(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗原結合領域をコードするポリヌクレオチドライブラリであって、該ポリヌクレオチドライブラリがコードするＣＤＲ配列において、
（ｉ）ＣＤＲ配列内の任意の一つの位置のアミノ酸残基が、標的抗原に対する抗体由来のクエリーＣＤＲペプチド配列とのアラインメントを行った際のそのクエリーＣＤＲペプチド配列の対応する位置のアミノ酸残基と同一であるか；または
（ii）アラインメントを行った位置にクエリーＣＤＲペプチド配列と同一のアミノ酸残基が参照ライブラリに存在しない場合は、参照ライブラリのペプチド配列の対応する位置のアミノ酸残基であり、
ここで、ポリヌクレオチドライブラリが、配列番号１３〜２７、４３〜１８９、１９１〜１９８、２００〜２０５および２０７〜２３６のいずれかのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３コホートライブラリ配列のいずれかに示されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３配列を含むＣＤＲアナログをコードし、
ポリヌクレオチドライブラリが、配列番号１３〜２７、４３〜１８９、１９１〜１９８、２００〜２０５および２０７〜２３６のいずれかのＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３コホートライブラリ配列のいずれかに示されるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３配列を含むＣＤＲアナログをコードし、
そしてここで、参照ライブラリは、ヒト生殖細胞系可変領域配列ライブラリである、上記ポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項２】
前記標的抗原がタンパク質、ペプチド、低分子、脂質、多糖類、またはポリヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項３】
クエリーＣＤＲペプチド配列が合成ＣＤＲ配列または脊椎動物ＣＤＲ配列である、請求項１に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項４】
脊椎動物ＣＤＲ配列がヒト、霊長類、マウス、ラット、ウサギ、またはニワトリ配列である、請求項３に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項５】
クエリーＣＤＲペプチド配列が標的抗原に結合する、請求項１に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項６】
標的抗原がタンパク質、ペプチド、低分子、多糖類、またはポリヌクレオチドである、請求項５に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項７】
ポリヌクレオチドライブラリ配列の１０％より多くが既知の天然に存在するＣＤＲ配列をコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項８】
ポリヌクレオチドライブラリ配列の５０％より多くが既知の天然に存在するＣＤＲ配列をコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項９】
ポリヌクレオチドライブラリ配列の８０％より多くが既知の天然に存在するＣＤＲ配列をコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項１０】
ポリヌクレオチドライブラリが、任意の所定のＣＤＲについて既知の天然に存在する多様性のみを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項１１】
ポリヌクレオチドライブラリが、ヒトＣＤＲについての全ての既知のＣＤＲの多様性を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項１２】
ポリヌクレオチドライブラリが、ある抗原クラスについての全ての既知のＣＤＲの多様性を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドライブラリが発現ライブラリである、請求項１に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項１４】
発現ライブラリが、リボソームディスプレイライブラリ、ポリソームディスプレイライブラリ、ファージディスプレイライブラリ、ウイルスディスプレイライブラリ、細菌発現ライブラリ、酵母ディスプレイライブラリ、および哺乳動物ディスプレイライブラリからなる群より選択される、請求項１３に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項１５】
一つまたはそれ以上のフレームワーク領域および一つまたはそれ以上のＣＤＲ領域をコードする、既定のポリヌクレオチドを合成することによって作製され、これらの領域をコードするポリヌクレオチドがさらに十分に重複する配列を含み、それによって、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）条件下でこのポリヌクレオチド配列から完全な抗原結合領域をコードするポリヌクレオチドが構築され得る、請求項１に記載のポリヌクレオチドライブラリ。
【請求項１６】
請求項１に記載のポリヌクレオチドライブラリのポリヌクレオチドによりコードされる抗原結合領域。
【請求項１７】
抗原結合領域を生成させるために請求項１３に記載の発現ライブラリを発現させること、および
所望の結合親和性を有する抗原結合領域を選択するために抗原結合領域をスクリーニングすることを含む、
所望の結合親和性を有するポリペプチドの同定方法。
【請求項１８】
スクリーニングが抗原結合領域を標的基質と接触させることを含み、抗原結合領域が抗原結合領域をコードするポリヌクレオチドと関連付けられている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
選択された抗原結合領域をコードするポリヌクレオチドを同定する工程をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ポリヌクレオチドが、リボソームディスプレイライブラリ、ポリソームディスプレイライブラリ、ファージディスプレイライブラリ、ウイルスディスプレイライブラリ、細菌発現ライブラリ、酵母ディスプレイライブラリ、および哺乳動物ディスプレイライブラリからなる群より選択される発現ディスプレイを用いて抗原結合領域と関連付けられる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
一つまたはそれ以上の工程がコンピューター支援により行われる、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書を通じて引用した全ての特許、特許出願、および参考文献の内容は、その全体を参照により本明細書で援用する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、研究ツールとして、ならびに診断および治療用途において非常に関連性がある。しかし、このような有用な抗体の同定は困難であり、しばしば、治療用途が想定される場合は特に、抗体が投与に適したものなるまで、相当な再設計または「ヒト化」が必要となる。
【０００３】
これまでの望ましい抗体の同定方法は、典型的には、代表的な抗体、例えばヒトライブラリまたは合成ライブラリのファージディスプレイを利用するものであるが、これらのアプローチには限界がある。例えば、ほとんどのヒトライブラリは、その供給源の組織から実験的に獲得またはクローニングできる抗体配列の多様性しか含まない。別の言い方をすれば、ヒトライブラリは、他の有益な抗体配列を欠いているかまたはそれらが不十分な可能性がある。合成ライブラリまたはコンセンサスライブラリは、例えば免疫原である可能性を有する非天然配列をコードする潜在性のような他の限界も有する。さらに、合成ライブラリは、包括的であろうとするがために、多様性がありすぎスクリーニングが困難な場合が多い。さらに、これらのライブラリは、特定の標的に結合する候補抗体を同定するために使用される場合、その候補分子の結合を改善する合理的、後追い的な親和性成熟技術と適合しない。例えば、事後的な抗体改善方法は、多くの場合、インビトロ変異誘発、例えばランダム突然変異誘発、飽和変異誘発、エラープローンＰＣＲ（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ）、遺伝子シャッフリング、および抗体鎖シャッフリングを伴うものである。これらのストラテジーは、本質的に確率論的なものであり、どのような有意義な配列多様性をも調査するために過剰に大規模なライブラリを構築することが求められる場合が多い。所定の抗体内の変異位置の数が多くなるにつれて、得られるライブラリのサイズは現実的にスクリーニングできる範囲を超えて大きくなる。
【０００４】
最近確認された方法は、所望の特性を有する非免疫原性の天然に存在する候補抗体を体系的に提示するユニバーサル抗体ライブラリ、例えば生殖細胞系（例えばＶ  ＢＡＳＥデータベース由来の抗体）および／または成熟抗体（例えばＫａｂａｔデータベース由来の抗体）における既知の優先的な（例えば調査した集団において＞１０％の頻度）天然に存在するＣＤＲの多様性を完全に提示するライブラリをインシリコ（および場合によりインビトロ）で構築することを示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
抗体の設計（例えば最適な親和性および最小の免疫原性を有する新規なヒト抗体の設計）を向上させるために、参照ライブラリ、例えばユニバーサル抗体ライブラリ内に含まれる天然配列の多様性に関する情報を最適に利用することのできる合理的、効率的なプロセスに対する要望が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、新規な抗体および／またはそのフラグメントにおいて使用するための新規な候補ＣＤＲ配列を同定するために、クエリー抗体の少なくとも一つのＣＤＲ配列を使用して参照抗体ライブラリ（例えばユニバーサル抗体ライブラリ）を検索するプロセスを提供することによって、上記の課題を解決する。
【０００７】
一つの実施態様において、本発明は、任意の選択されたＣＤＲ残基において参照ライブラリ（例えばユニバーサル抗体ライブラリ）に存在する既知の、優先的な、天然に存在する多様性のみを提示する少なくとも一つのＣＤＲ配列を含む配列ライブラリ（コホートライブラリ）を生成させる方法を特徴とする。参照ライブラリのＣＤＲドメインに存在するアラインメントを行った残基ごとの配列多様性は独立してソートされ、このようなコホートＣＤＲライブラリのメンバーとして新規なＣＤＲ配列が生成される。
【０００８】
本発明のアウトプット（コホート）ＣＤＲライブラリは、主として、参照（多様性）ライブラリから選択される残基ごとのヒト配列の多様性で構成されるが、本発明の方法はまた、アウトプットライブラリ配列において特定のＣＤＲ残基を「固定」し、その残基の位置において例えばアラインメントを行ったクエリー配列に存在する残基にマッチングさせることもできる。特定のアウトプット（コホートライブラリ）配列の残基をクエリー配列の残基として固定するには、「ギャップ導入アラインメント」ストラテジーを用いて本発明の方法の実施を伴う場合もある。このようなギャップ導入アラインメントストラテジーはまた、本発明の方法に十分な柔軟性を与え、クエリー配列および参照（多様性）ライブラリ配列のアラインメントにおいてならびに／またはアウトプット（コホートライブラリ）配列の生成の際に、一つまたはそれ以上のヌクレオチド長のヌクレオチド挿入および／または欠失（ｉｎ／ｄｅｌ）の存在を許容するために利用され得る。
【０００９】
本発明の方法はまた、アウトプット（コホート）ＣＤＲライブラリの全体的な多様性を合理的な様式で調整するために、クエリー配列とライブラリ配列の残基間の類似比較（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ）の使用を可能にする。このような実施態様において、２０個の天然に存在する哺乳動物のアミノ酸残基は、側鎖の特徴に基づき７つの別個のグループに割り当てられる。所定のＣＤＲの位置のクエリー残基がヒト多様性ライブラリの同じ位置の残基と一致しない場合、このような類似比較の使用は、一つまたはそれ以上の類似残基が参照（多様性）ライブラリに存在する場合、このような一つまたはそれ以上の類似残基を、アウトプット（コホート）ライブラリのその残基の位置における構成要素として選択することを可能にする。アウトプット（コホート）ＣＤＲの残基の選択に類似基準を適用することにより、同一基準（ある位置におけるクエリー配列の残基と参照（多様性）ライブラリの残基が非同一であれば、得られるアウトプット（コホート）ライブラリの対応する位置において、参照（多様性）ライブラリのその位置に存在する全てのＣＤＲの残基を使用することになるもの）を使用した場合と比較して、複雑度が低下したコホートライブラリが生成させ得る。このような類似基準はまた、任意に選択されるＣＤＲ残基の位置において許容的（ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ）または制限的（ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｖｅ）様式で適用され得る。特定の実施態様において、類似基準の適用は、アウトプット（コホート）ライブラリ配列のその位置への導入について、対応するクエリー配列の残基と類似する一つのみのアミノ酸残基を参照（多様性）ライブラリから選択することがある。他の実施態様において、所定の位置においてクエリー配列の残基と類似する二以上の参照（多様性）ライブラリのアミノ酸残基が、本発明のアウトプット（コホート）ライブラリ配列において使用するために選択され得る。このような実施態様の最も許容的な場合、所定の（クエリー配列と参照ライブラリの間で）非同一な残基のところで参照（多様性）ライブラリに存在する全ての類似の残基が、アウトプット（コホート）配列ライブラリのその残基のところで提示される（「全類似」基準と称する）。本発明の方法は、任意に選択される残基の位置において、アウトプット（コホート）ライブラリ配列を生成させるために、上記の基準（固定残基／ギャップ導入アラインメント、ｉｎ／ｄｅｌ、任意の許容度の類似基準、および／または同一基準）を任意の組み合わせで使用することで実施され得る（従ってクエリー配列の一つの残基の位置に適用される基準は同じ配列内の隣の残基に適用される基準とは別個のものであってよい）。
【００１０】
本発明の選択されたコホートＣＤＲライブラリおよび／またはコホートＣＤＲライブラリから選択された配列は、相互に（および選択されたフレームワークドメインの配列と共に；例えば遺伝子のＳＯＥ（シングル・オーバラップ・エクステンション）を通じて）組み合わされ、残基ごとに試験することによって天然に存在するＣＤＲのバリエーションを優先的に組み込んだ、従ってこのような新規抗体またはフラグメントが免疫原性である可能性を最小限に抑えた、少なくとも一つの抗体またはそのフラグメントを含む新規な抗体ライブラリが完全に作製され得る。
【００１１】
本発明の任意の選択されたＣＤＲライブラリの複雑度は、ランダム型またはその他の形式の合成ＣＤＲライブラリと比較して最小限に抑えられているので、本発明の選択されたＣＤＲライブラリ（例えば、独立したＶH  ＣＤＲ１、ＶH  ＣＤＲ２、ＶH  ＣＤＲ３等
のライブラリ）はまた相互に独立してソートされ、例えば、クエリーＣＤＲ配列が任意の参照ライブラリのある位置のＣＤＲアミノ酸の残基と同一ではないアミノ酸残基における全てのＣＤＲの配列を網羅する全てのヒトの多様性を提示するが、それでも現在の技術を用いて容易にスクリーニングできるサイズ（例えば約１０12〜１０15未満、より好ましくは１０〜１０12、またはその間もしくは範囲のライブラリの複雑性）である、新規な抗体ライブラリが作製され得る。本発明はまた、本発明のプロセスによって作製される組成物および本発明の特徴であるプロセスを実施するための機器を特徴とする。
【００１２】
従って本発明は、少なくとも一つの相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするポリヌクレオチドのライブラリを作製する方法であって、天然に存在するＣＤＲアミノ酸領域を含む参照抗体ライブラリに存在するＣＤＲのアミノ酸配列のバリエーションを、ＣＤＲの各アミノ酸残基の位置で決定し；標的抗原に対する抗体由来のクエリーＣＤＲペプチド配列と参照抗体ライブラリのＣＤＲ配列のアラインメントを行い；および合成されるライブラリのＣＤＲ配列の大部分において、ＣＤＲ配列内の任意の一つの位置でコードされるアミノ酸残基が、候補抗原に対する抗体由来のクエリーＣＤＲペプチド配列の対応するアラインメントを行った位置のアミノ酸残基と同一であるか；またはアラインメントを行った位置にクエリーＣＤＲペプチド配列と同一のアミノ酸残基が参照ライブラリに存在しない場合は、既定のアミノ酸残基となるように、ＣＤＲ配列をコードするポリヌクレオチドのライブラリを合成することを含み、それによって、一つまたはそれ以上の残基の位置において天然に存在するアミノ酸残基が豊富な、標的抗原に対する抗体由来のクエリーＣＤＲペプチド配列のＣＤＲアナログをコードするポリヌクレオチドのライブラリが提供される、方法を特徴とする。一つの実施態様において、アラインメントを行うクエリーＣＤＲのアミノ酸長は４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５である。別の実施態様において、既定のアミノ酸残基が、グリシン（Ｇ）およびアラニン（Ａ）からなる群より選択される小型の側鎖のアミノ酸残基；セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）、およびヒスチジン（Ｈ）からなる群より選択される求核性側鎖のアミノ酸残基；バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、およびプロリン（Ｐ）からなる群より選択される疎水性側鎖のアミノ酸残基；フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、およびトリプトファン（Ｗ）からなる群より選択される芳香族側鎖のアミノ酸残基；アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）からなる群より選択される酸性側鎖のアミノ酸残基；アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）からなる群より選択されるアミド側鎖のアミノ酸残基；またはリジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）からなる群より選択される塩基性側鎖のアミノ酸残基である。特定の実施態様において、アラインメントは、ギャップ導入アラインメント、完全アラインメント、不連続アラインメント、またはそれらの組み合わせからなる群より選択されるプロセスによって行なわれる。別の実施態様において、ＣＤＲは、ＥＵインデックス、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａに従い、または接触点定義（ｃｏｎｔａｃｔ−ｐｏｉｎｔ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）に基づき定義される
。さらなる実施態様は、上記方法により作製されるライブラリを特徴とする。
【００１３】
さらなる側面において、本発明は、少なくとも一つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗原結合領域のライブラリであって、ライブラリのＣＤＲ配列の大部分について、ＣＤＲ配列内の任意の一つの位置のアミノ酸残基が、標的抗原に対する抗体由来のクエリーＣＤＲペプチド配列の対応するアラインメントを行った位置のアミノ酸残基と同一であるか；またはアラインメントを行った位置にクエリーＣＤＲペプチド配列と同一のアミノ酸残基が参照ライブラリに存在しない場合は、既定のアミノ酸残基となり、それによって、一つまたはそれ以上の残基の位置において天然に存在するアミノ酸残基が豊富な、候補抗原に対する抗体由来のクエリーＣＤＲペプチド配列のＣＤＲアナログのライブラリが提供される、ライブラリを特徴とする。一つの実施態様において、参照抗体ライブラリの標的抗原はタンパク質、ペプチド、低分子、脂質、多糖類、またはポリヌクレオチドである。別の実施態様において、クエリーＣＤＲペプチド配列は合成ＣＤＲ配列または脊椎動物ＣＤＲ配列である。さらなる実施態様において、脊椎動物ＣＤＲ配列はヒト、霊長類、マウス、ラット、ウサギ、またはニワトリ配列である。
【００１４】
特定の実施態様において、クエリーＣＤＲペプチド配列は標的抗原に結合する。関連する実施態様において、標的抗原はタンパク質、ペプチド、低分子、多糖、またはポリヌクレオチドである。さらなる実施態様において、ライブラリ配列の１０％より多く、５０％より多く、８０％より多くが既知の天然に存在するＣＤＲ配列を含む。一つの実施態様において、ライブラリは、任意の所定のＣＤＲについて既知の天然に存在する多様性のみを含む。別の実施態様において、ライブラリは、ヒトＣＤＲについての全ての既知のＣＤＲの多様性を含む。さらなる実施態様において、ライブラリは、抗原クラスについての全ての既知のＣＤＲの多様性を含む。特定の実施態様において、ＣＤＲアナログは、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。他の実施態様において、クエリーＣＤＲ配列は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３からなる群より選択される。さらなる実施態様において、二以上のＣＤＲのアラインメントを行い、一つの合成ＣＤＲライブラリ配列の多様性が、直線的に連結されたＣＤＲの可変性に基づき規定、拡張、または限定される。
【００１５】
一つの実施態様において、ＣＤＲ−Ｈ１は、図１３または１６〜２７のいずれかに示されるコホートライブラリのアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、ＣＤＲ−Ｈ２は、図１３または１６〜２７のいずれかに示されるコホートライブラリのアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、ＣＤＲ−Ｈ３は、図１３または１６〜２７のいずれかに示されるコホートライブラリのアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、ＣＤＲ−Ｌ１は、図１３または１６〜２７のいずれかに示されるコホートライブラリのアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、ＣＤＲ−Ｌ２は、図１３または１６〜２７のいずれかに示されるコホートライブラリのアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、ＣＤＲ−Ｌ３は、図１３または１６〜２７のいずれかに示されるコホートライブラリのアミノ酸配列を含む。
【００１６】
特定の実施態様において、軽鎖ＣＤＲ−Ｌ１（ラムダ（Ｌ））は、図４４に示されるアミノ酸配列を含む。他の実施態様において、軽鎖ＣＤＲ−Ｌ１（カッパ（Ｋ））は、図４４に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる実施態様において、軽鎖ＣＤＲ−Ｌ２は、図４４に示されるアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、軽鎖ＣＤＲ−Ｌ３は、図４４に示されるアミノ酸配列を含む。
【００１７】
一つの実施態様において、ＣＤＲアナログは、図９〜３１、３４〜３６、または４４〜６１のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、ＣＤＲアナログは、ＣＤＲアナログ内の一つまたはそれ以上の残基が縮重コドン、ウォークスルー型変異誘発、またはルックスルー型変異誘発を用いて示される多様性を含む。さらなる実施態様において、抗体結合領域はさらに、一つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、挿入、または欠失を含む。さらなる実施態様において、抗原結合領域はさらに、ヒト、霊長類、マウス、ラット、ウサギ、またはニワトリ由来の天然に存在するフレームワーク領域を含む。特定の実施態様において、天然に存在するフレームワーク領域は、ＶＨ１、ＶＨ３、またはＶＨ４である。関連する実施態様において、ヒトフレームワーク領域は、軽鎖フレームワーク領域、重鎖フレームワーク領域、交配クローニングにより得た（ｃｒｏｓｓ−ｃｌｏｎｅｄ）フレームワーク領域、コンセンサスフレームワーク領域、またはそれらの組み合わせである。別の実施態様において、ヒトフレームワーク領域は、一つまたはそれ以上のヒトＣＤＲ領域との直線的接続におけるそれらの出現頻度に従い選択されている。別の実施態様において、ＣＤＲ間のヒトフレームワーク領域はアイソタイプ一致させたものである。
【００１８】
一つの実施態様において、本発明のライブラリは発現ライブラリである。特定の実施態様において、発現ライブラリは、リボソームディスプレイライブラリ、ポリソームディスプレイライブラリ、ファージディスプレイライブラリ、ウイルスディスプレイライブラリ、細菌発現ライブラリ、酵母ディスプレイライブラリ、および哺乳動物ディスプレイライブラリからなる群より選択される。さらなる実施態様において、ライブラリは、一つまたはそれ以上のフレームワーク領域および一つまたはそれ以上のＣＤＲ領域をコードする既定のポリヌクレオチドを合成することによって作製され、これらの領域をコードするポリヌクレオチドはさらに十分に重複する配列を含み、それによりポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）条件下でこのポリヌクレオチド配列から完全な抗体結合領域をコードするポリヌクレオチドが構築され得る。本発明の別の実施態様は、本発明のライブラリのポリヌクレオチドによりコードされる抗体結合領域を特徴とする。さらなる実施態様は、抗体結合領域を作製するために本発明の発現ライブラリを発現させること、および所望の結合親和性を有する抗体結合領域を選択するために抗体結合領域をスクリーニングすることを含む、所望の結合親和性を有するポリペプチドの同定方法を特徴とする。一つの実施態様において、スクリーニングは、抗原結合領域を標的基質と接触させることを含み、抗体結合領域は、抗体結合領域をコードするポリヌクレオチドと関連している。別の実施態様において、この方法は、選択された抗体結合領域をコードするポリヌクレオチドを同定する工程をさらに包含する。さらなる実施態様において、ポリヌクレオチドは、リボソームディスプレイライブラリ、ポリソームディスプレイライブラリ、ファージディスプレイライブラリ、ウイルスディスプレイライブラリ、細菌発現ライブラリ、酵母ディスプレイライブラリ、および哺乳動物ディスプレイライブラリからなる群より選択される発現ディスプレイを用いて抗体結合領域と関連付けられる。さらなる実施態様は、上記方法に従い同定される抗体結合領域を特徴とする。
【００１９】
一つの実施態様において、本発明の特徴的な方法の一つまたはそれ以上の工程は、コンピューター支援により行われる。関連する実施態様は、本発明の方法の一つまたはそれ以上の工程を実行するための指令を含む、電子機器において使用するのに適した媒体を特徴とする。別の実施態様は、本発明の方法の一つまたはそれ以上の工程を実行するための機器を特徴とする。
【００２０】
最後の側面は、図または表のいずれかに示される配列を有する一つまたはそれ以上のフレームワーク領域；および図または表のいずれかに示される配列を有する一つまたはそれ以上のＣＤＲ領域、を含む抗体結合領域をコードし、ａ）のフレームワーク領域およびｂ）のＣＤＲ領域が組み合わされて既定の抗原に対する抗体結合領域が形成される、ポリヌクレオチドのライブラリを特徴とする。
【００２１】
図１は、本発明の特定の実施態様において特徴的なユニバーサル抗体ライブラリの構築をコンピュータ支援データベースバイオマイニングを用いて実行するための概略図を示す。
図２は、クエリーｍＡｂ  ＣＤＲプローブをコホートライブラリのインシリコ同定に使用する本発明の選択プロセスを強調したものであり、コホートライブラリはその後に最適化コホートクローンを同定するためのインビトロスクリーニングアプローチに使用され得る。
図３は、コホートの調査のおいて使用するために照合ユニバーサル抗体ライブラリを構築するプロセスの概要を示す。
図４はＣＤＲ１およびＣＤＲ２の頻度表を生成させるプロセスの概要を提供する。
図５は、ＵＡＬフレームワークおよびＣＤＲ配列の、ＶＨ（記載順に、それぞれ、配列番号１〜５）、Ｖκ（記載順に、それぞれ、配列番号６８）、およびＶλ（記載順に、それぞれ、配列番号９〜１２）クラス間での分配分類の例を示す。
図６は、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２フレームワークの交配を可能にするＵＡＬ重鎖の構築の例を示す。
図７は、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２フレームワークの交配を可能にするＵＡＬカッパ軽鎖の構築の例を示す。ＶＫ−３＿ＣＤＲ１−７、ＶＫ−１＿ＣＤＲ２−１０、およびＶＫ−３＿ＣＤＲ２−１０の配列は、それぞれ、配列番号１６７、２７６、および２７８として開示した。
図８は、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２フレームワークの交配を可能にするＵＡＬラムダ軽鎖の構築の例を示す。ＶＬ−１＿ＣＤＲ２−１０、ＶＬ−２＿ＣＤＲ２−１０、およびＶＬ−３＿ＣＤＲ２−１０の配列は、配列番号２８０として開示した。
図９は、１２残基長のＶＨ−４アイソタイプクラスのＣＤＲ２配列について同定された４つのカノニカル構造（図９ＡはＣＳ１−Ａ（配列番号６３６）およびＣＳ１−１（配列番号６３７）を示し、図９ＢはＣＳ１−２（配列番号６３８）およびＣＳ１−３（配列番号６３９）を示す）についての位置ごとのアミノ酸残基の集団優先性のヒストグラムを示す。集団優先性の分布は可変性残基の位置において４つのサブクラスの間で変化することが観察される。
図１０（マウスＣＤＲ１プローブＶＨ  ＣＤＲ１「ＴＮＹＧＭＮ」（配列番号１３）を用いるＵＡＬのブラスティング）は、ＶＨ−１  ＣＤＲ１（配列番号１４）およびＶＨ−３  ＣＤＲ１（配列番号１５）参照ユニバーサル抗体ライブラリに存在するヒトＣＤＲ１配列における各ＣＤＲ１アミノ酸位置に存在する配列多様性を同定するための、マウス抗体由来のＣＤＲ１ペプチド配列の使用例を示す。
【００２２】
図１１（マウスＣＤＲ２プローブＶＨ  ＣＤＲ２「ＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴ」（配列番号１６）を用いるＵＡＬのブラスティング）は、ＶＨ−１  ＣＤＲ２（配列番号１７）およびＶＨ−３  ＣＤＲ２（配列番号１８）参照ユニバーサル抗体ライブラリに存在するヒトＣＤＲ２配列における各ＣＤＲ２アミノ酸位置に存在する配列多様性を同定するための、マウス抗体由来のＣＤＲ２ペプチド配列の使用例を示す。
図１２は、新規な抗体配列を生成させるために参照ライブラリの多様性の独立組み合わせにより生成されたコホートライブラリの多様性を計算した、数量化コホートライブラリの例を示す。
図１３は、マウスＡｖａｓｔｉｎ  Ａ４．６．１抗体由来のクエリー配列を用いる重鎖（図１３Ａ−１〜１３Ａ−４）および軽鎖（カッパ、図１３Ｂ−１〜１３Ｂ−３）についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。図１３Ａ−１において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１３および１５として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１３および１４として開示される。図１３Ａ−２において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１６および１７として開示される。図１３Ａ−３において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１６および１８として開示される。図１３Ａ−４において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１９および２０として開示される。図１３Ｂ−１において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２１および２２として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号２１および２４９として開示される。図１３Ｂ−２において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２３および２４として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号２３および２５として開示される。図１３Ｂ−３において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号２６および２７として開示される。
図１４（パネルＡ〜Ｅ）は、マウス抗ＨＩＶ  ｇｐ４１モノクローナル抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖および軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲ配列の選択を示す。下線は触媒性の三つ組残基である。図１４Ａにおいて、配列は、それぞれ、記載順に、配列番号２８〜３１として開示される。図１４Ｂにおいて、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号３２および３３として開示される。図１４Ｃにおいて、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号３２および３４として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号３５および３６として開示される。図１４Ｄにおいて、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号３０および３７として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号３０および３８として開示される。図１４Ｅにおいて、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号３１および３９として開示される。
【００２３】
図１５（パネルＡ〜Ｄ）は、ヒトＨＫ１４抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖および軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲ配列の選択を示す。図１５Ａにおいて、配列は、それぞれ、記載順に、配列番号４０〜４３として開示される。図１５Ｂにおいて、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号４１および４４として開示される。図１５Ｃにおいて、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号４２および４５として開示される。図１５Ｄにおいて、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号４３および４６として開示される。
図１６は、ヒトＡＡＶ２９３  ＭＣＰ−１抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖（図１６Ａ−１〜１６Ａ−４）および軽鎖（カッパ、図１６Ｂ−１〜１６Ｂ−３）についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。図１６Ａ−１において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号４７および４８として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号４９および５０として開示される。図１６Ａ−２において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号５１および５２として開示される。図１６Ａ−３において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号５１および５３として開示される。図１６Ａ−４において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号５４および５５として開示される。図１６Ｂ−１において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号５６および５７として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号５６および５８として開示される。図１６Ｂ−２において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号５９および６０として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号５９および６０として開示される。図１６Ｂ−３において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号５９および５８２として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号６１および６２として開示される。
図１７は、マウスＡＣＺ８８５抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖（図１７Ａ−１〜１７Ａ−４）および軽鎖（カッパ、図１７Ｂ−１〜１７Ｂ−３）についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。図１７Ａ−１において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号６３および６４として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号６３および６５として開示される。図１７Ａ−２において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号６６および６７として開示される。図１７Ａ−３において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号６６および６８として開示される。図１７Ａ−４において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号６９および７０として開示される。図１７Ｂ−１において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号７１および７２として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号７１および７３として開示される。図１７Ｂ−２において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号７４および７５として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号７４および７６として開示される。図１７Ｂ−３において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号７７および７８として開示される。
【００２４】
図１８は、ヒトｇｐ１２０  ＩＴＨ５２抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖（図１８Ａ−１〜１８Ａ−４）および軽鎖（カッパ、図１８Ｂ−１〜１８Ｂ−３）についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。図１８Ａ−１において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号７９および８０として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号７９および８１として開示される。図１８Ａ−２において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号８２および８３として開示される。図１８Ａ−３において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号８２および８４として開示される。図１８Ａ−４において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号８５および８６として開示される。図１８Ｂ−１において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、両方の表において、それぞれ、配列番号８７および８８として開示される。図１８Ｂ−２において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号８９および９０として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号８９および９１として開示される。図１８Ｂ−３において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号９２および９３として開示される。
図１９は、ヒトｓｃＦｖ  ｇｐ１２０  ＩＴＨ５２抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖（図１９Ａ−１〜１９Ａ−４）および軽鎖（カッパ、図１９Ｂ−１〜１９Ｂ−２）についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。図１９Ａ−１において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号９４および９５として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号９４および９６として開示される。図１９Ａ−２において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号９７および９８として開示される。図１９Ａ−３において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号９７および９９として開示される。図１９Ａ−４において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１００および１０１として開示される。図１９Ｂ−１において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１０２および１０３として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１０４および１０５として開示される。図１９Ｂ−２において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１０４および１０６として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１０７および１０８として開示される。
図２０は、ヒト４Ｄ５  Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖（図２０Ａ−１〜２０Ａ−４）および軽鎖（カッパ、図２０Ｂ−１〜２０Ｂ−３）についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。図２０Ａ−１において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１０９および１１０として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１０９および１１１として開示される。図２０Ａ−２において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１１２および１１３として開示される。図２０Ａ−３において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１１２および１１４として開示される。図２０Ａ−４において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１１５および１１６として開示される。図２０Ｂ−１において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１１７および１１８として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１１７および１１９として開示される。図２０Ｂ−２において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１２０および１２１として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１２０および１２２として開示される。図２０Ｂ−３において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１２３および１２４として開示される。
【００２５】
図２１は、ヒトＨＤ３７  ＣＤ１９抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖（図２１Ａ−１〜２１Ａ−４）および軽鎖（カッパ、図２１Ｂ−１〜２１Ｂ−３）についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。図２１Ａ−１において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１２５および１２６として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１２５および１２７として開示される。図２１Ａ−２において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１２８および１２９として開示される。図２１Ａ−３において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１２８および１３０として開示される。図２１Ａ−４において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１３１および１３２として開示される。図２１Ｂ−１において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１３３および１３４として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１３３および１３５として開示される。図２１Ｂ−２において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１３６および１３７として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１３６および１３８として開示される。図２１Ｂ−３において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１３９および１４０として開示される。
図２２は、ヒトＣＤ８  ｇ１０−１抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖（図２２Ａ−１〜２２Ａ−３）および軽鎖（カッパ、図２２Ｂ−１〜２２Ｂ−３）についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。図２２Ａ−１において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１４１および１４２として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１４１および１４３として開示される。図２２Ａ−２において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１４４および１４５として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１４４および１４６として開示される。図２２Ａ−３において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１４７および１４８として開示される。図２２Ｂ−１において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１４９および１５０として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１４９および１５１として開示される。図２２Ｂ−２において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１５２および１５３として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１５２および１５４として開示される。図２２Ｂ−３において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１５５および１５６として開示される。
図２３は、マウス５Ｇ１．１  Ｃ５抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖（図２３Ａ−１〜２３Ａ−３）および軽鎖（カッパ、図２３Ｂ−１〜２３Ｂ−３）についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。図２３Ａ−１において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１５７および１５８として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１５７および１５９として開示される。図２３Ａ−２において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１６０および１６１として、ならびに二番目の表においては、配列番号１６０および１６２として開示される。図２３Ａ−３において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１６３および１６４として開示される。図２３Ｂ−１において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１６５および１６６として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１６５および１６７として開示される。図２３Ｂ−２において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１６８および１６９として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１６８および１７０として開示される。図２３Ｂ−３において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１７１および１７２として開示される。
【００２６】
図２４は、マウスＲｅｏｐｒｏ  ７Ｅ３抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖（図２４Ａ−１〜２４Ａ−４）および軽鎖（カッパ、図２４Ｂ−１〜２４Ｂ−３）についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。図２４Ａ−１において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１７３および１７４として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１７３および１７５として開示される。図２４Ａ−２において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１７６および１７７として開示される。図２４Ａ−３において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１７６および１７８として開示される。図２４Ａ−４において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１７９および１８０として開示される。図２４Ｂ−１において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１８１および１８２として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１８１および１８３として開示される。図２４Ｂ−２において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１８４および１８５として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１８４および１８６として開示される。図２４Ｂ−３において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１８７および１８８として開示される。
図２５は、マウスＲａｐｔｉｖａ  ＭＨＭ２４抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖（図２５Ａ−１〜２５Ａ−３）および軽鎖（カッパ、図２５Ｂ−１〜２５Ｂ−３）についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。図２５Ａ−１において、マウスプローブ配列は、最初の表においては、配列番号１８９として、ならびにマウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、二番目の表においては、それぞれ、配列番号１８９および１９１として開示される。図２５Ａ−２において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１９２および１９３として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１９２および１９４として開示される。図２５Ａ−３において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１９５および１９６として開示される。図２５Ｂ−１において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１９７および１９８として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１９７および１９８として開示される。図２５Ｂ−２において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２００および２０１として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号２００および２０２として開示される。
図２５Ｂ−３において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号２０３および２０４として開示される。
図２６は、マウスＯＶＡ抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖（図２６Ａ−１〜２６Ａ−３）および軽鎖（カッパ、図２６Ｂ−１〜２６Ｂ−２）についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。図２６Ａ−１において、マウスプローブ配列は、最初の表においては、配列番号２０５として、ならびにヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、二番目の表においては、それぞれ、配列番号２０７および２０８として開示される。図２６Ａ−２において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２０９および２１０として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号２０９および２１１として開示される。図２６Ａ−３において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号２１２および２１３として開示される。図２６Ｂ−１において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２１４および２１５として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号２１６および２１７として開示される。図２６Ｂ−２において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２１６および２１８として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号２１９および２２０として開示される。
【００２７】
図２７は、マウスＴＮＦ−αモノクローナル抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖（図２７Ａ−１〜２７Ａ−３）および軽鎖（カッパ、図２７Ｂ−１〜２７Ｂ−３）についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。図２７Ａ−１において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２２１および２２２として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号２２１および２２３として開示される。図２７Ａ−２において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２２４および２２５として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号２２４および２２６として開示される。図２７Ａ−３において、ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号２２７および２２８として開示される。図２７Ｂ−１において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２２９および２３０として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号２２９および２３１として開示される。図２７Ｂ−２において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２３２および２３３として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号２３２および２３４として開示される。図２７Ｂ−３において、マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号２３５および２３６として開示される。
図２８は、本発明の例示の実施態様において使用される、側鎖化学に基づき類似するものと分類されたアミノ酸のグループ化を示す。
図２９は、本発明の方法を用いて、ＶＨ４  ＣＤＲ１参照ライブラリとの比較のために、類似基準または同一基準の下で４Ｈ６抗ＤＲ４  ＣＤＲ１クエリー配列について獲得したコホート配列の比較を示す。最初の表は、記載順に、それぞれ、配列番号２３７〜２３９を開示する。第二の表は、記載順に、それぞれ、配列番号２４０〜２４２を開示する。第三の表は、記載順に、それぞれ、配列番号２４３〜２４５を開示する。
図３０（パネルＡ〜Ｇ）は、マウスモノクローナル抗ＶＥＧＦ  Ａ４．６．１抗体をプローブ抗体として用いて、類似基準および同一基準の下で獲得されたコホートライブラリ配列を示す。パネルＡ：マウスプローブＶＨ  ＣＤＲ１  「ＴＮＹＧＭＮ」（配列番号１３）。類似配列および同一配列は、最初の表においては配列番号１４として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号２４６および１５として開示される。パネルＢ：マウスプローブＶＨ  ＣＤＲ２  「ＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴ」（配列番号１６）。類似配列および同一配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２４７および１７として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号２４８および１８として開
示される。パネルＣ：マウスプローブＶＨ  ＣＤＲ３  「ＡＫＹＰＨＹＹＧＳＳＨＷＹＦＤ」（配列番号１９）。類似配列および同一配列は、配列番号２０として開示される。パネルＤ：マウスプローブＶＬ  ＣＤＲ１  「ＳＮＹＬＮＷＹ」（配列番号２１）。類似配列および同一配列は、最初の表においては、配列番号２２として、二番目の表においては、配列番号２４９として、ならびに三番目の表においては、それぞれ、配列番号２５０および２５１として開示される。パネルＥ：マウスプローブＶＬ  ＣＤＲ２  「ＶＬＩＹＦＴＳＳＬＨ」（配列番号２３）。類似配列および同一配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２５２および２４として、二番目の表においては、それぞれ、配列番号２５３および２５として、ならびに三番目の表においては、それぞれ、配列番号２５４および２５５として開示される。パネルＦ：マウスプローブＶＬ  ＣＤＲ３  「ＱＱＹＳＴＶＰＷ」（配列番号２６）。類似配列および同一配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２５６および２７として、ならびに類似配列は、二番目の表においては、配列番号２５７として開示される。パネルＧ：コンビナトリアルコホートの多様性および類似性減少倍率値
【００２８】
図３１（パネルＡ〜Ｆ）は、類似基準および同一基準に加えて「全類似」基準を使用した場合の抗ＶＥＧＦ  Ａ４．６．１抗体について獲得されたコホートライブラリ配列を示す。パネルＡ：マウスプローブＶＨ  ＣＤＲ１  「ＴＮＹＧＭＮ」（配列番号１３）。類似配列、同一配列、および全類似配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１４、１４、および２５９として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号２４６、１５、および２６１として開示される。パネルＢ：マウスプローブＶＨ  ＣＤＲ２  「ＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴ」（配列番号１６）。類似配列、同一配列、全類似配列、およびデータベース配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２４７、１７、２６３、および２６４として開示される。類似配列、同一配列、および全類似配列は、二番目の表においては、それぞれ、配列番号２４８、１８、および２６５として開示される。パネルＣ：マウスプローブＶＨ  ＣＤＲ３  「ＡＫＹＰＨＹＹＧＳＳＨＷＹＦＤ」（配列番号１９）。類似配列および同一配列は、配列番号２０として開示される。パネルＤ：マウスプローブＶＬ  ＣＤＲ１  「ＳＮＹＬＮＷＹ」（配列番号２１）。類似配列、同一配列、および全類似配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２２、２２、および２６９として開示される。類似配列、同一配列、全類似配列、およびデータベース配列は、二番目の表においては、それぞれ、配列番号２４９、２４９、２７１、および２７２として開示される。類似配列および同一配列は、三番目の表においては、それぞれ、配列番号２５０および２５１として開示される。パネルＥ：マウスプローブＶＬ  ＣＤＲ２  「ＶＬＩＹＦＴＳＳＬＨ」（配列番号２３）。類似配列、同一配列、全類似配列、およびデータベース配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２５２、２４、２７５、および２７６として、二番目の表においては、それぞれ、配列番号２５３、２５、２７７、および２７８として、ならびに三番目の表においては、それぞれ、配列番号２５４、２５５、２７９、および２８０として開示される。パネルＦ：マウスプローブＶＬ  ＣＤＲ３
「ＱＱＹＳＴＶＰＷ」（配列番号２６）。類似配列、同一配列、および全類似配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２５６、２７、および２８１として開示される。類似配列および全類似配列は、二番目の表においては、それぞれ、配列番号２５７および２８３として開示した。
図３２は、本発明の例証の実施態様を実施するのに適した電子機器５００の一例の実施態様を示す。
図３３は、本発明に従い形成された様々な典型的ｓｃＦｖキメラ分子の概略図を示す。キメラｓｃＦｖ構築物は、細菌ペリプラズムへの輸送および保持のためのＮ末端リーダー配列を含み得る。代替のｓｃＦｖ  Ｃ末端キメラ構築物は、ｓｃＦｖタンパク質を保持するＧｅｎｅ  ＩＩＩアンカーシグナルを利用するものである。
図３４は、重複・非縮重オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いる野生型抗ＶＥＧＦ  Ａ４．６．１重鎖ライブラリの構築を示し、これはシングルオーバーラップエクステンションポリメラーゼ連鎖反応（ＳＯＥ−ＰＣＲ）を用いて二本鎖核酸に変換され得る。図は配列番号２８５を開示する。
【００２９】
図３５は、重複・非縮重オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いる野生型抗ＶＥＧＦ  Ａ４．６．１軽鎖ライブラリの構築を示し、これはシングルオーバーラップエクステンションポリメラーゼ連鎖反応（ＳＯＥ−ＰＣＲ）を用いて二本鎖核酸に変換され得る。図は配列番号２８６を開示する。
図３６は、コンビナトリアル有用変異（ＣＢＭ）を示すｓｃＦｖクローンのアレイを示す。試験参照ｓｃＦｖヒト抗体内に導入されたＶＬおよびＶＨ  ＣＤＲ領域に複数の変異があり、これは優れた標的抗原に対するＫｏｆｆ結合値に関連する。これらのＣＢＭの構築における位置的置換は、高いＫｏｆｆおよびＫｏｎ結合特性を有する個別のルックスルー型変異誘発（ＬＴＭ）クローンとして予め同定された。Ｌ１配列は、記載順に、それぞれ、配列番号２８７〜２９８として開示される。Ｌ２配列は、記載順に、それぞれ、配列番号２９９〜３１０として開示される。Ｌ３配列は、記載順に、それぞれ、配列番号３１１〜３２２として開示される。Ｈ１配列は、記載順に、それぞれ、配列番号３２３〜３３４として開示される。Ｈ２配列は、記載順に、それぞれ、配列番号３３５〜３４６として開示される。Ｈ３配列は、記載順に、それぞれ、配列番号３４７〜３５８として開示される。
図３７は、図３６からの６つの高親和性ＣＢＭクローンについての結合ＫｏｆｆキネティクスのＢｉａｃｏｒｅによる測定を、その親の野生型クローンのキネティクスと対比させて示す。
図３８は、試験候補ｓｃＦｖに対するビオチン化標的抗原およびストレプトアビジンＦＩＴＣの結合を示すＦＡＣＳプロットである。左パネルのＦＡＣＳプロットは、ＬＴＭライブラリ全体の結合親和性の分布に比べて、標的抗原に対してより高い結合親和性を有するｓｃＦｖ融合物を発現するクローンのみを同定するための選択ゲート（台形Ｐ２）を示す。右のＦＡＣＳパネルは、ソーティング後のＦＡＣＳ分析を示し、これによりＰ２未スクリーニングｓｃＦｖクローンの＞２５％が既定の高標的抗原親和性の基準内であることが確認された。
図３９は、Ａ４．６．１コホートライブラリから回収された３Ｄ５抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖクローンについてのＢｉａｃｏｒｅ結合キネティクスを示す（左パネル）。３Ｄ５抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖクローンがＶＥＧＦに結合することは、より多くのＶＥＧＦ抗原の追加に伴って反応単位（ＲＵ）が上昇したことにより実証された。対照的に、非特異的ＢＳＡを３Ｄ５抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖに添加した場合は、ＲＵの上昇は見られなかった。
【００３０】
図４０は、実施例２において詳述される、重鎖配列のサブグループプールの選択プロセス、サブグループ配列のサブクラス分類、およびカノニカル構造に基づくサブクラス集団のさらなる分類を示す。
図４１は、実施例２において詳述される、ＣＤＲ可変性プロフィールの選択を示すフローチャートを示す。
図４２は、共通のＣＤＲ３ドメインに接続させる、ＶＨ１およびＶＨ３  ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の設計の交配を示す。
図４３は、共通のＣＤＲ３ドメインに接続させる、ＶＫ１およびＶＫ３  ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の設計の交配を示す。ＶＫ−１＿ＣＤＲ２−１０、ＶＫ−３＿ＣＤＲ１−７、およびＶＫ−３＿ＣＤＲ２−１０の配列は、それぞれ、配列番号２７６、１６７、および２７８として開示した。
図４４は、様々な長さの重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ライブラリについての多様性の表を示す。ＶＬ１−ＣＤＲ２、ＶＬ２−ＣＤＲ２、およびＶＬ３−ＣＤＲ２の配列は、それぞれ、配列番号６４０、６４１、および２８０として開示した。
図４５は、Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、ＶＨ−１（パネルＡ）、ＶＨ−３（パネルＢ）、およびＶＨ−４（パネルＣ）の重鎖由来の長さ６のＣＤＲ１の可変性プロフィールの一覧を示す。列挙したＣＤＲの境界は、配列アラインメントの前に、接触点ＣＤＲ定義に従い線引きした。縦（Ｙ）軸は、インビボで発現された抗体のＣＤＲ位置における特定のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＣＤＲ１可変性プロフィール（図４４）は、宿主種の優先性を模倣するよう各ＣＤＲ位置で置換できる潜在的多様性を示した。
図４６は、Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、ＶＨ−１（パネルＡ）、ＶＨ−３（パネルＢ）重鎖由来の長さ１３のＣＤＲ２、およびＶＨ−４（パネルＣ）の重鎖由来の長さ１２のＣＤＲ２の可変性プロフィールの一覧を示す。列挙したＣＤＲの境界は、配列アラインメントの前に、接触点ＣＤＲ定義に従い線引きした。縦（Ｙ）軸は、インビボで発現された抗体のＣＤＲ位置における特定のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＣＤＲ１可変性プロフィール（図４４）は、宿主種の優先性を模倣するよう各ＣＤＲ位置で置換できる潜在的多様性を示した。
図４７は、Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ１０のＶＨ  ＣＤＲ３（パネルＡ）および長さ１１のＶＨ  ＣＤＲ３（パネルＢ）の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのＶＨファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、ＶＨ  ＣＤＲ３配列のアラインメントを接触点ＣＤＲ定義に従い行った。縦（Ｙ）軸は、特定のＶＨ  ＣＤＲ３位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＶＨ  ＣＤＲ３可変性プロフィール（図４４）は、長さ１０および１１の各々のＶＨ  ＣＤＲ３の位置において置換できる潜在的多様性を示した。
【００３１】
図４８は、Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ１２のＶＨ  ＣＤＲ３（パネルＡ）および長さ１３のＶＨ  ＣＤＲ３（パネルＢ）の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのＶＨファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、ＶＨ  ＣＤＲ３配列のアラインメントを接触点ＣＤＲ定義に従い行った。縦（Ｙ）軸は、特定のＶＨ  ＣＤＲ３位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＶＨ  ＣＤＲ３可変性プロフィール（図４４）は、長さ１２および１３の各々のＶＨ  ＣＤＲ３の位置において置換できる潜在的多様性を示した。
図４９は、Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ１４のＶＨ  ＣＤＲ３（パネルＡ）および長さ１５のＶＨ  ＣＤＲ３（パネルＢ）の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのＶＨファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、ＶＨ  ＣＤＲ３配列のアラインメントを接触点ＣＤＲ定義に従い行った。縦（Ｙ）軸は、特定のＶＨ  ＣＤＲ３位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＶＨ  ＣＤＲ３可変性プロフィール（図４４）は、長さ１４および１５の各々のＶＨ  ＣＤＲ３の位置において置換できる潜在的多様性を示した。
図５０は、Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ１６のＶＨ  ＣＤＲ３（パネルＡ）および長さ１７のＶＨ  ＣＤＲ３（パネルＢ）の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのＶＨファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、ＶＨ  ＣＤＲ３配列のアラインメントを接触点ＣＤＲ定義に従い行った。縦（Ｙ）軸は、特定のＶＨ  ＣＤＲ３位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＶＨ  ＣＤＲ３可変性プロフィール（図４４）は、長さ１６および１７の各々のＶＨ  ＣＤＲ３の位置において置換できる潜在的多様性を示した。
図５１は、Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ１８のＶＨ  ＣＤＲ３（パネルＡ）および長さ１９のＶＨ  ＣＤＲ３（パネルＢ）の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのＶＨファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、ＶＨ  ＣＤＲ３配列のアラインメントを接触点ＣＤＲ定義に従い行った。縦（Ｙ）軸は、特定のＶＨ  ＣＤＲ３位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＶＨ  ＣＤＲ３可変性プロフィール（図４４）は、長さ１８および１９の各々のＶＨ  ＣＤＲ３の位置において置換できる潜在的多様性を示した。
図５２は、Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ２０のＶＨ  ＣＤＲ３の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのＶＨファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、ＶＨ  ＣＤＲ３配列のアラインメントを接触点ＣＤＲ定義に従い行った。縦（Ｙ）軸は、特定のＶＨ  ＣＤＲ３位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＶＨ  ＣＤＲ３可変性プロフィール（図４４）は、長さ２０の各々のＶＨ  ＣＤＲ３の位置において置換できる潜在的多様性を示した。
【００３２】
図５３は、Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ７のＶκ−１（上パネル）およびＶκ−３（下パネル）ＣＤＲ１の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのＶκファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、Ｖκ  ＣＤＲ１配列のアラインメントを接触点ＣＤＲ定義に従い行った。縦（Ｙ）軸は、特定のＶκ  ＣＤＲ１位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＶκ  ＣＤＲ１可変性プロフィール（図４４、各グラフ下の表）は、長さ７の各々のＶκ  ＣＤＲ１の位置において置換できる潜在的多様性を示した。ＶＫ−３＿ＣＤＲ１−７の配列は配列番号１６７として開示した。
図５４は、Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ１０のＶκ−１（配列番号２７６）（パネルＡ）およびＶκ−３（配列番号２７８）（パネルＢ）ＣＤＲ２の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのＶκファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、Ｖκ  ＣＤＲ２配列のアラインメントを接触点ＣＤＲ定義に従い行った。縦（Ｙ）軸は、特定のＶκ  ＣＤＲ２位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＶκ  ＣＤＲ２可変性プロフィール（図４４、各グラフ下の表）は、長さ１０の各々のＶκ  ＣＤＲ１の位置において置換できる潜在的多様性を示した。
図５５は、Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ９のＶκ（パネルＡ）およびＶλ（パネルＢ）ＣＤＲ３の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのＶκおよびＶλサブファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、ＣＤＲ３配列のアラインメントを接触点ＣＤＲ定義に従い行った。縦（Ｙ）軸は、特定のＶＬ  ＣＤＲ３位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＶκおよびＶλ  ＣＤＲ３可変性プロフィール（図４４、各グラフ下の表）は、長さ９の各々のＶＬ  ＣＤＲ３の位置において置換できる潜在的多様性を示した。
図５６は、Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ８のＶＬ（カッパおよびラムダの両方）ＣＤＲ３（パネルＡ）および長さ１０のＶＬ  ＣＤＲ３（パネルＢ）の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのＶκおよびＶλファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、ＣＤＲ３配列のアラインメントを接触点ＣＤＲ定義に従い行った。縦（Ｙ）軸は、特定のＶＬ  ＣＤＲ３位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＶＬ  ＣＤＲ３可変性プロフィール（図４４、各グラフ下の表）は、長さ８および１０の各々のＶＬ  ＣＤＲ３の位置において置換できる潜在的多様性を示した。
【００３３】
図５７は、Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ１１のＶＬ（カッパおよびラムダの両方）ＣＤＲ３の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのＶκおよびＶλファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、ＣＤＲ３配列のアラインメントを接触点ＣＤＲ定義に従い行った。縦（Ｙ）軸は、特定のＶＬ  ＣＤＲ３位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＶＬ  ＣＤＲ３可変性プロフィール（図４４、各グラフ下の表）は、長さ１１の各々のＶＬ  ＣＤＲ３の位置において置換できる潜在的多様性を示した。
図５８は、単一の直鎖配列に三つの別個のＣＤＲ変異を生成させるために複数のオリゴヌクレオチドを用いて適用されたクンケル型変異誘発法を解説するものである。所望のＶＬおよびＶＨ  ＣＤＲ変異が全て導入されるまでこれらを繰り返した。
図５９は、単一のオリゴヌクレオチドアニーリング反応を用いて変異をコードするＣＤＲを生成させるために本発明において適用されたクンケル型変異誘発法を解説するものである。示されるプロセスにおいて、第一修飾型ＷＴＭ−ＣＤＲＨ３テンプレートを再単離し第二の異なるＣＤＲＨ１オリゴヌクレオチドと再アニールさせて同じ直鎖配列に二つの別個のＷＴＭ−ＣＤＲ変異を生成させた。これらを所望のＣＤＲ変異の全てが導入されるまで繰り返した。
図６０は、長さ６、カノニカル構造１のＶＨ−１  ＣＤＲ１ユニバーサル抗体ライブラリ（ＵＡＬ）についての位置ごとのアミノ酸残基の頻度のヒストグラムを示す。
図６１は、長さ１３、カノニカル構造２（パネルＡ）および３（パネルＢ）のＶＨ−１
ＣＤＲ２ユニバーサル抗体ライブラリ（ＵＡＬ）についての位置ごとのアミノ酸残基の頻度のヒストグラムを示す。
図６２Ａ〜Ｊは、本発明の構築物のオリゴヌクレオチド配列を示す（記載順に、それぞれ、配列番号３５９〜５６２）。
図６３は、タンパク質（左下パネル）および非タンパク質（右上パネル）抗原についてのＶＨ  ＣＤＲ３の長さ分析のヒストグラムを示す。
【００３４】
明細書および特許請求の範囲を明確に理解してもらうために、以下の定義を提供する。定義
本明細書中で使用する場合、用語「ユニバーサル抗体ライブラリ」は、その内容全体が参照により本明細書で援用される、米国特許出願６０／５８５,９３１に記載される抗体ライブラリを意味する。ユニバーサル抗体ライブラリは、参照ライブラリであり得る。参照ライブラリは、天然に存在するＣＤＲの多様性、例えばヒトＣＤＲの多様性、特に既定の抗原クラスに反応して発現された抗体において見出されるＣＤＲの多様性を提示するインシリコ情報であり得る。
【００３５】
用語「コホートライブラリ（ｃｏｈｏｒｔ  ｌｉｂｒａｒｙ）」は、本発明の方法に従い構築でき、所定のクエリーＣＤＲ配列またはプローブＣＤＲ配列を表示および／または含み、かつ好ましくはクエリー／プローブＣＤＲ配列とアラインメントを行った場合にアミノ酸位置の大部分でヒトアミノ酸残基が豊富な、ＣＤＲの多様性を提示するサブセットライブラリ、サブライブラリ、またはアナログライブラリを意味する。
【００３６】
用語「候補抗原」は、既知の、および典型的にはその抗原に対して結合できる抗体、例えばマウス抗体が入手可能である、十分明確な標的または標的抗原を意味する。このような抗体は、クエリーＣＤＲ配列の供給源として利用できる。標的抗原は、例えば特定の抗原クラス、例えばタンパク質抗原クラス、ペプチド抗原クラス、低分子抗原クラス、多糖抗原クラス、脂質抗原クラス、またはポリヌクレオチド抗原クラスに属するものであり得る。抗原クラス、例えばタンパク質またはポリペプチド抗原クラスはさらに、可溶性抗原、細胞表面抗原、細胞外抗原、細胞内抗原等を含むクラスとして定義され得る。
【００３７】
用語「クエリーＣＤＲ配列」または「プローブＣＤＲ配列」は、典型的には、既知の結合特異性を有する抗体由来のＣＤＲ配列を意味するが、これらには、ヒトのまたはほぼヒトアナログのＣＤＲ配列が望ましい。
【００３８】
用語「抗体結合領域」は、抗原に結合できる免疫グロブリンまたは抗体可変領域の一つまたはそれ以上の部分を意味する。典型的には、抗体結合領域は、例えば、抗体軽鎖（ＶＬ）（もしくはその可変領域）、抗体重鎖（ＶＨ）（もしくはその可変領域）、重鎖Ｆｄ領域、組み合わせの抗体軽鎖および重鎖（もしくはそれらの可変領域）、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ'）2、単一ドメイン、もしくは単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、または全長抗体、例えばＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭ抗体である。当然ながら標的抗原に対する抗体由来のクエリーＣＤＲ配列は、天然または合成のいずれかの全長抗体または一つのＣＤＲを含む抗原結合性フラグメント、例えばＦａｂ、ｓｃＦｖ、重鎖、軽鎖、Ｆｄ、ＤＡｂ等から誘導することができる。
【００３９】
用語「フレームワーク領域」は、当該分野で理解されている、多様性のより高いＣＤＲ領域間に存在する抗体可変領域の部分を意味する。このようなフレームワーク領域は、典型的には、フレームワーク１〜４（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）と称され、重鎖または軽鎖の抗体可変領域において見出される三つのＣＤＲが抗原結合表面を形成できるよう三次元空間でそれらを保持するためのスカフォールドを提供する。必要に応じて、本明細書に記載されるようにして決定または獲得された一つまたはそれ以上のＣＤＲ配列を支持するのに使用されるフレームワーク領域は、当然ながら例えば天然に存在するものもしくは合成のものまたはその組み合わせであり得、例えばフレームワーク配列は、一部が天然に存在するまたは天然由来であるが全体もしくは一部が、例えば、コンセンサスＣＤＲもしくはカノニカルＣＤＲを可能にし、もしくは収容するためのコンセンサス配列を形成するよう手を加えられたものであるか、または交配クローニング、すなわち天然に存在するものであるが事後的に直鎖上で並置されたものであり得る。
【００４０】
用語「閾出現頻度（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ）」は、参照ユニバーサル抗体ライブラリ内で使用するために選択される配列が、例えば特定の抗原クラスに反応する場合免疫細胞により有利に発現される配列であることが決定されている配列由来であることを要求する、本発明の一定の実施態様の基準を意味する。典型的には、このような閾出現頻度を満たすことが決定された発現された（再構成された）配列は、約１０％またはそれ以上のパーセント出現率で発現される配列である。
【００４１】
用語「閾生殖細胞系起源頻度（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｏｒｉｇｉｎ）」は、参照ユニバーサル抗体ライブラリ内で使用のために選択される配列（すなわち発現または再構成された配列）が、例えば特定の抗原クラスに反応する場合免疫細胞により有利に発現される生殖細胞系配列であることが決定されている配列由来であることを要求する、本発明の一定の実施態様の基準を意味する。典型的には、この閾生殖細胞系起源頻度を満たすことが決定された配列は、約１０％またはそれ以上のパーセント出現率で生殖細胞系配列に由来するかまたはそこから発生した配列である。
【００４２】
用語「既定の抗原クラス」または「抗原のクラス」または「抗原クラス」は、それらの基本となる組成に関して構造的／化学的に類似する複数の抗原を意味する。典型的な抗原クラスはタンパク質（ポリペプチド）類、ペプチド類、多糖類、ポリヌクレオチド類、および低分子類である。
【００４３】
用語「カノニカル構造」は、例えばＫａｂａｔデータベースにおいて列挙されるような抗体の直鎖配列に関する考え方を含む。Ｋａｂａｔの番号付けスキームは、抗体可変のアミノ酸残基を一貫した様式で番号付けするスタンダードとして広く受け入れられている。さらなる構造上の考慮、例えばＣｈｏｔｈｉａらに記載されるような、Ｋａｂａｔの番号付けによっては十分に反映されない、例えば結晶化および三次元モデリングによって明らかになる相違点もまた、抗体のカノニカル構造を決定するのに使用され得る。従って、所定の抗体配列を、とりわけ適切なアクセプター配列の同定を可能にするカノニカルなクラスに分類することができる。抗体のアミノ酸配列のＫａｂａｔの番号付けおよび構造的な考慮、例えばＣｈｏｔｈｉａらにより記載されるような、ならびに所定の抗体のカノニカルな側面の構築に関する示唆は、文献に記載されている（例えば、以下の材料および方法も参照のこと）。
【００４４】
用語「規定のＣＤＲ領域」は、結合分子の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域の結合特性を形成する三つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を意味する。規定のＣＤＲ領域は、抗体分子の機能的活性に寄与し、スカフォールドまたはフレームワークにすぎない領域のアミノ酸配列により分断され得る。ＣＤＲ領域は、典型的には、ＥＵインデックス、Ｋａｂａｔ（例えばＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３を参照のこと）、Ｃｈｏｔｈｉａ（例えばＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７，１９８７）、または接触点の定義（例えばＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６）を参照のこと）に従い定義されるが、当然ながらフレームワーク領域および抗原接触可変領域を同定および区分できるあらゆるその他の系もまた使用することができる。さらに、規定のＣＤＲ領域内のアミノ酸残基／位置は、ＥＵインデックスの番号付け、Ｋａｂａｔの番号付け、Ｃｈｏｔｈｉａの番号付け、接触点の定義、および直鎖上のアミノ酸残基の位置による番号付けからなる群より選択される慣例に従い番号付けを行うことができる。
【００４５】
用語「ライブラリ」は、本発明の方法に従い変異誘発された、本明細書中に記載されるような多様性を有する一つまたはそれ以上のＣＤＲまたは抗体分子（またはその抗体フラグメント）を意味する。ライブラリの抗体は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、無細胞抽出物中のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの形態、またはファージ、原核細胞、もしくは真核細胞中のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドとして存在し得る。本発明のライブラリ、例えばＣＤＲアナログのライブラリはまた、仮想ライブラリ、すなわち実際のライブラリを設計もしくは合成するのに使用できる、またはインシリコもしくはそれ以外のいずれかでクエリーもしくはモデル化できる、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸残基の配列情報のライブラリの形態であり得る。
【００４６】
用語「ポリヌクレオチド」は、核酸、例えばＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子ならびにそれらのアナログ（例えば、ヌクレオチドアナログを用いてまたは核酸化学を用いて生成されるＤＮＡまたはＲＮＡ）を意味する。必要に応じて、ポリヌクレオチドは、合成により、例えば当該分野で認識されている核酸化学を用いて、または酵素的に、例えばポリメラーゼを用いて合成され、かつ必要に応じて修飾され得る。典型的な修飾には、メチル化、ビオチン化、およびその他の当該分野で公知の修飾が含まれる。さらに、核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得、必要に応じて検出可能な部分に連結され得る。
【００４７】
用語「変異誘発」は、そうでないことが示されない限り、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を変化させるための、当該分野で認識されているあらゆる技術を意味する。好ましい変異誘発のタイプには、ウォークスルー型変異誘発（ｗａｌｋ−ｔｈｒｏｕｇｈ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＷＴＭ）、ウォークスルー型有用変異誘発、ルックスルー型変異誘発（ｌｏｏｋ−ｔｈｒｏｕｇｈ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＬＴＭ）、改良型ルックスルー型変異誘発（ＬＴＭ２）、またはそれらの組み合わせが含まれる。
【００４８】
用語「コンビナトリアル有用変異誘発（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」は、既定のＬＴＭアミノ酸の変異誘発のスクリーニングから測定可能な特性が変化していることが初めに同定されているＶLおよび／またはＶH  ＣＤＲのアミノ酸配列のバリエーションの縮重混合物をコードするコード配列のコンビネーションライブラリを意味する。コンビナトリアル有用変異アプローチにおいて、ＬＴＭにより同定されたこれらの有益な変異の組み合わせに相当するオリゴヌクレオチドコード配列が作製される。これらの組み合わせは、単一のＣＤＲ内の異なる有益な変異、単一の抗体鎖内の二つもしくはそれ以上のＣＤＲ内の変異、または異なる抗体鎖のＣＤＲ内の変異の組み合わせであり得る。
【００４９】
用語「ギャップ導入アラインメント」は、少なくとも二つのヌクレオチドまたはペプチド配列のアラインメントであって、アラインメントのアルゴリズムにより比較対象の配列のいずれかにおける配列の挿入または欠失の存在を予測される場合に、一つまたはそれ以上の配列がその配列内に、例えばその配列の最適なアラインメントが得られる場所にギャップを導入することによってその配列のアラインメントが最適化されるものを意味する。ヒト集団においては、挿入／欠失（「ｉｎ／ｄｅｌ」）多型は一塩基多型（「ＳＮＰ」）と比較して稀なので（しかしこのような特徴（「ｉｎ／ｄｅｌ」）は一定のヒト配列において実在する）、ギャップ導入は、最も一般的には種をまたぐ配列比較（例えばマウス−ヒト）において使用される。本発明の特定の実施態様において、「ギャップ導入ＢＬＡＳＴ」アラインメントが行われる。用語「ギャップ導入ＢＬＡＳＴ」アラインメントは、本明細書中で使用する場合、クエリーポリペプチド（またはポリヌクレオチド）の一つまたはそれ以上の残基が一つまたはそれ以上のスペーサー残基で示される場合があり（一般的には、そのようなアラインメントの配列中のダッシュ記号「−」で表される）、このようなスペーサー残基はアラインメント時に周囲の残基に対する間隔調整（ｓｐａｃｉｎｇ）を提供する以外に得られるＢＬＡＳＴアラインメントに対して影響を及ぼさない、ギャップ導入アラインメント形式を意味する。本発明の目的上、このようなギャップ導入ＢＬＡＳＴアラインメントはしばしば、クエリー配列のギャップ導入部分の残基がアウトプット（コホートライブラリ）配列においてクエリー配列内の対応する位置に存在する同じ残基で固定される場合に行われる。ギャップ導入アラインメントを生成するのに一般的に使用されるデータベース検索／配列アラインメントツールには、例えば、ＦＡＳＴＡ（Ｗｉｌｂｕｒ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：７２６−７３０；Ｌｉｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７：１４３５−１４４１；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４−２４４８；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３：６３−９８）およびＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２）が含まれる。
【００５０】
用語「不連続アラインメント」は、本明細書中で使用する場合、直鎖のクエリー配列の少なくとも一つの残基が「固定」される（固定された残基は参照配列の残基と比較される必要がないことを意味する）、少なくとも二つのペプチド配列のアラインメントを意味する。用語「部分アラインメント」は、直鎖のクエリー配列の少なくとも一つのＮ末端またはＣ末端残基が固定され、従って参照配列の残基と比較される必要がなくなる、関連するアラインメント形式を意味する。当業者に認識されることであるが、上記のアラインメント形式はまた、コドンで構成されるヌクレオチド配列に対しても類似の効果を発揮し得、ペプチド配列の直接的なアラインメントの代わりに行われる場合もある。
【００５１】
用語「類似アミノ酸」は、最初のアミノ酸と同じ側鎖化学のクラスのアミノ酸を意味する。本発明の例示的な実施態様において、天然アミノ酸は、その側鎖化学に基づき、以下のクラスに分類される。
小型の側鎖：グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）
求核性：セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）、ヒスチジン（Ｈ）
疎水性：バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、プロリン（Ｐ）
芳香族：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）
酸性：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）
アミド：アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）
塩基性：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）
【００５２】
従って、グリシンおよびアラニンは相互に類似アミノ酸であり、セリン、スレオニン、システイン、およびヒスチジン；バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、およびプロリン；フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにリジンおよびアルギニンについても同様である。当業者は、天然アミノ酸および／または合成アミノ酸についての類似性の代替的な分類（例えば、電荷、疎水性、活性基、立体構造基準等による分類）もまた可能であり、これも本発明の範囲内に含まれることを当然認識するであろう。しかし、本発明の目的上、アミノ酸を類似のグループに分配するには、各グループが少なくとも一つのアミノ酸を含む、少なくとも二つのグループの指定が必要である。
【００５３】
総論
抗体は、強力な診断・治療ツールである。標的に対して容易にスクリーニングできる候補結合分子を含む抗体ライブラリが望ましい。本発明は、少なくとも部分的には、包括的なユニバーサル抗体ライブラリ（ＵＡＬ）を構築するという近年報告されたアプローチの見込みを利用しようとするものである。本発明の方法は、任意の選択されたアミノ酸残基の位置に天然に存在するヒトの多様性を優先的にまたは排他的に含む（従って、このような配列は、非免疫原性であり、なおかつ公知のＣＤＲおよび／または抗体配列のみの集団よりも有意に多様性が高い）多様なＣＤＲおよび／または抗体のコホートライブラリの合理的な作製を可能にする。従って、本発明の方法および組成物の特徴であるコホートライブラリは、例えば同範囲の配列に対するランダム変異誘発アプローチを通じて作製された合成ライブラリと比較して相対的に小さなサイズのライブラリの中で広範囲に及ぶヒト配列の多様性を（例えばＣＤＲ配列の残基ごとの多様性の独立した組み合わせを通じて）提示するという利点を有する。大部分の合成ライブラリ（例えば、ランダム変異誘発を通じて作製されたライブラリ）には、天然に存在しないノイズおよび過剰な多様性という問題がある。完全ヒトライブラリは、一定の抗原クラスに偏っており、捕捉技術が実現できる程度の多様性しか有さない。
【００５４】
本発明は、少なくとも部分的には、参照抗体ライブラリ、例えばユニバーサル抗体ライブラリ（ＵＡＬ）をクエリー抗体のＣＤＲ配列で「ＢＬＡＳＴする（ＢＬＡＳＴｅｄ）」（例えば、アラインメント、場合によりギャップ導入アラインメントを行う）ことによりヒトコホート抗体ライブラリを同定する方法を提供する。このようなストラテジーの応用には以下のようなものが含まれる：
（１）既存の非ヒト（例えばマウス）モノクローナル抗体を用いるヒト偏向型モノクローナル抗体コホートライブラリの同定。
（２）既存のモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体ファミリーに基づくヒト偏向型コホート抗体ライブラリの合理的な生成（再生）。
【００５５】
その場合、このようなＣＤＲの「ＢＬＡＳＴした」コホート抗体ライブラリは：
（１）非ヒト抗体を基礎とするヒト様抗体を作製するため、
（２）改善された性質（例えば、免疫原性、親和性、特異性、発現、安定性等）の特異的選択のために既存のヒト抗体または抗体群からヒトの多様性を再生するため、
（３）参照抗体ライブラリの生産的なサブライブラリを予見的に同定するため（例えば、ＵＡＬサブライブラリ；ＵＡＬは多くのサブライブラリの複合体であるため、多くの抗原についてのＣＤＲ  ＢＬＡＳＴ結果の分析が、生産的なＵＡＬサブライブラリに対するデノボスクリーニングの達成努力を誘導するために使用できる）、
に使用され得る。
【００５６】
特定の実施態様において、本発明は、包括的なユニバーサル抗体ライブラリを参照ライブラリとして利用するものであり、従ってこれはこのようなライブラリの包括的性質からの利益を享受するコホートＣＤＲおよび／または抗体ライブラリを同定／生成するのに使用され得る。参照抗体ライブラリ、例えばＵＡＬおよび本発明のコホートライブラリの両方は、新規な治療薬を獲得するために、例えばハイスループット法を用いて容易にスクリーニングできる。
【００５７】
特に、参照ライブラリ、例えばＵＡＬは、あらゆる抗原を認識する可能性を有する。このような参照ライブラリのその他の重要な利点には、より大きな多様性、例えば自己反応性抗体はドナーの免疫系の負の選択により除去されるために発現されたヒトライブラリにおいては通常失われた自己抗原にまで及ぶ多様性が含まれる。本明細書中に記載されるコホートライブラリおよび参照（例えばＵＡＬ）ライブラリの両方の別の利点は、ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）による正のクローン選択を用いるこのようなライブラリのスクリーニングが、ハイブリドーマライブラリの作製および上清のスクリーニングという標準的で冗長な手法を回避するということである。なおさらに、参照ライブラリ、例えばＵＡＬライブラリは、他の所望の標的に対する追加の抗体を発見するために再スクリーニングすることができる。
【００５８】
１．１  特徴的な参照抗体ライブラリ
本発明の特定の方法において利用する参照抗体ライブラリ、特にユニバーサル抗体ライブラリ（ＵＡＬ）は、所定の抗原クラスに対する望ましい候補抗体の全てを提示することができる。本発明の方法により利用され得る例示的なユニバーサル抗体ライブラリは、ヒト配列から得られ、従って非免疫原性であり、このようなライブラリから選択された抗体を治療用途に、例えばヒトの障害または疾患を予防または処置するためにヒト患者に投与するのに適したものにする。
【００５９】
本発明の特徴であるライブラリは、多残基の多様性または単一残基の多様性を所定の部位、例えば一つまたはそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）内に導入すべき必要があるかどうかに依存して、例えば変異誘発技術、例えばウォークスルー型変異誘発（ＷＴＭ）またはルックスルー型変異誘発（ＬＴＭ）（例えば、それぞれ、米国特許第６,６４９,３４０号；同第５,８３０,６５０号；同第５,７９８,２０８号；および米国特許出願６０／４８３,２８２を参照のこと）を用いて効率的に導入される多様性を有する。重要なことは
、これらの技術が、生産的な多様性の量を最大化し、かつ非生産的な多様性、すなわちノイズにすぎないかまたはでたらめ（ｒａｎｄｏｍｎｅｓｓ）なもの、の量を最小化することである。従って、本発明の特徴である参照ライブラリおよびコホートライブラリの両方は、既存の抗体ライブラリよりも小さいが、候補抗体結合分子をより効率的に同定するためのより大きい合理的な多様性を含むことができる。このような参照抗体ライブラリの効率性は、本発明の方法を用いてコホートＣＤＲおよび抗体ライブラリを作製するのに効果的に利用される。
【００６０】
特定の実施態様において、本発明のコホートおよび／または参照ライブラリ（例えばユニバーサル抗体ライブラリ）は、ＷＴＭまたはＬＴＭ技術を適用して軽鎖および／または重鎖の一つまたはそれ以上のＣＤＲにおける所望の多様性を提示する完全合成ライブラリを作出することにより得られる。参照ライブラリの抗体配列、例えばフレームワークおよびＣＤＲは、一定の基準に従い選択される。参照ライブラリからコホートライブラリを選択する基準は、主としてクエリー配列と参照ライブラリ配列との比較を含み、その後変異誘発アプローチにより本発明のコホートＣＤＲ／抗体ライブラリを作出する。このような参照ライブラリは、様々な基準によって選択および／または構築される。例えば、一つの基準は、参照抗体配列が、発現される（再構成される）、好ましくは特定の抗原クラスに反応して発現される（再構成される）抗体配列、例えばヒト抗体配列において最小閾出現頻度（例えば約１０％またはそれ以上）を有さなければならないことである。場合により、別の基準は、発現される（再構成される）抗体配列が、最小閾出現頻度（約１０％またはそれ以上）で生殖細胞系配列を起源とする（またはそれから誘導される）ことである。
その多様性が同定され、次いで体系的な様式で、ＰＣＲによる個々のフレームワークおよびクンケル型変異誘発による多様なＣＤＲ配列の完全な構築を可能にするオリゴヌクレオチドを用いて従来の遺伝子形式、例えば単鎖抗体形式（ｓｃＦｖ）、ｆａｂ、または全長Ｉｇに遺伝子操作される。
【００６１】
重要なことは、本発明のライブラリが、典型的にはランダムオリゴ縮重法またはエラープローンＰＣＲを用いた場合に起こる保証のない（ｕｎｗａｒｒａｎｔｅｄ）変異を回避することによって非機能性タンパク質をもたらし得るどのような変異をも最小限に抑えることである。さらに、ＷＴＭを用いた場合に得られる精度のレベルは、ランダム変異誘発および／または遺伝子シャッフリング技術と好対照である。さらに、位置およびアミノ酸タイプの点でフレームワークの選択および配列の多様性のレベルを制御することによって、ライブラリの「抗原」クラス認識が最適化される。さらに、このインビトロ法は、免疫学的な自己抗原の負の選択、および生物の環境暴露に起因するどのような遺伝的な偏りをも回避する。
【００６２】
従って、本発明は、情報が豊富であるが不必要に大きくないサイズのスクリーニングライブラリから出発することができるという利点を提供する。最初のクローンセットを同定した後、その後の親和性成熟ライブラリは、共通のＬＴＭおよび／またはＷＴＭオリゴヌクレオチドセットを共有でき、時間および試薬の費用を抑制できる。なおさらに、参照ライブラリ（例えばユニバーサル抗体ライブラリ）および本発明の方法を通じて参照ライブラリから得られたコホートライブラリは、迅速かつ効果的に、様々な抗原、特に例えば他のどのような方法によっても獲得することが困難な自己抗原、に対する非常に特異的な抗体を作製することができる。
【００６３】
本発明の参照ユニバーサル抗体ライブラリは、規定の抗体領域または領域群（ここでポリヌクレオチドは、集合的に、本明細書中に記載される基準に従って全ての可能性がある変種抗体を示す）をコードする個々のポリヌクレオチドを最初に合成することによって、作製およびスクリーニングされ得る。同様に、本発明のコホートＣＤＲおよび抗体ライブラリは、規定の抗体領域または領域群（ここでポリヌクレオチドは、集合的に、本発明の基準に従って変種ＣＤＲ位置の選択を示す）をコードする個々のポリヌクレオチドを最初に合成することによって、作製およびスクリーニングされ得る。抗体は、例えば、インビトロ転写および翻訳を用いてならびに／またはディスプレイ技術、例えばリボソームディスプレイ、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、もしくは酵母ディスプレイを用いて発現され得る。
【００６４】
あるいは、本発明の参照ユニバーサル抗体ライブラリは、規定の抗体領域または領域群（ここでポリペプチドは、集合的に、本明細書中に記載される基準に従って全ての可能性がある変種抗体を示す）に対応する個々のポリペプチドを最初に合成することによって、作製およびスクリーニングされ得る。同様に、本発明のコホートＣＤＲおよび抗体ライブラリは、規定の抗体領域または領域群（ここでポリペプチドは、集合的に、本発明の基準に従って変種ＣＤＲ位置の選択を示す）をコードする個々ポリペプチドを最初に合成することによって、作製およびスクリーニングされ得る。抗体は、ポリペプチドから作製および／または逆翻訳され（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）、例えばインビトロ転写および翻訳を用いてならびに／またはディスプレイ技術、例えばリボソームディスプレイ、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、もしくは酵母ディスプレイを用いて発現され得る。仮想参照（ユニバーサルまたはフィルター処理）抗体および／またはＣＤＲライブラリもまた、本発明の方法において使用でき、このようなライブラリはヒトペプチド配列の多様性情報から本発明の仮想参照ライブラリへのマニュアルおよび／またはインシリコ編集（ｉｎｓｉｌｉｃｏ  ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ）を通じて作製される。このような仮想参照ライブラリの構成要素となる配列（例えば単一配列、コホートライブラリ、または全参照ライブラリ）は、当該分野において広く知られた技術（例えば、ペプチド配列をコードする核酸配列の合成ならびにその後のインビボ（例えば細胞株による媒介）および／もしくはインビトロでの転写および／もしくは翻訳、ならびに／またはディスプレイ技術、例えばリボソームディスプレイ、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、もしくは酵母ディスプレイ）を用いて発現され得る。
【００６５】
次いで、発現された抗体は、機能アッセイ、例えば結合アッセイを用いてスクリーニングおよび選択され得る。例えば、ポリペプチドは、抗体結合分子、例えば単鎖抗体（ｓｃＦｖ）をコードするポリヌクレオチドに関連して発現され、それによってその抗体結合分子（例えばｓｃＦｖ）をコードするポリヌクレオチド配列の同定を可能にする。抗体はまた、例えばＵＳ２００４００７２７４０Ａ１；ＵＳ２００３００３６０９２Ａ１；およびＵＳ２００３０１０００２３Ａ１に記載される技術を用いて、原核生物、例えば大腸菌の膜上に分泌および提示され得る。
【００６６】
本発明の方法は、新規なまたは改善された抗体またはそのフラグメント、例えば単鎖抗体（ｓｃＦｖ）を開発するためにヒト抗体配列を同定するのに使用できる。さらに、本方法は、例えば本明細書中に記載の基準に従い、例えばＷＴＭまたはＬＴＭ変異誘発を用いて多様化しようとする配列の初期サブセットを示す参照ライブラリを調製するのに使用できる、例えばコンピュータモデリングおよび電子データベースのバイオマイニング（ｂｉｏｍｉｎｉｎｇ）を介する、アプリオリな情報の利益を伴なって行うことができる。
【００６７】
本発明のその他の利点および側面は、以下の開示および実施例から容易に明らかになるであろう。
【００６８】
１．２  バイオインフォマティクスを用いるユニバーサル抗体ライブラリの構成要素の同定および選択
本発明の特定の実施態様において利用してユニバーサル抗体ライブラリ（ＵＡＬ）を構築する最初の工程は、一定の既定の基準を満たす配列の選択である。例えば、最も頻繁に、特に特定の抗原クラスに対して示される配列について、非重複性の再構成された抗体配列を含む電子データベースであるＫａｂａｔデータベースへのクエリーがなされ得る。この抗原クラスには、例えば、タンパク質およびペプチド抗原だけでなく低分子、多糖類、およびポリヌクレオチドが含まれ得る。これらの抗体のフレームワーク配列のクラスタリング分析を行い、その後に生殖細胞系配列（Ｖ  ＢＡＳＥデータベース）との比較を行う（ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを用いて）ことにより、後に所定の抗原クラス、例えばタンパク質性の抗原または標的を認識する機能性抗体を生成するよう再構成されることになる、最も頻繁に使用される生殖細胞系ファミリーを決定する。
【００６９】
次いで、機能性抗体の最も大きく構造的多様性が最も多いグループを示す候補フレームワーク配列を選択し、次いでＣＤＲの長さ、つまりフレームワークに収容され得る多様性を決定するため、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２のカノニカル構造を決定する。ＣＤＲ３については、長さのサイズ分布を行い再構成される抗体配列の頻度分析を確認する。
【００７０】
ＣＤＲのアミノ酸配列を誘導する方法には、既存の再構成された抗体配列の頻度分析が含まれる。一般に、アミノ酸使用をＣＤＲ残基の位置ごとに計算し、ある集団または亜集団（例えばデータベース由来のＣＤＲ配列のパネル）においてその位置で最も頻繁に使用される（優先的な）アミノ酸を、頻度の和が既定の限度に達するまで記録する。次いで、既定の限度に達したら、それらの頻度（優先度）が既定の閾値と等しいまたはそれを超える場合にのみ、アミノ酸を参照ライブラリに加える。実施例４の参照ライブラリについては、限度を８０％に設定し、個々のアミノ酸についての優先度の閾値設定は１０％であった。
【００７１】
ユニバーサルライブラリの構築ストラテジーには、フレームワーク配列の選択およびその後の超可変性ＣＤＲループの設計が含まれる。フレームワーク配列の選択については、特定の抗原に反応して発現されることが決定された全ての利用可能なフレームワークスカフォールドのサブセットがアレイに配置される。自然界で所定の抗原クラスに反応して最も頻繁に発現されるフレームワークを決定することにより、適切なフレームワークアクセプターが選択される。例えば、タンパク質ベースの抗原に反応して発現される好ましいアクセプターフレームワークを決定するために、「タンパク質指向型（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）」フレームワークについて、Ｋａｂａｔデータベース（例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｂａｔｄａｔａｂａｓｅ．ｃｏｍ／からアクセスできるサブスクリプション抗体配列データベース）を検索する。異なる抗原クラスに対するＣＤＲを利用するのに好ましいアクセプター配列および／または特定の種のアクセプター配列が必要な場合、適宜、Ｋａｂａｔタンパク質配列フィルターを設定する。例えば、タンパク質ベースの標的に対するヒト治療剤として使用するための配列を決定するため、タンパク質／ペプチド抗原を認識する（マウス、ラット、またはニワトリ配列等ではなく）ヒト抗体配列のみに照準を合わせるようフィルターを設定する。これにより、結果にバイアスをかけるデータセットおよび配列情報における重複性が大きく軽減される。
【００７２】
上記の工程は、多くの様々な合成フレームワークスカフォールドを生成する必要性を最小限に抑え、かつ典型的には潜在的アクセプターのデータセットが約６００配列またはそれ未満になる。従って、抗原クラスによって選択される再構成された遺伝子配列を生じる生殖細胞系前駆配列を決定するさらなる分析のために得られる配列数を容易に管理することができる。この第二の生殖細胞系起源の決定は、過剰に示された最適な（または高頻度の）生殖細胞系フレームワーク配列が存在する場合に同定することになるため、抗原クラスによって選択される抗体配列の選択に磨きをかける。事実、多数の再構成された抗体配列が生成される、特定の抗原に対するいくつかの多クローン性反応において、わずかなアクセプターフレームワーク配列のみが使用されることが観察されている。このような場合、抗体配列およびその抗原に対する結合の多様性は、主としてフレームワークではなくＣＤＲに局在化する。上記のバイオインフォマティクス解析は、記述の目的上ＶH遺伝子に着目しているが、ＶλおよびＶκの両方に対する遺伝子も同様に評価されることが当然理解されるであろう。本発明のコホート抗体ライブラリにおいて使用するフレームワーク領域は、本発明によってまたは当該分野で認識されている任意のフレームワーク選択法によって使用される参照抗体ライブラリの設計時に使用されたフレームワーク領域から選択され得る。
【００７３】
１．３  ＣＤＲの多様性を最大化する設計ストラテジー
例示の参照ユニバーサル抗体ライブラリ（ＵＡＬ）において使用される候補フレームワークの選択は、ＣＤＲのサイズおよびＵＡＬの初期のアミノ酸配列の多様性の両方に影響する。抗体配列が、１）抗原クラスに対する出現頻度および２）生殖細胞系頻度について同定される場合、その配列はそれらのカノニカルクラスに従ってアレイ配置され得る。カノニカルクラスは、Ｃｈｏｔｈｉａにより記載された従来法（以下の材料および方法を参照のこと）を用いて決定される。所定の抗体配列のセットの中で、同定された抗体配列の大部分が特定のカノニカルクラスに属し得る。カノニカルクラスは、ＣＤＲに収容され得るアミノ酸残基の数に影響する。例えば、カノニカルクラスが１〜３の場合、ＣＤＲ１は５アミノ酸ループを有し、ＣＤＲ２は１７アミノ酸ループを有する。重鎖の可変配列については、Ｊセグメントの配列の寄与は比較的よく保存されており、典型的には、６つの配列のみのサブセットの中でベストフィットする配列のみが考慮される必要がある。ＫａｂａｔおよびＶ  ＢＡＳＥデータベースのＣＤＲアミノ酸頻度分析は、三つのカテゴリー、すなわち１）保存されるべき位置、２）多様性を出すのに適した位置、および３）体細胞超変異を模倣するために変異を導入できる位置に当てはまるＣＤＲアミノ酸残基の位置を同定する。
【００７４】
従って、参照ＵＡＬのＶH−ＣＤＲ１の多様性を設計する際、ＣＤＲ内のアミノ酸残基
は三つの異なるカテゴリー：１）生殖細胞系遺伝子および再構成された遺伝子の両方で保存されており、従って変化せずに残る位置、２）生殖細胞系においては保存されているが再構成された遺伝子においては変種である、従って最初は固定するが親和性成熟の間に変異させる位置、および３）生殖細胞系配列および再構成された配列において多様性を有する、従って初期ライブラリの構築の間にＷＴＭTMを用いて多様性を導入する位置として同定される位置、にグループ分けされる。
【００７５】
ＶＨ−ＣＤＲ２の設計において、Ｖ  ＢＡＳＥおよびＫａｂａｔデータベースにおける多様性分析は、上記のＶＨ−ＣＤＲ１について行われたのと同様の様式で行われる。
【００７６】
ＶH  ＣＤＲ３の多様性の設計においては、Ｋａｂａｔデータベース由来の抗体のＣＤＲ３配列をそれらのサイズおよび抗原クラスに従いアラインメントする。非タンパク質抗原およびタンパク質／ペプチド抗原を認識する抗体のＣＤＲ３の長さを比較し、頻度分析を行い、そしてＣＤＲ３の多様性の設計において使用するのに最も好ましい配列を同定するために１０％の閾出現頻度を使用する。ＣＤＲ３のサイズおよびアミノ酸残基の頻度分析は、例えば免疫グロブリンＤおよびＪ遺伝子の再構成された配列を用いて行われるので、フィルターをかけたＫａｂａｔとＶ  ＢＡＳＥの直接比較においては「ＣＤＲ３」生殖細胞系の等価物は存在しない。しかし、各々の再構成されたＣＤＲ３のサイズについてフィルターをかけたＫａｂａｔの頻度分析を行うことができ、これにより各サイズの分類についての、ＣＤＲ３の位置を通して最も頻度の高いアミノ酸が明らかにされ、コンセンサス「野生型」配列が得られる。驚くべきことに、この「コンセンサス」アプローチは、高い選択圧を受けた特定のアミノ酸を同定する。従って、これらの残基の位置は、典型的には固定され、多様性は（これらの位置に存在する特定のアミノ酸について同定された優先傾向（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を考慮して）残りのアミノ酸の位置に導入される。
【００７７】
上記のＣＤＲのいずれかについての参照ＵＡＬまたはそれから得られるコホートＣＤＲもしくは抗体ライブラリの多様性を設計する際、所望の場合は、修飾アミノ酸残基、例えば大部分のポリペプチドにおいて使用される伝統的な２０個のアミノ酸以外の残基、例えばホモシステインを、ＣＤＲに組み込むことができる。これは、典型的には修飾アミノ酸残基が望まれるポリヌクレオチドのところで、終止コドンを導入する当該分野で認識されている技術を用いて行われる。その場合、この技術は、そのポリペプチドに組み込むべき修飾アミノ酸に連結された修飾型ｔＲＮＡ（例えば、終止コドンであるアンバー、オパール、またはオーカーのいわゆるサプレッサーｔＲＮＡ）を提供する（例えばＫｏｅｈｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｐｏｒｔ  ｏｆ  ａｍｂｅｒ  ａｎｄ  ｏｃｈｒｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｔＲＮＡｓ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ：Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＰＮＡＳ，９８，１４３１０−１４３１５（２００１）を参照のこと）。
【００７８】
２．  コホート抗体ライブラリおよび参照ユニバーサル抗体ライブラリ（ＵＡＬ）の構築
本発明のコホート抗体ライブラリおよび参照ユニバーサル抗体ライブラリの生成およびそれらの構築は、生成させようとする抗体の多様性に関する配列および構造の情報を活用して行われるため、改善された抗体を生成する可能性が高くなっている。モデリング情報もまた、規定の領域、例えばＣＤＲに導入するアミノ酸の多様性の選択をガイドするために使用できる。なおさらに、本発明の抗体によって得られる実際の結果は、反復的な様式で作製およびスクリーニングされるその後の抗体の選択（または排除）、例えば親和性成熟をガイドすることができる。
【００７９】
特定の実施態様において、乏しいまたは望ましくない構造および／または機能を有すると推測されるどのような抗体の作製をも排除するために、モデリングが使用される。この方法で作製される抗体の数を大きく減少させることができ、それによってその後のスクリーニングアッセイにおけるシグナル・ノイズ比が高くなる。別の個別の実施態様において、モデリングは、仮想（特定の態様においては、インシリコ）データベースの予測能の精度を向上させるよう、あらゆる関連する供給源から、例えば遺伝子およびタンパク質の配列および三次元データベースならびに／または以前に試験した抗体の結果からの追加情報によって継続的にアップデートされる（図１）。
【００８０】
さらに別の実施態様において、仮想データベースは、アッセイ結果、例えば以前に試験した抗体の結合親和性／アビディティと共に提供され、アッセイ基準または基準群に基づき抗体をレスポンダーまたは非レスポンダーとして、例えば十分結合する抗体または十分に結合しない抗体として分類する。この方法で、本発明の親和性成熟は、特定の配列および構造情報をもつ機能的な応答の範囲を一致させることができ、このような情報を将来試験しようとする抗体の作製をガイドするために使用できる。この方法は特に、例えばＢｉａｃｏｒｅアッセイを用いて、標的抗原に対する特定の結合親和性について抗体または抗体フラグメントをスクリーニングするのに適している。
【００８１】
従って、ある領域内の不連続な残基の変異誘発は、その領域内の特定の残基が所望の機能に関与しないであろうことが、例えばインシリコモデリングを通じて既知である場合に望ましいことがある。規定の領域間、例えば抗体の規定の領域内の機能的なアミノ酸残基間の配位構造および空間的相互関係、例えば導入されている多様性が考慮され、モデル化され得る。このようなモデリングの基準には、例えば、アミノ酸残基の側鎖基の化学、原子間距離、結晶学的データ等が含まれる。従って、作製される抗体の数は、理知的に最小化できる。
【００８２】
参照ＵＡＬの合成については、上記工程の一つまたはそれ以上がコンピューター支援により行われ得る。コンピューター支援により行われる工程には、例えば、Ｋａｂａｔデータベースのマイニング、および場合により、Ｖ  ＢＡＳＥに対する結果の相互参照が含まれ得、それによって本発明の特定の基準が決定され、所望のＣＤＲの多様性を設計するのに使用される（図１）。参照ライブラリ（ＵＡＬ）の合成はまた、（場合により、コンピューター支援により）救出されたクローン集合からの配列情報の編集を伴うものであり得る。本発明の方法により利用される参照ライブラリからのコホートＣＤＲおよび抗体ライブラリの選択もまた、コンピューター支援により行われ得る。このような方法はまた、部分的にまたは全体的に、機器、例えばコンピューターにより駆動される機器により行われるのに適している。例えば、配列のアラインメント、配列の比較、位置特異的な残基の選択、ライブラリの多様性の計算、データベースマイニング  抗体配列の選択、多様性の設計、オリゴヌクレオチドの合成、上記のもののＰＣＲによるまたはクンケル型変異誘発による構築、ならびに所定の標的に結合する候補抗体の発現および選択は、部分的にまたは全体的に、インターレース機器により実行できる。さらに、この方法を実行するための指令が、部分的にまたは全体的に、その指令を実行するために電子機器において使用するのに適した媒体に与えられ得る。まとめると、本発明の方法は、ソフトウェア（例えばコンピュータ読み取り可能な指令）およびハードウェア（例えばコンピューター、ロボット、およびチップ）を含むハイスループットアプローチに変換できる。
【００８３】
本発明の特定の実施態様は、本発明の特徴である方法を実行できるおよび／またはその実行を補助できるコンピューターまたはその他の電子機器の使用を通じて補助され得る。本発明の例示の実施態様を実施するのに適した電子機器５００の一例となる実施態様を図３２に示す。電子機器５００は、多くの異なる技術、例えばパーソナルコンピューター（ＰＣ）、ラップトップコンピューター、ワークステーション、携帯情報端末（ＰＤＡ）、インターネットアプリケーション、携帯電話等の象徴である。例示の実施態様に置いて、電子機器５００は、中央演算処理装置（ＣＰＵ）５０２およびディスプレイ機器５０４を含む。ディスプレイ機器５０４は、視覚的な表示を通じてユーザーと電子機器５００が直接的に通信を行うことを可能にする。電子機器５００はさらに、キーボード５０６およびマウス５０８を含む。示されていない他の可能性のある入力機器には、スタイラス、トラックボール、ジョイスティック、タッチパッド、タッチスクリーン等が含まれる。電子機器５００は、データおよび指令を保存するための主記憶装置５１０および二次記憶装置５１２を含む。記憶装置５１０および５１２には、フロッピー（登録商標）ドライブ、ハードドライブ、テープドライブ、光学ドライブ、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）、ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）等の技術が含まれ得る。ブラウザ、ＪＡＶＡ（登録商標）仮想マシン等のアプリケーション、ならびに他のユーティリティおよびアプリケーションは、記憶装置５１０および５１２の一方または両方に置くことができる。電子機器５００はまた、示される電子機器５００の外部にある一つまたはそれ以上の電子機器と通信するためのネットワークインターフェース５１４を含み得る。モデムは、外部の電子機器またはネットワークとの接続を確立するためのネットワークインターフェース５１４の一形態である。ＣＰＵ  ５０２には、内蔵または外付けのいずれかで、上記コンポーネントの一つまたはそれ以上を装備される。上記のアプリケーションに加えて、Ｓｉｍｕｌｉｎｋ（登録商標）５１６等のモデリングアプリケーションが電子機器５００にインストールされ、実行され得る。
【００８４】
電子機器５００は本発明を実施する構造の象徴にすぎないことに留意されるべきである。しかし、当業者は、本発明が記載される機器５００による実施に限定されないことを理解するであろう。ユーザーによる入力またはディスプレイ機器が必要ない、部分的にまたは全体的に埋め込まれたコードに基づく実施法を含む他の実施法も利用できる。そうだとしても、プロセッサーは、別のプロセッサーまたは他の機器と直接通信できる。
【００８５】
３．  選択されたコホートＣＤＲおよび抗体ライブラリの合成
一つの実施態様において、本発明の選択されたコホートＣＤＲおよび抗体ライブラリは、スクリーニングのために、ポリペプチドの規定の領域をコードし既定のアミノ酸につき一つのコドンしか有さない個々のオリゴヌクレオチドを合成することによって作製される。これは、オリゴヌクレオチド内の各コドンの位置に、野生型ポリペプチドの合成に必要なコドンまたは既定のアミノ酸に対するコドンのいずれかを組み込むことによって達成され、これはルックスルー型変異誘発（ＬＴＭ）と称される（例えば米国特許出願６０／４８３２８２を参照のこと）。
【００８６】
別の実施態様において、複数のアミノ酸位置において多様性が必要とされる場合、オリゴヌクレオチド縮重法またはウォークスルー型変異誘発（ＷＴＭ）が使用され得る（例えば米国特許第６,６４９,３４０号；同第５,８３０,６５０号；および同第５,７９８,２０８号；ならびに米国特許出願６０／４８３,２８２を参照のこと）。ＷＴＭは、最小限の数のオリゴヌクレオチドで作製しようとする複数の変異を可能にする。このオリゴヌクレオチドは、例えばドーピング技術を用いて個別に、バッチで作製され、必要な場合は混合またはプールされ得る。
【００８７】
ライブラリ作製のためのオリゴヌクレオチドの混合物は、ＤＮＡ合成の公知技術を用いて容易に合成できる。好ましい方法は、固相ベータ−シアノエチルホスホルアミダイト化学を使用するものである（例えば、米国特許第４,７２５,６７７号を参照のこと）。便利なところでは、ヌクレオチド専用の試薬容器を含む全自動ＤＮＡ合成機が使用できる。ポリヌクレオチド、例えば規定の領域に相当するポリヌクレオチドをより大きな遺伝子コンテクストに導入または構築するのを容易にするために、制限部位またはプライマーハイブリダイゼーション部位を含むポリヌクレオチドも合成され得る。
【００８８】
合成されたポリヌクレオチドは、例えば標準的な遺伝子操作技術を用いて、より大きな遺伝子コンテクスト、例えば単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ｆａｂ、または全長Ｉｇに挿入され得る。例えば、制限酵素の認識部位を隣に含むポリヌクレオチドが作製され得る（例えば米国特許第４,８８８,２８６号を参照のこと）。認識部位は、天然に存在するかまたはその領域をコードするＤＮＡに隣接する遺伝子に導入される認識部位に対応するよう設計され得る。ポリヌクレオチドは、二本鎖形態に変換した後、標準的技術によって遺伝子または遺伝子ベクターにライゲートされる。その遺伝子は、適当なベクター（例えばファージベクター、プラスミドを含む）を利用して、抗体の発現に適した無細胞抽出物、ファージ、原核細胞、または真核細胞に導入される。
【００８９】
あるいは、部分的に重複するポリヌクレオチド、典型的には約２０〜６０ヌクレオチド長、が設計される。次いで、内部ポリヌクレオチドがそれらの相補性パートナーとアニールされ、さらなるアニーリングに有用な一本鎖の余剰部分（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ）を有する二本鎖ＤＮＡ分子が得られる。次いで、ＰＣＲを用いて全長の二本鎖分子を形成するために、アニーリングしたペアを混合し、伸長し、ライゲートする。適切なベクターへのクローニングのために、合成遺伝子の末端付近に都合の良い制限部位が設定され得る。次いで、全長分子は適切なベクターにライゲートされ得る。
【００９０】
部分重複ポリヌクレオチドが遺伝子の構築において使用される場合、縮重ヌクレオチドのセットがまた、ポリヌクレオチドの一つの代わりに直接導入され得る。適切な相補鎖は、ポリメラーゼによる酵素的伸長による他方の鎖の部分的に相補的なポリヌクレオチドからの伸長反応の間に合成される。合成段階での縮重ポリヌクレオチドの導入もまた、遺伝子の二以上のドメインまたは規定の領域が多様性を有するよう変異導入されるかまたは遺伝子操作されるクローニングを簡素化する。
【００９１】
別のアプローチにおいては、抗体は、一本鎖プラスミド上に存在する。例えば、その遺伝子は、ヘルパーファージを使用することで一本鎖分子の増幅を行うファージベクターまたは繊維状ファージの複製起点を有するベクターにクローニングされ得る。一本鎖テンプレートを、所望の変異を示す縮重ポリヌクレオチドのセットとアニールさせ、伸長し、ライゲートすることで、適切な宿主に導入され得る分子集団に各アナログ鎖を導入できる（例えばＳａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７９１−８０２（１９８８）を参照のこと）。このアプローチにより、変異誘発のために複数のドメインが選択される複数回のクローニング工程を回避することができる。
【００９２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法もまた、ポリヌクレオチドを遺伝子に、例えばＣＤＲの多様性をフレームワーク領域に導入するのに使用できる。例えば、ポリヌクレオチド自体を伸長のためのプライマーとして使用することができる。このアプローチにおいて、規定の領域（またはその部分）に対応する変異原性カセットをコードするポリヌクレオチドは、少なくとも部分的には、相互に相補的であり、かつポリメラーゼを用いて、例えばＰＣＲ増幅を用いて大きな遺伝子カセット（例えばｓｃＦｖ）を形成するために伸長することができる。
【００９３】
ライブラリのサイズは、ＣＤＲの長さおよび例えばＷＴＭまたはＬＴＭを用いて提示される必要のあるＣＤＲの多様性の量に依存して変化し得る。好ましくは、ライブラリは、１０15、１０14、１０13、１０12、１０11、１０10、１０9、１０8、１０7未満、より好
ましくは  １０6個の抗体またはそれ未満を含むよう設計され得る。
【００９４】
上記の記載は、対応するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを変化させることにより抗体の多様性を提示することを中心にしている。しかし、本発明の範囲は、タンパク質化学を用いる所望のポリペプチド領域の直接合成によって本明細書中に開示される抗体の多様性を提示する方法もまた包含することが当然理解されよう。このアプローチを行う場合、得られるポリペプチドもまた、ポリヌクレオチド中間体の使用を排除できることを除いて、本発明の特徴を包含するものである。
【００９５】
上記のライブラリについては、ポリヌクレオチドおよび／または対応するポリペプチドの形態によらず、そのライブラリがまた当然ながら、当該分野で認識されている技術を用いて固相支持体、例えばマイクロチップに付加され得、好ましくはアレイ配置されることが理解されよう。
【００９６】
本発明の方法は、親和性成熟により候補抗体分子を修飾するのに特に有用である。抗体の可変領域および／またはフレームワーク（定常）領域に変化が導入され得る。可変領域の修飾は、より良い抗原結合特性、および所望の場合は触媒特性を有する抗体を生成し得る。フレームワーク領域の修飾もまた、物理化学的特性、例えば溶解性または安定性の改善をもたらし得、これは例えば商業的生産、バイオアベイラビリティ、および抗原に対する親和性において特に有用である。典型的には、変異誘発は、抗体分子のＦｖ領域、すなわち、一方は重鎖（ＶＨ）由来で一方は軽鎖（ＶＬ）由来の二つの鎖の可変領域から構成される抗原結合活性に関与する構造を標的とする。所望の抗原結合特性が同定されれば、可変領域を適切な抗体クラス、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥに操作することができる。好ましい実施態様において、同定された候補結合分子は親和性成熟に供され、標的／抗原に対する結合分子の親和性／アビディティが高められる。
【００９７】
４．  発現およびスクリーニング系
上記の技術または他の適切な技術のいずれかにより生成されるポリヌクレオチドのライブラリは、所望の構造および／または活性を有する抗体を同定するために発現およびスクリーニングされ得る。抗体の発現は、無細胞抽出物（および例えばリボソームディスプレイ）、ファージディスプレイ、原核細胞、または真核細胞（例えば酵母ディスプレイ）を用いて行うことができる。
【００９８】
一つの実施態様において、ポリヌクレオチドは、無細胞抽出物において発現させることのできるテンプレートとして機能するよう操作される。例えば米国特許第５,３２４,６３７号；同第５,４９２,８１７号；同第５,６６５,５６３号に記載されるようなベクターおよび抽出物が使用でき、多くは市販されている。ポリヌクレオチド（すなわち遺伝子型）をポリペプチド（すなわち表現型）と関連付けるためのリボソームディスプレイおよび他の無細胞系技術、例えばＰｒｏｆｕｓｉｏｎTMが使用できる（例えば米国特許第６,３４
８,３１５号；同第６,２６１,８０４号；同第６,２５８,５５８号；および同第６,２１４,５５３号を参照のこと）。
【００９９】
あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、便利な大腸菌発現系において発現させることができ、これらはＰｌｕｃｋｔｈｕｎおよびＳｋｅｒｒａ（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４７６−５１５（１９８９）；Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２７３−２７８（１９９１））に記載されている。Ｍ．Ｂｅｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ａ．Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４７６（１９８９）に記載されるように、変異タンパク質は、培地におよび／または細菌の細胞質に分泌物を発現させることができる。一つの実施態様において、ＶＨおよびＶＬをコードする単一ドメインの各々を、シグナル配列、例えばｏｍｐＡ、ｐｈｏＡ、またはｐｅｌＢシグナル配列をコードする配列の３’末端に結合させる（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４３７９（１９８７））。これらの遺伝子融合物は、単一のベクターから発現され大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌され得、そこでリフォールディングされて活性な形態で回収できるよう、二シストロン性の構築物に組み込まれる（Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２７３−２７８（１９９１））。例えば、抗体重鎖遺伝子は、抗体軽鎖遺伝子と同時に発現させ、抗体または抗体フラグメントを生成させ得る。
【０１００】
別の実施態様において、抗体配列は、例えばＵＳ２００４００７２７４０Ａ１；ＵＳ２００３０１０００２３Ａ１；およびＵＳ２００３００３６０９２Ａ１に記載されるような分泌シグナルおよび脂質付加部分を用いることで、原核生物、例えば大腸菌の膜表面で発現される。
【０１０１】
さらに別の実施態様において、ポリヌクレオチドは、例えば米国特許第６,４２３,５３８号；同第６,３３１,３９１号；および同第６,３００,０６５号に記載されるような酵母ディスプレイを用いることで、真核細胞、例えば酵母において発現させることができる。このアプローチにおいて、ライブラリの抗体（例えばｓｃＦｖ）は、酵母の表面上で発現および提示されるポリペプチドに融合される。
【０１０２】
本発明の抗体の発現のための高等真核細胞、例えば哺乳動物細胞、例えば骨髄腫細胞（例えばＮＳ／０細胞）、ハイブリドーマ細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞もまた使用できる。典型的には、抗体は、哺乳動物細胞において発現させる場合、発現され培養培地に分泌されるよう、またはそのような細胞の表面上で発現されるよう設計される。抗体または抗体フラグメントは、例えば全長抗体分子としてまたは個々のＶＨおよびＶＬフラグメント、Ｆａｂフラグメント、単一ドメイン、または単鎖（ｓＦｖ）として産生させることができる（例えばＨｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）を参照のこと）。
【０１０３】
発現された抗体（または直接的な合成により作製された抗体）のスクリーニングは、適切な手段により行うことができる。例えば、標準的な免疫アッセイおよび／またはアフィニティクロマトグラフィによって結合活性を評価することができる。触媒機能、例えばタンパク質分解機能についての本発明の抗体のスクリーニングは、例えば米国特許第５,７９８,２０８号に記載されるような標準的なヘモグロビンプラークアッセイを用いることで達成することができる。候補抗体が治療標的に結合する能力の測定は、例えば所定の標的または抗原への抗体の結合速度を測定するＢｉａｃｏｒｅ機器を用いることでインビトロでアッセイできる。多くの動物モデルのいずれかを用いてインビボアッセイを行うことができ、適切な場合はその後にヒトにおいて試験される。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】本発明の特定の実施態様において特徴的なユニバーサル抗体ライブラリの構築をコンピュータ支援データベースバイオマイニングを用いて実行するための概略図を示す。
【図２】クエリーｍＡｂ  ＣＤＲプローブをコホートライブラリのインシリコ同定に使用する本発明の選択プロセスを強調したものであり、コホートライブラリはその後に最適化コホートクローンを同定するためのインビトロスクリーニングアプローチに使用され得る。
【図３】コホートの調査のおいて使用するために照合ユニバーサル抗体ライブラリを構築するプロセスの概要を示す。
【図４】ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の頻度表を生成させるプロセスの概要を提供する。
【図５】ＵＡＬフレームワークおよびＣＤＲ配列の、ＶH（記載順に、それぞれ、配列番号１〜５）、Ｖκ（記載順に、それぞれ、配列番号６〜８）、およびＶλ（記載順に、それぞれ、配列番号９〜１２）クラス間での分類の例を示す。
【図６】ＣＤＲ１およびＣＤＲ２フレームワークの交配を可能にするＵＡＬ重鎖の構築の例を示す。
【図６Ａ】ＣＤＲ１およびＣＤＲ２フレームワークの交配を可能にするＵＡＬ重鎖の構築の例を示す。
【図６Ｂ】ＣＤＲ１およびＣＤＲ２フレームワークの交配を可能にするＵＡＬ重鎖の構築の例を示す。
【図６Ｃ】ＣＤＲ１およびＣＤＲ２フレームワークの交配を可能にするＵＡＬ重鎖の構築の例を示す。
【図６Ｄ】ＣＤＲ１およびＣＤＲ２フレームワークの交配を可能にするＵＡＬ重鎖の構築の例を示す。
【図６Ｅ】ＣＤＲ１およびＣＤＲ２フレームワークの交配を可能にするＵＡＬ重鎖の構築の例を示す。
【図６Ｆ】ＣＤＲ１およびＣＤＲ２フレームワークの交配を可能にするＵＡＬ重鎖の構築の例を示す。
【図６Ｇ】ＣＤＲ１およびＣＤＲ２フレームワークの交配を可能にするＵＡＬ重鎖の構築の例を示す。
【図７】ＣＤＲ１およびＣＤＲ２フレームワークの交配を可能にするＵＡＬカッパ軽鎖の構築の例を示す。ＶＫ−３＿ＣＤＲ１−７、ＶＫ−１＿ＣＤＲ２−１０、およびＶＫ−３＿ＣＤＲ２−１０の配列は、それぞれ、配列番号１６７、２７６、および２７８として開示した。
【図７Ａ】ＣＤＲ１およびＣＤＲ２フレームワークの交配を可能にするＵＡＬカッパ軽鎖の構築の例を示す。ＶＫ−３＿ＣＤＲ１−７、ＶＫ−１＿ＣＤＲ２−１０、およびＶＫ−３＿ＣＤＲ２−１０の配列は、それぞれ、配列番号１６７、２７６、および２７８として開示した。
【図７Ｂ】ＣＤＲ１およびＣＤＲ２フレームワークの交配を可能にするＵＡＬカッパ軽鎖の構築の例を示す。ＶＫ−３＿ＣＤＲ１−７、ＶＫ−１＿ＣＤＲ２−１０、およびＶＫ−３＿ＣＤＲ２−１０の配列は、それぞれ、配列番号１６７、２７６、および２７８として開示した。
【図７Ｃ】ＣＤＲ１およびＣＤＲ２フレームワークの交配を可能にするＵＡＬカッパ軽鎖の構築の例を示す。ＶＫ−３＿ＣＤＲ１−７、ＶＫ−１＿ＣＤＲ２−１０、およびＶＫ−３＿ＣＤＲ２−１０の配列は、それぞれ、配列番号１６７、２７６、および２７８として開示した。
【図７Ｄ】ＣＤＲ１およびＣＤＲ２フレームワークの交配を可能にするＵＡＬカッパ軽鎖の構築の例を示す。ＶＫ−３＿ＣＤＲ１−７、ＶＫ−１＿ＣＤＲ２−１０、およびＶＫ−３＿ＣＤＲ２−１０の配列は、それぞれ、配列番号１６７、２７６、および２７８として開示した。
【図８】ＣＤＲ１およびＣＤＲ２フレームワークの交配を可能にするＵＡＬラムダ軽鎖の構築の例を示す。ＶＬ−１＿ＣＤＲ２−１０、ＶＬ−２＿ＣＤＲ２−１０、およびＶＬ−３＿ＣＤＲ２−１０の配列は、配列番号２８０として開示した。
【図８Ａ】ＣＤＲ１およびＣＤＲ２フレームワークの交配を可能にするＵＡＬラムダ軽鎖の構築の例を示す。ＶＬ−１＿ＣＤＲ２−１０、ＶＬ−２＿ＣＤＲ２−１０、およびＶＬ−３＿ＣＤＲ２−１０の配列は、配列番号２８０として開示した。
【図８Ｂ】ＣＤＲ１およびＣＤＲ２フレームワークの交配を可能にするＵＡＬラムダ軽鎖の構築の例を示す。ＶＬ−１＿ＣＤＲ２−１０、ＶＬ−２＿ＣＤＲ２−１０、およびＶＬ−３＿ＣＤＲ２−１０の配列は、配列番号２８０として開示した。
【図８Ｃ】ＣＤＲ１およびＣＤＲ２フレームワークの交配を可能にするＵＡＬラムダ軽鎖の構築の例を示す。ＶＬ−１＿ＣＤＲ２−１０、ＶＬ−２＿ＣＤＲ２−１０、およびＶＬ−３＿ＣＤＲ２−１０の配列は、配列番号２８０として開示した。
【図８Ｄ】ＣＤＲ１およびＣＤＲ２フレームワークの交配を可能にするＵＡＬラムダ軽鎖の構築の例を示す。ＶＬ−１＿ＣＤＲ２−１０、ＶＬ−２＿ＣＤＲ２−１０、およびＶＬ−３＿ＣＤＲ２−１０の配列は、配列番号２８０として開示した。
【図８Ｅ】ＣＤＲ１およびＣＤＲ２フレームワークの交配を可能にするＵＡＬラムダ軽鎖の構築の例を示す。ＶＬ−１＿ＣＤＲ２−１０、ＶＬ−２＿ＣＤＲ２−１０、およびＶＬ−３＿ＣＤＲ２−１０の配列は、配列番号２８０として開示した。
【図９Ａ】１２残基長のＶＨ−４アイソタイプクラスのＣＤＲ２配列について同定された４つのカノニカル構造（ＣＳ１−Ａ（配列番号６３６）およびＣＳ１−１（配列番号６３７）を示す）についての位置ごとのアミノ酸残基の集団優先性のヒストグラムを示す。集団優先性の分布は可変性残基の位置において４つのサブクラスの間で変化することが観察される。
【図９Ｂ】１２残基長のＶＨ−４アイソタイプクラスのＣＤＲ２配列について同定された４つのカノニカル構造（ＣＳ１−２（配列番号６３８）およびＣＳ１−３（配列番号６３９）を示す）についての位置ごとのアミノ酸残基の集団優先性のヒストグラムを示す。集団優先性の分布は可変性残基の位置において４つのサブクラスの間で変化することが観察される。
【図１０】（マウスＣＤＲ１プローブＶH  ＣＤＲ１「ＴＮＹＧＭＮ」（配列番号１３）を用いるＵＡＬのブラスティング）は、ＶＨ−１  ＣＤＲ１（配列番号１４）およびＶＨ−３  ＣＤＲ１（配列番号１５）参照ユニバーサル抗体ライブラリに存在するヒトＣＤＲ１配列における各ＣＤＲ１アミノ酸位置に存在する配列多様性を同定するための、マウス抗体由来のＣＤＲ１ペプチド配列の使用例を示す。
【図１１】（マウスＣＤＲ２プローブＶH  ＣＤＲ２「ＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴ」（配列番号１６）を用いるＵＡＬのブラスティング）は、ＶＨ−１  ＣＤＲ２（配列番号１７）およびＶＨ−３  ＣＤＲ２（配列番号１８）参照ユニバーサル抗体ライブラリに存在するヒトＣＤＲ２配列における各ＣＤＲ２アミノ酸位置に存在する配列多様性を同定するための、マウス抗体由来のＣＤＲ２ペプチド配列の使用例を示す。
【図１２】新規な抗体配列を生成させるために参照ライブラリの多様性の独立組み合わせにより生成されたコホートライブラリの多様性を計算した、数量化コホートライブラリの例を示す。
【図１３Ａ−１】マウスＡｖａｓｔｉｎ  Ａ４．６．１抗体由来のクエリー配列を用いる重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１３および１５として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１３および１４として開示される。
【図１３Ａ−２】マウスＡｖａｓｔｉｎ  Ａ４．６．１抗体由来のクエリー配列を用いる重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１６および１７として開示される。
【図１３Ａ−３】マウスＡｖａｓｔｉｎ  Ａ４．６．１抗体由来のクエリー配列を用いる重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１６および１８として開示される。
【図１３Ａ−４】マウスＡｖａｓｔｉｎ  Ａ４．６．１抗体由来のクエリー配列を用いる重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１９および２０として開示される。
【図１３Ｂ−１】マウスＡｖａｓｔｉｎ  Ａ４．６．１抗体由来のクエリー配列を用いる軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２１および２２として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号２１および２４９として開示される。
【図１３Ｂ−２】マウスＡｖａｓｔｉｎ  Ａ４．６．１抗体由来のクエリー配列を用いる軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２３および２４として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号２３および２５として開示される。
【図１３Ｂ−３】マウスＡｖａｓｔｉｎ  Ａ４．６．１抗体由来のクエリー配列を用いる軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号２６および２７として開示される。
【図１４Ａ】マウス抗ＨＩＶ  ｇｐ４１モノクローナル抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖および軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲ配列の選択を示す。下線は触媒性の三つ組残基である。  配列は、それぞれ、記載順に、配列番号２８〜３１として開示される。
【図１４Ｂ】マウス抗ＨＩＶ  ｇｐ４１モノクローナル抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖および軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲ配列の選択を示す。下線は触媒性の三つ組残基である。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号３２および３３として開示される。
【図１４Ｃ】マウス抗ＨＩＶ  ｇｐ４１モノクローナル抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖および軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲ配列の選択を示す。下線は触媒性の三つ組残基である。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号３２および３４として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号３５および３６として開示される。
【図１４Ｄ】マウス抗ＨＩＶ  ｇｐ４１モノクローナル抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖および軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲ配列の選択を示す。下線は触媒性の三つ組残基である。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号３０および３７として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号３０および３８として開示される。
【図１４Ｅ】マウス抗ＨＩＶ  ｇｐ４１モノクローナル抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖および軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲ配列の選択を示す。下線は触媒性の三つ組残基である。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号３１および３９として開示される。
【図１５Ａ】ヒトＨＫ１４抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖および軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲ配列の選択を示す。  配列は、それぞれ、記載順に、配列番号４０〜４３として開示される。
【図１５Ｂ】ヒトＨＫ１４抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖および軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲ配列の選択を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号４１および４４として開示される。
【図１５Ｃ】ヒトＨＫ１４抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖および軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲ配列の選択を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号４２および４５として開示される。
【図１５Ｄ】ヒトＨＫ１４抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖および軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲ配列の選択を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号４３および４６として開示される。
【図１６Ａ−１】ヒトＡＡＶ２９３  ＭＣＰ−１抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号４７および４８として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号４９および５０として開示される。
【図１６Ａ−２】ヒトＡＡＶ２９３  ＭＣＰ−１抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号５１および５２として開示される。
【図１６Ａ−３】ヒトＡＡＶ２９３  ＭＣＰ−１抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号５１および５３として開示される。
【図１６Ａ−４】ヒトＡＡＶ２９３  ＭＣＰ−１抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号５４および５５として開示される。
【図１６Ｂ−１】ヒトＡＡＶ２９３  ＭＣＰ−１抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号５６および５７として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号５６および５８として開示される。
【図１６Ｂ−２】ヒトＡＡＶ２９３  ＭＣＰ−１抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号５９および６０として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号５９および６０として開示される。
【図１６Ｂ−３】ヒトＡＡＶ２９３  ＭＣＰ−１抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号５９および５８２として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号６１および６２として開示される。
【図１７Ａ−１】マウスＡＣＺ８８５抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号６３および６４として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号６３および６５として開示される。
【図１７Ａ−２】マウスＡＣＺ８８５抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号６６および６７として開示される。
【図１７Ａ−３】マウスＡＣＺ８８５抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号６６および６８として開示される。
【図１７Ａ−４】マウスＡＣＺ８８５抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号６９および７０として開示される。
【図１７Ｂ−１】マウスＡＣＺ８８５抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号７１および７２として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号７１および７３として開示される。
【図１７Ｂ−２】マウスＡＣＺ８８５抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号７４および７５として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号７４および７６として開示される。
【図１７Ｂ−３】マウスＡＣＺ８８５抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号７７および７８として開示される。
【図１８Ａ−１】ヒトｇｐ１２０  ＩＴＨ５２抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号７９および８０として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号７９および８１として開示される。
【図１８Ａ−２】ヒトｇｐ１２０  ＩＴＨ５２抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号８２および８３として開示される。
【図１８Ａ−３】ヒトｇｐ１２０  ＩＴＨ５２抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号８２および８４として開示される。
【図１８Ａ−４】ヒトｇｐ１２０  ＩＴＨ５２抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号８５および８６として開示される。
【図１８Ｂ−１】ヒトｇｐ１２０  ＩＴＨ５２抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、両方の表において、それぞれ、配列番号８７および８８として開示される。
【図１８Ｂ−２】ヒトｇｐ１２０  ＩＴＨ５２抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号８９および９０として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号８９および９１として開示される。
【図１８Ｂ−３】ヒトｇｐ１２０  ＩＴＨ５２抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号９２および９３として開示される。
【図１９Ａ−１】ヒトｓｃＦｖ  ｇｐ１２０  ＩＴＨ５２抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号９４および９５として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号９４および９６として開示される。
【図１９Ａ−２】ヒトｓｃＦｖ  ｇｐ１２０  ＩＴＨ５２抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号９７および９８として開示される。
【図１９Ａ−３】ヒトｓｃＦｖ  ｇｐ１２０  ＩＴＨ５２抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号９７および９９として開示される。
【図１９Ａ−４】ヒトｓｃＦｖ  ｇｐ１２０  ＩＴＨ５２抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１００および１０１として開示される。
【図１９Ｂ−１】ヒトｓｃＦｖ  ｇｐ１２０  ＩＴＨ５２抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１０２および１０３として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１０４および１０５として開示される。
【図１９Ｂ−２】ヒトｓｃＦｖ  ｇｐ１２０  ＩＴＨ５２抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１０４および１０６として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１０７および１０８として開示される。
【図２０Ａ−１】ヒト４Ｄ５  Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１０９および１１０として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１０９および１１１として開示される。
【図２０Ａ−２】ヒト４Ｄ５  Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１１２および１１３として開示される。
【図２０Ａ−３】ヒト４Ｄ５  Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１１２および１１４として開示される。
【図２０Ａ−４】ヒト４Ｄ５  Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１１５および１１６として開示される。
【図２０Ｂ−１】ヒト４Ｄ５  Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１１７および１１８として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１１７および１１９として開示される。
【図２０Ｂ−２】ヒト４Ｄ５  Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１２０および１２１として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１２０および１２２として開示される。
【図２０Ｂ−３】ヒト４Ｄ５  Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１２３および１２４として開示される。
【図２１Ａ−１】ヒトＨＤ３７  ＣＤ１９抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１２５および１２６として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１２５および１２７として開示される。
【図２１Ａ−２】ヒトＨＤ３７  ＣＤ１９抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１２８および１２９として開示される。
【図２１Ａ−３】ヒトＨＤ３７  ＣＤ１９抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１２８および１３０として開示される。
【図２１Ａ−４】ヒトＨＤ３７  ＣＤ１９抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１３１および１３２として開示される。
【図２１Ｂ−１】ヒトＨＤ３７  ＣＤ１９抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１３３および１３４として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１３３および１３５として開示される。
【図２１Ｂ−２】ヒトＨＤ３７  ＣＤ１９抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１３６および１３７として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１３６および１３８として開示される。
【図２１Ｂ−３】ヒトＨＤ３７  ＣＤ１９抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１３９および１４０として開示される。
【図２２Ａ−１】ヒトＣＤ８  ｇ１０−１抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１４１および１４２として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１４１および１４３として開示される。
【図２２Ａ−２】ヒトＣＤ８  ｇ１０−１抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１４４および１４５として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１４４および１４６として開示される。
【図２２Ａ−３】ヒトＣＤ８  ｇ１０−１抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１４７および１４８として開示される。
【図２２Ｂ−１】ヒトＣＤ８  ｇ１０−１抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１４９および１５０として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１４９および１５１として開示される。
【図２２Ｂ−２】ヒトＣＤ８  ｇ１０−１抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１５２および１５３として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１５２および１５４として開示される。
【図２２Ｂ−３】ヒトＣＤ８  ｇ１０−１抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１５５および１５６として開示される。
【図２３Ａ−１】マウス５Ｇ１．１  Ｃ５抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１５７および１５８として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１５７および１５９として開示される。
【図２３Ａ−２】マウス５Ｇ１．１  Ｃ５抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１６０および１６１として、ならびに二番目の表においては、配列番号１６０および１６２として開示される。
【図２３Ａ−３】マウス５Ｇ１．１  Ｃ５抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１６３および１６４として開示される。
【図２３Ｂ−１】マウス５Ｇ１．１  Ｃ５抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１６５および１６６として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１６５および１６７として開示される。
【図２３Ｂ−２】マウス５Ｇ１．１  Ｃ５抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１６８および１６９として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１６８および１７０として開示される。
【図２３Ｂ−３】マウス５Ｇ１．１  Ｃ５抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１７１および１７２として開示される。
【図２４Ａ−１】マウスＲｅｏｐｒｏ  ７Ｅ３抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１７３および１７４として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１７３および１７５として開示される。
【図２４Ａ−２】マウスＲｅｏｐｒｏ  ７Ｅ３抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１７６および１７７として開示される。
【図２４Ａ−３】マウスＲｅｏｐｒｏ  ７Ｅ３抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１７６および１７８として開示される。
【図２４Ａ−４】マウスＲｅｏｐｒｏ  ７Ｅ３抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１７９および１８０として開示される。
【図２４Ｂ−１】マウスＲｅｏｐｒｏ  ７Ｅ３抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１８１および１８２として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１８１および１８３として開示される。
【図２４Ｂ−２】マウスＲｅｏｐｒｏ  ７Ｅ３抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１８４および１８５として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１８４および１８６として開示される。
【図２４Ｂ−３】マウスＲｅｏｐｒｏ  ７Ｅ３抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１８７および１８８として開示される。
【図２５Ａ−１】マウスＲａｐｔｉｖａ  ＭＨＭ２４抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブ配列は、最初の表においては、配列番号１８９として、ならびにマウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、二番目の表においては、それぞれ、配列番号１８９および１９１として開示される。
【図２５Ａ−２】マウスＲａｐｔｉｖａ  ＭＨＭ２４抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１９２および１９３として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１９２および１９４として開示される。
【図２５Ａ−３】マウスＲａｐｔｉｖａ  ＭＨＭ２４抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号１９５および１９６として開示される。
【図２５Ｂ−１】マウスＲａｐｔｉｖａ  ＭＨＭ２４抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１９７および１９８として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号１９７および１９８として開示される。
【図２５Ｂ−２】マウスＲａｐｔｉｖａ  ＭＨＭ２４抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２００および２０１として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号２００および２０２として開示される。
【図２５Ｂ−３】マウスＲａｐｔｉｖａ  ＭＨＭ２４抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号２０３および２０４として開示される。
【図２６Ａ−１】マウスＯＶＡ抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブ配列は、最初の表においては、配列番号２０５として、ならびにヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、二番目の表においては、それぞれ、配列番号２０７および２０８として開示される。
【図２６Ａ−２】マウスＯＶＡ抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２０９および２１０として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号２０９および２１１として開示される。
【図２６Ａ−３】マウスＯＶＡ抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号２１２および２１３として開示される。
【図２６Ｂ−１】マウスＯＶＡ抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２１４および２１５として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号２１６および２１７として開示される。
【図２６Ｂ−２】マウスＯＶＡ抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２１６および２１８として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号２１９および２２０として開示される。
【図２７Ａ−１】マウスＴＮＦ−αモノクローナル抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２２１および２２２として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号２２１および２２３として開示される。
【図２７Ａ−２】マウスＴＮＦ−αモノクローナル抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２２４および２２５として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号２２４および２２６として開示される。
【図２７Ａ−３】マウスＴＮＦ−αモノクローナル抗体由来のクエリー配列を用いる、重鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  ヒトプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号２２７および２２８として開示される。
【図２７Ｂ−１】マウスＴＮＦ−αモノクローナル抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２２９および２３０として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号２２９および２３１として開示される。
【図２７Ｂ−２】マウスＴＮＦ−αモノクローナル抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２３２および２３３として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号２３２および２３４として開示される。
【図２７Ｂ−３】マウスＴＮＦ−αモノクローナル抗体由来のクエリー配列を用いる、軽鎖についてのコホートライブラリＣＤＲの選択表を示す。  マウスプローブおよびライブラリエンコード配列は、それぞれ、配列番号２３５および２３６として開示される。
【図２８】本発明の例示の実施態様において使用される、側鎖化学に基づき類似するものと分類されたアミノ酸のグループ化を示す。
【図２９】本発明の方法を用いて、ＶH４  ＣＤＲ１参照ライブラリとの比較のために、類似基準または同一基準の下で４Ｈ６抗ＤＲ４  ＣＤＲ１クエリー配列について獲得したコホート配列の比較を示す。最初の表は、記載順に、それぞれ、配列番号２３７〜２３９を開示する。第二の表は、記載順に、それぞれ、配列番号２４０〜２４２を開示する。第三の表は、記載順に、それぞれ、配列番号２４３〜２４５を開示する。
【図３０Ａ】マウスモノクローナル抗ＶＥＧＦ  Ａ４．６．１抗体をプローブ抗体として用いて、類似基準および同一基準の下で獲得されたコホートライブラリ配列を示す。  パネルＡ：マウスプローブＶH  ＣＤＲ１  「ＴＮＹＧＭＮ」（配列番号１３）。類似配列および同一配列は、最初の表においては配列番号１４として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号２４６および１５として開示される。
【図３０Ｂ】マウスモノクローナル抗ＶＥＧＦ  Ａ４．６．１抗体をプローブ抗体として用いて、類似基準および同一基準の下で獲得されたコホートライブラリ配列を示す。  パネルＢ：マウスプローブＶH  ＣＤＲ２  「ＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴ」（配列番号１６）。類似配列および同一配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２４７および１７として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号２４８および１８として開示される。
【図３０Ｃ】マウスモノクローナル抗ＶＥＧＦ  Ａ４．６．１抗体をプローブ抗体として用いて、類似基準および同一基準の下で獲得されたコホートライブラリ配列を示す。  パネルＣ：マウスプローブＶH  ＣＤＲ３  「ＡＫＹＰＨＹＹＧＳＳＨＷＹＦＤ」（配列番号１９）。類似配列および同一配列は、配列番号２０として開示される。
【図３０Ｄ】マウスモノクローナル抗ＶＥＧＦ  Ａ４．６．１抗体をプローブ抗体として用いて、類似基準および同一基準の下で獲得されたコホートライブラリ配列を示す。  パネルＤ：マウスプローブＶL  ＣＤＲ１  「ＳＮＹＬＮＷＹ」（配列番号２１）。類似配列および同一配列は、最初の表においては、配列番号２２として、二番目の表においては、配列番号２４９として、ならびに三番目の表においては、それぞれ、配列番号２５０および２５１として開示される。
【図３０Ｅ】マウスモノクローナル抗ＶＥＧＦ  Ａ４．６．１抗体をプローブ抗体として用いて、類似基準および同一基準の下で獲得されたコホートライブラリ配列を示す。  パネルＥ：マウスプローブＶL  ＣＤＲ２  「ＶＬＩＹＦＴＳＳＬＨ」（配列番号２３）。類似配列および同一配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２５２および２４として、二番目の表においては、それぞれ、配列番号２５３および２５として、ならびに三番目の表においては、それぞれ、配列番号２５４および２５５として開示される。
【図３０Ｆ】マウスモノクローナル抗ＶＥＧＦ  Ａ４．６．１抗体をプローブ抗体として用いて、類似基準および同一基準の下で獲得されたコホートライブラリ配列を示す。  パネルＦ：マウスプローブＶL  ＣＤＲ３  「ＱＱＹＳＴＶＰＷ」（配列番号２６）。類似配列および同一配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２５６および２７として、ならびに類似配列は、二番目の表においては、配列番号２５７として開示される。
【図３０Ｇ】マウスモノクローナル抗ＶＥＧＦ  Ａ４．６．１抗体をプローブ抗体として用いて、類似基準および同一基準の下で獲得されたコホートライブラリ配列を示す。  パネルＧ：コンビナトリアルコホートの多様性および類似性減少倍率値
【図３１Ａ】類似基準および同一基準に加えて「全類似」基準を使用した場合の抗ＶＥＧＦ  Ａ４．６．１抗体について獲得されたコホートライブラリ配列を示す。パネルＡ：マウスプローブＶH  ＣＤＲ１  「ＴＮＹＧＭＮ」（配列番号１３）。類似配列、同一配列、および全類似配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号１４、１４、および２５９として、ならびに二番目の表においては、それぞれ、配列番号２４６、１５、および２６１として開示される。
【図３１Ｂ】類似基準および同一基準に加えて「全類似」基準を使用した場合の抗ＶＥＧＦ  Ａ４．６．１抗体について獲得されたコホートライブラリ配列を示す。  パネルＢ：マウスプローブＶH  ＣＤＲ２  「ＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴ」（配列番号１６）。類似配列、同一配列、全類似配列、およびデータベース配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２４７、１７、２６３、および２６４として開示される。類似配列、同一配列、および全類似配列は、二番目の表においては、それぞれ、配列番号２４８、１８、および２６５として開示される。
【図３１Ｃ】類似基準および同一基準に加えて「全類似」基準を使用した場合の抗ＶＥＧＦ  Ａ４．６．１抗体について獲得されたコホートライブラリ配列を示す。  パネルＣ：マウスプローブＶH  ＣＤＲ３  「ＡＫＹＰＨＹＹＧＳＳＨＷＹＦＤ」（配列番号１９）。類似配列および同一配列は、配列番号２０として開示される。
【図３１Ｄ】類似基準および同一基準に加えて「全類似」基準を使用した場合の抗ＶＥＧＦ  Ａ４．６．１抗体について獲得されたコホートライブラリ配列を示す。  パネルＤ：マウスプローブＶL  ＣＤＲ１  「ＳＮＹＬＮＷＹ」（配列番号２１）。類似配列、同一配列、および全類似配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２２、２２、および２６９として開示される。類似配列、同一配列、全類似配列、およびデータベース配列は、二番目の表においては、それぞれ、配列番号２４９、２４９、２７１、および２７２として開示される。類似配列および同一配列は、三番目の表においては、それぞれ、配列番号２５０および２５１として開示される。
【図３１Ｅ】類似基準および同一基準に加えて「全類似」基準を使用した場合の抗ＶＥＧＦ  Ａ４．６．１抗体について獲得されたコホートライブラリ配列を示す。  パネルＥ：マウスプローブＶL  ＣＤＲ２  「ＶＬＩＹＦＴＳＳＬＨ」（配列番号２３）。類似配列、同一配列、全類似配列、およびデータベース配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２５２、２４、２７５、および２７６として、二番目の表においては、それぞれ、配列番号２５３、２５、２７７、および２７８として、ならびに三番目の表においては、それぞれ、配列番号２５４、２５５、２７９、および２８０として開示される。
【図３１Ｆ】類似基準および同一基準に加えて「全類似」基準を使用した場合の抗ＶＥＧＦ  Ａ４．６．１抗体について獲得されたコホートライブラリ配列を示す。  パネルＦ：マウスプローブＶL  ＣＤＲ３  「ＱＱＹＳＴＶＰＷ」（配列番号２６）。類似配列、同一配列、および全類似配列は、最初の表においては、それぞれ、配列番号２５６、２７、および２８１として開示される。類似配列および全類似配列は、二番目の表においては、それぞれ、配列番号２５７および２８３として開示した。
【図３２】本発明の例証の実施態様を実施するのに適した電子機器５００の一例の実施態様を示す。
【図３３】本発明に従い形成された様々なｓｃＦｖキメラ分子の概略図を示す。キメラｓｃＦｖ構築物は、細菌ペリプラズムへの輸送および保持のためのＮ末端リーダー配列を含み得る。代替のｓｃＦｖ  Ｃ末端キメラ構築物は、ｓｃＦｖタンパク質を保持するＧｅｎｅ  ＩＩＩアンカーシグナルを利用するものである。
【図３４】重複・非縮重オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いる野生型抗ＶＥＧＦ  Ａ４．６．１重鎖ライブラリの構築を示し、これはシングルオーバーラップエクステンションポリメラーゼ連鎖反応（ＳＯＥ−ＰＣＲ）を用いて二本鎖核酸に変換され得る。図は配列番号２８５を開示する。
【図３５】重複・非縮重オリゴヌクレオチドの組み合わせを用いる野生型抗ＶＥＧＦ  Ａ４．６．１軽鎖ライブラリの構築を示し、これはシングルオーバーラップエクステンションポリメラーゼ連鎖反応（ＳＯＥ−ＰＣＲ）を用いて二本鎖核酸に変換され得る。図は配列番号２８６を開示する。
【図３６】コンビナトリアル有用変異（ＣＢＭ）を示すｓｃＦｖクローンのアレイを示す。試験参照ｓｃＦｖヒト抗体内に導入されたＶLおよびＶH  ＣＤＲ領域に複数の変異があり、これは優れた標的抗原に対するＫoff結合値に関連する。これらのＣＢＭの構築における位置的置換は、高いＫoffおよびＫon結合特性を有する個別のルックスルー型変異誘発（ＬＴＭ）クローンとして予め同定されたものである。Ｌ１配列は、記載順に、それぞれ、配列番号２８７〜２９８として開示される。Ｌ２配列は、記載順に、それぞれ、配列番号２９９〜３１０として開示される。Ｌ３配列は、記載順に、それぞれ、配列番号３１１〜３２２として開示される。Ｈ１配列は、記載順に、それぞれ、配列番号３２３〜３３４として開示される。Ｈ２配列は、記載順に、それぞれ、配列番号３３５〜３４６として開示される。Ｈ３配列は、記載順に、それぞれ、配列番号３４７〜３５８として開示される。
【図３７】図３６からの６つの高親和性ＣＢＭクローンについての結合ＫoffキネティクスのＢｉａｃｏｒｅによる測定を、その親の野生型クローンのキネティクスと対比させて示す。
【図３８】試験候補ｓｃＦｖに対するビオチン化標的抗原およびストレプトアビジンＦＩＴＣの結合を示すＦＡＣＳプロットである。左パネルのＦＡＣＳプロットは、ＬＴＭライブラリ全体の結合親和性の分布に比べて、標的抗原に対してより高い結合親和性を有するｓｃＦｖ融合物を発現するクローンのみを同定するための選択ゲート（台形Ｐ２）を示す。右のＦＡＣＳパネルは、ソーティング後のＦＡＣＳ分析を示し、これによりＰ２未スクリーニングｓｃＦｖクローンの＞２５％が既定の高標的抗原親和性の基準内であることが確認された。
【図３９】Ａ４．６．１コホートライブラリから回収された３Ｄ５抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖクローンについてのＢｉａｃｏｒｅ結合キネティクスを示す（左パネル）。３Ｄ５抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖクローンがＶＥＧＦに結合することは、より多くのＶＥＧＦ抗原の追加に伴って反応単位（ＲＵ）が上昇したことにより実証された。対照的に、非特異的ＢＳＡを３Ｄ５抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖに添加した場合は、ＲＵの上昇は見られなかった。
【図４０】実施例２において詳述される、重鎖配列のサブグループプールの選択プロセス、サブグループ配列のサブクラス分類、およびカノニカル構造に基づくサブクラス集団のさらなる分類を示す。
【図４１】実施例２において詳述される、ＣＤＲ可変性プロフィールの選択を示すフローチャートを示す。
【図４２】共通のＣＤＲ３ドメインに接続させる、ＶH１およびＶH３  ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の設計の交配を示す。
【図４３】共通のＣＤＲ３ドメインに接続させる、ＶK１およびＶK３  ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の設計の交配を示す。ＶＫ−１＿ＣＤＲ２−１０、ＶＫ−３＿ＣＤＲ１−７、およびＶＫ−３＿ＣＤＲ２−１０の配列は、それぞれ、配列番号２７６、１６７、および２７８として開示した。
【図４４】様々な長さの重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ライブラリについての多様性の表を示す。ＶＬ１−ＣＤＲ２、ＶＬ２−ＣＤＲ２、およびＶＬ３−ＣＤＲ２の配列は、それぞれ、配列番号６４０、６４１、および２８０として開示した。
【図４４Ａ】様々な長さの重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ライブラリについての多様性の表を示す。ＶＬ１−ＣＤＲ２、ＶＬ２−ＣＤＲ２、およびＶＬ３−ＣＤＲ２の配列は、それぞれ、配列番号６４０、６４１、および２８０として開示した。
【図４４Ｂ】様々な長さの重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ライブラリについての多様性の表を示す。ＶＬ１−ＣＤＲ２、ＶＬ２−ＣＤＲ２、およびＶＬ３−ＣＤＲ２の配列は、それぞれ、配列番号６４０、６４１、および２８０として開示した。
【図４４Ｃ】様々な長さの重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ライブラリについての多様性の表を示す。ＶＬ１−ＣＤＲ２、ＶＬ２−ＣＤＲ２、およびＶＬ３−ＣＤＲ２の配列は、それぞれ、配列番号６４０、６４１、および２８０として開示した。
【図４４Ｄ】様々な長さの重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ライブラリについての多様性の表を示す。ＶＬ１−ＣＤＲ２、ＶＬ２−ＣＤＲ２、およびＶＬ３−ＣＤＲ２の配列は、それぞれ、配列番号６４０、６４１、および２８０として開示した。
【図４４Ｅ】様々な長さの重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ライブラリについての多様性の表を示す。ＶＬ１−ＣＤＲ２、ＶＬ２−ＣＤＲ２、およびＶＬ３−ＣＤＲ２の配列は、それぞれ、配列番号６４０、６４１、および２８０として開示した。
【図４４Ｆ】様々な長さの重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ライブラリについての多様性の表を示す。ＶＬ１−ＣＤＲ２、ＶＬ２−ＣＤＲ２、およびＶＬ３−ＣＤＲ２の配列は、それぞれ、配列番号６４０、６４１、および２８０として開示した。
【図４５Ａ】Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、ＶＨ−１（パネルＡ）の重鎖由来の長さ６のＣＤＲ１の可変性プロフィールの一覧を示す。列挙したＣＤＲの境界は、配列アラインメントの前に、接触点ＣＤＲ定義に従い線引きした。縦（Ｙ）軸は、インビボで発現された抗体のＣＤＲ位置における特定のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＣＤＲ１可変性プロフィール（図４４）は、宿主種の優先性を模倣するよう各ＣＤＲ位置で置換できる潜在的多様性を示した。
【図４５Ｂ】Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、ＶＨ−３（パネルＢ）の重鎖由来の長さ６のＣＤＲ１の可変性プロフィールの一覧を示す。列挙したＣＤＲの境界は、配列アラインメントの前に、接触点ＣＤＲ定義に従い線引きした。縦（Ｙ）軸は、インビボで発現された抗体のＣＤＲ位置における特定のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＣＤＲ１可変性プロフィール（図４４）は、宿主種の優先性を模倣するよう各ＣＤＲ位置で置換できる潜在的多様性を示した。
【図４５Ｃ】Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、ＶＨ−４（パネルＣ）の重鎖由来の長さ６のＣＤＲ１の可変性プロフィールの一覧を示す。列挙したＣＤＲの境界は、配列アラインメントの前に、接触点ＣＤＲ定義に従い線引きした。縦（Ｙ）軸は、インビボで発現された抗体のＣＤＲ位置における特定のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＣＤＲ１可変性プロフィール（図４４）は、宿主種の優先性を模倣するよう各ＣＤＲ位置で置換できる潜在的多様性を示した。
【図４６Ａ】Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、ＶＨ−１（パネルＡ）の重鎖由来の長さ１２のＣＤＲ２の可変性プロフィールの一覧を示す。列挙したＣＤＲの境界は、配列アラインメントの前に、接触点ＣＤＲ定義に従い線引きした。縦（Ｙ）軸は、インビボで発現された抗体のＣＤＲ位置における特定のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＣＤＲ１可変性プロフィール（図４４）は、宿主種の優先性を模倣するよう各ＣＤＲ位置で置換できる潜在的多様性を示した。
【図４６Ｂ】Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、ＶＨ−３（パネルＢ）重鎖由来の長さ１３のＣＤＲ２の重鎖由来の長さ１２のＣＤＲ２の可変性プロフィールの一覧を示す。列挙したＣＤＲの境界は、配列アラインメントの前に、接触点ＣＤＲ定義に従い線引きした。縦（Ｙ）軸は、インビボで発現された抗体のＣＤＲ位置における特定のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＣＤＲ１可変性プロフィール（図４４）は、宿主種の優先性を模倣するよう各ＣＤＲ位置で置換できる潜在的多様性を示した。
【図４６Ｃ】Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、ＶＨ−４（パネルＣ）の重鎖由来の長さ１２のＣＤＲ２の可変性プロフィールの一覧を示す。列挙したＣＤＲの境界は、配列アラインメントの前に、接触点ＣＤＲ定義に従い線引きした。縦（Ｙ）軸は、インビボで発現された抗体のＣＤＲ位置における特定のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＣＤＲ１可変性プロフィール（図４４）は、宿主種の優先性を模倣するよう各ＣＤＲ位置で置換できる潜在的多様性を示した。
【図４７Ａ】Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ１０のＶＨ  ＣＤＲ３（パネルＡ）の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのＶＨファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、ＶＨ  ＣＤＲ３配列のアラインメントを接触点ＣＤＲ定義に従い行った。縦（Ｙ）軸は、特定のＶＨ  ＣＤＲ３位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＶＨ  ＣＤＲ３可変性プロフィール（図４４）は、長さ１０および１１の各々のＶＨ  ＣＤＲ３の位置において置換できる潜在的多様性を示した。
【図４７Ｂ】Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ１１のＶＨ  ＣＤＲ３（パネルＢ）の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのＶＨファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、ＶＨ  ＣＤＲ３配列のアラインメントを接触点ＣＤＲ定義に従い行った。縦（Ｙ）軸は、特定のＶＨ  ＣＤＲ３位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＶＨ  ＣＤＲ３可変性プロフィール（図４４）は、長さ１０および１１の各々のＶＨ  ＣＤＲ３の位置において置換できる潜在的多様性を示した。
【図４８Ａ】Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ１２のＶＨ  ＣＤＲ３（パネルＡ）の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのＶＨファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、ＶＨ  ＣＤＲ３配列のアラインメントを接触点ＣＤＲ定義に従い行った。縦（Ｙ）軸は、特定のＶＨ  ＣＤＲ３位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＶＨ  ＣＤＲ３可変性プロフィール（図４４）は、長さ１２および１３の各々のＶＨ  ＣＤＲ３の位置において置換できる潜在的多様性を示した。
【図４８Ｂ】Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ１３のＶＨ  ＣＤＲ３（パネルＢ）の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのＶＨファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、ＶＨ  ＣＤＲ３配列のアラインメントを接触点ＣＤＲ定義に従い行った。縦（Ｙ）軸は、特定のＶＨ  ＣＤＲ３位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＶＨ  ＣＤＲ３可変性プロフィール（図４４）は、長さ１２および１３の各々のＶＨ  ＣＤＲ３の位置において置換できる潜在的多様性を示した。
【図４９Ａ】Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ１４のＶＨ  ＣＤＲ３（パネルＡ）の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのＶＨファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、ＶＨ  ＣＤＲ３配列のアラインメントを接触点ＣＤＲ定義に従い行った。縦（Ｙ）軸は、特定のＶＨ  ＣＤＲ３位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＶＨ  ＣＤＲ３可変性プロフィール（図４４）は、長さ１４および１５の各々のＶＨ  ＣＤＲ３の位置において置換できる潜在的多様性を示した。
【図４９Ｂ】Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ１５のＶＨ  ＣＤＲ３（パネルＢ）の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのＶＨファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、ＶＨ  ＣＤＲ３配列のアラインメントを接触点ＣＤＲ定義に従い行った。縦（Ｙ）軸は、特定のＶＨ  ＣＤＲ３位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＶＨ  ＣＤＲ３可変性プロフィール（図４４）は、長さ１４および１５の各々のＶＨ  ＣＤＲ３の位置において置換できる潜在的多様性を示した。
【図５０Ａ】Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ１６のＶＨ  ＣＤＲ３（パネルＡ）の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのＶＨファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、ＶＨ  ＣＤＲ３配列のアラインメントを接触点ＣＤＲ定義に従い行った。縦（Ｙ）軸は、特定のＶＨ  ＣＤＲ３位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＶＨ  ＣＤＲ３可変性プロフィール（図４４）は、長さ１６および１７の各々のＶＨ  ＣＤＲ３の位置において置換できる潜在的多様性を示した。
【図５０Ｂ】Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ１７のＶＨ  ＣＤＲ３（パネルＢ）の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのＶＨファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、ＶＨ  ＣＤＲ３配列のアラインメントを接触点ＣＤＲ定義に従い行った。縦（Ｙ）軸は、特定のＶＨ  ＣＤＲ３位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＶＨ  ＣＤＲ３可変性プロフィール（図４４）は、長さ１６および１７の各々のＶＨ  ＣＤＲ３の位置において置換できる潜在的多様性を示した。
【図５１Ａ】Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ１８のＶＨ  ＣＤＲ３（パネルＡ）の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのＶＨファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、ＶＨ  ＣＤＲ３配列のアラインメントを接触点ＣＤＲ定義に従い行った。縦（Ｙ）軸は、特定のＶＨ  ＣＤＲ３位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＶＨ  ＣＤＲ３可変性プロフィール（図４４）は、長さ１８および１９の各々のＶＨ  ＣＤＲ３の位置において置換できる潜在的多様性を示した。
【図５１Ｂ】Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ１９のＶＨ  ＣＤＲ３（パネルＢ）の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのＶＨファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、ＶＨ  ＣＤＲ３配列のアラインメントを接触点ＣＤＲ定義に従い行った。縦（Ｙ）軸は、特定のＶＨ  ＣＤＲ３位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＶＨ  ＣＤＲ３可変性プロフィール（図４４）は、長さ１８および１９の各々のＶＨ  ＣＤＲ３の位置において置換できる潜在的多様性を示した。
【図５２】Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ２０のＶＨ  ＣＤＲ３の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのＶＨファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、ＶＨ  ＣＤＲ３配列のアラインメントを接触点ＣＤＲ定義に従い行った。縦（Ｙ）軸は、特定のＶＨ  ＣＤＲ３位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＶＨ  ＣＤＲ３可変性プロフィール（図４４）は、長さ２０の各々のＶＨ  ＣＤＲ３の位置において置換できる潜在的多様性を示した。
【図５３】Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ７のＶκ−１（上パネル）およびＶκ−３（下パネル）ＣＤＲ１の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのＶκファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、Ｖκ  ＣＤＲ１配列のアラインメントを接触点ＣＤＲ定義に従い行った。縦（Ｙ）軸は、特定のＶκ  ＣＤＲ１位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＶκ  ＣＤＲ１可変性プロフィール（図４４、各グラフ下の表）は、長さ７の各々のＶκ  ＣＤＲ１の位置において置換できる潜在的多様性を示した。ＶＫ−３＿ＣＤＲ１−７の配列は配列番号１６７として開示した。
【図５４Ａ】Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ１０のＶκ−１（配列番号２７６）（パネルＡ）ＣＤＲ２の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのＶκファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、Ｖκ  ＣＤＲ２配列のアラインメントを接触点ＣＤＲ定義に従い行った。縦（Ｙ）軸は、特定のＶκ  ＣＤＲ２位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＶκ  ＣＤＲ２可変性プロフィール（図４４、各グラフ下の表）は、長さ１０の各々のＶκ  ＣＤＲ１の位置において置換できる潜在的多様性を示した。
【図５４Ｂ】Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、Ｖκ−３（配列番号２７８）（パネルＢ）ＣＤＲ２の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのＶκファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、Ｖκ  ＣＤＲ２配列のアラインメントを接触点ＣＤＲ定義に従い行った。縦（Ｙ）軸は、特定のＶκ  ＣＤＲ２位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＶκ  ＣＤＲ２可変性プロフィール（図４４、各グラフ下の表）は、長さ１０の各々のＶκ  ＣＤＲ１の位置において置換できる潜在的多様性を示した。
【図５５Ａ】Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ９のＶκ（パネルＡ）の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのＶκおよびＶλサブファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、ＣＤＲ３配列のアラインメントを接触点ＣＤＲ定義に従い行った。縦（Ｙ）軸は、特定のＶＬ  ＣＤＲ３位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＶκおよびＶλ  ＣＤＲ３可変性プロフィール（図４４、各グラフ下の表）は、長さ９の各々のＶＬ  ＣＤＲ３の位置において置換できる潜在的多様性を示した。
【図５５Ｂ】Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、Ｖλ（パネルＢ）ＣＤＲ３の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのＶκおよびＶλサブファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、ＣＤＲ３配列のアラインメントを接触点ＣＤＲ定義に従い行った。縦（Ｙ）軸は、特定のＶＬ  ＣＤＲ３位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＶκおよびＶλ  ＣＤＲ３可変性プロフィール（図４４、各グラフ下の表）は、長さ９の各々のＶＬ  ＣＤＲ３の位置において置換できる潜在的多様性を示した。
【図５６Ａ】Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ８のＶＬ（カッパおよびラムダの両方）ＣＤＲ３（パネルＡ）の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのＶκおよびＶλファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、ＣＤＲ３配列のアラインメントを接触点ＣＤＲ定義に従い行った。縦（Ｙ）軸は、特定のＶＬ  ＣＤＲ３位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＶＬ  ＣＤＲ３可変性プロフィール（図４４、各グラフ下の表）は、長さ８および１０の各々のＶＬ  ＣＤＲ３の位置において置換できる潜在的多様性を示した。
【図５６Ｂ】Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ１０のＶＬ  ＣＤＲ３（パネルＢ）の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのＶκおよびＶλファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、ＣＤＲ３配列のアラインメントを接触点ＣＤＲ定義に従い行った。縦（Ｙ）軸は、特定のＶＬ  ＣＤＲ３位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＶＬ  ＣＤＲ３可変性プロフィール（図４４、各グラフ下の表）は、長さ８および１０の各々のＶＬ  ＣＤＲ３の位置において置換できる潜在的多様性を示した。
【図５７】Ｋａｂａｔデータベースに蓄積された免疫学的配列から決定された、長さ１１のＶＬ（カッパおよびラムダの両方）ＣＤＲ３の可変性プロフィールの一覧を示す。それらのオリジナルのＶκおよびＶλファミリーに関わらず、アミノ酸プロフィールの一覧のために、ＣＤＲ３配列のアラインメントを接触点ＣＤＲ定義に従い行った。縦（Ｙ）軸は、特定のＶＬ  ＣＤＲ３位置のアミノ酸の出現頻度を示す。生成されたＶＬ  ＣＤＲ３可変性プロフィール（図４４、各グラフ下の表）は、長さ１１の各々のＶＬ  ＣＤＲ３の位置において置換できる潜在的多様性を示した。
【図５８】単一の直鎖配列に三つの別個のＣＤＲ変異を生成させるために複数のオリゴヌクレオチドを用いて適用されたクンケル型変異誘発法を解説するものである。所望のＶＬおよびＶＨ  ＣＤＲ変異が全て導入されるまでこれらを繰り返した。
【図５９】単一のオリゴヌクレオチドアニーリング反応を用いて変異をコードするＣＤＲを生成させるために本発明において適用されたクンケル型変異誘発法を解説するものである。示されるプロセスにおいて、第一修飾型ＷＴＭ−ＣＤＲＨ３テンプレートを再単離し第二の異なるＣＤＲＨ１オリゴヌクレオチドと再アニールさせて同じ直鎖配列に二つの別個のＷＴＭ−ＣＤＲ変異を生成させた。これらを所望のＣＤＲ変異の全てが導入されるまで繰り返した。
【図６０】長さ６、カノニカル構造１のＶＨ−１  ＣＤＲ１ユニバーサル抗体ライブラリ（ＵＡＬ）についての位置ごとのアミノ酸残基の頻度のヒストグラムを示す。
【図６１】長さ１３、カノニカル構造２（パネルＡ）および３（パネルＢ）のＶＨ−１  ＣＤＲ２ユニバーサル抗体ライブラリ（ＵＡＬ）についての位置ごとのアミノ酸残基の頻度のヒストグラムを示す。
【図６２Ａ】本発明の構築物のオリゴヌクレオチド配列を示す（記載順に、それぞれ、配列番号３５９〜５６２）。
【図６２Ｂ】本発明の構築物のオリゴヌクレオチド配列を示す（記載順に、それぞれ、配列番号３５９〜５６２）。
【図６２Ｃ】本発明の構築物のオリゴヌクレオチド配列を示す（記載順に、それぞれ、配列番号３５９〜５６２）。
【図６２Ｄ】本発明の構築物のオリゴヌクレオチド配列を示す（記載順に、それぞれ、配列番号３５９〜５６２）。
【図６２Ｅ】本発明の構築物のオリゴヌクレオチド配列を示す（記載順に、それぞれ、配列番号３５９〜５６２）。
【図６２Ｆ】本発明の構築物のオリゴヌクレオチド配列を示す（記載順に、それぞれ、配列番号３５９〜５６２）。
【図６２Ｇ】本発明の構築物のオリゴヌクレオチド配列を示す（記載順に、それぞれ、配列番号３５９〜５６２）。
【図６２Ｈ】本発明の構築物のオリゴヌクレオチド配列を示す（記載順に、それぞれ、配列番号３５９〜５６２）。
【図６２Ｉ】本発明の構築物のオリゴヌクレオチド配列を示す（記載順に、それぞれ、配列番号３５９〜５６２）。
【図６２Ｊ】本発明の構築物のオリゴヌクレオチド配列を示す（記載順に、それぞれ、配列番号３５９〜５６２）。
【図６３】タンパク質（左下パネル）および非タンパク質（右上パネル）抗原についてのＶＨ  ＣＤＲ３の長さ分析のヒストグラムを示す。
【実施例】
【０１０５】
本実施例中、そうでないことが示されない限り、以下の材料および方法を使用した。
【０１０６】
材料および方法
概して、本発明の実施では、そうでないことが示されない限り、当該分野の技術の範囲内であり文献に記載されている、化学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ技術、免疫学（特に、例えば抗体技術）、発現系（例えば無細胞発現、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、およびＰｒｏｆｕｓｉｏｎTM）、ならびに任意の必要な細胞培養の従来技術を利用する。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｓ．１  ａｎｄ  ２，（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ，Ｅｄ．１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，Ｅｄ．１９８４）；ＰＣＲ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９９）（Ｅｄｉｔｏｒ）；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎｅｉｄｌｅ，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；ＰＣＲ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｂｕｒｋｅ，Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎ  Ｌｔｄ（１９９６）；Ｔｈｅ  ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ：ＲＴ−ＰＣＲ，Ｓｉｅｂｅｒｔ，Ｅｄ．，Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．（１９９８）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），５１０，Ｐａｕｌ，Ｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，１６９），ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｅｄ．，Ｉｒｌ  Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ，Ｐｕｂ．（１９９９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９２）；Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｕｂｉｎｉｅｃｋｉ，Ａ．，Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｐｕｂ．，（１９９０）．Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃ．Ｂａｒｂａｓ（Ｅｄ．），ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，（２００１）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，ＰＯ'Ｂｒｉｅｎ（Ｅｄ．），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）；Ｂｏｒｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５（６）：５５３−７（１９９７）；Ｂｏｒｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｆｏｒ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｆｆｉｎｉｔｙ，ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３２８：４３０−４４（２０００）；米国特許第６,３４８,３１５号においてＰｌｕｃｋｔｈｕｎらにより記載されたようなリボソームディスプレイ、および米国特許第６,２５８,５５８��；同第６,２６１,８０４号；および同第６,２１４,５５３号においてＳｚｏｓｔａｋらにより記載されたようなＰｒｏｆｕｓｉｏｎTMを参照のこと。
【０１０７】
Ｋａｂａｔの取り決めを用いる抗体配列解析に関するさらなる詳細は、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｋａｂａｔ  ｄａｔａｂａｓｅ  ａｎｄ  ａ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｅｘａｍｐｌｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００４；２４８：１１−２５；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ  ＣＤＲＨ３  ｌｅｎｇｔｈｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８，Ｄｅｃ；１０（１２）：１８０１−５；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＥＱＨＵＮＴ．Ａ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｔｏ  ｓｃｒｅｅｎ  ａｌｉｇｎｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９５；５１：１−１５およびＷｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｎｇｔｈ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤＲＨ３  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；ならびにＪｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．１９９３  Ｍａｙ；１６（１）：１−７．Ｒｅｖｉｅｗに見出され得る。
【０１０８】
Ｃｈｏｔｈｉａの取り決めを用いる抗体配列解析に関するさらなる詳細は、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｉｎ
ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｖａｒｉａｂｌ
ｅ  ｄｏｍａｉｎ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９８  Ｍａｙ  １；２７８（２）：４５７−７９；Ｍｏｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｄｅｓｉｇｎ，Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ．１９９７  Ｏｃｔ；６８（１−３）：９−１６．；Ｍｏｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｉｒｄ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＶＨ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ；Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９８  Ｊａｎ  １６；２７５（２）：２６９−９４；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９７  Ｎｏｖ  ７；２７３（４）：９２７−４８．Ｂａｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．１９９４  Ｄｅｃ；１（１２）：９１５−２０；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＶＨ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９２  Ｏｃｔ  ５；２２７（３）：７９９−８１７  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ．１９８９  Ｄｅｃ  ２１−２８；３４２（６２５２）：８７７−８３；およびＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｖｉｅｗ  Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９８７  Ａｕｇ  ２０；１９６（４）：９０１−１７に見出され得る。
【０１０９】
Ｃｈｏｔｈｉａ解析に関するさらなる詳細は、例えば、Ｍｏｒｅａ  Ｖ，Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ  Ａ，Ｒｕｓｔｉｃｉ  Ｍ，Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ，Ｌｅｓｋ  ＡＭ．Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｉｒｄ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＶＨ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９８  Ｊａｎ  １６；２７５（２）：２６９−９４；Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ，Ｌｅｓｋ  ＡＭ，Ｇｈｅｒａｒｄｉ  Ｅ，Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ＩＭ，Ｗａｌｔｅｒ  Ｇ，Ｍａｒｋｓ  ＪＤ，Ｌｌｅｗｅｌｙｎ  ＭＢ，Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＶＨ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９２  Ｏｃｔ  ５；２２７（３）：７９９−８１７；Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ，Ｌｅｓｋ  ＡＭ，Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ  Ａ，Ｌｅｖｉｔｔ  Ｍ，Ｓｍｉｔｈ−Ｇｉｌｌ  ＳＪ，Ａｉｒ  Ｇ，Ｓｈｅｒｉｆｆ  Ｓ，Ｐａｄｌａｎ  ＥＡ，Ｄａｖｉｅｓ  Ｄ，Ｔｕｌｉｐ  ＷＲ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ．１９８９  Ｄｅｃ  ２１−２８；３４２（６２５２）：８７７−８３；Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ，Ｌｅｓｋ  ＡＭ．Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９８７  Ａｕｇ  ２０；１９６（４）：９０１−１７；およびＣｈｏｔｈｉａ  Ｃ，Ｌｅｓｋ  ＡＭ．Ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｓｙｍｐ  Ｑｕａｎｔ  Ｂｉｏｌ．１９８７；５２：３９９−４０５に記載されている。
【０１１０】
ＣＤＲの接触点の考察に関するさらなる詳細は、例えば、ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ＲＭ，Ｍａｒｔｉｎ  ＡＣ，Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ＪＭ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ｃｏｎｔａｃｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  Ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９６  Ｏｃｔ  １１；２６２（５）：７３２−４５に記載されている。
【０１１１】
本明細書中で言及される抗体配列およびデータベースに関するさらなる詳細は、例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ＩＭ，Ｗａｌｔｅｒ  Ｇ，Ｍａｒｋｓ  ＪＤ，Ｌｌｅｗｅｌｙｎ  ＭＢ，Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ．Ｔｈｅ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ＶＨ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａｂｏｕｔ  ｆｉｆｔｙ  ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ＶＨ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｏｏｐｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９２  Ｏｃｔ  ５；２２７（３）：７７６−９８；Ｌｉ  Ｗ，Ｊａｒｏｓｚｅｗｓｋｉ  Ｌ，Ｇｏｄｚｉｋ  Ａ．Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｔｏ  ｒｅｄｕｃｅ  ｔｈｅ  ｓｉｚｅ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００１  Ｍａｒ；１７（３）：２８２−３；［ＶＢＤＢ］ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／Ｖ  ＢＡＳＥ−ｏｋ．ｐｈｐ？ｍｅｎｕ＝９０１；［ＫＢＴＤＢ］ｗｗｗ．ｋａｂａｔｄａｔａｂａｓｅ．ｃｏｍ；［ＢＬＳＴ］ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／［ＣＤＨＩＴ］ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｌｊｃｒｆ．ｅｄｕ／ｃｄ−ｈｉ／；［ＥＭＢＯＳＳ］ｗｗｗ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＥＭＢＯＳＳ／；［ＰＨＹＬＩＰ］ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｐｈｙｌｉｐ．ｈｔｍｌ；および［ＦＡＳＴＡ］ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕに見出される。
【０１１２】
実施例１
参照ユニバーサル抗体ライブラリ配列の同定および選択方法
本実施例においては、バイオインフォマティクスおよびその内容全体を参考として本明細書で援用する米国特許出願６０／５８５,９３１に開示される選択基準を用いて、参照
ユニバーサル抗体ライブラリ配列を同定および選択した。
【０１１３】
簡単に説明すると、発現された、すなわち再構成された免疫グロブリン配列を含むＫａｂａｔの電子データベースを、特定のフィルターアルゴリズムを用いて検索した。特に、フィルターアルゴリズムは、特定の抗原クラスに反応して発現されたヒト配列のみを同定するよう設計した。選択した抗原クラスは、ヒト治療剤の開発において扱い易い標的セットであるという理由でタンパク質ベースの抗原／標的とした。しかし、このデータベースは、他の抗原クラス、例えばペプチド、多糖類、ポリヌクレオチド、および低分子について、ならびに例えば獣医学的用途の治療剤の開発にあっては他の種由来の抗体配列、例えば霊長類、マウス、ラット、またはニワトリ配列等についても容易にクエリーを行えることが当然理解されよう。上記の基準を、３３１９個のＶH配列からなる初期セットに適用
した（しかし、この配列セットは、さらなる配列がクローニングされデータベースに登録された場合に、数を増やすことができることに留意されたい）。
【０１１４】
上記の検索およびフィルター解析は、タンパク質抗原を認識する非重複の再構成されたヒト抗体クローンを表す約６００個のＶH遺伝子の配列のデータセットを出力した。次の工程は、これらの再構成された遺伝子配列を生成した生殖細胞系前駆遺伝子の設計、およびそれに続くこれらの候補生殖細胞系配列の頻度分析を含むものであった。言い換えると、タンパク質抗原にとって最適なまたは高頻度の生殖細胞系フレームワーク配列が存在するかどうかの決定であった。（Ｋａｂａｔ由来の）フィルターをかけたＶH配列における再構成された遺伝子により利用される生殖細胞系配列を決定するため、Ｖ  ＢＡＳＥを使用した。Ｖ  ＢＡＳＥは、ＧｅｎｂａｎｋおよびＥＭＢＬデータライブラリの最新版（例えば、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｇｉｓｈ，Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９９０）“Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０およびＣｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｈｉｌｌｓ  Ｒｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ，ＣＢ２  ２ＱＨにより運営されているｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／Ｖ  ＢＡＳＥ−ｏｋを参照のこと）の配列を含む千以上の公開された配列からコンパイルされた、全てのヒト生殖細胞系可変領域配列の包括的なディレクトリである。現在、５１の機能的なＶHセグメントが７のファミリー（すなわちＶH１〜７）に分類され、４０の機能的なＶKセグメントが７のファミリー（すなわちＶKＩ〜ＶＩＩ）に分類され、３１の機能的なＶλセグメントが１０のファミリー（すなわちＶλ１〜１０）に分類されている。フィルターをかけたＫａｂａｔ配列（約６００のＶH）によるＶ  ＢＡＳＥ生殖細胞系配列のバッチＢＬＡＳＴを行い、発現される（再構成される）配列に最も高い頻度で寄与するＶH生殖細胞系遺伝子（およびファミリー）を同定した。この解析は、例えば、８つの最も高頻度で現われるフレームワークのうちの６つ（フレームワーク１、２、および３）がＶH３生殖細胞系ファミリーに属すること、およびＶH４ファミリーのメンバーが中間表示（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）グループを形成することを同定した。フィルターをかけたＫａｂａｔデータベースにおいて示された生殖細胞系ＶHフレームワーク（１、２、および３）の配列について、頻度分析を行った。この分析においては、再構成された配列の生殖細胞系遺伝子への分類の際に、４つまでの体細胞変異を許容した。タンパク質／ペプチド抗原を認識する抗体の再構成された配列に最も高頻度で現われる生殖細胞系遺伝子を同定するための閾値ラインを設定した。
【０１１５】
最高頻度のＶH３フレームワークの同定の結果は、重要である。ＶH３初期フレームワーク配列の選択は、対応するＣＤＲ配列の多様性および標準的なカノニカル構造により規定されるサイズの限界に影響する（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＶＨ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，１９９２．２２７（３）：ｐ．７９９−８１７およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｖ  ｋａｐｐａ  ｄｏｍａｉｎ．Ｅｍｂｏ  Ｊ，１９９５．１４（１８）：ｐ．４６２８−３８を参照のこと）。Ｖ  ＢＡＳＥ−フィルターをかけたＫａｂａｔのＢＬＡＳＴ検索もまた、候補分子の親和性成熟の間に変異され得る体細胞超変異のいわゆる「ホットスポット」の位置を同定した。予備的なＫａｂａｔ−Ｖ  ＢＡＳＥの結果は、６つの高頻度で利用されるＶH３フレームワーク；３−０７
、３−２１、３−２３、３−３０．５、３−４８、および３−７４を同定した。複数の出発フレームワークを選択する際、潜在的な抗原結合のためにＣＤＲの外側に追加の構造的多様性を作出した。６つ全ての（フレームワーク４をコードする）ＪH配列の比較分析は
、これらの配列のうちの４つが同一であり、他の二つの配列においては二つのアミノ酸しか相違しないことを示した。この配列の保存は、６つ全てのフレームワークファミリーについて共通のフレームワーク４を使用して、非機能的な多様性の生成を最小限に抑えることを可能にした。
【０１１６】
従って、本発明の基準を使用し、かつバイオインフォマティクスアプローチおよび既存の抗体データベースを使用することで、取扱い可能な抗体フレームワーク配列セットを合理的に同定できることが実証された。さらに、以下で考察されるように、これらの配列の同定は、ユニバーサル抗体ライブラリおよびそこから選択した本発明のコホートライブラリ内のインテリジェントＣＤＲの多様性を最大にする基礎を提供した。
【０１１７】
実施例２
参照ユニバーサル抗体ライブラリのＣＤＲの多様性を設計する方法
本実施例においては、参照ユニバーサル抗体ライブラリのＣＤＲの多様性を最適化する方法を示す。
【０１１８】
上記のように、候補フレームワークの選択は、導入されるＣＤＲのサイズおよびアミノ酸配列の初期の選択の両方に影響する。６つ全ての選択されたＶH３遺伝子ファミリーは、同じ１〜３のカノニカル構造を有する。カノニカル構造１〜３は、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２が、それぞれ５アミノ酸および１７アミノ酸のループを有することを必要とする。ＫａｂａｔおよびＶ  ＢＡＳＥデータベースのＣＤＲアミノ酸の頻度分析は、１）完全な配列保存、２）多様性生成の最初のラウンド、および３）体細胞超変異を模倣することによるその後の親和性成熟のためのＣＤＲアミノ酸を同定した。重鎖可変領域および軽鎖可変領域における各ＣＤＲの設計については、以下で順次考察する。
【０１１９】
重鎖の第一ＣＤＲ、本明細書中以降では「ＶＨ−ＣＤＲ１」、を設計するため、上記の基準を以下の通り考慮した：生殖細胞系遺伝子および再構成された遺伝子の両方において保存されているＣＤＲの位置は固定する；生殖細胞系遺伝子においては保存されているが再構成された遺伝子においては変種であるＣＤＲの位置は、初期ライブラリの構築においては固定するが、親和性成熟の間に変異されるのを許容する；ならびに生殖細胞系配列および再構成された配列において多様性を示すＣＤＲの位置は、変異誘発、例えばウォークスルー型変異誘発（ＷＴＭTM）を用いて多様性を導入する位置である。同定した６つのＶH３遺伝子ファミリー（すなわち３−０７、３−２１、３−２３、３−３０．５、３−４８、および３−７４）を出発点とする、生殖細胞系の５アミノ酸ＣＤＲ１配列の比較Ｖ  ＢＡＳＥ分析は、Ｓ３１、Ｙ３２、およびＭ３４が６つの遺伝子の間で保存されていることを明らかにした。フィルターをかけたＫａｂａｔデータセットにおける全ての再構成された５アミノ酸ＣＤＲ１配列の頻度分析は、三つの重要な知見を示した：第一に、Ｙ３２は高度に保存されていること、第二に、保存された生殖細胞系のＳ３１およびＭ３４の位置はその後に体細胞変異に供されること、および第三に、ＣＤＲ１の３３および３５の位置は生殖細胞系の抗体配列においても再構成された抗体配列においても保存されていないこと。
【０１２０】
従って、ＶＨ−ＣＤＲ１において、Ｙ３２の厳格な保存はその保護のための強い選択圧を示すので、Ｙ３２は固定し、いかなる変更にも供さなかった。ＣＤＲ１の３３および３５の位置は、変異誘発、例えばＷＴＭTMによる初期ＣＤＲ１配列の多様性の作出部位とした。Ｓ３１およびＭ３４の位置は当初は「固定」したが、あらゆるｓｃＦｖ候補クローンにおいて親和性成熟の間に変異される部位であることが同定された。全ての部位で多様性を作出しない理由は、発現およびディスプレイを容易にするためにライブラリの初期の多様性を制限するためであった。
【０１２１】
上記のＫａｂａｔ頻度分析から、ＣＤＲ１は「野生型」コンセンサス配列ＳＹＡＭＨ（配列番号５６３）を有した。残基Ａ３３およびＨ３５は、それらの頻度が最も高かったために、野生型配列として選択された。その後のアミノ酸の多様性の導入によって、ＣＤＲ１配列はＳＹＸＭＸ（Ｘは変異誘発、例えばＷＴＭを行った位置を意味する）となった。例えば、変異誘発、例えばＷＴＭをＣＤＲ１の３３および３５の位置のチロシン残基に対して行う場合、所望の得られるＣＤＲ１配列はＳＹＹＭＨ（配列番号５６４）、ＳＹＡＭＹ（配列番号５６５）、およびＳＹＹＭＹ（配列番号５６６）である。この例において、芳香族側鎖の導入の効果を調査した。野生型Ａ３３の位置のオリゴヌクレオチドコドン配列はＧＣＸであった。Ｙ３３で置換した場合に必要とされる対応するオリゴヌクレオチド配列はＴＡＹとなった。従って、Ａ３３→Ｙ３３オリゴヌクレオチド混合物についての得られるコドン配列は（Ｇ／Ｔ）（Ａ／Ｃ）Ｃであった。この場合、生成されたＡ３３→Ｙ３３オリゴヌクレオチドはまた、グリシン（ＧＣＣ）、アスパラギン酸（ＧＡＣ）、およびセリン（ＴＣＣ）をコードするコドン順列を有し得た。これらの追加の「副産物」は、３３の位置における追加の多様性に寄与する。次のＷＴＭTM位置３５については、Ｈ３５の野生型コドン配列はＣＡＹであり、Ｙ３５で置換した場合に必要とされるオリゴヌクレオチド配列はＴＡＹであった。従って、Ｈ３５→Ｙ３５混合物についての得られるコドン配列は（Ｃ／Ｔ）ＡＣであった。この場合、形成される追加のアミノ酸「副産物」はなかった。
【０１２２】
別のアプローチにおいては、典型的には各々の所望の変化のためにオリゴヌクレオチドの合成を必要とするがどのような副産物（ノイズ）をも排除するルックスルー型変異誘発（ＬＴＭ）を利用することで、副産物を回避した。
【０１２３】
重鎖の第二ＣＤＲ（以下「ＶＨ−ＣＤＲ２」という）を設計するため、上記のＶ  ＢＡＳＥおよびＫａｂａｔデータベースにおける配列分析を、上記のＶＨ−ＣＤＲ１と同様の様式で扱った。ＶＨ−ＣＤＲ２配列について頻度分析を行い、６つの候補フレームワークの生殖細胞系ＣＤＲ２配列のアラインメントを構築し、１０％の閾出現頻度を選択した。
【０１２４】
同じＶH３遺伝子ファミリー（３−０７、３−２１、３−２３、３−３０．５、３−４
８、および３−７４）を出発点とする、Ｖ  ＢＡＳＥおよびフィルターをかけたＫａｂａｔの頻度分析は、ＣＤＲ２の位置Ｉ５１、Ｙ５９、Ａ６０、およびＧ６５が全ての生殖細胞系遺伝子および大部分の再構成された遺伝子において保存されていることを示し、従って合成されるＣＤＲ２において不変でなければならない。上記のＫａｂａｔの頻度分析は、ＶＨ−ＣＤＲ２が「野生型」コンセンサス配列ＧＩＳＧＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５６７）を有することを示した。ＶＨ−ＣＤＲ２の位置５４、５５、５８、６１、６２、６３、６４は、生殖細胞においては配列保存を示すが、その後に体細胞変異に供されるので、「固定」したが、親和性成熟の間に変異されるのを許容した。ＣＤＲ２の初期の多様性については、研究用アミノ酸（下線）を位置５０、５２、５２ａ、５３、５６、および５７に組み込み（ＸＩＸＸＸＧＧＸＸＹＹＡＤＳＶＫＧ）（配列番号５６８）、これを変異誘発、例えばＷＴＭTMにより導入した。
【０１２５】
ＷＴＭは、ランダム変異誘発と異なり、特定のアミノ酸の既定の配置を可能にする。例えば、位置５０、５２、５３、５６、および５７においてチロシン（Ｙ）残基（下線）を用いてＣＤＲ２のＷＴＭTMを行った場合の、所望の得られるＷＴＭTMＣＤＲ２配列は、以下の配列を含むものであった（下線は変更箇所である）：単一置換（ＹＩＸＸＸＧＧＸＸＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５６９）、ＸＩＹＸＸＧＧＸＸＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５７０）等）、二重置換（ＹＩＹＸＸＧＧＸＸＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５７１）、ＹＩＸＸＹＧＧＸＸＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５７２）等）、三重置換（ＹＩＸＸＹＧＧＹＸＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５７３）等）、四重置換（ＹＩＹＹＹＧＧＸＸＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５７４）またはＹＩＸＹＹＧＧＹＸＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５７５））、五重置換（ＹＩＸＹＹＧＧＹＹＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５７６））、および六重置換  （ＹＩＹＹＹＧＧＹＹＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５７７））。典型的には、ＣＤＲごとに２〜３置換が好ましく、これは、オリゴヌクレオチド合成ドーピング（例えば技術的な詳細についてはＵＳ２００４００３３５６９Ａ１を参照のこと）によって容易に達成できた。
【０１２６】
９つの事前選択したＷＴＭTMアミノ酸を用いるＣＤＲ２に対するＷＴＭTMは、９×２6
のライブラリ多様性すなわち５７６のメンバーを生成した。比較の目的で、２０個全てのアミノ酸を用いるＣＤＲ２の６つの位置での飽和変異誘発では２０6すなわち６．４×１０7となろう。従って、ＣＤＲ２のみの１２カ所の「非固定」の位置において飽和変異誘発を実施すれば、ライブラリの多様性は２０12または４×１０15となり、これは現在のライブラリディスプレイおよびスクリーニング技術の許容範囲を超えるものであろう。このことは、対照的に、より小さく、しかしより表現力の高いライブラリを構築できるという本発明の利点を示している。事実、本発明の方法は、第一世代の結合分子を同定するために、いくつかのＣＤＲの位置において取扱い可能なライブラリを提供した。他のＣＤＲの位置におけるその後の親和性成熟変異誘発は、同定された結合分子を最適化した。
【０１２７】
ＶH  ＣＤＲ３の多様性を設計するため、Ｋａｂａｔデータベース由来の抗体のＣＤＲ３配列を、それらのサイズおよび抗原クラスに従うアラインメントを行った。非タンパク質抗原およびタンパク質／ペプチド抗原を認識する抗体のＣＤＲ３の長さをトレンドラインに適合させた。フィルターをかけたＫａｂａｔデータセット由来の１３アミノ酸ＣＤＲ３配列の頻度分析も行い、１０％の閾出現頻度を選択した。ＣＤＲ３のサイズおよびアミノ酸残基の頻度分析は、例えば免疫グロブリンＤおよびＪ遺伝子の再構成された配列を用いて行うので、フィルターをかけたＫａｂａｔとＶ  ＢＡＳＥの直接比較においては「ＣＤＲ３」生殖細胞系の等価物は存在しない。にもかかわらず、フィルターをかけたＫａｂａｔデータベースを試験したところ、その検索結果は、ＣＤＲ３のループサイズに関して、正規分布曲線が６〜２４アミノ酸の範囲であり、ピークがおよそ１３アミノ酸にあることを示した。興味深いことは、この分析はまた、他の抗原タイプ（すなわち、非タンパク質／ペプチド）を認識する抗体が二峰性のサイズ分布に近いことを示した。この分裂した分布は、一部の抗体が低分子（すなわちハプテン）の方にバイアスがかかっており、一部がそれより大きな抗原（複合多糖、ＤＮＡ）に対して標的化されているという異種集団であることに起因する。
【０１２８】
ＣＤＲ３の位置についてのＶ  ＢＡＳＥ−Ｋａｂａｔの並行比較分析を行わずに、各々の再構成されたＣＤＲ３のサイズについて、フィルターをかけたＫａｂａｔの頻度分析を行った。各々のサイズ分類において、そのＣＤＲ３の位置において最も高頻度のアミノ酸を列挙することにより、コンセンサス「野生型」配列を得た。驚くべきことに、この「コンセンサス」アプローチは、高い選択圧下の特定のアミノ酸を同定した。例えば、１３アミノ酸サイズのＣＤＲ３において、位置１０１はアスパラギン酸で高度に保存されていた。従って、ＶＨ−ＣＤＲ１およびＶＨ−ＣＤＲ２の多様性の設計に関して上述したように、Ｄ１０１は、合成される１３アミノ酸のＶＨ−ＣＤＲ３において「固定」残基の位置として維持した。しかし、ＶＨ−ＣＤＲ３の位置９６、９８、１００ｃ、および１０２は、いくつかのアミノ酸に対して高い優先性を示し、従って予備的に「固定」するが、その後の親和性成熟の間に変異させた。この頻度分布は、ＣＤＲ３の位置９６、９７、９９、１００、１００ａ、１００ｂ、１００ｄ、および１００ｅがいかなる優先的アミノ酸も示さなかったことを示す。従って、１３アミノ酸ＣＤＲ３配列においては、式  ＸＧＸＳＸＸＸＸＹＸＸＤＹ（配列番号５７８）が、例えば変異誘発、例えばＷＴＭを用いる多様性の部位である位置（下線）を表す。同様の分析を、８〜２０アミノ酸の間の全てのサイズのＣＤＲ３配列について行うことができた。このサイズ範囲は、タンパク質性標的／抗原を認識する抗体のＣＤＲ３において見出される長さの多様性の大部分を包含した。
【０１２９】
実施例３
完全照合ＵＡＬレパートリーの構築
上記の実施例に記載されるように、ＣＤＲの位置的頻度分析は、本発明の方法において使用するための参照ライブラリを構築するのに使用され得る。完全照合ＵＡＬレパートリーの作製は、まず、このようなＣＤＲの位置的頻度分析から推測される全てのコンビナトリアルＣＤＲ配列の生成を必要とする。このような位置的頻度分析を、各々の適用可能な抗体鎖、重鎖または軽鎖（軽鎖についてはカッパクラスまたはラムダクラス）の各ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）について行った。次いで、これらのコンビナトリアルＣＤＲ配列を、全ての重鎖および軽鎖について個別に、フレームワークおよびアイソタイプを一致させたポリペプチドとして構築した。重鎖のアイソタイプにはＶＨ−１、ＶＨ−３、およびＶＨ−４が含まれ、カッパ軽鎖のアイソタイプにはＶＫ−１およびＶＫ−３が含まれ、ラムダ軽鎖のアイソタイプにはＶＬ−１、ＶＬ−２、およびＶＬ−３が含まれた。ＵＡＬ全体のアイソタイプマッチングの代わりに、ＣＤＲ配列を「フレームワークシャッフル（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｓｈｕｆｆｌｅｄ）」させる場合もあり、これは、ＵＡＬが、あるアイソタイプクラス由来のＣＤＲ１が別のアイソタイプクラス由来のＣＤＲ２に融合されたもの（例えば単一の構築されたＵＡＬ内にＶｋ１由来のＣＤＲＬ１およびＶｋ３由来のＣＤＲＬ２）を含み得ることを意味する。完全照合ＵＡＬの構築は、次いで、上記のようにして誘導された抗体の重鎖および軽鎖の全ての組み合わせの生成を必要とする（図３参照）。
【０１３０】
ＣＤＲクラスをその天然のフレームワークにマッチングさせることで、ＣＤＲ参照ライブラリに示される配列の範囲を画定できた。このようなフレームワークおよび例示のＶH
、Ｖκ、およびＶλ配列についてのＣＤＲ配列のグループ化を図５に示す。次いで、ＣＤＲ参照ライブラリ配列の組み合わせを行いＵＡＬを得た。図６は、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２において、ＶＨ−１クラスとＶＨ−３クラスの間でフレームワークアイソタイプの混合（「フレームワーク交配（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｃｒｏｓｓｅｓ）」と称する）を行うプロセスを介する、重鎖配列から重鎖ＵＡＬを構築する例を示す。同様に、図７は、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２において、ＶＫ−１クラスとＶＫ−３クラスの間でフレームワーク交配を行うプロセスを用いる、ＣＤＲ参照配列からのＶκ軽鎖ＵＡＬの構築の例を示す。最後に、図８は、ＣＤＲ１配列およびＣＤＲ２配列においてＶＬ−１クラス、ＶＬ−２クラス、およびＶＬ−３クラスの間でフレームワーク交配を行うプロセスを用いる、ＣＤＲ参照配列からのＶκ軽鎖ＵＡＬの構築の例を示す。
【０１３１】
抗体配列情報のカノニカルクラスへの細分類も行ったところ、得られるＣＤＲ参照ライブラリに示される配列の範囲をさらに変化させる効果があった。例えば、１２アミノ酸長のＶＨ−４  ＣＤＲ２ライブラリについては、４つの異なるカノニカル構造が存在し、各カノニカル構造は、その集団におけるばらつきを示す、それらＣＤＲ残基の位置についての異なる集団優性値（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｖａｌｕｅｓ）を明らかにした（図９参照）。
【０１３２】
実施例４
マウスプローブのＣＤＲドメインからの例示の抗ＶＥＧＦコホート抗体ライブラリの同定および作製
参照ライブラリ、例えばユニバーサル抗体ライブラリ（ＵＡＬ）からのコホートライブラリの選択は、クエリーＣＤＲペプチド配列と参照ライブラリ（例えばＵＡＬ）ＣＤＲペプチド配列のアラインメントおよび比較を通じて進めた。どのようなモノクローナル抗体（複数のモノクローナル抗体を含む）も、このようなコホートライブラリの構築のためのクエリーＣＤＲ配列を提供することができた。本実施例において、コホート抗体ライブラリの中に構築することができるコホートＣＤＲライブラリを、例としてマウス抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体（Ａｖａｓｔｉｎ  Ａ４．６．１）を用いて作製した。得られるコホートライブラリの構築の間の、全ての残基の比較において同一基準を使用した。
【０１３３】
マウスのＡｖａｓｔｉｎ  Ａ４．６．１モノクローナル抗体のＣＤＲ１配列は、「ＴＮＹＧＭＮ」（配列比較１３）であることを決定した。この場合のＣＤＲ１は、接触点の定義に従って規定した。このＣＤＲ１配列を、二つの別個のユニバーサル抗体ライブラリ（ＵＡＬ）、ＶＨ−１およびＶＨ−３に存在するＣＤＲ１ドメインの多様性との比較のためのクエリーペプチド配列として使用した。これらの比較の結果を図１０ならびに表１および２に要約する。
【０１３４】
【表１】
0005791496.tif 000002
【０１３５】
上記表のアラインメントは、二つの参照ＵＡＬ、ＶＨ−１およびＶＨ−３で見られる既知の優先的な配列の多様性とクエリー配列との、個別の、位置ごと比較を行ったものである。表１に示される比較については、マウスクエリー配列（「マウスプローブ」）「ＴＮＹＧＭＮ」（配列番号１３）の各残基が、調査した参照ＵＡＬにおける対応する位置で見出され、従ってそのＣＤＲ１の位置における既知の優先的な残基に相当する。従って、「ＴＮＹＧＭＮ」（配列番号１４）配列全体が参照ＵＡＬに存在し、その比較は、クエリー配列に対応する最適なＣＤＲ１コホートライブラリを作製するのにＵＡＬから追加の多様性を選択する必要がないという結果を出した。（マウスプローブ「ＴＮＹＧＭＮ」（配列番号１３）配列の各残基はヒトＣＤＲ１  ＶＨ−１  ＵＡＬにおいて同じ位置に存在する既知の残基と同一であったが、この発見は「ＴＮＹＧＭＮ」（配列番号１４）配列全体が天然に存在するヒトＣＤＲ１配列であることを示すものでなかったことに留意することが重要である。従って、調査した参照ＵＡＬがクエリー配列との「完全一致」を含むという発見は、クエリー配列が参照ＵＡＬの構築前に既知の天然に存在する配列であったということを意味するのではない。）
【０１３６】
クエリー配列「ＴＮＹＧＭＮ」（配列番号１３）と参照ＶＨ−３  ＣＤＲ１  ＵＡＬの間でも比較を行った（表２）。この比較において、参照ＶＨ−３  ＣＤＲ１  ＵＡＬは、ＣＤＲ１の最初の位置にスレオニン（Ｔ）残基を含まず、その代わりにセリン（Ｓ）およびアスパラギン（Ｎ）残基のみを含んでいた。従って、最適なＣＤＲ１コホートライブラリの多様性は、配列「ＳＮＹＧＭＮ」（配列番号２４６）および「ＮＮＹＧＭＮ」（配列番号５７９）を用いて得られ、従ってマウスＡｖａｓｔｉｎ  Ａ４．６．１モノクローナル抗体の参照ＶＨ−３  ＣＤＲ１  ＵＡＬ由来のコホートライブラリについては多様性が２であった。
【０１３７】
さらに、Ａｖａｓｔｉｎ  Ａ４．６．１モノクローナル抗体のＣＤＲ２配列「ＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴ」（配列番号１６）をクエリー配列として使用してＣＤＲ２コホートライブラリを作製した。この配列とＶＨ−１およびＶＨ−３  ＵＡＬに存在するＣＤＲ２の多様性とのアラインメントを行い、これらの比較の結果をそれぞれ図１１ならびに表３および４に示した。
【０１３８】
【表２】
0005791496.tif 000003
【０１３９】
上記の表３に示されるように、マウスＡｖａｓｔｉｎ  Ａ４．６．１重鎖ＣＤＲ２とＶＨ−１  ＵＡＬのＣＤＲ２ドメインのアラインメントは、ＣＤＲ２クエリー配列の最初の６つ、８番目、および１０番目の残基が、ＵＡＬにおける同じ位置に同一残基が存在することを明らかにした。ＵＡＬは、７番目の位置に優先的に使用される残基としてスレオニン（Ｔ）を含まず、その代わりにこの位置にプロリン（Ｐ）およびアラニン（Ａ）を含み、この位置における多様性に対する最終的な効果は２であった。ＣＤＲ２クエリー配列の９番目の位置におけるスレオニン（Ｔ）残基もまた、ＵＡＬのこの位置に存在する残基と一致せず、ＵＡＬはその代わり、この位置に共通して存在する残基としてフェニルアラニン（Ｆ）、セリン（Ｓ）、アルギニン（Ｎ）、およびグリシン（Ｇ）を含んでいた。この参照ＵＡＬからコホートライブラリを作製する目的上、この不一致の多様性への効果は４であった。ＣＤＲ２クエリー配列の最後の三つの残基を検討したところ、多様性への効果が、それぞれ、５（クエリー配列のグルタミン酸（Ｅ）はこの位置のＵＡＬのスレオニン（Ｔ）、アルギニン（ン）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）残基と一致しなかった）、２（クエリー配列のプロリン（Ｐ）はこの位置のＵＡＬのスレオニン（Ｔ）またはアラニン（Ａ）残基と一致しなかった）、および４（クエリー配列のスレオニン（Ｔ）はこの位置のＵＡＬのアルギニン（Ｎ）、リジン（Ｋ）、セリン（Ｓ）、またはグリシン（Ｇ）残基と一致しなかった）であった。従って、ヒトＶＨ−１  ＣＤＲ２  ＵＡＬ由来の最適なコホートライブラリは、配列「Ｗ−Ｍ−Ｇ−Ｗ−Ｉ−Ｎ−Ｐ／Ａ−Ｙ−Ｆ／Ｓ／Ｎ／Ｇ−Ｇ−Ｔ／Ｎ／Ｇ／Ｓ／Ｄ−Ｔ／Ａ−Ｎ／Ｋ／Ｓ／Ｇ」（配列番号１７）を有し、かつこれはウォークスルー型もしくはルックスルー型の変異誘発または他のこのような技術を用いて生成することができた。このようなコホートライブラリの総多様性は、この配列内の可変性の残基（７番目、９番目、および１１〜１３番目）の独立組み合わせの結果であり、その積は２×４×５×２×４＝３２０となった。コホートライブラリの構築において本発明の方法を用いてＵＡＬ（または関連形式の参照ライブラリ）に対するクエリーを行う利点は、このコホートライブラリ配列内の５つの可変部位のランダム化が３．２×１０6の異なる配列を生じ、この１０,０００倍の多様性の増加が潜在的に免疫反応性のＣＤＲ２配列の形態においてノイズを追加するにすぎないものである可能性が高いことを考慮すれば理解されよう。
【０１４０】
マウスＡｖａｓｔｉｎ  Ａ４．６．１重鎖ＣＤＲ２のクエリー配列とＶＨ−３  ＵＡＬのＣＤＲ２ドメインの比較を行う上で本発明の方法を使用することで、配列「Ｗ−Ｖ−Ｓ／Ａ−Ｖ／Ａ／Ｎ／Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｔ−Ｉ−Ｎ−Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｑ／Ｗ／Ｎ／Ｆ−Ｄ／Ｓ／Ｎ−Ｇ／Ｓ−Ｇ−Ｅ−Ｔ／Ｋ／Ｉ−Ｙ／Ｎ／Ｆ／Ｈ」（配列番号１８）を得た。この配列により示されるコホートライブラリは、７０５６の多様性を有した。この結果を導き出したアラインメントの詳細は上記の表４に示されている。
【０１４１】
本発明の方法をＡｖａｓｔｉｎ  Ａ４．６．１重鎖ＣＤＲ３クエリー配列にも適用して、ＶＨ  ＣＤＲ３  ＵＡＬからコホート配列「Ａ−Ｋ−Ｇ／Ｄ／Ｅ／Ｒ／Ａ／Ｈ／Ｖ／Ｔ−Ｐ−Ｈ−Ｙ−Ｙ−Ｇ−Ｓ−Ｓ−Ｈ−Ｗ−Ｙ−Ｆ−Ｄ」（配列番号２０）を同定した。このコホート配列は、８の多様性を有した。この結果を導き出したアラインメントの詳細を表５に示す。
【０１４２】
【表３】
0005791496.tif 000004
【０１４３】
本発明の方法をＡｖａｓｔｉｎ  Ａ４．６．１モノクローナル抗体の軽鎖ＣＤＲ配列に適用することで、全てのこのような軽鎖ＣＤＲドメインについてＣＤＲコホートライブラリ配列を得た。マウスＡｖａｓｔｉｎ  Ａ４．６．１抗体におけるカッパ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列は、それぞれ、「ＳＮＹＬＮＷＹ」（配列番号２１）、「ＶＬＩＹＦＴＳＳＬＨ」（配列番号２３）、および「ＱＱＹＳＴＶＰＷ」（配列番号２６）であった。本発明の方法をマウスＡｖａｓｔｉｎ  Ａ４．６．１カッパ鎖ＣＤＲ１クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトＶＫ−１  ＣＤＲ１  ＵＡＬおよびＶＫ−３  ＣＤＲ１  ＵＡＬと比較することにより、それぞれ「Ｓ−Ｎ−Ｙ−Ｌ−Ｎ−Ｗ−Ｙ」（配列番号２２）（多様性なし）および「Ｓ−Ｎ−Ｙ−Ｌ−Ａ−Ｗ−Ｙ」（配列番号２４９）（多様性１）のコホートライブラリ配列を得た。ヒトＶＫ−１  ＣＤＲ２  ＵＡＬに対してマウスＡｖａｓｔｉｎ  Ａ４．６．１カッパ鎖ＣＤＲ２配列をクエリーするのに本発明を利用することで、多様性が２０のコホートライブラリ配列「Ｌ／Ｒ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ａ／Ｄ／Ｋ／Ｇ／Ｓ−Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｑ／Ｅ」（配列番号２４）を得、本発明の方法によるカッパ鎖ＣＤＲ２プローブ配列とヒトＶＫ−３  ＣＤＲ２  ＵＡＬの比較により、多様性が２のコホートＣＤＲライブラリ配列「Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ｇ／Ｄ−Ｔ−Ｓ−Ｓ−Ｒ−Ａ」（配列番号２５）を得た。クエリー配列としてマウスＡＣＺ８８５  ＣＤＲ３を使用し、ＶＫ  ＣＤＲ３  ＵＡＬとアラインメントを行った場合、コホートライブラリＣＤＲ３配列「Ｑ−Ｑ−Ｙ−Ｓ−Ｔ−Ｙ／Ｔ／Ｓ／Ｌ／Ｗ／Ｆ−Ｐ−Ｗ」（配列番号２７）を得た。このカッパ鎖ＣＤＲ３ライブラリは６の多様性を有した。
【０１４４】
様々なコホートＣＤＲライブラリからの最終的なコホート抗体（またはそのフラグメント、例えばＦａｂ、ｓｃＦｖ等）ライブラリの作製は、コホートＣＤＲライブラリ配列の相互の独立組み合わせを通じて、本発明の方法によって同定したコホートＣＤＲライブラリから重鎖（例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）および軽鎖（例えばカッパまたはラムダ）ならびに完全抗体（またはそのフラグメント）を構築することによって行った。このようなコホートＣＤＲライブラリ配列の相互の独立組み合わせにより、図１２およびマウスＡｖａｓｔｉｎ  Ａ４．６．１クエリー配列を用いて作製されたコホートライブラリについては表６に示されるような構成鎖および抗体全体のコホートライブラリの多様性を得た。
【０１４５】
【表４】
0005791496.tif 000005
【０１４６】
これらの抗体ライブラリの中で最も多様性のあるものですら、現在利用可能な方法を用いて容易にディスプレイおよび／またはスクリーニングできるサイズ（例えば、実質的に約１０12未満の多様性）のものであった。このようなライブラリの合成は、例えばルックスルー型および／またはウォークスルー型の変異誘発等の技術を用いて行うことができ、全長構成鎖および／または抗体の合成には、遺伝子のシングル・オーバーラップ・エクステンション（ＳＯＥ）ＰＣＲ、クンケル型変異誘発、またはこのような融合タンパク質を作製するためのその他の公知の技術等の技術を利用することができる。
【０１４７】
実施例５
マウスプローブ抗ＨＩＶ  ｇｐ４１モノクローナル４１−Ｓ−２−ＬＣＤＲドメインからのカッパ軽鎖ＣＤＲコホートライブラリの同定および作製
マウス抗ＨＩＶ  ｇｐ４１モノクローナル抗体４１−Ｓ−２−Ｌのカッパ軽鎖配列を獲得した。これらの軽鎖配列における触媒性の三つ組を同定したところ、カッパ軽鎖のＣＤＲ１およびＣＤＲ３ドメイン内の残基を含んでいた。この抗体のカッパ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、「ＬＹＳＮＧＮＴＹＬＹＷＦ」（配列番号２９）、「ＬＬＩＹＲＬＦＨＬＡ」（配列番号３０）、および「ＭＱＨＬＥＹＰＹＴ」（配列番号３１）であった（下線は触媒性の三つ組の残基である）（図１４Ａ参照）。触媒性の三つ組を保存するため、コホートライブラリ配列がこれらの残基（下線）をＣＤＲ１およびＣＤＲ３のこれらの位置におけるマウスクエリー配列の残基として固定することを決定した。さらに、ギャップ導入アラインメントは、この抗体のマウスＣＤＲ１クエリー配列が、７アミノ酸残基長のヒトカッパ鎖ＣＤＲ１  ＵＡＬ構成要素と比較した場合に、５残基（「ＹＳＮＧＮ」）（配列番号５８０）の挿入を含むことを明らかにした。マウスＣＤＲ１クエリー配列配列に対して本発明の方法を適用し、参照ＶＫ−１  ＣＤＲ１−７およびＶＫ−３  ＣＤＲ１−７  ＵＡＬと比較することにより、それぞれ、配列「Ｓ／Ｒ／Ｇ／Ｎ／Ｙ−ＹＳＮＧＮ−Ｎ−Ｙ−Ｌ−Ａ／Ｎ−Ｗ−Ｙ」（配列番号３３）および「Ｓ／Ｇ／Ｎ−ＹＳＮＧＮ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ａ−Ｗ−Ｙ」（配列番号３４）のコホートライブラリを獲得した（図１４Ｂ〜Ｃ参照）。これらのコホートライブラリの多様性は、それぞれ、１０および３であった。マウス抗ＨＩＶ  ｇｐ４１  ＣＤＲ１において見出された挿入はまた、この配列と８ペプチド長のＣＤＲ１  ＵＡＬ構成要素との比較を可能にした。マウスＣＤＲ１クエリー配列と参照ライブラリＶＫ−３  ＣＤＲ１−８の間の比較により、「Ｓ−ＹＳＮＧ−Ｎ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ａ−Ｗ−Ｙ」（配列番号３６）のコホートライブラリＣＤＲ１配列を得た（図１４Ｃ）。本発明の方法により、マウス抗ＨＩＶ  ｇｐ４１カッパ軽鎖ＣＤＲ２クエリー配列とヒトＶＫ−１およびＶＫ−３  ＣＤＲ２参照ライブラリの比較も行い、それぞれ、配列「Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ａ／Ｄ／Ｋ／Ｇ／Ｓ−Ａ−Ｓ−Ｉ／Ｓ／Ｔ／Ｎ−Ｌ−Ｑ／Ｅ」（配列番号３７）および「Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ｇ／Ｄ−Ａ／Ｔ−Ｓ−Ｓ／Ｔ／Ｎ−Ｒ−Ａ」（配列番号３８）のコホートカッパ鎖ＣＤＲ２ライブラリを得た（図１４Ｄ）。これらのコホートライブラリは、それぞれ、４０および１２の多様性を有した。マウス抗ＨＩＶ  ｇｐ４１カッパ軽鎖ＣＤＲ３クエリー配列とヒトＶＫ  ＣＤＲ３−９参照ライブラリの並行比較により、配列「Ｑ−Ｑ−Ｈ−Ｓ／Ｄ／Ｙ／Ｎ／Ｇ−Ｄ／Ｇ／Ｔ／Ｎ／Ｓ−Ｙ−Ｐ−Ｐ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｔ−Ｔ」（配列番号３９）のカッパ鎖ＣＤＲ３コホートライブラリを得た（触媒性の三つ組を保存するため三番目の位置のヒスチジン残基を固定した；図１４Ｅ。このヒスチジン残基を固定した場合、クエリー配列と参照ライブラリ配列との間で不連続アラインメントを行った（クエリー配列と参照ライブラリ配列の間の残基１、２、および４〜９のみの比較を構成する）ことに留意されたい。ＣＤＲ３の最初の三残基をクエリー配列の残基「Ｍ−Ｑ−Ｈ」に固定する選択をした場合、クエリーおよび参照ライブラリの���基４〜９のみのアラインメントが望ましい、従って部分アラインメントを構成したことにも留意されたい）。このＣＤＲ３コホートライブラリは１２５の多様性を有した。
【０１４８】
本実施例においては、触媒活性は抗体の軽鎖に存在するので、重鎖の残基はコホートライブラリにおいて変化させずに残した。従って、この抗体について作製されたコホートライブラリの全体の多様性の値は、軽鎖の多様性の値により表され、これはＫ１およびＫ３コホートについて、それぞれ、５０,０００および４５００であった。
【０１４９】
実施例６
ヒトプローブＨＫ１４  ＣＤＲドメインからのカッパ軽鎖ＣＤＲコホートライブラリの同定および作製
ヒトＨＫ１４抗体におけるカッパ軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、「ＩＦＮＬＳＷＹ」（配列番号４１）、「ＬＶＬＹＡＡＳＴＬＱ」（配列番号４２）、および「ＱＱＳＹＩＬＰＰＴ」（配列番号４３）であった（図１５Ａ）。本発明の方法をこのカッパ鎖ＣＤＲ１クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトＶＫ−１  ＣＤＲ１  ＵＡＬと比較することにより、「Ｓ／Ｒ／Ｇ／Ｎ／Ｙ−Ｎ−Ｙ／Ｗ／Ｄ／Ｓ−Ｌ−Ａ／Ｎ−Ｗ−Ｙ」（配列番号５８１）のコホートライブラリ配列を得た。このコホートライブラリ配列は４０の多様性を有していた。本発明を用いた「ＩＦＮＬＳＷＹ」（配列番号４１）のＣＤＲ１配列とヒトＶＫ−３  ＣＤＲ１−７  ＵＡＬの比較により、多様性が９のコホート配列「Ｓ／Ｇ／Ｎ−Ｓ／Ｎ／Ｔ−Ｎ−Ｌ−Ａ−Ｗ−Ｙ」（配列番号４４）を得た（図１５Ｂ）。ヒトＶＫ−１  ＣＤＲ２  ＵＡＬに対してカッパ鎖ＣＤＲ２配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、クエリー配列と同一のコホートライブラリ配列「Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ａ−Ａ−Ｓ−Ｔ−Ｌ−Ｑ」（配列番号６３５）を得、ＶＫ−３  ＣＤＲ２ライブラリに対する同配列のクエリーにより、多様性が２の配列「Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ｇ／Ｄ−Ａ−Ｓ−Ｔ−Ｒ−Ａ」（配列番号４５）を得た（図１５Ｃ）。クエリー配列としてＨＫ１４  ＣＤＲ３を使用し、ＶＫ  ＣＤＲ３  ＵＡＬとのアラインメントを行うことで、「Ｑ−Ｑ−Ｓ−Ｙ−Ｓ／Ｎ／Ｔ／Ｇ／Ｄ−Ｙ／Ｔ／Ｓ／Ｗ−Ｐ−Ｐ−Ｔ」（配列番号４６）のコホートライブラリＣＤＲ３配列を得た（図１５Ｄ）。このカッパ鎖ＣＤＲ３ライブラリは、２０の多様性を有していた。
【０１５０】
上記の４１−Ｓ−２−Ｌ抗体の場合と同様、触媒活性は抗体の軽鎖に存在するので、重鎖の残基はコホートライブラリにおいて変化させずに残した。従って、この抗体について作製されたコホートライブラリの全体の多様性の値は、軽鎖の多様性の値により表され、これはＫ１およびＫ３コホートについて、それぞれ、８００および３６０であった。
【０１５１】
実施例７
プローブＣＤＲドメインからのＡＡＶ２９３  ＭＣＰ−１コホート抗体ライブラリの同定および作製
ヒトＡＡＶ２９３  ＭＣＰ−１抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、「ＳＨＹＷＭＳ」（配列番号４７）、「ＷＶＡＮＩＥＱＤＧＳＥＫＹ」（配列番号５１）、および「ＡＲＤＬＤＧＹＴＤ」（配列番号５４）であった。本発明の方法をこの重鎖ＣＤＲ１クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトＶＨ−３  ＣＤＲ１
ＵＡＬおよびヒトＶＨ−１  ＣＤＲ１  ＵＡＬと比較することにより、それぞれ、「Ｓ−Ｓ／Ｎ／Ｄ／Ｔ−Ｙ−Ｗ−Ｍ−Ｓ」（配列番号４８）（多様性４）および「Ｓ−Ｓ／Ｇ／Ｎ／Ｄ−Ｙ−Ａ／Ｙ／Ｇ／Ｄ−Ｍ−Ｓ」（配列番号５０）（多様性１６）のコホートライブラリ配列を得た（図１６Ａ）。ヒトＶＨ−１  ＣＤＲ２  ＵＡＬに対して重鎖ＣＤＲ２配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が４３２０のコホートライブラリ配列「Ｗ−Ｍ−Ｇ−Ｗ／Ｇ／Ｒ−Ｉ−Ｎ／Ｉ／Ｓ−Ｐ／Ａ−Ｉ／Ｎ／Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｍ−Ｇ−Ｇ−Ｔ／Ｎ／Ｇ／Ｓ／Ｄ−Ｔ／Ａ−Ｎ／Ｋ／Ｓ／Ｇ」（配列番号５２）を得、本発明の方法による重鎖ＣＤＲ２プローブ配列とヒトＶＨ−３  ＣＤＲ２  ＵＡＬの比較により多様性が４のコホートＣＤＲ２ライブラリ配列「Ｗ−Ｖ−Ａ−Ｎ−Ｉ−Ｓ／Ｋ／Ｗ／Ｎ−Ｑ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｅ−Ｋ−Ｙ」（配列番号５３）を得た。クエリー配列としてＡＡＶ２９３  ＭＣＰ−１  ＣＤＲ３を使用し、ＶＨ  ＣＤＲ３  ＵＡＬとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリＣＤＲ３配列「Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｌ−Ｇ／Ｓ／Ｖ／Ｙ／Ｒ／Ｔ／Ｎ／Ｉ／Ｌ／Ｑ−Ｇ−Ｙ−Ｆ／Ｌ／Ｇ／Ｓ／Ｍ／Ａ／Ｉ／Ｐ−Ｄ」（配列番号５５）を得た。この重鎖ＣＤＲ３コホートライブラリは８０の多様性を有していた。
【０１５２】
ヒトＡＡＶ２９３  ＭＣＰ−１抗体のカッパ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、「ＳＳＡＬＡＷＹ」（配列番号５６）、「ＬＬＩＹＤＡＳＳＬＥ」（配列番号５９）、および「ＱＱＦＮＳＹＰＬ」（配列番号６１）であった。本発明の方法をこのカッパ鎖ＣＤＲ１クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトＶＫ−１  ＣＤＲ１  ＵＡＬおよびヒトＶＫ−３  ＣＤＲ１  ＵＡＬと比較することにより、それぞれ、「Ｓ−Ｓ−Ｙ／Ｗ／Ｄ／Ｓ−Ｌ−Ａ−Ｗ−Ｙ」（配列番号５７）（多様性４）および「Ｓ−Ｓ−Ｎ／Ｙ−Ｌ−Ａ−Ｗ−Ｙ」（配列番号５８）（多様性２）のコホートライブラリ配列を得た（図１６Ｂ）。ヒトＶＫ−１  ＣＤＲ２  ＵＡＬに対してカッパ鎖ＣＤＲ２配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、クエリー配列と同一のコホートライブラリ配列「Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ｄ−Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｅ」（配列番号６０）を得、本発明の方法によるカッパ鎖ＣＤＲ２プローブ配列とヒトＶＫ−３  ＣＤＲ２  ＵＡＬの比較により多様性が１のコホートＣＤＲ２ライブラリ配列「Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ｄ−Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｒ−Ａ」（配列番号５８２）を得た。クエリー配列としてＡＡＶ２９３  ＣＤＲ３を使用し、ＶＫ  ＣＤＲ３  ＵＡＬとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリＣＤＲ３配列「Ｑ−Ｑ−Ｙ／Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｒ−Ｎ−Ｓ−Ｙ−Ｐ−Ｌ」（配列番号６２）を得た。このカッパ鎖ＣＤＲ３ライブラリは５の多様性を有していた。
【０１５３】
ここでも、様々なコホートＣＤＲライブラリからの最終的なコホート抗体（またはそのフラグメント、例えばＦａｂ、ｓｃＦｖ等）ライブラリの作製は、コホートＣＤＲライブラリ配列の相互の独立組み合わせを通じて、本発明の方法によって同定したコホートＣＤＲライブラリから重鎖および軽鎖の両方ならびに完全抗体（またはそのフラグメント）を構築することによって行うことができた。このようなコホートＣＤＲライブラリ配列の独立組み合わせにより、ヒトＡＡＶ２９３  ＭＣＰ−１抗体クエリー配列を用いて作製されたコホートライブラリについて表７に示されるような構成鎖および抗体全体のコホートライブラリの多様性を得た。
【０１５４】
【表５】
0005791496.tif 000006
【０１５５】
本発明の方法を通じて評価した他の抗体と同様、これらの抗体ライブラリの中で最も多様性のあるものですら、現在利用可能な方法を用いて容易にディスプレイおよび／またはスクリーニングできるサイズ（例えば、実質的に約１０12未満の多様性）のものであった。
【０１５６】
実施例８
マウスプローブＣＤＲドメインからのヒトＡＣＺ８８５コホート抗体ライブラリの同定および作製
マウスＡＣＺ８８５抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、「ＳＶＹＧＭＮ」（配列番号６３）、「ＷＶＡＩＩＷＹＤＧＤＮＱＹ」（配列番号６６）、および「ＡＲＤＬＲＴＧＰＦＤ」（配列番号６９）であった。本発明の方法をマウスＡＣＺ８８５重鎖ＣＤＲ１クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトＶＨ−３  ＣＤＲ１  ＵＡＬおよびヒトＶＨ−１  ＣＤＲ１  ＵＡＬと比較することにより、それぞれ、「Ｓ−Ｓ／Ｎ／Ｄ／Ｔ−Ｙ−Ｇ−Ｍ−Ｎ」（配列番号６４）（多様性４）および「Ｓ−Ｓ／Ｇ／Ｎ／Ｄ−Ｙ−Ｇ−Ｍ−Ｎ」（配列番号６５）（多様性４）のコホートライブラリ配列を得た（図１７Ａ）。ヒトＶＨ−１  ＣＤＲ２  ＵＡＬに対して重鎖ＣＤＲ２配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が２１６のコホートライブラリ配列「Ｗ−Ｍ−Ｇ−Ｗ／Ｇ／Ｒ−Ｉ−Ｎ／Ｉ／Ｓ−Ｐ／Ａ−Ｉ／Ｎ／Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｍ−Ｇ−Ｄ−Ｎ−Ｔ／Ａ−Ｎ／Ｋ／Ｓ／Ｇ」（配列番号６７）を得、本発明の方法による重鎖ＣＤＲ２プローブ配列とヒトＶＨ−３  ＣＤＲ２  ＵＡＬの比較により多様性が２１のコホートＣＤＲ２ライブラリ配列「Ｗ−Ｖ−Ａ−Ｖ／Ａ／Ｎ／Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｔ−Ｉ−Ｗ−Ｙ−Ｄ−Ｇ−Ｄ−Ｎ−Ｔ／Ｋ／Ｉ−Ｙ」（配列番号５８３）を得た。クエリー配列としてマウスＡＣＺ８８５重鎖ＣＤＲ３を使用し、ＶＨ  ＣＤＲ３  ＵＡＬとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリＣＤＲ３配列「Ａ−Ｒ−Ｄ−Ｌ−Ｒ−Ｇ／Ｓ／Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｙ／Ｖ／Ｉ／Ｐ／Ｑ−Ｇ−Ｐ−Ｆ−Ｄ」（配列番号７０）を得た。この重鎖ＣＤＲ３コホートライブラリは１０の多様性を有していた。
【０１５７】
マウスＡＣＺ８８５抗体のカッパ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、「ＧＳＳＬＨＷＹ」（配列番号７１）、「ＬＬＩＫＹＡＳＱＳＦ」（配列番号７４）、および「ＨＱＳＳＳＬＰＦ」（配列番号７７）であった。本発明の方法をマウスＡＣＺ８８５カッパ鎖ＣＤＲ１クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトＶＫ−１  ＣＤＲ１  ＵＡＬおよびヒトＶＫ−３  ＣＤＲ１  ＵＡＬと比較することにより、それぞれ、「Ｓ／Ｒ／Ｇ／Ｎ／Ｙ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ａ／Ｎ−Ｗ−Ｙ」（配列番号７２）（多様性１０）および「Ｇ−Ｓ−Ｎ／Ｙ−Ｌ−Ａ−Ｗ−Ｙ」（配列番号７３）（多様性２）のコホートライブラリ配列を得た（図１７Ｂ）。ヒトＶＫ−１  ＣＤＲ２  ＵＡＬに対してカッパ鎖ＣＤＲ２配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が４０のコホートライブラリ配列「Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ａ／Ｄ／Ｋ／Ｇ／Ｓ−Ａ−Ｓ−Ｉ／Ｓ／Ｔ／Ｎ−Ｌ−Ｑ／Ｅ」（配列番号７５）を得、本発明の方法によるカッパ鎖ＣＤＲ２プローブ配列とヒトＶＫ−３  ＣＤＲ２  ＵＡＬの比較により多様性が６のコホートＣＤＲ２ライブラリ配列「Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ｇ／Ｄ−Ａ−Ｓ−Ｓ／Ｔ／Ｎ−Ｒ−Ａ」（配列番号７６）を得た。クエリー配列としてマウスＡＣＺ８８５  ＣＤＲ３を使用し、ＶＫ  ＣＤＲ３  ＵＡＬとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリＣＤＲ３配列「Ｑ／Ｍ−Ｑ−Ｓ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｐ−Ｆ」（配列番号７８）を得た。このカッパ鎖ＣＤＲ３ライブラリは２の多様性を有していた。
【０１５８】
ここでも、様々なコホートＣＤＲライブラリからの最終的なコホート抗体（またはそのフラグメント、例えばＦａｂ、ｓｃＦｖ等）ライブラリの作製は、コホートＣＤＲライブラリ配列の相互の独立組み合わせを通じて、本発明の方法によって同定したコホートＣＤＲライブラリから重鎖および軽鎖の両方ならびに完全抗体（またはそのフラグメント）を構築することによって行った。このようなコホートＣＤＲライブラリ配列の独立組み合わせにより、マウスＡＣＺ８８５抗体クエリー配列を用いて作製されたコホートライブラリについて表８に示されるような構成鎖および抗体全体のコホートライブラリの多様性を得た。
【０１５９】
【表６】
0005791496.tif 000007
【０１６０】
本発明の方法を通じて評価した他の抗体と同様、これらの抗体ライブラリの中で最も多様性のあるものですら、現在利用可能な方法を用いて容易にディスプレイおよび／またはスクリーニングできるサイズ（例えば、実質的に約１０12未満の多様性）のものであった。
【０１６１】
実施例９
プローブＣＤＲドメインからのヒトｇｐ１２０  ＩＴＨ５２オリゴコホート抗体ライブラリの同定および作製
ヒトｇｐ１２０  ＩＴＨ５２オリゴ抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、「ＳＤＹＧＶＳ」（配列番号７９）、「ＷＬＳＧＩＳＧＧＧＳＴＶＹ」（配列番号８２）、および「ＡＲＤＬＲＴＧＰＦＤ」（配列番号８５）であった。本発明の方法をｇｐ１２０  ＩＴＨ５２オリゴ抗体の重鎖ＣＤＲ１クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトＶＨ−３  ＣＤＲ１  ＵＡＬおよびヒトＶＨ−１  ＣＤＲ１  ＵＡＬと比較することにより、それぞれ、「Ｓ−Ｄ−Ｙ−Ｇ−Ｍ−Ｓ」（配列番号８０）（多様性１）および「Ｓ−Ｄ−Ｙ−Ｇ−Ｉ／Ｍ−Ｓ」（配列番号８１）（多様性２）のコホートライブラリ配列を得た（図１８Ａ）。ヒトＶＨ−１  ＣＤＲ２  ＵＡＬに対して重鎖ＣＤＲ２配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が１６のコホートライブラリ配列「Ｗ−Ｍ−Ｇ−Ｇ−Ｉ−Ｓ−Ｐ／Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｔ／Ａ−Ｎ／Ｋ／Ｓ／Ｇ」（配列番号８３）を得、本発明の方法による重鎖ＣＤＲ２プローブ配列とヒトＶＨ−３  ＣＤＲ２  ＵＡＬの比較により多様性が９のコホートＣＤＲ２ライブラリ配列「Ｗ−Ｖ−Ｓ−Ｇ−Ｉ−Ｓ−Ｇ−Ｄ／Ｓ／Ｎ−Ｇ−Ｓ−Ｔ−Ｔ／Ｋ／Ｉ−Ｙ」（配列番号８４）を得た。クエリー配列としてｇｐ１２０  ＩＴＨ５２オリゴ抗体の重鎖ＣＤＲ３を使用し、ＶＨ  ＣＤＲ３  ＵＡＬとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリＣＤＲ３配列「Ａ−Ｒ−Ｇ−Ｒ−Ｇ−Ｇ−Ｙ−Ｆ／Ｌ／Ｇ／Ｓ／Ｍ／Ａ／Ｉ／Ｐ−Ｄ」（配列番号８６）を得た。この重鎖ＣＤＲ３コホートライブラリは８の多様性を有していた。
【０１６２】
ヒトｇｐ１２０  ＩＴＨ５２オリゴ抗体のカッパ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、「ＧＳＹＬＡＷＹ」（配列番号８７）、「ＳＬＩＹＡＡＳＳＬＱ」（配列番号８９）、および「ＱＱＹＮＳＹＰＩ」（配列番号９２）であった。本発明の方法をｇｐ１２０  ＩＴＨ５２オリゴ抗体のカッパ鎖ＣＤＲ１クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトＶＫ−１  ＣＤＲ１  ＵＡＬおよびヒトＶＫ−３  ＣＤＲ１  ＵＡＬと比較することにより、「Ｇ−Ｓ−Ｙ−Ｌ−Ａ−Ｗ−Ｙ」（配列番号８８）（多様性なし）の同一のコホートライブラリ配列を得た（図１８Ｂ）。ヒトＶＫ−１  ＣＤＲ２  ＵＡＬに対してカッパ鎖ＣＤＲ２配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が２のコホートライブラリ配列「Ｌ／Ｒ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ａ−Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｑ」（配列番号９０）を得、本発明の方法によるカッパ鎖ＣＤＲ２プローブ配列とヒトＶＫ−３  ＣＤＲ２  ＵＡＬの比較により多様性が２のコホートＣＤＲ２ライブラリ配列「Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ｇ／Ｄ−Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｒ−Ａ」（配列番号９１）を得た。クエリー配列としてｇｐ１２０  ＩＴＨ５２オリゴ抗体ＣＤＲ３を使用し、ＶＫ  ＣＤＲ３  ＵＡＬとのアラインメントを行うことにより、追加の多様性のないコホートライブラリＣＤＲ３配列「Ｑ−Ｑ−Ｙ−Ｎ−Ｓ−Ｙ−Ｐ−Ｉ」（配列番号９３）を得た。
【０１６３】
ここでも、様々なコホートＣＤＲライブラリからの最終的なコホート抗体（またはそのフラグメント、例えばＦａｂ、ｓｃＦｖ等）ライブラリの作製は、コホートＣＤＲライブラリ配列の相互の独立組み合わせを通じて、本発明の方法によって同定したコホートＣＤＲライブラリから重鎖および軽鎖の両方ならびに完全抗体（またはそのフラグメント）を構築することによって行った。このようなコホートＣＤＲライブラリ配列の独立組み合わせにより、ヒトｇｐ１２０  ＩＴＨ５２オリゴ抗体クエリー配列を用いて作製されたコホートライブラリについて表９に示されるような構成鎖および抗体全体のコホートライブラリの多様性を得た。
【０１６４】
【表７】
0005791496.tif 000008
【０１６５】
本発明の方法を通じて評価した他の抗体と同様、これらの抗体ライブラリの中で最も多様性のあるものですら、現在利用可能な方法を用いて容易にディスプレイおよび／またはスクリーニングできるサイズ（例えば、実質的に約１０12未満の多様性）のものであった。
【０１６６】
実施例１０
プローブＣＤＲドメインからのヒトｓｃＦｖ  ｇｐ１２０コホート抗体ライブラリの同定および作製
ヒトｓｃＦｖ  ｇｐ１２０抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、「ＳＮＦＶＩＨ」（配列番号９４）、「ＷＶＧＷＩＮＰＹＮＧＮＫＥ」（配列番号９７）、および「ＡＲＶＧＰＹＳＷＤＤＳＰＱＤＮＹＹＭＤ」（配列番号１００）であった。本発明の方法をｓｃＦｖ  ｇｐ１２０抗体の重鎖ＣＤＲ１クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトＶＨ−３  ＣＤＲ１  ＵＡＬおよびヒトＶＨ−１  ＣＤＲ１  ＵＡＬと比較することにより、それぞれ、「Ｓ−Ｎ−Ｙ／Ａ／Ｓ−Ａ／Ｇ／Ｗ／Ｙ−Ｍ−Ｈ」（配列番号９５）（多様性１２）および「Ｓ−Ｎ−Ｙ−Ａ／Ｙ／Ｇ／Ｄ−Ｉ−Ｈ」（配列番号９６）（多様性４）のコホートライブラリ配列を得た（図１９Ａ）。ヒトＶＨ−１  ＣＤＲ２  ＵＡＬに対して重鎖ＣＤＲ２配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が８のコホートライブラリ配列「Ｗ−Ｍ−Ｇ−Ｗ−Ｉ−Ｎ−Ｐ−Ｙ−Ｎ−Ｇ−Ｎ−Ｔ／Ａ−Ｎ／Ｋ／Ｓ／Ｇ」（配列番号９８）を得、本発明の方法による重鎖ＣＤＲ２プローブ配列とヒトＶＨ−３  ＣＤＲ２  ＵＡＬの比較により多様性が７０５６のコホートＣＤＲ２ライブラリ配列「Ｗ−Ｖ−Ｓ／Ａ−Ｖ／Ａ／Ｎ／Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｔ−Ｉ−Ｎ−Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｑ／Ｗ／Ｎ／Ｆ−Ｄ／Ｓ／Ｎ−Ｇ／Ｓ−Ｇ−Ｎ−Ｋ−Ｙ／Ｎ／Ｆ／Ｈ」（配列番号９９）を得た。クエリー配列としてｓｃＦｖ  ｇｐ１２０抗体の重鎖ＣＤＲ３を使用し、ＶＨ  ＣＤＲ３  ＵＡＬとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリＣＤＲ３配列「Ａ−Ｒ−Ｖ−Ｇ−Ｐ−Ｙ−Ｓ−Ｗ−Ｄ−Ｄ−Ｓ−Ｐ−Ｑ−Ｄ−Ｎ−Ｙ−Ｙ−Ｍ−Ｄ」（配列番号１０１）（多様性なし）を得た。
【０１６７】
ｓｃＦｖ  ｇｐ１２０抗体のカッパ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、「ＲＳＲＲＶＡＷＹ」（配列番号１０２）、「ＬＬＩＹＧＶＳＮＲＡ」（配列番号１０４）、および「ＱＶＹＧＡＳＳＹ」（配列番号１０７）であった。本発明の方法をｓｃＦｖ  ｇｐ１２０抗体のカッパ鎖ＣＤＲ１クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトＶＫ−３  ＣＤＲ１  ＵＡＬと比較することにより、「Ｓ／Ｎ−Ｓ／Ｎ−Ｓ／Ｎ／Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ａ−Ｗ−Ｙ」（配列番号１０３）（多様性１２）のコホートライブラリ配列を得た。ヒトＶＫ−３  ＣＤＲ２  ＵＡＬに対してカッパ鎖ＣＤＲ２配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が２のコホートライブラリ配列「Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ｇ−Ａ／Ｔ−Ｓ−Ｎ−Ｒ−Ａ」（配列番号１０６）を得、ヒトＶＫ−１  ＣＤＲ２  ＵＡＬに対するこの配列の問い合わせにより多様性が２の別個のコホートライブラリ配列「Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ｇ−Ａ−Ｓ−Ｎ−Ｌ−Ｑ／Ｅ」（配列番号１０５）を得た（図１９Ｂ）。クエリー配列としてｓｃＦｖ  ｇｐ１２０抗体ＣＤＲ３を使用し、ＶＫ  ＣＤＲ３
ＵＡＬとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリＣＤＲ３配列「Ｑ−Ｑ−Ｙ−Ｇ−Ｓ／Ｎ／Ｔ／Ｈ／Ｑ／Ｇ−Ｓ−Ｐ−Ｙ」（配列番号１０８）を得た。このカッパ鎖ＣＤＲ３ライブラリは６の多様性を有していた。
【０１６８】
ここでも、様々なコホートＣＤＲライブラリからの最終的なコホート抗体（またはそのフラグメント、例えばＦａｂ、ｓｃＦｖ等）ライブラリの作製は、コホートＣＤＲライブラリ配列の相互の独立組み合わせを通じて、本発明の方法によって同定したコホートＣＤＲライブラリから重鎖および軽鎖の両方ならびに完全抗体（またはそのフラグメント）を構築することによって行った。このようなコホートＣＤＲライブラリ配列の独立組み合わせにより、ｓｃＦｖ  ｇｐ１２０抗体クエリー配列を用いて作製されたコホートライブラリについて表１０に示されるような構成鎖および抗体全体のコホートライブラリの多様性を得た。
【０１６９】
【表８】
0005791496.tif 000009
【０１７０】
本発明の方法を通じて評価した他の抗体と同様、これらの抗体ライブラリの中で最も多様性のあるものですら、現在利用可能な方法を用いて容易にディスプレイおよび／またはスクリーニングできるサイズ（例えば、実質的に約１０12未満の多様性）のものであった。
【０１７１】
実施例１１
プローブＣＤＲドメインからのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ  ４Ｄ５コホート抗体ライブラリの同定および作製
ヒトＨｅｒｃｅｐｔｉｎ  ４Ｄ５抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、「ＫＤＴＹＩＨ」（配列番号１０９）、「ＷＩＧＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲ」（配列番号１１２）、および「ＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤ」（配列番号１１５）であった。本発明の方法をこの重鎖ＣＤＲ１クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトＶＨ−３  ＣＤＲ１  ＵＡＬおよびヒトＶＨ−１  ＣＤＲ１  ＵＡＬと比較することにより、それぞれ、「Ｓ／Ｎ−Ｄ−Ｙ／Ａ／Ｓ−Ｙ−Ｍ−Ｈ」（配列番号１１０）（多様性６）および「Ｔ／Ｓ−Ｄ−Ｙ−Ｙ−Ｉ−Ｈ」（配列番号１１１）（多様性２）のコホートライブラリ配列を得た（図２０Ａ）。ヒトＶＨ−１  ＣＤＲ２  ＵＡＬに対して重鎖ＣＤＲ２配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が３６０のコホートライブラリ配列「Ｗ−Ｍ−Ｇ−Ｒ−Ｉ−Ｎ／Ｉ／Ｓ−Ｐ−Ｉ／Ｎ／Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｍ−Ｎ−Ｇ−Ｔ／Ｎ／Ｇ／Ｓ／Ｄ−Ｔ−Ｎ／Ｋ／Ｓ／Ｇ」（配列番号１１３）を得、本発明の方法による重鎖ＣＤＲ２プローブ配列とヒトＶＨ−３  ＣＤＲ２  ＵＡＬの比較により多様性が９４０８のコホートＣＤＲ２ライブラリ配列「Ｗ−Ｖ−Ｓ／Ａ−Ｖ／Ａ／Ｎ／Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｔ−Ｉ−Ｓ／Ｋ／Ｗ／Ｎ−Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｑ／Ｗ／Ｎ／Ｆ−Ｄ／Ｓ／Ｎ−Ｇ／Ｓ−Ｇ−Ｙ−Ｔ−Ｙ／Ｎ／Ｆ／Ｈ」（配列番号１１４）を得た。クエリー配列としてＨｅｒｃｅｐｔｉｎ  ４Ｄ５重鎖ＣＤＲ３を使用し、ＶＨ  ＣＤＲ３  ＵＡＬとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリＣＤＲ３配列「Ａ−Ｒ−Ｇ／Ｄ／Ｅ／Ｒ／Ｖ／Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｓ／Ｇ／Ｙ／Ｌ／Ｔ／Ａ／Ｒ／Ｄ／Ｅ／Ｎ−Ｙ−Ａ−Ｍ−Ｄ」（配列番号１１６）を得た。この重鎖ＣＤＲ３コホートライブラリは６０の多様性を有していた。
【０１７２】
Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ  ４Ｄ５抗体のカッパ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、「ＮＴＡＶＡＷＹ」（配列番号１１７）、「ＬＬＩＹＳＡＳＦＲＹ」（配列番号１２０）、および「ＱＱＨＹＴＴＰＰ」（配列番号１２２）であった。本発明の方法をこのカッパ鎖ＣＤＲ１クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトＶＫ−１  ＣＤＲ１  ＵＡＬおよびＶＫ−３  ＣＤＲ１  ＵＡＬと比較することにより、それぞれ、「Ｎ−Ｔ−Ｙ／Ｗ／Ｄ／Ｓ−Ｌ−Ａ−Ｗ−Ｙ」（配列番号１１８）（多様性４）および「Ｎ−Ｔ−Ｎ／Ｙ−Ｌ−Ａ−Ｗ−Ｙ」（配列番号１１９）（多様性２）のコホートライブラリ配列を得た（図２０Ｂ）。ヒトＶＫ−１  ＣＤＲ２  ＵＡＬに対してカッパ鎖ＣＤＲ２配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が８のコホートライブラリ配列「Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ｓ−Ａ−Ｓ−Ｉ／Ｓ／Ｔ／Ｎ−Ｌ−Ｑ／Ｅ」（配列番号１２１）を得、本発明の方法によるカッパ鎖ＣＤＲ２プローブ配列とヒトＶＫ−３  ＣＤＲ２  ＵＡＬの比較により多様性が１２のコホートＣＤＲ２ライブラリ配列「Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ｇ／Ｄ−Ａ／Ｔ−Ｓ−Ｓ／Ｔ／Ｎ−Ｒ−Ａ」（配列番号１２２）を得た。クエリー配列としてＨｅｒｃｅｐｔｉｎ  ４Ｄ５  ＣＤＲ３を使用し、ＶＫ  ＣＤＲ３  ＵＡＬとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリＣＤＲ３配列「Ｑ−Ｑ−Ｙ／Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｒ−Ｙ−Ｔ−Ｔ−Ｐ−Ｌ／Ｙ／Ｗ／Ｒ／Ｆ／Ｉ」（配列番号１２４）を得た。このカッパ鎖ＣＤＲ３ライブラリは３０の多様性を有していた。
【０１７３】
ここでも、様々なコホートＣＤＲライブラリからの最終的なコホート抗体（またはそのフラグメント、例えばＦａｂ、ｓｃＦｖ等）ライブラリの作製は、コホートＣＤＲライブラリ配列の相互の独立組み合わせを通じて、本発明の方法によって同定したコホートＣＤＲライブラリから重鎖および軽鎖の両方ならびに完全抗体（またはそのフラグメント）を構築することによって行った。このようなコホートＣＤＲライブラリ配列の独立組み合わせにより、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ  ４Ｄ５抗体クエリー配列を用いて作製されたコホートライブラリについて表１１に示されるような構成鎖および抗体全体のコホートライブラリの多様性を得た。
【０１７４】
【表９】
0005791496.tif 000010
【０１７５】
本発明の方法を通じて評価した他の抗体と同様、これらの抗体ライブラリの中で最も多様性のあるものですら、現在利用可能な方法を用いて容易にディスプレイおよび／またはスクリーニングできるサイズ（例えば、実質的に約１０12未満の多様性）のものであった。
【０１７６】
実施例１２
プローブＣＤＲドメインからのＣＤ１９  ＨＤ３７コホート抗体ライブラリの同定および作製
ヒトＣＤ１９  ＨＤ３７抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、「ＳＳＹＷＭＮ」（配列番号１２５）、「ＷＩＧＱＩＷＰＧＤＧＤＴＮ」（配列番号１２８）、および「ＡＲＲＥＴＴＴＶＧＲＹＹＹＡＭＤ」（配列番号１３１）であった。本発明の方法をこの重鎖ＣＤＲ１クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトＶＨ−３  ＣＤＲ１  ＵＡＬおよびヒトＶＨ−１  ＣＤＲ１  ＵＡＬと比較することにより、それぞれ、「Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ｗ−Ｍ−Ｎ」（配列番号１２６）（多様性なし）および「Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ａ／Ｙ／Ｇ／Ｄ−Ｍ−Ｎ」（配列番号１２７）（多様性４）のコホートライブラリ配列を得た（図２１Ａ）。ヒトＶＨ−１  ＣＤＲ２  ＵＡＬに対して重鎖ＣＤＲ２配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が３６のコホートライブラリ配列「Ｗ−Ｍ−Ｇ−Ｗ／Ｇ／Ｒ−Ｉ−Ｎ／Ｉ／Ｓ−Ｐ−Ｇ−Ｆ／Ｓ／Ｎ／Ｇ−Ｇ−Ｄ−Ｔ−Ｎ」（配列番号１２９）を得、本発明の方法による重鎖ＣＤＲ２プローブ配列とヒトＶＨ
−３  ＣＤＲ２  ＵＡＬの比較により多様性が２３５２のコホートＣＤＲ２ライブラリ配列「Ｗ−Ｖ−Ｓ／Ａ−Ｖ／Ａ／Ｎ／Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｔ−Ｉ−Ｓ／Ｋ／Ｗ／Ｎ−Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｑ／Ｗ／Ｎ／Ｆ−Ｄ／Ｓ／Ｎ−Ｇ／Ｓ−Ｇ−Ｄ−Ｔ−Ｎ」（配列番号１３０）を得た。クエリー配列としてＣＤ１９  ＨＤ３７の重鎖ＣＤＲ３を使用し、ＶＨ  ＣＤＲ３  ＵＡＬとのアラインメントを行うことにより、多様性が９のコホートライブラリＣＤＲ３配列「Ａ−Ｒ−Ｒ−Ｅ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｇ／Ｓ／Ｙ／Ａ／Ｔ／Ｄ／Ｒ／Ｆ／Ｗ−Ｇ−Ｒ−Ｙ−Ｙ−Ｙ−Ａ−Ｍ−Ｄ」（配列番号１２）を得た。
【０１７７】
ＣＤ１９  ＨＤ３７抗体のカッパ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、「ＶＴＹＶＳＷＹ」（配列番号１３３）、「ＬＬＩＹＧＡＳＮＲＹ」（配列番号１３６）、および「ＧＱＧＹＳＹＰＹ」（配列番号１３９）であった。本発明の方法をこのカッパ鎖ＣＤＲ１クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトＶＫ−１  ＣＤＲ１  ＵＡＬおよびＶＫ−３  ＣＤＲ１  ＵＡＬと比較することにより、それぞれ、「Ｓ／Ｒ／Ｇ／Ｎ／Ｙ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ａ／Ｎ−Ｗ−Ｙ」（配列番号１３４）（多様性１０）および「Ｓ／Ｇ／Ｎ−Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ａ−Ｗ−Ｙ」（配列番号１３５）（多様性３）のコホートライブラリ配列を得た（図２１Ｂ）。ヒトＶＫ−１  ＣＤＲ２  ＵＡＬに対してカッパ鎖ＣＤＲ２配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が２のコホートライブラリ配列「Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ｇ−Ａ−Ｓ−Ｎ−Ｌ−Ｑ／Ｅ」（配列番号１３７）を得、本発明の方法によるカッパ鎖ＣＤＲ２プローブ配列とヒトＶＫ−３  ＣＤＲ２  ＵＡＬの比較により多様性が１のコホートＣＤＲ２ライブラリ配列「Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ｇ−Ａ−Ｓ−Ｎ−Ｒ−Ａ」（配列番号１３８）を得た。クエリー配列としてＣＤ１９  ＨＤ３７  ＣＤＲ３を使用し、ＶＫ  ＣＤＲ３  ＵＡＬとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリＣＤＲ３配列「Ｑ／Ｍ−Ｑ−Ｇ−Ｙ−Ｓ−Ｙ−Ｐ−Ｙ」（配列番号１４０）を得た。このカッパ鎖ＣＤＲ３ライブラリは２の多様性を有していた。
【０１７８】
ここでも、様々なコホートＣＤＲライブラリからの最終的なコホート抗体（またはそのフラグメント、例えばＦａｂ、ｓｃＦｖ等）ライブラリの作製は、コホートＣＤＲライブラリ配列の相互の独立組み合わせを通じて、本発明の方法によって同定したコホートＣＤＲライブラリから重鎖および軽鎖の両方ならびに完全抗体（またはそのフラグメント）を構築することによって行った。このようなコホートＣＤＲライブラリ配列の独立組み合わせにより、ヒトＣＤ１９  ＨＤ３７抗体クエリー配列を用いて作製されたコホートライブラリについて表１２に示されるような構成鎖および抗体全体のコホートライブラリの多様性を得た。
【０１７９】
【表１０】
0005791496.tif 000011
【０１８０】
本発明の方法を通じて評価した他の抗体と同様、これらの抗体ライブラリの中で最も多様性のあるものですら、現在利用可能な方法を用いて容易にディスプレイおよび／またはスクリーニングできるサイズ（例えば、実質的に約１０12未満の多様性）のものであった。
【０１８１】
実施例１３
マウスプローブＣＤＲドメインからのヒトＣＤ８  ｇ１０−１コホート抗体ライブラリの同定および作製
マウスＣＤ８  ｇ１０−１抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、「ＴＤＹＹＭＫ」（配列番号１４１）、「ＷＩＧＨＩＮＰＮＮＤＤＴＦ」（配列番号１４４）、および「ＶＲＤＤＹＤＧＧＷＦＡ」（配列番号１４７）であった。本発明の方法をこの重鎖ＣＤＲ１クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトＶＨ−３  ＣＤＲ１  ＵＡＬおよびヒトＶＨ−１  ＣＤＲ１  ＵＡＬと比較することにより、それぞれ、「Ｓ／Ｎ−Ｄ−Ｙ−Ｙ−Ｍ−Ｓ／Ｈ／Ｎ」（配列番号１４２）（多様性６）および「Ｔ−Ｄ−Ｙ−Ｙ−Ｍ−Ｓ／Ｈ／Ｎ」（配列番号１４３）（多様性３）のコホートライブラリ配列を得た（図２２Ａ）。ヒトＶＨ−１  ＣＤＲ２  ＵＡＬに対して重鎖ＣＤＲ２配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が１２のコホートライブラリ配列「Ｗ−Ｍ−Ｇ−Ｗ／Ｇ／Ｒ−Ｉ−Ｎ−Ｐ−Ｎ−Ｎ−Ｇ−Ｄ−Ｔ−Ｎ／Ｋ／Ｓ／Ｇ」（配列番号１４５）を得、本発明の方法による重鎖ＣＤＲ２プローブ配列とヒトＶＨ−３  ＣＤＲ２  ＵＡＬの比較により多様性が１９６のコホートＣＤＲ２ライブラリ配列「Ｗ−Ｖ−Ｓ／Ａ−Ｖ／Ａ／Ｎ／Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｔ−Ｉ−Ｎ−Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｑ／Ｗ／Ｎ／Ｆ−Ｎ−Ｇ／Ｓ−Ｄ−Ｄ−Ｔ−Ｆ」（配列番号１４６）を得た。クエリー配列としてＣＤ８  ｇ１０−１重鎖ＣＤＲ３を使用し、ＶＨ  ＣＤＲ３  ＵＡＬとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリＣＤＲ３配列「Ｖ−Ｒ−Ｄ−Ｄ−Ｙ−Ｄ−Ｇ−Ｇ−Ｗ−Ｆ−Ｄ／Ｇ」（配列番号１４８）を得た。この重鎖ＣＤＲ３コホートライブラリは２の多様性を有していた。
【０１８２】
ＣＤ８  ｇ１０−１抗体のカッパ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、「ＮＮＹＬＮＷＹ」（配列番号１４９）、「ＬＬＩＹＴＳＲＳＳＹ」（配列番号１５２）、および「ＱＱＧＫＴＬＰＷ」（配列番号１５５）であった。本発明の方法をこのカッパ鎖ＣＤＲ１クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトＶＫ−１  ＣＤＲ１  ＵＡＬおよびＶＫ−３  ＣＤＲ１  ＵＡＬと比較することにより、それぞれ、「Ｎ−Ｎ−Ｙ−Ｌ−Ｎ−Ｗ−Ｙ」（配列番号１５６）（多様性なし）および「Ｎ−Ｎ−Ｙ−Ｌ−Ａ−Ｗ−Ｙ」（配列番号１５１）（多様性１）のコホートライブラリ配列を得た（図２２Ｂ）。ヒトＶＫ−１  ＣＤＲ２  ＵＡＬに対してカッパ鎖ＣＤＲ２配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が１０のコホートライブラリ配列「Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ａ／Ｄ／Ｋ／Ｇ／Ｓ−Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｑ／Ｅ」（配列番号１５３）を得、本発明の方法によるカッパ鎖ＣＤＲ２プローブ配列とヒトＶＫ−３  ＣＤＲ２  ＵＡＬの比較により多様性が４のコホートＣＤＲ２ライブラリ配列「Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ｇ／Ｄ−Ａ／Ｔ−Ｓ−Ｓ−Ｒ−Ａ」（配列番号１５４）を得た。クエリー配列としてＣＤ８  ｇ１０−１カッパ鎖  ＣＤＲ３を使用し、ＶＫ  ＣＤＲ３  ＵＡＬとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリＣＤＲ３配列「Ｑ−Ｑ−Ｇ−Ｙ／Ｎ／Ｇ／Ｓ／Ｄ／Ｔ／Ｌ−Ｔ−Ｌ−Ｐ−Ｗ」（配列番号１５６）を得た。このカッパ鎖ＣＤＲ３ライブラリは７の多様性を有していた。
【０１８３】
ここでも、様々なコホートＣＤＲライブラリからの最終的なコホート抗体（またはそのフラグメント、例えばＦａｂ、ｓｃＦｖ等）ライブラリの作製は、コホートＣＤＲライブラリ配列の相互の独立組み合わせを通じて、本発明の方法によって同定したコホートＣＤＲライブラリから重鎖および軽鎖の両方ならびに完全抗体（またはそのフラグメント）を構築することによって行った。このようなコホートＣＤＲライブラリ配列の独立組み合わせにより、ヒトＣＤ８  ｇ１０−１抗体クエリー配列を用いて作製されたコホートライブラリについて表１３に示されるような構成鎖および抗体全体のコホートライブラリの多様性を得た。
【０１８４】
【表１１】
0005791496.tif 000012
【０１８５】
本発明の方法を通じて評価した他の抗体と同様、これらの抗体ライブラリの中で最も多様性のあるものですら、現在利用可能な方法を用いて容易にディスプレイおよび／またはスクリーニングできるサイズ（例えば、実質的に約１０12未満の多様性）のものであった。
【０１８６】
実施例１４
マウスプローブＣＤＲドメインからのヒト５Ｇ１．１  Ｃ５コホート抗体ライブラリの同定および作製
マウス５Ｇ１．１  Ｃ５抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、「ＳＮＹＷＩＱ」（配列番号１５７）、「ＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＥ」（配列番号１６０）、および「ＡＲＹＦＦＧＳＳＰＮＷＹＦＤ」（配列番号１６３）であった。本発明の方法をこの重鎖ＣＤＲ１クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトＶＨ−３  ＣＤＲ１  ＵＡＬおよびヒトＶＨ−１  ＣＤＲ１  ＵＡＬと比較することにより、それぞれ、「Ｓ−Ｎ−Ｙ−Ｗ−Ｍ−Ｓ／Ｈ／Ｎ」（配列番号１５８）（多様性３）および「Ｓ−Ｎ−Ｙ−Ａ／Ｙ／Ｇ／Ｄ−Ｉ−Ｈ／Ｓ／Ｎ」（配列番号１５９）（多様性１２）のコホートライブラリ配列を得た（図２３Ａ）。ヒトＶＨ−１  ＣＤＲ２  ＵＡＬに対して重鎖ＣＤＲ２配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が３６のコホートライブラリ配列「Ｗ−Ｍ−Ｇ−Ｗ／Ｇ／Ｒ−Ｉ−Ｎ／Ｉ／Ｓ−Ｐ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｔ−Ｎ／Ｋ／Ｓ／Ｇ」（配列番号１６１）を得、本発明の方法による重鎖ＣＤＲ２プローブ配列とヒトＶＨ−３  ＣＤＲ２  ＵＡＬの比較により多様性が４７０４のコホートＣＤＲ２ライブラリ配列「Ｗ−Ｖ−Ｓ／Ａ−Ｖ／Ａ／Ｎ／Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｔ−Ｉ−Ｓ／Ｋ／Ｗ／Ｎ−Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｑ／Ｗ／Ｎ／Ｆ−Ｄ／Ｓ／Ｎ−Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｔ−Ｙ／Ｎ／Ｆ／Ｈ」（配列番号１６２）を得た。クエリー配列としてマウス５Ｇ１．１  Ｃ５重鎖ＣＤＲ３を使用し、ＶＨ  ＣＤＲ３  ＵＡＬとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリＣＤＲ３配列「Ａ−Ｒ−Ｄ／Ｇ／Ｅ／Ａ／Ｓ／Ｒ／Ｔ／Ｖ／Ｈ−Ｒ／Ｇ／Ｌ／Ｐ／Ｓ／Ａ／Ｔ／Ｑ／Ｈ／Ｉ／Ｋ−Ｇ／Ｙ／Ｌ／Ｒ／Ｉ／Ｖ／Ａ／Ｐ／Ｓ／Ｄ／Ｔ／Ｅ−Ｇ−Ｓ−Ｓ−Ｐ−Ｙ／Ｇ／Ｄ／Ｓ／Ｔ／Ｆ／Ａ／Ｐ／Ｅ／Ｌ／Ｒ−Ｗ−Ｙ−Ｆ−Ｄ」（配列番号１６４）を得た。この重鎖ＣＤＲ３コホートライブラリは１３,０６８の多様性を有していた。
【０１８７】
マウス５Ｇ１．１  Ｃ５抗体のカッパ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、「ＴＧＡＬＮＷＹ」（配列番号１６５）、「ＬＬＩＹＧＡＴＮＬＡ」（配列番号１６８）、および「ＱＮＶＬＮＴＰＬ」（配列番号１７１）であった。本発明の方法をこのカッパ鎖ＣＤＲ１クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトＶＫ−１  ＣＤＲ１  ＵＡＬおよびＶＫ−３  ＣＤＲ１  ＵＡＬと比較することにより、それぞれ、「Ｓ／Ｒ／Ｇ／Ｎ／Ｙ−Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｋ−Ｙ／Ｗ／Ｄ／Ｓ−Ｌ−Ｎ−Ｗ−Ｙ」（配列番号１６６）（多様性８０）および「Ｓ／Ｇ／Ｎ−Ｓ／Ｎ／Ｔ−Ｎ／Ｙ−Ｌ−Ａ−Ｗ−Ｙ」（配列番号１６７）（多様性１８）のコホートライブラリ配列を得た（図２３Ｂ）。ヒトＶＫ−１  ＣＤＲ２  ＵＡＬに対してカッパ鎖ＣＤＲ２配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が２のコホートライブラリ配列「Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ｇ−Ａ−Ｓ−Ｎ−Ｌ−Ｑ／Ｅ」（配列番号１６９）を得、本発明の方法によるカッパ鎖ＣＤＲ２プローブ配列とヒトＶＫ−３  ＣＤＲ２  ＵＡＬの比較により多様性が１のコホートＣＤＲ２ライブラリ配列「Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ｇ−Ａ−Ｓ−Ｎ−Ｒ−Ａ」（配列番号１７０）を得た。クエリー配列としてマウス５Ｇ１．１  Ｃ５カッパ鎖ＣＤＲ３を使用し、ＶＫ  ＣＤＲ３  ＵＡＬとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリＣＤＲ３配列「Ｑ−Ｑ−Ｙ／Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｒ−Ｌ−Ｎ−Ｔ−Ｐ−Ｌ」（配列番号１７２）を得た。このカッパ鎖ＣＤＲ３ライブラリは５の多様性を有していた。
【０１８８】
ここでも、様々なコホートＣＤＲライブラリからの最終的なコホート抗体（またはそのフラグメント、例えばＦａｂ、ｓｃＦｖ等）ライブラリの作製は、コホートＣＤＲライブラリ配列の相互の独立組み合わせを通じて、本発明の方法によって同定したコホートＣＤＲライブラリから重鎖および軽鎖の両方ならびに完全抗体（またはそのフラグメント）を構築することによって行った。このようなコホートＣＤＲライブラリ配列の独立組み合わせにより、マウス５Ｇ１．１  Ｃ５抗体クエリー配列を用いて作製されたコホートライブラリについて表１４に示されるような構成鎖および抗体全体のコホートライブラリの多様性を得た。
【０１８９】
【表１２】
0005791496.tif 000013
【０１９０】
本発明の方法を通じて評価した他の抗体と同様、これらの抗体ライブラリの中で最も多様性のあるものですら、現在利用可能な方法を用いて容易にディスプレイおよび／またはスクリーニングできるサイズ（例えば、実質的に約１０12未満の多様性）のものであった。
【０１９１】
実施例１５
マウスプローブＣＤＲドメインからのヒトＲｅｏｐｒｏ  ７Ｅ３コホート抗体ライブラリの同定および作製
マウスＲｅｏｐｒｏ  ７Ｅ３抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、「ＫＤＴＹＶＨ」（配列番号１７３）、「ＷＩＧＲＩＤＰＡＮＧＹＴＫ」（配列番号１７６）、および「ＶＲＰＬＹＤＹＹＡＭＤ」（配列番号１７９）であった。本発明の方法をこの重鎖ＣＤＲ１クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトＶＨ−３  ＣＤＲ１  ＵＡＬおよびヒトＶＨ−１  ＣＤＲ１  ＵＡＬと比較することにより、それぞれ、「Ｓ／Ｎ−Ｄ−Ｙ／Ａ／Ｓ−Ｙ−Ｍ−Ｈ」（配列番号１７４）（多様性６）および「Ｔ／Ｓ−Ｄ−Ｙ−Ｙ−Ｉ／Ｍ−Ｈ」（配列番号１７５）（多様性４）のコホートライブラリ配列を得た（図２４Ａ）。ヒトＶＨ−１  ＣＤＲ２  ＵＡＬに対して重鎖ＣＤＲ２配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が９０のコホートライブラリ配
列「Ｗ−Ｍ−Ｇ−Ｒ−Ｉ−Ｎ／Ｉ／Ｓ−Ｐ−Ｉ／Ｎ／Ｓ／Ｙ／Ｇ／Ｍ−Ｎ−Ｇ−Ｔ／Ｎ／Ｇ／Ｓ／Ｄ−Ｔ−Ｋ」（配列番号１７７）を得、本発明の方法による重鎖ＣＤＲ２プローブ配列とヒトＶＨ−３  ＣＤＲ２  ＵＡＬの比較により多様性が９４０８のコホートＣＤＲ２ライブラリ配列「Ｗ−Ｖ−Ｓ／Ａ−Ｖ／Ａ／Ｎ／Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｔ−Ｉ−Ｓ／Ｋ／Ｗ／Ｎ−Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｑ／Ｗ／Ｎ／Ｆ−Ｄ／Ｓ／Ｎ−Ｇ／Ｓ−Ｇ−Ｙ−Ｔ−Ｙ／Ｎ／Ｆ／Ｈ」（配列番号１７８）を得た。クエリー配列としてマウスＲｅｏｐｒｏ  ７Ｅ３重鎖ＣＤＲ３を使用し、ＶＨ  ＣＤＲ３  ＵＡＬとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリＣＤＲ３配列「Ｖ−Ｒ−Ｄ／Ｋ／Ｇ／Ｉ／Ａ／Ｅ／Ｌ／Ｒ／Ｎ−Ｌ−Ｙ−Ｄ−Ｙ−Ｙ−Ａ−Ｍ−Ｄ」（配列番号１８０）を得た。この重鎖ＣＤＲ３コホートライブラリは９の多様性を有していた。
【０１９２】
マウスＲｅｏｐｒｏ  ７Ｅ３抗体のカッパ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、「ＳＳＮＩＧＷＬ」（配列番号１８１）、「ＧＬＩＹＹＧＴＮＬＶ」（配列番号１８４）、および「ＶＱＹＡＱＬＰＹ」（配列番号１８７）であった。本発明の方法をこのカッパ鎖ＣＤＲ１クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトＶＫ−１  ＣＤＲ１  ＵＡＬおよびＶＫ−３  ＣＤＲ１  ＵＡＬと比較することにより、それぞれ、「Ｓ−Ｓ−Ｙ／Ｗ／Ｄ／Ｓ−Ｌ−Ａ／Ｎ−Ｗ−Ｙ」（配列番号１８２）（多様性８）および「Ｓ−Ｓ−Ｎ−Ｌ−Ａ−Ｗ−Ｙ」（配列番号１８３）（多様性１）のコホートライブラリ配列を得た（図２４Ｂ）。ヒトＶＫ−１  ＣＤＲ２  ＵＡＬに対してカッパ鎖ＣＤＲ２配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が２０のコホートライブラリ配列「Ｌ／Ｒ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ａ／Ｄ／Ｋ／Ｇ／Ｓ−Ａ−Ｓ−Ｎ−Ｌ−Ｑ／Ｅ」（配列番号１８５）を得、本発明の方法によるカッパ鎖ＣＤＲ２プローブ配列とヒトＶＫ−３  ＣＤＲ２  ＵＡＬの比較により多様性が４のコホートＣＤＲ２ライブラリ配列「Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ｇ／Ｄ−Ｔ／Ａ−Ｓ−Ｎ−Ｒ−Ａ」（配列番号１８６）を得た。クエリー配列としてマウスＲｅｏｐｒｏ  ７Ｅ３のカッパ鎖ＣＤＲ３を使用し、ＶＫ  ＣＤＲ３  ＵＡＬとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリＣＤＲ３配列「Ｑ／Ｍ−Ｑ−Ｙ−Ｙ／Ｎ／Ｇ／Ｓ／Ｄ／Ｔ／Ｌ−Ｑ−Ｌ−Ｐ−Ｙ」（配列番号１８８）を得た。このカッパ鎖ＣＤＲ３ライブラリは１４の多様性を有していた。
【０１９３】
ここでも、様々なコホートＣＤＲライブラリからの最終的なコホート抗体（またはそのフラグメント、例えばＦａｂ、ｓｃＦｖ等）ライブラリの作製は、コホートＣＤＲライブラリ配列の相互の独立組み合わせを通じて、本発明の方法によって同定したコホートＣＤＲライブラリから重鎖および軽鎖の両方ならびに完全抗体（またはそのフラグメント）を構築することによって行った。このようなコホートＣＤＲライブラリ配列の独立組み合わせにより、マウスＲｅｏｐｒｏ  ７Ｅ３抗体クエリー配列を用いて作製されたコホートライブラリについて表１５に示されるような構成鎖および抗体全体のコホートライブラリの多様性を得た。
【０１９４】
【表１３】
0005791496.tif 000014
【０１９５】
本発明の方法を通じて評価した他の抗体と同様、これらの抗体ライブラリの中で最も多様性のあるものですら、現在利用可能な方法を用いて容易にディスプレイおよび／またはスクリーニングできるサイズ（例えば、実質的に約１０12未満の多様性）のものであった。
【０１９６】
実施例１６
マウスプローブＣＤＲドメインからのヒトＲａｐｔｉｖａ  ＭＨＭ２４コホート抗体ライブラリの同定および作製
マウスＲａｐｔｉｖａ  ＭＨＭ２４抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、「ＴＧＨＷＭＮ」（配列番号１８９）、「ＷＩＧＭＩＨＰＳＤＳＥＴＲ」（配列番号１９２）、および「ＡＲＧＩＹＦＹＧＴＴＹＦＤ」（配列番号１９５）であった。本発明の方法をこの重鎖ＣＤＲ１クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトＶＨ−３  ＣＤＲ１  ＵＡＬおよびヒトＶＨ−１  ＣＤＲ１  ＵＡＬと比較することにより、それぞれ、「Ｓ／Ｎ−Ｓ／Ｎ／Ｄ／Ｔ−Ｙ／Ａ／Ｓ−Ｗ−Ｍ−Ｎ」（多様性２４）および「Ｔ−Ｇ−Ｙ−Ａ／Ｙ／Ｇ／Ｄ−Ｍ−Ｎ」（配列番号１９１）（多様性４）のコホートライブラリ配列を得た（図２５Ａ）。ヒトＶＨ−１  ＣＤＲ２  ＵＡＬに対して重鎖ＣＤＲ２配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が７２０のコホートライブラリ配列「Ｗ−Ｍ−Ｇ−Ｗ／Ｇ／Ｒ−Ｉ−Ｎ／Ｉ／Ｓ−Ｐ−Ｓ−Ｆ／Ｓ／Ｎ／Ｇ−Ｇ−Ｔ／Ｎ／Ｇ／Ｓ／Ｄ−Ｔ−Ｎ／Ｋ／Ｓ／Ｇ」（配列番号１９３）を得、本発明の方法による重鎖ＣＤＲ２プローブ配列とヒトＶＨ−３  ＣＤＲ２  ＵＡＬの比較により多様性が３１３６のコホートＣＤＲ２ライブラリ配列「Ｗ−Ｖ−Ｓ／Ａ−Ｖ／Ａ／Ｎ／Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｔ−Ｉ−Ｓ／Ｋ／Ｗ／Ｎ−Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｑ／Ｗ／Ｎ／Ｆ−Ｓ−Ｇ／Ｓ−Ｓ−Ｅ−Ｔ−Ｙ／Ｎ／Ｆ／Ｈ」（配列番号１９４）を得た。クエリー配列としてマウスＲａｐｔｉｖａ  ＭＨＭ２４重鎖ＣＤＲ３を使用し、ＶＨ  ＣＤＲ３  ＵＡＬとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリＣＤＲ３配列「Ａ−Ｒ−Ｇ−Ｉ−Ｙ−Ｇ／Ｓ／Ｔ／Ｙ／Ｄ／Ｐ／Ｉ／Ｌ／Ｖ／Ｒ−Ｙ−Ｇ−Ｔ−Ｇ／Ｙ／Ｎ／Ｐ／Ｓ／Ａ／Ｄ／Ｒ／Ｆ−Ｙ−Ｆ−Ｄ」（配列番号１９６）を得た。この重鎖ＣＤＲ３コホートライブラリは９０の多様性を有していた。
【０１９７】
マウスＲａｐｔｉｖａ  ＭＨＭ２４抗体のカッパ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、「ＳＫＹＬＡＷＹ」（配列番号１９７）、「ＬＬＩＹＳＧＳＴＬＱ」（配列番号２００）、および「ＱＱＨＮＥＹＰＬ」（配列番号２０３）であった。本発明の方法をこのカッパ鎖ＣＤＲ１クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトＶＫ−１  ＣＤＲ１  ＵＡＬおよびＶＫ−３  ＣＤＲ１  ＵＡＬと比較することにより、それぞれ、「Ｓ−Ｋ−Ｙ−Ｌ−Ａ−Ｗ−Ｙ」（配列番号１９８）（多様性なし）および「Ｓ−Ｓ／Ｎ／Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ａ−Ｗ−Ｙ」（配列番号１９９）（多様性３）のコホートライブラリ配列を得た（図２５Ｂ）。ヒトＶＫ−１  ＣＤＲ２  ＵＡＬに対してカッパ鎖ＣＤＲ２配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が１のコホートライブラリ配列「Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ｓ−Ａ−Ｓ−Ｔ−Ｌ−Ｑ」（配列番号２０１）を得、本発明の方法によるカッパ鎖ＣＤＲ２プローブ配列とヒトＶＫ−３  ＣＤＲ２  ＵＡＬの比較により多様性が４のコホートＣＤＲ２ライブラリ配列「Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ｇ／Ｄ−Ｔ／Ａ−Ｓ−Ｔ−Ｒ−Ａ」（配列番号２０２）を得た。クエリー配列としてマウスＲａｐｔｉｖａ  ＭＨＭ２４カッパ鎖ＣＤＲ３を使用し、ＶＫ  ＣＤＲ３  ＵＡＬとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリＣＤＲ３配列「Ｑ−Ｑ−Ｙ／Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｒ−Ｎ−Ｓ／Ｎ／Ｔ／Ｈ／Ｑ／Ｇ−Ｙ−Ｐ−Ｌ」（配列番号２０４）を得た。このカッパ鎖ＣＤＲ３ライブラリは３０の多様性を有していた。
【０１９８】
ここでも、様々なコホートＣＤＲライブラリからの最終的なコホート抗体（またはそのフラグメント、例えばＦａｂ、ｓｃＦｖ等）ライブラリの作製は、コホートＣＤＲライブラリ配列の相互の独立組み合わせを通じて、本発明の方法によって同定したコホートＣＤＲライブラリから重鎖および軽鎖の両方ならびに完全抗体（またはそのフラグメント）を構築することによって行った。このようなコホートＣＤＲライブラリ配列の独立組み合わせにより、マウスＲａｐｔｉｖａ  ＭＨＭ２４抗体クエリー配列を用いて作製されたコホートライブラリについて表１６に示されるような構成鎖および抗体全体のコホートライブラリの多様性を得た。
【０１９９】
【表１４】
0005791496.tif 000015
【０２００】
本発明の方法を通じて評価した他の抗体と同様、これらの抗体ライブラリの中で最も多様性のあるものですら、現在利用可能な方法を用いて容易にディスプレイおよび／またはスクリーニングできるサイズ（例えば、実質的に約１０12未満の多様性）のものであった。
【０２０１】
実施例１７
プローブＣＤＲドメインからのマウスオボアルブミンコホート抗体ライブラリの同定および作製
マウスオボアルブミン抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、「ＴＤＹＮＭＤ」（配列番号２０５）、「ＷＩＧＤＩＮＰＳＮＧＹＴＩ」（配列番号２０９）、および「ＡＲＳＧＹＧＳＲＨＰＰＧＦＡ」（配列番号２１２）であった。本発明の方法をこの重鎖ＣＤＲ１クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトＶＨ−３  ＣＤＲ１  ＵＡＬおよびヒトＶＨ−１  ＣＤＲ１  ＵＡＬと比較することにより、それぞれ、「Ｓ／Ｎ−Ｄ−Ｙ−Ａ／Ｇ／Ｗ／Ｙ−Ｍ−Ｓ／Ｈ／Ｎ」（多様性２４）および「Ｔ−Ｄ−Ｙ−Ａ／Ｙ／Ｇ／Ｄ−Ｍ−Ｈ／Ｓ／Ｎ」（配列番号５８５）（多様性１２）のコホートライブラリ配列を得た（図２６Ａ）。ヒトＶＨ−１  ＣＤＲ２  ＵＡＬに対して重鎖ＣＤＲ２配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が６０のコホートライブラリ配列「Ｗ−Ｍ−Ｇ−Ｗ／Ｇ／Ｒ−Ｉ−Ｎ−Ｐ−Ｓ−Ｎ−Ｇ−Ｔ／Ｎ／Ｇ／Ｓ／Ｄ−Ｔ−Ｎ／Ｋ／Ｓ／Ｇ」（配列番号２１０）を得、本発明の方法による重鎖ＣＤＲ２プローブ配列とヒトＶＨ−３  ＣＤＲ２  ＵＡＬの比較により多様性が２３５２のコホートＣＤＲ２ライブラリ配列「Ｗ−Ｖ−Ｓ／Ａ−Ｖ／Ａ／Ｎ／Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｔ−Ｉ−Ｎ−Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｑ／Ｗ／Ｎ／Ｆ−Ｓ−Ｇ／Ｓ−Ｇ−Ｙ−Ｔ−Ｙ／Ｎ／Ｆ／Ｈ」（配列番号２１１）を得た。クエリー配列としてオボアルブミン重鎖ＣＤＲ３を使用し、ＶＨ  ＣＤＲ３  ＵＡＬとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリＣＤＲ３配列「Ａ−Ｒ−Ｓ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｓ−Ｎ／Ｄ／Ａ／Ｖ／Ｌ／Ｙ／Ｔ／Ｓ／Ｇ−Ｖ／Ｉ／Ｅ／Ｐ／Ｌ／Ｔ／Ａ／Ｙ／Ｓ／Ｇ−Ｐ−Ｔ／Ａ／Ｗ／Ｄ／Ｒ／Ｎ／Ｓ／Ｇ／Ｙ−Ｇ−Ｆ−Ａ」（配列番号２１３）を得た。この重鎖ＣＤＲ３コホートライブラリは８１０の多様性を有していた。
【０２０２】
オボアルブミン抗体のカッパ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、「ＤＳＹＧＮＳＦＭＨＷＹ」（配列番号５８６）、「ＬＬＩＹＬＡＳＮＬＥ」（配列番号５８７）、および「ＱＱＮＩＥＤＰＦ」（配列番号５８８）であった。抗オボアルブミンＣＤＲ１は１１個のアミノ酸を有するので、挿入分析（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ）またはフレームワークが一致する生殖細胞系ＣＤＲ配列（ＣＤＲ１については「ＳＮＹＬＡＷＦ」（５８９））の使用のいずれかを行った。従って、ＶＫ−１  ＣＤＲ１については本発明の方法によりコホート配列または多様性情報を生成しなかった。本発明の方法をこのカッパ鎖ＣＤＲ１クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトＶＫ−３  ＣＤＲ１  ＵＡＬと比較することにより、「Ｓ／Ｎ−Ｓ−Ｓ／Ｎ／Ｔ−Ｙ−Ｌ−Ａ−Ｗ−Ｙ」（配列番号２１５）（多様性６）のコホートライブラリ配列を得た（図２６Ｂ）。ヒトＶＫ−１  ＣＤＲ２  ＵＡＬに対してカッパ鎖ＣＤＲ２配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が２のコホートライブラリ配列「Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ｇ−Ａ−Ｓ−Ｎ−Ｌ−Ｑ／Ｅ」（配列番号２１７）を得、本発明の方法によるカッパ鎖ＣＤＲ２プローブ配列とヒトＶＫ−３  ＣＤＲ２  ＵＡＬの比較により多様性が２のコホートＣＤＲ２ライブラリ配列「Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ｇ−Ａ／Ｔ−Ｓ−Ｎ−Ｒ−Ａ」（配列番号２１８）を得た。クエリー配列としてオボアルブミン抗体のカッパ鎖ＣＤＲ３を使用し、ＶＫ  ＣＤＲ３  ＵＡＬとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリＣＤＲ３配列「Ｑ−Ｑ−Ｙ−Ｇ−Ｓ／Ｎ／Ｔ／Ｈ／Ｑ／Ｇ−Ｓ−Ｐ−Ｙ」（配列番号２２０）を得た。このカッパ鎖ＣＤＲ３ライブラリは６の多様性を有していた。
【０２０３】
ここでも、様々なコホートＣＤＲライブラリからの最終的なコホート抗体（またはそのフラグメント、例えばＦａｂ、ｓｃＦｖ等）ライブラリの作製は、コホートＣＤＲライブラリ配列の相互の独立組み合わせを通じて、本発明の方法によって同定したコホートＣＤＲライブラリから重鎖および軽鎖の両方ならびに完全抗体（またはそのフラグメント）を構築することによって行った。このようなコホートＣＤＲライブラリ配列の独立組み合わせにより、オボアルブミン抗体クエリー配列を用いて作製されたコホートライブラリについて表１７に示されるような構成鎖および抗体全体のコホートライブラリの多様性を得た。
【０２０４】
【表１５】
0005791496.tif 000016
【０２０５】
本発明の方法を通じて評価した他の抗体と同様、これらの抗体ライブラリの中で最も多様性のあるものですら、現在利用可能な方法を用いて容易にディスプレイおよび／またはスクリーニングできるサイズ（例えば、実質的に約１０12未満の多様性）のものであった。
【０２０６】
実施例１８
マウスプローブＣＤＲドメインからのヒトＴＮＦ−αコホート抗体ライブラリの同定および作製
マウスＴＮＦ−αモノクローナル抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、「ＴＨＹＧＭＮ」（配列番号２２１）、「ＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴ」（配列番号２２４）、および「ＡＲＥＲＧＤＡＭＤ」（配列番号２２７）であった。本発明の方法をこの重鎖ＣＤＲ１クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトＶＨ−３  ＣＤＲ１  ＵＡＬおよびヒトＶＨ−１  ＣＤＲ１  ＵＡＬと比較することにより、それぞれ、「Ｓ／Ｎ−Ｓ／Ｎ／Ｄ／Ｔ−Ｙ−Ｇ−Ｍ−Ｎ」（配列番号２２２）（多様性８）および「Ｔ−Ｓ／Ｇ／Ｎ／Ｄ−Ｙ−Ｇ−Ｍ−Ｎ」（配列番号２２３）（多様性４）のコホートライブラリ配列を得た（図２７Ａ）。ヒトＶＨ−１  ＣＤＲ２  ＵＡＬに対して重鎖ＣＤＲ２配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が３２０のコホートライブラリ配列「Ｗ−Ｍ−Ｇ−Ｗ−Ｉ−Ｎ−Ｐ／Ａ−Ｙ−Ｆ／Ｓ／Ｎ／Ｇ−Ｇ−Ｔ／Ｎ／Ｇ／Ｓ／Ｄ−Ｔ／Ａ−Ｎ／Ｋ／Ｓ／Ｇ」（配列番号２２５）を得、本発明の方法による重鎖ＣＤＲ２プローブ配列とヒトＶＨ−３  ＣＤＲ２  ＵＡＬの比較により多様性が７０５６のコホートＣＤＲ２ライブラリ配列「Ｗ−Ｖ−Ｓ／Ａ−Ｖ／Ａ／Ｎ／Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｔ−Ｉ−Ｎ−Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｑ／Ｗ／Ｎ／Ｆ−Ｄ／Ｓ／Ｎ−Ｇ／Ｓ−Ｇ−Ｅ−Ｔ／Ｋ／Ｉ−Ｙ／Ｎ／Ｆ／Ｈ」（配列番号２２６）を得た。クエリー配列としてマウスＴＮＦ−α重鎖ＣＤＲ３を使用し、ＶＨ  ＣＤＲ３  ＵＡＬとのアラインメントを行うことにより、同一の（多様性のない）コホートライブラリＣＤＲ３配列「Ａ−Ｒ−Ｅ−Ｒ−Ｇ−Ｄ−Ａ−Ｍ−Ｄ」（配列番号２２８）を得た。
【０２０７】
マウスＴＮＦ−α抗体のカッパ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、「ＳＮＤＶＶＷＹ」（配列番号２２９）、「ＭＬＭＹＳＡＦＮＲＹ」（配列番号２３２）、および「ＱＱＤＹＮＳＰＲ」（配列番号２３５）であった。本発明の方法をこのカッパ鎖ＣＤＲ１クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトＶＫ−１  ＣＤＲ１  ＵＡＬおよびＶＫ−３  ＣＤＲ１  ＵＡＬと比較することにより、それぞれ、「Ｓ−Ｎ−Ｄ−Ｌ−Ａ／Ｎ−Ｗ−Ｙ」（配列番号２３０）（多様性２）および「Ｓ−Ｎ−Ｎ／Ｙ−Ｌ−Ａ−Ｗ−Ｙ」（配列番号２３１）（多様性２）のコホートライブラリ配列を得た（図２７Ｂ）。ヒトＶＫ−１  ＣＤＲ２  ＵＡＬに対してカッパ鎖ＣＤＲ２配列をクエリーするのに本発明を適用することにより、多様性が４のコホートライブラリ配列「Ｌ／Ｒ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ｓ−Ａ−Ｓ−Ｎ−Ｌ−Ｑ／Ｅ」（配列番号２３３）を得、本発明の方法によるカッパ鎖ＣＤＲ２プローブ配列とヒトＶＫ−３  ＣＤＲ２  ＵＡＬの比較により多様性が２のコホートＣＤＲ２ライブラリ配列「Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ｇ／Ｄ−Ａ−Ｓ−Ｎ−Ｒ−Ａ」（配列番号２３４）を得た。クエリー配列としてマウスＴＮＦ−αのカッパ鎖ＣＤＲ３を使用し、ＶＫ  ＣＤＲ３  ＵＡＬとのアラインメントを行うことにより、コホートライブラリＣＤＲ３配列「Ｑ−Ｑ−Ｙ／Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｒ−Ｙ−Ｎ−Ｓ−Ｐ−Ｒ」（配列番号２３６）を得た。このカッパ鎖ＣＤＲ３ライブラリは５の多様性を有していた。
【０２０８】
ここでも、様々なコホートＣＤＲライブラリからの最終的なコホート抗体（またはそのフラグメント、例えばＦａｂ、ｓｃＦｖ等）ライブラリの作製は、コホートＣＤＲライブラリ配列の相互の独立組み合わせを通じて、本発明の方法によって同定したコホートＣＤＲライブラリから重鎖および軽鎖の両方ならびに完全抗体（またはそのフラグメント）を構築することによって行った。このようなコホートＣＤＲライブラリ配列の独立組み合わせにより、マウスＴＮＦ−α抗体クエリー配列を用いて作製されたコホートライブラリについて表１８に示されるような構成鎖および抗体全体のコホートライブラリの多様性を得た。
【０２０９】
【表１６】
0005791496.tif 000017
【０２１０】
本発明の方法を通じて評価した他の抗体と同様、これらの抗体ライブラリの中で最も多様性のあるものですら、現在利用可能な方法を用いて容易にディスプレイおよび／またはスクリーニングできるサイズ（例えば、実質的に約１０12未満の多様性）のものであった。
【０２１１】
実施例１９
コホート配列ライブラリの生成における類似基準の使用
本発明の方法は、コホート抗体ライブラリ配列の生成中、ＣＤＲ配列内の一つまたはそれ以上の残基の位置で異なる選択基準を適用することができる。（マウス抗ＨＩＶ  ｇｐ４１モノクローナル抗体４１−Ｓ−２−Ｌの触媒性の三つ組残基について）上記の実施例５に記載されるように、クエリーＣＤＲ配列の特定残基を「固定」し、従って参照ライブラリのその残基の位置に存在するアミノ酸使用に関わらずコホートライブラリ配列に組み込む場合がある。本発明の方法はさらに、コホート抗体配列の選択の際に、ＣＤＲ配列の一つまたはそれ以上の残基の位置において類似性に基づく（同一性に基づくのとは対照的な）基準を適用し得る。大部分の実施態様における、類似基準（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｃｒｉｔｅｒｉａ）と同一基準（ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｃｒｉｔｅｒｉａ）の違いは以下の点に要約され得る：同一基準の場合、参照ライブラリの同じ位置においても見られるクエリーＣＤＲ配列の残基は固定され（同一のアミノ酸が得られるコホートライブラリ配列に現れる）、対応位置と一致しない残基は、参照ライブラリのその位置の全てのアミノ酸構成要素で置換されるが；それとは対照的に、類似基準の場合、参照ライブラリの同じ位置においても見られるクエリーＣＤＲ配列の残基はこちらでも固定されるが、対応位置と一致しない残基は、参照ライブラリの構成要素のアミノ酸がクエリー配列のその残基と「類似する」ことが見出された場合、参照ライブラリのその位置のアミノ酸残基のサブセットと置換され得る（そのような類似性が認められない残基の位置については参照ライブラリの全ての残基がその位置に導入される）。
【０２１２】
本実施例においては、天然に存在するアミノ酸を、側鎖化学に基づき以下の７つの類似クラスに分類した（このクラスは図２８でも表として示されている）。
小型の側鎖：グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）
求核性：セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）、ヒスチジン（Ｈ）
疎水性：バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、プロリン（Ｐ）
芳香族：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）
酸性：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）
アミド：アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）
塩基性：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）
【０２１３】
類似基準と同一基準の違いを、両方の基準をマウス４Ｈ６抗ＤＲ４抗体に並列で適用することによって説明する。マウス４Ｈ６抗ＤＲ４モノクローナル抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列は、それぞれ、「ＴＳＹＧＶＨ」（配列番号２３７）、「ＷＬＧＶＩＷＡＶＧＳＴＮ」（配列番号２４０）、および「ＡＲＥＧＥＦＤＹＹＧＳＳＬＬＳＹＨＳＭＮ」（配列番号２４３）であった。類似基準を用いる本発明の方法をこの重鎖ＣＤＲ１クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトＶＨ４＿１−１  ＣＤＲ１  ＵＡＬと比較することにより、コホートライブラリ配列「Ｔ−Ｓ−Ｙ−Ｙ／Ｆ／Ｓ−Ｗ−Ｓ／Ｔ」（配列番号２３８）（多様性６）を得た（図２９）。他方、同じＣＤＲ１クエリー配列を同一基準の下で用いる本発明の方法を使用することによっては、コホートライブラリ配列「Ｔ−Ｓ−Ｙ−Ｙ／Ｆ／Ｓ−Ｗ−Ｓ／Ｔ／Ｎ」（配列番号２３９）（多様性）を得た。従って、類似基準の使用は、コホートライブラリ配列のＣＤＲ１の最後の位置におけるアスパラギンの合理的な排除を実現した（ヒスチジンは参照ライブラリの構成要素であるセリンおよびスレオニンと類似するものとみなされるがアスパラギンと類似であるとはみなされないため）。ヒトＶＨ４＿１−１  ＣＤＲ２  ＵＡＬに対して重鎖ＣＤＲ２配列をクエリーするのに類似基準を用いる本発明を適用することにより、多様性が１６のコホートライブラリ配列「Ｗ−Ｉ−Ｇ−Ｅ／Ｙ−Ｉ−Ｙ−Ｈ／Ｑ／Ｙ／Ｄ−Ｓ／Ｒ−Ｇ−Ｓ−Ｔ−Ｎ」（配列番号２４１）を得、同一性基準の並列適用によっては、多様性が６４のコホートライブラリ配列「Ｗ−Ｉ−Ｇ−Ｅ／Ｙ−Ｉ−Ｎ／Ｙ／Ｓ／Ｄ−Ｈ／Ｑ／Ｙ／Ｄ−Ｓ／Ｒ−Ｇ−Ｓ−Ｔ−Ｎ」（配列番号２４２）を得た。ヒトＶＨ  ＵＡＬに対して重鎖ＣＤＲ３配列をクエリーするのに類似基準を使用することにより、多様性が２のコホートライブラリ配列「Ａ−Ｒ−Ｅ−Ｇ−Ｄ−Ｆ−Ｄ−Ｙ−Ｆ−Ｇ−Ｓ−Ｓ−Ｖ−Ｉ−Ｓ−Ｙ−Ｓ−Ｓ−Ｍ−Ｄ／Ｇ」（配列番号２４４）を得、同一基準によっては、多様性が７９,２００のコホートライブラリ配列「Ａ−Ｒ−Ｅ−Ｇ−Ｙ／Ｐ／Ｇ／Ｄ／Ｌ／Ｒ／Ｔ／Ｈ／Ｓ−Ｆ−Ｄ−Ｙ−Ｓ／Ｇ／Ｎ／Ｄ／Ｅ／Ｖ／Ｔ／Ａ／Ｆ／Ｉ／Ｌ−Ｇ−Ｓ−Ｓ−Ｙ／Ｓ／Ｇ／Ｖ／Ｔ／Ｄ／Ｐ／Ｗ／Ａ／Ｃ−Ｔ／Ｇ／Ｒ／Ｓ／Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｉ−Ｓ−Ｙ−Ｙ／Ｄ／Ｔ／Ｓ−Ｓ−Ｍ−Ｄ／Ｇ」（配列番号２４５）を得た。従って、類似基準を用いて得られるコホートライブラリの総重鎖多様性は１９２であり、並列で同一基準を使用して設計された得られるコホートライブラリの総多様性は４５,６１９,２００であった。従って、類似基準の使用により、２００,０００倍を超える総多様性の減少が合理的に生じた。
【０２１４】
類似基準および同一基準の比較的適用を、マウス抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ４．６．１の重鎖および軽鎖のＣＤＲ配列についても行った。マウスＡ４．６．１抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列は、それぞれ、「ＴＮＹＧＭＮ」（配列番号１３）、「ＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴ」（配列番号１６）、および「ＡＫＹＰＨＹＹＧＳＳＨＷＹＦＤ」（配列番号１９）であった。類似基準または同一基準を用いる本発明の方法をこの重鎖ＣＤＲ１クエリー配列と共に使用し、クエリー配列をヒトＶＨ１  ＵＡＬと比較することにより、コホートライブラリ配列「Ｔ−Ｎ−Ｙ−Ｇ−Ｍ−Ｎ」（配列番号１４）（多様性１）を得た（図３０Ａ）。類似基準を用いて同じクエリー配列とヒトＶＨ３  ＵＡＬを比較することにより、多様性が１のコホートライブラリ配列「Ｓ−Ｎ−Ｙ−Ｇ−Ｍ−Ｎ」（配列番号２４６）を得、同一基準を用いる同じ比較によっては、多様性が２のコホートライブラリ配列「Ｓ／Ｎ−Ｎ−Ｙ−Ｇ−Ｍ−Ｎ」（配列番号１５）を得た。重鎖ＣＤＲ２に対して類似基準を用いる本発明の方法を適用し、ＶH１およびＶH３参照ライブラリと比較することにより、それぞれ、コホート抗体ライブラリ配列「Ｗ−Ｍ−Ｇ−Ｗ−Ｉ−Ｎ−Ｐ／Ａ−Ｙ−Ｓ−Ｇ−Ｄ−Ｔ／Ａ−Ｓ」（配列番号２４７）（多様性４）および「Ｗ−Ｖ−Ａ−Ｙ−Ｉ−Ｎ−Ｓ−Ｄ／Ｓ／Ｎ−Ｓ−Ｇ−Ｅ−Ｉ−Ｈ」（配列番号２４８）（多様性３）を得た（図３０Ｂ）。重鎖ＣＤＲ２に対して同一基準を用いる本発明の方法を並列適用し、ＶH１およびＶH３参照ライブラリと比較することにより、それぞれ、コホート抗体ライブラリ配列「Ｗ−Ｍ−Ｇ−Ｗ−Ｉ−Ｎ−Ｐ／Ａ−Ｙ−Ｆ／Ｓ／Ｎ／Ｇ−Ｇ−Ｔ／Ｎ／Ｇ／Ｓ／Ｄ−Ｔ／Ａ−Ｎ／Ｋ／Ｓ／Ｇ」（配列番号１７）（多様性３２０）および「Ｗ−Ｖ−Ｓ／Ａ−Ｖ／Ａ／Ｎ／Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｔ−Ｉ−Ｎ−Ｇ／Ｙ／Ｓ／Ｑ／Ｗ／Ｎ／Ｆ−Ｄ／Ｓ／Ｎ−Ｇ／Ｓ−Ｇ−Ｅ−Ｔ／Ｋ／Ｉ−Ｙ／Ｎ／Ｆ／Ｈ」（配列番号１８）（多様性７０５６）を得た。ＶH  ＣＤＲ３  ＵＡＬとの比較において、重鎖ＣＤＲ３に対して類似基準および同一基準を用いる本発明の方法を適用することにより、多様性が８の同一のコホートライブラリ配列「Ａ−Ｋ−Ｇ／Ｄ／Ｅ／Ｒ／Ａ／Ｈ／Ｖ／Ｔ−Ｐ−Ｈ−Ｙ−Ｙ−Ｇ−Ｓ−Ｓ−Ｈ−Ｗ−Ｙ−Ｆ−Ｄ」（配列番号２０）を得た（図３０Ｃ）。
【０２１５】
マウスＡ４．６．１抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列は、それぞれ、「ＳＮＹＬＮＷＹ」（配列番号２１）、「ＶＬＩＹＦＴＳＳＬＨ」（配列番号２３）、および「ＱＱＹＳＴＶＰＷ」（配列番号２６）であった。軽鎖ＣＤＲ１の比較により、類似基準を使用したか同一基準を使用したかによらず、軽鎖ＣＤＲ１クエリー配列とＶLκ１およびＶLκ３  ＣＤＲ１  ＵＡＬの比較についてそれぞれ、コホートライブラリ「Ｓ−Ｎ−Ｙ−Ｌ−Ｎ−Ｗ−Ｙ」（配列番号２２）（多様性１）および「Ｓ−Ｎ−Ｙ−Ｌ−Ａ−Ｗ−Ｙ」（配列番号２４９）（多様性１）を得た（図３０Ｄ）。クエリー軽鎖ＣＤＲ１配列をＶLλ３  ＣＤＲ１  ＵＡＬと比較した場合、類似基準によってはコホートライブラリ「Ｓ−Ｋ／Ｑ／Ｙ／Ｅ−Ｙ−Ｖ−Ｈ／Ｙ／Ｓ／Ｃ−Ｗ−Ｙ」（配列番号２５０）（多様性１６）が得られ、同一基準によってはコホートライブラリ「Ｓ−Ｋ／Ｑ／Ｙ／Ｅ−Ｙ−Ａ／Ｖ−Ｈ／Ｙ／Ｓ／Ｃ−Ｗ−Ｙ」（配列番号２５１）（多様性３２）が得られた。類似基準および同一基準の下での軽鎖ＣＤＲ２とＶLκ１  ＣＤＲ２  ＵＡＬとの比較によっては、それぞれ、コホートライブラリ「Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ａ／Ｄ／Ｋ／Ｇ／Ｓ−Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｑ／Ｅ」（配列番号２５２）（多様性１０）および「Ｌ／Ｒ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ａ／Ｄ／Ｋ／Ｇ／Ｓ−Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｑ／Ｅ」（配列番号２４）（多様性２０）が得られた（図３０Ｅ）。類似基準および同一基準の両方の下での軽鎖ＣＤＲ２とＶLκ３およびＶLλ３  ＣＤＲ２参照ライブラリとの比較によっては、それぞれ、コホートライブラリ配列「Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ｇ／Ｄ−Ｔ−Ｓ−Ｓ−Ｒ−Ａ」（配列番号２５３）（多様性２）および「Ｌ−Ｖ−Ｉ−Ｙ−Ｄ／Ｑ／Ｅ／Ｋ−Ｄ／Ｋ−Ｓ−Ｋ／Ｄ／Ｅ／Ｎ−Ｒ−Ｐ」（配列番号２５４）（多様性４０）が得られた。軽鎖ＣＤＲ３については、類似基準および多様性基準を用いてクエリー配列とＶLκ  ＣＤＲ３参照ライブラリを比較することにより、それぞれ、コホートライブラリ配列「Ｑ−Ｑ−Ｙ−Ｓ−Ｔ−Ｌ−Ｐ−Ｗ」（配列番号２５６）（多様性１）および「Ｑ−Ｑ−Ｙ−Ｓ−Ｔ−Ｙ／Ｔ／Ｓ／Ｌ／Ｗ／Ｆ−Ｐ−Ｗ」（配列番号２７）（多様性６）を得た。類似基準および多様性基準を用いてＣＤＲ３クエリー配列とＶLλ  ＣＤＲ３参照ライブラリを比較することによっては、それぞれ、コホートライブラリ配列「Ｑ−Ｓ／Ａ／Ｔ／Ｉ／Ｌ−Ｙ−Ｄ／Ｙ／Ｈ／Ａ−Ｓ−Ｓ／Ｇ／Ｎ／Ｄ−Ｉ／Ｌ−Ｗ」（配列番号２５７）（多様性１６０）および「Ｑ−Ｓ／Ａ／Ｔ／Ｉ／Ｌ−Ｙ−Ｄ／Ｙ／Ｈ／Ａ−Ｓ／Ｇ／Ｎ／Ｒ−Ｓ／Ｇ／Ｎ／Ｄ−Ｔ／Ａ／Ｎ／Ｉ／Ｓ／Ｌ／Ｇ−Ｗ」（多様性２２４０）を得た（図３０Ｆ）。同一基準および類似基準の下でのコホートライブラリ配列の総多様性の値を図３０Ｇおよび以下の表１９にまとめた。
【０２１６】
【表１７】
0005791496.tif 000018
【０２１７】
上記の類似基準を適用すれば、任意の個々の残基の位置においてクエリー配列と参照ライブラリ配列の間で同一一致（ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｍａｔｃｈ）が見出されない場合にのみ、一つまたはそれ以上の類似の残基がコホートライブラリ配列に組み込まれるが、類似基準はまた、クエリー配列と参照ライブラリ配列の間に同一性が存在する位置にも適用できる。このような適用では、参照ライブラリが同一一致および一つまたはそれ以上の類似の残基の両方を含む場合のクエリー配列の残基は、その位置に同一残基および一つまたはそれ以上のそのような類似残基を含むコホート配列を生成する。従って、この「全類似（ａｌｌ  ｓｉｍｉｌａｒ）」基準の適用は、コホートライブラリの多様性を合理的な様式で拡張するために使用され得、これは、上記の標準的な類似基準を使用した場合よりも大きな総多様性レベルを達成し、おそらくは同一基準のみを用いて達成される多様性よりもずっと大きな合理的に得られる総多様性をもたらす。本発明の一要素として「全類似」基準を用いる効果を、同一の上記抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体（Ａ４．６．１）に対して同一基準、類似基準、および「全類似」基準を適用することによって検証した。重鎖ＣＤＲ１配列「ＴＮＹＧＭＮ」（配列番号１３）に「全類似」基準を適用し、クエリー配列とＶH１参照ライブラリの間で比較を行った場合、「Ｔ／Ｓ−Ｎ−Ｙ−Ｇ−Ｍ−Ｎ」（配列番号２５９）（多様性２）のコホートライブラリ配列を得た（図３１Ａ）。つまり、クエリー配列と参照ライブラリの最初の残基（Ｔ）においては完全一致する残基が存在するが、「全類似」基準は、得られるＣＤＲ１コホートライブラリ配列の最初の位置においてＴまたは類似のアミノ酸であるＳのいずれかを使用した。重鎖ＣＤＲ１クエリー配列とＶH３  ＣＤＲ１参照ライブラリの比較において「全類似」基準を使用することで、コホートライブラリ配列「Ｓ−Ｎ−Ｙ−Ｇ／Ａ−Ｍ−Ｎ」（配列番号２６１）を得た。Ａ４．６．１の重鎖ＣＤＲ２の配列は「ＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴ」（配列番号１６）であった。
「全類似」基準を用いる本発明の方法を用いて、このクエリーＣＤＲ２配列をＶH１およびＶH３  ＣＤＲ２参照ライブラリと比較することにより、それぞれ、コホートライブラリ配列「Ｗ−Ｍ−Ｇ−Ｗ−Ｉ−Ｎ−Ｐ／Ａ−Ｙ−Ｓ−Ｇ−Ｄ−Ｔ／Ａ−Ｓ」（配列番号２６３）（多様性４）および「Ｗ−Ｖ−Ａ−Ｙ−Ｉ−Ｎ−Ｓ−Ｄ／Ｓ／Ｎ−Ｓ−Ｇ−Ｅ／Ｄ−Ｉ−Ｈ」（配列番号２６５）（多様性６）を得た（図３１Ｂ）。「全類似」基準の下で、重鎖ＣＤＲ３クエリー配列「ＡＫＹＰＨＹＹＧＳＳＨＷＹＦＤ」（配列番号１９）をＶH  ＣＤＲ３参照ライブラリと比較することで、コホートライブラリ配列「Ａ−Ｒ／Ｋ−Ｇ／Ｄ／Ｅ／Ｒ／Ａ／Ｈ／Ｖ／Ｔ−Ｐ／Ｖ／Ｌ−Ｓ／Ｔ／Ｈ−Ｙ／Ｆ−Ｙ／Ｗ−Ｇ／Ａ−Ｓ／Ｔ−Ｓ／Ｔ−Ｓ／Ｈ−Ｙ／Ｗ−Ｙ／Ｗ−Ｆ−Ｄ」（多様性３６,８６４；図３１Ｃ）を得た。
【０２１８】
Ａ４．６．１軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列（それぞれ「ＳＮＹＬＮＷＹ」（配列番号２１）、「ＶＬＩＹＦＴＳＳＬＨ」（配列番号２３）、および「ＱＱＹＳＴＶＰＷ」（配列番号２６））に対して「全類似」基準を適用することで、以下のコホートライブラリ配列を得た：ＣＤＲ１クエリー配列とＶLκ１、ＶLκ３、およびＶLλ３参照ライブラリとの比較においては、それぞれ、「Ｓ−Ｎ−Ｙ／Ｗ−Ｌ−Ｎ−Ｗ−Ｙ」（配列番号２６９）（多様性２）、「Ｓ−Ｎ−Ｙ−Ｌ−Ａ−Ｗ−Ｙ」（配列番号２７１）（多様性１）、および「Ｓ／Ｔ−Ｋ／Ｑ／Ｙ／Ｅ−Ｙ／Ｆ−Ｖ−Ｈ／Ｙ／Ｓ／Ｃ−Ｗ−Ｙ」（多様性６４）（図３１Ｄ）；ＣＤＲ２クエリー配列とＶLκ１、ＶLκ３、およびＶLλ３参照ライブラリとの比較においては、それぞれ、「Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ａ／Ｄ／Ｋ／Ｇ／Ｓ−Ａ−Ｓ−Ｓ／Ｔ−Ｌ−Ｑ／Ｅ」（配列番号２７５）（多様性２０）、「Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｙ−Ｇ／Ｄ−Ｔ−Ｓ−Ｓ／Ｔ−Ｒ−Ａ」（配列番号２７７）（多様性４）、および「Ｌ−Ｖ−Ｉ／Ｖ−Ｙ−Ｄ／Ｑ／Ｅ／Ｋ／Ｇ−Ｄ／Ｋ−Ｓ／Ｔ−Ｋ／Ｄ／Ｅ／Ｎ−Ｒ−Ｐ」（配列番号２８０）（多様性１６０）（図３１Ｅ）；ならびにＣＤＲ３クエリー配列とＶLκおよびＶLλ参照ライブラリとの比較においては、それぞれ、「Ｑ−Ｑ−Ｙ−Ｓ／Ｔ−Ｓ／Ｔ／Ｈ−Ｌ−Ｐ−Ｙ／Ｗ／Ｆ」（配列番号２８１）（多様性１８）および「Ｑ−Ｓ／Ａ／Ｔ／Ｉ／Ｌ−Ｗ／Ｙ−Ｈ−Ｓ−Ｓ／Ｇ／Ｎ／Ｄ−Ｉ／Ｌ−Ｗ」（配列番号２８３）（多様性８０）（図３１Ｆ）。これまでに考察した抗体配列の場合と同様、様々なコホートＣＤＲライブラリからの最終的なコホート抗体（またはそのフラグメント、例えばＦａｂ、ｓｃＦｖ等）ライブラリの作製は、コホートＣＤＲライブラリ配列の相互の独立組み合わせを通じて、本発明の方法によって同定したコホートＣＤＲライブラリから重鎖および軽鎖の両方ならびに完全抗体（またはそのフラグメント）を構築することによって行った。表２０は、マウスＡ４．６．１モノクローナル抗体のＣＤＲ配列に対して同一基準、類似基準、または「全類似」基準を適用することにより得られた本発明のコホートライブラリおよび抗体についての多様性のデータを要約したものである。
【０２１９】
【表１８】
0005791496.tif 000019
【０２２０】
実施例２０
コホート抗体ライブラリの遺伝子操作方法
本実施例においては、遺伝子操作技術を用いてコホート抗体ライブラリを作製および構築する工程を記載する。
ｓｃＦｖ型は、ひとつにつながった機能的抗原結合単位（ＶH領域およびＶL領域）からなる。簡単に説明すると、抗体のＶLフラグメントおよびＶHフラグメントを標準的な分子生物学的技術を用いてクローニングした。その可変領域のフレームワークおよびＣＤＲをコードするオリゴヌクレオチドを、シングルオーバーラップポリメラーゼ連鎖反応（ＳＯＥ−ＰＣＲ）によって構築した。次いで、別々のＶLフラグメントおよびＶHフラグメントをポリ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー（典型的にはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号５９０）で連結して単鎖抗体（ｓｃＦｖ）を作製した。次いで、発現ディスプレイベクターへのクローニングを容易にする制限部位を含む５’および３’隣接プライマーを用いて全長分子を増幅した。生成されたライブラリの総多様性は、フレームワーク配列の数および変異誘発、例えばＷＴＭを用いる変異誘発のために選択されたＣＤＲの位置の数に依存した。
【０２２１】
典型的には、完全参照ユニバーサル抗体参照ライブラリの合成においては、ＶHライブラリの平均多様性は、９アミノ酸を用いてＷＴＭTMを行った場合、３．５×１０6（６フレームワーク×９アミノ酸×（ＣＤＲ１についての２2×ＣＤＲ２についての２6×１３アミノ酸ＣＤＲ３についての２8））であった。ＶHライブラリの多様性は上限であり、ＶλライブラリおよびＶκライブラリの多様性はそれよりも有意に小さく、従ってそれらを合わせた完全ｓｃＦｖライブラリの多様性は、細菌系の形質転換効率の範囲内である１０10〜１０11に収まった。
【０２２２】
従って、参照ユニバーサル抗体ライブラリの作製においては、Ｎ末端およびＣ末端にそれぞれＨｉｓおよびＭｙｃ免疫タグをコードする２オリゴヌクレオチドに沿って様々なＶH、Ｖλ、およびＶκライブラリのフレームワーク（図６２Ａ〜６２Ｅを参照のこと）を
含む、９０のオリゴヌクレオチドを合成した（図３３）。さらに、この三つのライブラリの各々のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３において多様性を表す３０〜６０の縮重オリゴヌクレオチドのサブセットを合成した（合計９０〜１８０）。これらのオリゴヌクレオチドをＳＯＥ−ＰＣＲ法によって構築し、必要なＶH−ＶλおよびＶH−Ｖκの組み合わせを含むライブラリを作製した。次いで、配列の検証およびライブラリの品質の評価のために、各々のライブラリからランダムクローンを選択した。
【０２２３】
本発明のコホートＣＤＲおよび抗体ライブラリの合成は、ＵＡＬについて記載したのと同じプロセスによって行った。コホート抗体ライブラリの合成は、このようなコホートライブラリが参照ライブラリよりも低い多様性を有し、従ってコホートライブラリの作製は参照ライブラリよりも簡単であり、多く場合は必要なオリゴヌクレオチドがより少ないという付加的な利点を明らかにした。各々の標的抗体コホートライブラリの作製のために、野生型抗体のサブファミリーのメンバーであるＶLおよびＶHのＣＤＲ１、２、および３の配列のオリゴヌクレオチドのセットを合成した（図６２Ｇ〜Ｈ）。これらのＶH、ＶL、およびＣＤＲオリゴヌクレオチドもまた、ＳＯＥ−ＰＣＲによって構築し、ベースとなるｓｃＦｖ変異誘発テンプレートとして必要なＶH−ＶLの初期の組み合わせを作製した。ポジティブコントロールとしての出発点となる野生型抗体の作製は、本質的に同様の様式で行った。ＳＯＥ−ＰＣＲオリゴヌクレオチド（図６２Ｇ〜Ｉ）によりコードおよび構築された抗ＶＥＧＦ  Ａ４．６．１フレームワークおよびＣＤＲアミノ酸については図３４および３５を参照のこと。
【０２２４】
ＶLおよびＶHのＣＤＲ１、２、および３への終止コドンの導入（以下および図６２Ｇ〜Ｉ等を参照のこと）は、コホートライブラリのスクリーニング効率を上げるのに使用した野生型変異誘発テンプレートのさらなる特徴であった。例えば、ＶH  ＣＤＲ１  Ｈ１ｅ
＿１＿ＶＥＧＦ終止コドンオリゴヌクレオチドは、以下に示す通り、野生型配列の対応するＣＤＲの位置において、チロシンおよびグリシン（ＴＡＣ ＧＧＧ）残基の代わりに二つのインフレーム終止コドン（ＴＡＡ ＴＡＡ）を含んだ。
【化１】
0005791496.tif 000020
【０２２５】
インフレーム終止コドンを使用することで、非変異型ＶLおよびＶH、ＣＤＲテンプレートが十分に翻訳されず、および／または細菌細胞膜周辺腔に運搬されない。従って、その後のＦＡＣＳを機能的なｓｃＦｖのみに限定することにより、野生型ｓｃＦｖへの抗原の結合のバックグラウンドシグナル対ノイズのレベルを最小化させた。
【０２２６】
ＣＤＲの多様性に関して、抗体のＣＤＲループ内の小さな摂動（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ）（例えば一つのループごとに一つの変化）を調査するため、ＬＴＭを使用した。さらなる改善のために、ＣＤＲ内に二以上の置換の導入を可能にするＷＴＭをその後使用して、ＣＤＲの化学的背景（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ）を徹底的にスクリーニングした。ＷＴＭを用いて、野生型のアミノ酸および所望のアミノ酸変種を、オリゴヌクレオチド合成を操作することにより標的とされたＣＤＲの位置において調査した。特定位置において、あるオリゴヌクレオチドのサブセットが野生型をコードし、別のサブセットが標的の変異をコードするオリゴヌクレオチドの混合プールを合成した。ＷＴＭ手順における各合成工程において、成長させるオリゴヌクレオチド鎖を二つの塩基の一方によって伸長した。一方の塩基は野生型コドンをコードし、もう一方の塩基は所望の変異に対するコドンに属するものであった。
【０２２７】
野生型ＣＤＲと様々なＶHおよびＶLフレームワークを統合することによって、ＬＴＭおよびＷＴＭ  ＣＤＲ変異の多様性を上回る追加の多様性を生成した（以下の実施例２Ｘを参照のこと）。コホートライブラリの総多様性は、変異させたＣＤＲの位置の数および可変性プロフィールの一致に基づき置換されたアミノ酸の数の両方に基づき生成された。各々の出発テンプレートの可変性プロフィールは、その周囲のＶLおよびＶHフレームワークに依存した。
【０２２８】
実施例２１
ウォークスルー型変異誘発によるコホートＶH、Ｖλ、およびＶκ  ｓｃＦｖライブラリの作製
Ａ．  クンケル型変異誘発のためのｓｃＦｖ一本鎖テンプレートの調製
ｓｃＦｖ一本鎖ＤＮＡの調製のために、標的ｓｃＦｖ発現構築物をＰＢＳＫＩＩにクローニングした。大腸菌宿主ＣＪ２３６を、ＯＤ６００がおよそ０．２〜０．５吸光度単位（ＡＵ）に達するまで２ＹＴ／Ａｍｐ液体培地中で増殖させた。この時点で、Ｍ１３  Ｋ０７ヘルパーファージ１ｍＬを細菌培養物に加え、３７℃でのインキュベーションを継続した。３０分後、細菌およびファージ培養物を、０．２５μｇ／ｍＬウリジンを含有する大量の２ＹＴ／Ａｍｐ液体培地（３０ｍＬ）に移して一晩培養した。
翌日、培養培地を遠心分離（１０,０００×ｇで１０分間）により清澄にした後、上清を回収し、１／５量のＰＥＧ−ＮａＣｌを３０分間加えた。この混合物をさらに二回遠心分離したが、各遠心分離後に上清を廃棄して、ＰＥＧ／ファージペレットを得た。次いで、このＰＥＧ／ファージペレットをＰＢＳ（１ｍＬ）に再懸濁し、再遠心分離した（１４,０００×ｇで５分間）。その上清を回収し、次いでＤＮＡ精製カラム（ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍ１３，Ｑｉａｇｅｎ）にアプライし、一本鎖ｓｃＦｖウリジニル化ＤＮＡ（ｕｒｉｄｉｎｙｌａｔｅｄ−ＤＮＡ）を溶離させた。
【０２２９】
Ｂ．ウォークスルー型変異誘発（ＷＴＭ）用オリゴヌクレオチド
３９００オリゴシンセサイザー（Ｓｙｎｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ，Ａ）を製造元の指示書通りに使用して合成オリゴヌクレオチドを合成し、ＰＣＲまたはクンケル型変異誘発において使用する前にプライマーの質をＰＡＧＥ電気泳動により検証した。ウォークスルー型変異誘発（ＷＴＭ）用オリゴヌクレオチドをウリジニル化一本鎖テンプレートにアニールさせ、特定の位置を既定のアミノ酸で変異させるよう設計した（その全体が参照により本明細書で援用される特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２０３０６を参照のこと）。このアミノ酸置換の正確さおよび制御は、他の確率論的な変異誘発技術と異なり、複数の特定のＣＤＲ置換を実現した。
ＷＴＭを用いて、野生型のアミノ酸および所望のアミノ酸変種を、標的のＣＤＲの位置においてオリゴヌクレオチド合成を操作することにより調査した。特定位置においてあるオリゴヌクレオチドのサブセットが野生型をコードし別のサブセットが標的変異をコードするオリゴヌクレオチドの混合プールを合成した。ＷＴＭ手順における各合成工程において、成長させるオリゴヌクレオチド鎖を二つの塩基の一方によって伸長させた。一方の塩基は野生型コドンをコードし、もう一方の塩基は所望の変異コドンを挿入するよう設計されたものであった。
【０２３０】
Ｃ．Ａｖａｓｔｉｎ抗ＶＥＧＦ  ＶH  ＣＤＲブラスティング（ｂｌａｓｔｉｎｇ）由来
のＣＤＲオリゴヌクレオチドを用いた超ヒト化変異誘発
超ヒト化プロセスのために、特定のＣＤＲの位置を、それらのインビボでの頻度に基づき選択されたアミノ酸により置換した（上記実施例４および以下の結果を参照のこと）。マウス由来Ａｖａｓｔｉｎ  Ａ４．６．１から第一ヒトＶH１フレームワークへのヒト化の間に、対応する可変性プロフィール（以下の表）に基づくＣＤＲ１アミノ酸の置換は行われなかった。オリゴヌクレオチドＨ１ｅ＿１＿ＶＥＧＦ０１  ＣＤＲ１（図ＸＥ参照）は、配列５'−ＡＧＧＣＴＴＣＣＧＧＴＧＧＣＡＣＡＴＴＣ  ＡＣＣ  ＡＡＣ  ＴＡＣ  ＧＧＧ  ＡＴＧ  ＡＡＣ  ＴＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＧＧＣＡＣＣＴＧＧ−３'（配列番号５９２）からなるものであった。ＶH１  ＣＤＲ１コード配列５'−ＡＣＣ  ＡＡＣ  ＴＡＣ  ＧＧＧ  ＡＴＧ  ＡＡＣ−３'（配列番号５９３）は、その周囲のＶH１フレームワーク領域に延びる、それぞれ、ＤＮＡ配列５'−ＡＧＧＣＴＴＣＣＧＧＴＧＧＣＡＣＡＴＴＣ（配列番号５９４）およびＴＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＧＧＣＡＣＣＴＧＧ−３'（配列番号５９５）に隣接するものであった。
【０２３１】
【表１９】
0005791496.tif 000021
【０２３２】
ＣＤＲ−フレームワークのシャッフリングを繰り返すため、このヒト化ＶH１  ＣＤＲ１コード配列をまた、サブファミリー配列特異的なフレームワークの伸長部分の並置によって（サブファミリーＶH１メンバー、ＶH３、ＶH４、またはその他の）別のフレームワ
ーク下に組み込んだ。ＶH１  ＣＤＲ１コード配列は、代わりに、周囲のＶH３フレームワーク領域に伸びる上流側のＶH３−０７フレームワーク配列５'−ＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＴＴＡＣＣＴＴＣＴＣＴ（配列番号５９６）および下流側のＧＣＴＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＧＧＣＡＣＣＴ−３'（配列番号５９７）のエクステンションに隣接させることも可能であ
った。
【０２３３】
ＶH１  ＣＤＲ２  Ａｖａｓｔｉｎ  Ａ４．６．１のブラスティングの間に、１３の野生型アミノ酸のうちの５つ（Ｔ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、およびＴ）を、ＶH１  ＣＤＲ２の可変性プロフィールに基づき、ヒトの優先アミノ酸（それぞれＰ／Ａ、Ｆ／Ｓ／Ｎ／Ｔ、  Ｔ／Ｎ／Ｇ／Ｓ／Ｄ、およびＮ，Ｋ，Ｓ，Ｇ）で置換した（以下の可変性プロフィールの表における背景が白のボックスを参照のこと）。ここでは、ＣＤＲ２の野生型アミノ酸配列ＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴ（配列番号１６）は、ＶH１フレームワーク５'−ＣＡＣＣＴＧＧＴＣＡＧＧＧＣＴＴＧＧＡＧ（配列番号５９９）およびＴＡＣＧＣＴＣＡＧＡＡＡＴＴＣＣＡＧＧＧ−３'（配列番号６００）配列に隣接する、５'−ＴＴＧ  ＡＴＧ  ＧＧＡ  ＴＴＧ  ＡＴＡ  ＡＡＣ  ＣＣＡ  ＴＡＣ  ＴＴＣ  ＧＧＡ  ＡＣＡ  ＡＡＣ−３'（配列番号５９８）によってコードされた。
【０２３４】
【表２０】
0005791496.tif 000022
【０２３５】
このように、Ｐ／Ａ、Ｆ／Ｓ／Ｎ／Ｔ、Ｔ／Ｎ／Ｇ／Ｓ／Ｄ、およびＮ，Ｋ，Ｓ，ＧというこれらのＡ４．６．１  ＶH１  ＣＤＲ２のヒト化置換は、３２０の可能性のある特有の置換のバリエーションを生成させるために最低でも１２のオリゴヌクレオチドを必要とするものであった。上記の表に基づき、実施したＣＤＲ２の位置において必要とされたヒト化置換を、イタリック体の縮重塩基混在記号（Ｓは（ＣまたはＧ）であり、Ｒは（ＡまたはＧ）である）によって示す（以下のＨ１ｅ＿２＿ＶＥＧＦ０１−１２オリゴヌクレオチド配列を参照のこと）。
【０２３６】
【表２１】
0005791496.tif 000023
【０２３７】
ＶH  ＣＤＲ３については、ＣＤＲ３を免疫グロブリンＤおよびＪセグメント遺伝子の組換え接合により形成したため、その由来となるサブファミリーが存在しなかった。上記可変性プロフィール分析を用いて、長さが１５のＣＤＲ３の一つのみの位置を８つのヒト優先アミノ酸で置換した。特に、ＣＤＲ３の野生型アミノ酸配列ＡＫＹＰＨＹＹＧＳＳＨＷＹＰＤ（配列番号１９）を、配列Ａ−Ｋ−Ｇ／Ｄ／Ｅ／Ｒ／Ａ／Ｈ／Ｙ／Ｔ−Ｐ−Ｈ−Ｙ−Ｙ−Ｇ−Ｓ−Ｓ−Ｈ−Ｗ−Ｙ−Ｐ−Ｄ（配列番号２０）によりヒト化した。この場合、Ａ４．６．１  ＶH１  ＣＤＲ３ヒト化置換には、４つの縮重オリゴヌクレオチドのみが必要となった（以下のＨ１ｅ＿３＿ＶＥＧＦ０１−４配列を参照のこと）。
【０２３８】
【表２２】
0005791496.tif 000024
【０２３９】
ＣＤＲ３は、ＶH１フレームワーク５'−ＡＴＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴ（配列番号６１９）およびＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＧＣＡＣＴＣＴ−３'（配列番号６２０）配列に隣接する
【化２】
0005791496.tif 000025
によりコードされるものであった。ＣＤＲ３の縮重位置を太字の縮重塩基混在記号で示す（Ｓは（ＣまたはＧ）であり、Ｒは（ＡまたはＧ）であり、Ｗは（ＡまたはＴ）である）。
【０２４０】
Ａ４．６．１のＶH３  ＣＤＲ１およびＣＤＲ２のヒト化についての置換表およびＣＤＲコードオリゴヌクレオチドを以下に列挙する（完全なオリゴヌクレオチドのリストについては図６２Ｉ参照）。ＶH３については、４つの異なるファミリーメンバー３−３０、３−０７、３−１１、および３−２３を使用した。従って、それらの各々の出発点のＶH３変異原性ｓｃＦｖテンプレートへの正確なアニーリングのため、ＶH３：３−３０、３−０７、３−１１、および３−２３フレームワーク特異的配列を、各々の縮重ＣＤＲ１およびＣＤＲ２コード領域に隣接させた。
【０２４１】
【表２３】
0005791496.tif 000026
【０２４２】
Ｄ．Ａｖａｓｔｉｎ抗ＶＥＧＦ  ＶL  ＣＤＲのブラスティング
関連する様式で、ＶLκおよびＶLλ軽鎖における超ヒト化置換を、それら各々の可変性プロフィールから確立した。例えば、ＶLκ  ＩおよびＶLκ  ＩＩＩのファミリーメンバー、特にＶLκ−Ｌ１、ＶLκ  ＩＩＩ−Ａ２７、およびＶLκ  ＩＩＩ−Ｌ６の使用を決定した。同定された、得られた超ヒト化ＶＫ−１およびＶＫ−３の置換表を以下に示す。ＶＫ−１およびＶＫ−３の両方の場合においては、超ヒト化ＶＫ−１およびＶＫ−３置換の必要がなかった。
【０２４３】
【表２４】
0005791496.tif 000027
【０２４４】
同定された、得られたＶＫ−１およびＶＫ−３  ＣＤＲ１オリゴヌクレオチドを各々以下に示す（Ｋ１＿１＿ＶＥＧＦ０１およびＫ３＿１＿ＶＥＧＦ０１を参照のこと）。
Ｋ１＿１＿ＶＥＧＦ０１：  ５'−  ＧＣＡＧＡＧＣＴＴＣＴＣＡＧＧＧＴＡＴＣ−ＡＧＣ  ＡＡＣ  ＴＡＣ  ＣＴＧ  ＡＡＣ  ＴＴＧ  ＴＡＣ  −ＣＡＡＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＴＡＡＡＧＣ−３'（配列番号６２１）
Ｋ３＿１＿ＶＥＧＦ０１：  ５'−ＧＣＡＧＡＧＣＴＴＣＴＣＡＧＴＣＣＧＴＧ  ＡＧＣ  ＡＡＣ  ＴＡＣ  ＣＴＧ  ＧＣＣ  ＴＴＧ  ＴＡＣ  −ＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＴＣＡＧＧＣ−３'（配列番号６２２）
【０２４５】
ＶLκ  ＩおよびＶLκ  ＩＩＩ  ＣＤＲ２における超ヒト化は、以下に示すようなそれらの各々の可変性プロフィールの置換表から確立した。ＶＫ−１およびＶＫ−３の場合においては、４つのＣＤＲの位置でヒト化置換が必要であった。しかし、多様性の表は、同数の置換（４つの位置）によってであっても、作出される実際のＶＫ−１およびＶＫ−３の多様性はそれぞれ２０および２であることを実証した。このことは、同じ投入テンプレートをアラインメントに使用した場合に、異なる可変性プロフィールが異なる多様性レベルを生じるという特性を例証した。
【０２４６】
【表２５】
0005791496.tif 000028
【０２４７】
ＶＫ−１  ＣＤＲ２超ヒト化用オリゴヌクレオチドは以下の通りである（表３０、配列Ｋ１＿２＿ＶＥＧＦ０１−３を参照のこと）。ＣＤＲ２周りの５’および３’隣接フレームワーク配列は、それぞれ、５'−ＡＧＣＣＴＧＧＴＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧ−３'（配列番号６２３）および５'−ＴＣＣＧＧＣＧＴＴＣＣＴＡＧＣＡＧＡＴＴ−３'（配列番号６２４）であった。
【表２６】
0005791496.tif 000029
【０２４８】
ＶＫ−３  ＣＤＲ２における、ＣＤＲ２オリゴヌクレオチドヒト化コード配列は
【化３】
0005791496.tif 000030
であった。しかし、二つのＶＫ−３サブファミリー、特にＡ２７およびＬ６を使用したので、ＶＫ−３  ＣＤＲ２周りの５’および３’隣接フレームワーク配列における違い（太字の斜体）は、それぞれ、次の通りであった：
【化４】
0005791496.tif 000031
【０２４９】
【表２７】
0005791496.tif 000032
【０２５０】
Ｅ．ｓｃＦＶテンプレートの変異誘発
抗原結合ポケット内のヒト優先アミノ酸ＣＤＲ配列の効果を十分に調査するために、コホートライブラリには各々のｓｃＦｖの多変異型ＣＤＲが必要であった。クンケルテンプレートとして野生型標的ｓｃＦｖ遺伝子を用いて、第一のＷＴＭ−ＣＤＲライブラリテンプレートを作製した（図５９）。例として、ＣＤＲＨ３を、各々のＣＤＲＨ３  ＶH１、ＶH３、ＶH４可変性プロフィールから同定された適切なヒト優先アミノ酸で置換した。これらの第一世代ＷＴＭ−ＣＤＲＨ３  ｓｃＦＶをその後のテンプレートとして使用し、二重変異ＷＴＭ−ＣＤＲＨ１およびＷＴＭ−ＣＤＲＨ３領域のコホートライブラリを作製するために適切なＷＴＭ−ＣＤＲＨ１オリゴヌクレオチドセットとアニールさせた。次いで、この二重ＷＴＭ−ＣＤＲＨ１およびＷＴＭ−ＣＤＲＨ３ライブラリをテンプレートとして使用して、他の残りのＷＴＭ−ＣＤＲＨ２オリゴヌクレオチドを導入し、三重ＷＴＭ−ＣＤＲ  ＶHライブラリを作製した。ＶλおよびＶκのいずれかの軽鎖のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３  ＷＴＭオリゴヌクレオチドの残りを漸進的、反復的に組み合わせることによって、ＶH（ＶH１、ＶH３、ＶH４）およびＶＬ（ＶλおよびＶκ）コホートＣＤＲライブラリの複合アレイを開発した。
【０２５１】
Ｆ．ｓｃＦｖ  ＣＤＲの同時のクンケル二重、三重、四重変異
単一のＷＴＭ−ＣＤＲライブラリから二重ＷＴＭ−ＣＤＲ構築物に、その後に三重ＷＴＭ−ＣＤＲライブラリへと段階的に構築する代替法が存在する。この代替ストラテジーは、複数のオリゴヌクレオチドが同じ遺伝子構築物の異なる位置において同じｓｃＦｖテンプレートに同時にアニールできるという最近の実験的観察に基づくものである（図５８）。例えば、二つのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３  ＷＴＭオリゴヌクレオチドのセットが、三つ全てのＶH  ＣＤＲＳにアニーリングさせるための反応混合物に加え
られ得る。ＷＴＭ−ＣＤＲオリゴヌクレオチドの多重の組み込みが、５つのアニーリング反応を同時に行うのと同じレベルで起こることが観察された。
【０２５２】
一本鎖テンプレートは、三つのＷＴＭ−ＣＤＲＨ１、ＷＴＭ−ＣＤＲＨ２、およびＷＴＭ−ＣＤＲＨ３オリゴヌクレオチドの全てを組み込んだ。しかし、一ラウンドのアニーリング後に、三つのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３  ＷＴＭ修飾の全てを達成したｓｃＦｖ産物の回収率は約５０％であった。典型的には、多変異型ＣＤＲ  ｓｃＦｖの比率を高めるために、第一アニーリング反応からの反応産物を回収し、次いで同じ複数のＷＴＭ−ＣＤＲオリゴヌクレオチドで「再アニーリング」させた。この再アニーリングの後の多変異型ＣＤＲ  ｓｃＦｖの割合は、多変異型ＣＤＲを有する計７５％の集団においてさらに５０％増加した。
【０２５３】
この方法は、前の変異型テンプレートに複数のＷＴＭ−ＣＤＲオリゴヌクレオチドを再導入する能力から、「濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）」と命名した。このように、二回または三回のさらなる「濃縮」ラウンドを導入することによって、多変異型ＣＤＲ  ｓｃＦｖテンプレートの集団比率は９０％に達した。「濃縮」の一つの驚くべき側面は、複数の隣接するオリゴヌクレオチドのアニーリングが、そのオリゴヌクレオチドの末端が数塩基分重複する場合でさえも所望の置換を導入したことである。ライゲーションプロセスの間、二つのオリゴヌクレオチドの５’末端と３’末端の間のホスフェートジエステル結合は相互に直接隣接しなければ容易に形成されないと考えられていたため、これは予想外のことであった。もし重複部分があれば、一方のオリゴヌクレオチドは、他方の上で「めくれ上がる（ｒｉｄｅ  ｕｐ）」と予期されていた（図５８参照）。
【０２５４】
Ｇ．多様性を増加させるためのＶHおよびＶL  ＣＤＲのファミリー間の交配
図４２および４３は、各々のＶH１、３およびＶLκ、λの可変性プロフィールのＣＤＲマッチング後にヒト抗ＶＥＧＦ  Ａ４．６．１  ｓｃＦｖを再構築する上で利用できる、様々な可能性のあるＣＤＲの組み合わせを示す。例えば、図４２は、ヒト抗ＶＥＧＦ  ＶH１  ＣＤＲ１コホート配列が、期待されるヒトＶＥＧＦ  ＶH１  ＣＤＲ２コホート配列と（黒塗りの矢印）、次いで共通のＶＥＧＦ  ＶH１  ＣＤＲ３コホート配列と組み合わすことができることを実証する。次いで完全な抗ＶＥＧＦ  ＶH１  ＣＤＲ１、２、および３コホート配列をそれらの天然のＶH１  １−ｅフレームワーク配列との関係で発現させた。回収された抗ＶＥＧＦ  ＶH３  ＣＤＲ１、２、および３コホート配列の場合と同様、これらは、列挙された天然のＶH３  ３−０７、３−１１、３−２３、および３−３０フレームワーク配列と共に発現させることができた（図５）。
【０２５５】
抗体の多様性は、本発明の特徴的なインビトロ遺伝子学的方法に基づき増加させることができた。操作技術と合わせることで、人工ＣＤＲ−フレームワークの組み合わせを作出することができた。ＶHの場合、ＶH３  ＣＤＲをＶH１フレームワークと組み合わせることができ、その逆もまた同様であった。従って、４つの他の構造様式における抗原結合の背景を調査するため、ＶH１の個別のＣＤＲ１、２、および３の可変性プロフィール結果をＶH３  ３−０７、３−１１、３−２３、および３−３０フレームワークと組み合わせた（図４２の点線および破線）。同様に、ＶLについては、ＣＤＲ  Ｖλ１、λ２、およびλ３とＶκ１およびＶκ３の可変性プロフィールを混合および一致させた（図４３の点線および破線）。次いで、合併したＣＤＲを以下のＶLフレームワークのいずれかにおいて発現させた：Ｖλ１−１ｂ、Ｖλ２  ２ａ２、およびＶλ３  ３ｒ、３ｌとＶκ１  Ｌ１ならびにＶκ３  Ａ２７およびＬ２０（図５）。これらのＣＤＲ１およびＣＤＲ２の交配設計が、完全照合（ｏｖｅｒａｌｌ  ｃｏｌｌａｔｅｄ）ＵＡＬライブラリのサブセット（図６、７、および８）であった。コホートライブラリにおける違いは、野生型抗体のＣＤＲ３の長さに基づき一つのみのＣＤＲ３サイズが選択されたことであった。
【０２５６】
実施例２２
参照ユニバーサル抗体ライブラリの発現およびディスプレイの方法
ユニバーサル抗体ライブラリの発現およびディスプレイを実現するためのアプローチは、本発明の参照ライブラリおよびコホート抗体ライブラリのいずれにも容易に適用できる
。このようなライブラリは、天然レパートリーの多様性を増加させ、ひとたび構築されれば他の抗原について繰り返しスクリーニングすることが可能になる。
【０２５７】
ｓｃＦｖライブラリを、標準的な技術を用いてレシピエントの細菌宿主にトランスフェクションした。発現される融合ｓｃＦｖタンパク質を、蛍光標識した抗原の結合が可能な外表面の位置で発現させた。次いで、抗原に効果的に結合する適当なｓｃＦｖクローンを発現するライブラリメンバーを、ＦＡＣＳを用いて濃縮した。次いでこの細胞集団を再培養し、その後にストリンジェンシーのレベルを上げた選択に供して、高い特異性および親和性で標的を認識するクローンの小サブセットを単離した。このライブラリは、迅速な同定および検証のために、例えばＦＩＴＣ標識抗Ｍｙｃ−ｔａｇ抗体を用いるハイスループット形式ならびにＦＡＣＳ分析に容易に適合させることができた。
【０２５８】
次いで、候補クローンを単離し、プラスミド調製を行いｓｃＦｖ配列情報を獲得した。このアプローチは、この抗体のＶHおよびＶL領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）におけるアミノ酸の機能を決定および最適化するのに必要なコドンの仮説に基づく合理的な置換（ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ−ｄｒｉｖｅｎ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を実現した。次いで、比較配列分析および個々のクローンの親和性／特異性プロフィールから、どのクローンが親和性成熟を起こしたかを決定した。
【０２５９】
Ａ．  ｓｃＦｖ  ＡＰＥｘの表面発現
このスクリーニングプロセスの本質的な目的は、各細菌細胞にｓｃＦｖ融合タンパク質を発現させることであった。宿主株である大腸菌ＤＨ１２ＳTM（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎTM）を改良型ｐＡＰＥｘ１またはｐＡＫ２００  ｓｃＦｖ構築物で形質転換した。形質転換細胞を、２％グルコースおよびアンピシリンを補充したＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈに５０μｇ／ｍｌとなるよう接種し、ＯＤ600が０．１になるまで培養した。インキュベーション後、細胞の外膜を透過処理した。簡単に説明すると、細胞（２０ＯＤ600が約１ｍｌに相当）をペレット化し、０．７５Ｍスクロース／０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ８．０／１００μｇ／ｍｌ鶏卵リゾチームの氷冷溶液３５０μｌに再懸濁した。次いで、氷冷した１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ７００μｌを穏やかに加え、細胞懸濁物を氷上に１０分間静置し；次いで０．５Ｍ  ＭｇＣｌ2  ５０μｌを加え、その混合物を氷上にさらに１０分間静置した。
【０２６０】
得られた細胞を穏やかにペレット化し、室温にて４５分間、１×ＰＢＳに再懸濁した後、ＦＡＣＳによる評価を行った。次いで、ＡＲＩＡ／ＦＡＣＳｓｃａｎ  （Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）において製造元の指示書に従いＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いて細胞を分析した。抗ヒト抗ｓｃＦｖフィコエリトリン抗体を添加することによって、またはＭｙｃもしくはＨＡタグの染色によって（全てＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．）、ｓｃＦｖの周辺質での発現を決定した。
【０２６１】
ＡＰＥｘライブラリ細胞におけるｓｃＦｖのペリプラズムでの発現を確認した後の次の作業は、ｓｃＦｖ構築物がそれらの標的抗原に結合できることを検証することであった。機能的な抗原結合は、その後のコホートクローンのＦＡＣＳに必須であった。調査のため、オリジナルの野生型ｓｃＦｖを発現する大腸菌細胞を上記の通りに回収し、ビオチン、フィコエリトリン、またはＦＩＴＣ蛍光標識タンパク質のいずれかと共にインキュベートした。野生型および機能性のコホート変種は標識タンパク質に結合し、ベクターコントロール細胞と比較して高い蛍光読み取り値を生じた。以下のプロトコルは、ＶＥＧＦタンパク質のビオチン標識に使用した手順を表すが、直接的なフィコエリトリンまたはＦＩＴＣ複合体もまた可能であった。
【０２６２】
Ｂ．  コホートｓｃＦｖ抗体ライブラリの発現およびディスプレイ
本実施例においては、標的抗原に対してスクリーニングするためにコホート抗体ライブラリを発現およびディスプレイする方法を記載する。ｓｃＦｖライブラリを、標準的な技術を用いてレシピエントの細菌宿主をトランスフェクションした。簡単に説明すると、ライブラリからのｓｃＦｖ分子の発現に関して信頼性が実証されている細菌発現・ディスプレイ系を使用した。細菌細胞膜周辺腔への運搬およびディスプレイのために、ｓｃＦｖを、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかにおいて、それぞれ、ＮｌｐＡリポタンパク質またはＭ１３のファージ遺伝子３（Ｇｅｎｅ  ＩＩＩ）マイナーコートタンパク質由来の小リンカーペプチドに連結した（図３３）。大腸菌細菌は、細胞膜周辺腔を二つの膜、内膜および外膜で覆っている。ＡＰＥｘにおいては、ｓｃＦｖタンパク質を、ＮｌｐＡリポタンパク質またはＧｅｎｅ  ＩＩＩのいずれかによって内膜につなぎ、次いで外膜をリゾチームＥＤＴＡ処理によって化学的に分解して蛍光タグ標識した標的にアクセスさせた。
【０２６３】
次いで、標識抗原により効果的に結合するｓｃＦｖクローンを発現するコホートライブラリのメンバーを、ＦＡＣＳを通じて濃縮した。標的抗原は、二次抗体で直接的にまたはビオチン−ストレプトアビジン結合を通じて間接的にのいずれかで標識した。ｓｃＦｖプラスミドＤＮＡは、標準的なアルカリ溶解型のミニプレッププロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｅｃｔｉｏｎｓ  １．２５−１．２８を参照のこと）を用いて回収し、再形質転換し、次いで再培養して、その後にストリンジェンシーのレベルを上げた選択に供して、高い特異性および親和性で標的を認識するクローンの小サブセットを単離した。次いで、比較配列分析および個々のクローンの親和性／特異性プロフィールから、どのクローンが親和性成熟を起こしたかを決定した（図２３参照）。
【０２６４】
Ｃ．  ｓｃＦｃ結合タンパク質の産生および精製：ＶＥＧＦビオチン標識
生物活性を有するＶＥＧＦタンパク質は、精製形態のものが市販されている（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。ＶＥＧＦタンパク質のビオチン化は様々な方法によって行うことができる；しかし、過剰なビオチニル化は、エピトープ・抗体相互作用部位をブロックする可能性があるため望ましくない。使用したプロトコルは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ＦｌｕｏＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ｂｉｏｔｉｎ−ＸＸ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ｃａｔ＃  Ｆ−２６１０）に基づくものであった。簡単に説明すると、ストック濃度のＶＥＧＦを１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液およびビオチン−ＸＸ溶液（ＤＭＳＯ中のストック濃度のビオチン−ＸＸ）に加えた。この混合物を２５℃で１時間インキュベートした。この溶液を微量遠心分離フィルターチューブに移し、遠心分離し、ＰＢＳ溶液で繰り返し（４回）洗浄した。ビオチン化ＶＥＧＦ溶液を回収し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムで精製し、そしてタンパク質濃度をＯＤ２８０により決定した。
【０２６５】
Ｄ．  ＶＥＧＦ  ＦＩＴＣ標識
一つのＦＩＴＣ試薬のバイアルに、溶媒試薬８５０μｌを加え（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、十分に混合し、それによって得られたＦＩＴＣ溶媒試薬は１ｍｇ／ｍｌの濃度となった。次いで、ＦＩＴＣ混合物（５００μｌ）をＶＥＧＦタンパク質溶液２．５ｍｇ（２ｍｇ／ｍｌ）に加え、素早くボルテックスした。この反応混合物は、２００μｇ  ＦＩＴＣ対１ｍｇ抗体／タンパク質の接合比を提供した。このＶＥＧＦ−ＦＩＴＣを、撹拌中に自然光を遮断するためアルミホイルで覆った容器内で、室温で２時間、上下逆さにして（ｅｎｄ−ｏｖｅｒ−ｅｎｄ）混合した。ＰＢＳ緩衝液濃縮物を蒸留水で希釈し、次いでＶＥＧＦ−ＦＩＴＣ複合体を透析チューブに移して室温で一晩透析した。次いでＶＥＧＦ−ＦＩＴＣを透析チューブから取り出し、タンパク質濃度を再測定した。
【０２６６】
Ｅ．  ＡＲＩＡ−ＦＡＣＳソーティングおよびｓｃＦｖ変種ライブラリ細胞の回収
以下の方法は、コホート結合親和性変種の濃縮および単離のためにｓｃＦｖライブラリをスクリーニングするＦＡＣＳに関するものである。培養培地で培養した後、上記の透過処理した大腸菌細胞を、穏やかに回転させならが３７℃で３時間、飽和濃度（２００ｎｇ／ｍｌ）のビオチン化ＶＥＧＦと共にインキュベートした。次いで、大腸菌細胞を緩衝液で二度洗浄し、未結合のビオチン化ＶＥＧＦを除去した。次いで、ＡＲＩＡ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）において製造元の指示書に従いＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いて細胞をソーティングした。
コホート集団のフラクションを集収できるようソーティングゲートを調整した。ＶＥＧＦは親和性が強いため、ゲートをより高い蛍光シグナルに設定した。ＦＡＣＳゲーティングは、ここで、他の細胞株および関連する結合タンパク質を含む試験系において親和性の高い亜集団を８０％より多く濃縮することが実証された（図３８）。
【０２６７】
Ｆ．  コホートｓｃＦｖの回収および発現
最初のソーティング後に捕捉した大腸菌をフローサイトメーターを通じて直ちに再ソーティングした。その後、ソーティングした細胞懸濁物中のｓｃＦｖ遺伝子を再ソーティングし、回収し、３７℃で再形質転換した。次いで、変異ｓｃＦｖ遺伝子をｐＡＰＥｘ１ベクターに再クローニングし、細胞を再形質転換し、寒天プレート上、３０℃で一晩培養した。得られたクローンを、上記のように、第二ラウンドのソーティングおよび再ソーティングに供した。次いで、第二／第三ソーティングを行ったｓｃＦｖ遺伝子を、可溶型ｓｃＦｖタンパク質の産生のための発現プラスミド（ｐＢＡＤ）にサブクローニングした。
【０２６８】
Ｇ．  ＢＩＡｃｏｒｅ分析
機能性ｓｃＦｖの結合を評価し、予備的な親和性（ＫＤ＝ｋd／ｋa＝ｋoff／ｋon）を
測定するため、ＢＩＡｃｏｒｅ−２０００表面プラズモン共鳴系分析を使用した（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．Ｐｉｓｃａｔａｗｙ，ＮＪ）。リガンド、例えばＡｖａｓｔｉｎ  Ａ４．６．１抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖを、製造元の指示書（ＢＩＡｃｏｒｅ，  Ｉｎｃ）に従い、Ｎ−エチル−Ｎ'−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボ−ジイミドヒドロクロ
リド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いた共有結合カップリングによってＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサチップの表面に固定した。ブロッキング剤としてエタノールアミン溶液を注入した。
フロー分析のために、リガンドの標的、例えばＶＥＧＦを、ＢＩＡｃｏｒｅ流動緩衝液（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水ｐＨ７．０）で希釈し、等濃度、例えば０．０１０μＭの三つのアリコートにした。この標的、例えばＶＥＧＦのアリコートを、カイネティクスの測定のために、例えば２μｌ／分の流速で注入した。解離試薬を含まない流動緩衝液中での解離を観察した。次いで、結合反応のカイネティクスパラメータを、例えばＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ２．１ソフトウェアを用いて測定した。
【０２６９】
Ｈ．  大腸菌におけるｐＢＡＤの発現
コンピテントな大腸菌宿主細胞を製造元の指示書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｐＢＡＤ発現系）に従い調製した。簡単に説明すると、４０μｌ  ＬＭＧ  １９４コンピテント細胞および０．５μｌ  ｐＢＡＤ  ｓｃＦｖ構築物（およそ１μｇ  ＤＮＡ）をまとめて氷上で１５分間インキュベートした後、一分間の４２℃の熱ショックを与えた。次いで、細胞をＳＯＣ培地中、３７℃で１０分間回復させた後、ＬＢ−アンピシリンプレートにプレーティングして３７℃で一晩培養した。次の日に、単コロニーを掻き取り、ｓｃＦｖ産生に最適なＬ−アラビノース誘導濃度を最初に決定するための小スケール液体培養を行った。室温で一晩培養した後、ＯＤ600＝０．５に達した後の各クローンの複製物を、Ｌ−アラビノースの連続（１：１０）滴定（０．２％〜０．００００２％終濃度）により試験誘導した。試験培養物（１ｍｌ）を集収し、ペレット化し、１００μｌ  １×ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ、１６０ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭホウ酸、ｐＨ＝８．０）を加えて細胞を再懸濁した後、リゾチーム溶液５０μｌを加えて１時間（３７℃）置いた。遠心分離後にリゾチーム消化物の細胞上清を集収し、ＭｇＳＯ4を加えて終濃度を４０ｍＭとした。この溶液をＰＢＳで事前に平衡化したＮｉ−ＮＴＡカラムにアプライした。Ｈｉｓタグ結合型ｓｃＦｖサンプルをＰＢＳ緩衝液で二度洗浄し、２５０ｍＭイミダゾールの添加により溶離を完了した。次いで、可溶型ｓｃＦｖの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試験した。
【０２７０】
Ｉ．  大スケールの大腸菌培養物からのｓｃＦｖの精製
最適な培養条件を決定した後、大スケール（容量）の総大腸菌細胞培養ペレットを２５℃での一晩の培養後に遠心分離により集収した。次いでペレットをＰＢＳ緩衝液（０．１％  Ｔｗｅｅｎ）に再懸濁し、超音波処理を５ラウンド繰り返して（Ｖｉｒｔｉｓ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ）細菌細胞膜を溶解させて細胞質内容物を遊離させた。この懸濁物を、さらなる処理のために、最初に高速遠心分離により清澄化して上清を回収した。この上清を、ＰＢＳで事前に平衡化したＮｉ−ＮＴＡカラムにアプライした。Ｈｉｓタグ結合型ｓｃＦｖサンプルをＰＢＳ緩衝液で二度洗浄し、２５０ｍＭイミダゾールの添加により溶離を完了した。次いで、上清のｐＨを、６Ｍ  ＨＣｌにより５．５に調整した後、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ陽イオン交換カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にロードした。ｓｃＦｖを塩（ＮａＣｌ）勾配で溶離させ、ｓｃＦｖを含有するフラクションの濃度を２８０ｎｍにおける光学密度により決定し、ＰＡＧＥにより検証した。次いで、ｓｃＦｖを含有するフラクションをプールし、ＰＢＳで透析した。
【０２７１】
Ｊ．  マウスＡｖａｓｔｉｎ  Ａ４．６．１−ｓｃＦｖに結合するＶＥＧＦタンパク質のＢＩＡｃｏｒｅ分析
機能性ｓｃＦｖの結合を評価し、予備的な親和性（ＫＤ＝ｋd／ｋa＝ｋoff／ｋon）を
測定するため、ＢＩＡｃｏｒｅ−２０００表面プラズモン共鳴系分析を行った（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．  Ｐｉｓｃａｔａｗｙ，ＮＪ）。リガンド、マウスＡｖａｓｔｉｎ  Ａ４．６．１抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖを、製造元の指示書（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ）に従い、Ｎ−エチル−Ｎ'−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボ−ジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いた共有結合カップリングによってＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサチップの表面に固定した。ブロッキング剤としてエタノールアミン溶液を注入した。
フロー分析のために、ＶＥＧＦをＢＩＡｃｏｒｅ流動緩衝液（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水ｐＨ７．０）で希釈し、０．０１０μＭの濃度の三つのアリコートにした。ＶＥＧＦのアリコートを、カイネティクスの測定のために、２μｌ／分の流速で注入した。解離試薬を含まない流動緩衝液中での解離を観察した。次いで、結合反応のカイネティクスパラメータを、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ２．１ソフトウェアを用いて決定した。
図３９は、Ａ４．６．１抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖに対するＶＥＧＦの結合についてのＢＩＡｃｏｒｅ結果を示す。これらのプロットから、再構成されたＶＥＧＦは、熱変性タンパク質のネガティブコントロールとの比較におけるＲＵの増加（Ｋon）により示されるように、固定されたＡ４．６．１抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖに結合することが明らかとなった。さらに、ＲＵの増加は、アプライしたＡ４．６．１抗ＶＥＧＦ  ｓｃＦｖタンパク質の濃度に比例した。ＢＩＡｃｏｒｅプロフィールはまた、予想されたＶＥＧＦの解離プロフィールを示した。
【０２７２】
実施例２３
参照ユニバーサル抗体ライブラリ由来の候補物質のハイスループット親和性成熟を実行する方法。
この節では、ＷＴＭおよび／またはルックスルー型変異誘発（ＬＴＭ）親和性成熟を用いてコホート抗体ライブラリから候補配列を同定しこれをさらに改善するための工程の例について説明する。ルックスルー型変異誘発（ＬＴＭ）については、すでに、その全体が参考として本明細書で援用される米国特許出願１０／８７７,４６７（ＵＳ２００５０１
３６４２８として公開）に記載されている。
【０２７３】
簡単に説明すると、ユニバーサル抗体ライブラリの効力および候補抗体分子を選別しその分子の結合特性を向上させる能力を検証するために、本発明の方法に従い、市販の抗体を試験抗体とし（例えば、ＷＴＭTM／ＬＴＭTM技術を用いて）、発現させ、ディスプレイし、改良した。候補試験参照抗体の結合特性をＬＴＭ技術を用いて改善する例は、その全体が参考として本明細書で援用される米国特許出願６０／５８６,４８７に開示されている。
【０２７４】
試験抗体をｓｃＦｖ型において変異させ、次いで酵母ディスプレイを用いて発現およびディスプレイしたが、上記の任意の細菌ディスプレイ系も使用することができる。ｓｃＦｖ酵母ディスプレイライブラリのカイネティクス選択（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｓ）では、最初に細胞をビオチン化抗原で標識し、次いで大過剰の非ビオチン化抗原の存在下で時間依存的に追跡した。解離カイネティクスが遅かったクローンを、追跡期間後にＳＡ−ＰＥ標識によって同定し、高速ＦＡＣＳソーターを用いてソーティングした。野生型コントロールおよびソーティングゲート、ソーティングゲート内のライブラリおよびクローン数、ならびにソーティング後のライブラリから単離されたクローンのドットプロットを生成させた（図３８）。
【０２７５】
試験抗体ＬＴＭ分析から作表した配列データは、その親分子の親和性を１．５倍またはそれ以上増加させた２９の別個の変異からなる多様な収集を示した。これらの変異は、試験抗体の六つ全てのＣＤＲにおいて生じることが見出された。これらの変化のうちのいくつか、例えばＣＤＲ３における変化を複数単離したところ、三つの別個のＳからＫへの変化および二つのＳからＱへの変化が見出された。対照的に、いくつかのＣＤＲの位置における変化は、抗原に対する親和性を向上させることが見出されなかった。次の工程は、全ての発見されたＬＴＭ単一変異を単一ライブラリに組み合わせを含んだものであった。この工程の後に、ｓｃＦｖクローンは、ＣＤＲあたり一つ以上のＬＴＭ変異を導入することができた。一つのＣＤＲに複数の変異を導入するのに加えて、これらのｓｃＦｖクローンが、各ｓｃＦｖに一つ以上の変異型ＣＤＲを有するようにも設計した。この異なる単一のＬＴＭ変異を単一の直鎖配列に統合することを、「コンビナトリアル有用変異（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）」（ＣＢＭ）分析と命名した。このプロセスは、その全体が参考として本明細書で援用される関連する米国特許出願６０／５８５,９１８において詳述されている。全ての発見されたＬＴＭ単一変異の一つのライブラリへの組み合わせは、これらの高親和性変異体の中から改善されたアビディティを示すクローンを単離するのを容易にした。
【０２７６】
このＣＢＭライブラリの発現スクリーニングは、これらの高親和性変異体の中から相乗作用的相互作用を通じて改善されたアビディティを示すクローンを単離するのをさらに容易にした。図３６は、ＣＢＭ分析から回収された候補クローンの例を示す。さらに、図３７は、参照野生型ｓｃＦｖおよび６つの高親和性ＫoffクローンのＢＩＡｃｏｒｅ  ｓｃＦｖ結果を示す。これらのデータを、解離速度定数（ｋoff）を決定するために一つの指数関数曲線に当てはめた。これらのプロットから、参照野生型ｓｃＦｖが、六つ全てのクローンと比較して、Ｋoffが早いにもかかわらず、顕著に急な傾斜勾配を示すことが明らかとなった。
【０２７７】
上記の親和性成熟技術は、本発明の選択されたコホートライブラリに容易に適用することができる。
【０２７８】
実施例２４
バイオインフォマティクスを用いて抗体のＣＤＲについての位置的可変性プロフィール（ＶＰ）を生成させる方法
本実施例では、インビボで発現された抗体のＣＤＲについての位置的可変性プロフィール（ＶＰ）の決定について説明する。位置的可変性プロフィールは、自然界で発現された抗体の配列のアラインメントのデータセットの特定位置に存在する、異なるアミノ酸の一覧およびそれらの各々の出現頻度（集団優先性（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ））を表す（その全体が参考として本明細書で援用される米国特許出願６０／５８５,９３１（ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２４００２）を参照のこと）。ＵＡＬ  ＣＤＲ可変性プロフィールを生成させる主目的は、フレームワーク配列とＣＤＲのカノニカル構造およびそれらの可変配列をベストマッチさせて最も安定かつ機能的な構成を獲得することであった。
【０２７９】
従って、ＶＰの決定は、二つの工程、例えば工程１）：関心のある一つまたはそれ以上の規定の特性を共有するアミノ酸配列のアラインメント（のデータセット）を収集および選択してデータセットを作製する、を必要とする。典型的な目的においては、別々にアラインメントを行ったＶHまたはＶLのいずれか由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列が、初期データセットを形成した。工程２においては、対応するＶＰ結果を含むＣＤＲデータセットを獲得する上でいくつかのアプローチが利用可能であった。典型的には、工程２を実行するため、（ＣＤＲ）データセットを、各々のアラインメントを行った位置ごとにアミノ酸の可変性およびそれらの相対的な頻度について列挙した（図４）。各ＣＤＲデータセットについてのＶＰは、多様性のさらなる導入のための所定のＣＤＲの位置の所望の特性を明らかにした。
【０２８０】
工程１を実行するため、アラインメントを行った配列のＵＡＬデータベースを構築した。出発点のインプットデータベースは、すでに特徴付けおよびグループ分けがなされている配列についての従前の編集物、例えば内因的に発現された成熟抗体のＫａｂａｔデータベースから得ることができた。Ｋａｂａｔデータベースから、ヒト免疫グロブリン、特にＶＨ配列を、出発点のベースデータセットとして選択的に収集した。典型的には、各々の再構成されたヒトＶＨ配列の生殖細胞起源を、比較配列分析により決定した。この様式で、例えば発現された抗体をＶH１、ＶH２、ＶH３、ＶH４、またはＶH６等のいずれかのファミリーに帰属させた（工程１：構成鎖の選択）。対応する特定の生殖細胞の原拠を「原始サブファミリー（ｏｒｉｇｉｎａｔｉｎｇ  Ｓｕｂ−Ｆａｍｉｌｙ）」と命名した（図４の工程１）。次いで、この出発点の「ベースデータセット」内で接触点の定義（Ｃｏｎｔａｃｔ  Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）により示されるパラメータを用いてＶＨ配列における追加のＣＤＲを同定および描画することができた。ＣＤＲの設計およびそれらに含まれるアミノ酸はまた、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、または任意の他の適当な定義によっても表すことができた（図４の工程２）。
【０２８１】
出発点のヒトＶＨ配列「ベースデータセット」内にコンパイルされたＶＨ配列は、依然として大きく異なる特性を有する可能性があった。ＶＨフレームワーク配列は、特に、以下の点で変化する傾向がある：１−ファミリーのグループ化（ＶH１、ＶH２、ＶH３、ＶH４等）、２−「原始サブファミリー」（例えばＶH３  ３−０７、３−１１、３−２３、３−３０）、３−ＣＤＲの長さ、４−ＣＤＲのカノニカル構造のクラス、５−抗原特異性。「ベースデータセット」メンバーの間で配列が不均一であったため、整合性のある分析をなすプロセスには、一つまたはそれ以上の関心のある選択された特性を共有するデータセットを同定できるよう、出発点の「ベースデータセット」からさらに選択することが必要であった。これらの各々の特性を共有する構成メンバーは、そのサブグループ内での意味のある比較分析に関して「標準化された」配列セットを形成した。このプロセスを、より関係の強いより小さなデータセットが生成されるまで繰り返し、それを図４０に示す。図４１は、ＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３データベースを得るために使用した類似のプロセスを示す。
【０２８２】
ＣＤＲを以下の通りに分類した。全てのヒトＶＨ配列の非重複性の「ベースデータセット」から出発し、ＶＨ１配列を生成する配列のみをさらに選択した（図４０）。非重複性フィルタリングにより、同じ抗原に対して蓄積された重複する抗体配列を除去した。異なる抗体が同じ抗原に対して生じた場合は、これらの配列をデータベースに保持した。ＶＨ１サブグループ内で、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列を同定し、ＣＤＲ１サブグループまたはＣＤＲ２サブグループとしてさらに分類した。ＶＨファミリー内でのＣＤＲの分類において、ＣＤＲ１またはＣＤＲ２サブグループは異なる長さのＣＤＲを含むものであることに留意されたい。ＶＨ１  ＣＤＲ２は、１３アミノ酸および１５アミノ酸の両方の長さで生じた。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２については、それぞれ、６アミノ酸および１３アミノ酸の長さを選択し、それに応じて、生成したデータセットを、それぞれ、ＶＨ−１＿ＣＤＲ１＿６およびＶＨ−１＿ＣＤＲ２＿１３と命名した。
【０２８３】
よりストリンジェントなＵＡＬデータセットが必要な場合であっても、カノニカル構造に基づきグループ分けを行うことができた。例えば、ＶＨ１  ＣＤＲ２配列内で、カノニカル構造２（ＣＳ２）またはカノニカル構造（ＣＳ３）のいずれかの構造の間にフィルターをかける別のサブグループ分類を行った。カノニカル構造は、フレームワーク内の重要な位置における特徴的な残基を区別することによって規定できる。例えば、アミノ酸７１位にＶ、Ａ、Ｌ、またはＴを導入したＶＨ１  ＣＤＲ２配列はカノニカル構造２を示し、同じアミノ酸位置のＲはカノニカル構造３を意味する。これらの作業により、それぞれ、ＶＨ−１＿ＣＤＲ２＿１３＿ＣＳ２およびＶＨ−１＿ＣＤＲ２＿１３＿ＣＳ３と命名した可変性プロフィールデータセットが生成された（図６１）。同様に、ＶＨ１  ＣＤＲ１は、６アミノ酸残基の長さ要件を有するカノニカル構造１（ＣＳ１）を有するものであった。この場合、ＣＤＲ１  ＣＳ１を識別する重要なアミノ酸の特徴には、例えば２４位のＴ、Ａ、Ｖ、Ｇ、またはＳ；アミノ酸２６位のＧ；ならびに２９位のＩ、Ｆ、Ｌ、Ｖ、またはＳのいずれかが含まれた。従って、いくつかの６アミノ酸ＣＤＲ変異体は必須の特徴的な配列を有さなかったため、ＶＨ−１＿ＣＤＲ１＿６データセットはＣＳ１に属さない配列を含んでいる可能性があった。スクリーニングの後、ＶＨ１  ＣＤＲ１のカノニカルクラス１（ＣＳ１）についての可変性プロフィールを、ＶＨ−１＿ＣＤＲ１＿６＿ＣＳ１として生成した（図６０）。
【０２８４】
上記の結果は、アクセプターとして使用するために選択されたＣＤＲ１およびＣＤＲ２の両方のカノニカル構造に依存して、アミノ酸使用が「微調整（ｆｉｎｅ−ｔｕｎｅｄ）」され得ることを実証した。このような微調整は、発見される可能性が最も高い配列と特定の抗原クラスをマッチングすることによって使用された参照ライブラリの天然の多様性を複製する目的でどのアミノ酸が様々なＣＤＲアミノ酸の位置に導入しようとするかに依存すると考えられる。ＣＤＲ抗原の分類は以下の様式で行った。収集されたＣＤＲ配列メンバーは、構造的分類に基づきグループ分けできれば、抗原の特異性に基づきサブクラス化することもできた（図４０）。所定の抗原クラスについてＣＤＲ内の優先アミノ酸に相関関係が存在し、これは特定のフレームワークにおける抗原クラスの優先性について観察されたのと類似した。従って、抗原特異的な可変性プロフィールを生成するために、追加のパラメータである抗原特異性を、ＣＤＲ配列の分類の間に追加することができる。
【０２８５】
このプロセスの大きな利点は、多くの異なる「選択」または「収集」経路が使用可能であり、各々が異なるデータセット、従って異なる可変性プロフィール（ＶＰ）を生成したことである。これは、ＣＤＲ１についての可変性プロフィールを別個のＶＨ１、ＶＨ３、およびＶＨ４（図４５）のデータセットの間で比較することにより例証された。各棒グラフ下の表は、上記の「８０パーセント」パラメータに基づき利用可能なヒト化置換アミノ酸を列挙する。ＶＨ１、ＶＨ３、およびＶＨ４サブファミリーにおいて「Ｙ」は３０位で「固定」されるため、全体としてはＶＰはある程度類似するものであった。しかし、違いも観察された。ＶＨ３においては、「Ｓ」は３０位で固定できるが、ＶＨ１およびＶＨ４におけるＶＰは、「ＴおよびＳ」が３０位で置換され得ることを示した。他のＶＰの違いの例は３４位で見られた。ＶＨ４において「Ｗ」は固定されたが、ＶＨ３においては「Ｍ」が固定された。対照的に、ＶＨ１においては、「ＩおよびＭ」がコホートＣＤＲ設計に利用可能であった。
【０２８６】
これらのＣＤＲ１  ＶＰはＶＨサブファミリー間で異なるものであったため、コホートライブラリの設計は、どのＶＨフレームワークを選択したかに依存して変化させることができる。例えば、３３位のＣＤＲ１アミノ酸標的抗体がＶＨ１、ＶＨ３、またはＶＨ４の列挙されたアミノ酸のいずれとも一致しない場合、それらの各々のＶＰが代用される。従って、標的抗体ＣＤＲ１のＶＨ１への導入においては、アミノ酸Ａ、Ｙ、Ｇ、およびＤが３３位への導入において選択された。ＣＤＲ１のＶＨ３フレームワークへの導入においては、ＶＰはＡ、Ｇ、Ｗ、およびＹが使用されるべきことを示した。同様に、ＣＤＲ１のＶＨ４フレームワークへの導入においては、ＶＰはＹ、Ｆ、およびＳが３３位で置換されるべきことを示した。
【０２８７】
図４４は、コホート抗体ライブラリの生成に利用できる様々なＶＰを示す。本発明のこの実施態様においては、得られるＶＰにおいてより幅広い利用可能なアミノ酸のコレクションを収集するため、各々のＶＰをカノニカル構造に基づき事前にフィルターをかけなかった。例えば、ＶＨ−１  ＣＤＲ２の５３位のカノニカル構造２において、アミノ酸Ｉ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｌ、およびＥを、ＶＨ−１＿ＣＤＲ２＿１３＿ＣＳ２  ＶＰとして同定した（図６１）。同じ５３位のカノニカル構造３においては、ＶＨ−１＿ＣＤＲ２＿１３＿ＣＳ３のＶＰは、その代わりにＮ、Ｇ、Ｓ、およびＫを有していた。従って、カノニカル構造で分けないＶＨ−１＿ＣＤＲ２＿１３のＶＰは、Ｉ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｅ、Ｎ、Ｇ、およびＫを利用可能であった（図４６の上パネル）。「Ｌ」アミノ酸は、最初の７アミノ酸の出現頻度が「８０％」の閾値を満たしたため、ＶＰコレクションの一部にはならなかった。従って、この特別なセットは、選択された「同一」基準よりもその位置５３のコホートライブラリの多様性（従って、得られるＣＤＲ）を９倍増加させるよう機能した。
【０２８８】
対照的に、「類似」基準を使用した場合、コホートライブラリの多様性は、置換可能な、既定の（例えば脂肪族、極性等）グループにも属するアミノ酸を発見する可能性が高くなったために減少した。従って、図４６のデータベースは、長さ１３のＣＤＲ２におけるＶＨ１、ＶＨ３、およびＶＨ４の間のＶＰ配列の違いを示す。さらに幅広いＶＰプロフィールを収集するのに使用した本発明の別の実施態様は、全般的なＶＨ  ＣＤＲ２を得るためのものであった。この基本概念は、様々なＶＨ１、ＶＨ３、ＶＨ４、およびその他のサブファミリーに基づく事前分類を回避し、その代わりに長さ１３の全てのＶＨ  ＣＤＲ２配列を列挙のために単純に集めることであった。次いで、ＶＨ  ＣＤＲ２＿１３のＶＰを用いたＣＤＲのブラスティングは、ほぼ全ての可能性のある組み合わせが一つの大きなコホートライブラリにおいて生成できるために、様々なＶＨ１、ＶＨ３、およびＶＨ４コホートライブラリのＣＤＲ２交配設計を実施する必要性を排除した。
【０２８９】
全般的なＶＰの構築というこの概念は、ＶＨ  ＣＤＲ３において何が起こったのか、どこで最終的に発現されたＣＤＲ３配列が原始サブファミリーに明確に割り当てることができなかったのかであった。図４７〜５２は、長さ１０〜２０のＶＨ  ＣＤＲのＶＰ３を実証する。
【０２９０】
同じ分析を、ＶＬκおよびλに関しても行った。図５３においては、Ｖκ１とＶκ３の間の長さ７のＣＤＲ１のＶＰにおける違いを示す。図５４は、Ｖκ１とＶκ３の間の長さ１０のＣＤＲ２のＶＰを示す。図５５においては、長さ９のＣＤＲ３のＶＰをＶκおよびＶλについて得た。図５６および５７はまた、ＵＡＬデータベースから得た、より幅広い、長さ８、１０、および１１のＣＤＲ３のＶλ  ＶＰを実証する。
【０２９１】
等価物
当業者は、ありふれた実験のみを用いることで、本明細書中に記載される本発明の具体的な実施態様の多くの等価物を認識または確認することができるであろう。このような等価物は、添付の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１】
0005791496.tif 000033
【図２】
0005791496.tif 000034
【図３】
0005791496.tif 000035
【図４】
0005791496.tif 000036
【図５】
0005791496.tif 000037
【図６】
0005791496.tif 000038
【図６Ａ】
0005791496.tif 000039
【図６Ｂ】
0005791496.tif 000040
【図６Ｃ】
0005791496.tif 000041
【図６Ｄ】
0005791496.tif 000042
【図６Ｅ】
0005791496.tif 000043
【図６Ｆ】
0005791496.tif 000044
【図６Ｇ】
0005791496.tif 000045
【図７】
0005791496.tif 000046
【図７Ａ】
0005791496.tif 000047
【図７Ｂ】
0005791496.tif 000048
【図７Ｃ】
0005791496.tif 000049
【図７Ｄ】
0005791496.tif 000050
【図８】
0005791496.tif 000051
【図８Ａ】
0005791496.tif 000052
【図８Ｂ】
0005791496.tif 000053
【図８Ｃ】
0005791496.tif 000054
【図８Ｄ】
0005791496.tif 000055
【図８Ｅ】
0005791496.tif 000056
【図９Ａ】
0005791496.tif 000057
【図９Ｂ】
0005791496.tif 000058
【図１０】
0005791496.tif 000059
【図１１】
0005791496.tif 000060
【図１２】
0005791496.tif 000061
【図１３Ａ−１】
0005791496.tif 000062
【図１３Ａ−２】
0005791496.tif 000063
【図１３Ａ−３】
0005791496.tif 000064
【図１３Ａ−４】
0005791496.tif 000065
【図１３Ｂ−１】
0005791496.tif 000066
【図１３Ｂ−２】
0005791496.tif 000067
【図１３Ｂ−３】
0005791496.tif 000068
【図１４Ａ】
0005791496.tif 000069
【図１４Ｂ】
0005791496.tif 000070
【図１４Ｃ】
0005791496.tif 000071
【図１４Ｄ】
0005791496.tif 000072
【図１４Ｅ】
0005791496.tif 000073
【図１５Ａ】
0005791496.tif 000074
【図１５Ｂ】
0005791496.tif 000075
【図１５Ｃ】
0005791496.tif 000076
【図１５Ｄ】
0005791496.tif 000077
【図１６Ａ−１】
0005791496.tif 000078
【図１６Ａ−２】
0005791496.tif 000079
【図１６Ａ−３】
0005791496.tif 000080
【図１６Ａ−４】
0005791496.tif 000081
【図１６Ｂ−１】
0005791496.tif 000082
【図１６Ｂ−２】
0005791496.tif 000083
【図１６Ｂ−３】
0005791496.tif 000084
【図１７Ａ−１】
0005791496.tif 000085
【図１７Ａ−２】
0005791496.tif 000086
【図１７Ａ−３】
0005791496.tif 000087
【図１７Ａ−４】
0005791496.tif 000088
【図１７Ｂ−１】
0005791496.tif 000089
【図１７Ｂ−２】
0005791496.tif 000090
【図１７Ｂ−３】
0005791496.tif 000091
【図１８Ａ−１】
0005791496.tif 000092
【図１８Ａ−２】
0005791496.tif 000093
【図１８Ａ−３】
0005791496.tif 000094
【図１８Ａ−４】
0005791496.tif 000095
【図１８Ｂ−１】
0005791496.tif 000096
【図１８Ｂ−２】
0005791496.tif 000097
【図１８Ｂ−３】
0005791496.tif 000098
【図１９Ａ−１】
0005791496.tif 000099
【図１９Ａ−２】
0005791496.tif 000100
【図１９Ａ−３】
0005791496.tif 000101
【図１９Ａ−４】
0005791496.tif 000102
【図１９Ｂ−１】
0005791496.tif 000103
【図１９Ｂ−２】
0005791496.tif 000104
【図２０Ａ−１】
0005791496.tif 000105
【図２０Ａ−２】
0005791496.tif 000106
【図２０Ａ−３】
0005791496.tif 000107
【図２０Ａ−４】
0005791496.tif 000108
【図２０Ｂ−１】
0005791496.tif 000109
【図２０Ｂ−２】
0005791496.tif 000110
【図２０Ｂ−３】
0005791496.tif 000111
【図２１Ａ−１】
0005791496.tif 000112
【図２１Ａ−２】
0005791496.tif 000113
【図２１Ａ−３】
0005791496.tif 000114
【図２１Ａ−４】
0005791496.tif 000115
【図２１Ｂ−１】
0005791496.tif 000116
【図２１Ｂ−２】
0005791496.tif 000117
【図２１Ｂ−３】
0005791496.tif 000118
【図２２Ａ−１】
0005791496.tif 000119
【図２２Ａ−２】
0005791496.tif 000120
【図２２Ａ−３】
0005791496.tif 000121
【図２２Ｂ−１】
0005791496.tif 000122
【図２２Ｂ−２】
0005791496.tif 000123
【図２２Ｂ−３】
0005791496.tif 000124
【図２３Ａ−１】
0005791496.tif 000125
【図２３Ａ−２】
0005791496.tif 000126
【図２３Ａ−３】
0005791496.tif 000127
【図２３Ｂ−１】
0005791496.tif 000128
【図２３Ｂ−２】
0005791496.tif 000129
【図２３Ｂ−３】
0005791496.tif 000130
【図２４Ａ−１】
0005791496.tif 000131
【図２４Ａ−２】
0005791496.tif 000132
【図２４Ａ−３】
0005791496.tif 000133
【図２４Ａ−４】
0005791496.tif 000134
【図２４Ｂ−１】
0005791496.tif 000135
【図２４Ｂ−２】
0005791496.tif 000136
【図２４Ｂ−３】
0005791496.tif 000137
【図２５Ａ−１】
0005791496.tif 000138
【図２５Ａ−２】
0005791496.tif 000139
【図２５Ａ−３】
0005791496.tif 000140
【図２５Ｂ−１】
0005791496.tif 000141
【図２５Ｂ−２】
0005791496.tif 000142
【図２５Ｂ−３】
0005791496.tif 000143
【図２６Ａ−１】
0005791496.tif 000144
【図２６Ａ−２】
0005791496.tif 000145
【図２６Ａ−３】
0005791496.tif 000146
【図２６Ｂ−１】
0005791496.tif 000147
【図２６Ｂ−２】
0005791496.tif 000148
【図２７Ａ−１】
0005791496.tif 000149
【図２７Ａ−２】
0005791496.tif 000150
【図２７Ａ−３】
0005791496.tif 000151
【図２７Ｂ−１】
0005791496.tif 000152
【図２７Ｂ−２】
0005791496.tif 000153
【図２７Ｂ−３】
0005791496.tif 000154
【図２８】
0005791496.tif 000155
【図２９】
0005791496.tif 000156
【図３０Ａ】
0005791496.tif 000157
【図３０Ｂ】
0005791496.tif 000158
【図３０Ｃ】
0005791496.tif 000159
【図３０Ｄ】
0005791496.tif 000160
【図３０Ｅ】
0005791496.tif 000161
【図３０Ｆ】
0005791496.tif 000162
【図３０Ｇ】
0005791496.tif 000163
【図３１Ａ】
0005791496.tif 000164
【図３１Ｂ】
0005791496.tif 000165
【図３１Ｃ】
0005791496.tif 000166
【図３１Ｄ】
0005791496.tif 000167
【図３１Ｅ】
0005791496.tif 000168
【図３１Ｆ】
0005791496.tif 000169
【図３２】
0005791496.tif 000170
【図３３】
0005791496.tif 000171
【図３４】
0005791496.tif 000172
【図３５】
0005791496.tif 000173
【図３６】
0005791496.tif 000174
【図３７】
0005791496.tif 000175
【図３８】
0005791496.tif 000176
【図３９】
0005791496.tif 000177
【図４０】
0005791496.tif 000178
【図４１】
0005791496.tif 000179
【図４２】
0005791496.tif 000180
【図４３】
0005791496.tif 000181
【図４４】
0005791496.tif 000182
【図４４Ａ】
0005791496.tif 000183
【図４４Ｂ】
0005791496.tif 000184
【図４４Ｃ】
0005791496.tif 000185
【図４４Ｄ】
0005791496.tif 000186
【図４４Ｅ】
0005791496.tif 000187
【図４４Ｆ】
0005791496.tif 000188
【図４５Ａ】
0005791496.tif 000189
【図４５Ｂ】
0005791496.tif 000190
【図４５Ｃ】
0005791496.tif 000191
【図４６Ａ】
0005791496.tif 000192
【図４６Ｂ】
0005791496.tif 000193
【図４６Ｃ】
0005791496.tif 000194
【図４７Ａ】
0005791496.tif 000195
【図４７Ｂ】
0005791496.tif 000196
【図４８Ａ】
0005791496.tif 000197
【図４８Ｂ】
0005791496.tif 000198
【図４９Ａ】
0005791496.tif 000199
【図４９Ｂ】
0005791496.tif 000200
【図５０Ａ】
0005791496.tif 000201
【図５０Ｂ】
0005791496.tif 000202
【図５１Ａ】
0005791496.tif 000203
【図５１Ｂ】
0005791496.tif 000204
【図５２】
0005791496.tif 000205
【図５３】
0005791496.tif 000206
【図５４Ａ】
0005791496.tif 000207
【図５４Ｂ】
0005791496.tif 000208
【図５５Ａ】
0005791496.tif 000209
【図５５Ｂ】
0005791496.tif 000210
【図５６Ａ】
0005791496.tif 000211
【図５６Ｂ】
0005791496.tif 000212
【図５７】
0005791496.tif 000213
【図５８】
0005791496.tif 000214
【図５９】
0005791496.tif 000215
【図６０】
0005791496.tif 000216
【図６１】
0005791496.tif 000217
【図６２Ａ】
0005791496.tif 000218
【図６２Ｂ】
0005791496.tif 000219
【図６２Ｃ】
0005791496.tif 000220
【図６２Ｄ】
0005791496.tif 000221
【図６２Ｅ】
0005791496.tif 000222
【図６２Ｆ】
0005791496.tif 000223
【図６２Ｇ】
0005791496.tif 000224
【図６２Ｈ】
0005791496.tif 000225
【図６２Ｉ】
0005791496.tif 000226
【図６２Ｊ】
0005791496.tif 000227
【図６３】
0005791496.tif 000228
【配列表】
0005791496000001.app