(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蚊帳試料中のＩＩ型ピレスロイドの存在を検出するための溶液ベースの方法であって、溶媒／水の溶液中の塩基を試料に添加し、水素化物ドナーと水素化物アクセプターとの混合物を試料に添加するか、またはその逆を行い、試料の色の変化を観察するステップを含む方法。
【請求項２】
水素化物ドナーがパラ−ニトロベンズアルデヒドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
水素化物アクセプターがジニトロベンゼンまたはテトラゾリウム塩である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
酸溶液を添加することによって反応を停止させるステップをさらに含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
蚊帳におけるＩＩ型ピレスロイドの存在を試験するためのキットであって、
蚊帳試料を入れるための容器、溶媒の供給手段、水素化物ドナーの供給手段、水素化物アクセプターの供給手段、酸の供給手段、および塩基の供給手段を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に蚊帳および噴霧された壁におけるＩＩ型ピレスロイドの存在を検出するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
殺虫剤処理済み蚊帳（ＩＴＮ）および殺虫剤の室内残留性噴霧（ＩＲＳ）は、マラリア対策における介入の主要な様式として使用されている。蚊帳および壁に実際に付着した殺虫剤の量を測定することは、適用された介入の品質管理を指導書に則って評価する際に欠かすことができない。現在のところ、このような情報は、高価で高度なガスクロマトグラフィー［１，２］、高速液体クロマトグラフィー［３］の技法によってのみ得ることができるが、これらの技法は、容易に利用することができず、分析研究室を設置していない分野では現時点で使用不可能である。それ以外の方法としては、円錐形容器またはチューブ等のＷＨＯ生物検定キットを使用して、殺虫剤感受性系統の蚊を含浸蚊帳材料に曝露する生物検定が挙げられる。こうした生物検定によれば蚊帳に残存する殺虫剤の残留活性を明らかにすることができ、また、こうした生物検定を使用することによって、蚊帳に対する処理の質、すなわちまだ蚊を殺せるかどうかを間接的に推断することができる［４］。生物検定は、その実行の際の技術的な要求が厳しく、研究室および昆虫飼育設備に出入りできる熟練した人員を必要とする。また、現場で蚊帳に対して生物検定を実行することは非常に困難であり、この決定方法を行うためには蚊帳を家庭から移動させなければならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
一般的に、蚊帳の含浸の監視は、衛生管理従事者からの報告および蚊帳使用者に対する質問に限定されている。したがって、専門でない人が実施することができる、現場で扱いやすく費用対効果の大きい適切な試験が必要とされている。簡便な試験で蚊帳における殺虫剤の量およびＩＲＳの順守を決定できるようにすべきである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、例えば、蚊帳または噴霧された壁から殺虫剤を抽出し、殺虫剤の存在を比色分析によって確認するための迅速で簡便な方法を開発した。
【０００５】
ＩＩ型ピレスロイドはαシアノエステル基を含有する種類のピレスロイドであり、修飾されたピレスロ酸(pyrethroic acid)誘導体によってシアノヒドリン、多くの場合はｍ−フェノキシベンズアルデヒドシアノヒドリンをエステル化することによって得られる。このようなピレスロイドの例は、シペルメトリン、デルタメトリンおよびシハロトリンである。これらのＩＩ型ピレスロイドは塩基性条件下で容易に加水分解され、それによりピレスロ酸誘導体、ｍ−フェノキシベンズアルデヒドおよびシアン化物が形成される。ＩＩ型ピレスロイドを検出する試験は、ＩＩ型ピレスロイドが加水分解される際のシアン化物の形成および検出に基づいて開発されたものである。
【０００６】
試験は、αシアノピレスロイドの加水分解によって得られる遊離のシアン化物の検出に基づいている。遊離のシアン化物は芳香族アルデヒドと反応してシアノヒドリンを形成することができる。芳香族アルデヒドが電子吸引性基（複数可）によって置換される際、第２の化合物が適切なアクセプターである場合に電子移動反応が発生し得る。上記反応において、水素化物がシアノヒドリンから水素化物アクセプター分子に移動し、次いで水素化物アクセプター分子が還元される。このプロセスを通して、水素化物アクセプター分子の物理的特性が変化し得る。このプロセスにおいて、芳香族アルデヒドからシアン化アシルが形成される。塩基性条件下でシアン化アシルが加水分解されてシアン化物が放出され、次いでシアン化物が再び水素化物移動反応に加わることができる。
【０００７】
本発明によれば、試料中のＩＩ型ピレスロイドの存在を検出するための方法であって、塩基を試料に添加するステップと、水素化物ドナーと水素化物アクセプターとの混合物を試料に添加するステップと、試料の色の変化を観察するステップとを含む方法が提供される。試験がＩＩ型ピレスロイドから発生するシアン化物の検出に基づくことから、シアン化物を放出することができる有機または無機物質に対してこの試験を応用することもできる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
塩基は任意の塩基であってもよく、通常は水酸化物の水または溶媒／水の混合物の溶液であってもよい。塩基の濃度は使用される他の試薬によって決まるが、一般的には０．１〜１０００ｍＭの範囲であろう。
【０００９】
水素化物ドナーおよび水素化物アクセプターという用語は、当技術分野で十分に公知である。任意の水素化物ドナーまたは水素化物アクセプターを使用してもよい。ドナーおよびアクセプターは、２つの異なる化合物であってもよいし、または、ある状況においては、同一の化合物がドナーおよびアクセプターの両方となってもよい。水素化物ドナーの例は、芳香族アルデヒド、特にニトロ、シアノ、トリメチルスルホニルおよびトリハロメチルスルホニル基等の１つまたは複数の電子吸引性基によって置換された芳香族アルデヒドを含む。分子上での電子吸引性基の好ましい位置はパラ位である。水素化物ドナーの例は、パラ−ニトロベンズアルデヒド、パラ−シアノベンズアルデヒド、およびパラ−メチルスルホニルベンズアルデヒドを含む。
【００１０】
水素化物アクセプター化合物は、置換基がオルト位またはパラ位の電子吸引性基であるような置換されたニトロ芳香族化合物等の化合物を含む。このような化合物は、パラ−ニトロベンズアルデヒド、１，２−ジニトロベンゼン、１，４−ジニトロベンゼンおよび４，５−ジニトロ安息香酸を含む。水素化物アクセプターとしては、テトラゾリウム塩も有用である。
【００１１】
テトラゾリウム塩は、例えば、トリフェニルテトラゾリウムクロリド、テトラゾリウムブルー、ニトロテトラゾリウムブルー、ヨードニトロテトラゾリウム、テトラゾリウムバイオレット、ＷＳＴ−１である。
【００１２】
試薬の成分の最適な濃度は、水素化物ドナーおよびアクセプター化合物として選択されるものに応じてそれぞれ１〜１０００ｍＭおよび１〜５００ｍＭの範囲内である。
【００１３】
ピレスロイドはピレトリンの合成形態である。この用語は当技術分野で十分に公知である。ＩＩ型ピレスロイドは、例えば、シペルメトリン、シフルトリン、シハロトリン、デルタメトリン、シフェノトリン、フェンバレレートおよびフルバリネートを含む。好ましいＩＩ型ピレスロイドは、デルタメトリン、α−シペルメトリンおよびλ−シハロトリンを含む。
【００１４】
試料は、ピレスロイドが見いだされてもよい任意の試料であってもよい。例えば、試料は、ピレスロイドの溶液であってもよく、または、ピレスロイドで処理された物品の試料であってもよく、またはピレスロイドで処理された物品から得られてもよい。特に、試料は、ピレスロイドが噴霧されていてもよい蚊帳または壁であってもよい。さらに、試料は、このような物品から得られたスワブであってもよい。試料がピレスロイドを含浸させたまたは噴霧した物品である可能性がある場合には、上記方法は、好ましくは、ピレスロイドを有機溶媒で抽出するステップを含む。溶媒は、好ましくは、水素化物ドナーおよびアクセプターより前にまたは水素化物ドナーおよびアクセプターと同時に試料に添加される。任意の溶媒を使用してもよいが、ピレスロイドを抽出でき、試薬を溶解でき、塩基の水溶液と混和できる溶媒であることを条件とし、溶媒の例は、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロパノール、メトキシエタノール、エトキシエタノール、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、２−ピロリドンおよびＮ−メチル２−ピロリドンを含む。
【００１５】
試薬および溶媒が使用される場合、試薬および溶媒は任意の適切な方法で試料に添加されてもよい。例えば、試薬および溶媒を試料に対して噴霧してもよく、または試薬および溶媒がそれぞれ入っている容器の中に試料を浸漬してもよい。
【００１６】
試料自体が着色されている場合には、試薬を添加する際に見られる色の変化が試料の色によって妨げられよう。したがって、溶媒を添加した後で試料を希釈する必要がある場合もある。一方、分光光度計、例えばマイクロタイタープレートリーダーを使用することにより、試料の色の吸収を反応生成物から差し引くことも可能である。
【００１７】
試薬を添加した後で反応を停止させることが望ましい場合がある。この場合、上記方法は、酸溶液を添加することによって反応を停止させるステップをさらに含んでもよい。酸は、有機酸、例えば酢酸、または無機酸、例えばＨＣｌのいずれであることもできる。
【００１８】
上述のように、ＩＩ型ピレスロイドが存在する場合に試料の色が変化する。パラ−ニトロベンズアルデヒドおよび１，２−ジニトロベンゼンが使用される場合には、色は青紫色に変化する。青紫色という用語は、５００ｎｍ〜６００ｎｍ、より好ましくは５２０ｎｍ〜５８０ｎｍ、より好ましくは５４０〜５７０ｎｍの波長を有する任意の色を意味するために使用される。
【００１９】
本発明を以下に詳細に、例示によってのみ記載する。
【００２０】
水素化物移動反応
芳香族アルデヒドを起点とする水素化物移動反応は、化学文献中においてよく知られている。ベンズアルデヒドと水酸化物との反応、いわゆるカニッツァーロ反応がその例であり、この反応では水素化物が第２の分子に移動し、ベンズアルデヒドが還元され、安息香酸およびベンジルアルコールが反応において形成される。芳香族アルデヒドとシアン化物との反応により一般的にシアノヒドリン中間体を経てベンゾイン化合物が形成され、このベンゾイン化合物は別の芳香族アルデヒド分子と反応してベンゾインを形成することができ、ベンゾイン縮合と呼ばれる。反応全体において、シアン化物は触媒として作用し、最終生成物中には見いだされない。全ての芳香族アルデヒドがシアン化物の存在下においてベンゾイン縮合による生成物を生成できるわけではない。特定の置換された芳香族アルデヒドの場合には、カニッツァーロ反応において見られるプロセスと類似するプロセスにおいて水素化物移動反応がシアノヒドリン中間体を起点として発生することができる。上記系において芳香族アルデヒドよりも良好な水素化物アクセプターが存在する場合には、芳香族アルデヒドの第２の分子の代わりにこの化合物が還元されるであろう。このプロセスにおいて芳香族シアン化アシルが形成され、芳香族シアン化アシルが反応条件下において加水分解されて、芳香族カルボン酸およびシアン化物が付与されるであろう。後者によって新しい反応サイクルが開始される可能性があることから、シアン化物は触媒として作用する。
【００２１】
水素化物移動反応に加わるであろうアルデヒドの種類は、１つまたは複数の電子吸引性基、例えばニトロ、シアノ、トリメチルスルホニル、トリハロメチルスルホニルで置換されたベンズアルデヒド等の芳香族アルデヒド、特にアルデヒド基に対して電子吸引性基がパラ位にあるものである。
【００２２】
水素化物（電子）アクセプター分子は、それ自体単独で作用でき、容易に測定することができる特性の変化を与えることができる任意の種類の化合物であってもよい。使用することができる化合物の種類は、置換基が電子吸引性基、特にオルトまたはパラ位のニトロ基である置換されたニトロ芳香族化合物、例えば１，２および１，４−ジニトロベンゼンならびに関連する化合物である。
【００２３】
水素化物のニトロ基への移動によってまずニトロソ基が形成され、次いでニトロソ基が第２の水素化物の移動シフトを受けてヒドロキシルアミノ基に変換される。１，２および１，４−ジニトロベンゼンの場合、水酸化物との反応によって、濃く着色された生成物が形成される可能性がある。１，２−ジニトロベンゼンの場合には、最大値は５６０ｎｍである。
【００２４】
一方、ヒドロキシルアミノ化合物はニトロソ化合物および／または試験において水素化物ドナーとして使用される芳香族アルデヒドと反応し、着色された生成物を付与することができる。水素化物ドナーとして作用する芳香族アルデヒドがニトロ基で置換されている場合には、この芳香族アルデヒドは別の水素化物アクセプターの非存在下において水素化物アクセプターとしても反応に加わることができる。色の出現は、溶媒および試験において使用される塩基の濃度（ｐＨ）に依存する。
【００２５】
上記以外の水素化物アクセプターの種類は、いわゆるテトラゾリウム化合物である。水素化物によって還元されると、濃く着色された生成物（ホルマザン）が形成される。これらの水素化物アクセプターは、不溶性のホルマザンを付与するであろうテトラゾリウム塩および水溶性のホルマザンを提供するように設計されているテトラゾリウム塩であってもよい。
【００２６】
水素化物移動反応は、使用される溶媒、系における水の量および塩基の強さ（ｐＨ）に依存する。溶媒は、水と混和できる種類のものであるべきである。
【００２７】
試験系におけるｐＨは、ＩＩ型ピレスロイドの加水分解を生じさせることができるように十分に高くあるべきであり、水素化物移動反応にとって最適であるべきである。最適なｐＨは、水素化物ドナーおよびアクセプター分子の選択によって決まる。
【００２８】
一般的な手順
チューブに入った一片の蚊帳に溶媒ｘμｌを添加し、続いて同じ溶媒中の水素化物ドナー化合物ｘμｌおよび水素化物アクセプターｘμｌ（または試薬を添加する順序を逆にする）を添加し、最後に塩基の水溶液ｘμｌを添加する。蚊帳にＩＩ型ピレスロイドを含浸させた際に、溶液が着色し始めるであろう。
【００２９】
見える色の濃さは、蚊帳から放出されたＩＩ型ピレスロイドの量に依存する。一方、蚊帳または噴霧された表面のスワブ(swap)を作り、類似する方法で処理することができる。
【実施例１】
【００３０】
チューブに入った一片の蚊帳に、メタノール２００μｌ、メタノール中の２００ｍＭ  ｐ−ニトロベンズアルデヒド２００μｌおよび１００ｍＭ  １，２−ジニトロベンゼン２００μｌを添加する。１２５ｍＭ  ＮａＯＨ水溶液２００μｌを添加すると、ＩＩ型ピレスロイドが存在する場合に青紫色に着色し始めることになる。
【実施例２】
【００３１】
チューブに入った一片の蚊帳に、パラニトロベンズアルデヒド（１００ｍＭ）のアセトニトリル溶液６００μｌ、続いて５０ｍＭ  ＮａＯＨ水溶液２００μｌを添加する。ピンク色が現れ始めることになる。
【実施例３】
【００３２】
チューブに入った一片の蚊帳に、エタノール２００μｌ、エタノール中の２００ｍＭパラシアノベンズアルデヒド２００μｌ、テトラゾリウムバイオレット２００μｌ、最後に１０ｍＭ水性ＮａＯＨ  ２００μｌを添加する。紫色が現れ始めることになる。
【実施例４】
【００３３】
チューブに入った一片の蚊帳に、メトキシエタノール２００μｌ、メトキシエタノール中の２００ｍＭ  ｐ−ニトロベンズアルデヒド２００μｌおよび１００ｍＭ  １，２−ジニトロベンゼン２００μｌを添加する。１２５ｍＭ  ＮａＯＨ水溶液２００μｌを添加すると、ＩＩ型ピレスロイドが存在する場合に青紫色に着色し始めることになる。
【実施例５】
【００３４】
ピレスロイドの検出
多様な標準ピレスロイドを含有する溶液を、試薬Ｉ（ＮａＯＨ）で、続いて試薬ＩＩ（パラニトロベンズアルデヒドおよび１，２−ジニトロベンゼンの溶液）で処理した結果、青紫色が生成した。試薬ＩおよびＩＩを順序を逆にして添加することもできる。デルタメトリン、α−シペルメトリン、λ−シハロトリンでは青紫色が迅速に形成されるがペルメトリンでは形成されないことから、蚊帳に含浸させる際に今回使用されたα−シアノピレスロイドがこの試験において検出されたことが示される。
【００３５】
形成された反応生成物の吸収曲線は最大値が約５６０ｎｍである。青紫色の存在によって、結果を目視によって判断することが容易となる、すなわち、色が濃いほどピレスロイドの量と相関しているということである。
【００３６】
試験は９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて実行することもでき、これにより、試験抽出物の濃度をマイクロタイタープレートリーダーを使用して決定することができる。特殊なフィルタを購入する必要はなく、プレートリーダーについている標準的な種類のフィルタを使用して、感度を大きく低下させることなく、広い範囲の波長（５００〜６００ｎｍ）にわたって吸光度を測定することができる。酸を添加することによって反応を停止させた際に色の変化が見られる場合があり、適切な波長において測定することができる。生成した色は試験されたピレスロイド全てにおいて同一であり、さらにプレートリーダーから得られた値によって、上記試験の反応はデルタメトリン（ＤＭ）、α−シペルメトリンおよびλ−シハロトリンについては同一であるがペルメトリンは検出されなかったことが確認された。
【実施例６】
【００３７】
試料からのデルタメトリンの抽出効率
デルタメトリンを含む蚊帳を使用するこのプロセスに対して最適な条件を確立するために、多様な有機溶媒および加水分解の条件を検討した。次いで、手順全体、すなわち抽出および着色反応に対して最良の溶媒を決定するために、蚊帳を使用する実験を実施した。その蚊帳についてＨＰＬＣによる分析も行った。
【００３８】
蚊帳を裁断した（２．５×２．５ｃｍとし、各蚊帳を溶媒５００μｌ［Ａ〜Ｅ］中で抽出し、この抽出物５０μｌを比色試験に使用して、残りは２０μｌをカラム上に注入してＨＰＬＣ分析を行った）。
【００３９】
デルタメトリンは、蚊帳の試料の５１番からは抽出されなかったが、試験試薬で処理された場合に紫色の形成を示した。試料についての説明を参照すると、試料の５１番はデルタメトリンで処理されていない（その故に値が示されなかったのである）が、α−シペルメトリンを含むことが分かった。ＨＰＬＣクロマトグラムを再度考査すると、検出されたピークはα−シペルメトリンであることが確認された。この後者のピレスロイドは、溶媒Ａ中においてわずかな反応を示し、溶媒Ｃ、ＤおよびＥ中ではより強い反応を示すが、溶媒Ｂ中においては反応を示さない。
【００４０】
ＨＰＬＣ分析の結果から、蚊帳から多様な殺虫剤を抽出するための溶媒を最適化する必要性と、試験において使用される条件とが適合していなければならないであろうということが確認される。比色反応に影響を及ぼす溶媒もあるであろう。
【実施例７】
【００４１】
試験管およびマイクロタイタープレートにおいて試験を使用することの適合性
試験管またはマイクロタイタープレートのそれぞれの適合性を示すために蚊帳の試料を使用した。各蚊帳の試料（２．５×２．５ｃｍ）を、ＤＭの抽出において最も効率が高いことが見いだされている溶媒Ａ（２ｍｌ）中において抽出した。上記試験は半定量的な性質を有することが予想されるが、このことを示すために、既知の量のＤＭもマイクロタイタープレート中において使用した。
【００４２】
試験管における試験の適合性を示す：
上記の蚊帳の抽出物１００μｌを試験管の中に配置し、続いて試薬混合物Ｉ（２００μｌ）、次いで試薬ＩＩ（１００μｌ）を添加した。
【００４３】
マイクロタイタープレートを使用する試験の適合性を示す：
既知の濃度のＤＭ（０〜６２．２５μｇ／ｍｌ、２５μｌ）および上記の蚊帳の抽出物（各２５μｌ）を、マイクロタイタープレートの各ウェルの中に配置した。次いで試薬混合物Ｉ（５０μｌ）、続いて試薬ＩＩ（２５μｌ）を各ウェルに添加し、生成した色をプレートリーダーを使用して読み取った。
【００４４】
プレートリーダーを使用して色の濃さを測定するための適切な時間を示す：
既知の量（μｇ／ｍｌ）のＤＭによって形成された色の測定値を得るため、上記プレートを１５および３０分後に監視した。
【００４５】
実験を実施することによって、試薬ＩおよびＩＩを同量、すなわち抽出物の量に対して２倍となる量で使用した際、抽出物の体積の影響によって色がより濃くなるということが見いだされる。上記試験は、抽出された染料による干渉を克服することができる十分な感度を有しているか：
多くの蚊帳が明るく着色され、染料が試験を妨げるか否かを知ることが重要である。着色された多くの蚊帳からの染料は、ＤＭを抽出するために有機溶媒が使用された場合には抜けることはない。しかしそれ以外の場合には、この試験において必要な抽出手順の間にＤＭによって染料も抽出されることが考えられ、これによって試験の比色反応が妨げられるであろう。多くの場合は、明るく着色された蚊帳の抽出物は無色であるが、染料が抽出される場合には２通りの方法がある。試験の感度が十分であって試料をさらに希釈できる場合には抽出物の溶液を希釈することができ、その結果として染料による干渉が低減される、およびまたは反応生成物の吸収から吸収を差し引くことができ、この場合はマイクロタイタープレートリーダーを使用する必要がある。
【００４６】
試験の感度は、蚊帳の試料の寸法、上記試料を抽出するために使用される溶媒の体積および試験系において使用される試料の抽出物の量等の要因に依存するであろう。上述の抽出物の試料２５μｌおよび５０μｌを各ウェルの中において試薬混合物Ｉ（５０μｌ）、続いて試薬ＩＩ（２５μｌ）によって処理した。
【実施例８】
【００４７】
３つの代表的なＩＩ型ピレスロイド（デルタメトリン、λシハロトリン、シペルメントリン）についての、試験が一次性となる範囲の確立
色の形成の一次性は、分析の標準およびＨＰＬＣによって特徴づけられたＩＴＮ抽出物、すなわち色の濃さとピレスロイドの量との関連を用いることによって探究された。
【００４８】
マイクロタイタープレートリーダーを使用して５４４ｎｍにおいて測定したところ、色の形成は、試験反応を開始した後から６０分後までの任意の時点においてＤＭの濃度と正比例することが示された。
【実施例９】
【００４９】
ピレスロイドの分解生成物の試験
本発明者らは、上記以外のいくつもの既知のピレスロイドの分解生成物を購入し、試験することができた。これらの生成物は上記試験において反応しなかった。
【実施例１０】
【００５０】
偽陽性の有無を調べる試験
本発明者らは、殺虫剤によって処理された材料に存在する可能性がある他のもの（例えば洗浄に使用される石けん、配合添加剤、パラフィン、木炭等）による偽陽性の確度を、ＨＰＬＣによって特徴づけられた抽出物の多くにおいて探究した。
【００５１】
蚊帳は何回も洗浄される可能性があるため、本発明者らは、標準的な石けんによる影響を試験し、蚊帳を洗浄するために使用されるＷＨＯ指定の石けんの存在下において色が薄くなるか否かを調べた。本発明者らはまた、蚊帳にデルタメトリンを含浸させるために使用される結合剤（Ｂａｙｅｒ）の存在下における反応も実施した。理論的には、この結合剤は反応の開始に影響を及ぼす可能性があった。石けんまたは結合剤の存在下において、ＤＭは色の濃さに対して干渉しない。
【実施例１１】
【００５２】
溶媒の選択
異なる溶媒によるピレスロイドを抽出する能力を試験した。溶媒Ｂ中に溶解させた市販のＤＭを既知の濃度において試験管の中に配置した（各１００μｌ）。次いで各チューブに試薬混合物Ｉ（２００μｌ）、続いて試薬ＩＩ（１００μｌ）を添加した。色の形成を上記の所与の時間間隔で記録した。
【実施例１２】
【００５３】
経時的な色の変化
反応生成物の青紫色は３０〜６０分間の間経時的に強くなるが、安定しておらず、経時的に変化することが見いだされた。反応生成物の色は一晩で青紫色からオレンジ色に変化した。
【実施例１３】
【００５４】
反応の停止
色の強度は経時的に増大し続けるであろう。これは反応の触媒特性によるものであり、感度の非常に高い試験が得られるのはこのためである。したがって、本発明者らは、所与の任意の時点において色の形成を経時的に測定することができるように、反応を停止させる方法を開発した。
【００５５】
これは、第３の試薬（酸）をインキュベーション混合物に添加することによって達成されており、これによって反応が停止して色が青紫色から黄色に変化し、色の変化はλ＝４５０ｎｍにおいて測定することができる。この色に対して必要なフィルタは、マイクロタイタープレートリーダーの標準的な付属品である。この手順を使用することによって、４５０ｎｍにおいて測定される吸収の値（Ｏ．Ｄ）は、反応を停止させる前に５４４ｎｍにおいて測定される吸収の値の約半分となる。色は安定しており、試薬ＩＩＩを添加することによって反応を停止させてから１週間後でもまだ視認可能である。
【００５６】
特定の時間に反応を停止させることができることを示すために、ブラインド蚊帳の試料２０個の抽出物を使用した。
【実施例１４】
【００５７】
蚊帳の試料に対する試験の適用
本発明者らは蚊帳からの試料２０個を試験し、蚊帳の色、溶媒Ａ中に抽出された色および最後にＨＰＬＣによって測定されたＤＭの量を記録した。この分析においては溶媒Ａを使用した。結果を表１中に示す。表は、試料が何であるか、本発明者らによる任意(無原則）の番号、蚊帳の色、溶媒Ａ中に抽出された際に生成した色および最後に検出されたＤＭの量を示す。太字のＤＭの量は溶媒Ｂで抽出した後にプレートリーダーで測定したものであり、括弧内の量は溶媒Ａ中に抽出されＨＰＬＣによって測定された量である。２つの方法で検出されたＤＭの量は異なるが、これは抽出プロセスにおいて異なる溶媒が使用されるためである。８５６８番の蚊帳は、ＤＭではない可能性があることを示す。
【実施例１５】
【００５８】
一片の蚊帳をチューブの底に配置し、溶媒Ａ  ２００μｌ、置換されたベンズアルデヒド、例えば溶媒Ａ中のパラニトロベンズアルデヒド、パラシアノベンズアルデヒドの混合物４００μｌおよび塩基溶液２００μｌをチューブに添加する。色が現れ始め、適切な時間の経過後に酸溶液２００μｌを添加して反応を停止させる。
【００５９】
【表１】
0005762753.tif 000002