなる他の実施形態で、本発明の結合ドメインは、ｐ６２ｄｏｋのチロシンリン酸化、ならびにそれとＳＨＩＰおよびｒａｓＧＡＰとの結合を増強する。他の実施形態で、本発明の結合ドメインは、単球またはマクロファージでのＦｃγＲを介した食作用を阻害する。
【０１２０】
他の実施形態では、結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＢの少なくとも１つの活性にアンタゴナイズする。一の実施形態で、前記活性とは、Ｂ細胞受容体を介したシグナル伝達の活性化である。具体的な実施形態で、結合ドメインは、Ｂ細胞活性、Ｂ細胞の増殖、抗体産生、Ｂ細胞の細胞内カルシウム流入、またはＦｃγＲＩＩＢシグナル伝達経路における１以上の下流のシグナル伝達分子の活性を増強する。さらなる他の実施形態で、結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＢのリン酸化またはＳＨＩＰの動員を減少させる。本発明のさらなる実施形態で、結合ドメインは、Ｂ細胞受容体を介したシグナル伝達経路でのＭＡＰキナーゼ活性またはＡｋｔ動員を増強する。他の実施形態において、結合ドメインは、ＦｃεＲＩシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢを介した阻害にアンタゴナイズする。具体的な実施形態では、前記結合ドメインは、ＦｃεＲＩ誘導されたマスト細胞活性化、カルシウム動員、脱顆粒、サイトカイン産生、またはセロトニン放出を増強する。他の実施形態で、結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＢのリン酸化を阻害し、ＳＨＩＰの動員を阻害し、ＳＨＩＰのリン酸化およびそれとＳｈｃとの結合を阻害し、またはＭＡＰキナーゼファミリーメンバー（例えばＥｒｋ１、Ｅｒｋ２、ＪＮＫ、ｐ３８等）の活性化を増強する。さらなる他の実施形態で、本発明の結合ドメインは、ｐ６２ｄｏｋのチロシンリン酸化、ならびにそれとＳＨＩＰおよびｒａｓＧＡＰとの結合を阻害する。他の実施形態で、本発明の結合ドメインは、単球またはマクロファージでのＦｃγＲを介した食作用を増強する。他の実施形態において、結合ドメインは、脾臓マクロファージによるオプソニン化粒子の食作用、クリアランスを妨げる。
【０１２１】
その他の実施形態において、少なくとも１つの結合ドメインを使用して、ＦｃγＲＩＩＢを発現する細胞を本発明のダイアボディの標的とすることができる。
【０１２２】
一の具体的な実施形態で、結合ドメインの１つは、クローン２Ｂ６または３Ｈ７より産生されるマウスモノクローナル抗体に由来する。前記クローンは、それぞれＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４５９１およびＰＴＡ−４５９２を有する。２Ｂ６および３Ｈ７抗体を産生するハイブリドーマは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ．  ２０１１０−２２０９）に２００２年８月１３日に、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に基づいて寄託され、それぞれ受託番号ＰＴＡ−４５９１（２Ｂ６を産生するハイブリドーマ用）およびＰＴＡ−４５９２（３Ｈ７を産生するハイブリドーマ用）が付与された。これらは、参照により本明細書中に組み込まれる。結合ドメインはヒト由来であるか、またはヒト化されたものであることが実施形態として好ましい。３Ｈ７または２Ｂ６クローンから産生される抗体のヒト化バージョンに由来する結合ドメインが好ましい。
【０１２３】
本発明はまた、他の抗体由来の結合ドメインを有するダイアボディを包含する。他の抗体とは、特にＦｃγＲＩＩＢ、好ましくはヒトＦｃγＲＩＩＢ、より好ましくは天然のヒトＦｃγＲＩＩＢに結合し、かつ１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１および１Ｆ２（それぞれＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５９５８、ＰＴＡ−５９６１、ＰＴＡ−５９６２、ＰＴＡ−５９６０およびＰＴＡ−５９５９を有する）を含むがそれらに限定されないクローンに由来する。上記のクローンを産生するハイブリドーマは、ブダペスト条約の規定の下に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ．  ２０１１０−２２０９）に２００４年５月７日に寄託されている。それらのハイブリドーマは、参照によって本明細書中に組み込まれる。上記抗体由来の結合ドメインは、ヒト化されたものが実施形態としては好ましい。
【０１２４】
具体的な実施形態で、本発明のダイアボディに使用される結合ドメインは、抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１または１Ｆ２クローンにより産生される抗体の１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）、好ましくは６つのＣＤＲすべてを含む）由来である。他の実施形態で、結合ドメインは、２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１または１Ｆ２クローンのそれぞれで産生されるマウスモノクローナル抗体と同一のエピトープに結合し、および／または、例えばＥＬＩＳＡアッセイもしくは他の適当な競合イムノアッセイで測定したとき、２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１または１Ｆ２クローンにより産生されたマウスモノクローナル抗体と競合し、かつまた、その結合ドメインがＦｃγＲＩＩＡと結合するよりも強い親和性でＦｃγＲＩＩＢと結合する。
【０１２５】
本発明はまた、２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１または１Ｆ２クローンで産生されるマウスモノクローナル抗体の重鎖可変部および／または軽鎖可変部のアミノ酸配列と少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である重鎖可変部および／または軽鎖可変部のアミノ酸配列を含む結合ドメインを有するダイアボディを包含する。本発明はさらに、ＦｃγＲＩＩＡに結合するよりも高い親和性でＦｃγＲＩＩＢに特異的に結合し、また２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１または１Ｆ２クローンで産生されるマウスモノクローナル抗体の１以上のＣＤＲのアミノ酸配列と少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である１以上のＣＤＲのアミノ酸配列を含む、結合ドメインをもったダイアボディを包含する。２つのアミノ酸配列の同一性パーセントの決定は、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を含む当業者に公知のいずれの方法によっても決定することができる。
【０１２６】
本発明はまた、結合ドメインがＦｃγＲＩＩＡと結合するよりも強い親和性でＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合する結合ドメインを含むダイアボディの使用を包含する。この結合ドメインは、２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１または１Ｆ２クローンで産生されるマウスモノクローナル抗体のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされている。好ましい実施形態で、結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＡよりも強い親和性でＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合し、かつ２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１または１Ｆ２クローンで産生されるマウスモノクローナル抗体の軽鎖可変部および／または重鎖可変部のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変部および／または重鎖可変部を含む。他の好ましい実施形態で、結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＡよりも強い親和性でＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合し、かつ２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１または１Ｆ２クローンで産生されるマウスモノクローナル抗体の１以上のＣＤＲのヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる１以上のＣＤＲを含む。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、限定はしないが、フィルターに結合したＤＮＡを約４５℃の温度下で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）溶液中にて処理した後、約５０〜６５℃下で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液にて１回以上洗浄するハイブリダイゼーションを含む。より高度のストリンジェントな条件は、例えばフィルターに結合したＤＮＡを約４５℃の温度下で６×ＳＳＣ溶液中で処理した後、約６０℃下で０．１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ溶液にて１回以上洗浄するハイブリダイゼーションを含む。あるいは、当業者に公知の他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら編、１９８９年Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．  １、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、ＮＹ  ６．３．１〜６．３．６頁および２．１０．３頁を参照されたい；参照として本明細書に組み入れる）を含む。
【０１２７】
本発明はまた、フレームワークまたはＣＤＲ領域に変異（例えば、１以上のアミノ酸置換）を有する上記いずれかの結合ドメインのアミノ酸配列を含む結合ドメインの使用を包含する。これらの結合ドメインにおける変異は、結合ドメインが免疫特異的に結合するＦｃγＲＩＩＢに対する結合ドメインの結合力および／または親和性を維持または強化するものが好ましい。当業者に公知の標準的な技術（例えば、イムノアッセイ）を用いて、特定の抗原に対する抗体の親和性をアッセイすることができる。
【０１２８】
当業者に公知の標準的な技術を用いて抗体またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列中に変異を導入することができる。そのような技術には、例えば、アミノ酸置換をもたらす部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲを介した突然変異誘発が含まれる。誘導体は、元となった抗体もしくはそのフラグメントに対して１５アミノ酸未満の置換、１０アミノ酸未満の置換、５アミノ酸未満の置換、４アミノ酸未満の置換、３アミノ酸未満の置換、または２アミノ酸未満の置換を含むことが好ましい。誘導体が１以上の予測される非必須アミノ酸残基に保存的アミノ酸置換を有することが実施形態として好ましい。
【０１２９】
好ましい実施形態では、結合ドメインはヒト化抗体に由来する。ヒト化ＦｃγＲＩＩＢ特異的抗体は、少なくとも１つ、通常は２つの可変ドメインの実質的にすべてを含んでいてもよい。この可変ドメインでは、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリン（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲ領域と一致し、フレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域のコンセンサス配列となっている。
【０１３０】
本発明のダイアボディは、ＦｃγＲＩＩＢに特異的なヒト化可変ドメインを含む。この可変ドメインでは、ヒト抗体（レシピエント抗体）の重鎖および／または軽鎖可変領域の１以上のＣＤＲの１以上の領域が、ＦｃγＲＩＩＡよりも強い親和性でＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合するドナーのモノクローナル抗体の１以上のＣＤＲの類似部分で置換されている。そのようなモノクローナル抗体として、例えば、２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１または１Ｆ２クローンで産生されるモノクローナル抗体が挙げられる。他の実施形態では、ヒト化抗体は、それぞれ２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１または１Ｆ２と同一のエピトープに結合する。
【０１３１】
好ましい実施形態で、ヒト化ＦｃγＲＩＩＢ結合ドメインのＣＤＲ領域は、ＦｃγＲＩＩＢに特異的なマウス抗体に由来する。いくつかの実施形態で、本明細書に記載したヒト化抗体は、限定はしないが、アクセプター抗体のアミノ酸欠失、挿入、修飾を包含する改変を含む。ここで言うアクセプター抗体とは、すなわち、ヒト抗体であり、さらにドナーモノクローナル抗体の結合特異性を保持する上で必要な重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのフレームワーク領域を意味する。いくつかの実施形態で、本明細書に記載したヒト化抗体のフレームワーク領域は、必ずしも天然のヒト抗体可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列と正確に同じである必要はなく、ヒト化抗体の性質を変えるアミノ酸欠失、挿入、修飾を含む（ただし、これらに限定はされない）様々な改変を包含する。ここで、ヒト化抗体の性質を変えるとは、例えば、マウスのＦｃγＲＩＩＢ特異的抗体と同一の標的に対して特異的であるヒト化抗体領域の結合特性を改善すること等が該当する。最も好ましい実施形態では、非ヒトフレームワーク残基を広範に導入することを避け、かつヒトにおいてヒト化抗体の最小限の免疫原性を確保するために、フレームワーク領域に対して最少数の改変を行う。ドナーのモノクローナル抗体は、２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１または１Ｆ２クローンにより産生されるモノクローナル抗体であることが好ましい。
【０１３２】
具体的な実施形態で、結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＡと結合するよりも強い親和力でＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合するＣＤＲグラフト化抗体の可変ドメインを包含する。ここで、ＣＤＲグラフト化抗体は、レシピエント抗体のフレームワーク残基と、ドナーモノクローナル抗体由来の残基からなる重鎖可変領域ドメインを含む。ドナーモノクローナル抗体は、例えば、２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１または１Ｆ２クローンより産生されるモノクローナル抗体のように、ＦｃγＲＩＩＡと結合するよりも強い親和力でＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合する抗体である。他の具体的な実施形態で、本発明のダイアボディは、ＣＤＲグラフト化抗体がＦｃγＲＩＩＡと結合するよりも強い親和力でＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合する該ＣＤＲグラフト化抗体由来の可変ドメインを含む。ここで、ＣＤＲグラフト化抗体は、レシピエント抗体のフレームワーク残基と、ドナーモノクローナル抗体由来の残基からなる軽鎖可変領域ドメインを含む。ドナーモノクローナル抗体は、例えば、２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１または１Ｆ２クローンより産生されるモノクローナル抗体のように、ＦｃγＲＩＩＡと結合するよりも強い親和力でＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合する抗体である。
【０１３３】
本発明で用いられるヒト化抗ＦｃγＲＩＩＢの可変ドメインは、ＣＤＲ１（配列番号２４もしくは配列番号２５）および／またはＣＤＲ２（配列番号２６もしくは配列番号２７）および／またはＣＤＲ３（配列番号２８もしくは配列番号２９）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに／あるいはＣＤＲ１（配列番号３２もしくは配列番号３３）および／またはＣＤＲ２（配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６もしくは配列番号３７）および／またはＣＤＲ３（配列番号３８もしくは配列番号３９）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有していてもよい。
【０１３４】
具体的な実施形態で、ダイアボディはヒト化２Ｂ６抗体に由来する可変ドメインを含む。このダイアボディでは、ＶＨ領域がヒト生殖系列のＶＨセグメントであるＶＨ１−１８（Ｍａｔｓｕｄａら、（１９９８年）「Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｈｅａｖｙ  Ｃｈａｉｎ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎ  Ｌｏｃｕｓ」、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１８８巻、２１５１〜２１６２頁）およびＪＨ６  （Ｒａｖｅｔｃｈら、（１９８１年）「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｍｕ  Ｌｏｃｕｓ：  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ａｎｄ  Ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  Ｊ  Ａｎｄ  Ｄ  Ｇｅｎｅｓ」、Ｃｅｌｌ  ２７巻（３Ｐｔ．２）：５８３〜９１頁）に由来するＦＲセグメントと、配列番号２４、配列番号２６または配列番号２８のアミノ酸配列を有する２Ｂ６  ＶＨの１以上のＣＤＲ領域とからなる。一の実施形態で、２Ｂ６  ＶＨは配列番号４０のアミノ酸配列を有する。他の実施形態で、２Ｂ６  ＶＨドメインは、配列番号８７のＨｕ２Ｂ６ＶＨのアミノ酸配列を有し、配列番号８８のヌクレオチド配列によりコードされ得る。他の具体的な実施形態で、ダイアボディはＶＬ領域をさらに含み、このＶＬ領域はヒト生殖系列ＶＬセグメントであるＶＫ−Ａ２６（Ｌａｕｔｎｅｒ−Ｒｉｅｓｋｅら、（１９９２年）「Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｋａｐｐａ  Ｌｏｃｕｓ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｄｕｐｌｉｃａｔｅｄ  Ａ  Ｒｅｇｉｏｎｓ」、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２２巻、１０２３〜１０２９頁）およびＪＫ４（Ｈｉｅｔｅｒら、（１９８２年）「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｋａｐｐａ  Ｊ  Ｒｅｇｉｏｎ  Ｇｅｎｅｓ」、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５７巻、１５１６〜２２頁）のＦＲセグメントと、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３８のアミノ酸配列を有する、２Ｂ６  ＶＬの１以上のＣＤＲ領域とからなる。一の実施形態で、２Ｂ６  ＶＬは、配列番号４１、配列番号４２、または配列番号４３のアミノ酸配列を有する。具体的な実施形態において、２Ｂ６  ＶＬは、配列番号８９のＨｕ２Ｂ６ＶＬのアミノ酸配列を有し、配列番号９０のヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【０１３５】
他の具体的な実施形態で、ダイアボディは、ヒト化３Ｈ７抗体に由来する可変ドメインを有する。このダイアボディでは、ＶＨ領域がヒト生殖系列ＶＨセグメントに由来するＦＲセグメントと、配列番号３７のアミノ酸配列を有する３Ｈ７  ＶＨのＣＤＲ領域とからなる。他の具体的な実施形態において、ヒト化３Ｈ７抗体はさらにＶＬ領域を含み、このＶＬ領域はヒト生殖系列ＶＬセグメントのＦＲセグメントと、配列番号４４のアミノ酸配列を有する３Ｈ７ＶＬのＣＤＲ領域とからなる。
【０１３６】
具体的には、結合ドメインは、天然のヒトＦｃγＲＩＩＢの細胞外ドメインと免疫特異的に結合し、また以下の組合せのいずれかにおいて２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１または１Ｆ２のＣＤＲ配列を含む（あるいは、からなる）。前記組合せとは、ＶＨ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ１；ＶＨ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ２；ＶＨ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ３；ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ１；ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ２；ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ３；ＶＨ  ＣＤＲ３  ａｎｄ  ａ  ＶＨ  ＣＤＲ１；ＶＨ  ＣＤＲ３およびＶＬ  ＣＤＲ２；ＶＨ  ＣＤＲ３およびＶＬ  ＣＤＲ３；ＶＨ１  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ１；ＶＨ  ＣＤＲ１およびＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ２；ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ３；ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３およびＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３およびＶＬ  ＣＤＲ２；ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ３；ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ２；ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ３；ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＬ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ２；ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＬ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ３；ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ２；ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ３；ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３およびＶＬ  ＣＤＲ１；ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３およびＶＬ  ＣＤＲ２；ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３およびＶＬ  ＣＤＲ３；ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＬ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ２；ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＬ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ３；ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ２；ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ３；ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ２；ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ３；ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ３；ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ２；ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ３；ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、ＶＬ  ＣＤＲ３；ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、  およびＶＬ  ＣＤＲ３；ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３；または本明細書で開示したＶＨ  ＣＤＲおよびＶＬ  ＣＤＲのいずれかの組合せをいう。
【０１３７】
本発明のダイアボディに含まれる結合ドメインの由来となる抗体は、ＦｃγＲＩＩＡと比べてＦｃγＲＩＩＢに最も強い特異性をもった抗体を選択できるように、エピトープマッピングによってさらに特徴付けることができる。抗体のエピトープマッピング法は当該分野では周知であり、本発明の方法に包含される。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩＩＢの１以上の領域を含む融合タンパク質を、本発明の抗体のエピトープをマッピングするのに使用することができる。具体的な実施形態で、融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ２のＦｃ部分と融合したＦｃγＲＩＩＢの領域のアミノ酸配列を含んでいる。各融合タンパク質は、下記の表２に示すようなアミノ酸置換および／または相同受容体（例えばＦｃγＲＩＩＡ）の対応領域による該受容体の特定領域の交換をさらに含むことができる。ｐＭＧＸ１２５およびｐＭＧＸ１３２は、ＦｃγＲＩＩＢ受容体のＩｇＧ結合部位を含み（前者はＦｃγＲＩＩＢのＣ末端を有し、そして後者はＦｃγＲＩＩＡのＣ末端を有する）、Ｃ末端結合性を区別するために使用することができる。その他は、ＩｇＧ結合部位におけるＦｃγＲＩＩＡ置換、およびＦｃγＲＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＢのいずれかのＮ末端を有する。これらの分子は、抗体が結合する受容体分子の部分を決定するのに役に立つ。
【０１３８】
【表２】
0005718637.tif 000003
融合タンパク質は、本発明の抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体への結合を測定するためのいずれかの生化学的アッセイ法、例えばＥＬＩＳＡ法で使用することができる。他の実施形態においては、特定の残基をＦｃγＲＩＩＡ配列由来の残基と置き換えたペプチドを用いて、エピトープ特異性のさらなる確認を行うことができる。
【０１３９】
抗体は、本発明の抗体の機能、特にＦｃγＲＩＩＢシグナル伝達を調節する活性、を同定するためのアッセイ法を用いて性状解析することができる。例えば、本発明の性状解析は、ＦｃγＲＩＩＢのＩＴＩＭモチーフ中のチロシン残基のリン酸化を測定したり、あるいは、Ｂ細胞受容体によって生じるカルシウム動員の阻害を測定することもできる。本発明の性状解析は、細胞ベースのアッセイ法または無細胞系アッセイ法とすることができる。
【０１４０】
マスト細胞においては、高親和性ＩｇＥ受容体であるＦｃεＲＩとＦｃγＲＩＩＢとの共凝集が、抗原誘導性脱顆粒、カルシウム動員、およびサイトカイン産生の阻害をもたらすことは当該分野では十分に立証されている（Ｍｅｔｃａｌｆｅ  Ｄ．Ｄ．ら（１９９７年）「Ｍａｓｔ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｒｅｖ．、７７巻、１０３３〜１０７９頁、Ｌｏｎｇ  Ｅ．Ｏ．、（１９９９年）「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７巻、８７５〜９０４頁）。このシグナル伝達経路の分子的詳細については、最近明らかとなった（Ｏｔｔ  Ｖ．Ｌ．、（２００２年）「Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  Ｏｆ  Ｋｉｎａｓｅ，  ｐ６２（ｄｏｋ），  Ｉｓ  Ａ  Ｍｅｄｉａｔｏｒ  Ｏｆ  ＦｃｇａｍｍａＩＩＢ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｆｃ  Ｅｐｓｉｌｏｎ  ＲＩ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６２巻（９号）、４４３０〜４４３９頁）。ひとたびＦｃεＲＩと共凝集すると、ＦｃγＲＩＩＢは、そのＩＴＩＭモチーフ中のチロシン上で直ちにリン酸化され、その後Ｓｒｃホモロジー２含有イノシトール−５−ホスファターゼ（Ｓｒｃ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ−２  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｉｎｏｓｉｔｏｌ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：ＳＨＩＰ）を動員する。この酵素は、ＳＨ２ドメイン含有イノシトールポリホスフェート５−ホスファターゼであって、順次リン酸化されて、Ｓｈｃおよびｐ６２ｄｏｋと会合する。ｐ６２ｄｏｋは、アダプター分子ファミリーのプロトタイプであり、ここでいうアダプター分子ファミリーは、例えば、アミノ末端のプレクストリン相同ドメイン（ＰＨドメイン）のようなシグナル伝達ドメイン、ＰＴＢドメイン、およびＰＸＸＰモチーフと多数のリン酸化部位を含むカルボキシ末端領域を含む（Ｃａｒｐｉｎｏら、（１９９７年）「ｐ６２（ｄｏｋ）：  Ａ  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ−Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ，  ＧＡＰ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｃｅｌｌ、８８巻、１９７〜２０４頁、Ｙａｍａｎｓｈｉら、（１９９７年）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ａｂｌ−Ａｎｄ  ｒａｓＧＡＰ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ６２  ｋＤａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓ  Ａ  Ｄｏｃｋｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，  Ｄｏｋ」、Ｃｅｌｌ、８８巻、２０５〜２１１頁）。
【０１４１】
本発明で使用する抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体は、同様に、１以上のＩｇＥ介在応答を調節する能力について性状解析することができる。ＩｇＥに対して高親和性の受容体およびＦｃγＲＩＩＢに対して低親和性の受容体を共発現する細胞株を、ＩｇＥ介在応答の調節における抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体の性状解析に用いることが好ましい。具体的な実施形態において、全長のヒトＦｃγＲＩＩＢでトランスフェクトしたラット好塩基球性白血病細胞株（ＲＢＬ−Ｈ２３；  Ｂａｒｓｕｍｉａｎ  Ｅ．Ｌ．ら（１９８１年）「ＩｇＥ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｆｒｏｍ  Ｒａｔ  Ｂａｓｏｐｈｉｌｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ：  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ａｎｄ  Ｎｏｎｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ｃｌｏｎｅｓ」、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１巻、３１７〜３２３頁、参照として本明細書にそのすべてを組み入れる）由来の細胞を用いることができる。ＲＢＬ−２Ｈ３は、十分に特徴付けられたラット細胞株であり、ＩｇＥを介した細胞活性化後のシグナル伝達機構を研究するのに広く使用されている。ＲＢＬ−２Ｈ３細胞で発現され、そしてＦｃεＲＩと共凝集すると、ＦｃγＲＩＩＢは、ＦｃεＲＩ誘導カルシウム動員、脱顆粒およびサイトカイン産生を阻害する（Ｍａｌｂｅｃら、（１９９８年）「Ｆｃ  Ｅｐｓｉｌｏｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｉ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｌｙｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｆｃ  Ｇａｍｍａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＩＢ  Ｄｕｒｉｎｇ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｍａｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６０巻、１６４７〜１６５８頁、Ｄａｅｒｏｎら、（１９９５年）「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＩｇＥ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｍａｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｂｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｏｗ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＩｇＧ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、９５巻、５７７頁、Ｏｔｔ  Ｖ．  Ｌ．  （２００２年）「Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  Ｏｆ  Ｋｉｎａｓｅ，  ｐ６２（ｄｏｋ），  Ｉｓ  Ａ  Ｍｅｄｉａｔｏｒ  Ｏｆ  ＦｃｇａｍｍａＩＩＢ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｆｃ  Ｅｐｓｉｌｏｎ  ＲＩ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ」、Ｊ．  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６２巻（９号）、４４３０〜４４３９頁）。
【０１４２】
本発明で使用する抗体は、ＦｃεＲＩ誘導型マスト細胞活性化の阻害について性状解析することもできる。例えば、ＦｃγＲＩＩＢでトランスフェクトされたラット好塩基球性白血病細胞株（ＲＢＬ−Ｈ２３；  Ｂａｒｓｕｍｉａｎ  Ｅ．Ｌ．ら（１９８１年）「ＩｇＥ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｆｒｏｍ  Ｒａｔ  Ｂａｓｏｐｈｉｌｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ：  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ａｎｄ  Ｎｏｎｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ｃｌｏｎｅｓ」、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１巻、３１７〜３２３頁）由来の細胞を、ＩｇＥで感作し、そしてＦｃεＲＩだけを凝集するウサギ抗マウスＩｇＧのＦ（ａｂ’）２フラグメントで刺激するか、またはＦｃγＲＩＩＢとＦｃεＲＩを共凝集する完全なウサギ抗マウスＩｇＧで刺激する。この系では、下流シグナル伝達分子の間接的な調節を、感作および刺激した細胞に本発明の抗体を添加したときにアッセイできる。例えば、ＦｃγＲＩＩＢのチロシンリン酸化およびＳＨＩＰの動員とリン酸化、Ｅｒｋ１、Ｅｒｋ２、ＪＮＫまたはｐ３８を含むがそれらに限定されないＭＡＰキナーゼファミリーメンバーの活性化、ならびにｐ６２ｄｏｋのチロシンリン酸化およびそれとＳＨＩＰおよびＲａｓＧＡＰとの会合をアッセイする。
【０１４３】
本発明の抗体によりＦｃεＲＩ誘導型マスト細胞活性化の阻害を測定する１つの典型的なアッセイは、以下を含み得る。すなわち、ヒトＦｃγＲＩＩＢでＲＢＬ−Ｈ２３細胞をトランスフェクトすること、ＩｇＥでＲＢＬ−Ｈ２３細胞を感作すること、そしてウサギ抗マウスＩｇＧのＦ（ａｂ’）２（ＦｃεＲＩのみを凝集し、ＦｃεＲＩ介在シグナル伝達を引き起こす；対照として用いる）でＲＢＬ−Ｈ２３細胞を刺激するか、または完全なウサギ抗マウスＩｇＧ（ＦｃγＲＩＩＢとＦｃεＲＩを共凝集し、結果的にＦｃεＲＩ介在シグナル伝達を阻害する）でＲＢＬ−Ｈ２３細胞を刺激することを含み得る。完全なウサギ抗マウスＩｇＧ抗体で刺激した細胞を、さらに、本発明の抗体とプレインキュベートすることができる。本発明の抗体とプレインキュベートした細胞、および本発明の抗体とプレインキュベートしていない細胞のＦｃεＲＩ依存性活性を測定し、これらの細胞におけるＦｃεＲＩ依存性活性のレベルを比較することで、本発明の抗体によるＦｃεＲＩ依存性活性の調節を示すことができる。
【０１４４】
上記の典型的なアッセイを使用して、例えば、ＦｃγＲＩＩＢ受容体へのリガンド（ＩｇＧ）結合をブロックし、かつおよびＦｃεＲＩとＦｃγＲＩＩＢの共凝集を妨げることによってＦｃεＲＩシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ介在阻害にアンタゴナイズする抗体を同定することができる。同様にこのアッセイは、ＦｃγＲＩＩＢとＦｃεＲＩの共凝集を増強し、かつＦｃγＲＩＩＢとＦｃεＲＩの共凝集を促進することでＦｃεＲＩシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ介在阻害にアゴナイズする抗体を同定する。
【０１４５】
いくつかの実施形態で、本明細書で同定され記載されたまたは当該分野で知られた、本発明の抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体のエピトープ結合ドメインを含む抗ＦｃγＲＩＩＢダイアボディは、好ましくは細胞ベースのアッセイ法において、マスト細胞もしくは好塩基球の脱顆粒をモニターしおよび／または測定することにより、ＩｇＥ介在応答を調節するその能力について性状解析される。このようなアッセイで用いるマスト細胞または好塩基球は、当業者に公知の標準的な組換え法を用いて、ヒトＦｃγＲＩＩＢを含むように遺伝子操作されていることが好ましい。具体的な実施形態で、本発明の抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体は、細胞ベースのβヘキソサミニダーゼ（顆粒中に含まれる酵素）放出アッセイでＩｇＥ介在応答を調節するその能力について性状解析される。マスト細胞および好塩基球からのβヘキソサミニダーゼ放出は、急性アレルギー状態および急性炎症状態の最初の事象である（Ａｋｅｔａｎｉら、（２００１年）「Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ  Ｉｎ  ＲＢＬ−２Ｈ３  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  Ｏｆ  Ｖａｒｉｏｕｓ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＥｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．、７５巻、１８５〜１８９頁、Ａｋｅｔａｎｉら、（２０００年）「Ａ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｆｏｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＥ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍａｓｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｂａｓｅｄ  Ｏｎ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ」、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．、７２巻、２６５３〜２６５８頁）。セロトニンやヒスタミンを含むがこれらに限定されない他の炎症性メディエーターの放出を本発明の方法に従ってアッセイし、ＩｇＥ介在応答を測定してもよい。特定の作用機序に縛られるつもりはないが、マスト細胞および好塩基球からのβヘキソサミニダーゼ含有顆粒のような顆粒の放出は、ＦｃγＲＩと多価抗原との架橋により開始される細胞内カルシウム濃度依存性のプロセスである。
【０１４６】
ヒトマスト細胞の研究の可能性は、適当な長期のヒトマスト細胞培養物がないことで制限されている。最近になって、ＬＡＤ１およびＬＡＤ２と呼ばれる２種の新規幹細胞因子依存性のヒトマスト細胞株が、マスト細胞肉腫／白血病患者由来の骨髄液から樹立された（Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍら、（２００３年）「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｍａｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  ＬＡＤ  １  Ａｎｄ  ２  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ａ  Ｐａｔｉｅｎｔ  Ｗｉｔｈ  Ｍａｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｓａｒｃｏｍａ／Ｌｅｕｋｅｍｉａ；  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  Ｏｆ  ＦｃＲＩ  Ｏｒ  ＦｃｙＲｌ」、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、２７巻、６７７〜８２頁、参照としてそのすべてを本明細書に組み入れる）。両細胞株は、ＦｃεＲＩおよびいくつかのヒトマスト細胞マーカーを発現することが記載されている。ＬＡＤ  １細胞およびＬＡＤ２細胞は、ＩｇＥ介在応答に本発明の抗体が及ぼす効果を評価するのに使用することができる。具体的な実施形態で、上記のような細胞ベースのβヘキソサミニダーゼ放出アッセイをＬＡＤ細胞で使用して、本発明の抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体によるＩｇＥ介在応答のあらゆる調節を測定することができる。典型的なアッセイでは、例えば、ＬＡＤ  １等のヒトマスト細胞を、ヒトキメラＩｇＥ抗ニトロフェノール（ＮＰ）で刺激し、多価抗原であるＢＳＡ−ＮＰでチャレンジする。そして細胞の脱顆粒を、上清中に放出されるβヘキソサミニダーゼを測定することによりモニターする（Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍら、（２００３年）「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｍａｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  ＬＡＤ  １  Ａｎｄ  ２  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ａ  Ｐａｔｉｅｎｔ  Ｗｉｔｈ  Ｍａｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｓａｒｃｏｍａ／Ｌｅｕｋｅｍｉａ；  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  Ｏｆ  ＦｃＲＩ  Ｏｒ  ＦｃｙＲＩ」、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、２７巻、６７７〜６８２頁、参照としてそのすべてを本明細書に組み入れる）。
【０１４７】
いくつかの実施形態で、当該分野で公知の標準的な方法、例えばＦＡＣＳ染色等を使用して測定したとき、ヒトマスト細胞の内在性ＦｃγＲＩＩＢの発現が低い場合、本発明の抗ＦｃγＲＩＩＢダイアボディにより媒介される阻害経路の活性化の差異をモニターおよび／または検出することは困難かもしれない。それ故、本発明は、サイトカインおよび特定の増殖条件を用いてＦｃγＲＩＩＢ発現を上方制御することのできる別の方法を包含する。ＦｃγＲＩＩＢは、ＴＨＰ１やＵ９３７等のヒト単球系細胞株（Ｔｒｉｄａｎｄａｐａｎｉら、（２００２年）「Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｆｃｇａｍｍａ  ＲＩＩＢ  Ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７７巻（７号）、５０８２〜５０８９頁）、およびヒト初代単球（Ｐｒｉｃｏｐら、（２００１年）「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  Ａｎｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆｃ  Ｇａｍｍａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  Ｂｙ  Ｔｈｌ  Ａｎｄ  Ｔｈ２  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ」、Ｊ．  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６６巻、５３１〜５３７頁）では、ＩＬ−４により高度に上方制御されることが記載されている。ジブチリル環状ＡＭＰによるＵ９３７の分化は、ＦｃγＲＩＩの発現を増加することが記載されている（Ｃａｍｅｒｏｎら、（２００２年）「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ，  Ｕ９３７，  Ｗｉｔｈ  Ｄｉｂｕｔｙｒｙｌ  ＣｙｃｌｉｃＡＭＰ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，  ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＢ」、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ８３巻、１７１〜１７９頁）。したがって、検出感度を増強するために、本発明の方法で使用するヒトマスト細胞での内在性ＦｃγＲＩＩＢの発現は、例えばＩＬ−４、ＩＬ−１３のようなサイトカインを用いて上方制御することができる。
【０１４８】
抗ＦｃγＲＩＩＢダイアボディは、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）を介したシグナル伝達の阻害についてアッセイすることもできる。ＢＣＲを介したシグナル伝達は、少なくとも１つ以上の下流の生物学的応答、例えばＢ細胞の活性化および増殖、抗体産生等を含み得る。ＦｃγＲＩＩＢとＢＣＲとの共凝集は、細胞周期の進行および細胞の生存の阻害をもたらす。さらに、ＦｃγＲＩＩＢとＢＣＲとの共凝集は、ＢＣＲ介在シグナル伝達の阻害をもたらす。
【０１４９】
特に、ＢＣＲを介するシグナル伝達は、以下の少なくとも１つ以上を含む。すなわち、下流シグナル伝達分子の調節、例えば、ＦｃγＲＩＩＢのリン酸化状態、ＳＨＩＰの動員、Ｂｔｋおよび／またはＰＬＣγの局在、ＭＡＰキナーゼ活性、Ａｋｔ（抗アポトーシスシグナル）の動員、カルシウム動員、細胞周期の進行、および細胞増殖が挙げられる。
【０１５０】
ＢＣＲシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ介在阻害におけるエフェクター機能の多くはＳＨＩＰを介しているが、最近、ＳＨＩＰ欠損マウス由来のリポ多糖（ＬＰＳ）活性化Ｂ細胞が、カルシウム動員、Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ３産生、ならびにＥｒｋおよびＡｋｔのリン酸化の顕著なＦｃγＲＩＩＢ介在阻害を示すことが立証された（Ｂｒａｕｗｅｉｌｅｒ．ら、（２００１年）「Ｐａｒｔｉａｌｌｙ  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＢ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｉｎ  Ｒｅｓｔｉｎｇ  Ａｎｄ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｂ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６７巻（１号）：２０４〜２１１頁）。したがって、ＳＨＩＰ欠損マウス由来のｅｘ  ｖｉｖｏ  Ｂ細胞を用いて、本発明の抗体を特徴付けることができる。本発明の抗体によるＢＣＲシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ介在阻害を測定するための典型的なアッセイは、以下のステップを含み得る。すなわち、ＳＨＩＰ欠損マウスから脾臓Ｂ細胞を分離するステップ、前記細胞をリポ多糖で活性化するステップ、および前記細胞をＦ（ａｂ’）２抗ＩｇＭで刺激してＢＣＲを凝集させるか、または抗ＩｇＭで刺激してＢＣＲをＦｃγＲＩＩＢと共凝集させるステップである。完全な抗ＩｇＭで刺激し、ＢＣＲをＦｃγＲＩＩＢと共凝集させた細胞を、さらに本発明の抗体とプレインキュベートすることができる。細胞のＦｃγＲＩＩＢ依存性活性は、当該分野で知られる標準的な技術によって測定することができる。抗体とプレインキュベートした細胞およびプレインキュベートしていない細胞のＦｃγＲＩＩＢ依存性活性のレベルを比較することにより、その抗体によるＦｃγＲＩＩＢ依存性活性の調節を表すことができる。
【０１５１】
ＦｃγＲＩＩＢ依存性活性の測定は、例えば、フローサイトメトリーで細胞内カルシウム動員を測定すること、Ａｋｔおよび／もしくはＥｒｋのリン酸化を測定すること、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３のＢＣＲ介在蓄積を測定すること、またはＢ細胞のＦｃγＲＩＩＢ介在増殖を測定することを含み得る。
【０１５２】
前記アッセイを用いて、例えば、本発明で使用する以下のようなダイアボディまたは抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体を同定することができる。すなわち、ＦｃγＲＩＩＢ受容体のリガンド（ＩｇＧ）結合部位をブロックし、かつＦｃγＲＩＩＢとＢＣＲの共凝集を妨げることによりＢＣＲシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ介在阻害にアンタゴナイズすることで、ＢＣＲシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ介在阻害を調節するダイアボディまたは抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体である。また、前記アッセイを用いて、ＦｃγＲＩＩＢとＢＣＲの共凝集を増強しかつＢＣＲシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ介在阻害にアゴナイズする抗体を同定することもできる。
【０１５３】
抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体は、ヒト単球／マクロファージにおいてＦｃγＲＩＩを介したシグナル伝達についてアッセイすることもできる。ＦｃγＲＩＩＢと免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ：ＩＴＡＭ）を有する受容体との共凝集は、ＳＨＩＰをエフェクターとして用いるＦｃγＲ介在食作用を下方制御するように作用する（Ｔｒｉｄａｎｄａｐａｎｉら、（２００２年）「Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｆｃｇａｍｍａ  ＲＩＩＢ  Ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７７巻（７号）、５０８２〜５０８９頁）。ＦｃγＲＩＩＡとＦｃγＲＩＩＢの共凝集は、ＦｃγＲＩＩＢのＩＴＩＭモチーフ上のチロシン残基の迅速なリン酸化をもたらし、これはＳＨＩＰのリン酸化の増強、ＳＨＩＰとＳｈｃとの結合、および１２０ｋＤａおよび６０〜６５ｋＤａの分子量を有するタンパク質のリン酸化を引き起こす。さらに、ＦｃγＲＩＩＡとＦｃγＲＩＩＢの共凝集は、Ａｋｔのリン酸化の下方制御をもたらす。Ａｋｔは、セリン・トレオニンキナーゼであり、細胞制御に関与し、またアポトーシスを抑制する働きをもつ。
【０１５４】
抗ＦｃγＲＩＩＢダイアボディは、ヒト単球／マクロファージにおいてＦｃγＲを介した食作用の阻害についてアッセイすることができる。例えば、ヒト単球系細胞株ＴＨＰ−１由来の細胞を、ＦｃγＲＩＩに対するマウスモノクローナル抗体ＩＶ．３のＦａｂフラグメントおよびヤギ抗マウス抗体（ＦｃγＲＩＩＡのみを共凝集させる）で刺激するか、完全なＩＶ．３マウスモノクローナル抗体およびヤギ抗マウス抗体（ＦｃγＲＩＩＡとＦｃγＲＩＩＢを共凝集させる）で刺激することができる。この系では、下流のシグナル伝達分子の調節、例えばＦｃγＲＩＩＢのチロシンリン酸化、ＳＨＩＰのリン酸化、ＳＨＩＰとＳｈｃの結合、Ａｋｔのリン酸化、および１２０ｋＤａおよび６０〜６５ｋＤａの分子量を有するタンパク質のリン酸化等を、刺激した細胞に本発明の分子を加えることでアッセイすることができる。さらに、単球系細胞株のＦｃγＲＩＩＢ依存性食作用効率を、本発明の抗体の存在下および非存在下で直接、測定することができる。
【０１５５】
本発明の抗体によるヒト単球／マクロファージにおけるＦｃγＲ介在食作用の阻害を測定するための他の典型的なアッセイは、以下を含み得る。すなわち、ＴＨＰ−１細胞を、ＩＶ．３マウス抗ＦｃγＲＩＩ抗体のＦａｂおよびヤギ抗マウス抗体で刺激する（ＦｃγＲＩＩＡのみを凝集させ、ＦｃγＲＩＩＡ介在シグナル伝達を誘導する）か、マウス抗ＦｃγＲＩＩ抗体およびヤギ抗マウス抗体で刺激する（ＦｃγＲＩＩＡとＦｃγＲＩＩＢを共凝集させ、ＦｃγＲＩＩＡ介在シグナル伝達を阻害する）ことを含む。マウス抗ＦｃγＲＩＩ抗体およびヤギ抗マウス抗体で刺激した細胞を、さらに本発明の分子とプレインキュベートすることができる。本発明の分子とプレインキュベートした刺激済み細胞および本発明の分子とプレインキュベートしなかった細胞のＦｃγＲＩＩＡ依存性活性を測定すること、ならびにこれらの細胞におけるＦｃγＲＩＩＡ依存性活性のレベルを比較することで本発明の抗体によるＦｃγＲＩＩＡ依存性活性の調節を示すことができる。
【０１５６】
記載された典型的なアッセイを使用して、例えば、以下のような結合ドメインを同定することができる。すなわち、ＦｃγＲＩＩＢ受容体のリガンド結合をブロックし、かつＦｃγＲＩＩＢとＦｃγＲＩＩＡの共凝集を妨げることによってＦｃγＲＩＩＡシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ介在阻害にアンタゴナイズする結合ドメインである。同様に、このアッセイで、ＦｃγＲＩＩＢとＦｃγＲＩＩＡの共凝集を増強し、かつＦｃγＲＩＩＡシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ介在阻害にアゴナイズする結合ドメインを同定することができる。
【０１５７】
対象となるＦｃγＲＩＩＢ結合ドメインは、以前に報告された方法（Ｔｒｉｄａｎｄａｐａｎｉら、（２０００年）「Ｔｈｅ  Ａｄａｐｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬＡＴ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｆｃｇａｍｍａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５巻、２０４８０〜７頁）により、フルオレセイン化ＩｇＧオプソニン化ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を貪食するＴＨＰ−１細胞の能力を測定することでアッセイできる。例えば、食作用を測定するための典型的なアッセイは、ＴＨＰ−１細胞を本発明の抗体でまたはＦｃγＲＩＩに結合しない対照抗体で処理するステップ、前記細胞の活性レベルを比較するステップから構成される。その際、細胞の活性（例えば、ロゼット形成活性（ＩｇＧ被覆ＳＲＢＣと結合するＴＨＰ−１細胞の数）、付着活性（ＴＨＰ−１細胞に結合したＳＲＢＣの総数）、および食作用率）の差異が、本発明の抗体によるＦｃγＲＩＩＡ依存性活性の調節を示すことができる。このアッセイを用いて、例えば、ＦｃγＲＩＩＢ受容体のリガンド結合をブロックし、かつ食作用のＦｃγＲＩＩＢ介在阻害にアンタゴナイズする抗体を同定することができる。このアッセイは、ＦｃγＲＩＩＡシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ介在阻害を増強する抗体を同定することもできる。
【０１５８】
好ましい実施形態で、結合ドメインは、ヒト単球／マクロファージにおけるＦｃγＲＩＩＢ依存性活性を、以下の少なくとも１以上の方法で調節する。すなわち、下流シグナル伝達分子の調節（例えば、ＦｃγＲＩＩＢのリン酸化状態の調節、ＳＨＩＰリン酸化の調節、ＳＨＩＰとＳｈｃの結合の調節、Ａｋｔのリン酸化の調節、約１２０ｋＤａおよび６０〜６５ｋＤａのさらなるタンパク質のリン酸化の調節）および食作用の調節である。
【０１５９】
５．１．２  ＣＤ１６Ａ結合ドメイン
以下のセクションでは、ＣＤ１６Ａ結合タンパク質について論ずる。このタンパク質は、共有結合型ダイアボディの作製のための軽鎖および重鎖の可変領域のソースとして使用することができる。本発明では、ＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、抗ＣＤ１６Ａ抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなる分子を含む。このＶＬおよびＶＨドメインを、本発明のダイアボディの作製に使用する。
【０１６０】
様々なＣＤ１６Ａ結合タンパク質を、本発明に関連して用いることができる。適当なＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体、ならびにＣＤ１６Ａ結合抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖまたは一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、ミニボディ）、および軽鎖可変領域ドメイン、重鎖可変領域ドメイン、またはその両方との相互作用を介してＣＤ１６Ａに結合する他の抗体様タンパク質を含む。
【０１６１】
いくつかの実施形態で、本発明に従って使用するためのＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、非ヒト抗ＣＤ１６Ａ抗体（例えばマウス抗ＣＤ１６Ａ抗体）に由来する配列をもつ１以上のＣＤＲと、１以上のヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列に由来する１以上のフレームワーク領域とを有する、ＶＬおよび／またはＶＨドメインを含む。ＣＤＲおよび他の配列を得ることのできる多数の非ヒト抗ＣＤ１６Ａモノクローナル抗体が知られている（例えば、Ｔａｍｍら、（１９９６年）「Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｅｐｉｔｏｐｅｓ  Ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ１６  （Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ＲＩＩＩ）  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｆｏｒ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ」、Ｊ．  Ｉｍｍ．  １５７巻、１５７６〜８１頁、Ｆｌｅｉｔら、１９８９年、１５９頁、ＬＥＵＫＯＣＹＴＥ  ＴＹＰＩＮＧ  ＩＩ：  ＨＵＭＡＮ  ＭＹＥＬＯＩＤ  ＡＮＤ  ＨＥＭＡＴＯＰＯＩＥＴＩＣ  ＣＥＬＬＳ、Ｒｅｉｎｈｅｒｚら編、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９８６年、ＬＥＵＣＯＣＹＴＥ  ＴＹＰＩＮＧ  ＩＩＩ：  ＷＨＩＴＥ  ＣＥＬＬ  ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ  ＡＮＴＩＧＥＮＳ、ＭｃＭｉｃｈａｅｌ  Ａ  Ｊ，編、Ｏｘｆｏｒｄ：  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６；ＬＥＵＫＯＣＹＴＥ  ＴＹＰＩＮＧ  ＩＶ：  ＷＨＩＴＥ  ＣＥＬＬ  ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ  ＡＮＴＩＧＥＮＳ、Ｋａｐｐら編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ；ＬＥＵＫＯＣＹＴＥ  ＴＹＰＩＮＧ  Ｖ：  ＷＨＩＴＥ  ＣＥＬＬ  ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ  ＡＮＴＩＧＥＮＳ、Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎら編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ；ＬＥＵＫＯＣＹＴＥ  ＴＹＰＩＮＧ  ＶＩ：  ＷＨＩＴＥ  ＣＥＬＬ  ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ  ＡＮＴＩＧＥＮＳ、Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ編、Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓを参照されたい）。さらに、実施例で説明するように、細胞上に提示されるヒトＣＤ１６Ａを認識する新たなＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、モノクローナル抗体または関連する結合タンパク質の作製および選択のための周知の方法（例えば、ハイブリドーマ技術、ファージディスプレイ法等）を用いて得ることができる。例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌらの（２００２年）「Ｐｈａｇｅ  Ｖｅｒｓｕｓ  Ｐｈａｇｅｍｉｄ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、３２１巻、４９〜５６頁、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、（２０００年）「Ｎａｔｕｒａｌ  Ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅｓ  Ｍａｄｅ  Ｂｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｉｍｍ．  Ｔｏｄａｙ  ２１巻、３７１０７８頁、Ｋｒｅｂｓら、（２００１年）「Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｊ．  Ｉｍｍ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５４巻、６７〜８４頁、および本明細書で引用した他の文献を参照されたい。ヒト以外の種由来のモノクローナル抗体を、当該分��において知られている抗体のヒト化技術を用いてキメラ化またはヒト化することができる。
【０１６２】
あるいはまた、ＣＤ１６Ａに対する完全なヒト抗体は、ヒト免疫系の成分を有するトランスジェニック動物を用いて（例えば、米国特許第５，５６９，８２５号および第５，５４５，８０６号）、ヒト末梢血細胞を用いて（Ｃａｓａｌｉら、（１９８６年）「Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ  Ｆｒｏｍ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｂ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂｙ  ＥＢＶ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４巻、４７６〜４７９頁）、ヒトＢ細胞由来のＤＮＡライブラリーをＨｕｓｅら、（１９８９年）「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｌａｒｇｅ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  Ｉｎ  Ｐｈａｇｅ  Ｌａｍｂｄａ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６巻、１２７５〜１２８１頁で概説された通常のプロトコルに従ってスクリーニングすることにより、および他の方法により作製することができる。
【０１６３】
結合ドナーは、例えば、米国特許出願第２００４／００１０１２４号（参照としてそのすべてを本明細書に組み入れる）に開示されているような、３Ｇ８抗体またはそのヒト化型由来であることが実施形態として好ましい。いくつかの目的には、３Ｇ８が結合するエピトープと同一のエピトープで、または３Ｇ８による結合をブロックするために当該エピトープに少なくとも十分に近接するエピトープで、ＣＤ１６Ａ受容体に結合するＣＤ１６Ａ結合タンパク質を使用することが有利であると考えられる。所望の結合特性をもつ結合タンパク質を同定するためのエピトープマッピング法および競合的結合実験は、実験免疫学の当業者には周知である。例えば、上記で引用したＨａｒｌｏｗとＬａｎｅの論文；Ｓｔａｈｌらの（１９８３年）「Ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｅｐｉｔｏｐｅｓ  Ｂｙ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ９２巻、２４２〜２５３頁、Ｋｉｒｋｌａｎｄら、（１９８６年）「Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｉｎｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  Ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉ−Ｌｉｐｉｄ  Ａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３７巻、３６１４〜３６１９頁、Ｍｏｒｅｌら、（１９８８年）「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｔｏ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ：  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ａｎｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓ」、Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２５巻、７〜１５頁、Ｃｈｅｕｎｇら、（１９９０年）「Ｅｐｉｔｏｐｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｔｏ  Ｔｈｅ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｏｆ  Ｄｕｃｋ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔｅｄ  Ｄｕｃｋｓ」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６巻、５４６〜５５２頁、およびＭｏｌｄｅｎｈａｕｅｒら、（１９９０年）「Ｉｄｅｎｔｉｔｙ  Ｏｆ  ＨＭＬ−１  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｏｎ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｏｆ  Ｂ−１ｙ７  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｏｎ  Ｈａｉｒｙ  Ｃｅｌｌ  Ｌｅｕｋａｅｍｉａ」、Ｓｃａｎｄ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３２巻、７７〜８２頁を参照されたい。例えば、２つの抗体が同一部位に結合するかどうかは、一方の抗体を用いてＥＬＩＳＡプレート上で抗原を捕捉し、その後捕捉された抗原に結合する第２の抗体の能力を測定することによって、確認することが可能である。また、エピトープの比較は、第１の抗体を直接的にもしくは間接的に酵素、放射性核種または蛍光団で標識し、細胞上の、溶液中のまたは固相上の抗原への第１の抗体の結合を阻害する未標識の第２の抗体の能力を測定することによって達成することもできる。
【０１６４】
ＣＤ１６Ａ受容体とＥＬＩＳＡプレート上に形成された免疫複合体との結合をブロックする抗体の能力を測定することも可能である。前記免疫複合体は、まずフルオレセイン等の抗原でプレートを被覆し、次に特異的な抗フルオレセイン抗体をプレートにアプライすることによって形成される。この免疫複合体は、その後、ｓＦｃＲＩＩＩａのような可溶性Ｆｃ受容体のリガンドとして働く。あるいはまた、可溶性の免疫複合体を形成させて、酵素、放射性核種または蛍光団で直接的にもしくは間接的に標識してもよい。その後、これらの標識された免疫複合体と、細胞上の、溶液中のまたは固相上のＦｃ受容体との結合を阻害する抗体の能力を測定することができる。
【０１６５】
本発明のＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域を含んでいてもよいし、含まなくともよい。Ｆｃ領域は、例えば、ｓｃＦｖ結合タンパク質中には存在しない。Ｆｃ領域は、例えば、ヒトもしくはヒト化四量体モノクローナルＩｇＧ抗体には存在する。上記のように、本発明のいくつかの実施形態では、ＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、エフェクター機能が改変されているＦｃ領域を含む。改変されたエフェクター機能として、例えば、未改変Ｆｃ領域（例えば天然のＩｇＧ１タンパク質のＦｃ等）と比較した場合のＦｃ受容体または補体のＣ１成分のようなエフェクターリガンドに対する親和性の低下が挙げられる。一の実施形態で、Ｆｃ領域は、２９７位に相当するＦｃ領域のアミノ酸がグリコシル化されていない。このような抗体はＦｃエフェクター機能を欠いている。
【０１６６】
したがって、ＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、結合タンパク質中にＦｃドメインを欠くことから、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分のようなエフェクターリガンドへのＦｃ介在結合を示さないことがあるが、他のケースでは、結合やエフェクター機能の欠如は抗体の定常領域の変化に起因している。
【０１６７】
５．１．２．１  ｍＡｂ  ３Ｇ８  ＣＤＲ配列に類似するＣＤＲ配列を含むＣＤ１６Ａ結合タンパク質
本発明の実施に際して使用することができるＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、マウスモノクローナル抗体３Ｇ８のＣＤＲに由来する（すなわち同一もしくは類似の配列を有している）ＣＤＲ配列を含むタンパク質を包含する。マウス３Ｇ８モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードする相補的ｃＤＮＡ（ＣＤＲをコードする配列を含む）を、記載したようにクローン化して配列決定した。３Ｇ８の核酸配列およびタンパク質配列を以下に示す。マウス可変領域およびＣＤＲ配列を用いて、３Ｇ８のＣＤＲに由来する相補性決定領域を含む数多くのキメラおよびヒト化モノクローナル抗体を作製し、それらの特性を解析した。ＣＤ１６Ａに高親和性で結合し、さらに他の所望の性質を有するヒト化抗体を同定するために、３Ｇ８由来のＣＤＲを有するＶＨ領域を含む抗体重鎖を作製し、３Ｇ８由来のＣＤＲを有するＶＬ領域を含む抗体軽鎖と（共発現により）結合させて、解析用の四量体抗体を作製した。得られた四量体抗体の性質を以下に記載のように測定した。以下で説明するように、３Ｇ８のＣＤＲを含むＣＤ１６Ａ結合タンパク質、例えば、本明細書に記載したヒト化抗体タンパク質を本発明に従って使用することができる。
【０１６８】
５．１．２．１．１  ＶＨ領域
一態様において、本発明のＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、少なくとも１つのＣＤＲ（通常は３つのＣＤＲ）がマウスモノクローナル抗体３Ｇ８重鎖の１つのＣＤＲ（一般的には３つすべてのＣＤＲ）の配列を有し、該結合タンパク質の残りの部分が実質的にヒトの配列を有する（ヒト抗体の重鎖可変領域に由来し、実質的にそれに類似する）、重鎖可変ドメインを含むことができる。
【０１６９】
一態様において、本発明は、実質的にヒトのフレームワーク中に３Ｇ８抗体由来のＣＤＲを含むヒト化３Ｇ８抗体または抗体フラグメントであって、重鎖可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲが対応するマウス抗体３Ｇ８重鎖ＣＤＲと配列の点で異なる、上記抗体を提供する。例えば、一の実施形態で、ＣＤＲは、当該分野で公知のまたは表３および表４Ａ〜Ｈで開示したような、ＣＤ１６Ａへの３Ｇ８の結合に影響することが当該分野で知られている１以上のＣＤＲ置換を少なくとも有することで、３Ｇ８のＣＤＲ配列とは異なる。適当なＣＤ１６結合タンパク質は、これらの置換を０、１つ、２つ、３つまたは４つ、あるいはそれ以上含み（多くの場合、１〜４つの置換を有する）、任意で、追加の置換をも有することができる。
【０１７０】
【表３−１】
0005718637.tif 000004
【０１７１】
【表３−２】
0005718637.tif 000005
【０１７２】
【表４Ａ−１】
0005718637.tif 000006
【０１７３】
【表４Ａ−２】
0005718637.tif 000007
【０１７４】
【表４Ａ−３】
0005718637.tif 000008
【０１７５】
【表４Ｂ】
0005718637.tif 000009
【０１７６】
【表４Ｃ】
0005718637.tif 000010
【０１７７】
【表４Ｄ】
0005718637.tif 000011
【０１７８】
【表４Ｅ−１】
0005718637.tif 000012
【０１７９】
【表４Ｅ−２】
0005718637.tif 000013
【０１８０】
【表４Ｆ−１】
0005718637.tif 000014
【０１８１】
【表４Ｆ−２】
0005718637.tif 000015
【０１８２】
【表４Ｇ】
0005718637.tif 000016
【０１８３】
【表４Ｈ】
0005718637.tif 000017
一の実施形態で、ＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、Ｈｕ３Ｇ８ＶＨ−１構築物（配列番号７０に示す）のＶＨドメインと同一のまたは類似する重鎖可変ドメインの配列を含むことができる。例えば、本発明は、（１）表１に記載した、０、１またはそれ以上のＣＤＲ置換によりＨｕ３Ｇ８ＶＨ−１（配列番号７０）のＶＨドメインとは異なり、（２）表１に記載した、０、１またはそれ以上のフレームワーク置換によりＨｕ３Ｇ８ＶＨ−１のＶＨドメインとは異なり、（３）残りの位置でＨｕ３Ｇ８ＶＨ−１のＶＨ配列と少なくとも約８０％同一である、多くの場合少なくとも約９０％、時には少なくとも約９５％同一である、または少なくとも約９８％も同一である、配列を有するＶＨドメインを含むＣＤ１６Ａ結合タンパク質を提供する。
【０１８４】
本発明のＣＤ１６Ａ結合タンパク質の典型的なＶＨドメインは、３Ｇ８ＶＨ、Ｈｕ３Ｇ８ＶＨ−５およびＨｕ３Ｇ８ＶＨ−２２の配列（それぞれ、配列番号８１、配列番号７１および配列番号７２）を有する。３Ｇ８ＶＨおよびＨｕ３Ｇ８ＶＨ−５の配列（それぞれ、配列番号８１および配列番号７１）をコードする典型的なヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号８２および配列番号８３に示す。
【０１８５】
ＶＨドメインは、表３で示した置換の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは少なくとも６つによってＨｕ３Ｇ８ＶＨ−１（配列番号７０）の配列と異なる配列を有することができる。これらの置換は、ＣＤ１６Ａに対する親和性の増加をもたらし、および／またはヒトに投与した場合にＣＤ１６Ａ結合タンパク質の免疫原性を減じると考えられている。いくつかの実施形態で、残りの位置のＨｕ３Ｇ８ＶＨ−１のＶＨドメインとの配列同一性の程度は、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％である。
【０１８６】
限定ではなく例示として、多数のＣＤ１６Ａ結合タンパク質のＶＨドメインの配列を表４に示す。ヒトＣγ１定常領域と融合させた、これらの配列を含む重鎖を、ｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１軽鎖（以下に記載）と共に共発現させて、四量体の抗体を形成させた。また、ＣＤ１６Ａに対する該抗体の結合性を測定して、アミノ酸置換の効果をｈｕ３Ｇ８ＶＨ−１のＶＨドメインと比較して評価した。ＶＨドメインがｈｕ３Ｇ８ＶＨ−１、２、３、４、５、８、１２、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、４２、４３、４４および４５の配列を有する構築物は高親和結合性を示し、ｈｕ３Ｇ８ＶＨ−６および−４０のＶＨドメインは中間の結合性を示した。ｈｕ３Ｇ８ＶＨ−５およびｈｕ３Ｇ８ＶＨ−２２（それぞれ、配列番号７１および配列番号７２）のＶＨドメインを含むＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、特に好ましい結合性質を有すると考えられる。
【０１８７】
５．１．２．２  ＶＬ領域
好ましい結合特性を有する軽鎖可変ドメイン配列を同定するために同様の研究を行った。一の態様において、本発明は、以下のような軽鎖可変ドメインを含むＣＤ１６Ａ結合タンパク質を提供する。このドメインでは、少なくとも１つのＣＤＲ（通常は３つのＣＤＲ）が、マウスモノクローナル抗体３Ｇ８軽鎖の１つのＣＤＲ（通常は３つすべてのＣＤＲ）の配列を有し、該結合タンパク質の残りの部分は実質的にヒトの配列を有する（ヒト抗体の軽鎖可変領域に由来し、実質的にそれに類似する）。
【０１８８】
一の態様において、本発明は、実質的にヒトのフレームワーク中に３Ｇ８抗体由来のＣＤＲを含むヒト化３Ｇ８抗体のフラグメントであって、軽鎖可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲがマウスモノクローナル抗体３Ｇ８の軽鎖ＣＤＲと配列において異なる、上記抗体フラグメントを提供する。一の実施形態で、ＣＤＲは１以上のアミノ酸置換、例えば表２で示した１以上の置換（例えば、ＣＤＲ１の２４位のアルギニン；ＣＤＲ１の２５位のセリン；ＣＤＲ１の３２位のチロシン；ＣＤＲ１の３３位のロイシン；ＣＤＲ２の５０位のアスパラギン酸、トリプトファンもしくはセリン；ＣＤＲ２の５３位のセリン；  ＣＤＲ２の５５位のアラニンもしくはグルタミン；ＣＤＲ２の５６位のスレオニン；ＣＤＲ３の９３位におけるセリン；および／またはＣＤＲ３の９４位のスレオニン）をＣＤＲ中に少なくとも有することで、３Ｇ８配列とは異なっている。様々な実施形態で、可変ドメインは、このような置換を０、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上有し（多くの場合、１〜４つの前記置換）、任意でさらなる置換をも有することができる。
【０１８９】
実施形態の１つにおいて、適当なＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、Ｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１（配列番号７３）構築物のＶＬドメインと同一のまたは類似する軽鎖可変ドメイン配列を含むことができる。この配列を表６に示す。例えば、本発明は、（１）表５に記載した、０、１またはそれ以上のＣＤＲ置換によりＨｕ３Ｇ８ＶＬ−１（配列番号７３）のＶＬドメインとは異なり、（２）表５に記載した、０、１またはそれ以上のフレームワーク置換によりＨｕ３Ｇ８ＶＬ−１のＶＬドメインとは異なり、（３）残りの位置でＨｕ３Ｇ８ＶＬ−１のＶＬ配列（配列番号７３）と少なくとも約８０％同一である、多くの場合少なくとも約９０％、時には少なくとも約９５％同一である、または少なくとも約９８％も同一である、配列を有するＶＬドメインを含むＣＤ１６Ａ結合タンパク質を提供する。
【０１９０】
【表５】
0005718637.tif 000018
【０１９１】
【表６−１】
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【０１９２】
【表６−２】
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【０１９３】
【表６Ｂ−１】
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【０１９４】
【表６Ｂ−２】
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【０１９５】
【表６Ｃ】
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【０１９６】
【表６Ｄ−１】
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【０１９７】
【表６Ｄ−２】
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【０１９８】
【表６Ｅ】
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【０１９９】
【表６Ｆ−１】
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【０２００】
【表６Ｆ−２】
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【０２０１】
【表６Ｇ】
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【０２０２】
【表６Ｈ】
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本発明のＣＤ１６結合タンパク質の典型的なＶＬドメインは、表５および６で示すように、３Ｇ８ＶＬ、Ｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１またはＨｕ３Ｇ８ＶＬ−４３の配列（それぞれ、配列番号８４、配列番号７３および配列番号７４）を有する。３Ｇ８ＶＬ（配列番号８４）およびＨｕ３Ｇ８ＶＬ−１（配列番号７３）をコードする典型的なヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号８５および配列番号８６に示す。
【０２０３】
ＶＬドメインは、表２で示した置換の０、１、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つまたは少なくとも９つによってＨｕ３Ｇ８ＶＬ−１の配列（配列番号７３）とは異なる配列をもつことができる。これらの置換は、ＣＤ１６Ａに対する親和性の増加をもたらし、および／またはヒトに投与した場合にＣＤ１６Ａ結合タンパク質の免疫原性を減じると考えられる。いくつかの実施形態で、残りの位置の配列同一性の程度は、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％である。
【０２０４】
限定ではなく例示として、多数のＣＤ１６Ａ結合タンパク質のＶＬドメイン配列を表６に示す。ヒトＣκ定常ドメインと融合させたこれらの配列を含む軽鎖を、Ｈｕ３Ｇ８ＶＨ重鎖（上記）と共発現させ、四量体の抗体を形成させた。また、ＣＤ１６Ａに対する該抗体の結合性を測定して、アミノ酸置換の効果をＨｕ３Ｇ８ＶＬ−１のＶＬドメイン（配列番号７３）と比較して評価した。ＶＬドメインがｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１、２、３、４、５、１０、１６、１８、１９、２１、２２、２４、２７、２８、３２、３３、３４、３５、３６、３７、および４２の配列を有する構築物は高親和結合性を示した。また、ｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１５、１７、２０、２３、２５、２６、２９、３０、３１、３８、３９、４０および４１は中間の結合性を示した。ｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１、ｈｕ３Ｇ８ＶＬ−２２およびｈｕ３Ｇ８ＶＬ−４３（それぞれ、配列番号７３、配列番号７５および配列番号７４）のＶＬドメインを含むＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、特に好ましい結合性質を有すると考えられている。
【０２０５】
５．１．２．２．１  ＶＬおよび／またはＶＨドメインの組合せ
当該分野では公知であり、また本明細書の他の箇所でも記載したように、免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、それらの鎖が結合してダイアボディを産生する条件下で、組換え技術によって発現させることができ、またｉｎ  ｖｉｔｒｏでそのように組み合わせることができる。したがって、本明細書で記載した３Ｇ８由来のＶＬドメインを本明細書に記載した３Ｇ８由来のＶＨドメインと組み合わせて、ＣＤ１６Ａ結合性ダイアボディを作製することができ、そのような組合せのすべてが意図されていることがわかるであろう。
【０２０６】
限定ではなく例示として、有用なＣＤ１６Ａダイアボディの例は、少なくとも１つのＶＨドメインと少なくとも１つのＶＬドメインを含むダイアボディであり、そのＶＨドメインがｈｕ３Ｇ８ＶＨ−１、ｈｕ３Ｇ８ＶＨ−２２またはｈｕ３Ｇ８ＶＨ−５（それぞれ、配列番号７０、配列番号７２および配列番号７１）に由来し、またＶＬドメインがｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１、ｈｕ３Ｇ８ＶＬ−２２またはｈｕ３Ｇ８ＶＬ−４３（それぞれ、配列番号７３、配列番号７５および配列番号４３）に由来する。特に、ｈｕ３Ｇ８ＶＨ−２２（配列番号２２）とｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１、ｈｕ３Ｇ８ＶＬ−２２またはｈｕ３Ｇ８ＶＬ−４３（それぞれ、配列番号７３、配列番号７２および配列番号７３）、またはｈｕ３Ｇ８ＶＨ−５（配列番号７１）とｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１（配列番号７３）を含むヒト化抗体は、好ましい性質を有する。
【０２０７】
本明細書に記載したＶＬおよびＶＨドメインの配列を、当該分野で公知の方法、例えば親和性成熟等（Ｓｃｈｉｅｒら、（１９９６年）「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｉｃｏｍｏｌａｒ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ａｎｔｉ−Ｃ−ＥｒｂＢ−２  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  Ｂｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ」、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２６３巻、５５１〜５６７頁、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、（１９９８年）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  １１巻、８２５〜８３２頁、Ｂｏｄｅｒら、（１９９７年）「Ｙｅａｓｔ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｆｏｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５巻、５５３〜５５７頁、Ｂｏｄｅｒら、（２０００年）「Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  Ｆｅｍｔｏｍｏｌａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ」、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ  ９７巻、１０７０１〜１０７０５頁、Ｈｕｄｓｏｎら、（２００３年）「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９巻、１２９〜３９頁を参照されたい）によって、さらに改変することができることは、当業者であれば十分理解できるであろう。例えば、ＣＤ１６Ａ結合タンパク質を、親和性成熟技術を用いて改変し、ＣＤ１６Ａに対する親和性の増加したおよび／またはＣＤ１６Ｂに対する親和性の低下したタンパク質を同定することができる。
【０２０８】
典型的なＣＤ１６結合タンパク質の１つは、マウス３Ｇ８抗体である。ヒト化３Ｇ８のＶＨおよびＶＬドメインを含むアミノ酸配列を図２、９、１４に記載し、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３および配列番号７４で示す。
【０２０９】
５．２  Ｆｃ領域またはその一部を含むダイアボディ
本発明は、Ｆｃドメインまたはその一部（例えば、ＣＨ２もしくはＣＨ３ドメイン）を含むダイアボディ分子を包含する。いくつかの実施形態で、Ｆｃドメインまたはその一部は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃ領域（例えばＣＨ２もしくはＣＨ３）の１以上の定常ドメインを含む。他の実施形態で、本発明は、Ｆｃドメインまたはその一部を含む分子を包含し、ここで、前記Ｆｃドメインまたはその一部は、匹敵する野生型Ｆｃドメインまたはその一部に対して少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、置換）を含んでいる。変異型Ｆｃドメインは当該分野ではよく知られており、前記変異型Ｆｃドメインを含む抗体の表現型（当該分野で周知の結合活性解析法またはエフェクター機能解析法のいずれか、例えばＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ解析もしくはＡＤＣＣ等でアッセイされる）を変えるのに主として用いられる。このような変異型Ｆｃドメインまたはその一部は、Ｆｃドメイン（またはその一部）を含む本発明のダイアボディ分子によって示されるエフェクター機能（例えばＮＫ依存的もしくはマクロファージ依存的アッセイ等で機能的にアッセイされる）を付与するまたは改変することにより、本発明において使用される。エフェクター機能を改変すると同定されたＦｃドメイン変異体は、国際公開ＷＯ  ０４／０６３３５１号、米国特許出願公開第２００５／００３７０００号および同第２００５／００６４５１４号、２００４年１１月１０日に出願された米国仮出願第６０／６２６，５１０号、２００４年１２月１５日に出願された同第６０／６３６，６６３号および２００６年３月１０日に出願された同第６０／７８１，５６４号、ならびに本発明者の同時出願である２００５年１１月１０日に出願された米国特許出願第１１／２７１，１４０号および２００５年１２月１５日に出願された同第１１／３０５，７８７号中に開示されている。これらはいずれも参照としてそのすべてを本明細書中に組み入れる。
【０２１０】
他の実施形態で、本発明は、当該分野で知られるあらゆるＦｃ変異体の使用も包含する。例えば、Ｄｕｎｃａｎら、（１９８８年）「Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｏｎ．  ＩｇＧ」、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２巻、５６３〜５６４頁、Ｌｕｎｄら、（１９９１年）「Ｈｕｍａｎ  Ｆｃ  Ｇａｍｍａ  ＲＩ  Ａｎｄ  Ｆｃ  Ｇａｍｍａ  ＲＩＩ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ  Ｗｉｔｈ  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｂｕｔ  Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  Ｓｉｔｅｓ  Ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４７巻、２６５７〜２６６２頁、Ｌｕｎｄら、（１９９２年）「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅｓ  Ｏｎ  Ｔｈｅ  ＣＨ２  Ｄｏｍａｉｎ  Ｏｆ  ＩｇＧ  Ｆｏｒ  Ｍｏｕｓｅ  Ｆｃ  Ｇａｍｍａ  ＲＩＩ」、Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２９巻、５３〜５９頁、Ａｌｅｇｒｅら、（１９９４年）「Ａ  Ｎｏｎ−Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  “Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ”  Ａｎｔｉ−ＣＤ３  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｔａｉｎｓ  Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ」、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５７巻、１５３７〜１５４３頁、Ｈｕｔｃｈｉｎｓら、（１９９５年）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，  Ｔｕｍｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，  Ａｎｄ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  Ｉｎ  Ｍｉｃｅ  Ｗｉｔｈ  Ａ  Ｇａｍｍａ  ４  Ｖａｒｉａｎｔ  Ｏｆ  Ｃａｍｐａｔｈ−ＩＨ」、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９２巻、１１９８０〜１１９８４頁、Ｊｅｆｆｅｒｉｓら、（１９９５年）「Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｓｉｔｅｓ  Ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ｆｏｒ  Ｆｃ  Ｇａｍｍａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：  Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  Ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．、４４巻、１１１〜１１７頁、Ｌｕｎｄら、（１９９５年）「Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  Ｉｎ  ＩｇＧ  Ｃａｎ  Ｍｏｄｕｌａｔｅ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｂｙ  Ｆｃ  Ｇａｍｍａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ９巻、１１５〜１１９頁、Ｊｅｆｆｅｒｉｓら、（１９９６年）「Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｆｃ（Ｇａｍｍａ）Ｒ  Ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｂｙ  ＩｇＧ３−Ｃｏｒｅ  Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  ５４巻、１０１〜１０４頁、Ｌｕｎｄら、（１９９６年）「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  Ｏｆ  Ｉｇｇ  Ｗｉｔｈ  Ｉｔｓ  Ｃｏｒｅ  Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  Ｃａｎ  Ｍｏｄｕｌａｔｅ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｂｙ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｃ  Ｇａｍｍａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｉ  Ａｎｄ  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  Ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｏｆ  Ｉｔｓ  Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  Ｃｈａｉｎｓ」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５７巻、４９６３〜４９６９頁、Ａｒｍｏｕｒら、（１９９９年）「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ｍｏｌｅｃ��ｌｅｓ  Ｌａｃｋｉｎｇ  Ｆｃｇａｍｍａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｉ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ」、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２９巻、２６１３〜２６２４頁、Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、（２０００年）「Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  ＣＩＱ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｏｎ  Ｒｉｔｕｘａｎ，  Ａ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｗｉｔｈ  Ａ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｆｃ」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６４巻、４１７８〜４１８４頁、Ｒｅｄｄｙら、（２０００年）「Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  Ｏｆ  Ａ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＩｇＧ４  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ４」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６４巻、１９２５〜１９３３頁、Ｘｕら、（２０００年）「Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｆｉｖｅ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ＯＫＴ３  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｖａｒｉａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｃｅｌｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００巻、１６〜２６頁、Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、（２００１年）「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｗｉｔｈ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｔｏ  Ｒｅｃｒｕｉｔ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６６巻、２５７１〜２５７５頁、Ｓｈｉｅｌｄｓら、（２００１年）「Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｆｏｒ  Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ＲＩ，  Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ＲＩＩ，  Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ＲＩＩＩ，  Ａｎｄ  ＦｃＲｎ  Ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｏｆ  ＩｇＧ１  Ｖａｒｉａｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｔｏ  Ｔｈｅ  Ｆｃ  ｇａｍｍａ  Ｒ」、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６巻、６５９１〜６６０４頁、Ｊｅｆｆｅｒｉｓら、（２００２年）「Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｉｔｅｓ  Ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ−Ｆｃ  Ｆｏｒ  ＦｃｇａｍｍａＲ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｏｄｅｌｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  ８２巻、５７〜６５頁、Ｐｒｅｓｔａら、（２００２年）「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ  ３０巻、４８７〜４９０頁；米国特許第５，６２４，８２１号；米国特許第５，８８５，５７３号；米国特許第６，１９４，５５１号；国際公開ＷＯ  ００／４２０７２号；国際公開ＷＯ  ９９／５８５７２号（いずれも参照としてそのすべてを本明細書中に組み入れる）で開示されたＦｃ変異体等が挙げられる。
【０２１１】
いくつかの実施形態で、Ｆｃ領域のアミノ酸に対する前記１以上の改変は、Ｆｃ領域の、したがって本発明のダイアボディ分子の、１以上のＦｃγＲ受容体に対する親和性および結合力を減じる。特定の実施形態で、本発明は、変異型Ｆｃ領域もしくはその一部を含むダイアボディを包含し、ここで、前記変異型Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、変異型Ｆｃドメインのみが１つのＦｃγＲと結合し、該ＦｃγＲがＦｃγＲＩＩＩＡである。他の特定の実施形態で、本発明は、変異型Ｆｃ領域もしくはその一部を含むダイアボディを包含し、ここで、前記変異型Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、変異型Ｆｃ領域のみが１つのＦｃγＲと結合し、該ＦｃγＲがＦｃγＲＩＩＡである。他の特定の実施形態で、本発明は、変異型Ｆｃ領域もしくはその一部を含むダイアボディを包含し、ここで、前記変異型Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、変異型Ｆｃ領域のみが１つのＦｃγＲと結合し、該ＦｃγＲがＦｃγＲＩＩＢである。いくつかの実施形態で、本発明は、変異型Ｆｃドメインを含む分子を包含し、ここで、前記変異体は、当業者に公知であり、また本明細書に記載された方法を用いて測定したときに、Ｆｃドメインを含まない分子もしくは野生型Ｆｃドメインを含む分子と比較して、ＡＤＣＣ活性の増加および／またはＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）に対する結合増加を付与するか、または仲介する。別の実施形態で、本発明は変異型Ｆｃドメインを含む分子を包含し、ここで、前記変異体は、当業者に公知で、かつ本明細書に記載された方法を用いて測定したときに、Ｆｃドメインを含まないもしくは野生型Ｆｃドメインを含む分子と比較して、ＡＤＣＣ活性（もしくは他のエフェクター機能）の低下および／またはＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）への結合増大を付与するか、または仲介する。
【０２１２】
本発明はまた、２以上のＩｇＧアイソタイプに由来するドメインまたは領域を含むＦｃドメインの使用を包含する。当該分野で知られているように、Ｆｃ領域のアミノ酸改変は、Ｆｃを介するエフェクター機能および／または結合活性に大きな影響を及ぼし得る。しかし、機能特性のこうした改変は、選択したＩｇＧアイソタイプという背景で行う場合、さらに洗練され、かつ／または操作され得る。同様に、Ｆｃアイソタイプの天然の特性は、１以上のアミノ酸改変により操作することができる。複数のＩｇＧアイソタイプ（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）は、ヒンジおよび／またはＦｃドメインのアミノ酸配列の違いゆえに、異なった物理学的および機能的性質、例えば血中半減期、補体結合、ＦｃγＲ結合親和性、およびエフェクター機能活性（例えばＡＤＣＣ、ＣＤＣ）を示す。いくつかの実施形態で、所望の特徴をもつダイアボディを設計するために、アミノ酸改変およびＩｇＧ  Ｆｃ領域は、それらのそれぞれの個別の結合性および／またはエフェクター機能活性に基づいて、独立に選択される。大抵の実施形態では、前記アミノ酸改変およびＩｇＧヒンジ／Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１という状況において本明細書に記載されまたは当該分野で公知であるような結合性および／またはエフェクター機能活性に関して別々にアッセイされている。いくつかの実施形態で、前記アミノ酸改変およびＩｇＧヒンジ／Ｆｃ領域は、ダイアボディ分子または他のＦｃ含有分子（例えば免疫グロブリン）という状況においてＦｃγＲ結合性またはエフェクター機能について別々にアッセイしたとき、類似の機能性、例えばＦｃγＲＩＩＡに対する親和性の増加等を示す。前記アミノ酸改変と選択したＩｇＧ  Ｆｃ領域の組み合わせは、その後、相加的にまたはより好ましくは相乗的に作用して、野生型Ｆｃ領域を含む本発明のダイアボディ分子と比較して、本発明のダイアボディ分子の前記機能性を改変する。他の実施形態において、前記アミノ酸改変およびＩｇＧのＦｃ領域は、本明細書に記載したまたは当該分野で公知の野生型Ｆｃ領域を含むダイアボディ分子もしくは他のＦｃ含有分子（例えば、免疫グロブリン）という状況においてＦｃγＲ結合性および／またはエフェクター機能について別個にアッセイしたとき、相反する機能性、例えばＦｃγＲＩＩＡに対する親和性のそれぞれ増加および低下を示す。前記「相反する」アミノ酸改変および選択したＩｇＧ領域の組合せは、Ｆｃ領域を含まないまたは同一アイソタイプの野生型Ｆｃ領域を含む本発明のダイアボディと比較すると、本発明のダイアボディの特異的機能性を選択的に弱めるまたは減少させるように作用する。あるいはまた、本発明は、新規の性質を示す、当該分野で公知のアミノ酸改変と選択したＩｇＧ領域との組合せを含む変異型Ｆｃ領域を包含する。かかる性質は、前記改変および／または領域を本明細書で記載したように独立にアッセイした場合には検出不能である。
【０２１３】
複数のＩｇＧアイソタイプ、およびそのドメインの機能特性は、当該分野では周知である。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のアミノ酸配列を、図１Ａ〜１Ｂに示す。本発明の方法に用いる特定のＩｇＧアイソタイプに由来する２以上のドメインの選択および／または組合せは、ＦｃγＲに対する親和性を含めて、親アイソタイプのいずれかの既知パラメーターを基にすることができる（表７；  Ｆｌｅｓｃｈら、（２０００年）「Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ」、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｌａｂ．  Ａｎａｌ．、１４巻、１４１〜１５６頁、Ｃｈａｐｐｅｌら、（１９９３年）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｆｃ  Ｇａｍｍａ  ＲＩ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｗｉｔｈｉｎ  Ａ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ」、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、３３巻、２５１２４〜２５１３１頁、Ｃｈａｐｐｅｌら、（１９９１年）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｃ  Ｇａｍｍａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｃｌａｓｓ  Ｉ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＩｇＧ１／ＩｇＧ２  Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｎｄ  Ｐｏｉｎｔ−Ｍｕｔａｔｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８巻、９０３６〜９０４０頁いずれも参照としてそのすべてを本明細書中に援用する）。例を挙げると、ＦｃγＲＩＩＢへの限定された結合を示すか、またはＦｃγＲＩＩＢへの結合を示さないＩｇＧアイソタイプ（例えばＩｇＧ２またはＩｇＧ４）に由来する領域もしくはドメインの使用は、活性化受容体への結合を最大にし、抑制性受容体への結合を最小にするようにダイアボディを操作することが望れる場合に、特に有用である。同様に、Ｃ１ｑまたはＦｃγＲＩＩＩＡと優先的に結合することが知られる、例えばＩｇＧ３（Ｂｒｕｅｇｇｅｍａｎｎら、（１９８７年）「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  Ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ａ  Ｍａｔｃｈｅｄ  Ｓｅｔ  Ｏｆ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ  １６６巻、１３５１〜１３６１頁）等のＩｇＧアイソタイプに由来するＦｃ領域もしくはドメインの使用は、ＡＤＣＣを増強することが当該分野で知られるＦｃアミノ酸改変と組み合わせて、エフェクター機能活性（例えば、補体活性化またはＡＤＣＣ）が最大となるようにダイアボディ分子を操作することができる。
【０２１４】
【表７】
0005718637.tif 000031
５．３  分子結合体
本発明のダイアボディ分子を、異種ポリペプチド（すなわち、関連性のないポリペプチド、またはその一部、好ましくはそのポリペプチドの少なくとも１０アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも７０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも９０アミノ酸もしくは少なくとも１００アミノ酸）と、組換えによって融合させて、または化学的に結合（共有結合、非共有結合の両方を含む）させて、融合タンパク質を作製することができる。融合は、必ずしも直接的である必要はないが、リンカー配列を介して起こり得る。
【０２１５】
さらに、本発明のダイアボディ分子（すなわち、ポリペプチド）は、治療薬または所与の生物学的応答を改変する薬剤成分と結合することができる。直接的な結合に代わるものとして、本発明の多価（例えば四価）のダイアボディ分子上の複数のエピトープ結合部位により、ダイアボディの少なくとも１つの結合領域は、ダイアボディの結合に影響することなく、治療薬または所望の薬剤成分と結合するようにデザインすることができる。
【０２１６】
治療薬または薬剤成分は、古典的な化学治療薬であるとは限らない。例えば、薬剤成分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。このようなタンパク質としては以下が含まれる：アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素（すなわち、ＰＥ−４０）またはジフテリア毒素等の毒素、リシン、ゲロニンおよびポークウィード（ｐｏｋｅｗｅｅｄ）抗ウイルスタンパク質、例えば、腫瘍壊死因子、αインターフェロン（ＩＦＮ−α）およびβインターフェロン（ＩＦＮ−β）を含むがこれらに限定はしないインターフェロン、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、アポトーシス剤（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、国際公開ＷＯ  ９７／３３８９９号に記載のＡＩＭ  Ｉ）、ＡＩＭ  ＩＩ（国際公開ＷＯ  ９７／３４９１１号参照）、Ｆａｓリガンド、およびＶＥＧＩ（国際公開ＷＯ  ９９／２３１０５号）等のタンパク質、血栓剤もしくは血管新生阻害剤（例えば、アンジオスタチンもしくはエンドスタチン）、または例えばリンホカイン（例えば、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ））、または成長因子（例えば、成長ホルモン（ＧＨ））のような生物学的応答改変物質、プロテアーゼ、あるいはリボヌクレアーゼ。
【０２１７】
本発明のダイアボディ分子（すなわち、ポリペプチド）を、例えば精製を容易にするペプチド等のマーカー配列と融合させることができる。好ましい実施形態において、マーカーアミノ酸配列はヘキサヒスチジンペプチドであり、例えば、市販品の数ある中でも特にｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，  Ｉｎｃ．、９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、９１３１１）中にて提供されるタグが挙げられる。Ｇｅｎｔｚらが（１９８９年）「Ｂｉｏａｓｓａｙ  Ｆｏｒ  Ｔｒａｎｓ−Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ  ＴＡＴ−Ｅｎｃｏｄｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：  Ｔｒａｎｓ−Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｍＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８６巻、８２１〜８２４頁で記載しているように、例えば、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグには、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質のエピトープに相当するヘマグルチニン「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、（１９８４年）「Ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎ  Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  Ｉｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｃｅｌｌ、３７巻、７６７〜７７８頁）、および「Ｆｌａｇ」タグ（Ｋｎａｐｐｉｋら、（１９９４年）「Ａｎ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｔａｇ  Ｂａｓｅｄ  Ｏｎ  Ｔｈｅ  ＦＬＡＧ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１７巻（４号）、７５４〜７６１頁、１９９４年）が含まれるが、これらに限られない。
【０２１８】
さらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エクソンシャッフリングおよび／またはコドンシャッフリング（正確には「ＤＮＡシャッフリング」と呼ばれる）の技術を介して作製することができる。ＤＮＡシャッフリングを使用して、本発明の分子の活性（例えば、より高い親和性とより低い解離速度をもったエピトープ結合部位）を変えることができる。一般には、米国特許第５，６０５，７９３号；第５，８１１，２３８号；第５，８３０，７２１号；第５，８３４，２５２号；および第５，８３７，４５８号、ならびにＰａｔｔｅｎら、（１９９７年）「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｏｆ  ＤＮＡ  Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  Ｔｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８巻、７２４〜７３３頁、Ｈａｒａｙａｍａ、（１９９８年）「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂｙ  ＤＮＡ  Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６巻、７６〜８２頁、Ｈａｎｓｓｏｎら、（１９９９年）「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  Ｉｎ  Ｍｕ  Ｃｌａｓｓ  Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  Ｐｒｏｂｅｄ  Ｂｙ  ＤＮＡ  Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２８７巻、２６５〜２７６頁、Ｌｏｒｅｎｚｏら、（１９９８年）「ＰＣＲ−Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ」、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４巻、３０８〜３１３頁（いずれも参照としてそのすべてを本明細書中に組み入れる）を参照されたい。本発明のダイアボディ分子、または本発明の分子をコードする核酸は、さらにエラープローン（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ法、ランダムヌクレオチド挿入法または他の方法を用いたランダム変異誘発により、組換え前に改変することができる。本発明の分子をコードするポリヌクレオチドの１以上の部分を、１以上の異種分子の１以上の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片等と組み換えることができる。
【０２１９】
また、本発明は、診断薬もしくは治療薬、または他のいずれかの分子（血中半減期の増加／減少が望まれる分子および／または細胞の特定の小集団を標的とする分子）と結合した、またはそれらを免疫特異的に認識する本発明のダイアボディ分子も包含する。本発明の分子を診断に使用して、例えば、疾患、障害、または感染の発生もしくは進行を臨床試験の一環としてモニターして、例えば所与の治療計画の効果を測定することができる。本発明の分子を検出可能な物質と結合させることにより、または検出可能な物質を免疫特異的に認識する分子により、検出を容易にすることができる。検出可能な物質の例には、各種酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、陽電子放出金属、および非放射性常磁性金属イオンが含まれる。検出可能な物質は、本発明の分子と直接的に、もしくは媒介物質（例えば、当該分野で公知のリンカー）を介して間接的に、当該分野で公知の方法を用いて連結または結合することができる。あるいは、当該分子が検出可能な物質を免疫特異的に認識する（すなわち、前記物質と免疫特異的に結合する）ことができる。例えば、本発明の診断薬として用いるための抗体と結合させることができる金属イオンについては、米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。前記診断および検出は、検出可能な物質を免疫特異的に認識するように該分子をデザインするか、または本発明の分子を検出可能な物質と連結することにより、達成することができる。ここで検出可能な物質は、限定はしないが、各種酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼ（ただし、これらに限定はしない）；ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン等の補欠分子族複合体（ただし、これらに限定はしない）；ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリン等の蛍光物質（ただし、これらに限定しない）、ルミノール等の発光物質（ただし、これに限定しない）、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリン等の生物発光物質（ただし、これらに限定しない）、ビスマス（２１３Ｂｉ）、炭素（１４Ｃ）、クロム（５１Ｃｒ）、コバルト（５７Ｃｏ）、フッ素（１８Ｆ）、ガドリニウム（１５３Ｇｄ、１５９Ｇｄ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、ゲルマニウム（６８Ｇｅ）、ホルミウム（１６６Ｈｏ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、ランタン（１４０Ｌａ）、ルテチウム（１７７Ｌｕ）、マンガン（５４Ｍｎ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、亜リン酸（３２Ｐ）、プラセオジム（１４２Ｐｒ）、プロメチウム（１４９Ｐｍ）、レニウム（１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ）、ロジウム（１０５Ｒｈ）、ルテニウム（９７Ｒｕ）、サマリウム（１５３Ｓｍ）、スカンジウム（４７Ｓｃ）、セレン（７５Ｓｅ）、ストロンチウム（８５Ｓｒ）、硫黄（３５Ｓ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、スズ（１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ���、トリチウム（３Ｈ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、イッテルビウム（１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ）、イットリウム（９０Ｙ）、亜鉛（６５Ｚｎ）等の放射性物質（ただし、これらに限定しない）、様々な陽電子放射断層撮影で用いられる陽電子放出金属、ならびに非放射性常磁性金属イオンを含む。
【０２２０】
本発明のダイアボディ分子は、細胞毒素（例えば、細胞増殖抑制剤もしくは殺細胞剤）、治療剤、または放射性元素（例えば、α放射体、γ放射体等）のような治療成分を免疫特異的に認識するか、またはそれと結合することができる。細胞毒素または細胞毒性剤は細胞に有害などんな薬剤をも包含する。例として、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアンスラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎ  ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−ジハイドロテストステロン、糖コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびプロマイシンまたはそれらの類似体または同族体を含む。治療剤は、限定はしないが、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、ダカルバジン））、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣおよびシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン類（例えば、ダウノルビシン（かつてのダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗体（例えば、ダクチノマイシン（かつてのアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアンスラマイシン（ＡＭＣ）、ならびに有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）を含む。
【０２２１】
さらに、本発明のダイアボディ分子は、治療成分、例えば放射性物質または放射性金属イオンと結合させるのに有用な大環状キレート剤と結合させるか、またはそれを免疫特異的に認識するようにデザインすることができる（放射性物質の上記例を参照されたい）。いくつかの実施形態で、大環状キレート剤は、リンカー分子を介してポリペプチドに結合することのできる１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）である。前記リンカー分子は、当該分野で普通に知られており、Ｄｅｎａｒｄｏら、（１９９８年）「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ｏｆ  １，４，７，１０−Ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”‘−Ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ  （ＤＯＴＡ）−Ｐｅｐｔｉｄｅ−ＣｈＬ６，  Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｗｉｔｈ  Ｃａｔａｂｏｌｉｚａｂｌｅ  Ｌｉｎｋｅｒ，  Ｔｏ  ２−Ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ−２−［ｐ−（ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｂｅｎｚｙｌ］−ＤＯＴＡ−ＣｈＬ６  Ｉｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ」、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、４巻、２４８３〜２４９０頁、Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、（１９９９年）「Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｓ  Ｆｒｏｍ  Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．、１０巻、５５３頁、およびＺｉｍｍｅｒｍａｎら、（１９９９年）「Ａ  Ｔｒｉｇｌｙｃｉｎｅ  Ｌｉｎｋｅｒ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｕｐｔａｋｅ  Ａｎｄ  Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  Ｏｆ  ６７−Ｃｕ−Ｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉ−Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍＡｂ  ｃｈＣＥ７  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」、Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  ２６巻、９４３〜９５０頁にも記載されている。これらはいずれも参照としてそのすべてを本明細書中に援用する。
【０２２２】
前記治療成分を、例えばＦｃドメインを含めて、ポリヌクレオチドと結合させる方法は周知である。例えば、Ａｒｎｏｎら“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、１９８５年、２４３〜５６頁、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  （２ｎｄ  Ｅｄ．）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、１９８７年、６２３〜５３頁、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」、ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４年：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、１９８５年、４７５〜５０６頁、「Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｒｅｓｕｌｔｓ，  Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、１９８５年、３０３〜１６頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；ａｎｄ  Ｔｈｏｒｐｅら、（１９８２年）「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．、６２巻、１１９〜５８頁、１９８２年を参照されたい。
【０２２３】
本発明のダイアボディ分子は、当該分子と結合した治療成分と共にもしくは治療成分なしで投与してもよいし、単独で投与してもよいし、または治療処置用の細胞毒性因子および／またはサイトカインと組み合わせて投与してもよい。単独で投与する場合、多価の、例えば四価のダイアボディ分子の少なくとも１つのエピトープは、治療薬（例えば、細胞毒性因子および／またはサイトカイン）を免疫特異的に認識するように設計できる。この治療薬は、本発明の分子と同時に、またはそれに続いて投与することができる。このように、ダイアボディ分子は、直接的な結合と類似した方法で治療薬を特異的に標的とすることができる。あるいはまた、本発明の分子を抗体に結合させて、Ｓｅｇａｌが米国特許第４，６７６，９８０号に記載しているように抗体ヘテロ結合体を形成させることができる。この文献は、参照としてそのすべてを本明細書中に組み入れる。本発明のダイアボディ分子は、固相支持体に結合することもできる。これは、特に標的抗原のイムノアッセイまたは精製に有用である。このような固相支持体は、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンを含むが、これらに限定はされない。
【０２２４】
５．４  ダイアボディ分子の結合の性状解析
本発明のダイアボディ分子は、各種方法で性状解析することができる。特に、本発明の分子は、例えばＦｃＲＩＩＩＡもしくはＦｃＲＩＩＢ等の抗原と免疫特異的に結合する能力について、または当該分子がＦｃドメイン（もしくはその一部）を含む場合には、Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用（すなわち、Ｆｃドメイン（もしくはその一部）のＦｃγＲへの特異的結合）を示す能力について、アッセイすることができる。前記アッセイは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、（１９９２年）「Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１３巻、４１２〜４２１頁、１９９２年）、ビーズ上で（Ｌａｍ  （１９９１年）「Ａ  Ｎｅｗ  Ｔｙｐｅ  Ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｌｉｇａｎｄ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ」、Ｎａｔｕｒｅ、３５４巻、８２〜８４頁、１９９１年）、チップ上で（Ｆｏｄｏｒ  （１９９３年）「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｓｓａｙｓ  Ｗｉｔｈ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｉｐｓ」、Ｎａｔｕｒｅ、３６４巻、５５５〜５５６頁）、細菌上で（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子上で（米国特許第５，５７１，６９８号、第５，４０３，４８４号および第５，２２３，４０９号）、プラスミド上で（Ｃｕｌｌら、（１９９２年）「Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｆｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｌａｒｇｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｔｏ  Ｔｈｅ  Ｃ  Ｔｅｒｍｉｎｕｓ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｌａｃ  Ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ」、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻、１８６５〜１８６９頁）、またはファージ上で（Ｓｃｏｔｔら、（１９９０年）「Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  Ｆｏｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｗｉｔｈ  Ａｎ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻、３８６〜３９０頁、Ｄｅｖｌｉｎ  （１９９０年）「Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：  Ａ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｏｆ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻、４０４〜４０６頁、Ｃｗｉｒｌａら、（１９９０年）「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｏｎ  Ｐｈａｇｅ：  Ａ  Ｖａｓｔ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｌｉｇａｎｄｓ」、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８７巻、６３７８〜６３８２頁、およびＦｅｌｉｃｉ  （１９９１年）「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｆｒｏｍ  Ａ  Ｌａｒｇｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｏｎ  Ａ  Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  Ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ」、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２２巻、３０１〜３１０頁）（これらの文献は、参照としてそのすべてを本明細書中に組み入れる）実施することができる。抗原に免疫特異的に結合することが同定されている分子、例えばＦｃγＲＩＩＩＡは、その後、抗原に対する特異性および親和性についてアッセイすることができる。
【０２２５】
複数のエピトープ結合ドメインを含むように作製した本発明の分子は、１以上の抗原（例えば、癌抗原）に対する免疫特異的な結合性および他の抗原（ＦｃγＲ）との交差反応性について、またはその分子がＦｃドメイン（もしくはその一部）を含む場合にはＦｃ−ＦｃγＲ相互作用について、当該分野で公知のいずれかの方法によってアッセイすることができる。免疫特異的結合、交差反応性、およびＦｃ−ＦｃγＲ相互作用を解析するために用いることができるイムノアッセイ法には、ウェスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ法、ＥＬＩＳＡ法（酵素結合免疫吸着解析法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ法、免疫沈降アッセイ法、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ法、凝集アッセイ法、補体結合アッセイ法、イムノラジオメトリック法、蛍光イムノアッセイ法、プロテインＡイムノアッセイ法等と、ほんの数例ではあるが、これらの技術を用いた競合および非競合アッセイ系が含まれる。ただし、これらの技術に限定はしない。前記アッセイ法は、当該分野では日常的に行われており、周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．  １、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。これらは参照によりそのすべてを本明細書中に援用する）。
【０２２６】
抗原−結合ドメインの相互作用、またはＦｃ−ＦｃγＲ相互作用の結合親和性および解離速度を競合結合アッセイ法によって測定することができる。競合結合アッセイ法の一例に、ラジオイムノアッセイ法がある。この方法は、標識された抗原、例えば四量体ＦｃγＲ（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ、セクション５．４．１を参照）と対象の分子（例えば、複数のエピトープ結合ドメインを含む本発明の分子）とを、四量体ＦｃγＲ（セクション５．４．１を参照）のような未標識エピトープの量を増加していきながら、インキュベーションし、標識抗原に結合した該分子を検出することを含む。抗原に対する本発明の分子の親和性および結合解離速度は、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ解析法による飽和率から測定することができる。
【０２２７】
抗原またはＦｃγＲに対する本発明の分子の親和性および結合特性は、初めに抗原−結合ドメインまたはＦｃ−ＦｃγＲ相互作用について当該分野では公知のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ法（生化学または免疫学に基づくアッセイ法）を用いて測定することができる。ここで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ法は、ＥＬＩＳＡ法、表面プラズモン共鳴解析法、免疫沈降アッセイ法を含むが、これらに限定はされない。また、本発明の分子の結合特性を、セクション５．４．２に記載したような１以上のＦｃγＲ介在エフェクター細胞機能を測定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能アッセイ法によって特徴付けすることが好ましい。最も好ましい実施形態において、本発明の分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏベースのアッセイにおける結合特性と同様の結合特性をｉｎ  ｖｉｖｏモデル（例えば、本明細書で記載し、かつ開示したもの）でも有する。しかし、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏベースのアッセイでは所望の表現型を示さないが、ｉｎ  ｖｉｖｏでは所望の表現型を示す本発明の分子を排除するものではない。
【０２２８】
いくつかの実施形態で、複数のエピトープ結合ドメイン、および任意でＦｃドメイン（もしくはその一部）を含む分子のスクリーニングおよび同定は、機能に基づくアッセイ法、好ましくは高速処理能力をもつ方法で行われる。機能に基づくアッセイ法は、例えば、本明細書中のセクション５．４．２および５．４．３に記載されているような、１以上のＦｃγＲ介在エフェクター細胞機能を特徴付けるための当該分野で公知のいずれかアッセイ法とすることができる。本発明の方法で使用できるエフェクター細胞機能の非限定的な例として、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性食作用、食作用、オプソニン化、オプソニン食作用、細胞結合性、ロゼット形成、Ｃ１ｑ結合、および補体依存性細胞を介した細胞毒性を含む。ただし、これらに限らない。
【０２２９】
ＢＩＡｃｏｒｅ動態解析を使用して、抗原またはＦｃγＲに対する本発明の分子の結合速度および解離速度を測定する実施形態が好ましい。ＢＩＡｃｏｒｅ動態解析は、抗原またはＦｃγＲの結合と解離を、固定した分子（例えば、それぞれエピトープ結合ドメインまたはＦｃドメイン（もしくはその一部）を含む分子）をその表面に担持したチップ上で解析することを含む。ＢＩＡｃｏｒｅ解析は、セクション５．４．３で説明する。
【０２３０】
当業者に公知のいずれかの方法を用いた蛍光活性化セルソーティング装置（ＦＡＣＳ）を、免疫学または機能に基づくアッセイ法に用いて、本発明の分子を性状解析することが好ましい。フローソーターは、本発明の分子によって結合された（例えばそれによってオプソニン化された）多数の細胞を個別に、かつ迅速に調べることができる（例えば１時間あたり１０００万〜１憶個の細胞）（Ｓｈａｐｉｒｏら、１９９５年、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）。さらに、ダイアボディの挙動を最適化するのに使用される特定のパラメーターには、限定はしないが、抗原濃度（すなわち、ＦｃγＲ四量体複合体、セクション５．４．１を参照）、動態競合時間、またはＦＡＣＳストリンジェンシーが含まれる。これらをそれぞれ変化させて、特異的な結合特性（例えば複数のエピトープへの同時結合）を示す本発明の分子を包含するダイアボディ分子を選択することができる。生体細胞を分取して調べるフローサイトメーターは、当該分野では周知である。公知のフローサイトメーターは、例えば、米国特許第４，３４７，９３５号；第５，４６４，５８１号；第５，４８３，４６９号；第５，６０２，０３９号；第５，６４３，７９６号；および第６，２１１，４７７号に記載されている。これらの文献の内容のすべては、参照として本明細書中に組み込まれる。他の公知のフローサイトメーターには、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙより市販されているＦＡＣＳ  ＶａｎｔａｇｅＴＭシステム、およびＵｎｉｏｎ  Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃａより市販されているＣＯＰＡＳＴＭシステムがある。
【０２３１】
標的抗原結合親和性またはＦｃ−ＦｃγＲ結合親和性の性状解析、および細胞表面上の標的抗原密度またはＦｃγＲ密度の評価は、当該分野で周知の方法、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄ解析法等により、またはメーカー使用説明書に従ったキット、例えばＱｕａｎｔｕｍＴＭ  Ｓｉｍｐｌｙ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ（Ｓｉｍｐｌｙ  Ｃｅｌｌｕｌａｒは登録商標）（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、Ｆｉｓｈｅｒｓ、ＩＮ）の使用により、行うことができる。１以上の機能アッセイは、当業者に公知のまたは本明細書中に記載したような１以上のＦｃγＲ介在エフェクター細胞機能を特徴付けるための当該分野で公知のいずれのアッセイでもよい。特定の実施形態で、複数のエピトープ結合ドメイン、および任意でＦｃドメイン（もしくはその一部）を含む本発明の分子は、１以上の標的抗原または１以上のＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ）への結合についてＥＬＩＳＡアッセイ法でアッセイされ、続いて１以上のＡＤＣＣアッセイでアッセイされる。いくつかの実施形態で、本発明の分子は、さらに表面プラズモン共鳴に基づいたアッセイ、例えばＢＩＡｃｏｒｅを用いてアッセイされる。表面プラズモン共鳴に基づいたアッセイは、当該分野では周知であるが、セクション５．４．３でさらに説明し、本明細書中でも例えば実施例６．１において例証される。
【０２３２】
最も好ましい実施形態で、複数のエピトープ結合ドメイン、および任意でＦｃドメイン（もしくはその一部）を含む本発明の分子は、さらに標的抗原（例えばＦｃγＲ）との相互作用またはＦｃ−ＦｃγＲ相互作用について動物モデルで特徴付けされる。Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用をアッセイする場合、本発明の方法で使用する上で好ましい動物モデルは、例えば、ヒトＦｃγＲを発現するトランスジェニックマウス、例えば米国特許第５，８７７，３９７号および第６，６７６，９２７号に記載されているいずれかのマウスモデルである。これらの文献は、参照としてそのすべてを本明細書中に組み入れる。さらに、前記方法で使用するトランスジェニックマウスは、限定はしないが、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡを担持しているＦｃγＲＩＩＩＡノックアウトヌードマウス；ヒトＦｃγＲＩＩＡを担持しているＦｃγＲＩＩＩＡノックアウトヌードマウス；ヒトＦｃγＲＩＩＢおよびヒトＦｃγＲＩＩＩＡを担持しているＦｃγＲＩＩＩＡノックアウトヌードマウス；ヒトＦｃγＲＩＩＢおよびヒトＦｃγＲＩＩＡを担持しているＦｃγＲＩＩＩＡノックアウトヌードマウス；ヒトＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＡを担持しているＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＡノックアウトヌードマウス、ならびにヒトＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢを担持しているＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢノックアウトヌードマウスを含む。
【０２３３】
５．４．１  ＦｃγＲを含む結合アッセイ
Ｆｃドメイン（もしくはその一部）を含む、および／またはＦｃγＲに特異的なエピトープ結合ドメインを含む分子によるＦｃγＲへの結合の特徴付けは、限定はしないがＦｃγＲの多型変異体を含めて、いずれのＦｃγＲを使用しても行うことができる。いくつかの実施形態では、１５８位にフェニルアラニンを含むＦｃγＲＩＩＩＡの多型変異体が使用される。他の実施形態では、１５８位にバリンを含むＦｃγＲＩＩＩＡの多型変異体を用いて特徴付けが行われる。ＦｃγＲＩＩＩＡ  １５８Ｖは、ＩｇＧ１に対して１５８Ｆよりも高い親和性、およびＡＤＣＣ活性の増加を示す（例えば、Ｋｏｅｎｅら、（１９９７年）「Ｆｃ  ｇａｍｍａＲＩＩＩａ−１５８Ｖ／Ｆ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｏｆ  ＩｇＧ  Ｂｙ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｆｃ  ｇａｍｍａＲＩＩＩａ，  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｃ  ｇａｍｍａＲＩＩＩａ−４８Ｌ／Ｒ／Ｈ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ」、Ｂｌｏｏｄ、９０巻、１１０９〜１４頁、Ｗｕら、（１９９７年）「Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  Ｏｆ  ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａ  （ＣＤ１６）  Ａｌｔｅｒｓ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｅｓ  Ｔｏ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １００巻、１０５９〜７０頁、いずれも参照としてそのすべてを本明細書中に組み入れる）。この残基は、実際ＩｇＧ１の下部ヒンジ領域と直接相互作用するが、このことはＩｇＧ１−ＦｃγＲＩＩＩＡの共結晶化研究によって最近明らかにされた（例えば、Ｓｏｎｄｅｒｍａｎら、（２０００年）「Ｔｈｅ  ３．２−Ａ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｆｃ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ−Ｆｃ  ｇａｍｍａＲＩＩＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ」、Ｎａｔｕｒｅ、４０６巻（６７９３号）、２６７〜２７３頁を参照されたい。この文献は参照としてそのすべてが本明細書中に援用される）。研究により、いくつかのケースにおいて、治療用抗体はＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｖホモ接合患者で向上した効果を有することが明らかとなった。例えば、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）は、ＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｆホモ接合患者と比べてＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｖホモ接合患者で、より治療効果があった（例えば、Ｃａｒｔｒｏｎら、（２００２年）「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｏｆ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ａｎｔｉ−ＣＤ２０  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｎｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  Ｉｎ  ＩｇＧ  Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩＡ  Ｇｅｎｅ」、Ｂｌｏｏｄ、９９巻（３号）、７５４〜７５８頁）を参照されたい）。他の実施形態で、この領域を含む治療用分子はまた、ＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８ＶおよびＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｆに関してヘテロ接合の患者において、ならびにＦｃγＲＩＩＩＡ−１３１Ｈをもつ患者でも、効果的であり得る。特定の作用機序に縛られるつもりはないが、別のアロタイプを用いた本発明の分子の選択は、ひとたび治療用ダイアボディに作製されたら、そのようなアロタイプについてホモ接合性の患者に対して臨床的により効果があると思われる変異体を提供することができる。
【０２３４】
ＦｃγＲ結合アッセイが、本発明の分子とＦｃγＲとの結合を測定するために、特に、ＦｃドメインとＦｃγＲとの結合を測定するために開発された。このアッセイにより、リガンドに対する受容体の親和性が本質的に弱くても、例えばＦｃγＲＩＩＢとＦｃγＲＩＩＩＡについてマイクロモルの範囲であっても、Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用の検出および定量が可能となった。前記方法は、国際公開ＷＯ  ０４／０６３３５１号および米国特許出願公開第２００５／００３７０００号および第２００５／００６４５１４号にその詳細が記載されている。いずれも参照としてそのすべてを本明細書に援用する。簡単に言えば、この方法は、当該分野で知られるいずれかの標準的なイムノアッセイ法、例えばＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴等で追跡することができるＦｃγＲ複合体の形成を含む。さらに、ＦｃγＲ複合体は、複合体形成していないＦｃγＲと比べると、Ｆｃ領域に対して改善された結合活性を有している。本発明によれば、好ましい分子複合体は四量体の免疫複合体であり、この免疫複合体は、（ａ）ＦｃγＲの可溶性領域（例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＢの可溶性領域）；（ｂ）ＦｃγＲの可溶性領域（例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＢの可溶性領域）のＣ末端に機能し得るように連結されたビオチン化１５アミノ酸ＡＶＩＴＡＧ配列（ＡＶＩＴＡＧ）；および（ｃ）ストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＳＡ−ＰＥ）を、四量体ＦｃγＲ複合体を形成するモル比で（好ましくは５：１のモル比で）含んでなる。この融合タンパク質は、例えば１５アミノ酸ＡＶＩＴＡＧ配列中のリジン残基を特異的にビオチン化する大腸菌ビオチンリガーゼＢｉｒＡ酵素を用いて、酵素的にビオチン化されている。ビオチン化された可溶性ＦｃγＲタンパク質を、その後、四量体ＦｃγＲ複合体を形成させるためにＳＡ−ＰＥと、１×ＳＡ−ＰＥ：５×ビオチン化可溶性ＦｃγＲのモル比で混合する。
【０２３５】
Ｆｃ領域を含むポリペプチドは、単量体の非複合ＦｃγＲよりも少なくとも８倍高い親和性で四量体ＦｃγＲ複合体と結合することがわかった。Ｆｃ領域を含むポリペプチドの四量体ＦｃγＲ複合体への結合性は、当業者には公知の標準的な技術、例えば蛍光活性化セルソーティング法（ＦＡＣＳ）、ラジオイムノアッセイ法、ＥＬＩＳＡ法等を用いて測定することができる。
【０２３６】
本発明は、細胞ベースのまたは無細胞系のアッセイでＦｃ領域を含む分子の機能性を測定するための、上記方法により形成される本発明の分子を含む免疫複合体の使用を包含する。
【０２３７】
便宜上、試薬は、アッセイキットで、すなわちＦｃγＲ四量体複合体と結合するＦｃ領域を含んだ分子の能力をアッセイするためにパッケージされた試薬の組合せで提供され得る。Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用を測定するのに使用する分子複合体の他の形態は、本発明の方法での使用も考慮されている。例えば、２００３年１月１３日出願の米国仮出願第６０／４３９，７０９号（参照としてそのすべてを本明細書に組み入れる）に記載されているように形成された融合タンパク質が挙げられる。
【０２３８】
５．４．２  変異型重鎖をもつ分子の機能性アッセイ
本発明は、複数のエピトープ結合ドメインと、場合によりＦｃドメイン（またはその一部）とを含む本発明の分子を、該分子のエフェクター細胞機能を同定するための当業者に知られたアッセイを使用して、特徴づけることを包含する。特に、本発明は、本発明の分子を、ＦｃγＲ介在エフェクター細胞機能について特徴づけることを包含する。さらに、本発明のダイアボディ分子の標的抗原の少なくとも１つがＦｃγＲである場合、ダイアボディ分子によるＦｃγＲの結合は、ＦｃγＲ−Ｆｃ結合により活性化される経路と類似したＦｃγＲ介在経路を活性化するのに役立ち得る。こうして、ダイアボディ分子の少なくとも１つのエピトープ結合ドメインがＦｃγＲを認識する場合には、ダイアボディ分子は、Ｆｃドメイン（またはその一部）を含むことなく、または付随するＦｃ−ＦｃγＲ結合なしに、ＦｃγＲ介在エフェクター細胞機能を誘発することができる。本発明に従ってアッセイすることができるエフェクター細胞機能の例として、限定するわけではないが、以下が含まれる：抗体依存性細胞傷害、食作用、オプソニン作用、オプソニン食作用、Ｃｌｑ結合、および補体依存性細胞傷害。エフェクター細胞機能活性を判定するために、当業者に知られた細胞ベースのアッセイまたは無細胞アッセイはいずれも使用することができる（エフェクター細胞アッセイについては、以下を参照：Ｐｅｒｕｓｓｉａら、（２０００年）「Ａｓｓａｙｓ  Ｆｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  （ＡＤＣＣ）  Ａｎｄ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ＡＤＣＣ  （Ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）  Ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１２１巻、１７９〜９２頁、Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉら、（１９８８年）「Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｓ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｔｈａｔ  Ｍｏｄｕｌａｔｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｈａｇｏｃｙｔｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ」、Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ、４４巻（１０号）、８４１〜８４８頁、Ｌｅｈｍａｎｎら、（２０００年）「Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ：  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｂｙ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４３巻（１〜２号）、２２９〜４２頁、Ｂｒｏｗｎ  （１９９４年）「Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ａｓｓａｙｓ  Ｏｆ  Ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ：  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、４５巻、１４７〜６４頁、Ｍｕｎｎら、（１９９０年）「Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  Ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｂｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｉｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｃｏｌｏｎｙ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ」、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１７２巻、２３１〜２３７頁、Ａｂｄｕｌ−Ｍａｊｉｄら、（２００２年）「Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ａｒｅ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｆｏｒ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｄａｍａｇｅ  Ｔｏ  Ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ」、Ｓｃａｎｄ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５５巻、７０〜８１頁、Ｄｉｎｇら、（１９９８年）「Ｔｗｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｂｉｎｄ  Ｉｎ  Ａ  Ｓｉｍｉｌａｒ  Ｄｉａｇｏｎａｌ  Ｍｏｄｅ  Ｔｏ  Ｔｈｅ  ＨＬＡ−Ａ２／Ｔａｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｕｓｉｎｇ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ＴＣＲ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ」、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８巻、４０３〜４１１頁（それぞれの全内容を参照として本明細書中に組み入れる））。
【０２３９】
ある実施形態では、本発明の分子をヒト単球でＦｃγＲ介在食作用についてアッセイすることができる。あるいはまた、本発明の分子のＦｃγＲ介在食作用をその他の食細胞、例えば、好中球（多形核白血球；ＰＭＮ）；ヒト末梢血単球、単球由来マクロファージでアッセイすることもできる。これらは当業者に知られた標準的手順を使用して取得することができる（例えば、Ｂｒｏｗｎ  （１９９４年）「Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ａｓｓａｙｓ  Ｏｆ  Ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ：  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、４５巻、１４７〜１６４頁参照）。一実施形態では、本発明の分子の機能を、既述された方法（Ｔｒｉｄａｎｄａｐａｎｉら、（２０００年）「Ｔｈｅ  Ａｄａｐｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬＡＴ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｆｃｇａｍｍａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７５巻、２０４８０〜２０４８７頁）により、フルオレセイン化ＩｇＧ−オプソニン化ヒツジ赤血球細胞（ＳＲＢＣ）を貪食するＴＨＰ−１細胞の能力を測定することによって、特徴付ける。
【０２４０】
本発明の分子の食作用を判定するための別の例示的なアッセイは、抗体依存性オプソニン食作用アッセイ（ＡＤＣＰ）であり、これは以下のステップを含むことができる：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）−標識ＦＩＴＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）または黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）−ＦＩＴＣなどの標的生体粒子を、（ｉ）フルオレセインに対する抗体である野生型４−４−２０抗体（ＦｃγＲ依存性ＡＤＣＰについての対照抗体として）（全内容を参照として本明細書に組み入れるＢｅｄｚｙｋら、（１９８９年）「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ｏｆ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ｗｉｔｈｉｎ  Ａｎ  Ａｎｔｉ−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｉｄｉｏｔｙｐｅ  Ｆａｍｉｌｙ」、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ、２６４巻（３号）、１５６５〜１５６９頁参照）、または（ｉｉ）ＦｃγＲＩＩＩへの結合をノックアウトするＤ２６５Ａ突然変異を保有する４−４−２０抗体（ＦｃγＲ依存性ＡＤＣＰについてのバックグラウンド対照として）、（ｉｉｉ）４−４−２０のエピトープ結合ドメインおよびＦｃドメインおよび／またはＦｃγＲＩＩＩに特異的なエピトープ結合ドメインを含むダイアボディ、でコートすること；そしてオプソニン化した粒子を形成させること；記載したオプソニン化粒子（ｉ〜ｉｉｉ）のいずれかをＴＨＰ−１エフェクター細胞（単球細胞系、ＡＴＣＣより入手可能）に１：１、１０：１、３０：１、６０：１、７５：１、または１００：１の比で添加して、ＦｃγＲ介在食作用を発生させること；好ましくは該細胞と大腸菌−ＦＩＴＣ／抗体を３７℃で１．５時間インキュベートすること；インキュベーション後、細胞にトリパンブルーを添加して（好ましくは室温で２〜３分）、内部に取り込まれないで細胞表面の外側に付着した細菌の蛍光を消失させること；細胞をＦＡＣＳバッファー（例えば、ＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウム）中に移し、ＦＡＣＳ（例えば、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ）を用いてＴＨＰ１細胞の蛍光を分析すること。好ましくは、このアッセイに用いられるＴＨＰ−１細胞を、ＦＡＣＳにより細胞表面上のＦｃγＲの発現について分析する。ＴＨＰ−１細胞はＣＤ３２ＡとＣＤ６４の両方を発現する。ＣＤ６４は、本発明の方法に従ってＡＤＣＰアッセイを実行する際にブロックされる、高親和性ＦｃγＲである。ＴＨＰ−１細胞を、好ましくは１００μｇ／ｍＬの可溶性ＩｇＧ１または１０％ヒト血清でブロックする。ＡＤＣＰの程度を分析するため、ゲートを好ましくはＴＨＰ−１細胞に設定し、蛍光強度の中央値を測定する。個々の突然変異体についてのＡＤＣＰ活性を算出し、得られた野生型ｃｈＭａｂ  ４−４−２０に対して標準化した数値として記録する。オプソニン化した粒子をＴＨＰ−１細胞に添加して、Ｔオプソニン化粒子とＴＨＰ−１細胞の比が３０：１または６０：１になるようにする。最も好ましい実施形態では、ＡＤＣＰアッセイを以下のような対照を用いて実施する：培地中の大腸菌−ＦＩＴＣ、大腸菌−ＦＩＴＣおよびＴＨＰ−１細胞（ＦｃγＲ非依存性ＡＤＣＰ活性として役立つ）、大腸菌−ＦＩＴＣ、ＴＨＰ−１細胞および野生型４−４−２０抗体（ＦｃγＲ依存性ＡＤＣＰ活性として役立つ）、大腸菌−ＦＩＴＣ、ＴＨＰ−１細胞、４−４−２０  Ｄ２６５Ａ（ＦｃγＲ依存性ＡＤＣＰ活性についてのバックグラウンド対照として役立つ）。
【０２４１】
別の実施形態では、本発明の分子を、当業者に知られた標準的な方法のいずれかを使用して、エフェクター細胞、例えばナチュラルキラー細胞で、ＦｃγＲ介在ＡＤＣＣ活性についてアッセイすることができる（例えば、Ｐｅｒｕｓｓｉａら、（２０００年）「Ａｓｓａｙｓ  Ｆｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  （ＡＤＣＣ）  Ａｎｄ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ＡＤＣＣ（Ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）  Ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１２１巻、１７９〜９２頁、Ｗｅｎｇら、（２００３年）「Ｔｗｏ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  Ｐｒｅｄｉｃｔ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｔｏ  Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  Ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ」、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．、２１巻、３９４０〜３９４７頁、Ｄｉｎｇら、（１９９８年）「Ｔｗｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｂｉｎｄ  Ｉｎ  Ａ  Ｓｉｍｉｌａｒ  Ｄｉａｇｏｎａｌ  Ｍｏｄｅ  Ｔｏ  Ｔｈｅ  ＨＬＡ−Ａ２／Ｔａｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｕｓｉｎｇ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ＴＣＲ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ」、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、８巻４０３〜４１１頁）参照）。本発明の分子のＡＤＣＣ活性を判定するための例示的なアッセイは、以下のステップを含む５ｌＣｒ放出アッセイに基づくものである：標的細胞を［５１Ｃｒ］Ｎａ２ＣｒＯ４で標識すること（この細胞膜透過性分子が標識用に一般的に使用される。なぜならば、これは細胞質タンパク質と結合し、細胞から速度論的に緩慢に自発放出されるが、標的細胞の壊死後、大量に放出されるからである）；変異型重鎖を含む本発明の分子で標的細胞をオプソニン化すること；オプソニン化した放射性標識標的細胞とエフェクター細胞とを、標的細胞とエフェクター細胞の適切な比で、マイクロタイタープレートにて混合すること；細胞の混合物を１６〜１８時間、３７℃でインキュベートすること；上清を回収すること；および放射活性を分析すること。その後、本発明の分子の細胞傷害性を、例えば以下の式を使用して算出することができる：溶解％＝（実験ｃｐｍ−標的漏出ｃｐｍ）／（界面活性剤溶解ｃｐｍ−標的漏出ｃｐｍ）ｘ１００％、あるいは、溶解％＝（ＡＤＣＣ−ＡＩＣＣ）／（最大放出−自発放出）。比溶解は以下の式を使用して算出することができる：比溶解＝本発明の分子の存在下での溶解％−本発明の分子の不在下での溶解％。標的：エフェクター細胞の比または抗体濃度のいずれかを変更することによって、グラフを作成することができる。
【０２４２】
好ましくは、本発明のＡＤＣＣアッセイで使用するエフェクター細胞は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。これは好ましくは、当業者に知られた標準的方法、例えばＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離を使用して、正常ヒト血液から精製される。本発明の方法で使用するのに好ましいエフェクター細胞は、異なるＦｃγＲ活性化受容体を発現する。本発明は、重鎖抗体突然変異体が野生型ＩｇＧｌ抗体に比較して増加したＡＤＣＣ活性および食作用を示すかどうかを判定するために、エフェクター細胞、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢを発現するＴＨＰ−１、ならびにＦｃγＲＩＩＩＡとＦｃγＲＩＩＢの両方を発現する、ヒト全血に由来する単球由来の一次マクロファージを包含する。
【０２４３】
ヒト単球細胞系であるＴＨＰ−１は、高親和性受容体ＦｃγＲＩおよび低親和性受容体ＦｃγＲＩＩＡの発現を介して食作用を活性化する（Ｆｌｅｉｔら、（１９９１年）「Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ−Ｌｉｋｅ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  ＴＨＰ−１  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ  Ｆｃ  Ｇａｍｍａ  ＲＩ  Ａｎｄ  Ｆｃ  Ｇａｍｍａ  ＲＩＩ」、Ｊ．  Ｌｅｕｋ．  Ｂｉｏｌ．、４９巻、５５６−５６５頁）。ＴＨＰ−１細胞は、ＦｃγＲＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＢを構成的に発現しない。サイトカインを用いてこれらの細胞を刺激すると、ＦｃＲ発現パターンが影響される（Ｐｒｉｃｏｐら、（２００１年）「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  Ａｎｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆｃ  Ｇａｍｍａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  Ｂｙ  Ｔｈｌ  Ａｎｄ  Ｔｈ２  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ」、Ｊ．  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６６巻、５３１〜５３７頁）。サイトカインＩＬ４の存在下でのＴＨＰ−１細胞の生育はＦｃγＲＩＩＢ発現を誘発し、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩ発現の減退をもたらす。また、ＦｃγＲＩＩＢ発現も細胞密度の増加によって増大される（Ｔｒｉｄａｎｄａｐａｎｉら、（２００２年）「Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｆｃｇａｍｍａ  ＲＩＩＢ  Ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７７巻（７号）、５０８２〜５０８９頁）。対照的に、ＩＦＮγはＦｃγＲＩＩＩＡの発現を導くことができると報告されている（Ｐｅａｒｓｅら、（１９９３年）「Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｇａｍｍａ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆｏｒ  ＩｇＧ  Ｒｅｑｕｉｒｅｓ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｏｆ  Ａ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｔｈａｔ  Ｉｎｃｌｕｄｅｓ  Ｔｈｅ  ９１−ｋＤａ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＳＧＦ３」、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻、４３１４〜４３１８頁）。細胞表面上の受容体の存在または不在は、当業者に知られた一般的方法を使用して、ＦＡＣＳによって確認することができる。サイトカインにより誘発される細胞表面上でのＦｃγＲの発現は、ＦｃγＲＩＩＢの存在下で活性化および抑制の両方を試験する系を提供する。ＴＨＰ−１細胞がＦｃγＲＩＩＢを発現することができない場合は、本発明は別のヒト単球細胞系であるＵ９３７をさらに包含する。これらの細胞は、ＩＦＮγおよびＴＮＦの存在下で、最終的にマクロファージに分化することがわかっている（Ｋｏｒｅｎら、（１９７９年）「Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−Ｌｉｋｅ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ」、Ｎａｔｕｒｅ  ２７９巻、３２８〜３３１頁）。
【０２４４】
ＦｃγＲ依存性腫瘍細胞死滅は、マウス腫瘍モデルではマクロファージとＮＫ細胞によって仲介される（Ｃｌｙｎｅｓら、（１９９８年）「Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ａｒｅ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  Ｉｎ  Ｐａｓｓｉｖｅ  Ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  Ｔｏ  Ｍｅｌａｎｏｍａ」、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５巻、６５２〜６５６頁）。本発明は、食作用およびＡＤＣＣアッセイの両方で、標的細胞の細胞傷害を誘発するＦｃ突然変異体の効力を分析するため、エフェクター細胞としての、ドナー由来のエルトリエートした（ｅｌｕｔｒｉａｔｅｄ）単球の使用を包含する。ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、およびＦｃγＲＩＩＢの発現パターンは、異なる増殖条件によって影響を受ける。エルトリエートして凍結させた単球、新鮮なエルトリエートした単球、１０％ＦＢＳ中に維持した単球、ＦＢＳ＋ＧＭ−ＣＳＦ中および／またはヒト血清中で培養した単球からのＦｃγＲ発現は、当業者に知られた一般的方法を使用して測定することができる。例えば、細胞をＦｃγＲ特異的抗体で染色し、ＦＡＣＳによって分析してＦｃγＲプロファイルを決定することができる。その後、マクロファージのｉｎ  ｖｉｖｏ  ＦｃγＲ発現を最もよく模倣する条件を本発明の方法で使用する。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、本発明は、特に適合するＦｃγＲプロファイルをもつヒト細胞を取得することができない場合には、マウス細胞の使用を包含する。いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡでトランスフェクトすることができるマウスマクロファージ細胞系ＲＡＷ２６４．７（ＡＴＣＣ）、および当技術分野で知られた方法を使用して単離された安定なトランスフェクタントを包含する（例えば、Ｒａｌｐｈら、（１９７７年）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｋｉｌｌｉｎｇ  Ｏｆ  Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  Ａｎｄ  Ｔｕｍｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｂｙ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ：  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  Ｂｙ  ＰＰＤ  Ａｎｄ  ＬＰＳ」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１９巻、９５０〜４頁参照）。トランスフェクタントは、通常の実験操作を用いたＦＡＣＳ分析によって、ＦｃγＲＩＩＩＡ発現について定量し、高発現体を本発明のＡＤＣＣアッセイに使用することができる。別の実施形態では、本発明は、本明細書で開示したものなどのノックアウトトランスジェニックマウスからの、ヒトＦｃγＲを発現する脾臓腹腔マクロファージの単離を包含する。
【０２４６】
リンパ球は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、ドナーの末梢血（ＰＢＭ）から回収することができる。単離された細胞の単核集団内では、ほとんでＡＤＣＣ活性が、その表面にＦｃγＲＩＩＩＡを含むがＦｃγＲＩＩＢは含まないナチュラルキラー細胞（ＮＫ）を介して生じる。これらの細胞を用いた結果は、ＮＫ細胞ＡＤＣＣの誘発に対する突然変異体の効力を示し、エルトリエートした単球を用いて試験するための試薬を確立する。
【０２４７】
本発明のＡＤＣＣアッセイで使用する標的細胞として、限定するわけではないが、以下が含まれる：乳癌細胞系、例えばＳＫ−ＢＲ−３（ＡＴＣＣ受託番号ＨＴＢ−３０）（例えば、Ｔｒｅｍｐら、（１９７６年）「Ｈｕｍａｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｒｅｃｅｎｔ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ３３〜４１頁）；Ｂリンパ球；バーキットリンパ腫由来の細胞、例えばＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ受託番号  ＣＣＬ−８６）（例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら、（１９６５年）「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  Ａｎｄ  Ｍｏｄｅ  Ｏｆ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｔｒａｉｎ  （ＥＢＪ）  Ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｓ  Ｆｒｏｍ  Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ」、Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ３４巻、２３１〜２４０頁参照）、およびＤａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ受託番号  ＣＣＬ−２１３）（例えば、Ｋｌｅｉｎら、（１９６８年）「Ｓｕｒｆａｃｅ  ＩｇＭ−Ｋａｐｐａ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  Ｏｎ  Ａ  Ｂｕｒｋｉｔｔ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ａｎｄ  Ｉｎ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌｉｎｅｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２８巻、１３００〜１３１０頁）。標的細胞はアッセイすべきダイアボディ分子の抗原結合部位によって認識されるものでなければならない。
【０２４８】
ＡＤＣＣアッセイは、アポトーシス経路によって細胞死を仲介するＮＫ細胞の能力に基づいている。ＮＫ細胞は、一部には細胞表面の抗原に結合したＩｇＧ  ＦｃドメインのＦｃγＲＩＩＩＡ認識によって、細胞死を仲介する。本発明の方法に従って使用するＡＤＣＣアッセイは、放射性ベースのアッセイまたは蛍光ベースのアッセイでもよい。変異型Ｆｃ領域を含む本発明の分子を特徴付けるるために使用するＡＤＣＣアッセイは以下のステップを含む：標的細胞、例えばＳＫ−ＢＲ−３、ＭＣＦ−７、ＯＶＣＡＲ３、Ｒａｊｉ、Ｄａｕｄｉ細胞を標識すること；標的細胞を、抗原結合部位を介して標的細胞上の細胞表面受容体を認識する抗体でオプソニン化すること；標識したオプソニン化標的細胞とエフェクター細胞とを適切な比（これは通常の実験操作によって決定することができる）で混合すること；細胞を回収すること；使用した標識に基づく適切な検出スキームを使用して、溶解した標的細胞の上清中の標識を検出すること。標的細胞は当技術分野で知られた標準的方法を使用して、放射性標識または蛍光標識で標識することができる。例えば、標識として、限定するわけではないが、以下が含まれる：［５１Ｃｒ］Ｎａ２Ｃｒ０４；および蛍光増給リガンドである２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６−６’’−ジカルボン酸（ＴＤＡ）のアセトキシメチルエステル。
【０２４９】
特定の好ましい実施形態では、蛍光増強リガンドである２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６−６’’−ジカルボン酸（ＴＤＡ）のアセトキシメチルエステルで標識した標的細胞に対するＡＤＣＣ活性を測定するために、時間分解蛍光測定アッセイを使用する。こうした蛍光測定アッセイは、当技術分野で知られている。例えば、Ｂｌｏｍｂｅｒｇら、（１９９６年）「Ｔｉｍｅ−Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ｆｏｒ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ａ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  Ｌｉｇａｎｄ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９３巻、１９９〜２０６頁（その全内容を参照として本明細書に組み入れる）を参照されたい。簡単に述べると、標的細胞を膜透過性ＴＤＡのアセトキシメチルジエステルである（ビス（アセトキシメチル）２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６−６’’−ジカルボン酸（ＢＡＴＤＡ））で標識する。これは生細胞の細胞膜を通過して迅速に拡散する。細胞内エステラーゼがエステル基を開裂させ、再生された膜非透過性ＴＤＡ分子は細胞内に捕捉される。エフェクター細胞および標的細胞を例えば少なくとも２時間、長くとも３．５時間、３７℃、５％  ＣＯ２下でインキュベートした後、溶解標的細胞から放出されたＴＤＡをＥｕ３＋でキレート化し、生成したユーロピウム−ＴＤＡキレートの蛍光を時間分解蛍光光度計（例えば、Ｖｉｃｔｏｒ  １４２０、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／Ｗａｌｌａｃｅ）で定量する。
【０２５０】
別の特定の実施形態では、複数のエピトープ結合部位、および場合によりＦｃドメイン（またはその一部）を含む本発明の分子を特徴付けるために使用するＡＤＣＣアッセイは以下のステップを含む：好ましくは４〜５ｘ１０６個の標的細胞（例えば、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＣＦ−７、ＯＶＣＡＲ３、Ｒａｊｉ細胞）をビス（アセトキシメチル）２，２’：６’，２’’−ターピリジン−ｔ−６’’−ジカルボン酸（ＤＥＬＦＩＡ  ＢＡＴＤＡ試薬、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ｗａｌｌａｃ）で標識する。最適な標識効率のため、ＡＤＣＣアッセイで使用する標的細胞の数は、好ましくは５ｘ１０６個を超えないようにすべきである。この細胞にＢＡＴＤＡ試薬を添加し、混合物を３７℃、好ましくは５％ＣＯ２下で、少なくとも３０分間インキュベートする。次に細胞を生理学的バッファー（例えば、０．１２５ｍＭスルフィンピラゾールを含むＰＢＳ）、および０．１２５ｍＭスルフィンピラゾールを含有する培地で洗浄する。次に標識した標的細胞を、ＥｃγＲＩＩＡに特異的なエピトープ結合ドメイン、および場合によりＦｃドメイン（またはその一部）を含む本発明の分子でオプソニン化（コート）する。好ましい実施形態では、ＡＤＣＣアッセイで使用する分子はまた、細胞表面受容体、腫瘍抗原、または癌抗原に特異的である。本発明のダイアボディ分子は、セクション５．６．１に列挙するものなどの癌または腫瘍抗原と特異的に結合することができる。ＡＤＣＣアッセイで使用する標的細胞は、本発明のダイアボディが標的細胞の細胞表面受容体と特異的に結合するように、該ダイアボディに導入されたエピトープ結合部位に従って選択される。
【０２５１】
標的細胞をエフェクター細胞、例えばＰＢＭＣに、エフェクター：標的の比が約１：１、１０：１、３０：１、５０：１、７５：１、または１００：１になるように添加する。エフェクターおよび標的細胞を少なくとも２時間、長くとも３．５時間、３７℃、５％ＣＯ２下でインキュベートする。細胞上清を回収し、酸性ユーロピウム溶液（例えば、ＤＥＬＦＩＡユーロピウム溶液、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ｗａｌｌａｃ）に添加する。生成したユーロピウム−ＴＤＡキレートの蛍光を、時間分解蛍光光度計（例えば、Ｖｉｃｔｏｒ  １４２０、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ｗａｌｌａｃ）で定量する。最大放出（ＭＲ）および自発放出（ＳＲ）は、標的細胞を、それぞれ１％  ＴＸ−１００および培地のみとインキュベートすることによって測定する。抗体非依存性細胞傷害（ＡＩＣＣ）を、試験分子（例えば本発明のダイアボディ）の不在下で標的およびエフェクター細胞をインキュベーションすることによって測定する。各アッセイは、好ましくは３回反復して実施する。比溶解の平均パーセントを以下によって算出する：実験放出値（ＡＤＣＣ）−ＡＩＣＣ）／（ＭＲ−ＳＲ）ｘ１００。
【０２５２】
本発明は、Ｆｃドメイン（またはその一部）を含む本発明の分子によるＣ１ｑの結合および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の仲介を特徴づけるための、当技術分野で公知でありかつ本明細書に例示されるアッセイを包含する。Ｃ１ｑ結合性を測定するために、Ｃ１ｑ結合ＥＬＩＳＡを実施することができる。例示的なアッセイは、以下のステップを含み得る：アッセイプレートを、コーティングバッファー中で本発明の分子または出発ポリペプチド（対照）により、４℃で一晩コーティングする。次いでこのプレートを洗浄し、ブロックする。洗浄後、ヒトＣ１ｑのアリコートを各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートする。さらに洗浄した後、１００μＬのヒツジ抗補体Ｃ１ｑペルオキシダーゼコンジュゲート抗体を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートする。プレートを再度洗浄バッファーで洗浄し、ＯＰＤ（Ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（Ｓｉｇｍａ））を含む１００μｌの基質バッファーを各ウェルに添加する。黄色の出現によって観察される酸化反応を３０分間進行させて、１００μｌの４．５  ＮＨ２ＳＯ４の添加によって該反応を停止させる。次いで吸光度を（４９２〜４０５）ｎｍで読み取る。
【０２５３】
補体活性化を評価するために、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイを、例えば参照としてその全体を本明細書に組み入れるＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、（１９９７年）「Ａ  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｆｏｒ  Ａｎｔｉ−ＣＤ２０  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２巻、１６３〜１７１頁に記載されるように、実施することができる。簡潔に言うと、（変異型）Ｆｃドメイン（またはその一部）を含む分子およびヒト補体を様々な濃度にバッファーで希釈する。ダイアボディ分子が結合する抗原を発現する細胞は、１ｍｌあたり約１ｘ１０６細胞の密度に希釈する。（変異型）Ｆｃドメイン（またはその一部）を含むダイアボディ分子、希釈したヒト補体および抗原を発現する細胞の混合物を、平底組織培養９６ウェルプレートに添加して、３７℃、５％ＣＯ２下で２時間インキュベートさせて、補体介在細胞溶解を促進させる。次いで、５０μＬのアラマーブルー（Ａｃｃｕｍｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を各ウェルに添加して、３７℃で一晩インキュベートする。吸光度は５３０ｎｍの励起および５９０ｎｍの発光を有する９６ウェル蛍光光度計を用いて測定する。結果は相対蛍光単位（ＲＦＵ）で表すことができる。サンプル濃度を標準曲線から求めて、非変異型分子（すなわち、Ｆｃドメインを含まないかまたは非変異型Ｆｃドメインを含む分子）と比較した活性％を対象の変異体について記録する。
【０２５４】
５．４．３  その他のアッセイ
複数のエピトープ結合ドメイン、および場合によりＦｃドメイン、を含む本発明の分子は、抗原結合ドメインまたはＦｃ−ＦｃγＲ結合の速度論的パラメーターを特徴付けるための、当技術分野で知られた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づくアッセイのいずれかを使用してアッセイすることができる。限定するわけではないが以下を含む市販のＳＰＲ装置のいずれかを本発明で使用することができる：Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ製のＢＩＡｃｏｒｅ装置（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）；Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｅｎｓｏｒｓ製のＩＡｓｙｓ装置（Ｆｒａｎｋｌｉｎ、ＭＡ．）；Ｗｉｎｄｓｏｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｉｍｉｔｅｄ製のＩＢＩＳシステム（Ｂｅｒｋｓ、ＵＫ）；日本レーザ電子製のＳＰＲ−ＣＥＬＬＩＡシステム（北海道、日本）；およびＴｅｘａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製のＳＰＲ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｐｒｅｅｔａ（Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）。ＳＰＲに基づく技法の概説については、以下を参照されたい：Ｍｕｌｌｅｔら、（２０００年）「Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２巻、７７〜９１頁、Ｄｏｎｇら、（２００２年）「Ｓｏｍｅ  ｎｅｗ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｉｎ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ」、Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、８２巻、３０３〜２３頁、Ｆｉｖａｓｈら、（１９９８年）「ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｆｏｒ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９巻、９７〜１０１頁、Ｒｉｃｈら、（２０００年）「Ａｄｖａｎｃｅｓ  Ｉｎ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１巻、５４〜６１頁（その全体を参照として本明細書中に組み入れる）。さらに、そのすべてが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３７３，５７７号、同第６，２８９，２８６号、同第５，３２２，７９８号、同第５，３４１，２１５号、同第６，２６８，１２５号で説明されるタンパク質間相互作用を測定する任意のＳＰＲ測定器およびＳＰＲに基づく方法が、本発明の方法において意図される。
【０２５５】
簡単に述べると、ＳＰＲベースのアッセイは、結合ペアの一方を表面に固定化すること、および溶液中の結合ペアの他方との相互作用をリアルタイムでモニタリングすることを含む。ＳＰＲは、複合体の形成または解離時に生じる表面付近での溶媒の屈折率の変化を測定することに基づくものである。固定化を行う表面はセンサーチップであって、これがＳＰＲ技法の心臓部となるものである。これは金の薄層でコートされたガラス表面からなり、分子の表面への結合性を最適化するように設計された特殊な表面領域の基礎を形成する。様々なセンサーチップが特に上記の会社から市販されており、これらのすべてを本発明の方法で使用することができる。センサーチップの例としては、ＢＩＡｃｏｒｅ  ＡＢ，  Ｉｎｃ．から市販されているもの、例えばＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５、ＳＡ、ＮＴＡ、およびＨＰＡが挙げられる。本発明の分子は、限定するわけではないが、以下を含む、当技術分野で知られた固定化方法および化学作用を使用して、センサーチップの表面に固定化することができる：アミン基を介した直接共有結合、スルフヒドリル基を介した直接共有結合、アビジンコート表面へのビオチン結合、炭水化物基へのアルデヒド結合、およびヒスチジンタグを介したＮＴＡチップとの結合。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、複数のエピトープ結合部位および場合によりＦｃドメインを含む本発明の分子と、抗原またはＦｃγＲとの結合の速度論的パラメーターは、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ装置１０００、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して測定することができる。上で述べたように（セクション５．４．１参照）、ダイアボディ分子の少なくとも１つのエピトープ結合部位がＦｃγＲを免疫特異的に認識する場合、および／またはダイアボディ分子がＦｃドメイン（またはその一部）を含む場合、任意のＦｃγＲを使用して本発明の分子の結合を評価することができる。特定の実施形態では、ＦｃγＲはＦｃγＲＩＩＩＡ、好ましくは可溶性の単量体ＦｃγＲＩＩＩＡである。例えば、一実施形態では、可溶性単量体ＦｃγＲＩＩＩＡは、リンカー−ＡＶＩＴＡＧ配列に結合されたＦｃγＲＩＩＩＡの細胞外領域である（米国仮出願番号６０／４３９，４９８号、２００３年１月９日出願および米国仮出願番号６０／４５６，０４１号、２００３年３月１９日出願を参照されたい（これらの全体を参照として本明細書中に組み入れる））。別の特定の実施形態では、ＦｃγＲはＦｃγＲＩＩＢ、好ましくは可溶性の二量体ＦｃγＲＩＩＢである。例えば、一実施形態では、可溶性二量体ＦｃγＲＩＩＢタンパク質を以下に記載された方法に従って調製する：米国仮出願番号６０／４３９，７０９号、２００３年１月１３日出願（その全体を参照として本明細書に組み入れる）。
【０２５７】
すべての免疫学的アッセイにおいて、本発明の分子によるＦｃγＲの認識／結合は複数のドメインによって影響される。ある特定の実施形態では、本発明の分子は複数のエピトープ結合ドメインのうちの１つを介してＦｃγＲを免疫特異的に認識する。本発明の分子がＦｃドメイン（またはその一部）を含む、さらに他の実施形態では、ダイアボディ分子はＦｃ−ＦｃγＲ相互作用を介してＦｃγＲを免疫特異的に認識することができる。本発明の分子がＦｃドメイン（またはその一部）と、ＦｃγＲを免疫特異的に認識するエピトープ結合部位の両方を含む、さらに他の実施形態では、ダイアボディ分子はエピトープ結合ドメインとＦｃドメイン（またはその一部）の一方または両方を介してＦｃγＲを認識することができる。複数のエピトープ結合部位および場合によりＦｃドメイン（またはその一部）を含む本発明の分子の、抗原および／またはＦｃγＲに対する速度論的パラメーターを、ＢＩＡｃｏｒｅ装置を用いて測定するための例示的なアッセイは、以下を含む：第１の抗原をセンサーチップ表面の４つのフローセルの１つに、好ましくはアミンカップリング化学を介して固定化し、それにより約５０００反応単位（ＲＵ）の第１の抗原が表面に固定化されるようにする。好適な表面が調製された時点で、第１の抗原を免疫特異的に認識する本発明の分子を、好ましくは２０μｇ／ｍＬ溶液の流速５μＬ／ｍＬでの１分間の注入によって、該表面を通過させる。この段階で該表面に結合した本発明の分子のレベルは、一般的に４００〜７００ＲＵの範囲である。次に、ＨＢＳ−Ｐバッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中の第２の抗原（例えば、ＦｃγＲ）またはＦｃγＲ受容体の一連の希釈系列を表面上に１００μＬ／分で注入する。異なる第２の抗原または受容体希釈物間での分子の再生は、好ましくは１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ９．４；３Ｍ  ＮａＣｌの１回の５秒間注入によって行われる。当技術分野で知られたいずれの再生技術も本発明の方法で想定されている。
【０２５８】
すべてのデータセットが収集された時点で、得られる結合曲線を、ＳＰＲ装置製造元、例えばＢＩＡｃｏｒｅ社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から供給されているコンピュータアルゴリズムを使用して、包括的に適合させる。これらのアルゴリズムでは、ＫｏｎおよびＫｏｆｆの両方を算出し、これらから見かけの平衡結合定数Ｋｄを、２つの速度定数の比（すなわち、Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）として演繹する。個々の速度定数をどのようにして誘導するかについてのさらに詳細な処理法は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（ＢＩＡｃｏｒｅ，  Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から得られる。作成したデータの解析は、当技術分野で知られたどの方法を使用しても実施することができる。作成した速度論的データを解釈する各種方法の概説については、以下を参照されたい：Ｍｙｓｚｋａ、（１９９７年）「Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｏｆ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８巻、５０〜７頁、Ｆｉｓｈｅｒら、（１９９４年）「Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ａｎｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５巻、３８９〜９５頁、Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ  （１９９４年）「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｒａｔｅ  Ａｎｄ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃｏｎｓｔａｎｔｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：  Ａ  Ｃｒｉｔｉｑｕｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５巻、６５〜７１頁、Ｃｈａｉｋｅｎら、（１９９２年）「Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｏｆ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１巻、１９７〜２１０頁、Ｍｏｒｔｏｎら、（１９９５年）「Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｆｒｏｍ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ：  Ａ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ｏｆ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｂｙ  Ｌｉｎｅａｒｉｚａｔｉｏｎ，  Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｒａｔｅ  Ｅｑｕａｔｉｏｎ，  Ａｎｄ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ」、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２７巻、１７６〜８５頁Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙら、１９９６年、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３６巻、２７５〜８３頁（これらの全体を参照として本明細書中に組み入れる）。
【０２５９】
好ましい実施形態では、ＳＰＲ分析、例えばＢＩＡｃｏｒｅを使用して測定した速度論的パラメーターは、本発明の分子が機能的アッセイ、例えばＡＤＣＣ中で、どのように機能するかを予測するための指標として使用することができる。ＳＰＲ分析から取得した速度論的パラメーターに基づいて本発明の分子の効力を予測するための例示的な方法は、以下を含む：本発明の分子の（エピトープ結合ドメインおよび／またはＦｃドメイン（もしくはその一部）を介した）ＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢとの結合についてのＫｏｆｆ値を測定すること；ＡＤＣＣデータに対して、（１）ＦｃγＲＩＩＩＡについてのＫｏｆｆ（ｗｔ）／Ｋｏｆｆ（ｍｕｔ）；（２）ＦｃγＲＩＩＢについてのＫｏｆｆ（ｍｕｔ）／Ｋｏｆｆ（ｗｔ）をプロットすること。１よりも高い数値が、野生型と比較して、ＦｃγＲＩＩＩＡについての減少した解離速度、およびＦｃγＲＩＩＢについての増加した解離速度を示し、増大したＡＤＣＣ機能を有することを示す。
【０２６０】
５．５  本発明のダイアボディ分子の製造方法
本発明のダイアボディ分子は、当技術分野で周知の各種方法により製造することができ、ｄｅ  ｎｏｖｏタンパク質合成、結合タンパク質をコードする核酸の組換え発現といった方法がある。所望の核酸配列は組換え法（例えば、所望のポリヌクレオチドの以前に作製された変異体のＰＣＲ突然変異誘発）により、または固相ＤＮＡ合成により得ることができる。通常は組換え発現が用いられる。ある態様において、本発明はＣＤ１６Ａ  ＶＨおよび／またはＶＬをコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供する。別の態様では、本発明はＣＤ３２Ｂ  ＶＨおよび／またはＶＬをコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供する。遺伝子コードの縮重のため、それぞれの免疫グロブリンアミノ酸配列を種々の核酸配列がコードしており、本発明はここに記載する結合タンパク質をコードするあらゆる核酸を包含する。
【０２６１】
５．５．１  本発明の分子をコードするポリヌクレオチド
本発明は、本発明の分子（ポリペプチドおよび抗体を含む）をコードするポリヌクレオチドをも含む。当技術分野で知られたいずれかの方法により、本発明の分子をコードするポリヌクレオチドを取得し、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。
【０２６２】
本発明の方法によって同定される分子のヌクレオチド配列が決定されたら、そのヌクレオチド配列を当技術分野で周知の方法、例えば組換えＤＮＡ技術、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ等を使用して操作し（例えば以下に記載された技術を参照されたい：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；およびＡｕｓｕｂｅｌら編集、１９９８年Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ（これらの両方の全体を参照として本明細書に組み入れる））、例えばアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を生じさせることによって、例えば異なるアミノ酸配列をもつ抗体を作製することができる。
【０２６３】
一実施形態では、ヒトライブラリーまたは当技術分野で利用し得るその他のライブラリーを当技術分野で知られた標準的技術によってスクリーニングして、本発明の分子をコードする核酸をクローニングすることができる。
【０２６４】
５．５．２  本発明の分子の組換え発現
本発明の分子（すなわち、抗体）をコードする核酸配列が得られた時点で、該分子を産生するためのベクターを、組換えＤＮＡ技術により当技術分野で周知の技術を用いて作製することができる。当業者に周知の方法を利用して、本発明の分子のコード配列および適当な転写・翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝的組換えが挙げられる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、およびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹに記載される技術を参照されたい）。
【０２６５】
本発明の方法により同定された分子のヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、従来技術（例えば、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション、およびリン酸カルシウム沈降）により宿主細胞に導入し、次いでトランスフェクトした細胞を従来技術により培養して、本発明の分子を産生させることができる。特定の実施形態においては、本発明の分子の発現を構成的、誘導性、または組織特異的なプロモーターにより制御する。
【０２６６】
本発明の方法により同定された分子を発現させるために利用する宿主細胞は、細菌細胞、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）であるか、または好ましくは、特に完全な組換え免疫グロブリン分子を発現させるためには、真核細胞であり得る。特に、哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）は、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターとの併用において、免疫グロブリンのための有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、（１９８６年）「Ｐｏｗｅｒｆｕｌ  Ａｎｄ  Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｕｎｉｔ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」、Ｇｅｎｅ  ４５巻、１０１〜１０６頁、Ｃｏｃｋｅｔｔら、（１９９０年）「Ｈｉｇｈ  Ｌｅｖｅｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｏｆ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  Ｉｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ  Ｃｅｌｌｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８巻、６６２〜６６７頁）。
【０２６７】
様々な宿主−発現ベクター系を利用して、本発明の方法により同定された分子を発現させることができる。このような宿主−発現系は、本発明の分子のコード配列を産生し、続いて精製することができるビヒクルに相当するが、適当なヌクレオチドコード配列により形質転換またはトランスフェクトされると本発明の分子をｉｎ  ｓｉｔｕで発現することができる細胞にも相当する。これらとしては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：例えば、本発明の方法により同定された分子のコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）や枯草菌（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等）の微生物；本発明の方法により同定された分子をコードする配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロミセス属、ピキア属）；本発明の方法により同定された分子をコードする配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；本発明の方法により同定された分子をコードする配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）およびタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））を感染させたまたは組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３細胞、リンパ球（米国特許第５，８０７，７１５号を参照）、Ｐｅｒ  Ｃ．６細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌにより開発されたヒト網膜細胞））。
【０２６８】
細菌系においては、発現される分子に対して意図される用途に応じて、多くの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、抗体の医薬組成物を調製するために大量のタンパク質を産生させる必要がある場合には、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を指令するベクターが望ましい。このようなベクターとしては、限定するものではないが、抗体コード配列をベクター中にｌａｃＺコード領域と共にインフレームで個々に連結して融合タンパク質が産生されるようにする大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、（１９８３年）「Ｅａｓｙ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｃｌｏｎｅｓ」、ＥＭＢＯ  Ｊ．、２巻、１７９１〜１７９４頁）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅら、（１９８５年）「Ｕｐ−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  ｌｐｐ  Ｇｅｎｅ  Ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１３巻、３１０１〜３１１０頁、Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅら、（１９８９年）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  Ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ」、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２４巻、５５０３〜５５０９頁）などが挙げられる。また、ｐＧＥＸベクターを用いて、外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させることもできる。一般的に、このような融合タンパク質は可溶性であり、溶解した細胞から、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合、続いて遊離グルタチオンの存在下での溶出により容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターはトロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されており、その結果、クローニングされた標的遺伝子産物をＧＳＴ成分から切り離すことが可能である。
【０２６９】
昆虫系においては、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＡＣＮＰＶ）が外来遺伝子を発現させるためのベクターとして利用される。このウイルスはスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞中で増殖する。抗体コード配列をウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）中に個々にクローニングして、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置させることができる。
【０２７０】
哺乳動物宿主細胞においては、多くのウイルスベースの発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合には、目的の抗体コード配列を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび３分節（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列と連結することができる。このキメラ遺伝子を次いでアデノウイルスゲノムにｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ組換えにより挿入し得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１またはＥ３領域）への挿入により、感染した宿主内で生存可能でありかつ免疫グロブリン分子を発現することができる組換えウイルスが得られる（例えば、Ｌｏｇａｎら、（１９８４年）「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  Ｌｅａｄｅｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｏｆ  ｍＲＮＡｓ  Ｌａｔｅ  Ａｆｔｅｒ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１巻、３６５５〜３６５９を参照されたい）。特定の開始シグナルも、挿入した抗体コード配列の効率的な翻訳のために必要であり得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。さらに、開始コドンは、全インサートの翻訳を確実にするために、目的のコード配列のリーディングフレームと同じフェーズになければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、様々な起源のものであってよく、天然でも合成でもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることにより増強することができる（Ｂｉｔｔｎｅｒら、（１９８７年）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｙｅａｓｔ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５３巻５１６〜５４４頁を参照されたい）。
【０２７１】
さらに、挿入した配列の発現をモジュレートしたり、遺伝子産物を所望の特定の様式で改変またはプロセシングしたりする宿主細胞株を選択することができる。このようなタンパク質産物の修飾（例えばグリコシル化）およびプロセシング（例えば切断）はタンパク質の機能にとって重要であり得る。例えば、特定の実施形態では、本発明のダイアボディ分子を含むポリペプチドは単一の遺伝子産物として（例えば単一のポリペプチド鎖として、すなわちポリタンパク質前駆体として）発現させることができるが、かかる単一の遺伝子産物は本発明のダイアボディ分子の別個のポリペプチドを形成するために天然のまたは組換えの細胞機構によるタンパク質分解切断を必要とする。したがって、本発明は、本発明のポリペプチドを含むポリタンパク質前駆体分子をコードする核酸配列（該ポリタンパク質前駆体の翻訳後切断を指令することができるコード配列を含む）を遺伝子工学的に作製することを包含する。ポリタンパク質前駆体の翻訳後切断は本発明のポリペプチドをもたらす。本発明のポリペプチドを含む前駆体分子の翻訳後切断はｉｎ  ｖｉｖｏ（すなわち、天然のまたは組換えの細胞系／機構、例えば適切な部位でのフューリン切断、により宿主細胞内）で起こってもよいし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、既知の活性のプロテアーゼもしくはペプチダーゼを含む組成物および／または所望のタンパク質分解作用を促すことが知られている条件もしくは試薬を含む組成物中での該ポリペプチド鎖のインキュベーション）で起こってもよい。組換えタンパク質の精製および修飾は当技術分野でよく知られており、ポリタンパク質前駆体の設計には当業者が容易に理解し得るいくつかの実施形態が含まれる。上記の前駆体分子の修飾のためには当技術分野で知られたプロテアーゼまたはペプチダーゼを使用することができ、例えば、トロンビン（アミノ酸配列ＬＶＰＲＧＳ（配列番号９１）を認識する）、またはＸａ因子（アミノ酸配列Ｉ（Ｅ／Ｄ）ＧＲ（配列番号９２）を認識する（Ｎａｇａｎｉら、（１９８５年）「Ｏｘｙｇｅｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｓ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  Ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ」、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８２巻、７２５２〜７２５５頁、およびＪｅｎｎｙら、（２００３年）「Ａ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｏｒ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｏｆ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｗｉｔｈ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ａｎｄ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．、３１巻、１〜１１の総説、その全内容を参照として本明細書に組み入れる））、エンテロキナーゼ（アミノ酸配列ＤＤＤＤＫ（配列番号９３）を認識する（Ｃｏｌｌｉｎｓ−Ｒａｃｉｅら、（１９９５年）「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｎｏｖｅｌ  Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐａｒｔｎｅｒ  ＤｓｂＡ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３巻、９８２〜９８７頁、その��内容を参照として本明細書に組み入れる））、フューリン（アミノ酸配列ＲＸＸＲ＾を認識し、ＲＸ（Ｋ／Ｒ）Ｒを優先的に認識する（それぞれ配列番号９４および配列番号９５）（Ｐ６位の追加のＲは切断を促進するようである））、およびＡｃＴＥＶ（アミノ酸配列ＥＮＬＹＦＱ＾Ｇ（配列番号９６）を認識する（Ｐａｒｋｓら、（１９９４年）「Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｌａｎｔ  Ｖｉｒｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ」、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２１６巻、４１３頁、その全内容を参照として本明細書に組み入れる））、ならびに口蹄疫ウイルスプロテアーゼＣ３が使用される。例えば、セクション６．４を参照されたい。
【０２７２】
それぞれの宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾に対する特徴的かつ特異的な機構を有する。適当な細胞株または宿主系を選ぶことにより、発現される外来タンパク質の正しい修飾とプロセシングを確実にすることができる。このために、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構をもつ真核宿主細胞を用いることができる。このような哺乳動物宿主細胞としては、限定するものではないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３、ＷＩ３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄ、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔが挙げられる。
【０２７３】
組換えタンパク質を長期間、高収率で産生させるためには、安定した発現が好ましい。例えば、本発明の抗体を安定に発現する細胞株を遺伝子工学的に作製することができる。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使うよりもむしろ、選択マーカーおよび適当な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）により制御されるＤＮＡで宿主細胞を形質転換する。外来ＤＮＡを導入した後に、遺伝子操作した細胞を富化培地中で１〜２日間増殖させ、次いで選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択マーカーは選択に対する耐性を付与するので、細胞が安定してプラスミドをその染色体中に組み込み、増殖して巣を形成し、続いてクローニングして細胞株に増やすことが可能である。この方法は、本発明の抗体を発現する細胞株を遺伝子工学的に作製するために有利に使用することができる。このような遺伝子工学的に作製された細胞株は、本発明の分子と直接的または間接的に相互作用する化合物をスクリーニングして評価する上で特に有用である。
【０２７４】
多くの選択系を利用することができ、それらには、限定するものではないが、以下のものが含まれる：単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、（１９７７年）「Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｏｆ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｈｅｒｐｅｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｇｅｎｅ  Ｔｏ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｃｅｌｌ  １１巻、２２３〜２３２頁）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａら、（１９９２年）「Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  ＨＰＲＴ  Ｇｅｎｅ  Ａｎｄ  Ｔｈｅ  ＨＡＴ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  Ｉｎ  ＤＮＡ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ：  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｅｐｓ  Ｔｏｗａｒｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  １４巻、４９５〜５００頁）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、（１９８０年）「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ＤＮＡ：  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  ａｐｒｔ  Ｇｅｎｅ」、Ｃｅｌｌ  ２２巻、８１７〜８２３頁）遺伝子はそれぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞において使用することができる。また、代謝拮抗物質耐性は以下の遺伝子を選択するための基礎として用いることができる：メトトレキセート耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら、（１９８０年）「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  Ｗｉｔｈ  Ａｎ  Ａｍｐｌｉｆｉａｂｌｅ  Ｄｏｍｉｎａｎｔ−Ａｃｔｉｎｇ  Ｇｅｎｅ」、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、７７巻、３５６７〜３５７０頁、Ｏ’Ｈａｒｅら、（１９８１年）「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｂｙ  Ａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ａ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ」、Ｐｒｏｃ．  ＮＡＴＬ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、７８巻、１５２７〜１５３１頁）；ミコフェノール酸耐性を与えるｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎら、（１９８１年）「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｈａｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｉｎｇ  Ｆｏｒ  Ｘａｎｔｈｉｎｅ−Ｇｕａｎｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ」、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、７８巻、２０７２〜２０７６頁）アミノグリコシドＧ−４１８耐性を与えるｎｅｏ（Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ  （１９９３年）「Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｒｉａｌｓ  Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ」、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．、３２巻、５７３〜５９６頁、Ｍｕｌｌｉｇａｎ、（１９９３年）「Ｔｈｅ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０巻、９２６〜９３２頁、およびＭｏｒｇａｎら、（１９９３年）「Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第６２巻、１９１〜２１７頁）、ならびにヒグロマイシン耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら（１９８４年）、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｓ  Ｆｏｒ  Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ  Ａｎｄ  Ｇ４１８  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ａｓ  Ｄｏｍｉｎａｎｔ−Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍａｒｋｅｒｓ  Ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｌ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｇｅｎｅ、第３０巻、１４７〜１５６頁）。組換えＤＮＡ技術の分野で一般的に知られる利用可能な方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９３年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０年、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；ならびに第１２および１３章、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（編）、１９９４年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、（１９８１年）「Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｏｍｉｎａｎｔ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｆｏｒ  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１５０巻、１〜１４頁に記載されている。
【０２７５】
本発明の分子の発現レベルはベクター増幅により増加させることができる（概要については、ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、「ＤＮＡクローニングにおける哺乳動物細胞でのクローン化遺伝子の発現のための遺伝子増幅に基づくベクターの利用（Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ）」、Ｖｏｌ．３、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７を参照されたい）。抗体を発現するベクター系中のマーカーが増幅可能であるとき、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルを増加させると、マーカー遺伝子のコピー数が増加するだろう。増幅された領域はダイアボディ分子のポリペプチドのヌクレオチド配列と結びついているので、該ポリペプチドの産生も増加するだろう（Ｃｒｏｕｓｅら、（１９８３年）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  Ｍｉｎｉｇｅｎｅｓ」、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、３巻、２５７〜２６６頁）。
【０２７６】
宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクター、すなわち、ダイアボディ分子の第１のポリペプチドをコードする第１のベクターおよびダイアボディ分子の第２のポリペプチドをコードする第２のベクターで同時トランスフェクトすることができる。これら２つのベクターは、両方のポリペプチドの同等の発現を可能にする同一の選択マーカーを含有してもよい。あるいは、両方のポリペプチドをコードする単一のベクターを用いてもよい。本発明の分子のポリペプチドをコードする配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡであり得る。
【０２７７】
本発明の分子（すなわち、ダイアボディ）が組換えにより発現された時点で、これを、当技術分野で公知の、ポリペプチド、ポリタンパク質またはダイアボディを精製するための当技術分野で公知の方法（抗原選択性に基づく抗体精製スキームに類似）のいずれかで精製することができる。かかる精製法として、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、特に（任意で、ダイアボディ分子がＦｃドメインまたはその一部を含む場合はプロテインＡによる選択の後に）特異的抗原に対する親和性によるもの、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度、またはポリペプチド、ポリタンパク質もしくはダイアボディを精製するための他の標準的な技法がある。
【０２７８】
５．６  予防および治療方法
本発明の分子は、ＦｃγＲにより仲介されるエフェクター細胞機能（例えば、ＡＤＣＣ）が望まれる疾患、障害または感染（例えば、癌、感染性疾患）を治療および／または予防するのに特に有用である。以下で述べるように、本発明のダイアボディは、Ｆｃドメインを含まないにもかかわらず、エフェクター機能を引き出すのに抗体に似た機能性を示し得る。ＦｃγＲを免疫特異的に認識する少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを含むことにより、ダイアボディ分子はＦｃ−ＦｃγＲ相互作用に類似したＦｃγＲ結合および活性を示すことができる。例えば、本発明の分子は免疫エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞）上の細胞表面抗原とＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ）と結合して、該細胞に対してエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、食作用、オプソニン化など）を刺激する。
【０２７９】
他の実施形態において、本発明のダイアボディ分子はＦｃドメイン（またはその一部）を含むものである。かかる実施形態では、Ｆｃドメインは野生型Ｆｃドメイン（またはその一部）に対して少なくとも１つのアミノ酸修飾をさらに含み、かつ／または１以上のＩｇＧアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）由来のドメインを含むことができる。変異型Ｆｃドメインを含む本発明の分子は、野生型Ｆｃドメインを含む分子と比べて、賦与されたまたは改変された表現型、例えば改変されたまたは賦与されたエフェクター機能活性（例えば、ＮＫ依存性またはマクロファージ依存性アッセイでアッセイされる）を示し得る。この実施形態において、エフェクター機能活性が賦与または改変されている本発明の分子は、エフェクター機能活性の増大した効力が望まれる疾患、障害または感染の治療および／または予防に有用である。ある特定の実施形態では、Ｆｃドメイン（またはその一部）を含む本発明のダイアボディ分子が補体依存性カスケードを仲介する。エフェクター機能を改変するものとして確認されたＦｃドメイン変異体は、国際出願ＷＯ０４／０６３３５１、米国特許出願公開２００５／００３７０００および２００５／００６４５１４、米国仮出願６０／６２６，５１０（２００４年１１月１０日出願）、６０／６３６，６６３（２００４年１２月１５日出願）、および６０／７８１，５６４（２００６年３月１０日出願）、ならびに米国特許出願１１／２７１，１４０（２００５年１１月１０日出願）、および１１／３０５，７８７（２００５年１２月１５日出願）（本発明者らの同時出願）に開示されており、それぞれの全内容を参照として本明細書に組み入れる。
【０２８０】
本発明は、被験者に、治療に有効な量の１種以上の分子を投与することを含む、、被験者の癌を治療、予防または管理するための方法ならびに組成物を包含し、前記分子は１つ以上のエピトープ結合部位および場合により本発明に従って遺伝子操作されたＦｃドメイン（またはその一部）を含み、かつ該分子は癌抗原とさらに結合する。本発明の分子は原発性腫瘍、癌細胞の転移、および感染性疾患の予防、阻止、増殖抑制または退行に特に有用である。特定の作用機構によって束縛されるものではないが、本発明の分子はエフェクター機能を仲介して腫瘍の消失、腫瘍の抑制、またはその両方をもたらす。別の実施形態では、本発明のダイアボディは、細胞表面抗原および／または受容体の架橋およびアポトーシスまたは負の増殖調節のシグナル伝達の増加により治療活性を仲介する。
【０２８１】
特定の作用機構によって束縛されるものではないが、本発明のダイアボディ分子は当技術分野で知られた治療用抗体と比べて増大した治療効力を示すが、これは一部には、例えばダイアボディ−エピトープ相互作用の向上した結合力ゆえに標的細胞上により長く留まっているダイアボディの能力によって、ダイアボディが特定の抗原（例えば、ＦｃγＲ）を低レベルで発現する標的細胞と免疫特異的に結合できるためである。
【０２８２】
抗原（例えば、ＦｃγＲ）に対する親和性および結合力が増大している本発明のダイアボディは、標的細胞集団ではＦｃγＲが低レベルで発現される被験者において、癌または別の疾患もしくは障害を治療、予防または管理するのに特に有用である。本明細書中で用いる場合、細胞でのＦｃγＲ発現は、細胞あたりの該分子の密度によって定義され、これは当業者に公知の通常の方法を用いて測定される。複数のエピトープ結合部位、および場合によりＦｃγＲ（またはその一部）を含む本発明の分子はまた、好ましくは、標的抗原（例えば、癌抗原）を３０，０００〜２０，０００分子／細胞の密度で、２０，０００〜１０，０００分子／細胞の密度で、１０，０００分子／細胞もしくはそれ以下の密度で、５０００分子／細胞もしくはそれ以下の密度で、または１０００分子／細胞もしくはそれ以下の密度で発現する細胞において、結合力および親和性および／またはエフェクター機能が賦与されているか、または増大されている。本発明の分子は、標的細胞集団では標的抗原が低レベルで発現される亜集団において、癌のような疾患または障害を治療、予防または管理するのに特に利用される。
【０２８３】
本発明の分子はまた、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患、または感染性疾患のような疾患を治療または予防するための当技術分野で公知の他の治療薬と組み合わせて、有利に使用することもできる。特定の実施形態では、本発明の分子を、例えば該分子と相互作用して免疫応答を高めるエフェクター細胞の数または活性を増加させるのに役立つ、造血性増殖因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ−７など）、リンホカイン、またはモノクローナルもしくはキメラ抗体と併用してもよい。本発明の分子はまた、疾患、障害、または感染を治療するために用いる１種以上の薬物、例えば抗癌剤、抗炎症剤または抗ウイルス剤と組み合わせて有利に利用することもでき、これらは、例えば、以下のセクション５．７に詳述される。
【０２８４】
５．６．１  癌
本発明は、被験者に治療上有効な量の、複数のエピトープ結合ドメインを含む１種以上の分子を投与することを含む、被験者の癌を治療または予防するための方法および組成物を包含する。いくつかの実施形態において、本発明は、ＦｃγＲ多型を有する被験者（例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８ＶまたはＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｆ対立遺伝子についてホモ接合性の被験者）の癌を治療または予防するための方法および組成物を包含する。いくつかの実施形態において、本発明は、ＦｃγＲＩＩＩＡ（１５８Ｆ）と免疫特異的に結合する、ダイアボディ分子の少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを工学的に操作することを包含する。他の実施形態では、本発明は、ＦｃγＲＩＩＩＡ（１５８Ｖ）と免疫特異的に結合する、ダイアボディ分子の少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを工学的に操作することを包含する。
【０２８５】
標準的なモノクローナル抗体療法の効力は、被験者のＦｃγＲ多型に依存する（Ｃａｒｔｒｏｎら、（２００２年）「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｏｆ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ａｎｔｉ−ＣＤ２０  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｎｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  Ｉｎ  ＩｇＧ  Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＦｃＲＩＩＩａ  Ｇｅｎｅ」、Ｂｌｏｏｄ、９９巻、７５４〜７５８頁、Ｗｅｎｇら、（２００３年）「Ｔｗｏ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  Ｐｒｅｄｉｃｔ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｔｏ  Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  Ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ」、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．、２１巻（２１号）、３９４０〜３９４７頁、この両者の全体を参照として本明細書に組み入れる）。これらの受容体はエフェクター細胞の表面上に発現され、ＡＤＣＣを仲介する。低親和性の活性化受容体の高親和性対立遺伝子は、ＡＤＣＣを仲介するエフェクター細胞の能力を改善する。Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用に頼ってエフェクター機能を果たすのとは対照的に、本発明の方法は、低親和性の活性化受容体を免疫特異的に認識するように分子を操作して、該分子を特定の多型用に設計することを包含する。これとは別に、またはこれに加えて、本発明の分子はエフェクター細胞上のＦｃγＲに対して（野生型Ｆｃドメインと比べて）増大した親和性を示す変異型Ｆｃドメインを含むように操作してもよい。本発明の操作された分子は、患者についてそのＦｃγＲ多型にかかわらず、よりよい免疫療法試薬を提供する。
【０２８６】
本発明に従って作製されたダイアボディ分子は、培養細胞系または患者由来のＰＭＢＣ細胞を用いたＡＤＣＣによって試験して、ＡＤＣＣを増大させるＦｃ変異体の能力を判定する。本明細書に開示した方法を使用して、標準的ＡＤＣＣを実施する。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、リンパ球を末梢血から回収する。標的細胞（すなわち、培養細胞系または患者由来の細胞）にユーロピウム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を負荷し、エフェクターとともに３７℃で４時間インキュベートする。蛍光プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ）を使用して、放出されたユーロピウムを検出する。得られたＡＤＣＣデータは、ＮＫ細胞介在細胞傷害を誘発する本発明の分子の効力を示し、どの分子が患者サンプルおよびエルトリエートした（ｅｌｕｔｒｉａｔｅｄ）単球の両方を用いて試験できるかを立証する。その後、ＡＤＣＣ活性を誘発させるのに最大の能力を示すダイアボディ分子を、患者由来のＰＢＭＣを用いたＡＤＣＣアッセイで試験する。健康なドナー由来のＰＢＭＣがエフェクター細胞として用られる。
【０２８７】
したがって本発明は、癌抗原を免疫特異的に認識するダイアボディ分子を作製することによって、癌抗原により特徴付けられる癌を予防または治療する方法を提供するが、該ダイアボディ分子はそれ自体が細胞傷害性（アポトーシスまたは増殖性シグナルのダウンレギュレーションを増大させる細胞表面受容体の架橋による）であり、かつ／または本発明に従ってＦｃドメインを含み、かつ／または１以上のエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ、食作用）を仲介するように作製される。本発明に従って作製されたダイアボディは、細胞傷害活性（例えば、増大した腫瘍細胞殺傷および／または増大したＡＤＣＣ活性もしくはＣＤＣ活性）をもつので、癌の予防または治療に有用である。
【０２８８】
癌抗原を伴う癌は、癌抗原に結合しかつ細胞傷害性であり、かつ／または本発明の方法に従って操作したことにより増大したエフェクター機能を示すダイアボディの投与によって治療または予防することができる。例えば、限定するわけではないが、以下の癌抗原を伴う癌を本発明の方法および組成物によって治療または予防することができる：ＫＳ  １／４  汎癌腫抗原（Ｐｅｒｅｚら、（１９８９年）「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｃｄｎａ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｋｓｌ／４  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｍａｒｋｅｒ」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４２巻、３６６２〜３６６７頁、Ｍｏｌｌｅｒら、（１９９１年）「Ｂｉｓｐｅｃｉｆｃ−Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｌｙｓｉｓ  Ｏｆ  Ｏｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ  Ｂｙ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３３巻（４号）、２１０〜２１６頁）、卵巣癌抗原（ＣＡ１２５）（Ｙｕら、（１９９１年）「Ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  Ｍａｒｋｅｒｓ  Ｏｎ  Ｍｏｉｅｔｉｅｓ  Ｔｈａｔ  Ｂｅａｒ  ＣＡ  １２５  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５１巻（２号）、４６８〜４７５頁）、前立腺酸性ホスフェート（Ｔａｉｌｏｒら、（１９９０年）「Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ａ  Ｆｕｌｌ−Ｌｅｎｇｔｈ  ｃＤＮＡ  Ｃｌｏｎｅ」、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１８巻（１６号）、４９２８頁）、前立腺特異的抗原（Ｈｅｎｔｔｕら、（１９８９年）「ｃＤＮＡ  Ｃｏｄｉｎｇ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｅｎｔｉｒｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｓｈｏｗｓ  Ｈｉｇｈ  Ｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓ  Ｔｏ  Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ  Ｇｅｎｅｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．、１０巻（２号）、９０３〜９１０頁、Ｉｓｒａｅｌｉら、（１９９３年）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｏｆ  Ａ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ａ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５３巻、２２７〜２３０頁）、黒色腫関連抗原ｐ９７（Ｅｓｔｉｎら、（１９８９年）「Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｌｉｎｅｓ  Ｔｈａｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｖａｒｉｏｕｓ  Ｌｅｖｅｌｓ  Ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｌａｎｏｍａ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ｐ９７」、Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔ．、８１巻（６号）、４４５〜４５４頁）、黒色腫抗原ｇｐ７５（Ｖｉｊａｙａｓａｒｄａｈｌら、（１９９０年）「Ｔｈｅ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｇｐ７５  Ｉｓ  Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｂ  （Ｂｒｏｗｎ）  Ｌｏｃｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔ」、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１７１巻���４号）、１３７５〜１３８０頁）、高分子量黒色腫抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）（Ｎａｔａｌｉら、（１９８７年）「Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｍｅｌａｎｏｍａｓ  Ｂｙ  Ｔｈｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  １４０．２４０  Ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ」、Ｃａｎｃｅｒ  ５９巻、５５〜６３頁、Ｍｉｔｔｅｌｍａｎら、（１９９０年）「Ａｃｔｉｖｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｍｅｌａｎｏｍａ．  Ａ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  Ｗｉｔｈ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉｉｄｉｏｔｙｐｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｅｌｉｃｉｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ  Ａｎｔｉ−Ｈｉｇｈ−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−Ｗｅｉｇｈｔ−Ｍｅｌａｎｏｍａ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、８６巻、２１３６〜２１４４頁）、前立腺特異的膜抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）（Ｆｏｏｎら、（１９９５年）「Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｔｏ  Ｔｈｅ  Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ａｎ  Ａｎｔｉ−Ｉｄｉｏｔｙｐｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｃｃｉｎｅ」、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、９６巻（１号）、３３４〜４２頁）、多形性上皮ムチン抗原、ヒト乳脂肪小球抗原、結直腸腫瘍関連抗原（例えばＣＥＡ、ＴＡＧ−７２（Ｙｏｋａｔａら、（１９９２年）「Ｒａｐｉｄ  Ｔｕｍｏｒ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  Ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｏｔｈｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｏｒｍｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５２巻、３４０２〜３４０８頁）、ＣＯ１７−１Ａ（Ｒａｇｎｈａｍｍａｒら、（１９９３年）「Ｅｆｆｅｃｔ  Ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  １７−ＩＡ  Ａｎｄ  ＧＭ−ＣＳＦ  Ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ−Ｌｏｎｇ−Ｌａｓｔｉｎｇ，  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｒｅｍｉｓｓｉｏｎｓ  Ｃａｎ  Ｂｅ  Ｉｎｄｕｃｅｄ」、Ｉｎｔ．  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、５３巻、７５１〜７５８頁）；ＧＩＣＡ  １９−９（Ｈｅｒｌｙｎら、（１９８２年）「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ．  Ｉ．  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎ  Ｓｅｒａ  Ｏｆ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ，  Ｇａｓｔｒｉｃ，  Ａｎｄ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ」、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２巻、１３５〜１４０頁）、ＣＴＡ−１およびＬＥＡ）、バーキットリンパ腫抗原−３８．１３，ＣＤ１９（Ｇｈｅｔｉｅら、（１９９４年）「Ａｎｔｉ−ＣＤ１９  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｔｈｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｂ−Ｃｅｌｌ  Ｔｕｍｏｒ  Ｌｉｎｅｓ  Ｉｎ  Ｖｉｔ���ｏ  Ａｎｄ  Ｏｆ  Ｄａｕｄｉ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎ  ＳＣＩＤ  Ｍｉｃｅ  Ｂｙ  Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  Ａｒｒｅｓｔ」、Ｂｌｏｏｄ  ８３巻、１３２９〜１３３６頁）、ヒトＢ−リンパ腫抗原−ＣＤ２０（Ｒｅｆｆら、（１９９４年）「Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｂ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｂｙ  Ａ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｍｏｕｓｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｏ  ＣＤ２０」、Ｂｌｏｏｄ  ８３巻、４３５〜４４５頁）、ＣＤ３３  （Ｓｇｏｕｒｏｓら、（１９９３年）「Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ａｎｄ  Ｄｏｓｉｍｅｔｒｙ，  Ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍ１９５  （Ａｎｔｉ−ＣＤ３３）  Ｉｎ  Ａｃｕｔｅ  Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ」、Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．、３４巻、４２２〜４３０頁）、黒色腫特異的抗原（例えばガングリオシドＧＤ２（Ｓａｌｅｈら、（１９９３年）「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｈａｔ  Ｍｉｍｉｃｓ  Ｔｈｅ  ＧＤ２  Ａｎｔｉｇｅｎ」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻、３３９０〜３３９８頁）、ガングリオシドＧＤ３（Ｓｈｉｔａｒａら、（１９９３年）「Ａ  Ｍｏｕｓｅ／Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉ−（Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  ＧＤ３）  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｗｉｔｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３６巻、３７３〜３８０頁）、ガングリオシドＧＭ２（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら、（１９９４年）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  Ｉｎ  Ｓｔａｇｅ  ＩＩＩ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  ＧＭ２  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  Ｔｒｉａｌ  Ｏｆ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  ＧＭ２  Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ」、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．、１２巻、１０３６〜１０４４頁）、ガングリオシドＧＭ３（Ｈｏｏｎら、（１９９３年）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｏｆ  Ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｔｏ  Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  ＧＭ３  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５３巻、５２４４〜５２５０頁））、腫瘍特異的移植型細胞表面抗原（ＴＳＴＡ）（例えばＤＮＡ腫瘍ウイルスのＴ抗原およびＲＮＡ腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原を始めとするウイルス誘発腫瘍抗原など）、腫瘍胎児抗原−アルファフェトプロテイン（例えば結腸のＣＥＡ）、膀胱腫瘍胎児抗原（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、（１９８５年）「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｔｏ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  Ｓｈａｒｅｄ  Ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｍｏｕｓｅ  Ｂｌａｄｄｅｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ」、Ｃａｎｃｅｒ．  Ｒｅｓ．、４５巻、２２１０〜２１８８頁）、分化抗原（例えばヒト肺癌抗原）Ｌ６、Ｌ２０（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、（１９８６年）「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｒａｉｓｅｄ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ」、Ｃａｎｃｅ���  Ｒｅｓ．、４６巻、３９１７〜３９２３頁）、線維肉腫の抗原、ヒト白血病Ｔ細胞抗原−Ｇｐ３７（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ−Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、（１９８８年）「Ｉｄｉｏｔｙｐｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ．  ＩＩ．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｉｄｉｏｔｙｐｅ  Ｃａｓｃａｄｅ  （Ａｂｌ，  Ａｂ２，  ａｎｄ  Ａｂ３）」、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４１巻、１３９８〜１４０３頁）、新生糖タンパク質、スフィンゴリピド、乳癌抗原（例えばＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体））、ＨＥＲ２抗原（ｐｌ８５ＨＥＲ２）、多形上皮ムチン（ＰＥＭ）（Ｈｉｌｋｅｎｓら、（１９９２年）「Ｃｅｌｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｍｕｃｉｎｓ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ−Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ」、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、Ｓｃｉ．、１７巻、３５９〜３６３頁）、悪性ヒトリンパ球抗原−ＡＰＯ−１  （Ｔｒａｕｔｈら、（１９８９年）「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｕｍｏｒ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ｂｙ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５巻、３０１〜３０４頁）、分化抗原（Ｆｅｉｚｉ  （１９８５年）「Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｂｙ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｔｈａｔ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ  Ａｒｅ  Ｏｎｃｏ−Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４巻、５３〜５７頁）（例えば胎児赤血球および初期内胚葉中のＩ抗原）、胃腺癌中のＩ（Ｍａ）、乳房上皮中のＭ１８およびＭ３９、骨髄細胞中のＳＳＥＡ−１、結直腸癌中のＶＥＰ８、ＶＥＰ９、Ｍｙｌ、ＶＩＭ−Ｄ５およびＤ１５６−２２、ＴＲＡ−１−８５（血液型Ｈ）、結腸腺癌中のＣ１４、肺腺癌中のＦ３、胃癌中のＡＨ６、胚性癌細
胞中のＹハプテンであるＬｅＹ、ＴＬ５（血液型Ａ）、Ａ４３１細胞中のＥＧＦ受容体、膵癌中のＥｌシリーズ（血液型Ｂ）、胚性癌細胞中のＦＣ１０．２、胃腺癌抗原、腺癌中のＣＯ−５１４（血液型Ｌｅａ）、腺癌中のＮＳ−１０、ＣＯ−４３（血液型Ｌｅｂ）、Ｇ４９、ＥＧＦ受容体、結腸腺癌中のＭＨ２（血液型ＡＬｅｂ／Ｌｅｙ）、結腸癌、胃癌ムチン中の１９．９、骨髄細胞中のＴ５Ａ７、黒色腫中のＲ２４、胚性癌細胞中の４．２、ＧＤ３、Ｄｌ．１、ＯＦＡ−１、ＧＭ２、ＯＦＡ−２、ＧＤ２、およびＭｌ：２２：２５：８、ならびに４〜８細胞胚中のＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４。別の実施形態では、抗原は皮膚Ｔ細胞リンパ腫からのＴ細胞受容体由来ペプチドである（Ｅｄｅｌｓｏｎ、（１９９８年）「Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ：  Ａ  Ｍｏｄｅｌ  Ｆｏｒ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｓｃｉ  Ａｍ．、４巻、６２〜７１頁）。
【０２８９】
本発明の方法および組成物によって治療または予防することができる癌およびこれに関連する疾患には、限定するわけではないが、以下が含まれる：白血病（限定するものではないが、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血球性白血病、および脊髄形成異常症候群など）、慢性白血病（限定するわけではないが、慢性骨髄性（顆粒球）白血病、慢性リンパ性白血病、毛様細胞白血病など））；真性赤血球増加症；リンパ腫（限定するわけではないが、ホジキン病、非ホジキン病など）；多発骨髄腫（限定するわけではないが、非定型的多発骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞白血病、孤立性形質細胞腫および髄外性形質細胞腫など）；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；特徴未確定の単クローングロブリン血症；良性単クローングロブリン血症；重鎖病；骨および結合組織肉腫（限定するわけではないが、骨部肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫、骨の線維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟組織肉腫、血管腫（血管肉腫）、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫など）；脳腫瘍（限定するわけではないが、グリオーマ、星状細胞腫、脳幹グリオーマ、上衣細胞腫、希突起グリオーマ、非グリア腫、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体腫、松果体芽腫、初発脳リンパ腫など）；乳癌（限定するわけではないが、腺癌、小葉（小細胞）癌、管内癌、髄様乳癌、粘液乳癌、管状乳癌、乳頭癌、ページェット病、および炎症性乳癌など）；副腎癌、（限定するわけではないが、クロム親和性細胞腫および副腎皮質癌など）；甲状腺癌（限定するわけではないが、乳頭性もしくは小胞性甲状腺癌、髄様甲状腺癌および未分化甲状腺癌など）；膵癌、（限定するわけではないが、膵島細胞腫、ガトリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍、およびカルチノイドもしくは膵島細胞腫瘍など）；下垂体癌（限定するわけではないが、クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、末端肥大症、および尿崩症など）；眼の癌（限定するわけではないが、虹彩黒色腫、脈絡膜黒色腫、および毛様体黒色腫などの眼部黒色腫、および網膜芽腫など）；膣癌（限定するわけではないが、扁平上皮癌、腺癌、および黒色腫など）；外陰部癌（限定するわけではないが、扁平上皮癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫、およびページェット病など）；子宮頚部癌（限定するわけではないが、扁平上皮癌、および腺癌など）；子宮癌（限定するわけではないが、子宮内膜癌および子宮肉腫など）；卵巣癌（限定するわけではないが、卵巣上皮癌、境界性腫瘍、胚細胞腫瘍、および間質腫瘍など）；食道癌（限定するわけではないが、扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌、粘膜表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、疣状癌、および燕麦細胞（小細胞）癌など）；胃癌（限定するわけではないが、腺癌、菌状（ポリープ状）、潰瘍性、表在性、拡散性、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫、および癌肉腫など）；結腸癌；直腸癌；肝癌（限定するわけではないが、肝細胞癌および肝芽腫など）；胆嚢癌（限定するわけではないが、腺癌など）；胆管癌（限定するわけではないが、乳頭様、結節性、および拡散性など）；肺癌（限定するわけではないが、非小細胞肺癌、扁平上皮癌（表皮癌）、腺癌、大細胞癌および小細胞肺癌など）；精巣癌（限定するわけではないが、胚腫瘍、精上皮腫、未分化性、古典的（典型的）、精子細胞、非精上皮腫、胎児性癌、奇形腫、絨毛癌（卵黄のう腫瘍）など）；前立腺癌（限定するわけではないが、腺癌、平滑筋肉腫、および横紋筋肉腫など）；陰茎癌；口腔癌（限定するわけではないが、扁平上皮癌など）；基底癌；唾液腺癌（限定するわけではないが、腺癌、粘膜表皮癌、および腺様嚢胞癌など）；咽頭癌（限定するわけではないが、扁平上皮癌、および疣状癌など）；皮膚癌（限定するわけではないが、基底細胞癌、扁平上皮癌および黒色腫、表在性黒色腫、結節性黒色腫、悪性黒子黒色腫、末端性黒子性黒色腫など）；腎癌（限定するわけではないが、腎細胞癌、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行性細胞癌（腎骨盤および／または子宮））；ウィルムス腫瘍；膀胱癌（限定するわけではないが、移行性細胞癌、扁平上皮癌、腺癌、癌肉腫など）。さらに、癌は以下を含む：粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑膜腫、血管芽腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支原性癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌および乳頭腺癌（こうした疾患の総説については、以下を参照されたい：Ｆｉｓｌｕｎａｎら、１９８５年、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２版、Ｊ．  Ｂ．  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．、ＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａおよびＭｕｒｐｈｙら、１９９７年、Ｉｎｆｏｒｍｅｄ  Ｄｅｃｉｓｉｏｎｓ：  Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ，  Ｖｉｋｉｎｇ  Ｐｅｎｇｕｉｎ、Ｐｅｎｇｕｉｎ  Ｂｏｏｋｓ  Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｉｎｃ．、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）。
【０２９０】
したがって、本発明の方法および組成物は、限定するわけではないが、以下を含む多様な癌またはその他の異常増殖性疾患の治療または予防においても有用である：癌（膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、前立腺、子宮頚部、甲状腺および皮膚の癌を含む）；扁平上皮癌など；リンパ造血系腫瘍、例えば白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫など；骨髄造血系腫瘍、例えば急性および慢性骨髄性白血病および前骨髄球性白血病など；間葉起源の腫瘍、例えば線維肉腫および横紋筋肉腫など；その他の腫瘍、例えば黒色腫、精上皮腫、奇形癌、神経芽腫およびグリオーマなど；中枢および末梢神経系の腫瘍、例えば星状細胞腫、神経芽腫、グリオーマ、および神経鞘腫など；間葉起源の腫瘍、例えば線維肉腫、横紋筋肉腫、および骨肉腫など；ならびにその他の腫瘍、例えば黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺小胞癌および奇形癌等。アポトーシスの異常に起因する癌も、本発明の方法および組成物によって治療し得ると想定される。こうした癌として、限定するわけではないが以下が含まれる：小胞腫、ｐ５３突然変異を伴う癌、乳房、前立腺および卵巣のホルモン依存性腫瘍、ならびに家族性腺腫様ポリープ症および脊髄形成異常症候群などの前癌性病変。特定の実施形態では、卵巣、膀胱、乳房、結腸、肺、皮膚、膵臓または子宮において、悪性疾患もしくは増殖異常変化（異形成および形成不全等）、または過剰増殖性疾患を、本発明の方法および組成物によって治療または予防する。別の特定の実施形態では、肉腫、黒色腫、または白血病を、本発明の方法および組成物によって治療または予防する。
【０２９１】
特定の実施形態では、本発明の分子（例えば、複数のエピトープ結合ドメイン、および任意にＦｃドメインまたはその一部を含むダイアボディ）は、癌細胞の増殖を、本発明の該分子の不在下での癌細胞の増殖と比較して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％、または少なくとも１０％、抑制するかまたは減少させる。
【０２９２】
特定の実施形態では、本発明の分子（例えば、複数のエピトープ結合ドメイン、および任意にＦｃドメインまたはその一部を含むダイアボディ）は、親分子よりも、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％多く、細胞を殺傷するか、癌細胞の増殖を抑制または軽減する。
【０２９３】
５．６．２  自己免疫疾患および炎症性疾患
いくつかの実施形態において、本発明の分子は、本発明の方法に従って操作された、ＦｃγＲＩＩＢに特異的なエピトープ結合ドメインおよび／または変異型Ｆｃドメイン（またはその一部）を含み、該Ｆｃドメインが野生型Ｆｃドメインと比べてより大きなＦｃγＲＩＩＢに対する親和性、および低下したＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＡに対する親和性を示す。そのような結合特性を有する本発明の分子は、免疫応答の調節、例えば自己免疫疾患または炎症性疾患に関連する免疫応答の抑制、において有用である。いずれの作用機構にも拘束されることを意図しないが、ＦｃγＲＩＩＢに対する親和性を有する、および／または増大したＦｃγＲＩＩＢに対する親和性と低下したＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＡに対する親和性を有するＦｃドメインを含む、本発明の分子は、ＦｃγＲに対する活性化応答を弱め、かつ細胞応答性の抑制をもたらし、したがって自己免疫疾患の治療および／または予防において治療効力を有すると考えられる。
【０２９４】
本発明はまた、被験者における、炎症性障害に関連する１以上の症状を予防し、治療し、または管理する方法を提供し、該方法は、１以上の抗炎症薬の、治療上または予防上有効な量を被験者に投与することをさらに含む。本発明はまた、自己免疫疾患に関連する１以上の症状を予防し、治療し、または管理する方法を提供し、該方法は、１以上の免疫調節薬の、治療上または予防上有効な量を被験者に投与することをさらに含む。セクション５．７は、抗炎症薬および免疫調節薬の非限定的な例を掲げる。
【０２９５】
本発明の分子を投与することにより治療できる自己免疫障害の例は、限定されるものでないが、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫卵巣炎および睾丸炎、自己免疫血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎（ｃｅｌｉａｃ  ｓｐｒｕｅ−ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、チャーグ−ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素病、クローン病、円板状狼蒼、本態性混合クリオグロブリン血症、線維筋痛−線維筋炎、糸球体腎炎、グレーヴズ病、ギヤン−バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ神経障害、若年性関節炎、扁平苔癬、紅斑性狼瘡、メニエール病、混合結合組織病、多発性硬化症、Ｉ型または免疫を介する糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、疱疹状皮膚炎脈管炎のような血管炎、白斑、およびヴェーゲナー肉芽腫症を含む。炎症性障害の例は、限定されるものでないが、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー障害、敗血症ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、および慢性的なウイルスまたは細菌感染から生じる慢性炎症を含む。本明細書のセクション２．２．２に記載の通り、いくつかの自己免疫障害は炎症性障害と関連している。このように、自己免疫障害と考えられる障害と炎症性障害と考えられる障害との間には重複がある。したがって、いくつかの自己免疫障害は炎症性障害としても特徴付けることができる。本発明の方法に従って予防、治療または管理することができる炎症性障害の例としては、限定されるものでないが、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー障害、敗血症ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、および慢性的なウイルスまたは細菌感染から生じる慢性炎症が挙げられる。
【０２９６】
ＦｃγＲＩＩＢに特異的な少なくとも１つのエピトープ結合ドメインおよび／または増大したＦｃγＲＩＩＢ親和性および低下したＦｃγＲＩＩＩＡ親和性を有する変異型Ｆｃドメインを含む本発明の分子はさらに、炎症性障害のある動物（特に哺乳動物）が被る炎症を軽減するために使用することもできる。特定の実施形態では、本発明の分子は動物の炎症を、前記分子を投与されてない動物の炎症と比較して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％，または少なくとも１０％軽減する。
【０２９７】
ＦｃγＲＩＩＢに特異的な少なくとも１つのエピトープ結合ドメインおよび／または増大したＦｃγＲＩＩＢ親和性および低下したＦｃγＲＩＩＩＡ親和性を有する変異型Ｆｃドメインを含む本発明の分子はさらに、移植の拒絶反応を防止するために用いることもできる。
【０２９８】
５．６．３  感染性疾患
本発明はまた、被験者における感染症の治療または予防の方法を包含し、該方法は、感染症と関連した感染性病原体に特異的な少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを含む、１種以上の本発明の分子の治療上または予防上有効な量を投与することを含む。特定の実施形態において、本発明の分子は感染性病原体に対して毒性であり、該分子の不在下での免疫応答と比べて、該病原体に対する免疫応答を増強するか、または該病原体に対するエフェクター機能を増強する。本発明の分子によって治療または予防し得る感染症は、限定するものではないが、ウイルス、細菌、真菌、原虫、およびウイルスを含む感染性病原体により引き起こされる。
【０２９９】
本発明の方法との関連で、本発明の分子を用いて治療または予防し得るウイルス性疾患は、限定するものでないが、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、水痘ウイルス、アデノウイルス、Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−Ｉ）、ＩＩ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−ＩＩ）、牛疫ウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス（ｅｃｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、天然痘ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、Ｉ型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−Ｉ）、ＩＩ型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−ＩＩ）、およびウイルス性髄膜炎、脳炎、デング熱または天然痘のようなウイルス性疾患の病原体により引き起こされるものを含む。
【０３００】
本発明の方法との関連で、本発明の分子を用いて治療または予防し得る細菌性疾患は、限定するものでないが、マイコバクテリア、リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア、肺炎球菌（Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、ライム病ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）（ライム病）、炭疽菌（炭疽病）、破傷風菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、マイコバクテリウム、破傷風菌、百日咳菌、コレラ菌、ペスト菌、ジフテリア菌、クラミジア、黄色ブドウ球菌（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ）およびレジオネラ菌を含む細菌により引き起こされるものを含む。
【０３０１】
本発明の方法との関連で、本発明の分子を用いて治療または予防し得る原虫性疾患は、限定するものでないが、リーシュマニア、コクシジウム（ｋｏｋｚｉｄｉｏａ）、トリパノソーマまたはマラリア原虫を含む原虫により引き起こされる。
【０３０２】
本発明の方法との関連で、本発明の分子を用いて治療または予防し得る寄生虫性疾患は、限定するものでないが、クラミジアおよびリケッチアを含む寄生虫により引き起こされる。
【０３０３】
本発明の１つの態様によれば、感染性病原体に特異的な少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを含む本発明の分子は、該病原体（例えば病原性タンパク質）に対する抗体エフェクター機能を示す。感染性病原体の例として、限定するものではないが、細菌（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉａｌｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、スタフィロコッカス・ビリダンス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ）およびシュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））、病原体（例えば、Ｂリンパ球向性パポバウイルス（ＬＰＶ）；ボルダテラ・ペルツッシス（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）；ボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）；ウシコロナウイルス；脈絡髄膜炎ウイルス；デング熱ウイルス；ウイルス、大腸菌；エボラ；エコーウイルス１；エコーウイルス１１（ＥＶ）；エンドトキシン（ＬＰＳ）；腸内細菌；腸内オーファンウイルス；腸内ウイルス；ネコ白血病ウイルス；手足口病ウイルス；テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）；グラム陰性細菌；ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｏｃａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）；単純ヘルペスウイルス；ＨＩＶ−１；ヒトサイトメガロウイルス；ヒトコロナウイルス；インフルエンザＡ、ＢおよびＣ；レジオネラ菌；リーシュマニア・メキシカーナ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａ）；リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；  麻疹ウイルス；髄膜炎菌；麻疹ウイルス；マウス肝炎ウイルス；マウス白血病ウイルス；マウスガンマヘルペスウイルス；マウスレトロウイルス；マウスコロナウイルス；マウス肝炎ウイルス；ミコバクテリウム・アビウムＭ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ−Ｍ）；リン菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）；ニューキャッスル病ウイルス；パーボウイルスＢ１９；熱帯熱マラリア原虫；ポックスウイルス；シュードモナス；ロタウイルス；サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｕｒｉｕｍ）；赤痢菌；連鎖球菌；Ｔ−細胞リンパ球ウイルス１；ワクシニアウイルス）が挙げられる。
【０３０４】
５．６．４  解毒
本発明はまた、毒素（例えば、毒性の薬物分子）に曝された被験者の解毒方法を包含し、該方法は、毒性の薬物分子に特異的な少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを含む１種以上の本発明の分子の治療上または予防上有効な量を投与することを含む。特定の実施形態において、本発明の分子の毒素への結合は該毒素の有害な生理学的作用を軽減または排除する。さらに他の実施形態では、本発明のダイアボディの毒素への結合は、該ダイアボディの不在下での毒素の除去、分解もしくは中和と比べて、毒素の除去、分解もしくは中和を増大または増強する。本発明の方法に従う免疫毒素療法は、ジゴキシン、ＰＣＰ、コカイン、コルヒチン、三環式抗うつ薬を含むがこれらに限らない薬物の過剰投与または該薬物への曝露を治療するために使用することができる。
【０３０５】
５．７  併用療法
本発明はさらに、限定するわけではないが、現行の標準的および実験的化学療法、ホルモン療法、生物学的療法、免疫療法、放射線療法または外科手術を含む、癌、自己免疫疾患、感染症、または中毒の治療または予防について当業者に知られたその他の療法と併用して、本発明の分子を投与することを包含する。いくつかの実施形態では、本発明の分子を、治療上または予防上有効な量の１種以上の薬剤、治療用抗体、または癌、自己免疫疾患、感染症、もしくは中毒の治療および／または予防について当業者に知られた他の薬剤と併用して、投与することができる。
【０３０６】
特定の実施形態では、１種以上の本発明の分子を、癌の治療に有用なその他の１種以上の治療薬と同時に、哺乳動物、好ましくはヒトに投与する。「同時に」なる用語は、予防薬または治療薬の正確な同時投与に限定するものではなく、むしろ本発明の分子とその他の薬剤を哺乳動物に連続的かつ一定の時間間隔以内に投与して、本発明の分子がその他の薬剤と共に作用して、これらを別々に投与した場合よりも増大した利益を提供するようにしたものを意味する。例えば、予防または治療用（例えば、化学療法、放射線療法、ホルモン療法または生物学的療法）薬のそれぞれを、同時に、または任意の順序で連続的に、異なる時点で投与することができる。しかし、同時に投与しない場合は、所望の治療または予防効果が提供されるように、時間的に十分近接させて投与すべきである。各治療薬は、任意の適切な形態で、かつ任意の好適な経路で、別々に投与することができる。種々の実施形態では、予防薬または治療薬を以下のように投与する：１時間未満の間隔、約１時間間隔、約１時間〜約２時間間隔、約２時間〜約３時間間隔、約３時間〜約４時間間隔、約４時間〜約５時間間隔、約５時間〜約６時間間隔、約６時間〜約７時間間隔、約７時間〜約８時間間隔、約８時間〜約９時間間隔、約９時間〜約１０時間間隔、約１０時間〜約１１時間間隔、約１１時間〜約１２時間間隔、２４時間間隔以下または４８時間間隔以下。好ましい実施形態では、２種以上の成分を患者の同一来診時に投与する。
【０３０７】
別の実施形態では、予防薬または治療薬を、約２〜４日間隔、約４〜６日間隔、約１週間間隔、約１〜２週間間隔、２週間以上の間隔で、投与する。好ましい実施形態では、予防薬または治療薬を、両方の薬剤が依然活性である時間枠内に、投与する。当業者ならば、投与する薬剤の半減期を測定することによって、こうした時間を決定することができるだろう。
【０３０８】
特定の実施形態では、本発明の予防薬または治療薬を、被験者に周期的に投与する。周期的治療には、第１薬剤をある期間投与した後、第２薬剤および／または第３薬剤をある期間投与し、この連続投与を反復することを含む。周期的治療は、１種以上の療法に対する耐性の進行を減少させ、療法の１つの副作用を回避するかまたは減少させ、かつ／または治療の効力を向上させることができる。
【０３０９】
ある実施形態では、予防薬または治療薬を、約３週間未満の周期で、約２週間毎に１回、約１０日毎に１回、または約１週間毎に１回、投与する。１周期には、周期毎に約９０分間、周期毎に約１時間、周期毎に約４５分間かけて注入することによる、治療薬または予防薬の投与が含まれる。各周期は少なくとも１週間の休止、少なくとも２週間の休止、少なくとも３週間の休止期を含む。投与する周期の回数は約１〜約１２周期、より典型的には約２〜約１０周期、より典型的には約２〜約８周期である。
【０３１０】
さらに別の実施形態では、本発明の治療および予防薬を、メトロノーム的投薬方式で、長期の休止期間を置かない連続注入または頻繁投与のいずれかによって投与する。こうしたメトロノーム的投与には、休止期間のない、一定の間隔での投薬が含まれ得る。典型的には、治療薬、特に細胞傷害薬を低用量で使用する。こうした投薬方式には、長期間の比較的低用量の連日投与が含まれる。好ましい実施形態では、低用量の使用は、毒性副作用を最少にし、休止期間を排除することができる。特定の実施形態では、治療および予防薬は、以下の範囲で、連日低用量投与または連続注入によって送達される：約２４時間から約２日まで、約１週間まで、約２週間まで、約３週間まで、約１ヶ月まで、約２ヶ月まで、約３ヶ月まで、約４ヶ月まで、約５ヶ月まで、約６ヶ月まで。こうした投薬方式のスケジュールは腫瘍専門家が最適化することができる。
【０３１１】
別の実施形態では、複数の治療コースを哺乳動物に同時に投与する。すなわち、個別の用量の治療薬を別々に投与するけれども、本発明の分子が別の薬剤と協同して作用できるような時間間隔内に投与する。例えば、ある成分を１週間に１回投与し、それと組み合わせて、別の成分を２週間毎に１回、または３週間毎に１回投与してもよい。言い換えれば、治療薬の投薬レジメンは、治療薬が同時にまたは患者の同一来診時に投与されないときでさえ、同時に実施される。
【０３１２】
他の予防および／または治療薬と併用する場合、本発明の分子と他の予防および／または治療薬は相加的に、より好ましくは相乗的に、作用することができる。１つの実施形態では、本発明の分子を１以上の治療薬とともに同一の医薬組成物中で同時に投与する。別の実施形態では、本発明の分子を１以上の治療薬とともに別々の医薬組成物として同時に投与する。さらに別の実施形態では、本発明の分子を、他の予防または治療薬の投与前、またはその後に投与する。本発明は、同一または異なる投与経路、例えば経口および非経口で、本発明の分子を他の予防または治療薬と併用して投与することを想定している。特定の実施形態では、本発明の分子を、限定するわけではないが、毒性などの有害副作用をもたらす可能性がある他の予防または治療薬と同時に投与する場合、その予防または治療薬は、有害副作用が誘発される閾値より低い用量で投与することが有利である。
【０３１３】
本明細書で提供する投薬量および投与頻度は、治療上有効なおよび予防上有効なという用語により包含されている。投薬量および頻度はさらに、典型的には各患者に特有な要因に従って、投与する特定の治療または予防薬、癌の重篤度およびタイプ、投与経路、ならびに患者の年齢、体重、応答性、および過去の病歴に応じて、変更されよう。好適な治療計画は、こうした要因を考慮し、例えば文献に報告され、また以下で推奨されている投薬量に従うことによって、当業者が選択し得るものである：Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（第５６版、２００２年）。
【０３１４】
５．７．１  抗癌剤
特定の実施形態では、本発明の方法は、１以上の本発明の分子を、癌の治療および／または予防のために使用される１以上の治療薬とともに投与することを包含する。１つの実施形態では、血管新生阻害薬を本発明の分子と併用して投与することができる。本発明の方法および組成物中で使用することができる血管新生阻害薬としては、限定するわけではないが以下が含まれる：アンギオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）（プラスミノーゲン断片）；抗血管新生抗トロンビンＩＩＩ；アンギオザイム（Ａｎｇｉｏｚｙｍｅ）；ＡＢＴ−６２７；Ｂａｙ  １２−９５６６；ベネフィン（Ｂｅｎｅｆｉｎ）；ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）；ＢＭＳ−  ２７５２９１；軟骨由来阻害薬（ＣＤＩ）；ＣＡＩ；ＣＤ５９  補体断片；ＣＥＰ−７０５５；Ｃｏｌ  ３；コンブレタスタチン（Ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ）Ａ−４；エンドスタチン（コラーゲンＸＶＩＩＩ断片）；フィブロネクチン断片；Ｇｒｏ−β；ハロフギノン（Ｈａｌｏｆｕｇｉｎｏｎｅ）；ヘパリナーゼ類；ヘパリンヘキササッカライド断片；ＨＭＶ８３３；ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）；ＩＭ−８６２；インターフェロンα／β／γ；インターフェロン誘導性タンパク質（ＩＰ−１０）；インターロイキン−１２；クリングル（Ｋｒｉｎｇｌｅ）５（プラスミノーゲン断片）；マリマスタット（Ｍａｒｉｍａｓｔａｔ）；メタロプロテイナーゼ阻害薬（ＴＩＭＰｓ）；２−メトキシエストラジオール；ＭＭＩ  ２７０（ＣＧＳ  ２７０２３Ａ）；ＭｏＡｂ  ＩＭＣ−１Ｃ１１；ネオバスタット（Ｎｅｏｖａｓｔａｔ）；ＮＭ−３；パンゼム（Ｐａｎｚｅｍ）；ＰＩ−８８；胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤；プラスミノーゲン活性化因子阻害剤；血小板因子−４（ＰＦ４）；プリノマスタット（Ｐｒｉｎｏｍａｓｔａｔ）；プロラクチン１６ｋＤａ断片；プロリフェリン（Ｐｒｏｌｉｆｅｒｉｎ）関連タンパク質（ＰＲＰ）；ＰＴＫ７８７／ＺＫ  ２２２５９４；レチノイド；ソリマスタット（Ｓｏｌｉｍａｓｔａｔ）；スクアラミン（Ｓｑｕａｌａｍｉｎｅ）；ＳＳ  ３３０４；ＳＵ  ５４１６；ＳＵ６６６８；ＳＵ１１２４８；テトラヒドロコルチゾール−Ｓ；テトラチオモリブダート；サリドマイド；トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）；ＴＮＰ−４７０；トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−ｂ）；バスキュロスタチン（Ｖａｓｃｕｌｏｓｔａｔｉｎ）；バソスタチン（Ｖａｓｏｓｔａｔｉｎ）（カルレチキュリン断片）；ＺＤ６１２６；ＺＤ  ６４７４；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害薬（ＦＴＩ）；およびビスホスホナート類。
【０３１５】
本発明の医薬組成物および剤形ならびにキットを含む、本発明の各種の実施形態において本発明の分子と併用して使用することができる抗癌薬としては、限定するわけではないが以下が含まれる：アシビシン（ａｃｉｖｉｃｉｎ）；アクラルビシン（ａｃｌａｒｕｂｉｃｉｎ）；塩酸アコダゾール（ａｃｏｄａｚｏｌｅ）；アクロニン（ａｃｒｏｎｉｎｅ）；アドゼレシン（ａｄｏｚｅｌｅｓｉｎ）；アルデスロイキン（ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ）；アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）；アンボマイシン（ａｍｂｏｍｙｃｉｎ）；酢酸アメタントロン（ａｍｅｔａｎｔｒｏｎｅ）；アミノグルテチミド（ａｍｉｎｏｇｌｕｔｅｔｈｉｍｉｄｅ）；アンサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）；アナストロゾール（ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）；アントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）；アスパラギナーゼ；アスペルリン（ａｓｐｅｒｌｉｎ）；アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）；アゼテパ（ａｚｅｔｅｐａ）；アゾトマイシン（ａｚｏｔｏｍｙｃｉｎ）；バチマスタット（ｂａｔｉｍａｓｔａｔ）；ベンゾデパ（ｂｅｎｚｏｄｅｐａ）；ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）；塩酸ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；ジメシル酸ビスナフィド（ｂｉｓｎａｆｉｄｅ）；ビゼレシン（ｂｉｚｅｌｅｓｉｎ）；硫酸ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）；ナトリウムブレキナル（ｂｒｅｑｕｉｎａｒ）；ブロピリミン（ｂｒｏｐｉｒｉｍｉｎｅ）；ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）；カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）；カルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）；カラセミド（ｃａｒａｃｅｍｉｄｅ）；カルベチメル（ｃａｒｂｅｔｉｍｅｒ）；カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）；カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）  ；塩酸カルビシン（ｃａｒｕｂｉｃｉｎ）；カルゼレシン（ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎ）；セデフィンゴル（ｃｅｄｅｆｉｎｇｏｌ）；クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）；シロレマイシン（ｃｉｒｏｌｅｍｙｃｉｎ）；シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）；クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）；メシル酸クリスナトル（ｃｒｉｓｎａｔｏｌ）；シクロホスファミド；シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）；ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）；ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）；塩酸ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）；デシタビン（ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ）；デキソルマプラチン（ｄｅｘｏｒｍａｐｌａｔｉｎ）；デザグアニン（ｄｅｚａｇｕａｎｉｎｅ）；メシル酸デザグアニン（ｄｅｚａｇｕａｎｉｎｅ）；ジアジクオン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）；ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）；塩酸ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）；ドロロキシフェン（ｄｒｏｌｏｘｉｆｅｎｅ）；クエン酸ドロロキシフェン（ｄｒｏｌｏｘｉｆｅｎｅ）；プロピオン酸ドロモスタノロン（ｄｒｏｍｏｓｔａｎｏｌｏｎｅ）；ジュアゾマイシン（ｄｕａｚｏｍｙｃｉｎ）；エダトレキサート（ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）；塩酸エフロルニチン（ｅｆｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；エルサミトルシン（ｅｌｓａｍｉｔｒｕｃｉｎ）；エンドプラチン（ｅｎｌｏｐｌａｔｉｎ���；エンプロマート（ｅｎｐｒｏｍａｔｅ）；エピプロピジン（ｅｐｉｐｒｏｐｉｄｉｎｅ）；塩酸エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）；エルブロゾール（ｅｒｂｕｌｏｚｏｌｅ）；塩酸エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）；エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）；リン酸エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）ナトリウム；エタニダゾール（ｅｔａｎｉｄａｚｏｌｅ）；エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）；リン酸エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）；エトプリン（ｅｔｏｐｒｉｎｅ）；塩酸ファドロゾール（ｆａｄｒｏｚｏｌｅ）；ファザラビン（ｆａｚａｒａｂｉｎｅ）；フェンレチニド（ｆｅｎｒｅｔｉｎｉｄｅ）；フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）；リン酸フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）；フルオロウラシル；フルロシタビン（ｆｌｕｒｏｃｉｔａｂｉｎｅ）；フォスキドン（ｆｏｓｑｕｉｄｏｎｅ）；ナトリウムフォストリエシン（ｆｏｓｔｒｉｅｃｉｎ）；ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）；塩酸ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）；ヒドロキシウレア；塩酸イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）；イフォスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）；イルモフォシン（ｉｌｍｏｆｏｓｉｎｅ）；インターロイキンＩＩ（組換えインターロイキンＩＩ、またはｒＩＬ２を含む）、インターフェロンα−２ａ；インターフェロンα−２ｂ；インターフェロンα−ｎｌ；インターフェロンα−ｎ３；インターフェロンβ−Ｉａ；インターフェロンγ−Ｉｂ；イプロプラチン（ｉｐｒｏｐｌａｔｉｎ）；塩酸イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）；酢酸ランレオチド（ｌａｎｒｅｏｔｉｄｅ）；レトロゾール（ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ）；酢酸ロイプロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）；塩酸リアロゾール（ｌｉａｒｏｚｏｌｅ）；ロメトレキソル（ｌｏｍｅｔｒｅｘｏｌ）ナトリウム；ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）；塩酸ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；マソプロコル（ｍａｓｏｐｒｏｃｏｌ）；メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）；塩酸メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）；酢酸メゲストロル（ｍｅｇｅｓｔｒｏｌ）；酢酸メレンゲストロル（ｍｅｌｅｎｇｅｓｔｒｏｌ）；メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）；メノガリル（ｍｅｎｏｇａｒｉｌ）；メルカプトプリン  ；メトトレキサート；ナトリウムメトトレキサート；メトプリン（ｍｅｔｏｐｒｉｎｅ）；メツレデパ（ｍｅｔｕｒｅｄｅｐａ）；ミチンドミド（ｍｉｔｉｎｄｏｍｉｄｅ）；ミトカルシン（ｍｉｔｏｃａｒｃｉｎ）；ミトクロミン（ｍｉｔｏｃｒｏｍｉｎ）；ミトギリン（ｍｉｔｏｇｉｌｌｉｎ）；ミトマルシン（ｍｉｔｏｍａｌｃｉｎ）；マイトマイシン；ミトスペル（ｍｉｔｏｓｐｅｒ）；ミトタン（ｍｉｔｏｔａｎｅ）；塩酸ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）；ノコダゾール（ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）；ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）；オルマプラチン（ｏｒｍａｐｌａｔｉｎ）；オキシスラン（ｏｘｉｓｕｒａｎ）；パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）；ペガスパルガーゼ（ｐｅｇａｓｐａｒｇａｓｅ）；ペリオマイシン（ｐｅｌｉｏｍｙｃｉｎ）；ペンタムスチン（ｐｅｎｔａｍｕｓｔｉｎｅ）；硫酸ペプロマイシン（ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）；ペルホスファミド（ｐｅｒｆｏｓｆａｍｉｄｅ）；ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）；ピポスルファン（ｐｉｐｏｓｕｌｆａｎ）；塩酸ピロキサントロン（ｐｉｒｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）；プロメスタン（ｐｌｏｍｅｓｔａｎｅ）；ポルフィマー（ｐｏｒｆｉｍｅｒ）ナトリウム；ポルフィロマイシン（ｐｏｒｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）；プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）；塩酸プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）；ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）；塩酸ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）；ピラゾフリン（ｐｙｒａｚｏｆｕｒｉｎ）；リボプリン（ｒｉｂｏｐｒｉｎｅ）；ログレチミド（ｒｏｇｌｅｔｉｍｉｄｅ）；サフィンゴル（ｓａｆｉｎｇｏｌ）；塩酸サフィンゴル（ｓａｆｉｎｇｏｌ）；セムスチン（ｓｅｍｕｓｔｉｎｅ）；シントラゼン（ｓｉｍｔｒａｚｅｎｅ）；ナトリウムスパルフォサート（ｓｐａｒｆｏｓａｔｅ）；スパルソマイシン（ｓｐａｒｓｏｍｙｃｉｎ）；塩酸スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）；スピロムスチン（ｓｐｉｒｏｍｕｓｔｉｎｅ）；スピロプラチン（ｓｐｉｒｏｐｌａｔｉｎ）；ストレプトニグリン（ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｇｒｉｎ）；ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）；スロフェヌル（ｓｕｌｏｆｅｎｕｒ）；タリソマイシン（ｔａｌｉｓｏｍｙｃｉｎ）；テコガラン（ｔｅｃｏｇａｌａｎ）ナトリウム；テガフル（ｔｅｇａｆｕｒ）；塩酸テロキサントロン（ｔｅｌｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；テモポルフィン（ｔｅｍｏｐｏｒｆｉｎ）；テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）；テロキシロン（ｔｅｒｏｘｉｒｏｎｅ）；テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）；チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）；チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）；チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）；チアゾフリン（ｔｉａｚｏｆｕｒｉｎ）；チラパザミン（ｔｉｒａｐａｚａｍｉｎｅ）；クエン酸トレミフェン（ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ）；酢酸トレストロン（ｔｒｅｓｔｏｌｏｎｅ）；リン酸トリシリビン（ｔｒｉｃｉｒｉｂｉｎｅ）；トリメトレキサート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）；グルクロン酸トリメトレキサート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）；トリプトレリン（ｔｒｉｐｔｏｒｅｌｉｎ）；塩酸ツブロゾール（ｔｕｂｕｌｏｚｏｌｅ）；ウラシルマスタード（ｕｒａｃｉｌ  ｍｕｓｔａｒｄ）；ウレデパ（ｕｒｅｄｅｐａ）；バプレオチド（ｖａｐｒｅｏｔｉｄｅ）；ベルテポルフィン（ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ）；硫酸ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）；硫酸ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）；ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）；硫酸ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）；硫酸ビンエピジン（ｖｉｎｅｐｉｄｉｎｅ）；硫酸ビングリシナート（ｖｉｎｇｌｙｃｉｎａｔｅ）；硫酸ビンレウロシン（ｖｉｎｌｅｕｒｏｓｉｎｅ）；酒石酸ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）；硫酸ビンロシジン（ｖｉｎｒｏｓｉｄｉｎｅ）；硫酸ビンゾリジン（ｖｉｎｚｏｌｉｄｉｎｅ）；ボロゾール（ｖｏｒｏｚｏｌｅ）；ゼニプラチン���ｚｅｎｉｐｌａｔｉｎ）；ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）；塩酸ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）。その他の抗癌薬として、限定するわけではないが、以下が含まれる：２０−エピ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３  ；５−エチニルウラシル；アビラテロン（ａｂｉｒａｔｅｒｏｎｅ）；アクラルビシン（ａｃｌａｒｕｂｉｃｉｎ）；アシルフルベン（ａｃｙｌｆｕｌｖｅｎｅ）；アデシペノル（ａｄｅｃｙｐｅｎｏｌ）；アドゼレシン（ａｄｏｚｅｌｅｓｉｎ）；アルデスロイキン（ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ）；ＡＬＬ−ＴＫ拮抗薬；アルトレタミン；アンバムスチン（ａｍｂａｍｕｓｔｉｎｅ）；アミドックス（ａｍｉｄｏｘ）；アミフォスチン（ａｍｉｆｏｓｔｉｎｅ）；アミノレブリン酸；アンルビシン（ａｍｒｕｂｉｃｉｎ）；アンサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）；アナグレリド（ａｎａｇｒｅｌｉｄｅ）；アナストロゾール（ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）；アンドログラホリド（ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｏｌｉｄｅ）；血管形成阻害薬；拮抗薬Ｄ；拮抗薬Ｇ；アンタレリクス（ａｎｔａｒｅｌｉｘ）；抗背方化形態発生タンパク質−１  ；抗アンドロゲン前立腺癌；抗エストロゲン；抗ネオプラストン；アンチセンスオリゴヌクレオチド；グリシン酸アフィジコリン（ａｐｈｉｄｉｃｏｌｉｎ）；アポトーシス遺伝子モジュレーター；アポトーシスレギュレーター；アプリン酸；アラ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アシュラクリン（ａｓｕｌａｃｒｉｎｅ）；アタメスタン（ａｔａｍｅｓｔａｎｅ）；アトリムスチン（ａｔｒｉｍｕｓｔｉｎｅ）；アキシナスタチン（ａｘｉｎａｓｔａｔｉｎ）１；アキシナスタチン２  ；アキシナスタチン３  ；アザセトロン（ａｚａｓｅｔｒｏｎ）；アザトキシン（ａｚａｔｏｘｉｎ）；アザチロシン（ａｚａｔｙｒｏｓｉｎｅ）；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノル（ｂａｌａｎｏｌ）；バチマスタット（ｂａｔｉｍａｓｔａｔ）；ＢＣＲ／ＡＢＬ拮抗薬；ベンゾクロリン類；ベンゾイルスタウロスポリン（ｂｅｎｚｏｙｌｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）；βラクタム誘導体；βアレチン（ｂｅｔａ−ａｌｅｔｈｉｎｅ）；βクラマイシン（ｂｅｔａｃｌａｍｙｃｉｎ）Ｂ；ベチュリン酸；ｂＦＧＦ阻害薬；ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；ビサジリジニルスペルミン（ｂｉｓａｚｉｒｉｄｉｎｙｌｓｐｅｒｍｉｎｅ）；ビ
スナフィド（ｂｉｓｎａｆｉｄｅ）；ビストラテン（ｂｉｓｔｒａｔｅｎｅ）Ａ；ビゼレシン（ｂｉｚｅｌｅｓｉｎ）；ブレフラート（ｂｒｅｆｌａｔｅ）；ブロピリミン（ｂｒｏｐｉｒｉｍｉｎｅ）；ブドチタン（ｂｕｄｏｔｉｔａｎｅ）；ブチオニンスルホキシイミン（ｂｕｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｍｉｎｅ）；カルシポトリオル（ｃａｌｃｉｐｏｔｒｉｏｌ）；カルホスチン（ｃａｌｐｈｏｓｔｉｎ）Ｃ；カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）誘導体；カナリポクス（ｃａｎａｒｙｐｏｘ）ＩＬ−２；カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）；カルボキサミド−アミノ−トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ  Ｍ３；ＣＡＲＮ  ７００；軟骨由来阻害薬；カルゼレシン（ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎ）；カゼインキナーゼ阻害薬（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン（ｃａｓｔａｎｏｓｐｅｒｍｉｎｅ）；セクロピン（ｃｅｃｒｏｐｉｎ）Ｂ；セトロレリクス（ｃｅｔｒｏｒｅｌｉｘ）；クロルン（ｃｈｌｏｒｌｎｓ）；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト（ｃｉｃａｐｒｏｓｔ）；ｃｉｓポルフィリン；クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）；クロミフェン（ｃｌｏｍｉｆｅｎｅ）類似体；クロトリマゾール（ｃｌｏｔｒｉｍａｚｏｌｅ）；コリスマイシン（ｃｏｌｌｉｓｍｙｃｉｎ）Ａ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチン（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ）Ａ４；コンブレタスタチン類似体；コナゲニン（ｃｏｎａｇｅｎｉｎ）；クランベシジン（ｃｒａｍｂｅｓｃｉｄｉｎ）８１６；クリスナトル（ｃｒｉｓｎａｔｏｌ）；クリプトフィシン（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｉｎ）８；クリプトフィシンＡ誘導体；キュラシン（ｃｕｒａｃｉｎ）Ａ；シクロペンタアントラキノン類；シクロプラタム（ｃｙｃｌｏｐｌａｔａｍ）；シペマイシン（ｃｙｐｅｍｙｃｉｎ）；シタラビンオクホスファート（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅｏｃｆｏｓｆａｔｅ）；細胞溶解因子；シトスタチン（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｎ）；ダクリキシマブ（ｄａｃｌｉｘｉｍａｂ）；デシタビン（ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ）；デヒドロジデムニン（ｄｅｈｙｄｒｏｄｉｄｅｍｎｉｎ）Ｂ；デスロレリン（ｄｅｓｌｏｒｅｌｉｎ）；デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）；デキシホスファミド（ｄｅｘｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）；デクスラゾキサン（ｄｅｘｒａｚｏｘａｎｅ）；デクスベラパミル（ｄｅｘｖｅｒａｐａｍｉｌ）；ジアジクオン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；ジデミン（ｄｉｄｅｍｎｉｎ）Ｂ  ；ジドクス（ｄｉｄｏｘ）；ジエチルノルスペニン（ｄｉｅｔｈｙｌｎｏｒｓｐｅｎｎｉｎｅ）；ジヒドロ−５−アザシチジン；ジヒドロタキソール，９−  ；ジオキサマイシン（ｄｉｏｘａｍｙｃｉｎ）；ジフェニルスピロムスチン（ｄｉｐｈｅｎｙｌ  ｓｐｉｒｏｍｕｓｔｉｎｅ）；ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）；ドコサノル（ｄｏｃｏｓａｎｏｌ）；ドラセトロン（ｄｏｌａｓｅｔｒｏｎ）；ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）；ドロロキシフェン（ｄｒｏｌｏｘｉｆｅｎｅ）；ドロナビノル（ｄｒｏｎａｂｉｎｏｌ）；ジュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）ＳＡ；エブセレン（ｅｂｓｅｌｅｎ）；エコムスチン（ｅｃｏｍｕｓｔｉｎｅ）；エデルフォシン（ｅｄｅｌｆｏｓｉｎｅ）；エドレコロマブ（ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ）；エフロルニチン（ｅｆｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；エレメン（ｅｌｅｍｅｎｅ）；エミテフル（ｅｍｉｔｅｆｕｒ）；エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）；エプリステリド（ｅｐｒｉｓｔｅｒｉｄｅ）；エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）類似体；エストロゲン作動薬；エストロゲン拮抗薬；エタニダゾール（ｅｔａｎｉｄａｚｏｌｅ）；リン酸エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）；エキセメスタン（ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ）；ファドロゾール（ｆａｄｒｏｚｏｌｅ）；ファザラビン（ｆａｚａｒａｂｉｎｅ）；フェンレチニド（ｆｅｎｒｅｔｉｎｉｄｅ）；フィルグラスチム（ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）；フィナステリド（ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄｅ）；フラボピリドル（ｆｌａｖｏｐｉｒｉｄｏｌ）；フレゼラスチン（ｆｌｅｚｅｌａｓｔｉｎｅ）；フルアステロン（ｆｌｕａｓｔｅｒｏｎｅ）；フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）  ；塩酸フルロダウノルニシン（ｆｌｕｏｒｏｄａｕｎｏｒｕｎｉｃｉｎ）；ホルフェニメクス（ｆｏｒｆｅｎｉｍｅｘ）；ホルメスタン（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｅ）；ホストリエシン（ｆｏｓｔｒｉｅｃｉｎ）；ホテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）；テキサフィリンガドリニウム（ｇａｄｏｌｉｎｉｕｍ  ｔｅｘａｐｈｙｒｉｎ）；硝酸ガリウム；ガロシタビン（ｇａｌｏｃｉｔａｂｉｎｅ）；ガニレリクス（ｇａｎｉｒｅｌｉｘ）；ゲラチナーゼ阻害薬；ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）；グルタチオン阻害薬；ヘプスルファム（ｈｅｐｓｕｌｆａｍ）；ヘレグリン（ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ）；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ハイペリシン（ｈｙｐｅｒｉｃｉｎ）；イバンドロン酸；イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）；イドキシフェン（ｉｄｏｘｉｆｅｎｅ）；イドラマントン（ｉｄｒａｍａｎｔｏｎｅ）；イルモフォシン（ｉｌｍｏｆｏｓｉｎｅ）；イロマスタット（ｉｌｏｍａｓｔａｔ）；イミダゾアクリドン類；イミキモド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）；免疫刺激ペプチド類；インスリン様成長因子−１受容体阻害薬；インターフェロン作動薬；インターフェロン類；インターロイキン類；イオベングアン（ｉｏｂｅｎｇｕａｎｅ）；ヨードドキソルビシン（ｉｏｄｏｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）；イポメアノル（ｉｐｏｍｅａｎｏｌ），４−；イロプラクト（ｉｒｏｐｌａｃｔ）；イルソグラジン（ｉｒｓｏｇｌａｄｉｎｅ）；イソベンガゾール（ｉｓｏｂｅｎｇａｚｏｌｅ）；イソホモハリコンドリン（ｉｓｏｈｏｍｏｈａｌｉｃｏｎｄｒｉｎ）Ｂ；イタセトロン（ｉｔａｓｅｔｒｏｎ）；ジャスプラキノリド（ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）；カハラリド（ｋａｈａｌａｌｉｄｅ）Ｆ；３酢酸ラメラリン（ｌａｍｅｌｌａｒｉｎ）−Ｎ；ランレオチド（ｌａｎｒｅｏｔｉｄｅ）；レイナマイシン（ｌｅｉｎａｍｙｃｉｎ）；レノグラスチム（ｌｅｎｏｇｒａｓｔｉｍ）；硫酸レンチナン（ｌｅｎｔｉｎａｎ）；レプトルスタチン（ｌｅｐｔｏｌｓｔａｔｉｎ）；レトロゾール（ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ）；白血病抑制因子；白血球αインターフェロン；ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；ロイプロレリン（ｌｅｕｐｒｏｒｅｌｉｎ）；レバミソール（ｌｅｖａｍｉｓｏｌｅ）；リアロゾール（ｌｉａｒｏｚｏｌｅ）；線状ポリアミン類似体；親油性ジサッカライドペプチド；親油性白金化合物；リソクリナミド（ｌｉｓｓｏｃｌｉｎａｍｉｄｅ）７；ロバプラチン（ｌｏｂａｐｌａｔｉｎ）；ロンブリシン（ｌｏｍｂｒｉｃｉｎｅ）；ロメトレキソル（ｌｏｍｅｔｒｅｘｏｌ）；ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）；ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）；ロキソリビン（ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ）；ルルトテカン（ｌｕｒｔｏｔｅｃａｎ）；テキサフィリンルテチウム（ｌｕｔｅｔｉｕｍ  ｔｅｘａｐｈｙｒｉｎ）；リソフィリン（ｌｙｓｏｆｙｌｌｉｎｅ）  ；溶解性ペプチド類；マイタンシン（ｍａｉｔａｎｓｉｎｅ）；マンノスタチン（ｍａｎｎｏｓｔａｔｉｎ）Ａ；マリマスタット（ｍａｒｉｍａｓｔａｔ）；マソプロコル（ｍａｓｏｐｒｏｃｏｌ）；マスピン（ｍａｓｐｉｎ）；マトリリシン（ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ）阻害薬；マトリックス金属プロテイナーゼ阻害薬；メノガリル（ｍｅｎｏｇａｒｉｌ）；メルバロン（ｍｅｒｂａｒｏｎｅ）；メテレリン（ｍｅｔｅｒｅｌｉｎ）；メチオニナーゼ；メトクロプラミド（ｍｅｔｏｃｌｏｐｒａｍｉｄｅ）；ＭＩＦ阻害薬；ミフェプリストン（ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ）；ミルテホシン（ｍｉｌｔｅｆｏｓｉｎｅ）；ミリモスチム（ｍｉｒｉｍｏｓｔｉｍ）；ミスマッチ二本鎖ＲＮＡ；ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）；ミトラクトル（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）；マイトマイシン類似体；ミトナフィド（ｍｉｔｏｎａｆｉｄｅ）；マイトトキシン線維芽成長因子−サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）；ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；モファロテン（ｍｏｆａｒｏｔｅｎｅ）；モルグラモスチム（ｍｏｌｇｒａｍｏｓｔｉｍ）；モノクローナル抗体、ヒト絨毛ゴナドトロフィン；モノホスホリルリピドＡ＋ミオバクテリウム細胞壁ｓｋ；モピダモル（ｍｏｐｉｄａｍｏｌ）；多重薬剤耐性遺伝子阻害薬；多発性腫瘍抑制因子１ベースの治療；マスタード抗癌薬；マイカペルオキシドＢ；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン（ｍｙｒｉａｐｏｒｏｎｅ）；Ｎ−アセチルジナリン（ａｃｅｔｙｌｄｉｎａｌｉｎｅ）；Ｎ−置換ベンズアミド類；ナファレリン（ｎａｆａｒｅｌｉｎ）；ナグレスチップ（ｎａｇｒｅｓｔｉｐ）；ナロキソン（ｎａｌｏｘｏｎｅ）＋ペンタゾシン（ｐｅｎｔａｚｏｃｉｎｅ）；ナパビン（ｎａｐａｖｉｎ）；ナフテルピン（ｎａｐｈｔｅｒｐｉｎ）；ナルトグラスチム（ｎａｒｔｏｇｒａｓｔｉｍ）；ネダプラチン（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）；ネモルビシン（ｎｅｍｏｒｕｂｉｃｉｎ）；ネリドロン酸；中性エンドペプチダーゼ；ニルタミド（ｎｉｌｕｔａｍｉｄｅ）；ニサマイシン（ｎｉｓａｍｙｃｉｎ）；一酸化窒素モジュレーター；ニトロキシド抗酸化剤；ニトルリン（ｎｉｔｒｕｌｌｙｎ）；０６−ベンジルグアニン；オクトレオチド（ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ）；オキセノン（ｏｋｉｃｅｎｏｎｅ）；オリゴヌクレオチド類；オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）；オンダンセトロン（ｏｎｄａｎｓｅｔｒｏｎ）；オンダンセトロン（ｏｎｄａｎｓｅｔｒｏｎ）；オラシン（ｏｒａｃｉｎ）；経口サイ��カイン誘導薬；オルマプラチン（ｏｒｍａｐｌａｔｉｎ）；オサテロン（ｏｓａｔｅｒｏｎｅ）；オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）；オキサウノマイシン（ｏｘａｕｎｏｍｙｃｉｎ）；パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）；パクリタキセル類似体；パクリタキセル誘導体類  ；パラウアミン（ｐａｌａｕａｍｉｎｅ）；パルミトイルリゾキシン（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｒｈｉｚｏｘｉｎ）；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン（ｐａｎｏｍｉｆｅｎｅ）；パラバクチン（ｐａｒａｂａｃｔｉｎ）；パゼリプチン（ｐａｚｅｌｌｉｐｔｉｎｅ）；ぺグアスパルガーゼ（ｐｅｇａｓｐａｒｇａｓｅ）；ペルデシン（ｐｅｌｄｅｓｉｎｅ）；ポリ硫酸ペントサンナトリウム；ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）；ペントロゾール（ｐｅｎｔｒｏｚｏｌｅ）；パーフルブロン（ｐｅｒｆｌｕｂｒｏｎ）；パーホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン（ｐｈｅｎａｚｉｎｏｍｙｃｉｎ）；酢酸フェニル；リン酸塩阻害薬；ピシバニル（ｐｉｃｉｂａｎｉｌ）；塩酸ピロカルピン（ｐｉｌｏｃａｒｐｉｎｅ）；ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）；ピリトレキシム（ｐｉｒｉｔｒｅｘｉｍ）；プラセチン（ｐｌａｃｅｔｉｎ）Ａ；プラセチンＢ；プラスミノーゲン活性化因子阻害薬；白金複合体；白金化合物；白金−トリアミン複合体；ポルフィマー（ｐｏｒｆｉｍｅｒ）ナトリウム；ポルフィロマイシン（ｐｏｒｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）；プレドニゾン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）；プロピルｂｉｓ−アクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソーム阻害薬；タンパク質Ａベースの免疫モジュレーター；タンパク質キナーゼＣ阻害薬；タンパク質キナーゼＣ阻害薬類、ミクロアルガル（ｍｉｃｒｏａｌｇａｌ）；タンパク質チロシンホスファターゼ阻害薬；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害薬；プルプリン類；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート；ｒａｆ拮抗薬；ラルチトレキセド（ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｄ）；ラモセトロン（ｒａｍｏｓｅｔｒｏｎ）；ｒａｓファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害薬；ｒａｓ阻害薬；ｒａｓ−ＧＡＰ阻害薬；脱メチル化レテリプチン（ｒｅｔｅｌｌｉｐｔｉｎｅ）；レニウムＲｅ１８６エチドロナート；リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）；リボザイム類；ＲＩＩレチナミド（ｒｅｔｉｎａｍｉｄｅ）；ログレチ
ミド（ｒｏｇｌｅｔｉｍｉｄｅ）；ロヒツキン（ｒｏｈｉｔｕｋｉｎｅ）；ロムルチド（ｒｏｍｕｒｔｉｄｅ）；ロキニメクス（ｒｏｑｕｉｎｉｍｅｘ）；ルビギノン（ｒｕｂｉｇｉｎｏｎｅ）Ｂｌ；ルボキシル（ｒｕｂｏｘｙｌ）；サフィンゴル（ｓａｆｉｎｇｏｌ）；サイントピン（ｓａｉｎｔｏｐｉｎ）；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトル（ｓａｒｃｏｐｈｙｔｏｌ）Ａ；サルグラモスチン（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ）；Ｓｄｉ  １模倣体；セムスチン（ｓｅｍｕｓｔｉｎｅ）；セネセンス誘導阻害薬１；センスオリゴヌクレオチド類；シグナル導入阻害薬；シグナル導入モジュレーター；一本鎖抗原結合性タンパク質；シゾフィラン（ｓｉｚｏｆｉｒａｎ）；ソブゾキサン（ｓｏｂｕｚｏｘａｎｅ）；ボロカプト酸ナトリウム；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロル（ｓｏｌｖｅｒｏｌ）；ソマトメジン結合性タンパク質；ソネルミン（ｓｏｎｅｒｍｉｎ）；スパルホジン酸（ｓｐａｒｆｏｓｉｃ  ａｃｉｄ）；スピカマイシンＤ；スピロムスチン（ｓｐｉｒｏｍｕｓｔｉｎｅ）；スプレノペンチン（ｓｐｌｅｎｏｐｅｎｔｉｎ）；スポンギスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）１；スクアラミン；幹細胞阻害薬；幹細胞分裂阻害薬；スチピアミド（ｓｔｉｐｉａｍｉｄｅ）；ストロメリシン（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ）阻害薬；スルフィノシン（ｓｕｌｆｉｎｏｓｉｎｅ）；高作用性血管作用性腸内ペプチド拮抗薬；スラジスタ（ｓｕｒａｄｉｓｔａ）；スラミン（ｓｕｒａｍｉｎ）；スウェインソニン（ｓｗａｉｎｓｏｎｉｎｅ）；合成グリコサミンオグリカン；タリムスチン（ｔａｌｌｉｍｕｓｔｉｎｅ）；タモキシフェンメチオジド（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ  ｍｅｔｈｉｏｄｉｄｅ）；タウロムスチン（ｔａｕｒｏｍｕｓｔｉｎｅ）；タザロテン（ｔａｚａｒｏｔｅｎｅ）；テコガラン（ｔｅｃｏｇａｌａｎ）ナトリウム；テガフル（ｔｅｇａｆｕｒ）；テルラピリリウム（ｔｅｌｌｕｒａｐｙｒｙｌｉｕｍ）；テロメラーゼ阻害薬；テモポルフィン（ｔｅｍｏｐｏｒｆｉｎ）；テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）；テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン（ｔｅｔｒａｚｏｍｉｎｅ）；タリブラスチン（ｔｈａｌｉｂｌａｓｔｉｎｅ）；チオコラリン（ｔｈｉｏｃｏｒａｌｉｎｅ）；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣体；チマルファシン（ｔｈｙｍａｌｆａｓｉｎ）；チモポエチン（ｔｈｙｍｏｐｏｉｅｔｉｎ）受容体作動薬；チモトリナン（ｔｈｙｍｏｔｒｉｎａｎ）  ；甲状腺刺激ホルモン；チエニルエチオプルプリン；チラパザミン（ｔｉｒａｐａｚａｍｉｎｅ）；２塩化チタノセン；トプセンチン（ｔｏｐｓｅｎｔｉｎ）；トレミフェン（ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ）；全能性幹細胞因子；翻訳阻害薬；トレチノイン（ｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）；トリアセチルウリジン；トリシリビン（ｔｒｉｃｉｒｉｂｉｎｅ）；トリメトレキサート；トリプトレリン（ｔｒｉｐｔｏｒｅｌｉｎ）；トロピセトロン（ｔｒｏｐｉｓｅｔｒｏｎ）；ツロステリド（ｔｕｒｏｓｔｅｒｉｄｅ）；チロシンキナーゼ阻害薬；チルホスチン類；ＵＢＣ阻害薬；ウベニメクス（ｕｂｅｎｉｍｅｘ）；尿生殖洞由来成長抑制因子；ウロキナーゼ受容体拮抗薬；バプレオチド（ｖａｐｒ���ｏｔｉｄｅ）；バリオリン（ｖａｒｉｏｌｉｎ）Ｂ；ベクターシステム、赤血球遺伝子治療；ベラレソル（ｖｅｌａｒｅｓｏｌ）；ベラミン（ｖｅｒａｍｉｎｅ）；ベルジン類；ベルテポルフィン（ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ）；ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）；ビンキサルチン（ｖｉｎｘａｌｔｉｎｅ）；ビタキシン（ｖｉｔａｘｉｎ）；ボロゾール（ｖｏｒｏｚｏｌｅ）；ザノテロン（ｚａｎｏｔｅｒｏｎｅ）；ゼニプラチン（ｚｅｎｉｐｌａｔｉｎ）；ジラスコルブ（ｚｉｌａｓｃｏｒｂ）；およびジノスタチンスチマラマー（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ  ｓｔｉｍａｌａｍｅｒ）。好ましいその他の抗癌薬は５−フルオロウラシルおよびロイコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ）である。
【０３１６】
本発明の方法で使用することができる治療用抗体の例としては、限定するわけではないが、以下が含まれる：ＺＥＮＡＰＡＸＳ（登録商標）（ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）（Ｒｏｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）（急性腎同種移植片拒絶反応の予防用の、免疫抑制性ヒト化抗ＣＤ２５モノクローナル抗体）；ＰＡＮＯＲＥＸＴＭ（マウス抗１７−ＩＡ細胞表面抗原ＩｇＧ２ａ抗体）（Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ／Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；ＢＥＣ２（マウス抗イディオタイプ（ＧＤ３エピトープ）ＩｇＧ抗体）（ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）；ＩＭＣ−Ｃ２２５（キメラ抗ＥＧＦＲ  ＩｇＧ抗体）（Ｃｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）；ＶＩＴＡＸＩＮＴＭ（ヒト化抗αＶβ３インテグリン抗体）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）；Ｓｍａｒｔ  Ｍ１９５（ヒト化抗ＣＤ３３  ＩｇＧ抗体）（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂ／Ｋａｎｅｂｏ）；ＬＹＭＰＨＯＣＩＤＥＴＭ（ヒト化抗ＣＤ２２ＩｇＧ抗体）（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）；ＩＣＭ３（ヒト化抗ＩＣＡＭ３抗体）（ＩＣＯＳ  Ｐｈａｎｎ）；ＩＤＥＣ−１１４（霊長類化抗ＣＤ８０抗体）（ＩＤＥＣＰｈａｒｍ／Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）；ＩＤＥＣ−１３１（ヒト化抗ＣＤ４０Ｌ抗体）（ＩＤＥＣ／Ｅｉｓａｉ）；ＩＤＥＣ−１５１（霊長類化抗ＣＤ４抗体）（ＩＤＥＣ）；ＩＤＥＣ−１５２（霊長類化抗ＣＤ２３抗体）（ＩＤＥＣ／Ｓｅｉｋａｇａｋｕ）；ＳＭＡＲＴ抗ＣＤ３（ヒト化抗ＣＤ３  ＩｇＧ）（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂ）；５Ｇ１．１（ヒト化抗補体因子５（Ｃ５）抗体）（Ａｌｅｘｉｏｎ  Ｐｈａｒｍ）；Ｄ２Ｅ７（ヒト化抗ＴＮＦ−α抗体）（ＣＡＴ／ＢＡＳＦ）；ＣＤＰ８７０（ヒト化抗ＴＮＦ−αＦａｂ断片）（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）；ＩＤＥＣ−１５１（霊長類化抗ＣＤ４  ＩｇＧｌ抗体）（ＩＤＥＣＰｈａｒｍ／ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）；ＭＤＸ−ＣＤ４（ヒト抗ＣＤ４  ＩｇＧ抗体）（Ｍｅｄａｒｅｘ／Ｅｉｓａｉ／Ｇｅｎｍａｂ）；ＣＤＰ５７１（ヒト化抗ＴＮＦ−αＩｇＧ４抗体）（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）；ＬＤＰ−０２（ヒト化抗α４β７抗体）（ＬｅｕｋｏＳｉｔｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ＯｒｔｈｏＣｌｏｎｅ  ＯＫＴ４Ａ（ヒト化抗ＣＤ４  ＩｇＧ抗体）（Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）；ＡＮＴＯＶＡＴＭ（ヒト化抗ＣＤ４０Ｌ  ＩｇＧ抗体）（Ｂｉｏｇｅｎ）；ＡＮＴＥＧＲＥＮＴＭ（ヒト化抗  ＶＬＡ−４  ＩｇＧ抗体）（Ｅｌａｎ）；およびＣＡＴ−１５２（ヒト抗ＴＧＦ−β２抗体）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｂ  Ｔｅｃｈ）。本発明に従って使用することができる治療用抗体のその他の例を表８に示す。
【０３１７】
【表８−１】
0005718637.tif 000032
【０３１８】
【表８−２】
0005718637.tif 000033
【０３１９】
【表８−３】
0005718637.tif 000034
【０３２０】
【表８−４】
0005718637.tif 000035
【０３２１】
【表８−５】
0005718637.tif 000036
【０３２２】
【表８−６】
0005718637.tif 000037
５．７．２  免疫調節薬および抗炎症薬
本発明は、本発明の分子を他の治療薬とともに投与することを含む、自己免疫疾患および炎症性疾患の治療方法を提供する。免疫調節薬の例としては、限定するものではないが、メトトレキセート、エンブレル（ＥＮＢＲＥＬ）、レミケード（ＲＥＭＩＣＡＤＥＴＭ）、レフルノミド、シクロホスファミド、シクロスポリンＡ、およびマクロライド抗生物質（例えば、ＦＫ５０６（タクロリムス））、メチルプレドニゾロン（ＭＰ）、コルチコステロイド、ステロイド、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン（シロリムス）、ミゾリビン、デオキシスペルグアリン（ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）、ブレキナル（ｂｒｅｑｕｉｎａｒ）、マロノニトリルアミド（例えば、レフルナミド）、Ｔ細胞受容体モジュレーター、およびサイトカイン受容体モジュレーターを含む。
【０３２３】
抗炎症薬は、炎症性疾患および自己免疫疾患の治療において成功をおさめており、現在、このような疾患のための共通かつ標準の治療薬となっている。当業者に知られたいずれの抗炎症薬も本発明の方法に使用することができる。抗炎症薬の非限定的な例は、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ステロイド系抗炎症薬、β作動薬、抗コリン作動薬、およびメチルキサンチンを含む。ＮＳＡＩＤの例は、限定するものではないが、アスピリン、イブプロフェン、セレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸＴＭ）、ジクロフェナク（ＶＯＬＴＡＲＥＮＴＭ）、エトドラク（ＬＯＤＩＮＥＴＭ）、フェノプロフェン（ＮＡＬＦＯＮＴＭ）、インドメタシン（ＩＮＤＯＣＩＮＴＭ）、ケトロラク（ＴＯＲＡＤＯＬＴＭ）、オキサプロジン（ＤＡＹＰＲＯＴＭ）、ナブメトン（ＲＥＬＡＦＥＮＴＭ）、スリンダク（ＣＬＩＮＯＲＩＬＴＭ）、トルメチン（ＴＯＬＥＣＴＩＮＴＭ）、ロフェコキシブ（ＶＩＯＸＸＴＭ）、ナプロキセン（ＡＬＥＶＥＴＭ、ＮＡＰＲＯＳＹＮＴＭ）、ケトプロフェン（ＡＣＴＲＯＮＴＭ）およびナブメトン（ＲＥＬＡＦＥＮＴＭ）を含む。このようなＮＳＡＩＤはシクロオキシゲナーゼ酵素（例えば、ＣＯＸ−１および／またはＣＯＸ−２）を阻害することにより機能する。ステロイド系抗炎症薬の例は、限定するものではないが、グルココルチコイド、デキサメタゾン（ＤＥＣＡＤＲＯＮＴＭ）、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン（ＤＥＬＴＡＳＯＮＥＴＭ）、プレドニゾロン、トリアムシノロン、アザルフィジン、およびエイコサノイド、例えばプロスタグランジン、トロンボキサン、およびロイコトリエンを含む。
【０３２４】
炎症性疾患の治療または予防のために本発明の分子と併用して使用することができる抗体の非限定的な例を表９に示し、また、自己免疫疾患の治療または予防のために使用することができる抗体の非限定的な例を表１０に示す。
【０３２５】
【表９−１】
0005718637.tif 000038
【０３２６】
【表９−２】
0005718637.tif 000039
【０３２７】
【表９−３】
0005718637.tif 000040
【０３２８】
【表９−４】
0005718637.tif 000041
【０３２９】
【表１０−１】
0005718637.tif 000042
【０３３０】
【表１０−２】
0005718637.tif 000043
【０３３１】
【表１０−３】
0005718637.tif 000044
５．７．３  感染症治療用の薬剤
いくつかの実施形態では、本発明の分子は、感染症の治療および／または予防のために、当業者に公知の１種以上のさらなる治療薬の治療上または予防上有効な量と組み合わせて投与することができる。本発明は、感染症の治療および／または予防のための当業者に公知の抗生物質と組み合わせた、本発明の分子の使用を想定している。本発明の分子と組み合わせて用いることができる抗生物質としては、限定するものではないが、マクロライド（例えばトブラマイシン（Ｔｏｂｉ（登録商標）））、セファロスポリン（例えばセファレキシン（Ｋｅｆｌｅｘ（登録商標））、セフラジン（Ｖｅｌｏｃｅｆ（登録商標））、セフロキシム（Ｃｅｆｔｉｎ（登録商標））、セフプロジル（Ｃｅｆｚｉｌ（登録商標））、セファクロール（Ｃｅｃｌｏｒ（登録商標））、セフィキシム（Ｓｕｐｒａｘ（登録商標））またはセファドロキシル（Ｄｕｒｉｃｅｆ（登録商標）））、クラリスロマイシン（例えばクラリスロマイシン（Ｂｉａｘｉｎ（登録商標）））、エリスロマイシン（例えばエリスロマイシン（ＥＭｙｃｉｎ（登録商標）））、ペニシリン（例えば、ペニシリンＶ（Ｖ−Ｃｉｌｌｉｎ  Ｋ（登録商標）またはＰｅｎ  Ｖｅｅ  Ｋ（登録商標）））またはキノロン（例えばオフロキサシン（Ｆｌｏｘｉｎ（登録商標））、シプロフロキサシン（Ｃｉｐｒｏ（登録商標））またはノルフロキサシン（Ｎｏｒｏｘｉｎ（登録商標）））、アミノ配糖体系抗生物質（例えばアプラマイシン、アルベカシン、バンバーマイシン（ｂａｍｂｅｒｍｙｃｉｎ）、ブチロシン、ジベカシン、ネオマイシン、ネオマイシン、ウンデシレネート、ネチルマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、およびスペクチノマイシン）、アンフェニコール（ａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）系抗生物質（例えばアジダムフェニコール（ａｚｉｄａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）、クロラムフェニコール、フロルフェニコール、およびチアンフェニコール）、アンサマイシン系抗生物質（例えばリファマイド（ｒｉｐｈａｍｉｄｅ）およびリファンピン）、カルバセフェム系（例えばロラカルベフ）、カルバペネム系（例えばビアペネムおよびイミペネム）、セファロスポリン系（例えばセファクロール、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン（ｃｅｆａｚｅｄｏｎｅ）、セフォゾプラン、セフピミゾール、セフピラミド、およびセフピロム）、セファマイシン系（例えばセフブペラゾン、セフメタゾール、およびセフミノクス）、モノバクタム系（例えばアズトレオナム、カルモナム、およびチゲモナム（ｔｉｇｅｍｏｎａｍ））、オキサセフェム系（例えばフロモキセフ、およびモキサラクタム）、ペニシリン系（例えばアムジノシリン（ａｍｄｉｎｏｃｉｌｌｉｎ）、アムジノシリンピボキシル（ａｍｄｉｎｏｃｉｌｌｉｎ  ｐｉｖｏｘｉｌ）、アモキシシリン、バカンピシリン、ベンジルペニシリン酸、ベンジルペニシリンナトリウム、エピシリン、フェンベニシリン、フロキサシリン、ペナムシリン、ペネタメートヒドリオダイド（ｐｅｎｅｔｈａｍａｔｅ  ｈｙｄｒｉｏｄｉｄｅ）、ペニシリンｏ−ベネタミン、ペニシリンＯ、ペニシリンＶ、ペニシリンＶベンザチン、ペニシリンＶヒドラバミン（ｐｅｎｉｃｉ��ｌｉｎ  Ｖ  ｈｙｄｒａｂａｍｉｎｅ）、ペニメピシクリン（ｐｅｎｉｍｅｐｉｃｙｃｌｉｎｅ）、およびフェンシヒシリン（ｐｈｅｎｃｉｈｉｃｉｌｌｉｎ）カリウム）、リンコサミド系（例えばクリンダマイシン、およびリンコマイシン）、アンフォマイシン、バシトラシン、カプレオマイシン、コリスチン、エンジュラシジン、エンビオマイシン、テトラサイクリン系（例えばアピサイクリン（ａｐｉｃｙｃｌｉｎｅ）、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリン、およびデメクロサイクリン）、２，４−ジアミノピリミジン系（例えばブロジモプリム（ｂｒｏｄｉｍｏｐｒｉｍ））ニトロフラン系（例えばフラルタドン、および塩化フラゾリウム（ｆｕｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ））、キノロンおよびその類似体（例えばシノキサシン、クリナフロキサシン、フルメキン、およびグレパグロキサシン（ｇｒｅｐａｇｌｏｘａｃｉｎ））、スルホンアミド系（例えばアセチルスルファメトキシピラジン、ベンジルスルフアミド、ノプリルスルフアミド、フタリルスルフアセトアミド、スルフアクリソイジン（ｓｕｌｆａｃｈｒｙｓｏｉｄｉｎｅ）、およびスルファシチン（ｓｕｌｆａｃｙｔｉｎｅ））、スルホン系（例えばジアチモスルホン（ｄｉａｔｈｙｍｏｓｕｌｆｏｎｅ）、グルコスルホンナトリウム、およびソラスルホン（ｓｏｌａｓｕｌｆｏｎｅ））、シクロセリン、ムピロシンおよびチュベリン（ｔｕｂｅｒｉｎ）を含む。
【０３３２】
特定の実施形態では、本発明の分子は、治療上または予防上有効な量の１種以上の抗真菌剤と組み合わせて投与することができる。本発明の分子と組み合わせて用いることができる抗真菌剤には、限定するものではないが、アンフォテリシンＢ、イトラコナゾール、ケトコナゾール、フルコナゾール、イントラセカル（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、フルシトシン、ミコナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、ニスタチン、テルコナゾール、チオコナゾール、シクロピロクス、エコナゾール、ハロプログリン（ｈａｌｏｐｒｏｇｒｉｎ）、ナフチフィン、テルビナフィン、ウンデシレネート、およびグリセオフルビンが含まれる。
【０３３３】
いくつかの実施形態では、本発明の分子は、治療上または予防上有効な量の１種以上の抗ウイルス薬と組み合わせて投与することができる。本発明の分子と組み合わせて用いることができる有効な抗ウイルス薬には、限定するものではないが、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤およびヌクレオシド類似体が含まれる。抗ウイルス薬の例としては、限定するものではないが、ジドブジン、アシクロビル、ガンシクロビル、ビダラビン、イドクスウリジン、トリフルリジン、およびリバビリン、ならびにホスカルネット、アマンタジン、リマンタジン、サキナビル、インジナビル、アンプレナビル、ロピナビル、リトナビル、αインターフェロン；アデフォビル、クレバジン（ｃｌｅｖａｄｉｎｅ）、エンテカビル、プレコナリルが挙げられる。
【０３３４】
５．８  ワクチン療法
本発明は、本発明の組成物を用いて、抗原性または免疫原性物質に対する免疫応答を誘発することをさらに包含し、該物質としては、限定するものではないが、癌抗原および感染症抗原（これらの例は後述する）が含まれる。本発明のワクチン組成物は、１以上の抗原性または免疫原性物質（それに対する免疫応答が望まれる）を含み、該１以上の抗原性または免疫原性物質は、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する増大した親和性を有する本発明の変異型抗体によりコートされる。本発明のワクチン組成物は、抗原性または免疫原性物質に対する免疫応答、好ましくは防御性免疫応答を引き起こすのに特に有効である。
【０３３５】
いくつかの実施形態では、本発明のワクチン組成物中の抗原性または免疫原性物質は、ウイルス（それに対する免疫応答が望まれる）を含む。ウイルスは組換え体またはキメラでもよく、好ましくは弱毒化されている。組換え体、キメラ、および弱毒化ウイルスの産生は、当業者に公知の標準的な手法を用いて行うことができる。本発明は、本発明に従って製剤化される生組換えウイルスワクチンまたは不活化組換えウイルスワクチンを包含する。生ワクチンが好ましく、なぜなら宿主内での複製が、自然な感染において起こるのと同種かつ同程度の持続的な刺激をもたらし、したがって十分な、長期的な免疫を付与するためである。そのような生組換えウイルスワクチン製剤の生産は、細胞培養物またはニワトリ胚尿膜中でのウイルス増殖と、それに続く精製を含む従来の方法を用いて達成し得る。
【０３３６】
具体的な実施形態では、組換えウイルスは、それが投与される被験者に対して非病原性のものである。これに関して、ワクチン用に遺伝子操作ウイルスを使用するには、これらのウイルス株が弱毒化特性をもつ必要がある。トランスフェクションに用いる鋳型に適当な突然変異（例えば欠失）を導入すると、弱毒化特性を有する新規ウイルスが得られる。例えば、温度感受性または寒冷適応に関連する特定のミスセンス突然変異を、欠失突然変異中に導入することができる。これらの突然変異は、寒冷または温度感受性変異体に関連する点突然変異よりも安定であるはずであり、復帰突然変異の頻度が極めて低いはずである。組換えウイルスを作製するための組換えＤＮＡ技術は、当技術分野で公知であり、本発明に包含される。例えば、負鎖ＲＮＡウイルスの改変のための技術が当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第５，１６６，０５７号を参照されたい（その全文を参照として本明細書に組み入れる）。
【０３３７】
あるいはまた、「自殺」特性を有するキメラウイルスが、本発明の皮内ワクチン製剤での使用のために構築され得る。そのようなウイルスは、宿主内でわずかに１〜数回の複製しか行うことがない。ワクチンとして用いたときには、組換えウイルスは限られた複製サイクルを行い、十分なレベルの免疫応答を誘発するが、ヒト宿主中でさらに複製サイクルを行って、病気を引き起こすことはない。あるいはまた、不活化（死滅）ウイルスを本発明に従って製剤化することができる。不活化ワクチン製剤は、キメラウイルスを「死滅させる」ための、従来の方法を用いて調製することが可能である。不活化ワクチンは、その感染性が破壊されているという意味で「死んでいる」。理想的には、ウイルスの感染性がその免疫原性を損なうことなく破壊される。不活化ワクチンを調製するためには、キメラウイルスを細胞培養物もしくはニワトリ胚尿膜中で増殖させ、ゾーン超遠心により精製し、ホルムアルデヒドもしくはβ−プロピオラクトンにより不活化してプールする。
【０３３８】
特定の実施形態では、完全に外来性のエピトープ（他のウイルス性または非ウイルス性病原体に由来する抗原を含む）が本発明の皮内ワクチン製剤に使用するためのウイルスへと遺伝子工学的に操作される。例えば、例えばＨＩＶ（ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１）のような非関連ウイルスの抗原、寄生虫抗原（例えばマラリア）、細菌もしくは真菌抗原または腫瘍抗原を操作して、弱毒化株にすることができる。
【０３３９】
事実上あらゆる異種遺伝子配列が、皮内ワクチン製剤で使用するための本発明のキメラウイルスへと構築され得る。好ましくは、異種遺伝子配列は、生物学的応答の改変因子として作用する部分またはペプチドである。好ましくは、様々な病原体のいずれかに対して防御性免疫応答を引き起こすエピトープ、または中和抗体に結合する抗原が、キメラウイルスによって、またはその一部として発現される。例えば、本発明のキメラウイルスに構築され得る異種遺伝子配列は、限定するものではないが、インフルエンザおよびパラインフルエンザの血球凝集素、ノイラミニダーゼおよび融合糖タンパク質（例えばヒトＰＩＶ３のＨＮおよびＦ遺伝子）を含む。また別の実施形態では、キメラウイルスへと操作し得る異種遺伝子配列には、免疫調節活性を有するタンパク質をコードするものが含まれる。免疫調節タンパク質の例としては、限定するものではないが、サイトカイン、Ｉ型インターフェロン、γインターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン−１、−２、−４、−５、−６、−１２、およびこれらの物質のアンタゴニストが含まれる。
【０３４０】
また別の実施形態では、本発明は、変異型抗体を表面に発現する病原性細胞またはウイルス、好ましくは弱毒化ウイルスを包含する。
【０３４１】
代替的な実施形態では、本発明のワクチン組成物は、抗原性または免疫原性物質がＦｃγＲＩＩＩＡに対する増大した親和性を有する本発明の変異型抗体と機能的に連結されている、融合ポリペプチドを含む。本発明のワクチン組成物に使用するための融合ポリペプチドの操作は、慣例的な組換えＤＮＡ技術の方法を用いて行われ、通常の技能の範囲内である。
【０３４２】
本発明は、本発明の組成物を投与することにより、被験者において免疫寛容を誘発する方法をさらに包含する。好ましくは、被験者において免疫寛容を誘発するのに適した組成物は、本発明の変異型抗体によってコートされた抗原性または免疫原性物質を含み、その際、該変異型抗体はＦｃγＲＩＩＢに対してより高い親和性を有するものである。特定の作用機構に拘束されることを意図しないが、そのような組成物はＦｃγＲＩＩＢを介した阻害経路を活性化することにより免疫寛容を誘発するのに有効である。
【０３４３】
５．９  組成物および投与方法
本発明は、複数のエピトープ結合ドメインおよび任意にＦｃドメイン（またはその一部）を含む本発明の分子（すなわちダイアボディ）を含む方法および医薬組成物を提供する。本発明はまた、疾患、障害または感染に関連する１以上の症状を治療、予防、および改善する方法であって、被験者に有効な量の、本発明の融合タンパク質もしくはコンジュゲート分子、または本発明の融合タンパク質もしくはコンジュゲート分子を含む医薬組成物を投与することによる上記方法をさらに提供する。好ましい態様では、抗体、融合タンパク質、またはコンジュゲート分子は、実質的に精製されている（すなわち、その効果を限定するかまたは望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない）。具体的な実施形態では、被験者は動物、好ましくは哺乳動物、例えば非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）および霊長類（例えば、サル、例えばカニクイザルおよびヒト）である。好ましい実施形態では、被験者はヒトである。また別の好ましい実施形態では、本発明の抗体は被験者と同じ生物種に由来するものである。
【０３４４】
様々な送達系が知られていて、本発明の分子を含む組成物を投与するために利用することができるが、例えばリポソーム、微粒子、マイクロカプセル内への封入、抗体または融合タンパク質を発現することができる組換え細胞、受容体介在エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕら、（１９８７年）「Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂｙ  Ａ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  ＤＮＡ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６２巻、４４２９〜４４３２頁を参照）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築などがある。本発明の分子を投与する方法には、限定するものではないが、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下）、硬膜外、および粘膜（例えば、鼻腔内および口腔経路）が含まれる。具体的な実施形態では、本発明の分子を筋肉内、静脈内、または皮下に投与する。組成物を任意の都合のよい経路により、例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または皮膚粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸管粘膜など）を介する吸収により投与してもよく、他の生物学的活性薬剤と一緒に投与してもよい。投与は全身的でも局所的でもよい。さらに、例えば、吸入器または噴霧器の使用により、およびエアロゾル化剤を用いる製剤化により肺投与を採用することもできる。例えば、米国特許第６，０１９，９６８；５，９８５，３２０；５，９８５，３０９；５，９３４，２７２；５，８７４，０６４；５，８５５，９１３；５，２９０，５４０；および４，８８０，０７８号；ならびにＰＣＴ公開ＷＯ  ９２／１９２４４；ＷＯ  ９７／３２５７２；ＷＯ  ９７／４４０１３；ＷＯ  ９８／３１３４６；およびＷＯ  ９９／６６９０３を参照されたい（これらのそれぞれの全体を参照として本明細書に組み入れる）。
【０３４５】
本発明はまた、本発明の分子を密閉容器（例えばアンプルまたは小袋）中にパッケージして、抗体の量を表示することを提供する。一実施形態では、本発明の分子を、乾燥した無菌凍結乾燥粉末または無水濃縮物として密閉容器に入れて供給し、そして例えば水または生理食塩水を用いて被験者に投与するための適当な濃度に再調製する。好ましくは、本発明の分子を、乾燥した無菌凍結乾燥粉末または無水濃縮物として密閉容器に入れて、少なくとも５ｍｇ、さらに好ましくは少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、または少なくとも７５ｍｇの単位用量にて供給する。凍結乾燥した本発明の分子はその元の容器内で２〜８℃の間で貯蔵しなければならず、また、該分子は、再調製した後１２時間以内、好ましくは６時間以内、５時間以内、３時間以内、または１時間以内に投与しなければならない。代替的な実施形態では、本発明の分子を、液剤として密閉容器に入れて、該分子、融合タンパク質、またはコンジュゲート分子の量および濃度を表示して供給する。好ましくは、本発明の分子の液剤を、密閉容器に入れて、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは少なくとも２．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２００ｍｇ／ｍｌの該分子にて供給する。
【０３４６】
疾患に関連する１以上の症状を治療、予防または改善するために有効であり得る本発明の組成物の量は、標準的な臨床技術により決定することができる。製剤中で用いる正確な用量はまた、投与経路や病状の重篤度にも左右され、医師の判断および各患者の状況によって決定されねばならない。有効な用量をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から誘導した用量−応答曲線から推定することができる。
【０３４７】
本発明により包含されるダイアボディの場合、患者に投与される投与量は、典型的には、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）である。好ましくは、患者に投与される用量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜２ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．２５ｍｇ／ｋｇまたは０．０１〜０．１０ｍｇ／ｋｇである。本発明のダイアボディの投与量と頻度は、例えば、リピド化などの修飾によりダイアボディの取込みおよび組織浸透を増強することによって、低減または変更することができる。
【０３４８】
一実施形態では、患者に投与される本発明の分子の投与量は、単剤療法として用いるとき、０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ／日であってよい。他の実施形態では、本発明の分子を他の治療用組成物と一緒に用いて、患者に投与される投与量を、上記分子を単剤療法として用いるときより低くする。
【０３４９】
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物を、治療の必要な部位に局所投与することが望ましい。これは、例えば、限定するものではないが、局所注入により、注射により、またはシアラスチック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）メンブランなどのメンブランまたは繊維を含む多孔質、非多孔質、またはゼラチン状の材料からなる移植片を用いて達成することができる。好ましくは、本発明の分子を投与するとき、該分子が吸収されない材料を使うように注意しなければならない。
【０３５０】
他の実施形態では、組成物を小胞、特にリポソームに入れて送達することができる（Ｌａｎｇｅｒ、（１９９０年）「Ｎｅｗ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９巻、１５２７〜１５３３頁）；Ｔｒｅａｔら「感染症と癌の治療法におけるリポソーム（Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ）」、Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（編）、Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ．３５３〜３６５頁（１９８９年）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ、前掲、３１７〜３２７頁を参照されたい；一般的には前掲を参照）。
【０３５１】
さらに他の実施形態では、組成物を制御放出または持続放出システムで送達することができる。本発明の１種以上の分子を含む持続放出製剤を作るために、当業者に公知のいずれの技術を用いてもよい。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号；ＰＣＴ公開ＷＯ  ９１／０５５４８；ＰＣＴ公開ＷＯ  ９６／２０６９８；Ｎｉｎｇら、１９９６年、「持続放出ゲルを用いたヒト大腸癌異種移植片の腫瘍内放射線免疫療法（Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｈｙ  ｏｆ  ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｇｅｌ）」Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ＆  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３９巻、１７９〜１８９頁、Ｓｏｎｇら、１９９５年、「長循環エマルジョンの抗体を介する肺ターゲティング（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｌｕｎｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｌｏｎｇ−Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ）」ＰＤＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５０巻、３７２〜３９７頁、Ｃｌｅｅｋら、１９９７年、「心血管適用のためのｂＦＧＦ抗体に対する生物分解性ポリマー担体（Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｆｏｒ  ａ  ｂＦＧＦ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」Ｐｒｏ．  Ｉｎｔ’ｌ．  Ｓｙｍｐ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌ．  Ｂｉｏａｃｔ．  Ｍａｔｅｒ．  ２４巻、８５３〜８５４頁、およびＬａｍら、１９９７頁、「局所送達のための組換えヒト化モノクローナル抗体のマイクロカプセル化（Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｌｏｃａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」Ｐｒｏｃ．  Ｉｎｔ’ｌ．  Ｓｙｍｐ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．  Ｂｉｏａｃｔ．  Ｍａｔｅｒ．  ２４巻、７５９〜７６０頁を参照されたい（それぞれの全体を参照として本明細書に組み入れる）。一実施形態では、ポンプを制御放出システムで用いることができる（Ｌａｎｇｅｒ、前掲；Ｓｅｆｔｏｎ、（１９８７年）「Ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ  Ｐｕｍｐｓ」、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．  １４巻、２０１〜２４０頁、Ｂｕｃｈｗａｌｄら、（１９８０年）「Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ，  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  Ｈｅｐａｒｉｎ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｂｙ  Ａｎ  Ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｐｕｍｐ  Ｉｎ  Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｖｅｎｏｕｓ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ」、Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８巻、５０７〜５１６頁、およびＳａｕｄｅｋら、（１９８９年）「Ａ  Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  Ｔｒｉａｌ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｆｏｒ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、３２１巻、５７４〜５７９頁）。他の実施形態では、ポリマー材料を用いて抗体の制御放出を達成することができる（例えば「制御放出の���療上の応用例（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ）」、ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ  （１９７４年）；「制御放出薬物バイオアベイラビリティー、医薬品設計と性能（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ、Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）」、Ｓｍｏｌｅｎ  およびＢａｌｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８４年）；  Ｌｅｖｙら、（１９８５年）「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ  Ｈｅａｒｔ  Ｖａｌｖｅｓ  Ｂｙ  Ｌｏｃａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８巻、１９０〜１９２頁、Ｄｕｒｉｎｇら、（１９８９年）「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｏｆ  Ｄｏｐａｍｉｎｅ  Ｆｒｏｍ  Ａ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｂｒａｉｎ  Ｉｍｐｌａｎｔ：  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ」、Ａｎｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．、２５巻、３５１〜３５６頁、Ｈｏｗａｒｄら、（１９８９年）「Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｉｎ  Ｒａｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｌｅｓｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ｄｅｆｉｃｉｔｓ」、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．、７巻（１号）、１０５〜１１２頁、米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号；ＰＣＴ公開ＷＯ  ９９／１５１５４；およびＰＣＴ公開ＷＯ  ９９／２０２５３を参照）。持続放出製剤に使用されるポリマーの例としては、限定するものではないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ酸無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、およびポリオルトエステルが挙げられる。さらに他の実施形態では、制御放出システムを治療標的（例えば、肺）の近位に配置することで、全身用量の一部しか必要としないようにすることができる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、「制御放出の医療上の応用（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ）」、前掲、２巻１１５〜１３８頁（１９８４年）を参照）。他の実施形態では、制御放出移植片として有用なポリマー組成物が、Ｄｕｎｎら（米国特許第５，９４５，１５５号を参照）に従い用いられる。この特定の方法は、ポリマー系からの生物活性物質のｉｎ  ｓｉｔｕ制御放出の治療効果に基づく。移植は一般的に、治療処置を必要とする患者体内のいずれの場所で行ってもよい。他の実施形態では非ポリマー系の持続送達システムが使用されるが、この場合には、被験者体内の非ポリマー移植片が薬物送達システムとして使用される。体内に移植すると、移植片の有機溶媒が、該組成物から周囲組織液中に散逸、分散または浸出して、非ポリマー材料が徐々に凝集または沈降し、固体の微孔質マトリックスを形成する（米国特許第５，８８８，５３３号を参照）。
【０３５２】
制御放出システムは、Ｌａｎｇｅｒによる文献（１９９０年、「Ｎｅｗ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９巻、１５２７〜１５３３頁）に述べられている。本発明の１種以上の治療薬を含む持続放出製剤を作るために、当業者に公知のいずれの技術を用いてもよい。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号；国際公開ＷＯ  ９１／０５５４８およびＷＯ  ９６／２０６９８；Ｎｉｎｇら、（１９９６年）「Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｈｙ  Ｏｆ  Ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｕｓｉｎｇ  Ａ  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｇｅｌ」、Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ＆  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３９巻、１７９〜１８９頁、Ｓｏｎｇら、（１９９５年）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｌｕｎｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｌｏｎｇ−Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ」、ＰＤＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５０巻、３７２〜３９７頁、Ｃｌｅｅｋら、（１９９７年）「Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｆｏｒ  Ａ  ｂＦＧＦ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｏｒ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｐｒｏ．  Ｉｎｔ’ｌ．  Ｓｙｍｐ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌ．  Ｂｉｏａｃｔ．  Ｍａｔｅｒ．、２４巻、８５３〜８５４頁、およびＬａｍら、（１９９７年）「Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｏｒ  Ｌｏｃａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｐｒｏｃ．  Ｉｎｔ’ｌ．  Ｓｙｍｐ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌ．  Ｂｉｏａｃｔ．  Ｍａｔｅｒ．  ２４巻、７５９〜７６０頁を参照されたい（それぞれの全体を参照として本明細書に組み入れる）。
【０３５３】
具体的な実施形態では、本発明の組成物が本発明のダイアボディをコードする核酸である場合、これを適当な核酸発現ベクターの一部として構成し、それが細胞内に取り込まれるようにこれを投与することによって、そのコード化されたダイアボディの発現を促進するために該核酸をｉｎ  ｖｉｖｏで投与することができる。細胞内への取込みは、例えば、レトロウイルスベクターを使用することによって（米国特許第４，９８０，２８６号を参照）、または直接注射によって、または微粒子衝突（例えば遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）によって、または脂質、細胞表面受容体もしくはトランスフェクト試薬でコーティングすることによって、または核に侵入することが知られるホメオボックス様ペプチドと連結して投与する（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら、（１９９１年）「Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ  Ｈｏｍｅｏｂｏｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８巻、１８６４〜１８６８頁を参照）こと等によって行う。あるいはまた、核酸を細胞内に導入して、相同的組換えによって発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。
【０３５４】
治療上または予防上有効な量の本発明の分子を用いる被験者の治療は、単回治療であってもよいが、好ましくは、一連の治療を含む。好ましい例においては、約０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ（体重）の本発明の分子を用いて、週１回、約１〜１０週間にわたって、好ましくは約２〜８週間にわたって、さらに好ましくは約３〜７週間にわたって、より一層好ましくは約４、５、または６週間にわたって、被験者を治療する。他の実施形態では、本発明の医薬組成物を１日１回、１日２回、または１日３回投与する。他の実施形態では、医薬組成物を週１回、週２回、２週毎に１回、月１回、６週毎に１回、２ヶ月毎に１回、年２回または年１回投与する。治療に使用する分子の有効投与量が、特定の治療期間を通して増加したり減少したりすることもまた理解されよう。
【０３５５】
５．９．１  医薬組成物
本発明の組成物は、医薬組成物の製造に有用であるバルク薬組成物（例えば、不純なまたは非滅菌の組成物）および単位投与剤形の調製に利用できる医薬組成物（すなわち、被験者または患者に投与するのに適した組成物）を含む。そのような組成物は、予防上または治療上有効な量の本明細書中に開示した予防薬および／または治療薬またはそれらの薬剤の組合せと、製薬上許容し得る担体とを含む。好ましくは本発明の組成物は、予防上または治療上有効な量の１種以上の本発明の分子および製薬上許容される担体を含む。
【０３５６】
本発明はまた、本発明のダイアボディ分子と、特定の癌抗原に特異的な治療用抗体（例えば腫瘍特異的モノクローナル抗体）と、製薬上許容される担体とを含む医薬組成物を包含する。
【０３５７】
特定の実施形態において、「製薬上許容し得る」との用語は、動物、特にヒトでの使用について、連邦政府または州政府の規制当局により認可された、または米国薬局方もしくは他の一般的に認められた薬局方に掲げられたことを意味する。「担体」との用語は、治療薬がそれらとともに投与される、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全および不完全））、賦形剤、またはビヒクルを意味する。このような製薬上の担体は、水や油などの無菌液体であってもよく、石油、動物、植物または合成起源のもの、例えばピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などを含む。医薬組成物を静脈内投与するとき、水は好ましい担体である。生理食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール水溶液は、特に注射液用の、液状担体として利用することができる。好適な製薬上の賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどを含む。所望であれば、組成物はまた、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有してもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳化液、錠剤、丸薬、カプセル剤、粉剤、持続放出製剤などの剤形をとり得る。
【０３５８】
一般的に、本発明の組成物の成分は、別々にまたは一緒に混合して単位投与剤形で、例えば、乾燥した凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、密閉容器、例えばアンプルまたは小袋に入れ、活性薬剤の量を表示して供給される。組成物を注入により投与する場合は、薬品級の滅菌水または生理食塩水を含有する注入ボトルを用いて調剤してもよい。組成物を注射により投与する場合は、無菌の注射用水または生理食塩水のアンプルを提供して、諸成分が投与前に混合されるようにすることができる。
【０３５９】
本発明の組成物を、中性または塩形態として製剤化してもよい。製薬上許容し得る塩としては、限定するものではないが、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるアニオンにより形成された塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されたカチオンにより形成された塩が含まれる。
【０３６０】
５．９．２  遺伝子治療
特定の実施形態では、本発明の分子をコードする配列を含む核酸を投与することにより、遺伝子治療を用いて疾患、障害、または感染に関連する１以上の症状を治療、予防、または改善する。遺伝子治療は、発現されるまたは発現可能な核酸を被験者に投与することにより行われる治療を意味する。本発明のこの実施形態では、核酸が、治療または予防効果を媒介するそのコード化抗体または融合タンパク質を産生する。
【０３６１】
当技術分野で利用し得るいずれの遺伝子治療法も本発明に従って使用することができる。代表的な方法を以下に記載する。
【０３６２】
遺伝子治療法の一般的総括については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら、（１９９３年）「Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２巻、４８８〜５０５頁、Ｗｕら、（１９９１年）「Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３巻、８７〜９５頁、Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ  （１９９３年）「Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｒｉａｌｓ  Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ」、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．、３２巻、５７３〜５９６頁、Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９９３年）「Ｔｈｅ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０巻、９２６〜９３２頁、およびＭｏｒｇａｎら、（１９９３年）「Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６２巻１９１〜２１７頁を参照されたい。利用することができる組換えＤＮＡ技術の技術分野で公知の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ  （１９９３年）；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ  （１９９０年）に記載されている。
【０３６３】
好ましい態様では、本発明の組成物は本発明のダイアボディをコードする核酸を含み、該核酸は好適な宿主内で抗体を発現する発現ベクターの一部である。特に、このような核酸は、抗体コード領域と機能的に連結されたプロモーター、好ましくは異種プロモーターを有し、上記プロモーターは誘導性、構成的、場合によっては組織特異的なものであり得る。他の特定の実施形態では、抗体コード配列および他の所望の配列が、ゲノム内の所望の部位での相同的組換えを促進する領域によって挟まれており、その結果として、抗体をコードする核酸の染色体内発現をもたらすような核酸分子が使用される（Ｋｏｌｌｅｒら、（１９８９年）「Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｂｅｔａ  ２−Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｌｏｃｕｓ  Ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｂｙ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８６巻、８９３２〜８９３５頁、ならびにＺｉｊｌｓｔｒａら（１９８９年）「Ｇｅｒｍ−Ｌｉｎｅ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ  Ｂｅｔａ  ２−Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  Ｂｙ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２巻、４３５〜４３８頁）。
【０３６４】
他の好ましい態様では、本発明の組成物は融合タンパク質をコードする核酸を含み、上記核酸は好適な宿主において融合タンパク質を発現する発現ベクターの一部分である。特に、このような核酸は、融合タンパク質のコード領域と機能的に連結されたプロモーター、好ましくは異種プロモーターを有し、上記プロモーターは誘導性、構成的、場合によっては組織特異的なものであり得る。他の特定の実施形態では、融合タンパク質のコード配列および他の所望の配列が、ゲノム内の所望の部位での相同的組換えを促進する領域によって挟まれており、その結果として、融合タンパク質をコードする核酸の染色体内発現をもたらすような核酸分子が使用される。
【０３６５】
核酸の被験者への送達は、直接的（この場合には被験者を核酸または核酸担持ベクターに直接曝す）または間接的（この場合には細胞を最初に核酸でｉｎ  ｖｉｔｒｏにて形質転換し、次いで被験者に移植する）のいずれであってもよい。これらの２つの手法は、それぞれ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療として知られている。
【０３６６】
特定の実施形態では、核酸配列を直接ｉｎ  ｖｉｖｏで（そこで発現されて、コードされた産物をもたらす）投与する。これは、当技術分野で公知の多数の方法のいずれかにより、例えばそれを適当な核酸発現ベクターの一部として構築し、それを細胞内に取込まれるように投与することにより、実施することができる。このような取込みは、例えば、欠損もしくは弱毒化レトロウイルスまたは他のベクターを使った感染により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照）、または裸のＤＮＡの直接注入により、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）により、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション試薬のコーティングにより、またはリポソーム、微粒子、もしくはマイクロカプセル内への封入により、あるいは核に侵入することが知られるペプチドとそれらを連結して投与することにより、受容体介在エンドサイトーシスを受ける抗原と連結して投与することにより（例えば、Ｗｕら、（１９８７年）「Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂｙ  Ａ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  ＤＮＡ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６２巻、４４２９〜４４３２頁を参照）（この方法は受容体を特異的に発現する細胞型を標的とするために用いられる）、実施することができる。別の実施形態では、核酸−抗原複合体（この抗原はエンドソームを破壊する融合性ウイルスペプチドを含む）を形成させて、核酸のリソソーム分解を回避させることができる。さらに別の実施形態では、核酸は、特異的受容体を標的とすることにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞特異的な取込みおよび発現へと目標を定めることができる（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ  ９２／０６１８０；ＷＯ  ９２／２２６３５；Ｗ０９２／２０３１６；Ｗ０９３／１４１８８；ＷＯ  ９３／２０２２１を参照）。あるいはまた、核酸は、細胞内に導入して、相同的組換えによって、発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる（Ｋｏｌｌｅｒら、（１９８９年）「Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｂｅｔａ  ２−Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｌｏｃｕｓ  Ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｂｙ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８６巻、８９３２〜８９３５頁、およびＺｉｊｌｓｔｒａら、（１９８９年）「Ｇｅｒｍ−Ｌｉｎｅ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ  Ｂｅｔａ  ２−Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  Ｂｙ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｎａｔｕｒｅ、３４２巻、４３５〜４３８頁）。
【０３６７】
特定の実施形態では、本発明の分子（例えばダイアボディまたは融合タンパク質）をコードする核酸配列を含有するウイルスベクターが用いられる。例えば、レトロウイルスベクターを利用することができる（Ｍｉｌｌｅｒら、（１９９３年）「Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２１７巻、５８１〜５９９頁を参照）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡ中への組込みのために必要な成分を含有する。遺伝子治療に利用する抗体または融合タンパク質をコードする核酸配列は１以上のベクター中にクローニングされ、これによりヌクレオチド配列の被験者への送達が容易になる。レトロウイルスベクターについてのさらなる詳細はＢｏｅｓｅｎら（（１９９３年）「Ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｍｙｅｌｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｂｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｍｄｒｌ  Ｇｅｎｅ」、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ６巻、２９１〜３０２頁）に見出すことができ、これは、化学療法により耐性のある造血幹細胞を作る目的でｍｄｒ  １遺伝子を幹細胞へ送達するためのレトロウイルスベクターの使用を記載する。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献には以下のものがある：Ｃｌｏｗｅｓら、（１９９４年）「Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｏｆ  Ｉｎｊｕｒｅｄ  Ｒａｔ  Ｃａｒｏｔｉｄ  Ａｒｔｅｒｙ  Ｓｅｅｄｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｅｌｌｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｌｙ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｓ」、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、９３巻、６４４〜６５１頁、Ｋｅｉｍら、（１９９４年）「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｉｎｔｏ  Ｃａｎｉｎｅ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｂｌｏｏｄ  ８３巻、１４６７〜１４７３頁、Ｓａｌｍｏｎｓら、（１９９３年）「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４巻、１２９〜１４１頁；ならびにＧｒｏｓｓｍａｎら、（１９９３年）「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ：  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｖｅｈｉｃｌｅ  Ｔｏ  Ｔｈｅ  Ｌｉｖｅｒ」、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．  ３巻、１１０〜１１４頁。
【０３６８】
アデノウイルスは、遺伝子治療に利用し得る他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、遺伝子を呼吸器上皮に送達する運搬体として特に興味をそそる。アデノウイルスは元来、呼吸器上皮に感染して軽度の疾患を引き起こす。アデノウイルスに基づく送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは分裂しない細胞に感染することができるので有利である。Ｋｏｚａｒｓｋｙら、（１９９３年、「Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３巻、４９９〜５０３頁）はアデノウイルスに基づく遺伝子治療法の総説を報じている。Ｂｏｕｔら、（１９９４年、「Ｌｕｎｇ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｔｏ  Ｒｈｅｓｕｓ  Ｍｏｎｋｅｙ  Ａｉｒｗａｙ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ」、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、５巻、３〜１０）は、遺伝子をアカゲザルの呼吸器上皮へ導入するためのアデノウイルスベクターの利用を実証した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの利用の他の例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９１年）「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｏｆ  Ａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｌｐｈａ  Ｉ−Ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｏ  Ｔｈｅ  Ｌｕｎｇ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２巻、４３１〜４３４頁、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９２年）「Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｏ  Ｔｈｅ  Ａｉｒｗａｙ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ」、Ｃｅｌｌ  ６８巻、１４３〜１５５頁、Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉら、（１９９３年）「Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｏｆ  Ａｉｒｗａｙ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｆｏｒ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ」、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、９１巻、２２５〜２３４頁、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１２６４９；ならびにＷａｎｇら、（１９９５年）「Ａ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｆｏｒ  Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｔｗｏ  Ｌｅｔｈａｌ  Ｇｅｎｅ−Ｒｅｇｉｏｎ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ」、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２巻、７７５〜７８３頁に見出すことができる。好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターが用いられる。
【０３６９】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）も遺伝子治療における利用が提案されている（例えば、Ｗａｌｓｈら、（１９９３年）「Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ」、Ｐｒｏｃ．  Ｓｏｃ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．  ２０４巻、２８９〜３００頁および米国特許第５，４３６，１４６号を参照）。
【０３７０】
遺伝子治療に対する他のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウムを介したトランスフェクション、またはウイルス感染などの方法により、組織培養物中の細胞に遺伝子を導入することを含む。通常、導入の方法は、選択マーカーの細胞への導入を含む。次いで細胞を選択に供し、回収し、かつ導入した遺伝子を発現する細胞を単離する。次いでそれらの細胞を被験者に送達する。
【０３７１】
この実施形態では、核酸を細胞中に導入した後に、得られる組換え細胞をｉｎ  ｖｉｖｏ投与する。このような導入は、当技術分野で公知のいずれかの方法、例えば、限定するものではないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含有するウイルスまたはバクテリオファージベクターを用いる感染、細胞融合、染色体を介した遺伝子導入、微小細胞を介した遺伝子導入（ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）、スフェロプラスト融合などにより実施することができる。外来遺伝子を細胞中に導入するための多数の技術は当技術分野で公知であり（例えば、Ｌｏｅｆｆｌｅｒら、（１９９３年）「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｉｎｔｏ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ａｎｄ  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｗｉｔｈ  Ｌｉｐｏｐｏｌｙａｍｉｎｅ−Ｃｏａｔｅｄ  ＤＮＡ」、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２１７巻、５９９〜６１８頁、Ｃｏｔｔｅｎら、（１９９３年）「Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｏｆ  ＤＮＡ  Ｉｎｔｏ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２１７巻、６１８〜６４４頁を参照）、受容細胞の必要な発生的および生理学的機能が破壊されないことを条件として本発明に従って利用することができる。その技術は核酸の細胞への安定な導入を提供して、それにより核酸が細胞により発現可能になり、そして好ましくはその細胞子孫に遺伝してかつ発現され得るものでなければならない。
【０３７２】
得られる組換え細胞は、当技術分野で公知の様々な方法により被験者に送達することができる。組換え血液細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）は、好ましくは、静脈内に投与される。使用のために想定される細胞量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、当業者が決定することが可能である。
【０３７３】
遺伝子治療の目的で核酸が導入される細胞は、あらゆる所望の入手可能な細胞型を包含し、限定するものではないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞；血液細胞、例えばＴリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球；様々な幹細胞または前駆細胞、特に造血幹細胞または前駆細胞、例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝などから得られるものを含む。
【０３７４】
好ましい実施形態では、遺伝子治療に使用される細胞は被験者自身に由来するものである。
【０３７５】
組換え細胞を遺伝子治療に使用する実施形態では、抗体または融合タンパク質をコードする核酸配列を細胞中に導入して、それらが該細胞またはその子孫により発現されるようにし、次いでその組換え細胞を治療効果のためにｉｎ  ｖｉｖｏで投与する。具体的な実施形態では、幹細胞または前駆細胞を用いる。分離可能でｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持できる幹細胞および／または前駆細胞はどれも本発明のこの実施形態に従って利用できる可能性がある（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ  ９４／０８５９８；  Ｓｔｅｍｐｌｅら、（１９９２年）「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｎｓ  Ａｎｄ  Ｇｌｉａ  Ｆｒｏｍ  Ｔｈｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｃｒｅｓｔ」、Ｃｅｌｌ  ７１巻、９７３〜９８５頁、Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ  （１９８０年）「Ｓｅｒｉａｌ  Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ」、Ｍｅｔｈ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．  ２１Ａ  巻、２２９〜２５４頁、ならびにＰｉｔｔｅｌｋｏｗら、（１９８６年）「Ｎｅｗ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｋｉｎ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ  Ａｎｄ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  Ｏｎ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ  Ｆｏｒ  Ｇｒａｆｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  Ｂｕｒｎｓ」、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｐｒｏｃ．、６１巻、７７１〜７７７頁）。
【０３７６】
特定の実施形態では、遺伝子治療の目的で導入される核酸は、コード領域と機能的に連結された誘導性プロモーターを含み、それにより適当な転写誘導物質の存在または不在を制御することにより核酸の発現が制御可能となる。
【０３７７】
５．９．３  キット
本発明は、本発明の分子を充填した１以上の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。さらに、疾患の治療に有用な１以上の他の予防または治療薬を、医薬パックまたはキット中に含んでもよい。本発明はまた、本発明の医薬組成物の１以上の成分を充填した１以上の容器を含む医薬パックまたはキットも含む。場合によっては、このような容器に、医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府当局が指示した形式で、ヒト投与のための製造、使用または販売の行政当局による認可を反映する注意書きを添付してもよい。
【０３７８】
本発明は、上記の方法で使用することができるキットを提供する。一実施形態では、キットは１以上の本発明の分子を含む。他の実施形態では、キットはさらに、１以上の容器中に、癌の治療に有用な１以上の他の予防または治療薬を含む。別の実施形態では、キットはさらに、癌に関連する１以上の癌抗原と結合する１以上の細胞傷害性抗体を含む。ある実施形態では、他の予防または治療薬は化学療法剤である。他の実施形態では、予防または治療薬は生物学的またはホルモン治療薬である。
【０３７９】
５．１０  治療上の有用性の特徴付けおよび検証
ヒトに使用する前に、本発明の医薬組成物、予防または治療薬のいくつかの態様は、好ましくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、細胞培養系で、および動物モデル生物で、例えばげっ歯類動物モデル系で、所望の治療活性について試験される。例えば、特定の医薬組成物の投与が適切なものかを確認するのに用いることができるアッセイは、細胞培養アッセイを含み、該アッセイにおいては、患者組織サンプルを培養で増殖させ、本発明の医薬組成物に曝すかまたは別の方法で接触させ、そして組織サンプルに対する該組成物の効果を観察する。組織サンプルは患者から生検により得ることができる。この試験により、個々の患者に対して治療上最も有効な予防または治療分子を同定することができる。様々な具体的実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを、自己免疫疾患または炎症性疾患に関係する細胞型の代表的細胞（例えば、Ｔ細胞）を用いて実施し、本発明の医薬組成物がそのような細胞型に対して所望の効果を奏するかを確認することができる。
【０３８０】
予防薬および／または治療薬の組合せは、ヒトで使用する前に、適当な動物モデル系で試験することができる。このような動物モデル系としては、限定するものではないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギなどが挙げられる。当技術分野で周知のいずれの動物系を使用してもよい。本発明の具体的な実施形態では、予防および／または治療薬の組合せはマウスモデル系で試験する。このようなモデル系は広く使用されていて、当業者に周知である。予防および／または治療薬は反復して投与することができる。手順のいくつかの様相は様々であり得る。かかる様相には、予防および／または治療薬の投与の時間的管理、およびこのような薬剤を別々に投与するのか混合物として投与するのかが含まれる。
【０３８１】
本発明の方法に使用する好ましい動物モデルは、例えば、マウスエフェクター細胞上にＦｃγＲを発現するトランスジェニックマウスであり、例えば、米国特許第５，８７７，３９６号（その全体を参照として本明細書に組み入れる）に記載されたいずれかのマウスモデルを本発明に用いることができる。本発明の方法に使用するトランスジェニックマウスとしては、限定するものではないが、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡを保有するマウス；ヒトＦｃγＲＩＩＡを保有するマウス；ヒトＦｃγＲＩＩＢおよびヒトＦｃγＲＩＩＩＡを保有するマウス；ヒトＦｃγＲＩＩＢおよびヒトＦｃγＲＩＩＡを保有するマウスが挙げられる。好ましくは、上記の機能的アッセイにおいて最高レベルの活性を示した変異を、ヒトでの使用に先立って動物モデル研究での使用について試験する。十分量の抗体は、上記の方法を用いて、動物モデルでの使用のために調製することが可能であり、例えば本明細書に開示され例示される哺乳動物発現系および精製法を用いて調製することができる。
【０３８２】
マウス異種移植モデルを用いて、腫瘍特異的標的に対して作製されたマウス抗体の効力を、本発明のダイアボディ分子のエピトープ結合ドメインの親和性と特異性、および免疫応答を引き出すダイアボディの能力に基づいて試験することができる（Ｗｕら、（２００１年）「Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌｓ  Ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｓｔｅｐ  Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １１：  Ｓ２−９）。マウスエフェクター細胞上にヒトＦｃγＲを発現するトランスジェニックマウスはユニークであり、ヒトＦｃ−ＦｃγＲ相互作用の効力を試験するためのテーラーメイド動物モデルである。Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ｒａｖｅｔｃｈ博士の研究室で作製されたＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＡトランスジェニックマウス系統のペアが利用可能であり（Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ大学とＳｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ癌センターとのライセンス契約を介して）、以下の表１１に挙げられているようなものである。
【０３８３】
【表１１】
0005718637.tif 000045
本発明の併用療法の抗炎症活性は、当技術分野で公知の、かつＣｒｏｆｆｏｒｄ  Ｌ．  Ｊ．およびＷｉｌｄｅｒ  Ｒ．  Ｌ．「動物の関節炎と自己免疫（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  Ａｎｉｍａｌｓ）」、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｅｄ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ、ＭｃＣａｒｔｙら（編）、第３０章（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｆｅｂｉｇｅｒ、１９９３）に記載の様々な炎症性関節炎の実験動物モデルを利用して確認することができる。炎症性関節炎および自己免疫リウマチ疾患の実験的および自然発生的動物モデルはまた、本発明の併用療法の抗炎症活性を評価するために利用することもできる。以下は例として掲げたいくつかのアッセイであり、限定するものではない。
【０３８４】
当技術分野で公知の、かつ広く利用される関節炎または炎症性疾患の主な動物モデルは、以下のものを含む：アジュバント誘導関節炎ラットモデル、コラーゲン誘導関節炎ラットおよびマウスモデル、ならびに、抗原誘導関節炎ラット、ウサギおよびハムスターモデル。これらはすべて、Ｃｒｏｆｆｏｒｄ  Ｌ．  Ｊ．およびＷｉｌｄｅｒ  Ｒ．  Ｌ．「動物の関節炎と自己免疫（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  Ａｎｉｍａｌｓ）」、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ａｌｌｉｅｄ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ、ＭｃＣａｒｔｙら（編）、第３０章（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｆｅｂｉｇｅｒ）、１９９３に記載されている（その全体を参照として本明細書に組み入れる）。
【０３８５】
本発明の併用療法の抗炎症活性は、カラゲナン誘導関節炎ラットモデルを用いて評価することができる。カラゲナンが誘導する関節炎はまた、慢性関節炎または炎症の研究において、ウサギ、イヌおよびブタでも利用されている。定量的な組織形態計測的評価が治療効力の決定に用いられる。このようなカラゲナン誘導関節炎モデルを利用する方法は、Ｈａｎｓｒａ  Ｐ．ら、（２０００年）「ラットにおけるカラゲナン誘導関節炎（Ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒａｔ）」、Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、２４巻（２号）、１４１〜１５５頁に記載されている。また、ザイモサン誘導炎症動物モデルも一般的に利用されており、当技術分野で公知である。
【０３８６】
本発明の併用療法の抗炎症活性はまた、カラゲナンが誘導するラットの足浮腫（ｐａｗ  ｅｄｅｍａ）の抑制を、Ｗｉｎｔｅｒ  Ｃ．  Ａ．ら、（１９６２年）「抗炎症薬アッセイとしての、カラゲナンが誘導するラット後足浮腫（Ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｅｄｅｍａ  ｉｎ  Ｈｉｎｄ  Ｐａｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒａｔ  ａｓ  ａｎ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｄｒｕｇｓ）」Ｐｒｏｃ．  Ｓｏｃ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．  １１１巻、５４４〜５４７頁に記載される方法の改変法を用いて測定することにより、評価することもできる。このアッセイはほとんどのＮＳＡＩＤの抗炎症活性に対する一次ｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングとして用いられており、ヒトでの効力を予測すると考えられている。試験予防薬または治療薬の抗炎症活性は、ビヒクルを投与した対照群に対する試験群の後足重量増加の抑制パーセントとして表される。
【０３８７】
さらに、炎症性腸疾患の動物モデルを、本発明の併用療法の効力を評価するのに用いることもできる（Ｋｉｍら、（１９９２年）「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｏｌｉｔｉｓ  Ｉｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ」、Ｓｃａｎｄ．  Ｊ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｒｏｌ．、２７巻、５２９〜５３７頁、Ｓｔｒｏｂｅｒ  （１９８５年）「Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ  Ｏｆ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ−Ａｎ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ」、Ｄｉｇ．  Ｄｉｓ．  Ｓｃｉ、３０巻（補巻１２巻）、３Ｓ〜１０Ｓ頁）。潰瘍性大腸炎およびクローン病は、動物で誘導し得るヒト炎症性腸疾患である。硫酸化された多糖類（限定するものではないが、アミロペクチン、カラゲナン、硫酸アミロペクチンおよび硫酸デキストランを含む）または化学刺激剤（限定するものではないが、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）および酢酸を含む）を動物に経口投与して炎症性腸疾患を誘導することができる。
【０３８８】
自己免疫疾患の動物モデルもまた、本発明の併用療法の効力を評価するのに用いることができる。自己免疫疾患、例えばＩ型糖尿病、甲状腺自己免疫、全身性エリテマトーデス、および糸球体腎炎の動物モデルが開発されている（Ｆｌａｎｄｅｒｓら、（１９９９年）「Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｙｐｅ  １  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｏ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ」、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２９巻、２３５〜２４６頁、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、（１９９９年）「Ｍｏｄｅｌｓ  Ｔｏ  Ｓｔｕｄｙ  Ｔｈｅ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｏｆ  Ｔｈｙｒｏｉｄ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ」、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８１巻、５１１〜５１５頁、Ｆｏｓｔｅｒ  （１９９９年）「Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  Ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｌｕｐｕｓ  Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ  Ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ  Ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｓｅｍｉｎ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  １９巻、１２〜２４頁）。
【０３８９】
さらに、当業者に公知のアッセイはどれも、自己免疫および／または炎症性疾患に対する本明細書に開示した併用療法の予防上および／または治療上の有用性を評価するのに用いることができる。
【０３９０】
本発明の予防および／または治療プロトコルの毒性および効力は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手法により確認することができ、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死量）およびＥＤ５０（集団の５０％における治療有効量）を決定する手法により確認することができる。毒性と治療効果の間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表現される。大きな治療指数を示す予防および／または治療薬が好ましい。毒性副作用を示す予防および／または治療薬を使用することはできるが、このような薬物を罹患組織の部位にターゲッティングする送達システムを設計して、非罹患細胞の起こり得る損傷を最小限に抑え、それにより副作用を軽減するよう注意を払うべきである。
【０３９１】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトに使用する予防および／または治療薬の投与量の範囲を決定するのに利用することができる。このような薬物の投与量は、好ましくは、毒性が低いかまったくなく、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、採用する投与剤形および利用する投与経路に依存して変わり得る。本発明の方法で使用するいずれの薬物に対しても、治療上有効な用量はまず細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、細胞培養で決定したＩＣ５０（すなわち、症状の最大の２分の１の抑制（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて決定してもよい。このような情報は、ヒトに有用な投与量をさらに正確に決定するのに用いることができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【０３９２】
本発明に従って使用される治療法の抗癌活性はまた、癌研究用の様々な実験動物モデル、例えばＳＣＩＤマウスモデルまたはトランスジェニックマウスまたはヒト異種移植片をもつヌードマウス、動物モデル、例えば、ハムスター、ウサギなどを用いることにより決定することもでき、これらは当技術分野で公知であり、かつＲｅｌｅｖａｎｃｅ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  （１９９９、ＦｉｅｂｉｇおよびＢｕｒｇｅｒ編）；Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  （１９９９、Ｋａｒｇｅｒ）；Ｔｈｅ  Ｎｕｄｅ  Ｍｏｕｓｅ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （１９９１、Ｂｏｖｅｎ  ａｎｄ  Ｗｉｎｏｇｒａｄ編）；およびＡｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｇｕｉｄｅ  （１９９７  編  Ｔｅｉｃｈｅｒ）（これらの全体を参照として本明細書に組み入れる）に記載されている。
【０３９３】
本発明の分子の治療効力を決定するのに好ましい動物モデルは、マウス異種移植モデルである。異種移植腫瘍の供給源として用いることができる腫瘍細胞株は、限定するものではないが、ＳＫＢＲ３およびＭＣＦ７細胞を含み、それらは乳腺癌の患者に由来する。これらの細胞は、ｅｒｂＢ２とプロラクチン受容体の両者を有する。ＳＫＢＲ３細胞は、ＡＤＣＣおよび異種移植腫瘍モデルとして、当技術分野において通常用いられている。これとは別に、ヒト卵巣腺癌に由来するＯＶＣＡＲ３細胞を異種移植腫瘍の供給源として用いることができる。
【０３９４】
本発明のプロトコルと組成物は、ヒトで使用する前に、好ましくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、次いでｉｎ  ｖｉｖｏで、所望の治療または予防活性について試験される。治療薬および治療法は、腫瘍または悪性培養細胞株の細胞を用いてスクリーニングすることができる。当技術分野において標準的な多くのアッセイを、このような生存および／または増殖を評価するのに用いることができる；例えば、細胞増殖は３Ｈ−チミジン取込みを測定することにより、直接細胞計数より、プロトオンコジーン（例えば、ｆｏｓ、ｍｙｃ）または細胞周期マーカーなどの公知の遺伝子の転写活性の変化を検出することにより評価することができる；細胞生存率はトリパンブルー染色により評価することができ、分化は形態の変化、軟寒天中での増殖および／またはコロニー形成の減少または三次元基底膜または細胞外マトリックス調製物中の管状ネットワーク形成などに基づいて視覚的に評価することができる。
【０３９５】
治療に用いる化合物は、ヒトで試験する前に好適な動物モデル系で試験することができ、動物としては、限定するものではないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ、ハムスターなどがあり、例えば、上記の動物モデルで試験することができる。化合物はその後、適当な臨床試験で使用される。
【０３９６】
さらに、当業者に公知のアッセイはどれも、癌、炎症性疾患、または自己免疫疾患の治療または予防について本明細書に開示した併用療法の予防上および／または治療上の有効性を評価するのに用いることができる。
【実施例】
【０３９７】
６．１  共有結合型二重特異性ダイアボディの設計と特徴付け
単一特異性共有結合型ダイアボディおよび二重特異性共有結合型ダイアボディを構築し、それぞれの組換え体の作製、精製および結合特性を評価した。本明細書に記載した組換え発現系によって作製され、アフィニティー精製されたダイアボディ分子は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣ解析により単一の二量体種からなることが判明した。ＥＬＩＳＡおよびＳＰＲ解析により、共有結合型二重特異性ダイアボディは双方の標的抗原に親和性を示すこと、および双方の抗原と同時に結合できることがさらに明らかになった。
【０３９８】
＜材料と方法＞
ポリペプチド分子の構築および設計
核酸発現ベクターを設計し、図２で模式図により示した４つのポリペプチド構築物を作製した。構築物１（配列番号９）は、ＦｃγＲＩＩＢを認識するヒト化２Ｂ６抗体のＶＬドメイン、およびＦｃγＲＩＩＩＡを認識するヒト化３Ｇ８抗体のＶＨドメインを含む。構築物２（配列番号１１）は、Ｈｕ３Ｇ８のＶＬドメイン、およびＨｕ２Ｂ６のＶＨドメインを含む。構築物３（配列番号１２）は、Ｈｕ３Ｇ８のＶＬドメイン、およびＨｕ３Ｇ８のＶＨドメインを含む。構築物４（配列番号１３）は、Ｈｕ２Ｂ６のＶＬドメイン、およびＨｕ２Ｂ６のＶＨドメインを含む。
【０３９９】
ＰＣＲおよび発現ベクターの構築
ＶＬおよびＶＨドメインのコード配列を、第１ＰＣＲ産物が重複配列を含むように設計したフォワードおよびリバースプライマーを用いて鋳型ＤＮＡから増幅した。これにより、重複ＰＣＲで所望のポリペプチド構築物のコード配列を作製することが可能となる。
【０４００】
鋳型ＤＮＡの第１ＰＣＲ増幅
約３５ｎｇの鋳型ＤＮＡ（例えば、目的の抗体の軽鎖および重鎖）、１μｌの１０μＭフォワードプライマーおよびリバースプライマー、２．５μｌの１０×ｐｆｕＵｌｔｒａバッファー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｉｎｃ．）、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μｌの２．５ユニット／μｌのｐｆｕＵｌｔｒａ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｉｎｃ．）、および総量２５μｌになるように加えた蒸留水を、微量遠心チューブ内で静かに混合し、微量遠心機で短時間スピンして反応混合物をチューブの底に集めた。ＰＣＲ反応を、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて行った。反応は、９４℃で２分間；続いて９４℃で１５秒間、５８℃で３０秒間および７２℃で１分間を２５サイクルに設定した。
【０４０１】
Ｈｕ２Ｂ６のＶＬは、Ｈｕ２Ｂ６の軽鎖からフォワードおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号５７および５８）を用いて増幅した。Ｈｕ２Ｂ６のＶＨは、Ｈｕ２Ｂ６の重鎖からフォワードおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号５９および６０）を用いて増幅した。Ｈｕ３Ｇ８のＶＬは、Ｈｕ３Ｇ８の軽鎖からフォワードおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号５７および６１）を用いて増幅した。Ｈｕ３Ｇ８のＶＨは、Ｈｕ３Ｇ８の重鎖からフォワードおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号６２および６３）を用いて増幅した。
【０４０２】
１％アガロースゲルにてＰＣＲ産物を１２０ボルトで３０分間、電気泳動した。ＰＣＲ産物をゲルから切り出した後、ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｉｎｃ．）を用いて精製した。
【０４０３】
重複ＰＣＲ
第１ＰＣＲ産物を下記のように結合させて、鋳型ＤＮＡの最初の増幅で説明したＰＣＲ条件と同一の条件を用いて増幅した。重複ＰＣＲの産物も、上記のように精製した。
【０４０４】
構築物１をコードする核酸配列（配列番号９）（図２に模式図で示す）をＨｕ２Ｂ６のＶＬおよびＨｕ３Ｇ８のＶＨのＰＣＲ増幅産物、ならびにフォワードおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号５７および６３）を混合して増幅した。構築物２をコードする核酸配列（配列番号１１）（図２に模式図で示す）をＨｕ３Ｇ８のＶＬおよびＨｕ２Ｂ６のＶＨのＰＣＲ増幅産物、ならびにフォワードおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号５７および６０）を混合して増幅した。構築物３をコードする核酸配列（配列番号１２）（図２に模式図で示す）をＨｕ３Ｇ８のＶＬおよびＨｕ３Ｇ８のＶＨのＰＣＲ増幅産物、ならびにフォワードおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号５７および６３）を混合して増幅した。構築物４をコードする核酸配列（配列番号１３）（図２に模式図で示す）をＨｕ２Ｂ６のＶＬおよびＨｕ２Ｂ６のＶＨのＰＣＲ増幅産物、ならびにフォワードおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号５７および６０）を混合して増幅した。
【０４０５】
ＶＬドメインのフォワードプライマー（すなわち、配列番号５７）およびＶＨドメインのリバースプライマー（すなわち、配列番号６０および配列番号６３）は、発現ベクター内への最終産物のクローニングを可能にするユニークな制限部位を含んでいる。精製された重複ＰＣＲ産物を制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、哺乳動物発現ベクターｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｉｎｃ．）内に導入してクローン化した。構築物をコードするプラスミドを表１２に示すように命名した。
【０４０６】
【表１２】
0005718637.tif 000046
ポリペプチド／ダイアボディの発現
構築物１をコードするｐＭＧＸ０６６９を、構築物２をコードするｐＭＧＸ０６６７と共に、リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、使用説明書に従ってＨＥＫ−２９３細胞にコトランスフェクションした。これら２つのプラスミドのコトランスフェクションは、ＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＩＡの双方に対して免疫特異的な共有結合型二重特異性ダイアボディ（ＣＢＤ）（ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ダイアボディ）が発現するように設計されている。構築物３および４をそれぞれコードするｐＭＧＸ０６６６およびｐＭＧＸ０６６８を、それぞれＦｃγＲＩＩＩＡに対して免疫特異的な共有結合型単一特異性ダイアボディ（ＣＭＤ）（ｈ３Ｇ８ダイアボディ）およびＦｃγＲＩＩＢに対して免疫特異的な共有結合型単一特異性ダイアボディ（ＣＭＤ）（ｈ２Ｂ６ダイアボディ）の発現のために、ＨＥＫ−２９３細胞に別々にトランスフェクトした。培養３日後、分泌された産物を条件培地から精製した。
【０４０７】
精製
ダイアボディを条件培地から、ＣＮＢｒ活性型セファロース４Ｂと結合させた関連する抗原を用いて回収した。ローディング前にアフィニティーセファロース樹脂を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化した。ローディング後、溶出前に、樹脂を平衡バッファーで洗浄した。ダイアボディを、５０ｍＭグリシン（ｐＨ３．０）を用いて洗浄済み樹脂から溶出した。溶出したダイアボディを、１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で直ちに中和し、遠心分離型濃縮器を用いて濃縮した。濃縮したダイアボディを、さらにＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムを用いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。
【０４０８】
ＳＥＣ
サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、カラムから溶出されたダイアボディのおおよそのサイズと異質性を分析した。ＳＥＣ解析は、ＰＢＳで平衡化したＧＥヘルスケア社のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ＨＲ  １０／３０カラムで行われた。全長ＩｇＧ（約１５０ｋＤａ）、Ｆａｂフラグメント（約５０ｋＤａ）および一本鎖Ｆｖ（約３０ｋＤａ）の溶出プロファイルとの比較を対照として用いた。
【０４０９】
ＥＬＩＳＡ
溶出および精製されたダイアボディの結合性を、ＥＬＩＳＡアッセイによってセクション５．４．２で説明したように、性状解析した。１ウェルあたり５０μｌの２μｇ／ｍｌのｓＣＤ３２Ｂ−Ｉｇ溶液を、炭酸バッファーの入った９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート上に４℃で一晩コーティングした。プレートをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ中の０．５％  ＢＳＡで３０分間、室温にてブロッキングした。続いて、ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤ、ｈ２Ｂ６  ＣＭＤまたはｈ３Ｇ８  ＣＭＤを、ブロッキングバッファーを用いて２倍希釈で連続希釈し、０．５μｇ／ｍｌから０．００１μｇ／ｍｌまでの範囲のダイアボディ濃度を作製した。その後、プレートを室温で１時間インキュベーションした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、０．２μｇ／ｍｌのｓＣＤ１６Ａ−ビオチンを１ウェルあたり５０μｌで、各ウェルに加えた。プレートを再び室温で１時間インキュベーションした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、１：５０００希釈したＨＲＰ結合ストレプトアビジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を検出のために１ウェルあたり５０μｌ用いた。ＨＲＰ−ストレプトアビジンを４５分間、室温でインキュベーションした。プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＴＭＢ基質を１ウェルあたり８０μｌ用いて発色させた。１０分間のインキュベーション後、１％  Ｈ２ＳＯ４を１ウェルあたり４０μｌ加えることによって、ＨＲＰ−ＴＭＢ反応を停止させた。ＯＤ４５０を９６ウェルプレートリーダーとＳＯＦＴｍａｘソフトウェアを用いて読み込み、結果をＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ  ３．０３ソフトウェアを用いてプロットした。
【０４１０】
ＢＩＡｃｏｒｅ解析
溶出および精製されたダイアボディの動態パラメーターを、セクション５．４．３で説明したようにＢＩＡｃｏｒｅアッセイ（ＢＩＡｃｏｒｅ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  １０００、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）および付属のソフトウェアを用いて解析した。
【０４１１】
ｓＣＤ１６Ａ、ｓＣＤ３２Ｂ、またはｓＣＤ３２Ａ（陰性対照）を、センサーチップ表面の４つのフローセルのうちの１つ（フローセル２）に、いずれの受容体も約１０００の応答ユニット（ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｕｎｉｔｓ：ＲＵ）が表面上に固定されるように、（ＮＨＳ／ＥＤＣの混合物によるカルボキシメチル基の修飾によって）アミン結合化学を介して固定した。これに続いて、未反応の活性エステルを、１Ｍ  Ｅｔ−ＮＨ２を加えて「キャップオフ（ｃａｐｐｅｄ  ｏｆｆ）」した。適当な表面が調製されたら、共有結合型二重特異性ダイアボディ（ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤ）または共有結合型単一特異性ダイアボディ（ｈ２Ｂ６  ＣＭＤもしくはｈ３Ｇ８  ＣＭＢ）を表面に、６．２５〜２００ｎＭの溶液を７０ｍＬ／ｍｉｎの流速で１８０秒間導入することにより、流した。ｈ３Ｇ８  ｓｃＦＶも比較用にテストした。
【０４１２】
全データセットを回収した時点で、得られた結合曲線を、製造業者であるＢＩＡｃｏｒｅ，  Ｉｎｃ．社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）より提供されるコンピュータアルゴリズムを用いて、全体的にフィット（近似）させた。これらのアルゴリズムにより、ＫｏｎおよびＫｏｆｆの双方が算出された。これから、見かけの平衡結合定数ＫＤが２つの速度定数の比（すなわちＫｏｆｆ／Ｋｏｎ）として推定される。個々の速度定数をどうやって導き出したかについてのより詳細な処理については、ＢＩＡｅｖａｌｕａｉｏｎソフトウェアハンドブック（ＢＩＡｃｏｒｅ，  Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で知ることができる。
【０４１３】
結合期および解離期は別々にフィットさせた。解離速度定数を、１８０秒の解離期において３２〜３４秒間隔で得られた。結合期フィットを１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルで得た。基底フィットを二重特異性ダイアボディとｓｃＦｖに関するＲｍａｘおよびカイ二乗法に基づいて選択した。二価分析物フィットはＣＭＤ結合に使用された。
【０４１４】
＜結果＞
非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、ｈ３Ｇ８  ＣＭＤ、ｈ２Ｂ６  ＣＭＤおよびｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤ発現系の精製産物は、それぞれ単一種であり、約５０ｋＤａ（図３のそれぞれレーン４、５および６）の推定分子量をもつことが明らかとなった。還元条件下では、ＣＭＤの各発現系から精製された産物は、単一バンド（レーン１および２）として移動したが、ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤ系から精製された産物は、２つに分離するタンパク質（図３、レーン３）であることが明らかとなった。発現系から精製され、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって視覚化された全ポリペプチドは、約２８ｋＤａの位置に移動した。
【０４１５】
各発現系産物のＳＥＣ解析でも、それらが単一分子種であり（図４Ｂ）、それぞれＩｇＧのＦａｂフラグメント（約５０ｋＤａ）とほぼ同じ時間で溶出されること（図４Ａ）が明らかとなった。これらの結果は、アフィニティー精製した産物がＣＭＤ発現系の場合は同種の共有結合型ホモ二量体であり、またｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤの場合は同種の共有結合型へテロ二量体であることを示している。
【０４１６】
ＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイを使用して、ＣＤ３２Ｂおよび／またはＣＤ１６Ａのいずれか一方または両方に対するｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤの結合特異性を試験した（図５）。ＣＤ３２Ｂを標的抗原として使用し、またＣＤ１６Ａを第２プローブとして使用した。ＥＬＩＳＡの陽性シグナルにより、ヘテロニ量体であるｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤは両抗原に対して特異性を有することが明らかとなった。ｈ３Ｇ８  ＣＭＤ（ＣＤ３２Ｂに結合しないはずである）での同様の試験では、シグナルが見られなかった。
【０４１７】
ＳＰＲ解析は、ｈ３Ｇ８  ＣＭＤがｓＣＤ１６を免疫特異的に認識するがｓＣＤ３２Ｂは認識できないこと、ｈ２Ｂ６  ＣＭＤがｓＣＤ３２Ｂを免疫特異的に認識するがｓＣＤ１６は認識できないこと、そしてｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤがｓＣＤ１６とｓＣＤ３２Ｂの両方を免疫特異的に認識できることを示した（図６Ａ〜Ｂ）。試験したダイアボディはいずれも、対照受容体ｓＣＤ３２Ａには結合しなかった（図６Ｃ）。
【０４１８】
また、ＳＰＲ解析を使用して、ｓＣＤ１６および／またはｓＣＤ３２Ｂに対する２つのＣＭＤおよびｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤの速度定数および平衡定数を推定した。結果をｈ３Ｇ８  ｓｃＦＶについて算出された上記定数と比較した。図７Ａ〜Ｅは、ＳＰＲ解析の結果をグラフで示したものである。図７で描かれた結果から計算された、ｏｎおよびｏｆｆ速度、ならびに平衡定数を表１３に示す。
【０４１９】
【表１３】
0005718637.tif 000047
ＥＬＩＳＡ解析の結果と合わせると、ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８共有結合型へテロニ量体はＣＤ３２ＢおよびＣＤ１６の双方に対して特異性を保持していること、および両抗原に同時に結合することができることが実験から裏付けられた。本分子を図８に模式図で示してある。
【０４２０】
６．２  Ｆｃドメインを含む共有結合型二重特異性ダイアボディの設計と性状解析
ＩｇＧ様分子、つまりＦｃドメインを含む分子を作るために、実施例６．１で示したヘテロ二量体ＣＢＤ分子を含むポリペプチドの１つを、Ｆｃドメインをさらに含む（抗体の重鎖および軽鎖に類似する「重い」鎖および「軽い」鎖を作り出す）ように改変した。したがって、ヘテロ二量体の二重特異性分子が同種分子と二量体化するＦｃドメインを含むことで、四価の四量体ＩｇＧ様分子（すなわち、ヘテロ二量体の二重特異性分子のＦｃドメインを介して二量体化することで形成される分子）が形成されるだろう。興味深いことに、このような四量体分子は、例えば標的抗原に対する免疫特異的結合性について条件培地を試験するといった機能アッセイを用いて、組換え発現系の条件培地中には検出されなかった。その代わりに、ＶＬ、ＶＨおよびＦｃドメインからなる単量体を含む二量体分子のみが、前記機能アッセイで検出された。理論上の四量体構造が安定性の面で問題となるかどうかを試験するために、Ｆｃドメインを含むポリペプチドがヒンジ領域をさらに含むように遺伝子操作し、一方「軽い」鎖を含むポリペプチドはヒトκ型軽鎖の定常ドメインの６個のＣ末端アミノ酸を含むように遺伝子操作した。このように遺伝子操作した「重い」および「軽い」鎖を組換え発現系で共発現させたとき、機能アッセイによって、標的抗原と抗Ｆｃ抗体の双方に免疫特異的に結合できるダイアボディ分子が検出された。
【０４２１】
＜材料と方法＞
ポリペプチド分子の構築および設計
実施例６．１で示した構築物１および２の改変型を作製するために、核酸発現ベクターを設計した。構築物５（配列番号１４）および６（配列番号１５）は、さらにＦｃドメインを含むように、それぞれ構築物１および２を遺伝子操作することにより作製された。構築物７（配列番号１６）は、構築物１を遺伝子操作して、さらにそのＣ末端に配列ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含むように作製された。構築物８（配列番号１８）は、構築物２を遺伝子操作して、さらにヒンジ領域とＦｃドメイン（Ｖ２１５Ａ変異を含む）を含むように作製された。構築物５〜８の模式図を図９に示す。
【０４２２】
ＰＣＲおよび発現ベクターの構築
ＰＣＲおよびＰＣＲ産物の精製プロトコルはすべて、実施例６．１で説明した通りである。プラスミドｐＭＧＸ０６６９およびｐＭＧＸ０６６７を、それぞれ構築物１および２のコード配列用の鋳型として用いた。ＨｕＩｇＧのＦｃドメイン用のおよび／またはヒンジドメイン用のコード配列は、それぞれ配列番号５または配列番号１および配列番号５とした。鋳型ＤＮＡのコード配列はフォワードおよびリバースプライマーを用いて増幅したが、ＰＣＲ産物が重複配列を含み、重複ＰＣＲが所望の産物のコード配列を生成させるようなプライマーを用いた。
【０４２３】
構築物１のコード配列は、ｐＭＧＸ０６６９からフォワードおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号５７および配列番号６４）を用いて増幅された。構築物２のコード配列は、ｐＭＧＸ０６６７から、フォワードおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号５７および配列番号６５）を用いて増幅された。ＨｕＩｇＧヒンジ−Ｆｃは、フォワードおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号６７および配列番号６８）を用いて増幅した。構築物７（配列番号１６）のコード配列は、ｐＭＧＸ０６６９から、フォワードおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号５７および配列番号６９）を用いて増幅された。
【０４２４】
重複ＰＣＲ
第１ＰＣＲ産物を以下に記載したように組み合わせ、実施例６．１で説明したように増幅および精製した。
【０４２５】
構築物５（配列番号１４）（図９に模式図で示す）をコードする核酸配列は、構築物１およびＨｕＩｇＧ  ＦｃのＰＣＲ増幅産物、ならびにフォワードおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号５７および配列番号６６）を組み合わせて増幅した。構築物６（配列番号１５）（図９に模式図で示す）をコードする核酸配列は、構築物２およびＨｕＩｇＧ  ＦｃのＰＣＲ増幅産物、ならびにフォワードおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号５７および配列番号６６）を組み合わせて増幅した。構築物８（配列番号１８）（図９に模式図で示す）をコードする核酸配列は、構築物２およびＨｕＩｇＧヒンジ−ＦｃのＰＣＲ増幅産物、ならびにフォワードおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号５７および配列番号６８）を組み合わせて増幅した。
【０４２６】
最終産物を、前述のように哺乳動物発現ベクターｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｉｎｃ．）内にクローン化した。構築物をコードするプラスミドは表１４に示したように命名した。
【０４２７】
【表１４】
0005718637.tif 000048
ポリペプチド／ダイアボディの発現
セクション６．１で記載したように、リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＨＥＫ−２９３細胞内に別個に４つのコトランスフェクションを行った。前記コトランスフェクションは、すなわち、構築物１および６をそれぞれコードするｐＭＧＸ０６６９およびｐＭＧＸ０６７４、構築物２および５をそれぞれコードするｐＭＧＸ０６６７およびｐＭＧＸ０６７６、ならびに構築物７および８をそれぞれコードするｐＭＧＸ０６７７およびｐＭＧＸ０６７８である。
【０４２８】
これらのプラスミドのコトランスフェクションは、ＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＩＡの双方に免疫特異的なＩｇＧ様構造を有する、四価の二重特異性ダイアボディ（ＣＢＤ）を発現するように設計された。構築物６および５をそれぞれコードするｐＭＧＸ０６７４およびｐＭＧＸ０６７６の追加的なコトランスフェクションも行った。培養３日後、条件培地を回収した。条件培地中の分泌産物の量を、精製されたＦｃを基準に用いて、抗ＩｇＧ  Ｆｃ  ＥＬＩＳＡによって定量化した。その後、サンプル中の産物の濃度を定量値に基づいて正規化し、この正規化したサンプルを以降のアッセイに使用した。
【０４２９】
ＥＬＩＳＡ
培地中に分泌されたダイアボディ分子の結合性を、上記サンドイッチＥＬＩＳＡでアッセイした。特に示した場合を除き、ＣＤ３２Ｂをプレートコーティング用に、つまり標的タンパク質として用いた。また、ＨＲＰ結合ＣＤ１６をプローブとして使用した。
【０４３０】
＜結果＞
ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、構築物１および６（ｐＭＧＸ６６９−ｐＭＧＸ６７４）、構築物２および５（ｐＭＧＸ６６７−ｐＮＧＸ６７６）、ならびに構築物５および６（ｐＭＧＸ６７４−ｐＭＧＸ６７６）を含む組換え発現系由来の正規化したサンプルを、ＣＤ３２ＢおよびＣＤ１６Ａと同時に結合可能なダイアボディ分子の発現について試験した（図１０）。ＥＬＩＳＡデータは、構築物１および６を用いたコトランスフェクション、または構築物２および５を用いたコトランスフェクションでは、一方または両方の抗原に結合できる産物は生じなかった（図１０、それぞれ□および▲）。しかしながら、構築物５および６のコトランスフェクションは、ＣＤ３２ＢおよびＣＤ１６Ａの両抗原に結合できる産物の分泌をもたらした。後者の産物は、構築物５および６の二量体であり、図１１に模式図で示した構造を有し、それぞれの抗原に対する１つの結合部位を含んでいる。
【０４３１】
ＩｇＧ様へテロ四量体構造の形成を導くため、付加的な６アミノ酸のコード配列を構築物１のＣ末端に付加して、構築物７（配列番号１６；図９に模式図で示す）を作製した。付加的な６アミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）は、κ型軽鎖のＣ末端に由来し、通常ＩｇＧ分子内で重鎖の上部ヒンジドメインと相互に作用する。また、ヒンジドメインを構築物６の内部に遺伝子操作で導入し、構築物８（配列番号１８、および図９）を作製した。構築物８は、さらに、上部ヒンジ領域中にアミノ酸変異Ａ２１５Ｖを含んでいた。構築物７および構築物８をコードする発現プラスミドである、それぞれｐＭＧＸ６７７およびｐＭＧＸ６７８を、その後ＨＥＫ−２９３細胞にコトランスフェクションし、上記のように発現させた。
【０４３２】
構築物７および８（ｐＭＧＸ０６７７  ＋  ｐＭＧＸ０６７８）を含む組換え発現系から産生されたダイアボディ分子は、ＥＬＩＳＡアッセイでＣＤ３２ＢおよびＣＤ１６Ａとの結合に関して、構築物１および６（ｐＭＧＸ６６９＋ｐＭＧＸ６７４）、構築物２および８（ｐＭＧＸ６６９＋ｐＭＧＸ６７８）、ならびに構築物６および７（ｐＭＧＸ６７＋ｐＭＧＸ６７４）（図１２）を含む発現系から産生されたダイアボディ分子と比較した。
【０４３３】
既に述べたように、構築物１および６（ｐＭＧＸ６６９  ＋  ｐＭＧＸ６７４）を含む発現系によって産生された分子は、ＣＤ３２ＡおよびＣＤ１６Ａのいずれにも結合できないことがわかった（図１０および図１２）。これに対して、構築物７および６（ｐＭＧＸ０６７７  ＋  ｐＭＧＸ０６７４）の共発現、または構築物７および８（ｐＭＧＸ０６７７−ｐＭＧＸ０６７８）の共発現から得られる産物は、ＣＤ３２ＡおよびＣＤ１６Ａの両方と結合できた（図１２）。構築物７がＣ末端配列ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含むことを除けば構築物１に類似していること、ならびに構築物８がヒンジドメインおよびＡ２１５Ｖ変異を含むことを除けば構築物６に類似していることが注目される。このデータは、Ｃ−κ型軽鎖のＣ末端に由来する余分な６アミノ酸（ＦＮＲＧＥＣ；配列番号２３）を、Ｆｃを持たない「軽い」鎖に付加することが、対応する重い鎖がヒンジドメインを含むか否かにかかわらず（すなわちｐＭＧＸ０６７７  ＋  ｐＭＧＸ０６７４およびｐＭＧＸ０６７７−ｐＭＧＸ０６７８、図１２）、四量体ＩｇＧ様ダイアボディ分子の形成を安定化するのに役立つ、ことを示している。Ｆｃを有する「重い」ポリペプチドにヒンジドメインを付加することは、対応する「軽い」鎖へのＣ末端配列ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）の付加なしでは、明らかに同様の安定化を達成することができなかった（つまり、構築物２および８（ｐＭＧＸ６６９  ＋  ｐＭＧＸ６７）のコトランスフェクションの産物による結合が欠如している）。四量体ダイアボディ分子の構造を図１３に模式図で示す。
【０４３４】
６．３  四量体ＩｇＧ様ダイアボディの形成におけるドメインの順番および追加的なジスルフィド結合の効果
四量体ＩｇＧ様ダイアボディ分子の「軽い」および「重い」ポリペプチド鎖間の追加的な安定化の効果を、ポリペプチド鎖上の選択された残基のシステインによる置換によって調べた。付加的なシステイン残基は、「重い」および「軽い」鎖間に付加的なジスルフィド結合を付与する。さらに、Ｆｃドメインまたはヒンジ−Ｆｃドメインをポリペプチド鎖のＣ末端からＮ末端に移すことで、結合活性おけるドメインの順番を調べた。付加的なジスルフィド結合を含む分子の結合活性は、そのような結合をもつ先に構築されたダイアボディ分子と比べて変わらなかったが、Ｆｃもしくはヒンジ−Ｆｃドメインを、ダイアボディを構成する「重い」ポリペプチド鎖のＮ末端に移すと、その標的抗原の一方もしくは双方に対する二重特異性分子の結合親和性および／または結合力が驚くほど改善された。
【０４３５】
＜材料と方法＞
ポリペプチド分子の構築および設計
実施例６．２で示した構築物５、６および８の改変型を作製するために、核酸発現ベクターを設計した。構築物９（配列番号１９）および構築物１０（配列番号２０）（いずれも図１３に模式図で示す）は、それぞれＦｃドメインまたはヒンジ−ＦｃドメインがポリペプチドのＣ末端からＮ末端にシフトしていることを除けば、構築物８および６と類似する。さらに、使用したＦｃドメインはすべて、野生型ＩｇＧ１のＦｃドメインである。構築物１１（配列番号２１）（図１４に模式図で示す）は、Ｃ末端が配列ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）をさらに含むように設計されていることを除けば、実施例６．１からの構築物２に類似する。構築物１２（配列番号２２）（図１４に模式図で示す）は、Ｆｃドメインがさらにヒンジ領域を含むことを除けば、実施例６．２からの構築物５に類似する。また、構築物１１および１２に関しては、２Ｂ６のＶＬドメインおよび２Ｂ６のＶＨドメインは、各ドメイン中のグリシンをシステインに置換するための単一アミノ酸変異（それぞれＧ１０５ＣおよびＧ４４Ｃ）を含んでいる。
【０４３６】
ＰＣＲおよび発現ベクターの構築
ＰＣＲおよびＰＣＲ産物の精製プロトコルはすべて、実施例６．１および６．２で説明した通りである。
【０４３７】
重複ＰＣＲ
実施例６．１および６．２に記載の方法を用いて、最終産物を構築し、増幅し、精製した。
【０４３８】
最終産物を、前記のように哺乳動物発現ベクターｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｉｎｃ．）内にクローン化した。構築物をコードするプラスミドは表１５に示すように命名した。
【０４３９】
【表１５】
0005718637.tif 000049
ポリペプチド／ダイアボディの発現
セクション６．１で記載したようにリポフェクトアミン２０００を用いてＨＥＫ−２９３細胞内に別個に３つのコトランスフェクションを行った。前記コトランスフェクションは、すなわち構築物１および９をそれぞれコードするｐＭＧＸ０６６９およびｐＭＧＸ０７１９、構築物１および１０をそれぞれコードするｐＭＧＸ０６６９およびｐＭＧＸ０７１８、ならびに構築物１１および１２をそれぞれコードするｐＭＧＸ０６１７およびｐＭＧＸ０７１７である。これらのプラスミドのコトランスフェクションは、ＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＩＡの双方に免疫特異的なＩｇＧ様構造をもった四価の二重特異性ダイアボディ（ＣＢＤ）を発現するように設計されている。培養３日後、条件培地を回収した。条件培地中の分泌産物の量を、抗ＩｇＧ  Ｆｃ  ＥＬＩＳＡによって、精製したＦｃを基準として用いて定量化した。その後、サンプル中の産物の濃度を定量値に基づいて正規化し、この正規化したサンプルを以降のアッセイに使用した。
【０４４０】
ＥＬＩＳＡ
培地中に分泌されたダイアボディ分子の結合性を、上記サンドイッチＥＬＩＳＡによってアッセイした。特に示した場合を除き、ＣＤ３２Ｂをプレートコーティング用に、つまり標的タンパク質として用いた。また、ＨＲＰ結合ＣＤ１６をプローブとして使用した。
【０４４１】
ウェスタンブロット
上記３つのコトランスフェクションからの条件培地約１５ｍｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって非還元条件下で解析した。一枚のゲルをＳｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、続いて、同一ゲルを一般的な転写方法を用いてＰＶＤＦメンブレン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に転写した。転写後、メンブレンを１×ＰＢＳ中の５％脱脂粉乳でブロッキングした。その後、メンブレンを、２％脱脂粉乳１×ＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０中の１：８０００希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ１  Ｈ＋Ｌ抗体  １０ｍｌ中で室温にて１時間静かに撹拌しながらインキュベーションした。１×ＰＢＳ／０．３％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で、それぞれ５分間ずつ２回洗浄した後、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、使用説明書に従って室温で２０分間、メンブレンを露光した。フィルムをＸ線処理装置で現像した。
【０４４２】
＜結果＞
構築物１および９、構築物１および１０、ならびに構築物１１および１２を含む組換え発現系由来の条件培地を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元条件下）解析およびウェスタンブロッティング（抗ＩｇＧをプローブとして使用）によって解析した。ウェスタンブロットにより、構築物１１および１２を含む系または構築物９および１を含む系由来の産物は、主に約１５０ｋＤａの単一分子種（それぞれ図１５のレーン３および２）を形成することが明らかとなった。これらの産物はいずれも、内部ジスルフィド結合がダイアボディを構成する「軽い」および「重い」鎖の間に設計されている。一方、「軽い」および「重い」鎖の間に内部ジスルフィド結合を設計されていない構築物１０および１から形成された分子は、分子量約７５ｋＤａおよび約１００ｋＤａ（図１５のレーン１）の少なくとも２つの分子種を形成した。
【０４４３】
ウェスタンブロットの結果にもかかわらず、３つの産物のそれぞれがＣＤ３２ＡおよびＣＤ１６の両方と結合できることがわかった（図１６）。驚いたことに、Ｃ末端にヒンジ−Ｆｃドメインを含む産物（構築物１１および１２から形成された）と比べて、Ｆｃ（またはＦｃ−ヒンジ）ドメインが、Ｆｃ含有ポリペプチド鎖（すなわち「重い」鎖）のアミノ末端にある両方の発現系由来の産物（構築物９＋１および構築物１０＋１）では、その標的ペプチド（すなわちＣＤ３２Ｂおよび／またはＣＤ１６）の一方または両方に対する親和性および／または結合力が増強されることが実証された。
【０４４４】
６．４  ポリプロテイン前駆体のプロセシングにおける内部／外部切断部位の効果、および共有結合型二重特異性ダイアボディの発現；ヒトＩｇＧラムダ鎖およびヒンジドメインの一部を含む二重特異性ダイアボディの設計および性状解析
本明細書で説明したように、本発明のダイアボディの個々のポリペプチド鎖またはダイアボディ分子を、単一のポリプロテイン前駆体分子として発現させることができる。実施例６．１〜６．３で説明した組換え系の、前記ポリプロテイン前駆体から機能的なＣＢＤを適切にプロセシングして発現する能力は、内部切断部位（特にフューリン切断部位）によって分離されるＣＢＤの第１および第２ポリペプチド鎖の両方をコードする核酸を作製することによって試験した。機能的なＣＢＤは、ポリプロテイン前駆体分子を含む組換え系から単離した。
【０４４５】
実施例６．３で既に述べたように、ヒトκ軽鎖由来のＣ末端の６アミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）の付加は、ダイアボディ形成を安定化することがわかった。おそらく、これは、配列番号２３を含むドメインと、Ｆｃドメインもしくはヒンジ−Ｆｃドメインを含むドメインとの間で鎖間相互作用が増強されるためと思われる。このラムダ鎖／Ｆｃ様相互作用の安定効果を、どちらのポリペプチド鎖もＦｃドメインを含まないＣＢＤで試験した。ダイアボディの一方のポリペプチド鎖を遺伝子操作して、そのＣ末端に配列番号２３を導入した。その相手方となるポリペプチド鎖は、ＩｇＧのヒンジドメインに由来するアミノ酸配列ＶＥＰＫＳＣ（配列番号７９）を含むように遺伝子操作した。このＣＢＤと構築物１および２を含むＣＢＤ（実施例６．１由来）との比較により、ヒンジドメインおよびラムダ鎖に由来するドメインを含むＣＢＤは、その標的エピトープの一方または両方に対してわずかに大きい親和性を示すことが明らかとなった。
【０４４６】
＜材料と方法＞
ポリペプチド分子の構築および設計
（ポリプロテイン前駆体）
２つのポリプロテイン前駆体分子を作製するために核酸発現ベクターを設計した。両分子とも図１７に模式図で示してある。構築物１３（配列番号９７）は、ポリペプチド鎖のＮ末端側から順に、３Ｇ８のＶＬドメイン、２．４Ｇ２のＶＨドメイン（ｍＣＤ３２Ｂに結合する）、フューリン切断部位、２．４Ｇ２のＶＬドメイン、および３Ｇ８のＶＨドメインを含んでいる。構築物１３をコードするヌクレオチド配列を配列番号９８に示す。構築物１４（配列番号９９）（図１７）は、ポリペプチド鎖のＮ末端側から順に、３Ｇ８のＶＬドメイン、２．４Ｇ２のＶＨドメイン（ｍＣＤ３２Ｂに結合する）、フューリン切断部位、ＦＭＤ（口蹄疫ウイルスプロテアーゼＣ３）部位、２．４Ｇ２のＶＬドメイン、および３Ｇ８のＶＨドメインを含んでいる。構築物１４をコードするヌクレオチド配列を配列番号１００に示す。
【０４４７】
核酸発現ベクターを、実施例６．１で示した構築物１および２の改変型を作製するために設計した。構築物１５（配列番号１０１）（図１７）は、構築物１５のＣ末端がアミノ酸配列ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含むことを除けば、実施例６．１で示した構築物１（配列番号９）に類似している。構築物１５をコードする核酸配列を配列番号１０２に示す。構築物１６（配列番号１０３）（図１７）は、構築物１６のＣ末端がアミノ酸配列ＶＥＰＳＫ（配列番号７９）を含むことを除けば、実施例６．１で示した構築物２に類似している。構築物１６コードする核酸配列を配列番号１０４に示す。
【０４４８】
ＰＣＲおよび発現ベクターの構築
ＰＣＲおよびＰＣＲ産物の精製プロトコルはすべて、実施例６．１および６．２で説明した通りである。
【０４４９】
重複ＰＣＲ
実施例６．１および６．２に記載の方法を用いて、適当なプライマーを使って、最終産物を構築し、増幅し、精製した。
【０４５０】
最終産物を、前述のように哺乳動物発現ベクターｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｉｎｃ．）内にクローン化した。構築物をコードするプラスミドは表１６に示すように命名した。
【０４５１】
【表１６】
0005718637.tif 000050
ポリペプチド／ダイアボディの発現
セクション６．１で記載したようにリポフェクトアミン２０００を用いてＨＥＫ−２９３細胞内に１回のトランスフェクションおよび１回のコトランスフェクションを行った。単独のトランスフェクションでは、構築物１３をコードするｐＭＧＸ０７５０を、また、コトランスフェクションでは構築物１５および１６をそれぞれコードするｐＭＧＸ０７５２およびｐＭＧＸ０７５３を用いた。培養３日後、条件培地を回収し、分泌された産物を上記のようにアフィニティー精製した。
【０４５２】
ＥＬＩＳＡ
培地中に分泌されたダイアボディ分子の結合性を上記サンドイッチＥＬＩＳＡによってアッセイした。マウスＣＤ３２Ｂを標的タンパク質として用いてプレートをコーティングした。また、ＨＲＰ結合ＣＤ１６を、構築物１５および１６のコトランスフェクションの産物用プローブとして使用した。ｍＣＤ３２Ｂを標的タンパク質として使用し、またビオチン結合ＣＤ１６Ａを構築物１３を含む組換え系用のプローブとして使用した。
【０４５３】
＜結果＞
構築物１３を含む組換え発現系から得られた条件培地を、サンドイッチＥＬＩＳＡで解析した。ＥＬＩＳＡアッセイは、ｍＣＤ３２Ｂおよび／またはＣＤ１６の一方または両方への特異性についてＣＢＤの結合性を試験した（図１８）。ＣＤ３２Ｂを標的抗原として利用し、またＣＤ１６Ａを二次プローブとして用いた。ＥＬＩＳＡにおける陽性シグナルにより、ポリプロテイン前駆体から生成されるヘテロ二量体ｈ２．４Ｇ２−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤは両抗原に対して特異性を有することが明らかとなった。
【０４５４】
同様に、構築物１５および１６をコードするベクターのコトランスフェクションによって生じた精製産物をＥＬＩＳＡアッセイで試験し、構築物１および２からなる産物（実施例６．１）と比較した。ＣＤ３２Ｂを標的抗原として利用し、またＣＤ１６Ａを二次プローブとして用いた。構築物１および２からなる産物と同様、構築物１５および１６の産物は、同時にＣＤ３２ＢおよびＣＤ１６Ａと結合できることがわかった。むしろ、構築物１５および１６の産物が、標的抗原、すなわちＣＤ３２ＢまたはＣＤ１６Ａの一方または両方に対してわずかに増強された親和性を有することがわかった。これは、おそらく構築物１および２からなる産物にはない、ラムダ鎖領域ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）とヒンジ領域ＶＥＰＫＳＣ（配列番号７９）の相互作用によって与えられる鎖間結合の安定性および／または忠実度の増加（野生型のＶＨ−ＶＬドメインの相互作用と比較したとき）によるものと思われる。
【０４５５】
６．５  複数の親和性を共に連関させる二重親和性再標的化試薬（「ＤＡＲＴ」）の使用
本発明の一態様は、新規の二重親和性再標的化試薬（「ＤＡＲＴ」）の他、複数の親和性を共に連関させる新規の方法に関する。「ＤＡＲＴ」は、単一特異性、二重特異性、三重特異性などであり得、このため、１個、２個、３個またはそれ以上の異なるエピトープ（同じ抗原または異なる抗原のものであり得る）に同時に結合することが可能である。「ＤＡＲＴ」は、さらに、一価、二価、三価、四価、五価、六価などでもあり得、このため、１個、２個、３個、４個、５個、６個またはそれ以上の分子に同時に結合することが可能である。図３５に示すように、ＤＡＲＴのこれら２つの属性を組み合わせて、例えば、四価である二重特異性抗体などを作製することができる。
【０４５６】
１つの進歩は、原型的な免疫受容体であるｈｕＣＤ３２Ｂに対する親和性の他、ハプテン、フルオレセインに対する親和性も有するＤＡＲＴの開発である。「２Ｂ６／４４２０」と称するこのＤＡＲＴは、ｈｕＣＤ３２Ｂを、フルオレセインコンジュゲート結合パートナーと相互作用する分子とコライゲーションすることが可能な万能アダプターとして用いられる。ＣＤ３２Ｂは、活性化シグナル伝達免疫複合体とのクラスター化によって活性化シグナルを抑制する能力を有するＦｃ受容体である。その最初の実装形態において、この技法は、新規のＤＡＲＴ構築物を作製する必要なしに、ｈｕＣＤ３２Ｂとのクラスター化のための複数種の生物学的標的の迅速なスクリーニングを可能とする。２Ｂ６／４４２０は、細胞表面受容体に対するフルオレセイン化された抗体と簡単に混合することができ、これにより、該受容体に対する親和性を有するＤＡＲＴの作用を模倣することができる（図２０）。さらに、この試薬は、容易に発現または生成されない親和性試薬の効率的な連結を可能とし、これにより、技術的な限界を克服することができる。２Ｂ６／４４２０含有ＤＡＲＴは、研究ツールとして有用であり、また、臨床用候補物質としても有用であることが明らかである。ＨＥＫ２９３細胞から作製された２Ｂ６／４４２０は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＣＤ３２Ｂとフルオレセインとに同時に結合し得る。さらに、２Ｂ６／４４２０は、ＣＤ７９とのコライゲーションを介してＣＤ３２ＢをＢＣＲ複合体へと動員することにより、細胞増殖も阻害し得る。ＤＡＲＴの２Ｂ６アームは、異なる抗体配列または他の関連特異性を有する結合配列により置換することができる。
【０４５７】
材料と方法：
プラスミド構築物
２Ｂ６／４４２０は、ヒト化２Ｂ６ＭＡｂ（ｈｕ２Ｂ６、ＭＧＡ３２１）と、抗フルオレセインＭＡｂのキメラマウスＦｖ／ヒトＦｃ変化形である４４２０との配列に由来する。完全に構築されたＤＡＲＴは、２つのポリペプチドからなり、その結果、２つのＦｖ領域の共有結合がもたらされる。第１のポリペプチドは、分泌シグナル配列に後続する、アミノ酸残基ＧＧＧＳＧＧＧＧからなるリンカーにより分離される４４２０ＶＨとの融合タンパク質として作製されるｈｕ２Ｂ６ＶＬからなる。カッパ軽鎖のＣ末端に由来する配列ＦＮＲＧＥＣを、このポリペプチドのＣ末端に付加する。他のポリペプチドは、シグナル配列−４４２０ＶＬ−ＧＧＧＳＧＧＧＧ−ｈｕ２Ｂ６ＶＨからなり、ヒトＩｇＧ１  ＦｄフラグメントのＣ末端に由来する配列ＶＥＰＫＳＣをＣ末端に付加する。２つの鎖中のシステインがジスルフィド結合を形成し、２つのポリペプチドを一緒に共有結合させる（図２０）。説明したポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を既存のプラスミドからＰＣＲ増幅し、重複ＰＣＲにより組み合わせ、Ｎｈｅ  Ｉ部位とＥｃｏＲＩ部位との間のｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）内にクローニングした。最後に、上述した方法と同様の方法を用いて既に構築しておいた、ｈｕＣＤ３２ＢとｈｕＣＤ１６とに対する親和性を有するＤＡＲＴ（２Ｂ６／３Ｇ８）を、対照として用いた。
【０４５８】
抗体
抗ヒトＣＤ７９ｂマウスモノクローナル抗体であるＣＢ３．１およびＣＢ３．２（ハイブリドーマ）は、アラバマ州、バーミンガム、アラバマ大学バーミンガム校のＣｏｏｐｅｒ  ＭＤ博士から入手した。製造元の指示書（イリノイ州、ロックフォード、Ｐｉｅｒｃｅ社製）に従い、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）により、ＣＢ３．１およびＣＢ３．２に標識した。Ｆｃフラグメント特異的なヤギ抗マウス（ＧＡＭ）ＩｇＧのＦ（ａｂ’）２フラグメントは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（ペンシルベニア州、ウェストグローブ）から入手した。抗ｈｕＣＤ３２ＢマウスＭＡｂである３Ｈ７は、自社で作製し精製した。ヤギ抗２Ｂ６Ｆｖ抗体は、ｈｕ２Ｂ６全抗体によりヤギに対して免疫感作し、ｈｕ２Ｂ６のＦｖ領域に対してアフィニティー精製することにより作製した。ｈｕＩｇＧ、ＦＩＴＣ−ｈｕＩｇＧ、およびＨＲＰ−抗マウスＩｇＧは、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社から入手した。ＨＲＰ−抗ヤギは、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社から入手した。
【０４５９】
ＤＡＲＴの発現
製造元の指示書に従い、リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、各鎖をコードするプラスミドを、２９３Ｈ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）内に同時トランスフェクトした。３日間隔で３〜４回、分泌されたタンパク質を回収し、ＣＤ３２Ｂの固定化可溶性形態に対する液体クロマトグラフィーにより精製した。
【０４６０】
ＥＬＩＳＡ
ＦＩＴＣ標識プロテインＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ヒトＩｇＧ、またはＦＩＴＣ−ｈｕＩｇＧでコーティングしたＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ社製）上において、２Ｂ６／４４２０  ＤＡＲＴまたは２Ｂ６／３Ｇ８  ＤＡＲＴを捕捉した。検出は、可溶性ＣＤ３２Ｂ細胞外ドメインに対する結合の後、３Ｈ７（ＣＤ３２Ｂに対して特異的なマウスモノクローナル抗体）、最後に抗マウスＨＲＰにより行った。あるいは、アフィニティー精製したヤギ抗２Ｂ６  Ｆｖポリクローナル抗血清に対する結合の後、抗ヤギ抗体−ＨＲＰにより検出を実施した。ＨＲＰ活性は、比色分析用ＴＭＢ基質（ＢｉｏＦＸ社製）を用いて検出し、ＶｅｒｓａＭａｘ  ＥＬＩＳＡプレートリーダー上で読み取った。
【０４６１】
Ｂ細胞の精製および増殖アッセイ
健康なドナー由来の血液を用いるＦｉｃｏｌｌ／Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（英国、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）勾配法により、末梢血単核細胞を分離した。製造元の指示書に従い、Ｄｙｎａｌ  Ｂ細胞陰性単離キット（ニューヨーク州、Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて、Ｂリンパ球を単離した。単離されたＢ細胞（ＣＤ２０＋）の純度は、ＦＡＣＳ解析による推定で９０％を超えた。増殖アッセイでは、精製されたＢ細胞を、平底９６ウェルマイクロ滴定プレート内の完全ＲＰＭＩ  １６４０培地中に、２００μｌの最終容量におけるウェルあたり１×１０５個の細胞密度で播種し、５％のＣＯ２中３７℃の抗体およびダイアボディの存在または不在下において４８時間にわたりインキュベートした。次いで、１μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］チミジン（マサチューセッツ州、ウェルズリー、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を添加し、回収前にさらに１６〜１８時間にわたりインキュベーションを継続した。［３Ｈ］チミジンの取込みは、液体シンチレーションカウント法により測定した。
【０４６２】
結果
２Ｂ６／４４２０  ＤＡＲＴが活性であり特異的であることを示すため、２つのＥＬＩＳＡ実験を実施した。まず、２Ｂ６／４４２０または２Ｂ６／３Ｇ８（陰性対照として）を、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングさせておいたフルオレセインコンジュゲートタンパク質（Ｓタンパク質）に結合させた。次に、ＤＡＲＴの２Ｂ６アームを可溶性ＣＤ３２Ｂにより結合させる。結合は、２Ｂ６のエピトープと重複しないエピトープを有するＣＤ３２Ｂに対する別の抗体の後、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体により検出した。２Ｂ６／４４２０  ＤＡＲＴにはフルオレセインとＣＤ３２Ｂとに対して同時に結合する能力があるのに対し、２Ｂ６／３Ｇ８にはその能力がない（図２１、パネルＡ）。可溶性ＣＤ３２Ｂでコーティングしたプレート上において該ＤＡＲＴを捕捉し、ｈｕ２Ｂ６  Ｆｖに対して特異的な抗体により結合を検出すると、いずれのＤＡＲＴも良好な結合を示す。２Ｂ６／４４２０  ＤＡＲＴには、ヒトＩｇＧにコンジュゲートさせたフルオレセインに結合する能力があることを示す（これが、本試薬の最初の実装形態の場面であるとする）ため、フルオレセインにより標識されないかまたは標識されたＨｕＩｇＧをＥＬＩＳＡプレートに結合させ、これを用いて２Ｂ６／４４２０を捕捉した。ここでもまた、２Ｂ６／３Ｇ８を陰性対照として用いた。結合は、Ｈｕ２Ｂ６  Ｆｖに対して特異的な抗体を用いて検出した。２Ｂ６／４４２０  ＤＡＲＴは、ＦＩＴＣ−ＨｕＩｇＧに結合することが明らかであるが、非標識のＨｕＩｇＧには結合せず、このＤＡＲＴには抗体にコンジュゲートさせたフルオレセインに結合する能力があり、抗体単独に対しては顕著な結合が見られないことを示す。予測したように、これらの場面のいずれにおいても、２Ｂ６／３Ｇ８  ＤＡＲＴによる結合は検出されなかった。
【０４６３】
実験は、２Ｂ６／４４２０  ＤＡＲＴに、細胞ベースのアッセイの場面におけるシグナル伝達に対して効果を有し得る二重親和性試薬として機能する能力があることを示すために実施した。ＣＤ３２ＢのＢＣＲとの共凝集は、Ｂ細胞活性を阻害することを示している。２Ｂ６／４４２０  ＤＡＲＴが、フルオレセインで標識したαＣＤ７９ｂ抗体によりコーティングしたＢＣＲと共にＣＤ３２Ｂに同時結合し、細胞増殖の阻害を誘発する能力を探索した。Ｂ細胞は、ヒト血液から陰性選択し、固定濃度（５μｇ／ｍＬ）の２Ｂ６／４４２０  ＤＡＲＴまたは、フルオレセインを標的とせず、このため、対照として用いられる分子である同等量の２Ｂ６／３Ｇ８  ＤＡＲＴと共に、濃度を上昇させるＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ７９ｂ抗体クローンであるＣＢ３．１およびＣＢ３．２による処理と、ＢＣＲに架橋する二次試薬としてのＦｃ特異的ＧＡＭ抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメントの添加とにより活性化させた。該ＤＡＲＴの不在下または対照の２Ｂ６／３Ｇ８  ＤＡＲＴの存在下において、［３Ｈ］チミジンの取込みとして測定される細胞増殖は、活性化因子である抗ＣＤ７９ｂモノクローナル抗体−ＦＩＴＣの濃度上昇と共に上昇した。２Ｂ６／４４２０  ＤＡＲＴの存在は、抗ヒトＣＤ７９ｂ抗体−ＦＩＴＣのすべての濃度において、Ｂ細胞増殖の大幅な低下をもたらした（図２２、パネルＡおよびＢ、ならびに図２３、パネルＡ）。
【０４６４】
非標識ＣＢ３．２によりコーティングし、同じ実験条件を用いて活性化させたＢ細胞を２Ｂ６／４４２０  ＤＡＲＴにより処理しても増殖の阻害が観察されなかったことから、その標的特異性が判明する（図２３、パネルＢ）。これらのデータは、２Ｂ６／４４２０  ＤＡＲＴに、ＣＤ３２ＢとＢＣＲとを架橋し、抗原受容体により誘導される細胞活性化を遮断する能力がある阻害シグナルを送ることが可能であることを示す。
【０４６５】
６．６  ＣＤ３２Ｂを発現するＢ細胞悪性疾患に対するＤＡＲＴ免疫療法剤
現在のところ、Ｂ細胞悪性疾患は、リツキサン（登録商標）抗ＣＤ２０抗体を用いて治療されている。しかし、一部のＢ細胞悪性疾患はＣＤ２０を発現しないか、またはリツキサンに対して耐性となる。本発明のＤＡＲＴは、リツキサン（登録商標）抗ＣＤ２０抗体と関連する問題を克服する能力がある代替的な免疫療法剤を提供する。
【０４６６】
ＭＧＤ２６１は、ｈＣＤ３２Ｂ（ｈ２Ｂ６抗体を介して）ならびにｈＣＤ１６ＡおよびｈＣＤ１６Ｂ（ｈ３Ｇ８抗体を介して）に結合する二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ）分子である。
【０４６７】
ＭＧＤ２６１の有効性（Ｂ細胞枯渇）および安全性を、ｍＣＤ３２−／−  ｈＣＤ１６Ａ＋  Ｃ５７Ｂ１／６マウス、ｍＣＤ３２−／−  ｈＣＤ３２Ｂ＋  Ｃ５７Ｂ１／６マウス、およびｍＣＤ３２−／−  ｈＣＤ１６Ａ＋  ｈＣＤ３２Ｂ＋  Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおいて試験した。この反復投与実験では、マウスに６回の静脈内注射（毎週２回、３週間にわたる）を行った。Ｂ細胞枯渇は、ＦＡＣＳによりモニタリングした。安全性は、ケージ越しの観察によりモニタリングした。
【０４６８】
データは、ＭＧＤ２６１に、二重トランスジェニックマウスにおいて、顕著な副作用を誘導することなくＢ細胞を枯渇させる能力があることを示す。
【０４６９】
データ
第０、３、７、１０、１４、および１７日において、ＭａｒｃｏＧｅｎｉｃｓ社製繁殖コロニーのｍＣＤ３２−／−  ｈＣＤ１６Ａ＋  Ｃ５７Ｂｌ／６マウス、ｍＣＤ３２−／−  ｈＣＤ３２Ｂ＋  Ｃ５７Ｂｌ／６マウス、およびｍＣＤ３２−／−  ｈＣＤ１６Ａ＋  ｈＣＤ３２Ｂ＋  Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、ＭＧＤ２６１（１０、３、１、または０．３ｍｇ／ｋｇ）または非関連抗体（１０ｍｇ／ｋｇのｈＥ１６）を静脈内注射した。第−１９（血液採取前）、４、１１、１８、２５、および３２日において血液を採取し、ＦＡＣＳ解析にかけた。毎週３回、動物の健康および活動を記録した。
【０４７０】
【表１７】
0005718637.tif 000051
ＦＡＣＳ解析法：
ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８投与の１８日前、ならびに該治療の４、１１、１８、２５、および３２日後において、全血液試料を採取した。ＦＡＣＳベースのアッセイにより血液試料を解析して、ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８のＢ細胞カウントに対する効果を決定した。Ｂｅｃｈｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製のＦｌｏｗＣｏｕｎｔビーズを用いることにより、洗浄なしのプロトコールをＢ細胞カウント、Ｔ細胞カウント、およびＰＭＮカウントに用いた。解析で用いた抗体パネルは、ＰＭＮが１Ａ８−ＦＩＴＣ、Ｔ細胞がＣＤ３−ＰＥ、Ｂ細胞がＣＤ１９−ＡＰＣ、および全白血球がＣＤ４５−ＰｅｒＣＰであった。
【０４７１】
結果
ｈＥ１６またはＭＧＤ２６１（任意の濃度で）により処理したマウスは、実験期間中のどの時点でも不快感の徴候を示さなかった。
【０４７２】
ｈＣＤ１６ＡおよびｈＣＤ３２Ｂの二重トランスジェニックマウスでは、Ｂ細胞枯渇が観察された。ダイアボディｈ２Ｂ６−３Ｇ８は、ｈＣＤ１６Ａ発現エフェクター細胞およびｈＣＤ３２Ｂ発現Ｂ細胞に結合し、その結合がＢ細胞の死滅に必要とされた。単一トランスジェニックマウスでは、Ｂ細胞枯渇が観察されなかった（図２４）。試験中において、Ｔ細胞レベルおよびＰＭＮレベルに顕著な変化は見られなかった。
【０４７３】
本発明の代替的な免疫療法剤に対するさらなる裏付けとして、「２．４Ｇ２−３Ｇ８  ＤＢ」と称するＭＧＤ２６１のサロゲートを構築した。２．４Ｇ２−３Ｇ８  ＤＢは、ｍＣＤ３２Ｂ（２．４Ｇ２抗体を介して）ならびにｈＣＤ１６ＡおよびｈＣＤ１６Ｂ（ｈ３Ｇ８抗体を介して）に結合する二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ）分子である。
【０４７４】
２．４Ｇ２−３Ｇ８  ＤＢの有効性（Ｂ細胞枯渇）および安全性を、ｍＣＤ１６−／−マウス、ｍＣＤ１６−／−  ｈＣＤ１６Ａ＋  Ｃ５７Ｂｌ／６マウス、ｍＣＤ１６−／−  ｈＣＤ１６Ｂ＋マウス、およびｍＣＤ１６−／−  ｈＣＤ１６Ａ＋  ｈＣＤ１６Ｂ＋マウスにおいて試験した。この反復投与実験では、マウスに９回の腹腔内注射（毎週３回、３週間にわたる）を行った。Ｂ細胞枯渇は、ＦＡＣＳによりモニタリングした。安全性は、ケージ越しの観察によりモニタリングした。
【０４７５】
データは、２．４Ｇ２−３Ｇ８  ＤＢに、ｈＣＤ１６トランスジェニックマウスにおいて、顕著な副作用を誘導することなくＢ細胞を枯渇させる能力があることを示す。
【０４７６】
データ
第０、２、４、７、９、１１、１４、１６、および１８日において、ＭａｒｃｏＧｅｎｉｃｓ社製繁殖コロニーのｍＣＤ１６−／−マウス、ｍＣＤ１６−／−  ｈＣＤ１６Ａ＋  Ｃ５７Ｂｌ／６マウス、ｍＣＤ１６−／−  ｈＣＤ１６Ｂ＋マウス、およびｍＣＤ１６−／−  ｈＣＤ１６Ａ＋  ｈＣＤ１６Ｂ＋マウスに、２．４Ｇ２−３Ｇ８  ＤＢ（７５ｕｇ／匹）またはＰＢＳを腹腔内注射した。第−１０（血液採取前）、４、１１、および１８日において血液を採取し、ＦＡＣＳ解析にかけた。毎週３回、動物の健康および活動を記録した。
【０４７７】
【表１８】
0005718637.tif 000052
ＦＡＣＳ解析法：
２．４Ｇ２−３Ｇ８投与の１０日前、ならびに該治療開始の４、１１、および１８日後において、全血液試料を採取した。ＦＡＣＳベースのアッセイにより血液試料を解析して、２．４Ｇ２−３Ｇ８のＢ細胞カウントに対する効果を決定した。ＢＤ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ社製のＴｒｕＣＯＵＮＴチューブを用いることにより、洗浄なしのプロトコールをＢ細胞カウント、Ｔ細胞カウント、およびＰＭＮカウントに用いた。解析で用いた抗体パネルは、ＰＭＮが１Ａ８−ＦＩＴＣ、Ｔ細胞がＣＤ３−ＰＥ、Ｂ細胞がＣＤ１９−ＡＰＣ、および全白血球がＣＤ４５−ＰｅｒＣＰであった。
【０４７８】
結果
ｈＥ１６または２．４Ｇ２−３Ｇ８  ＤＢにより処理したマウスは、実験期間中のどの時点でも不快感の徴候を示さなかった。
【０４７９】
ｍＣＤ１６−／−  ｈＣＤ１６Ａ＋マウスまたはｍＣＤ１６−／−  ｈＣＤ１６Ａ＋  ｈＣＤ１６Ｂ＋マウスではＢ細胞枯渇が観察されたが、ｍＣＤ１６−／−マウスでは観察されなかった。これらのデータは、Ｂ細胞の死滅にはｈＣＤ１６Ａを担持するエフェクター細胞が必要とされたことを示す（図２５）。試験中において、Ｔ細胞レベルおよびＰＭＮレベルに顕著な変化は見られなかった。
【０４８０】
静脈内（ＩＶ）モデル
ヒト腫瘍細胞株Ｒａｊｉの静脈内（ＩＶ）モデルを用いて、ＭＧＤ２６１の抗腫瘍活性を試験した。Ｒａｊｉは、ｈＣＤ３２Ｂを発現するヒトバーキットリンパ腫細胞株である。ｍＣＤ１６−／−マウス、ｈＣＤ１６Ａ＋マウス、ＲＡＧ１−／−マウスに静脈内注射すると、腫瘍細胞が脊椎に局在化され、結果的に後肢麻痺が生じる。
【０４８１】
データは、ＭＧＤ２６１に、ｍＣＤ１６−／−マウス、ｈＣＤ１６Ａ＋マウス、ＲＡＧ１−／−マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでのＲａｊｉ腫瘍細胞増殖を遮断する能力があることを示す。データは、ヒトにおけるＣＤ３２Ｂ発現Ｂ細胞悪性疾患の治療においてＭＧＤ２６１を用い得ることを示す。
【０４８２】
データ
第０日において、ＭａｒｃｏＧｅｎｉｃｓ社製繁殖コロニーで２０週齢のｍＣＤ１６−／−マウス、ｈＣＤ１６Ａ＋マウス、ＲＡＧ１−／−  Ｃ５７Ｂｌ／６マウス１２匹に、５×１０６個のＲａｊｉ細胞を静脈内注射した。第６、９、１３、１６、２０、２３、２７、および３０日において、マウスはまた、２５０、２５、または２．５ｕｇのＭＧＤ２６１またはＰＢＳ（陰性対照）による腹腔内（ＩＰ）治療も受けた。次いで、マウスを毎日観察し、毎週２回体重を記録した。後肢麻痺を発症するマウスは安楽死させた。
【０４８３】
結果
ＰＢＳで治療したマウスは、第２５日と第５０日との間に死亡した。ＭＧＤ２６１で治療したマウスは、少なくとも第９０日まで生存した（図２６）。生存の延長は、統計学的に有意であった。ログランク検定を用いる生存曲線の比較により、９６．４６のχ２（ｄｆ＝９；Ｐ値＜０．０００１）が得られた。
【０４８４】
６．７  原核動物におけるＤＡＲＴ発現
非哺乳動物宿主においてＤＡＲＴを作製できることを裏付けるために、実験を実施した。したがって、ＤＡＲＴ発現プラスミドにより大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を形質転換し、ＤＡＲＴ発現をモニタリングした。
【０４８５】
材料と方法
プラスミドの構築
３Ｇ８は、ＨｕＣＤ１６に対するヒト化モノクローナル抗体である。本明細書で説明するＤＡＲＴは、その各々がＶＬの後にスペーサーを有し、次いで、ＶＨの後に対向鎖に対するジスルフィド結合を形成するのに良好な前後関係でＣｙｓを有する、２本の共有結合鎖からなる。３Ｇ８ＶＬ−ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙ−３Ｇ８ＶＨ−ＬｅｕＧｌｙＧｌｙＣｙｓをコードするＤＡＲＴ配列を既存の真核細胞発現構築物からＰＣＲ増幅し、Ｎｃｏ  ＩおよびＥｃｏＲＩにより消化した。標的ベクターは、大腸菌内における分泌のためのｐｅｌＢリーダー配列を含有するｐＥＴ２５ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）であった。３Ｇ８／３Ｇ８  ＤＡＲＴ配列の挿入前に、ベクターを以下の通りに改変した：まず、たとえより低レベルであってもタンパク質の可溶性発現がその制御下にあることを促すため、より低活性のｌａｃプロモーターによりＴ７プロモーターを置換した。さらに、ｐｅｌＢリーダーの開始部に存在するＭｅｔでの開始を促すため、２カ所の点変異を導入して、多重クローニング部位（ＭＣＳ）の開始部に存在する２個の内部Ｍｅｔコドンを除去した。この構築物により作製されるＤＡＲＴは、同一の特異性、すなわち、ＨｕＣＤ１６を有する２本のＶ領域アームからなる。
【０４８６】
発現
ｐＥＴ２５ｂ（＋）  Ｔ７−  ｌａｃ＋  ３Ｇ８／３Ｇ８プラスミドによりＢＬ２１ＤＥ３細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を形質転換させ、ａｍｐ耐性コロニーを用いてブロス培地に播種した。培養物が０．５  ＯＤ６００単位に達したところで、０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加して発現を誘導した。３０℃で２時間にわたり培養物を増殖させ、無細胞培地を回収した。
【０４８７】
精製
アフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィーを用いる２段階で３Ｇ８／３Ｇ８  ＤＡＲＴを精製した。アフィニティークロマトグラフィーを用いて、条件培地からＤＡＲＴを捕捉した。特に、ＣＤ１６ＡをＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に結合させた。ローディング前に、ｐＨ８．０の２０ｍＭトリス／ＨＣｌ中でＣＤ１６Ａ−セファロース樹脂を平衡化した。ローディングが完了したら、ｐＨ３．０の５０ｍＭグリシンによる結合したＤＡＲＴの溶出前に、平衡化緩衝液により該樹脂を洗浄した。溶出したＤＡＲＴは、即座にｐＨ８．０の１Ｍトリス／ＨＣｌにより中和化させ、遠心分離型濃縮器（ＶｉｖａＳｃｉｅｎｃｅ社製のＶｉｖａｓｐｉｎ  ２０、１０ｋ  ＭＷＣＯ  ＰＥＳ）を用いて濃縮した。濃縮されたＤＡＲＴは、ＰＢＳ中で平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いるサイズ除外クロマトグラフィーによりさらに精製した。
【０４８８】
結果
ＣＤ１６Ａセファロースカラムにより、大腸菌を培養した１．７リットルの条件培地を処理した。ＤＡＲＴの収量は、０．１２ｍｇであった。精製したＤＡＲＴのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣによる解析は、哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞）により発現した対照ＤＡＲＴとの同等性を示した（図２７）。
【０４８９】
大腸菌により発現したｈ３Ｇ８−ｈ３Ｇ８  ＤＡＲＴの結合ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡを用いて、大腸菌内におけるｈ３Ｇ８−ｈ３Ｇ８  ＤＡＲＴの発現を測定した。４℃の炭酸緩衝液中で一晩にわたり、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート上に、５０μｌ／ウェルで２μｇ／ｍｌの抗ｈ３Ｇ８  Ｆｖ特異的抗体である２Ｃ１１をコーティングした。ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）によりプレートを３回洗浄し、次いで、試験対象のＤＡＲＴを添加する前に、室温で３０分間にわたり、ＰＢＳ−Ｔ中において０．５％のＢＳＡによりブロックした。ブロッキング時において、大腸菌により発現したｈ３Ｇ８−ｈ３Ｇ８  ＤＡＲＴ、ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＤＡＲＴ、およびｈ２Ｂ６−ｈ２Ｂ６  ＤＡＲＴ（陰性対照）を、ＰＢＳＴ／ＢＳＡ中において１μｇ／ｍｌおよび０．３μｇ／ｍｌに希釈した。５０μｌ／ウェルの希釈したＤＡＲＴを各ウェルに添加した。室温で１時間にわたりプレートをインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔによる３回の洗浄後、５０μｌ／ウェルで０．１μｇ／ｍｌのビオチニル化したｓＣＤ１６−Ｆｃ融合体をプレートに添加した。室温で１時間にわたりプレートをインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔによる３回の洗浄後、５０μｌ／ウェルのＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）の１：５０００希釈液を検出に用い、室温で１時間にわたりインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔによりプレートを３回洗浄し、８０ｕｌ／ウェルのＴＭＢ基質を用いて発色させた。５分間のインキュベーション後、４０μｌ／ウェルの１％  Ｈ２ＳＯ４により反応を停止させた。９６ウェルプレートリーダーおよびＳＯＦＴｍａｘソフトウェアを用いてＯＤ４５０ｎｍを読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ  ３．０３ソフトウェアを用いてリードアウトをプロットした（図２８）。
【０４９０】
６．８  ＤＡＲＴにより誘導したヒトＢ細胞死
一晩にわたり、ヒトＰＢＭＣを、ＣＤ１６−ＣＤ３２Ｂ−ｈｕ３Ｇ８−ｈｕ２ｂ６（上述）、ｃｈ２Ｂ６−ａｇｌｙｃ―非グリコシル化キメラ２Ｂ６抗体（参照により本明細書に組み込む、ＵＳ２００５／０２６０２１３として公開された同時係属の米国特許出願第１１／１０８，１３５号で説明した）、およびＣＤ１６−ＣＤ７９と共にインキュベートした。ＣＤ１６−ＣＤ７９のＤＮＡ配列およびコードされたタンパク質配列は、以下の通りである。
【０４９１】
【化１】
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【０４９２】
【化２】
0005718637.tif 000054
ＦＡＣＳ解析により、ゲート設定されないＦＳＣ／ＳＳＣ総細胞集団に対するＢ細胞（ＣＤ２０＋細胞）のＰＩ＋アネキシンＶ＋細胞集団の百分率として、アポトーシスをアッセイした（図２９）。
【０４９３】
６．９  ８Ｂ５−ＣＢ３．１  ＤＡＲＴ
８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＶＥＰＫＳＣ
８Ｂ５ＶＬは、Ｈ９およびｌｇｈ６３０Ｒをプライマー、ｃｈ８Ｂ５Ｌｃを鋳型として用いることにより増幅した。ＣＢ３．１は、ｌｇｈ６２８Ｆおよびｌｇｈ６２９Ｒをプライマー、ｃｈ８Ｂ５Ｈｃを鋳型として用いることにより増幅した。リンカー配列は、プライマーｌｇｈ６３０Ｒおよびｌｇｈ６２８Ｆ内に組み込んだ。ｃ末端のリンカーおよび終止コドンは、ｌｇｈ６２９Ｒプライマー内に組み込んだ。ＰＣＲ産物をゲル精製して等モル比で共に混合し、次いで、Ｈ９およびｌｇｈ６３０Ｒをプライマーとして用いることにより増幅した。次いで、重複ＰＣＲ産物をＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼにより消化し、ｐＣＩｎｅｏベクター内にクローニングした。
【０４９４】
ＣＢ３．１ＶＬ−８Ｂ５ＶＨ−ＦＮＲＧＥＣ
ＣＢ３．１ＶＬは、Ｈ９と、ＦＲ４において８Ｂ５ＶＬと同じ配列を共有するｌｇｈ６３０Ｒとをプライマーとして、ｃｈＣＢ３．１Ｌｃを鋳型として用いることにより増幅した。８Ｂ５ＶＨは、ｌｇｈ６３１Ｆおよびｌｇｈ６４０Ｒをプライマー、ｃｈ８Ｂ５Ｈｃを鋳型として用いることにより増幅した。リンカー配列は、プライマーｌｇｈ６３０Ｒおよびｌｇｈ６３１Ｆ内に組み込んだ。ｃ末端のリンカーおよび終止コドンは、ｌｇｈ６４０Ｒプライマー内に組み込んだ。ＰＣＲ産物をゲル精製して等モル比で共に混合し、次いで、Ｈ９およびｌｇｈ６４０Ｒをプライマーとして用いることにより増幅した。次いで、重複ＰＣＲ産物をＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼにより消化し、ｐＣＩｎｅｏベクター内にクローニングした。
【０４９５】
抗Ｆｌａｇタグ−８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＶＥＰＫＳＣ
抗Ｆｌａｇタグは、重複ＰＣＲによりシグナル配列と８Ｂ５ＶＬとの間に挿入した。シグナル配列およびＦｌａｇタグは、Ｈ９およびｌｇｈ６４７Ｒをプライマー、ｃｈ８Ｂ５Ｌｃを鋳型として用いることにより増幅した。８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＶＥＰＫＳＣは、ｌｇｈ６４７Ｆおよびｌｇｈ６２９Ｒをプライマー、８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＶＥＰＫＳＣを鋳型として用いることにより再増幅した。ＰＣＲ産物をゲル精製して等モル比で共に混合し、次いで、Ｈ９およびｌｇｈ６２９Ｒをプライマーとして用いることにより増幅した。次いで、重複ＰＣＲ産物をＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼにより消化し、ｐＣＩｎｅｏベクター内にクローニングした。
【０４９６】
８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＬＧＧＣ
８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＶＥＰＫＳＣ構築物内において異なるＣ末端リンカーを作製するため、Ｈ９およびｌｇｈ６４６Ｒをプライマーとして用いることにより該構築物を再増幅した。Ｃ末端ＬＧＧＣリンカーは、ｌｇｈ６４６Ｒプライマー内に組み込んだ。次いで、ＰＣＲ産物をＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼにより消化し、ｐＣＩｎｅｏベクター内にクローニングした。
【０４９７】
ＣＢ３．１ＶＬ−８Ｂ５ＶＨ−ＬＧＧＣ
同じ戦略を用いて、ＣＢ３．１ＶＬ−８Ｂ５ＶＨ−ＬＧＧＣを作製した。Ｃ末端ＬＧＧＣリンカーは、ｌｇｈ６４８Ｒプライマー内に組み込み、ＣＢ３．１ＶＬ−８Ｂ５ＶＨ−ＦＮＲＧＥＣを鋳型として用いた。次いで、ＰＣＲ産物をＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼにより消化し、ｐＣＩｎｅｏベクター内にクローニングした。
【０４９８】
抗Ｆｌａｇタグ−８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＬＧＧＣ
また同じ戦略を用いて、抗Ｆｌａｇタグ−８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＬＧＧＣを作製した。Ｃ末端ＬＧＧＣリンカーは、ｌｇｈ６４８Ｒプライマー内に組み込み、抗Ｆｌａｇタグ−８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＶＥＰＫＳＣを鋳型として用いた。次いで、ＰＣＲ産物をＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼにより消化し、ｐＣＩｎｅｏベクター内にクローニングした。
【０４９９】
【化３】
0005718637.tif 000055
８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＬＧＧＣ
８Ｂ５ＶＬは、Ｈ９およびｌｇｈ６９４Ｒをプライマー、ｃｈ８Ｂ５Ｌｃを鋳型として用いることにより増幅した。８Ｂ５ＶＨは、ｌｇｈ６９５Ｆおよびｌｇｈ６９６Ｒをプライマー、ｃｈ８Ｂ５Ｈｃを鋳型として用いることにより増幅した。リンカー配列は、プライマーｌｇｈ６９４Ｒおよびｌｇｈ６９５Ｆ内に組み込んだ。ＨｕＩｇＧ１Ｆｃは、ｌｇｈ３５５Ｆおよびｌｇｈ３６６Ｒをプライマー、ｃｈ８Ｂ５Ｈｃを鋳型として用いることにより増幅した。ＰＣＲ産物をゲル精製して等モル比で共に混合し、次いで、Ｈ９およびｌｇｈ３６６Ｒをプライマーとして用いることにより増幅した。次いで、重複ＰＣＲ産物をＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼにより消化し、ｐＣＩｎｅｏベクター内にクローニングした。
【０５００】
【化４】
0005718637.tif 000056
【０５０１】
【化５】
0005718637.tif 000057
発現：
リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、構築物５および６、または６および７、または８および９、または９および１０によりコードされる発現プラスミド（図３０）を、ＨＥＫ−２９３細胞内に同時トランスフェクトし、抗ｆｌａｇタグを伴うかまたは伴わない８Ｂ５−ＣＢ３．１  ＤＡＲＴを発現させた。３日毎に３回にわたり条件培地を回収した。次いで、ＣＤ３２Ｂアフィニティーカラムを用いて条件培地を精製した。
【０５０２】
ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡは、以下の通りに実施した。４℃の炭酸緩衝液中で一晩にわたり、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート上に、５０μｌ／ウェルで２ｕｇ／ｍｌのＣＤ３２Ｂ−Ｆｃをコーティングした。ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）によりプレートを３回洗浄し、次いで、試験対象の単鎖Ｆｃ融合タンパク質を添加する前に、室温で３０分間にわたり、ＰＢＳ−Ｔ中において０．５％のＢＳＡによりブロックした。ブロッキング時において、８Ｂ５−ＣＢ３．１  ＤＡＲＴを、２μｇ／ｍｌに始まる２倍濃度の希釈系列で希釈した。２５μｌ／ウェルで５０ｎｇ／ｍｌのｃｈ８Ｂ５と混合した２５μｌ／ウェルの希釈したＤＡＲＴを、希釈プレートからＥＬＩＳＡプレートに移した。室温で１時間にわたりプレートをインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔによる３回の洗浄後、５０μｌ／ウェルの１：１０，０００に希釈したＨＲＰコンジュゲートＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製）をプレートに添加した。プレートを室温で１時間にわたりインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔによりプレートを３回洗浄し、８０ｕｌ／ウェルのＴＭＢ基質により発色させた。５分間のインキュベーション後、４０μｌ／ウェルの１％  Ｈ２ＳＯ４により反応を停止させた。９６ウェルプレートリーダーおよびＳＯＦＴｍａｘソフトウェアを用いてＯＤ４５０ｎｍを読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ  ３．０３ソフトウェアを用いてリードアウトをプロットした（図３１）。
【０５０３】
６．１０  Ｉｇ様四価ＤＡＲＴの設計および性状解析
４本のポリペプチド鎖を用いて、四価の抗原結合部位を有するＩｇ様ＤＡＲＴを作製した（図３２、図３３）。Ｉｇ様ＤＡＲＴ分子種は、そのドメインが同じエピトープ（４個の同一の抗原分子に結合する能力がある四価のモノエピトープ特異的Ｉｇ様ＤＡＲＴを形成するように）または異なるエピトープもしくは抗原に結合するように設計し得るので、独自の特性を有する。例えば、そのドメインを、同じ抗原の２個のエピトープ（四価で単一抗原特異的なバイエピトープ特異的Ｉｇ様ＤＡＲＴを形成するように）または異なる抗原分子のエピトープ（第１の抗原に対して特異的な結合部位の対と、第２の抗原に対して特異的な第２の結合部位の対とを有する四価のＩｇ様ＤＡＲＴを形成するように）に結合するように設計することができる。このような属性の組合せを有するハイブリッド分子を容易に作製することができる。
【０５０４】
このようなＩｇ様ＤＡＲＴ分子種の特性を例示するため、ＣＤ３２に特異的な結合部位の対と、ＣＤ１６Ａに特異的な第２の結合部位の対とを有する、例示的な四価Ｉｇ様ＤＡＲＴ分子種を作製した。このＩｇ様ＤＡＲＴ分子種は、以下の４本のポリペプチド鎖を用いて作製した。
【０５０５】
【化６】
0005718637.tif 000058
【０５０６】
【化７】
0005718637.tif 000059
【０５０７】
【化８】
0005718637.tif 000060
上記配列を有するＩｇ様ＤＡＲＴ分子の調製物を異なるプラスミド単離物から得、「Ｉｇ  ＤＡＲＴ  １」および「Ｉｇ  ＤＡＲＴ  ２」と命名した。ＥＬＩＳＡにおいてこれらのＩｇ様ＤＡＲＴ分子種がｍＣＤ３２−ｈＣＤ１６Ａに結合する能力を、培地単独、単一のＣＤ３２結合部位を有するＤＡＲＴおよび単一のＣＤ１６Ａ結合部位を有するＤＡＲＴ（「ＤＡＲＴ」）、対照の抗ｃｈ−ｍＣＤ３２  ｍＡｂの該能力と比較した（図３４）。本発明のＩｇ様ＤＡＲＴは、ＤＡＲＴまたは対照抗体のいずれよりも遙かに大きな抗原結合親和性を有することが判明した。
【０５０８】
６．１１  ＣＤ３２Ｂ−ＣＤ７９−１およびＣＤ３２Ｂ−ＣＤ７９−２の二重特異性ダイアボディの設計および性状解析
ＣＤ７９ＶＬ−ＣＤ３２ＢＶＨ（配列１）、ＣＤ３２ＢＶＬ−ＣＤ７９ＶＨ−１（配列２）、およびＣＤ３２ＢＶＬ−ＣＤ７９ＶＨ−２（配列３）をコードする遺伝子を、発現ベクターｐＥＥ１３内にクローニングした結果、それぞれ、発現構築物１、２、および３がもたらされた。構築物１の発現プラスミドを、発現プラスミド２または３と共にＨＥＫ−２９３細胞内に同時トランスフェクトし、それぞれ、ＣＤ３２Ｂ−ＣＤ７９−１およびＣＤ３２Ｂ−ＣＤ７９−２の二重特異性ダイアボディを作製した。３日毎に３回にわたり条件培地を回収した。次いで、ＣＤ３２Ｂアフィニティーカラムを用いて条件培地を精製した。
【０５０９】
ＥＬＩＳＡは、以下の通りに実施した。４℃の炭酸緩衝液中で一晩にわたり、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート上に、５０μｌ／ウェルで２μｇ／ｍｌのＣＤ３２Ｂ−Ｆｃをコーティングした。ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）によりプレートを３回洗浄し、次いで、試験対象の単鎖Ｆｃ融合タンパク質を添加する前に、室温で３０分間にわたり、ＰＢＳ−Ｔ中において０．５％のＢＳＡによりブロックした。ブロッキング時において、ＣＤ３２Ｂ−ＣＤ７９−１またはＣＤ３２Ｂ−ＣＤ７９−２の二重特異性ダイアボディを、２μｇ／ｍｌに始まる２倍濃度の希釈系列で希釈した。２５μｌ／ウェルの希釈した二重特異性ダイアボディを、２５μｌ／ウェルで５０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３２Ｂ抗体と混合し、ＥＬＩＳＡプレートに添加した。室温で１時間にわたりプレートをインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔによる３回の洗浄後、５０μｌ／ウェルの１：１０，０００に希釈したＨＲＰコンジュゲートＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製）をプレートに添加した。プレートを室温で１時間にわたりインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔによりプレートを３回洗浄し、８０ｕｌ／ウェルのＴＭＢ基質により発色させた。５分間のインキュベーション後、４０μｌ／ウェルの１％  Ｈ２ＳＯ４により反応を停止させた。９６ウェルプレートリーダーおよびＳＯＦＴｍａｘソフトウェアを用いてＯＤ４５０ｎｍを読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ  ３．０３ソフトウェアを用いてリードアウトをプロットした。実験は、ＣＤ３２Ｂ−ＣＤ７９−１およびＣＤ３２Ｂ−ＣＤ７９−２の二重特異性ダイアボディに、抗ＣＤ３２Ｂ対照抗体の親和性と同等の親和性によりＣＤ３２−Ｆｃに対する免疫特異的結合の能力があることを明らかにした。上述した構築物のヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を以下に記載する。
【０５１０】
【化９】
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【０５１１】
【化１０】
0005718637.tif 000062
【０５１２】
【化１１】
0005718637.tif 000063
本発明においては、当業者にとって明らかであるように、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、多数の改変および変異を含むことができる。本明細書に記載した具体的な実施形態は、単に例示の目的で提示したものである。本発明は、添付の特許請求の範囲およびその権利が付与される均等の範囲によってのみ限定されるべきである。このような修飾は、添付の特許請求の範囲内にあることを意図している。
【０５１３】
本明細書で引用したすべての文献、特許および非特許文献は、個々の刊行物、特許または特許出願の全内容を参照として組み込むことが明確かつ個別に示される程度に、あらゆる目的のためにその全内容を参照として本明細書に組み入れるものとする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図９】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３５Ｄ】
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【図３５Ｅ】
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【図３５Ｆ】
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【図３５Ｇ】
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【図３５Ｈ】
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【図３５Ｉ】
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【図３５Ｊ】
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【図３５Ｋ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【配列表】
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