(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
かき混ぜ機、および透析モジュールを培養容器内部に備える装置であって、前記かき混ぜ機が、
少なくとも2つの攪拌羽根を備えた1つの半径方向搬送要素と、少なくとも2つの攪拌羽根をそれぞれ備えた1つ以上の軸方向搬送要素とを備え、
前記半径方向搬送要素の攪拌羽根が、シャフト軸に対して傾斜を有さず、かつ互いに平行であり、
前記軸方向搬送要素の攪拌羽根が、シャフト軸に対して傾斜を有し、
すべての軸方向搬送要素の外径が前記半径方向搬送要素の内径以下であり、
すべての軸方向搬送要素が個別に前記半径方向搬送要素に接続され、
すべての軸方向搬送要素が前記半径方向搬送要素の内部に位置し、かつ
すべての搬送要素が、距離および角度に関して互いに対してそれぞれ一定の空間的配向を有する
ことを特徴とする、
前記装置。
【請求項２】
軸方向搬送要素の数が1または2または3であることを特徴とする、請求項1記載の装置。
【請求項３】
前記半径方向搬送要素の対向する攪拌羽根が軸方向搬送要素の2つの反対向きの攪拌羽根によって互いに連結されることを特徴とする、請求項1または2記載の装置。
【請求項４】
前記軸方向搬送要素が傾斜羽根攪拌機であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項記載の装置。
【請求項５】
前記半径方向搬送要素がアンカー翼であり、前記軸方向搬送要素が、該アンカー翼の羽根の接続要素として作用するように設計された傾斜羽根攪拌機であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項記載の装置。
【請求項６】
前記傾斜羽根攪拌機の攪拌羽根の傾斜度が前記使用のシャフト軸に対して10°から80°であることを特徴とする、請求項5記載の装置。
【請求項７】
前記半径方向搬送要素の高さが少なくとも200mmであることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項記載の装置。
【請求項８】
かき混ぜ機径(d)と培養容器径(D)の比d/Dが0.2〜0.8であり、かつ該かき混ぜ機が、培養容器内部の壁面近傍に垂直に配置されることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項記載の装置。
【請求項９】
前記培養容器の充填高さ(H)と培養容器幅(D)の比H/Dが1.0〜2.5であることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項記載の装置。
【請求項１０】
ポリペプチドを発現する細胞を培養するための、請求項1〜9のいずれか一項記載の装置の使用。
【請求項１１】
細胞が、哺乳類細胞であることを特徴とする、請求項10記載の使用。
【請求項１２】
前記哺乳類細胞が、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、COS細胞、PER.C6細胞、Sp2/0細胞、またはHEK293細胞から選択されることを特徴とする、請求項11記載の使用。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが抗体であることを特徴とする、請求項10〜12のいずれか一項記載の使用。
【請求項１４】
以下の工程を含む、ポリペプチドを製造するための方法：
(a)前記ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を提供する工程；
(b)請求項1〜9のいずれか一項に記載の装置を提供する工程；
(c)前記細胞を前記装置内で培地中で培養する工程であって、かき混ぜ機が培養容器内部に乱流を提供する、工程；および
(d)前記細胞または前記培地から前記ポリペプチドを回収し、それによりポリペプチドを製造する工程。
【請求項１５】
細胞が、哺乳類細胞であることを特徴とする、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳類細胞が、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、COS細胞、PER.C6細胞、Sp2/0細胞、またはHEK293細胞から選択されることを特徴とする、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが抗体であることを特徴とする、請求項14〜16のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書において、かき混ぜ機、該かき混ぜ機を備えた装置、および細胞の培養のための該かき混ぜ機の使用が記載される。かき混ぜ機は、少なくとも1つの軸方向搬送要素および少なくとも1つの半径方向搬送要素、例えば半径方向搬送要素としてのアンカー翼と軸方向搬送要素としての1つ以上の傾斜羽根攪拌翼との組み合わせを含む。かき混ぜ機の使用により、混合が改善され、特に、透析プロセスにおいて生物付着が低減し、さらに物質移動速度が速くなる。
【背景技術】
【０００２】
技術的背景
原核細胞および真核細胞を用いた組換えタンパク質、ワクチン、および抗体の製造は、現代の医薬製造において不可欠な役割を果たしている。複合翻訳後修飾タンパク質および抗体を製造するのに動物由来細胞が主として用いられる。しかしながら、動物由来細胞の使用は、例えば、培地、制限および阻害（例えば、乳酸塩、CO2、アンモニウム等による）に対する感受性、感受性の強い外膜（剪断応力）、比速度の低さ、および培養条件のばらつき（例えば、局所的不均質性、pHのばらつき、pO2のばらつき等による）に対する感受性といった、これらの細胞の特異的な特性により、発酵プロセスに対する要求が高度である。バイオリアクターの設計時やプロセス制御のためには、これらの特性を考慮に入れなければならない。
【０００３】
近年、細胞を培養するための様々な種類の反応器が開発されている。種類に関わらず、反応器は、以下の基本的な技術的機能を満たさなければならない：懸濁および均質化が十分であること、物質輸送および熱輸送が十分であること、ならびに細胞にかかる剪断応力が最小であること。攪拌タンク反応器は産業用に特に適している。この反応器では、基本的な機能を果たすのに必要なエネルギーが機械的攪拌によって導入される。
【０００４】
高い生成物力価と仕様に合致した生成物品質とを達成するためには、細胞株の開発、培地の組成、および反応器の設計に加えて、特に反応器の動作モードが重要な役割を果たす。一般に、以下の動作モードが採用される：バッチプロセス、フェドバッチプロセス、細胞保持をするまたはしない連続プロセス（例えば灌流またはケモスタット）、および例えば内部透析または外部透析などの半連続プロセス。
【０００５】
栄養制限を防止するために、供給液が濃縮溶液の形態で反応器に添加される（いわゆるフェドバッチプロセス）。細胞代謝の最終生成物による阻害を回避するために、細胞代謝の生成物を反応器からまたは反応器内の培地から除去しなければならない。これは、例えば灌流または透析によって実施することができる。透析の場合は外部透析か内部透析かが区別される。
【０００６】
EP 1 474 223（特許文献1）には、ダイナミック・ミキサーが記載されている。細胞懸濁液の取込み用の容器と、細胞懸濁液に気体を供給および排出するための装置と、細胞懸濁液内に流れを発生させる装置とを含む動物細胞培養装置がDE 10 2005 053 333（特許文献2）に記載されている。細胞培養方法および装置がEP 0 224 800（特許文献3）に記載されている。Nomura, T., et al., J. Chem. Eng. Jap. 29 (1996) 134-138（非特許文献1）には、丸底フラスコ用折り畳み式アンカー翼の開発およびその混合特性が記載されている。攪拌タンク反応器内での気液混合用の攪拌翼ドラフトチューブかき混ぜシステムがWO 01/41919（特許文献4）に記載されている。US 4,438,074（特許文献5）には、連続重合反応器が記載されている。気体を液体中へ移動させるためのかき混ぜシステムおよび方法がEP-A 0 200 886（特許文献6）に記載されている。EP-B 0 049 229（特許文献7）には、攪拌装置を有する調理装置が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】EP 1 474 223
【特許文献２】DE 10 2005 053 333
【特許文献３】EP 0 224 800
【特許文献４】WO 01/41919
【特許文献５】US 4,438,074
【特許文献６】EP-A 0 200 886
【特許文献７】EP-B 0 049 229
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Nomura, T., et al., J. Chem. Eng. Jap. 29 (1996) 134-138
【発明の概要】
【０００９】
本明細書に記載のかき混ぜ機は、少なくとも、（i）他の攪拌機と比較して、例えば酸または塩基などの中和剤を液体表面または培地表面を介して導入するための、迅速な培地の混合を可能にし、（ii）泡沫形成を低減し、（iii）透析プロセスにおいて生物付着を低減し、かつ（iv）透析プロセスにおいて、搬送のしかたが異なる要素の組み合わせの結果としての透析モジュールにぶつかる直接の直交流れにより、物質移動を増加させる。
【００１０】
本明細書において、かき混ぜ機のシャフトに対して少なくとも1つの軸方向搬送要素と少なくとも1つの半径方向搬送要素とを備えたかき混ぜ機（組合せ攪拌機）であって、該少なくとも1つの軸方向搬送要素の最大径が半径方向搬送要素の内径di以下であるかき混ぜ機が記載される。
【００１１】
本明細書に記載の一局面は、
- 少なくとも2つの攪拌羽根を備えた1つの半径方向搬送要素と
- 少なくとも2つの攪拌羽根をそれぞれ備えた1つ以上の軸方向搬送要素と
を備えたかき混ぜ機であって、
半径方向搬送要素の攪拌羽根は互いに平行かつかき混ぜ機のシャフト軸に平行であり、
すべての軸方向搬送要素の外径が半径方向搬送要素の内径以下であり、
すべての軸方向搬送要素が半径方向搬送要素に個別に接続され、
すべての軸方向搬送要素が半径方向搬送要素の内部に位置し、かつ
すべての搬送要素が互いに対してかつかき混ぜ機のシャフト軸に対して一定の空間的配向を有する、かき混ぜ機である。
【００１２】
一態様において、かき混ぜ機は、1つ〜5つの軸方向搬送要素、または別の態様においては1つ〜3つの軸方向搬送要素、またはさらに一態様においては1つもしくは2つの軸方向搬送要素を含む。一態様において、上記少なくとも1つの軸方向搬送要素は、かき混ぜ機のヘッドから画成されるかき混ぜ機の上側5分の4の位置にあり、かき混ぜ機のヘッドまでの最大距離がh4/5である。さらに一態様においては、1つの軸方向搬送要素が、半径方向搬送要素の羽根の頂部からの最大距離の80％（すなわち最大距離の0.8h）の所に位置しており、かつ／または1つの軸方向搬送要素が、半径方向搬送要素の羽根の頂部からの最大距離の20％（すなわち最大距離の0.2h）の所に位置している。さらなる態様において、上記少なくとも1つの軸方向搬送要素と上記少なくとも1つの半径方向搬送要素とは一緒になって単一の要素を形成する。別の態様においては、半径方向搬送要素の対向する攪拌羽根は、軸方向搬送要素の2つの反対向きの攪拌羽根によって互いに連結される。一態様においては、すべての軸方向搬送要素の直径が同一である。別の態様においては、軸方向搬送要素は、互いに独立して、プロペラかき混ぜ機、勾配付き羽根かき混ぜ機、または傾斜羽根かき混ぜ機から選択される。
【００１３】
軸方向搬送要素の直径が半径方向搬送要素の内径未満である場合は、軸方向搬送要素の攪拌羽根の先端と半径方向搬送要素の内縁との間の空間距離がコネクターによって埋められる。コネクターは、一態様において、針金、棒、薄板、および円板から選択される。
【００１４】
さらなる態様において、かき混ぜ機を培養容器内で動作させると、すべての搬送要素、すなわち軸方向搬送要素および半径方向搬送要素が、かき混ぜ機のシャフト軸の周りを時間単位当たり同じ回転数で回転する。一態様において、搬送要素は永久結合され、かき混ぜ機は1つのパーツからなる。すなわち、両要素が同じ回転シャフトによって駆動され、かき混ぜ機のシャフト軸を回る時間単位当たりの回転数が同じである。
【００１５】
かき混ぜ機径(d)と培養容器径(D)の比d/Dは、一態様においては0.2〜0.8であり、別の態様においては0.3〜0.6であり、さらに一態様においては0.33〜0.5である。別の態様において、羽根高さ(h)とかき混ぜ機径(d)の比h/dは、0.5〜5であり、別の態様においては1〜4であり、さらに一態様においては1〜3である。さらに別の態様において、かき混ぜ機の羽根幅(b)とかき混ぜ機径(d)の比b/dは、0.05〜0.3であり、別の態様においては0.1〜0.25である。「〜」という用語は、記載された境界値を含む範囲を指す。別の態様において、攪拌機径(d)は、500mm、600mm、700mm、800mm、1000mm、1200mm、1400mm、1600mm、1800mm、および2000mmから選択される。さらなる態様において、かき混ぜ機の羽根幅(b)は、42mm、60mm、89mm、108mm、133mmから選択される。
【００１６】
一態様において、上記1つの半径方向搬送要素はアンカー翼である。さらなる態様において、半径方向搬送要素の個々の攪拌羽根を接続する要素は、軸方向搬送要素の攪拌羽根（接続攪拌羽根）である。一態様において、接続攪拌羽根は、軸方向搬送要素として20％〜100％動作し、別の態様においては軸方向搬送要素として50％〜100％動作し、さらに一態様においては軸方向搬送要素として略100％動作する。「略」という用語は、所与の値がその値を中心にしてプラスマイナス10％にわたる範囲の中心点であることを指す。この値がパーセント値であれば「略」は同様にプラスマイナス10％を意味するが、値100％を超えることはありえない。
【００１７】
さらなる態様において、軸方向搬送要素は傾斜羽根攪拌機である。別の態様において、半径方向搬送要素は、アンカー翼であり、かつ軸方向搬送要素は、該アンカー翼の羽根の接続要素として作用するように設計された傾斜羽根攪拌機である。別の態様において、半径方向搬送要素のすべての対向する羽根が軸方向搬送要素の羽根を介して互いに接続される。一態様において、かき混ぜ機は、かき混ぜ機のシャフト軸に対して1つまたは2つの軸方向搬送要素と1つの半径方向搬送要素との組み合わせからなる。別の態様において、半径方向搬送要素は、アンカー翼であり、軸方向搬送要素は、2つの傾斜羽根攪拌機であり、該傾斜羽根攪拌機の羽根は、対向するアンカー翼羽根の接続要素として作用するように設計される。
【００１８】
軸方向搬送要素の高さと半径方向搬送要素の羽根の幅の比hSB/bは、0.5〜4であり、別の態様においては0.8〜3であり、さらに一態様においては1〜2である。別の態様において、上記傾斜羽根攪拌機の攪拌羽根の傾斜度は、かき混ぜ機のシャフト軸に対して、10°〜80°であり、さらなる態様においては24°〜60°であり、さらに一態様においては40°〜50°である。
【００１９】
一態様において、半径方向搬送要素は、1つ〜8つの攪拌羽根、別の態様においては1つ〜4つの攪拌羽根、さらに一態様においては4つの攪拌羽根を有する。軸方向搬送要素は、一態様においては1つ〜10個の攪拌羽根、別の態様においては2つ〜6つの攪拌羽根、さらに一態様においては4つの攪拌羽根を有する。別の態様において、半径方向搬送要素と軸方向搬送要素とは、同数の攪拌羽根を有する。
【００２０】
一態様において、かき混ぜ機のシャフトの係止装置は、攪拌機のヘッドから見て下側3分の1にあり、縮小部の高さ(hu)と締付蓋の高さ(hm)の比hu/hmは、0.05〜1であり、別の態様においては0.2〜0.8、さらに一態様においては0.3〜0.5である。
【００２１】
一態様において、かき混ぜ機の高さは、少なくとも200mmであり、別の態様においては200mm〜5000mmである。別の態様において、かき混ぜ機の高さは、半径方向搬送要素の羽根の高さhである。
【００２２】
本明細書において、一局面として、本明細書に記載のかき混ぜ機と培養容器とを備えた装置がさらに記載される。一態様において、かき混ぜ機と培養容器とは、機能単位を形成する。すなわち、かき混ぜ機は、培養容器の内部にあり、培養容器内で空間的に無制限に回転することができる。一態様において、上記装置は透析モジュールをさらに備える。一態様において、上記培養容器は攪拌タンク反応器である。さらなる態様において、上記培養容器は曝気式または液中通気式（submerse gassed）攪拌タンク反応器である。一態様において、上記培養容器は2つ〜4つのバッフルを含む。別の態様において、バッフルは、培養容器の内側表面の縁の周りに等間隔で配置される。
【００２３】
かき混ぜ機径(d)と培養容器径(D)の比d/Dは、一態様においては0.2〜0.8であり、別の態様においては0.3〜0.6であり、さらに一態様においては0.33〜0.5である。別の態様において、反応容器の充填高さ(H)と培養容器径(D)の比H/Dは、1.0〜2.5であり、さらなる態様においては1.1〜2.0であり、さらに一態様においては1.4〜1.8である。一態様において、培養容器は5 l〜25,000 lの作業容量を有する。
【００２４】
本明細書においては、一局面として、本明細書に記載のかき混ぜ機または装置の使用も記載される。一態様において、この使用は、ポリペプチドの製造のための細胞の培養のため、すなわち異種核酸によってコードされたポリペプチドを発現する細胞を培養するためのものである。一態様において、上記培養は透析である。さらなる態様において、上記培養は、液中通気式攪拌タンク反応器内で実施される。別の態様において、上記細胞は真核細胞である。さらに一態様において、上記細胞は哺乳類細胞である。なおさらなる態様において、上記細胞は、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、COS細胞、PER.C6細胞、Sp2/0細胞、およびHEK293細胞から選択される。一態様において、上記ポリペプチドは抗体である。さらなる態様において、該抗体は、CD20、CD22、HLA-DR、CD33、CD52、EGFR、G250、GD3、HER2、PSMA、CD56、VEGF、VEGF2、CEA、Lewis Y抗原、IL-6受容体、またはIGF-1受容体に対する抗体である。
【００２５】
本明細書において、一局面として、以下の工程を含む、ポリペプチドを製造するための方法がさらに記載される：
(a)前記ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を提供する工程；
(b)本明細書に記載の装置を提供する工程；
(c)前記細胞を前記装置内で培地中で培養する工程であって、かき混ぜ機が培養容器の内部に乱流を提供する、工程；および
(d)前記細胞または前記培地から前記ポリペプチドを回収し、それによりポリペプチドを製造する工程。
【００２６】  一態様において、上記方法は、異種核酸によってコードされたポリペプチドを発現する細胞を培養するためのものである。一態様において、上記培養は透析である。さらなる態様において、上記培養は、液中通気式攪拌タンク反応器内で実施される。別の態様において、上記細胞は真核細胞である。さらに一態様において、上記細胞は哺乳類細胞である。なおさらなる態様において、上記細胞は、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、COS細胞、PER.C6細胞、Sp2/0細胞、およびHEK293細胞から選択される。一態様において、上記ポリペプチドは抗体である。別の態様において、該抗体は、CD20、CD22、HLA-DR、CD33、CD52、EGFR、G250、GD3、HER2、PSMA、CD56、VEGF、VEGF2、CEA、Lewis Y抗原、IL-6受容体、またはIGF-1受容体に対する抗体である。以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。［１］  - 少なくとも2つの攪拌羽根を備えた1つの半径方向搬送要素と、  - 少なくとも2つの攪拌羽根をそれぞれ備えた1つ以上の軸方向搬送要素と、を備えたかき混ぜ機であって、  前記半径方向搬送要素の攪拌羽根が互いに平行であり、  すべての軸方向搬送要素の外径が前記半径方向搬送要素の内径以下であり、  すべての軸方向搬送要素が個別に前記半径方向搬送要素に接続され、  すべての軸方向搬送要素が前記半径方向搬送要素の内部に位置し、かつ  すべての搬送要素が互いに対して一定の空間的配向を有する、かき混ぜ機。［２］  軸方向搬送要素の数が1または2または3であることを特徴とする、［1］記載のかき混ぜ機。［３］  1つの軸方向搬送要素が、前記半径方向搬送要素の羽根の頂部からの最大距離の80％の所に位置しており、かつ／または1つの軸方向搬送要素が、前記半径方向搬送要素の羽根の頂部からの最大距離の20％の所に位置していることを特徴とする、前記［1］〜［2］のいずれか一項記載のかき混ぜ機。［４］  前記半径方向搬送要素の対向する攪拌羽根が軸方向搬送要素の2つの反対向きの攪拌羽根によって互いに連結されることを特徴とする、前記［1］〜［3］のいずれか一項記載のかき混ぜ機。［５］  前記半径方向搬送要素がアンカー翼であることを特徴とする、前記［1］〜［4］のいずれか一項記載のかき混ぜ機。［６］  前記軸方向搬送要素が傾斜羽根攪拌機であることを特徴とする、前記［1］〜［5］のいずれか一項記載のかき混ぜ機。［７］  前記傾斜羽根攪拌機の攪拌羽根の傾斜度が前記かき混ぜ機のシャフト軸に対して10°から80°であることを特徴とする、［6］記載のかき混ぜ機。［８］  前記半径方向搬送要素が1つ〜8つの攪拌羽根を有することを特徴とする、前記［1］〜［7］のうちの一項記載のかき混ぜ機。［９］  前記1つ以上の軸方向搬送要素が互いに独立して1つ〜10個の攪拌羽根を有することを特徴とする、前記［1］〜［8］のうちの一項記載のかき混ぜ機。［１０］  前記半径方向搬送要素の高さが少なくとも200mmであることを特徴とする、前記［1］〜［9］のいずれか一項記載のかき混ぜ機。［１１］  ［1］〜［10］のいずれか一項記載のかき混ぜ機を培養容器内部に備える、装置。［１２］  透析モジュールをさらに備えることを特徴とする、［11］記載の装置。［１３］  培養容器が攪拌タンク反応器であることを特徴とする、［11］および［12］のいずれか一項記載の装置。［１４］  前記培養���器が液中通気式（submersed gassed）攪拌タンク反応器であることを特徴とする、［11］〜［13］のいずれか一項記載の装置。［１５］  かき混ぜ機径(d)と培養容器径(D)の比d/Dが0.2〜0.8であることを特徴とする、［11］〜［14］のいずれか一項記載の装置。［１６］  前記培養容器の充填高さ(H)と培養容器幅(D)の比H/Dが1.0〜2.5であることを特徴とする、［11］〜［15］のいずれか一項記載の装置。［１７］  ポリペプチドを発現する細胞を培養するための、［1］〜［10］のいずれか一項記載のかき混ぜ機または［11］〜［16］のいずれか一項記載の装置の使用。［１８］  以下の工程を含む、ポリペプチドを製造するための方法：  (a)前記ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を提供する工程；  (b)本明細書に記載の装置を提供する工程；  (c)前記細胞を前記装置内で培地中で培養する工程であって、かき混ぜ機が培養容器内部に乱流を提供する、工程；および  (d)前記細胞または前記培地から前記ポリペプチドを回収し、それによりポリペプチドを製造する工程。［１９］  前記培養が透析であることを特徴とする、［17］記載の使用または［18］記載の方法。［２０］  前記細胞が哺乳類細胞であることを特徴とする、［17］もしくは［19］のいずれか一項記載の使用または［18］〜［19］のいずれか一項記載の方法。［２１］  前記哺乳類細胞が、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、COS細胞、PER.C6細胞、Sp2/0細胞、またはHEK293細胞から選択されることを特徴とする、［20］記載の使用または方法。［２２］  前記ポリペプチドが抗体であることを特徴とする、［17］および［19］〜［21］のいずれか一項記載の使用または［18］〜［21］のいずれか一項記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明による組合せ攪拌機の様々な態様の概略図であり、b：攪拌羽根の幅、d：攪拌機の径、dw：回転シャフトの直径、h：半径方向搬送攪拌機の攪拌羽根の高さ、hm：締結スリーブの高さ、hSB：軸方向搬送攪拌機の高さ、hu：径違い継手の高さ、l：軸方向搬送攪拌機の攪拌羽根の長さ、α：軸方向搬送攪拌機の羽根傾斜度、z：攪拌機1つ当たりの攪拌羽根数、di：半径方向搬送攪拌機の攪拌羽根間の内側距離、h4/5：hの上方から4/5までの高さ、K：攪拌機ヘッドであり、a)は本明細書に記載のかき混ぜ機の一般的図式であり、b)〜f)は本明細書に記載のかき混ぜ機の複数の態様であり、g)はシャフト軸に沿って上面から見た半径方向搬送要素の図であり、h)はシャフト軸に沿って上面から見た軸方向搬送要素の図であり、i)は軸方向搬送要素の接続攪拌羽根を介した半径方向搬送要素の対向する攪拌羽根の接続を示す、シャフト軸に沿って上面から見た本明細書に記載のかき混ぜ機の一態様の図であり、j)は軸方向搬送要素の直径が半径方向搬送要素の内径未満であり空間距離がコネクターによって埋められている、軸方向搬送要素の接続攪拌羽根を介した半径方向搬送要素の対向する攪拌羽根の接続を示す、シャフト軸に沿って上面から見た本明細書に記載のかき混ぜ機の一態様の図である。
【図２】透析培養のための装置の概略図である。
【図３】透析モジュールの中空繊維の濃度勾配の概略図である。
【図４】反応器（CR）および貯蔵容器（CV）内の濃度の典型的な時間変化を示す。
【図５】レイノルズ数（Re）の関数としての異なる攪拌機の混合係数CHの比較を示し、KR＝本明細書に記載の組合せ攪拌機、SSR＝標準の円板攪拌機、SBR＝傾斜羽根攪拌機である。
【図６】体積比動力入力および攪拌機構成の関数としての基準フレーク直径dVFを示し、KR＝本明細書に記載の組合せ攪拌機、SSR＝標準の円板攪拌機、SBR＝傾斜羽根攪拌機、Pohlscheidt, M., et al.＝Chem. Ing. Tec. 80 (2008) 821-830である。
【図７】レイノルズ数（Re）の関数としての異なる攪拌機の動力係数Neを示す図であり、KR＝本明細書に記載の組合せ攪拌機、SSR＝標準の円板攪拌機、SBR＝傾斜羽根攪拌機である。
【図８】比動力入力の関数としての透析における物質移動係数kaを示し、KR＝本明細書に記載の組合せ攪拌機、SBR＝傾斜羽根攪拌機である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
発明の詳細な説明
本明細書において、1つ以上の規定され一体化された軸方向搬送要素と半径方向搬送要素とを備えた、組合せ攪拌機としてのかき混ぜ機が記載される。「要素」という用語は、距離および角度に関して互いに対して一定の空間構成にある攪拌羽根の（機能）単位を指す。半径方向搬送要素は、攪拌羽根がシャフト軸に対して傾斜を有さない攪拌機を指す。軸方向搬送要素は、攪拌羽根がシャフト軸に対して傾斜を有する攪拌機を指す。搬送要素の攪拌羽根は、他の幾何学的形態を用いてもよいが、一態様においては矩形板である。要素の搬送方向は、かき混ぜ機のシャフト軸に対して表される。軸方向搬送要素、特にその個々の羽根は、半径方向搬送要素の羽根間に接続される部品として配置される。本明細書においては、上記かき混ぜ機と培養容器とを備えた装置も記載される。上記かき混ぜ機および上記装置の、細胞の培養、特に、例えば内部透析または外部透析などの半連続プロセスにおける使用がさらに記載される。本明細書に記載のかき混ぜ機の例示的な態様を図1に示す。
【００２９】
搬送要素のそれぞれは、規定数の攪拌羽根からなる。各羽根は、回転シャフトに直接接続されるかまたはハブを介して回転シャフトに接続される。搬送要素から独立した各攪拌羽根は外縁と内縁とを有する。各攪拌羽根のシャフト軸までの距離が最大である部分を羽根の先端とする。各搬送要素は外径と内径とを有する。例えば、軸方向搬送要素の外径は、対向する攪拌羽根の先端間の最大距離であり、半径方向搬送要素の内径は、対向する攪拌羽根の内縁間の最小距離である。本明細書に記載のかき混ぜ機において、軸方向搬送要素は半径方向搬送要素の内部に位置する。したがって、（すべての）軸方向搬送要素の外径は、半径方向搬送要素の内径以下であり、軸方向搬送要素を半径方向搬送要素の内部に配置することを可能にしている。軸方向搬送要素（のそれぞれ）のいくつかの攪拌羽根は、半径方向搬送要素の対向する攪拌羽根を接続する。半径方向搬送要素はこの接続によって互いに直接接続されるわけではないので、軸方向搬送要素（のそれぞれ）は個別にすなわち単独で半径方向搬送要素に接続される。軸方向搬送要素の接続攪拌羽根は、半径方向搬送要素の攪拌羽根間の距離全体にわたって攪拌羽根として形成される必要はない。このため、軸方向搬送要素の接続羽根は、上記距離全体にわたって軸方向に搬送する機能を有する必要はない。すなわち、上記距離全体にわたって攪拌羽根として形成される必要はない。つまり、軸方向搬送要素の攪拌羽根は、半径方向搬送要素の攪拌羽根の内縁までの空間距離より短くてもよい。この空間的隔たりは、特別な形態を有するわけではないが軸方向搬送要素の羽根の先端を半径方向搬送要素の羽根の内縁に接続するコネクターによって埋められる。
【００３０】
半径方向搬送要素の高さhは軸方向搬送要素の高さhSBの10倍を超える。このため、軸方向搬送要素のそれぞれを半径方向搬送要素の高さに対して異なる位置に配置可能である。一態様において、軸方向搬送要素が位置するつまり配置される最大距離は、かき混ぜ機のヘッドKに対して半径方向搬送要素の全高hの80％である。このことは、軸方向搬送要素のかき混ぜ機のヘッドからの最大距離が0.8hであることを指している。
【００３１】
回転シャフト（駆動シャフトともいう）は、かき混ぜ機が使用される培養容器の縦軸を通って伸びている。
【００３２】
主に半径方向に搬送する攪拌翼、例えばアンカー翼に関する変更点は、半径方向搬送要素の上側および／または中央および／または下側の領域に一体化された（軸方向に）下方搬送する傾斜羽根攪拌機である。本明細書に記載のかき混ぜ機は、例えば、酸もしくは塩基などの中和剤、栄養液、消泡剤、またはCO2もしくはO2などを液体表面を介して導入するために、とりわけ、溶液の混合が改善される。さらに、かき混ぜ機は、泡沫形成を低減し、透析プロセスにおいては、生物付着を低減し、透析モジュールにぶつかる直接の直交流れにより物質移動を増加させる。この追加の軸方向搬送要素は、驚くべきことに、透析モジュールにおける混合および物質輸送を改善しながらも剪断応力を増加させないことが分かっている。
【００３３】
例えば外部透析または内部透析などの半連続培養プロセスにおいては、基質が膜を通して反応器に供給され、それと同時に、阻害成分／培養細胞の代謝産物が排出される。この物質交換は、拡散による。したがって、主な影響要因は、現状の濃度差、膜材料、膜表面、膜材料内部の各化合物の拡散係数、および膜にぶつかる流れによって決定される相界面の厚さである。
【００３４】
透析が高細胞密度発酵で用いられる場合、透析は、反応器内に取り付けられた（中空繊維）透析モジュールが培地と新鮮な培養液との交換領域を提供する灌流様の半連続プロセスである。培養液は、貯蔵容器から汲み出されて透析モジュールを通り、その後、再び貯蔵容器へ戻される（図2の概略図参照）。透析モジュールは、反応器の外側に位置していてもよく（外部透析）、反応器内部に位置していてもよい（内部透析）。どちらの動作モードにも同じ物理法則が当てはまる。
【００３５】
このため、本明細書においては、本明細書に記載のかき混ぜ機と培養容器とを備えた装置が記載される。一態様において、上記装置は透析モジュールも備える。上記装置の各構成要素は、意図された機能を発揮できるような寸法、すなわち、培養容器は、培地を取り込むことができ、かき混ぜ機は、培地を混合し、添加された化合物を分散させることができ、透析モジュールは、新鮮な培地を提供し、培養細胞によって分泌される代謝化合物を排出することができるような寸法に合わせられている。このため、かき混ぜ機は、透析モジュールの有無に関わらず容器内で妨げられることなく回転することが可能な直径を有する。本明細書に記載の装置を用いれば、灌流培養としてまたは透析培養としての高細胞密度培養を有利に実施できることが分かっている。培養は、一態様においては、培地へのレイノルズ数に依存しない一定の動力入力を達成可能なかき混ぜ機の回転速度で実施される。すなわち、培養中、培養容器内の培地の乱流が提供される。本明細書に記載の装置を用いると、公知の攪拌機と比較してかき混ぜ機の回転速度がより低速であっても同じ動力入力で、剪断による影響を受けやすい哺乳類細胞を培養することが可能である。
【００３６】
培養容器の形態は限定されない。一態様において、培養容器は円筒容器である。別の態様において、培養容器は攪拌タンク反応器である。培養容器は任意の寸法を有し得る。一態様において、培養容器は5 l〜25,000 lの作業容量を有する。
【００３７】
新鮮な培養液からの成分は透析モジュールの内部から半透過性中空繊維膜を通過して反応器へと拡散し、それと同時に、培養細胞の代謝物は濃度差に応じて反対方向に反応器から培養液へと拡散する。その目的は、反応器内の阻害代謝物の絶対濃度を可能な限り低く保つ（希釈）と同時に必須栄養分の濃度を可能な限り長く培養に最適なレベルに維持することである。この結果、透析を行わないプロセスと比較して培養条件が改善され、それにより、より高い最大細胞密度または生成物力価を達成することが可能になる。
【００３８】
透析モジュールでの輸送プロセスは、フィックの第1法則と関連して二重境膜説によって気泡での物質移動と同等に説明することができる。このため、中空繊維透析モジュールの交換領域AHに基づいた線形勾配を仮定すると、有効移動拡散流束Jeffは、下記式1による。
0005827617.tif 000002
【００３９】
拡散の推進力は、有効拡散経路zeffに対する透析モジュールの内外の濃度差ΔCiである。この有効拡散経路は、透析モジュールの中空繊維膜の内側の内側層流境界層δBI、中空繊維膜自体δM、および反応器内の中空繊維膜の外側の外側層流境界層δHIをそれぞれ通過する個々の経路で構成される（図3参照）。それらは一般に拡散分子の大きさおよび形状、周囲の培地の性質、ならびに温度に依存する。
【００４０】
上記の部分のそれぞれについて別個の物質移動係数を定義することができ、それらの逆数の合計から、式2により全物質移動抵抗1/kが求められる。
0005827617.tif 000003
【００４１】
中空繊維膜の内側および外側の層流境界層における輸送抵抗もまた、中空繊維膜にぶつかる流れに依存する。膜に向かう流れが良好なほど、すなわちより垂直になるほど、層流境界層は狭くなり、対応する輸送抵抗は低くなる。
【００４２】
反応器内の透析モジュールに関しては、外側層流境界層の輸送抵抗は、とりわけ以下の要因に直接依存する:
・攪拌機の回転速度、
・攪拌機の種類、
・膜にぶつかる流れ、
・攪拌機によって生成される主な流れプロファイル。
【００４３】
中空繊維膜の内側の層流境界層の抵抗は、内径が小さいこと、およびそれに伴って流速が速いことにより無視できる。本出願において、「中空繊維膜の内側」という用語は、中空繊維膜の貯蔵容器に面する側を指す。「中空繊維膜の外側」という用語は、中空繊維膜の反応器に面する側を指す。これにより、全物質移動抵抗は、主に膜内部の抵抗と外側層流境界層の抵抗とが寄与する直列抵抗である（Rehm, et. al., Biotechnology - volume 3: Bioprocessing, VCH Weinheim, 1993）。全物質移動係数kは、全物質移動抵抗の逆数の結果であり、中空繊維透析モジュールの体積比表面aとの乗算により表面積と関係づけることができる（ka値）。
【００４４】
以下の式3を用いて、差し引きした間隔である（balance space）反応器および貯蔵容器の濃度の時間経過を説明することができる。
0005827617.tif 000004
【００４５】
反応器cRおよび貯蔵容器cVにおける典型的な濃度の時間経過を図4に示す。
【００４６】
概して、液中通気式反応器が細胞培養に用いられる。これらの場合、一段または二段の軸方向搬送攪拌システムが主に用いられる。このことにより、使用される攪拌機の回転シャフトと本質的に平行な流れプロファイルが生じる。このため、図2に示す配置において、回転シャフトに平行な透析モジュールを用いると、透析モジュールにぶつかる直接の流れは得られない。このことは、透析モジュール内の物質輸送に悪影響を及ぼす（繊維表面上のより広い外側層流境界層）。
【００４７】
透析膜にぶつかる直接の接線方向流れつまり半径方向流れは、例えば標準のアンカー翼によって達成可能な有利な効果を有する。この攪拌翼は、反応器内の1つまたは複数の透析モジュールに直接向けられ、ひいては透析モジュール表面上の層流境界層を低減する流れを発生させる。しかしながら、この単純な半径方向流れは、特に、反応器の混合および特に液中通気式反応器における物質移動に関して、その他の基本的な技術的プロセス機能に不利である。気体は、例えばパイプスパージャまたはリングスパージャを介して培養容器に導入され得る。
【００４８】
本明細書に記載のかき混ぜ機（組合せ攪拌機）は透析モジュールにぶつかるかまたは向かう直接の直交流れを提供し、それと同時に培地表面での／からの液体の混合および培地の迅速な全体混合に適しており、それにより、反応器内の細胞の剪断応力が他の攪拌システムと比較してほとんど増加しないことが分かっている。軸方向搬送要素すなわち例えば傾斜羽根攪拌機によって生じる軸方向流れが短時間での培地の混合を確実にするということが判明した。さらに、本明細書に記載のかき混ぜ機を用いることによって、哺乳類細胞のような剪断による影響を受けやすい細胞を同じ剪断応力で高い混合効率で培養することができる。
【００４９】
本明細書に記載のかき混ぜ機は、透析プロセスにおける応用にとって重要な半径方向搬送要素の性質すなわち例えばアンカー翼の性質を、基本的な技術的プロセス要件または機能を果たすのに重要な例えば傾斜羽根攪拌機などの軸方向搬送要素の性質と組み合わせるかまたは統合する。本明細書に記載のかき混ぜ機の例示的な態様を、半径方向搬送要素（アンカー翼）の接続要素の1つ以上が軸方向搬送要素（傾斜羽根攪拌機）として設計されている図1a)〜図1f)に示す。図1a)〜図1f)には特定の態様を示す。
【００５０】
攪拌機の回転速度nを特徴的な速度として用い、攪拌機幅dを特徴的な長さとして用いる。
【００５１】
流体力学において、レイノルズ数は水力学システムにおける慣性力と内部摩擦力の比を表す。そこから、動かされた培地の乱流の程度について説明することもできる。攪拌された液体に関して、攪拌機レイノルズ数は式4において以下のように定義される。
0005827617.tif 000005
【００５２】
ニュートン数（動力数ともいう）は抵抗力と流れの力の比を表し、それゆえに攪拌された材料における流れ抵抗の尺度であり、式5で表される。
0005827617.tif 000006
【００５３】
プロペラ攪拌機または傾斜羽根攪拌機などのニュートン数の低いかき混ぜ機は、ラシュトンタービンなどのニュートン数の高いものよりも効率的に動力入力を水力学的出力すなわち流体の動きに変換する。
【００５４】
培養プロセスにおける攪拌プロセスを評価するための基準として、混合時間が挙げられる。不均質な液体と液体との混合における「混合時間」とは、培地において規定の均質性を達成するのに必要な時間を指す。混合時間に影響を及ぼす要因は、混合の程度および観察部位である。そして、混合の程度は、反応器の幾何学的形状、攪拌機の幾何学的形状、攪拌機の回転頻度、および攪拌される材料の物質に依存する。
【００５５】
培養プロセスにとって重要なのは、可能な限り、すべての細胞に、必要な基質（培養液、O2等）が最適かつ均一に供給されることと、代謝物（オーバーフロー生成物、CO2等）が同時に排出されることである。つまり、細胞の損傷を回避するために、反応器内で空間的および時間的に起こり得る貯蔵および沈積が回避または最小化されなければならない。これは、例えば反応器内容物の混合に適合させた攪拌システムを用いることによって達成することができる。混合プロセスは、サブプロセスであるミクロ混合とマクロ混合とに分類することができる。ミクロ混合は拡散またはミクロ乱流による分子濃度調節として定義され、これに対して、マクロ混合は攪拌機によって引き起こされる対流性の粗混合として定義される（例えば、Houcine, I., et al., Chem. Eng. Technol. 23 (2000) 605-613; Zlokarnik, M., "Ruhrtechnik Theorie und Praxis", Springer Publishers, Berlin Heidelberg, 1999参照）。混合の程度は、Henzler（Henzler, H.-J., "Homogenisieren: Referenz-Ruhrsysteme und Methoden zur Erfassung der Homogenisierungseigenschaften von Ruhrsystemen", GVC Fachausschus Mischvorgange, 1998）により、以下のように式6で定義することができる。
0005827617.tif 000007
【００５６】
この式において、
0005827617.tif 000008
は理論上完全な混合の後のトレーサ物質の濃度に対応し、Δaは時間tにおけるトレーサ物質の局所的濃度の最大差に対応する。概して、相互混合の程度X1 = 0.95が十分であるとみなされる（上記Henzler参照）。式7で表される混合係数CH 0.95は、この混合の程度に基づくものであり、混合時間Θ0.95と使用された攪拌機の回転速度nとの積である。このように、上記混合係数は、相互混合の程度0.95を達成するために中和剤を添加した後で必要とされる攪拌機の回転の回数に対応し、式7の結果として得られる。
0005827617.tif 000009
【００５７】
表1に示しかつ図5に抜粋した混合係数は、脱色法を用いることによって測定されたものであり、混合時間調査（混合特性、式7参照）の結果として得られる。複数回の計測によって最大相対誤差は±15％と決定された。
【００５８】
（表１）混合係数
0005827617.tif 000010
【００５９】
表1に提示したデータから、本明細書に記載のかき混ぜ機（KR）は、例えば3つの別個の傾斜羽根攪拌機からなる平均混合係数64の攪拌機組み合わせ（3SBR）と比較すると、一定のレイノルド数で略31という極めて短い平均混合指数を提供することが分かる。実験では、チオ硫酸ナトリウムがかき混ぜ機のシャフト付近で迅速に液体に吸い込まれることが分かる。
【００６０】
動物細胞の培養のための別のプロセス関連パラメータは、培地中の細胞にかかる剪断応力である。動物細胞の培養は、とりわけ、細胞にかかる機械的および水力学的応力によって制限される。応力は、一方では攪拌機自体によって、他方では培地の気泡曝気によって、生じる（例えば、Wollny, S., and Sperling, R., Chem. Ing. Tec. 79 (2007) 199-208参照）。攪拌タンク反応器内の大部分を占める乱流領域に関しては、水力学的応力は、式8によるレイノルズ応力のアプローチによって求められる（Henzler, H.J. and Biedermann, A., Chem. Ing. Tec, 68 (1996) 1546-1561）。
τturb＝ρ・u'2（式8）
【００６１】
式8によると、主な応力を流体要素の乱流速度変動u'によるものと推論することができる。
【００６２】
剪断応力の特性決定を、通気しない状態で内蔵の透析モジュールで実施した。測定された基準粒径dVFを図6に示す。
【００６３】
本明細書に記載のかき混ぜ機を用いると、最大基準粒径のうちの1つが得られ、それゆえ、これが一定の動力入力で剪断が最も低いシステムであることが分かる。このため、例えば培養細胞について同じ剪断力では、より高い回転数になることでより強い乱流および透析モジュールにぶつかるより強い流れならびにより良好な完全混合につながるより高い動力入力を達成することが可能である。
【００６４】
NaClに加えて、グルコースもトレーサ物質として物質移動係数を実験的に測定するために用いた。概して、透析モジュールの物質移動は一方では動力入力に影響され、他方では攪拌機の幾何学的形状、すなわち一次的に生じた流れモードに影響されることが示された。接線方向流れつまり半径方向流れのプロファイルは、中空繊維透析膜の周りの外側層流境界層を減少させる（物質移動速度を速める）ことに関して特に適切であることが分かった。いずれの場合にも本明細書に記載のかき混ぜ機によって最も高い物質移動係数を達成することができる。
【００６５】
図7は、ニュートン数の比較を示す。図示するように、本明細書に記載のかき混ぜ機は、ニュートン数が著しく高い。同時に、動力数はレイノルズ数と無関係であることが分かる。このため、かき混ぜ機は、反応容器内部に乱流を生じさせるために動作するときは、レイノルズ数とは無関係に高い動力数を提供する。
【００６６】
図8は、一定の体積比動力入力での透析モジュールの最も高い物質移動係数が本明細書に記載のかき混ぜ機で達成可能であることを示している。これは、標準の攪拌システムと比較して中空繊維透析モジュールにぶつかるより良好な流れを可能にする本発明による攪拌機が発生させる半径方向流れによるものである。
【００６７】
標準の攪拌システムと比較すると、本明細書に記載のかき混ぜ機は、混合（図5、表1）、発生する剪断応力（図6）、および透析における物質移動係数（図8）の点で大きな利点を提供する。特に顕著であるのは、導入された変更にもかかわらず、有意に高い剪断応力は計測されないことである（例えば、Pohlscheidt, M., et. al., Chem. Ing. Tec. 80 (2008) 821-830参照）。
【００６８】
本出願において用いられる略語は以下の意味を有する（図1aも参照）。
b：半径方向搬送要素の羽根の幅
d：かき混ぜ機の全外径
dw：シャフトの直径
h：半径方向搬送要素の攪拌羽根の高さ
hm：締結スリーブの高さ
hSB：軸方向搬送要素の高さ
hu：径違い継手の高さ
Δh：2つの軸方向搬送要素の高さの差
l：軸方向搬送要素の攪拌羽根の長さ
α：軸方向搬送要素の羽根の羽根傾斜度
z：攪拌機1つ当たりの攪拌羽根数
di：半径方向搬送要素の攪拌羽根間の内側距離
h4/5：hの上方から4/5までの高さ
K：攪拌機ヘッド、すなわち回転シャフトに取り付けられていないときの攪拌機の最も高い点
D：培養容器の内径
H：培養容器の充填高さ
【００６９】
一態様において、2つの軸方向搬送要素の高さの差（Δh）と培養容器径（D）の比は少なくとも0.75である。
【００７０】
本明細書において、一局面としてタンパク質または抗体の組換え製造のための細胞の培養のための本明細書に記載のかき混ぜ機の使用が記載される。一態様において、培養は透析である。さらなる態様において、培養は、液中通気式攪拌タンク反応器内で実施される。別の態様において、細胞は真核細胞であり、別の態様においては哺乳類細胞である。なおさらなる態様において、細胞は、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、COS細胞、PER.C6細胞、Sp2/0細胞またはHEK293細胞である。一態様において、細胞は、アルスロバクター・プロトホルミエ（Arthrobacter protophormiae）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草菌（Bacillus subtilis）、BHK細胞、カンジダ・ボイジニ（Candida boidinii）、セルロモナス・セルランス（Cellulomonas cellulans）、コリネバクテリウム・リリウム（Corynebacterium lilium）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、CHO細胞、大腸菌（E.coli）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）、H.ポリモルファ（H. polymorpha）、HEK細胞、HeLa細胞、ラクトバチルス・デルブリュッキ（Lactobacillus delbruekii）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）、ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）、MDCK細胞、パエニバチルス・マセランス（Paenebacillus macerans）、P.パストリス（P. pastoris）、シュードモナス（Pseudomonas）属種、出芽酵母（S. cerevisiae）、ロドバクター（Rhodobacter）属種、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）、ストレプトマイセス（Streptomyces）属種、ストレプトマイセス・アヌラタス（Streptomyces anulatus）、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）、Sf-9細胞、およびキサントモナス・カンペストリス（Xantomonas campestris）から選択される。なおさらなる態様において、抗体は、CD20、CD22、HLA-DR、CD33、CD52、EGFR、G250、GD3、HER2、PSMA、CD56、VEGF、VEGF2、CEA、Lewis Y抗原、IL-6受容体、またはIGF-1受容体に対する抗体である。
【００７１】
以下の実施例および図面は、本発明の主題を例示するために提供される。保護範囲は添付の特許請求の範囲によって定められる。開示された方法の主題を本発明の主題から逸脱することなく変更することができることは明らかである。
【実施例】
【００７２】
実施例1
培養容器
すべての調査を100 lのPlexiglas（登録商標）モデル容器（以下DN440と呼ぶ）中で実施した。
【００７３】
実施例2
動力入力
異なる攪拌機の動力入力を、回転シャフトのトルクを計測することによって測定した。データ処理システムモデルGMV2をトルクセンサモデルDRFL-II-5-A（どちらも"ETH Messtechnik" Company, Gschwend, Germanyから）と共に用いてトルクを記録した。攪拌システムごとに、まず無充填状態（Mempty）で様々な回転速度でトルクを記録し、次いで、充填状態（Mload）で式9により三重測定によってトルクを記録した。
M＝Mload−Mempty（式9）
【００７４】
その後、対応するニュートン数（Ne数）およびレイノルズ数（Re数）をポイントごとに算出した。攪拌システムのニュートン数は乱流領域内で一定になるため、算出したニュートン数を次いでこの領域内で平均した（UhI, V. W. and Gray, J.B., Mixing Theory and Practice, Academic Press, 1966）。この平均値は、各攪拌機の全ニュートン数を表す。
【００７５】
実施例3
均質化
変色法および導電率法を用いて均質化を測定した。
【００７６】
変色法は、ヨウ素ヨウ化カリウムで染色されたデンプン溶液をチオ硫酸ナトリウムの添加により脱色させることに基づくものである（I、KI、デンプン、Na2S2O3はCarl Roth GmbH & Co KG Company, Karlsruhe, Germanyより入手）。1モルのチオ硫酸ナトリウム溶液および1モルのヨウ素ヨウ化カリウム溶液（ルゴール溶液）ならびに10g/lの濃度のデンプン溶液を出発溶液として用いた。導電率実験に対応して、攪拌機1つ当たり少なくとも4段階の速度を試験し（速度1段階当たり四重測定）、容器充填量当たり最大で4つの実験を実施した。いずれの場合にも、容器を1回充填するたびにデンプン溶液を添加した。計測ごとに、対応する体積のヨウ素ヨウ化カリウム溶液をまず添加し、次いで、チオ硫酸ナトリウムを添加した。混合時間は、チオ硫酸ナトリウムの添加時点から手動で測定し、添加時間を考慮に入れるためにいずれの場合にも1秒を差し引いた。計測完了後、先に添加された過剰のチオ硫酸ナトリウムを相殺するために、容器充填体積をヨウ素ヨウ化カリウムで滴定（中和）した。
【００７７】
導電率法においては、混合時間は、電解質溶液の添加から、最後に計測された導電率の変動が定常状態で達する導電率値を中心として±5％の許容差範囲を超えた時点までの時間として定義される。いくつかのプローブが用いられるのであれば、いずれの場合にも最長の検出混合時間がシステム全体の代表とみなされる。
【００７８】
30％(w/v)NaCl溶液（NaCl結晶、Merck KGaA Company, Darmstadt, Germany）を電解質溶液として用いて、導電率法によって混合時間を測定した。この溶液を攪拌機の回転シャフトにおいて液体表面にパルスで添加し、添加1回当たりの体積は、定常状態で生じた導電率の急な変化が200mS/cmを超えないように選択した。
【００７９】
攪拌機ごとに少なくとも4段階の速度を試験した。速度1段階につき少なくとも8回混合時間を測定し、これらの8つの値を平均した。各攪拌システムの混合係数は、速度1段階ごとに平均された混合係数の平均値として求められる。導電率は、いずれの場合にも、3つの4極導電率プローブ（TetraCon, WTW Company, Weilheim）によって容器内の様々な半径方向位置または軸方向位置で計測した。導電率信号は、使用した計測増幅器（Cond813, Knick "Elektronische Messgerate GmbH & Co, KG" Company, Berlin, Germany）を介してオンラインで読み出した。計測値は、サンプリングレート5秒でソフトウェアParaly SW 109（Knick "Elektronische Messgerate GmbH & Co, KG" Company, Berlin, Germany）によってすべてのプローブについて同時にオンラインで記憶した。一連の計測を完了した後、データをプローブごとに個別に評価した。
【００８０】
実施例4
剪断応力
モデル粒子系として青色粘土ポリマーフレーク系を用いて剪断応力を測定した。これは、カチオンポリマー（Praestol BC 650）と容器内に置かれた粘土鉱物（青色粘土）とからなるモデル粒子系である。規定の大きさのフレークを生成するPraestol BC 650を添加することによって凝集反応を開始させる。次いで、これらのフレークを攪拌システムの機械的および流体力学的応力によって破壊する。気泡通気式システムの場合は、気泡が形成され破裂する際のエネルギーの散逸によってさらに破壊される。モデル粒子系の平均粒径を計測変数として用いて剪断応力を特性決定した。この場合、Mettler Toledo CompanyのFocused Beam Reflectance Measurement Probe（以下FBRM（登録商標）と呼ぶ）によってインサイチューで粒度の変化を計測した。測定された粒度の変化率は、モデル系において優勢な剪断応力の尺度である。粒度の変化率の勾配は、実験中小さくなっていくが、平衡状態にはならない（青色粘土一次粒子の直径が15μmにほぼ等しくなるまでの粒子粉砕）。このため、以下の基準（式10）により、青色粘土ポリマーフレーク系の最終フレーク直径dp50'を測定した。
0005827617.tif 000011
【００８１】
異なる動力入力でかつ異なる攪拌機間での最終フレーク直径の比較性を確保するために、基準フレーク直径を以下のように算出した（式11〜13）。
0005827617.tif 000012
【００８２】
（表２）粒子応力の測定に使用した物質（濃度は容器充填体積に基づく）
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【００８３】
まず、100 lのモデル容器を、対応する体積（H/D比）の完全に脱塩した水（VE水）で充填し、20℃の温度に維持した。次いで、CaCl2溶液での滴定によって導電率を1000μS/cmの値に調節した。4極導電率プローブ(プローブ：TetraCon, WTW Co. Weilheim、計測増幅器：Cond813, Knick "Elektronische Messgerate GmbH & Co, KG" Company, Berlin, Germany）によって導電率を計測した。その後、適切な量の青色粘土とNaClとを上記溶液に添加した。次いで、均質化フェーズが少なくとも20分間、最高速度で起こった。FBRM（登録商標）プローブ(FBRM（登録商標）Lasentec（登録商標）D600L, Mettler-Toledo GmbH Co., Giessen, Germany）を、容器内に上方から垂直に（浸漬深さ300mm）壁までの半径方向距離70mmにて装着した。次いで、Praestol 650 BSを規定速度で添加することによって凝集反応を開始させた。プログラムデータ取得制御インターフェースバージョン6.7.0（Mettler-Toledo GmbH, Giessen, Germany）によって計測値をオンラインで記録した。計測データから基準フレーク径を決定した。攪拌機ごとに少なくとも3つの動力入力を計測した。いずれの場合にも、1つの動力入力につき3回の計測を実施した。
【００８４】
実施例5
透析（物質移動  液体-液体）
NaCl溶液（NaCl結晶、Merck KGaA Company, Darmstadt, Germany）をトレーサ物質として用いて、使用した攪拌システムおよび体積比動力入力に関連して、モジュール（DIADYN-DP 070 Fl OL; MICRODYN-NADIR GmbH Company, Wiesbaden, Germany）の濃度半減期を測定した。各実験開始時に貯蔵容器内でトレーサ物質を1500μS/cmの基準値導電率に調節した。各実験毎に反応器を完全に脱塩した水で充填した。反応器の充填体積は100 l（H/D = 1.6）、貯蔵容器の充填体積は400 l（H/D = 2.0）であり、両容器を各実験開始時に20℃の温度に維持した。両容器内の導電率を4極導電率プローブ（プローブ：TetraCon, WTW Co. Weilheim, Germany、計測増幅器：Cond813, Knick "Elektronische Messgerate GmbH & Co, KG" Company, Berlin, Germany）によって計測した。使用した計測増幅器のサンプリングレートは5秒であり、計測値はソフトウェアParaly SW 109（Knick "Elektronische Messgerate GmbH & Co, KG" Company, Berlin, Germany）によってすべてのプローブについて同時にオンラインで記憶した。NaCl溶液は、供給容器と透析モジュールとの間のぜん動ポンプ（housing pump 520 U, Watson-Marlow GmbH, Company, Rommerskirchen, Germany）によって、2.1 l/分の一定流量で循環させた。評価のために、プローブ1を反応器用の基準プローブとして用い、プローブ3を貯蔵容器用の基準プローブとして用いた。これらの2つのプローブのデータを評価ルーチンによって評価した。いずれの場合にも、攪拌機1つ当たり、反応器における少なくとも6つの異なる動力入力を調べた。
【００８５】
NaCl溶液によって測定された物質移動特性を比較するために、グルコース溶液をトレーサ物質として追加の計測を実施した。このために実験の段取りを変えることはしなかった。3g/lの濃度の規定のグルコース濃度（グルコース固形物、Merck KGaA Company, Darmstadt, Germany）を貯蔵容器内に提供した。グルコース濃度を、血糖計測器（ACCU-CHEK（登録商標）Aviva, Roche Diagnostics GmbH Company, Mannheim, Germany）によって、10分間隔で貯蔵容器および反応器について同時に手動で測定した。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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