(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
【化１】
0005736590.tif 000081
【化２】
0005736590.tif 000082
【化３】
0005736590.tif 000083
【化４】
0005736590.tif 000084
【化５】
0005736590.tif 000085
［式中、黒長方形は固体担体を表す］
からなる群から選択される式を有する、基材。
【請求項２】
少なくとも１種の生体物質を含む試料を請求項１に記載の基材で処理する方法であって、前記試料中の少なくとも１種の生体物質を前記基材に結合させるのに十分な時間、前記基材を前記試料と接触させるステップを含む方法。
【請求項３】
液体試料から少なくとも１種の物質を分離する方法であって、前記方法が、請求項１に記載の基材を少なくとも１種の物質を含む前記液体試料と接触させるステップであって、前記物質が前記基材に吸着するステップと、前記物質が前記基材から脱着するようにｐＨ、イオン強度、又はその双方を調整するステップとを含む方法。
【請求項４】
前記少なくとも１種の物質が抗体を含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
ＩｇＧ、ＩｇＭ及び／又はＩｇＡを選択的に結合するステップを含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１種の物質が抗体断片を含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項７】
前記試料が体液を含む、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記試料が血漿を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記基材がカラム内に配置し、前記方法が前記試料を前記カラムに通すステップを含む、請求項２〜８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
[0001]本特許出願は、参照により本明細書に組み込まれている、２０１１年７月２７日に出願された米国特許仮出願第６１／５１２，０９７号の利益を主張するものである。
【発明の背景】
【０００２】
[0002]本発明は、一般に、混合モード又は複数モード相互作用クロマトグラフィー材料に関する。タンパク質などの大量の生体関連分子（つまり、生体分子）に対する必要性が増加したために、生理的単離物からかかる生体分子を単離するためのさまざまな技術が生み出された。特に重要な１つの分離法は、液体クロマトグラフィーである。
【０００３】
[0003]高い結合能、特異性、及び回収率を示し、しかも、クロマトグラフィー性能の低下なしで大量に再生が可能な混合モードクロマトグラフィー材料に対する必要性が当技術分野に存在する。
【発明の概要】
【０００４】
[0004]本発明による基材及び基材の使用方法の実施形態によれば、免疫グロブリン（好ましくは、モノクロナール抗体）などの生体物質は、好ましくは、結合されるが、集合体には結合しない。一部の実施形態では、免疫グロブリンＩｇＡ及び／又はＩｇＭは、選択的に結合する。有利には、生体物質は、精製するのと同時に集合体を除去することができ、それによってワンステップでの精製及び集合体除去が可能になる。
【０００５】
[0005]一実施形態では、本発明は、固体担体と、配位子と、リンカーとを含む基材を提供する。一部の実施形態では、リンカーは、固体担体を配位子に共有結合によって接続させる少なくとも１つのＣ、Ｏ、Ｎ、又はＳ原子を含む。
【０００６】
[0006]一実施形態では、配位子は、次式
0005736590.tif 000002
を有し、式中、
0005736590.tif 000003
は、芳香族基又はヘテロ芳香族基を表し、これは、任意選択で置換されていてもよい。一部の実施形態では、芳香族基又はヘテロ芳香族基は、環系に５〜１２個の原子を有し、Ｏ、Ｎ、及びＳから選択される０〜３個のヘテロ原子を含む、単環式又は二環式であってもよい。
【０００７】
[0007]一部の実施形態では、配位子は、
0005736590.tif 000004
0005736590.tif 000005
0005736590.tif 000006
からなる群から選択される式を有する。上の式中の波線は、リンカーが接続される配位子上の位置を指す。
【０００８】
[0008]他の実施形態では、配位子は、次式
0005736590.tif 000007
を有し、式中、
0005736590.tif 000008
は、−Ｈ、−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、ハロゲン、−ＯＨ、−Ｏ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、−ＳＯ３Ｈ、−ＰＯ３Ｈ、−ＮＯ２、−ＮＨ２、
0005736590.tif 000009
からなる群から選択される０〜４個の置換基で任意選択で置換されている、フェニル、ピリジル、ピリミジニル、及びナフチルからなる群から選択される芳香環又は芳香族複素環を表す。
【０００９】
[0009]一部の実施形態では、
0005736590.tif 000010
は、−Ｈ、−ＣＯＯＨ、及び−ＳＯ３Ｈからなる群から選択される０〜１個の置換基で任意選択で置換されている、フェニル、ピリジル、又はナフチルを表す。他の実施形態では、
0005736590.tif 000011
は、−Ｈ、−ＣＯＯＨ、及び−ＳＯ３Ｈからなる群から選択される０〜１個の置換基で任意選択で置換されている、フェニルを表す。追加の実施形態では、
0005736590.tif 000012
は、
0005736590.tif 000013
からなる群から選択される０〜１個の置換基で任意選択で置換されている、フェニルを表す。
【００１０】
[0010]さらなる他の実施形態では、本発明は、
0005736590.tif 000014
0005736590.tif 000015
0005736590.tif 000016
0005736590.tif 000017
0005736590.tif 000018
からなる群から選択される式を有する基材を提供し、式中、黒長方形は固体担体を表す。
【００１１】
[0011]本発明は又、試料から少なくとも１種の物質を分離することを提供する。一実施形態では、基材を用いて少なくとも１種の生体物質を含む試料を処理する方法は、試料中の少なくとも１種の生体物質を基材に結合させるのに十分な時間、基材を試料と接触させるステップを含む。好ましい一実施形態では、この方法は、（ａ）本発明の一実施形態による基材を、少なくとも１種の物質を含む液体試料と接触させるステップであって、該物質が基材に吸着するステップと、（ｂ）該物質が基材から脱着するようにｐＨ、イオン強度、又はその双方を調整するステップとを含む。典型的な一実施形態では、該方法は、（ａ）で得られた基材を平衡緩衝液で洗浄するステップをさらに含む。
【００１２】
[0012]別の実施形態では、試薬を固体担体に結合させるリンカーの一部分又は全部を含む二官能性試薬の１つの官能基と固体担体を接触させることによって固体担体を活性化するステップを含む、基材を作製するための方法が提供される。活性化された固体担体は、次いで、配位子を含む試薬と反応してリンカーと配位子との間の結合を形成する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】[0013]  本発明の一実施形態による基材を使用した場合のさまざまな配位子密度及び動的結合能（ＤＢＣ）を示すグラフである。
【００１４】
【図２】[0014]  本発明の一実施形態によるｐａｒａ−フェニレンジアミン（ＰＤＡ）配位子を含む基材を使用した場合の配位子密度の変化及び純ＩｇＧの取得を示すグラフである。
【００１５】
【図３】[0015]  本発明の一実施形態による基材を使用した場合の、ｐＨ及び導電率値が１０％漏出における純ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）動的結合能（ＤＢＣ）に及ぼす影響を示すグラフである。
【発明の詳細な説明】
【００１６】
[0016]本発明の実施形態は、重要な生体物質を含めてのさまざまな物質を分離及び単離する際に使用するための有効な吸着剤である基材を提供する。本発明の実施形態による基材は、例えば、カラムクロマトグラフィーなどの調製技術で使用することができる。
【００１７】
[0017]本明細書に記載の基材の一実施形態の１つの利点は、タンパク質などの生体物質に対する高い選択性及び特異性である。代替的に又は追加的に、別の利点は、本基材の実施形態の高い生体分子結合能である。したがって、より少ない体積の試料を取扱うこと、処理時間を短縮すること及び／又はカラムの単位体積当り大量の試料を処理することが可能である。本発明の実施形態の別の利点は、タンパク質集合体の存在下でのタンパク質に対する基材の選択性である。このために、タンパク質試料からの精製及び集合体の除去がワンステップで可能となり得る。加えて、基材は、コスト効率よく調製することができる。
【００１８】
[0018]基材は、固体担体と、リンカーを介して固体担体に共有結合する配位子とを含む。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも１つのＣ、Ｏ、Ｎ、又はＳ原子を含む。
【００１９】
[0019]一実施形態では、配位子は、次式
0005736590.tif 000019
を有し、式中、
0005736590.tif 000020
は、芳香族基又はヘテロ芳香族基を表し、これは、任意選択で置換されていてもよい。一部の実施形態では、芳香族基又はヘテロ芳香族基は、環系に５〜１２個の原子を有し、Ｏ、Ｎ、及びＳから選択される０〜３個のヘテロ原子を含む、単環式又は二環式であってもよい。
【００２０】
[0020]一部の実施形態では、配位子は、
0005736590.tif 000021
0005736590.tif 000022
0005736590.tif 000023
からなる群から選択される式を有する。上の式中の波線は、リンカーが接続される配位子上の位置を指す。
【００２１】
[0021]他の実施形態では、配位子は、次式
0005736590.tif 000024
を有し、式中、
0005736590.tif 000025
は、−Ｈ、−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、ハロゲン、−ＯＨ、−Ｏ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、−ＳＯ３Ｈ、−ＰＯ３Ｈ、−ＮＯ２、−ＮＨ２、
0005736590.tif 000026
からなる群から選択される０〜４個の置換基で任意選択で置換されている、フェニル、ピリジル、ピリミジニル、及びナフチルからなる群から選択される芳香環又は芳香族複素環を表す。
【００２２】
[0022]一部の実施形態では、
0005736590.tif 000027
は、−Ｈ、−ＣＯＯＨ、及び−ＳＯ３Ｈからなる群から選択される０〜１個の置換基で任意選択で置換されている、フェニル、ピリジル、又はナフチルを表す。他の実施形態では、
0005736590.tif 000028
は、−Ｈ、−ＣＯＯＨ、及び−ＳＯ３Ｈからなる群から選択される０〜１個の置換基で任意選択で置換されている、フェニルを表す。追加の実施形態では、
0005736590.tif 000029
は、
0005736590.tif 000030
からなる群から選択される０〜１個の置換基で任意選択で置換されている、フェニルを表す。
【００２３】
[0023]配位子は、リンカーに共有結合によって接続され、該リンカーが、配位子を固体担体に連結する。リンカーは、立体障害を低減し、配位子を被結合物質に接近しやすくすることができる。配位子とリンカーの間の接続は、例えば、アミド結合であってもよい。
【００２４】
[0024]リンカーは典型的には、少なくとも１つのＣ、Ｏ、Ｎ、又はＳ原子を含む。一実施形態では、リンカーは、
0005736590.tif 000031
又は
0005736590.tif 000032
を含み、式中、Ｘ、Ｘ１、及びＸ２は、それぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、ＮＨから選択され、共有結合であり、ｍ、ｎ、及びｐは、それぞれ独立に、０、１、２、３、４、５、又は６である。別の実施形態では、上の式のＨ原子のうちの１、２、又は３個は、等価数のＯＨ基及び／又はメチル基で置換することができる。
【００２５】
[0025]一実施形態では、リンカーは、
0005736590.tif 000033
からなる群から選択される構造を備え、式中、Ｘ１及びＸ２のそれぞれは、独立に、Ｏ、Ｓ、及びＮＨから選択され、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、及びＲｄのそれぞれは、独立に、Ｈ、ＯＨ、及びメチルから選択される。
【００２６】
[0026]別の実施形態では、リンカーは、
0005736590.tif 000034
からなる群から選択される構造を備える。
【００２７】
[0027]リンカーは、配位子を固体担体に接続する。固体担体は、クロマトグラフィー媒体用として典型的に使用される形態のもの、例えば、直径約０．１μｍ〜約１０００μｍなどの多孔質若しくは非多孔質のビーズ又は不規則粒子であってもよい。こうしたビーズ又は粒子は、リンカーと配位子の組合せと一緒になって誘導体化することができる。ビーズ又は粒子は、例えば、カラムを充填するのに使用できるクロマトグラフィー媒体を提供することができる。或いは、一部の実施形態では、固体担体は、ファイバー、メンブラン、又は、例えば、大きさがミクロン〜数ミリメートルの開口部又は空隙の充満したスポンジ状の材料を含む。
【００２８】
[0028]適切な固体担体は、当技術分野で公知である。一実施形態では、固体担体は、有機材料を含むことができる。例示的な有機材料は、セルロース、デンプン、寒天、アガロース、及びデキストランなどのポリサッカライドである。置換又は非置換の、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリビニルアルコールなどのポリビニルポリマー、ポリスチレン、ポリスルホン、及びスチレンとジビニルベンゼンのコポリマー、並びにその混合物を含む合成ポリマーが企図されている。別の実施形態では、無機材料を固体担体材料として使用することができる。かかる無機材料として、限定されないが、シリカ、ヒドロゲル含有シリカ、ジルコニア、チタニア、アルミナなどの多孔質鉱物材料、及びその他のセラミック材料が挙げられる。こうした材料の混合物、又は、米国特許第５，２６８，０９７号；第５，２３４，９９１号；及び第５，０７５，３７１号に開示のものなど、２種の材料の共重合又は相互貫通ネットワークによって形成された複合材料を使用することも可能である。
【００２９】
[0029]一実施形態では、本発明の基材は、少なくとも約２０μｍｏｌ／ｍｌ基材、少なくとも約３０μｍｏｌ／ｍｌ、又は少なくとも約４０μｍｏｌ／ｍｌ、又は少なくとも約５０μｍｏｌ／ｍｌの配位子密度（基材の体積当りの配位子の数）を示す。一部の実施形態では、配位子密度は、約１８０μｍｏｌ／ｍｌ未満、例えば、約１５０μｍｏｌ／ｍｌ未満、又は約１００μｍｏｌ／ｍｌ未満、又は約８０μｍｏｌ／ｍｌ未満、又は約６０μｍｏｌ／ｍｌ未満、又は約５０μｍｏｌ／ｍｌ未満である。配位子密度は、約２０μｍｏｌ／ｍｌ〜約１８０μｍｏｌ／ｍｌ、約３０μｍｏｌ／ｍｌ〜約１５０μｍｏｌ／ｍｌ、又は約４０μｍｏｌ／ｍｌ〜約１００μｍｏｌ／ｍｌ、又は約５０μｍｏｌ／ｍｌ〜約８０μｍｏｌ／ｍｌ、又は約３０μｍｏｌ／ｍｌ〜約６０μｍｏｌ／ｍｌ、又は約５０μｍｏｌ／ｍｌ〜約６０μｍｏｌ／ｍｌの範囲であってもよい。
【００３０】
[0030]本発明の他の実施形態は、以下に示されている。この場合及び全体を通じて、式の黒長方形は固体担体を表す。
【００３１】
[0031]さらなる他の実施形態では、本発明は、
0005736590.tif 000035
0005736590.tif 000036
0005736590.tif 000037
0005736590.tif 000038
0005736590.tif 000039
からなる群から選択される式を有する基材を提供する。
【００３２】
[0032]別の実施形態では、本発明は、入口端と出口端を備え、本明細書に記載の基材の一実施形態で充填された管状部材を備えるクロマトグラフィーカラムを含む。管状部材は、ガラス、プラスティック、又は金属など任意の適切な材料から作製することができる。充填された基材は、管状部材内部に配置された多孔質部材によって一方の端又はそれぞれの端で隣接することができ、この多孔質部材が、基材を管状部材内部に固定保持する。
【００３３】
[0033]一部の実施形態では、カラム内の液体の重力流れは、例えば、基材を、液体試料、洗浄流体、及び／又は溶離液と接触させるために十分である。他の実施形態では、カラムは、デバイスを移動してカラム内の流体の上方流又は下方流を実現する、１つ又は複数の流体を含むことができる。かかるデバイスとして、ポンプ、注射器、及び当技術分野で公知のようにクロマトグラフィー装置と一緒に典型的に用いられる任意の他のデバイスが挙げられる。
【００３４】
[0034]クロマトグラフィーカラムは、任意の適切な体積のものであってもよい。例えば、実験室規模の分離は、例えば、約１ミリリットル、又はさらに約１マイクロリットルという小さいカラム体積で実施することができる。生体物質の大規模な精製及び単離は、例えば、約５０００リットルという大きなカラムで実施することができる。より典型的な体積は、例えば、１リットル〜１００リットルの間である。カラムは、全体の形状が管状であるが、他の点では、長さ又は直径も特に限定されていない。カラムが用いられる状況に応じて、カラム直径は、例えば、約０．５ｍｍ〜約１０００ｍｍの間で変化することができる。加えて、カラム長は、例えば、約５０ｍｍ〜約１０００ｍｍの間で変化することができる。したがって、本発明は、多様な寸法及びそれに対応する体積のカラムを企図する。
【００３５】
[0035]追加の一実施形態では、本発明は、基材を作製するための方法を含む。該方法は、試薬を固体担体に結合させるためリンカーの一部分又は全部を含む二官能性試薬の１つの官能基と固体担体を接触させることによって固体担体を活性化するステップを一般に含む。活性化された固体担体は、次いで、配位子を含む試薬と反応してリンカーと配位子との間の結合を形成する。二官能性試薬は、限定されないが、クロロ、ブロモ、ヨード、エポキシド、カルボキシル、エステル、アルデヒド、ケトン、アミド、アルケニル、シアノ、及びイミノを含めての少なくとも二つの官能基を含むことができる。
【００３６】
[0036]本発明の別の実施形態は、試料から少なくとも１種の物質を分離するための方法である。一実施形態では、基材を用いて少なくとも１種の生体物質を含む試料を処理する方法は、試料中の少なくとも１種の生体物質を基材に結合させるのに十分な時間、本発明の一実施形態による基材を試料と接触させるステップを含む。好ましい一実施形態では、該方法は、（ａ）基材を、少なくとも１種の物質を含む液体試料と接触させるステップであって、該物質が基材に吸着するステップと、（ｂ）該物質が基材から脱着するようにｐＨ、イオン強度、又はその双方を調整するステップとを含む。典型的な一実施形態では、該方法は、（ａ）で得られた基材を平衡緩衝液で洗浄するステップをさらに含む。
【００３７】
[0037]本発明の別の実施形態は、基材を調製するための方法を含む。上で説明された配位子は、固体担体とリンカーの間、及びリンカーと配位子の間の共有結合を形成することによって固体担体上に化学的に固定化されている。典型的には、固体担体は、最初に、二官能性試薬で処理され、該二官能性試薬は、リンカーの一部又は全部を形成する反応性基を固体担体上に導入する働きをする。セルロース、ヒドロゲルを含む複合材、又はヒドロキシル基を提供するその他の材料など一部の固体担体では、例えば、二官能性試薬と反応する前に、水酸化物源でヒドロキシル基を脱プロトン化することが有利な場合がある。二官能性試薬は、固体担体と、配位子を含む試薬との双方と反応することができる。同じ又は異なる官能基を含む例示的な二官能性試薬として、限定されないが、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、ジブロモ−及びジクロロプロパノール、ジブロモブタン、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ジビニルスルホン、アリルグリシジルエーテル、及び臭化アリルが挙げられる。臭化アリルなどのアリルへテロ官能性化合物は、好ましい二官能性試薬である。
【００３８】
[0038]一旦官能化されると、固体担体は典型的には、次いで１種又は複数の溶媒で十分に洗浄されて未反応二官能性試薬、反応副産物、又は双方が除去される。この点で使用される典型的な溶媒は水である。
【００３９】
[0039]配位子は、上で説明したような官能化固体担体によって提供される官能基と反応する試薬によって導入することができる。配位子試薬は、当業者に公知である合成方法によって調製することができる。
【００４０】
[0040]二官能性試薬と配位子試薬との特定の組は、周知の化学反応によって導かれる。例えば、エポキシドによって官能化される固体担体は、メルカプト、ヒドロキシ、又はアミノ含有試薬と反応して、基材にエチレン含有連結基を与えることができる。例えば、臭化アリルで修飾された他の固体担体は、アルケン基を提供し、該アルケン基は、メルカプト含有試薬と直接反応することができ、それによってイオウ原子を含むリンカーが提供される。或いは、アルケン基は、さらに臭素化して適切に反応性であるブロモ誘導体を提供することもできる。別の例示的な方法では、固体担体は、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）などのイオウ含有二官能性試薬と反応することを可能にすることもできる。この場合、配位子を含む試薬は、ＤＶＳによって活性化された固体担体によって提供されるビニル基とのみ反応する必要がある。
【００４１】
[0041]代替の経路では、上述のように活性化された固体担体は、中間の二官能性試薬で処理することができる。この反応の生成物は、次いで、配位子を含む試薬で処理することができる。この点に関する例示的な例は、上述したようなアリル活性化固体担体とメルカプトヘキサン酸の間の反応である。生成した懸垂カルボキシル基は、例えば、第一級アミンを有する任意の好都合な配位子試薬と反応することができる。この方法を用いる実施形態では、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、又はジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、若しくは４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム（ＤＭ−ＴＭＭ）などの一般に知られているカルボジイミドなどのカップリング試薬を使用することが必要である場合もある。
【００４２】
[0042]固定化されたリンカー及び配位子の濃度は、当技術分野で公知のように、固体担体を作製するのに使用された二官能性試薬の濃度に応じて、例えば、固体担体１ミリリットル当りの１マイクロモル〜数百マイクロモルの割合の間で変化することができる。固定化された基が低濃度であると、典型的には、クロマトグラフィー材料の分離能が低くなり、高濃度では、一般に、分離能が増加する。
【００４３】
[0043]特定の実施形態では、本発明の基材は、生体関連分子、並びに、抗体、タンパク質、糖タンパク質、融合タンパク質、組み換えタンパク質、標識タンパク質、酵素及び生物触媒、ペプチド、細胞、バクテリア、ウイルス、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ワクチン、核酸、炭水化物、及び脂質などの生体物質を含めての、多様な物質を分離し、所望なら精製するのに使用することができる。分離（及び、所望なら精製）に適したその他の物質として、オリゴサッカライド及びポリサッカライド、リポポリサッカライド、ポリペプチド、並びに可溶性の合成ポリマーが挙げられる。生体物質は典型的には、限定されないが、唾液、体液、尿、リンパ液、前立腺液、精液、乳、乳清、器官抽出物、植物抽出物、細胞抽出物、（細胞株を含む）細胞培養物、発酵ブロス、血清、腹水、並びに遺伝子導入植物及び動物の抽出物などの液体試料を含めての供給源から誘導され、又は、該供給源に含まれている。本明細書で使用する場合は、体液として、生体に関連する任意の処理若しくは未処理液、特に、全血、温若しくは冷血、臍帯血、及び貯蔵若しくは新鮮血を含めての血液；限定されないが、生理食塩水、栄養剤及び／又は凝固防止溶液を含めての少なくとも１種の生理溶液で希釈された血液などの処理血液；濃縮血小板（ＰＣ）、血小板富化血漿（ＰＲＰ）、貧血小板血漿（ＰＰＰ）、無血小板血漿、血漿、新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）、血漿から得られたコンポーネント、充填赤色細胞（ＰＲＣ）、遷移帯材料又は軟膜（ＢＣ）などの血液コンポーネント；血液若しくは血液コンポーネント由来の、又は骨髄由来の血液製品；白血球、幹細胞；血漿から分離され、生理溶液又は不凍液中で再懸濁された赤色細胞；並びに、血漿から分離され、生理溶液又は不凍液中で再懸濁された血小板が挙げられる。体液として又、骨髄吸引物を含む生理溶液が挙げられる。体液は、本発明に従って使用される前に、処理して一部の白血球を除去することができる。血液製品又は体液とは、上記のコンポーネント、及び類似の血液製品又は他の手段で得られ、類似の特性を有する体液を指す。
【００４４】
[0044]これに関連して、特に好ましいクラスの生体物質は免疫グロブリンである。「免疫グロブリン」というカテゴリーは、モノクロナール及びポリクロナール抗体、及びＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ及びＦｖ断片、並びにその他の改変抗体種を含めての全体の免疫グロブリンを包含する。一実施形態では、免疫グロブリンは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）であってもよい。代替的に又は追加的に、以下のもの：即ち、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥのうちの任意の１種又は複数が結合することができる。一部の実施形態では、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭが選択的に結合する。
【００４５】
[0045]本発明の実施形態によるクロマトグラフィー分離は、例えば、クロマトグラフィーイオン交換樹脂を含む基材、及び、一部の実施形態においては、生理ｐＨ及び／又はイオン強度下で機能できるものを含めての疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂を含むことができる。本発明の基材は、例えば、国際公開第２００５／０７３７１１号パンフレットに開示のものを含めてのさまざまな方法に従って物質を分離するのに使用することができる。１種又は複数の生体物質を含む液体試料は、少なくとも１種の生体物質を基材に結合させるのに十分な時間、本発明の基材の一実施形態と接触させる。典型的には、接触期間は、約３０秒〜約１２時間の間である。
【００４６】
[0046]少なくとも１種の生体物質を含む試料を処理する方法の一実施形態は、試料中の少なくとも１種の生体物質を基材に結合させるのに十分な時間、基材の一実施形態を試料と接触させるステップを含む。
【００４７】
[0047]別の実施形態では、液体試料から少なくとも１種の物質を分離するための方法は、基材の一実施形態を、少なくとも１種の物質を含む液体試料と接触させるステップであって、該物質が基材に吸着するステップと、該物質が基材から脱着するようにｐＨ、イオン強度、又はその双方を調整するステップとを含む。
【００４８】
[0048]該方法の一実施形態では、少なくとも１種の物質は、抗体、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、又はその抗体断片を含む。
【００４９】
[0049]該方法の一部の実施形態では、試料は、体液、例えば、限定されないが、血漿を含む。
【００５０】
[0050]該方法の好ましい一実施形態では、基材をカラム内に配置し、該方法が試料をカラムに通すステップを含む。
【００５１】
[0051]適切な場合、液体試料のｐＨ、イオン強度、又はその双方は、試料を基材と接触させる前に調整することができる。追加的に、又は代替的に、試料は、濃縮、希釈、又は塩などの添加剤と混合することができる。ある範囲のタンパク質に対する典型的な捕獲ｐＨ値は、約４〜約１０である。但し、捕獲ｐＨは、これより高くても低くてもよい。典型的には、約４〜約８の範囲のｐＨは、カチオン交換部分を含む基材に対するタンパク質の吸着を増進するが、約６〜約１０の範囲のｐＨは、アニオン交換部分が使用される場合に同じ働きをする。一部の実施形態では、基材は、約５．５のｐＨで、又は約７．２のｐＨで、又は約８．０のｐＨでタンパク質を結合することができる。しかし、基材は、これより高いｐＨでも低いｐＨでもタンパク質を結合することができる。
【００５２】
[0052]本発明の基材は、試料のイオン強度によって制限されず、低いイオン強度及び高いイオン強度を有する試料と一緒に使用することができる。多数の生体物質は、生理的イオン強度で基材に容易に吸着する。生理的イオン強度は典型的には約１５〜約２０ｍＳ／ｃｍの範囲であるが、イオン強度は、こうした値よりも高くても低くてもよい。この範囲に対応する典型的な塩濃度は、約０．１〜約０．２Ｍ，好ましくは、０．１４〜約０．１７Ｍに入る。
【００５３】
[0053]液体試料が基材と接触する温度は、当技術分野で公知のように試料と所与のクロマトグラフィー材料によって異なる。好ましくは、温度は周囲温度であるが、周囲よりも高くても低くてもよい。
【００５４】
[0054]試料を基材と接触させた後、基材は、当技術分野で公知のように、好ましくは、平衡緩衝液で洗浄される。平衡緩衝液は、好ましくは、液体試料が基材と接触したｐＨを有する緩衝液である。さらには、平衡緩衝液は、基材に吸着していない物質を基材物質から洗い落とす。適切な平衡緩衝液は、当技術分野で公知であり、例えば、それには、酢酸塩緩衝液及びリン酸塩緩衝生理食塩水が含まれる。洗浄は、結合した生体物質を含む基材を平衡緩衝液内に、入浴、浸漬、又はディッピングすることによって実施することができる。代替的に又は追加的に、平衡緩衝液は、基材上ですすいだり、スプレーしたり、又は洗浄することができる。
【００５５】
[0055]所望の生体物質は典型的には、基材に吸着するものである。他の実施形態では、重要な生体物質は、例えば、平衡緩衝液の洗浄で除去することができる。この場合、物質は、当技術分野で公知の方法によって緩衝液から単離することができる。別の実施形態では、所望の生体物質は、基材に吸着しないが、除去すべき不純物こそが基材に吸着する。この場合、所望の生体物質は、当技術分野で公知の方法によって装入緩衝液又は洗浄緩衝液から回収することができる。
【００５６】
[0056]基材に吸着される生体物質は、一実施形態では、次いで、ｐＨを物質が脱着する値に調整することによって脱着される。脱着が行われるｐＨは、物質及び所与の基材で決まることになる。例えば、アニオン交換部分を含む基材では、脱着は、典型的には、約ｐＨ８で出発し約ｐＨ３まで減少するｐＨ勾配で行われる。カチオン交換部分を含む基材では、適用されるｐＨ勾配は典型的には、約ｐＨ４で出発し約ｐＨ１１まで増加する。主として疎水基を特徴とする基材では、脱着用のｐＨ勾配は典型的には、約ｐＨ７で出発し約ｐＨ３まで減少する。主として疎水基を特徴とする基材では、好ましくは、イオン強度勾配が又、以下に記載のように適用される。ｐＨは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ水溶液や炭酸塩緩衝液など任意の日常的に市販されている試薬によって調整することができる。
【００５７】
[0057]一部の場合では、上述したように、溶離液のイオン強度を調整すると、基材の効率を増加させることができる。したがって、主として疎水基を含む基材では、イオン強度は、ｐＨと同時に減少させることができる。これは、追加的に−ＮＨ−部分を含む材料では、特にそうである。該−ＮＨ−部分は、中程度のイオン電荷を生成することができ、イオン強度が減少するにつれてそのイオン電荷がより有効になるからである。塩勾配の使用は、当技術分野で周知である。典型的には、本基材に対する塩濃度は、約１．０Ｍ、又は約０．５Ｍを超える必要はない。
【００５８】
[0058]典型的には、脱着した生体物質は、次いで、集められ、所望ならさらに加工することができる。本発明の実施形態に従って精製される抗体などの生体物質の典型的な純度は、約７０％以上、一部の実施形態では、約８５％以上、より好ましくは、約９０％〜約９９％である。
【００５９】
[0059]一部の実施形態では、本発明の基材は、生体物質を精製し、同時に集合体を除去するのに使用することができ、それによって、ワンステップでの精製及び集合体除去が可能になる。一部の実施形態では、基材は、優先的には、免疫グロブリン（好ましくは、モノクロナール抗体）などの生体物質を結合するが、集合体を結合しない。したがって、精製すべき生体物質を含む試料は、上述のように、基材と接触することができ、生体物質は、基材に吸着し、不純物及び集合体は通過することになる。精製生体物質は、次いで、脱着し、上述のように集めることができる。一部の実施形態では、精製生体物質中の集合体の量は、例えば、約５％未満、又は約２％未満、又は約１％未満などの約１０％未満である。
【００６０】
[0060]上述の実施形態の多くは、生体物質を含む溶液を基材と接触させるステップと、基材によって溶液中の少なくとも１種の生体物質を選択的に吸着するステップとを含む。所望の生体物質（複数可）が基材に結合した場合に、後者の溶離によって、それ又はそれらが分離され、精製及び濃縮形態で集められることが可能になる。所望の生体物質が、処理溶液（他の生体物質は、基材に結合している）中に残っている場合、所望の分離は、溶離液を集めることによって直接得ることができる。
【００６１】
[0061]好ましくは、本発明の実施形態による基材は、劣化することなく反復して再生することができる。再生は、当業者に公知の手順によって実施することができる。例えば、使用後、基材は、水酸化ナトリウム水溶液などの再生溶液と接触させることができる。一実施形態では、基材は、３０分という最小接触時間で５本のカラム体積分の１Ｍ  ＮａＯＨと接触する。代替的に又は追加的に、基材は、塩酸水溶液や酢酸水溶液などの酸溶液と接触することができる。一実施形態では、基材は、３０分という最小接触時間で５本のカラム体積分の０．１Ｍ  ＨＣｌ又は０．１Ｍ酢酸と接触する。代替的に又は追加的に、基材は、塩化ナトリウム水溶液などの塩溶液と接触することができる。一実施形態では、基材は、３０分という最小接触時間で５本のカラム体積分の１Ｍ  ＮａＣｌと接触する。再使用前に、基材は、好ましくは、平衡緩衝液で洗浄される。接触時間並びに再生溶液（複数可）の組成及び濃度は、再生が確実に効率的になるように、配位子の性質及び原液の組成に基づいて当業者によって選択することができる。
【００６２】
[0062]上述の例示的な分離方法は、例えば、固定床、流動床、及びバッチクロマトグラフィーを用いる調製方法を含めての、さまざまな技術で使用することができる。或いは、該方法は、例えば、デバイス体積が数マイクロリットルという小さなものであってもよいスピンカラムやマルチウエルプレートフォーマットなどのより小さいデバイスを利用するハイスループット分離技術との関連で、例えば、実施することができる。
【００６３】
[0063]バッチ式の吸着／分離を使用する場合、基材は生体物質の溶液に直接添加することができ、基材／生体物質混合物は典型的には、生体物質を基材に結合させるのに十分な時間、静かに撹拌する。吸着された生体物質を含む基材は、次いで、例えば、遠心分離又はろ過によって除去することができ、生体物質は、次いで、別個のステップで基材から溶離される。
【００６４】
[0064]別の実施形態では、カラムクロマトグラフィーを使用することができる。固定床カラムクロマトグラフィーでは、基材は、カラム内に充填され、分離すべき生体物質を含む溶液は、生体物質が基材に結合することが可能である速度で基材内に注がれることによって基材に施用される。
【００６５】
[0065]流動床カラムクロマトグラフィーでは、上昇力に対して平衡を保つために、上昇ろ過流及び大型／高密度粒子が使用される。他の部分の頂部に置かれる１〜５段の間から典型的になる基本的に垂直なカラムが使用され、溶液は、順次、それぞれの段内を通過し、上の段の上部でオーバーフローによって引出される。好ましくは、カラムは３段である。最上段を除いて、それぞれの段は、２つの分配系によって分離されており、１つは、該当する段の底部で溶液を分配し、他は、直上に位置する段の方に溶液を分配する。
【００６６】
[0066]一実施形態では、本基材を含むカラムは、他の基材を含むカラムと直列で使用することができ、これは、試料からのさまざまの不純物を排除するのに有効であると思われる。したがって、本カラムの１つ又は複数の利点は、他の又は従来のカラムの特徴を補うものとみなすことができる。これに関連して、カラムのかかる直列配置は、溶離液及び平衡緩衝液を節約すると思われ、したがって、試料の追加の操作及び調製に対する必要性を排除ではなくても低減することになる。
【００６７】
[0067]以下の実施例は、本発明をさらに例示するものであるが、当然、いかなる意味においてもその範囲を限定するものとみなすべきではない。
実施例１
【００６８】
[0068]本実施例は、配位子試薬２−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−５−（イソプロポキシカルボニルアミノ）ベンズアミド）酢酸メチルを合成するための方法を実際に示す。
【００６９】
[0069]グリシンメチルエステル塩酸塩（６７５ｍｇ、５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１５ｍｌ）に溶解し、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（６７５ｍｇ、５ｍｍｏｌ）、３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−５−（イソプロポキシカルボニルアミノ）安息香酸（１．７６ｇ、５ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を０℃まで冷却し、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（１．５４ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）をゆっくりと加える。反応混合物を０℃で５分間及び室温で終夜さらに撹拌する。水（１００ｍｌ）を加え、撹拌をさらに２０分間継続した後に、酢酸エチル（１００ｍｌ）を加える。粗生成物をさらに５分間撹拌し、有機層を分離する。水性相を酢酸エチル２×７０ｍｌでさらに抽出し、合わせた有機相を水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、真空下で濃縮する。
0005736590.tif 000040
【００７０】
[0070]酢酸エチル／ヘキサン１：１におけるシリカゲルを含むカラムクロマトグラフィーによって、収率７８％で白色固体１．６５ｇ、３．９ｍｍｏｌを得る。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：７．７２（ｓ、１Ｈ、芳香族）、７．５０（ｓ、２Ｈ、芳香族）、６．５０（ｓ、１Ｈ、アミド）、６．６０（ｓ、２Ｈ、アミド）、４．２２（ｄｄ、２Ｈ、）、３．８０（ｓ、３Ｈ）、１．５５（ｓ、１８Ｈ）。ＬＣＭＳ（イオンモード：ＥＳＩ）ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ＋］計算値４２２．２０、実測値４２２．００、［Ｍ＋Ｎａ］＋４６６．０７。
実施例２
【００７１】
[0071]本実施例は、セルロースのｐａｒａ−フェニレンジアミン（ＰＤＡ）誘導体を調製するための方法を実際に示す。
【００７２】
[0072]セルロースビーズの５０％スラリー１００ｍｌを水酸化ナトリウム１Ｍ溶液で十分に洗浄し、次いで、中性のｐＨが得られるまで水で洗浄する。水気を切ったビーズ５０ｍｌに、ｐＨ１１〜１２の水酸化ナトリウム溶液５０ｍｌ及びクロロ酢酸５ｍｌを加える。次いで、生成混合物を６０℃で２４時間撹拌する。反応混合物を室温まで放置冷却し、洗浄して未反応クロロ酢酸を除去し、次いで、中和する。
【００７３】
[0073]ＣＯＯＨの密度は、６０μｍｏｌ／ｍｌビーズであった。これは、さまざまな官能基を結合させるための酸−塩基滴定によって測定する。
【００７４】
[0074]ＣＯＯＨが６０μｍｏｌ／ｍｌであるカルボキシメチルセルロースのビーズ１０ｍｌを、ｐＨ４．７の０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液中のＥＤＣ（２．１ｍｍｏｌ）の存在下でＮ−Ｂｏｃ−ｐ−フェニレンジアミン（０．３７４ｇ、１．８ｍｍｏｌ、３当量）とカップリングさせる。反応混合物を洗浄して過剰のＢｏｃ−ｐ−フェニレンジアミン及び副生物を除去する。ＢＯＣ保護基を３Ｍ  ＨＣｌで除去して以下に示す材料を得る：
0005736590.tif 000041
【００７５】
[0075]生成物は白色である。窒素元素分析によって決定される配位子の密度は４０μｍｏｌ／ｍｌビーズであった。生成物は、ｐＨ７のリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の５０％スラリーとして４〜８℃で貯蔵する。
実施例３
【００７６】
[0076]本実施例は、イオウ含有リンカーを含むセルロースのｐａｒａ−フェニレンジアミン（ＰＤＡ）誘導体を調製するための方法を実際に示す。
【００７７】
[0077]湿潤ケーキまで吸引乾燥された架橋セルロースビーズ１００ｇを水（７５ｇ）、３２％ＮａＯＨ（１９．５ｇ）及び臭化アリル（１８．７５ｇ）と混合する。混合物を室温で２４時間、回転ドラムに掛ける。
【００７８】
[0078]ビーズを十分に洗浄して未反応臭化アリル及び副産物を除去し、さまざまな官能基を結合させるための基材としてのアリル−セルロースを得る。
【００７９】
[0079]湿潤ケーキまで吸引乾燥されたアリル−セルロースビーズ１００ｇを水（９９ｇ）及びｐＨ１１〜１２の２−メルカプト酢酸（１．０ｇ）と混合し、混合物を室温で４８時間回転ドラムに掛ける。生成カルボキシル誘導体を洗浄して、副生物を除去し、さまざまな官能基を結合させるための基材としての酸活性化セルロースを得る。酸密度は、元素分析を使用することによって９０μｍｏｌ／ｍｌビーズであると決定される。
【００８０】
[0080]次いで、得られた酸活性化ビーズの５０％スラリー１０．０ｍｌをＥＤＣ（３当量）の存在下でｐＨ４．７の０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液中のＢｏｃ−ｐ−フェニレンジアミンの（０．５６２ｇ、２．７ｍｍｏｌ、３当量）と縮合させる。反応混合物を室温で１２時間振とうする。混合物を十分洗浄して未反応Ｂｏｃ−ｐ−フェニレンジアミン及び反応の副生物を除去する。ＢＯＣ保護基を３Ｍ  ＨＣｌで除去して以下に示す材料を得る：
0005736590.tif 000042
【００８１】
[0081]生成物は白色であり、窒素元素分析によって決定されるｐ−フェニレンジアミン配位子の密度は７８μｍｏｌ／ｍｌビーズである。生成物は、ｐＨ７のＰＢＳ緩衝液中の５０％スラリーとして４〜８℃で貯蔵することができる。
実施例４
【００８２】
[0082]本実施例は、イオウ含有リンカーを含むセルロースのｍｅｔａ−フェニレンジアミン誘導体を調製するための方法を実際に示す。
【００８３】
[0083]実施例３で上記したプロトコルに従って得られた酸活性化セルロースビーズの５０％スラリー１０ｍｌをＥＤＣ（３当量）の存在下でｐＨ４．７の０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液中のＮ−Ｂｏｃ−ｍ−フェニレンジアミンの（０．５６２ｇ、２．７ｍｍｏｌ、３当量）と縮合させる。ＢＯＣ保護基を３Ｍ  ＨＣｌで除去して以下に示す材料を得る：
0005736590.tif 000043
【００８４】
[0084]生成物は白色である。窒素元素分析によって決定される配位子密度は６２μｍｏｌ／ｍｌビーズである。生成物は、ｐＨ７のＰＢＳ緩衝液中の５０％スラリーとして４〜８℃で貯蔵することができる。
【００８５】
[0085]Ｎ−Ｂｏｃ−ｍ−フェニレンジアミンの代わりにｍ−フェニレンジアミンをカップリングすることによって同じ生成物を調製する。配位子密度は、６４μｍｏｌ／ｍｌビーズである。
実施例５
【００８６】
[0086]本実施例は、イオウ含有リンカーを含むセルロースのｏｒｔｈｏ−フェニレンジアミン誘導体を調製するための方法を実際に示す。
【００８７】
[0087]実施例３で上記したプロトコルに従って得られた酸活性化セルロースビーズの５０％スラリー１０ｍｌをＥＤＣ（３当量）の存在下でｐＨ４．７の０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液中のＢｏｃ−ｏ−フェニレンジアミンの（０．５６２ｇ、２．７ｍｍｏｌ、３当量）と縮合させる。反応混合物を室温で２４時間振とうする。混合物を十分洗浄して未反応Ｂｏｃ−ｏ−フェニレンジアミン及び反応の副生物を除去する。ＢＯＣ保護基を３Ｍ  ＨＣｌで除去して以下に示す材料を得る：
0005736590.tif 000044
【００８８】
[0088]生成物は白色である。元素分析によって決定される配位子密度は４０μｍｏｌ／ｍｌビーズであった。生成物は、ｐＨ７のＰＢＳ緩衝液中の５０％スラリーとして貯蔵する。
実施例６
【００８９】
[0089]本実施例は、イオウ含有リンカーを含むセルロースの４，６−ジアミノピリミジン誘導体を調製するための方法を実際に示す。
【００９０】
[0090]実施例３で上記したプロトコルに従って得られた酸活性化セルロースビーズの５０％スラリー１０ｍｌをＥＤＣ（３当量）の存在下、室温で１２時間、ｐＨ４．７の０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液中の４，６−ジアミノピリミジン塩酸塩の（０．３９５ｇ、２．７ｍｍｏｌ、３当量）と縮合させる。生成物を洗浄して未反応４，６−ジアミノピリミジン及び副生物を除去する。
0005736590.tif 000045
【００９１】
[0091]４，６−ジアミノピリミジンで誘導体化されたビーズは白色である。配位子密度は、３０μｍｏｌ／ｍｌビーズと決定される。ビーズは、ｐＨ７のＰＢＳ緩衝液中の５０％スラリーとして４〜８℃で貯蔵することができる。
実施例７
【００９２】
[0092]本実施例は、イオウ含有リンカーを含むセルロースの２，４，６−トリアミノピリミジン誘導体を調製するための方法を実際に示す。
【００９３】
[0093]実施例３で上記したプロトコルに従って得られた酸活性化セルロースビーズの５０％スラリー１０ｍｌを水で完全に洗浄して貯蔵溶液を除去し、次いで、ｐＨ４．７の０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液で洗浄する。その後、ビーズを、０．１Ｍ  ＭＥＳ（３ｍｌ）及び２Ｍ  ＨＣｌ（１．７５ｍｌ）に溶解した３．５ｍｍｏｌ２，４，６−トリアミノピリミジンと混合した後に、ＥＤＣ（１．５ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を３時間室温で回転ドラムに掛け、十分に清浄にして未反応試薬及び副生物を除去する。
0005736590.tif 000046
【００９４】
[0094]生成物は白色であり、元素分析によって決定される配位子密度は３０μｍｏｌ／ｍｌビーズである。生成物は、ｐＨ７のＰＢＳ緩衝液中の５０％スラリーとして貯蔵する。
実施例８
【００９５】
[0095]本実施例は、イオウ含有リンカーを含むセルロースの１，５−ジアミノナフタレン誘導体を調製するための方法を実際に示す。
【００９６】
[0096]実施例３で上記したプロトコルに従って得られた酸活性化セルロースビーズの５０％スラリー１０ｍｌをＥＤＣ（３当量）の存在下、室温で１２時間、メタノールとｐＨ４．７の０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液の混合物中の１，５−ジアミノナフタレンの（０．４２７ｇ、２．７ｍｍｏｌ、３当量）と縮合させる。次いで、生成物を十分に洗浄して未反応ジアミン及び副生物を除去する。
0005736590.tif 000047
【００９７】
[0097]１，５−ジアミノナフタレンによって誘導体化されたビーズは、オフピンク色である。配位子密度は、元素分析によって４１μｍｏｌ／ｍｌビーズと決定される。生成物は安定であり、ｐＨ７のＰＢＳ緩衝液中の５０％スラリーとして４〜８℃で貯蔵することができる。
実施例９
【００９８】
[0098]本実施例は、イオウ含有リンカーを含むセルロースの２，５−ジアミノピリジン誘導体を調製するための方法を実際に示す。
【００９９】
[0099]実施例３で上記したプロトコルに従って得られた酸活性化セルロースビーズの５０％スラリー１０ｍｌをＥＤＣ（５当量）の存在下でｐＨ４．７の０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液中の２，５−ジアミノピリジン二塩酸塩の（０．４９１ｇ、３ｍｍｏｌ、３当量）と縮合させる。生成物を十分に洗浄して未反応試薬及び副生物を除去する。
0005736590.tif 000048
【０１００】
[00100]２，５−ジアミノピリジンで誘導体化されたビーズは、白色である。元素分析によって決定される配位子密度は５８μｍｏｌ／ｍｌビーズである。生成物は、ｐＨ７のＰＢＳ緩衝液中の５０％スラリーとして４〜８℃で貯蔵することができる。
実施例１０
【０１０１】
[00101]本実施例は、イオウ含有リンカーを含むセルロースの２，４，６−トリメチル−１，３−ベンゼンジアミン誘導体を調製するための方法を実際に示す。
【０１０２】
[0100]実施例３で上記したプロトコルに従って得られた酸活性化セルロースビーズの５０％スラリー１０ｍｌをＥＤＣ（３当量）の存在下、メタノールとｐＨ４．７の０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液の混合物中の２，４，６−トリメチル−１，３−ベンゼンジアミンの（０．４０５ｇ、２．７ｍｍｏｌ、３当量）と縮合させる。生成物を洗浄して副生物及び未反応試薬を除去する。
0005736590.tif 000049
【０１０３】
[0101]２，４，６−トリメチル−１，３−ベンゼンジアミンで誘導体化されたビーズは、白色である。配位子密度は７２μｍｏｌ／ｍｌビーズであり、元素分析によって決定される。
実施例１１
【０１０４】
[0102]本実施例は、イオウ含有リンカーを含むセルロースのテトラメチル−ｐ−フェニレンジアミン誘導体を調製するための方法を実際に示す。
【０１０５】
[0103]実施例３で上記したプロトコルに従って得られた酸活性化セルロースビーズの５０％スラリー１０ｍｌを水で完全に洗浄して貯蔵溶液を除去し、次いで、ｐＨ４．７の０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液で洗浄する。メタノール（４ｍｌ）に溶解した２，３，５，６−テトラメチル−１，４−フェニレンジアミン（４．０ｍｍｏｌ）を加えた後に、０．１Ｍ  ＭＥＳに溶解したＥＤＣ（４．０ｍｍｏｌ）をビーズに加える。ビーズを終夜回転ドラムに掛け、十分に洗浄して過剰のジアミン及び副生物を除去する。
0005736590.tif 000050
【０１０６】
[0104]生成物は、白色であり、配位子密度は６５μｍｏｌ／ｍｌビーズであり、元素分析によって決定される。生成物は、ｐＨ７のＰＢＳ緩衝液中の５０％スラリーとして貯蔵する。
実施例１２
【０１０７】
[0105]本実施例は、イオウ含有リンカーを含むセルロースの３，５−ジアミノ安息香酸誘導体を調製するための方法を実際に示す。
【０１０８】
[0106]実施例３で上記したプロトコルに従って得られた酸活性化セルロースビーズの５０％スラリー１０ｍｌをＥＤＣ（３当量）の存在下、メタノールとｐＨ４．７の０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液の１：１混合物中の３，５−ジアミノ安息香酸のエチルエステルの（０．４８６ｇ、２．７ｍｍｏｌ、３当量）と縮合させる。次いで、室温で１２時間、１Ｍ  ＮａＯＨを使用することによって鹸化を実施して以下に示す生成物を得る：
0005736590.tif 000051
【０１０９】
[0107]このジアミノ安息香酸で誘導体化されたビーズは、オフホワイト色である。配位子密度は４０μｍｏｌ／ｍｌビーズであり、元素分析によって決定される。
実施例１３
【０１１０】
[0108]本実施例は、イオウ含有リンカーを含むセルロースの２−メトキシ−５−ｔｅｒｔ−ブチル−１，３−ベンゼンジアミン誘導体を調製するための方法を実際に示す。
【０１１１】
[0109]実施例３で上記したプロトコルに従って得られた酸活性化セルロースビーズの５０％スラリー１０ｍｌを水で完全に洗浄して貯蔵溶液を除去し、次いで、ｐＨ４．７の０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液で洗浄する。メタノール（４ｍｌ）に溶解した４−ｔｅｒｔ−ブチル−２，６−ジアミノアニソール（４．０ｍｍｏｌ）を加えた後に、０．１Ｍ  ＭＥＳに溶解したＥＤＣ（４．０ｍｍｏｌ）を加える。ビーズを終夜回転ドラムに掛け、十分に洗浄して過剰のジアミン及び副生物を除去する。
0005736590.tif 000052
【０１１２】
[0110]生成物は白色であり、ｐＨ７のＰＢＳ緩衝液中の５０％スラリーとして貯蔵することができる。
実施例１４
【０１１３】
[0111]本実施例は、イオウ含有リンカーを含むセルロースの２，６−ジアミノピリジン誘導体を調製するための方法を実際に示す。
【０１１４】
[0112]実施例３で上記したプロトコルに従って得られた酸活性化セルロースビーズの５０％スラリー５．０ｍｌを水で完全に洗浄して貯蔵溶液を除去し、次いで、ｐＨ４．７の０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液で洗浄する。ビーズを、０．１Ｍ  ＭＥＳ（２ｍｌ）及び２Ｍ  ＨＣｌ（１．７５ｍｌ）に溶解した２，６−ジアミノピリジン（３８２ｍｇ、３．５ｍｍｏｌ）と混合する。０．１Ｍ  ＭＥＳ（１．５ｍｌ）に溶解したＥＤＣ（３０６ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を加えた。ビーズを終夜室温で回転ドラムに掛け、十分に洗浄して未反応試薬及び副生物を除去する。
0005736590.tif 000053
【０１１５】
[0113]カップリングした配位子の密度は、２６μｍｏｌ／ｍｌ湿潤ビーズであると元素分析によって決定される。生成物は白色であり、ｐＨ７のＰＢＳ緩衝液中の５０％スラリーとして貯蔵することができる。
実施例１５
【０１１６】
[0114]本実施例は、イオウ含有リンカーを含むセルロースの４−ニトロ−１，２−フェニレンジアミン誘導体を調製するための方法を実際に示す。
【０１１７】
[0115]実施例３で上記したプロトコルに従って得られた酸活性化セルロースビーズの５０％スラリー６．０ｍｌを水で完全に洗浄して貯蔵溶液を除去し、次いで、ｐＨ４．７の０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液で洗浄する。メタノール（４ｍｌ）に溶解した４−ニトロ−１，２−フェニレンジアミン（２．４ｍｍｏｌ）を加えた後に、０．１Ｍ  ＭＥＳ（２ｍｌ）に溶解したＥＤＣ（２．４ｍｍｏｌ、４５８ｍｇ）を加える。ビーズを終夜回転ドラムに掛け、十分に洗浄して未反応試薬及び副生物を除去する。
0005736590.tif 000054
【０１１８】
[0116]最終生成物は橙色であり、ｐＨ７のＰＢＳ緩衝液中の５０％スラリーとして貯蔵することができる。
実施例１６
【０１１９】
[0117]本実施例は、イオウ含有リンカーを含むセルロースの４，５，６−トリアミノピリミジン誘導体を調製するための方法を実際に示す。
【０１２０】
[0118]実施例３で上記したプロトコルに従って得られた酸活性化セルロースビーズの５０％スラリー５．０ｍｌを水で完全に洗浄して貯蔵溶液を除去し、次いで、ｐＨ４．７の０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液で洗浄する。０．１Ｍ  ＭＥＳ（４ｍｌ）に懸濁した４，５，６−トリアミノピリミジンスルフェート（３．２ｍｍｏｌ、７０２ｍｇ）を加えた後に、０．１Ｍ  ＭＥＳ（１ｍｌ）に溶解したＥＤＣ（１．５ｍｍｏｌ、２８０ｍｇ）を加える。反応混合物を３時間回転ドラムに掛け、十分に洗浄して未反応試薬及び副生物を除去する。
0005736590.tif 000055
【０１２１】
[0119]最終生成物は白色であり、ｐＨ７のＰＢＳ緩衝液中の５０％スラリーとして貯蔵することができる。
実施例１７
【０１２２】
[0120]本実施例は、イオウ含有リンカーを含むセルロースの４−クロロ−２，６−ジアミノピリジン誘導体を調製するための方法を実際に示す。
【０１２３】
[0121]実施例３で上記したプロトコルに従って得られた酸活性化セルロースビーズの５０％スラリー５．０ｍｌを水で完全に洗浄して貯蔵溶液を除去し、次いで、ｐＨ４．７の０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液で洗浄する。ビーズを、０．１Ｍ  ＭＥＳ（３ｍｌ）及び２Ｍ  ＨＣｌ（１．７５ｍｌ）に溶解した４−クロロ−２，６−ジアミノピリジン（３．５ｍｍｏｌ）と混合した後に、ＥＤＣ（１．５ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を、次いで、３時間室温で回転ドラムに掛け、十分に洗浄して未反応試薬及び副生物を除去する。
0005736590.tif 000056
【０１２４】
[0122]最終生成物は白色であり、ｐＨ７のＰＢＳ緩衝液中の５０％スラリーとして貯蔵することができる。
実施例１８
【０１２５】
[0123]本実施例は、イオウ含有リンカーを含むセルロースの２，４−ジアミノピリミジン誘導体を調製するための方法を実際に示す。
【０１２６】
[0124]実施例３で上記したプロトコルに従って得られた酸活性化セルロースビーズの５０％スラリー１０．０ｍｌを水で完全に洗浄して貯蔵溶液を除去し、次いで、ｐＨ４．７の０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液で洗浄する。次いで、ビーズを、０．１Ｍ  ＭＥＳ（６ｍｌ）及び２Ｍ  ＨＣｌ（３．５ｍｌ）に溶解した２，４−ジアミノピリミジン（７．０ｍｍｏｌ）と混合した後に、ＥＤＣ（３．０ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を３時間室温で回転ドラムに掛け、十分に洗浄して過剰の試薬及び副生物を除去する。
0005736590.tif 000057
【０１２７】
[0125]最終生成物は白色であり、ｐＨ７のＰＢＳ緩衝液中の５０％スラリーとして貯蔵することができる。
実施例１９
【０１２８】
[0126]本実施例は、イオウ含有リンカーを含むセルロースの２，５−ジアミノベンゼンスルホン酸誘導体を調製するための方法を実際に示す。
【０１２９】
[0127]実施例３で上記したプロトコルに従って得られた酸活性化セルロースビーズの５０％スラリー５．０ｍｌを水で完全に洗浄して貯蔵溶液を除去し、次いで、ｐＨ４．７の０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液で洗浄する。次いで、ビーズを、０．１Ｍ  ＭＥＳ（３ｍｌ）及び１Ｍ  ＮａＯＨ（１．５ｍｌ）に溶解した２，５−ジアミノベンゼンスルホン酸（３００ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）と混合した後に、０．１Ｍ  ＭＥＳ（２ｍｌ）に溶解したＥＤＣ（３０６ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を加える。ビーズを２４時間室温で回転ドラムに掛け、十分に洗浄して過剰の試薬及び副生物を除去する。
0005736590.tif 000058
【０１３０】
[0128]配位子の密度は２８μｍｏｌ／ｍｌビーズであり、元素分析によって決定される。最終生成物は、ｐＨ７のＰＢＳ緩衝液中の５０％スラリーとして貯蔵することができる。
実施例２０
【０１３１】
[0129]本実施例は、イオウ含有リンカーを含むセルロースの３，４−ジアミノ安息香酸誘導体を調製するための方法を実際に示す。
【０１３２】
[0130]実施例３で上記したプロトコルに従って得られた酸活性化セルロースビーズの５０％スラリー１０ｍｌをＥＤＣ（３当量）の存在下、メタノールとｐＨ４．７の０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液の１：１混合物中の３，４−ジアミノ安息香酸のエチルエステルの（０．４８６ｇ、２．７ｍｍｏｌ、３当量）と縮合させる。次いで、室温で１２時間１Ｍ  ＮａＯＨを使用することによって鹸化を実施して以下に示す生成物を得る：
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【０１３３】
[0131]このジアミノ安息香酸で誘導体化されたビーズはオフホワイト色である。配位子密度は、７０μｍｏｌ／ｍｌ樹脂であり、元素分析によって決定される。
実施例２１〜４５
【０１３４】
[0132]以下の表１に示すようなイオウ含有リンカー及び配位子を含むセルロース誘導体を、実施例１９の２，５−ジアミノベンゼンスルホン酸を適切な配位子試薬で置換して、実施例８に記載のプロトコルに従って調製する。
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実施例４６
【０１３５】
[0133]本実施例は、本発明の一実施形態による固体基材を使用することによって、ヒトの粗血漿からＩｇＧを単離及び精製するための方法を実際に示す。
【０１３６】
[0134]１ｍｌのカラムを、実施例３に従って調製した固体基材で充填する。固体基材をｐＨ７．２の２０ｍＭリン酸塩緩衝液で平衡化する。
【０１３７】
[0135]次に、ヒトの粗血漿の試料１０ｍｌを平衡緩衝液で１：１に希釈し、０．２μｍメンブランでろ過し、１２ｍｌを直接カラムに装入する。次いで、非吸着タンパク質を確実に排除するために、カラムをｐＨ７．２の２０ｍＭリン酸塩緩衝化０．５Ｍ  ＮａＣｌで洗浄する。ｐＨ７．２の２０ｍＭリン酸塩緩衝液でカラムを洗浄することによって結合不純物を除去する。
【０１３８】
[0136]所望のＩｇＧをｐＨ４．０の２０ｍＭ酢酸塩緩衝液で溶離する。ＩｇＧ２５ｍｇを集める。その純度を＞９９％であると推定した。
実施例４７
【０１３９】
[0137]本実施例は、本発明の別の実施形態による固体基材を使用することによって、血漿からＩｇＧを単離及び精製するための方法を実際に示す。
【０１４０】
[0138]１ｍｌのカラムを、実施例９に従って調製した固体基材で充填する。固体基材をｐＨ７．４の２０ｍＭリン酸塩緩衝液で平衡化する。
【０１４１】
[0139]次に、ヒトの血漿の試料１０ｍｌを平衡緩衝液で１：１に希釈し、０．２μｍメンブランでろ過し、２０ｍｌを直接カラムに装入する。次いで、非吸着タンパク質を確実に排除するために、カラムをｐＨ７．２の２０ｍＭリン酸塩緩衝化０．１５Ｍ  ＮａＣｌで洗浄する。ｐＨ７．２の２０ｍＭリン酸塩緩衝液でカラムを洗浄することによって結合不純物を除去する。
【０１４２】
[0140]所望のＩｇＧをｐＨ５．０の２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で溶離する。所望のＩｇＧ３５ｍｇを集める。その純度を＞９９％であると推定した。
実施例４８
【０１４３】
[0141]本実施例は、本発明の実施形態による基材を使用することによってさまざまな配位子密度で良好な動的結合能が実現可能であることを実際に示す。
【０１４４】
[0142]ｐ−フェニレンジアミンを酸活性化ビーズとカップリングさせる条件（酸密度に対するフェニレンジアミン及びＥＤＣの化学量論量を変化させること）をさまざまに変えてさまざまな配位子密度を有する試料を生成することを除いて、固体基材を実施例３に従って調製する。
【０１４５】
[0143]それぞれの基材試料に対するＩｇＧ動的タンパク質結合能（ＤＢＣ）を、ＵＮＩＣＯＲＮソフトウエア手引書に従って、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００  ＬＣ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）で決定する。平衡及び洗浄流速は、１ｍｌ／分であり、装入流速は、０．３３ｍｌ／分（滞留時間３分）である。ヒトＩｇＧを５０％漏出（ＢＴ）まで装入する。Ａｍｅｒｓｈａｍ１８−０３８３−０１からのＨＲ５／５カラム（直径５ｍｍ及び長さ５ｃｍ、体積＝１ｍｌ）を樹脂充填のために使用し、ＵｌｔｒａＳｐｅｃ１０００を使用することによって、Ａ２８０の読みを決定する。濃度２．０ｍｇ／ｍｌの市販ＩｇＧ（ＳｅｒａＣａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ロット番号Ｇ１１１ＲＭ−２５Ｂ０８０２）を使用する。ＩｇＧ用の装入緩衝液は、ｐＨ７．２の２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４であり、平衡及び洗浄緩衝液も、やはり、ｐＨ７．２の２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４である。溶離緩衝液は、ｐＨ３．１の０．１Ｍ酢酸である。溶離からの動的結合能を、全ての溶離画分中のタンパク質量を測定することによって計算する。溶離タンパク質をカラムに実際に結合したタンパク質で除した量を使用することによって回収率を計算する（カラムに結合したタンパク質量＝カラムに装入したタンパク質量−漏出及び洗浄タンパク質）。１０％漏出における結合能を、次式：装入タンパク質濃度×（Ｖ１０％ＢＴ−Ｖ空隙）を使用することによって計算する。系及びカラムの空隙体積を１％アセトンを注入することによって測定する。
【０１４６】
[0144]１つの基材試料の配位子密度及び動的結合能を図１に示す。試験した基材は、約５０μｍｏｌ／ｍｌ以上の低い配位子密度でも良好な動的結合能を示す。
実施例４９
【０１４７】
[0145]本実施例は、本発明の実施形態による基材を使用することによって、純ＩｇＧを依然として得ながら、配位子密度を変化させることが可能であることを実際に示す。
【０１４８】
[0146]ｐ−フェニレンジアミンを酸活性化ビーズとカップリングさせる条件（酸密度に対するフェニレンジアミン及びＥＤＣの化学量論量を変化させる）をさまざまに変えてさまざまなｐ−フェニレンジアミン（ＰＤＡ）配位子密度を有する試料を生成することを除いて、固体基材を実施例３に従って調製する。それぞれの固体基材試料を別々のカラム内に装入し、それを使用して実施例４６に記載したようにヒト血漿からのＩｇＧを精製する。
【０１４９】
[0147]それぞれの基材試料から得られたＩｇＧの純度を図２に示す。配位子密度が３５μｍｏｌ／ｍｌという低さでも、純度９９％のＩｇＧが得られる。３５μｍｏｌ／ｍｌ以上の配位子密度を有する基材では、配位子密度の増加につれてのＩｇＧ純度の有意な増加はみられない。
実施例５０
【０１５０】
[0148]本実施例は、本発明の実施形態による基材を使用することによって、ＩｇＧ結合と滞留時間との関係を実際に示す。
【０１５１】
[0149]固体基材を実施例３に従って調製する。それぞれの固体基材試料を別々のカラム内に装入し、それを使用して以下の手順に従って純ＩｇＧを結合させる：ｐＨ７．２及び導電率６ｍＳ／ｃｍのリン酸塩緩衝液中ＩｇＧ２ｍｇ／ｍｌを５０％ＢＴに到達するまでそれぞれのカラムに装入する。次いで、カラムを０．５Ｍ  ＮａＣｌで洗浄してビーズに吸着したＩｇＧを除去する。次いで、ＩｇＧを、ｐＨ３．１の０．１Ｍ酢酸緩衝液を使用することによって溶離する。
【０１５２】
[0150]試験したそれぞれの滞留時間に対する、１０％漏出時の結合ＩｇＧ量及び溶離ＩｇＧ量、並びにｐＨ３における回収率％を表２に示す。基材は、滞留時間６分で高い結合能を示し、ＩｇＧの回収率は、さまざまな滞留時間で高い。
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実施例５１
【０１５３】
[0151]本実施例は、本発明の実施形態による基材を使用することによって、ｐＨがＩｇＧ結合及び回収率に及ぼす影響を実際に示す。
【０１５４】
[0152]固体基材を実施例１２に従って調製した。それぞれの固体基材試料を別々のカラム内に装入し、それを使用して以下の手順に従ってヒト血漿からのＩｇＧを精製した：可変ｐＨ（５〜８．５）（表２を参照されたい）及び導電率６ｍＳ／ｃｍを有するさまざまな緩衝溶液中のＩｇＧ２ｍｇ／ｍｌを１０％ＢＴに到達するまでそれぞれのカラムに装入した。次いで、カラムを０．５Ｍ  ＮａＣｌで洗浄してビーズに吸着したＩｇＧを除去した。次いで、ＩｇＧをｐＨ３．１の０．１Ｍ酢酸緩衝液を使用することによって溶離した。
【０１５５】
[0153]試験したそれぞれのｐＨ値に対する、１０％漏出時の結合ＩｇＧ量及び溶離ＩｇＧ量、並びに回収率％を表３に示す。試験した全てのｐＨ値で、結合ＩｇＧの少なくとも９８．８％が回収された。ｐＨ５．５が、この配位子に対する最適の装入ｐＨである。
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実施例５２
【０１５６】
[0154]本実施例は、本発明の実施形態による基材を使用することによって、ヒトの粗血漿からのＩｇＧを精製するための基材の再使用を実際に示す。
【０１５７】
[0155]固体基材を実施例３に従って調製し、カラム内に装入し、使用して、実施例４６に記載の手順に従ってＩｇＧを含む生体材料試料を処理する。溶離した後に、１ｍｌ／分の流速で１Ｍ  ＮａＯＨを使用することによって固体基材を再生し、再度使用して、同じ手順に従ってＩｇＧを含む生体材料試料を処理する。再生と再使用のサイクルをもう１回反復し、生体試料を全部で３回処理する。
【０１５８】
[0156]それぞれのサイクルに対するＩｇＧ結合量及び純度を表４に示す。基材は、反復使用の後でも高純度のＩｇＧを生成する。
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実施例５３
【０１５９】
[0157]本実施例は、本発明の実施形態による基材を使用することによって、ヒトの粗血漿からのＩｇＧの精製（滞留時間３分）を実際に示す。
【０１６０】
[0158]実施例３、４、９、１０、及び１１に従って固体基材を調製する。それぞれの固体基材試料を別々のカラム内に装入し、それを使用して実施例４６に記載したように、ヒト血漿からのＩｇＧを精製する。
【０１６１】
[0159]それぞれの試験した基材に対する溶離ＩｇＧ量及びＩｇＧ純度を表５に示す。試験された全ての基材は高純度のＩｇＧをもたらす。
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実施例５４
【０１６２】
[0160]本実施例は、本発明の実施形態による基材を使用することによって、１０％漏出における純ＩｇＧ結合及び回収率（滞留時間３分）を実際に示す。
【０１６３】
[0161]実施例３、１０、１１、及び１３に従って固体基材を調製する。それぞれの固体基材試料を別々のカラム内に装入し、それを使用して実施例５０に記載したように純ＩｇＧを結合させる。
【０１６４】
[0162]それぞれの基材に対する、１０％漏出及び滞留時間３分における結合ＩｇＧ量及び溶離ＩｇＧ量並びに回収率％を表６に示す。
0005736590.tif 000068
実施例５５
【０１６５】
[0163]本実施例は、本発明の実施形態による基材を使用することによって、Ｆａｂ結合及び１０％漏出における回収率を実際に示す。
【０１６６】
[0164]実施例３、４、５、及び８に従って固体基材を調製する。それぞれの固体基材試料を別々のカラム内に装入し、それを使用して以下の条件下で純Ｆａｂを結合させる：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．４）中の０．５ｍｇ／ｍｌＦａｂ溶液を、１０％漏出に到達するまでそれぞれのカラムに装入する。次いで、カラムを平衡緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及び１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で洗浄し、ＦａｂをｐＨ３の３００ｍＭグリシン緩衝液で溶離する。
【０１６７】
[0165]それぞれの基材に対する、１０％漏出及び滞留時間３分におけるＦａｂ動的結合能（ＤＢＣ）、並びに回収率％を表７に示す。
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実施例５６
【０１６８】
[0166]本実施例は、本発明の実施形態による基材を使用することによって、モノクロナール抗体結合と滞留時間との関係を実際に示す。
【０１６９】
[0167]実施例３に従って固体基材を調製し、カラム内に装入し、それを使用して以下の手順に従って純モノクロナール抗体を結合させる：導電率６ｍＳ／ｃｍを有するｐＨ７．２のリン酸ナトリウム緩衝液中のｍＡｂ２ｍｇ／ｍｌを、さまざまな滞留時間で１０％漏出に到達するまでそれぞれのカラムに装入する。カラムを２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液及び５００ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄し、ｍＡｂをｐＨ４．０の２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で溶離する。
【０１７０】
[0168]基材に結合している及び基材から溶離したモノクロナール抗体の量、並びに回収率％を表８に示す。基材は、短い滞留時間でモノクロナール抗体の高回収率を示す。
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実施例５７
【０１７１】
[0169]本実施例は、本発明の実施形態による基材を使用することによって、モノクロナール抗体結合と滞留時間との関係を実際に示す。
【０１７２】
[0170]実施例２０に従って固体基材を調製し、カラム内に装入し、それを使用して以下の手順に従って純モノクロナール抗体を結合させる：導電率１５ｍＳ／ｃｍを有するｐＨ５．５のリン酸ナトリウム＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中のｍＡｂ２ｍｇ／ｍｌを、さまざまな滞留時間時間で１０％漏出に到達するまでそれぞれのカラムに装入する。カラムを２０ｍＭリン酸ナトリウム＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（導電率１５ｍＳ／ｃｍを有する）で洗浄し、ｍＡｂをｐＨ８．０の５０ｍＭリン酸ナトリウム＋２５０ｍＭ  ＮａＣｌ（導電率２５ｍＳ／ｃｍを有する）で溶離する。
【０１７３】
[0171]基材に結合しているモノクロナール抗体の量、及び回収率％を表９に示す。基材は、短い滞留時間でモノクロナール抗体の高回収率を示す。
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実施例５８
【０１７４】
[0172]本実施例は、本発明の実施形態による基材を使用することによって、１０％漏出及び滞留時間３分におけるモノクロナール抗体結合及び回収率を実際に示す。
【０１７５】
[0173]実施例３、４、８、及び９に従って固体基材を調製する。それぞれの固体基材試料を別々のカラム内に装入し、それを使用して実施例５６に記載したようにモノクロナール抗体を含む生体材料試料を処理する。
【０１７６】
[0174]それぞれの基材に対する、１０％漏出及び滞留時間３分におけるｍＡｂ動的結合能（ＤＢＣ）、並びに回収率％を表１０に示す。
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実施例５９
【０１７７】
[0175]本実施例は、本発明の実施形態による基材を使用することによって、集合体の除去を実際に示す。
【０１７８】
[0176]実施例４及び５に従って固体基材を調製する。それぞれの固体基材試料を別々のカラム内に装入し、それを使用して実施例５６に記載の手順に従って、モノクロナール抗体７５．５％と集合体２４．５％とを含む生体材料試料を処理する。
【０１７９】
[0177]基材で処理した後の、試料中のモノクロナール抗体及び集合体の量を表１１に示す。実施例３に記載の基材で処理した後、得られた生成物は、モノクロナール抗体９１．９％と集合体８．１％とを有する。集合体に比較してモノクロナール抗体の割合の更に大きい増加が、実施例３に記載の基材で処理した試料で観察され、処理後、該試料は、モノクロナール抗体９９．０％と集合体１．０％とを有する。
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実施例６０
【０１８０】
[0178]本実施例は、本発明の実施形態による基材を使用することによって、ＩｇＧ静的結合能を実際に示す。
【０１８１】
[0179]固体基材を実施例３〜１２、１４、１５、及び１９〜４５に従って調製する。ＩｇＧの静的結合分析を、純度約９４％の凍結乾燥ヒトＩｇＧ（ＳｅｒａＣａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ロット番号Ｇ１１１ＲＭ−２５Ｂ０８０２）２７ｍｇをＰＢＳ１０ｍｌに溶解して２．５ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ溶液を作製することによって実施する。ＩｇＧ溶液の一連の希釈液を、２組調製し、ＵＶ吸収度を２８０ｎｍで決定する。吸収値を使用して、公称濃度に対するグラフをプロットし、このプロットの傾きを使用して、ＩｇＧの吸光係数として１．４３を用いて希釈液の実際のＩｇＧ濃度を計算する。ＰＢＳ中のそれぞれのビーズ試料の１：１スラリーの５０μＬを２組の別々の１．５ｍｌ微小遠心管にピペットで入れ、それぞれの管にＰＢＳ中の２．５ｍｇ／ｍｌ  ＩｇＧの１ｍｌを加える。管を２時間回転させ、２分間沈降させる。次いで、試料をそれぞれ１２０μＬずつ９６個のウエル板にピペットで投入し、ＵＶ吸収度を２８０ｎｍで読み取る。
【０１８２】
[0180]それぞれの基材に対する静的結合能及び配位子密度を表１２に示す。基材は、低い配位子密度でも高い静的結合能を示す。
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実施例６１
【０１８３】
[0181]本実施例は、本発明の実施形態による基材を使用することによって、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）静的結合能を実際に示す。
【０１８４】
[0182]固体基材を実施例２２〜２６、２９〜３１、３４、３５、３７、３８、４１、４２、及び４４に従って調製する。ＢＳＡの静的結合分析を、純度約９６％のＢＳＡ粉末（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、バッチ番号１０６Ｋ０６８７）２２ｍｇをｐＨ４．７の０．１Ｍ  ＭＥＳ１０ｍｌに溶解して２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液を作製することによって実施する。ＢＳＡ溶液の一連の希釈液を、２組調製し、ＵＶ吸収度を２８０ｎｍで決定する。吸収値を使用して、公称濃度に対するグラフをプロットし、このプロットの傾きを使用して、ＢＳＡの吸光係数として０．６２５を用いて希釈液の実際のＢＳＡ濃度を計算する。ｐＨ４．７の０．１Ｍ  ＭＥＳ中のそれぞれのビーズ試料の１：１スラリーの５０μＬを２組の別々の１．５ｍｌ微小遠心管にピペットで入れ、それぞれの管にｐＨ４．７の０．１Ｍ  ＭＥＳ中の２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡの１ｍｌを加える。管を２時間回転させ、２分間沈降させる。次いで、試料をそれぞれ１２０μＬずつ９６個のウエル板にピペットで投入し、ＵＶ吸収度を２８０ｎｍで読み取る。
【０１８５】
[0183]それぞれの基材に対する静的結合能及び配位子密度を表１３に示す。基材は、低い配位子密度でも高い静的結合能を示す。
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実施例６２
【０１８６】
[0184]本実施例は、本発明の実施形態による基材を使用することによって、ｐＨ及び導電率値が１０％漏出における純ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の動的結合に及ぼす影響を実際に示す。
【０１８７】
[0185]実施例２０に従って固体基材を調製する。それぞれの固体基材試料を別々のカラム内に装入し、それを使用して以下の手順に従って、ＢＳＡの動的結合能（ＤＢＣ）を決定する：さまざまなｐＨ（３．４〜８．５）及びさまざまな導電率（０〜８０ｍＳ／ｃｍ）を有するさまざまな緩衝溶液中のＢＳＡ２ｍｇ／ｍｌを１０％漏出が到達するまでそれぞれのカラムに装入する（図３）。次いで、カラムを装入緩衝液（例えば、ｐＨ４．７及び導電率１５ｍＳ／ｃｍ）で洗浄して基材に吸着したＢＳＡを除去する。次いで、ｐＨ８．０の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液及び２５０ｍＭ  ＮａＣｌを使用してＢＳＡを溶離する。
【０１８８】
[0186]試験されたそれぞれのｐＨ及び導電率の組合せで１０％漏出において結合したＢＳＡ量を図３に示す。６．０以上のｐＨ値では、５ｍＳ／ｃｍ超の導電率でＢＳＡ結合は観察されなかった。ｐＨ３．４では、ＢＳＡ結合能は、導電率の増加とともに増加する。本配位子では、ｐＨ４．７が最適装入ｐＨであり、この場合、導電率は、１５ｍＳ／ｃｍ以下である。
【０１８９】
[0187]刊行物、特許出願、及び特許を含めての本明細書に引用された参考文献は全て、参照により本明細書に組み込まれているが、これは、それぞれの参考文献が、個別に且つ具体的に参照により組み込まれ、且つその全体が本明細書中に記載されていることと同等である。
【０１９０】
[0188]本発明を説明する文脈（特に、以下の特許請求の範囲の文脈）中の「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び「ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ」という用語及び類似の指示語の使用は、本明細書で別段の指示のない限り、又は文脈中明白な矛盾のない限り、単数と複数の双方を包含するものとみなされるべきである。１つ又は複数の事項のリストの前の「少なくとも１つ（１種）の」という用語（例えば、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ（１種）の」）の使用は、本明細書で別段の指示のない限り、又は文脈中明白な矛盾のない限り、列挙された事項から選択される１つ（１種）の事項（Ａ又はＢ）、又は２種以上の列挙された事項の任意の組合せ（Ａ及びＢ）を意味するとみなされるべきである。「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｈａｖｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」及び「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」という用語は、別段の指示のない限り、オープンエンドな用語（つまり、「含むが、それに限定されない」ことを意味する）としてみなされるべきである。本明細書中で数値の範囲を記載は、本明細書で別段の指示のない限り、その範囲内にあるそれぞれの別々の値を個別に指す省略法としての役割を果たすよう意図されるにすぎず、それぞれの別々の値は、あたかもそれらが個別に本明細書に記載されているように、本明細書に組み込まれている。本明細書に記載の方法は全て、本明細書で別段の指示のない限り、又は文脈中明白な矛盾のない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書に示される任意の及び全ての例、又は例示的な言葉（例えば、「など（の）」）の使用は、本発明をよりよく明らかにするよう意図されるにすぎず、別段の指示のない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいかなる言葉も、特許請求されていない要素が本発明の実施に必須であると指示すると解釈すべきではない。
【０１９１】
[0189]本発明を実施するための、発明者らに公知のベストモードを含めての本発明の好ましい実施形態が、本明細書に記載されている。前述の説明を読めば、こうした好ましい実施形態の変形形態は、当業者には明白であろう。本発明者らは、当業者がかかる変形形態を適宜用いることを期待するものであり、本発明者らは、本発明が、本明細書に具体的に記載されたもの以外の方法で実施されることを意図するものである。したがって、本発明は、本明細書に添付された特許請求の範囲に記載された主題事項の適用可能な法律により許可される全ての変更形態及び均等物を含むものである。さらに、全ての可能な変形形態中の上述の要素の任意の組合せが、本明細書で別段の指示のない限り、又は文脈中明白な矛盾のない限り、本発明に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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