(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列ＧＧＳＩＳＮＳＹＦ（配列番号１）を有するＣＤＲＨ１、
配列ＳＦＹＹＧＥＫＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号２）を有するＣＤＲＨ２、
配列ＧＰＴＭＩＲＧＶＩＤＳ（配列番号３）を有するＣＤＲＨ３、
配列ＲＡＳＱＳＶＲＳＹＬＡ（配列番号１０）を有するＣＤＲＬ１、
配列ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号１１）を有するＣＤＲＬ２、および、
配列ＱＱＲＳＮＷＰＰＴ（配列番号１２）を有するＣＤＲＬ３
を含む、ヒトＴＧＦβＲＩＩに対して特異的に結合する抗体。
【請求項２】
ＨＣＶＲアミノ酸配列：
ＱＬＱＶＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＮＳＹＦＳＷＧＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＳＦＹＹＧＥＫＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＡＴＩＳＩＤＴＳＫＳＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＰＲＧＰＴＭＩＲＧＶＩＤＳＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２５）、および、
ＬＣＶＲアミノ酸配列：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＲＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２７）、
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
配列番号３７の重鎖を含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
重鎖および軽鎖を含む請求項２に記載の抗体であって、該重鎖は配列番号：３７で示されるものであり、該軽鎖はＬＣＶＲアミノ酸配列：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＲＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号：２７）および軽鎖定常領域
からなるものである、抗体。
【請求項５】
２つの重鎖および２つの軽鎖を含む請求項２に記載の抗体であって、各重鎖は配列番号：３７のアミノ酸配列であり、各軽鎖はＬＣＶＲアミノ酸配列：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＲＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号：２７）および軽鎖定常領域
からなるものである、抗体。
【請求項６】
ヒトＴＧＦβ受容体ＩＩ（ＴＧＦβＩＩ）の細胞外ドメインに１０〜８０ｐＭのＫＤ値にて特異的に結合する、請求項１〜５のいずれか一項記載の抗体。
【請求項７】
ＴＧＦβにより誘導されるＳｍａｄ２リン酸化反応を４．５〜２５．５ｎＭのＩＣ５０値にて阻害する、請求項１〜５のいずれか一項記載の抗体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体またはそのフラグメント、ならびに、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または、賦形剤を含む、癌の治療のための医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体またはそのフラグメント、ならびに、治療において同時使用、別個使用、または、連続使用のために組み合わせて処置する追加の抗癌剤を含む、癌の治療のための製剤。
【請求項１０】
癌の治療に用いる医薬の製造における請求項１〜７のいずれか一項記載の抗体またはそのフラグメントの使用であって、癌が乳癌、膵臓癌または肺癌である、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬分野におけるものであり、特に、ヒト形質転換成長因子ベータ受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）に結合する抗体、抗体を含む薬学的組成物、および、当該抗体を用いて例えば癌、線維化、および線維症を治療する方法の分野におけるものである。
【背景技術】
【０００２】
ＴＧＦβは、細胞増殖および分化、運動性、細胞外マトリックス生成、および免疫機能を制御する多面サイトカインである。ＴＧＦβは、３つの哺乳動物アイソフォーム（ＴＧＦβ−１、ＴＧＦβ−２およびＴＧＦβ−３）を有し、それぞれがインビボにおける異なる機能を有する。３つ全てのＴＧＦβは、同一の受容体シグナル伝達系を使用する。ＴＧＦβＲＩＩに対するＴＧＦβの結合は、Ｓｍａｄ２のリン酸化反応および遺伝子発現を調節するための活性化Ｓｍａｄ２／Ｓｍａｄ４複合体の核転座を導く、ＴＧＦβシグナル伝達経路の活性化の開始において重要な段階である。
【０００３】
高い親和性（８．０６×１０−１０および１．９１×１０−９ＭのＫＤ）にてヒトＴＧＦβＲＩＩに結合して腎疾患および組織線維化を治療するヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が、特許文献１に開示されている。当該特許文献１はまた、ｍＡｂがケラチノサイトのＴＧＦβ誘導増殖を抑制すること（ＩＣ５０の平均値は、２．１７〜３．８９μｇ／ｍｌ、３．１７〜４．９５μｇ／ｍｌ、および３．２１〜５．０７μｇ／ｍｌ）を開示している。ＴＧＦβＲＩＩに対する完全ヒトモノクローナル抗体の使用が、ラット抗Ｔｈｙ−１腎炎において細胞外マトリックスの沈着物を減少するのに効果的であることが報告されていた（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４―１２１００１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｋａｓｕｇａ，Ｈ．ら著、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ’ｌ、第６０巻、１７４５−１７５５（２００１年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これまでに、高度に特異的であり高い親和性を有する抗ＴＧＦβＲＩＩ抗体に関する開示がないため必要とされている。ここで、必要とされる抗ＴＧＦβＲＩＩ抗体とは、非常に高い親和性にてヒトＴＧＦβＲＩＩの細胞外ドメインに特異的に結合し、ヒトＴＧＦβＲＩＩに対するヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３の結合をブロックし、血管形成を阻害し、腫瘍細胞増殖を抑制し、癌細胞の遊走および浸潤を阻害し、コラーゲン沈着および肝機能を低減し、Ｔ細胞のリガンド誘導制御を阻害し、または、細胞毒性薬と組み合わせて腫瘍増殖を阻害するものである。
【０００７】
本発明は、上述の必要に応える新規の単離された抗ＴＧＦβＲＩＩｍＡｂを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ＴＧＦベータＲＩＩは、哺乳動物、好ましくはヒト由来である。本発明の抗体は、以下（１）〜（６）の活動のうち一つ以上を行うことができる。（１）ヒトＴＧＦβＲＩＩの細胞外ドメインに対する高親和性結合を示すこと、（２）ＴＧＦβＲＩＩに対するＴＧＦβＲＩＩリガンド（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３）結合をブロックし、これにより、ＴＧＦβ誘導Ｓｍａｄ２リン酸化反応を阻害すること、（３）リガンド−受容体相互作用から独立してシグナル伝達下流制御機構として機能し得るＴＧＦβＲＩＩを内在化すること、（４）リガンド誘導ＴＧＦβＲＩＩシグナル伝達経路を阻害すること、（５）ＴＧＦβＲＩＩ仲介細胞活動を阻害すること、（６）インビトロおよびインビボにおいて腫瘍増殖を阻害すること。また、本発明の抗体は、より好ましくは、以下（７）〜（１１）のうち一つ以上を更に行うことができる。（７）ＴＧＦβ誘導血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）の分泌を低減させることにより血管形成を阻害すること、（８）癌細胞の遊走および浸潤を阻害すること、（９）コラーゲン沈着および肝機能を低減すること、（１０）Ｔ細胞のリガンド誘導制御を阻害して、免疫抑制効果を有するＴｒｅｇ細胞を形成すること、または、（１１）細胞毒性薬と組み合わせて腫瘍増殖を阻害すること。
【０００９】
ＴＧＦβＲＩＩ対して特異的に結合し、かつ、ＴＧＦβＲＩＩ仲介活動を中和する高親和性モノクローナル抗体は、ＴＧＦβシグナル伝達仲介疾患の治療のための治療生物因子として、特に有用である。
【００１０】
本発明の第一の態様では、室温（２０〜２５℃）において１００ｐＭ未満のＫＤにて、ヒトＴＧＦβＲＩＩの細胞外ドメインに対して特異的に結合する、単離された抗体が提供される。
【００１１】
一つの態様において、本発明の抗体は、ＥＬＩＳＡにより決定される１．０ｎＭ未満のＩＣ５０にて、ヒトＴＧＦβＲＩＩに対してヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、またはＴＧＦβ３が結合することをブロックする。
【００１２】
別の態様において、本発明の抗体は、３０ｎＭ未満のＩＣ５０にて、ＴＧＦβ誘導Ｓｍａｄ２リン酸化反応を阻害する。
【００１３】
更に別の態様において、本発明の抗体は、
ｉ）配列ＧＧＳＩＳＮＳＹＦ（配列番号１）を有するＣＤＲＨ１、配列ＳＦＹＹＧＥＫＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号２）を有するＣＤＲＨ２、配列ＧＰＴＭＩＲＧＶＩＤＳ（配列番号３）を有するＣＤＲＨ３、配列ＲＡＳＱＳＶＲＳＹＬＡ（配列番号１０）を有するＣＤＲＬ１、配列ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号１１）を有するＣＤＲＬ２、および、配列ＱＱＲＳＮＷＰＰＴ（配列番号１２）を有するＣＤＲＬ３、または、
ｉｉ）配列ＧＧＳＩＳＳＳＳＹ（配列番号７）を有するＣＤＲＨ１、配列ＳＦＹＹＳＧＩＴＹＹＳＰＳＬＫＳ（配列番号８）を有するＣＤＲＨ２、配列ＧＦＴＭＩＲＧＡＬＤＹ（配列番号９）を有するＣＤＲＨ３、配列ＲＡＳＱＳＶＲＳＦＬＡ（配列番号１６）を有するＣＤＲＬ１、配列ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号１１）を有するＣＤＲＬ２、および、配列ＱＱＲＳＮＷＰＰＴ（配列番号１２）を有するＣＤＲＬ３、
を含むＴＧＦβＲＩＩに対して特異的に結合する抗体を含む。
【００１４】
別の態様において、本発明の抗体は、
ｉ）ＨＣＶＲアミノ酸配列：ＱＬＱＶＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＮＳＹＦＳＷＧＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＳＦＹＹＧＥＫＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＡＴＩＳＩＤＴＳＫＳＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＰＲＧＰＴＭＩＲＧＶＩＤＳＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２５）、および、ＬＣＶＲアミノ酸配列：ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＲＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２７）、または、
ｉｉ）ＨＣＶＲアミノ酸配列：ＱＬＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＳＳＳＹＳＷＧＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＳＦＹＹＳＧＩＴＹＹＳＰＳＬＫＳＲＩＩＩＳＥＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＳＧＦＴＭＩＲＧＡＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３３）、および、ＬＣＶＲアミノ酸配列：ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＲＳＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号３５）、
を含む。
【００１５】
別の態様において、本発明の抗体は、
ＨＣＶＲアミノ酸配列：ＱＬＱＶＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＮＳＹＦＳＷＧＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＳＦＹＹＧＥＫＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＡＴＩＳＩＤＴＳＫＳＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＰＲＧＰＴＭＩＲＧＶＩＤＳＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２５）、および、ＬＣＶＲアミノ酸配列：ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＲＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２７）を含む。
【００１６】
別の態様において、本発明の抗体は、
ｉ）配列番号３７の重鎖および配列番号４の軽鎖、または、
ｉｉ）配列番号６の重鎖および配列番号１４の軽鎖、
を含む。
【００１７】
別の態様において、本発明の抗体は、配列番号３７の２本の重鎖および配列番号４の２本の軽鎖を含む。
【００１８】
別の態様において、本発明は、ヒトＴＧＦβＲＩＩ結合フラグメントを含む。
【００１９】
本発明の抗体のいずれも、それを必要とする患者に対して投与され得ることが理解される。したがって、本発明の一態様では、本発明の抗体またはフラグメント、ならびに、薬学的に受容可能な担体、希釈剤、または、賦形剤を含む、薬学的組成物を提供する。
【００２０】
本発明の好ましい態様において、抗体またはその機能的フラグメントは、競合抗体を用いる競合ＥＬＩＳＡアッセイにて、ＴＧＦβＲＩＩの細胞外ドメインに対する結合に対して競合し、ここで、競合抗体は、室温（２０〜２５℃）において１００ｐＭ未満のＫＤにてＴＧＦβＲＩＩと結合する。
【００２１】
本発明の別の好ましい態様において、本発明の抗体は、ＥＬＩＳＡにより決定される１．０ｎＭ未満のＩＣ５０にて、ヒトＴＧＦβＲＩＩに対してヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、またはＴＧＦβ３が結合することをブロックする。
【００２２】
本発明のｍＡｂが、肺、肝臓および腎臓の線維化または線維症の治療に使用され得ることもまた理解される。一つの態様において、治療を必要とする患者に対して有効量の本発明のｍＡｂを投与することを含む、肺、肝臓および腎臓の線維化または線維症を治療する方法を提供する。
【００２３】
本発明の一つの態様では、医薬として使用される本発明の抗体を提供する。本発明の一つの態様では、癌の治療において使用される本発明の抗体を提供する。本発明の更なる態様では、胸部、肺または脾臓における癌の治療において使用される抗体を提供する。本発明の抗体は、抗癌剤とともに癌の治療において使用され得る。本発明の別の態様では、抗体またはフラグメント、ならびに、治療において同時使用、別個使用、または、連続使用を組み合わせて処置する追加の抗癌剤を含有する製剤を提供する。
【００２４】
本発明の好ましい態様では、配列ＧＧＳＩＳＸ１ＳＸ２Ｘ３（配列番号１７）を有するＣＤＲＨ１（ここで、Ｘ１はＮまたはＳであり、Ｘ２はＹまたはＳであり、Ｘ３はＦまたはＹである）、配列ＳＦＹＹＸ１Ｘ２Ｘ３ＴＹＹＸ４ＰＳＬＫＳ（配列番号１８）を有するＣＤＲＨ２（ここで、Ｘ１はＧまたはＳであり、Ｘ２はＥまたはＧであり、Ｘ３はＫまたはＩであり、Ｘ４はＮまたはＳである）、配列ＧＸ１ＴＭＩＲＧＸ２Ｘ３ＤＸ４（配列番号４２）を有するＣＤＲＨ３（ここで、Ｘ１はＰまたはＦであり、Ｘ２はＶまたはＡであり、Ｘ３はＩまたはＬであり、Ｘ４はＳまたはＹである）、配列ＲＡＳＱＳＶＲＳＸ１ＬＡ（配列番号２０）を有するＣＤＲＬ１（ここで、Ｘ１はＹまたはＦである）、配列ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号１１）を有するＣＤＲＬ２、および、配列ＱＱＲＳＮＷＰＰＴ（配列番号１２）を有するＣＤＲＬ３を含む、ｈＴＧＦβＲＩＩの細胞外ドメインに特異的に結合する単離された抗体を提供する。
【００２５】
本発明の別の態様では、患者に対して有効量の本発明の抗体を投与することを含む、患者において癌を治療する方法を提供する。癌は、胸部、肺、または、脾臓における癌であり得る。抗体は、有効量または別の抗癌剤ともに、同時、別個または連続的に患者に対して投与され得る。抗癌剤は、シクロホスファミドであり得る。
【００２６】
本発明の別の態様では、
配列ＧＧＳＩＳＮＳＹＦ（配列番号１）を有するＣＤＲＨ１、配列ＳＦＹＹＧＥＫＴＹＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号２）を有するＣＤＲＨ２、配列ＧＰＴＭＩＲＧＶＩＤＳ（配列番号３）を有するＣＤＲＨ３、配列ＲＡＳＱＳＶＲＳＹＬＡ（配列番号１０）を有するＣＤＲＬ１、配列ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号１１）を有するＣＤＲＬ２、および、配列ＱＱＲＳＮＷＰＰＴ（配列番号１２）を有するＣＤＲＬ３、あるいは、
配列ＧＧＳＩＳＳＳＳＹ（配列番号７）を有するＣＤＲＨ１、配列ＳＦＹＹＳＧＩＴＹＹＳＰＳＬＫＳ（配列番号８）を有するＣＤＲＨ２、配列ＧＦＴＭＩＲＧＡＬＤＹ（配列番号９）を有するＣＤＲＨ３、配列ＲＡＳＱＳＶＲＳＦＬＡ（配列番号１６）を有するＣＤＲＬ１、配列ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号１１）を有するＣＤＲＬ２、および、配列ＱＱＲＳＮＷＰＰＴ（配列番号１２）有するＣＤＲＬ３、
を含むヒトＴＧＦβ受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）の細胞外ドメインに対して特異的に結合する単離された抗体、あるいは、該抗体のＴＧＦβＲＩＩ結合フラグメントを提供する。
【００２７】
本発明の別の態様では、
ＨＣＶＲアミノ酸配列：ＱＬＱＶＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＮＳＹＦＳＷＧＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＳＦＹＹＧＥＫＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＡＴＩＳＩＤＴＳＫＳＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＰＲＧＰＴＭＩＲＧＶＩＤＳＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２５）、および、ＬＣＶＲアミノ酸配列：ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＲＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号２７）、あるいは、
ＨＣＶＲアミノ酸配列：ＱＬＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＳＳＳＹＳＷＧＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＳＦＹＹＳＧＩＴＹＹＳＰＳＬＫＳＲＩＩＩＳＥＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＳＧＦＴＭＩＲＧＡＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３３）、および、ＬＣＶＲアミノ酸配列：ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＲＳＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号３５）、
を含む、本発明の抗体、あるいは、該抗体のＴＧＦβＲＩＩ結合フラグメントを含む。
【００２８】
本発明の別の態様では、配列番号３７の重鎖および配列番号４の軽鎖、あるいは、配列番号６の重鎖および配列番号１４の軽鎖を含む、本発明の抗体を含む。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
「単離された抗体」とは、（１）構成要素の混合物から部分的、実質的、または、完全に精製されており、（２）自然環境の構成要素から同定、分離、および／または回収されており、（３）モノクローナルであり、（４）同種由来の他のタンパク質が存在しなく、（５）異種由来の細胞により発現されており、または、（６）自然発生しない、抗体である。自然環境における汚染物質の構成要素は、本発明の抗体を用いる診断または治療を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク性溶質または非タンパク性溶質を含み得る。単離された抗体の例としては、アフィニティー精製された抗体、ハイブリドーマまたは他の細胞株によりインビトロで作成された抗体および、形質転換マウス由来のヒト抗体が挙げられる。
【００３０】
本願明細書において使用される、用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子を意味し、当該分子は、４本のポリペプチド鎖（２本の重鎖（Ｈ）および２本の軽鎖（Ｌ））を含み、ジスルフィド結合により相互に結合されている。個々の重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲまたはＶＨとして略称される）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）を含む。個々の軽鎖は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲまたはＶＬとして略称される）および軽鎖定常領域から構成される。任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の軽鎖には、それらの定常領域のアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、２つの明らかに異なるタイプのうち一つが割り当てられ得る。カッパ軽鎖の可変領域は本願明細書においてＶＫと呼ばれる。本願明細書において用いられる、ＶＬという表現は、カッパ型軽鎖（Ｖκ）由来の可変領域およびラムダ型軽鎖（Ｖλ）由来の可変領域の両方を含むことを意図する。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）から構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域が散在される相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域を含む。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲにより構成されており、以下の順序「ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４」でアミノ末端からカルボキシ末端へ配置される。
【００３１】
「ＣＤＲＨ１」は、抗体重鎖における第１のＣＤＲ領域を意味し、「ＣＤＲＨ２」は、抗体重鎖における第２のＣＤＲ領域を意味し、「ＣＤＲＨ３」は、抗体重鎖における第３のＣＤＲ領域を意味する。「ＣＤＲＬ１」は、抗体軽鎖における第１のＣＤＲ領域を意味し、「ＣＤＲＬ２」は、抗体軽鎖における第２のＣＤＲ領域を意味し、「ＣＤＲＬ３」は、抗体軽鎖における第３のＣＤＲ領域を意味する。
【００３２】
用語「抗原結合フラグメント」は、その抗原結合領域または可変領域を含むインタクトな抗体の一部分またはフラグメントを意味する。抗体フラグメントの例としては、完全長未満の抗体を含む。例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、または単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。同様に、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、直鎖抗体、単鎖抗体、一本鎖抗体、融合タンパク質、組み換えタンパク質、および、本発明の抗原結合フラグメントにより形成または一部形成された多価または多特異的な抗体もまた、本発明により包含される。
【００３３】
本願明細書において使用される、用語「ＴＧＦベータ受容体ＩＩ」または「ＴＧＦβＲＩＩ」は、リガンドに結合する細胞表面受容体を意味し、ここでリガンドは、限定されないが、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３を含み、結果として、細胞内のシグナル伝達経路を開始させる。ヒトＴＧＦβＲＩＩは、配列番号４０のＤＮＡ配列によってコードされる膜貫通タンパク質である。
【００３４】
本発明の抗体は、ヒトＴＧＦβＲＩＩ（より具体的には、ヒトＴＧＦβＲＩＩの細胞外ドメイン）に結合し、ヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、および、ＴＧＦβ３のヒトＴＧＦβＲＩＩに対する結合をブロックする。
【００３５】
本発明の抗体はまた、当該技術分野において公知である直接変異法、親和性成熟法、ファージ提示法、または、鎖シャッフリング法により改善された結合特性を有するものも含む。本発明の抗体はＴＧＦ１、およびＴＧＦ３として呼ばれる、本発明の抗体由来の重鎖および軽鎖（完全長またはその一部のいずれか）の任意の組み合わせを含む。
【００３６】
本発明の抗体は、ＣＤＲグラフティング、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）または表面再構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）、および、鎖シャッフリングを含む（例えば、米国特許第５５６５３３２号において開示される）種々の技術を用いて本発明の追加の抗体を作成するために、テンプレートまたは親抗体として用いられ得る。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲにおいて、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例えば、インビトロにおけるランダム突然変異または部位特異的突然変異により、あるいは、インビボにおける体細胞変異により誘導された変異）によりコードされていないアミノ酸残基を含み得る。ヒト抗体は、アミノ酸残基（例えば、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされていない活性促進アミノ酸残基）で置換された少なくとも１つの位置を有し得る。また、その際に、本願明細書により提供された配列由来の更なる可変領域アミノ酸配列を生成する。
【００３７】
１つの方法において、親抗体ＣＤＲは、親抗体フレームワークに対する高い配列同一性を有するヒトフレームワークにグラフトされる。新規フレームワークの配列同一性は、一般的に、親抗体中の対応するフレームワークに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％となる。このグラフティングにより、親抗体と比較して結合親和性が減少する結果となり得る。この場合、フレームワークは、Ｑｕｅｅｎにより公開された具体的な基準に基づいて（Ｑｕｅｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，２８６９（１９９１））、特定の位置にて親フレームワークに復帰突然変異され得る。使用され得る更なる方法としては、例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）、および、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４（１９８８）が挙げられる。
【００３８】
全２０個までの代替自然発生アミノ酸が、特定の置換部位において導入され得る。本願明細書において定義されたインビトロ選択プロセスは、次いで、主張した交差反応性を有するＦａｂフラグメントについて、これらの追加の可変領域アミノ酸配列をインビトロでスクリーニングするために適切に使用され得る。このようにして、更に、本発明に従ったヒト化抗体を調製するために適切なＦａｂフラグメントが同定される。好ましくは、フレームワーク内のアミノ酸置換は、本願明細書に開示された１つまたはそれぞれのフレームワーク配列内における１、２または３箇所の位置に制限される。好ましくは、ＣＤＲ内のアミノ酸置換は、１つまたはそれぞれのＣＤＲ内において１から３箇所の位置に制限され、より好ましくは、１つまたはそれぞれのＣＤＲ内における１または２箇所のアミノ酸位置にて置換が行われる。更に好ましくは、アミノ酸置換は、重鎖可変領域のＣＤＲにおける１または２箇所のアミノ酸位置にて行われる。本願明細書に説明された抗体を親抗体として用いて、本発明に従って代替抗体を調製するためにＣＤＲおよびフレームワーク置換を組み合わせる適切な方法は、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９４：１５１−１６２により提供される。
【００３９】
用語「ＫＤ」は、特定の抗体−抗原相互作用における解離定数を意味する。これは、以下の式「ｋｏｆｆ／ｋｏｎ＝ＫＤ」により算出される。用語「ｋｏｎ」は、単位「Ｍ−１秒−１」にて測定される、正反応または複合体形成反応における結合定数または速度定数、あるいは特定の反応速度を意味する。用語「ｋｏｆｆ」は、単位「１／秒」にて測定される、抗体／抗原複合体からの抗体の解離についての解離定数またはオフ速度定数、あるいは特定の反応速度を意味する。本発明の抗体の結合親和性は多くの場合、高ｋｏｎよりももっと、低ｋｏｆｆと相関する。しかしながら、理論により限定されないが、改善されたｋｏｆｆおよびｋｏｎの両方の実施形態が包含される。より好ましい態様において、本発明の抗体は、低いｋｏｆｆ値を一般的に示す、高力価の抗体またはそのフラグメントである。
【００４０】
特定の態様において、本発明の抗体は、約１ｐＭから約２００ｐＭ、約５ｐＭから約１００ｐＭ、または、約１０ｐＭから約８０ｐＭのＫＤを有する。
【００４１】
本願明細書において用いられる用語「結合をブロックする」および「結合を阻害する」は、互換的に用いられ、サイトカイン／受容体シグナル伝達経路の生物学的機能における完全または部分的な阻害または減少をもたらす、サイトカインのその受容体に対する結合のブロック／阻害を意味する。ＴＧＦβのＴＧＦβＲＩＩに対する結合のブロック／阻害は、ＴＧＦβ活性（例えば、受容体結合、細胞増殖の阻害効果、走化性、アポトーシス、細胞内タンパク質リン酸化反応、または、シグナル伝達）における１つ以上のインビトロまたはインビボの指標の完全または部分的な阻害または減少を測定することにより評価される。ＴＧＦβのＴＧＦβＲＩＩに対する結合をブロックする能力は、本願明細書において記載されるようにＥＬＩＳＡにより測定され得る。ＴＧＦβ活性を阻害する能力は、本願明細書において記載されるように細胞（例えばヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）におけるＳｍａｄ２リン酸化反応の阻害を測定することにより評価され得る。
【００４２】
本発明の抗体は、ヒトＴＧＦβＲＩＩに対するヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、またはＴＧＦβ３の結合を、約０．０５ｎＭから約１．０ｎＭ、約０．０８ｎＭから約０．７５ｎＭ、または、約０．１０ｎＭから約０．６０ｎＭのＩＣ５０にてブロックする。
【００４３】
本発明の抗体は、インビトロブロッキングアッセイ（例えば、本願明細書に記載されるインビトロＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞ブロッキングアッセイ）において、約２．０ｎＭから約３０ｎＭ、約３．０ｎＭから約１５．０ｎＭ、または、約４．０ｎＭから約７．５ｎＭ以下のＩＣ５０にて、ＴＧＦβ誘導Ｓｍａｄ２リン酸化反応を阻害する。
【００４４】
抗体は、在来種において見出されたものとは異なるかまたは変更された糖鎖付加パターンを有し得る。当該技術分野において公知なように、糖鎖付加パターンは、抗体の配列（例えば、特定の糖鎖付加アミノ酸残基の存在または非存在）、あるいは、宿主細胞またはタンパク質が生成される生物に依存し得る。本発明の抗体は、本願明細書において開示された抗体ならびにその糖鎖付加改変体を含むことが意図される。
【００４５】
本発明はまた、本願明細書に記載された任意のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。例示的なベクターとしては、原核宿主または真核宿主（例えば細胞（哺乳動物細胞等））において複製可能なプラスミド、ファージミド、コスミド、ウイルスおよびファージ核酸または他の核酸分子が挙げられる。ベクターは、発現ベクターであり得、ここで、抗体をコードするポリヌクレオチドは、発現制御エレメントと操作可能に結合される。一般的な発現ベクターは、本発明の核酸分子における発現の制御に有用な、転写および翻訳ターミネーター、開始配列、および、プロモーターを含む。ベクターはまた、独立したターミネーター配列を含む遺伝子発現カセットを含み得、ここで、配列は、真核生物および原核生物の両方においてベクターの複製を許容するものであり、すなわち、真核系および原核系の両方についてのシャトルベクターおよび選択マーカーである。ベクターは、一般的に、形質転換宿主の選択のための表現型形質を提供する（例えば、アンピシリンまたはネオマイシン等の抗生物質に対する抵抗性を与える）マーカーを含む。
【００４６】
適切なプロモーターは、構成的プロモーターおよび誘導プロモーターを含む。代表的なプロモーターとしては、ヒトサイトメガロウイルス由来のプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ＳＶ−４０早期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、マウス乳癌腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、および、ポリヘドリンプロモーターを含む。
【００４７】
本発明はまた、本発明の核酸分子または発現ベクターを含む組み換え細胞を含む。「組換え細胞」は、非ヒト多細胞生物、または、本願発明の核酸分子またはベクターが導入される細胞または細胞集団である「宿主細胞」を意味する。本発明の宿主細胞は、真核細胞もしくは細胞株（例えば、植物、動物、脊椎動物、哺乳動物、齧歯類、マウス、霊長類、または、ヒト細胞もしくは細胞株）であり得る。
【００４８】
一つの態様において、本発明の宿主は、原核または真核であり得る。適切な原核宿主としては、例えば、大腸菌（例えば、大腸菌ＳＧ−９３６、大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌Ｘ１７７６、大腸菌Ｘ２２８２、大腸菌ＤＨＩ、および大腸菌ＭＲＣ１）、シュードモナス菌、バシラス属（例えば、枯草菌）、およびストレプトミセスが挙げられる。適切な真核細胞としては、酵母および他の菌類、昆虫細胞、植物細胞、ヒト細胞、および動物細胞が挙げられ、例えば、ハイブリドーマ株、ＣＯＳ細胞、ＮＳ０細胞およびＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞を含む。
【００４９】
本発明は、本発明の抗体をコードする１つ以上の核酸配列を発現する組換え細胞を培養し、培養培地から抗体を回収することにより抗体を生成する方法を含む。このように発現された抗体は、一般的に、発現後に精製または単離される。抗体は、当該技術分野において公知の種々の方法において単離または精製され得る。標準的な精製方法としては、クロマトグラフィー手法、電気泳動手法、免疫学的手法、沈殿手法、透析手法、濾過手法、濃縮手法、クロマト分画手法が挙げられる。当該技術分野において周知なように、種々の天然タンパク質が抗体に結合し、例えば、細菌タンパク質Ａ、ＧおよびＬが挙げられ、これらのタンパク質は、本発明において精製に利用され得る。精製は多くの場合、特定の融合パートナーにより使用可能になり得る。例えば、タンパク質は、ＧＳＴ融合が適用される場合にグルタチオン樹脂、Ｈｉｓタグが適用される場合にＮｉ＋２親和性クロマトグラフィー、またはＨｉｓタグが使用される場合に固定化抗Ｆｌａｇ抗体、を用いて精製され得る。抗体は、培養培地からそれを分離することにより精製され得る。２以上の鎖を含む抗体は、同一宿主において各鎖ともに発現されるか、または、培養培地からの回収前もしくは回収後に組み立てられるよう別個の鎖として発現されることにより、生成され得る。
【００５０】
抗体は、例えば、限定されないが、インビトロアッセイ、インビトロセルベースアッセイ、インビボアッセイ、および、選択技術を含む種々の方法を用いてスクリーニングされ得る。スクリーニングされ得る抗体の特性は、限定されないが、生物学的活性、安定性、可溶性、および、標的に対する結合親和性が挙げられる。多数の特性が、同時または別個にスクリーニングされ得る。タンパク質は、アッセイの要件に依存して、精製され得るかまたは精製され得ない。一つの態様において、スクリーニングは、抗体に結合することが知られるかそう考えられている、タンパク質分子または非タンパク質分子に対する抗体の結合についての定性的または定量的な結合アッセイである。一つの態様において、スクリーングは、標的抗原に対する結合を測定するための結合アッセイである。自動およびハイスループットのスクリーニング技術は、スクリーニング手順において使用され得る。スクリーニングは、融合タンパク質またはラベル化タンパク質の使用を適用し得る。結合アッセイは、限定されないがＥＬＩＳＡを含む、当該技術分野において公知の種々の方法を用いて実行され得る。本願明細書において用いられる「結合について競合する」とは、抗体が結合またはシグナル伝達を、当該技術分野において利用可能な技術（例えば、競合ＥＬＩＳＡまたはＢＩＡｃｏｒｅを用いるＫＤ測定）により測定される場合に、少なくとも約２０％、３０％、５０％、７０％または９０％減少させる状況を意味するが、結合を完全に除外することを意図しない。
【００５１】
結合相互作用を測定するための当該技術分野において周知である一つの装置は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から市販されているＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００機器である。
【００５２】
本発明は、本願明細書において開示された本発明の抗体、および、薬学的に受容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む薬学的組成物を含む。薬学的組成物は、他の治療成分を任意に含み得る。本願明細書において用いられる「薬学的に受容可能な担体」とは、生理学的に適合可能な、溶媒、分散媒質、コーティング、防菌防黴剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。
【００５３】
薬学的に受容可能な担体の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびに、それらの組み合わせが挙げられる。薬学的に受容可能な担体は、抗体の保存可能期間または有効性を増進する、少量の補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤またはバッファー）、ならびに、等張剤（例えば、糖、多価アルコール（例えば、マンニトールおよびソルビトール）および塩化ナトリウム）を、更に含み得る。
【００５４】
本発明の薬学的組成物は、例えば、液体、半液体、および固体の投与形態を含む種々の様式に製剤され得、例えば、液体溶液（例えば、注射可能溶液および注入可能溶液）、分散物または懸濁液、粉末、リポソームおよび座薬が挙げられる。組成物は、好ましくは、注射可能溶液または注入可能溶液の形態である。投与の好ましい様式は、非経口投与（例えば、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与）である。特に好ましい様式は、静脈内注入または静脈注射、筋肉注射、および、皮下注射である。上述の組成物は、実践者が一般的に知っている例えば製剤技術の概要を記載したＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １９９５のような常套技術にしたがって設計され得る。
【００５５】
本願明細書において記載される病気または疾患の治療のための本発明の組成物における有効量は、多くの異なる因子（例えば、投与手段、標的部位、対象の生理学的状態、対象がヒトまたは動物であるか、投与される他の医薬、および、処置が予防または治療であるか）に依存して変化する。投薬量は、安全性および有効性を最適化するために当業者に公知の所定方法を用いて漸増され得る。
【００５６】
用語「処置」、「処置する」および「治療」は、治療的処置を意味し、ここで、物体は病気または疾患に関連した望ましくない生理学的変化を遅れさせる（減少させる）。有益または所望の臨床結果としては、限定されないが、検出可能または検出不可能であっても、症状の軽減、病気または疾患の程度の縮小、病気または疾患の安定化（すなわち、病気または疾患は悪化しない）、病気または疾患の進行を遅延または減速、および、病気または疾患の（部分的または全体的な）寛解が挙げられる。「治療」はまた、処置を受けない場合に予測される生存と比較して生存を延命させることも意味しうる。治療を必要とする者は、病気または疾患を既に有している者ならびに病気または疾患を有する傾向がある者である。
【００５７】
本発明の薬学的組成物は、「治療有効量」における本発明の抗ＴＧＦβＲＩＩ抗体を含み得る。「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するために必要な用量および期間にて有効な量を意味する。抗体の治療有効量は、例えば、疾患状態、年齢、性別、個体の体重、抗体または抗体部分がもつ個体における所望の反応を引き起こす能力等の因子にしたがって変化し得る。治療有効量はまた、抗体または抗体部分の任意の毒性または有害な影響が、治療に有効な影響よりも下回る量である。
【００５８】
投与レジメンは、最適な所望の反応を提供するように調整され得る。例えば、単一ボーラスが投与され得、いくつかに分割された投与量が徐々に投与され得、または、投与量が治療状況における要件により指定されるように比例的に削減または増加され得る。投与の容易性および投与量の均一性のために投与単位形態において非経口組成物を製剤することが特に有効である。投与単位形態は、必要な薬学的担体に関連する所望の治療効果をもたらすために算出された活性化合物の所定量を含む投与量を意味する。本発明の投与単位形態についての仕様は、（ａ）活性化合物の特有な特徴および達成される特定の治療効果または予防効果と、（ｂ）個体の敏感性を治療するための活性化合物を配合する際の当該技術分野固有の限定により、決定されかつ直接的に依存する。
【００５９】
本発明の抗体の治療有効量についての例示的かつ非限定的な範囲は、０．１〜５０ｍｇ／ｋｇである。別の態様において、抗体の有効量は、３〜３５ｍｇ／ｋｇである。別の態様において、抗体の有効量は、１０〜２５ｍｇ／ｋｇである。別の態様において、抗体の有効量は、５〜２０ｍｇ／ｋｇである。別の態様において、抗体の有効量は、３〜１５ｍｇ／ｋｇである。別の態様において、抗体の有効量は、２〜１０ｍｇ／ｋｇである。別の態様において、抗体の有効量は、５〜１０ｍｇ／ｋｇである。別の態様において、抗体の有効量は、１〜１０ｍｇ／ｋｇである。投与量の値は、軽減される症状のタイプおよび重篤度により変化し得ることを留意されたい。更に、任意の特定の対象について、特定の投与レジメンが、個体のニーズおよび組成物の投与を行うかまたは管理する者の専門的判断にしたがって徐々に調整されるべきであり、また、本願明細書において記載された投与量の範囲は、例示のみであり、特許請求した組成物の実際の範囲を限定することを意図しないことが、理解される。
【００６０】
本発明の抗体は、癌の治療に用いられ得る。癌は、発生源の組織および腫瘍進行の程度により分類された疾患の大きなグループであると考えられている。癌はまた、原発腫瘍および転移性腫瘍、ならびに、難治性腫瘍または再発性腫瘍として分類され得る。難治性腫瘍は、化学療法剤のみ、抗体のみ、放射線療法のみ、または、それらを組み合わせる治療に対して、反応がないかまたは耐性がある腫瘍である。再発性腫瘍は、このような薬剤を用いる治療により阻害されたように見えるが、治療を中断してから５年後（時々１０年後以上）までに再発する腫瘍である。
【００６１】
治療され得る癌はまた、血管新生されていない腫瘍、または、実質的にまだ血管新生されていない腫瘍、ならびに、血管新生された腫瘍を含む。癌は、非固形腫瘍または固形腫瘍から構成され得る。
【００６２】
本発明の抗ＴＧＦβＲＩＩ抗体はまた、哺乳動物を疾患にかかりやすくする病理学的状態などの慢性および急性疾患または病気を含む、ＴＧＦβＲＩＩ関連疾患、病気、または、症状の治療に使用され得る。本願明細書において治療される疾患は、動脈損傷により生じる線維化、感染、関節リウマチ、糖尿病または糖尿病状態、あるいは、悪性腫瘍、細胞外マトリックスの蓄積により特徴付けられた疾患、ＴＧＦβＲＩＩシグナル伝達により生じる疾患、ＴＧＦβＲＩＩ仲介活性に起因する免疫系の抑制により生じる状態、重篤な損傷、熱傷、および病気（例えば、ウイルス感染または細菌感染）により生じる急性免疫欠損、および、ＴＧＦβＲＩＩ仲介活性に起因する多臓器全身性疾患が挙げられる。
【００６３】
ＴＧＦβは、造血幹細胞の自己再生、増殖、分化において重要な役割を担う。本発明の抗体は、幹細胞の富化および再生、ならびに、心筋梗塞後、ニューロン疾患および種々のタイプの組織再生における幹細胞ベースの治療法を促進するために使用され得る。
【００６４】
本発明の抗体は、単独で投与され得るか、または、化学療法剤、放射線療法、他のＴＧＦβＲＩＩアンタゴニスト、ＴＧＦβアンタゴニスト、抗血管形成剤、他の標的に対する抗体、および、低分子を含む、抗ヒトＴＧＦβＲＩＩ抗体以外の抗腫瘍剤と組み合わせて投与され得る。抗ＴＧＦβＲＩＩ抗体は特に、抗ＶＥＧＦ−Ａ耐性腫瘍の治療において有用である。他の抗体および／または治療を用いる抗体の投与は、同一または異なる経路を介して、同一または異なる時間にて、同時または別個に行われ得る。
【００６５】
本願明細書において説明された治療方法は、霊長類（例えば、サルおよびヒト）、ウマ、ウシ、ネコ、イヌ、ウサギならびに齧歯類（例えば、ラットおよびマウス）を含む、任意の適切な哺乳動物を治療するために使用され得る。
【００６６】
以下の実施例は、例示目的のためのみに提供されるものであって、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００６７】
物質および細胞株
ヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３は、組み換え技術により産生でき、精製できるか、または例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入できる。組み換えＴＧＦβＲＩＩ  Ｆｃ融合タンパク質（ＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ）および可溶性組み換えＴＧＦβＲＩＩアルカリホスファターゼ（ＴＧＦβＲＩＩ−ＡＰ）タンパク質は、当業者に公知の手順に従って安定にトランスフェクトされた細胞で発現でき、細胞培養上清から精製できる（Ｔｅｓｓｌｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１２４５６−１２４６１（１９９４））。
【００６８】
ヒト癌細胞株ＢＸＰＣ−３、ＰＡＮＣ−１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびマウス腫瘍細胞株ＥＭＴ６、４Ｔ１、ＣＴ２６、Ｂ１６−Ｆ１０および骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３は、アメリカ合衆国組織培養保存機関（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得ることができる。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ルシフェラーゼトランスフェクト細胞株は、Ｓｕｎｎｙｂｒｏｏｋ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅから得ることができる。細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を含有するＲＰＭＩ１６４０またはＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中で維持できる。全ての細胞は、加湿した、５％ＣＯ２雰囲気下中で３７℃にて維持できる。
【００６９】
抗ＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂの生成
抗ＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂは、ヒト免疫グロブリン形質転換マウス（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いた標準のハイブリドーマ技術（Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，ｅｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，２１１−２１３（１９９８））によって実質的に生成でき、これは、ヒト免疫グロブリンガンマ重鎖およびカッパ軽鎖を産生し、あるいはＬｅｗｉｓラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を用いても生成できる。つまり、マウスまたはラットに、完全フロイントアジュバンドを用いて乳化された組み換えヒトまたはマウスＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃタンパク質で皮下（ｓ．ｃ．）に免疫性を与える。動物は腹腔内（ｉ．ｐ．）で、不完全フロイントアジュバンド中の同じＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃタンパク質を用いて３回追加免疫する。動物がリン酸緩衝水溶液（ＰＢＳ）中に５０マイクログラム（μｇ）のＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃタンパク質の最終的な腹腔内追加免疫を受容する前に、その動物を一ヶ月の間、休ませる。脾臓細胞を、免疫を与えたマウスから採取し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ，ＭＷ：１４５０ＫＤ）を用いてＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３形質細胞腫細胞と融合させる。融合後、それらの細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）培地に再懸濁し、ハイブリドーマ細胞を作製するために、ウェル毎に２００マイクロリットルの密度で、９６ウェルプレートに分配する。
【００７０】
融合後１０日〜１２日に、ＥＬＩＳＡベースの結合およびブロッキングアッセイにおいて、ＴＧＦβＲＩＩタンパク質を用いて、培養上清の抗体産生および特異的結合活性についてハイブリドーマをスクリーニングする。特に、抗ＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂを産生するハイブリドーマを、以下の手順に従って、ヤギ抗ヒトカッパ軽鎖または抗マウスＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合抗体を用いて、ＴＧＦβＲＩＩ結合抗体の検出によってまず同定する。ヒトＴＧＦβＲＩＩ−ＦｃまたはマウスＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃを、一晩、４℃にて、９６マイクロタイタープレート上で、１００ｎｇ／ウェルでコーティングする。コーティングしたプレートを、室温で２時間、ブロッキングバッファー（５％粉乳を含む、ＰＢＳ  ０．０５％  ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）でブロッキングする。ハイブリドーマの上清または精製した抗体を２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．０５％  ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（ＥＬＩＳＡバッファー）を有するＰＢＳにおいて希釈し、ＴＧＦβＲＩＩコーティングした、９６ウェルのマイクロタイタープレートにおいて３０分インキュベートする。プレートをＥＬＩＳＡバッファーで洗浄し、ヤギ抗ヒトカッパ軽鎖または抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ複合体を用いて３０分インキュベートする。ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラ−メチルベンジジン）基質を製造者の使用説明書に従って発色現像のために用いる。４５０ナノメートル（ｎｍ）での吸光度を抗体の結合活性を定量化するために読み取る。中和抗ＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂを産生するハイブリドーマを同定するために、ＥＬＩＳＡベースのブロッキングアッセイを以下の手順に従って行う。ＴＧＦβ１，ＴＧＦβ２，またはＴＧＦβ３を、９６ウェルプレート上でウェル毎に２００ｎｇにてコーティングし、次いで、ウェルを、ブロッキングバッファーを用いてブロッキングする。ハイブリドーマの上清を、ＴＧＦβコーティングした９６ウェルのマイクロタイタープレートにおいて、１時間、ＴＧＦβＲＩＩ−ＡＰを含むＥＬＩＳＡバッファーを用いてインキュベートする。洗浄後、ＡＰのためのｐ−ニトロフェニルリン酸塩（ＰＮＰＰ）基質を、製造者の使用説明書に従って発色現像のためにウェルに加える。４０５ｎｍでの吸光度をＴＧＦβ１，ＴＧＦβ２，およびＴＧＦβ３へのＴＧＦβＲＩＩ結合を定量化するために読み取る。光学密度（ＯＤ）の値を、マイクロタイタープレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）上で読み取る。
【００７１】
陽性ハイブリドーマを、モノクローナルハイブリドーマの細胞株の作製のために、限界希釈培養により、３回サブクローニングする。
【００７２】
表１は、ｍＡｂ  ＴＧＦ１，およびＴＧＦ３の軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
【００７３】
表１  抗ヒトＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂの軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列
【表１】
0005667067.tif 000002
【００７４】
アミノ酸配列の配列番号、ならびに、ｍＡｂ  ＴＧＦ１，およびＴＧＦ３のための、ＨＣＶＲ，ＬＣＶＲ、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を以下の表２に示す。
【００７５】
表２  抗ヒトＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂのアミノ酸配列およびコードＤＮＡ配列の配列番号
【表２】
0005667067.tif 000003
【００７６】
ヒトＩｇＧ１抗ヒトＴＧＦβ受容体ＩＩ抗体の操作および発現
抗ＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂの重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡ配列を、発現ベクターにクローニングするためにＰＣＲにより増幅できる。重鎖の可変領域を、ベクターｐＥＥ６．１（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｐｌｃ，Ｓｌｏｕｇｈ，Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ，ＵＫ）において、ヒト免疫グロブリン重鎖ガンマ１の定常領域に、イン・フレームにて融合できる。ヒト軽鎖ｃＤＮＡ全体を、ベクターｐＥＥ１２．１（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ＰＬＣ，Ｓｌｏｕｇｈ，Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ，ＵＫ）に、直接クローニングできる。操作した免疫グロブリン発現ベクターを、エレクトロポレーションによりＮＳ０骨髄腫細胞に安定してトランスフェクトでき、グルタミン合成酵素選択培地において選択する。安定したクローンを、抗ヒトＴＧＦβＲＩＩ特異的結合ＥＬＩＳＡにより抗体発現についてスクリーニングできる。陽性クローンを、スピナーフラスコまたは生物反応器において、抗体産生のために無血清培地へと培養できる。完全長ＩｇＧ１抗体を、タンパク質親和性クロマトグラフィー（Ｐｏｒｏｓ  Ａ，ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により精製でき、中性緩衝食塩溶液に溶出できる。
【００７７】
抗ヒトＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂ  ＴＧＦ１，およびＴＧＦ３の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡをクローニングでき、ＧＳ（グルタミン合成酵素）発現ベクターにおいて、ヒト免疫グロブリン重鎖ガンマ１定常領域に、イン・フレームにて融合できる。操作した免疫グロブリン発現ベクターを、ＣＨＯ細胞に安定してトランスフェクトできる。安定したクローンを、ヒトＴＧＦβＲＩＩに特異的に結合する抗体の発現について検証できる。陽性のクローンを生物反応器において抗体産生のための無血清培地へと広げることができる。完全長ＩｇＧ１抗体を、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーによって精製でき、中性緩衝食塩溶液に溶出できる。
【００７８】
抗ＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂは、ＴＧＦβＲＩＩへ結合し、ＴＧＦβＲＩＩのそのリガンドへの結合をブロックする。
精製した抗ＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂの結合およびブロッキング活性を、上述の「抗ＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂの生成」で記載したように、ＥＬＩＳＡにおいて決定する。抗体のＥＤ５０およびＩＣ５０をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）  ソフトウェア３．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて分析する。抗ヒトＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂ  ＴＧＦ１，およびＴＧＦ３はそれぞれ、ＥＬＩＳＡベースの結合アッセイにおいて０．０３１〜０．０５９ｎＭのＥＤ５０にてヒトＴＧＦβＲＩＩに対する結合活性を別々に示すが、他方で通常のヒトＩｇＧは受容体に対しては結合活性を有さない。精製したｍＡｂ  ＴＧＦ１，およびＴＧＦ３は、０．１０〜０．５４ｎＭのＩＣ５０にてヒトＴＧＦβＲＩＩに対するヒトＴＧＦβ１，ＴＧＦβ２，またはＴＧＦβ３の結合を効果的に、各々別々にブロックする。
【００７９】
抗ヒトＴＧＦβＲＩＩ抗体の結合およびブロッキング特性を表３に要約する。
【００８０】
表３  抗ヒトＴＧＦβＲＩＩ抗体の結合およびブロッキング特性
【表３】
0005667067.tif 000004
【００８１】
マウスＴＧＦβＲＩＩへの抗マウスＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂ  ＭＴ１の結合活性は０．０５４ｎＭのＥＤ５０を有し、マウスＴＧＦβ１，ＴＧＦβ２，またはＴＧＦβ３へ結合するマウスＴＧＦβＲＩＩへのｍＡｂ  ＭＴ１のブロッキング活性は０．１２〜０．５４ｎＭのＩＣ５０の値を有する。
【００８２】
ｍＡｂ  ＭＴ１の結合およびブロッキング特性を表４に要約する。
【００８３】
表４  抗マウスＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂ  ＭＴ１の結合およびブロッキング特性
【表４】
0005667067.tif 000005
【００８４】
抗ＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂの結合親和性
抗ＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂの結合親和性を、室温（２０〜２５℃）にて、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００を用いて、表面プラズモン共鳴技術によって決定する（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）。ｍＡｂの動態分析を、５〜１００ｎＭの濃度にてセンサ表面上に、マウスＴＧＦβＲＩＩ（配列番号４１）の組み換え細胞外ドメイン、あるいは、マウスまたはヒトのＦｃまたは重鎖定常領域と各々リンクされた配列番号４０によってコードされるヒトＴＧＦβＲＩＩの細胞外ドメインの融合タンパク質の固定化によって行う。抗ヒトＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂ  ＴＧＦ１，およびＴＧＦ３は、各々１１、７８、１９ｐＭのＫＤ値を有して、高い親和性を示す。抗マウスＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂ  ＭＴ１は、３３ｐＭのＫＤ値を有して、高い親和性を示す。
【００８５】
ｍＡｂの動態を表５に要約する。
【００８６】
表５  抗ヒトＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂの反応速度
【表５】
0005667067.tif 000006
【００８７】
抗ヒトＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂの種特異性
抗ヒトＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂの特異性を、ＥＬＩＳＡによって、ヒトＴＧＦβＲＩＩまたはマウスＴＧＦβＲＩＩに対する抗体の反応性を測定することによって決定する。抗ヒトＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂ  ＴＧＦ１は、マウスＴＧＦβＲＩＩと交差反応を示さない。これに対して、ｍＡｂ ＴＧＦ３は、マウスＴＧＦβＲＩＩと、中程度または小程度の交差反応を示す。しかしながら、ｍＡｂ ＴＧＦ３は、マウスＴＧＦβＲＩＩに対するヒトＴＧＦβ１の結合をブロックしない。
【００８８】
ＴＧＦβＲＩＩ発現細胞上での抗ＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂの天然のＴＧＦβＲＩＩへの結合
抗ヒトＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂ  ＴＧＦ１およびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識化されたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体の結合活性を、２９３−ヒトＴＧＦβＲＩＩ形質転換細胞およびヒト癌細胞を用いた染色アッセイにより決定できる。特に、形質転換細胞、癌細胞、脾臓細胞、またはリンパ節細胞の一定分量を増殖途中（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）の培養から採取し、フルオレセイン標識付けた、または標識付けのない所望の分子に対する一次抗体を用いて、氷上で一時間、１％ＢＳＡ（染色バッファー）を有するＰＢＳ中にてインキュベートする。マッチさせたＩｇＧアイソタイプをネガティブコントロールとして用いる。細胞を、染色バッファーを用いて２回洗浄し、次いで、氷上で３０分間、バッファー中で、ＦＩＴＣ、フィコエリトリン（ＰＥ）、または、一次抗体に対するＡｌｘａｓレッド標識化種特異的二次抗体（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）でインキュベートする。上述のように、細胞を洗浄し、フローサイトメーターで分析する。死滅細胞および残留物を前方および側方からの光散乱に基づいて分析から除く。平均の蛍光強度単位（ＭＦＩＵ）を、陽性の集団の百分率を乗じた対数平均蛍光として計算する。平均蛍光強度比（ＭＦＩＲ）を、細胞株におけるＴＧＦβＲＩＩの相対的な発現レベルを定量化するために計算する。ＭＦＩＲは、アイソタイプのコントロール抗体を用いて染色した細胞のＭＦＩで割った、ＴＧＦβＲＩＩ特異的ｍＡｂを用いて染色した細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）である。
【００８９】
抗ヒトＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂ  ＴＧＦ１は、２９３−ヒトＴＧＦβＲＩＩ形質転換細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞との結合反応性を検証の結果、それぞれ４６と２０９のＭＦＩＲを有する。これとは対照的に通常のヒトＩｇＧは細胞に反応性を有さない。結果は、ｍＡｂ  ＴＧＦ１が、細胞表面上において発現した天然のヒトＴＧＦβＲＩＩに特異的な反応性を有することを示す。
【００９０】
キナーゼＳｍａｄ２の下流でのＴＧＦβ１に応答したＴＧＦβＲＩＩの活性に対する抗ＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂの阻害活性
ＴＧＦβに誘導されたＳｍａｄ２（ｐ−Ｓｍａｄ２）のリン酸化反応は、例えば様々な細胞種における増殖、運動、生存、分化など、細胞の生物学的反応を仲介するＴＧＦβＲＩＩを介したＴＧＦβシグナル伝達の典型的な下流シグナル伝達経路である。ｐ−Ｓｍａｄ２活性化を阻害する、抗ヒトＴＧＦβＲＩＩおよび抗ヒトマウスＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂの能力を、以下の手順に従って、４Ｔ１マウス乳癌細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞を用いることによって決定できる。つまり、細胞をＦＣＳ含有培地において８０％のコンフルエンス状態にまで培養する。その培地と無血清培地とを取り替えた後、細胞を、１時間、１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦβの存在下において、抗体またはアイソタイプのコントロールで処理する。洗浄後、細胞溶解物を溶解バッファーで調製し、電気泳動法を用いて、ニトロセルロース膜に電気移動する。リン酸化Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ２を、抗−ホスホ−Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ２モノクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｅ）を用いたウェスタンブロット法および電気化学発光システム（ＥＣＬ）によって検出し、画像化して、フジ画像アナライザー（Ｆｕｊｉ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いた濃度測定で定量化する。
【００９１】
抗ＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂ  ＴＧＦ１およびＭＴ１はヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびマウス４Ｔ１乳癌細胞におけるＳｍａｄ２のＴＧＦβ誘導されたリン酸化反応を、用量依存的な方法において低減する。ｐ−Ｓｍａｄ２阻害試験において、ｍＡｂ  ＴＧＦ１およびＭＴ１のＩＣ５０を、５±０．５ｎＭであると決定し、他方でｍＡｂ ＴＧＦ３は２５±０．５ｎＭ未満のＩＣ５０を示す。
【００９２】
腫瘍細胞のインビトロでの移動および浸襲における抗ＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂの阻害活性
腫瘍細胞の浸襲性に対する抗ＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂの阻害効果は、インビトロの移動および浸襲アッセイによって決定できる。つまり、癌細胞を、ウェル毎に５×１０３の密度で、無血清培地中の４８ウェルプレートのコラーゲンＩおよびＩＶコーティングした下側のチャンバーに挿入されている上側のチャンバーに投与する。細胞を、２４〜４８時間、３７℃にて、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβの存在下において、３、１０、および３０μｇ／ｍＬの投与量において、ｍＡｂ  ＴＧＦ１またはＭＴ１で処理する。２５μｇ／ｍＬ  ＴＧＦβＲＩＩ−ＦｃまたはアイソタイプＩｇＧは、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとしてアッセイにおいて用いる。同様の条件を、マトリゲルコーティングした上側のチャンバーを用いることは例外として浸襲アッセイにおいて用いる。インキュベーションの後、上側のチャンバーの反対側に移動した細胞を、１０％緩衝中性ホルマリンで固定し、２μｇ／ｍＬ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２，三塩酸塩，三水和物溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、Ｚｅｉｓｓ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｉｍａｇｅ  Ｃａｍｅｒａおよびｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  ５．１を用いて２０倍の倍率で数える。
【００９３】
抗ＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂ  ＴＧＦ１およびＭＴ１は、ＩｇＧ処理されたコントロールと比較すると、ＢＸＰＣ−３ヒト膵臓癌細胞の移動および４Ｔ１マウス乳癌細胞の浸襲をそれぞれ１００％（Ｐ＜０．０００１）および９３％  （Ｐ＜０．０００５）と著しく阻害した。
【００９４】
これらの結果は、その表面上にＴＧＦβＲＩＩを有する癌細胞の浸襲に対する本発明の抗ＴＧＦβＲＩＩ抗体の阻害効果を示す。
【００９５】
腫瘍細胞におけるＶＥＧＦ−Ａ分泌に対する抗ＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂの阻害活性
ＴＧＦβは、腫瘍細胞におけるＶＥＧＦ−Ａ分泌の刺激および内皮細胞機能の調節を介した病状の進行の間の血管形成を促進させる役割を担う。腫瘍細胞におけるＴＧＦβ誘導されたＶＥＧＦ−Ａの分泌に対する抗ＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂの阻害効果を細胞培養において決定できる。
【００９６】
つまり、腫瘍細胞を、４８時間、１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦβおよび限界希釈のｍＡｂの存在下または非存在下において、５％ＣＯ２での培養器中で、３７℃で無血清培地において培養する。馴化培養物上清中のＶＥＧＦ−Ａ分泌における変化を、製造者の使用説明書に従ってＥＬＩＫＯＮキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して決定する。
【００９７】
１０μＭ／ｍＬでの抗ヒトＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂ  ＴＧＦ１は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞において、ＶＥＧＦ−ＡのＴＧＦβ誘導生成を６３％（Ｐ＜０．０１）阻害する。１０μＭ／ｍＬでの抗マウスＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂ  ＭＴ１は、４Ｔ１マウス乳癌細胞において、ＶＥＧＦ−ＡのＴＧＦβ誘導生成を３０％（Ｐ＜０．０２）阻害する。
【００９８】
これらの結果は、ＴＧＦβ誘導ＶＥＧＦ−Ａ分泌を低減することによって本発明の抗ＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂが血管生成を阻害することを示す。
【００９９】
インビトロでのＴＧＦβ誘導Ｔｒｅｇ転換に対する抗ＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂの阻害活性
ＴＧＦβは、免疫反応を陰性に制御する免疫抑制能力を有する制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞を形成するために、未感作Ｔ細胞を誘導することができることが証明されている。ＴＧＦβ誘導制御性細胞転換に対する抗ＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂの阻害効果を、以下のように、インビトロで評価できる。
【０１００】
つまり、精製した未感作のＣＤ４＋細胞を、７日間、５％ＣＯ２下の培養器において、３７℃で、完全ＲＰＭＩ培地中で、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβおよび段階希釈のｍＡｂ  ＭＴ１の存在下または非存在下において、１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体および精製した抗原提示細胞（ＡＰＣ）で刺激する。細胞を、次いで、ＣＤ２５＋／Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の染色のために採取して、染色した細胞をフローサイトメーターで分析する。
【０１０１】
１０μＭ／ｍＬでの抗マウスＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂ  ＭＴ１は、コントロールＩｇＧで処理した細胞と比較して、インビトロにて、ＴＧＦβ誘導Ｔｒｅｇ細胞の数を７５％（Ｐ＜０．００５）低減する。
【０１０２】
腫瘍の増殖および転移に対する抗ＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂの阻害活性
抗ＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂの抗腫瘍効果を、静脈または皮下転移腫瘍モデルにおいて試験できる。
【０１０３】
無胸腺ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）、Ｂａｌｂ／ｃマウス、またはＣ５７Ｂ６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を、マウスまたはヒト癌細胞による接種のために用いることができる。皮下モデルにおける生成された腫瘍の処置のために、腫瘍を、約２００ｍｍ３の大きさまで成長させることができ、次いで、マウスを、グループ毎に１２匹〜１５匹のグループとなるよう無作為に抽出する。肺転移モデルにおいて、マウスに、尾静脈を介して腫瘍細胞を静脈注射できる。動物は、毎週３回、１０〜４０ｍｇ／ｋｇの投与量で腹腔内投与の抗ＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂを受容できる。コントロールグループ中のマウスは、等量の生理食塩水または通常のＩｇＧ溶液を受容できる。動物の処置は、実験期間の間継続できる。腫瘍は測径器を用いて毎週２回測定できる。腫瘍の体積を、以下の式「π／６（ｗ１×ｗ２×ｗ２）」を用いて計算でき、ここで「ｗ１」は、最大の腫瘍直径を示し、「ｗ２」は、最小の腫瘍直径を示す。
【０１０４】
腫瘍体積のデータを、処置、時点、および処置時間の相互作用の間での腫瘍の大きさにおける有意差を決定するために、反復測定ＡＮＯＶＡ（ＲＭ−ＡＮＯＶＡ）を用いて分析できる。処置とコントロールとの間のインビトロでの腫瘍細胞の成長の比較を、両側スチューデントＴ検定（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ）を用いて行うことができる。０．０５未満のＰ値が統計的に有意であると考えられる。
【０１０５】
腫瘍を有するマウスを、腫瘍細胞の静脈注射後または一次腫瘍が確立した２４時間後、毎週３回、４０ｍｇ／ｋｇの投与量で、ｍＡｂ  ＴＧＦ１で処置する。ｍＡｂ  ＴＧＦ１の全身投与は、ＰＡＮＣ−１膵臓癌異種移植片（Ｔ／Ｃ＝６９％，ＡＮＯＶＡ  ｐ＜０．０３），ＢＸＰＣ−３膵臓癌異種移植片（Ｔ／Ｃ＝３０％，ＡＮＯＶＡ  ｐ＜０．０００１），およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１  乳癌異種移植片（Ｔ／Ｃ＝６３％，ＡＮＯＶＡ  ｐ＜０．０１）の皮下一次腫瘍の成長を抑制する。
【０１０６】
抗マウスＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂ  ＭＴ１を、免疫担当マウスにおける一次および転移性腫瘍に対する抗腫瘍活性を決定するために、マウス同系（ｓｙｎｇｅｎｅｔｉｃ）腫瘍モデルにおいて試験する。マウスに、マウス４Ｔ１，ＣＴ２６またはＢ１６  Ｆ１０癌細胞を静脈注射（ｉ．ｖ．）し、または、ＥＭＴ６マウス腫瘍細胞を皮下注射（ｓ．ｃ．）する。マウスは、静脈注射接種後または一次皮下腫瘍が確立した２４時間後、毎週３回、４０ｍｇ／ｋｇの投与量で、ｍＡｂ  ＭＴ１の投与を受容する。
【０１０７】
ｍＡｂ  ＭＴ１の全身投与は、８４％（Ｐ＜０．０００１）で４Ｔ１、９４％（Ｐ＜０．０００１）でＣＴ２６、および６３％（Ｐ＜０．００１）でＢ１６  Ｆ１０腫瘍の肺への転移をそれぞれ有意に抑制する。抗マウスＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂ  ＭＴ１は、ＥＭＴ６  皮下注射腫瘍モデルにおいて、２８％（Ｐ＜０．０５）で一次腫瘍の成長および８４％（Ｐ＜０．０００１）で不随意的な肺転移を阻害する。
【０１０８】
Ｇｒ−１／ＣＤ１１ｂ＋表現型を有する骨髄性細胞は、腫瘍進行の間、転移を促進し、血管形成の免疫抑制を促進する重要な役割を果たすことが報告されている。ＣＤ４／ＣＤ２５／Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞は、腫瘍細胞に対するナチュラルキラー細胞の機能、および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）免疫エフェクター細胞の機能を抑制する能力を有する。免疫抑制細胞、すなわちＣＤ４／ＣＤ２５／Ｆｏｘｐ３／ＴＧＦβＲＩＩ＋Ｔｒｅｇ細胞およびＧｒ−１＋／ＣＤ１１ｂ＋／ＴＧＦβＲＩＩ＋骨髄性細胞に対するｍＡｂ  ＭＴ１の阻害活性を、ＥＭＴ６  皮下注射腫瘍モデルにおいて評価する。腫瘍を有するマウス中のＴｒｅｇおよびＧｒ−１＋／ＣＤ１１ｂ＋骨髄性細胞集団に対する抗ＴＧＦβＲＩＩ抗体の阻害効果を、ｍＡｂ  ＭＴ１によるマウスの処置後のＧｒ−１＋／ＣＤ１１ｂ＋集団ならびにＣＤ４／ＣＤ２５／Ｆｏｘｐ３／ＴＧＦβＲＩＩ＋およびＧｒ−１＋／ＣＤ１１ｂ＋／ＴＧＦβＲＩＩ＋集団の変化についてのＦＡＣＳ分析によって決定できる。
【０１０９】
抗マウスＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂ  ＭＴ１は、ＥＭＴ６腫瘍を有する処置済みのマウス中に、９５％（Ｐ＜０．０００１）でＧｒ−１＋／ＣＤ１１ｂ＋／ＴＧＦβＲＩＩ＋骨髄性細胞および７１％（Ｐ＜０．０００５）でＣＤ４／ＣＤ２５／Ｆｏｘｐ３／ＴＧＦβＲＩＩ＋Ｔｒｅｇ細胞の数をそれぞれ有意に低減する。
【０１１０】
これらの結果は、抗ＴＧＦβＲＩＩの抗体が、ＴＧＦβＲＩＩ＋Ｔｒｅｇおよび骨髄性細胞の阻害および／または喪失により、ＣＤ４／ＣＤ２５／Ｆｏｘｐ３／ＴＧＦβＲＩＩ＋およびＧｒ−１＋／ＣＤ１１ｂ＋集団を制御できることを示す。
【０１１１】
マウスにおける線維症モデル
ＴＧＦβは、肝星細胞（ＨＳＣ）の活性化ならびに筋線維芽細胞および線維症の一因となる細胞外マトリックス蓄積における主要調節因子である。動物における肝線維症モデルは、線維症を阻害するＴＧＦβシグナル伝達阻害因子の活性の評価のための実験的なモデルとして広く利用されている。コラーゲン沈着は、肝臓中の線維症の形成についての公知の指標である。線維症の保護および干渉における抗ＴＧＦβＲＩＩ抗体の治療活性を、四塩化炭素（ＣＣｌ４）誘導肝線維症モデルにおいて評価できる。
【０１１２】
つまり、Ｃ５７ＢＬ６マウスに、１週間に２回、トウモロコシ油を混入した１ｍＬ／ｋｇのＣＣｌ４溶液を腹腔内注射できる。干渉治療グループ中のマウスに、そのマウスにＣＣｌ４を腹腔内注射した１４日後、一週間に３回、４０ｍｇ／ｋｇの投与量でｍＡｂ  ＭＴ１を投与できる。コントロールグループ中のマウスに、同じ量で、コントロールラットＩｇＧを投与できる。ＣＣｌ４注射の８週間後、肝組織および血漿試料を処置後のマウスから収集できる。アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の血漿レベル、すなわち肝機能障害の指標を、血清ＡＬＴキットを用いて決定できる（Ｐｏｉｎｔｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．ＭＩ）。肝臓組織を、コラーゲン沈着のＳｉｒｉｕｓレッド染色を用いて免疫組織化学（ＩＨＣ）分析により評価できる。
【０１１３】
上述のように実質的に行われた研究において、抗マウスＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂ  ＭＴ１は、ＣＣｌ４を与えられたマウスの肝臓中、９５％（Ｐ＜００００１）で、コラーゲン沈着を有意に低減し、他方で、コントロールラットＩｇＧは効果を有さない。抗マウスＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂ  ＭＴ１は、ＣＣｌ４を与えられたマウス中のＡＬＴの血漿レベルによって測定されるように、８５％（Ｐ＜０．００１）で、肝臓を機能障害から保護し、他方で、コントロールラットＩｇＧで処置したマウスは有意に高いＡＬＴレベルを有する。
【０１１４】
これらの結果は、抗ＴＧＦβＲＩＩ抗体ＭＴ１が、損傷によって誘発された線維症および肝機能障害からマウスを保護するのに有効であることを示唆する。
【０１１５】
ｍＡｂ  ＭＴ１およびシクロホスファミドを用いた併用療法についてのインビボでの研究
シクロホスファミド（ＣＴＸ）、すなわち造血および骨髄性前駆細胞を抑制する能力を有する潜在的細胞毒性薬は、骨髄性細胞に対する阻害効果を有すると報告されている（Ｈｏｎｅｙｃｈｕｒｃｈら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：７４９３−７５０１（２００５）を参照）。ＥＭＴ６−腫瘍を有するマウスを、ｍＡｂ  ＭＴ１を単独で、ＣＴＸ単独で、またはそれらの組み合わせで処置できる。例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスまたはＣ５７Ｂ６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を、癌細胞の接種のために使用できる。確立した腫瘍を有するマウスを、例えば、グループ毎に１２匹の動物となるように無作為化できる。動物に、４０ｍｇ／ｋｇの抗ＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂまたは８０ｍｇ／ｋｇのＣＸＴ、あるいは両方の組み合わせを、毎週３回腹腔内投与できる。コントロールグループ中のマウスは、等量の生理食塩水または通常のＩｇＧ溶液を受容できる。腫瘍の大きさを、以下の式「π／６（ｗ１×ｗ２×ｗ２）」を用いて計算でき、ここで「ｗ１」は、最大の腫瘍直径を示し、「ｗ２」は、最小の腫瘍直径を示す。
【０１１６】
上述のように、実質的に行われる抗マウスＴＧＦβＲＩＩ  ｍＡｂ  ＭＴ１およびＣＴＸを用いた併用療法は、一次腫瘍成長の阻害において、ｍＡｂ  ＭＴ１  ２８％（Ｐ＜０．０５）またはＣＴＸ  ６２％（Ｐ＜０．０００５）、ならびに、転移の阻害において、ｍＡｂ  ＭＴ１  ８４％（Ｐ＜０．０００１）またはＣＴＸ  ９６％（Ｐ＜０．００００１）を用いた単剤療法と比較して、ＥＭＴ６腫瘍を有するマウスにおいて、８０％（Ｐ＜０．０００１）で一次腫瘍成長および９９．９９％（Ｐ＜０．０００００１）で不随意的な肺転移を低減する。
【０１１７】
その結果は、骨髄性細胞抑制化学療法と組み合わせた抗ＴＧＦβＲＩＩ抗体によるＴＧＦβＲＩＩ陽性骨髄性細胞のサブセットの阻害が、腫瘍の成長および転移における干渉のために効果的なストラテジーであることを証明する。
【配列表】
0005667067000001.app