(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における虚血性心疾患、心筋症および心不全の診断を補助する方法であって、前記対象から得られた生体試料におけるシトルリン化タンパク質の存在を検出することを含み、シトルリン化タンパク質のレベルがシトルリン化タンパク質の対照量と比べて上昇している場合に虚血性心疾患、心筋症および心不全の可能性を示している方法。
【請求項２】
前記生体試料が、血液、血漿、血清および組織生検からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組織生検が心筋組織である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記シトルリン化タンパク質が、アルギニン残基からシトルリンへの翻訳後変換を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記シトルリン化タンパク質が、ミオシン重鎖、ミオシン結合タンパク質Ｃ、トロポミオシンα１、トロポミオシンα３、アクチン、タイチン、リポタンパク質リパーゼ、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼＢ鎖、アルファ−１−抗キモトリプシン、カスパーゼ動員ドメイン含有タンパク質１０、ジンクフィンガーＺＺ型およびＥＦ−ハンドドメイン含有タンパク質１からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記シトルリン化タンパク質が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記シトルリン化タンパク質が、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記シトルリン化タンパク質の存在が、質量分析、高分解能質量分析、タンデム質量分析、結合アッセイ、免疫アッセイ、抗体結合または免疫組織化学を使用して検出される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は２０１０年１１月１２日出願の米国特許仮出願第６１／４１２，８１９号の優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［配列表］
本出願はＥＦＳ−ＷｅｂによりＡＳＣＩＩフォーマットで提出されている配列表を含有し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１１年１１月９日作成の前記ＡＳＣＩＩコピーは、２２４０３２０３．ｔｘｔと命名され、サイズは７，３４２バイトである。
【０００３】
［連邦政府による資金提供を受けた研究開発に関する記載］
本発明は、米国国立衛生研究所により授与されたＮＨＬＢＩプロテオミクス契約番号ＮＩＨ  Ｎ０１−ＨＶ−２８１８０およびＲＯ１ＨＬ６３０３８の政府支援を受けて行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景】
【０００４】
心血管研究および臨床治療の大幅な進歩にもかかわらず、心臓疾患は西洋世界では依然として罹患率および死亡率の主な原因であり、発展途上国では増加している。循環器病（ＣＶＤ）は、ＣＶＤの２つの主因である、虚血性心疾患（ＩＨＤ）および心不全（ＨＦ）を含むあらゆる重大な病態に及ぶ広範囲な研究が行われてきた。心不全は、心筋への血液供給が減少して、そのため機能が低下することを特徴とする。心不全患者を薬剤（たとえば、強心配糖体）を用いて治療すると心筋細胞の収縮力を増加させることによりポンプ機能を増強し、血行動態および運動耐容能を改善することができることも認識されている。これらの所見により、心不全は主に欠陥のある心筋細胞収縮力により引き起こされるという「血行動態仮説」が生まれた。他の要因、すなわち、心構造の変化（膨張）、細胞死（アポトーシス）、変化した血管構造および反応性、異常なエネルギー利用ならびに神経ホルモン障害もＣＶＤの進行の一因であることを指摘することは重要である。心収縮機能は、部分的には、筋フィラメントに対する翻訳後修飾（ＰＴＭ）により調節されている。この機構が力発生プロセスの直接の原因となっている。動的ＰＴＭも不可逆的ＰＴＭ、たとえばリン酸化も筋フィラメントタンパク質に起こり、心疾患の数多くのモデルにおいて観察されてきた。
【０００５】
重要なことに、ＩＨＤは急性的に起こり、心筋スタニングもしくは心筋梗塞（心臓発作）を生じ、または慢性的に起こることがあり、心不全の１つの共通原因である。興味深いことに、急性の状況では、間欠性虚血事象は、それに続くより重篤な虚血事象を防ぎ、細胞死および心臓に対する損傷を減らすことがある。これは心筋プレコンディショニングと呼ばれ、腎臓および骨格筋を含む他の多くの器官に起こることは公知である。プレコンディショニングは、部分的に、細胞ｐＨの低下および再灌流とともに起こるカルシウム濃度の増加を減少させる。この状態は、基質タンパク質上のアルギニン残基を標準的でないアミノ酸シトルリンに翻訳後に変換するカルシウム依存性酵素のファミリーであるペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）を生じさせることがある。
【０００６】
アルギニンからシトルリンへの酵素的変換は、生理学的プロセス、たとえば上皮分化、毛包の形成および中枢神経系の発生中のミエリン鞘の分化において起こる。これは、関節リウマチに罹った患者の滑膜においてシトルリン化タンパク質が実証されたことにより人体病理に初めて関連付けられた。最近になって、タンパク質シトルリン化は、非リウマチ様炎症性関節滑膜炎において、また自己免疫神経変性疾患、たとえば多発性硬化症およびアルツハイマー病においても記載されてきた。これらの所見に照らして、我々はシトルリン化は心臓で起こるのかどうか、およびこの修飾が心臓における特定の疾患状態の病理への洞察を与えることになるのかどうかを問うた。さらに、健康または疾患事象の間にＰＡＤが心臓に存在するのかどうかを確定する調査はこれまで行われていない。
【０００７】
心不全および拡張機能障害の発生率は、関節リウマチ（ＲＡ）患者では非ＲＡ対照と比べると増加し、心筋リモデリングがＲＡ疾患プロセスの一部として起こることが示唆される。ＲＡにおける心不全の表現型は、診察時のより少ない症状、より低い血圧およびより高い駆出率を特徴とする非ＲＡ患者の表現型とは異なり、ＲＡ患者における心不全への進行の根底にある病態生理学的機序は母集団の機序とは異なる可能性があることが示唆される。最近、既知の循環器病のないＲＡ患者では、血清抗ＣＣＰ抗体の濃度が高いほど、心筋質量が低く左心室腔容積が小さくなるという関連性が報告されており、シトルリン化タンパク質に対するＲＡ特異的自己免疫が心筋の形態に対する変化を媒介して、この変化が今度は心筋機能に影響を及ぼすことができる可能性が高まっている。シトルリン化、すなわち、塩基性アミノ酸アルギニンから中性アミノ酸シトルリンへの翻訳後修飾の結果、塩基性の電荷が失われ、これにより全体的電荷分布、等電点ならびにイオンおよび水素結合形成に影響を及ぼすことができる。このＰＴＭは、それが、タンパク質フォールディング、分布、安定性、活性および機能を調節しているタンパク質の物理的化学的特性を変更することができるために、極めて重要である。その反応は、リウマチ滑膜に豊富にあるがＲＡに限定されていない一連のペプチジルアルギニンデイミナーゼ酵素（ＰＡＤ）により触媒される。
【０００８】
北米では、伝染性心筋症がウイルス感染（たとえば、コクサッキーウイルスＢ３、アデノウイルスまたはパルボウイルスＢ１９）中に起こるまたはそれに続いて起こることがある。実際、免疫心筋症は、特に小児および若年成人におけるＨＦまたは突然死の重要な原因である。したがって、心筋シトルリン化は他の状態と比べてＲＡのほうが豊富であり、シトルリン化を示している心筋領域は、組織損傷（すなわち、心筋炎、線維症等）およびＰＡＤの証拠と共局在化していると考えられる。
【０００９】
［概要］
一態様では、本発明は、対象における循環器病を診断する方法であって、対象から得られた生体試料におけるシトルリン化タンパク質の存在を検出することを含む方法を対象とする。別の態様では、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ活性の調節も考慮されている。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】シトルリン化誘導スキームおよび質量分析法によるその検出を示す図。Ａ）シトルリンのウレイド基は２，３−ブタンジオンおよびアンチピリンにより修飾されて、修飾シトルリン残基を形成する。質量は２３９Ｄａ増加している。Ｂ）ＭＳ／ＭＳスペクトルは誘導体化シトルリンの同定を図示している。
【図２】対照対ＨＦ試料（ＩＨＤ、ＩＤＣＭ）の部位特異的内在性シトルリン化を示す図。ミオシン重鎖は４つのシトルリン化部位を有し、トロポミオシンも４個のシトルリン化部位を有するが、修飾された残基の部位特異性間に違いがある。
【図３】Ａ）対照およびＨＦ患者（ＩＨＤ、ＩＤＣＭ）から得られた心臓ホモジネートにおけるシトルリン化タンパク質の検出を示す図。筋フィラメントタンパク質のシトルリン化は、タンパク質負荷における差を補正するために直接ブルー染色に対して表された。＊ｔ−検定においてドナー対ＩＨＤ対ＩＤＣＭがｐ＜０．０５。ＩＤＣＭ組織では、ミオシン重鎖シトルリン化対対照およびＩＨＤに有意な増加が見られた。ドナー組織対ＩＤＣＭ試料においてはアクチンシトルリン化のわずかな減少が観察された。Ｂ）対照患者由来の心臓におけるシトルリン化タンパク質の免疫組織化学染色を示す図。（１）対照の筋原線維においてシトルリン化タンパク質が検出された。（２）負の対照では、筋原線維は明らかに未染色である。
【図４】多量のタンパク質の確認が対照およびＰＡＤ２処理ヒト心臓（左心室）の２Ｄ−ＤＩＧＥ解析を用いて実施されたことを示す図。試料はＣｙ２（内部標準）、Ｃｙ３（未処理）およびＣｙ５（処理された）で標識された。それぞれのゲルは、一次元ではｐＩ範囲４〜７および２Ｄでは１０％線形ポリアクリルアミドゲルにより分離された１５０μｇの全タンパク質を含有する。Ａ）緑のシフトがシトルリン化を示している細胞質およびＢ）筋フィラメント濃縮画分の代表的大２Ｄ−ＤＩＧＥゲルを示す図。関連画像はＴｙｐｈｏｏｎ９２１０を使用する異なるレーザーを用いた励起により捕獲された。矢印は、画像解析により決定されＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより同定された異なる調節を受けたタンパク質スポットを示している。タンパク質は表２に従って番号が付けられている。
【図５】対照マウス（Ａ、Ｂ）マウス角化細胞（Ｃ）由来の心臓におけるＰＡＤアイソフォームの発現レベルのＲＴ−ＰＣＲ解析を示す図。ＰＣＲ産物ＰＡＤ２はすべての種類の試料に見られ、ＰＡＤ４およびＰＡＤ１は心臓線維芽細胞および角化細胞において見られる。ＰＡＤ３はいずれの試料においても見られなかった。
【詳細な説明】
【００１１】
ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）によるアルギニンからシトルリンへの翻訳後修飾（ＰＭＴ）はリウマチ滑膜において豊富であり、シトルリン化タンパク質に対する自己免疫はＲＡに高度に特異的であり（Ｇｉｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２０１０年；６２：９４０〜９５１頁）、関節損傷の強力な予測因子である（ｖａｎ  Ｇａａｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００４年；５０（７）：２１１３〜２１２１頁）。シトルリン化は、リウマチ滑膜以外の組織において、典型的には、炎症／自己免疫、たとえば多発性硬化症、炎症性腸疾患ならびに多発性筋炎（Ｍａｋｒｙｇｉａｎｎａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ２００６年；９：１２１９〜１２２２頁）虚血性心疾患（ＩＨＤ）および心不全（ＨＦ）を特徴とする状態において観察される。シトルリン化タンパク質の免疫ターゲティングがこれらの障害の表現型特長のどれかを媒介するかどうかは不確かであるが、これらの多様な障害において観察される豊富なシトルリン化により、他の組織、たとえば心筋も翻訳後シトルリン化を示すことができることが示唆される。
【００１２】
タンパク質シトルリン化は、Ｃａ2+依存性酵素であるペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）のファミリーにより触媒され、この酵素は正電荷を帯びたアルギニン残基を塩基性特性の喪失によりタンパク質の構造および機能を変化させることができる中性シトルリンに脱アミノ化する。この翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、いくつかの生理学的および病理学的プロセスにおけるその役割により関心領域になっている。生理学的プロセスには、上皮末端分化、遺伝子発現調節およびアポトーシスが含まれる。多発性硬化症、アルツハイマー病および関節リウマチ（ＲＡ）は、タンパク質シトルリン化関与が実証されているヒト疾患の例である。タンパク質シトルリン化は、虚血／再灌流損傷もしくは心不全（ＨＦ）単独の進行および発症においてまたはＲＡおよび他の疾患に関してある役割を果たしていると我々は提唱する。さらに、リウマチ滑膜においてシトルリン化を受け（すなわち、ビメンチン、エノラーゼ、フィブロネクチン）、ＲＡにおける抗ＣＣＰ抗体の標的であるタンパク質標的の一部は心筋にも存在している（Ｇｉｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２０１０年、６２：９４０〜９５１頁）。心筋におけるタンパク質はシトルリン化の基質としての役割を果たしていることを我々は明らかにしている。さらに、機能不全の特定の機序に限定されることなく、筋フィラメントにおける基本的収縮要素がシトルリン化されると心筋機能不全の一因となり得る可能性がある。タンパク質シトルリン化は正常心臓（健康な）において起こり、タンパク質シトルリン化状態は心疾患とともに変化することを我々は明らかにしている。我々は、心臓からならびに心筋細胞から単離された組織においてシトルリン化タンパク質およびその修飾されたアミノ酸残基を同定した。修飾されたタンパク質の数および修飾されたアミノ酸は異なる心疾患表現型を反映することができる。一態様では、本発明は、血漿または血清ならびに組織（たとえば、生検）におけるシトルリン化タンパク質および無傷のまたは分解したタンパク質のシトルリン化の部位の検出に焦点を合わせている。別の態様では、シトルリン化タンパク質は心筋疾患に対する診断マーカーとして使用することが可能である。別の態様では、ＰＡＤ活性は調節することができる。
【００１３】
心筋収縮力の調節および増強は多くの疾患環境において求められている。重要な心筋特異的筋フィラメントタンパク質のシトルリン化が起こり、したがって、心臓の収縮能を調節するのに中心的役割を有する可能性がある。シトルリン化を調節（増加または減少）すれば、急性（たとえば、虚血再灌流障害）および慢性（たとえば、心不全）疾患表現型における心臓機能の制御を可能にすることができるであろう。組織または体液（たとえば、血液、血漿および血清）におけるシトルリン化タンパク質の検出は、心筋損傷および心不全を含む心疾患に罹っている患者における診断、予後またはリスク層別化のバイオマーカー（複数可）になり得る。シトルリン化心臓タンパク質は、特に心筋損傷に続いて分泌されるまたは放出される場合、循環している自己抗体の免疫標的として作用してもよい。
【００１４】
ＲＡにおける心筋症の役割。ＲＡ患者における心血管罹患率および死亡率の証拠の増加がつい最近認識された。研究によれば、心筋梗塞（ＭＩ）、心不全（ＨＦ）および脳卒中のリスクはＲＡに罹った患者のほうが高く、これらの患者の死亡の最大４０％を引き起こし得ることが明らかにされている（Ｗｏｌｆｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００８年、９：２６１２〜２６２１頁；Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  ２００８年、４：６７３〜６７９頁；Ｎａｄａｒｅｉｓｈｖｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００８年、８：１０９０〜１０９６頁；Ｌｏｐｅｘ−Ｌｏｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００９年  ４：４１９〜４２４頁；Ｓｉｈｖｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  ２００４年  ３３：２２１〜２２７頁）。疾患の根底にある炎症プロセスがＲＡの発症に先立って起こる抗ＣＣＰ抗体の産生／誘導の一因となっており、虚血性心疾患の発症と独立して関連している可能性があると関節リウマチでは推測されている（Ｔｕｒｅｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ２００７年、６６：７０〜７５頁）。抗ＣＣＰ抗体はＲＡに対する特異的マーカーである（Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｆｕｔｕｒｅ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ２００６年、２：２４９〜２５８頁）。シトルリン化は、自己免疫神経変性疾患、たとえば、多発性硬化症およびアルツハイマー病において（Ｎｉｃｈｏｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２００３年、２：５１〜６６頁；Ｓｈｉｄａ−Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  ２００２年、１１８：２８２〜２８７頁）ならびに様々な一般的な生物学的プロセス、たとえば、上皮末端分化、遺伝子発現調節およびアポトーシスでも（Ｓｈｉｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００９年、５３：３４〜３９頁；Ｍａｓｔｒｏｎａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２００６年、４４：１１３８７〜１１３９６頁；Ｌｕｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００８年、５８：３００９〜３０１９頁；Ｒａｐｔｏｐｏｕｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｓｃｉ  ２００７年、４４：３３９〜３６３頁；Ｇａｂｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  １９９９年、４２：４１５〜４２０頁）起こる。我々は、ヒト心臓の画分を調べ、健康対ＨＦ個人におけるシトルリン化タンパク質を確定した。さらに、修飾（複数可）を有するタンパク質が疾患により変化するのかどうか、または修飾がタンパク質機能に影響を及ぼすことができるのかどうかを判定した。
【００１５】
シトルリン化（脱アミノ化としても知られる）は、正電荷を帯びたアミノ酸残基アルギニンから中性電荷シトルリンへの変換を特徴とするＰＴＭ（翻訳後修飾）である（図１）。シトルリンの導入は、タンパク質の全電荷分布、等電点ならびにイオンおよび水素結合形成能に影響を及ぼす強塩基性特性（ｐＩ＝１０．７６）の喪失によりタンパク質の構造および機能を劇的に変化させることができる。理論に限定されたくはないが、そのような変化はタンパク質構造を変更することができ、いくらかほぐれたより開いた立体配置をもたらす（Ｔａｒｃｓａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９６年、４８：３０７０９〜３０７１６頁）。したがって、シトルリン化は、分子と他のタンパク質の相互作用にも影響を与えることができる。たとえば、ビメンチンフィラメントのシトルリン化はほぼ完全な脱重合を誘導して、細胞骨格ネットワークを破壊することができる（Ｉｎａｇａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９８９年、２６４：１８１１９〜１８１２７頁；Ｂａｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００６年、９８：１５〜２４頁）。ヒストンでは、シトルリン化はヌクレオソーム−ヌクレオソーム相互作用に抑制効果があり、したがってこの効果は高次クロマチン構造に影響を及ぼすことが最近わかった（Ｓｐｅｎｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ  １９９９年、２４０：１〜１２頁）。最近の研究により、急性および慢性ストレス刺激に対する応答での心臓増大および遺伝子発現の制御におけるクロマチンリモデリングの重要性が実証された。さらに、ヒストンでのアルギニンメチル化もクロマチン構造に影響を及ぼす。本研究にとって重要であるが、シトルリン化において利用される酵素がアルギニンメチル化を間接的にアンタゴナイズすることができることが明らかにされた（Ｓｐｅｎｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ  １９９９年、２４０：１〜１２頁）。ヒストンのシトルリン化と脱アセチル化間のこの機能的関連は、心機能の変更をもたらす急性および慢性ストレス刺激に対する応答でのリモデリングまたは遺伝子発現にある隠れた意味合いを有する可能性がある。
【００１６】
本明細書で発明者らは、健康な患者における（表１Ａ）および心不全（罹患した）患者における（表１Ｂ）シトルリン化タンパク質を開示する。シトルリン化は、筋フィラメントタンパク質；トロポミオシン、ミオシン（重および軽鎖）およびミオシン結合タンパク質Ｃを含む特定のタンパク質において起こり、この修飾がこれらの筋フィラメントタンパク質が優勢でもある骨格筋においても見ることができることが示唆される。この情報を用いて、循環器病に対する感受性およびシトルリン化タンパク質に対する自己免疫に対する感受性を診断することが今や可能である。したがって、循環器病を診断する方法が開示される。循環器病におけるシトルリン化タンパク質に対する自己免疫に対する感受性を診断する方法が開示される。どちらの方法にも、組織または血液、血漿もしくは血清を含む体液におけるシトルリン化タンパク質の検出が含まれる。
【表１】
0005701994.tif 000002
【表２】
0005701994.tif 000003
【００１７】
アルギニンアミノ酸残基からシトルリンへの変換はタンパク質の構造にいくつかの意味合いを有しており、たとえば、シトルリンのウレイド基は、その尿素様特性によりタンパク質構造に対して不安定化効果を有することができる；立体構造変化を誘発することもでき、等電点（ｐＩ）値および電気泳動移動度を変更することができる。シトルリンのこの不安定化効果は、これらのタンパク質の組織化された二次構造の喪失をもたらす、フィラグリン、トリコヒアリンおよびミエリン塩基性タンパク質を含むいくつかのタンパク質に関して記載されている。シトルリン化に伴う正電荷の喪失は、タンパク質間の相互作用に大きな影響を与え、シグナル伝達能を調節し、タンパク質分解に対する感受性を妨げると予測することも可能である。したがって、このＰＴＭは、いくつかの生理学的および病理学的プロセスにおけるその役割により関心領域になっている。生理学的プロセスには、上皮末端分化、遺伝子発現調節およびアポトーシスが含まれる。多発性硬化症、アルツハイマー病および関節リウマチ（ＲＡ）は、タンパク質シトルリン化関与が実証されているヒト疾患の例である。タンパク質シトルリン化は、虚血／再灌流損傷、心筋プレコンディショニングまたは心不全の進行および発症にある役割を果たすことができる。
【００１８】
５個のＰＡＤアイソフォーム（ＰＡＤ１からＰＡＤＳ４およびＰＡＤ６）が存在し、それぞれが別々の遺伝子によりコードされている。アイソフォームは高度なアミノ酸配列相同性を共有しているが、異なる組織特異的発現を有しているように思われる。ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロット解析により、ＰＡＤ２およびＰＡＤ４は単離された心筋細胞（成人）に、さらにＰＡＤ１は心臓から得られる単離された心筋線維芽細胞（成人）に見出されることが明らかにされた。ＰＡＤ１、ＰＡＤ２およびＰＡＤ４は骨格筋にも存在するが心臓よりも高いレベルで存在する。この所見により、これらのアイソフォームは、心臓におけるアルギニンの脱アミノ化の原因であることが示唆される。本明細書で開示されるように、心筋細胞および心筋線維芽細胞に特異的であるＰＡＤアイソフォームの調節は、ＰＡＤに対してまたは特定のアイソフォームに対して開発された干渉ＲＮＡ（たとえば、ｓｉＲＮＡ）を使用すれば可能である。遺伝子療法アプローチを使用して、標的組織においてＰＡＤアイソフォームを増加させることが可能である。これは、改変ウイルスまたはＤＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ取り込みのための他の確立した方法を使用して実現することが可能である。ＰＡＤアイソフォームの特定の阻害剤を使用して内在性活性を低下させることが可能である。さらに、ＰＡＤの触媒ドメイン内のＡｒｇおよびＣｙｓからＡｌａまたは他のアミノ酸残基への突然変異を使用して酵素機能を低下させることが可能である。
【００１９】
ＰＡＤアイソフォーム活性を調節する方法において有用である当技術分野で公知のＰＡＤ阻害剤がいくつか存在する。これらには、Ｆ−アミジン［Ｎ−α−ベンゾイル−Ｎ５−（２−フルオロ−１−イミノエチル）−１−オルニチンアミド］、２−クロロアセトアミジンおよびＣｌ−アミジン［Ｎ−α−ベンゾイル−Ｎ５−（２−クロロ−１−イミノエチル）−１−オルニチンアミド］が含まれる。
【００２０】
［定義］
以下の用語は、他の方法で指示されなければ、以下の本出願全体を通じて定義される通りに使用される。
【００２１】
「マーカー」または「バイオマーカー」は本明細書では互換的に使用され、本発明の文脈では、特定のシトルリン化アミノ酸残基を有するタンパク質もしくはペプチドまたは対照値と比べた場合、特定の疾患もしくは障害を有する患者から採取された試料に差次的に存在する酵素それ自体、ＰＡＤ１、ＰＡＤ２もしくはＰＡＤ４（特定の特異的同一性または見掛けの分子量の）のことであり、対照値は、たとえば、対照対象（たとえば、陰性診断の人、正常または健康な対象）から採取された比較可能な試料における平均値または中間値からなる。バイオマーカーは、抗体または質量分析により検出することができる特定のペプチドまたはタンパク質（表１Ａまたは表１Ｂ）として決定してもよい。一部の出願では、たとえば、質量分析または他のプロファイルまたは複数の抗体を使用して複数のバイオマーカーを決めてもよく、個々のバイオマーカーおよび／または部分的もしくは完全なプロファイル間の違いを診断のために使用してもよい。これは、酵素またはシトルリン化したタンパク質の、単独でのまたは組み合わせての検出を含むことが可能である。
【００２２】
語句「差次的に存在する」とは、対照対象と比べた場合に、特定の疾患または障害を有する患者から採取された試料中に存在するマーカーの量および／または発生頻度の違いのことを指す。たとえば、マーカーは、対照値（たとえば、対照対象の試料から決定される）と比べた疾患または障害を有する患者の試料中に上昇したレベルでまたは減少したレベルで存在することがある。代わりに、マーカーは、対照対象の試料と比べた患者の試料においてより高い頻度でまたはより低い頻度で検出されることがある。マーカーは、量、頻度またはその両方ならびに２つ以上の特定の修飾されたアミノ酸残基および／または酵素それ自体の間の違いの比に関して差次的に存在することがある。
【００２３】
マーカー、化合物、組成物または物質は、試料中のマーカー、化合物、組成物もしくは物質の量が別の試料中のマーカー、化合物、組成物もしくは物質の量と、または対照値と統計的に有意に異なっているならば、試料中に差次的に存在している。たとえば、化合物は、それがもう一方の試料（たとえば、対照）中に存在するよりも少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約５００％、少なくとも約７００％、少なくとも約９００％もしくは少なくとも約１０００％多いまたは少なく存在するならば、あるいは化合物が１つの試料では検出可能であるがもう一方の試料では検出可能ではないならば、差次的に存在している。
【００２４】
代わりにまたはさらに、マーカー、化合物、組成物または物質は、特定の疾患または障害に罹っている患者の試料においてマーカー等を検出する頻度が健康な個人から得られた対照試料または対照値よりも統計的に有意に高いまたは低いならば、試料間で差次的に存在する。たとえば、バイオマーカーは、それがもう一方のセットの試料よりも一セットの試料中で観察される少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約５００％、少なくとも約７００％、少なくとも約９００％もしくは少なくとも約１０００％高い頻度でまたは低い頻度で検出されるならば、２つのセットの試料間で差次的に存在している。これらは例示的な値であるが、当業者であれば、マーカーが差次的に存在しているかどうかを判定するために統計的に有意な違いを表すカットオフポイント等を決定することができると予想される。
【００２５】
「診断の」は、病的状態の存在または性質を確認することを意味し、特定の疾患または障害を発症する危険のある患者を確認することを含む。診断法はその感度および特異度が異なる。診断アッセイの「感度」は、罹患した個人で陽性反応を示す百分率である（「真の陽性」の百分率）。アッセイでは検出されない罹患した個人は「偽陰性」である。罹患していない対象およびアッセイにおいて陰性反応を示す対象は「真の陰性」と呼ばれる。診断アッセイの「特異度」は、１−偽陽性率であり、「偽陽性」率は、疾患がなく陽性反応を示す者の割合と定義される。特定の診断法は状態の確定診断を提供しなくてもよいが、その方法が、診断に役立つ陽性の徴候を提供すれば、それで十分である。
【００２６】
用語「検出」、「検出する」等は、バイオマーカーを検出するまたは疾患もしくは障害を検出するという文脈において（たとえば、陽性のアッセイ結果が得られる場合）使用してもよい。後者の文脈では、「検出する」と「診断する」は同義と見なされる。
【００２７】
「の危険がある」は、正常対象と比べて、または対照群、たとえば、患者集団と比べて、危険が増加していることを意味することが意図されている。したがって、特定のマーカーを担持している対象は、特定の疾患または障害の危険が増加しており、さらに検査が必要であると確認されてもよい。「増加した危険」または「高い危険」は、たとえば、対象が障害に罹っている確率の任意の統計的に有意な増加を意味する。その危険は、比較されている対照群よりも、好ましくは少なくとも１０％、さらに好ましくは少なくとも２０％、さらに好ましくは少なくとも５０％増加している。
【００２８】
マーカーの「試験量」とは、試験されている試料中に存在するマーカーの量のことを指す。試験量は、絶対量（たとえば、μｇ／ｍｌ）または相対量（たとえば、シグナルの相対強度）のいずれであっても可能である。
【００２９】
マーカーの「診断量」とは、特定の疾患または障害の診断にふさわしい対象の試料中のマーカーの量のことを指す。診断量は、絶対量（たとえば、μｇ／ｍｌ）または相対量（たとえば、シグナルの相対強度）のいずれであっても可能である。
【００３０】
マーカーの「対照量」とは、マーカーの試験量に対して比較されることになる任意の量でもまたは一定範囲の量であっても可能である。たとえば、マーカーの対照量は、診断しようとする疾患または障害に罹っていないヒトにおけるマーカーの量であることができる。対照量は、絶対量（たとえば、μｇ／ｍｌ）または相対量（たとえば、シグナルの相対強度）のいずれであっても可能である。
【００３１】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、αアミノ酸残基、特に、天然に存在するαアミノ酸のポリマーを指すのに本明細書では互換的に使用される。この用語は、１個以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の類似物または模倣物であるアミノ酸ポリマーならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用する。ポリペプチドは、たとえば、炭水化物残基を付加して糖タンパク質を形成する、リン酸化してリン酸化タンパク質を形成する、および多数の化学修飾（たとえば、酸化、脱アミド、アミド化、メチル化、ホルミル化、ヒドロキシメチル化、グアニジン化）することにより修飾する、ならびに分解する、還元するまたは架橋することが可能である。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、タンパク質のあらゆる無修飾および修飾形態を含む。ペプチドはシトルリン化残基を有すると考えられるまたはＰＡＤ酵素の一部である。
【００３２】
「検出可能部分」または「標識」とは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段により検出可能な組成物のことを指す。たとえば、有用な標識には、32Ｐ、35Ｓ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（たとえば、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用されているような）、ビオチン−ストレプトアビジン、ジオキシゲニン、ハプテンおよび抗血清もしくはモノクローナル抗体が利用可能であるタンパク質または標的に相補的である配列を有する核酸分子が含まれる。検出可能部分は、試料中の結合した検出可能部分の量を定量化するのに使用することができる測定可能なシグナル、たとえば放射性、色素生産性または蛍光シグナルを発生することが多い。シグナルの定量化は、たとえば、シンチレーション測定、デンシトメトリー、フローサイトメトリーまたは潜在的シトルリン化残基またはＰＡＤ酵素の一部を有する無傷のタンパク質もしくはペプチドの質量分析による（１個以上のペプチドを評価することが可能である）直接解析により達成される。タンパク質またはペプチドの一部としてのシトルリン化ＡｒｇはＭＳによりまたは化学的誘導体化を介して直接検出することが可能である。
【００３３】
「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子または複数の免疫グロブリン遺伝子、またはそれらの断片により実質的にコードされていて、エピトープ（たとえば、抗原）に特異的に結合し認識するポリペプチドリガンドのことを指す。認知された免疫グロブリン遺伝子には、カッパおよびラムダ軽鎖定常領域遺伝子、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー重鎖定常領域遺伝子ならびに夥しい免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。抗体は、たとえば、無傷の免疫グロブリンとしてまたは様々なペプチダーゼでの消化により産生されるいくつかの特徴がはっきりした断片として存在する。これには、たとえば、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ）’2断片が含まれる。本明細書で使用される用語「抗体」は、全抗体の修飾により産生される抗体断片または組換えＤＮＡ方法論を使用して新規に合成される抗体断片のいずれも含まれる。その用語にはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体または一本鎖抗体も含まれる。抗体の「Ｆｃ」部分とは、免疫グロブリン重鎖のうち１個以上の重鎖定常領域ドメイン、ＣＨ1、ＣＨ2およびＣＨ3を含むが重鎖可変領域は含まない部分のことを指す。
【００３４】
「結合アッセイ」は、作用物質、たとえば抗体に結合することによりバイオマーカーが検出される生化学アッセイを意味し、これを通じて検出プロセスが実施される。検出プロセスは、放射性または蛍光標識等を含んでいてもよい。そのアッセイは、バイオマーカーの固定化を含んでいてもよいし、溶液中で行われてもよい。さらに、シトルリン化残基との化学的結合は直接行うことが可能である。
【００３５】
「免疫アッセイ」は、抗原（たとえば、マーカー）に特異的に結合する抗体を使用するアッセイである。免疫アッセイは特定の抗体の特異的結合特性を使用して抗原を単離する、標的にするおよび／または定量化することを特徴とする。
【００３６】
抗体に「特異的に（または、選択的に）結合する」またはタンパク質もしくはペプチドに言及する場合は「と特異的に（または、選択的に）免疫反応性である」という語句は、タンパク質および他の生物製剤の異種集団におけるタンパク質の存在を判定する結合反応のことを指す。したがって、所定の免疫アッセイ条件下では、特定の抗体は特定のタンパク質にバックグラウンドの少なくとも２倍結合し、試料中に存在する他のタンパク質に大量には実質的に結合しない。そのような条件下での抗体との特異的結合には、特定のタンパク質に対するその特異性で選択される抗体が必要となり得る。種々の免疫アッセイフォーマットを使用して、特定のタンパク質との特異的免疫反応性のある抗体を選択してもよい。たとえば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイはタンパク質との特異的免疫反応性のある抗体を選択するのに日常的に使用されている（たとえば、特定の免疫反応性を決定するのに使用することができる免疫アッセイフォーマットおよび条件の説明については、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８）参照）。
【００３７】
「シトルリン化を検出するための方法」とは、シトルリン化されたペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を検出するために使用される質量分析（ＭＳ）ベースの方法のことを指す。その方法は、脱イミノ化がＡｒｇ上で起こる場合は１Ｄａの中性喪失；未修飾シトルリンからのイソシアン酸の中性喪失（このイオンをタンパク質シトルリン化を検出するための診断マーカーとして使用する）；２３８Ｄａまたは２３９Ｄａの化学修飾がＣｉｔ残基上で起こる場合は誘導体化（ペプチドおよびタンパク質レベルでモニターすることが可能である）；ビーズ／カラム／マトリックス上に固定化され、低ｐＨでシトルリン残基のウレイド基と独占的に反応するグリオキサール誘導体の特異的反応に基づくシトルリン化ペプチド（またはタンパク質）の濃縮を含むがこれらに限定されない。同様に、標的法、たとえば、複数のまたは選択的反応モニタリングを使用するＭＳは修飾されたペプチドを直接定量化するのに使用することが可能である。本明細書で使用されるように、既知の濃度の標識された（たとえば、Ｎ１５または安定同位体が付加された化学物質）ペプチドは試料に添加され、内在性（非標識）の対応するペプチドと直接比較される。
【００３８】
用語「対象」、「患者」または「個人」は一般的にはヒトのことを指すが、本発明の方法はヒトに限定されることはなく、他の動物（たとえば、トリ、爬虫類、両生類、哺乳動物）において、アルブミンが種間で相同であるために、特に哺乳動物において有用なはずである。
【００３９】
「試料」は本明細書ではそのもっとも広い意味で使用される。試料は、血液、血清、血漿、涙液、眼房水および硝子体液、髄液を含む体液；細胞もしく組織調製物の可溶性画分または細胞が増殖された培養液；あるいは細胞または組織から単離されたまたは抽出された膜；溶液中のまたは基質に結合しているポリペプチドまたはペプチド；細胞；組織；組織プリント；指紋、皮膚または毛髪；その断片および誘導体を含んでいてもよい。対象試料は通常、血液、血漿および血清を含む血液製剤の誘導体を含む。
【００４０】
用語「特異的ＰＡＤアイソフォームの調節」は、遺伝子治療、ｓｉＲＮＡ、ＰＡＤの公知の阻害剤または部位特異的突然変異誘発を使用して内在性ＰＡＤアイソフォームの活性を増加するまたは減少することを含むが、これらに限定されない。
【００４１】
［実施例］
組織試料：ヒト左心室（ＬＶ）経壁組織試料は、末期ＩＳＨＤ、ＩＤＣＭおよび非不全ドナー心臓を有する患者から得られた。これらの非特定化組織保存試料由来の組織は心停止液中に収集され、液体窒素中で保存された。試料は、Ｄｒ．Ｃｒｉｓ  Ｄｏｓ  Ｒｅｍｏｉｄｏｉｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｉｄｎｅｙ、Ａｕｓｔｒａｌｉａにより我々に提供された。本研究ではサブセットが解析される（表２）。
【表３】
0005701994.tif 000004
【００４２】
心臓組織の細分画：その方法により、異なるｐＨでの可溶性に基づいて３つの分画：（１）細胞質濃縮された抽出物（中性ｐＨ）、（２）筋フィラメント濃縮された抽出物（酸性ｐＨ）および（３）膜タンパク質濃縮されたペレットが生じる。このような方法での心臓組織の分画は徹底的なプロテオーム解析の基礎を提供する（Ｋａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００７年、３５７：８７〜９０頁）。
【００４３】
質量分析によるタンパク質シトルリン化の標的解析：ＭＳは、タンパク質およびペプチドに対するＰＴＭの解析のための最適の方法になっている。しかし、ＰＴＭは典型的には、異種の複雑なタンパク質混合物中に比較的少量で存在する。具体的には、シトルリン化の場合、その同定は、アルギニンからシトルリンへの変換に起因する質量シフトがわずかである（＋１  Ｄａ）という事実のために複雑であり、低分解能ＭＳ計測手段を使用してシトルリン化を同定するのは困難になっている。この難問を克服するために、我々はＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ高分解能ＭＳを使用した（Ｓｔｅｎｓｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  ２００９年、２３：２７５４〜２７６２頁）。その上、この誘導体化戦略はシトルリン残基に±２３９Ｄａの特定の質量タグ（図１Ａ）を付加するので、修飾部位を確信的に同定することができる。我々の最近の調査によれば、この戦略を使用することにより、異種混合物、たとえば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のトリプシン消化物からシトルリン化ペプチドを同定することができることが明らかになっている（図１Ｂ）。
【００４４】
二次元ゲル電気泳動：二次元ゲル電気泳動（２ＤＥ）は、一次元における固定化ｐＨ勾配１８ｃｍストライプ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）、ｐＨ範囲４〜７で実施された。試料は、４％ｗ／ｖ  ＣＨＡＰＳ、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する２−ＤＥ溶解バッファー中に再懸濁された。２Ｄ−ＤＩＧＥを実施する前に、タンパク質試料はシアニン色素Ｃｙ２、Ｃｙ３およびＣｙ５のＮ−ヒドロキシサクシニミジルエステル誘導体で標識された。手短に言えば、１５０μｇのタンパク質試料は、同一２−ＤＥ上での比較のために３７５ｐｍｏｌのＣｙ３またはＣｙ５のいずれかで最小限に標識された。画像マッチングおよびクロスゲル統計比較を促進するために、すべての試料のプールも調製され、すべてのゲルについての内部標準として１μｇのタンパク質あたり２．５ｐｍｏｌ  Ｃｙ２のモル比のＣｙ２で標識された。このようにして、３通りの試料および内部標準を流し複数の２−ＤＥ上で定量化することができた。標識化反応は暗所において氷上で３０分間実施され、次に２０倍モル比過剰なフリーＬ−リジンで１０分間クエンチされた。次に、差次的にＣｙ３−およびＣｙ５標識された試料はＣｙ２−標識内部標準と混合され、ジチオスレイトールで３０分間還元された。ＩＰＧバッファー、ｐＨ４〜７非線形（２％（ｖ／ｖ）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が添加され、最終容積は再水和のために２Ｄ−溶解バッファーで３５０μｌに調整された。固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ストライプ（１８ｃｍ  ｐＨ４〜７直線勾配）は５０Ｖで１２時間、試料（３５０μＬのＩＥＦバッファー中１５０μｇのタンパク質）と活発に再水和され、続いて２５０、５００および１０００Ｖでそれぞれ１時間、次に２０℃、４５ｋＶｈで１００００Ｖからなる急速電圧ランピングが行われた。等電点電気泳動は２０℃で合計６２．５ｋＶ−ｈで実施された。ストライプは、６Ｍ尿素、３０％（ｖ／ｖ）グリセリン、４％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、６５ｍＭジチオスレイトール中で２０分間、次に２４０ｍＭヨードアセトアミドを含有する同一バッファー中でさらに２０分間平衡化された。平衡化されたＩＰＧストライプは２０×２０ｃｍ  １０％ポリアクリルアミドゲル上に移された。ゲルは、２（ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）ランニングバッファーを用いてＰｒｏｔｅａｎ（登録商標）ＩＩ  ＸＬシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上、９０Ｖで一晩流された。続いて、ゲルはＴｙｐｈｏｏｎ可変モード撮像装置９２１０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してスキャンされた。ＣｙＤｙｅ染色により可視になる大部分のスポットは通常、Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  １９９６年、６８：８５０〜８５８頁）のプロトコールに従えば、銀染色により可視になる。
【００４５】
ゲル内消化およびペプチド抽出：ゲル染色が完了すると、個々のバンドはゲルから切り取られた。ゲル内消化およびペプチド抽出は、以前の改良プロトコールを使用して達成された（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２００７年、６：２２９５〜２３０３頁）。手短に言えば、ｃＴｎＩバンドは切り取られ、１ｍｍ3片に切断され、５０％アセトニトリル／２５ｍＭ炭酸水素アンモニウムを用いて１５分間振盪しながら３回洗浄された。ゲル片は２５ｍＭ炭酸水素アンモニウム＋１０ｍＭジチオスレイトールと一緒に５５℃で６０分間インキュベートされ、アセトニトリル（ＡＣＮ）で洗浄され、次に２０ｍＭ炭酸水素アンモニウム＋５５ｍＭヨードアセトアミド（作り立て）と一緒に暗所で３０分間インキュベートされた。ゲル片はアセトニトリルで洗浄され、風乾され、２５ｍＭ炭酸水素アンモニウム中で１２．５ｎｇ／μＬトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、シークエンシング等級、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて再水和され、次に３７℃で１８時間または一晩インキュベートされた。その液体は清潔なチューブに移された。ペプチドは、２５℃で２０分間５０％ＡＣＮ＋０．１ＴＦＡ％を使用し、続いて２０分間の振盪、１分間の遠心分離および前段階由来の液体を用いた２度の抽出を組み合わせて、二度抽出された。
【００４６】
免疫ブロッティング解析：タンパク質試料はＬａｅｍｍｌｉバッファー（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ６．８、２％  ＳＤＳ、１０％グリセリン、ブロモフェノールブルー）に、５％β−メルカプトエタノールと一緒に溶解され９５℃で５分間インキュベートされた。試料は１０％  ＴｒｉｓＨＣｌポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）上に充填され、電気泳動は１５０Ｖを７０分間印加することにより実施された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、マウス由来の分離されたタンパク質はニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）にブロットされた。転写は、電気泳動転写用のセルにおいて６０分間、１００Ｖの定電圧設定で、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリシンおよび１０％容積分率のメタノール、ｐＨ＝８．３を含有するバッファー中で実施された。ニトロセルロースブロット上のシトルリン化タンパク質の存在は、製造業者のプロトコールに従って、抗修飾シトルリン（ＡＭＣ）検出キット（Ｕｐｓｔａｔｅ、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、ＶＡ、ＵＳＡ）を使用して検出された。
【００４７】
ｉｎ  ｓｉｔｕでのシトルリン化タンパク質の検出：シトルリン化タンパク質の免疫染色は、抗修飾シトルリンＩｇＧポリクローナル抗体を使用することにより実施された。手短に言えば、シトルリン化染色のためのスライドは、３７℃で３時間、アンチピリンおよび２，３−ブタンジオンを含有する強酸液中で改変された。内在性ペルオキシダーゼ活性は、メタノール中０．３％Ｈ2Ｏ2中での１８分間のインキュベーションにより遮断された。非特異的タンパク質活性は、非血清タンパク質溶液（ＤＡＫＯ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）と一緒のインキュベーションにより遮断された。シトルリン染色についての点数化も、最小、中程度および顕著なシトルリン化染色に従って５ポイントスケール（０．５増加で１〜３）を使用して盲検で実施された。
【００４８】
結果：我々のデータは、シトルリン化が心筋で起こることを示している。我々は健康様疾患試料においてシトルリン化タンパク質を検出した。同様に、それぞれの不活性な（exanimate）画分において修飾されたタンパク質を見出した。興味深いことに、アクチンとの周期的歯止め様相互作用を通じて筋節短縮を推進する分子モーターであるミオシンおよびトロポミオシンにおいて少数のシトルリン化残基を見出した。したがって、心筋タンパク質がシトルリン化されると心不全において心機能に影響を及ぼすことができると思われる。
【００４９】
タンデム質量分析によるタンパク質シトルリン化のｉｎ  ｖｉｖｏ標的解析：我々は、タンデムＭＳ／ＭＳによるシトルリン含有ペプチドの特定の検出および同定のために２，３−ブタンジオンおよびアンチピリン修飾を調べた。適用された条件下では、２，３−ブタンジオン／アンチピリンによる修飾はシトルリンに絶対的に特異的である。この条件下では、ヒト心筋の未処理細胞成分画分においていくつかのタンパク質を同定することができた（表１Ａおよび１Ｂ）。興味深いことに、いくつかの修飾された部位は対照と比べてＨＦにより特異的であると思われる（図１）。
【００５０】
シトルリン化はヒト心臓組織において起こる：我々の仮説を支持するために、シトルリン化タンパク質の存在についてヒト心臓組織を調査した。シトルリン化タンパク質に対する市販の抗体（抗シトルリン（修飾）検出キット、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、シトルリン化タンパク質がヒト心臓組織に存在することを確証した（図２ａ）。さらに、我々は免疫組織化学を使用して心臓組織においてシトルリン化の位置を突き止める（図２ｂ）。図２ａに示されるように、２個の主要タンパク質、ミオシンおよびアクチンは比較された群内では異なる作用をする。ＨＦ組織では、対照と比べてミオシン重鎖シトルリン化の有意な増加が見られた。一方、アクチンはミオシンとは反対のパターンを示した。さらに、対照心臓組織のＩＨＣ染色により、ヒト心臓組織におけるシトルリン化タンパク質の存在が証明された。
【００５１】
ＤＩＧＥおよび質量分析：９個のゲルのＤＩＧＥ画像により変動スポットの位置確認が
可能になった。ＣｙＤｙｅｓ染色により検出されるスポットは切り取られ、同定に供され
た。全体で、９個のゲル上で最大２５個の異なるスポットが検出された。Ｏｒｂｉｔｒａ
ｐ  ＬＴＱを使用して、それぞれのスポットのゲル内消化後にペプチドを解析した。全体
で２５個のタンパク質スポットのうち、７個のスポットのみが同定に成功した。表４は同
定されたタンパク質を示している。
【表４】
0005701994.tif 000005
本願の出願当初の請求項の記載を、実施の態様として、以下に付記する。
（１）
対象における循環器病を診断する方法であって、（ａ）前記対象から生体試料を得ることおよび（ｂ）前記対象から得られた前記生体試料におけるシトルリン化タンパク質の存在を検出することを含み、シトルリン化タンパク質のレベルが循環器病を示している方法。
（２）
前記シトルリン化タンパク質が、前記シトルリン化タンパク質の対照量と比べて上昇している、（１）に記載の方法。
（３）
前記生体試料が、血液、血漿、血清および組織生検からなる群から選択される、（１）に記載の方法。
（４）
前記組織生検が心筋組織である、（２）に記載の方法。
（５）
前記シトルリン化タンパク質が、アルギニン残基からシトルリンへの翻訳後変換を含む、（１）に記載の方法。
（６）
前記シトルリン化タンパク質が、ミオシン重鎖、ミオシン結合タンパク質Ｃ、トロポミオシンα１、トロポミオシンα３、アクチン、タイチン、リポタンパク質リパーゼ、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼＢ鎖、アルファ−１−抗キモトリプシン、カスパーゼ動員ドメイン含有タンパク質１０、ジンクフィンガーＺＺ型およびＥＦ−ハンドドメイン含有タンパク質１からなる群から選択される、（１）に記載の方法。
（７）
前記シトルリン化タンパク質が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、（１）に記載の方法。
（８）
前記シトルリン化タンパク質が、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、（１）に記載の方法。
（９）
前記シトルリン化タンパク質の存在が、質量分析、高分解能質量分析、タンデム質量分析、結合アッセイ、免疫アッセイ、抗体結合または免疫組織化学を使用して検出される、（１）に記載の方法。
（１０）
対象におけるシトルリン化タンパク質に対する自己免疫に対する感受性を診断する方法であって、（ａ）前記対象から生体試料を得ることおよび（ｂ）前記対象から得られた前記生体試料におけるシトルリン化タンパク質の存在を検出することを含み、シトルリン化タンパク質のレベルが循環器病を示している方法。
（１１）
前記シトルリン化タンパク質が、前記シトルリン化タンパク質の対照量と比べて上昇している、（１０）に記載の方法。
（１２）
前記生体試料が、血液、血漿、血清および組織生検からなる群から選択される、（１０）に記載の方法。
（１３）
前記組織生検が心筋組織である、（１２）に記載の方法。
（１４）
前記シトルリン化タンパク質が、アルギニン残基からシトルリンへの変換を含む、（１０）に記載の方法。
（１５）
前記シトルリン化タンパク質が、ミオシン重鎖、ミオシン結合タンパク質Ｃ、トロポミオシンα１、トロポミオシンα３、アクチン、タイチン、リポタンパク質リパーゼ、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼＢ鎖、アルファ−１−抗キモトリプシン、カスパーゼ動員ドメイン含有タンパク質１０、ジンクフィンガーＺＺ型およびＥＦ−ハンドドメイン含有タンパク質１からなる群から選択される、（１０）に記載の方法。
（１６）
前記シトルリン化タンパク質が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、（１０）に記載の方法。
（１７）
前記シトルリン化タンパク質が、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、（１０）に記載の方法。
（１８）
前記シトルリン化タンパク質の存在が、質量分析、高分解能質量分析、タンデム質量分析、結合アッセイ、免疫アッセイ、抗体結合または免疫組織化学を使用して検出される、（１０）に記載の方法。
（１９）
ＰＡＤ活性の阻害剤を、それを必要とする対象に投与することにより、ペプチジルアルギニンデイミナーゼアイソフォーム１（ＰＡＤ１）、アイソフォーム２（ＰＡＤ２）および／またはアイソフォーム４（ＰＡＤ４）の活性を調節する方法。
（２０）
前記阻害剤が、Ｆ−アミジン［Ｎ−α−ベンゾイル−Ｎ５−（２−フルオロ−１−イミノエチル）−１−オルニチンアミド］、２−クロロアセトアミジンおよびＣｌ−アミジン［Ｎ−α−ベンゾイル−Ｎ５−（２−クロロ−１−イミノエチル）−１−オルニチンアミド］からなる群から選択される、（１９）に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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