(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットであって、前記ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットは、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマーを含み、前記ＦＩＰプライマー、前記ＢＩＰプライマー、前記Ｆ３プライマーおよび前記Ｂ３プライマーの組み合わせが以下からなる群より少なくとも１選択され、前記増幅がコロナウイルス由来の核酸の増幅であるプライマーセット；
（１）  配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（２）  配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（３）  配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（４）  配列番号１３、配列番号１０、配列番号１４および配列番号１２によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（５）  配列番号１３、配列番号１５、配列番号１４および配列番号１６によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（６）  配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（７）  配列番号１７、配列番号２１、配列番号１９および配列番号２２によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（８）  配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー、ここで、各配列により示されるポリヌクレオチドがミックス塩基であるプライマーセット； 
（９）      配列番号５９、配列番号６０、配列番号５８および配列番号６１によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（１０）      配列番号６８、配列番号６９、配列番号６７および配列番号７０によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（１１）      配列番号７７、配列番号７８、配列番号７６および配列番号７９によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（１２）      配列番号８６、配列番号８７、配列番号８５および配列番号８９によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（１３）      配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０３および配列番号１０６によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（１４）      配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１２および配列番号１１５によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（１５）      配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２１および配列番号１２４によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；並びに
（１６）      配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３０および配列番号１３３によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット。
【請求項２】
請求項１に記載のプライマーセットであって、前記ＦＩＰプライマー、前記ＢＩＰプライマー、前記Ｆ３プライマーおよび前記Ｂ３プライマーの組み合わせが以下からなる群より少なくとも１選択されるプライマーセット；
（１７）  配列番号５９、配列番号６０、配列番号５８および配列番号６１によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（１８）  配列番号６８、配列番号６９、配列番号６７および配列番号７０によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（１９）  配列番号７７、配列番号７８、配列番号７６および配列番号７９によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（２０）  配列番号８６、配列番号８７、配列番号８５および配列番号８９によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（２１）  配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０３および配列番号１０６によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（２２）  配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１２および配列番号１１５によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；
（２３）  配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２１および配列番号１２４によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット；並びに
（２４）  配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３０および配列番号１３３によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーセット。
【請求項３】
前記ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットが、更に、ループプライマーＬＰｆおよびＬＰｂを含み、前記ＬＰｆが、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３７、配列番号４８、配列番号６２、配列番号７１、配列番号８０、配列番号８９、配列番号１０７、配列番号１１６、配列番号１２５若しくは配列番号１３４またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドを含み、前記ＬＰｂが配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号４９、配列番号６３、配列番号７２、配列番号８１、配列番号９０、配列番号１０８、配列番号１１７、配列番号１２６若しくは配列番号１３５またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドを含む請求項１または２に記載のプライマーセット。
【請求項４】
コロナウイルスに由来する核酸を特異的に増幅する方法であって、試料を請求項１〜３の何れか１項に記載のプライマーセットを用いてＬＡＭＰ増幅することを具備する方法。
【請求項５】
コロナウイルスを検出および／または分類する方法であって、
試料に含まれる核酸を請求項１〜３の何れか１項に記載のプライマーセットを用いてＬＡＭＰ増幅することと、
前記ＬＡＭＰ増幅により生じた反応産物と、
配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３、並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドを含むプローブ群；および／または
配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１４５、配列番号１４６および配列番号１４７並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドを含むプローブ群；
より形成されるプローブ群から選択される少なくとも１種類のプローブから選択される少なくとも１種類のプローブと、
を反応することと、
前記反応の結果から、試料に存在するコロナウイルスを検出および／または分類することと
を具備する方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記プローブ群が基体に固定化されている方法。
【請求項７】
コロナウイルスの検出および／または分類するためのアッセイキットであって、
請求項１または２に記載のプライマーセットと、
前記プライマーセットを用いて得られた増幅産物からコロナウイルスを特異的に検出および／または分類するためのプローブであり、
配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３、並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドを含むプローブ群；および／または
配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１４５、配列番号１４６および配列番号１４７、並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドを含むプローブ群；
より形成されるプローブ群から選択される少なくとも１種類のプローブと、
を含むことを特徴とするアッセイキット。
【請求項８】
請求項７に記載のアッセイキットであって、前記プローブ群が基体に固定化されているアッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コロナウイルス由来の核酸を増幅および／または検出する手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
コロナウイルスは、1本鎖の（+）鎖RNAゲノムを持つエンベロープウイルスである。細胞膜由来のウイルスエンベロープ表面に存在するクラブ様突起(Spike)によって太陽のコロナのような外観を持つことからこのように称される。ウイルス粒子形状は、直径60〜220nmの多形性であるが、楕円形あるいは、多形成の粒子を示すものも良く知られている。ウイルスの増殖は細胞質内で行われ、小胞体やゴルジ装置から出芽する。このウイルスはニドウイルス目、コロナウイルス科に分類されるが、コロナウイルス科は更に、コロナウイルス属、トロウイルス属に大別される。ヒトを含み様々な哺乳動物や鳥類に感染し、さまざまな疾病を引き起こす。主に呼吸器系、肝臓、小腸、中枢神経系等の疾患の原因となることが知られている。
【０００３】
特に、コロナウイルス属ウイルスによって引き起こされる経済動物に対する重大な疾病には、牛コロナウイルス病（bovine coronavirus infection）、家畜伝染病予防法における届出伝染病である豚流行性下痢（porcine epidemic diarrhea;PED）や、豚伝染性胃腸炎（transmissible gastroenteritis of swine;TGE）が知られており、注目を集めている。一方、マウス、ラットなどの動物実験は、生命科学研究には必要不可欠である。再現性の高い動物実験を行うためには、病原微生物等を対象とした定期的な微生物モニタリングが必須である。それにより品質管理された実験動物が提供される。そのような状況において、マウスなどの実験動物では、最も重要な病原微生物の１つとしてコロナウイルス属ウイルスであるラットコロナウイルス（Rat coronavirus 、Rat sialodacryoadenitis coronavirus）や、マウス肝炎ウイルス（Murine hepatitis virus）を対象とした微生物モニタリングが定期的に実施されている。これまでの検査手法は、主に「血清抗体の検査」が用いられている。しかしながら、免疫不全動物や感染初期の動物では十分な抗体上昇がなく、囮動物を使用したとしても、あくまでも飼育室環境をモニターする形となり、実際に使用する実験動物自体の汚染の有無を直接検査することが出来ない。そのため、汚染を見逃す危険がある。これら抗体検査が無効な動物や、動物実験に関連した細胞及び配偶子などの汚染検査にはウイルス自体を特異的且つ迅速に検出する検査手法が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、コロナウイルス由来の核酸を特異的且つ迅速に増幅するためのプライマーセットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するための手段は、
（１）コロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅するためのLAMP増幅用核酸プライマーセットであって、前記LAMP増幅用核酸プライマーセットは、ＦIPプライマー、BIPプライマー、F３プライマー、Ｂ３プライマーを含み、
当該ＦＩＰプライマーは配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１３若しくは配列番号１７若しくは配列番号４４またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドを含み、
当該ＢＩＰプライマーは配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１若しくは配列番号４５またはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含み、
当該Ｆ３プライマーは配列番号３、配列番号７、配列番号１１、配列番号１４若しくは配列番号１９、配列番号３４、配列番号３５若しくは配列番号４６またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドを含み、および
当該Ｂ３プライマーは配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０若しくは配列番号２２またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドを含む
プライマーセット
である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、コロナウイルス由来の核酸を特異的且つ迅速に増幅するためのプライマーセットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ＬＡＭＰ法におけるプライマーの各領域を示す模式図。
【図２】LAMP法を用いて得られる増幅産物を示す模式図。
【図３】ＬＡＭＰ法におけるプライマーの各領域を示す模式図。
【図４】ＬＡＭＰ法の増幅産物を示す模式図。
【図５】本発明の核酸プローブ固定化チップ。
【図６】本発明の核酸プローブ固定化チップ。
【図７】LAMP増幅の電気泳動写真の一例を示す図。
【図８】電流検出型核酸チップによる検出結果の一例を示す図。
【図９】電流検出型核酸チップによる検出結果の一例を示す図。
【図１０】電流検出型核酸チップによる検出結果の一例を示す図。
【図１１】電流検出型核酸チップによる検出結果の一例を示す図。
【図１２】電流検出型核酸チップによる検出結果の一例を示す図。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
１．プライマー
本発明の１態様により、コロナウイルス由来の核酸を特異的且つ迅速に増幅するためのLAMP増幅用核酸プライマーセットが提供される。
【０００９】
ここにおける「ＬＡＭＰ法」は、それ自身公知の何れのＬＡＭＰ法をも含むが、好ましくはＲＴ−ＬＡＭＰ法である。ＲＴ-ＬＡＭＰ法とは、等温遺伝子増幅法であるＬＡＭＰ法の１種で、逆転写反応とＬＡＭＰ反応を同時に行う事によりＲＮＡを鋳型にＬＡＭＰ増幅できる方法である。ここにおいて「ＬＡＭＰ法」というとき、ＲＴ−ＬＡＭＰ法などを含むそれ自身公知の何れのＬＡＭＰ法を含む。「ＬＡＭＰ増幅」および「ＲＴ−ＬＡＭＰ増幅」とは、ＬＡＭＰ法またはＲＴ−ＬＡＭＰ法により行なわれる増幅または増幅工程を指す。
【００１０】
一般的にＬＡＭＰ法は２種若しくは４領域または４種若しくは６領域のプライマーを用いる点がＰＣＲ法とは異なる。ＬＡＭＰ法は、ＰＣＲを用いた方法に比べ増幅効率が優れていると共に、サンプル中の不純物の影響も受けにくい。そのため、簡便なサンプルの前処理で微量なコロナウイルス属に分類される微生物を検出することが可能である。
【００１１】
ＬＡＭＰ法におけるプライマー設計および得られる増幅産物について、図１および図２を参照して説明する。
【００１２】
図１は、検出されるべき二本鎖ＤＮＡと、合計４種類のプライマー配列、即ち、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーを示す。ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーは、各々二つの領域を含む。即ち、ＦＩＰはＦ１ｃとＦ２を含み、ＢＩＰはＢ２とＢ１ｃを含む。Ｆ３プライマーはＦ３領域を含む。Ｂ３プライマーはＢ３領域を含む。
【００１３】
ここでＦ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃおよびＢ３ｃの各領域は、前記二本鎖ＤＮＡのうちの一本鎖ＤＮＡの５’→３’方向に向けてこの順で設定された領域である。またＢ３、Ｂ２、Ｂ１、Ｆ１ｃ、Ｆ２ｃおよびＦ３ｃの各領域は、その相補鎖の一本鎖ＤＮＡの５´→３´方向に向けてこの順で設定された領域である。Ｂ３とＢ３ｃ、Ｂ２とＢ２ｃ、Ｂ１とＢ１ｃ、Ｆ１ｃとＦ１、Ｆ２ｃとＦ２、Ｆ３ｃとＦ３は互いに相補鎖である。ここにおいて、ある配列名の配列は、当該配列名に「ｃ」を付した配列と互いに相補的な関係にあることを示す。例えば、「配列」という名称の配列がある場合、その相補鎖は「配列ｃ」と記載される。
【００１４】
このようなＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマーおよびＢ３プライマーを用いてＬＡＭＰ増幅を行なうと、図１の二本鎖ＤＮＡの夫々の鎖から、図２に示すようなダンベル型のステム・アンド・ループ構造の増幅産物が得られる。その増幅機構については、例えば特開２００２−１８６７８１号公報を参照することが可能である。また、この４種のプライマーのほかにループプライマーを併せて用いてもよい。
【００１５】
ＲＴ−ＬＡＭＰ法が使用される場合、前記ＬＡＭＰ法反応液に逆転写活性を持つ酵素を添加して、逆転写反応を行いながらＬＡＭＰ増幅法を行えばよい。ＬＡＰＭ法であっても、ＲＴ−ＬＡＭＰ法であっても、同じ配列のプライマーを等しく使用することが可能である。
【００１６】
検出しようする配列であるターゲット配列は、一本鎖のループ部分またはステム部分の何れに対しても設定することが可能である。好ましくはループ部分に設定される。ターゲット配列とは、所望の増幅が行なわれた後に得られる増幅産物を検出する際に使用される配列である。ターゲット配列の有無の検出は、例えば、ターゲット配列に相補的なプローブとのハイブリダイゼーションの有無を検出することにより行えばよい。
【００１７】
次に、一本鎖ループ部分にターゲット配列が位置するようにプライマーを設計する場合を説明する。図３を参照されたい。ターゲット配列（図３ではＦＰｃ、ＦＰ、ＢＰおよびＢＰｃの何れかとして理解されればよい）が、領域Ｆ１とＦ２との間(この領域はＦ２領域を含んでもよい)、領域Ｆ２ｃとＦ１ｃとの間(この領域はＦ２ｃ領域を含んでもよい)、領域Ｂ１とＢ２との間(この領域はＢ２領域を含んでもよい)、および／または領域Ｂ２ｃとＢ１ｃとの間(この領域はＢ２ｃ領域を含んでもよい)の何れかに対応して位置するように、６つのプライマー領域を設定する。ターゲット配列は、上記それぞれの領域間に形成される一本鎖のループ部分のいずれの部位に位置するように設計されてもよい。ここで、プライマー領域Ｆ１とＦ２との間のループ部分には、Ｆ２領域自体も含まれてよい。こうして設定された６つのプライマー領域に基づいて４種類のプライマーを作製し、これらプライマーを用いてＬＡＭＰ増幅を行なう。それにより、図４に示すような部分を一部として含むＬＡＭＰ増幅産物が得られる。このＬＡＭＰ増幅産物中においては、ターゲット配列ＦＰｃ、ＦＰ、ＢＰ、ＢＰｃは増幅産物のダンベル構造における一本鎖ループ中に位置する。
【００１８】
一方、プライマー領域Ｆ１ｃとＦ１、およびＢ１ｃとＢ１は、もともと相補的な配列を有しているので、相互に自己ハイブリダイゼーションを生じて二本鎖を形成する。
【００１９】
増幅産物中に含まれるターゲット配列は、図４に示すように、ループ中に一本鎖の部分が存在する。その部分を利用すれば、変性操作を行なうことなく、各ターゲット配列に対して相補的なプローブ核酸（ＦＰ、ＦＰｃ、ＢＰ、ＢＰｃ）との特異的ハイブリダイゼーションが行なえる。
【００２０】
特異的ハイブリダイゼーションとは、一塩基多型(Single  Nucleotide  Polymorphisms:SNPs)または変異が存在する場合、その僅かの違いも検出することが可能であることを意味する。
【００２１】
コロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセットは、ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットであってよい。各プライマーは、対象となるコロナウイルスのゲノムの塩基配列を基に、Ｆ１、Ｆ２、F３、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３領域を決定することにより設計することが可能である。
【００２２】
好ましいＦ１領域、Ｆ２領域、F３領域、Ｂ１領域、Ｂ２領域およびＢ３領域、並びにＬＰｆ領域およびＬＰｂ領域の例を表Ａ−１に示す。ＬＰｆ領域およびＬＰｂ領域は、ループプライマーのための領域である。ループプライマーについては後述する。
【表Ａ−１】
0005740112.tif 000002
【００２３】
ここにおいて、表中の配列番号を示すカラムにおいて“（）”内に示される番号は、同じヌクレオチド配列を有する配列の配列番号を示す。
【００２４】
また、それを基に設計した好ましいＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３、ＬＰｆおよびＬＰｂの例を表Ａ−２に示す。
【表Ａ−２】
0005740112.tif 000003
【００２５】
表Ａ−１の領域を基に設計されたプライマーにより得られる増幅産物を検出するためのプローブ領域の例を表Ｂ−１に示す。
【表Ｂ−１】
0005740112.tif 000004
【００２６】
表Ｂ−１に示した領域を利用したプローブの例を表Ｂ−２に示す。
【表Ｂ−２】
0005740112.tif 000005
【００２７】
また、表Ａ−１の領域を基に設計したプライマーの例は表１に示されるものであってもよい。
【表１−１】
0005740112.tif 000006
【００２８】
【表１−２】
0005740112.tif 000007
【００２９】
【表１−３】
0005740112.tif 000008
【００３０】
表Ａ−１に記載される領域が、コロナウイルスのゲノムのどの位置に対応するのかを表２に示す。
【表２−１】
0005740112.tif 000009
【００３１】
【表２−２】
0005740112.tif 000010
【００３２】
【表２−３】
0005740112.tif 000011
【００３３】
表２には、複数種のコロナウイルスのゲノムについてアラインメントを示した。最下段には、塩基について全ての種が共通する塩基を有する位置には「＊」を示し、種により変異のある位置には「．」を記した。表２に示す領域は、コロナウイルス属において高度に保存された領域である。また、当該プライマーにより増幅される領域は、コロナウイルスを特定するために特徴的な領域である。
【００３４】
好ましいプライマーセットにおいて、当該Ｆ１領域は配列番号２４７（または配列番号２４１）またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなっても、当該ポリヌクレオチドを含んでなってもよい。また、当該Ｆ１領域は、配列番号２４７またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドの何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入による変異を有していてもよい。そのようなポリヌクレオチドの例は、表２の同アライメント上の同領域の他の配列を参照されたい。また、配列番号２４７、変異を含む配列番号２４７およびそれらの相補配列は、その配列の何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが、混合ヌクレオチドまたはユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。
【００３５】
ここで、ユニバーサルなヌクレオチドの例は、これらに限定するものではないが、デオキシイノシン（deoxyinosine；dI)や、Ｇｒｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社の3−ニトロピロール（Nitropyrrole）、5-ニトロインドール（Nitroindole）、デオキシリボルラノシル（deoxyribofuranosyl ；dP)、デオキシ-5'-ジメトキシトリチル-D-リボフラノシル（deoxy-5'-dimethoxytrityl-D-ribofuranosyl ；dK)が含まれる。
【００３６】
またここで、プライマーの各配列間またはその末端側には、１〜１００ヌクレオチド、好ましくは２〜３０ヌクレオチド程度の配列（例えば、スペーサーとして使用される配列）が含まれていてもよい。当該プライマーの長さは３０〜２００ヌクレオチド程度であってよく、好ましくは３５〜１００ヌクレオチド、更に好ましくは４３〜６０ヌクレオチドであってよい。
【００３７】
混合ヌクレオチドは一般的に「ミックス塩基」とも称される。混合ヌクレオチドを使用する場合、当該箇所が異なる塩基、即ち、アデニン、チミン、シトシンおよびグアニンの何れかをある塩基を含む複数の配列からなるプライマーが、１つの反応系、例えば、１つの反応容器中で２以上または全て混合されて一緒に使用されればよい。
【００３８】
好ましいプライマーセットにおいて、当該Ｆ２領域は、配列番号２４８（または配列番号２４２）およびそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドからなっても、当該ポリヌクレオチドを含んでなってもよい。このようなＦ２領域に好ましい各配列は、その何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入の変異を有していてもよい。そのようなポリヌクレオチドの例は、表２のアライメント上の同領域の他の配列を参照して得られる配列またはその相補鎖であってもよく、例えば、配列番号２４９またはその相補配列であってもよい。また、配列番号２４８および配列番号２４９、並びに変異を含む配列番号２４８および配列番号２４９、並びにそれらの相補配列は、その配列の何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが、混合ヌクレオチドまたはユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。
【００３９】
好ましいプライマーセットにおいて、当該Ｆ３領域は配列番号２５０（または配列番号３）またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドからなっても、当該ポリヌクレオチドを含んでなってもよい。このようなＦ３領域に好ましい各配列は、その何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入の変異を有していてもよい。そのようなポリヌクレオチドの例は、表２のアライメント上の同領域の他の配列を参照して得られる配列またはその相補鎖であってもよく、例えば、配列番号２５１（または配列番号３１若しくは２４３）またはその相補配列であってもよい。また、配列番号２５０、変異を含む配列番号２５０およびそれらの相補配列は、その配列の何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが、混合ヌクレオチドまたはユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。
【００４０】
好ましいプライマーセットにおいて、当該Ｂ１領域は配列番号２５２（または配列番号２４４）およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなっても、当該ポリヌクレオチドを含んでなってもよい。このようなＢ１領域に好ましい各配列はその何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入の変異を有していてもよい。そのようなポリヌクレオチドの例は、表２のアライメント上の同領域の他の配列を参照されたい。また、配列番号２５２、変異を含む配列番号２５２およびそれらの相補配列の何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが混合ヌクレオチドまたはユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。
【００４１】
好ましいプライマーセットにおいて、当該Ｂ２領域は配列番号２５３およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなっても、当該ポリヌクレオチドを含んでなってもよい。このようなＢ２領域に好ましい各配列はその何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入の変異を有していてもよい。そのようなポリヌクレオチドの例は、表２のアライメント上の同領域の他の配列を参照されたい。また、配列番号２５３、変異を含む配列番号２５３およびそれらの相補配列の何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが混合ヌクレオチドまたはユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。
【００４２】
好ましいプライマーセットにおいて、当該Ｂ３領域は配列番号２５４（または配列番号４）およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなっても、当該ポリヌクレオチドを含んでなってもよい。このようなＢ３領域に好ましい各配列はその何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入の変異を有していてもよい。そのようなポリヌクレオチドの例は、表２のアライメント上の同領域の他の配列を参照して得られる配列またはその相補鎖であってもよく、例えば、配列番号２５５またはその相補配列であってもよい。また、配列番号２５４および配列番号２５５、および変異を含む配列番号２５４および配列番号２５５、並びにそれらの相補配列の何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが混合ヌクレオチドまたはユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。
【００４３】
上記のような領域を使用したプライマーを用いて、コロナウイルス属に分類される微生物あるいはその遺伝子を含有する検体試料に対してＬＡＭＰ法による増幅を行うと、図４で説明したように、ステム・アンド・ループ構造が形成され、一本鎖のループ構造内に含まれるコロナウイルス属に分類される微生物由来のターゲット配列が得られる。
【００４４】
表１に示したプライマーの中でもコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅するために好ましいプライマーセットの例は次の通りである。
【００４５】
当該ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号４４若しくは配列番号２６０またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む、少なくとも１種類のＦＩＰプライマーであり、
当該ＢＩＰプライマーが配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１若しくは配列番号４５またはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む、少なくとも１種類のＢＩＰプライマーであり、
当該Ｆ３プライマーが配列番号３、配列番号７、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１９、配列番号３４、配列番号３５若しくは配列番号４８またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む、少なくとも１種類のＦ３プライマーであり、および
当該Ｂ３プライマーが配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号36若しくは配列番号４７またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む、少なくとも１種類のＢ３プライマーである
ＦIPプライマー、ＢIPプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーを含むプライマーセットである。
【００４６】
プライマーセットにおいて使用されるＦIPプライマー、ＢIPプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーの組み合わせの例は、以下の（１）〜（９）よりなる群から少なくとも１選択された組み合わせであってよい。これらの組み合わせは、（１）〜（９）に示される他のプライマーやそれ自身公知の何れのプライマーと同時に使用されてもよい。１つの組み合わせに含まれる配列の並びは、ＦIPプライマー、ＢIPプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーの順である：
（１）  配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ；
（２）  配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ；
（３）  配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ；
（４）  配列番号１３、配列番号１０、配列番号１４および配列番号１２によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ；
（５）  配列番号１３、配列番号１５、配列番号１４および配列番号１６によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ；
（６）  配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ；
（７）  配列番号１７、配列番号２１、配列番号１９および配列番号２２によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ；
ここで、（１）〜（７）の組み合わせは、コロナウイルスを検出することが可能なプライマーの組み合わせである。更に、そこにおいて、少なくとも１つのプライマーの一部にコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含んでもよい。そのような範囲とは、分類学的にコロナウイルスと同定されるために必ずしも必要ではない範囲であればよい；
（８）  配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ；
ここで、（８）の組み合わせにおいては、各配列中に複数の塩基を示す1塩基表示による記号を含む。それらの記号の示す塩基の意味は通常当該技術分野において一般的に使用される意味である。即ち、「ｒ」はグアニンまたはアデニン、「ｙ」はチミンまたはシトシン、「ｍ」はアデニンまたはシトシン、「ｋ」はグアニンまたはチミン、「ｓ」はグアニンまたはシトシン、「ｗ」はアデニンまたはチミン、「ｂ」はグアニンまたはシトシンまたはチミン、「ｄ」はアデニンまたはグアニンまたはチミン、「ｈ」はアデニンまたはシトシンまたはチミン、「ｖ」はアデニンまたはグアニンまたはシトシン、「ｎ」はアデニンまたはグアニンまたはシトシンまたはチミンである。本明細書においてもこの通りに意味する。（８）の組み合わせでプライマーセットを使用する場合には、ミックス塩基で使用することは、ユニバーサルにウイルスを増幅するためにより効果的である。また、そこにおいて、少なくとも１つのプライマーの一部にコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含んでもよい。そのような範囲とは、分類学的にコロナウイルスと同定されるために必ずしも必要ではない範囲であればよい；
（９）      配列番号５９、配列番号６０、配列番号５８および配列番号６１によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（ａ）配列番号６８、配列番号６９、配列番号６７および配列番号７０によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（ｂ）配列番号７７、配列番号７８、配列番号７６および配列番号７９によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（ｃ）配列番号８６、配列番号８７、配列番号８５および配列番号８９によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（ｄ）配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０３および配列番号１０６によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（ｄ）配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１２および配列番号１１５によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（ｆ）配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２１および配列番号１２４によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；並びに
（ｇ）配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３０および配列番号１３３によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；を含むプライマーの組み合わせ；
ここにおいて、（９）の組み合わせに含まれるプライマーセットは、コロナウイルスの種を同定する、または判定するために使用することも可能なプライマーセットである。これらのプライマーセットによりユニバーサルにウイルスを増幅する場合には、全てのプライマーセットを使用する方が好ましい。特定の種のコロナウイルスを増幅したい場合には、種に応じて使用するプライマーセットを選択してよい。組み合わせ（ａ）および（ｆ）はウシコロナウイルス（Bovine coronavirus）、（ｂ）、（ｃ）、（ｇ）および（ｈ）はヒトコロナウイルス（Human coronavirus）、（ｄ）および（ｉ）はブタ血球凝集脳脊髄炎ウイルス（Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus）にそれぞれ好ましい。また、そこにおいて、少なくとも１つのプライマーの一部にコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含んでもよい。
【００４７】
前記（９）のプライマーセットは、コロナウイルスの種に応じた増幅を可能にするプライマーセットの組み合わせの例である。これらの組み合わせは、以下に示すような組み合わせにおいて、種特異的に増幅するためのプライマーセットとして使用されてもよい。また、上記（１）〜（９）および／または以下の（１０）〜（１７）に示される他のプライマーやそれ自身公知の何れのプライマーと同時に使用されてもよい。１つの組み合わせに含まれる配列の並びは、ＦIPプライマー、ＢIPプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーの順である：
（１０）  配列番号５９、配列番号６０、配列番号５８および配列番号６１によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ；
（１１）  配列番号６８、配列番号６９、配列番号６７および配列番号７０によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ；
（１２）  配列番号７７、配列番号７８、配列番号７６および配列番号７９によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ；
（１３）  配列番号８６、配列番号８７、配列番号８５および配列番号８９によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ；
（１４）  配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０３および配列番号１０６によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ；
（１５）  配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１２および配列番号１１５によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ；
（１６）  配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２１および配列番号１２４によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ；並びに
（１７）  配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３０および配列番号１３３によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマーの組み合わせ：
また、そこにおいて、少なくとも１つのプライマーの一部にコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含んでもよい。
【００４８】
上述のプライマーの組合わせに加えて、更にループプライマーを使用してもよい。ループプライマーを使用することにより更に効率よく増幅を行なうことが可能である。好ましいループプライマーの例は、前記ＬＰｆが、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３７、配列番号４８、配列番号６２、配列番号７１、配列番号８０、配列番号８９、配列番号１０７、配列番号１１６、配列番号１２５若しくは配列番号１３４またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含み、前記ＬＰｂが配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号４９、配列番号６３、配列番号７２、配列番号８１、配列番号９０、配列番号１０８、配列番号１１７、配列番号１２６若しくは配列番号１３５またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む。
【００４９】
ユニバーサルな増幅を行なう場合に好ましいループプライマーは、ＬＰｆが、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９であり、ＬＰｂが配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３である。ループプライマーは、ＬＰｆまたはＬＰｂの何れかを使用してもよく、これらを同時に使用してもよいが、好ましくはＬＰｆまたはＬＰｂを同時に使用する。
【００５０】
本発明は、上記のようなプライマーセットをコロナウイルス属に分類される微生物に対して適用すれば、コロナウイルス属に特徴的な遺伝子型を反映する核酸が増幅される。得られる増幅産物の有無を判定することにより、コロナウイルスの検出を行うことが可能である。従って、試料におけるコロナウイルスの検出は、検出対象である試料について、当該プライマーセットを用いて増幅反応を行うことを含む。
【００５１】
増幅反応の条件は、それ自身公知の何れかの条件を利用すればよい。また、当該増幅反応を行った結果を基に当該試料はコロナウイルスが含まれていると判定すればよい。そのような判定により試料中のコロナウイルスを検出することが可能である。
【００５２】
例えば、上記増幅反応は、１チューブ当たり１プライマーセットで行ってもよく、あるいは１チューブに各種遺伝子型に対応した複数のプライマーセットを用いて行ってもよい。複数の遺伝子型を特定する必要がある場合は、後者の方法で行う方が効率的である。
【００５３】
また、上記増幅反応は、これに限定するものではないが、例えば、ＲＴ−ＬＡＭＰ法場合、反応液は以下の組成であってもよい；
ＲＴ−ＬＡＭＰ法の反応液組成
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．８）
１０ｍＭ  ＫＣＬ
８ｍＭ  ＭｇＳＯ４
１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４
０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０
０．８Ｍ  Ｂｅｔａｉｎｅ
１．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
16 U Bst DNA polymerase  
0.625U AMV Reverse transcriptase
このような組成の反応液で、総量２５μＬで反応を行う際には、下記の濃度でそれぞれのプライマーを持ち込んでもよい；
プライマー添加量
ＦＩＰプライマー  ４０ｐｍｏＬ
ＢＩＰプライマー  ４０ｐｍｏＬ
Ｆ３プライマー      ５ｐｍｏＬ
Ｂ３プライマー      ５ｐｍｏＬ。
【００５４】
ここで「試料」は「検体」または「検体試料」とも称してよく、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、フェレット、オナガザル、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、アザラシ、ネズミイルカなどの哺乳類、鳥類などの体液、組織、細胞、並びに水、湖水、川水、海水および土壌などの環境に存在する何れかの物質であってもよい。例えば、血液、血清、白血球、尿、精液、唾液、組織、バイオプシー、口腔内粘膜、培養細胞、喀痰等であってもよい。また、当該試料は、コロナウイルス属に分類される微生物あるいはその遺伝子が含まれている可能性の疑われる物質であってよい。そのような物質をそれ自身公知の手段により、核酸の増幅に適した状態に前処理したものであってもよく、何れの前処理もなされなくてもよい。例えば、そのような前処理の例は、変性、濾過、核酸抽出、不純物除去などを含む。
【００５５】
以上のようなプライマーセットを用いて核酸の増幅を行うことにより、簡便、安価、高速に、特異的にコロナウイルスを増幅することが可能である。これを利用して、試料に含まれる核酸を当該プライマーまたはプライマーセットを用いるＬＡＭＰ増幅反応に供し、増幅反応の結果生じた増幅産物の有無を判定することにより、当該試料にコロナウイルスを特異的に検出することが可能である。
【００５６】
従来の方法では、特異性を配列検出の際の特異性は、一般的にＰＣＲ法で増幅した目的遺伝子産物をＤＮＡチップにより検出している。この場合、ＰＣＲにより生成される産物は２本鎖であるため、プローブとハイブリダイゼーション反応させると、相補鎖がプローブに対するコンペティターとなりハイブリ効率が低く検出感度が悪い。そのような方法において、また従来では、ターゲットを１本鎖にするために、相補鎖を分解する、または分離するといった方法も取られている。これらの場合、酵素の使用、磁気ビーズの使用などによる高価な価格となったり、操作が煩雑性になったりする。また、コロナウイルス属に分類される微生物は、培養が難しく、適切な培養条件を整えたとしても、時間がかかる。このような問題も本発明を用いることにより解決される。
【００５７】
これまで、迅速診断法としては特異的な抗体を使って抗原−抗体反応を介して検出する方法や、ＤＮＡ配列中の特徴的な配列を含む領域をポリメラーゼチェインリアクション（PCR）で増幅し、電気泳動法により検出する方法などが知られていた。しかしながら、前者の方法では近縁株等との区別が難しいことや、感染初期には抗体が検出できない事が知られている。また、後者のＰＣＲを利用する方法は、サーマルサイクラーのような複雑な温度制御装置が必要なことや簡便性に課題があるなどの不利点がある。またＰＣＲ法では、万が一誤って相補鎖合成が行われてしまった場合にはその生成物が鋳型となり増幅してしまい、誤った判定をしてしまう可能性がある。実際に、プライマーの末端の１塩基相違のみでは特異的な増幅を制御することは困難である。このような問題も本発明を用いることにより解決される。
【００５８】
ここで、本明細書に記載される核酸に関する情報を表３に纏めて示す。
【表３−１】
0005740112.tif 000012
【００５９】
【表３−２】
0005740112.tif 000013
【００６０】
【表３−３】
0005740112.tif 000014
【００６１】
【表３−４】
0005740112.tif 000015
【００６２】
【表３−５】
0005740112.tif 000016
【００６３】
【表３−６】
0005740112.tif 000017
【００６４】
【表３−７】
0005740112.tif 000018
【００６５】
【表３−８】
0005740112.tif 000019
【００６６】
【表３−９】
0005740112.tif 000020
【００６７】
【表３−１０】
0005740112.tif 000021
【００６８】
【表３−１１】
0005740112.tif 000022
【００６９】
【表３−１２】
0005740112.tif 000023
【００７０】
２．プローブ
本発明は更に、上述のポリペプチドプライマーにより増幅されたコロナウイルスに由来する核酸を検出および／または分類するためのプローブおよびプローブセットもまた提供する。
【００７１】
プローブは、所望の種を特異的に検出するためのプローブであってもよく、また、幾つかの種を特異的に検出するためのプローブであってもよい。このようなプローブは、例えば、上述のプライマーにより増幅されたステム・アンド・ループ構造を有するポリヌクレオチドの一本鎖のループ部分の領域に対して結合するように設定されればよい。また、当該プローブは好ましくは、約１０〜6０塩基長、約１２〜40塩基長などであればよい。
【００７２】
当該増幅産物を検出するためのプローブは、検出する細ウイルス株の保持する遺伝的多型や変異などに応じて変化させてもよい。上述したプローブは、何れも各表に示した配列の任意の位置の塩基が1つまたは数個置換あるいは欠失あるいは塩基を挿入された配列からなってもよい。また、核酸プローブの構造も特に限定されるものではなく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、メチルホスホネート骨格の核酸、その他の人工核酸鎖を用いることが可能である。また、これらのキメラ核酸でもよい。
【００７３】
例えば、好ましいプローブは、図３に示すようなステム・アンド・ループ構造のプライマー領域Ｆ１とＦ２との間(この領域はＦ２領域を含んでもよい)、プライマー領域Ｆ２ｃとＦ１ｃとの間(この領域はＦ２ｃ領域を含んでもよい)、プライマー領域Ｂ１とＢ２との間(この領域はＢ２領域を含んでもよい)、および／またはプライマー領域Ｂ２ｃとＢ１ｃとの間(この領域はＢ２ｃ領域を含んでもよい)の何れかの位置に対応するように選択されてよい。この選択は検出しようとするウイルス種に特異的な配列が適宜選択されるように行えばよい。或いは複数種を同時且つ特異的に、または広い範囲のウイルス種に亘り包括的、即ち、ユニバーサルに検出を行ってもよい。
【００７４】
本発明に従うプローブの例は、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１４５、配列番号１４６および配列番号１４７並びにそれらの相補配列により示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に検出可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドによりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプローブ群から選択される少なくとも１であってもよい。これらのプローブは組み合わされて使用されてもよく、その塩基にミックス塩基が含まれている塩基がミックス塩基として使用されてもよい。これらのプローブを組み合わせたミックス塩基として、および／または単独でミックス塩基として使用可能である場合にはそのミックス塩基として使用することが、ユニバーサルな検出のためにより有利であるので好ましい。これらのプローブセットにより、コロナウイルス属、特にグループ2aに分類される微生物をユニバーサルに検出することが可能である。グループ２ａに含まれるコロナウイルスの例はウシコロナウイルス(Bovine coronavirus)、マウス肝炎ウイルス(Murine（Mouse） hepatitis virus)、ヒトコロナウイルス、ブタ血球凝集脳脊髄炎ウイルスおよびラットコロナウイルス（Rat coronavirus）であるが、これらに限るものではない。
【００７５】
また、当該プローブは、所望の種を検出するためのプローブであってもよい。そのようなプローブは、例えば、上述のプライマーにより増幅されたステム・アンド・ループ構造を有するポリヌクレオチドの一本鎖のループ部分の領域に対して結合するように設定されればよい。また、当該プローブは好ましくは、約１０〜6０塩基長、約１２〜40塩基長などであればよい。所望の種を検出するためのプローブは、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１４５、配列番号１４６および配列番号１４７、並びにそれらの相補配列により示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に検出可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドによりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプローブ群から選択される少なくとも１であってもよい。また、複数の種を同時に検出するために、上記の配列から２または２以上選択して組み合わせて使用されてもよい。また、検出したいウイルス種のためのプローブを所望に応じて選択し、それらを組み合わせて、プローブセットとして使用してもよい。２種以上のプローブが選択され組み合わされて使用されてもよく、それぞれの配列からなる全てのプローブが一緒に使用されてもよい。また、これらの配列を構成する何れかの１以上の塩基がミックス塩基で設計されてもよい。また、複数種類の塩基に対して対合可能な修飾塩基で置換するように設計されてもよい。更に、このようなプローブは所望の種を検出することに加えて、或いは当該検出に代えてウイルスの型分けのために使用してもよい。更に、組み合わせて使用して、および／またはミックス塩基で使用してユニバーサルにウイルスを検出するために使用されてもよい。
【００７６】
ウイルス種に対応するプローブの組み合わせの例を表４および表５に示す。
【表４−１】
0005740112.tif 000024
【００７７】
【表４−２】
0005740112.tif 000025
【００７８】
【表５−１】
0005740112.tif 000026
【００７９】
【表５−２】
0005740112.tif 000027
【００８０】
また、何れのプローブも、例えば、コロナウイルス・ピロリの場合などのように、同一種内での配列変異が明らかになっているなどの場合には、同一種内の配列変異に対応するために異なる配列からなるプローブを複数使用してよい。
【００８１】
何れのプローブおよびプローブセットも、上述した増幅産物を所望に応じて検出するために使用されてよい。当該プローブは、固相基体表面に固定化されたものであってもよく、典型的にはＤＮＡチップとして構成されたものが用いられてよく、また他のマイクロアレイを構成するプローブとして用いられてもよい。
【００８２】
核酸プローブを固相、例えば、基体に固定化する場合は、末端にアミノ基、チオール基、ビオチン、などの官能基を導入してもよく、更に、官能基とヌクレオチドの間にスペーサーを導入してもよい。ここで用いられるスペーサーの種類は特に限定されないが、例えばアルカン骨格、エチレングリコール骨格などを用いてよい。また、一部の塩基がユニバーサルなヌクレオチドに置換されてもよい。本発明使用可能なユニバーサルなヌクレオチドの例は、deoxyinosine(dI)や、Gren Research社の3-Nitropyrrole、5-Nitroindole、deoxyribofuranosyl (dP)、deoxy-5'-dimethoxytrityl-D-ribofuranosyl (dK)などを含む。
【００８３】
本発明で使用する検出法は、これらに特に限定されるものではないが、濁度、可視光、蛍光、化学発光、電気化学発光、化学蛍光、蛍光エネルギー転移法、ＥＳＲなどの光学的な手法や、電流、電圧、周波数、伝導度、抵抗などの電気的な性質を利用することも可能である。
【００８４】
基体に核酸プローブが固相されたＤＮＡチップの例を以下に説明する。図５のＤＮＡチップは、核酸プローブ固定化チップの非限定的な１例であるである。ＤＮＡチップ１は、基体２に固定化領域３を具備する。核酸プローブ４は該固定化領域３に固定化される。このようなＤＮＡチップ１は、当該分野で周知の方法によって製造することができる。基体２に配置される固定化領域３の数及びその配置は、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。このようなＤＮＡチップは、蛍光を用いた検出方法のために好適に用いられてよい。1つの固定化領域には、独立した１つの信号として得ることが必要な情報を得るために必要な１種類または１種類以上の核酸プローブまたはプローブセットが固定化される。
【００８５】
図６のＤＮＡチップは、核酸プローブ固定化チップの非限定的な１例であるである。図６のＤＮＡチップ１１は、基体１２に電極１３を具備する。核酸プローブ１４は電極１３に固定化される。電極１３は、パット１５に接続される。電極１３からの電気的情報はパット１５を介して取得される。このようなＤＮＡチップ１１は、当該分野で周知の方法によって製造することができる。基体１２に配置される電極１３の数及びその配置は、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。さらに、本例のＤＮＡチップは、必要に応じて、参照電極及び対極を具備してもよい。1つの固定化領域には、独立した１つの信号として得ることが必要な情報を得るために必要な１種類または１種類以上の核酸プローブまたはプローブセットが固定化される。
【００８６】
本発明で用いるプローブを固定化するための表面は、特に限定されるものではないが、樹脂ビーズ、磁気ビーズ、金属微粒子、マイクロタイタープート、ガラス基板、シリコン基板、樹脂製基板、電極基板などを用いることができる。
【００８７】
本発明で使用する基体の材料は、特に限定されるものではない。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素、等の無機絶縁材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。
【００８８】
例えば、電気的な性質を利用する場合、電極を基体に配置することが好ましい。電極は特に限定されるものではないが、例えば、金、金の合金、銀、プラチナ、水銀、ニッケル、パラジウム、シリコン、ゲルマニウム、ガリウム、タングステン等の金属単体及びそれらの合金、あるいはグラファイト、グラシーカーボン等の炭素等、またはこれらの酸化物、化合物であってよい。更に、酸化珪素等の半導体化合物や、CCD、FET、CMOSなど各種半導体デバイスを用いてもよい。
【００８９】
抽出方法は特に限定される物ではなく、フェノール−クロロホルム法等の液−液抽出法や担体を用いる固液抽出法を用いることができる。また、市販の核酸抽出方法ＱＩＡａｍｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、（社製）等を利用することも可能である。次に、抽出した核酸成分を鋳型にＲＴ-ＬＡＭＰ増幅を行った後、遺伝子検出用電極とでハイブリダイゼーション反応を行う。反応溶液は、イオン強度0.01〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液中で行う。この溶液中にはハイブリダイゼーション促進剤である硫酸デキストランや、サケ精子DNA、牛胸腺DNA、EDTA、界面活性剤などを添加することが可能である。ここに抽出・増幅した核酸成分を添加の上、核酸プローブとのハイブリダイゼーション反応に供与する。反応中は、撹拌、あるいは振とうなどの操作で反応速度を高めることもできる。反応温度は10℃〜90℃の範囲で、また反応時間は1分以上1晩程度行う。ハイブリダイゼーション反応後の洗浄には、イオン強度0.01〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液を用いる。
【００９０】
抽出・増幅したサンプル核酸は、あらかじめFITCやCy3、Cy5、ローダミンなどの蛍光色素やビオチン、ハプテン、オキシダーゼやポスファターゼ等の酵素や、フェロセンやキノン類等の電気化学的に活性な物質で標識するか、あるいは前述した物質で標識したセカンドプローブを用いることで検出が可能になる。
【００９１】
電気化学的に活性な核酸結合物質を用いた検出を行う場合は、以下のような手順で検出を行う。基体を洗浄後、電極表面に形成した二本鎖部分に選択的に結合する核酸結合物質を作用させ、電気化学的な測定を行ってよい。ここで用いられる核酸結合物質は特に限定される物ではないが、例えば、ヘキスト33258、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーター、ポリインターカレーター等を用いることが可能である。更に、これらのインターカレーターを電気化学的に活性な金属錯体、例えば、フェロセン、ビオロゲン等で修飾しておくことも可能である。核酸結合物質の濃度は、その種類によって異なるが、一般的には1ng/ml〜1mg/mlの範囲で使用する。この際、イオン強度0.001〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液を用いる。電極を核酸結合物質と反応させた後、電気化学的な測定を行う。電気化学的な測定は、3電極タイプ、すなわち参照電極、対極、作用極、あるいは2電極タイプ、すなわち対極、作用極で行う。測定では、核酸結合物質が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加し、核酸結合物質に由来する反応電流値を測定する。この際、電位は定速で掃引するか、あるいはパルスで印加するか、あるいは、定電位を印加することができる。測定には、ポテンショスタット、デジタルマルチメーター、ファンクションジェネレーター等の装置を用いて電流、電圧を制御する。得られた電流値を基に、検量線から標的遺伝子の濃度を算出する。遺伝子検出用電極を用いた遺伝子検出装置は、遺伝子抽出部、遺伝子反応部、核酸結合物質反応部、電気化学測定部、洗浄部等から構成される。
【００９２】
３．アッセイキット
本発明に従うと、コロナウイルスの検出および／または分類するためのアッセイキットが提供されてもよい。そのようなアッセイキットは、上述のプライマーまたはプライマーセットとプローブまたはプローブセットとを含めばよい。当該アッセイキットは、当該プライマーまたはプライマーセットおよびプローブまたはプローブセットに加えて、ＬＡＭＰ増幅に必要なバッファーを含んでもよく、ハイブリダイゼーションに必要なバッファー、並びにそこにおいて当該増幅および／またはハイブリダイゼーションを行うための容器を具備してもよい。また、アッセイキットに含まれるプローブは基体に固定化されていてもよい。その場合の基体は上述した何れかの基体であればよい。
【００９３】
４．コロナウイルス属の検出および分類方法
本発明に従うと、更に、コロナウイルスを検出する方法が提供される。当該検出方法は、上記したプライマー、プローブおよび増幅方法を利用することによって、更に、コロナウイルス属に分類される微生物の検出および属レベルまたは種レベルで遺伝子型分類を行う方法である。
【００９４】
そのような方法は、試料に含まれる核酸を上述の何れかのプライマーセットを用いてＬＡＭＰ増幅する工程と、前記増幅により生じた増幅産物と上述の何れかのプローブとを反応することと、前記反応の結果から試料に存在するコロナウイルスを検出および／または分類することを具備すればよい。
【００９５】
また、上述の何れかのプライマーセットを用いて、試料についてＬＡＭＰ増幅反応またはＲＴ−ＬＡＭＰ増幅を行うことと、当該増幅反応により生じた増幅産物と、上述の何れかのプローブとを反応し、それにより生じるハイブリダイズの有無を検出することにより試料におけるコロナウイルスの存在の有無を判定する、および／または試料に含まれるコロナウイルスを分類することを具備する方法であってもよい。
【００９６】
また、例えば、そのようなコロナウイルス属に分類される微生物の感染や存在を検出する方法は；
本発明に従うプライマーから任意に選択される少なくとも１つのプライマーを含む複数のプライマーを使用して、ＬＡＭＰ反応またはＲＴ−ＬＡＭＰ反応により試料について核酸鎖増幅反応を行う工程と、
前記増幅反応後に増幅産物の有無を検出する工程と、
を具備すればよい。当該試料は、予め核酸を抽出する工程に供されてもよい。
【００９７】
「ＬＡＭＰ増幅」とはそれ自身公知の何れかの条件下でＬＡＭＰ増幅を行なうことをいう。「ＲＴ-ＬＡＭＰ増幅」とは、逆転写を行いながらＬＡＭＰ反応により増幅対象の核酸を増幅することをいう。当該ＬＡＭＰ増幅は、上述の何れかのプライマーを用いて増幅対象の核酸を増幅可能なそれ自身公知の何れの条件で行なえばよい。
【００９８】
当該増幅産物と当該プローブとの反応は、上述の何れかのプローブを用いてハイブリダイズが可能なそれ自身公知の何れかの条件で行えばよい。
【００９９】
LAMP産物に特徴的な複雑な高次構造が、ハイブリダイゼーション反応時においてプローブが結合した基体と物理的な障害を起こす要因となり、その結果ハイブリダイゼーション効率に悪影響を及ぼすことが見出されている（たとえば、特開2005-95043を参照されたい）。そのような悪影響を受けないようにするために、本発明に従うプローブは、従来のターゲット配列の位置とは異なり、一本鎖のループ部分にコロナウイルス属に分類される微生物由来のターゲット配列が位置するようにプライマーを設計した。
【０１００】
本発明によれば、簡便、安価、高速にコロナウイルス属に分類される微生物の検出および属レベルまたは種レベルで遺伝子型を分類する方法が提供される。
【０１０１】
以上のようなことから、問題となるウイルスに特徴的な遺伝子配列の存在の検出と迅速な同定を行うことの出来る方法が臨床診断現場や微生物モニタリング、疫学研究、その他様々な分野において求められている。これまで、迅速診断法としてはウイルスＲＮＡから逆転写酵素によりＤＮＡを作成した上、前記DNA配列中の特徴的な配列を含む領域をポリメラーゼチェインリアクション（PCR）で増幅し、電気泳動法により検出する方法（ＲＴ-ＰＣＲ法）などが知られている。しかしながら、PCRを利用する方法は、サーマルサイクラーのような複雑な温度制御装置が必要なことや簡便性に課題があるなどの不利点がある。またPCR法では、万が一誤って相補鎖合成が行われてしまった場合にはその生成物が鋳型となり増幅してしまい、誤った判定をしてしまう可能性がある。実際に、プライマーの末端の1塩基相違のみでは特異的な増幅を制御することは困難である。特異性を配列検出の際の特異性を挙げる方法としては、一般的にPCR法で増幅した目的遺伝子産物をDNAチップにより検出する手法が挙げられるが、PCRにて生成される産物が2本鎖であるため、プローブとハイブリダイゼーション反応させる場合に、相補鎖がプローブに対するコンペティターとなりハイブリ効率が低く検出感度が悪いのが問題であった。そこで、ターゲットを1本鎖にするために、相補鎖を分解する、または分離するといった方法がとられているが、いずれも、酵素の使用、磁気ビーズの使用などによる高価格化、操作における煩雑性が課題として残されており、これらに代わる新しい手法が求められている。
【０１０２】
［例］
以下に、本発明による核酸検知方法について例を用いて具体的に説明する。
【０１０３】
今回、発明者らは、コロナウイルス  グループ２ａ（Coronavirus group 2a）および2bを構成するウイルス種では、ウイルスゲノム解析の結果nucleocapsid proteinをコードする遺伝子配列の一部領域が、ウイルス種毎にユニークな配列を保持しながら高度に保存されていることを見出した。そこで、先ず、コロナウイルス  グループ２ａおよび２ｂの代表列としてＭＨＶ及びＳＤＡＶを用い、前記遺伝子領域において検知に最適なPrimer/Probe設計遺伝子配列を検討した（例１−６）。選定されたプライマーおよびプローブを用いて様々な検体を検出した。その結果、望ましい検出特性（検出信号量および検出特異性）が得られることが確認された。
【０１０４】
次に、他のコロナウイルス２ａの種および株、即ち、ウシコロナウイルス、ヒトコロナウイルス  ＨＫＵ１、ヒトコロナウイルス ＯＣ４３、ブタ血球凝集脳脊髄炎ウイルス、およびグループ2b（例として、ＳＡＲＳコロナウイルス）についても、前述したＭＨＶおよびＳＤＡＶを代表として選定した最適なプライマーおよびプローブに対応する遺伝子配列領域にプライマーおよびプローブを設計した。それぞれの核酸検出特性を確認した。それにより、望ましい検出特性が得られることを確認した。詳細を以下に記す。
【０１０５】
例１
＜プライマーセットの選択＞
MHV（Murine hepatitis virus、アクセション番号NC_001846, NC_006852, AF208067, AF190408, AF190408, AF201929, AF700211, AY910861, M35253, M35254, M35255, M35256, M80644））からアライメントを作成し、変異のない、または変異頻度の少ない領域を選んでプライマーを設計した。MHVの一部をクローニングしたプラスミド（103copies/reaction）をテンプレートにして、以下の組成にて63℃90分Realoop-30（モリテックス社製）を用いてLAMP増幅を行った。プライマーの組み合わせと増幅結果（濁度立上がり時間）を合わせて表１に示す。濁度立上がり時間80分未満が３種、80分以上が４種得られた。このうち、上位４種を候補として選択し、ループプライマーの設計を行った。結果を表６に示す。
【表６−１】
0005740112.tif 000028
【０１０６】
【表６−２】
0005740112.tif 000029
【０１０７】
LAMP反応液組成（１×）
FIP          40 pmol
BIP          40 pmol
F3            5 pmol
B3            5 pmol
(Lfc/Lb        20 pmol)
2×Reaction Mixture            12.5 μl
8 U/μl Bst DNA polymerase  1μl
Template                             1μl
Distilled Water        Up to 25μl。
【０１０８】
Reaction Mixture（反応時濃度）
Tris-HCl (pH8.8)            20 mM
KCL                            10 mM
MgSO4                        8 mM
(NH4)SO4                    10 mM
Tween-20                    0.1 %
Betaine                      0.8 M
dNTPs                      1.4 mM each。
【０１０９】
＜ループプライマーの選択＞
上記で候補となったプライマーセットに対し、定法に従ってループプライマーを設計して合成した。上述の反応組成に20pmolのループプライマーを追加して同様にLAMP増幅を行った。テンプレートは添加前に９５℃５分処理したものを使用した。プライマーの組合せと増幅結果を合わせて表７に示す。この実験から各プライマーセットに対する良好なループプライマーを選択した。
【表７−１】
0005740112.tif 000030
【０１１０】
【表７−２】
0005740112.tif 000031
【０１１１】
＜プライマーセットの最終選択＞
プライマー中に変異塩基があると増幅特性を悪化させるため、変異に富む実際の検体を網羅的に検出するには、変異が存在しない箇所をプライマーにすることが望ましい。したがって、絞り込まれた４種のプライマーセットのうち、最も変異確率の少ない、セット１−１が最良であると判断した。調査した配列中に存在する変異数は、以下の表で表される。
【表８】
0005740112.tif 000032
【０１１２】
上述の検討により、MHVを良好にLAMP増幅可能なプライマーセットを見出すことができた。
【０１１３】
ＭＨＶについて上記プライマーでＬＡＭＰ増幅した結果を図７に示す。レーン２および３はＨＭＶのＬＡＭＰ産物についての結果である。レーン１は１００ｂｐラダーのマーカーである。
【０１１４】
例２
＜SDAV（Rat sialodacryoadenitis coronavirus）用プライマーの設計＞
SDAV（Rat sialodacryoadenitis coronavirus、アクセション番号 AF207551）は、ラットに感染するコロナウイルスであるが、MHVと配列が類似していることから、共通のプライマーで増幅できる可能性が高い。そこで、SDAVも対応可能なプライマーとするため、プライマーセット１−１，１７−１それぞれに対応する領域の配列を調べ、表９に示すプライマーの組み合わせで増幅を行った。
【表９】
0005740112.tif 000033
【０１１５】
対応するプライマーは等量の混合とした。その結果、この混合プライマーはMHV、SDAVのいずれも濁度立上がり時間30分未満で増幅可能であることが示された。
【０１１６】
例３
＜変異株用プライマーの設計＞
プライマーセット1-1について、プライマー領域にある変異箇所を調べたところ、F2領域、F3領域、B3領域およびLPb領域に頻度の高い変異があることがわかった。そこで、これら変異株も良好に増幅できるよう、表１０のプライマーを新たに追加して増幅を行った。
【表１０−１】
0005740112.tif 000034
【０１１７】
【表１０−２】
0005740112.tif 000035
【０１１８】
【表１０−３】
0005740112.tif 000036
【０１１９】
対応するプライマーの混合量は等量とした。その結果、この混合プライマーは変異のない基準株、変異株のいずれも配列でも濁度立上がり時間30分未満で増幅可能であることが示された。
【０１２０】
例４
＜RT-LAMP＞
プライマーセット１-1および変異対応追加プライマーを混合したLAMP増幅液（上述の例１の記載の組成と同様）に、0.625UのAMV transcriptaseを添加し、実際のMHVウイルス（譲渡された２つの基準株A59, JHM  ）およびSDAVウイルスのRT-LAMP（６３℃６０分）を行った。その結果、抽出検体の段階希釈液において良好な増幅であった。
【表Ｃ】
0005740112.tif 000037
【０１２１】
例５
Probe配列設計
前記プライマーセットにて増幅されたＬＡＭＰ産物検出用プローブを選定するため、ＬＡＭＰ産物の1本鎖核酸領域にハイブリダイゼーションが可能な設計にて複数の候補配列を選定した。３’末端チオール修飾を持つ合成核酸として表１１に示すプローブ候補を準備した。
【表１１】
0005740112.tif 000038
【０１２２】
例6
＜プローブの選定＞
図6に模式的に示すような構成の核酸プローブ固定化電極を作製した。基板１２に配置された金電極１３に対して、プローブ候補となる配列の合成核酸（３’末端がチオール修飾されている）７〜１０をスポットすることにより配列毎に固定化した。
【０１２３】
また、同様にネガティブコントロールプローブもスポットした。その後、超純水で洗浄し、風乾し、電流検知型の核酸チップを作製した。作製した核酸チップを２×ＳＳＣの塩を添加したＬＡＭＰ産物に浸漬し、３５℃で60分間静置することによってハイブリダイゼーション反応を行った。LAMP産物は、標準株配列を持つプラスミドをテンプレートに増幅したものを用いた。更に、この電極を挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含むリン酸緩衝液中に１５分間浸漬した後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。電流測定の結果を表４に示す。
【０１２４】
電極に固定化したプローブは、領域中に存在する変異をあらかじめ考慮したものを複数用意した。30nA以上の増加量を示す最適なプローブ、20-30nAの増加量を示す良好なプローブが得られ、MHV検出用核酸チップに搭載するプローブ配列を選択することができた。また、今回選定した最適なプローブを用いた場合、上述の例２から得られたＳＤＡＶ由来ＬＡＭＰ産物を検出サンプルとして使用したばあいについても、何れのプローブ配列からも30nA以上の電流増加量が得られることを確認した。
【０１２５】
例７
検出対象である、ＭＨＶ及びＳＤＡＶはＲＮＡウイルスである事から、ゲノム配列には多様な変異（バリエーション）が存在する。そこで、公表されている全てのＭＨＶ及びＳＤＡＶゲノム配列情報を基に、例１−６にて選定されてきた最適プライマーおよびプローブ領域の変異発生状況を確認した（表11を参照されたい）。
【０１２６】
具体的には、それぞれの変異に対応する鋳型配列を合成遺伝子により作成したと伴に、全パターンについて変異対応プライマーおよびプローブを準備した。配列変異を含むウイルス配列検知を試みた。その結果、何れの組み合わせにおいてもプライマーおよびプローブ配列と検体がフルマッチであれば、30nA以上の電流増加量にて検出が可能であることを確認した。なお、近縁ウイルスであるBovine coronavirus、Human coronavirus HKU1、Human coronavirus OC43、Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus等の配列を持つ鋳型核酸を検体として適用した場合、何れのプライマーおよびプローブの組み合わせにおいても、優位な電流値増加（20ｎＡ以上）は認められなかった。
【０１２７】
以上の事から、ＭＨＶ及びＳＤＡＶにおいては、上述の例１−６にて選定されたプライマーおよびプローブ領域を用いることで、望ましい検出特性（即ち、検出信号量および検出特異性）が得られること、必要に応じてプライマーおよびプローブの配列を一部改変することで、ウイルス配列変異に対しても検出特性を損なうことなく対応可能であることが確認できた。
【０１２８】
ＨＭＶの陽性検体を用いて検出を行った結果を図８示す。また、陰性検体を用いた結果を図９に示す。
【０１２９】
例８
他のCoronavirus group 2a（Bovine coronavirus   NC_003045、Human coronavirus HKU1   NC_005147、Human coronavirus OC43   NC_006577、Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus   NC_007732）、 2b（ＳＡＲＳcoronavirus   NC_004718）についても、上述の例１−７で示されたＭＨＶおよびＳＤＡＶを代表として選定した最適なプライマーおよびプローブの設計に対応する遺伝子領域を特定した。それぞれのウイルス種に対応したプライマーおよびプローブを構築した（表12を参照されたい）。
【表１２−１】
0005740112.tif 000039
【０１３０】
【表１２−２】
0005740112.tif 000040
【０１３１】
ＭＨＶ及びＳＤＡＶを含めたCoronavirus group 2a、2bに対する検出特性を確認した。その結果、構築したプライマーおよびプローブにて、Coronavirus group 2a、2bの分類されるウイルス種を特異的かつ十分な信号量にて検知できることが確認できた
（表１3を参照されたい）。
【表１３】
0005740112.tif 000041
【０１３２】
例９
検出対象である、Coronavirus group 2a、2bはＲＮＡウイルスである事から、ゲノム配列には多様な変異（バリエーション）が存在する。そこで、上述の例７同様、公表されている全てのBovine coronavirus、Human coronavirus HKU1、Human coronavirus OC43、Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus、ＳＡＲＳcoronavirusのゲノム配列情報を元に、前述の例において選定されてきた最適なプライマーおよびプローブの領域の変異発生状況を確認。それぞれの変異に対応する鋳型配列を合成遺伝子により作成したと伴に、全パターンについて変異対応プライマーおよびプローブを準備した。それらを用いて配列変異を含むウイルス配列検出を試みた。その結果、何れの組み合わせにおいてもプライマーおよびプローブ配列と検体がフルマッチであれば、30nA以上の電流増加量にて検出が可能であることを確認した。検出結果の例を図１０〜図１２に示す。図１０はorcine hemagglutinating encephalomyelitis virus  陽性検体を用いて得た結果の例である。図１１は、Ｂｏｖｉｎｅ corona virus  陽性検体を当てた結果である。図１２は、陰性検体を当てた結果を示す。
【０１３３】
なお、変異対応を行なったプライマーおよびプローブを使用した場合であっても、表13に示したのと同様、近縁ウイルス間での交差反応による２０ｎＡ以上の優位な電流値増加は全く認められなかった。この事は、配列の更に異なる他のウイルス属・ウイルス種や、他の微生物との交差反応を生じないことを示唆する。
【０１３４】
考察
以上の事から、本発明にて選定されたプライマーおよびプローブ領域を用いることで、コロナウイルス  グループ2aおよび2bの検出ならびに種判別および／またはタイピングを、望ましい検出特性（即ち、検出信号量および検出特異性）にて行な得ることが示された。また必要に応じてプライマーおよびプローブの配列を一部改変する事で、コロナウイルス  グループ2aおよび2bを構成するウイルス種およびウイルス配列変異に対して、検出特性を損なうことなく対応可能であることが確認できた。
以下に、本願出願の当初の特許請求の範囲に記載された実施形態を付記する。
[１]  コロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅するためのLAMP増幅用核酸プライマーセットであって、前記LAMP増幅用核酸プライマーセットは、ＦIPプライマー、BIPプライマー、F３プライマー、Ｂ３プライマーを含み、
当該ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７若しくは配列番号４４またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む、少なくとも１種類のＦＩＰプライマーであり、
当該ＢＩＰプライマーが配列番号２、配列番号６、配列番号１０、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１若しくは配列番号４５またはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む、少なくとも１種類のＢＩＰプライマーであり、
当該Ｆ３プライマーが配列番号３、配列番号７、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１９、配列番号３４、配列番号３５若しくは配列番号４６またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む、少なくとも１種類のＦ３プライマーであり、および
当該Ｂ３プライマーが配列番号４、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号36若しくは配列番号４７またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む、少なくとも１種類のＢ３プライマーである
プライマーセット。
[２]   前記[１]に記載のプライマーセットであって、前記ＦIPプライマー、前記ＢＩＰプライマー、前記Ｆ３プライマーおよび前記Ｂ３プライマーの組み合わせが以下からなる群より少なくとも１選択され、前記増幅がコロナウイルス由来の核酸の増幅であるプライマーセット；
（１）  配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（２）  配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（３）  配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（４）  配列番号１３、配列番号１０、配列番号１４および配列番号１２によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（５）  配列番号１３、配列番号１５、配列番号１４および配列番号１６によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（６）  配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（７）  配列番号１７、配列番号２１、配列番号１９および配列番号２２によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（８）  配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー、ここで、各配列により示されるポリヌクレオチドがミックス塩基であるプライマー；ならびに
（９）      配列番号５９、配列番号６０、配列番号５８および配列番号６１によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
配列番号６８、配列番号６９、配列番号６７および配列番号７０によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
配列番号７７、配列番号７８、配列番号７６および配列番号７９によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
配列番号８６、配列番号８７、配列番号８５および配列番号８９によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０３および配列番号１０６によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１２および配列番号１１５によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２１および配列番号１２４によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；並びに
配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３０および配列番号１３３によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；からなるプライマー。
[３]  前記[１]また[２]に記載のプライマーセットであって、前記ＦＩＰプライマー、前記ＢＩＰプライマー、前記Ｆ３プライマーおよび前記Ｂ３プライマーの組み合わせが以下からなる群より少なくとも１選択されるプライマーセット；
（１０）  配列番号５９、配列番号６０、配列番号５８および配列番号６１によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（１１）  配列番号６８、配列番号６９、配列番号６７および配列番号７０によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（１２）  配列番号７７、配列番号７８、配列番号７６および配列番号７９によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（１３）  配列番号８６、配列番号８７、配列番号８５および配列番号８９によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（１４）  配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０３および配列番号１０６によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（１５）  配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１２および配列番号１１５によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；
（１６）  配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２１および配列番号１２４によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー；並びに
（１７）  配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３０および配列番号１３３によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなるプライマー。
[４]  前記LAPM増幅用核酸プライマーセットが、更に、ループプライマーＬＰｆおよびＬＰｂを含み、前記ＬＰｆが、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３７、配列番号４８、配列番号６２、配列番号７１、配列番号８０、配列番号８９、配列番号１０７、配列番号１１６、配列番号１２５若しくは配列番号１３４またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含み、前記ＬＰｂが配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号４９、配列番号６３、配列番号７２、配列番号８１、配列番号９０、配列番号１０８、配列番号１１７、配列番号１２６若しくは配列番号１３５またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含む前記［１］〜［３］の何れか１項に記載のプライマーセット。
[５]  コロナウイルスに由来する核酸を特異的に増幅する方法であって、試料を前記［１］〜［４］の何れか１項に記載のプライマーセットを用いてＬＡＭＰ増幅することを具備する方法。
[６]  コロナウイルスを検出および／または分類する方法であって、
試料に含まれる核酸を前記［１］〜［４］の何れか１項に記載のプライマーセットを用いてＬＡＭＰ増幅することと、
前記ＬＡＭＰ増幅により生じた反応産物と、
配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３、並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に検出可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含むプローブ群；および／または
配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１４５、配列番号１４６および配列番号１４７並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に検出可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含むプローブ群；
より形成されるプローブ群から選択される少なくとも１種類のプローブから選択される少なくとも１種類のプローブと、
を反応することと、
前記反応の結果から、試料に存在するコロナウイルスを検出および／または分類することと
を具備する方法。
[７]  前記［６］に記載の方法であって、前記プローブ群が基体に固定化されている方法。
[８]  コロナウイルスの検出および／または分類するためのアッセイキットであって、
前記［１］〜［３］の何れか１項に記載のプライマーセットと、
前記プライマーセットを用いて得られた増幅産物からコロナウイルスを特異的に検出および／または分類するためのプローブであり、
配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３、並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に検出可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含むプローブ群；および／または
配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１４５、配列番号１４６および配列番号１４７、並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドまたはコロナウイルス由来の核酸を特異的に検出可能な範囲で変異を含む前記ポリヌクレオチドを含むプローブ群；
より形成されるプローブ群から選択される少なくとも１種類のプローブと、
を含むことを特徴とするアッセイキット。
[９]  前記［８］に記載のアッセイキットであって、前記プローブ群が基体に固定化されているアッセイキット。
【符号の説明】
【０１３５】
１・・ＤＮＡチップ、２・・基体、３・・固定化領域、４・・核酸プローブ、１１・・ＤＮＡチップ、１２・・基体、１３・・電極、１４・・核酸プローブ、１５・・パット
【図１】
0005740112.tif 000042
【図２】
0005740112.tif 000043
【図３】
0005740112.tif 000044
【図４】
0005740112.tif 000045
【図５】
0005740112.tif 000046
【図６】
0005740112.tif 000047
【図７】
0005740112.tif 000048
【図８】
0005740112.tif 000049
【図９】
0005740112.tif 000050
【図１０】
0005740112.tif 000051
【図１１】
0005740112.tif 000052
【図１２】
0005740112.tif 000053
【配列表】
0005740112000001.app