(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１：
【化１】
0005701117.tif 000007
で表される化合物であって、以下のいずれかの1H-NMRスペクトルを有する化合物：
1H-NMRスペクトル：δ 6.65 (dq, J=14.9, 6.9 Hz, 1H), 6.52 (dq, J=14.9, 1.7 Hz, 1H), 5.20 (d, J=7.4 Hz, 1H), 4.87 (d, J=4.0 Hz, 1H), 2.10-2.19 (ddq, J=12.3, 6.4, 4.0 Hz, 1H), 1.99-2.06 (ddq, J=12.6, 7.4, 6.8 Hz, 1H), 2.00 (dd, J=6.9, 1.7 Hz, 3H), 1.15 (d, J=6.8 Hz, 3H), 1.07 (d, J=6.4 Hz, 3H)；
1H-NMRスペクトル：δ 6.59 (dq, J=15.0, 6.4 Hz, 1H), 6.54 (dq, J=15.0, 1.7 Hz, 1H), 5.15 (d, J=7.4 Hz, 1H), 4.97 (d, J=5.2 Hz, 1H), 2.25 (ddq, J=12.0, 6.85, 5.2 Hz, 1H), 1.98 (dd, J=6.4, 1.7 Hz, 3H), 1.88 (ddq, J=12.0, 7.4, 6.3 Hz, 1H), 1.19 (d, J=6.8 Hz, 3H), 1.16 (d, J=6.3 Hz, 3H)；又は
1H-NMRスペクトル：δ 6.57 (dq, J=15.0, 7.0 Hz, 1H), 6.50 (d, J=15.0 Hz, 1H), 5.36 (d, J=4.0 Hz, 1H), 5.19 (d, J=5.2 Hz, 1H), 2.53 (m, J=6.3 Hz, 1H), 1.96 (d, J=7.0 Hz, 3H), 1.93 (m, J=6.9, 5.2 Hz, 1H), 1.21 (d, J=6.9 Hz, 3H), 1.09 (d, J=6.3 Hz, 3H)
を有効成分として含有する、シクロオキシゲナーゼ-1 (COX-1) 阻害剤。
【請求項２】
式１：
【化２】
0005701117.tif 000008
で表される化合物であって、以下のいずれかの1H-NMRスペクトルを有する化合物：
1H-NMRスペクトル：δ 6.65 (dq, J=14.9, 6.9 Hz, 1H), 6.52 (dq, J=14.9, 1.7 Hz, 1H), 5.20 (d, J=7.4 Hz, 1H), 4.87 (d, J=4.0 Hz, 1H), 2.10-2.19 (ddq, J=12.3, 6.4, 4.0 Hz, 1H), 1.99-2.06 (ddq, J=12.6, 7.4, 6.8 Hz, 1H), 2.00 (dd, J=6.9, 1.7 Hz, 3H), 1.15 (d, J=6.8 Hz, 3H), 1.07 (d, J=6.4 Hz, 3H)；
1H-NMRスペクトル：δ 6.59 (dq, J=15.0, 6.4 Hz, 1H), 6.54 (dq, J=15.0, 1.7 Hz, 1H), 5.15 (d, J=7.4 Hz, 1H), 4.97 (d, J=5.2 Hz, 1H), 2.25 (ddq, J=12.0, 6.85, 5.2 Hz, 1H), 1.98 (dd, J=6.4, 1.7 Hz, 3H), 1.88 (ddq, J=12.0, 7.4, 6.3 Hz, 1H), 1.19 (d, J=6.8 Hz, 3H), 1.16 (d, J=6.3 Hz, 3H)；又は
1H-NMRスペクトル：δ 6.57 (dq, J=15.0, 7.0 Hz, 1H), 6.50 (d, J=15.0 Hz, 1H), 5.36 (d, J=4.0 Hz, 1H), 5.19 (d, J=5.2 Hz, 1H), 2.53 (m, J=6.3 Hz, 1H), 1.96 (d, J=7.0 Hz, 3H), 1.93 (m, J=6.9, 5.2 Hz, 1H), 1.21 (d, J=6.9 Hz, 3H), 1.09 (d, J=6.3 Hz, 3H)を有効成分として含有する、α-グルコシダーゼ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、LFS抑制タマネギで増加する事が確認されていた化合物（Zwiebelane isomer）のCOX-1阻害剤としての用途、及びα-グルコシダーゼ阻害剤としての用途、及び当該化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タマネギは古くから世界中で広く食されている野菜の一つであり、人に対して有効な生理作用を示すことに関しては多くの報告がある（非特許文献１）。さらに、2002年に催涙成分生成酵素（LFS）が発見され、タマネギの催涙成分(LF)であるpropanthial S-oxideが、前駆物質であるPRENCSOに酵素アリイナーゼが作用して1-プロペニルスルフェン酸（E-1-propenylsulfenic acid）となり、1-プロペニルスルフェン酸がLFSにより異性化されて生じる機構が明らかとなった。このため、LFSの発現を抑制できれば、タマネギ中の有用成分の量が増加し、有用な生理作用の効果も強くなるのではないかと期待されていた（非特許文献２）。
【０００３】
過去に行われた研究で、PRENCSOのアリイナーゼ分解物は、1-プロペニルスルフェン酸であることや、この1-プロペニルスルフェン酸から誘導されるチオスルフィネートは不安定なため、短時間でZwiebelanesと呼ばれる化合物に変化することが報告されていた (非特許文献４)。さらに、RNAi技術を用いて作出したLFS抑制タマネギについての成分分析の結果から、LFS抑制タマネギでは、通常のタマネギに比べてチオスルフィネート量が増加していることや、Zwiebelane isomerと呼ばれる成分が増加していることが確認されていた。しかし、増加する当該化合物にどんな有用性があるのかについては、含硫黄化合物の反応性が高いこともあって明らかにされていなかった（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2010-143866号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Griffiths G et al.; Onions-A Global Benefit to Health. Phytother. Res. 16, 603-615 (2002)
【非特許文献２】Imai S et al.; An onion enzyme that makes the eyes water. Nature 419, 685 (2002).
【非特許文献３】Eady C. C. et al.; Silencing Onion Lachrymatory Factor Synthase Causes a Significant Change in the Sulfur Secondary Metabolite Profile. Plant Physiology, 147, 2096-2106 (2008).
【非特許文献４】Block E et al.; The Organosulfur Chemistry of the Onion. Phosphorus Sulfur and Silicon 58, 3-15 (1991)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、LFS抑制タマネギで増加する事が確認されていた化合物（Zwiebelane isomer）が持つ有益な生理活性を利用する方法、及び通常のタマネギで少量しか含有されていない当該化合物を効率的に製造する方法を提供する事を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは低LFSタマネギの抽出液中の成分、及び、LFS非存在下でのPRENCSOのアリイナーゼ分解反応の反応液中の成分について鋭意研究を積み重ねた結果、これらの抽出液及び反応液中で特徴的に増加する化合物がCOX-1阻害剤やα-グルコシダーゼ阻害剤として有用なものであることを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成させるに至った。
【０００８】
本発明は以下の発明を包含する。
（１）式１：
【化１】
0005701117.tif 000002
で表される化合物。
（２）催涙成分生成酵素 (LFS) の活性が低減された低LFSタマネギを粉砕する工程を含む、式１で表される化合物又は該化合物を含む組成物の製造方法。
（３）（２）の方法により製造された、式１で表される化合物又は該化合物を含む組成物。
（４）催涙成分生成酵素 (LFS) 非存在下で、S-1-プロペニル-システインスルフォキシド(PRENCSO) をアリイナーゼにより分解する工程を含む、式１で表される化合物又は該化合物を含む組成物の製造方法。
（５）（４）の方法により製造された、式１で表される化合物又は該化合物を含む組成物。
（６）式１で表される化合物を有効成分として含有する、シクロオキシゲナーゼ-1 (COX-1) 阻害剤。
（７）式１で表される化合物を有効成分として含有する、α-グルコシダーゼ阻害剤。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】シリカゲルカラムによる分離前後の試料の、薄層クロマトグラフィー（TLC）による分析結果を示す。
【図２】PRENCSO＋アリイナーゼの反応液(a)、LFS発現抑制タマネギバルブの粉砕物の抽出液(b)、LFS発現非抑制タマネギバルブの粉砕物の抽出液(c)における式1の化合物の有無のHPLCによる確認結果を示す。
【図３】実施例3において式1の成分の残存率の算出に用いたHPCLチャートを示す。
【図４】実施例3での式1の成分の残存率の経時的変化を示す。図4(a)は水300 μlに各濃度の酢酸を添加した系の結果を示し、図4(b)はイソプロパンノール300 μlに各濃度の酢酸を添加した系の結果を示す。
【図５ａ】アスピリンの濃度とCOX-1阻害率との関係を示す。
【図５ｂ】A1フラクション1の濃度とCOX-1阻害率との関係を示す。
【図５ｃ】A1フラクション2の濃度とCOX-1阻害率との関係を示す。
【図５ｄ】アリシンの濃度とCOX-1阻害率との関係を示す。
【図６ａ】カフェ酸の濃度とα-グルコシダーゼ阻害率との関係を示す。
【図６ｂ】A1フラクション1の濃度とα-グルコシダーゼ阻害率との関係を示す。
【図６ｃ】A1フラクション2の濃度とα-グルコシダーゼ阻害率との関係を示す。
【図７】タマネギにおけるLFS活性と、式1の成分の生成量との関係を示す。
【発明の概要】
【００１０】
本発明によれば、シクロオキシゲナーゼ-1 (COX-1)を阻害する活性、及びα-グルコシダーゼを阻害する活性を有する、食用作物又は食用作物由来の成分から誘導されるZwiebelane isomerと呼ばれる化合物又は該化合物を含む組成物が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
1. 化合物
本発明の化合物は式1で表される平面構造を有する。式1で表される平面構造を有する化合物には、複数の光学異性体が存在する。本発明の化合物は、式1で表される平面構造を有する化合物であればよく、光学異性体の構造は特に限定されない。
【００１２】
本発明において「式1で表される化合物」とは、式1で表される平面構造を有する化合物の複数の光学異性体の混合物と、単離又は高濃度化された個別の光学異性体との両方を包含する。
【００１３】
本発明者らは、LFS非存在下でのPRENCSOのアリイナーゼによる分解反応の反応物、及び低LFSタマネギの粉砕物において、LFS抑制タマネギで増加する事が確認されていた化合物（Zwiebelane isomer）が式1で表される平面構造を持つ化合物であり、複数の光学異性体の混合物の形態で含まれることを見出した。式１で示される化合物のうちの１つの光学異性体については、ネギ香を有するタマネギ由来成分としての報告ある（特許文献１）。しかし、本発明の式１で示される化合物には、それ以外の光学異性体が含まれていた。
【００１４】
具体的には、当該反応物及び粉砕物には、以下の条件：
カラム：ThermoFisher ODS Hypersil 250mm X 4.6mm, 5μm、カラムオーブン：30℃、移動相（CH3CN/H2O）：0分(18%/82%), 45分(90%/10%), 50分(90%/10%), 50.1分(18%/82%)、60分(18%/82%)(具体的には、0分から45分において、グラジエントをかけてCH3CN濃度を18％から90％に上げる。45分から50分までの5分間は、CH3CNを90％で保持する。その直後50.1分からは、CH3CN濃度を18％に切り替えて60分まで流す)、流速：0.5 ml/分、検出254nmの高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)によるクロマトグラムにおいて、保持時間約22.00分〜約26.00分の間に主要な3つのピークとして現れる、式1で表される平面構造を有する化合物の複数の光学異性体化合物が含まれる。これらの光学異性体化合物は相互に分離して取得されてもよいし、複数の光学異性体の混合物として取得されてもよい。これらの光学異性体化合物（相互に分離して取得されてもよいし、複数の光学異性体の混合物として取得されてもよい）は新規な化合物であると考えられる。
【００１５】
上記条件でのHPLCによるクロマトグラムにおいて、保持時間約22.0分〜約26.0分の間に現れる主要な3つのピークのうち、保持時間の最も長いピーク（実施例2では25.0分）に対応する画分中の式1で表される化合物は、以下の物理化学的特徴を有する。
【００１６】
(1) 外観：無色油状
(2) 比旋光度：[α]D23 ＝ -7.42（c =0.128, CHCl3）
(3) MS [M]+：m/z 252.40
(4) HR MS [M+H]+：m/z 253.0383（253.0385 calcd. for C9H17O2S3）
(5) 分子式: C9H16O2S3
(6) 溶解性：水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、クロロホルム、ヘキサン
(7) 紫外吸収スペクトル：λmaxnm 260 (in 58% CH3CN)
(8) 赤外吸収スペクトル：IR (neat, νmax) 3342 (b), 2964 (s), 2930 (m), 2873 (m), 1722 (w), 1627 (w), 1453 (m), 1377 (w), 1092 (s), 1043 (vs), 946 (s), 887 (w) cm-1
(9) 1H  NMRスペクトル：δ 6.65 (dq, J=14.9, 6.9 Hz, 1H), 6.52 (dq, J=14.9, 1.7 Hz, 1H), 5.20 (d, J=7.4 Hz, 1H), 4.87 (d, J=4.0 Hz, 1H), 2.10-2.19 (ddq, J=12.3, 6.4, 4.0 Hz, 1H), 1.99-2.06 (ddq, J=12.6, 7.4, 6.8 Hz, 1H), 2.00 (dd, J=6.9, 1.7 Hz, 3H), 1.15 (d, J=6.8 Hz, 3H), 1.07 (d, J=6.4 Hz, 3H)
(10) 13C  NMRスペクトル：δ 137.72, 129.19, 90.87, 59.93, 48.95, 48.83, 18.02, 14.67, 14.60
【００１７】
上記条件でのHPLCによるクロマトグラムにおいて、保持時間約22.0分〜約26.0分の間に現れる主要な3つのピークのうち、保持時間が最も短いピーク（実施例2では23.2分）及び保持時間が次に短いピーク（実施例2では24.4分）に対応する画分（保持時間が最も短いピークの開始から、保持時間が次に短いピークの終了までに対応する画分）中の式1で表される化合物は、以下の物理化学的特徴を有する。
【００１８】
(1) 外観：無色油状
(2) MS [M]+：m/z 252.40
(3) HR MS [M+H]+：m/z 253.0383（253.0385 calcd. for C9H17O2S3）
(4) 分子式: C9H16O2S3
(5) 溶解性：水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、クロロホルム、ヘキサン
(6) 紫外吸収スペクトル：λmaxnm 260 (in 55% CH3CN)
(7) HPLC保持時間：22.4〜24.5分 (実施例2でのピークトップの検出時間：23.2分，24.4分)
(条件) カラム：ThermoFisher ODS Hypersil 250mm X 4.6mm, 5μm、カラムオーブン：30℃、移動相（CH3CN/H2O）：0分(18%/82%), 45分(90%/10%), 50分(90%/10%), 50.1分(18%/82%)、60分(18%/82%)(具体的には、0分から45分において、グラジエントをかけてCH3CN濃度を18％から90％に上げた。45分から50分までの5分間は、CH3CNを90％で保持した。その直後50.1分からは、CH3CN濃度を18％に切り替えて60分まで流した)、流速：0.5 ml/分、検出254nm
(8) 保持時間が短い成分（実施例2においてHPLCピークトップ23.2分の成分（B-Fr.1））の1H NMRスペクトル：δ 6.59 (dq, J=15.0, 6.4 Hz, 1H), 6.54 (dq, J=15.0, 1.7 Hz, 1H), 5.15 (d, J=7.4 Hz, 1H), 4.97 (d, J=5.2 Hz, 1H), 2.25 (ddq, J=12.0, 6.85, 5.2 Hz, 1H), 1.98 (dd, J=6.4, 1.7 Hz, 3H), 1.88 (ddq, J=12.0, 7.4, 6.3 Hz, 1H), 1.19 (d, J=6.8 Hz, 3H), 1.16 (d, J=6.3 Hz, 3H)
(9) 保持時間が短い成分（実施例2においてHPLCピークトップ23.2分の成分（B-Fr.1））の13C NMRスペクトル：δ136.07, 132.46, 89.17, 62.01, 50.99, 48.95, 17.66, 16.23, 15.20
(10) 保持時間が長い成分（実施例2において HPLCピークトップ24.4分の成分（B-Fr.2））の1H NMRスペクトル：δ 6.57 (dq, J=15.0, 7.0 Hz, 1H), 6.50 (d, J=15.0 Hz, 1H), 5.36 (d, J=4.0 Hz, 1H), 5.19 (d, J=5.2 Hz, 1H), 2.53 (m, J=6.3 Hz, 1H), 1.96 (d, J=7.0 Hz, 3H), 1.93 (m, J=6.9, 5.2 Hz, 1H), 1.21 (d, J=6.9 Hz, 3H), 1.09 (d, J=6.3 Hz, 3H)
(11) 保持時間が長い成分（実施例2においてHPLCピークトップ24.4分の成分（B-Fr.2））の13C NMRスペクトル：δ135.92, 132.50, 83.42, 61.52, 47.28, 44.46, 17.98, 15.19, 12.42
【００１９】
式1で表される化合物は単離精製された形態の化合物で提供されてもよいし、式1で表される化合物を含む組成物として提供されてもよい。式1で表される化合物を含む組成物としては、組成物の固形分に対して当該化合物を10質量％以上、好ましくは30質量％以上、より好ましくは50質量％以上、より好ましくは70質量％以上、特に好ましくは90質量％以上の量で含む組成物が挙げられる。このような組成物は、後述する式1で表される化合物の製造方法において調製することができる。
【００２０】
式1で表される化合物は、水との水和物や、低級アルコール等との溶媒和物の形態で存在していてもよい。水和物又は溶媒和物は医薬、飲食品等の用途に許容される水和物又は溶媒和物であれば特に限定されない。すなわち、本発明における「式1で表される化合物」には、それらの水和物又は溶媒和物の形態も下位概念として包含される。
【００２１】
2. 製造方法
式1で表される化合物は、PRENCSOをアリイナーゼにより処理して分解することにより得られる。タマネギを粉砕することによりこの分解反応は進行するが、通常のタマネギ粉砕物中にはLFSが含まれるため、PRENCSOのアリイナーゼによる分解物（1-プロペニルスルフェン酸）はLFSによるLF(催涙成分)の合成に用いられて速やかに消費されるため、式１で表わされる化合物は蓄積され難い。そこで本明細書では、式1で表される化合物を以下の2つの方法により製造することを開示するが、該化合物を工業的に製造するには、LFS非存在下で、PRENCSOをアリイナーゼにより分解する工程を含む、下記第二の製造方法が好適である。
【００２２】
式1で表される化合物又は該化合物を含む組成物の第一の製造方法は、LFSの活性が低減された低LFSタマネギを粉砕する工程を含む。第二の製造方法は、LFS非存在下で、PRENCSOをアリイナーゼにより分解する工程を含む。
【００２３】
上記第一の製造方法について詳述する。
【００２４】
低LFSタマネギは通常のタマネギと比較してLFSの活性が低減したタマネギであり、遺伝子組み換えや突然変異処理により得ることができる。好ましい低LFSタマネギは、親株（通常のタマネギ）のLFS活性の20分の1以下、好ましくは40分の1以下、より好ましくは160分の1以下、特に好ましくは400分の1以下のLFS活性を有する。LFS活性は以下の方法により測定することができる。
【００２５】
＜LFS活性測定方法＞
LFS活性は、酵素反応で発生した催涙成分（LF）のピーク面積に基づいて定量する。測定試料（タマネギ抽出液）10μlに対し、250 U/ml の精製アリイナーゼ溶液を40μl添加し、さらに20mg/ml の精製PRENCSO溶液20μlを添加して、酵素基質反応を開始させる。3分後に反応液1μlをHPLCへ注入し、LF発生量を測定する。
【００２６】
HPLC条件としては以下の条件を用いることができる：
カラム：Pegasil ODS  4.6mmΦ×25cm （センシュウ科学）, 移動相：酸性水pH3.3とメタノールを7対3で混合したもの, 温度：35℃, 検出波長：254nm, 流速：0.6ml/min。この条件を用いると、LFのピークは、保持時間9.6分に検出される。
【００２７】
移動相として用いた酸性水pH3.3としてはTFA溶液を使用することができる。作製方法は以下である。蒸留水2リットルを密栓できる容器に注ぎ、アスピレーターを用いて脱気する。脱気した蒸留水2リットルにTFA（アミノ酸配列分析用特製試薬  ナカライテスク  34902-11 1ｍｌアンプル×5本入り）1mlを加え、ストック溶液（TFA溶液（×10））とする。そのストック溶液を、脱気した蒸留水で10倍に希釈して、酸性水 pH3.3を作製することができる。
【００２８】
精製アリイナーゼ溶液及び精製PRENCSO溶液としては、下記実施例2-1及び1-1に記載の方法で作製したものを用いることができる。
【００２９】
本発明では低LFSタマネギとして該タマネギの鱗茎（一般に、「バルブ」または「球」と呼ばれる部分）、或いは鱗茎から伸びる鞘葉の部分を用いることができる。
【００３０】
低LFSタマネギの粉砕はホモジナイザー、ミキサー等の通常の粉砕装置により行うことができる。
【００３１】
上記第一の製造方法は更に、低LFSタマネギの粉砕物から式1で表される化合物を抽出する工程を含むことが好ましい。式1で表される化合物はPRENCSOをアリイナーゼで処理したのち短時間で生成し、その後は経時的に分解してしまうことから、低LFSタマネギ粉砕物から、粉砕後は速やかに、好ましくは2時間以内に、当該化合物を抽出することが好ましい。
【００３２】
LFSタマネギ粉砕物から式1で表される化合物を抽出する方法としては、ジエチルエーテル、ヘキサン、酢酸エチル、ジクロロメタンなどの水不溶の有機溶媒で抽出する方法と、LFSタマネギの粉砕物を合成吸着剤により処理して前記化合物を合成吸着剤に吸着させ、次いでメタノール、エタノール、プロパノール、アセトニトリル、アセトンなどの水可溶な有機溶媒を含む溶液により、吸着された前記化合物を溶出させる方法が挙げられる。合成吸着剤としては、ダイアイオンHP-20（三菱化学株式会社）やアンバーライトXAD-2（オルガノ株式会社）など各種吸着剤が使用できる。「式1で表される化合物を含む組成物」は、典型的には、このような手段により抽出された抽出物を指す。
【００３３】
上記第一の製造方法は更に、式1で表される化合物を含有する抽出物から当該化合物を精製する工程を含んでもよい。精製はシリカゲルカラムクロマトグラフィー、HPLC等の手段により行うことができる。
【００３４】
次に、上記第二の製造方法について詳述する。
【００３５】
原料として用いられるS-1-プロペニル-システインスルフォキシド(PRENCSO)は、天然由来の場合、以下の構造：
【化２】
0005701117.tif 000003
を有する。ただし当該天然型とは異なるPRENCSOの立体異性体（例えばスルフォキシドの立体配置が異なる異性体）もまた原料PRENCSOとして利用可能である。
【００３６】
原料として用いるPRENCSOは合成されたものであってもよいし、タマネギ等に由来するものであってもよい。更に、PRENCSOを含む組成物を、PRENCSO原料として使用することもできる。例えば、タマネギを加熱処理して酵素を失活させ、次いで粉砕して調製されたジュースやペースト（加熱タマネギジュース、加熱タマネギペースト）はPRENCSOを含む組成物であり、PRENCSO原料としてアリイナーゼ処理に供することができる。
【００３７】
アリイナーゼ(E.C.4.4.1.4, S-alk(en)yl-L-cysteine sulfoxide lyase)はアルキル（アルケニル）システインスルフォキシドをデヒドロアラニンとスルフェン酸に分解する酵素であり、アリインを分解する事からその名がつけられた。現在ではC-Sリアーゼとも呼ばれている（出典：香辛料成分の食品機能  岩井和夫、中谷延二  編集、(株)光生館  P174-175 (1989)）。上記第二の製造方法に用いることができるアリイナーゼの起源は特に限定されず、タマネギ、ニンニク、ネギ、ニラ、ラッキョなどのネギ属の他、アブラナ科のブロッコリーやカリフラワー、マメ科の灌木Albizzia lophantha (出典は上記と同じ) 等に由来するものを使用することができる。
【００３８】
PRENCSOをアリイナーゼで処理する条件は特に限定されない。しかし、アリイナーゼの特性は由来によって異なるため、反応条件を使用する個々のアリイナーゼの特性に合わせるとPRENCSOの分解を効率化できる。例えば、アリイナーゼがニンニク由来の場合は、至適pHの範囲は広いのでpHは5〜8の範囲でよく、温度は37℃が最適である。一方、タマネギ由来のアリイナーゼを使う場合は、pHを7.5〜8.6にすると酵素活性が最適化され、Welsh onionの葉由来のアリイナーゼを用いる場合は、pHを7.0にすると最適化される（出典：香辛料成分の食品機能  岩井和夫、中谷延二  編集、(株)光生館  P174-175 (1989)）。なお、アリイナーゼは、ピリドキサールリン酸を補酵素とするため、実施例１の様に、ピリドキサールリン酸を添加したバッファーを使う事も、アリイナーゼの活性を最適化するのに役立つ。
【００３９】
上記第二の製造方法は更に、PRENCSOをアリイナーゼで分解処理して得られた反応液から式1で表される化合物を抽出する工程を含むことが好ましい。式1で表される化合物はPRENCSOをアリイナーゼで処理したのち短時間で生成し、その後は経時的に分解してしまうことから、反応液後は速やかに、好ましくは2時間以内に、当該化合物を抽出することが好ましい。抽出は、第一の製造方法について上述した手順により行うことができる。得られた抽出物は、「式1で表される化合物を含む組成物」として利用することができる。
【００４０】
上記第二の製造方法は更に、式1で表される化合物を含有する抽出物から当該化合物を精製する工程を含んでもよい。精製は第一の製造方法について上述した手順により行うことができる。
【００４１】
式1で表される化合物はpH5以下の酸性条件において安定であることを本発明者らは見出した（実施例3）。そこで式1で表される化合物又は該化合物を含む組成物を上記の方法で製造した後に、該化合物又は組成物に酸を添加してpHを5以下にすることにより安定化することがより好ましい。酸としては酢酸等の有機酸でも、塩酸等の無機酸でも好適に使用することができる。
【００４２】
3. 用途
式1で表される化合物は、シクロオキシゲナーゼ-1 (COX-1) 阻害剤及びα-グルコシダーゼ阻害剤の有効成分として有用である。
【００４３】
式1で表される化合物はCOX-1阻害作用を有しているため、血小板内のアラキドン酸からプロスタグランジンH2への酵素反応を阻害し、血小板の凝集を抑制することによる血栓形成の予防等に有用である。
【００４４】
式1で表される化合物はα-グルコシダーゼ阻害作用を有しているため、小腸からのブドウ糖の吸収を遅らせて、インスリンの分泌量のピークと血糖が増えるときのタイミングを合わせることで、食後の血糖の急上昇を抑えることができ、糖尿病の治療薬として有用である。さらに、α-グルコシダーゼ阻害薬は、肥満を解消する効果もあるほか、２型糖尿病の発症を予防する効果も期待されている（http://www5b.biglobe.ne.jp/~yakugaku/GULUKO.html参照）。
【００４５】
本発明のCOX-1阻害剤は、ヒト等の哺乳動物に投与することにより、COX-1を阻害することにより改善される疾患又は症状を予防又は治療する目的に用いられてもよいし、in vitroにおいてCOX-1を阻害するための試薬として用いられてもよい。
【００４６】
本発明のα-グルコシダーゼ阻害剤は、ヒト等の哺乳動物に投与することにより、α-グルコシダーゼを阻害することにより改善される疾患又は症状を予防又は治療する目的に用いられてもよいし、in vitroにおいてα-グルコシダーゼを阻害するための試薬として用いられてもよい。
【００４７】
本発明のCOX-1阻害剤及びα-グルコシダーゼ阻害剤は飲食品組成物または医薬品組成物（医薬部外品組成物を含む。以下同じ）等の任意の形態であってよい。
【００４８】
飲食品組成物の形態としては、飲料、固形食品、半固形食品等が挙げられる。飲料としては、具体的には、果汁飲料、清涼飲料、アルコール飲料等が挙げられる。固形食品としては、例えば、飴、トローチ等を含む錠剤（タブレット）や糖衣錠の形態、顆粒の形態、粉末飲料、粉末スープ等の粉末の形態、ビスケット等のブロック菓子類の形態、カプセル、ゼリー等の形態等、種々の形態が挙げられる。半固形食品としては、例えばジャムのようなペーストの形態、チューイングガムのようなガムの形態が挙げられる。これらの飲食品組成物には式1で表される化合物又は該化合物を含む組成物のほかに、本発明の所望の効果が損なわれない範囲で、飲食品原料として通常用いられる種々の成分を配合することができる。これらの成分は単独で、または組み合わされて使用され得る。
【００４９】
医薬品組成物としては種々の投与形態用に製剤化されたものを使用することができる。医薬品組成物の製剤形態は特に制限はなく、液剤、錠剤、顆粒剤、細粒、散剤、チュアブル剤等の経口剤、注射剤等の非経口剤等の通常の製剤形態が挙げられる。上記製剤は式1で表される化合物又は該化合物を含む組成物と、賦形剤等の製薬上許容される他の成分とを使用して常法により調製することができる。
【実施例】
【００５０】
実施例1.  式１の化合物の誘導
実施例1-1.
精製PRENCSO溶液の調製
（１）加熱タマネギからPRENCSOの抽出
生タマネギ３玉（約1000 g）の外皮をはがし、ラップをして電子レンジで12分間加熱した。加熱したタマネギをミキサーに入れ、等量の蒸留水を加えてから粗砕し、粗砕液を8000rpmで10分間遠心分離した。上清を回収し、陽イオン交換樹脂IR120B（Hタイプ）を加えて攪拌したのち、吸引濾過により、樹脂を回収した。回収した樹脂に蒸留水1Lを加え、これに濃アンモニア水を加えてpH8.5に調整した。吸引濾過により、上清を回収し、残った樹脂に再度pH8.5のアンモニア水を加えた。再度、吸引濾過により、上清を回収した。得られた溶液に1N塩酸を加えてpH7.0に中和した。エバポレーターを用いて溶液を濃縮乾固した。
【００５１】
（２）PRENCSOの精製
残留物に蒸留水50mlを加えて溶解させた。得られた粗PRENCSO溶液を中圧逆相クロマトグラフィーによって精製した。必要に応じて、さらにHPLC（カラム：ODS，移動相：酸性水pH3.3，温度：35℃，UV：230nm）によって精製した。カラムから得られた溶出液をエバポレーターおよび凍結乾燥機を用いて乾固し、精製PRENCSO粉末（約100mg）を得た。
【００５２】
実施例1-2.
精製アリイナーゼ溶液の調製
（１）ニンニクを粉砕・酸沈
まず、ミキサーのジョッキを冷蔵庫に入れて冷やしておいた。また、低温遠心機にローターをセットし、温度を4℃にセットして冷却しておいた。ニンニク片（100g）に等量のバッファー A（後述）を加えて、ミキサーで粉砕した。氷上に置いたジョッキの口に二重にしたガーゼを輪ゴムでとめ。粉砕物をそのガーゼの上に流して、濾した。ろ液がある程度得られた後で、ガーゼ上の粉砕物をガーゼで包んで絞った。得られたろ液を4℃、12000rpmで10 分間遠心分離し、上清を回収した。回収した遠心上清を氷上に置いた状態で攪拌しつつ、pHをモニターしながら、酢酸を加えていき、pHを4.0に調整した。pHが4.0になったら、そのまま5分間静置した。沈殿の出てきたサンプルを4℃、12000rpmで10分間遠心分離し、遠心ペレットを回収した（バッファー Aを使用した）。
【００５３】
回収したペレットを50ml〜100mlにして（バッファーA）、そのまま、5℃で30分間静置した。回収したペレットの懸濁液を4℃、12000rpmで10分間遠心分離した。1N水酸化ナトリウム水溶液を用いて、回収した遠心上清のpHを6.5に調整した。これをアリイナーゼ粗抽出液とした。
【００５４】
（２）ハイドロキシアパタイトカラム処理
上記アリイナーゼ粗抽出液（遠心上清）をバッファー Aで平衡化したハイドロキシアパタイトカラムにアプライした。アリイナーゼは、ハイドロキシアパタイトカラムに黄色のバンドとなって吸着された。サンプルをアプライしたハイドロキシアパタイトカラムを300mlのバッファー Aで洗浄した。洗浄の終了したハイドロキシアパタイトカラムに300mlのバッファー C（後述）を流して、溶出させた。溶出液はフラクションコレクターを使って10 mlずつ分画し、黄色の溶出液が分画されているフラクションを集めた。
【００５５】
（３）ConAカラムによるアリイナーゼの精製
集めたフラクション（20ml）の1/20倍volの20mM塩化カルシウム、塩化マグネシウム溶液を加えて、サンプル溶液のカルシウムイオン、マグネシウムイオン濃度を上げた。そうした上で、再生し、startingバッファー（ConA Sepharose 4Bのマニュアルに記載されている推奨バッファー）で平衡化したConAカラムにアプライした。サンプルをアプライした後のConAカラムを50mlのstartingバッファーで洗浄した。洗浄の終了したConAカラムに50mlのConA溶出バッファー（ConA Sepharose 4Bのマニュアルに記載されている推奨バッファー）を流して、溶出させた。溶出液はフラクションコレクターを使って2mlずつ分画し、黄色の溶出液が分画されているフラクションを集めた。
【００５６】
（４）精製したアリイナーゼの濃縮方法
ConAカラム精製によって得られた黄色い溶出液（アリイナーゼ溶液）10mlをCENTRIPLUS CONCENTRATORS(up to 15ml,No.4421)（ミリポア社製）に入れた。CENTRIPLUS CONCENTRATORSを、4℃に冷却した遠心機にセットし、3000rpmで30分遠心した。中身を一度確認した後、もう一度、3000rpmで30分間遠心した。
【００５７】
なお、上記バッファーA(pH7.0)（アリイナーゼ精製用50mMバッファーA）は次のように調製した。50mMリン酸水素２カリウム溶液（5.22gを600mlに溶解）と50mMリン酸二水素カリウム溶液（3.4gを500mlに溶解）を調製した。pHをモニターしながら、両者を混合して、pHを7.0に調整した。出来上がったバッファー9倍volに対して、グリセロールを1倍vol加えてよく混合した。出来上がったグリセロール入りバッファー 1Lに対して、5.3 mgのピリドキサールリン酸を添加して混合した。出来上がったバッファーは、10℃で保存した。
【００５８】
また、バッファーC(pH7.0)（アリイナーゼ精製用500mMバッファーC）は、次のように調製した。500mMリン酸水素２カリウム溶液（43.6gを500mlに溶解）と500mMリン酸二水素カリウム溶液（34.0gを500mlに溶解）を調製した。pHをモニターしながら、両者を混合して、pHを7.0に調整した。出来上がったバッファー9倍volに対して、グリセロールを1倍vol加えてよく混合した。出来上がったグリセロール入りバッファー 1Lに対して、5.3mgのピリドキサールリン酸を添加して混合した。出来上がったバッファーは、10℃で保した。
【００５９】
実施例1-3. 式1の化合物の誘導と単離精製
ガラス製遠沈管に250 U/ml のアリイナーゼ溶液（500 mM リン酸ナトリウムバッファー（pH 7.0）, 10％グリセロール，25 μMピリドキサールリン酸）3.2mlを採る。ここに20 mg/mlのPRENCSO水溶液1.6mlを加えて酵素反応を開始させた。反応開始から60秒後にクロロホルム1.5mlを添加し、30秒間混合した。遠沈管を3000rpmで30秒間遠心し、有機層を回収した。残った水層にさらにクロロホルムを1.5ml 添加し、30秒間混合後、3000rpmで30秒間遠心して有機層を回収した。得られた有機層に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。こうして得られたクロロホルム抽出物から、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、反応初期生成物を単離精製した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、ワコーゲルC300を5 g用い、溶出溶媒はヘキサン：酢酸エチル（8：2）を用いた。シリカゲルカラム溶出後の画分については、薄層クロマトグラフィー（TLC）を用いて目的物の有無を確認し、2種類の画分（先に溶出したほうを画分A，後に溶出したほうを画分Bとする）を得た（図1）。それぞれの画分についてエバポレーターを用いて濃縮乾固させ、画分Aより4.5 mg、画分Bより4.4 mgの乾固物を得た。画分AをNMR、MS、IR、UV、元素分析構造解析をした結果、式1の平面構造を有することを特定できた。後に溶出した画分Bについては、Waters社のUPLC-MSを用いたMSスペクトル解析の結果、画分Aと同様のUVスペクトル、MSスペクトルを示したことから、画分Aの異性体画分であると決定できた。
【００６０】
画分Aの物理化学的性状
(1) 外観：無色油状
(2) 比旋光度：[α]D23 ＝ -7.42（c =0.128, CHCl3）
(3) MS [M]+：m/z 252.40
(4) HR MS [M+H]+：m/z 253.0383（253.0385 calcd. for C9H17O2S3）
(5) 分子式: C9H16O2S3
(6) 溶解性：水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、クロロホルム、ヘキサン
(7) 紫外吸収スペクトル：λmaxnm 260 (in 58% CH3CN)
(8) 赤外吸収スペクトル：IR (neat, νmax) 3342 (b), 2964 (s), 2930 (m), 2873 (m), 1722 (w), 1627 (w), 1453 (m), 1377 (w), 1092 (s), 1043 (vs), 946 (s), 887 (w) cm-1
(9) 1H  NMRスペクトル：δ 6.65 (dq, J=14.9, 6.9 Hz, 1H), 6.52 (dq, J=14.9, 1.7 Hz, 1H), 5.20 (d, J=7.4 Hz, 1H), 4.87 (d, J=4.0 Hz, 1H), 2.10-2.19 (ddq, J=12.3, 6.4, 4.0 Hz, 1H), 1.99-2.06 (ddq, J=12.6, 7.4, 6.8 Hz, 1H), 2.00 (dd, J=6.9, 1.7 Hz, 3H), 1.15 (d, J=6.8 Hz, 3H), 1.07 (d, J=6.4, 3H)
(10) 13C  NMRスペクトル：δ 137.72, 129.19, 90.87, 59.93, 48.95, 48.83, 18.02, 14.67, 14.60
(11) HPLC保持時間：24.6〜26.0分 (ピークトップの検出時間:25.0分)
（条件）カラム：ThermoFisher ODS Hypersil 250mm X 4.6mm, 5μm、カラムオーブン：30℃、移動相（CH3CN/H2O）：0分(18%/82%), 45分(90%/10%), 50分(90%/10%), 50.1分(18%/82%)、60分(18%/82%)（具体的には、0分から45分において、グラジエントをかけてCH3CN濃度を18％から90％に上げた。45分から50分までの5分間は、CH3CNを90％で保持した。その直後50.1分からは、CH3CN濃度を18％に切り替えて60分まで流した）、流速：0.5 ml/分、検出254nm
【００６１】
画分Bの物理化学的性状
(1) 外観：無色油状
(2) MS [M]+：m/z 252.40
(3) HR MS [M+H]+：m/z 253.0383（253.0385 calcd. for C9H17O2S3）
(4) 分子式: C9H16O2S3
(5) 溶解性：水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、クロロホルム、ヘキサン
(6) 紫外吸収スペクトル：λmaxnm 260 (in 55% CH3CN)
(7) HPLC保持時間：22.4〜24.5分 (実施例2でのピークトップの検出時間：23.2分，24.4分)
（条件）カラム：ThermoFisher ODS Hypersil 250mm X 4.6mm, 5μm、カラムオーブン：30℃、移動相（CH3CN/H2O）：0分(18%/82%), 45分(90%/10%), 50分(90%/10%), 50.1分(18%/82%)、60分(18%/82%)(具体的には、0分から45分において、グラジエントをかけてCH3CN濃度を18％から90％に上げた。45分から50分までの5分間は、CH3CNを90％で保持した。その直後50.1分からは、CH3CN濃度を18％に切り替えて60分まで流した)、流速：0.5 ml/分、検出254nm
(8) 保持時間が短い成分（実施例2においてHPLCピークトップ23.2分の成分（B-Fr.1））の1H NMRスペクトル：δ 6.59 (dq, J=15.0, 6.4 Hz, 1H), 6.54 (dq, J=15.0, 1.7 Hz, 1H), 5.15 (d, J=7.4 Hz, 1H), 4.97 (d, J=5.2 Hz, 1H), 2.25 (ddq, J=12.0, 6.85, 5.2 Hz, 1H), 1.98 (dd, J=6.4, 1.7 Hz, 3H), 1.88 (ddq, J=12.0, 7.4, 6.3 Hz, 1H), 1.19 (d, J=6.8 Hz, 3H), 1.16 (d, J=6.3 Hz, 3H)
(9) 保持時間が短い成分（実施例2においてHPLCピークトップ23.2分の成分（B-Fr.1））の13C NMRスペクトル：δ136.07, 132.46, 89.17, 62.01, 50.99, 48.95, 17.66, 16.23, 15.20
(10) 保持時間が長い成分（実施例2においてHPLCピークトップ24.4分の成分（B-Fr.2））の1H NMRスペクトル：δ 6.57 (dq, J=15.0, 7.0 Hz, 1H), 6.50 (d, J=15.0 Hz, 1H), 5.36 (d, J=4.0 Hz, 1H), 5.19 (d, J=5.2 Hz, 1H), 2.53 (m, J=6.3 Hz, 1H), 1.96 (d, J=7.0 Hz, 3H), 1.93 (m, J=6.9, 5.2 Hz, 1H), 1.21 (d, J=6.9 Hz, 3H), 1.09 (d, J=6.3 Hz, 3H)
(11) 保持時間が長い成分（実施例2においてHPLCピークトップ24.4分の成分（B-Fr.2））の13C NMRスペクトル：δ135.92, 132.50, 83.42, 61.52, 47.28, 44.46, 17.98, 15.19, 12.42
【００６２】
実施例2．  式１の化合物の誘導
（１）PRENCSO＋アリイナーゼの反応液から
1.5 mlマイクロチューブに250 U/ml のアリイナーゼ溶液（500 mM リン酸ナトリウムバッファー（pH 7.0）,10％グリセロール，25 μMピリドキサールリン酸）30 μlを採った。ここに20 mg/mlのPRENCSO水溶液20 μlと蒸留水50 μlを加えて酵素反応を開始させた。反応開始から30秒後に10 μg/mlホルモノネチン含有イソプロパノール300 μlを添加し、30秒間混合した。チューブを15000rpmで3分間遠心し、その上清をHPLCを用いて下記の条件にて分析したところ、式1の化合物が誘導されたことが確認された。
【００６３】
結果を図2(a)に示す。HPLC保持時間25.0分の単一のピークが観察された。このピークに対応するHPLCフラクションを「A1フラクション2」とする。A1フラクション2は実施例1-3においてシリカゲルで精製した画分Aに相当する。HPLC保持時間22.4分から24.5分にかけて、2つ以上のピークが観察された。これらのピークに対応するHPLCフラクションを「A1フラクション1」とする。A1フラクション1は実施例1-3においてシリカゲルで精製した画分Bに相当する。なお「A1」はZwiebelane isomerを指す。「A1フラクション1」、「A1フラクション2」はそれぞれ「Zwiebelane isomerフラクション1」、「Zwiebelane isomerフラクション2」を意味する。
【００６４】
（２）LFS抑制タマネギから
10 ml容ガラス製遠沈内で、LFS発現抑制タマネギ (非特許文献3記載に記載されている、RNAi技術を用いて作出された、LFS活性が通常タマネギの約1/20に低減された、LFS発現抑制タマネギ) のバルブの凍結粉砕物1.5 gに蒸留水5 mlを加え、30秒間ボルテックッスで混合した後、3分間室温にて放置した。次に少量のNaCl、5 mlのジエチルエーテルを加えた後、1分間ボルテックスで混合し、3500rpmで10分間遠心した。有機層を回収し、再度ジエチルエーテルによる抽出を繰り返した。集めた有機層に無水硫酸マグネシウムを加え脱水し、フィルターろ過した。その後、窒素ガスによる濃縮乾固を行い、10 μg/mlホルモノネチン含有メタノールに溶解した後、HPLCを用いて下記の条件にて分析したところ、式1の化合物が誘導されたことが確認された。
【００６５】
結果を図2(b)に示す。上記(1)でのHPLC分析結果と同様の結果が得られた。
【００６６】
比較のために、LFS発現抑制タマネギのバルブに代えてLFS非抑制タマネギのバルブを用いた以外は上記と同様の方法及び条件により試料を調製しHPLC分析を行った。結果を図2(c)に示す。式1の化合物はPDA（フォトダイオードアレイ検出器）では検出されなかった。
【００６７】
［HPLC条件]
HPLC：Agilent 1100 Series、検出波長：254nm、カラム：ThermoFisher ODS Hypersil 250mm X 4.6mm, 5μm、カラムオーブン：30℃、移動相（CH3CN/H2O）：0分(18%/82%), 45分(90%/10%), 50分(90%/10%), 50.1分(18%/82%)、60分(18%/82%)、流速：0.5 ml/分
【００６８】
実施例3.  式1の化合物の溶液中での安定性
1.5 ml マイクロチューブに250 U/ml のアリイナーゼ溶液（500 mM リン酸ナトリウムバッファー（pH 7.0）,10％グリセロール，25 μMピリドキサールリン酸）60 μlを採った。ここに20 mg/mlのPRENCSO水溶液30 μl を加えて酵素反応を開始させた。反応開始から30秒後に水または酢酸（約 1.7、0.17、0.017 mol/l） 10 μlと、水またはイソプロパノール300 μlを添加し混合し5℃で保存した。保存開始後4時間毎に12時間、式1の化合物についてHPLCを用いて下記の条件にて分析を行い、保存開始直後に対する残存率を確認した。
【００６９】
[HPLC条件]
HPLC：Waters 2695 Separaions Module、検出器：Waters 2998 Photodiode Array Detector、検出波長：254nm、カラム：ThermoFisher ODS Hypersil 250mm X 4.6mm, 5μm、カラムオーブン：30℃、移動相（CH3CN/H2O）：0分(35%/65%), 35分(87.5%/12.5%), 40分(35%/65%), 50分(35%/65%)、流速：0.6 ml/分
【００７０】
式1の成分の残存率算出時のHPCLのチャートを図3に示す。式1の成分の残存率の経時的変化を図4に示す。図4(a)は式1の成分を含む反応液に水300 μlと各濃度の酢酸を添加した系の結果を示し、図4(b)はイソプロパノール300 μlと各濃度の酢酸を添加した系での結果を示す。いずれの場合も、酸性にすることによって安定性が増した。また、式1の成分はpHが6以下になると安定性が増した。
【００７１】
実施例4. 式１の化合物の調製：活性測定用
実施例5及び6の活性測定に用いるために、式１の化合物の異性体である、A1フラクション1とA1フラクション2を以下の方法で調製・精製した。
【００７２】
10ml容量のガラス製遠沈管に250 U/ml のアリイナーゼ溶液（500 mM リン酸ナトリウムバッファー（pH 7.0）,10％グリセロール，25 μMピリドキサールリン酸）4mlを量り取った。そこに20 mg/mlのPRENCSO水溶液2mlを加えて酵素反応を開始させた。反応開始から30秒後にクロロホルム3mlを添加し、ボルテックスで30秒間混合した。遠沈管を室温、3000rpmで5分間遠心した後、有機層約3mlをガラス製遠沈管に回収した。さらに、残った水層にクロロホルムを3ml添加し、30秒間ボルテックスで混合した。その後、室温、3000rpmで5分間遠心して、有機層約3mlを一回目と同じガラス製遠沈管に回収した。得られた有機層に適量の無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。脱水後の溶液は、エバポレーターで200μl程度まで濃縮した後、アセトニトリル300μlを加えて、分取HPLC試料とした。
【００７３】
上記得られた分取HPLC試料は、リサイクル分取HPLC（日本分析工業株式会社製）に供し、A1フラクション1、2をそれぞれ分取した。A1フラクション1の保持時間は117〜143分、A1フラクション2の保持時間は160〜167分であった。
【００７４】
分取したA1フラクション1、2の量は、それぞれ約100mlと約30mlであった。その後、分取したA1フラクション1、2に飽和するまで塩化ナトリウムを加えて、水とアセトニトリル層を分離させた。分離したA1フラクション1、2からそれぞれアセトニトリル層を回収し、無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。脱水後のA1フラクション1、2は、5ml程度までエバポレーターで濃縮した。濃縮したA1フラクション1、2に蒸留水5 ml、クロロホルム10mlを加えて、30秒間ボルテックスで混合した。その後、室温、3000rpmで5分間遠心して、クロロホルム層約5mlを回収した。それぞれ回収したクロロホルム層に適量の無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した。脱水後の各溶液を0.45μmのディスクフィルターでろ過した後、エバポレーターで乾固させた。乾固後は一晩凍結乾燥し、翌日重量測定を行った。
【００７５】
上記一連の操作を2度実施し、A1フラクション1を11.2mg、A1フラクション2を2.5mg得た。
【００７６】
[リサイクル分取HPLCの条件]
カラム：Intertsil ODS-3 20φ×250mm（GLサイエンス）とPEGASIL ODS 20φ×250mm（センシュー科学）の直列, 移動相：0.1%TFAを含有した40%アセトニトリル , 検出波長：254nm , 流速：5.0ml/分
【００７７】
実施例5. 式1の化合物のCOX-1阻害活性
＜使用試薬＞
26 U/μlのCOX-1（Cayman Chemical：76011）を100 mM Tris-HCl（pH 8.0）で2.6 U/μlに希釈した。COX-1の補酵素として、ヘム（Cayman Chemical：760116）を100 mM Tris-HCl（pH 8.0）で22.7倍希釈した。基質として、22 mMのアラキドン酸エタノール溶液（Cayman Chemical）を0.5 mM KOH溶液で110 μMに希釈した。ポジティブコントロールとして、濃度の異なるアスピリン（Cayman Chemical：70260 / 179.2 mM、44.8 mM、11.2 mM、2.8 mM）のエタノール溶液を調製した。阻害活性試験用試料として、濃度の異なる式1の化合物のA1フラクション1とA1フラクション2（11.2 mM、2.8 mM、0.7 mM、0.175 mM）のエタノール溶液を調製した。
【００７８】
阻害活性試験比較用試料として、濃度の異なるアリシン（LKT Laboratories, Inc：A4440 / 44.8 mM、11.2 mM、2.8 mM、0.7 mM）のエタノール溶液を調製した
【００７９】
＜実験方法＞
1.5 mlのマイクロチューブに200 mM Tris-HCl（pH 8.0）Buffer、蒸留水、ヘム、COX-1を下表に従って添加した。次に、テスト区では各種濃度のアスピリン、又は各種濃度のA1フラクション1、A1フラクション2、又はアリシンを添加して24℃の恒温槽で5分加温した。その後、アラキドン酸溶液を加えて24℃の恒温槽で更に1分加温した後、800 μlのエタノールを添加して酵素反応を止めた。一方、Blank区ではアスピリン、A1フラクション1、A1フラクション2、アリシンの代わりにエタノールを添加して上記と同様の操作を行った。各反応液をUPLC-MS/MSで分析を行い、アラキドン酸のCOX-1による反応産物であるプロスタグランジンH2（PGH2）を検出した。試料の酵素阻害率は、以下の式で求めた。
【００８０】
酵素阻害率（%）＝｛（ブランク区のPGH2のピーク面積−テスト区のPGH2のピーク面積）／ブランク区のPGH2のピーク面積）｝＊100
【００８１】
［UPLC-MS/MS条件］
UPLC：Waters Acquity、カラム：Waters Acquity UPLC BEH C18 100 mm X 2.1 mm, 1.7 μm、カラムオーブン：40℃、移動相（1mM トリエチルアミン（TEA）in CH3CN/1 mM TEA in H2O）：0分(10%/90%), 10分(60%/40%), 10.5分(80%/20%), 15.5分(80%/20%), 15.51分(10%/80%), 35分(10%/80%)、流速：0.3 ml/分、サンプルトレイ：5℃
検出器：Micromass Quattro Premier XE、Ionizationモード：ネガティブ、Capillary電圧：3 kV、Cone電圧：15 V、Source温度：120℃、Desolvation温度：350℃、Coneガス流速：50 L/hr、Desolvationガス流速：600 L/hr、Collisionエネルギー：16 eV、MRM条件：Parent m/z=351, Daughter m/z=271
【００８２】
【表１】
0005701117.tif 000004
【００８３】
アスピリン、A1フラクション1、A1フラクション2、アリシンのCOX-1阻害率の測定結果をそれぞれ図5(a)、図5(b)、図5(c)、図5(d)に示す。
【００８４】
検討の結果、本評価系でのアスピリンのIC50（酵素反応液200μl中での濃度）は3.3 mMだった。A1フラクション1のIC50（酵素反応液200μl中での濃度）は41.8 μM、A1フラクション2のIC50は35.4 μMだった。
【００８５】
以上の結果から、A1フラクション1はアスピリンの約79倍、A1フラクション2はアスピリンの約93倍、阻害活性が高いことがわかった。
【００８６】
更に、図5(b)〜図5(d)の対比から、A1フラクション1及びA1フラクション2によるCOX-1阻害活性が、同じチオスルフィネート基を有するアリシンによるCOX-1阻害活性と比較して、予想外に顕著に高いことが明らかとなった。
【００８７】
実施例6. 式1の化合物のα-グルコシダーゼ阻害活性
＜使用試薬＞
牛血清アルブミン（シグマ社製）を0.01Mのリン酸バッファーpH7.0で溶解し、0.2%溶液を作製した。α-グルコシダーゼ（和光純薬社製：076-02841）を、この0.2%牛血清アルブミン溶液で希釈し、37.2mU/mlのα-グルコシダーゼ溶液を作製した。また、α-グルコシダーゼの合成基質として、p-ニトロフェニルα-D-グルコピラノシド（和光純薬社製：325-34671）を蒸留水で溶解し、0.02M溶液を作製した。反応停止として、炭酸Na溶液を蒸留水で溶解した0.2 M溶液を作製した。ポジティブコントロールとして、濃度の異なるカフェ酸（100, 50, 25. 12.5, 6.25, 3.125 μg/μl）のエタノール溶液を作製した。A1フラクション1 (112mM)と、A1フラクション2 (56mM)は、COX阻害活性と同じ試料を使用した。
【００８８】
＜実験方法＞
1. カフェ酸による阻害活性
96wellのプレートに0.1Mリン酸バッファーpH7.0とα-グルコシダーゼ溶液を下表の添加量加え、37℃の恒温槽に5分間入れた。次に、各種濃度のカフェ酸溶液または、エタノールを3.75μl加え、37℃の恒温槽でさらに5分加温した。Test区では、p-ニトロフェニルα-D-グルコピラノシド溶液25μlを加え37℃の恒温槽でさらに15分加温した後、炭酸Na溶液を100μl加え、酵素反応を止めた。一方Blank区では、15分の加温時にp-ニトロフェニルα-D-グルコピラノシド溶液は添加せず、炭酸Naで酵素反応を止めた後に添加した。試料の酵素活性量と酵素阻害率は、以下の式で求めた。
酵素活性量＝（Test区の400nmの吸光度の平均）−（Blankの400nmの吸光度の平均）
酵素阻害率（％）＝（エタノール区の酵素活性量−試料の酵素活性量）＊100／（エタノール区の酵素活性量）
【００８９】
【表２】
0005701117.tif 000005
【００９０】
結果を図6(a)に示す。検討の結果、本評価系でのカフェ酸のIC50（酵素反応液100μl中での濃度）は12.9 mM（2.33μg／μl）だった。
（繰り返し数はtest区でn=3、Blank区でn=2）
【００９１】
2. A1フラクション1とA1フラクション2による阻害活性
112mM のA1フラクション1溶液を、エタノールで2倍ずつ段階的に希釈した（112, 56, 28, 14, 7 mM）。56mM のA1フラクション2溶液も、エタノールで2倍ずつ段階的に希釈した（56, 28, 14, 7, 3.5 mM）。これらの調製したA1フラクション1溶液とA1フラクション2溶液を試料とし、カフェ酸と同じ方法で、酵素活性量と酵素阻害率を算出した。
【００９２】
ただし、以下の2点は、修正を行った。
1.  吸光度測定前の溶液に濁りが生じることがあったので、遠心分離によって濁りを除いた後、400nmの吸光度は測定した。
2．アセトニトリル濃度が試料溶液によって20%〜1.25%まで幅があるため、試料と同じ濃度のアセトニトリル含有エタノールを作成しこれをコントロール（カフェ酸の場合のエタノール添加区に匹敵）とした。
【００９３】
A1フラクション1、A1フラクション2のα-グルコシダーゼ阻害率の測定結果をそれぞれ図6(b)、図6(c)に示す。検討の結果、本評価系でのA1フラクション1のIC50（酵素反応液100μl中での濃度）は1.54 mM、A1フラクション2のIC50は0.85 mMだった。
（繰り返し数はtest区でn=3、Blank区でn=2）
【００９４】
以上の結果から、A1フラクション1はカフェ酸の約8倍、A1フラクション2はカフェ酸の約15倍、阻害活性が高いことがわかった。
【００９５】
実施例7. タマネギでのLFS活性と式1の化合物の生成量との関係
＜実験方法＞
2.0mlのマイクロチューブに、実施例1-2に記載した方法で調製した精製アリイナーゼ、及び下記のように調製したタマネギパウダー、rLFSを下表に従い混合した（但しアリイナーゼは最後に添加した）。25℃で4分間反応させた後、10%酢酸水溶液30μlを加えボルテックスで混合した。4℃、15000rpmで5分間遠心し、上清を回収した。回収した上清は、0.45μmフィルターでろ過した後、HPLCで分析した。
【００９６】
[HPLC条件]
HPLC：Waters 2695 Separaions Module、検出器：Waters 2998 Photodiode Array Detector、検出波長：254nm、カラム：SunFire C18（waters社製）250mm X 4.6mm, 5μm、カラムオーブン：30℃、移動相（CH3CN/H2O）：0分(35%/65%), 35分(87.5%/12.5%), 40分(35%/65%), 50分(35%/65%)、流速：0.6 ml/分
【００９７】
【表３】
0005701117.tif 000006
【００９８】
各試料は、種々のLFS活性を有するタマネギ粉砕物を模している。試料名は、各試料のLFS活性が、通常のタマネギ粉砕物でのLFS活性の何分の一に相当するかを示す。
【００９９】
LFS活性と式1の化合物の生成量との関係を図7に示す。式1の化合物はLFSの活性が通常のタマネギの1/20以下になると増加することが確認できた。
【０１００】
タマネギパウダーの調製方法
生タマネギ1玉（約300 g）の外皮をはがし、ラップをして電子レンジで5分間加熱した。液体窒素で急速凍結した後、減圧下、-10℃で凍結乾燥した。凍結乾燥後、乳棒、乳鉢を用いて直径1mm以下のパウダーになるように粉砕した。作製したパウダーは、使用時までシリカゲルを入れたデシケーター内で保存した。
【０１０１】
rLFSの調製方法
WO 02/020808 A1に記載された方法により、遺伝子組み換え法によりLFSを作製した。
【０１０２】
概要は次のとおりである。コンピテント法により、LFSタンパクを発現するプラスミド（pGEX-4T-3-E2-3-1）を大腸菌に導入し、形質転換体を得た。得られた形質転換体を100μg/mlのアンピシリンを含むLB培地で37℃で振盪培養した。培地にイソプロピル‐β‐チオガラクトピラノシド（IPTG）を添加して生産誘導するとGSTとE2‐2-3-1の融合タンパク質（以下、GST-E2-3と称す）が菌体内に蓄積した。
【０１０３】
上記のようにして形質転換体を培養し、菌体を遠心分離によって集めた後、超音波破砕した。遠心によって回収した上清をグルタチオンセファロース４ Fast Flowカラム（アマシャムファルマシア製）に流し、GST融合タンパク質をカラムに吸着させた。カラムを洗浄後、還元型グルタチオンを含む溶出バッファーで、融合タンパク質を溶出し、E2-3融合タンパク質試料の精製物を得た。
【０１０４】
融合タンパク質試料をHiTrap Desaltingカラム（アマシャムファルマシア）製に流し、還元型グルタチオンを除去し、再度グルタチオンセファロース4 Fast Flowカラムに吸着させた。カラムを洗浄後、トロンビンを含むバッファーでカラムを満たし、室温で２時間プロテアーゼ処理をおこなって、GSTタグを融合タンパク質から切り離した。GSTタグを除いた組換えE2-3をカムから溶出させ、さらに、この溶出液にBenzamidine Sepharose 6を加え混合し、遠心分離することによって溶出液中のトロンビンを除き、組換えE2-3試料を得た（これをrLFSとしている）。
【図５ｄ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７】
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