(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式ＸＶ
【化１】
0005693950.tif 000013
｛式中、
Ｚが、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ＋（ＣＨ３）３、−ＳＯ３Ｒ’、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＲ’、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｆ、ヨードニウム塩−Ｉ＋（Ｒ’）２、ジアルキル／−アリールシラン−ＳｉＯＨ（Ｒ’）２、及びシラノール−ＳｉＨ（Ｒ’）２（式中、Ｒ’は独立して直鎖状又は分枝状Ｃ（１−１２）アルキル基又は場合により置換された、５−、６−又は１０−員環系炭素環状及びヘテロ環状基である。）から選ばれる電子求引性基であり、Ｒ５、Ｒ６が相互に独立してＨ又は直鎖状又は分枝状Ｃ１−Ｃ１２アルキルであり、このアルキルは置換されていないか、又は少なくとも１種のＣＮ、Ｈａｌ又はＮＯ２によって置換され、そして１つ以上の組み込まれた、非隣接のＣＨ２基は独立して−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−ＮＲ’−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−によって置き換えられていてよく、
Ｙ１、Ｙ２が相互に独立してＨ、直鎖状又は分枝状Ｃ１−Ｃ６アルキルから選ばれ、
Ｒ４がＨ、ニトロソ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ、Ｃ１−Ｃ１２アルカノイル、ハロ置換されたＣ１−Ｃ１２アルカノイルから選ばれ、
ｍが０、１、２又は３であり、そして
ｎが１である。｝
で表わされる、アミノベンゾイル部分がフッ素−１８によって置換されている化合物。
【請求項２】
式ＸＶＩ
【化２】
0005693950.tif 000014
｛式中、
Ｚが、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ＋（ＣＨ３）３、−ＳＯ３Ｒ’、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＲ’、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｆ、ヨードニウム塩−Ｉ＋（Ｒ’）２、ジアルキル／−アリールシラン−ＳｉＯＨ（Ｒ’）２、及びシラノール−ＳｉＨ（Ｒ’）２（式中、Ｒ’は独立して直鎖状又は分枝状Ｃ（１−１２）アルキル基又は場合により置換された、５−、６−又は１０−員環系炭素環状及びヘテロ環状基である。）から選ばれる電子求引性基であり、Ｒ３、Ｒ４が相互に独立してＨ、ホルミル、イミノメチル、ニトロソ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ、Ｃ１−Ｃ１２アルカノイル、ハロ置換されたＣ１−Ｃ１２アルカノイルであり、Ｒ５、Ｒ６が相互に独立してＨ又は直鎖状又は分枝状Ｃ１−Ｃ１２アルキルであり、このアルキルは置換されていないか、又は少なくとも１種のＣＮ、Ｈａｌ又はＮＯ２によって置換され、そして１つ以上の組み込まれた、非隣接のＣＨ２基は独立して−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−ＮＲ’−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−によって置き換えられていてよく、
Ｙ１、Ｙ２が相互に独立してＨ、直鎖状又は分枝状Ｃ１−Ｃ６アルキルから選ばれ、
ｍが０、１、２又は３であり、
ｎが１である。｝
で表わされる、アミノベンゾイル部分がフッ素−１８によって置換されている化合物。
【請求項３】
式ＸＶＩＩ
【化３】
0005693950.tif 000015
｛式中、
Ｚが、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ＋（ＣＨ３）３、−ＳＯ３Ｒ’、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＲ’、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｆ、ヨードニウム塩−Ｉ＋（Ｒ’）２、ジアルキル／−アリールシラン−ＳｉＯＨ（Ｒ’）２、及びシラノール−ＳｉＨ（Ｒ’）２（式中、Ｒ’は独立して直鎖状又は分枝状Ｃ（１−１２）アルキル基又は場合により置換された、５−、６−又は１０−員環系炭素環状及びヘテロ環状基である。）から選ばれる電子求引性基であり、Ｒ５、Ｒ６が相互に独立してＨ又は直鎖状又は分枝状Ｃ１−Ｃ１２アルキルであり、このアルキルは置換されていないか、又は少なくとも１種のＣＮ、Ｈａｌ又はＮＯ２によって置換され、そして１つ以上の組み込まれた、非隣接のＣＨ２基は独立して−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−ＮＲ’−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−によって置き換えられていてよく、
ｍが０、１、２又は３であり、そして
ｎが１である。｝
で表わされる、アミノベンゾイル部分がフッ素−１８によって置換されている化合物。
【請求項４】
式ＸＶＩＩＩ
【化４】
0005693950.tif 000016
｛式中、
Ｚが、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ＋（ＣＨ３）３、−ＳＯ３Ｒ’、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＲ’、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｆ、ヨードニウム塩−Ｉ＋（Ｒ’）２、ジアルキル／−アリールシラン−ＳｉＯＨ（Ｒ’）２、及びシラノール−ＳｉＨ（Ｒ’）２（式中、Ｒ’は独立して直鎖状又は分枝状Ｃ（１−１２）アルキル基又は場合により置換された、５−、６−又は１０−員環系炭素環状及びヘテロ環状基である。）から選ばれる電子求引性基であり、Ｒ３がＨ、メチル−又はホルミル−であり、
Ｒ５、Ｒ６が相互に独立してＨ又は直鎖状又は分枝状Ｃ１−Ｃ１２アルキルであり、このアルキルは置換されていないか、又は少なくとも１種のＣＮ、Ｈａｌ又はＮＯ２によって置換され、そして１つ以上の組み込まれた、非隣接のＣＨ２基は独立して−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−ＮＲ’−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−によって置き換えられていてよく、
ｍが０、１、２又は３であり、そして
ｎが１である。｝
で表わされる、アミノベンゾイル部分がフッ素−１８によって置換されている化合物。
【請求項５】
アミノベンゾイル部分を［１８Ｆ］フルオライドによって直接的放射標識化するステップを含む、請求項１−４のいずれか１つに記載の化合物の製造方法。
【請求項６】
インビトロ又はインビボで葉酸受容体を発現させる細胞又は細胞集団の画像診断のための医薬の製造への、請求項１−４のいずれか１つに記載の化合物の使用。
【請求項７】
画像診断を必要とする対象への便利で効果的な投与のための医薬の製造への、請求項１−４のいずれか１つに記載の化合物の使用。
【請求項８】
インビトロで葉酸受容体を発現させる細胞又は細胞集団の画像診断法するための医薬の製造への、請求項１−４のいずれか１つに記載の化合物の使用であって、上記画像診断法が、請求項１−４のいずれか１つに記載の、少なくとも１種の化合物を画像診断量で投与し、ついで前記細胞又は細胞集団の診断画像を取得するステップを含む、上記使用。
【請求項９】
組織試料中の葉酸受容体を発現させる細胞をインビトロ検出するための方法であって、前記組織試料を、請求項１−４のいずれか１つに記載の化合物と、結合を起こさせてその結合を検出することができるように、有効な量ならびに十分な時間および条件で、接触させることを含む、上記方法。
【請求項１０】
前記結合がオートラジオグラフィーによって検出される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
対象を画像診断またはモニタリングするための医薬の製造への請求項１−４のいずれか１つに記載の化合物の使用であって、上記画像診断またはモニタリングが（ｉ）請求項１−４のいずれか１つに記載の化合物の少なくとも１種を画像診断量で投与するステップ、および（ｉｉ）上記少なくとも１種の化合物からのシグナルを検出することにより、ＰＥＴを使って画像診断を行うステップを含む、上記使用。
【請求項１２】
対象におけるがん、炎症性疾患および自己免疫疾患の治療をモニタリングするための医薬の製造への請求項１−４のいずれか１つに記載の化合物の使用であって、上記治療のモニタリングが（ｉ）その必要がある対象に請求項１−４のいずれか１つに記載の少なくとも１種の化合物を画像診断量で治療活性剤と組み合わせて投与するステップ、および（ｉｉ）がん、炎症性疾患および自己免疫疾患の治療の経過を追跡するために前記少なくとも一つの化合物からのシグナルを検出することによりＰＥＴを使って画像診断を行うステップを含む、上記使用
【請求項１３】
がん、炎症性疾患および自己免疫疾患の他の任意の診断方法または治療方法との組み合わせで適用される、請求項１１または１２記載の医薬の製造への使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フッ素−１８が、縮合したピリミジンヘテロ環を葉酸（folate）構造内のアミノ酸部分に結合させるアミノベンゾイル部分に共有結合で連結される新規１８Ｆ葉酸放射性医薬品、それらの前駆体、それらの製造方法、そして葉酸受容体を発現する細胞又は細胞集団の診断、がん、炎症性疾患および自己免疫疾患の診断およびモニタリングならびにその治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
診断剤または治療剤などのエフェクター部分を送達するための細胞特異的ターゲティングは広く研究されている分野であり、非侵襲的診断および／または非侵襲的治療への医学的応用の開発につながっている。特に、γ線または粒子線として電磁放射線を放射する放射性物質を利用する核医学的手順および処置では、特定組織を可視化し、疾患を検討評価しかつ／または治療的処置の効果をモニタリングするべく高いシグナル強度を達成するために、または他の例えば健常組織における放射線傷害のリスクを伴わずに特定患部に十分な線量の電離放射線を送達するべく高い放射線量を達成するために、標的とする細胞または組織におけるこれら放射性物質の選択的局在化が要求される。したがって、細胞特異的構造、特にがん（すなわち腫瘍）または炎症性疾患および自己免疫疾患の場合に存在する構造、例えばそれぞれの生物学的媒体によって特異的にターゲティングされうる受容体、抗原、ハプテンなどを決定し検討評価することは、極めて重要な関心事である。
【０００３】
葉酸受容体（ＦＲ）はこれらの構造の一つであると同定されている。ＦＲは高アフィニティー（ＫＤ＜１０−９Ｍ）膜結合型タンパク質である。正常な組織および器官では、ＦＲ発現はほんのわずかな器官（例えば腎臓、肺、脈絡叢、および胎盤）に強く制限され、それらの器官では、発現が主に上皮細胞の管腔面で起こるので、循環中の葉酸が供されることはない。ＦＲ−アルファは、広範囲にわたるさまざまな特定細胞タイプ、例えば上皮腫瘍（例えば卵巣、子宮頚部、子宮内膜、乳房、結腸直腸、腎臓、肺、鼻咽頭）などで、しばしば過剰発現され、一方、ＦＲ−ベータは白血病細胞でしばしば過剰発現される（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の約７０％はＦＲ−ベータ陽性である）。したがって、これらはどちらも、選択的腫瘍ターゲティングのための貴重な腫瘍マーカーとして使用することができる（非特許文献１：ElnakatおよびRatnam, Adv. Drug Deliv. Rev. 2004; 56:1067-84）。また、慢性関節リウマチと診断された患者における活性化滑膜マクロファージが機能的に活性なＦＲ−ベータを持つ（しかし休止滑膜マクロファージは持たない）ことも、最近になって発見されている（非特許文献ン２：Nakashima-Matsushitaら, Arthritis & Rheumatism, 1999, 42(8): 1609-16）。したがって、関節炎関節では活性化マクロファージを葉酸コンジュゲートでターゲティングすることができ、これは、慢性関節リウマチの診断および処置への可能性を切り開く特性である（非特許文献３：Paulosら, Adv. Drug Deliv. Rev. 2004; 56:1205-17）。
【０００４】
葉酸は、生合成経路の領域に関与する化学的に類似する、一群の化合物に対する総称として本明細書中に使用される。葉酸は３つのユニットから成る。それらのユニットは、  (iii) １種以上のアミノ酸ユニットに結合する(ii) p-アミノ安息香酸ユニットにメチレン基を介してC-6 位で結合する、(i) 縮合したピリミジンヘテロ環ユニットを含む。たとえば、葉酸(folic acid)誘導体の場合、プテリジンヘテロ環ユニットは、種々のグルタミン酸ユニットに結合するp-アミノ安息香酸ユニットにメチレン基を介してC-6 位で結合する。これらの３つのユニットのそれぞれは、変化して種々の葉酸構造のライブラリーを生じさせることができる。このようなバリエーションは、プテリジン環の酸化状態、N5 及び／又は N10 位での１個の炭素置換基の種類、コンジュゲートされるアミノ酸残基の種類及び数、及び種々のユニットの置換パターンの点で異なる葉酸を含むことができる。 合成類似体及び葉酸グループのメンバーとしての葉酸(folic acid)それぞれ自体は最も酸化される形であり、一方ジヒドロフォラート及びテトラヒドロフォラートは徐々により還元される葉酸の形である(その名前が示すように)。 
【０００５】
葉酸は、生体分子、たとえばメチオニン、プリン及びピリミジン生合成の主要合成経路で1-C ユニットのトランスファーに関与する。 更に、これらはセリン及びグリシンの相互変換で、及びヒスチジン異化で重要な役割を果たす。したがって、葉酸及びその誘導体は、葉酸受容体を保有する細胞集団に治療剤および／または診断剤を送達するためのターゲティング剤として、正常細胞との比較でそのような細胞における治療剤および／または診断剤の選択的濃縮を達成するために、過去１５年間にわたって徹底的に研究されてきた。 
【０００６】
種々の試料(probe)が葉酸にコンジュゲートし、（前）臨床的に評価されている。これらには、葉酸放射性医薬品（非特許文献４：LeamonおよびLow, Drug Discov. Today 2001; 6:44-51；特許文献１：米国特許第4,276,280号明細書）、フッ素化葉酸化学療法剤（特許文献２：米国特許第 4,628,090号明細書）、化学療法剤との葉酸コンジュゲート（非特許文献５：LeamonおよびReddy, Adv. Drug Deliv. Rev. 2004; 56:1127-41；非特許文献６：Leamonら, Bioconjugate Chem. 2005; 16:803-11）、タンパク質およびタンパク質毒素との葉酸コンジュゲート（非特許文献７：Wardら, J. Drug Target. 2000; 8:119-23；非特許文献８：Leamonら, J. Biol. Chem. 1993; 268:24847-54；非特許文献９：LeamonおよびLow, J. Drug Target. 1994; 2:101-12）、アンチセンスオリゴヌクレオチドとの葉酸コンジュゲート（非特許文献１０：Liら, Pharm. Res. 1998; 15:1540-45；非特許文献１１：ZhaoおよびLee, Adv. Drug Deliv. Rev. 2004; 56:1193-204）、リポソームとの葉酸コンジュゲート（非特許文献１２：LeeおよびLow, Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1995; 1233:134-44；非特許文献１３：Gabizonら, Adv. Drug Deliv. Rev. 2004; 56:1177-92）、ハプテン分子との葉酸コンジュゲート（非特許文献１４：Paulosら, Adv. Drug Deliv. Rev. 2004; 56:1205-17）、ＭＲＩ造影剤との葉酸コンジュゲート（非特許文献１５：Kondaら, Magn. Reson. Mat. Phys. Biol. Med. 2001; 12:104-13）などが含まれる。通例、これらの試料の全ては、それ自体、既知のカルボン酸カップリング方法に適している葉酸のグルタミン酸部分で葉酸にコンジュゲートされている。
【０００７】
葉酸放射性医薬品は、特に、がん、炎症性疾患および自己免疫疾患の改良された診断、ならびにその治療の有効性の評価には、極めて有用である。これには、処置応答の検討評価および／または予測が含まれ、したがって照射線量測定の改良が含まれうる。当技術分野ではラジオイメージングに適した典型的可視化技法が知られており、例えば陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、プラナーイメージングまたは単光子放射型コンピュータ断層（ＳＰＥＣＴ）イメージング、ガンマカメラ、シンチレーションなどがある。
【０００８】
ＰＥＴとＳＰＥＣＴはどちらも、選択したターゲット部位をイメージングし、マッピングし、その活性を測定するために、放射性トレーサーを使用する。しかし、ＰＥＴが近接したサイクロトロンを必要とする陽電子放出核種を、陽電子放射体の短い半減期のゆえに使用するのに対して、ＳＰＥＣＴはジェネレータシステムで入手することができる単光子放出核種を使用し、これにより、その使用が近接した設備、たとえばサイクロトロン又は反応器の独立をさせ、そしてより便利になりうる。しかしながら、ＳＰＥＣＴはＰＥＴより感度が低く、数少ないアプローチを除くと、定量方法を欠いている。これに反して、PET PETは、より高い感度 (SPECTの１００倍より大きい) を示し、そして十分に精巧な定量法を提供する。更に、ＰＥＴは、脳および他の器官におけるリガンドまたは代謝基質の取り込みおよびアフィニティーを検討評価するための最も洗練された機能イメージング技術の一つであり、それゆえに代謝活性に基づくイメージングの手段になる。これは、例えば陽電子放出同位体を対象に投与することによって達成され、それが放射性崩壊を起こす際に、陽電子消滅によってもたらされるガンマ線がＰＥＴスキャナー中に２つ１組で同時発生的に連結される検出器のリングによって検出される。
【０００９】
ＰＥＴに有用な適切な同位体を選択する際に考慮する必要がある因子には、患者への投与に先だって、場合によっては薬学的に許容できる担体に、診断用組成物を調製することを可能にするのに十分な、その陽電子放出同位体の半減期、およびＰＥＴスキャンによる体外測定を可能とするに足りる活性を与えるのに十分な残留半減期が含まれる。さらにまた、適切な同位体は、不必要な放射線への患者曝露を制限するために、十分に短い半減期を持つべきでもある。通例、ＰＥＴ用の適切な放射性医薬品はガリウムまたは銅などの金属同位体に基づきうる。しかし、これら二つはその金属の捕捉にキレーターを必要し、それが立体的および化学的性質に影響を及ぼしうる。もう一つの選択肢として、放射性医薬品は、最小限の構造変化をもたらす、共有結合で連結された同位体に基づくこともできる。共有結合による取付けに使用される、ＰＥＴスキャニングに適した放射性核種は、典型的には、１１Ｃ（約２０分）、１３Ｎ（約１０分）、１５Ｏ（約２分）、１８Ｆ（約１１０分）など、短い半減期を持つ同位体である。
【００１０】
現在までに、キレートベースの葉酸放射性医薬品がいくつか合成され、葉酸受容体陽性腫瘍をイメージングするための診断剤として、成功裏に評価されている。最も広く研究された誘導体は、１１１Ｉｎおよび９９ｍＴｃで標識されるか（非特許文献１６：Siegelら, J. Nucl. Med. 2003, 44:700；非特許文献１７：Muellerら, J. Organomet. Chem. 2004, 689:4712）、又は68Gaで標識された（非特許文献１８：Mathiasら, Nucl. Med. Biol. 2003, 30(7):725）。しかし、後者の１つのみが陽電子放射体であり、ＰＥＴイメージングに適し、一方、前者の２つは単光子放射体であり、SPECTに使用される。上記はいずれも適切なキレート剤を必要とし、それは通例、葉酸(folic acid)にそのアミノ酸、すなわちグルタミン酸部分を介して連結される。
【００１１】
したがって、共有結合で連結された同位体を持つ葉酸放射性医薬品は、大いに興味が持たれるだろう。特に１８Ｆ標識葉酸放射性医薬品は、上記の考慮事項を全て満たすであろうそのイメージング特性ゆえに、ＰＥＴイメージングに最も適しているだろう。他の適切な放射性核種（１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ）と比較して、１８Ｆは、その半減期が約１１０分と長く、しかも６３５ｋｅＶの低い陽電子エネルギーを持つ陽電子を放出して崩壊し、それが高分解能ＰＥＴにおける最も鮮明なイメージを可能にするので、極めて有用である。さらにまた、１８Ｆの長い半減期が、より複雑な合成と、サイクロトン及び／又は放射化学施設を持たないＰＥＴセンターへのサテライト供給も可能にする。更に、フッ素の原子半径は、 Ｈの原子半径に相当する。これは、Ｈのフッ素−置換の立体効果がリガンドの受容体への結合をほとんど妨げないであろうことを示唆する。フッ素の高い電気陰性度のみが、非置換類似体に比べてフッ素化されたリガンドの生化学的性質に影響を与えることができる。
【００１２】
しかし、葉酸の構造は１８Ｆによる直接的な放射標識には適していない。したがって今までのところ、文献に報告された１８Ｆ標識葉酸誘導体は極めてわずかしかない（非特許文献１９：Bettioら, J. Nucl. Med., 2006, 47(7), 1153；特許文献３：国際特許公開第2006/071754号パンフレット）。更に、これらは、葉酸のグルタミン酸部分でのコンジュゲーションによる18F-標識化を示唆する。今まで、フッ素-１８が 葉酸骨格内に連結される、たとえばベンゾイルアミン部分に連結される18F-標識葉酸 又は その誘導体は知られていない。その上、現在報告されている放射合成は時間がかかり、５％未満という低い放射化学収率しか与えず（非特許文献２０：Bettioら, J. Nucl. Med., 2006, 47(7), 1153）、したがって通常の臨床適用に適さない。
【００１３】
したがって、現在知られている１８Ｆ標識葉酸またはその誘導体では、がん、炎症性疾患および自己免疫疾患の診断および処置を改良するための腫瘍の代謝イメージングに適した特異的放射性医薬品のニーズを満たすことができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第4,276,280号明細書
【特許文献２】米国特許第 4,628,090号明細書
【特許文献３】国際公開第2006/071754号パンフレット
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】ElnakatおよびRatnam, Adv. Drug Deliv. Rev. 2004; 56:1067-84
【非特許文献２】Nakashima-Matsushitaら, Arthritis & Rheumatism, 1999, 42(8): 1609-16
【非特許文献３】非特許文献３：Paulosら, Adv. Drug Deliv. Rev. 2004; 56:1205-17
【非特許文献４】LeamonおよびLow, Drug Discov. Today 2001; 6:44-51
【非特許文献５】LeamonおよびReddy, Adv. Drug Deliv. Rev. 2004; 56:1127-41
【非特許文献６】Leamonら, Bioconjugate Chem. 2005; 16:803-11
【非特許文献７】Wardら, J. Drug Target. 2000; 8:119-23
【非特許文献８】Leamonら, J. Biol. Chem. 1993; 268:24847-54
【非特許文献９】LeamonおよびLow, J. Drug Target. 1994; 2:101-12
【非特許文献１０】Liら, Pharm. Res. 1998; 15:1540-45
【非特許文献１１】ZhaoおよびLee, Adv. Drug Deliv. Rev. 2004; 56:1193-204
【非特許文献１２】LeeおよびLow, Biochim. Biophys. Acta-Biomembr. 1995; 1233:134-44
【非特許文献１３】Gabizonら, Adv. Drug Deliv. Rev. 2004; 56:1177-92
【非特許文献１４】Paulosら, Adv. Drug Deliv. Rev. 2004; 56:1205-17
【非特許文献１５】Kondaら, Magn. Reson. Mat. Phys. Biol. Med. 2001; 12:104-13
【非特許文献１６】Siegelら, J. Nucl. Med. 2003, 44:700
【非特許文献１７】Muellerら, J. Organomet. Chem. 2004, 689:4712
【非特許文献１８】Mathiasら, Nucl. Med. Biol. 2003, 30(7):725
【非特許文献１９】Bettioら, J. Nucl. Med., 2006, 47(7), 1153；WO 2006/071754
【非特許文献２０】Bettioら, J. Nucl. Med., 2006, 47(7), 1153
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本出願人は、フッ素-18が葉酸骨格内のアミノベンゾイル部分に連結される18F-標識葉酸放射性医薬品をたとえば直接的放射標識によって得ることができることをここに見出した。
【００１７】
したがって、本発明は、フッ素−１８が、縮合したプテリジンヘテロ環を葉酸（葉酸）構造内のアミノ酸部分に連結させるアミノベンゾイル部分に共有結合で連結された新規１８Ｆ葉酸放射性医薬品、それらの前駆体、それらの製造方法、好ましくは直接的放射標識による製造方法、がん、炎症性疾患および自己免疫疾患治療の診断およびモニタリングならびにその治療におけるそれらの使用に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
発明の要約
本発明は、第１の態様において、フッ素-18 及び／又は少なくとも１種の電子求引性基 がアミノベンゾイル部分に共有結合で連結された、新規18F-葉酸放射性医薬品及びそれらの前駆体 (以下、本発明の化合物と呼称する。)に関する。 
【００１９】
ある具体的実施態様において、新規葉酸放射性医薬品はアミノベンゾイル部分の2’- 及び／又は6’-位でフッ素-18によって置換され、この医薬品は場合により少なくとも１種の 更なる電子求引性基を含む。 
【００２０】
好ましい実施態様において、本発明は場合により少なくとも１種の更なる電子求引性基を含む2’- 及び6’-18F-葉酸放射性医薬品にも関する。 
【００２１】
もう一つの具体的実施態様において、本発明は新規の葉酸放射性医薬品の前駆体に関する。これらはたとえば離脱基として作用することができ、そして[18F]フルオライドによって求核芳香族置換されうるベンゾイル部分で少なくとも１種の電子求引性基によって置換された化合物を含む。あるいは、少なくとも１種の電子求引性基は、[18F]フルオライドによる置換を助ける活性剤として作用することができる。好ましくは電子求引性基は、たとえば窒素、シアノ、(トリメチル)アンモニウム、スルホナート、エステル、ケトン、塩素、臭素、フッ素、ヨードニウム塩、ジアルキル/-アリールシラン、 シラノールなどを含むことができる。
【００２２】
更にもう一つの態様において、本発明はその製造方法に関する。好ましい実施態様において、本発明の18F-葉酸放射性医薬品は、適する前駆体の直接的 18F-放射標識によって得られる。
【００２３】
もう一つの態様において、本願発明は葉酸受容体を発現させる細胞又は細胞集団の診断に及びインビトロ又はインビボでのがん及びがん治療のモニタリング又は炎症及び自己免疫疾患、たとえば関節リュウマチ及び それらの治療のモニタリングに使用することに関する。
【００２４】
ある実施態様において、本発明は、葉酸受容体を発現させる細胞又は細胞集団の画像診断に本発明の18F-葉酸 放射性医薬品を使用することに関する。
【００２５】
さらに詳しくは、本発明は葉酸受容体を発現させる細胞又は細胞集団の画像診断法を含み、この方法は、たとえば組織サンプル中で、葉酸受容体を発現させる細胞、たとえば腫瘍細胞又は活性化されたマクロファージのインビトロ検出法を含む。このような方法はインビボで行うこともできる。
【００２６】
したがって、更にもう一つの態様において、本発明は画像診断を必要とする対象への便利で効果的な投与のための、及び／又はがん又は炎症及び自動免疫疾患治療のモニタリングのための本発明の18F-葉酸放射性医薬品の使用に関する。本発明の方法の対象は、好ましくは哺乳類、たとえば動物又はヒト、好ましくはヒトである。
【００２７】
本発明のこのような方法は、その他のすでに開発された診断剤及び／又は治療剤を用いる方法及びＸ線コンピュータ断層撮影 (CT)、磁気共鳴画像診断(MRI)、機能的磁気共鳴画像診断  (fMRI)、単光子放出コンピュータ断層撮影(SPECT)、光学的画像及び超音波を用いるて方法を含む、がん又は炎症及び自己免疫疾患の診断又は治療の任意のその他の組み合わせで行うことができる。
【００２８】
本発明のその他の特徴及び利点は、下記の発明の詳細な説明及び特許請求の範囲の記載から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、2’-[18F]フッ素-葉酸を用いるエックスビボ生体内分布からのデータ: 葉酸受容体-陽性組織中に特異的取り込みを示す。
【図２】図 2は、2’-[18F]フッ素-葉酸を用いるPET イメージ (矢印はKB 異種移植片腫瘍の位置を示す。)を示す。
【図３】図 3は、2’-[18F]フッ素-葉酸を用いるPET イメージ(矢印は腎臓の位置をを示す。)を示す。
【図４】図 4は、2’-[18F]フッ素-葉酸を用いるKB 異種移植片腫瘍のエクスビボPET イメージを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
本発明は、第１の態様において、フッ素-18 及び／又は少なくとも１種の電子求引性基 がアミノベンゾイル部分に共有結合で連結された、新規18F-葉酸放射性医薬品及びそれらの前駆体 (以下、本発明の化合物と呼称する。)  に関する。 
【００３１】
18F は、電子求引性 [18F]F2として、そして一般にここで使用されるように, 求核 [18F]フルオライドとして常に使用される。[18F]フルオライドの形で、フッ素-18は 生産可能であり、より一層効果的である。更に、これは、キャリーが付加されていない放射性トレサー を十分に調製するのに唯一の可能性である。
【００３２】
好ましい実施態様において、本発明で使用する葉酸 (構造) 又は その誘導体（以下、簡単に「葉酸(ｆｏｌａｔｅ)」 又は 「葉酸類(ｆｏｌａｔｅｓ)」とも呼ぶ）は、パラ―位にアミノ酸部分を有するアミノベンゾイル部分に連結する、縮合したピリミジンヘテロ環に基づく化合物を包含する。本明細書で使用される「縮合ピリミジンヘテロ環」は別の5- 又は 6-員のヘテロ環、たとえばプテリジン又はピロロピリミジン二環と融合したピリミジンを含む。本明細書で使用される用語「アミノ酸」は、アミノ基(たとえばNH2又は NH3+) とカルボン酸基 (たとえばCOOH 又は COO-)の双方を有する化合物を含む。具体的実施態様において、アミノ酸はα-アミノ酸, β-アミノ酸, D-アミノ酸 又はL-アミノ酸であることができる。アミノ酸 は天然に生じるアミノ酸 (たとえばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、グリシン、 セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、又は ヒスチジンなど)であることができるか、又は それらの誘導体であることができる。誘導体の例は、場合により置換されたアミノ酸を含み、このアミノ酸はたとえばCN、Hal、及び／又は NO2(たとえばフルオログルタミン酸)から選ばれる置換基の１種以上を有する。アミノ酸は、任意の他の非天然に生じるアミノ酸、 たとえばノルロイシン、ノルバリン、L- 又は D-ナフトアラニン、アルニチン、ホモアルギニン及びペプチド技術でよく知られてその他のものも含むことができる（たとえばM. Bodanzsky, "Principles of Peptide 合成," 第１版及び第２改訂版, Springer- Verlag, New York, NY, 1984 及び1993, 及びStewart and Young, "Solid Phase Peptide 合成," 第２版, Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984参照、上記文献の双方を本願に引用して援用する。)。 アミノ酸及びアミノ酸類似体/誘導体は市場で入手できるか(Sigma Chemical Co.; Advanced Chemtech) 又は 従来知られている方法を用いて合成することができる。別の具体的な実施態様で、アミノ酸はポリアミノ酸の一部であることもでき (ポリペプチドとも呼ばれる)、この際上記に定義された通りの、大多数の同一又は異なるアミノ酸が共有結合、すなわち通常のペプチド又は他の結合を介して結合される。好ましいアミノ酸は、たとえばグルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、 アスパルチン、リジン、アルギニン、システイン及びそれらの誘導体を含み、そして好ましいポリアミノ酸は、それらのそれぞれのホモポリマー (すなわちポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸など)を含む。場合により置換されたアスパラギン酸及びグルタミン酸が最も好ましい。
【００３３】
本明細書にいう葉酸の好ましい代表例は、葉酸骨格、すなわちプテロイル-グルタミン酸またはＮ−［４（プテリジン−６−イルメチルアミノ）ベンゾイル］−グルタミン酸）、およびその誘導体に基づき、これには、適宜置換された葉酸、フォリン酸、プテロポリグルタミン酸、および葉酸受容体結合性プテリジン類、例えばテトラヒドロプテリン類、ジヒドロ葉酸類、テトラヒドロ葉酸類、ならびにそれらのデアザおよびジデアザ類似体が含まれる。葉酸（folic acid）は本発明の化合物に使用される好ましい基本構造である。用語「デアザ」および「ジデアザ」類似体とは、天然葉酸構造中の１個または２個の窒素原子の代わりに炭素原子を持つ、当技術分野で認識されている類似体を指す。例えばデアザ類似体には、１−デアザ、３−デアザ、５−デアザ、８−デアザ、および１０−デアザ類似体が含まれる。ジデアザ類似体には、例えば１，５−ジデアザ、５，１０−ジデアザ、８，１０−ジデアザ、および５，８−ジデアザ類似体が含まれる。好ましいデアザ類似体化合物には、Ｎ−［４−［２−［（６Ｒ）−２−アミノ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロ−４−オキソピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル］エチル］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸（ロメトレキソール）およびＮ−［４−［１−［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル］プロピル］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸（エダトレキセート）が含まれる。
【００３４】
特定の実施態様において、新規の葉酸 放射性医薬品はアミノベンゾイル部分の 2’-, 3’-, 5’- 又は 6’-位で、好ましくは2’- 又は 6’-位でフッ素-18によって標識される。2’- 及び6’-18F-葉酸放射性医薬品が最も好ましい。場合により新規の放射性医薬品は更に少なくとも１種の電子求引性基を含む。
【００３５】
もう一つ特定の実施態様において、本発明はこれらの新規の葉酸放射性医薬品の前駆体に関し、この際アミノベンゾイル部分は、少なくとも１種の電子求引性基によって、好ましくは-NO2、-CN、-N+(CH3)3、-SO3R’、-COOR’、-COR’、-Cl、-Br、-F、ヨードニウム塩 -I+(R’)2、ジアルキル/-アリールシラン-SiOH(R’)2、及びシラノール -SiH(R’)2（式中、R’ は独立して直鎖状又は分枝状C(1-12)アルキル基又は場合により置換された、５−、６−又は１０−員環系からなる炭素環状及びヘテロ環状基である。）から選ばれる電子求引性基、最も好ましくは１又は２種の電子求引性基によって アミノベンゾイル部分の2’- 及び／又は 6’-位で置換されている。
【００３６】
したがって、具体的な実施態様において、本発明は、式 I
【００３７】
【化１】
0005693950.tif 000002
【００３８】
｛式中、
Aはアミノ酸であり、
X1〜 X5は相互に独立して N 又は Cであり、
X6、 X7は相互に独立して C、N 又は Oであり、
Z    は 、好ましくは -NO2、-CN、-N+(CH3)3、-SO3R’、-COOR’、-COR’、-Cl、-Br、-F、ヨードニウム塩 -I+(R’)2、ジアルキル/-アリールシラン-SiOH(R’)2、及びシラノール -SiHR(’’)2 （式中、R’ は独立して直鎖状又は分枝状C(1-12)アルキル基 又は場合により置換された、５−、６−又は１０−員環系炭素環状及びヘテロ環状基である。）から選ばれる電子求引性基であり、
R1、R2   は相互に独立して H、Hal、-OR’’、-NHR’’、C1-C12 アルキル、C1-C12 アルコキシ、C1-C12 アルカノイル、C2-C12アルケニル、C2-C12 アルキニル、(C1-C12 アルコキシ)カルボニル、及び(C1-C12 アルキルアミノ)カルボニル（式中、R’’ はH 又はC1-C6 アルキルである。）であり、
R3、R4   は相互に独立して H、ホルミル、イミノメチル、ニトロソ、C1-C12 アルキル、C1-C12 アルコキシ、C1-C12 アルカノイル、ハロ置換されたC1-C12 アルカノイルであり、
R5、R6     は相互に独立して H 又は 直鎖状 又は 分枝状 C1-C12アルキルであり、 このアルキルは置換されていないか、又は少なくとも１種の CN、Hal、又は NO2、によって置換され、そして１つ以上の 組み込まれた、非隣接の CH2 基は 独立して-O-、-CO-、-CO-O-、-CO-NR’-、-CH=CH-、-C≡C-によって置き換えられていてよく、
m    は 0、1、2 又は 3であり、
n    は 0 又は 1であり、
p    は 0、1 又は 2であり、 
q    は1 〜 7の値を有し、そして
r    は 0 又は 1である。}
で表わされる化合物に関する。
【００３９】
特定の実施態様において、Aはグルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパルチン、リジン、アルギニン、システイン、及びそれらの誘導体 又はポリアミノ酸 それぞれのホモポリマーから選ばれるアミノ酸である。好ましい実施態様において、Aは場合によりアスパラギン酸、グルタミン酸、ポリアスパラギン酸 又は ポリグルタミン酸である。
【００４０】
したがって、更に本発明は、式 Iで表わされる化合物（式中、A がたとえばグルタミン酸残基である。）に関し、その化合物は式 II
【００４１】
【化２】
0005693950.tif 000003
【００４２】
｛式中、
X1〜 X5が相互に独立して N 又は Cであり、
X6、X7      が相互に独立して C、N 又は Oであり、
Z    が 、好ましくは -NO2、-CN、-N+(CH3)3、-SO3R’、-COOR’、-COR’、-Cl、-Br、-F、ヨードニウム塩 -I+(R’)2、ジアルキル/-アリールシラン-SiOH(R’)2、及びシラノール -SiHR(’’)2 （式中、R’ は独立して直鎖状又は分枝状C(1-12)アルキル基 又は場合により置換された、５−、６−又は１０−員環系炭素環状及びヘテロ環状基である。）から選ばれる電子求引性基であり、
R1、R2   が相互に独立して H、Hal、-OR’’、-NHR’’、C1-C12 アルキル、C1-C12 アルコキシ、C1-C12 アルカノイル、C2-C12アルケニル、C2-C12 アルキニル、(C1-C12 アルコキシ)カルボニル、及び(C1-C12 アルキルアミノ)カルボニル（式中、R’’ はH 又はC1-C6 アルキルである。）であり、
R3、R4   が相互に独立して H、ホルミル、イミノメチル、ニトロソ、C1-C12 アルキル、C1-C12 アルコキシ、C1-C12 アルカノイル、ハロ置換されたC1-C12 アルカノイルであり、
R5、R6     が相互に独立して H 又は 直鎖状 又は 分枝状 C1-C12アルキルであり、 このアルキルは置換されていないか、又は少なくとも１種の CN、Hal、又は NO2、によって置換され、そして１つ以上の 組み込まれた、非隣接の CH2 基は 独立して-O-、-CO-、-CO-O-、-CO-NR’-、-CH=CH-、-C≡C-によって置き換えられていてよく、
m    が 0、1、2 又は 3であり、
n    が 0 又は 1であり、
p    が 0、1 又は 2であり、 
q    が1 〜 7の値を有し、そして
r    が 0 又は 1である。｝ 
で表わされる化合物である。
【００４３】
好ましい実施態様において、フッ素-18は2’- 又は 6’-位にある。
【００４４】
もう一つの好ましい実施態様において、
R’  はH、C1-C6アルキル、C1-C6 アルコキシ、C1-C6アルカノイル、C2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、(C1-C6 アルコキシ)カルボニル、又は (C1-6アルキルアミノ)カルボニルである。
【００４５】
更に好ましい実施態様において、
R3、R4      は相互に独立して H、ホルミル、イミノメチル、ニトロソ、C1-C12 アルキル、C1-C12 アルコキシ、C1-C12 アルカノイル、ハロ置換されたC1-C12 アルカノイル、であり、そして
R5、R6は相互に独立してH 又は直鎖状又は分枝状 C1-C12 アルキルであって、この基は置換されていないか、又は 少なくとも１種の CN、Hal、又は NO2によって置換されている、そして１つ以上の組み込まれた、非隣接の CH2 基は独立して -O-、-CO-、-CO-O-、-CO-NR’-、-CH=CH-、-C≡C-によって置き換えられる。
【００４６】
更に好ましい実施態様において、
R’  は H、メチル基又はエチル基であり、
R3、R4     は相互に独立して H、メチル基又は ホルミル基であり、そして
R5、R6     は相互に独立して H、メチル基、エチル基又は tert.-ブチル基である。
【００４７】
したがって、更に好ましくは式ＩＩＩ 又はＩＶ
【００４８】
【化３】
0005693950.tif 000004
【００４９】
｛式中、
X1 〜 X5 が相互に独立して N 又は Cであり、
X6、X7     が相互に独立して C、N 又は Oであり、
Z    が 、好ましくは -NO2、-CN、-N+(CH3)3、-SO3R’、-COOR’、-COR’、-Cl、-Br、-F、ヨードニウム塩 -I+(R’)2、ジアルキル/-アリールシラン-SiOH(R’)2、及びシラノール -SiHR(’’)2 （式中、R’ は独立して直鎖状又は分枝状C(1-12)アルキル基 又は場合により置換された、５−、６−又は１０−員環系炭素環状及びヘテロ環状基である。）から選ばれる電子求引性基であり、
R1、R2     が相互に独立して H、Hal、-OR’’、-NHR’’、C1-C12 アルキル、C1-C12 アルコキシ、C1-C12 アルカノイル、C2-C12アルケニル、C2-C12 アルキニル、(C1-C12 アルコキシ)カルボニル及び(C1-C12 アルキルアミノ)カルボニル（式中、R’’ はH 又はC1-C6 アルキルである。）であり、
R3、R4     が相互に独立して H、ホルミル、イミノメチル、ニトロソ、C1-C12 アルキル、C1-C12 アルコキシ、C1-C12 アルカノイル、ハロ置換されたC1-C12 アルカノイルであり、
R5、R6     が相互に独立して H 又は 直鎖状 又は 分枝状 C1-C12アルキルであり、 このアルキルは置換されていないか、又は少なくとも１種の CN、Hal、又は NO2、によって置換され、そして１つ以上の 組み込まれた、非隣接の CH2 基は 独立して-O-、-CO-、-CO-O-、-CO-NR’-、-CH=CH-、-C≡C-によって置き換えられていてよく、
m    が 0、1、2 又は 3であり、
p    が 0、1 又は 2であり、
q    が 1 〜 7の値を有し、そして
r    が 0 又は 1である。｝
で表わされる化合物である。
【００５０】
式 Ｉで表わされる化合物の好ましい実施態様は、式ＩＩＩ 及びＩＶで表わされる化合物にも当てはまる。
【００５１】
更に好ましい化合物は、式I、II、III 又は IV（式中、m = 0）で表わされる化合物である。したがって、もう一つの好ましい実施態様において、本発明は、式Ｖ及びＶＩ
【００５２】
【化４】
0005693950.tif 000005
【００５３】
｛式中、
X1 〜X5       が相互に独立して N 又は Cであり、
X6、X7      が相互に独立して C、N 又は Oであり、
R1、R2     が相互に独立して H、Hal、-OR’’、-NHR’’、C1-C12 アルキル、C1-C12 アルコキシ、C1-C12 アルカノイル、C2-C12アルケニル、C2-C12 アルキニル、(C1-C12 アルコキシ)カルボニル、及び(C1-C12 アルキルアミノ)カルボニル（式中、R’’ はH 又はC1-C6 アルキルである。）であり、
R3、R4     が相互に独立して H、ホルミル、イミノメチル、ニトロソ、C1-C12 アルキル、C1-C12 アルコキシ、C1-C12 アルカノイル、ハロ置換されたC1-C12 アルカノイルであり、
R5、R6     が相互に独立して H 又は 直鎖状 又は 分枝状 C1-C12アルキルであり、 このアルキルは置換されていないか、又は少なくとも１種の CN、Hal、又は NO2、によって置換され、そして１つ以上の 組み込まれた、非隣接の CH2 基は 独立して-O-、-CO-、-CO-O-、-CO-NR’-、-CH=CH-、-C≡C-によって置き換えられていてよく、
p    が0、1 又は 2であり、
q        が 1〜 7の値を有し、そして
r    が 0 又は 1である。｝
で表わされる化合物である。
【００５４】
式Ｉ〜ＩＶで表わされる化合物の好ましい実施態様は、式Ｖ及びＶＩで表わされる化合物にも当てはまる。
【００５５】
もう一つの具体的な実施態様において、本発明は、式 I で表わされる化合物（式中、m は1 又は 2）、より好ましくは電子求引性基 Z が2’- 及び／又は 6’-位にあるような化合物に関する。
【００５６】
したがって、より好ましくは式 ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ及びＸＩ
【００５７】
【化５】
0005693950.tif 000006
0005693950.tif 000007
【００５８】
｛式中、
X1〜 X5  が相互に独立して N 又は Cであり、
X6、X7      が相互に独立して C、N 又は Oであり、
Z    が 、好ましくは -NO2、-CN、-N+(CH3)3、-SO3R’、-COOR’、-COR’、-Cl、-Br、-F、ヨードニウム塩 -I+(R’)2、ジアルキル/-アリールシラン-SiOH(R’)2、及びシラノール -SiHR(’’)2 （式中、R’ は独立して直鎖状又は分枝状C(1-12)アルキル基 又は場合により置換された、５−、６−又は１０−員環系炭素環状及びヘテロ環状基である。）から選ばれる電子求引性基であり、
R1、R2     が相互に独立して H、Hal、-OR’’、-NHR’’、C1-C12 アルキル、C1-C12 アルコキシ、C1-C12 アルカノイル、C2-C12アルケニル、C2-C12 アルキニル、(C1-C12 アルコキシ)カルボニル及び(C1-C12 アルキルアミノ)カルボニル（式中、R’’ はH 又はC1-C6 アルキルである。）であり、
R3、R4     が相互に独立して H、ホルミル、イミノメチル、ニトロソ、C1-C12 アルキル、C1-C12 アルコキシ、C1-C12 アルカノイル、ハロ置換されたC1-C12 アルカノイルであり、
R5、R6     が相互に独立してH又は 直鎖状又は分枝状 C1-C12アルキルであり、 このアルキルは置換されていないか、又は少なくとも１種の CN、Hal、又は NO2、によって置換され、そして１つ以上の 組み込まれた、非隣接の CH2 基は 独立して-O-、-CO-、-CO-O-、-CO-NR’-、-CH=CH-、-C≡C-によって置き換えられていてよく、
n    が 0 又は 1であり、
p    が 0、1 又は 2であり、
q    が 1〜 7の値であり、そして
r    が 0 又は 1である。｝
で表わされる化合物である。
【００５９】
式Ｉ〜ＶＩで表わされる化合物の好ましい実施態様は式VII、VIII、IX、X 及びXIで表わされる化合物にも当てはまる。
【００６０】
更に好ましい化合物は、式I、VII、VIII、IX、X 又は XIで表わされる化合物（式中、n = 0）である。したがって、もう一つの好ましい実施態様において、本発明は式XII、XIII及びXIV
【００６１】
【化６】
0005693950.tif 000008
【００６２】
｛式中、
X1〜 X5  が相互に独立して N 又は Cであり、
X6、X7      が相互に独立して C、 N 又は Oであり、
Z    が 、好ましくは -NO2、-CN、-N+(CH3)3、-SO3R’、-COOR’、-COR’、-Cl、-Br、-F、ヨードニウム塩 -I+(R’)2、ジアルキル/-アリールシラン -SiOH(R’)2、及びシラノール-SiHR(’’)2 （式中、R’ は独立して直鎖状又は分枝状C(1-12)アルキル基 又は場合により置換された、５−、６−又は１０−員環系炭素環状及びヘテロ環状基である。）から選ばれる電子求引性基であり、
R1、R2     が相互に独立して H、Hal、-OR’’、-NHR’’、C1-C12 アルキル、C1-C12 アルコキシ、C1-C12 アルカノイル、C2-C12アルケニル、C2-C12 アルキニル、(C1-C12 アルコキシ)カルボニル及び(C1-C12 アルキルアミノ)カルボニル（式中、R’’ はH 又はC1-C6 アルキルである。）であり、
R3、R4     が相互に独立して H、ホルミル、イミノメチル、ニトロソ、C1-C12 アルキル、C1-C12 アルコキシ、C1-C12 アルカノイル、ハロ置換されたC1-C12 アルカノイルであり、
R5、R6     が相互に独立して H 又は 直鎖状 又は 分枝状 C1-C12アルキルであり、 このアルキルは置換されていないか、又は少なくとも１種の CN、Hal、又は NO2、によって置換され、そして１つ以上の 組み込まれた、非隣接の CH2 基は 独立して-O-、-CO-、-CO-O-、-CO-NR’-、-CH=CH-、-C≡C-によって置き換えられていてよく、
p    が 0、 1 又は 2であり、
q    が 1〜 7の値を有し、そして
r    が 0 又は 1である。｝
で表わされる化合物に関する。
【００６３】
式I 〜XIで表わされる化合物の好ましい実施態様は、式XII、XIII 及びXIVで表わされる化合物にも当てはまる。
【００６４】
略号「N」 及び「C」はすべての可能な飽和度を表わし、すなわちN は -NH- 及び-N= リンケージを含み、そして Cは -CH2- 及び -CH= リンケージを含むと解される。
【００６５】
(H)qは示した環上の (すなわちX3、C6、C7 及び X4上の)すべてのＨ置換基であって、たとえば q = 5の場合、完全に飽和された、非置換の類似体(X3= X4 = N、p = 0) 又は q = 7の場合、完全に飽和された、非置換の5,8-ジデアザ類似体 (X3= X4 = C、p = 0) 及び q = 1の場合、完全に不飽和の類似体（X3= X4 = N、p = 0）であると解される。
【００６６】
式 I 〜 XIV で表わされる化合物の好ましい実施態様は、たとえば式中、X1〜 X5 は N、R1 は NY4Y5、R2は O、p は 0 、そして q は1である化合物を含む。
【００６７】
したがって、別の具体的実施態様において、本発明は式 XV
【００６８】
【化７】
0005693950.tif 000009
【００６９】
｛式中、
Z    が 、好ましくは -NO2、-CN、-N+(CH3)3、-SO3R’、-COOR’、-COR’、-Cl、-Br、-F、ヨードニウム塩 -I+(R’)2、ジアルキル/-アリールシラン-SiOH(R’)2、及びシラノール -SiHR(’’)2 （式中、R’ は独立して直鎖状又は分枝状C(1-12)アルキル基 又は場合により置換された、５−、６−又は１０−員環系炭素環状及びヘテロ環状基である。）から選ばれる電子求引性基であり、
R5、R6     が相互に独立して H 又は 直鎖状 又は 分枝状 C1-C12アルキルであり、 このアルキルは置換されていないか、又は少なくとも１種の CN、Hal、又は NO2、によって置換され、そして１つ以上の 組み込まれた、非隣接の CH2 基は 独立して-O-、-CO-、-CO-O-、-CO-NR’-、-CH=CH-、-C≡C-によって置き換えられていてよく、
Y1、Y2     が相互に独立してH、ホルミル、直鎖状 又は 分枝状 C1-C12アルキル（この基は置換されていないか、又は少なくとも１種の CN、Hal、又は NO2によって置換され、そして１つ以上の組み込まれた、非隣接の CH2 基は独立して -O-、-CO-、-CO-O-、-CO-NR’-、-CH=CH-、-C≡C-によって置き換えられていてよい。）から選ばれ、
R4   がH、ニトロソ、C1-C12アルキル、C1-C12 アルコキシ、C1-C12アルカノイル、ハロ置換された C1-C12 アルカノイルから選ばれ、
m    が 0、1、2 又は 3であり、そして
n    が 0 又は 1である。｝
で表わされる化合物に関する。
【００７０】
式I 〜XIVで表わされる化合物の好ましい実施態様は、式 XVで表わされる化合物にも当てはまる。
【００７１】
したがって、別の具体的な実施態様において、本発明は式 XVI
【００７２】
【化８】
0005693950.tif 000010
【００７３】
｛式中、
Z    が 、好ましくは -NO2、-CN、-N+(CH3)3、-SO3R’、-COOR’、-COR’、-Cl、-Br、-F、ヨードニウム塩 -I+(R’)2、ジアルキル/-アリールシラン-SiOH(R’)2、及びシラノール -SiHR(’’)2 （式中、R’ は独立して直鎖状又は分枝状C(1-12)アルキル基 又は場合により置換された、５−、６−又は１０−員環系炭素環状及びヘテロ環状基である。）から選ばれる電子求引性基であり、
R3、R4     が相互に独立して H、ホルミル、イミノメチル、ニトロソ、C1-C12 アルキル、C1-C12 アルコキシ、C1-C12 アルカノイル、ハロ置換されたC1-C12 アルカノイルであり、
R5、R6     が相互に独立して H 又は 直鎖状 又は 分枝状 C1-C12アルキルであり、 このアルキルは置換されていないか、又は少なくとも１種の CN、Hal、又は NO2、によって置換され、そして１つ以上の 組み込まれた、非隣接の CH2 基は 独立して-O-、-CO-、-CO-O-、-CO-NR’-、-CH=CH-、-C≡C-によって置き換えられていてよく、
Y1、Y2     が相互に独立してH、ホルミル、直鎖状 又は 分枝状 C1-C12アルキル（この基は置換されていないか、又は少なくとも１種の CN、Hal、又は NO2によって置換され、そして１つ以上の組み込まれた、非隣接の CH2 基は独立して -O-、-CO-、-CO-O-、-CO-NR’-、-CH=CH-、-C≡C-によって置き換えられていてよい。）から選ばれ、
m    が 0、1、2 又は 3であり、
n    が 0 又は 1である。｝
で表わされる化合物に関する。
【００７４】
式I 〜XVで表わされる化合物の好ましい実施態様は、式 XVIで表わされる化合物にも当てはまる。
【００７５】
その他の実施態様は、 式 I 〜XIVで表わされる化合物（式中、X1 〜X5及び R1 及び R2 は Nであり、R3 = R5 = R6 は Hであり、R4は CH3であり、p は 0であり、そして  q は 1である。）である。
【００７６】
したがって、別の具体的な実施態様において、本発明は式 XVII
【００７７】
【化９】
0005693950.tif 000011
【００７８】
｛式中、
Z    が 、好ましくは -NO2、-CN、-N+(CH3)3、-SO3R’、-COOR’、-COR’、-Cl、-Br、-F、ヨードニウム塩 -I+(R’)2、ジアルキル/-アリールシラン-SiOH(R’)2、及びシラノール -SiHR(’’)2 （式中、R’ は独立して直鎖状又は分枝状C(1-12)アルキル基 又は場合により置換された、５−、６−又は１０−員環系炭素環状及びヘテロ環状基である。）から選ばれる電子求引性基であり、
R5、R6     が相互に独立して H 又は 直鎖状 又は 分枝状 C1-C12アルキルであり、 このアルキルは置換されていないか、又は少なくとも１種の CN、Hal、又は NO2、によって置換され、そして１つ以上の 組み込まれた、非隣接の CH2 基は 独立して-O-、-CO-、-CO-O-、-CO-NR’-、-CH=CH-、-C≡C-によって置き換えられていてよく、
m    が 0、1、2 又は 3であり、そして
n    が 0 又は 1である。｝
で表わされる化合物に関する。
【００７９】
その他の実施態様は、式 I 〜XIVで表わされる化合物（式中、X1 〜 X5及び R1 及び R2 は Nであり、R4 = R5 = R6 はHであり、R3はCH3 又は ホルミルであり、p は1 であり、そして q は 4である。）である。
【００８０】
したがって、別の具体的な実施態様において、本発明は式 XVIII
【００８１】
【化１０】
0005693950.tif 000012
【００８２】
｛式中、
Z    が 、好ましくは -NO2、-CN、-N+(CH3)3、-SO3R’、-COOR’、-COR’、-Cl、-Br、-F、ヨードニウム塩 -I+(R’)2、ジアルキル/-アリールシラン-SiOH(R’)2、及びシラノール -SiHR(’’)2 （式中、R’ は独立して直鎖状又は分枝状C(1-12)アルキル基 又は場合により置換された、５−、６−又は１０−員環系炭素環状及びヘテロ環状基である。）から選ばれる電子求引性基であり、
R3   が H、メチル- 又は ホルミル-であり、
R5、R6     が相互に独立して H 又は 直鎖状 又は 分枝状 C1-C12アルキルであり、 このアルキルは置換されていないか、又は少なくとも１種の CN、Hal、又は NO2、によって置換され、そして１つ以上の 組み込まれた、非隣接の CH2 基は 独立して-O-、-CO-、-CO-O-、-CO-NR’-、-CH=CH-、-C≡C-によって置き換えられていてよく、
m    が 0、1、2 又は 3であり、そして
n    が 0 又は 1である。｝
で表わされる化合物に関する。
【００８３】
用語「アルキル」が単独でまたは組み合わされて使用される場合、この用語は、通例、好ましくは、１〜１２個、好ましくは１〜８個、より好ましくは１〜４個の炭素原子を有する直鎖状又は分枝状アルキル基、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、t-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシルなどを指す。
【００８４】
本明細書で使用する用語「アルケニル」(すなわち少なくとも１種の二重結合を有する、上記に定義された通りのアルキル基)は、単独で、または他の基と組み合わされて、２〜１２個の炭素原子を含有する直鎖状又は分枝状アルキル基、例えばメチレン、エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン、t-ブチレン、ｓｅｃ−ブチレン、イソブチレン、アミレン、イソアミレン、ペンチレン、イソペンチレン、ヘキシレンなどを指す。好ましいアルケニル基は２〜８個の炭素原子を含有する。
【００８５】
本明細書で使用する用語「アルキニル」(すなわち少なくとも１種の三重結合を有する、上記に定義された通りのアルキル基)は、一つ以上の炭素-炭素三重結合を持つ炭素原子の線状鎖または分枝状鎖を指す。好ましいアルキニル基は、２〜１２個、より好ましくは２〜８個の炭素原子を含有する。
【００８６】
本明細書で使用する用語「アルコキシ」は、酸素で置換された、上記に定義された通りのアルキル、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシなどを指す。
【００８７】
本明細書で使用する用語「アルカノイル」は、ホルミルを指すか、または末端がカルボニルで置換された、上記に定義された通りのアルキル、例えばアセチル、プロパノイル、ブタノイル、ペンタノイルなどを指す。
【００８８】
本明細書で使用する用語「アルキルアミノ」は、窒素で置換された、上記に定義された通りのアルキルを指し、モノアルキルアミノ、例えばメチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノ、ｔｅｒｔ−ブチルアミノなどと、ジアルキルアミノ、例えばジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルプロピルアミノなどの両方を包含する。
本明細書で使用する用語「ハロ」は、任意の第１７族元素を指し、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、およびアスタチン（アスタチノ）を包含する。
【００８９】
表現「場合により置換された」は、好ましくはヒドロキシ、アルコキシ、(ジ)アルキルアミノ、アルキルスルホニル、アルキルカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アルコキシカルボニル、カルボキシル、Hal、CN、NO2による置換を含む。
【００９０】
表現「５−、６−又は１０−員環系などからなる炭素環状及びヘテロ環状基」は好ましくはフェニル、ナフチル、アゼチル、ピロリジニル、イミダゾリル、インドリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサトリアゾリル、チアトリアゾリル、ピリダジニル、モルホリニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピリジル、キノリニル、イソキノリニル、ピペリジニル、ピラゾリル、イミダゾピリジニル及びピペリラジニル、より好ましくはフェニル、ナフチル、ピロリジニル、イミダゾリル、トリアゾリル、ピリミジニル、ピリジル、ピペリジニル及びピラゾリル、最も好ましくはフェニル、ピリジル及びナフチルを含む。
【００９１】
本明細書で使用される用語「電子求引性基」又は 「基Z」は、離脱基として作用することができ、したがって入ってくる [18F]フルオライド によって交換できるかあるいは [18F]フルオライドの導入のための活性剤として作用することができる官能基を指す。適当な電子求引性基は、-NO2、-CN、-N+(CH3)3、-SO3R’、-COOR’、-COR’、-Cl、-Br、-F、ヨードニウム塩 -I+(R’)2、ジアルキル/-アリールシラン-SiOH(R’)2、及びシラノール -SiH(R’)2（式中、R’ は独立して直鎖状又は分枝状C(1-12)アルキル基又は場合により置換された、５−、６−又は１０−員環系などを含む炭素環状及びヘテロ環状基である。）、好ましくは -NO2、-CN、-N+(CH3)3、-SO3R’、-COOR’、-COR’、-Cl、-Br、-F、より 好ましくは -NO2、-CN、-N+(CH3)3を含む。
【００９２】
好ましい実施態様において、R1 及びR2は相互に独立して H、-OR’’、-NHR’’ （式中、 R’’ は H、C1-C6アルキル、C1-C4 アルコキシ、C1-C4アルカノイル、(C1-C4 アルコキシ)カルボニル、及び (C1-C6アルキルアミノ)カルボニルであり、より好ましくは R1 及びR2が相互に独立して -OH、NH2  である。）である。
【００９３】
好ましい実施態様において、R3 及び R4が相互に独立して H、メチル 又は ホルミルである。
【００９４】
好ましい実施態様において、R5 及び R6が相互に独立して H、メチル、エチル 又はtert.-ブチルである。
【００９５】
好ましい実施態様において、 R’は H、メチル又はエチルである。 
【００９６】
好ましい実施態様において、 R’’ はH、メチル 又は エチルである。
【００９７】
別の態様において、本発明は本発明の化合物の合成方法を提供する。本出願人は、本発明の葉酸放射性医薬品が、 [18F]フルオライドを用いる直接的放射標識によって得られる ことを見出した。
【００９８】
更に詳しくは、本発明の製造方法は、式 I で表わされる前駆体（式中、n = 0）を提供し、ついで前記前駆体を、相間移動触媒、たとえばテトラブチルアンモニウムカーボネート又はアミノポリエーテル (たとえば登録商標Kryptofix 2.2.2)とシュウ酸又は炭酸カリウムとの組み合わせによって活性化される [18F]フルオライド と反応させて、[18F]フッ素基を含む式 Iで表わされる化合物を生じさせるステップを包含する。好ましい実施態様において、葉酸放射性医薬品は、フッ素―窒素−交換に基づく直接標識化方法で得られる。
【００９９】
典型的な反応において、適する有機溶剤を乾燥18F-フルオライド-クリプタートに添加し、得られた溶液を、密閉された反応容器中で塩基、たとえばDIEA、TEA又はピリジンが供給された、適切に保護されて前駆体に添加する。得られた混合物を140 - 145℃に20 - 25分間加熱する。ショートカートリッジ精製の後、脱保護を塩基性又は酸性条件及び穏やかな加熱下で5 - 10分間行う。粗製生成物溶液を中和し、セミ分取用HPLC システムに注入する。放射性生成物を集め、ついでHPLC溶剤を窒素流、減圧及び穏やかな加熱によって除去する。製剤化のために、乾燥生成物を生理溶液を用いて再溶解し、滅菌フィルターを用いて滅菌バイアルに移す。
【０１００】
別の態様において、本発明は、本発明の葉酸放射性医薬品の、画像診断を必要とする対象への便利で効果的な投与への使用を提供する。
【０１０１】
したがって、本発明は葉酸受容体を発現させる細胞又は細胞集団の画像診断の方法を提供し、本発明の少なくとも１種の葉酸放射性医薬品をを画像診断量で投与し、ついで前記細胞又は細胞集団の診断画像を取得するステップを含む。
【０１０２】
このような画像処理は、インビトロ又はインビボで葉酸受容体を発現させる細胞又は細胞集団に対して行うことができる。
【０１０３】
したがって、本発明は、組織試料中の葉酸受容体を発現させる細胞をインビトロ検出するための方法であって、この方法は前記組織試料を、本発明の少なくとも１種の葉酸放射性医薬品と、結合を起こさせてそのような結合を技術、たとえばオートラジオグラフィーなどによって検出することができるように、有効な量ならびに十分な時間および条件で、接触させることを含む。
【０１０４】
別の態様において、本発明は本発明の葉酸放射性医薬品の画像診断を必要とする対象への便利で効果的な投与への、又はがん又は炎症及び自動免疫疾患治療のモニタリングへの使用を提供する。
【０１０５】
もう一つの態様において、本発明は同時診断及び治療方法を提供し、この方法は、その必要がある対象に本発明の少なくとも１種の葉酸放射性医薬品を診断に有効な量で、治療活性剤と組み合わせて投与し、ついで治療の経過を追跡するために上記組織の診断画像を得るステップを含む。
【０１０６】
本発明の方法の対象は、好ましくは哺乳動物、例えば動物またはヒト、好ましくはヒトである。
【０１０７】
投薬量は所望する効果の性質、例えば診断または治療の形態、処置の種類および頻度、診断装置、調製物の適用の形態、ならびに受容者の年齢、体重、栄養および状態、もしあれば同時処置の種類に左右される。
【０１０８】
しかし、最も好ましい投薬量は、当業者には理解される通り、また当業者であれば甚だしい実験を行わずに決定することができるように、個々の対象に合わせて調整することができる。これには通例、標準用量の調節（例えば患者の体重が軽ければ用量の削減）を伴う。
【０１０９】
処置は、最適量を下回る少量で開始し、最適な効果が達成されるように、それを増加させることができる。
【０１１０】
本発明の葉酸放射性医薬品は、反復投与としてか又は好ましくは単回投与として投与することができる。たとえば、本発明の葉酸放射性医薬品は、対象に静脈内ボーラス注射によって投与することができる。注射に適した形態は、本発明の上記葉酸放射性医薬品の滅菌水性溶液または分散系を含む。
【０１１１】
注射用溶液剤の場合、好ましい単位投薬量をは約０．０１ｍＬ〜約１０ｍＬである。たとえば静脈内投与後、インビボの器官または腫瘍のイメージングを、所望であれば、放射標識試薬が対象に投与された後３０分から４時間で、行うことができる。通例、投与された用量のうちの十分な量は標的領域に蓄積される。
【０１１２】
葉酸放射性医薬品は、好ましくはHPLCによって精製される。HPLC精製の溶剤の除去の後、生成物を適用前に、好ましくは生理溶液、たとえば0.9% NaCl 又は 0.15Mリン酸緩衝液に溶解させ、製剤化された放射性医薬品を滅菌フィルターを介して滅菌バイアルに移す。
【０１１３】
本発明の葉酸放射性医薬品は、対象から採取した組織生検中の葉酸受容体を発現させる細胞のインビトロ検出にも使用することができる。したがって、さらにもう一つの実施形態において、本発明は、組織試料中の葉酸受容体を発現させる細胞（例えば腫瘍細胞又は 活性化されたマクロファージ）をインビトロ検出するための方法であって、前記組織試料を、本発明の葉酸放射性医薬品と、結合を起こさせてそのような結合をイメージング技法によって検出することができるように、有効な量ならびに十分な時間および条件で接触させることを含む方法を提供する。
【０１１４】
試料は、当業者に知られている手法によって、例えば組織生検材料もしくは体液を収集することによって、または気管もしくは肺試料などを吸引することによって収集することができる。
【０１１５】
試験される組織試料には、例えば腫瘍細胞、上皮細胞、腎臓、胃腸系または肝胆道系など、葉酸受容体を発現させる細胞を含有すると疑われる任意の組織が含まれる。試料は、顕微鏡による検査および観察を容易にするために、例えばミクロトームなどで薄切することができる。試料は、試料組織の組織学的品質を改良するために、本発明の葉酸放射性医薬品の一つとのインキュベーションの前または後に、適当な固定剤で固定することもできる。
【０１１６】
本発明の葉酸放射性医薬品が細胞上の葉酸受容体に結合するのに十分な時間および条件には、標準的な組織培養条件が含まれる。すなわち、試料をインビトロで培養し、生理的媒質中で本発明の複合体または組成物の一つと共にインキュベートすることができる。そのような条件は当業者にはよく知られている。あるいは、試料を固定した後、等張緩衝液または生理的緩衝液中で本発明の葉酸放射性医薬品と共にインキュベートすることもできる。
【０１１７】
どの応用でも、本発明の化合物を使用する場か、またはその近くで、本発明の化合物を製造することが便利である。
【０１１８】
ここに開示し、特許請求する化合物および／または方法は全て、本開示を考慮すれば甚だしい実験を行わずに、製造および実行することができる。本発明の範囲から逸脱することなく本発明に変形を加えうることは、当業者には明白だろう。本明細書に記載する実施例は、例示を意図するものであって網羅的ではないので、決して、例示される実施例を本発明の限定であるとみなしてはならない。
【０１１９】
実施例
材料及び方法
[18F]フルオライドの製造。 n.c.a. [18F]フルオライドをCyclone 18/9 cyclotron (IBA、ベルギー)での 18O(p,n)18F 核反応によって製造した。９７％同位体濃縮された［１８Ｏ］水を、２．１ｍｌの液体ターゲットをつかって、１６ＭｅＶ陽子線で照射した。［１８Ｆ］フルオリド／［１８Ｏ］水溶液を、ターゲットから、マニピュレータを装備した合成ホットセルに、ヘリウム流を使って移した。５ｍｌの０．５Ｍ炭酸カリウム溶液と５ｍｌの水でプレコンディショニングしておいたアニオン交換カートリッジ（Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｌｉｇｈｔ  Ａｃｃｅｌｌ  Ｐｌｕｓ  ＱＭＡ、Ｗａｔｅｒｓ  ＡＧ）上に［１８Ｆ］フルオリド（約２０〜３０ＧＢｑ）を捕捉すると共に、［１８Ｏ］水を再利用するために回収した。
【０１２０】
1H-NMR-スペクトル： 1H-NMR-スペクトルをVarian Mercury Plus 200 (200 MHz) スペクロメータで記録した。 化学シフトを内部標準としてTMS (テトラメチルシラン) を用いて記録した。エレクトロンスプレイイオン化質量スペクトルをAgilent XCT スペクトロメータで記録した。
【０１２１】
HPLC: 前駆体及び2’-フッ素-葉酸の HPLC分析に対して、次のHPLC方法を使用した: 溶離剤 A は、32% 水酸化ナトリウム水溶液の添加によってpH 7.0に調整された水性0.05 M NaH2PO4 である。溶離剤 B は、溶剤 A 及びメタノールの１：１混合物である。使用されるカラムは RP 18、Nucelosilであり、勾配は100% 溶離剤 Aから100% 溶離剤 Bへ 30分以内 であって、20 mg の試料を1000 ml の水中に20 gの NaHCO3及び 20 gのKHCO3を有する緩衝液中に溶解させた。
【０１２２】
すべての他の中間体に関して、次のHPLC法を使用した: 上述と同一の方法、しかし溶離剤 Bは、800 mlのメタノール及び200 mlの 0.05 M NaH2PO4から成る。
【０１２３】
2’[18F]フッ素-葉酸のセミ-分取用HPLC精製を、RP 18 カラム、Gemini 5μ C18、250 x 10 mm上で、勾配を用いて次のように行った。溶剤A = 0.05M リン酸緩衝液、B = メタノール、0 - 30分: A: 99% → 40%、30 - 40分: A:40% → 10%、40 - 45分: A: 40% → 99%。
【０１２４】
例 1: 2’-ニトロ葉酸(folic acid)の合成
(a) 4-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-2-ニトロ安息香酸の合成
10 mlの水中に1 gの 4-アミノ-2-ニトロ安息香酸を有する懸濁液に、0.69 gの水酸化ナトリウム水溶液 (32%)を、 ついで12 mlのジオキサン中に1.2 gのジ-tert.-ブチル-ジカルボナートを有する溶液を添加した。室温で 29時間後、更に0.24 gのジ-tert.-ブチル-ジカルボナートを添加し、混合物を更に 2 時間室温で攪拌した。
【０１２５】
反応混合物を３回メチル-tert.-ブチルエーテルで洗浄した。pH=3が得られるまで、水性層を10% クエン酸水溶液で処理した。得られた懸濁液を0℃に冷却した。生成物吸引濾取し、水洗し、40℃で減圧下に乾燥させて、 0.72 g の 4-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-2-ニトロ安息香酸を得た。
【０１２６】
(b) ジ-tert-ブチル-N-(4-(tert.-ブトキシカルボニルアミノ)-2-ニトロベンズアミド)-L-グルタマートの合成
60 mlのジクロロメタン中に4-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-2-ニトロ安息香酸を有する混合物に、4.8 g の N,N,N’,N’-テトラメチル-O-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-ウロニウム-ヘキサフルオロ-ホスフェートを添加した。15分間の攪拌後、60 mlのジクロロメタン中に3.8 g の L-グルタミン酸-ジtert.-ブチルエステル塩酸塩及び3 mlの トリエチルアミンを有する混合物を滴加した。室温で20時間攪拌後、混合物を濾過し、ろ液を５回10% クエン酸水溶液で、４回5% 炭酸ナトリウム水溶液で、ついで２回水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムを介して乾燥させ、減圧で濃縮して、6.3 g のジ-tert-ブチル N-(4-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-2-ニトロベンズアミド)-L-グルタマート を 黄色泡状物として得た。これをそのまま例 3で使用する。
【０１２７】
(c) N-(4-アミノ-2-ニトロベンズアミド)-L-グルタミン酸 x トリフルオロ酢酸塩
53 mlのジクロロメタン中にジ-tert.-ブチル-N-(4-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-2-ニトロベンズアミド)-L-グルタマートを有する溶液に、 53 ml のトリフルオロ酢酸を0℃でアルゴン下で添加した。室温で 1 時間、混合物を濃縮乾固し、3.54 g の N-(4-アミノ-2-ニトロベンズアミド)-L-グルタミン酸を 黄色泡状物として得た。
【０１２８】
(d)  2’-ニトロ葉酸(folic acid)の合成
50 ml のジメチルアセトアミド中に 3,5 gのN-(4-アミノ-2-ニトロベンズアミド)-L-グルタミン酸 x トリフルオロ酢酸塩を有する溶液に、2,31 gの2-アミノ-4-オキソ-6-ブロモメチル-プテリジンヒドロブロマイドを窒素雰囲気下で添加した。懸濁液を60℃で 5時間、ついで20時間室温で攪拌した。固体を濾過によって除去し、ジメチルアセトアミドで洗浄した。ろ液を10分以内に321 ml の 0.1 M塩酸水溶液に室温で滴加する。得られた懸濁液を2 時間室温で攪拌した。生成物を吸引濾取し、24 ml の 0.1 M塩酸水溶液で、ついで24 mlの水で洗浄し、40℃で減圧下に乾燥させて、1.54 g の粗製2’-ニトロ葉酸(folic acid)を得た、これを水から再結晶によって精製して、1.04 g の純粋な2’-ニトロ葉酸(folic acid)を得た (HPLC 純度: 98.1% area、m/z = 487 [M+1]+、1H-NMR (200 MHz、DMSO-d6) [ppm]: 8.65 (s, C(7)-H, 1H); 7.75 (t, N(8’)-H, 1H, D2Oと交換可能); 7.51 (t, C(3’H), 1H); 7.20 (t, N(10)-H, 1H, D2Oと交換可能); 7.03 (bs, NH2, 2H, D2Oと交換可能); 6.50 (m, C(5’)-H, (C(6’)-H, 2H); 4.48 (d, C(6)H2, 2H); 4.29 (m, C(α)-H, 1H); 2.28 (m, C(β)-H2, 2H); 1.96 (m, C(γ)-H2, 2H)。
【０１２９】
例 2: 2’-ニトロ葉酸(folic acid) ジメチルエステルベンゼンスルホネートの合成
2’-ニトロ葉酸(folic acid) のエステル化を、国際公開（WO）第 2001/04121号パンフレットに記載された葉酸(folic acid)のエステル化法と同様にして達成させる。
【０１３０】
例 3: N2,N,N-ジメチルアミノメチレン-2’-ニトロ葉酸(folic acid)-ジ-tert.ブチルエステルの合成
(a) 4-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニルアミノ)-2-ニトロ安息香酸の合成
6.63 gの炭酸ナトリウムを含有する水228 ml中に11.4 gの4-アミノ-2-ニトロ安息香酸を有する溶液に、17.0 g の 9-フルオレニルメチル-クロロホルミアートを添加し、ついで 20 mlのジオキサンを滴加した。窒素下で20 時間攪拌後、混合物を濾過し、ろ液を５回メチル-tert.-ブチルエーテルで洗浄した。残存するメチル-tert.-ブチルエーテルを減圧下に蒸発させることによって水性相から除去した。水性相に456 gの 0℃の冷水を添加した。混合物を、31 mlの 2M塩酸水溶液の添加によってpH=3に調整した。 沈殿を吸引濾取し、513 mlの水で洗浄し、 40℃で減圧で乾燥させ、17.0 gの4-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニルアミノ)-2-ニトロ安息香酸をオフホワイト結晶として得た。
【０１３１】
(b) ジ-tert-ブチル-N-(4-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニルアミノ)-2-ニトロベンズアミド)-L-グルタマートの合成
222 mlのジクロロメタン中に17,2 gの4-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニルアミノ)-2-ニトロ安息香酸を有する懸濁液に、17.7 gの N,N,N’,N’-テトラメチル-O-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-ウロニウム-ヘキサフルオロ-ホスフェートを添加した。 15 分間 室温で攪拌後、172 mlのジクロロメタン及び12.9 mlのトリエチルアミン中に 13.8 g の L-グルタミン酸 -ジ-tert.ブチルエステル塩酸塩を有する溶液を30分以内に滴加した。混合物を窒素下で 室温で２０時間攪拌する。860 ml のメチル-tert.-ブチルエーテルの添加後、 混合物を５回炭酸水素ナトリウム水溶液(5%)で、5 回クエン酸水溶液 (5%) で、ついで２回ブラインで洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムを介して乾燥させ、減圧で蒸発乾固させて、 27.9 g の粗製ジ-tert-ブチル 2-(4-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニルアミノ)-2-ニトロベンズアミド)-L-グルタマートを黄色泡状物として得た。粗製生成物をシリカゲル60 及び溶離剤として酢酸エチル/n-ヘプタン/ 45:55を用いるフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。 生成物フラクションの蒸発後、23.8 g のジ-tert-ブチル-N-(4-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニルアミノ)-2-ニトロベンズアミド)-L-グルタマートを黄色泡状物として得た(HPLC、純度: 99.9% area)。
【０１３２】
(c) N-(4-アミノ-2-ニトロベンズアミド)-L-グルタミン酸 ジ-tert.-ブチエステルの合成
200 mlのN,N-ジメチルホルムアミド中に10 g のジ-tert-ブチルN-(4-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニルアミノ)-2-ニトロベンズアミド)-L-グルタマートを有する混合物に、 1.34 mlのピロリジンを添加した。混合物を30 分間室温で攪拌し、ついで減圧下に蒸発乾固した。 200 mlの ジイソプロピルエーテルの添加及び15 分間の攪拌後、 得られた懸濁液を 0℃で一晩放置した。生成物を吸引濾取し、60 mlのジイソプロピルエーテルで洗浄し、 ついで減圧下に乾燥させて、4.3 gのN-(4-アミノ-2-ニトロベンズアミド)-L-グルタミン酸 ジ-tert.-ブチルエステルを黄色針状物として得た(HPLC, アッセイ 99.7% area)。
【０１３３】
(d) 2’-ニトロ葉酸(folic acid)-ジ-tert.-ブチルエステルの合成
100 ml のジメチルアセトアミド中に1 g のN-(4-アミノ-2-ニトロベンズアミド)-L-グルタミン酸 ジ-tert.-ブチルエステルを有する溶液に、2.1 g の2-アミノ-4-オキソ-6-ブロモメチルプテリジン ハイドロブロマイドを添加した。混合物を窒素下で 60℃で13 時間攪拌した。室温に冷却後、混合物をろ過し、ろ液を700 mlの水に滴加した。結晶を吸引濾取し、70 mlの水で洗浄し、 35℃で減圧下で乾燥させて、 1.12 g の2’-ニトロ葉酸(folic acid)-ジ-tert.-ブチルエステルを得た。
【０１３４】
(e) N2,N,N-ジメチルアミノメチレン-2’-ニトロ葉酸(folic acid)-ジ-tert.-ブチルエステルの合成
150 ml の乾燥ジメチルホルムアミド 中に1 gの2’-ニトロ葉酸(folic acid)-ジ-tert.-ブチルエステルを有する溶液に、3.5 ml の ジイソプロピルジメチルアセタールを添加した。混合物を窒素下で２０時間、室温で攪拌し、ついで蒸発乾固した。残留物をフラッシュクロマトグラフィーによってシリカゲル 60及び溶離剤としてジクロロメタン / メタノール/ 95:5を用いて精製し、0.62 gのN2,N,N-ジメチルアミノメチレン-2’-ニトロ葉酸(folic acid)-ジ-tert.-ブチルエステルを得た。
【０１３５】
例 4: N2,N,N-ジメチルアミノメチレン-2’-ニトロ葉酸(folic acid)-ジメチル エステルの合成
(a) ジメチル-N-(4-(tert.-ブトキシカルボニルアミノ)-2-ニトロベンズアミド)-L-グルタマートの合成
合成をL-グルタミン酸-ジ-tert.-ブチルエステル-塩酸塩の代わりにL-グルタミン酸-ジメチルエステル-塩酸塩を用いて例２と同様に行う。14.8 gの4-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-2-ニトロ安息香酸 から、27.4 g の粗製ジメチル-N-(4-(tert.-ブトキシカルボニルアミノ)-2-ニトロベンズアミド)-L-グルタマートが得られ、これを溶離剤としてシリカゲル 60及び酢酸エチル/n-ヘプタン / 65:35を用いて フラッシュクロマトグラフィーによって ２回精製した。 精製後、17.38 g のジメチル-N-(4-(tert.-ブトキシカルボニルアミノ)-2-ニトロベンズアミド)-L-グルタマートを得た。
【０１３６】
(b) N-(4-アミノ-2-ニトロベンズアミド)-L-グルタミン酸-ジメチルエステル x トリフルオロ酢酸塩の合成
合成を例3と同様に行った。17 g のジメチル-N-(4-(tert.-ブトキシカルボニルアミノ)-2-ニトロベンズアミド)-L-グルタマートから、 19.5 gの N-(4-アミノ-2-ニトロベンズアミド)-L-グルタミン酸-ジメチルエステル x トリフルオロ酢酸塩を得、これをそのまま例4(c)で使用する。
【０１３７】
(c)   2’-ニトロ葉酸(folic acid)ジメチルエステルの合成
合成5 g のN-(4-アミノ-2-ニトロベンズアミド)-L-グルタミン酸-ジメチルエステル x トリフルオロ酢酸塩から出発して例８と同様に行った。後処理を次のように変更した。反応混合物のろ過の後、ろ液を3.5Ｌの 0.1 M塩酸水溶液に滴加する。混合物を0℃で一晩放置し、生成物を吸引濾取し、50 ml の 0.1 M塩酸水溶液で、 ついで300 mlの水で洗浄し、40℃で減圧で乾燥させて、 2.14 gの粗製 2’-ニトロ葉酸(folic acid) ジメチルエステルを得た。 母液から、さらに 0.82 g の粗製 2’-ニトロ葉酸ジメチルエステルを得た。2.9 g の粗製2’-ニトロ葉酸ジメチルエステルをDMACから再結晶し、2.28 gの粗製 2’-ニトロ 葉酸ジメチルエステルを得た。
【０１３８】
(d) N2,N,N-ジメチルアミノメチレン-2’-ニトロ葉酸(folic acid)-ジメチルエステルの合成
これは例 3(e)と同様に行われた。
【０１３９】
例 5: 2’-フッ素-葉酸(folic acid)の合成 
合成を、例1 〜 4にしたがう2’-ニトロ葉酸(folic acid)の合成と同様に行った。例1 において、4-アミノ-2-フルオロ-安息香酸 を4-アミノ-2-ニトロ安息香酸の代わりに使用した。(HPLC 純度: 97.5% area, m/z = 460 [M+1]+, 1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6) [ppm]: 8.65 (s, C(7)-H, 1H); 7.75 (t, N(8’)-H, 1H, D2Oと交換可能); 7.51 (t, C(3’H), 1H); 7.20 (t, N(10)-H, 1H, D2Oと交換可能); 7.03 (bs, NH2, 2H, D2Oと交換可能); 6.50 (m, C(5’)-H, (C(6’)-H, 2H); 4.48 (d, C(6)H2, 2H); 4.31 (m, C(α)-H, 1H); 2.28 (m, C(β)-H2, 2H); 1.96 (m, C(γ)-H2, 2H).
例 6: 2’-ニトロ葉酸(folic acid)を用いて2’-[18F]フッ素-葉酸:
アニオン交換カートリッジに捕捉された [18F]フルオライドを、1.5 mlのアセトニトリル/水 (4:1)中に炭酸カリウム(1 mg)及び Kryptofix（登録商標）2.2.2 (5 mg)を有する溶液を用いて、10 mlの密封された反応容器に直接溶離させた。85 - 90℃で、溶剤を減圧及び窒素流で除去した。ついで、1 mlの乾燥アセトニトリルを３回添加し、蒸発乾固した。
【０１４０】
乾燥 [18F]フルオライド-クリプタートコンプレックスに、0.2 mlの DMF中の前駆体N2,N,N-ジメチルアミノメチレン-2’-ニトロ葉酸(folic acid) ジ-tert.-ブチルエステル(5.2 mg)を添加した。混合物を140 -145℃に 20 分間加熱する。
【０１４１】
冷却後、8 mlの水を添加し、混合物を逆相カートリッジ(Sep-Pak（登録商標） tC18 plus, Waters AG)に挿入した。 カートリッジを３回8 ml の水で洗浄し、ついで 2分窒素流によって乾燥させる。18F-標識され、保護された化合物を、2.5 mlのアセトニトリルを用いて別の10 mlの密閉されえた反応容器に溶離させた。アセトニトリルの容量を0.3 mlに減圧、窒素流及び 80 - 90℃の僅かな加温下で減少させた。
【０１４２】
加水分解のために、0.5 mlの4M HCl溶液を添加し、混合物を60℃に 5 - 10 分間加熱した。冷却後、混合物を0.5 mlの4M NaOH溶液によって中和した。0.5 mlの0.15M リン酸緩衝液を添加し、混合物を HPLC溶剤 Aで満たして、5 mlの容量にした。 
【０１４３】
セミ-分取用HPLC精製をRP 18 カラム (Phenomenex  （登録商標） Gemini 5μ C18, 250 x 10 mm) 上で勾配を用いて次のように行った。 溶剤 A = 0.05M リン酸緩衝液, B = メタノール, 0 - 30 分: A: 99% → 40%, 30 - 40 分: A:40% → 10%, 40 - 45 分: A: 40% → 99%。
【０１４４】
生成物フラクションのHPLC 溶剤を減圧及び窒素流下で100℃で蒸発させた。製剤化のために水及び0.15M リン酸緩衝液を乾燥生成物に添加し、混合物を滅菌ろ過した。
【０１４５】
例 7: 2’-[18F]フッ素-葉酸を用いるインビボ及びエクスビボ研究
2’-[18F]フッ素-葉酸 をＫＢ異種移植片腫瘍を保有する８匹のヌードマウスを用いるエクスビボ生体内分布研究に応用した。約２ＭＢｑの放射性トレーサーを各動物に注射した。遮断群では、２００μｇの天然葉酸を放射性トレーサーの８６．６％という特異的遮断率で、放射性トレーサーの高い特異的取り込みを示す。さらにまた、葉酸受容体を発現させることが知られている腎臓にも、９５．５％の特異的遮断で特異的取り込みが見出された。
【０１４６】
図 1 は、葉酸受容体-陽性組織中での2’-[18F]フッ素-葉酸の高い特異的取り込みを示す。
【０１４７】
2’-[18F]フッ素-葉酸を使ったインビボＰＥＴイメージングをＫＢ異種移植片腫瘍を保有するヌードマウスで行った。約１０ＭＢｑの放射性トレーサーを各動物に注射した。遮断群では２００μｇの天然葉酸を放射性トレーサーの１０分前に注射した。ＰＥＴスキャンを注射後３０分から９０分まで取得した。
【０１４８】
2’-[18F]フッ素-葉酸を使ったＰＥＴ研究は、ＫＢ腫瘍の優れたイメージをもたらす。更に、その取り込みは高度に特異的で、天然の葉酸(folic acid)によって遮断される。放射性トレーサーの高い特異的取り込みは、腎臓皮質中にも見出され、一方取り込みは腎臓髄質中で見出されない。このパターンは葉酸受容体の分布と一致し、 2’-[18F]フッ素-葉酸の高い特異性を注目させる。
【０１４９】
図 2は2’-[18F]フッ素-葉酸を用いたPET イメージ 示す。矢印はKB 異種移植片腫瘍の位置を示す。
【０１５０】
図 3は2’-[18F]フッ素-葉酸を用いたPET イメージを示す。矢印は腎臓を示す。
【０１５１】
図 4は2’-[18F]フッ素-葉酸を用いたKB 異種移植片 腫瘍のエクスビボPET イメージを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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