(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＶＩＩＩ凝血促進活性を有し、ヒトＦＶＩＩＩ欠乏症を修正することができる治療有効量の複合体を含む、必要とする対象におけるフォン・ヴィレブランド病を処置することにおける使用のための医薬組成物であって、
該複合体は、ＦＶＩＩＩアミノ酸配列を含む機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドを含み、
該機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドは、
１）１つ以上の生体適合性ポリマーが、アミノ酸位置４９１および１８０４にて、ポリペプチドへ共有結合している機能性ＦＶＩＩＩポリペプチド、および
２）１つ以上の生体適合性ポリマーが、アミノ酸位置１８０４にて、ポリペプチドへ共有結合している機能性ＦＶＩＩＩポリペプチド
からなる群から選択され、
アミノ酸位置４９１および１８０４は、配列番号：１の全長ヒトＦＶＩＩＩアミノ酸配列である成熟体を基準にし、システイン残基に変異されており、
該生体適合性ポリマーはポリエチレングリコールである、
医薬組成物。
【請求項２】
ポリエチレングリコールがメトキシポリエチレングリコールを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
メトキシポリエチレングリコールが５ｋＤから６４ｋＤの範囲のサイズを有する、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
低密度のリポタンパク質受容体関連タンパク質のポリペプチドへの結合が、複合体化していないときのポリペプチドへの結合よりも少ないように、生体適合性ポリマーが機能性ＦＶＩＩＩポリペプチド上に共有結合している、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
低密度のリポタンパク質受容体関連タンパク質の複合体への結合が、複合体化していないときのポリペプチドへの結合の２分の１未満である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
へパラン硫酸プロテオグリカンのポリペプチドへの結合が、複合体化していないときのポリペプチドへの結合よりも少ないように、生体適合性ポリマーが機能性ＦＶＩＩＩポリペプチド上に共有結合している、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ヘパリン硫酸プロテオグリカンの複合体への結合が、複合体化していないときのポリペプチドへの結合の２分の１未満である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ＦＶＩＩＩ阻害抗体のポリペプチドへの結合が、複合体化していないときのポリペプチドへの結合よりも少ないように、生体適合性ポリマーが機能性ＦＶＩＩＩポリペプチド上に共有結合している、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
ＦＶＩＩＩ阻害抗体の複合体への結合が、複合体化していないときのポリペプチドへの結合の２分の１未満である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
低密度のリポタンパク質受容体のポリペプチドへの結合が、複合体化していないときのポリペプチドへの結合よりも少ないように、生体適合性ポリマーが機能性ＦＶＩＩＩポリペプチド上に共有結合している、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
低密度のリポタンパク質受容体の複合体への結合が、複合体化していないときのポリペプチドへの結合の２分の１未満である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
血漿プロテアーゼが、ポリペプチドが複合体化していないときよりポリペプチドを分解しないように、生体適合性ポリマーが機能性ＦＶＩＩＩポリペプチド上に共有結合している、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
血漿プロテアーゼによるポリペプチドの分解が、同じ条件下で同じ期間にわたって測定したとき複合体化していないときのポリペプチドの分解の２分の１未満である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
血漿プロテアーゼが活性化タンパク質Ｃである、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドがＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
複合体が機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドを含み、ポリエチレングリコールが配列番号：１の全長ヒトＦＶＩＩＩアミノ酸配列である成熟体を基準にして、ＦＶＩＩＩアミノ酸位置１８０４にてポリペプチドに結合している、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
フォン・ヴィレブランド病がフォン・ヴィレブランド因子の欠乏および／または異常により特徴付けられる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
フォン・ヴィレブランド病が２Ｎ型である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
フォン・ヴィレブランド病が３型である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
ＦＶＩＩＩ凝血促進活性を有し、ヒトＦＶＩＩＩ欠乏症を修正することができる複合体を製造することを含む、フォン・ヴィレブランド病を処置することにおける使用のための薬物を製造するための方法であって、
該複合体は、ＦＶＩＩＩアミノ酸配列を含む機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドを含み、
該機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドは、
１）１つ以上の生体適合性ポリマーが、アミノ酸位置４９１および１８０４にて、ポリペプチドへ共有結合している機能性ＦＶＩＩＩポリペプチド、および
２）１つ以上の生体適合性ポリマーが、アミノ酸位置１８０４にて、ポリペプチドへ共有結合している機能性ＦＶＩＩＩポリペプチド
からなる群から選択され、
アミノ酸位置４９１および１８０４は、配列番号：１の全長ヒトＦＶＩＩＩアミノ酸配列である成熟体を基準にし、システイン残基に変異されており、
該生体適合性ポリマーはポリエチレングリコールである、
方法。
【請求項２１】
ＦＶＩＩＩ凝血促進活性を有し、ヒトＦＶＩＩＩ欠乏症を修正することができる治療有効量の複合体を含む、手術による一過性の出血を弱めるための、手術前のフォン・ヴィレブランド病を有する対象の予防処置における使用のための医薬組成物であって、
該複合体は、ＦＶＩＩＩアミノ酸配列を含む機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドを含み、
該機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドは、
１）１つ以上の生体適合性ポリマーが、アミノ酸位置４９１および１８０４にて、ポリペプチドへ共有結合している機能性ＦＶＩＩＩポリペプチド、および
２）１つ以上の生体適合性ポリマーが、アミノ酸位置１８０４にて、ポリペプチドへ共有結合している機能性ＦＶＩＩＩポリペプチド
からなる群から選択され、
アミノ酸位置４９１および１８０４は、配列番号：１の全長ヒトＦＶＩＩＩアミノ酸配列である成熟体を基準にし、システイン残基に変異されており、
該生体適合性ポリマーはポリエチレングリコールである、
医薬組成物。
【請求項２２】
対象が３型フォン・ヴィレブランド病を有する、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
ＦＶＩＩＩ凝血促進活性を有し、ヒトＦＶＩＩＩ欠乏症を修正することができる治療有効量の複合体を含む、フォン・ヴィレブランド病を有する対象における外傷の処置における使用のための医薬組成物であって、
該複合体は、ＦＶＩＩＩアミノ酸配列を含む機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドを含み、
該機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドは、
１）１つ以上の生体適合性ポリマーが、アミノ酸位置４９１および１８０４にて、ポリペプチドへ共有結合している機能性ＦＶＩＩＩポリペプチド、および
２）１つ以上の生体適合性ポリマーが、アミノ酸位置１８０４にて、ポリペプチドへ共有結合している機能性ＦＶＩＩＩポリペプチド
からなる群から選択され、
アミノ酸位置４９１および１８０４は、配列番号：１の全長ヒトＦＶＩＩＩアミノ酸配列である成熟体を基準にし、システイン残基に変異されており、
該生体適合性ポリマーはポリエチレングリコールである、
医薬組成物。
【請求項２４】
対象が３型フォン・ヴィレブランド病を有する、請求項２３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００８年６月４日に出願された米国仮出願第６１／０５８，７９５号（この内容は、その全体において出典明示により本明細書に包含させる）の利益を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、フォン・ヴィレブランド病（ｖＷＤ）の処置のために有用である第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）変異タンパク質およびその誘導体に関する。ＦＶＩＩＩ変異タンパク質は、定義された位置にて、１つ以上の生体適合性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコールに結合することができる。加えて、治療目的のためのそれらの関連製剤、用量および投与の方法を提供する。これらの修飾されたＦＶＩＩＩ変異体ならびに関連組成物および方法は、フォン・ヴィレブランド病に罹患している個体に対する注射頻度の減少および免疫原性応答の減少をもたらす処置選択の提供に有用である。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景
ｖＷＤは、先天性または後天性疾患の種々の病因群を表す用語である。多数の型のｖＷＤの原因は、他の特性と共に、凝血促進ＦＶＩＩＩに結合し、血液循環中の天然ＦＶＩＩＩの半減期を延長させる一連の多量体血漿糖タンパク質であるフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）の機能に属する（例えば、Federici, Haemophilia 10 (suppl 4):169,2004; Denis, et al., Thromb. Haemost. 99:271, 2008、参照）。正常なヒトにおいて、ＦＶＩＩＩの半減期は、ｖＷＦの非存在下において約８分であり、ｖＷＦの存在下において８時間である。
【０００４】
軽度の型（１型）において、ｖＷＤは、ヒト集団において１００人に１人もの割合で罹患されており、そして男性および女性に等しく罹患されている非常に一般的なものである。
【０００５】
２型ｖＷＤは、ｖＷＤの重度の型であり得、５つのサブタイプ：２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｍおよび２Ｎにおいて知られている。これらの中で、２Ｎ型はＦＶＩＩＩのｖＷＦへの結合の欠乏により特徴付けられる。したがって、２Ｎ型ｖＷＤを有する患者において、ＦＶＩＩＩは迅速に分解され、循環レベルが低下する。２Ｎ型ｖＷＦは、ＦＶＩＩＩへの結合を害するホモ接合体または化合物ヘテロ接合体ｖＷＦ変異体による。ｖＷＦとの複合体ではない遊離ＦＶＩＩＩは循環から迅速に除去されるため、２Ｎ型ｖＷＤは常染色体劣性型の血友病Ａを装う。しかしながら、患者は一般的に、ＦＶＩＩＩレベルは減少しているが、正常レベルのｖＷＦ−抗原およびｖＷＦ−血小板ＧＰ１ｂ結合に対するリストセチン補因子活性（ｖＷＦ：ＲＣｏ活性）を有する。
【０００６】
エリックフォン・ヴィレブランドの型でフィンランド人ファミリーにおいて初めて発見された３型ｖＷＤは、ｖＷＦのホモ接合体欠乏または二重ヘテロ接合体欠乏である。３型ｖＷＤは、ノンセンス変異体またはｖＷＦをコードする核酸へのわずかな挿入または欠失によるフレームシフトにより、完全またはほぼ完全なｖＷＦの欠乏を引き起こす。ほとんどの場合において、ｖＷＦ：ＲＣｏおよびｖＷＦ：Ａｇは検出することができず、ＦＶＩＩＩレベルは非常に少ない。３型ｖＷＤを有する患者は、血友病のような関節血症および関節または関節腔出血を有し得る。
【０００７】
後天性ｖＷＤは、通常、抗−ｖＷＦ抗体の発生、流体せん断応力−誘導タンパク質分解または血小板もしくは他の細胞への結合の増加による、自己免疫性クリアランスにより引き起こされる。後天性ｖＷＤ症候群は、少ないレベルのｖＷＦ−Ａｇ、ｖＷＦ：ＲｃｏおよびＦＶＩＩＩを有する３型ｖＷＤのものと同様である。３型ｖＷＤおよび後天性ｖＷＤ患者は、ｖＷＤの特徴である粘膜出血だけでなく血友病Ａの特徴である軟組織、筋肉および関節出血も有する。
【０００８】
血友病Ａは、５０００人の男性あたり１人の推定発現率である最も一般的な遺伝的凝固障害である。血液凝固の内因経路の重要な成分であるＦＶＩＩＩの欠乏または構造欠陥により引き起こされる。血友病Ａに対する現在の処置はヒトＦＶＩＩＩの静脈内注射を含む。ヒトＦＶＩＩＩは、約３００ｋＤの一本鎖分子として組換え的に生産されている。それは構造ドメインＡ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２からなる（Thompson, Semin. Hematol. 29:11-22, 2003）。金属イオンにより互いに保持されている２つの鎖を有する前駆体産物は、ゴルジ装置において２００ｋＤ（重鎖）および８０ｋＤ（軽鎖）の２つのポリペプチド鎖に処理される（Kaufman, et al., J. Biol. Chem. 263:6352, 1988; Andersson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83:2979, 1986）。
【０００９】
Ｂ−ドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ、９０ｋＤのＡ１−Ａ２重鎖プラス８０ｋＤの軽鎖）が血友病Ａに対する補充療法のとき有効であることが示されているため、ＦＶＩＩＩのＢ−ドメインは重要ではないようである。Ｂ−ドメイン欠失ＦＶＩＩＩ配列は、１４個のアミノ酸のＢ−ドメインのほとんどが欠失している。
【００１０】
血友病Ａ患者は現在、要求に応じてＦＶＩＩＩの静脈内投与または１週間に数回の予防的治療投与により処置される。予防処置のために、１５−２５ＩＵ／ｋｇ体重にてＦＶＩＩＩを１週間に３回投与する。患者において定期的に必要である。ヒトにおいて半減期が短いため、ＦＶＩＩＩは頻繁に投与されなければならない。全長タンパク質に関して３００ｋＤ以上の大型サイズにもかかわらず、ＦＶＩＩＩはヒトにおいてわずか約１１時間の半減期である（Ewenstein, et al., Semin. Hematol. 41:1-16, 2004）。頻繁な静脈内注射の必要性は患者のコンプライアンスに対する巨大な障壁を作る。長い半減期を有し、投与頻度が少なくてよいＦＶＩＩＩ産物が開発されることが患者にとってより都合がよい。さらに、必要とされる投与がより少なくなるため、半減期が増加したとき処置費用を減少させることができる。
【００１１】
現在の治療のさらなる不利益は、約２５−３０％の患者がＦＶＩＩＩ活性を阻害する抗体を産生することである（Saenko, et al., Haemophilia 8:111, 2002）。阻害抗体の主なエピトープは、Ａ２ドメインの残基４８４−５０８、Ａ３ドメインの残基１８１１−１８１８およびＣ２ドメイン内に位置する。抗体産生は補充療法のようなＦＶＩＩＩの使用を妨げ、このグループの患者に高用量の組換え第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）および免疫寛容療法でのさらに費用のかかる処置を探させる。
【００１２】
以下の試験によって、阻害抗体のＦＶＩＩＩエピトープを同定した。２５個の阻害血漿サンプルの試験において、１１個はトロンビン生産７３ｋＤの軽鎖フラグメントＡ３Ｃ１Ｃ２へ、４個はＡ２ドメインへ、１０個は両方へ結合することが見出された（Fulcher, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 2:7728-32, 1985）。他の試験において、患者由来のＡ２ドメインインヒビターの８個中６個が、組換えＡ２ポリペプチドにより中和された（Scandella, et al., Blood 82:1767-75, 1993）。患者由来のインヒビターの９個中６個に対するエピトープがＡ２残基３７９５３８にマップされていた（Scandella, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:6152-6, 1988）。１８個の重鎖インヒビターに対するエピトープは、Ａ２ドメインの同じＮ−末端１８．３ｋＤ領域に局在していた（Scandella, et al., Blood 74:1618-26, 1989）。
【００１３】
ヒトＡ２ドメイン残基３８７−６０４を相同ブタ配列で置き換えることにより生産された活性な組換えハイブリッドヒト／ブタＦＶＩＩＩ分子は、患者Ａ２インヒビターに抵抗性であり（Lubin, et al., J. Biol. Chem. 269:8639-41, 1994）、Ａ２への結合に対する患者Ａ２インヒビターと競合するマウスモノクローナル抗体ｍＡＢ４１３ＩｇＧに抵抗性であった（Scandella, et al., Thromb Haemost. 67:665-71, 1992）。ｍＡＢ４１３ＩｇＧおよび４個の患者インヒビターがＡ２ドメイン残基４８４−５０８がブタのもので置換されているハイブリッドヒト／ブタＦＶＩＩＩを抑制しないことを実験において示されるとき、このＡ２ドメインエピトープはさらにＡ２ドメイン残基４８４−５０８に局在している（Healey, et al., J. Biol. Chem. 270:14505-14509, 1995）。このハイブリッドＦＶＩＩＩは、また、スクリーニングされた２３個の患者血漿の少なくとも半分に抵抗性であった（Barrow, et al., Blood 95:564-568, 2000）。アラニン走査変異誘発によって、残基４８７が試験された全５個の患者インヒビターへの結合に対して重要であることを同定されたが、残基４８４、４８７、４８９および４９２はｍＡＢ４１３ＩｇＧとの相互作用に極めて重要であった（Lubin, J. Biol. Chem. 272:30191-30195, 1997）。Ｒ４８４Ａ／Ｒ４８９Ａ変異体ではなくＲ４８４Ａ／Ｒ４８９Ａ／Ｐ４９２Ａ変異体を受けているマウスにおける阻害抗体力価は、対照ヒトＢＤＤＦＶＩＩＩを受けているマウスよりも有意に低かった（Parker, et al., Blood 104:704-710, 2004）。要するに、Ａ２ドメインの４８４−５０８領域は、ＦＶＩＩＩ活性のインヒビターに対する結合部位であるようである。
【００１４】
ＦＶＩＩＩへの免疫応答の発達に加えて、慣用の治療での他の問題は、ＦＶＩＩＩの短いインビボ半減期のため、頻繁な投与が必要であることである。循環からのＦＶＩＩＩのクリアランスに対するメカニズムが試験されている。
【００１５】
循環からのＦＶＩＩＩクリアランスは、広いリガンド特異性を有する肝臓クリアランス受容体である低密度のリポタンパク質受容体−関連タンパク質（ＬＲＰ）への特異的結合に部分的に起因していた（Oldenburg, et al., Haemophilia 10 Suppl 4:133-139, 2004）。最近、低密度のリポタンパク質（ＬＤＬ）受容体は、また、例えば、血漿制御レベルのＦＶＩＩＩにおいてＬＲＰと共同することにより、ＦＶＩＩＩクリアランスにおける役割を果たすことを示された（Bovenschen, et al., Blood 106:906-910, 2005）。両方の相互作用は、細胞表面ヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）へ結合することにより促進される。マウスにおける血漿半減期は、ＬＲＰがブロックされるとき３．３倍またはＬＲＰおよび細胞表面ＨＳＰＧの両方がブロックされるとき５．５倍延長され得る（Sarafanov, et al., J. Biol. Chem. 276:11970-11979, 2001）。ＨＳＰＧは、細胞表面上でＦＶＩＩＩを濃縮し、それをＬＲＰに与えると仮説が立てられる。ＦＶＩＩＩ上のＬＲＰ結合部位は、Ａ２残基４８４−５０９（Saenko, et al., J. Biol. Chem. 274:37685-37692, 1999）、Ａ３残基１８１１−１８１８（Bovenschen, et al., J. Biol. Chem. 278:9370-9377, 2003）およびＣ２ドメインにおけるエピトープ（Lenting, et al., J. Biol. Chem. 274:23734-23739, 1999）に局在していた。
【００１６】
ＦＶＩＩＩは、また、プロテアーゼの作用により循環から除去される。この作用を理解するためには、ＦＶＩＩＩが血液凝固に関与するメカニズムを理解しなければならい。ＦＶＩＩＩは、ｖＷＦへ結合している重鎖および軽鎖のヘテロダイマーとして循環する。ｖＷＦ結合は、ＦＶＩＩＩ残基１６４９−１６８９（Foster, et al., J. Biol. Chem. 263:5230-5234, 1998）およびＣ１の部分（Jacquemin, et al., Blood 96:958-965, 2000）およびＣ２ドメイン（Spiegel, et al., J. Biol. Chem. 279:53691-53698, 2004）と関与する。ＦＶＩＩＩは、残基３７２、７４０および１６８９後のペプチド結合を開裂させ、Ａ１、Ａ２およびＡ３−Ｃ１−Ｃ２ドメインのヘテロトリマーを生産するトロンビンにより活性化される（Pittman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 276:12434-12439, 2001）。活性化時、ＦＶＩＩＩはｖＷＦから解離し、リン脂質に結合することにより血小板の細胞表面に濃縮される。リン脂質結合はＦＶＩＩＩ残基２１９９、２２００、２２５１および２２５２と関与する（Gilbert et al., J. Biol. Chem. 277:6374-6381, 2002）。それは、ＦＶＩＩＩ残基５５８−５６５（Fay, et al., J. Biol. Chem. 269:20522-20527, 1994）および１８１１−１８１８（Lenting, et al., J. Biol. Chem. 271:1935-1940, 1996）との相互作用を介してＦＩＸへ、ならびにＦＶＩＩＩ残基３４９−３７２との相互作用を介してＦＸへ（Nogami, et al., J. Biol. Chem. 279:15763-15771, 2004）結合し、内因性凝固経路の重要な成分であるＦＸのＦＩＸ活性化のための補因子として作用する。活性化ＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩａ）は、ＦＶＩＩＩ残基３３６および５６２後の開裂を介してプロテアーゼ活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）により部分的に不活性化される（Regan, et al., J. Biol. Chem. 271:3982-3987, 1996）。しかしながら、不活性化の主な決定因子は、Ａ１およびＡ３−Ｃ１−Ｃ２からのＡ２ドメインの解離である（Fay, et al., J. Biol. Chem. 266:8957-8962, 1991）。
【００１７】
タンパク質のインビボ半減期を増加させるために証明されている１つの方法はペグ化である。ペグ化は長鎖ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子のタンパク質または他の分子への共有結合である。ＰＥＧは直線形態または分岐形態であり、異なる特徴を有する異なる分子を生産することができる。ペプチドまたはタンパク質の半減期を増加させること以外では、ペグ化は、抗体発生を減少させ、プロテアーゼ消化からタンパク質を保護し、腎臓濾液から物質を排出し続けるために使用されている（Harris, et al., Clinical Pharmacokinetics 40:539-551, 2001）。加えて、ペグ化はタンパク質の全ての安定性および溶解度も増加させ得る。最後に、ペグ化タンパク質の持続血漿濃度は、薬物のトラフ／ピークレベルを低減し、したがって早期の時点にて生理学的レベルを越えるタンパク質を導入する必要性を排除することにより、有害な副作用の程度を減少させ得る。
【００１８】
大型ポリマー、例えば、ＰＥＧおよびデキストランにて一級アミン（Ｎ−末端およびリシン）を標的化することによるＦＶＩＩＩのランダム修飾は、種々の程度の成功で試みられている（ＷＯ９４／１５６２５、米国特許４９７０３００、米国特許６０４８７２０）。１９９４年の特許出願（ＷＯ９４／１５６２５）において記載されている非常に劇的な改善は、２倍の費用がかかるが、全長ＦＶＩＩＩを５０倍モル過剰のＰＥＧと反応後に４倍の半減期改善として示すことである。ＷＯ２００４／０７５９２３は、ランダム修飾を介して生産されるＦＶＩＩＩおよびポリエチレングリコールの複合体を記載している。ランダムペグ化タンパク質、例えば、インターフェロン−アルファ（Kozlowski, et al, BioDrugs 15:419-429, 2001）は治療剤としてこれまでに承認されている。
【００１９】
しかしながら、このランダム手段は、ヘテロ二量体ＦＶＩＩＩに関してさらなる問題がある。ＦＶＩＩＩは１５８個のリシン、２つのＮ−末端ならびに多数のヒスチジン、セリン、スレオニンおよびチロシンを含む何百もの可能なペグ化の位置を有し、これら全てが主に一級アミンを標的にする試薬にてペグ化され得る。例えば、ペグ化インターフェロンアルファ−２ｂに関する主な位置異性体は、ヒスチジンであることが示された（Wang, et al., Biochemistry 39:10634-10640, 2000）。さらに、全長ＦＶＩＩＩの不均一過程は、ペグ化産物におけるさらなる複雑さとなる出発物質の混合物をもたらし得る。ＦＶＩＩＩ上のペグ化の位置を制御しないさらなる欠点は、ＰＥＧが重要な活性部位、または部位付近に結合するとき、とりわけ２つ以上のＰＥＧまたは１つの大きなＰＥＧがＦＶＩＩＩと複合体化するとき、起こりうる活性の減少である。ランダムペグ化は常に多量の多様なペグ化産物を生産するため、モノ−ペグ化産物のみを得るための精製は劇的に低い全収率となる。最後に、製品プロフィールにおける大きな不均一性は一貫性のある合成および特性化をそれぞれ非常に不可能なことにさせる。良い製造物は一貫性のある、よく特徴付けられた産物である必要があるため、産物の不均一性は商業化への障壁である。すべてのこれらの理由のため、ＦＶＩＩＩをペグ化するためのさらなる特定の方法が望まれる。
【００２０】
種々の部位特異的タンパク質ペグ化戦略は最近の文献に要約されている（Kochendoerfer, et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 9:555-560, 2005）。１つの手段は、化学合成または組換え発現による非天然アミノ酸のタンパク質への取り込み、次に非天然アミノ酸と特異的に反応するＰＥＧ誘導体の付加を含む。例えば、非天然アミノ酸は、天然タンパク質に見られないケト基を含むものであり得る。しかしながら、タンパク質の化学合成は、ＦＶＩＩＩほどの大きさのタンパク質に対して実行不可能である。現在のペプチド合成の限界は約５０残基である。いくつかのペプチドは大きなポリペプチドを形成するために結合することができるが、Ｂ−ドメイン欠失ＦＶＩＩＩでさえ生産するために２０以上の結合が必要であるため、これでは理想的な反応条件下でさえ１％未満の回収率となる。非天然アミノ酸を有するタンパク質の組換え発現は、今までのところ主に非哺乳動物の発現系に限定されている。この手段は、哺乳動物系において発現する必要がある大型かつ複雑なタンパク質、例えば、ＦＶＩＩＩに対して問題のあることが予期される。
【００２１】
タンパク質の部位特異的ペグ化のための他の手段は、ＰＥＧ−アルデヒドにてＮ−末端骨格アミンを標的化することによる。しかしながら、他のアミン基を越える特異性を達成するためのこのプロセス下にて必要とされる低いｐＨは、ＦＶＩＩＩの安定性のために必要であるほぼ中性のｐＨ範囲と適合性ではない（Wang, et al., Intl. J. Pharmaceutics 259, pp. 1-15, 2003）。さらに、ＦＶＩＩＩのＮ−末端ペグ化は、この領域が血漿クリアランスに関連しないとき、血漿半減期の改善を引き起こさないであろう。
【００２２】
ＷＯ９０／１２８７４は、システインを挿入するか、またはシステインを他のアミノ酸と置換し、次にスルフヒドリル反応基を有するリガンドを付加することによる、ヒトＩＬ−３、顆粒球コロニー刺激因子およびエリスロポエチンポリペプチドの部位特異的修飾を記載している。リガンドは選択的にシステイン残基に結合する。ＦＶＩＩＩまたはその変異体の修飾は記載されていない。
【００２３】
ＥＰ０３１９３１５は、ｖＷＦ結合の減少をもたらすｖＷＦ結合部位の欠失または変化を有するＦＶＩＩＩ変異タンパク質を記載している。ＥＰ０３１９３１５は、さらにこのような変異タンパク質を投与することによるｖＷＦ阻害活性によるＦＶＩＩＩ欠乏症の軽減を記載している。
【００２４】
Rottensteiner et al.は、ポリエチレングリコールまたはポリシアル酸との複合体を形成するためのＦＶＩＩＩにおけるリシン残基のランダム化学修飾を記載している。Ｂｌｏｏｄ  １１０（１１）、３１５０Ａ  （２００７）。Rottensteiner et al.は、さらにランダム修飾されたＦＶＩＩＩが２Ｎ型ｖＷＤに有用であり得ることを示唆している。
【００２５】
上記理由のため、より良いインビボ作用持続期間および減少した免疫原性を有するが、機能活性を維持している改良されたＦＶＩＩＩ変異体の必要性がある。さらに、このようなタンパク質は一貫した方法で均質製品として生産されることが望ましい。
【発明の概要】
【００２６】
発明の概要
本発明の目的は、改良された薬物動態学的特性および治療特性を有する生体適合性ポリマー−複合体化機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドの投与を含むｖＷＤを処置する方法を提供することである。
【００２７】
また、本発明の目的は、ＦＶＩＩＩ凝血促進活性を有し、ヒトＦＶＩＩＩ欠乏症を修正することができる治療有効量の複合体を必要とする対象に投与することを含むｖＷＤを処置するための方法であって、該複合体はポリペプチド上の１つ以上の所定の位置にて１つ以上の生体適合性ポリマーへ共有結合している機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドを含み、該所定の位置はポリペプチドのアミノ酸配列における位置番号(numerical position)により識別される特定のアミノ酸残基であり、Ｎ−末端アミンではない方法を提供することである。フォン・ヴィレブランド病はフォン・ヴィレブランド因子の欠乏および／または異常により特徴付けることができる。
【００２８】
また、本発明のさらなる目的は、ＦＶＩＩＩ凝血促進活性を有し、ヒトＦＶＩＩＩ欠乏症を修正することができる複合体を製造することを含むｖＷＤを処置するための薬物を製造するための方法であって、該複合体はポリペプチド上の１つ以上の所定の位置にて１つ以上の生体適合性ポリマーへ共有結合している機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドを含み、該所定の位置はポリペプチドのアミノ酸配列における位置番号により識別される特定のアミノ酸残基であり、Ｎ−末端アミンではない方法を提供することである。
【００２９】
本発明のさらなる目的は、ＦＶＩＩＩ凝血促進活性を有し、ヒトＦＶＩＩＩ欠乏症を修正することができる治療有効量のＦＶＩＩＩのシステイン置換変異体を必要とする対象に投与することを含むｖＷＤを処置するための方法であって、該変異体はＦＶＩＩＩ配列におけるアミノ酸に対して置換されたシステイン残基を有することにより特徴付けられ、該置換は配列番号：１の全長ヒトＦＶＩＩＩアミノ酸配列である成熟体を基準にして、システイン残基がＦＶＩＩＩに存在しないアミノ酸位置にてシステイン残基をもたらし、該システイン付加変異体は該置換システイン残基へ共有結合している生体適合性ポリマーを有することによりさらに特徴付けられる方法を提供することである。
【００３０】
本発明のさらなる目的は、改良された薬物動態学的特性を有する生体適合性ポリマー−複合体化Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩタンパク質を必要とする対象に投与することを含むｖＷＤを処置するための方法を提供することである。
【００３１】
本発明のさらなる目的は、低密度のリポタンパク質受容体−関連タンパク質（ＬＲＰ）、低密度のリポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、へパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）および／またはＦＶＩＩＩに対する阻害抗体への減少した結合性を有する生体適合性ポリマー−複合体化機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドを必要とする対象に投与することを含むｖＷＤを処置するための方法を提供する。
【００３２】
本発明のさらなる目的は、一貫した方法で均質製品として生産することができる、より良いインビボ作用持続期間および減少した免疫原性を有する治療有効量の改良されたＦＶＩＩＩ変異体の必要とする対象への投与を含むｖＷＤを処置するための方法を提供する。
【００３３】
本発明の１つの局面において、ＦＶＩＩＩ凝血促進活性を有し、ポリペプチド上の１つ以上の所定の位置にて１つ以上の生体適合性ポリマーへ共有結合している機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドを含む治療有効量の複合体を必要とする対象に投与することを含むｖＷＤを処置するための方法であって、該所定の位置はＮ−末端アミンではない方法を提供する。
【００３４】
本発明のさらなる局面において、手術前にＦＶＩＩＩ凝血促進活性を有し、ヒトＦＶＩＩＩ欠乏症を修正することができる治療有効量の複合体を対象に手術前に投与することを含み、それによって一過性の出血を弱める予防処置のための方法であって、該複合体はポリペプチド上の１つ以上の所定の位置にて１つ以上の生体適合性ポリマーへ共有結合している機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドを含み、該所定の位置はポリペプチドのアミノ酸配列における位置番号により識別される特定のアミノ酸残基であり、Ｎ−末端アミンではない方法を提供する。対象はｖＷＤ、例えば、３型ｖＷＤを有することができる。有利には、複合体を手術前２４時間以内に、好ましくは８時間以内、より好ましくは手術０．５から２時間前に投与する。
【００３５】
本発明のさらなる局面において、ＦＶＩＩＩ凝血促進活性を有し、ヒトＦＶＩＩＩ欠乏症を修正することができる治療有効量の複合体を必要とする対象に投与することを含み、それによって一過性の出血を弱める外傷の処置のための方法であって、該複合体はポリペプチド上の１つ以上の所定の位置にて１つ以上の生体適合性ポリマーへ共有結合している機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドを含み、該所定の位置はポリペプチドのアミノ酸配列における位置番号により識別される特定のアミノ酸残基であり、Ｎ−末端アミンではない方法を提供する。対象は３型ｖＷＤを含むｖＷＤを含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ｖＷＤノックアウト（ＫＯ）マウスにおけるＦＶＩＩＩ半減期が正常に戻るペグ化ＦＶＩＩＩの効果。図は、ｉ）ｖＷＦ  ＫＯマウスへのｒＦＶＩＩＩの投与（黒丸）、ｉｉ）ＦＶＩＩＩ  ＫＯマウスへのｒＦＶＩＩＩの投与（白丸）、ｉｉｉ）ｖＷＦ  ＫＯマウスへのペグ化ｒＦＶＩＩＩの投与（６４ｋＤ  ＰＥＧ１４、黒四角）、およびｉｖ）ｖＷＦ  ＫＯマウスへの異なったペグ化ｒＦＶＩＩＩの投与（６４ｋＤ  ＰＥＧ２＋１４、黒三角）による血漿ＦＶＩＩＩ活性の経時変化を説明する。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明の詳細な説明
本発明は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドがＮ−末端アミンではない所定の位置にて生体適合性ポリマーに共有結合することができ、実質的に凝固活性を維持している発見に基づく。さらに、これらのポリペプチド複合体は、改善された循環時間および減少した抗原性を有する。
【００３８】
本発明は、さらに、所定の位置にて生体適合性ポリマーに共有結合したＦＶＩＩＩ変異タンパク質が、修飾されていないＦＶＩＩＩよりも、ｖＷＦを欠いている対象の循環においてより長い半減期の凝血促進活性を有する発見に基づく。本発明の複合体を使用するｖＷＦを実質的に欠いている対象の処置は、ＦＶＩＩＩへのランダムポリマー結合またはＮ−末端での結合を有する先行技術の複合体の使用を越えて有利であり得る。部位特異的結合は生物学的活性のために必要である領域を避ける修飾を設計することで可能であり、それにより実質的なＦＶＩＩＩ活性を維持する。また、ＦＶＩＩＩクリアランスに関連する部位における結合をブロックするようにポリマーを結合するように設計することが可能である。部位特異的結合は、また、ランダムポリマー結合により当分野で生産される不均一な複合体よりも、均一な生産物ができる。軽鎖のＮ−末端アミンにおける結合を避けることにより、本発明の複合体は、ＦＶＩＩＩポリペプチドの活性部位へのリガンドの結合による活性の喪失の可能性を避ける。
【００３９】
定義
生体適合性ポリマー。生体適合性ポリマーは、ポリアルキレンオキシド、例えば、限定はしないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、コロミン酸または他の炭水化物ベースのポリマー、アミノ酸のポリマー、ビオチン誘導体、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−コ−リンゴ酸無水物、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ヘパリン、アルブミン、セルロース、キトサンの加水分解物、デンプン、例えば、ヒドロキシエチル−デンプンおよびヒドロキシプロピル−デンプン、グリコーゲン、アガロースおよびそれらの誘導体、グアーガム、プルラン、イヌリン、キサンタンゴム、カラギーナン、ペクチン、アルギン酸加水分解物、他の生物ポリマーおよびそれらのあらゆる同等物を含む。ポリマーの例は、ポリエチレングリコール、例えば、メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である。他の有用なポリアルキレングリコール化合物は、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリブチレングリコール（ＰＢＧ）、ＰＥＧ−グリシジルエーテル（Ｅｐｏｘ−ＰＥＧ）、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール（ＣＤＩ−ＰＥＧ）、分岐ポリエチレングリコール、直鎖ポリエチレングリコール、フォーク状ポリエチレングリコールおよび多分岐または“超分岐”ポリエチレングリコール（星形−ＰＥＧ）である。
【００４０】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）。本明細書において使用される“ＰＥＧ”および“ポリエチレングリコール”は相互互換であり、あらゆる水溶性ポリ（エチレンオキシド）を含む。一般的に、本発明において使用するためのＰＥＧは、構造“−−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−−”（（ｎ）は２から４０００である）を含む。本明細書において使用されるＰＥＧは、また、末端の酸素が置換されているか否かに依存して“−−ＣＨ２ＣＨ２−−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−−”および“−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯ−−”を含む。本明細書および本特許請求の範囲を通して、“ＰＥＧ”なる用語が、例えば、ヒドロキシルまたはＣ１−２０アルコキシ基に限定することなく、種々の末端または“末端キャップ”基を有する構造を含むことを認識すべきである。“ＰＥＧ”なる用語は、また、−ＯＣＨ  ２ＣＨ２−−繰り返しサブユニットの大部分、すなわち、５０％以上を含むポリマーを意味する。特定の形態に対して、ＰＥＧは非常に種々の分子量、ならびに構造または形状、例えば、分岐状、直鎖状、フォーク状および多分岐状であり得る。
【００４１】
ペグ化。ペグ化はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が分子、例えば、タンパク質に共有結合するプロセスである。
【００４２】
活性化または活性な官能基。官能基、例えば、生体適合性ポリマーが活性化として記載されているとき、官能基は他の分子上の求電子または求核原子と容易に反応する。
【００４３】
Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ）。本明細書において使用されるＢＤＤは、ＦＶＩＩＩのＢ−ドメインの全１４アミノ酸の欠失を含むアミノ酸配列を有することにより特徴付けられる。Ｂ−ドメインの最初の４アミノ酸（ＳＦＳＱ、配列番号：２）はＢ−ドメインの最後の１０残基（ＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ、配列番号：３）に結合する（Lind, et al, Eur. J. Biochem. 232:19-27, 1995）。本明細書において使用されるＢＤＤは配列番号：４のアミノ酸配列を有する。ＢＤＤポリペプチドの例はＷＯ２００６／０５３２９９（これは出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている。
【００４４】
ＦＶＩＩＩ。血液凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は肝臓により合成された糖タンパク質であり、血流に放出される。循環血液において、それはフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ、ＦＶＩＩＩ−関連抗原としても知られている）に結合し、安定な複合体を形成する。トロンビンにより活性化されると、それは複合体から解離し、凝固カスケードにおける他の凝固因子と相互作用し、最後に血栓の形成を誘導する。ヒト全長ＦＶＩＩＩは配列番号：１のアミノ酸配列を有するが、対立遺伝子多型が起こりうる。
【００４５】
機能性ＦＶＩＩＩポリペプチド。本明細書において使用される機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドは、インビボまたはインビトロにて、例えば、血友病Ａにより特徴付けられるヒトＦＶＩＩＩ欠乏を修正することが可能である機能性ポリペプチドまたはポリペプチドの組合せを示す。ＦＶＩＩＩは、天然状態における多数の分解物または加工された形態を有する。これらは、本明細書において証明されるとおり一本鎖タンパク質である前駆体からタンパク質分解により得られる。機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドは、このような一本鎖タンパク質を含み、ヒトＦＶＩＩＩ欠乏を修正する生物学的活性を有するこれらの種々の分解産物も提供する。アレル変異体が恐らく存在する。機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドは、ヒトＦＶＩＩＩの機能性セグメントを含み、必須の特徴的なヒトＦＶＩＩＩ機能活性が同じやり方で影響を受けずに維持されている限り、ＦＶＩＩＩの誘導体となるすべてのこのようなアレル変異体、グリコシル化バージョン、修飾物およびフラグメントを含む。このような必要な機能活性を有するＦＶＩＩＩの誘導体は、本明細書に記載されている直接的インビトロ試験により容易に同定することができる。さらに、機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドは、ＦＩＸａ、カルシウムおよびリン脂質の存在下でのＦＸａへの因子Ｘ（ＦＸ）の変換を触媒すること、ならびに血友病Ａ罹患個体由来の血漿における凝固障害を修正することが可能である。ヒトＦＶＩＩＩアミノ酸配列およびその機能性領域の配列の公開から、ＤＮＡの制限酵素切断またはヒトＦＶＩＩＩタンパク質のタンパク質分解もしくは他の分解を介して得ることができるフラグメントは、当業者に明らかである。機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドの例は、ＷＯ２００６／０５３２９９（これを出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている。
【００４６】
ＦＩＸ。本明細書において使用されるＦＩＸは、ヒト凝固因子ＩＸとしても知られている凝固因子ＩＸ、または血漿トロンボプラスチン成分を意味する。
【００４７】
ＦＸ。本明細書において使用されるＦＸは、名称、ヒト凝固因子Ｘおよび名称、スチュアートプラウナー因子としても知られている凝固因子Ｘを意味する。
【００４８】
薬物動態学。“薬物動態学”（“ＰＫ”）は、体内の薬物の吸収、分配、代謝および除去の特性を述べるために使用される用語である。薬物の薬物動態学の改善は、薬物を治療剤としてインビボにてより有効にさせる特性、とりわけ体内の有効な持続時間の改善を意味する。
【００４９】
変異タンパク質。変異タンパク質は、タンパク質またはポリペプチドにおける実験誘導変異の結果として生じる遺伝的に加工されたタンパク質である。
【００５０】
タンパク質。本明細書において使用されるタンパク質およびポリペプチドは同義である。
【００５１】
ＦＶＩＩＩクリアランス受容体。本明細書において使用されるＦＶＩＩＩクリアランス受容体は、１つ以上の他の分子と結合または関連して、循環からＦＶＩＩＩクリアランスをもたらす機能性ＦＶＩＩＩポリペプチド上の受容体領域を意味する。ＦＶＩＩＩクリアランス受容体は、ＬＲＰ、ＬＤＬ受容体および／またはＨＳＰＧに結合するＦＶＩＩＩ分子の領域を含むが、これらに限定されない。
【００５２】
すべての機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドが所定の位置にて変異されていてよく、本発明の方法にしたがって生体適合性ポリマーへ所定の位置にて共有結合していてよいと想定する。有用なポリペプチドは、配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有する全長ＦＶＩＩＩおよび配列番号：４に示されるアミノ酸配列を有するＢＤＤ  ＦＶＩＩＩを含むが、これらに限定されない。
【００５３】
本発明の複合体において使用される生体適合性ポリマーは、上記のあらゆるポリマーであり得る。生体適合性ポリマーは、薬物動態学において所望の改善を提供するように選択される。例えば、ポリマーの独自性、サイズおよび構造は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの循環半減期を改善させるか、または活性において許容されない減少なくポリペプチドの抗原性を減少させるように選択される。ポリマーはＰＥＧを含んでいてよく、一例として、ＰＥＧとして分子量の少なくとも５０％を有し得る。１つの態様において、ポリマーは、末端キャップ分子、例えば、ヒドロキシル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルケノキシ、置換アルケノキシ、アルキノキシ、置換アルキノキシ、アリールオキシおよび置換アリールオキシで末端を覆われているポリエチレングリコールである。他の態様において、ポリマーはメトキシポリエチレングリコールを含み得る。さらなる態様において、ポリマーは、３ｋＤから１００ｋＤまたは５ｋＤから６４ｋＤまたは５ｋＤから４３ｋＤの範囲のサイズを有するメトキシポリエチレングリコールを含み得る。
【００５４】
ポリマーは反応性部分を有し得る。例えば、１つの態様において、ポリマーは、機能性ＦＶＩＩＩポリペプチド上の遊離システインと反応し、共有結合を形成することができるスルフヒドリル反応性部分を有する。このようなスルフヒドリル反応性部分は、チオール、トリフラート、トレシラート、アジリジン、オキシラン、Ｓ−ピリジルまたはマレイミド部分を含む。１つの態様において、ポリマーは直鎖状であり、スルフヒドリル（例えば、メトキシ）に対して強く反応しない一方の末端に“キャップ”および他方の末端にスルフヒドリル反応性部分を有する。１つの態様において、複合体はＰＥＧ−マレイミドを含み、５ｋＤから６４ｋＤの範囲のサイズを有する。
【００５５】
有用な生体適合性ポリマーを選択するためのさらなるアドバイスは、以下の実施例において提供される。
【００５６】
ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列の部位特異的変異体は、当分野で既知のいずれかの方法により行われ得る。方法は、ポリマーの共有結合に対して選択される部位にシステインコドンを導入するための変異誘発を含む。これは、市販されている部位特異的変異誘発キット、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ｃＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  ＩＩ  部位特異的変異誘発キット、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  部位特異的変異誘発キットナンバーＫ１６００−１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｅｎＴａｙｌｏｒ  部位特異的変異誘発システムナンバー１２３９７０１４、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｓｉｔｅｓ  ＩＩ  インビトロ変異誘発システムキットナンバーＱ６２１０またはＴａｋａｒａ  Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ  ＬＡ  ＰＣＲ  変異誘発キットナンバーＴＡＫ  ＲＲ０１６を使用して達成され得る。
【００５７】
本発明の複合体は、最初に機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドの表面上の１つ以上のアミノ酸に対するコドンをシステインに対するコドンで置換し、組換え発現系においてシステイン変異タンパク質を生産し、変異タンパク質をシステイン−特異的ポリマー試薬と反応させ、そして、変異タンパク質を精製することにより製造され得る。
【００５８】
このシステムにおいて、システイン部位へのポリマーの付加はポリマー上のマレイミド活性官能基を介して成し遂げることができる。この技術の例は以下に提供されている。使用されるスルフヒドリル反応性ポリマーの量は、誘導体化されるシステインのモル量と少なくとも等モルであり、好ましくは過剰に存在する。例えば、少なくとも５倍モル過剰のスルフヒドリル反応性ポリマーが使用されるか、または少なくとも１０倍過剰のこのようなポリマーが使用される。共有結合のために有用な他の条件は当業者に知られている。
【００５９】
以下の実施例において、変異タンパク質は当分野の慣用の様式において名付けられる。変異体を名付けるための慣例は、配列番号：１において提供されている全長ＦＶＩＩＩの成熟体に対するアミノ酸配列に基づく。分泌タンパク質として、ＦＶＩＩＩは翻訳プロセス中にタンパク質分解的に開裂されるシグナル配列を含む。１９のアミノ酸シグナル配列の除去後、分泌されたＦＶＩＩＩ産物の第１のアミノ酸はアラニンである。
【００６０】
一般的に、かつ本明細書に使用されているとおり、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩにおける変異アミノ酸に言及しているとき、変異アミノ酸は全長ＦＶＩＩＩ配列における位置により示される。例えば、以下に記載されているＰＥＧ６変異タンパク質は、全長配列における１８０８と類似である位置にてリシン（Ｋ）をシステイン（Ｃ）に変化しているとき、Ｋ１８０８Ｃと示される。
【００６１】
ポリマーの共有結合に関する所定の位置は、ＦＶＩＩＩ活性に関連していないポリペプチドの表面に暴露されている部位から選択されるのが最も良い。このような部位は、また、ＦＶＩＩＩが循環から不活性化されるか、除外されるメカニズムに関連することが知られている部位から選択されるのが最も良い。これらの部位の選択は以下に詳細に記載されている。好ましい部位は、（ａ）低密度のリポタンパク質受容体関連タンパク質、（ｂ）ヘパリン硫酸プロテオグリカン、（ｃ）低密度のリポタンパク質受容体、および／または（ｄ）ＦＶＩＩＩ阻害抗体に対する結合部位中またはその付近のアミノ酸残基を含む。“結合部位中またはその付近”とは、生体適合性ポリマーの共有結合が結合部位の立体障害をもたらすであろう、結合部位に非常に近接している残基を意味する。このような部位は、例えば、結合部位の２０Å以内であると予期される。
【００６２】
本発明の１つの態様において、生体適合性ポリマーは、（ａ）ＦＶＩＩＩを分解することができるプロテアーゼに対する結合部位、および／または（ｂ）ＦＶＩＩＩ阻害抗体に対する結合部位中またはその付近のアミノ酸残基にて機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドに共有結合している。プロテアーゼは活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）であり得る。他の態様において、低密度のリポタンパク質受容体関連タンパク質のポリペプチドへの結合が、複合体化していないときのポリペプチドへの結合よりも少ないように（例えば、２分の１未満）、生体適合性ポリマーが機能性ＦＶＩＩＩポリペプチド上の所定の位置にて共有結合している。１つの態様において、生体適合性ポリマーは、ヘパリン硫酸プロテオグリカンのポリペプチドへの結合が、複合体化していないときのポリペプチドへの結合よりも少ないように（例えば、２分の１未満）、機能性ＦＶＩＩＩポリペプチド上の所定の位置にて共有結合している。さらなる態様において、生体適合性ポリマーは、ＦＶＩＩＩ阻害抗体のポリペプチドへの結合が、複合体化していないときのポリペプチドへの結合よりも少ないように（例えば、複合体化していないときのポリペプチドへの結合の２分の１未満）、機能性ＦＶＩＩＩポリペプチド上の所定の位置にて共有結合している。他の態様において、生体適合性ポリマーは、低密度のリポタンパク質受容体のポリペプチドへの結合が、複合体化していないときのポリペプチドへの結合よりも少ないように（例えば、２分の１未満）、機能性ＦＶＩＩＩポリペプチド上の所定の位置にて共有結合している。他の態様において、生体適合性ポリマーは、ポリペプチドが複合体化していないときよりも少ないポリペプチドを血漿プロテアーゼが分解するように、機能性ＦＶＩＩＩポリペプチド上の所定の位置にて共有結合している。さらなる態様において、血漿プロテアーゼによるポリペプチドの分解は、同じ条件下で同じ期間にわたって測定したとき、複合体化していないときのポリペプチドの分解の２分の１未満である。
【００６３】
ＦＶＩＩＩに対するＬＲＰ、ＬＤＬ受容体またはＨＳＰＧ結合親和性は、表面プラズモン共鳴技術（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して決定することができる。例えば、ＦＶＩＩＩをＢｉａｃｏｒｅＴＭチップに直接的に、またはＦＶＩＩＩ抗体を介して間接的に被覆し、種々の濃度のＬＲＰをチップ上を通過させ、相互作用のオン速度(on-rate)およびオフ速度(off-rate)両方を測定することができる（Bovenschen, et al., J. Biol. Chem. 278:9370-9377, 2003）。２つの速度の比率は親和性の基準を与える。ペグ化時に親和性の２倍、５倍、１０倍または３０倍の減少が望ましい。
【００６４】
プロテアーゼＡＰＣによるＦＶＩＩＩの分解は当業者に知られている方法により測定することができる。
【００６５】
１つの態様において、方法はＦＶＩＩＩアミノ酸位置８１、１２９、３７７、３７８、４６８、４８７、４９１、５０４、５５６、５７０、７１１、１６４８、１７９５、１７９６、１８０３、１８０４、１８０８、１８１０、１８６４、１９０３、１９１１、２０９１、２１１８および２２８４のうち１つ以上にて、ポリペプチドへ共有結合している生体適合性ポリマーを投与することを含む。他の態様において、生体適合性ポリマーが、ＦＶＩＩＩアミノ酸位置３７７、３７８、４６８、４９１、５０４、５５６、１７９５、１７９６、１８０３、１８０４、１８０８、１８１０、１８６４、１９０３、１９１１および２２８４のうち１つ以上にて、ポリペプチドへ共有結合しており、さらに（１）複合体の低密度のリポタンパク質受容体関連タンパク質への結合が非複合体化ポリペプチドの低密度のリポタンパク質受容体関連タンパク質への結合より少ないか；（２）複合体の低密度のリポタンパク質受容体への結合が非複合体化ポリペプチドの低密度のリポタンパク質受容体への結合より少ないか；または（３）複合体の低密度のリポタンパク質受容体関連タンパク質および低密度のリポタンパク質受容体両方への結合が非複合体化ポリペプチドの低密度のリポタンパク質受容体関連タンパク質および低密度のリポタンパク質受容体への結合への結合より少ない。
【００６６】
さらなる態様において、方法は、ＦＶＩＩＩアミノ酸位置３７７、３７８、４６８、４９１、５０４、５５６および７１１のうち１つ以上にてポリペプチドへ共有結合している生体適合性ポリマーを投与することを含み、複合体のヘパリン硫酸プロテオグリカンへの結合が非複合体化ポリペプチドのヘパリン硫酸プロテオグリカンへの結合より少ない。さらなる態様において、生体適合性ポリマーは、ＦＶＩＩＩアミノ酸位置８１、１２９、３７７、３７８、４６８、４８７、４９１、５０４、５５６、５７０、７１１、１６４８、１７９５、１７９６、１８０３、１８０４、１８０８、１８１０、１８６４、１９０３、１９１１、２０９１、２１１８および２２８４のうち１つ以上にてポリペプチドへ共有結合しており、複合体は非複合体化ポリペプチドよりＦＶＩＩＩ阻害抗体への結合が少ない。さらなる態様において、生体適合性ポリマーは、ＦＶＩＩＩアミノ酸位置８１、１２９、３７７、３７８、４６８、４８７、４９１、５０４、５５６、５７０、７１１、１６４８、１７９５、１７９６、１８０３、１８０４、１８０８、１８１０、１８６４、１９０３、１９１１、２０９１、２１１８および２２８４のうち１つ以上にて、例えば、位置３７７、３７８、４６８、４９１、５０４、５５６および７１１のうち１つ以上にてポリペプチドへ共有結合しており、複合体は非複合体化ポリペプチドよりもＦＶＩＩＩを分解できる血漿プロテアーゼから分解されない。血漿プロテアーゼは活性化タンパク質Ｃであり得る。
【００６７】
さらなる態様において、方法は、アミノ酸位置１２９、４９１、１８０４および／または１８０８にてＢ−ドメイン欠失ＦＶＩＩＩに共有結合している生体適合性ポリマーを投与することを含む。さらなる態様において、生体適合性ポリマーはＦＶＩＩＩアミノ酸位置１８０４にてポリペプチドに結合しており、ポリエチレングリコールを含む。生体適合性ポリマー結合のための１つ以上の所定の位置は部位特異的システイン変異により制御され得る。
【００６８】
機能性ＦＶＩＩＩポリペプチド上の１つ以上、例えば、１つまたは２つの位置は、ポリマー結合に関する所定の位置であり得る。特定の態様において、ポリペプチドはモノ−ペグ化またはジ−ペグ化される。
【００６９】
本発明は、また、所定の位置にてコード配列をシステイン残基と置き換えるように機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする核酸配列を変異させ；変異核酸配列を発現させ、システイン増大変異タンパク質を生産し；変異タンパク質を精製し；複合体が形成されるように、実質的に還元されたシステイン残基のみにてポリペプチドと反応するように活性化されている生体適合性ポリマーと変異タンパク質を反応させ；そして、複合体を精製することを含む、複合体の製造のための方法に関する。他の態様において、本発明は、（ａ）部位特異的ＦＶＩＩＩ変異タンパク質を発現させ、ここで、変異タンパク質はＦＶＩＩＩ変異タンパク質の暴露されている表面上のアミノ酸残基の代わりにシステインを有し、システインはキャップされている；（ｂ）システイン変異タンパク質を穏やかに還元させ、キャップを放出する条件下で、システイン変異タンパク質を還元剤と接触させ；（ｃ）システイン変異タンパク質からキャップおよび還元剤を除去し；そして（ｄ）還元剤の除去から少なくとも約５分、少なくとも１５分、少なくとも３０分後、ペグ化ＦＶＩＩＩ変異タンパク質が生産される条件下で、システイン変異タンパク質をスルフヒドリル結合部分を含むＰＥＧで処理することを含む、ＦＶＩＩＩ変異タンパク質の部位特異的ペグ化のための方法を提供する。ＰＥＧのスルフヒドリル結合部分は、チオール、トリフラート、トレシラート、アジリジン、オキシラン、Ｓ−ピリジルおよびマレイミド部分からなる群から選択される。
【００７０】
本発明は、また、治療有効量本発明の複合体および薬学的に許容されるアジュバントを含む非経口投与用医薬組成物を含む。薬学的に許容されるアジュバントは、活性成分に加えられ得る物質であり、製造物を製剤化または安定化するための助けとなり、患者に有意な有害な毒性効果を引き起こさない。このようなアジュバントの例は当業者に知られており、水、糖、例えば、マルトースまたはスクロース、アルブミン、塩などを含む。他のアジュバントは、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences by E. W. Martinに記載されている。このような組成物は、宿主への有効な投与のために適当な薬学的に許容される組成物を製造するために、有効量の本複合体を適当な量のビヒクルと共に含む。例えば、複合体は、出血の発現の重症度で変化し得る用量で血友病Ａに罹患している対象に非経腸的に投与され得る。血友病Ａに対して静脈内に投与される平均用量は、術前適応に対してキログラムあたり４０単位、軽度の出血に対してキログラムあたり１５から２０単位および維持投与のために８時間にわたっての投与に対してキログラムあたり２０から４０単位の範囲である。ｖＷＤの処置に対して、用量はキログラムあたり２５−４００ＩＵであり得る。ｖＷＤに対する他の有効な用量は、２５−５０、２５−１００、５０−７５、５０−１００、１００−２００、１５０−２００、２００−３００、２５０−３００、３００−３５０、３００−４００、２５−２５０、１００−４００および２００−４００ＩＵ／ｋｇである。低用量が予防のために有用であり、高用量がＦＶＩＩＩインヒビターを有する患者における免疫寛容誘導のために有用である。
【００７１】
１つの態様において、本発明の方法は、１つ以上の表面ＢＤＤアミノ酸をシステインで置換し、哺乳動物発現系においてシステイン変異タンパク質を生産し、培養培地由来のシステインにより発現中にキャップされているシステインを還元し、ＢＤＤジスルフィドが再形成できるように還元剤を除去し、そしてシステイン−特異的生体適合性ポリマー試薬、例えば、ＰＥＧ−マレイミドと反応させることを含む。このような試薬の例は、例えば、Ｎｅｋｔａｒ  カタログナンバー  2D2M0H01 mPEG-MAL MW 5,000 Da、2D2M0P01 mPEG-MAL MW 20 kD、2D3X0P01 mPEG2-MAL MW 40 kDの下にNektar Therapeutics of San Carlos, CAから入手できる５、２２または４３ｋＤ、または、ＮＯＦ  カタログナンバー  Sunbright ME-120MAおよびSunbright ME-300MAの下にNOF Corporation, Tokyo, Japanから入手できる１２または３３ｋＤのＰＥＧサイズを有するＰＥＧ−マレイミドである。ペグ化生産物は、未反応ＰＥＧを除去するためにイオン交換クロマトグラフィーを使用して、未反応ＢＤＤを除去するためにサイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製される。この方法は、同定するために、および、ＦＶＩＩＩとの好ましくない相互作用、例えば、受容体−介在クリアランス、阻害抗体結合およびタンパク質分解酵素による分解から選択的に保護するために使用することができる。ＰＥＧ試薬が、我々の研究室において６ｋＤとして分析されたものが５ｋＤとしてＮｅｋｔａｒまたはＮＯＦにより提供され、ならびに、同様にＰＥＧ試薬が、我々の研究室において２２ｋＤとして分析されたものが直鎖２０ｋＤとして提供され、４３ｋＤとして分析されたものが４０ｋＤとして提供され、および６４ｋＤとして分析されたものが６０ｋＤとして提供されたことを、我々は指摘する。混乱を避けるため、我々は、５ｋＤ  ＰＥＧ（我々は製造業者がそれを確認したとおりの５ｋＤとして報告する）を除いて、本明細書の記載において我々の研究室において分析されているとおりの分子量を使用する。
【００７２】
ＢＤＤの位置４９１および１８０８（上記）でのシステイン変異体に加えて、位置４８７、４９６、５０４、４６８、１８１０、１８１２、１８１３、１８１５、１７９５、１７９６、１８０３および１８０４を、可能性があるペグ化時にＬＲＰ結合の妨害を可能にするために、システインに変異させた。また、位置３７７、３７８および５５６を、ペグ化時にＬＲＰおよびＨＳＰＧ結合両方の妨害を可能にするために、システインに変異させた。これらの位置における大きなＰＥＧ（＞４０ｋＤ）での部位特異的ペグ化が、天然のグリコシル化部位（４１、２３９および２１１８）およびＬＲＰ結合部位におけるペグ化と共に、ＢＤＤの表面を完全に覆い、ＢＤＤに関する新規クリアランスメカニズムを同定することができるように、位置８１、１２９、４２２、５２３、５７０、１８６４、１９１１、２０９１および２２８４をＢＤＤにおいて等間隔に選択した。
【００７３】
１つの態様において、細胞培養培地は、ジスルフィド結合を形成することにより変異タンパク質のシステイン残基を“キャップ”するシステインを含む。複合体の製造において、組換え系において生産されるシステイン変異タンパク質は培地由来のシステインでキャップされ、このキャップはシステイン−特異的ポリマー試薬を加える前にキャップを放出する穏やかな還元により除去される。ＦＶＩＩＩの部位特異的変異体の当分野で既知の他の方法も、当業者に明らかであるため使用され得る。
【００７４】
ＦＶＩＩＩの構造活性相関分析
ＦＶＩＩＩおよびＢＤＤ  ＦＶＩＩＩは、生物学的反応に関連する多数の異なる部位を有する非常に大きな複合体分子である。薬物動態学的特性を改善するためにそれらを共有結合により修飾する以前の試みは、混同した結果であった。分子を特異的に変異させ、次に部位特異的方法においてポリマーを付加させることができることは、驚くべきことであった。さらに、非特異的付加および活性の減少を引き起こすこれまでのポリマー複合体における問題を考慮すると、改良された薬物動態学的特性および維持されている活性の結果も驚く
【００７５】
１つの態様において、本発明は、システイン−特異的リガンド、例えば、ＰＥＧ−マレイミドを使用する部位特異的変異誘発に関する。非変異ＢＤＤは、ＰＥＧ−マレイミドと反応するために利用できるシステインを有さないため、変異システイン位置のみがペグ化の位置である。より具体的には、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩは１９個のシステインを有し、このうち１６個はジスルフィドを形成し、他の３個は遊離システインである（McMullen, et al., Protein Sci. 4:740-746, 1995）。ＢＤＤの構造モデルは、全３個の遊離システインが覆い隠されていることを示唆する（Stoliova-McPhie, et al., Blood 99:1215-1223, 2002）。酸化されているシステインはＰＥＧマレイミドによりペグ化されないため、ＢＤＤにおいてジスルフィドを形成する１６個のシステインは、最初に還元されることなくペグ化されない。ＢＤＤの構造モデルに基づいて、ＢＤＤにおける３個の遊離システインは、最初にタンパク質を変性させ、これらのシステインがＰＥＧ試薬に暴露されることなくペグ化され得ない。したがって、機能を破壊するようなＢＤＤ構造が劇的に変化することなく、天然のシステイン残基にてペグ化によりＢＤＤの特異的なペグ化が達成されることは実行可能であると思えない。
【００７６】
全長ＦＶＩＩＩのＢドメインにおける４個のシステインのレドックス状態は未知である。Ｂドメインにおける４個のシステインのペグ化は、それらがジスルフィドを形成しておらず、表面に暴露されているとき可能であり得る。しかしながら、全長ＦＶＩＩＩおよびＢＤＤは同様の薬物動態学（ＰＫ）プロフィールおよび同様のインビボ半減期（Gruppo, et al., Haemophilia 9:251-260, 2003）を有するため、ＰＥＧが偶然に非Ｂドメイン領域も保護しないかぎり、Ｂドメインペグ化が血漿半減期の改善をもたらすことは起こりそうにない。
【００７７】
ＦＶＩＩＩ活性を維持し、薬物動態学を改善するポリマー結合に関するＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドにおける所定の位置を決定するために、以下の指針をＢＤＤ  ＦＶＩＩＩに基づいて示す。修飾はクリアランス、不活性化および免疫原性メカニズム、例えば、ＬＲＰ、ＨＳＰＧ、ＡＰＣおよび阻害抗体結合部位を標的とすべきである。Stoilova-McPhie, et al., (Blood 99:1215-23, 2002)はＢＤＤの構造を示す。例えば、半減期を延長するために、１個のＰＥＧをＡ２残基４８４−５０９およびＡ３残基１８１１−１８１８におけるＬＲＰ結合部位、または部位付近における特定の部位に導入することができる。これらの部位への巨大なＰＥＧの導入は、ＦＶＩＩＩがＬＲＰに結合する能力を破壊し、循環からのＦＶＩＩＩのクリアランスを減少させるはずである。活性に有意に影響せずに半減期を延長するために、ＰＥＧを残基１６４８に導入することができるとも思われ、それは全長分子中のＢドメインとＡ３ドメインの連結部分にあり、ＢＤＤではＡ２及びＡ３ドメインの間の１４−アミノ酸リンカー(linker)中にある。
【００７８】
ペグ化の特異性は、組換えＤＮＡ変異誘発技術を使用してＡ２またはＡ３ドメインへ単一システイン残基を設計し、次にシステイン−特異的ＰＥＧ試薬、例えば、ＰＥＧ−マレイミドにて導入されたシステインの部位特異的ペグ化により達成することができる。４８４−５０９および１８１１−１８１８におけるペグ化のさらなる利点は、これらの２つのエピトープが患者における阻害抗原部位の３つの主なクラスの２つを示すことである。循環半減期の改善および免疫原性応答の減少における最大の効果を達成するために、Ａ２およびＡ３  ＬＲＰ結合部位の両方をペグ化し、ジペグ化生成物を得ることができる。１８１１−１８１８領域はＦＩＸ結合にも関連しているため、この領域内のペグ化は活性の有意な喪失を引き起こし得ることに注意すべきである。また、５５８−５６５内の部位特異的ペグ化はＨＳＰＧ結合を破壊し、この領域がＦＩＸに結合するような活性を減少させ得る。
【００７９】
ＦＶＩＩＩの新規クリアランスメカニズムを確認するために、さらなる表面部位をペグ化することができる。Ａ２ドメインは活性化時にＦＶＩＩＩから解離され、小さなサイズであるため、ＦＶＩＩＩ分子の残りよりも恐らく速く循環から除去されるという点において、Ａ２ドメインのペグ化はさらなる利点を提供し得る。他方では、ペグ化Ａ２は、腎臓クリアランスから逃れるために十分な大きさであり、ＦＶＩＩＩの残りに匹敵する血漿半減期を有し得、したがってインビボにて活性化ＦＶＩＩＩを再構成することができる。
【００８０】
Ａ２およびＡ３領域におけるペグ化部位の同定。推定Ａ２  ＬＲＰ結合領域、または領域付近における５つの位置（ＰＥＧ１−５位置に対応するＹ４８７、Ｌ４９１、Ｋ４９６、Ｌ５０４およびＱ４６８）を、高い表面暴露およびそれらのＣαからＣβへの軌道の外側への向きに基づき、部位特異的ペグ化のための例として選択した。さらに、これらの残基は分子の三次元構造において互いからほぼ等距離であり、それらは一緒になってこの領域全体を表す。推定Ａ３  ＬＲＰ結合領域、または領域付近における８つの位置（ＰＥＧ６−１４に対応する１８０８、１８１０、１８１２、１８１３、１８１５、１７９５、１７９６、１８０３、１８０４）を部位特異的ペグ化のための例として選択した。ＰＥＧ６（Ｋ１８０８）は１８１１−１８１８および１８１０における天然のＮ結合グリコシル化部位に隣接している。位置１８１０（ＰＥＧ７）におけるペグ化は糖をＰＥＧで置換されるであろう。ＰＥＧ８位置Ｔ１８１２における変異体も、グリコシル化部位を破壊するであろう。ＰＥＧ９位置（Ｋ１８１３）は内側に向いていると予測されたが、構造モデルが正しくない場合にそれを選択した。ＰＥＧ１０（Ｙ１８１５）はＬＲＰ結合ループ内の巨大な疎水性アミノ酸であり、疎水性アミノ酸は一般的にタンパク質−タンパク質相互作用の中心に見られるため、重要な相互作用残基であり得る。１８１１−１８１８領域はＬＲＰおよびＦＩＸ結合の両方に含まれると報告されているため、このループ内におけるペグ化はおそらく活性の減少をもたらすと考えられた。したがって、ＰＥＧ１１−ＰＥＧ１４（１７９５、１７９６、１８０３、１８０４）は、異なるＰＥＧサイズによってＬＲＰおよびＦＩＸ結合を解離することができるように、１８１１−１８１８ループ付近であるがループ内にないように設計した。
【００８１】
ＬＲＰ結合部位の両方を同時にブロックするために、例えば、ＰＥＧ２およびＰＥＧ６位置におけるダブルペグ化(double PEGylation)を生じさせることができる。
【００８２】
５５８−５６５領域がＨＳＰＧおよびＦＩＸ両方へ結合することが示されているため、部位をこの領域内に設計しなかった。代わりに、ＰＥＧ１５−ＰＥＧ１７（３７７、３７８および５５６）を、結合したＰＥＧが両方の相互作用を妨げ、それらの間の起こりうる相互作用を崩壊させることができるように、Ａ２  ＬＲＰおよびＨＳＰＧ結合領域間に設計した。表面暴露されており外側に向いているさらなる部位も、ＬＲＰおよびＨＰＳＧ結合領域内または領域付近で選択することができる。新規クリアランスメカニズムを同定するために、ＦＶＩＩＩを系統的にペグ化することができる。ＰＥＧ１−１７に加えて、ＰＥＧ１８−２０に対応する３つの他の天然グリコシル化部位、すなわち、Ｎ４１、Ｎ２３９およびＮ２１１８は、表面暴露されているはずであるから、ペグ化のための連結点として使用することができる。ＰＥＧ２、ＰＥＧ６および４つのグリコシル化部位のＣβ原子から２０オングストローム半径内の表面領域は、ｖＷＦ、ＦＩＸ、ＦＸ、リン脂質およびトロンビンに関する機能性相互作用部位に加えてＢＤＤモデル上にマッピングされた。
【００８３】
次にＹ８１、Ｆ１２９、Ｋ４２２、Ｋ５２３、Ｋ５７０、Ｎ１８６４、Ｔ１９１１、Ｑ２０９１およびＱ２２８４に対応するＰＥＧ２１−２９を、それらのＣβ原子のそれぞれから２０オングストローム半径で、残っているＢＤＤ表面のほぼ全体を覆う能力に基づいて選択した。これらの位置も、完全に暴露されており、外側を向いており、天然のシステインから遠く離れており、正しくないジスルフィド形成の可能性が最小になるため、選択した。大型ＰＥＧ、例えば、６４ｋＤ分岐状ＰＥＧは約２０オングストローム半径を有する球を覆う可能性を有すると予期されるため、２０オングストローム半径を選択する。ＰＥＧ２およびＰＥＧ６ならびにグリコシル化部位ＰＥＧ１８、１９および２０と一緒のＰＥＧ２１−２９のペグ化はＦＶＩＩＩの非機能性表面のほぼ全体を保護する可能性がある。
【００８４】
増強された特性、例えば、改良されたＰＫプロファイル、より良い安定性または減少した免疫原性を誘導するペグ化の位置は、最大に増強された特性を有する複数−ペグ化された生成物を生産するために組み合わせることができる。ＰＥＧ３０およびＰＥＧ３１は、Ａ２およびＡ３ドメイン各々における暴露されているジスルフィドを除去することにより設計した。ＰＥＧ３０またはＣ６３０Ａは、ペグ化のため、そのジスルフィドパートナーＣ７１１を自由にさせる。同様に、ＰＥＧ３１、Ｃ１８９９ＡはＣ１９０３がペグ化されることを可能にする。
【実施例】
【００８５】
実施例
本発明をさらに理解するために、以下の実施例を説明する。これらの実施例は説明の目的のためのみであり、いかなる方法によっても本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。本明細書に記載されているすべての刊行物を、出典明示よりそれら全体を包含する。
【００８６】
実施例１．変異誘発
ペグ化のために選択された部位にシステインコドンを導入することにより、ＦＶＩＩＩの部位特異的ペグ化のための基質を生成することができる。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ｃＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ  ＩＩ  部位特異的変異誘発キットを使用して、すべてのＰＥＧ変異体を生産した（Stratagene Corporation, La Jolla, CA）。ｃＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ部位特異的な変異誘発方法は、ＰｆｕＴｕｒｂｏ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼおよび温度サイクラー(temperature cycler)を使用して行う。所望の変異体を含む２個の相補的オリゴヌクレオチドプライマーを、プライマーを置き換えないであろうＰｆｕＴｕｒｂｏ（登録商標）を使用して延長させる。野生型ＦＶＩＩＩ遺伝子を含むｄｓＤＮＡを鋳型として使用する。複数回伸長サイクル後、生成物をメチル化ＤＮＡに対して特異的であるＤｐｎＩ  エンドヌクレアーゼで消化する。変異体を含む新しく合成されたＤＮＡはメチル化されていないが、親の野生型ＤＮＡをメチル化されている。次に消化されたＤＮＡを使用して、ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  超−コンピテント細胞を形質転換させる。
【００８７】
変異誘発反応をｐＳＫ２０７＋ＢＤＤ  Ｃ２．６またはｐＳＫ２０７＋ＢＤＤのいずれかで行った。ＦＶＩＩＩの部位特異的な変異誘発、変異タンパク質の精製、ペグ化および活性測定の記載は、ＷＯ２００６／０５３２９９（これを出典明示により本明細書に包含させる）において見出すことができる。変異タンパク質の要約を表１に提供する。
表１
【表１】
0005674650.tif 000002
【００８８】
実施例２．ｖＷＦ結合ＥＬＩＳＡ
ＦＶＩＩＩを、溶液中の重度の血友病血漿中のｖＷｆに結合させる。次にＦＶＩＩＩ−ｖＷｆ複合体を、ｖＷｆ−特異的モノクローナル抗体で被覆されているマイクロタイタープレート上に捕獲する。ｖＷｆに結合したＦＶＩＩＩを、ＦＶＩＩＩポリクローナル抗体およびセイヨウワサビペルオキシダーゼ−抗−ウサギ複合体で検出する。ペルオキシダーゼ−複合体化抗体複合体は、基質を添加すると呈色反応を生じる。４パラメーターフィットモデルを使用して、サンプル濃度を標準曲線から補間する。ＦＶＩＩＩ結合の結果をμｇ／ｍＬで報告する。ペグ化により活性のいずれにおいても有意な影響はなく、これはＢドメインにおけるペグ化と一致する。結果は表２に見出すことができる。
表２
【表２】
0005674650.tif 000003
【００８９】
実施例３．薬物動態活性
ペグ化ＦＶＩＩＩおよびＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ）のＰＫを、ＦＶＩＩＩノックアウト（ＫＯ）マウスにおいて測定した。マウスに、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ（２００ＩＵ／ｋｇ）、アミノ酸位置１８０４に導入されたシステイン変異体において６４ｋＤ  ＰＥＧ（６４ｋＤ  ＰＥＧ１４）と複合体化したＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ（１０８ＩＵ／ｋｇ）、または位置４９１および１８０４にてそれぞれシステイン変異体において６４ｋＤ  ＰＥＧ（６４ｋＤ  ＰＥＧ２＋１４）と複合体化したＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ（１９４ＩＵ／ｋｇ）を静脈内(i.v.)注射によって与えた。血液試料を、５分、４時間、８時間、１６時間、２４時間、３２時間および４８時間に処理されたマウス（５匹マウス／処置／時点）から回収した。血漿ＦＶＩＩＩ活性をＣｏａｔｅｓｔ  アッセイにより測定した。終末相半減期を、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎにおける活性ｖｓ時間曲線のnon-compartment modelingにより測定した。ＦＶＩＩＩ  ＫＯマウスにおけるＢＤＤ−ＦＶＩＩＩに対するｔ１／２は６時間であるが、６４ｋＤ  ＰＥＧ（６４ｋＤ  ＰＥＧ１４）または１２８ｋＤ  ＰＥＧ（６４ｋＤ  ＰＥＧ２＋１４）と複合体化したＦＶＩＩＩに対するｔ１／２はそれぞれ１２．４３時間および１２．７５時間である。したがって、ペグ化ＦＶＩＩＩの半減期は、ＦＶＩＩＩ  ＫＯマウスにおけるＢＤＤ−ＦＶＩＩＩと比較して、約２倍に増加した。
【００９０】
ｖＷＦ  ＫＯマウスにおいて証明されるとおり、循環におけるｖＷＦの欠如はペグ化ＦＶＩＩＩの半減期延長への限界を排除した。マウスにＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ（２００ＩＵ／ｋｇ）、６４ｋＤ  ＰＥＧ１４（５２０ＩＵ／ｋｇ）、または６４ｋＤ  ＰＥＧ２＋１４（４００ＩＵ／ｋｇ）をi.v.投与により投与した。血液試料を、ＢＤＤＦＶＩＩＩ処置マウスから５分、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間および８時間に、およびペグ化ＦＶＩＩＩ処置マウスから５分、４時間、８時間、１６時間、２４時間、３２時間および４８時間に回収した（５匹マウス／処置／時点）。ｖＷＦ  ＫＯマウスにおいて約２％の正常レベルである、内因性マウスＦＶＩＩＩからバックグラウンド活性を除去するために、注入されたヒトＦＶＩＩＩの血漿活性をＣａｐｔｕｒｅ  Ｃｏａｔｅｓｔにより測定した。最初に、血漿におけるＢＤＤ−ＦＶＩＩＩおよびペグ化ＦＶＩＩＩをヒトＦＶＩＩＩのＡ３ドメインに特異的であるｍＡｂ  Ｒ８Ｂ１２（２ｕｇ／ｍＬ）により捕獲し、次にＣｏａｔｅｓｔにより測定した。ｖＷＦの保護なしに迅速にクリアされ、１８分と短いｔ１／２であるＢＤＤ−ＦＶＩＩＩと対照的に、６４ｋＤ  ＰＥＧ１４および６４ｋＤ  ＰＥＧ２＋１４のｔ１／２はそれぞれ５．７時間および８．２時間である（図１）。したがって、ＦＶＩＩＩ  ＫＯマウスにおけるｖＷＦの存在下において観察されるＢＤＤ−ＦＶＩＩＩと比較してＰＥＧ−ＦＶＩＩＩのｔ１／２の最大２倍増加と対照的に、６４ｋＤ  ＰＥＧ１４および６４ｋＤ  ＰＥＧ２＋１４のｔ１／２は、ｖＷＦ  ＫＯマウスにおけるｖＷＦの非存在下において、１９から２７倍延長される。さらに、ＰＥＧ−ＦＶＩＩＩのｔ１／２の延長はＰＥＧのサイズに比例する。
【００９１】
本明細書に記載されている全ての刊行物および特許は、出典明示により本明細書に包含させる。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、記載されている本発明の方法の種々の修飾および変化が当業者に明らかである。
【００９２】
本発明は特定の態様と関連して記載されているが、本発明はこのような特定の態様に不都合に限定されるべきでないと理解すべきである。実際に、生化学の分野または関連分野の当業者に明らかである本発明を実施するための上記様式の種々の修飾は、特許請求の範囲内であると意図される。当業者は、わずかに日常の実験を使用して、本明細書に記載されている本発明の特定の態様における多数の均等を認識するか、または確かめることができる。このような均等は特許請求の範囲に包含されることを意図する。
【図１】
0005674650.tif 000004
【配列表】
0005674650000001.app