(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において補体を活性化させる、ナノ粒子の外側に配置されたチオール官能基を含み、
抗原と合成ポリマーとを含む平均粒子直径が７０ｎｍ未満の合成ナノ粒子の集合体を含み、
前記抗原がジスルフィド結合を介して前記ナノ粒子に結合している、
哺乳動物に導入するための医療用組成物。
【請求項２】
前記ナノ粒子がミセルである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ミセルが親水性ポリマーおよび疎水性ポリマーのブロックコポリマーを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記親水性ポリマーがポリエチレンオキシドを含み、前記疎水性ポリマーがポリ（プロピレンスルフィド）を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ミセルでカプセル化された治療剤をさらに含む、請求項２〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が合成ポリマー以外のアジュバントを含まない、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記官能基が哺乳動物でＴｈ−１応答を誘導する、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記集合体が生体分子危険シグナル、疎水性危険シグナル、または炎症性サイトカインおよびＴｏｌｌ様受容体のリガンドからなる群から選択される危険シグナルをさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
前記合成ポリマーが、ポリアルキレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）のコポリマーまたはポリプロピレンスルフィドを含む、請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗原が腫瘍抗原または感染症の抗原である、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
前記ナノ粒子が細胞に特異的に結合する標的用リガンドを含まず、前記抗原が腫瘍免疫療法または感染症の抗原であり、炎症性サイトカインおよびＴｏｌｌ様受容体のリガンドからなる群から選択される危険シグナルをさらに含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
前記合成ポリマーが少なくとも１つの疎水性ブロックおよび少なくとも１つの親水性ブロックの両親媒性ブロックコポリマーを含み、前記ブロックコポリマーが水溶液中にて自己会合して前記粒子を形成する、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
前記ナノ粒子が疎水性コアと親水性コロナとを含み、前記コアがポリ（プロピレンスルフィド）で構成され、前記親水性コロナがポリエチレングリコールを含む合成ポリマーで構成され、前記官能基が求核種を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
前記抗原が、Ｃａｓｐａｓｅ−８、ＭＡＧＥ−１、チロシナーゼ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＭＵＣ−１またはサバイビンを含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照により本明細書に援用する米国特許出願第１１／７０７，６２７号に関連するものである。
【０００２】
技術分野は、いくつかの態様で、免疫系を活性化させるための表面化学を有するナノ粒子に関する。
【背景技術】
【０００３】
抗原に対する寛容を開発する、あるいはこれを拒絶することを学ぶなど、抗原に対して望ましい形で応答するよう免疫系を訓練できれば、多くの医療的な利点を実現できよう。この課題を解決するために、全身薬剤治療、抗原の注入、抗体療法をはじめとする様々な手法が試みられてきた。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書に開示する諸々の手法のうち、ひとつの新規な手法では、体内の特定の場所で抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対する治療物質を特異的に標的する。ＡＰＣは一般に樹状細胞とマクロファージであり、場合によってはＢ細胞である。一方、本明細書でのＡＰＣとは、樹状細胞とマクロファージを説明するためだけに使われる用語であり、Ｂ細胞は除外する。たとえＡＰＣが身体中に拡散しても、この手法では決まった場所、すなわちリンパ節でＡＰＣに対する作用剤を標的する。リンパ節では体内の他の部分の場合とＡＰＣの振る舞いが異なるため、この場所でその作用剤を取り込むと都合がよい。さらに、ビヒクルはその作用を発揮できるよう数時間または数日にわたって維持され、生分解性でもある。ＡＰＣがリンパ節で特異的に標的されるだけでなく、この治療剤用の送達ビヒクルを用いて特定の形すなわち補体系を活性化させることによって、ＡＰＣを活性化させることが可能である。補体系を活性化させると既知の応答経路が発動され、適切な免疫治療剤を選択できる。さらに、生物剤を使用しなくても、送達ビヒクル中の合成材料によって補体系を活性化させることも可能である。これらの特異的に標的されるあらゆる特徴の結果が、ＡＰＣが活性化されて所望の免疫療法を達成する時点および場所でＡＰＣまで治療剤を一般的に送達するビヒクルである。このビヒクル自体は、生物分子またはポリペプチドを必要としないため、免疫系の衝突や交差反応または不要な拮抗作用を伴うことなく、どのような作用剤でも受け入れられる状態にある。
【０００５】
この手法は、いくつかの実施形態では、好適な物性を有し、間質腔を流れてリンパ系に浸透するだけのサイズの粒子を含む。粒子が大きすぎるとリンパ系まで効果的に移動することがない。このような粒子を、生分解性の合成ポリマーならびに、補体を活性化するポリマーを用いて生成してもよい。このような粒子を、様々なポリマー同士を架橋させ、補体の活性化に利用できる粒子上の場所に特定の補体活性化官能基を配置して生成してもよい。これらの特徴についてはいずれも詳細に後述する。
【０００６】
いくつかの実施形態では、組成物が、免疫治療剤と関連し、補体を活性化させる第１のポリマーと、第２の共有結合的に架橋されたポリマーとを含む合成生分解性粒子の単離された集合体を含むナノ粒子組成物であり、集合体の平均直径が約１０ｎｍ〜約１００ｎｍまたは約７０ｎｍ未満であり、第１のポリマーが、補体を活性化させる天然に生じる生体分子を含まず、第１のポリマーが第２のポリマーに強く結合されている。
【０００７】
いくつかの実施形態は、第１のポリマーと、平均直径が約２０ｎｍ〜約１００ｎｍまたは約７０ｎｍ未満の生分解性粒子の集合体を生成するための重合時に用いられる乳化剤である第２のポリマーとのエマルション重合を含むナノ粒子の免疫治療用組成物の製造方法に関し、第２のポリマーについては、補体を活性化させるヒドロキシルおよび／またはチオール官能基を含むよう選択し、免疫治療用を粒子と関連させることを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態は、免疫治療剤を送達する方法に関し、この方法は、リンパ節で抗原提示細胞に特異的に標的される合成生分解性粒子の集合体を患者に導入することを含み、粒子が補体を活性化させる第１のポリマーを含み、集合体の平均直径が約１０ｎｍ〜約１００ｎｍまたは約７０ｎｍ未満であり、第１のポリマーが補体を活性化させる天然に生じる生体分子を含まず、粒子が第１のポリマーと強く結合される第２の共有結合的に架橋されたポリマーを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態は、補体を活性化させる合成ポリマーを含む合成粒子の単離された集合体を含むナノ粒子組成物に関し、集合体の平均粒子直径が約１０ｎｍ〜約１００ｎｍまたは約７０ｎｍなどである。粒子はさらに、抗原と関連していてもよい。いくつかの実施形態における合成ポリマーは、補体を活性化させるアミノ酸の配列または多糖の配列を含まないか、アミノ酸および／または核酸および／または多糖を全く含まない。合成ポリマーは、例えば、ナノ粒子のコアを形成する第２の生分解性ポリマーの疎水性部分に吸着されることで、合成ポリマーをコアに結合する疎水性部分を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態は、合成粒子の単離された集合体を含むナノ粒子組成物に関し、集合体の平均直径が約１０ｎｍなどから約１００ｎｍまたは約７０ｎｍ未満であり、粒子が免疫抑制剤または他の作用剤を含み、粒子がさらに抗原と関連している。いくつかの形態では、粒子が少なくとも１つの疎水性ブロックと少なくとも１つの親水性ブロックからなる両親媒性ブロックコポリマーを含み、ブロックコポリマーが水溶液中で自己会合して粒子を形成する。
【００１１】
いくつかの実施形態は、哺乳動物で補体を活性化させる官能基がナノ粒子の外側に配置された、抗原と合成ポリマーとを含む、平均粒子直径が約７０ｎｍ未満の合成ナノ粒子の集合体を含む、哺乳動物に導入するための医療用組成物に関する。官能基は、ヒドロキシルおよび／またはチオールなどの求核基を含むものであってもよい。官能基は、ナノ粒子系の文脈で適用されるような哺乳動物でＴｈ−１応答を誘導するよう選択できる。
【００１２】
ナノ粒子はミセルであってもよい。ミセルの実施形態の中には、親水性ポリマーと疎水性ポリマーを含むブロックコポリマーで生成されるものがある。親水性ポリマーの例として、水溶性でポリエチレンオキシドを含むものがあげられる。例示的な疎水性ポリマーには、水溶性ではなくポリ（プロピレンスルフィド）を含むポリマーがある。治療剤をミセルでカプセル化してもよい。組成物は概して、合成ポリマー以外のアジュバントを含まない。
【００１３】
ナノ粒子は、多様性について本明細書にて詳細に説明する１つ以上の抗原または危険シグナルと関連していてもよい。このような関連付けには、共有結合、イオンおよび／またはジスルフィド結合を伴うものもある。危険シグナルは、ナノ粒子を形成するのに用いるポリマーまたは官能基以外の生物活性分子であってもよい；言葉をかえると、ナノ粒子を製造するための製剤を、危険シグナルである別の分子でさらに修飾してもよく、これが天然に見られるものであっても天然に見られないものであってもよい。いくつかの危険シグナルは疎水性であり、ナノ粒子の疎水性部分と結合していてもよい。関連付けの方法は、電荷と電荷の相互作用、粒子に対する関連付けの対象となる部分が一方の電荷を持ち、ナノ粒子が、関連付けの前に他方の電荷を持てばよく、例えばナノ粒子が正電荷、関連付け対象となる部分が負電荷といった具合である。例えば、アスパラギン酸および／またはグルタミン酸などの複数の正または負に荷電した部分でペプチドを発現させてもよい（電荷の状態は一般的なｉｎ  ｖｉｖｏでのｐＨ条件を示す）。抗原の例としては、Ｃａｓｐａｓｅ−８、ＭＡＧＥ−１、チロシナーゼ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕまたはＭＵＣ−１などの腫瘍抗原または感染症の抗原があげられる。危険シグナルの例としては、炎症性サイトカインまたはＴｏｌｌ様受容体のリガンドがあげられる。ナノ粒子は、細胞に特異的に結合する標的用リガンドを含まないものであってもよい。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子が、少なくとも１つの疎水性ブロックと少なくとも１つの親水性ブロックからなる両親媒性ブロックコポリマーを含む合成ポリマーを使用して生成され、ブロックコポリマーが水溶液中で自己会合して粒子を形成し、官能基がヒドロキシルおよび／またはチオールを含む。あるいは、ナノ粒子がコアおよび親水性コロナを含むことが可能であり、コアはポリ（プロピレンスルフィド）からなり、親水性コロナはポリエチレングリコールを含む合成ポリマーからなり、官能基が求核種を含む。
【００１５】
一実施形態は、平均粒子直径が約７０ｎｍ未満で抗原を含む合成ナノ粒子の集合体を含む、患者に導入するための免疫賦活組成物であり、組成物がＴＮＦ−α応答を誘導することなく、なおかつＩＬ−６応答も誘導せずに、患者で抗原に対する免疫応答を誘導する。このようなナノ粒子は、ナノ粒子が細胞と特異的に結合する標的用リガンドを含まない、および／または抗原が腫瘍または感染症の抗原であるなど、本明細書で説明するような特徴を持つものであってもよい。
【００１６】
ナノ粒子は免疫抑制剤をさらに含むものであってもよい。この特徴は、ＤＣ活性化誘導寛容が完全にない場合に抗原でのワクチン接種で寛容化を誘導する上で好都合である。よって、ナノ粒子は、抗原を送達するが、影響される樹状細胞の高度に特異的かつ高度に効果的な免疫抑制でもある。
【００１７】
もうひとつの実施形態は、抗原をコードする核酸と合成ポリマーとを含む、平均粒子直径が約７０ｎｍ未満の合成ナノ粒子の集合体を含み、官能基が、哺乳動物で補体を活性化させるナノ粒子の外側に配置される、哺乳動物に導入するための医療用組成物に関する。
【００１８】
実施形態は、患者のリンパ節で樹状細胞をトランスフェクトする組成物または方法であって、リンパ節外の場所で、抗原をコードする核酸を含む合成ナノ粒子の集合体を患者に投与することを含み、ナノ粒子が、平均粒子直径約７０ｎｍ未満であり、樹状細胞による取り込み用に患者のリンパ節まで移動して樹状細胞を核酸でトランスフェクトする表面化学を有し、表面化学が、補体を活性化させる合成親水性ポリマーと結合した複数の求核基を有する。トランスフェクション効率は、例えば、リンパ節の樹状細胞の少なくとも約３０％が核酸でトランスフェクトされるなどである。この場合、様々なナノ粒子の実施形態を利用でき、例えば、ナノ粒子がポリ（プロピレンスルフィド）のコアを含み、合成親水性ポリマーがポリエチレングリコールを含み、官能基がヒドロキシルおよび／またはチオールを含むか、ナノ粒子がコアと、親水性ポリマーおよび求核基を含む親水性コロナとを含み、コアがポリ（プロピレンスルフィド）で構成されるか、ナノ粒子がミセルを含む。
【００１９】
もうひとつの実施形態は、抗原にコンジュゲートされた分岐鎖ポリマーを含む、患者に導入するための方法または組成物であって、分岐鎖ポリマーが、求核基であって患者への導入後に補体を活性化させる少なくとも４つの末端を含み、組成物が抗原に応答するよう患者の免疫系を刺激する。例えば、分岐鎖ポリマーがポリエチレングリコールを含むものであってもよく、求核基がヒドロキシルまたはチオールであってもよい。
【００２０】
実施形態は、患者のリンパ節で樹状細胞を刺激する組成物または方法であって、リンパ節外の場所で、補体を活性化させる分岐鎖ポリマーを患者に投与することを含み、ポリマーが抗原にコンジュゲートされ、求核基である少なくとも４つの末端を含み、ポリマーが、抗原を提示するための樹状細胞による取り込み用に患者のリンパ節まで移動する。
【００２１】
実施形態は、患者のリンパ節で樹状細胞を刺激する組成物または方法であって、リンパ節外の場所で、抗原を含み補体を活性化させる合成分岐鎖ポリマーの集合体を患者に投与することを含み、ポリマーが、リンパ節での樹状細胞による取り込みと樹状細胞に対する抗原の放出用に求核基を含む少なくとも４つの末端をさらに含み、表面化学が合成親水性ポリマーと結合した複数の求核基を含む。
【００２２】
実施形態は、ナノ粒子の集合体を提供することを含む、医療用ワクチンを送達する組成物または方法である。例えば、患者のリンパ節で樹状細胞をトランスフェクトする方法は、穏やかな圧力下で、抗原を含む合成ナノ粒子の集合体を患者の外粘膜表面に投与することを含み、ナノ粒子は、平均粒子直径約７０ｎｍ未満であり、樹状細胞による取り込み用に患者のリンパ節まで移動して樹状細胞を核酸でトランスフェクトする表面化学を有し、表面化学が、補体を活性化させる合成親水性ポリマーと結合した複数の求核基を有する。粘膜表面の例が鼻粘膜である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】毛細リンパ管へのナノ粒子の取り込みを比較した顕微鏡写真の分割画像である。これは、直径（Ａ）２０ｎｍ、（Ｂ）４５ｎｍ、（Ｃ）１００ｎｍの蛍光負荷ＰＰＳナノ粒子注入９０分後のマウス尾皮膚における毛細リンパ管網を蛍光顕微鏡リンパ管造影したものである。画像は一定露光下で撮影した。六角形のリンパ管網が２０ｎｍの粒子とともに明確に目視確認できた。バー＝１００μｍ。
【００２４】
【図２】ナノ粒子がリンパ節で保持されることを示す顕微鏡写真の分割画像である。図示されているのは、マウスの尾に２０ｎｍ、４５ｎｍ、１００ｎｍのＰＰＳナノ粒子を注入した後の流入領域リンパ節から得た切片である。リンパ節については、注入後２４時間、７２時間、９６時間、１２０時間の時点で取り出した。２０ｎｍと４５ｎｍのナノ粒子では、どの時点でもナノ粒子が鮮明に確認されたが、１００ｎｍの粒子はリンパ節に認められなかった。バー＝２００μｍ。
【００２５】
【図３】リンパ節内でのナノ粒子の局在を示す顕微鏡写真の分割画像である。図示されているのは、２０ｎｍのＰＰＳナノ粒子を注入後９６時間の時点での連続したリンパ節切片である。（Ａ）ＣＤ３ｅ（Ｔ細胞）、（Ｂ）ＣＤ４５Ｒ（Ｂ細胞）、（Ｃ）ＣＤ６８（マクロファージ（Ｍａｃ）および樹状細胞（ＤＣ））に対する抗体で示したものとして、免疫細胞を識別した。Ｔ細胞およびＢ細胞のゾーンには明らかにナノ粒子が存在しないが、マクロファージおよびＤＣには明確に同時局在している。バー＝１００μｍ。（Ｄ）内皮マーカーＣＤ３１は、リンパ節洞アーキテクチャに対するナノ粒子（緑）分布を示す。バー＝１００μｍ。
【００２６】
【図４】マクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）によるナノ粒子の内部移行を示す顕微鏡写真の分割画像である。図示されているのは、２０ｎｍのＰＰＳナノ粒子を注入後９６時間の時点でのリンパ節切片の共焦点画像である。（Ａ）マクロファージとＤＣの両方で発現されるＣＤ６８を染色すると、これらの細胞によるナノ粒子の内部移行が明らかになる。（Ｂ）ＤＣだけに見られるＤｅｃ−２０５に対する染色では、ＤＣもナノ粒子を内部移行させることが分かる。バー＝２０μｍ。
【００２７】
【図５】ナノ粒子（ＮＰ）の細胞取り込みを定量化した棒グラフである。フローサイトメトリー解析を用いて、ＮＰ（ＦＩＴＣ＋）を内部移行したリンパ節ＡＰＣ（ＭＨＣＩＩ＋）およびＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋）の画分を判断した。（Ａ）注入後２４時間の時点で、リンパ節における３８％を超えるＡＰＣと５０％のＤＣが、２０ｎｍのナノ粒子を内部移行した。４５ｎｍのナノ粒子では両方の細胞集団で取り込みが減少し、ＡＰＣ全体のわずか１０％前後が１００ｎｍのナノ粒子を取り込んだ。（Ｂ）ＡＰＣおよびＤＣをナノ粒子で２４時間ｉｎ  ｖｉｔｒｏでパルシングした後、ほぼすべてのＡＰＣおよびＤＣが３種類のサイズすべてのナノ粒子を内部移行した。よって、３種類のナノ粒度がすべて等しくｉｎ  ｖｉｔｒｏで取り込まれ、ｉｎ  ｖｉｖｏ注入後に見られた差異は、注入後のリンパへのナノ粒子取り込みの差による可能性が最も高い。これらの結果は、ナノ粒子の取り込みが末梢部位での細胞によってではなくリンパ節で生じ、これがリンパ節に移行することも示している。
【００２８】
【図６】マクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）の存在量の経時的な増加を示す、（Ａ）顕微鏡写真の分割画像、（Ｂ）棒グラフである。図示されているのは、２０ｎｍのＰＰＳナノ粒子（ＮＰ）の注入後２４時間および９６時間の時点でマクロファージ（Ｍａｃ）およびＤＣ（ＣＤ６８＋細胞）ならびに核を染色したリンパ節の切片である。ＭａｃおよびＤＣの同時局在が経時的に増加した。バー＝１００μｍ。（Ｂ）フローサイトメトリー解析を用いて、２０ｎｍのナノ粒子注入後２４時間および９６時間の時点でのＡＰＣ（ＭＨＣＩＩ＋）およびＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋）であるナノ粒子（ＮＰ＋）を含むリンパ節（ＬＮ）細胞の画分を判断した。２４時間に対して９６時間の時点では、ＡＰＣおよびＤＣであるナノ粒子を含む細胞画分の有意な増加がある。また、２４時間の時点ではナノ粒子を含むほぼすべてのＡＰＣがＤＣであるように見える。
【００２９】
【図７】ナノ粒子（ＮＰ）内部移行後のＤＣ成熟マーカー、ＣＤ８６、ＣＤ８０の発現量の増加を示すグラフである。（Ａ）ＰＢＳまたは２０ｎｍ粒子注入後２４時間の時点でのＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋）のＣＤ８６発現の一般的なヒストグラム。ナノ粒子（ＣＤ１１ｃ＋ＦＩＴＣ＋）を含むＤＣではＣＤ８６発現の鮮明なシフトが観察される。（Ｂ）ＣＤ８６およびＣＤ８０を陽性発現する細胞画分が、ナノ粒子内部移行後に有意に大きくなっていることがわかる。さらに、注入後９６時間の時点でＣＤ８６およびＣＤ８０の発現も高めのレベルに維持されることも示されている。
【００３０】
【図８】末端ＯＨ基がＯＣＨ３基に変換されるようＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−１２７が修飾されることを示すデータである（Ａ）。（Ｂ）血清を用いるＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化（よって、ヒドロキシル化された）補体活性化ナノ粒子（ＯＨ−ＮＰ）のインキュベーションによって、血清＋ＰＢＳにてＣ３ａの増加率で測定した場合に、末端メトキシ化ＰＬＵＲＯＮＩＣ（ＣＨ３ＮＰ）で安定化させたナノ粒子よりも補体が活性化されることを示すデータである。
【００３１】
【図９】ナノ粒子表面化学がＤＣの成熟応答を左右することを示すグラフである。２５ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化（よって、ヒドロキシル化された）補体活性化ナノ粒子（ＯＨ−ＮＰ）は、メトキシ末端ＰＬＵＲＯＮＩＣ（ＣＨ３ＮＰ）で安定化させた２５ｎｍのナノ粒子および２０ｎｍのカルボキシル化ポリスチレンナノ球体（ＣＯＯＨ−ＮＳ）よりもＤＣを成熟させる。
【００３２】
【図１０】ナノ粒度がＤＣの成熟応答を左右することを示すグラフである。２５ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化（よって、ヒドロキシル化された）補体活性化ナノ粒子（ＯＨ−ＮＰ）がＤＣの成熟を誘導するのに対し、１００ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化（よって、ヒドロキシル化された）補体活性化ナノ粒子はこれを誘導しない。
【００３３】
【図１１】ナノ粒子を修飾するための化学スキームならびに、リンパ節でのその顕微鏡写真を示す。図中、（Ａ）ＰＬＵＲＯＮＩＣはビニルスルホン（ＰＬ−ＶＳ）で官能化されている。このようになると、ビニルスルホンは卵白アルブミン（ＯＶＡ）の遊離システインと結合可能である。その後、ＰＬ−ＶＳ−ＯＶＡをＰＬＵＲＯＮＩＣと混合し、２５ｎｍのナノ粒子を通常どおり合成する。（Ｂ）２５ｎｍのＯＶＡ−コンジュゲート化ＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ナノ粒子がＯＶＡをリンパ節まで送達する。
【００３４】
【図１２】２５ｎｍのＯＶＡ−コンジュゲート化ＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化（よって、ヒドロキシル化された）補体活性化ＰＰＳナノ粒子（ＯＨ−ＯＶＡ−ＮＰ）が、注入後２４時間の時点でＤＣの成熟をＯＶＡを有するＬＰＳと同様のレベルまで誘導することを示すグラフである
【００３５】
【図１３】２５ｎｍのＯＶＡ−コンジュゲート化ＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化（よって、ヒドロキシル化された）補体活性化ナノ粒子（ＯＨ−ＯＶＡ−ＮＰ）が、ＯＴ−ＩＩマウスからのＴ細胞の養子移入後にＬＰＳを有するＯＶＡと同じレベルでＣＤ４  Ｔ細胞増殖を引き起こすことを示すグラフである。
【００３６】
【図１４】２５ｎｍのＯＶＡ−コンジュゲート化ＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化（よって、ヒドロキシル化された）補体活性化ナノ粒子（ＯＨ−ＯＶＡ−ＮＰ）が、ＥＦＮ−γスポット／リンパ節細胞で測定したＣＤ８  Ｔ細胞メモリを引き起こすことを示すグラフである。＊，Ｐ＜０．０５。
【００３７】
【図１５】２１日目のＯＶＡ  Ａｂ力価を示すグラフである。２５ｎｍのＯＶＡ−コンジュゲート化ＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化（よって、ヒドロキシル化された）ナノ粒子（ＯＨ−ＯＶＡ−ＮＰ）が、ＬＰＳを有するＯＶＡと同様のレベルでＯＶＡ  Ａｂ力価を引き起こす。２５ｎｍのＯＶＡ−コンジュゲート化末端メトキシ化ＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ＰＰＳナノ粒子および１００ｎｍのＯＶＡ−コンジュゲート化ＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化（よって、ヒドロキシル化された）ナノ粒子（ＯＨ−ＯＶＡ−１００）が、低めのＡｂ力価を引き起こす。２５ｎｍのＯＶＡ−コンジュゲート化ＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化（よって、ヒドロキシル化された）（ＯＨ−ＯＶＡ−２５）はＣ３−／−マウスで低めのＡｂ力価を引き起こす。
【００３８】
【図１６】補体活性化ナノ粒子がＴｈ１バイアス応答で細胞免疫を誘導することを示すグラフである。パネルａは、ナノ粒子および対照を用いる２４時間のインキュベーション後に骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）によるインターロイキン１２ｐ４０（ＩＬ−１２ｐ４０）の産生を示す棒グラフである。ＩＬ−１２ｐ４０を細胞培地上にてＥＬＩＳＡで測定した。増加率は血清のものである。パネルｂは、ナノ粒子および対照を用いるＢＭＤＣの２４時間のインキュベーション後のＭＨＣ  Ｉ発現（フローサイトメトリーで測定）を示す棒グラフである。パネルｃは、ＣＤ８  Ｔ細胞メモリを求めるのに用いた再刺激アッセイの結果を示す棒グラフである。マウスには抗原およびナノ粒子製剤の様々な注入をし、流入領域リンパ節を注入後２１日目に単離した。グラフは、ＭＨＣ−Ｉ  ＯＶＡ抗原ペプチドへの曝露後のインターフェロン−γ（ＩＦＮ−ｇ）生成ＣＤ８  Ｔ細胞を示し、ＯＨ−ＯＶＡ−２５−ＮＰでの処理後にはメモリがあるがＣＨ３Ｏ−ＯＶＡ−２５−ＮＰではないことを実証する。結果は各群３匹のマウスの平均値である、エラーバーはＳＥＭに相当する。＊，Ｐ＜０．０５。
【００３９】
【図１７】補体活性化ナノ粒子の結果が炎症誘発性サイトカインを誘導しないことを示す。パネルａおよびｂは、ナノ粒子および対照を用いる２４時間のインキュベーション後に骨髄由来の樹状細胞による腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ）およびインターロイキン６（ＩＬ−６）の産生を示す棒グラフである。サイトカインについては細胞培地上にてＥＬＩＳＡで測定した。Ｎ．Ｄ．（検出不能）。
【００４０】
【図１８】ヒドロキシル化ナノ粒子ＩＬ−１２ｐ４０分泌のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分子測定値および抗ＯＶＡ力価のｉｎ  ｖｉｖｏでの分子測定値を示す。パネルａは、ＴＬＲ４のあるマウスにおける血清曝露ヒドロキシル化ナノ粒子の高ＩＬ−１２ｐ４０分泌に対するＴＬＲ４のない低分泌マウスの棒グラフである。パネルｂは、ヒドロキシル化ナノ粒子をＴＬＲ４のあるマウス（野生型）またはＴＬＲ４のないマウス（ＴＬＲ４−／−）に導入することで誘導される卵白アルブミン（ＯＶＡ）に対する抗体の対数散布図である。ＴＬＲ４のないマウスのほうがＯＶＡに対する抗体レベルがかなり低かったことから、ＴＬＲ４がヒドロキシル化ナノ粒子による抗体誘導の機序にとって重要なメディエータであることが分かる。
【００４１】
【図１９】チオール表面を有するヒドロキシルおよびメトキシナノ粒子（それぞれＯＨ−ＳＨ−およびＣＨ３ＳＨ−ＮＰ）が、チオールのないナノ粒子よりも補体を有意に多く活性化させることを示す。ナノ粒子を用いるインキュベーション後にヒト血清中のＣ３ａの存在で測定した場合のナノ粒子誘導補体活性化は、チオールのないナノ粒子（ＯＨ−およびＣＨ３Ｏ−ＮＰ）と比較してＯＨ−ＳＨ−ＮＰおよびＣＨ３ＳＨ−ＮＰのほうがかなり高いことを実証した。ＰＢＳを用いる血清インキュベーションでの対照に対して結果を正規化する。値は３回の独立した実験の平均である。エラーバーは、標準誤差（ＳＥＭ）に対応する。
【００４２】
【図２０】ヒドロキシおよびチオール表面のあるナノ粒子（ＯＨ−ＳＨ−ＮＰ）が樹状細胞を活性化させることを示す。パネルａのフローサイトメトリーのヒストグラムは、ＣＤ８０の発現すなわち、ナノ粒子および対照への曝露後の骨髄由来の樹状細胞（ＢＭＤＣ）の成熟マーカーを示す。血清（補体）を有するＯＨ−ＳＨ−ＮＰは樹状細胞の成熟を誘導するのに対し、チオール（ＯＨ−ＮＰ）および血清のないヒドロキシナノ粒子はこれを誘導しない。パネルｂの棒グラフは、ナノ粒子および対照を用いる２４時間のインキュベーション後のＢＭＤＣによるインターロイキン１２ｐ４０（ＩＬ−１２ｐ４０）の産生を示す。ＩＬ−１２ｐ４０については細胞培地上にてＥＬＩＳＡで測定し、増加率は血清のものである。血清を含むＯＨ−ＳＨ−ＮＰは、高いレベルのＩＬ−１２ｐ４０を引き起こすのに対し、血清を含むＯＨ−ＮＰはそうではない。
【００４３】
【図２１】イミキモドをロードしたＰＥＧ−ＰＰＳナノ粒子が骨髄由来の樹状細胞（ＢＭＤＣ）の強い成熟を実証したことを示すフローサイトメトリーのヒストグラムである。成熟マーカーＣＤ８６のフローサイトメトリーのヒストグラムは、イミキモドをロードしたＰＥＧ−ＰＰＳミセルがＢＭＤＣを成熟させ、強力な活性化因子であるＬＰＳに近づいていることを示す。
【００４４】
【図２２】ＰＥＧ−ＰＰＳブロックコポリマー両親媒性物質の産生の合成経路を示し、そこからポリマーミセルを形成可能である。ＰＥＧ鎖の末端で−ＯＨ基を得るための経路を示す。エンドキャップなしで末端−ＳＨが得られ、エンドキャップすると末端−ＳＨ基をブロックすることが可能である。
【００４５】
【図２３】ＰＥＧ−ＰＰＳブロックコポリマー両親媒性物質の産生の合成経路を示し、そこからポリマーミセルを形成可能である。ＰＥＧ鎖の末端に−ＣＨ３基があるポリマーすなわちＰＥＧ鎖の末端に−ＯＨ基のないポリマーを得るための経路を示す。図２２同様に、末端−ＳＨ鎖を保存またはブロックすることが可能である。
【００４６】
【図２４ａ】アミン含有ＰＥＧ−ＰＰＳブロックコポリマー両親媒性物質の産生の合成経路を示し、そこから抗原を結合可能なポリマーミセルを形成可能である。ＰＥＧ鎖の末端に−ＣＨ３基がある場合を示す。
【図２４ｂ】ＰＥＧ鎖の末端に−ＯＨ基があるポリマーの場合の産生の合成経路を示す。
【図２４ｃ】図２４ａおよび図２４ｂに示すポリマーの末端を活性化させて、抗原を結合するための経路となる末端アミンを形成可能な合成経路を示す。
【００４７】
【図２５ａ】ナノ粒子およびミセル表面のポリマー鎖末端のピリジルジスルフィド活性化用の経路を示し、遊離システインを有するか、遊離システイン残基を有するために操作された抗原のカップリングに対する容易な手段を提供するものである。
【図２５ｂ】中間コンジュゲーションステップとしてチオールを保護するための経路を示す。
【図２５ｃ】遊離チオールを反応させて部分をナノ粒子に結合するためのコンジュゲーションスキームを示す。ＮＳＶＹＷＦＦＶＷＬ（配列番号１）を一例として示す点に注意されたい。
【００４８】
【図２６】注入およびリンパ節への移動後（これがさらにリンパ節内在ＤＣへの取り込みへと続く）、ＭＣＨＩでのＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２）固定化ならびに適切な表示につながる抗原でのシステイン残基または他のチオール残基のピリジルジスルフィド活性化の経路を示す。
【００４９】
【図２７】ピリジルジスルフィドまたはビニルスルホン部分などを介してナノ粒子表面に結合可能な官能に対するＮ末端α−アミンの誘導体化のための合成スキームを示す。「Ｆｌｉｃ」は特性タンパク質を示し、「ＴＳＴＰ」は特性ナノ粒子表面を示す。
【００５０】
【図２８】上述のポリマーミセルを血清に曝露し、または曝露せず、続いてＢＭＤＣにｉｎ  ｖｉｔｒｏで曝露し、その後フローサイトメトリーでのＣＤ８６測定によってＤＣの活性化がどの程度かを判断したことを示す棒グラフである。架橋コアＰＰＳナノ粒子（表面ＨＯ−およびＨＳ−基を有する）（ＮＰＨＳ０４０）およびＣｐＧオリゴヌクレオチドによる活性化との比較結果を示す。ＰＥＧ−ＰＰＳポリマーミセルの実施によって全活性が可能であることがわかる。
【００５１】
【図２９】どのようにして危険シグナル（ここではＣｐＧ  ＤＮＡで示す）もナノ粒子およびミセル表面にコンジュゲートできるかを示す。
【００５２】
【図３０】ＤＣをｉｎ  ｖｉｖｏで活性化させる８アームの分岐鎖ＰＥＧを示す。８アームのＰＥＧ、チオールを有する２５ｎｍのポリヒドロキシル化−ＮＰ（ＯＨ−ＳＨ−ＮＰ）のいずれかでの皮内注入後、２４時間の時点でのＣＤ１１ｃ＋マウスのリンパ節から単離したＤＣを示すフローサイトメトリーのヒストグラム。８アームのＰＥＧはＤＣ成熟マーカーＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ４０の上方制御を、ＯＨ−ＳＨ−ＮＰの場合と同様に誘導する。ヒストグラムは、それぞれ陰性および陽性対照であるＰＢＳおよびＬＰＳを注入したマウスからも示される。これは、８アームの活性化がＬＰＳでの活性化に匹敵することを示す。
【００５３】
【図３１】補体活性化用の末端ＨＯ−基ならびに、ピリジルジスルフィド部位でのジスルフィド交換による抗原結合用の部位を含有する分岐鎖ＰＥＧを形成するための合成スキームである。
【００５４】
【図３２ａ】ＤＮＡとさらに複合体を形成できるミセルを形成するＰＥＧ−ＰＰＳ−ＰＥＩを形成するための合成スキームを示す。
【図３２ｂ】リンパ節内在細胞を高度にトランスフェクトした直径約３０ｎｍのＤＮＡ含有ナノ粒子を生成した、ＰＥＧ−ＰＰＳ−ＰＥＩとブレンドしたＰＥＧ−ＰＰＳから形成した混合ミセルとのプラスミドＤＮＡ複合体を用いる実験結果を示す。Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＤＣをトランスフェクトした。
【００５５】
【図３３】ナノ粒子取り込み免疫抑制剤分子を用いて、ＬＰＳなどの極めて強力なＤＣ活性化シグナルに対してさえも曝露後にＤＣ活性化を防止できることを示す。
【００５６】
【図３４Ａ】ペプチドまたはタンパク質抗原のモデルとして、ＰＥＧ−ｓｓ−ＰＰＳベシクルカプセル化カルセインの透過電子顕微鏡写真を示す。
【図３４ｂ】ベシクル破壊後に脱クエンチした際にカルセインの蛍光を測定した状態で、図３４Ａのカルセインが細胞の細胞質に効率的に取り込まれたことを示す。
【００５７】
【図３５】先端の鈍いカニューレを用いて３０ｎｍのＰＰＳコアナノ粒子を穏やかな圧力（Ａ）で齧歯類の舌下組織に導入し、圧力（Ｂ）なしでの適用時と比較して組織を非常によく浸透する。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
発明の導入
好適な特性を有するナノ粒子を使用して、リンパ節で樹状細胞（ＤＣ）を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対する治療用物質を特異的に標的することが可能である。リンパ取り込み、リンパ節保持、リンパ節ＡＰＣおよびＤＣによる内部移行に対してナノ粒度の及ぼす影響が、本明細書ではマウス（ヒトと似たようなサイズのリンパ毛細管（１０〜８０μｍ）を有するが、両種で極めてバラツキがある［２０、４２］）における皮内注入に応答して実証される。多岐にわたるナノ粒度を使用できるが、直径約２０ｎｍのナノ粒子が最も容易に取り込まれ、さらに、他の粒子で過去に報告されているよりも長時間（最大１２０時間）にわたってリンパ節で保持される［３１〜３４、３６］。
【００５９】
驚くべきことに、特定のナノ粒子表面化学によって、ｔｏｌｌ様受容体ＴＬＲ４を伴う補体およびＴｈ１による免疫応答が活性化されることが実証されている（実施例１８および２０）。これらのナノ粒子は、驚くべきことに、免疫系の効率的かつ強力な活性化を引き起こし、ナノ粒子ワクチンの製造に使用可能である。ナノ粒子は、抗原がナノ粒子の内部または表面に導入されるか、あるいはナノ粒子との混合物中で、アジュバントとして作用できる。別の選択肢に関しては、詳細に後述する。また、本質的に腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）またはインターロイキン−６（ＩＬ−６）の産生を引き起こさないナノ粒子で、驚くべきことに低毒性のナノ粒子を調製することも可能である（実施例１９）。
【００６０】
ヒドロキシルおよびチオール基をナノ粒子と組み合わせることで、驚くべき相乗効果が達成された（実施例２１）。この組み合わせは、ヒドロキシル調製物だけの場合よりもさらに効果的ですらあった。よって、ナノ粒子の特定の実施形態は、チオールとヒドロキシルとの組み合わせを含む。
【００６１】
リンパ節内では、補体活性化ナノ粒子が、内在ＡＰＣ（ＤＣおよびいくつかのマクロファージを含むＭＨＣＩＩ＋細胞）および他の非抗原提示マクロファージ（ＭＨＣＩＩ−）によって、標的用リガンドなしで効果的に内部移行したことが認められた。リンパ節内在ＤＣの大きな画分（最大５０％）は２０ｎｍの補体活性化ナノ粒子を内部移行し、その数は経時的に増加した。ＤＣの成熟が補体活性化ナノ粒子の内部移行後に生じることが明らかになった。
【００６２】
サイズと表面化学は同時に重要である：特定の効率でリンパに侵入できるサイズではない補体活性化ナノ粒子（１００ｎｍのナノ粒子など）は、侵入効率の高い同じ化学で比較的小さめのナノ粒子（２５ｎｍなど）ほど強力なアジュバントではない。リンパに容易に侵入できるサイズの補体非活性化ナノ粒子（メトキシル表面基を有する２５ｎｍのナノ粒子など）は、補体を活性化させる表面化学の同じサイズのナノ粒子（ヒドロキシル表面基を有する２５ｎｍのナノ粒子など）ほど強力なアジュバントではない。その補体活性化は、機序において鍵になる役割を果たし、メトキシル表面基を有する２５ｎｍの抗原結合ナノ粒子を注入したＣ３−／−動物での劣った免疫応答によって証明される。よって、小さな（２０〜４５ｎｍなど）ヒドロキシル化ナノ粒子によって、リンパ節で免疫治療剤をＤＣや他のＡＰＣに送達するための戦略が得られる。通常、棒状あるいは楕円状などの非球状粒子でたどることが可能な球の直径や最大長などの粒子の最大寸法を、ナノ粒度で示す。
【００６３】
特定の表面化学を利用して、ＤＣをはじめとするＡＰＣを活性化させた後、Ｔ細胞依存性適応免疫応答を誘導することが可能である。材料表面によっては、ヒドロキシル化表面［１１７］あるいはＰＬＵＲＯＮＩＣでの安定化によって得られるヒドロキシル化表面［１１８］をはじめとする補体カスケードを活性化させることが可能である。材料表面を特定のヒドロキシル化分子および生体分子とコンジュゲートさせ、補体を活性化させることが可能である。例えば、当業者であれば、本明細書に記載の技術を適用してコンジュゲーションを達成することができる。さらに、インプラント、医療装置またはナノ粒子以外のキャリアで、本明細書で説明するような補体活性化ポリマーの層を受けるようにしてもよいし、ポリマーまたはヒドロキシルをこのような材料に直接導入することも可能である。アジュバント開発にあたっては、ＤＣなどの細胞をリポ多糖（ＬＰＳ）などのＴｏｌｌ様受容体の外来性活性化因子によって活性化させるのに科学者らが従来の手法を用いた［１１９〜１２１］。しかしながら、特定のナノ粒子表面化学が異なる態様の自然免疫すなわち補体カスケードを活性化できることが発見された。本明細書における詳細な例は、ヒドロキシル化および／またはナノ粒子が補体カスケードの内在性成分を活性化可能であることならびに、これがひいてはＤＣを含むＡＰＣを活性化させ、Ｔ細胞依存性体液性免疫および細胞免疫を誘導可能であることを実証するものである。他の実施形態は、チオールまたはチオールとヒドロキシルの両方を有する、ヒドロキシルまたはナノ粒子を提示するための別のスキームでのナノ粒子である。アジュバントとしてのナノ粒子での他の研究では、補体の機序を用いることなく、ＤＣが標的されて活性化される程度をポリマーナノ粒度で判断した。カルボキシル化ポリスチレンナノ粒子中間体（４５ｎｍ）サイズのナノ粒子がＤＣによって取り込まれ、これを活性化させるが、これより小さなもの（２０ｎｍ）はそうではない［１１６］。しかしながら、本明細書にて説明するナノ粒子を用いると、補体を活発に活性化可能であり、これによってＤＣを活性化させ、適応免疫応答のＴ細胞依存性体液性および細胞性の態様を誘導するための強力なシグナルが得られる。
【００６４】
補体活性化は、適応免疫応答、特にＢ細胞免疫を亢進することが知られている。過去の研究では、補体タンパク質Ｃ３ｂおよびＣ３ｄをＢ細胞依存性体液性免疫亢進用の分子アジュバントとして利用できることが実証された。モデル抗原に対するＣ３ｂまたはＣ３ｄの融合によるマウスの免疫化によって、遊離抗原単独の場合に比して後天性免疫Ｂ細胞応答が有意に増加することが実証される［１３４、１３５］。Ｃ３ｂおよびＣ３ｄアジュバントが働く機序は、ＣＤ１９すなわちＢ細胞活性化の周知の増幅器と関連するＣ３ｄ受容体（ＣＤ２１／３５）の直接的な結合による場合がある。しかしながら、ＣＤ２１／３５は、このＢ細胞応答に常に必要とは限らないことが見出されている［１３６］。Ｃ３ｂ−およびＣ３ｄ−抗原融合に対してひとつ確実なのは、そのアジュバントの体液性免疫能がＢ細胞との直接的な相互作用によるものだということである［１３７］。これは、本明細書にて教示するような、ＤＣによって抗原が取り込まれると生じるＴ細胞依存性体液性免疫、ＤＣの成熟、ＤＣプロセスとは異なり、ＭＨＣ  ＩＩを介してＣＤ４Ｔ細胞に抗原を提示し、ＣＤ４Ｔ細胞がＢ細胞に抗原を提示し、最後にＢ細胞が抗体を産生する。補体はＴ細胞依存性免疫に関与することが発見されたが、これが起こることによる機序は説明されていない［１３８］。さらに、補体の活性化をＴ細胞依存性免疫に対する分子アジュバントとして利用できるであろうことも、過去には示唆されていない。
【００６５】
しかしながら、本明細書の系は、補体の活性化をどのようにＴ細胞依存性免疫用の分子アジュバントとして利用できるかについて説明するものである。さらに、いくつかの実施形態は、ナノ粒子表面化学によって補体を活性化させるナノ粒子を含む。具体的には、例えば、ヒドロキシル化および／またはチオラート化ナノ粒子がＤＣの成熟を誘導することを、結果が示しており、ヒドロキシル化および／またはチオラート化表面による補体の活性化をＤＣの成熟誘導の危険シグナルとして利用できることを初めて実証している。また、本明細書で説明するように、ヒドロキシル化および／またはチオラート化ナノ粒子による補体活性化を、ＤＣによるＴ細胞依存性体液性免疫および細胞免疫の誘導に対するアジュバントとして使用する。
【００６６】
免疫系標的
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ＭＨＣクラスＩ、ＩＩおよび他の同時刺激型分子（すなわち、ＣＤ８６およびＣＤ８０）を利用して未変性Ｔ細胞を刺激し、細胞性免疫を誘導する極めて効率的な食細胞である。いくつかのマクロファージおよび一層強力な樹状細胞（ＤＣ）を含むＡＰＣが末梢組織に存在し、そこで内部移行と外来抗原のプロセシング後に成熟してＴ細胞に対する抗原提示目的でリンパ節に移行するセンチネルとして作用する［１〜３］。ＡＰＣおよびＤＣが適応免疫で果たす決定的な役割を利用して、ＤＮＡ、タンパク質、ポリペプチドなどの免疫調節剤でこれらの細胞を標的するための様々な実験がなされている［４〜１４］。ポリペプチドとは、互いに結合された２つ以上のアミノ酸を示す用語であり、タンパク質を含む。
【００６７】
ポリマーベースおよびリポソームベースの供給系では主に、末梢ＤＣへのタンパク質およびＤＮＡの送達に焦点を当てており、そこでまずは薬剤ビヒクルを内部移行した上で、約１〜２日以内にリンパ節に移行してＴ細胞を活性化させる［９、１２、１３］。最近まで、抗原を取り込める未熟なＤＣがリンパ節に存在することは明らかではなかった。しかしながら、最近の研究で、リンパ節における内在ＤＣのかなりの画分が表現型的に未熟であり、抗原および粒子をそこで内部移行できることが証明された［１５、１６］。よって、本明細書にて説明するように、内在リンパ節ＡＰＣも免疫治療剤または他の治療剤の標的として利用できる。末梢部位ではなくリンパ節におけるＡＰＣまたはＤＣを標的することによる潜在的な利益として、早熟な抗原提示（すなわち、リンパ節に到達する前に表面で抗原を発現する移行途中のＤＣ）が免疫細胞の寛容につながり得る場合が多い点があげられる［１３、１７、１８］；したがって、リンパ節ＡＰＣへの送達は、この問題を潜在的に防止する。さらに、他のＤＣ標的研究では、抗Ｄｅｃ−２０５および抗ＣＤ１１ｃなどのコンジュゲート化標的用リガンドを使用して、ＤＣ特異性を高めている［４、５、８、９、１２、１９］。
【００６８】
しかしながら、従来には理解されていないことに、ＤＣが生来、高度に食作用性であり、高濃度でリンパ節に存在する事実を効果的に活用できる点がある。このため、本明細書にて説明するように、標的用リガンドを使用しない標的化をはじめとして、これらの細胞をリンパ節で特異的に標的するための材料および方法が開発されている。標的用リガンドとは、細胞表面レセプターまたは細胞表面タンパク質などの細胞上の特定の化学基と特異的に結合する化学基を示す。よって、いくつかの実施形態は、サイズおよび他の物性に基づいて標的可能であり、外来性のポリペプチドを使用せず、外来性リガンドを使用せず、外来性の核酸を使用せず、その抗体または断片を使用せず、あるいは、受容体、細胞表面分子、細胞外マトリックス分子、細胞表面抗原、細胞マーカー分子または多糖に対する外来性リガンドを使用せずに、標的される。
【００６９】
リンパ節においてＤＣをはじめとするＡＰＣを標的するためには、本明細書にて実証するように、リンパ管に容易に取り込まれて流入領域リンパ節に保持可能な送達ビヒクルを設計すると有用である。送達ビヒクルとは、抗原または免疫抑制薬などの治療剤を送達する粒子またはミセルなどの作用剤を示す。リンパ系の主な役割のひとつに、微小循環の小さいが重要な成分としての間質腔からの流体および微粒子の取り込みがある［２０〜２３］。
【００７０】
リンパ系を調べるためにリポソームおよびポリマー粒子を用いる他のｉｎ  ｖｉｖｏリンパ標的実験研究では、粒度が間質腔からのリンパ取り込みの要因となり得ることが示された［２１、２４〜２９］。１７０ｎｍを超えるリポソームは通常、リンパ取り込みが悪く、注入部位にとどまったのに対し、４０〜７０ｎｍの範囲の粒子ではリンパ管への有意な取り込みが認められた［２５］。
【００７１】
カルボキシル化ポリスチレン粒子を用いるこのような研究のひとつでは、４０〜５０ｎｍという狭い範囲の粒子だけが、このサイズがＤＣに認識される危険シグナルであるがゆえに実用上有用である旨が教示される；結果として、ＤＣは皮膚部位で活性化され、リンパ節では活性化されない［１１６］。このポリスチレンビーズの研究によって、ビーズが小さめ（２０ｎｍ）および大きめ（＞１００ｎｍ）のサイズよりも中間のサイズ（４０ｎｍ）でリンパ節に蓄積されることが示され、４０〜５０ｎｍがビーズとして使用すべきサイズである旨が教示された。特に、この研究では、極めて小さな粒子（２０ｎｍ）と大きめの粒子（１００ｎｍ）は、ＤＣ抗原ＤＥＣ２０５で示されるようなＤＣマーカー陽性の細胞には４０ｎｍの粒子に比して蓄積量が有意に少ないことが認められたと示された［１１６］。著者らは、４０ｎｍのポリスチレンビーズが、皮膚部位におけるＤＣの活性化とリンパ節への移行を引き起こすため、４０ｎｍのビーズはリンパ節の内在ＤＣを標的しない可能性を教示している。
【００７２】
さらに、ポリスチレンビーズの研究では、ＤＣがウイルスのサイズの範囲を認識するよう進化してきたがゆえに、ビーズのサイズがＤＣにとっての危険シグナルである旨も教示している。このため、正しいサイズのビーズがＤＣによって末梢で認識される状態で、ビーズのサイズがＤＣ標的の成功を制御し、ＤＣの活性化を引き起こすであろう。この教示内容は、本明細書で説明するようにＤＣの活性化に小さめのナノ粒子（約４０または約３５または約２５ｎｍ未満）を用いて成功することとは、明らかに対照的である。この教示内容はまた、危険シグナルとしての補体を活性化させるのにヒドロキシルおよび／またはチオラート化表面化学を利用する、ナノ粒子などにおける表面化学が危険シグナルであることを示す本明細書における結果とは対照的である。さらに、本明細書における結果は、粒度をＤＣのサイズの認識ではなくリンパ節標的能力に関連付けるものである。例えば、２５ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化補体活性化ナノ粒子は、ｉｎ  ｖｉｖｏ注入後にＤＣの活性化と適応Ｔ細胞免疫において１００ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化補体活性化ナノ粒子よりも優れていた。
【００７３】
少なくともある程度は、便利な合成特性およびエマルション重合特性がゆえに狭くて制御可能なサイズの分布を得られることが理由で、実験モデル系にはカルボキシル化ポリスチレンビーズが使用されていた［１１６］。これを治療用または予防用の系として用いることに対する潜在的な欠点は、ポリスチレンビーズに関連している。例えば、このような粒子を分解でき、体内から除去できる生物経路が存在しない。対照的に、本明細書で説明するような生分解性の系は、エンドサイトーシスおよびプロセシング後に生じる酸化条件下で分解されるＰＰＳナノ粒子の場合のように、ｉｎ  ｖｉｖｏでの環境に応答して容易かつ効果的に可溶性ポリマーに分解される。ナノ粒子の分解には利点があり得るが、アジュバントとして用いる上での必須要件ではない。
【００７４】
粒子表面と間質との相互作用は、リンパ取り込みで何らかの役割を果たす他の要因であり得る［３０］。リポソームおよび粒子にポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）ならびに、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（ポリ（エチレングリコール）のコポリマーを含む）−ｂｌ−ポリ（プロピレングリコール）−ｂｌ−ポリ（エチレングリコール）などのそのコポリマー）などの親水性層を被覆することによる立体的な安定化によって、皮下注入後にリンパ取り込みが改善されることで実証されているように、間質のタンパク質との非特異的相互作用を減らせることがある［２１、２７、３１〜３５］。これらの事実はいずれも、リンパ取り込みに関して粒子の物性が持つ重要性を示すものである。
【００７５】
しかしながら、小さめの粒子は一層容易に取り込まれるが、リンパ節からも一層容易に出るため、効率的なリンパ取り込みとリンパ節保持の両方を実現することが重要である。したがって、特定のナノ粒子の実施形態は、本明細書に記載の実施例および実施形態から明らかなように、取り込みと保持の両方に対処する特徴を有する。例えば、ナノ粒子のサイズに関して、リンパ系の研究調査では、注入後１２時間を超えると注入した７０ｎｍのリポソームのわずか１〜２％しかリンパ節に保持されず［３０］、大きなリポソーム（＞７０ｎｍ）の節保持のほうが小さめのリポソームの場合よりも効率的である［２４、２９］ことが示された。これは、明らかに一部はリンパ節のマクロファージが大きめの粒子のほうを一層効率的に貪食するという事実によるものである。従来はリポソームをＰＥＧなどの立体保護剤で被覆するとマクロファージによる貪食が低減されるはずだと仮定されていたが、このような被覆はリンパ節保持に有意に影響しないことが示された［３６］。また、従来は、リンパ節で貪食される粒子は主にマクロファージによって貪食されると仮定されていた［２１、２７、２９、３０、３２、３６、３７］。カルボキシル化ポリスチレンナノ粒子を用いると、２０ｎｍのナノ粒子がｉｎ  ｖｉｖｏでは４０ｎｍのナノ粒子よりもＤＣによってかなり少なく取り込まれることが見出された［１１６］。よって、マクロファージによる取り込み用の送達用薬剤以外に、ＤＣをはじめとする他のＡＰＣ取り込み用の薬剤をリンパ節に送達すると好都合である。後述するように、本発明による粒子の特定の実施形態は、事実、少なくとも２０ｎｍという小さなサイズでもＡＰＣおよび／またはＤＣによって取り込まれる。
【００７６】
過去の研究では、抗原取り込み後、ＤＣの成熟とその後の細胞性免疫の誘導には、炎症性サイトカイン（すなわちＣＤ４０リガンド）などの強力な生物学的「危険シグナル」が必要であると示唆された［５、１２、３８］。しかしながら、このようなシグナルに先んずると好都合なことがある。事実、いくつかの実施形態では、ポリペプチド、抗体、核酸配列などの従来の生物学的生体分子の「危険シグナル」の使用を回避するのは、ナノ粒子自体が成熟刺激として用いられることである。これらの結果は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのナノ粒子の内部移行後に観察されたＤＣの成熟応答において明らかである。
【００７７】
ナノ粒子製剤
本明細書にて説明するように、サイズはリンパ節でのナノ粒子の取り込みと保持に関連している。ナノ粒子のリンパ取り込み、リンパ節保持ならびにリンパ節内やそこの細胞集団での局在について、本明細書にて説明する。従来の手法を用いることに伴う課題のひとつに、効率的なリンパ取り込みとリンパ節保持を得ることがある。なぜなら、サイズや表面特性などのナノ粒子の特性は、矛盾する作用であり得るからである。通常、小さめの粒子は大きめの粒子よりもリンパに取り込まれやすいが、リンパ節保持率は低い。サイズが直径約５ｎｍ〜約１００ｎｍのナノ粒子が好ましい。２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５または８０ｎｍなど、明示的に示した範囲内の範囲と値がすべて企図されることは、当業者であれば自明であろう。ナノ粒子については、平均直径が約５〜約１００ｎｍの粒子の集合体で製造してもよい。約１０〜約７０ｎｍなど、明示的に示した範囲内の範囲と値がすべて企図されることは、当業者であれば自明であろう。このような粒子集合体のサイズの分布は、粒子集合体の平均直径前後の変動係数（標準偏差を平均粒度で割ったもの）が、約５０、約３５、約２０、約１０または約５ｎｍ未満になるように制御可能である［３９］。明示的に示した範囲内の範囲と値がすべて企図されることは、当業者であれば自明であろう。
【００７８】
物性は、リンパ節での取り込みおよび保持後のナノ粒子の有用性にも関連している。これには、捩り剛性または弾力性などの機械的特性も含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧでの場合、全身（ただし標的されていないか免疫ではない）送達用に最近開発されて特徴付けられたＰＰＳ−ＰＥＧ系での場合ように、親水性重層などの重層のあるポリ（プロピレンスルフィド）（ＰＰＳ）コアなどのゴム状のコアを利用している［３９、４０］。対照的に、ゴム状コアはポリスチレンまたは金属ナノ粒子系での場合のように実質的に剛性のコアである。ゴム状という表現は、天然ゴムまたは合成ゴム以外の特定の弾力性材料を示し、ゴム状とはポリマー業界の人々によく知られた表現である。例えば、架橋ＰＰＳを用いて、疎水性のゴム状コアを形成することが可能である。ＰＰＳは、酸化条件下で分解してポリスルホキシドになり、最後にポリスルホンになるポリマーである［４１］ため、疎水性ゴムから親水性の水溶性ポリマーへと遷移する［３９］。スルフィドポリマーという用語がポリマーの骨格に硫黄を含むポリマーを示すという前提で、他のスルフィドポリマーを使用に適することもある。使用できる他のゴム状ポリマーには、ガラス転移点が約３７℃未満である水和条件未満のポリエステルがある。疎水性コアを親水性の重層とともに都合よく用いることも可能である。なぜなら、コアと重層は混ざりにくいため、重層はコアから離れて立体的に拡張しやすいからである。コアとは、表面に層がある粒子を示す。層とは、コアの少なくとも一部を覆う材料を示す。層は、吸着または共有結合的に結合されてもよい。粒子またはコアは、実質であっても中空であってもよい。ゴム状の疎水性コアを有する粒子のほうが多くの疎水性薬剤を吸着して持てるという点で、結晶性またはガラス質（ポリスチレンの場合など）のコアなどの剛性の疎水性コアよりもゴム状の疎水性コアのほうが都合がよい。
【００７９】
もうひとつの物性に表面の親水性がある。親水性材料は、架橋していない状態で水に対する溶解性が１リットルあたり少なくとも１グラムである。親水性ポリマーを用いる粒子の立体安定化によって、非特異的相互作用を低減することで間質からの取り込みを改善できる。しかしながら、粒子のステルス性が高まることで、リンパ節における食細胞による内部移行が低減される可能性もある。しかしながら、これらの拮抗する特徴のバランスを取るという課題は解決されておらず、本出願では、リンパ節でＤＣおよび他のＡＰＣに効果的にリンパ送達するためのナノ粒子の製造について説明している。よって、いくつかの実施形態は、親水性材料の層などの親水性成分を含む。好適な親水性材料の例として、ポリアルキレンオキシド、ポリエチレンオキシド、多糖、ポリアクリル酸、ポリエーテルのうちの１つ以上があげられる。層におけるポリマーの分子量を調節して、約１，０００〜約１００，０００またはそれより多くなどの有用な度合いの立体障害をｉｎ  ｖｉｖｏで得ることが可能である。１０，０００〜５０，０００など、明示的に示した範囲内の範囲と値がすべて企図されることは、当業者であれば自明であろう。この例には、エマルションとしての合成時に安定剤として用いられたＰＬＵＲＯＮＩＣ由来のＰＥＧである親水性表面を有する粒子を含む。
【００８０】
以後の反応のために、ナノ粒子に官能基を取り込んでもよい。以後の反応用の官能基としては、求電子試薬または求核試薬があげられる。これらは他の分子と反応させるのに便利である。求核試薬の例としては、第１級アミン、チオール、ヒドロキシルがあげられる。求電子試薬の例としては、サクシニミジルエステル、アルデヒド、イソシアナート、マレイミドがあげられる。例えば、一例としてＰＰＳ−ＰＬＵＲＯＮＩＣナノ粒子を使用すると、実施例１で説明するような粒子が合成され、ＰＬＵＲＯＮＩＣの２％がＯＶＡ／ＯＶＡ２５７−２６４／ＯＶＡ３２３−３３９誘導体化ＰＬＵＲＯＮＩＣに置換されるという差異がある。総量で１．５％のＰＬＵＲＯＮＩＣを使用する。反応時間を２時間まで減らし、塩基を１：１の等モル比で開始剤−チオールに加えて、ナノ粒子の合成時にタンパク質またはペプチドが塩基条件に曝露されるのを減らす。このスキームは、ＰＥＧ官能化のひとつの例示的な方法にすぎず、コンジュゲート対照となるタンパク質またはペプチドに応じて他のいくつかの手法を利用することも可能である［１１１］。
【００８１】
また、このナノ粒子は、補体活性化用の官能基またはモチーフを取り込むこともできる。好ましい官能基にヒドロキシルがあるが、これは本明細書に記載したような補体の活性化に特に効果的である。求核性である他の官能基は、Ｃ３のチオエステルと反応可能である。リンパ節におけるＤＣをはじめとするＡＰＣを標的するにあたり、ヒドロキシル化ナノ粒子表面が特に有用であることが、本明細書にて実証される。本明細書の例でのＰＰＳナノ粒子の場合、ヒドロキシル基で終端したＰＬＵＲＯＮＩＣでの安定化によって水酸化が得られた。これらのヒドロキシル基をメトキシ基に変換し、ヒドロキシ基をブロックすると、ナノ粒子はアジュバントとしてはうまく機能しなかった。このヒドロキシル化ナノ粒子をＣ３−／−マウスで試験すると、そのアジュバント作用が大幅に減少した。これらの結果に、本明細書における例で説明するＣ３活性化の測定値を組み合わせると、補体活性化ナノ粒子でＤＣをはじめとするＡＰＣを標的することの特定の有用性が実証される。よって、いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、補体を活性化させるのにＯＨだけに頼っており、ｐＨ７．０〜７．４のカチオン、アミン、第１級アミン、第２級アミン、ｐＨ７．０〜７．４のアニオン、チオール、ｐＨ７．０〜７．４の双性イオンのうちの１つ以上を除外している。あるいは、このような基はナノ粒子に存在するが、このような基のうちの１つ以上を除外するのはナノ粒子上のポリマーの層である。あるいは、ナノ粒子および／または層が、ＯＨ以外にはｐＨ７．０〜７．４でイオンを効果的に形成できる基を持たない。
【００８２】
官能基は、利用可能なように必要に応じて粒子上に局在可能である。ひとつの場所として、コアポリマーまたはコア上の層であるポリマーまたは粒子と他の形で繋留されたポリマー上の側鎖または末端としてのものが可能である。例えば、特異的な細胞標的またはタンパク質およびペプチド薬剤送達用に容易に官能化可能なナノ粒子を安定化させるＰＥＧについて説明した例が本明細書に含まれる。
【００８３】
ポリマーおよび／または粒子および／または層のすべてまたは一部を生成するのに、生分解性ポリマーを利用してもよい。生分解性とは、自然な加水分解、特定のアミノ酸配列を切断する酵素による化学攻撃、あるいは酸化の影響を受けやすい官能基の取り込みによって分解されるポリマーを示す。自然な加水分解が生じるポリマーは、官能基が溶液中の水と反応した結果として、ｐＨ７．０〜７．４に保たれた水溶液中にてｉｎ  ｖｉｔｒｏで分解される。「分解」という用語は、本明細書にて使用する場合、分子量の減少（ポリエステルの場合と同様）または疎水基から親水基への変換（ＰＰＳの場合と同様）のいずれかによって、可溶性になることを示す。ポリラクチドおよびポリグリコライドなど、エステル基を有するポリマーは通常、自然に加水分解される。コラゲナーゼまたはメタロプロテイナーゼによって分解されるなど、特異的な酵素攻撃にさらされる多くのペプチド配列が周知である。生物学的フリーラジカル機序によってのみ分解される配列は特異的には分解されない。酸化感受性の官能基を有するポリマーは、おだやかな酸化剤によって化学的に変化する。これについての試験では、１０％の過酸化水素に２０時間ｉｎ  ｖｉｔｒｏで曝露することで、可溶性が増加している。例えば、ＰＰＳは酸化の影響を受けやすいポリマーである［３９］。
【００８４】
特定の実施形態では、ＰＰＳ粒子を例示的な系として使用してどのようにナノ粒子を製造および使用するかを示したが、別の材料を使用してもよい。通常、粒子系の各成分の特徴は、機能的粒子を製造する必要性に導かれるように、自由に混合および整合できる。例えば、小さい（約１００ｎｍ未満または約７０ｎｍ未満など）がゆえにリンパ循環に効率的に侵入する他の粒子を使用してもよい。このような粒子を、任意にＰＥＧの重層でグラフトしてもよいし、そうでなければ親水性ポリマーを取り入れてもよく、任意に抗原、危険シグナルまたはその両方とグラフトしてもよい。例えば、ＰＥＧ含有ブロックコポリマーを適当なサイズの分解可能なポリマーナノ粒子に吸着可能であり、抗原をさらにそのような処理済みポリマーの表面と結合可能である。もうひとつの例として、ＰＥＧ含有ブロックコポリマーを適当なサイズの無機ナノ粒子に吸着可能であり、抗原をさらにそのような処理済みポリマーの表面に結合可能である。ナノ粒子コアの分解が望ましいこともあるが、必ずしも必要とされるわけではない。
【００８５】
ミセル系についても、ポリ（エチレングリコール）およびＰＰＳのＡＢおよびＡＢＡブロックコポリマーから形成されたミセルをはじめとして、上述したものと同じ有用な特性を呈することがある［１００〜１０４］。約４０％過剰などの比較的高いポリ（エチレングリコール）の分子画分を有するこのようなコポリマーが形成されると、球状ミセルが特定の条件下で形成されると想定できる。これらのミセルは、リンパ侵入について上述したサイズを満たすなどの小さなものであってもよく、任意にＰＥＧの重層とグラフトしてもよいし、そうでなければＰＥＧまたは他のポリマーを取り入れて同様の特性を達成してもよい。さらに、本明細書にて教示するような抗原、危険シグナルまたはその両方と、ミセル表面でコンジュゲート可能でもある。ブロックコポリマーは、補体活性化の場合はヒドロキシル基で終端でき、親水性ブロックがヒドロキシル基で終端すると、このヒドロキシル基が補体結合用にミセルのナノ粒子表面で一層容易に利用できるようになるため、特に利点がある。このようなヒドロキシル化されたこのような表面を調整して、補体を効果的に活性化させることが可能である。特に有用な親水性ブロックのひとつに、ヒドロキシル基で終端されたＰＥＧがある。ミセル形成ポリマーのアーキテクチャに加えて、ブロックのサイズとブロックのサイズの比も選択して、小胞構造を形成することが可能である。また、使用できるミセル製剤の他の多数の可能な化学的組成物も存在する［１０５〜１０８］。
【００８６】
ポリマーミセルは、サイズの分布が極めて狭い極めて小さな構造を生成するという視点ならびに、架橋されたコアナノ粒子よりも体内から短時間で除去されるという視点で、好都合なことがある。この特徴は、表面ヒドロキシル基ならびに表面チオール基を呈することのできるミセルとして生成したポリエチレングリコール−ポリ（プロピレンスルフィド）（ＰＥＧ−ＰＰＳ）ナノ粒子で実証された。実施例２３などを参照のこと。末端−ＳＨ基のブロックありまたはブロックなしでのヒドロキシル−ＰＥＧ−ＰＰＳの合成に対する一経路を図２２に示し、メチル−ＰＥＧ−ＰＰＳの合成に対する一経路を図２３に示す。
【００８７】
部分を、抗原、ペプチド、抗体、抗体断片、核酸、核酸断片などの分岐ポリマーまたはナノ粒子に結合してもよい。ミセルのナノ粒子に対する部分の結合例については後述し、図２４〜図２７ならびに図２９に示す。実施例２３も参照のこと。図２８は、ミセルとして調製したナノ粒子が架橋させたコアナノ粒子に匹敵することを示す詳細な実験の結果をまとめたものである。ＮＰＨＳ０４０の表示を付したバーは、ヒドロキシルおよびチオール表面基のＰＰＳ架橋コアナノ粒子である。
【００８８】
いくつかの実施形態では、ミセル状ナノ粒子を調製し、乾燥させてミセルの構造を保持し、これらは、ミセルが通常は溶液中の構造を示す用語であることを認識しつつ、「乾燥ミセル」と呼ばれる。乾燥ミセルを形成する方法のひとつに、ミセルの集合体を凍結させ、これを凍結乾燥させて水を除去することがあげられる。得られる材料は、使用するまで０℃未満の温度に保ってもよいし、これより高めの温度で貯蔵してもよい。また、真空蒸発またはスプレー乾燥などの他の乾燥プロセス後に、乾燥ミセルを乾燥状態で貯蔵してもよい。この乾燥ミセルは、乾燥したまま投与してもよいし、投与前に再水和させてもよい。あるいは、ミセルを溶液中で凍結させ、凍結状態で投与してもよいし、室温の生理学的に許容可能な溶液を加えるなどして使用前に解凍してもよい。
【００８９】
ポリマー系によっては、それ自体がナノ微粒子であり、ナノ粒子の用語に含まれる。例えば、デンドリマーは、１０ｎｍの範囲のナノ微粒子であり得る一種のポリマーである［１４１］。これらのポリマーは、多数の官能基をその表面に含み、それが例えば生体分子および他の基とのコンジュゲートに用いられてきた［１４２、１４３］。同様に、抗原をデンドリマー表面にコンジュゲートさせることもできよう。さらに、デンドリマー表面の官能基を、例えば水酸化によって補体の活性化に合わせて最適化することもできる。デンドリマー−ＤＮＡ複合体の中には、補体を活性化させることが実証されたものもある［１４４、１４５］。このように、デンドリマーは、例えば米国特許出願公開第２００４／００８６４７９号明細書、同第２００６／０２０４４４３号明細書、米国特許第６，４５５，０７１号明細書、同第６，９９８，１１５号明細書（本明細書に明示的に開示されていることと相反しない程度に、参照により本明細書に援用する）に記載されているように、本明細書に記載の技術を用いて、リンパ標的用、抗原コンジュゲーション用、補体活性化用として適応可能な興味深いナノ微粒子化学を示す。
【００９０】
樹状分子は、中央のコアから放射状に広がる多くのアームおよびサブアームに原子が配置される、繰り返し分割されるポリマーである。デンドリマーは、対称性および多分散性の両方での評価に基づいた場合に、その構造的な完全性が特徴であり、合成に特定の化学プロセスを必要とする。このため、当業者であればデンドリマーのナノ粒子と非デンドリマーのナノ粒子とを容易に区別できる。本明細書におけるナノ粒子の実施形態は、非デンドリマーのナノ粒子を含む。非デンドリマーの中には、重合度が少なくとも５の分岐鎖を有する分岐ポリマーのナノ粒子もあり、ここで分岐鎖という用語は、分岐点間に存在するポリマー鎖部分を示す。非デンドリマーの中には、重合度が少なくとも５のポリエチレングリコールなど、分子量が少なくとも２００の分岐鎖を有するものもある。
【００９１】
デンドリマーは、特定の環境におけるその成分ポリマーの溶解性に対する依存性が極めて高い形状を有し、温度、ｐＨ、イオン含有量の変化などの周囲の溶媒または溶質に応じて、あるいはＤＣによる取り込み後に、劇的に変化することがある。対照的に、物理的な寸法がデンドリマーまたは他の単なる分岐鎖ポリマー系よりも比較的安定したナノ粒子は、貯蔵目的に、あるいは関するものとして、あるいは生物活性に有用となり得て、例えば、親水性コロナを有する固体コアが、コロナをその環境に一貫して提示し得る。このため、ナノ粒子のいくつかの実施形態では、デンドリマーではない粒子か、固体のコアを有する粒子および／または架橋されたハイドロゲルであるコアを有する粒子に頼っている。ＰＰＳを主成分とするナノ粒子はデンドリマーではなく、固体のコアを有する。
【００９２】
実施形態には、補体を活性化できる、本明細書で説明するような部分を呈する極めて小さなナノ構造が含まれる。このような構造は、抗原または他の部分も提示することがある。特定の実施形態は、重合度が少なくとも約５で分岐経路または複数の分岐経路を有する分岐鎖ＰＥＧといった分岐鎖ポリマーなどの水溶性の多官能性ポリマーである。水溶性とは、溶解性が水１リットルあたり少なくとも１グラムの材料を示す用語である。図３０（実施例２４参照）は、ヒドロキシル末端基を有する８アーム（８末端）の分岐鎖ＰＥＧ（合計ＭＷ約４０，０００）がｉｎ  ｖｉｖｏで樹状細胞を効果的に活性化させたことを示す。図３１は、分岐鎖ＰＥＧを製造するための詳細なスキームを示す。末端とは、ポリマー末端基を示し、８アームの分岐鎖ＰＥＧは８つのヒドロキシル末端を有する。分岐経路とは、ポリマー骨格またはコアから伸びている側鎖を示す。対称なポリマーの場合、コアは分子の中心部分である。骨格という用語は、これらの技術分野では一般的であり、その境界と範囲は当業者であれば自明であろう。
【００９３】
このため、実施形態は、分子量１０，０００〜１，０００，０００、分子量４〜５，０００末端の水溶性ポリマーを含み、例えば実施例２４および／または図３０の方法で試験すると、このポリマーが樹状細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで活性化させる。少なくとも４末端、または少なくとも８末端、または４〜２０末端など、明示的に示した範囲内の範囲と値がすべて企図されることは、当業者であれば自明であろう。ポリマーは、間質組織を介して浸透し、流入領域リンパ内でこれを回収できるようにするサイズであり、そこに内在するＡＰＣの標的を可能にしている。そのようなものとして、長めのポリマーのほうが組織のタンパク質およびグリコサミノグリカン網内で纏絡されやすいという点で、同じ分子量と末端数の長い分岐鎖ポリマーよりも球状の分岐鎖ポリマーが好ましいこともある。それにもかかわらず、間質組織への浸透が適切であるかぎり、側鎖分岐のある長いポリマーが有用である。そのようなものとして、実施形態は、１つまたはいくつかの中心分岐点から出る分岐鎖ポリマーならびに、側鎖分岐のある長いポリマーの両方を含む。分岐鎖ポリマーは、非樹状ポリマーであってもよい。
【００９４】
図３１のとおり、分岐鎖ポリマーはさらに、アミンまたはチオールなど、以後の反応用に官能基を含有してもよい。また、本明細書で説明するように、抗原または危険シグナルなどの他の部分を結合してもよい。さらに、ポリマーを生分解性の基で生成してもよい。本明細書に記載の様々な実施形態では、ナノ粒子の用途と修飾について説明している。これらの用途と修飾は、本明細書で説明するような水溶性デンドリマーまたは分岐鎖材料にも適用できる。
【００９５】
ナノ粒子を、水様コアベシクルなどのベシクルとして生成してもよい。水様コアベシクルは、両親媒性コポリマーなどで生成でき、ナノ微粒子構造および寸法を達成するよう処理される。ベシクルを、還元の影響を受けやすいリンケージで生成してもよい。ベシクルを、抗原部分または治療用部分との関連で生成してもよい。
【００９６】
ナノ粒子を用いる免疫療法
使用時、このようなナノ粒子は、リンパ節でＡＰＣ、特にＤＣを標的するための抗原および薬剤送達ビヒクルなどとして有用である。抗原および／または薬剤および／または危険シグナルをリンパ節でＤＣに送達する機能は、免疫療法にとって有用な手法である。ナノ粒子でリンパ節ＤＣおよび他のＡＰＣを効果的に標的する機能がゆえに、抗原タンパク質およびポリペプチドおよび抗原コード核酸を送達するための方法が得られる。ＤＣはＴ細胞に対する抗原提示によって細胞性免疫の開始に臨床的に関与するため、この送達手法をいくつかのワクチンおよび免疫療法での用途に利用可能である。さらに、ナノ粒子は、診断ツール（イメージングなど）、リサーチツール（ＡＬＤＲＩＣＨカタログで販売されているようなものまたは顕微鏡を用いた可視化など）またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬剤送達または可視化（薬剤またはイメージング剤などのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡＰＣおよび／またはＤＣおよび／またはマクロファージ取り込みなど）として有用である。
【００９７】
抗原および／または薬剤および／または危険シグナルを粒子に共有結合的に結合、粒子に吸着、粒子にロードまたは粒子の集合体と混合して、患者に同時導入してもよい。共有結合するためのモチーフについては本明細書の他のところで説明し、この例に適用してもよい。吸着は、あらかじめ定められた時間、作用剤と粒子とを混合した後、遠心分離または濾過などによって粒子を混合物から物理的に分離することで達成可能である。分離は、混合物を注入して拡散および対流力で成分を分離させるなどの方法で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは体内で、投与前または投与後に実施すればよい。ローディングは、粒子合成時または粒子合成後に実施すればよい。例えば、ミセルベースの重合での場合のように、吸着または相分離によって捕捉される作用剤の存在下、粒子を重合してもよい。合成後のローディングは、粒子を膨潤させるか作用剤の容易な拡散を可能にする第１の溶媒にて粒子を作用剤に曝露した後、この粒子を、粒子を縮小させるか作用剤の拡散を停止または遅らせる水溶液に戻す第２の溶媒に曝露するなどして、必要に応じて実施すればよく、例えば、疎水性薬剤を有機溶媒にローディングし、粒子を水溶液に保存するなどである。同時導入用の混合については、抗原および／または薬剤および／または危険シグナルの溶液が入った注入器に粒子を導入し、これを患者に同時注入するなどして達成すればよい。
【００９８】
本明細書で説明するようなミセルを含むナノ粒子または分岐鎖ポリマーは、ヒドロキシルおよび／またはチオールなど、活性化用の官能基を含むものであってもよい。また、アミン、チオール、不対システイン残基など、さらに誘導体化するための別の官能基を用いて材料を調製してもよい。いくつかの実施形態では、免疫活性化とさらなる誘導体化の両方のための官能基を用いてナノ粒子または分岐鎖ポリマーの集合体が調製される。他の実施形態では、ナノ粒子または分岐鎖ポリマーの集合体を、免疫活性化用の官能基または誘導体化用の官能基を用いて調製し、この集合体を患者に対して別々にまたは混合物として投与あるいは、別々ではあるが基本的に同時に投与する。誘導体化可能な基を有するナノ粒子または分岐鎖ポリマーを、本明細書で説明するような部分で誘導体化し、誘導体化材料の集合体を生成してもよい。どの集合体についてもさらに、本明細書で説明するように吸着された作用剤または可溶性作用剤と組み合わせてまたは混合して使用してもよいし、本明細書で説明するように作用剤でロードしてもよい。方法は、ナノ粒子または分岐鎖ポリマーでのリンパ節におけるＡＰＣまたはＤＣの成熟の刺激を含む。
【００９９】
ミセルを含むナノ粒子または分岐鎖ポリマーを調製して、適応免疫系の完全応答を活性化してもよい。例えば、実施例１８〜２１を参照のこと。方法は、リンパ節においてＡＰＣまたはＤＣでＴｈ１バイアス応答および／またはＩＬ−１２分泌および／またはＴＬＲ４による免疫応答を刺激するのに効果的な量で材料を投与することを含む。方法は、任意に産生なしまたは本質的に（これらの分子で一般的に用いられているアッセイで患者の血液試料にて検出可能ではないという意味）ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−６産生なしで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ免疫応答（完全適応免疫応答、補体活性化、抗体産生、ＩＬ−１２分泌、ＡＰＣ成熟、ＤＣの成熟、ＣＤ８０−誘導）を刺激することを含む。
【０１００】
ナノ粒子および免疫抑制薬を用いる免疫療法
免疫抑制は、臨床移植（同種移植片など）および自己免疫疾患（多発性硬化症など）の状況で強く必要とされている免疫療法の決定的な形態のひとつである。コルチコステロイド、シクロスポリン、ラパマイシンなどの免疫抑制薬を用いると、これらの免疫不全の治療が大幅に進んだ［１２２］。通常は、炎症性サイトカインの遺伝子、主にＩＬ−２およびＴＮＦ−γの遺伝子を阻害することで作用するＴ細胞が免疫抑制薬の重要な標的として考慮されるため、Ｔ細胞の増殖が抑制される。開発中の免疫抑制のもうひとつの手法に、抗体を使用してＴ細胞受容体ＣＤ２８およびＣＤ４０をブロックすることがある［１２３］。これらの受容体をブロックすると、ＤＣに存在する同時刺激型分子による活性化が不十分になり、よってＴ細胞の増殖を効果的に中断させる寛容作用が引き起こされる。しかしながら、コルチコステロイドでの治療または抗体をブロックすることは、非常に非特異的であり、免疫系が他の感染と闘う機能の低下などの副作用を引き起こしかねない。よって、一層特異的な免疫抑制の戦略すなわち、抗原特異的寛容を誘導するものが、免疫療法では例外的な進歩であり得るのである。
【０１０１】
最近、ＤＣが免疫抑制の標的となり得ることが発見された。Ｔ細胞免疫を刺激する機能だけでなく、ＤＣはＴ細胞の寛容を調節することもできる［１２４］。同種移植片の移植の拒絶を防ぐなどの用途で免疫抑制に利用されている合成糖質コルチコイドに、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）がある。従来、糖質コルチコイドは単独でＴ細胞に作用すると考えられていた。しかしながら、最近の研究で、ＤｅｘがＤＣに作用して、同時刺激型分子の発現と炎症性サイトカインの分泌を下方制御することが実証された［１２５、１２６］。これは、寛容の誘導にＤＣを利用できる潜在性を実質的に示唆するものである。同時刺激型分子非存在下、Ｔ細胞に抗原を提示するＤＣは、提示された抗原にＴ細胞アネルギーまたは寛容を誘導する。
【０１０２】
免疫抑制薬をナノ粒子とともに送達してもよい。いくつかの実施形態では、そのサイズとリンパへの間質流入および侵入との相互作用がゆえに、抗原をリンパ節ＤＣに効果的に標的可能である。ＤＣ活性化を防ぐために抗原と同時に免疫抑制剤を送達することで、寛容につながるであろう。このような場合、補体を活性化させないナノ粒子に利点があることもある。主な免疫抑制薬のいくつかが糖質コルチコイドであり、これは疎水性であって、ナノ粒子の疎水性ＰＰＳコアにロードされる。デキサメタゾン、タクロリムス、シクロスポリンＡなどの特定の糖質コルチコイドが、同時刺激型分子（すなわち、ＣＤ８０およびＣＤ８６）の発現と炎症性サイトカイン（すなわち、ＩＬ−６およびＴＮＦ−α）の分泌を下方制御することで、ＤＣの成熟およびアロ刺激能を阻害することが実証された［１２５〜１３１］。
【０１０３】
免疫抑制薬を本明細書に記載のナノ粒子にロードし、患者に導入してもよい。ナノ粒子をリンパ系およびリンパ節に特異的に標的してもよく、ＡＰＣおよび／またはＤＣによる取り込み用に特異的に標的してもよい。疎水性の成分またはコアを有するナノ粒子を用いると、疎水性の薬剤または他の作用剤を都合よく送達できる。さらに、薬剤との組み合わせで抗原を送達してもよい。同時注入、吸着または共有結合などによって、抗原をナノ粒子と関連させてもよい。
【０１０４】
例えば、１つの戦略に、疎水性の免疫抑制薬（Ｄｅｘなど）を、末端メトキシ化部分（よってヒドロキシル化されておらず、補体活性化性でもない）ナノ粒子で安定化させたナノ粒子のコアにロードし、抗原を表面に移植することがある。免疫抑制薬が疎水性になればなるほど、通常は放出が長くなる。例えば、コルチコステロイドモメタゾンフルオレートはＤｅｘより疎水性であるため、さらに徐放的に放出可能である。このため、Ｄｅｘまたは他の免疫抑制薬をリンパ節でＤＣに対する抗原と一緒に送達することで、抗原を依然として送達しつつ同時刺激型分子を下方制御し、それによって抗原特異的寛容を引き起こすことが可能である。よって、メトキシ末端ＰＬＵＲＯＮＩＣで安定化されたＰＰＳナノ粒子などのナノ粒子を、抗原コンジュゲーションおよび免疫抑制薬ローディングとの組み合わせで利用して、自己免疫疾患および移植拒絶に対する治療法などの用途のための寛容を誘導することができる。
【０１０５】
さらに、免疫抑制剤をスキームとの組み合わせで用いて、免疫寛容誘発ワクチンを製造するなど細胞をトランスフェクトしてもよい。免疫抑制剤でロードしてＤＮＡまたはＲＮＡを保持するよう誘導体化した粒子を用いて、ナノ粒子の集合体を生成してもよいし、あるいは、免疫抑制剤送達粒子の別の集合体を核酸送達粒子との組み合わせ（混合物または別途投与）で用いてもよい。このようにして、ミセルまたは非樹状ポリマーを含むナノ粒子によって抗原が送達される免疫療法との組み合わせで、免疫抑制剤を使用することが可能である。
【０１０６】
抗原を用いる免疫療法
タンパク質抗原を内部移行するＡＰＣは、ＭＨＣ−ＩおよびＩＩ経路を介して抗原ペプチドエピトープを処理して提示できる。免疫治療手法のひとつに、１つ以上の抗原をナノ粒子に共有結合的に結合させるか、そうでなければこれらを関連させることがある。抗原は、免疫系によって認識可能なグリコシル化がないかまたはあるポリペプチドであって、通常は少なくとも約３アミノ酸長である。また、抗原はＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸配列によってコードされる。例えば、ＤＮＡは、病原体に存在するポリペプチド抗原をコードするのであれば、抗原をコードできる。ＡＰＣの核へのＤＮＡ送達後、抗原ポリペプチド抗原の発現と、ＭＨＣ  Ｉでのそれの提示が生じる。タンパク質全体を使用することが可能であるが、抗原断片を使用可能であるため、約３〜約２０残基を有するポリペプチドを使用可能である。約１０残基未満など、明示的に示した範囲内の範囲と値がすべて企図されることは、当業者であれば自明であろう。ポリペプチドを必要とせずに補体系を直接に活性化させるナノ粒子を用いてもよいため、補体系を活性化させない抗原も使用できる。
【０１０７】
プロテアーゼによって特異的に切断される基質を含むリンカーを介してミセルを含む分岐鎖ポリマーまたはナノ粒子に抗原を結合させることで抗原（または他の部分）を送達してもよく、この基質は抗原プロセシングに関与している。例えば、カテプシン基質ＫＱＫＬＲ（配列番号３）は、リンカーに取り込まれ、カテプシンＳで切断される。また、ＡＰＣによる取り込み後に還元されるジスルフィド結合を介して抗原をナノ粒子または分岐鎖ポリマーに結合させてもよい。例えば、抗原ペプチドは、ポリマー上の遊離スルフィドとのジスルフィド結合の形成に利用できるシステイン残基またはスルフィド部分を含むものであってもよい。図２５ａ、図２５ｂ、図２５ｃは、ペプチドまたは他の部分をナノ粒子または分岐鎖ポリマーに結合する方法を示す。実験から、ペプチドが標的細胞に放出されて生物活性であることが分かる。図２６は、ナノ粒子に結合したペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２）が粒子に固定化され、リンパ節にｉｎ  ｖｉｖｏで送達され、リンパ節滞留ＤＣによって取り込まれ、ＭＨＣ１に認められる（実施例２３）ことを示している。特定の実施形態は、ＡＰＣ、ＤＣまたはリンパ節内在ＡＰＣまたはＤＣによって取り込まれ、生物活性の形態で細胞に放出されるか、あるいはＭＨＣ複合体での発現用に細胞に放出される抗原または他の部分を組み入れるナノ粒子または分岐鎖ポリマーを含む。部分に対するリンケージは、任意に、細胞内プロテアーゼなどのプロテアーゼによって切断されるジスルフィドブリッジまたはペプチド配列を含む。
【０１０８】
抗原は、多くの異なる疾患に対する免疫療法に使用可能なものである。具体的な一用途として、腫瘍免疫療法用があげられる。有用な抗原は、腫瘍細胞には認められるが健康な細胞には認められない。Ｃａｓｐａｓｅ−８、ＭＡＧＥ−１、チロシナーゼ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＭＵＣ−１など、いくつかの抗原が特定タイプの腫瘍に特異的なものとして同定されている［１１２］。この点に留意して、腫瘍を攻撃するためのＴ細胞を活性化するための手段として、リンパ節にてナノ粒子を用いて当該抗原をＤＣに送達することが可能である。もうひとつの用途に、感染症の予防がある。抗原への曝露によって、このような疾患に対する耐性が生じたり、あるいは様々な症状に対するワクチン接種として作用したりすることができる。
【０１０９】
リンパ節で細胞を効率的にトランスフェクトする機能も、ＤＣ活性化シグナルの存在下での免疫の誘導あるいは、ＤＣ活性化シグナルの非存在下での抗原特異的寛容化には有用である。ＣｐＧ  ＤＮＡの非存在下、トランスフェクションが抗原発現につながることがあり、危険シグナルおよび同時刺激型分子発現の非存在下、延長された抗原発現につながることもある。よって、実施形態は、ＣｐＧ  ＤＮＡを含まないナノ粒子の集合体を含む。さらに、ＡＰＣ活性化疎水性免疫調節物質を取り込めるのと同じで、デキサメタゾンなどの疎水性免疫抑制剤分子も上述のとおり取り込むことが可能である。方法は、抗原を特異的かつ直接にリンパ節内で発現させるための細胞のトランスフェクションを含み、トランスフェクションは免疫抑制薬によって達成されるものであってもよい。ベクターと薬剤の両方を含む本明細書にて記載のナノ粒子またはポリマーを使用してもよく、あるいは、一方および／または他方のものを有するナノ粒子／ポリマーを一緒に混合し、あるいは逐次使用してもよく、あるいは、トランスフェクション作用剤の薬用量と免疫抑制剤の反復薬用量など、一方または他方のものを経時的に投与してもよい。
【０１１０】
いわゆる免疫寛容誘発ワクチン製剤は、今まで、顕著に粗かった。抗原をリンパ節に直接に送達する機能によって、免疫寛容誘発ワクチンにおける問題すなわち、リンパ節内で抗原をＤＣに送達するが、これらのＤＣを活性化させないようにするにはどうすればよいかという問題が回避される。通常、抗原が末梢に集まると、ＤＣは活性化されるまではリンパ節に移行しない。よって、問題であった。特定の実施形態では、抗原がＤＣ非活性化ナノ粒子と複合化またはコンジュゲートされることで、免疫寛容誘発抗原特異的製剤が得られる。さらに、このようなナノ粒子は、逆エマルション重合によって形成されるかミセル化によって形成されるかを問わず、デキサメタゾン、シロリムス、タクロリムス、エベロリムスまたはシクロスポリンＡなどの免疫抑制剤分子をロード可能である。これらの薬剤は、先在し得るか、ナノ粒子取り込みのプロセスによって誘導され得るＤＣの活性化をさらに防止する。図３３（実施例２６参照）は、骨髄由来のＤＣをデキサメタゾンロードナノ粒子に曝露可能であり、次いでＬＰＳなどの極めて強いＤＣ活性化シグナルに曝露可能であることを示す。ナノ粒子を取り込んだ免疫抑制剤は、このような強いシグナルに対してすらＤＣ活性化を防止することが可能である。ガレクチン−１またはｉＣ３ｂなどの他の免疫調節分子も、ナノ粒子表面にコンジュゲートまたはナノ粒子に結合あるいはナノ粒子内に結合可能である。特定の実施形態は、細胞を抗原および／または免疫抑制剤に曝露するリンパ細胞に標的される本明細書に記載のナノ粒子またはポリマーを提供するものである。抗原と薬剤の両方を有する本明細書に記載のナノ粒子またはポリマーを使用してもよく、一方および／または他方を有するナノ粒子／ポリマーを一緒に混合または順次使用あるいは、薬用量のトランスフェクション作用剤と反復薬用量の免疫抑制剤など、一方または他方を経時的に投与してもよい。
【０１１１】
さらに、免疫調節薬を本明細書に記載のナノ粒子および／またはポリマーと一緒に送達してもよい。リンパ系における細胞の特異的標的は、全身送達を都合よく回避する。
【０１１２】
ＤＣ非活性化抗原保持ナノ粒子は、例えば抗原プロインスリン、プロインスリン由来のペプチドまたはグルタミン酸デカルボキシラーゼを用いてＩ型糖尿病など、あるいは、例えば抗原ミエリン塩基性タンパク質を用いて多発性硬化症など、あるいは、例えば抗原コラーゲンＩＩを用いて関節リウマチなどの多数の疾患における免疫寛容誘発ワクチン製剤として有用である。
【０１１３】
ナノ粒子および核酸を用いる免疫療法
いくつかのナノ粒子集合体が、抗原などのペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡなどのナノ粒子および核酸を含み得る。さらに、これらはまた、発現カセットを含むものであってもよいし、プロモーターまたはエンハンサーを含むものであってもよく、ベクターの一部であってもよいし、あるいは従来技術において既知のように遺伝子送達モチーフを取り込んでもよい。例えば、米国特許第７，１６０，６９５号明細書、同第７，１５７，０８９号明細書、同第７，１２２，３５４号明細書、同第７，０５２，６９４号明細書、同第７，０２６，１６２号明細書、同第６，８６９，９３５号明細書（本明細書に明示的に開示されていることと相反しない程度に、参照により本明細書に援用する）を参照のこと。さらに、この配列は、他の治療用生体分子もコードできる。ポリマーミセル内での複合化またはポリマーベシクル内へのカプセル化をはじめとして、ＤＮＡなどの核酸抗原を、本明細書にて抗原および他の作用剤について説明したようにしてナノ粒子または分岐鎖ポリマーに結合可能である。また、例えば、ＤＮＡ−ポリマーコンジュゲーションを、静電吸着、ポリマー−ビオチン化によって実施可能である［１３９］。ポリマーをＤＮＡに結合させるための多数の他の化学的コンジュゲーション戦略が存在し、これを本明細書にて使用するようにできる［１４０］。本明細書に記載のナノ粒子を用いることで、リンパ節ＤＣを含むＡＰＣを抗原遺伝子発現用に標的し、活性化させて適当なＴ細胞刺激を保証することができる。
【０１１４】
ＰＥＧ−ＰＰＳ−ＰＥＩとブレンドしたＰＥＧ−ＰＰＳを主成分とする超小型ＤＮＡ複合体を使用して、ＤＮＡワクチンなどの核酸を送達してもよい。Ｔ細胞の標的も有用である。図３２（実施例２５参照）は、これらの超小型複合体が、モデルタンパク質（緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ）で細胞をｉｎ  ｖｉｖｏにて効率的にトランスフェクトすることを示している。現在まで、ＤＮＡワクチンは、その細胞標的に関して極めて非特異的に用いられてきた。本明細書では、異なる手法を実証すなわち、リンパ節に内在する細胞をトランスフェクトする。ＰＥＧ−ＰＰＳおよびＰＥＧ−ＰＰＳ−ＰＥＩプラットフォームは、ワクチン接種における多面的な手法となる。例えば、イミキモドなどの疎水性の免疫調節物質をＤＮＡ複合体に取り込んでもよい。あるいは、ＣｐＧ  ＤＮＡを、プラスミド自体の中または別々に複合体内に取り込むことも可能である。複合体については、補体を活性化させるよう設計可能であり、あるいは、フラジェリンなどの他の危険シグナルとも結合可能である。また、遺伝子発現による長期間の存在に続いて抗原の短期間の存在を達成するようペプチド／タンパク質製剤をＤＮＡ製剤と組み合わせると有用である。
【０１１５】
ＤＮＡワクチンは他者によって調査されており、手法はカチオン性ポリマーおよびカチオン性脂質を有する裸のＤＮＡまたは複合体から、ウイルス形態にまでおよぶ。遺伝子送達用、ＤＮＡワクチン用の非ウイルス性ベクターでリンパ節内の細胞を標的することは、他の要因の中でも特に、カチオン性脂質またはカチオン性ポリマーの非ウイルス性複合体のサイズがゆえに極めて複雑である。プラスミドＤＮＡを用いると、例えば、これらの複合体は一般にサイズの範囲が１００〜２５０ｎｍであり、例外的で特異体質の製剤でも６０〜１００ｎｍのサイズがある。しかしながら、本明細書にて示すように、間質流によって移動する粒子は、例えば本明細書における２０〜２５ｎｍのナノ粒子で示されるように、極めて小さなナノ粒子にとって極めて効果的である。実施例２５は、初めて、リンパ節に到達して、そこで意図した細胞型を標的する超小型プラスミドＤＮＡ複合体を形成可能であることを実証するものである。これらの複合体は、ＰＥＧ−ＰＰＳおよびＰＥＧ−ＰＰＳ−ＰＥＩの混合ミセルから生成したものであった。ＰＥＧ−ＰＰＳ−ＰＥＩはＤＮＡを複合し、ＰＥＧ−ＰＰＳ対ＰＥＧ−ＰＰＳ−ＰＥＩの比によって複合体のサイズが制御される。実施例２５に示すように、これらの超小型プラスミドＤＮＡ複合体は、例えば皮内または皮下で注入されると、リンパ節に到達できる。Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＤＣのトランスフェクションが観察された。よって、本明細書にて教示される複合体は、多数の細胞型を標的するＤＮＡワクチンとして有用である。あるいは、複合体は通常、イメージング剤または治療剤を送達するのに有用である。用途としては、イメージングおよび診断があげられる。
【０１１６】
ナノ粒子に対する部分のコンジュゲーション
抗原または他の部分を求核または求電子官能基に結合するための多岐にわたるスキームが利用可能である。通常、このようなスキームは、必要に応じて、薬剤または危険シグナルの結合に適応可能である。
【０１１７】
一例として、実施例のソルド（ｓｏｌｄ）−コアＰＰＳナノ粒子上のＰＬＵＲＯＮＩＣに対する抗原結合が得られる。ＰＰＳナノ粒子に対する抗原コンジュゲーションは、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（ＰＥＧおよびＰＰＧのブロックコポリマー）表面をタンパク質またはペプチドで官能化することで達成可能である。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７（Ｓｉｇｍａ）、ジビニルスルホン（Ｆｌｕｋａ）、水素化ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ）、トルエン（ＶＷＲ）、酢酸（Ｆｌｕｋａ）、ジエチルエーテル（Ｆｉｓｈｅｒ）、ジクロロメタン（Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｃｅｌｉｔｅ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ）については、取得時のまま使用した。アルゴン（Ｍｅｓｓｅｒ）下で反応を実施した。重水素化クロロホルム（Ａｒｍａｒ）中にて１Ｈ  ＮＭＲを測定し、化学的シフト（δ）を０．０ｐｐｍの内部標準のテトラメチルシラン（Ａｒｍａｒ）シグナルに対するｐｐｍ単位で得る。１５ｇ（１．１８ｍｍｏｌ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７を４００ｍｌのトルエンに入れた溶液を、ディーン−スタークトラップを用いて共沸蒸留で４時間乾燥させた。この溶液を氷浴中にて冷却し、０．２８３ｇ（１１．８ｍｍｏｌ）の水素化ナトリウムを加えた。反応混合物を１５分間撹拌し、３．５５ｍｌ（３５．４ｍｍｏｌ）のジビニルスルホン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をすみやかに加えた。室温にて暗所で５日間撹拌した後、１．３５ｍｌ（２３．６ｍｍｏｌ）の酢酸を加えて反応をクエンチした。セライト上で濾過し、濾液を減圧下で少量になるまで濃縮した後、１リットルの氷冷ジエチルエーテル中にて生成物を沈殿させた。固体を濾別し、最小量のジクロロメタンに溶解させ、氷冷ジエチルエーテル中で合計４回沈殿させた。このポリマーを真空下で乾燥させて６．０ｇを得て、ＯＶＡコンジュゲーション前にアルゴン下で−２０℃にて保存した。ＮＭＲでは、ビニルスルホンの存在が示され、官能化度は８８％であった。δ＝１．１（ｍ，ＣＨ３，ＰＰＧ）、３．４（ｍ，ＣＨ，ＰＰＧ）、３．５（ｍ，ＣＨ２，ＰＰＧ）、３．６（ＰＥＧ）、６．１（ｄ，ＣＨｃｉｓ＝ＣＨ−ＳＯ２）、６．４（ｄ，ＣＨｔｒａｎｓ＝ＣＨ−ＳＯ２）、６．８５（ｄｄ，ＣＨ２＝ＣＨＳＯ２−）。
【０１１８】
次に、ペプチドまたはタンパク質抗原をＰＬＵＲＯＮＩＣビニルスルホン（ＶＳ）にコンジュゲート可能である。ＤＣ抗原提示を調査するためのモデルタンパク質は、卵白アルブミン（ＯＶＡ）である。ＯＶＡは、それぞれＭＨＣＩおよびＩＩ経路を介してＤＣによって処理される抗原ペプチドＯＶＡ２５７−２６４およびＯＶＡ３２３−３３９を有する。ＯＶＡ２５７−２６４およびＯＶＡ３２３−３３９は、ペプチド合成器を用いることでシステイン残基にコンジュゲートされる。次に、そのシステインチオールとの反応によって、ペプチドをＰＬＵＲＯＮＩＣ−ＶＳにコンジュゲートさせる。１８ｍｇのペプチドを６．４３ｍｌの０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液にｐＨ８．５で可溶化し、２ｍＭの溶液を得る。６０ｍｇ（１．６８ｍＭ）のＰＬＵＲＯＮＩＣ−ＶＳを加える。混合物を３時間撹拌し、エルマンによるチオール検出用のアリコートを１５〜３０分ごとに採取した。４ｍｇのエルマン試薬（５，５’ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸））を、１ｍｌの０．１Ｍのリン酸ナトリウムおよび１ｍＭのＥＤＴＡ（スルフヒドリルを酸化可能な二価金属イオンをキレート化するため）にｐＨ８．５で可溶化する。１５μｌを１．５ｍｌの０．１Ｍのリン酸ナトリウムと混合し、３０μｌの反応混合物を１２０μｌのリン酸ナトリウムでｐＨ７にてクエンチする。混合と室温での１５分間のインキュベーション後、４１２ｎｍでの吸光度を測定する。チオールの量についてはｃ＝Ａｂｓ／Ｅ×Ｄで計算し、Ｅ（消光率）＝１４１５０Ｍ−１およびＤは希釈係数である。ＰＬＵＲＯＮＩＣを６〜８ｋＤａのＭＷＣＯ膜で水に対して透析し、溶液を凍結乾燥させる。収率約８８％で、１Ｈ−ＮＭＲで確認するとビニルスルホン基が完全に変換されている。ＰＬＵＲＯＮＩＣ−ＶＳに対するＯＶＡのコンジュゲーションは、遊離システインチオールおよびリシンアミンを用いることで、同様の戦略で実施される［１０９〜１１１］。その後、ナノ粒子合成に用いられるまでＰＬ−ＶＳ−ＯＶＡペプチド／タンパク質を−２０℃で貯蔵する。
【０１１９】
天然に生じるポリペプチド抗原に対して外来性のアミノ酸との共有結合コンジュゲーション、天然に生じる抗原に対して内在性のアミノ酸との共有結合コンジュゲーション、物理化学的吸着、他の手段などの他の手段で、抗原をナノ粒子にコンジュゲートしてもよい。
【０１２０】
実施形態は、以後の反応に利用できる１つ以上の遊離求核基を有するナノ粒子を含む。求核基としては、例えば、ヒドロキシル、アミン、チオールがあげられる。以後の反応用にカルボキシル基を有するナノ粒子も生成できる。図２４ａは、部分との反応に利用できるアミンを有するナノ粒子を調製するための合成経路を説明するものである。図２４ｂは、以後の反応に利用できるヒドロキシルを有するナノ粒子を説明するものである。図２４ｃは、他の部分と反応させるヒドロキシルまたはアミンを反応させるためのスキームを示す。ヒドロキシル、アミン、チオールとの反応には、Bioconjugate Techniques, 2nd Edition by Greg T. Hermanson, published by Academic Press, Inc., 2008, 1202 pages（参照により本明細書に援用する）に記載されているように、多くのスキームを利用できる。例として、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、アルデヒド、イソシアナート、塩化トレシルまたはヒドラジン／ヒドラジドを用いるコンジュゲーションがあげられる。図２５は、部分とナノ粒子との結合を達成するためのジスルフィド結合を用いるスキームを示す。図２６は、ペプチド部分ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２）がうまくナノ粒子に固定化され、リンパ節に送達された後、リンパ節内在ＤＣに取り込まれたことを示す。ここで、細胞の内部移行後に還元され、遊離ペプチドを自由にし、ＭＨＣ  ＩまたはＭＨＣ  ＩＩでの提示を可能にするという点で、ジスルフィドリンクが特に有用である。ペプチドまたはタンパク質抗原が、内在性部位または操作された部位のいずれかで、抗原プロセシングで用いられるプロテアーゼに影響されやすい部位を含む場合、このようなスキームは役立つこともあるが必要ではない。このような部位なしでペプチドを利用するのであれば、上記および図２６で教示するように、還元可能なリンケージを介してペプチドをナノ粒子に結合すると都合がよい場合もある。コンジュゲーションの最適な部位を見つけるために多数の部位を介してのコンジュゲーションを企図してもよく、免疫学的応答が判断されてもよいが、Ｎ末端に存在するかまたはＮ末端付近に存在するシステイン残基を介してのコンジュゲーションが都合のよいことが多い。これは、抗原ペプチドとその対応する受容体とのフィットの忠実度が高く、Ｎ末端よりも識別されやすいことが理由である。図２７は、ナノ粒子に対するペプチドまたは他の部分のＮ末端αアミン（タンパク質を含む用語）を、例えばピリジルジスルフィドまたはビニルスルホン部分と反応させるためのスキームを示す；ＮＰはナノ粒子を示し、「Ｆｌｉｃ」はペプチドを示す。
【０１２１】
ナノ粒子または分岐鎖ポリマー上の部分（抗原、ペプチド、核酸など）の共有結合グラフトに加えて、物理化学的手段も利用できる。強力な方法のひとつに、ペプチドまたはタンパク質抗原を合成または発現させ、ｏｌｉｇｏＥまたはｏｌｉｇｏＤ領域などの強いアニオン性のアミノ酸ストレッチまたは他のアニオン性アミノ酸あるいは、アニオン性アミノ酸の組み合わせを取り込み、ｓｉＲＮＡまたはアプタマー複合体の場合のような静電複合体を形成できるようにすることがある。例えば、ナノ粒子と関連させるのに望ましいペプチドを、３〜３０などの複数のアスパラギン酸またはグルタミン酸残基で生成してもよい。少なくとも４または５〜１５など、明示的に示した範囲内の範囲と値がすべて企図されることは、当業者であれば自明であろう。使用できるもうひとつの方法に、例えばＰＥＧ−ｓｓ−ＰＰＳで形成された水様コアベシクル内で抗原ペプチドまたはタンパク質などの部分を取り込むことがある。ポリマーベシクルは、Velluto et al., Molecular Pharmaceutics 2008, “PEG−b−PPS Diblock Copolymer Aggregates for Hydrophobic Drug Solubilization and Release: Cyclosporin A as an Example“（参照により本明細書に援用する）に教示されているように、両親媒性コポリマーから形成できるものである。Cerritelli et al., Biomacromolecules 2007:1966−1972（参照により本明細書に援用する）に教示されているように、内部にある還元の影響を受けやすいリンケージからのポリマーベシクルへのカプセル化は、ジスルフィドがエンドサイトーシス後に還元されるという点で、細胞内の放出を標的するにあたって特に強力である。したがって、患者における生理学的環境への曝露後に自らのジスルフィドブリッジのｉｎ  ｓｉｔｕでの反応時に分解するナノ粒子を形成するなどして、還元の影響を受けやすいリンケージをミセルまたはナノ粒子に取り込んでもよい。
【０１２２】
図３４は、骨髄由来のＤＣの蛍光レポーターの送達によって実証されたように、ＤＣの細胞質に対する水溶性ペイロードの極めて効果的な送達としての細胞取り込み後の放出を実証するものである。図３４Ａおよび図３４ｂを参照のこと。細胞質への抗原送達は、ＭＨＣ  Ｉ経路による抗原提示において特に重要であるため、ポリマーベシクルの水様コア内にカプセル化された抗原は、抗原の化学的コンジュゲーションをまったく必要としない抗原送達の特に強力な手段である。さらに、危険シグナルなどの他の作用剤をポリマーベシクルの表面にコンジュゲートしてもよいし、ポリマーベシクルの水様コア内に取り込んでもよく、あるいはベシクルのシェルを形成する疎水性ラメラ内にカプセル化してもよい。また、ミセルを含む他のポリマーナノ粒子を用いて本明細書にて教示されているように、補体を活性化させるようポリマーベシクル表面を設計することも可能である。
【０１２３】
ナノ粒子および危険シグナルを用いる免疫療法
もうひとつの免疫療法手法は、危険シグナルの適用を伴うものである。本明細書における結果は、ヒドロキシル化および／またはチオラート化ナノ粒子または分岐鎖ポリマーを生成し、同時刺激型分子ＣＤ８６およびＣＤ８０の発現増加などによって判断できるようなＤＣを成熟させる危険シグナルまたは刺激の機能を提供できることを示している。ナノ粒子または分岐鎖ポリマーは非補体危険シグナルまたは成熟シグナルを必要としないが、場合によっては、このようなシグナルを加えると、免疫学的応答の発生をさらに補助できることがある。他のＤＣ標的研究では、抗原取り込み後に炎症性サイトカイン（すなわち、ＣＤ４０リガンド）および／またはＴｏｌｌ様受容体の活性化因子（ＬＰＳおよびＣｐＧ  ＤＮＡなど）などの危険シグナルがＤＣの成熟と以後の細胞性免疫誘導に必要であることが示唆された［１１３〜１１５］。危険シグナルは、遺伝子ＮＦ−κＢの上方制御につながる生体分子として同定され、これがＡＰＣの成熟と炎症性サイトカインの放出につながる。このような場合、例えばタンパク質またはペプチドコンジュゲーションの場合で上述したプロトコールに従うなどして、ＣＤ４０リガンド、ＧＭ−ＣＳＦまたはＴｏｌｌ様受容体活性化因子などの危険シグナルサイトカインをナノ粒子に結合でき（コアまたは表面層または親水性ポリマー層など）［１０９〜１１１］。さらに、その表面に結合した抗原および／または非補体危険シグナルを用いてナノ粒子を合成することも可能である。
【０１２４】
実施形態は、危険シグナルと結合したナノ粒子および／または分岐鎖ポリマーを含む。危険シグナルは、例えば本明細書の他の部分で説明したように、共有結合的に結合または吸着できるものである。ナノ粒子および／または分岐鎖ポリマーは、危険シグナルあるいは、このシグナルで誘導体化されたその利用可能な末端または表面基の一部または全部との組み合わせで、チオールおよび／またはヒドロキシルを有するものであってもよい。実施例２２および図２１では、イミキモドすなわち現時点で薬剤として用いられている化学的危険シグナルをロードしたナノ粒子を用いる実験が極めて効果的で、ＬＰＳに匹敵するものであったことを説明する。図２９（実施例２３参照）は、ナノ粒子が一例としてＣｐＧ  ＤＮＡと反応した、送達用に共有結合的に結合された危険シグナルの例を提供するものである。危険シグナルは、フラジェリン、フラジェリン断片、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、イミキモド、モノホスホリル脂質Ａ、特にサポニンなど、現段階でアジュバント分子として調査されている化合物を含む。
【０１２５】
抗体産生のための免疫療法
いくつかの実施形態は、患者に抗原を導入して、患者にて抗原に対する抗体を生成することに関するものである。例えば、ワクチン接種または抗腫瘍療法を、このようにして探究してもよい。あるいは、このような手法を用いて、動物などで科学的な試薬として用いる抗体を生成してもよい。
【０１２６】
このように、ナノ粒子および抗原の組み合わせを患者に導入してもよい。あらかじめ定められた時間（１〜３０日など）経過後、試料を患者から採取し、抗原に対する抗体を測定する。別の試料および測定値を定期的に取得してもよい。抗体力価が低すぎる場合、プロセスを必要に応じて組み合わせナノ粒子および抗原を再度導入して追加の測定を実施し、抗体力価を所望のレベルまで引き上げてもよい。組み合わせを数回投与してもよい。
【０１２７】
実験結果についての考察
抗原提示細胞（ＡＰＣ）、特に樹状細胞（ＤＣ）、さらにはマクロファージならびにＢ細胞に対する生分解性ナノ粒子の送達について、免疫療法への応用も含めて本明細書で説明する。本明細書における詳細な例では、直径２０ｎｍ、２５ｎｍ、４５ｎｍ、１００ｎｍのポリ（エチレングリコール）−安定化ポリ（プロピレンスルフィド）（ＰＰＳ）ナノ粒子を、リンパ節でＤＣに送達することについて説明する。詳細な例におけるナノ粒子は、ポリ（エチレングリコール）の親水性コロナで囲まれたＰＰＳの架橋されたゴム状コアを含む。ＰＰＳドメインは、疎水性薬剤を担持でき、酸化環境内で分解して可溶性ポリマーになる。糖ペプチド（本明細書ではグリコシル化されたポリペプチドと定義）抗原を含むペプチドまたはタンパク質抗原ならびに、抗原をコードする核酸を、ナノ粒子表面に結合させることが可能である。２０ｎｍの粒子が間質注入後に最も容易にリンパに取り込まれるのに対し、２０ｎｍと４５ｎｍの両方の粒子が、注入後２４、７２、９６および１２０時間の時点で一貫して強い存在を呈してリンパ節で有意な保持を示した。ナノ粒子は、外来性の標的用リガンドを用いることなくリンパ節ＤＣ（およびＡＰＣ）の最大４０〜５０％まで内部移行し、内部移行部位は注入部位ではなくリンパ節内であった。ナノ粒子含有ＤＣ（および他のＡＰＣ）の増加は、２４時間に対して９６時間の時点で見られ、これらの細胞のリンパ節に対する浸潤を示していた。ナノ粒度および表面化学の両方が、ｉｎ  ｖｉｖｏ注入後にＤＣの成熟に影響することが見出された。
【０１２８】
ナノ粒子が極めて小さい場合に、合成された塩基性ＰＰＳナノ粒子すなわち、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とポリプロピレングリコールのブロックコポリマー）で安定化されたＰＰＳナノ粒子コアは、成熟マーカーＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ４０の発現増加によって示されるように、ナノ粒子のｉｎ  ｖｉｖｏ注入後にＤＣを活性化させることが見出された。２５ｎｍのナノ粒子はｉｎ  ｖｉｖｏ注入後にＤＣを幅広く活性化させたのに対し、１００ｎｍのナノ粒子ではそうならなかった。第２のナノ粒子表面化学を利用するすなわち、ＰＰＳナノ粒子コアを末端メトキシ化ＰＬＵＲＯＮＩＣで安定化させる場合、極めて小さなナノ粒子ですらｉｎ  ｖｉｖｏ注入後にＤＣを活性化させなかった。ＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ナノ粒子は、補体を効果的に活性化させることが実証されたのに対し、末端メトキシ化ＰＬＵＲＯＮＩＣで安定化させたナノ粒子は補体を活性化させるのに効果的ではなかった。表面チオールを持つ選択された製剤も、補体の活性化を誘導することが見出され、本明細書にて提示するデータは、適応免疫応答をトリガーするにあたってチオール活性化補体が特に強力であり得ることを示している。よって、ナノ粒子補体活性化は、これらのナノ粒子の曝露後にＤＣ活性化を誘導した。
【０１２９】
ナノ粒度および表面化学の両方とも、ｉｎ  ｖｉｖｏ注入後に適応免疫に影響することが見出された。抗原をＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ナノ粒子表面にコンジュゲートしたところ、ナノ粒子が極めて小さい場合にのみ抗体形成を強く誘導することが見出された。２５ｎｍのナノ粒子のほうが、１００ｎｍのナノ粒子よりもかなり強く抗体形成を誘導した。第２のナノ粒子表面化学を利用するすなわち、ＰＰＳナノ粒子コアを末端メトキシ化ＰＬＵＲＯＮＩＣで安定化させると、極めて小さなナノ粒子ですらもｉｎ  ｖｉｖｏ注入後に強い抗体形成を誘導しなかった。さらに、２５ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ナノ粒子を、補体タンパク質３をノックアウトしたマウス（Ｃ３−／−マウス）に注入すると、これらのナノ粒子は抗体形成を強く誘導しなかった。このため、詳細な例では、２０〜４５ｎｍなどの好適なサイズのナノ粒子に、免疫治療用途の可能性があることを示している。例えば、これらを使用して、リンパ節でＤＣを特異的に標的および活性化させてもよい。さらに、ＰＬＵＲＯＮＩＣによる安定化によって得られたなど、これらのナノ粒子が補体を活性化させる表面化学を持つ場合、抗原キャリアおよび適応免疫誘導アジュバントとして機能する強い潜在力を持つ。アジュバントとしてのワクチン製剤では、小さなサイズ（２０〜４５ｎｍなど）と補体活性化との特別な組み合わせに価値がある。
【０１３０】
このように、上記の例は、標的される抗原とリンパ節でのＡＰＣ、特にＤＣへの薬剤送達にナノ粒子を使用できることを示している。この手法の単純さは、サイズを制御することで、特定の外来性標的用リガンドを用いることなく、ナノ粒子を効果的にリンパに取り込んでリンパ節に保持できる（図示のように、少なくとも５日間）ことにある。これらは節の内在ＤＣおよび他のＡＰＣ（マクロファージなど）によって効果的に内部移行する。約４５ｎｍまたは最大約１００ｎｍと大きいナノ粒子は、この手段ではリンパおよびリンパ節に効果的に標的できない。さらに、最大約４０〜約５０％の内在リンパ節ＤＣが、この送達ビヒクルの効果をさらに示しつつナノ粒子を内部移行することが実証される。また、リンパに効果的に標的されるようなサイズの範囲のナノ粒子への曝露後、これらのナノ粒子が補体を活性化させると、一層成熟してＴ細胞依存性適応免疫を誘導することでＤＣが応答する旨が実証された。これは、抗原提示アジュバント製剤において補体カスケードを危険シグナルとして用いることの効力を示す明らかな実例である。小さなサイズ（投与後にリンパに効果的に侵入するため）と補体の活性化（ＤＣの成熟を含むＡＰＣを刺激するため）との組み合わせにより、強い適応免疫応答であるＴ細胞依存性体液性（Ａｂ力価による）および細胞性（Ｔ細胞増殖およびＥＬＩＳＰＯＴ測定によるＴ細胞メモリの測定による）の両方が誘導できることが実証された。小さなサイズと補体の活性化のこの特別な組み合わせは、免疫治療薬で極めて価値が高い。本明細書にて提示する実験は、ＴＬＲ４受容体が、この応答でも役割を果たし得ることを実証するものである。補体による適応免疫応答の活性化は、補体活性化ナノ粒子で刺激したＤＣからＩＬ−６およびＴＮＦαなどの強力で危険な炎症性サイトカインの産生が、ＬＰＳまたはＣｐＧで刺激した場合に比して極めて低いという点で、安全生と副作用の観点から極めて価値の高いものとなり得る。したがって、実施形態は、抗原を含む合成ナノ粒子の集合体を含む、患者に導入するための免疫賦活組成物を含み、この組成物が、ＴＮＦ−α応答を誘導することなく、ＩＬ−６応答も誘導せずに患者で抗原に対する免疫応答を誘導する。
【０１３１】
他のナノ粒子形態も実施例で実証する。実験例として、ＰＥＧとＰＰＳならびに、ＰＥＧ、ＰＰＳ、ＰＥＩのブロックコポリマーを用いて、両親媒性ブロックコポリマーから形成されるミセルを提示する。ミセルは、極めて狭いサイズの分布で極めて小さなサイズに形成できるという点で、極めて便利である。その表面は、表面ヒドロキシルまたは表面チオールを介して補体を活性化させるよう設計可能である。疎水性の危険シグナルまたは免疫抑制剤をミセルコア内に取り込むことが可能である。抗原を、ミセル表面に化学的にコンジュゲートまたは複合化することが可能である。実施例では、ミセルの形成、抗原とのコンジュゲーション、補体の活性化、ＤＣの活性化、適応免疫の誘導について実証する。実施例では、ポリマーナノ粒子を有するプラスミドＤＮＡの極めて小さなナノ粒子の形成ならびに、注入部位をドレインするリンパのリンパ節内でのＤＣ、Ｂ細胞およびＴ細胞の効率的なトランスフェクションを実証する。よって、実施例では、ブロックコポリマーからのこのような形態をペプチド／タンパク質抗原とＤＮＡコード抗原の両方に使用することができることを示す。これらの例は、ペプチド／タンパク質抗原およびＤＮＡコード抗原の両方に対する標的としてのリンパ節内の細胞の有用性を教示する。
【０１３２】
ブロックコポリマー両親媒性物質からの他のナノ粒子形態も実施例で実証する。文献ではポリマーソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅ）またはポリメロソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｏｓｏｍｅ）とも呼ばれることがある水様コアベシクルは、実験例としてＰＥＧとＰＰＳのブロックコポリマーを用いてブロックコポリマーから形成される。ベシクルは、その水様コア内に親水性ペイロードを含有できるという点で、極めて便利である。この親水性ペイロードは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドなどの親水性の危険シグナルあるいは、ペプチドまたはタンパク質などの抗原あるいは、抗原の発現をコードする遺伝子配列、他の免疫調節タンパク質または上記の２つ以上を含むものであってもよい。
【０１３３】
分岐鎖ポリマーからの他のナノ粒子形態を実施例で実証する。このナノ粒子は、単一の分岐鎖ポリマーから効果的に形成できるほど非常に小さくすることが可能である。分岐は、抗原のコンジュゲーションまたは危険シグナルのコンジュゲーションあるいは、補体などの危険シグナルとの同時会合またはその両方用の複数の部位を提供する。実施例では、このような官能化分岐鎖ポリマーを合成するための手法を提示する。
【０１３４】
実施例では、適応免疫応答の誘導と寛容の誘導の両方に対するリンパ節標的ナノ粒子を実証する。本明細書ならびに実施例で詳細に説明するように、抗原および危険シグナルを、ナノ粒子にコンジュゲートまたは複合化あるいは、ミセルおよびベシクルを含むナノ粒子または適応免疫応答を誘導するための分岐鎖ポリマー内にカプセル化可能である；あるいは、抗原を、危険シグナルの不存在下、寛容を誘導するための免疫抑制剤または免疫調節分子と一緒であってすら、ナノ粒子にコンジュゲートまたは複合化あるいは、ミセルおよびベシクルを含むナノ粒子または分岐鎖ポリマー内にカプセル化可能である。同様に、抗原コードＤＮＡを危険シグナルと一緒に誘導された適応免疫にまたは危険シグナルの不存在下または寛容を誘導するための免疫抑制剤または免疫調節分子と一緒であってすら、送達可能である。
【０１３５】
実施例では、実験データを、ミセルおよびベシクルを含むポリマーナノ粒子の疎水性成分としてのＰＰＳに合わせている。ＰＰＳは、水の存在下では安定であるが、体内の酸化条件、特にエンドサイトーシス後のリソソームの酸化条件では不安定である。そのため、ポリマーは疎水性ポリプロピレンスルフィドから酸化されて親水性スルホキシドおよびスルホンになり、ポリマー酸化後に、水溶性で腎濾過によって腎臓で排出可能となる。それ自体として、ＰＰＳおよびそのコポリマーは、バイアル内で水中にて配合すると安定になり得るが、体内への注入後には不安定である。これによって、明確なコストおよびロジスティックな利点が得られるが、これは応用時に特に重要となる場合がある。ナノ粒子をさらに凍結乾燥または単純な乾燥によって乾燥させることが可能であり、再水和して注入可能なナノ微粒子製剤を再形成することが可能である。用途によっては、粘膜組織表面に置く場合など、乾燥製剤が直接有用なこともある。
【０１３６】
実施例では、異なる投与経路も実証する。皮内、皮下または筋肉内など、組織間質内で注入すると、超小型のサイズのナノ粒子が間質流の対流の影響下で間質での自己の浸透を可能にし、組織の毛細血管からリンパ毛細管に流れるか、流入領域リンパ節にクリアランスされる。粒子が十分に小さいと、間質に捕捉されず、効果的にリンパまで搬送されない。また、実施例では、十分小さなナノ粒子に穏やかな圧力を加える口腔粘膜への浸透など、外圧を印加して組織バリアに浸透させることについても実証する。穏やかな圧力とは、高圧に頼って薬物を患者に送る高圧での針なし注入系を除外する用語である。穏やかな圧力を用いると、実際の粘膜破壊が都合よく回避される。特定の実施形態は、約７６０ｍｍ  Ｈｇ未満の外圧を使用することに関する。約４０、１００または２００ｍｍ  Ｈｇ未満または約１０〜１２０ｍｍ  Ｈｇなど、明示的に示した範囲内の範囲と値がすべて企図されることは、当業者であれば自明であろう。外粘膜の例として、バッカル、ペッサリーまたは坐薬手段によって送達される、鼻、頬、口腔、膣、結腸などがあげられる。
【実施例】
【０１３７】
実施例１：ナノ粒子
直径２０ｎｍ、４５ｎｍ、１００ｎｍのＰＰＳナノ粒子を、他の場所で説明したような逆エマルション重合によって合成した。「エマルション重合」という用語には、本明細書で使用する場合、逆エマルション重合を含み、「エマルション」という用語には、逆エマルションを含む［３９］。簡単に説明すると、ＰＥＧブロックコポリマー乳化剤、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−１２７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、（Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））およびモノマープロピレンスルフィドを、一定撹拌下でｍｉｌｌｉＱ超純水に加えることで、エマルションを生成した。保護した開始剤であるペンタエリスリトールテトラチオエステルを他の場所で説明したようにして合成し［３９］、別のフラスコで、これを撹拌下で１０分間、０．２０ｍＬの０．５Ｍナトリウムメチレート溶液と混合して脱保護した。脱保護後、モノマーエマルションに開始剤を加え、５分後に６０μｌの塩基ジアザ［５．４．０］ビシクロウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）を反応物に加え、これを不活性雰囲気下で連続的に２４時間撹拌した。次に、ジスルフィド架橋を生成するためにナノ粒子を空気に曝露した。
【０１３８】
残ったモノマー、塩基または遊離ＰＬＵＲＯＮＩＣから、ｍｉｌｌｉＱ超純水に対して１２〜１４ｋＤａのＭＷＣＯ膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、（Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ））での２日間の透析を繰り返してナノ粒子を精製した。動的光散乱機器（Ｍａｌｖｅｒｎ、（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｈｉｒｅ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ））を用いてナノ粒度分布を求めた。６−ヨードアセトアミド−フルオレセインまたはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８マレイミド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ））をナノ粒子溶液１ｍｇ／ｍｌで、ナノ粒子上に残った反応性チオールに加えることで、蛍光標識を達成した後、暗所で６時間撹拌した。次に、ナノ粒子を空気に曝露して、さらにジスルフィド架橋させた。２５ｋＤａ  ＭＷのカットオフ膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて５ｍＭのＰＢＳに対して１日間繰り返し透析し、遊離ヨードアセトアミド−フルオレセインまたはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒマレイミドを除去した。
【０１３９】
実施例２：末端メトキシ化ＰＬＵＲＯＮＩＣの合成
【化１】
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Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７（Ｓｉｇｍａ）、ヨウ化メチル（Ｆｌｕｋａ）、水酸化カリウム（Ｆｌｕｋａ）、チオ硫酸ナトリウム五水和物（Ｒｉｅｄｅｌ  ｄｅ  Ｈａｅｎ）、無水硫酸ナトリウム（Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ）、塩化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、ジエチルエーテル（Ｆｉｓｈｅｒ）、ジクロロメタン（Ｆｉｓｈｅｒ）を取得時のまま使用した。０．０２５％ＢＨＴ（Ａｃｒｏｓ）で安定化させたテトラヒドロフランをモレキュラーシーブで使用前に乾燥させた。アルゴン（Ｍｅｓｓｅｒ）雰囲気下で反応を実施した。透析には、分子量カットオフ３４００の再生セルロース管（Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ）を用いた。重水素化ジメチルスルホキシド（Ａｒｍａｒ）で１Ｈ  ＮＭＲを測定し、化学的シフト（δ）を２．５ｐｐｍでの残留溶媒シグナルに対するｐｐｍで得た。
【０１４０】
１０．０ｇ（０．７９ｍｍｏｌ）のＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ１２７を１００ｍｌのＴＨＦに入れた溶液に、２．９９ｇ（５３．３ｍｍｏｌ）の微粉砕水酸化カリウムと９８８μｌ（１５．９ｍｍｏｌ）のヨウ化メチルを加え、混合物を暗所で１９時間撹拌した。透明な溶液をデカントし、３．９４ｇのチオ硫酸ナトリウム五水和物、１００ｍｌの飽和塩化ナトリウム水溶液、１００ｍｌのジクロロメタンを加える。混合物を強く撹拌し、分離漏斗に移した。層を分離し、水性相をジクロロメタンで抽出した（２×１００ｍｌ）。有機画分を組み合わせ、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。固体を最小量の再蒸留水に溶解させ、４５００ｍｌの水に対して１日透析した。透明な水溶液を塩化ナトリウムで飽和させ、ジクロロメタンで抽出し（３×１００ｍｌ）、硫酸ナトリウム上で乾燥させる。溶媒除去後、ソックスレー抽出器でジエチルエーテルを用いて６時間かけて残渣を抽出し、減圧下での乾燥後に９．２５ｇの白色固体を得る。ＮＭＲによって、４．６ｐｐｍにはＯＨ基が存在せず、３．２ｐｐｍでＯＣＨ３基が存在することが示された。δ＝１．１（ｄ，ＣＨ３、ＰＰＧ）、３．２（ｓ，ＯＣＨ３）３．３（ｍ，ＣＨ、ＰＰＧ）、３．４（ｍ，ＣＨ２、ＰＰＧ）、３．５（ｍ，ＰＥＧ）。
【０１４１】
実施例３：動物
特に明記しないかぎり、この研究では６〜９週齢で体重２０〜３０ｇのＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した。すべてのプロトコールについて、スイスの法律に基づいてＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃａｎｔｏｎ  Ｖａｕｄの承認を受けた。１０ｍｇ／ｋｇの塩酸ケタミンおよび１ｍｇ／ｋｇのキシラジンの皮下注入で麻酔を送達させた。マウスをＣＯ２窒息で安楽死させた。
【０１４２】
実施例４：顕微鏡リンパ管造影
皮膚への間質注入後のナノ粒子の相対取り込み特性を判断するために、過去に説明されているような尾への先端への一定圧力での注入によって蛍光顕微鏡リンパ管造影を実施した［４３〜４５］。マウスの尾の毛を剃毛し、マウスを加熱パッド付きの顕微鏡ステージ（Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ、Ｚｅｉｓｓ）上に載せて、３７℃の体温を維持した。２０ｍｇ／ｍｌの蛍光ＰＰＳナノ粒子（２０ｎｍ、４５ｎｍまたは１００ｎｍ）を滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に加えた溶液をカテーテル内まで引いた。；カテーテルに取り付けられた３０ゲージの針を１ｍｍ前後で尾の先端に皮内挿入し、二方活栓を開いて４０ｍｍ  Ｈｇという一定圧力での流れを開始した。ナノ粒子溶液の流量（管材上流の泡を使って監視）は、ほぼ２０ｍｍ３の組織に対して平均０．１μｌ／分（注入デポから見える容量から概算）または約５μｌ／ｇ／分とした。目視可能な膨潤は観察されなかった。尾の長さ方向での連続画像を一定の曝露時間で収集した。各ナノ粒度について３回の実験を繰り返した。
【０１４３】
マウスの尾の蛍光顕微鏡リンパ管造影を使用して、直径２０ｎｍ、４５ｎｍ、１００ｎｍのＰＰＳナノ粒子のリンパ取り込みを評価した。２０ｎｍの粒子注入後、９０分後に六角形の毛細リンパ管網がはっきりと目視確認され、均一に注入部位から充填されていた（図１ａ）。対照的に、４５ｎｍの粒子の注入後には極めてかすかなリンパ管網しか観察されず（図１ｂ）、１００ｎｍの粒子では極めて小さな網が認められ（図１ｃ）、取り込みが弱いことが示された。毛細血管に漏れる巨大分子／タンパク質／粒子のサイズの上限は、３．５ｎｍ前後であることが既知である［４２］ため、本発明者らの最小２０ｎｍの粒子の血液脈管構造への漏れは効果的にゼロである。よって、この方法は、４５ｎｍおよび１００ｎｍの粒子と比して２０ｎｍの粒子のほうが容易に間質腔からリンパ毛細管に取り込まれることを定性的に確認するものである。
【０１４４】
実施例５：リンパ節でのナノ粒子分布の評価：小さなナノ粒子（２０〜４５ｎｍなど）のリンパ節保持
リンパ節保持を評価するために、２０ｍｇ／ｍｌの蛍光ＰＰＳナノ粒子（直径２０ｎｍ、４５ｎｍ、１００ｎｍ）２０μｌをボーラスとしてマウスの尾の先端または前足蹠に３０ゲージの針で注入した。２０μｌのＰＢＳ注入を対照とした。注入部位に炎症は観察されなかった。２４時間、７２時間、９６時間または１２０時間の時点で、ＣＯ２窒息によってマウスを屠殺した。尾と脚のリンパを排出する仙椎および腰椎のリンパ節と、前足蹠領域のリンパを排出する上腕および腋窩のリンパ節を除去し、フラッシュ凍結させ、凍結切開して１０μｍの切片にして、マウスＣＤ３ｅ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））、ＣＤ４５Ｒ（Ｃａｌｔａｇ、（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ））、ＣＤ６８（Ｓｅｒｏｔｅｃ、（Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ））、Ｄｅｃ−２０５（Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ＣＤ３１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に対する抗体で免疫染色して、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ／ＤＣ、ＤＣ、内皮細胞をそれぞれ標識した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ５９４ｎｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）抗体で二次検出を実施した。リンパ節切片を蛍光（Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ、Ｚｅｉｓｓ）および共焦点レーザ走査顕微鏡（ＬＳＭ  ５１０  Ｍｅｔａ、Ｚｅｉｓｓ）で画像化した。
【０１４５】
リンパ系を研究する目的で、ナノ粒子およびリポソームのリンパ節保持時間が他のいくつかの研究で調査されており、一般に注入後６〜５２時間の範囲の時点に焦点があてられている［３１〜３４、３６］。本明細書にて報告する例では、最大１２０時間のナノ粒子のリンパ節保持について記載し、２０ｎｍの粒子が、２０μｌを皮内ボーラス注入後２４時間、７２時間、９６時間、１２０時間の時点で定性的に一貫したレベルでリンパ節内に有意に存在することを示した（図２）。量は少なかったが４５ｎｍのナノ粒子もリンパ節にすべての時点で存在したのに対し、１００ｎｍのナノ粒子はどの時点でもリンパ節に目視では存在しなかった（図２）。よって、図１の結果とあいまって、これらのデータは、リンパ取り込みとリンパ節保持の両方にとって２０〜４５ｎｍが良好なＰＰＳナノ粒度範囲であり、２０ｎｍが最適なのに対し、１００ｎｍの粒子は一定圧力での注入後に間質からの効率的なリンパ取り込みをするには大きすぎることを示している。これは、リポソーム＞７０ｎｍが注入部位に最も残ることを示した過去の研究とも一致する［２４、３０］。
【０１４６】
具体的な位置については、ＰＰＳナノ粒子がリンパ節内に蓄積される様々な免疫細胞に関して、評価した。Ｔリンパ球およびＢリンパ球に対する特定のゾーンが容易に見られた場合、染色結果は既知のリンパ節アーキテクチャと一致していた［２］。Ｔ細胞は節の中央領域に集まっている傾向があるのに対し、Ｂ細胞は外側の膜の方に存在する胚中心に見られることが多い。リンパ節にある他の主な細胞タイプはＡＰＣまたはＭＨＣＩｌ＋細胞すなわち、ＤＣおよびいくつかのマクロファージであり、それらの位置はさらに分散されていることが多い。図３は、２０ｎｍの粒子を皮内注入後の同じリンパ節の連続切片を示す。ナノ粒子は、Ｔ細胞またはＢ細胞ゾーン（図３ａ、図３ｂ）には存在しなかった。しかしながら、マクロファージおよびＤＣすなわちＣＤ６８＋細胞とナノ粒子の有意な同時局在が認められた（図３ｃ）。
【０１４７】
リンパ節に送達されるリポソームおよびナノ粒子は通常、主にマクロファージによってそこで貪食されると仮定されていた［２１、２７、２９、３０、３２、３６、３７］。しかしながら、さらに、抗原を取り込める未熟なＤＣがリンパ節にも存在することは、これらの技術では評価されていない［１５、１６］。ＰＰＳナノ粒子送達を使用し、ＣＤ６８（膜貫通タンパク質も細胞内で発現される［４７〜５０］が）に対する免疫染色によって、マクロファージおよびＤＣがＰＰＳナノ粒子を内部移行したことが確認された（図４ａ）。ＣＤ６８＋細胞が、マクロファージ、ＤＣあるいはその両方であるか否かをさらに判断するために、高度に特異的なＤＣ受容体Ｄｅｃ−２０５でリンパ節を免疫染色した［４、３８、５１〜５６］。Ｄｅｃ−２０５＋と、そのナノ粒子との同時局在（図４ｂ）は、ナノ粒子を貪食するリンパ節中の細胞の有意な画分が、確かにＤＣであることを実証している。これは、最も強力なＡＰＣタイプ−ＤＣを含むＡＰＣを刺激するために抗原をリンパ節に送達する上で好都合である。
【０１４８】
実施例６：リンパ節細胞の単離と染色
過去に記述されたプロトコールに従ってリンパ節の細胞を単離した［４６］。簡単に説明すると、先に説明したような蛍光ナノ粒子またはＰＢＳの注入後、リンパ節を取り除き、２６ゲージの針で裂き、３７℃で２５分間、コラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ、（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））中にて消化した。次に、組織を７０μｍの細胞ストレーナー（ＢＤ、（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））に通し、細胞懸濁液を回収した。このリンパ節の細胞懸濁液を用いて、ＡＰＣについては抗ＭＨＣクラスＩＩ−（Ｉ−Ａ）−Ｒ−ＰＥ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ））、ＤＣについては抗ＣＤ１１ｃ−アロフィコシアニン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した。ＤＣの成熟を抗ＣＤ８６−Ｒ−ＰＥおよび抗ＣＤ８０−Ｒ−ＰＥ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色して測定した。
【０１４９】
実施例７：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのナノ粒子の内部移行
リンパ節の細胞単離後、細胞をＲＰＭＩ（５％ＦＢＳ）に５００，０００個前後／ｍｌで播種した。次に、細胞を２０ｍｇ／ｍｌの蛍光ナノ粒子２０μｌでパルスし、２４時間インキュベートした。続いて細胞をＨＢＳＳで２回洗浄し、上述したようにしてＡＰＣおよびＤＣについて染色した。
【０１５０】
実施例８：フローサイトメトリー＆分析およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでのナノ粒子の内部移行：ＤＣを含むＡＰＣによる取り込み
染色後、リンパ節の細胞懸濁液をフローサイトメトリー（ＣｙＡｎ  ＡＤＰ、Ｄａｋｏ、（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ））で分析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ、（Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ））を用いてさらに分析を実施した。蛍光ナノ粒子を内部移行したＡＰＣおよびＤＣはそれぞれ、ＭＨＣＩＩ＋ＦＩＴＣ＋およびＣＤ１１ｃ＋ＦＩＴＣ＋であると判断された。ＦＩＴＣはナノ粒子の標識を表す。ＣＤ８６およびＣＤ８０を発現する細胞の画分を計算することで、ナノ粒子の内部移行後のＤＣの成熟を評価した。
【０１５１】
フローサイトメトリー分析を実施して、ナノ粒子を内部移行したリンパ節中のＡＰＣおよびＤＣの画分の量を求めた。図５ａは、リンパ節にて最大４０％前後のＡＰＣ（ＭＨＣＩＩ＋）、特に５０％前後のＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋）が注入後２４時間で２０ｎｍのナノ粒子を取り込んだことを示す。このため、通常はＡＰＣおよび／またはＤＣによる少なくとも１０％〜約９５％の取り込みで、ナノ粒子の用途が企図される。少なくとも約２５％、少なくとも約４０％または約２５％〜約７５％／５０％など、明示的に示した範囲内の範囲と値がすべて企図されることは、当業者であれば自明であろう。また、ＡＰＣおよびＤＣの有意な画分は４５ｎｍのナノ粒子を貪食するのに対し、１００ｎｍのナノ粒子の取り込みはｉｎ  ｖｉｖｏ注入後に極めてわずかしか観察されなかった。ＤＣを含むＡＰＣは、リンパ節に到達した後に粒子を飲食するか、注入部位でこれを内部移行した後に、リンパ節に移動することができた。後者の場合、１００ｎｍの粒子がリンパ節に認められるであろう。なぜなら、大きめの粒子（１〜１０μｍ）も小さめのものと同じように効率的にＡＰＣによって飲食されるからである［１３、５７］。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの実験では、ナノ粒度はＡＰＣまたはＤＣの内部移行に影響しないことが確認された。ほぼすべてのＡＰＣおよびＤＣが、サイズとは関係なくナノ粒子を内部移行した（図５ｂ）。したがって、ＰＰＳナノ粒子は、末梢リンパ管に受動的に取り込まれてリンパ節に到達しやすく、そこで内在ＤＣまたはＡＰＣに貪食される。これらの結果は、抗原を内部移行できる相当数の未熟なＤＣがリンパ節に存在するという最近の所見を裏付けるものである［１５、１６］。特に、リンパ節におけるＤＣおよび他のＡＰＣは、薬剤送達ビヒクルによって細胞性免疫を開始するための価値のある標的となる。
【０１５２】
異なる時点でのナノ粒子の内部移行の比較結果を調査した。ナノ粒子とマクロファージおよびＤＣとの同時局在が、２４時間の時点よりも９６時間の時点で可視的に高くなることが見出された（図６ａ）。フローサイトメトリー分析を用いて、２４時間に対して９６時間の時点でナノ粒子を内部移行するマクロファージおよびＤＣのタイプに変化があるかどうかを判断した。２４時間の時点でナノ粒子を内部移行したすべての細胞のうち、１５％前後がＡＰＣ（ＭＨＣＩＩ＋）で１３％前後がＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋）であったことから、ＡＰＣの大半がＤＣであり、細胞を含む残りの８５％前後のナノ粒子が非抗原提示マクロファージ（ＭＨＣＩＩ−）であることが示唆された。９６時間の時点で、ＡＰＣまたはＤＣであるナノ粒子を有する細胞の画分は、それぞれ６１±５％および３３±３％であった（これは、ナノ粒子を含有するリンパ節のＡＰＣおよびＤＣの画分の増加を反映するものではなく、それは図５ａに示すレベルで一定に保たれる）。ナノ粒子含有ＭＨＣＩＩ＋およびＣＤ１１ｃ＋細胞の増加は、ＡＰＣおよびＤＣがリンパ節に浸潤した後、節組織に依然として残っている遊離ナノ粒子を拾ったことによるかもしれない。また、ナノ粒子を含むＭＨＣＩＩ＋細胞の増加は、２４〜９６時間のマクロファージの活性化による（すなわち、活性化されるＭＨＣＩＩ−マクロファージ、よって、ナノ粒子の内部移行後のＭＨＣＩＩ＋）可能性もある。
【０１５３】
リンパ節におけるＤＣの有意な画分はすでに成熟しているが、未熟なＤＣが存在するため、抗原取り込み後にこれらの細胞が成熟する可能性がある。したがって、ＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化補体活性化ＰＰＳナノ粒子と併用した場合に、２０ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化補体活性化（よって、ヒドロキシル化された）ＰＰＳナノ粒子が従来の生物学的外来性「危険シグナル」を必要としないような形でＤＣの成熟の誘導の一助となるか否かを判断した。２０ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化補体活性化ナノ粒子の注入後、ＤＣ成熟マーカーＣＤ８６の発現が、ＰＢＳを注入した対照に比して増えた（図７）。ＣＤ８０のＤＣ発現も測定したところ、ナノ粒子の内部移行後に有意に大きいと判断された（図７ｂ）。最後に、ナノ粒子を有するＤＣにおけるＣＤ８６およびＣＤ８０の発現レベルは、注入後２４時間に対して９６時間の時点で変化しなかったことも見出された。これは、２０ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化補体活性化ナノ粒子が成熟刺激の時間を長くし、これが長時間にわたってＴ細胞活性化および細胞性免疫を維持する上で有用なものとなり得ることを示唆している。よって、これらの結果は、ＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化補体活性化ＰＰＳナノ粒子が、ＤＣ特異的抗原送達用のビヒクルとして、同時にリンパ節でのＤＣを成熟させて活性化させるアジュバントとして、２つの役割を果たし得ることを示している。
【０１５４】
実施例９：ヒト血清におけるＣ３ａ検出
９６ウェルのプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に、ＰＢＳ中にて１：４０００希釈したＣ３ａ／Ｃ３ａ（ｄｅｓＡｒｇ）マウス抗ヒトモノクローナル抗体（ＡｎｔｉｂｏｄｙＳｈｏｐ、（Ｇｒｕｓｂａｋｋｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ））を１００μｌ／ウェルでコーティングをほどこした。プレートを室温（ＲＴ）にて一晩放置した。未結合の抗体を払い落とし（すなわち、突然の機械的な動きによって除去し）、プレートを２００μｌ／ウェルのＤＩ水で３回洗浄した。次に、プレートを２００μｌ／ウェルのブロック用緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０＋０．５％のウシ血清アルブミン）でＲＴにて１．５時間ブロックした。
【０１５５】
ヒト血清を、１：１容量で、ＰＢＳ、ＰＬＵＲＯＮＩＣで安定化させたナノ粒子（よってヒドロキシル化されたナノ粒子）の懸濁液と、末端メトキシ化ナノ粒子で安定化させたナノ粒子（よってヒドロキシル化されていないナノ粒子）の懸濁液とともに、３７℃で４５分間、エッペンドルフ管にてインキュベートした。プレートのブロックを終了したら、２５０μｌ／ウェルの洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。次に、血清−ナノ粒子試料を５０μｌ／ウェルで２時間、ＲＴにて三重にしてウェルに加えた。さらに、試料を払い落とした後、洗浄緩衝液を用いて２５０μｌ／ウェルで５回プレートを洗浄した。Ｃ３ａ／Ｃ３ａ（ｄｅｓＡｒｇ）−ビオチン化検出抗体（ＡｎｔｉｂｏｄｙＳｈｏｐ）を１：４０００に希釈して５０μｌ／ウェルでＲＴにて２時間、ブロック用緩衝液に加えた。次に、Ｃ３ａ検出抗体を払い落とし、プレートを洗浄緩衝液で２５０μｌ／ウェルにて５回洗浄した。次に、ストレプトアビジン−ＨＲＰ抗体（Ｒ＆Ｄ系）をブロック用緩衝液中で製造業者の推奨濃度に希釈し、５０μｌ／ウェルでＲＴにて２時間、プレートに加えた。さらに、ＨＲＰ抗体を払い落とし、プレートを洗浄緩衝液で２５０μｌ／ウェルにて５回洗浄した。次に、暗所にて４５分間、ＲＴでＨＲＰ基質試薬（Ｒ＆Ｄ系）を１００μｌ／ウェルで加えた。５０μｌ／ウェルの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止させた。次に、Ｔｅｃａｎプレートリーダーで、波長４５０ｎｍおよび５４０ｎｍでプレートを読み取った。５４０ｎｍのバックグラウンド値を４５０ｎｍから引いて最終的な値を得た。
【０１５６】
ＰＢＳとともにインキュベートした血清中に存在するＣ３ａを、ＰＬＵＲＯＮＩＣで安定化させたＰＰＳナノ粒子（よって、ヒドロキシル化されたナノ粒子）および末端メトキシ化ＰＬＵＲＯＮＩＣで安定化させたＰＰＳナノ粒子（よって、ヒドロキシル化されていないナノ粒子）とのインキュベーション後に存在するＣ３ａと比較した。図８に示すように、ＰＢＳでの血清中に存在するＣ３ａが、末端メトキシ化ＰＬＵＲＯＮＩＣで安定化させたＰＰＳナノ粒子とのインキュベーションでは７倍前後の増加率、ＰＬＵＲＯＮＩＣで安定化させたＰＰＳナノ粒子とのインキュベーションでは３２倍前後の増加率となる。このように、ヒト血清Ｃ３から可溶性Ｃ３ａと結合Ｃ３ｂとの切断で測定したところ、ヒドロキシル化ナノ粒子は、非ヒドロキシル化ナノ粒子よりもかなり補体系を活性化させた。これは、ナノ粒子のＯＨ表面が、補体系の別の経路をメトキシ表面よりもかなり効率的に活性化していることを裏付けるものである。
【０１５７】
実施例１０：ＤＣの成熟に対して表面化学が及ぼす影響
２５ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ナノ粒子（よって、ヒドロキシル化されたナノ粒子；本明細書で説明するようにして生成）、末端メトキシ化ＰＬＵＲＯＮＩＣで安定化させた２５ｎｍのナノ粒子（よって、ヒドロキシル化されていない）ナノ粒子、２０ｎｍのカルボキシル化ポリスチレンナノ球体（ＣＯＯＨ−ＮＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＢＳ、ＬＰＳ（３０μｇ）を、上述したようにしてマウスに皮内注入した。次に、リンパ節を回収し、細胞を単離し、上述したようにしてＣＤ１１ｃ、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ４０について染色する。フローサイトメトリーを実施して、リンパ節ＤＣの成熟プロファイルを求めた。
【０１５８】
図９から分かるように、末端メトキシ化ＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ナノ粒子（よって、ヒドロキシル化されていない）ナノ粒子およびカルボキシル化ポリスチレンナノ球体と比較したＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化（よって、ヒドロキシル化された）ナノ粒子のＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ４０プロファイルは、有意に異なる。ＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ナノ粒子で処理した動物から得たＤＣは、これらのＤＣ成熟マーカーの発現量が多く、さらに、陽性対照のＬＰＳと同様のレベルまで成熟を誘導する。末端メトキシ化ＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ナノ粒子で処理した動物からのＤＣならびに、カルボキシル化ポリスチレンナノ球体で処理した動物からのＤＣは、陰性対照のＰＢＳ注入とほぼ同じＤＣの成熟応答を示した。これらの結果から、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＣの成熟応答が２０〜２５ｎｍのナノ粒子の表面化学によって特異的に指示されることがわかる。ヒドロキシル化表面がＤＣの成熟を誘導するのに対し、メトキシおよびカルボキシル表面は誘導しない。本明細書にて提示する結果によれば、これらの表面の機能的な差異は、ヒドロキシル化表面による補体の活性化にある。
【０１５９】
実施例１１：ＤＣの成熟に対してサイズが及ぼす影響
２５ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化（よって、ヒドロキシル化された）ナノ粒子、１００ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化（よって、ヒドロキシル化された）ナノ粒子、ＰＢＳを、上述したようにしてマウスに皮内注入した。次に、本明細書で説明するようにして、リンパ節を回収し、細胞を単離し、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ４０について染色した。フローサイトメトリーを実施して、リンパ節ＤＣの成熟プロファイルを求めた。
【０１６０】
図１０から分かるように、１００ｎｍの同じ表面化学と比較した２５ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化（よって、ヒドロキシル化された）ナノ粒子のＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ４０プロファイルは、有意に異なる。２５ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ナノ粒子は、これらのＤＣ成熟マーカーより高い発現を示す。１００ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ナノ粒子注入によって、陰性対照ＰＢＳ注入とほぼ同じＤＣ成熟応答が得られた。これらの結果は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＣの成熟応答がナノ粒度と特異的に関連していることを示す。本明細書では、２５ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ナノ粒子が１００ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ナノ粒子よりかなり効率的にリンパ毛細管に侵入し、リンパ節まで移動することを説明している。また、２５ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ナノ粒子の保持とリンパ節でのＤＣによる内部移行は、１００ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ナノ粒子の場合よりもかなり大きい。ここで、ＤＣの成熟も２５ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ナノ粒子での場合のほうが１００ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ナノ粒子の場合よりもかなり大きいことが示される。２５ｎｍの超小型ＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ナノ粒子がＤＣの成熟を誘導する機能は、リンパ節の標的と表面化学がＤＣを活性化させるのに有用であることを実証する。本明細書にて提示するリンパ毛細管へのナノ粒子の侵入についての結果によれば、４５ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化（よって、ヒドロキシル化された）ナノ粒子がリンパ節内でＤＣを活性化可能であることが想定される。
【０１６１】
実施例１２：ナノ粒子に対するＯＶＡコンジュゲーション
糖ペプチドを含むタンパク質またはペプチドでＰｌｕｒｏｎｉｃ（ＰＥＧとＰＰＧのブロックコポリマー）表面を官能化することで、ＰＰＳナノ粒子に対する抗原コンジュゲーションを達成可能である。この例では、化学的コンジュゲーション用の遊離システイン残基を含むタンパク質抗原についてのコンジュゲーションスキームを示す。Ｎ末端あるいはリジン残基上のアミンなどの関連するスキームで他の官能基を使用することも可能である。抗原をナノ粒子表面に吸着させてもよい。
【０１６２】
ここでは、卵白アルブミン（ＯＶＡ）のコンジュゲーションスキームを示す。ＯＶＡは、それぞれＭＨＣＩおよびＩＩの経路でＤＣによって処理される抗原ポリペプチドＯＶＡ２５７−２６４およびＯＶＡ３２３−３３９を有するＤＣ抗原提示を調査するためのモデルタンパク質である。このコンジュゲーションスキームは、マイケル付加反応でＯＶＡ上の遊離チオール基によってＯＶＡが連結される対象となるＰｌｕｒｏｎｉｃジビニルスルホンの合成から開始される。両方のステップでの合成の詳細については後述する。
【０１６３】
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７（Ｓｉｇｍａ）、ジビニルスルホン（Ｆｌｕｋａ）、水素化ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ）、トルエン（ＶＷＲ）、酢酸（Ｆｌｕｋａ）、ジエチルエーテル（Ｆｉｓｈｅｒ）、ジクロロメタン（Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｃｅｌｉｔｅ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ）については、取得時のまま使用した。アルゴン（Ｍｅｓｓｅｒ）下で反応を実施した。重水素化クロロホルム（Ａｒｍａｒ）中にて１Ｈ  ＮＭＲを測定し、化学的シフト（δ）を０．０ｐｐｍの内部標準のテトラメチルシラン（Ａｒｍａｒ）シグナルに対するｐｐｍ単位で得る。
【０１６４】
１５ｇ（１．１８ｍｍｏｌ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７を４００ｍｌのトルエンに入れた溶液を、ディーン−スタークトラップを用いて共沸蒸留で４時間乾燥させた。この溶液を氷浴中にて冷却し、０．２８３ｇ（１１．８ｍｍｏｌ）の水素化ナトリウムを加えた。反応混合物を１５分間撹拌し、３．５５ｍｌ（３５．４ｍｍｏｌ）のジビニルスルホン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をすみやかに加えた。室温にて暗所で５日間撹拌した後、１．３５ｍｌ（２３．６ｍｍｏｌ）の酢酸を加えて反応をクエンチした。セライト上で濾過し、濾液を減圧下で少量になるまで濃縮した後、１リットルの氷冷ジエチルエーテル中にて生成物を沈殿させた。固体を濾別し、最小量のジクロロメタンに溶解させ、氷冷ジエチルエーテル中で合計４回沈殿させた。このポリマーを真空下で乾燥させて６．０ｇを得て、ＯＶＡコンジュゲーション前にアルゴン下で−２０℃にて保存した。ＮＭＲでは、ビニルスルホンの存在が示され、官能化度は８８％であった。δ＝１．１（ｍ，ＣＨ３，ＰＰＧ）、３．４（ｍ，ＣＨ，ＰＰＧ）、３．５（ｍ，ＣＨ２，ＰＰＧ）、３．６（ＰＥＧ）、６．１（ｄ，ＣＨｃｉｓ＝ＣＨ−ＳＯ２）、６．４（ｄ，ＣＨｔｒａｎｓ＝ＣＨ−ＳＯ２）、６．８５（ｄｄ，ＣＨ２＝ＣＨＳＯ２−）。
【０１６５】
コンジュゲーションの前に、再生セルロース透析管を用いて分子量カットオフ６〜８で数日間、ＰＬＵＲＯＮＩＣビニルスルホンを水に対して透析した。材料を凍結乾燥によって回収した。ＮＭＲを測定してこのステップがビニルスルホン基の数に影響しないことを確認する。ＯＶＡのコンジュゲーションは、５０ｍｇ（０．００１１ｍｍｏｌ）のＯＶＡを０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝８．１）に入れた溶液に、３００ｍｇ（０．０２３ｍｍｏｌ）のＰＬＵＲＯＮＩＣビニルスルホンを加えて実施される。４℃で６時間反応させた後、反応混合物を凍結乾燥させた。ジクロロメタンを加え、濁った混合物を１２０００ｒｐｍで５分間、室温にて遠心処理する。未反応のＰＬＵＲＯＮＩＣビニルスルホンを含有するジクロロメタンを除去し、沈澱物を減圧下で乾燥させて残留ジクロロメタンを除去する。次に、ナノ粒子合成に使用されるまで、ＰＬ−ＶＳ−ＯＶＡを−２０℃で貯蔵した。
【０１６６】
２重量％のＰｌｕｒｏｎｉｃがＰＬ−ＶＳ−ＯＶＡと置き換わった点が異なる、本明細書で説明するような粒子が合成された。総量で１．５％のＰＬＵＲＯＮＩＣ対ＰＰＳ（重量／容量）を用いた。ナノ粒子合成時の塩基条件へのタンパク質またはペプチドの曝露を減らすために、反応時間を６時間まで減らし、開始剤−チオールに塩基を１：１モル比で加えた。
【０１６７】
また、ＰＬ−ＶＳ−ＯＶＡは、ＯＶＡ上に残る遊離チオールを反応させることによりローダミンヨードアセトアミドで蛍光標識可能である。ナノ粒子を合成し、フルオレセインヨードアセトアミドで標識して、二重標識ＯＶＡコンジュゲートナノ粒子を生成可能である。この場合、ＯＶＡはローダミンで標識され、ナノ粒子はフルオレセインで標識される。
【０１６８】
二重標識ＯＶＡコンジュゲートナノ粒子を、本明細書で説明するようにして、マウスに皮内注入した。その後、注入後２４時間と４８時間の時点でリンパ節を取り除き、それを凍結および凍結切開した。次に、リンパ節の切片を蛍光顕微鏡検査法で観察した。
【０１６９】
動的光散乱をＯＶＡコンジュゲートＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ナノ粒子で実施し、サイズが２５ｎｍ前後に維持されていることを実証した。二重標識ＯＶＡコンジュゲートＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ナノ粒子は、図１１で実証されるように、注入後２４時間および４８時間の時点でリンパ節に存在した。ＯＶＡはナノ粒子と同じ場所に存在した。これらの結果から、４３ｋＤａ前後のＭＷのタンパク質抗原ＯＶＡでナノ粒子を官能化しても、ナノ粒度には有意に影響しないことが実証される。２５ｎｍのＯＶＡコンジュゲートナノ粒子を生成する機能によって、リンパ経由でリンパ節のＤＣにタンパク質抗原を送達できるようになる。この内在リンパ節ＤＣへの抗原送達は、以後の適応免疫応答を高められる可能性を提供するものである。ここでのＯＶＡは、単に例示的なモデル抗原として示される。ペプチド、糖ペプチドを含むタンパク質、タンパク質抗原をコードする核酸をはじめとして、どのような数の分子抗原でも同じように使用可能である。
【０１７０】
実施例１３：ＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ナノ粒子にコンジュゲートされたＯＶＡによって誘導されるＤＣの成熟
２５ｎｍのＯＶＡ−コンジュゲート化ＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ナノ粒子およびＯＶＡをリポ多糖（ＬＰＳ）と混合し、本明細書で説明するようにしてマウスに皮内注入した。リンパ節を回収し、細胞を単離し、本明細書で説明するようにしてＣＤ１１ｃ、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ４０について染色した。フローサイトメトリーを実施して、リンパ節ＤＣの成熟プロファイルを求めた。
【０１７１】
図１２に示すように、ＬＰＳを用いる陽性対照ＯＶＡと比較した２５ｎｍのＯＶＡコンジュゲートＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ナノ粒子の場合におけるＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ４０のプロファイルは、ほぼ同じである。どちらもこれらのＤＣの成熟マーカーを高レベルで発現する。これらの結果から、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＣの成熟応答は、ＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化２５ｎｍナノ粒子によって送達されたＯＶＡと、分子危険シグナルＬＰＳと同時注入されたＯＶＡとで、ほぼ同じであることがわかる。このことから、ＰＰＳナノ粒子のヒドロキシル化および補体活性化、例えばＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化によって形成される、２０〜４５ｎｍなどの小さなナノ粒子にコンジュゲートされたＯＶＡを、抗原送達ビヒクルと成熟刺激アジュバントの両方として用いる可能性が示唆される。
【０１７２】
実施例１４：Ｔ細胞の増殖
Ｔ細胞養子移入として知られる方法を用いて、Ｔ細胞の増殖を測定した。ＯＴ−ＩＩ  Ｔｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）マウスは、ＣＤ４  Ｔ細胞に上方制御されたレベルＯＶＡ  Ｔ細胞受容体を有する点でトランスジェニックである。ＯＴ−ＩＩ  Ｔｇマウス由来の脾臓およびリンパ節を単離し、細胞懸濁液を生成した。脾臓細胞懸濁液については、１．６６７％のＮＨ４Ｃｌで赤血球を溶解させた。脾臓およびリンパ節由来の細胞をプールして計数したところ、合計４００×１０６個の細胞が回収された。
【０１７３】
細胞をカルボキシフルオレセインサクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、２０×１０６／ｍｌでＲＰＭＩ  ｗ／ｏ  ＦＢＳに再懸濁させた。ＣＦＳＥストック溶液は５ｍＭのＤＭＳＯとした。１／１０にする１回目の希釈をＰＢＳ中で実施し、必要な容量を細胞に加えて最終濃度を５μＭとした。ＣＦＳＥを加え、静かに混合し、細胞とともに３７℃で１０分間インキュベートし、蓋を開けたまま放置し、約２分ごとに静かに混合した（細胞を２本の管に分けてクロットの形成や細胞死を防止した）。インキュベーション後、５％ＦＢＳを有するＲＰＭＩを加えて細胞を洗浄し、ＲＰＭＩ  ｗ／ｏ  ＦＢＳで１回、ＰＢＳで１回洗浄した。ＣＦＳＥ標識後に細胞を計数したところ、合計３００×１０６個の細胞であった。
【０１７４】
細胞を５０×１０６／ｍｌでＰＢＳに再懸濁させ、１０×１０６個の細胞をＣＤ４５．１コンジェニックレシピエントマウスの尾静脈に注入した（２００μｌ／マウス）。細胞画分を維持し、フローサイトメトリーによってＣＦＳＥ標識と注入したＣＦＳＥ＋Ｔ細胞の割合とをチェックした。細胞をＡＰＣ抗ＣＤ４で染色した。
【０１７５】
２日目、抗原２０μｌ（ＯＶＡ  １０ｕｇ＋５ｕｇ  ＬＰＳまたは２５ｎｍのＯＶＡ−コンジュゲート化ＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ナノ粒子  １０ｕｇ）をレシピエントマウスの前足蹠に注入した。５日目、マウスを屠殺し、各マウスから、上腕および腋窩のリンパ節を取り出し、プールして細胞懸濁液を生成した。ＣＤ４５．２ＰＥではヨウ化プロピジウム（死細胞）、ＣＤ４ではアロフィコシアニンで細胞を染色した。フローサイトメトリーを実施してＴ細胞の増殖を測定した。
【０１７６】
図１３（左）は、ＰＢＳの注入後、ＣＦＳＥ標識ＯＴ−ＩＩ  Ｔ細胞がすべて最大蛍光レベルに残ったことを示す。しかしながら、ＬＰＳ（中央）を含む陽性対照ＯＶＡと２５ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化（よって、ヒドロキシル化された）ＰＰＳナノ粒子にコンジュゲートしたＯＶＡを注入すると、ＣＤ４  Ｔ細胞の蛍光の著しい減少が認められる。このような蛍光の減少は細胞の娘個体群を示すものであり、親個体群より少ない蛍光を呈する。ＬＰＳを有するＯＶＡまたはＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ＰＰＳナノ粒子にコンジュゲートしたＯＶＡを注入した後、約７サイクルの増殖があった。
【０１７７】
ＯＴ−ＩＩマウスは、ＯＶＡに対してＴ細胞受容体を上方制御するＣＤ４  Ｔ細胞を有するという点で、トランスジェニックである。したがって、ＯＶＡ抗原に遭遇すると、これらのＴ細胞は非常に影響されやすい。よって、ＷＴマウスへのＣＦＳＥ標識ＯＴ−ＩＩ  Ｔ細胞の養子移入は、Ｔ細胞増殖をｉｎ  ｖｉｖｏで測定するための優れたモデルである。
【０１７８】
本明細書では、２５ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化（よって、ヒドロキシル化された）ＰＰＳナノ粒子にコンジュゲートされたＯＶＡを送達後のリンパ節ＤＣの成熟が実証される。これらの結果は、このナノ粒子の内部移行後、ＯＶＡ抗原がＭＨＣ−ＩＩ経路経由で少なくとも部分的に処理され、その抗原ペプチドが成熟ＤＣによってＣＤ４  Ｔ細胞に提示されることを示すものである。これによってＣＤ４  Ｔ細胞が活性化され、増殖する。活性化されたＣＤ４  Ｔ細胞は、適応免疫応答を助けることができる（抗体産生を誘導するための抗原をＢ細胞に提示するなど）。本発明者らが得た結果は、２５ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化（よって、ヒドロキシル化および補体活性化）にコンジュゲートされたＯＶＡがＬＰＳを有する陽性対照ＯＶＡと極めて同様のレベルでＴ細胞増殖を誘導できることを実証するものである。これは、別のＴ細胞による免疫応答が実装されることを示唆するがゆえに重要である。
【０１７９】
実施例１５：ＣＤ８  Ｔ細胞メモリ−細胞免疫の測定
２５ｎｍのＯＶＡ−コンジュゲート化ＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ナノ粒子、ＰＢＳ中のＯＶＡ、ＬＰＳを有するＯＶＡを、本明細書で説明するようにしてＣ５７／ＢＬ６マウスに注入した。次に、７日目にマウスにブースター注入をした。２１日目、マウスを屠殺し、リンパ節を取り出し、本明細書で説明するようにして細胞を単離した。細胞懸濁液を血球計数器で計数した。
【０１８０】
ＩＦＮ−γ用のＥＬＩＳＰＯＴプレート（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を製造業者のプロトコールに沿って調製した。１０％のマウス血清を含むＲＰＭＩ培地を、各ウェルに２０μｌ／ウェルで加えた。次に、２単位のＩＬ−２および０．４μｇのＣＤ２８を各ウェルに加えた。次に、２０μｌ／ウェルのＯＶＡ３２３−３３９ＭＨＣ−Ｉペプチドを２ｍＭの濃度で加えた。次に、細胞を１００μｌ／ウェルでウェルに加えた。ウェルによっては未刺激対照としてＯＶＡペプチドを与えず、一方、他のウェルにはＰＭＡを陽性対照として与えた。プレートを３７℃のインキュベーター内で２日間維持した。２日後、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを製造業者のプロトコールに沿って現像した。Ｌｅｉｃａ  ＭＺ  １６ＦＡステレオスコープを用いたウェルの画像を得た。次に、Ｍａｔｌａｂ画像解析プログラムでウェルにあるスポットを計数した。
【０１８１】
図１４に示すように、マウスの免疫化後、抗原への再曝露後にＥＬＩＳＰＯＴ分析を用いて、ＣＤ８  Ｔ細胞を産生しているＩＦＮ−γの量を判断した（プレートのスポットによって測定）。ＰＢＳ中のＯＶＡを注入されたマウスは、ＩＦＮ−γ細胞が非常に少なかったのに対し、２５ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化（よって、ヒドロキシル化および補体活性化）ナノ粒子にコンジュゲートしたＯＶＡおよびＬＰＳを有する陽性対照ＯＶＡを注入されたマウスでは、有意な増加が認められた。本明細書にて提示する他の結果と一致して、補体活性化（ＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化（よって、ヒドロキシル化された）ＰＰＳナノ粒子など）である極めて小さなナノ粒子（２０〜４５ｎｍなど）にコンジュゲートされたＯＶＡは、ＤＣの成熟およびＣＤ４  Ｔ細胞増殖を誘導できる。これらの結果は、２５ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ナノ粒子にコンジュゲートされたＯＶＡが、ＣＤ８  Ｔ細胞メモリを有意に産生できることを示すものであった。ＣＤ８  Ｔ細胞は、ＭＨＣ−Ｉ経路によって処理されて提示された抗原応答する。ＭＨＣ−Ｉ経路は通常、ＤＣの細胞質で処理される抗原と関連している。これは、ナノ粒子がＭＨＣ−Ｉと−ＩＩのプロセシングおよび提示の両方の抗原を送達できることを示唆する。ＣＤ８  Ｔ細胞も、病原体や病原体に感染した細胞を直接攻撃することから、細胞毒素のキラーＴ細胞として知られている。したがって、小さな（２０〜４５ｎｍなど）補体活性化（ＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化）ナノ粒子がＣＤ８  Ｔ細胞メモリを産生する機能は、これをワクチンで使用できる強い可能性を示している。
【０１８２】
実施例１６：抗体（Ａｂ）力価−体液性免疫の測定
２５ｎｍのＯＶＡ−コンジュゲート化ＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化（よって、ヒドロキシル化された）ナノ粒子、１００ｎｍのＯＶＡ−コンジュゲート化ＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化（よって、ヒドロキシル化された）ナノ粒子、２５ｎｍのＯＶＡ−コンジュゲート化末端メトキシ化ＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化（よって、ヒドロキシル化されていない）ナノ粒子、ＰＢＳ中のＯＶＡ、ＬＰＳを有するＯＶＡを、上述したようにしてＣ５７／ＢＬ６マウスに注入した。２５ｎｍのＯＶＡ−コンジュゲート化ＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化（よって、ヒドロキシル化された）ナノ粒子およびＬＰＳを有するＯＶＡを、Ｃ３−／−マウスに注入した。注入前と注入後２１日目にマウスから採取した血液から血清を単離し、使用するまで−２０℃で貯蔵した。ブースター注入はしなかった。
【０１８３】
９６ウェルのプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に、ＰＢＳ中のＯＶＡ（２μｇ／ｍｌ）を１００μｌ／ウェルでコーティングをほどこした。プレートを室温（ＲＴ）にて一晩放置した。未結合の抗体を払い落とし、プレートを２００μｌ／ウェルのＤＩ水で３回洗浄した。次に、プレートを２００μｌ／ウェルのブロック用緩衝液でＲＴにて１．５時間ブロックした。
【０１８４】
ブロック用緩衝液にてマウスの血清試料を１：１０３から１：１０８まで段階希釈した。プレートのブロックを終了したら、１５０μｌ／ウェルの洗浄緩衝液で３回洗浄した。次に、血清試料を５０μｌ／ウェルで２時間、ＲＴにてウェルに加えた。注入前の血清試料を三重に加えた。さらに、試料を払い落とした後、洗浄緩衝液を用いて１５０μｌ／ウェルで５回プレートを洗浄した。ブロック用緩衝液中でマウス抗ＩｇＧ−ＨＲＰを１：３０００に希釈して５０μｌ／ウェルでＲＴにて２時間、ブロック用緩衝液に加えた。次に、ＨＲＰ抗体を払い落とし、プレートを洗浄緩衝液で１５０μｌ／ウェルにて５回洗浄した。次に、暗所にて４５分間、ＲＴでＨＲＰ基質試薬（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を１００μｌ／ウェルで加えた。５０μｌ／ウェルの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止させた。次に、Ｔｅｃａｎプレートリーダーで、波長４５０ｎｍおよび５４０ｎｍでプレートの吸光度を測定した。５４０ｎｍのバックグラウンド値を４５０ｎｍから引いて最終的な値を得た。注入後の血清値がカットオフ値より大きいかどうか、陽性試料を判断した。カットオフ値については、注入前の三重平均に標準偏差を加えて３を掛けることで計算した。陽性値での最大希釈を抗体（Ａｂ）力価値とみなす。
【０１８５】
図１５に示すように、様々な処理で注入をしたマウスにおいて、ｌｏｇ１０ＩｇＧ  ＯＶＡ  Ａｂ力価を求めた。ＰＢＳを含むＯＶＡの陰性対照を注入したマウスは陽性力価を示さなかった。ＬＰＳを有するＯＶＡの陽性対照を注入したマウスは、野生型とＣ３−／−マウスの両方とも３〜６の間で陽性力価を示した。２５ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ＰＰＳナノ粒子にコンジュゲートしたＯＶＡを注入すると力価が４であったのに対し、１００ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ＰＰＳナノ粒子にコンジュゲートしたＯＶＡと２５ｎｍの末端メトキシ化ＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ＰＰＳナノ粒子にコンジュゲートしたＯＶＡを注入すると、力価の値が小さくなった。最後に、２５ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ＰＰＳナノ粒子にコンジュゲートしたＯＶＡで処理した動物のＡｂ力価は、Ｃ３−／−マウスで有意に低かった。
【０１８６】
ＯＶＡ  ＩｇＧ  Ａｂ力価の存在は体液性免疫の証拠である。このプロセスを生じさせる１つの経路に、抗原がＤＣによって処理され、ＣＤ４  Ｔ細胞に提示されると、それがＢ細胞を刺激して抗原に対するＡｂを産生させることがある。危険信号の不存在下で遊離タンパク質抗原が送達されても、体液性免疫を有意に誘導できないことが知られており、ＰＢＳ中のＯＶＡは陽性力価を生じないため、本発明者らの結果はこれを示している。しかしながら、ＬＰＳを有するＯＶＡの陽性対照は、野生型とＣ３−／−マウスの両方において有意なレベルの力価を示している。本発明者らは、２５ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化（よって、ヒドロキシル化および補体活性化）ＰＰＳナノ粒子にコンジュゲートされたＯＶＡが、ＤＣの成熟、Ｔ細胞増殖、ＣＤ８  Ｔ細胞メモリを誘導できることを本明細書にて示している。これらの結果は、２５ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化（よって、ヒドロキシル化および補体活性化）ナノ粒子にコンジュゲートされたＯＶＡも、抗ＯＶＡ  ＩｇＧ力価を生むことで体液性免疫を誘導可能であることを示す。１００ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ナノ粒子にコンジュゲートされたＯＶＡは陽性力価を生じないことから、リンパ節標的がナノ粒子誘導体液性免疫にとって決定的であることがわかる。また、２５ｎｍの末端メトキシ化ＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ナノ粒子にコンジュゲートされたＯＶＡは、補体をかなり低い度合いで活性化させるものであり、Ａｂ力価の値も低いことから、補体活性化によってこのような強い免疫応答を得るには表面化学の制御も必要であることがわかる。最後に、２５ｎｍのＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化ＰＰＳナノ粒子にコンジュゲートされたＯＶＡは、Ｃ３−／−マウスで野生型マウスよりも力価値がかなり低かったことから、体液性免疫の誘導において補体活性化が重要な役割を果たしていることが示される。
【０１８７】
これらの結果は、リンパ節標的によって作用するための特別なサイズと、特別な表面化学の両方を有する、すなわち、補体を活性化（ＰＬＵＲＯＮＩＣ安定化および他の手段によって得られるヒドロキシル化など）できる、本明細書で説明するようにして生成される様々な実施形態のナノ粒子を使用して、同時注入抗原を用いて強いＴ細胞依存性体液性免疫を生成できることを証明するものである。ここで実証されるのは、抗原がナノ粒子表面にコンジュゲートされ、抗原をナノ粒子表面に結合する吸着方法も効果的である場合である。抗原とこのようなナノ粒子との同時注入も効果的であるはずだが、程度は低いと思われる。
【０１８８】
実施例１７：疎水性薬剤ローディング
適当な溶媒蒸発方法によって、デキサメタゾンなどの疎水性薬剤をローディングした［１３２，１３３］。簡単に説明すると、一例として、薬剤を溶媒であるジクロロメタン（１ｍｇ／ｍｌ）に加えた。次に、１ｍｌの薬剤溶媒懸濁液を１ｍｌのＰＰＳナノ粒子溶液に２０ｍｇ／ｍｌで加えた。このエマルションを暗所にて室温で連続撹拌し、溶媒を蒸発させた。薬剤ローディング効率をＧＰＣで測定した。
【０１８９】
実施例１８：細胞免疫の活性化を示すＴｈ１バイアス応答を誘導する補体活性化ナノ粒子を生成可能である
Ｔｈ１バイアス応答によって特徴づけられる細胞免疫は、多くの用途でのワクチンに必要とされる。骨髄由来のＤＣ（ＢＭＤＣ）の活性化のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを使用し、ＤＣ活性化の分子マーカーを判断してＴｈ１応答の証拠を集めた。サイトカイン発現のパターンが、ナノ粒子製剤の作用機序を示した。特に、ＢＭＤＣをナノ粒子および対照製剤にｉｎ  ｖｉｔｒｏで曝露し、ＤＣがＴ細胞を活性化させる機能の鍵になるレギュレーターであるＩＬ−１２ｐ４０を測定した。ＬＰＳに曝露して誘導されたものに匹敵する、頑強なＩＬ−１２ｐ４０分泌が観察された（図１６のパネルａ）。ヒドロキシル保持ナノ粒子の見かけ上の作用機序と一致して、この作用はナノ粒子を血清に曝露した後だけに観察され（注入後に生じるように）、補体を活性化させるのはナノ粒子表面でのヒドロキシル基の存在に左右されていた。このような強いＩＬ−１２ｐ４０応答は、Ｔｈ１応答を含む適応免疫応答の完全応答を示す。図１６のパネルｂは、血清単独と比較して、ヒドロキシル基を呈するナノ粒子に対する血清の存在下、ＭＨＣＩが４倍増加したことを示す。さらに、図１６のパネルｃは、ヒドロキシルを有する２５ｎｍのＰＰＳコア補体活性化ナノ粒子は、ナノ粒子によって生じるインターフェロン−γの産生から明らかなように、マウスにおいてＣＤ８  Ｔ細胞メモリを誘導したが、対照ではそうでなかったことを示す。
【０１９０】
実施例１９：補体活性化ナノ粒子が都合のよい安全プロファイルを呈する
これらの結果は、驚くべきことに、ＤＣのための活性化シグナルを提供するための補体活性化の経路が特別な毒物学的利点を有することを実証するものである。血清曝露後にｉｎ  ｖｉｔｒｏで２５ｎｍのＰＰＳコア補体活性化ナノ粒子によって刺激されたＢＭＤＣは、強く活性化された（ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ４０の発現によって測定した場合）が、危険シグナル曝露から有毒な作用につながり得るＴＮＦ−ａまたはＩＬ−６、サイトカインは発現しなかった。比較のためのアジュバントとして、ＬＰＳを選択し（臨床使用するには毒性が高すぎる）、ＣｐＧ  ＤＮＡを選択した（臨床用途向けに活発に開発中）。このＢＭＤＣでのデータは、ＣｐＧ  ＤＮＡおよびＬＰＳへの曝露後に観察されたものとは対照的に、ＴＮＦ−ａまたはＩＬ−６のどちらも測定可能なレベルでは産生されなかった（図１７）ことを実証するものである。
【０１９１】
実施例２０：ＴＬＲ−４活性化によって機能する補体活性化ナノ粒子
Ｔｏｌｌ様受容体ＴＬＲ４は、ナノ粒子結合補体の強力な応答を媒介すると考えられている。ＴＬＲ４−ｌ−マウス（ＴＬＲ４を発現しないマウス）から単離したＢＭＤＣからのＩＬ−１２ｐ４０分泌を、血清に曝露した２５ｎｍのＰＰＳコア補体活性化ヒドロキシル化ナノ粒子について測定すると、野生型マウス（ＴＬＲ４を発現する）に比してＩＬ−１２ｐ４０レベルが実質的に低下する。対照として、ＣｐＧ  ＤＮＡ（異なるＴＬＲのリガンド）で刺激したＢＭＤＣでは、差異は実証されなかった（図１８のパネルａ）。さらに、抗卵白アルブミン（ＯＶＡ）力価をヒドロキシル化ナノ粒子について測定すると、ＯＶＡ結合ナノ粒子はＴＬＲ４−ｌ−動物で応答を誘導できなかったのに対し、対照アジュバントであるＣｐＧ  ＤＮＡは正常な応答を誘導した（図１８、パネルｂ）。ＴＬＲ４を持たないマウスは、ＯＶＡ結合ナノ粒子に対する抗体を産生しなかったが、ＴＬＲ４受容体を有するマウスはＯＶＡ結合ナノ粒子に応答して抗ＯＶＡ抗体を生成した。対照の生物学的および化学的測定は、ナノ粒子がＴＬＲ−活性化因子で汚染されているという可能性を決定的に除外した。
【０１９２】
実施例２１：ナノ粒子結合チオール部分が適応免疫応答をトリガーする
表面チオールを有するナノ粒子は、補体依存性適応免疫応答の活性化に対して想定外で驚くべき作用を有する。これらの結果は、新たなナノ粒子材料製剤および用途を提示するものである。例えば、表面にヒドロキシルまたはメトキシルのいずれかも存在する２５ｎｍのＰＰＳコアナノ粒子保持チオールは、Ｃ３ａ産生によって測定した場合に補体を著しく活性化させたのに対し、チオールが存在しないと補体の活性化レベルが有意に低下した（図１９）。この現象は、ヒドロキシルとチオールの両方を有するナノ粒子表面で最も顕著であった。
【０１９３】
さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＢＭＤＣは、ヒドロキシおよびチオール表面を有する２５ｎｍのＰＰＳコアナノ粒子で強く（ＣＤ８０発現およびＩＬ−１２ｐ４０産生によって測定）活性化された。しかしながら、この作用は、チオールの存在しないナノ粒子ヒドロキシ表面では観察されなかった（図２０）。
【０１９４】
実施例２２：分子危険シグナルをナノ粒子ワクチン組成物に取り込むことが可能である
様々な分子危険シグナルをナノ粒子表面の中または上に取り込むことができる。ナノ粒子表面の親水性の危険シグナルを結合することも可能であるが、ナノ粒子の疎水性コア内に疎水性の危険シグナルを取り込むことも可能である。疎水性危険シグナルの一例に、薬剤であるイミキモドならびにそのファミリがあるが、これはＴＬＲ−７を活性化させる。上述したように、２５ｎｍのＰＰＳコアナノ粒子の疎水性コア内にイミキモドをロードし、これらをＢＭＤＣにｉｎ  ｖｉｔｒｏで曝露した。フローサイトメトリーによるＤＣ活性化のキャラクタリゼーションによって、ナノ粒子の疎水性コアに取り込まれたイミキモドによるＤＣ活性化の強力な証拠が得られた（図２１）。
【０１９５】
実施例２３：技術プラットフォームとしての自己会合ナノ粒子
ミセルの形成
ポリマーミセルを含むナノ粒子は、補体活性化用の多岐にわたる実施形態を実施するのに利用できるものである。図２２は、末端ＳＨ基の遮断あり、または遮断なしでのＯＨ−ＰＥＧ−ＰＰＳの合成経路の例を示す。図２３は、ＣＨ３ＰＥＧ−ＰＰＳの合成経路の例を示す。これらの分子をミセル形成に使用してもよい。ミセル形成の方法は、有機溶媒からの水性媒質への分散、薄膜からの水性媒質中での懸濁あるいはポリマーの直接水和を含む。
【０１９６】
ミセル形成の方法の一例が、Velluto et al., Molecular Pharmaceutics 2008, “PEG−＆−PPS Diblock Copolymer Aggregates for Hydrophobic Drug Solubilization and Release: Cyclosporin A as an Example“（参照により本明細書に援用する）に記載されている。特定の実施形態は、約３０％を超える効率で作用剤がロードされたミセルを含む。約５０％を超える、あるいは約６６％を超えるなど、明示的に示した範囲内の範囲と値がすべて企図されることは、当業者であれば自明であろう。ローディング方法は、例えば、共溶媒蒸発方法や湯に入れた懸濁液を含む。作用剤（抗原、薬剤または核酸など）をミセルにカプセル化してもよい。カプセル化方法は、効率が約３０％を超えるものを含む。約５０％を超える、あるいは約７０％を超えるなど、明示的に示した範囲内の範囲と値がすべて企図されることは、当業者であれば自明であろう。
【０１９７】
抗原を結合させたミセルの形成
抗原をＰＥＧ−ＰＰＳブロックコポリマーミセル表面に容易に結合させることが可能である。これをするための経路のひとつに、アミン官能性の鎖末端を提供し、それによってペプチドまたはタンパク質抗原を結合することがある。このようなポリマーに対するひとつの経路を図２４に示す。
【０１９８】
抗原を結合するための他の経路も実施された。使用した１つのスキームは、対のないシステイン残基を持たせるようペプチドまたはタンパク質抗原を合成するものである。図２５に示すように、それはナノ粒子表面のピリジルジスルフィド基と結合可能である。使用されている別の手法は、抗原プロセシングに関与する、カテプシンＳ基質などのプロテアーゼ基質を含むようペプチドまたはタンパク質抗原を合成することにある。カテプシンＳは、ＭＨＣ  ＩおよびＭＨＣ  ＩＩ抗原プロセシングの両方に関与する。配列ＫＱＢＣＬＲ（配列番号３）を一例として説明する。このように、実際の抗原ペプチドはｉｎ  ｓｉｔｕで生成される。
【０１９９】
図２５ａに示し、図２５ｂおよび図２５ｃにおける別の構成にも示すスキームを使用して、ペプチド抗原をナノ粒子表面にコンジュゲートさせ、細胞取り込みとプロセシングの後にそのペプチドペイロードを細胞内で放出することが実証された。例えば、図２６は、卵白アルブミンのＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２）ＭＨＣ  Ｉペプチドを２５ｎｍのＰＰＳコア補体活性化ヒドロキシル化ナノ粒子にコンジュゲートし、注入およびリンパ節内在ＤＣの回収後、ＳＩＩＮＦＥＫＬ−ＭＨＣ  Ｉ複合体に特異的な抗体を用いて、ＭＨＣ  Ｉ複合体内でペプチドが正しく呈されることがフローサイトメトリーによって実証される結果を示す。これは、コンジュゲーションスキームが効果的であり、設計された放出機序すなわち、ジスルフィドの還元の両方が、十分に機能していることを実証するものである。
【０２００】
対にならないシステインを持つ変異体抗原を発現させたくない場合に、タンパク質抗原など、このような官能性を持たない抗原にチオール官能性を加えるスキームを開発した。多くの場合は、図２７などに示すスキームを使用して、末端α−アミンを末端チオールに修飾してもよい。
【０２０１】
ＤＣ活性化を用いる実験では、架橋コアＰＰＳナノ粒子で観察されたものと同じ効果がＰＥＧ−ＰＰＳミセルにも見られることが実証された。組換えＧＭ−ＣＳＦを用いて健康な６〜８週齢のＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスの骨髄由来の樹状細胞（ＢＭＤＣ）の抽出および細胞培養を達成し、ＤＣへの分化を誘導した。ＰＥＧ−ＰＰＳのミセルを以下のようにして調製した。非チオールミセルを形成するために、１０ｍｍｏｌのＰＢＳ、ｐＨ７．４（ｐｈｔｈはフタルイミジルを示す）中、Ｈ３ＣＯ−ＥＧ４６−ＰＳ１７−ｐｈｔｈ、ＨＯ−ＥＧ６８−ＰＳ２０−ｐｈｔｈ、Ｈ３ＣＯ−ＥＧ４６−ＰＳ１１−ＳＨ、ＨＯ−ＥＧ６８−ＰＳ２５−ＳＨを用いてＴＨＦからミセルを形成した。Ｈ３ＣＯ−ＥＧ４６−ＰＳ１７−ｐｈｔｈおよびＨ３ＣＯ−ＥＧ４６−ＰＳ１１−ＳＨでは試料を８．２ｍｇ／ｍＬに標準化し、ＨＯ−ＥＧ６８−ＰＳ２５−ＳＨおよびＨＯ−ＥＧ６８−ＰＳ２０−ｐｈｔｈでは１６．６ｍｇ／ｍＬに標準化した。次に、これらをＢＭＤＣ（１ウェルあたり１００，０００細胞）に、Ｈ３ＣＯポリマーでは１２２μＬ、ＨＯポリマーでは６０．３μＬで加え、１ウェルあたり１ｍｇのポリマーを加えた。細胞およびミセルをマウス血清ありまたはなしで４５分間インキュベートし、洗浄した後、培地で２４時間インキュベートした。細胞を抗ＣＤ１１ｃ−アロフィコシアニンおよび抗ＣＤ８６−ＰＥ（Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）抗体で標識し、結果をＦＡＣＳで上記のようにして定性した。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７  ＰＰＳコアナノ粒子（１ｍｍｏｌ前後のＳＨ）および未メチル化ＣｐＧ対照を比較に用いた。
【０２０２】
この例で用いたミセルは、平均直径１８ｎｍであり、ＰＥＧおよびＰＰＳの分子量を調節することで１０ｎｍ〜５０ｎｍの範囲内で容易に生成可能である。ミセルの形状または自己会合構造が親水性ブロックの分子量（ここではＰＥＧ分子量）と疎水性ブロックの分子量（ここではＰＰＳ分子量）との比に左右されるのに対し、ミセルまたは自己会合構造のサイズは合計分子量に左右されることは、当業者であれば分かるであろう。よって、この例で調べたよりも大きめの球状ミセルは、同様のブロック分子量比であれば高分子量のブロックコポリマー由来で生成可能であるし、小さめの球状ミセルは同様のブロック分子量比であれば低分子量のブロックコポリマー由来で生成可能である。この例に示すＰＥＧ−ＰＰＳミセルを用いると、図２８に示すように、同じ重要性のＨＯ−基ならびに補体活性化によるＨＳ−基の役割が観察される点に注意されたい。それ自体として、抗原保持補体活性化リンパ節標的ミセルのミセル的な実現は極めて有用である。
【０２０３】
抗原分子に加えて、危険シグナル分子も上述した化学スキームを使用してナノ粒子表面に化学的にコンジュゲート可能である。例えば、図２９に示すように、ＣｐＧ  ＤＮＡをナノ粒子表面に結合することが可能である。
【０２０４】
実施例２４：分岐または多官能性可溶性ポリマーが有用なプラットフォームである
これらのデータは、補体を活性化でき、分岐鎖ＰＥＧなど、分岐鎖ポリマーなどの可溶性の多官能性ポリマーからの抗原を提示できる、極めて小さなナノ構造を形成可能なことを示す。ヒドロキシル化され、補体を活性化できる分岐鎖ＰＥＧが、リンパ節にてｉｎ  ｖｉｖｏでＤＣを活性化する機能は、分子量４０ｋＤａの８アームのＰＥＧを注入して確立された。細胞をマウスのリンパ節から単離し、ＤＣの活性化をフローサイトメトリーで分析した。図３０に示すように、ＨＯ末端化分岐鎖ＰＥＧは、ＤＣをｉｎ  ｖｉｖｏで強力に活性化させることができる。図３１に示すものなど、抗原結合用に活性化される分岐鎖ＰＥＧを生成するためのスキームを利用できる。
【０２０５】
実施例２５：ＤＮＡワクチンおよび他の用途向けのナノ粒子ベクター
寸法が極めて小さく（そこに示されるように直径３０ｎｍ）、ＰＥＧ−ＰＰＳ−ＰＥＩとブレンドされたＰＥＧ−ＰＰＳから形成された超小型ＤＮＡ複合体（参照により本明細書に援用する国際特許出願公開第ＷＯ２００７／００８３００号パンフレットまたは米国特許出願公開第２００５０００６８６１８８号明細書を参照のこと）が、間質注入の後にリンパに侵入でき、リンパ節で細胞を効果的にトランスフェクトできることが実証された。ＰＰＳドメインとＰＥＩドメインとの間におけるジスルフィドリンクの存在を示すためにＰＥＧ−ＰＰＳ−ｓｓ−ＰＥＩとも呼ばれるＰＥＧ−ＰＰＳ−ＰＥＩを合成するためのスキーム（このジスルフィドリンクは任意である）を図３２ａに示す。この図は、重合度が４４のＰＥＧを用いた合成について説明するものであるが、他の重合度でも同様にして扱える。ミセルのサイズは、この例で示すようにＰＥＧ−ＰＰＳ−ＰＥＩとＰＥＧ−ＰＰＳのブレンドから混合ミセルを形成することで、強力に制御可能である。混合ミセルをＰＥＧ４４−ＰＰＳ４０−ＰＥＩ１２０（１ｍｇ）およびＰＥＧ４４−ＰＰＳ２０（１０ｍｇ）から形成すると、ＤＮＡとの複合体が平均直径わずか３０ｎｍになり、当業者であれば極めて小さなＤＮＡ複合体であることが分かるであろう。よって、図示の分子量のＰＥＧ−ＰＰＳ−ＰＥＩからどちらかといえば大きめのミセルを形成したが、ＰＥＧ−ＰＰＳとブレンドすれば、ＤＮＡとの複合化後であってもミセルのサイズがもっと小さな寸法になる。図３２ｂに示すように、２つの別々の実験で、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を用いて、リンパ節に内在する細胞の５％（かなり多い）を超えてトランスフェクトした。このうち、フローサイトメトリーでの分析では、Ｔ細胞およびＢ細胞が極めて効果的にトランスフェクトされ、ＤＣも効果的にトランスフェクトされたことが示された。ＤＮＡワクチンのコンセプトすなわち、遺伝子配列としてコードされる抗原を提供することは、もちろん他でも示されてはいるが、末梢の細胞ではなくリンパ節における細胞を本明細書で説明するようにトランスフェクトすることは、新たな治療薬や新たな治療手法につながるまったく異なるコンセプトであり、まったく異なる装置を必要とすることは、当業者であれば理解できよう。よって、間質流によってリンパ節を標的し、Ｂ細胞、ＤＣおよびマクロファージならびにＴ細胞などの免疫細胞をリンパ節でトランスフェクトできる構造を有する本明細書に記載の超小型ナノ微粒子形態は、ＤＮＡワクチンに対する強力な新規の手法となる。これは、約５０ｎｍ未満、一層好ましくは約３０ｎｍという極めて小さな複合体としてＤＮＡを提供することで実現される。
【０２０６】
実施例２６：抗原特異的免疫寛容誘発ワクチン用のナノ粒子ベクター
本明細書で説明するようなナノ粒子およびポリマーミセルを使用して、抗原を樹状細胞に送達し、免疫抑制剤を細胞に送達することが可能である。図３３は、デキサメタゾンをロードした２５ｎｍのＰＰＳコアナノ粒子に骨髄由来のＤＣを曝露可能であり、続いてこれをＬＰＳなどの極めて強いＤＣ活性化シグナルに曝露可能であることを示す。ナノ粒子取り込み免疫抑制剤は、このような強いシグナルに対してすらＤＣの活性化を防止する。
【０２０７】
実施例２７：抗原取り込みの物理化学的機序
ナノ粒子での抗原の共有結合的なグラフトに加えて、物理化学的な手段も企図される。強力な方法のひとつに、ｓｉＲＮＡまたはアプタマー複合体に関しては、ｏｌｉｇｏＥまたはｏｌｉｇｏＤ領域などの強いアニオン性のアミノ酸ストレッチを取り込んで静電複合体の形成可能にするためのペプチドまたはタンパク質抗原の合成あるいは発現がある。ちＰＥＧ−ＰＰＳ−ＰＥＩ含有ミセルとポリアニオン性ＤＮＡとの複合体を形成できるのと同じで、これらのポリカチオン含有ポリマーミセルに、操作されたアニオン性領域を含む抗原を取り込むことが可能である。別の物理化学的な方法は、ＰＥＧ−ｓｓ−ＰＰＳなどで形成された水様コアベシクル内に抗原ペプチドまたはタンパク質を取り込むことである。このようなベシクルの形成は、達成できる。Cerritelli et al., Biomacromolecules 2007:1966−1972を参照のこと。ＭＨＣ  Ｉ組成提示の場合のように抗原の細胞質放出が望ましい場合、この抗原送達方法は特に有用である。このようなベシクルのサイズは、灌流対象となる膜の孔と同様のサイズのベシクルを生成する濾過膜による灌流によるなど、多くの手段によって制御可能である。Napoli et al., Nature Materials, 2004, 3:183−189を参照のこと。細胞取り込み後の放出は、図３４の骨髄由来のＤＣで実証されるように、ＤＣの細胞質に対して極めて効果的に水溶性ペイロードを送達することができる。よって、本発明の実施形態は、サイズの範囲が約１０ｎｍから約５０ｎｍあるいは７０ｎｍのナノ粒子など、水様コアベシクルまたはベシクルであるナノ粒子を含む。約５０ｎｍまたは１８ｎｍ未満など、明示的に示した範囲内の範囲と値がすべて企図されることは、当業者であれば自明であろう。
【０２０８】
実施例２８：粘膜表面へのナノ粒子の送達
上記の例において、調査の対象とした主な投与経路は皮内または皮下注入など組織への注入であるが、筋肉内注入も同様に想定されよう。超小型のサイズのナノ粒子は、流入リンパに対するナノ粒子の侵入の鍵であった。ナノ粒子の超小型の性質は、他の組織への侵入を得るのにも使用可能である。ワクチン接種では、粘膜免疫を生成すると望ましく、さらに、針のない投与を得られるという点で、粘膜が興味深い。粘膜は、注入後に、口の中で、鼻腔内、膣腔内、直腸腔内で到達可能である。直径３０ｎｍのＰＰＳコアナノ粒子を、齧歯類の舌下粘膜に投与し、粘膜組織への浸透を蛍光顕微鏡検査法で判断した。さらに、ナノ粒子製剤を、端を鈍くしたカニューレを用いて穏やかな圧力下で舌下粘膜に投与した。図３５は、３０ｎｍのＰＰＳコアナノ粒子が穏やかな圧力下で舌下粘膜に非常に効果的に浸透するのに対し、１００ｎｍのＰＰＳコアナノ粒子では効果的にはまったく比較にならないほど浸透しなかったことを実証するものである。１００ｎｍのＰＰＳコアナノ粒子の浸透は３０ｎｍのＰＰＳコアナノ粒子で得られたものよりはるかに少なかった。これらの結果は、超小型ナノ粒子が、間質などの組織バリア内での浸透に加えて粘膜などの組織バリアを越えて浸透するのに有用であることを実証する。口腔粘膜をはじめとする粘膜での浸透の場合には、ここでは抗原提示細胞による収集のための粘膜層への浸透と、流入領域リンパ節での最終的な収集のための粘膜層を通過する浸透の両方が興味深い。極めて小さな３０ｎｍのナノ粒子を穏やかな圧力下で投与した場合、図３５は粘膜の深さへ浸透を実証する。本例では齧歯類で先端を鈍くしたカニューレを使用したが、人間の場合なら、弾性であるか変形可能なカップの開口側を舌下組織上に置き指で押すなどの極めて単純な装置を使用して、穏やかな浸透補助圧力を印加することが可能である。
【０２０９】
統計
実施例における統計的有意差は、特に明記しないかぎり両側スチューデントｔ検定で求めた。結果は平均±ＳＤを示し、特に明記しないかぎり条件ごとに３〜８回の実験を実施した。
【０２１０】
キャリア、希釈剤、キット
薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤を使用して、本明細書で説明するような実施形態を送達してもよい。賦形剤とは、治療剤の希釈剤またはビヒクルとして用いられる不活性物質を示す。薬学的に許容されるキャリアは、通常、治療法または生成物にとって化合物を有用なものとするために当前記化合物と併用される。通常、どのような物質でも、薬学的に許容されるキャリアは、動物への送達用に物質と併用される材料である。従来の製剤キャリア、水性、粉末または油性のベース、増粘剤などが必要または望ましいこともある。場合によっては、不溶性化合物を液体送達用に可溶化する；活性を保つために物質のｐＨを制御するための緩衝液；または貯蔵容器での物質の損失を防止する希釈剤などの場合には、送達にキャリアが必須である。しかしながら、他の場合、キャリアは、液体を投与しやすくするなど便利さからくるものである。本明細書に記載の化合物の薬学的に許容される塩は、当業者間で既知の方法で合成できるものである。残留アミンは、ナトリウム、カリウムまたは他の好適な対イオンとの複合体であってもよい。よって、薬学的に許容される組成物は、患者への投与に適したキャリア、塩または賦形剤を有する。さらに、このような組成物の不活性成分も生体適合性で無毒である。
【０２１１】
本明細書に記載のナノ粒子を、意図した投与形態を考慮して、従来の薬学的な実務に合うように適宜選択した好適な薬学的希釈剤、溶液、賦形剤、エクステンダーまたはキャリア（本明細書では薬学的に許容されるキャリアまたはキャリアと呼ぶ）との混合物で投与してもよい。よって、送達可能な化合物は、経口、直腸、局所、静脈注入、関節内注入または非経口投与に適した形態で生成できるものである。キャリアは、固体または液体を含み、キャリアのタイプは使用する投与のタイプに基づいて選択される。好適なバインダー、潤滑剤、崩壊剤、着色剤、香味剤、流動誘導剤、融解剤を、ピル用などのキャリアとして含めてもよい。例えば、活性成分を、ラクトース、ゼラチン、寒天、スターチ、スクロース、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、マンニトール、ソルビトールなどの無毒で薬学的に許容される経口不活性キャリアと組み合わせることが可能である。化合物を、カプセル、錠剤、粉末などの固体剤形あるいは、エリキシル剤、シロップ、懸濁液などの液体剤形で、経口的に投与可能である。活性化合物を滅菌液体剤形で非経口投与することも可能である。生理学的ｐＨまたは浸透圧を達成するための緩衝液を使用してもよい。使用時、注入、経口、頬側、坐薬として、経皮的に、経皮パッチで、あるいは軟膏や塗り薬などで局所的になどの方法で患者に導入することを含む方法で、ナノ粒子を患者に与えてもよい。
【０２１２】
実施形態は、ナノ粒子を調製および／または送達するための成分を含むキットの一部としても作製できるものである。キットは、意図した作業を達成するのに利用者が必要とする材料を集めたものである。このキットを、例えば、箱、封筒またはパッケージなどの一体型の筐体で提供してもよい。ナノ粒子を調製および／または使用するための指示に、本明細書の他の場所で説明したような利用者を助けるステップを、必要に応じて含むようにしてもよい。アプリケーターについてはキットで提供してもよいし、別々に提供してもよい。アプリケーターの例としては、注入器、スワブ、拭き取り綿または穏やかな圧力を生成するための装置があげられる。
【０２１３】
参考文献
本出願に記載の明示的な開示内容と相反しない程度に、以下の参考文献を参照により本明細書に援用する。
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４ａ】
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【図２４ｂ】
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【図２４ｃ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２ａ】
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【図３２ｂ】
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【図３３】
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【図３４ａ】
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【図３４ｂ】
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【図３５】
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【配列表】
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