(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
不純物を含有する組成物中の抗体またはＦｃ領域を含む融合タンパク質を単離する方法であって前記抗体または融合タンパク質は、哺乳類宿主細胞中で発現され、前記不純物は、前記宿主細胞の細胞成分を含み、ここで該方法は：
（ａ）前記組成物のｐＨを低下させることと、
（ｂ）前記組成物に二価カチオンを添加することと、
（ｃ）前記不純物から前記抗体または融合タンパク質を分離することと
を含み、
前記（ｃ）の分離することが前記組成物を遠心分離にかけることによって行われ、前記遠心分離が上清および沈澱物を形成し；
前記抗体または融合タンパク質が前記上清に存在し；
前記（ｃ）の分離することが前記組成物を濾過することによって行われ、前記濾過することが透過流れおよび未透過流れを形成し；
前記抗体または融合タンパク質が前記透過流れに存在し、そして
（ａ）および（ｂ）は（ｃ）の前の任意の順序で連続して実施される、
方法。
【請求項２】
前記濾過の前記透過流れおよび未透過流れがタンジェンシャルフローフィルターによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（ａ）の組成物の前記ｐＨが以下：
ｉ）ｐＨ３．０〜６．５；
ｉｉ）ｐＨ３．０〜５．０；および
ｉｉｉ）ｐＨ４．０〜４．７
からなる群より選択されるｐＨの範囲で低下される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳類細胞の細胞成分は、不溶性タンパク質、脂質、核酸、リボ核酸またはそれらの組み合わせを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記二価カチオンがＣａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｂｅ２＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋、Ｒａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｄ２＋、Ａｇ２＋、Ｐｄ２＋、Ｒｈ２＋、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記二価カチオンがＣａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｎ２＋、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記二価のカチオンが、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記二価カチオンを前記組成物に添加することが以下：
ｉ）０．１ｍＭ〜５００ｍＭ、
ｉｉ）１ｍＭ〜１００ｍＭ、および
ｉｉｉ）２ｍＭ〜５０ｍＭ、
からなる群より選択される二価カチオン濃度をもたらす、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記二価カチオンを前記組成物に添加することが２ｍＭ〜５０ｍＭの二価カチオン濃度をもたらす、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記二価カチオンを前記組成物に添加することが２ｍＭ〜２０ｍＭの二価カチオン濃度をもたらす、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記二価カチオンの添加が、前記抗体または融合タンパク質の回収を、前記二価カチオンを加えない回収に比較して、以下：
ｉ）３％を超え、５０％まで；
ｉｉ）１０％を超え、５０％まで；および
ｉｉｉ）５０％まで
からなる群より選択される量だけ増加させる、
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記（ｃ）の分離することが前記組成物を濾過することによって行われ、前記濾過することが膜貫通圧をもたらし、そして前記膜貫通圧が前記濾過する間、一定のままである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）前記組成物の前記ｐＨがｐＨ３．０〜５．０まで低下され、
（ｂ）前記二価カチオンがＣｏ２＋、Ｍｎ２＋、Ｎｉ２＋またはそれらの組み合わせからなる群から選択され、そして
（ｃ）前記分離することが前記組成物を濾過することによって行われる、
請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記二価カチオンはＣｏ２＋である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記二価カチオンはＮｉ２＋である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の工程は、（ａ）−（ｂ）−（ｃ）の順序で実施される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の工程は、（ｂ）−（ａ）−（ｃ）の順序で実施される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組成物中の生物高分子を単離する方法に関する。具体的には、本発明は、不純物を含有する組成物中の生物高分子を単離する方法に関し、前記方法は、（ａ）組成物のｐＨを低下させること、（ｂ）組成物に二価カチオンを添加すること、および（ｃ）不純物から生体高分子を分離することを含む。
【背景技術】
【０００２】
生物高分子（すなわち生体高分子）（例えば組換え生体高分子）は、多種多様な技術において重要である。従来から、生体高分子は、数多くの様々な方法（２、３例を挙げるだけでも、濾過、遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および前述の組み合わせ）を用いて、精製されてきた。精製の方法は、通常、組成物中に生体高分子と共存する１つ以上の不純物とそれを区別する、生体高分子の特徴に基づいて選択される。おびただしい数の生体高分子が商業的に重要であり、およびタイムリーにかつ効率の良い方法で大量の生体高分子を精製する能力が望まれている。現在の精製技術および生体高分子を精製する方法の効率を上げるために、広範囲の研究が行われてきた。小規模の調製に適している精製技術は、工業規模の精製に適さないことが多い。
【０００３】
商業的に重要な生体高分子としては、例えば、タンパク質および核酸（例えばＤＮＡおよびＲＮＡ）が挙げられる。工業規模で単離されることが多い生体高分子の２つ例は、モノクローナル抗体および融合タンパク質である。これらの抗体および融合タンパク質は、種々の診断および治療分野において役立ち、かつ種々の疾患（例えば遺伝性および後天性の免疫不全症ならびに感染症）を処置するために用いられている。
【０００４】
精製抗体を生成するための従来からのアプローチとしては、硫安沈澱、カプリル酸の使用に続く遠心分離、イオン交換クロマトグラフィー（例えばＤＥＡＥまたはヒドロキシアパタイド）、免疫親和性精製（例えばタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇ）、および透析が挙げられる。例えば、非特許文献１を参照。上記の方法を組み合わせて使用することは一般的である（例えば、エタノール分画に続くイオン交換クロマトグラフィーおよび／またはカプリ酸（ＣＡ）沈澱を用いる血漿からの抗体精製）。例えば、非特許文献２；特許文献１；特許文献２；特許文献３；特許文献４；および特許文献５を参照。さらに、発酵の酸性化を用いて、抗体および組換えタンパク質の回収ならびに安定性が改善されてきた。例えば、非特許文献３を参照。
【０００５】
種々の他の方法は、酸沈澱の応用を含み、抗体の単離および／または精製が開発されてきた。例えば、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３、および特許文献１４を参照。しかし、これらの方法の多くは、大量の原料および回収損失をもたらす可能性があり、および／または工業規模で抗体を生成するための原価高を有する可能性がある。限定された作業は、収集条件を調整する利点を活用して、細胞浄化のロバスト性（特に、それがタンジェンシャルフロー濾過に関するとき）を改善してきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第４，１６４，４９５号明細書
【特許文献２】米国特許第４，１７７，１８８号明細書
【特許文献３】米国再発行特許第３１，２６８号明細書
【特許文献４】米国特許第４，９３９，１７６号明細書
【特許文献５】米国特許第５，１６４，４８７号明細書
【特許文献６】米国特許第７，０３８，０１７号明細書
【特許文献７】米国特許第７，０６４，１９１号明細書
【特許文献８】米国特許第６，８４６，４１０号明細書
【特許文献９】米国特許第５，４２９，７４６号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，１５１，５０４号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，１１０，９１３号明細書
【特許文献１２】米国特許第４，９３３，４３５号明細書
【特許文献１３】米国特許第４，８４１，０２４号明細書
【特許文献１４】米国特許第４，８０１，６８７号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８８）
【非特許文献２】ＭｃＫｉｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９６：２７１−２７８（１９８７）
【非特許文献３】Ｌｙｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎａｌｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ７４５：２２２−３１（１９９４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
哺乳類細胞または細菌細胞を含有する工業規模のバイオリアクターからの抗体および組換えタンパク質の収集は、通常、濾過または遠心分離のいずれかを用いて行われる。しかし、これらの技法の場合、核酸（例えばＤＮＡ）、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、および増殖培地成分は、目的の生体高分子から適切に分離されないことが多い。細胞培養でタンパク質生成量を増加させて生成する最近の傾向は、高い細胞密度で操作するためにバイオリアクターを必要としているが、これはＤＮＡ、ＨＣＰ、および他の培地成分等の不純物の量を増加させる。混入物の濃度が上がると、細胞収集操作（例えば、濾過および遠心分離の手順）、ならびに下流精製手順（例えば、クロマトグラフィーおよび透析の手順）の両方に関して強い要望が生じている。これらの不純物の高い濃度に加えて、実行すべき精製手順数が増加することもあり、従って全生成処理量を低下させることもある。
【０００９】
上述の問題点および非効率の結果、生体高分子の単離のための戦略を改善する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、不純物を含有する組成物中の生体高分子を単離する方法に関し、前記方法は（ａ）組成物のｐＨを低下させること、（ｂ）組成物に二価カチオンを添加すること、および（ｃ）不純物から生体高分子を分離することを含む。一部の実施形態では、（ａ）のｐＨを低下させることおよび（ｂ）の二価カチオンを添加することは、（ｃ）の分離することの前に起こる。
【００１１】
生体高分子を分離することは、種々の方法によって達成されることができる。一部の実施形態では、（ｃ）の分離することは、組成物を濾過することによって行われ、濾過することは、透過流れおよび未透過流れを形成する。一部の実施形態では、濾過を使用する場合、生体高分子は、実質的に、透過流れにあり、一部の実施形態では、濾過は、タンジェンシャルフローフィルターによって行われる。他の実施形態では、（ｃ）の分離することは、組成物を遠心分離にかけることによって行われ、遠心分離は、上清および沈澱物を形成する。一部の実施形態では、遠心分離を使用する場合、生体高分子は、実質的に、上清にある。
【００１２】
本発明の一部の態様では、（ａ）における組成物のｐＨは、少なくとも１ｐＨ単位低下する。本発明の一部の態様では、（ａ）における組成物のｐＨは、約３．０〜約６．５、約３．０〜約５．０、または約４．０〜約４．７の範囲内で調整される。
【００１３】
本発明の一部の態様では、生体高分子はタンパク質である。一部の実施形態では、タンパク質は可溶性タンパク質である。一部の実施形態では、タンパク質は抗体である。一部の実施形態では、組成物は真核細胞物質を含む。一部実施形態では、不純物は、タンパク質、脂質、核酸、リボ核酸、またはそれらの組み合わせを含む。
【００１４】
本発明では種々の二価カチオンを使用することができる。一部の実施形態では、二価カチオンは、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｂｅ２＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋、Ｒａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｄ２＋、Ａｇ２＋、Ｐｄ２＋、Ｒｈ２＋、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態では、二価カチオンは、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｎ２＋、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態では、組成物は、約１ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約２ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度の二価カチオンを含む。
【００１５】
本発明の一部の態様は、生体高分子を単離する方法に関し、ここでは、二価カチオンを添加することで生体高分子の回収が３％を超えて増加する。一部の実施形態では、生体高分子の回収は、１０％を超えて増加する。
【００１６】
本発明の一部の実施形態では、分離することは、組成物を、濾過することによって行われ、膜貫通圧をもたらす。膜貫通圧は濾過の間、実質的に一定のままである。
【００１７】
本発明の一部の実施形態では、前述の組成物のｐＨは、３．０〜５．０のｐＨに低下し、二価カチオンはＣａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｎ２＋、またはそれらの組み合わせからなる群から選択され、分離することは該組成物を濾過することによって行われ、および生体高分子は抗体である。
【００１８】
一部の実施形態では、本発明は、不純物を含有する組成物中の生体高分子を浄化する方法に関し、前記方法は（ａ）該組成物のｐＨを低下させること、（ｂ）該組成物に二価カチオンを添加すること、および（ｃ）該組成物中の該不純物から該生体高分子を分離することを含む。一部の実施形態では、本発明は生体高分子および不純物を含有する組成物を明確にする方法に関し、前記方法は（ａ）該組成物のｐＨを低下させること、（ｂ）該組成物に二価カチオンを添加すること、および（ｃ）該組成物中の該不純物から該生体高分子を分離することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ｐＨ４．５、５．７５、および７．１（未調整）でのモノクローナル抗体（Ｍａｂ）細胞培養の粒子径分布の分析を示す。ｐＨ４．５では、２．５μｍ未満の粒子径の比率が明白に低下し、および２．５〜６．０μｍの粒子の集団が増加している。
【図２】ｐＨ４．５（図２ｃ）、５．７５（図２ｂ）、および７．１（図２ａ）でＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅで染色した細胞の拡大像を表す。実験像は、低いｐＨレベルで染色が増加することを示した。
【図３】ｐＨの低下に応じて、細胞培養の上清の濁度を示す。通常、細胞および粒子の綿状沈澱のために、濁度は低いｐＨレベルで減少する。
【図４】上清の濁度に対する、収集原料のｐＨ調整の効果を表す。ｙ軸は、収集ｐＨ調整および綿状沈澱細胞＋細胞片の沈降後の上清の濁度を表す。ｘ軸は、収集物質の種々のｐＨ調整値を表す。特に、このデータは、収集原料のアリコートを、２５％ｖ／ｖ酢酸またはクエン酸を用いて特定のｐＨに調整し、綿状沈澱および生じる細胞の塊の沈降を可能し、ならびに澄んだ上清の濁度（透明度）を測定することによって生成した。図４のデータは、抗体および融合タンパク質を含む様々な組換えタンパク質を含有する種々の収集流れから生成される。このグラフは、調整した収集物質のｐＨが低下するにつれて、上清濁度の一般的な減少を示し、ｐＨ値が低くなるにつれて上清がより澄むことを示す。これは、低いｐＨで生じる細胞綿状沈澱のより高い程度で、細胞の塊の沈降がより急速にもたらされる結果である。この綿状沈澱および向上した沈降は、膜表面付近の向上した物質移動を提供し、従ってより効率的な精密濾過の操作性能を提供する（図１２および図１３を参照）。
【図５】２つの別々の細胞培養物（細胞培養物は抗体ＡおよびＢを生成する）から宿主細胞タンパク質（図５ａ）およびＤＮＡ（図５ｂ）の除去への種々のｐＨレベルの効果を表す。ｘ軸は、細胞培養物の種々のｐＨ調整値を表す。ｙ軸は、試料中に残存する宿主細胞タンパク質またはＤＮＡいずれかの％を表す。
【図６】２つの異なるモノクローナル抗体（Ａ（図６ａ）およびＢ（図６ｂ））の生成物の品質および回収への種々のｐＨレベルの効果を表す。ｘ軸は、細胞培養物の種々のｐＨ調整値を表す。モノクローナル抗体Ａのグラフ（図６ａ）については、四角形はタンパク質回収を表し、丸はＳＥＣ単量体を表し、三角形は、ＩＲＣの主要なアイソフォームを表す。モノクローナル抗体Ｂのグラフ（図６ｂ）については、菱形はタンパク質回収を表し、×はＳＥＣ単量体を表し、丸はＩＥＣの主要なアイソフォームを表す。
【図７】精密濾過の性能に対する種々のｐＨレベルの効果を表す。ｘ軸は、細胞培養物の種々のｐＨ調整値を表す。×は、宿主細胞タンパク質の濃度パーセンテージを表し、星形はＤＮＡの濃度を表し、黒三角形は濁度を表し、白三角形はＳＥＣ単量体を表し、およびアスタリスクはＩＥＣの主要なアイソフォームを表す。
【図８】精密濾過後のモノクローナル抗体Ａの収率に対する、種々のｐＨレベルの効果を表す。ｐＨレベル５．５を超える測定は、膜の付着物のために失敗した。
【図９】遠心分離後、モノクローナル抗体Ｂを単離することに対する、、種々のｐＨレベルの効果を表す。菱形は抗体Ｂの回収を表し、四角形は宿主細胞タンパク質の濃度を表し、三角形はＤＮＡ濃度を表し、プラス（＋）記号は、濁度の測定値を表し、丸（○）はＳＥＣ単量体を、および×はＩＥＣの主要なアイソフォームを表す。
【図１０】精密濾過システムの模式図を示す。このシステム操作の目的は、クロマトグラフ精製の前に、細胞培養物から細胞片および他の細片を取り除くことである。浄化を、マイクロフィルター（０．２〜０．６５μｍのポア呼び径）を交差流配置（膜表面に対して収集原料および未透過流れは平行）で用いることによって行われる。このシステムには、精密濾過（ＭＦ）カートリッジを通って原料を循環させるための蠕動ポンプが含まれるが、他のポンプ（例えば回転ローブまたは隔膜ポンプ）を使用することも可能である。濾過の間、経過時間、透過流れの重さ、およびカートリッジの入口、出口、ならびに透過流れ圧がモニターされる。細胞培養条件培地を５〜７倍に濃縮させた後、緩衝溶液（収集原料ｐＨと同様のｐＨ）による定容積ダイアフィルトレーションを行い、残存する生成物のほとんどを回収する。透過流れは一定流速でこのシステムから引き出され、容器に収集される。操作温度は、２〜２６℃で起こり得る。原料容器は、未調整またはｐＨ調整された収集原料のいずれかが含有され、細胞沈降を防ぐために攪拌される。
【図１１】マイクロフィルターを通る膜貫通圧（ＴＭＰ）低下を算出する方法を示す。ＴＭＰは、収集原料の未透過流れ側、および透過流れ側で測定される圧力から算出される。圧力測定は、針圧計、デジタル計測器、または圧力トランスデューサーを用いて行われる。
【図１２】精密濾過の操作性能に対する、ｐＨ調整の効果を表す。ｙ軸は、０．６５μｍポア径の中空繊維フィルターを用いる精密濾過フィルターの平均膜貫通圧（ＴＭＰ）のｐｓｉの差を表し、ｘ軸は、膜に負荷される収集原料の量対膜面積の割合（Ｌ／ｍ２）を表す。これらの精密濾過実験で用いる収集物質は、グリコシル化ヒト化モノクローナル抗体（ＩｇＧ１）チャイニーズハムスター卵巣細胞を含む。図１２の凡例は、種々のｐＨを調整した収集流および種々のパーセント細胞生存率のデータを示す。グラフは、中性のバイオリアクター状態からｐＨ４．７〜５．３に低下した未調整収集原料を濾過することは、ｐＨ６．８〜７．２の範囲のままである収集原料を濾過することと比較して、フィルターを横切る、より低い全体的な膜貫通圧をもたらすことを示す。データは、収集流れのｐＨを下げることで定められた透過流量（高い負荷で低いＴＭＰによって示されるように）でフィルターの付着物を減少させることを可能にし、より強い精密濾過操作をもたらす。
【図１３】図１２に類似するが別のモノクローナル抗体のための精密濾過の操作性能に対する、ｐＨ調整の効果を表す。ｙ軸は、０．６５μｍポア径の中空繊維フィルターを用いる精密濾過フィルターの平均膜貫通圧（ＴＭＰ）のｐｓｉの差を表し、ｘ軸は、膜に負荷される収集原料の量対膜面積の割合（Ｌ／ｍ２）を表す。これらの精密濾過実験で用いる収集物質は、十分に分化したヒト化モノクローナル抗体を産生するチャイニーズハムスター卵巣細胞を含む。図１３の凡例は、種々のｐＨを調整した収集流および種々のパーセント細胞生存率のデータを示す。グラフは、中性のバイオリアクター状態からｐＨ４．７〜５．２に低下する未調整収集原料のフィルタリングが、６．８〜７．２のｐＨの範囲で残る収集原料のフィルタリングに対してフィルターを横切るより低い全体的な膜貫通圧をもたらすことを示す。データは、収集流れのｐＨを下げることで定められた透過流量（高い負荷で低いＴＭＰによって示されるように）でフィルターの付着物を減少させることを可能にする。これにより、より強い精密濾過操作がもたらされる。
【図１４】条件付き収集流れにおけるｐＨ変化および生成物タンパク質タイタ−に対する、異なる二価カチオンの存在の効果を表す。ｙ軸は生成物タイター（添加されたカチンがないｐＨ７．０収集のタイターに規準化された）を表す。ｘ軸は、いくつかのｐＨ値（ｐＨ７、５、または４）および二価カチオン型で種々の生体高分子のための収集流れを表す。融合タンパク質に関するデータは、ｐＨ５調整の間にＣｏ２＋を添加することで溶液中の融合タンパク質が保存される、または凝集細胞および細胞片とのタンパク質の共沈澱の可能性を除去されることを示す。抗体に関するデータは、ｐＨ５調整の間にＭｇ２＋またはＣａ２＋を添加することで溶液中の抗体が保存される、または凝集細胞および細胞片との共沈澱の可能性を除去されることを示す。
【図１５】種々の抗体を含有する様々な収集流れのためのＤＮＡ除去に対する、収集のｐＨ調整の効果を表す。ｙ軸は、浄化した収集流れにおける抗体の量の存在（ｋｇ）あたりのＤＮＡ不純物の量の存在（μｇ）を示す。ｘ軸は、ｐＨ未調整および２５％酢酸でｐＨを４．７に調整した両方の収集／抗体流れを表す。以下に示すすべての抗体について、約７．０から４．７への収集ｐＨの調整することで、ＤＮＡ沈澱が効率的にもたらされ、ＤＮＡ不純物レベルで１．５〜３ログの減少を有する浄化収集流れをもたらす。
【図１６】種々のカチオンを収集原料に添加し、続いてその収集をｐＨ５に調整する効果を表す。ｙ軸は付加的なイオンの存在または非存在で未調整収集流れに基づく％タンパク質での損失を示す。グラフの左側の最初の棒は、任意の付加的な二価イオンなしでｐＨ収集をｐＨ５．０に調整した後の１４％のタンパク質損失（沈澱に起因する）を表す。残りの棒は、種々の二価カチオンの存在で、付加的なタンパク質損失（＞１４％）またはタンパク質生成物回復（＜１４％）を表す。データは、種々の遷移金属イオン（例えば、Ｎｉ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、およびＣｏ２＋）の存在がタンパク質回収を向上させることを示す。
【図１７】２５％酢酸でｐＨを５．０に調整する収集流れからタンパク質タイター回収に対する、ＣｏＣｌ２の濃度の効果を表す。ｙ軸は、ＣｏＣｌ２の種々のレベルでｐＨを調整した収集流れの％タンパク質での損失を表す。ｘ軸は、ｐＨを５．０に調整した収集流れに存在するＣｏＣｌ２（ｍＭ）の濃度を表す。データは、Ｃｏ２＋イオンの濃度が上がるにつれて、ｐＨに誘発された沈澱に起因するタンパク質生成物の％損失が減少することを示す。１０ｍＭの平衡濃度は、融合タンパク質に対して示される。
【図１８】タンパク質の濾過拒絶および全浄化回収に対する、本発明の方法の効果を表す。ｙ軸は、保持係数（Ｒ）によって規定されるタンパク質の即時濾過拒絶を表す。ｘ軸は、目的の生体高分子を含む組成物の浄化操作の間の処理体積量を表す。データは、４つの別々のＭＦ実験を示す。すなわち、白三角形および黒三角形によって示される操作は、１０ｍＭ  ＣｏＣｌ２の添加を含み、ｐＨ５．０に調整された収集流れを表し、白丸および黒丸によって示される操作は、ＣｏＣｌ２を添加されない未調整収集流れを表す。データは、研究したすべての負荷率に関して、１０ｍＭ  ＣｏＣｌ２を含有するｐＨを調整した収集原料に対して低いことを示す。データは、Ｃｏ２＋二価イオンを含有する操作が未調整収集原料を用いる操作による２０％収率損傷と比較すると、所望のタンパク質の完全回収を示すことを表す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、不純物を含有する組成物中の生体高分子を単離する方法に関し、前記方法は、（ａ）組成物のｐＨを低下させること、（ｂ）組成物に二価カチオンを添加すること、および（ｃ）不純物から生体高分子を分離することを含む。本発明の発明者は、最初の生物由来物質を高密度で有する細胞培養物を含有するバイオリアクターから工業規模量の抗体を分離する（濾過によって）ことを試みた場合、高濃度の細胞物質に起因する膜表面の付着物の結果と思われる、フィルターを横切る膜貫通圧の低下が著しく増大したことを見出した。フィルター付着物が増加し、次いで、回収される抗体の量に悪影響を及ぼし、浄化収率を低下させ、次いで透過流れにおいて相対的に高いレベルの不純物をもたらした。一部の例では、膜貫通圧がフィルターの機械的性能を超えた値まで増加し、従って完了する前に操作が停止され、生成物収率の著しい低下をもたらした。
【００２１】
フィルターの膜貫通圧を減少させ、透過流れにおけるタンパク質回収を増加させ、および透過流れにおける不純物の量を減少させるために、本発明の方法は、濾過の前に収集原料のｐＨを下げて、他の不純物（例えばＤＮＡ）の沈澱とともに大型細胞および細胞片の綿状沈澱を引き起こす。不純物（細胞、細胞片、およびＤＮＡ）の大粒子への綿状沈澱は、フィルター表面近くの組成物の物質移動を向上させ、従って所定の透過流れの流量または流速でフィルターを横切る膜貫通圧を減少させた。さらに、収集流れのｐＨを下げることによって起こる不純物の共沈澱は、フィルター上でこれらの不純物の保持を向上させ、従って透過流れにおける不純物レベルを減少させる。
【００２２】
組成物のｐＨを下げることにより、収集原料内の所望の抗体の沈澱を誘導し、膜によって所望の抗体の保持がもたらされ、次いで透過流れにおける所望の抗体の量が減少することが見出された。本発明の方法は、濾過の前にｐＨを調整した収集原料に、二価カチオンを添加することによって抗体の共沈殿をさらに選択的に減少させ、および透過流れにおける抗体回収の量を増加させながら、不純物の量に影響を及ぼさない。
【００２３】
本発明の方法は、組成物中の不純物から生体高分子を単離するのに有用である。生体高分子の例としては、例えば抗体、組換えタンパク質、融合タンパク質等であり、二価カチオンの存在下の低ｐＨで類似する溶解特性を有する。
【００２４】
文脈から明白でない限り、「単数形の（ａ）または（ａｎ）」という用語の実体は、その実体の１つ以上をいうことに注目すべきであり、例えば、「単数形のタンパク質」は、１つ以上のタンパク質を表すと理解される。そのようなものとして、「単数形の（ａ）（または（ａｎ））」、「１つ以上の」、および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では互換的に用いられ得る。
【００２５】
「単離すること」および「単離」という用語は、組成物中に見出される少なくとも１つの他の望ましくない成分または不純物から生体高分子を分離することをいう。「単離すること」という用語は、「精製すること」および「浄化すること」を含む。生体高分子の単離には特定のレベルは必要ではないが、一部の実施形態では、不純物の少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％、または９５％（ｗ／ｗ）が生体高分子から分離される。例えば、一部の実施形態では、生体高分子の単離は、組成物中に最初に存在するＨＣＰの８０％から生体高分子を分離することを含む。
【００２６】
「浄化すること」および「浄化」という用語は、組成物から大粒子の除去をいう。例えば、細胞培養物および増殖培地に適用すると、「浄化すること」という用語は、細胞培養物から例えば、原核細胞および真核（例えば哺乳類の）細胞、脂質、および／または核酸（例えば染色体およびプラスミドＤＮＡ）の除去をいう。一部の実施形態では、本発明の方法は、（ａ）組成物のｐＨを下げて、不純物が組成物内に凝集させることを可能すること、（ｂ）二価カチオンを組成物に添加すること、および（ｃ）組成物中の不純物から生体高分子を分離することを含む。不純物の綿状沈澱には特定のレベルは必要ではないが、一部の実施形態では、不純物の少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％、または９５％（ｗ／ｗ）が凝集される。例えば、一部の実施形態では、生体高分子の浄化は、組成物中に存在する哺乳類細胞の８０％を凝集させることを含む。綿状沈澱は、濁度計等の写真測光法を含む、当業者にとって公知の方法によって測定されることができる。
【００２７】
「精製すること」および「精製」という用語は、不純物の大きさにかかわらず組成物中の不純物または他の混入物から本発明の生体高分子を分離することをいう。従って、「精製」という用語は、「浄化」を包含するが、さらに、浄化の間に除去されるものよりも小さい大きさの不純物（例えば、タンパク質、脂質、核酸、および細胞片、ウイルス片、混入細菌片、培地成分等の他の形態）を包含する。生体高分子の精製には特定のレベルは必要ではないが、一部の実施形態では、不純物の少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％、または９５％（ｗ／ｗ）が生体高分子から精製される。例えば、一部の実施形態では、生体高分子の精製は、組成物中に最初に存在するＨＣＰの８０％から生体高分子を分離することを含む。
【００２８】
本明細書に用いるように「生物生体高分子」または「生体高分子」という用語は、生物または細胞培養物（例えば、真核（例えば、哺乳類等）細胞培養物または原核（例えば、細菌等）細胞培養物）から単離されることができる１ｋＤａを超える分子量を有する分子をいう。一部の実施形態では、この用語の使用は、ポリマー、例えば、生体高分子（核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ）、ポリペプチド（例えばタンパク質）、炭水化物、および脂質）をいう。一部の実施形態では、「生体高分子」という用語は、タンパク質をいう。一部の実施形態では、「生体高分子」という用語は、組換えタンパク質または融合タンパク質をいう。一部の実施形態では、タンパク質は可溶性である。一部の実施形態では、生体高分子は、抗体（例えばモノクローナル抗体）である。
【００２９】
本明細書で用いるように、「タンパク質」という用語は、単数の「タンパク質」ならびに複数の「タンパク質」を包含することを意図する。従って、本明細書で用いるように、「ペプチド」、「ポリペプチド」、「アミノ酸鎖」、または１本鎖のアミノ酸または複数鎖のアミノ酸を参照するために用いる任意の他の用語を含むがそれらに限定されない用語は、「タンパク質」の定義に含まれ、および「タンパク質」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、または互換的に使用することが可能である。この用語は、翻訳後の修飾（例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／封鎖基による誘導体化、タンパク質切断、または非天然のアミノ酸による修飾）を受けているタンパク質をさらに含む。タンパク質は、多量体（例えば二量体、三量体等）を形成するポリペプチドも含む。「タンパク質」という用語は、融合タンパク質（例えば、タンパク質（またはタンパク質のフラグメント）が抗体（または抗体のフラグメント）に結合する遺伝子融合のプロセスを介して産生されるタンパク質）も含む。本発明の融合タンパク質の例としては、ヒトＩｇＧ１およびヒトＩｇＥに由来する、連結したＦｃ領域を含むジスルフィド結合二官能性タンパク質、およびリンホトキシンβ受容体免疫グロブリンＧ１が挙げられる。
【００３０】
抗体は、本発明の方法によって精製されることができる。用語［抗体］とは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多選択性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ‘）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成されるフラグメント、坑イディオタイプ（坑Ｉｄ）抗体（例えば本発明の抗体に対する坑Ｉｄ抗体を含む）、および前述のいずれかのエピトープ結合フラグメントをいう。一部の実施形態では、「抗体」という用語は、モノクローナル抗体をいう。「抗体」という用語は、また、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性の部分（すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子）いう。本発明の方法によって精製されることができる免疫グロブリン分子は、型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）、または免疫グロブリン分子のサブクラスのいずれかであり得る。本発明の抗体としては、キメラ抗体、一本鎖抗体、およびヒト化抗体も挙げられる。本発明の抗体の例としては、商品化された抗体（例えば、ｎａｔａｌｉｚｍａｂ（ヒト化坑ａ４インテグリンモノクローナル抗体）、ヒト化坑αＶβ６モノクローナル抗体、ヒト化坑ＶＬＡ１  ＩｇＧ１κモノクローナル抗体、ｈｕＢ３Ｆ６（ヒト化ＩｇＧ１／κモノクローナル抗体）が挙げられる。
【００３１】
本発明の方法によって精製される抗体は、鳥および哺乳類を含む任意の動物に由来することもある。好ましくは、本発明の方法によって精製される抗体は、ヒト、ネズミ科の動物（例えばマウスおよびラット）、ロバ、シップウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ）に由来する。本明細書で用いるように、「ヒト」抗体とは、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、およびヒト免疫グロブリンライブラリーから、または１つ以上のヒト免疫グロブリンとの動物トランスジェニックから単離され、内在性免疫グロブリンを発現しない抗体を含む。例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第５，９３９，５９８号を参照。一部の実施形態では、抗体としては、商品化された抗体（例えばｎａｔａｌｉｚｍａｂ（ＴＹＳＢＡＲＩ（登録商標），  Ｅｌａｎ  Ｐａｈｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ））を含む、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４の抗体が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３２】
本発明の方法によって精製されることができる抗体としては、例えば、自然抗体、インタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２種類のインタクトな抗体から形成される多選択性抗体（例えば二重特異性抗体）、抗体フラグメント（例えば、１つ以上の抗原に結合し、および／または認識する抗体フラグメント）、ヒト化抗体、ヒト抗体（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）；  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６２，  ２５５−２５８（１９９３）；  Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７：３３  （１９９３）、米国特許第５，５９１，６６９号および第５，５４５，８０７号）、抗体ファージライブラリーから単離される抗体および抗体フラグメント（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）；  Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２２２：５８１−５９７（１９９１）；  Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）；  Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２１：  ２２６５−２２６６（１９９３））が挙げられる。本発明の方法によって精製される抗体は、Ｎ末端もしくはＣ末端で非相同ポリペプチドに組換えで融合され得る、またはポリペプチドもしくは他の組成物に化学的に抱合（共有抱合および非共有抱合）され得る。例えば、本発明の方法によって精製される抗体は、検出アッセイおよびエフェクター分子（例えば、非相同ポリペプチド、薬物、または毒素）において標的として有用な分子に組換えで融合され得るまたは抱合され得る。例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ９２／０８４９５号、第ＷＯ９１／１４４３８号、第ＷＯ８９／１２６２４号、米国特許第５，３１４，９９５号、および欧州特許第ＥＰ３９６，３８７号を参照。
【００３３】
一部の実施形態では、本発明の生体高分子または組成物は、医薬的に許容される。「医薬的に許容される」とは、健全な医学的判断に従って、有用性／危険性の妥当な比に釣り合い、過剰な毒性または他の合併症もなく、人間および動物の組織との接触に適した生体高分子または組成物をいう。
【００３４】
一部の実施形態では、生体高分子は可溶性タンパク質である。「可溶性」という用語は、細胞宿主の親水性もしくは水性の環境（例えば細胞質、周辺質、または細胞外媒体）に実質的に局在化するためのタンパク質の性質をいう。従って、細胞分画の間、可溶性タンパク質は、通常、宿主細胞の細胞質成分、周辺質成分、または細胞外成分によって実質的に単離される。一部の実施形態では、可溶性タンパク質は、界面活性剤の非存在下で水溶性である。当業者は、ポリペプチドの細胞局在またはタンパク質の細胞分画のどちらも絶対的でないことを認識する。従って、語句「実施的に局在化させる」とは、タンパク質の５０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％が指定された細胞部位（例えば細胞質、周辺質、または細胞外媒体）にあるタンパク質をいう。
【００３５】
本発明での「組成物」という用語は、本発明の生体高分子の１つ以上の分子、および場合により、不純物および生体高分子が同一でない、少なくとも１つの不純物の混合物をいう。一部の実施形態では、組成物は、生体高分子、細胞宿主生物（例えば哺乳類細胞）、および宿主生物を増殖させ、ならびに目的の生体高分子の発現を可能にするのに十分な培養基を含む。増殖培地の選択および使用は、当業者にとって公知である。一部の実施形態では、培養基は、細胞培養培地である。細胞培養培地は、増殖する細胞培養の種類によって異なる。一部の実施形態では、細胞培養培地は、市販されている培地である。一部の実施形態では、例えば無機塩類、炭水化物（例えば、グルコース、ガラクトース、マルトース、または果糖等の糖類）、アミノ酸、ビタミン（例えば、ビタミンＢ群（例えばＢ１２）、ビタミンＡ、ビタミンＥ、リボフラビン、チアミン、およびビオチン）、脂肪酸および脂質（例えば、コレステロールおよびステロイド）、タンパク質およびペプチド（例えばアルブミン、トランスフェリン、フィブロネクチン、およびフェチュイン）、血清（例えばアルブミン、成長因子、および成長抑制物質を含む組成物（例えばウシ血清、新生仔牛血清、およびウマ血清））、微量元素（例えば亜鉛、銅、セレン、およびトリカルボン酸の中間体）、ならびにそれらの組み合わせを含有する増殖培地を含む。増殖培地の例としては、基本培地（例えばＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＧＭＥＭ）、複合培地（ＲＰＭＩ  １６４０、Ｉｓｃｏｖｅｓ  ＤＭＥＭ、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ  Ｌ−１５、ＴＣ１００）、無血清培地（例えばＣＨＯ、Ｈａｍ  Ｆ１０および誘導体、Ｈａｍ  Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２）が挙げられるがこれらに限定されない。増殖培地で見られる通常の緩衝液として、ＰＢＳ、Ｈａｎｋｓ  ＢＳＳ、Ｅａｒｌｅｓ塩類、ＤＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＥＢＳＳが挙げられる。哺乳類細胞を培養するための培地は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  （Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）、ＨｙＣｌｏｎｅ  （Ｌｏｇａｎ，  ＵＴ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  （Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  （Ｅ．  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，  ＮＪ）、ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  （Ｌｅｎｅｘａ，  ＫＳ）、Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  （Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，  ＣＡ）、および他から入手可能である。増殖培地で見られる他の成分としては、アスコルビン酸、クエン酸、システイン／シスチン、グルタミン、葉酸、グルタチオン、リノール酸、リノレン酸、リポ酸、オレイン酸、パルミチン酸、ピリドキサール／ピリドキシン、リボフラビン、セレン、チアミン、トランスフェリンを挙げることができる。当業者は、本発明の範囲に含まれる増殖培地に修飾が存在することを認識する。
【００３６】
一部の実施形態では、組成物は収集原料をさらに含む。「収集原料」という用語は、細胞が収集の直前に存在する培地、または収集された細胞が収集直後に置かれ、かつ細胞がそれに再懸濁される培地をいう。収集原料としては、増殖培地に関して上述した組成物の任意の、または収集細胞もしくは細胞分画を再懸濁させるのに適した他の培地を挙げることができる。例えば、一部の実施形態では収集培地は、水、緩衝液、浸透圧剤、坑分解剤等を含有することもある。
【００３７】
「不純物」という用語は、本発明の生体高分子と異なる、組成物の１つ以上の成分をいう。一部の実施形態では、不純物としては、インタクトな哺乳類細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）もしくはマウス骨髄腫細胞（ＮＳＯ細胞））、または部分細胞（例えば細胞片）を挙げることができる。一部の実施形態では、不純物は、タンパク質（例えば、可溶性もしくは不溶性のタンパク質、またはＨＣＰ等のタンパク質のフラグメント）、脂質（例えば細胞壁物質）、核酸（例えば染色体ＤＮＡもしくは染色体外ＤＮＡ）、リボ核酸（ｔ−ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ）、またはそれらの組み合わせ、または目的の生体高分子とは異なる任意の他のどんな細胞片でも含む。一部の実施形態では、不純物は、目的の生体高分子を産生した、または含有した宿主生物から生じ得る。例えば、不純物は、目的のタンパク質を発現した原核細胞または真核細胞（例えば、細胞壁、細胞タンパク質、ＤＮＡもしくはＲＮＡ等）の細胞成分であり得る。一部の実施形態では、不純物は宿主生物に由来せず、例えば不純物は、細胞培養培地、増殖培地、緩衝液、または培地添加物に由来することもある。本明細書で用いるように不純物は、単一の望ましくない成分、またはいくつかの望ましくない成分の組み合わせを含み得る。
【００３８】
本発明の生体高分子は、増殖培地および種々の真核細胞（例えば哺乳類細胞）を含む細胞培養物から単離されることも可能である。本発明の哺乳類細胞（本発明の方法で用いられる哺乳類細胞を含む）は、培養で増殖することが可能な任意の哺乳類細胞である。典型的な哺乳類細胞としては、例えば、ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ  ＤＵＫＸ−Ｂ１１、ＣＨＯ  ＤＧ４４を含む）、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＶ１（Ｃｏｓ、Ｃｏｓ−７を含む）、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｃ１２７、骨髄腫細胞系（特にマウス）、ＰＣ１２、ＨＥＫ−２９３細胞（ＨＥＫ−２９３ＴおよびＨＥＫ−２９３Ｅを含む）、ＰＥＲＣ６、Ｓｐ２／０、ＮＳＯ細胞、およびＷ１３８細胞が挙げられる。任意の前述の細胞に由来する哺乳類細胞も、用いることが可能である。
【００３９】
本発明の生体高分子は、増殖培地および種々の原核細胞（例えば、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、ならびにシュードモナス属内の種々の種（例えば緑膿菌）、酵母菌（例えばサッカロミセス、ピキア、ハンゼヌラ、クリベロマイセス、分裂酵母、シュワニオミセス、およびヤロウイア）、昆虫細胞（例えばイラクサギンウワバ、鱗翅目カブラヤガ、スポドプテラ属、ショウジョウバエ、およびＳｆ９）、植物細胞（例えばシロイヌナズナ）を含む細胞培養物から単離され得る。当業者は、目的の生体高分子に応じて、適切な細胞系を選択できる。
【００４０】
本発明では、組成物のｐＨは、収集原料のｐＨよりも低いｐＨに調整される。本発明の組成物（例えば、収集原料を含むもの）は、通常、調整なしで、約６．０〜約８．０、約６．５〜約７．５、または約６．８〜約７．２のｐＨを有する。一部の実施形態では、収集原料のｐＨよりも低い任意のｐＨを、本発明の単離で用いる。一部の実施形態では、組成物のｐＨは、約１．０〜約６．０、約２．０〜約５．５、約３．０〜約６．５、約３．０〜約５．０、約４．０〜約５．０、約４．０〜約４．７、約４．３〜約５．０、または約４．７〜約５．０の範囲内のｐＨに下げる。一部の実施形態では、組成物のｐＨは、約４．０〜約４．７の範囲内に下げる。一部の実施形態では、ｐＨは、約３．５のｐＨまで下げることができる。一部の生体高分子では、３．５よりも低いｐＨは、目的の生体高分子の変性または不安定性をもたらし、従って望ましくない。任意の理論に制約されることなく、一部の実施形態では、収集原料のｐＨを下げることによって、組成物、主に細胞、および細胞片のうちの１つ以上の成分を凝集させる。一部の実施形態では、宿主細胞ＤＮＡは凝集され、目的の生体高分子の単離をより簡単および／またはより効率的にできるようにする。一部の実施形態では、宿主細胞タンパク質は凝集され、目的の生体高分子の単離をより簡単および／またはより効率的にできるようにする。一部の実施形態では、濾過を用いて生体高分子を単離する場合、凝集した大粒子は、フィルターのポアの付着物を減少させ、従ってフィルタリング効果を上昇させ、膜貫通圧を低下させ、処理体積量を増大させる。一部の実施形態では、本発明は、ｐＨを下げることによる生体高分子を単離する方法に関する。
【００４１】
本発明の組成物のｐＨは、種々の方法によって調整されることが可能である。一部の実施形態では、ｐＨを、組成物に酸を添加することによって下げる。適切な酸としては、強酸（例えば、過塩素酸（ＨＣｌＯ４）、ヨウ化水素酸（ＨＩ）、臭化水素酸（ＨＢｒ）、塩酸（ＨＣｌ）、硝酸（ＨＮＯ３）、硫酸（二塩基酸）（Ｈ２ＯＳ４））、もしくは弱酸（例えば酢酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）（例えば氷酢酸）、クエン酸（Ｃ６Ｈ８Ｏ７）、ギ酸（ＨＣＯＯＨ）、シアン化水素酸（ＨＣＮ）、硫酸水素塩イオン（ＨＳＯ４−））、または上記の酸のいずれかの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、組成物のｐＨは、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液（例えばリン酸ナトリウムおよびリン酸カリウム）、炭酸水素緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液、トロメタミン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、およびそれらの組み合わせ）を用いることによって調整され得る。
【００４２】
任意の理論にも制約されることなく、本発明の一部の実施形態では、ｐＨを低下させることによって大きな不純物の粒子を凝集させるのに役立ち、それによって「付着物」（すなわち、フィルターのポアを塞ぐまたは詰める）を減少させる。フィルターの付着物が増加すると、透過流れにおける所望の生体高分子の回収に悪影響を及ぼす可能性があり、透過流れにおける浄化収率の低下および比較的高いレベルの不純物をもたらす。場合によっては、フィルターの付着物は、膜貫通圧を増加させる。フィルターの付着物は、フィルターの機械的性能を超える値まで膜貫通圧を増大させ、従って、完了する前にフィルター操作を停止させ、著しく低い生成物回収をもたらす。従って、一部の実施形態では、本発明は、組成物のｐＨを下げることによって、組成物中の生体高分子のより多くの量または容積を単離する方法に関する。一部の実施形態では、ｐＨを下げることによって、回収される生体高分子の純度および品質を増加させることができる。
【００４３】
一部の実施形態では、組成物のｐＨを下げることは、目的の生体高分子ならびに不純物の共沈澱をもたらし、細胞外媒体における生体高分子の回収を減少させる結果となる。本発明の発明者は、一部の実施形態では、ｐＨを調整した組成物に二価カチオンを添加することは、目的の生体高分子の回収を増加させることに適していることが分った。「回収の増加」という用語は、同一の精製方法であるが二価カチオンを添加しない方法に比べて、本発明の方法の比較をいう。例えば、方法Ａが本発明の方法（収集原料への二価カチオンの添加を含まないことを除いて）であって、目的の生体高分子を１００ｍｇもたらし、方法Ｂが方法Ａと同一（方法Ｂが収集原料への二価カチオンの添加を含むことを除いて）であり、生体高分子を１１０ｍｇもたらす場合、方法Ｂは１０％の「回収の増加」を有すると判定される。一部の実施形態では、本発明の方法は、生体高分子の回収を３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、または２５％を超えて増加させる。一部の実施形態では、本発明の方法は、回収を、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、または５０％まで増加させる。
【００４４】
本発明では、二価カチオンを組成物に添加する。種々の二価カチオンが存在し、当業者にとって公知であり、例えば、カルシウムカチオン（Ｃａ２＋）、マグネシウムカチオン（Ｍｇ２＋）、銅カチオン（Ｃｕ２＋）、コバルトカチオン（Ｃｏ２＋）、マンガンカチオン（Ｍｎ２＋、ニッケルカチオン（Ｎｉ２＋）、ベリリウムカチオン（Ｂｅ２＋）、ストロンチウムカチオン（Ｓｒ２＋）、バリウムカチオン（Ｂａ２＋）、ラジウムカチオン（Ｒａ２＋）、亜鉛カチオン（Ｚｎ２＋）、カドミウムカチオン（Ｃｄ２＋）、銀カチオン（Ａｇ２＋）、パラジウムカチオン（Ｐｄ２＋）、ロジウムカチオン（Ｒｈ２＋）、およびそれらの組み合わせが挙げられる。当業者は、カチオンが塩の形（例えば、ＣａＣｌ２等のカルシウム塩は、水溶液に加えて、カルシウムカチオンを生成できる）で存在できることを理解する。従って、本明細書で用いるように、語句「二価カチオンを添加すること」は、その荷電状態にカチオンを添加することだけでなく、本発明の組成物に導入されると、二価カチオンを生成する塩もしくは他の成分を添加することも包含する。一部の実施形態では、二価カチオンはＣｏ２＋もしくはＮｉ２＋、またはそれらの塩類（例えばＣｏＣｌ２、ＮｉＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２２、およびＣｕＣｌ２）、またはこれらのカチオンもしくは塩類のうちの１つ以上の組み合わせである。ある二価カチオンが様々な生体高分子により適していることもあり得ると予想される。また一方、当業者は、多数の二価カチオンを容易にかつ手早く試験して、どれが目的の生体高分子の最大回収を達成するかを決定することができる。
【００４５】
組成物における二価カチオンの種々の濃度が本発明での使用に適している。当業者は、種々の量の二価カチオンが通常、収集原料（内在性二価カチオン）で少量存在し、種々の量の二価カチオンが本発明によって収集原料に添加される（外因性二価カチオン）ことができることを認識する。一部の実施形態では、二価カチオンの濃度は、外因性カチオンおよび内在性カチオンの両方を含む。しかし、実際的には、内在性二価カチオンの量は、外因性二価カチオンの量と比べて、比較的に少量であるので、二価カチオンの濃度は、単純に外因性二価カチオンを考慮することで算出されることが可能である。一部の実施形態では、組成物中の二価カチオンは、組成物の約０．０１ｍＭ〜約１Ｍの濃度で組成物に存在する。一部の実施形態では、約０．１ｍＭ〜約５００ｍＭ，または約０．５ｍＭ〜約２００ｍＭ、約１．０ｍＭ〜約１００ｍＭ，約２ｍＭ〜約５０ｍＭ、約５ｍＭ〜約１５ｍＭ、または約２ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度で組成物に存在する。一部の実施形態では、二価カチオンは、約１０ｍＭの濃度で組成物に存在する。任意の方法論に制約されることなく、二価カチオンの適切な濃度は、実施例１４で分ったものに類似する方法で決定されることが可能である。この実施例では、種々の濃度の二価カチオンを、生体高分子を含む、ｐＨを調整した組成物に添加し、次いで最大量の生体高分子を回収できる最低濃度を決定する。当業者は、様々な濃度のカチオンが種々の生体高分子で必要とされ得ると理解する。
【００４６】
種々の方法を用いて、１つ以上の不純物から本発明の生体高分子を分離することができる。不純物から生体高分子を分離する方法の例としては、沈澱、免疫沈降、クロマトグラフィー、濾過、遠心分離、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、不純物から生体高分子を分離することは、フィルターを用いることによって達成される。「濾過」または「濾過すること」という用語は、特定のポア径からなる、１つ以上の半透膜（または媒体）に組成物を通過させることによって組成物から浮遊粒子を除去するプロセスをいう。濾過について言及するとき、「透過流れ」という用語は、濾過の間、フィルターポアを通過する組成物の画分をいう。濾過について言及するとき、「未透過流れ」という用語は、濾過の間、フィルター上に残存する、またはフィルターポアを通過しない組成物の画分をいう。一部の実施形態では、濾過後、本発明の生体高分子は、実質的に透過流れ（すなわち、フィルターポアを通過して、収集される）に存在し、一方不純物（例えば、細胞片、ＤＮＡ、および／またはＨＣＰ）は実質的に未透過流れに存在する。一部の実施形態では、濾過後、本発明の生体高分子は、実質的に未透過流れに存在し、一方不純物は、実質的に透過流れに存在する。一部の実施形態では、「ベンチ規模」の濾過を用いて、工業規模濾過の適切な条件を予測することができる。
【００４７】
特定の生体高分子を精製するための適切なフィルターの種類、化学的性質、およびモジュール配置は、当業者にとって公知であり、種々の因子（例えば濾過される組成物の成分の量および大きさ、濾過される組成物の容積、および濾過される組成物の細胞密度および生存率）に基づいて選択されることができる。一部の実施形態では、フィルター（例えば薄膜フィルター、プレートフィルター、カートリッジフィルター、バッグフィルター、加圧リーフフィルター、回転ドラムフィルター、または真空フィルター）を用いることが可能である。一部の実施形態では、デプスフィルターまたは交差フィルターを用いる。本発明に適用される交差流フィルターモジュールの種類としては、中空繊維型、管状型、平板（板・骨組）型、スパイラル型、または渦流型（例えば回転）のフィルター形状が挙げられる。一部の実施形態では、タンジェンシャルフローフィルターが用いられる。一部の実施形態では、タンジェンシャルフロー（交差流）モードで、中空繊維、管状、および平膜のモジュールを利用した。利用できる市販のフィルターは、種々の製造ベンダー（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  （Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，  ＭＡ）、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  （Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ，  ＮＹ）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）、およびＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  （Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ））のために製造されている。
【００４８】
本発明のフィルターのポア径は、単離される生体高分子の型および組成物中に存在する不純物の種類によって変わり得る。一部の実施形態では、フィルターのポア径は、直径０．１μｍ〜１．０μｍ、０．２μｍ〜０．８μｍ、または０．２μｍ〜０．６５μｍである。
【００４９】
濾過の間、フィルターを通る組成物の移動（例えば、収集原料）は、膜抵抗の結果として起こる膜貫通圧を生成する。膜表面に細胞物質が蓄積する（または極性化する）につれて、一定流速で膜を横切って流れる抵抗が増大し、従って推進力または膜貫通圧が増大する原因になる。膜表面近くの細胞物質の量が減少する場合、または膜の極性化が低下する場合、膜貫通圧は実質的に一定のままである傾向がある。膜電位差を算出する方法は、当業者にとって公知であり、圧力トランスデューサーまたはゲージの使用が挙げられる。本発明の一部の実施形態では、膜貫通圧は、原料および未透過流れの出口圧力および透過流れの圧力との間の平均の差を取って、算出されることができる。図８は、膜貫通圧算出の模式図を示す。
【００５０】
通常、ｐＨを調整してない組成物の濾過の間（例えば、収集原料）、より多くの組成物がフィルターに負荷されるにつれて、フィルターの膜貫通圧は著しく増大する。例えば、一部の実施形態では、フィルターのポアが詰まるにつれて、膜貫通圧は、濾過プロセスの開始（組成物の最初の量をフィルターに配置するとき）から濾過プロセスの終了（通常、７〜１０×細胞物質の濃度および３〜５×ダイアフィルトレーションの後）までに５ｐｓｉ、７ｐｓｉ、１０ｐｓｉ、１５ｐｓｉ、または２０ｐｓｉもしくはそれ以上増大する。例えば、図１２（原料組成物Ａ）および図１３（原料組成物Ａ）に示すように、収集原料溶液（ｐＨを調整してない）の濾過の間、膜貫通圧は、収集原料の負荷の開始時の約１ｐｓｉ未満から、６０リットル／ｍ２の収集原料をフィルターに負荷（１０００％の膜貫通圧の増加）した後の約１０ｐｓｉを超えるまで増大することもある。従って、膜貫通圧について言及するとき、「実質的に一定の」という用語は、濾過の間に、４ｐｓｉ、３ｐｓｉ、または２ｐｓｉより大きく増大しない膜貫通圧をいう。実質的に一定の膜貫通圧は、図１２の収集原料組成物Ｂ〜Ｇ、および図１３の原料組成物Ｂ〜Ｆによって例証される。これらの組成物のそれぞれは、約１ｐｓｉ未満の膜貫通圧で開始し、濾過の間、これらの組成物を濾過するフィルター上の膜貫通圧は、２ｐｓｉを超えない。従って、図１２の組成物Ｂ〜Ｇおよび図１３の原料組成物Ｂ〜Ｆを濾過するフィルター上の膜貫通圧は、実質的に一定であると考えられる。一部の実施形態では、本発明は、組成物中の生体高分子を精製する方法に関し、前記方法は、（ａ）組成物のｐＨを低下させること、（ｂ）組成物に二価カチオンを添加させること、および次いで（ｃ）膜を通して組成物を濾過させることを含み、この濾過方法は、濾過の間、実質的に一定のままである膜貫通圧をもたらす。
【００５１】
一部の実施形態では、本発明の方法は、タンパク質濾過の拒絶を減少させる。「タンパク質濾過の拒絶」という用語は、式Ｒ＝（１−［ＣＰ／ＣＲ］）によって実証することができる。ここで、Ｒはタンパク質濾過の拒絶係数、ＣＰは目的の生体高分子の即時透過濃度、およびＣＲは目的の生体高分子の即時未透過濃度である。一部の実施形態では、本発明は、組成物のｐＨを低下させること、組成物に二価カチオンを添加させること、および生体高分子を濾過することを含む、組成物中の生体高分子を単離する方法に関する。ここで、タンパク質濾過の拒絶係数の値は、ｐＨの調整および／または二価カチオンの添加を行わない組成物中の生体高分子と比較して、所定の処理体積量に対してより低い。例えば図１８を参照。
【００５２】
生体高分子を単離するとき、一部の実施形態では、大量の組成物（例えば収集原料）が、例えば商業生産プロセスの間に存在し得る。量が大量になると、精製プロセスにおいていくつかの課題が生じる。例えば、単離した生体高分子の回収の際にフィルターを通る流速の多少の変化が有する影響は、大量で用いる場合に、増幅される。同様に、大量で用いる場合、生成物回収の際に、収集原料における細胞密度の増加も増幅される。従って、大量の組成物の使用は、増幅されかつ少量の使用と比較すると、より大きい分枝を有するという独特な問題を提起する。従って、一部の実施形態では、本発明は大量の組成物に存在する生体高分子を単離する方法に関する。「大量」という用語は、生体高分子の商業生産および／または工業生産に関連する量をいう。一部の実施形態では、「大量」という用語は、１０〜２０００リットル、２０〜１０００リットル、または５０〜５００リットルをいう。
【００５３】
一部の実施形態では、高細胞密度の組成物（例えば収集原料）から生体高分子を収集することは有益である、もしくは望ましい。高細胞密度の組成物は、通常の細胞密度の組成物と比較すると、独特な問題を提起する。例えば、高細胞密度の組成物は、組成物中に存在する不純物を大量に有し、それによって、精製プロセスの間に除去される必要がある不純物の量を増加させる。従って、より高い細胞密度の組成物は、フィルターをより早く詰まらせる可能性があり、それによって、組成物の濾過が妨げられる。一部の実施形態では、高細胞密度の組成物は、より多くのフィルター、またはより大きい表面積を有するフィルターを使用する必要がある。これらの両要件は、濾過に付随する費用および／または生成物の損失をより大きくする結果になり得る。本発明では、組成物のｐＨを低下させ、それによって一部の不純物を除去して、より高い細胞密度の組成物の精製を可能にする。従って、本発明の一部の実施形態は、高細胞密度の組成物中に存在する生体高分子を単離する方法に関する。「高細胞密度」という用語は、通常、哺乳類細胞の場合、約１×１０５〜３．５×１０７、約１．０×１０６〜約１．０×１０７、または約５．０×１０６〜約９．０×１０６の細胞／ｍｌをいう。もちろん、当業者は、種々の細胞が伝統的に異なる細胞密度で増殖することを認識する。従って、一部の実施形態では、「高細胞密度」細胞培養物は、その細胞系について従来行われている密度よりも、より高い密度で細胞を含有する細胞培養物をいう。
【００５４】
本発明の一部の実施形態では、本発明の方法は、濾過プロセスのロバスト性を増大させる方法に関する。前記方法は、（ａ）組成物のｐＨを低下させること、（ｂ）組成物に二価カチオンを添加させること、および（ｃ）膜を通して組成物を濾過させることを含む。「ロバスト性を増大させる」という用語は、膜貫通圧、不純物濃度、または生成物の損失を増大させずに、所定のフィルターに対してより広い範囲の流速を用いる能力をいう。「ロバスト性を増大させる」という用語は、また、膜貫通圧、不純物濃度、または生成物の損失を増大させずに、より大きい容量、または所定のフィルターの収集原料のより高い細胞密度を濾過する能力をいう。
【００５５】
本発明の一部の実施形態では、方法は、濾過する前に、生体高分子（例えば収集原料）を含む組成物を浄化する方法に関する。前記方法は、（ａ）組成物のｐＨを低下させること、（ｂ）組成物に二価カチオンを添加させること、および（ｃ）組成物中の不純物から生体高分子を分離させることを含む。一部の実施形態では、組成物を浄化することは、濁度計（例えば、Ｈａｃｈ  ２１００ＡＮ濁度計（Ｈａｃｈ  Ｃｏ．，  Ｌｏｖｅｌａｎｄ，  ＣＯ））によって測定されるように、濁度の減少と相関する。
【００５６】
一部の実施形態では、本発明の方法は、遠心力（すなわち遠心分離）に組成物をさらすし、遠心分離が上清および沈澱物を形成することによって不純物から生体高分子を分離することを含む。一部の実施形態では、遠心分離は、実質的に不純物（細胞または細胞片）を含まない上清および細胞／細胞片が濃縮した沈澱物を形成する。遠心分離について言及するとき、「沈澱物」という用語は、遠心分離の間に沈澱して（またはペレット状になり）細胞／細胞片の塊を形成する組成物の画分をいう。「上清」という用語は、遠心分離の間に沈澱（またはペレット状）しない、組成物の画分、例えば、組成物中の水相にとどまり、実質的に無細胞である組成物の画分をいう。一部の実施形態では、遠心分離後、本発明の生体高分子は、実質的に上清に存在する（すなわち、組成物の液体画分に実質的に浮遊したままである）。一部の実施形態では、遠心分離後、本発明の生体高分子は、実質的に沈澱物中に存在する（すなわち、溶液から沈澱する、または遠心分離によって生ずるペレット中に存在する）。一部の実施形態では、密度勾配を用いて、不純物から生体高分子を分離する。従って、一部の実施形態では、遠心分離後に、生体高分子および不純物の両方は、異なる密度で、従って遠心分離装置内の異なる部位で、上清中に残る。
【００５７】
種々の遠心分離装置が使用できる。一部の実施形態では、遠心分離は、分離板型遠心分離機によって達成されることができる。一部の実施形態では、「ベンチ規模」の濾過を用いて、工業規模濾過の適切な条件を予測することができる。遠心分離の変数を変えて、目的の生体高分子の最適な単離を達成することができる。例えば、一部の実施形態では、種々の回転速度または流速を用いて、生体高分子回収の品質、および／または生体高分子回収の量を上げることができる。
【００５８】
本発明の方法の手順は、種々の順番で順序付けることが可能である。例えば、本発明の一部の実施形態では、ｐＨを下げることおよび二価カチオンを添加することは、不純物から生体高分子を分離することの前に行う。一部の実施形態では、収集媒体のｐＨを最初に調整して、二価カチオンを添加して、次いで生体高分子を不純物から分離する。他の実施形態では、二価カチオンを最初に添加して、組成物のｐＨを調整し、次いで生体高分子を分離する。一部の実施形態では、１つ以上の精製手段が（ａ）ｐＨを低下させること、（ｂ）二価カチオンを添加させること、または（ｃ）不純物から生体高分子を分離することのいずれかの間で起こることもある。あるいは、本発明の方法の手順（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）は、連続的（例えば、付加的な精製手段が手順（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の間に起こらない）であり得る。しかし、手順（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が連続的であるとき、付加的な精製手段は、手順（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の前もしくは後に起こり得る。
【００５９】
本発明の一部の実施形態は、生体高分子および不純物を含む組成物中の生体高分子を単離する間、浄化操作のロバスト性を向上させる方法に関し、前記方法は、（ａ）組成物のｐＨを低下させること、（ｂ）不純物が凝集することを可能にすること、（ｃ）組成物に二価カチオンを添加すること、および（ｄ）組成物中の不純物から生体高分子を分離することを含む。「操作のロバスト性」という用語は、所定（例えばフィルター径）の分離装置のためのより幅広い種類の細胞負荷を処理する単離操作（例えば濾過プロセス）の能力をいう。一部の実施形態では、ｐＨを低下させることは、不純物（例えば細胞片等）によるフィルター膜の付着物を逆行させ、従って、より高い体積負荷の下でより高い処理体積量によって濾過が操作されることを可能にする。
【実施例】
【００６０】
本発明を、具体的な実施例を通して、より詳細に説明する。以下の実施例を、例示を目的として提示し、および任意の方法によっても本発明を限定することを意図しない。当業者は、本発明によって別の実施形態をもたらすために、変更または修飾され得る種々の非重大パラメータを容易に認識する。
（実施例１）
細胞の綿状沈澱に対するｐＨの効果を、種々のｐＨレベルで、培養細胞の粒子径分布を比較することによって調べた。細胞培養液を、２つのバイオリアクターから収集し、次いで３つの異なる群（１つの対照群、および２つの実験群）に分けた。実験群を、２５％酢酸を用いておおよそｐＨ４．５または５．７５に調整した。対照群は、おおよそｐＨ７．１の未調整のままにした。次いで、各群の試料を、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ  ＩＩＩ  （Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，  ＣＡ）を使用して分析し、平均径を決定した。結果を図１に示す。
【００６１】
実験の結果は、５．７５未満のｐＨで、直径２．５μｍ未満の粒子が明らかに減少し、２．５〜６．０μｍの粒子集団が増加することを示す。
（実施例２）
細胞の綿状沈澱に対するｐＨ変化の効果を、種々のｐＨレベルで、Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅを用いて細胞を染色し、次いで着色した細胞をＣＥＤＥＸ細胞分析装置（Ｆｌｏｎａｍｉｃｓ，  Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）で分析することによって調べた。実施例１に記述するように、細胞培養液を２つのバイオリアクターから収集し、次いで３つの異なる群（１つの対照群、および２つの実験群）に分けた。実験群を、２５％酢酸を用いておおよそｐＨ４．５および５．７５に調整した。対照群は、おおよそｐＨ７．１の未調整のままにした。次いでＴＢ染料液を添加し、拡大像を使用して分析した。結果を図２に示す。
【００６２】
ＴＢ色素は、浸透して、細胞内タンパク質を着色することによって死細胞を着色した。ｐＨ４．５０で細胞を提示したデータは、ｐＨ７．００および５．７５のデータと比較して、単位面積あたりより多くの着色された微粒子を示している。これは、ＴＢが死細胞を着色しただけでなく、同様の大きさの他のタンパク質集合体も着色することを示唆する。この観察は、タンパク質の沈澱および綿状沈澱が低いｐＨで起こるという仮説をさらに支持する。
（実施例３）
上清の濁度に対するｐＨ変化の効果を決定した。細胞培養物を、種々のアリコートに分け、次いでｐＨ４．２５、４．５、４．７５、５．０、５．２５、５．５、６．０に調整した、または未調整（ｐＨ７．１）のままにした。次いで、沈降速度実験を行い、結果として生じる上清の濁度を測定した。結果を図３に示す。
【００６３】
実験の結果は、上清の濁度がｐＨレベルの増加とともに増加することを示す。これは、沈降速度実験の間、低いｐＨ範囲で細胞が凝集し、除去されることを示唆する。
（実施例４）
ＩｇＧ１およびＩｇＧ４クラスのモノクローナル抗体を、組換えチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）またはマウス（ＮＳＯ）の細胞発酵によって生成した。Ｍａｓｔｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋのバイアルを解凍し、次いで接種調製で、種々の大きさのシェーカーフラスコおよびバイオリアクターを介して伸長させた。接種調製および生成バイオリアクター培地を、無動物成分を用いて作製した。温度、ｐＨ、および溶存酸素レベルを、記述したすべてのバイオリアクターで制御した。
（実施例５）
実施例４の収集原料は、（ａ）ｐＨ未調整、または（ｂ）ｐＨ４．７に調整したいずれかであった。調整した（または未調整の）収集原料を、次いで、一定の再循環および透過流速で、タンジェンシャルフロー濾過モードでマイクロフィルターに通過させた。濾過プロセスの間、ｐＨ調整した収集原料およびｐＨ未調整の収集原料の両方に対する膜貫通圧を算出した（図１１を参照）。ＩｇＧ１クラス抗体およびＩｇＧ４クラス抗体に対する膜貫通圧の測定結果を、図１２および図１３にそれぞれ示す。両図は、収集原料をフィルターに適用するとき、収集原料をｐＨ４．７〜５．３の範囲に低下させると、比較的一定の低い膜貫通圧をもたらすのに対して、ｐＨを調整しない収集原料をフィルターに適用すると、急増する膜貫通圧をもたらすことを示している。
【００６４】
特定の理論に制約されることなく、証拠は、ｐＨを低下させることで細胞物質の綿状沈澱の増加をもたらし、マイクロフィルター上のポアを妨げる可能性が少ない大きい粒子をもたらすことを示唆する。浄化を、微多孔膜を含有する精密濾過モジュール内に収集原料を方向付ける交差流モードで行った。無細胞透過物がフィルター膜を通過して収集される間、保持される細胞および細胞片を保持し、原料容器に再循環させてもどした（図１０の模式図を参照）。透過物を一定流速でシステムから引出し、次いで容器に収集した。高濃度の細胞物質が薄膜フィルター表面に付着する結果、最初の高密度の生物由来物質を有する細胞培養物を含有するバイオリアクターから所望のタンパク質を精密濾過によって分離することで、マイクロフィルターを通過する膜貫通圧低下の増加をもたらした。精密濾過操作のロバスト性を増大させ、透過でタンパク質回収を増大させるためにフィルター膜貫通圧の低下を減少させるために、収集原料のｐＨを、精密濾過の前に４．０〜５．０まで低下させた。ｐＨを低下させることにより、不純物（例えばＤＮＡ）の沈澱とともに大型細胞および細胞片の綿状沈澱を引き起こした。大粒子への不純物（細胞、細胞片、およびＤＮＡ）の綿状沈澱は、フィルター表面近くの組成物の物質移動を向上させ、従って、所定の透過流量または流速でフィルターを横切る膜貫通圧の低下を推進する力を減少させる（図３および４を参照）。
（実施例６）
宿主細胞タンパク質およびＤＮＡの除去に対する、ｐＨレベルの低下の効果を調べた。図５は、ｐＨレベルを低下させると、溶液からの宿主細胞タンパク質およびＤＮＡの両除去を増大させることを示す。細胞培養物を、様々なアリコートに分け、次いで各アリコートからの試料のｐＨを調整した。次いで、試料を遠心分離して、宿主細胞タンパク質またはＤＮＡの量を決定した。データは、ＤＮＡが５．０未満のｐＨで９０％を超えて減少し、宿主細胞タンパク質が５．０未満のｐＨで５０％を超えて減少したことを示す。これらの不純物は溶液から沈澱し、遠心分離によって除去される可能性がある。
（実施例７）
ｐＨを低下させることによる、２つのモノクローナル抗体の品質および回収に対する効果を調べた。図６は、両モノクローナル抗体のタンパク質回収がｐＨ６．０以下で５％〜１０％減少し、およびｐＨ４．５以下で抗体Ａが大きく減少したことを示す。タンパク質回収におけるこの著しい減少を、集合体および酸性異型のレベルを増加させることで達成した。低いｐＨで分子の不安定性を示す、単量体および主要なアイソフォームのレベルを低下させることで、本明細書に示した。抗体Ｂは、観察したｐＨの範囲にわたり、著しい分解を示さなかった。
（実施例８）
中空繊維の精密濾過（ＭＦ）の効率に対する、ｐＨを低下させる効果を調べた。図７は、精密濾過の収集生成物の品質および不純物の結果が、図５の結果と一致したことを示す。宿主細胞タンパク質およびＤＮＡが５．０未満のｐＨで、それぞれ５０％および９０％減少した。浄化した濁度のレベルは、精密濾過ユニットの操作に関連した濾過プロセスのため、図３の最初の実験よりも低かった。それでも、結果は、低いｐＨレベルに調節した細胞培養で、濁度において２倍以上の減少を示している。
【００６５】
ベンチ規模のＭＦ収率の結果を、図８に示す。最初の条件付け実験で見られたように、結果は、ｐＨ４．５以下で収率の損失を示している。さらに、ＭＦプロセスの間の膜付着物のため、５．５もしくはそれ以上のｐＨで、実質的な損失が観察された。低いｐＨレベルに調節した細胞培養によってもたらされた綿状沈澱の効果は、この付着物を減少させる。
（実施例９）
モノクローナル抗体の収集に対する、ｐＨを低下させる効果を調べた。抗体Ｂの遠心分離の結果も、図３および図５の浄化結果と一致した。ベンチ規模の遠心分離の操作の全収率数は、条件付けおよび遠心分離ユニットの操作による付加的な生成物の損失のために、最初の浄化実験よりも低かった。また、ベンチ規模の遠心分離と、パイロット規模の遠心分離とのせん断差のために、濁度レベルは、浄化実験よりも高かった。しかし、これらの両プロセスの結果は、浄化実験の間に見られたものと同じ傾向を示している。遠心分離のデータポイントにおけるばらつきの増加は、遠心分離の異なる作動条件に起因した。
（実施例１０）
実施例４の収集原料の濁度に対する、ｐＨレベルを低下させる効果を調べた。ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、またはＮａＣｌのいずれかを含有する収集原料のｐＨは、（１）未調整（ｐＨ６．９〜７．２）、（２）ｐＨ６．０に調整、（３）ｐＨ５．０に調整、（４）ｐＨ５．０に調整、（５）ｐＨ４．５に調整、または（６）ｐＨ４．０に調整のいずれかであった。２５％ｖ／ｖ酢酸を用いて、収集原料のアリコートを特定のｐＨに調整し、約２〜２４時間の間、綿状沈澱および細胞の塊を沈降させた。次いで濁度計を使用して、澄んだ上清の濁度（透明度）を測定することによって、データを作成した。調整した収集物質のｐＨが低下するにつれて、上清濁度の一般的な減少が起こり、ｐＨ値が低下するとより澄んだ上清を示す（図４を参照）。濁度におけるこの減少は、低ｐＨレベルで起こる高程度の細胞綿状沈澱の結果であり、細胞の塊のより急速な沈降をもたらした。綿状沈澱および向上した沈降によって、さらに効率的な精密濾過の操作性能がもたらされた（図１２または図１３を参照）。
（実施例１１）
収集原料からのＤＮＡ混入物の回収に対する、ｐＨ調整の効果を、実施例４に説明するように収集原料を収集し、次いで（ａ）収集原料のｐＨを調整しない、または（ｂ）収集原料のｐＨを４．７まで低下させることで決定した。次いで、調整および未調整の収集原料を、２４時間沈降させた。試料を、澄んだ上清から収集して、ＤＮＡに対する検査を行った。無細胞収集に残存するＤＮＡの量を、定量ポリメラーゼ連鎖反応法（ＱＰＣＲ）によって決定した。図１５は、ｐＨを調整しなかった収集原料と比較して、ｐＨを４．７に調整した収集原料でのＤＮＡ混入物の減少が約１．５〜３ログであることを示す。
（実施例１２）
モノクローナル抗体（ＩｇＧ４）および融合タンパク質の回収に対する、ｐＨ調整の効果を、実施例４に説明するように収集原料を収集することで決定した。次いで、収集原料を、ｐＨ７．０、５．０、または４．０のいずれかに調整し、２〜２４時間の間沈降させた。試料を、澄んだ上清から収集して、タンパク質タイターに対する検査を行った。無細胞収集原料に存在する抗体または融合タンパク質の量を、次いで、タンパク質Ｇタイターアッセイによって決定した。図１４は、条件付き収集流れにおける生成物タンパク質タイターに対する、ｐＨ変化の効果を示す。ＩｇＧ４クラス抗体および融合タンパク質に関するデータを示す。両タンパク質型のデータは、ｐＨが７．０から４．０に低下するにつれて、タンパク質が著しく減少したことを示す。ｐＨに誘導された沈澱によるタンパク質損失量は、３％から５２％に及んだ。組成物のタンパク質濃度を決定する方法は、タンパク質Ｇ結合ＨＰＬＣ樹脂上の抗体または融合タンパク質の親和性捕捉に基づいた。
（実施例１３）
タンパク質に対する、ｐＨを調整した収集原料への二価カチオンの添加の効果を、１０ｍＭの種々の二価カチオンを収集原料に添加し、次いで前記収集原料のｐＨを５．０に低下させることによって、調べた。結果として生じた収集原料を、２〜２４時間の間、沈降させた。試料を、澄んだ上清から収集し、次いでタンパク質タイターに対する検査を行った。そのタイターを、対照実験（二価カチオンを持たない、ｐＨ５．０に調整した収集）と比較した。無細胞の収集原料に存在する抗体または融合タンパク質の量を、タンパク質Ｇタイターアッセイによって決定した。図１６は、何らイオンを添加しない対照の操作と比較して、二価カチオンを添加することによって、ほとんどの場合、可溶性抗体の損失が減少したことを示す。ｙ軸は、（カチオンで処理した濾過収集原料のタイター）を（カチンで処理しなかった濾過収集原料のタイター）で割ることで表す、規準化したタイターを示す。
（実施例１４）
ｐＨを調整した収集原料に添加する二価カチオンの種々の濃度の効果を調べた。具体的には、ＣｏＣｌ２（またはＣｏ２＋）を、ｐＨを調整した収集原料に、最終濃度の１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、または２０ｍＭを添加した。次いで、ｐＨを調整した収集原料から回収した生成物の量を、タンパク質Ｇを用いてアッセイし、生成物回収に対する、ＣｏＣｌ２の種々の濃度の効果を決定した。図１７は、ｐＨ調整後、約１０ｍＭのＣｏＣｌ２が生成物の損失を最小化する（すなわち、生成物の収率回収を最大化する）のに十分であったことを示す。
（実施離１５）
タンパク質の濾過拒絶に対する、本発明の方法の効果を、濃度相およびダイアフィルトレーション相の間に微多孔膜を通して処理される累積量に応じて調べた。タンパク質の濾過拒絶の係数を、種々の時間間隔で未透過物タイターおよび透過物タイターを測定し、タンパク質のフィルター拒絶の係数を、式Ｒ＝（１−［ＣＰ／ＣＲ］）を用いて算出することで、決定した。データは、４通りの別々のＭＦ実験を示す。すなわち、白三角形および黒三角形によって示される操作は、１０ｍＭのＣｏＣｌ２の添加を含む、ｐＨ５．０に調整した収集流れを表し、白丸および黒丸によって示される操作は、ＣｏＣｌ２が存在しない未調整の収集流れを表す。データは、研究したすべての負荷率に関して、１０ｍＭのＣｏＣｌ２を含有するｐＨを調整した収集原料に対してＭＦ保持係数が低いことを示している。例えば、６０〜７０Ｌ／ｍ２の典型的な大規模負荷率で算出した拒絶係数は、ｐＨを調整しなかった操作に対するほぼ完全な拒絶（９０〜１００％）と比較すると、約３０％である。また、図６に示すのは、各精密濾過の操作からの全タンパク質回収である。Ｃｏ２＋二価イオンを含有する操作は、未調整収集原料を用いる操作による２０％収率損失と比較すると所望のタンパク質の完全回収を示す。
【００６６】
タンパク質の濾過拒絶に対する、本発明の方法の効果を、濃度相およびダイアフィルトレーション相の間に、微多孔膜を通して処理される累積量に応じて調べた。タンパク質の濾過拒絶の係数を、種々の時間間隔で未透過物タイターおよび透過物タイターを測定し、タンパク質の濾過拒絶の係数を、式Ｒ＝（１−［ＣＰ／ＣＲ］）を用いて算出することで、決定した。図１８に示すデータは、４通りの別々の精密濾過実験からである。すなわち、ＣおよびＤでは、ｐＨ調整の間、１０ｍＭのＣｏＣｌ２を収集流れに添加し、ＡおよびＢでは、ＣｏＣｌ２を添加しなかった。収集原料のすべてをｐＨ５．０まで低下させた。図１８は、研究したすべての負荷率に関して、１０ｍＭのＣｏＣｌ２でｐＨを調整した収集原料に対して精密濾過保持係数が低いことを示している。例えば、６０〜７０Ｌ／ｍ２の典型的な大規模負荷率で、精密濾過の操作ＣおよびＤに対して算出した拒絶係数は、操作ＡおよびＢに対するほぼ完全な拒絶（９０〜１００％）と比較すると、約３０％であった。また、図１８は、各精密濾過の操作からの全タンパク質回収を示す。Ｃｏ２＋二価イオンを含有する操作（ＣおよびＤ）は、所望のタンパク質の完全に近い回収を示すのに対して、Ｃｏ２＋を添加しなかった操作（ＡおよびＢ）は、２０％収率損失をもたらした。
【００６７】
本発明は、記述した特定の実施形態によって範囲を限定されるものではなく、これらの実施形態は、本発明の個別の態様の単一の説明として意図し、および機能的に同等である任意の組成物または方法でも、本発明の範囲内である。実際に、本明細書に示し、説明したものに加えて、本発明の種々の修飾は、前述の説明および添付する図面から当業者にとって明らかになる。そのような修飾が添付する特許請求の範囲内に収まることを意図する。
【００６８】
本明細書で記述する刊行物および特許出願のすべては、それぞれ個別の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参考として援用されることを示されるかのように同じ程度まで、参考として本明細書で援用する。
【図１】
0005732196.tif 000002
【図２】
0005732196.tif 000003
【図３】
0005732196.tif 000004
【図４】
0005732196.tif 000005
【図５】
0005732196.tif 000006
【図６】
0005732196.tif 000007
【図７】
0005732196.tif 000008
【図８】
0005732196.tif 000009
【図９】
0005732196.tif 000010
【図１０】
0005732196.tif 000011
【図１１】
0005732196.tif 000012
【図１２】
0005732196.tif 000013
【図１３】
0005732196.tif 000014
【図１４】
0005732196.tif 000015
【図１５】
0005732196.tif 000016
【図１６】
0005732196.tif 000017
【図１７】
0005732196.tif 000018
【図１８】
0005732196.tif 000019