(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)  配列番号11であるヌクレオチド配列、および
b)  配列番号11であるヌクレオチド配列に少なくとも90%同一のヌクレオチド配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む少なくとも1個の遺伝子の遺伝子産物のレベルを植物中で変化させる工程を含む、野生型と比較して調節された生育及び／またはバイオマスを有する植物の作製方法であって、
(i) 以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する工程：
a) 配列番号11であるヌクレオチド配列、および
b) 配列番号11であるヌクレオチド配列に少なくとも90%同一のヌクレオチド配列
(ii) 発現ベクターを少なくとも1つの植物中に導入する工程；及び
(iii) 野生型と比較して調節された生育及び／またはバイオマスを有する少なくとも1つのトランスジェニック植物を選択する工程、
を含む、野生型と比較して調節された生育及び／またはバイオマスを有する植物の作製方法。
【請求項２】
前記調節された発現が、配列番号11を含むポリペプチドをコードする遺伝子の遺伝子座において遺伝子改変を導入することによって達成される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記改変が、方法のいずれかの段階において、マーカーとして配列番号11を使用した、T-DNA活性化、TILLING、相同組み換え、部位特異的変異導入、または直接交配のうちの1つによって達成される、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記調節が生育における収量及び／またはバイオマスの増加である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項５】
a)  配列番号11である配列を含むヌクレオチド配列、
b)  a)のヌクレオチド配列の相補的ヌクレオチド配列、ならびに
c)  a)およびb)における配列のいずれか1つと少なくとも90%同一の核酸配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、組換えDNA構築物を提供する工程を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
a)のポリペプチドの保存的に置換された変異体を含むポリペプチドをヌクレオチド配列がコードする、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ヌクレオチド配列がヌクレオチド配列中におけるサイレント置換を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結された構成的、誘導性、または組織特異的プロモーターを組換えDNA構築物がさらに含む、請求項5から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
組換えDNA構築物が、請求項5に規定されているa)〜c) からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む転写カセットの前に強力な構成的プロモーターをさらに含み、続いて植物の機能的イントロン、続いて逆方向性の請求項5に規定されているa)〜c) からなる群から選択されるヌクレオチド配列をさらに含む、請求項5から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
植物の再生可能細胞を前記組換えDNA構築物で形質転換し、前記形質転換細胞からトランスジェニック植物を再生させる工程をさらに含む、請求項5から9いずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
a)  配列番号11である配列を含むヌクレオチド配列、
b)  a)のヌクレオチド配列の相補的ヌクレオチド配列、ならびに
c)  a)およびb)における配列のいずれか1つと少なくとも90%同一の核酸配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、組換えポリヌクレオチド(DNA構築物)を含むトランスジェニック植物。
【請求項１２】
a)またはc)のポリペプチドの保存的に置換された変異体を含むポリペプチドをヌクレオチド配列がコードする、請求項11に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１３】
ヌクレオチド配列がヌクレオチド配列中におけるサイレント置換を含む、請求項11または12に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１４】
前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結された構成的、誘導性、または組織特異的プロモーターを組換えDNA構築物がさらに含む、請求項11から13のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１５】
組換えDNA構築物が、請求項11に規定されているa)〜c) からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む転写カセットの前に強力な構成的プロモーターをさらに含み、続いて植物の機能的イントロン、続いて逆方向性の請求項11に規定されているa)〜c) からなる群から選択されるヌクレオチド配列をさらに含む、請求項12から14のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１６】
請求項11から15のいずれか一項に記載のトランスジェニックである植物の植物細胞または植物の子孫。
【請求項１７】
請求項11から15のいずれか一項に記載のトランスジェニックである植物により産生される木本。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的に分子生物学の分野に関し、植物の生育特徴を改良するための方法に関する。より具体的には、本発明は、植物及びトランスジェニック植物及び遺伝子の発現を変化させる特別な交雑法によって得られる植物の表現型を改変させて、その結果改変された生育表現型を得る方法に関する。本発明は、本発明の方法に有用な構築物をも提供する。さらに、本発明は、本発明による植物により作製される植物及び木本の植物細胞または植物の子孫に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、森林樹木工学および分子育種の主目的は、木材品質および産出量を改善することである。木製品に対する世界的需要は毎年約1.7%で増加しており、世界の森林からの最大持続収穫率にすでに到達しているまたは上回っているという事実にもかかわらず、木材消費のこのような増加が生じている。したがって、世界規模の植林地木材生産が増加する必要性がある。林業植林地は、増加する大気CO2に対応する炭素隔離作物としての利点も有する可能性がある。同様に、例えば、エネルギー生産のための原料に対する需要を満たすために、非木本植物からのバイオマス生産の増加は望ましい。したがって、高等種における細胞発生中の特定の過程を改変するのは、樹木の特性だけではなく、他の植物の特性も改良することになると、商業的に大いに興味深い。
【０００３】
頂端分裂組織による植物生育により、一連の一次組織が成長し、茎と根が伸びる。この一次生育に加えて、樹種は二次生育を経て形成層から二次組織「木部」を生成する。二次生育は茎と根の周囲の寸法を増加させる。
【０００４】
寿命の長い木などの多年生植物は、シロイヌナズナ(Arabidopsis)などの一年生植物とは、木本などの多年生植物が無限生長する一方で、シロイヌナズナのような植物は植物が花を咲かせる場合に生長が終わりを迎える点で、生活様式がかなり異なる。植物シロイヌナズナの最終的なサイズは、多くの点で、発芽から開花及び結実の発育プログラムに依存する。これらの事象の時期におけるあらゆる変化が、植物のサイズを劇的に変化させ得るのがその一例である。
【０００５】
多年生植物は、また、活発な成長期及び休眠期の間をサイクルする。活発な成長期の間、葉は光合成を行ってエネルギーを捕まえ、ついでそれらのエネルギーは使用されて様々な細胞の作用を駆動させる。スクロースに変換された固定炭素は、茎組織及び頂芽に移り、そこでは、初めはデンプンとして、後にスクロースとして、休眠期の間に貯蔵される。休眠から解き放たれた後に生長が再開される際、このスクロースは活発に生長している組織に移行するが、これは、再活性化の初期の段階は、光合成が開始する前に起こるからである。窒素に関しても同様であり、アミノ酸もまた茎頂組織に移行され、休眠の間、貯蔵タンパク質として蓄えられ、生長が開始する際に分解される。このようにして、長寿の木本の生活様式は、頻繁に炭素及び窒素を種子に移行させる一年生作物とは、著しく相違する。一年生作物と木本などの多年生植物の間のこれらの違いにより、生産量の決定要因及びこれらを測定するための能力はかなり相違することになる。実際、多くの場合、Populus tremula x Populus tremuloides (ヤマナラシの交雑種)などのモデル系は、バイオマス生産量を増加させるために使用され得る遺伝子を確実に発見するには遥かに優れている。一年生作物に関しては例えば、種子のサイズ／収量は、植物のサイズ及び生産力の測定手段として提案されているが、これは多年生植物の場合には考えにくい、なぜならば、木などの多年生植物は数年かけて花を咲かせるので、従って、例えあったとしても、種子の収量は、植物が花を咲かせる年の間に有効である生育条件の指標に過ぎないからである。従って、一年生作物から得られる研究及び発見の直接的な解釈が木本の場合において有効であるとは想定しにくい。
【０００６】
木本のバイオマスの非常に重要な部分は茎組織にある。このバイオマスの蓄積は、葉の光合成及び窒素獲得及び様々な細胞処理のための栄養素の再分配の結果である。葉のサイズ、葉の光合成、窒素を獲得するための能力、根系のサイズそれら自体が、全て、植物の生産性及びバイオマスの生産量の決定における重要な決定要因となり得る。しかし、これら自身よってはいずれも全体のバイオマス生産量を説明することはできない。例えば、葉のサイズは、葉のサイズにおいて発見され得る著しい変化ほどには常にバイオマスに関連しているわけではない。さらに、ストレスへ対処する能力は、バイオマス生産量の重要な決定要因である。それゆえに、木本におけるバイオマス生産量を高めるために変えることが必要な複数の要因が存在する。
【０００７】
さらに、木本の密度はバイオマス生産量の増加において重要な特質であり、木本の密度の増加により、輸送されるべき体積がより少なくなり、体積あたりにより多くのエネルギー含量を有する。従って、密度の増加は、例え全体のバイオマスが増加しない場合であっても興味深い。密度はまた、樹高及び直径における計量的生育の増加が木本の密度の減少と結び付かないことを示すので重要である。
【０００８】
生長を増加させるための1つの方法は、遺伝子機能についてより多く知り、その情報を用いることにより生育及びバイオマス生産量を増加させることである。かかる遺伝子機能の知識及びこの知識の使い方が本特許において記述される。
【０００９】
非常に多くの遺伝子が、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana） (Arabidopsis Genome Initiative 2000)及びPopulus tremula x tremuloides (Sterky et al. 2004)及びブラックコットンウツド（Populus trichocarpa） (Tuskan et al.2006)などのたくさんの植物において現在同定されている。
【００１０】
Hertzberg et al. 2001及びSchrader et al. 2005は、転写産物のプロファイリングを用いて、木部の発達の間における数千の遺伝子に対する転写の優先度を明らかにしたのみならず、発現データを提供した。かかるデータは、未知の機能を有する多くの遺伝子のさらなる解明を促進できる（White et al. 1999; Aharoni et al. 2000）。
【００１１】
残っている問題の1つとして、細胞分裂及び他の生長に関連するプロセスの調節に関与する潜在的に非常に重要な遺伝子を如何に同定するかがある。本発明において、我々は、それらの使用のためにいくつかの転写因子を調査し、それらは、過剰発現すると予期せずに生育を増加させた。分析用に転写因子を選択する理由は、植物を含む生物において例えほとんどのプロセスでないとしてもプロセスの多くの部分調節因子としてそれらが知られているからである。シロイヌナズナは、配列ホモロジーに基づいて〜30のサブクラスに分けることが可能な1500の異なる転写因子を含有すると予測されている（Riechmann et al. 2000）。ある転写因子が植物内で有する機能は、それが調節する遺伝子に密接に関連しており、例えば、MYBクラスとして転写因子サブグループ内の転写因子が類似しているにも関わらず、それらは植物において複数の異なるプロセスを調節することが知られている。転写因子は、特定の遺伝子または異なる遺伝子を含むゲノム領域の転写開始を抑制するかまたは活性化するかのいずれかにより、遺伝子の転写を調節するタンパク質である。
【００１２】
植物の性質を変化させるために利用可能な遺伝子を発見するために、植物において転写因子を特異的に標的化することは、既に行われている。例えばWO 02/15675において、非常にたくさんの転写因子が解析され、それらの多くに対する潜在的な使用が言及されている。US 2007/0039070はユーカリ及びラジアータパイン(Pinus radiata)由来の非常に多くの転写因子遺伝子を記載しかつリスト化しており、それらの遺伝子の使用に関して推測している。本明細書において、我々は、実験データにより裏付けらた、実質的に成育を増加させる点で、産業上の関連性を有する効果を持つ特定の転写因子を提示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】WO 02/15675
【特許文献２】US 2007/0039070
【特許文献３】US 2003101481
【特許文献４】US 7265263
【特許文献５】US 20070022495
【特許文献６】WO 01036444
【特許文献７】US 20060272060
【特許文献８】US 7238860
【特許文献９】US 20030226173
【特許文献１０】US 20040019927
【特許文献１１】WO 02015675
【特許文献１２】US 20030226173
【特許文献１３】US 20060195944
【特許文献１４】US 20070022495
【特許文献１５】WO 01035727
【特許文献１６】US 20060272060
【特許文献１７】WO 2007003409
【特許文献１８】US 20030226173
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Arabidopsos Genome Initiative 2000)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
EST計画、ゲノム配列決定およびDNAアレイ技術を使用した発現研究からの結果がどこでいつ遺伝子が発現するのかを立証できることは明白であるが、これらの種類の分析手段からのみで遺伝子の生物学的および/または技術的機能を明らかにすることはほとんど可能ではない。遺伝子機能を分析しかつ立証するためには、例えば、遺伝子不活化および/または遺伝子過剰発現により機能的特徴付けを実施しなければならない。しかし、興味深くかつほとんどの場合思いがけない商業的な特徴を備えた遺伝子を同定することができるためには、機能的解析に基づいて候補遺伝子を評価しなければならず、複数の判定基準を用いて生育の増加を測定しなければならない。
【００１６】
MYB転写因子。本明細書に提示される遺伝子の1つ（配列番号12）は転写因子のMYBクラスに属する。MYB転写因子ファミリーは、シロイヌナズナにおいて〜180のメンバーを有すると予測されている(Riechmann et al 2000)。複数の異なる機能が植物におけるMYB遺伝子に対して見出されている(Jin and Martin 1999)。配列番号12に密接に関連するより特異的な遺伝子が生長速度及びバイオマス生産量を調節することに関与することは知見として示されていない。密接に関連する遺伝子AT2G01060及びAB192880が生物ストレス応答に関与することが、US 2003101481及びKatou et al 2005で示されている。
【００１７】
SETドメイン転写因子(Ng et al. 2007)。本明細書で提示される遺伝子の1つである配列番号11は転写因子のSETドメインクラスに属する。SETドメインタンパク質はクロマチン構造を調節することにより転写を調節する。シロイヌナズナのゲノムは少なくとも29のアクティブなsetドメインタンパク質を含有することで知られている。配列番号11に密接に関連する遺伝子が生長速度及びバイオマス生産量を調節することに関与することは知見として示されていない。
【００１８】
転写調節因子のbHLHクラスは植物における転写因子の大きなグループであり、例えば、シロイヌナズナは〜139のメンバーを含有すると予測されている（Riechmann et al 2000）。bHLHタンパク質は、多くの異なるプロセスに関与する(稲における概説用にXiaoxing et al 2006を参照のこと）。本明細書に提示される遺伝子の1つである配列番号10は転写因子のbHLHクラスに属する。配列番号10に密接に関連する遺伝子が生長速度及びバイオマス生産量を調節することに関与することは知見として示されていない。
【００１９】
配列番号9の遺伝子はホメオボックス(Homeobox)クラス遺伝子に属する。構築物TF0013で過剰発現される遺伝子に最も近いシロイヌナズナのホモログはAT1G23380であると予測されている。構築物TF0013で過剰発現される遺伝子に対して関連性のあるジャガイモ（Solanum tuberosum）のホモログの過剰発現は、生育、節間長及び葉のサイズを減少させる（US 7265263）。構築物TF0013で過剰発現される遺伝子に対して関連性のあるシロイヌナズナのホモログの過剰発現は葉の形態を変化させる（US 7265263、US 20070022495及びWO 01036444）。構築物TF0013で過剰発現される遺伝子の発現レベルを変化させることによって収量及びバイオマス生産量を増加させるための使用は、これまで知られていない。
【００２０】
転写因子のIAA/AUXグループは主に植物において発見される転写因子の小さなグループである(Riechmann et al. 2000によりシロイヌナズナにおいて26のメンバーが予測された)。配列番号13に相当する遺伝子はこのグループに属し、Moyle et al 2002において記述される。配列番号13に密接に関連する遺伝子が生長速度及びバイオマス生産量を調節することに関与することは知見として示されていない。
【００２１】
WRKY遺伝子ファミリーグループ。WRKY転写因子ファミリーは植物における大きなファミリー遺伝子である。稲は90以上のメンバーを有すると予測され、シロイヌナズナは74のメンバーを有すると予測される(Ulker and Somssich 2004)。WRKY遺伝子と非常に関連している機能の1つは創傷及び病原体防御シグナリングであるが、また、非生物的ストレスに関与するシグナリング、並びに非生物的及び生物的ストレスの両方に対する抵抗性である。
【００２２】
本明細書に提示される8つの遺伝子は転写因子のWRKYクラスに属する。
【００２３】
配列番号4及び配列番号7はWRKY遺伝子のあるサブグループに属する。配列番号4及び配列番号7に密接に関連する遺伝子が生長速度及びバイオマス生産量を調節することに関与することは知見として示されていない。
【００２４】
配列番号1はWRKY遺伝子の別のサブグループに属する。配列番号1の遺伝子に密接に関連するシロイヌナズナのホモログ(AT2G23320)は、C/Nセンサー(sensing)(US 20060272060)、葉のサイズの変化（US 7238860、US 20030226173、US 20040019927、及びWO 02015675）及び種子タンパク質の含量の変化（US 20030226173）に関与すると考えられている。AT2G23320は、また、特許出願第WO 04087952によると、過酸化ストレスに対する反応及び順応に関与すると考えられている。US 20040019927、US 7238860、US 20030226173、WO 02015675は、葉のサイズの増大及び体長の増加と併せて遺伝子AT2G23320について言及しており、この遺伝子の過剰発現は生育及びバイオマス生産量の増加に利用可能であると推測されている。我々は本明細書において配列番号1が木本において生育を産業上有意な程度までに増大させるために使用可能であることを示している。
【００２５】
配列番号6は配列番号1が属しているサブグループに関連するWRKY遺伝子のサブグループに属するが、そのグループの遺伝子とは明らかに異なっている。この遺伝子に密接に関連する遺伝子は、シロイヌナズナにおける基礎的抵抗性（basal resistance）の負の調節因子として知られている（Journot-Catalino et al 2006）。密接に関連する遺伝子AT4G31550は、種子のプレニル脂質（prenyl lipid）及び種子のルテインの量に関係していると考えられている(US 20060195944及びUS 20070022495、及びWO 01035727)。配列番号6に対しての別の予測されたシロイヌナズナホモログであるAT2G24570は、C/Nセンサーに関与していると考えられている(US 20070022495及び20060272060)。配列番号6に密接に関連する遺伝子が生長速度及びバイオマス生産量を調節することに関与することは知見として示されていない。
【００２６】
配列番号2はWRKY遺伝子の別のサブグループに属する。配列番号2に密接に関連する遺伝子が生長速度及びバイオマス生産量を調節することに関与することは知見として示されていない。
【００２７】
配列番号3及び配列番号5は、2つのWRKYドメインを含有するWRKY遺伝子の大きなグループに属する。2つのWRKYドメインを含有する配列番号3及び配列番号5に対するいくつかの関連ホモログは、特許出願第WO 2007003409によれば、オリザ・サティバ(Oryza sativa)における種子の収量及び花の数を変化させるのに関与すると考えられている。発現レベルを変化させることによって生長及びバイオマス生産量を増加させるための利用はこれまで知られていない。
【００２８】
配列番号8はWRKY遺伝子の別のサブグループに属する。密接に関連するシロイヌナズナの遺伝子AT4G23810は、植物のサイズを減少させ、種子タンパク質の含量を変化させることに関与していることで知られている(US 20030226173)。別の関連するシロイヌナズナのホモログ（AT5G24110）は、種子タンパク質の含量を変化させ、早咲きを誘導させることに関与していることで知られている（US 20030226173)。配列番号8に密接に関連する遺伝子が生長速度及びバイオマス生産量を調節することに関与することは知見として示されていない。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明は、生育を増加させるために使用可能である新規遺伝子に関する。これらの遺伝子は、複数の判定基準の組合せに基づいた生育挙動を分析することに注力する分析プラットフォームを使用して発見される。本発明は、前記判定基準を満たす遺伝子のグループから選択された1個または複数の遺伝子の発現を変えることによりトランスジェニック植物を作製するための方法を提供する。従って、本発明は、植物及びトランスジェニック植物及び遺伝子の発現を変化させる特別な交雑法によって得られる植物の表現型を改変させて、その結果改変された生育表現型を得る方法に関する。本発明は、本発明の方法に有用な構築物をも提供する。さらに、本発明は、本発明による植物により作製される予期せぬ良好な特性を有する植物及び木本の植物細胞または植物の子孫に関する。
【００３０】
分析プラットフォームを使用して分析されるいくつかの遺伝子は、興味深く、ほとんどの場合予期せぬ商業的特徴を示す。したがって、本発明の態様は、転写因子の配列である配列番号1-13、97-115の1つに属する少なくとも1つの遺伝子の遺伝子産物のレベルを植物において変化させる（増加させる）工程を含む、その野生型と比べると予期せずに高い生育を示す植物を作製する方法を提供する。
【００３１】
明期18時間、温度22℃/15℃(昼/夜)および1対100に希釈した毎週施肥Weibulls Rika S NPK 7-1-5の下で、温室で8週間生育したトランスジェニック植物群を、同一条件の下で生育した野生型植物群と比較した際に、生育増加が観察可能である。
【００３２】
本発明の別の態様は、本発明による1つの遺伝子である配列番号1-13、97-115のレベルを意図的に変化させた（増加させた）、組換えポリヌクレオチドを含む、トランスジェニック植物または植物の植物細胞または植物の子孫を提供する。
【００３３】
本発明の追加の態様は、上記の特徴を意図的に有する植物により生成されるその産物及びバイオマスを提供する。
【００３４】
本発明のさらに別の態様は、本明細書に記載されるように上述の少なくとも1つの配列を含むDNA構築物を提供する。
【００３５】
最後に、本発明の一態様は、本発明によるDNA構築物を含む植物細胞または植物の子孫を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】樹高生育曲線の例を示す図である。4つの異なるデータ点で線形回帰によって得られた直線が示され、黒色の回帰直線は、最大樹高生育速度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
定義
本発明をさらに詳細に論じるのに先立って、以下の用語および従来技術をまず定義する。
【００３８】
用語「トランスジェニック植物」とは、同一種、変種または品種の野生型植物には存在しない遺伝子材料を含有する植物のことである。前記遺伝子材料には、トランス遺伝子、挿入変異事象(トランスポゾンまたはT-DNA挿入突然変異によるなどの)、活性化標識配列、変異配列、相同組換え事象またはキメラ形成法により改変された配列が挙げられ得る。典型的には、外来遺伝子材料は人的操作により植物に導入されてきた。前記用語は、遺伝子材料が選択マーカーとして機能するように挿入された植物のことでもある。そのような選択マーカーの例には、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノトリシン、クロルスルフロン、メトトレキサート、ゲンタマイシン、スペクチノマイシン、イミダゾリノン、d-アミノ酸およびグリフォセートが挙げられる。
【００３９】
本文脈において、用語「生育」は、茎および根の伸長を含む一次生育、ならびに形成層からの二次組織、すなわち「木部」の生成、および茎と根の周囲の寸法の増加を含む植物の二次生育を含む。したがって、語句「生育の増大」は、本文脈では、同一生育条件の下で生育された場合、トランスジェニック植物のもとになる野生型植物と比べてのトランスジェニック植物の生育の増大に関する。下記のように、トランスジェニック植物は、植物が以下の実施例に定義する「生育差選択判定基準」のうちの少なくとも1つを満たす場合、生育が増大していると特徴付けられる。
【００４０】
用語「表現型」とは、本文脈では、生育などの個々の植物の全物理的外観のことである。本文脈で使用される異なった生育表現型の例は、下表のtable1.2に収載されている。
【００４１】
用語「遺伝子」とは広く、生物学的機能と関連するDNAの任意のセグメントのことである。遺伝子には、コード配列および/またはコード配列の発現に必要な調節配列が挙げられる。遺伝子には、例えば他のタンパク質の認識配列(例えば、プロモーター、エンハンサー、または他の調節領域)を形成する非発現DNA核酸セグメントも挙げられる。遺伝子は、対象の供給源からのクローニングまたは既知のもしくは予想される配列情報からの合成を含む種々の供給源から得ることができ、所望のパラメーターを有するように設計された配列を含んでいてもよい。
【００４２】
「過剰発現」は宿主細胞中に導入される配列番号1-13、97-115または類似の配列のDNAによりコードされるポリペプチドまたはタンパク質の発現を意味し、ここで、前記ポリペプチドまたはタンパク質は宿主細胞中に通常存在しないか、あるいは前記ポリペプチドまたはタンパク質は、前記ポリペプチドまたはタンパク質をコードする内在性遺伝子より通常に発現するレベルより高いレベルで前記宿主細胞中に存在するかのいずれかである。
【００４３】
本発明のタンパク質の過剰発現は、望んだ組織において発達の望ましい段階で遺伝子の発現を指向することが可能なプロモーターに作動可能にコード領域が結合したキメラ遺伝子をまず構築することによって達成させてもよい。キメラ遺伝子はプロモーター配列及び同一遺伝子由来の翻訳リーダー配列を含んでもよい。転写終了シグナルをコードする3’非コード配列もまた提供されてもよい。本発明のキメラ遺伝子はまた1種以上のイントロンを含んでもよく、それにより遺伝子発現を促進させることができる。適切なプロモーターは、ベクターとしてアグロバクテリウムとともに使用してもよいCaMV 35 Sプロモーターであってもよい。
【００４４】
用語「RNA干渉」または「RNAi」とは一般的に、二本鎖RNA分子または短ヘアピンRNAが実質的なまたは完全な相同性を共有する核酸配列の発現を変化させるプロセスのことである。
【００４５】
用語「RNAi下方調節」とは、1つまたは複数のRNAi種により媒介される核酸配列の発現の減少のことである。用語「RNAi種」とは、RNAiを誘発する特徴的なRNA配列のことである。
【００４６】
用語「明期」とは、明と暗の1日周期のことである。
【００４７】
用語「核酸構築物」、「DNA構築物」および「ベクター」とは、植物または他の生物を形質転換するために使用される遺伝子配列のことである。前記核酸構築物またはDNA構築物は、形質転換植物において、タンパク質または、例えばアンチセンスRNAなどの核酸配列の発現を指示することができるのがよい。典型的には、そのような核酸構築物またはDNA構築物は、所望の遺伝子産物または5'および3'転写調節エレメントに作動可能に連結された所望の核酸産物に対するコード領域を少なくとも含む。いくつかの実施形態では、そのような核酸構築物またはDNA構築物はキメラである、すなわち、異なる供給源の配列の混合物からなる。しかし、非キメラ核酸構築物またはDNA構築物も本発明では使用してよい。
【００４８】
例えば、細胞、ヌクレオチド、ベクター、タンパク質またはポリペプチドに関して使用する場合の用語「組換え」は、典型的には、細胞、ヌクレオチド、またはベクターが、異種(もしくは外来)核酸の導入または天然の核酸の改変により改変されていること、あるいはタンパク質またはポリペプチドが異種アミノ酸の導入により改変されていること、あるいは細胞がそのようにして改変された細胞由来であることを示している。組換え細胞は、天然(非組換え)型の細胞には存在しない核酸配列(例えば、遺伝子)を発現する、または低発現で異常に発現するもしくはまったく発現されないと考えられる天然の核酸配列(例えば、遺伝子)を発現させる。細胞に関して使用される場合の用語「組換え」は、細胞が異種核酸を複製する、または異種核酸にコードされているペプチドもしくはタンパク質を発現することを示している。組換え細胞は天然(非組換え)型の細胞内には存在しない遺伝子を含有することができる。組換え細胞は、遺伝子が人為的な手段により改変され細胞に再導入されている天然型の細胞に存在する遺伝子も含有することができる。前記用語は、細胞から核酸を除去することなく改変されている細胞に内在性の核酸を含有する細胞も包含しており、そのような改変物には、遺伝子置換、部位特異的突然変異、および関連する技術により得られる改変物が挙げられる。
【００４９】
用語「核酸配列」とは、一本鎖型のまたは二本鎖型のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーのことである。前記用語は、特に限定しない限り、基準核酸と類似の結合特性を有し天然に存在するヌクレオチドに類似する形で代謝される天然のヌクレオチドの既知類似物を含有する核酸配列を包含する。特定の核酸配列は、明確に示される配列だけではなく、他の形で指示しない限り、暗黙のうちに、その保存的に改変された変異体(例えば、縮重コドン置換物)および相補的配列も包含している。
【００５０】
「ポリヌクレオチド」は複数個の重合したヌクレオチド残基、例えば、少なくとも約15連続重合ヌクレオチド残基、任意選択に少なくとも約30連続ヌクレオチド、少なくとも約50連続ヌクレオチドを含む核酸配列である。多くの例では、ポリヌクレオチドは、ポリペプチド(もしくはタンパク質)またはそのドメインもしくはフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む。さらに、ポリヌクレオチドは、プロモーター、イントロン、エンハンサー領域、ポリアデニル化部位、翻訳開始部位、5'または3'非翻訳領域、レポーター遺伝子、選択マーカーまたは同様のものを含んでいてよい。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖DNAまたはRNAであってよい。ポリヌクレオチドは、改変された塩基または改変された骨格を場合によって含む。ポリヌクレオチドは、例えば、ゲノムDNAもしくはRNA、転写物(mRNAなどの)、cDNA、PCR産物、クローン化DNA、合成DNAもしくはRNA、または同様のものであってよい。ポリヌクレオチドは、センス方向にでもアンチセンス方向にでも配列を含むことができる。
【００５１】
用語「ポリペプチド」は、天然に存在するおよびその合成類似物を含む直鎖のアミノ酸残基を定義するのに広く使用されている。
【００５２】
本発明の文脈では、「相補的な」は、2つのヌクレオチド配列間でのお互いの正確な対合能力のことである。例えば、オリゴヌクレオチドのある位置のヌクレオチドがDNAまたはRNA分子の対応する位置のヌクレオチドと水素結合することができれば、前記オリゴヌクレオチドと前記DNAまたはRNAはその位置で互いに相補的であるとみなされる。オリゴヌクレオチド内の十分な数のヌクレオチドが標的DNAまたはRNA内の対応するヌクレオチドと水素結合を形成することができて安定な複合体の形成を可能にする場合には、前記DNAまたはRNA鎖は互いに相補的であるとみなされる。
【００５３】
本文脈では、語句「相補的配列」または「相補体」は、したがって、ストリンジェントな条件の下で本発明の核酸分子にアニールするヌクレオチド配列のことでもある。
【００５４】
用語「ストリンジェントな条件」とは、高い、弱いまたは低いストリンジェンシーの一般的条件のことである。
【００５５】
用語「ストリンジェンシー」とは、当技術分野では公知であり、核酸ハイブリダイゼーションが行われる条件(温度、イオン強度および有機溶剤などの他の化合物の存在)に関して使用される。「弱い」または「低い」ストリンジェンシーの条件と比べた場合、「高いストリンジェンシー」条件では、高頻度の相補的塩基配列を有する核酸フラグメントの間でのみ核酸塩基対合は起きる。ハイブリダイゼーションを試験するための適切な条件は、5×SSC中での予浸および、20%ホルムアミド、5×デンハルト液、50mMリン酸ナトリウム、pH6.8、および50mgの変性超音波処理したウシ胸腺DNA溶液中で〜40℃、1時間のプレハイブリダイズ、続いて約40℃、18時間の100mM ATPを補充した同一溶液中でのハイブリダイゼーション、続いて30分間、40℃(低いストリンジェンシー)、好ましくは50℃(中程度のストンジェンシー)、さらに好ましくは65℃(高いストリンジェンシー)、さらに好ましくは約75℃(非常に高いストリンジェンシー)での2×SSC、0.2%SDS中のフィルターの3回洗浄を含む。ハイブリダイゼーション法についてのさらに多くの詳細は、Sambrookら、Molecular Cloning;A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor、1989年に見出すことができる。
【００５６】
用語「ハイブリダイゼーション」および「ハイブリダイズ」とは、核酸配列が分離された変性過程の逆戻りなどの、相補的または一部相補的核酸配列間の会合を示すのに広く使用される。相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間で、ワトソンクリック、フーグスティーン、逆フーグスティーン水素結合、等がある水素結合によりハイブリダイゼーションは起きる。DNAに一般に存在する4核酸塩基は、G、A、TおよびCであり、そのうちGはCと対合し、AはTと対合する。RNAでは、Tはウラシル(U)で置き換えられ、次にAと対合する。標準二本鎖形成に関与する核酸塩基中の化学基はワトソンクリック面をなす。フーグスティーンは、数年後に、プリン核酸塩基(GおよびA)はそのワトソンクリック面に加えて、二本鎖の外側から認識することができ、水素結合を介してピリミジンオリゴヌクレオチドに結合しそれにより三重らせん構造を形成するのに使用することのできるフーグスティーン面を有することを明らかにした。
【００５７】
「サブ配列」または「フラグメント」は、完全配列の任意の部分である。したがって、フラグメントまたはサブ配列とは、それぞれ、アミノ酸(例えば、ポリペプチド)または核酸(例えば、ポリヌクレオチド)のより長い配列の一部を含むアミノ酸または核酸の配列のことである。
【００５８】
本文脈では、用語「ホモロジー」は、2つのアミノ酸配列間のまたは2つのヌクレオチド配列間の類似性が、パラメーター「配列同一性」により記述されることを示す。
【００５９】
用語「配列同一性」は、等長の2つのアミノ酸配列間のまたは2つの核酸配列間の相同性の程度の定量的尺度を示す。比較する2つの配列が等長ではない場合、間隙の挿入または代替的にポリペプチド配列もしくはヌクレオチド配列の末端での切断を可能にして、考えられる最良の一致が得られるように整列させなければならない。配列同一性は、
【００６０】
【数１】
0005701610.tif 000002
【００６１】
として計算することができ、Ndlfは整列させた場合の2つの配列中の非同一残基の総数であり、Nrefは配列のうちの1つの残基の数である。したがって、DNA配列AGTCAGTCは、配列AATCAATCとは75%の配列同一性を有することになる(Ndlf=2およびNref=8)。間隙は、特定の残基(複数可)の非同一性として計測され、すなわち、DNA配列AGTGTCは、DNA配列AGTCAGTCとは75%の配列同一性を有することになる(Ndlf=2およびNref=8)。
【００６２】
ヌクレオチド配列に関係する本発明のすべての実施形態に関しては、1つまたは複数の配列間の配列同一性の割合は、初期設定でclustalWソフトウェア(http:/www.ebi.ac.uk/clustalW/Index.html)を使用したアラインメントに基づいていてもよい。ヌクレオチド配列アラインメントでは、これらの設定は:Alignment=3Dfull、Gap Open 10.00、Gap Ext.0.20、Gap separation Dist.4、DNA weight matrix:identity(IUB)である。あるいは、配列はプログラムDNASIS Maxを使用して分析してもよく、配列の比較はhttp://www.paralign.org/.で行える。このサービスはSmith-Waterman(SW)およびParAlignと呼ばれる2つの比較アルゴリズムに基づいている。最初のアルゴリズムはSmithおよびWaterman(1981)により発表され、2つの配列の最適局所的アラインメントを見出す定評のある方法である。もう1つのアルゴリズムのParAlignは、配列アラインメントの発見的方法であり、方法に関する詳細はRognes(2001)に発表されている。スコアマトリックスおよびGap penaltiesのための初期設定ならびにE-値が使用された。
【００６３】
2つの核酸またはポリペプチドという文脈での語句「実質的に同一の」または「実質的同一性」とは、以下の配列比較アルゴリズムのうちの1つを使用してまたは目視検査により測定した、最大一致で比較され整列された場合、それぞれ、少なくとも約60%、70%、75%、好ましくは80%もしくは85%、さらに好ましくは90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、またはさらに大きなヌクレオチドもしくはアミノ酸残基割合同一性を有する2つ以上の配列またはサブ配列のことである。ある種の態様では、少なくとも約100、110、120、125、130、135、140、145、150、155、160、または165アミノ酸残基などの、長さが少なくとも約50残基のアミノ酸配列の領域にわたって実質的な同一性が存在する。ある種の態様では、少なくとも約200、250、300、330、360、375、400、425、450、460、480、500、600、700、800などの、少なくとも約900ヌクレオチドなどのまたは少なくとも約1kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2kb、2.1kb、2.2kb、2.3kb、2.4kb、2.5kb、2.6kb、2.7kb、2.8kb、2.9kbなどのまたは少なくとも約3kbなどの、少なくとも約150核酸残基の核酸配列の領域にわたり実質的同一性が存在する。いくつかの態様では、アミノ酸または核酸配列は、ポリペプチド配列または対応するコード領域の全長にわたり実質的に同一である。
【００６４】
用語「保存的置換」は、塩基性アミノ酸(アルギニン、リシンおよびヒスチジン)、酸性アミノ酸(グルタミン酸およびアスパラギン酸)、極性アミノ酸(グルタミンおよびアスパラギン)、疎水性アミノ酸(ロイシン、イソロイシン、バリンおよびメチオニン)、芳香族アミノ酸(フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン)、ならびに小アミノ酸(グリシン、アラニン、セリンおよびスレオニン)のグループ内にある。通常、比活性を変えないアミノ酸置換は当技術分野では公知であり、例えば、NeurathおよびHill、1979年により記載されている。最も一般的に起こる交換は、Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、およびAsp/Gly、ならびにこれらの逆の交換である。
【００６５】
本明細書で使用する用語「保存的に置換された変異体」とは、1つまたは複数の保存的置換を含むヌクレオチド配列の変異体のことである。
【００６６】
一般におよび本文脈において、用語「サイレント置換」とは、コドンのセンスに影響を与えずしたがってポリペプチド構造にまったく影響を与えない塩基置換のことである。当業者であればわかるように、サイレント置換は、遺伝子コードの縮重のせいで可能である。
【００６７】
用語「保存ドメイン」とは、複数の種間で類似しているポリペプチド中のアミノ酸配列またはDNAもしくはRNA中のヌクレオチド配列のことである。既知の一連の保存配列はコンセンサス配列により表される。アミノ酸モチーフは多くの場合保存配列で構成されている。さらに、用語「保存配列」とは、進化を通じてずっと基本的に無変化のままである核酸配列分子中の塩基配列またはタンパク質中のアミノ酸配列のことである。「コンセンサス配列」は、核酸配列中の各位置に最も多く存在する塩基、またはタンパク質中の各位置に最も多く存在するアミノ酸を表す理想的配列の点から定義されている。「コンセンサス配列」は、配列同一性を最大化するように、核酸配列またはタンパク質のあらゆる既知の例を整列させることにより同定される。ある配列がコンセンサス配列として受け入れられるためには、それぞれの特定の塩基またはアミノ酸はその位置で適度に優勢でなければならないし、その配列の大半は、1または2などのごくわずかな置換でコンセンサスと関連付けられなければならない。
【００６８】
ホモログはタンパク質の「挿入的変異体」の形態で存在してもよい、すなわち、ここでは、1種以上のアミノ酸残基がタンパク質の所定の部位に導入される。挿入は、N末及び／またはC末の融合並びに単一または複数のアミノ酸の配列内挿入を含んでもよい。全般的に、アミノ酸配列内の挿入は、N末もしくはC末の融合より小さく、約1から10残基の規模であろう。N末もしくはC末融合タンパク質もしくはペプチドの例には、酵母ツーハイブリッドシステム、ファージコーティングタンパク質、(ヒスチジン)-6-タグ、グルタチオン S-トランスフェラーゼ-タグ、プロテインA、マルトース結合タンパク質、ジヒドロ葉酸還元酵素、タグ-100エピトープ、c-mycエピトープ、FLAG（登録商標）-エピトープ、lacZ、CMP（カルモジュリン結合タンパク質）、HAエピトープ、プロテインCエピトープ及びVSVエピトープにおいて使用される際の転写活性化因子の結合ドメインまたは活性化ドメインが挙げられる。
【００６９】
タンパク質の「欠失変異体」の形態にあるホモログは、タンパク質由来の1種以上のアミノ酸の除去によって特徴付けられる。
【００７０】
タンパク質の「付加変異体」の形態にあるホモログは、タンパク質由来の1種以上のアミノ酸の付加によって特徴付けられ、ここで、付加は配列の末端に存在してもよい。
【００７１】
タンパク質のアミノ酸変異体は、固相ペプチド合成等など、または組換DNA操作によって、当該技術分野で周知のペプチド合成技術を用いて容易に作製し得る。タンパク質の置換、挿入または欠失変異体のためのDNA配列の操作方法は、当該技術分野において周知である。例えば、DNAにおける所定の位置での置換変異体の作製技術は当業者に周知であり、M13突然変異生成 (mutagenesis)、T7-Gen in vitro突然変異生成 (USB, Cleveland, OH)、QuickChange部位特異的変異導入 (Stratagene, San Diego, CA)、PCR媒介部位特異的突然変異誘発 (PCR-mediated site-directed mutagenesis)または他の部位特異的変異導入プロトコルが挙げられる。
【００７２】
用語「オーソログ」及び「パラログ」配列は、上述のように相同配列のタイプでもある。これらの機能的に相同配列を同定し及び定義するために、複数の異なる方法が当業者に知られている。オーソログ及びパラログを定義するための3つの一般的方法が記述される；オーソログ、パラログまたはホモログを以下に記述する1種以上の方法によって同定してもよい。
【００７３】
オーソログ及びパラログは類似の配列及び類似の機能を有する進化的に関連した遺伝子である。オーソログは異なる種において種分化の事象によって派生した構造的に関連した遺伝子である。パラログは複製事象によって派生した単一種内における構造的に関連した遺伝子である。
【００７４】
単一の植物種のうちで、遺伝子複製は特定の遺伝子の2コピーを生じさせ、類似の配列を有し、しばしばパラログとして知られる類似の機能を有する2種以上の遺伝子を生じさせ得る。従ってパラログは同一種内での複製によって形成される類似の遺伝子である。パラログは、典型的には、CLUSTAL (Thompson et al.;Higgins et al.)などのプログラムを用いて遺伝子ファミリーの系統発生を分析する場合に、一緒にまたは同一のクレード（類似遺伝子のグループ）内にまとめて一団とされる。類似遺伝子のグループは、ペアワイズ（pair-wise）BLAST分析（Feng及びDoolittle）を用いてもまた同定が可能である。例えば、シロイヌナズナ由来の非常に類似したMADSドメインの転写因子のクレードは、全て、開花期において共通する機能を共有し(Ratcliffe et al.)、シロイヌナズナ由来の非常に類似したAP2ドメイン転写因子のグループは、凍結に対する植物の耐性に関与する（Glimour et al.）。1つのクレード内に収まる類似機能を有する類似遺伝子のグループ解析により、そのクレードに特別なサブ配列が得られる。コンセンサス配列として知られるこれらのサブ配列は、各クレード内の配列を定義するためのみならず、これらの遺伝子の機能を定義するために使用することが可能である；クレード内の遺伝子は同一の機能を共有するパラログ配列またはオーソログ配列を含んでもよい（例えば、Bioinformatics, Mount (2001):Sequence and Genome Analysis Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., page 543も参照のこと）。
【００７５】
親の種由来の新しい種の産出である種分化は、類似の配列及び類似の機能を有する2種以上の遺伝子をも産出可能である。オーソログとして名付けられるこれらの遺伝子は、しばしばこれらの宿主植物内で同一の機能を有し、しばしば機能を失うことなく種間で交換可能である。植物は共通の先祖を有するため、いずれかの植物種における多くの遺伝子が別の植物種における対応するオーソログ遺伝子を有する。ある種の遺伝子ファミリーに対する系統樹をCLUSTALなどのプログラムを用いて構築してしまえば、潜在的なオーソログ配列が系統樹内に配置され、興味のある種由来の遺伝子に対するそれらの関係が決定可能である。オーソログ配列はまた相互のBLAST戦略によって同定可能である。オーソログ配列がいったん同定されると、オーソログの機能は参照配列の同定された機能から推定可能である。
【００７６】
異なる生物由来のオーソログ遺伝子は高度に保存された機能を有し、非常に多くの場合本質的に同一の機能を有する(Lee et al.及びRemm et al.)。遺伝子複製を介して枝分かれしたパラログ遺伝子はコードされるタンパク質の類似機能を保持してよい。かかる場合には、パラログは、本発明のある実施形態に関して、交換して使用可能である（例えば、コード配列の一過性発現）。シロイヌナズナにおいて3つのよく定義されたメンバー及びセイヨウアブラナ(Brassica napus)において少なくとも1つのオーソログの場合、このような高度に関連したパラログの例にはCBFファミリーがあり、それらの全てが凍結及び干ばつストレスの両方に関与する経路を制御する（Gilmour et al. 及びJaglo et al.）。
【００７７】
以下の参照例は、多様な種由来の保存された転写因子の遺伝子が同様に機能する（すなわち、類似の標的配列を調節し、同一の特徴を制御する）こと、及び転写因子が多様な種中に形質転換されて特質を与えるかまたは改善させることを示す多くの研究のうちのわずかな例を提示する。
【００７８】
(1) シロイヌナズナNPR1遺伝子は全身獲得抵抗性(SAR)を制御し；NPR1の過剰発現はシロイヌナズナにおける抵抗性の上昇へとつながる。シロイヌナズナのNPR1または稲のNPR1のオーソログのいずれかを（単子葉植物として、シロイヌナズナ由来の異なった）稲において過剰発現させた場合に、稲の細菌である胴枯れ病の病原体のXanthomonas oryzae pv. Oryzaeを挑ませても、これらのトランスジェニック植物は抵抗性の増加を示した（Chern et al.）。NPR1はTGA2などの転写因子の遺伝子の発現の活性化を介して作用する(Fan and Dong)。
【００７９】
(2) E2F遺伝子は核内増殖抗原(PCNA)に対する植物遺伝子の転写に関与する。植物E2Fは単子葉植物及び双子葉植物の間でアミノ酸配列において高度な類似性を共有し、動物E2Fの保存ドメインに対してさえ類似している。かかる保存は植物及び動物のE2Fの間の機能的類似性を示す。分裂組織の発達を調節するE2F転写因子は、共通のcisエレメントを介して作用し、関連した(PCNA)遺伝子を制御する(Kosugi and Ohashi)。
【００８０】
用語「密接に関連した」遺伝子はオーソログまたはパラログである遺伝子に対して使用される。
【００８１】
本明細書で使用される用語「プロモーター」とは、遺伝子の転写開始の上流に位置し、転写を開始し調節するRNAポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識および結合に関与する配列決定因子の領域のことである。植物に有用なプロモーターは、植物起源でなくてもよい。「基本プロモーター」は、転写開始に必要な転写複合体の構築に必要な最小配列である。基本プロモーターには多くの場合、通常、転写開始部位から15ヌクレオチドと35ヌクレオチド上流間に位置するTATAボックスエレメントが含まれる。基本プロモーターには、転写開始部位から通常40ヌクレオチドと200ヌクレオチド、好ましくは60ヌクレオチド〜120ヌクレオチド上流間に位置するCCAATボックスエレメント(典型的には、配列CCAAT)および/またはGGGCG配列も含まれることがある。
【００８２】
本明細書で「構成的プロモーター」と呼ばれるプロモーターは、必ずしもすべてではないが大半の環境条件および発生または細胞分化の状態の下で、転写を積極的に促進する。構成的プロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35S転写開始領域、およびアグロバクテリウムツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のTDNAの1'または2'プロモーター、およびトウモロコシユビキチン-1プロモーターなどの、当業者に公知の種々の植物遺伝子の他の転写開始領域が挙げられる。器官特異的プロモーターは、例えば、種子、ジャガイモ塊茎、および果実などの貯蔵シンク組織の、もしくは成長点などの代謝シンク組織のプロモーター、グルテリン、プロラミン、グロブリンもしくはイネのアルブミンプロモーターなどの種子特異的プロモーター、レグミンB4およびソラマメ(Vicia faba)の未知の種子タンパク質遺伝子のソラマメプロモーター、種油体タンパク質のプロモーター、セイヨウアブラナ(Brassica napus)の貯蔵タンパク質napAプロモーター、または当技術分野で公知の、例えば、国際公開第91/14772号に記載の他のあらゆる種子特異的プロモーターでもよい。さらに、プロモーターは、イネもしくはトマトのrbcsプロモーター、クロレラウイルスアデニンメチルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーター、またはイネのaldP遺伝子プロモーターなどの葉特異的プロモーター、あるいはジャガイモpin2プロモーターなどの創傷誘導性プロモーターでもよい。
【００８３】
本発明の文脈での「誘導性プロモーター」とは、光、化学的濃度、タンパク質濃度、生物、細胞、または細胞小器官内の条件、等などのある種の条件の下で調節されるプロモーターのことである。誘導性プロモーターの例には、HSPプロモーターならびにPARSK1、すなわち、セリン-スレオニンキナーゼ酵素をコードしているシロイヌナズナ(Arabidopsis)遺伝子の、脱水状態、アブシジン酸および塩化ナトリウムにより誘導されるプロモーターがある。基本的に、誘導性プロモーターの制御下での発現は、用いられる刺激に応じて「スイッチが入る」または増加される。刺激の性質はプロモーターにより異なり、上記の環境要因を含むこともある。前記刺激の不在の下での発現レベルがどうであれ、いかなる誘導性プロモーターからの発現も、正確な刺激の存在の下では増加される。
【００８４】
本明細書で使用するように、用語「組織特異的な」とは、一般にあらゆる組織に存在するわけではない、または対象の組織のみに存在していることもある特定の組織の特徴のことである。本出願では、「組織特異的な」は、遺伝子調節エレメント(プロモーターまたはプロモータープラスエンハンサーおよび/もしくはサイレンサー)、それが調節する遺伝子、あるいはそのような遺伝子のポリペプチド産物に関して使用される。遺伝子調節エレメントまたは「組織特異的プロモーター」の文脈では、前記用語は、プロモーター(ならびにエンハンサーおよび/またはサイレンサーエレメントなどの他の調節エレメントも)は特定の分化系列、組織、または細胞型の細胞において連結された配列の転写を指示するが、その分化系列、組織、または細胞型ではない細胞または組織においては実質的に不活性であることを意味する。本発明による有用な組織特異的プロモーターは、他の組織の細胞におけるまたは同一分化系列の形質転換されたもしくは悪性の細胞におけるよりも、特定の組織における転写物産生の点で、少なくとも5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、500倍または1000倍も活性である。遺伝子または遺伝子のポリペプチド産物の文脈では、用語組織特異的は、遺伝子のポリペプチド産物がその特定の組織または細胞型の細胞において検出可能であるが、ある種の他の細胞型においては実質的に検出可能ではないことを意味する。特に関連する組織特異的プロモーターには、植物中の木部形成組織において特異的に発現するまたは活性なプロモーター配列が挙げられる。そのようなプロモーターの例は、国際公開第2004097024号に記載のLmp1、Lmx2、Lmx3、Lmx4およびLmx5プロモーターである。
【００８５】
「転写終結配列」とは、転写のためにゲノムDNA上の遺伝子またはオペロンの末端を標す遺伝子配列の部分のことである。転写終結配列は、ポリアデニル化シグナルで新生RNAを同時転写的に切断して、RNAポリメラーゼによる転写産物のさらなる伸長を停止するタンパク質因子により認識される。核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係に置かれると「作動可能に連結」される。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写を増加させるならば、コード配列に作動可能に連結されている。「作動可能に連結された」は、連結されているDNA配列が典型的に近接しており、2つのタンパク質コード領域を結合させる必要がある場合には、近接していて読み枠内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは通常、プロモーターから数キロ塩基離されている場合に機能し、イントロン配列は可変長であることがあるために、一部のポリヌクレオチドエレメントは作動可能に連結されてはいるが近接していないことがある。
【００８６】
本発明の文脈では、用語「形質転換」および「トランスフォーミング」は、交互におよび、それぞれ「トランスフェクティング」および「トランスフェクション」の同義語として使用され、DNAを細胞に導入するプロセスのことである。対象の遺伝子またはプロモーターの少なくとも一部を含むDNA構築物を、以前述べたように、個々の細胞、培養細胞、宿主生物の一部としての細胞、受精卵母細胞もしくは配偶体または胚性細胞でもよい宿主細胞に導入することができる。宿主細胞に関して使用される場合の用語「導入」は、組換えベクターDNAを標的宿主細胞に導入するための当技術分野で公知の標準手順であることを意味する。そのような手順には、トランスフェクション、感染、形質転換、自然の取り込み、エレクトロポレーション、遺伝子銃およびアグロバクテリウムが挙げられるが、これらは限定されるものではない。
【００８７】
「再生可能細胞」とは、植物全体を再生することができるもとになる植物細胞を意味する。再生可能細胞は、当技術分野では「全能性」としても知られる遺伝的潜在能力を維持してきた細胞であることは理解されるであろう。再生可能細胞は、培養下で生育された場合、親植物の全遺伝的潜在能力を発現する適切な刺激が必要なこともあることはさらに理解されるであろう。
【００８８】
トランスジェニック植物を作製する方法
本発明の特定の実施形態では、有利な植物表現型は、それらの対応する野生型植物と比べて、上記の判定基準により評価され選択された候補遺伝子の発現レベルを改変することにより生み出される。これらの態様によれば、
a) 配列番号1-13、97-115由来のヌクレオチド配列、
b) 配列番号1-13、97-115由来のヌクレオチド配列に少なくとも60%同一のヌクレオチド配列、
c) a)またはb)のヌクレオチド配列のサブ配列またはフラグメント、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む少なくとも1個の遺伝子の遺伝子産物のレベルを植物中で変化させる工程を含む方法が提供される。
【００８９】
これは以下の工程を含む以下の技術的に改変された交雑法により行ってもよい：
i) 以下からなる群から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列を発現する植物種を選択する工程：
a) 配列番号1-13、97-115由来のヌクレオチド配列、
b) 配列番号1-13、97-115由来のヌクレオチド配列に少なくとも60%同一のヌクレオチド配列、
c) a)またはb)のヌクレオチド配列のサブ配列またはフラグメント、
ii) i)で選択した植物種と、i)で選択したのと同一または別の植物種と交雑させる工程、
iii) i)の下に選択された植物種と比較して、以下からなる群から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列の調節された発現を有する植物を選択する工程：
a) 配列番号1-13、97-115由来のヌクレオチド配列、
b) 配列番号1-13、97-115由来のヌクレオチド配列に少なくとも60%同一のヌクレオチド配列、
c) a)またはb)のヌクレオチド配列のサブ配列またはフラグメント、
iv) 場合によりiii)で得た植物を1回以上戻し交配し、i)で使用した植物のいずれか及び／またはiii)で得た植物と比較して、以下からなる群から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列の調節された発現を有する植物を選択する工程：
a) 配列番号1-13、97-115由来のヌクレオチド配列、
b) 配列番号1-13、97-115由来のヌクレオチド配列に少なくとも60%同一のヌクレオチド配列、
c) a)またはb)のヌクレオチド配列のサブ配列またはフラグメント。
【００９０】
本発明の一態様によれば、以下の工程を含む方法が提供される：
(i) 以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する工程：
a) 配列番号1-13、97-115由来のヌクレオチド配列、または
b) 配列番号1-13、97-115由来のヌクレオチド配列に少なくとも60%同一のヌクレオチド配列、または
c) a)またはb)のヌクレオチド配列のサブ配列またはフラグメント、及び
d) ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結し、標的植物におけるポリヌクレオチド配列の発現を調節する少なくとも1つの調節エレメント、
(ii) 発現ベクターを少なくとも1つの植物中に導入する工程、及び
(iii) その野生型と比較して調節された生育及び／またはバイオマスを有する少なくとも1つのトランスジェニック植物を選択する工程。
【００９１】
配列番号1-13、97-115により特定される配列は、ブラックコットンウツド（Populus trichocarpa）から予測された候補遺伝子の配列及びハイブリッドアスペンからクローン化された配列番号73-95を表す。当業者であれば理解するように、配列番号73-95に記述される配列への、5'および3'へのこれらの遺伝子に由来する追加配列は、Sambrookらに記載される技術などの従来のクローン化技術を使用して容易に達成可能である。
【００９２】
一実施形態によれば、調節された発現は、好ましくは配列番号1-13、97-115を含む、ポリペプチドまたはかかるポリペプチドのホモログをコードする遺伝子の遺伝子座において遺伝子改変を導入することによって達成される。
【００９３】
改変は、方法のいずれかの段階におけるマーカーとしての配列番号1-13、97-115の1種以上を使用したT-DNA活性化、TILLING、相同組み換え、部位特異的変異導入、または直接交配のうちの1つによって達成させてもよい。
【００９４】
改変の効果は生育における収量及び／またはバイオマスの増加であってもよい。
【００９５】
核酸構築物
本発明のさらに特定の実施形態によれば、前記方法は、
a) 配列番号1-13、97-115から選択される配列を含むヌクレオチド配列、
b) a)のヌクレオチド配列の相補的ヌクレオチド配列、
c) a)またはb)のヌクレオチド配列のサブ配列またはフラグメント、
d) a)、b)およびc)における配列のいずれか1つと少なくとも60%同一の核酸配列、ならびに
e) a)、b)またはc)のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、組換えDNA構築物などの核酸構築物を提供する工程を含む。
【００９６】
本発明の追加の実施形態では、c)またはg)における核酸配列が、a)、c)、d)、e)またはf)における配列のうちのいずれか1つと少なくとも65%同一、例えばa)、c)、d)、e)またはf)における配列のうちのいずれか1つに少なくとも70%同一、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも87%同一、少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、少なくとも99%同一、または少なくとも99.5%同一などである。
【００９７】
本発明のこの態様の好ましい実施形態では、a)のヌクレオチド配列は、配列番号1、4、6、7、9、10、101、102、104、106及び107からなる群から選択される。
【００９８】
本発明の核酸配列および核酸/DNA構築物を作製するための種々の方法が当技術分野には存在する。DNAクローンを同定し単離するための手順は当業者には公知であり、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第2版)、1〜3巻、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、New York、1989年に記載されている。あるいは、本発明の核酸配列は、特異的または縮重プライマーの適切な選択により本発明に適合させた種々のインビトロ増幅法によって作製することができる。例えば、本発明の相同核酸を作製するための、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、Q beta-レプリカーゼ増幅および他のRNAポリメラーゼ媒介技術(例えば、NASBA)を含むインビトロ増幅法へ当業者を導くのに十分なプロトコルの例は、上記のSambrookに見られる。
【００９９】
あるいは、本発明の核酸構築物は、固相合成法により作製されたフラグメントから構築することができる。典型的には、最大約100塩基のフラグメントを個別に合成し、次に酵素的にまたは化学的にライゲートして、所望の配列、例えば、転写因子のすべてまたは一部をコードするポリヌクレオチドを作製する。例えば、ホスホラミダイト法を使用した化学合成は当業者には公知である。そのような方法に従って、オリゴヌクレオチドを合成し、精製し、その相補鎖にアニールし、ライゲートし、次に適切なベクターに場合によってクローン化する。本発明はまたDNA構築物を含むベクターに関する。
【０１００】
上述したように、上記の配列はハイブリッドアスペン及びポプラ由来である。当業者であれば理解するように、記載の配列の相同体は他の種から単離してもよく、その非限定的な例には、アカシア、ユーカリ、シデ、ブナ、マホガニー、クルミ、オーク、セイヨウトネリコ、ヒッコリー、カバの木、クリ、ハンノキ、カエデ、スズカケノキ、イチョウ、ヤシ、モミジバフウ、糸杉、ベイマツ、モミ、セコイア、アメリカツガ、ヒマラヤスギ、ビャクシン、カラマツ、マツ、アメリカスギ、トウヒおよびイチイ、リンゴ、セイヨウスモモ、セイヨウナシ、バナナ、オレンジ、キーウィ、レモン、サクランボ、ブドウ、イチジク、ワタ、タケ、スイッチグラス、クサヨシ、ならびにゴムノキが挙げられる。記載の配列の有用な相同体は、ヤナギ科(Salicaceae family)の、例えば、ヤナギ属およびポプラ属の広葉樹植物から単離してもよい。この属の植物は慣用名:ヤナギ(willow)、ポプラ(poplar)およびアスペン(aspen)で知られている。
【０１０１】
本明細書で記述される本発明のいずれかの態様に従う使用のための他の適切な植物の例には、単子葉植物、双子葉植物、裸子植物、及び藻類、シダ類、及び蘚類が挙げられる。特に興味のあるものは、トランスジェニック高等植物、特に農作物であって、例えば、上述のように異種核酸を運ぶために操作されている穀物及び花であって、タバコ、セイヨウカボチャ、にんじん、アブラナ属野菜、メロン、唐辛子、ブドウ(grape vine)、レタス、イチゴ、アブラナの脂肪種子(oilseed brassica)、テンサイ、小麦、大麦、トウモロコシ、稲、サトウキビ、大豆、エンドウ、モロコシ、ヒマワリ、トマト、ジャガイモ、コショウ、菊、カーネーション、亜麻仁油、麻及びライ麦が含まれる。
【０１０２】
いくつかの好ましい実施形態において、植物は多年生植物、例えば多年生木本である。多年生木本は2年より長いライフサイクルを有する植物であって、栄養増殖のみが生じる長い幼齢期を伴う。これは一年内に完了するライフサイクルを有するシロイヌナズナまたはLycopersicon esculentum(トマト)などの一年生または草本植物と対照的である。
【０１０３】
特に、本発明による方法は、記載された特定の配列と比べると、保存的変異体を含むヌクレオチド配列を含む、組換えDNA構築物などの核酸構築物を提供する工程を含んでもよく、本発明によれば、コードされたポリペプチド中の1つだけ、または少数のアミノ酸を変化させることも提供され使用される。したがって、a)のポリペプチドの保存的に置換された変異体を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えDNA構築物を提供し使用することは本発明の範囲内である。
【０１０４】
ポリヌクレオチドにコードされているアミノ酸配列を変えない配列変化は、「サイレント」置換と名付けられている。それぞれメチオニンおよびトリプトファンをコードするコドンATGおよびTGGの例外はあるが、同一アミノ酸を表す可能なコドンのうちのいずれも、当技術分野で利用することができる種々の技術、例えば、部位特異的突然変異誘発により置換することができる。したがって、本発明は、ヌクレオチド配列がヌクレオチド配列中におけるサイレント置換を含む組換え核酸構築物も提供することができる。
【０１０５】
本発明のある種の追加の実施形態では、前記サブ配列またはフラグメントは、項目a)またはd)下の上記のヌクレオチド配列の保存ドメインと少なくとも70%同一、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも87%同一、少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、少なくとも99%同一、または少なくとも99.5%同一など、項目a)またはd)下の上記のヌクレオチド配列の保存ドメインに少なくとも65%の配列同一性を有する。
【０１０６】
このようにして、本明細書に記述される1種以上のポリヌクレオチドに類似またはパラログであるまたはオーソログであるまたは相同である配列、またはそれらのポリヌクレオチドによってコードされる1種以上の標的ポリペプチド、または本明細書に記述されるそれら以外のものを同定するための方法が存在し、その方法は所望の植物の表現型または遺伝子機能を配列と結び付けるかまたは関連付ける工程を含んでもよい。該方法において、配列データベースは（局所的にまたはインターネットもしくはイントラネットを介して）提供され、クエリーは本明細書の関連配列を使用して配列データベースに対して作成され、植物の表現型または遺伝子機能と関連付けられる。
【０１０７】
遺伝子産物のレベルを改変することを得るためのアプローチ
本発明は、ある種の遺伝子の発現を増加させることにより使用され、これをどのように実行できるかについての非限定的な例が本明細書に示されている。上記の核酸構築物または組換えDNA構築物は、野生型と比べて生育特徴が改変されている植物の同定のために使用してもよい。そのような植物は、例えば、天然に存在する変異体でも、遺伝的に改変されていて改変された生育特性を示す植物でもよい。そのような目的のために、本発明による核酸構築物または組換えDNA構築物は、例えば、従来のハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブとしても、核酸フラグメントの特異的増幅のためのプライマーとしても使用してよい。
【０１０８】
本発明の主要部分は、遺伝子産物の上方調節がどのようにして所望の効果を与えるかであるが、本明細書に示される遺伝子の発現を変えることを利用して所望の特性を改変することができること、これがデータのもう1つの見方であること、およびこの見方の効果は植物内で遺伝子産物を減少させることも所望の形質を改変する方法であることも示している。遺伝子産物のレベルを増加させる異なる方法があり、これらの方法は下の遺伝子産物を上方調節する方法と並行して記載されている。
【０１０９】
遺伝子調節配列の変化は発現パターンを変化させることができ、コード配列の変化は遺伝子機能を変化させることができるので、配列番号1-13、97-115の遺伝子の1つは、マーカー支援育種の標的として使用することもでき、これらの遺伝子を操作すれば所望の形質を変化させることを我々は示している。これは、通常、遺伝子配列番号1-13、97-115が候補遺伝子として使用可能であることを指す(Brady and Provart 2007、及びVarshney et al 2005)。
【０１１０】
本発明を利用するためのある特定の態様は、例えば、天然の集団において定量RT-PCRを使用して、遺伝子配列番号1-13、97-115の1種以上の発現を測定し、測定された遺伝子の並外れた高い発現に対して選択し、育種のプログラムにおいてこれらの植物を親として使用することであり、これにより各育種サイクルに対して反復が可能である。リアルタイムPCRを含む遺伝子発現の定量化のための方法は、Sambrookらに記述される。
【０１１１】
本明細書で提示される遺伝子は、候補遺伝子ベースの関連研究においてもまた使用可能であり、これらの研究から得られる結果は、次いで、マーカー支援育種において使用可能である(Burke et al 2007)。
【０１１２】
遺伝子の過剰発現の上方調節は、他のどこかにおいて記述される、適切なプロモーターの下に、遺伝子の完全なオープンリーディングフレームを配置し、大抵は過剰発現される遺伝子の3’にターミネーター及びポリアデニル化シグナル配列を配置することにより達成可能である。
【０１１３】
さらに、本発明による核酸構築物または組換えDNA構築物は、植物生育表現型を改変するために、遺伝子置換という目的のために使用してもよい。
【０１１４】
内在性遺伝子発現の抑制は、例えば、リボザイムを使用して実現することができる。リボザイムは、高度に特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するRNA分子である。リボザイムの作製および使用は、米国特許第4987071号および米国特許第5543508号に開示されている。アンチセンス技術は下記で論じられているが、アンチセンスRNAにハイブリダイズする内在性mRNA分子を切断し、それにより今度は内在性遺伝子発現のアンチセンス阻害が増強されるように、アンチセンスRNAを含む合成リボザイム配列を使用してRNA切断活性を前記アンチセンスRNAに与えることができることに言及すべきである。
【０１１５】
関連する遺伝子相同体にコードされているRNAが過剰発現されているベクターを使用して、例えば、Jorgensenの米国特許第5231020号に記載された形で対応する内在性遺伝子の同時抑制を得ることができる。そのような同時抑制(センス抑制とも名付けられている)は、全遺伝子配列を植物細胞に導入する必要はなく、導入された配列が対象の内在性配列とまったく同一である必要もない。しかし、ハイブリダイゼーションの特異性が増加するので、例えば、導入された配列が伸長されるので、および/または導入された配列と内在性転写因子遺伝子間の配列類似性が増加するので、前記抑制効率は増強されることになる。
【０１１６】
翻訳不可能型の遺伝子、例えば、1つもしくは複数の終止コドン、またはナンセンス変異を含む配列を発現するベクターを使用して、内在性転写因子の発現を抑制し、それによってその因子の活性を低下させるまたは除去し、1つもしくは複数の形質を改変することもできる。そのような構築物を作製するための方法は、米国特許第5583021号に記載されている。特に、そのような構築物は、中途終止コドンを遺伝子に導入することにより作製することができる。
【０１１７】
標的DNA挿入を実施する1つの方法は、国際公開第2006078431号に記載のレトロウイルスDNA組込み機構の使用によるものである。この技術は、インテグラーゼをDNA結合タンパク質(繋留タンパク質)に作動可能に連結することにより、レトロウイルスとレトロトランスポゾンインテグラーゼの組込み部位特異性を改変する可能性に基づいている。インテグラーゼの工学的処理は、好ましくは、PCRによるインテグラーゼの野生型コード配列の改変を介して、核酸レベル上で実施される。したがって、インテグラーゼ複合体は、所望の部分に向けてもよいし、ゲノムDNAの望ましくない部分から離して向け、それにより所望の組込み部位特徴を作り出してもよい。
【０１１８】
本発明において、遺伝子発現を変化させ、好ましくは増加させるのに使用可能な他の技術は「ゲノム中の標的化誘導局所的損傷」であり、これは遺伝子機能を標的された形で改変する非遺伝子組換え法である。このアプローチは、例えば、エチルメタンスルホン酸(EMS)を植物に変異導入し、後に特定の所望の遺伝子が改変されている個体を見つけることを含む。前記技術は、例えば、SladeおよびKnauf、2005及びHenikoffらに記載されている。
【０１１９】
遺伝子の発現を無効にするための方法は、アグロバクテリウムツメファシエンスのT-DNAを使用した挿入突然変異によるものである。挿入変異体を作製後、変異体をスクリーニングして、適切な遺伝子中に前記挿入体を含有する変異体を同定することができる。所望の遺伝子で単一トランス遺伝子挿入事象を含有する植物を交雑させて、前記突然変異についてホモ接合の植物を作製することができる。
【０１２０】
当業者には明らかであるように、植物の形質は、cre-loxシステムを使用することにより改変することもできる。植物ゲノムは、その後Creリコンビナーゼと接触させる第1および第2のlox部位を含むように改変することができる。前記lox部位が同一方向であれば、前記2つの部位間に介在するDNA配列は切除される。前記lox部位が反対方向であれば、介在する配列は反転される。
【０１２１】
他の手段により、例えば、T-DNA活性化タギング法により遺伝子を異所的に発現させることによって、内在性遺伝子の活性または発現レベルを操作することにより発現カセットの不在の下で、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを植物内で発現させることもできる(Ichikawaら、(1997);Kakimotoら、(1996))。この方法は、植物を複数の転写エンハンサーを含有する遺伝子タグで形質転換する必要があり、前記タグがゲノム内に挿入されると、隣接遺伝子コード配列の発現が調節解除される。別の例では、植物内の転写機構を、本発明のポリヌクレオチドの転写レベルを増加させるように改変することができる(例えば、DNA結合モチーフ内の特定のアミノ酸を変えることによるジンクフィンガータンパク質のDNA結合特異性の改変を記載しているPCT公開国際公開第96/06166号および国際公開第98/53057号を参照されたい)。
【０１２２】
発現のアンチセンス抑制
しかし、上記のヌクレオチド配列を含む組換えDNA構築物は、生育が増大した植物表現型を得るための発現のセンスおよびアンチセンス抑制のためには、例えば、特定の遺伝子の発現を下方調節するためには特に有用である。すなわち、本発明のヌクレオチド配列、またはそのサブ配列もしくはアンチセンス配列を使用して、天然に存在する相同核酸の発現を遮断することができる。例えば、LichtensteinおよびNellen(1997)に記載のような種々の従来のセンスおよびアンチセンス技術が当技術分野では公知である。アンチセンスアプローチの目的は、標的遺伝子に相補的な配列を使用してその発現を遮断し、単一の選択されたタンパク質のレベルが選択的に低下されているまたは無効にされている変異株化細胞または生物を創り出すことである。
【０１２３】
植物細胞において適用される遺伝子発現のアンチセンス調節についてのさらに入念な説明は、米国特許第5107065号を参照されたい。前記特許文献の内容はその全体を本明細書に組み込まれているものとする。
【０１２４】
RNA干渉
二本鎖RNAにより誘導される遺伝子サイレンシングは、一般的にRNA干渉またはRNAiと呼ばれている。RNA干渉とは、二本鎖リボ核酸(dsRNA)のフラグメントが、前記dsRNAと相同配列を共有する特定の遺伝子の発現に干渉する分子機構である。このプロセスは、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)として知られる、マイクロRNAをプロセシングする同一細胞機構に媒介される。前記プロセスはリボヌクレアーゼタンパク質ダイサーにより開始され、ダイサーは外因性二本鎖RNA分子に結合して切断し、各末端に少数の不対突出塩基のある20〜25塩基対の二本鎖フラグメントを作り出す。ダイサーにより作り出され、低分子干渉RNA(siRNA)と呼ばれる短二本鎖フラグメントは分離されて、活動性RISC複合体に組み込まれる。RNA転写物の一部がRNAi分子または構築物により標的とされると、転写物全体が下方調節される。
【０１２５】
dsRNAの転写による植物でのRNAi遺伝子抑制のさらに入念な説明は、米国特許第6506559号、米国特許出願公開第2002/0168707号、および国際公開第98/53083号、国際公開第99/53050号および国際公開第99/61631号が参考としてあるが、これらのすべてはそれらの全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【０１２６】
ベクターの構築
一般に、当業者であれば本発明のベクターを構築し、組換え遺伝子発現のためのプロトコルを設計することは十分可能である。ベクターの調製のための一般プロトコルに関する追加の詳細は、Molecular Cloning:a Laboratory Manual:第2版、Sambrookら、1989年、Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。アンチセンス遺伝子に使用するプロモーターは、過剰発現のレベル、時期、組織、特異性または誘導能に影響を与える可能性がある。。
【０１２７】
一般に、遺伝子の過剰発現は、前記遺伝子のゲノムDNAまたはcDNAのセグメント（例えば、セグメントは機能的なタンパク質を産生するための十分なオープンリーディングフレーム、好ましくは完全なオープンリーディングフレームを含むべきである）のセンスエレメントを含むDNAエレメントに作動可能に連結されたプロモーターを有する組換えDNA構築物を使用して実現することができる。
【０１２８】
本発明の関連する実施形態では、核酸構築物、または組換えDNA構築物は、前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結された構成的、誘導性、または組織特異的プロモーターをさらに含む。
【０１２９】
本発明の現在好ましい実施形態では、核酸構築物、または組換えDNA構築物はベクター配列番号96の配列を含む。
【０１３０】
過剰発現のための本発明の好ましい核酸構築物は、pK2GW7と名付けられたベクターである。前記ベクターは、Gateway vectors for Agrobacterium-mediated plants transformation、Karimi, 2002に記載されている。
【０１３１】
植物細胞の形質転換
本発明によれば、その方法は、植物の再生可能細胞を前記核酸構築物または組換えDNA構築物で形質転換し、前記形質転換細胞からトランスジェニック植物を再生させる追加の工程を含む。上記のDNA構築物またはベクターを植物細胞に導入するときには、当業者には公知のある種の配慮をしなければならない。挿入させる核酸は、上記のように転写を推進する効果的な調節エレメントを含有する構築物内で構築すべきである。前記構築物を細胞内に輸送する方法が利用できなければならない。前記構築物が細胞内に入ると、内在性染色体物質への組込みが起こることもあれば起こらないこともある。
【０１３２】
当業者に公知の形質転換技術を使用して、DNA構築物およびベクターを植物細胞に導入し、植物生育が増大したトランスジェニック植物、特にトランスジェニック樹木を作製することができる。
【０１３３】
当業者であれば、本発明によれば、多種多様な宿主細胞をDNA構築物およびベクターのレシピエントとして用いてもよいことを理解するであろう。宿主細胞の非限定的な例には、胚組織、カルス組織型I、II、およびIII、胚軸、成長点、根の組織、師部での発現のための組織における細胞が挙げられる。
【０１３４】
上に収載するように、アグロバクテリウム形質転換は、樹木種、特にポプラなどの広葉樹種を形質転換するのに当業者によって広く利用されている1つの方法である。安定で繁殖性のトランスジェニック植物の作製は、現在当技術分野では常用になっている。微粒子もしくは粒子銃、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、直接DNA取込み、リポソーム媒介DNA取込み、またはボルテックス法などの他の方法は、アグロバクテリウム形質転換が非効率的または無効である場合に、例えば、一部の裸子植物種で使用することができる。
【０１３５】
あるいは、異なる技術の組合せ、例えば、創傷を誘導するアグロバクテリウム被膜微小粒子の照射または微粒子銃、続いてアグロバクテリウムとの共存培養を用いて、形質転換プロセスの効率を増強することができる。
【０１３６】
形質転換技術の特定の選択は、ある種の植物種を形質転換する効率、ならびに本発明を好みの特定の方法論で実施する人間の経験および好みにより決定されることは理解されるであろう。核酸を植物細胞に導入する形質転換系の特定の選択は本発明にとって不可欠ではなく、本発明を限定するものでもなく、植物再生のための技術の選択も同じであることは当業者には明らかであろう。
【０１３７】
形質転換に続いて、トランスジェニック植物は、形質転換ベクターに取り込まれた優性な選択可能マーカーを使用して選択されるのが好ましい。典型的には、そのようなマーカーは形質転換植物に抗生物質または除草剤抵抗性を与え、形質転換体の選択は、前記植物を適切な濃度の前記抗生物質または除草剤に曝露することにより実現することができる。D型アミノ酸を使用し、その植物はL型のみに耐容性を示すことができるという事実に基づいた新規の選択マーカーは、迅速で効率的な環境に配慮した選択系を提供する。この選択系の興味深い特徴は、それが選択も対抗選択も可能にすることである。
【０１３８】
引き続いて、植物は、例えば、当技術分野では標準的である単一細胞、カルス組織または葉片から再生することができる。ほとんどいかなる植物も、前記植物の細胞、組織および器官から完全に再生することができる。利用できる技術は、Vasilら、1984年で概説されている。
【０１３９】
形質転換植物を選択し成熟するまで生育した後、生育の増大の表現型を示す植物を同定する。さらに、前記表現型が本明細書に開示するポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現レベルまたは活性の変化に起因することを確証するのは、ノーザンブロット、RT-PCRもしくはマイクロアレイを使用してmRNA発現を、または免疫ブロットもしくはウェスタンブロットもしくはゲルシフトアッセイを使用してタンパク質発現を解析することにより判定することができる。
【０１４０】
植物種
本発明によれば、本方法は、トランスジェニック植物のもとになる野生型植物と比べると、生育が増大しているトランスジェニック植物を作製する。本方法の実施形態では、トランスジェニック植物は多年生植物、すなわち2年よりも長く生存する植物である。特定の実施形態では、多年生植物は高度に木化されている茎(または複数の茎)を有する維管束植物と定義される木本植物である。
【０１４１】
好ましい実施形態では、木本植物は広葉樹植物、すなわち広葉または被子樹木であり、これは、アカシア、ユーカリ、シデ、ブナ、マホガニー、クルミ、オーク、セイヨウトネリコ、ヤナギ、ヒッコリー、カバの木、クリ、ポプラ、ハンノキ、カエデ、スズカケノキ、イチョウ、ヤシおよびモミジバフウからなる群から選択してよい。これらの2つのグループには、特に材木および加熱用バイオ燃料を提供するように生育される急成長種の樹木または木質低木が含まれるために、その変異体を含むヤナギ、ポプラおよびアスペンなどのヤナギ科の広葉樹植物は特に興味深い。スイッチグラスおよびクサヨシのようなバイオエネルギーに使用されるセルロースグラスも興味深い。
【０１４２】
追加の実施形態では、木本植物は、糸杉、ベイマツ、モミ、セコイア、アメリカツガ、ヒマラヤスギ、ビャクシン、カラマツ、マツ、アメリカスギ、トウヒおよびイチイからなる群から選択できる針葉樹または球果植物である。
【０１４３】
有用な実施形態では、木本植物は、リンゴ、セイヨウスモモ、セイヨウナシ、バナナ、オレンジ、キーウィ、レモン、サクランボ、ブドウおよびイチジクからなる群から選択できる実の成る植物である。
【０１４４】
本方法において有用である可能性のある他の木本植物は、ワタ、タケおよびゴムノキからなる群から選択してもよい。
【０１４５】
DNA構築物
本発明の第2の主態様によれば、上記の少なくとも1つの配列を含む、組換えDNA構築物などのDNA構築物が提供される。特に、組換えDNA構築物は、
a)配列番号1-13、97-115から選択される配列を含むヌクレオチド配列、
b)a)のヌクレオチド配列の相補的ヌクレオチド配列、
c)a)またはb)のヌクレオチド配列のサブ配列またはフラグメント、
d)a)、b)およびc)における配列のいずれか1つと少なくとも60%同一である核酸配列、ならびに
e)a)、b)またはc)のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでいてよい。
【０１４６】
本発明の選択された実施形態では、d)における核酸配列は、a)、b)およびc)における配列のいずれか1つと少なくとも70%同一、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも87%同一、少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、少なくとも99%同一、または少なくとも99.5%同一など、a)、b)およびc)における配列のいずれか1つと少なくとも65%同一である。
【０１４７】
さらに、上記の論述に従って、前記ヌクレオチド配列は、(a)のポリペプチドの保存的に置換された変異体を含むポリペプチドをコードしている。さらに、前記ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列中におけるサイレント置換を含む。
【０１４８】
本発明のこの態様に関する追加の実施形態では、前記サブ配列またはフラグメントは、項目a)の下の上記のヌクレオチド配列の保存ドメインと少なくとも70%同一、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも87%同一、少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、少なくとも99%同一、または少なくとも99.5%同一など、項目a)の下の上記のヌクレオチド配列の保存ドメインと少なくとも65%の配列同一性を有する。
【０１４９】
追加の実施形態ではおよび上の記載に従って、前記組換えDNA構築物は、前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結された構成的、誘導性または組織特異的プロモーターをさらに含む。特に、前記組換えDNA構築物は、遺伝子の完全なオープンリーディングフレームに続いてターミネーター配列からなる転写カセットの前に強力な構成的プロモーターをさらに含んでいてよい。かかるカセットは、請求項7に記載の並びに第21頁並びに第21及び第22頁にまたがる段落に記載のヌクレオチド配列を含んでもよい。
【０１５０】
本発明のここに例示される実施形態では、前記組換えDNA構築物は、配列番号96の配列を含む。
【０１５１】
トランスジェニック植物
本発明の第3の態様は、少なくとも1個の遺伝子の配列番号1-13、97-115の遺伝子の遺伝子産物のレベルを植物中で変化させることができるヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチド(DNA構築物)を含むトランスジェニック植物を提供する；明期18時間、温度22℃/15℃(昼/夜)および毎週施肥N 84g/l、Pl 2g/l、K 56g/lの下で、同一条件の下で生育した野生型植物群と比べた場合に、生育が増加している。
【０１５２】
本発明の特定の実施形態によれば、
a) 配列番号1-13、97-115由来のヌクレオチド配列、
b) 配列番号1-13、97-115由来のヌクレオチド配列に少なくとも60%同一のヌクレオチド配列、
c) a)またはb)のヌクレオチド配列のサブ配列またはフラグメント、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの遺伝子の遺伝子産物のレベルは、それぞれ対応する野生型植物に見られるレベルと比べると変化している。
【０１５３】
本発明のさらに別の実施形態によれば、トランスジェニック植物は、
a) 配列番号1-13、97-115から選択される配列を含むヌクレオチド配列、
b) a)のヌクレオチド配列の相補的ヌクレオチド配列、
c) b)またはc)のヌクレオチド配列のサブ配列またはフラグメント、
d) a)、b)およびc)における配列のいずれか1つと少なくとも60%同一の核酸配列、ならびに
e) a)、b)またはc)のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む組換えポリヌクレオチド(DNA構築物)を含む。
【０１５４】
本発明のこの態様の追加の実施形態では、c)またはg)における核酸配列が、a)、b)、c)、d)またはe)における配列のうちのいずれか1つと、少なくとも70%同一、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも87%同一、少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、少なくとも99%同一、または少なくとも99.5%同一など、a)、b)、c)、d)またはe)における配列のうちのいずれか1つと少なくとも65%同一である。トランスジェニック植物は、また、a)またはb)のポリペプチドの保存的に置換された変異体を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。ヌクレオチド配列はヌクレオチド配列中におけるサイレント置換を含んでもよい。さらに、サブ配列またはフラグメントは保存ドメインに対して少なくとも65％の配列同一性を有してもよい。
【０１５５】
上記のように、当業者であれば、本発明の核酸配列およびポリペプチド構築物を作製するためには、例えば、クローン化技術、固相合成により作製されるフラグメントの構築による種々の方法が当技術分野には存在することを理解されるであろう。さらに、当業者であれば、記載された配列の相同体は他の種から単離してもよく、その非限定的な例には、アカシア、ユーカリ、シデ、ブナ、マホガニー、クルミ、オーク、セイヨウトネリコ、ヒッコリー、カバの木、クリ、ハンノキ、カエデ、スズカケノキ、イチョウ、ヤシ、モミジバフウ、糸杉、ベイマツ、モミ、セコイア、アメリカツガ、ヒマラヤスギ、ビャクシン、カラマツ、マツ、アメリカスギ、トウヒおよびイチイ、リンゴ、セイヨウスモモ、セイヨウナシ、バナナ、オレンジ、キーウィ、レモン、サクランボ、ブドウ、イチジク、ワタ、タケ、スイッチグラス、クサヨシならびにゴムノキが挙げられることを理解するであろう。記載の配列の有用な相同体は、ヤナギ、ポプラまたはアスペンなどの、ヤナギ科の広葉樹植物から単離してもよい。
【０１５６】
特に、本発明によるトランスジェニック植物は、記載された特定の配列と比べると、保存的変異体を含むヌクレオチド配列を含む組換えDNA構築物を含んでいてもよく、本発明に従って、コードされたポリペプチド中の1つだけ、または少数のアミノ酸を改変させることも提供され使用される。したがって、a)またはd)のポリペプチドの保存的に置換された変異体を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換えDNA構築物を含むトランスジェニック植物を提供することは本発明の範囲内である。
【０１５７】
したがって、本発明は、前記ヌクレオチド配列がヌクレオチド配列中におけるサイレント置換を含む、すなわち、前記組換えDNA構築物が、前記ポリヌクレオチドにコードされているアミノ酸配列を変えない配列変化を含んでいてもよい組換えDNA構築物も提供することができる。
【０１５８】
本発明のある種の追加の実施形態では、前記サブ配列またはフラグメントは、
項目a)またはd)下の上記のヌクレオチド配列の保存ドメインと少なくとも70%同一、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも87%同一、少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、少なくとも99%同一、または少なくとも99.5%同一など、項目a)またはd)下の上記のヌクレオチド配列の保存ドメインと少なくとも65%の配列同一性を有する。
【０１５９】
本発明が例示される特定の実施形態では、c)におけるサブ配列またはフラグメントは、配列番号18-34の配列を含む。
【０１６０】
追加の実施形態では、本発明に従って提供されるトランスジェニック植物は、前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結された構成的、誘導性または組織特異的プロモーターをさらに含む組換えポリヌクレオチド構築物を含む。
【０１６１】
さらに追加の実施形態では、組換えポリヌクレオチド構築物は、転写カセットの前に強力な構成的プロモーターをさらに含む。カセットはヌクレオチド配列を含んでもよく、ここで、調節された発現は、配列番号1-13、97-115を含む、ポリペプチドまたはかかるポリペプチドのホモログをコードする遺伝子、それに続く植物の機能的イントロン、それに続く逆方向性のa)またはd)のポリペプチドの保存的置換変異体を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の、遺伝子座における好ましくは遺伝的改変が導入されることによってもたらされる。
【０１６２】
本発明の現在の好ましい実施形態では、本発明によるトランスジェニック植物は、配列番号96の配列を含む組換えDNA構築物を含む。
【０１６３】
植物種
本発明によれば、トランスジェニック植物は、好ましくは木本植物または木本種である多年生植物でよい。有用な実施形態では、木本植物は、アカシア、ユーカリ、シデ、ブナ、マホガニー、クルミ、オーク、セイヨウトネリコ、ヤナギ、ヒッコリー、カバの木、クリ、ポプラ、ハンノキ、カエデ、スズカケノキ、イチョウ、ヤシおよびモミジバフウからなる群から選択できる広葉樹植物である。これらの2つのグループには、特に材木および加熱用バイオ燃料を提供するように生育される急成長種の樹木または木質低木が含まれるために、その変異体を含むヤナギ、ポプラおよびアスペンなどのヤナギ科の広葉樹植物は特に興味深い。
【０１６４】
追加の実施形態では、木本植物は、糸杉、ベイマツ、モミ、セコイア、アメリカツガ、ヒマラヤスギ、ビャクシン、カラマツ、マツ、アメリカスギ、トウヒおよびイチイからなる群から選択できる針葉樹である。
【０１６５】
有用な実施形態では、木本植物は、リンゴ、セイヨウスモモ、セイヨウナシ、バナナ、オレンジ、キーウィ、レモン、サクランボ、ブドウおよびイチジクからなる群から選択できる実の成る植物である。
【０１６６】
本方法において有用である可能性のある他の木本植物は、ワタ、タケおよびゴムノキからなる群から選択してもよい。
【０１６７】
本発明は、本明細書に記載の方法によって得られる上のトランスジェニック植物の任意の植物細胞、ならびに植物の収穫可能部分、種子およびその栄養繁殖体を含むあらゆる植物部分、および植物外植体または植物組織に及ぶ。本発明は、本発明によるDNA構築物を含む植物、その一部、植物細胞または植物の子孫も包含する。本発明はさらに広がって、上述の方法のいずれかにより作製された一次の形質転換されたまたはトランスフェクトされた細胞、組織、器官もしくは植物全体の子孫を包含し、唯一の必要条件は、子孫が本発明による方法により親で生み出された特徴と同一の遺伝子型のおよび/または表現型の特徴を示すことである。
【０１６８】
本発明の態様の1つの文脈において記載された実施形態および特徴は、本発明のその他の態様にもあてはまることに注目すべきである。従って、一実施形態を包含するまたはそれに関連する他の全ての実施形態に、かかる一実施形態の定義が、変更されるべきところは変更して適用される。例えば、DNA構築物または配列に関して定義が為される場合、かかる定義はまた、例えば、植物を作製する方法、ベクター、植物細胞、植物、バイオマス、及びDNA構築物を含む木本にも関し、その逆も然りである。植物に関連して記載されるDNA構築物はまた全ての他の実施形態にも関連する。
【０１６９】
本出願に引用されているあらゆる特許および非特許文献は、これによって参照によりその全体を組み込まれているものとする。
【０１７０】
本発明は、この時点で、以下の非限定的な実施例においてさらに詳細に説明される。
【実施例】
【０１７１】
序論
生育に関与する遺伝子の機能を見つけ解明するために、広範な遺伝子探索プログラム（gene mining program）を実施し、それにより工業応用できる生育を増加させるのに有用な遺伝子を同定した。
【０１７２】
材料および方法
遺伝子選択
この遺伝子探索プログラムの第1段階は、それらの機能に対して試験するべき遺伝子を限定するために大きな遺伝子プールからいくらかの遺伝子を選択することであった。
【０１７３】
我々は転写因子を試験することを決定した。分析用転写因子の選択理由は、生体植物において非常に多くのプロセスの全部ではなくても多くの部分的調節因子として長い間それらが知られているからである。
【０１７４】
機能を解析する目的である遺伝子の選択は、森林バイオテクノロジーのために興味深い機能を経済的に効率的な形で有する遺伝子を発見することの重要な一部ではあるが、産業上の応用でのその使用を見出すための決定的段階は、選択された遺伝子の遺伝子機能を実際に試験することである。本明細書で実施されるような遺伝子選択は、単に、ある種の特性/機能に対する機能的なゲノム計画(例えば、変異体またはトランスジェニック植物/生物を使用した遺伝子の大規模試験)のポジティブな結果を最大とするのに重要である。
【０１７５】
転写因子の遺伝子は、Riano-Pachon et al 2007に記載されたhttp://plntfdb.bio.uni-potsdam.de/v2.0/及びhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/などのデータベースに存在する転写因子として注釈が付いた植物遺伝子に対する、ポプラデータベース(Populus DB)(Sterky et al. 2004)に存在する遺伝子のBLAST解析によって同定された。いくつかの例においては、遺伝子は、また、木部形成の間に差次的発現パターンを有することに基づいて選択された（構築物TFSTT019、035、047及び051に対応する遺伝子）。
【０１７６】
選択された遺伝子のクローン化
ブラックコットンウツドのゲノム配列由来のデータ(Tuskan et al. 2006)からBLAST解析を使用して、選択した遺伝子に対する対応する遺伝子モデルを抽出した。遺伝子モデルは、シロイヌナズナ及び他の植物種における相同遺伝子に対して刊行された情報と比較され、いくつかの場合にはそれらの情報に基づいて訂正された。これは、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/及びhttp://www.arabidopsis.org/などのデータベースを使用して行った。選択された遺伝子を次いでCaMV 35Sプロモーターの制御下において過剰発現用ベクター中にクローニングした。cDNAの単離用に、全RNAをハイブリッドアスペンクローンT89植物よりサンプリングした茎、葉及び樹皮組織から単離し、Superscript III First Strand Synthesis System (Invitrogen)を使用してcDNAに逆転写した。次いでcDNAをPhusion high fidelity DNAポリメラーゼ(Finnzymes)を使用して遺伝子特異的順方向（フォワード）及び逆方法（リバース）プライマーを用いてPCRにより増幅させた。PCRプライマーは以下のように選択された；5’プライマーはスタートコドンとして配置され、3’リバースプライマーは翻訳停止コドンの3’に配置された。フォワードプライマーを各標的遺伝子のKozak配列(5’-AGAACC-3’)の上流であってスタートコドンの隣に導入させることによって改変させた。増幅させたcDNAをGatewayエントリーベクターpENTR/D-TOPO (Invtriogen)中に挿入させ、次いで、Gateway LR組換反応(Invtirogen)を使用して発現ベクターpK2GW7 (配列番号96)中に遺伝子を移動させた。クローニングされた遺伝子をコントロール用にシークエンシングし、植物ベクターpK2GW7中にサブクローニングする前に標準技術を用いて選択された遺伝子と比較した。
【０１７７】
本明細書に提示される遺伝子に対する遺伝子の配列、ポリペプチド配列及びPCRプライマーをTable AからCに収載する。
【０１７８】
【表１】
0005701610.tif 000003
【０１７９】
【表２】
0005701610.tif 000004
【０１８０】
【表３】
0005701610.tif 000005
【０１８１】
植物形質転換
CaMV35S:過剰発現DNA構築物は、アグロバクテリウムに、続いてハイブリッドアスペンのヨーロッパヤマナラシ×アメリカヤマナラシに形質転換された。以後「ポプラ」と称するクローンT89は、基本的にNilssonら、(1992)に記載の通りに形質転換され再生された。構築物ごとにほぼ3〜8種の独立した系統が作製された。1つの構築物を使用して作製された1つのそのようなグループのトランスジェニック樹木、例えば、1つの構築物から発出する異なったトランスジェニック樹木は以降は「構築物群」と呼ばれる。各構築物群内の各トランスジェニック系統、例えば、TF0555-2B、TF0555-3Aなどは、異なった形質転換事象であり、したがって、組換えDNAが植物ゲノム中の異なった位置に挿入されている可能性が最も高い。このせいで、1つの構築物群内の異なる系統は部分的に異なっている。例えば、異なる形質転換事象は、遺伝子上方調節のレベルが異なる植物を作製することになることが知られている。例えば、TF055RP-2Bなどの個体を持つTF0555RPと命名された構築物群は、RP部分を持たないものと同一である。RPは、これがrp部分を持たないものと同一の構築物群の再植林したものであることを意味する。RP2は2回目の再植林体を意味し、RP3は3回目の再植林体であり、以下同じである。
【０１８２】
植物生育
トランスジェニックポプラ系統は、明期18時間および温度22℃/15℃(昼/夜)の下、温室内で、その野生型対照(wt)樹木と一緒に生育された。植物は毎週Weibulls Rika S NPK 7-1-5 希釈1対100を施肥した(最終濃度NO3、55g/l;NH4、29g/l;P、12g/l;K、56g/l;Mg、7.2g/l;S、7.2g/l;B、0.18g/l;Cu、0.02g/l;Fe、0.84g/l;Mn、0.42g/l;Mo、0.03g/l;Zn、0.13g/L)。植物は収穫までに8〜9週間生育した。この時期中、その樹高および直径を週1から2回測定した。生育グループ中、多くの野生型樹木(典型的には35〜45樹木)およびいくつかの構築物群(典型的には6〜20構築物群)を含む多くのトランスジェニック樹木は、上の同一条件の下で温室で同時に生育した。野生型樹木と構築物群間の比較はすべて、各生育グループ内で行う。
【０１８３】
試料採取
主な2つのタイプの収穫および試料採取を実施した。1つの一般的なタイプは、例えば、化学分析、木部形態学的解析、遺伝子発現解析、木部密度解析およびメタボロミクス解析用に設計された。2番目のタイプは、樹皮、木部、葉および根の乾燥重量測定用に設計された。
【０１８４】
構築物群の選択
生育の第1回目では、過剰発現した特定の遺伝子を有する樹木の各グループ、すなわち、構築物群ごとに、いくつかの以下の解析を実施した:生育測定及び多くの場合樹木の密度。野生型対照樹木と比較しての表現型変化、例えば生育の増加を示した構築物群を選び出すために、これらのデータを解析した。
【０１８５】
再植林及び再生育
温室育成の第1回目における生育データに基づいて、特定の遺伝子が過剰発現した樹木のグループ、すなわち、構築物群を選択し、生育の第1回目と同一の条件下で再植林及び再生育させた。各構築物群内の選択されたトランスジェニックポプラ系統は、トリプリケート(triplicate)で再生育された。再植林の回数の番号及び植物系統の個体の複製番号を、それらをユニークなものとし続けるために、例えばTF0555rp1-2B-1、TF0555rp1-2B-2、TF0555rp1-2b-3などのように、構築物群の系統の名前に追加し、ここで、rp1は構築物群TF0555系統2Bの再植林が1回目であることを意味し、-1、-2、-3は植物系統の個体の複製体を示す。同様に、rp2は再植林が2回目であることを意味する。温室育成の第1回目に含まれない、新しい構築物群系統が植林される場合には、接尾辞(.2回目または.2nd）がこれを記述するために構築物群の名称に追加される。
【０１８６】
生育データに基づいて、構築物群およびそれによって生育特徴を改変するために利用することが可能な遺伝子を選択するために、いくつかの解析および生長速度因子を実施して計算した。選択判定基準および方法は以下に記載する通りであった。
【０１８７】
［実施例１］
生育解析
最大樹高生育速度
樹高生育速度測定(本明細書では「最大樹高生育速度」と名付ける)は、4連続樹高データ点にわたってフィットさせた一次関数の勾配として定義した。樹高生育速度値は、段階的な方法でデータ点1〜4、データ点2〜5等で計算した。例は図1を参照されたい。各植物ごとに段階的な線形回帰分析から生み出される最大値として定義された最大樹高生育速度はコンピュータ処理した。構築物群中の個々の形質転換体からの高い最大樹高生育速度値の一次データは、不良値に基づかないようにチェックした。樹高生育曲線の例を示している図1から、樹高生育速度は生育の第1部分中は増加し、次に植物はその最大樹高生育に到達し、次に生育速度は植物が大きくなるに従って低下することがわかる。これらの段階は植物が異なれば時期も異なり、植物の測定にノイズがいくらか加わるために、速度法を使用した我々の上記の最大樹高生育は、異なった個々の樹木に対しこれらの条件で最大生育速度を計算するのに非常に有用である。
【０１８８】
直径生育速度
上に定義する生育条件下で、茎幅は時間の経過とともに比較的線形増加を示し、それは、d(t)=c*t+d0（式中、d0は初期幅であり、cは直径生育速度(勾配)である）により記述される。直径データに関する線形回帰は、直径生育速度を評価するために使用した。
【０１８９】
最終樹高および直径
また、最終樹高および直径を使用して改変された生長特性を有する構築物群を選択した。これらの値は、樹木生育能力および組織培養から土壌へ移植し温室へ置くときの生育を開始する樹木の能力の両方を考慮に入れる。
【０１９０】
選択パラメーター
上記の生育パラメーター、すなわち、直径生育速度、最大樹高生育速度、最終樹高および最終直径において、野生型集団と比べて有意なまたは明白な増加を示した構築物群は、その生育特性が改変された構築物群として同定され、したがって、相当する遺伝子を使用してこれらの特性を改変することができる。選択判定基準は下で述べている。2つの異なった選択判断基準が使用され、1つは基本的なレベルであり、もう1つは格別の関心のある生育表現型を与える構築物用である。
【０１９１】
生育差選択判定基準
表であるTable 1.2は、構築物の表現型を記述するために使用される際の異なる生育パラメーターに対して使用される略称をリスト化する。
【０１９２】
［表１.２．］
異なる表現型に対して使用される略称：
AFH: 野生型集団及び各構築物群集団の平均最終樹高
AFD: 野生型集団及び各構築物群集団の平均最終直径
AMHGR: 野生型集団及び各構築物群集団の平均最大樹高生長速度
ADGR: 野生型集団及び各構築物群集団の平均直径生長速度
MFH: 野生型集団及び各構築物群集団の最大最終樹高
MFD: 野生型集団及び各構築物群集団の最大最終直径
MMHGR: 野生型集団及び各構築物群集団の最大の最大樹高生長速度
MDC: 野生型集団及び各構築物群集団の最大の直径生長速度
【０１９３】
生育差選択判定基準は以下の通りである。
1.構築物群AFH、MFH、AMHGRおよびMMHGRが、対応する野生型グループAFH、MFH、AMHGRおよびMMHGRよりも少なくとも5%(もしくは2番目により厳しい水準では8%)大きい場合、または
2.構築物群AFD、MFD、ADGRおよびMDCが、対応する野生型グループAFD、MFD、ADGRおよびMDCよりも少なくとも5%(もしくは2番目により厳しい水準では8%)大きい場合、または
3.構築物群AFH、AFD、AMHGRもしくはADGRが、対応する野生型グループAFH、AFD、AMHGRもしくはADGRよりも少なくとも18%(もしくは2番目により厳しい水準では22%)大きい場合、または
4.構築物群MFH、MFD、MMHGRもしくはMDCが、対応する野生型グループMFH、MFD、MMHGRもしくはMDCよりも少なくとも18%(もしくは2番目により厳しい水準では22%)大きい場合。
【０１９４】
ラージスケールの機能的なゲノム計画を実行すると、得られるデータには一定量の変動と不確実性が生じる。この設定では、以下に示すようような原因から変動がもたらされる：構築物群内の系統が異なれば過剰発現のレベルも異なるために、構築物群内の、試験に供した1つの系統から全ての系統が、表現型を示す可能性があること；植物を組織培養から温室に移植するときの植物状態のわずかな変動による実験手順中に起きる生育の変動、および生育周期中の異なった時点中の温室内での位置の違いに基づく変動。これらの変動は、データを解析する際に処理しなければならない。これに基づいて、生育が増大した構築物群を選択するために、5%の増加および18%の増加という2つの異なる閾値を使用した。選択基準1および2は5%増加を使用しているが、この増加は、樹高生育に対応する全表現型AFH、MFH、AMHGRおよびMMHGRに、または直径生育に対応する全表現型AFD、MFD、ADGRおよびMDCに存在しなければならない。植物の一部または1つのみにおよび1つの表現型クラスのみに表現型が見られる場合、無作為の変動に基づいて構築物群を選択しないように、高い方の18%増加を使用してポジティブな構築物群を選択した(選択基準3と4は、それぞれ平均値と最大個体値に基づいて選択する)。
【０１９５】
これらの判定基準のうち1つまたは複数を満たす構築物群を選択した。
【０１９６】
リアルタイムRT PCRを使用して、組換え過剰発現構築物群の構築物遺伝子の発現レベルを、対応する野生型の群と比較した。26Sプロテオソーム調節サブユニットS2の発現レベルを、構築物遺伝子の発現を標準化するために参照として使用した。比較CT法を相対的構築物遺伝子発現レベルの計算用に使用し、ここで、構築物と参照群の遺伝子発現レベル間の比率は、(1 + E標的)-CT標的/(1 + E参照)-CT参照（式中、E標的及びE参照は、それぞれ、構築物と参照用遺伝子のPCR増幅効率であり、CT標的及びCT参照は、それぞれ、構築物と参照用遺伝子の増幅に対して計算される閾値サイクルである。）で記述される。構築物と参照群の遺伝子発現レベル間の比率は、次いで、野生型群の比の平均で標準化された。
【０１９７】
全RNA抽出のために、茎試料（約50 mg)を温室生育した植物から回収し、液体窒素中に急速冷凍させた。凍結試料をビーズミル(Retsch MM301)で細かく粉砕した。全RNAを、製造業者(Omega Bio-Tek)の推奨に従って、E-Z 96 Plant RNAキットを使用して、抽出した。cDNAの合成を、製造業者(Bio-Rad)の推奨に従って、iScript cDNA合成キットを使用して、実施した。RNA濃度を測定し、等量をcDNA合成用に使用して、PCR反応用の、等量のcDNAを確保した。cDNAをリアルタイムPCRに先立ち、12.5 x に希釈した。
【０１９８】
リアルタイムPCRプライマーを、プライマーアニーリング部位での鋳型の2次構造の干渉を最小限化するために、Beacon Designer 6 (PREMEIER Biosoft International)を使用し、内包されたツールを用いることにより設計した。
【０１９９】
リアルタイムPCRのために、cDNA鋳型を、対応する構築物遺伝子特異的プライマー(配列番号53-61及び配列番号63-71)、内部参照用遺伝子特異的プライマー(配列番号62及び72）及びSYBR Green Supermix (Bio-Rad)と混合させた。リアルタイムPCR反応をMyiQ PCRサーマルサイクラー(Bio-Rad)で行い、内包されたソフトウェアiQ5を使用して解析した。反応はトリプリケートで設けられ、各試料に対して構築物遺伝子の特異的プライマーを使用して3回、参照用遺伝子特異的プライマーを使用して3回実施し、各トリプリケートに対する平均閾値サイクルを、次いで、相対的な構築物の遺伝子発現レベルの計算用に使用した。
【０２００】
96穴プレートをマクロフィルムで覆い、サーマルサイクラー中にセットして反応サイクルを開始させた。例示として、反応サイクルは以下の工程を含んでもよい：95℃で3分30秒間初期変性後、以下の工程：95℃で10秒間、55℃で30秒間、及び72℃で40秒間を含む増幅を40回。
【０２０１】
【表４】
0005701610.tif 000006
【０２０２】
結果
特定の構築物群及びそれらに対応する野生型群の生育の生データをTable 1.4-1.16に示す。表の行は、特定の構築物群（「TF」と命名）及び対応する野生型群（「T89」）と命名）の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０２０３】
リアルタイムRT-PCRを使用して構築物の過剰発現を確認する。リアルタイムRT-PCRのデータ表は、参照用遺伝子発現に対する構築物遺伝子の遺伝子発現レベルを含む。示される構築物群及び参照群の遺伝子発現レベル間の全ての比率が、野生型群の比率の平均で標準化されている。
【０２０４】
構築物群TF0002
この構築物は生育の増加を誘導する。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して12%高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して31％高い。TF0002構築物群は、table 1.4dに示されるように、生長差選択判断基準(3)のより厳しい水準を満たす。
【０２０５】
Table 1.4a及び1.4bは、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０２０６】
【表５】
0005701610.tif 000007
【０２０７】
【表６】
0005701610.tif 000008
【０２０８】
リアルタイムRT-PCRを使用して、構築物TF0002の過剰発現を確認した。Table 1.4cは参照用遺伝子発現に対しての構築物遺伝子の遺伝子発現レベルを含む。示される構築物群及び参照群の遺伝子発現レベル間の全ての比率が、野生型群の比率の平均で標準化されている。構築物群TF0002の全ての個体が、本RT-PCRデータによれば過剰発現している。
【０２０９】
【表７】
0005701610.tif 000009
【０２１０】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 1.4dに示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０２１１】
【表８】
0005701610.tif 000010
【０２１２】
構築物群TF0052
この構築物は生育の増加を誘導する。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して24%高い。TF0052構築物群は、table 1.5cに示されるように、生長差選択判断基準(4)のより厳しい水準を満たす。
【０２１３】
Table 1.5a及び1.5bは、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０２１４】
【表９】
0005701610.tif 000011
【０２１５】
【表１０】
0005701610.tif 000012
【０２１６】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 1.5cに示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０２１７】
【表１１】
0005701610.tif 000013
【０２１８】
構築物群TF0065
この構築物は生育の増加を誘導する。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して8%高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して11％高い。TF0065構築物群は、table 1.6cに示されるように、生長差選択判断基準(1)を満たす。
【０２１９】
Table 1.6a及び1.6bは、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０２２０】
【表１２Ａ】
0005701610.tif 000014
【０２２１】
【表１２Ｂ】
0005701610.tif 000015
【０２２２】
【表１３Ａ】
0005701610.tif 000016
【０２２３】
【表１３Ｂ】
0005701610.tif 000017
【０２２４】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 1.6cに示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０２２５】
【表１４】
0005701610.tif 000018
【０２２６】
構築物群TF0076
この構築物は生育の増加を誘導する。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して10%高い。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して18%高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して13％高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して18％高い。TF0076構築物群は、table 1.7dに示されるように、生長差選択判断基準(1)のより厳しい水準及び生長差選択判断基準(4)のより厳しくない水準を満たす。
【０２２７】
Table 1.7a及び1.7bは、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０２２８】
【表１５Ａ】
0005701610.tif 000019
【０２２９】
【表１５Ｂ】
0005701610.tif 000020
【０２３０】
【表１６Ａ】
0005701610.tif 000021
【０２３１】
【表１６Ｂ】
0005701610.tif 000022
【０２３２】
リアルタイムRT-PCRを使用して、構築物TF0076の過剰発現を確認した。Table 1.7cは参照用遺伝子発現に対しての構築物遺伝子の遺伝子発現レベルを含む。示される構築物群及び参照群の遺伝子発現レベル間の全ての比率が、野生型群の比率の平均で標準化されている。構築物群TF0076のうちの4から6の個体が、本RT-PCRデータによれば過剰発現している。
【０２３３】
【表１７】
0005701610.tif 000023
【０２３４】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 1.7dに示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０２３５】
【表１８】
0005701610.tif 000024
【０２３６】
構築物群TF0089
この構築物は生育の増加を誘導する。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して7%高い。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して17%高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して12％高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して17％高い。TF0089構築物群は、table 1.8cに示されるように、生長差選択判断基準(1)のより厳しい水準を満たす。
【０２３７】
Table 1.8a及び1.8bは、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０２３８】
【表１９Ａ】
0005701610.tif 000025
【０２３９】
【表１９Ｂ】
0005701610.tif 000026
【０２４０】
【表２０Ａ】
0005701610.tif 000027
【０２４１】
【表２０Ｂ】
0005701610.tif 000028
【０２４２】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 1.8cに示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０２４３】
【表２１】
0005701610.tif 000029
【０２４４】
構築物群TF0109
この構築物は生育の増加を誘導する。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して24%高い。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して39%高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して27％高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して44％高い。TF0109構築物群は、table 1.9dに示されるように、生長差選択判断基準(1)、(3)及び(4)のより厳しい水準を満たす。
【０２４５】
Table 1.9a及び1.9bは、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０２４６】
【表２２】
0005701610.tif 000030
【０２４７】
【表２３】
0005701610.tif 000031
【０２４８】
リアルタイムRT-PCRを使用して、構築物TF0109の過剰発現を確認した。Table 1.9cは参照用遺伝子発現に対しての構築物遺伝子の遺伝子発現レベルを含む。示される構築物群及び参照群の遺伝子発現レベル間の全ての比率が、野生型群の比率の平均で標準化されている。構築物群TF0109のうちの4から7の個体が、本RT-PCRデータによれば過剰発現している。構築物群TF0109のうちの2から7の個体が、本RT-PCRデータによれば下方制御されている。構築物TF0109がより高い発現レベルである個体は、相対的に高くかつ早く生長し、構築物TF0109がより低い発現レベルである個体はより低い。
【０２４９】
【表２４】
0005701610.tif 000032
【０２５０】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 1.9dに示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０２５１】
【表２５】
0005701610.tif 000033
【０２５２】
構築物群TF0132
この構築物は生育の増加を誘導する。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して13%高い。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して26%高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して18％高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して18％高い。TF0132構築物群は、table 1.10cに示されるように、生長差選択判断基準(1)及び(4)のより厳しい水準を満たす。
【０２５３】
Table 1.10a及び1.10bは、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０２５４】
【表２６】
0005701610.tif 000034
【０２５５】
【表２７】
0005701610.tif 000035
【０２５６】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 1.10cに示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０２５７】
【表２８】
0005701610.tif 000036
【０２５８】
構築物群TFSTT051
この構築物は生育の増加を誘導する。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して7%高い。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して11%高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して5％高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して10％高い。TFSTT051構築物群は、table 1.11dに示されるように、生長差選択判断基準(1)を満たす。
【０２５９】
Table 1.11a及び1.11bは、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０２６０】
【表２９】
0005701610.tif 000037
【０２６１】
【表３０】
0005701610.tif 000038
【０２６２】
リアルタイムRT-PCRを使用して、構築物TFSTT051の過剰発現を確認した。Table 1.11cは参照用遺伝子発現に対しての構築物遺伝子の遺伝子発現レベルを含む。示される構築物群及び参照群の遺伝子発現レベル間の全ての比率が、野生型群の比率の平均で標準化されている。構築物群TFSTT051のうちの1から8の個体が、本RT-PCRデータによれば過剰発現している。
【０２６３】
【表３１】
0005701610.tif 000039
【０２６４】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 1.11dに示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０２６５】
【表３２】
0005701610.tif 000040
【０２６６】
構築物群TF0013
この構築物は生育の増加を誘導する。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して12%高い。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して6%高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して20％高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して33％高い。TF0013構築物群は、table 1.12dに示されるように、生長差選択判断基準(4)のより厳しい水準及び生長差選択判断基準(1)及び(3)のより厳しくない水準を満たす。
【０２６７】
Table 1.12a及び1.12bは、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０２６８】
【表３３Ａ】
0005701610.tif 000041
【０２６９】
【表３３Ｂ】
0005701610.tif 000042
【０２７０】
【表３４Ａ】
0005701610.tif 000043
【０２７１】
【表３４Ｂ】
0005701610.tif 000044
【０２７２】
リアルタイムRT-PCRを使用して、構築物TF0013の過剰発現を確認した。Table 1.12cは参照用遺伝子発現に対しての構築物遺伝子の遺伝子発現レベルを含む。示される構築物群及び参照群の遺伝子発現レベル間の全ての比率が、野生型群の比率の平均で標準化されている。構築物群TF0013のうちの3から8の個体が、本RT-PCRデータによれば過剰発現している。
【０２７３】
【表３５】
0005701610.tif 000045
【０２７４】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 1.12dに示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０２７５】
【表３６】
0005701610.tif 000046
【０２７６】
1.3.10 構築物群TF0097
この構築物は生育の増加を誘導する。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して10%高い。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して16%高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して15％高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して15％高い。直径生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して7％高い。直径生育速度は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して21％高い。TF0097構築物群は、table 1.13dに示されるように、生長差選択判断基準(1)のより厳しい水準及び生長差選択判断基準(4)のより厳しくない水準を満たす。
【０２７７】
Table 1.13a及び1.13bは、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０２７８】
【表３７Ａ】
0005701610.tif 000047
【０２７９】
【表３７Ｂ】
0005701610.tif 000048
【０２８０】
【表３８Ａ】
0005701610.tif 000049
【０２８１】
【表３８Ｂ】
0005701610.tif 000050
【０２８２】
リアルタイムRT-PCRを使用して、構築物TF0097の過剰発現を確認した。Table 1.13cは参照用遺伝子発現に対しての構築物遺伝子の遺伝子発現レベルを含む。示される構築物群及び参照群の遺伝子発現レベル間の全ての比率が、野生型群の比率の平均で標準化されている。構築物群TF0076のうちの2から9の個体が、本RT-PCRデータによれば過剰発現している。
【０２８３】
【表３９】
0005701610.tif 000051
【０２８４】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 1.13dに特定する。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０２８５】
【表４０】
0005701610.tif 000052
【０２８６】
1.3.11 構築物群TFSTT019
この構築物は生育の増加を誘導する。最終直径は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して11%高い。最終直径は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して8%高い。直径生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して18％高い。直径生育速度は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して9％高い。TFSTT019構築物群は、table 1.14cに示されるように、生長差選択判断基準(2)を満たす。
【０２８７】
Table 1.14a及び1.14bは、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０２８８】
【表４１Ａ】
0005701610.tif 000053
【０２８９】
【表４１Ｂ】
0005701610.tif 000054
【０２９０】
【表４２Ａ】
0005701610.tif 000055
【０２９１】
【表４２Ｂ】
0005701610.tif 000056
【０２９２】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 1.14cに特定する。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０２９３】
【表４３】
0005701610.tif 000057
【０２９４】
1.3.12 構築物群TFSTT035
この構築物は生育の増加を誘導する。最終直径は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して8%高い。最終直径は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して11%高い。直径生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して12％高い。直径生育速度は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して8％高い。TFSTT035構築物群は、table 1.15cに示されるように、生長差選択判断基準(2)を満たす。
【０２９５】
Table 1.15a及び1.15bは、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０２９６】
【表４４Ａ】
0005701610.tif 000058
【０２９７】
【表４４Ｂ】
0005701610.tif 000059
【０２９８】
【表４５Ａ】
0005701610.tif 000060
【０２９９】
【表４５Ｂ】
0005701610.tif 000061
【０３００】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 1.15cに示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０３０１】
【表４６】
0005701610.tif 000062
【０３０２】
1.3.13 構築物群TFSTT047
この構築物は生育の増加を誘導する。最終直径は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して8%高い。最終直径は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して11%高い。直径生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して12％高い。直径生育速度は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して8％高い。TFSTT047構築物群は、table 1.16cに示されるように、生長差選択判断基準(3)を満たす。
【０３０３】
Table 1.16a及び1.16bは、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０３０４】
【表４７】
0005701610.tif 000063
【０３０５】
【表４８】
0005701610.tif 000064
【０３０６】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 1.16cに示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０３０７】
【表４９】
0005701610.tif 000065
【０３０８】
［実施例２］
構築物群TF0002Rp2
この構築物は生育の増加を誘導する。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して29%高い。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して27%高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して36％高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して38％高い。直径生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して10％高い。直径生育速度は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して9％高い。TF0002Rp2構築物群は、table 2.3に示されるように、生長差選択判断基準(1)、(3)及び(4)のより厳しい水準を満たす。
【０３０９】
Table 2.1及び2.2は、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０３１０】
【表５０】
0005701610.tif 000066
【０３１１】
【表５１】
0005701610.tif 000067
【０３１２】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 2.3に示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０３１３】
【表５２】
0005701610.tif 000068
【０３１４】
構築物群TF0003
Table 2.4及び2.5は、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０３１５】
【表５３Ａ】
0005701610.tif 000069
【０３１６】
【表５３Ｂ】
0005701610.tif 000070
【０３１７】
【表５４Ａ】
0005701610.tif 000071
【０３１８】
【表５４Ｂ】
0005701610.tif 000072
【０３１９】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 2.6に示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０３２０】
【表５５】
0005701610.tif 000073
【０３２１】
構築物群TF0011
Table 2.7及び2.8は、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０３２２】
【表５６Ａ】
0005701610.tif 000074
【０３２３】
【表５６Ｂ】
0005701610.tif 000075
【０３２４】
【表５７】
0005701610.tif 000076
【０３２５】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 2.9に示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０３２６】
【表５８】
0005701610.tif 000077
【０３２７】
構築物群TF0013rp2
Table 2.10及び2.11は、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０３２８】
【表５９】
0005701610.tif 000078
【０３２９】
【表６０】
0005701610.tif 000079
【０３３０】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 2.12に示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０３３１】
【表６１】
0005701610.tif 000080
【０３３２】
構築物群TF0045
この構築物は生育の増加を誘導する。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して6%高い。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して11%高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して9％高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して12％高い。最終直径は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して10%高い。最終直径は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して9%高い。TF0045構築物群は、table 2.15に示されるように、生長差選択判断基準(1)を満たす。
【０３３３】
Table 2.13及び2.14は、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０３３４】
【表６２】
0005701610.tif 000081
【０３３５】
【表６３】
0005701610.tif 000082
【０３３６】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 2.15に示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０３３７】
【表６４】
0005701610.tif 000083
【０３３８】
構築物群TF0052Rp1
Table 2.16及び2.17は、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０３３９】
【表６５】
0005701610.tif 000084
【０３４０】
【表６６】
0005701610.tif 000085
【０３４１】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 2.18に示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０３４２】
【表６７】
0005701610.tif 000086
【０３４３】
構築物群TF0076Rp2
この構築物は生育の増加を誘導する。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して13%高い。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して13%高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して13％高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して18％高い。TF0076Rp2構築物群は、table 2.21に示されるように、生長差選択判断基準(1)のより厳しい水準を満たす。
【０３４４】
Table 2.19及び2.20は、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０３４５】
【表６８】
0005701610.tif 000087
【０３４６】
【表６９】
0005701610.tif 000088
【０３４７】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 2.21に示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０３４８】
【表７０】
0005701610.tif 000089
【０３４９】
構築物群TF0096
この構築物は生育の増加を誘導する。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して11%高い。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して8%高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して18％高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して14％高い。最終直径は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して15%高い。最終直径は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して8%高い。直径生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して27％高い。直径生育速度は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して14％高い。TF0096構築物群は、table 2.24に示されるように、生長差選択判断基準(3)のより厳しい水準及び生長差選択判断基準(1)及び(2)のより厳しくない水準を満たす。
【０３５０】
Table 2.22及び2.23は、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０３５１】
【表７１】
0005701610.tif 000090
【０３５２】
【表７２】
0005701610.tif 000091
【０３５３】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 2.24に示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０３５４】
【表７３】
0005701610.tif 000092
【０３５５】
構築物群TF0097Rp1
この構築物は生育の増加を誘導する。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して33%高い。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して43%高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して32％高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して41％高い。最終直径は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して11%高い。最終直径は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して13%高い。直径生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して20％高い。直径生育速度は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して26％高い。TF0097Rp1構築物群は、table 2.27に示されるように、生長差選択判断基準(1)、(2)、(3)及び(4)のより厳しい水準を満たす。
【０３５６】
Table 2.25及び2.26は、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０３５７】
【表７４】
0005701610.tif 000093
【０３５８】
【表７５】
0005701610.tif 000094
【０３５９】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 2.27に示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０３６０】
【表７６】
0005701610.tif 000095
【０３６１】
構築物群TF0104
この構築物は生育の増加を誘導する。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して15%高い。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して12%高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して16％高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して14％高い。最終直径は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して23%高い。最終直径は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して20%高い。直径生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して20％高い。直径生育速度は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して10％高い。TF0104構築物群は、table 2.30に示されるように、生長差選択判断基準(1)、(2)、(3)のより厳しい水準及び生長差選択判断基準の(4)のより厳しくない水準を満たす。
【０３６２】
Table 2.28及び2.29は、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０３６３】
【表７７】
0005701610.tif 000096
【０３６４】
【表７８】
0005701610.tif 000097
【０３６５】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 2.30に示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０３６６】
【表７９】
0005701610.tif 000098
【０３６７】
構築物群TF0109Rp1
この構築物は生育の増加を誘導する。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して22%高い。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して32%高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して26％高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して40％高い。最終直径は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して15%高い。最終直径は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して14%高い。直径生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して25％高い。直径生育速度は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して27％高い。TF0109Rp1構築物群は、table 2.33に示されるように、生長差選択判断基準(1)、(2)、(3)及び(4)のより厳しい水準を満たす。
【０３６８】
Table 2.31及び2.32は、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０３６９】
【表８０】
0005701610.tif 000099
【０３７０】
【表８１】
0005701610.tif 000100
【０３７１】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 2.33に示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０３７２】
【表８２】
0005701610.tif 000101
【０３７３】
構築物群TF0116
Table 2.34及び2.35は、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０３７４】
【表８３】
0005701610.tif 000102
【０３７５】
【表８４】
0005701610.tif 000103
【０３７６】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 2.36に示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０３７７】
【表８５】
0005701610.tif 000104
【０３７８】
構築物群TF0132.2nd
この構築物は生育の増加を誘導する。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して27%高い。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して32%高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して38％高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して41％高い。最終直径は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して12%高い。最終直径は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して9%高い。直径生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して15％高い。直径生育速度は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して8％高い。TF0132.2nd構築物群は、table 2.39に示されるように、生長差選択判断基準(1)、(3)及び(4)のより厳しい水準及び生長差選択判断基準(2)のより厳しくない水準を満たす。
【０３７９】
Table 2.37及び2.38は、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０３８０】
【表８６】
0005701610.tif 000105
【０３８１】
【表８７】
0005701610.tif 000106
【０３８２】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 2.39に示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０３８３】
【表８８】
0005701610.tif 000107
【０３８４】
構築物群TF0132rp1
この構築物は生育の増加を誘導する。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して29%高い。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して28%高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して31％高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して23％高い。TF0132rp1構築物群は、table 2.42に示されるように、生長差選択判断基準(1)、(3)及び(4)のより厳しい水準を満たす。
【０３８５】
Table 2.40及び2.41は、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０３８６】
【表８９】
0005701610.tif 000108
【０３８７】
【表９０】
0005701610.tif 000109
【０３８８】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 2.42に示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０３８９】
【表９１】
0005701610.tif 000110
【０３９０】
構築物群TF0146
この構築物は生育の増加を誘導する。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して13%高い。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して16%高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して18％高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して25％高い。最終直径は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して8%高い。最終直径は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して8%高い。TF0146構築物群は、table 2.45に示されるように、生長差選択判断基準(1)及び(4)のより厳しい水準を満たす。
【０３９１】
Table 2.43及び2.44は、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０３９２】
【表９２】
0005701610.tif 000111
【０３９３】
【表９３】
0005701610.tif 000112
【０３９４】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 2.45に示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０３９５】
【表９４】
0005701610.tif 000113
【０３９６】
構築物群TF0173
この構築物は生育の増加を誘導する。直径生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して19％高い。TF0173構築物群は、table 2.48に示されるように、生長差選択判断基準(3)を満たす。
【０３９７】
Table 2.46及び2.47は、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０３９８】
【表９５】
0005701610.tif 000114
【０３９９】
【表９６】
0005701610.tif 000115
【０４００】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 2.48に示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０４０１】
【表９７】
0005701610.tif 000116
【０４０２】
構築物群TF0247
この構築物は生育の増加を誘導する。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して7%高い。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して10%高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して5％高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して7％高い。最終直径は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して18%高い。最終直径は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して9%高い。直径生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して22％高い。直径生育速度は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して18％高い。TF0247構築物群は、table 2.51に示されるように、生長差選択判断基準(2)のより厳しい水準及び生長差選択判断基準(1)、(3)及び(4)のより厳しくない水準を満たす。
【０４０３】
Table 2.49及び2.50は、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０４０４】
【表９８】
0005701610.tif 000117
【０４０５】
【表９９】
0005701610.tif 000118
【０４０６】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 2.51に示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０４０７】
【表１００】
0005701610.tif 000119
【０４０８】
構築物群TF0405
この構築物は生育の増加を誘導する。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して10%高い。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して9%高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して13％高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して15％高い。最終直径は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して15%高い。最終直径は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して10%高い。直径生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して22％高い。直径生育速度は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して19％高い。TF0405構築物群は、table 2.54に示されるように、生長差選択判断基準(1)及び(2)のより厳しい水準及び生長差選択判断基準(3)及び(4)のより厳しくない水準を満たす。
【０４０９】
Table 2.52及び2.53は、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０４１０】
【表１０１】
0005701610.tif 000120
【０４１１】
【表１０２】
0005701610.tif 000121
【０４１２】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 2.54に示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０４１３】
【表１０３】
0005701610.tif 000122
【０４１４】
構築物群TFSTT004
Table 2.55及び2.56は、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０４１５】
【表１０４】
0005701610.tif 000123
【０４１６】
【表１０５】
0005701610.tif 000124
【０４１７】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 2.57に示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０４１８】
【表１０６】
0005701610.tif 000125
【０４１９】
構築物群TFSTT013
構築物TFSTT013で過剰発現される遺伝子は、ラックコットンウツドに対して、Joint Genome Institute web page (http://genome.jgi-psf.org/cgi-bin/runAlignment?db=Poptr1_1)でのJamboree Gene ModelデータベースでBLASTサーチを使用した際に、構築物TFSTT038で過剰発現される遺伝子と同じトップヒットを与えるので、それら2遺伝子間の高いホモロジーが示される。
【０４２０】
Table 2.58及び2.59は、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０４２１】
【表１０７Ａ】
0005701610.tif 000126
【０４２２】
【表１０７Ｂ】
0005701610.tif 000127
【０４２３】
【表１０８】
0005701610.tif 000128
【０４２４】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 2.60に示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０４２５】
【表１０９】
0005701610.tif 000129
【０４２６】
構築物群TFSTT016
Table 2.61及び2.62は、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０４２７】
【表１１０】
0005701610.tif 000130
【０４２８】
【表１１１】
0005701610.tif 000131
【０４２９】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 2.63に示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０４３０】
【表１１２】
0005701610.tif 000132
【０４３１】
構築物群TFSTT019Rp1
Table 2.64及び2.65は、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０４３２】
【表１１３】
0005701610.tif 000133
【０４３３】
【表１１４】
0005701610.tif 000134
【０４３４】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 2.66に示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０４３５】
【表１１５】
0005701610.tif 000135
【０４３６】
構築物群TFSTT036
この構築物は生育の増加を誘導する。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して10%高い。最終樹高は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して8%高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して14％高い。最大樹高生育速度は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して12％高い。最終直径は、構築物群と野生型の対照群の平均と比較して7%高い。最終直径は、構築物群と野生型の対照群の最大個体と比較して14%高い。TFSTT036構築物群は、table 2.69に示されるように、生長差選択判断基準(1)を満たす。
【０４３７】
Table 2.67及び2.68は、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０４３８】
【表１１６】
0005701610.tif 000136
【０４３９】
【表１１７】
0005701610.tif 000137
【０４４０】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 2.69に示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０４４１】
【表１１８】
0005701610.tif 000138
【０４４２】
構築物群TFSTT038
構築物TFSTT038で過剰発現される遺伝子は、ラックコットンウツドに対して、Joint Genome Institute web page (http://genome.jgi-psf.org/cgi-bin/runAlignment?db=Poptr1_1)でのJamboree Gene ModelデータベースでBLASTサーチを使用した際に、TFSTT013で過剰発現される遺伝子と同じトップヒットを与えるので、それら2遺伝子間の高いホモロジーが示される。
【０４４３】
Table 2.70及び2.71は、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０４４４】
【表１１９】
0005701610.tif 000139
【０４４５】
【表１２０】
0005701610.tif 000140
【０４４６】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 2.72に示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０４４７】
【表１２１】
0005701610.tif 000141
【０４４８】
構築物群TFSTT045
Table 2.73及び2.74は、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０４４９】
【表１２２】
0005701610.tif 000142
【０４５０】
【表１２３】
0005701610.tif 000143
【０４５１】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 2.75に示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０４５２】
【表１２４】
0005701610.tif 000144
【０４５３】
構築物群TFSTT051Rp1
Table 2.76及び2.77は、特定構築物群及び対応する野生型群に対する生育データを含む。表の行は、特定の構築物群及び対応する野生型群の個体の樹高及び直径の測定を含む。温室における日数としての測定時間を表の見出しに示す。
【０４５４】
【表１２５】
0005701610.tif 000145
【０４５５】
【表１２６】
0005701610.tif 000146
【０４５６】
生育解析より得られた結果を要約表であるtable 2.78に示す。特定構築物群の決定された生育効果が、構築物群と野生型群の間の比率としてAFH、AFD、AMHGR、ADGR、MFH、MFD、MMHGR及びMDCについて示される。
【０４５７】
【表１２７】
0005701610.tif 000147
【０４５８】
［実施例３］
容積による生育計算
各個体植物の茎の容積は、直円錐の容積を使用して、最終樹高及び最終直径から見積もれる。
【０４５９】
茎の容積近似値：
【０４６０】
V=π*h*r2/3
【０４６１】
式中、
V=体積
h=樹高（最終樹高）
r=半径（最終直径/2）。
【０４６２】
各構築物群の集団及び対応する野生型集団の平均最終容積を次に計算する。もし構築群の平均最終容積が、対応する野生型群の平均最終容積に比べて少なくとも25％（または2番目のより厳しい水準において50％）以上大きい場合、構築物群は野生型集団と比較して優位なもしくは顕著な容積増加をしたとみなされ、容積生長選択判断基準が適用される。
【０４６３】
容積近似値から得られる結果を要約表であるtable3.1に記す。決定された生育効果が、構築物群と野生型群の平均最終容積AFV間の比として提示される。
【０４６４】
以下の構築物群は容積による生育判断基準を満たす。構築物群TF0002Rp2は36％の平均最終容積増加を有する；構築物群TF0013は27％の平均最終容積増加を有する；構築物群TF0045は33％の平均最終容積増加を有する；構築物群TF0096は44％の平均最終容積増加を有する；構築物群TF0109は44％の平均最終容積増加を有する；構築物群TF0116は31％の平均最終容積増加を有する；構築物群TF0132rp1は46％の平均最終容積増加を有し、ここで構築物群系統TF0132rp1-4ACは70%（±20％）の平均最終容積増加を有する；構築物群TF0146は34％の平均最終容積増加を有する；構築物群TF0247は49％の平均最終容積増加を有する；構築物群TF0405は45％の平均最終容積増加を有する；構築物群TFSTT016は36％の平均最終容積増加を有する；構築物群TFSTT036は28％の平均最終容積増加を有する；構築物群TFSTT038は32％の平均最終容積増加を有する；構築物群TFSTT045は38％の平均最終容積増加を有する。
【０４６５】
以下の構築物群は、table3.1に示されるように、容積による生長判断基準(5)のより厳しい水準を満たす。構築物群TF0097RP1は68％の平均最終容積増加を有し、ここで、構築物群系統TF0097Rp1-3Aは116％（±37%）の平均最終容積増加を有する；構築物群TF0104は79％の平均最終容積増加を有する；構築物群TF0109Rp1は58％の平均最終容積増加を有し、ここで構築物群系統TF0109Rp1-4Aは92％（±5%）の平均最終容積増加を有する；構築物群TF0132.2ndは65％の平均最終容積増加を有する；構築物群TFSTT004は51％の平均最終容積増加を有する。これらの構築物群は、table3.1に示されるように、容積による生長判断基準(5)のより厳しい水準を満たす。
【０４６６】
【表１２８】
0005701610.tif 000148
【０４６７】
［実施例４］
乾燥重量測定
乾燥重量測定を再植林した構築物群に対して実施した。植物を標準的な手法に従って収穫した；茎、樹皮、5つの完全に発達した葉、他の葉及び根を別々の試料として採集した。葉面積を5つの完全に発達した葉に対して測定し、20の完全に発達した節間の長さを測定した。植物材料の別々の試料を乾燥機中に48時間以上置いた。乾燥重量を測定し、対応する野生型群と比較しての差により解析した。乾燥重量解析において使用した略称及びパラメーターをtable 4.1に示す。
【０４６８】
【表１２９】
0005701610.tif 000149
【０４６９】
乾燥重量実験結果
構築物群TF0013
この構築物はバイオマス生産の増加を誘導する。構築物群の乾燥重量測定は平均茎の20％の増加、平均樹皮の14％の増加、平均葉の14％の増加及び平均合計の16％の増加を対応する野生型群と比較して示す。構築物群系統の1つは、平均茎の48％の増加、平均樹皮の37％の増加、平均葉の31％の増加及び平均合計の36％の増加を対応する野生型群と比較して示す。
【０４７０】
Table 4.2は特定の構築物群及び対応する野生型群に対する乾燥重量データを含む。
【０４７１】
【表１３０】
0005701610.tif 000150
【０４７２】
Table 4.3は、対応する野生型群の平均茎、平均樹皮、平均根、平均葉及び平均合計に対する特定の構築物群の乾燥重量比を含む。Table 4.3は、対応する野生型群に対する特定の構築物群の平均SLA及び平均節間長の比をも示す。
【０４７３】
【表１３１】
0005701610.tif 000151
【０４７４】
Table 4.4は、対応する野生型群の最大茎、最大樹皮、最大根、最大葉及び最大合計に対する特定の構築物群の乾燥重量比を含む。
【０４７５】
【表１３２】
0005701610.tif 000152
【０４７６】
Table 4.5は、対応する野生型群の平均茎、平均樹皮、平均根、平均葉及び平均合計に対する特定の構築物群の乾燥重量比を含む。Table 4.5は、対応する野生型群に対する特定の構築物群の平均SLA及び平均節間長の比をも示す。
【０４７７】
【表１３３】
0005701610.tif 000153
【０４７８】
構築物群TF0132
この構築物はバイオマス生産量の増加を誘導する。構築物群の乾燥重量測定は平均茎の83％の増加、平均樹皮の58％の増加、平均葉の34％の増加及び平均合計の49％の増加を対応する野生型群と比較して示す。構築物群系統の1つは、平均茎の119％の増加、平均樹皮の82％の増加、平均葉の53％の増加及び平均合計の73％の増加を対応する野生型群と比較して示す。根乾燥重量が測定された系統においては、芽-根(shot-root)比の増加が観察された。
【０４７９】
Table 4.6は特定の構築物群及び対応する野生型群に対する乾燥重量データを含む。
【０４８０】
【表１３４】
0005701610.tif 000154
【０４８１】
Table 4.7は、対応する野生型群の平均茎、平均樹皮、平均根、平均葉及び平均合計に対する特定の構築物群の乾燥重量比を含む。Table 4.7は、対応する野生型群に対する特定の構築物群の平均SLA及び平均節間長の比をも示す。
【０４８２】
【表１３５】
0005701610.tif 000155
【０４８３】
Table 4.8は、対応する野生型群の最大茎、最大樹皮、最大根、最大葉及び最大合計に対する特定の構築物群の乾燥重量比を含む。
【０４８４】
【表１３６】
0005701610.tif 000156
【０４８５】
Table 4.9は、対応する野生型群の平均茎、平均樹皮、平均根、平均葉及び平均合計に対する特定の構築物群の乾燥重量比を含む。Table 4.9は、対応する野生型群に対する特定の構築物群の平均SLA及び平均節間長の比をも示す。
【０４８６】
【表１３７】
0005701610.tif 000157
【０４８７】
構築物群TF0002
この構築物はバイオマス生産の増加を誘導する。構築物群の乾燥重量測定は平均茎の50％の増加、平均樹皮の52％の増加、平均葉の6％の増加及び平均合計の20％の増加を対応する野生型群と比較して示す。構築物群系統の1つは、平均茎の72％の増加、平均樹皮の61％の増加、平均葉の20％の増加及び平均合計の35％の増加を対応する野生型群と比較して示す。根乾燥重量が測定された系統においては、芽-根(shot-root)比の増加が観察された。
【０４８８】
Table 4.10は特定の構築物群及び対応する野生型群に対する乾燥重量データを含む。
【０４８９】
【表１３８】
0005701610.tif 000158
【０４９０】
Table 4.11は、対応する野生型群の平均茎、平均樹皮、平均根、平均葉及び平均合計に対する特定の構築物群の乾燥重量比を含む。Table 4.11は、対応する野生型群に対する特定の構築物群の平均SLA及び平均節間長の比をも示す。
【０４９１】
【表１３９】
0005701610.tif 000159
【０４９２】
Table 4.12は、対応する野生型群の最大茎、最大樹皮、最大根、最大葉及び最大合計に対する特定の構築物群の乾燥重量比を含む。
【０４９３】
【表１４０】
0005701610.tif 000160
【０４９４】
Table 4.13は、対応する野生型群の平均茎、平均樹皮、平均根、平均葉及び平均合計に対する特定の構築物群の乾燥重量比を含む。Table 4.13は、対応する野生型群に対する特定の構築物群の平均SLA及び平均節間長の比をも示す。
【０４９５】
【表１４１】
0005701610.tif 000161
【０４９６】
構築物群TF0052
この構築物はバイオマス生産の増加を誘導する。構築物群系統の1つの乾燥重量測定は平均茎の49％の増加、平均樹皮の64％の増加、平均葉の32％の増加及び平均合計の38％の増加を対応する野生型群と比較して示す。
【０４９７】
Table 4.14は特定の構築物群及び対応する野生型群に対する乾燥重量データを含む。
【０４９８】
【表１４２】
0005701610.tif 000162
【０４９９】
Table 4.15は、対応する野生型群の平均茎、平均樹皮、平均根、平均葉及び平均合計に対する特定の構築物群の乾燥重量比を含む。Table 4.15は、対応する野生型群に対する特定の構築物群の平均SLA及び平均節間長の比をも示す。
【０５００】
【表１４３】
0005701610.tif 000163
【０５０１】
Table 4.16は、対応する野生型群の最大茎、最大樹皮、最大根、最大葉及び最大合計に対する特定の構築物群の乾燥重量比を含む。
【０５０２】
【表１４４】
0005701610.tif 000164
【０５０３】
Table 4.17は、対応する野生型群の平均茎、平均樹皮、平均根、平均葉及び平均合計に対する特定の構築物群の乾燥重量比を含む。Table 4.17は、対応する野生型群に対する特定の構築物群の平均SLA及び平均節間長の比をも示す。
【０５０４】
【表１４５】
0005701610.tif 000165
【０５０５】
構築物群TF0076
この構築物はバイオマス生産の増加を誘導する。構築物群の乾燥重量測定は平均茎の16％の増加、平均樹皮の11％の増加、平均葉の4％の増加及び平均合計の7％の増加を対応する野生型群と比較して示す。構築物群系統の1つは、平均茎の42％の増加、平均樹皮の29％の増加、平均葉の16％の増加及び平均合計の23％の増加を対応する野生型群と比較して示す。根乾燥重量が測定された系統においては、芽-根(shot-root)比の増加が観察された。
【０５０６】
Table 4.18は特定の構築物群及び対応する野生型群に対する乾燥重量データを含む。
【０５０７】
【表１４６】
0005701610.tif 000166
【０５０８】
Table 4.19は、対応する野生型群の平均茎、平均樹皮、平均根、平均葉及び平均合計に対する特定の構築物群の乾燥重量比を含む。Table 4.19は、対応する野生型群に対する特定の構築物群の平均SLA及び平均節間長の比をも示す。
【０５０９】
【表１４７】
0005701610.tif 000167
【０５１０】
Table 4.20は、対応する野生型群の最大茎、最大樹皮、最大根、最大葉及び最大合計に対する特定の構築物群の乾燥重量比を含む。
【０５１１】
【表１４８】
0005701610.tif 000168
【０５１２】
Table 4.21は、対応する野生型群の平均茎、平均樹皮、平均根、平均葉及び平均合計に対する特定の構築物群の乾燥重量比を含む。Table 4.21は、対応する野生型群に対する特定の構築物群の平均SLA及び平均節間長の比をも示す。
【０５１３】
【表１４９】
0005701610.tif 000169
【０５１４】
構築物群TF0097
この構築物はバイオマス生産の増加を誘導する。構築物群の乾燥重量測定は平均茎の74％の増加、平均樹皮の82％の増加、平均葉の28％の増加及び平均合計の43％の増加を対応する野生型群と比較して示す。構築物群系統の1つは、平均茎の136％の増加、平均樹皮の141％の増加、平均葉の63％の増加及び平均合計の87％の増加を対応する野生型群と比較して示す。根乾燥重量が測定された系統においては、芽-根(shot-root)比の増加が観察された。
【０５１５】
Table 4.22は特定の構築物群及び対応する野生型群に対する乾燥重量データを含む。
【０５１６】
【表１５０】
0005701610.tif 000170
【０５１７】
Table 4.23は、対応する野生型群の平均茎、平均樹皮、平均根、平均葉及び平均合計に対する特定の構築物群の乾燥重量比を含む。Table 4.23は、対応する野生型群に対する特定の構築物群の平均SLA及び平均節間長の比をも示す。
【０５１８】
【表１５１】
0005701610.tif 000171
【０５１９】
Table 4.24は、対応する野生型群の最大茎、最大樹皮、最大根、最大葉及び最大合計に対する特定の構築物群の乾燥重量比を含む。
【０５２０】
【表１５２】
0005701610.tif 000172
【０５２１】
Table 4.25は、対応する野生型群の平均茎、平均樹皮、平均根、平均葉及び平均合計に対する特定の構築物群の乾燥重量比を含む。Table 4.25は、対応する野生型群に対する特定の構築物群の平均SLA及び平均節間長の比をも示す。
【０５２２】
【表１５３】
0005701610.tif 000173
【０５２３】
構築物群TF0109
この構築物はバイオマス生産の増加を誘導する。構築物群の乾燥重量測定は平均茎の57％の増加、平均樹皮の56％の増加、平均葉の34％の増加及び平均合計の40％の増加を対応する野生型群と比較して示す。構築物群系統の1つは、平均茎の82％の増加、平均樹皮の62％の増加、平均葉の10％の増加及び平均合計の31％の増加を対応する野生型群と比較して示す。根乾燥重量が測定された系統においては、芽-根(shot-root)比の増加が観察された。
【０５２４】
Table 4.26は特定の構築物群及び対応する野生型群に対する乾燥重量データを含む。
【０５２５】
【表１５４】
0005701610.tif 000174
【０５２６】
Table 4.27は、対応する野生型群の平均茎、平均樹皮、平均根、平均葉及び平均合計に対する特定の構築物群の乾燥重量比を含む。Table 4.27は、対応する野生型群に対する特定の構築物群の平均SLA及び平均節間長の比をも示す。
【０５２７】
【表１５５】
0005701610.tif 000175
【０５２８】
Table 4.28は、対応する野生型群の最大茎、最大樹皮、最大根、最大葉及び最大合計に対する特定の構築物群の乾燥重量比を含む。
【０５２９】
【表１５６】
0005701610.tif 000176
【０５３０】
Table 4.29は、対応する野生型群の平均茎、平均樹皮、平均根、平均葉及び平均合計に対する特定の構築物群の乾燥重量比を含む。Table 4.29は、対応する野生型群に対する特定の構築物群の平均SLA及び平均節間長の比をも示す。
【０５３１】
【表１５７】
0005701610.tif 000177
【０５３２】
構築物群TFSTT019
この構築物はバイオマス生産の増加を誘導する。構築物群系統の1つの乾燥重量測定は平均茎の19％の増加、平均樹皮の12％の増加、平均葉の10％の増加及び平均合計の11％の増加を対応する野生型群と比較して示す。この遺伝子は、多くの系統においてSLAの増加をも与え、多くの場合においてこれらは効率的な生長と組み合わされる。
【０５３３】
Table 4.30は特定の構築物群及び対応する野生型群に対する乾燥重量データを含む。
【０５３４】
【表１５８】
0005701610.tif 000178
【０５３５】
Table 4.31は、対応する野生型群の平均茎、平均樹皮、平均根、平均葉及び平均合計に対する特定の構築物群の乾燥重量比を含む。Table 4.31は、対応する野生型群に対する特定の構築物群の平均SLA及び平均節間長の比をも示す。
【０５３６】
【表１５９】
0005701610.tif 000179
【０５３７】
Table 4.32は、対応する野生型群の最大茎、最大樹皮、最大根、最大葉及び最大合計に対する特定の構築物群の乾燥重量比を含む。
【０５３８】
【表１６０】
0005701610.tif 000180
【０５３９】
Table 4.33は、対応する野生型群の平均茎、平均樹皮、平均根、平均葉及び平均合計に対する特定の構築物群の乾燥重量比を含む。Table 4.33は、対応する野生型群に対する特定の構築物群の平均SLA及び平均節間長の比をも示す。
【０５４０】
【表１６１】
0005701610.tif 000181
【０５４１】
構築物群TFSTT051
この構築物はバイオマス生産の増加を誘導する。構築物群系統の1つの乾燥重量測定は平均茎の22％の増加、平均樹皮の30％の増加、平均葉の29％の増加及び平均合計の26％の増加を対応する野生型群と比較して示す。
【０５４２】
Table 4.34は特定の構築物群及び対応する野生型群に対する乾燥重量データを含む。
【０５４３】
【表１６２】
0005701610.tif 000182
【０５４４】
Table 4.35は、対応する野生型群の平均茎、平均樹皮、平均根、平均葉及び平均合計に対する特定の構築物群の乾燥重量比を含む。Table 4.35は、対応する野生型群に対する特定の構築物群の平均SLA及び平均節間長の比をも示す。
【０５４５】
【表１６３】
0005701610.tif 000183
【０５４６】
Table 4.36は、対応する野生型群の最大茎、最大樹皮、最大根、最大葉及び最大合計に対する特定の構築物群の乾燥重量比を含む。
【０５４７】
【表１６４】
0005701610.tif 000184
【０５４８】
Table 4.37は、対応する野生型群の平均茎、平均樹皮、平均根、平均葉及び平均合計に対する特定の構築物群の乾燥重量比を含む。Table 4.37は、対応する野生型群に対する特定の構築物群の平均SLA及び平均節間長の比をも示す。
【０５４９】
【表１６５】
0005701610.tif 000185
【０５５０】
［実施例５］
密度測定
各植物の5cm長のスチーム部分(steam section)（土壌から36cmと41cmの間の部分）を収穫後に冷凍庫(-20℃）に貯蔵した。密度測定を行う試料をまず解凍して皮を剥ぎ、次いで中心コアを除去した。重量(w)を天秤はかりを用いて測定し、容積(v)をアルキメデスの原理を用いて決定したが、木本試料は（針を用いて）水の入ったビーカー(baker)（天秤はかりの上に設置されている）中に押し込まれ、重量増加は木本試料により押し出される水の重量に相当した。これは、水の密度が1 g/cm3なので、木本の試料の容積に相当するからである。次いで試料を乾燥機中で、48時間以上45℃で乾燥させた。乾燥重量(dw)を測定し、密度(d)を(1)に従って計算した。
【０５５１】
(1) d=dw/v
【０５５２】
各構築物の試料を同じ栽培回数由来の野生型試料(T89)と比較する。各構築物は、変化した密度を有する構築物群として理解されるためには2つの判断基準を満たさなければならない。
1. t検定による平均密度における有意差(p値<0.01)。t検定は両側検定され、不均衡な分散(unequal variance)が推定される。
2. 野生型の集団における95%信頼区間の（同じ側における）外側の2以上の個体。
【０５５３】
【表１６６】
0005701610.tif 000186
【０５５４】
)* 構築物群TF0109（再植林体1）は変化した密度に対しての判断基準を満たさないが、構築物群系統；TF0109Rp1-2B(+18%)及びTF0109Rp1-4A(-16%)は満たす。
【０５５５】
構築物群の要約表-密度の説明
【０５５６】
【表１６７】
0005701610.tif 000187
【０５５７】
以下の構築物群はTF0089、TF0097、TF0109、TF0132及びTFSTT047に対してデータを有さない。
【０５５８】
【表１６８】
0005701610.tif 000188
【０５５９】
TF0002Rp2は対応するT89群よりも(判断基準1及び2に従い）有意に高い密度（平均して+18%)を有する。TF0002Rp2 (各系統について3個体）の3つの構築物群系統に対する（T89と比較しての）密度変化：TF0002Rp2-1B（平均して+17%)、TF0002Rp2-2A(平均して+19%)及びTF0002Rp2-3B(平均して+18%)。系統TF0002Rp2-3Bはそれ自身判断基準1及び2を満たす。
【０５６０】
【表１６９】
0005701610.tif 000189
【０５６１】
構築物群TF0003は対応するT89群よりも(判断基準1及び2に従い）有意に高い密度（平均して+14%)を有する。
【０５６２】
【表１７０】
0005701610.tif 000190
【０５６３】
構築物群TF0011は対応するT89群よりも(判断基準1及び2に従い）有意に高い密度（平均して+11%)を有する。
【０５６４】
【表１７１】
0005701610.tif 000191
【０５６５】
構築物群TF0013は対応するT89群と比較して(判断基準1及び2に従い）密度における有意差は有さない。
【０５６６】
【表１７２】
0005701610.tif 000192
【０５６７】
TF0045は対応するT89群よりも(判断基準1及び2に従い）有意に高い密度（平均して+12%)を有する。TF0045の3つの構築物群系統に対する（T89と比較しての）密度変化：TF0045-1A（（2つの測定された個体で）平均して+12%)、TF0045-1B((3つの個体で）平均して+18%)及びTF0045-2B((2つの個体で)平均して+2%)。
【０５６８】
【表１７３】
0005701610.tif 000193
【０５６９】
構築物群TF0052は対応するT89群と比較して(判断基準1に従い）密度における有意差は有さない。しかしながらTF0052は平均して密度の増加(+10%)を有し、判断基準2を満たす。
【０５７０】
【表１７４】
0005701610.tif 000194
【０５７１】
構築物群TF0065は対応するT89群と比較して(判断基準1及び2に従い）密度における有意差は有さない。
【０５７２】
【表１７５】
0005701610.tif 000195
【０５７３】
構築物群TF0067は対応するT89群と比較して(判断基準1及び2に従い）密度における有意差は有さない。
【０５７４】
【表１７６】
0005701610.tif 000196
【０５７５】
構築物群TF0076Rp2は対応するT89群と比較して(判断基準1及び2に従い）密度における有意差は有さない。
【０５７６】
【表１７７】
0005701610.tif 000197
【０５７７】
構築物群TF0096は対応するT89群と比較して(判断基準1及び2に従い）密度における有意差は有さない。
【０５７８】
【表１７８】
0005701610.tif 000198
【０５７９】
TF0097Rp1は対応するT89群よりも(判断基準1及び2に従い）有意に高い密度（平均して+11%)を有する。TF0097Rp1 (各系統について3個体）の5つの構築物群系統に対する（T89と比較しての）密度変化：TF00097Rp1-1A（平均して+18%)、TF00097Rp1-2A(平均して+2%)、TF00097Rp1-2B（平均して+16%)、TF00097Rp1-3A(平均して+3%)及びTF00097Rp1-4A（平均して+15%)。系統TF00097Rp1-1A、TF00097Rp1-2B及びTF00097Rp1-4Aはそれら自身判断基準1及び2を満たす。
【０５８０】
【表１７９】
0005701610.tif 000199
【０５８１】
構築物群TF0104は対応するT89群と比較して(判断基準1及び2に従い）密度における有意差は有さない。
【０５８２】
【表１８０】
0005701610.tif 000200
【０５８３】
構築物群TF0109Rp1は対応するT89群と比較して(判断基準1及び2に従い）密度における有意差は有さない。TF0109Rp1 (各系統について3個体）の4つの構築物群系統に対する（T89と比較しての）密度変化：TF0109Rp1-2A（平均して+3%)、TF0109Rp1-2B(平均して+18%)、TF0109Rp1-3B(平均して-3%)及びTF0109Rp1-4A(平均して-16)。系統TF0109Rp1-2B及びTF0109Rp1-4Aはそれら自身判断基準1及び2を満たす。
【０５８４】
【表１８１】
0005701610.tif 000201
【０５８５】
構築物群TF0116は対応するT89群と比較して(判断基準1及び2に従い）密度における有意差は有さない。
【０５８６】
【表１８２】
0005701610.tif 000202
【０５８７】
構築物群TF0132.2ndは対応するT89群と比較して(判断基準1及び2に従い）密度における有意差は有さない。
【０５８８】
【表１８３】
0005701610.tif 000203
【０５８９】
TF0132Rp1は対応するT89群よりも(判断基準1及び2に従い）有意に高い密度（平均して+7%)を有する。TF0132Rp1 (各系統について3個体）の5つの構築物群系統に対する（T89と比較しての）密度変化：TF0132Rp1-1B（平均して+5%)、TF0132Rp1-3BB(平均して+4%)、TF0132Rp1-4AC（平均して+9%)、TF0132Rp1-4B(平均して+9%)及びTF0132Rp1-6B（平均して+7%)。系統TF0132Rp1-4Bはそれ自身判断基準1及び2を満たす。
【０５９０】
【表１８４】
0005701610.tif 000204
【０５９１】
構築物群TF0146は対応するT89群よりも(判断基準1及び2に従い）有意に高い密度（平均して+16%)を有する。
【０５９２】
【表１８５】
0005701610.tif 000205
【０５９３】
構築物群TF0173は対応するT89群と比較して(判断基準1及び2に従い）密度における有意差は有さない。
【０５９４】
【表１８６】
0005701610.tif 000206
【０５９５】
構築物群TF0247は対応するT89群と比較して(判断基準1及び2に従い）密度における有意差は有さない。
【０５９６】
【表１８７】
0005701610.tif 000207
【０５９７】
構築物群TF0405は対応するT89群と比較して(判断基準1及び2に従い）密度における有意差は有さない。
【０５９８】
【表１８８】
0005701610.tif 000208
【０５９９】
構築物群TFSTT004は対応するT89群と比較して(判断基準1及び2に従い）密度における有意差は有さない。
【０６００】
【表１８９】
0005701610.tif 000209
【０６０１】
構築物群TFSTT013は対応するT89群よりも(判断基準1及び2に従い）有意に高い密度（平均して+12%)を有する。
【０６０２】
【表１９０】
0005701610.tif 000210
【０６０３】
構築物群TFSTT016は対応するT89群と比較して(判断基準1及び2に従い）密度における有意差は有さない。
【０６０４】
【表１９１】
0005701610.tif 000211
【０６０５】
構築物群TFSTT019は対応するT89群と比較して(判断基準1及び2に従い）密度における有意差は有さない。
【０６０６】
【表１９２】
0005701610.tif 000212
【０６０７】
構築物群TFSTT035は対応するT89群と比較して(判断基準1及び2に従い）密度における有意差は有さない。
【０６０８】
【表１９３】
0005701610.tif 000213
【０６０９】
構築物群TFSTT036は対応するT89群よりも(判断基準1及び2に従い）有意に高い密度（平均して+12%)を有する。
【０６１０】
【表１９４】
0005701610.tif 000214
【０６１１】
構築物群TFSTT038は対応するT89群と比較して(判断基準1及び2に従い）密度における有意差は有さない。
【０６１２】
【表１９５】
0005701610.tif 000215
【０６１３】
構築物群TFSTT045は対応するT89群と比較して(判断基準1及び2に従い）密度における有意差は有さない。
【０６１４】
【表１９６】
0005701610.tif 000216
【０６１５】
構築物群TFSTT051は対応するT89群と比較して(判断基準1及び2に従い）密度における有意差は有さない。
【０６１６】
［実施例６］
繊維測定
繊維測定を、茎の高さが33から36cm時に試料に対して実施した。約1.5 mm x 1.5 mm x 1.5 mmの木片そのものを茎の部分から切り出した。浸漬(maceration)調製(Franklin et al. 1945)を木本の小片から単繊維の浸漬体を得るために実施した。次いで、Metso AutomationよりのKajaaniFibreLab（商標）を用いて試料を測定し、平均繊維長、平均繊維幅及び繊維細胞壁の厚みの推定データを得た。供給されたコンピューターソフトウェアが、製造業者による以下の式を用いて、これらの数値を算出する。
【０６１７】
繊維長
繊維の正確な長さを用いて、中心線に沿って、平均繊維長であるL(n)を測定した：
【０６１８】
【数２】
0005701610.tif 000217
【０６１９】
式中、
ni=クラスiにおける繊維数
i=1から152、
li=(0.05*i)-0.025、
li=クラスiの長さ。
【０６２０】
繊維幅
平均繊維幅であるW;断面的な測定に基づく：
【０６２１】
【数３】
0005701610.tif 000218
【０６２２】
式中、
ni=クラスiにおける繊維数
i=1から100、
wi=kw*(i-0.5)、
wi=クラスiの幅、
kw=幅較正係数。
【０６２３】
細胞壁の厚み
平均細胞壁の厚みであるCWT;断面的な測定に基づく：
【０６２４】
【数４】
0005701610.tif 000219
【０６２５】
式中、
ni=クラスiにおける繊維数
i=1から100、
CWTi=kt*(i-0.5)、
CWTi=クラスiの細胞壁の厚み、
kt=細胞壁の厚みの較正係数。
【０６２６】
繊維長または繊維幅において少なくとも10％の増加または15％の減少を伴う繊維を有する構築物群が、以下の選択判断基準に従った繊維容量(fibre dimension)を改変するために遺伝子として有用なものとして有効であるとして選択された。
【０６２７】
繊維パラメーターの選択判断基準
Table 6.1において、繊維の選択判断基準用に使用された表現型用に使用した略称をリスト化する。
【０６２８】
【表１９７】
0005701610.tif 000220
【０６２９】
前述した繊維パラメーターのいずれかにおいて野生型の集団と比較して差を示した構築物群が、それらの生育特性を変化させる構築物群としてスコア化され、それにより、対応する遺伝子がこれらの特性を変化させるために使用可能である。
【０６３０】
繊維容量において10％増加または15％減少が産業上の関心があるものとして、以下の選択判断基準を使用し、繊維容積を変化させるために使用可能な遺伝子を選択した。
【０６３１】
繊維パラメーターの選択判断基準は以下のとおりである：
1. 構築物群AFLが対応する野生型群AFLよりも少なくとも10％高い場合、または
2. 構築物群AFWが対応する野生型群AFWよりも少なくとも10％高い場合、または
3. 構築物群最大FLが対応する野生型群最大FLよりも少なくとも10％高い場合、または
4. 構築物群最大FW対応する野生型群最大FWよりも少なくとも10％高い場合、または
5. 構築物群AFLが対応する野生型群AFLよりも少なくとも15％低い場合、または
6. 構築物群AFWが対応する野生型群AFWよりも少なくとも15％低い場合、または
7. 構築物群最小FLが対応する野生型群最小FLよりも少なくとも15％低い場合、または
8. 構築物群最小FWが対応する野生型群最小FWよりも少なくとも15％低い場合。
【０６３２】
1種以上のこれらの判断基準を満たす構築物群を選択した。以下の結果を構築物群に従って提示する。
【０６３３】
構築物群TF0002
この構築物は繊維パラメーターにおける変化を誘導する。最大繊維幅は対応する最大野生型より16％高い。TF0002構築物群は繊維パラメーターの選択判断基準(4)を満たす。
【０６３４】
Table 6.2は特定の構築物群及び対応する野生型群に対する繊維測定データを含む。
【０６３５】
【表１９８】
0005701610.tif 000221
【０６３６】
繊維測定から得られる結果は、対応する野生型群に対する特定の構築物群の平均繊維長(AFL)、平均繊維幅(AFW)、最大繊維長(最大FL)、最大繊維幅(最大FW)、最小繊維長(最小FL)、最小繊維幅(最小FW)の比としてtable 6.3に提示される。
【０６３７】
【表１９９】
0005701610.tif 000222
【０６３８】
構築物群TF0052
この構築物は繊維パラメーターにおける変化を誘導する。平均繊維幅は対応する野生型より13％高い。最大繊維幅は対応する最大野生型より22％高い。TF0052構築物群は繊維パラメーターの選択判断基準(2)及び(4)を満たす。
【０６３９】
Table 6.4は特定の構築物群及び対応する野生型群に対する繊維測定データを含む。
【０６４０】
【表２００】
0005701610.tif 000223
【０６４１】
繊維測定から得られる結果は、対応する野生型群に対する特定の構築物群の平均繊維長(AFL)、平均繊維幅(AFW)、最大繊維長(最大FL)、最大繊維幅(最大FW)、最小繊維長(最小FL)、最小繊維幅(最小FW)の比としてtable 6.5に提示される。
【０６４２】
【表２０１】
0005701610.tif 000224
【０６４３】
構築物群TF0058
この構築物は繊維パラメーターにおける変化を誘導する。平均繊維幅は対応する野生型より16％高い。最大繊維幅は対応する最大野生型より23％高い。TF0058構築物群は繊維パラメーターの選択判断基準(2)及び(4)を満たす。
【０６４４】
Table 6.6は特定の構築物群及び対応する野生型群に対する繊維測定データを含む。
【０６４５】
【表２０２】
0005701610.tif 000225
【０６４６】
繊維測定から得られる結果は、対応する野生型群に対する特定の構築物群の平均繊維長(AFL)、平均繊維幅(AFW)、最大繊維長(最大FL)、最大繊維幅(最大FW)、最小繊維長(最小FL)、最小繊維幅(最小FW)の比としてtable 6.7に提示される。
【０６４７】
【表２０３】
0005701610.tif 000226
【０６４８】
構築物群TF0097
この構築物は繊維パラメーターにおける変化を誘導する。最大繊維幅は対応する野生型より13％高い。TF0097構築物群は繊維パラメーターの選択判断基準(4)を満たす。
【０６４９】
Table 6.8は特定の構築物群及び対応する野生型群に対する繊維測定データを含む。
【０６５０】
【表２０４】
0005701610.tif 000227
【０６５１】
繊維測定から得られる結果は、対応する野生型群に対する特定の構築物群の平均繊維長(AFL)、平均繊維幅(AFW)、最大繊維長(最大FL)、最大繊維幅(最大FW)、最小繊維長(最小FL)、最小繊維幅(最小FW)の比としてtable 6.9に提示される。
【０６５２】
【表２０５】
0005701610.tif 000228
【０６５３】
構築物群TF0109
この構築物は繊維パラメーターにおける変化を誘導する。平均繊維長は対応する野生型より11％高い。最大繊維長は対応する最大野生型より25％高い。最大繊維幅は対応する最大野生型より23％高い。TF0109構築物群は繊維パラメーターの選択判断基準(1)、(3)及び(4)を満たす。
【０６５４】
Table 6.10は特定の構築物群及び対応する野生型群に対する繊維測定データを含む。
【０６５５】
【表２０６】
0005701610.tif 000229
【０６５６】
繊維測定から得られる結果は、対応する野生型群に対する特定の構築物群の平均繊維長(AFL)、平均繊維幅(AFW)、最大繊維長(最大FL)、最大繊維幅(最大FW)、最小繊維長(最小FL)、最小繊維幅(最小FW)の比としてtable 6.11に提示される。
【０６５７】
【表２０７】
0005701610.tif 000230
【０６５８】
構築物群TF0116
この構築物は繊維パラメーターにおける変化を誘導する。平均繊維幅は対応する野生型より11％高い。最大繊維幅は対応する最大野生型より20％高い。TF0116構築物群は繊維パラメーターの選択判断基準(2)及び(4)を満たす。
【０６５９】
Table 6.12は特定の構築物群及び対応する野生型群に対する繊維測定データを含む。
【０６６０】
【表２０８】
0005701610.tif 000231
【０６６１】
繊維測定から得られる結果は、対応する野生型群に対する特定の構築物群の平均繊維長(AFL)、平均繊維幅(AFW)、最大繊維長(最大FL)、最大繊維幅(最大FW)、最小繊維長(最小FL)、最小繊維幅(最小FW)の比としてtable 6.13に提示される。
【０６６２】
【表２０９】
0005701610.tif 000232
【０６６３】
構築物群TFSTT001
この構築物は繊維パラメーターにおける変化を誘導する。平均繊維幅は対応する最小野生型より14％低い。最小繊維長は対応する最小野生型より17％低い。最小繊維幅は対応する最小野生型より30％低い。TFSTT001構築物群は繊維パラメーターの選択判断基準(7)及び(8)を満たす。
【０６６４】
Table 6.14は特定の構築物群及び対応する野生型群に対する繊維測定データを含む。
【０６６５】
【表２１０】
0005701610.tif 000233
【０６６６】
繊維測定から得られる結果は、対応する野生型群に対する特定の構築物群の平均繊維長(AFL)、平均繊維幅(AFW)、最大繊維長(最大FL)、最大繊維幅(最大FW)、最小繊維長(最小FL)、最小繊維幅(最小FW)の比としてtable 6.15に提示される。
【０６６７】
【表２１１】
0005701610.tif 000234
【０６６８】
構築物群TFSTT004
この構築物は繊維パラメーターにおける変化を誘導する。平均繊維幅は対応する野生型より15％高い。最大繊維幅は対応する最大野生型より29％高い。TFSTT004構築物群は繊維パラメーターの選択判断基準(2)及び(4)を満たす。
【０６６９】
Table 6.16は特定の構築物群及び対応する野生型群に対する繊維測定データを含む。
【０６７０】
【表２１２】
0005701610.tif 000235
【０６７１】
繊維測定から得られる結果は、対応する野生型群に対する特定の構築物群の平均繊維長(AFL)、平均繊維幅(AFW)、最大繊維長(最大FL)、最大繊維幅(最大FW)、最小繊維長(最小FL)、最小繊維幅(最小FW)の比としてtable 6.17に提示される。
【０６７２】
【表２１３】
0005701610.tif 000236
【０６７３】
構築物群TFSTT017
この構築物は繊維パラメーターにおける変化を誘導する。最小繊維長は対応する野生型より17％低い。TFSTT017構築物群は繊維パラメーターの選択判断基準(7)を満たす。
【０６７４】
Table 6.18は特定の構築物群及び対応する野生型群に対する繊維測定データを含む。
【０６７５】
【表２１４】
0005701610.tif 000237
【０６７６】
繊維測定から得られる結果は、対応する野生型群に対する特定の構築物群の平均繊維長(AFL)、平均繊維幅(AFW)、最大繊維長(最大FL)、最大繊維幅(最大FW)、最小繊維長(最小FL)、最小繊維幅(最小FW)の比としてtable 6.19に提示される。
【０６７７】
【表２１５】
0005701610.tif 000238
【０６７８】
構築物群TFSTT038
この構築物は繊維パラメーターにおける変化を誘導する。平均繊維幅は対応する野生型より16％高い。最大繊維幅は対応する最大野生型より21％高い。TFSTT038構築物群は繊維パラメーターの選択判断基準(2)及び(4)を満たす。
【０６７９】
Table 6.20は特定の構築物群及び対応する野生型群に対する繊維測定データを含む。
【０６８０】
【表２１６】
0005701610.tif 000239
【０６８１】
繊維測定から得られる結果は、対応する野生型群に対する特定の構築物群の平均繊維長(AFL)、平均繊維幅(AFW)、最大繊維長(最大FL)、最大繊維幅(最大FW)、最小繊維長(最小FL)、最小繊維幅(最小FW)の比としてtable 6.21に提示される。
【０６８２】
【表２１７】
0005701610.tif 000240
【０６８３】
［実施例７］
タバコの形質転換用に使用される選択された構築物
タバコの形質転換
ポプラの実験から得られた生育データに基づいて、選択されたセットの構築物、つまり、CaMV 35S:過剰発現DNA構築物TF0097、TF0132及びTFSTT019が、タバコ(Nicotiana tabacum cv. SR1)中に形質転換用に使用された。植物を形質転換して、Nilsson et al.(1992)に記載されるように本質的に再生させたが、葉外植片(leaf disc explant)を使用した。
【０６８４】
およそ10-15の独立した系統が各構築物用に生育された。ある構築物を使用して生産されるトランスジェニック植物のかかる1群は、本明細書において「構築物群」と呼ばれ、例えば、異なるトランスジェニック植物がある構築物から生じる。各構築物群内の各トランスジェニック系統、例えば、TF0555-01、TF0555-02、TF0555-03などは、異なる形質転換事象であり、従って、最も可能性があるのは、組換DNAが植物のゲノムでの異なる位置中に挿入されている。これは、ある構築物群内の異なる系統を部分的に異ならせる。例えば、異なる形質転換事象は、異なるレベルの遺伝子の過剰発現を伴う植物を生産することが知られている。
【０６８５】
9-15の独立した系統をそれぞれ有する3つの構築物群を含むトランスジェニックタバコ植物を、明期18時間および温度22℃/15℃(昼/夜)の下、温室内で、14の野生型対照樹木と一緒に生育した。植物にWeibulls Rika S NPK 7-1-5 希釈1対100を施肥した(最終濃度NO3、55g/l;NH4、29g/l;P、12g/l;K、56g/l;Mg、7.2g/l;S、7.2g/l;B、0.18g/l;Cu、0.02g/l;Fe、0.84g/l;Mn、0.42g/l;Mo、0.03g/l;Zn、0.13g/L)。植物の樹高及び直径を温室内で生育中に定期的に測定した。
【０６８６】
タバコの形質転換体において観察される生育効果には、構築物TF0132で形質転換されたより早い再生を示すタバコの植物が含まれ、ここで、再生された植物体は、初期の組織培養期の間に著しく大きな葉を有した。また、選択された構築物(すなわち、TF0097、TF0132またはTFSTT019)のいずれかで形質転換されたタバコ植物において、野生型SR1植物よりもより長い期間の栄養増殖及びそれゆえに少し遅れた開花が観察された。
【０６８７】
［参考文献］
0005701610.tif 000241
0005701610.tif 000242
0005701610.tif 000243
【図１】
0005701610.tif 000244
【配列表】
0005701610000001.app