(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ流路の底面に複数のマイクロチャンバーが形成された細胞展開用デバイスにおいて、プレウェット液通液工程後にマイクロチャンバー内に残存する気泡を除去するため
の、細胞展開用デバイスの前処理方法であって、
前記マイクロチャンバーの１個当たりの体積と、前記マイクロチャンバーの総数とが予め設定されるマイクロチャンバーチップ形成工程と、
前記マイクロチャンバーチップ形成工程で得られた前記複数のマイクロチャンバーの上部に形成されているマイクロ流路にプレウェット液を通液するプレウェット液通液工程と、
前記プレウェット液を通液した後、前記マイクロチャンバー内に気泡が存在するマイクロチャンバーの数を検出する気泡付きマイクロチャンバー検出工程と、
前記気泡付きマイクロチャンバー検出工程で検出された気泡状態の空気の合計量Ａを算出する気泡空気体積算出工程と、
前記気泡空気体積算出工程で得られた前記気泡状態の空気の合計体積Ａと、前記プレウェット液中に既に溶解している空気の体積Ｂとの和から、（Ａ＋Ｂ）／Ｂを算出し、この算出された値に常圧Ｐを掛けあわせて、作動圧力Ｘ＝Ｐ×（Ａ＋Ｂ）／Ｂを算出する作動圧算出工程と、
前記作動圧算出工程で得られた前記作動圧力Ｘ以上の圧力を前記マイクロ流路に作用させることにより、前記気泡付きマイクロチャンバー内に気泡として存在する空気を前記プレウェット液内に溶かし込む気泡溶解工程と、を有する細胞展開用デバイスの前処理方法。
【請求項２】
前記マイクロチャンバーチップは、前記マイクロチャンバーが形成される領域の長さが１０ｍｍ以上であり、かつその領域内に１０００〜３００００個のマイクロチャンバーが形成されている請求項１に記載の細胞展開用デバイスの前処理方法。
【請求項３】
前記マイクロ流路の断面積が５ｍｍ2以下である請求項１または２に記載の細胞展開用デバイスの前処理方法。
【請求項４】
前記マイクロチャンバーの開口上部の直径が２０〜５００μｍ、深さが１０〜２５０μｍである請求項１〜３のいずれかに記載の細胞展開用デバイスの前処理方法。
【請求項５】
前記プレウェット液は、予め脱気されている請求項４に記載の細胞展開用デバイスの前処理方法。
【請求項６】
前記プレウェット液は、濃度が３０容量％以下のエタノール水溶液である請求項１〜５のいずれかに記載の細胞展開用デバイスの前処理方法。
【請求項７】
前記マイクロ流路内の温度が４〜１０℃になるように、前記プレウェット液が通液された後に冷却される請求項１〜６のいずれかに記載の細胞展開用デバイスの前処理方法。
【請求項８】
複数のマイクロチャンバーが形成された細胞展開用デバイスと、細胞検出装置と、制御手段とを備え、
前記細胞検出装置は、少なくとも、前記細胞展開用デバイスに供給されるプレウェット液と細胞懸濁液とが貯留された薬液収容器ホルダーと、
前記細胞展開用デバイスと前記薬液収容器ホルダーとの間に移動可能に配置された通液系機構とを備え、
前記制御手段は、少なくとも、前記細胞展開用デバイス内にプレウェット液が通液された後、前記マイクロチャンバー上に気泡状態で存在する空気の合計量Ａを前記プレウェット液に溶解させるのに必要な作動圧力Ｘを算出する作動圧算出手段と、
前記薬液収容器ホルダーに貯留されたプレウェット液を、前記薬液通液機構を介して前記細胞展開用デバイス内に通液した後、前記作動圧算出手段で算出された作動圧力Ｘ以上の圧力を前記細胞展開用デバイス内に作用させ、これにより、前記プレウェット液を通液したときに前記マイクロチャンバー上に付着した気泡状態の空気の合計量Ａを、前記プレウェット液内に溶解させるように処理する、細胞展開用デバイスの前処理システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞懸濁液に先立ってマイクロチャンバー内に通液されるプレウェット液を用いる細胞展開用デバイスの前処理方法、そのような前処理により得られる細胞展開用デバイス、およびそのような前処理を実施するための細胞展開用デバイスの前処理システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
循環腫瘍細胞〔ＣＴＣ〕、循環血管内皮細胞〔ＣＥＣ〕、循環血管内皮前駆細胞〔ＣＥＰ〕、各種幹細胞等（本明細書において、まとめて「希少細胞」という。）は病態に応じて全血中に極めて稀に存在する細胞である。希少細胞の検出は臨床的な有用性が明らかであるにもかかわらず、その検出は極めて難しい。近年様々な細胞分離手法を応用してその検出が試みられ製品化がなされているが、いずれにおいても対象の希少性が故、検出結果の有効性を評価（希少細胞のロスや不要細胞の混入の有無）することが重要である。【０００３】
採血した血液などの検体中に目的とする希少細胞が存在するか否かを検査するための手法の一つとして、図７に示したような細胞展開用デバイス１０（複数のマイクロチャンバー４を備えたマイクロチャンバーチップ２）の表面に血液由来検体などの細胞懸濁液を平面状に展開し、各マイクロチャンバー４内に細胞を収容し、それらマイクロチャンバー４内に収容された複数の細胞中に、特定の細胞が存在するか否かを確認する方法が知られている。【０００４】
そのような稀少細胞の回収方法においては、希少細胞がマイクロチャンバー内に確実に収容されるようにする必要がある。例えば、特許文献１には、マイクロチャンバーチップ表面およびマイクロチャンバー内壁面の一部または全部を、細胞の非特異的吸着を抑制できるブロッキング剤（例えば、カゼイン等のタンパク質）で被覆することにより、血液等に含まれる多種類かつ多量の細胞を当該チップ上に展開した際、細胞がマイクロチャンバー内に格納、保持されやすく、さらに細胞がマイクロチャンバーの内壁面に吸着しにくいため、細胞同士がマイクロチャンバー内で重層化せずに、顕微鏡下での観察が容易になるという作用効果が奏される、細胞展開用マイクロチャンバーチップの発明が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２０１４／００７１９２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述したような細胞展開用デバイス１０を用いて稀少細胞を検出する方法において、マイクロチャンバーチップ２が、例えば、ポリスチレンなどの疎水性の材料から形成されている場合には、マイクロ流路５内に細胞懸濁液を導入したとしても、表面張力の関係で細胞懸濁液を全てのマイクロチャンバー４内に充填させることができず、複数のマイクロチャンバー４内に気泡が残存してしまう（図９参照）。【０００７】
そのような問題を抑制するため、細胞懸濁液を展開する前に、予め表面張力の低い有機溶剤、例えばエタノールを「プレウェット液」として、マイクロチャンバーチップ２内に通液することにより、マイクロチャンバー４の濡れ性を向上させておくことが行われている。このようにプレウェット液で処理した後、純水を通液してプレウェット液を置換、洗浄してから、細胞懸濁液を通液するようにすれば、細胞懸濁液はほとんど全てのマイクロチャンバー４の内部に入り込み、細胞をマイクロチャンバー４で効率的に回収することができるようになる。【０００８】
ところが、特許文献１に記載されているように、マイクロチャンバーチップ表面およびマイクロチャンバー内壁面の一部または全部をブロッキング剤で処理する場合、プレウェット液による処理が、ブロッキング剤の効果に悪影響を与えないよう留意する必要がある。例えば、エタノール水溶液をプレウェット液として用いる場合、その濃度を３０容量％以下程度にまで低くすれば、ブロッキング剤の効果に悪影響を与えることは避けられるが、今度は前述したようなプレウェット液自体に求められる効果が十分ではなくなり、マイクロチャンバー４内の気泡の残存を抑制することができなくなる。結果的に、プレウェット液に続いて細胞懸濁液をマイクロ流路５内に展開しても、マイクロチャンバー４内に細胞を効率的に回収することができず、希少細胞の検出結果の有効性を正しく評価することができなくなってしまうという問題が発生する。このような現象は、マイクロ流路５の断面積が小さく、しかもマイクロチャンバー４の密度が大きい程に生じ易い。【０００９】
本発明は、このような実情に鑑み、細胞展開用デバイスにブロッキング処理がなされている場合にも利用することができ、かつ実質的に全てのマイクロチャンバーに気泡を残存させず、プレウェット液とそれに続いて通液される細胞懸濁液で充填することができるようにする細胞展開用デバイスの前処理方法、およびそのような処理が実施された結果、マイクロチャンバー内に気泡が残存しない状態で保存されている細胞展開用デバイス、ならびにそのような処理を実施するための細胞展開用デバイスの前処理システムを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意検討した結果、マイクロ流路内にプレウェット液を通液してマイクロチャンバー上に気泡が生じてしまった場合に、プレウェット液を加圧することで、その気泡（空気）をプレウェット液中に溶解させて、マイクロチャンバー内から除去することができることを見出し、本発明の完成に至った。【００１１】
すなわち、上述した目的の内少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映した、細胞展開用デバイスの前処理方法は、以下の通りである。
［１］
マイクロ流路の底面に複数のマイクロチャンバーが形成された細胞展開用デバイスにおいて、プレウェット液通液工程後にマイクロチャンバー内に残存する気泡を除去するための、細胞展開用デバイスの前処理方法であって、
前記マイクロチャンバーの１個当たりの体積と、前記マイクロチャンバーの総数とが予め設定されるマイクロチャンバーチップ形成工程と、
前記マイクロチャンバーチップ形成工程で得られた前記複数のマイクロチャンバーの上部に形成されているマイクロ流路にプレウェット液を通液するプレウェット液通液工程と、
前記プレウェット液を通液した後、前記マイクロチャンバー内に気泡が存在するマイクロチャンバーの数を検出する気泡付きマイクロチャンバー検出工程と、
前記気泡付きマイクロチャンバー検出工程で検出された気泡状態の空気の合計量Ａを算出する気泡空気体積算出工程と、
前記気泡空気体積算出工程で得られた前記気泡状態の空気の合計体積Ａと、前記プレウェット液中に既に溶解している空気の体積Ｂとの和から、（Ａ＋Ｂ）／Ｂを算出し、この算出された値に常圧Ｐを掛けあわせて、作動圧力Ｘ＝Ｐ×（Ａ＋Ｂ）／Ｂを算出する作動圧算出工程と、
前記作動圧算出工程で得られた前記作動圧力Ｘ以上の圧力を前記マイクロ流路に作用させることにより、前記気泡付きマイクロチャンバー内に気泡として存在する空気を前記プレウェット液内に溶かし込む気泡溶解工程と、を有する細胞展開用デバイスの前処理方法。【００１２】
また、上述した目的の内少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映した、細胞展開用デバイスは、以下の通りである。
［８］
前記方法が実施されている、前処理によりマイクロチャンバーがプレウェット液で満たされた細胞展開用デバイス。【００１３】
さらに、上述した目的の内少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映した、細胞展開用デバイスの前処理システムは、以下の通りである。
［９］
複数のマイクロチャンバーが形成された細胞展開用デバイスと、細胞検出装置と、制御手段とを備え、
前記細胞検出装置は、少なくとも、前記細胞展開用デバイスに供給されるプレウェット液と細胞懸濁液とが貯留された薬液収容器ホルダーと、
前記細胞展開用デバイスと前記薬液収容器ホルダーとの間に移動可能に配置された通液系機構とを備え、
前記制御手段は、少なくとも、前記細胞展開用デバイス内にプレウェット液が通液された後、前記マイクロチャンバー上に気泡状態で存在する空気の合計量Ａを前記プレウェット液に溶解させるのに必要な作動圧力Ｘを算出する作動圧算出手段と、
前記薬液収容器ホルダーに貯留されたプレウェット液を、前記薬液通液機構を介して前記細胞展開用デバイス内に通液した後、前記作動圧算出手段で算出された作動圧力Ｘ以上の圧力を前記細胞展開用デバイス内に作用させ、これにより、前記プレウェット液を通液したときに前記マイクロチャンバー上に付着した気泡状態の空気の合計量Ａを、前記プレウェット液内に溶解させるように処理する、細胞展開用デバイスの前処理システム。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理方法によれば、細胞展開用デバイスのマイクロチャンバーチップ上にプレウェット液を通液する場合に、細胞回収の阻害要因となる気泡をプレウェット液中に溶解して、マイクロチャンバー内をプレウェット液で確実に充填することができる。これにより、後に細胞懸濁液を展開した場合に、各マイクロチャンバー内を細胞懸濁液で確実に満たすことが可能となり、細胞の回収率および希少細胞の検出結果の信頼性を向上させることができる。【００１５】
また、本発明に係る細胞展開用デバイスによれば、実質的に全てのチャンバーがプレウェット液で予め満たされているため、速やかに細胞懸濁液の展開のために用いることができる。【００１６】
さらに、本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理システムであれば、その機能を従来の細胞回収システムおよび細胞観察システムと統合することが可能であるため、細胞回収および細胞観察に先立って速やかに細胞展開用デバイスをそのために適した状態にすることができる。一方で、細胞回収および細胞観察に適した状態の商品として出荷することのできる本発明に係る細胞展開用デバイスを、低コストで、工業的に連続して大量生産することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明の好ましい実施の形態に係る細胞展開用デバイスを示した概略平面図である。
【図２】図２は、マイクロチャンバーチップにブロッキング剤を塗布したときのマイクロチャンバーチップの概略図である。
【図３】図３は、本発明の好ましい実施の形態に係る細胞展開用デバイスの前処理方法における各工程を示すフローチャートである。
【図４】図４は、本発明の好ましい実施の形態に係る細胞展開用デバイスの前処理方法を実施した場合の細胞展開用デバイスの内部の様子を模式的に示す概略断面図である。同図（Ａ）はマイクロチャンバーチップ形成工程を経て得られた細胞展開用デバイスの断面図、同図（Ｂ）は同図（Ａ）の細胞展開用デバイスにプレウェット液を通液して気泡が残存した状態を示す断面図、同図（Ｃ）は同図（Ｂ）のマイクロ流路内に圧力を加えたときの断面図、同図（Ｄ）は同図（Ｃ）からさらに圧力が加えられて、気泡が完全に溶解したことを示す断面図である。
【図５】図５は、細胞展開用装置および細胞観察用装置としての機能も兼ね備えた、本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理システムの概略図である。
【図６】図６は、エタノール濃度と、気泡を有するマイクロチャンバーの存在割合との関係を示すグラフである。
【図７】図７は、従来の細胞展開用デバイスの概略図である。
【図８】図８は、本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理方法が適用される細胞展開用デバイスを、流体が流れる方向に沿って切断した模式的断面図であり、図１のＸ−Ｘ線方向の概略断面図である。
【図９】図９は、図８に示した細胞展開用デバイスにプレウェットを通液し、マイクロチャンバー上に気泡が付着している状態を示す拡大断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の好ましい実施の形態に係る細胞展開用デバイスの前処理方法、細胞展開用デバイス、および細胞展開用デバイスの前処理システムについて、図面を参照しながら詳細に説明する。
【００１９】
［細胞展開用デバイス］
先ず、本発明に係る前処理方法が適用される細胞展開用デバイスについて説明する。
【００２０】
図１は、本発明の好ましい実施の形態に係る細胞展開用デバイスの前処理方法が適用される細胞展開用デバイス３０を示した概略図である。
【００２１】
なお、図１に示した細胞展開用デバイス３０の断面は、図８と略同一であるので、断面については図８を参照して説明する。
【００２２】
図１および図８に示したように、細胞展開用デバイス３０は、複数のマイクロチャンバー４が形成されたマイクロチャンバーチップ２と、複数のマイクロチャンバー４上に一つのマイクロ流路５が形成されるように、枠状のシール部材３４を介して配置された流路形成枠体８と、流路形成枠体８に設けられた入口部３と、入口部３からマイクロ流路５に導入された細胞懸濁液をマイクロ流路５から導出させるために流路形成枠体８に設けられた出口部７などとを有する。
【００２３】
マイクロチャンバーチップ２は、マイクロチャンバーアレイ〔ＭＣＡ〕とも称され、この実施の形態では、長さＪ、幅Ｈからなる範囲にマイクロチャンバー４が１０００〜３００００個以上形成されている。
【００２４】
また、マイクロチャンバー４が形成される領域の長さＪは１０ｍｍ以上であり、マイクロ流路５の断面積は５ｍｍ2以下である。
【００２５】
マイクロチャンバー４とは、一個以上の細胞を「収容」し、「保持」することができる凹状の微細穴をいい、有底であることが好ましい。
【００２６】
ここで、「保持」とは、マイクロチャンバー４に収容された細胞が、細胞展開用のマイクロチャンバーチップ２のマイクロ流路５に対する染色液や洗浄液の通液等によってマイクロチャンバー４の外方に出難いことをいう。
【００２７】
また、マイクロチャンバー４の開口上部の直径は、２０〜５００μｍであることが好ましい。該直径が２０〜５００μｍの範囲内であると、マイクロチャンバー４内に好適に細胞を収容、保持することができる。
【００２８】
マイクロチャンバー４の深さは、マイクロチャンバー１つあたりに細胞を１０〜１５個程度収容できることが好ましく、典型的には、マイクロチャンバー４の深さは、１０〜２５０μｍである。
【００２９】
マイクロチャンバー４の形状は、底部が平坦な逆円錐形であるが、これに限定されない。
【００３０】
マイクロチャンバーチップ２の材料としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕、ポリメチルメタクリレート〔ＰＭＭＡ〕、環状オレフィンコポリマー〔ＣＯＣ〕などのポリマーが挙げられる。マイクロチャンバーチップ２は、成形されたポリマーに、金属、ガラス、石英ガラスなどからなる基板を貼り合わせたような複数の材料を組み合わせたものであってもよい。
【００３１】
マイクロ流路５は、細胞懸濁液をマイクロチャンバーチップ２上で流通させることが可能なものであれば、この例に限定されない。
【００３２】
図１に示した細胞展開用デバイス３０では、図８に示したように、マイクロチャンバーチップ２の上面を底面とし、さらに、マイクロチャンバーチップ２の上面側に設けられた流路形成枠体８とシール部材３４とによりマイクロ流路５が画成されている。
【００３３】
流路形成枠体８の材料としては、例えばマイクロチャンバーチップ２と同じ材料を用いることが好ましい。
【００３４】
このマイクロ流路５は、流路形成枠体８の入口部３と出口部７とに連通しており、入口部３から流入した細胞懸濁液が矢印で示す方向に流れて、出口部７から導出できるようになっている。
【００３５】
［前処理方法］
以下、図３、図４（Ａ）〜（Ｄ）を参照しながら、本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理方法について、また図５を参照しながら、本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理システムについて説明する。
【００３６】
図３に示したように、本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理方法は、マイクロチャンバーチップ形成工程Ｃと、プレウェット液通液工程Ｄと、気泡付きマイクロチャンバー検出工程Ｅと、気泡空気体積算出工程Ｆと、作動圧算出工程Ｇと、気泡溶解工程Ｈとを有し、これらの工程をこの順番で行う方法である。マイクロチャンバーチップ形成工程Ｃを経た後の細胞展開用デバイスは図４（Ａ）に示され、プレウェット液通液工程Ｄを経た後の細胞展開用デバイスは図４（Ｂ）に、気泡溶解工程Ｈを始めたときの細胞展開用デバイスは図４（Ｃ）に、気泡溶解工程Ｈを経た後の細胞展開用デバイスは図４（Ｄ）に、それぞれ示されている。
【００３７】
本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理方法によれば、図３に示した各工程をこの順番で行うことにより、例えば、図４（Ｂ）に示したように、プレウェット液をマイクロ流路５に通液した場合にマイクロチャンバー４上に付着してしまった気泡９を、図４（Ｄ）に示したようにプレウェット液１１内に全て溶解させることが可能となる。これにより、細胞展開用デバイス３０の濡れ性を向上させることができる。
【００３８】
＜プレウェット液＞
プレウェット液としては、水と相溶性のある有機溶媒の水溶液を用いることができる。例えば、エタノール水溶液であることが好ましく、特には３０容量％以下のエタノール水溶液であることが好ましい。このような濃度のエタノール水溶液であれば、例えば、図２に示したように、マイクロチャンバー４の底面３２以外の部分に、細胞の付着を防止するブロッキング剤５０を付着させた場合であっても、ブロッキング効果が損なわれることは少ない（例えば、特許文献１参照）。なお、「濃度が３０容量％以下の有機溶媒（エタノール）水溶液」には、当該有機溶媒（エタノール）の濃度が０容量％に相当する、純水、生理食塩水、緩衝液その他の水溶液自体も包含される。
【００３９】
＜細胞懸濁液＞
細胞懸濁液は、希少細胞を含んでいる可能性がある、例えばヒトなどの血液、リンパ液、組織液、体腔液などであり、希釈液などで適宜希釈されていてもよい。また、細胞懸濁液は、生体由来のものに限定されず、試験・研究等のために人工的に細胞を懸濁させて調製した細胞の分散液であってもよい。特に、血液から赤血球を分離した後の細胞懸濁液を適用することがＣＴＣ等の希少細胞の回収・検出には好適である。
【００４０】
希少細胞としては、例えば癌細胞などが挙げられる。特に、細胞懸濁液が血液または血液由来検体である場合、希少細胞は、ＣＴＣ〔循環腫瘍細胞または循環癌細胞〕、ＣＥＣ〔循環血管内皮細胞〕およびＣＥＰ〔循環血管内皮前駆細胞〕のいずれか一種以上の細胞であってもよい。
【００４１】
このような細胞懸濁液に含まれる種々の細胞の直径は、１０〜１００μｍであることが好ましいが、少なくともマイクロチャンバー４の直径より小さいことが必要である。
【００４２】
上記マイクロチャンバーチップ形成工程Ｃでは、少なくとも、マイクロチャンバー４が形成される領域のマイクロ流路５の体積Ｖと、その領域内に形成されるマイクロチャンバー４の体積の総和Ｗとを算出することのできる情報が予め設定される。
【００４３】
例えば、マイクロチャンバー４が長方形の領域に形成されている場合、前記マイクロ流路５の体積Ｖは、マイクロチャンバー４が形成される領域の長さＪおよび幅Ｑと、マイクロ流路５の高さＨとから、式：Ｖ＝Ｊ×Ｑ×Ｈにより算出することができる。
【００４４】
また、前記マイクロチャンバー４の体積の総和Ｗは、前記領域内に形成されるマイクロチャンバー４の総数Ｎと、マイクロチャンバー１個当たりの体積Ｕとから、式：Ｗ＝Ｕ×Ｎにより算出することができる。マイクロチャンバー１個当たりの体積Ｕは、例えばマイクロチャンバー５が円柱の形状である場合、マイクロチャンバー４の直径Ｌと深さＤとから、式：Ｕ＝π（Ｌ／２）2Ｄにより算出することができる。
【００４５】
これら設定された値は、既知情報として、例えば図５に示した細胞展開用デバイスの前処理システム２００の制御手段１９０などに保存される。上記プレウェット液通液工程Ｄは、マイクロチャンバー４の濡れ性を向上させて、細胞懸濁液でマイクロチャンバー４を満たすことができるようにするために、マイクロ流路５内に予めプレウェット液１１を通液する（プレウェット液を送液して、マイクロチャンバー４の内部に空気は残存しているものの、それを除いてマイクロ流路がプレウェット液１１で満たされた状態とする）工程である。
【００４６】
プレウェット液通液工程Ｄでは、入口部３から出口部７に向かうプレウェット液１１の一方向の流れで行っても良いが、入口部３からプレウェット液１１の導入と吸引を交互に行って両方向の流れで行っても良い。
【００４７】
上記気泡付きマイクロチャンバー検出工程Ｅは、プレウェット液通液工程Ｄによりマイクロ流路５内にプレウェット液１１を通液したときに、マイクロチャンバー４の内部に気泡９が存在する（マイクロチャンバー４の底面に気泡９が付着している）マイクロチャンバー４の数ｎを検出する工程である。マイクロチャンバー４上に付着した気泡９の検出は撮像装置などで行うことができる。撮像装置を介して行う場合には、単位面積（視野面積）当たりの気泡数を測定して、その単位面積内で気泡が残存するマイクロチャンバー４の割合を算出し、それをマイクロチャンバー４が形成される領域全体で気泡が残存するマイクロチャンバー４の割合Ｒとみなし、前記内部に気泡９が残存するマイクロチャンバー４の数ｎを、式：ｎ＝Ｎ×Ｒにより算出することができる。また、その情報は制御手段１９０などに保存される。
【００４８】
気泡空気体積算出工程Ｆは、気泡付きマイクロチャンバー検出工程Ｅで検出された気泡状態の空気体積（容積）の合計量Ａを算出する工程である。この気泡状態の空気体積の合計量Ａの算出は、各種データが保存された制御手段１９０などにより行われ、制御手段１９０などに保存される。例えば、マイクロチャンバー４の１個あたりの内部に残存する気泡９の体積を、マイクロチャンバー４の１個あたりの体積Ｕとみなせば、気泡状態の空気体積の合計量Ａは、式：Ａ＝Ｕ×ｎで算出することができる。
【００４９】
上記作動圧算出工程Ｇは、気泡空気体積算出工程Ｆで得られた気泡状態の空気の合計体積Ａと、プレウェット液１１中に既に溶解している空気の溶解体積Ｂから、（Ａ＋Ｂ）／Ｂを算出し、この算出された値に常圧Ｐを掛けあわせて、作動圧力Ｘ＝Ｐ×（Ａ＋Ｂ）／Ｂを算出する工程である。
【００５０】
作動圧力Ｘは、気泡９として残存する空気泡を全てプレウェット液１１内に溶解させるために、マイクロ流路内に印加する圧力であり、以下のような原理に基づいて求められる値である。ヘンリーの法則により、気体の溶解度は圧力に比例するため、常圧Ｐにおいて体積Ｂの空気が溶解しているプレウェット液１１中には、作動圧力Ｘ＝Ｐ×（Ａ＋Ｂ）／Ｂ（＞Ｐ）において、気泡９として残存する空気泡の体積Ａと、既にプレウェット液１１中に溶解している空気の体積Ｂの合計体積Ａ＋Ｂを溶解させることができる。ボイルの法則より、一定温度における気体の体積は、圧力に反比例するため、体積が（Ａ＋Ｂ）／Ｂ倍の場合は、少なくとも、常圧Ｐの（Ａ＋Ｂ）／Ｂ倍の作動圧力Ｘを掛ければ良い。また、溶解させるためには作動圧力Ｘ以上の圧力をかけても良いが、マイクロチャンバー部に対して破損等を生じない程度の圧力にする必要がある。
【００５１】
ここで、試薬収容器に収容したプレウェット液１１が、脱気していない通常の状態のものである場合、その試薬収容基に収容したプレウェット液１１中に既に溶解している空気の体積Ｂ0がそのまま、前記式に用いられるＢとなる。このような脱気していないプレウェット液１１を用いた場合の、プレウェット液通液工程後のマイクロチャンバー内の残存気泡量をＡ0とおく。
【００５２】
一方、試薬収容器には、予め脱気することで溶解している空気の体積が実質的にゼロである状態のプレウェット液１１を収容しておくこともできる。このような脱気したプレウェット液１１を用いた場合の、プレウェット液通液工程後のマイクロチャンバー内の残存気泡量Ａ1はおよそＡ0−Ｂ0となり、脱気していないプレウェット液を用いた場合の残存気泡量Ａ0に比べて少なくすることができ、その結果作動圧力Ｘを低くすることができる。Ａ0−Ｂ0≦０のときは、残存気泡量Ａ1は実質的にゼロになり、気泡溶解工程Ｈはもはや必要なくなる。したがって、Ａ1＝Ａ0−Ｂ0＞０のときだけ、上記式のＡにＡ1を代入し、作動圧力Ｘ＝Ｐ×（Ａ＋Ｂ）／Ｂを算出し、気泡溶解工程Ｈを実施すればよい。また、このプレウェット液通液工程によって、試薬収容器に収容された状態では実質的にゼロであったプレウェット液への空気の溶解体積はＢ0となり、このＢ0を前記式のＢとすることになる。
【００５３】
この作動圧力Ｘの算出も、制御手段１９０で行うことができ、得られた情報は制御手段１９０などに保存される。
【００５４】
上記気泡溶解工程Ｈは、作動圧算出工程Ｇで得られた作動圧力Ｘ以上の圧力をマイクロ流路５に作用させることにより、気泡付きマイクロチャンバー上に気泡９として存在する空気をプレウェット液１１内に溶かし込む工程である。
【００５５】
＜圧力の印加方法＞
気泡溶解工程Ｈは、通液系機構１１０に具備された圧力ポンプなどにより行われる。また、細胞検出装置１００（通液系機構１１０）および制御手段１９０は、所定の圧力がプレウェット液に印加されることを確実なものとするために、マイクロ流路内の圧力の測定機構（図示せず）およびその制御プログラムを備えていることが好ましい。
【００５６】
代表的には、次の２通りの方法で、所定の作動圧力Ｘをマイクロ流路内のプレウェット液に印加することができる。
【００５７】
（１）マイクロ流路内にプレウェット液を通液した後、出口部７を封止してから、さらに通液系機構１１０によりプレウェット液を押し出すようにする。通液系機構１１０による吐出操作を繰り返す（所定の時間続ける）ことにより、徐々にプレウェット液に印加される圧力を高め、所定の作動圧力Ｘに到達させることができ、到達すればその操作を止めればよい。
【００５８】
このような（１）の実施形態を採用する場合、細胞検出装置１００は、出口部封止機構（図示せず）を備え、制御手段１９０は、所定のタイムスケジュールで自動的に、当該出口部封止機構により出口部７を封止し、通液系機構１１０でプレウェット液１１を押すよう操作することのできる制御プログラムを実行可能なものとすることが好ましい。
【００５９】
（２）マイクロ流路内にプレウェット液を通液させる時から、あるいは通液した後、出口部７を封止せず開放したまま、通液系機構１１０によりプレウェット液を高流量でマイクロ流路中を移動させる。プレウェット液の移動は、通液系機構による吐出および／または吸引により行うことができ、移動の方向は、一方向でもよいし、双方向（往復送液）でもよい。少なくとも所定の作動圧力Ｘを生み出すために必要なプレウェット液の流量は、通液系機構１１０にとって適切な流量の範囲内に収まっていることが好ましいが、もしもその範囲外にある場合でも、通液系機構１１０の流量を適切な範囲内で設定した上で、所定の時間、吐出および／または吸引することで、所定の作動圧力Ｘを生み出すことが可能である。
【００６０】
このような（２）の実施形態を採用する場合、制御手段１９０は、所定のタイムスケジュールで自動的に、通液系機構１１０でプレウェット液１１を所定の高流量で移動させるよう操作することのできる制御プログラムを実行可能なものとすることが好ましい。また、細胞展開用デバイス３０の出口部７は、マイクロ流路内のプレウェット液に圧力がかかりやすくするよう、面積が小さいものの方が好ましい。
【００６１】
以上のように、本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理方法では、上記の各工程（Ｃ）〜（Ｈ）を連続的に行うことにより、全てのマイクロチャンバー４をプレウェット液１１で満たした細胞展開用デバイスを提供することができる。すなわち、本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理方法では、細胞展開用デバイス３０のマイクロ流路５内に、単にプレウェット液１１を通液しただけでは、図９に示したようにマイクロチャンバー４内に気泡９が残存してしまうので、このマイクロ流路５内に常圧より大きい圧力を印加することにより、気泡９をプレウェット液中に溶解させている。
【００６２】
［前処理システム］
以下に、本発明に係る前処理方法を実施するのに好適な細胞展開用デバイスの前処理システム２００について説明する。
【００６３】
前処理システム２００は、細胞展開用デバイス３０と、試薬収容器２０と、細胞検出装置１００と、制御手段１９０などとから構成されている。細胞展開用デバイス３０および試薬収容器２０は、細胞検出装置１００にセットして用いられ、また制御手段１９０は細胞検出装置１００を制御可能なよう接続して用いられる。
【００６４】
細胞検出装置１００は、細胞展開用デバイス３０のマイクロ流路５に、各種の液体を通液するための通液系機構１１０、撮像装置１２０、細胞展開用デバイス３０を保持する細胞回収デバイスホルダー１６０、試薬収容器を保持する試薬収容器ホルダー１７０、ならびに細胞検出装置１００が備える各種の機器類を制御するための制御手段１９０を備える。通液系機構１１０および撮像装置１２０は、任意の位置で液の吸引・吐出および細胞観察を可能にするための空間的な移動手段を備えることが望ましい。
【００６５】
通液系機構１１０は、制御手段１９０の制御により、試薬収容器２０内に貯留されたプレウェット液１１や細胞懸濁液の他、染色液、解離液、洗浄液、その他の試薬類のそれぞれの収納部と、細胞展開用デバイス１０の入口部３との間を移動し、それらの液の吸引および吐出を行う機構である。具体的には、通液系機構１１０によって、試薬収容器に収容されているプレウェット液１１、細胞懸濁液などの液体を所定の量吸引し、細胞展開用デバイス３０の入口部３で所定の流量で吐出して、マイクロ流路５に導入する。
【００６６】
また、通液により所定の処理が終わった後は、マイクロ流路５を満たしていた液体を入口部３から吸引して排出し、試薬収容器２０の廃液収納部で吐出する。通液系機構１１０は、例えば、シリンジポンプ、交換可能なチップ、Ｘ軸方向（図５の左右方向）およびＺ軸方向（図５の上下方向）に移動可能なアクチュエーターなどを用いて構築することができる。シリンジポンプは、細胞観察に関する各工程において、所望の流量で吸引および吐出ができる能力を有する。
【００６７】
撮像装置１２０は、対物レンズ、対眼レンズ、ＣＣＤカメラなどを含む蛍光顕微鏡に準じた形態とし、マイクロチャンバー４に付着した気泡９を撮影することができる。
【００６８】
制御手段１９０としては、細胞検出装置１００の各種の機器類に接続され、それらの機器類の制御プログラムを実行可能なパーソナルコンピュータを用いることができる。制御プログラムは、パーソナルコンピュータが内蔵する記憶媒体に記憶されていても良いし、ネットワークまたは取り外し可能な記憶媒体を介してパーソナルコンピュータが利用できる状態に置かれていても良い。
【００６９】
制御プログラムは、気泡空気９の検出や作動圧力Ｘの算出、作動圧力Ｘをマイクロ流路５に作用させる操作などを、各種データから自動化して求めることができるものである。また、細胞観察のための所定の工程に従って、所定のタイムスケジュールで、プレウェット液１１や細胞懸濁液などを通液するよう通液系機構１１０を操作したりできるものである。
【００７０】
本発明の好ましい実施の形態では、制御手段１９０により作動圧力Ｘを算出するようにしているが、本発明は、これに限定されない。
【００７１】
プレウェット液１１の通液により気泡９が残存するマイクロチャンバー４の割合は、用いるプレウェット液の実施形態によって一定の傾向が定まっており、例えばプレウェット液としてエタノール水溶液を用いる場合、当該プレウェット液中のエタノールの濃度によって図６のように定まることが実験の結果から明らかである（なお、図６では、複数回の実験結果の中から最大値を採用している）。そのため、予め用意された図６のグラフに基づいて、気泡９が付着するマイクロチャンバー４の割合を仮定し、これにマイクロチャンバー４の体積を掛けあわせることで残存する気泡状態の空気の合計量Ａを算出することもできる。
【００７２】
このように、本発明では、制御手段１９０に図６の情報を記憶させておき、この情報から作動圧力Ｘを近似的に求めることもできる。
【００７３】
試薬収容器２０には、プレウェット液１１、細胞懸濁液、洗浄液など、細胞観察を行う上で流路１に通液する必要のある各種の液体が収容されている。
【００７４】
本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理システム２００によれば、本発明に係る前処理方法を容易に実施することができ、これにより実質的に全てのマイクロチャンバーがプレウェット液で予め満たされた細胞展開用デバイスを作製することができる。
【００７５】
なお、本発明に係る細胞展開用デバイスの前処理システム２００では、マイクロ流路５内の温度を室温あるいは定められたある温度で一定に維持するものであってもよいが、細胞展開用デバイス３０のマイクロ流路５内にプレウェット液１１を通液した後に、プレウェット液１１の温度を、例えば４〜１０℃程度に下げるように設定することが好ましい。プレウェット液１１の温度を下げるように通液後に冷却すれば、マイクロ流路５に通液した後に残存した気泡９は、温度低下により体積が減少するため、気泡状態の空気の合計体積Ａが少なくなり、また水（プレウェット液）の温度が低いほど空気の飽和溶解量が増加するので、結果として、作動圧力Ｘを低くすることができる。
【００７６】
このような実施形態を採用する場合、細胞検出装置１００（細胞回収デバイスホルダー１６０）は、例えば冷却用プレートや小型の温度センサーを含む温度調節機構（図示せず）を備え、制御手段１９０は、当該温度調節機構により所定のタイムスケジュールで自動的にプレウェット液１１の温度を下げるよう操作することのできる、温度調節用の制御プログラムを実行可能なものとすることが好ましい。
【実施例】
【００７７】
＜比較例１：純水をプレウェットとして、低流量（１ｍｌ／ｍｉｎ）で通水した場合＞
幅１５ｍｍ、深さ０．１ｍｍ、長さ４３ｍｍのマイクロ流路５の底面に、直径０．１２ｍｍ、深さ０．０５ｍｍの円柱状のマイクロチャンバー４が１４０００個配置された細胞展開用デバイスのマイクロ流路５中に、シリンジポンプを用いて１ｍｌ／ｍｉｎで１００μｌの純水（エタノール濃度０％）をゆっくりと通液した。顕微鏡で観察した画像より、チャンバー数の全体の約９９％のチャンバーに気泡が残存し、プレウェット液が満たされていない状態が生じた。【００７８】
＜比較例２：３０％エタノール水溶液を低流量（シリンジポンプ：１ｍｌ／ｍｉｎ）で通水した場合＞
幅１５ｍｍ、深さ０．１ｍｍ、長さ４３ｍｍのマイクロ流路５の底面に、直径０．１２ｍｍ、深さ０．０５ｍｍの円柱状のマイクロチャンバー４が１４０００個配置された細胞展開用デバイスのマイクロ流路５中に、シリンジポンプを用いて１ｍｌ／ｍｉｎで１００μｌの３０％のエタノール水溶液をゆっくりと通液した。顕微鏡で観察した画像より、チャンバー数の全体の約１５％のチャンバーに気泡が残存し、プレウェット液が満たされていない状態が生じた。【００７９】
＜実施例１：出口部を封止して圧力を掛けた場合＞
幅１５ｍｍ、深さ０．１ｍｍ、長さ４３ｍｍのマイクロ流路５の底面に、直径０．１２ｍｍ、深さ０．０５ｍｍの円柱状のマイクロチャンバー４が１４０００個配置された細胞展開用デバイスのマイクロ流路５中に、シリンジポンプを用いて１ｍｌ／ｍｉｎで１００μｌの純水をプレウェット液としてゆっくりと通液した。顕微鏡で観察した画像より、約９９％のチャンバーに気泡が残存したことが確認できた。チャンバー１個当たりの残存空気泡の体積が約０．８nlで、１４０００個のマイクロチャンバーの９９％に空気泡が残存しているため、その体積の合計量Ａは約１１nlであった。２５℃の室温における空気の溶解度が、１ｃｍ3中純水で約０．０２ｃｍ3であるとする（理科年表より）と、マイクロ流路体積８６μｌ中のプレウェット液には既に約１．５μｌ（Ｂ）の空気が溶解していると考えられるため、全ての空気を溶解するためには、（Ａ＋Ｂ）／Ｂ＝約８となり、少なくとも常圧Ｐの８倍の空気（８Ｐ）を印加する必要があることがわかった。事前に、出口部７を封止したシリンジ（ハミルトン社製、容量１ｍｌ）の駆動量と内部圧力の関係を圧力センサ（ＫＥＹＥＮＣＥ社製）で測定し、プレウェット液（純水）が入った状態のマイクロ流路５内が９Ｐの圧力となるように、シリンジとシリンジポンプ（マイクロシリンジポンプ）で印加した。再度顕微鏡で画像を撮影したところ、約９９％のマイクロチャンバーがプレウェット液で満たされていた。【００８０】
＜実施例２：出口部を開放した状態で高流量（シリンジポンプ：４０ｍｌ／ｍｉｎ）でプレウェットした場合＞
幅１５ｍｍ、深さ０．１ｍｍ、長さ４３ｍｍのマイクロ流路５の底面に、直径０．１２ｍｍ、深さ０．０５ｍｍの円柱状のマイクロチャンバー４が１４０００個配置された細胞展開用デバイスのマイクロ流路５にプレウェット液として純水を通液した場合、全てのマイクロチャンバーに、空気の気泡が残存することを仮定し、マイクロチャンバー１個当たりの残存空気泡の体積が約０．８ｎｌで、１４０００個のチャンバーがあるため、その体積の合計量Ａは約１１μｌと算出された。２５℃の室温における空気の溶解度が、１ｃｍ3中純水で約０．０２ｃｍ3であるとする（理科年表）と、マイクロ流路体積８６μｌ中のプレウェット液には常圧で約１．５μｌ（Ｂ）の空気が溶解していると考えられるため、全ての空気を溶解するためには、少なくとも（Ａ＋Ｂ）／Ｂ＝約８倍の圧力を印加する必要があることが分かった。流量は、マイクロシリンジポンプで制御した。マイクロ流路デバイスの耐圧性を考慮して、４０ｍｌ／ｍｉｎの流量を設定し、出口部７を開放したマイクロ流路５に設置したシリンジ（テルモ社製、容量５０ｍｌ）とマイクロ流路５との間にかかる圧力を圧力センサ（ＫＥＹＥＮＣＥ社製）で測定した。約１分間ポンプを駆動させることで、内部圧力が常圧Ｐの約９倍（９Ｐ）となることが分かったため、ポンプの設定流量を４０ｍｌ／ｍｉｎとして１分間（４０ｍｌ）、純水をプレウェット液としてマイクロ流路５に通液して圧力を印加した。再度顕微鏡で画像を撮影したところ、約９９％のマイクロチャンバーがプレウェット液で満たされていた。
【符号の説明】
【００８１】
２      マイクロチャンバーチップ
３      入口部
４      マイクロチャンバー
５      マイクロ流路
７      出口部
８      流路形成枠体
９      気泡
１１    プレウェット液
２０    試薬収容器
３０    細胞展開用デバイス
３４    枠状のシール部材
１００  細胞検出装置
１１０  通液系機構
１２０  撮像装置
１７０  試薬収容器
１９０  制御手段
２００  細胞展開用デバイスの前処理システム
Ｂ      既に溶解している空気の溶解量
Ｃ      マイクロチャンバーチップ形成工程
Ｄ      プレウェット液通液工程
Ｅ      気泡付きマイクロチャンバー検出工程
Ｆ      気泡空気体積算出工程
Ｇ      作動圧力算出工程
Ｈ      気泡溶解工程
Ｊ      長さ
Ｘ      作動圧力
【要約】
予め細胞用展開用デバイスの濡れ性を向上させるために、マイクロ流路内にプレウェット液を通液する場合に、プレウェット液による濡れ性を確実に向上させることができる細胞展開用デバイスの前処理方法、および濡れ性を向上させた細胞展開用デバイス、ならびに濡れ性を向上させるための細胞展開用デバイスの前処理システムを提供することを課題とする。本発明は、複数のマイクロチャンバーが形成された細胞展開用デバイスにおいて、プレウェット液通液工程後にマイクロチャンバー内に残存する気泡を除去するための、細胞展開用デバイスの前処理方法であって、前記マイクロチャンバーの１個当たりの体積と、前記マイクロチャンバーの総数とが予め設定されるマイクロチャンバーチップ形成工程と、マイクロ流路にプレウェット液を通液するプレウェット液通液工程と、プレウェット液を通液した後、気泡が存在するマイクロチャンバーの数を検出する気泡付きマイクロチャンバー検出工程と、気泡状態の空気の合計量Ａを算出する気泡空気体積算出工程と、前記気泡状態の空気の合計体積Ａと、前記プレウェット液中に既に溶解している空気の体積Ｂとの和から、（Ａ＋Ｂ）／Ｂを算出し、この算出された値に常圧Ｐを掛けあわせて、作動圧力Ｘ＝Ｐ×（Ａ＋Ｂ）／Ｂを算出する作動圧算出工程と、作動圧力Ｘを前記マイクロ流路に作用させることにより、気泡として存在する空気を前記プレウェット液内に溶かし込む気泡溶解工程と、を有する。【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0005825460.tif 000009
【図９】
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