(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質ＥのコンセンサスＤＩＩＩ領域をコードする単離した核酸であって、配列番号１３のヌクレオチド７〜３６６またはその相補体を含む核酸。
【請求項２】
前記核酸が、配列番号１３のヌクレオチド７〜３６６である、請求項１に記載の単離した核酸。
【請求項３】
請求項１の単離した核酸の配列を含む遺伝子構築物。
【請求項４】
配列番号１５のコザック配列をさらに含む、請求項３に記載の遺伝子構築物。
【請求項５】
ＩｇＧまたはＩｇＥの一部から選択されるリーダー配列をさらに含む、請求項３または４に記載の遺伝子構築物。
【請求項６】
前記リーダー配列が配列番号８の核酸配列を含む、請求項５に記載の遺伝子構築物。
【請求項７】
宿主に複数のＷＮＶおよびＪＥＶ血清型に対する免疫反応を起こすことができるＤＮＡワクチンであって、前記ワクチンは：
（ａ）請求項１に記載の核酸を含むコード配列と作用可能に連結したプロモーターを含む遺伝子構築物；および
（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤、
を含み、
ここで前記遺伝子構築物は、宿主の細胞に免疫反応を引き起こすのに効果的な量で、タンパク質Ｅ抗原のコンセンサスＤＩＩＩ領域を発現することができるワクチン。
【請求項８】
前記遺伝子構築物が、前記コード配列の３’末端の後にポリアデニル化配列をさらに含む、請求項７に記載のワクチン。
【請求項９】
前記遺伝子構築物がコドン最適化される、請求項７に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記薬学的に許容可能な賦形剤がアジュバンドである、請求項７に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記アジュバントが、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８およびＲＡＮＴＥＳからなる群から選択される、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
前記薬学的に許容可能な賦形剤がトランスフェクション促進剤である、請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
宿主に複数のＷＮＹおよびＪＥＶ血清型に対する免疫反応を引き起こす薬剤として使用するための、請求項７に記載のワクチン。
【請求項１４】
ワクチンが、皮内、皮下、または筋肉の組織の注射に適合される、請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１５】
免疫反応を引き起こすことが、以下：
（ａ）ワクチンを宿主の組織に送達させ；および
（ｂ）ワクチンの遺伝子構築物を細胞に侵入させることを可能にするのに効果的なエネルギーのパルスを送達する電気穿孔装置を用いて、組織の細胞を電気穿孔する
ことを含む、請求項１３または１４に記載のワクチン。
【請求項１６】
事前に設定した電流に等しい定電流でエネルギーのパルスを組織に送達するために、電流を事前設定する、請求項１５に記載のワクチン。
【請求項１７】
電気穿孔ステップが、
（ａ）電気穿孔された細胞においてインピーダンスを測定し；および
（ｂ）電気穿孔された細胞における定電流を維持するために、測定されたインピーダンスと比較して、エネルギーのパルスのエネルギーレベルを調節する
ことを含むことをさらに含み、ここで、測定ステップおよび調節ステップがエネルギーパルスの存続期間内で生じる、請求項１５に記載のワクチン。
【請求項１８】
電気穿孔ステップが、分散的パターンでエネルギーパルスを送達するパルスシークエンスパターンに従って、複数の電極にエネルギーパルスを送達することを含む、請求項１５に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）血清型群のグループは、蚊媒介フラビウイルスからなり、それにはウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）およびＪＥＶが含まれ、両方ともヒトにおいて深刻な脳炎を引き起こし得る。ＷＮＶは、１９９９年にもたらされて以来、米国の全域で急速に蔓延し、西半球内のその地理的分布はさらに拡大することが予想される一方で、ＪＥＶは、東南アジア、中国およびインドにおいてウイルス性脳炎の最も一般的な原因である。現在、両ウイルスに対するＦＤＡ(食品医薬品局)に承認された特異的治療法はないが、両ウイルスに対するワクチン開発が試みられている。
【０００２】
フラビウイルスのウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）および日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）は、ヒトの大部分のウイルス性脳炎に関与する。ＷＮＶは、広範囲のトリの種及びヒトを含む哺乳類の種に感染する。ＷＮＶは、輸血、臓器移植、および授乳を通じて感染することも証明されている。ウエストナイル脳炎（ＷＮＶ）ウイルスは、南ヨーロッパ、アフリカ、中央アジア、およびつい最近では北アメリカを含む広い地域の範囲に及ぶ。このウイルスは、イスラエル、エジプト、インドおよびパキスタンにおいて、しばしば髄膜脳炎の症状を引き起こす。エジプトにおいて、このウイルスが全ての髄膜炎および無菌性脳炎の３％の原因である。ＪＥＶは、平均３０％の症例死亡率を示し、アジアにおけるウイルス性脳炎の単一の最も重大な原因である。ＪＥＶは東南アジア、インド、および中国において重大な問題であり、該ウイルスはこれらの地域における固有種である。近年、ＪＥＶは、オーストラリア、およびパキスタンなどの他の地域に蔓延しており、従って、これらの地域において重大で新興のウイルス感染となっている。
【０００３】
日本脳炎（ＪＥ）は、大脳、小脳、および脊髄を含む中枢神経系における炎症性疾患である。マウスの脳由来の不活化ワクチンを用いるＪＥＶに対するワクチン接種は、非常に効果的であることが証明され、病気の苦しみを軽減させた。しかしながら、このワクチンの免疫原性および安全性について懸念されている。初代のハムスター腎臓（ＰＨＫ）細胞で産生される弱毒生ＪＥＶワクチン及び細胞培養に基づくＪＥＶワクチンは、中国において出願人にライセンスが認可され、安全で、効果的であることが証明された。しかしながら、ＰＨＫは、ヒトワクチンの産生のために承認された細胞株ではないので、多くの国々がこのＪＥＶワクチンを使用しないであろう。
【０００４】
ＪＥＶ感染は、最高３０〜５０％の死亡率を有し、生存者においては高率の神経学的後遺症を患い、脳炎の最も深刻なウイルス性原因の一つとしてみなされている（８）。従って、ＷＨＯを含む地方および国内の公共保健機関によって、流行地に居住している住民に対して、日本脳炎の集団予防接種が一般に推奨されている。風土病のない先進国において、ＪＥは珍しい外来病としてみなされている。しかし、最近数十年、非流行地からの観光客および他の旅行者において感染の症例がほぼ毎年報告されている。しかしながら、危険にさらされている国際旅行者の集団のワクチン接種率は非常に低く、このことは一部の旅行者および彼らの旅行中の健康相談役のこの病気に対する認識欠如に起因するだけでなく、現在ライセンスが認可されているマウスの脳由来のＪＥＶワクチンＪＥ−ＶＡＸＲと関連する潜在的な副作用の恐れにもよる（３３）。
【０００５】
ＪＥ−ＶＡＸＲは、日本の子供達ならびに米国およびいくつかのヨーロッパの国々の旅行者及び軍人に使用するために、マウス脳から生産され、ライセンスが認可されたホルマリン不活化ワクチンである。頻回注射法の条件および反応源性の問題がその使用を複雑にしている。頻繁な追加免疫の必要がなく、持続性の免疫を引き起こす手ごろな価格のワクチンが、途上国におけるＪＥの制御に必要である。マウス脳由来のＪＥＶワクチンは、何十年もの間、アジアの様々な国々およびいくつかの先進国において広く使用されてきた。オーストラリア、ヨーロッパおよび北アメリカの予防接種を受けた成人において、じん麻疹または血管性浮腫、ならびにいくつかの症例では、呼吸困難からなる深刻な副作用が報告された。これらの副作用は様々であり、１００００回の注射あたり１〜１０４回未満の範囲で発生し、懸念の主な原因の一つであるアナフィラキシーを伴う。
【０００６】
フラビウイルスのＥタンパク質が最も免疫原性があり、ワクチン開発に適する。Ｅタンパク質は３つの構造領域（ＤＩ、ＤＩＩおよびＤＩＩＩ）からなり、そのうちのＤＩＩＩは主に部分複合体および型に特異的なエピトープを含む。ＤＩＩＩに基づくいくつかのワクチンは、特定の条件下、免疫原性があり、効果的であることが証明された。
【０００７】
ＤＩＩＩタンパク質は、いくつかのＷＮＶおよびＪＥＶ株間で高度に保存されている。ＷＮＶ  ＤＩＩＩのＪＥＶ  ＤＩＩＩとの全アミノ酸同一性および類似性の値は、それぞれ約８１％および９４％である。ＤＩＩＩは受容体結合領域として機能し、単独で折り畳むことができる連続的なポリペプチド断片を形成する。ＤＩＩＩ内の変異が、フラビウイルスの病原性および指向性に影響を与えることがはっきり証明された。ｒＤＩＩＩは非常に安定なタンパク質であり、それゆえ、誘因性抗原になり得る。天然のＤＩＩＩもグリコシル化されないので、原核細胞内における細菌性発現中にこのタンパク質がグリコシル化されないことは、その抗原性に影響を与えない。ＪＥＶおよびデングウイルスの組換えＤＩＩＩは、それぞれの悪性ウイルスを接種されたマウスにおいて免疫原性および保護性があることが証明され、フラビウイルスに対するＤＩＩＩに基づくワクチン製剤の適合性を明確に示す。しかしながら、以前の試みにおいて、比較的高い濃度のｒＤＩＩＩが中和抗体反応の誘導に必要とされることが明らかになり、このことはｒＤＩＩＩの免疫原性が低いことを示す。
【０００８】
アジアのＪＥＶ株の最近の分子解析により、この株は４つの異なる遺伝子型群に分類された（３７）。現在入手可能なＪＥＶワクチンはＪＥの一株にのみ基づいているので、この高レベルの配列多様性は、出回っているＪＥＶ株に対するＪＥＶワクチンの交差防御効果について疑問および懸念をもたらしている（１２、１３）。
【０００９】
免疫療法の場面では、ＤＮＡワクチンは、弱毒化したウイルスの生ワクチンおよび組換えタンパク質に基づくワクチンなどの従来のワクチンを上回るいくつかの利点を有する（２４、２６）。ＤＮＡワクチンは、ヒトにおいて非常に耐容性がよいのは明らかである。前臨床安全性試験は、プラスミドがインテグレートされるという証拠がほとんどなく、またプラスミドベクターの有効性は以前から存在する中和抗体によって影響されないので、ＤＮＡワクチンが反復投与にも使用できることを示す。さらに、ＤＮＡワクチンは非常に安定で産生が簡便であるように思われる。しかしながら、初期の試験では、多くの動物およびヒトにおいて、ＤＮＡワクチンの効力が低いことが報告された。
【００１０】
出回っている全ての株が、中和によって規定される単一の血清型に属することは一般に認められるが（３７）、フラビウイルスのＲＮＡゲノムが高率の変異を有するため、アジアおよびオーストラリアのヒト集団において出回っているＪＥＶが遺伝子的に多様であり、ワクチン開発の問題を複雑にしている（３５、３６）。
【００１１】
複数のＪＥＶおよびＷＮＶの血清型に対する、哺乳類を保護するための安全で効果的なＪＥＶワクチンの必要性が今もなおある。ＤＮＡワクチンの免疫反応を効果的に高めることができる効果的なアジュバンドの必要性もある。
【発明の概要】
【００１２】
本発明の態様は、タンパク質ＥのコンセンサスＤＩＩＩ領域をコードする単離した核酸を含む。これらの核酸は、以下のヌクレオチド配列を含み得る：（ａ）配列番号１２、１３、もしくは１４；（ｂ）配列番号９、１０、もしくは１１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；または（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の相補体。本発明の別の態様には、本明細書に記載の単離した核酸を含む遺伝子構築物がある。いくつかの実施形態において、遺伝子構築物は、コザック配列ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＧＣＣ  ＡＣＣ（配列番号１５）および／またはＩｇＧもしくはＩｇＥの一部から選択されるリーダー配列を含み得る。
【００１３】
本発明のさらに別の態様は、以下を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドである：（ａ）配列番号９、１０もしくは１１；または（ｂ）（ａ）の断片。
【００１４】
本発明の態様は、宿主にＷＮＶおよびＪＥＶの複数の血清型に対する免疫反応を起こすことのできるＤＮＡワクチンであり、このワクチンは以下を含む：（ａ）本明細書に記載の単離した核酸を含むコード配列と作用可能に連結したプロモーターを含む遺伝子構築物；および（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤；ここで、この遺伝子構築物は、宿主の細胞に免疫反応を引き起こすことに効果的な量で、タンパク質Ｅ抗原のコンセンサスＤＩＩＩ領域を発現することができる。
【００１５】
本発明の一態様は、宿主に、フラビウイルスの複数のウイルス血清型に対する免疫応答を引き起こす以下を含む方法である：（ａ）本明細書に記載のワクチンを宿主の組織に送達するステップ；および（ｂ）このワクチンの遺伝子構築物を細胞に侵入させることを可能にするのに効果的なエネルギーパルスを送達する電気穿孔装置を用いて、組織の細胞を電気穿孔するステップ。
【００１６】
本発明の多数の目的および利点は、添付の図を参照することにより当業者により理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１Ａは、ウイルスおよび宿主細胞のプロテアーゼによって触媒される切断部位を有するフラビウイルスポリタンパク質の構造を示す図である。フラビウイルスＥの３次元構造は、３つの異なる領域Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩを有することを示す。右側のプラスミド地図は、本研究で使用するワクチン構築物の様々な要素を示す。図１Ｂは、ＤＶ−Ｕのコンセンサスアミノ酸配列を示す図である。分泌過程を最大限にするＩｇＥのリーダー配列に下線を引く。図１Ｃは、ＪＥＶ  ＤＩＩＩ、キメラＪＥ／ＷＮＶ  ＤＩＩＩおよびＷＮＶ  ＤＩＩＩ  ＪＥ／ＷＮＶ  ＤＩＩＩ断片の制限酵素消化の結果の写真であり、ＤＩＩＩコード領域の長さ（４３５ｂｐ）を示す。左端のレーンにＤＮＡラダーを示す。図１Ｄは、ＤＮＡワクチン構築物のインビトロ発現を示す写真である。材料および方法の欄に記載したように、ＤＮＡワクチン構築物から生成される３５Ｓ標識遺伝子産物をＳＤＳゲルで分離した。これらのタンパク質産物は、約１６．５ｋＤａの質量の移動度に相当した。ｐＶＡＸ空ベクターから対応するタンパク質産物が得られないことは、この反応の特異性を示す。図１Ｅは、ＲＤ細胞におけるＤＩＩＩワクチン構築物の発現解析の結果を示す写真である。細胞をワクチン構築物でトランスフェクトし、トランスフェクション２日後に、ＤＩＩＩ特異的ｍＲＮＡ転写産物の存在についてＲＴ−ＰＣＲにより解析した。模擬トランスフェクトした細胞は、適切な増幅産物を示さなかった。適切なプライマーを用いて、ＤＩＩＩ構築物でトランスフェクトした細胞から約４３５塩基対の産物を観察することで、対応するＤＩＩＩをコードする転写産物の存在を確かめた。
【図２】図２Ａは、３つの異なるＩＬ１５アイソフォームの局在を示す写真である。ＨｅＬａ細胞をＩＬ１５アイソフォームのＳＳＰまたはＬＳＰまたはＯＰＴを発現するプラスミドでトランスフェクトし、トランスフェクション３６時間後、免疫蛍光アッセイにより解析した。これらの細胞を固定し、抗ＩＬ１５モノクローナル抗体とインキュベートし、次いで抗マウスＦＩＴＣ結合２次抗体とインキュベートした。ＤＡＰＩを使用して、細胞の核の内容物を対比染色した。空ベクターを陰性対照として使用し、模擬トランスフェクトした細胞からは、特異的染色はまったく生じなかった（ａ〜ｃ）。ＩＬ１５−ＳＳＰアイソフォームは分泌されず、むしろ細胞内に貯蔵され、核成分にあるように見えるが（ｄ〜ｆ）、ＩＬ１５−ＬＳＰアイソフォーム（ｇ〜ｉ）およびヒトコドン最適化ＩＬ１５（ｊ〜ｌ）は、分泌型ＩＬ１５と関連して細胞質領域にはっきりと見られる。図２Ｂは、ＩＬ１５アイソフォームの分泌レベルを示すグラフである。ＲＤ細胞をＩＬ１５発現構築物（１μｇ／ウェル）でトランスフェクトし、２日後、ＥＬＩＳＡにより分泌型ＩＬ１５タンパク質の存在について上清を分析した。ＩＬ１５  ＥＣＲＯ発現構築物は、最も高レベルのＩＬ１５分泌を生じさせた。図２Ｃは、分泌レベルを比較したグラフであり、ＩＬ１５  ＬＳＰおよびＯＰＴ構築物からの分泌量は、ＳＳＰ型の倍数として示した。
【図３】ＤＩＩＩタンパク質断片の細菌による産生および精製を示す写真である。材料および方法に記載したように、ＤＩＩＩコード領域をｐＱＥ３０発現ベクターにクローニングし、タンパク質試料を細菌溶解物から精製した。ＰＡＧＥのクーマシー染色は、細菌発現系の精製工程の異なる段階から回収した試料を示す。Ｎｉカラムと結合させた後、２ＯｍＭのイミダゾールを含む溶出緩衝液ではＤＩＩＩ断片を遊離させることができず、２５ＯｍＭのイミダゾールがヒスチジンタグ付きＤＩＩＩ断片を選択的に溶出することに効果的であった。適切な分子量（１６．５ｋＤａ）を有する精製したＤＩＩＩ断片の顕著なバンドに印をつけた。
【図４】図４Ａは、ワクチン接種および免疫付与の計画の概略図を示す。ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）電気穿孔装置（ＶＧＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｂｌｕｅ  Ｂｅｌｌ  ＰＡ）により、ＢＡＬＢ／ｃマウスを２０Ｘｇワクチン構築物またはｐＶＡＸ空ベクターで２週間空けて免疫化し、１週間後屠殺した。図４Ｂは、抗ＤＩＩＩ血清が精製ＤＩＩＩ断片と特異的に反応することを示すグラフである。９６ウェルのＮｉキレート処理プレート上で、ＤＩＩＩのＤＮＡワクチンを接種したマウスの血清を、１μｇ／ウェルの精製したＤＩＩＩタンパク質試料と３７℃で１時間、インキュベートした。通常の発色現像法により、適切な抗体の産生を抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰを用いて検出した。これらのプレートを４５０ｎｍで読み取った。値は、３ウェルの平均（±Ｓ．Ｄ）を表す。
【図５】ＤＮＡワクチンを接種したマウスの血清を用いた、ＤＩＩＩでトランスフェクトした細胞の染色を示す写真である。ＨｅＬａ細胞を、ｐＶＡＸまたはｐＷＮＶ  ＤＩＩＩ（図５Ａのスライド写真）もしくはｐＪＥＶ  ＤＩＩＩ（図５Ｂのスライド写真）でトランスフェクトした。トランスフェクション２日後、細胞を固定し、これらのＤＮＡワクチン構築物で免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウスの血清とインキュベートした。続いて、細胞をＦＩＴＣ結合抗マウス２次抗体および細胞の核内容物を対比染色するＤＡＰＩとインキュベートした。ｐＶＡＸ血清試料による適当な染色が無いことを、各セットの下に示す。
【図６】Ｅ  ＤＩＩＩ  ＥＬＩＳｐｏｔのグラフを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、２０μｇのｐＶＡＸベクターまたはＤＩＩＩ発現構築物で３回、各々２週間の間隔をあけて免疫化し、１週間後屠殺した。脾細胞を回収し、ＲｌＯ（陰性対照）の存在下、または２μｇ／ｍｌの３つの精製ＤＩＩＩタンパク質試料のうちの１つの存在下で、一晩培養した。スポット形成単位を、自動化ＥＬＩＳＰＯＴリーダーにより定量化し、生の値を１００万個の脾細胞あたりのＳＦＵに標準化した。値は、３ウェルの平均（±Ｓ．Ｄ）を表す。
【図７】ＤＮＡ構築物ｐＶＡＸｌ−ＷＮＶ  ＤＩＩＩ、ｐＶＡＸｌ−ＪＥＶ  ＤＩＩＩ、およびキメラ構築物のｐＶＡＸｌ−ＪＷ  ＤＩＩＩのプラスミド地図を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下の簡略化した、または短縮した定義を、本発明の好ましい実施形態の理解を助けるために与える。本明細書に与えられる簡略化した定義は、決して網羅的ではなく、当分野で理解されるような定義または辞書の意味と相反するものでもない。簡略化した定義は、本明細書において、当該技術分野で知られる定義を補足するか、あるいはより明確に定義するために与える。
【００１９】
定義
本明細書で使用するヌクレオチドおよびアミノ酸の配列相同性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９７，２５，３３８９、これは、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる）ならびにＰＡＵＰ＊４．ＯｂＩＯ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｄ．Ｌ．Ｓｗｏｆｆｏｒｄ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて決定してもよい。簡潔に述べると、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌを表すＢＬＡＳＴアルゴリズムは、配列類似度の決定に適している（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３−４１０、これは、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる）。ＢＬＡＳＴ解析を行うソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を通じて公表されている。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似度の１つの測定は、２つのヌクレオチド配列間の一致が偶然生じる確率の指標を与える最小合計確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ  ｓｕｍ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸と他の核酸の比較における最小合計確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸配列は別の核酸配列と類似するとみなされる。「類似度のパーセンテージ」を、ＰＡＵＰ＊４．ＯｂＩＯ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｄ．Ｌ．Ｓｗｏｆｆｏｒｄ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて計算することができる。コンセンサス配列の平均類似度を、系統樹の全配列と比較して計算する。
【００２０】
本明細書で使用される「相補する」または「相補的」という用語は、核酸分子のヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体間のワトソン−クリック（例えば、Ａ−Ｔ／ＵおよびＣ−Ｇ）またはフーグスティーン塩基対を意味することができる核酸を意味する。
【００２１】
本明細書で使用される「発現できる型」という用語は、タンパク質をコードするコード配列と作用可能に連結した必須の調節要素を含む核酸構築物を表し、個々の細胞に存在する時、このコード配列は発現する。
【００２２】
本明細書で使用される「定電流」という用語は、組織、または前記組織を明示する細胞が、同組織に送達される電気パルスの継続期間にわたって受けるあるいは経験する電流を規定する。電気パルスは、本明細書記載の電気穿孔装置から送達される。本明細書に記載の電気穿孔装置がフィードバック要素を有する、好ましくは瞬間的フィードバックを有するので、この電流は、電気パルスの継続期間にわたって、前記組織において一定のアンペア数で維持される。フィードバック要素は、パルスの継続期間中、組織（または細胞）の抵抗を測定することができ、電気穿孔装置にその電気エネルギー出力を変更させ（例えば、電圧を増大させ）、そのため、同組織中の電流を電気パルス（約マイクロ秒）の間中、およびパルス間で一定に維持される。いくつかの実施形態において、フィードバック要素は制御装置を含む。
【００２３】
「フィードバック」または「電流フィードバック」という用語は、互換的に使用され、提供される電気穿孔装置の能動的な反応を意味し、この装置は電極間の組織の電流を測定し、それに応じて一定レベルに電流を維持するために、ＥＰ装置から送達されるエネルギー出力を変更することを含む。この一定レベルは、パルスシーケンスまたは電気的処置の開始前に、使用者により事前に設定される。電気穿孔装置内の電気回路は、電極間の組織の電流を連続的に監視し、その監視された電流（または組織中の電流）と事前設定された電流を比較し、連続的にエネルギー出力調節を行い、監視された電流を事前設定値に維持することがきるので、好ましくは、フィードバックは、電気穿孔装置の電気穿孔要素、例えば制御装置により行われる。いくつかの実施形態において、フィードバックループはアナログ閉ループフィードバックであるので、これは瞬間的である。
【００２４】
本明細書で互換的に使用される「電気穿孔」、「電気透過処理」または「動電学的エンハンスメント（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｋｉｎｅｔｉｃ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）」（「ＥＰ」）という用語は、膜貫通電界パルスを使用して生体膜に微小経路（孔）を生じさせることを言い、これらの微小経路が存在することにより、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬剤、イオン、および水などの生体分子の、細胞膜の一方の側から他方の側への通過を可能にする。
【００２５】
本明細書で使用される「分散電流」という用語は、本明細書記載の電気穿孔装置の様々なニードル電極アレイから送達される電流のパターンを規定し、このパターンは、電気穿孔される組織の任意の領域における電気穿孔関連熱応力の発生を最小限にするか、あるいは好ましくは排除する。
【００２６】
本明細書で使用される「フィードバック機構」という用語は、ソフトウェアまたはハードウェア（またはファームウェア）のいずれかによって実行されるプロセスを表し、このプロセスは、所望の組織の電気抵抗を受けて、（エネルギーパルスの送達前、送達中、および／または送達後に）事前設定値、好ましくは電流と比較し、送達されるエネルギーパルスを調節して事前設定値を得る。本明細書で使用される「インピーダンス」という用語は、フィードバック機構について論じる際に、オームの法則に従って電流値に変換することができ、従って、事前に設定された電流との比較を可能にする。好ましい実施形態において、「フィードバック機構」は、アナログ閉ループ回路により実行される。
【００２７】
本明細書で使用される「免疫反応」という用語は、提供するＤＮＡプラスミドワクチンによるフラビウイルスコンセンサス抗原の導入に反応して、宿主の免疫系、例えば哺乳類の免疫系が活性化されることを意味する。免疫反応は、細胞性もしくは体液性反応、またはその両方の形態であり得る。
【００２８】
本明細書で使用される「コンセンサス」または「コンセンサス配列」という用語は、フラビウイルス抗原の複数のサブタイプのアラインメント解析に基づいて構築された合成核酸配列、または対応するポリペプチド配列を意味する。コンセンサスフラビウイルス抗原は、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）および日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）または両方の配列の要素を結合するキメラ配列のＥタンパク質のＤＩＩＩ領域を含む。
【００２９】
本明細書で使用される「断片」という用語は、コンセンサスＤＩＩＩ抗原の少なくとも１つに対して、断片ではないものの免疫反応と実質的に類似する哺乳類における免疫反応を引き起こすことができるポリぺプチドをコードする核酸、またはその一部を意味する。これらの断片は、配列番号１２、１３、および１４を含む本発明の様々なコードするヌクレオチド配列の少なくとも１つから選択されるＤＮＡ断片であり得る。これらのＤＮＡ断片は、３０以上のヌクレオチド長、４５以上のヌクレオチド長、６０以上のヌクレオチド長、７５以上のヌクレオチド長、９０以上のヌクレオチド長、１２０以上のヌクレオチド長、１５０以上のヌクレオチド長、１８０以上のヌクレオチド長、２１０以上のヌクレオチド長、２４０以上のヌクレオチド長、２７０以上のヌクレオチド長、３００以上のヌクレオチド長、３６０以上のヌクレオチド長、４００以上のヌクレオチド長であり得る。ＤＮＡ断片は、ＩｇＥまたＩｇＧ配列などの免疫グロブリンリーダーのコード配列を含み得る。
【００３０】
ＤＮＡ断片は、１０未満のヌクレオチド、２０未満のヌクレオチド、３０未満のヌクレオチド、４０未満のヌクレオチド、５０未満のヌクレオチド、６０未満のヌクレオチド、７５未満のヌクレオチド、９０未満のヌクレオチド、１２０未満のヌクレオチド、１５０未満のヌクレオチド、１８０未満のヌクレオチド、２１０未満のヌクレオチド、２４０未満のヌクレオチド、２７０未満のヌクレオチド、３００未満のヌクレオチド、３６０未満のヌクレオチド、４００未満のヌクレオチドであり得る。
【００３１】
「断片」は、少なくとも１つのＤＩＩＩタンパク質（または抗原）に対して、断片ではないものの免疫反応と実質的に類似する哺乳類における免疫反応を引き起こすことができるポリぺプチド断片も意味する。この断片は、配列番号９、１０、および１１を含む本発明の様々なコードされたポリぺプチド配列の少なくとも１つから選択されるポリペプチド断片であり得る。ポリペプチド断片は分析され、公表されているデータベースによって提供されるような少なくとも１つの抗原エピトープと接触することができる。ポリペプチドＤＩＩＩ断片は、ＩｇＥまたはＩｇＧなどの免疫グロブリンリーダーのアミノ酸配列をさらに含み得る。これらのポリペプチド断片は、３０以上のアミノ酸長、４５以上のアミノ酸長、６０以上のアミノ酸長、７５以上のアミノ酸長、９０以上のアミノ酸長、１２０以上のアミノ酸長、１３０以上のアミノ酸長であり得る。
【００３２】
ポリペプチド断片は、１０未満のアミノ酸長、２０未満のアミノ酸長、３０未満のアミノ酸長、４０未満のアミノ酸長、５０未満のアミノ酸長、６０未満のアミノ酸長、７５未満のアミノ酸長、９０未満のアミノ酸長、１２０未満のアミノ酸長、または１３０未満のアミノ酸長であり得る。
【００３３】
本明細書で使用される「アジュバンド」という用語は、ＤＮＡプラスミドおよび本明細書の以下に記載されるコードする核酸配列によってコードされる所望の抗原、好ましくはコンセンサス抗原の抗原性を高め、本明細書記載のＤＮＡプラスミドワクチンに加えられる任意の分子を意味する。
【００３４】
本明細書で互換的に使用される「サブタイプ」または「血清型」という用語は、１つのサブタイプが他のサブタイプとは別に免疫系によって認識される、言いかえれば、１つのサブタイプが、別のサブタイプとは異なる免疫原性の特性を有するような、ウイルスの、またはそのエピトープの遺伝的変異体を意味する。
【００３５】
ＤＩＩＩ配列の３つの型：コンセンサスＪＥＶ  ＤＩＩＩ、コンセンサスＷＮＶ  ＤＩＩＩおよびキメラ配列ＪＥＶ配列、その中で、ＷＮＶに対する中和抗体の誘導の決定因子であることが証明された（ＪＷ  ＤＩＩＩまたはＪＥＶ／ＷＮ  ＤＩＩＩまたはＷＮ／ＪＥＶ  ＤＩＩＩを意味する）ＷＮＶ  ＤＩＩＩ残基（１６、１７）は、対応する位置で取り込まれる。これらの全配列は、２０株にわたってそれぞれ一致する。ＤＮＡワクチン開発のためにコンセンサス配列を使用することは、感染症に対する戦いにおける最新の技術の１つである（２２、２３）。コンセンサス配列に基づいて、本研究において合成ヒトコドン最適化配列を免疫化のために産生した。
【００３６】
コードするヌクレオチド
本発明の態様は、タンパク質ＥのコンセンサスＤＩＩＩ領域をコードする単離した核酸配列を含む。これらの核酸配列は以下のヌクレオチド配列を含み得る：（ａ）配列番号１２、１３、もしくは１４；（ｂ）配列番号９、１０、もしくは１１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；または（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の相補体。本発明の別の態様は、本明細書に記載の単離した核酸配列を含む遺伝子構築物である。いくつかの実施形態において、遺伝子構築物は、コザック配列ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＧＣＣ  ＡＣＣ（配列番号１５）および／またはＩｇＧもしくはＩｇＥの一部、好ましくはＩｇＥ、より好ましくは配列番号８の配列を有するＩｇＥから選択されるリーダー配列を含み得る。
【００３７】
コンセンサスＤＩＩＩタンパク質は、コンセンサスＤＩＩＩ核酸、その変異体またはその断片によりコードされ得る。コンセンサスＤＩＩＩ核酸は、コドン最適化および／またはＲＮＡ最適化され得る。コンセンサスＤＩＩＩ核酸配列は、リーダー配列を含み得る。リーダー配列は、ＤＩＩＩコード配列の５’側に存在し得る。この配列にコードされるコンセンサスＤＩＩＩタンパク質は、Ｎ−末端リーダー、続いてコンセンサスＤＩＩＩタンパク質を含み得る。Ｎ−末端リーダーは、ＩｇＥまたはＩｇＧであり得る。
【００３８】
ポリペプチド／抗原
本明細書に記載のポリペプチド／抗原は、１つまたは複数のフラビウイルス血清型、特にウエストナイルウイルスおよび日本脳炎ウイルスの様々な血清型に対する免疫反応を哺乳類において引き起こすことができる抗原である。本抗原は、１つまたは複数の流行株に対する免疫反応を含む、１つまたは複数のフラビウイルス血清型に対する免疫反応を哺乳類において引き起こすことができる。本抗原は、抗フラビウイルス免疫反応が誘導され得る免疫原として特に効果的にさせるエピトープを含み得る。
【００３９】
本発明の一態様は、コンセンサスＤＩＩＩタンパク質であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ＤＩＩＩタンパク質は以下を含み得る：（ａ）配列番号９、１０もしくは１１；または（ｂ）（ａ）の断片。コンセンサスＤＩＩＩタンパク質は、そのＮ−末端にＩｇＥまたはＩｇＧリーダーアミノ酸配列をさらに含み得る。このＩｇＥリーダーアミノ酸配列は、配列番号７で説明され得る。ＩｇＥリーダー配列を有するコンセンサスＤＩＩＩタンパク質は、それぞれＪＥＶ  ＤＩＩＩ、ＷＮＶ  ＤＩＩＩ、またはＪＷ  ＤＩＩＩも含む、配列番号１、２、または３のアミノ酸配列を有し得る。
【００４０】
ワクチン
本発明の態様は、宿主に複数のＷＮＶおよびＪＥＶ血清型に対する免疫反応を引き起こすことのできるＤＮＡワクチンであり、このワクチンは以下を含む：（ａ）本明細書に記載の単離した核酸配列を含むコード配列に作用可能に連結されたプロモーターを含む遺伝子構築物；および（ｂ）薬学的に許容可能な賦形剤；ここで、この遺伝子構築物は、免疫反応を引き起こすことに効果的な量で、宿主細胞にタンパク質Ｅ抗原のコンセンサスＤＩＩＩ領域を発現することができる。
【００４１】
いくつかの実施形態において、本発明のＤＮＡワクチンは、核酸分子の遺伝子発現に不可欠な調節要素を有する遺伝子構築物を含む。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態において、ＤＮＡワクチンはさらにアジュバンドを含み得る。アジュバンドは以下のものから選択され得る：α−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、胸腺上皮発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、シグナル配列が除去されたＩＬ−１５と任意でＩｇＥのシグナルペプチドを含むＣＤ８６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−ＩＯ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−Ｉ、ＶＬＡ−Ｉ、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−Ｉ、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異型、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰｌ、ＴＡＰ２およびそれらの機能的断片またはそれらの組み合わせ。ＤＮＡワクチンは、ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質またはそれらの機能的断片と併用して投与してもよい。
【００４３】
いくつかの好ましい実施形態において、アジュバンドは、１つまたは複数の追加のアジュバンドに加えたＩＬ−１５である。
【００４４】
遺伝子構築物
ＤＩＩＩ抗原をコードする核酸を含み得る遺伝子構築物を本明細書で提供する。遺伝子構築物は、ＤＩＩＩ抗原をコードする核酸、好ましくはＤＮＡプラスミドを含む染色体外で機能する分子として細胞内に存在し得る。ＤＩＩＩ抗原をコードする核酸含む遺伝子構築物は、セントロメア、テロマーを含む直鎖状の小染色体であり得る。本遺伝子構築物は、組換えアデノウイルス、組換えアデノウイルス関連ウイルスおよび組換えワクシニアを含む組換えウイルスベクターのゲノムの一部でもあり得る。本遺伝子構築物は、弱毒化した、生きている微生物内の遺伝物質の一部、または細胞内に居住する組換え微生物ベクターの一部であり得る。本遺伝子構築物は、ＤＩＩＩ核酸の遺伝子発現の調節要素を含み得る。これらの調節要素は、プロモーター、エンハンサー、開始コドン、終止コドン、またはポリアデニル化シグナルであり得る。エンハンサーは、大抵、標的タンパク質または免疫調節タンパク質をコードする配列の遺伝子発現に必要とされる。これらの要素は、所望のタンパク質をコードする配列と作用可能に連結され得、これらの調節要素は、それらが投与される固体において機能し得る。
【００４５】
本遺伝子構築物、つまりベクターは、ＤＩＩＩコード配列に作用可能に連結されるプロモーターも含み得る。ＤＩＩＩコード配列に作用可能に連結されたプロモーターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のプロモーター、マウス乳ガンウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、例えばウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ最初期プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターのプロモーターであり得る。本プロモーターは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子のプロモーターでもあり得る。本プロモーターは、筋肉または皮膚特異的プロモーターなどの組織特異的な、天然のまたは合成のプロモーターでもあり得る。かかるプロモーターの例は、米国特許出願公開第２００４０１７５７２７号に記載され、その内容は本明細書にその全体が組み込まれる。
【００４６】
本ベクターは、ＤＩＩＩコード配列の下流にあり得るポリアデニル化シグナルも含み得る。このポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ−グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のポリアデニル化シグナルであり得る。
【００４７】
本ベクターは、ＤＩＩＩコード配列の上流のエンハンサーも含み得る。このエンハンサーは、ＤＮＡ発現に不可欠であり得る。このエンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンまたはウイルスエンハンサー、例えばＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶまたはＥＢＶの１つであり得る。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、米国特許第５，５９３，９７２号、米国特許第５，９６２，４２８号、および国際特許出願第９４／０１６７３７号に記載され、各々の内容は参照により完全に組み込まれる。
【００４８】
遺伝子構築物は、染色体外に構築物を維持し、細胞内で構築物の複数のコピーを産生するために、哺乳類複製開始点が供給され得る。インビトロジェン（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のｐＶＡＸｌ、ｐＣＥＰ４およびｐＲＥＰ４プラスミドは、インテグレーション無しに、高コピーのエピソーム複製を行うエプスタイン・バーウイルス複製開始点および核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含む。このベクターの骨格はｐＡＶ０２４２であり得る。このベクターは、複製不良アデノウイルス５型（Ａｄ５）ベクターであり得る。
【００４９】
本ベクターは、本ベクターが投与される哺乳類またはヒトの細胞における遺伝子発現に十分適し得る調節配列も含み得る。ＤＩＩＩコード配列は、宿主細胞におけるコード配列の転写をより効率的にさせ得る最適化コドンを含み得る。
【００５０】
本ベクターは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるタンパク質産生のために使用され得るｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得る。本ベクターは、酵母のサッカロマイセス・セレヴィシエ株におけるタンパク質産生のために使用され得るｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆ．）でもあり得る。本ベクターは、昆虫細胞におけるタンパク質産生のために使用され得るＭＡＸＢＡＣ（登録商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）のベクターでもあり得る。本ベクターは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳類細胞におけるタンパク質産生のために使用され得るｐｃＤＮＡ  ＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）でもあり得る。本ベクターは、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールドスプリングハーバー（１９８９）（これは参照により完全に組み込まれる）を含む通例の技術およびすぐに入手できる出発原料によりタンパク質を産生する発現ベクターまたは発現系であり得る。
【００５１】
タンパク質産生を最大限にするために、構築物が投与される細胞における遺伝子発現に十分に適した調節配列が選択され得る。しかし、前記タンパク質をコードし、宿主細胞において最も効率的に転写される、すなわちコドン最適化されるコドンが選択され得る。当業者は細胞内で機能的なＤＮＡ構築物を作製することができる。
【００５２】
いくつかの実施形態において、本明細書記載のタンパク質のコード配列がＩｇＥシグナルペプチドに連結される核酸構築物が提供され得る。いくつかの実施形態において、本明細書記載のタンパク質は、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される。
【００５３】
本ベクターは、ｐＶＡＸｌ−ＷＮＶ  ＤＩＩＩ、ｐＶＡＸｌ−ＪＥＶ  ＤＩＩＩ、またはｐＶＡＸｌ−ＪＷ  ＤＩＩＩであり得、これら全ては、それぞれのＤＩＩＩ抗原を発現するために使用され得る。ベクターｐＶＡＸｌ−ＷＮＶ  ＤＩＩＩは、配列番号５または１３のヌクレオチド配列を含む；ベクターｐＶＡＸｌ−ＪＥＶ  ＤＩＩＩは、配列番号４または１２のヌクレオチド配列を含む；ベクターｐＶＡＸｌ−ＪＷ  ＤＩＩＩは、配列番号６または１４のヌクレオチド配列を含む。
【００５４】
免疫化の方法
本発明の態様には、宿主に複数のフラビウイルス血清型に対する免疫反応を引き起こすための以下を含む方法がある：（ａ）本明細書に記載のワクチンを宿主の組織に送達するステップ；および（ｂ）ワクチンの遺伝子構築物を宿主へ侵入させることに効果的なエネルギーパルスを送達する電気穿孔装置を用いて、組織の細胞を電気穿孔するステップ。
【００５５】
本ワクチンは、哺乳類において免疫反応を引き起こすために哺乳類に投与され得る。哺乳類は、ヒト、ヒトではない霊長類、ウシ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、レイヨウ、バイソン、水牛、バイソン、ウシ、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、またはニワトリ、および好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、またはニワトリであり得る。
【００５６】
インビボ電気穿孔を用いるおよび用いない、リポソーム仲介型の、ナノ粒子促進型の組換えベクター、例えば、組換えアデノウイルス、組換えアデノウイルス関連ウイルスおよび組換えワクシニアのＤＮＡ注射（ＤＮＡワクチン接種とも称される）を含む任意のいくつかの周知の技術を用いて、ＤＮＡワクチンは送達され得る。好ましくは、本明細書記載のＤＮＡプラスミドなどの核酸分子は、ＤＮＡ注射によりおよびインビボの電気穿孔法と共に送達される。
【００５７】
投与経路には、筋肉内経路、鼻腔内経路、腹腔内経路、皮内経路、皮下経路、静脈内経路、動脈内経路、眼球内経路、および経口経路、ならびに粘膜組織への吸入剤もしくは坐薬による、例えば、膣、直腸、尿道、頬および舌下の組織へ洗浄などによる局所的経路、経皮的経路が含まれるがそれらに限定されない。好ましい投与経路には、筋肉内注射、腹腔内注射、皮内注射および皮下注射が含まれる。遺伝子構築物は、従来の注射器、無針注射器具、「微粒子銃によって行われる銃撃」、または他の物理的方法、例えば、電気穿孔（「ＥＰ」）、「流体力学法」、もしくは超音波を含むがそれらに限定されない手段により投与されてもよい。
【００５８】
本発明のＤＮＡワクチンの送達を促進するのに好ましい電気穿孔装置および電気穿孔法例には、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈらにより出願された米国特許公開第２００５／００５２６３０号（これらの内容は参照により本明細書にその全体が組み込まれる）に記載される例が含まれる。３５ＵＳＣ１１９（ｅ）条の下、２００６年１０月１７日に出願された米国特許仮出願第６０／８５２，１４９号および２００７年１０月１０日に出願された米国特許仮出願第６０／９７８，９８２号の利益を主張する、２００７年１０月１７日に出願された同時係属で共同所有の米国特許出願第１１／８７４０７２号（これらの全ては本明細書にその全体が組み込まれる）に提供されるＤＮＡワクチンの送達を促進する電気穿孔装置および電気穿孔法も好ましい。
【００５９】
Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号は、体内または植物内の選択された組織の細胞への生体分子の導入を促進するモジュラー電極システムおよびそれらの使用について記載している。モジュラー電極システムは、複数の針電極；皮下注射針；プログラムで制御できる定電流パルス調節器から複数の針電極へ伝導性の連結を提供する電気コネクター；および電源を含む。操作者は、支持構造物上に取り付けられた複数の針電極をつかみ、体内または植物内の選択された組織の中にその針電極をしっかり挿入することができる。その後、選択された組織への皮下注射針により、生体分子を送達する。プログラムで制御できる定電流パルス調節器を活性化し、定電流電気パルスを複数の針電極に加える。加えた定電流電気パルスは、複数の電極間にある細胞への生体分子の導入を促進する。米国特許第７，２４５，９６３号の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００６０】
Ｓｍｉｔｈらにより出願された米国特許公開第２００５／００５２６３０号は、体内または植物内の選択された組織の細胞への生体分子の導入を効果的に促進するために使用され得る電気穿孔装置について記載している。この電気穿孔装置は、その操作がソフトウェアまたはファームウェアによって特定される動電装置（「ＥＫＤ装置」）を含む。ＥＫＤ装置は、使用者の制御およびパルスパラメーターの入力に基づいて、アレイの電極間に一連のプログラムで制御できる定電流パルスパターンを形成し、電流波形データの保存および収集を可能にする。この電気穿孔装置は、針電極のアレイを有する交換可能な電極ディスク、注射針のための中央の注入チャネル、および取り外し可能なガイドディスクも含む。米国特許公開第２００５／００５２６３０号の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００６１】
米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載される電極アレイおよび方法は、筋肉などの組織だけでなく他の組織または臓器への深い侵入に適合する。電極アレイの配置のおかげで、（選択した生体分子を送達するために）注射針は、電極により事前に輪郭が描かれた領域内にある標的臓器にも完全に挿入され、注射は標的組織に直角に行われる。米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載される電極は、好ましくは２０ｍｍの長さおよび２１ゲージである。
【００６２】
以下は本発明の方法の例であり、上記で論じた特許参考文献により詳細に論じられる：電気穿孔装置は、使用者により事前に設定された電流入力と同じような定電流を生み出すエネルギーのパルスを、哺乳類の所望の組織へ送達するように配置され得る。電気穿孔装置は、電気穿孔構成要素および電極集合体またはハンドル集合体を含む。電気穿孔構成要素には、制御装置、電流波形発生器、インピーダンス試験器、波形自動記録装置、入力要素、状況報告要素、伝達ポート、記録構成要素、電源、および電源スイッチを含む電気穿孔装置の１つまたは複数の様々な要素を含むこと、および取り込むことができる。電気穿孔構成要素は、電気穿孔装置の１つの要素として機能することができ、他の要素は、電気穿孔構成要素と連通する別々の要素（または構成要素）である。いくつかの実施形態において、電気穿孔構成要素は、電気穿孔装置の２つ以上の要素として機能し得、それは電気穿孔構成要素から分離した電気穿孔装置のさらに他の要素と連通することができる。要素は１つの装置として、または互いに連通する別々の要素として機能することができるので、本発明は、１つの電気機械装置または機械装置の一部として存在する電気穿孔装置の要素に限定されない。電気穿孔構成要素は、所望の組織に定電流を生み出すエネルギーパルスを送達することができ、フィードバック機構を含む。電極集合体は、空間的配置に複数の電極を有する電極アレイを含み、電極集合体は、電気穿孔構成要素からエネルギーパルスを受け取り、電極を通して所望の組織にエネルギーパルス送る。複数の電極の少なくとも１つは、エネルギーパルスの送達の間は中性で、所望の組織のインピーダンスを測定し、電気穿孔構成要素へそのインピーダンスを伝える。フィードバック機構は、測定されたインピーダンスを受け取ることができ、定電流を維持するために、電気穿孔構成要素により送達されたエネルギーパルスを調節することができる。
【００６３】
いくつかの実施形態において、複数の電極は、分散的パターンでエネルギーパルスを送達することができる。いくつかの実施形態において、複数の電極は、プログラムされた順番の下で、電極制御を介して分散的パターンでエネルギーパルスを送達することができ、使用者は、プログラムされた順番を電気穿孔構成要素に入力する。いくつかの実施形態において、プログラムされた順番は、順に送達された複数のパルスを含み、複数のパルスの各パルスは、インピーダンスを測定する１つの中性極と共に少なくとも２つの活性電極により送達され、複数のパルスの次のパルスは、インピーダンスを測定する１つの中性極と共に少なくとも２つの活性電極の別の１つによって送達される。
【００６４】
いくつかの実施形態において、フィードバック機構は、ハードウェアまたはソフトウェアのいずれかによって行われる。好ましくは、フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路によって行われる。好ましくは、このフィードバックは、毎５０μｓ、２０μｓ、１０μｓまたは１μｓで生じるが、好ましくはリアルタイムなフィードバックつまり瞬間的（すなわち、反応時間を決定するための利用できる技術によって決定されるような事実上の瞬間的）である。いくつかの実施形態において、中性電極は、所望の組織においてインピーダンスを測定し、そのインピーダンスをフィードバック機構へ伝達し、フィードバック機構はそのインピーダンスに応答し、事前設定電流と同じような値で定電流を維持するためにエネルギーパルスを調節する。いくつかの実施形態において、フィードバック機構は、エネルギーパルス送達の間、連続的に、瞬間的に定電流を維持する。
【実施例】
【００６５】
本発明は、以下の実施例においてさらに明らかにされる。本発明の好ましい実施形態を示すこれらの実施例は、単なる説明の目的で与えられるということが理解されるべきである。上記の議論およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特徴を突き止めることができ、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、様々な使用および状態に適合させるために本発明の様々な変更および改良を行うことができる。従って、本発明の様々な改良は、本明細書に示され、記載される改良に加えて、先の記載から当業者に明らかになる。かかる改良は、添付の特許請求の範囲に入ることも意図される。
【００６６】
本発明のＥＰ装置と共に使用するＤＮＡプラスミドを、既知の装置および技術とを併用して調製または製造することができるが、好ましくは、２００７年５月２３日に出願された、共同所有の、同時係属の米国特許仮出願第６０／９３９，７９２号に記載の最適化プラスミド製造技術を使用してそれらを製造する。いくつかの実施例において、これらの研究において使用するＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で調製することができる。製造技術は、当業者に一般的に知られている様々な装置およびプロトコール、ならびに米国特許仮出願第６０／９３９，７９２号に記載された装置およびプロトコール、ならびに２００７年７月３日に発行された、共同所有の米国特許第７，２３８，５２２号に記載された装置およびプロトコールも含む、つまり取り込む。米国特許仮出願第６０／９３９，７９２号および米国特許第７，２３８，５２２号の両方は、本明細書にその全体が組み込まれる。
【００６７】
細胞株
ＨｅＬａおよびＲＤ細胞を、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得た。加熱不活性化した１０％ウシ胎仔血清、ペニシリンＧ（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補充したＤＭＥＭ培地で、３７℃、５％ＣＯ２で細胞を培養した。
【００６８】
間接的免疫蛍光アッセイ
ＨｅＬａ細胞を用いて、間接的免疫蛍光アッセイを行った。細胞を２つのチャンバースライドに蒔き、一晩成長させ、その後トランスフェクションにそれらの細胞を用いた。ＦｕＧＥＮＥ  ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、それらの細胞をワクチン構築物またはｐＶＡＸ（１ｍｇ／ウェル）でトランスフェクトした。トランスフェクション３６時間後、常温で２０分間、細胞をメタノールで固定し、ＰＢＳで穏やかに洗浄した。それらの細胞を、９０分間、ワクチン接種したマウスの抗マウス血清とインキュベートし、再び洗浄した。その後、４５分間、その試料をＦＩＴＣ結合２次抗体（Ｓｉｇｍａ−  Ａｌｄｒｉｃｈ）とインキュベートした。与えられたフィールドで利用できる全細胞数を示すために、核内容物を対比染色するための２次抗体の溶液に４０，６−ジアミド−２−フェニルインドール塩酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。蛍光顕微鏡（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）のＰｈａｓｅ  ３  Ｐｒｏ  ｐｒｏｇｒａｍを用いて画像を得た。
【００６９】
統計解析
全ての値を、各実験群の３つの試料から計算された平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表す。必要に応じて、統計学的差異を両側ペア・スチューデントt-検定（Ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ、ｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  Ｔｅｓｔ）によって評価し、各実験群について特定のｐ値を得た。通常通り、示したデータは、２通りまたは３通り行った少なくとも３つの独立した実験を代表する。
【００７０】
実施例１  コンセンサスＤＮＡワクチンの構築物及び合成
ＪＥＶおよびＷＮＶ  Ｅ  ＤＩＩＩコンセンサス配列を生成するために、標本抽出バイアスを避けるため、ＧｅｎｅＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）から約１５個の異なる配列を異なる地理的領域から収集し、ＭｅｇＡｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて整列させた。ＩｇＥリーダー配列を得られたコンセンサス配列のアミノ末端に加え、２つのストップコドンを翻訳領域の末端に加えた。ＫｐｎｌおよびＰｓｔｌ部位をそれぞれ５’末端および３’末端に結合させた。ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（ＧＥＮＥＡＲＴ，  Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、完全配列をコドン最適化およびＲＮＡ最適化した。その後、コドン最適化合成配列を、本明細書記載のｐＶＡＸｌ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。
【００７１】
ヒトＩＬ−１５ＥＣＲＯのｐＶＡＸｌベクターへのクローニングおよびＩＬ−１５発現解析
天然のＩＬ−１５は２つの別のリーダーペプチドを含み、それらはＩＬ−１５の翻訳の調節に関わるだけでなく、その細胞内移動を指示する。標準的な長い（４８アミノ酸）シグナルペプチドはＩＬ−１５の全ての分泌型と関連し、一方、短い２１個のアミノ酸のシグナルペプチドを含むＩＬ−１５は、分泌されずむしろ細胞内に貯蔵される（１〜４）。最適化ヒトＩＬ−１５のプラスミド型（ｐＩＬ１５  ＥＣＲＯ）の設計は、タンパク質発現を増加させるために発明者らの実験室で設計され、ＬＳＰを「最適化」ＩｇＥリーダーと置換することを必要とする（５、６）。さらに、コドン使用頻度を、ヒト遺伝子のコドンバイアスに適合させ、高いＣＡＩ値（非最適化：０．６６；最適化：０．９８）を得た。ヒトおよびマウスの遺伝子は７３％の相同性を共有するので、マウスモデルを用いてインビボでｐＩＬ１５  ＥＣＲＯを利用した。設計および合成のために、可能であれば、非常に高い（＞８０％）または非常に低い（＜３０％）ＧＣ含有量の領域を避けるようにコドンを選択した。この点において、野生型ＩＬ１５遺伝子は高頻度にレアコドンを使用し、かつＧＣ含量が非常に低く（３５％）、迅速なｍＲＮＡの代謝回転を促進することが見出された。従って、ｍＲＮＡの半減期を延ばすために、ＧＣ含量を増加させた（５７％）。最適化の工程の間、以下のシス作用性配列モチーフを避けた：内部のＴＡＴＡボックス、Ｃｈｉ部位およびリボソーム進入部位、ＡＴリッチまたはＧＣリッチ配列ストレッチ、ＡＲＥ、ＩＮＳ（登録商標）、ＣＲＳ配列要素、反復配列およびＲＮＡ２次構造、（潜在性の）スプライス供与および受容部位ならびに枝分かれ部位。解析後、３つのネガティブにシス作用するモチーフを特定し、除去した。遺伝子の最終設計は、野生型ＬＳＰ型を置換したＩｇＥリーダーを有するヒトＩＬ１５の成熟型と１００％一致した。合成の高度に最適化したヒトＩＬ１５遺伝子を、Ｇｅｎｅａｒｔ社（Ｇｅｒｍａｎｙ）の合成オリゴヌクレオチドから構築した。コザック配列を導入し、翻訳開始を増加させ、２つのストップコドンを加えて効率的な翻訳終止を確実にした。ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏｌ制限酵素認識部位を用いて、その断片をｐＶＡＸｌにクローニングした。最終構築物を配列決定により検証し、１００％一致することが判明した。トランスフェクション１日前に、ＤｌＯ培地（ＤＭＥＭ、２０％ＦＢＳ、１％抗生物質）で増殖させた７．０×１０５のＨｅＬａまたはＲＤ細胞を、６０ｍｍ培養皿（Ｆａｌｃｏｎ）上に蒔いた。
【００７２】
その後、ＤＯＴＡＰリポソームトランスフェクションキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＣＡ）を用いて、メーカーの手順書に従い、５μｇのＩＬ−１５構築物でこれらの細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション２４、４８、および７２時間後に上清を回収し、メーカーの手順書に従い、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ）によりタンパク質量について解析した。
【００７３】
コンセンサス抗原の検証
配列決定により挿入断片配列確認後のワクチン接種試験への適用の前に、ＤＩＩＩワクチン構築物を、適切な分子量を有する遺伝子産物を発現するそれらの能力について検証した。インビトロ翻訳／転写システム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いることによって、３５Ｓ標識放射性タンパク質産物をこれらの構築物から生成し、免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。これらのプラスミドは、翻訳領域の予想された長さに相当する約１６．５ｋＤａの質量の遺伝子産物を生成した（図１Ｄ）。細胞内でのそれらの発現中に、適切なｍＲＮＡ転写産物の存在をＲＴ−ＰＣＲにより確認するために、空ベクターまたはＤＩＩＩ領域構築物を運ぶｐＶＡＸｌのいずれか一方でＲＤ細胞をトランスフェクトした。個々のＤＩＩＩ構築物を発現するトランスフェクトした細胞において、約４２０塩基対を有するｃＤＮＡの存在を、ＤＩＩＩ構築物でトランスフェクトした細胞からのみ観察した。模擬トランスフェクトした細胞から対応するシグナルが観察されなかったことが、このアッセイの特異異性を確かにする（図１Ｅ）。これらの結果は共に、ＪＥＶ、ＷＮＶおよびＪＥ／ＷＮＶ  ＤＩＩＩ構築物を検証し、それゆえに、これらの構築物についてさらに免疫化試験を行った。
【００７４】
ＩＬ−１５  ＥＣＲＯ構築物の発現解析
ＩＬ１５の局在パターンを確認するために、ＨｅＬａ細胞をこれらのＩＬ１５構築物のそれぞれでトランスフェクトし、モノクローナル抗ＩＬ１５抗体を用いて免疫蛍光解析を行った。予想通り、ＩＬ１５ＳＳＰは核領域内で保持され、ＩＬ１５  ＬＳＰおよびＩＬ１５  ＥＣＲＯの両方は、細胞質の局在パターンを示した（図２Ａ）。次に、ＲＤ細胞内でトランスフェクションアッセイを行い、機能的ＩＬ１５を発現し、分泌するそれらの能力に対するＩＬ１５構築物の効率を比較した。特異的ＥＬＩＳＡ解析によって測定した時、タンパク質産物および分泌の（天然ＩＬ−１５より８７倍高い、ＩＬ−１５−ＬＳＰ構築物より５．７倍高い）実質的増加が、ヒト最適化構築物ＩＬ１５  ＥＣＲＯから観察されたことをデータは示した（３３）（図２Ｂ、Ｃ）。ｐＩＬ１５  ＥＣＲＯ構築物は、発明者らが以前に報告した、ＩＬ１５を発現する全プラスミドよりもＩＬ１５を発現し、分泌することに非常に効率的であることをこれらのデータは明確に示す。
【００７５】
実施例２  ワクチン構築物のインビトロ発現
予想された分子量を有する遺伝子産物を生成する構築物の能力を、ワクチン接種試験に使用する前に確認した。ｐＶＡＸｌ骨格の中のＴ７プロモーターを利用することによって、ＴＮＴ  Ｔ７  インビトロ／翻訳キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、メーカーの手順書に従い、３５Ｓメチオニン標識タンパク質試料を生成した。これらの放射性標識タンパク質試料を、抗ＷＮＶ  Ｅまたは抗ＪＥＶ  Ｅ抗体により免疫沈降し、免疫沈降した複合体を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＢｉｏＲａｄ）で電気泳動を行った。このゲルを、リン酸エンハンサー溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて固定し、真空乾燥機（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて乾燥させた。オートラジオグラフィーを行い、取り込まれた３５Ｓ標識遺伝子産物を検出した。
【００７６】
図１Ａは、フラビウイルスポリペプチドの組成およびＥタンパク質の立体構造の特徴を模式的に示す。高い交差反応性細胞応答を誘導する能力を有する免疫原を開発する目的で、ＪＥＶおよびＷＮＶ  Ｅ  ＤＩＩＩ領域のアミノ酸配列を公共のデータベースからダウンロードした。これらの配列は多様な地理的な位置から選択し、それらは非組換えの配列であった。ＭｅｇＡｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）プログラムを使用して、これらのアミノ酸配列を整列させ、各位置の最も共通のアミノ酸を選択した。発明者らは、コンセンサスＷＮＶ  ＤＩＩＩ構築物、コンセンサスＪＥＶ  ＤＩＩＩ構築物およびキメラＪＥＶ構築物の３つの構築物を作製し、この中で中和抗体を誘導する決定因子であることが証明されたＷＮＶ  ＤＩＩＩのいくつかの残基は、ＤＩＩＩ断片の長さを変えることなく、ＪＥＶ  ＤＩＩＩの対応する位置に取り込まれた；この抗原をＪＥ／ＷＮＶ  ＤＩＩＩ領域と称する（図１Ｂ）。このキメラクローンの原理は、２つの個々のワクチン構築物のかわりに、ＷＮＶおよびＪＥＶの両方の向上した免疫力をもたらすことができる１つのワクチン構築物を有することであった。コンセンサス配列の生成後、ＩｇＥリーダー配列を、ＤＩＩＩ領域をコードする配列のＮ末端に融合した。アミノ酸配列に基づいて、ヒト最適化合成遺伝子配列を構築し、全３つのワクチン構築物について作製し、ｐＶＡＸベクターにクローニングした（図１Ｃ）。
【００７７】
実施例３  Ｅ  ＤＩＩＩタンパク質の細菌での発現
ＤＩＩＩコード領域を、Ｋｐｎｌ／Ｐｓｔｌによる消化によりそれらのｐＶＡＸ骨格から除去した。除去した断片をゲル精製し、その後Ｋｐｎｌ／Ｐｓｔｌで消化したｐＱＥ−３０に結合させた。結合産物をＪＭ  １０９細胞に形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に蒔いた。３７℃で一晩コロニーを形成させた。グリセロールストックを、個々のコロニーから調製した。タンパク質発現のために、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む６ミリリットルのＬＢ培養液を含む１６ｘ１５０ｍｍの試験管にグリセロールストックの３μｌ分を加えた。タンパク質試料の精製を行う標準手順書に従って、得られた細菌ペレットを処理し、溶解物をＮｉカラムに通過させた。得られた精製タンパク質試料を、ＥＬＩＳＡおよびＢ細胞増殖ＥＬＩＳｐｏｔアッセイのコーティング用抗原として使用する。
【００７８】
ＪＥＶ、ＷＮＶおよびＪＥ／ＷＮＶ  ＤＩＩＩタンパク質の産生
ＤＩＩＩコード断片を細菌発現ベクターにサブクローニングし、このタンパク質断片を本明細書記載のＮｉキレートカラムを用いて精製した。図３に、異なる精製ステップのＤＩＩＩ断片の精製量について記載する。ＤＩＩＩを発現する細菌細胞の粗溶解物を含むレーンは、ＩＰＴＧによる誘導がなくても、ＤＩＩＩ断片の発現量が非常に顕著であることを示した。全粗試料のレーンに存在する試料のラダーと比較すると、１６ｋＤａの質量に相当する明確な単一バンドが２５０ｍＭのイミダゾールを含む溶出画分から観察され、ＤＩＩＩ発現断片の高レベルな純度を示した。２０ｍＭの濃度のイミダゾールは、Ｎｉキレート基質からＨｉｓタグ付きＤＩＩＩ試料を遊離させるのに不十分であった。従って、溶出緩衝液におけるイミダゾールの選択は、ヒスチジン標識タンパク質の溶出には非常に特異的であった。本試験のコーティング用抗原として次に適用するために精製画分の濃度を決定した際、精製画分を透析し、アリコートで保存した。
【００７９】
実施例４  マウスおよび免疫化
メスの６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスをジャクソン研究所から購入した。６〜８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）の大腿四頭筋に、隔週の間隔で各１０μｇのＤＮＡを３回注射し、電気穿孔した。ＤＮＡの免疫化について、マウスを各５匹のマウス群に分離し、それぞれｐＩＬ１５  ＥＣＲＯおよびｐＶＡＸ（対照群）またはｐＩＬ１５  ＥＣＲＯおよびｐＪＥＶ  ＤＩＩＩ、ｐＩＬ１５  ＥＣＲＯおよびｐＪＥ／ＷＮＶ  ＤＩＩＩ、ｐＩＬ１５  ＥＣＲＯおよびｐＷＮＶ  ＤＩＩＩ、ならびにｐＩＬ１５  ＥＣＲＯおよびｐＪＥＶ  ＤＩＩＩ＋ｐＷＮＶ  ＤＩＩＩを用いて電気穿孔することにより免疫化した。
【００８０】
簡潔に述べると、短形波パルスを用い、短形波パルスを定電流ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）電気穿孔装置（ＶＧＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｌｕｅ  Ｂｅｌｌ，ＰＡ）を用いて送達した。３つの電極アレイ（３−ＥＡ）を用い、それは、非導電プラスチックによりまとめられた、０．５ｍｍ長の２つの長い側面および０．３ｍｍ長の短い側面を有する二等辺三角形の構造の３つの２６ゲージの堅いステンレス鋼電極から成る。プラスミド投与／ＥＰの一連のイベントは以下の通りであった：使い捨て電極アレイをハンドルの容器に入れ、ハンドルの開始ボタンを押し、動物の実験群の番号を入力し、インスリン注射器を用いてＤＮＡプラスミドを注射し、注射部位の周辺領域にアレイをすぐに置き、ハンドルの開始ボタンを押し、４秒の秒読み後、パルスを送達する。ＥＰ条件は、０．２アンペア、２パルス、５２ｍｓ／パルス、パルス間で１秒であった。全ての処置の間、全電極を筋肉に完全に挿入した。全ＤＮＡを内毒素の無いキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）カラムを用いて作製した。マウスを格納し、ペンシルベニア大学で処置し、ＮＩＨおよびペンシルベニア大学の動物の施設保護および使用に関する委員会（ＩＡＣＵＣ）の指針の下で飼育した。
【００８１】
ＤＮＡワクチン化血清の抗ＤＩＩＩ抗体の力価測定
ＤＮＡワクチンの送達のためのインビボ電気穿孔法（ＩＶＥ）をコンセンサス抗原と組み合わせ、合成ＤＮＡ抗原に対する潜在的な免疫反応を引き起こした。ｐＩＬ１５  ＥＣＲＯの存在下または非存在下で、Ｂａｌｂ／ｃマウスを個々のワクチン候補の各々で免疫化し、電気穿孔した（図４Ａ）。３回目の追加免疫１週間後に得たＤＮＡワクチン接種マウスの血清試料を、ＪＥＶおよびＷＮＶに対するそれぞれの抗体の存在について、ＥＬＩＳＡによりアッセイした。全ワクチン接種マウスはＤＩＩＩ領域に対する抗体を産生した。全ＤＮＡワクチン接種マウスの血清を、全３つの抗原：ＪＥＶ  ＤＩＩＩ、ＷＮＶ  ＤＩＩＩおよびＪＥ／ＷＮＶ  ＤＩＩＩに対して個々に評価した。
【００８２】
図４Ｂに示すように、ＥＬＩＳＡデータは興味深い結果を生み出した。第一に、ＩＬ１５プラスミドとＤＩＩＩ構築物の同時免疫が、ＪＥＶおよびＷＮＶ  ＤＩＩＩの両方の抗原に対する抗体産生を顕著に増加したことをこのアッセイは示した。比較的、ＩＬ１５の付加は、ＷＮＶ  ＤＩＩＩに対する最も高レベルの反応を誘導した。第二に、ＩＬ１５と同時免疫しなかった動物群において、ＪＥＶおよびＷＮＶ  ＤＩＩＩ発現プラスミドの組み合わせは、これらの２つのワクチン構築物の個々によって引き起こされた反応よりも高レベルの抗体産生を誘導した。第三に、キメラＪＥＶ／ＷＮＶ構築物に関して、抗体産生は顕著に低いことが判明した。ＩＬ１５が、このキメラ構築物に対して好ましい影響を及ぼしているようには見られなかった。従って、このキメラＪＥＶ／ＷＮＶ抗原は、ＪＥＶ  ＤＩＩＩおよびＷＮＶ  ＤＩＩＩたけでなく、キメラタンパク質それ自体に対する強力な抗体免疫反応を誘導する有望な抗原として役立たなかった。概して、ＷＮＶ  ＤＩＩＩおよびＩＬ１５構築物の混合物を投与したマウスの抗体力価は非常に高く、最も重要なことに、その群の血清は、全３つの抗原と結合することができ、この構築物によって誘導される広範囲の反応性を一貫して示した。
【００８３】
実施例５  ＤＩＩＩ抗体ＥＬＩＳＡアッセイ
ＤＩＩＩタンパク質懸濁液を解凍し、試験管をボルテックスして、細かいタンパク質微粒子に懸濁した。再懸濁したタンパク質試料の少量のアリコートをＴＵ（６２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／８Ｍ尿素、ｐＨ８．０）緩衝液に溶解し、１０μｇ／ｍｌ溶液を生成した。希釈したタンパク質試料の１００μｌ（１μｇ）分量を、Ｐｉｅｒｃｅ  ＨｉｓＧｒａｂの銅で被覆した高結合能プレートのウェルに入れ、４℃で一晩インキュベートした。次の日、プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）で洗浄し、ＰＢＳＴ中に存在する３％ＢＳＡで１時間ブロックし、３７℃で１時間、免疫化および天然マウスの段階希釈した血清とインキュベートした。１：１００００の希釈で、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＮＪ）を用いて、結合したＩｇＧを検出した。色素原基質溶液テトラメチルベンジン（ＴＭＢ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の付加により、結合した酵素を検出し、バイオテック社のＥＬ３１２ｅ  Ｂｉｏ−Ｋｉｎｅｔｉｃｓリーダーの４５０ｎｍにおいて読み取った。全血清試料を２通りで試験した。
【００８４】
ＤＩＩＩを発現するトランスフェクト細胞に対する抗ＤＩＩＩ血清の特異性
ＤＮＡワクチン接種したマウスの血清も試験し、それが、これらのワクチン構築物でトランスフェクトした細胞内で発現したＤＩＩＩ抗原と結合することができるか否かを確かめた。この目的のために、３つのＤＩＩＩをコードするｐＶＡＸ発現構築物でＨｅＬａ細胞を一過的にトランスフェクトし、トランスフェクション３６時間後、免疫蛍光解析のために細胞を固定した（上記方法を参照）。これらの細胞を最初に適切な血清試料とインキュベートし、その後、ＦＩＴＣ結合抗マウス２次抗体とインキュベートした。与えられたフィールドで利用可能な全細胞数を知るために、ＤＡＰＩを用いてこれらの細胞の核内容物を対比染色した。ＤＮＡワクチン接種したマウスの抗ＤＩＩＩ血清は、ＷＮＶ  ＤＩＩＩ（図５Ａ）およびＪＥＶ  ＤＩＩＩ（図５Ｂ）を発現したトランスフェクト細胞のみを染色した。その染色パターンは、フラビウイルス  Ｅの原型発現の染色パターンに似ていた（３５）。最も重要なことに、ＤＩＩＩ発現細胞は、主に細胞質局在パターンを明らかにした。抗ＤＩＩＩ血清は、非トランスフェクトＨｅＬａ細胞またはｐＶＡＸ１トランスフェクトＨｅＬａ細胞のいずれにおいてもいかなる顕著な染色も示さなかった。
【００８５】
実施例６  脾細胞の精製
３回目の免疫化の１週間後にマウスを屠殺し、各マウスの脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ  １６４０を含む１５ｍｌコニカル試験管（各実験群に対して１つの試験管）に貯蔵した。滅菌組織培養フードの中で、各実験群の貯蔵した脾臓をペトリ皿に置き、Ｓｔｏｍａｃｈｅｒブレンダー（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ）を用いて滅菌袋の中で粉砕した。これらの脾細胞を洗浄し、沈殿させた（１２００ｒｐｍ）；５〜１０分間、このペレットをＡＣＫ溶解緩衝液（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）で処理し、その後、洗浄し、沈殿させ（１２００ｒｐｍ）、残っているいかなる脾臓の臓器の基質をも除去するために、７０μｍ細胞濾過器に通過させた。これらの脾細胞を、ＲＰＭＩ  １６４０で２回洗浄し、ＲｌＯ培地（１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０）で再懸濁し、血球計を用いて数を数えた（細胞生存率を、トリパンブルー染色を用いて決定する）。
【００８６】
実施例７  記憶Ｂ細胞ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
ＥＬＩＳｐｏｔ９６ウェルプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をｌＯＯμｌ（２μｇ／ｍｌ）の精製タンパク質でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。別々のプレートに各コーティング用抗原を使用した。次の日、プレートを洗浄し、２時間、１％ＢＳＡでブロックした。免疫化マウスの２５万個の脾細胞を各ウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２で、５〜６時間、ＲＰＭＩ  １６４０存在下で刺激した（陰性対照）。インキュベーション後、これらの細胞を洗浄し、ビオチン化抗マウス抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に４℃で一晩、インキュベートした。これらのプレートを洗浄し、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を各ウェルに加えて、常温で２時間、インキュベートした。このプレートを再び洗浄し、５−ブロモ−４−クロロ−３’−インドリルリン酸Ｐ−トルイジン塩およびニトロブルー塩化テトラゾリウム（色原体色試薬；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を各ウェルに加えた。その後、プレートを蒸留水でリンスし、常温で乾燥させた。自動化ＥＬＩＳＰＯＴリーダー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）によりスポットを数えた。結果を抗原特異的抗体分泌細胞数（ＡＳＣｓ）として表す。
【００８７】
ＪＥＶおよびＷＮＶ抗原に対するＩＬｌ５により強化された記憶Ｂ細胞の活性化
Ｂ細胞ＥＬＩＳＰＯＴ技術は、適切な抗原による刺激後、抗体分泌プラズマ細胞の中にＢ−記憶細胞のインビトロ分化を誘導することにより、抗原特異的記憶Ｂ細胞の定量化を可能にする。ＩＬ１５アジュバンドによって誘導される免疫反応の質をさらに評価するため、Ｂ−記憶反応をマウスにおいて評価した。「方法」の欄で記載したように、マウスの脾臓を準備し、ＤＩＩＩタンパク質に対する抗体を産生することができるＢ細胞の発生頻度を測定した。興味深いことに、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイの結果は、上記のＤＩＩＩ抗体のＥＬＩＳＡデータと一致する。ＤＩＩＩＤＮＡワクチンのみを投与した群よりも、ＩＬ１５で共刺激したマウスにおいて、ＤＩＩＩ特異的マウス抗体分泌細胞の高い発生頻度を観察した（図６）。この群が最も高レベルの抗体分泌細胞を示したことを証明したので、ＩＬ１５が、ｐＷＮＶ  ＤＩＩＩワクチンに対する抗体分泌細胞応答を明確に高めたこともこのアッセイは示唆した。最も重要なことに、この群の動物の血清を用いたＥＬＩＳＡデータにおいて観察されたように、ＷＮＶ  ＤＩＩＩ＋ＩＬ１５の群のＢ細胞は全３つの抗原と結合するができた。この群とは別に、ＪＥＶ  ＤＩＩＩ＋ＩＬ１５は、ＪＥＶ  ＤＩＩＩのみを投与したマウスより、Ｂ−細胞応答量の増加を示した。キメラＪＥ／ＷＮＶ  ＤＩＩＩワクチン接種マウスのＥＬＩＳＡの結果と一致して、この群のマウスのＢ細胞は、ＪＥＶ  ＤＩＩＩまたはＷＮＶ  ＤＩＩＩのワクチン接種マウスだけでなく、キメラ抗原のみを投与した群と結合しなかった。総合すると、ＥＬＩＳＡ試験によって決定されたＤＩＩＩ特異的抗体の力価に相当する高い親和性の抗原特異的Ｂ細胞の活性化を、ＥＬＩＳｐｏｔの結果は示した。
【００８８】
発明者らの試験結果は、ＤＩＩＩタンパク質試料が有望なワクチン候補ではないかもしれないという可能性と一致する。１つの可能な解釈は、正しく折り畳まれた可溶化タンパク質の割合が低く、異なる研究者によって行われる精製手段も、ｒＤＩＩＩの免疫原性に影響を与え得るということである。発明者らは、ＩＬ１５の援助なしに、単量体のＤＩＩＩ発現構築物の使用から、満足できる抗体を見つけることは出来なかった。本試験において、発明者らは、１匹の動物あたりわずか２０μｇのＤＮＡを用いることによって、Ｂ−細胞増殖および抗体産生の量の増加を示した。従って、ＩＬ１５プラスミドと組み合わせたＤＮＡワクチンは、ＪＥＶおよびＷＮＶに対する免疫化の、より優れた、費用効率の高い代替物となることができた。
【００８９】
まとめると、本実験で得られたこれらのデータは、ＤＩＩＩが、有効なアジュバントと組み合わせて使用することができる、ＷＮＶおよびＪＥＶに対する防御免疫の誘導のために使用される前途有望な、洗練されたワクチン候補であることを示す。ＩＬ１５の共刺激により抗体産生細胞の量が４〜５倍増加したことが、ＷＮＶおよびＪＥＶに対する抗体産生記憶Ｂ細胞の増加を経て、ＩＬ１５が中和抗体の産生を誘導することができるという直接証拠をもたらした。発明者らがキメラＤＩＩＩタンパク質の作製について説明した原理に反して、抗体反応の不全および抗体産生記憶Ｂ細胞の最低数から分かるように、得られたキメラタンパク質は優れた抗原として機能しなかった。ＷＮＶ  ＤＩＩＩからＪＥＶ  ＤＩＩＩへのエピトープの導入が、免疫反応を引き起こすための適切な提示を必要とする構造状態に影響を与えたかもしれないということが、１つの可能性のある理由であり得る。それゆえ、キメラタンパク質は、天然のＪＥＶおよびＷＮＶのＤＩＩＩなどのその前駆体分子と比較すると、免疫反応を誘導することにおいて機能が低い。今まで、いかなるヒトの実験においても、ＩＬ−１５が全身的に使用されたことはない。最近、ＩＬ−１５が、髄膜炎、関節リュウマチ、自己免疫甲状腺炎、自己免疫性糖尿病のメディエーターとして関係しているとみなされていることに留意すべきである。Ｍｃｌｎｎｅｓらおよび他の研究所は、関節リュウマチの関節の髄液に存在する高濃度のＩＬ−１５について報告をし、ＩＬ−１５が髄膜の裏打ち細胞によって発現することを示した。今まで、自己免疫疾患の誘導とＩＬ−１５の因果関係とを直接的に関連付けるヒトの試験は無かった。発明者らは、ｐＩＬ−１５−Ｏｐｔを注射しても、マウスの血清において、抗ヒトＩＬ−１５  Ａｂが検出不能なレベルにあると確定し、ワクチン接種マウスの血清においてヒトＩＬ−１５を検出することができず（未発表の観察）、これらのことは、ｐＩＬ−１５−Ｏｐｔのワクチン接種後に産生されるＩＬ−１５の量は非常に低いが、本試験で観察されたＤＩＩＩ特異的免疫反応を局所的に高めることに十分な量であるということを示唆する。
【００９０】
本報告は、最適化サイトカインプラスミド由来のＩＬ−１５が、中和抗体反応を誘導する役割として知られるフラビウイルスＤＩＩＩに特異的な記憶Ｂ細胞を増加することができる方法を示す。
参考資料
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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