(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体サンプルから固体画分を分離する装置であって、前記装置は、ろ過装置を備え、前記ろ過装置は、
音波生成素子と、
前記装置を、前記流体サンプルを受け入れると共に上段室である前置ろ過室と音波を伝播可能な流体を受け入れると共に下段室である後置ろ過室とに分割する、少なくともひとつのフィルタと、
前記後置ろ過室と関連するように構成された基材であり、音波の印加に対し共振可能な前記基材と、
を備え、
前記基材が前記後置ろ過室の底に位置しており、
前記音波生成素子は、前記音波生成素子が前記基材の共振を引き起こし、前記後置ろ過室内の前記流体および前記前置ろ過室の前記流体サンプルの両者を通じ、次々に定在波を伝播するように、前記基材と関連するように構成されており、
前記後置ろ過室には前記フィルタを通して流体サンプルを前記前置ろ過室から前記後置ろ過室へ重力方向に移送させる真空引き手段が設けられ、
前記音波生成素子により生成される定在波の周波数の範囲が、３００Ｈｚ〜７００Ｈｚである装置。
【請求項２】
前記音波生成素子が、前記基材に可逆的に連結している請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記流体サンプルの正味の移動が、前記後置ろ過室へ行われる、請求項１または２に記載の装置。
【請求項４】
少なくともひとつの前記フィルタが、分離工程中に揺り動かされる請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記フィルタが、前記フィルタを垂直方向、横方向、またはその組み合わせの方向に振動可能な保持具と結合している請求項３に記載の装置。
【請求項６】
前記流体サンプルは液体である請求項１〜５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７】
前記液体は生物学的サンプルである請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記生物学的サンプルが、血液サンプル、浸出液、尿サンプル、精液、骨髄穿刺液、脊髄液、組織からの細胞懸濁液、粘液、痰、または唾液である請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記固体画分が細胞画分である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１０】
前記細胞画分が白血球画分である、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記細胞画分が、幹細胞または前駆細胞から選択された未分化細胞である、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記フィルタが合成材料から製造された、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１３】
前記フィルタ上の孔の直径が２μｍ〜４μｍである、請求項１〜１２のいずれか一項
に記載の装置。
【請求項１４】
前記孔の直径が３μｍである、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
前記装置が自動式である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１６】
請求項１の装置を用いて流体サンプルから固体画分を分離する方法であり、前記方法が
ｉ）請求項１の装置に流体サンプルを導入するステップと、
ｉｉ）前記流体サンプルをろ過するステップと、
ｉｉｉ）前記後置ろ過室に設けられた真空引きを用いて前記後置ろ過室に対して真空引き工程を行い、前記フィルタを通して流体サンプルを前記前置ろ過室から前記後置ろ過室へ重力方向に移送させるステップと、
ｉｖ）前記前置ろ過室から分離された画分を取り除くステップと、
を備え、前記音波生成素子により生成される定在波の周波数の範囲が、３００Ｈｚ〜７００Ｈｚである方法。
【請求項１７】
前記音波による前記前置ろ過室、および前記後置ろ過室内の前記流体の撹拌が、分離の全工程を通して連続的に行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記音波による前記前置ろ過室、および前記後置ろ過室内の前記流体の撹拌が、分離の全工程を通してパルス状である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記流体サンプルの正味の移動が、後置ろ過室へ入る請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法が、分離工程中に前記フィルタを揺り動かすステップをさらに備える請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記フィルタが、前記フィルタを垂直方向、横方向、またはその組み合わせの方向に振動可能な保持具と結合する請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記流体サンプルが液体である、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記液体が生物学的サンプルである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記生物学的サンプルが、血液サンプル、浸出液、尿サンプル、精液、骨髄穿刺液、脊髄液、組織からの細胞懸濁液、粘液、痰、または唾液である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記固体画分が細胞画分である、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞画分が白血球画分である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞画分が、幹細胞または前駆細胞から選択された未分化細胞である、請求項２６
に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する特許出願
本出願は、２００７年３月２日出願の英国仮出願第０７０４１８０．９号、２００７年１１月１５日出願の英国仮出願第０７２２４４８．８号、および２００８年２月１日出願の英国仮出願第０８０１９０１．０号に対する優先権を主張し、これら出願のすべては、ここに組み込まれている。
【０００２】
技術分野
本発明は、流体サンプルからの固体画分の分離に関する。特に本発明は、治療用細胞画分を骨髄サンプルなどの生物学的サンプルから分離する装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
前駆細胞は、分化する際に多分化機能を有するため、潜在的に治療処置範囲の多様化に役立っている。病変、または損傷組織部位に運ばれる、これらの細胞の濃縮画分は加速された組織治癒を通じて最大の治療利益を有すると考えられている。前駆細胞は、いくつかの哺乳類細胞および体液内の非治療用細胞の不均一混合物内に含まれる細胞において、通常大変まれな個体数である（Caplan2005）。
【０００４】
細胞を捕捉するための様々な技術と装置が文献にて公表されており、それらには沈降法（Takazawa&Tokashiki、1989）、遠心分離法（Apelman et al,1992;Jaeger,1992）、回転フィルタ（Himmerlflab et al,1969）、及びクロスフロー精密ろ過（Maiorella et al,1991）が含まれる。しかしこれらには、多くの不都合点がある。沈降プロセスは、細胞の低沈降速度、および遅い分離プロセスという難点がある。遠心分離法装置は、流体から細胞を外側に動かす半径方向の力に依存し、高い回収が迅速に行われたとしても、これらの装置は、通常装置に関し高い資本コストがかかる。さらに、高いせん断応力は、潜在的に細胞を損傷し、または例えば前駆細胞などに好ましくない変化を誘発させる場合がある。回転フィルタおよびクロスフローフィルタは、細胞懸濁液のろ過に膜を使用し、これらは付着物に影響されやすく、後に性能が損なわれる。これらのフィルタを使用する他のプロセスは、せん断制御ろ過（Vogel and Kroner,1999）、接線フローろ過（Radlett,1972）、およびダイナミックろ過を含む。分離の割合および効率は、付着物の程度に依存する。ダイナミックろ過は、フィルタを横切る流れと独立したせん断フローを発生させるための、膜とハウジングとの間の相互運動に依存する（Castilho&Medrohno,2002）。うず流ろ過、および回転円板フィルタは、ダイナミックろ過装置の一般的な二つのタイプである（Stromberg et al,1989）。Karumanchi et.al.（2002）は、所望の分離を達成するために電気、磁気および音響現象を含む、細胞および生体高分子に対するフィールド支援分離技術の概要を提供した。誘電泳動は、不均一な電場により生じた偏極効果による非荷電粒子の横方向の動きである（Docoslis et al,1997,1999）。これは、非常に低い導電性媒体にのみ適用でき、他の場合には流体を過剰な加熱が起こる。磁気分離は、二つのタイプに分類される。一つ目は、分離される細胞が固有磁気特性を有するタイプ（例えば、赤血球、走磁性細菌）であり、二つ目は、必要な混合物の非磁性成分が磁気応答性物質により磁化されるタイプである。両方の事例において、分離を達成するために、流体は磁場にさらされなければならない。磁気分離は、前駆細胞のための骨髄濃縮処理を含む、多数の細胞分離に広く用いられてきた（Roath et al,1990)。音響分離機は、微生物および細胞を分離するために広く用いられてきたが、一般的にほとんどは、超音波の使用に依存している。超音波細胞保持は、超音波が波の伝播と反対方向に反射する場合に形成される定在波により達成される。細胞は、定在波の波節面において捕捉される。Kilburn et al,（1989）およびWO95/001214は、懸濁液から細胞を分離する手段としてこれらの波の使用可能性を最初に報告し、その後この技術を利用した他の多数のレポートが報告されている（Coakley et al,1994;Dobelhoof-Dier,1994;Gaida et al,1996;Gorenflo et al,2003,2004）。超音波分離機は、慎重な波長調整が必要であり、かつ通常荷重が制限されるため小容量の細胞しか回収できない。さらに、この技術は、流体相から細胞の均一集団を取り出すことに使用され、それゆえ均一混合物から特定の個体群を捕捉することができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】英国仮出願第０７０４１８０．９号
【特許文献２】英国仮出願第０７２２４４８．８号
【特許文献２】英国仮出願第０８０１９０１．０号
【特許文献３】ＷＯ９５／００１２１４
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Caplan Al, review: Mesenchymal stem cells: Cell Based Reconstructive Therapy in orthopaedics. Tissue Eng. 11 (7/8) 1198-1211 (2005)
【非特許文献２】Takazawa Y, Tokashiki M. Production of human-mouse chimeric antibody by high cell density perfusion culture. Cytotechnology 2 95-101 (1989)
【非特許文献３】Apelman S. Separation of animal cells in continuous cell culture systems. In Animal cell technology: basic and applied aspects. Kluwer Academic Publishers 149-54 (1992)
【非特許文献４】Jaeger V. High density perfusion culture of animal cells using a novel continuous flow centrifuge: In Animal cell technology: basic and applied aspects 209-348 (1992)
【非特許文献５】Himmerlfarb P, Thayer PS, et al. Spin filter culture: the propagation of mammalian cells in suspension. Science 164 555-7 (1969)
【非特許文献６】Maiorella B, Dorin G et al. Crossflow micro filtration of animal cells. Biotechnol. Bioeng. 37 121-6 (1991)
【非特許文献７】Vogel JH, Kroner KH, Controlled shear filtration: a novel technique for animal cell separation. Biotechnol. Bioeng. 63(6) 663-74 (1999)
【非特許文献８】Radlett PJ, The concentration of mammalian cells in a tangential flow filtration unit. J Appl. Chem Biotechnol. 22 495 (1972)
【非特許文献９】Castilho LR Medronho RA, Cell retention devices for suspended cell-perfusion cultures. Adv. Biochem Eng Biotechnol. 74 129-69 (2002)
【非特許文献１０】Stromberg RR, Friedman LI et al. Membrane technology applied to donor plasmapheresis. J Membrane Sci 44(1) 131-143 (1989)
【非特許文献１１】Karumanchi RSMS, et al. Field assisted extraction of cells, particles and macromolecules. Trends Biotechnol. 20 (2) 72-78 (2002)
【非特許文献１２】Docoslis A, et al. A novel dielectrophoresis-based device for the selective retention of viable cells in culture media. Biotechnol. Bioeng. 54(3) 239-50 (1997)
【非特許文献１３】Docoslis A et al. Dielectrophoretic forces can be safely used to retain viable cells in perfusion cultures of animal cells. Cytotechnology 30 133-42 (1999)
【非特許文献１４】Roath S, Richards Smith A, et al. High gradient magnetic separation in blood and bone marrow processing. J Magnetism and Magnetic Mater. 85 (1-3) 285-90 (1990)
【非特許文献１５】Kilburn DG, Clarke DJ et al. Enhanced sedimentation of mammalian cells following acoustic aggregation. Biotechnol. Bioeng. 34 559-62 (1989)
【非特許文献１６】Coakley WT1 Whitworth G et al. Ultrasonic manipulation of particles and cells. Bioseparation. 4 73-83 (1994)
【非特許文献１７】Doblhoff-Dier O, Gaider TH et al. A novel ultrasonic resonance field device for the retention of animal cells. Biotechnol. Prog. 10 428-432 (1994)
【非特許文献１８】Gaida TH, et al. Selective retention of viable cells in ultrasonic resonance field devices. Biotechnol. Prog. 12 73-6 (1996)
【非特許文献１９】Gorenflo VM, Smith L et al. Scale-up and optimisation of an acoustic filter for 200 L/day perfusion of CHO cell culture. Biotechnol. Bioeng. 80 (4) 438-44 (2002)
【非特許文献２０】Gorenflo GM, Angepat S et al. Optimization of an acoustic cell filter with a novel air backflush system. Biotechnol. Prog. 19 30-6 (2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、流体サンプルから固体画分を分離するための装置および方法を示す。本発明は特に、流体サンプル中の細胞均一混合物からの細胞画分の分離を示す。工程は、物理的手段のみを用いたサンプルの機械的ろ過に基づく、細胞分離の単一ステップ工程である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の１つの見地によれば、流体サンプルから固体画分を分離する装置が提供され、装置はろ過装置を備え、ろ過装置は、
音波生成素子と、
装置を、流体サンプルを受け入れる前置ろ過室と音波の伝播が可能な流体を受け入れる後置ろ過室とに分割する、少なくともひとつのフィルタと、
後置ろ過室と関連するように構成された基材であり、音波の印加に対し共振可能な基材と、
を備え、
前記音波生成素子は、前記音波生成素子が前記基材の共振を引き起こし、前記後置ろ過室内の前記流体および前記前置ろ過室の前記流体サンプルの両者を通じ、次々に定在波を伝播するように、前記基材と関連するように構成されている装置。
【０００９】
ろ過装置内の流体を通じる音響定在波の伝播により、分離工程中、連続的にまたはパルス状に流体が撹拌される。この撹拌の特定な利点は、フィルタの付着物と目詰まりとを最小限に抑えることである。
【００１０】
流体サンプルから細胞画分を分離するために装置が利用される本発明の実施形態において、装置内の流体の撹拌は、フィルタを有する前置ろ過室内において細胞の接触時間または滞在時間を最小源に抑えるというさらなる利点を有する。細胞がフィルタの表面に接触、または十分近接している場合、周囲の流体の圧力により細胞が強制的に孔を通過させられる傾向があるため、この撹拌は好ましい。このような孔の通過は、細胞の変形によって行われるが、通過中、細胞はせん断応力のような細胞に対し悪影響を及ぼす、好ましくない応力にさらされる。特に、白血球機能は、せん断応力の重大な影響を受ける場合があるということが示されている(Carter et al, 2003)。したがって、対象となる細胞がフィルタを通過することを避けることが好ましい。この点において、対象となる細胞が前置ろ過室に保持されている間、フィルタは、流体および他の細胞画分の通過を許容するよう設計されている。音波生成素子は、電力信号に応じて音波場を生成可能な構造として形成されている。例えば単純なスピーカの場合、電力信号は、所定の振幅および周波数にて物理的に振動板を偏向させて音波を生成する。他の音響素子としては圧電型振動子が含まれ、圧電型振動子は、印加されたＡＣ電圧に応じて振動エネルギーを生成し、物理的な振動は、音響の力として流体へ伝えられる。圧電型振動子の例としては、両面に金属被膜の電極を有するセラミックディスクがあり、これらの薄い圧電型フィルムは通常酸化亜鉛である。
【００１１】
音波生成素子と共振可能な基材との組み合わせは、音響素子単体での使用よりも多くの利点を有する。音響素子は、素子自体の錐体よりさらに広い面積を有する基材材料が付加された場合、この素子が向上した共振を提供するよう設計されているので、直接流体に接触しない。つまり、小型の音響素子を使用していたとしても、より大きなエネルギーを流体に供給することができる。これにより、全体としてエネルギー効率および装置占有面積が大幅に改善され、特に多量の流体を扱う場合に好都合である。適当な音響素子としては、モデル番号RM-ETN0033K19C-2K01がNXT Technology Limited(Hong Kong)より入手可能である。
【００１２】
本発明の実施形態においては、音波生成素子は、周波数範囲が約３００Ｈｚ〜７００Ｈｚの音響定在波を生成する。流体の量と必要な最適周波数との間には関連がある。したがって、本発明の特定の実施形態においては好都合に、使用者は流体サンプルの量を入力することができ、音響定在波の周波数が計算される。例えば、約５ｍｌ〜１５ｍｌの量を有するサンプルに対しては、音響定在波の最適周波数は約３００Ｈｚ〜７００Ｈｚである。
【００１３】
本発明による特定の実施形態においては、音波生成素子は、出力０．４Ｗ、抵抗４Ω、振幅範囲が波高値約４．２Ｖ〜７．３６Ｖ、および周波数範囲が約３００Ｈｚ〜７００Ｈｚのスピーカである。
【００１４】
本発明の実施形態においては、基材は実質的にフィルタと平行に配置される。本発明の実施形態においては、基材は、ろ過装置の基底に配置される。
【００１５】
基材は、音響生成素子による刺激に応じて共振可能である適当な材料のいずれかを用いて作ることができる。例えば、金属、セラミックまたはポリマーなどである。基材は、装置内にて使用される流体と接触する可能性があるため、基材は、好都合に医療グレードの材料から作られる。これは、有毒物質汚染の危険性を低減させる。
【００１６】
本発明の実施形態においては、音波生成素子は基材と可逆的に連結している。この連結は、当業者にとって利用可能な多様な手段、例えば接着剤の使用などにより達成される。これは、音響素子が離脱でき、他の装置に再利用できるため、特にろ過装置が使い捨てできるよう設計されている場合に特に好都合である。
【００１７】
フィルタを横切る流体の移動は、重力による受動運動を介して行うことができる。一方、流体サンプルは、正圧または負圧の印加により、活発にフィルタを横切って動くことができる。フィルタを横切る流体サンプルの流量は、一定または可変にできる。
【００１８】
また、本発明の実施形態においては、後置ろ過室内に提供される音波の伝播が可能な流体は、洗浄液として振舞う。本実施形態においては、圧ポンプが設けられ、正圧ポンプが洗浄液を、後置ろ過室からフィルタを通り前置ろ過室へ押し込む。同時に、負圧ポンプは前置ろ過室から後置ろ過室へ流体を引き込む。したがって、流体サンプルおよび洗浄液は、順次フィルタを横切り反対方向へ移動させられるため、流体サンプルの正味の移動は、後置ろ過室へ行われ、分離された固体画分は前置ろ過室に留まる。
【００１９】
流体サンプルおよび洗浄液のフィルタを横切る反対方向への連続的な移動は、フィルタの付着物と目詰まりを防ぎ、さらに分離工程の効率を向上させる。この連続的な移動は、周期的にすることができ、この周期の第一段階は、洗浄液を使用しフィルタの高速逆流洗浄を行い、周期の第二段階は、流体サンプルを下方へ強制的にフィルタを通じさせる。サンプル量を十分に減らすために、また一方で微粒子画分が溶液に留まるように十分な流体の量をフィルタより上に留めるために、この周期的な工程は継続される。通常、サンプル量は約十分の一に減少する。
【００２０】
本発明のさらなる実施形態においては、分離工程中にフィルタ自体が、振動している。この振動は、例えば、フィルタを可動保持具と結合することにより達成される。振動は、垂直方向、横方向またはその組み合わせとすることができる。本発明の他の実施形態においては、フィルタを回転させることができる。
【００２１】
洗浄液および／または流体サンプルの追加的な振動のための他の手段は、回転素子（例えば、羽根車または流体への挿入物）の使用、室の壁の回転、または室の壁に邪魔板またはアクティブチップを設けた室の壁を回転させることを含んでいる。
【００２２】
「流体サンプル」は、固体成分が分離できる流体ならば何でもよい。サンプルはどのような源からでもよく、例えば生命体源、同種または異種からなる生命体グループ源、水分または土のような環境源、食品源または工業的な源などがある。サンプルは、処理済みサンプル、または未処理サンプルとすることができる。サンプルは、気体または液体とすることができる。サンプルは、土または食品サンプルからの抽出液などの抽出物とすることができる。
【００２３】
本装置は特に、フィルタ表面にフィルムまたは被膜形成することにより、フィルタに付着する傾向がより大きい、粘性を有する液体に適している。フィルタを通る洗浄液による逆流洗浄、および流体サンプルおよび／またはフィルタの任意の振動は、十分にフィルタの付着物を減少し、また粒子画分を前置ろ過副室の溶液内に留まらせる。
【００２４】
サンプルは、被検体から得ることができる。被検体は、動物または人間などの生命体とすることができる。動物は、野生動物または家畜などの動物を含むことができる。家畜は、例えば犬または猫などの愛玩動物を含むことができる。
【００２５】
サンプルは、血液サンプル、浸出液、尿サンプル、精液、骨髄穿刺液、脊髄液、組織からの細胞懸濁液、粘液、痰、または唾液などの生物学的サンプルとすることができる。生物学的サンプルはどんな動物からも得ることができ、人間からの生物学的サンプルに限定されない。ここで使用される「血液サンプル」は、処理済みサンプル、もしくは臍帯血サンプル、骨髄液、内部血液または末梢血液などの未処理血液サンプルに関し、どのような量でもよく、かつ動物または人間などのどの被検体のものでもよい。好ましい被検体は、人間である。
【００２６】
生物学的流体サンプルから分離される固体画分は、少なくともひとつの細胞画分を備えている。細胞画分は、治療用細胞を備えることが好ましく、これは治療効果または治癒効果を有する任意の細胞である。
【００２７】
細胞画分は、少なくともひとつの白血球を備える、または少なくともひとつの白血球からなることができる。「白血球細胞」は、白血球もしくは、網赤血球または血小板ではない造血系細胞であり、動物または人間の血液内に見つけることができる。白血球は、ナチュラルキラー細胞（「ＮＫ細胞」）と、Ｂリンパ球（「Ｂ細胞」）またはＴリンパ球（「Ｔ細胞」）などのリンパ球とを含むことができる。また白血球は、単球、マクロファージおよび、好塩基球と、好酸球と、好中球とを含む顆粒球などの食細胞を含むことができる。また白血球は、肥満細胞を含むことができる。
【００２８】
細胞画分は、少なくともひとつの赤血球を備える、または少なくともひとつの赤血球からなることができる。「赤血球細胞」は赤血球である。
【００２９】
細胞画分は、少なくともひとつの新生細胞を備える、または少なくともひとつの新生細胞からなることができる。「新生細胞」は、制御不可能な細胞増殖性を有し、新成長を誘起する刺激を止めた後も成長し続ける異常細胞に関する。新生細胞は、部分的な、または完全な組織構造の欠損、および正常な組織との機能的協調を示す傾向があり、さらに新生細胞は、良性または悪性であり得る。
【００３０】
細胞画分は、少なくともひとつの悪性細胞を備える、または少なくともひとつの悪性細胞からなることができる。「悪性細胞」は、局所的に侵入し、かつ破壊的に成長および転移する性質を有する細胞に関する。悪性細胞の例は、ただしこれに限らないが、血液、骨髄、腹水、尿、気管支洗浄液などの様々な体液内の、白血病細胞、リンパ腫細胞、固形腫瘍のがん細胞、転移性固形腫瘍細胞(例えば、乳がん細胞、前立腺がん細胞、肺がん細胞、大腸がん細胞など）を含んでいる。
【００３１】
細胞画分は、少なくともひとつの癌性細胞を備える、または少なくともひとつの癌性細胞からなることができる。「癌性細胞」は、無秩序な成長を示し、ほとんどの場合、少なくともひとつの分化特性を失った細胞に関する。この分化特性は、限定はしないが、例えば特徴的形態、非転移性行動、細胞間相互作用、細胞シグナル伝達行動、およびたんぱく質の発現および分泌パターンなどである。
【００３２】
細胞画分は、少なくともひとつの幹細胞を備える、または少なくともひとつの幹細胞からなることができる。「幹細胞」は、一回または複数の細胞分裂周期を経て、少なくともひとつの分化細胞型を生じることのできる未分化細胞である。
【００３３】
細胞画分は、少なくともひとつの前駆細胞を備える、または少なくともひとつの前駆細胞からなる。「前駆細胞」は、一回または複数の細胞分裂周期を経て、少なくともひとつの分化細胞型を生じることのできる、未分化細胞ではない委任細胞である。通常幹細胞は、一回または複数の細胞分裂周期を経て、特定の刺激または複数の刺激に応じて前駆細胞を生じ、かつ前駆細胞は、特定の刺激または複数の刺激に応じ、ひとつまたは複数の分化細胞型を生じる。
【００３４】
骨髄（bone marrow）（またはmedulla ossea）は、骨の中空内部に見つかる柔らかい組織である。骨髄には、赤色骨髄（または骨髄組織として知られている）および黄色骨髄の二種類がある。赤血球、血小板、およびほとんどの白血球は、赤色骨髄から発生し、白血球の一部は、黄色骨髄にて成長する。
【００３５】
骨髄は、造血幹細胞、および間葉系幹細胞の二種類の幹細胞を含む。幹細胞は、多細胞生体に共通する初期の細胞であり、細胞分裂により自らを再生する能力を保持し、広い範囲の特殊化した細胞型に分化することができる。造血幹細胞は、血液循環中に見られる３クラスの血液細胞、つまり白血球（白血球）、赤血球（赤血球）および血小板（血小板）を生じる。間葉系幹細胞は、骨髄の中央洞部周辺に整列して見られ、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、および他多数のタイプの細胞に分化する能力を有する。
【００３６】
胚幹細胞は、分化全能性または多能性という点において、真の幹細胞であり、自己複製の能力を無限に示す一方、骨髄内の成長した幹細胞は、より適切には前駆細胞と名づけられ、はるかに限定されるが、幹細胞のように自己複製および分化の能力を有する。通常前駆細胞は、多能性というよりも、単能性または複能性である。
【００３７】
通常骨髄より得られる間葉系幹細胞またはＭＳＣは、多種の細胞型に分化可能な複能性幹細胞である。ＭＳＣが分化することが示された細胞型は、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞、および神経細胞を含んでいる。
【００３８】
骨髄密度は、患者により変動する場合があり、実際に変動しておりかつ骨髄の粘性は均一ではない。若い患者は、空洞内のより小柱状の組織により、濃密かつ粘度の高い骨髄を有する場合が多い。この粘性骨髄は、分離装置のフィルタに付着する傾向がある。
【００３９】
本発明の実施形態における流体サンプルは、骨髄穿刺液である。
【００４０】
本発明のさらなる実施形態においては、流体サンプルは骨髄穿刺液であり、かつ固体画分は前駆細胞である。
【００４１】
ここで使用される「組織」は、すべての動物に存在する基本の４タイプの組織を含み、それは、上皮組織、結合組織、筋組織、および神経組織である。
【００４２】
結合組織の例は、皮膚、筋肉、軟骨、骨、腱、靭帯、関節包、および脂肪組織を含んでいる。
【００４３】
ここで使用される「脂肪組織」は、体内の脂肪および他の微小血管組織源を意味することを意図する。脂肪組織は、脂肪細胞、周皮細胞、線維芽細胞、マクロファージ、幹細胞、および微小血管細胞を含む多細胞タイプを包含する複合組織である。このような脂肪組織は、体内の前駆細胞の最も好都合な源のひとつである。
【００４４】
ここで使用される「微小血管細胞」は、例えば内皮細胞、平滑筋細胞および周皮細胞などの、微小血管系の構造を備える細胞を意味することを意図する。
【００４５】
脂肪細胞は、体内に蓄積した脂肪から取り出すことができる。最適な蓄積場所は、精巣上体、肩甲骨間の脂肪パッド、または膝蓋下の脂肪パッド（ホッファ脂肪パッド）を含んでいる。代わりに、潜在的にさらに好都合なのは、脂肪組織は、脂肪吸引術方法により吸引脂肪として得ることができる。
【００４６】
吸引脂肪は、本発明の装置に直接導入可能ではあるが、脂肪組織の断片は前処理が必要である。断片組織は、組織の細胞成分を解放するために粉砕され、および／または酵素により分解される。その後、この細胞成分を適切な担体に懸濁させ、装置に導入することができる。
【００４７】
上述により得られた吸引脂肪、および／または細胞懸濁液は、装置への導入前にさらに処理を受ける場合があることが想定される。例えば、大きい脂肪小球および脂肪細胞を（幹細胞、内皮細胞、および周皮細胞を備える）間質画分から分離するために、重力沈降、および／または遠心分離法を使用する場合がある。
【００４８】
生物学的サンプルがろ過される本発明の実施形態においては、流体を被験者から直接ろ過装置へ移動するために、ろ過装置を吸引装置に連結することができる。ろ過装置は、無菌環境において使用することができ、この配置により、患者からサンプルを取り、ろ過装置へ導入する間のサンプルの汚染の危険性を減少させる。
【００４９】
本発明の代替実施形態においては、固体画分は、被験者に感染するバクテリア、菌、原生動物、ウィルス、寄生生物、またはプリオンなどの病因からなることができる。
【００５０】
サンプルは、試験管内の細胞懸濁液とすることができる。
【００５１】
金属箔とも呼べるフィルタは、本発明において示した方法による流体サンプルからの固体画分の分離に適した任意の材料から製造することができる。フィルタは、自然材料、合成材料またはそれらの組み合わせから製造することができる。適した材料は、金属に限定はしないが、金属合金、セラミック、または高分子材料を含んでいる。例としては、ポリカーボネート（ＰＬＣ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリイミド（ＰＩ）、ニッケル、およびステンレス鋼を含んでいる。材料は、医療グレードの材料が好ましい。適当なトラックエッチドフィルタはｉｔ４ｉｐ（ベルギー）から入手可能である。適当なニッケル箔フィルタは、Tecan Limited (英国)から入手可能である。
【００５２】
本発明の実施形態においては、フィルタは実質的に平面である。つまりフィルタは、フィルタ直径がフィルタ高さより大きい、二次元の形状を有する。このような形状は、フィルタが流体サンプルにさらされる潜在的面積を増加させ、それによりろ過率を増加させる。またこの形状は、固形物質がフィルタの目詰まりとなる可能性を最小にする。
【００５３】
フィルタの適当な厚さの例は、１１μｍ、２３μｍ、および５０μｍである。フィルタが薄くなるほど、流体がフィルタを通って流れる速度は早くなる。
【００５４】
フィルタは、同じ形状の等しい直径、または異なる直径の孔とともに提供される場合があることが想定される。あるいは、フィルタは異なる形状の等しい直径の孔とともに提供される場合がある。またあるいはフィルタは、異なる形状の異なる直径の孔とともに提供される場合がある。
【００５５】
適当な孔の形状は、限定はしないが、横断面が円形、楕円形、正方形、長方形、または三角形を含んでいる。
【００５６】
孔は、テーパー状とすることができる。孔のテーパーは、真空下にて細胞の変形を容易にする。各テーパーの先端の孔の大きさ、およびテーパーの向きに依存し、大きさに基づいた優先的選択が行われる。本発明の好都合な実施形態において、テーパー孔の最も狭い点は、フィルタの上面に位置する。この配置は、大きな細胞はフィルタより上に留まるが、より小さな細胞は孔を通って流れることを許容する。逆に、洗浄液がフィルタを通る上向きの逆流洗浄中には、後置ろ過室内の細胞が孔を通って戻ることが、さらに困難となるようにみえる。孔の最も狭い点がフィルタの下面に位置する場合、細胞が孔に入り、最も狭い点に押し込むために歪む傾向を有するということがわかっている。
【００５７】
本発明の特定の実施形態においては、孔の直径は、１μｍ〜１２μｍの範囲である。
【００５８】
本発明のさらなる実施形態においては、孔は円柱形状とすることができる。
【００５９】
骨髄穿刺液から前駆細胞を分離する、本発明のさらなる実施形態においては、適当なフィルタはＰＥＴから作られ、フィルタは厚さ２３μｍ、孔直径３μｍ、および孔密度４００，０００個／ｃｍ２である。フィルタを通して流体を効率的に「引っぱる」ために、真空ポンプにより発生させる最適な負圧の範囲は、約−０．１ｐｓｉ〜−０．５ｐｓｉ、特に−０．２ｐｓｉ〜−０．３ｐｓｉである。あるいは、フィルタを通して流体を効率的に「押す」ために、正圧を発生させてもよい。このようなポンプにて発生させる最適な正圧の範囲は、約＋０．１ｐｓｉ〜＋０．５ｐｓｉ、特に＋０．２ｐｓｉ〜＋０．３ｐｓｉである。
【００６０】
ろ過装置の設計は、流体サンプル用前置ろ過室の縦横比を減少させるような改良が可能であり、それにより単位体積あたりより大きなろ過面積を設けることができる。
【００６１】
本発明のさらなる実施形態においては、ろ過装置の前置ろ過室は、ウェルプレートフォーマットとも呼ばれる、一回分の流体サンプルを受け入れるために使用することができる複数の室に分けられる。
【００６２】
ろ過に続き、分離（精製、濃縮、または濃厚とも言われる）固体画分を備える残留流体サンプルは、例えばピペットを使用し、吸引によりろ過装置の上段室から取り出され、貯蔵または使用される。本発明の他の実施形態において、特に残留流体サンプルが治療用細胞画分を備える実施形態においては、残留流体サンプルは、例えばヒドロゲルまたは骨セメントと混合することができる。これらの実施形態においては、ヒドロゲルまたは骨セメントは、細胞の保管場所として機能する。
【００６３】
本発明の態様によると、流体サンプルから固体画分を分離する方法が提供され、前記方法は、
i) 流体サンプルを本発明による装置内に導入するステップと、
ii) 流体サンプルをろ過するステップと、
iii)分離された画分を前置ろ過室から取り出すステップと、
を備える。
【００６４】
本発明のさらなる態様によると、本発明の装置を使用し、流体サンプルから治療用細胞を隔離、または分離する方法が提供される。
【００６５】
本発明の実施形態において、流体サンプルは、血液サンプル、浸出液、尿サンプル、精液、骨髄穿刺液、脊髄液、組織からの細胞懸濁液、粘液、痰、または唾液などの生物学的サンプルとすることができる。
【００６６】
本発明の実施形態において、治療用細胞は、前駆細胞である。
【００６７】
本発明のさらなる態様によると、本発明の装置を使用し、骨髄穿刺液から治療用細胞を隔離、または分離する方法が提供される。
【００６８】
本発明の実施形態において、治療用細胞は、前駆細胞である。
【００６９】
このシステムは、手動で操作することができる。しかし、分離工程の全体としての効率と正確性を向上させるために、特に医療スタッフにより手術室にて装置が使用される場合、装置は好都合に自動化される。プログラマブルロジックコントローラ（ＰＬＣ）は、時限付きシーケンスにより、周期的に交互に、真空ポンプおよび逆流洗浄ポンプのオンとオフとを切り替えるようプログラムできる。真空ポンプは、負圧下にて流体サンプルがフィルタを通り下へ向かうよう引き寄せる。逆流洗浄ポンプは、洗浄液がフィルタを通り上へ向かうよう押し上げる。
【００７０】
ろ過室および／またはフィルタは、使い捨て可能である。制御装置は、使い捨て可能、または独立型専用装置とすることができる。
【００７１】
本発明のさらなる態様において、隔離された単体または複数の治療用細胞は、懸濁液としてそれを必要とする環境の中に直接投与される。あるいは、細胞は、例えばゲル、ペースト、セメント、グルー、スカフォード、フィルム、インプラントまたはドレッシングなどの適切な担体物質と組み合わせる、または結合させることができる。
【００７２】
隔離された治療用細胞は、人間および／または人間以外の動物を治療、再生、および／または組織機能を増強するために、医療の適用範囲内で利用されることが想定される。
【００７３】
医療の適用例は、整形外科、神経科、心臓血管科、皮膚科、美容外科、および歯科を含んでいる。
【００７４】
本発明の特定の実施形態において、隔離された治療用細胞は、間葉系幹細胞を備えることが想定される。これらの細胞は、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、および脂肪細胞に分化可能である。間葉系幹細胞を備える治療用画分は、病気または怪我がもたらした整形外科の適応症、例えば、軟骨治療、骨治療（骨折治療を含む）、脊椎固定、変性椎間板治療（環部の治療、髄核密度増強、椎間板増強を含む）などに使用することができる。
【００７５】
機能的な内皮前駆細胞（ＥＰＣ）は、血管形成および血管新生の中心となる。ＥＰＣは、成体動物の骨髄単核球細胞から発達することが示されている。したがって、本発明の特定の実施形態において、隔離された治療用細胞はＥＰＣを備え、この治療用画分は、末梢血管疾患のように、損傷を受けた、または虚血の組織を治療、再生または血管形成する必要のある適応症に使用することができることが想定される。
【００７６】
したがって、ｉ）被験者の組織内の新しい血管を形成する、ｉｉ）被験者の組織内の血流を増加させる、ｉｉｉ）被験者の患部組織を治療する、ｉｖ）患部組織の血管新生を増加させる、またはｖ）被験者の心臓麻痺を防ぐための方法が提供され、すべての前記方法は、
ａ）本発明による装置を使用し骨髄単核球細胞を隔離するステップと、
ｂ）組織内で新しい血管を形成させるために、有効な量の骨髄単核球細胞を組織に局所的に移植するステップと、
を備える。
【００７７】
本発明の実施形態において、骨髄単核球細胞は、自家移植性である。
【００７８】
骨髄単核球細胞が移植される組織は、病気の、または損傷を受けた組織、および治療または再生が必要な組織を含んでいる。この治療または再生が必要な組織は、灌流の悪い組織に限らず、例えば慢性虚血、さらに心筋組織、骨格筋組織、例えば脳卒中または動静脈奇形に冒された脳組織、冠状血管、腎臓、肝臓、消化管の臓器、神経学に基づいた筋肉萎縮を含む萎縮に悩まされる筋肉組織にみられる組織を含んでいる。
【００７９】
本発明の実施形態における、新しい血管は、毛血管および／または側副血管である。
【００８０】
添付図を参照して、本発明を下記に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】本発明の装置の一般的な動作原理を示した概略図である。
【図２】前置ろ過室および後置ろ過室内の流体がフィルタを横切り順次移動する本発明の装置の実施形態を示した概略図である。
【図３】制御装置の写真である。
【図４】ろ過装置の写真である。
【図５】制御装置に接続されたろ過装置の写真である。
【図６】音波生成素子の写真である。
【図７】ろ過装置内にて使用する振動フィルタ保持具である。
【図８】本発明の装置内の、所定の平均サイズの孔のフィルタを使用した、ブタの全血からの単核球（ＭＮＣ）の平均濃縮度を示す（ｎ＝６）。
【図９】本発明の装置内の、平均２．９μｍの大きさの孔のフィルタを使用した、ブタの全血からのＭＮＣを濃縮する工程時間を示す（ｎ＝３）。
【図１０】本発明の装置を使用し、運用条件を変化させ、８分を越えた場合のブタの骨髄の体積減少を示す。この装置は、平均約３μｍの大きさの孔のフィルタを使用し、流速は６ｄｒｏｐｓ／分である。
【図１１】直列のニードルバルブを用いた減圧制限によるフィルタを横切る最適な流速を示す。
【図１２】本発明の装置を使用した白血球および赤血球の増加倍率を示す。
【図１３】本発明の装置を使用したろ過前後の、ブタの全血サンプル内の白血球の赤血球に対する割合を示す。
【図１４】分離装置を使用し、１０分の１までおよび１０分の１を越える体積減少により、９０％を越える単核球の回収が達成されたことを示すデータである。体積減少および単核球の濃縮度は、線形的に相関する。通常の工程時間は、１０分以下である。
【図１５】単核球をブタのＢＭＡから分離するＰＥＴフィルタの孔の大きさ分布の代表的な分析表を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
図１：本発明の装置の一般的な動作原理を示した概略図であり、図中の下記の符号は以下を示す。
１．ろ過装置
２．多孔質フィルタ
３．流体サンプルを受け入れる、上段（前置ろ過）室
４．流体サンプル
５．逆流洗浄液を受け入れる、下段（後置ろ過）室
６．後置ろ過室に提供された流体
７．共振基材
８．音波生成素子
９．真空引き（オプション）
【００８３】
多孔質フィルタ２は、ろ過装置１を、細胞分離を必要とする流体サンプル４が導入される上段（前置ろ過）室３と、音響定在波を伝播可能な流体６が導入される下段（後置ろ過）室５との二つの室に分ける。音響素子８は基材７と結合しており、この基材７は、下段室内の底に位置し、音波生成素子に応じて共振し、二つの流体面およびフィルタを通じて定在波を生成してサンプルを撹拌する。同時に、周期的な真空引き９プロセスにより、サンプルはフィルタを通り下方へ移動する。真空圧、流体速度、および振動周波数は、適切なポンプとバルブを収容した遠隔装置により制御される。より小さい細胞がフィルタを通り廃棄容器（図示せず）へ向かう一方、所望の大きい細胞が濃縮された画分は、フィルタ上方に保持される。
【００８４】
本発明の特定の実施形態においては、音響素子は、出力０．４Ｗ、抵抗４０Ω、振幅範囲の波高値が約４．２Ｖ〜７．３６Ｖ、および周波数範囲約３００Ｈｚ〜７００Ｈｚのスピーカである。
【００８５】
図２：前置ろ過室および後置ろ過室内の流体がフィルタを横切り順次移動する本発明の装置の実施形態を示した概略図であり、図中の下記の符号は以下を示す。
１０．ろ過装置
１１．多孔質フィルタ
１２．ろ過装置から排出液を受け入れる容器
１３．逆流洗浄液を受け入れる容器
１４．逆流洗浄ポンプ
１５．真空ポンプ
１６．音波生成素子／共振基材
１７．ソレノイドバルブ（逆流洗浄ライン）
１８．ソレノイドバルブ（真空ライン）
１９．ＰＬＣデジタル制御装置およびディスプレイ
２０．ニードルバルブ
【００８６】
この図は、（図１に示した）本発明のろ過装置および制御装置を備える装置を示す。制御装置１９内のＰＬＣコントローラ（三菱AL2-24MR-04）は、真空ポンプ１５および逆流洗浄ポンプ１４（両ポンプともに、Koge KPV14A-6A）のオンとオフとを切り替えるようプログラムできる。また、このコントローラはソレノイドバルブ（Cole Parmer 98302-02）１７および１８の始動を制御するためにも使用される。これは、バルブおよびポンプを時限付きシーケンスにより動作させる、またはポンプを手動で制御するようプログラムできる。制御装置に組み込まれた増幅器および信号生成チップは、ＰＬＣを介して音響素子１８の周波数および振幅を設定することができる。装置からの排出液を収集する容器１２および逆流洗浄液を供給する容器１３は、ろ過装置および制御装置に適切な流管にて接続されている。
【００８７】
図３：制御装置の写真であり、図中の下記の符号は以下を示す。
２１．制御ボックスに収容されたＰＬＣ装置
２２．制御キーボード
２３．装置オン／オフ
２４．真空ラインソレノイド制御
２５．音響素子オン／オフ
２６．真空手動切り替え
２７．逆流洗浄手動切り替え
２８．音響周波数制御
２９．音響素子振幅制御
３０．音響素子周波数表示器
３１．滴下現象表示ＬＥＤ
【００８８】
図４：本発明のろ過装置の構成品の組み立てを示す写真であり、図中の下記の符号は以下を示す。
３２．上段室
３３．中段室
３４．上段室および下段室を固定するクランプ
３５．膜フィルタ
３６．上段室および中段室が共に固定された場合のフィルタを密封するOリング
３７．中段室内の組織サンプル用上段タンク
３８．フィルタ下方の生理食塩水タンクへの入口
３９．下段室
４０．音響素子
４１．音響素子を密封するOリング
４２．音響素子の電気接続用出口
【００８９】
図５：制御装置に接続したろ過装置の写真であり、図中の下記の符号は以下を示す。
４３．ろ過装置
４４．ろ過装置から真空ポンプへの真空ライン
４５．真空ポンプ
４６．真空ソレノイド
４７．廃棄室への真空ライン
４８．廃棄室
４９．ろ過装置への逆流洗浄ライン
５０．逆流洗浄ポンプ
５１．逆流洗浄ソレノイド
５２．逆流洗浄生理食塩水タンク
５３．滴下現象センサ
【００９０】
図６：音波生成素子の写真である。５４は可動コイルＮＸＴ励起子を示す。
【００９１】
下記の説明は、流体が順次フィルタを横切り移動する本発明の実施形態に関する。
【００９２】
通常の運転において、ろ過装置には流体はない。ろ過装置（１０）の下段室に流体を供給するために、流体がフィルタ（１１）を通じて上段（前置ろ過）室に入るまで、逆流洗浄ポンプのスイッチがオンにされる。音響素子は、振幅の波高値が４．２Ｖ〜７．３６Ｖの範囲、周波数範囲が３００Ｈｚ〜７００Ｈｚである。素子は、流体を通じて定在波を起こすよう設置され、流体が一定の撹拌状態にある様子が観察される。液面を、ちょうどフィルタを横切り通過するポイントに引き下げるために、真空ポンプのスイッチを入れる。フィルタを横切る流速は、ニードルバルブ２０により適宜調節される。サンプル流体は、上段（前置ろ過）室へ供給され、一定の攪拌状態にある様子が観察される。サンプル量をゆっくり減少させるために、ＰＬＣにより急速な逆流洗浄および真空引きの周期的な工程を開始する。サンプル量が、通常１０分の１まで減少し、ＰＬＣによりこの工程が停止される。サンプルは、上段（前置ろ過）室から取り除かれる。
【００９３】
図７は、本発明の装置において使用するフィルタ保持具を示す。フィルタ保持具の設計は、フィルタが横方向、垂直方向またはその組み合わせの方向への移動を許容する。保持具５５は、実質的に円形である。馬蹄型またはＵ型の開口部５６は、保持具を外側環状部５７および中央円形島５８の二つの部分に分ける。５７によって示された部分は、架橋素子５９ａおよび５９ｂにより５８によって示された部分に接続されている。部分５８には、複数の孔が設けられている。これら孔は、均一のパターンとして配置されている。孔は実質的に直径約３μｍの円形である。ピン素子６０が、架橋素子５９ｂの方向に沿って５７の外面に設けられている。このピン素子６０は、装置外部のモータおよびカム（図示せず）により機械的に駆動される。
【００９４】
フィルタ保持具とフィルタとの組み合わせは、単体のプラスチックユニットとして製造されている。
【００９５】
流体サンプルからの固体画分の分離例
1.ヒト骨髄穿刺液サンプル
ヒト骨髄穿刺液は、Ｃａｍｂｒｅｘより購入し、使用前に７０μｍ細胞ろ過器に通し、脂肪細胞および大きな細胞集団を除去した。白血球（ＷＢＣ）および赤血球（ＲＢＣ）を、コールター・カウンターにて計数した。約〜３μｍの孔を有するフィルタとして作用する電気メッキ蝕刻された網を装填した装置に、２ｍｌの細胞懸濁液を加えた。分離工程は、装置の制御装置を使用して開始され、装置の上段室のフィルタより上流に約２００μｌの濃縮流体画分が残留するまで継続された。工程後、１００μｌの濃縮液が装置のフィルタ上方より取り出され、各実験前に毎日、基準標準に校正されたコールター・カウンターに通された。サンプルにおけるＷＢＣおよびＲＢＣの計数結果が得られた。
【００９６】
２．ブタ骨髄液サンプル
ブタ細胞の個体数の隔離および培養拡大
新鮮なブタ後肢を屠殺場から集めた。骨髄小柱（trabeculum）は、各肢の大腿骨頭から抽出され、ＰＢＳを含むポットに収集された。はさみを使用し骨髄をよく細分し、得られた懸濁液を、３７℃／５％ＣＯ２でオービタルシェーカーにて撹拌するために残し、その後、上澄み液を７０μｍ細胞ろ過器に通し、個別の管に入れた。さらに管を１５００ｒｐｍで５分間回転させ、上澄み液は廃棄され、得られた沈殿物を１０ｍｌのα−ＭＥＭ＋１５％ＦＣＳ媒体に再び懸濁した。
【００９７】
骨髄は、上述のように分離かつ処理され、さらに１００μｌの骨髄懸濁液は、各実験前に日ごとの基準に校正されたコールター・カウンターに通された。得られたＷＢＣおよびＲＢＣの計数結果は、骨髄のＷＢＣ抽出液をブタの血漿の抽出液により希釈して１ｍｌあたり細胞数を１×１０７にするために、使用された。この流体２ｍｌは、ろ過のために装置に追加された。
【００９８】
ブタ血漿の準備
新鮮なブタの血液は、屠殺場から４％（ｗ／ｖ）のクエン酸ナトリウム三塩基性溶液（ｓｉｇｍａ）を含む貯蔵ビンに、１：９の割合（クエン酸対血液）で集められた。血液は、５０ｍｌファルコンチューブに等分され、２５００ｒｐｍで３０分回転され、上澄み液は慎重に別のファルコンチューブに移された。上澄み液は、再度２５００ｒｐｍで３０分回転され、その上澄み液は、新しい５０ｍｌファルコンチューブに移され、使用されるまで−２０℃にて貯蔵された。
【００９９】
ブタ骨髄穿刺液のフィコール分離
前に説明したように、骨髄は新鮮なブタ後肢より抽出され、最終の細胞沈殿物は、２５ｍｌのα-MEM＋１５％ＦＣＳ媒体に再び懸濁された。
【０１００】
新鮮なブタ血液を、リン酸緩衝生理食塩水により希釈し、ＲＢＣの数を、１ｍｌあたりの細胞約３．５×１０９に減少させた。一旦これが実施されると、前に得られた骨髄を加えることによりＷＢＣの数は１ｍｌあたりの細胞約２．５×１０７に増加した。その後、血液は、２：１（平衡塩類溶液：血液）に希釈され、この希釈血液３５ｍｌを、１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ（Amersham biosciences）の上に重ねた。その後チューブを、ブレーキのスイッチを切った状態において、１８００ｒｐｍで３０分回転させた（Megafuge 1.0R SOP/CB/021）。ＷＢＣ層は、抽出され、沈殿され、低グルコースＤＭＥＭ媒体にて再び懸濁され、ＲＢＣおよびＷＢＣ両方の生成物の計数が行われた。
【０１０１】
３．ブタ血液サンプル
新鮮なブタの血液は屠殺場から、４％（ｗ／ｖ）のクエン酸ナトリウム三塩基性溶液を含む貯蔵ビンに、１：９の割合（クエン酸対血液）で集められた。通常、等分された２０ｍｌのこの液は、７０μｍ細胞ろ過器に通され、収集管に入れられる。毎回新しいろ過器を使用して、この工程は３回繰り返された。ろ過された最終のサンプル２ｍｌは、ろ過のために装置に追加された。
【０１０２】
結果
図８：ブタの全血からＭＮＣを回収するには、約３μｍの大きさの孔を持つフィルタが最適（ｐ＜０．０５）であることが実証された。利用された統計検査は、Ｔｕｋｅｙ事後解析による一元配置分散分析法であり、信頼区間は９５％である。
【０１０３】
図９は、約３μｍの大きさの孔のフィルタを使用した場合、ブタの全血からのＭＮＣは、６分以内に６倍以上に濃縮されることを示す。
【０１０４】
図１０は、以下の装置の組み合わせの運用条件にて、ブタ骨髄組織の体積が約１０分の１に減少できることを示す。（ｉ）流体サンプルがフィルタを通り下へ行くようにする真空引き、（ｉｉ）洗浄液がフィルタを通り上へ行くようにする逆流洗浄、および(iii)洗浄液およびサンプル液を介し上へ向かう定在波を生成および伝播する音響素子
【０１０５】
図１１フィルタを通る流体の最適な流速が決定された。流体サンプルは、ブタの骨髄から抽出した。ろ過前の流体サンプルの体積は２ｍｌであった。ろ過後の流体サンプルの体積は２００μｌであった。この流体サンプルの体積減少を達成するための時間は、６ｄｒｏｐｓ／分にて８分、１２ｄｒｏｐｓ／分にて４分、２５ｄｒｏｐｓ／分にて２分であり、すべてにおいて３μｍのメッシュフィルタを使用した。流速が１２ｄｒｏｐｓ／分または２５ｄｒｏｐｓ／分の場合に比べ、濃縮流体サンプルにおいて、ＭＮＣｓの濃縮率が向上したので、最適な流速は、６ｄｒｏｐｓ／分であることが判明した。
【０１０６】
図１２は、ろ過後の流体サンプル内の、ＲＢＣと比べたＷＢＣの濃縮度を示す。１未満のグラフは、ＲＢＣがフィルタを通過したことを示す。
【０１０７】
図１３は、ブタの全血サンプルにおいて、ろ過前およびろ過後のＲＢＣ対ＷＢＣの比を示す。ろ過前のＲＢＣ対ＷＢＣの比は、約３７５：１である。ろ過後のＲＢＣ対ＷＢＣの比は、約５０：１である。
【０１０８】
図１４は、骨髄有核細胞の濃縮倍率およびヒト骨髄の骨髄有核細胞残留％を示し、厚さ２３μｍ、孔の密度４００ｋおよび孔の大きさ３．５μｍのＰＥＴフィルタを使用した。
【０１０９】
図１５は、孔の密度が４００，０００であるＰＥＴフィルタ上の孔の大きさの分布を示す。さらに図は、骨髄穿刺液からの処理細胞の場合の、このフィルタの効率を示す。
【符号の説明】
【０１１０】
１  ろ過装置
２  多孔質フィルタ
３  流体サンプルを受け入れる、上段（前置ろ過）室
４  流体サンプル
５  逆流洗浄液を受け入れる、下段（後置ろ過）室
６  後置ろ過室に提供された流体
７  共振基材
８  音波生成素子
９  真空引き（オプション）
１０  ろ過装置
１１  多孔質フィルタ
１２  ろ過装置から排出液を受け入れる容器
１３  逆流洗浄液を受け入れる容器
１４  逆流洗浄ポンプ
１５  真空ポンプ
１６  音波生成素子／共振基材
１７  ソレノイドバルブ（逆流洗浄ライン）
１８  ソレノイドバルブ（真空ライン）
１９  ＰＬＣデジタル制御装置およびディスプレイ
２０  ニードルバルブ
２１  制御ボックスに収容されたＰＬＣ装置
２２  制御キーボード
２３  装置オン／オフ
２４  真空ラインソレノイド制御
２５  音響素子オン／オフ
２６  真空手動切り替え
２７  逆流洗浄手動切り替え
２８  音響周波数制御
２９  音響素子振幅制御
３０  音響素子周波数表示器
３１  滴下現象表示ＬＥＤ
３２  上段室
３３  中段室
３４  上段室および下段室を固定するクランプ
３５  膜フィルタ
３６  上段室および中段室が共に固定された場合のフィルタを密封するOリング
３７  中段室内の組織サンプル用上段タンク
３８  フィルタ下方の生理食塩水タンクへの入口
３９  下段室
４０  音響素子
４１  音響素子を密封するOリング
４２  音響素子の電気接続用出口
４３  ろ過装置
４４  ろ過装置から真空ポンプへの真空ライン
４５  真空ポンプ
４６  真空ソレノイド
４７  廃棄室への真空ライン
４８  廃棄室
４９  ろ過装置への逆流洗浄ライン
５０  逆流洗浄ポンプ
５１  逆流洗浄ソレノイド
５２  逆流洗浄生理食塩水タンク
５３  滴下現象センサ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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