(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）疎水性有機物質で表面処理された磁性酸化鉄ナノ粒子と塩粒子とを含む混合粉末をアニーリングすることで、有機物質がない酸化鉄ナノ粒子を得ること、及び
b）前記有機物質がない酸化鉄ナノ粒子の表面を親水性物質でコーティングすることを含む、親水性物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の調製方法。
【請求項２】
前記a）の酸化鉄ナノ粒子に付着されている疎水性有機物質は、C４〜C２５の脂肪酸、C４〜C２５の脂肪族アルコール、及びC４〜C２５の脂肪族アミンからなる群から選択される少なくとも１つであることを特徴とする、請求項１に記載の親水性物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の調製方法。
【請求項３】
前記a）の酸化鉄ナノ粒子に付着されている脂肪酸はオレイン酸（oleic acid）であることを特徴とする、請求項２に記載の親水性物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の調製方法。
【請求項４】
前記a）の塩粒子は、硫酸ナトリウム（Sodium sulfate、Na２SO４）、炭酸水素ナトリウム（Sodium bicarbonate、NaHCO３）、炭酸水素カリウム（Potassium bicarbonate、KHCO３）、炭酸水素カルシウム（Calcium bicarbonate、Ca（HCO３）２）、塩化ナトリウム（Sodium chloride、NaCl）、塩化カリウム（Potassium chloride、KCl）、及び塩化カルシウム（Calcium chloride、CaCl２）から選択される少なくとも１つであることを特徴とする、請求項１乃至３の何れか一項に記載の親水性物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の調製方法。
【請求項５】
前記a）の塩粒子は１〜５００μmの直径を有することを特徴とする、請求項１乃至４の何れか一項に記載の親水性物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の調製方法。
【請求項６】
前記a）の酸化鉄ナノ粒子は、中心原子として鉄と、配位子としてそれに付着したC４〜C２５の有機酸基（カルボキシラート）とを含む鉄錯体と、C４〜C２５の脂肪酸とを反応させることで得ることを特徴とする、請求項１乃至５の何れか一項に記載の親水性物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の調製方法。
【請求項７】
前記鉄錯体はオレイン酸鉄錯体（iron oleate）であることを特徴とする、請求項６に記載の親水性物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の調製方法。
【請求項８】
前記脂肪酸はオレイン酸であることを特徴とする、請求項６又は７に記載の親水性物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の調製方法。
【請求項９】
前記a）の酸化鉄ナノ粒子の直径が１〜１００nmであることを特徴とする、請求項１乃至８の何れか一項に記載の親水性物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の調製方法。
【請求項１０】
前記a）の酸化鉄ナノ粒子と塩粒子は、１:１０〜１:１０００の範囲の重量比を有することを特徴とする、請求項１乃至９の何れか一項に記載の親水性物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の調製方法。
【請求項１１】
前記a）のアニーリングは、空気雰囲気下で４００〜６００℃で１〜１０時間加熱することで行われることを特徴とする、請求項１乃至１０の何れか一項に記載の親水性物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の調製方法。
【請求項１２】
前記a）のアニーリング後、さらに塩粒子を除去することを特徴とする、請求項１乃至１１の何れか一項に記載の親水性物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の調製方法。
【請求項１３】
前記a）の塩粒子を除去することは遠心分離により行われることを特徴とする、請求項１２に記載の親水性物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の調製方法。
【請求項１４】
前記a）のアニーリング後、塩を除去する前に温度を室温に低下させることを特徴とする、請求項１２又は１３に記載の親水性物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の調製方法。
【請求項１５】
前記b）の親水性物質は、デキストラン誘導体（Dextran derivatives）、ポリアクリル酸（Polyacrylic acid）、澱粉（Starch）、シリカ（Silica）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはリン酸‐ポリエチレングリコール（ＰＥＧ‐Phosphate、ＰＯ‐ＰＥＧｓ）であることを特徴とする、請求項１乃至１４の何れか一項に記載の親水性物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の調製方法。
【請求項１６】
前記b）の親水性物質であるデキストラン誘導体は、ジエチルアミノエチル‐デキストラン（diethylaminoethyl‐dextran、ＤＥＡＥ‐ デキストラン）、デキストラン硫酸（dextran sulfate、ＤＳ）、またはカルボキシメチルデキストラン（Carboxymethyl dextran、ＣＭ‐デキストラン）であることを特徴とする、請求項１５に記載の親水性物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の調製方法。
【請求項１７】
前記b）で、親水性物質のコーティングと塩の除去が同時に行われることを特徴とする、請求項１乃至１６の何れか一項に記載の親水性物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の調製方法。
【請求項１８】
調製される親水性物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子が、磁性及び造影効果を有することを特徴とする、請求項１に記載の親水性物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機物質でコーティングされた単分散酸化鉄ナノ粒子を親水化した、親水性物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の調製方法、及び前記ナノ粒子を含む磁気共鳴画像造影剤に関する。
【０００２】
より詳細には、有機物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子を塩（salt）粒子に付着し、高温でアニーリングする（annealing）ことにより表面の有機物質を除去した後、親水性物質水溶液と混合することで、表面に親水性物質がコーティングされた酸化鉄ナノ粒子を調製する方法、及びこれにより調製される前記ナノ粒子を含む造影剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
磁性（magnetic）ナノ粒子は、細胞標識（cell  labeling）、磁気共鳴画像（magnetic  resonance  imaging、ＭＲＩ）、薬物送達（drug  delivery）、温熱療法（hyperthermia）を含む生体医学分野で広く用いられている。様々な種類の磁性ナノ粒子のうち超常磁性（superparamagnetic）の酸化鉄ナノ粒子（iron  oxide  based  nanoparticles）は、高い磁気感受率（magnetic  susceptibility）及び超常磁性のため、Ｔ２  ＭＲＩ造影剤として幅広く研究されている。現在商用化されているFeridex、Resovist、CombidexなどのＴ２  ＭＲＩ造影剤は、親水性高分子水溶液で塩化鉄の還元及び共沈法を用いて製造される（C．W．Jung，et．al．Magn．Reson．Imaging  １９９５，１３，６６１）。
【０００４】
しかし、上記の方法により製造された酸化鉄ナノ粒子は、幾つかの短所を有する。水溶液で合成するため１００℃以上の高温で反応させることが困難であり、結晶性が劣るため磁性も低くなる。最近、このような短所を克服するために、物質の磁性を向上させて新しいＴ２  ＭＲＩ造影剤を開発するための研究が多く行われている。この１０年間、均一で優れた結晶性を有する酸化鉄ナノ粒子の合成法が開発されており、大量合成も可能となっている（J．Park，et．al．Nat．Mater．２００４，３，８９１）。マンガンフェライト（MnFe２O４）ナノ粒子の場合、非常に高い磁性を有するため優れたＴ２造影効果を示すことが報告されている（J．-H．Lee，et  al．Nat．Med．２００７，１３，９５）。
【０００５】
しかし、常用化されたＴ２  ＭＲＩ造影剤と異なって、１００℃以上の高温で合成された磁性ナノ粒子は、疎水性界面活性剤でコーティングされているため水溶液に分散されない。生体医学的に応用されるためには、このような疎水性磁性ナノ粒子がデキストラン（dextran）、澱粉（starch）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、シリカ（silica）などの生体適合性及び親水性の物質でコーティングされなければならない。現在、デキストランでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子がＴ２  ＭＲＩ造影剤として医学的使用が承認されて用いられている。しかし、親水性物質であるデキストランは水溶液でのみ分散されるため、疎水性界面活性剤でコーティングされたナノ粒子に直接コーティングすることが困難である。したがって、親水性物質であるデキストランが有機溶媒にも分散されるようにさらに改変したり、或いは、デキストランをコーティングする前にナノ粒子を水溶液に分散することが試されているが、方法が複雑で、収率が低いという短所がある。
【０００６】
上述の短所を克服するための方法として、物質の構造を変換したり、性質を向上させるためのアニーリング処理方法が用いられている。しかし、ナノ粒子の場合、高温熱処理は、粒子同士が凝集してナノ粒子の固有の性質を失ってしまう結果をもたらすことがある。このような副作用を防止するために、最近、「wrap-bake-peel」方法が考案されて（Y．Piao，et  al．Nat．Mater．２００８，７，２４２）、ナノ粒子をシリカでコーティングすることで熱処理過程中におけるナノ粒子の凝集を防止する。
【０００７】
また他の方法として、アニーリング処理過程中に塩（salt）を用いて粒子の凝集を防止する方法が提案された。面心正方（Face  centered  tetragonal、ＦＣＴ）構造を有する白金‐鉄（Pt‐Fe）ナノ粒子を過剰量の塩化ナトリウム（NaCl）と混合して高温でアニーリング処理した後、面心立方（Face  centered  cubic、ＦＣＣ）構造を有する白金-鉄ナノ粒子を製造することが報告されている（D．Li，et  al．J．Appl．Phys．２００６，９９，０８E９１１）。高温でアニーリング処理により粒子の結晶構造を改変し、これによって磁性が向上された。
【０００８】
最近報告された方法によると、塩化ナトリウムを除去した後、ナノ粒子を水溶液に分散し、システイン（cysteine）でコーティングすることで、非常に安定したナノ粒子水溶液を製造することができる（A．Delattre，et  al．Small  ２０１０，６，９３２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】C．W．Jung，et．al．Magn．Reson．Imaging  １９９５，１３，６６１
【非特許文献２】J．Park，et．al．Nat．Mater．２００４，３，８９１
【非特許文献３】J．-H．Lee，et  al．Nat．Med．２００７，１３，９５
【非特許文献４】Y．Piao，et  al．Nat．Mater．２００８，７，２４２
【非特許文献５】D．Li，et  al．J．Appl．Phys．２００６，９９，０８E９１１
【非特許文献６】A．Delattre，et  al．Small  ２０１０，６，９３２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本出願人は、疎水性界面活性剤でコーティングされたナノ粒子に親水性物質を直接コーティングすることに係る従来技術の問題点を補完するために、塩粒子を用いたアニーリング処理方法による新しい親水性物質のコーティング方法を提供することをその目的とする。
【００１１】
より詳細には、本発明の目的は、アニーリング処理（図１）により有機物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の磁性を向上させ、アニーリングされた酸化鉄ナノ粒子を親水性物質でコーティングすることで、向上された安定性及び生体適合性を有する酸化鉄ナノ粒子の調製方法を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、向上された磁性及び生体適合性を有する親水性物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子を提供することにある。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、前記向上された磁性及び生体適合性を有するナノ粒子を含む磁気共鳴画像（magnetic  resonance  imaging、ＭＲＩ）造影剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
酸化鉄ナノ粒子は、鉄を中心原子とし、C４〜C２５の有機酸基（カルボキシラート（carboxylate））が配位子として結合されている鉄錯体と、C４〜C２５の脂肪酸と、C４〜C２５の脂肪族アルコールまたはC４〜C２５の脂肪族アミンとを、１５０℃〜３５０℃で反応させることで調製することができる。
【００１５】
前記酸化鉄ナノ粒子の調製段階で用いられることができる鉄前駆体は、C１０〜C２２の脂肪酸基が鉄原子に配位子として結合されたものが好ましく、オレイン酸鉄錯体（iron  oleate）がより好ましい。
【００１６】
また、酸化鉄ナノ粒子の調製方法で用いられることができる脂肪酸及び脂肪族アルコール（または脂肪族アミン）は、C１０〜C２２の脂肪酸及び脂肪族アルコール（または脂肪族アミン）が好ましい。前記脂肪酸及び脂肪族アルコールは、オレイン酸（oleic  acid）及びオレイルアルコール（oleyl  alcohol）がより好ましく、脂肪族アミンの場合、オレイルアミン（oleyl  amine）がより好ましい。
【００１７】
一方、前記酸化鉄ナノ粒子の調製方法の具体的な工程条件は、前記反応原料である鉄錯体、脂肪酸及び脂肪族アルコール混合物（または脂肪族アミン）を室温から２００〜３１０℃まで５℃／min以上の加熱率で加熱し、２００〜３１０℃で５〜６０分間反応させることで達成することができる。この際、調製される酸化鉄ナノ粒子のサイズは、反応原料であるC４〜C２５の脂肪酸及びC４〜C２５の脂肪族アルコール（または脂肪族アミン）が投入されるモル比を調節することにより調節されることができる。
【００１８】
酸化鉄ナノ粒子の他の調製方法は、鉄中心原子と、それに付着したC４〜C２５の有機酸基（カルボキシラート）配位子とを含む鉄錯体と、C４〜C２５の脂肪酸とを、３〜３．５℃／minの加熱率で２９０〜３２０℃で反応させることで酸化鉄ナノ粒子を調製することを特徴とする。また、鉄中心原子と、それに付着したC４〜C２５の有機酸基（カルボキシラート）配位子とを含む鉄錯体と、C４〜C２５の脂肪酸とを、２６５〜２７５℃で１次反応させた後、３１５〜３２５℃で２次反応させることで酸化鉄ナノ粒子を調製することを特徴とする。調製された酸化鉄ナノ粒子は、直径が１〜１００nmであることができ、２〜２０nmであることが好ましい。調製された酸化鉄ナノ粒子の表面に付着されている疎水性有機物質の種類は、限定されないが、C４〜C２５の脂肪酸、C４〜C２５の脂肪族アルコール及びC４〜C２５の脂肪族アミンからなる群から選択される少なくとも１つであることが好ましく、疎水性有機物質である脂肪酸はオレイン酸が好ましい。
【００１９】
前記調製された酸化鉄ナノ粒子と塩粒子の混合物を空気条件でアニーリングした後、蒸溜水を用いて過剰量の塩粒子を除去することができる。この際、塩粒子を除去する前に温度を室温に低下させることができる。塩粒子の種類は、限定されないが、硫酸ナトリウム（Na２SO４）、塩化ナトリウム（NaCl）、塩化カリウム（KCl）、塩化カルシウム（CaCl２）、炭酸水素ナトリウム（NaHCO３）、炭酸水素カリウム（KHCO３）または炭酸水素カルシウム（Ca（HCO３）２）などであることが好ましい。塩粒子は、平均直径が１〜５００μmであり、１５０μm以下であることが好ましい。塩粒子に対する酸化鉄ナノ粒子の重量比は、ナノ粒子と塩粒子の直径を考慮して調節することができるが、１:１０〜１:１０００の範囲であることが好ましい。酸化鉄ナノ粒子と塩粒子の混合物のアニーリング処理は、窒素、アルゴンまたはネオンなどの非活性気体の流量下で行うこともできるが、空気中でアニーリング処理することが最も好ましい。非活性気体の条件下でのアニーリング処理は、ナノ粒子の原形及びサイズがうまく維持されないという問題点があり、ナノ粒子の表面から疎水性有機物質を二酸化炭素の形態で効率的に除去することは、空気条件下で可能である。アニーリング処理温度及び空気条件の適用時間は、調節されることができるが、４００〜６００℃で１〜１０時間に設定することが好ましい。塩粒子を除去する方法は、限定されないが、遠心分離を含む方法が好ましく、遠心分離は様々な条件下で実施することができ、例えば約１３，０００rpmで３０分間実施することができる。
【００２０】
アニーリング処理及び塩粒子の除去後、酸化鉄ナノ粒子は粒子表面に誘導されたヒドロキシル基（hydroxyl  group）によって水溶液に分散される。水溶液のpHが増加するにつれて、酸化鉄ナノ粒子のゼータ電位の変化を観察することができる。
【００２１】
また、水溶液でより安定的且つ生体適合性を有する酸化鉄ナノ粒子を調製するために、親水性物質を表面コーティング材として用いる。親水性物質としては、デキストラン誘導体、ポリアクリル酸（Polyacrylic  acid）、澱粉（Starch）、シリカ（Silica）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びリン酸‐ポリエチレングリコール（ＰＥＧ‐Phosphate、ＰＯ‐ＰＥＧｓ）を含む。塩粒子を除去する過程で粒子が凝集することを防止するために、親水性物質のコーティングと塩粒子の除去を同時に行うことができる（図１）。アニールしたナノ粒子と塩粒子の混合粉末を親水性物質水溶液に添加する。塩粒子が親水性物質水溶液に溶けながら、ナノ粒子が親水性物質でコーティングされる。親水性物質でコーティングされたナノ粒子は遠心分離により回収され、このような塩粒子の除去及び親水性物質のコーティングが数回繰り返される。親水性物質のうち、アニールしたナノ粒子を安定化させるのに適するデキストラン誘導体を確認するために、常用化された様々なデキストラン誘導体が粒子のコーティングに用いられる。親水性物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子は、透過型電子顕微鏡（Transmission  Electron  Microscopy、ＴＥＭ）及び動的光散乱（Dynamic  Light  Scattering、ＤＬＳ）を用いて分析することができる。
【００２２】
一方、親水性物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子のコロイド安定性を、pH、塩化ナトリウムの濃度、熱抵抗性に基づいて測定することができる。生体医学分野に適用するためには、ナノ粒子は、一定量の塩化ナトリウムと一定範囲のpHで安定性を維持しなければならない。また、熱抵抗性は、ナノ粒子の表面とコーティング物質との間の結合力を測定することで判断することができる。安定性試験は、動的光散乱によるサイズの変化から観察することができる。
【００２３】
また、親水性物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の細胞毒性試験を行うことができ、乳癌細胞であるMDA‐MB‐２３１を用いてＭＴＴ方法で測定することができる。
【００２４】
また、親水性物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の磁気共鳴画像（magnetic  resonance  imaging、ＭＲＩ）造影剤への応用可能性は、動物ＭＲＩ実験などにより確認することができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によると、高温アニーリング処理は、ナノ粒子の結晶性を向上させて酸化鉄ナノ粒子の磁性を向上させる。また、優れた安定性及び生体適合性を有するように、酸化鉄ナノ粒子が親水性物質でコーティングされるが、様々な親水性物質のうち負電荷を有するカルボキシメチルデキストラン（Carboxymethyl  dextran、ＣＭ‐デキストラン）が、ナノ粒子をコーティングして安定化させるにあたり最も効率的である。向上された磁性、及びコーティング過程で１つ以上のナノ粒子がデキストランシェルでコーティングされることにより、カルボキシメチルデキストランでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の造影効果は優れている。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
本発明の上記並び他の目的、特徴、及び利点は、添付図面とともに提供される好ましい実施形態の以下の説明により明らかになる。
【００２７】
【図１】酸化鉄ナノ粒子を塩粒子を用いてアニーリングし、さらに親水性物質でコーティングする過程を示す。
【図２】１０nmの酸化鉄ナノ粒子の透過型電子顕微鏡（Transmission  Electron  Microscopy、ＴＥＭ）写真を示す。
【図３】アニーリング処理前と後の酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真を示し、左側がアニーリング処理前、右側がアニーリング処理後の写真を示す。
【図４】アニーリング処理前と後の酸化鉄ナノ粒子のX線回折（X‐ray  diffraction、ＸＲＤ）データを示す。
【図５】アニーリング処理前と後の酸化鉄ナノ粒子の色を示す。
【図６】アニーリング処理前と後の酸化鉄ナノ粒子の磁性データを示したグラフである。
【図７】デキストラン硫酸（Dextran  sulfate、ＤＳ）でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真及び流体力学的径（hydrodynamic diameter）を示したグラフである。
【図８】カルボキシメチルデキストラン（Carboxymethyl  dextran、ＣＭ‐デキストラン）でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真及び流体力学的径を示したグラフである。
【図９】ＤＳでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の安定性試験の結果を示すグラフである。
【図１０】ＣＭ‐デキストランでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の安定性試験の結果を示すグラフである。
【図１１】ＣＭ‐デキストランでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子のpHによるサンプル写真及びゼータ電位を示したグラフである。
【図１２】ＣＭ‐デキストランでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の塩化ナトリウムの濃度によるサンプル写真を示す。
【図１３】ポリアクリル酸（Polyacrylic  acid）でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真である。
【図１４】リン酸‐ポリエチレングリコール（ＰＥＧ‐Phosphate、ＰＯ‐ＰＥＧｓ）でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真及び流体力学的径を示したグラフである。
【図１５】ＤＳ、ＣＭ‐デキストランでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の細胞毒性実験の結果を示したグラフである。
【図１６】ＣＭ‐デキストランでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の磁気共鳴画像（magnetic  resonance  imaging、ＭＲＩ）写真を示す。
【図１７】ＣＭ‐デキストランでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の磁性データを示したグラフである。
【図１８】ＣＭ‐デキストランでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の動物実験ＭＲＩ写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、添付図面を参照して本発明による好ましい実施例を詳細に説明する。
【００２９】
本発明は、特定の事項と限定された実施例及び図面により説明されるが、これは本発明の全般的な理解をより容易にするために提供されるものにすぎず、本発明は下記の実施例に限定されるものではなく、本発明が属する分野で通常の知識を有する者であれば、このような記載から様々な修正及び変形が可能である。
【００３０】
したがって、本発明の思想は下記に説明された実施例に限定して決まってはならず、特許請求の範囲だけでなく、特許請求の範囲と均等または等価的変形がある全てが本発明の思想の範疇に属するといえる。
【００３１】
透過型電子顕微鏡（Transmission  Electron  Microscopy、ＴＥＭ）はJeol  EM‐２０１０  microscopeを用い、X線回折（X‐ray  diffraction、ＸＲＤ）にはRigaku  D／Max‐３C  diffractometerを用いた。流体力学的径（hydrodynamic  diameter）とゼータ電位（zeta‐potential）には粒度分析器（particle  size  analyzer（ELS‐Z２、Otsuka））を用い、M‐H曲線には振動試料磁力計（Vibrating  sample  magnetometer（ＶＳＭ、Quantum  Design  PPMS））を用いた。
【００３２】
（調製例）
酸化鉄ナノ粒子の合成
「J．Park  et  al．Nat．Mater．２００４，４，  ８９１」に記載の方法により１００Lのパイロットプラントでオレイン酸鉄錯体（Iron  oleate  complex）を合成し、これを用いて酸化鉄ナノ粒子を合成した。オレイン酸鉄錯体は、オレイン酸ナトリウム（sodium  oleate）と塩化第二鉄六水和物（FeCl３６H２O）とを反応させることで調製したものを用いた。より詳細には、塩化第二鉄六水和物１．０８kg及びオレイン酸ナトリウム３．６５kgを水６L、エタノール８L及びヘキサン１４Lからなる混合溶媒と混合した後、強く撹拌しながら６０℃程度で１時間反応させる。２つの層に分離された生成物のうち透明な下層を除去した後、残りの茶色の有機層に水を混合し、さらに水層を除去して、残りの水溶性塩を除去する。このような水洗過程を３回繰り返す。精製された錯体溶液のヘキサン溶媒を蒸発させることで、オレイン酸鉄錯体を得る。
【００３３】
前記調製されたオレイン酸鉄錯体３．６kg（４mol）及びオレイン酸０．５７kg（２mol）を１‐オクタデセン（octadecene）２０kgと混合した後、１０℃／minの加熱率で３１０℃まで加熱し、３１０℃で６０分間反応させた。これを室温まで冷却し、ヘキサンとアセトンの比率が１:４である混合溶液に沈澱させた後、遠心分離により酸化鉄ナノ粒子を得る。ＴＥＭ観察により、合成された酸化鉄ナノ粒子の直径が１０nmであることを確認した（図２）。
【００３４】
（実施例１）
酸化鉄ナノ粒子と塩粒子を含む混合物のアニーリング処理による有機物が除去された酸化鉄ナノ粒子の調製、及び有機物が除去された酸化鉄ナノ粒子の磁性及び流体力学的径の測定
前記調製された酸化鉄ナノ粒子５０mg と硫酸ナトリウム（Sodium  sulfate、Na２SO４）（平均粒子サイズ１５０μm）２５gを１:５００の重量比でヘキサン（hexane）で撹拌する。温度を高めてヘキサンを徐々に蒸発させる。ヘキサンを蒸発させた後、ナノ粒子と上記塩が混合された粉末を空気条件下で５００℃で５時間加熱する。熱処理後、過剰量の塩は蒸溜水に溶かして１３，０００rpmで３０分間遠心分離することで除去する。塩を十分に除去するために、蒸溜水を用いた洗浄及び遠心分離を数回繰り返す。
【００３５】
塩粒子を用いたアニーリング処理により有機物が除去された酸化鉄ナノ粒子の物理的特性変化を分析した。アニーリング処理過程で粒子凝集により粒子のサイズが大きくなることは観察されなかった（図３）。アニールしたナノ粒子の結晶構造をＸＲＤにより分析した（図４）。最初に合成された酸化鉄ナノ粒子のＸＲＤパターンはマグネタイト（magnetite（Fe３O４、ＪＣＰＤＳ  １９‐０６２９））のＸＲＤパターンと一致した。前記ＪＣＰＤＳ（Joint  Committee  on  Powder  Diffraction  Standards）は１９６９年から物質の回折データを収集して分類したファイルであり、１つのカードに１つの回折パターンが記録されている。したがって、測定されたＸＲＤパターンから物質の結晶構造を把握するための参照資料になる。また、アニーリング処理後のナノ粒子のＸＲＤパターンはアニーリング処理前のナノ粒子のＸＲＤパターンと類似していた。小さいサイズのナノ粒子の場合、ＸＲＤピークの幅が広くなる傾向を有するため、ＸＲＤパターンが類似しているマグネタイトとマグヘマイト（maghemite（γ‐Fe２O３、ＪＣＰＤＳ２５‐１４０２））をＸＲＤ分析により正確に区分することは難しい。通常、マグネタイトは、空気条件でアニールする時に、追加的な酸化によってマグヘマイト又はヘマタイト（hematite（α‐Fe２O３））になる傾向を有する。しかし、ヘマタイト（ＪＣＰＤＳ２４‐００７２）のＸＲＤパターンは、マグネタイトやマグヘマイトと確実に区分される。また、アニーリング処理後の酸化鉄ナノ粒子は茶色を呈するが、アニーリング処理前の酸化鉄ナノ粒子は黒色を呈する（図５）。したがって、アニールした酸化鉄ナノ粒子は追加的な酸化によってマグヘマイトになると思われる。アニーリング処理前後の磁性の変化を分析するために、ＶＳＭを用いたサンプルの磁性測定を行った。アニーリング処理前の飽和磁化値は７８emu／g[Fe]であり、アニーリング処理後の飽和磁化値は１０３emu／g[Fe]であった（図６）。高温アニーリング処理による結晶性の向上が、このような磁性の増加に影響を及ぼしたと思われる。
【００３６】
アニールした酸化鉄ナノ粒子が水溶液に分散されて、水溶液のpHが増加することにより、酸化鉄ナノ粒子のゼータ電位が正電荷から負電荷に変化することが観察され、このような変化につれて流体力学的径も変化した（表１）。pH７では、アニールしたナノ粒子のゼータ電位が小さく、表面を安定化させる界面活性剤がないため、粒子が凝集して沈む傾向を有する。pH７で測定したナノ粒子の流体力学的径は、酸性や塩基性条件と異なって１μmを超えることが観察された（表１）。
【００３７】
【表１】
0005701408.tif 000002
【００３８】
（実施例２）
酸化鉄ナノ粒子と塩粒子を含む混合物のアニーリング処理による親水性物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の調製、及び親水性物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の流体力学的径及び安定性の測定
親水性物質がコーティングされる工程を除き、実施例１と同様の工程で酸化鉄ナノ粒子と塩の混合物をアニールした。親水性物質（表２）１g を蒸溜水２５０mlに溶かした。親水性物質水溶液を撹拌しながら１:１２．５の重量比でアニールした酸化鉄ナノ粒子１２．５gと塩の粉末を徐々に添加する。親水性物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子は、１３，０００rpmで３０分間遠心分離することで分離する。親水性物質水溶液を用いた追加的な洗浄及び遠心分離をさらに２回繰り返す。
【００３９】
【表２】
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【００４０】
親水性物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の形態及び直径を測定するために、ＴＥＭ及びＤＬＳ分析を行った。正電荷を有するＤＥＡＥ‐デキストランでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子は、水溶液に良好に分散され、流体力学的径は８４．３nmであった（表３）。しかし、常用化されたＤＥＡＥ‐デキストランは、分子量が大きいため粒子のコーティング効率が低い。負電荷を有するデキストラン誘導体のうちＤＳ及びＣＭ‐デキストランがナノ粒子のコーティングに用いられ、コーティングされた酸化鉄ナノ粒子は水溶液で１ヵ月以上安定した。ＴＥＭ写真は、ＤＳ及びＣＭ‐デキストランのコーティング過程で粒子凝集はないことを示す（図７、８）。ＤＳでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の流体力学的径は３６．８nmであり（表３）、この数値は、リン脂質‐ポリエチレングリコール（ＰＥＧ‐phospholipid）でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の値（２８．７nm）と類似する（表３）。しかし、ＣＭ‐デキストランでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の流体力学的径は６６．４nmであり、前記ＤＳやリン脂質‐ポリエチレングリコールでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子より遥かに大きい（表３）。これに基いて、ＣＭ‐デキストランの場合、１つ以上のナノ粒子がともにコーティングされているとみなすことができる。比較実験として、電荷を有しないデキストランをナノ粒子のコーティングに用いた。コーティング後の粒子の流体力学的径が１００nmを超過し（表３）、時間が経過するにつれて容易に沈むことが観察された。このことから、ナノ粒子とコーティング物質との間の静電気的作用が粒子のコーティング効率及び安定性に影響を与えると判断される。様々な種類のデキストラン誘導体のうち負電荷を有するデキストランがコーティングに効率的であり、そのうちＤＳでコーティングされたナノ粒子が最も小さい流体力学的径を示した。
【００４１】
親水性物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子のコロイド安定性を確認するために、pHが変化した場合と加熱した場合の酸化鉄ナノ粒子の直径の変化を観察した。ＤＳでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子は、pH４〜１１の区間で安定していた（図９）。また、ＤＳでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子は、１００℃で４時間の間にサイズの変化がなかった。しかし、ＤＳでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子は、塩化ナトリウム溶液で不安定であって沈むことが観察された。ＣＭ‐デキストランでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の場合、pH４〜１３の区間で安定していたが、pH３でナノ粒子が不安定となり、直ぐ沈むことが観察された（図１０、図１１）。ゼータ電位を測定した結果、安定していたナノ粒子が‐２３．７４mV〜‐３６．８８mVの値を有する反面、pH３では１．８１mVの値を有すると測定された（図１１）。このような結果は、pH３付近が等電点であり、ゼータ電位が小さくなってナノ粒子が不安定となることを裏付ける。また、このようなことは、静電気的作用（反発力）がナノ粒子の安定性に寄与することを示す。ＣＭ‐デキストランでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子も１００℃で４時間の間にサイズの変化がなかった。また、このナノ粒子は０．１５Mの塩化ナトリウム濃度まで安定していた（図１０、図１２）。従って、このような結果は、ＣＭ‐デキストランでコーティングされたナノ粒子が医療分野の応用に適した安定性を有するということを示す。ＤＳでコーティングされたナノ粒子は、塩化ナトリウム溶液で不安定であるため医療分野への応用に適していない。
【００４２】
ポリアクリル酸（Polyacrylic  acid、Mw  １，８００）溶液は酸性であるため、ポリアクリル酸でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子は、塩を除去した直後に水溶液での分散性が劣る。水酸化ナトリウム（NaOH）を添加してpHを高めることで、分散性が向上し、流体力学的径が小さくなる（表４）。これは、塩基性でポリアクリル酸を構成しているカルボン酸が負電荷を有するためである。酸性で９１．９nmであった流体力学的径は、中性で５９．４nm、塩基性で３９．９nmになる。ＴＥＭ写真に示すように、ポリアクリル酸のコーティング過程で粒子は凝集しなかった（図１３）。
【００４３】
リン酸‐ポリエチレングリコール（ＰＥＧ‐Phosphate、ＰＯ‐ＰＥＧｓ）でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子は水溶液で良好に分散される。ＴＥＭ写真に示すように、ＰＯ‐ＰＥＧｓのコーティング過程で粒子は凝集せず、流体力学的径は６９．２nmであった（図１４）。
【００４４】
（実施例３）
小さいサイズの塩粒子を用いたアニーリング処理によるデキストラン硫酸でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の調製
塩粒子のサイズが１３μmであることを除き、実施例２と同様の過程でＤＳでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子を調製した。ＤＳでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の流体力学的径は３１．０３nmであった（表３）。
【００４５】
【表３】
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【００４６】
【表４】
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【００４７】
（実施例４）
デキストラン誘導体でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の細胞毒性試験
ＤＳとＣＭ‐デキストランでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子に対してＭＴＴ方法により測定した。様々な濃度の酸化鉄ナノ粒子を４８時間細胞と培養した後、細胞の生存率を測定した結果、２００μg[Fe]／mlの濃度以下で全ての細胞が生きていることを確認することができた（図１５）。
【００４８】
（実施例５）
デキストラン誘導体でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子の磁気共鳴画像（magnetic  resonance  imaging、ＭＲＩ）造影剤としての応用可能性試験
優れた安定性のため、ＤＳの代わりにＣＭ‐デキストランでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子を選択した。水溶液に分散されたナノ粒子のＴ２  ＭＲＩイメージは、鉄イオンの濃度が増加するほどシグナルが減少することを示す（図１６）。造影効果を評価するために、r２弛緩率（relaxivity）値を計算した。r２弛緩率は、造影剤濃度に対するＴ２弛緩時間の逆数の勾配値である。これは、造影剤の濃度変化に応じてＴ２弛緩時間がどれくらい敏感に変化するかを示す指標である。r２弛緩率値を計算するにあたり、１／Ｔ２＝１／Ｔ２o＋r２＊Cの式を用い、この際、Ｔ２はＴ２弛緩時間、Ｔ２０は初期Ｔ２弛緩時間、Cは造影剤の濃度を示す。親水性物質でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子を含む造影剤の濃度をx軸変数とし、前記濃度で測定された１／Ｔ２の値をy軸変数とすると、グラフプロットで勾配値からr２を誘導することができ、r２はr２弛緩率値を示す。アニーリング処理せずにＰＥＧ‐phospholipidでコーティングした酸化鉄ナノ粒子の場合、１２４．４６mM‐１s‐１であったが、アニーリング処理後にＣＭ‐デキストランでコーティングした酸化鉄ナノ粒子は３５８．９mM‐１s‐１であって、２．９倍向上された値を示した。このような高い弛緩率は、アニーリング処理過程で結晶性が向上されたことと、ＣＭ‐デキストランのコーティング過程で多くの粒子が１つのデキストランシェルでコーティングされたことによる結果である。実施例１で上述したように、アニーリング処理後の飽和磁化値は追加的な結晶化により増加した。また、ＣＭ‐デキストランでコーティングした後にも、アニーリング処理後の飽和磁化値と類似の値（１０６emu／g[Fe]）を有することを確認した（図１７）。また、分散された超常磁性ナノ粒子の凝集時にr２弛緩率が増加することは、「magnetic  relaxation  switch」という概念として報告されている（J．M．Perez，et．al．Chem．Bio．Chem．２００４，５，２６１）。また、このように造影効果が高い物質を用いると、ナノ粒子の体内注入量を減少させることができるため、毒性効果を低めることができるという長所も有する。このような結果に基いて、ＣＭ‐デキストランでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子は造影効果が高い生体適合性ＭＲＩ造影剤として用いられることができると判断される。
【００４９】
ＣＭ‐デキストランでコーティングされた酸化鉄ナノ粒子を動物ＭＲＩ実験にも適用した。ナノ粒子（２．５mg[Fe]per  kg  of  mouse  body  weight）をマウスの尾静脈より注射した。ナノ粒子の注入前と後のＭＲＩイメージは、肝臓及び脾臓にナノ粒子が蓄積されて効果的に造影することを示す（図１８）。このことから、生体内（in  vivo）応用に適するナノ物質であることが確認された。
【図２】
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【図３】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１７】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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