(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体適合性ポリマーを含む液体溶液から多孔質材料を製造するための方法であって、
a.生体適合性ポリマー溶液を、熱伝導性表面を有する断熱容器に導入し、
b.所望により、冷却装置内で容器を、試料融点(Tm)から25℃の範囲の温度に冷却することによって、生体適合性ポリマー溶液の少なくとも一部をゲル化させ、
c.熱伝導性表面を介して、
(i)冷却装置の温度を、5分以内に、約-10℃から約-50℃の間に急速に降下させることによって、熱伝導性表面上に、凍結した生体適合性ポリマーゲル/溶液の薄層を形成させ、
(ii)冷却装置の温度を、5分以内に、試料Tmにより近いが、依然としてTm未満の温度まで急速に上昇させ、
(iii)冷却装置の温度を徐々に低下させることによって、ステップc(i)で形成された凍結層から開始された、生体適合性ポリマーゲル/溶液中の氷結晶の一定の一方向性の成長速度を誘発する
ことにより、生体適合性ポリマーゲル/溶液を制御された形式で凍結し、
d.ステップc(iii)の生成物を凍結乾燥すること、
を含む方法。
【請求項２】
多孔質材料が多孔質組織スキャフォールドである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
凍結乾燥後、ステップc(i)で形成された薄い高密度の層に対応し、円柱状細孔を有さない材料が除去される、請求項1又は請求項2のいずれかに記載の方法
【請求項４】
凍結乾燥後、多孔質材料が架橋される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
多孔質材料が、化学的架橋を含むプロセスにより架橋される、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
多孔質材料が、デヒドロサーマル架橋を含むプロセスにより架橋される、請求項4に記載の方法。
【請求項７】
生体適合性ポリマー溶液が使用前に脱気される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
生体適合性ポリマー溶液が粒子を本質的に含まない、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
生体適合性ポリマー溶液が使用前にフィルター滅菌される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
生体適合性ポリマー溶液が、遺伝子組み換えゼラチン様タンパク質を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子組み換えゼラチン様タンパク質が、少なくとも1つのRGDモチーフを含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
遺伝子組み換えゼラチン様タンパク質において、アミノ酸総数に対するRGDモチーフのパーセンテージが、少なくとも0.4%であり、前記遺伝子組み換えゼラチン様タンパク質が、350以上のアミノ酸を含む場合、350のアミノ酸の各広がりが、少なくとも1つのRGDモチーフを含有する、請求項10又は請求項11のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
遺伝子組み換えゼラチン様タンパク質において、アミノ酸総数に対するRGDモチーフのパーセンテージが少なくとも0.6%である、請求項10又は請求項11のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
a.溶媒又は溶媒混合物に生体適合性ポリマーを溶解させ、
b.生体適合性ポリマー溶液を脱気し、
c.生体適合性ポリマー溶液を、単一の熱伝導性表面を有する断熱容器に導入し、所望により添加剤を加え、
d.所望により、容器を試料Tmから25℃の範囲の温度に冷却することにより、生体適合性ポリマー溶液の少なくとも一部をゲル化させ、
e.凍結速度を制御しながら、少なくとも以下の3つのステップを含む温度プロファイルを利用する、冷却装置に容器を曝露することにより試料を一定方向に凍結させ、
(i)冷却装置の温度を、5分以内に、約-10℃から約-50℃の間に急速に降下させることによって、熱伝導性表面上に、凍結した生体適合性ポリマーゲル/溶液の薄層を形成する、
(ii)冷却装置の温度を、5分以内に、試料Tmにより近いが、依然としてTm未満の温度まで急速に上昇させる、
(iii)冷却装置の温度を徐々に低下させることによって、ステップe(i)で形成された凍結層から開始された、生体適合性ポリマーゲル/溶液中の氷結晶の層状成長を誘発する、
f.ステップ(e)で得た材料を減圧で凍結乾燥し、
g.所望により、ステップe(i)で形成された薄い凍結層に対応し、円柱状細孔を有さない材料を除去し、及び
h.ステップgで得た材料を架橋するステップ、
を含む、多孔質組織スキャフォールド材料を製造するための方法を提供する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔質材料、特に明確な細孔形状を有する多孔質組織スキャフォールドを、生体適合性ポリマーの溶液から製造するための方法及びこれらのスキャフォールドから製造される生体適合性製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオマテリアルは、損傷又は罹患した組織を置き換えるように設計される。理想的には、バイオマテリアルは、これらが置き換える健常な組織の特性と同様の特性を有する組織再生のためのスキャフォールドである。これらは、二次元の表面を覆う又は三次元の空隙を満たすように設計されているので、治癒と平行して、最終的には、損傷部位が周辺の組織とほとんど区別できなくなるよう、徐々に吸収されるべきである。これらの目標を達成するために、バイオマテリアルは、設計におけるいくつかの要求事項を満たさなければならない:バイオマテリアルは、十分に大きな多孔度を保有しなければならない。その表面化学及びトポグラフィーは、細胞接着、増殖及び分化に対して適していなければならない;バイオマテリアルは、組織再生を先導するのに適当な構造を保有する必要がある;及びバイオマテリアルは、スキャフォールドがもはや必要とされなくなった場合、調節された吸収が可能であるべきである。加えて、スキャフォールドは、その機械的特性をかなり弱めてしまう全体的に高い多孔度にもかかわらず、外傷の治癒中に、自然の組織の機能を実施するのに十分な剛性、強度及び靭性を保有する。現在利用可能な組織スキャフォールドは、異なる非吸収性生体適合性ポリマー、例えば、ポリエチレンテレフタラートなど;フッ化ポリマー、例えばポリテトラフルオロエチレン(PTFE)など、及び延伸PTFEの繊維;並びにポリウレタンを含む。いくつかの利用可能な組織スキャフォールドは、吸収性ポリマー、例えば、ポリ乳酸、ヒアルロン酸、コラーゲン及びゼラチンなどを含む。しかし、これらの細孔形状範囲は最適ではない。
【０００３】
このような三次元多孔質ポリマースキャフォールドを調製するための典型的な方法として以下が挙げられる:溶液流延法及び粒子浸出法、これは、ポリマーを単結晶塩粒子と混合し、混合物を乾燥させ、次いで乾燥した材料を浸漬することにより塩粒子を浸出することを含む(A. G. Mikos et al., Polymer, 35, 1068 (1994));気体形成技術、これは、ポリマーをCO2気体で膨張させることを含む(L. D. Harris et al., J. Biomed. Mater. Res., 42, 396 (1998));熱誘起相分離技術、これは、非溶媒中にポリマー含有溶媒を浸漬することによって、ポリマー多孔質を作製することを含む(C. Schugens, et al., J. Biomed. Mater. Res., 30, 449 (1996));及び凍結乾燥法、これは、ポリマーを溶媒中に溶解することによって、ポリマー溶液を調製し、次いでポリマー溶液を液体窒素で凍結乾燥することを含む(K. Whang, Polymer, 36, 837(1995))。方向性のあるフリーズキャスティングとも呼ばれる、特定化された形態の熱誘起相分離は、これまでの中でも最も明確な多孔質組織スキャフォールドを得たが、これは文献において、広く記載されている(Wegst et al Phil. Trans. R. Soc. A 2010, 368 p.2099-2122)。この方法は、分散液中での、溶媒、例えば水などの制御された固化に依存し、固体溶媒結晶の方向性のある成長により、溶媒と分散した材料の間に方向性のある相分離が結果として生じる。溶媒の除去後(例えば凍結乾燥)、多孔質材料が残留する。本方法は、凍結最前部が分散した材料全体にわたり移動する速度を制御することによって、材料の形状の一部の制御を可能にする。動物由来の天然コラーゲン及びエラスチンを含む組織スキャフォールド材料であるRemaix及びOptiMaixは、米国特許第6,447,701号に記載されているフリーズキャスティング法を使用して調製されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、多くの用途のためには、材料が高度に均一であること(例えば材料密度、細孔サイズ及び細孔配向性又は機械的特性は、材料全体を通してばらつきが限られるべきである)が好ましい。現在の生体適合性ポリマーの多孔質組織スキャフォールドは、十分な均一性を欠いている。加えて、細胞付着及び成長に対して増強された特性を有する、好ましい特注の生体適合性ポリマーは、水性溶媒又は溶媒混合物中で完全かつ分子的に可溶性になるように設計されている。さらに、これらの生体適合性ポリマーは、高度に精製され、可溶性及び不溶性(微粒子)不純物を含まないことが普通望ましい。このような分子的に溶解された生体適合性ポリマーの使用は、結果として生じる多孔質スキャフォールドの均一性を改善する。本発明の目的は、生体適合性ポリマーを含む、高度に均一な生体適合性ポリマー組織スキャフォールド、及びこれらの組織スキャフォールドを用いて調製される製品の調製を可能とするプロセスを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、生体適合性ポリマーを含む液体溶液から多孔質材料を製造するための方法であって、
a.生体適合性ポリマー溶液を、熱伝導性表面を有する断熱容器に導入し、
b.所望により、冷却装置内で容器を、試料融点(Tm)から25℃の範囲の温度に冷却することによって、生体適合性ポリマー溶液の少なくとも一部をゲル化させ、
c.熱伝導性表面を介して、
(i)冷却装置の温度を、5分以内に、約-10℃から約-50℃の間に急速に降下させることによって、熱伝導性表面上に、凍結した生体適合性ポリマーゲル/溶液の薄層を形成させ、
(ii)冷却装置の温度を、5分以内に、Tmにより近いが、依然としてTm未満の温度まで急速に上昇させ、
(iii)冷却装置の温度を徐々に低下させることによって、ステップc(i)で形成された凍結層から開始された、生体適合性ポリマーゲル/溶液中の氷結晶の一定の一方向性の成長速度を誘発する
ことにより、生体適合性ポリマーゲル/溶液を制御された形式で凍結し、
d.ステップc(iii)の生成物を凍結乾燥すること、
を含む方法を提供する。
【０００６】
好ましくは、本発明の方法により生成された多孔質材料は、多孔質組織スキャフォールドである。
Tm、水性試料の融点は、通常0℃近くであるが、有機溶媒又は塩の添加により、0℃から有意に外れることがある。有機溶媒及び/又は塩を試料に加えた場合、結果としてTmの低下が生じ、試料の融点は0から-10℃の間の範囲となることがあるが、ほとんどの場合、Tmは0から-5℃の間の範囲にある。
【０００７】
本方法で生成された多孔質組織材料は、平均円相当径(ECD)が、標的とする細胞タイプ並びに組織タイプ及び位置に応じて、約10〜約1000ミクロンの間の範囲であり、ECD標準偏差(ECDSD)の小さい、均一な多孔質構造を有する。本発明により得た典型的なECDSD値は、ECD値の60〜20%の範囲である。好ましいECDSD値は40%以下である。本方法で調製される多孔質材料は、約10〜約1000ミクロンの間の範囲、好ましくは約100〜500ミクロンの範囲の円柱状多孔質構造の平均ECDを有することもまた好ましい。
【０００８】
本発明の方法で生成された多孔質組織材料は、従来技術において記載されている材料よりも、その材料密度、細孔サイズ及び細孔の配向性に関して改善された均一性を有する。これにより、本発明の多孔質組織材料は、多孔質組織スキャフォールド及び生体適合性の製品における使用に対して特に適切なものとなる。
【０００９】
一般的定義
「含む」という用語は、述べられている部分、ステップ又は構成部分の存在を特定すると解釈されるが、1つ以上の追加的部分、ステップ又は構成部分の存在を除外するものではない。
不定冠詞「a」又は「an」による元素への言及は、文脈により、一個及び一個のみの要素の存在が明らかに必要とされない限り、1個より多くの要素(複数可)が存在する可能性を除外しない。したがって、不定冠詞「a」又は「an」は、普通「少なくとも1個」を意味する。
「多孔質組織スキャフォールド」及び「多孔質スキャフォールド」という用語は、交換可能なものとして使用され、本明細書で使用される場合、組織細胞が誘引され、付着することができる微環境として作用する、生体適合性ポリマーの三次元分子マトリックスとして解釈されるものとする。
【００１０】
生体適合性ポリマーは、本明細書で使用される場合、任意の人工又は天然の生分解性又は非分解性ポリマーを意味し、例えば、これらに限定されないが、コラーゲン、ゼラチン、キトサン、カラギーナム、アルジネート、ヒアルロン酸、デキストラン、ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)(PGA)、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)、ポリ(エプシロン-カプロラクトン(carprolactone))、ポリ(無水物)、ポリオルトエステル、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(エチレングリコール)、ポリウレタン、ポリ(アクリル酸)、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)、ポリ(エチレンオキシド)-ポリ(プロピレンオキシド)-ポリ(エチレンオキシド)コポリマー(Pluronic(商標))、そのコポリマー、又はこれらの混合物である。
【００１１】
「均一」及び「均一性」という用語は、本明細書で使用されている場合、パラメーター、例えば、これらに限定されないが、細孔サイズ、(楕円)円の直径、細孔形状、方向づけられた個々の細孔の間に観察される角度の範囲、細孔の真直度など、及び機械的特性、例えば、これらに限定されないが、剛性、脆性、圧縮性などのばらつきが限定されていることと解釈されるものとする。
「円柱状細孔」という用語は、本明細書で使用される場合、円柱又は楕円形の円柱に近い細孔形状の細孔の内腔と解釈され、ここで、円柱は、その表面が所与の線分、円柱の軸から一定の距離の点により形成される物体であると定義される。この表面、及び軸に垂直の2つの平面により囲まれた固体もまた円柱と呼ばれる。楕円形の円柱とは、その準線が楕円である円柱である。縦方向の円柱状細孔の方向に垂直の断面は、本明細書で使用される場合、真円度が0.5以上の不規則な形状を有することができる。一実施形態では、真円度誤差は40以下である。
【００１２】
真円度(R)という用語は、細孔の円形の尺度を提供する。完璧な円は真円度1を有する。Rは、式:
【数１】
0005740059.tif 000002
により、細孔(A)の領域及び最大直径(dmax)から計算する。
【００１３】
円相当径(ECD)という用語は、不揃いな形の細孔の領域、A、として定義され、これはECDで表現することができる。ECDと細孔の実際の直径の間の一致は、細孔の真円度の増加と共に明らかに改善する。ECDは、式:
【数２】
0005740059.tif 000003
により得られる。
【００１４】
平均ECDは、与えられた一定の表面積内でそれぞれ個々の細孔に対する細孔ピクセルをカウントし、簡単な数学的転換によりそれぞれ個々の細孔ECDを導き出すことによって測定した。次いで平均ECD及びECDSDが測定される。これらのパラメーターは、縦方向の細孔方向に対して垂直に撮られた断面画像において測定される。
【００１５】
生体適合性スキャフォールド材料内の細孔の形状、形態及び分布を記載するこれら及び他のパラメーターのさらなる詳細については、ASTM Standard Guide for Interpreting Images of polymeric Tissue Scaffolds, Designation:F2603-06を参照。「ECD」の定義もまたこの標準規格において見出すことができる。
「円柱状の細孔直径」という用語は、本明細書で使用される場合、平均細孔ECDとして解釈され、与えられた一定の表面積内でそれぞれ個々の細孔に対する細孔ピクセルをカウントし、簡単な数学的転換によりそれぞれ個々の細孔ECDを導き出すことによって測定される。次いで、平均ECD及びECDSDが測定される。これらパラメーターは、縦方向の細孔方向に対して垂直に撮られた断面画像で測定される。
【００１６】
「インビトロ培養システム」という用語は、本明細書で使用される場合、エクスビボでの細胞、組織、器官又は器官部位の成長に対して使用した任意のキット、装置又は化合物であると解釈される。
「生体適合性製品」という用語は、本明細書で使用される場合、材料がヒト又は動物の体の上又は体内に置かれ、有害な免疫学的応答を引き起こさない、医学的状態の治療のため又は美容補正のために使用される任意の材料として解釈されるものとする。これは、時間と共に分解し、体により吸収され得る材料を含む。本材料は、任意の形態、例えば、これらに限定されないが、包帯、粉末、スポンジ、止血剤、及び縫合糸、任意の種類のインプラント、注射用粒子、ミクロスフェア、マイクロ担体、ゲル又はパテであってよい。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「万能性である」「万能性」、「万能性細胞」及び同等の表現は、細胞培養における増殖及び自己再生、並びに様々な細胞集団への分化の両方が可能な細胞を指し、これは多能性特性を示すものを含み、例えば万能性ES細胞は、3つの胚細胞系統のそれぞれを生じることができる。しかし、万能性細胞は、胚外組織、例えば、羊膜、絨毛膜、及び胎盤の他の構成部分などを生じることができず、生物全身を生成することができない可能性もあり、つまり万能性細胞は、「全能性」ではない。万能性は、単細胞の子孫からのすべての三胚葉の誘導体を形成する、及び免疫抑制されたマウスへ注入後、奇形腫を作り出す、安定した発育の可能性の証明を提供することによって実証することができる。万能化の他の印は、万能性細胞において発現されることが知られている遺伝子の発現、及び特徴的な形態を含む。本発明の万能性細胞は、当業者に公知の任意の方法を使用して誘導することができる。「万能性細胞」として、これらに限定されないが、幹細胞、人工多能性細胞(iPS細胞)、例えば、人工多能性幹細胞(iPSC)、例えば、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)、又はヒト胚幹細胞(hESC)、単為発生細胞などが挙げられる。
【００１８】
「全能性」は、本明細書で使用される場合、胚体外組織(例えば胎盤)を含むすべてのタイプの細胞を生み出し、生物全身(例えばマウス又はヒト)を生じる細胞の能力を指す。
「自己再生」とは、分割して、親幹細胞と同一の特性を有するさらなる幹細胞を形成し、これによって、幹細胞集団の無制限の補充を可能にする、幹細胞の能力を指す。
【００１９】
「粒子」という用語は、本明細書で使用される場合、少なくとも20〜50nmの「最も小さな寸法サイズ」を有する、不規則又は離散した、任意の形状の固体材料の任意の粒子であると解釈されるものとし、これには、ミクロスフェア、任意のタイプの顆粒、任意のタイプの繊維又はフィラメントが含まれる。
「粒子を含まない」という用語は、本明細書で使用される場合、溶液が、50nmより大きいサイズの粒子を本質的に含まず、好ましくは20nmより大きいサイズの粒子を含まないことを意味する。いずれの粒子のサイズも、電子顕微鏡による検査又はレーザー光散乱技術、ダイナミック式(PCS)又はスタティック式(SLS)により測定することができる。粒子の存在は、様々な独立した方法、例えば、特定の元素の増強した密度を局在的に観察するための試料断面の元素マッピング(EDAX)、又は埋込型粒子を検出するための、試料断面の(光学又は電子)顕微鏡法検査、又は試料ポリマーネットワークを完了まで加水分解するための特定の酵素(例えばコラーゲン又はゼラチンに対してトリプシン)を使用すること、及び粒子を検出するために光散乱技術を使用することなどにより検出することができる。
【００２０】
「フリーズキャスティング」及び「熱誘起相分離法」という用語は、交換可能なものとして使用され、溶解及び分散した材料から溶媒が分離するように、溶液、分散液又はゾル-ゲルの温度を低下させることによって、溶液、ゾル-ゲル又は分散液中の溶媒を固化することによって多孔質構造を作り出す方法を指す。固化した溶媒を、第2のプロセスで除去することによって、溶解した材料の多孔質構造が残留する。温度変化が分散液、溶液又はゾル-ゲル全体を通してどのように散らばるかを制御することによって、細孔の形状を調節することができる。温度勾配が一方向に適用される場合(凍結最前部の動方向とも呼ばれる)、これは、「一方向性のフリーズキャスティング」として知られている。
「垂直の」という用語は、本明細書で使用される場合、別の線又は平面と約80〜110度の角度を形成する線又は平面と解釈されるものとする。
【００２１】
「タンパク質」又は「ポリペプチド」又は「ペプチド」という用語は、交換可能なものとして使用され、特定の作用様式、サイズ、三次元構造又は起源を言及することなく、アミノ酸の鎖からなる分子を指す。
「ゼラチン」及び「ゼラチン様」は、本明細書で使用される場合、従来の方法で抽出したものか、又は遺伝子組み換え若しくは生合成由来のものか、又はゼラチンの少なくとも1つの構造的及び/又は機能的特徴を有する任意の分子であるかに関わらず、任意のゼラチンを指す。この用語は、ゼラチン生成物の中に含まれている1つより多くのポリペプチドの組成物、並びにゼラチン材料に寄与している個々のポリペプチドの両方を包含する。したがって、ゼラチンという用語は、本発明に関連して使用された場合、ゼラチンポリペプチドを含むゼラチン材料、並びに個々のゼラチンポリペプチドの両方を包含する。ゼラチンが誘導され得るポリペプチドとは、コラーゲン、プロコラーゲン、及びコラーゲンの少なくとも1つの構造的及び/又は機能的特徴を有する他のポリペプチドなどのポリペプチドである。このようなポリペプチドとして、単一のコラーゲン鎖、又はコラーゲンホモトリマー若しくはヘテロトリマー、又はその任意のフラグメント、誘導体、オリゴマー、ポリマー、又はサブユニットを挙げることができ、これらは少なくとも1つのコラーゲン性ドメイン(Gly-Xaa-Yaa領域であり、ここで、Xaa及びYaaは、独立して、任意のアミノ酸である)を含有する。特に、この用語は、自然界には見られない、技術的に作り出された配列、例えば、改変されたコラーゲン配列、例えば、天然由来のコラーゲン配列から、欠失、付加、置換、又は他の変更を介して改変された配列などを想定している。このような配列は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるEP0926543、EP1014176、WO01/34646、WO04/085473、EP1894945、WO08/103041、WO08/103044、WO08/103043、さらに具体的にはEP0926543及びEP1014176の実施例に記載されているような、適切な改変されたコラーゲンポリヌクレオチド構造体から得ることができる。
【００２２】
本明細書中に記載されている「架橋剤」は、クロスリンカーを含む組成物を指す。「クロスリンカー」とは、本明細書で使用される場合、有機分子内に共有結合の分子内化学結合及び分子間化学結合を導入することができる反応性化合物を指す。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、本発明による生体適合性ポリマーから多孔質材料を生成するための温度/時間プロファイルを示している。
【図２】図２は、より小さな円柱状細孔が必要とされる場合の、本発明による生体適合性ポリマーから多孔質材料を生成するための温度/時間を示している。
【図３】図３は、本発明による方法を使用して、粒子を含まない遺伝子組み換えゼラチン溶液で均一に調製することができる円柱状細孔サイズの範囲の走査型電子顕微鏡(SEM)画像を示している。上の列は、試料の中央部分を横方向に/垂直に切った切断面の画像であり、下の列は、上から下へ横向き/水平に2〜3mm切った切断面の画像である。
【図４】図４は、比較例3全体の側面の光学顕微鏡像を示している。試料の高さは12mmであり、試料の円径は4.5cmである。
【図５】図５は、試料上側の領域を切った比較例3の側面の(垂直)断面のSEM画像を示している。
【図６】図６は、試料底部の領域を切った比較例3の横断面(水平)のSEM画像を示している。
【図７】図７は、試料最上部の領域を切った比較例3の横断面(水平)のSEM画像を示している。
【図８】図８は、本発明の実施例1の側面の光学顕微鏡像を示している。試料の高さは12mmであり、試料の円径は4.5mmである。
【図９】図９は、本発明の実施例1に従い調製した試料の全高さ試料の側面(垂直)断面のSEM画像を示しており、底部における、細い、密度の高い核形成層及びこの層からの試料最上部までの均一な平行した細孔を示している。
【図１０】図１０は、核形成層のすぐ上の下部領域を切った、本発明の実施例1のSEM横断面(水平)を示している。
【図１１】図１１は、試料の最上部領域を切った、本発明の実施例1の横断面(水平)のSEM画像を示している。
【図１２】図１２は、試料の最上部付近を切った、比較例4の側面(垂直)の断面のSEM画像を示している。
【図１３】図１３は、試料の最上部付近の領域を切った、比較例4の横断面(水平)のSEM画像を示している。
【図１４】図１４は、比較例5全体の側面の断面の光学顕微鏡像を示している。試料の高さは12mmであり、試料円径は4.5mmである。
【図１５】図１５は、試料最上部付近を切った比較例5の側面(垂直)の断面のSEM画像を示している。
【図１６】図１６は、核形成層のすぐ上の試料底部の領域付近を切った、比較例5の横断面(水平)のSEM画像を示している。
【図１７】図１７は、試料最上部付近を切った、比較例5の横断面(水平)SEM画像を示している。
【図１８】図１８は、比較例6全体の側面の断面の光学顕微鏡像を示している。試料の高さは12mmであり、試料の円径は4.5mmである。
【図１９】図１９は、試料の最上部付近を切った、比較例6の側面(垂直)の断面のSEM画像を示している。
【図２０】図２０は、核形成層のすぐ上の試料の底部領域付近を切った、比較例6の横断面(水平)のSEM画像を示している。
【図２１】図２１は、試料最上部付近を切った、比較例6の横断面(水平)のSEM画像を示している。
【図２２】図２２は、本発明の実施例3の側面(垂直)の断面のSEM画像を示している。
【図２３】図２３は、核形成層のすぐ上の試料の底部領域付近を切った、本発明の実施例3の横断面(水平)のSEM画像を示している。
【図２４】図２４は、試料最上部付近を切った、本発明の実施例3の横断面(水平)のSEM画像を示している。
【図２５】図２５は、本発明の実施例4の側面(垂直)の断面のSEM画像を示している。
【図２６】図２６は、核形成層のすぐ上の試料の底部領域付近を切った、本発明の実施例4の横断面(水平)のSEM画像を示している。
【図２７】図２７は、試料を最上部付近で切った、本発明の実施例4の横断面(水平)のSEM画像を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
フリーズキャスティング手順の間の新規の3つのステッププロセスを使用することによって、多孔質スキャフォールド材料全体を通して一貫した円柱状細孔サイズを有することに関して、以前に記述された多孔質スキャフォールド材料よりもさらに均一な多孔質組織スキャフォールドを調製することが可能であることを驚くことに見出した。本プロセスは、その側面のうちの少なくとも1つの側面上が熱伝導性である容器内で行われる。本プロセスは、本質的に、試料全体の小さな部分を急速に冷却及び凍結させることによって、容器片側の全領域にわたり薄い凍結した試料層を作り出すための極低温の冷却温度の使用を提供する。この薄い凍結層は、続いて、プロセスのそれに続くステップにおいて、円柱状の氷結晶の成長のための氷の鋳型部位として作用する。この薄い、高密度の凍結層の存在は、円柱状の氷結晶のそれに続く成長のさらに均一な及びより良好な制御、したがって、生体適合性ポリマー材料内に残される細孔空洞のサイズ、形態及び数密度のより良好な制御を提供する。この層の厚さは、冷凍容器設計の熱特性及び形状並びにステップc(i)及びc(ii)における冷却及び加熱速度を最適化することによって最小限に抑えることができる。通常の厚さの値は、生体適合性ポリマーのタイプ及びその濃度にも応じて、0.1〜1.5mmである。
凍結/温度制御は、当業者には公知である任意の適切な冷却装置を使用して達成することができる。好ましくは、冷却装置は、冷浴槽である。
【００２５】
本発明は、ここで図１及び２を参照して説明する。
図１及び２は、生体適合性ポリマー溶液が冷浴槽(T0、t0)内で単一の熱伝導性表面を有する、断熱容器へ導入されていることを示す。添加剤、例えば、エタノール、メタノール又は酢酸又は他の無毒性若しくは他の容易に除去可能な化合物などを、所望により添加することによって、最終の凍結乾燥試料の平均細孔サイズを変更することができる。
【００２６】
i.生体適合性ポリマー溶液を冷却し、そのうちの少なくとも一部の画分がゲルを形成する(ゲルを有する1容量パーセント以上が通常、冷やした表面に最も近い容量を占める)(T1、t1)。次いで、温度を急速に降下させる。
ii.冷浴槽を5分(t2〜t1)以内に温度(T2)まで冷却し、生体適合性ポリマーのゲル/溶液が、容器の熱伝導性側面に、凍結した生体適合性ポリマー溶液の薄層を形成するようにする (T3、t3)。
iii.次いで、冷浴槽温度を、5分以内(t4〜t3)に、温度(T4)まで急速に上昇させるが、ここで、T4は、T2よりもTmにより近いが、依然としてそれ未満である。
iv. 少なくとも5分間の、T4からT5への、ゆっくり及び徐々にランピングされた温度降下時間(t5〜t4) (生体適合性ポリマー溶液又はゲル中の氷結晶の円柱状の成長を誘発するため、T5はT4よりも低い)。これは、容器の熱伝導性側面に垂直である生体適合性ポリマー溶液のすでに凍結された層により開始される。
【００２７】
標的とする細孔構造及び平均ECDを得るための、温度パラメーターT0、T1、T2、T3、T4及びT5並びに時間パラメーターt1、t2、t3、t4、及びt5、は、生体適合性ポリマーの各タイプ及び濃度に対して、並びに任意の添加剤の存在に対して最適化する必要がある。さらに、試料の高さは、T4及びt4に対するパラメーターT5及びt5の最適化を必要とする。試料が高くなると、凍結プロセスを完了するために、T4からT5へのゆっくりとした温度ランピングをより長い時間継続する必要がある。
本発明の方法を使用して多孔質材料内に形成された円柱状細孔は、以前に記述された材料と比較して優れた均一性及び対称性を有する。好ましくは、ステップciで形成された、円柱状細孔を有さない、薄い凍結層に対応する材料は除去される。この密度の高い低層は、通常0.1〜2mm厚さと測定されるが、所望により、冷浴槽の温度プロファイルを最適化することによって1mm未満まで減少することができる。具体的には、パラメーターt2−t1、T2、t3−t2、T3、T4及びt4−t3である。
【００２８】
好ましい一実施形態では、温度T2は、約マイナス10℃〜約マイナス50℃の範囲内である。冷浴槽温度のT1からT2への降下は、好ましくは3分以内に到達し、より好ましくは2分未満に到達する。この温度変更に対する温度プロファイルは、任意の形状又は形態を有していてもよい。これは、線状及び非線状プロファイルの両方を含み、特定の均一な細孔サイズを達成するために最適化してもよい。
さらなる好ましい実施形態では、温度T4は約マイナス4℃であるが、常に温度T3よりも上である。冷浴槽の温度のT3からT4への上昇は、好ましくは2分以内に到達し、より好ましくは1分未満で到達する。この温度の変更に対する温度プロファイルは、任意の形状又は形態を有していてもよい。これには、直線的及び非直線的プロファイルの両方が含まれ、特定の均一な平均細孔サイズを達成するために最適化してもよい。
【００２９】
T4からT5への温度プロファイルは、任意の形状又は形態を有していてもよい。これには、直線的及び非直線的プロファイルの両方が含まれ、特定の均一な細孔サイズを達成するために最適化してもよい。
一般的には、T4をより低く設定し、T4からT5への温度降下の勾配をより大きく設定するほど、細孔サイズが小さくなる。
【００３０】
断熱容器は、任意の形状又は形態を有することができ、任意の適切な材料から作製することができる。熱伝導性表面は、任意の適切な熱伝導性材料、例えば、銅及びアルミニウムのような金属などで作製することができ、熱伝導性セラミクス及びポリマーを含むことができる。
好ましくは、断熱容器は、所望により発泡体材料、例えば、ポリウレタン又はセラミック発泡体などと組み合わせた、PTFE又はテフロン様プラスチックであり、熱伝導性表面は、金属、特にアルミニウム又は銅のような良好な熱導体である。
【００３１】
好ましくは、容器は、円柱状、楕円形の円柱状又は丸みのある長方形であり、その側面及び所望により上面が断熱されている。
ステップdにおいて、当技術分野で公知の任意の適切な凍結乾燥法を使用することができる。
好ましくは凍結乾燥後、ステップc(i)で形成された薄い高密度の層に対応し、円柱状細孔を有さない材料は除去される。
好ましくは、本発明の方法で形成された多孔質材料は、1つの対称的な均一の円柱状多孔質構造を有し、約10〜1000ミクロンの間の平均細孔ECDを有する、実質的に粒子を含まない生体適合性ポリマーを含む多孔質材料を含む。より好ましくは、平均細孔ECDは、約50(好ましくは100)〜500ミクロンの間である。
【００３２】
好ましくは、生体適合性ポリマー溶液は、使用前に脱気する。これは、当技術分野で公知の任意の技術で実施することができる。好ましくは、生体適合性ポリマー溶液は、少なくとも10分間、大気圧を50mbar未満に低下させることによって脱気する。
生体適合性ポリマー溶液は粒子を本質的に含まないこともまた好ましい。粒子を本質的に含まない生体適合性ポリマーの分子溶液を使用することによって、多孔質スキャフォールド材料全体を通して一貫した円柱状細孔サイズを有することに関して、以前に記述された多孔質スキャフォールド材料よりもさらに均一であるばかりでなく、粒子がないことから材料密度に関してもより均一である多孔質組織スキャフォールドを調製することが可能である。従来の技術では、材料の懸濁液又は分散液を使用して多孔質スキャフォールドを調製する(Kuberka et al. 2002 Int J Artif Organs 20 (1): 67-73; Wegst et al. Phil. Trans. R. Soc. A2010, 368 p.2099-2122; Meghri et al. 2010 JOM 62(7): 71-75及び米特許第6,447,701号)。本発明者は、これらの材料中の粒子は、材料密度においてのみならず、円柱状細孔の対称性及び細孔サイズにおいても変動をもたらすことを見出した。この第２の作用は、粒子が、フリーズキャスティングプロセス中に、氷形成に対する核形成部位として作用する結果であると考えられる。本発明では、このような粒子がないことにより、試料ゲル/溶液の核形成温度が低下する。これは、生体適合性ポリマーの分子溶液内での氷の形成が、粒子を含有する系に対する温度より低い温度で生じるという事実により示されている。粒子を含まない生体適合性ポリマー溶液における典型的な核形成温度は-8〜-30℃の間であるのに対して、Schoof et al, 2001, J Biomed Mater Res 58(4): 352-357は、コラーゲン懸濁液が0℃のすぐ下で凍結することを示している。このようにより低い温度であることから、それに続く、生体適合性ポリマーの分子溶液中での形成された氷結晶の成長は、さらに突発的であり、粒子を含有する系内よりも制御が難しい。しかし、本発明の発明者は、驚くことに、この問題は、フリーズキャスティング手順の間に本発明の新規の3つのステッププロセスを使用することによって回避することができることを見出した。
【００３３】
生体適合性ポリマー溶液が、使用前に、好ましくは0.45ミクロンフィルターを介して、より好ましくは0.2ミクロンフィルターを介してフィルター滅菌されることもまた好ましい。
好ましくは凍結乾燥(ステップd)後、多孔質材料は架橋される。
好ましくは、本発明の方法を使用して、多孔質組織スキャフォールド材料を製造するが、この場合、ステップdからの凍結乾燥した材料は、好ましくは架橋される。
架橋は、任意の架橋剤及び当業者に公知の技術を利用することができる。
【００３４】
好ましい一実施形態では、多孔質材料は、化学的架橋を含むプロセスで架橋される。適切な化学的架橋剤として、以下が挙げられる:アルデヒド又はジアルデヒド、例えば、ホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒドなど、カルボジイミド、ジイソシアネート、ジケトン、例えば、ジアセチル及びクロロペンタンジオン、ビス(2-クロロエチルウレア)、2-ヒドロキシ-4,6-ジクロロ-1,3,5-トリアジン、反応性ハロゲン含有化合物(US3,288,775において開示されている)、カルバモイルピリジニウム化合物(ピリジン環はスルフェート又は硫酸アルキル基を担持している) （US4,063,952及びUS5,529,892に開示されている）、ジビニルスルホンなど、並びにS-トリアジン誘導体、例えば、2-ヒドロキシ-4,6-ジクロロ-s-トリアジンなど。これにはまた光活性化架橋技術も含まれる。
好ましい化学架橋剤は、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)及びヘキサメチレンジイソシアネート(HMDIC)である。
【００３５】
別の好ましい実施形態では、多孔質材料は、デヒドロサーマル架橋を含むプロセスにより架橋される。
好ましい実施形態では、好ましくは、生体適合性ポリマーは、ポリグリコール酸(PGA)、ポリ乳酸(PLA)、及びポリ(DL-乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)からなる群から選択される合成による生分解性ポリマー、又はキトサン、コラーゲン、ゼラチン、そのコポリマー、若しくはこれらの混合物からなる群から選択される天然の生分解性ポリマーのいずれかである。さらに好ましい実施形態では、生体適合性ポリマー溶液は、遺伝子組み換えゼラチン様タンパク質を含む。
【００３６】
遺伝子組み換えゼラチン様タンパク質の使用には、動物の供給源から慣用的に製造したゼラチンと比較して医学的な利点がある。天然のゼラチンには安全性の問題、例えば、潜在的な免疫原性、例えば、抗原性及びアレルギー性応答などに対する懸念などが存在する。また、天然由来のゼラチン混合物を完全に特徴づけ、精製し、又は十分に再生産することができないことは、薬学及び医学コミュニティーの中で継続的な懸念である。抽出及び精製プロセスから生じる細菌汚染及びエンドトキシンの取込みに関する追加的な安全性の懸念も存在する。
遺伝子組み換え技術により、優れた特徴、例えば、低い免疫原性、改善された細胞付着性及び制御された生分解性を有するゼラチン様タンパク質の設計が可能になる。EP0926543、EP1014176、WO01/34646、WO2004/085473、EP1894945、WO2008/103041、WO2008/103044、WO2008/103043、並びに具体的にはEP0926543及びEP1014176の実施例には、遺伝子組み換えゼラチン、並びにメチロトローフ酵母、特にメタノール資化性酵母(Pichia pastoris)を用いたその製造方法が記載されており、これらの文献に記載されている遺伝子組み換えゼラチン様タンパク質は本明細書に参照により組み込まれる。
【００３７】
本発明の方法に使用される生体適合性ポリマー溶液は、少なくとも1つのRGDモチーフを含む遺伝子組み換えゼラチン様タンパク質を含むことが好ましい。より好ましくは、生体適合性ポリマー溶液は、さらにRGDモチーフを豊富に含む遺伝子組み換えゼラチン様タンパク質を含む。本発明におけるRGDを豊富に含むゼラチンは、WO2004/085473及びWO2008/103041において記載されており、それらに開示されているRGDを豊富に含むゼラチンは、本明細書に参照により組み込まれる。
好ましくは、遺伝子組み換えゼラチン様タンパク質において、アミノ酸総数に対するRGDモチーフのパーセンテージ、少なくとも0.4%であり、前記遺伝子組み換えゼラチン様タンパク質が、350以上のアミノ酸を含む場合、350アミノ酸の各ストレッチは、少なくとも1つのRGDモチーフを含有する。
【００３８】
より好ましくは、遺伝子組み換えゼラチン様タンパク質において、アミノ酸総数に対するRGDモチーフのパーセンテージは、少なくとも0.6%であり、特には少なくとも0.8%であり、特には少なくとも1.0%であり、さらに特には少なくとも1.2%であり、より特別には少なくとも1.5%である。
さらに好ましい実施形態では、遺伝子組み換えゼラチン様タンパク質は、低下した量のヒドロキシプロリン残基を有する。プロリンのヒドロキシル化は、コラーゲンにおける三重らせん体形成のための必要条件であり、これは、微粒子凝集体及びタンパク質材料の繊維又はフィラメントをもたらすため、本発明により形成される多孔質スキャフォールド材料に対して好ましくない特徴である。好ましくは、遺伝子組み換えゼラチン様タンパク質において、遺伝子組み換えゼラチン様タンパク質のアミノ酸残基の10%未満、より好ましくは5%未満がヒドロキシプロリンである。遺伝子組み換えゼラチン様タンパク質がヒドロキシプロリンを含まないことが特に好ましい。WO2002/070000において記載されているヒドロキシプロリンを含まない遺伝子組み換えゼラチン様タンパク質のさらなる利点は、これらが、天然のゼラチンとは対照的に、IgEを含む免疫反応を示さないことである。
【００３９】
さらなる好ましい実施形態では、ゼラチン様タンパク質は、例えばEP1608681及びEP1368056で開示されているゼラチン様タンパク質などのように、細胞結合の増強及び/又は最小の免疫原性を有するように機能化される。機能化した遺伝子組み換えゼラチン様タンパク質は、インプランテーション後、医療用具の周辺の組織の細胞浸潤を刺激する、改善された細胞結合特性を有するように設計することができる。
別のさらなる実施形態では、本発明で使用される遺伝子組み換えゼラチン様タンパク質は、計算した等電点が5より上、好ましくは計算した等電点が6より上、最も好ましくは計算した等電点が7より上である遺伝子組み換えゼラチン様タンパク質である。
さらなる実施形態では、本発明で使用される遺伝子組み換えゼラチン様タンパク質は、少なくとも20kDa、より好ましくは25kDa、特に少なくとも35kDa、さらに特に少なくとも50kDaの分子量を有する。
【００４０】
本発明で使用される遺伝子組み換えゼラチン様タンパク質は、20kDa〜75kDaの範囲の分子量を有することが好ましい。
ゼラチン様タンパク質を含む多孔質材料の製造中に、１より多くの形態のゼラチンを使用してもよい。
【００４１】
本発明の方法を使用して多孔質組織スキャフォールド材料を製造する場合、使用されるゼラチンは生分解性であり、刺激/組織の再生後、その除去のために侵襲手術法を必要としないことが好ましい。さらに生分解性は、組織再生において別の重要な刺激因子である。推測的には、遺伝子組み換えゼラチンが、天然ゼラチンの分解を引き起こすものと同じメカニズムにより細分化されるかどうかは明らかではない。天然ゼラチン及びコラーゲンはヒト体内でタンパク質分解酵素、具体的にはマトリックス-メタロプロテイナーゼ(MMP)により分解することが知られている。マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)は亜鉛依存性エンドペプチダーゼである。MMPは、メトジンシンスーパーファミリーとして知られるタンパク質分解酵素のより大きなファミリーに属する。総合的にこれらは、すべての種類の細胞外マトリクスタンパク質を分解することが可能であるが、いくつかの生理活性分子を処理することもできる。MMPの重要なグループはコラゲナーゼである。これらのMMPは、三重らせん状の線維性コラーゲンをはっきりとした3/4及び1/4フラグメントに分解することができる。これらのコラーゲンは骨及び軟骨の主成分であり、MMPは、これらを分解することができる唯一の既知の哺乳動物酵素である。慣習的には、コラゲナーゼは、MMP-1(間質性コラゲナーゼ)、MMP-8(好中球コラゲナーゼ)、MMP-13(コラゲナーゼ3)及びMMP-18(コラゲナーゼ4)である。別の重要なグループのMMPは、ゼラチナーゼにより形成される。これらのMMPの主要基質は、IV型コラーゲン及びゼラチンであり、これらの酵素は、触媒ドメインに挿入される追加ドメインの存在により区別される。このゼラチン結合領域は、亜鉛結合モチーフの直前に位置し、触媒ドメイン構造を崩壊させない、分離した折りたたみ単位を形成する。このサブグループの2つのメンバーは、MMP-2(72kDaゼラチナーゼ、ゼラチナーゼ-A)及びMMP-9(92 kDa ゼラチナーゼ、ゼラチナーゼ-B)である。しかし、国際特許出願WO2008/103045は、MMPに対して公知の切断部位を含まない遺伝子組み換えゼラチンが、ヒトマトリックスメタロプロテアーゼ1(MMP1)により酵素的に分解可能であることを開示している。明らかに、予測したよりも多くのさらなるタイプの遺伝子組み換えゼラチンが分解可能である。従って、遺伝子組み換えゼラチンを含む多孔質組織スキャフォールドは、組成物に対して、必要とされる徐々の生分解を示すことになり、第一に細胞のスキャフォールド機能を提供し、分解するにつれてこれが自己細胞外マトリクスで徐々に置き換えられる。
【００４２】
本発明の好ましい態様は、
a.溶媒又は溶媒混合物に生体適合性ポリマーを溶解させ、
b.生体適合性ポリマー溶液を脱気し、
c.生体適合性ポリマー溶液を、単一の熱伝導性表面を有する断熱容器に導入し、所望によって添加剤を加え;
d.所望により、容器を試料Tmから25℃の範囲の温度に冷却することにより、生体適合性ポリマー溶液の少なくとも一部をゲル化させ、
e.凍結速度を制御しながら、少なくとも以下の3つのステップを含む温度プロファイルを利用する、冷却装置に容器を曝露することにより試料を一定方向に凍結させ、
(i)冷却装置の温度を、5分以内に、約-10℃から約-50℃の間に急速に降下させることによって、熱伝導性表面上に、凍結した生体適合性ポリマーゲル/溶液の薄層を形成する、
(ii)冷却装置の温度を、5分以内に、試料Tmにより近いが、依然としてTm未満の温度まで急速に上昇させる、
(iii)冷却装置の温度を徐々に低下させることによって、ステップe(i)で形成された凍結層から開始された、生体適合性ポリマーゲル/溶液中の氷結晶の層状成長を誘発する、
f.ステップeで得た材料を減圧で凍結乾燥させ、
g.所望により、ステップe(i)で形成された薄い高密度の層に対応し、円柱状細孔を有さない材料を除去し、及び
h.ステップgで得た材料を架橋するステップ、
を含む方法を含む、多孔質組織スキャフォールド材料を製造するための方法を提供する。
【００４３】
好ましくは、ステップaにおいて、溶液は、実質的に粒子を含まない。
本発明による方法を使用して、狭い細孔ECDの標準偏差ECDSDを有する広範囲な円柱状細孔を有する多孔質組織スキャフォールド材料を製造することができる。これは、生体適合性ポリマー溶液を介して凍結最前部の速度を制御する、T4からT3への冷却ステップの温度プロファイルを使用することによって達成される。一般的に、平均円柱状細孔直径は凍結最前部が移動する速度が増加すると共に低減する。異なる細胞型は、形状及び機械的特性に関して異なる環境を必要とするため、平均円柱状細孔直径を微調整するこの能力は有利である。
【００４４】
一実施形態では、本発明の方法は、均一な円柱状の多孔質構造、及び約10〜約1000ミクロンの範囲、好ましくは約50〜約1000ミクロンの範囲、より好ましくは約50〜約500ミクロンの範囲、特に約100〜約500ミクロンの範囲の平均円柱状細孔ECDを有する多孔質組織スキャフォールド材料を調製する。
本発明の第2の態様は、上記した方法、好ましくは本発明の第1の態様において記載した方法により得ることができる多孔質材料を提供する。
好ましくは、本発明の第2の態様による材料は多孔質組織スキャフォールドである。
本発明の第3の態様は、本発明の第2の態様による多孔質組織スキャフォールドを含むインビトロ細胞培養系を提供する。
【００４５】
本発明の第4の態様は、本発明の第2の態様による多孔質組織スキャフォールド材料を含む、移植可能な生体適合性製品を提供する。
本発明の第5の態様は、骨充填材料又は骨充填物、好ましくは歯科用骨充填物として使用される、本発明の第2の態様による多孔質組織スキャフォールド材料を含む移植可能な生体適合性製品を提供する。
本発明の第6の態様は、細胞、好ましくは万能性細胞のためのマイクロ担体として使用される、本発明の第2の態様による多孔質組織スキャフォールド材料を含む、移植可能な生体適合性製品を提供する。
本発明は、以下の非限定的な例においてさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００４６】
一般的方法:
1.生体適合性ポリマーの溶解後、試料溶液を減圧で脱気した(好ましくは、90mbar未満で少なくとも5分間)。
2.続いて試料を、殺菌消毒(0.2ミクロン)シリンジフィルターを介して濾過し、その側面が、テフロンブッシュ、及びテフロンブッシュとアルミニウム側面の間の絶縁性ポリマー発泡体で断熱された、円柱状、熱伝導性のテフロンコート済み薄壁を有するアルミニウム容器内に堆積させた。
3.試料は、T0からT1へ減少させた温度、好ましくは試料Tmと+25℃の間の温度で所望によりゲル化した。
4.次いで、以下により、液体又はゲル状の試料溶液を一方向に凍結させた:
(a)試料容器の熱伝導性表面の温度を、低い氷点下の温度T2(-10〜-50℃)に急速に低下させることによって、凍結した試料の薄層を形成し、
(b)凍結した試料の薄層が熱伝導性表面(T3、t3)全体を覆った際に、熱伝導性表面の温度を、所望の試料凍結速度のために必要な氷点下温度T4に増加させる。
(c)熱伝導性表面が受ける温度を徐々に低下させる。ここで温度降下速度は、所望の細孔構造及び細孔サイズ(T4、t4〜T5、t5)により決定する。T4からT5へのT-プロファイルは、必ずしも直線的ではないが、当業者により最適化することができる。
【００４７】
当技術分野では一般的であるように、凍結した試料を真空下で乾燥させることによって、乾燥した、多孔質スキャフォールドを生成する。次いでスキャフォールドを、水の不在下で、多くの一般的に使用される薬剤のうちの1つ(HMDIC、EDC、グルタルアルデヒドなど)又はプロセス(真空条件下での加熱)により架橋する。
【００４８】
[比較例１]
本例で使用する塩基性コラーゲン懸濁液を、市販の子牛皮膚のＩ型コラーゲン（Sigma-Aldrich、prod、nrC3511）から調製した。フラスコ内で秤量し、水を加えることによって、2%(質量パーセント)分散液を作製した。次いでHClを加えることによって、pH値を3.2に調整した。(Schoof、Apel et al.2001)によると、方向性のある細孔構造を作製するために酢酸を加えるべきである。よって、2.5重量%の酢酸を試料に加えた。このコラーゲン調製は、ウシの皮膚から単離した、原線維の、不溶性Ｉ型コラーゲンである。Schoofによると、この懸濁液は、低濃度の分子、フィブリル、及び繊維を含有する多分散系である。コラーゲン凝集体の長さ及び幅は広い範囲で変動する。続いて、分散液を遠心分離することによって、気泡を除去し、204グラムの量が冷凍容器内に堆積した。試料を、冷蔵庫内で、2℃に2時間冷却し、次いで-5℃で冷浴槽中に置くことによって、凍結を完了させた。
【００４９】
結果
乾燥後のスポンジ構造は、方向性の細孔を示した。しかし、細孔構造の均一性はあまり良好ではなかった。
【００５０】
[比較例２]
精製された遺伝子組み換えCBE3ゼラチン(実施例が本明細書中に参照により組み込まれている、EP0926543の実施例1又はEP1014176の実施例1に記載の通り調製された)を試料に使用した。エタノール(abs)はJ. T. Baker製である。使用した水は、薬学的等級のWater For Injection(WFI)と同じ仕様に限外濾過し、脱イオン化した。10ml NORM-JECT(登録商標)ルアーシリンジを使用して、Whatman PURADISC(登録商標)25 AS (PES)シリンジフィルター0.2μmに通すことによって、溶液を濾過した。試料の凍結及び乾燥のために使用した容器は、0.1mm厚のポリスチレン10cm×10cm×2cm(2cm=高さ)カップであった。使用した凍結乾燥器は、Zirbus 3×4×5 Sublimatorであった。Thermo-Electra手持ち式プローブnr.80106を有する、AZ 8852 デュアルインプットタイプK/J/T温度計を溶液温度の測定に使用した。光学的スポンジ検査を、OlympusデジタルカメラC-3040ZOOM及びDP-Soft V3.2ソフトウエアを備えたOlympus SZX12 顕微鏡を使用して行なった。試料の照明は、内部光供給源又はFOSTEC(商標)DCR(DDL)外部光供給源のいずれかを使用して行った。Jeol JSM-6330F Field Emission Scanning Electron Microscopeを使用してSEM画像を生成した。試料の切断は、GEMステンレススチールかみそり刃(コーティングなし)を使用して手作業で行なった。
【００５１】
試料の調製
遺伝子組み換えゼラチンCBE3を秤量し、300mlフラスコに移し、続いて温水(50〜60℃)を加えることによって、4%(質量パーセント)濃度にした。次いで、恒温水槽内で、50℃で30分間、CBE3溶液を磁気撹拌子で撹拌することによって、ゼラチンを完全に溶解した。溶液を室温まで冷却させておく間、これを、20〜90mbarの真空下で15分間脱気した。過剰な沸騰は、そのような影響が観察又は予測された時にはいつでも、真空を手作業で制御することによって、これが生じないように注意を払った。シリンジ及び0.2ミクロンPESシリンジフィルターを使用して、試料溶液(20.4g)を冷凍容器に加えた。充填中又は充填後に、試料内に出現するすべての表面接着性の気泡を除去するように注意を払った。次いでCBE3溶液を、冷蔵庫内で、2℃で2時間冷却させ、次いで-5℃の冷浴槽に入れた。
【００５２】
結果
試料はゲル状態のまま保たれ、少なくとも24時間内に凍結しなかった。試料をわずかに撹乱した後、試料は直ちに撹乱された場所で凍結し始めた。これは、ボトムアップからの方向的な凍結が本方法では不可能であることを示す。
【００５３】
[比較例３]
CBE3を秤量し、300mlフラスコに移し、温水(50〜60℃)を加えることによって、4%(質量パーセント)濃度の溶液を作製した。次いで、恒温水槽内で、50℃で30分間、溶液を磁気撹拌子で撹拌することによって、完全にゼラチンを溶解した。溶液を室温に冷却させる間、これを、20〜90mbarの真空下で15分間脱気した。過剰な沸騰は、そのような影響が観察又は予測された時にはいつでも、真空を手作業で制御することによって、これが生じないように注意を払った。続いて、シリンジ及び0.2ミクロンPESシリンジフィルターを使用して、溶液を20.4グラムのアリコートの量で冷凍容器に加えた。充填中又は充填後に試料内に出現するすべての表面接着性の気泡を除去するように注意を払った。すべての試料に対して、空気浮遊ダストを除外し、試料最上部からの水又はエタノールの蒸発を防ぐためのカバーとしてPE-ホイルを使用する。
【００５４】
試料溶液は、2℃の冷蔵庫内に少なくとも3時間入れることでゲル化した。次いでこの(予めゲル化した)試料を、恒温循環装置の槽(2〜3mmの深さ)内で、完全に凍結するまで45分間、-10℃の凍結条件に供した。次いで、凍結した試料を真空下で2日間乾燥させた。所望のサイズに切断された試料を用いて、真空オーブン内、160℃で、2mbar未満の圧力で2日間加熱することによって、デヒドロサーマル(DeHydro Thermal:DHT)処理による架橋を行った。
【００５５】
結果
結果として生じた細孔構造は円柱状であった(図4及び5を参照)。しかし、底部(50ミクロン)から最上部(100ミクロン)にかけて細孔サイズの大きな望ましくない差異が存在する。図6及び7も参照。真円度は0.5より良い。最上部での平均細孔ECDは155ミクロンであり、ECDSDは46ミクロンである。
【００５６】
[比較例４]
CBE3を秤量し、300mlフラスコに移し、温水(50〜60℃)を加えることによって、4%(質量パーセント)溶液を作製した。次いで、恒温水槽内で、50℃で30分間、溶液を磁気撹拌子で撹拌することによって、ゼラチンを完全に溶解した。溶液を室温まで冷却させておく間、これを、20〜90mbarの真空下で15分間脱気した。過剰な沸騰は、そのような影響が観察又は予測された時にはいつでも、真空を手作業で制御することによって、これが生じないように注意を払った。続いて、シリンジ及び0.2ミクロンPESシリンジフィルターを使用して、溶液を20.4グラムのアリコートの量で冷凍容器に加えた。この時点で、溶媒を、0.2ミクロンPESシリンジフィルターを介してゆっくりと加えることによって0.2gエタノール(abs.)の量を加え、ピペットを使用して液体の流れを作り出すことによって、このミックスを撹拌した。充填中又は充填後に試料内に出現するすべての表面接着性の気泡を除去するように注意を払った。すべての試料に対して、空気浮遊ダストを除外し、試料最上部からの水又はエタノールの蒸発を防ぐためのカバーとしてPE-ホイルを使用した。試料溶液は、2℃に設定した冷蔵庫内で少なくとも3時間ゲル化させた。次いで、この(予めゲル化した)試料を、恒温循環装置槽(2〜3mmの深さ)内で、完全に凍結するまで45分間、-10℃の凍結条件に供した。次いで、凍結した試料を真空下で2日間乾燥させた。所望のサイズに切断された試料を用いて、真空オーブン内、160℃で、2mbar未満の圧力で2日間加熱することによって、デヒドロサーマル(DHT)処理による架橋を行った。
【００５７】
結果
結果として生じた細孔構造は、円柱状細孔のサイズ分布が狭く、平均サイズがおよそ350ミクロンと大きく、試料体積にわたりむしろ均一であった(図13を参照)。しかし、わずかではあるが、定温冷浴槽による、底部から最上部にかけての細孔サイズの望ましくない差異が依然として存在した(図12を参照)。
【００５８】
[比較例５]
CBE3を秤量し、300mlフラスコに移し、温水(50〜60℃)を加えることによって、8%(質量パーセント)溶液を作製した。次いで、恒温水槽内で、50℃で30分間、溶液を磁気撹拌子で撹拌することによって、ゼラチンを完全に溶解した。溶液を室温まで冷却させておく間、これを、20〜90mbarの真空下で15分間脱気した。過剰な沸騰は、そのような影響が観察又は予測された時にはいつでも、真空を手作業で制御することによって、これが生じないように注意を払った。続いて、シリンジ及び0.2ミクロンPESシリンジフィルターを使用して、溶液を20.4グラムのアリコートの量で冷凍容器に加えた。0.2ミクロンPESシリンジフィルターを介して、0.2gのエタノールの量(abs.)をゆっくりと加え、ピペットを使用して「かき回す」ことによってこのミックスを撹拌した。充填中又は充填後に、試料内に出現するすべての表面接着性の気泡を除去するように注意を払った。すべての試料に対して、空気浮遊ダストの沈降及び試料最上部からの水又はエタノールの蒸発を防ぐためのカバーとしてPE-ホイルを使用した。
【００５９】
試料溶液は、2℃に設定した冷蔵庫内で45分間ゲル化させた。次いで、この(予めゲル化した)試料を、冷浴槽(2〜3mmの深さ)内で、完全に凍結するまで、45分間、-10℃の凍結条件に供した。次いで、凍結した試料を真空下で2日間乾燥させた。所望のサイズに切断された試料を用いて、真空オーブン内、160℃で、2mbar未満の圧力で2日間、デヒドロサーマル(DHT)処理による架橋を行った。
【００６０】
結果
結果として生じた細孔構造は、円柱状細孔のサイズ分布が狭く、試料の上半分の平均サイズがおよそ350ミクロンと大きく、試料体積にわたり円柱状であった。円柱状細孔が下部から上部の試料体積へと拡大していることも見られた。図16及び17を参照。これは、徐々の温度ランピングの代わりに一定の冷浴槽温度を使用したことによるものと考えられる。したがって、凍結最前部が冷却された容器から遠ざかるにつれて、局所的な凍結温度が今までより高くなると予想され、このために、細孔がより大きく成長した。
【００６１】
[比較例６]
CBE3を秤量し、300mlフラスコに移し、温水(50〜60℃)を加えることによって、7.5%(質量パーセント)溶液を作製した。次いで、恒温水槽内で、50℃で30分間、溶液を磁気撹拌子で撹拌することによって、ゼラチンを完全に溶解した。溶液を室温まで冷却させておく間、これを、20〜90mbarの真空下で15分間脱気した。過剰な沸騰は、そのような影響が観察又は予測された時にはいつでも、真空を手作業で制御することによって、これが生じないように注意を払った。次いで、シリンジ及び0.2ミクロンPESシリンジフィルターを使用して、溶液を20.4グラムのアリコートの量で冷凍容器に加えた。充填中又は充填後に、試料内に出現するすべての表面接着性の気泡を除去するように注意を払った。すべての試料に対して、空気浮遊ダストを除外し、試料最上部からの水又はエタノールの蒸発を防ぐためのカバーとしてPE-ホイルを使用した。2℃の冷蔵庫内に1日置くことによって、試料溶液をゲル化させた。次いで、試料を18℃に設定した冷浴槽内に置き、ポンプAを起動し、冷浴槽温度が-52℃に到達するまで、冷浴槽温度が22℃/分の速度で降下するような速度で激しく混合しながら、極めて冷たい(-72±2℃)液体(エタノール)を冷浴槽にポンプで供給した。このT-ランピングの間、氷形成の第1の出現が、冷浴槽温度-16℃で観察された。10分以内に試料体積が完全に凍結した。次いで、凍結した試料を真空下で4日間乾燥させた。所望のサイズに切断された試料を用いて、160℃及び2mbar未満の気圧での真空オーブン内に2日間置くことによって、デヒドロサーマル(DHT)処理による架橋を行った。
【００６２】
結果
結果として生じた細孔構造は、円柱状細孔のサイズ分布が狭く(図18及び19を参照)、試料の下部の領域の平均サイズがおよそ20ミクロンと極めて小さく、全試料体積にわたり円柱状であった(図20を参照)。しかし、最上部から底部に細孔サイズの望ましくない差異が依然として存在する(図20及び21を比較)。
【００６３】
[発明の実施例１]
CBE3を秤量し、300mlフラスコに移し、温水(50〜60℃)を加えることによって、7.5%(質量パーセント)溶液を作製した。次いで、恒温水槽内で、50℃で30分間、溶液を磁気撹拌子で撹拌することによって、ゼラチンを完全に溶解した。溶液を室温まで冷却させておく間、これを、20〜90mbarの真空下で15分間脱気した。過剰な沸騰は、そのような影響が観察又は予測された時にはいつでも、真空を手作業で制御することによって、これが生じないように注意を払った。続いて、シリンジ及び0.2ミクロンPESシリンジフィルターを使用して、溶液を20.4グラムのアリコートの量で冷凍容器に加えた。この時点で、溶媒を、0.2ミクロンPESシリンジフィルターを介してゆっくりと加えることによって、0.2gのエタノール(abs.)の量を加え、ピペットを使用して「かき回す」ことによって、このミックスを撹拌した。充填中又は充填後に、試料内に出現するすべての表面接着性の気泡を除去するように注意を払った。すべての試料に対して、空気浮遊ダストを除外し、試料最上部からの水又はエタノールの蒸発を防ぐためのカバーとしてPE-ホイルを使用した。
【００６４】
試料溶液を、冷浴槽内で、10℃で20分間ゲル化させた。次いで、温度が-30℃に到達するまで、冷浴槽温度が28℃/分の速度で降下するような速度で激しく混合しながら、極めて冷たい(-72±2℃)液体(エタノール)を冷浴槽にポンプで供給することによって、冷浴槽を急速に冷却した。このT-ランピングの間、氷形成の第1の出現が冷浴槽温度-25℃で観察された。続いて冷たい液体のポンプAを停止し、全部の接触している試料容器が凍結した試料層で覆われるようになるまでの間、冷浴槽温度はほぼ一定のままであった。全部が覆われたら直ちに、冷浴槽温度がおよそ100℃/分の速度で、-4℃に増加するような速度で、温かい(+40℃)液体(エタノール)ポンプBを起動した。冷浴槽温度が-4℃に到達したらすぐに、ポンプBを停止し、全部の試料体積が凍結するまで、冷浴槽温度が0.1℃/分の速度で低下するような極めてゆっくりとした速度で、ポンプAを起動した。
【００６５】
次いで凍結した試料を、真空下で2日間乾燥させた。所望のサイズに切断された試料を用いて、真空オーブン内で、160℃で、2mbar未満の圧力で2日間加熱することによって、デヒドロサーマル(DHT)架橋を行った。
【００６６】
結果
結果として生じた細孔構造は、円柱状細孔のサイズ分布が狭く、平均サイズがおよそ350ミクロンと大きく、試料体積にわたり極めて均一であった。比較例6(図20及び21)とは対照的に、試料の下部領域における細孔構造は、試料の上部領域における構造と極めて似ていた(図10及び11)。好ましいことに、細孔の真円度は、0.5より高かった。高密度の核形成された低層(図8及び9を参照)は、随意に切断及び廃棄できる。この実施例に対する平均細孔ECDは300ミクロンであり、ECDSDは90ミクロンであった。
【００６７】
[発明の実施例２]
脱イオン化した骨-石灰のゼラチンを秤量し、300mlフラスコに移し、続いて温水(50〜60℃)を加えることによって、7.5%(質量パーセント)溶液を作製した。恒温水槽内で、50℃で30分間、溶液を磁気撹拌子で撹拌することによって、ゼラチンを完全に溶解した。溶液を室温に冷却する間、これを、20〜90mbarの真空下で15分間脱気した。過剰な沸騰は、そのような影響が観察又は予測された時にはいつでも、真空を手作業で制御することによって、これが生じないように注意を払った。続いて、シリンジ及び0.2ミクロンPESシリンジフィルターを使用して、溶液を20.4グラムのアリコートの量で冷凍容器に加えた。0.2ミクロンPESシリンジフィルターを介して、0.2gエタノールの量(abs.)をゆっくりと加え、ピペットを使用して「かき回す」ことによって、このミックスを撹拌した。充填中又は充填後に、試料内に出現するすべての表面接着性の気泡を除去するように注意を払った。すべての試料に対して、空気浮遊ダストによる汚染及び試料最上部からの水又はエタノールの蒸発を防ぐためのカバーとして、PE-ホイルを使用した。試料溶液を、冷浴槽内で、10℃で20分間ゲル化させた。次いで、冷浴槽温度が-30℃に到達するまで、冷浴槽温度が28℃/分の速度で降下するような速度で激しく混合しながら、極めて冷たい(-72±2℃)液体(エタノール)を冷浴槽にポンプで供給することによって、冷浴槽を急速に冷却した。このT-ランピングの間、氷形成の第1の出現が冷浴槽温度-25℃で観察された。続いて、冷たい液体ポンプAを停止し、全部の接触している試料容器が凍結した試料層で覆われるようになるまでの間、冷浴槽温度は、ほぼ一定のままであった。全部が覆われたら直ちに、冷浴槽温度がおよそ100℃/分の速度で、-4℃に増加するような速度で、温かい(+40℃)液体(エタノール)ポンプBを起動した。冷浴槽温度が所望の-4℃に到達したらすぐに、ポンプBを停止し、全部の試料体積が凍結するまで、冷浴槽温度が0.1℃/分の速度で低下するような極めてゆっくりとした速度で、ポンプAを起動した。
【００６８】
結果
結果として生じた細孔構造は、本発明の実施例1に似ていた。細孔構造は、円柱状細孔のサイズ分布が狭く、平均サイズがおよそ350ミクロンと大きく、試料体積にわたり極めて均一であった。試料の下部領域における細孔構造は、試料上部の構造と極めて似ていた。好ましいことに、細孔の真円度は0.5より良かった。高密度の、核形成した低層は随意に切断及び廃棄できる。
【００６９】
[発明の実施例３]
カッパ-カラギーナムを秤量し、300mlフラスコに移し、温水(およそ70℃)を加えることによって、4.0%(質量パーセント)溶液を作製した。恒温水槽内で、溶液を70℃で1時間、磁気撹拌子で撹拌することによって、生体適合性ポリマーを完全に溶解した。溶液を温かく保持している間、これを20〜90mbarの真空下で15分間脱気した。続いて、シリンジを使用して、溶液を20.4グラムのアリコートの量で冷凍容器に加えた。冷凍容器内に気泡が堆積したら、いかなる気泡も溶液から除去するように注意を払った。すべての試料に対して、空気浮遊ダストによる汚染及び試料最上部からの水又はエタノールの蒸発を防ぐためのカバーとして、PE-ホイルを使用した。試料溶液を冷蔵庫内で、2℃で2時間ゲル化させ、続いて試料を深さ数ミリメートルに冷浴槽内に載せた。次いで、冷浴槽温度が-30〜-40℃に到達するまで、冷浴槽温度が20〜100℃/分の間の速度で降下するような速度で激しく混合しながら、極めて冷たい(-73±3℃)液体(エタノール)を冷浴槽にポンプで供給することによって、冷浴槽の温度を急速に低下させた。このT-ランピングの間、氷形成の第1の出現が、冷浴槽温度-20〜-30℃で観察された。試料底部が、冷凍容器の底部全体を覆う薄い氷層を含有した直後、冷浴槽温度がおよそ100℃/分の速度で増加するように高速で、温かい(+50℃)液体(エタノール)ポンプBを起動した。冷浴槽温度が所望の-4℃に到達したらすぐに、ポンプBを停止し、全部の試料体積が凍結するまで、冷浴槽温度がおよそ0.5℃/分の速度で低下するよう極めてゆっくりとした速度でポンプAを起動した。
【００７０】
結果
結果として生じた細孔構造は、本発明の実施例1に似ていた。細孔のサイズ分布は狭く、平均サイズが500〜800ミクロンと大きく、細孔構造は、試料体積にわたり極めて均一であった。試料の下部領域における細孔構造は、試料上部の構造と極めて似ていた。好ましいことに、細孔の真円度は0.5より良い。本実施例についての平均細孔ECDは450ミクロンであり、ECDSDは200ミクロンである。高密度の核形成された低層の厚さは、ミリメートルの半分より小さく、随意に切断及び廃棄することができる。図22、23及び24を参照。
【００７１】
[発明の実施例４]
エビの殻からのキトサンを秤量し、300mlフラスコに移し、温水(およそ50℃)を加えることによって、7.5%(質量パーセント)溶液を作製した。恒温水槽内で、50℃で1時間、溶液を磁気撹拌子で撹拌することによって、生体適合性ポリマーを完全に溶解した。溶液を温かく保持しながら、これを20〜90mbarの真空下で15分間脱気した。続いて、シリンジを使用して、溶液を20.4グラムのアリコートの量で冷凍容器に加えた。冷凍容器内に気泡が堆積したら、いかなる気泡も溶液から除去するよう注意を払った。すべての試料に対して、空気浮遊ダストの汚染及び試料最上部からの水又はエタノールの蒸発を防ぐためのカバーとしてPE-ホイルを使用した。試料溶液を、冷蔵庫内で、2℃で2時間ゲル化し、続いて試料を数ミリメートルの深さに冷浴槽内に載せた。次いで、冷浴槽温度が-30〜-40℃に到達するまで、20〜100℃/分の間の速度で冷浴槽温度が降下するような速度で激しく混合しながら、極めて冷たい(-73±3℃)液体(エタノール)を冷浴槽にポンプで供給することによって、冷浴槽の温度を急速に低下させた。このT-ランピングの間、氷形成の第1の出現が冷浴槽温度-20〜-30℃で観察された。薄い氷層が、容器の全部の凍結表面を覆ったらすぐに、冷浴槽温度がおよそ100℃/分の速度で増加するように、温かい(+50℃)液体(エタノール)ポンプBを高速で起動した。冷浴槽温度が所望の温度(-4℃)に到達した時点でポンプBを停止し、全部の試料体積が凍結するまで、冷浴槽温度がおよそ0.1℃/分の速度で低下するような極めてゆっくりとした速度でポンプAを起動した。
【００７２】
結果
結果として生じた細孔構造は、細孔形状が伸び、サイズ分布が狭く、試料体積にわたり極めて均一であった。平均細孔サイズは約100ミクロンであった。試料の下部領域における細孔構造は、試料上部の構造に極めて似ていた。本実施例についての平均細孔ECDは60ミクロンであり、ECDSDは27ミクロンであった。高密度の核形成した低層の厚さは、ミリメートルのおよそ半分であり、随意に切断及び廃棄することができる。図25、26及び27を参照。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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