(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光軸方向に移動が可能な球面収差補正レンズを有する対物レンズと、
カバーガラスを通して標本の顕微像を前記対物レンズと協働して得る結像レンズと、
前記結像レンズの結像面に配置された撮像部と、
前記対物レンズと前記標本との間隔を合焦位置を含む範囲内で変化させ、それぞれの間隔位置で前記撮像部にて撮像された画像の画質の評価値を計測する計測部と、
前記撮像された画像において支配的な空間周波数を解析する周波数解析部と、
前記計測された画質の評価値の前記間隔位置に対する応答曲線の前記合焦位置を基準とする非対称性を定量化する定量化部と、
空間周波数別に前記カバーガラスの厚み誤差を補正可能な前記球面収差補正レンズの位置情報と前記非対称性との相関を記憶する記憶部と、
前記解析された空間周波数と前記定量化された非対称性をもとに前記記憶部から前記球面収差補正レンズの位置情報を取得し、この位置情報をもとに前記球面収差補正レンズの位置を制御する補正レンズ制御部と
を具備する顕微鏡装置。
【請求項２】
光軸方向に移動が可能な球面収差補正レンズを有する対物レンズと、カバーガラスが上面に配置された標本との間隔を合焦位置を含む範囲内で可変して、それぞれの間隔位置で撮像された画像の画質の評価値を計測し、
前記撮像された画像において支配的な空間周波数を解析し、
前記計測された画質の評価値の前記間隔位置に対する応答曲線の前記合焦位置を基準とする非対称性を定量化し、
前記解析された空間周波数と前記定量化された非対称性をもとに前記記憶部から前記球面収差補正レンズの位置情報を取得し、この位置情報をもとに前記球面収差補正レンズの位置を制御する
顕微鏡装置の球面収差補正方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カバーガラスの厚さ誤差に起因する収差の補正機能を有する対物レンズを備えた顕微鏡装置及び球面収差補正方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
顕微鏡は、観察対象である標本をその上に重ねられたカバーガラスを通して観察する。顕微鏡の顕微鏡用対物レンズは、カバーガラスに起因する収差の影響を想定して設計されている。このため、製造誤差などによってカバーガラスの厚さが設計値からずれると収差の発生状況が変わり、結像性能が劣化する傾向にある。この傾向は、特に開口数の大きい高性能な対物レンズほど顕著になる。
【０００３】
そこで顕微鏡用対物レンズに光軸方向への移動が可能な球面収差補正用レンズを設け、カバーガラスの厚さの変動による収差変動を球面収差補正用レンズの位置の調整により補正することが行われている。そして、球面収差補正用レンズの位置調整による収差補正は、対物レンズに組み込まれた補正環のマニュアル操作によって行うことが主流であった（例えば特許文献１、２，３）。
【０００４】
一方、特許文献４は、球面収差補正用レンズによる収差補正を自動化する技術を開示している。これは、球面収差補正用レンズの移動、撮像、撮像した画像のコントラストの評価を繰り返し、最もコントラストが高くなった球面収差補正用レンズの位置を判断するというものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−４３６２４号公報（段落［００１７−００１８］）
【特許文献２】特開２０１０−４８８４１号公報（段落［００１１−００１２］）
【特許文献３】特開平２００２−１６９１０１号公報（段落［００２２−００２４］）
【特許文献４】特開２００１−８３４２８号公報（段落［００３７−００３８］）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、球面収差補正用レンズを移動させると対物レンズの合焦位置も変動する。したがって、球面収差補正用レンズを移動させて最もコントラストが高くなった位置を球面収差の補正結果とする方法では、コントラストの計測結果にフォーカス変動に起因する成分も含まれてしまうため、球面収差補正を精度良く行うことが困難であった。コントラストの計測結果からフォーカス変動による成分を排除するためには、球面収差補正用レンズの移動に伴いフォーカス調整を行う必要があり、この結果、手間がかかり、球面収差補正を高速に行うことが困難であった。
【０００７】
以上のような事情に鑑み、本発明の目的は、カバーガラスの厚み誤差に起因する球面収差の補正を高速且つ良好に行うことのできる顕微鏡装置及び球面収差補正方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するため、本発明の一形態に係る顕微鏡装置は、光軸方向に移動が可能な球面収差補正レンズを有する対物レンズと、カバーガラスを通して標本の顕微像を前記対物レンズと協働して得る結像レンズと、前記結像レンズの結像面に配置された撮像部と、前記対物レンズと前記標本との間隔を合焦位置を含む範囲内で変化させ、それぞれの間隔で前記撮像部にて撮像された画像の画質の評価値を計測する計測部と、前記計測された画質の評価値の前記間隔位置に対する応答曲線の前記合焦位置を基準とする非対称性を定量化する定量化部と、前記カバーガラスの厚み誤差を補正可能な前記球面収差補正レンズの位置情報と前記非対称性との相関を記憶する記憶部と、前記定量化部にて定量化された非対称性をもとに前記記憶部から前記球面収差補正レンズの位置情報を取得し、この位置情報をもとに前記球面収差補正レンズの位置を制御する補正レンズ制御部とを具備する。
【０００９】
コントラスト評価値の応答曲線は、カバーガラスの厚みが最適値である場合に、合焦位置を基準に左右対称となり、カバーガラスの厚みが最適値よりずれている場合には、そのずれ量とずれの方向が、コントラスト評価値の応答曲線の合焦位置を基準する非対称性の形状となって現れる。本発明では、コントラスト評価値の応答曲線の非対称性の形状を定量化した値と、カバーガラスの厚みの最適値からの誤差に起因する球面収差を補正するための球面収差補正レンズの位置情報との相関を実測等により予め作成して記憶部に記憶する。そして、定量化部にて、観察あるいは撮影対象の標本について定量化した非対称性をもとに、記憶部から球面収差補正レンズの位置情報を取得し、この位置情報をもとに球面収差補正レンズの位置を制御する。これにより、カバーガラスの厚み誤差に起因する球面収差の補正を高速且つ良好に行うことができる。
【００１０】
前記計測部は、前記画像の画質の評価値としてコントラスト評価値を計測するものであってもよい。
【００１１】
前記計測部は、コントラスト方式のオートフォーカス評価値を計測するものであってもよい。これにより、合焦位置の判定と同時に画像の画質の評価値が得られることで、球面収差補正をより高速化できる。
【００１２】
前記記憶部は、空間周波数別に前記カバーガラスの厚み誤差を補正可能な前記球面収差補正レンズの位置情報と前記非対称性との相関を記憶し、前記計測部は、前記撮像された画像において支配的な空間周波数を分析し、前記補正レンズ制御部は、前記分析された空間周波数と前記定量化部にて定量化された非対称性をもとに前記記憶部から前記球面収差補正レンズの位置情報を取得し、この位置情報をもとに前記球面収差補正レンズの位置を制御するようにしてもよい。これにより、画像の空間周波数の違いによる球面収差補正の誤差を低減することができる。
【００１３】
前記計測部は、前記画像の画質の評価値としてＳ／Ｎ比を計測するものとしてもよい。
【００１４】
本発明の別の側面の球面収差補正方法は、光軸方向に移動が可能な球面収差補正レンズを有する対物レンズと、カバーガラスが上面に配置された標本との間隔を合焦位置を含む範囲内で可変して、それぞれの間隔位置で撮像された画像の画質の評価値を計測し、前記画質の評価値の前記各間隔位置に対する応答曲線の前記合焦位置を基準とする非対称性を定量化し、前記定量化された非対称性をもとに、前記カバーガラスの厚み誤差を補正可能な前記球面収差補正レンズの位置情報と前記非対称性との相関を記憶する前記記憶部から前記球面収差補正レンズの位置情報を取得し、この位置情報をもとに前記球面収差補正レンズの位置を制御することを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、標本のカバーガラスの厚み誤差に起因する球面収差の補正を高速且つ良好に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡装置の構成を示す図である。
【図２】図１の対物レンズにおける球面収差補正レンズの駆動について説明する図である。
【図３】（Ａ）は標本のカバーガラス厚が最適値（設計値）である場合の撮影画像のコントラストのデフォーカスに対する応答曲線を示すグラフ、（Ｂ）は標本のカバーガラス厚が最適値（設計値）より厚い場合の撮影画像のコントラストのデフォーカスに対する応答曲線を示すグラフ、（Ｃ）は標本のカバーガラス厚が最適値（設計値）より薄い場合の撮影画像のコントラストのデフォーカスに対する応答曲線を示すグラフである。
【図４】非対称性パラメータκの定義の一例を示す図である。
【図５】カバーガラスの厚み誤差δＣＧとレンズ間隔ｄ１、ｄ２の各値との相関を示す図である。
【図６】カバーガラスの厚み誤差δＣＧと非対称性パラメータκとの相関の一例を示す図である。
【図７】非対称性パラメータκとレンズ間隔ｄ１、ｄ２の各値との相関表の例を示す図である。
【図８】第１の実施形態の球面収差補正のフローチャートである。
【図９】第２の実施形態に係る顕微鏡装置の構成を示す図である。
【図１０】（Ａ）はカバーガラスの厚みが基準厚ＣＧ０  そのものである場合の各間隔位置（デフォーカス位置）のＡＦ評価値の応答曲線を示すグラフ、（Ｂ）は基準厚ＣＧ０  に対して０．０１［ｍｍ］の厚み誤差δＣＧをもつカバーガラスＧを用いた場合の各間隔位置（デフォーカス位置）のＡＦ評価値の応答曲線を示すグラフ、（Ｃ）は基準厚ＣＧ０  に対して-０．０３５［ｍｍ］の厚み誤差δＣＧをもつカバーガラスＧを用いた場合の各間隔位置（デフォーカス位置）のＡＦ評価値の応答曲線を示すグラフである。
【図１１】第２の実施形態の球面収差補正のフローチャートである。
【図１２】第３の実施形態に係る顕微鏡装置の構成を示す図である。
【図１３】第３の実施形態の球面収差補正のフローチャートである。
【図１４】変形例１の球面収差補正のフローチャートである。
【図１５】非対称性パラメータκの定義の別の例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、図面を参照しながら、本発明の実施形態を説明する。
＜第１の実施形態＞
［顕微鏡装置の構成］
図１は、本発明の一実施形態に係る顕微鏡装置の構成を示す図である。
同図に示すように、この顕微鏡装置１００は、ステージ１１、ステージ駆動部１２、球面収差補正レンズ付き対物レンズ１３、補正レンズ駆動部１４、結像レンズ１５、撮像部１６、及び制御装置１７などで構成される。
【００１８】
ステージ１１は、カバーガラスＧを載せたカバーガラス付き標本（以下単に「標本」と呼ぶ。）１が載置され、ステージ駆動部１２によって光軸方向ＯｐをＺ軸方向としてＸ，Ｙ，Ｚの３軸方向に駆動される。ステージ駆動部１２は、制御装置１７からの制御信号に基づきステージ１１を駆動する。球面収差補正レンズ付き対物レンズ（以下単に「対物レンズ」と呼ぶ。）１３は、ステージ１１の上方に配置される。この対物レンズ１３は、標本１におけるカバーガラスＧの厚さ誤差などに起因した球面収差を補正する球面収差補正レンズ１３Ａ，１３Ｂを含む対物レンズシステムである。対物レンズ１３において、球面収差補正レンズ１３Ａ，１３Ｂは光軸方向Ｏｐ（＝Ｚ軸方向）に移動可能である。補正レンズ駆動部１４は、対物レンズ１３内にて球面収差補正レンズ１３Ａ，１３Ｂを光軸方向Ｏｐに駆動する。結像レンズ１５は、対物レンズ１３と協働して標本１の顕微像を撮像部１６の撮像面に結ぶ。撮像部１６は、ＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｄｅｖｉｃｅ）のようなイメージセンサなどで構成され、顕微像を構成する光信号を電気的な信号に変換するとともにデジタル化して制御装置１７に供給する。
【００１９】
制御装置１７は、例えば、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）、各種のインタフェースを有する典型的なコンピュータシステムなどにより構成される。制御装置１７はＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）であってもよい。
【００２０】
制御装置１７のＲＯＭには、顕微鏡装置１００を制御するためのプログラム及びデータなどのソフトウェアが格納されており、運用時はＲＯＭからメインメモリとしてのＲＡＭに必要なプログラム及びデータがロードされる。ＣＰＵはＲＡＭにロードされたプログラム及びデータを読み込んで制御を実行する。
【００２１】
次に、ＣＰＵがＲＡＭにロードされたプログラムを読み込んで制御を実行することによって実現される制御装置１７の機能的な構成を説明する。
【００２２】
図１に示すように、制御装置１７は、コントラスト計測部１７１（計測部）、非対称性計算部１７２（定量化部）、相関表記憶部１７３（記憶部）、補正レンズ制御部１７４（補正レンズ制御部）を有する。
【００２３】
コントラスト計測部１７１は、ステージ１１を制御して標本１と対物レンズ１３との間隔を合焦位置を含む範囲内で変化させ、それぞれの間隔位置（デフォーカス位置）で撮像部１６より取得した画像のコントラストの例えば平均値などのコントラスト評価値を計測して非対称性計算部１７２に与える。また、間隔の変化の方法は上記に限定されず、対物レンズ１３を駆動して行っても良い。
【００２４】
非対称性計算部１７２は、コントラスト計測部１７１より計測されたコントラスト評価値の間隔位置（デフォーカス位置）に対する応答曲線の合焦位置を基準とする非対称性を定量化した非対称性パラメータκを計算する。
【００２５】
相関表記憶部１７３は、カバーガラスＧの厚み誤差を補正可能な球面収差補正レンズ１３Ａ，１３Ｂの位置情報と非対称性パラメータκとの相関表を記憶する。
【００２６】
補正レンズ制御部１７４は、非対称性計算部１７２により求められた非対称性パラメータκをもとに、相関表記憶部１７３に記憶された相関表から球面収差補正レンズ１３Ａ，１３Ｂの位置情報を取得し、補正レンズ駆動部１４に制御信号を供給する。
【００２７】
図２は対物レンズ１３における球面収差補正レンズの駆動について説明する図である。
本例の対物レンズ１３は、例えば、４つのレンズ１３Ａ，１３Ｂ，１３Ｃ，１３Ｄで構成される。これらのレンズ１３Ａ，１３Ｂ，１３Ｃ，１３Ｄにおいて、観察対象である標本１寄りの２つのレンズ１３Ａ，１３Ｂは球面収差補正レンズ１３Ａ，１３Ｂとして光軸方向Ｏｐに移動可能とされ、レンズ１３Ａとレンズ１３Ｂとの距離ｄ１及びレンズ１３Ｂとレンズ１３Ｃとの距離ｄ２の制御によって、球面収差補正を行うことが可能とされている。ここで、距離ｄ１及び距離ｄ２が球面収差補正レンズ１３Ａ，１３Ｂの位置情報とされる。
【００２８】
［非対称性パラメータκについて］
図３（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）は、ある空間周波数における撮影画像のコントラスト評価値のデフォーカス位置に対する応答曲線を、カバーガラスＧの厚みが最適値（設計値）である場合（Ａ）、最適値より厚い場合（Ｂ）、最適値より薄い場合（Ｃ）についてそれぞれ示したグラフである。
【００２９】
図３（Ａ）に示すように、ある空間周波数における撮影画像のコントラスト評価値のデフォーカス位置に対する応答曲線は、カバーガラスＧの厚みが設計値通り（最適値）であれば、合焦位置を基準にほぼ左右対称の形状となる。ところが、図３（Ｂ）及び（Ｃ）に示すように、カバーガラスＧの厚みが最適値からずれると、応答曲線の形状が合焦位置に対して非対称になる。これは光軸方向における光学性能の非対称性を示している。光軸方向の対称性の崩れから発生する収差は球面収差であるため、図３（Ｂ）及び（Ｃ）は球面収差そのものを表していると言える。また、カバーガラスＧが最適値よりも厚い場合と薄い場合とでは互いに逆向きの非対称性を示す。
【００３０】
本実施形態では、コントラスト評価値の応答曲線の非対称性を定量化する非対称性パラメータκを定義する。
図４は、この非対称性パラメータκの定義の一例を示す図である。
図４において、ＣＮＴmax  はコントラスト評価値の応答曲線における最大値、ＣＮＴ１／ｅ２は最大値ＣＮＴmax  の１／ｅ２に相当するコントラスト評価値、Ｚ０は最大値ＣＮＴmax  が得られるときのデフォーカス位置、Ｚ１はＣＮＴ１／ｅ２が得られるときのマイナス側のデフォーカス位置、Ｚ２はＣＮＴ１／ｅ２が得られるときのプラス側のデフォーカス位置である。
【００３１】
この例では、非対称性パラメータκは、上記のＺ０，Ｚ１，Ｚ２を用いて次のように定義される。
κ＝（｜Ｚ０−Ｚ１｜−｜Ｚ２−Ｚ０｜）／（｜Ｚ２−Ｚ１｜）×１００  …（１）
【００３２】
勿論、これは一例に過ぎず、非対称性を良好に定量化できるものであればよい。
【００３３】
図１５は、非対称性パラメータκの定義の別の例を示す図である。
図１５において、ＣＮＴmax  はコントラスト評価値の最大値、ＣＮＴＦＷＨＭは最大値ＣＮＴmax  の半値全幅（ＦＷＨＭ：Ｆｕｌｌ Ｗｉｄｔｈ ａｔ Ｈａｌｆ Ｍａｘｉｍｕｍ）に相当するコントラスト評価値、Ｚ０は最大値ＣＮＴmax  が得られるときのデフォーカス位置、Ｚ１はＣＮＴＦＷＨＭが得られるときのマイナス側のデフォーカス位置、Ｚ２はＣＮＴＦＷＨＭが得られるときのプラス側のデフォーカス位置である。この場合も、非対称性パラメータκは上記（１）式により定義される。
【００３４】
次に、本実施形態の顕微鏡装置１００の動作を説明する。
図８は、本実施形態の顕微鏡装置１００による球面収差補正のフローチャートである。
【００３５】
［球面収差補正のための事前準備］
まず、球面収差補正のための事前準備が行われる。
カバーガラスＧの基準厚をＣＧ０  、カバーガラスＧの基準厚ＣＧ０  に対する厚み誤差をδＣＧとする（ステップＳＳ１０１，Ｓ１０２）。事前準備において、制御装置１７は、基準厚ＣＧ０  （厚み誤差δＣＧ＝０）のカバーガラスＧが付けられたテストチャート画像標本を用いて、基準厚ＣＧ０  のカバーガラスＧに対して最適なレンズ間隔ｄ１、ｄ２をシミュレーションまたは実測等により求める。また制御装置１７は、基準厚ＣＧ０  に対して様々な厚み誤差δＣＧをもつカバーガラスＧが付けられた複数のテストチャート画像標本を順次用いて、それぞれの厚み誤差δＣＧに対して最適なレンズ間隔ｄ１、ｄ２をシミュレーションまたは実測等により求める（ステップＳ１０３）。図５はカバーガラスＧの基準厚ＣＧ０  を０．１７［ｍｍ］とした場合の厚み誤差δＣＧとレンズ間隔ｄ１、ｄ２との相関を示す図である。
【００３６】
次に、基準厚ＣＧ０  （厚み誤差δＣＧ＝０）に対して最適なレンズ間隔ｄ１０  、ｄ２０  が設定された状態で（ステップＳ１０４）、コントラスト計測部１７１は、基準厚ＣＧ０  のカバーガラスＧが付けられたテストチャート画像標本を用いて、このテストチャート画像標本と対物レンズ１３との間隔を±ｘ［μｍ］の範囲でｙ［μｍ］刻みで変更し、それぞれの間隔位置（デフォーカス位置）で撮影された画像のコントラスト評価値を計測する。各計測結果は非対称性計算部１７２に与えられる。非対称性計算部１７２は、コントラスト計測部１７１より与えられたコントラスト評価値の応答曲線から（１）式により非対称性パラメータκを計算する。この結果、基準厚ＣＧ０  （厚み誤差δＣＧ＝０）と非対称性パラメータκとの相関が得られる。基準厚ＣＧ０  に対して様々な厚み誤差δＣＧを有するカバーガラスＧが付けられたテストチャート画像標本についても同様に、画像のコントラスト評価値の計測と、コントラスト評価値の応答曲線からの非対称性パラメータκの計算が行われ、この結果、各厚み誤差δＣＧ と非対称性パラメータκとの相関が得られる（ステップＳ１０５）。図６はカバーガラスＧの基準厚ＣＧ０  を０．１７［ｍｍ］とした場合の厚み誤差δＣＧと非対称性パラメータκとの相関の一例を示す図である。
【００３７】
以上により求められた、カバーガラスＧの基準厚ＣＧ０  及び各厚み誤差δＣＧとレンズ間隔ｄ１、ｄ２との相関と、カバーガラスＧの基準厚ＣＧ０  及び各厚み誤差δＣＧと非対称性パラメータκとの相関から、非対称性パラメータκとレンズ間隔ｄ１、ｄ２との相関表が生成され、相関表記憶部１７３に格納される（ステップＳ１０６）。図７は、カバーガラスＧの基準厚ＣＧ０  を０．１７［ｍｍ］とした場合の非対称性パラメータκとレンズ間隔ｄ１、ｄ２との相関表の例を示す図である。
以上で、球面収差補正のための事前準備が完了となる。
【００３８】
［球面収差補正のための制御］
まず、ステージ１１の上に標本１がセットされ、透過照明が標本１に照射される（ステップＳ１０７）。次に、制御装置１７は、オートフォーカスにより合焦位置を決定する（ステップＳ１０８）。次に、コントラスト計測部１７１が、合焦位置を中心に±ｘ［μｍ］の範囲でｙ［μｍ］刻みで標本１と対物レンズ１３との間隔を変更し、それぞれの間隔位置（デフォーカス位置）で撮像部１６にて撮像された画像のコントラスト評価値を計測し、その計測結果を非対称性計算部１７２に供給する（ステップＳ１０９）。非対称性計算部１７２は、コントラスト計測部１７１からのコントラスト評価値の応答曲線から（１）式により非対称性パラメータκを計算する（ステップＳ１１０）。
【００３９】
続いて、補正レンズ制御部１７４は、計算された非対称性パラメータκをもとにレンズ間隔ｄ１、ｄ２を決定する。すなわち、補正レンズ制御部１７４は、相関表記憶部１７３に記憶された非対称性パラメータκとレンズ間隔ｄ１、ｄ２との相関表を参照して、例えば、計算された非対称性パラメータκに最も近い相関表記憶部１７３内の非対称性パラメータκを判定し、この非対称性パラメータκに対応するレンズ間隔ｄ１、ｄ２を取得する（ステップＳ１１１）。そして補正レンズ制御部１７４は、取得したレンズ間隔ｄ１、ｄ２をもとにそれぞれの球面収差補正レンズ１３Ａ，１３Ｂの光軸方向Ｏｐでの位置を算出し、補正レンズ駆動部１４に制御信号を供給する。補正レンズ駆動部１４は、補正レンズ制御部１７４からの制御信号をもとに２つの球面収差補正レンズ１３Ａ，１３Ｂを駆動する。これにより、対物レンズ１３内のレンズ間隔ｄ１、ｄ２が、非対称性パラメータκに対応する各値に設定される（ステップＳ１１２）。
【００４０】
以上で、球面収差補正のための制御が完了し、この後、制御装置１７はオートフォーカス処理を実行して合焦位置を決定し（ステップＳ１１３）、標本１の実際の撮影が行われる（ステップＳ１１４）。
【００４１】
以上のようにコントラスト評価値の応答曲線は、カバーガラスＧの厚みが最適値である場合に、合焦位置を基準に左右対称となり、カバーガラスＧの厚みが最適値よりずれている場合には、そのずれ量とずれの方向が、コントラスト評価値の応答曲線の合焦位置を基準する非対称性の形状となって現れる。本実施形態では、コントラスト評価値の応答曲線の非対称性を定量化した非対称性パラメータκと、カバーガラスＧの厚みの最適値からの誤差に起因する球面収差を補正するための球面収差補正レンズ１３Ａ，１３Ｂの位置情報との相関を実測等により予め作成して相関表記憶部１７３に記憶しておく。補正レンズ制御部１７４は、コントラスト計測部１７１及び非対称性計算部１７２による処理によって観察あるいは撮影対象の標本１から得られた非対称性パラメータκをもとに、相関表記憶部１７３から球面収差補正レンズ１３Ａ，１３Ｂの位置情報を取得し、この位置情報をもとに球面収差補正レンズ１３Ａ，１３Ｂの位置を制御する。これにより、カバーガラスＧの厚み誤差に起因する球面収差の補正を高速且つ良好に行うことができる。
【００４２】
＜第２の実施形態＞
自動撮影のＡＦ（オートフォーカス）方式としてコントラストＡＦがよく用いられる。コントラストＡＦは、ステージを駆動して標本と対物レンズとの間隔の距離を変化させながら、各間隔位置（デフォーカス位置）でのコントラスト評価値（ＡＦ評価値）を算出し、ＡＦ評価値が最大となったステージの位置（標本と対物レンズとの間隔の距離）を探す方式である。
【００４３】
図９は、第２の実施形態の顕微鏡装置１００Ａの構成を示す図である。
第２の実施形態は、球面収差補正の制御においてコントラスト評価値を計測する手段としてコントラストＡＦ部１７１Ａを採用したものである。コントラストＡＦの際に得られるＡＦ評価値は、ｙ［μｍ］刻みで標本と対物レンズとの間隔を変更し、それぞれの間隔位置（デフォーカス位置）で撮像された画像のＡＦ評価値であることから、第１の実施形態のコントラスト計測部１７１によって計測されるコントラスト評価値と等価なものである。このことからＡＦ評価値から非対称性パラメータκを計算することが可能である。
【００４４】
図１０（Ａ）はカバーガラスＧの厚みが基準厚ＣＧ０  と等しい（δＣＧ＝０）場合の各間隔位置（デフォーカス位置）でのＡＦ評価値を示すグラフである。このＡＦ評価値の間隔位置（デフォーカス位置）に対する応答曲線は合焦位置を基準に左右対称性を有していることが分かる。したがって、対称性パラメータκは、κ＝０に近い値となる。完全にκ＝０にならない理由としては、本実施形態に用いた光学系の残存球面収差、製造公差に起因すると考えられる。それらが除去されていれば、当然、κ＝０となる。一方、図１０（Ｂ）は基準厚ＣＧ０  に対して＋０．０１［ｍｍ］の厚み誤差δＣＧをもつカバーガラスＧを用いた場合の各間隔位置（デフォーカス位置）のＡＦ評価値である。この応答曲線は、合焦位置を基準に非対称性を有しており、例えば（１）式によって非対称性パラメータκを計算するとκ＝３６．８となる。一方、図１０（Ｃ）は基準厚ＣＧ０  に対して−０．０３５［ｍｍ］の厚み誤差δＣＧをもつカバーガラスＧを用いた場合の各間隔位置（デフォーカス位置）のＡＦ評価値である。この応答曲線は、合焦位置を基準に非対称性を有しており、例えば（１）式によって非対称性パラメータκを計算するとκ＝−２６．０となる。
【００４５】
図１１は、コントラストＡＦを採用した球面収差補正のフローチャートである。
ここでステップＳ２０１からステップＳ２０６までの事前準備は、第１の実施形態の図８のステップＳ１０１からステップＳ１０６までの事前準備と同じである。
準備処理が完了した後、ステージ１１の上に標本１がセットされ、透過照明が標本１に照射される（ステップＳ２０７）。この後、制御装置１７は、コントラストＡＦ部１７１Ａを起動してコントラストＡＦを実行させて合焦位置を決定する（ステップＳ２０８）。次に、制御装置１７は、コントラストＡＦの際に得られたＡＦ評価値から非対称性計算部１７２にて非対称性パラメータκを計算する（ステップＳ２０９）。
【００４６】
この後は第１の実施形態の図８のフローのステップＳ１０７以降の動作と同様に、補正レンズ制御部１７４が、非対称性パラメータκをもとにレンズ間隔ｄ１、ｄ２を決定する。
【００４７】
例えば、図１０（Ｂ）に示したＡＦ評価値から非対称性パラメータκがκ＝３６．８と計算された場合、補正レンズ制御部１７４は、相関表記憶部１７３に記憶された相関表（図７参照）からκ＝３６．８に対応するレンズ間隔ｄ１、ｄ２を抽出する。例えば、ＡＦ評価値から求められた非対称性パラメータκの値が相関表におけるどのκの値と最も近いか調べ、その最も近いκに対応するレンズ間隔ｄ１、ｄ２が抽出される。
【００４８】
次に、補正レンズ制御部１７４は、抽出したレンズ間隔ｄ１、ｄ２をもとにそれぞれの球面収差補正レンズ１３Ａ，１３Ｂの光軸方向Ｏｐでの位置を算出し、補正レンズ駆動部１４に制御信号を供給することで、対物レンズ１３内のレンズ間隔ｄ１、ｄ２を補正する（ステップＳ２０７−Ｓ２１１）。以上で、球面収差補正のための制御が完了し、この後、制御装置１７は再びコントラストＡＦ部１７１Ａを起動してコントラストＡＦを実行させて合焦位置を決定し（ステップＳ２１２）、標本１の実際の撮影が行われる（ステップＳ２１３）。
【００４９】
本実施形態によれば、コントラストＡＦで合焦位置を決定し、そのコントラストＡＦの際に得られるＡＦ評価値から非対称性パラメータκを計算するようにしたことで、処理の高速化を図ることができる。すなわち、第１の実施形態と比較すると、合焦位置の決定に対して別途にコントラスト計測部１７１で各間隔位置（デフォーカス位置）でのコントラスト評価値を計測する処理（図８のステップＳ１０９）を省くことができ、球面収差補正の処理時間の大幅な短縮が可能になる。
【００５０】
また、ステップＳ２１２の球面収差補正後のコントラストＡＦの際に得られるＡＦ評価値から再度非対称性パラメータκの値を算出し、球面収差補正のために求めた非対称性パラメータκの値と比較することで、正しく球面収差補正が行われているかどうかの検査を行うようにしてもよい。もし、双方の非対称性パラメータκの値の差が閾値より大きい場合には、例えば、複数回求めた対称性パラメータκの値の平均値をもとに補正を行う方法等が考えられる。
【００５１】
＜第３の実施形態＞
以上の実施形態では、事前準備において、ある空間周波数のテストチャート画像標本を用いて非対称性パラメータκとレンズ間隔ｄ１、ｄ２との相関表を作成した。これに対し、実際に撮影される標本１の画像において支配的な空間周波数が相関表の作成で用いられたテストチャート画像標本において支配的な空間周波数に近いとは限らない。このような空間周波数の違いは球面収差補正の誤差原因となり得る。この問題は、空間周波数別に対称性パラメータκとレンズ間隔のデータとの相関を相関表記憶部１７３に記憶することで解決可能である。
【００５２】
図１２は、第３の実施形態の顕微鏡装置１００Ｂの構成を示す図である。
制御装置１７は、標本１を撮像した画像の空間周波数解析を行い、その結果を補正レンズ制御部１７４Ｂに出力する周波数解析部１７５を有する。
【００５３】
図１３は、第３の実施形態による球面収差補正のフローチャートである。
ここでステップＳ３０１からステップＳ３０６までの事前準備は、第１の実施形態の図８のステップＳ１０１からステップＳ１０６までの事前準備と基本的には同じであるが、ステップＳ３０５では、厚み誤差δＣＧと非対称性パラメータκとの相関を生成する際に、空間周波数ｕ別に相関が生成され、さらに、ステップＳ３０６では、対称性パラメータκ（ｕ）とレンズ間隔ｄ１、ｄ２との相関表が空間周波数ｕ別に作成されて相関表記憶部１７３に保存される。
【００５４】
空間周波数ｕ別の対称性パラメータκ（ｕ）と厚み誤差δＣＧとの相関を生成する方法としては、空間周波数ｕが既知であるテストチャート画像標本を使用する方法等がある。すなわち、制御装置１７は、カバーガラスＧの基準厚ＣＧ０  に対して最適なレンズ間隔ｄ１０  、ｄ２０  を設定したままステージ１１を駆動することによってテストチャート画像標本と対物レンズ１３との距離を変えて、それぞれの間隔位置（デフォーカス位置）で撮影された画像のコントラスト評価値をコントラスト計測部１７１にて計測する。続いて制御装置１７は、非対称性計算部１７２にて、コントラスト応答曲線から非対称性パラメータκ（ｕ）を計算し、この非対称性パラメータκ（ｕ）とレンズ間隔ｄ１、ｄ２との相関表を既知の空間周波数ｕに対応する相関表として相関表記憶部１７３に記憶する。この処理を、他の既知の空間周波数ｕを有するテストチャート画像標本に切り替えて繰り返す。このコントラスト評価値の計測時に、サンプリング周波数を画像において支配的な空間周波数ｕｄに随時設定することが望ましい。
【００５５】
球面収差補正のための制御において、制御装置１７は、ステップＳ３０８にてオートフォーカスにより合焦位置を決定した後、周波数解析部１７５にて標本１の画像に対して周波数解析を行うことで、この画像において支配的な空間周波数ｕｄを計算する（ステップＳ３０９）。次に、コントラスト計測部１７１は合焦位置を中心に±ｘ［μｍ］の範囲でｙ［μｍ］刻みで間隔位置（デフォーカス位置）を変更し、それぞれの間隔位置（デフォーカス位置）で撮像部１６にて撮像された画像のコントラスト評価値を計測し、その計測結果を非対称性計算部１７２に供給する（ステップＳ３１０）。
【００５６】
非対称性計算部１７２は、コントラスト計測部１７１からのコントラスト評価値の応答曲線から（１）式により非対称性パラメータκ（ｕｄ）を計算する（ステップＳ３１１）。この後、補正レンズ制御部１７４は、相関表記憶部１７３に記憶された、当該標本１の画像において支配的な空間周波数ｕに応じた非対称性パラメータκ（ｕ）と最適なレンズ間隔ｄ１、ｄ２との相関表を参照して、非対称性パラメータκ（ｕｄ）に対して最適なレンズ間隔ｄ１、ｄ２を取得する（ステップＳ３１２）。
【００５７】
この後、補正レンズ制御部１７４は、読み込んだレンズ間隔ｄ１、ｄ２をもとにそれぞれの球面収差補正レンズ１３Ａ，１３Ｂの光軸方向Ｏｐでの位置を算出し、補正レンズ駆動部１４に制御信号を供給することで、対物レンズ１３内のレンズ間隔ｄ１、ｄ２を補正する（ステップＳ３１２−Ｓ３１３）。以上で、球面収差補正のための制御が完了し、この後、制御装置１７はオートフォーカス処理を実行して合焦位置を決定し（ステップＳ３１４）、標本１の実際の撮影が行われる（ステップＳ３１５）。
【００５８】
第３の実施形態によれば、画像の空間周波数の違いによる球面収差補正の誤差を低減することができる。
【００５９】
＜変形例１＞
標本１の照明方式として暗視野落射照明を採用した場合、球面収差補正の制御において画像のコントラストを評価することが困難である。この場合、図１４に示すように、コントラストに代えて画像のＳ／Ｎ比を間隔位置（デフォーカス位置）毎に計測し（ステップＳ４０９）、Ｓ／Ｎ比の応答曲線から非対称性パラメータκを算出して（ステップＳ４１０）、相関表記憶部１７３に記憶された相関表から、当該非対称性パラメータκに対応する最適なレンズ間隔ｄ１、ｄ２を読み込むようにしてもよい（ステップＳ４１１）。
【００６０】
＜変形例２＞
上記の球面収差補正は、カバーガラスＧを複数の領域に区分して、それぞれの領域毎に行うようにしてもよい。この方法は、カバーガラスＧの厚みが場所によって変化するような場合に好適である。この場合、制御装置１７は、カバーガラスＧの個々の領域に対して、上記の球面収差補正のためのレンズ間隔ｄ１、ｄ２を求めたら、これらのデータを、領域を示す情報と対応付けて相関表記憶部１７３に記憶する。制御装置１７は、個々の領域の本撮影の前に、相関表記憶部１７３から、これから撮影しようとしている領域に対応する球面収差補正のためのレンズ間隔ｄ１、ｄ２を読み出し、これらを設定する。
【００６１】
本発明は、上述の実施形態にのみ限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々更新を加え得ることは勿論である。
【符号の説明】
【００６２】
１…標本
１１…ステージ
１２…ステージ駆動部
１３…対物レンズ
１３Ａ．１３Ｂ…球面収差補正レンズ
１４…補正レンズ駆動部
１５…結像レンズ
１６…撮像部
１７…制御装置
１００…顕微鏡装置
１７１…コントラスト計測部
１７１Ａ…コントラストＡＦ部
１７２…非対称性計算部
１７３…相関表記憶部
１７４…補正レンズ制御部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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