(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(1)〜(3)の性質：
(1)  オーレオバシジウム・プルランスGM-NH-1A1株又はオーレオバシジウム・プルランスGM-NH-1A2株に由来する；
(2)  １Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有する；
(3)  水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下である、
を有するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む、ストレス状態における血中コルチコステロン低下剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストレス緩和剤、副交感神経の刺激剤及び／又は交感神経抑制剤、及びストレス緩和のため、又は交感神経抑制及び／又は副交感神経刺激(若しくはストレス緩和）のために用いられる飲食品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在の多様化した社会環境では、絶えずストレスに暴露され、肉体的・精神的な疲労を訴える人が増加している。そのメカニズムは動物でも同様のことが起こり、マウスへの強制拘束などのストレス負荷は、血中のコルチコステロン上昇や免疫力の低下（特にナチュラルキラー(ＮＫ)活性の低下）が報告されている。（非特許文献１，２、３）
【０００３】
ストレスという言葉は、古くはカナダの生理学者セリエ（H. Selye）により提唱され、生体が外部から強い熱や圧力などの強い刺激を受けたり、傷害を受けた際に生体が一定の変調をきたし、副腎皮質の肥大、脾臓や胸腺の萎縮、胃・十二指腸の出血や潰瘍といった一定の状態を引き起こすことを見つけた。このような状態をストレス状態と定義されている。これはストレスによって、大脳の視床下部、脳下垂体、副腎系に支配される内分泌系、そして自律神経系の機能亢進が起こることを示唆するものであった。また、アメリカの生理学者であるキャノン (W. B. Cannon) も生体が外部からの強い物理的あるいは精神的な刺激にさらされた場合、生体の恒常性を維持するために、交感神経系刺激によるアドレナリンの分泌による全身反応が誘引されることを発見した。具体的には、ネコが興奮して瞳孔の拡大や呼吸数・脈拍の増大、血圧上昇、胃腸機能の低下が起こることを見出していた。
【０００４】
最近では、ストレスに対する生体の反応として、内分泌系、自律神経系、免疫系での応答が明らかになってきている。生体にストレスがかかるとそれに応答して、アドレナリン、ノルアドレナリン、グルココルチコイド（糖質コルチコイドとも言われる）などのホルモンが分泌される。アドレナリン、ノルアドレナリン、カテコールアミンおよびドーパミンは副腎髄質から分泌され、グルココルチコイド、コルチゾールおよびコルチコステロンは副腎皮質から分泌される。そのメカニズムは、次のように説明されている。ストレスを感知した脳は、その不快シグナルを視床下部へ送り、順次、脳下垂体へと働きかけ、そこから副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）が分泌され、その刺激によって副腎皮質からグルココルチコイド等が分泌され、血中のグルコース濃度が増加する。同時に、ストレッサーを感じた脳は視床下部から自律神経に作用して活発化する。その際に自律神経のうち交感神経が刺激され、副腎髄質からアドレナリン等が分泌されて、血糖が増加すると共に血圧上昇などを誘引する。これらが、ストレスが与えられたときの生体の対応である。
過度のストレスがかかり続けると、上記の状態が持続し、傷害部位治癒遅延や筋肉の萎縮、胃粘膜の傷害、血管の傷害、胸腺の萎縮などを誘引して種々の疾病を引き起こすことになる。特に免疫系への傷害は深刻で、リンパ球の減少、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の活性低下を余儀なくされ、ウイルスや細菌感染などにさらされることとなる。
一方、自律神経は免疫を担当している器官（胸腺、リンパ節、骨髄、脾臓など）にも分布しており、その影響は大きいと考えられる。また白血球やＮＫ細胞、リンパ球に対しても自律神経系により調節されている。例えば、ＮＫ細胞は、交感神経優位な際に分泌されるアドレナリンによりその活性が低下する。グルココルチコイドはリンパ球を衰弱させ、マクロファージの活性も低下させることが知られている。逆に副交感神経優位になるとリンパ球の活性は増大する。このようにストレスによって免疫系が低下することは知られており、多くの疾病を引き起こす原因となっている。しかしながら抗ストレス効果と免疫賦活効果を合わせ持つ食品素材は知られていない。
近年、食習慣の変化、運動不足、過度のストレス、高齢化等の要因により、常習性ストレス者が増加している。ストレス者が増加していることは、厚生労働省の発表している、平成１４年患者調査（厚生労働省大臣官房統計情報部人口動態・保険統計課：平成１４年患者調査報告（疾病分類学））からも明らかである。
【０００５】
このような背景もあり、ストレスを緩和する機能を持った食品素材の開発が盛んに行なわれている。
【０００６】
β-1,3-1,6-D-グルカンはオーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)から調製され得ることが報告され（特許文献１）、腸管免疫活性化作用を有することが報告されている（特許文献２）。しかしながら、その由来に限られずβ-1,3-1,6-D-グルカンがストレス緩和作用を有することは報告されていない。
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−１０４４３９号公報
【特許文献２】特開２００６−１３７７１９号公報
【非特許文献１】「ストレスの生物学」室伏きみ子  著、オーム社  発刊日２００５年４月１０日、２−５５頁
【非特許文献２】「シンプル免疫学  改定第３版」中島  泉、高橋利忠、吉開泰信  著  南江堂  発刊日２００６年２月２０日、７３−８２頁
【非特許文献３】「ストレスと免疫」星  恵子  著、ブルーバックス  講談社  発刊日１９９３年５月２０日、５−８４頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、天然素材からなる安全なストレス緩和剤、及びストレス緩和の効果を有する飲食品組成物を提供することを課題とする。
【０００９】
さらにはストレスにより低下した免疫力の賦活効果を有する天然素材からなる飲食品組成物を提供することを課題とする。
【００１０】
さらに、本発明は、天然素材からなる安全な副交感神経刺激剤及び／又は交感神経抑制剤、及び副交感神経を刺激及び／又は交感神経を抑制することができる飲食品組成物を提供することも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物が産生するβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン（以下、本明細書においてβ−グルカンと称す）の健康維持・増進のための有効利用について研究を重ねた結果、このβ−グルカンをアルカリ処理により低粘度化したものは、ストレス緩和に優れた効果を示し、さらに自律神経系をも抑制及び／又は刺激して抗ストレス効果を示すことを見出した。さらにストレスを受けた際に低下した免疫活性を回復させる能力をも見出した。
【００１２】
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下のストレス緩和剤などを提供する。
【００１３】
本発明は、以下の(1)〜(3)の性質：
(1)  オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物に由来する。
(2)  １Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有する。
(3)  水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下である、
を有するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む、ストレス緩和剤を提供する。
【００１４】
本発明はまた、以下の(1)〜(3)の性質：
(1)  オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物に由来する。
(2)  １Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有する。
(3)  水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下である、
を有するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む、副交感神経刺激剤及び／又は交感神経抑制剤を提供する。
【００１５】
本発明はさらに、以下の(1)〜(3)の性質：
(1)  オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物に由来する。
(2)  １Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有する。
(3)  水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下である、
を有するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む、飲食品組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のストレス緩和剤は、ストレスに起因する症状の予防、改善、及び／又は治療等に有効である。
【００１７】
また、本発明のストレス緩和剤は、自律神経系、特に副交感神経系を亢進ないしは刺激、及び／又は交感神経系を抑制することから、ストレス緩和との関連が示唆される。
【００１８】
さらに、本発明におけるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの水溶液は低粘度であるため、摂取や除菌を行い易い点で有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ｉ）ストレス緩和剤
本発明のストレス緩和剤は、オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物に由来するβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンを含むものである。このβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンは、１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有し、かつ水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が好ましくは２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下、より好ましくは１００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下、さらに好ましくは５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下のものである。上記粘度の下限値は通常１０ｃＰ（ｍＰａ・s）程度であり得る。ＮＭＲの測定値は条件の微妙な変化によって変化し、また誤差を伴うことは周知のことであることから、「約４．７ｐｐｍ」「約４．５ｐｐｍ」は、通常予測される範囲の測定値の変動幅（例えば±０．２）を含む数値を意味する。
【００２０】
オーレオバシジウム属微生物が生産するβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン
オーレオバシジウム属の微生物が生産するβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンは、菌体外に分泌されるために回収が容易であり、また水溶性である点で好ましいものである。オーレオバシジウム属の微生物は、分子量が１００万以上の高分子量のグルカンから分子量が数万程度の低分子のグルカンまでを培養条件に応じて生産することができる。
【００２１】
中でも、オーレオバシジウム・プルランス(Aureobasidium pullulans)が生産するものが好ましく、オーレオバシジウム・プルランスGM-NH-1A1株、又はGM-NH-1A2株（独立行政法人産業技術研究所特許生物寄託センターにそれぞれFERM P-19285及びFERM P-19286として寄託済み）が生産するものが好ましい。GM-NH-1A1株及びGM-NH-1A2株は、オーレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）K-1株の変異株である。オーレオバシジウム属K-1株は、分子量２００万以上と１００万程度の２種類のβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンを生産することが知られている。
【００２２】
また、オーレオバシジウム属細菌が生産するβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、通常、硫黄含有基を有するところ、K-1株の生産するβ−グルカンはスルホ酢酸基を有することが知られている（Arg.Biol.Chem.,47,1167-1172(1983)）,科学と工業,64,131-135（1990））。GM-NH-1A1株、及びGM-NH-1A2株が生産するβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンもスルホ酢酸基を有すると考えられる。オーレオバシジウム属微生物の中には、リン酸基のようなリン含有基、リンゴ酸基などを含むβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンを生産する菌種、菌株も存在する。
【００２３】
GM-NH-1A1株及びGM-NH-1A2株は、後に実施例において示すようにメインピークが見かけ上５０〜２５０万の高分子量のβ−グルカン（微粒子グルカン）とメインピークが見かけ上２〜３０万の低分子量のβ−グルカンの両方を生産する菌株である。この微粒子状グルカンは、一次粒子径が０．０５〜２μｍ程度である。
【００２４】
β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの溶解度は、ｐＨ及び温度に依存する。このβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、ｐＨ３．５、温度２５℃の条件で２ｍｇ／ｍｌ水溶液を調製しようとすると、その５０重量％以上が一次粒子径０．０５〜２μｍの微粒子を形成し、残部は水に溶解する。本発明において粒子径は、レーザー回折散乱法により測定した値である。
【００２５】
β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが水溶液として製剤中に含まれている場合は、レシチンのような乳化剤や、環状デキストリンのような安定化剤を水溶液に添加することにより、微粒子をさらに安定化させることができる。
【００２６】
また、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンがオーレオバシジウム・プルランス由来のものである場合は、β-１，３結合／β-１，６結合の結合比は、１〜１．５程度、特に１．１〜１．４程度である。
【００２７】
本発明のストレス緩和剤に含まれるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン
本発明のストレス緩和剤に含まれるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、水溶液にしたときの粘度が、オーレオバシジウム属微生物が生産する天然型β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンより低い。この低粘度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、０．５％(w/v)水溶液（ｐＨ５．０）の３０℃における粘度が好ましくは２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、より好ましくは１００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、さらに好ましくは５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、よりさらに好ましくは１０ｃＰ以下である。本発明において、粘度はＢＭ型回転粘度計で測定した値である。
【００２８】
この低粘度グルカンは、オーレオバシジウム属微生物が生産する天然型β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンと同様の一次構造を有し得る。具体的には、１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである。ＮＭＲの測定値は条件の微妙な変化によって変化し、また誤差を伴うことは周知のことであることから、「約４．７ｐｐｍ」「約４．５ｐｐｍ」は、通常予測される範囲の測定値の変動幅（例えば±０．２）を含む数値を意味する。
【００２９】
このグルカンがオーレオバシディウム・プルランス（例えばＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株）由来のものである場合、得られるβ−１，３−１，６−D−グルカンをエキソ型のβ−１，３−グルカナーゼ（キタラーゼ Ｍ、ケイアイ化成製）で加水分解処理すると、分解生成物としてグルコースとゲンチオビオースの遊離が確認できる。このこと及びNMRの積算比から、オーレオバシディウム・プルランス由来のβ−１，３−１，６−D−グルカンはβ−１，３結合の主鎖に対し、β−１，６結合でグルコ−スが１分子側鎖に分岐した構造で、１，３−結合主鎖に対する１，６−結合の側鎖分岐度は、５０〜１００％程度、特に５０
〜９０％と推測される。
【００３０】
本発明のストレス緩和剤に含まれるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、金属イオン濃度が、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの固形分１ｇ当たり０．４ｇ以下であることが好ましく、０．２ｇ以下であることがより好ましく、０．１ｇ以下であることがさらにより好ましい。製剤中にβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが水溶液状態で含まれる場合は、金属イオン濃度は、水溶液の１００ｍｌ当たり１２０ｍｇ以下であることが好ましく、５０ｍｇ以下であることがより好ましく、２０ｍｇ以下であることがさらにより好ましい。
【００３１】
ここでいう金属イオンには、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、第３〜第５族金属イオン、遷移金属イオンなどが含まれるが、混入する可能性のある金属イオンとしては、代表的には、低粘度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの製造において使用されるアルカリ由来のカリウムイオン、ナトリウムイオンなどが挙げられる。金属イオン濃度は、限外ろ過や透析により調整できる。金属イオン濃度が上記範囲であれば、水溶液状態で保存する場合や、水溶液状態で加熱滅菌する際に、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンのゲル化、凝集、沈殿が生じ難い。また、固形製剤においても、再溶解させる場合に凝集などが生じ難い。
【００３２】
本発明のストレス緩和剤は、低粘度β−１，３−１，６−D−グルカンを固体状態で含んでいてもよく、又は水溶液のような液体ないしは流動状で含んでいてもよい。
【００３３】
オーレオバシジウム属のβ−１，３−１，６−D−グルカンの生産方法
β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、例えば、これを生産する微生物の培養上清に有機溶媒を添加することにより沈殿物として得ることができる。
【００３４】
また、オーレオバシジウム属の微生物を培養して、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産させる方法は種々報告されている。使用できる炭素源としては、シュークロース、グルコース、フラクトースなどの炭水化物、ペプトンや酵母エキスなどの有機栄養源等を挙げることができる。
【００３５】
窒素源としては、硫酸アンモニウムや硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素源等を挙げることができる。場合によってはβ−グルカンの生産量を上昇させるために適宜、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などの無機塩、更には鉄、銅、マンガンなどの微量金属塩やビタミン類等を添加するのも有効な方法である。
【００３６】
オーレオバシジウム属微生物を、炭素源としてシュークロースを含むツアペック培地にアスコルビン酸を添加した培地で培養した場合、高濃度のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産することが報告されている（Arg.Biol.Chem.,47,1167-1172(1983)）；科学と工業,64,131-135（1990）；特開平７−５１０８２号公報）。しかし、培地は、微生物が生育し、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産するものなら特に限定されない。必要に応じて酵母エキスやペプトンなどの有機栄養源を添加してもよい。
【００３７】
オーレオバシジウム属の微生物を上記培地で好気培養するための条件としては、１０〜４５℃程度、好ましくは２０〜３５℃程度の温度条件、３〜７程度、好ましくは３．５〜５程度のｐＨ条件等が挙げられる。
【００３８】
効果的に培養ｐＨを制御するためにアルカリ、あるいは酸で培養液のｐＨを制御することも可能である。更に培養液の消泡のために適宜、泡消剤を添加してもよい。培養時間は通常１〜１０日間程度、好ましくは1〜４日間程度であり、これによりβ−グルカンを生産することが可能である。なお、β−グルカンの生産量を測定しながら培養時間を決めてもよい。
【００３９】
上記条件下オーレオバシジウム属の微生物を４〜６日間程度通気攪拌培養すると、培養液にはβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを主成分とするβ−グルカン多糖が０．１％から数％(w/v)含有されており、その培養液の粘度はＢＭ型回転粘度計（東機産業社製）により３０℃では数百ｃＰ([ｍＰａ・s])から数千ｃＰ（[ｍＰａ・s]）という非常に高い粘度を有する。この培養を遠心分離して得られる上清に例えば有機溶媒を添加することにより、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを沈殿物として得ることができる。
【００４０】
低粘度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの製造方法
上記の高粘度のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを含む培養液を、常温で攪拌しながら、これにアルカリを添加すると、急激に粘度が低下する。
【００４１】
アルカリは、水溶性で、かつ医薬品や食品添加物として用いることができるものであればよく、特に限定されない。例えば、炭酸カルシウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸アンモニウム水溶液などの炭酸アルカリ水溶液；水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液などの水酸化アルカリ水溶液；あるいはアンモニア水溶液などを使用できる。アルカリは、培養液のｐＨが１２以上、好ましくは１３以上になるように添加すればよい。例えば水酸化ナトリウムを使用して培養液のｐＨを上げる場合は、水酸化ナトリウムの最終濃度が好ましくは０．５％(w/v)以上、より好ましくは１．２５％(w/v)以上になるように添加すればよい。培養液にアルカリを添加し、良く攪拌すると、瞬時に培養液の粘度が低下する。
【００４２】
次いで、アルカリ処理後の培養液から菌体などの不溶性物質を分離する。培養液の粘度が低いため、菌体を自然沈降させて上澄みを回収する方法（デカント法）、遠心分離、ろ紙あるいはろ布を利用した全量ろ過、フィルタープレス、更に膜ろ過（ＭＦ膜などの限外ろ過）などの方法で、容易に不溶性物質とグルカンとを分離できる。ろ紙あるいはろ布による全量ろ過の場合は、セライトなどろ過助剤を利用するのも一つの手段である。工業的にはフィルタープレスによる菌体除去が好ましい。
【００４３】
次いで、グルカンを含む溶液に酸を添加して中和する。中和は、不溶物の除去前に行ってもよい。酸は、医薬や食品添加物として使用できるものであればよく、特に限定されない。例えば、塩酸、燐酸、硫酸、クエン酸、リンゴ酸などを使用できる。酸の使用量は、溶液又は培養液の液性が中性（ｐＨ５〜８程度）になるような量とすればよい。即ち、中和はｐＨ７に合わせることを必ずしも要さない。
【００４４】
ｐＨ１２以上のアルカリ処理後、中和して得られるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が通常２００ｃＰ以下、場合によっては５０ｃＰ以下である。粘度は製造方法ないしは精製方法によって変動する。
【００４５】
アルカリ処理された低粘度のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、中和しても粘度が高くなることがない。さらに、常温（１５〜３５℃）では、液性をｐＨが４を下回るような酸性にしても、粘度が高くなることがない。
【００４６】
また、培養上清をアルカリ処理、及び中和した後に、菌体などを除去するのに代えて、培養上清から菌体などを除去した後に、アルカリ処理、及び中和を行うこともできる。
【００４７】
得られるグルカン水溶液からグルカンより低分子量の可溶性夾雑物（例えば塩類など）を除去する場合は、例えば限外ろ過を行えばよい。
【００４８】
また、アルカリ処理、除菌した後、中和せずに、アルカリ性条件下で限外ろ過することもでき、これにより透明性、熱安定性、長期保存性に一層優れる精製β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが得られる。アルカリ性条件は、ｐＨ１０以上、好ましくは１２以上であり、ｐＨの上限は通常１３．５程度である。
【００４９】
このようにして得られる水溶液に含まれるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、乾燥させて固形製剤にする場合も、また水溶液のまま製剤として使用する場合も、一旦、水溶液から析出させることができる。β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの析出方法は、特に限定されないが、例えば、限外ろ過などにより濃縮してグルカン濃度を１ｗ／ｗ％以上にした水溶液に、エタノールのようなアルコールを、水溶液に対して容積比で等倍以上、好ましくは２倍以上添加することにより、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを析出させることができる。
【００５０】
β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを低粘度化することにより、限外ろ過などによる濃縮を容易に行えることから、アルコール沈殿に使用するアルコール量を少なくすることができる。
【００５１】
固形製剤にする場合は、低粘度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン水溶液を直接乾燥させてもよく、析出させたβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを乾燥させてもよい。乾燥は、噴霧乾燥法、凍結乾燥法等公知の方法で行うことができる。
【００５２】
（Ｉ）製剤
本発明のストレス緩和剤において、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは、必要に応じて薬学的に許容される担体とともに適当な製剤とすることができる。このような担体として、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、付湿剤等が挙げられる。また、酸化防止剤のような慣用の添加剤なども含まれていてよい。
【００５３】
製剤の形態は特に限定されず、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等のどのような形態であってもよい。アルカリ処理された低粘度のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを使用する場合は、高濃度の水溶液を調製できることから、シロップ剤にする場合にも、１日に無理なく摂取できる量に有効量のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを含ませることができる。
【００５４】
賦形剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、乳糖、ショ糖、ブドウ糖等の各種の糖類；バレイショデンプン、コムギデンプン、トウモロコシデンプン等の各種デンプン類、；結晶セルロース等の各種セルロース類；無水リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム等の各種無機塩類等が挙げられる。
【００５５】
結合剤としては、公知のものを使用でき、例えば、結晶セルロース、プルラン、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等が挙げられる。
【００５６】
崩壊剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、デンプン、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００５７】
潤沢剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油などが挙げられる。
【００５８】
付湿剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、ココナッツ油、オリーブ油、ゴマ油、落花生油、大豆リン脂質、グリセリン、ソルビトール等が挙げられる。
【００５９】
製剤中に含まれるβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの量は、投与対象又は患者の年齢、体重、症状、投与方法等によって変化し得るが、例えば、体重７０ｋｇの成人男性の場合、１日摂取量が１〜１０００ｍｇ程度、好ましくは１０〜５００ｍｇ程度、より好ましくは１０〜２００ｍｇ程度、さらに好ましくは２５〜１００ｍｇ程度になるような量含まれていればよい。上記摂取量の範囲であれば、十分にストレス緩和効果が得られるとともに、下痢のような副作用や毒性が現れるということがない。
【００６０】
１日１回投与する製剤である場合は、１日必要量が一つの製剤に含まれていればよく、例えば１日３回投与する製剤である場合は、１日必要量の３分の１が製剤に含まれていればよい。
【００６１】
また、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤のような固形製剤の場合は、製剤中にβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが０．１〜１００重量％程度、特に1〜５０重量％程度含まれていることが好ましい。
【００６２】
また、シロップ剤のような液体又は流動状の製剤の場合は、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが０．０１〜２重量％程度、特に０．０５〜０．５重量％程度含まれていることが好ましい。なお、液体又は流動状の製剤中のグルカンは一部が溶解していない場合もある。
【００６３】
上記範囲であれば、摂取し易い製剤量中に、ストレス緩和効果が十分に得られるとともに副作用や毒性が現れない量のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが含まれることになる。またシロップ剤の場合は、上記範囲であれば、飲み易い粘度のシロップ剤が得られる。
【００６４】
また、本発明のストレス緩和剤には、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンによるストレス緩和効果を損なわない範囲で、ストレス緩和剤に通常含まれる成分や添加剤が含まれていてもよい。
投与対象
本発明のストレス緩和剤は、ストレスに曝されているヒトを含む哺乳動物に好適に投与できる。この中には、ストレス下にある以外は健康なヒトの他に、他の疾患を併発している患者も含まれる。さらに、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは安全な天然成分であることから、ストレスを受け易い生活環境の健常人も予防的に適時又は常時摂取することができる。
【００６５】
本発明のストレス緩和剤は、ストレスに起因する身体的、精神的不調を予防及び／又は改善する作用を有する。ここで「予防」とは、ストレスに起因する不調の発症を完全に阻止することのみならず、その程度を抑制することも含むものとする。また、「改善」とは、かかる不調から完全に回復することのみならず、不調を緩和することも含むものとする。
【００６６】
本発明におけるストレスとは、精神的、肉体的に負担となる刺激や状況を含む概念である。
【００６７】
本発明のストレス緩和剤は、うつ病、不安障害、胃・十二指腸潰瘍、過敏性腸症候群、気管支喘息、高血圧症、自律神経失調症等ストレスにより惹起される症状を予防及び／又は改善し、より具体的には、心的外傷後ストレス障害、ストレス性胃炎、ストレス性潰瘍、過敏性腸症候群、ストレス性喘息、ストレス性脱毛、ストレス性精神障害、鬱、心身症、パニック障害、ストレス性不眠、ストレス性高血圧症、ストレス性頭痛、ストレス性無月経、ストレス性便秘、ストレス性過食あるいは拒食症、およびストレス性性機能不全等を予防及び／又は改善する。
【００６８】
（ＩＩ）副交感神経刺激剤及び／又は交感神経抑制剤（ストレス緩和剤）
上記説明したオーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物に由来するβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンは、副腎交感神経活動の抑制、胃副交感（迷走）神経の亢進、脾臓交感神経活動を抑制することから、交感神経抑制剤及び／又は副交感神経刺激剤として使用することができる。また、交感神経を抑制及び／又は副交感神経を刺激するためストレスを緩和することができ、ストレス緩和剤としても使用することができる。
【００６９】
前述したように、このβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンは、１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有し、かつ水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が好ましくは２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下、より好ましくは１００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下、さらに好ましくは５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下、よりさらに好ましくは１０ｃＰ以下のものである。
【００７０】
投与対象は、自律神経系の異常が悪影響を及ぼす種々の疾患に羅患しているヒトを含み、好ましくはストレスを感じているヒトを含む。また、上記グルカンは天然の安全な成分であることから、健常人が常時摂取することもできる。
【００７１】
（ＩＩＩ）飲食品組成物
本発明の飲食品組成物は、上記説明したβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを含む。この飲食品組成物は、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを含むことからストレスを緩和する作用、及び交感神経を抑制し及び／又は副交感神経を刺激しストレスを緩和する作用を有するため、健康食品、機能性食品、又は栄養機能食品又は特定保健用食品のような保健機能食品として好適に使用できる。ここで、本発明における健康食品は、一般に「健康によい」として売られている食品全般、又は消費者が健康に良いと積極的な効果を期待して摂取する医薬品以外の食品を含み、健康補助食品を含む。また、本発明における機能性食品は、生体調節機能を充分に効率よく発現するように設計した食品を含む。
【００７２】
従って、本発明の飲食品組成物は、ストレスを緩和するために使用される旨の表示、又は交感神経を抑制及び／又は副交感神経を刺激するため、若しくはストレスを緩和するために使用される旨の表示が付されたものとすることができる。
【００７３】
本発明の飲食品組成物に含まれる飲食品の種類は特に限定されない。β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを添加できるものであれば、栄養ドリンク、ジュース、茶、スープのような各種飲料品はもちろんのこと、クッキー、飴、ガム、ゼリー、寒天、プリン、グミ、チョコレート、澱粉加工食品などいかなる飲食品でも用いることができる。パン、うどんのような麺類、ヨーグルトやチーズなどの乳製品、ドレッシングやマヨネーズなどの加工食品、嚥下用補助食品等も好適である。各飲食品の特性や目的に応じ、製造工程の適切な段階で配合すればよい。
【００７４】
本発明の飲食品組成物中には、１日摂取量が好ましくは１〜１０００ｍｇ程度、好ましくは１０〜５００ｍｇ程度、さらに好ましくは１０〜２００ｍｇ程度、よりさらに好ましくは２５〜１００ｍｇ程度になるようにβ−１，３−１，６−グルカンが含まれていればよい。特に、難治性のストレスに起因する疾患を有する患者に与えるためのものである場合は、１日摂取量が１〜１０００ｍｇ程度、特に１０〜５００ｍｇ程度になる量のβ−１，３−１，６−グルカンが含まれていればよい。
【００７５】
β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンは人体に対して無毒性であるから、その添加割合に特に制限はないが、各飲食品の特性、呈味性あるいは経済性等を考慮して、固形、半固形又はゲル状食品の場合、その添加量は組成物全体量に対して通常０．０１〜５重量％程度、好ましくは０．０1%〜２重量％程度であればよい。ヨーグルトのような半固形状の食品も、食する上で流動性が求められない点で固形状食品に含まれる。上記の範囲であれば、無理なく摂取できる食品量中に、ストレス緩和に有効な１日摂取量のβ−１，３−１，６−グルカンが含まれることになる。また、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの上記含有比率であれば、グルカンの溶解性が良好であり粘度が低く吸収され易い。
【００７６】
また同様の理由で、液体、流動状、又は半流動状の飲料組成物にβ−１，３−１，６−グルカンを含ませる場合のその含有量は、組成物全体に対して、０．０１〜５重量％程度が好ましく、０．０１〜２重量％程度がより好ましい。上記の範囲であれば、無理なく摂取できる食品量中にストレス緩和に有効な１日摂取量のβ−１，３−１，６−グルカンが含まれることになる。また、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの含有比率が上記範囲であれば、殺菌などの熱処理によってもゲル化や粘度上昇を起こす恐れがない。なお、飲料組成物中のグルカン濃度が高い場合は一部が溶けずに含まれる場合もある。
【００７７】
本発明の飲食品組成物には、本発明の効果を損なわない範囲で、食品分野で慣用の補助成分が含まれていて良い。このような補助成分として、例えばフラクトオリゴ糖、乳果オリゴ糖、大豆オリゴ糖、イソマルトースのようなオリゴ糖；ビフィドバクテリウム、ラクトバチラス、エンテロコッカス属のような乳酸菌；アガリクス、マイタケ、シイタケ、メシマコブ、チャーガ、ハナビラタケのようなキノコ類、またはその抽出物；α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリンのようなシクロデキストリンや直鎖デキストリンおよび難消化デキストリン；クエン酸、リンゴ酸、ヒアルロン酸のような有機酸；トリプトファン、メチオニン、テアニン、GABA（γ‐アミノ酪酸）などのアミノ酸、β‐カロテン、ルテイン、アスタキサンチン、フコキサンチンなどのβ‐カロチノイド類、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンEのようなビタミン類；亜鉛、鉄、マグネシウム、セレン、クロム、銅、マンガン、モリブデン、ヨウ素のようなミネラル；ラクトフェリン；ローヤルゼリー；プロポリス；カテキン；ウコン；トレハロース；高麗ニンジン；ショウガ；紅花；イチョウ葉またはイチョウ葉エキス；アロエ；サイリウム；シャンピニオン；黒酢；各種香料などが挙げられる。
【００７８】
特に、β−１，３−１，６−D−グルカン０．０１〜５重量％(特に０．０１〜２重量％）程度と乳酸菌（中でも、殺菌乳酸菌粉末）、オリゴ糖、又は／及びアミノ酸をそれぞれ０．０１〜２重量％程度とを含む飲食品組成物が好ましい。この場合の飲食品組成物は、固形、半固形、ゲル状、液体状、流動状、半流動状のいずれの飲食品組成物であってもよい。
【００７９】
また、本発明の飲食品組成物は、一般の飲食品を主体とするものではなく、賦形剤又は担体等とともにβ−１，３−１，６−グルカンを錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤などの形状に成形した、例えば固形のいわゆるサプリメント製剤(栄養補助製剤）であってもよい。賦形剤は製剤の項目で例示したものを使用できる。この場合のβ−１，３−１，６−グルカンの含有量は、組成物全体に対して、１０〜８０重量％程度が好ましく、１０〜５０重量％程度がより好ましい。
【００８０】
特に、β−１，３−１，６−D−グルカン１０〜８０重量％（特に１０〜５０重量％）程度と乳酸菌（中でも、殺菌乳酸菌粉末）、オリゴ糖、又は／及びアミノ酸をそれぞれ１〜１０重量％程度とを含むものが好ましい。
【００８１】
本発明の飲食品組成物は、ストレス状態又はストレス状態気味のヒト、ストレスを感じているヒト、自律神経系の異常による疾患に羅患しているヒトが必要時、又は日常的に摂取するのに好適である。
実施例
次に実施例及び試験例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００８２】
（１）低粘度β−１，３−１，６−グルカンの調製
（１-1）β−グルカンの培養生産
後掲の表１に示す組成を有する液体培地１００ｍｌを５００ｍｌ容量の肩付きフラスコに入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌を行った後、オーレオバシジウム  プルランス（Aureobasidium pullulans）GM-NH-1A1株（FERM P-19285）を同培地組成のスラントより無菌的に１白金耳植菌し、１３０ｒｐｍの速度で通気攪拌しつつ、３０℃で２４時間培養することにより種培養液を調製した。
【００８３】
次いで、同じ組成の培地２００Ｌを３００Ｌ容量の培養装置（丸菱バイオエンジ製）に入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌し、上記のようにして得られた種培養液２Ｌを無菌的に植菌し、２００ｒｐｍ、２７℃、４０L／ｍｉｎの通気攪拌培養を行った。なお、培地のｐＨは水酸化ナトリウム及び塩酸を用いてｐＨ４．２〜４．５の範囲内に制御した。９６時間後の菌体濁度はＯＤ６６０ｎｍで２３ ＯＤで、多糖濃度は０．５％(w/v)で、置換スルホ酢酸含量は０．０９％であった。
＜多糖濃度測定＞
多糖濃度は、培養液を数ｍｌサンプリングし、菌体を遠心分離除去した後、その上清に最終濃度が６６％(v/v)となるようにエタノールを加えて多糖を沈殿させて回収した後、イオン交換水に溶解し、フェノール硫酸法で定量した。
＜置換スルホ含量測定＞
同様にして菌体を除去した培養上清にエタノールを最終濃度が６６％となるように添加し、β−グルカンを沈殿回収した。その後、再度イオン交換水に溶解し、再度遠心分離後、その上清に最終濃度が０．９％になるように食塩を加えた後、再度６６％エタノールでβ−グルカンを回収した。このβ−グルカン回収精製操作を更に２回繰り返し、得られたβ−グルカン水溶液をイオン交換水で透析後、凍結乾燥によりβ−グルカン粉末を得た。
【００８４】
このβ−グルカン粉末を燃焼管式燃焼吸収後、イオンクロマト法で組成分析した結果、Ｓ含量は２３９ｍｇ／ｋｇであり、この値から計算される置換スルホ酢酸含量は０．０９％であった。
【００８５】
【表１】
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【００８６】
（１−２）アルカリ処理
上記のようにして得られた培養液の粘度をＢＭ型回転粘度計（東京計器製）を用いて、３０℃、１２ｒｐｍで測定したところ、１５００ｃＰ（(ｍＰａ・ｓ)）であった。測定に用いるロータは粘度にあわせて適当なものを選択した。
【００８７】
この培養液に水酸化ナトリウム最終濃度が２．４％(w/v)となるように２５％(w/w)水酸化ナトリウムを添加し攪拌したところ（ｐＨ１３．６）、瞬時に粘度が低下した。引き続いて５０％(w/v)クエン酸水溶液でｐＨ５．０となるように中和してから濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度を測定したところ、そのときの粘度（３０℃）は２０ｃＰ([ｍＰａ・s])であった。
【００８８】
次いで、この培養液にろ過助剤としてＫＣフロック（日本製紙社製）を１ｗｔ％添加し、薮田式ろ過圧搾機（薮田機械製）を用いて菌体を除去し、最終的に培養ろ液（約２３０Ｌ）を得た。その多糖濃度は０．５％(w/v)で、ほぼ１００％の回収率であった。
【００８９】
（１−３）β−グルカン水溶液の脱塩
上記のβ−グルカン水溶液（培養ろ液）を０．３％に希釈後、限外ろ過（ＵＦ）膜（分子量カット５万、日東電工社製）を用いて脱塩を行い、最終的にナトリウムイオン濃度を２０ｍｇ／１００ｍｌに落とした後、５０％(w/v)クエン酸水溶液によりｐＨを３．５に調整した。
【００９０】
引き続いて、ホット充填用加熱ユニット（日阪製作所製）を用いて９５℃で、３分間保持することにより殺菌処理を行い、最終製品のβ−グルカン水溶液を得た。この時のβ−グルカンの濃度をフェノール硫酸法により測定したところ０．２２％(w/v)であった。また、培養液からのトータル収率は約７３％であった。
＜硫黄含有量の測定＞
また、得られたβ−グルカン水溶液をイオン交換水で透析後、凍結乾燥によりβ−グルカン粉末を得た。本β−グルカンの組成分析結果からＳ含量は３３０ｍｇ／ｋｇであり、これから計算される置換スルホ酢酸含量は０．１２％であった。
＜結合状態の確認＞
また、脱塩を行った上記培養ろ液について、コンゴーレッド法によって、４８０ｎｍから５２５ｎｍ付近への波長シフトを確認することができたのでβ−１，３結合を含むグルカンを含有していることが証明された（K. Ogawa, Carbohydrate Research, 67, 527-535 (1978)、今中忠行  監修, 微生物利用の大展開, 1012-1015, エヌ・ティー・エス（2002））。そのときの極大値へのシフト差分はΔ0.48/500μｇ多糖であった。
【００９１】
上記培養ろ液１５ｍｌを取り出し、３０ｍｌのエタノールを添加し、４℃、１０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎで遠心して、沈殿する多糖を回収した。６６％エタノールで洗浄し、４℃、１０００ｒｐｍ、１０分間遠心して、沈殿する多糖に２ｍｌのイオン交換水と、１ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加撹拌後、６０℃、１時間保温して沈殿を溶解させた。次に-８０℃にて凍結後、一晩、真空凍結乾燥を行い、乾燥後の粉末を１ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液に溶解させ、２次元ＮＭＲに供した。
【００９２】
２次元ＮＭＲ（１３Ｃ−１Ｈ  ＣＯＳＹ ＮＭＲ）１０６ｐｐｍと相関関係を有する１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを図７に示す。このスペクトルにおいて４．７ｐｐｍと４．５ｐｐｍ付近との２つのシグナルが得られた。
【００９３】
この結果、本β−グルカンがβ−１，３−１，６−Ｄグルカンであることが証明された（今中忠行  監修、微生物利用の大展開、1012-1015、エヌ・ティー・エス（2002））。それぞれの１Ｈ  ＮＭＲシグナルの積分比から、β−１，３結合／β−１，６結合の比は１．１５であることが判明した。
＜粒度測定＞
次に、レ−ザ回折/散乱式粒度分布測定装置(ＨＯＲＩＢＡ製ＬＡ−９２０)を用いて培養液の粒度を測定したところ、粒子としては０．３μｍと１００μｍ程度の大きさのところにピ−クが見られた。続いて、超音波を照射しながら、粒度測定を行うと、１００μｍのピ−クはみるみるうちに消失し、０．３μｍのピ−クが増え、最終的に０．３μｍのみとなった。超音波照射したときの培養液の粒度分布を図８に示す。
【００９４】
０．３μｍのピークはβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの一次粒子によるピークであり、１００〜２００μｍのピークはβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの一次粒子が凝集した二次粒子によるピークであると考えられる。
【００９５】
また、二次粒子はマグネチックスタラ−による攪拌、軽い振とうでも同じように消失し、容易に砕けて一次粒子になることが確認された。よって、二次粒子は非常に緩い凝集(緩凝集状態)と考えられる。
＜分子量測定＞
また、東ソー社製のトーヨーパールＨＷ６５（カラムサイズ７５ｃｍ×φ１ｃｍ、排除分子量２５０万（デキストラン））を用いて、０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルろ過クロマトグラフィーを行い、溶解β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンとβ−１，３−１，６−Ｄグルカンの１次粒子とを含む溶液の分子量を測定したところ、溶解β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンに由来する２〜３０万のピークの低分子画分と、１次粒子に由来する見かけ上５０〜２５０万の高分子画分との二種類が検出された。分子量のマーカーとしてＳｈｏｄｅｘ社製のプルランを用いた。
【００９６】
水溶性β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンと微粒子とを分離するため、上記の微粒子画分と可溶性画分とを含むβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン溶液をアドバンテック社製のフィルター（０．２μｍ）でろ過を行ったところ、５０〜２５０万の高分子画分が消失した。このことから、高分子画分はβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの一次粒子や一次粒子が凝集した二次粒子に相当することが判明した。よって、水溶性β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの分子量は２〜３０万と考えられる。
【００９７】
（２）粉末化グルカンの調製
（１）において、アルカリ処理および菌体除去処理により調製された微粒子β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを含むβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン水溶液に、最終濃度が６６％(v/v)となるようにエタノールを添加して、多糖グルカンを沈殿させ、遠心分離法により回収した。次いで凍結乾燥法によりエタノールと水分を除去し、乾燥β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを得た。そのときの収率はエタノール沈殿前の全糖濃度と比較して９５％以上であった。
【００９８】
次いで、得られた乾燥β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを最終濃度が０．３％（ｗ／ｖ）となるように水に溶解分散後、前述したと同様にして東ソー社製のトーヨーパールＨＷ６５（カラムサイズ  ７５ｃｍ×φ１ｃｍ、排除分子量２５０万（デキストラン））により０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルクロマトグラフィーを行い、分子量を測定したところ、得られた多糖の分子量は２〜３０万のピークの低分子画分と見かけ上５０〜２５０万の高分子画分の二種類からなることが判明した。ここで、分子量のマーカーとしてＳｈｏｄｅｘ社製のプルランを用いた。
【００９９】
一方、水溶性β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンと微粒子を分離するため、本法で調製したβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン水溶液（微粒子と可溶化グルカンを含むもの）をアドバンテック社製のフィルター（０．２μｍ）でろ過を行ったところ、５０〜２５０万の高分子画分が消失した。よって、本法により得られたβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを乾燥させても、再溶解させれば乾燥前のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンと同様の物理的挙動を再現することが実証された。
【０１００】
（３）高純度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン粉末の製造
（１）において得られた培養液（多糖濃度０．５％（５ｍｇ／ｍｌ））９０Ｌを５０％クエン酸水溶液９ｋｇで中和後、濾過助剤（日本製紙ケミカル製粉末セルロ−スＫＣフロック）を１．８ｋｇプレコートした薮田式濾過圧搾機40D-4を通して、菌体を取り除いた。ろ液を限外濾過スパイラルエレメント（日東電工製ＮＴＵ３１５０−Ｓ４）で９Ｌまで濃縮した。本濃縮液を攪拌しながら、エタノール１８Ｌを加え、グルカン／エタノール／水スラリーを得た。スラリーの粘度はＢＭ型粘度計で２２ｍＰａ・ｓ（３０℃）であった。室温で３時間静置し、上澄み液（エタノール／水）約１７Ｌを取り除いた。残ったスラリーの粘度は４５ｍＰａ・ｓ（３０℃）であった。本濃縮スラリー１０Ｌを坂本技研型の噴霧乾燥装置R-3を用いて噴霧乾燥し、３６０ｇのβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン粉末を得た（回収率８０％）。得られたβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンの純度はＮＭＲスペクトルの解析の結果、９０％以上であった。
なお、得られたβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン粉末を１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液に溶解させ、ＮＭＲスペクトルを測定したところ、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを得た。また、得られたβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカン粉末の濃度０．５（ｗ／ｖ％）の水溶液の粘度は２００ｃＰ以下であった（ｐＨ５．０、３０℃）。
【０１０１】
（４）ストレス緩和効果の検討
マウスの拘束ストレスに対する改善効果
低粘度化β―１，３−１，６−グルカンが、拘束により誘発されるストレスを抑制することを以下のようにして確認した。
1) 使用物質
低粘度化処理グルカンとして、上記（３）の項目で得た高純度β―１，３−１，６−グルカン粉末を超純水を用いて、投与量が２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ／ｋｇになるよう調製したものを用いた。
【０１０２】
２）使用動物
Ｂａｌｂ／ｃマウス（雄性、８週齢）を日本クレア（株）から購入し、１週間予備飼育した後に健康なマウスを選択して実験に使用した。本動物実験は、「愛媛大学動物実験指針」並びに「実験動物の飼育および保管などに関する基準」（昭和５５年３月総理府告示第６号）に則って計画し、愛媛大学動物倫理委員会の承認を得た後、実施した。
【０１０３】
３）拘束ストレス負荷
β−グルカンは、毎朝、７日間経口投与した。強制拘束は投与３日目、５日目および７日目の１９時から翌朝７時までの１２時間行った。強制拘束には１００箇所以上の通気孔を開けた５０ｍｌのプラスチックチューブを用い、拘束時には傷や痛みを伴わないように留意した。強制拘束中は餌と水の摂取ができないため、拘束コントロール群（水を毎朝経口投与し、強制拘束を行う）とは別に、拘束なしで、餌と水を夜間与えないコントロール群（絶飲食対照群）を置いた。
【０１０４】
即ち、第１群（正常群）は、拘束は行わず、通常の餌と水の摂取に加えて、超滅菌水を１日１回連続７日間単回経口投与した。
【０１０５】
第２群（絶飲食対照群）、拘束は行わないが、投与３日目、５日目および７日目の１９時から翌朝７時までの１２時間に、餌と水を与えなかった。また、超滅菌水を１日１回連続７日間単回経口投与した。
【０１０６】
第３群（拘束コントロール群）は、強制拘束を投与３日目、５日目および７日目の１９時から翌朝７時までの１２時間行った。また、超滅菌水を１日１回連続７日間単回経口投与した。
【０１０７】
第４群（β−グルカン２５ｍｇ／ｋｇ投与群）は、強制拘束を投与３日目、５日目および７日目の１９時から翌朝７時までの１２時間行った。また、マウス個体あたり、β−グルカン２５ｍｇ／ｋｇを１日１回連続７日間単回経口投与した。
【０１０８】
第５群（β−グルカン５０ｍｇ／ｋｇ投与群）は、強制拘束を投与３日目、５日目および７日目の１９時から翌朝７時までの１２時間行った。また、マウス個体あたり、β−グルカン５０ｍｇ／ｋｇを１日１回連続７日間単回経口投与した。
【０１０９】
第６群（β−グルカン１００ｍｇ／ｋｇ投与群）は、強制拘束を投与３日目、５日目および７日目の１９時から翌朝７時までの１２時間行った。また、マウス個体あたり、β−グルカン１００ｍｇ／ｋｇを１日１回連続７日間単回経口投与した。
【０１１０】
７日目（３回目）の拘束解除と同時にエーテル麻酔下で無菌的に脾臓を摘出し、下大静脈から採血した。
【０１１１】
４）血中コルチコステロン濃度の測定
採取した血液は遠心分離して血漿を分離し、測定まで−２０℃以下で保存した。血中コルチコステロン濃度はＥＩＡキット（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＴＸ，ＵＳＡ）を用いて測定した。
【０１１２】
５）脾臓免疫機能の評価および測定
無菌的に摘出した脾臓を培養液（５％ウシ胎児血清および抗生剤を含むＲＰＭＩ１６４０）中でホモジナイズしてナイロンメッシュでろ過し、脾臓細胞を分離した。脾臓細胞の一部をマルチウェルプレートに加え、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を１０μｇ／ｍｌとなるように加えて、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％  ＣＯ２）で培養した。４８時間後、培養上清を回収し、測定まで−２０℃以下で保存した。培養液中のインターロイキン６（ＩＬ−６）およびＩＬ−１２をそれぞれＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，ＭＮ，ＵＳＡおよびＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて測定した。
【０１１３】
分離した脾臓細胞からリンパ球分離試薬（ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を用いてリンパ球を分離した。ＮＫ感受性のマウスリンパ腫細胞ＹＡＣ−１をＢＣＳＣＦ−ＡＭ（ＤＯＪＩＮＤＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）で蛍光標識し標的細胞とした。マウスリンパ球とＹＡＣ−１細胞を１００：１となるように調整してマルチウェルプレートへ加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％  ＣＯ２）で２時間培養した。培養上清を回収し、蛍光強度を測定し、標識ＹＡＣ−１細胞の総蛍光強度に対する％を算出し、ＮＫ活性とした。
【０１１４】
６）結果
＜脾臓重量＞
絶飲食対照群の脾臓重量は、正常群と比較して有意に低下していた。また、拘束を繰り返した後の脾臓重量は、正常群および絶飲食対照群と比較して著しく低下した。拘束ストレスによる脾臓重量の低下に対して、β−グルカンは影響を及ぼさなかった。（表２）
【表２】
0005740072.tif 000003
脾臓重量は平均値±標準誤差で示した（n=6）。
＊はP<0.05で拘束ストレスコントロール群との間に有意差あり
One-way ANOVA検定で有意な差異が認められたものについて、さらにFishers Protected LSDによる多重検定群間検定を行った。
【０１１５】
＜血中コルチコステロン濃度＞
血中コルチコステロン濃度は、拘束ストレスによって正常群と比較して有意に上昇した。また、絶飲食によっても上昇する傾向が認められた。これに対して、β−グルカン投与群では、血中コルチコステロン濃度の上昇を抑制する傾向が認められ、β−グルカン５０ｍｇ／ｋｇ投与群では、拘束コントロール群および絶飲食対照群と比較して有意な血中コルチコステロン濃度の低下が見られた。（図１）
【０１１６】
＜脾臓細胞のサイトカイン分泌能＞
摘出した脾臓から分離した脾臓細胞から分泌されるＩＬ−１２およびＩＬ−６は拘束ストレスによって著しく低下した。これに対してβ−グルカン投与群はＩＬ−１２およびＩＬ−６の拘束ストレスによる低下を抑制し、β−グルカン１００ｍｇ／ｋｇ投与群ではＩＬ−１２の分泌量は拘束コントロール群と比較して有意に上昇していた。しかしながら、この低下抑制効果は、正常群および絶飲食対照群の高い分泌量には及ばなかった。（図２および図３）
【０１１７】
コンカナバリンＡ刺激によって、脾臓細胞からのＩＬ−１２分泌量は約２倍に、ＩＬ−６分泌量は約３１倍に上昇した。コンカナバリンＡで刺激した脾臓細胞からのＩＬ−１２およびＩＬ−６分泌量は拘束ストレスによって著しく低下した。これに対してβ−グルカン（１００ｍｇ／ｋｇ）投与はＩＬ−１２およびＩＬ−６の拘束ストレスによる低下を有意に抑制した。（図２および図３）
【０１１８】
＜脾臓リンパ球のＮＫ活性＞
脾臓リンパ球のＮＫ活性は、拘束ストレスによって著しく低下した。β−グルカン（５０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇ）投与によって、拘束ストレスによるＮＫ活性の低下は有意に抑制された。（表３）
【表３】
0005740072.tif 000004
NK活性は平均値±標準誤差で示した（n=6）。
エフェクター細胞/ターゲット細胞 ＝ 100 : 1
＊はP<0.05で拘束ストレスコントロール群との間に有意差あり
One-way ANOVA検定で有意な差異が認められたものについて、さらにFishers Protected LSDによる多重検定群間検定を行った。
【０１１９】
この結果、低粘度化処理グルカンはマウスの拘束ストレスに対して拮抗作用を有することが分かる。
【０１２０】
（５）ラット自立神経系に対する電気生理学的測定法を用いた機能評価
ストレスに関係する自律神経系（交感神経及び副交感神経）に対するβ−グルカンの作用を検討するためにラットを用いて副腎及び脾臓を支配する交感神経と胃を支配する副交感（迷走）神経の活動を電気生理学的に測定した。
1) 使用物質
低粘度化処理グルカンとして、上記（３）の項目で得た高純度β―１，３−１，６−グルカン粉末を60℃に熱した水に溶解し、室温にまで冷却して十二指腸内に投与した。
【０１２１】
２）使用動物
実験には12時間毎の明暗周期（8時〜20時まで点灯）下に24℃の恒温動物室にて１週間以上飼育した体重約300ｇのWistar系雄ラットを使用した。餌（オリエンタル酵母、MF）及び水は自由摂食させた。
【０１２２】
３）自律神経系の電気生理学的測定
自律神経の活動を検討するために、3時間絶食後明期の中間期にurethane（1g／kg、ip）麻酔下で開腹し、副腎と脾臓を支配する交感神経と胃を支配する副交感神経を銀電極で釣り上げ、既述の方法（○文献１−10参照）にて神経活動を測定した。尚、手術開始から測定終了までチューブを気管に挿入して気道を確保し、保温装置にて体温（ラット直腸温）を35.0±0.5℃に保つようにした。
○文献１−１０
文献１：Yamano T. et al. Neurosci. Lett. 313:78-82, 2001.
文献２：Niijima A. et al. Auton. Neurosci.:Basic & Clin. 97:99-102, 2002.
文献３：Nagai K. et al. Exp. Biol. Med. (Maywood) 228:1138-1145, 2003.
文献４：Shen J. et al. Neurosci. 380:289-294, 2005.
文献５：Shen J. et al. Neurosci. 383:188-193, 2005.
文献６：Tanida M. et al. Am. J. Physiol. 288:R447-455, 2005.
文献７：Tanida M, et al. Brain Res. 1058: 44-55, 2005.
文献８：Tanida M. et al. Neurosci. Lett. 398:102-106, 2006.
文献９：Tanida M. et al. Neurosci. Lett. 389:109-114, 2005.
文献１０：Yamano T. et al. Life Sci. (in press) 2006.
【０１２３】
十二指腸内投与は、十二指腸に挿入したポリエチレンtubeを使用し、1匹あたりの投与量は1mlで、投与速度は1ml/minであった。投与効果については、10ngから10mgまでのβ−グルカンを水１mlに溶解して十二指腸内に投与し、自律神経の活動を電気生理学的に測定して、その活動を上昇あるいは低下を測定した。対照実験としては溶媒である水を１ml同様の条件で十二指腸内投与することで行った。データは５分間毎の５秒あたりの発電頻度（pulse/5sec）の平均値にて解析し、投与前の値を100%として百分率で表し、平均値±標準誤差で示した。統計計算は分散分析法（ANOVA with repeated measures）および Mann-Whitney U-testにて行った。
【０１２４】
４）結果
＜副腎交感神経活動測定のためのβ−グルカン投与量の決定＞
10ngから10mgまでのβ−グルカンを十二指腸内投与し副腎交感神経活動（Adrenal sympathetic nerve activity、ASNA）の測定を行った実際のデータとそれを投与前値を100％とした5分間毎の平均活動量として表したものである。1μg（=1000ng）から10mgの広範囲の投与量で副腎交感神経活動が低下し、投与35分後までにもっとも著明に低下したのは10μgのβ−グルカンを投与した時であった。そこで、最も効果の強かった10μgを十二指腸内に投与したときの副腎交感神経の活動変化について検討した。
【０１２５】
＜副腎交感神経活動に対するβ−グルカンの十二指腸内投与効果＞
10μgのβ−グルカンおよび対照実験として行った溶媒である水を、それぞれ、十二指腸内投与した時の実際の副腎交感神経活動の変化について検討した。対照水投与時には殆ど神経活動に変化は認められなかったが、10μgのβ−グルカンの十二指腸内投与により副腎交感神経活動が著明に低下することが認められた。これらのデータを、投与前の神経活動を100％として5分毎の平均活動量として示したものを図４に示す。
【０１２６】
水投与対照動物では殆ど副腎交感神経活動（ASNA）は変化しないのに対して、10μgのβ−グルカン投与群では投与5分後から15分後にかけて急速に活動が低下し、その後約30〜40％のレベルに留まった。両群の値を5分後から60分後まで群として分散分析法（ANOVA with repeated measures）により解析すると両者の値に有意差（p<0.0005; F=364）が認められた。なお、投与前の副腎交感神経活動の値は水投与群とβ−グルカン投与群で、それぞれ、102.5 ± 2.6 spikes/5secと132.7 ± 15.7 spikes/5secであり両者の間に統計学的有意差は認められなかった（Mann-Whitney U-testにてp=0.4）。
【０１２７】
＜胃副交感（迷走）神経活動測定のためのβ−グルカン投与量の決定＞
0.1μgから10μgまでの量のβ−グルカンを十二指腸内投与した時の実際の胃副交感神経活動（Gastric Vagal Nerve Activity、GVNA）の変化について測定した。0.1μgのβ−グルカン投与は胃副交感神経活動をやや低下させたが、1μgと10μgのβ−グルカンの十二指腸内投与は胃副交感神経活動を著明に増加させた。そこで、この内最も効果の強かった1μgのβ−グルカンの胃副交感神経活動に対する作用を水投与作用とともに各３匹ずつのラットを用いて検討した。
【０１２８】
＜胃副交感（迷走）神経活動に対するβ−グルカンの十二指腸内投与効果＞
1μgのβ−グルカンおよび対照実験として行った溶媒である水を、それぞれ、十二指腸内投与した時の実際の胃副交感（迷走）神経活動の変化について検討した。図５にはその時の実際の測定データと投与前の神経活動を100％として5分毎の平均活動量として示したものを示す。
【０１２９】
対照水投与は胃副交感神経活動を殆ど変化させなかったが、1μgのβ−グルカンの十二指腸内投与は水投与後と比較すると有意に（P<0.0005、F=22.9）胃を支配する副交感神経活動を上昇させた。なお、投与前の胃交感神経活動の値は水投与群とβ−グルカン投与群で、それぞれ、112.3 ± 28.3 spikes/5secと129.4 ± 41.1 spikes/5secであり統計学的有意差は認められなかった（Mann-Whitney U-testにてp=0.４）。
【０１３０】
＜脾臓交感神経活動のためのβ−グルカン投与量の決定＞
0.1μgから10μgのβ−グルカンの十二指腸内投与後の脾臓交感神経活動（Splenic Sympathetic Nerve Activity、SSNA）の変化について測定した。0.1μg、1μg、10μgと投与量に依存してβ−グルカンは脾臓交感神経活動を抑制した。そこで、３匹ずつのラットを用いて脾臓交感神経活動に対する10μgのβ−グルカンおよび水の十二指腸内投与効果について検討した。
【０１３１】
＜脾臓交感神経活動に対するβ−グルカンの十二指腸内投与効果＞
1０μgのβ−グルカンおよび対照実験として行った溶媒である水を、それぞれ、十二指腸内投与した時の実際の脾臓交感神経活動の変化について検討した。その結果を図６に示す。
【０１３２】
対照水投与は脾臓交感神経活動をやや上昇させたが、10μgのβ−グルカン投与は水投与後と比較すると有意に（P<0.0005、F=68.9）脾臓交感神経活動を増加させた。なお、投与前の脾臓交感神経の活動は水投与群とβ−グルカン投与群で、それぞれ、116.0 ± 17.9 spikes/5secと116.2 ± 16.6 spikes/5secであり統計学的有意差は認められなかった（Mann-Whitney U-testにてp=1）。
【０１３３】
これらの結果は０．１から１０μgのβ−グルカンは副腎および脾臓を支配する交感神経の活動を抑制し、胃副交感神経の活動を促進することを示している。
【０１３４】
以上の事実はβ−グルカンが副腎と脾臓を支配する交感神経活動を抑制し、胃副交感神経活動を促進して、血糖低下、血圧低下、腸管での消化・吸収促進、食慾促進、リンパ球のNK活性上昇などを引き起し、免疫促進効果や便秘改善効果を持つことを示唆する。脾臓の交感神経活動抑制はリンパ球のTh1（T helper 1 ）細胞系を優位にするので、花粉症などのアレルギー反応の軽減効果も期待される。
【０１３５】
（６）飲食品組成物の処方例
処方例１（クッキー）
粉末β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン  1重量％
殺菌乳酸菌末                          0.2重量％
カテキン                              1重量％
クッキー                              残量
処方例２（サプリメント）
粉末β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン  10重量％
コラーゲンペプチド                    42重量％
ヒアルロン酸                          0.06重量％
殺菌乳酸菌末                          １重量％
ビタミンC                             10重量％
ビタミンB2                              0.03重量％
ビタミンB6                              0.03重量％
賦形剤（デンプンなど）                   残量
処方例３（サプリメント）
粉末β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン   1重量％
コラーゲンペプチド                     42重量％
ヒアルロン酸                            0.06重量％
ビタミンC                              10重量％
ビタミンB2                             0.03重量％
ビタミンB6                              0.03重量％
ナイアシン                              0.15重量％
賦形剤（デンプンなど）                  残量
処方例４（ドリンク剤）
β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン水溶液
（0.2重量％β‐グルカン水溶液）        61.5重量％
殺菌乳酸菌末                            0.03重量％
ミルクオリゴ糖                          0.8重量％
ラクトフェリン                          0.09重量％
甘味料（スクラロース）                  0.03重量％
クエン酸                                0.22重量％
香料                                    0.37重量％
水                                       残部
処方例５（ドリンク剤）
β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン水溶液
（0.2重量％β‐グルカン水溶液）        61.5重量％
殺菌乳酸菌末                            0.03重量％
テアニン                                0.8重量％
GABA                                    0.09重量％
甘味料（スクラロース）                  0.03重量％
クエン酸                                0.22重量％
香料                                    0.37重量％
水                                       残部
処方例６（ドリンク剤）
粉末β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン
（オーレオバシジウム属由来）            0.2重量％
紅花エキス                              7％
イチョウ葉エキス                        7％
高麗人参エキス                          7％
ザクロエキス                            1％
天草エキス                              3.5％
桂皮エキス                              3.5％
陳皮エキス                              3.5％
ウコンエキス                            2.1％
生姜エキス                              1％
ハチミツ                                ３％
水                                       残部
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】拘束ストレスにさらされたBalb/cマウスの血漿中コルチコステロン濃度に対するβ−グルカンの効果を示す。  血漿中コルチコステロン濃度は平均値±標準誤差で示した（n=6）。  ＊はP<0.05で拘束ストレスコントロール群との間に有意差あり  One-way ANOVA検定で有意な差異が認められたものについて、さらにFishers Protected LSDによる多重検定群間検定を行った。
【図２】拘束ストレスにさらされたBalb/cマウスの脾臓からのIL-12分泌に対するβ−グルカンの効果を示す。  脾臓細胞は5%FBSを含むRPMI1640中で48時間、コンカナバリンA（final conc. 10μg/ml）を添加、または無添加条件化で培養した。  ＊はP<0.05で拘束ストレスコントロール群との間に有意差あり  One-way ANOVA検定で有意な差異が認められたものについて、さらにFishers Protected LSDによる多重検定群間検定を行った。
【図３】拘束ストレスにさらされたBalb/cマウスの脾臓からのIL-6分泌に対するβ−グルカンの効果を示す。  脾臓細胞は5%FBSを含むRPMI1640中で48時間、コンカナバリンA（final conc. 10μg/ml）を添加、または無添加条件化で培養した。  ＊はP<0.05で拘束ストレスコントロール群との間に有意差あり  One-way ANOVA検定で有意な差異が認められたものについて、さらにFishers Protected LSDによる多重検定群間検定を行った。
【図４】ダイソーβ−グルカン(10ug/ml)の十二指腸投与による副腎交感神経活動（ASNA）の変化を示す。
【図５】ダイソーβ−グルカン（1ug/ml)の十二指腸投与による胃副交感神経活動（GVNA）の変化を示す。
【図６】ダイソーβ−グルカン（10ug/ml)の十二指腸投与による脾臓交感神経活動（SSNA）の変化を示す。
【図７】NMRスペクトルを示す。  帰属：  １Ｈ−ＮＭＲの４．５ｐｐｍ付近のピーク：１位の水素（β１→６結合）４．４７２９ｐｐｍ  １Ｈ−ＮＭＲの４．７ｐｐｍ付近のピーク：１位の水素（β１→３結合）４．７２５８ｐｐｍ
【図８】超音波照射後の粒度分布を示す。
【図１】
0005740072.tif 000005
【図２】
0005740072.tif 000006
【図３】
0005740072.tif 000007
【図４】
0005740072.tif 000008
【図５】
0005740072.tif 000009
【図６】
0005740072.tif 000010
【図７】
0005740072.tif 000011
【図８】
0005740072.tif 000012