(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＧＦＢＩ（ＴＧＦ  ｂｅｔａ  ｉｎｄｕｃｅｄ）遺伝子変異角膜異常症（ｃｏｒｎｅａｌ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）の予防又は治療用薬剤学的組成物であって、
リチウムを含み、
前記ＴＧＦＢＩ遺伝子変異角膜異常症が、変異型ＴＧＦＢＩ蛋白質（ｍｕｔａｎｔ  ＴＧＦＢＩｐ）が角膜に蓄積されて発生し、
オートファジー経路を利用して前記変異型ＴＧＦＢＩ蛋白質を除去することを特徴とする薬剤学的組成物。
【請求項２】
前記リチウムが、リチウムイオン、薬剤学的に許容可能なリチウム塩、又はこれらの溶媒和物若しくは水和物の形態で前記組成物に含まれることを特徴とする請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項３】
前記薬剤学的に許容可能なリチウム塩が、炭酸リチウム（Ｌｉ２ＣＯ３）、クエン酸リチウム（ｌｉｔｈｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）、硫酸リチウム（Ｌｉ２ＳＯ４）、アスパラギン酸リチウム（ｌｉｔｈｉｕｍ  ａｓｐａｒｔａｔｅ）、オロチン酸リチウム（ｌｉｔｈｉｕｍ  ｏｒｏｔａｔｅ）、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、及び酢酸リチウム（ｌｉｔｈｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）からなる群から一つ以上選択されることを特徴とする請求項２に記載の薬剤学的組成物。
【請求項４】
前記ＴＧＦＢＩ遺伝子変異角膜異常症が、アベリノ（Ａｖｅｌｌｉｎｏ  ｔｙｐｅ）角膜異常症、Ｒｅｉｓ−Ｂｕｃｋｌｅｒｓ  ｔｙｐｅ角膜異常症、格子状（ｌａｔｔｉｃｅ  ｔｙｐｅ）角膜異常症、顆粒状（ｇｒａｎｕｌａｒ  ｔｙｐｅ）角膜異常症、Ｔｈｉｅｌ−Ｂｅｈｎｋｅ  ｔｙｐｅ角膜異常症、上皮基底膜（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）角膜異常症、及びグレノー型（Ｇｒｏｅｎｏｕｗ  ｔｙｐｅ）角膜異常症からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項５】
前記変異型ＴＧＦＢＩ蛋白質が、正常ＴＧＦＢＩ蛋白質と比較し、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ５５５Ｗ、Ｒ５５５Ｑ、Ｉ５２２Ｎ、Ｎ５４４Ｓ、Ｍ６１９Ｋ、Ｆ５４７Ｓ、Ａ５４６Ｄ、Ｖ６２５Ｄ、Ｇ６２３Ｄ、Ｖ５０５Ｄ、Ｐ５５１Ｑ、Ｌ５５８Ｐ、Ｖ６２４Ｍ、Ｈ６２６Ｐ、Ｌ１７３Ｐ、Ｈ５７２Ｒ、Ｔ５３８Ｐ、Ｈ５７２ｄｅｌ、Ｌ５２７Ｒ、Ｌ５６９Ｒ、Ｈ６２６Ｒ、Ｒ１２４Ｌ、Ｔ１２５ｄｅｌ、Ｅ１２６ｄｅｌ及びＲ１２４Ｓからなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸変異が生じたことを特徴とする請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項６】
角膜細胞の酸化的ストレスに対する抵抗性を増加させることを特徴とする請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＧＦＢＩ遺伝子変異角膜異常症の予防又は治療用薬剤学的組成物及びそのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
βｉｇ−ｈ３として知られた形質転換成長因子−β−誘導性遺伝子蛋白質（ＴＧＦＢＩｐ）は、ＴＧＦ−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β）に反応し、ヒト腺癌腫細胞及びその他の細胞種から分泌される蛋白質であって（非特許文献１参照）、腫瘍抑制活性を有することが知られている（非特許文献２及び３参照）。最近の報告によると、マウス内ＴＧＦＢＩｐ欠乏は、細胞増殖及び自然的腫瘍成長を誘導するという（非特許文献４参照）。ＴＧＦＢＩ遺伝子は、よく保存された６８３個のアミノ酸（ａａ）からなる蛋白質をコーディングしており、これは、インテグリンのリガンド認識部位として作用するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフ及び分泌信号配列を含む（非特許文献１参照）。ＴＧＦＢＩｐは、細胞外基質（ＥＣＭ）の一構成要素であって、インテグリンとの相互作用によって細胞付着及び移動を媒介する（非特許文献５〜７参照）。
【０００３】
第２型顆粒状角膜異常症（Ｇｒａｎｕｌａｒ  Ｃｏｒｎｅａｌ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  Ｔｙｐｅ  ２；ＧＣＤ２、又はアベリノ角膜異常症）は、染色体５ｑ３１上のＴＧＦＢＩ遺伝子内点変異（Ｒ１２４Ｈ）により発生する常染色体優性疾患である（非特許文献１参照）。年齢依存的に進行される角膜基質内ヒアリン及びアミロイド蓄積は、第２型顆粒状角膜異常症の代表的症状であって、第２型顆粒状角膜異常症は、角膜上皮細胞及び基質内ＴＧＦＢＩｐ生産及びこれによる角膜透明度の低下をその特徴とする（非特許文献１、８及び９参照）。これまでに角膜異常症と関連し、３８個の異なるＴＧＦＢＩ遺伝子変異が報告された。面白いことに、それぞれの異なる変異は、独特の角膜異常症表現型を示すが、例えば、Ｒ１２４Ｈ変異は、第２型顆粒状角膜異常症を、Ｒ１２４Ｃ変異は、格子状角膜異常症第１型を、Ｒ５５５Ｗ変異は、顆粒状角膜異常症第１型を、そしてＲ５５５Ｑ変異は、Ｔｈｉｅｌ−Ｂｅｈｎｋｅ角膜異常症を示す（非特許文献１０参照）。
【０００４】
グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）は、細胞内の様々な作用に関与する細胞内酵素である（非特許文献１１参照）。特に、ＧＳＫ−３は、Ｗｎｔ信号経路の構成要素としてよく知られている。Ｗｎｔは、その受容体に結合してＧＳＫ−３を抑制し、それによるβ−カテニンレベルの上昇をもたらす（非特許文献１２及び１３参照）。また、ＧＳＫ−３は、ＡＫＴと関係のあるものを含む他の信号経路により調節されて、他の転写因子及び細胞蛋白質のアップストリーム調節子としても作用する（非特許文献１１、１４及び１５参照）。
【０００５】
ＧＳＫ−３の不活性化は、一般に抗−アポトーシスを誘発する。リチウムがＧＳＫ−３を抑制するということは、たくさんの研究結果により報告されており（非特許文献１６〜２１参照）、リチウムが直接的にＧＳＫ−３活性を抑制するという事実が証明された（非特許文献１８及び１９参照）。ＧＳＫ−３は、一般に好−アポトーシス的役割をすると考えられ、これを抑制する場合、細胞保護効果がある（非特許文献２２参照）。また、リチウムは、ＧＳＫ−３のＳｅｒ２１／Ｓｅｒ９部位リン酸化を誘導することにより、間接的にもＧＳＫ−３を抑制する（非特許文献２３〜２５参照）。リチウムは、主にＧＳＫ−３を抑制し、神経保護効果を有するとの事実を立証する証拠が提示されている（非特許文献２６及び２７参照）。このような直接的な抑制だけではなく、ＰＫＡ（非特許文献２８参照）、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）−依存性ＡＫＴ（非特許文献２３参照）、蛋白質キナーゼＣ（ＰＫＣ）（非特許文献２９参照）、及びＧＳＫ−３自動調節（非特許文献２５及び３０参照）の活性化を含む数段階のメカニズムによるＧＳＫ−３αのＳｅｒ２１部位リン酸化及びＧＳＫ−３βのＳｅｒ９部位リン酸化を通じて、リチウムは間接的にＧＳＫ−３を抑制することもできる（非特許文献２８参照）。
【０００６】
最近の報告では、転写因子Ｓｍａｄ３／４が、神経細胞におけるＧＳＫ−３の新規なターゲットとして記述されている（非特許文献３１参照）。
【０００７】
Ｓｍａｄ３／４は、ＴＧＦ−β−媒介信号経路のダウンストリーム媒介子である（非特許文献３２参照）。セリン／トレオニンキナーゼ受容体に対するＴＧＦ−βの結合は、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３のリン酸化を生じる。リン酸化されたＳｍａｄ（ｐ−Ｓｍａｄ）蛋白質は、Ｓｍａｄ４と複合体を形成して、核に移動し、他の遺伝子−特異的転写因子と結合して、遺伝子発現を調節する（非特許文献３２及び３３参照）。
Ｓｍａｄ３／４は、神経細胞の生存／死滅、分化及び柔軟性に係わる蛋白質発現の調節において、著しい役割を果たす（非特許文献３４及び３５参照）。
【０００８】
研究結果によると、ＴＧＦ−βは、Ｓｍａｄ３のＴｈｒ−１７９、Ｓｅｒ−２０４及びＳｅｒ−２０８にリン酸化を誘導することができるという。また、ＧＳＫ−３は、直接的にＳｍａｄ３のＳｅｒ−２０４にリン酸化を生じさせる。
【０００９】
本明細書全体にかけて多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｓｋｏｎｉｅｒ  Ｊ，  Ｎｅｕｂａｕｅｒ  Ｍ，  Ｍａｄｉｓｅｎ  Ｌ，  Ｂｅｎｎｅｔｔ  Ｋ，  Ｐｌｏｗｍａｎ  ＧＤ，  Ｐｕｒｃｈｉｏ  ＡＦ．  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｂｅｔａ  ｉｇ−ｈ３，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｇｅｎｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ａ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ａｆｔｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ．  ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９９２；１１：５１１−５２２．
【非特許文献２】Ｚｈａｏ  Ｙ，  Ｓｈａｏ  Ｇ，  Ｐｉａｏ  ＣＱ，  Ｂｅｒｅｎｇｕｅｒ  Ｊ，  Ｈｅｉ  ＴＫ．  Ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｅｔａｉｇ−ｈ３  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｈｅａｖｙ−ｉｏｎ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ．  Ｒａｄｉａｔ  Ｒｅｓ  ２００４；１６２：６５５−６５９．
【非特許文献３】Ｚｈａｏ  ＹＬ，  Ｐｉａｏ  ＣＱ，  Ｈｅｉ  ＴＫ．  Ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｅｔａｉｇ−ｈ３  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ｃａｕｓａｌｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  ａｓｂｅｓｔｏｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００２；２１：７４７１−７４７７．
【非特許文献４】Ｚｈａｎｇ  Ｙ，  Ｗｅｎ  Ｇ，  Ｓｈａｏ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．  ＴＧＦＢＩ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｅｓ  ｍｉｃｅ  ｔｏ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｔｕｍｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００９；６９：３７−４４．
【非特許文献５】ＬｅＢａｒｏｎ  ＲＧ，  Ｂｅｚｖｅｒｋｏｖ  ＫＩ，  Ｚｉｍｂｅｒ  ＭＰ，  Ｐａｖｅｌｅｃ  Ｒ，  Ｓｋｏｎｉｅｒ  Ｊ，  Ｐｕｒｃｈｉｏ  ＡＦ．  Ｂｅｔａ  ＩＧ−Ｈ３，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ，  ｉｓ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｓｋｉｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｈｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｒｅａｄｉｎｇ  ｏｆ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １９９５；１０４：８４４−８４９．
【非特許文献６】Ｂｉｌｌｉｎｇｓ  ＰＣ，  Ｈｅｒｒｉｃｋ  ＤＪ，  Ｋｕｃｉｃｈ  Ｕ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ  ｉｇ−ｈ３  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｎｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０００；７９：２６１−２７３．
【非特許文献７】Ｋｉｍ  ＪＥ，  Ｊｅｏｎｇ  ＨＷ，  Ｎａｍ  ＪＯ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆａｓｃｉｃｌｉｎ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｅｔａｉｇ−ｈ３  ｔｈａｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａｖｂｅｔａ５  ｉｎｔｅｇｒｉｎ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００２；２７７：４６１５９−４６１６５．
【非特許文献８】Ｋｌｉｎｔｗｏｒｔｈ  ＧＫ．  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｅｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  １９９９；１２８：７４７−７５４．
【非特許文献９】Ｋｏｒｖａｔｓｋａ  Ｅ，  Ｈｅｎｒｙ  Ｈ，  Ｍａｓｈｉｍａ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍｙｌｏｉｄ  ａｎｄ  ｎｏｎａｍｙｌｏｉｄ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ５ｑ３１−ｌｉｎｋｅｄ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｋｅｒａｔｏｅｐｉｔｈｅｌｉｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  Ａｒｇ−１２４  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｂｎｏｒｍａｌ  ｔｕｒｎｏｖｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２０００；２７５：１１４６５−１１４６９．
【非特許文献１０】Ｍｏｏｎ  ＪＷ，  Ｋｉｍ  ＳＷ，  Ｋｉｍ  ＴＩ，  Ｃｒｉｓｔｏｌ  ＳＭ，  Ｃｈｕｎｇ  ＥＳ，  Ｋｉｍ  ＥＫ．  Ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ  ｇｒａｎｕｌａｒ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  （Ａｖｅｌｌｉｎｏ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）：  ｎａｔｕｒａｌ  ｈｉｓｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．  Ｃｏｒｎｅａ  ２００７；２６：１０９５−１１００．
【非特許文献１１】Ｗｏｏｄｇｅｔｔ  ＪＲ．  Ｊｕｄｇｉｎｇ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｉｔｓ  ｎａｍｅ：  ＧＳＫ−３．  Ｓｃｉ  ＳＴＫＥ  ２００１；２００１：ｒｅ１２．
【非特許文献１２】Ｃａｄｉｇａｎ  ＫＭ，  Ｎｕｓｓｅ  Ｒ．  Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｔｈｅｍｅ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １９９７；１１：３２８６−３３０５．
【非特許文献１３】Ｗｏｄａｒｚ  Ａ，  Ｎｕｓｓｅ  Ｒ．  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １９９８；１４：５９−８８．
【非特許文献１４】Ｆｒａｍｅ  Ｓ，  Ｃｏｈｅｎ  Ｐ．  ＧＳＫ３  ｔａｋｅｓ  ｃｅｎｔｒｅ  ｓｔａｇｅ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ２０  ｙｅａｒｓ  ａｆｔｅｒ  ｉｔｓ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２００１；３５９：１−１６．
【非特許文献１５】Ｇｒｉｍｅｓ  ＣＡ，  Ｊｏｐｅ  ＲＳ．  Ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｆａｃｅｔｅｄ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３ｂｅｔａ  ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｐｒｏｇ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  ２００１；６５：３９１−４２６．
【非特許文献１６】Ｈｅｄｇｅｐｅｔｈ  ＣＭ，  Ｃｏｎｒａｄ  ＬＪ，  Ｚｈａｎｇ  Ｊ，  Ｈｕａｎｇ  ＨＣ，  Ｌｅｅ  ＶＭ，  Ｋｌｅｉｎ  ＰＳ．  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ：  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｌｉｔｈｉｕｍ  ａｃｔｉｏｎ．  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １９９７；１８５：８２−９１．
【非特許文献１７】Ｐｈｉｅｌ  ＣＪ，  Ｋｌｅｉｎ  ＰＳ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｏｆ  ｌｉｔｈｉｕｍ  ａｃｔｉｏｎ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ２００１；４１：７８９−８１３．
【非特許文献１８】Ｓｔａｍｂｏｌｉｃ  Ｖ，  Ｒｕｅｌ  Ｌ，  Ｗｏｏｄｇｅｔｔ  ＪＲ．  Ｌｉｔｈｉｕｍ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｉｍｉｃｓ  ｗｉｎｇｌｅｓｓ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｉｎ  ｉｎｔａｃｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １９９６；６：１６６４−１６６８．
【非特許文献１９】Ｋｌｅｉｎ  ＰＳ，  Ｍｅｌｔｏｎ  ＤＡ．  Ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｌｉｔｈｉｕｍ  ｏｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １９９６；９３：８４５５−８４５９．
【非特許文献２０】Ｆｕｋｕｍｏｔｏ  Ｔ，  Ｍｏｒｉｎｏｂｕ  Ｓ，  Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｙ，  Ｋａｇａｙａ  Ａ，  Ｙａｍａｗａｋｉ  Ｓ．  Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｉｔｈｉｕｍ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｂｒａｉｎ．  Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  （Ｂｅｒｌ）  ２００１；１５８：１００−１０６．
【非特許文献２１】Ｇｏｕｌｄ  ＴＤ，  Ｍａｎｊｉ  ＨＫ．  Ｔｈｅ  Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｂｉｐｏｌａｒ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  ２００２；８：４９７−５１１．
【非特許文献２２】Ｄｏｂｌｅ  ＢＷ，  Ｗｏｏｄｇｅｔｔ  ＪＲ．  ＧＳＫ−３：  ｔｒｉｃｋｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｄｅ  ｆｏｒ  ａ  ｍｕｌｔｉ−ｔａｓｋｉｎｇ  ｋｉｎａｓｅ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  ２００３；１１６：１１７５−１１８６．
【非特許文献２３】Ｃｈａｌｅｃｋａ−Ｆｒａｎａｓｚｅｋ  Ｅ，  Ｃｈｕａｎｇ  ＤＭ．  Ｌｉｔｈｉｕｍ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  Ａｋｔ−１  ａｎｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｋｔ−１  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｎｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９９；９６：８７４５−８７５０．
【非特許文献２４】Ｄｅ  Ｓａｒｎｏ  Ｐ，  Ｌｉ  Ｘ，  Ｊｏｐｅ  ＲＳ．  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｋｔ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３  ｂｅｔａ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｏｄｉｕｍ  ｖａｌｐｒｏａｔｅ  ａｎｄ  ｌｉｔｈｉｕｍ．  Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２００２；４３：１１５８−１１６４．
【非特許文献２５】Ｚｈａｎｇ  Ｆ，  Ｐｈｉｅｌ  ＣＪ，  Ｓｐｅｃｅ  Ｌ，  Ｇｕｒｖｉｃｈ  Ｎ，  Ｋｌｅｉｎ  ＰＳ．  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３  （ＧＳＫ−３）  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｌｉｔｈｉｕｍ．  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＧＳＫ−３．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００３；２７８：３３０６７−３３０７７．
【非特許文献２６】Ｒｏｗｅ  ＭＫ，  Ｗｉｅｓｔ  Ｃ，  Ｃｈｕａｎｇ  ＤＭ．  ＧＳＫ−３  ｉｓ  ａ  ｖｉａｂｌｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｉｐｏｌａｒ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｂｉｏｂｅｈａｖ  Ｒｅｖ  ２００７；３１：９２０−９３１．
【非特許文献２７】Ｇｏｕｌｄ  ＴＤ，  Ｑｕｉｒｏｚ  ＪＡ，  Ｓｉｎｇｈ  Ｊ，  Ｚａｒａｔｅ  ＣＡ，  Ｍａｎｊｉ  ＨＫ．  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｆｏｒ  ｂｉｐｏｌａｒ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ：  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｍｏｏｄ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ．  Ｍｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ２００４；９：７３４−７５５．
【非特許文献２８】Ｊｏｐｅ  ＲＳ．  Ａｎｔｉ−ｂｉｐｏｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｔｈｉｕｍ．  Ｍｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １９９９；４：１１７−１２８．
【非特許文献２９】Ｋｉｒｓｈｅｎｂｏｉｍ  Ｎ，  Ｐｌｏｔｋｉｎ  Ｂ，  Ｓｈｌｏｍｏ  ＳＢ，  Ｋａｉｄａｎｏｖｉｃｈ−Ｂｅｉｌｉｎ  Ｏ，  Ｅｌｄａｒ−Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ  Ｈ．  Ｌｉｔｈｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３ｂｅｔａ  ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ＰＩ３  ｋｉｎａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃａｌｐｈａ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２００４；２４：２３７−２４５．
【非特許文献３０】Ｌｉａｎｇ  ＭＨ，  Ｃｈｕａｎｇ  ＤＭ．  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３  ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００７；２８２：３９０４−３９１７．
【非特許文献３１】Ｌｉａｎｇ  ＭＨ，  Ｃｈｕａｎｇ  ＤＭ．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３  ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００６；２８１：３０４７９−３０４８４．
【非特許文献３２】Ｄｅｒｙｎｃｋ  Ｒ，  Ｚｈａｎｇ  ＹＥ．  Ｓｍａｄ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  Ｓｍａｄ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｆａｍｉｌｙ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２００３；４２５：５７７−５８４．
【非特許文献３３】Ｓｈｉ  Ｙ，  Ｍａｓｓａｇｕｅ  Ｊ．  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｕｓ．  Ｃｅｌｌ  ２００３；１１３：６８５−７００．
【非特許文献３４】Ｓａｎｙａｌ  Ｓ，  Ｋｉｍ  ＳＭ，  Ｒａｍａｓｗａｍｉ  Ｍ．  Ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＣＮＳ；  ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｎｅｕｒｏｎ  ２００４；４１：８４５−８４８．
【非特許文献３５】Ｇｏｍｅｓ  ＦＣ，  Ｓｏｕｓａ  Ｖｄｅ  Ｏ，  Ｒｏｍａｏ  Ｌ．  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ＴＧＦｂｅｔａ１  ｉｎ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｄｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２００５；２３：４１３−４２４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、眼科的難治性疾患であるＴＧＦＢＩ遺伝子変異角膜異常症の予防又は治療用薬剤学的組成物の開発のために鋭意研究した。その結果、リチウムが変異型ＴＧＦＢＩ蛋白質の発現をより効果的に抑制するだけではなく、オートファジー経路を活性化して変異型ＴＧＦＢＩ蛋白質を選別的に分解除去して、角膜細胞の酸化的ストレスを調節することを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、ＴＧＦＢＩ遺伝子変異角膜異常症の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供することにある。
【００１３】
また、本発明の他の目的は、ＴＧＦＢＩ遺伝子変異角膜異常症の予防又は治療剤のスクリーニング方法を提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の一様態によると、本発明は、リチウムを含むＴＧＦＢＩ（ＴＧＦ  ｂｅｔａ  ｉｎｄｕｃｅｄ）遺伝子変異角膜異常症（ｃｏｒｎｅａｌ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供する。
【００１６】
本発明者らは、眼科的難治性疾患であるＴＧＦＢＩ遺伝子変異角膜異常症の予防又は治療用薬剤学的組成物の開発のために鋭意研究した。その結果、リチウムが変異型ＴＧＦＢＩ蛋白質の発現をより効果的に抑制するだけではなく、オートファジー経路を活性化して変異型ＴＧＦＢＩ蛋白質を選別的に分解除去して、角膜細胞の酸化的ストレスを調節することを見出し、本発明を完成させた。
【００１７】
ＴＧＦＢＩ遺伝子は、分泌信号及びインテグリンのリガンド認識部位として作用するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）モチーフを含む６８３個のアミノ酸からなる蛋白質をコーディングする遺伝子であって、この遺伝子に変異が生じて変異ＴＧＦＢＩ蛋白質が生成される場合、多様なタイプの角膜異常症を発病するようになる。ＴＧＦＢＩ蛋白質は、インテグリンと相互作用して細胞付着及び移動を媒介する細胞外基質（ＥＣＭ）要素であって、正常ＴＧＦＢＩ蛋白質は、配列番号１に当たるアミノ酸シーケンスを有する。
【００１８】
本発明におけるＴＧＦＢＩ遺伝子変異角膜異常症は、変異ＴＧＦＢＩ蛋白質が角膜に蓄積されて発生することを特徴とする。
【００１９】
本発明の好ましい具現例において、前記ＴＧＦＢＩ遺伝子変異による角膜異常症は、遺伝子変異の種類によって、アベリノ（Ａｖｅｌｌｉｎｏ  ｔｙｐｅ）角膜異常症、Ｒｅｉｓ−Ｂｕｃｋｌｅｒｓ  ｔｙｐｅ角膜異常症、格子状（ｌａｔｔｉｃｅ  ｔｙｐｅ）角膜異常症、顆粒状（ｇｒａｎｕｌａｒ  ｔｙｐｅ）角膜異常症、Ｔｈｉｅｌ−Ｂｅｈｎｋｅ  ｔｙｐｅ角膜異常症、上皮基底膜（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）角膜異常症、及びグレノー型（Ｇｒｏｅｎｏｕｗ  ｔｙｐｅ）角膜異常症からなる群から選択される。これらの角膜異常症は、ＴＧＦＢＩ蛋白質のアミノ酸配列の変異が生じた位置によって多様な表現形を示すことから上記のように分類されたが、蛋白質のコンフォメーション変化により変異ＴＧＦＢＩ蛋白質が正常に分泌又は分解されないため角膜に蓄積されて発生する疾病であるという点で、その発病原因は同一である。
【００２０】
本発明の好ましい具現例において、ＴＧＦＢＩ遺伝子変異角膜異常症を起こす前記変異ＴＧＦＢＩ蛋白質は、正常ＴＧＦＢＩ蛋白質と比較し、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ５５５Ｗ、Ｒ５５５Ｑ、Ｉ５２２Ｎ、Ｎ５４４Ｓ、Ｍ６１９Ｋ、Ｆ５４７Ｓ、Ａ５４６Ｄ、Ｖ６２５Ｄ、Ｇ６２３Ｄ、Ｖ５０５Ｄ、Ｐ５５１Ｑ、Ｌ５５８Ｐ、Ｖ６２４Ｍ、Ｈ６２６Ｐ、Ｌ１７３Ｐ、Ｈ５７２Ｒ、Ｔ５３８Ｐ、Ｈ５７２ｄｅｌ、Ｌ５２７Ｒ、Ｌ５６９Ｒ、Ｈ６２６Ｒ、Ｒ１２４Ｌ、Ｔ１２５ｄｅｌ、Ｅ１２６ｄｅｌ、及びＲ１２４Ｓからなる群から選択される一つ以上のアミノ酸変異を含むが、必ずしもこれらに制限されるものではない。上記において、Ｒ１２４Ｈは、正常ＴＧＦＢＩ蛋白質を構成するアミノ酸の１２４番目アルギニンがヒスチジンに変異されたものを意味し、Ｒ１２４Ｃは、１２４番目アルギニンがシステインに変異されたものを意味し、Ｒ５５５Ｗは、５５５番目アルギニンがトリプトファンに変異されたものを意味する。その他のものも前記説明と同一な規則で各アミノ酸の変異を示す。また、上記において、Ｈ５７２ｄｅｌは、５７２番目ヒスチジンを欠如したものを、Ｔ１２５ｄｅｌは、１２５番目トレオニンを欠如したものを意味する。前記述べたアミノ酸の変異の他にも、今まで総計３８個のＴＧＦＢＩ遺伝子変異が報告されており、これらは全て、変異ＴＧＦＢＩ蛋白質が角膜に蓄積される遺伝的素因の眼科的難治性疾患であるという点で発病原因が共通する。
【００２１】
本発明のＴＧＦＢＩ遺伝子変異角膜異常症の予防又は治療用薬剤学的組成物は、変異型ＴＧＦＢＩ蛋白質の発現を転写レベルで効果的に抑制して、オートファジー活性化を通じて変異型ＴＧＦＢＩ蛋白質のみを効果的に除去し、ＴＧＦＢＩ遺伝子変異角膜異常症を予防又は治療するという点にその特徴がある。したがって、本発明の薬剤学的組成物は、ＴＧＦＢＩ遺伝子変異角膜異常症の表現型又は遺伝子内変異が発生した位置に係わらず、変異型ＴＧＦＢＩ蛋白質が発現され、角膜に蓄積されて発病するものであれば、制限なく、その予防又は治療のために使用できる。同様に、今まで報告された総計３８個のＴＧＦＢＩ遺伝子変異の他に、将来に報告される新しいＴＧＦＢＩ遺伝子変異による角膜異常症でも、それが変異ＴＧＦＢＩ蛋白質が発現され角膜に蓄積されて発病するものである限り、本発明の対象疾病の範囲に属する。
【００２２】
本発明の薬剤学的組成物で使用されるリチウムは、転写レベルにおける調節を通じてＴＧＦＢＩｐ発現を抑制する役割をする。本発明者らは、リチウムが正常ＴＧＦＢＩｐの発現も抑制するが、変異型ＴＧＦＢＩｐの発現をさらに大きく抑制する長所があることを見出した。多様な生理学的条件下で、受容体の上方制御によるＴＧＦＢＩｐの発現は、正常角膜細胞内より遺伝子変異角膜異常症患者の角膜細胞内でさらに大きく現れる。その反面、リチウムは、正常ＴＧＦＢＩｐより変異型ＴＧＦＢＩｐの発現をさらに大きく抑制するため、ＴＧＦＢＩ遺伝子変異角膜異常症治療用薬物として好ましく利用できる。また、本発明者らは、リチウムがオートファジー経路を活性化させて変異ＴＧＦＢＩ蛋白質を除去し、角膜細胞の酸化的ストレスに対する抵抗性を増加させるという事実も見出した。
【００２３】
本発明の薬剤学的組成物に使用されるリチウムは、リチウムイオン、薬剤学的に許容可能なリチウム塩、又はこれらの溶媒和物又は水和物の形態で前記組成物に含まれる。
【００２４】
用語‘薬剤学的に許容可能なリチウム塩’は、投与対象有機体に深刻な刺激を誘発することがなく、化合物の生物学的活性と物性を損傷しない剤形を意味し、例えば、炭酸リチウム（Ｌｉ２ＣＯ３）、クエン酸リチウム（ｌｉｔｈｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）、硫酸リチウム（Ｌｉ２ＳＯ４）、アスパラギン酸リチウム（ｌｉｔｈｉｕｍ  ａｓｐａｒｔａｔｅ）、オロチン酸リチウム（ｌｉｔｈｉｕｍ  ｏｒｏｔａｔｅ）、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、及び酢酸リチウム（ｌｉｔｈｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
用語‘水和物（ｈｙｄｒａｔｅ）’は、非共有的分子間力（ｎｏｎ−ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｏｒｃｅ）により結合された化学量論的（ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ）又は非化学量論的（ｎｏｎ−ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ）量の水を含んでいる形態を意味する。
【００２６】
用語‘溶媒和物（ｓｏｌｖａｔｅ）’は、非共有的分子間力により結合された化学量論的又は非化学量論的量の溶媒を含んでいる形態を意味する。それに関する好ましい溶媒としては、揮発性、非毒性、及び／又は人間に投与可能な溶媒である。
【００２７】
本発明の薬剤学的組成物は、上記詳細に説明した有効成分として含まれるリチウムの他にも、薬剤学的に許容される担体を含むことができる。本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを更に含むことができる。薬剤学的に許容される好適な担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，  １９９５）に詳細に記載されている。
【００２８】
本発明の薬剤学的組成物は、経口又は非経口のいずれも可能であって、非経口投与は、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などを含む。好ましくは、直接眼球に本発明の薬剤学的組成物を投与することができる。
【００２９】
前記組成物の剤形は、使用方法によって異なるが、硬膏剤（Ｐｌａｓｔｅｒｓ）、顆粒剤（Ｇｒａｎｕｌｅ）、散剤（Ｐｏｗｄｅｒｓ）、シロップ剤（Ｓｙｒｕｐｓ）、液剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、流動エキス剤（ＦｌｕｉｄｅｘｔｒａｃｔｓＩ）、乳剤（Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ）、懸濁剤（Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ）、浸剤（Ｉｎｆｕｓｉｏｎｓ）、錠剤（Ｔａｂｌｅｔｓ）、注射剤（Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ）、カプセル剤（Ｃａｐｓｕｌｅｓ）、及び丸剤（Ｐｉｌｌｓ）などに製造することができる。好適な剤形は、選択された投与経路によって左右され、眼球に直接投与する場合、液剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、流動エキス剤（ＦｌｕｉｄｅｘｔｒａｃｔｓＩ）、乳剤（Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ）、懸濁剤（Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ）などに製造することが好ましい。公知技術、担体及び賦形剤のいずれにも、適合でき、そして当該分野、例えば前述したＲｅｍｉｎｇｓｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓで理解されるように使用できる。
【００３０】
更に、本発明の薬剤学的組成物の投与量は、患者の年齢、性別、状態、体内における活性成分の吸収度、不活性率、及び併用される薬物を考慮して決定することが好ましく、前記リチウムを基準に、０．０００１ｎｇ／ｋｇ（体重）〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）で投与することができる。
【００３１】
本発明の他の様態によると、本発明は、（ａ）角膜細胞に試験物質を処理する工程と、（ｂ）細胞内ＧＳＫ−３α（ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３  ａｌｐｈａ）及びＧＳＫ−３β（ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３  ｂｅｔａ）の活性を分析する工程とを含むＴＧＦＢＩ遺伝子変異角膜異常症の予防又は治療剤のスクリーニング方法を提供し、前記試験物質がＧＳＫ−３α及びＧＳＫ−３βの活性を抑制したら、ＴＧＦＢＩ遺伝子変異角膜異常症の予防又は治療剤と判断する。
【００３２】
本発明のＴＧＦＢＩ遺伝子変異角膜異常症の予防又は治療剤のスクリーニング方法は、上述の薬剤学的組成物と対象疾病が共通するため、前記薬剤学的組成物との関係において共通する内容は、本明細書が過度に複雑となることを避けるために、その記載を省略する。
【００３３】
本発明者らは、ＴＧＦＢＩｐの発現を抑制する経路の一つとして、リチウムがＧＳＫ−３α／βの活性を陰性的に調節するということを見出した。角膜細胞にリチウムを処理した場合、ＧＳＫ−３α／βのリン酸化が非常に著しく増加した。これは、リチウム以外の他のＧＳＫ−３α／β抑制剤もリチウムと同様にＴＧＦ−β信号経路の抑制を誘導してＴＧＦＢＩｐの発現を減少させる場合、ＴＧＦＢＩ遺伝子変異角膜異常症の予防又は治療剤の候補物質としての可能性があることを提案する。
【００３４】
本発明のスクリーニング方法において、前記細胞内ＧＳＫ−３α（ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３  ａｌｐｈａ）及びＧＳＫ−３β（ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３  ｂｅｔａ）の活性を分析する工程は、当業界に公知された多様な方法により行うことができ、例えば、分光分析法、色度分析法、ＭＴＴ分析法、カップル分析法、蛍光分析法、熱量測定法、化学発光法、ウェスタンブロッティング、光散乱法、放射能分析法、及びクロマトグラフィー分析法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
また、ＧＳＫ−３α（ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３  ａｌｐｈａ）及びＧＳＫ−３β（ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３  ｂｅｔａ）の活性を分析する方法は、公知文献（Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ，  Ｈ．  Ｕ．  “Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ”，  Ｖｏｌ．  ４，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），  ２０６６−２０７２（１９７４）；  Ｐａｓｓｏｎｎｅａｕ，  Ｊ．  Ｖ．，  ａｎｄ  Ｌｏｗｒｙ，  Ｏ．  Ｈ．  “Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．  ＡＰｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ”，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（Ｔｏｔｏｗａ，  ＮＪ），  ８５−１１０（１９９３）；  Ｔｏｄｄ  ＭＪ  ｅｔ  ａｌ，  Ｅｎｚｙｍｅ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｕｓｉｎｇ  ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ：  ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２９６（２）：１７９−８７（２００１）；  Ｃｈｕｒｃｈｗｅｌｌａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ  ８２５（２）  １３４−１４３（２００５）；  Ｄａｎｉｅｌ  ＲＭ，  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ＭＥ，  Ｄａｎｓｏｎ  ＭＪ，  ｅｔ  ａｌ．  “Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ”．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ４２５（２）：  ３５３６０（２０１０）；  Ｃｏｗａｎ  ＤＡ  “Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｏｌｖｅｎｔｓ”．  Ｃｏｍｐ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １１８（３）：  ４２９３８（１９９７）；  Ｍｉｎｔｏｎ  ＡＰ，  “Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｏｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｄｉａ”．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６（１４）：  １０５７７−８０（２００１）参照）に記載の方法により行うことができる。
【発明の効果】
【００３６】
本発明の特徴及び利点を要約すると、以下のようである。
【００３７】
（ｉ）本発明は、リチウムを含むＴＧＦＢＩ遺伝子変異角膜異常症の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供する。
【００３８】
（ｉｉ）本発明の組成物は、変異型ＴＧＦＢＩ蛋白質の発現を抑制し、オートファジー経路を活性化して、変異型ＴＧＦＢＩ蛋白質を選別的に分解除去するだけではなく、角膜細胞の酸化的ストレスを調節するため、ＴＧＦＢＩ遺伝子変異角膜異常症の予防及び治療に非常に効果的である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ＬｉＣｌは、一次培養された角膜線維母細胞内ＴＧＦＢＩｐ発現を減少させる。（Ａ）正常角膜線維母細胞株をＬｉＣｌ又はＫＣｌの指示された量で１２時間処理した。ＫＣｌは、対照群として使用した。ＴＧＦＢＩｐのレベルをウェスタンブロットで測定した。（Ｂ）正常角膜線維母細胞株を１０ｍＭ  ＬｉＣｌで指示された時間処理した。ＴＧＦＢＩｐのレベルをウェスタンブロットで測定した。（Ｃ）ＬｉＣｌを指示された濃度で１２時間処理した正常角膜線維母細胞内ＴＧＦＢＩ  ｍＲＮＡのレベルをＲＴ−ＰＣＲで測定した。（Ｄ）（Ｃ）に示されたデータを定量化したものである。（Ｅ）野生型（ＷＴ）及び同型接合子（ＨＯ）一次角膜線維母細胞を指示された量のＬｉＣｌで１２時間処理した。ＴＧＦＢＩｐのレベルはウェスタンブロットで測定した。β−アクチンをローディング対照群として使用した。（Ｆ）（Ｅ）に示されたデータを定量化したものである。全ての信号は、ＮＩＨイメージＪを使用して定量化した。値は、少なくとも三つの独立的な実験の平均±ＳＤを示す。一元分散分析法を使用して統計的分析を行った後、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較分析を行った。＊＊Ｐ＜０．０１  ＬｉＣｌ処理  ｖｓ  ＬｉＣｌ未処理。
【図２】ＴＧＦ−β１−誘導性ＴＧＦＢＩｐの発現は、ＬｉＣｌ処理により抑制される。（Ａ）正常角膜線維母細胞をＴＧＦ−β１の指示された量で１２時間処理した。細胞溶出液及び培地のＴＧＦＢＩｐをウェスタンブロットで分析した。（Ｂ）正常角膜線維母細胞株を５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−β１で指示された時間処理した。（Ｃ）５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−β１で２時間前処理した正常角膜線維母細胞を１０ｍＭ、３０ｍＭ及び５０ｍＭ  ＬｉＣｌと共に１２時間培養した。ＴＧＦＢＩｐのレベルはウェスタンブロットで測定した。（Ｄ）（Ｃ）に示されたデータを定量化したものである。ＴＧＦＢＩｐのレベルは、ＮＩＨイメージＪソフトウェアを使用して定量化し、β−アクチンに対して標準化した。値は、三つの独立的な実験の平均±ＳＤを示す。一元分散分析法を使用して統計的分析を行った後、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較分析を行った。＊Ｐ＜０．０５；  ＊＊Ｐ＜０．０１  ＬｉＣｌ処理  ｖｓ  ＬｉＣｌ未処理。
【図３】ＬｉＣｌは、Ｓｍａｄ３の脱リン酸化を促進することにより、ＴＧＦ−β信号を抑制する。（Ａ）正常角膜線維母細胞を指示された量のＬｉＣｌで１２時間処理した。ｐ−Ｓｍａｄ３（Ｓ４２３／４２５）、Ｓｍａｄ３、ｐ−ＧＳＫ−３α／β、ｐ−β−カテニン及びβ−カテニンのレベルは、ウェスタンブロットで分析した。（Ｂ）ｐ−Ｓｍａｄ３（Ｓ４２３／４２５）レベルは、ＮＩＨイメージＪソフトウェアを使用して定量化して、総Ｓｍａｄ３に対して標準化した。（Ｃ）正常角膜線維母細胞を指示された量のＬｉＣｌで１２時間処理した。ｐ−ＧＳＫ−３αのレベルは、ウェスタンブロットで分析し、ＮＩＨイメージＪソフトウェアを使用して定量化して、総ＧＳＫ−３αに対して標準化した。（Ｄ）正常角膜線維母細胞を指示された量のＬｉＣｌで１２時間処理した。ｐ−ＧＳＫ−３βのレベルをＮＩＨイメージＪソフトウェアを使用して定量化して、総ＧＳＫ−３α／βに対して標準化した。値は、三つの独立的な実験の平均±ＳＤを示す。一元分散分析法を使用して統計的分析を行った後、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較分析を行った。＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１  ＬｉＣｌ処理  ｖｓ  ＬｉＣｌ未処理。
【図４】リチウムは、角膜線維母細胞内オートファジーを誘導する。（Ａ）正常角膜線維母細胞を指示された量のＬｉＣｌで１２時間処理した。ＬＣ３蛋白質レベルは、ウェスタンブロットで分析した。（Ｂ）ＬＣ３−ＩＩレベルは、ＮＩＨイメージＪソフトウェアを使用して定量化して、ＬＣ３−Ｉに対して標準化した。値は、三つの独立的な実験の平均±ＳＤを示す。一元分散分析法を使用して統計的分析を行った後、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較分析を行った。＊＊Ｐ＜０．０１  ＬｉＣｌ処理  ｖｓ  ＬｉＣｌ未処理。
【図５】リチウムは、角膜線維母細胞に対する毒性がない。野生型（Ａ）及びＨＯ（Ｂ）角膜線維母細胞を異なる濃度（０ｍＭ〜１００ｍＭ）のＬｉＣｌで指示された時間（１２時間〜３６時間）処理した。細胞生存能力は、ＭＴＴ分析法で測定した。細胞生存能力は、次の公式を使用して計算した。サンプルのＭＴＳ光学密度（ＯＤ）値／対照群（ＰＢＳで処理した細胞）のＭＴＳ  ＯＤ値。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
以下、実施例を通じて本発明を更に詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことである。
【実施例】
【００４１】
＜実験材料及び方法＞
ＬｉＣｌ及びＫＣｌは、シグマアルドリッチ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）から、組み換えＴＧＦ−β１は、Ｒ＆Ｄシステム（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＭＩ）から入手した。スーパーシグナルウェストピコ化学発光基質は、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）から購入した。
【００４２】
＜１．一次角膜線維母細胞の分離及び培養＞
一次正常角膜線維母細胞及び一次異型接合子角膜線維母細胞の精製及び培養は、従来文献（Ｃｈｏｉ  ＳＩ，  Ｋｉｍ  ＴＩ，  Ｋｉｍ  ＫＳ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｃａｔａｌａｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｇｒａｎｕｌａｒ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｔｙｐｅ  ＩＩ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００９；１７５：２４８−２６１．参照）に記述の方法によって行った。ヘルシンキ宣言に従って、供与者秘密を保護し、ヨンセ大学セブランス病院ＩＲＢ委員会（ＣＲ０４１２４）の承認を受けた。ＴＧＦＢＩ遺伝子変異のＤＮＡシーケンシング分析法で第２型顆粒状角膜異常症を診断した。全層角膜移植のために、角膜半球皮を除去した後、残っている角膜縁を正常角膜線維母細胞の培養のために取得した。ヨンセ大学セブランス病院アイバンク（ｅｙｅ  ｂａｎｋ）から取得した供与者の医療記録には、いかなる遺伝的又はシステム的障害もなかった。角膜縁断片から育った線維母細胞を正常対照群として、正常一次培養角膜線維母細胞内ＢＩＧＨ３遺伝子をＤＮＡシーケンシング分析法で分析し、正常遺伝子を確認した。正常ヒト角膜線維母細胞株（Ｊｅｓｔｅｒ  ＪＶ，  Ｈｕａｎｇ  Ｊ，  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｋｅｒａｔｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｈＴＥＲＴ，  ｅｘｔｅｎｄｅｄ−ｌｉｆｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２００３；４４：１８５０−１８５８．参照）は、Ｊａｍｅｓ  Ｊｅｓｔｅｒ博士から提供してもらった。前記細胞は、９５％空気及び５％  ＣＯ２を含んだ湿っている培養器内で、１０％牛胎児血清を補充したＤＭＥＭを使用し、３７℃で培養した。
【００４３】
＜２．細胞に対するリチウム処理＞
リチウムは、使用前に常温でリン酸緩衝塩水液（ＰＢＳ；  Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）に溶かして新鮮な状態で用意した。リチウムのＴＧＦＢＩｐ蛋白質発現に対する影響を試験するために、角膜線維母細胞を１０ｍＭ〜１００ｍＭのＬｉＣｌと培養し、イムノブロット分析法を使用して分析した。
【００４４】
＜３．ＲＮＡ精製及び逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）＞
ＴＧＦＢＩ及びβ−アクチンの増幅のために、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を使用した抽出法で、角膜線維母細胞から総ＲＮＡを分離した。ｃＤＮＡ合成及びＤＮＡ増幅は、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭ一段階ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＴＧＦＢＩに特異的なプライマー（正方向プライマー：  ５’ＧＴＧＴＧＴＧＣＴＧＴＧＣＡＧＡＡＧＧＴ−３’及び逆方向プライマー：  ５’ＴＴＧＡＧＡＧＴＧＧＴＡＧＧＧＣＴＧＣＴ−３’）及びβ−アクチンに特異的なプライマー（正方向プライマー：  ５’ＧＧＡＣＴＴＣＧＡＧＣＡＡＧＡＧＡＴＧＧ−３’及び逆方向プライマー：  ５’ＡＧＣＡＣＴＧＴＧＴＴＧＧＣＧＴＡＣＡＧ−３’）を使用して行った。臭化エチジウムを含む１．２％アガロースゲルを使用した電気泳動法で増幅産物を視覚化した。
【００４５】
＜４．細胞溶出液の準備及びイムノブロット分析法＞
角膜線維母細胞の細胞溶出液は、プロテアーゼ抑制剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ｔａｂｌｅｔ、Ｒｏｃｈｅ  ＃１８３６１７０、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）及びホスファターゼ抑制剤（ＰｈｏｓＳＴＯＰ、Ｒｏｃｈｅ  ＃０４９０６８４５００１）を含む放射性−免疫沈降分析緩衝液（ＲＩＰＡ緩衝液；１５０ｍＭ／Ｌ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ−４０、０．５％デオキシコレート、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）内に準備した。クルード細胞溶出液を４℃で１０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、核片及びその残骸を除去した。ＢＣＡ（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  Ａｃｉｄ）キット（Ｐｉｅｒｃｅ）で総蛋白質濃度を測定するために、上澄み液の一部を使用した。総細胞蛋白質を１０％トリス−グリシンＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。蛋白質をポリビニリデンジフルオリド膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）に移転させて、ＴＢＳ−Ｔ（０．０２ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ、０．１５  ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）内５％乾燥乳で常温で一時間ブロックさせて、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、その後、ＴＧＦＢＩｐ（０．２  ／ｍｌ；Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ＡＦ２９３５；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、β−アクチン（１：５，０００希釈；Ｃａｔ．  Ｎｏ．  Ａ−５４４１；Ｓｉｇｍａ）、ＧＳＫ−３α／β、ｐ−ＧＳＫ−３α／β、Ｓｍａｄ３及びｐ−Ｓｍａｄ３（１：１，０００希釈；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）に対する１次抗体と共に４℃で一晩中反応した。
【００４６】
ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、ブロットをＨＲＰ−接合二次抗体［抗−マウスＩｇＧ（１：５，０００希釈；Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ＮＡ９３１Ｖ）又は抗−ラビットＩｇＧ（１：５，０００希釈；Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ＮＡ９３４Ｖ）  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ］と常温で一時間反応した。向上された化学発光システム（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してウェスタンブロットを視覚化した。免疫反応性蛋白質バンドの二種の強度をイメージスキャンして、バンドの視覚的密度をコンピューターソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ  ｓｏｆｔｗａｒｅ，  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．３７，  Ｗａｙｎｅ  Ｒａｓｂａｎｄ，  ＮＩＨ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ）を使用して定量化し、これを背景分離で補正して、β−アクチン蛋白質バンド強度を使用して標準化した。
【００４７】
＜５．細胞生存能力＞
第２型顆粒状角膜異常症の角膜線維母細胞をウェル当たり１０，０００細胞の密度で９６−ウェルプレートに入れて、これを一晩中培養した。テトラゾリウム化合物（３−［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−５−（３−ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−［４−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ］−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ；ｉｎｎｅｒ  ｓａｌｔ  ＭＴＳ；  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  Ｇ３５８０；  Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）及びＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６アクアウォンソリューション試薬細胞増殖分析キットを使用して、細胞増殖を測定した。即ち、培養培地を除去して、２０μlのＭＴＳ溶液を１００μlの培養培地を含むそれぞれのウェルに添加した。前記培養液を３７℃、９５％湿度及び５％  ＣＯ２条件下で２乃至４時間培養した。プレートリーダーを使用して４５０ｎｍで視覚的密度を測定した。
【００４８】
＜６．統計的分析法＞
一元分散分析法を使用して、前記結果の統計学的重要性を評価して（Ｐ＜０．０５）、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較分析を行った。結果を平均±ＳＤで表示した。全てのデータは、グラフパッドプリズムバージョン４．０（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）統計パッケージを使用して処理した。
【００４９】
（実施例１：リチウムにより角膜線維母細胞内ＴＧＦＢＩｐ発現が減少される）
最近の研究では、ＧＳＫ−３抑制剤がＴＧＦ−β信号伝達を遮断することにより、ＴＧＦＢＩｐ発現を下方制御することができることが報告された。前記仮説を検証するために、ＧＳＫ−３抑制剤として知られたリチウムを一次角膜線維母細胞に処理した後、細胞内ＴＧＦＢＩｐを分析した。ウェスタンブロット分析結果は、リチウムが量依存的（図１Ａ）及び時間依存的方式（図１Ｂ）でＴＧＦＢＩｐレベルを減少させることを示した。次に、リチウムのＴＧＦＢＩ  ｍＲＮＡ発現に対する影響を試験した。定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析結果、３０ｍＭ及び５０ｍＭのＬｉＣｌを１２時間処理した場合、ＴＧＦＢＩ  ｍＲＮＡ発現が、対照群として使用したβ−アクチンと比較し、それぞれ略６９．１２±５．８６８％及び３４．８０±６．１３８％に減少することを確認することができた（Ｐ＜０．０１）（図１Ｃ及びＤ）。前記結果は、総合的にＴＧＦＢＩｐの調節が転写レベルで起こることを提示する。
【００５０】
また、本発明者らは、ＧＳＫ−３抑制剤が第２型顆粒状角膜異常症−関連変異型ＴＧＦＢＩｐの発現も遮断できるかどうかを試験するために、第２型顆粒状角膜異常症の同型接合子（ＨＯ）角膜線維母細胞にリチウムを処理した後、細胞内変異型（ｍｕｔ）−ＴＧＦＢＩｐ発現を分析した。野性型角膜線維母細胞にＬｉＣｌ  １０ｍＭ、３０ｍＭ及び５０ｍＭを１２時間処理した結果、未処理角膜線維母細胞と比較し、ＴＧＦＢＩｐレベルがそれぞれ７８．３７±１０．００％、４１．４３±４．２５％及び２４．３３±４．１４％に減少した（Ｐ＜０．０１）（図１Ｅ及びＦ）。また、第２型顆粒状角膜異常症の同型接合子（ＨＯ）角膜線維母細胞に対する同じ濃度のＬｉＣｌ処理は、細胞内ＴＧＦＢＩｐ発現を略６１．９６±３．５１％、３０．２１±３．６３％及び１６．７５±２．７４％に減少させた（Ｐ＜０．０１）（図１Ｅ及びＦ）。しかし、ＴＧＦＢＩｐ発現は、正常線維母細胞及び第２型顆粒状角膜異常症の同型接合子（ＨＯ）角膜線維母細胞間に統計的に有意な差は示さなかった（図１Ｄ及びＥ）。
【００５１】
（実施例２：ＴＧＦ−β１によるＴＧＦＢＩｐ発現誘導は、リチウム処理により抑制される）
ＴＧＦＢＩｐは、ヒト腺癌腫細胞株内で最初に発見されたもので、ＴＧＦ−β処理により上方制御される。したがって、本発明者らは、角膜線維母細胞内でもＴＧＦ−β処理によりＴＧＦＢＩｐ発現が誘導されるかどうかを実験した。実験の結果、ＴＧＦ−β１は、量依存的（図２Ａ）及び時間依存的（図２Ｂ）方式でＴＧＦＢＩｐの発現を誘導した。ＴＧＦＢＩｐ発現誘導に対するリチウムの効能を試験するために、２時間ＴＧＦ−β１で前処理した角膜線維母細胞にＬｉＣｌ  １０ｍＭ、３０ｍＭ及び５０ｍＭを１２時間追加処理した。図２Ｃ及びＤから分かるように、１０ｍＭ、３０ｍＭ及び５０ｍＭのリチウムは、ただＴＧＦ−β１のみを処理したサンプルと比較し、ＴＧＦ−β−誘導ＴＧＦＢＩｐのレベルをそれぞれ４１．８９±９．０６％、６７．５４±５．７９％及び８５．２０±３．９４６％に減少させた。
【００５２】
（実施例３：リチウムは、Ｓｍａｄ３のリン酸化を抑制し、ＴＧＦ−β信号伝達を抑制する）
ＬｉＣｌがＴＧＦＢＩｐ蛋白質レベルを減少させる方法に関して、少なくとも二つのメカニズムが考えられる：（１）ＬｉＣｌがＴＧＦＢＩ分解を促進するか、或いは（２）ＬｉＣｌがＴＧＦＢＩｐ生合成を減少させることができる。Ｇｕｏらは、Ｓｍａｄ３／ＧＳＫ−３複合体を同定した後にＧＳＫ−３がＳｍａｄ３を活性化させることができることを提案した（Ｇｕｏ  Ｘ，  Ｒａｍｉｒｅｚ  Ａ，  Ｗａｄｄｅｌｌ  ＤＳ，  Ｌｉ  Ｚ，  Ｌｉｕ  Ｘ，  Ｗａｎｇ  ＸＦ．  Ａｘｉｎ  ａｎｄ  ＧＳＫ３−  ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｍａｄ３  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ＴＧＦ−  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２００８；２２：１０６−１２０．参照）。また、リチウムは、ＧＳＫ−３抑制剤としてよく知られている。したがって、本発明者らは、ＴＧＦ−β信号経路研究を通じてＬｉＣｌのＴＧＦＢＩｐ発現に対する影響を調べた。角膜線維母細胞にＬｉＣｌ  １０ｍＭ、３０ｍＭ及び５０ｍＭを処理した場合、Ｓｍａｄ３リン酸化がそれぞれ４６．０９±５．５３％、３１．２９±６．７０％及び２０．３７±６．２９％に減少した（図３Ａ及びＢ）。また、ＬｉＣｌは、ＧＳＫ−３α／βと反応し、その活性を陰性的に調節した（図３Ｃ及びＤ）。角膜線維母細胞にＬｉＣｌ  １０ｍＭ、３０ｍＭ及び５０ｍＭを１２時間処理した場合、ＧＳＫ−３αリン酸化がそれぞれ３１７．３±３８．００％、４０１．０±４３．８６％及び５１２．０±２３．９０％に著しく増加し（Ｐ＜０．０１）、ＧＳＫ−３βリン酸化も著しく増加した（図３Ｃ及びＤ）。前記結果は、総合的に、観察されたリチウム−誘導性ＴＧＦＢＩｐレベル減少がＴＧＦ−β信号経路の抑制によるものであることを提示する。
【００５３】
（実施例４：リチウムは、オートファジーを誘導する）
リチウムがＰＩ３Ｋ信号経路を通じてオートファジーを誘導するという事実が報告されている（Ｓａｒｋａｒ  Ｓ，  Ｆｌｏｔｏ  ＲＡ，  Ｂｅｒｇｅｒ  Ｚ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｉｔｈｉｕｍ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｉｎｏｓｉｔｏｌ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００５；１７０：１１０１−１１１１．参照）。本発明者らは、以前の研究で、オートファジーの活性化が、一次培養された第２型顆粒状角膜異常症の角膜線維母細胞サイトゾール内に蓄積された変異型−ＴＧＦＢＩｐの浄化を促進することを提案した（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，現在論文審査中、未公開）。したがって、本発明者らは、リチウムが角膜線維母細胞内オートファジーを活性化させるかどうかを調べた。１０ｍＭ、３０ｍＭ及び５０ｍＭのＬｉＣｌを角膜線維母細胞に処理した場合、対照群と比較し、ＬＣ３−ＩＩ／ＬＣ３−Ｉの比率がそれぞれ１．０９±０．１６％、１．６０±０．１９％及び２．５６±０．２４％に増加した（Ｐ＜０．０１）（図４Ａ及びＢ）。このような結果は、リチウムがＴＧＦＢＩｐ発現を抑制するだけではなく、角膜線維母細胞サイトゾール内に蓄積された変異型−ＴＧＦＢＩｐの浄化を促進することを意味する。
【００５４】
（実施例５：リチウムは、一次培養された角膜線維母細胞に対する毒性がない）
ＬｉＣｌの細胞毒性を試験するために、一次角膜線維母細胞をＬｉＣｌと共に培養して、ＭＴＴ分析法で細胞生存能力を測定した。図５から分かるように、ＬｉＣｌの四つの異なる投与量に対して、細胞生存能力はいずれも９８％を超過し、これは、ＬｉＣｌが試験対象濃度においていかなる深刻な細胞死滅も起こさないことを意味する。即ち、ＬｉＣｌのＴＧＦＢＩｐ発現を減少させる効能は、角膜線維母細胞の死滅によるものではなかった。
【００５５】
現在、ＴＧＦＢＩ−関連角膜異常症に対する予防法又は治療法はなく、そのため、新規な治療療法に対する期待が大きい。本発明は、ＴＧＦＢＩ−関連角膜異常症患者由来の標本に作用するリチウムの効果を最初に記述したものであって、リチウムが細胞毒性なしにＴＧＦＢＩｐ発現を効果的に減少させることを見出した。また、角膜線維母細胞内オートファジーを刺激するリチウムの役割を確認した。このような発見は、リチウムがＴＧＦＢＩ−関連角膜異常症の予防又は治療に使用できることを強く示唆する。
【００５６】
ＴＧＦＢＩは、ＴＧＦ−βに反応し、ヒト線癌腫細胞及び他のヒト細胞型からも分泌される蛋白質であって（非特許文献１参照）、癌抑制機能を示す（非特許文献２及び３参照）。本発明者らは、ＴＧＦ−βにより、ＴＧＦＢＩｐの発現が量依存的方式で誘導され、リチウムは、角膜線維母細胞内のこのような誘導を抑制するという事実を見出した。したがって、このような結果は、リチウムがＴＧＦ−β信号経路を抑制する役割をすることができることを提示する。リチウムは、１９９６年にＫｌｅｉｎとＭｅｌｔｏｎにより、可逆的なＧＳＫ−３抑制剤として明かされた（非特許文献１９参照）。多様な研究結果、リチウムは、ＧＳＫ−３活性を二つの方法で減少させると確立された（Ｒｙｖｅｓ  ＷＪ，  Ｈａｒｗｏｏｄ  ＡＪ．  Ｌｉｔｈｉｕｍ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３  ｂｙ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍａｇｎｅｓｉｕｍ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２００１；２８０：７２０−７２５．参照）。リチウムは、直接的な抑制剤として、ＧＳＫ−３結合に対してマグネシウムと競争する。又は、間接的抑制剤として、ＧＳＫ−３  Ｎ−末端のセリンリン酸化を増加させて酵素機能を不活性化させる。更に最近、Ｍｉｌｌｅｔらは、ＧＳＫ−３活性がＴＧＦ−β信号経路を陰性的に調節することを提案した（Ｍｉｌｌｅｔ  Ｃ，  Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｍ，  Ｈｅｌｌｅｒ  Ｍ，  Ｙｕ  ＬＲ，  Ｖｅｅｎｓｔｒａ  ＴＤ，  Ｚｈａｎｇ  ＹＥ．  Ａ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｆｅｅｄｂａｃｋ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｓｍａｄ３  ｌｉｎｋｅｒ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ａｔ  Ｓｅｒ−２０４．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００９；２８４：１９８０８−１９８１６．参照）。前記結果は、リチウムが、ＴＧＦ−β信号伝達により調節される遺伝子に影響を及ぼすことができることを意味する。前記結果に基づき、本発明者らは、ＧＳＫ−３抑制剤がＴＧＦＢＩ−関連角膜異常症の潜在的な治療剤として使用できるという仮説を立て、正常及び第２型顆粒状角膜異常症の角膜線維母細胞内ＴＧＦＢＩｐ発現に対するリチウムの役割を試験した。本明細書において、リチウムがＴＧＦ−β信号経路を抑制することにより、ＴＧＦＢＩ−関連角膜異常症を予防又は治療できることを示した。
【００５７】
ＴＧＦ−β信号経路は、ＥＣＭ恒常性を含む数多い細胞過程及び生理学的過程の調節子として知られてきた（非特許文献１６参照）。前記経路は、ＴＧＦ−βのタイプＩ（ＴβＲＩ）及びタイプＩＩ  ＴＧＦ−β受容体（ＴβＲＩＩ）への結合により開始されて、二つのタイプともセリン／トレオニンキナーゼである。活性化された受容体複合体は、ダウンストリーム転写因子のＳｍａｄ２及びＳｍａｄ３をリン酸化させて、これらがＳｍａｄ４と結合する。その後、前記Ｓｍａｄ複合体は、核内に密集されて、ターゲット遺伝子の発現を調節する（非特許文献３３参照）。このような過程は、Ｓｍａｄ２／３によりなされる、細胞膜から核への信号伝達を確実にするために、厳しく統制される。したがって、リチウム処理によるＴＧＦＢＩｐ発現の減少は、抑制子の存在下でＳｍａｄ３リン酸化が減少される現象とも一致する（図３Ａ）。
【００５８】
しかし、Ｓｍａｄ活性化の統制が、適切なＴＧＦ−β信号伝達及びそれに係わる要素のために必須的である反面、リチウム−誘導性Ｓｍａｄ３リン酸化の減少に係わる特定メカニズムは知られていない状態である。更に最近、Ｇｕｏらは、活性化されなかったＳｍａｄ３が、骨格蛋白質アキシン（Ａｘｉｎ）及び関連キナーゼＧＳＫ−３βの協力作用によりプロテアソーム−依存的分解を経るようになるが、Ｓｍａｄ２はそうではないことを立証した（Ｇｕｏ  Ｘ，  Ｒａｍｉｒｅｚ  Ａ，  Ｗａｄｄｅｌｌ  ＤＳ，  Ｌｉ  Ｚ，  Ｌｉｕ  Ｘ，  Ｗａｎｇ  ＸＦ．  Ａｘｉｎ  ａｎｄ  ＧＳＫ３−  ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｓｍａｄ３  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ＴＧＦ−  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２００８；２２：１０６−１２０．参照）。Ｓｍａｄ３は、ＴＧＦ−βの不存在下で物理的に専らアキシン及びＧＳＫ−３βと相互作用する。
【００５９】
アキシン／ＧＳＫ−３β活性の減少又は発現の減少は、Ｓｍａｄ３の安定の増加及びＴＧＦ−β受容体又はＳｍａｄ２に影響のない転写活性の増加を誘発する。その反面、前記蛋白質の過発現は、Ｓｍａｄ３基底分解を促進して、細胞がＴＧＦ−βに対して敏感にならないようにする。しかし、リチウムに対する反応においてＴＧＦＢＩｐ減少のメカニズムは、総Ｓｍａｄ３蛋白質の減少なしに減少されたＳｍａｄ３リン酸化を通じてなされるＴＧＦ−β信号伝達の抑制を通じて媒介され得る。また、Ｍｉｌｌｅｔらは、ＴＧＦ−βが、Ｓｍａｄ３のＣ−末端残基の２サイトに加えて、Ｓｍａｄ３リンカー領域内の３サイトにリン酸化を誘導することを示した。ＧＳＫ−３は、これらのサイトの一つのＳｅｒ−２０４にリン酸化を起こす。Ｓｍａｄ３（Ｓｅｒ−２０４）リン酸化を分析してはいないが、本発明の実験結果は、リチウム−処理細胞内Ｓ４２３／４２５へのＳｍａｄ３リン酸化減少を示した。即ち、ＴＧＦ−βに対する細胞反応だけではなく、ＴＧＦＢＩ発現の最終の大きさを調節するＳｍａｄ３信号伝達の新規な局面を示す。
【００６０】
第２型顆粒状角膜異常症の角膜線維母細胞内ＴβＲ発現の増加を起こす特定メカニズムは知られていないが、本発明者らの従前の研究は、正常型と比較し、異型接合子及び同型接合子第２型顆粒状角膜異常症の角膜線維母細胞内ＴβＲＩ、ＴβＲＩＩ、及びＴβＲＩＩＩが上方制御されたことを示した（Ｃｈｏｉ  ＳＩ，  Ｙｏｏ  ＹＭ，  Ｋｉｍ  ＢＹ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＴＧＦ−｛ｂｅｔａ｝  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−  ａｎｄ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｇｒａｎｕｌａｒ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ＩＩ．  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２０１０；５１：１８３２−１８４７．参照）。
【００６１】
このような結果は、ＴＧＦＢＩｐ発現の増加が、多様な生理学的条件下で受容体の上方制御により、正常角膜線維母細胞より第２型顆粒状角膜異常症の角膜線維母細胞内でさらに大きい可能性を提案する。このような増加は、ＴＧＦＢＩｐ蓄積を加速化して、第２型顆粒状角膜異常症疾病を引き起こす可能性がある。その反面、リチウムは、ＴＧＦＢＩｐ発現を、正常角膜線維母細胞より第２型顆粒状角膜異常症の角膜線維母細胞内でさらに大きく抑制することができる。したがって、本発明者らは、リチウム治療が第２型顆粒状角膜異常症疾病において変異型ＴＧＦＢＩｐ蓄積を減少させる長所があることを提案する。
【００６２】
プロテアソーム及びオートファジー／リソゾーム経路は、サイトゾール蛋白質を浄化する主な経路である。狭いプロテアソーム障壁は、固まりやすい細胞内蛋白質のオリゴマー／集塊の進入を防ぎ、その間、上記のような基質はオートファジーにより分解され得る。本発明者らは、以前の研究で、ＴＧＦＢＩｐがリソゾーム／オートファジー分解経路により分解されて、第２型顆粒状角膜異常症の角膜線維母細胞内ではその分解が遅延されることを提案した。なお、オートファジー誘導剤であるラパマイシンは、サイトゾール内変異型ＴＧＦＢＩｐレベルを減少させて、第２型顆粒状角膜異常症の同型接合子角膜線維母細胞内変異型ＴＧＦＢＩｐの毒性を減少させた。さらに、このような結果は、正常蛋白質との異なって固まりやすい変異型ＴＧＦＢＩｐがオートファジー浄化に非常に強く依存することを示した。また、本発明者らは、第２型顆粒状角膜異常症の角膜繊維母細胞内リソゾーム又はオートリソゾーム内の変異型ＴＧＦＢＩｐは、オートファジーの欠陥のため蓄積されるという事実を見出した（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，  論文審査中、未公開）。したがって、このような結果は、オートファジー誘導剤も同様に、将来ＴＧＦＢＩ−関連角膜異常症の治療薬物として使用できることを示す。
【００６３】
オートファジー経路は、ＩＰ３レベルにより強く調節されるが、これは、内因性オートファジー抑制剤として作用する。その反面、リチウムは、ＩＰ３活性を遮断することにより、オートファジーを促進する（Ｓａｒｋａｒ  Ｓ，  Ｆｌｏｔｏ  ＲＡ，  Ｂｅｒｇｅｒ  Ｚ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｉｔｈｉｕｍ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｉｎｏｓｉｔｏｌ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００５；１７０：１１０１−１１１１、Ｓａｒｋａｒ  Ｓ，  Ｋｒｉｓｈｎａ  Ｇ，  Ｉｍａｒｉｓｉｏ  Ｓ，  Ｓａｉｋｉ  Ｓ，  Ｏ‘Ｋａｎｅ  ＣＪ，  Ｒｕｂｉｎｓｚｔｅｉｎ  ＤＣ．  Ａ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｕｓｉｎｇ  ｌｉｔｈｉｕｍ  ａｎｄ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ．  Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ２００８；１７：１７０−１７８、Ｓａｒｋａｒ  Ｓ，  Ｒｕｂｉｎｓｚｔｅｉｎ  ＤＣ．  Ｉｎｏｓｉｔｏｌ  ａｎｄ  ＩＰ３  ｌｅｖｅｌｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ：  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｐｅｃｕｌａｔｉｏｎｓ．  Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ２００６；２：１３２−１３４．参照）。本発明の研究で本発明者らは、リチウムが角膜線維母細胞内オートファジーを誘導することを見出した。リチウムによりオートファジーが活性化された後に減少されたＴＧＦＢＩｐレベルを測定してはいないが、前記結果は、リチウムのＴＧＦＢＩ−関連角膜異常症に対する治療的長所を提案する。リチウムは、非常に高濃度（１００ｍＭ）でも角膜線維母細胞の深刻な死滅を誘導しないため、リチウムが第２型顆粒状角膜異常症の治療のための治療剤として使用される可能性は非常に高い。
【００６４】
また、従来の研究は、リチウムの酸化的ストレスに対抗する細胞保護的効能がシトクロムｃの分泌及びカスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）−３活性化に依存的であることを示した（Ｌａｉ  ＪＳ，  Ｚｈａｏ  Ｃ，  Ｗａｒｓｈ  ＪＪ，  Ｌｉ  ＰＰ．  Ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｌｉｔｈｉｕｍ  ａｎｄ  ｖａｌｐｒｏａｔｅ  ｖａｒｉｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｔｒｅｓｓｅｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００６；５３９：１８−２６．参照）。従来の研究で本発明者らは、酸化的ストレスが第２型顆粒状角膜異常症の発病と関連があることを立証した（Ｃｈｏｉ  ＳＩ，  Ｋｉｍ  ＴＩ，  Ｋｉｍ  ＫＳ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｃａｔａｌａｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｇｒａｎｕｌａｒ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｔｙｐｅ  ＩＩ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００９；１７５：２４８−２６１．参照）。ＧＳＫ−３β活性及び酸化的ストレス間の関係はよく知られている（Ｂｏｗｅｒｍａｎ  Ｂ．  Ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ：  ａ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５；３０８：１１１９−１１２０．参照）。酸化的ストレスは、退化を促進し、究極的にはＤＮＡ切片化、脂質過酸化及びカスパーゼ及びＧＳＫ−３βに係わるミトコンドリア好−アポトーシス性経路の誘導による細胞死滅を引き起こす可能性がある（Ｍａｉｅｓｅ  Ｋ，  Ｃｈｏｎｇ  ＺＺ．  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｎｏｖｅｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｒｅｓｔｏｒ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２００４；２２：８７−１０４．参照）。なお、過酸化水素−誘導性酸化的ストレスに対する細胞抵抗に内在されている分子メカニズムを理解するための努力は、減少されたＧＳＫ−３β活性が細胞生存に必須的である。ＧＳＫ−３β抑制剤としてのリチウムを細胞に処理した場合、過酸化水素−誘導性酸化的ストレスに対する抵抗性が増加された（Ｓｃｈａｆｅｒ  Ｍ，  Ｇｏｏｄｅｎｏｕｇｈ  Ｓ，  Ｍｏｏｓｍａｎｎ  Ｂ，  Ｂｅｈｌ  Ｃ．  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３  ｂｅｔａ  ｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ＨＴ２２  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ２００４；１００５：８４−８９．参照）。ＧＳＫ−３βの抑制が内在的酸化ストレスから細胞を特異的に保護するということを立証する証拠が存在する（Ｋｉｎｇ  ＴＤ，  Ｊｏｐｅ  ＲＳ．  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ  ｏｘ��ｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ．  Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ２００５；１６：５９７−６０１．参照）。即ち、ＧＳＫ−３βは、ＰＩ３Ｋ−及びＡｋｔ−媒介細胞生存経路において重要な役割をする。リチウムは、ｐ５３、Ｂａｘ及びカスパーゼのような多様なアポトーシス性蛋白質の発現を減少させて、また、Ｂｃｌ−２レベルを増加させ、抗−アポトーシス効能を有すると知られている（非特許文献２３、Ｃｈｅｎ  ＲＷ，  Ｃｈｕａｎｇ  ＤＭ．  Ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍ  ｌｉｔｈｉｕｍ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｐ５３  ａｎｄ  Ｂａｘ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｕｔ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｂｃｌ−２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ａ  ｐｒｏｍｉｎｅｎｔ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９９；２７４：６０３９−６０４２、Ｒｏｗｅ  ＭＫ，  Ｃｈｕａｎｇ  ＤＭ．  Ｌｉｔｈｉｕｍ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ：  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２００４；６：１−１８．参照）。したがって、更に本発明者らは、ＴＧＦＢＩ−関連角膜異常症のリチウム治療が多機能的な長所を有することを提案する。まとめると、リチウム治療剤は、多様な疾病のＴＧＦ−β信号伝達、オートファジー及び酸化的ストレスを調節するのに効果的である。
【００６５】
以上、本発明の望ましい具現例を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。
【図２Ｄ】
0005701183.tif 000002
【図３Ｂ】
0005701183.tif 000003
【図３Ｃ】
0005701183.tif 000004
【図３Ｄ】
0005701183.tif 000005
【図４Ｂ】
0005701183.tif 000006
【図１Ａ】
0005701183.tif 000007
【図１Ｂ】
0005701183.tif 000008
【図１Ｃ】
0005701183.tif 000009
【図１Ｄ】
0005701183.tif 000010
【図１Ｅ】
0005701183.tif 000011
【図１Ｆ】
0005701183.tif 000012
【図２Ａ】
0005701183.tif 000013
【図２Ｂ】
0005701183.tif 000014
【図２Ｃ】
0005701183.tif 000015
【図３Ａ】
0005701183.tif 000016
【図４Ａ】
0005701183.tif 000017
【図５Ａ】
0005701183.tif 000018
【図５Ｂ】
0005701183.tif 000019