(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を含む流体が流れる流路と、
前記流路の第１の位置で前記流体が流れる方向とは異なる方向に勾配を有する電場を、細胞の分取を指示する分取信号に応じて印加することが可能な電場印加部と、
前記流路の第１の位置より下流の第２の位置で前記電場が印加されて誘電泳動力によって流れ方向が変わった細胞を分岐する分岐部と
を具備し、
前記電場印加部は、前記電場を形成するための電極対を、前記流路での流体の流れ方向に沿って複数有し、
これら電極対のそれぞれ、又はいくつかに分けられた電極対グループのそれぞれは、個別に電場を制御することが可能であり、前記細胞の分取方向に応じて順次電場を形成し、
前記電極対は、前記勾配を有する電場を形成するため、信号が印加される電極指とコモン電極とからなり、
前記電極指と前記コモン電極との間隔が、前記勾配を有する電場を形成するための領域以外の領域では、一定とされている
細胞分取装置。
【請求項２】
基板と、
基板に設けられ、細胞を含む流体が流れる流路と、
基板に設けられ、細胞を分取するための分取信号が入力される入力部と、
前記流路の第１の位置に設けられ、前記入力部から分取信号を使って前記流体が流れる方向とは異なる方向に勾配を有する電場を印加する電極対と、
前記流路の第１の位置より下流の第２の位置で前記電場が印加されて誘電泳動力によって流れ方向が変わった細胞を分岐する分岐部と
を具備し、
前記電極対は、前記流路での流体の流れ方向に沿って複数設けられ、
これら電極対のそれぞれ、又はいくつかに分けられた電極対グループのそれぞれが、個別に電場を制御することが可能な分取信号であって、前記細胞の分取方向に応じて順次電場を形成する分取信号が、前記入力部に入力され、
前記電極対は、前記勾配を有する電場を形成するため、信号が印加される電極指とコモン電極とからなり、
前記電極指と前記コモン電極との間隔が、前記勾配を有する電場を形成するための領域以外の領域では、一定とされている
細胞分取チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的とする細胞を分取するための細胞分取装置、細胞分取チップ及び細胞分取方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞を分取する装置として、蛍光フローサイトメータやセルソータが知られている。これらの装置では、各細胞が適切な振動条件（一般には、出口流速は数ｍ／ｓであり、振動数は数１０ｋＨｚである。）の下で周囲流体によって吐出口にて気液界面に閉じ込めら、同時に各細胞には電荷を与えられる。各細胞は、静電場が印加された空中を荷電量に応じた方向へ液滴として飛翔し、最終的に流路外に設けた分取用容器内に分取される。
【０００３】
この技術は流速が前述のように比較的速い場合において有用であるが、流速の遅いフローサイトメータや誘電サイトメータにおいては、液滴化および吐出条件を満足することは困難である。このため、むしろ分岐を設けた流路内で分取動作を行い、その後段で細胞を保持することが望ましい。
【０００４】
流路内での分取機構として、例えばピエゾ素子等を用いることによって流体の流れ方向を変え、流体中の細胞を間接的に駆動する方法が提案されている。しかしながら、その機械的素子の応答性はミリ秒程度であり、流路の圧力波の応答性を考慮すると、細胞の分取速度には限界がある。
【０００５】
一方、細胞を直接駆動する方法として、誘電泳動法が提案されている。特許文献１では、細胞種間での誘電泳動力の差と沈降速度の差を利用して、電極を敷設した流路を流れる細胞を種類別に分離している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００３−５０７７３９号公報（図１〜図２など参照）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、誘電泳動力に寄与する細胞の大きさなどに比べると、細胞種間での誘電泳動力の差は非常に小さく、しかも細胞径や細胞周期等、本質的に細胞が持ち合わせている同種細胞の中でのばらつきを考慮すると、実際にはそういった分別はうまく機能しないものと予想される。
【０００８】
従って、本発明の目的は、流速の遅い環境下においても応答性がよくしかも確実に細胞を分取することができる細胞分取装置、細胞分取チップ及び細胞分取方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る細胞分取装置は、流路と、電場印加部と、分岐部とを具備する。  
流路は、細胞を含む流体が流れる。  
【００１０】
電場印加部は、前記流路の第１の位置で前記流体が流れる方向とは異なる方向に勾配を有する電場を、細胞の分取を指示する分取信号に応じて印加することが可能である。  
分岐部は、前記流路の第１の位置より下流の第２の位置で前記電場が印加されて誘電泳動力によって流れ方向が変わった細胞を分岐する。
【００１１】
本発明では、電場の勾配が誘電泳動力に寄与する度合いが細胞種間での誘電泳動力の差などに比べると非常に大きいことに着目してものである。予め何らかの手法による測定部ないし測定値解析部などから発せられる分取信号に応じて、電場をオン・オフまたは振幅変調し、選択的に細胞に電場を印加して誘電泳動力を与える。これにより、細胞径や物性にばらつきを持った細胞群であっても、例えば分取対象である細胞についてのみ、十分な誘電泳動力によって、流速の遅い環境下においても応答性がよくしかも確実に細胞を分取することができる。
【００１２】
本発明の一形態として、前記電場印加部は、前記電場を形成するための電極対を複数有し、これら電極対のそれぞれ、又はいくつかに分けられた電極対グループのそれぞれは、個別に電場の制御が可能であってもよい。
【００１３】
本発明では、誘電泳動力を発するための電場を形成する電極対が例えば流路中に設けられており、これら電極対のそれぞれ、又はいくつかに分けられた電極対グループのそれぞれは、個別に電場の制御が可能である。従って、電極対が設けられている分取領域において複数の細胞が存在していても、電場の制御によってそれぞれの細胞を確実に選択的に分取することが可能である。
【００１４】
本発明の一形態として、前記電場印加部は、前記電場を形成するための電極対を複数有し、前記各電極対は、前記各電極対において誘電泳動力が極大となる位置が誘電泳動力によって流れ方向が変わった細胞の平均的な軌跡に沿うように、設けられていてもよい。
【００１５】
本発明では、このように各電極対を設けることで、誘電泳動力の位置依存性を効果的に用いることができる。これにより、電極対の数を減らし、コスト低減などを図ることができる。
【００１６】
本発明の一形態として、前記電場印加部は、前記勾配を有する電場を形成するため、信号が印加される印加電極とコモン電極とからなる電極対を有し、前記印加電極は、前記勾配を有する電場を形成するための領域以外の領域では、前記コモン電極との間隔が一定とされていてもよい。
【００１７】
本発明では、主流方向（細胞を含む流体が流れる方向）における電極対と電極対との間のある部分において、細胞に対して逆向きの力が発生する箇所が存在してしまうが、このようなコモン電極により、主流方向に細胞が泳動する際、逆向きの誘電泳動力は、その力が働く区間がない、あるいは正の向きの領域に比べて無視できるほど小さくなる。
本発明に係る細胞分取チップは、基板と、入力部と、流路と、電極対と、分岐部とを具備する。  
流路は、基板に設けられ、細胞を含む流体が流れる。  
入力部は、基板に設けられ、細胞を分取するための分取信号が入力される。  
電極対は、流路の第１の位置に設けられ、前記入力部から分取信号を使って前記流体が流れる方向とは異なる方向に勾配を有する電場を印加する。  
分岐部は、流路の第１の位置より下流の第２の位置で前記電場が印加されて誘電泳動力によって流れ方向が変わった細胞を分岐する。  
【００１８】
本発明では、このような構成の細胞分取チップを用いることで、細胞径や物性にばらつきを持った細胞群であっても、分取対象である細胞についてのみ、十分な誘電泳動力によって、流速の遅い環境下においても応答性がよくしかも確実に細胞を分取することができる。
【００１９】
本発明に係る細胞分取方法は、流路に細胞を含む流体を流す。流路の第１の位置で流体が流れる方向とは異なる方向に勾配を有する電場を分取信号に応じて選択的に印加する。そして、流路の第１の位置より下流の第２の位置で電場が印加されて誘電泳動力によって流れ方向が変わった細胞を分岐することで、細胞を分取する。 
【００２０】
本発明では、このような方法によって、細胞径や物性にばらつきを持った細胞群であっても、分取対象である細胞についてのみ、十分な誘電泳動力によって、流速の遅い環境下においても応答性がよくしかも確実に細胞を分取することができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、流速の遅い環境下においても応答性がよくしかも確実に細胞を分取することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明に係る細胞機能分析・分取システムの概念的な図である。
【図２】図１に示した細胞機能分析・分取システムに適用することが可能な細胞分取チップの構成を示す斜視図である。
【図３】図２に示した分取部の構成（分取信号オフ）を示す平面図である。
【図４】図３のＡ−Ａ断面図である。
【図５】図２に示した分取部の構成（分取信号オン）を示す平面図である。
【図６】電場印加部の他の構成（その１）を示す平面図である。
【図７】図６に示した電極印加部における各グループに対する電場印加を制御するための構成を示すブロック図である。
【図８】図７に示した増幅器に入力されるイネーブル信号のタイミングを示す図である。
【図９】電場印加部の他の構成（その２）を示す平面図である。
【図１０】電場印加部の他の構成（その３）を示す平面図である。
【図１１】電場印加部の他の構成（その４）を示す平面図である。
【図１２】電場印加部の他の構成（その５）を示す斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の実施の形態を図面に基づき詳細に説明する。
（細胞機能分析・分取システムの概略）
図１は本発明に係る細胞機能分析・分取システムの概念的な図である。  
【００２４】
図１に示すように、細胞機能分析・分取システム１は、マイクロ流路（以下、単に「流路」と呼ぶ。）２に沿って、その上流より投入部３、測定部４、分取部５、細胞取出部６、７、流出部１０が設けられている。
投入部３は、サンプリングされた細胞Ｃを含む液体が例えばポンプを使って投入される。  
流路２は、投入部３より投入された液体が流れる。  
【００２５】
測定部４は、流路２中を流れる一個一個の細胞Ｃに対して、細胞Ｃの誘電緩和現象が起こる周波数範囲（例えば０．１ ＭＨｚから５０ ＭＨｚ）の多点周波数（３点以上、典型的には１０から２０点程度）にわたり、それらの細胞Ｃの複素誘電率を測定する。測定部４は、測定した細胞Ｃの複素誘電率に基づき分取すべき細胞Ｃかを判断し、分取すべき細胞Ｃの場合には分取信号を出力する。測定部４は、例えば電極対から構成される信号検出部と、検出された信号に基づき細胞Ｃの機能を分析する細胞機能分析部とから構成してもよい。
【００２６】
分取部５は、投入部３から投入された複数種類の細胞Ｃのうち、所望とする細胞Ｃを細胞取出部５に、それ以外の細胞Ｃを細胞取出部６に分取する。分取部５は、電場印加部８と、分岐部９とを有する。
【００２７】
電場印加部８は、流体が流れる方向Ｘとは異なる方向、例えばＸ方向とは直交するＹ方向に勾配を有する電場を印加することが可能である。例えば、電場印加部８は、分取信号を入力されていないときには電場を印加しないが、分取信号を入力すると、電場を印加する。もちろん、その逆であっても構わない。
【００２８】
分岐部９は、電場印加部８で電場が印加されない細胞Ｃについては分岐流路２ｂを通り細胞取出部７に流れるように分岐し、電場印加部８で電場が印加された細胞Ｃについては分岐流路２ａを通り細胞取出部６に流れるように分岐する。
細胞取出部６、７は流路２を介して流出部１０へ通じており、細胞取出部６、７を通過した液体は流出部１０より例えばポンプを使って外部に排出される。
【００２９】
ここで、液体中に存在する細胞Ｃに電場を印加すると、媒質と細胞Ｃの分極率の違いにより誘起双極子モーメントが生じる。印加電場が不均一である場合、電場強度が細胞Ｃ周囲で異なるために、誘起双極子によって式（１）に示す誘電泳動力が生じる。式（１）において、ε’m は媒質の複素比誘電率（複素比誘電率は式（２）によって定義）の実部、εv は真空誘電率、R は細胞半径、Ermsは印加された電場のRMS値である。また、K は式（３）に示されるClausius-Mossotti関数であり、同式中のε*pとε*mはそれぞれ細胞Ｃと媒質の誘電率である。
【００３０】
【数１】
0005732816.tif 000002
既に説明したとおり、特許文献１では、細胞種間のKの違いに着目して誘電泳動法単独で細胞Ｃを分別している。これに対して、この細胞機能分析・分取システム１では、細胞種類ごとの誘電泳動力の違いは周波数依存性を敢えて用いず、予め何らかの別の手法による測定部ないし測定値解析部から発せられる分取信号に応じて、電場をオン・オフまたは振幅変調して印加し、細胞径や物性にばらつきを持った細胞群であっても、分取対象である細胞Ｃについてのみ、十分な誘電泳動力によって分取する。
【００３１】
（細胞機能分析・分取用のチップ）
図２は図１に示した細胞機能分析・分取システム１に適用することが可能な細胞分取チップの構成を示す斜視図である。  
図２に示すように、チップ１１は、基板１２及び高分子膜等からなるシート状の部材１３を有する。基板１２には、流路２、分岐流路２ａ、２ｂ、投入部３としての液体投入部３ａ、分岐部９、細胞取出部６、７、流出部１０が設けられている。これらは、基板１２の表面に溝などを形成し、その表面をシート状の部材１３で覆うことで構成される。
【００３２】
細胞Ｃを含め液体が投入される細胞投入部３ｂは、シート状の部材１３の微細な孔を設けて構成され、その上にピペットで細胞Ｃを含む液体を垂らすと、微細な孔を介して流路２を流れる液体に巻き込まれるように流路２の下流に流れていく。微細な孔であることから、細胞Ｃは複数まとめて流路２に流れ込むことなく、１個ずつ流路２に流れ込んでいく。
【００３３】
微細な孔を挟むように一対の信号検出電極４ａ、４ｂが設けれている。一方の信号検出電極４ａはシート状の部材１３の表面に、他方の信号検出電極４ｂはシート状の部材１３の裏面に設けられている。電場印加部８を構成する電極対（後述する）もシート状の部材１３の裏面に設けられている。
細胞取出部６、７はその上部がシート状の部材１３により覆われているが、シート状の部材１３にピペットを刺してピペットを介して細胞Ｃが取り出される。
【００３４】
電極パッド１４は信号検出電極４ａ、４ｂで検出された信号を外部に取り出す。取り出された信号は例えば細胞機能分析部（図示を省略する。）に送られる。入力部としての電極パット１５は細胞機能分析部から出力される分取信号が入力される。入力された分取信号は電場印加部８を構成する電極対に送られる。
貫通孔２６は、チップ１１が細胞機能分析部等を有する装置本体に装着されたときの位置決め用の孔である。
【００３５】
（分取部の構成）
図３は図２に示した分取部５の構成を示す平面図、図４は図３の断面図である。
図３及び図４に示すように、分取部５は、電場印加部８と、分岐部９とを有する。
電場印加部８は、流路２の所定の位置に設けられた電極１６、１７を有する。例えば、電極１６と電極１７とが流路２を流れる流体の方向（Ｘ方向）とは異なる例えばＹ方向に流路２を挟むように対向して配置されている。
【００３６】
電極１６、１７は、シート状の部材１３の裏面（流路２内の天面）に設けられている。電極１６は、例えば信号が印加される電極で、電極１７に向けて多数の電極指１６ａが突出するように構成される。電極１７は、例えばコモン電極で、電極１６に対して凹凸を持たないように構成される。以下では、一つの電極指１６ａと電極１７との組み合わせを電極対１８と呼ぶ。
このように電極対１８を構成することで、電極１６、１７に信号が印加されたときに、各電極対１８でそれぞれＹ方向に勾配を有する電場が印加される。
【００３７】
分岐部９は、流路２の電場印加部８より下流の所定の位置で、電場印加部８により電場が印加されて誘電泳動力によって流れ方向が変わった細胞Ｃを分岐する。分岐部９は、流路２がＹ字状に分岐して構成され、一つは分岐流路２ａを通り細胞取出部６に向けて分岐し、もう一つは分岐流路２ｂを通り細胞取出部７に向けて分岐する。
【００３８】
例えば、投入部３においては細胞Ｃが細胞取出部７側の偏った位置に投入される。このように細胞取出部７側の偏った位置に投入された細胞Ｃは、分取対象でない細胞Ｃが電場印加部８を通過するときには電場印加部８で電場が印加されず（ｎｏｎ−ａｃｔｉｖｅ）、図３に示したように、流路２をその偏った位置側を流れそのまま分岐流路２ｂを通り細胞取出部７に流れる。しかし、分取対象の細胞Ｃが電場印加部８を通過するときには電場印加部８で電場が印加され(ａｃｔｉｖｅ)て細胞Ｃに誘電泳動力が与えられ、図５に示すように、細胞Ｃの流れ方向が細胞取出部６側に変わり、その分取対象の細胞Ｃは分岐部９により分岐流路２ａを通り細胞取出部６側に分岐される。  
【００３９】
このように構成された電場印加部８では、各電極対１８でそれぞれＹ方向に勾配を有する電場が印加されるので、電場印加部８を通過する細胞Ｃが徐々に行路を変えて分岐流路２ａを通り細胞取出部６側に分岐することが可能となる。
【００４０】
（電場印加部の他の構成（その１））
細胞Ｃが致命的ダメージを受けない程度の電場下で細胞Ｃが受ける誘電泳動力は、ｍｍ/ｓ程度の流速で水中を流れる細胞Ｃが受ける粘性抵抗力に比べて、一般に非常に小さい。従って、流れに直交する方向の誘電泳動力を積極的に形成するための不均一電場、あるいはそれを形成するための電極対１８の列は、多数必要になる。図３及び図５に示したように、この多数の電極対１８に同時に電圧を印加した場合、その電極列分取領域を排他的に使用せねばならず、スループットが上がらない場合がある。
【００４１】
そこで、図６に示すように、電極対１８の列をグループＧ１〜Ｇ５に分け、これらのグループＧ１〜Ｇ５に対して個別に印加電圧を制御することにより、電場印加部８を通過する細胞Ｃの多重化を許してスループット向上を図ることが可能である。すなわち、図３及び図５に示した構成の電場印加部８では、１つの細胞Ｃが電場印加部８を通過するまでは、その後からくる細胞Ｃが電場印加部８に侵入しないようなタイミングで流路２に細胞Ｃを流すようにしなければならない。これに対して、図６に示した構成の電場印加部８では、例えばグループＧ５を通過している細胞Ｃは電場を印加して、グループＧ４を通過している細胞Ｃは電場を印加しないような制御が可能なので、結果として５つのグループＧ１〜Ｇ５においてそれぞれ細胞Ｃの分取制御が可能となる。
図７はこのような電極印加部８における各グループＧ１〜Ｇ５に対する電場印加を制御するための構成を示すブロック図である。
【００４２】
図７に示すように、電場を印加するための交流源１９からの信号は、それぞれ増幅器２０１〜２０５により増幅され、各グループＧ１〜Ｇ５に対して供給される。遅延回路付信号発生器２１は、信号解析部２２から分取信号を入力すると、図８に示すように、増幅器２０１から順番に、２０２、２０３、２０４、２０５に対してイネーブル信号を出力する。各増幅器２０１〜２０５に出力するイネーブル信号の期間は、分取すべき細胞Ｃが当該グループＧ１〜Ｇ５を通過している期間に一致する。これにより、電極印加部８の領域に入った細胞Ｃが分取すべきものである場合、その細胞ＣがグループＧ１から順番に、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５においてそれぞれ通過する際に電場が印加され、細胞Ｃの流れ方向が順次変わっていき細胞取出部６側に分岐される。
なお、グループ単位ではなく、電極対単位で上記の制御を行ってももちろん構わない。
【００４３】
（電場印加部の他の構成（その２））
図９は電場印加部８の他の構成を示す平面図である。
図９に示すように、この電場印加部８は、各電極対１８において誘電泳動力が極大となる位置が、誘電泳動力によって流れ方向が変わった細胞Ｃの平均的な軌跡に沿うように、各電極対１８が設けられている。電極対１８において誘電泳動力が極大となる位置は、通常、電極指１６ａの先端部であるから、これらの先端部が上記の軌跡に沿うように、各電極対１８が設けられている。
【００４４】
本発明に係る電極対１８の列は、目的とする細胞Ｃを分取する上で効率的な不均一電場を形成するように設計されているが、不均一電場ゆえに電極対１８間（電極指１６ａと電極１７との間）において誘電泳動力の位置依存性が存在する。すなわち、電極指１６ａと電極１７との間では、誘電泳動力は一定とはならず、電極指１６ａの先端部が誘電泳動力が極大となる。図９に示した電場印加部８では、このような誘電泳動力の位置依存性を効果的に用いることで電極対の数を減らし、コスト低減などを図ることができる。
【００４５】
（電場印加部の他の構成（その３））
図１０は電場印加部８の他の構成を示す平面図である。
図１０に示すように、この電場印加部８では、各電極１６の電極指１６ａは流路２を横切るように等間隔で配置され、各電極１７の電極指１７ａは隣り合う電極１６の電極指１６ａ間に流路２を横切るように等間隔で配置されている。各電極１６の電極指１６ａは長方形状であり、対向する２辺は流路２を液体が流れる方向と直交している。各電極１７の電極指１７ａは二等辺三角形状であり、隣接する電極１６の電極指１６ａに対して傾斜する辺となっている。各電極１６の電極指１６ａに対してその両側の隣接する電極１７の電極指１７ａは鏡面対称となっている。
【００４６】
このように構成された電場印加部８では、各電極１６（１７）間における電場の勾配は均一となり、分取対象となる細胞Ｃは電場印加時にはその電場勾配の２乗に比例した大きさで紙面上向きに移動する。
【００４７】
（電場印加部の他の構成（その４））
図１１は電場印加部８の他の構成を示す平面図である。
図１１に示すように、この電場印加部８では、各電極１６の電極指１６ａは流路２に対して突出しており、各電極指１６ａを囲うように電極１７が設けられている。この電場印加部８では、図１０に示した電極の構造と異なり、電極指１６ａが勾配を有する電場を形成するための領域以外の領域では、電極１７との間隔が一定とされている。すなわち、上記領域において、電極１７は電極指１６ａと隣接する部分において平行になっているので、主流方向に細胞Ｃが泳動する際、逆向きの誘電泳動力が働く区間がない、あるいは正の向きの領域に比べて無視できるほど小さい。
【００４８】
（電場印加部の他の構成（その５））
図１２は電場印加８部の他の構成を示す斜視図である。
図１２に示すように、この電場印加部８では、図３に示した電極印加部が流路２の床面と天井面の２か所に設けられている（電極印加部８ａ、８ｂ）。電極印加部８ａと電極印加部８ｂとは、流路２を流れる細胞Ｃに対して逆方向（細胞取出部６側とは細胞取出部７側）に誘電泳動力を与える。
このような構成を有することで、投入部３において細胞Ｃを偏った位置より投入する必要もなく、またより確実に細胞Ｃの分取が可能となる。
【００４９】
（作用効果）
予め何らかの別の手法による分取信号の発生が必要となるものの、細胞径や物性にばらつきを持った細胞群であっても、分取対象である細胞Ｃについてのみ、十分な誘電泳動力によって分取することが可能できるため、誘電泳動力感受率の違いによって分取する方法に比べ、分取精度が向上し、細胞治療等に用いるうえで絶対的に必要となる信頼性が高まる。
なお、本発明は、上記の実施形態には限定されず、その技術思想の範囲内で様々な変形が可能あり、その変形の範囲も本発明の技術的範囲に属するものである。
【符号の説明】
【００５０】
２  マイクロ流路
５  分取部
８  電場印加部
９  分岐部
１１  細胞分取チップ
１２  基板
１５  電極パット（入力部）
１６、１７  電極
１６ａ  電極指
１８  電極対
Ｃ  細胞
【図１】
0005732816.tif 000003
【図２】
0005732816.tif 000004
【図３】
0005732816.tif 000005
【図４】
0005732816.tif 000006
【図５】
0005732816.tif 000007
【図６】
0005732816.tif 000008
【図７】
0005732816.tif 000009
【図８】
0005732816.tif 000010
【図９】
0005732816.tif 000011
【図１０】
0005732816.tif 000012
【図１１】
0005732816.tif 000013
【図１２】
0005732816.tif 000014