(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
‐  サンプルＤＮＡ、プライマー、元の核酸鎖に相補的な核酸鎖を合成できる１つ若しくは複数の酵素、ｄＮＴＰｓの混合物、及びバッファーを含む反応混合物を準備し、
‐  変性ステップにおいてＤＮＡを変性させ、
‐  アニーリング・ステップにおいてプライマーをアニーリングさせ、
‐  伸長ステップにおいてアニールしたプライマーを伸長して、増幅されたＤＮＡを得る、
を含んでなるＤＮＡの構造非依存型増幅のためのプライマー伸長反応法であって、複数サイクルにわたって、伸長ステップにおいて、温度を、最初にアニーリング温度から７０〜９０℃の範囲内の第１伸長温度まで上げ、次に７５〜９５℃の範囲内のより高い第２伸長温度まで変動させ、そして、より低い第１伸長温度に戻して、伸長が可能になるようにＤＮＡ内の二次構造を不安定化させることを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
前記ステップが、複数サイクルにわたって繰り返されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１伸長温度が、７０〜７８℃の範囲内であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１伸長温度が、７６〜７８℃の範囲内であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第２伸長温度が、８０〜８３℃の範囲内であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
第１伸長温度と第２伸長温度との間の変動サイクルが、それぞれの伸長ステップにおいて、３〜数百回繰り返されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記変動サイクルが、それぞれの伸長ステップにおいて、２０〜３０回繰り返されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記伸長ステップにおいて、温度の変動速度が、０．０１〜１０℃／ｓの範囲内であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記伸長ステップにおいて、温度の変動速度が、０．０１〜１℃／ｓの範囲内であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記伸長ステップにおいて、温度の変動速度が、０．１℃／ｓであることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＤＮＡが、ＧＣ、ＣＴＧ又はＧＣＣリッチな反復を含んでいることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記反応混合物が、ＤＭＳＯ、グリセロール及びベタインからなる群から選ばれる共溶媒を含んでいることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ＤＮＡを増幅するために請求項１〜１２のいずれか１項に記載のプライマー伸長反応を使用することを特徴とするポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項１４】
定量的ＰＣＲ法又は逆転写ＰＣＲ法であることを特徴とする、請求項１３に記載のポリメラーゼ連鎖反応法。
【請求項１５】
二次構造を形成する反復配列を含むＤＮＡに関連する疾患又は障害の診断を補助する方法であって、請求項１３に記載のポリメラーゼ連鎖反応法を使用して、診断を補助する目的で上記ＤＮＡを増幅することを特徴とする、前記方法。
【請求項１６】
上記疾患が脆弱Ｘ症候群であることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
上記疾患が筋強直性ジストロフィーであることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のプライマー伸長反応を使用することを特徴とするＤＮＡの配列決定法。
【請求項１９】
ＤＮＡを増幅するために請求項１３に記載のポリメラーゼ連鎖反応法を使用することを特徴とする、ハイブリダイゼーション・アッセイのための標識ＤＮＡ断片の調製方法。
【請求項２０】
コンピューターに、
変性工程において、加熱手段を作動させて、DNAを変性させ；
アニーリング工程において、冷却手段を作動させて、プライマーをアニーリングさせ；そして
伸長工程において、加熱又は冷却手段を作動させて、増幅されたDNAを取得させる指示を含む
プログラムであって、前記伸長工程において、温度を、最初にアニーリング温度から７０〜９０℃の範囲内の第１伸長温度まで上げ、次に７５〜９５℃の範囲内のより高い第２伸長温度まで変動させ、そして、より低い第１伸長温度に戻して、伸長が可能になるようにＤＮＡ内の二次構造を不安定化させることを特徴とする、前記プログラム。
【請求項２１】
請求項２０に記載のプログラムを導入されたサーマルサイクラー。
【請求項２２】
請求項２０に記載のプログラムのコードを含むコンピューター読み取り可能データ記憶媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプライマー伸長反応法に関する。特に、本発明は、シトシン及びグアノシン・ヌクレオチドの含有率が高い反復配列を持ち、堅固な二次構造を形成する増幅困難なＤＮＡの構造に依存しない増幅を可能にするプライマー伸長反応法、例えばポリメラーゼ連鎖反応法などに関する。本発明はまた、ポリメラーゼ連鎖反応によって、障害、例えば、筋強直性ジストロフィー１型や、脆弱Ｘ症候群や、ＥＰＭ１などを診断する方法にも関する。本発明はまた、本発明の方法を実施するようにプログラムされたサーマルサイクラーにも関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、元の鋳型ＤＮＡのセグメントの複数のコピーを製造するために２０年あまりにわたって使用されてきており、そして、日々、新しい応用と変更が出てきている。
【０００３】
例えば、ＵＳ  ４  ６８３  ２０２は、ＰＣＲ法を開示している最先の特許文献の１つである。それには、核酸、又は各核酸が長さの等しい若しくは異なる２本の別々の相補鎖から成るような核酸混合物の中に含まれる少なくとも１つの特定の核酸配列を増幅する方法が説明されており、その方法は、以下のステップ：（ａ）それぞれ異なる配列を合成するために、それぞれの核酸鎖に相補的であるそれぞれのプライマーの伸長産物が増幅されるような条件下、それぞれ異なる特定の配列を増幅するために２つのオリゴヌクレオチド・プライマーで鎖を処理し、ここで、上述のプライマーは、（一方のプライマーから合成された伸長産物が、その相補鎖から切り離されると、もう一方のプライマーの伸長産物の合成のための鋳型としての役割を果たすことができるように）そこにハイブリダイズできるくらいそれぞれの特定の配列の異なる鎖に対して相補的であるように選択され；（ｂ）それらが合成された鋳型からプライマー伸長産物を切り離して、一本鎖分子を作り；そして（ｃ）鋳型としてステップ（ｂ）で作られたそれぞれの一本鎖を使用してプライマー伸長産物が合成される条件下、ステップ（ａ）のプライマーで、ステップ（ｂ）から作り出された一本鎖分子を処理する、を含んでなる。それ以来、この方法は、例えばＵＳ  ４  ８００  １５９及びＵＳ  ４  ９６５  １８８に記載のとおりさらに発達したが、基本原理は当業者に周知である。
【０００４】
ＰＣＲ法を実施するためのサーマルサイクラーもまた、当該技術分野で周知である。例えば、ＵＳ  ５  ０３８  ８５２では、反応混合物を保持するための熱伝導コンテナ、（利用者が定めた）複数の所定の温度に、若しくはそのいずれかにて上述のコンテナを加熱、冷却、及び維持する手段であり、且つ、上述のコンテナをそこまで加熱、冷却、又はそこに維持する上述の所定の温度を制御する制御信号を受信する入力装置を持つ手段；並びに温度レベル、温度の変化速度のランプ、及び特定の温度レベルでのインキュベーションのタイミングを制御するために適切な制御信号を発生するように上述の加熱及び冷却手段の入力装置と組み合わせたコンピューター手段、を含んでなる基本的なＰＣＲデバイスを開示している。
【０００５】
ＰＣＲ法はあらゆる適用のために存在しているように見えるが、特定の鋳型のＰＣＲは対処できないままで依然として残っている。プルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼがｌｏｎｇ−ＰＣＲ増幅を改善できることがわかるまで、長い断片の増幅は難しかった（Barnes, W.M. 1994,「PCR amplification of up to 35-kb DNA with high fidelity and high yield from lambda bacteriophage templates」, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 91, no. 6, pp. 2216-2220;Mukai, H. & Nakagawa, T, 1996,「Long and accurate PCR (LA PCR)」, Nippon rinsho. Japanese Journal of Clinical Medicine, vol. 54, no. 4, pp. 917-92）。しかしながら、これらの酵素の増幅効率は、標準的な非プルーフリーディング・ポリメラーゼと比較して比較的低い。このような理由で、数社が、長くて困難な断片の増幅のために設計した、プルーフリーディングの、より進歩した伝統的なＤＮＡポリメラーゼの混合物を市場に投入した。
【０００６】
ＰＣＲ増幅を実施する人々が依然として頻繁に直面している問題の１つは、どのように堅固な二次構造を形成している反復塩基配列を含むＣＧリッチなＤＮＡに渡って増幅するかということである。そのような構造の例としては、ＣＧ、ＣＴＧ、及びＧＣＣ反復が挙げられる。そのような構造が形成された場合には、ＤＮＡポリメラーゼが二本鎖の二次構造にぶつかることが予想されるので、部分的な伸長しかおこらないことが想定される。これが不完全な伸長と低い全体的な増幅効率という結果を招く。不完全な伸長はまた、別の一般的に知られている現象にも関連する。その反復領域で終止すれば、部分的に伸長した新しいＤＮＡ鎖は３’末端に反復配列の範囲を持つことになる。それが次の変性ステップにおいて放出され、そして、その３’末端は正しい位置でも間違った位置でも反復のあらゆる部分にアニーリングできるので、次の伸長ステップでは、それが伸長されるであろう。この誤整列と、実験条件、例えばＤＮＡポリメラーゼ又は鋳型ＤＮＡ濃度などに関連する多くのその他の理由のため、最終的に断片は長さが異なり、それはアガロースゲル上で独特なスメアとして見られる。
【０００７】
疾患を引き起こす反復の不安定性は、４０を超える神経系疾患、神経変性疾患、及び神経筋疾患に関係している突然変異の重要、且つ、独特な形態である。これらの反復は、複数の（多くの場合、数十個又は数百個の）短い（通常１０ヌクレオチド長未満の）反復単位のコピーから成る。ＤＮＡ反復拡大突然変異（DNA repeat expansion mutations）は、動的なものであり、且つ、組織内で世代を超えて起こっている。遺伝性の組織特異的な不安定性のパターンは、遺伝子に特異的なシス・エレメントとトランス作動性ＤＮＡ代謝タンパク質の両方によって判断される。反復の不安定性は、ＤＮＡの複製、修復、及び組み換え中の異常なＤＮＡ構造の形成に恐らく関与している。反復の不安定性の機構について説明することに貢献した実験的な進歩は、この突然変異過程に対する我々の理解を広げた。それらは、代謝経路を駆動できる又は反復の不安定性から保護できる驚くべき方法を明らかにした。
【０００８】
多数の一般的な遺伝病はＣＧリッチな反復配列の拡大によって引き起こされる（Mirkin, S.M. 2007,「Expandable DNA repeats and human disease」, Nature, vol. 447, no. 21, pp. 932-940;Mirkin, S.M. 2006,「DNA structures, repeat expansions and human hereditary disorders」, Current Opinion in Structural Biology, vol. 16, no. 3, pp. 351-358）。これら伸長したＣＧリッチな反復において形成された二次構造が、主要な疾患機構であると考えられた。
ＣＧリッチな断片の高い融解温度に起因する二次構造、そして一本鎖状態のままで残ることの難しさが、プライマー伸長中にＤＮＡポリメラーゼが伸長することを妨げる主な障害である。これが、効率の悪いプライマー伸長と低い増幅効率という結果を招く。
【０００９】
二次構造は、それらの最小構造エネルギー状態を求めた自己相補ＤＮＡ鎖の結果として多くの場合形成される。二次構造をエネルギー状態最小とみなすことができれば、当業者は、一定の条件において、エネルギー最小は増幅産物のあらゆる分子について同じなので、その分子が最終的に同様の二次構造になると予想するであろう。
【００１０】
しかしながら、長くて反復性の断片では、過程がより複雑なので、ただ一つの末端構造はあまりありそうにないが、非常に類似した最小エネルギー状態を有するかなり多くの構造が見つけられる。
【００１１】
反復拡大の長さの診断的解析を、多くの方法で行うことができる。予想される反復拡大が比較的短いのであれば、これらの反復に渡る伸長が可能である。これらの反復配列の増幅し、その後に断片化をすることは、診断検査施設の日常的な手法である。しかしながら、疾患の多くでは、現在のＰＣＲ法には反復拡大が長過ぎるか、及び／又はＣＧリッチでありすぎる。
【００１２】
優性遺伝病を引き起こすか、又は劣性遺伝病の非罹患保因者に見られる拡大したＣＧリッチな反復の１つのコピーの確実な識別は、拡大していない短い反復対立遺伝子の１つのコピーの存在のために特に難しい。準最適なＰＣＲ条件では、この短い野性型対立遺伝子は非常に高い増幅効率を有し、そしてそれは増幅反応を占有することが多く、拡大対立遺伝子の増幅低下、及び診断誤差を結果的にもたらす。長いＣＧリッチなセグメントにわたって確実に増幅できないことが、診断検査施設に他の技術、例えばサザンブロッティングを使用して、これらの反復拡大を分析することを余儀なくしている。
【００１３】
ＧＣリッチな領域を増幅するという問題を克服するために、ある方法が開発された。種々の添加物（ＤＭＳＯ、グリセロール、及びベタインを含めた共溶媒）が、ＣＧリッチなセグメントの高い融解温度を下げるために使用された（Henke, W., Herdel, K., Jung, K., Schnorr, D. & Loening, S.A. 1997,「Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DMA sequences」, Nucleic acids research, vol. 25, no. 19, pp. 3957-3958;Hube, R, Reverdiau, P., lochmann, S. & Gruel, Y. 2005,「Improved PCR method for amplification of GC-rich DNA sequences」, Molecular biotechnology, vol. 31, no. 1, pp. 81-84）。
【００１４】
いくつかの方法で、ｄＧＴＰの類似体が使用される。例えば、ＵＳ  ５  ０９１  ３１０では、ポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡの構造非依存型増幅の方法が開示されており、上述の方法は、以下のステップ：（ａ）ハイブリダイジング条件下、ＤＮＡを、１組のオリゴヌクレオチド・プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ＴＴＰ、及びｃ7ｄＧＴＰで（それぞれのオリゴヌクレオチド・プライマーの伸長産物が形成されるように、すなわち上記ＤＮＡに相補的であるように）処理し、ここで、上述のプライマー対の第１プライマー伸長産物は、その鋳型から切り離されると、上述の対の第２プライマー伸長産物の合成のための鋳型としての役割を果たし；（ｂ）伸長産物が合成された鋳型から伸長産物を切り離し；そして（ｃ）ステップ（ｂ）で作られた伸長産物上でステップ（ａ）と（ｂ）を繰り返す、を含んでなる。これらの添加物にもかかわらず、長く反復性の、及び／又はＣＧリッチな断片は「ＰＣＲ不可能な（un-PCRable）」ままであることが多い。
【００１５】
ＵＳ  ６  ３５５  ４２２  Ｂ１では、２つの異なる一定の伸長温度が使用される方法が開示されている（Liu, Q. & Sommer, S.S. 1998,「Subcycling-PCR for multiplex long-distance amplification of regions with high and low GC content: application to the inversion hotspot in the factor VIII gene」, BioTechniques, vol. 25, no. 6, pp. 1022-1028）。著者は、ＧＣリッチ及びＣＧプアなセグメントを示す長い複製の増幅のためのＰＣＲ法を説明している。セグメントには低いＧＣ含量を有する領域があったので、彼らは、より一般的な６５℃と一緒に６０℃の低い伸長温度を使用した。１つの伸長ステップに、両方の温度による２つの２分のセッションが含まれた。
【００１６】
ヒト・ゲノムが配列決定されているが、大規模配列決定プロジェクトは、ＣＧリッチな反復性セグメントを含む領域にわたる効率の悪い増幅に頻繁に苦しめられている。より高いＣＧ含量を有するヒト以外の種からのゲノムを研究する場合、この問題はより一層顕著になる。この問題を克服するＰＣＲ法が必要である。そのようなＰＣＲ法は、例えば、先に記載の疾患などのそういった配列に関連する疾患及び障害の診断にも有益であろう。ＣＧリッチな配列にわたる効果的なプライマー伸長はまた、ＣＧリッチな配列にわたる確実なＤＮＡ配列決定も可能にするであろう。
【００１７】
本発明は、一定の変性、プライマー・アニーリング、及びプライマー伸長温度（２ステップＰＣＲでは最後の２つのステップを組み合わせることができる）を使用した古典的なＰＣＲ増幅から、ＣＧリッチな反復配列にわたる増幅効率を著しく改善したよりダイナミックな過程へとＰＣＲ反応を転換する驚くべき発見に基づいている。
【００１８】
慣習的に使用される温度よりもはるかに高いプライマー伸長温度への遅くて、段階的な上昇が、非常にＣＧリッチな反復にわたる伸長を結果的にもたらした。しかしながら、これは、二次構造を形成する長い自己相補的でＣＧリッチな反復にわたる効率的な増幅を可能にするには十分でなかった。
【００１９】
ＤＮＡ鎖が決まった二次構造に落ち着くことを許すのではなく、むしろパルス様式で伸長温度を継続的に変えることによって移行状態を維持すれば、長いＣＧリッチな反復をわたる伸長が達成できるように考えられる。温度変化が、二次構造を連続的に変化させるので、最も堅固な二次構造であっても最終的に、そして少なくとも一時的に、開いて、ＤＮＡポリメラーゼがさらにステップを延長することを可能にするであろう。適切な実験条件では、たとえ二次構造が開かれても、新たに合成された伸長ＤＮＡ鎖は鋳型鎖に対してその位置を維持する。パルセイションはまた、至適温度にて伸長を実施する顕著により長い時間、そして完全な伸長の増加に至る可能性もＤＮＡポリメラーゼに与える。
【００２０】
Ｈｅａｔ  Ｐｕｓｈ  ＰＣＲとも呼ばれる本発明の方法を開発する本来の理由は、ＣＧリッチな反復配列の伸長によって引き起こされる遺伝病の分析のための新規な方法の必要性が発端であった。
【００２１】
ＰＣＲ増幅にとっての最大の難題の１つが、進行性ミオクローヌスてんかん１型、別名ＥＰＭ１障害の診断検査である。フィンランド人の患者で見つかった主な突然変異は、シスタチンＢ（ＣＳＴＢ）遺伝子の５’非翻訳領域内の十二塩基反復（ＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＧ）の拡大である。正常な対立遺伝子は２又は３コピーの十二塩基反復を通常含んでいるのに対して、拡大突然変異対立遺伝子では３０〜８０コピーを含むことが報告された。この拡大はプロモーター機能を害するので、ホモ接合の個体ではＣＳＴＢ発現の欠損と重度の疾病表現型を結果的にもたらす。ＥＰＭ１は劣性遺伝される；よって、罹患者は２つの拡大対立遺伝子を持つのに対して、非罹患突然変異保因者は１つの拡大対立遺伝子しか持たない。ＥＰＭ１の十二塩基反復は、対称的なものでも自己相補的なものでもなく、対称的な反復と同じように堅固な二次構造を作らないであろうことを示唆している。よって、ＥＰＭ１拡大にわたるＰＣＲ増幅における問題は、堅固な二次構造よりも、非常に高いＣＧ含有率（約１ｋｂでＣ又はＧヌクレオチドのみ）と関連する可能性がある。
【００２２】
筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）は、筋強直性ジストロフィー・プロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子のプロモーター領域におけるＣＴＧ反復拡大によって引き起こされる遺伝病である。優性遺伝性の反復拡大疾患のように、対立遺伝子の一方だけが拡大される。非罹患個体が５〜３４反復単位を保有しているのに対して、罹患患者は５０超、時には２０００を上回る反復単位を示す。ＤＭ１の先天的な形態では、均一なサイズの大きい反復拡大が通常見られる。その拡大は、サザンブロッティング・アッセイで容易に検出される。その一方で、ＤＭ１の成人型の診断は、拡大した反復の細胞間の長さの高度な可変性によって複雑になることもある。個々の長さの可変性が大きければ、単一バンドの代わりに、スメア及び／又は複数のバンドがサザンブロッティングで見られ、アッセイのＳＮ比を大幅に減少させる。
【００２３】
脆弱Ｘ症候群（ＦＲＡＸＡ）は、Ｘ染色体脆弱部位精神遅滞１（ＦＭＲ１）遺伝子の５’非翻訳領域におけるＣＧＧ反復の拡大によって引き起こされる。５０〜２００の反復長は前突然変異であるとみなされ、２００反復単位を超える長さの拡大は完全突然変異であるとみなされる。
【００２４】
予測される、わずかに拡大した対立遺伝子の次世代における更なる拡大は、反復拡大によって引き起こされる遺伝病の共通の問題である。これで、わずかに拡大した対立遺伝子を有する無症候性保因者を特定することもまた重要になる（Pearson CE, Nichol EK, Cleary JD: Repeat instability: mechanisms of dynamic mutations. Nat Rev Genet, 2005 Oct; 6(10):729-42）。
【００２５】
細胞モザイクと同様に、反復長の組織不均一性が拡大対立遺伝子の検出を著しく妨げている。サンプル中の細胞のうちの一部だけが大きな拡大を保有していることもあるので、それらの場合には、従来の方法が使用されたときに、短い野性型対立遺伝子の増幅が拡大断片が増幅されるのを完全に妨げることもある。
【００２６】
以下の理由のため、筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）が、本発明の方法の初期モデル系として選ばれた：
−  優性遺伝病であり、罹患患者が１つの非拡大対立遺伝子と１つの拡大対立遺伝子を持つ。
−  ＣＴＧ反復拡大が１０００反復単位を超える長さになることがあり、そしてサンプル中において一部が複数の可変の拡大断片を持つことがある。
−  長い反復拡大にわたる効率的な増幅のためのＰＣＲプロトコールが存在しない。
−  サザンブロッティング分析が、元のサンプルの反復拡大の長さとその可変性の直接評価を可能にした。よって、増幅効率を、拡大対立遺伝子と非拡大対立遺伝子の間で評価するだけではなく、サイズがわずかに異なる複数の拡大断片の間でも評価することができた。
【００２７】
本発明の方法の堅牢性を実証するために、別の、臨床的に非常に重要な遺伝病である脆弱Ｘ症候群が選ばれた。ＣＧＧ反復は、強固な二次が構造を形成するので、増幅するのが最も難しい断片の１つであると考えられる。
【発明の概要】
【００２８】
本発明は、ＤＮＡの構造非依存型増幅のための、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法などのプライマー伸長反応法であって、以下のステップ：サンプルＤＮＡ、プライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼなどの元の核酸鎖に相補的な核酸鎖を合成することができる１つ若しくは複数の酵素、ｄＮＴＰｓの混合物、及びバッファーを含む反応混合物を準備し、変性ステップにおいてＤＮＡを変性させ、アニーリング・ステップにおいてプライマーをアニーリングさせ、伸長ステップにおいてアニーリングしたプライマーを伸長させる、を含んでなり、ここで、上記伸長ステップにおいて、複数サイクルにわたって、最初に、温度をアニーリング温度から７０〜９０℃の範囲内のより低い第１伸長温度に上げ、その後７５〜９５℃の範囲内のより高い第２伸長温度まで変動させ、そして第１伸長温度まで戻して、伸長ができるようにＤＮＡの二次構造を不安定化させる上記方法を提供する。伸長温度におけるこの上下のパルス状の変化は、２つ以上の温度間の反復循環を使用して実施できる。１つの実施形態において、上記ステップが、増幅ＤＮＡを得るために複数サイクルにわたり反復される。本発明はまた、本発明の方法を実施するようにプログラムされたサーマルサイクラーを提供する。好ましくは、上述のサーマルサイクラーには、例えば１００以上の多量のパルスを実施するようにプログラムできる。
【００２９】
本発明は、本発明の方法を実施するように作動する、記憶されたコンピューター実行可能プログラムコードを備えたコンピューター読み取り可能データ記憶媒体をさらに提供する。
【００３０】
本発明はまた、二次構造を形成する反復配列を含むＤＮＡに関連する疾患又は障害を診断する方法も提供し、ここで、本発明のプライマー伸長法は、診断目的で上述のＤＮＡを増幅するのに使用される。本発明はまた、進行性ミオクローヌスてんかん１型（ＥＰＭ１）を診断する方法を提供し、ここで、本発明の方法をＥＰＭ１特異的にＤＮＡを増幅するのに使用して、上述のＤＮＡ内の反復単位数の分析で診断することを可能にする。
【００３１】
本発明はまた、脆弱Ｘ症候群を診断する方法を提供し、ここで、本発明の方法を脆弱Ｘ症候群に特異的なＤＮＡを増幅するのに使用して、上述のＤＮＡ内の反復単位数の分析で診断することを可能にする。
【００３２】
本発明はまた、筋強直性ジストロフィー１型を診断する方法を提供し、ここで、本発明の方法は、筋強直性ジストロフィー１型に特異的なＤＮＡを増幅するのに使用して、上述のＤＮＡ内の反復単位数の分析で診断することを可能にする。
【００３３】
本発明の方法は、反復性のＣＧリッチなセグメントの長さに関係なく断片を増幅するのに効率的な改良された増幅を示し、長くてＣＧリッチな反復配列の均衡のとれた、効果的な増幅におけるその有用性を実証した。
【００３４】
高い融解温度、及び／又は問題の多い二次構造を持つＤＮＡ配列をすぐに効率的に増幅できることが本発明の利点である。これは、以前は増幅するのが不可能であるか、又は非常に難しかった特定のＤＮＡ配列を増幅することが可能にするであろう。これは、ＰＣＲ法を利用した高性能な診断法をさらに可能にし、それによって以前は診断又は認識するのが難しかった特定の疾患及び障害を診断することもまた可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ＥＰＭ１サンプルのシングル・ヒーティング・ステップＰＣＲ分析からの結果であるアガロースゲルを示す。−＝野性型、＋＝拡大十二塩基反復。
【図２】ＤＭ１サンプルのシングル・ヒーティング・ステップＰＣＲ分析からの結果であるアガロースゲルを示す。サザンブロッティング分析で検出された（ＣＴＧ）反復単位の数がＸ軸に示されている。ひどいスメア化が見られる。
【図３】ＤＭ１サンプルからのサザンブロッティングの結果（左側）を示す。ＤＭ１の成人型を患っている（しかし先天型を患っていない）患者からの非増幅サンプルＤＮＡは、わずかに異なるＣＴＧ拡大長を有する複数の断片を含んでいた。これらの断片はヒート‐プッシュ法を使用して増幅され、アガロースゲル（右側）上に非常に類似した特性を結果的にもたらした。ＷＴ＝野性型、Ｃ＝先天型ＤＭ１、Ａ＝成人型ＤＭ１。スメア化はごくわずかである。
【図４】シングル・ヒーティング・ステップＰＣＲ法と本発明の方法の同時比較からの結果であるアガロースゲルを示す。ＤＭ１サンプルの分析。〜ｎは（ＣＴＧ）反復単位の数を指す、Ｃ＝先天型ＤＭ１、Ａ＝成人型ＤＭ１。それぞれの異なるサンプルについて、最初の列がシングル・ヒーティング・ステップ（ＳＨ）の結果に相当し、２番目の列がヒート‐プッシュ（ＨＰ）の結果に相当する。スメア化は、ヒート‐プッシュＰＣＲ法で増幅したサンプルではごくわずかである。
【図５】ＤＭ１ヒート‐プッシュ法を使用して増幅したＤＮＡサンプルからの結果であるアガロースゲルを示す。Ｘ軸上の枠で囲んだ数字は、サザンブロッティングによって検出された反復サイズを使用して計算したＰＣＲ産物の予想サイズを示す。
【図６】希釈系列実験からの結果であるアガロースゲルを示す。大きなＤＭ１  ＣＴＧ反復拡大を持つＤＮＡサンプルの希釈物は、ＤＭ１ヒート‐プッシュ法を使用して増幅された。過剰の鋳型ＤＮＡは、拡大対立遺伝子が増幅するのを妨げる。
【図７】様々な脆弱Ｘ（ＣＧＧ）反復単位数を有する男性からのサンプルＤＮＡのヒート‐プッシュ（ＨＰ）増幅からの結果であるアガロースゲルを示す。Ａｑ＝ブランク、−＝野性型、＋＝拡大（ＣＧＧ）反復。
【図８】男性（拡大した反復）及び女性（複数の拡大した反復と１つの拡大していない反復）からの脆弱Ｘ（ＣＧＧ）サンプルＤＮＡのヒート‐プッシュ（ＨＰ）増幅からの結果であるアガロースゲルを示す。
【図９】本発明のヒート‐プッシュ法の例である概略図を示す。最初の変性と最後の伸長ステップは示されていない。最初に、変性ステップにおいて、温度を変性温度まで、例えば、最初に４５秒間で約９５℃まで、その後、１０秒間で約９８℃までといったように上げる。そして、アニーリング・ステップで、温度を４５秒間で約６８℃まで下げる。その後に、本発明の独特の伸長ステップを始める。伸長温度は、複数回にわたって、第１伸長温度（ここでは約７８℃）と第２の伸長温度（ここでは約８３℃）の間で変動させる。全サイクルが数回繰り返される。
【図１０】本発明のシングル・ヒーティング・ステップＰＣＲ法の例である概略図を示す。最初の変性と最後の伸長ステップは示されていない。最初に、変性ステップにおいて、温度を変性温度まで、例えば４５秒間で約９６℃までといったように上げる。そして、アニーリング・ステップで、温度を４５秒間で約６９℃まで下げる。その後に、本発明の独特の伸長ステップを始める。伸長温度を、最初と最後の伸長温度（ここでは約７９℃）まで非常にゆっくりと上げる。全サイクルが数回繰り返される。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
定義
用語「ＣＧリッチな反復」は、そのうちの６０％超がＣ又はＧのいずれかである短い反復単位（一般的に＜２０ヌクレオチドの長さ）を含んでなるゲノムのセグメントを指す。この反復単位は、連続して３回超、しばしば何十回又は何百回も一般的に複製される。
用語「拡大した反復」は、反復単位が連続して３回超、しばしば何十回又は数百回も複製されることを意味する。罹患者における反復数は、一般集団に見られるよりも高い。それは、前突然変異又は完全変異であることができる。
【００３７】
用語「ヒート‐プッシュ（Heat-Push）」は、第１伸長温度と第２伸長温度の間で温度を複数回変動させることを意味する。加熱速度と冷却速度は異なっていてもよく、そして、第１伸長温度と第２伸長温度の間には追加の温度転換点があってもよい。第１伸長温度と第２伸長温度の間のこの温度変動は、ＰＣＲサイクル中に複数回、一般的に３回超、例えば２０〜４０回、最高で数百回、繰り返される。標的と実験条件によって、当業者は、より遅い加熱速度のより少ないパルス数か、又はより多数のより速いパルスの使用を最適化しなければならない。
【００３８】
用語「温度」は、サーモサイクラー・ソフトウェアにプログラムされた温度の値を指す。サーモサイクラーは、ブロックと容器内の液体との間に温度勾配を形成することによって温度を変える。それは器具と予測されるランプ速度に依存する。プログラムされた反応容量値はまた、これらの熱勾配の形成に影響する。より小さく反応容量をプログラムすることによって、この特徴を減少させることがある程度可能である。
【００３９】
ＣＧリッチな反復拡大の二次構造
一般的に、ＣＧリッチな反復を持つ一本鎖ＤＮＡ鋳型の二次構造がＤＮＡポリメラーゼを止め、プライマー伸長反応が鋳型鎖の末端に達するのを妨げることが想定される。ＤＮＡポリメラーゼは、堅固な二次構造によって止められる前に、このＣＧリッチな反復領域の一部しか伸長することができない。従来のＰＣＲ反応の次のサイクルの変性ステップにて、部分的に伸長した鎖と鋳型鎖が分離する。次のアニーリング・ステップ中に、この部分的に伸長した鎖は、一本鎖の鋳型ＤＮＡに再アニールする。しかしながら、これには２つの重大な問題がある。伸長が反復領域に達した場合に、特にその反復領域が数百塩基の長さであれば、３’末端の再アニーリングがその反復領域内のどこでも起こり得る。鋳型鎖に沿ったこのシフティングは、新しく合成された鎖の長さにおける可変性を結果的にもたらす。反復長の可変性を有する鎖がその後のＰＣＲサイクルの鋳型としての役割を果たすので、可変性は、次のＰＣＲサイクルのあいだ、一層強くなる。その増幅産物がゲル電気泳動で分析され、そして本来の反復長の正確な推定が非常に難しいときに、スメア化とスタッタリング（stuttering）が見られる。
【００４０】
短い拡大は長いものに比べてより高い効率で増幅される
１回の完全な伸長に達する前に複数回のＰＣＲサイクルが必要であるなら、別の問題が低い増幅効率と関連する。拡大対立遺伝子が単独で存在していれば、非常に低い効率であってもＣＧリッチな反復拡大のＰＣＲ産物が形成されることがある。より短い鋳型ＤＮＡも持っている異型接合サンプル又はモザイク・サンプルでは、類似したサイズの拡大は増幅されない。この理由は、非常に短い反復領域を持つ対立遺伝子が顕著に高い増幅効率で増幅され、そして短い対立遺伝子が増幅反応を独占するからである。拡大対立遺伝子は、非常に不十分にしか増幅されない。低い増幅効率のために、当業者は、拡大対立遺伝子からのＰＣＲ産物の検出にサザンブロッティングを使用している（Gennarelli, M., Pavoni, M., Amicucci, P., Novelli, G. & Dallapiccola, B. 1998,「A single polymerase chain reaction-based protocol for detecting normal and expanded alleles in myotonic dystrophy」, Diagnostic molecular pathology: the American journal of surgical pathology, part B, vol. 7, no. 3, pp. 135-137, Brugnoni R, Morandi L, Briscioli V, Cornelio F, Mantegazza R; A new non-radioactive method for the screening and prenatal diagnosis of myotonic dystrophy patients. J Neurol (1998) 245: 289-93）。
【００４１】
１回の加熱ステップＰＣＲによるＣＧリッチ配列にわたる増幅
Ｃ及びＧヌクレオチドの高い含有率は、二本鎖ＤＮＡの融解温度を上げる。高いＣＧ含有率は、その初期の頃からＰＣＲ増幅の一般的、且つ、周知の問題である。言うまでもなく、単により高い伸長温度を単独で使用するのはうまくいっていない；今日では、ＣＧリッチな配列にわたる別の方法での増幅が簡単な日常業務になっている。
【００４２】
１回の加熱ステップＰＣＲ法を含む本発明の１つの実施形態において、プライマー伸長温度を、従来のＰＣＲ法で使用されたものより高い最終温度である８０℃まで、非常にゆっくりと連続的に上げる。この段階的な加熱の結果として、ＤＮＡポリメラーゼが１００％のＣＧ含有率を有する約１０００塩基の拡大ＥＰＭ１十二塩基反復をにわたって伸長することができ、そしてＰＣＲ産物はエチジウムブロマイド染色されたアガロースゲル電気泳動法により検出される（図１）。増幅効率がとても高かったので、短い非拡大対立遺伝子の存在下でも拡大対立遺伝子が増幅された。十二塩基反復は自己相補性でないので、ＥＰＭ１反復のＰＣＲ増幅に関連する難しさは、堅固な二次構造によって引き起こされるのではなく、ただ単に高いＣＧ含有率によって引き起こされるものである。同等の条件下での拡大ＤＭ１反復にわたる増幅は、アガロースゲル上の激しいスメア化を結果的にもたらす（図２）。
【００４３】
ヒート・プッシュＰＣＲによって改善された増幅効率
本発明のヒート・プッシュ法は、二次構造を形成する短いＣＧリッチな反復にわたる増幅効率と長いＣＧリッチな反復にわたる増幅効率とのあいだの相違を顕著に改善する。
【００４４】
従来の定温伸長又はシングル・ヒーティング・ステップＰＣＲと異なり、ヒート・プッシュＰＣＲのサーマル・パルセイションは、新たに合成された部分的に伸長した鎖に連続的にわずかに鋳型と分離させ、そして再アニールさせるが、常に十分な結合が鋳型と合成された鎖の間に残っており、鎖が滑ること（slipping）及びその位置を離れること（losing）を防ぐようなやり方による。低い温度相と高い温度相の間のパルシング中、ＤＮＡポリメラーゼは、次の二次構造によって再び止まるまで、次の利用可能な遊離一本鎖セグメントにわたって伸長することができる。再びゆっくりと温度を上げることで、このストッパー構造が融解し、そして伸長がしばらく続くこともある。これが、単一のプライマー伸長ステップ中に複数回繰り返され、そしてその結果、これらの伸長物の大部分が段階的に完全な伸長の長さに達する。新たに合成された鎖が鋳型鎖に対してその位置を離れないときに、鋳型鎖の完全、且つ、正確なコピーが作られるので、伸長中に鎖が離れ過ぎないことが最も重要である。これは、高い増幅効率を結果的にもたらし、且つ、長いＣＧリッチな反復と短いＣＧリッチな反復の両方の効果的な同時増幅を可能にするらしい。
【００４５】
何年もの試験にもかかわらず、古典的なＰＣＲ法はいずれも堅固な二次構造を形成するＣＧリッチな反復にわたって効率的な増幅ができなかった。しかしながら、これらの古典的手法は、一定温度でのインキュベーションが実質的に全くなく、伸長温度がより低い伸長温度とより高い伸長温度の間（例えば７６℃と８３℃の間）で変動する本発明と大幅に異なっている。この短時間のサイクルが、１回の「伸長ステップ」中に＞２０回（これまでのところ、使用したサーモサイクラー・モデルのメモリーによって制限される）繰り返されることが好ましい。その都度、（第２伸長温度に達するのに必要な時間が延びる）加熱速度と伸長パルス数の間の適性なバランスを見つけなければならない。両方の要因が全体的なアッセイ時間に影響する。
【００４６】
以前の研究は、高い及び低いＣＧ含有率を有する領域の長距離増幅のために異なる伸長温度を使用しようと試みた。ＵＳ  ６  ３５５  ４２２（Liu, Q. & Sommer, S.S. 1998,「Subcycling-PCR for multiplex long-distance amplification of regions with high and low GC content: application to the inversion hotspot in the factor VIII gene」, BioTechniques, vol. 25, no, 6, pp. 1022-1028）に記載のサブサイクリング法では、２つの異なる伸長温度（６０℃と６５℃、それぞれ２分間）が使用された。それは、Ｘ染色体第ＶＩＩ因子遺伝子の第２２イントロンの逆位複製のＣＧリッチ及びＡＴリッチなセグメントにわたる伸長を可能にした。このゲノム構造は、堅固な二次構造を形成する自己相補的なＣＧリッチな反復ではない。
【００４７】
既存の方法との比較は、従来のＰＣＲを使用した長いＣＧリッチな反復の効率的な増幅に関する刊行物がほぼ完全にないことによって妨げられている。この理由は、現在のＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性では堅固な二次構造を形成するＣＧリッチな反復構造にわたる増幅ができないことにあるかもしれない。
【００４８】
よって、本発明の方法は、ＤＮＡの増幅のための改良された構造非依存性を有するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法などのプライマー伸長反応法を提供する。その方法は、非常に高ＧＣ含有率を有するか、及び／又はＤＮＡ二次構造の形成を引き起こす配列又はセグメントを含むＤＮＡの増幅を特に可能にする。そのような構造の制限されることのない例としては、ＣＧ、ＣＴＧ、及びＧＣＣリッチな反復が挙げられる。
【００４９】
複数回の増幅サイクルが存在するＰＣＲ法をおもに参照しながら、本明細書において本発明を説明している。しかしながら、１又は複数回のそのようなサイクルを持っているそうしたすべての方法が本発明の範囲内にある。ＰＣＲ法以外にも、１つの実施形態において、本発明は、本発明のプライマー伸長反応を使用したＤＮＡの配列決定方法を提供する。他の実施形態において、本発明は、本発明のプライマー伸長反応を使用することによる、ハイブリダイゼーション・アッセイのための標識ＤＮＡ断片の調製方法を提供する。
【００５０】
本発明の方法において、少なくともサンプルＤＮＡ、プライマー、元の核酸鎖に相補的な核酸鎖を合成できる１以上の酵素、例えば熱安定性ＤＮＡポリメラーゼなど、ｄＮＴＰｓの混合物、バッファー、及び場合により共溶媒等を一般的に含む、従来のプライマー伸長反応混合物を利用してもよい。こういった反応混合物の調製は、当業者にとって周知である。
【００５１】
本発明の方法は、変性ステップにおいてＤＮＡを変性させ、アニーリング・ステップにおいてプライマーをアニーリングさせ、伸長ステップにおいてアニーリングしたプライマーを伸長し、そしてＰＣＲの場合には、複数回のサイクルにわたってそのステップを繰り返して、増幅されたＤＮＡを得ることを含んでなる。また、これらのステップは、従来のＰＣＲ法の大部分に含まれていて、当業者に知られている。
【００５２】
本発明の方法の特徴は、何サイクルにもわたって、伸長ステップにおいて、まずアニーリング温度から段階的に最も低い第１伸長温度まで温度を上げた後、次に、それを第２又はそれ以降のより高い伸長温度まで徐々に変動させ、そして最も低い第１伸長温度まで戻して、伸長が可能になるようにＤＮＡの二次構造を不安定化させることである。実際には、伸長の間において一定温度でのインキュベーションは実質的に存在することはない。伸長温度のこの変動は、２以上の温度及び加熱若しくは冷却速度を使用して行うことができる。別々のアニーリング・ステップもまた除かれる。
【００５３】
最も低い伸長温度と最も高い伸長温度の違いは、伸長している新しいＤＮＡ鎖のアニーリングを維持し、且つ、温度が上下に変動する際に、鋳型ＤＮＡが堅固に固定された二次構造に落ち着くのを防ぐのに十分であるべきである。これはまた、変動速度にも依存することもある。通常、第１の最も低い伸長温度は７０〜９０℃の範囲内にあってもよい。１つの実施形態において、最も低い伸長温度は７０〜７８℃の範囲内にある。他の実施形態において、最も低い伸長温度は７６〜７８℃の範囲内にある。（第１の伸長温度より高い）第２の最も高い伸長温度は７５〜９５℃の範囲内にあってもよい。１つの実施形態において、最も高い伸長温度は８０〜８３℃の範囲内にある。一般的に、第１の伸長温度と第２の伸長温度の違いは、１〜２０℃、好ましくは３〜１０℃の範囲内にある。また、上述の最も低い温度と最も高い温度の間で使用される他の低い温度及び高い温度が存在してもよい。
【００５４】
最も低い伸長温度と最も高い伸長温度の間の変動サイクルは、それぞれの伸長ステップで３回よりも多く繰り返される。最適の加熱速度と伸長パルス数の間のバランスは、実験条件に依存する。一般的に、２０〜４０サイクルが使用されているが、何百サイクルが可能であっても、ＰＣＲデバイスの能力に依存する。
【００５５】
１つの実施形態において、伸長ステップの加熱及び冷却速度は、０．０１〜１０℃／ｓの範囲内にあり、好ましくは０．０１〜１℃／ｓの範囲内、例えば約０．１℃／ｓなどである。１つの実施形態において、そういった制御された加熱速度は、温度の上昇と冷却ができるだけ速く行われるときに使用される。
【００５６】
１つの実施形態において、反応混合物には、共溶媒、例えばＤＭＳＯ、グリセロール又はベタインなどが含まれている。ベタインなどの共溶媒を加えることによって、より低い伸長温度を使用することもできる。通常、約１．８ｍｏｌ／ｌのベタインが実験で使用されたが、その量は、例えば０〜３ｍｏｌ／ｌ、通常１〜２ｍｏｌ／ｌの範囲内であってもよい。
【００５７】
本発明はまた、本発明の方法を実施するようにプログラムされたサーマルサイクラーを提供する。そのサーマルサイクラーは、当該技術分野で知られているようなＰＣＲデバイスの必須要素、例えば、温度レベル、変化ランプの温度速度、及び特定の温度レベルでのインキュベーションのタイミングを制御するための適切な制御信号を発生するコンピューター手段など、を含むいずれの好適なサーマルサイクラーであってもよい。そのコンピューター手段は、上記サイクラー内に組み込まれていてもよい。
【００５８】
本発明は、本発明の方法を実施するように作動する、記憶されたコンピューター実行可能プログラムコードを備えたコンピューター読み取り可能データ記憶媒体をさらに提供する。そのようなデータ記憶媒体は、ＰＣＲ法でサイクラーを運転するためにサーマルサイクラーのコンピューター手段にプログラムを提供するのに使用されてもよい。
【００５９】
全体として、本発明は、二次構造を形成する拡大したＣＧリッチな反復配列を含むＤＮＡに関連する疾患又は障害の診断方法であって、ここで、本発明のＰＣＲ法が診断目的のために上述のＤＮＡを増幅するのに使用される上記方法を提供する。１つの実施形態において、診断方法は電気泳動断片分析である。また、診断をするための他の方法、又はＤＮＡ増幅を伴う他の非診断方法、例えば、配列決定法、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）又は同様のものなど、が使用されてもよい。１つの実施形態において、上記ＰＣＲは、鋳型として相補ＤＮＡを使用する。当業者は、これらの方法を知っているので、本発明の方法をそれらに適用することができる。
【００６０】
１つの実施形態において、本発明はまた、進行性ミオクローヌスてんかん１型（ＥＰＭ１）の診断方法も提供する。１つの実施形態において、本発明のＰＣＲ法は、ＥＰＭ１特異的ＤＮＡを増幅するのに使用されて、診断をするための上述のＤＮＡ内の反復単位数の分析を可能にする。
【００６１】
他の実施形態において、本発明はまた、脆弱Ｘ症候群の診断方法も提供する。１つの実施形態において、本発明のＰＣＲ法が、脆弱Ｘ症候群特異的ＤＮＡを増幅するのに使用されて、診断をするための上述のＤＮＡ内の反復単位数の分析を可能にする。
【００６２】
さらに他の実施形態において、本発明はまた、筋強直性ジストロフィーの診断方法も提供する。１つの実施形態において、本発明のＰＣＲ法は、筋強直性ジストロフィー特異的ＤＮＡを増幅するのに使用されて、診断をするための上述のＤＮＡ内の反復単位数の分析を可能にする。
【実施例】
【００６３】
ＰＣＲの設計
本発明において使用されるプライマーを実際の反復と近接させすぎて配置しないことが重要である。できれば、プライマーは、増幅効率のバランスをとるために、いくつかのＣＧリッチな範囲もまた短い野性型対立遺伝子内に含まれるように配置されるべきである。プライマーは、通常より長く、且つ、比較的ＣＧリッチなセグメント内に配置され、それにより、ＤＮＡポリメラーゼがすぐにプライマー伸長を開始するようにプライマーが比較的高い温度にてアニールする条件がもたらされる。１つの実施形態において、ＰＣＲ添加物であるベタインが、そのＰＣＲには含められる。
【００６４】
一回の加熱ステップＰＣＲプログラム
比較的短いＣＧリッチな反復（＜１ｋｂ）が、１回の、非常にゆっくりとした加熱‐伸長ステップを用いて増幅できることがわかった。伸長温度は、アニーリング温度から８０℃まで徐々に、そして非常にゆっくりと上げるように設定された。
【００６５】
１．８Ｍのベタインの存在下、短い野性型と８０の十二塩基反復を持つ拡大ＥＰＭ１対立遺伝子との両方の完全伸長が、１回のゆっくりとした段階的な加熱ステップ中に達成できた。こうした高いベタイン濃度では、伸長中の熱による推進が、明らかに従来のＰＣＲ増幅を妨げていた拡大対立遺伝子の全ての二次構造を開くことができた（図１）。
同様のＰＣＲ条件が長いＤＭ１反復の増幅に使用された場合、スタッタリングとポリメラーゼ・スリッピングが観察され、それにより、アガロースゲル上の増幅産物のスメア化がもたらされた。長いＤＭ１拡大は増幅できなかった（図２）。
【００６６】
本発明のヒート・プッシュＰＣＲプログラム
全ての伸長ステップの間、伸長温度を一定に維持する従来のＰＣＲ法と異なり、本発明のヒート‐プッシュＰＣＲ法では、伸長温度が連続的に変動する。１つの限定されない実験（図９を参照のこと）では、プログラムされた変性ステップは、最初に９５℃にて４５秒間、次に９８℃にて１０秒間であった。アニーリング・ステップは６８℃にて３０秒間であり、次に７８℃まで加熱することによって伸長が開始し、その後に複数回の段階的な加熱及び冷却ステップが続いた。ヒート‐プッシュ・パルスは、７８℃から８３℃までのゆっくりとした上昇（約０．１℃／ｓ．）とその後の７８℃への素早い戻しを含んでなった。これらのヒーティング・パルスを、１ＰＣＲサイクル中に２１回繰り返した。ヒート‐プッシュ・パルス数は、１サイクルにつきプログラムできるプログラム・ステップ数を制限しているサーモサイクラー（GeneAmp PCR System 9700、Applied Biosystems）のメモリによって制限された。
【００６７】
伸長温度を連続的にパルス状に変化させることによるＤＮＡ二次構造の不安定化が、長いＣＧリッチな反復にわたる伸長を可能にした。どうやら、周期的なより低い温度では鋳型と伸長断片の十分なアニーリングが保たれたのに対して、ヒーティング・パルスは鋳型鎖の二次構造を不安定化させ、無視できるほどわずかなスタッタリングに伴う伸長を可能にした。１回のＰＣＲ伸長ステップ中の２０回を超えるこの変動する伸長を繰り返すことで、１つの短い野性型対立遺伝子と約１４００のＣＴＧ反復を含む１つの拡大対立遺伝子を含むサンプルにおいて、両方の対立遺伝子がほぼ同等の増幅効率で増幅されるような高い伸長効率が結果的にもたらされた。サザンブロッティングの結果に示されるように、非増幅サンプルＤＮＡにはわずかに異なるＣＴＧ拡大長を有する複数の断片が含まれており、本発明の方法を使用するとき、これらの断片が非常に類似した特性で増幅された（図３）。
【００６８】
（できる限り最適化した）シングル・ヒーティング・ステップＰＣＲ法とヒート‐プッシュ法の間の増幅効率の違いを図４に示す。小さい、中程度又は大きいＤＭ１  ＣＴＧ拡大を含むサンプル（４０ｎｇ）を分析した。シングル・ヒーティング・ステップＰＣＲの増幅産物は小さい拡大と非常に類似した産物を示した。野性型対立遺伝子の選択的増幅と考えられる増幅効率の損失、及びくっきりしたバンドのスメア化及び欠落は、中程度のサイズの拡大を含むサンプルを分析したときに見られる。鋳型量がより多ければ（図６）又は拡大がより長ければ、スメア化は重大な問題になる。反復にわたるＰＣＲが失敗していたので、大きい先天的なＤＭ１を含むサンプルは誤診される。その一方、本発明のヒート‐プッシュ法は、短い拡大と長い拡大にわたる増幅において顕著に改善されたバランスを示した。中程度のサイズの成人ＤＭ１からの増幅産物は、組織不均一性を示すが、明確なバンドが見られる。図３及び４で見られるように、検証した先天的ＤＭ１サンプルから単一の約５ｋｂのＰＣＲ産物を得る。
【００６９】
ＤＭ１反復拡大の長さについて以前に分析したＤＮＡサンプルを、本発明のＰＣＲ法によって分析した。ヒート‐プッシュＰＣＲ法の予測サイズを計算し、そして各産物の下の枠内に示した（図５）。アッセイの検証段階では、７８個のサンプルを分析し、そして正しく遺伝子型を同定した。
拡大対立遺伝子の増幅の成功は、鋳型ＤＮＡの質と量に依存している。多量すぎる鋳型ＤＮＡを使用すると、拡大対立遺伝子はわずかしか増幅されない（図６）。
【００７０】
本発明の方法はまた、ＰＣＲが増幅するのに最も難しい反復構造の１つと考えられる脆弱ＸのＣＣＧ拡大の分析にも使用できた（図７）。
脆弱Ｘのサンプルには、断片サイズにより大きな可変性があり、そして、ＣＣＧ反復は二次構造を非常に形成しやすく、それが非常に高い融解温度を持っている。サイズが約３ｋｂまでの明確なバンドを１つのＸ染色体しか持たない男性からのサンプルから得、そして女性からのサンプル中の１つの非拡大反復の存在は、拡大断片が増幅されるのを妨げなかった（図８）。
【００７１】
モザイク性、拡大長さの不均一性、及び短い野性型対立遺伝子の存在は、ＤＭ１及び脆弱Ｘサンプルの両方で全て見られる。ヒート‐プッシュＰＣＲの使用が、短い反復と長い反復の間の増幅のバランスを顕著に改善した。
【図１】
0005763526.tif 000002
【図２】
0005763526.tif 000003
【図３】
0005763526.tif 000004
【図４】
0005763526.tif 000005
【図５】
0005763526.tif 000006
【図６】
0005763526.tif 000007
【図７】
0005763526.tif 000008
【図８】
0005763526.tif 000009
【図９】
0005763526.tif 000010
【図１０】
0005763526.tif 000011