(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
超強磁場を形成する超伝導マグネットと、この超伝導マグネットが形成する超強磁場内に設置される結晶生成容器とを有し、超強磁場内の磁気無重力環境下で結晶を成長させる結晶生成装置において、前記結晶生成容器内における結晶生成の過程をその場観察するための強磁場中顕微鏡観察装置であって、
前記超強磁場に設置され軸方向の移動操作及び軸回りの回転操作が可能となされた中空軸と、
前記中空軸内に設置されたＣＣＤイメージセンサ、傾斜鏡、対物レンズ及び結像レンズとを備え、
前記中空軸が前記結晶生成容器の中央部に設けられた透孔内に挿通され、前記ＣＣＤイメージセンサは、前記中空軸の側面に開設された観察窓を通じて、傾斜鏡、対物レンズ及び結像レンズを介して、前記中空軸の周囲の前記結晶生成容器内を観察した画像の画像信号を出力する
ことを特徴とする強磁場中顕微鏡観察装置。
【請求項２】
前記対物レンズのみを光軸方向に移動させることによる撮像位置の焦点調整が可能である
ことを特徴とする請求項１記載の強磁場中顕微鏡観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、超強磁場内の磁気無重力環境下で結晶生成を行う結晶生成装置において使用される強磁場中顕微鏡観察装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
生命現象は、生体を構成し生体内で作用する各種タンパク質の機能と深く関わっている。それぞれのタンパク質の機能はその立体構造にも大きく依存しており、それを知ることは、生命現象の解明のみならず、人体の仕組みを明らかにしたり、病気に対する的確な治療薬を開発する、といった成果につながると期待され、ポストゲノムとして世界中で戦略的に取り組まれている。その場合、対象とするタンパク質の立体構造を１オングストローム台の分解能で精密に（超高分解能で）決定することが可能になれば、その有用度は飛躍的に向上する。
【０００３】
例えば、創薬分野においては、疾患関連タンパク質の立体構造を高精度に決定することによりはじめて立体構造に基づくドラッグデザイン(Structure-based drug design: SBDD)が可能となり、創薬プロセスの大幅な迅速化が期待される。また、有用タンパク質の立体構造に基づいて酵素機能の改変(安定性、反応特異性、反応速度の向上等)を行うことにより、高機能なタンパク質の創製が可能になれば、低コストで、環境に対して低負荷で、高効率、省スペースの工業プロセスを構築することが可能となる。
【０００４】
このようなタンパク質の立体構造解析を行うために現在最も一般的に用いられているのはＸ線回折法である。Ｘ線構造解析ではタンパク質分子を結晶化させることで整列させ、それに対してＸ線を照射しタンパク質結晶からの回折パターンを観測して分子構造を決定する。このとき良好な解析結果を得るためには結晶の大きさが重要であり、現在の技術では結晶の大きさが0.1mm程度は必要であるとされている。
【０００５】
しかし、多くの重要タンパク質の結晶化は非常に困難であり、たとえ結晶が得られても品質が悪く、構造解析が可能な分解能のＸ線回折データが取得できない場合が多い。すなわち、結晶化の段階がタンパク質のＸ線結晶構造解析のボトルネックになっている。
【０００６】
これを解決する一手段として、宇宙の微小重力環境を利用した結晶化が行われ、高分解能のＸ線回折像を与える（高品位の）タンパク質結晶生成に有効であることが示されてきた。しかし、宇宙実験は実験機会が限られており、多種多様なタンパク質の構造解析への網羅的な適用は難しい。また、実験衛星では、軌道修正時に無重力状態が崩れるため、必ずしも理想的な無重力とはいえない。
【０００７】
近年、図７に示すように、地上において超伝導マグネットを利用した磁気力浮揚により擬似的な微小重力環境を創り出し、その中でタンパク質結晶を生成するアプローチが注目されている。磁気力浮揚を利用した結晶化はわが国を中心に研究され、タンパク質結晶の品位を向上させることも実証されてきた。
【０００８】
また、均一磁気力場発生用超伝導マグネットとして、９２０ＭＨｚＮＭＲマグネットをはじめとする種々の強磁場超伝導マグネットの開発が行われている。
【０００９】
磁気力浮揚による擬似的な微小重力環境中に結晶化プレートを設置し、この結晶化プレートにおいてタンパク質の結晶化を行えば、品質の良い、構造解析が可能な分解能のＸ線回折データが取得できる結晶が得られるはずである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】J.S.Brooks, et al., J. Appl. Phys. 87 (2000) 6194-6199)
【非特許文献２】尾崎修、森田裕、藤平潤一、小柳圭、松本真二、木吉司、和田仁、「均一磁気力場発生用ＮｂＴｉ超伝導マグネットの開発」：低温工学３６（2002）271．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ところで、磁気力浮揚による擬似的な微小重力環境において、タンパク質結晶を効率よく生成し、また、これを観察する手法が十分に確率されていない。
【００１２】
すなわち、超伝導マグネット内部での結晶成長を確認するために、結晶化プレートを外部に取り出すと、その時点で無重力環境が崩れるので、たとえ観察後にプレートを再び超伝導マグネット内部に戻したとしても、無重力環境で結晶成長させたことにならない。
【００１３】
したがって、実験では、結晶成長時間のバラツキのうちその最大値を目安に超伝導マグネット内部へ滞在させなければならない。
【００１４】
しかし、これは未知のタンパク質開発という目的と本質的に矛盾している。未知のタンパク質では結晶成長時間は不明であるから、明確な根拠のないまま、ほとんどの結晶について意味もなく、徒に長時間を結晶成長のために当てなければならない。
【００１５】
そこで、本発明者らは、超強磁場内の観察装置について開発経験があることを踏まえ、超伝導マグネットが発生する磁気力場中での結晶成長のその場観察を可能とし、個別のタンパク、個別の成長条件において常に最短の時間で実験を終了することができようにして、効率的に高品位結晶を生成することができる結晶生成装置において使用される強磁場中顕微鏡観察装置を提供しようとする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明に係る強磁場中顕微鏡観察装置は、上述の課題を解決するため、以下の構成のいずれか一を有するものである。
【００１７】
〔構成１〕
超強磁場を形成する超伝導マグネットと超伝導マグネットが形成する超強磁場内に設置される結晶生成容器とを有し超強磁場内の磁気無重力環境下で結晶を成長させる結晶生成装置において結晶生成容器内における結晶生成の過程をその場観察するための強磁場中顕微鏡観察装置であって、超強磁場に設置され軸方向の移動操作及び軸回りの回転操作が可能となされた中空軸と、中空軸内に設置されたＣＣＤイメージセンサ、傾斜鏡、対物レンズ及び結像レンズとを備え、中空軸が結晶生成容器の中央部に設けられた透孔内に挿通され、ＣＣＤイメージセンサは、中空軸の側面に開設された観察窓を通じて、傾斜鏡、対物レンズ及び結像レンズを介して、中空軸の周囲の結晶生成容器内を観察した画像の画像信号を出力することを特徴とするものである。
【００１８】
〔構成２〕
構成１を有する強磁場中顕微鏡観察装置において、対物レンズのみを光軸方向に移動させることによる撮像位置の焦点調整が可能であることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係る強磁場中顕微鏡観察装置においては、観察機構により結晶生成の過程をその場観察することにより結晶が成長したことを知り、その時点で結晶生成容器を取り出すことにより、作業時間を短縮することができる。
【００２０】
すなわち、この強磁場中顕微鏡観察装置によれば、狭い空間に配置された物体を拡大撮像できる。
【００２１】
この強磁場中顕微鏡観察装置によれば、狭い空間に配置された物体を側方から観察できる。
【００２２】
この強磁場中顕微鏡観察装置によれば、狭い空間に配置された物体を観察するにあたり焦点面を動かすことなく光軸方向の位置決めが可能である。
【００２３】
この強磁場中顕微鏡観察装置によれば、狭い空間に配置された物体を円周方向に回転位置決めして観察できる。
【００２４】
この強磁場中顕微鏡観察装置によれば、狭い空間に配置された物体を観察するにあたり観察位置に影響を及ばさないで焦点調節できる。
【００２５】
この強磁場中顕微鏡観察装置によれば、超強磁場下でも磁場を乱すことなく観察できる。
【００２６】
この強磁場中顕微鏡観察装置によれば、温度制御用空気の流路を確保することができる。
【００２７】
すなわち、本発明によれば、結晶成長をその場観察可能であるから、個別のタンパク、個別の成長条件において常に最短の時間で実験を終了することができ、極めて効率的である。
【００２８】
また、結晶生成容器は複数の個室を有し、これら個室ごとに結晶生成条件を変えられ、また、温度を安定化し、任意の温度で結晶生成を行うことができる。
【００２９】
すなわち、本発明は、超伝導マグネットが発生する磁気力場中で高品位結晶を効率よく生成するための結晶生成装置を提供し、また、生成したタンパク質結晶の効率的な評価を行うことができる結晶生成装置において使用される強磁場中顕微鏡観察装置を提供することができるものである。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明に係る強磁場中顕微鏡観察装置が使用される結晶生成装置の構成を示す模式図である。
【図２】均一磁気力発生用超伝導マグネットのコイル配置を示す模式図である。
【図３】本発明に係る強磁場中顕微鏡観察装置が使用される結晶生成装置の構成を示す分解斜視図である。
【図４】本発明に係る強磁場中顕微鏡観察装置が使用される結晶生成装置の構成を示す縦断面図である。
【図５】本発明に係る強磁場中顕微鏡観察装置が使用される結晶生成装置の要部の構成を示す縦断面図である。
【図６】本発明に係る強磁場中顕微鏡観察装置が使用される結晶生成装置の観察機構の構成を示す斜視図である。
【図７】超伝導マグネットを利用した磁気力浮揚により擬似的な微小重力環境を創り出す装置の構成を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照しながら説明する。
【００３２】
本発明に係る強磁場中顕微鏡観察装置が使用される結晶生成装置は、高品位タンパク質結晶を高効率で生成する装置であり、プロテオーム研究やドラッグデザイン等に必要不可欠な様々なタンパク質の立体構造と機能を、迅速、かつ、精密（高分解能）に解明することを可能とする。特に、解析困難とされてきたGPCRをはじめとする生活習慣病やガンなどの疾患に関連するタンパク質の精密構造解析に有効であり、医薬品設計に大きく貢献することが期待できる。また、食品・環境分野で有用酵素の機能向上への貢献も期待される。
【００３３】
本発明に係る結晶生成装置は、「タンパク質結晶を高品位化」し、さらに、「タンパク質結晶の生成過程を可視化」することができる装置である。
【００３４】
図１は、本発明に係る強磁場中顕微鏡観察装置が使用される結晶生成装置の構成を示す模式図である。
【００３５】
本発明に係る強磁場中顕微鏡観察装置が使用される結晶生成装置は、図１に示すように、「タンパク質結晶の高品位化」のために、均一磁気力場発生用の円環状の超伝導マグネット１を備えている。この超伝導マグネット１の均一磁力空間は、直径が４０ｍｍ、高さが１５ｍｍ程度であり、空間内の磁場不均一性は±５％以下である。この超伝導マグネット１が生成する均一磁気力空間においては、純水に対して１００％の重力キャンセル（１４００Ｔ２／ｍ程度）が可能である。
【００３６】
また、この結晶生成装置は、「タンパク質結晶生成過程の可視化」のために、観察機構（結晶化過程観察機構）２及び結晶生成容器（結晶化用セル）３を備えている。結晶生成容器３内には、多検体用結晶化プレートが設置されている。観察機構２は、超伝導マグネット１による磁気力場中において、結晶生成過程のｉｎ−ｓｉｔｕ観察が可能な自動結晶観察機構である。この観察機構２は、使用温度範囲が４°Ｃ〜３０°Ｃ程度（精度±０．５°Ｃ）で、画像計測技術を利用し、多検体用結晶化プレート上のタンパク質液滴を逐次観察できるものである。多検体用結晶化プレートは、直径が４０ｍｍ、高さが５０ｍｍ程度の空間において、複数を多段に積層して設置できる設計となっており、５０条件程度の多検体用結晶化プレートである。
【００３７】
（１）タンパク質結晶の高品位化について
宇宙空間における微小重力環境では、溶液の重力対流と結晶の沈降が抑制される。すなわち、高度に静的な溶液環境が作り出され、タンパク質の結晶化は拡散のみによって進行することから、タンパク質分子配向の規則性を最大限に高めることが可能となる。その結果、微小重力場中で得られた結晶は、Ｘ線回折能が飛躍的に向上すると考えられる。
【００３８】
タンパク質のような反磁性を示す物質に、重力と逆向きの磁気力が発生するように磁場を印加すると、微小重力環境を得ることができる。磁場の強さＨの中で単位質量当りの磁化率χの物質が受ける磁気力Ｆは、以下のように示される。
Ｆ＝χＨ・gradＨ＝（χ／μ２）Ｂ・gradＢ（μは物質の透磁率、Ｂは磁束密度）
【００３９】
ここで、物質に依存しないＢとその勾配gradＢの積「Ｂ・gradＢ」を「磁気力場」と定義する。重力場が空間的に極めて均一であるのに対して、磁気力場は、一般には極めて不均一である。タンパク質の結晶生成プロセス等に磁気力を利用するためには、磁気力場がある空間範囲で均一になることが望ましい。しかし、従来の超伝導マグネット内で、磁気力場が均一な場所はごく狭く、微小重力環境が得られる範囲は、わずか０．１ｍｍに過ぎない。
【００４０】
図２は、均一磁気力発生用の超伝導マグネットのコイル配置を示す模式図である。
【００４１】
非線形計画法をもちいた均一磁気力場発生用コイル配置技術が開発されており、サンプル空間（直径１０ｍｍｘ長さ１０ｍｍ）の内部に均一度〜２％の磁気力場を発生することができる。この超伝導マグネットは、図２に示すように、試料の両側にＮｂ３Ｓｎコイル１ｂを配置し、これらの両側にＮｂＴｉコイル１ａを配置し、さらに、試料近傍にＮｂ３Ｓｎ反転コイル１ｃを配置することにより、大電磁力を発生するように構成したものである。
【００４２】
なお、この型の超伝導マグネットには、反転磁場による磁束勾配の増強、局部に集中する１０tonレベルの電磁力の制御など多くの新たな課題がある。その後、磁気力を局所的に増強する磁気力ブースタも提案されている。
【００４３】
磁場反転コイルを装着した１５Ｔ超伝導マグネット（磁気力場均一度が、直径３０ｍｍｘ高さ１５ｍｍにて±５％以内）において、タンパク質結晶の高品位化に及ぼす磁気力場の効果が調べられている。その結果、〔表１〕に示すように、多数（１３種類）のトライアルの中から、現在までに４種類のタンパク質において結晶の高品位化が確認されている。
【００４４】
【表１】
0005657326.tif 000002
（２）タンパク質結晶生成過程の可視化について（結晶化過程観察機構、多検体用結晶化結晶プレート）
(1)磁気力場中で結晶生成過程のｉｎ−ｓｉｔｕ観察が可能な自動結晶観察機構
強磁場中で効率よく高品位の結晶を得るためには、結晶生成のプロセスをその場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）観察する必要がある。しかし、磁場空間の大きさは限られ、また、構造体には磁性材料を使用することができないため、通常の顕微鏡などの可視化機構は使えない。
【００４５】
本発明者らは、強磁場中での可視化技術に関し、ＣＣＤ素子を用いた可視化機構（分解能２０μｍ程度）、特殊な光学エクステンションを用いたレーザ顕微鏡（分解能８００ｎｍ以上）を開発してきた。
【００４６】
タンパク質の構造決定を行うＸ線回折装置に必要な結晶の大きさは約１００μｍ以上といわれている。このような結晶が生成されたことを確認する装置に求められる分解能は、５〜１０μｍ程度であり、この分解能は通常の接写装置では不十分である。一方、これまでの光学エクステンションを利用したレーザ顕微鏡では、磁場空間の直径が１００ｍｍ必要であり、また、対象となる試料の数は５個程度以下に限られる。本発明におけるハイスループットのタンパク質結晶生成には、１０Ｔを超える強磁場中に置かれた数百個の試料を、試料を動かすことなく観測できる機構が必要である。
【００４７】
図３は、本発明に係る強磁場中顕微鏡観察装置が使用される結晶生成装置の構成を示す分解斜視図である。
【００４８】
本発明においては、図３に示すように、円環状の超伝導マグネット１が形成する直径５０ｍｍの円筒型磁場空間の中央の１５〜２０ｍｍ程度に、観察機構（ＣＣＤカメラ）２を設置し、その周囲に配置した試料容器（スタックされた結晶化プレート）３中の結晶生成過程を観測する。観察機構２を中心に置くことにより、単純な軸回転のみで周辺に置かれた試料を観測できるシンプルな構造とすることができる。また、試料の位置を面内の中心に近くすることにより、均一度の高い磁気力場を利用することができる。
【００４９】
図４は、本発明に係る強磁場中顕微鏡観察装置が使用される結晶生成装置の構成を示す縦断面図である。
【００５０】
この結晶生成装置においては、図３及び図４に示すように、観察機構となるＣＣＤイメージセンサ２が、中空軸（アウタースリーブ）１１内に設置されており、この中空軸１１が円筒型磁場空間の中央に挿入されている。中空軸１１の上端側は、非磁性回転機構６及び非磁性二重上下動機構７によって支持されている。中空軸１１の下端側は、軸受け１０によって支持されている。この中空軸１１は、軸方向（上下方向）に移動操作可能であり、また、軸回りの回転操作が可能である。
【００５１】
ＣＣＤイメージセンサ２は、中空軸１１の側面に開設された観察窓５を通じて、中空軸１１内に設置された傾斜鏡１２、対物レンズ１３及び結像レンズ１４を介して、中空軸１１の周囲を観察した画像の画像信号を出力する。ここで、中空軸１１の軸方向の移動操作及び軸回りの回転操作がなされることにより、ＣＣＤイメージセンサ２は、中空軸１１の周囲のあらゆる位置を観察することができる。
【００５２】
中空軸１１の周囲には、試料容器３であるスタックされた結晶化プレート４が配置される。この試料容器３は、複数の円盤状の結晶化プレート４が多段に積層配置（スタック）されたものである。
【００５３】
結晶化プレート４の中央部には、中空軸１１が貫通するための透孔が開設されている。結晶化プレート４は、非磁性の透明材料により形成されている。結晶化プレート４には、結晶生成用の複数の個室が設けられている。これら各個室は、結晶化プレート４の周縁位置に配列されている。
【００５４】
スタックされた結晶化プレート４の周囲、すなわち、超伝導マグネット１の内周面には、結晶化プレート４を照明するためのバックライト１５が設置されている。
【００５５】
この結晶生成装置においては、効率を増すために結晶化プレート４を多段式にした場合も、観察系を中心軸上で平行移動させるだけで観測が可能であり、試料数の増加に対応できる。
【００５６】
また、円筒型磁場空間には、温調用エア導入口９より、温度調節用の空気（外気）が導入される。この温度調節用の空気は、温調用エア排出口８より、円筒型磁場空間の外に排出される。
【００５７】
図５は、本発明に係る強磁場中顕微鏡観察装置が使用される結晶生成装置の要部の構成を示す縦断面図である。
【００５８】
円筒型磁場空間内においては、図５に示すように、温度調節用の空気は、バックライト１５と結晶化プレート４の外周面との間、及び、中空軸１１と結晶化プレート４の内周面との間を通って、温調用エア排出口８に向かう、この温度調節用の空気の流量及び通過位置を調節することにより、各結晶化プレート４の複数の個室ごとに結晶生成条件を変えることができる。
【００５９】
図６は、本発明に係る強磁場中顕微鏡観察装置が使用される結晶生成装置の観察機構の構成を示す斜視図である。
【００６０】
観察機構２は、図６に示すように、中空軸１１の側面に開設された観察窓５からの入射光が、中空軸１１内に設置された傾斜鏡１２、対物レンズ１３及び結像レンズ１４を介して、ＣＣＤイメージセンサ２に到達するように構成されている。
【００６１】
対物レンズ１３は、プッシュロッド１６によって光軸方向（中空軸１１の軸方向）に移動操作可能となっている。プッシュロッド１６は、結像レンズ１４を移動させずに対物レンズ１３のみを移動させることにより、ＣＣＤイメージセンサ２の撮像位置を調整する。この撮像位置とは、中空軸１１からの距離の調節であり、すなわち、結晶化プレート４の径方向の調節である。
【００６２】
なお、観測方式としては、以下の２種類が採用可能である。
【００６３】
ａ）ＣＣＤ素子を磁場中に入れ、その前方に配置する光学系を設計することにより高倍率観測を可能にする方式。
【００６４】
ｂ）光源としてレーザを使用し、レンズ、偏光子等の光学系のみを磁場中に入れることにより、偏光観察などのより高コントラストな映像を得る方式。
【００６５】
(2)多検体用結晶化プレート
通常、１つのタンパク質の最適結晶化条件の探索には、数百〜千程度の条件検討が必要であり、横１３ｃｍ×縦９ｃｍ×高さ１．５ｃｍ程度のプラスチック製の結晶化プレート４を数枚から１０枚程度用いる。本発明においては、マグネットボア内の限られた空間（直径４０ｍｍ×高さ５０ｍｍ程度）で結晶化実験を実施する。高品位結晶の生成の高効率化（ハイスループット）のためには、この限られた空間内で一度に数百条件の結晶化スクリーニングをすることが必要である。そのため、ボアの大きさ、形状に則した多検体（５０条件程度）用の専用プラスチック製の結晶化プレート４を設計、作製し、これを複数枚重層して設置する。
【００６６】
本発明においては、純水に対してほぼ１００％の重力キャンセルができる１４００Ｔ２／ｍ程度の磁気力場を発生させる超伝導マグネット１により±５％程度の均一磁気力空間を、直径４０ｍｍ、高さ〜１５ｍｍに発生する。この超伝導マグネット１に、温度範囲４〜３０°Ｃ（±０．５°Ｃ）の結晶生成系及び結晶生成過程のｉｎ−ｓｉｔｕ自動結晶観察機能を組み合わせている。さらに、ハイスループット化への対応として、複数の結晶化プレート４の同時処理を行う。
【００６７】
（３）まとめ
以上のように、本発明においては、磁場中で起こる現象をｉｎ−ｓｉｔｕに観察することができる。また、本発明者らは、これまでの磁気力場中結晶化実験において、ボア径に応じた小検体（１２条件）用プラスチック製の結晶化プレート４を開発し、結晶化に有用であることを示した。本発明においては、ハイスループットを実現するため、新規に多検体用の結晶化プレート４を開発した。このような磁気力場マグネット使用に特化した多検体用の結晶化プレート４の開発は、これまでに全く例がなく、新規なものである。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明は、超強磁場内の磁気無重力環境下で結晶生成を行う結晶生成装置において使用される強磁場中顕微鏡観察装置に適用される。
【符号の説明】
【００６９】
１      超伝導マグネット
２      観察機構
３      結晶生成容器
４      結晶化プレート
１１      中空軸
１２      傾斜鏡
１３      対物レンズ
１４      結像レンズ
【図１】
0005657326.tif 000003
【図２】
0005657326.tif 000004
【図３】
0005657326.tif 000005
【図４】
0005657326.tif 000006
【図５】
0005657326.tif 000007
【図６】
0005657326.tif 000008
【図７】
0005657326.tif 000009