(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫療法用の低アレルギー性物質候補を製造するための方法であって、
ａ）Bet v 2、Api m 1、Der p 2 および Api g 1からなる群より選ばれるアレルギー性ポリペプチドの単量体−単量体境界面を改変することによって、該ポリペプチドが天然で有する一過性二量体形成能を不活性化または低下させる工程であって、該単量体−単量体境界面は、該ポリペプチドをコードする核酸の部位特異的変異によって改変して、該ポリペプチドにアミノ酸置換を導入し、そして
ｂ）工程ａ）で得た改変ポリペプチドについて、ヒト細胞のヒスタミン放出に対する活性化能、または他のアレルギー反応性メディエーターに対する活性化能をin vitroで試験し、該アレルギー性ポリペプチドに特異的なＩｇＥ抗体が、工程ａ）で得た改変ポリペプチドにも結合することをさらに確認して、該改変アレルギー性ポリペプチドが未改変構造様の構造を有し、ＩｇＥ−ＦｃεＲＩ複合体とマスト細胞表面抗体または好塩基球表面抗体との架橋に対する防止能を有し、且つ防御性ＩｇＧ抗体の産生を生じる免疫能力を有することを検証し、ヒスタミン放出または他のメディエーターを活性化しない改変ポリペプチド、あるいはヒスタミン放出または他のメディエーターの活性化の程度が親ポリペプチドよりも低い改変ポリペプチドであって、未改変構造様の構造を有するものを、免疫療法用の低アレルギー性物質候補とする
ことを包含する方法。
【請求項２】
工程ｂ）で使用するヒト細胞が、白血球またはマスト細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該置換が、小さな残基からより大きな残基への置換、あるいは疎水性残基から親水性残基への置換であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー性（過敏性）疾患の分野、特に免疫療法に使用するための修飾アレルギー性ポリペプチド（低アレルギー性物質）を製造するためのタンパク質工学技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー性疾患（例えば、喘息、鼻炎、湿疹および食物アレルギー）は、全世界において流行性疾患となりつつある。これらＩ型過敏性反応は、原則として無害な抗原であるアレルゲンに対して形成された免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体に基づくものである。
【０００３】
免疫グロブリンＥ分子は、Ｂ細胞によって産生される。それぞれの未成熟Ｂ細胞が単量体型のＩｇＭをその表面に発現するが、これら抗体のアミノ酸配列は同一であるため、抗原の結合特異性も同一である。ＩｇＭ抗体に結合することによって、外来の多価抗原は未成熟Ｂ細胞表面のＢ細胞（Ｉｇα／Ｉｇβ）受容体に架橋する。これがＢ細胞の増殖、抗体産生性形質細胞への分化、記憶形成およびＴ細胞の抗原提示を誘引する。Ｔ細胞は、Ｂ細胞の成熟を手助けするためのアイソタイプ転換および体細胞変異の活性化の両方を担い、分泌抗体の親和性と選択性を向上させる。アレルギーが発症している場合、ヘルパーＴ細胞はＴｈ２細胞に分化し、Ｔｈ２細胞は、ＩｇＭ抗体からＩｇＥ抗体へのアイソタイプ転換（抗体の重鎖型がμからεに変わり、軽鎖型は変化しない）をもたらすサイトカイン（ＩＬ−４およびＩＬ−１３）を産生することが知られている（Alam et al., 2003、Chaplin 2003）。
【０００４】
その後、成熟Ｂ細胞は、抗原（アレルゲン）のみならず、マスト細胞表面または好塩基球表面の高親和性ＦｃεＲＩ受容体にも結合可能な、ＩｇＥ抗体を分泌できるようになる。細胞表面のＦｃεＲＩ複合体の架橋が、炎症反応を引き起こすヒスタミンなどの生物学的メディエーターおよび脂質メディエーターの顆粒化を誘発する（Prussin et al., 2003）。
【０００５】
既に報告されているように、細胞表面受容体の架橋には、２つの段階がある。１つ目は、抗原（アレルゲン）が未成熟Ｂ細胞表面上のＩｇα／Ｉｇβ受容体に架橋する時であり、２つ目はアレルゲンがマスト細胞表面のＦｃεＲＩ受容体に架橋する時である。更に、同様の架橋が、樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活性化の際にも見られる（Gould et al. 2008）。これらの事例においては、抗原（アレルゲン）が抗体に対する複数の結合部位（エピトープ）を有する多価物質である場合に、架橋が可能となる。
【０００６】
アレルゲンとＩｇＥ抗体の３次元免疫複合体構造が最近初めて発表された（Niemi et al., 2007）。この構造においては、牛乳由来の二量体型β−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）（Bos d 5）が２つのＩｇＥ／Ｆａｂ断片に結合している。驚くべきことに、ＢＬＧのＩｇＥ結合エピトープは、アレルゲン表面の平坦な領域に位置していた。結晶構造の観点からは、公知のＩｇＧエピトープの大部分が抗原の突出領域に位置していることから、これは珍しい現象である。ＩｇＥ／Ｆａｂ断片が同じ側面に位置しているということは、原理的には、二量体型ＢＬＧが２つの同じＩｇＥ抗体に結合することを可能にし、これはマスト細胞の顆粒化をもたらす。
【０００７】
ＢＬＧのアレルゲン性に係わる二量体化の役割に関するこの新規な知見を受けて、本発明者らは、さらにアレルゲンの二量体化（または他のオリゴマー化）の一般性に関する検証を行った。ある種のアレルゲンはオリゴマー化していると報告されているが、大部分のアレルゲンが単量体であると報告されている。文献には問題のあるデータが存在することもすぐに判明した。対応する事例、例えば、シラカバのアレルゲンであるBet v 1に関する報告によれば、このアレルゲンは単量体として存在し、時には二量体として存在する。実際、ＢＬＧはよく研究された一過性の二量体、即ち、溶液中に単量体または二量体として存在することのできるタンパク質の一例である（Nooren et al., 2003）。Sakurai and Goto (2002)においても、ＢＬＧの単量体−二量体平衡をタンパク質−タンパク質相互作用のモデルとして研究している。熱力学的には、二量体の解離定数は非常に高く、溶液中のＢＬＧは単量体と二量体の両方の形で存在し得る。当然、ｐＨや塩濃度などの環境因子は平衡に影響を与える。しかし、体内の生理学的な条件においては、ＢＬＧはほぼ完全に単量体である。本発明の鍵となる要素は、一過性の二量体化が多くの事例においてアレルゲンの重大な特徴であり、この一過性の二量体化は、部位特異的変異によって妨害可能であるということである。
【０００８】
一過性二量体の解離定数は高く、正常な細胞内濃度（１０〜１００ｎＭ）における二量体画分は無視できるほど小さくなるため、一過性二量体の検出は難しい。しかし、細胞内の共局在化によって局所的に濃度が増加した（〜１ｍＭとなった）場合、単量体間の相互作用は無視できるレベルから実質的なレベルにまで増加することがある（Kuriyan et al., 2007）。このような共局在化の一例が、抗原（アレルゲン）の未成熟Ｂ細胞表面またはマスト細胞表面への結合である。これは、細胞表面におけるアレルゲンの弱いホモ二量体化が、感作またはアレルギー反応に繋がるシグナル伝達を生じるのに十分であることを意味している。
【０００９】
アレルゲンの二量体化の重要性は、今までほとんど研究されていなかった。ショール（Scholl）らは、シラカバ花粉のアレルゲンであるBet v 1の架橋における二量体化の役割について研究した。Bet v 1アレルギー性マウス（mize）の皮膚試験においては、Bet v 1二量体に対して陽性だったが、単量体を用いた場合は陰性のままだった。更に単量体の方が、in vivoにおいてＩｇＥ産生のためにマウス記憶Ｂ細胞を活性化する能力が低かった。この研究では、単量体型のBet v 1は４％グリセリンの添加によって調製した（Scholl et al., 2005）。しかし、グリセリンは徐々に希釈されて、正常な単量体／二量体平衡に達してしまうため、添加剤の効果は一時的でしかないという問題がある。その後、分子モデリング解析によって、Bet v 1タンパク質ファミリーの一員であるＴ１タンパク質の非アレルゲン性は、Ｔ１タンパク質の二量体化が防止されていることに基づく可能性が示唆された（Ghosh D et al., 2008）。ヴェルディノ（Verdino）らは、Phl p 7アレルゲンの二量体構造の崩壊が架橋を減少させることを、２００２年に示唆した。しかし、Phl p 7の場合は、２本のポリペプチド鎖が非常に強固に会合して非常に安定な二量体を形成しているため、実際問題として、安定な単量体型変異体の作製は非常に難しい（Verdino et al. 2002）。 
【００１０】
ゴキブリアレルゲンであるPer a 3のアレルゲン性および免疫原性に対する四次構造の影響についても研究されている。六量体型は、好塩基球からのロイコトリエン放出を単量体型よりも強く誘導したことが報告されている。しかし、あいにくこの文献には、単量体型および六量体型のPer a 3の作製に関する記載がない（Bellinghausen et al., 2007）。ゴキブリのアレルゲンであるBla g 2に関する別の研究は、単量体型のBla g 2変異体よりも、二量体型の野生型Bla g 2の方が、マスト細胞によるβ−ヘキソアミニダーゼの放出をより多く誘導することを示した（Li et al. 2008）。しかし、著者は、生理学的条件下においてBla g 2は二量体として存在すると結論付けている。
【００１１】
de Halleux et al., 2006には、感作された患者に注射した場合、Der p 1の単量体型の方がアナフィラキシー反応を誘引しにくいと予想されるという記載がある。しかし、このような結果を示す実験に関する開示はない。
【００１２】
略称 
ＢＬＧ        β−ラクトグロブリン
ｃＤＮＡ      相補的デオキシリボ核酸
ＤＮＡ        デオキシリボ核酸
E. coli Escherichia coli
ＥＩＡ        酵素免疫アッセイ
ＥＬＩＳＡ    酵素結合免疫吸着アッセイ
Ｆａｂ        特異的抗原結合性を有する断片
ＩｇＧ        免疫グロブリンＧ
ＩｇＥ        免疫グロブリンＥ
ＩｇＭ        免疫グロブリンＭ
ＮＭＲ        核磁気共鳴法
ＰＣＲ        ポリメラーゼ連鎖反応
【００１３】
発明の詳細な説明
上で説明したように、二量体またはオリゴマーを形成する能力は、アレルゲンの免疫原性（Ｂ細胞の活性化）およびアレルゲン性（マスト細胞や好塩基球の誘発）に関して顕著な役割を担っていると考えられる。安定な対称ホモ二量体形成の減少、または一過性の対称ホモ二量体形成の減少でさえも実施できれば、アレルゲンは単量体型でのみ存在するため、新世代の低アレルギー性物質（即ち、単量体型アレルゲン）の開発のための基礎を提供することとなる。特異的な免疫療法を考慮すると、単量体型の異型は種々の有意な性質を有する。単量体型アレルゲンは、マスト細胞または好塩基球の脱顆粒化を誘発することはない。更に、単量体型の異型はアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体に結合し、未改変のアレルゲンの結合を防止する。これは、防御ＩｇＧ抗体の産生を誘導するか、天然アレルゲンと競合するアレルギーワクチンとなる単量体型の異型の大量使用を可能にする。また、架橋したＦｃεＲＩ複合体の形成を生じない低アレルギー性単量体型アレルゲンの高濃度使用に基づく競合によって、天然二量体型アレルゲンのマスト細胞または好塩基球への結合を減少させることも可能になる。
【００１４】
アレルゲン性に関する二量体化、特に一過性の二量体化、の重要性の発見に基づいた本発明の目的は、免疫療法用の低アレルギー性物質の製造方法を提供することである。この方法は、以下の工程を包含する。
ａ）公知のアレルギー性ポリペプチドの表面構造を確認して、二量体またはオリゴマーの形成に関与する表面構造（即ち、単量体−単量体境界面）を有するものを提供するか、あるいは二量体形成またはオリゴマー形成のための表面積の存在が既に解明されているポリペプチドを提供して次の工程ｂ）を直接実施し、
ｂ）二量体またはオリゴマーの形成に対する関与が判明したか予想される該ポリペプチドの表面積を改変することによって、該ポリペプチドが天然で有する二量体形成能またはオリゴマー形成能を不活性化または低下させ、そして
ｃ）工程ｂ）で得た改変ポリペプチドについて、ヒト細胞のヒスタミン放出に対する活性化能、または他のアレルギー反応性メディエーターに対する活性化能を試験し、ヒスタミン放出または他のメディエーターを活性化しない改変ポリペプチド、あるいはヒスタミン放出または他のメディエーターの活性化の程度が親ポリペプチドよりも低い改変ポリペプチドを、免疫療法用の低アレルギー性物質候補とする。
【００１５】
この方法は、該アレルギー性ポリペプチドに特異的なＩｇＥ抗体が、工程ｂ）またはｃ）で得た改変ポリペプチドにも結合することを確認して、該改変アレルギー性ポリペプチドが未改変構造様の構造を有し、ＩｇＥ抗体の結合に対する防止能を有し、且つ防御性ＩｇＧ抗体の産生を生じる免疫能力を有することを検証する工程を更に包含してもよい。
【００１６】
更にこの方法は、アレルギーを患う患者に、工程ｂ）またはｃ）で得た改変ポリペプチドを薬学的に効果的な量で投与する工程を更に包含してもよい。改変ポリペプチドは、アレルギーの免疫療法に使用するための薬学的に許容される担体および希釈剤と混合することもできる。
【００１７】
従って本発明は、アレルゲンの単量体型の異型（例えば、配列番号１〜４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する修飾β−ラクトグロブリン）の免疫療法における使用にも関する。本願において「免疫療法」という用語は、少なくとも次の３種の治療法として定義されるものである。
ａ）アレルゲンの単量体型の異型を、長期にわたり、低濃度で複数回投与する脱感作療法、
ｂ）比較的高濃度の単量体型の異型を数回のみ投与し、未改変のアレルゲンに対するＩｇＧ応答を誘導する方法（即ち、アレルギー予防接種計画）、そして
ｃ）単量体型の異型を、未改変アレルゲンとＩｇＥとの結合に競合させることによって、アレルギー症状を治癒する方法。
【００１８】
本発明は、特に本発明の方法によって得られた、配列番号１〜４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する修飾β−ラクトグロブリン、またはミルクアレルギー治療用の医薬組成物またはワクチンの製造のための上記修飾β−ラクトグロブリンの使用に関する。
【００１９】
更に本発明は、治療を必要とする患者に薬学的に効果的な量の低アレルギー性物質を投与することを特徴とする、ミルクアレルギーの治療法に関する。
【００２０】
該低アレルギー性物質を包含する医薬組成物またはワクチンは、保存のために、所望の精製度に達したタンパク質を、所望の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤と混合して凍結乾燥固体または水溶液にすることができる。許容される担体、賦形剤または安定化剤は、使用する用量および濃度においてレシピエントに対して非毒性のものであり、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液や他の有機酸系緩衝液等の緩衝液が挙げられる。
【００２１】
低アレルギー性物質は、マイクロカプセル（例えば、コアセルベーション技術によって製造したマイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース製またはゼラチン製のマイクロカプセルなど）、界面重合法によって製造したマイクロカプセル（ポリメチルメタクリレート製マイクロカプセルなど））、コロイド状のドラッグ送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）、あるいはマクロエマルジョンに封入することができる。
【００２２】
低アレルギー性物質の投与経路は公知の方法に基づくものであり、例えば、局所投与、経口投与あるいは静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼球内、動脈内または病巣内への注射または点滴による全身投与である。投与は連続的でも定期的でもかまわない。
【００２３】
一過性二量体
アレルゲンの一過性二量体形成に関する実験的研究について公開されたものは存在しない。しかし、入手可能な結晶構造を観察することによって、一過性二量体の頻度を評価することができる。典型的な結晶化実験におけるタンパク質濃度は、２０ｋＤａのタンパク質で０．５ｍＭ濃度に相当する約１０ｍｇ／ｍｌである。この濃度は、形成され得る二量体型タンパク質の画分を相当増加させることができる。しかし、結晶化溶液は、結晶化する可能性のある単量体画分も含んでいる点に留意しなければならない。更に、非常に高いか低いｐＨ、沈殿剤や添加剤も結晶化に影響を与えることがある。一過性であると予想される二量体境界面面積は５３０Å2（ＢＬＧ）、６２０Å2（Der p 1）または８２０Å2（Bet v 1）であることから、一過性二量体の二量体境界面の面積は約８５０Å2またはそれ以下が好ましい。より強固な二量体ほど大きな二量体境界面を有する傾向にあり、例えば、Bla g 2は１１３９Å2である。
【００２４】
従って、上述したように、「一過性二量体」という表現は、以下の特徴を有するものを意味する。
ａ）アレルゲンの二量体化は濃度依存性であり、生理学的な濃度（１０〜１００ｎＭ）においては、実質的に単量体として存在し、
ｂ）局所濃度の共局在化仲介性増加がin vivoの二量体化に必要であり、マスト細胞上または好塩基球上のＩｇＥ−ＦｃεＲＩ受容体複合体へのアレルゲンの結合によって、単量体型アレルゲンが一過性の二量体を形成し、
ｃ）一過性二量体において、単量体サブユニットは共有結合しておらず、それぞれの単量体サブユニットは独立にフォールディングすることが可能であり、そして
ｄ）一過性二量体の単量体−単量体境界面の表面積は比較的小さい（８５０Å2未満）。
【００２５】
タンパク質データバンク（www.rcsb.org）には、現時点（２００８年２月）で５４種のアレルゲン構造の座標が含まれる。９種の構造はＮＭＲで決定したものであり、これらは評価に使用することができない。残りの４５種のアレルゲン構造は、欧州バイオインフォマティクス研究所（European Bioinformatics Institute）のＰＩＳＡサーバー（www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/pistart.html）を使用して研究したものである（Krissinel E et al., 2007）。ＰＩＳＡは、結晶データを使用してオリゴマー化の状態（四次構造）を予測するものであり、タンパク質−タンパク質境界面の評価にも使用することができる。更にＰＩＳＡは、安定な二量体の構造を高い精度で予測することができる。しかし、ＢＬＧに関しては、単量体−単量体境界面が小さいため、ＰＩＳＡによる予測は、単量体型ということになってしまう。
【００２６】
しかしながら、タンパク質−タンパク質境界面を提供するため、ＰＩＳＡは本研究において有用である。原理的には、二量体境界面を結晶接触と区別するのは困難である。しかし、真のホモ二量体型複合体はほとんどの場合対称であり、単量体間に回転対称軸が存在する（Blundell et al., 1996）。ＰＩＳＡサーバーは境界面の探索および単量体間に存在し得る回転対称軸を見つけるために使用することができる。
【００２７】
我々は４５種のアレルゲン結晶構造を解析した。その内の３５種のアレルゲン（７８％）は、アレルゲンが対称なホモオリゴマー、主として二量体、を形成している結晶型で存在した。対称な二量体のうちの２種は非常に弱かった。しかし、アレルゲン間のホモオリゴマー画分の存在率は非常に高く、オリゴマー形成能がアレルゲンの間で非常に一般的な性質であることの証拠となった。見出したアレルゲン二量体の一部を図１に示す。１０種のアレルゲンが結晶中に単量体型で存在していた。
【００２８】
単量体−単量体境界面の検出および低アレルギー性変異の設計
１）  目的アレルゲンの３次元構造が入手可能ではない場合は、i）アレルゲンを結晶化し、ii）その構造をＸ線回析で決定し、そしてiii）解明された３次元結晶構造の座標を用い、分子画像化ソフトウエア（ＰＹＭＯＬ（DeLano 2002）、Ｏ（Jones et al. 1991）およびＸＴＡＬＶＩＥＷ（McRee, 1999）など）によって、アレルゲン分子パッキングを視覚的に解析する。上記の代わりに、ＰＩＳＡ（Krissinel et al. 2007、http://www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/pistart.html）などのコンピュータープログラムを使用して、結晶中のアレルゲン分子パッキングを解析することもできる。解析の目標はアレルゲン分子間の回転対称軸を見出すことである。多くの場合、それは２回対称軸である。（回転対称軸を有する物体とは、軸を中心に回転させることが可能で、回転の際に少なくとも１回はその形状を繰り返す物体である。回転の中心となる軸が、回転軸と呼ばれる対称要素である。１８０°の回転で同一図形となる、即ち、３６０°の回転では同一図形が２つとなる物体を、２回対称軸を有すると言う。）アレルゲンの単量体間に回転対称軸が見つかった場合、それは少なくとも高タンパク質濃度においては、アレルゲンは対称ホモオリゴマーを形成可能であること示している。
【００２９】
２．  ３次元結晶構造が解明されている場合、上記１）において、直接工程iii）を実施することが可能である。
【００３０】
３．  軸が見つかったら、ＰＹＭＯＬなどの分子画像化プログラムを用いて、アレルゲン単量体間の単量体−単量体境界面を解析することができる。表２には、種々のアレルゲンから検出した単量体−単量体境界面の面積を列挙した。次の工程では、単量体−単量体境界面を使用して、置換によって二量体形成が妨げられるアミノ酸残基を検出する。図３に、種々のアレルゲンの単量体−単量体境界面への導入が考えられるアミノ酸置換を列挙した。典型的なアミノ酸置換は、小さな残基の大きなものへの変異である。更に、疎水性残基（フェニルアラニンやロイシンなど）を親水性残基（グルタミン酸、リシン）に置換することもできる。他の好ましい置換については後述する。
【００３１】
４．  単量体間に回転対称軸が見出せなかった場合には、ｉ）アレルゲンを（異なる結晶化条件、例えば、ｐＨ、タンパク質濃度または沈殿剤濃度の変更によって）別の結晶型に結晶化することができる。代わりに、対称制約を使用したコンピューターシミュレーションにより、単量体を結合させることもできる。このようなコンピューターシミュレーションには、ＲＯＳＥＴＴＡソフトウエア（Andre et al., 2007）を使用することができる。
【００３２】
５．  変異体タンパク質において低下した二量体形成能を、例えば、二量体の解離定数の決定によって試験することが好ましい。しかし、単量体型の異型が未改変のタンパク質と同様にフォールディングされており、ＩｇＥ抗体結合能を保持していることを確認することが重要である。
【００３３】
６．  原理的には、アレルゲンの３次元構造が不明な場合、タンパク質の残基にランダムな変異を導入することができる。この場合も、低下が見込まれる二量体形成能および単量体型変異体のフォールディングを試験する（図９も参照）。
【００３４】
単量体型低アレルギー性物質の開発
アレルゲンの安定な単量体型の異型は、二量体境界面のアミノ酸残基に変異を導入することによって作製することができる。一例として、ＢＬＧの単量体−単量体境界面を図２に示す。図３に示した変異アミノ酸残基（His 146、Arg 148、Ser 150）は、溶液中のＢＬＧの二量体型を減少させ、単量体型を増加させた。
【００３５】
単量体型の異型は、二量体形成またはオリゴマー形成に関与する表面のいくつか（例えば、１〜５個）のアミノ酸残基を嵩高の残基に変異させて作製することが好ましい（例えば、Arg、Tyr、Lys、TrpをAlaまたはProに変異させる）。変異後の残基は、側鎖が溶媒に向かって突き出しているために、アレルゲンの基本構造に与える影響が最小となるものが好ましい。当業者であれば、公知の遺伝子工学技術を用いてアレルギー性ポリペプチドの表面積を容易に改変することが可能である。例えば、ＰＣＲに基づく方法や部位特異的変異のための他の方法のみならず、ランダムな変異導入や完全長の合成遺伝子によって、該ポリペプチドをコードする核酸に変異を導入することができる。これらの方法は当業界でよく知られるものである（例えば、Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学の最近のプロトコル）、Ausubel et al編、John Wiley & Sons: 1992を参照）。
【００３６】
ヒスタミン放出アッセイ
ヒスタミンは、アレルゲン投与後の「即時型」アレルギーにおける重要なメディエーターであり、アナフィラキシー反応の初期段階で検出される物質である。従って、低アレルギー性物質の免疫療法用としての可能性は、種々のヒスタミン放出アッセイによって容易に試験することができる。
【００３７】
本発明の低アレルギー性物質は、対応する野生型アレルゲンと比べて、アレルゲン活性が低下している。本発明において「アレルゲン活性」という用語は、感作された哺乳動物（例えば、ミルクアレルギー患者）において化合物または組成物がアレルギー反応を誘導する能力を意味する。アレルギー反応は、マスト細胞の脱顆粒化、陽性の皮膚反応および／または鼻腔反応である。アレルゲン活性は、適切なin vitroまたはin vivoの試験によって定義されることが好ましい。アレルゲン活性は、van Hage-Hamsten et al. (1999)またはPauli et al. (2000)に記載の皮膚プリック試験で決定することができる。 
【００３８】
低アレルギー性物質のアレルゲン活性は、野生型アレルゲンのアレルゲン活性の５０％未満であることが好ましい。低アレルギー性物質のアレルゲン活性が野生型アレルゲンの２５％未満であることがより好ましい。最も好ましい態様においては、低アレルギー性物質はアレルゲン活性を実質的に有していない。一般的に、本発明の低アレルギー性物質の誘導するヒスタミン放出は、対応する野生型アレルギー性ポリペプチドの誘導するヒスタミン放出よりも著しく低下している。ヒスタミン放出を決定するための好ましいin vitroの試験は、Vrtala et al., (1997)に記載されているような好塩基球ヒスタミン放出アッセイである（実施例３も参照）。対応する野生型アレルゲンが最大ヒスタミン放出を示すアレルゲン濃度において決定したヒスタミン放出量が、野生型と比べて少なくとも２５％減少することが好ましく、少なくとも５０％減少することがより好ましく、少なくとも７５％減少することが最も好ましい。
【００３９】
本明細書において、本発明の背景、特にその実施に係わる詳細、を明らかにするために使用した出版物や他の資料は、参照を持って本明細書に組み込まれたものとする。更に、本発明を以下の実施例によって説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例
【実施例１】
【００４０】
β−ラクトグロブリンの単量体−単量体境界面の検出
Sakurai and Goto (2002)に準拠し、そして最近発行されたNiemi et al., 2007のアレルゲンとＩｇＥ抗体の３次元免疫複合体構造によって確認されたように、β−ラクトグロブリンの単量体−単量体境界面は、アミノ酸 Asp33、Ala34、Arg40、His146、Arg148およびSer150を他のアミノ酸と共に包含することが明らかになった。
【実施例２】
【００４１】
組み換え単量体型β−ラクトグロブリン変異体の特徴づけ
この実施例では、アミノ酸置換を有する組み換え単量体型β−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）変異体を構築し、それらの抗ＢＬＧ ＩｇＥ抗体（Ｄ１）結合特性を特徴づけた。Sakurai and Goto (2002)はＢＬＧの単量体−二量体平衡をタンパク質−タンパク質相互作用のモデルとして研究した。
【００４２】
Ｉ．単量体型β−ラクトグロブリン変異体の構築
単量体型ＢＬＧ変異体の構築のために、次のアミノ酸置換を実施した： Ｈ１４６Ｐ、Ｒ１４８Ｐ、Ｓ１５０ＰおよびＨ１４６Ｐ／Ｒ１４８Ｐ／Ｓ１５０Ｐ（三重変異体）（配列番号１〜４）。組み換え二量体型ＢＬＧをコードするｃＤＮＡは既に細菌発現ベクターｐＫＫｔａｃにクローニングされている。アミノ酸置換は、５’末端プライマーＡおよび３’末端プライマーＢ〜Ｅ（表１）を使用したＰＣＲ増幅で実施した。プライマーＢはＨ１４６Ｐ、プライマーＣはＲ１４８Ｐ、プライマーＤはＳ１５０Ｐ、そしてプライマーＥはＨ１４６Ｐ／Ｒ１４８Ｐ／Ｓ１５０Ｐの置換にそれぞれ使用した。ＰＣＲ増幅は、「タッチダウン」条件において実施した：始めに９５℃で２分；次に変性のための９４℃で１分、アニーリングのための７０℃で３０秒（但しサイクルごとに温度は０．７℃低下させる）および伸張反応のための７０℃で２分からなるサイクルを２５回；続いて９４℃で１分、５５℃で３０秒および７２℃で２分からなるサイクルを２０回；そして７２℃で１０分のサイクルを１回。
【００４３】
得られた単量体型ＢＬＧ変異体の増幅ｃＤＮＡをNcoIクローニング部位およびHindIIIクローニング部位を使用して細菌発現ベクター（ｐＫＫｔａｃ）にクローニングし（図４）、その後、E. coli RV308に形質転換した。ＩＭＡＣ精製のために、Ｃ末端ヘキサヒスチジニルタグを有する単量体型ＢＬＧ変異体の、細菌による大規模生成（１リットル）を実施した。組み換えＢＬＧ変異体はE. coliの周辺腔に分泌されるが、培地には分泌されないため、周辺質を単離してからニッケルを固定化したセファロースカラムにかけた。精製単量体型ＢＬＧ変異体は実質的に純粋だった。
【００４４】
II．単量体型β−ラクトグロブリン変異体の特徴づけ
抗ＢＬＧ ＩｇＥ抗体（Ｄ１）の精製単量体型ＢＬＧ変異体に対する結合特性を競合的ＥＬＩＳＡで解析した。
【００４５】
始めに、非ビオチン化未改変ＢＬＧ（ｎＢＬＧ）および単量体型ＢＬＧ変異体の量上昇系列をＤ１ ＩｇＥ Ｆａｂ断片と共にインキュベートし、その後、反応混合物を、ビオチン化ＢＬＧで被覆したストレプトアビジンマイクロタイタープレートのウエルに加えた。図５は、競合的ＥＬＩＳＡの結果を示す。競合物質として未改変ＢＬＧおよび単量体型のＨ１４６Ｐ ＢＬＧ変異体、Ｒ１４８Ｐ ＢＬＧ変異体およびＳ１５０Ｐ ＢＬＧ変異体を使用した場合、Ｄ１ ＩｇＥ Ｆａｂのビオチン化β−ラクトグロブリンに対する結合を阻害することができた。
【００４６】
III．円偏光二色性の測定
円偏光二色性（ＣＤ）は、タンパク質が正しくフォールディングされているか否かを決定し、更に同じタンパク質に対する異なる変異体の構造を比較するために使用することができる。円偏光二色性（ＣＤ）の測定のために、全てのｒＢＬＧの緩衝液を透析によって５ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）に交換した。未改変ＢＬＧ（ｎＢＬＧ、Sigma製）ならびに単量体型のＨ１４６Ｐ ＢＬＧ変異体、Ｒ１４８Ｐ ＢＬＧ変異体およびＳ１５０Ｐ ＢＬＧ変異体の遠紫外線スペクトルは、１ｍｍの石英セルを使用し、ペルチェサーモスタット（Jasco PTC-348WI）で２０℃に制御したJasco J-715旋光分散計で測定した。タンパク質濃度は、ｎＢＬＧが１ｍｇ／ｍｌ、Ｈ１４６Ｐ ＢＬＧ変異体が０．５０ｍｇ／ｍｌ、Ｒ１４８Ｐ ＢＬＧ変異体が０．２０ｍｇ／ｍｌ、そしてＳ１５０Ｐ ＢＬＧ変異体が０．２３ｍｇ／ｍｌだった。ＣＤスペクトルは３回の測定結果の平均値を示す（図６）。ＣＤスペクトルによると、組み換え単量体型ＢＬＧ変異体（３重変異体以外）は、未改変ＢＬＧ（ｎＢＬＧ）と類似した構造を示した。
【実施例３】
【００４７】
単量体型ＢＬＧ変異体のヒスタミン放出における機能性
ｎＢＬＧおよび単量体型ＢＬＧ変異体による、好塩基球系の白血球からのヒスタミンのin vitro放出の誘発を、ストリッピングし、感作された好塩基球を用いたヒスタミン放出ＥＩＡで解析し、続いてヒスタミンＥＬＩＳＡ（ＬＤ−ＢＡ）を実施した。
【００４８】
非ミルクアレルギードナーの全血（２５ｍｌ）を白血球の単離に使用した。融解バッファー（１５５ｍＭのＮＨ4Ｃｌ、１０ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）と混合することで赤血球を融解し、氷中で１５分間インキュベートし、室温、４５０×ｇで１０分間の遠心分離に付した。上澄みは廃棄し、細胞ペレットを再び上記と同様に融解した。最後に得られた白血球ペレットを滅菌ＰＢＳおよび０．９％のＮａＣｌ（ｗ／ｖ）で１回洗浄し、血球計算計で細胞数を求めた。次に、５ｍｌのストリッピング緩衝液（１３．４ｍＭの乳酸、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ３．９）の中で３．５分間インキュベートすることで、結合しているＩｇＥ分子を好塩基球からストリッピングした。ストリッピングした細胞をＨｅｐｅｓ緩衝液［２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１３２ｍＭのＮａＣｌ、６ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＳＯ4、１．２ｍＭのＫ2ＨＰＯ4、５．５ｍＭのブドウ糖、０．５％のヒト血清アルブミン（ｗ／ｖ、Sigma A3782）、ｐＨ７．４］で洗浄した。最後に細胞を６００μｌのＨｅｐｅｓ緩衝液に再懸濁し、２本のチューブ、即ち、Ｐ３（＋）チューブ（４００μｌ）および陰性の対照（−）チューブ（２００μｌ）に分けた。ミルクアレルギーＩｇＥ血清による感作のために、以下の感作混合物中で＋３７℃で９０分間、細胞をインキュベートした：１００μｌのミルクアレルギー性Ｐ３（＋）ドナー血清または５０μｌの非アレルギー性（−）ドナーの血清、ならびに４ｍＭのＥＤＴＡを含む、総量０．５ｍｌの混合物。感作後には、２ｍｌのＨｅｐｅｓ緩衝液を細胞に添加し、Ｈｅｐｅｓ緩衝液で２回洗浄した。細胞は、１ｍＭのＣａＣｌ2を含むＨｅｐｅｓ緩衝液中に、＋３７℃で３０分間かけて回復させた。１ｍＭのＣａＣｌ2を含むＨｅｐｅｓ緩衝液を用いて、次のように最終容量を調節した：Ｐ３（＋）細胞は８ｍｌ、そして陰性対照（−）細胞は４ｍｌ（約２．２×１０5細胞／ｍｌ）。 
【００４９】
ヒスタミン放出アッセイは、ヒスタミン放出用の補足キット（Supplementary Kit for Histamine Release）（Labor Diagnostika Nord GmbH & Co. KG製、カタログ番号BA 10-1100）を用いて行った。ヒスタミンの総放出量を求めるために、３０μｌのストリッピングおよび感作された細胞を２７０μｌの放出緩衝液と混合し、９０℃で１０分間インキュベートした。得られたサンプルを７００×ｇで１０分間遠心分離し、アシル化のために５０μｌの上澄みを取り出した。アレルゲン誘導性ヒスタミン放出の測定には、アレルゲン（ｎＢＬＧ、ｒＢＬＧおよびその変異体）を、濃度が０．１ｍｇ／ｍｌ、０．０１ｍｇ／ｍｌおよび０．００１ｍｇ／ｍｌとなるように放出緩衝液（Ｖtot＝５００μｌ）で希釈した。１５０μｌの各アレルゲン希釈液と１５０μｌの細胞懸濁液、１５０μｌの放出緩衝液と１５０μｌの細胞懸濁液（自発的放出用）、または１５０μｌの抗ＩｇＥ抗血清（１μｇ／ｍｌ）と１５０μｌの細胞懸濁液（陽性対照用）を混合し、＋３７℃で６０分間インキュベートした。放出反応を停止するために、サンプルを氷中で１０分間インキュベートし、７００×ｇで１０分間遠心分離した。放出ヒスタミンのアシル化には、５０μｌの透明な上澄みを使用した。
【００５０】
放出ヒスタミンはヒスタミンＥＬＩＳＡ（Labor Diagnostika Nord GmbH & Co. KG製、カタログ番号BA 10-1000）で測定した。ＥＬＩＳＡにおいては、ヒスタミンは定量的にＮ−アシルヒスタミンに誘導体化され、マイクロタイタープレートの固相に結合された。放出され、アシル化されたヒスタミンと固相結合アシルヒスタミンが抗血清の一定数のＩｇＥ結合部位を競合した。システムが平衡状態にあった時に、遊離抗原および遊離抗原−抗血清複合体は洗浄工程で取り除いた。固相ヒスタミンに結合した抗体はパーオキシダーゼ結合抗ヤギ抗体で検出した。基質ＴＭＢ／パーオキシダーゼ反応は４５０ｎｍで観察した。固相ヒスタミンに結合した抗体の量は、サンプルの放出ヒスタミン濃度と反比例した。サンプルのアシル化および免疫アッセイは製造者の説明書に従って実施した（Labor Diagnostika Nord GmbH & Co. KG製、カタログ番号BA 10-1000）。サンプルのヒスタミン濃度は、標準曲線から直接読み取り、総ヒスタミンの結果は５倍にした。総ヒスタミン濃度（１００％）に基づいて、アレルゲン誘導性ヒスタミン濃度を百分率でも計算した。
【００５１】
図７のＡは、ヒスタミン放出アッセイに使用した細胞の総括的な状態を示す。製造者のプロトコルによると、自発的な放出は総ヒスタミン放出量の５％未満となり、陽性対照サンプルは５％を超える。ｎＢＬＧおよび組み換え単量体型ＢＬＧ変異体のヒスタミン放出を図７のＢに示した。二量体型のｎＢＬＧは高レベルのヒスタミン放出を誘引したが、単量体型の変異体は顕著に低いヒスタミン放出レベルを示した。これの結果は、単量体型ＢＬＧ変異体は機能的アッセイにおいて予想通りの挙動を示すことを表している。
【００５２】
サンドイッチＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレートのウエル（Nunc製）を、＋４℃で１６時間にわたって、１μｇの抗ＢＬＧ Ｄ１ Ｆａｂで被覆した。ウエルへの非特異的結合を防止するために、２００μｌの０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳを用い、室温で１時間ブロックした。ＢＬＧ（未改変または組み換え単量体型変異体）を、０．５％のＢＳＡ−ＰＢＳ中の濃度が１００μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌとなるようにウエルに添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄工程の後、ｍｙｃタグを有する抗ＢＬＧ Ｄ１ ｓｃＦｖ（１：１０００希釈）をウエルに添加し、室温で１時間インキュベートした。結合したＤ１ ｓｃＦｖはマウス抗ｍｙｃ抗体（クローン９Ｅ１０、ＡＴＣＣ＃ ＣＲＬ−１７２９）およびＡＦＯＳ接合抗マウスＩｇ抗体（Bio-Rad製）を用いて検出した。陰性対照としては、ＢＬＧの３重変異体（Ｔ１８Ｙ、Ｅ４５Ｙ、Ｌ５７Ｙ）をこのアッセイに使用した。
【００５３】
このサンドイッチＥＬＩＳＡの構図は、組み換えＢＬＧ変異体であるＨ１４６Ｐ、Ｈ１４８ＰおよびＳ１５０Ｐは濃度依存的な単量体であることを示している。高濃度（１００μｇ／ｍｌ）において、ＢＬＧ変異体は二量体のような挙動を示すが、より低い濃度（１０μｇ／ｍｌ）では、Ｄ１ Ｆａｂ断片をウエルに被覆し、Ｄ１ ｓｃＦｖ−ｍｙｃ融合タンパク質を検出に用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて認識されない単量体が存在した。その一方で、二量体型の未改変ＢＬＧは１０μｇ／ｍｌの濃度においても明確に検出された。この結果は、高濃度においてｒＢＬＧ変異体は一過性の二量体を形成するが、低濃度においてＢＬＧ変異体は単量体であり、そのため、サンドイッチ型のＥＬＩＳＡにおいてＢＬＧ特異的抗体によって認識されないということを示している。
【実施例４】
【００５４】
アレルゲンである Bos d 5、Bet v 1、Bet v 2、Equ c 1、Api m 1、Phl p 1、Der p 1、Der p 2、Fel d 1、Api g 1、Che a 3およびApl m 5の解明されている３次元結晶構造の座標を用い、分子画像化ソフトウエア（ＰＹＭＯＬ（DeLano 2002）、Ｏ（Jones et al. 1991）およびＸＴＡＬＶＩＥＷ（McRee, 1999））を使用して、アレルゲン分子パッキングを視覚的に解析した。この解析の目標は、アレルゲン分子間の回転対称軸および対応する単量体−単量体境界面を見出すことだった（図１も参照）。１２種の対称なアレルゲン二量体について見出した、考えられる単量体−単量体境界面の変異の一例を図３に示した。
【００５５】
【表１】
0005740713.tif 000002
【００５６】
【表２ａ】
0005740713.tif 000003
【００５７】
【表２ｂ】
0005740713.tif 000004
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００５８】
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【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、結晶構造に見られる対称なアレルゲン二量体の例を、同じ縮尺で描いたものである。第１の単量体を薄いグレーのリボンモデルで示し、第２の単量体を濃いグレーのリボンモデルで示した。二量体型アレルゲンは、２つの配向で示した。左側の図においては、対称な２回軸が観察者の方を向いており、右側の図においては、軸は紙面と同じ平面に存在する。左上の角の図がＢＬＧ−Ｄ１／ＩｇＥ（Ｆａｂ）（Bos d 5）免疫複合体の結晶構造であり、ＩｇＥ断片はグレーの表面モデルで示した。アレルゲンの座標はタンパク質データバンクから入手し、二量体の座標はＰＩＳＡ−サーバーで作製した。図面はＰＹＭＯＬプログラム（DeLano 2002）で作製した。Che a 3は、４本のポリペプチド鎖を有する。その内の２本のポリペプチド鎖が偏性二量体を形成する（２つの単量体が１つになって密集構造を形成するが、単量体は単独では安定な構造を形成することができない（Nooren et al., 2003））。２つの偏性二量体が一過性の二量体を形成する。Api m 4は８本のポリペプチド鎖を有する。その内の４本が安定な偏性四量体を形成する。２つの四量体が一過性構造を形成する。他の具体例は、単量体単位が１本のポリペプチド鎖からなる一過性の二量体構造を表している。
【図２】図２は、二量体型のBos d 5（β−ラクトグロブリン）およびBet v 1 アレルゲンの、単量体−単量体境界面に設計した変異の位置を示している。この図面はＰＹＭＯＬプログラムで作製した。
【図３】図３は、１２種の対称なアレルゲン二量体の単量体−単量体境界面に対して考えられる変異体の一例を示す表である。
【図４】図４は、単量体型ＢＬＧ変異体の構築および産生に使用した細菌発現ベクターの模式図である。
【図５】図５は、Ｄ１ ＩｇＥ Ｆａｂ断片とヒト ＩｇＧ１サブタイプとの競合的ＥＬＩＳＡの阻害結果を示し、固定化したビオチン化β−ラクトグロブリンへの結合は、可溶化未改変β−ラクトグロブリンのみならず、単量体型のＨ１４６Ｐ ＢＬＧ変異体、Ｒ１４８Ｐ ＢＬＧ変異体およびＳ１５０Ｐ ＢＬＧ変異体によっても阻害された。
【図６】図６は、可溶化未改変β−ラクトグロブリンのみならず、単量体型のＨ１４６Ｐ ＢＬＧ変異体、Ｒ１４８Ｐ ＢＬＧ変異体およびＳ１５０Ｐ ＢＬＧ変異体のＣＤスペクトルである。
【図７】図７は、対照サンプル（Ａ）およびアレルゲン（ＢＬＧとその変異体）（Ｂ）が誘導した、ストリッピングおよび感作した好塩基球によるヒスタミン放出を示す。製造者のプロトコルによると、自発的な放出は、総ヒスタミン放出量の５％未満となり、陽性対照サンプルは総ヒスタミン放出量の５％を超える。
【図８】図８は、Ｄ１ ＦａｂおよびＤ１ ｓｃＦｖの、二量体型ＢＬＧおよびその単量体型変異体への結合をＥＬＩＳＡで解析した結果である。
【図９】図９は、単量体−単量体境界面の探索、および二量体形成を防止しうる低アレルギー性変異体の設計のためのワーク・フローチャートである。
【配列表フリーテキスト】
【００６０】
配列番号１：  組み換えＨ１４６Ｐ β−ラクトグロブリンのアミノ酸配列
配列番号２：  組み換えＲ１４８Ｐ β−ラクトグロブリンのアミノ酸配列
配列番号３：  組み換えＳ１５０Ｐ β−ラクトグロブリンのアミノ酸配列
配列番号４：  組み換えＨ１４６Ｐ／Ｒ１４８Ｐ／Ｓ１５０Ｐ（三重変異体）
β−ラクトグロブリンのアミノ酸配列
【図１】
0005740713.tif 000005
【図２】
0005740713.tif 000006
【図３】
0005740713.tif 000007
【図４】
0005740713.tif 000008
【図５】
0005740713.tif 000009
【図６】
0005740713.tif 000010
【図７】
0005740713.tif 000011
【図８】
0005740713.tif 000012
【図９】
0005740713.tif 000013
【配列表】
0005740713000001.app