(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に含まれる標的物質を検出するものであって、
基板と、
前記基板の表面において平面状に形成された２つの金属電極と、
前記基板の前記表面において２つの前記金属電極の間に形成され、一定量の前記標的物質を固定し、前記標的物質と特異的に反応する既知量の標的物質結合物質と前記試料との混合物と接触させられる標的物質固定部とを含み、
固定された前記標的物質と前記標的物質結合物質とで形成される、第１の固定された複合体の量と相関し、かつ前記標的物質固定部における表面状態の変化に相関する電気的な物理量を出力し、
前記標的物質固定部は、一定量の前記標的物質を固定したカーボンナノチューブを含み、前記カーボンナノチューブに固定された前記標的物質の大きさは、前記カーボンナノチューブのデバイ長よりも小さく、
前記カーボンナノチューブは、複数であって不規則な網目状に配置されるとともに、２つの前記金属電極の間、及び２つの前記金属電極の表面の一部に亘って配置されていることを特徴とする、標的物質検出バイオセンサー。
【請求項２】
前記混合物中の前記標的物質は、前記標的物質結合物質と複合体を形成していることを特徴とする、請求項１に記載の標的物質検出バイオセンサー。
【請求項３】
前記第１の固定された複合体と、前記第１の固定された複合体と特異的に反応する複合体結合物質とで形成される、第２の固定された複合体の量と相関する物理量を出力する、請求項１または請求項２に記載の標的物質検出バイオセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的物質を検出するバイオセンサーおよび標的物質を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微量の低分子物質や生体由来物質等を検出する方法として、いわゆるＥＬＩＳＡ法が知られている。例えば、非特許文献１には、ヒト唾液中のＩｇＡをペルオキシダーゼ酵素標識した既知量の抗体と反応させ、次いで未反応の抗体と既知量の固定化ＩｇＡとを反応させ、固定化ＩｇＡ−抗体の量を、テトラメチルベンジジンと標識抗体との反応によって得られる発色の強度によって検出する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】２０１１年１０月７日検索、http://www.salimetrics.com/assets/documents/products-and-services/salivary-assays/SIgA%20Kit%20Insert.pdf
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、非特許文献１の技術は、検出すべき標的物質と反応する抗体を、酵素によって標識する必要がある。また、酵素と基質とを反応させるための時間が必要である。さらに、操作が煩雑であるために、熟練した操作者が必要である。
【０００５】
本発明は、検出すべき標的物質と反応する標的物質結合物質を酵素標識する必要がなく、短時間で簡単に標的物質を検出できる、標的物質検出バイオセンサーおよび標的物質検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の標的物質検出バイオセンサーは、試料に含まれる標的物質を検出するものであって、基板と、前記基板の表面において平面状に形成された２つの金属電極と、前記基板の前記表面において２つの前記金属電極の間に形成され、一定量の前記標的物質を固定し、前記標的物質と特異的に反応する既知量の標的物質結合物質と前記試料との混合物と接触させられる標的物質固定部とを含み、固定された前記標的物質と前記標的物質結合物質とで形成される、第１の固定された複合体の量と相関し、かつ前記標的物質固定部における表面状態の変化に相関する電気的な物理量を出力し、前記標的物質固定部は、一定量の前記標的物質を固定したカーボンナノチューブを含み、前記カーボンナノチューブは、複数であって不規則な網目状に配置されるとともに、２つの前記金属電極の間、及び２つの前記金属電極の表面の一部に亘って配置されていることを特徴とする。これにより、検出すべき標的物質と反応する標的物質結合物質を酵素標識する必要がなく、短時間で簡単に標的物質を検出できる。また、カーボンナノチューブを不規則な網目状に配置することにより、簡易に標的物質検出バイオセンサーを作製でき、その結果簡易に標的物質を検出することができる。
【０００７】
本発明の標的物質検出バイオセンサーは、前記混合物中の前記標的物質が、前記標的物質結合物質と複合体を形成していることが好ましい。
【０００８】
また本発明の標的物質検出バイオセンサーは、前記第１の固定された複合体と、前記第１の固定された複合体と特異的に反応する複合体結合物質とで形成される、第２の固定された複合体の量と相関する物理量を出力することが好ましい。これにより、標的物質検出バイオセンサーは、検出感度が上昇する。
【０００９】
また本発明の標的物質検出バイオセンサーは、前記標的物質固定部が、一定量の前記標的物質を固定したカーボンナノチューブを含み、前記物理量は、電気的な物理量であることが好ましい。
【００１０】
また本発明の標的物質検出バイオセンサーは、前記カーボンナノチューブが、複数であって不規則な網目状に配置されていることが好ましい。これにより、簡易に標的物質検出バイオセンサーを作製でき、その結果簡易に標的物質を検出することができる。
【００１１】
本発明の標的物質検出バイオセンサーは、試料に含まれる標的物質を検出するものであって、一定量の前記標的物質を固定し、前記標的物質と特異的に反応する既知量の標的物質結合物質と前記試料との混合物と接触させられる標的物質固定部を含み、固定された前記標的物質と前記標的物質結合物質とで形成される、第１の固定された複合体の量と相関し、かつ前記標的物質固定部における表面状態の変化に相関する光学的な物理量を出力し、前記標的物質固定部は、一定量の前記標的物質を固定したフォトニック結晶を含み、前記標的物質固定部に前記標的物質を固定させる前における反射光の強度を第１の強度とし、前記標的物質固定部に前記標的物質を固定したときの反射光の強度を第２の強度とし、前記標的物質固定部に前記第１の固定された複合体が形成されたときの反射光の強度を第３の強度としたときに、前記試料に含まれる前記標的物質の量は、前記第３の強度を前記第１の強度で除した値と、前記第２の強度を前記第１の強度で除した値との差の絶対値に基づいて求められることを特徴とする。これにより、検出すべき標的物質と反応する標的物質結合物質を酵素標識する必要がなく、短時間で簡単に標的物質を検出できる。
【００１２】
また本発明の標的物質検出バイオセンサーは、前記標的物質固定部が、一定量の前記標的物質を固定したフォトニック結晶を含むことが好ましい。
【００１３】
また本発明の標的物質検出バイオセンサーは、前記物理量が、光の反射率が極値となる波長のシフト量であることが好ましい。
【００１４】
また本発明の標的物質検出バイオセンサーは、前記物理量が、極値である光の反射率の変化量であることが好ましい。
【００１５】
本発明の標的物質検出方法は、一定量の標的物質が固定された標的物質固定部を含む標的物質検出バイオセンサーにより試料中の標的物質を検出する方法であって、前記標的物質と特異的に反応する既知量の標的物質結合物質と前記試料とを混合して混合物とするステップと、前記標的物質固定部に、前記混合物を接触させるステップと、前記標的物質検出バイオセンサーから、固定された前記標的物質と前記標的物質結合物質とで形成される、第１の固定された複合体の量と相関し、かつ前記標的物質固定部における表面状態の変化に相関する光学的な物理量を出力させるステップと、を含み、前記標的物質固定部は、一定量の前記標的物質を固定したフォトニック結晶を含み、前記標的物質固定部に前記標的物質を固定させる前における反射光の強度を第１の強度とし、前記標的物質固定部に前記標的物質を固定したときの反射光の強度を第２の強度とし、前記標的物質固定部に前記第１の固定された複合体が形成されたときの反射光の強度を第３の強度としたときに、前記試料に含まれる前記標的物質の量は、前記第３の強度を前記第１の強度で除した値と、前記第２の強度を前記第１の強度で除した値との差の絶対値に基づいて求められることを特徴とする。これにより、検出すべき標的物質と反応する標的物質結合物質を酵素標識する必要がなく、短時間で簡単に標的物質を検出できる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の標的物質検出バイオセンサーによれば、検出すべき標的物質と反応する標的物質結合物質を酵素標識する必要がなく、短時間で簡単に標的物質を検出できる。また、本発明の標的物質検出方法によれば、検出すべき標的物質と反応する標的物質結合物質を酵素標識する必要がなく、短時間で簡単に標的物質を検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１−１】図１−１は、標的物質検出バイオセンサーによる標的物質検出の原理を説明する図である。
【図１−２】図１−２は、標的物質検出バイオセンサーによる標的物質検出の原理を説明する図である。
【図１−３】図１−３は、標的物質検出バイオセンサーにより試料中の標的物質を検出する方法のフローチャートである。
【図２】図２は、実施形態２に係る標的物質検出バイオセンサーの模式図である。
【図３】図３は、実施形態２に係る標的物質検出バイオセンサーと比較例のバイオセンサーとの比較を示すグラフである。
【図４−１】図４−１は、実施形態３に係る標的物質検出バイオセンサーの模式図である。
【図４−２】図４−２は、フォトニック結晶の平面図である。
【図４−３】図４−３は、図４−２におけるＡ−Ａ断面を示す図である。
【図５】図５は、実施形態３に係る標的物質検出バイオセンサーと比較例のバイオセンサーとの比較を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、この発明につき図面を参照しつつ詳細に説明する。なお、この発明を実施するための形態（以下、実施形態という）によりこの発明が限定されるものではない。また、下記実施形態における構成要素には、当業者が容易に想定できるもの、実質的に同一のものが含まれる。また、同一機能を有する構成要素には同一の符号を付し、重複する説明は省略する。
【００１９】
［実施形態１］
まず、図１−１および図１−２を用いて標的物質検出の原理を説明する。図１−１および図１−２は、本実施形態による標的物質検出バイオセンサーによる標的物質検出の原理を説明する図である。この原理およびこの原理に関する説明は、後述する実施形態にも同様に適用することができる。
【００２０】
なお、標的物質検出バイオセンサー１は、標的物質２の有無を検出するもののみに限定されず、標的物質２を定量するものであってもよい。標的物質検出バイオセンサー１は、一定量の標的物質２を固定する標的物質固定部１０１を含む。
【００２１】
未知量Ｘの標的物質２を含む試料Ｓを定量するためには、まず検量線を作成する。既知量の標的物質２を含む複数の試料について、標的物質検出バイオセンサー１を用いて以下の手順にしたがって対応する物理量を出力させ、標的物質２の量と出力される物理量との関係を表す関数を求め、検量線とする。
【００２２】
試料Ｓに標的物質２が含まれているか否かを検出するためには、検量線を作成する必要はなく、標的物質２を含まない試料について以下の手順にしたがって対応する物理量を標的物質検出バイオセンサー１に出力させ、試料Ｓの測定により出力された物理量を、標的物質２を含まない試料の物理量と比較することによって検出することができる。
【００２３】
未知量Ｘの標的物質２（例えば抗原）を含む試料Ｓを、必要に応じて前処理する。次いで試料Ｓを、少なくとも標的物質２と特異的に反応する既知量Ａａの標的物質結合物質３（例えば、レセプター、抗体、一次抗体）と混合する。標的物質固定部１０１に接触させる前に、標的物質２は標的物質結合物質３と複合体４ａを形成していることが好ましい。複合体４ａを確実に形成させるために、混合物Ｍを所定の時間、所定の温度条件で温置することが好ましい。次いで、混合物Ｍを、一定量の標的物質２が固定された標的物質固定部１０１に接触させる。標的物質２と複合体４ａを形成していない標的物質結合物質３は、標的物質固定部１０１に固定された標的物質２と複合体４ｂ（第１の固定された複合体）を形成する。必要に応じて、標的物質固定部１０１を洗浄して、第１の固定された複合体４ｂ以外の複合体４ａを除去する。次いで、標的物質検出バイオセンサー１から、第１の固定された複合体４ｂの量Ｃａと相関する物理量を出力させ、第１の固定された複合体４ｂの量Ｃａを測定する。すなわち、試料Ｓ中の標的物質２と複合体４ａを形成しなかった標的物質結合物質３の量（Ａａ−Ｘ）を測定する。標的物質結合物質３の量Ａａは既知であり、Ｘ＝Ａａ−Ｃａより、試料Ｓ中の標的物質２の量Ｘが測定できることになる。
【００２４】
ただし、各物質の量は、物質の分子数に基づく量であり、例えば単位はｍｏｌである。一分子の標的物質２および一分子の標的物質結合物質３から一分子の複合体（４ａ，４ｂ）が構成されるとする。試料Ｓに含まれる標的物質２の量Ｘが微量である場合でも、測定する量はＡａ−ＸであってＸと比較して微量ではないために、標的物質２を感度よく測定することができる。
【００２５】
試料Ｓ中の標的物質２の量と、出力される物理量との関係を表す関数が得られるならば、標的物質２と標的物質結合物質３との具体的な結合様式が判明していなくとも標的物質２の量を測定することができる。例えば、複数の標的物質２および一分子の標的物質結合物質３から一分子の複合体が構成される場合であっても、試料Ｓ中の標的物質２の量を測定することができる。
【００２６】
ここで、標的物質結合物質３の量Ａａが、試料Ｓに含まれる標的物質２より十分に多くなければ、標的物質結合物質３は試料Ｓに含まれる標的物質２とすべて反応してしまうので、固定された標的物質２と複合体４ｂを形成することができない。その結果、試料Ｓ中の標的物質２を直接定量することができない。この場合は、試料Ｓを適宜希釈して希釈液中の標的物質２を定量することにより、試料Ｓ中の標的物質２を定量することができる。
【００２７】
標的物質固定部１０１に固定される標的物質２の量は一定量である。これにより、固定される標的物質２と標的物質結合物質３とが複合体４ｂを形成した場合に、形成した複合体４ｂの量と相関する物理量を、標的物質検出バイオセンサー１が出力できる。固定される標的物質２の一定量は、適宜変更してもよく、例えば、試料Ｓに含まれる標的物質２の量の範囲によって最適な量に設定することができる。標的物質固定部１０１に固定された標的物質２の量は、一定量であれば、具体的な量が明らかでなくともよい。
【００２８】
標的物質固定部１０１に固定される標的物質２の量は、一定量であるので、あらかじめ一つの標的物質検出バイオセンサー１について検量線を作成しておけば、標的物質検出バイオセンサー１ごとに検量線を作成しなくてもよい。すなわち、標的物質固定部１０１に固定される標的物質２の量が一定量である、複数の標的物質検出バイオセンサー１の間で検量線を共用することができる。
【００２９】
標的物質検出バイオセンサー１は、第１の固定された複合体４ｂと特異的に反応する複合体結合物質５とで形成される、第２の固定された複合体６の量と相関する物理量を出力するものであってもよい。標的物質検出バイオセンサー１が、このような物理量を出力するものである場合には、標的物質２の検出は、以下のように行うことができる。
【００３０】
標的物質固定部１０１に、第１の固定された複合体４ｂが形成された後、第１の固定された複合体４ｂと特異的に反応する複合体結合物質５（例えば二次抗体）であって第１の固定された複合体４ｂより過剰である量を標的物質固定部１０１に接触させて、第１の固定された複合体４ｂをすべて第２の固定された複合体６に変換する。次いで、標的物質検出バイオセンサー１に、第２の固定された複合体６の量と相関する物理量を出力させることによって、第２の固定された複合体６を定量する。第２の固定された複合体６の量は第１の固定された複合体４ｂと同一であるから、第１の固定された複合体４ｂが定量できることになる。
【００３１】
このように、標的物質検出バイオセンサー１が、第２の固定された複合体６の量と相関する物理量を出力できることで、標的物質固定部１０１の表面状態におけるより大きい変化が検出できるようになる。したがって、標的物質検出バイオセンサー１は、第２の固定された複合体６の量と相関する物理量を出力できない標的物質検出バイオセンサーと比較して感度が大きくなる。以上の説明は、本実施形態以降に記載される実施形態にも適用される。
【００３２】
（標的物質）
標的物質２とは、検出する対象物であって、低分子、タンパク質などの高分子、オリゴマーのいずれであってもよい。また、単分子に限定されず、複数の分子からなる複合体であってもよい。標的物質２として、例えば、生体内に存在する、生体活性物質が挙げられ、なかでも、コルチゾールが好ましい。コルチゾールとは分子量３６２ｇ／ｍｏｌの低分子物質であり、人間がストレスを感じると唾液中のコルチゾール濃度が増加するため、人間が感じているストレスの度合いを評価する物質として注目されている。コルチゾールを標的物質としてその濃度を測定すれば、例えば、ヒトの唾液中のコルチゾールの濃度を測定することで、ストレスの度合いを評価することができる。
【００３３】
（標的物質結合物質）
標的物質結合物質３とは、標的物質２と特異的に反応する物質である。特異的に反応するとは、選択的に標的物質２と可逆的または不可逆的な結合をして複合体を形成することを意味し、化学反応に限定されない。また、特異的に反応する物質が標的物質２以外に存在していても構わない。試料Ｓ中に標的物質２の他に標的物質結合物質３と反応する物質があっても、親和性が標的物質２と比較して非常に小さい場合は、標的物質２を定量することができる。
【００３４】
標的物質結合物質３として、標的物質２を抗原とした抗体や、人工的に作製した抗体、アデニン、チミン、グアニン、シトシン等のＤＮＡを構成する物質から構成される分子、ペプチドを用いることができる。例えば、標的物質２がコルチゾールである場合は、標的物質結合物質３は、コルチゾール抗体であることが好ましい。
【００３５】
標的物質結合物質３を作製するには公知の方法を採用することができる。例えば、抗体は、血清法、ハイブリドーマ法、ファージディスプレイ法によって作製できる。ＤＮＡを構成する物質から構成される分子は、例えばＳＥＬＥＸ法（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment:試験管内人工進化法）により作製できる。ペプチドは、例えばファージディスプレイ法により作製できる。
【００３６】
標的物質結合物質３として、特定の抗原（例えばコルチゾール）とのみ結合する抗体（例えばコルチゾール抗体）を用いることにより、特定の抗原を検出する標的物質検出バイオセンサー１とすることができる。これは、標的物質固定部１０１の表面もしくは表面近傍で起こる抗原抗体反応を利用するものである。
【００３７】
標的物質結合物質３は、何らかの酵素・同位体により標識されている必要はない。しかし、酵素・同位体によって標識されていてもよい。
【００３８】
（複合体結合物質）
複合体結合物質５は、第１の固定された複合体４ｂと特異的に反応して、第２の固定された複合体６を形成するものである。第１の固定された複合体４ｂと特異的に反応するとは、選択的に第１の固定された複合体４ｂと可逆的または不可逆的な結合をして複合体を形成することを意味し、化学反応に限定されない。また、特異的に反応する物質が第１の固定された複合体４ｂ以外に存在していても構わない。
【００３９】
複合体結合物質５を作製するには公知の方法を採用することができる。例えば、抗体は、血清法、ハイブリドーマ法、ファージディスプレイ法によって作製できる。ＤＮＡを構成する物質から構成される分子は、例えばＳＥＬＥＸ法（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment:試験管内人工進化法）により作製できる。ペプチドは、例えばファージディスプレイ法により作製できる。複合体結合物質５は、何らかの酵素・同位体により標識されている必要はない。しかし、酵素・同位体によって標識されていてもよい。
【００４０】
（標的物質検出バイオセンサー）
標的物質検出バイオセンサー１は、試料Ｓに含まれる標的物質２を検出するものであり、標的物質固定部１０１を含んでいる。標的物質固定部１０１には、一定量の標的物質２が固定されている。標的物質固定部１０１の基礎１０２として、その表面状態の変化により出力する物理量が変化する物質が使用される。この基礎１０２となる物質の表面に、標的物質２が固定されている。基礎１０２となる物質として、例えば、カーボンナノチューブ、ナノワイヤ、表面プラズモン効果が得られる物質、フォトニック結晶が挙げられる。カーボンナノチューブを基礎１０２として使用する場合、一分子のみを用いることもできるし、複数のカーボンナノチューブを連結したり、不規則な網目状に配置したりして用いることもできる。
【００４１】
標的物質２を基礎１０２となる物質に固定するには、共有結合、化学吸着、物理吸着などの、化学的結合、物理的結合方法を、基礎１０２となる物質および標的物質２の性質に応じて適宜選択して行うことができる。
【００４２】
標的物質固定部１０１の表面には、試料Ｓと標的物質結合物質３との混合物Ｍが接触させられる。これにより、標的物質固定部１０１に固定された標的物質２と、標的物質結合物質３とが反応して、標的物質固定部１０１の表面に標的物質２と標的物質結合物質３との複合体（第１の固定された複合体）４ｂが固定される。その結果、標的物質固定部１０１における表面の状態が変化し、標的物質検出バイオセンサー１は、標的物質固定部１０１に固定された複合体４ｂの量と相関し、かつ標的物質固定部１０１における表面状態の変化に相関する物理量を出力することができる。
【００４３】
物理量として、電気的な物理量、光学的な物理量などが挙げられる。電気的な物理量として、電圧、電流、周波数、電気抵抗値、導電性などが挙げられる。光学的な物理量として、光の波長、光の強度、光の反射率、光の透過率などが挙げられる。
【００４４】
標的物質検出バイオセンサー１は、標的物質固定部１０１における表面状態の変化に相関する物理量を出力するものである。したがって、第１の固定された複合体４ｂが、他の物質を変化させ、変化後の物質が、その量に応じて物理量を変化させる場合は含まれない。例えば、いわゆるＥＬＩＳＡ法のように、第１の固定された複合体４ｂに酵素活性を持たせ、この酵素と反応する基質を加えた後に、変化後の基質の量と相関する物理量を測定することで、第１の固定された複合体４ｂの量を間接的に検出するものは含まれない。
【００４５】
また、相関するとは、第１の固定された複合体４ｂの増加に伴って、物理量が増加または減少するという関係であって、比例関係には限定されない。第１の固定された複合体４ｂの量と出力される物理量との関係を表す関数は、例えば、１次関数、２次関数、指数関数であってもよい。第１の固定された複合体４ｂの量と、出力される物理量との関係は、一次関数であるか、一次関数に近似できることが好ましい。このような関係であると、検量線を作成することが容易となる。
【００４６】
標的物質検出バイオセンサー１は、標的物質固定部１０１の他に、物理量を出力するための様々な要素を含むことができる。例えば、標的物質固定部１０１から電気的信号を取り出すための電極、電線などを含むことができる。また、試料溶液を保持するための試料保持部が形成されていてもよい。
【００４７】
本実施形態の標的物質検出バイオセンサー１によれば、標的物質結合物質３を酵素標識する必要がなく、短時間で簡便に標的物質２を検出することができる。
【００４８】
（標的物質検出バイオセンサーによる標的物質検出方法）
次に、標的物質検出バイオセンサー１により試料Ｓ中の標的物質２を検出する方法について述べる。図１−３は、標的物質検出バイオセンサー１により試料Ｓ中の標的物質２を検出する方法のフローチャートである。標的物質検出バイオセンサー１には、一定量の標的物質２が固定されている。試料Ｓと、既知量の標的物質結合物質３とを混合して混合物Ｍとする（ステップＳ１）。次いで、混合物Ｍを標的物質固定部１０１に接触させる（ステップＳ２）。次いで、標的物質検出バイオセンサー１から、物理量を出力させる（ステップＳ３）。ここで、出力させる物理量は、第１の固定された複合体４ｂの量と相関し、かつ標的物質固定部１０１における表面状態の変化に相関する物理量である。次いで、出力させた物理量に基づいて標的物質２を検出する（ステップＳ４）。本実施形態の標的物質検出方法によれば、標的物質結合物質３を酵素標識する必要がなく、短時間で簡便に標的物質２を検出することができる。
【００４９】
［実施形態２］
図２は、本実施形態に係る標的物質検出バイオセンサーの模式図である。標的物質検出バイオセンサー２００は、標的物質固定部２０１を含み、標的物質固定部２０１は基板２０４上に配置されている。標的物質固定部２０１は、基礎として、カーボンナノチューブ２０２を含む。カーボンナノチューブ２０２には一定量の標的物質２が固定されている。カーボンナノチューブ２０２は、複数であって、不規則な網目状に配置されている。また標的物質検出バイオセンサー２００は、標的物質固定部２０１と電気的に結合された少なくとも二つの電極２０３、２０３を含んでいる。二つの電極２０３、２０３は基板２０４上に配置されている。
【００５０】
一般に、カーボンナノチューブは比表面積が大きく、その表面で起こる反応を電気的信号変化で読み取ることができる。カーボンナノチューブのデバイ長は、水溶液中で３ｎｍ程度あるとされる。そのデバイ長以内の距離における反応は、カーボンナノチューブに大きな影響を及ぼす。例えば、標的物質２がコルチゾールであり、標的物質結合物質３が抗コルチゾール抗体であるとする。抗コルチゾール抗体のＩｇＧは、大きさが１０ｎｍ程度であり、コルチゾールは１ｎｍ程度の大きさである。抗原抗体反応が起こる場所は、本実施形態においては、カーボンナノチューブから、固定されたコルチゾールの大きさだけ距離が離れた場所であり、カーボンナノチューブからおよそ１ｎｍ程度離れた場所であると考えられる。したがって、カーボンナノチューブのデバイ長以下の場所で抗原抗体反応が起こると考えられ、この反応はカーボンナノチューブに大きな影響を及ぼすと考えられる。
【００５１】
一方、カーボンナノチューブに抗コルチゾール抗体を固定させた場合、抗原抗体反応が起こる場所は、カーボンナノチューブから、固定された抗コルチゾール抗体の大きさだけ距離が離れた場所であると考えられ、カーボンナノチューブからおよそ１０ｎｍ程度離れた場所であると考えられる。したがって、カーボンナノチューブのデバイ長を超えた場所で抗原抗体反応が起こると考えられ、この反応は、本実施形態における反応よりも、カーボンナノチューブに及ぼす影響が少ないと考えられる。
【００５２】
本実施形態のようにカーボンナノチューブ２０２に標的物質２を固定させることで、カーボンナノチューブ２０２に標的物質結合物質３を固定させた場合より大きな検出信号（物理量）を標的物質検出バイオセンサー２００に出力させることができる。
【００５３】
（カーボンナノチューブ）
カーボンナノチューブ２０２は、炭素原子により形成される円筒形の結晶である。カーボンナノチューブ２０２は、炭素原子のみにより形成されているもののほか、各種官能基が導入されているものであってもよい。カーボンナノチューブ２０２に各種官能基を導入するには、公知の方法を使用することができる。例えば、カーボンナノチューブ２０２に対し、フッ素化、アミノ化、カルボキシル化、アルキル化、１，３−双極子付加環化、ジアゾ化、求核反応、ナイトレン付加環化、Bingel反応、ジクロロカルベン付加を行うことによって、カーボンナノチューブ２０２に官能基を導入できる。
【００５４】
カーボンナノチューブ２０２に官能基を導入する場合、官能基はカルボキシル基またはアミノ基が好ましい。カーボンナノチューブ２０２にカルボキシル基またはアミノ基を導入すると、カーボンナノチューブ２０２の各種溶媒に対する溶解性または分散性が向上する。また、カーボンナノチューブ２０２にカルボキシル基またはアミノ基を導入すると、標的物質２が抗体等のタンパク質の場合は、カーボンナノチューブ２０２のカルボキシル基またはアミノ基と、タンパク質との間にアミド結合を形成することができるので、容易にカーボンナノチューブ２０２と標的物質２とを結合させることができる。
【００５５】
カーボンナノチューブ２０２は、単層であっても、多層であってもよい。また、カーボンナノチューブ２０２は、格子欠陥を有するものでもよく、有さないものでもよい。
【００５６】
カーボンナノチューブ２０２は、金属性カーボンナノチューブであっても半導体性カーボンナノチューブであってもよい。また、これらの任意の割合の混合物であってもよい。一般に、金属性カーボンナノチューブと半導体性カーボンナノチューブとを分離することは困難である。本実施形態に係るカーボンナノチューブ２０２として、金属性カーボンナノチューブと半導体性カーボンナノチューブとの任意の割合の混合物を使用できるので、分離工程を必要とせず安価に標的物質検出バイオセンサー２００を作製することができる。
【００５７】
カーボンナノチューブ２０２は公知の方法によって製造することができる。例えば、CVD法（Chemical Vapor Deposition:化学気相成長法)で製造することができる。CVD法の中でも、例えば、アルコールCVD法、HiPCO法、スーパーグロースCVD法等で製造することができる。アーク法、レーザーアブレーション法、DIPS法（Direct Injection Pyrolytic Synthesis）等の方法により製造することもできる。本実施形態に係るカーボンナノチューブ２０２は、どの製造方法で製造されたものでもよい。しかし、カーボンナノチューブの量産化が容易で、得られるカーボンナノチューブの純度が比較的高い点で、CVD法、特にスーパーグロースCVD法、または、アーク法で得られたカーボンナノチューブを使用することが好ましい。
【００５８】
カーボンナノチューブ２０２に標的物質２を固定させるには、共有結合、化学吸着、物理吸着などの、化学的結合、物理的結合方法を、標的物質２の性質に応じて適宜選択して行うことができる。例えば、カーボンナノチューブ２０２に標的物質２を所定時間接触させ、カーボンナノチューブ２０２に標的物質２を吸着させる方法、カーボンナノチューブ２０２に各種官能基を導入し、導入した官能基と標的物質２とを共有結合させる方法等の方法を採用することができる。
【００５９】
（電極）
電極２０３は、標的物質固定部２０１を挟むように、基板２０４の表面に２個設けられる。本実施形態のように、二つの電極２０３、２０３を標的物質固定部２０１と同一平面上に作製することができるが、基板２０４の厚さ方向に、第１の電極と、標的物質固定部２０１と、第２の電極とをこの順で積層することで電極を作製してもよい。
【００６０】
標的物質固定部２０１と電極２０３、２０３を一つの基板２０４に作製する他、プロセス条件や工程を勘案して、標的物質固定部２０１および電極を個別に作製した後、両者をボンディングしてもよい。例えば、基板にカーボンナノチューブを塗布し、これに電極が作製された基板を合わせることにより標的物質検出バイオセンサー２００を作製することができる。このとき、標的物質検出バイオセンサー２００は、少なくともカーボンナノチューブ２０２を含む標的物質固定部２０１が露出するように構成される。
【００６１】
電極２０３、２０３は、導電性のある材料で作製され、標的物質固定部２０１と電気的に接続される。電極２０３、２０３を作製する方法は特に限定されず、公知のＭＥＭＳ（Micro Electro Mechanical Systems）技術を用いることができる。例えば電極２０３をリソグラフィー法により作製することができる。本実施形態においては、一対の電極２０３、２０３で標的物質固定部２０１の両端を挟むようにしているが、電極の数は２個に限定されるものではない。すなわち、基板２０４は、少なくとも２個の電極を有していればよい。
【００６２】
（標的物質固定部）
以下、複数のカーボンナノチューブというときは、カーボンナノチューブ２０２の一分子ではなく、複数のカーボンナノチューブ２０２全体を指すものとする。複数のカーボンナノチューブ２０５は、一種類のカーボンナノチューブの集合であってもよく、複数種類のカーボンナノチューブの集合であってもよい。標的物質固定部２０１を作製するには、基板２０４上に電極２０３を作製してから複数のカーボンナノチューブ２０５を配置する方法、基板２０４上に電極２０３を作製する前に複数のカーボンナノチューブ２０５を配置する方法のいずれであってもよい。いずれの場合も、標的物質固定部２０１以外に付着したカーボンナノチューブは、酸素プラズマにより除去することが好ましい。
【００６３】
基板２０４上に複数のカーボンナノチューブ２０５を配置する方法には、例えば気相法および液相法が挙げられる。気相法では、複数のカーボンナノチューブ２０５を基板２０４に噴霧することにより基板２０４に塗布する。液相法では、複数のカーボンナノチューブ２０５を各種溶媒に分散または溶解させ、分散液または溶液をピペットやスポッター、スプレー等を用いて基板２０４に塗布する。塗布の均一性に優れているので、スプレーを用いて塗布することが好ましい。複数のカーボンナノチューブ２０５の分散液または溶液を基板２０４に塗布することで、基板２０４に複数のカーボンナノチューブ２０５が不規則な網目状に配置される。
【００６４】
液相法において用いられる各種溶媒として、例えば、純水、１，２−ジクロロベンゼン、１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、ジクロロエタン、ナノ純水、エタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール置換ポリチオフェン（ＨＦＩＰ−ＰＴ）、ポリ（３−へキシルチオフェン）（Ｐ３ＨＴ）、ｎ，ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、トルエン等が挙げられる。また、各種溶媒に界面活性剤を加えた溶液も、カーボンナノチューブを分散または溶解させる溶媒として使用できる。界面活性剤として、例えば、コラン酸ナトリウム、デオキシコラン酸ナトリウム（ＳＯＤ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＳＤＢＳ）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００が挙げられる。界面活性剤を加えた溶媒として、例えば、コラン酸ナトリウム水溶液、デオキシコラン酸ナトリウム（ＳＯＤ）水溶液、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液が挙げられる。
【００６５】
溶媒に加える分散助剤あるいは溶解助剤として、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ等の生体物質を用いることができ、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシル基等の親水基、および／または、アリール基、アルキル基等の疎水基が結合した各種多環式芳香族分子、側鎖にピレン等の多環式芳香族炭化水素を有する高分子、非共役系高分子、共役系高分子、これらのブロック共重合体等を用いることができる。
【００６６】
複数のカーボンナノチューブ２０５の分散または溶解のために溶媒に界面活性剤、分散助剤、または溶解助剤を加えない場合は、複数のカーボンナノチューブ２０５を基板２０４上に配置した後に溶媒を除去するだけでよく、界面活性剤、分散助剤、または溶解助剤を除去する必要がない点で有利である。
【００６７】
複数のカーボンナノチューブ２０５の分散または溶解のために溶媒に界面活性剤、分散助剤、または溶解助剤を加えると、これらを加えない場合と比較して短時間で複数のカーボンナノチューブ２０５を溶媒中に分散または溶解することができる。また、カーボンナノチューブ２０２の溶媒中の濃度を大きくすることができる。
【００６８】
複数のカーボンナノチューブ２０５を各種溶媒に分散または溶解する場合に、各種溶媒と複数のカーボンナノチューブ２０５との混合物に超音波を加えると、分散または溶解の速度が大きくなるので好ましい。各種溶媒と複数のカーボンナノチューブ２０５との混合物を加温してもよい。各種溶媒に、界面活性剤、分散助剤、または溶解助剤（以下界面活性剤等という）が加えられている場合も同様であり、混合物に超音波を加えることが好ましく、混合物を加温してもよい。
【００６９】
溶媒または界面活性剤等を加えた溶媒中に分散または溶解させた複数のカーボンナノチューブ２０５の分散液または溶解液を基板２０４に配置した後、溶媒を除去する。溶媒に界面活性剤等を加えた場合は、複数のカーボンナノチューブ２０５を基板２０４に配置した後に、基板２０４から溶媒を除去し、さらに界面活性剤等を洗浄除去し基板２０４から洗浄液を除去する。次いで、基板２０４を乾燥させる。
【００７０】
複数のカーボンナノチューブ２０５を基板２０４に配置した後、複数のカーボンナノチューブ２０５に標的物質２を接触させて、複数のカーボンナノチューブ２０５に標的物質２を物理吸着させ、カーボンナノチューブ２０２に標的物質２を固定させる。または、複数のカーボンナノチューブ２０５に、標的物質２および各種試薬を加えて、複数のカーボンナノチューブ２０５と標的物質２との間に化学的結合を形成させ、カーボンナノチューブ２０２に標的物質２を固定させる。
【００７１】
複数のカーボンナノチューブ２０５を基板２０４に配置した後に、カーボンナノチューブ２０２に標的物質２を固定させてもよいが、カーボンナノチューブ２０２に標的物質２を固定させた後に、標的物質２を固定したカーボンナノチューブ２０２を各種溶媒に分散または溶解し、得られた分散液または溶解液を基板２０４に塗布してもよい。その場合、標的物質２を固定したカーボンナノチューブ２０２が変性しないような分散・溶解の条件を選択することが好ましい。
【００７２】
基板２０４上に複数のカーボンナノチューブ２０５を不規則な網目状に配置し、次いで複数のカーボンナノチューブ２０５に標的物質２を固定させる。このようにすることで、標的物質２が固定された複数のカーボンナノチューブ２０５が、不規則な網目状に配置された標的物質固定部２０１が形成される。または、基板２０４上に標的物質２が固定された複数のカーボンナノチューブ２０５を不規則な網目状に配置することで、基板２０４上に標的物質固定部２０１が形成される。
【００７３】
標的物質２を固定した複数のカーボンナノチューブ２０５を不規則な網目状に配置することで、複数のカーボンナノチューブ２０５が、様々な特性を持ったカーボンナノチューブの集合であっても、平均化されたカーボンナノチューブの特性が標的物質検出バイオセンサー２００に現れる。そのため、複数の標的物質検出バイオセンサー２００同士の関係ではばらつきのない特性を得ることができる。すなわち、様々な特性を持ったカーボンナノチューブを分離せずに用いることができるので、簡易に標的物質検出バイオセンサー２００を作製でき、その結果簡易に標的物質２を検出することができる。
【００７４】
以下に、標的物質固定部１０１および電極２０３、２０３の作製例を示す。絶縁膜として酸化ケイ素膜が形成されたケイ素基板上に、厚さ２μｍのフォトレジスト（ＯＦＰＲ８００ＬＢ：東京応化株式会社製）をスピンコートにより塗布し、基板に対して９０℃で８分間プレベーク処理を行う。その後、電極のパターンを持つマスクを用いて基板を露光（ＥＭＡ−４００：ユニオン光学株式会社製）し、現像液（ＭＮＤ３：東京応化株式会社製）を用いてパターンを現像する。最後に超純水で基板を６０秒間リンスする。その後リフトオフ法により基板上に電極を形成する。具体的には、スパッタリング法により基板に連続的に１０ｎｍのＣｒ、次いで５０ｎｍのＡｕを塗布し、アセトンにより基板上の残留フォトレジストを除去する。その後、ダイシング装置により１０μｍ×１０μｍのチップサイズに切断する。切断したチップの電極に配線を施し、パッケージングを行って、電極が作製された基板を得る。
【００７５】
純水中に、カーボンナノチューブ（製品Ｍｅｉｊｏ  Ａｒｃ：名城ナノカーボン製）を加える。得られた混合物に超音波を５時間加えてカーボンナノチューブを液中に分散させる。この分散液をピペットに取り、電極が作製された基板上に滴下する。その後、基板を乾燥し、カーボンナノチューブが不規則な網目状に基板上に配置されたカーボンナノチューブ塗布基板を得る。このカーボンナノチューブ塗布基板のカーボンナノチューブ部分に、一定量の標的物質２を固定させる。
【００７６】
標的物質検出バイオセンサー２００は、第１の固定された複合体４ｂの量と相関し、かつ標的物質固定部２０１に含まれるカーボンナノチューブ２０２の表面状態の変化に相関する物理量として、電気的な物理量である電気抵抗値を出力する。具体的には、標的物質検出バイオセンサー２００は、二つの電極２０３間の電気抵抗値を物理量として出力する。
【００７７】
標的物質２の検出および定量は、−ΔＧ／Ｇ０の値に基づいて行う。ここで、Ｇ０は標的物質検出バイオセンサー２００の標的物質固定部２０１に試料を接触させる直前の電気抵抗値Ｒ０の逆数であり、Ｇｔは標的物質検出バイオセンサー２００に試料を接触させた時をｔ＝０とした場合におけるｔ秒後の電気抵抗値Ｒｔの逆数であり、ΔＧ＝Ｇｔ−Ｇ０である。標的物質２の濃度を定量するには、標的物質２の濃度が既知である参照試料を標的物質検出バイオセンサー２００の標的物質固定部２０１に接触させる。１０分後〜数１０分後に−ΔＧ／Ｇ０の値は一定値に達する。標的物質２の濃度により、この−ΔＧ／Ｇ０の一定値は変化する。標的物質２の濃度に対して−ΔＧ／Ｇ０の値をプロットすると、標的物質２の検量線が得られる。標的物質２の濃度が未知である試料の−ΔＧ／Ｇ０の一定値を測定し、前記参照試料から得られた前記一定値と検量線とを比較することにより、試料に含まれる標的物質２の濃度を決定することができる。なお、標的物質２の検出および定量は、−ΔＧ／Ｇ０ではなくΔＧ／Ｇ０の値に基づいて行ってもよい。
【００７８】
標的物質２の検出をするにあたり、参照電極として銀−塩化銀電極、カロメル電極、パラジウム−水素電極などを用いることができる。安定性に優れるため、銀−塩化銀電極を用いることが好ましい。また、参照電極として、市販のものを用いてもよいし、参照電極を標的物質検出バイオセンサー２００に組み込んでもよい。
【００７９】
次に、標的物質検出バイオセンサー２００が検出感度に優れている点を示す。比較例として、標的物質２ではなく、標的物質結合物質３を標的物質固定部２０１に固定させた以外は、標的物質検出バイオセンサー２００と同じ構成のバイオセンサーを用いた。比較例では、試料Ｓを標的物質結合物質３と反応させることなく、直接標的物質結合物質３を固定させた場所に接触させ、バイオセンサーから電気抵抗値を出力させた。
【００８０】
比較は、同一試料を標的物質検出バイオセンサー２００および比較例のバイオセンサーにそれぞれ接触させ、標的物質検出バイオセンサー２００および比較例のバイオセンサーから電気抵抗値を出力させることにより行った。図３は、標的物質検出バイオセンサー２００から出力される電気抵抗値から換算された−ΔＧ／Ｇ０と、比較例のバイオセンサーから出力される電気抵抗値から換算された−ΔＧ／Ｇ０との、相対的大きさについて示すグラフである。標的物質２としてコルチゾール、標的物質結合物質３として抗コルチゾール抗体を用いた。
【００８１】
図３によれば、本実施形態の標的物質検出バイオセンサー２００が出力する−ΔＧ／Ｇ０は、比較例のバイオセンサーが出力する物理量−ΔＧ／Ｇ０よりも大きく、比較例のバイオセンサーよりも標的物質２の検出感度が大きいことがわかる。
【００８２】
本実施形態の標的物質検出バイオセンサー２００は、標的物質結合物質３を酵素標識する必要がなく、短時間で簡単に標的物質２を感度よく検出することができる。
【００８３】
［実施形態３］
図４−１は、本実施形態に係る標的物質検出バイオセンサーの模式図である。本実施形態に係る標的物質検出バイオセンサー３００（標的物質検出フォトニック結晶バイオセンサー）は、基礎としてのフォトニック結晶３５０に、一定量の標的物質２を固定した標的物質固定部３０１を含む。標的物質固定部３０１は、試料Ｓと、標的物質２と特異的に反応する既知量の標的物質結合物質３との混合物Ｍと接触させられる。標的物質検出バイオセンサー３００は、固定された標的物質２と標的物質結合物質３とで形成される、第１の固定された複合体４ｂの量と相関し、かつ標的物質固定部３０１における表面状態の変化に相関する物理量を出力するものである。
【００８４】
ここで、一般にフォトニック結晶とは、サブ波長間隔の格子構造をもつ構造体であって、構造体表面（以後反射面という。）に広領域波長の光を照射すると、フォトニック結晶の形状および材質に依存した、すなわち、フォトニック結晶の表面状態に依存した特定の波長帯の光を反射または透過するものである。この反射光または透過光の変化を読み取ることにより、フォトニック結晶の表面状態の変化を定量化することができる。フォトニック結晶の表面状態の変化としては、表面への物質の吸着、構造変化等が挙げられる。表面に金属薄膜が形成されたフォトニック結晶も、光が照射されると、光の反射率または光の透過率に極値（極大値または極小値）が現れる。この反射率または透過率の極値は、金属の種類、金属の膜厚、フォトニック結晶の表面形状に依存するものである。この光の反射率または光の透過率を読み取ることにより、フォトニック結晶の表面状態の変化を定量化することができる。金属薄膜については後述する。フォトニック結晶の表面状態の変化を反射光または透過光の変化から定量化するには、例えば、極値（極大値または極小値）である、極値である反射率または透過率の変化量、あるいは反射率または透過率が極値となる波長のシフト量を求めるなどの方法を用いることができる。なお、反射率または透過率の極値が複数ある場合には、任意の極値に着目する。そして、着目した極値について変化量を求め、または着目した極値となる波長のシフト量を求めることによりフォトニック結晶の表面状態の変化を定量することができる。
【００８５】
例えば、標的物質２と標的物質結合物質３との特異的反応として、コルチゾールと抗コルチゾール抗体との抗原抗体反応を考える。レセプターであるＩｇＧ抗体は、大きさが１０ｎｍ程度であり、コルチゾールは１ｎｍ程度の大きさである。したがって、フォトニック結晶３５０にＩｇＧ抗体を固定させて、抗原であるコルチゾールを反応させる場合よりも、フォトニック結晶３５０に抗原であるコルチゾールを固定させて、抗体であるＩｇＧを反応させる場合の方が、フォトニック結晶３５０の表面状態の変化が大きく、標的物質固定部３０１の感度が大きくなる。また、複合体結合物質５として、例えば抗体に対する抗体（二次抗体）を反応させることによって、フォトニック結晶３５０の表面状態の変化はさらに大きくなり、感度が上昇する。二次抗体はそのまま使用することもできるし、他の物質を付加した二次抗体を用いてもよい。複合体結合物質５である二次抗体が大きいほどフォトニック結晶３５０の表面状態の変化が大きくなり、標的物質固定部３０１の感度が大きくなる。
【００８６】
標的物質検出バイオセンサー３００は、第１の固定された複合体４ｂの量が変化することで、反射面の状態が変化し、反射光に変化が生じる。すなわち、標的物質固定部３０１の表面状態に変化が生じる。標的物質検出バイオセンサー３００は、物理量として、標的物質固定部３０１の表面状態の変化に相関し、かつ第１の固定された複合体４ｂの量と相関する光学的な物理量を出力する。光学的な物理量は、例えば、反射光または透過光の強度、極値である反射光または透過光の強度の変化量、反射光または透過光の強度が極値となる波長のシフト量、光の反射率または透過率の変化量、光の反射率または透過率が極値となる波長のシフト量である。
【００８７】
光学的な物理量を出力させるには、例えば以下のようにして行う。例えば、標的物質固定部３０１に対して垂直に光を入射し、反射された光を検出する。標的物質固定部３０１に対して角度をつけて光を入射し、反射された光を検出することもできる。また、標的物質固定部３０１から反射された光ではなく、標的物質固定部３０１を透過した光を検出することもできる。反射された光を検出することが好ましい。これにより、装置を構造上省スペースとすることができ、装置を小型化することができる。垂直に入射され、垂直に反射された光を検出する場合には、二股ファイバを用いて光を入射し、反射光を検出することが好ましい。
【００８８】
図４−２および図４−３は、本実施形態に係るフォトニック結晶３５０を説明する図である。図４−２はフォトニック結晶３５０の平面図であり、図４−３は図４−２におけるＡ−Ａ断面を示す図である。
【００８９】
本実施形態に係るフォトニック結晶３５０は、表面に凸部３５２が周期的に形成された反射面３５１を有している。円柱状の凸部３５２の直径Ｄは２５０ｎｍである。円柱状の凸部３５２の中心間の距離は、約５００ｎｍである。円柱状の凸部３５２は、三角形の格子状に配置されている。円柱状の凸部３５２の高さＨは、１５０ｎｍである。円柱状の凸部３５２の直径Ｄは５０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であることが好ましい。また、円柱状の凸部３５２同士の間隔は１００ｎｍを超え２０００ｎｍ以下であることが好ましい。
【００９０】
本実施形態に係るフォトニック結晶３５０の形態は、図４−２および図４−３に示した形態に限定されることはない。例えば、表面に凹部が周期的に形成されたもの、矩形または多角形の格子状の微細パターンが表面に形成されたもの、もしくは、平行線状パターンや波型形状パターン等が表面に形成されたもの、詳しくは周期的にパターン等が形成されたもの、またはこれらのパターンの組合せであってもよい。
【００９１】
フォトニック結晶３５０の材質としては、合成樹脂等の有機材料、金属・セラミック等の無機材料を使用することができる。
【００９２】
合成樹脂としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、ポリシクロオレフィン、ポリアミド、ポリイミド、アクリル、ポリメタクリル酸エステル、ポリカーボネート、ポリアセタール、ポリテトラフルオロエチレン、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエーテルエーテルケトン等の熱可塑性樹脂、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂等の熱硬化性樹脂が使用できる。
【００９３】
セラミックとしては、シリカ、アルミナ、ジルコニア、チタニア、イットリア等のセラミックを好適に使用することができる。
【００９４】
金属としては、鉄鋼材料をはじめ各種合金が使用可能である。具体的には、ステンレス鋼やチタン、チタン合金等を好適に使用できる。
【００９５】
上記した各種材料の中でも、光学特性、加工性、標的物質２（ターゲットとなる物質）を含有する溶液に対する耐性、標的物質２の吸着性、洗浄剤に対する耐性等を考慮すると、ポリシクロオレフィン系合成樹脂もしくはシリカ系のセラミックがより好ましい。この中でも、ポリシクロオレフィン系合成樹脂は加工性に優れており最も好適である。
【００９６】
フォトニック結晶３５０は、上記材料基板の表面に微細な加工を施すことにより作成される。加工方法としては、レーザー加工、熱ナノインプリント、光ナノインプリント、フォトマスクとエッチングの組合せ等が使用できる。
【００９７】
特に、ポリシクロオレフィン系合成樹脂等の熱可塑性樹脂を材料とする場合には、熱ナノインプリントによる方法が好適である。
【００９８】
フォトニック結晶３５０は、その表面に金属薄膜が形成されたものであることが好ましい。金属は、ＡｕまたはＡｇであることが好ましい。安定性に優れるために、Ａｕであることが特に好ましい。金属薄膜の形成は、スパッタリングや、蒸着装置による形成など、公知の方法を用いて行うことができる。金属薄膜の厚さは、好ましくは５０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であり、さらに好ましくは１５０ｎｍ以上４００ｎｍ以下である。金属薄膜が適度に厚いと、光を透過させないため好ましく、金属薄膜が適度に薄いと、フォトニック結晶３５０の表面に詳細なパターン形状を作製することが容易であるので好ましい。例えば、パターンの角がシャープになって、パターンの寸法を確保することが容易となる。
【００９９】
フォトニック結晶３５０の表面を、3-triethoxysilylpropylamine（ＡＰＴＥＳ）を用いて改質することが好ましい。フォトニック結晶３５０の表面に、ＡｕまたはＡｇ薄膜を形成させた場合には、ＡＰＴＥＳではなく、一端にチオール基を有し、他端にアミノ基やカルボキシル基などの官能基を有する炭素鎖を用いてフォトニック結晶３５０の表面を改質することが好ましい。ＡｕやＡｇ以外の金属薄膜をフォトニック結晶３５０の表面に形成させた場合は、一端に官能基を有するシラン系カップリング剤、例えばＡＰＴＥＳを使用して、フォトニック結晶３５０の表面を改質することが好ましい。
【０１００】
標的物質２は、フォトニック結晶３５０の反射面３５１に固定される。標的物質２をフォトニック結晶３５０の反射面３５１に固定する手段として、共有結合、化学吸着、物理吸着などの、化学的結合、物理的結合方法が挙げられ、これらの手段を、標的物質２の性質に応じて適宜選択することができる。例えば、固定する手段として吸着を選択した場合、操作は例えば以下のようなものである。標的物質２を含んだ溶液を、フォトニック結晶３５０の反射面３５１に滴下し、所定の時間、室温で、または必要に応じ冷却・加温して、標的物質２を反射面３５１に吸着させる。
【０１０１】
フォトニック結晶３５０に固定される標的物質２の量は、一定量である。固定される標的物質２の量が一定量であることで、固定される標的物質２と標的物質結合物質３とが複合体４ｂを形成した場合に、形成した複合体４ｂの量と相関する物理量を、標的物質検出バイオセンサー３００が出力できる。固定される標的物質２の一定量は、適宜変更してもよく、例えば、試料Ｓに含まれる標的物質２の量の範囲によって最適な量に設定することができる。
【０１０２】
標的物質固定部３０１は、標的物質２が固定された後の反射面３５１に、ブロッキング剤（保護物質）が固定されたものであってもよい。ブロッキング剤は、標的物質結合物質３が標的物質固定部３０１に接触させられる前に固定される。フォトニック結晶３５０の表面は、一般的に超疎水性であり、疎水性相互作用によって標的物質結合物質３以外の不純物を吸着してしまうおそれがある。さらに、フォトニック結晶３５０の光学特性は表面状態に大きく影響されるので、フォトニック結晶３５０の表面には、なるべく不純物が吸着されていない方が検出の精度は向上する。
【０１０３】
したがって、標的物質２が吸着（固定）された部分以外の箇所には、不純物等が固定されない様に、いわゆるブロッキング剤をあらかじめ固定させておくことが好ましい。ブロッキング剤をあらかじめ吸着させておくには、ブロッキング剤を、フォトニック結晶３５０の表面に接触させる。ブロッキング剤として、スキムミルクやウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等を使用することができる。
【０１０４】
次に、標的物質検出バイオセンサー３００の構造について説明する。標的物質検出バイオセンサー３００は、プレート３０２と、開口部３０４が設けられているプレート３０３とにより標的物質固定部３０１を挟む構造である。開口部３０４の一端は、標的物質固定部３０１の基礎となるフォトニック結晶３５０の反射面３５１により閉塞される。このような構造のため、プレート３０３の開口部３０４側内壁と反射面３５１とで囲まれたある一定容積の凹部（試料保持部）ができる。この凹部に試料が保持されるので、少量の試料であっても検出・測定が可能となる。なお、開口部３０４側内壁とは、プレート３０３と開口部３０４との境界面である、プレート３０３の内壁をいう。
【０１０５】
開口部３０４は、試料を保持することができる形状であれば図示した円柱形に限らず、各種の形状とすることができる。また、開口部３０４を円柱状とした場合、その直径等は、標的物質２と標的物質結合物質３との組み合わせの種類、例えば抗体と抗原との組合せの種類や、必要な測定精度、または、反射光の検出器の光学系に合わせて様々な直径とすることができる。好ましくは、開口部３０４は直径０．５ｍｍ〜１０ｍｍとするのが好ましい。より好ましくは、上記リンス操作や吸着操作時の操作や取り扱いの利便性を考慮し２〜６ｍｍ程度とすることが好ましい。
【０１０６】
プレート３０２，３０３の材料として種々のものを選択することができる。表面が清浄である材料が好ましく、特にステンレス鋼、ポリシクロオレフィン系樹脂、シリカを有するものが好ましい。
【０１０７】
プレート３０３を疎水性の材料とすると、唾液等の親水性の試料の検出・定量を行う場合は、凹部に試料を集めることができるので好ましい。また、脂質等のいわゆる親油性の試料溶液の検出・定量を行う場合はプレート３０３を親水性の材料とすることが好ましい。
【０１０８】
さらに、プレート３０３を撥水性、撥油性、または、撥水撥油性のある材料で形成することも好ましい。また、表面処理やコーティングを行うことにより、プレート３０３表面に撥水性、撥油性、または、撥水撥油性を付与してもよい。このようにすることで、凹部に試料を集めることができる。
【０１０９】
標的物質２の検出・定量は、標的物質検出バイオセンサー３００が出力する光学的な物理量、例えば、光強度の極値の変化量、光強度が極値となる波長のシフト量、光の反射率または透過率の極値の変化量、光の反射率または透過率が極値となる波長のシフト量に基づいて行われる。標的物質２の検出・定量を、光の最大強度波長または最小強度波長のシフト量に基づいて行ってもよい。標的物質２の検出・定量を光の反射率が極値となる波長のシフト量に基づいて行う場合には、例えば以下のようにして行う。
【０１１０】
まず、フォトニック結晶３５０に一定量の標的物質２を固定させて、フォトニック結晶３５０の反射面３５１に、例えば３００ｎｍ以上９００ｎｍ以下の光を照射する。このときの、光の反射率が極値（極大値または極小値）となる波長をλ１とする。
【０１１１】
次に、標的物質検出バイオセンサー３００の標的物質固定部３０１に、試料Ｓと既知量の標的物質結合物質３との混合物Ｍを接触させて、標的物質固定部３０１の表面に第１の固定された複合体４ｂを形成させる。その後、標的物質検出バイオセンサー３００の反射面３５１に、例えば３００ｎｍ以上９００ｎｍ以下の光を照射する。このときの、光の反射率が極値（極大値または極小値）となる波長をλ２とする。標的物質固定部３０１に、第２の固定された複合体６を形成させる場合は、形成させた後の標的物質検出バイオセンサー３００に光を照射する。その結果得られる光の反射率が極値となる波長をλ２とする。極値が複数ある場合には、着目する極値を適宜選定する。選定された任意の極値について、波長λ１および波長λ２を求める。
【０１１２】
光の反射率が極値となる波長のシフト量Δλは、λ２−λ１である。標的物質固定部３０１における表面状態の変化に応じて、シフト量Δλは変化する。このΔλに基づいて、標的物質２の検出・定量を行う。
【０１１３】
標的物質２の検出・定量を、光強度を用いて行う場合には、以下のようにして行う。まず、フォトニック結晶３５０に標的物質２を固定させる前に、フォトニック結晶３５０の反射面３５１に光を照射して、特定波長における反射光の強度を出力させ、これを第１の強度Ｉ１とする。
【０１１４】
次に、標的物質２が固定された標的物質検出バイオセンサー３００の反射面３５１に光を照射して、特定波長における反射光の強度を出力させ、これを第２の強度Ｉ２とする。
【０１１５】
次に、標的物質検出バイオセンサー３００の標的物質固定部３０１に、試料Ｓと既知量の標的物質結合物質３との混合物Ｍを接触させて、標的物質固定部３０１の表面に第１の固定された複合体４ｂを形成させる。その後、標的物質検出バイオセンサー３００の反射面３５１に光を照射して、特定波長における反射光の強度を出力させ、これを第３の強度Ｉ３とする。標的物質固定部３０１に、第２の固定された複合体６を形成させる場合は、形成させた後の標的物質検出バイオセンサー３００に光を照射して得られた反射光の強度を第３の強度Ｉ３とする。
【０１１６】
標的物質２の定量は、第３の強度と第２の強度との差の絶対値｜Ｉ３−Ｉ２｜に基づいて行ってもよいが、第３の強度を第１の強度で除した値と、第２の強度を第１の強度で除した値との差の絶対値｜Ｉ３／Ｉ１−Ｉ２／Ｉ１｜に基づいて行うことが好ましい。それは以下の理由による。フォトニック結晶３５０に標的物質２が固定される前に出力された、フォトニック結晶３５０の反射光強度は、熱ナノインプリントの成形条件などによってバラツキが発生する場合がある。また、標的物質２がフォトニック結晶３５０に固定される量は、標的物質検出バイオセンサー３００毎にバラツキが発生する場合がある。そのため、出力結果の反射光強度をそのまま使用した場合は、これらのバラツキが検出結果に影響を与える可能性がある。そこで、第３の強度を第１の強度で除した値と、第２の強度を第１の強度で除した値との差の絶対値｜Ｉ３／Ｉ１−Ｉ２／Ｉ１｜に基づいて標的物質２の検出・定量を行うことで、これらのバラツキの影響を少なくすることができる。
【０１１７】
次に、標的物質検出バイオセンサー３００が検出感度に優れている点を示す。比較例として、標的物質２ではなく、標的物質結合物質３をフォトニック結晶３５０に固定させた以外は、標的物質検出バイオセンサー３００と同じ構成のバイオセンサーを用いた。比較例では、試料Ｓを標的物質結合物質３と反応させることなく、フォトニック結晶３５０に接触させた。
【０１１８】
比較は、同一試料を標的物質検出バイオセンサー３００および比較例のバイオセンサーにそれぞれ接触させ、標的物質検出バイオセンサー３００および比較例のバイオセンサーから出力される、光の反射率が任意の極値となる波長のシフト量Δλを比較することにより行った。また、標的物質検出バイオセンサー３００に第２の固定された複合体６を形成させた場合の検出感度についても比較を行った。この場合は、試料を標的物質検出バイオセンサー３００に接触させた後、さらに第１の固定された複合体４ｂと特異的に反応する複合体結合物質５を接触させて、光の反射率が任意の極値となる波長のシフト量Δλを出力させた。標的物質２としてコルチゾール、標的物質結合物質３として抗コルチゾール抗体、第２の固定された複合体６として、二次抗体を用いた。
【０１１９】
フォトニック結晶３５０としては、熱ナノインプリントにより所定の微細構造を表面に形成したシクロオレフィン系ポリマーのシートを所定の大きさに切断したものを用いている。
【０１２０】
図５は、標的物質検出バイオセンサー３００から出力される、光の反射率が任意の極値となる波長のシフト量Δλと、比較例のバイオセンサーから出力される、光の反射率が任意の極値となる波長のシフト量Δλとの相対的大きさについて示すグラフである。なお、「標的物質検出バイオセンサー３００＋複合体結合物質」のグラフは、標的物質検出バイオセンサー３００に第２の固定された複合体６を形成させた場合の、光の反射率が任意の極値となる波長のシフト量Δλを示すものである。
【０１２１】
図５によれば、比較例のバイオセンサーと比較して、標的物質検出バイオセンサー３００は、検出感度に優れていることがわかる。さらに、標的物質検出バイオセンサー３００に、第２の固定された複合体６を形成させると、検出感度が上昇することがわかる。
【０１２２】
本実施形態に係る標的物質検出バイオセンサー３００は、標的物質結合物質３を酵素標識する必要がなく、短時間に簡単に感度よく標的物質２を検出することができる。
【符号の説明】
【０１２３】
１、２００、３００  標的物質検出バイオセンサー
２  標的物質
３  標的物質結合物質
４ａ  複合体
４ｂ  第１の固定された複合体
５  複合体結合物質
６  第２の固定された複合体
１０１、２０１、３０１  標的物質固定部
１０２  基礎
２０２  カーボンナノチューブ
２０３  電極
２０４  基板
２０５  複数のカーボンナノチューブ
３０２  プレート
３０３  プレート
３０４  開口部
３５０  フォトニック結晶
３５１  反射面
３５２  凸部
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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