(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｉｉ−ｋｅｙ部位およびＨＰＶ１６型Ｅ７部位から本質的に構成されるハイブリッドペプチドを含む組成物であって、
前記Ｉｉ−ｋｅｙ部位は、ＬＲＭＫ（アミノ酸1〜4）残基［配列番号：９］およびこれに連続する０〜１２個の残基から本質的に構成され、
前記ＨＰＶ１６型Ｅ７部位は、ＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜26）［配列番号：２］、ＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）［配列番号：３］、ＨＰＶ１６型Ｅ７（9〜22）［配列番号：２０］またはＨＰＶ１６型Ｅ７（10〜22）［配列番号：２１］の連続するアミノ酸配列から本質的に構成され、
前記Ｉｉ−ｋｅｙ部位と前記ＨＰＶ１６型Ｅ７部位とが、約２０個以下のアミノ酸の長さのスペーサーで接続され、Ｉｉ−ｋｅｙ／ＨＰＶ１６型Ｅ７のハイブリッドペプチドを形成している、組成物。
【請求項２】
請求項１において、前記ＨＰＶ１６型Ｅ７部位がＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）［配列番号：３］である、組成物。
【請求項３】
請求項１において、前記Ｉｉ−ｋｅｙ／ＨＰＶ１６型Ｅ７のハイブリッドペプチドが、ＨＰＶ２［配列番号：４］、ＨＰＶ３［配列番号：５］およびＨＰＶ４［配列番号：６］からなる群から選択されたものである、組成物。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項において、前記Ｉｉ−ｋｅｙ／ＨＰＶ１６型Ｅ７のハイブリッドペプチドがＨＰＶ４［配列番号：６］である、組成物。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項において、前記ハイブリッドペプチドが、さらに、薬学的に許容可能な担体を含む、組成物。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載のＩｉ−ｋｅｙ／ＨＰＶ１６型Ｅ７のハイブリッドペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、組成物。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項において、前記スペーサーがポリメチレンリンカー（ａｖａ）である、組成物。
【請求項８】
請求項１に記載されたＩｉ−ｋｅｙ部位およびＨＰＶ１６型Ｅ７部位から本質的に構成されるアミノ酸配列を含む組成物。
【請求項９】
請求項１に記載されたＩｉ−ｋｅｙ部位およびＨＰＶ１６型Ｅ７部位から本質的に構成されるアミノ酸配列を含む組成物であって、前記ＨＰＶ１６型Ｅ７部位がＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）ペプチド［配列番号：３］である組成物。
【請求項１０】
Ｉｉ−ｋｅｙ／ＨＰＶ１６型Ｅ７のハイブリッドペプチドを含む免疫応答刺激剤であって、
前記ハイブリッドペプチドは、Ｉｉ−ｋｅｙ部位およびＨＰＶ１６型Ｅ７部位から本質的に構成され、
前記Ｉｉ−ｋｅｙ部位は、ＬＲＭＫ（アミノ酸1〜4）残基［配列番号：９］およびこれに連続する０〜１２個の残基から本質的に構成され、
前記ＨＰＶ１６型Ｅ７部位は、ＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜26）［配列番号：２］、ＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）［配列番号：３］、ＨＰＶ１６型Ｅ７（9〜22）［配列番号：２０］またはＨＰＶ１６型Ｅ７（10〜22）［配列番号：２１］の連続するアミノ酸配列から本質的に構成され、
前記Ｉｉ−ｋｅｙ部位と前記ＨＰＶ１６型Ｅ７部位とが、約２０個以下のアミノ酸の長さのスペーサーで接続されている、免疫応答刺激剤。
【請求項１１】
請求項１０において、前記ＨＰＶ１６型Ｅ７部位がＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）［配列番号：３］である、免疫応答刺激剤。
【請求項１２】
請求項１０において、前記Ｉｉ−ｋｅｙ／ＨＰＶ１６型Ｅ７のハイブリッドペプチドがＨＰＶ２［配列番号：４］、ＨＰＶ３［配列番号：５］およびＨＰＶ４［配列番号：６］からなる群から選択されたものである、免疫応答刺激剤。
【請求項１３】
請求項１０から１２のいずれか一項において、前記Ｉｉ−ｋｅｙ／ＨＰＶ１６型Ｅ７のハイブリッドペプチドがＨＰＶ４［配列番号：６］である、免疫応答刺激剤。
【請求項１４】
請求項１０から１３のいずれか一項において、前記組成物が、さらに、薬学的に許容可能な担体を有する、免疫応答刺激剤。
【請求項１５】
請求項１０から１４のいずれか一項において、前記スペーサーがポリメチレンリンカー（ａｖａ）である、免疫応答刺激剤。
【請求項１６】
請求項１０から１５のいずれか一項において、前記Ｉｉ−ｋｅｙ／ＨＰＶ１６型Ｅ７のハイブリッドペプチドが核酸によってコードされており、当該核酸が前記対象に投与される、免疫応答刺激剤。
【請求項１７】
免疫応答刺激剤であって、
請求項１に記載されたＩｉ−ｋｅｙ部位およびＨＰＶ１６型Ｅ７部位から本質的に構成されるアミノ酸配列を含む組成物、または請求項１に記載されたＩｉ−ｋｅｙ部位およびＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）［配列番号：３］から本質的に構成されるアミノ酸配列を含む組成物で構成された、免疫応答刺激剤。
【請求項１８】
対象内のＨＰＶ病原体に対するワクチンの力価を増強させるキットであって、前記キットは、
ａ）ＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜26）［配列番号：２］、ＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）［配列番号：３］、ＨＰＶ１６型Ｅ７（9〜22）［配列番号：２０］またはＨＰＶ１６型Ｅ７（10〜22）［配列番号：２１］の連続するアミノ酸配列から本質的に構成されるＭＨＣＩＩクラスエピトープを有するペプチドを含むワクチンと、
ｂ）ｉ）Ｉｉ−ｋｅｙタンパク質のＬＲＭＫ残基およびｉｉ）前記ａ）ステップのワクチンと同じ、ＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜26）［配列番号：２］の連続するアミノ酸８個以上の配列から本質的に構成されるＭＨＣクラスＩＩのエピトープ含有ペプチドを含む、Ｉｉ−ｋｅｙハイブリッド構築物とで構成され、前記キットは
ｃ）前記対象の免疫応答を刺激するのに適した条件下で、前記ｂ）ステップのＩｉ−ｋｅｙ構築物を投与し、当該対象の免疫系を予備刺激するステップと、
ｄ）前記ｃ）ステップの免疫応答をブーストするのに適した条件下で、前記ａ）のワクチンまたは前記ｃ）ステップのハイブリッドを投与することにより、前記予備刺激を行わない場合よりも免疫応答の力価を増強させるステップと、において用いられる
ワクチン力価増強キット。
【請求項１９】
請求項１８において、前記ＨＰＶエピトープ含有ペプチドが、ＨＰＶ１６型Ｅ７のエピトープ含有ペプチドである、ワクチン力価増強キット。
【請求項２０】
請求項１９において、前記ＨＰＶ１６型Ｅ７のエピトープ含有ペプチドが、ＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）［配列番号：３］である、ワクチン力価増強キット。
【請求項２１】
請求項１８または１９において、前記Ｉｉ−ｋｅｙハイブリッド構築物が、ＨＰＶ２［配列番号：４］、ＨＰＶ３［配列番号：５］およびＨＰＶ４［配列番号：６］からなる群から選択されたものである、ワクチン力価増強キット。
【請求項２２】
請求項１８から２１のいずれか一項において、前記Ｉｉ−ｋｅｙハイブリッド構築物がＨＰＶ４［配列番号：６］である、ワクチン力価増強キット。
【請求項２３】
請求項１８から２２のいずれか一項において、前記ワクチンまたはＩｉ−ｋｅｙ構築物が、さらに、薬学的に許容可能な担体を有する、ワクチン力価増強キット。
【請求項２４】
請求項１８から２３のいずれか一項において、前記Ｉｉ−ｋｅｙタンパク質のＬＲＭＫ残基およびクラスＩＩのエピトープ含有ペプチドを結びつけるスペーサーがポリメチレンリンカー（ａｖａ）である、ワクチン力価増強キット。
【請求項２５】
請求項１８から２４のいずれか一項において、前記Ｉｉ−ｋｅｙ構築物が核酸によってコードされており、当該核酸が前記対象に投与される、ワクチン力価増強キット。
【請求項２６】
請求項１８から２５のいずれか一項において、前記ワクチンが、前記ａ）および前記ｂ）のペプチドをコードするＤＮＡワクチンであり、かつ、そのコドン使用頻度が前記対象のコドン選択性と合致するように最適化されている、ワクチン力価増強キット。
【請求項２７】
請求項１８から２６のいずれか一項において、前記ａ）のエピトープと前記ｂ）のＩｉ−ｋｅｙハイブリッドが共免疫される、ワクチン力価増強キット。
【請求項２８】
請求項１８から２７のいずれか一項において、前記ワクチンが、さらに、ＭＨＣクラスＩのＣＴＬエピトープを含む、ワクチン力価増強キット。
【請求項２９】
標的のＨＰＶに対する免疫応答を引き起こすための組成物であって、
薬学的に許容可能な担体に含まれたＩｉ−ｋｅｙのハイブリッドペプチドを有し、
前記Ｉｉ−ｋｅｙのハイブリッドペプチドは、
ａ）Ｉｉ−ｋｅｙタンパク質のＬＲＭＫ残基と、
ｂ）ＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜26）［配列番号：２］、ＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）［配列番号：３］、ＨＰＶ１６型Ｅ７（9〜22）［配列番号：２０］またはＨＰＶ１６型Ｅ７（10〜22）［配列番号：２１］の連続するアミノ酸配列によってコードされる、ＭＨＣクラスＩＩエピトープと、
を含む、組成物。
【請求項３０】
請求項２９において、前記ＭＨＣクラスＩＩエピトープがＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）［配列番号：３］によってコードされる、組成物。
【請求項３１】
請求項３０において、前記Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＨＰＶ１６型Ｅ７のハイブリッドが、ＨＰＶ２［配列番号：４］、ＨＰＶ３［配列番号：５］およびＨＰＶ４［配列番号：６］からなる群から選択されたものである、組成物。
【請求項３２】
請求項２９から３１のいずれか一項において、前記ハイブリッドペプチドがＨＰＶ４［配列番号：６］である、組成物。
【請求項３３】
請求項２９から３２のいずれか一項において、さらに、ＨＰＶ１６型およびＨＰＶ１８型のＣＴＬエピトープからなる群から選択されたエピトープを含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
子宮頸がんと診断されるケースは毎年４７０，０００にも及ぶ。子宮頸がんのほぼ１００％が高リスク型ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ１６型またはＨＰＶ１８型）に由来しており、これらのウイルスへの子宮頸部の持続感染が、子宮頸がんの必須原因であると考えられている（他種の肛門性器部のがんの９０％もＨＰＶに由来する）。口腔がん、陰茎がんおよび一部の頸部がんについても、ＨＰＶ感染との関連性が疑われている。子宮頸がんなどのＨＰＶ由来のがんの転移後に有効な治療は少なく、そのため、新たに効果的な治療法が早急に望まれている。
【０００２】
ＨＰＶ感染の予防ワクチンはＦＤＡ（米国食品医薬品局）によって既に承認されている：ガーダシル（Ｇａｒｄａｓｉｌ）と呼ばれる、ＨＰＶ６型、ＨＰＶ１１型、ＨＰＶ１６型およびＨＰＶ１８型のＬ１タンパク質をターゲットとするウイルス様粒子は、女性のＨＰＶ感染をほぼ１００％予防する。この種のワクチンは、主に、ウイルスを中和する抗体を発生させる体液性免疫応答を誘導するものである。したがって、ガーダシルは、ＨＰＶ感染を予防するのに有効なワクチンである。しかしながら、この種のワクチンは、ＨＰＶ陽性がんの治療には有効でない。というのも、ＨＰＶ陽性がんを根治するには、ＣＤ４陽性Ｔ細胞免疫およびＣＤ８陽性Ｔ細胞免疫が誘導されなければならないからである。
【０００３】
蓄積されたデータによると、子宮頸がんおよび他種のＨＰＶ陽性がんに対しては、免疫療法が期待できることが分かっている。大半の子宮頸がんおよび他種のＨＰＶ陽性がんにおいてＨＰＶのＥ６遺伝子およびＥ７遺伝子の発現が見出されており、このことから、ＨＰＶ発がん蛋白Ｅ６，Ｅ７が、細胞形質転換の誘導および維持にとって重要な役割を担っていることが分かる。多くのＨＰＶ陽性癌での、これらの遺伝子の特異的な発現からみて、当該遺伝子が免疫療法の有力なターゲットであると予測される。
【０００４】
現在、数種類の治療ワクチンが研究されている：１）Ｅ６遺伝子および／またはＥ７遺伝子を含む組換えアデノウイルスなどのウイルスベクターベースのＤＮＡワクチン：このワクチンの利点は強力な免疫原だということである。短所は安全性およびコストである；２）プラスミドベースのＤＮＡワクチン：利点は、一般的に安全かつ製造コストが経済的だということである。しかし、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でのトランスフェクション率が低いので免疫原性は弱い；３）ペプチドワクチン：利点は、極めて安全かつ経済的だということである。しかし、免疫原性が弱く、かつ、ＨＬＡ拘束性を有する；４）タンパク質ワクチン：安全面が大きな利点である。しかしながら、細胞の免疫誘導能が低い；５）樹状細胞（ＤＣ）ベースのワクチン：Ｅ７蛋白またはＥ６蛋白でパルスした自己樹状細胞の免疫原性は極めて強い。短所は、高コストな点と、接種ごとに必要とされる労働力が膨大な点である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
以上の理由から、安全で効率のよい免疫療法が、ＨＰＶ陽性腫瘍の治療または予防に求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書では、ＨＰＶ用のペプチドワクチンの効率を大幅に増強させる新規かつ非自明の方法も含め、本発明の実施形態を複数紹介する。本発明は、Ｉｉ−ｋｅｙ／ＨＰＶ（Ｉｉ鎖ＨＰＶ）のハイブリッドペプチドや当該ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組成物に関する。また、本発明は、本発明にかかる１種以上の化合物を対象に投与することによってＨＰＶ感染を予防する方法に関する。さらに、本発明は、ＨＰＶ感染が病因の少なくとも一部をなす疾患の治療に関する。このような疾患には、疣贅（またはイボ）や、子宮頸がん、陰茎がん、一部の頸部がんなどの前がん病変、がん病変などが含まれるが、これらに限定されない。本発明の他の構成において、本発明にかかるＨＰＶ配列を含む組成物は、ＨＰＶが病因の少なくとも一部をなす疾患の治療または予防のための、対象に対する予防接種やワクチン接種において有用である。
【０００７】
本発明は、他の構成において、複数のＨＰＶ抗原のＭＨＣクラスＩＩ提示エピトープを含むＤＮＡワクチンやペプチドワクチンの力価を増強させる方法に関する。本発明には、対象の免疫系をＩｉ−Ｋｅｙハイブリッドペプチドで予備刺激し、後に投与されるＤＮＡワクチンまたはペプチドワクチンの力価を増強させることも包含される。Ｉｉ−Ｋｅｙハイブリッド構築物は、Ｉｉ−Ｋｅｙのハイブリッドペプチドをコードする核酸構築物の形態で投与されてもよい。
【０００８】
例えば、Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドの用途として、ワクチンプロトコルでのＨＰＶからの防御のための使用が挙げられるが、これに限定されない。ＨＰＶ由来の高度に保存されたＭＨＣクラスＩＩエピトープとＩｉ−Ｋｅｙとで構成されたハイブリッドタンパク質を用いて、ナイーブＴヘルパー細胞を予備刺激しておくことにより、臨床試験を通過したか、またはｐｒｏｂａｂｌｅな（候補に挙がっている）ＨＰＶ感染の予防・治療用のＨＰＶワクチンに対する免疫応答を増強させることができる。対象の免疫系をこれらのハイブリッドペプチドで予備刺激しておいてから、ＤＮＡワクチンまたはタンパク質ワクチンで追加免疫することにより、ワクチンの投与数が少ない場合でも有効期間を延ばすことができる。あるいは、投与量を減少できるので、安全性が増強する。
【０００９】
本発明は、他の構成において、対象の免疫応答を予備刺激することによってＤＮＡワクチンやペプチドワクチンの力価を増強させる組成物に関する。この組成物は、Ｉｉ−Ｋｅｙタンパク質の４つのアミノ酸残基（ＬＲＭＫ）とＭＨＣクラスＩＩエピトープとで構成されるハイブリッドペプチドであり、前記ＭＨＣクラスＩＩエピトープは、ＨＰＶエピトープであると確実視されているか、その可能性があるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＨＬＡ−ＤＲ４−ｔｇ（トランスジェニック）マウスに対して最も有効なＨＰＶハイブリッドを示すデータのグラフである。ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウス（１グループあたり３匹）に対し、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）（マウスの全体積あたり１００μｌ）に含有された６０ｎモルのペプチドで免疫化した。免疫化から３週間後、脾臓リンパ球を得て、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でエピトープ単独のＨＰＶ１、Ｉｉ−Ｋｅｙハイブリッド（ＨＰＶ１〜ＨＰＶ６；ただし、図にはＨＰＶ１（上図）およびＨＰＶ４（下図）のみを示す）により刺激し、インターフェロンγ分泌について、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法を実施した。ＨＰＶ４で免疫されたマウスの脾臓におけるインターフェロンγ分泌細胞の数は、ＨＰＶ１で免疫されたマウスの脾臓におけるインターフェロンγ分泌細胞の数の約５倍超であった。再現試験（repeat study）でも同様の結果が得られた。
【図２】Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＨＰＶ１６型Ｅ７エピトープの結合性ハイブリッドペプチドと、ＨＰＶ１６型Ｅ７のエピトープを単独で含むペプチドとの比較を示すグラフである。１００万個のＨＬＡ−ＤＲ４陽性Ｈ９細胞を、ＨＰＶ１にＨＡタグを施したペプチドであるＨＰＶ７（○）またはＨＰＶ４にＨＡタグを施したペプチドであるＨＰＶ１７（□）と共に、図示の様々な濃度でインキュベートした。フローサイトメトリーによる解析後、ゲートにかかった細胞のパーセンテージ（百分率）を、ペプチド濃度に対してプロットした。なお、ペプチド処理に曝されなかった細胞の約９８％が外れるよう、ゲーティングの設定をした。
【図３】ＨＰＶ４の投与量に依存する、ＭＨＣクラスＩエピトープに対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の活性の増強を示すグラフである。ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスを、（Ａ）ペプチドなし；（Ｂ）６０ｎモルのＨＰＶ１１（ＨＰＶ１６型Ｅ７（49〜57）すなわちＨ−２Ｄb拘束性のＣＴＬエピトープ）；（Ｃ）６０ｎモルのＨＰＶ１１と１５ｎモルのＨＰＶ４ハイブリッド；（Ｄ）６０ｎモルのＨＰＶ１１と３０ｎモルのＨＰＶ４ハイブリッド；または（Ｅ）６０ｎモルのＨＰＶ１１と６０ｎモルのＨＰＶ４ハイブリッドで免疫化した。いずれのペプチドも、２０μｇのＣｐＧ（シトシン−リン酸−グアニン）（マウス１匹あたり全体積１５０μｌ）と混合した後、不完全フロイントアジュバントで乳化させた。免疫化から３週間後、ＨＰＶ１１に特異的なＣＴＬ活性を、免疫原性ペプチド（ＨＰＶ１１）と高濃度のＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインジアセテート）、または低濃度のＣＦＳＥ単独（ペプチドなし）と共にインキュベートされた細胞を用いて、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）アッセイ法で測定した。等しい個数からなるこれら二種類の細胞集団の混合物を同数用意し、マウスに尾静脈注射した。上図は、ＨＰＶ１１に特異的なＣＴＬ殺傷を、フローサイトメトリーによる式：（１−ＣＦＳＥlow／ＣＦＳＥhigh）を用いて、ＣＦＳＥlow／ＣＦＳＥhighの細胞比で表したものである。下図は、各グループのヒストグラムを示したものである。図示のデータは、脾臓細胞のプールから得たものである（１グループあたりマウス２匹）。
【図４】Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＨＰＶ１６型Ｅ７エピトープのハイブリッドであるＨＰＶ４と、エピトープ単独を含むペプチドであるＨＰＶ１との間の、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での特異的なＣＴＬ活性を支援する能力の比較を示すグラフである。ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスを、（Ａ）ペプチドなし；（Ｂ）６０ｎモルのＨＰＶ１１（ＨＰＶ１６型Ｅ７（49〜57）すなわちＨ−２Ｄb拘束性のＣＴＬエピトープ）；（Ｃ）３０ｎモルのＨＰＶ１と６０ｎモルのＨＰＶ１１；または（Ｄ）３０ｎモルのＨＰＶ４と６０ｎモルのＨＰＶ１１で免疫した。いずれのペプチドも、図３と同様の条件で投与した。免疫化から３週間後、ＨＰＶ１１に特異的なＣＴＬ活性を、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）アッセイ法で測定した（図３を参照）。図示のデータは、プールされた脾臓細胞（グループＡは３匹のマウス、グループＢ、ＣおよびＤはそれぞれ４匹のマウス）から得たものである。上図は、ＨＰＶ１１に特異的なＣＴＬ殺傷を、フローサイトメトリーによる式：（１−ＣＦＳＥlow／ＣＦＳＥhigh）を用いて、ＣＦＳＥlowのＣＦＳＥhighに対する細胞比で表したものである。下図は、各グループのヒストグラムを示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書に開示された、ハイブリッドペプチドを含む組成物およびその使用方法は、従来のペプチドワクチンおよび免疫賦活剤の短所を改善するものである。本発明にかかるハイブリッドペプチドのワクチンは、ＨＰＶエピトープ、Ｉｉ−ｋｅｙペプチド（またはＩｉ−ｋｅｙペプチドの一部または改変物）、およびスペーサーを含む。以降、これをＩｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩのハイブリッド構築物やＩｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩのハイブリッドペプチドと称することがある。本発明にかかる組成物および方法は、Ｉｉ−Ｋｅｙタンパク質とＭＨＣクラスＩＩ分子との相互作用を利用することで、通常の抗原プロセシングの経路をバイパスし、ＭＨＣクラスＩＩ分子結合溝へのＨＰＶの抗原性エピトープの結合を促進させる。その後、抗原が免疫系に提示されることで、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の特異的応答が刺激される。Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩのハイブリッドにより、免疫応答を刺激する力価が増強されるため、低効率のプロセスも許容可能となり、免疫系刺激剤を使用しなくても済む可能性が高まる。
【００１２】
すなわち、本明細書には、ヒトのＨＰＶ感染、およびＨＰＶの存在によって特徴付けられる関連疾患および／または関連がんを治療する組成物ならびに方法が開示されている。また、本明細書には、ＨＰＶ感染を予防する組成物および方法が開示されている。技術分野の欄で述べたように、ＨＰＶ感染が病因の少なくとも一部をなすと考えられているかまたはそうであることが確実とされているがんの種類には、子宮頸がん、陰茎がんなどが含まれる。ＨＰＶ感染が関係する他の疾患には、例えば、疣贅などが含まれる。本発明にかかる方法は、例えば、薬学的に許容可能な担体に含まれたＩｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩのハイブリッド構築物を用意すること、および免疫応答を刺激するのに適した条件下でそのハイブリッド構築物を患者にワクチン接種することを含む。このハイブリッド構築物は、Ｉｉ−Ｋｅｙのハイブリッドペプチドとして投与されてもよいし、Ｉｉ−Ｋｅｙのハイブリッドペプチドをコードする核酸の形態で投与されてもよい。
【００１３】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩのハイブリッドペプチドは、Ｉｉタンパク質のＬＲＭＫ（および／またはその改変物；ＹＲＭＫ）のアミノ酸残基を含んでおり、当該アミノ酸残基は、ＨＰＶの断片を含むＭＨＣクラスＩＩエピトープのＮ末端に直接または間接的に結合されている。Ｉｉ−ｋｅｙの残基とＨＰＶエピトープとの間（スペース）は、約２〜２０個のアミノ酸残基の長さに対応する範囲内の距離で離れているのが望ましいが、必ずしもそうである必要はない。このスペースには、様々なリンカー（またはスペーサー）が含まれてよく、そのようなリンカー（またはスペーサー）には、単純なポリメチレンリンカー（ａｖａ）、ＬＲＭＫのＣ末端から伸長するＩｉの天然由来の配列や、ＨＰＶエピトープのＮ末端から伸長する当該ＨＰＶの天然由来の配列が含まれる。好適なリンカーの他の例およびＩｉ−ｋｅｙのハイブリッドペプチドの他の様々な実施形態は、2007年2月20日付発行の米国特許第7,179,645号明細書および2007年4月17日付発行の米国特許第7,205,274号明細書に記載されており、これらの米国特許の内容は参照をもって本願に取り入れたものとする。上記の方法により、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の応答を刺激することができる。なお、ハイブリッド構築物は、Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＨＰＶのハイブリッドペプチドをコードする核酸の形態で投与されてもよい。前述した選択肢の内容をより明らかにするには、本発明にかかるＩｉ−ｋｅｙのハイブリッドペプチドについて詳細に説明する必要がある。
【００１４】
（リンカー）
【００１５】
本発明にかかるリンカー（またはスペーサー）は、ハイブリッドのＮ末端とＣ末端とを共有結合で結ぶ介在的化学構造であり、直線または略直線的に並べられると最大２０個のアミノ酸の長さにまで伸張する、共有結合原子群の可撓性の鎖である。つまり、本発明にかかるリンカーは、その配列にアミノ酸など（必ずしもアミノ酸でなくてもよい）が含まれる範囲に応じて、リンカーのアミノ酸残基に対して、スペースを占有する役割以上の付加的な機能性（functionality）をもたらす。
【００１６】
上述のリンカーの長さ（直線で最大２０個のアミノ酸の長さ）は、第２の（さらなる）完全なエピトープ、例えば、完全なＭＨＣクラスＩＩエピトープ、完全なＭＨＣクラスＩエピトープ、または完全なＡＲＤ（抗体認識部位または抗原決定基）（antibody-recognized determinant）を含むのに十分な長さである。あるいは、これらのエピトープの一部を含むのに十分な長さである。また、上述のリンカーの長さは、ＭＨＣクラスＩエピトープ、ＭＨＣクラスＩＩエピトープおよびＡＲＤからなる群から選択される複数のエピトープを互いに重複せずに含むことができる。
【００１７】
上記の介在的化学構造が１つ以上のエピトープ／抗原決定基を含む場合、その全体の長さは、所定の範囲内には落ち着くものの、当該エピトープ／抗原決定基が何であるかによって大きく影響される。上記の介在的化学構造が抗原としてニュートラル（実質的に抗体を生じさせないという意味）である場合については、米国特許出願第09/396,813号（現在の米国特許第6,432,409号）明細書を参照されたい。同文献の全内容は、参照をもって本明細書に取り入れたものとする。同文献に記載されているように、例えば、抗原としてニュートラルであるスペーサーは、直線で９個よりも短いアミノ酸長の主鎖ペプチドであるのが好ましい。最も好適なのは、スペーサーが、直線で４〜６個のアミノ酸長の主鎖ペプチドである場合である。好ましくは、スペーサーは、ハイブリッドペプチドを増強させる他の構成成分に対して、空間的（立体的）に顕著な変化を伴う水素結合を形成しないものである。
【００１８】
抗原としてニュートラルなスペーサーのスペーサー領域には、アミノ酸の代わりに様々な種類の化学基が含まれていてもよい。その例は、米国特許第5,910,300号明細書に記載されており、その内容は、参照をもって本明細書に取り入れたものとする。好ましい一実施形態において、スペーサーは、ヘテロ原子が適度に介在した脂肪族鎖で構成されており、例えば、Ｃ2〜Ｃ6アルキレン、すなわち、＝Ｎ−（ＣＨ2）2〜6−Ｎ＝などが挙げられる。あるいは、スペーサーは、疎水性配列、親油性配列、脂肪族配列、芳香族−脂肪族配列などの単位が交互に並び、Ｏ、Ｎ、Ｓなどのヘテロ原子が適度に介在したものである。このようなスペーサーの好ましい構成成分は、以下の種類の化合物から選択される：ステロール類、アルキルアルコール類、様々なアルキル基を有するポリグリセリド、アルキル−フェノール類、アルキル−アミン類、アミド類、疎水性ポリオキシアルキレンなど。他の例として、疎水性ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリヒドロキシ酸、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリヒドロキシ酪酸などが挙げられる。スペーサーは、酸素原子によって互いに隔てられた、短い脂肪族鎖の繰り返し単位、例えば、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレン、ペンタメチレンなどを含むものであってもよい。また、リンカーは、例えば、メチレン基（−ＣＨ2−）の繰り返し単位で構成されたものであってもよい。
【００１９】
また、スペーサー中に使用可能なペプチド配列は、米国特許第5,856,456号に記載されている。この米国特許の内容は、参照をもって本明細書に取り入れたものとする。一実施形態において、スペーサーは、内部で切断される化学基を含む。このような化学基は、プロテアーゼ、所定の化学基、または触媒活性を有するモノクローナル抗体によって、切断が触媒されるものであってもよいが、必ずしもこれらに限定されない。プロテアーゼ感受性を有する化学基の場合、トリプシンターゲット（カチオン性の側鎖を有する２種類のアミノ酸）、キモトリプシンターゲット（疎水性の側鎖を有するアミノ酸）、およびカテプシン（Ｂ、ＤまたはＳ）に感受性を示すものが好適である。本明細書において「トリプシンターゲット」とは、トリプシンやトリプシン様酵素によって認識されるアミノ酸配列を指す。本明細書において「キモトリプシンターゲット」とは、キモトリプシンやキモトリプシン様酵素によって認識されるアミノ酸配列を指す。また、触媒活性を有するモノクローナル抗体の化学的ターゲットや化学的に切断可能なその他の化学基は、ペプチド合成、酵素触媒、および有機化学一般の分野における当業者にとって周知であり、通常の実験的方法を用いて合成したり、ハイブリッド構造体に組み込んだりすることができる。
【００２０】
ただし、本発明の全ての実施形態に、免疫原性がニュートラルである介在的化学構造またはスペーサーが含まれるわけではないことに留意されたい。すなわち、本発明には、前記介在的化学構造またはスペーサーが：１）ＭＨＣクラスＩエピトープまたはその一部；および２）抗体認識決定基またはその一部；からなる群から選択される実施形態も含まれる。
【００２１】
本発明にかかるＩｉ−ｋｅｙのハイブリッドでは、全体的にペプチド様の性質を有するものから、実質的に非ペプチドの性質の部分を含むものまで、様々なスペーサーを含んでいてもよい。ホモログの中には、ペプチド様の性質を著しく低下させたものまたは実質的に非ペプチド性のものがあることを考えると、このようなホモログは、好適な特性、例えば、細胞膜内への侵入、可溶性、耐タンパク質分解性、抱合による不活性化に対する耐性、経口バイオアベイラビリティ、長いインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での半減期などを有する傾向が強い。
【００２２】
好適なスペーサーは、１つ以上の単純なポリメチレンリンカー（ａｖａ）を有する。
【００２３】
幾つかの理由から、出来るだけ短い配列（または長さ）が好ましい。そのような理由には、合成の単純性、合成コスト、タンパク質分解可能性の低さ、クリアランスや吸着につながる代謝変化可能性の低さなどが含まれる。よって、リンカーは、複数のエピトープが互いに重複するものであってもよい（すなわち、あるアミノ酸残基が、複数のエピトープの一構成成分であってもよい）。同様に、本発明にかかるＨＰＶペプチドが含まれたＣ末端領域に、複数のエピトープ（ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩまたはＡＲＤ）が、互いに重複してまたは互いに重複せずに含まれていてもよい。
【００２４】
本発明にかかるＩｉ−ｋｅｙのハイブリッドペプチド内の各種構成領域間の境界は、所定の範囲内に収まるものの、やや曖昧である。各種構成領域間の接合部をまたいで延在するエピトープも、本発明の範囲に包含される。つまり、例えば、あるエピトープの一部が、増強を達成するハイブリッドペプチド内の複数の構成要素またはドメイン（例えば、リンカー領域）のうちの１つに含まれている、と請求項に記載されている場合、これは当然、そのエピトープの残りの部分が、隣接するフランキング部位またはフランキング領域に含まれていることを意味している。パーシャル（partial）エピトープ（すなわち、非機能性（non-functional）のエピトープ）に関しては、本発明では、スペースを占有する役割以外に有用性はないだろう。
【００２５】
機能性を備えた（functional）ＭＨＣクラスＩエピトープ、ＭＨＣクラスＩＩエピトープおよびＡＲＤは、互いに重複していても、それぞれの提示エピトープの完全な機能性（functionality）を維持していることが知られている。ただし、ハイブリッド内の各エピトープの機能（function）は、同一のペプチドにおいて同時に発現することはできない。というのも、ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合しており、折り畳み構造の状態で、抗体による認識を受けるからである。しかしながら、投与（例えば、注射）されるペプチドの一群に、それぞれのペプチドをプロセシングするＭＨＣ分子および／またはそれぞれのペプチドと細胞表面で結合するＭＨＣ分子が与えられた場合、促進性Ｉｉ−Ｋｅｙのハイブリッドペプチド内の三種類のいずれのエピトープも、免疫された動物内において効果的な抗原となることができる。
【００２６】
（Ｉｉ−Ｋｅｙペプチド）
【００２７】
この分野での初期の研究では、哺乳類のＩｉ−ｋｅｙペプチド：ＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号：９）およびその改変物：ＹＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号：１０）に、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性の幾つかの抗原性ペプチドの、当該抗原性ペプチドを認識するＴ細胞ハイブリドーマへの提示に変化を引き起こす能力があることを証明した（米国特許第5,559,028号明細書；米国特許第5,919,639号明細書；これら米国特許の開示内容は、参照をもって本明細書に取り入れたものとする）。Ｉｉ−ｋｅｙのペプチドの改変バージョンを用いた過去の実験によると、Ｉｉ−ｋｅｙポリペプチドに対し、その活性に悪影響を及ぼすことなく様々な変更または改変が可能であることが分かっている。事実、そのような変更または改変により、当該ポリペプチドの抗原提示能が増強した事例が多く存在する。
【００２８】
米国特許出願第09/396,813号（現在の米国特許第6,432,409号）明細書（その内容は、参照をもって本願に取り入れたものとする）の実施例に詳述された結果は、Ｉｉ−ｋｅｙペプチドの、抗原提示促進活性を有するどのような改変物も、適切に組み込まれると本発明のハイブリッドペプチドの促進性に関して適切に機能することを示唆している。Ｉｉ−ｋｅｙペプチドの改変には、Ｃ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失、Ｎ末端の保護、アミノ酸の置換や、環状ペプチドの挿入などが含まれる。Ｉｉ−ｋｅｙのペプチドの欠失物であっても、少なくとも元来の配列からの４つの連続するアミノ酸（ＬＲＭＫ）またはその置換バージョン（ＹＲＭＫ）が残っていれば、機能活性（functional activity）を示す。また、各残基部は、様々な天然由来または非天然由来のアミノ酸で置換されていてもよい。置換に使用可能な分子の例として、ペプチド模倣構造体、Ｄ−異性体アミノ酸、Ｎ−メチル化アミノ酸、Ｌ−異性体アミノ酸、修飾Ｌ−異性体アミノ酸、環誘導体などが含まれる。また、創薬化学の当業者であれば、当該技術分野の技法を通常の実験法で適用することにより、ハイブリッドのＮ末端領域の他の改変物を得ることができる。このような技法の例として、合理的ドラッグデザイン、Ｘ線回折データや核磁気共鳴データ（およびその他の算出法（computational methods））からの構造的情報に基づく分子モデリング、コンビナトリアル化学合成生成物のスクリーニング、天然物の単離などが挙げられる。Ｉｉ−ｋｅｙペプチドにおいて、高い抗原提示促進活性を有することが知られている改変バージョンの例として、ＬＲＭＫ（配列番号：１１）、ＬＲＭＫＬＰＫ（配列番号：１５）、ＬＲＭＫＬＰＫＳ（配列番号：１６）、ＬＲＭＫＬＰＫＳＡＫＰ（配列番号１７）、ＬＲＭＫＬＰＫＳＡＫＰＶＳＫ（配列番号：１８）などが挙げられる。Ｉｉ−ｋｅｙペプチドの他の改変物および改変バージョンは、米国特許第5,919,639号明細書および米国特許第5,559,028号明細書（これら米国特許の全内容は、参照をもって本明細書に取り入れたものとする）に記載されている。Ｉｉ−ｋｅｙペプチドの、抗原提示促進活性があることが知られている改変バージョン（ＹＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号：１０））は、以降、「Ｉｉ−ｋｅｙのホモログ」と称する。本明細書において「Ｉｉ−ｋｅｙのホモログ」という用語は、Ｉｉ−ｋｅｙペプチド自体も包含する。
【００２９】
これらのようなＩｉ−Ｋｅｙペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合部位の端部に位置するアロステリック部位に結合することが、幾つかの実験法で証明されている（Xu, M., Arneimittelforschung. 1999 49:791 9を参照）。このアロステリック部位に対する結合プロセスにより、細胞表面のＭＨＣクラスＩＩ分子への、内因性結合抗原性ペプチドの放出および交換が促進される。
【００３０】
Ｉｉ−Ｋｅｙペプチドのホモログは、マウスまたはヒトのＭＨＣクラスＩＩ分子に作用することで、結合状態の抗原性ペプチドの放出、およびこの抗原性ペプチドと合成ペプチドとの交換を促進する（Adams, S., Arneimittelforschung. 1997 47:1069 1077; Xu, M., Arneimittelforschung. 1999 49:791 9を参照）。単純なポリメチレンリンカーまたはＩｉタンパク質の天然由来の配列の伸長物を介して抗原性エピトープペプチドに結合したＩｉ−Ｋｅｙペプチドのハイブリッド構築物は、抗原性ペプチド単独と比べて、５００〜２０００倍の提示能力を有する（Humphreys, R. E., Vaccine. 2000 18:2693 2697を参照）。この特性は、本明細書で述べるように、様々な疾患および健康状態の診断、治療モニタリングおよび治療にとって臨床的に有用である。Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープのハイブリッドにおけるＩｉ−Ｋｅｙ部位の活性は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｏｒｏ）でもインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でも見受けられる。この活性は、細胞表面のＭＨＣクラスＩＩ分子と当該Ｉｉ−Ｋｅｙ部位との相互作用に起因するものと考えられる。というのも、Ｉｉ−Ｋｅｙ化合物のインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での活性が、生きた抗原提示細胞およびパラホルムアルデヒド固定された抗原提示細胞のいずれにも見受けられるからである（Adams, S., Eur J. Immunol. 1995 25: 1693 1702）。ただし、この化合物はインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）では有効（ｐｏｔｅｎｔ）とされているので、外来抗原を処理する経路に取り込まれることにより、ポストゴルジすなわち抗原をチャージする区画（antigen charging compartment）でＭＨＣクラスＩＩ分子と結合する可能性がある。
【００３１】
（ＨＰＶエピトープ）
【００３２】
本発明は、特定のＨＰＶエピトープやＨＰＶエピトープ含有ペプチドに限定されないが、本発明にかかるＨＰＶエピトープの例（それ単独で有用、またはエピトープ含有ペプチドの形態で有用なもの）には、ペプチド：ｍｈｇｄｔｐｔｌｈｅｙｍｌｄｌｑｐｅｔｔｄｌｙｃｙｅｑｌｎｄ（配列番号：１）内の、ＭＨＣクラスＩＩエピトープであるＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜26）（配列番号：２）、ＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）（配列番号：３）、ＨＰＶ１６型Ｅ７（9〜22）（配列番号：２０）、ＨＰＶ１６型Ｅ７（10〜22）（配列番号：２１）、ＨＰＶ１６型Ｅ７（11〜22）（配列番号：２２）、ＨＰＶ１６型Ｅ７（11〜20）（配列番号：２３）などが含まれる。また、本発明は、ＨＰＶ１６型Ｅ７のハイブリッドに限定されない。本発明の他の構成では、ＭＨＣクラスＩエピトープおよびＭＨＣクラスＩＩエピトープである、ＨＰＶ１６型の他のエピトープ、およびＨＰＶ１８型のエピトープも使用可能である。本発明のさらに他の構成では、本発明にかかるワクチンおよび／またはＩｉ−ｋｅｙのハイブリッドにＨＰＶ１６型のエピトープおよびＨＰＶ１８型のエピトープの一方または両方が使用可能であり、また、これらのエピトープは同時投与または併用投与されてもよい。
【００３３】
本発明にかかる方法は、Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＨＰＶのハイブリッド構築物を患者にワクチン接種することを含み、これにより、特定のＨＰＶエピトープに特異的なＣＤ４陽性Ｔ細胞応答が引き起こされたり増強したりする。後述の実施例に示すＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法の結果から分かるように、ネイティブなＨＰＶペプチドに比べて、本発明のＨＰＶペプチドに対するＣＤ４陽性Ｔ細胞応答が増強している。また、ワクチンは、ＭＨＣクラスＩエピトープを含み、任意で、ＭＨＣクラスＩＩエピトープを含むものであってもよい。
【００３４】
一実施形態において、本発明は、ペプチド：ｍｈｇｄｔｐｔｌｈｅｙｍｌｄｌｑｐｅｔｔｄｌｙｃｙｅｑｌｎｄ（配列番号：１）内の、ＭＨＣクラスＩＩエピトープの形態のＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜26）（配列番号：２）、ＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）（配列番号：３）、またはその他のエピトープを含む化合物を、患者にワクチン接種もしくは投与すること、またはこの化合物と同一のアミノ酸配列をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡを患者にワクチン接種することを含む。なお、ここで、化合物は、Ｉｉ−ｋｅｙハイブリッドでない。一般的に、このアミノ酸配列をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡは、効率的なＤＮＡの転写および／またはＲＮＡの翻訳を行うのに必要な、当業者にとって既知のプロモーター、イニシエーターなどと作用可能に連結（リンク）されていてもよい。例えば、Sambrook達による HYPERLINK "http://www.MolecularCloning.com" www.MolecularCloning.comを参照されたい。同様に、本発明にかかるＩｉ−ｋｅｙ／ＨＰＶのハイブリッドは、当該ハイブリッドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡとして投与されるものであってもよく、かつ、当該ＤＮＡまたはＲＮＡは、一般的に、必要なプロモーター、イニシエーターなどに作用可能に連結（リンク）されていてもよい。
【００３５】
（Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＨＰＶのハイブリッドおよびその使用）
本発明にかかる方法は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープがＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜26）（配列番号：２）および／またはＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）（配列番号：３）である、Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩのハイブリッド構築物を含む化合物を、患者にワクチン接種または投与することを含む。
【００３６】
他の実施形態において、本発明は、ＨＰＶ感染の治療もしくは予防、および／またはＨＰＶ感染によって引き起こされたかまたはＨＰＶ感染によって悪化した疾患の治療もしくは予防に用いられる、ＭＨＣクラスＩＩエピトープ（配列番号：２および／または配列番号：３）を含むハイブリッド構築物、または薬学的に許容可能な担体に含まれた前記Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩのハイブリッド構築物を有する医薬組成物を提供する。このＩｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩのハイブリッド構築物は、配列番号：２または配列番号：３のＭＨＣクラスＩＩエピトープのＮ末端に連結されたＩｉタンパク質のＬＲＭＫ残基を含む。ＬＲＭＫ残基とＭＨＣクラスＩＩエピトープとの間（スペース）は、約２〜２０個のアミノ酸残基の長さに相当する距離で離れているのが望ましい。このスペースには、様々なリンカーが含まれてもよく、そのようなリンカーには、単純なポリメチレンリンカー（ａｖａ）、ＩｉのＬＲＭＫのＣ末端から伸長した天然由来の配列や、ＭＨＣクラスＩＩエピトープのＮ末端から延びる、ＨＰＶの天然由来の配列が含まれる。前記Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩのハイブリッド構築物は、同一のハイブリッドペプチドをコードするＤＮＡも含んでいてもよい。詳細には、本発明は、ハイブリッド構築物のＭＨＣクラスＩＩエピトープがペプチド：ｍｈｇｄｔｐｔｌｈｅｙｍｌｄｌｑｐｅｔｔｄｌｙｃｙｅｑｌｎｄ（配列番号：１）に含まれるものである組成物も包含する。本発明にかかる組成物は、後述の表２に示された任意の配列を有するアミノ酸配列またはそれをコードするＤＮＡを有するハイブリッド構築物を含む。後述の実施例でのＥＬＩＳＰＯＴ法の結果によると、Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＨＰＶのハイブリッド構築物をワクチン接種されたマウス被験体（対象）では、ネイティブなＨＰＶペプチドに比べて、ＣＤ４陽性Ｔ細胞応答が増強する。
【００３７】
本発明にかかる抗原提示能力が増強しているハイブリッドの生成に使用するために選択された上記のようなエピトープ／抗原決定基は、さらに改変されてもよい。すなわち、本明細書に開示された、増強ハイブリッドのエピトープ／抗原決定基は、天然ポリペプチド、その配列の改変物、ペプチド模倣構造体、および非天然由来のアミノ酸またはアミノ酸の改変物である化学構造を含んでもよい。また、増強ハイブリッドの抗原性エピトープ／抗原決定基に対し、様々な化学的な改変または変更を施してもよい。例えば、抗原性エピトープ／抗原決定基の結合特異性が維持される範囲で、非天然由来のアミノ酸の全体もしくは一部、または他の主鎖部位もしくは側鎖部位を組み込んでもよい。このような化学構造は、天然由来のタンパク質配列から導き出された抗原性ペプチドに比べて構造的類似性を少ししか持たないか、ほぼ持たないか、または全く持たない。また、このような改変または変更は、Ｔ細胞受容体による認識に影響を及ぼさない。改変または変更によっては、抗原性エピトープの認識を増強させる可能性も考えられる（例えば、改変または変更前は認識を行わなかったＴ細胞受容体のサブセットが、認識を行うようになる可能性がある）。
【００３８】
本発明は、さらに、ＨＰＶ感染の治療もしくは予防、および／またはＨＰＶ感染によって引き起こされたかまたはＨＰＶ感染によって悪化した疾患の治療もしくは予防に用いられる、アジュバントと、ＭＨＣクラスＩＩエピトープまたはＩｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩのハイブリッド構築物とを有し、薬学的に許容可能な担体に含まれた医薬組成物を提供する。このＩｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩのハイブリッド構築物は、ＨＰＶの断片を含むＭＨＣクラスＩＩエピトープのＮ末端に連結された、Ｉｉ−Ｋｅｙタンパク質のＬＲＭＫ残基を含む。前記構築物は、これと同一のハイブリッドペプチドをコードするＤＮＡを含むものであってもよい。この組成物は、アジュバントＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子）を含むものであってもよいが、これに限定されない。
【００３９】
ＣＤ４陽性Ｔヘルパー細胞は、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性化および維持に重要な役割を担っている。そのため、抗原特異的なＣＤ４陽性Ｔ細胞の活性化は、ワクチンデザインにとって重要である。ＨＰＶ陽性がんの効果的な治療ワクチンは、安全で経済的に製造でき、かつ、効率的であるのが望ましいが、ペプチドワクチンの場合、安全で経済的に製造可能である。本発明の一実施形態は、ペプチドワクチンの効率を大幅に増強させる新規的かつ進歩的な技術に関する。Ｉｉ−Ｋｅｙの機能基（functional group）であるＬＲＭＫをポリメチレンリンカーを介してＭＨＣクラスＩＩエピトープにリンクすることにより、実施例の双方のマウスモデルにおいて、そのエピトープに対するＣＤ４陽性Ｔ細胞応答の大幅な増強が達成され、かつ、臨床試験においても同様の活性が見受けられた。
【００４０】
後述の実施例では、Ｉｉ−Ｋｅｙのハイブリッド技術を用いて、ＨＰＶ陽性がんの効果的なペプチド免疫療法を実現した。すなわち、ＨＬＡ−ＤＲ拘束性の有効なＨＰＶ１６型のＥ７エピトープ：ＨＰＶ１６型（8〜22）を決定した。ＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）について、Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）のハイブリッドのホモログシリーズ（複数のホモログ）を合成し、スペーサーの長さが、ＨＰＶ１６型のＥ７（8〜22）に特異的なＣＤ４陽性Ｔリンパ球の応答に与える影響を試験した。ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスを、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中に含まれている状態で、Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）のハイブリッド、ＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）エピトープのみを含んだペプチド（ＨＬＡ−Ａ２拘束性のＣＴＬエピトープ）、およびＨＰＶ１６型Ｅ７（１１−２０）エピトープのみを含んだペプチド（ＨＬＡ−Ａ２拘束性のＣＴＬエピトープ）で免疫化した。ＩＦＮ−γ（インターフェロン−ガンマ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法で測定したところ、Ｉｉ−Ｋｅｙのハイブリッドは、ＥＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）エピトープのみを含んだペプチドに比べて、ＨＬＡ−ＤＲ４モデル系におけるＣＤ４陽性Ｔ細胞活性能が５倍増強した。したがって、Ｉｉ−Ｋｅｙのハイブリッドは、子宮頸がんやＨＰＶ感染に関連する他の種類のがんも含め、ＨＰＶ１６型陽性がんに対する、安全、シンプルかつ効果的なＨＰＶペプチド免疫療法を提供する。
【００４１】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩのハイブリッドワクチンは、抗原特異的なＣＤ４陽性Ｔ細胞刺激を長期にわたって誘導することができる。Ｉｉ−ＫｅｙとのハイブリダイゼーションによりもたらされるＴヘルパー細胞の活性能の増強は、ペプチドワクチンのデザインにとって重要な進歩である。さらに、上述のようなＴヘルパー細胞の抗原特異的な刺激メカニズムでは、Ｉｉ−Ｋｅｙのハイブリッドの技術を、他の方法（例えば、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）（ＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇ社製；米国ペンシルバニア州キングオブプラシャ））と共に使用することができる。これにより、ＭＨＣクラスＩＩワクチンペプチドの力価をさらに増強させることができる。
【００４２】
当業者であれば、ハイブリッド構築物を有する組成物を、Ｉｉ−Ｋｅｙのハイブリッドペプチドの形態で投与してもよいし、アミノ酸ベースの、Ｉｉ−Ｋｅｙのハイブリッドペプチドをコードする核酸構築物として投与してもよいことを理解できるであろう。当業者であれば、通常の実験法を用いて、ハイブリッドペプチド内の残基を様々な天然由来のアミノ酸または非天然由来のアミノ酸に置換することができる。置換に利用可能な分子の例として、ペプチド模倣構造体、Ｄ異性体アミノ酸、Ｍメチル化アミノ酸、Ｌ異性体アミノ酸、修飾Ｌ−異性体アミノ酸、環誘導体などが挙げられる。
【００４３】
（共刺激）
【００４４】
一構成において、本発明は、対象内の病原体に対するワクチンの力価を増強させる方法に関する。この方法では、ワクチンが用意される。ワクチンは、例えば、従来の加熱死滅されたウイルスまたは化学的に不活性化されたウイルスを含むことができる。あるいは、ワクチンは、病原体から単離されたタンパク質またはタンパク質の断片を含むものであってもよい。ワクチンは、ＤＮＡ組換え技術で生成されたペプチドもしくはタンパク質、または合成ペプチドを含むものであってもよい。本発明は、ウイルスまたは細菌といった病原体に対するワクチンの力価を増強させる方法を包含する。詳細には、本発明は、病原体がＨＰＶ１６型Ｅ７株を含むＨＰＶウイルスである方法を包含する。ワクチンの限られた供給量で出来るだけ多くの個人を免疫できるように、および／または副作用を最小限に抑えるようにしながら、ワクチンの力価を増強させるのが望ましい。
【００４５】
本明細書に開示した結果は、ワクチンを投与する前にＩｉ−ｋｅｙのハイブリッド構築物を用いて対象の免疫系を予備刺激することにより、予備刺激しなかった場合に比べてワクチンの力価が驚くべきほど効果的に増強することを証明している。Ｉｉ−ｋｅｙの配列は既述のとおりである。本発明において使用されるＩｉ−ｋｅｙ構築物は、少なくとも、Ｉｉ−ｋｅｙ配列のＬＲＭＫ残基が、前述のハイブリッド構築物内のＭＨＣクラスＩＩエピトープにリンカーを介して接続されたものであってもよい。リンカーは、免疫応答を最大限に増強させるサイズで、Ｉｉ−ｋｅｙ領域とＭＨＣクラスＩＩエピトープとの間のスペースを占める。一般的に、このスペーサー（またはリンカー）は、Ｉｉ−ｋｅｙ領域とＭＨＣクラスＩＩエピトープとの間で約１５〜２５個のアミノ酸残基のアミノ酸配列により提供されるのに相当するスペースを占める。このリンカーは、必ずしもアミノ酸で構成される必要はない。ただし、リンカーがアミノ酸で構成されている場合、ハイブリッド構築物の製造は容易になる。前述のとおり、アミノ酸のリンカー部位の代替物については先行技術を参照されたい。
【００４６】
対象の免疫系は、前述したタイプのＩｉ−ｋｅｙ構築物を用いて予備刺激される。一般的に、Ｉｉ−ｋｅｙのハイブリッド構築物は、注射用に製剤化される。この製剤は、生理学的に適合可能なバッファーと、任意で、アジュバントとを含む。数多くのアジュバントが当該技術分野において知られており、どのアジュバントを選ぶかは、日常的な実験事項である。典型的には、Ｉｉ−ｋｅｙ構築物製剤の投与は、筋肉注射または皮下注射によって行われる。
【００４７】
生物には、Ｉｉ−ｋｅｙのハイブリッドの投与に対して当該生物の免疫系が応答を生じる十分な時間を経た後、ワクチン組成物が投与される。典型的に、ワクチン組成物は、Ｉｉ−ｋｅｙ製剤と同様に、生理学的に適合可能なバッファー及び、任意で加えられるアジュバントが投与される。他の構成では、Ｉｉ−ｋｅｙのハイブリッドが、Ｉｉ−ｋｅｙのハイブリッドを用いた予備刺激後のワクチンとして使用される。そのＩｉ−ｋｅｙのハイブリッドは、免疫応答を予備刺激するのに用いられたものと同一のハイブリッドであってもよいし、そうでなくてもよい。後述する結果によると、Ｉｉ−ｋｅｙのハイブリッド構築物を用いた予備刺激後、ＨＰＶワクチン組成物の力価は、著しい増強を示している。これらの結果は、後述の実施例で詳細に説明する。また、予備刺激用のＩｉ−ｋｅｙのハイブリッドと、ワクチン組成物とを、共投与してもよい（すなわち、同時投与または共刺激してもよい）。
【００４８】
当業者であれば、Ｉｉ−ｋｅｙのハイブリッド構築物およびワクチン組成物のいずれも、それぞれ、Ｉｉ−ｋｅｙ構築物をコードする核酸構築物の形態、アミノ酸ベースのワクチンをコードする核酸構築物の形態で投与されてよいことを理解できるであろう。ＤＮＡワクチンは、対象のコドン選択性（codon preference）と合致するように最適化されたコドンであってもよい。ＤＮＡ構築物がコードされた生成物を用いて免疫応答を刺激するために、ＤＮＡ構築物を投与する方法、およびそのような構築物に関する文献は豊富に存在する。そのような構築物の多くはウイルスベースであるが、機械的な導入法（例えば、遺伝子銃技術など）を利用してもよい。
【００４９】
以上のように本発明を説明したが、当業者にとって、本発明の精神または範囲を逸脱することなく種々の変形または変更が可能であることは明白である。
また、本発明は、以下の態様を含んでいてもよい。
［態様１］
Ｉｉ−ｋｅｙ部位およびＨＰＶ１６型Ｅ７部位から本質的に構成されるハイブリッドペプチドを含む組成物であって、
前記Ｉｉ−ｋｅｙ部位は、ＬＲＭＫ（アミノ酸1〜4）残基［配列番号：９］およびこれに連続する０〜１２個の残基から本質的に構成され、
前記ＨＰＶ１６型Ｅ７部位は、配列番号：１に含まれるＨＰＶ１６型Ｅ７の連続するアミノ酸８個以上の配列から本質的に構成され、
前記Ｉｉ−ｋｅｙ部位と前記ＨＰＶ１６型Ｅ７部位とが、約２０個以下のアミノ酸の長さのスペーサーで接続されている、組成物。
［態様２］
ＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜26）ペプチド［配列番号：２］からなるアミノ酸を含む組成物。
［態様３］
ＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）ペプチド［配列番号：３］からなるアミノ酸を含む組成物。
［態様４］
態様１において、前記ＨＰＶ１６型Ｅ７部位がＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）［配列番号：３］である、組成物。
［態様５］
態様１において、前記ＨＰＶ１６型Ｅ７部位が、ＨＰＶ２、ＨＰＶ３およびＨＰＶ４からなる群から選択されたものである、組成物。
［態様６］
態様１において、前記ＨＰＶ１６型Ｅ７部位がＨＰＶ４である、組成物。
［態様７］
態様１において、前記ハイブリッドペプチドが、さらに、薬学的に許容可能な担体を含む、組成物。
［態様８］
態様１に記載のＩｉ−ｋｅｙ／ＨＰＶ１６型Ｅ７のハイブリッドペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、組成物。
［態様９］
態様１において、前記スペーサーがポリメチレンリンカー（ａｖａ）である、組成物。
［態様１０］
免疫応答を刺激する方法であって、
Ｉｉ−ｋｅｙ／ＨＰＶ１６型Ｅ７のハイブリッドペプチドを対象に投与すること、またはＩｉ−ｋｅｙ／ＨＰＶ１６型Ｅ７のハイブリッドペプチドが対象に投与されるようにすること、
を含み、
前記ハイブリッドペプチドは、Ｉｉ−ｋｅｙ部位およびＨＰＶ１６型Ｅ７部位から本質的に構成され、
前記Ｉｉ−ｋｅｙ部位は、ＬＲＭＫ（アミノ酸1〜4）残基［配列番号：９］およびこれに連続する０〜１２個の残基から本質的に構成され、
前記ＨＰＶ１６型Ｅ７部位は、配列番号：１に含まれるＨＰＶ１６型Ｅ７の連続するアミノ酸８個以上の配列から本質的に構成され、
前記Ｉｉ−ｋｅｙ部位と前記ＨＰＶ１６型Ｅ７部位とが、約２０個以下のアミノ酸の長さのスペーサーで接続されている、免疫応答刺激方法。
［態様１１］
免疫応答を刺激する方法であって、
ＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）［配列番号：３］から本質的に構成されるアミノ酸配列を含む組成物を対象に投与すること、またはＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）［配列番号：３］から本質的に構成されるアミノ酸配列を含む組成物が対象に投与されるようにすること、
を含む、免疫応答刺激方法。
［態様１２］
態様１０において、前記ＨＰＶ１６型Ｅ７部位がＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）［配列番号：３］である、免疫応答刺激方法。
［態様１３］
態様１０において、前記ＨＰＶ１６型Ｅ７部位がＨＰＶ２、ＨＰＶ３およびＨＰＶ４からなる群から選択されたものである、免疫応答刺激方法。
［態様１４］
態様１０において、前記ハイブリッドペプチドがＨＰＶ４である、免疫応答刺激方法。
［態様１５］
態様１０において、前記組成物が、さらに、薬学的に許容可能な担体を有する、免疫応答刺激方法。
［態様１６］
態様１０において、前記スペーサーがポリメチレンリンカー（ａｖａ）である、免疫応答刺激方法。
［態様１７］
態様１０において、前記Ｉｉ−ｋｅｙ／ＨＰＶ１６型Ｅ７のハイブリッドペプチドが核酸によってコードされており、当該核酸が前記対象に投与される、免疫応答刺激方法。
［態様１８］
対象内のＨＰＶ病原体に対するワクチンの力価を増強させる方法であって、
ａ）ＨＰＶ１６型およびＨＰＶ１８型からなる群から選択されたＭＨＣＩＩクラスエピトープを有するペプチドを含むワクチンを用意するステップと、
ｂ）ｉ）Ｉｉ−ｋｅｙタンパク質のＬＲＭＫ残基およびｉｉ）前記ａ）ステップのＭＨＣクラスＩＩのエピトープ含有ペプチドを含む、Ｉｉ−ｋｅｙハイブリッド構築物を用意するステップと、
ｃ）前記対象の免疫応答を刺激するのに適した条件下で、前記ｂ）ステップのＩｉ−ｋｅｙ構築物を投与し、当該対象の免疫系を予備刺激するステップと、
ｄ）前記ｃ）ステップの免疫応答をブーストするのに適した条件下で、前記ａ）のワクチンまたは前記ｃ）ステップのハイブリッドを投与することにより、前記予備刺激を行わない場合よりも免疫応答の力価を増強させるステップと、
を含む、ワクチン力価増強方法。
［態様１９］
態様１８において、前記ＨＰＶエピトープ含有ペプチドが、ＨＰＶ１６型Ｅ７のエピトープ含有ペプチドである、ワクチン力価増強方法。
［態様２０］
態様１９において、前記ＨＰＶ１６型Ｅ７のエピトープ含有ペプチドが、ＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）［配列番号：３］である、ワクチン力価増強方法。
［態様２１］
態様１９において、前記ＨＰＶ１６型Ｅ７が、ＨＰＶ２、ＨＰＶ３およびＨＰＶ４からなる群から選択されたものである、ワクチン力価増強方法。
［態様２２］
態様１８において、前記ハイブリッドペプチドがＨＰＶ４である、ワクチン力価増強方法。
［態様２３］
態様１８において、前記組成物が、さらに、薬学的に許容可能な担体を有する、ワクチン力価増強方法。
［態様２４］
態様１８において、前記スペーサーがポリメチレンリンカー（ａｖａ）である、ワクチン力価増強方法。
［態様２５］
態様１８において、前記Ｉｉ−ｋｅｙ／ＨＰＶ１６型Ｅ７のハイブリッドペプチドが核酸によってコードされており、当該核酸が前記対象に投与される、ワクチン力価増強方法。
［態様２６］
態様１８において、前記ワクチンが、前記ａ）ステップおよび前記ｂ）ステップのペプチドをコードするＤＮＡワクチンであり、かつ、そのコドン使用頻度が前記対象のコドン選択性と合致するように最適化されている、ワクチン力価増強方法。
［態様２７］
態様１８において、前記ａ）ステップのエピトープと前記ｂ）ステップのＩｉ−ｋｅｙハイブリッドが共免疫される、ワクチン力価増強方法。
［態様２８］
態様１８において、前記ワクチンが、さらに、ＭＨＣクラスＩのＣＴＬエピトープを含む、ワクチン力価増強方法。
［態様２９］
標的のＨＰＶに対する免疫応答を引き起こすための組成物であって、
薬学的に許容可能な担体に含まれたＩｉ−ｋｅｙのハイブリッドペプチドを有し、
前記Ｉｉ−ｋｅｙのハイブリッドペプチドは、
ａ）Ｉｉ−ｋｅｙタンパク質のＬＲＭＫ残基と、
ｂ）ＨＰＶ１６型およびＨＰＶ１８型の一方または両方によってコードされる、ＭＨＣクラスＩＩエピトープと、
を含む、組成物。
［態様３０］
態様２９において、前記ＭＨＣクラスＩＩエピトープがＩｉ−Ｋｅｙ／ＨＰＶ１６型Ｅ７ハイブリッドである、組成物。
［態様３１］
態様３０において、前記Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＨＰＶ１６型Ｅ７のハイブリッドが、ＨＰＶ２、ＨＰＶ３およびＨＰＶ４からなる群から選択されたものである、組成物。
［態様３２］
態様２９において、前記ハイブリッドペプチドがＨＰＶ４である、組成物。
［態様３３］
態様２９において、さらに、ＨＰＶ１６型およびＨＰＶ１８型のＣＴＬエピトープからなる群から選択されたエピトープを含む、組成物。
【実施例】
【００５０】
（Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＨＰＶ１６型Ｅ７のハイブリッドの治療ワクチン）
【００５１】
［方法］
【００５２】
＜ＨＬＡ−ＤＲ拘束性のエピトープの予測＞
【００５３】
コンピュータアルゴリズム（例えば、 HYPERLINK "http://www.syfpeothi.de/scripts/MHCServer.dll/home.
htm" www.syfpeithi.de/scripts/MHCServer.dll/home.
htmなどを）を用いて、ＨＰＶ１６型Ｅ７の配列（ＧｅｎＢａｎｋ／ＰｕｂＭｅｄのAAD33253）に含まれる、ＨＬＡ−ＤＲ拘束性のエピトープの候補を分析した。このアルゴリズム方法により、ＨＰＶ１６型Ｅ７タンパク質のアミノ酸8〜26（配列番号：２）によって表されるペプチドが特異的でない（Ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）ＨＬＡ−ＤＲエピトープ（ＨＬＡ−ＤＲの多くの型で提示可能なエピトープ）を含むことが判明した。
【００５４】
【表１】
0005707326.tif 000002
【００５５】
（Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）のハイブリッドのデザインおよび合成）
【００５６】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）のハイブリッドのホモロググループを合成し、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）において当該ハイブリッドのスペーサーの長さがＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスのＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）に対する特異的なＣＤ４陽性Ｔリンパ球の応答の増強性に対して与える影響を試験した。本明細書では、Ｉｉ−ｋｅｙ配列を、ＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号：９）と定義する。このＩｉ−ｋｅｙ配列の最初の４つのアミノ酸であるＩｉ−Ｋｅｙ断片（ＬＲＭＫ（配列番号：１１））を、可撓性のポリメチレンスペーサー（ａｖａ：５−アミノ吉草酸、すなわち、５アミノペンタン酸）スペーサーを介して、ＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）エピトープの様々なアミノ酸のＮ末端に連結した。本発明にかかるＩｉ−ｋｅｙ／ＨＰＶのハイブリッドの調製（製造）において、前記Ｉｉ−ｋｅｙ断片に隣接する領域で、Ｉｉ−ｋｅｙ配列に含まる他のアミノ酸を挿入してもよい。いずれのペプチドも、エキソペプチダーゼを阻害するために、Ｎアセチル化やＣアミド化を施した。また、いずれのペプチドも、２１ｓｔ  Ｃｅｎｔｕｒｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（米国マサチューセッツ州マールボロ）によって９５％超の純度で合成されたものであった。このエピトープは、大半の場合、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４対立遺伝子によって拘束されるものであり、かつ、ＨＬＡ−ＤＲ４発現トランスジェニックマウスは市場で簡単に入手できるので、ＨＬＡ−ＤＲ４での活性について先ず試験した。最初に、スペーサーの長さの影響を試験した。ａｖａリンカーを、ＭＨＣクラスＩＩエピトープ結合溝のｐ１部位を占領すると予測されるアミノ酸（ＨＰＶ配列に含まれる位置１１のチロシン）から始めて、様々な距離に位置するアミノ酸に結合させた。詳細には、ａｖａリンカーを、Ｐ１部位に対応するチロシンから１〜３番目のアミノ酸、および当該チロシン（エピトープ中のＰ１と予測されるアミノ酸）にそれぞれ結合させた。ＨＰＶ１はエピトープのみを含むコントロールペプチド（対照ペプチド）であり、ＨＰＶ２、ＨＰＶ３、ＨＰＶ４およびＨＰＶ５は、互いに異なる長さのスペーサーを有するハイブリッドとした。ＨＰＶ６は、予め臨床試験で試験済みのＨＬＡ−Ａ２拘束性のＣＴＬエピトープとした。この実験の目的は：１）Ｉｉ−Ｋｅｙのハイブリッドを用いたＣＤ４陽性Ｔヘルパー細胞の抗原特異的な刺激の増強を試験すること；および２）ＨＬＡ−ＤＲ４陽性の子宮頸がん患者への臨床試験に使用するために、Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）のハイブリッドの中から、ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスにおいて最も有効なものを決定すること；であった。臨床試験に使用するための、Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）の最も有効なハイブリッドを決定した後、今後は、他種のＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子のトランスジェニックマウスに対し、どのハイブリッドが有効であるかについて研究を続ける予定である。
【００５７】
【表２】
0005707326.tif 000003
【００５８】
（マウスの免疫化）
【００５９】
ＨＬＡ−ＤＲ４−ＩＥトランスジェニックマウス（１グループあたり３匹のマウス）について、３０ｎモルのＨＰＶ１６Ｅ７／ＭＨＣクラスＩＩのハイブリッド、エピトープのみを含むペプチド、またはＣＴＬエピトープペプチドを尾根に皮下注射して免疫した。ペプチドは、生理食塩水に溶解させた後、同一体積の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）で乳化させたものを用いた。マウスの尾根への皮下注射による免疫化は、２８ゲージの針で漏れを生じずに行った。免疫化から３週間後、脾臓リンパ球を取り出し、ＨＰＶ１（ＨＰＶ１６Ｅ７（8〜22）エピトープのみを含むペプチド：ＨＰＶ１）およびＨＰＶ６（ＣＴＬエピトープ）によるインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）刺激に対するインターフェロンγ分泌について、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法を実施した。
【００６０】
（ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法）
脾臓リンパ球をＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法で使用した。各グループ内の免疫された動物の脾臓プール由来のリンパ球を大量培養したもの（０．５〜１．０×１０6細胞／ウェル）を、９６ウェル（穴）のイムノスポットを有する２００枚のプレート上で、２．７ｎモルのＨＰＶ１６Ｅ７（8〜22）エピトープのみを含むペプチドおよびＣＴＬエピトープ（ＨＰＶ６）によって４２時間刺激した。このＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法を、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社のインターフェロンγ分泌用のセット（カタログ番号551859）を用いて、この製造元の説明書に従って実行した。概略を述べると、プレートをサイトカインキャプチャー抗体によって４℃で一晩コーティングした。そして、そのプレートを、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＲＰＭＩ−１６４０バッファーによって室温で２時間ブロッキングし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液（洗浄用バッファー）で４回洗浄した。精製ＣＤ４陽性Ｔ細胞の懸濁液を、サイトカイン抗体で予備コーティングされたプレートに添加した。精製ＣＤ４陽性Ｔ細胞を大量培養法で３６時間培養するか、または一晩インキュベーションした後、プレートを洗浄用バッファーで５回洗浄した。ビオチン化されたサイトカイン検出用抗体（２μｇ／ｍＬ）を添加し、室温で２時間静置した。プレートを洗浄用バッファーで４回洗浄し、アビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（アビジンＨＲＰ）を、上市されている保存溶液から１：１００で希釈したものを添加し、室温で１時間インキュベーションした。アビジンＨＲＰを、洗浄用バッファーによる４回の洗浄およびリン酸緩衝液による２回の洗浄によって除去した。ＨＲＰ−３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を用いて室温で３０分間反応させることにより、スポットが生じた。プレートは、減菌水を用いて２回洗浄してから室温で１〜２時間乾燥させた。
【００６１】
（結果）
【００６２】
［無差別である（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）ＨＬＡ−ＤＲエピトープの決定］
【００６３】
アルゴリズムの予測によると、ＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜26）（配列番号：２）に、有望なＨＬＡ−ＤＲ拘束性の幾つかの互いに重複するエピトープが含まれているとのことである：そのうちの１つは、Ｐ１部位に結合する１１番目のチロシンから始まり、別のものは、同様にＰ１部位に結合する１２番目のメチオニンから始まる。当該エピトープは、他種のＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子によっても拘束される。３つの有望なエピトープに対するアルゴリズムの詳細な予想スコアは、次のとおりである：８番目のロイシンから始まるエピトープ（Ｐ１部位は１１番目のチロシン）は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１*０４０１（スコア＝２８）およびＨＬＡ−ＤＲＢ１*０３０１（スコア＝１８）によって拘束された。９番目のヒスチジンから始まるエピトープ（Ｐ１部位は１２番目のメチオニン）は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１*０１０１（スコア＝２２）、ＨＬＡ−ＤＲＢ１*０４０１（スコア＝２０）およびＨＬＡ−ＤＲＢ１*０５０１（スコア＝１８）によって拘束された。１０番目のグルタミン酸から始まるエピトープ（Ｐ１部位は１３番目のロイシン）は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１*０３０１（スコア＝２０）、ＨＬＡ−ＤＲＢ*０７０１（スコア＝２２）およびＨＬＡ−ＤＲＢ１*１５０１（スコア＝２４）によって拘束された。
【００６４】
［ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスのデータ］
【００６５】
下記の表３から、Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）（配列番号：３）の数種類のハイブリッドが、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）のＣＤ４陽性活性に対して、より高い特異的な刺激活性を示したことが分かる（ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスは他種のＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子やＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子を有さない。また、ＨＰＶ６は他種のＭＨＣクラスＩ対立遺伝子によって拘束されなかった）。これらの中でも、特に、ＨＰＶ４は、ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスにおいて高い活性を有するＨＰＶ１（エピトープのみを含むペプチド）の５倍の免疫応答の増強を示し（表３）、アルゴリズムによる予測を裏付けた。ＨＰＶ５の免疫活性は低く、このことは、１０番目のグルタミン酸が、ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスをインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で刺激するにあたって、ＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）エピトープにおいて必要なアミノ酸である可能性、またはＨＰＶ４におけるＬＲＭＫとエピトープとの間のスペースが最適であることを示している。ＨＰＶ２およびＨＰＶ３は、それぞれ、インターフェロンγの応答の２倍、３倍の増強を示し、このことから、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフとエピトープとの間のスペーサーが重要であること、およびスペーサーの長さの選択の融通性が読み取れる。この結果から、ＨＰＶ４が最も有効なハイブリッドペプチドの候補であり（ＨＰＶ３も優秀であるが）、子宮頸がんまたは他種のＨＰＶ１６型陽性がんのＨＬＡ−ＤＲ４陽性患者への臨床試験において有望であると考えられる。このグループのハイブリッドを、さらに、他種のＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子のトランスジェニックマウスで試験し、当該他種のＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子において最も有効なＩｉ−Ｋｅｙ／ＨＰＶ１６型Ｅ７（8〜22）を決定する予定である。
【００６６】
【表３】
0005707326.tif 000004
【００６７】
図１に、ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスにおいて最も有効なＨＰＶハイブリッドを明らかにするための、同様の実証研究のデータを示す。このデータは、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でエピトープ単独（ＨＰＶ１）またはＨＰＶ４によって刺激した後に、ＨＰＶ１またはＩｉ−ｋｅｙのハイブリッド（構築物Ｈ２〜構築物Ｈ６）で追加免疫したマウスの脾細胞におけるインターフェロンγ生成を示したものである。ＨＰＶ４で免疫化されたマウスは、エピトープ単独（ＨＰＶ１）で免疫化されたマウスに比べて、インターフェロンγ分泌細胞の数が約５倍超であった。
【００６８】
［ＨＬＡ−ＤＲ４エピトープとＩｉ−Ｋｅｙモチーフとの連結により、ＨＬＡ−ＤＲ４分子に対する当該エピトープの結合能が増強した］
【００６９】
ＨＰＶ４のハイブリッドペプチドの力価の増強のメカニズムを明らかにするために、ＨＬＡ−ＤＲ４陽性Ｈ９リンパ腫細胞に対する結合親和性を、ＨＰＶ４とＨＰＶ１とで比較した。抗ＨＡモノクローナル抗体を用いて、Ｈ４の結合モニタリングが可能なＨＡタグに接続された２種類のペプチド（ＨＰＶ７およびＨＰＶ１７）を合成した。詳細には、ＨＰＶ７（配列番号：１２）は、ＨＰＶ１のＣ末端を２つのグリシン残基のスペーサーとＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号：１９））とで伸長させたものであり、ＨＰＶ１７（配列番号：１３）は、ＨＰＶ４のＣ末端を２つのグリシン残基のスペーサーとＨＡタグとで同様に伸長させたものである。先ず、これら２種類のペプチドを、様々な濃度で、１×１０6個のＨＬＡ−ＤＲ４陽性ヒトリンパ腫細胞（Ｈ９細胞）と培養媒体で１時間インキュベートした。Ｈ９細胞と抗ＨＡタグモノクローナル抗体とを反応させ、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）標識された二次抗体で染色することにより、結合効率をモニタリングした。ＨＰＶ１７は、中間の濃度（１０μＭから５０μＭ）においてＨＰＶ７に比べて結合効率が優れていることが分かった（表４および図２）。最大濃度（１００μＭ）では、いずれの種類のペプチドも、同様の結合効率を示す。
【００７０】
【表４】
0005707326.tif 000005
【００７１】
［Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＨＰＶのハイブリッド（ＨＰＶ４）は、共免疫されたＨＰＶのＣＴＬエピトープの力価を、投与量依存的に増強させた。］
【００７２】
次に、ＨＰＶ４とＨ−２Ｄb拘束性のＣＴＬエピトープであるＨＰＶ１１（ＨＰＶ１６型Ｅ７（49〜57）（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（配列番号：２４））（Feltkamp, M. C., et al., Eur. J. Immunol. 1993, 23:2242-2249））とで共免疫することによってＣＤ４陽性Ｔ細胞活性が増強し、より強力なＣＴＬ応答が誘導されることを示す。ＨＰＶ１１と様々な濃度のＨＰＶ４とを用いてＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスを免疫した。インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）ＣＴＬアッセイにより、ＣＴＬエピトープであるＨＰＶ１６型Ｅ７（49〜57）がＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスにおいて免疫原性を有し、エピトープ特異的な細胞殺傷を引き起こすことが証明された。ＨＰＶ１６型Ｅ７（49〜57）は、ＨＰＶ４のハイブリッドと共免疫されることにより、その活性が大幅に増強した。なお、３０ｎモルのＨＰＶ４を投与された動物において、最大の活性が確認された（表５および図３）。ＥＬＩＳＰＯＴのデータは、ＣＴＬエピトープの活性の増強がＨＰＶ４の活性に比例していることを明らかに示している（data not shown）。つまり、これは、ＭＨＣクラスＩＩによって誘導されるＴヘルパー細胞の活性が、ペプチドワクチンによるＣＴＬ活性の誘導に重要であることを証明している。
【００７３】
【表５】
0005707326.tif 000006
【００７４】
［Ｉｉ−Ｋｅｙのハイブリッドは、共免疫されたＨＰＶのＣＴＬエピトープの活性を増強するにあたって、ペプチド単独を含む親ペプチドよりも効果的であった。］
【００７５】
この実験では、Ｉｉ−ＫｅｙのハイブリッドＨＰＶ４が、ＨＰＶのＣＴＬエピトープの活性を増強するにあたって、エピトープ単独を含むＨＰＶ（ＨＰＶ１）よりも効果的であるか否かについて試験した。ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスを、ＨＰＶ１１（ＨＰＶ１６型Ｅ７（49〜57））のＣＴＬエピトープ単独、ＨＰＶ１１のＣＴＬエピトープと３０ｎモルのＨＰＶ１、またはＨＰＶ１１のＣＴＬエピトープと３０ｎモルのＨＰＶ４で免疫した。インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）のＣＴＬ分析は、共免疫されたＣＴＬエピトープの活性を増強させるにあたって、ＨＰＶ４がＨＰＶ１よりも効果的であることを示した。具体的に述べると、ＨＰＶ１１に特異的な細胞殺傷レベルは、ＨＰＶ１およびＨＰＶ１１で共免疫されたマウスに比べて、ＨＰＶ４およびＨＰＶ１１で共免疫されたマウスにおいて２倍であった（表６および図４）。
【００７６】
【表６】
0005707326.tif 000007
【図１】
0005707326.tif 000008
【図２】
0005707326.tif 000009
【図３】
0005707326.tif 000010
【図４】
0005707326.tif 000011
【配列表】
0005707326000001.app