(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストおよび担体を含む、緑内障を処置するための薬学的組成物であって、該組成物は、ＴｒｋＢアゴニストと組み合わせて用いられることを特徴とし、ここで、
該ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストが、
（ｉ）可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドであって、ＬＩＮＧＯ−１  ＬＲＲドメインもしくはＬＩＮＧＯ−１免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを含む、可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド；
（ｉｉ）ＬＩＮＧＯ−１抗体もしくはその抗原結合断片；または
（ｉｉｉ）ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリヌクレオチドであって、アンチセンスポリヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もしくは低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリヌクレオチド
であり、そして、
該ＴｒｋＢアゴニストが、
（ｉ）ＴｒｋＢアゴニストポリペプチドであって、ＢＤＮＦポリペプチドである、ＴｒｋＢアゴニストポリペプチド；または
（ｉｉ）ＴｒｋＢアゴニストポリヌクレオチドであって、ＢＤＮＦポリペプチドをコードする、ＴｒｋＢアゴニストポリヌクレオチド
である、組成物。
【請求項２】
前記ＴｒｋＢアゴニストをさらに含む、請求項１に記載の組成物であって、
該ＴｒｋＢアゴニストが、
（ｉ）ＴｒｋＢアゴニストポリペプチドであって、ＢＤＮＦポリペプチドである、ＴｒｋＢアゴニストポリペプチド；または
（ｉｉ）ＴｒｋＢアゴニストポリヌクレオチドであって、ＢＤＮＦポリペプチドをコードする、ＴｒｋＢアゴニストポリヌクレオチド
である、組成物。
【請求項３】
ＴｒｋＢアゴニストおよび担体を含む、緑内障を処置するための薬学的組成物であって、該組成物は、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストと組み合わせて用いられることを特徴とし、ここで、
該ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストが、
（ｉ）可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドであって、ＬＩＮＧＯ−１  ＬＲＲドメインもしくはＬＩＮＧＯ−１免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを含む、可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド；
（ｉｉ）ＬＩＮＧＯ−１抗体もしくはその抗原結合断片；または
（ｉｉｉ）ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリヌクレオチドであって、アンチセンスポリヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もしくは低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリヌクレオチド
であり、そして、
該ＴｒｋＢアゴニストが、
（ｉ）ＴｒｋＢアゴニストポリペプチドであって、ＢＤＮＦポリペプチドである、ＴｒｋＢアゴニストポリペプチド；または
（ｉｉ）ＴｒｋＢアゴニストポリヌクレオチドであって、ＢＤＮＦポリペプチドをコードする、ＴｒｋＢアゴニストポリヌクレオチド
である、組成物。
【請求項４】
前記可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸３４〜５３２、配列番号２のアミノ酸３６〜５３２または配列番号２のアミノ酸４１７〜４９３を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが、免疫グロブリン断片、血清アルブミン、標的化タンパク質、レポータータンパク質、または精製を容易にするタンパク質に融合される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＬＩＮＧＯ−１抗体が、以下：
【数１】
0005674469.tif 000019
からなる群より選択される抗体と同じＬＩＮＧＯ−１エピトープに結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＬＩＮＧＯ−１抗体が１Ａ７である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記ｓｈＲＮＡが、ヌクレオチド配列：ＵＧＡＵＣＧＵＣＡＵ  ＣＣＵＧＣＵＡＧＡＣ  ＵＵＣＡＡＧＡＧＡＧ  ＵＣＵＡＧＣＡＧＧＡ  ＵＧＡＣＧＡＵＣＵＵ  ＵＵＵＵＣ（配列番号３４）を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
ニューロンの生存を促進するためのインビトロの方法であって、該ニューロンを有効量のＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストおよびＴｒｋＢアゴニストと接触させる工程を含み、ここで、
該ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストが、
（ｉ）可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドであって、ＬＩＮＧＯ−１  ＬＲＲドメインもしくはＬＩＮＧＯ−１免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを含む、可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド；
（ｉｉ）ＬＩＮＧＯ−１抗体もしくはその抗原結合断片；または
（ｉｉｉ）ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリヌクレオチドであって、アンチセンスポリヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もしくは低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリヌクレオチド
であり、そして、
該ＴｒｋＢアゴニストが、
（ｉ）ＴｒｋＢアゴニストポリペプチドであって、ＢＤＮＦポリペプチドである、ＴｒｋＢアゴニストポリペプチド；または
（ｉｉ）ＴｒｋＢアゴニストポリヌクレオチドであって、ＢＤＮＦポリペプチドをコードする、ＴｒｋＢアゴニストポリヌクレオチド
である、方法。
【請求項１０】
細胞内でのＴｒｋＢリン酸化を促進するためのインビトロの方法であって、ＬＩＮＧＯ−１とＴｒｋＢとを共発現する細胞をＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストと接触させる工程を含み、ここで、
該ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストが、
（ｉ）可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドであって、ＬＩＮＧＯ−１  ＬＲＲドメインもしくはＬＩＮＧＯ−１免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを含む、可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド；
（ｉｉ）ＬＩＮＧＯ−１抗体もしくはその抗原結合断片；または
（ｉｉｉ）ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリヌクレオチドであって、アンチセンスポリヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もしくは低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリヌクレオチド
である、方法。
【請求項１１】
前記細胞がニューロンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ニューロンが網膜神経節細胞または有毛細胞である、請求項９または１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストをさらに含む、請求項３に記載の組成物であって、
該ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストが、
（ｉ）可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドであって、ＬＩＮＧＯ−１  ＬＲＲドメインもしくはＬＩＮＧＯ−１免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを含む、可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド；
（ｉｉ）ＬＩＮＧＯ−１抗体もしくはその抗原結合断片；または
（ｉｉｉ）ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリヌクレオチドであって、アンチセンスポリヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もしくは低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリヌクレオチド
である、組成物。
【請求項１４】
ＬＩＮＧＯ−１抗体がＬｉ１３である、請求項６に記載の組成物。
【請求項１５】
ＬＩＮＧＯ−１抗体がＬｉ３３である、請求項６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経学、神経生物学、分子生物学、および薬理学に関する。より詳細には、本発明は、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストおよびＴｒｋＢアゴニストを用いて、ニューロンの生存と再生を促進する方法に関する。さらに、本発明は、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストを用いて、圧力誘導性の視神経障害を処置する方法に関する。本発明はまた、一般に、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストを用いて、ＴｒｋＢ活性を増大させ、かつＪＮＫ経路のシグナル伝達を阻害する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
視神経障害は、様々な臨床症状および病因を包含する眼科疾患群の１つである。緑内障は、視神経の病理学的変化、視神経円板に見られる病理学的変化、および視野喪失に相当する病理学的変化を含み、治療しないと失明する例示的な視神経障害である。緑内障は、眼圧の増大と関連するが、その他の要素も含んでいる。
【０００３】
緑内障に対する現在の治療は、眼圧を下げることに向けられている。内科的治療としては、眼内液の産生を低下させるかまたはその流出を増大させる局所点眼薬または経口医薬品が挙げられる。しかしながら、緑内障に対するこれら薬物治療は、時に、頭痛、目のかすみ、アレルギー反応、心肺合併症に起因する死亡、およびその他の薬物との潜在的相互作用などの重大な副作用を伴う。外科的治療も用いられるが、それには多くの欠点もあり、成功率も低い。
【０００４】
したがって、緑内障、および網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の変性または死を特徴とするその他の疾患を含む、圧力誘導性の視神経障害に対するさらなる処置法が依然として必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ニューロンにおいて、ＬＩＮＧＯ−１がＴｒｋＢと相互作用し、これを阻害するという発見に基づく。眼圧上昇後、ＴｒｋＢリガンドである脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）が上方調節される。ＢＤＮＦは、ＴｒｋＢリン酸化および細胞生存シグナル伝達経路の活性化を促進する。しかしながら、ＬＩＮＧＯ−１もまた、眼圧上昇後に上方調節される。本明細書に記載される実験は、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストを用いて、ＬＩＮＧＯ−１がＴｒｋＢのリン酸化および活性化を阻害し、それによって細胞生存シグナル伝達経路を阻害することを示す。本明細書に記載される実験はまた、ＬＩＮＧＯ−１が細胞死と関連するＪＮＫシグナル伝達経路の活性化を促進することを示す。したがって、ＬＩＮＧＯ−１のアンタゴニストおよびＴｒｋＢのアゴニストは細胞生存を促進する。
【０００６】
これらの発見を基に、本発明は、一般にＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストの投与によってＬＩＮＧＯ−１とＴｒｋＢの相互作用を阻害する方法に関する。本発明はまた、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストの投与によってＴｒｋＢリン酸化およびＴｒｋＢシグナル伝達を促進し、ＪＮＫリン酸化およびＪＮＫシグナル伝達を阻害する方法に関する。さらに、本発明は、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストの投与によって網膜神経節細胞の生存を促進するかまたは圧力誘導性の視神経障害を処置する方法に関する。さらに、本発明は、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストおよびＴｒｋＢアゴニストの投与によってニューロン細胞の生存を促進する方法に関する。ある実施形態において、本発明はまた、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストおよびＴｒｋＢアゴニストの投与によってニューロン細胞死と関連する状態を処置する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ある実施形態において、本発明は、細胞内のＬＩＮＧＯ−１とＴｒｋＢの相互作用を阻害する方法であって、ＬＩＮＧＯ−１とＴｒｋＢとを共発現する細胞をＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストと接触させる工程を含む方法を含む。その他の実施形態において、本発明は、細胞内のＴｒｋＢリン酸化またはＴｒｋＢ経路のシグナル伝達を促進する方法であって、ＬＩＮＧＯ−１とＴｒｋＢとを共発現する細胞をＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストと接触させる工程を含む方法を含む。その他のある実施形態において、本発明は、ＴｒｋＢリン酸化を促進する方法であって、ＣＮＳニューロンをＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストと接触させる工程を含む方法を含む。
【０００８】
ある実施形態において、本発明は、細胞内のＪＮＫリン酸化を促進する方法であって、ＬＩＮＧＯ−１およびＪＮＫを発現する細胞をＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストと接触させる工程を含む方法を含む。その他の実施形態において、本発明は、ＪＮＫリン酸化を阻害する方法であって、ＣＮＳニューロンをＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストと接触させる工程を含む方法を提供する。
【０００９】
ある実施形態において、本発明は、死の危険にさらされたニューロンの生存を促進する方法であって、該ニューロンを有効量のＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストおよびＴｒｋＢアゴニストと接触させる工程を含む方法を含む。
【００１０】
その他の実施形態において、本発明は、圧力誘導性の眼神経障害の兆候または症状を示す哺乳動物の網膜神経節細胞の生存を促進する方法であって、そのような処置を必要とする哺乳動物に有効量のＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストおよび担体を投与する工程を含む方法を含む。本発明はまた、ニューロン細胞死と関連する疾患または障害を処置する方法であって、そのような処置を必要とする哺乳動物に有効量のＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストおよびＴｒｋＢアゴニストを投与する工程を含む方法を含む。いくつかの実施形態において、該哺乳類は緑内障であると診断されている。
【００１１】
上記方法の様々な実施形態において、該ＴｒｋＢアゴニストは、ＴｒｋＢがニューロンの生存を促進する能力を増大させる任意の分子であってもよい。ある実施形態において、該ＴｒｋＢアゴニストは、ＴｒｋＢアゴニスト化合物、ＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＴｒｋＢアゴニスト抗体もしくはその断片、ＴｒｋＢアゴニストポリヌクレオチド、ＴｒｋＢアプタマー、または２つ以上のＴｒｋＢアゴニストの組合せからなる群より選択される。
【００１２】
ある実施形態において、該ＴｒｋＢアゴニストはＴｒｋＢアゴニスト化合物である。本発明のあるＴｒｋＢアゴニスト化合物は、Ｌ−７８３、２８１、アデノシン、およびＣＧＳ  ２１６８０を含むが、これらに限定されない。さらに、該ＴｒｋＢアゴニスト化合物は、ニューロトロフィンの極めて重要な領域を模倣する小分子であることができる。例えば、該小分子は、ＢＤＮＦのβ−ターンループの模倣体であることができる。本発明に従って使用され得る小分子模倣体の特定の例は、米国公開出願第２００７／００６０５２６  Ａ１号に開示されており、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００１３】
ある実施形態において、該ＴｒｋＢアゴニストはＴｒｋＢアゴニストポリペプチドである。本発明のある種のＴｒｋＢアゴニストポリペプチドとしてはＢＤＮＦ、ＮＴ−３、およびＮＴ−４／５が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、該ＴｒｋＢアゴニストポリペプチドは配列番号：４を含む。いくつかの実施形態において、該ＴｒｋＢアゴニストは、非ＴｒｋＢアゴニスト異種ポリペプチドまたは非ＴｒｋＢアゴニスト異種ポリマーを含む融合ポリペプチドまたは結合体である。いくつかの実施形態において、該非ＴｒｋＢアゴニストポリペプチドまたは非ＴｒｋＢアゴニストポリマーは、ポリエチレングリコール、１−アシル−グリセロール誘導体、抗体Ｉｇペプチド、血清アルブミンペプチド、標的化ペプチド、レポーターペプチド、および精製を容易にするペプチドからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、該抗体Ｉｇペプチドは、ヒンジおよびＦｃペプチドである。
【００１４】
代替の実施形態において、該ＴｒｋＢアゴニストは、ＴｒｋＢポリペプチドに結合する抗体またはその断片である。本発明の方法で使用されるＴｒｋＢアゴニスト抗体としては、６Ｅ２、７Ｆ５、１１Ｅ１、１６Ｅ１１、１７Ｄ１１、１９Ｅ１２、および２９Ｄ７が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
その他の実施形態において、該ＴｒｋＢアゴニストは、ＴｒｋＢアゴニストポリヌクレオチド（例えば、ペプチドもしくはタンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはアプタマー）である。
【００１６】
さらなる実施形態において、該ＴｒｋＢアゴニストはＴｒｋＢアプタマーである。ＴｒｋＢアプタマーは、ＴｒｋＢに結合し、ＴｒｋＢがニューロンの生存を増大させる能力を促進する小さいポリヌクレオチドである。
【００１７】
上記方法の様々な実施形態において、該ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストは、ＬＩＮＧＯ−１がニューロンの生存を負に調節する能力、および／またはＬＩＮＧＯ−１がＴｒｋＢに結合する能力、および／またはＬＩＮＧＯ−１がＴｒｋＢリン酸化を阻害するかもしくは減少させる能力に干渉する任意の分子であってもよい。ある実施形態において、該ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストは、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはその断片、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ干渉）、ＬＩＮＧＯ−１アプタマー、または２つ以上のＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストの組み合わせからなる群より選択される。
【００１８】
ある実施形態において、該ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドは可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドである。本発明のある可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドとしては、以下のドメイン：（ｉ）ＬＩＮＧＯ−１ロイシン−リッチリピート（ＬＲＲ）ドメイン、（ｉｉ）ＬＲＲドメインのＣ末端のＬＩＮＧＯ−１塩基性領域、および（ｉｉｉ）ＬＩＮＧＯ−１免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインのうちの１つ以上を含むかまたは欠く可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、該可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドは、ＬＩＮＧＯ−１  Ｉｇドメイン、ＬＩＮＧＯ−１  ＬＲＲドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインのうちの１つ以上を欠く。本発明のさらなるＬＩＮＧＯ−１可溶性ポリペプチドとしては、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠くポリペプチドが挙げられる。いくつかの実施形態において、該可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドは、ＬＩＮＧＯ−１  ＬＲＲドメインを含み、かつＬＩＮＧＯ−１  Ｉｇドメイン、ＬＩＮＧＯ−１塩基性領域、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを欠く。いくつかの実施形態において、該可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸残基３４〜５３２または配列番号：２のアミノ酸残基３６〜５３２を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、該ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストは、非ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト異種ポリペプチドを含む融合ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、該非ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドは、抗体Ｉｇポリペプチド、血清アルブミンポリペプチド、標的化ポリペプチド、レポーターポリペプチド、および精製を容易にするポリペプチドからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、該抗体ＩｇポリペプチドはヒンジおよびＦｃポリペプチドである。
【００２０】
代替の実施形態において、該ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストは、以下のＬＩＮＧＯ−１ドメイン：（ｉ）ＬＩＮＧＯ−１ロイシン−リッチリピート（ＬＲＲ）ドメイン、（ｉｉ）ＬＲＲドメインのＣ末端のＬＩＮＧＯ−１  塩基性領域、および（ｉｉｉ）ＬＩＮＧＯ−１免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインのうちの１つ以上を含むＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドに結合する抗体またはその断片である。さらに、該ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体またはその断片は、本明細書に記載されるようなＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド断片を含むポリペプチド内のエピトープに特異的に結合する。さらなる実施形態において、該ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体またはその断片は、２０１’、３Ａ３、３Ａ６、３Ｂ５、１Ａ７、１Ｄ５、１Ｇ７、２Ｂ１０、２Ｃ１１、２Ｆ３、３Ｐ１Ｂ１．１Ｆ９、３Ｐ１Ｄ１０．２Ｃ３、３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７、３Ｐ２Ｃ６．３Ｇ１０．２Ｈ７、３Ｐ２Ｃ９．２Ｇ４、３Ｐ４Ａ６．１Ｄ９、３Ｐ４Ａ１．２Ｂ９、３Ｐ４Ｃ２．２Ｄ２、３Ｐ４Ｃ５．１Ｄ８、３Ｐ４Ｃ８．２Ｇ９、６Ｐ４Ｆ４．１Ｄｓ、６Ｐ４Ｆ４．１Ｆ９、７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９、１Ｂ６．４、２Ｃ７．２、２Ｄ６．１、２Ｆ７．３、２Ｈ３．２、３Ｃ１１．１、３Ｅ３．１、３Ｈ１１．２、３Ｇ８．１、２Ｂ８．１、３Ｂ５．２３０−Ｃ１２（Ｌｉ０１）、３８−Ｄ０１（Ｌｉ０２）、３５−Ｅ０４（Ｌｉ０３）、３６−Ｃ０９（Ｌｉ０４）、３０−Ａ１１（Ｌｉ０５）、３４−Ｆ０２（Ｌｉ０６）、２９−Ｅ０７（Ｌｉ０７）、３４−Ｇ０４（Ｌｉ０８）、３６−Ａ１２（Ｌｉ０９）、２８−Ｄ０２（Ｌｉ１０）、３０−Ｂ０１（Ｌｉ１１）、３４−Ｂ０３（Ｌｉ１２）、Ｌｉ１３、Ｌｉ３２、Ｌｉ３３、Ｌｉ３４、３３８３（Ｌ１ａ．１）、３４９５（Ｌ１ａ．２）、３５６３（Ｌ１ａ．３）、３５６４（Ｌ１ａ．４）、３５６５（Ｌ１ａ．５）、３５６６（Ｌ１ａ．６）、３５６７（Ｌ１ａ．７）、３５６８（Ｌ１ａ．８）、３５６９（Ｌ１ａ．９）、３５７０（Ｌ１ａ．１０）、３５７１（Ｌ１ａ．１１）、３５８２（Ｌ１ａ．１２）、１９６８（Ｌ１ａ．１３）、３０１１、３０１２、３０１３、３４１８、３４２２、３５６２、Ｄ０５、Ｄ０７、Ｄ０８、Ｄ１０、およびＤ１１からなる群より選択される。該ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストは、これらの抗体のいずれか１つの抗原結合断片または２つ以上の抗体もしくはそれらの断片の組み合わせであることができる。
【００２１】
その他の実施形態において、該ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストは、アンチセンスポリヌクレオチド、アプタマー、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）などのＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリヌクレオチドである。
【００２２】
さらなる実施形態において、該ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストはＬＩＮＧＯ−１アプタマーである。ＬＩＮＧＯ−１アプタマーは、ＬＩＮＧＯ−１に結合し、ＬＩＮＧＯ−１とＴｒｋＢの相互作用に干渉し、かつ／またはＴｒｋＢリン酸化を促進するかもしくは増大させる、小さいポリペプチドまたはポリヌクレオチドである。
【００２３】
上記方法のいくつかの実施形態において、該ＴｒｋＢアゴニストおよび／またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストは、（ａ）発現制御配列との作動可能な結合を通じて、該ＴｒｋＢアゴニストおよび／または該ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドをＣＮＳニューロンに導入する工程；ならびに（ｂ）該ＴｒｋＢアゴニストおよび／またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストを発現させる工程を含む方法によって投与される。いくつかの実施形態において、該ＣＮＳニューロンは哺乳動物内にあり、該導入する工程は、（ａ）発現制御配列との作動可能な結合を通じて、ＴｒｋＢアゴニストおよび／またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを該哺乳動物に導入する工程を含む。いくつかの実施形態において、培養宿主細胞は、処置される哺乳動物に由来する。ある実施形態において、該ポリヌクレオチドは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、ウイルスによる形質導入、または直接的なマイクロインジェクションを介して、該宿主細胞またはＣＮＳニューロンに導入される。
【００２４】
ある実施形態において、該ＴｒｋＢアゴニストおよび／またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストは、疾患、障害、もしくは損傷の部位またはその付近で、哺乳動物に投与されることができるポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、該ポリヌクレオチドは発現ベクターとして投与される。ある実施形態において、該ベクターは、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター（例えば、エプスタイン・バーウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクター）、パポバウイルスベクター、ポックスウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルスベクター）、およびパルボウイルスからなる群より選択されるウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、該ベクターは、局所投与、眼内投与、および非経口投与（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、心腔内、皮下、皮内、髄腔内、腹腔内）からなる群より選択される経路によって投与される。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
細胞内でのＬＩＮＧＯ−１とＴｒｋＢの相互作用を阻害する方法であって、ＬＩＮＧＯ−１とＴｒｋＢとを共発現する細胞をＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストと接触させる工程を含む方法。
（項目２）
細胞内でのＴｒｋＢリン酸化を促進する方法であって、ＬＩＮＧＯ−１とＴｒｋＢとを共発現する細胞をＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストと接触させる工程を含む方法。
（項目３）
ＴｒｋＢリン酸化を促進する方法であって、ＣＮＳニューロンをＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストと接触させる工程を含む方法。
（項目４）
細胞内でのＪＮＫリン酸化を阻害する方法であって、ＬＩＮＧＯ−１とＪＮＫとを共発現する細胞をＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストと接触させる工程を含む方法。
（項目５）
ＪＮＫリン酸化を阻害する方法であって、ＣＮＳニューロンをＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストと接触させる工程を含む方法。
（項目６）
死の危険にさらされたニューロンの生存を促進する方法であって、前記ニューロンを有効量のＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストおよびＴｒｋＢアゴニストと接触させる工程を含む方法。
（項目７）
圧力誘導性の眼神経障害の兆候または症状を示す哺乳動物の網膜神経節の生存を促進する方法であって、そのような処置を必要とする哺乳動物に治療有効量のＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストおよび担体を投与する工程を含む方法。
（項目８）
圧力誘導性の眼神経障害の兆候または症状を示す哺乳動物の網膜神経節の生存を促進する方法であって、そのような処置を必要とする哺乳動物に治療有効量のＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストとＴｒｋＢアゴニストの組み合わせを投与する工程を含む方法。
（項目９）
ニューロンの細胞死と関連する疾患または障害を処置する方法であって、そのような処置を必要とする哺乳動物に有効量のＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストおよびＴｒｋＢアゴニストを投与する工程を含む方法。
（項目１０）
前記細胞をＴｒｋＢアゴニストと接触させる工程をさらに含む、項目１〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストが可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドを含む、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが、以下：
（ｉ）ＬＩＮＧＯ  Ｉｇドメイン、またはその断片、変異体、もしくは誘導体、
（ｉｉ）ＬＩＮＧＯ  ＬＲＲドメイン、またはその断片、変異体、もしくは誘導体、
（ｉｉｉ）ＬＩＮＧＯ細胞質ドメイン、またはその断片、変異体、もしくは誘導体、
（ｉｖ）ＬＩＮＧＯ膜貫通ドメイン、またはその断片、変異体、もしくは誘導体、
（ｖ）前記ＬＲＲドメインのＣ末端のＬＩＮＧＯ塩基性領域、またはその断片、変異体、もしくは誘導体、および
（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖ）の前記ＬＩＮＧＯドメイン、またはその断片、変異体、もしくは誘導体のうちの少なくとも２つの組み合わせ、
からなる群より選択されるＬＩＮＧＯ−１領域を含む、項目１１記載の方法。
（項目１３）
前記可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが、以下：
（ｉ）ＬＩＮＧＯ  Ｉｇドメイン、
（ｉｉ）ＬＩＮＧＯ  ＬＲＲドメイン、
（ｉｉｉ）ＬＩＮＧＯ細胞質ドメイン、
（ｉｖ）ＬＩＮＧＯ膜貫通ドメイン、
（ｖ）前記ＬＲＲドメインのＣ末端のＬＩＮＧＯ塩基性領域、および
（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖ）の前記ＬＩＮＧＯ−１ドメインのうちの少なくとも２つの組み合わせ、
からなる群より選択されるＬＩＮＧＯ−１領域を欠く、項目１１記載の方法。
（項目１４）
前記可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが、ＬＩＮＧＯ−１膜貫通ドメインおよびＬＩＮＧＯ細胞質ドメインを欠く、項目１３記載の方法。
（項目１５）
前記可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが以下：
（ｉ）ＬＩＮＧＯ−１  ＬＲＲドメイン、またはその断片、変異体、もしくは誘導体、
（ｉｉ）前記ＬＲＲドメインのＣ末端のＬＩＮＧＯ−１塩基性領域、またはその断片、変異体、もしくは誘導体、および  
（ｉｉｉ）ＬＩＮＧＯ−１免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン、またはその断片、変異体、もしくは誘導体、
を含む、項目１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが、ＬＩＮＧＯ−１  ＬＲＲドメインの少なくとも一部を含むが、ＬＩＮＧＯ−１  Ｉｇドメイン、ＬＩＮＧＯ−１塩基性領域、ＬＩＮＧＯ−１膜貫通ドメイン、およびＬＩＮＧＯ−１細胞質ドメインを欠く、項目１３または項目１４記載の方法。
（項目１７）
前記可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが、以下からなる群より選択されるポリペプチド断片を含む、項目１１〜１５のいずれか一項に記載の方法記載の方法：
（ｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜３３；
（ｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜３５；
（ｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜６４；
（ｉｖ）配列番号：２のアミノ酸３６〜６４；
（ｖ）配列番号：２のアミノ酸６６〜８９；
（ｖｉ）配列番号：２のアミノ酸９０〜１１３；
（ｖｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１１４〜１３７；
（ｖｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１３８〜１６１；
（ｉｘ）配列番号：２のアミノ酸１６２〜１８５；
（ｘ）配列番号：２のアミノ酸１８６〜２０９；
（ｘｉ）配列番号：２のアミノ酸２１０〜２３３；
（ｘｉｉ）配列番号：２のアミノ酸２３４〜２５７；
（ｘｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸２５８〜２８１；
（ｘｉｖ）配列番号：２のアミノ酸２８２〜３０５；
（ｘｖ）配列番号：２のアミノ酸３０６〜３２９；
（ｘｖｉ）配列番号：２のアミノ酸３３０〜３５３；
（ｘｖｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３６３〜４１６；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸４１７〜４２４；
（ｘｉｘ）配列番号：２のアミノ酸４１９〜４９３；
（ｘｘ）配列番号：２のアミノ酸４９４〜５５１；
（ｘｘｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜６４；
（ｘｘｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜８９；
（ｘｘｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜１１３；
（ｘｘｉｖ）配列番号：２のアミノ酸１〜１３７；
（ｘｘｖ）配列番号：２のアミノ酸１〜１６１；
（ｘｘｖｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜１８５；
（ｘｘｖｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜２０９；
（ｘｘｖｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜２３３；
（ｘｘｉｘ）配列番号：２のアミノ酸１〜２５７；
（ｘｘｘｘ）配列番号：２のアミノ酸１〜２８１；
（ｘｘｘｘｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜３０５；
（ｘｘｘｘｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜３２９；
（ｘｘｘｘｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜３５３；
（ｘｘｘｘｉｖ）配列番号：２のアミノ酸１〜４１６；
（ｘｘｘｘｖ）配列番号：２のアミノ酸１〜４２４；
（ｘｘｘｘｖｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜４９３；
（ｘｘｘｘｖｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜５５１；
（ｘｘｘｘｖｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１〜５３１；
（ｉＬ）配列番号：２のアミノ酸１〜５３２；
（Ｌｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜８９；
（Ｌｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜１１３；
（Ｌｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜１３７；
（Ｌｉｖ）配列番号：２のアミノ酸３４〜１６１；
（Ｌｖ）配列番号：２のアミノ酸３４〜１８５；
（Ｌｖｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜２０９；
（Ｌｖｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜２３３；
（Ｌｖｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜２５７；
（Ｌｉｘ）配列番号：２のアミノ酸３４〜２８１；
（Ｌｘ）配列番号：２のアミノ酸３４〜３０５；
（Ｌｘｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜３２９；
（Ｌｘｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜３５３；
（Ｌｘｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜４１６；
（Ｌｘｉｖ）配列番号：２のアミノ酸３４〜４２４；
（Ｌｘｖ）配列番号：２のアミノ酸３４〜４９３；
（Ｌｘｖｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜５５１；
（Ｌｘｘｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜５３０；
（Ｌｘｘｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜５３１；
（Ｌｘｘｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜５３２；
（Ｌｘｘｉｖ）配列番号：２のアミノ酸３４〜５３３；
（Ｌｘｘｖ）配列番号：２のアミノ酸３４〜５３４；
（Ｌｘｘｖｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜５３５；
（Ｌｘｘｖｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜５３６；
（Ｌｘｘｖｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜５３７；
（Ｌｘｘｉｘ）配列番号：２のアミノ酸３４〜５３８；
（Ｌｘｘｘ）配列番号：２のアミノ酸３４〜５３９；
（Ｌｘｘｘｉ）配列番号：２のアミノ酸３０〜５３２；
（Ｌｘｘｘｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３１〜５３２；
（Ｌｘｘｘｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３２〜５３２；
（Ｌｘｘｘｉｖ）配列番号：２のアミノ酸３３〜５３２；
（Ｌｘｘｘｖ）配列番号：２のアミノ酸３４〜５３２；
（Ｌｘｘｘｖｉ）配列番号：２のアミノ酸３５〜５３２；
（Ｌｘｘｘｖｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３６〜５３２；
（Ｌｘｘｘｖｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３０〜５３１；
（Ｌｘｘｘｉｘ）配列番号：２のアミノ酸３１〜５３１；
（Ｌｘｘｘｘ）配列番号：２のアミノ酸３２〜５３１；
（Ｌｘｘｘｘｉ）配列番号：２のアミノ酸３３〜５３１；
（Ｌｘｘｘｘｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３４〜５３１；
（Ｌｘｘｘｘｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３５〜５３１；
（Ｌｘｘｘｘｉｖ）配列番号：２のアミノ酸３６〜５３１；
（Ｌｘｘｘｘｖ）配列番号：２のアミノ酸３６〜８９；
（Ｌｘｘｘｘｖｉ）配列番号：２のアミノ酸３６〜１１３；
（Ｌｘｘｘｘｖｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３６〜１３７；
（Ｌｘｘｘｘｖｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３６〜１６１；
（Ｌｘｘｘｘｖｃ）配列番号：２のアミノ酸３６〜１８５；
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸３６〜２０９；
（ｃｉ）配列番号：２のアミノ酸３６〜２３３；
（ｃｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３６〜２５７；
（ｃｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３６〜２８１；
（ｃｉｖ）配列番号：２のアミノ酸３６〜３０５；
（ｃｖ）配列番号：２のアミノ酸３６〜３２９；
（ｃｖｉ）配列番号：２のアミノ酸３６〜３５３；
（ｃｖｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３６〜４１６；
（ｃｖｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３６〜４２４；
（ｃｉｘ）配列番号：２のアミノ酸３６〜４９３；
（ｃｘ）配列番号：２のアミノ酸３６〜５５１；
（ｃｘｉ）配列番号：２のアミノ酸３６〜５３０；
（ｃｘｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３６〜５３１；
（ｃｘｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３６〜５３２；
（ｃｘｉｖ）配列番号：２のアミノ酸３６〜５３３；
（ｃｘｖ）配列番号：２のアミノ酸３６〜５３４；
（ｃｘｖｉ）配列番号：２のアミノ酸３６〜５３５；
（ｃｘｖｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３６〜５３６；
（ｃｘｖｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３６〜５３７；
（ｃｘｉｘ）配列番号：２のアミノ酸３６〜５３８；
（ｃｘｘ）配列番号：２のアミノ酸３６〜５３９；
（ｃｘｘｉ）前記ポリペプチド断片のいずれかの変異体または誘導体、および
（ｃｘｘｉｉ）前記ポリペプチド断片、またはその変異体もしくは誘導体のいずれかのうちの少なくとも２つの組み合わせ。  
（項目１８）
前記可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが、配列番号：２のアミノ酸３４〜５３２または配列番号：２のアミノ酸３６〜５３２を含む、項目１７記載の方法。
（項目１９）
前記可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが、ＬＩＮＧＯ−１  Ｉｇドメイン、またはその断片、変異体、もしくは誘導体を含む、項目１１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが、配列番号：２のアミノ酸４１７〜４９３を含む、項目１９記載の方法。
（項目２１）
前記可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが、非ＬＩＮＧＯ−１部分をさらに含む、項目１１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記非ＬＩＮＧＯ−１部分が、前記可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドに融合した異種ポリペプチドである、項目２１記載の方法。
（項目２３）
異種ポリペプチドが、免疫グロブリン断片、血清アルブミン、標的化タンパク質、レポータータンパク質、および精製を容易にするタンパク質からなる群より選択される、項目２２記載の方法。
（項目２４）
前記異種ポリペプチドが免疫グロブリン断片である、項目２３記載の方法。
（項目２５）
前記免疫グロブリン断片がヒンジおよびＦｃ領域を含む、項目２４記載の方法。
（項目２６）
前記可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが、ポリマーに結合体化している、項目２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記ポリマーが、ポリアルキレングリコール、糖ポリマー、およびポリペプチドからなる群より選択される、項目２６記載の方法。
（項目２８）
前記ポリマーがポリアルキレングリコールである、項目２７記載の方法。
（項目２９）
前記ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、項目２８記載の方法。
（項目３０）
前記可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが、１つ、２つ、３つ、または４つのポリマーに結合体化している、項目２６記載の方法。
（項目３１）
前記ポリマーの総分子量が、５，０００Ｄａ〜１００，０００Ｄａである、項目３０記載の方法。
（項目３２）
前記ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストが、ＬＩＮＧＯ−１抗体、またはその断片を含む、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記ＬＩＮＧＯ−１抗体またはその断片が、以下からなる群より選択されるポリペプチドから本質的になるエピトープに特異的に結合する、項目３２記載の方法：
（ｉ）配列番号：２のアミノ酸６６〜８９；
（ｉｉ）配列番号：２のアミノ酸６６〜１１３；
（ｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸６６〜１３７；
（ｉｖ）配列番号：２のアミノ酸９０〜１１３；
（ｖ）配列番号：２のアミノ酸１１４〜１３７；
（ｖｉ）配列番号：２のアミノ酸１３８〜１６１；
（ｖｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１６２〜１８５；
（ｖｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸１８６〜２０９；
（ｉｘ）配列番号：２のアミノ酸２１０〜２３３；
（ｘ）配列番号：２のアミノ酸２３４〜２５７；
（ｘｉ）配列番号：２のアミノ酸２５８〜２８１；
（ｘｉｉ）配列番号：２のアミノ酸２８２〜３０５；
（ｘｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸３０６〜３２９；
（ｘｉｖ）配列番号：２のアミノ酸３３０〜３５３；
（ｘｖ）配列番号：２のアミノ酸３４〜６４；
（ｘｖｉ）配列番号：２のアミノ酸３６３〜４１６；
（ｘｖｉｉ）前記ポリペプチド断片のいずれかの変異体または誘導体；および
（ｘｖｉｉｉ）前記ポリペプチド断片またはその変異体もしくは誘導体のいずれかのうちの２つ以上の組み合わせ。
（項目３４）
前記ＬＩＮＧＯ−１抗体が、以下からなる群より選択される、項目３２記載の方法：２０１’、３Ａ３、３Ａ６、３Ｂ５、１Ａ７、１Ｄ５、１Ｇ７、２Ｂ１０、２Ｃ１１、２Ｆ３、３Ｐ１Ｂ１．１Ｆ９、３Ｐ１Ｄ１０．２Ｃ３、３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７、３Ｐ２Ｃ６．３Ｇ１０．２Ｈ７、３Ｐ２Ｃ９．２Ｇ４、３Ｐ４Ａ６．１Ｄ９、３Ｐ４Ａ１．２Ｂ９、３Ｐ４Ｃ２．２Ｄ２、３Ｐ４Ｃ５．１Ｄ８、３Ｐ４Ｃ８．２Ｇ９、６Ｐ４Ｆ４．１Ｄｓ、６Ｐ４Ｆ４．１Ｆ９、７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９、１Ｂ６．４、２Ｃ７．２、２Ｄ６．１、２Ｆ７．３、２Ｈ３．２、３Ｃ１１．１、３Ｅ３．１、３Ｈ１１．２、３Ｇ８．１、２Ｂ８．１、３Ｂ５．２３０−Ｃ１２（Ｌｉ０１）、３８−Ｄ０１（Ｌｉ０２）、３５−Ｅ０４（Ｌｉ０３）、３６−Ｃ０９（Ｌｉ０４）、３０−Ａ１１（Ｌｉ０５）、３４−Ｆ０２（Ｌｉ０６）、２９−Ｅ０７（Ｌｉ０７）、３４−Ｇ０４（Ｌｉ０８）、３６−Ａ１２（Ｌｉ０９）、２８−Ｄ０２（Ｌｉ１０）、３０−Ｂ０１（Ｌｉ１１）、３４−Ｂ０３（Ｌｉ１２）、Ｌｉ１３、Ｌｉ３２、Ｌｉ３３、Ｌｉ３４、３３８３（Ｌ１ａ．１）、３４９５（Ｌ１ａ．２）、３５６３（Ｌ１ａ．３）、３５６４（Ｌ１ａ．４）、３５６５（Ｌ１ａ．５）、３５６６（Ｌ１ａ．６）、３５６７（Ｌ１ａ．７）、３５６８（Ｌ１ａ．８）、３５６９（Ｌ１ａ．９）、３５７０（Ｌ１ａ．１０）、３５７１（Ｌ１ａ．１１）、３５８２（Ｌ１ａ．１２）、１９６８（Ｌ１ａ．１３）、３０１１、３０１２、３０１３、３４１８、３４２２、３５６２、Ｄ０５、Ｄ０７、Ｄ０８、Ｄ１０、およびＤ１１。
（項目３５）
前記ＬＩＮＧＯ−１抗体が１Ａ７である、項目３４記載の方法。
（項目３６）
前記ＬＩＮＧＯ−１抗体が３Ｂ５である、項目３４記載の方法。
（項目３７）
前記ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストがＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリヌクレオチドを含む、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリヌクレオチドが以下：
（ｉ）アンチセンスポリヌクレオチド；
（ｉｉ）リボザイム；
（ｉｉｉ）低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；および
（ｉｖ）低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、
からなる群より選択される、項目３７記載の方法。
（項目３９）
前記ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリヌクレオチドが、ＬＩＮＧＯ−１  ｍＲＮＡのコード部分に相補的な少なくとも１０塩基を含むアンチセンスポリヌクレオチドである、項目３８記載の方法。
（項目４０）
前記ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリヌクレオチドがリボザイムである、項目３９記載の方法。
（項目４１）
前記ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリヌクレオチドがｓｉＲＮＡである、項目３８記載の方法。
（項目４２）
前記ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリヌクレオチドがｓｈＲＮＡである、項目３８記載の方法。
（項目４３）
前記ｓｈＲＮＡ  が、ヌクレオチド配列：ＵＧＡＵＣＧＵＣＡＵ  ＣＣＵＧＣＵＡＧＡＣ  ＵＵＣＡＡＧＡＧＡＧ  ＵＣＵＡＧＣＡＧＧＡ  ＵＧＡＣＧＡＵＣＵＵ  ＵＵＵＵＣ（配列番号：３４）を含む、項目３９記載の方法。
（項目４４）
前記ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストがアプタマーである、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記接触させる工程が、（ａ）発現制御配列との作動可能な結合によって前記ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを前記細胞または前記ＣＮＳニューロンに導入する工程、および（ｂ）前記ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストを発現させる工程を含む、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記ポリヌクレオチドが、以下：
（ａ）トランスフェクション；
（ｂ）エレクトロポレーション；
（ｃ）形質導入；および
（ｄ）直接的なマイクロインジェクション、
からなる群より選択される方法によって前記細胞に導入される、項目４５記載の方法。
（項目４７）
前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターとして投与される、項目４４〜４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記発現ベクターがウイルスベクターである、項目４７記載の方法。
（項目４９）
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、およびパルボウイルスベクターからなる群より選択される、項目４８記載の方法。
（項目５０）
前記ヘルペスウイルスベクターが、単純ヘルペスウイルスベクターおよびエプスタイン・バーウイルスベクターからなる群より選択される、項目４９記載の方法。
（項目５１）
前記ポックスウイルスベクターがワクシニアウイルスベクターである、項目４９記載の方法。
（項目５２）
前記レンチウイルスベクターがｐＬＬ３．７である、項目４９記載の方法。
（項目５３）
前記パルボウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、項目４９記載の方法。
（項目５４）
前記細胞、前記ニューロン、または前記ＣＮＳニューロンを、以下：
（ｉ）ＮＧＦアンタゴニスト；
（ｉｉ）ＮｇＲ１アンタゴニスト；
（ｉｉｉ）ＴＡＪアンタゴニスト；および
（ｉｖ）ＯＭｇｐアンタゴニスト、
からなる群より選択されるさらなるアンタゴニストと接触させる工程をさらに含む、項目１〜６または１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
以下：
（ｉ）ＮＧＦアンタゴニスト；
（ｉｉ）ＮｇＲ１アンタゴニスト；
（ｉｉｉ）ＴＡＪアンタゴニスト；および
（ｉｖ）ＯＭｇｐアンタゴニスト、
からなる群より選択されるさらなるアンタゴニストを投与する工程をさらに含む、項目７〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記ＴｒｋＢアゴニストがＴｒｋＢアゴニスト化合物である、項目６、８、９、または１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記ＴｒｋＢアゴニスト化合物が、Ｌ−７８３，２８１、アデノシン、およびＣＧＳ  ２１６８０からなる群より選択される、項目５６記載の方法。
（項目５８）
前記ＴｒｋＢアゴニストがＴｒｋＢアゴニストポリペプチドである、項目６、８、９、または１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記ＴｒｋＢアゴニストポリペプチドが、ＴｒｋＢリガンド、ＴｒｋＢリガンドの断片、ＴｒｋＢリガンドの変異体、ＴｒｋＢポリペプチド、ＴｒｋＢポリペプチドの断片、またはＴｒｋＢポリペプチドの変異体からなる群より選択される、項目５８記載の方法。
（項目６０）
前記ＴｒｋＢアゴニストポリペプチドがＢＤＮＦポリペプチドである、項目５９記載の方法。
（項目６１）
前記ＴｒｋＢアゴニストポリペプチドが非ＴｒｋＢアゴニスト部分をさらに含む、項目５８〜６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記非ＴｒｋＢアゴニスト部分が、前記ＴｒｋＢアゴニストポリペプチドに融合した異種ポリペプチドである、項目６１記載の方法。
（項目６３）
前記非ＴｒｋＢアゴニスト部分が、免疫グロブリン断片、血清アルブミン、標的化タンパク質、レポータータンパク質、および精製を容易にするタンパク質からなる群より選択される、項目６１または６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記非ＴｒｋＢアゴニスト部分が免疫グロブリン断片である、項目６３記載の方法。
（項目６５）
前記免疫グロブリン断片がヒンジおよびＦｃ領域を含む、項目６３記載の方法。
（項目６６）
前記ＴｒｋＢアゴニストポリペプチドがポリマーに結合体化している、項目６１記載の方法。
（項目６７）
前記ポリマーが、ポリアルキレングリコール、糖ポリマー、およびポリペプチドからなる群より選択される、項目６６記載の方法。
（項目６８）
前記ポリマーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、項目６７記載の方法。
（項目６９）
前記ＴｒｋＢアゴニストポリペプチドが、１−アシル−グリセロール誘導体に結合体化している、項目６１記載の方法。
（項目７０）
前記ＴｒｋＢアゴニストポリペプチドが、１つ、２つ、３つ、または４つのポリマーに結合体化している、項目６６記載の方法。
（項目７１）
前記ポリマーの総分子量が、５，０００Ｄａ〜１００，０００Ｄａである、項目７０記載の方法。
（項目７２）
前記ＴｒｋＢアゴニストが、ＴｒｋＢアゴニスト抗体またはその断片である、項目６、８、９、または１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目７３）
前記ＴｒｋＢアゴニスト抗体またはその断片が、６Ｅ２、７Ｆ５、１１Ｅ１、１６Ｅ１１、１７Ｄ１１、１９Ｅ１２、２９Ｄ７、またはＴｒｋＢモノクローナル抗体からなる群より選択される、項目７２記載の方法。
（項目７４）
前記ＴｒｋＢアゴニストがＴｒｋＢアゴニストポリヌクレオチドである、項目６、８、９、または１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目７５）
前記ＴｒｋＢアゴニストポリヌクレオチドが、ニューロトロフィンまたはその断片もしくは変異体をコードする、項目７４記載の方法。
（項目７６）
前記ニューロトロフィンがＢＤＮＦである、項目７５記載の方法。
（項目７７）
前記ＴｒｋＢアゴニストがＴｒｋＢアゴニストアプタマーである、項目６、８、９、または１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目７８）
前記細胞もしくはニューロンまたは前記ＣＮＳニューロンが哺乳動物内にあり、かつ前記接触させる工程が、有効量の前記ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストまたは前記ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストとＴｒｋＢアゴニストを、それを必要とする哺乳動物に投与する工程を含む、項目１〜６または１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目７９）
前記哺乳動物が、神経変性を伴う疾患、障害、または損傷を有すると診断されている、項目７〜１０または７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
前記疾患、障害、または損傷が、緑内障である、項目７９記載の方法。
（項目８１）
前記ＴｒｋＢアゴニストまたはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストの少なくとも１つが、ボーラス注射または慢性的注入によって投与される、項目７〜１０または７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８２）
前記ＴｒｋＢアゴニストまたはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストの少なくとも１つが、中枢神経系に直接投与される、項目７〜１０または７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
前記ＴｒｋＢアゴニストが、ＴｒｋＢアゴニストポリヌクレオチドまたはＴｒｋＢアゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマーをコードするポリヌクレオチドからなる群より選択される、項目６、８、９、１０、または７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８４）
前記接触させる工程または投与する工程が、（ａ）細胞に前記ＴｒｋＢアゴニストポリヌクレオチドまたは前記ＴｒｋＢアゴニストをコードするポリヌクレオチドを導入する工程、および（ｂ）前記ＴｒｋＢアゴニストを発現させる工程を含む、項目８３記載の方法。    
（項目８５）
前記ポリヌクレオチドが、以下：
（ａ）トランスフェクション；
（ｂ）エレクトロポレーション；
（ｃ）形質導入；および
（ｄ）直接的なマイクロインジェクション、
からなる群より選択される方法によって前記細胞に導入される、項目８４記載の方法。
（項目８６）
前記細胞が哺乳動物内にあり、かつ前記導入する工程が、（ａ）前記哺乳動物に前記ＴｒｋＢアゴニストポリヌクレオチドまたは前記ＴｒｋＢアゴニストをコードする前記ポリヌクレオチドを投与する工程、および（ｂ）前記ＴｒｋＢアゴニストを発現させる工程を含む、項目８４〜８５記載のいずれか一項に記載の方法。
（項目８７）
前記ＴｒｋＢアゴニストポリヌクレオチドまたは前記ＴｒｋＢアゴニストをコードする前記ポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドを発現することができる培養宿主細胞に投与される、項目８３記載の方法。
（項目８８）
前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターとして投与される、項目８４〜８７のいずれか一項に記載の方法。
（項目８９）
前記発現ベクターがウイルスベクターである、項目８８記載の方法。
（項目９０）
前記ポリヌクレオチドが、前記疾患、障害、もしくは損傷の部位またはその付近で前記哺乳動物に導入される、項目８６〜８９のいずれか一項に記載の方法。
（項目９１）
前記培養宿主細胞が、（ａ）レシピエント宿主細胞を、項目８３記載のＴｒｋＢアゴニストポリヌクレオチドもしくはＴｒｋＢアゴニストをコードするポリヌクレオチドまたは項目８８もしくは項目８９記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトする工程、および（ｂ）前記形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を培養する工程を含む方法によって作製される、項目８７記載の方法。
（項目９２）
前記宿主細胞が処置される前記哺乳動物に由来する、項目８７〜９１のいずれか一項に記載の方法。
（項目９３）
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、およびパルボウイルスベクターからなる群より選択される、項目８９記載の方法。
（項目９４）
前記ヘルペスウイルスベクターが、単純ヘルペスウイルスベクターおよびエプスタイン・バーウイルスベクターからなる群より選択される、項目９３記載の方法。
（項目９５）
前記ポックスウイルスベクターがワクシニアウイルスベクターである、項目９３記載の方法。
（項目９６）
前記レンチウイルスベクターがｐＬＬ３．７である、項目９３記載の方法。
（項目９７）
前記パルボウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、項目９３記載の方法。
（項目９８）
前記ＴｒｋＢアゴニストが、局所投与、眼内投与、硝子体内投与、非経口投与、髄腔内投与、硬膜下投与、皮下投与、またはカプセルインプラントを介するものからなる群より選択される経路によって投与される、項目８〜１０または７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目９９）
前記ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストまたはＴｒｋＢアゴニストの少なくとも１つが、眼に直接投与される、項目９８記載の方法。
（項目１００）
前記ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストまたはＴｒｋＢアゴニストの少なくとも１つが、カプセルインプラントを介して投与される、項目９８記載の方法。
（項目１０１）
前記細胞もしくはニューロンまたは前記ＣＮＳニューロンが感覚ニューロンである、項目１〜６または７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０２）
前記感覚ニューロンが網膜神経節細胞（ＲＧＣ）である、項目１０１記載の方法。
（項目１０３）
前記哺乳動物が視神経障害に罹患している、項目７〜１０または７８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０４）
前記視神経障害が緑内障である、項目１０３記載の方法。
（項目１０５）
前記感覚ニューロンが有毛細胞である、項目１０１記載の方法。
（項目１０６）
前記哺乳動物が、ＡＬＳ、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、糖尿病性神経障害、脳卒中、および聴力損失からなる群より選択される疾患または障害に罹患している、項目９または７８記載の方法。
（項目１０７）
前記ＬＩＮＧＯ−１抗体がＬｉ３３である、項目３４記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】実施例で使用された２週間（図１Ａ）および４週間（図１Ｂ）の実験的高眼圧モデルの模式的概要。
【図２】網膜フラットマウント標本の網膜神経節細胞（ＲＧＣ）を定量するために用いられた区分を示す概略図。ＲＧＣを、２００×２００μｍ２の接眼レンズグリッド下で、各４半分の正中線に沿って、視神経円板からその境界まで５００μｍ間隔で定量した。
【図３】レーザー光凝固前（上）およびその直後（下）の房水静脈の画像。
【図４】正常なラット網膜および損傷したラット網膜の切片におけるＬＩＮＧＯ−１発現。
【図５】正常なラット網膜および損傷したラット網膜におけるＬＩＮＧＯ−１のウエスタンブロットならびにその定量。
【図６】ＰＢＳ、対照タンパク質、抗ＬＩＮＧＯ−１抗体（１Ａ７）、または可溶性ＬＩＮＧＯ−１（ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ）で処置した左眼（正常）および右眼（損傷）における眼圧の測定。
【図７】損傷し、ＰＢＳ、対照タンパク質、１Ａ７、またはＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃで処置した２週間後および４週間後に生存しているＲＧＣの数（図７Ａ）および密度（図７Ｂ）の定量。
【図８】ＰＢＳ、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ、または１Ａ７で処置した正常動物および損傷動物におけるＲＧＣ（図８Ａ）および内網状層細胞（図８Ｂ）の微細構造の画像。
【図９】インビトロで増殖し、かつ対照タンパク質、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ、ＢＤＮＦと対照タンパク質、またはＢＤＮＦとＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃにさらされた生存しているＲＧＣの定量。
【図１０】正常網膜、処置されていない損傷網膜、およびＰＢＳ、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ、または１Ａ７で処置した損傷網膜におけるＢＤＮＦのウエスタンブロットならびにその定量。
【図１１】ＰＢＳ、抗ＢＤＮＦ抗体、１Ａ７、１Ａ７と抗ＢＤＮＦ抗体、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ、またはＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃと抗ＢＤＮＦ抗体で処置した損傷眼におけるＲＧＣの数（図１１Ａ）および密度（図１１Ｂ）の定量。
【図１２】ＴｒｋＢとＬＩＮＧＯ−１とを共発現する２９３細胞からの抗ＬＩＮＧＯ−１免疫沈降物におけるＴｒｋＢおよびＬＩＮＧＯ−１のウエスタンブロット（図１２Ａ）。ＬＩＮＧＯ−１発現ありおよび発現なし、ならびにＢＤＮＦ刺激ありおよび刺激なしの細胞からの抗ＴｒｋＢ免疫沈降物におけるホスホＴｒｋＢ、トータルＴｒｋＢ、およびＬＩＮＧＯ−１のウエスタンブロットならびにその定量（図１２Ｂ）。
【図１３】正常網膜および損傷網膜のライセートからの抗ＴｒｋＢ、抗ＬＩＮＧＯ−１、および抗対照タンパク質による免疫沈降物におけるＬＩＮＧＯ−１のウエスタンブロット（図１３Ａ）。網膜切片におけるＬＩＮＧＯ−１およびホスホＴｒｋＢの免疫染色（図１３Ｂ）。
【図１４】正常眼およびＰＢＳ、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ、または１Ａ７で処置した損傷眼におけるホスホＴｒｋＢおよびトータルＴｒｋＢのウエスタンブロットならびにその定量（図１４Ａ）。正常眼、およびＢＤＮＦ、ＢＤＮＦとＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ、またはＢＤＮＦと１Ａ７で処置した損傷眼におけるホスホＴｒｋＢおよびトータルＴｒｋＢのウエスタンブロット（図１４Ｂ）。
【図１５】正常眼およびＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ処置ありまたは処置なしの損傷眼におけるホスホＡｋｔおよびトータルＡｋｔのウエスタンブロッドならびにその定量。
【図１６】網膜切片におけるｐＡｋｔ免疫染色。
【図１７】ＰＢＳ、ＬＹ２９４００２（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の阻害剤）、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ、またはＬＹ２９４００２とＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃで処置した損傷眼におけるＲＧＣの数（図１７Ａ）および密度（図１７Ｂ）の定量。
【図１８】ＬＩＮＧＯ−１−ＦｃとＬＹ２９４００２またはＬＹ２９４００２単独で処置した動物の左眼（正常）および右目（損傷）における眼圧の測定。
【図１９】正常眼ならびにＰＢＳ、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ、および１Ａ７で処置した損傷眼におけるホスホＪＮＫ−２、ホスホＪＮＫ−１、トータルＪＮＫ−２、およびトータルＪＮＫ−１のウエスタンブロットならびにその定量。
【図２０】提案される分子機構を示す概略図。眼圧の上昇はＬＩＮＧＯ−１とＢＤＮＦ両方のレベルの増大を引き起こす。ＢＤＮＦはＴｒｋＢのリン酸化および細胞生存シグナル伝達経路の活性化を促進するが、ＬＩＮＧＯ−１はこの活性を阻害する。ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト（例えば、１Ａ７またはＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ）は、ＢＤＮＦシグナル伝達に応答したＴｒｋＢリン酸化を妨げるＬＩＮＧＯ−１の能力に干渉することによって細胞生存を促進する。
【図２１】正常眼およびＰＢＳまたはＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃで処置した損傷眼におけるＧＴＰ−ＲｈｏＡおよびトータルＲｈｏＡのウエスタンブロットならびにその定量。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。不一致がある場合、定義を含む本出願が優先する。文脈上別途要求されない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書で言及される全ての出版物、特許、およびその他の参考文献は、あたかも各々の個々の出版物または特許出願が参照により組み入れられることが具体的かつ個別的に示されているかのように全ての目的のためにその全体が参照により組み入れられる。
【００２７】
本明細書で記載される方法および材料と同様または同等の方法および材料を本発明の実施または試行で使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。材料、方法、および実施例は、実例であるに過ぎず、限定的であることが意図されない。本発明のその他の特色および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明白である。
【００２８】
本発明をさらに定義するために、以下の用語および定義を提供する。
【００２９】
用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」実体は、１つ以上のその実体を指すということに留意すべきである。例えば、「１つの免疫グロブリン分子」は、１つ以上の免疫グロブリン分子を表すと理解される。そのようなものとして、用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つ以上の」、および「少なくとも１つの」は、本明細書で互換的に使用することができる。
【００３０】
本明細書および特許請求の範囲の全体を通じて、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、任意の列挙された整数または整数の群を含むことを示すが、任意のその他の整数または整数の群を除外することは示さない。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、包括的であるかまたは制限がなく、追加の、列挙されていない要素または方法工程を除外しない。語句「本質的に〜からなる」は、指定の材料または工程、ならびに請求された発明の基本的な特徴および新規な特徴に大きく影響を与えない材料または工程を含むことを示す。本明細書で使用される場合、用語「〜からなる」は、示された材料または方法工程のみを指す。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「治療的有効量」とは、所望の治療結果を達成するのに必要な投薬量および必要な期間で、有効な量を指す。治療結果は、例えば、症状の軽減、生存の延長、運動性の向上などであり得る。治療結果は、「治癒」である必要はない。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾患の症状を改善または軽減させるために動物に薬剤を投与することを指す。さらに、用語「処置」または「処置する」は、疾患の進行を防ぐために動物に薬剤を投与することを指す。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「予防的有効量」とは、所望の予防結果を達成するのに必要な投薬量および必要な期間で、有効な量を指す。典型的には、疾患前または疾患の早期段階では、予防用量が対象に使用されるので、予防的有効量は、治療的有効量よりも少ない。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」は、全長ｃＤＮＡ配列の核酸配列を含有することができ、非翻訳５’配列および３’配列、コード領域、またはならびにこの核酸配列の断片もしくは変異体を含んでもよい。ポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成されることができ、無修飾のＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子（一本鎖、または、より典型的には二本鎖、もしくは一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であり得る）から構成されることができる。さらに、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域から構成されることができる。ポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾塩基または安定性のためにもしくはその他の理由のために修飾されたＤＮＡ骨格もしくはＲＮＡ骨格も含んでもよい。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化塩基および非正規塩基（例えば、イノシン）が挙げられる。種々の修飾が、ＤＮＡおよびＲＮＡに対してなされ得る。したがって、「ポリヌクレオチド」は、化学修飾、酵素修飾、または代謝修飾された形態を包含する。
【００３５】
本発明において、「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合によって互いに接続されたアミノ酸、すなわち、ペプチド同配体から構成されることができ、遺伝子にコードされた２０個のアミノ酸以外のアミノ酸（例えば、非天然アミノ酸）を含んでもよい。本発明を説明するのに使用される場合、用語「ペプチド」および「ポリペプチド」は、互換的に使用されてもよい。本発明のポリペプチドは、自然なプロセス（例えば、翻訳後処理）か、または当技術分野で周知である化学修飾技術のいずれかによって修飾されてもよい。このような修飾は、基礎的な教科書およびより詳細な論文、ならびに大量の研究文献に十分記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含む、ポリペプチドのいかなる場所でも生じることができる。同じ種類の修飾が、所与のポリペプチドのいくつかの部位に同じ程度または異なる程度で存在し得るということが理解されよう。また、所与のポリペプチドは、多種類の修飾を含んでもよい。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として、分岐状であってもよく、分岐の有無にかかわらず、環状であってもよい。環状、分岐状、および分岐環状のポリペプチドは、翻訳後の自然なプロセスから結果として得られてもよく、または合成法によって作製されてもよい。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質への転移ＲＮＡ媒介型のアミノ酸付加（例えば、アルギニン化）、およびユビキチン化が挙げられる。（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  −  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  第２版，  Ｔ．Ｅ．  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｂ．Ｃ．  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  編，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １−１２頁  （１９８３）；  Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−６４６（１９９０）；  Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと。）
本発明のＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストまたはＴｒｋＢアゴニストに言及する場合、用語「断片」、「変異体」、「誘導体」、および「類似体」は、ＬＩＮＧＯ−１活性を阻害するかまたはＴｒｋＢ活性を促進する少なくともいくらかの能力を保持する任意のアンタゴニスト分子またはアゴニスト分子を含む。ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストまたはＴｒｋＢアゴニストがなおその機能を果たす限り、本明細書に記載されるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストおよびＴｒｋＢアゴニストには、断片、変異体、または誘導体分子がその中に含まれてもよいが、これらに限定されるわけではない。本発明のＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドまたはＴｒｋＢアゴニストポリペプチドには、ＬＩＮＧＯ−１またはＴｒｋＢアゴニストのタンパク質分解性断片、欠失断片、および特に、動物に送達されたときに作用の部位により容易に到達する断片が含まれてもよい。ポリペプチド断片には、ネイティブポリペプチドの抗原性または免疫原性エピトープ（線状および三次元エピトープを含む）を含むポリペプチドの任意の部分がさらに含まれる。本発明のＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドまたはＴｒｋＢアゴニストポリペプチドは、変異体ＬＩＮＧＯ−１またはＴｒｋＢアゴニスト領域（上記のような断片を含む）、またアミノ酸の置換、欠失、または挿入のために改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。アレル変異体などの変異体は自然に生じてもよい。「アレル変異体」によって、生物の染色体上の所与の遺伝子座を占める別形態の遺伝子が意図される。Ｇｅｎｅｓ  ＩＩ，  Ｌｅｗｉｎ，  Ｂ．，  編，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８５）。非天然の変異体が、当業者に公知の突然変異導入技術を用いて産生され得る。ＬＩＮＧＯ−１またはＴｒｋＢアゴニストポリペプチドは、保存的もしくは非保存的なアミノ酸の置換、欠失、または付加を含んでもよい。本発明のＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストまたはＴｒｋＢアゴニストには、誘導体分子も含まれてよい。例えば、本発明のＬＩＮＧＯ−１またはＴｒｋＢアゴニストポリペプチドには、ネイティブポリペプチドには見られない付加的な特色を示すように改変されたＬＩＮＧＯ−１またはＴｒｋＢアゴニスト領域が含まれてもよい。例として、融合タンパク質およびタンパク質結合体が挙げられる。
【００３６】
本発明において、「ポリペプチド断片」とは、ＬＩＮＧＯ−１またはＴｒｋＢアゴニストポリペプチドの短いアミノ酸配列を指す。タンパク質断片は、「独立している」か、またはこの断片がその一部もしくは領域を形成するより大きいポリペプチドの中に含まれていてもよい。本発明のポリペプチド断片の代表例としては、例えば、約５アミノ酸長、約１０アミノ酸長、約１５アミノ酸長、約２０アミノ酸長、約３０アミノ酸長、約４０アミノ酸長、約５０アミノ酸長、約６０アミノ酸長、約７０アミノ酸長、約８０アミノ酸長、約９０アミノ酸長、および約１００アミノ酸長以上を含む断片が挙げられる。
【００３７】
ある実施形態において、本明細書に開示される方法で使用されるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストまたはＴｒｋＢアゴニストは、「抗体」分子もしくは「免疫グロブリン」分子、またはそれらの免疫特異性断片であって、例えば、天然の抗体もしくは免疫グロブリン分子、または抗体分子と同様の様式で抗原に結合する改変抗体分子もしくは断片である。用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、本明細書で互換的に使用される。さらに、本発明の方法で使用される免疫グロブリン分子は、「免疫特異的」分子または「抗原特異的」分子または「抗原結合性」分子とも記載され、抗体分子およびその断片を指すよう互換的に使用される。抗体または免疫グロブリンは、少なくとも重鎖の可変ドメインを含み、通常は、少なくとも重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む。脊椎動物系の基本的な免疫グロブリン構造は、比較的よく理解されている。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  第２版  １９８８）を参照されたい。
【００３８】
以下でより詳細に議論されるように、用語「免疫グロブリン」は、生化学的に区別することができる５つの広範なクラスのポリペプチドを含む。５つのクラスは全て、明確に本発明の範囲内であり、以下の議論は、一般に、ＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子に対するものである。ＩｇＧに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量約２３，０００ダルトンの２つの同一な軽鎖ポリペプチド、および分子量５３，０００〜７０，０００の２つの同一な重鎖ポリペプチドを含む。４つの鎖は、典型的には、「Ｙ」字の形状でジスルフィド結合により接続されており、そこでは、軽鎖が重鎖を腕木として支え（ｂｒａｃｋｅｔ）、それが「Ｙ」字の口の部分から始まって可変領域を通して続いている。
【００３９】
軽鎖と重鎖はともに、構造的および機能的に相同な領域に分けられる。用語「定常」および「可変」は、機能に関して用いられる。この点について、軽（ＶＬ）鎖部分と重（ＶＨ）鎖部分の両方の可変ドメインが抗原認識および抗原特異性を決定するということが理解されよう。逆に、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３）は、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などのような重要な生物学的特性を付与する。慣例により、定常領域ドメインの付番は、抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠くなるにつれて増大する。Ｎ末端部分は可変領域であり、Ｃ末端部分に定常領域がある。ＣＨ３ドメインおよびＣＬドメインは実際に、それぞれ、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含む。
【００４０】
軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかとして分類される。各重鎖のクラスは、κ軽鎖またはλ軽鎖のいずれかと結合し得る。通常、免疫グロブリンが、ハイブリドーマ、Ｂ細胞、または遺伝子改変宿主細胞のいずれかで産生されるときに、軽鎖と重鎖は互いに共有結合し、２つの重鎖の「尾」部は、共有結合的なジスルフィド結合または非共有結合によって互いに結合する。重鎖において、アミノ酸配列は、Ｙ字形の二股の端のＮ末端から各鎖の最後尾のＣ末端まで続いている。重鎖が、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として分類され、それらの中にいくつかのサブクラス（例えば、γ１〜γ４）があるということを当業者は理解するであろう。抗体の「クラス」をそれぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥと決定するのは、この鎖の性質である。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１など）は、十分に特徴解析されており、機能特化を付与することが知られている。これらのクラスおよびアイソタイプの各々の修飾バージョンは、本開示を考慮すれば当業者に容易に識別され、したがって、本発明の範囲内である。
【００４１】
上で示されているように、可変領域は、抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識し、このエピトープに特異的に結合するのを可能にする。すなわち、抗体のＶＬドメインとＶＨドメインが組み合わさって、三次元の抗原結合部位を規定する可変領域が形成される。この４つの部分からなる抗体構造により、Ｙ字の各腕の端に存在する抗原結合部位が形成される。より具体的には、抗原結合部位は、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖の各々の上の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって規定される。いくつかの例（例えば、ラクダ科の種に由来するかまたはラクダ科の免疫グロブリンを基にして改変されたある種の免疫グロブリン分子）において、完全な免疫グロブリン分子が軽鎖を有さず、重鎖のみからなる場合がある。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８  （１９９３）を参照されたい。
【００４２】
天然抗体において、各抗原結合ドメインに存在する６つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、抗体が水性環境で３次元の立体配置を取るときに抗原結合ドメインを形成するよう特異的に位置付けられる、短い、非連続的なアミノ酸配列である。抗原結合ドメインの残りのアミノ酸（「フレームワーク」領域と呼ばれる）は、分子間変動性をあまり示さない。フレームワーク領域は、主としてβ−シート立体構造を取り、ＣＤＲは、β−シート構造に接続し、時には、β−シート構造の一部を形成するループを形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合的な相互作用によってＣＤＲを正しい向きに位置付ける骨格を形成するように作用する。位置付けられたＣＤＲによって形成される抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を規定する。この相補的表面は、抗体がそのコグネートなエピトープに非共有結合するのを促進する。正確に規定されているので、ＣＤＲおよびフレームワーク領域を含むアミノ酸は、それぞれ、任意の所与の重鎖または軽鎖の可変領域について、当業者により容易に同定されることができる（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，  Ｋａｂａｔ，  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  （１９８３）；およびＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９６：９０１−９１１  （１９８７）を参照されたく、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。
【００４３】
しかしながら、ラクダ科の種では、ＶＨＨと呼ばれる重鎖可変領域が完全なＣＤＲを形成する。ラクダ科のＶＨＨ可変領域と従来抗体（ＶＨ）由来の可変領域の間の主な相違としては、（ａ）ＶＨＨの対応する領域と比較して、ＶＨの軽鎖接触表面のアミノ酸がより疎水性であること、（ｂ）ＶＨＨのＣＤＲ３がより長いこと、および（ｃ）ＶＨＨのＣＤＲ１とＣＤＲ３の間のジスルフィド結合が高い頻度で出現することが挙げられる。
【００４４】
１つの実施形態において、本発明の方法で使用される抗原結合分子は、抗体分子の少なくとも１つの重鎖または軽鎖ＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の方法で使用される抗原結合分子は、１つ以上の抗体分子由来の少なくとも２つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の方法で使用される抗原結合分子は、１つ以上の抗体分子由来の少なくとも３つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の方法で使用される抗原結合分子は、１つ以上の抗体分子由来の少なくとも４つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の方法で使用される抗原結合分子は、１つ以上の抗体分子由来の少なくとも５つのＣＤＲを含む。別の実施形態において、本発明の方法で使用される抗原結合分子は、１つ以上の抗体分子由来の少なくとも６つのＣＤＲを含む。本抗原結合分子に含めることができる少なくとも１つのＣＤＲを含む例示的な抗体分子は、当技術分野で公知であり、例示的な分子が本明細書に記載されている。
【００４５】
本発明の方法で使用される抗体またはその免疫特異性断片としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２）、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬドメインまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生された断片、ならびに抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書に開示される結合分子に対する抗Ｉｄ抗体を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。ｓｃＦｖ分子は当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。本発明の免疫グロブリン分子または抗体分子は、任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスの免疫グロブリン分子であることができる。
【００４６】
抗体断片（単鎖抗体を含む）は、単独でまたは以下のもの：ヒンジ領域、重鎖のＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、もしくは軽鎖のＣＬの全体もしくは一部と組み合わせて、可変領域を含んでもよい。可変領域とヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、もしくはＣＨ３ドメイン、またはＣＬドメインとの任意の組み合わせをも含む抗原結合断片もまた、本発明に含まれる。本明細書に開示される方法で使用される抗体またはその免疫特異的断片は、鳥類および哺乳動物を含む任意の動物起源に由来するものであってもよい。抗体は、ヒト抗体、マウス抗体、ロバ抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、モルモット抗体、ラクダ抗体、ラマ抗体、ウマ抗体、またはニワトリ抗体であることができる。別の実施形態において、可変領域は、コンドリクトイド（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）起源（例えば、サメ由来）であってもよい。本明細書で使用される場合、「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体または１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックであり以下、および例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによって米国特許第５，９３９，５９８号に記載されているように、内因性の免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体が含まれる。このような抗体には、１つ以上のアミノ酸置換を含む変異体も含まれる。
【００４７】
本明細書で使用される場合、用語「重鎖部分」には、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列が含まれる。重鎖部分を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中央部、および／もしくは下部のヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはそれらの変異体もしくは断片の少なくとも１つが含まれる。例えば、重鎖部分は、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖、または、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含んでもよい。また、重鎖部分には、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含むポリペプチドが含まれてもよい。さらに、本発明で使用される結合ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（例えば、ＣＨ２ドメインの全体または一部）を欠いていてもよい。上で示されているように、これらのドメイン（例えば、重鎖部分）を、天然に存在する免疫グロブリン分子とはアミノ酸配列が異なるように修飾し得るということが当業者によって理解されるであろう。
【００４８】
本明細書に開示される方法で使用されるある種のＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはその免疫特異的断片、またはＴｒｋＢアゴニスト抗体もしくはその免疫特異的断片において、多量体の１つのポリペプチド鎖の重鎖部分は、多量体の第２のポリペプチド鎖上の重鎖部分と同一である。あるいは、本発明の方法で使用される重鎖部分を含む単量体は同一ではない。例えば、各々の単量体が異なる標的結合部位を含み、例えば、二重特異性抗体を形成してもよい。
【００４９】
本明細書に開示される方法で使用される結合ポリペプチドの重鎖部分は、異なる免疫グロブリン分子に由来してもよい。例えば、ポリペプチドの重鎖部分は、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ１ドメインとＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域とを含んでもよい。別の例において、重鎖部分は、一部ＩｇＧ１分子に由来し、一部ＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含むことができる。別の例においては、重鎖部分は、一部ＩｇＧ１分子に由来し、一部ＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジを含むことができる。
【００５０】
本明細書で使用される場合、用語「軽鎖部分」には、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列が含まれる。軽鎖部分は、ＶＬドメインまたはＣＬドメインの少なくとも１つを含むことができる。
【００５１】
免疫グロブリンに由来するポリペプチド（例えば、免疫グロブリンの重鎖部分または軽鎖部分）の非天然の変異体をコードする単離された核酸分子は、１つ以上のアミノ酸の置換、付加、または欠失が、コードされるタンパク質に導入されるように、免疫グロブリンのヌクレオチド配列の中に１つ以上のヌクレオチドの置換、付加、または欠失を導入することによって作り出すことができる。突然変異を標準的な技術（例えば、部位特異的な突然変異導入およびＰＣＲを介する突然変異導入）によって導入してもよい。保存的なアミノ酸置換を、１つ以上の非必須アミノ酸残基で行なうことができる。
【００５２】
また、本明細書に開示される方法で使用される抗体またはその免疫特異的断片は、本発明のポリペプチドに対するそれらの結合親和性に関して記載または特定される場合がある。いくつかの実施形態において、結合親和性は、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有する結合親和性である。
【００５３】
本明細書に開示される方法で使用される抗体またはその免疫特異的断片は、本明細書に記載されるようなＬＩＮＧＯ−１のアンタゴニストまたはＴｒｋＢのアゴニストとして作用する。例えば、本発明の方法で使用される抗体は、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの抑制的活性を阻止もしくは阻害するアンタゴニストとして、またはＴｒｋＢの活性を促進するアゴニストとして機能し得る。
【００５４】
本明細書で使用される場合、用語「キメラ抗体」は、免疫反応性の領域または部位が第１の種から得られるかまたは第１の種に由来し、定常領域（インタクトであるか、部分的であるか、または本発明に従って修飾されたものであり得る）が第２の種から得られる、任意の抗体を意味するように適用される。ある実施形態において、標的結合領域または標的結合部位は、非ヒト源（例えば、マウスまたは霊長類）由来であり、定常領域はヒトのものである。
【００５５】
本明細書で使用される場合、用語「改変抗体」は、重鎖もしくは軽鎖のいずれか、またはその両方の可変ドメインが、公知の特異性の抗体に由来する１つ以上のＣＤＲの少なくとも部分的な置き換えによって改変されており、必要である場合には、部分的なフレームワーク領域の置き換えおよび配列の変化によって改変されている抗体を指す。ＣＤＲは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラスまたはさらには同じサブクラスの抗体に由来し得るが、ＣＤＲが、異なるクラスの抗体または異なる種由来の抗体に由来することが想定される。公知の特異性の非ヒト抗体に由来する１つ以上の「ドナー」ＣＤＲが、ヒトの重鎖または軽鎖のフレームワーク領域に接合されている改変抗体を、本明細書では「ヒト化抗体」と呼ぶ。１つの可変ドメインの抗原結合能を別のものに移すために、ＣＤＲの全てをドナー可変領域由来の完全なＣＤＲと置き換えることが、必ずしも必要ではない場合がある。むしろ、標的結合部位の活性を維持するために必要である残基を移すことだけが必要である場合がある。例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、および同第６，１８０，３７０号に示されている説明を前提とすると、日常的な実験を行なうことによるか、または試行錯誤の試験によるかのいずれかによって、機能的な改変抗体またはヒト化抗体を得ることは、十分に当業者の能力の範囲内であろう。
【００５６】
本明細書で使用される場合、用語「連結された」、「融合された」、または「融合」は、互換的に使用される。これらの用語は、化学的結合または組換え手段を含む何らかの手段によって、さらに２つの要素または成分を１つに接続することを指す。「インフレームでの融合」とは、もとのＯＲＦの正確なリーディングフレームを維持する形で、２つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を接続して、連続するより長いＯＲＦを形成させることを指す。したがって、得られる組換え融合タンパク質は、もとのＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する２つ以上のセグメントを含む単一のタンパク質である（これらのセグメントは、通常、天然ではそのように接続されていない）。したがって、リーディングフレームは、融合されたセグメント全体にわたって連続させられるが、セグメントは、例えば、インフレームのリンカー配列によって、物理的または空間的に分離させ得る。
【００５７】
ポリペプチドの文脈において、「線状配列」または「配列」とは、アミノ末端からカルボキシル末端への方向のポリペプチド中のアミノ酸の順序であり、この場合、配列中で互いに隣接する残基が、ポリペプチドの一次構造において連続している。
【００５８】
本明細書で使用される場合の用語「発現」は、ＤＮＡ配列が、生化学物質（例えば、ＲＮＡまたはポリペプチド）を産生するために使用されるプロセスを指す。このプロセスには、遺伝子ノックダウン、および一過性発現と安定発現の両方を含むが、これらに限定されない、細胞内の遺伝子の機能的存在の任意の発現が含まれる。これには、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または任意のその他のＲＮＡ産物への転写、およびそのようなｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳が含まれるが、これらに限定されない。最終的な所望産物が生化学物質である場合、発現には、その生化学物質および任意の前駆体の生成が含まれる。
【００５９】
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」によって、診断、予後診断、または治療が所望される任意の対象、特に、哺乳動物対象が意味される。哺乳動物対象としては、ヒト、家畜動物、飼育動物、動物園の動物、競技用動物、愛玩動物（例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ウサギ、ラット、マウス）；霊長類（例えば、類人猿、サル、オランウータン、およびチンパンジー）；イヌ科（例えば、キツネおよびオオカミ）；ネコ科（例えば、ライオン、およびトラ）；ウマ科（例えば、ウマ、ロバ、およびシマウマ）；食用動物（例えば、ウシ、ブタ、およびヒツジ）；有蹄動物（例えば、シカおよびキリン）；クマなどが挙げられるが、これらに限定はされない。ある実施形態において、哺乳動物はヒト対象である。
【００６０】
用語「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」は、ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現のサイレンシングまたは減少を指す。これは、その二重鎖領域がサイレンシングされる遺伝子の配列と相同であるｓｉＲＮＡによって開始される、動物および植物における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスである。遺伝子は、生物にとって内因性であっても、または外因性であってもよく、染色体に組み込まれて存在していても、またはゲノムに組み込まれないトランスフェクションベクター中に存在していてもよい。遺伝子の発現は、完全に阻害されるか、または部分的に阻害されるかのいずれかである。また、ＲＮＡｉが標的ＲＮＡの機能を阻害すると考えてもよい。標的ＲＮＡの機能は、完全なものであっても、または部分的なものであってもよい。
【００６１】
ＬＩＮＧＯ−１（Ｓｐ３５／ＬＲＲＮ６）
天然のヒトＬＩＮＧＯ−１は、６１４アミノ酸（配列番号：２）からなるグリコシル化された神経系特異的タンパク質である。ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドは、１４個のロイシンリッチリピート（Ｎ末端およびＣ末端のキャップを含む）からなるＬＲＲドメイン、Ｉｇドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含む。細胞質ドメインは、カノニカルなチロシンリン酸化部位を含む。さらに、天然のＬＩＮＧＯ−１タンパク質は、シグナル配列、ＬＲＲＣＴドメインとＩｇドメインの間の短い塩基性領域、およびＩｇドメインと細胞質ドメインの間の膜貫通ドメインを含む。ヒトＬＩＮＧＯ−１遺伝子は、ほかに取り得る翻訳開始コドンを含み、そのため、６つの付加的なアミノ酸（ＭＱＶＳＫＲ；配列番号：７）がＬＩＮＧＯ−１シグナル配列のＮ末端に存在する場合も、または存在しない場合もある。表１に、配列番号：２の配列を基に、アミノ酸残基の番号に従って、ＬＩＮＧＯ−１のドメインおよびその他の領域を記載する。当業者が理解するように、以下に記載されたドメインの最初と最後の残基は、ドメインを決定するのに使用されるコンピュータモデリングプログラムまたは方法によって異なり得る。ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドは、ＰＣＴ公開ＷＯ  ２００４／０８５６４８号および米国公開出願第２００６／０００９３８８  Ａ１号でより詳細に特徴解析されており、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００６２】
【表１】
0005674469.tif 000002
ＬＩＮＧＯ−１の組織分布および発生段階での発現はヒトおよびラットで研究されている。ＬＩＮＧＯ−１の生物学は、実験動物（ラット）モデルで研究されている。ノーザンブロットおよび免疫組織化学的染色によって決定されるように、ラットＬＩＮＧＯ−１の発現は、神経系ニューロンおよび脳のオリゴデンドロサイトに局在する。ラットＬＩＮＧＯ−１  ｍＲＮＡ発現のレベルは、発生的に調節されており、生後すぐに、すなわち、出生後約１日で最大になる。ラットの脊髄切断損傷モデルにおいて、ＲＴ−ＰＣＲで決定されるように、ＬＩＮＧＯ−１は損傷部位で上方調節されている。さらに、ＬＩＮＧＯ−１は、Ｎｏｇｏ６６受容体（Ｎｏｇｏ受容体）と相互作用することが示されている。例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００８３２号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００４／０８５６４号を参照されたい。
【００６３】
ＬＩＮＧＯ−１は、Ｎｏｇｏ受容体−１−ｐ７５−Ｔａｊニューロトロフィン受容体複合体のさらなる構成成分である。Ｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ７：２２１−２２８  （２００４）を参照されたく、これは参照により本明細書に組み入れられる。Ｎｏｇｏ受容体１とは異なり、ＬＩＮＧＯ−１遺伝子発現は、脊髄の成体神経細胞が外傷性損傷にさらされたときに増大し、ＬＩＮＧＯ−１がＣＮＳの神経学的機能にとって重要な生物学的役割を有することを示唆している（同上）。
【００６４】
全長ヒトＬＩＮＧＯ−１分子のヌクレオチド配列は以下の通りである。
【００６５】
【数１】
0005674469.tif 000003
全長ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのポリペプチド配列は以下の通りである。
【００６６】
【数２】
0005674469.tif 000004
【００６７】
【数３】
0005674469.tif 000005
ＴｒｋＢ（ＮＴＲＫ２）
ニューロトロフィンは、ニューロンの分化、生存、および機能に関与する小さいファミリーの高度に相同な成長因子である。哺乳動物において、公知のニューロトロフィンは、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）（ＮＴ−４／５またはＮＴ−５としても知られている）、ニューロトロフィン−６（ＮＴ−６）、およびニューロトロフィン−７（ＮＴ−７）である（Ｂａｒｂａｃｉｄ，  Ｊ．  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．  ２５：１３８６−１４０３  （１９９４）およびＮｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  ４２４：２８５−２９０  （１９９８））。ニューロトロフィンは、２つの受容体タイプ、すなわち、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）と、Ｔｒｋ受容体ファミリーのチロシンキナーゼの３つの（哺乳動物の）メンバー（ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、およびＴｒｋＣ）に結合する。Ｔｒｋ受容体細胞外ドメインへのニューロトロフィンの結合は、シグナル伝達経路を開始させる。ニューロトロフィンの結合は、受容体の二量体化および自己リン酸化を引き起こす。ＴｒｋＢの自己リン酸化は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）、ホスホリパーゼＣ−γ（ＰＬＣ−γ）、およびホスファチジルイノシトール−３キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）を含む、シグナル伝達経路の活性化を引き起こす（Ｙａｍａｄａ，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｓｃｉ．  ９１：２６７−２７０  （２００３））。
【００６８】
以下のヌクレオチド配列は、ヒトＴｒｋＢ受容体のｍＲＮＡとして報告されたものであり、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿００６１８０である。
【００６９】
【数４】
0005674469.tif 000006
【００７０】
【数５】
0005674469.tif 000007
【００７１】
【数６】
0005674469.tif 000008
以下のポリペプチド配列は、ヒトＴｒｋＢポリペプチド配列（配列番号：３のヌクレオチド９３９−３４５５によってコードされている）として報告されたものであり、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ＿００６１７１を有する。
【００７２】
【数７】
0005674469.tif 000009
以下のヌクレオチド配列は、ラットＴｒｋＢ受容体のｍＲＮＡとして報告されたものであり、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿０１２７３１である。
【００７３】
【数８】
0005674469.tif 000010
【００７４】
【数９】
0005674469.tif 000011
【００７５】
【数１０】
0005674469.tif 000012
以下のポリペプチド配列は、ラットＴｒｋＢポリペプチド配列（配列番号：５のヌクレオチド６６５−３１３０によってコードされている）として報告されたものであり、Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ＿０３６８６３を有する。
【００７６】
【数１１】
0005674469.tif 000013
表２に、配列番号：４を基に、アミノ酸残基の番号に従って、ＴｒｋＢのドメインおよびその他の領域を記載する。当業者が理解するように、以下に記載されたドメインの最初と最後の残基は、ドメインを決定するのに使用されるコンピュータモデリングプログラムまたは方法によって異なり得る。
【００７７】
【表２】
0005674469.tif 000014
ＬＩＮＧＯ−１のアンタゴニストを用いる方法
本発明の１つの実施形態は、細胞内のＬＩＮＧＯ−１とＴｒｋＢの相互作用を阻害する方法であって、ＬＩＮＧＯ−１とＴｒｋＢとを共発現する細胞をＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストと接触させる工程を含む方法を提供する。本発明の目的のためのＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストは、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１抗体、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリヌクレオチド、ＬＩＮＧＯ−１アプタマー、または２つ以上のＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストの組み合わせであってもよい。
【００７８】
本発明のさらなる実施形態には、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストの非存在下でのＴｒｋＢリン酸化のレベルと比べて、細胞内のＴｒｋＢリン酸化を促進する方法であって、ＬＩＮＧＯ−１とＴｒｋＢとを共発現する細胞をＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストと接触させる工程を含む方法が含まれる。同様に、本発明は、ＴｒｋＢシグナル伝達を促進する方法であって、ＬＩＮＧＯ−１とＴｒｋＢとを共発現する細胞をＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストと接触させる工程を含む方法も提供する。本発明には、ＴｒｋＢリン酸化を促進する方法であって、ＣＮＳニューロンをＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストと接触させる工程を含む方法も含まれる。
【００７９】
本発明のさらなる実施形態には、細胞内のＪＮＫリン酸化を阻害する方法であって、ＬＩＮＧＯ−１とＪＮＫとを共発現する細胞をＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストと接触させる工程を含む方法、およびＪＮＫ経路のシグナル伝達を阻害する方法であって、ＬＩＮＧＯ−１とＪＮＫとを共発現する細胞をＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストと接触させる工程を含む方法が含まれる。本発明による、ＪＮＫリン酸化の阻害には、ＪＮＫ−１リン酸化の阻害、ＪＮＫ−２リン酸化の阻害、またはＪＮＫ−１およびＪＮＫ−２のリン酸化の阻害が含まれる。本発明による、ＪＮＫリン酸化の阻害には、リン酸化ＪＮＫタンパク質の全体量を減少させること、またはＪＮＫタンパク質がリン酸化されたままの時間の長さを減少させることが含まれ得る。本発明には、ＪＮＫリン酸化を阻害する方法であって、ＣＮＳニューロンをＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストと接触させる工程を含む方法も含まれる。
【００８０】
本発明のさらなる実施形態は、圧力誘導性の眼神経障害の兆候または症状を示す哺乳動物の網膜神経節細胞の生存を促進する方法であって、そのような処置を必要とする哺乳動物に有効量のＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストおよび担体を投与する工程を含む方法を提供する。１つの実施形態において、該圧力誘導性の眼神経障害は、緑内障である。
【００８１】
ＬＩＮＧＯ−１のアンタゴニストおよびＴｒｋＢアゴニストを用いる方法
本発明のいくつかの方法において、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストとＴｒｋＢアゴニストの両方が使用される。例えば、本発明の１つの実施形態には、死の危険にさらされているニューロンの生存を促進する方法であって、該ニューロンを有効量のＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストとＴｒｋＢアゴニストの組み合わせと接触させる工程を含む方法が含まれる。ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストとＴｒｋＢアゴニストの両方が使用される本発明の実施形態において、用語「有効量」は、所望の結果をもたらすのに十分であるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストとＴｒｋＢアゴニストの組み合わせの量を指す。いくつかの例において、所望の効果をもたらすのに必要とされるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストの量は、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストが単独で使用されるときの方が、ＴｒｋＢアゴニストと組み合わせて使用されるときよりも多い場合がある。同様に、いくつかの例において、所望の効果をもたらすのに必要とされるＴｒｋＢアゴニストの量は、ＴｒｋＢアゴニストが単独で使用されるときの方が、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストと組み合わせて使用されるときよりも多い場合がある。
【００８２】
本発明の別の実施形態は、ニューロンの細胞死と関連する疾患または障害を処置する方法であって、そのような処置を必要とする動物に有効量のＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストとＴｒｋＢアゴニストの組み合わせを投与する工程を含む方法を提供する。いくつかの特定の実施形態において、疾患または障害は、圧力誘導性の視神経障害であることができる。本発明のさらなる実施形態には、ニューロンの細胞死を伴う状態の兆候または症状を示す哺乳動物のＣＮＳニューロンの再生または生存を促進する方法であって、該哺乳動物に有効量のＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストとＴｒｋＢアゴニストの組み合わせを投与する工程を含む方法が含まれる。本発明のいくつかの実施形態において、該疾患または障害は、ＡＬＳ、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、糖尿病性神経障害、脳卒中、または聴力損失である。別の特定の実施形態において、該ＣＮＳニューロンは、網膜神経節または有毛細胞などの感覚ニューロンである。
【００８３】
ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストとＴｒｋＢアゴニストの組み合わせの使用を含む本発明の実施形態において、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストとＴｒｋＢアゴニストとを単一組成物として投与することができ、または別々に投与することができる。さらに、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストとＴｒｋＢアゴニストとを同時にまたは連続的に投与することができる。
【００８４】
ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト化合物およびＴｒｋＢアゴニスト化合物
本発明の方法におけるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストには、アンタゴニスト化合物の非存在下でのＬＩＮＧＯ−１の活性と比較して、ＬＩＮＧＯ−１の活性を阻害するかまたは減少させる任意の化学化合物または合成化合物が含まれる。
【００８５】
本発明の方法におけるＴｒｋＢアゴニストには、アゴニスト化合物の非存在下でのＴｒｋＢの状態と比較した場合に、ＴｒｋＢの活性を促進するかもしくは増大させるまたはＴｒｋＢのリン酸化を促進するかもしくは増大させる任意の化学化合物または合成化合物が含まれる。
【００８６】
ＴｒｋＢアゴニスト化合物には、神経栄養因子模倣体が含まれるが、これらに限定されない。ＴｒｋＢアゴニスト化合物には、Ｐｏｌｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｒｒ．  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇ−  ＣＮＳ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｌ．  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  １：５９−８０  （２００２）（これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）に概説されているような、Ｌ−７８３，２８１、アデノシン、ＣＧＳ  ２１６８０なども含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＴｒｋＢアゴニスト化合物は、ＴｒｋＢに選択的であり、ＴｒｋＡまたはＴｒｋＣを上回る程度にＴｒｋＢを活性化する。いくつかの実施形態において、ＴｒｋＢアゴニスト化合物は、ＴｒｋＢに特異的であり、ＴｒｋＡまたはＴｒｋＣを活性化しない。さらに、ＴｒｋＢアゴニスト化合物は、ニューロトロフィンの極めて重要な領域を模倣する小分子であることもできる。例えば、該小分子は、ＢＤＮＦのβ−ターンループの模倣体であることができる。本発明に従って使用し得る小分子模倣体の特定の例は、米国公開出願第２００７／００６０５２６  Ａ１号に開示されており、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００８７】
当業者であれば、例えば、本明細書の他の場所に記載されているアッセイを用いてニューロンの生存を修飾する化合物をスクリーニングすることにより、本発明の方法で有用であるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト化合物およびＴｒｋＢアゴニスト化合物をスクリーニングし、試験する方法を知っているであろう。
【００８８】
可溶性ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドおよびＴｒｋＢアゴニストポリペプチド
可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド
本発明の方法で使用されるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストには、天然のＬＩＮＧＯ−１の生物学的機能を阻止するか、阻害するか、またはそれに干渉するポリペプチドが含まれる。具体的に、本発明の可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドには、可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの断片、変異体、または誘導体が含まれる。上記の表１に、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの様々なドメインが記載されている。可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドは、膜貫通ドメインを欠いており、典型的には、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの細胞内ドメインを欠いている。例えば、ある可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドは、ＬＩＮＧＯ−１の膜貫通ドメインを含むアミノ酸５５２〜５７６および／またはＬＩＮＧＯ−１の細胞内ドメインを含むアミノ酸５７７〜６１４を欠いている。さらに、ある可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドは、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのＬＲＲドメイン、Ｉｇドメイン、塩基性領域、および／または細胞内ドメイン全体（配列番号：２のアミノ酸３４〜５３２に対応する）を含む。当業者であれば理解するように、ＬＩＮＧＯ−１の細胞外ドメイン全体は、細胞外ドメインポリペプチドのＣ末端上またはＮ末端上のいずれかに付加的なまたはより少数のアミノ酸を含み得る。
【００８９】
このようなものとして、本発明の方法で使用される可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドには、配列番号：２のアミノ酸４１〜５２５；配列番号：２のアミノ酸４０〜５２６；配列番号：２のアミノ酸３９〜５２７；配列番号：２のアミノ酸３８〜５２８；配列番号：２のアミノ酸３７〜５２９；配列番号：２のアミノ酸３６〜５３０；配列番号：２のアミノ酸３５〜５３１；配列番号：２のアミノ酸３４〜５３１；配列番号：２のアミノ酸４６〜５２０；配列番号：２のアミノ酸４５〜５２１；配列番号：２のアミノ酸４４〜５２２；配列番号：２のアミノ酸４３〜５２３；および配列番号：２のアミノ酸４２〜５２４、もしくはこのようなポリペプチドの断片、変異体、もしくは誘導体を含むか、本質的に該ポリペプチドもしくは該ポリペプチドの断片、変異体、もしくは誘導体からなるか、または該ポリペプチドもしくは該ポリペプチドの断片、変異体、もしくは誘導体からなるＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドのアンタゴニストには、表１に記載されているようなドメインの任意の組み合わせが含まれてもよい。
【００９０】
本発明の方法で使用されるさらなる可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドには、配列番号：２のアミノ酸１〜３３；配列番号：２のアミノ酸１〜３５；配列番号：２のアミノ酸３４〜６４；配列番号：２のアミノ酸３６〜６４；配列番号：２のアミノ酸６６〜８９；配列番号：２のアミノ酸９０〜１１３；配列番号：２のアミノ酸１１４〜１３７；配列番号：２のアミノ酸１３８〜１６１；配列番号：２のアミノ酸１６２〜１８５；配列番号：２のアミノ酸１８６〜２０９；配列番号：２のアミノ酸２１０〜２３３；配列番号：２のアミノ酸２３４〜２５７；配列番号：２のアミノ酸２５８〜２８１；配列番号：２のアミノ酸２８２〜３０５；配列番号：２のアミノ酸３０６〜３２９；配列番号：２のアミノ酸３３０〜３５３；配列番号：２のアミノ酸３６３〜４１６；配列番号：２のアミノ酸４１７〜４２４；配列番号：２のアミノ酸４１９〜４９３；および配列番号：２のアミノ酸４９４〜５５１、もしくはこのようなポリペプチドの断片、変異体、もしくは誘導体を含むか、本質的に該ポリペプチドもしくは該ポリペプチドの断片、変異体、もしくは誘導体からなるか、または該ポリペプチドもしくは該ポリペプチドの断片、変異体、もしくは誘導体からなるＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００９１】
本発明の方法で使用されるさらなる可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドには、配列番号：２のアミノ酸１〜３３；配列番号：２のアミノ酸１〜３５；配列番号：２のアミノ酸１〜６４；配列番号：２のアミノ酸１〜８９；配列番号：２のアミノ酸１〜１１３；配列番号：２のアミノ酸１〜１３７；配列番号：２のアミノ酸１〜１６１；配列番号：２のアミノ酸１〜１８５；配列番号：２のアミノ酸１〜２０９；配列番号：２のアミノ酸１〜２３３；配列番号：２のアミノ酸１〜２５７；配列番号：２のアミノ酸１〜２８１；配列番号：２のアミノ酸１〜３０５；配列番号：２のアミノ酸１〜３２９；配列番号：２のアミノ酸１〜３５３；配列番号：２のアミノ酸１〜４１６；配列番号：２のアミノ酸１〜４２４；配列番号：２のアミノ酸１〜４９３；配列番号：２のアミノ酸１〜５５１；配列番号：２のアミノ酸１〜５３１；および配列番号：２のアミノ酸１〜５３２、もしくはこのようなポリペプチドの断片、変異体、もしくは誘導体を含むか、本質的に該ポリペプチドもしくは該ポリペプチドの断片、変異体、もしくは誘導体からなるか、または該ポリペプチドもしくは該ポリペプチドの断片、変異体、もしくは誘導体からなるＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００９２】
本発明の方法で使用されるまたさらなる可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドには、配列番号：２のアミノ酸３４〜６４；配列番号：２のアミノ酸３４〜８９；配列番号：２のアミノ酸３４〜１１３；配列番号：２のアミノ酸３４〜１３７；配列番号：２のアミノ酸３４〜１６１；配列番号：２のアミノ酸３４〜１８５；配列番号：２のアミノ酸３４〜２０９；配列番号：２のアミノ酸３４〜２３３；配列番号：２のアミノ酸３４〜２５７；配列番号：２のアミノ酸３４〜２８１；配列番号：２のアミノ酸３４〜３０５；配列番号：２のアミノ酸３４〜３２９；配列番号：２のアミノ酸３４〜３５３；配列番号：２のアミノ酸３４〜４１６；配列番号：２のアミノ酸３４〜４２４；配列番号：２のアミノ酸３４〜４９３；および配列番号：２のアミノ酸３４〜５５１、もしくはこのようなポリペプチドの断片、変異体、もしくは誘導体を含むか、本質的に該ポリペプチドもしくは該ポリペプチドの断片、変異体、もしくは誘導体からなるか、または該ポリペプチドもしくは該ポリペプチドの断片、変異体、もしくは誘導体からなるＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００９３】
本発明の方法で使用されるさらなる可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドには、配列番号：２のアミノ酸３４〜５３０；配列番号：２のアミノ酸３４〜５３１；配列番号：２のアミノ酸３４〜５３２；配列番号：２のアミノ酸３４〜５３３；配列番号：２のアミノ酸３４〜５３４；配列番号：２のアミノ酸３４〜５３５；配列番号：２のアミノ酸３４〜５３６；配列番号：２のアミノ酸３４〜５３７；配列番号：２のアミノ酸３４〜５３８；配列番号：２のアミノ酸３４〜５３９；配列番号：２のアミノ酸３０〜５３２；配列番号：２のアミノ酸３１〜５３２；配列番号：２のアミノ酸３２〜５３２；配列番号：２のアミノ酸３３〜５３２；配列番号：２のアミノ酸３４〜５３２；配列番号：２のアミノ酸３５〜５３２；配列番号：２のアミノ酸３６〜５３２；配列番号：２のアミノ酸３０〜５３１；配列番号：２のアミノ酸３１〜５３１；配列番号：２のアミノ酸３２〜５３１；配列番号：２のアミノ酸３３〜５３１；配列番号：２のアミノ酸３４〜５３１；配列番号：２のアミノ酸３５〜５３１；および配列番号：２のアミノ酸３６〜５３１、もしくはこのようなポリペプチドの断片、変異体、もしくは誘導体を含むか、本質的に該ポリペプチドもしくは該ポリペプチドの断片、変異体、もしくは誘導体からなるか、または該ポリペプチドもしくは該ポリペプチドの断片、変異体、もしくは誘導体からなるＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００９４】
本発明の方法で使用されるまたさらなる可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドには、配列番号：２のアミノ酸３６〜６４；配列番号：２のアミノ酸３６〜８９；配列番号：２のアミノ酸３６〜１１３；配列番号：２のアミノ酸３６〜１３７；配列番号：２のアミノ酸３６〜１６１；配列番号：２のアミノ酸３６〜１８５；配列番号：２のアミノ酸３６〜２０９；配列番号：２のアミノ酸３６〜２３３；配列番号：２のアミノ酸３６〜２５７；配列番号：２のアミノ酸３６〜２８１；配列番号：２のアミノ酸３６〜３０５；配列番号：２のアミノ酸３６〜３２９；配列番号：２のアミノ酸３６〜３５３；配列番号：２のアミノ酸３６〜４１６；配列番号：２のアミノ酸３６〜４２４；配列番号：２のアミノ酸３６〜４９３；および配列番号：２のアミノ酸３６〜５５１、もしくはこのようなポリペプチドの断片、変異体、もしくは誘導体を含むか、本質的に該ポリペプチドもしくは該ポリペプチドの断片、変異体、もしくは誘導体からなるか、または該ポリペプチドもしくは該ポリペプチドの断片、変異体、もしくは誘導体からなるＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００９５】
本発明の方法で使用されるさらなる可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドには、；配列番号：２のアミノ酸３６〜５３０；配列番号：２のアミノ酸３６〜５３１；配列番号：２のアミノ酸３６〜５３２；配列番号：２のアミノ酸３６〜５３３；配列番号：２のアミノ酸３６〜５３４；配列番号：２のアミノ酸３６〜５３５；配列番号：２のアミノ酸３６〜５３６；配列番号：２のアミノ酸３６〜５３７；配列番号：２のアミノ酸３６〜５３８；および配列番号：２のアミノ酸３６〜５３９、もしくはこのようなポリペプチドの断片、変異体、もしくは誘導体を含むか、本質的に該ポリペプチドもしくは該ポリペプチドの断片、変異体、もしくは誘導体からなるか、または該ポリペプチドもしくは該ポリペプチドの断片、変異体、もしくは誘導体からなるＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００９６】
さらなる可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド、その断片、変異体、または誘導体には、ＬＩＮＧＯ−１のＩｇドメインを含むポリペプチドが含まれる。例えば、配列番号：２のアミノ酸４１７〜４９３；配列番号：２のアミノ酸４１７〜４９４；配列番号：２のアミノ酸４１７〜４９５；配列番号：２のアミノ酸４１７〜４９６；配列番号：２のアミノ酸４１７〜４９７；配列番号：２のアミノ酸４１７〜４９８；配列番号：２のアミノ酸４１７〜４９９；配列番号：２のアミノ酸４１７〜５００；配列番号：２のアミノ酸４１７〜４９２；配列番号：２のアミノ酸４１７〜４９１；配列番号：２のアミノ酸４１２〜４９３；配列番号：２のアミノ酸４１３〜４９３；配列番号：２のアミノ酸４１４〜４９３；配列番号：２のアミノ酸４１５〜４９３；配列番号：２のアミノ酸４１６〜４９３；配列番号：２のアミノ酸４１１〜４９３；配列番号：２のアミノ酸４１０〜４９３；配列番号：２のアミノ酸４１０〜４９４；配列番号：２のアミノ酸４１１〜４９４；配列番号：２のアミノ酸４１２〜４９４；配列番号：２のアミノ酸４１３〜４９４；配列番号：２のアミノ酸４１４〜４９４；配列番号：２のアミノ酸４１５〜４９４；配列番号：２のアミノ酸４１６〜４９４；配列番号：２のアミノ酸４１７〜４９４；および配列番号：２のアミノ酸４１８〜４９４、もしくはこのようなポリペプチドの断片、変異体、もしくは誘導体を含むか、本質的に該ポリペプチドもしくは該ポリペプチドの断片、変異体、もしくは誘導体からなるか、または該ポリペプチドもしくは該ポリペプチドの断片、変異体、もしくは誘導体からなるＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド。
【００９７】
本発明の方法で使用される可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドには、本明細書に開示される２つ以上の可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの組み合わせも含まれる。本発明の方法で使用される２つ以上の可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドは、本明細書に開示される複数のＬＩＮＧＯ−１可溶性ポリペプチドを含む単一のポリペプチドを形成するように１つに融合されてもよく、または本発明の方法で使用される組成物を含む個々の可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドであってもよい。
【００９８】
本発明を実施するための様々な例示的な可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドならびにこれらの分子を得るための方法および材料は、以下に記載されており、かつ／または例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ  ２００４／０８５６４８号、同ＷＯ  ２００６／００２４３７号、同ＷＯ  ２００７／００５９７９３号、同ＷＯ  ２００７／００８５４７号、同ＷＯ  ２００７／０５６１６１号、および同ＷＯ  ２００７／０６４８８２号、ならびに米国公開出願第２００６／０１７６７３号に見出され得、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００９９】
ＴｒｋＢアゴニストポリペプチド
本発明の方法で使用されるＴｒｋＢアゴニストポリペプチドには、ＴｒｋＢの活性を促進するか、増幅するか、増強させるか、または増大させることができる任意のポリペプチドが含まれる。このようなタンパク質には、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、およびＮＴ−４／５などのニューロトロフィンを含むＴｒｋＢリガンドが含まれるが、これらに限定されない。さらに、本発明のＴｒｋＢアゴニストポリペプチドには、ＴｒｋＢリガンドの断片、変異体、または誘導体、およびキメラのニューロトロフィン分子も含まれる。いくつかの実施形態において、ＴｒｋＢリガンドポリペプチド、その断片、変異体、または誘導体は、二量体化または多量体化されている。本発明のＴｒｋＢアゴニストポリペプチドは、ホモ二量体またはヘテロ二量体として作用することができる。本発明のＴｒｋＢアゴニストポリペプチドには、Ｉｂａｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．  ＥＭＢＯ  ７２：１２：２２８１−２２９３  （１９９３）に開示されているパン−ニュートロフィン（ｐａｎ−ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｎ）のようなパン−ニュートロフィンも含まれる。特に、本発明のＴｒｋＢアゴニストポリペプチドには、ＴｒｋＢまたはそのようなポリペプチドの変異体に結合するＴｒｋＢリガンドのドメインが含まれる。本発明の１つの特定の実施形態において、ＴｒｋＢアゴニストは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、またはその断片、変異体、もしくは誘導体である。
【０１００】
本発明のＴｒｋＢアゴニストポリペプチドは、米国特許第７，２０５，３８７号に開示されているようなＴｒｋＢリガンドのヘアピンモチーフであってもよい。さらに、ＴｒｋＢリガンドポリペプチド、その断片、変異体、または誘導体は、その他のタンパク質もしくはペプチド配列に融合していてもよく、かつ／または米国特許第５，７７０，５７７号に開示されているようなポリエチレングリコールを含む水溶性のポリマーもしくは米国特許第６，８００，６０７号に開示されているような１−アシル−グリセロール誘導体に結合していてもよい。さらにまたは代わりに、ＴｒｋＢリガンド、その断片または変異体は、投与時の安定性を増大させるために、例えば、米国特許第６，７２３，７０１号に記載されているようなより低い等電点を有する変異体を用いることによって改変することができる。ＴｒｋＢリガンド、およびその断片または変異体は、例えば、「ミニニューロトロフィン」（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．  ＪＢＣ  ２５０：５８６２−５８６９  （２００４）に記載されているようなＢＡＧ）を形成するように直列に配置し、環化することができる。
【０１０１】
さらに、本発明の方法で使用されるＴｒｋＢアゴニストポリペプチドには、ＴｒｋＢリガンドポリペプチド、その断片、変異体、または誘導体が含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法で使用されるＴｒｋＢリガンドポリペプチド、その断片、変異体、または誘導体には、免疫グロブリンドメインに融合した全長ＴｒｋＢタンパク質を含むか、本質的に該タンパク質からなるか、または該タンパク質からなるＴｒｋＢポリペプチド（例えば、ＩｇＧドメインに融合した配列番号：４のアミノ酸１〜８２８；配列番号：４のアミノ酸３２〜８２８を含むか、本質的に該アミノ酸からなるか、または該アミノ酸からなるＴｒｋＢポリペプチド）も含まれる。また、本明細書に記載されるさらなるＴｒｋＢポリペプチド、その断片、変異体、または誘導体は、免疫グロブリンドメインに融合されてもよい。いくつかの実施形態において、本発明のＴｒｋＢポリペプチドは、二量体化または多量体化されてもよい。本発明のＴｒｋＢポリペプチドには、ＬＩＮＧＯ−１と相互作用せず、二量体化もしくは多量体化する増大した傾向を有し、内因性もしくは非内因性のリガンドに対する増大した親和性を有し、かつ／または配列番号：４のポリペプチドと比較して増大したキナーゼ活性を有するＴｒｋＢの断片、変異体、アイソフォーム、または誘導体も含まれる。
【０１０２】
本発明の方法で使用されるさらなるＴｒｋＢアゴニストポリペプチドには、本明細書に開示される２つ以上のＴｒｋＢアゴニストポリペプチドの組み合わせも含まれる。本発明の方法で使用される２つ以上のＴｒｋＢアゴニストポリペプチドは、本明細書に開示される複数のＴｒｋＢアゴニストポリペプチドを含む単一のポリペプチドを形成するように１つに融合されてもよく、または本発明の方法で使用される組成物を含む個々のＴｒｋＢアゴニストポリペプチドであってもよい。
【０１０３】
可溶性ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドおよび／またはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド
本明細書に記載される本発明の方法で使用される可溶性ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドおよびＴｒｋＢアゴニストポリペプチドは、環状であってもよい。可溶性ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドまたはＴｒｋＢアゴニストポリペプチドの環化によって、線状ペプチドの立体構造的な自由が低下し、より構造的に拘束された分子が生じる。多くのペプチド環化方法が当技術分野で公知であり、例えば、ペプチドのＮ末端のアミノ酸残基とＣ末端のアミノ酸残基の間でのアミド結合の形成による「骨格対骨格」環化である。「骨格対骨格」環化の方法としては、２つのω−チオアミノ酸残基（例えば、システイン、ホモシステイン）の間でのジスルフィド架橋の形成が挙げられる。本発明のある種の可溶性ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストペプチドおよびＴｒｋＢアゴニストペプチドには、環状のＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドおよびＴｒｋＢアゴニストポリペプチドを形成させるための、ペプチドのＮ末端およびＣ末端上の修飾が含まれる。このような修飾としては、システイン残基、アセチル化システイン残基、ＮＨ２部分を有するシステイン残基、およびビオチンが挙げられるが、これらに限定されない。その他のペプチド環化の方法は、Ｌｉ  ＆  Ｒｏｌｌｅｒ，  Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３：３２５−３４１  （２００２）に記載されており、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０４】
本明細書に記載される可溶性ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドまたはＴｒｋＢアゴニストポリペプチドは、置換、挿入、または欠失などの様々な改変を有してもよい。例えば、置換としては、以下の置換、すなわち、配列番号：２のＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの位置６のバリンからメチオニンへの置換；配列番号：２のＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの位置２９４のセリンからグリシンへの置換；配列番号：２のＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの位置３４８のバリンからアラニンへの置換；  ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの位置４１９のアルギニンからヒスチジンへの置換；位置４５６のアルギニンからグルタミン酸への置換；および配列番号：２の位置４５８のヒスチジンからバリンへの置換が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０５】
本明細書に記載される配列番号：２または配列番号：４のポリペプチドに対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一である可溶性ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドまたはＴｒｋＢアゴニストポリペプチドの対応する断片も企図される。
【０１０６】
当技術分野で公知であるように、２つのポリペプチドの間の「配列同一性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列を第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。本明細書で議論される場合、任意の特定のポリペプチドが別のポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるかどうかは、当技術分野で公知の方法およびコンピュータプログラム／ソフトウェア（例えば、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｕｎｉｘ（登録商標）用のバージョン８，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ  ５３７１１）であるが、これに限定されない）を用いて決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９  （１９８１）の局所相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列の間で相同性のある最良のセグメントを見つける。ＢＥＳＴＦＩＴまたは任意のその他の配列アラインメントプログラムを用いて、特定の配列が、本発明による参照配列に対して、例えば、９５％同一であるかどうかを決定する場合、パラメータは当然、同一性のパーセンテージが参照ポリペプチド配列の全長にわたって計算されるように、かつ参照配列中のアミノ酸の総数の５％までの相同性のギャップが許されるように設定される。
【０１０７】
本発明の方法で使用される可溶性ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドおよびＴｒｋＢアゴニストポリペプチドには、２つ以上の可溶性ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドおよびＴｒｋＢアゴニストポリペプチドの任意の組み合わせが含まれてもよい。
【０１０８】
抗体またはその抗原結合断片
１つの実施形態において、本発明の方法で使用される可溶性ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドおよびＴｒｋＢアゴニストポリペプチドには、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストまたはＴｒｋＢアゴニストである抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体が含まれる。例えば、ある種のＬＩＮＧＯ−１抗体またはＴｒｋＢ抗体が、ＣＮＳニューロンによって発現されるＬＩＮＧＯ−１またはＴｒｋＢに結合することによって、ニューロンの細胞生存が促進される。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、ＬＩＮＧＯ−１抗体は抗体１Ａ７である。１Ａ７抗体は、２００６年７月７日に出願された国際出願ＰＣＴＵＳ０６／２６２７１に記載されており、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。１Ａ７抗体の配列を下記表に示す。
【０１１０】
【表３】
0005674469.tif 000015
本発明の抗体は、１Ａ７抗体の１つ以上のＣＤＲを含む抗体であることもできる。以下は、それぞれ、１Ａ７抗体のＶＨ  ＣＤＲ１領域、ＶＨ  ＣＤＲ２領域、およびＶＨ  ＣＤＲ３領域の配列である：ＮＹＧＭＮ（配列番号：１０）、ＷＩＮＴＤＴＧＥＰＴＹＴＥＤＦＱＧ（配列番号：１１）、およびＥＧＶＨＦＤＹ（配列番号：１２）。以下は、それぞれ、１Ａ７抗体のＶＬ  ＣＤＲ１領域、ＶＬ  ＣＤＲ２領域、およびＶＬ  ＣＤＲ３領域の配列である：ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号：１３）、ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号：１４）、およびＱＱＷＳＳＮＰＦＴ（配列番号：１５）。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、ＬＩＮＧＯ−１抗体は、ハイブリドーマ２．Ｐ３Ｂ５．２から産生することができる、モノクローナル抗体３Ｂ５．２（３Ｂ５とも表す）である。２．Ｐ３Ｂ５．２ハイブリドーマは、２００６年１２月２７日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎｎａｓｓｓａｓ，  ＶＡ）に寄託された。３Ｂ５抗体は、２００７年１月９日に出願された米国仮特許出願第６０／８７９，３２４号に記載されており、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。３．Ｂ５の配列を下記表に示す。
【０１１２】
【表４】
0005674469.tif 000016
本発明の抗体は、３Ｂ５抗体の１つ以上のＣＤＲを含む抗体であることもできる。以下は、それぞれ、３Ｂ５抗体のＶＨ  ＣＤＲ１領域、ＶＨ  ＣＤＲ２領域、およびＶＨ  ＣＤＲ３領域の配列である：ＳＹＷＭＨ（配列番号：１８）、ＶＩＤＰＳＤＳＹＴＮＹＮＱＫＦＲＧ（配列番号：１９）、およびＰＹＹＧＳＨＷＦＦＤＶ（配列番号：２０）。以下は、それぞれ、３Ｂ５抗体のＶＬ  ＣＤＲ１領域、ＶＬ  ＣＤＲ２領域、およびＶＬ  ＣＤＲ３領域の配列である：ＳＡＳＳＲＶＳＹＶＨ（配列番号：２１）、ＤＴＳＮＬＡＳ（配列番号：２２）、およびＱＱＷＳＴＮＰＰＴ（配列番号：２３）。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、ＬＩＮＧＯ−１抗体は、モノクローナル抗体ＬＩ３３である。ＬＩ３３抗体は、２００７年１月９日に出願された米国仮特許出願第６０／８７９，３２４号に記載されており、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。ＬＩ３３抗体の配列を下記表に示す。
【０１１４】
【表５】
0005674469.tif 000017
本発明の抗体は、ＬＩ３３抗体の１つ以上のＣＤＲを含む抗体であることもできる。以下は、それぞれ、ＬＩ３３抗体のＶＨ  ＣＤＲ１領域、ＶＨ  ＣＤＲ２領域、およびＶＨ  ＣＤＲ３領域の配列である：ＩＹＰＭＦ（配列番号：２６）、ＷＩＧＰＳＧＧＩＴＫＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号：２７）、およびＥＧＨＮＤＷＹＦＤＬ（配列番号：２８）。以下は、それぞれ、ＬＩ３３抗体のＶＬ  ＣＤＲ１領域、ＶＬ  ＣＤＲ２領域、およびＶＬ  ＣＤＲ３領域の配列である：ＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡ（配列番号：２９）、ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号：３０）、およびＱＱＹＤＫＷＰＬＴ（配列番号：３１）。
【０１１５】
別の実施形態において、ＬＩＮＧＯ−１抗体は、７．Ｐ１Ｄ５．１．Ｇ９から産生することができる、モノクローナル抗体７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９である。７．Ｐ１Ｄ５．１．Ｇ９ハイブリドーマは、２００６年１２月２７日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎｎａｓｓｓａｓ，  ＶＡ）に寄託された。７．Ｐ１Ｄ５．１．Ｇ９抗体は、に記載されている。
【０１１６】
本明細書に記載される方法で使用されるある種のＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体は、特定のＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの断片またはドメインに特異的または優先的に結合する。このようなＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド断片には、配列番号：２のアミノ酸３４〜５３２；３４〜４１７、３４〜４２５、３４〜４９３、６６〜５３２、６６〜４１７（ＬＲＲドメイン）、６６〜４２６、６６〜４９３、６６〜５３２、４１７〜５３２、４１７〜４２５（ＬＩＮＧＯ−１塩基性領域）、４１７〜４２４（ＬＩＮＧＯ−１塩基性領域）、４１７〜４９３、４１７〜５３２、４１９〜４９３（ＬＩＮＧＯ−１  Ｉｇ領域）、もしくは４２５〜５３２を含むか、本質的に該アミノ酸からなるか、もしくは該アミノ酸からなるＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド、または配列番号：２のアミノ酸３４〜５３２；３４〜４１７、３４〜４２５、３４〜４９３、６６〜５３２、６６〜４１７、６６〜４２６、６６〜４９３、６６〜５３２、４１７〜５３２、４１７〜４２５（ＬＩＮＧＯ−１塩基性領域）、４１７〜４９３、４１７〜５３２、４１９〜４９３（ＬＩＮＧＯ−１  Ｉｇ領域）、もしくは４２５〜５３２に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％同一のＬＩＮＧＯ−１変異体ポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１７】
本発明の方法で使用されるある種のＬＩＮＧＯ−１特異的抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体が結合するさらなるＬＩＮＧＯ−１ペプチド断片には、ＬＩＮＧＯ−１の１つ以上のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を含むか、本質的に該リピートからなるか、または該リピートからなる断片が含まれるが、これらに限定されない。このような断片には、例えば、配列番号：２のアミノ酸６６〜８９、６６〜１１３、６６〜１３７、９０〜１１３、１１４〜１３７、１３８〜１６１、１６２〜１８５、１８６〜２０９、２１０〜２３３、２３４〜２５７、２５８〜２８１、２８２〜３０５、３０６〜３２９、もしくは３３０〜３５３を含むか、本質的に該アミノ酸からなるか、または該アミノ酸からなる断片が含まれる。配列番号：２のアミノ酸６６〜８９、６６〜１１３、９０〜１１３、１１４〜１３７、１３８〜１６１、１６２〜１８５、１８６〜２０９、２１０〜２３３、２３４〜２５７、２５８〜２８１、２８２〜３０５、３０６〜３２９、または３３０〜３５３に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一の変異体ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの対応する断片も企図される。
【０１１８】
本発明のある種の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体が結合するさらなるＬＩＮＧＯ−１ペプチド断片には、ＬＩＮＧＯ−１のＬＲＲに隣接する１つ以上のシステインリッチ領域を含むか、本質的に該領域からなるか、または該領域からなる断片が含まれるが、これらに限定されない。このような断片には、例えば、配列番号：２のアミノ酸３４〜６４（Ｎ末端のＬＲＲ隣接領域（ＬＲＲＮＴ））を含むか、本質的に該アミノ酸からなるか、もしくは該アミノ酸からなる断片、または配列番号：２のアミノ酸３６３〜４１６（Ｃ末端のＬＲＲ隣接領域（ＬＲＲＣＴ））を含むか、本質的に該アミノ酸からなるか、もしくは該アミノ酸からなる断片が含まれる。配列番号：２のアミノ酸３４〜６４および３６３〜４１６に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一の変異体ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドの対応する断片も企図される。
【０１１９】
その他の実施形態において、本明細書に記載される方法で使用されるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストには、ＬＩＮＧＯ−１の少なくとも１つのエピトープに特異的または優先的に結合する抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体が含まれ、この場合、そのエピトープは、配列番号：２の少なくとも約４〜５個のアミノ酸、配列番号：２の少なくとも７個、少なくとも９個、または少なくとも約１５個〜約３０個のアミノ酸を含むか、本質的に該アミノ酸からなるか、または該アミノ酸からなる。記載されているような配列番号：２の所与のエピトープのアミノ酸は、連続的であっても、または線状であってもよいが、そうである必要はない。ある実施形態において、ＬＩＮＧＯ−１の少なくとも１つのエピトープは、細胞の表面上に発現されるかまたは例えば、ＩｇＧ  Ｆｃ領域に融合した可溶性断片として発現されるようなＬＩＮＧＯ−１の細胞外ドメインによって形成される非線状エピトープを含むか、本質的に該エピトープからなるか、または該エピトープからなる。したがって、ある実施形態において、ＬＩＮＧＯ−１の少なくとも１つのエピトープは、配列番号：２の少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、約１５個〜約３０個の、または少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、もしくは１００個の連続的または非連続的アミノ酸を含むか、本質的に該アミノ酸からなるか、または該アミノ酸からなり、この場合、非連続的アミノ酸は、タンパク質の折り畳みを通じてエピトープを形成する。
【０１２０】
本明細書に記載される方法で使用されるある種のＴｒｋＢアゴニスト抗体は、特定のＴｒｋＢポリペプチドの断片またはドメインに特異的または優先的に結合する。例えば、本発明の抗体は、ＴｒｋＢのＩｇＧ−１領域またはＩｇＧ−２領域内のエピトープに結合することができ、かつＩｇＧ−１ドメインおよび／またはＩｇＧ−２ドメインのループ領域内の配列に結合することができる。本発明の抗体には、ＴｒｋＢ自己リン酸化を増大させる抗体も含まれる。ＴｒｋＢアゴニスト抗体のある非限定的な例としては、ＢＤＮＦなどのリガンドのＴｒｋＢ受容体への結合を阻止するモノクローナル抗体、ＢＤＮＦなどのリガンドのＴｒｋＢ受容体への結合を部分的に阻止するモノクローナル抗体、ＢＤＮＦなどのリガンドのＴｒｋＢ受容体への結合を阻止しないモノクローナル抗体、およびＢＤＮＦなどのリガンドのＴｒｋＢ受容体への結合を促進するかまたは増大させるモノクローナル抗体も挙げられるが、これらに限定されない。本発明のＴｒｋＢアゴニスト抗体には、ＢＤＮＦなどのリガンドのＴｒｋＢ受容体への結合に影響を及ぼさないモノクローナル抗体も含まれる。ＴｒｋＢアゴニスト抗体のある非限定的な例としては、６Ｅ２、７Ｆ５、１１Ｅ１、１６Ｅ１１、１７Ｄ１１、１９Ｅ１２、２９Ｄ７（これらは、米国公開特許出願第２００７／００５９３０４号およびＱｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒ．  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．  ２６：９３９４−９４０３  （２００６）に記載されており、その各々が参照により本明細書に組み入れられる）ならびにそれらの抗体と同じエピトープに結合する抗体または抗原結合断片も挙げられる。本発明の方法で使用される例示的なＴｒｋＢアゴニスト抗体には、上記のＴｒｋＢアゴニスト抗体と同じＴｒｋＢエピトープに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片も含まれる。
【０１２１】
本発明の方法で使用される例示的な抗体またはその断片には、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、２００６年７月７日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０６／２６２７１（「Ｓｐ３５  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」という題でＭｉらに権利が付与されている）に記載されているような、２０１’、３Ａ３、３Ａ６、３Ｂ５、１Ａ７、１Ｄ５、１Ｇ７、２Ｂ１０、２Ｃ１１、２Ｆ３、３Ｐ１Ｂ１．１Ｆ９、３Ｐ１Ｄ１０．２Ｃ３、３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７、３Ｐ２Ｃ６．３Ｇ１０．２Ｈ７、３Ｐ２Ｃ９．２Ｇ４、３Ｐ４Ａ６．１Ｄ９、３Ｐ４Ａ１．２Ｂ９、３Ｐ４Ｃ２．２Ｄ２、３Ｐ４Ｃ５．１Ｄ８、３Ｐ４Ｃ８．２Ｇ９、６Ｐ４Ｆ４．１Ｄｓ、６Ｐ４Ｆ４．１Ｆ９、７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９、１Ｂ６．４、２Ｃ７．２、２Ｄ６．１、２Ｆ７．３、２Ｈ３．２、３Ｃ１１．１、３Ｅ３．１、３Ｈ１１．２、３Ｇ８．１、２Ｂ８．１、３Ｂ５．２３０−Ｃ１２（Ｌｉ０１）、３８−Ｄ０１（Ｌｉ０２）、３５−Ｅ０４（Ｌｉ０３）、３６−Ｃ０９（ＬｉＯ４）、３０−Ａ１１（Ｌｉ０５）、３４−Ｆ０２（Ｌｉ０６）、２９−Ｅ０７（Ｌｉ０７）、３４−Ｇ０４（Ｌｉ０８）、３６−Ａ１２（Ｌｉ０９）、２８−Ｄ０２（Ｌｉ１０）、３０−Ｂ０１（Ｌｉ１１）、３４−Ｂ０３（Ｌｉ１２）、Ｌｉ１３、Ｌｉ３２、Ｌｉ３３、Ｌｉ３４、３３８３（Ｌ１ａ．１）、３４９５（Ｌ１ａ．２）、３５６３（Ｌ１ａ．３）、３５６４（Ｌ１ａ．４）、３５６５（Ｌ１ａ．５）、３５６６（Ｌ１ａ．６）、３５６７（Ｌ１ａ．７）、３５６８（Ｌ１ａ．８）、３５６９（Ｌ１ａ．９）、３５７０（Ｌ１ａ．１０）、３５７１（Ｌ１ａ．１１）、３５８２（Ｌ１ａ．１２）、１９６８（Ｌ１ａ．１３）、３０１１、３０１２、３０１３、３４１８、３４２２、３５６２、Ｄ０５、Ｄ０７、Ｄ０８、Ｄ１０、およびＤ１１からなる群より選択される参照モノクローナル抗体と同じＬＩＮＧＯ−１エピトープに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片も含まれる。
【０１２２】
その他の実施形態において、本発明の方法で使用されるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストおよびＴｒｋＢアゴニストには、ＬＩＮＧＯ−１またはＴｒｋＢの少なくとも１つのエピトープに特異的または優先的に結合するＬＩＮＧＯ−１抗体もしくはＴｒｋＢ抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体が含まれ、この場合、エピトープは、上記のような、それぞれ、配列番号：２または配列番号：４の１個、２個、３個、４個、５個、６個、またはそれより多くの連続的または非連続的アミノ酸に加えて、タンパク質を修飾する付加的な部分を含むか、本質的に該部分からなるか、または該部分からなる。例えば、ＬＩＮＧＯ−１抗体またはＴｒｋＢ抗体が、未修飾バージョンのタンパク質に結合するよりも高い親和性で修飾された標的タンパク質に結合するように、炭水化物部分が含まれてもよい。あるいは、ＬＩＮＧＯ−１抗体またはＴｒｋＢ抗体は、未修飾バージョンの標的タンパク質には全く結合しない。
【０１２３】
ある実施形態において、本発明の方法で使用されるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストおよびＴｒｋＢアゴニストには、上記のＬＩＮＧＯ−１もしくはＴｒｋＢもしくは断片もしくは変異体の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する、すなわち、無関係なエピトープ、もしくはランダムなエピトープに結合するよりも容易にそのようなエピトープに結合するか；上記のＬＩＮＧＯ−１もしくはＴｒｋＢもしくは断片もしくは変異体の少なくとも１つのエピトープに優先的に結合する、すなわち、関連のあるエピトープ、同様のエピトープ、相同なエピトープ、もしくは類似するエピトープに結合するよりも容易にそのようなエピトープに結合するか；それ自体、上記のＬＩＮＧＯ−１もしくはＴｒｋＢもしくは断片もしくは変異体のあるエピトープに特異的もしくは優先的に結合する参照抗体の結合を競合的に阻害するか；または約５×１０−２Ｍ、約１０−２Ｍ、約５×１０−３Ｍ、約１０−３Ｍ、約５×１０−４Ｍ、約１０−４Ｍ、約５×１０−５Ｍ、約１０−５Ｍ、約５×１０−６Ｍ、約１０−６Ｍ、約５×１０−７Ｍ、約１０−７Ｍ、約５×１０−８Ｍ、約１０−８Ｍ、約５×１０−９Ｍ、約１０−９Ｍ、約５×１０−１０Ｍ、約１０−１０Ｍ、約５×１０−１１Ｍ、約１０−１１Ｍ、約５×１０−１２Ｍ、約１０−１２Ｍ、約５×１０−１３Ｍ、約１０−１３Ｍ、約５×１０−１４Ｍ、約１０−１４Ｍ、約５×１０−１５Ｍ、もしくは約１０−１５Ｍ未満の解離定数ＫＤを特徴とする親和性で、上記のＬＩＮＧＯ−１もしくはＴｒｋＢもしくは断片もしくは変異体の少なくとも１つのエピトープに結合する、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体が含まれる。特定の態様において、抗体またはその断片は、マウスＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドもしくはその断片またはマウスＴｒｋＢポリペプチドもしくはその断片と比べて、ヒトＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドもしくはその断片またはヒトＴｒｋＢポリペプチドもしくはその断片に優先的に結合する。
【０１２４】
抗体の結合解離定数の文脈で使用される場合、用語「約」は、抗体の親和性を測定するために利用される方法に固有の変動の程度を可能にする。例えば、使用される装置の精度のレベル、測定される試料の数に基づく標準誤差、および丸め誤差に応じて、用語「約１０−２Ｍ」には、例えば、０．０５Ｍから０．００５Ｍまでが含まれる場合がある。
【０１２５】
特定の実施形態において、本発明の方法で使用されるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストまたはＴｒｋＢアゴニストには、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドもしくはその断片もしくは変異体、またはＴｒｋＢポリペプチドもしくはその断片もしくは変異体に、５×１０−２秒−１以下、１０−２秒−１以下、５×１０−３秒−１以下、もしくは１０−３秒−１以下の解離速度定数（ｋ（ｏｆｆ））で結合する本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体が含まれる。あるいは、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドまたはＴｒｋＢポリペプチドまたはその断片もしくは変異体に、５×１０−４秒−１以下、１０−４秒−１以下、５×１０−５秒−１以下、もしくは１０−５秒−１以下、５×１０−６秒−以下１、１０−６秒−１以下、５×１０−７秒−１以下、もしくは１０−７秒−１以下の解離速度定数（ｋ（ｏｆｆ））で結合する。
【０１２６】
その他の実施形態において、本発明の方法で使用されるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストまたはＴｒｋＢアゴニストには、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドもしくはその断片もしくは変異体、またはＴｒｋＢポリペプチドもしくはその断片もしくは変異体に、１０３Ｍ−１秒−１以上、５×１０３Ｍ−１秒−１以上、１０４Ｍ−１秒−１以上、もしくは５×１０４Ｍ−１秒−１以上の結合速度定数（ｋ（ｏｎ））で結合する本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体が含まれる。あるいは、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドもしくはその断片もしくは変異体、またはＴｒｋＢポリペプチドもしくはその断片もしくは変異体に、１０５Ｍ−１秒−１以上、５×１０５Ｍ−１秒−１以上、１０６Ｍ−１秒−１以上、５×１０６Ｍ−１秒−１以上、もしくは１０７Ｍ−１秒−１以上の結合速度定数（ｋ（ｏｎ））で結合する。
【０１２７】
１つの実施形態において、本発明の方法で使用されるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体またはＴｒｋＢアゴニスト抗体は、抗体分子またはその免疫特異的断片である。別途記載されなければ、本明細書に記載される場合、抗体に関する「その断片」は、免疫特異的断片、すなわち、抗原特異的断片を指す。１つの実施形態において、本発明の方法で使用される抗体は、二重特異性の結合分子、結合ポリペプチド、または抗体であり、例えば、二重特異性の抗体、ミニボディー、ドメイン欠失抗体、または２つ以上のエピトープ（例えば、２つ以上の抗原、もしくは同じ抗原上の２つ以上のエピトープ）に対して結合特異性を有する融合タンパク質である。１つの実施形態において、二重特異性抗体は、ＬＩＮＧＯ−１またはＴｒｋＢ上の少なくとも１つのエピトープに特異的な少なくとも１つの結合ドメインを有する。二重特異性抗体は、ＬＩＮＧＯ−１またはＴｒｋＢの１つのエピトープに特異的な２つの標的結合ドメインと、第２の標的に特異的な２つの標的結合ドメインを有する四価抗体であり得る。したがって、四価二重特異性抗体は、各々の特異性について二価であり得る。
【０１２８】
本発明のある実施形態は、所望の生化学的特性（例えば、ほぼ同じ免疫原性の改変されていない抗体全体と比較した場合の、低下したエフェクター機能、非共有結合的に二量体化する能力、所望の部位に局在化する増大した能力、低下した血清半減期、または増大した血清半減期）を提供するように、定常領域ドメインの１つ以上の少なくとも一部が欠失されているかまたは別の方法で改変されている、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはその免疫特異的断片またはＴｒｋＢアゴニスト抗体もしくはその免疫特異的断片の投与を含む。例えば、本明細書に記載される方法で使用されるある種の抗体は、ドメイン欠失抗体であり、これは、免疫グロブリン重鎖と同様のポリペプチド鎖を含むが、１つ以上の重鎖ドメインの少なくとも一部を欠いている。例えば、ある種の抗体において、修飾抗体の定常領域の１つのドメイン全体が欠失しており、例えば、ＣＨ２ドメインの全体または一部が欠失している。
【０１２９】
本明細書に記載される方法で使用されるある種のＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはその免疫特異的断片またはＴｒｋＢアゴニスト抗体もしくはその免疫特異的断片において、Ｆｃ部分は、当技術分野で公知の技術を用いてエフェクター機能を減少させるように突然変異させてもよい。例えば、定常領域ドメインの欠失または不活化（点突然変異またはその他の手段による）によって、血液循環する修飾抗体のＦｃ受容体結合が低下し、それによって、所望の作用の部位での局在化が増大し得る。その他の場合において、本発明と一致する定常領域の修飾によって、補体結合が和らげられ、それにより、結合体化した細胞毒素の血清半減期および非特異的会合が低下するということがあり得る。定常領域に対するその他の望ましい修飾には、効力、安全性、抗原結合、Ｆｃエフェクター機能、安定性、および／または抗体産物の一貫性に影響を及ぼすために、グリコシル化を改変する（例えば、グリコシル化を低下させる）よう設計された突然変異が含まれる。さらなる望ましい修飾には、例えば、多量体形成に関与することが知られているかまたは予想されている残基の修飾によって、抗体の溶解性を改変する修飾が含まれる。定常領域のさらにその他の修飾を用いて、ジスルフィド結合またはオリゴ糖部分を修飾してもよく、これにより、抗原特異性または抗体柔軟性の増大が原因で局在化の増強が可能になる。得られる修飾の生理学的プロファイル、バイオアベイラビリティー、およびその他の生化学的効果（例えば、局在化、生体分布、および血清半減期）は、過度の実験を行うことなく、周知の免疫学的技術を用いて、容易に測定および定量され得る。
【０１３０】
本明細書に開示される方法で使用される修飾された形態の抗体またはその免疫特異的断片は、当技術分野で公知の技術を用いて、前駆体またはもとの抗体全体から作製することができる。例示的な技術は、本明細書でさらに詳細に議論されている。
【０１３１】
ある実施形態において、本明細書に開示される方法で使用されるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはその免疫特異的断片またはＴｒｋＢアゴニスト抗体もしくはその免疫特異的断片の可変領域と定常領域の両方は、完全にヒトのものである。完全なヒト抗体は、当技術分野で公知でありかつ本明細書に記載されるような技術を用いて作製することができる。例えば、特異的抗原に対する完全なヒト抗体は、抗原によるチャレンジに応答してそのような抗体を産生するように修飾されているが、その内因性遺伝子座が不能にさせられているトランスジェニック動物に抗原を投与することによって調製することができる。そのような抗体を作製するのに使用することができる例示的な技術は、米国特許第６，１５０，５８４号；同第６，４５８，５９２号；同第６，４２０，１４０号に記載されている。その他の技術は当技術分野で公知である。完全なヒト抗体は、様々なディスプレイ技術（例えば、本明細書の他の場所でさらに詳細に記載されるような、ファージディスプレイ系またはその他のウイルスディスプレイ系）によって、同様に産生することができる。
【０１３２】
本明細書に開示される方法で使用されるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはその免疫特異的断片またはＴｒｋＢアゴニスト抗体もしくはその免疫特異的断片は、当技術分野で公知である技術を用いて作製または製造することができる。ある実施形態において、抗体分子またはその断片は、「組換えによって産生される」、すなわち、組換えＤＮＡ技術を用いて産生される。抗体分子またはその断片を作製するための例示的な技術は、本明細書の他の場所でさらに詳細に議論されている。
【０１３３】
本明細書の方法で使用されるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはその免疫特異的断片またはＴｒｋＢアゴニスト抗体もしくはその免疫特異的断片は、当技術分野で公知の任意の好適な方法によって作製し得る。
【０１３４】
ポリクローナル抗体は、当技術分野で周知の様々な手順によって産生することができる。例えば、ＬＩＮＧＯ−１免疫特異的断片またはＴｒｋＢ免疫特異的断片を、ウサギ、マウス、ラットなどを含むが、これらに限定されない、様々な宿主動物に投与して、抗原に特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導することができる。免疫学的応答を増大させるために、宿主の種に応じて、様々なアジュバントを使用してもよい。これには、フロイトのアジュバント（完全および不完全）、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、表面活性物質（例えば、リゾレシチン）、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油状エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および有用である可能性があるヒトアジュバント（例えば、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）、およびコリネバクテリウム・パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ））が含まれるが、これらに限定はされない。このようなアジュバントもまた当技術分野で周知である。
【０１３５】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組換え技術、およびファージディスプレイ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当技術分野で公知の種々様々な技術を用いて調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野で公知の技術、およびＨａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  第２版  （１９８８）；  Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−ＣｅＩｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ｎ．Ｙ．，  ５６３−６８１  （１９８１）（該参考文献はその全体が参照により本明細書に組み入れられる）に教示されている技術を含むハイブリドーマ技術を用いて産生することができる。本明細書で使用される場合の用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、任意の真核生物、原核生物、またはファージのクローンを含む、単一のクローンに由来する抗体を指し、それが産生される方法を指すものではない。したがって、用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術によって産生された抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術および組換え技術およびファージディスプレイ技術の使用を含む、当技術分野で公知の種々様々な技術を用いて調製することができる。
【０１３６】
１つの例において、当技術分野で認識されているプロトコルを用いて、関連抗原（例えば、精製されたＬＩＮＧＯ−１抗原もしくはＴｒｋＢ抗原、またはこのような抗原を含む細胞もしくは細胞抽出物）とアジュバントの複数回の皮下注射または腹腔内注射によって、抗体を哺乳動物で惹起する。この免疫化は、典型的には、活性化された脾臓細胞またはリンパ球からの抗原反応性抗体の産生を含む免疫応答を誘発する。得られる抗体を動物の血清から採取して、ポリクローナル調製物を提供し得るが、多くの場合、脾臓、リンパ節、または末梢血から個々のリンパ球を単離して、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の均質な調製物を提供することが望ましい。リンパ球は、例えば、脾臓から得ことができる。
【０１３７】
この周知のプロセス（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５  （１９７５））においては、抗原が注射された哺乳動物に由来する、比較的短期間しか生存できないか、または死ぬ運命にあるリンパ球が、不死化腫瘍細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）と融合させられ、それによって、不死であり、かつ遺伝子によってコードされるＢ細胞の抗体を産生することもできるハイブリッド細胞、すなわち、「ハイブリドーマ」が生じる。得られるハイブリッドは、単一の抗体の形成のための特異的な遺伝子を含む各々個別の株での選択、希釈、および再増殖によって、単一の遺伝的な株に分離される。これらは、所望の抗原に対して均質であり、それらの純粋な遺伝的血統に関して「モノクローナル」と呼ばれる抗体を産生する。
【０１３８】
典型的には、このように調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない、もとの骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含むことができる好適な培養培地中に播種し、その中で増殖させる。当業者は、ハイブリドーマの形成、選択、および増殖のための試薬、細胞株、および培地が、多くの供給源から市販されており、標準化されたプロトコルが十分に確立されているということを理解するであろう。通常、ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地を、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、または酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）のようなインビトロアッセイによって決定することができる。所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを、限界希釈手順によってサブクローニングし、標準的な方法（Ｇｏｄｉｎｇ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ５９−１０３頁  （１９８６））によって増殖させてもよい。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体を、培養培地、腹水、または血清から、例えば、プロテイン−Ａ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または親和性クロマトグラフィーのような、従来の精製手順によって分離し得るということがさらに理解されるであろう。
【０１３９】
特異的エピトープを認識する抗体断片を公知の技術によって作製してもよい。例えば、Ｆａｂ断片およびＦ（ａｂ’）２断片を、パパイン（Ｆａｂ断片を産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を産生するため）などの酵素を用いて、免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断によって産生してもよい。Ｆ（ａｂ’）２断片は、可変領域、軽鎖定常領域、および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
【０１４０】
当業者は、抗体または抗体断片（例えば、抗原結合部位）をコードするＤＮＡを抗体ファージライブラリーから取得し得るということも理解するであろう。特に、このようなファージを利用して、レパートリー抗体ライブラリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現された抗原結合ドメインをディスプレイさせることができる。関心となる抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて（例えば、標識された抗原、または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉させられた抗原を用いて）選択または同定することができる。これらの方法で使用されるファージは、典型的には、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかのタンパク質に組換えによって融合させられた、Ｆａｂ抗体ドメイン、Ｆｖ抗体ドメイン、またはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するファージから発現されたｆｄ結合ドメインとＭ１３結合ドメインとを含む繊維状ファージである。例示的な方法は、例えば、ＥＰ  ３６８  ６８４  Ｂ１号；米国特許第５，９６９，１０８号、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，  Ｈ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｃｈａｍｅｓ，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１  （２０００）；Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ８：８０１  （２００２）；Ｈｕｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：２６８２  （２００１）；Ｌｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３１５：１０６３  （２００２）に示されており、これらは各々、参照により本明細書に組み入れられる。いくつかの刊行物（例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３  （１９９２））には、鎖シャッフリングによる高親和性ヒト抗体の産生、ならびに大きなファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染およびインビボ組換えが記載されている。別の実施形態において、バクテリオファージの代わりに、ディスプレイプラットフォームとしてリボソームディスプレイを使用することができる（例えば、Ｈａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １８：１２８７  （２０００）；Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９８：３７５０  （２００１）；またはＩｒｖｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：３１  （２００１）を参照されたい）。また別の実施形態において、細胞表面ライブラリーを抗体についてスクリーニングすることができる（Ｂｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７：１０７０１（２０００）；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４３：２１１（２０００））。このような手順によって、モノクローナル抗体の単離とその後のクローニングのための伝統的なハイブリドーマ技術の代替法が提供される。
【０１４１】
ファージディスプレイ法においては、機能的な抗体ドメインが、それらをコードするポリヌクレオチド配列を持つファージ粒子の表面上にディスプレイされる。特に、ＶＨ領域およびＶＬ領域をコードするＤＮＡ配列は、動物のｃＤＮＡライブラリー（例えば、ヒトもしくはマウスの、リンパ系組織のｃＤＮＡライブラリー）から、または合成のｃＤＮＡライブラリーから増幅される。ある実施形態において、ＶＨ領域およびＶＬ領域をコードするＤＮＡは、ＰＣＲでｓｃＦｖリンカーによって１つに接続され、ファージミドベクター（例えば、ｐ  ＣＡＮＴＡＢ  ６またはｐＣｏｍｂ  ３  ＨＳＳ）にクローニングされる。ベクターは大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）にエレクトロポレートされ、大腸菌はヘルパーファージに感染させられる。これらの方法で使用されるファージは、典型的には、ｆｄとＭ１３とを含む繊維状ファージであり、ＶＨ領域またはＶＬ領域は、通常、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかに組換えによって融合されている。関心となる抗原（すなわち、ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドまたはＴｒｋＢポリペプチドまたはその断片）に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて（例えば、標識された抗原、または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉された抗原を用いて）選択または同定することができる。
【０１４２】
抗体を作製するために使用することができるファージディスプレイ法のさらなる例としては、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０  （１９９５）；Ａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６  （１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４：９５２−９５８  （１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  １８７：９−１８  （１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１−２８０  （１９９４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号；  ＰＣＴ公開ＷＯ  ９０／０２８０９号；  ＷＯ  ９１／１０７３７号；  ＷＯ  ９２／０１０４７号；  ＷＯ  ９２／１８６１９号；  ＷＯ  ９３／１１２３６号；  ＷＯ  ９５／１５９８２号；  ＷＯ  ９５／２０４０１号；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３号、および同第５，９６９，１０８号に開示されている方法が挙げられ、これらは各々、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１４３】
上記参考文献に記載されているように、ファージの選択後、ファージ由来の抗体コード領域を単離し、抗体全体（ヒト抗体を含む）、または任意のその他の所望の抗原結合断片を作製するために使用し、任意の所望の宿主（哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む）で発現させることができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２断片を組換えによって産生するための技術も、ＰＣＴ公開ＷＯ  ９２／２２３２４号；Ｍｕｌｌｉｎａｘ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４−８６９  （１９９２）；およびＳａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＪＲＩ  ３４：２６−３４  （１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３  （１９８８）  （該参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）に開示されている方法のような、当技術分野で公知の方法を用いて利用することができる。
【０１４４】
別の実施形態において、本発明の方法で使用される所望のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離し、配列決定し得る。単離され、サブクローニングされたハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡのあり得る供給源としての役割を果たす。ひとたび単離すれば、ＤＮＡを発現ベクターの中に入れてもよく、これは、その後、別の方法で免疫グロブリンを産生することはない原核生物または真核生物の宿主細胞（例えば、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞）にトランスフェクトされる。より具体的には、単離されたＤＮＡ（本明細書に記載されるように合成されたものであり得る）を用いて、１９９５年１月２５日に出願されたＮｅｗｍａｎらの米国特許第５，６５８，５７０号（これは参照により本明細書に組み入れられる）に記載されているような製造抗体のための定常領域および可変領域の配列をクローニングしてもよい。本質的に、これにより、選択された細胞からのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの変換、およびＩｇ特異的プライマーを用いたＰＣＲによる増幅が可能になる。この目的のために好適なプライマーも、米国特許第５，６５８，５７０号に記載されている。以下にさらに詳細に議論されるように、所望の抗体を発現する形質転換細胞を比較的大量に増殖させ、免疫グロブリンの臨床的および商業的な供給を提供し得る。
【０１４５】
特定の実施形態において、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列を、当技術分野で周知である方法によって（例えば、その他の重鎖および軽鎖の可変領域の公知のアミノ酸配列と比較することによって）調べて、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を同定し、配列超可変性の領域を決定してもよい。日常的な組換えＤＮＡ技術を用いて、１つ以上のＣＤＲをフレームワーク領域に、例えば、ヒトのフレームワーク領域に挿入し、非ヒト抗体をヒト化してもよい。フレームワーク領域は、天然のフレームワーク領域、またはコンセンサスフレームワーク領域であってもよく、ヒトフレームワーク領域であってもよい（例えば、ヒトフレームワーク領域のリストについては、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，  ２７８：４５７−４７９（１９９８）を参照されたい）。フレームワーク領域とＣＤＲの組み合わせによって作製されるポリヌクレオチドは、所望のポリペプチド（例えば、ＬＩＮＧＯ−１）の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体をコードしてもよい。１つ以上のアミノ酸置換をフレームワーク領域内に作製してもよく、このアミノ酸置換は、その抗原に対する抗体の結合を向上させ得る。さらに、このような方法を用いて、鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠失を作製し、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合を欠く抗体分子を作製してもよい。ポリヌクレオチドに対するその他の改変が本発明に包含されており、これらは当業者の能力の範囲内である。
【０１４６】
ある実施形態において、本発明に開示される方法で使用されるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはその免疫特異的断片またはＴｒｋＢアゴニスト抗体もしくはその免疫特異的断片は、処置される動物における（例えば、ヒトにおける）有害な免疫応答を誘発しない。１つの実施形態において、本発明に開示される方法で使用されるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはその免疫特異的断片またはＴｒｋＢアゴニスト抗体もしくはその免疫特異的断片は、当技術分野で認識されている技術を用いて、それらの免疫原性を低下させるように修飾することができる。例えば、抗体をヒト化し、霊長類化し、脱免疫化することができ、またはキメラ抗体を作製することができる。これらのタイプの抗体は、もとの抗体の抗原結合特性を保持または実質的に保持するが、ヒトにおいて免疫原性がより少ない非ヒト抗体、典型的には、マウス抗体または霊長類抗体から得られる。これを様々な方法によって達成してもよく、これには、（ａ）キメラ抗体を作製するために、ヒト定常領域上に非ヒト可変ドメインの全体を接合する工程；（ｂ）極めて重要なフレームワーク残基を保持しているかもしくは保持していないヒトのフレームワーク領域および定常領域に１つ以上の非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部を接合する工程；または（ｃ）表面残基の置き換えによって非ヒト可変ドメインの全体を移植する工程であるが、ヒト様部分でそれを「覆い隠す」工程が含まれる。このような方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８１：６８５１−６８５５  （１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４４：６５−９２  （１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６  （１９８８）；  Ｐａｄｌａｎ，  Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎ．  ２８：４８９−４９８  （１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，  Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎ．  ３１：１６９−２１７  （１９９４）、ならびに米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、および同第６，１９０，３７０号に開示されており、これらは全て、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１４７】
脱免疫化を用いて、抗体の免疫原性を減少させることもできる。本明細書で使用される場合、用語「脱免疫化」には、Ｔ細胞エピトープを修飾するための抗体の改変が含まれる（例えば、ＷＯ９８５２９７６Ａ１号、ＷＯ００３４３１７Ａ２号を参照のこと）。例えば、出発抗体に由来するＶＨ配列およびＶＬ配列が解析され、ヒトＴ細胞エピトープが、相補性決定領域（ＣＤＲ）および配列内のその他の重要な残基に関するエピトープの位置を示す各々のＶ領域から「マップ」される。Ｔ細胞エピトープマップからの個々のＴ細胞エピトープは、最終的な抗体の活性を変化させる危険性が低い代替のアミノ酸置換を同定するために解析される。アミノ酸置換の組み合わせを含む代替の様々なＶＨ配列およびＶＬ配列が設計され、これらの配列は、様々な結合ポリペプチド（例えば、本明細書に開示される方法で使用されるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはその免疫特異的断片またはＴｒｋＢアゴニスト抗体もしくはその免疫特異的断片）に実質的に組み込まれ、その後、これは、機能について試験される。典型的には、１２個〜２４個の変異体抗体が作製され、試験される。その後、修飾されたＶ領域およびヒトＣ領域を含む完全な重鎖および軽鎖の遺伝子が、発現ベクターにクローニングされ、次に、プラスミドが抗体全体の産生のために細胞株に導入される。その後、抗体は、適当な生化学的アッセイおよび生物学的アッセイで比較され、最適な変異体が同定される。
【０１４８】
キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子（例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリンの定常領域とを有する抗体）である。キメラ抗体を産生する方法は当技術分野で公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２  （１９８５）；Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４  （１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２  （１９８９）；米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６３９７号を参照されたく、これらは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。ヒト化抗体は、非ヒト種に由来する１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域とを有する、所望の抗原に結合する非ヒト種由来の抗体分子である。多くの場合、ヒトフレームワーク領域中のフレームワーク残基をＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基と置換し、抗原結合を変化させ、かつ抗原結合を潜在的に向上させる。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法によって（例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲ残基とフレームワーク残基の相互作用のモデリング、および特定の位置の非正規フレームワーク残基を同定するための配列比較によって）同定される。（例えば、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３  （１９８８）を参照されたく、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。）抗体は、例えば、ＣＤＲの接合（欧州特許第２３９，４００；ＰＣＴ公開ＷＯ  ９１／０９９６７号；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号；および同第５，５８５，０８９号）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）または新しい表面を作ること（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第ＥＰ  ５９２，１０６号；欧州特許第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９−４９８  （１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３  （１９９４））、ならびに鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む、当技術分野で公知の種々の技術を用いてヒト化することができる。
【０１４９】
組換え抗体を産生するためのまた別の極めて効率的な手段は、Ｎｅｗｍａｎ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：  １４５５−１４６０  （１９９２）によって開示されている。具体的には、この技術によって、サルの可変ドメインとヒトの定常配列を含む霊長類化抗体の作製がもたらされる。この参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。さらに、この技術は、同一出願人による米国特許第５，６５８，５７０号、同第５，６９３，７８０号、および同第５，７５６，０９６号にも記載されており、これらは各々、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１５０】
完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置に特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用する上記のファージディスプレイ法を含む当技術分野で公知の種々の方法によって作製することができる。米国特許第４，４４４，８８７号、および第４，７１６，１１１号；ならびにＰＣＴ公開ＷＯ  ９８／４６６４５号、ＷＯ  ９８／５０４３３号、ＷＯ  ９８／２４８９３号、ＷＯ  ９８／１６６５４号、ＷＯ  ９６／３４０９６号、ＷＯ  ９６／３３７３５号、およびＷＯ  ９１／１０７４１号も参照されたく、これらは各々、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１５１】
ヒト抗体は、機能的な内因性免疫グロブリンを発現することはできないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて産生することもできる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖の免疫グロブリン遺伝子複合体を、マウスの胚性幹細胞に、ランダムにまたは相同組換えによって導入し得る。あるいは、ヒトの可変領域、定常領域、および多様性領域を、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、マウスの胚性幹細胞に導入し得る。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは別々に、またはこれと同時に、機能しないようにし得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合型欠失によって、内因性の抗体の産生が妨げられる。修飾された胚性幹細胞を拡大し、胚盤胞にマイクロインジェクションして、キメラマウスを産生する。その後、キメラマウスを交配させ、ヒト抗体を発現するホモ接合型子孫を産生する。トランスジェニックマウスは、選択された抗原（例えば、所望の標的ポリペプチドの全体または一部）を用いて、通常の方法で免疫化される。抗原に対するモノクローナル抗体は、免疫化されたトランスジェニックマウスから、従来のハイブリドーマ技術を用いて得ることができる。トランスジェニックマウスが持つヒト免疫グロブリントランス遺伝子は、Ｂ細胞分化の間に再配置され、その後、クラススイッチおよび体細胞突然変異を受ける。したがって、このような技術を用いて、治療的に有用なＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体、およびＩｇＥ抗体を産生することが可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ  Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術、ならびにこのような抗体を産生するためのプロトコルの詳細な議論については、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ  ９８／２４８９３号；ＷＯ  ９６／３４０９６号；ＷＯ  ９６／３３７３５号；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；および同第５，９３９，５９８号を参照されたく、これらは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，  Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，  Ｃａｌｉｆ．）およびＧｅｎＰｈａｒｍ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  Ｃａｌｉｆ．）などの会社は、上記の技術と同様の技術を用いて、選択された抗原に対するヒト抗体を提供することに従事することができる。
【０１５２】
ＳＣＩＤマウスを用いてヒト抗体を作製する別の手段は、米国特許第５，８１１，５２４号に開示されており、これは、参照により本明細書に組み入れられる。これらのヒト抗体と関連する遺伝物質も、本明細書に記載されるように単離し、操作し得るということが明らかであろう。
【０１５３】
選択されたエピトープを認識する完全なヒト抗体を、「ガイドされた選択」と呼ばれる技術を用いて作製することができる。このアプローチにおいて、選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）は、同じエピトープを認識する完全なヒト抗体の選択を導くために使用される（Ｊｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３（１９８８））。米国特許第５，５６５，３３２号も参照されたい。
【０１５４】
あるいは、単鎖抗体の産生について記載されている技術（米国特許第４，６９４，７７８号；Ｂｉｒｄ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４４２  （１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３  （１９８８）；およびＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５５４  （１９８９））を適合させて、単鎖抗体を産生することができる。単鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖断片と軽鎖断片を連結させ、単鎖抗体を生じさせることによって形成される。機能的なＦｖ断片を大腸菌内で組み立てるための技術も使用し得る（Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８−１０４１  （１９８８））。単鎖Ｆｖおよび単鎖抗体を産生するのに使用することができる技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６−８８  （１９９１）；Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  ９０：７９９５−７９９９  （１９９３）；ならびにＳｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４０  （１９８８）に記載されている技術が挙げられる。特に、ヒトにおける抗体のインビボ使用およびインビトロ検出アッセイを含む、いくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体を使用することができる。
【０１５５】
さらに、適切な生物学的活性のヒト抗体分子に由来する遺伝子と一緒に、適切な抗原特異性のマウス抗体分子に由来する遺伝子をスプライシングすることによって「キメラ抗体」を産生するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８１：８５１−８５５  （１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８  （１９８４）；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４  （１９８５））を使用することができる。本明細書で使用される場合、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子（例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリンの定常領域とを有する抗体（例えば、ヒト化抗体））である。
【０１５６】
また、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体またはＴｒｋＢアゴニスト抗体は、内因性免疫グロブリンの産生ができないトランスジェニック動物（例えば、マウス）で作製されたヒトまたは実質的にヒトの抗体であってもよい（例えば、米国特許第６，０７５，１８１号、同第５，９３９，５９８号、同第５，５９１，６６９号、および同第５，５８９，３６９号（これらは各々、参照により本明細書に組み入れられる）を参照のこと）。例えば、キメラの、生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖接続領域のホモ接合型欠失によって、内因性抗体産生が完全に阻害がされることが記載されている。ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを、このような生殖系列突然変異体マウスに移入することによって、抗原チャレンジの際に、ヒト抗体の産生が生じる。
【０１５７】
別の実施形態において、リンパ球を顕微操作によって選択し、可変遺伝子を単離することができる。例えば、末梢血単核細胞を、免疫化した哺乳動物から単離し、インビトロで約７日間培養することができる。この培養物を、スクリーニング基準を満たす特異的ＩｇＧについてスクリーニングすることができる。陽性のウェルに由来する細胞を単離することができる。個々のＩｇ産生Ｂ細胞を、ＦＡＣＳによるかまたは補体媒介性の溶血プラークアッセイでそれらを同定することによって単離することができる。Ｉｇ産生Ｂ細胞を、顕微操作してチューブに入れることができ、ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子を、例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅することができる。このＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子を抗体発現ベクターにクローニングし、発現のための細胞（例えば、真核細胞または原核細胞）にトランスフェクトすることができる。
【０１５８】
あるいは、抗体産生細胞株を、当業者に周知の技術を用いて選択し、培養してもよい。このような技術は、種々の研究室用マニュアルおよび主要な刊行物に記載されている。この点において、以下に記載される本発明で使用するのに好適な技術は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  編．，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９１）  に記載されており、これは、補遣を含むその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１５９】
本明細書に開示される方法で使用される抗体を、抗体の合成（具体的には、化学合成）のための当技術分野で公知の任意の方法によるかまたは本明細書に記載されている組換え発現技術によって産生することができる。
【０１６０】
本発明の範囲は、抗原結合ＤＮＡ配列のアレル、変異体、および突然変異の全てをさらに包含するということが理解されるであろう。
【０１６１】
周知の通り、ＲＮＡは、標準的な技術（例えば、グアニジンイソチオシアネート抽出および沈殿と、その後の遠心分離またはクロマトグラフィー）によって、もとのハイブリドーマ細胞からまたはその他の形質転換細胞から単離し得る。望ましい場合、ｍＲＮＡは、標準的な技術（例えば、オリゴｄＴセルロース上でのクロマトグラフィー）によってトータルＲＮＡから単離し得る。好適な技術は当技術分野でよく知られている。
【０１６２】
１つの実施形態において、本発明の方法で使用される抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、周知の方法に従って、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼとを用いて、同時にまたは別々にのいずれかで、作製し得る。ＰＣＲは、コンセンサス定常領域プライマーによるかまたは公開されている重鎖および軽鎖のＤＮＡ配列ならびにアミノ酸配列に基づくより特異的なプライマーによって開始させ得る。上で議論されているように、ＰＣＲは、抗体の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離するためにも使用し得る。この場合、ライブラリーは、コンセンサスプライマーまたはより大きな相同プローブ（例えば、マウス定常領域プローブ）によってスクリーニングし得る。
【０１６３】
ＤＮＡ（典型的にはプラスミドＤＮＡ）を、当技術分野で公知の技術を用いて細胞から単離し、例えば、組換えＤＮＡ技術に関する前述の参考文献に詳細に示されている標準的な周知の技術に従って、制限マップし、配列決定してもよい。もちろん、ＤＮＡを、単離のプロセスまたはその後の解析の間の任意の時点で、本発明に従って合成してもよい。
【０１６４】
抗体、またはその断片、誘導体、もしくは類似体（例えば、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストもしくはＴｒｋＢアゴニストである抗体の重鎖もしくは軽鎖）の組換え発現には、抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築が必要である。一旦、本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖もしくはその一部（重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインを含み得る）をコードするポリヌクレオチドが得られると、抗体分子を産生するためのベクターを、当技術分野で周知の技術を用いた組換えＤＮＡ技術によって産生し得る。このように、抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現させることによってタンパク質を調製する方法が、本明細書に記載される。当業者に周知である方法を用いて、抗体をコードする配列、ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、インビトロでの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボでの遺伝子組換えが挙げられる。したがって、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体分子、またはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ８６／０５８０７号；ＰＣＴ公開ＷＯ８９／０１０３６号；および米国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと）を含んでもよく、抗体の可変ドメインが、重鎖または軽鎖全体の発現のためのそのようなベクターにクローニングされてもよい。
【０１６５】
発現ベクターを従来技術によって宿主細胞に移入し、その後、トランスフェクトされた細胞を従来技術によって培養し、本明細書に記載される方法で使用される抗体を産生させる。したがって、本発明には、異種プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体、またはその重鎖もしくは軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞が含まれる。二本鎖抗体の発現についてのある実施形態においては、重鎖と軽鎖の両方をコードするベクターを、以下に詳細に記載されるように、免疫グロブリン分子全体の発現のための宿主細胞で共発現させてもよい。
【０１６６】
種々の宿主発現ベクター系を利用して、本明細書の他の場所に記載されている方法で使用される抗体分子を発現させてもよい。
【０１６７】
第１のベクターが重鎖由来のポリペプチドをコードし、第２のベクターが軽鎖由来のポリペプチドをコードする、本発明の２つの発現ベクターを、宿主細胞に共トランスフェクトしてもよい。２つのベクターは、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの同等の発現を可能にする同一の選択マーカーを含んでもよい。あるいは、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの両方をコードする単一のベクターを使用してもよい。そのような状況では、毒性のない重鎖が過剰になるを避けるために、軽鎖を重鎖の前に有利に配置する（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５２（１９８６）；  Ｋｏｈｌｅｒ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：２１９７  （１９８０））。重鎖および軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含んでもよい。
【０１６８】
本発明の抗体分子が組換えによって発現されると、これは、免疫グロブリン分子の精製のための当技術分野で公知の任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（特に、プロテインＡの後の特異的抗原に対する親和性によるもの）、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度によるかまたはタンパク質の精製のための任意のその他の標準的な技術により精製し得る。あるいは、本発明の抗体の親和性を増大させるための別の方法は、ＵＳ  ２００２  ０１２３０５７  Ａ１号に開示されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。
【０１６９】
１つの実施形態において、本発明の方法で使用される結合分子または抗原結合分子は、１つ以上のドメインが部分的または完全に欠失している合成の定常領域を含む（「ドメイン欠失抗体」）。ある実施形態において、適合する修飾抗体は、ＣＨ２ドメイン全体が除去されているドメイン欠失コンストラクトまたは変異体（ΔＣＨ２コンストラクト）を含む。その他の実施形態については、短い接続ペプチドを欠失したドメインに置き換えて、可変領域の動きに柔軟性および自由を与えてもよい。当業者は、抗体の代謝速度に対するＣＨ２ドメインの調節特性の理由から、このようなコンストラクトが特に有用であるということを理解するであろう。
【０１７０】
ある実施形態において、本明細書に開示される方法で使用される修飾抗体は、ミニボディーである。ミニボディーは当技術分野で記載されている方法を用いて作製することができる（例えば、米国特許５，８３７，８２１号、またはＷＯ  ９４／０９８１７  Ａ１号を参照されたい）。
【０１７１】
別の実施形態において、本明細書に開示される方法で使用される修飾抗体は、当技術分野で公知であるＣＨ２ドメイン欠失抗体である。ドメイン欠失コンストラクトは、ＩｇＧ１ヒト定常ドメインをコードするベクター（例えば、Ｂｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）を用いて得ることができる（例えば、参照により本明細書に組み入れられるＷＯ０２／０６０９５５Ａ２号およびＷＯ０２／０９６９４８Ａ２号を参照のこと）。この例示的なベクターは、ＣＨ２ドメインを欠失させ、ドメイン欠失ＩｇＧ１定常領域を発現する合成ベクターを提供するために改変された。
【０１７２】
１つの実施形態において、本明細書に開示される方法で使用されるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはその断片またはＴｒｋＢアゴニスト抗体もしくはその断片は、単量体サブユニット間で会合することができる限り、数個、もしくはさらには１個のアミノ酸の欠失または置換を有する免疫グロブリン重鎖を含む。同様に、調整されるエフェクター機能（例えば、補体結合）を制御する１つ以上の定常領域ドメインの一部を単に欠失させることが望ましい場合もある。定常領域のこのような部分欠失は、本定常領域ドメインと関連するその他の望ましい機能を完全なままにしながらも、抗体の選択される特徴（血清半減期）を向上させ得る。さらに、上で指摘されているように、開示される抗体の定常領域は、得られるコンストラクトのプロファイルを増強させる１つ以上のアミノ酸の突然変異または置換によって合成され得る。この点において、修飾された抗体の立体配置および免疫原性プロファイルを実質的に維持しながらも、保存された結合部位によって提供される活性（例えば、Ｆｃ結合）を破壊することが可能であり得る。またその他の実施形態は、望ましい特徴（例えば、エフェクター機能）を増強させるための、またはより多くの細胞毒素もしくは炭水化物の結合を提供するための定常領域への１つ以上のアミノ酸の付加を含む。このような実施形態において、選択される定常領域ドメインに由来する特異的配列を挿入するかまたは複製することが望ましい場合がある。
【０１７３】
本発明は、本明細書に記載される抗体分子（例えば、ＶＨ領域および／もしくはＶＬ領域）の変異体（誘導体を含む）を含むか、本質的に該変異体からなるか、または該変異体からなる抗体の使用も提供する。この抗体またはその断片は、ＬＩＮＧＯ−１またはＴｒｋＢポリペプチドに免疫特異的に結合する。アミノ酸置換を生じる部位特異的突然変異導入およびＰＣＲによって媒介される突然変異導入を含むが、これらに限定されない、当業者に公知の標準的な技術を用いて、結合分子をコードするヌクレオチド配列に突然変異を導入することができる。変異体（誘導体を含む）は、参照となるＶＨ領域、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬ領域、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、またはＶＬＣＤＲ３と比べて、５０個未満のアミノ酸の置換、４０個未満のアミノ酸緒置換、３０個未満のアミノ酸の置換、２５個未満のアミノ酸の置換、２０個未満のアミノ酸の置換、１５個未満のアミノ酸の置換、１０個未満のアミノ酸の置換、５個未満のアミノ酸の置換、４個未満のアミノ酸の置換、３個未満のアミノ酸の置換、または２個未満のアミノ酸の置換をコードすることができる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられている置換である。類似の電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、電荷を持たない極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。あるいは、突然変異は、コード配列の全体または一部に沿ってランダムに（例えば、飽和突然変異導入によって）導入することができ、得られる突然変異体を生物学的活性についてスクリーニングして、活性を保持する突然変異体を同定することができる。
【０１７４】
例えば、抗体分子のフレームワーク領域だけまたはＣＤＲ領域だけに突然変異を導入することが可能である。導入される突然変異は、サイレント突然変異または中性のミスセンス突然変異であってよく、すなわち、抗原に結合する抗体の能力に対して全く影響を及ぼさないかほとんど影響を及ぼさないものであってよい。これらのタイプの突然変異は、コドン使用を最適化するのに、またはハイブリドーマの抗体産生を向上させるのに有用であり得る。あるいは、非中性のミスセンス変異によって、抗原に結合する抗体の能力が変化する場合がある。ほとんどのサイレント突然変異または中性のミスセンス突然変異の位置がフレームワーク領域にある可能性が高いのに対し、ほとんどの非中性のミスセンス変異の位置はＣＤＲにある可能性が高い。とはいえ、これは絶対条件ではない。当業者であれば、抗原結合活性が変化していないことまたは結合活性が変化していないこと（例えば、抗原結合活性の向上または抗体特異性の変化）のような所望の特性を有する突然変異体分子を設計し、試験することができるであろう。突然変異導入の後、コードされるタンパク質を日常的に行われているように発現させてもよく、コードされるタンパク質の機能的活性および／または生物学的活性を、本明細書に記載されている技術を用いて、または当技術分野で公知の技術を日常的に行なわれているように修正することによって決定することができる。
【０１７５】
本発明の方法で使用されるさらなるアンタゴニストおよびアゴニストおよびその組み合わせ
先に記載されたアゴニストおよびアンタゴニストに加えて、本発明の方法で使用されるさらなるＴｒｋＢアゴニストには、ＴｒｋＢの活性を促進するか、増大させるか、もしくは増強させる任意のポリペプチド、抗体、化合物、またはヌクレオチドが含まれる。このようなアゴニストには、ＴｒｋＢリガンド（例えば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ））のＴｒｋＢ受容体への結合に干渉するかまたはこの結合を促進し、そのようなものとしてＢＤＮＦアゴニストとも見なされるポリペプチド、抗体、化合物、またはヌクレオチドが含まれる。このような分子としては、リガンドとＴｒｋＢの間の相互作用を破壊する抗体、ＴｒｋＢのペプチド模倣体アゴニスト、ならびにリガンド類似体（例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、５，７７０，５７７号、６，０７７，８２９号、６，７２３，７０１号、および６，８００，６０７号に記載されている類似体）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７６】
本発明の方法で使用される本明細書に記載されるアンタゴニストおよびアゴニストを、組成物として様々な組み合わせで投与してもよい。例えば、様々なＴｒｋＢアゴニストをＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストと組み合わせて使用してもよい。本発明の方法で使用される組成物には、複数のＴｒｋＢアゴニストおよび／またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストも含まれてよい。
【０１７７】
さらに、本発明の方法で使用される組成物には、ＣＮＳで発現されるタンパク質（例えば、Ｎｏｇｏ受容体１（ＮｇＲ１）、ＬＩＮＧＯ−１（ＬＩＮＧＯ−１）、ＴＡＪ、またはオリゴデンドロサイト−ミエリン糖タンパク質（ＯＭｇｐ））のその他のアンタゴニストまたはアゴニストが含まれてもよい。ＮｇＲ１のアンタゴニストは、米国公開第２００２／００７７２９５号および第２００５／０２７１６５５  Ａ１号、ならびに国際出願公開ＷＯ  ０１／５１５２０号、ＷＯ  ０３／０３１４６２号、ＷＯ  ２００４／０１４３１１号、およびＷＯ  ２００５／０１６９５５号に記載されており、これらは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。ＬＩＮＧＯ−１（ＬＩＮＧＯ−１）のアンタゴニストは、米国公開第２００６／０００９３８８  Ａ１号および国際公開ＷＯ  ２００４／０８５６４８号に見出され得、これらは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。ＴＡＪアンタゴニストの例は、米国公開第２００６／００５８２２３  Ａ１号に記載されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。ＯＭｇｐアンタゴニストは、米国仮出願第６０／７３０，３５７号および第６０／７３５，１７０号に記載されており、これらは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。本発明の方法で使用される組成物には、任意の数および組み合わせのＴｒｋＢアンタゴニスト、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト、ＮｇＲ１アンタゴニスト、ＴＡＪアンタゴニスト、およびＯＭｇｐアンタゴニストも含まれてよい。
【０１７８】
アプタマー
別の実施形態において、本発明の方法で使用されるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストまたはＴｒｋＢアゴニストはアプタマーである。アプタマーは、固有の配列を有し、所望の標的（例えば、ポリペプチド）に特異的に結合する特性を有し、かつ所与の標的の特異的リガンドであるヌクレオチドまたはポリペプチドであることができる。本発明のヌクレオチドアプタマーには、ＬＩＮＧＯ−１またはＴｒｋＢに結合する二本鎖ＤＮＡ分子および一本鎖ＲＮＡ分子が含まれる。
【０１７９】
核酸アプタマーは、当技術分野で公知の技術を用いて（例えば、指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化（ＳＥＬＥＸ）プロセスによって）選択される。ＳＥＬＥＸは、米国特許第５，４７５，０９６号、同第５，５８０，７３７号、同第５，５６７，５８８号、同第５，７０７，７９６号、同第５，７６３，１７７号、同第６，０１１，５７７号、および同第６，６９９，８４３号（これらは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載されているような標的分子に対する極めて特異的な結合を有する核酸分子のインビトロ進化のための方法である。アプタマーを同定するための別のスクリーニング法は、米国特許第５，２７０，１６３号に記載されており、これも参照により本明細書に組み入れられる。ＳＥＬＥＸプロセスは、核酸が種々の二次元構造および三次元構造、ならびにヌクレオチド単量体内部で利用可能な化学的多用途性を形成して、その他の核酸分子およびポリペプチドを含む、ほとんど全ての化学的化合物（単量体であるかポリマーであるかを問わない）のリガンドとして作用する（リガンドとの特異的な結合対を形成する）能力に基づいている。任意のサイズまたは組成の分子が、標的としての役割を果たすことができる。
【０１８０】
ＳＥＬＥＸ法は、所望の結合親和性および選択性を達成するために、同じ一般的選択スキームを用いて、候補オリゴヌクレオチドの混合物から選択すること、ならびに結合、分配、および増幅を段階的に反復することを含む。核酸の混合物（ランダム化配列の断片を含むことができる）から出発し、ＳＥＬＥＸ法は、結合に好都合な条件下でこの混合物を標的と接触させる工程；標的分子に特異的に結合した核酸から結合していない核酸を分配する工程；核酸−標的複合体を解離させる工程；核酸−標的複合体から解離した核酸を増幅してリガンドが濃縮された核酸混合物を生じさせる工程を含む。標的分子に対して極めて特異的な高親和性核酸リガンドを得るのに望ましい回数だけ、これらの結合、分配、解離、および増幅の工程を繰り返す。
【０１８１】
ヌクレオチドアプタマーを、例えば、診断ツールとしてまたは特異的阻害剤として用いて、細胞内シグナル伝達および輸送経路を細かく調べることができる。Ｊａｍｅｓ  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １：５４０−５４６  （２００１）を参照されたい。ヌクレオチドアプタマーは親和性および特異性が高いので、ヌクレオチドアプタマーは薬物発見の良好な候補となっている。例えば、リシン毒素に対するアプタマーンタゴニストが単離されており、これはナノモル範囲のＩＣ５０値を有する。Ｈｅｓｓｅｌｂｅｒｔｈ  ＪＲ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：４９３７−４９４２  （２０００）を参照されたい。また、ヌクレオチドアプタマーを、感染性疾患、悪性腫瘍、およびウイルス表面タンパク質に対して用いて、細胞の感染性を低下させてもよい。
【０１８２】
本発明の方法で使用されるヌクレオチドアプタマーを、その他のポリヌクレオチドについて本明細書に記載されているように（例えば、骨格もしくは塩基を修飾することによるかまたはペプチドに結合体化することによって）修飾してもよい。
【０１８３】
ＬＩＮＧＯ−１またはＴｒｋＢのタンパク質構造を用いると、ＳＥＬＥＸプロセスを用いてＬＩＮＧＯ−１またはＴｒｋＢに作用するアプタマーをスクリーニングすることにより、ＬＩＮＧＯ−１媒介性のプロセスを阻害するかまたはＴｒｋＢ媒介性のプロセスを促進するアプタマーの同定が可能になるであろう（これらのプロセスは、例えば、ＬＩＮＧＯ−１またはＴｒｋＢ媒介性の細胞生存の促進である）。
【０１８４】
本発明の方法で使用されるポリペプチドアプタマーは、ＬＩＮＧＯ−１に結合し、その作用を阻止する能力について選択されたランダムペプチドである。ポリペプチドアプタマーには、両端でタンパク質骨格に結合している短い可変ペプチドドメインが含まれてもよい。この二重の構造的拘束により、ペプチドアプタマーの結合親和性は、抗体の結合親和性に匹敵するレベル（ナノモル範囲）まで大いに増大する。例えば、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ７８（８）：４２６−４３０  （２０００）を参照されたい。短い可変ペプチドの長さは、典型的には、約１０〜２０アミノ酸であり、骨格は、良好な溶解性および緻密度（ｃｏｍｐａｃｉｔｙ）特性を有する任意のタンパク質であってもよい。骨格タンパク質の１つの非限定的な例は、大腸菌タンパク質チオレドキシン−Ａである。例えば、Ｃｏｈｅｎ  ＢＡ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＮＡＳ  ９５（２４）：  １４２７２−１４２７７  （１９９８）を参照されたい。本発明の方法で使用されるポリペプチドアプタマーのさらなる非限定的な例は、リガンド調節性のペプチドアプタマー（ＬｉＲＰＡ）である。ＬｉＲＰＡ骨格は、３つのタンパク質ドメイン：ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）、ＦＲＢＰ−ラパマイシン結合ドメイン（ＦＲＢ）、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）から構成され得る。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Ｂｉｎｋｏｗｓｋｉ  ＢＦ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ  ＆  Ｂｉｏｌ  １２（７）：  ８４７−  ８５５  （２００５）を参照されたい。
【０１８５】
ポリペプチドアプタマーは、タンパク質機能の最も有力な阻害剤として作用するペプチドまたは小ポリペプチドである。ペプチドアプタマーは、標的タンパク質に特異的に結合し、それらの機能的能力を阻止する。Ｋｏｌｏｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９５：  １４，２６６−１４，２７１  （１９９８）。高い親和性および特異性で標的タンパク質に結合するペプチドアプタマーは、当技術分野で公知の種々の技術によって単離することができる。ペプチドアプタマーは、酵母ツー・ハイブリッドスクリーン（Ｘｕ，  Ｃ．Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９４：１２，４７３−１２，４７８  （１９９７））によるかまたはリボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９４：４９３７−４９４２  （１９９７））によって、ランダムなペプチドライブラリーから単離することができる。ペプチドアプタマーは、ファージライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，  Ｈ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：１−２０  （１９９８））または化学的に生成されたペプチドライブラリーからも単離することができる。ペプチドアプタマーを合成する手段が難しいために、これらの使用はポリヌクレオチドアプタマーよりも複雑になるが、ペプチドアプタマーは無限の化学的多様性を有する。
【０１８６】
本発明の方法で使用されるペプチドアプタマーを、その他のポリペプチドについて本明細書の他の場所で記載されているように修飾（例えば、ポリマーに結合体化またはタンパク質に融合）してもよい。
【０１８７】
融合タンパク質ならびに結合体化されたポリペプチド、アプタマー、化合物、および抗体
本明細書に開示される方法で使用されるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドまたはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーまたはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト化合物またはＴｒｋＢアゴニスト化合物、およびＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体またはＴｒｋＢアゴニスト抗体をさらに、異種ポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端に組換えによって融合するか、またはポリペプチドもしくはその他の組成物に化学的に結合体化（共有結合および非共有結合を含む）してもよい。例えば、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストまたはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーまたはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト化合物またはＴｒｋＢアゴニスト化合物、およびＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体またはＴｒｋＢアゴニスト抗体を、検出アッセイにおける標識として有用な分子およびエフェクター分子（例えば、異種ポリペプチド、薬物、放射性核種、または毒素）に組換えによって融合させるかまたは結合体化してもよい。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ  ９２／０８４９５号；ＷＯ  ９１／１４４３８号；ＷＯ  ８９／１２６２４号；米国特許第５，３１４，９９５号；および欧州特許第３９６，３８７号を参照されたい。
【０１８８】
本明細書に開示される方法で使用されるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドまたはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーまたはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト化合物またはＴｒｋＢアゴニスト化合物、およびＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体またはＴｒｋＢアゴニスト抗体には、すなわち、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト化合物もしくはＴｒｋＢアゴニスト化合物、またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体によるＬＩＮＧＯ−１またはＴｒｋＢの生物学的機能の阻害が共有結合によって妨げられるように、任意の種類の分子の共有結合によって修飾されている誘導体が含まれる。限定としてではなく、例として、本発明のＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドまたはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーまたはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト化合物またはＴｒｋＢアゴニスト化合物、およびＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体またはＴｒｋＢアゴニスト抗体を、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞性リガンドまたはその他のタンパク質との会合などによって、修飾してもよい。多くの化学修飾をいずれも、特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などを含むが、これらに限定されない、公知の技術によって実行してもよい。さらに、誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含んでもよい。
【０１８９】
本明細書に開示される方法で使用されるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドまたはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーまたはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト化合物またはＴｒｋＢアゴニスト化合物、およびＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体またはＴｒｋＢアゴニスト抗体は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合（すなわち、ペプチド同配体）によって互いに接続されているアミノ酸から構成されることができ、遺伝子にコードされる２０個のアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドまたはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーまたはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、およびＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体またはＴｒｋＢアゴニスト抗体は、自然なプロセス（例えば、翻訳後処理）によって、または当技術分野で周知である化学修飾技術によって修飾してもよい。このような修飾は、基礎的な教科書およびより詳細な論文、ならびに大量の研究文献に十分記載されている。修飾は、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチドもしくはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体（ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端もしくはカルボキシル末端を含む）の、または炭水化物などの部分の、いかなる場所でも生じることができる。同じ種類の修飾が、所与のＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体のいくつかの部位に同じ程度または異なる程度で存在し得るということが理解されよう。また、所与のＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体は、多種類の修飾を含んでもよい。ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体は、例えば、ユビキチン化の結果として、分岐状であってもよく、分岐の有無にかかわらず、環状であってもよい。環状、分岐状、および分岐環状のＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドまたはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーまたはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、およびＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体またはＴｒｋＢアゴニスト抗体は、翻訳後の自然のプロセスから結果として得られてもよく、または合成法によって作製されてもよい。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合的架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質への転移ＲＮＡ媒介型のアミノ酸付加（例えば、アルギニン化）、およびユビキチン化が挙げられる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  −  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｔ．  Ｅ．  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  第２版，  （１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｂ．  Ｃ．  Ｊｏｈｎｓｏｎ  編，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １−１２頁  （１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ，  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−６４６．（１９９０）；Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３：  ４８−６２  （１９９２）を参照のこと）。
【０１９０】
本発明は、ＬＩＮＧＯ−１機能を阻害するかもしくは減少させる、またはＴｒｋＢ機能を増大させるかもしくは促進する、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体融合体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体融合体を含むか、本質的にこれらからなるか、またはこれらからなる融合タンパク質も提供する。いくつかの実施形態において、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体が融合している異種ポリペプチドは、機能のために有用であるか、またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチドもしくはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体を標的するのに有用である。本発明のある実施形態において、例えば、ＢＤＮＦポリペプチドを異種ポリペプチド部分に融合して、ＴｒｋＢアゴニスト融合ポリペプチドを形成させるように、可溶性ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドまたはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド（例えば、ＬＲＲドメイン、Ｉｇドメイン、または（配列番号：２のアミノ酸３４〜５３２に対応する）細胞外ドメイン全体を含むＬＩＮＧＯ−１ポリペプチド）を異種ポリペプチド部分に融合して、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト融合ポリペプチドまたはＴｒｋＢアゴニストポリペプチドを形成させる。ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト融合タンパク質またはＴｒｋＢアゴニスト融合タンパク質、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーまたはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、およびＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体またはＴｒｋＢアゴニスト抗体を用いて、様々な目的（例えば、血清半減期の増大、バイオアベイラビリティーの向上、特異的な器官または組織型へのインビボ標的化、組換え発現効率の向上、宿主細胞による分泌の向上、精製の容易さ、およびより高い結合力）を果たすことができる。達成されるべき目的によって、異種部分は、不活性であることもできまたは生物学的活性があることもできる。また、異種部分は、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、もしくはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体に安定に融合されるように、またはインビトロもしくはインビボで切断可能であるように、選択することができる。これらのその他の目的を果たす異種部分は、当技術分野で公知である。
【０１９１】
ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト融合ポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニスト融合ポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体の発現の代わりとして、選定された異種部分を前形成させ、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体に化学的に結合体化することができる。多くの場合、選定された異種部分は、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体に融合されていようと、結合体化されていようと、同じように機能するであろう。それゆえに、異種アミノ酸配列についての以下の議論においては、別途言及されない限り、異種配列は、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体に、融合タンパク質の形態でまたは化学的結合体として接続することができるということが理解されるべきである。
【０１９２】
薬理学的活性のあるポリペプチド（例えば、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体）は、しばしば、迅速なインビボクリアランスを示し、体内での治療的有効濃度を達成するために多くの用量を必要とする。さらに、約６０ｋＤａよりも小さいポリペプチドは、糸球体濾過を受ける可能性があり、これは、時として腎毒性を引き起こす。比較的小さいポリペプチド（例えば、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体）の融合または結合を利用して、このような腎毒性の危険性を低下させるかまたは回避することができる。治療的ポリペプチドのインビボ安定性（すなわち、血清半減期）を増大させるための、様々な異種アミノ酸配列（すなわち、ポリペプチド部分または「担体」）は公知である。
【０１９３】
半減期が長く、インビボ分布が広く、酵素的機能または免疫学的機能が欠如しているという理由から、本質的に全長のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはＨＳＡ断片が、異種部分としてよく使用される。Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：  １９０４−０８  （１９９２）およびＳｙｅｄ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｌｏｏｄ  ８９：３２４３−５２  （１９９７）に教示されている方法および材料のような方法および材料を適用することにより、ＨＳＡを用いて、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト融合ポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニスト融合ポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体、またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチド／抗体結合体もしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド／抗体結合体を形成させることができる。これは、ＬＩＮＧＯ−１部分またはＴｒｋＢアゴニスト部分によって薬理学的活性を示しながら、一方で、顕著に増大した（例えば、１０倍〜１００倍より高い）インビボ安定性を示す。ＨＳＡのＣ末端を、可溶性ＬＩＮＧＯ−１部分またはＴｒｋＢアゴニスト部分のＮ末端に融合することができる。ＨＳＡは天然に分泌されているタンパク質なので、融合タンパク質を真核生物（例えば、哺乳動物）の発現系で産生させるときに、ＨＳＡシグナル配列を利用して、可溶性ＬＩＮＧＯ−１融合タンパク質またはＴｒｋＢアゴニスト融合タンパク質を培養培地中に分泌させることができる。
【０１９４】
ある実施形態において、本発明の方法で使用されるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドまたはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーまたはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト化合物またはＴｒｋＢアゴニスト化合物、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体またはＴｒｋＢアゴニスト抗体、およびその抗体断片は、標的化部分をさらに含む。標的化部分には、身体のある部分（例えば、脳またはその中のコンパートメント）への局在化を導くタンパク質またはペプチドが含まれる。ある実施形態において、本発明の方法で使用されるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト化合物もしくはＴｒｋＢアゴニスト化合物、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはその抗体断片、またはＴｒｋＢアゴニスト抗体もしくはその抗体断片を、脳標的化部分に結合または融合させる。脳標的化部分を、共有結合的に（例えば、直接的な、翻訳による融合、もしくは直接的かもしくはスペーサー分子（任意で切断可能であり得る）を介するかのいずれかの化学的連結によって）結合させるか、または非共有結合的に（例えば、アビジン、ビオチン、プロテインＡ、ＩｇＧなどの可逆的相互作用を通じて）結合させる。その他の実施形態において、本発明の方法で使用されるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト化合物もしくはＴｒｋＢアゴニスト化合物、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはその抗体断片、またはＴｒｋＢアゴニスト抗体もしくはその抗体断片を、１つ以上の脳標的化部分に結合させる。さらなる実施形態において、脳標的化部分を、複数の、本発明の方法で使用されるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト化合物もしくはＴｒｋＢアゴニスト化合物、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはその抗体断片、またはＴｒｋＢアゴニスト抗体もしくはその抗体断片に結合させる。
【０１９５】
ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト化合物もしくはＴｒｋＢアゴニスト化合物、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはその抗体断片、またはＴｒｋＢアゴニスト抗体もしくはその抗体断片と関連する脳標的化部分は、そのようなＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト化合物もしくはＴｒｋＢアゴニスト化合物、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはその抗体断片、またはＴｒｋＢアゴニスト抗体もしくはその抗体断片の脳送達を増強させる。タンパク質または治療剤に融合したときに、このタンパク質または治療剤を、血液脳関門（ＢＢＢ）を通して送達する多くのポリペプチドが記載されている。非限定的な例としては、単ドメイン抗体ＦＣ５（Ａｂｕｌｒｏｂ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ９５，  １２０１−１２１４  （２００５））；ヒトインスリン受容体に対するモノクローナル抗体である、ｍＡＢ  ８３−１４（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｒｅｓ．  １２，  ８０７−８１６  （１９９５））；ヒトトランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）に結合するＢ２、Ｂ６、およびＢ８ペプチド（Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７４，  １１３５９−１１３６６  （２０００））；トランスフェリン受容体に対するＯＸ２６モノクローナル抗体（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．  ２５９，  ６６−７０  （１９９１））；ならびに米国特許第６，３０６，３６５号の配列番号：１〜１８が挙げられる。上記の参考文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１９６】
ＬＩＮＧＯ−１組成物またはＴｒｋＢ組成物の増強された脳送達は、当技術分野で十分確立された多くの手段によって決定される。例えば、脳標的化部分に連結されている放射性標識、酵素標識、もしくは蛍光標識されたＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト化合物もしくはＴｒｋＢアゴニスト化合物、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはその抗体断片、またはＴｒｋＢアゴニスト抗体もしくはその抗体断片を動物に投与すること；脳局在を決定すること；および脳標的化部分と関連していない同等に放射性標識されたＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト化合物もしくはＴｒｋＢアゴニスト化合物、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはその抗体断片、またはＴｒｋＢアゴニスト抗体もしくはその抗体断片と局在を比較すること。増強された標的化を決定するその他の手段は、上記の参考文献に記載されている。
【０１９７】
シグナル配列は、小胞体の膜を横断するタンパク質の輸送を開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。免疫融合体（ｉｍｍｕｎｏｆｕｓｉｎ）を構築するのに有用なシグナル配列としては、抗体軽鎖シグナル配列、例えば、抗体１４．１８（Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  １２５：１９１−２０２  （１９８９））、抗体重鎖シグナル配列、例えば、ＭＯＰＣ１４１抗体重鎖シグナル配列（Ｓａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２８６：５７７４  （１９８０））が挙げられる。あるいは、その他のシグナル配列を使用することができる。例えば、Ｗａｔｓｏｎ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２：５１４５  （１９８４）を参照されたい。シグナルペプチドは、通常、シグナルペプチダーゼによって小胞体の内腔で切断される。これにより、Ｆｃ領域と可溶性ＬＩＮＧＯ−１部分またはＴｒｋＢアゴニスト部分とを含む免疫融合体の分泌が生じる。
【０１９８】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ配列は、分泌カセットとＬＩＮＧＯ−１部分またはＴｒｋＢアゴニスト部分との間のタンパク質分解的切断部位をコードしてもよい。例えば、コードされる融合タンパク質のタンパク質分解的切断のための、このような切断部位が提供され、それにより、標的タンパク質からＦｃドメインが分離されてもよい。有用なタンパク質分解的切断部位には、トリプシン、プラスミン、トロンビン、第Ｘａ因子、またはエンテロキナーゼＫのようなタンパク質分解酵素によって認識されるアミノ酸配列が含まれる。
【０１９９】
分泌カセットは、複製可能な発現ベクターに組み入れることができる。有用なベクターとしては、線状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミドなどが挙げられる。例示的な発現ベクターはｐｄＣであり、その中で、免疫融合体ＤＮＡの転写は、ヒトサイトメガロウイルスのエンハンサーおよびプロモーターの制御下に置かれている。例えば、Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １０８８：７１２  （１９９１）；およびＬｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：４９５−５００  （１９９８）を参照されたい。適切な宿主細胞を、可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドまたはＴｒｋＢアゴニストポリペプチドをコードするＤＮＡで形質転換またはトランスフェクトすることができ、可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドまたはＴｒｋＢアゴニストポリペプチドの発現および分泌のために使用することができる。典型的に使用される宿主細胞としては、不死化ハイブリドーマ細胞、骨髄腫細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｈｅｌａ細胞、およびＣＯＳ細胞が挙げられる。
【０２００】
１つの実施形態において、可溶性ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドまたはＴｒｋＢアゴニストポリペプチドは、ヒンジおよびＦｃ領域（すなわち、Ｉｇ重鎖定常領域のＣ末端部分）に融合される。ＴｒｋＢアゴニスト−Ｆｃ融合体のＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃの潜在的な利点としては、溶解性、インビボ安定性、および多価性（例えば、二量体化）が挙げられる。使用されるＦｃ領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＧのＦｃ領域（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）であることができる。あるいは、それは、ＩｇＥまたはＩｇＭのＦｃ領域（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４）であることができる。ＩｇＧ  Ｆｃ領域（例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域）が通常使用される。１つの実施形態において、ＩｇＧ  Ｆｃを化学的に規定するパパイン切断部位（すなわち、重鎖定常領域の最初の残基をＫａｂａｔシステムによる１１４と考えて、残基２１６）のすぐ上流にあるヒンジ領域に始まる配列、またはその他の免疫グロブリンの類似の部位が、融合体で使用される。融合がなされる正確な部位は、重要ではない。特定の部位は周知であり、分子の生物学的活性、分泌、または結合特徴を最適化するために選択され得る。Ｆｃ融合体をコードするＤＮＡを構築および発現するための材料および方法は、当技術分野で公知であり、過度の実験をすることなく、可溶性ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト融合体またはＴｒｋＢアゴニスト融合体を得るために適用することができる。本発明のいくつかの実施形態は、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト融合タンパク質またはＴｒｋＢアゴニスト融合タンパク質（例えば、Ｃａｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  米国特許第５，４２８，１３０号および第５，５６５，３３５号に記載されている融合タンパク質）を利用する。
【０２０１】
完全にインタクトの、野生型Ｆｃ領域は、本発明の方法で使用されるＦｃ融合タンパク質において、通常は不必要でかつ望ましくないエフェクター機能を示す。それゆえに、ある結合部位を、典型的には、分泌カセットの構築の間にＦｃ領域から欠失させる。例えば、軽鎖との共発現は必要ないので、重鎖結合タンパク質Ｂｉｐの結合部位（Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  ５：１１１−１４  （１９８７））を、この部位が免疫融合体の効率的な分泌に干渉しないように、ＩｇＥのＦｃ領域のＣＨ２ドメインから欠失させる。膜貫通ドメインの配列（例えば、ＩｇＭに存在する配列）も通常欠失させる。
【０２０２】
ＩｇＧ１  Ｆｃ領域が最もよく使用される。あるいは、免疫グロブリンγ（γ−２、γ−３、およびγ−４）のその他のサブクラスのＦｃ領域を、分泌カセットで使用することができる。免疫グロブリンγ−１のＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、通常は分泌カセットで使用され、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態において、免疫グロブリンγ−１のＦｃ領域は、ＣＨ２が欠失しているＦｃであり、これには、ヒンジ領域の一部とＣＨ３領域が含まれるが、ＣＨ２領域は含まれない。ＣＨ２が欠失しているＦｃは、Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍ．  Ａｎｔｉｂｏｄ．  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  １：４７  （１９９０）によって記載されている。いくつかの実施形態において、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭのＦｃ領域が使用される。
【０２０３】
ＬＩＮＧＯ−１−アンタゴニスト−Ｆｃ融合タンパク質またはＴｒｋＢ−アゴニスト−Ｆｃ融合タンパク質は、いくつかの異なる立体配置で構築することができる。１つの立体配置において、可溶性ＬＩＮＧＯ−１部分またはＴｒｋＢ−アゴニスト部分のＣ末端は、Ｆｃヒンジ部分のＮ末端に直接融合される。わずかに異なる立体配置において、短いポリペプチド（例えば、２〜１０個のアミノ酸）が、可溶性ＬＩＮＧＯ−１部分またはＴｒｋＢ−アゴニスト部分のＮ末端とＦｃ部分のＣ末端の間で、融合体に組み込まれる。このようなリンカーは立体構造上の柔軟性を提供し、この柔軟性がいくつかの状況下で生物学的活性を向上させ得る。ヒンジ領域の十分な部分がＦｃ部分に保持されている場合、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ融合体またはＴｒｋＢ−アゴニスト−Ｆｃ融合体は二量体化し、それによって二価の分子を形成する。単量体Ｆｃ融合体の均質な集団は、単一特異性の二価二量体を生じさせる。各々が異なる特異性を有する２つの単量体Ｆｃ融合体の混合物は、二重特異性の二価二量体を生じさせる。
【０２０４】
対応するアミノ反応基およびチオール反応基を含む多数のクロスリンカーのいずれかを用いて、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドまたはＴｒｋＢアゴニストポリペプチドを血清アルブミンに連結させることができる。好適なリンカーの例としては、チオール反応性マレイミド（例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳ、およびＧＭＢＳ）を挿入するアミノ反応性クロスリンカーが挙げられる。その他の好適なリンカーは、チオール反応性ハロアセテート基（例えば、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ）を挿入する。還元性の連結を生じさせるためのスルフヒドリル基との反応のための保護チオールまたは非保護チオールを提供するリンカーとしては、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡ、およびＳＡＴＰが挙げられる。このような試薬は市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
【０２０５】
結合体に、可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドまたはＴｒｋＢアゴニストポリペプチドのＮ末端、または血清アルブミン上のチオール部分が含まれる必要はない。例えば、可溶性ＬＩＮＧＯ−１−アルブミン融合体またはＴｒｋＢアゴニスト−アルブミン融合体は、遺伝子改変技術を用いて得ることができる。この場合、可溶性ＬＩＮＧＯ−１部分またはＴｒｋＢ−アゴニスト部分を、そのＮ末端、Ｃ末端、またはこれらの両方で、血清アルブミン遺伝子に融合させる。
【０２０６】
可溶性ＬＩＮＧＯ−１部分もしくはＴｒｋＢアゴニスト部分の精製または同定をしやすくするために、可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドまたはＴｒｋＢアゴニストポリペプチドを、Ｎ末端またはＣ末端で、異種ペプチドに融合させることができる。例えば、市販のクロマトグラフィー媒体を用いて精製しやすくするために、ヒスチジンタグを、可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドまたはＴｒｋＢアゴニストポリペプチドに融合させることができる。さらに、エピトープタグにより、可溶性ＬＩＮＧＯ−１融合ポリペプチドまたはＴｒｋＢアゴニスト融合ポリペプチドを、抗タグ抗体またはエピトープタグに結合する別のタイプの親和性マトリックスを用いた親和性精製によって容易に精製することができる。このような精製タグの多くの例は、当技術分野で公知であり、ポリ−ヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）タグまたはポリ−ヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タグポリペプチドと、その抗体１２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ，  ８：２１５９−２１６５  （１９８８）；ｃ−ｍｙｃタグと、それに対する８Ｆ９抗体、３Ｃ７抗体、６Ｅ１０抗体、Ｇ４抗体、Ｂ７抗体、および９Ｅ１０抗体（Ｅｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏ．  ５：３６１０−３６１６  （１９８５））；ならびに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグと、その抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｊ（６）：５４７−５５３  （１９９０））を含むが、これらに限定されない。その他のタグポリペプチドとしては、Ｆｌａｇペプチド（Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４−１２１０  （１９８８））；ＫＴ３エピトープペプチド（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：１９２−１９４  （１９９２））；α−チューブリンエピトープペプチド（Ｓｋｉｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６：１５１６３−１５１６６  （１９９１））；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ（Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８７：６３９３−６３９７  （１９９０））が挙げられる。タグは、抗体によって認識され、かつ可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドまたはＴｒｋＢアゴニストポリペプチドの機能に干渉しない任意のペプチドエピトープであることができる。
【０２０７】
本発明のいくつかの実施形態において、可溶性ＬＩＮＧＯ−１融合コンストラクトまたはＴｒｋＢアゴニスト融合コンストラクトを用いて、細菌内での可溶性ＬＩＮＧＯ−１部分またはＴｒｋＢアゴニスト部分の産生を増強させる。このようなコンストラクトにおいては、通常高レベルで発現および／または分泌される細菌タンパク質を、可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドまたはＴｒｋＢアゴニストポリペプチドのＮ末端融合パートナーとして利用する。例えば、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ６７：３１  （１９８８）；  Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４  （１９８８）；  Ｌａ  Ｖａｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１８７  （１９９３）を参照されたい。
【０２０８】
可溶性ＬＩＮＧＯ−１部分またはＴｒｋＢアゴニスト部分を好適な融合パートナーのアミノ末端およびカルボキシ末端で融合させることにより、二価形態または四価形態の可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドまたはＴｒｋＢアゴニストポリペプチドを得ることができる。例えば、可溶性ＬＩＮＧＯ−１部分またはＴｒｋＢアゴニスト部分をＩｇ部分のアミノ末端およびカルボキシ末端に融合させて、２つの可溶性ＬＩＮＧＯ−１部分またはＴｒｋＢアゴニスト部分を含む二価単量体ポリペプチドを産生することができる。これらの単量体のうちの２つが二量体化すると、Ｉｇ部分により、四価形態の可溶性ＬＩＮＧＯ−１タンパク質またはＴｒｋＢアゴニストタンパク質が得られる。このような多価形態を用いて、標的に対する結合親和性の増大を達成することができる。多価形態の可溶性ＬＩＮＧＯ−１またはＴｒｋＢアゴニストは、可溶性ＬＩＮＧＯ−１部分またはＴｒｋＢアゴニスト部分を直列に配置してコンカテマーを形成させることによって得ることもでき、コンカテマーは、単独で利用するかまたは融合パートナー（例えば、ＩｇもしくはＨＳＡ）に融合させることができる。
【０２０９】
結合体化ポリマー（ポリペプチド以外）
本発明のいくつかの実施形態は、可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、ＴｒｋＢアゴニスト化合物、またはアンタゴニスト性ＬＩＮＧＯ−１抗体もしくはアゴニスト性ＴｒｋＢ抗体を含む。この場合、１つ以上のポリマーは、本発明の方法で使用されるＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１化合物もしくはＴｒｋＢアゴニスト化合物、ＬＩＮＧＯ−１アプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、またはＬＩＮＧＯ−１抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体に結合体化（共有結合）される。このような結合体化に好適なポリマーの例としては、ポリペプチド（上で議論されている）、アプタマー、糖ポリマー、およびポリアルキレングリコール鎖が挙げられる。以下のもの、すなわち、溶解性、安定性、またはバイオアベイラビリティーのうちの１つ以上を向上させる目的のために、ポリマーは、典型的には、可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、可溶性ＬＩＮＧＯ−１アプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、ＴｒｋＢアゴニスト化合物、またはＬＩＮＧＯ−１抗体もしくはＴｒｋＢ抗体に結合体化されるが、必ずしもその必要はない。
【０２１０】
ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト化合物、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマー、もしくはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体、またはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＴｒｋＢアゴニスト化合物、ＴｒｋＢアゴニストアプタマー、もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体への結合体化に通常使用されるポリマーのクラスはポリアルキレングリコールである。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が最も頻繁に使用される。ＰＥＧ部分（例えば、１、２、３、４、または５  ＰＥＧポリマー）を、各々のＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、もしくはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体、またはＴｒｋＢアゴニスト化合物に結合体化させて、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト化合物もしくはＴｒｋＢアゴニスト化合物、またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体単独と比較して、血清半減期を増大させることができる。ＰＥＧ部分は非抗原性で、本質的には生物学的に不活性である。本発明の実施に使用されるＰＥＧ部分は分岐していても、または分岐していなくてもよい。
【０２１１】
ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト化合物もしくはＴｒｋＢアゴニスト化合物、またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体に結合されるＰＥＧ部分の数、および個々のＰＥＧ鎖の分子量は様々であり得る。一般に、ポリマーの分子量が大きければ大きいほど、少ない数のポリマー鎖がポリペプチドに結合される。通常、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト化合物もしくはＴｒｋＢアゴニスト化合物、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体に結合される総ポリマー質量は、２０ｋＤａ〜４０ｋＤａである。したがって、１個のポリマー鎖を結合させる場合、この鎖の分子量は、通常２０〜４０ｋＤａである。２個の鎖を結合させる場合、各鎖の分子量は、通常１０〜２０ｋＤａである。３個の鎖を結合させる場合、分子量は、通常７〜１４ｋＤａである。
【０２１２】
ポリマー（例えば、ＰＥＧ）は、ポリペプチド上の任意の好適な露出している反応基を介してＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体に連結させることができる。露出している反応基は、例えば、Ｎ末端アミノ基、または内部リジン残基のεアミノ基、またはこれらの両方であることができる。活性化されたポリマーは、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体上の任意の遊離のアミノ基で反応し、共有結合することができる。遊離のカルボン酸基、好適に活性化されたカルボニル基、ヒドロキシル、グアニジル、イミダゾル、酸化された炭水化物部分、およびＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体のメルカプト基（利用できる場合）も、ポリマーの結合のための反応基として使用することができる。
【０２１３】
結合反応において、典型的には、ポリペプチドの濃度に応じて、１モルのポリペプチド当たり約１．０〜約１０モルの活性化されたポリマーが利用される。通常、選定される割合は、この反応の最大化と、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチドまたはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体の所望の薬理学的活性を損なう可能性がある副反応（多くの場合は非特異的である）の最小化との間のバランスを示す。いくつかの実施形態において、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体の（例えば、本明細書に記載されるアッセイのいずれかで示されるかまたは当技術分野で公知である）生物学的活性の少なくとも５０％が保持され、いくつかの実施形態において、ほぼ１００％が保持される。
【０２１４】
ポリマーは、従来の化学反応を用いて、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体に結合体化することができる。例えば、ポリアルキレングリコール部分を、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体のリジンεアミノ基に結合体化させることができる。リジン側鎖への結合は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の活性エステル（例えば、ＰＥＧスクシンイミジルスクシネート（ＳＳ−ＰＥＧ）およびスクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ−ＰＥＧ））を用いて行うことができる。好適なポリアルキレングリコール部分としては、例えば、カルボキシメチル−ＮＨＳおよびノルロイシン−ＮＨＳ、ＳＣが挙げられる。これらの試薬は市販されている。さらなるアミン反応性ＰＥＧリンカーで、スクシンイミジル部分を置換することができる。これらには、例えば、イソチオシアネート、ニトロフェニルカルボネート（ＰＮＰ）、エポキシド、ベンゾトリアゾルカルボネート、ＳＣ−ＰＥＧ、トレシレート、アルデヒド、エポキシド、カルボニルイミダゾル、およびＰＮＰカルボネートが含まれる。条件は、通常、反応の選択性および程度を最大化するように最適化される。反応条件のこのような最適化は、当業者の能力の範囲内である。
【０２１５】
ＰＥＧ化は、当技術分野で公知のＰＥＧ化反応のいずれかによって実行することができる。例えば、Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３：４−１０  （１９９２）、および欧州特許出願ＥＰ  ０  １５４  ３１６号およびＥＰ  ０  ４０１  ３８４号を参照されたい。ＰＥＧ化は、反応性ポリエチレングリコール分子（または、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を用いて実行してもよい。
【０２１６】
アシル化によるＰＥＧ化は、通常、ポリエチレングリコールの活性エステル誘導体の反応を含む。任意の反応性ＰＥＧ分子を、ＰＥＧ化に利用することができる。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）にエステル化されたＰＥＧは、頻繁に用いられる活性化ＰＥＧエステルである。本明細書で使用される場合、「アシル化」には、治療用タンパク質と水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）の間の以下のタイプの結合、すなわち、アミド結合、カルバメート結合、ウレタン結合などが含まれるが、これらに限定されない。Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ５：１３３−１４０，  １９９４を参照されたい。反応パラメータは、通常、可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、可溶性ＬＩＮＧＯ−１アプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、または可溶性ＬＩＮＧＯ−１抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体を損傷させるかまたは不活化する温度条件、溶媒条件、およびｐＨ条件を避けるように選択される。
【０２１７】
通常、接続している結合はアミドであり、得られる生成物の少なくとも９５％が、モノ−、ジ−、またはトリ−ＰＥＧ化される。しかしながら、ＰＥＧ化の程度がより高いいくつかの種が、使用される特異的な反応条件に応じた量で形成される場合がある。任意で、精製されたＰＥＧ化種は、混合物から、特に、未反応の種から、従来の精製法（例えば、透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水性交換クロマトグラフィー、および電気泳動を含む）によって分離される。
【０２１８】
アルキル化によるＰＥＧ化は、通常、ＰＥＧの末端アルデヒド誘導体を、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体と還元剤の存在下で反応させる工程が含まれる。さらに、実質的にＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体のＮ末端アミノ基だけをＰＥＧ化（すなわち、モノ−ＰＥＧ化タンパク質）するのに有利に働くように、反応条件を操作することができる。モノ−ＰＥＧ化またはポリ−ＰＥＧ化のいずれの場合においても、ＰＥＧ基は、典型的には、−ＣＨ２−ＮＨ−基を介してタンパク質に結合される。特に−ＣＨ２−基に関して、このタイプの結合は「アルキル」結合として知られている。
【０２１９】
Ｎ末端に標的化されたモノ−ＰＥＧ化生成物を生じさせるための還元アルキル化を介する誘導体化は、誘導体化に利用できる異なるタイプの１級アミノ基（Ｎ末端に対するリジン）の異なる反応性を利用する。この反応は、リジン残基のε−アミノ基とタンパク質のＮ末端アミノ基のε−アミノ基の間のｐＫａの差を利用することができるｐＨで行われる。このような選択的な誘導体化によって、アルデヒドのような反応基を含む水溶性ポリマーのタンパク質への結合が制御される。ポリマーとの結合体化は、主にタンパク質のＮ末端で起こり、その他の反応基（例えば、リジン側鎖のアミノ基）の顕著な修飾は生じない。
【０２２０】
アシル化とアルキル化の両方のアプローチで使用されるポリマー分子は、水溶性ポリマーの中から選択される。選択されるポリマーは、典型的には、単一の反応基（例えば、アシル化のための活性エステル、またはアルキル化のためのアルデヒド）を有するように修飾され、その結果、重合の程度は、本発明の方法で提供されるように制御し得る。例示的な反応性ＰＥＧアルデヒドは、水安定性のポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはそのモノＣ１〜Ｃ１０アルコキシもしくはアリールオキシ誘導体である（例えば、Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。ポリマーは分岐していてもよく、または分岐していなくてもよい。アシル化反応について、選択されるポリマーは、典型的には、単一の反応性エステル基を有する。還元アルキル化について、選択されるポリマーは、典型的には、単一の反応性アルデヒド基を有する。通常、水溶性ポリマーは、天然に存在するグリコシル残基からは選択されない。なぜなら、これらは、通常は、哺乳動物の組換え発現系によってより好都合に行われるからである。
【０２２１】
ＰＥＧ化されたＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＰＥＧ化されたＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、またはＰＥＧ化されたＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体を調製する方法には、通常、（ａ）分子が１つ以上のＰＥＧ基に結合する条件下で、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体を、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）と反応させる工程、および（ｂ）反応産物（単数または複数）を得る工程が含まれる。一般に、アシル化反応についての最適な反応条件は、公知のパラメータと所望の結果に基づいてケース・バイ・ケースで決定される。例えば、通常、ＰＥＧ：タンパク質の比が大きければ大きいほど、ポリ−ＰＥＧ化産物の割合は大きくなる。
【０２２２】
モノ−ポリマー／可溶性ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはモノ−ポリマー／ＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、モノ−ポリマー／ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはモノ−ポリマー／ＴｒｋＢアゴニストアプタマー、またはモノ−ポリマー／アンタゴニスト性ＬＩＮＧＯ−１抗体もしくはモノ−ポリマー／アゴニスト性ＴｒｋＢ抗体の実質的に均質な集団を産生するための還元アルキル化には、通常、（ａ）ポリペプチドまたは抗体のＮ末端アミノ基の選択的な修飾を可能にするのに好適なｐＨで、還元アルキル化条件下で、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストタンパク質もしくはＴｒｋＢアゴニストタンパク質またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチドを反応性ＰＥＧ分子と反応させる工程；および（ｂ）反応産物を得る工程が含まれる。
【０２２３】
モノ−ポリマー／可溶性ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはモノ−ポリマー／ＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、モノ−ポリマー／ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはモノ−ポリマー／ＴｒｋＢアゴニストアプタマー、またはモノ−ポリマー／アンタゴニスト性ＬＩＮＧＯ−１抗体もしくはモノ−ポリマー／アゴニスト性ＴｒｋＢ抗体の実質的に均質な集団について、還元アルキル化反応条件は、ポリペプチドまたは抗体のＮ末端への水溶性ポリマー部分の選択的結合を可能にする条件である。このような反応条件は、通常、リジン側鎖のアミノ基とＮ末端アミノ基の間にｐＫａの差をもたらす。本発明の目的のために、ｐＨは、通常３〜９、典型的には、３〜６の範囲にある。
【０２２４】
ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体は、タグ（例えば、タンパク質分解によって後で放出することができる部分）を含むことができる。したがって、リジンとＮ末端の両方と反応する低分子量のリンカー（例えば、Ｔｒａｕｔ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ））で修飾されたＨｉｓタグを最初に反応させ、その後、このＨｉｓタグを放出することにより、リジン部分を選択的に修飾することができる。その後、ポリペプチドは、チオール反応性頭部基（例えば、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基、または遊離ＳＨもしくは保護ＳＨ）を含むＰＥＧで選択的に修飾することができる遊離ＳＨ基を含む。
【０２２５】
Ｔｒａｕｔ試薬は、ＰＥＧ結合のための特異的部位を構成する任意のリンカーで置き換えることができる。例えば、Ｔｒａｕｔ試薬は、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡ、またはＳＡＴＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）で置き換えることができる。同様に、タンパク質を、マレイミドを挿入するアミン反応性リンカー（例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳ、もしくはＧＭＢＳ）、ハロアセテート基（ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ）、またはビニルスルホン基と反応させることができ、得られる生成物を、遊離ＳＨを含むＰＥＧと反応させることができる。
【０２２６】
いくつかの実施形態において、ポリアルキレングリコール部分を、本発明の方法で使用されるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体のシステイン基に結合体化させる。結合体化は、例えば、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基、またはチオール基を用いて行なうことができる。
【０２２７】
任意で、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストアプタマーもしくはＴｒｋＢアゴニストアプタマー、またはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体もしくはＴｒｋＢアゴニスト抗体を、不安定な結合を介してポリエチレングリコール部分と結合体化させる。不安定な結合は、例えば、生化学的加水分解、タンパク質分解、またはスルフヒドリルによる切断において切断することができる。例えば、この結合は、インビボ（生理学的）条件下で切断することができる。
【０２２８】
反応基がＮ末端のαアミノ基上にある場合、反応は、通常、約ｐＨ５〜８（例えば、ｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ７、またはｐＨ８）で生物学的活性材料を不活性なポリマーと反応させるのに使用される任意の好適な方法によって起こり得る。通常、このプロセスは、活性化されたポリマーを調製する工程、およびその後、タンパク質を活性化したポリマーと反応させて、製剤に好適な可溶性タンパク質を産生する工程を含む。
【０２２９】
ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリヌクレオチドおよびＴｒｋＢアゴニストポリヌクレオチド
ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリヌクレオチド
本発明の方法におけるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストには、ＬＩＮＧＯ−１をコードするポリヌクレオチドに特異的に結合する核酸分子を含むＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリヌクレオチドが含まれる。ＬＩＮＧＯ−１ポリヌクレオチドアンタゴニストは、通常、ＬＩＮＧＯ−１の発現を妨げる（ノックダウン）。ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストとしては、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉが挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、このような結合分子は、動物に別々に投与される（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ５６：５６０  （１９９１）を参照のこと）が、このような結合分子はまた、宿主細胞によって取り込まれかつインビボで発現されるポリヌクレオチドからインビボで発現されてもよい。例えば、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ＦＬ  （１９８８）も参照されたい。
【０２３０】
ＲＮＡｉとは、標的化されたｍＲＮＡの発現に干渉するＲＮＡの発現を指す。具体的には、ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡ（短い干渉ＲＮＡ）を介した特異的ｍＲＮＡ（例えば、ＬＩＮＧＯ−１またはＴｒｋＢ）との相互作用によって標的化遺伝子をサイレンシングする。その後、ｄｓＲＮＡ複合体は、細胞による分解の標的とされる。さらなるＲＮＡｉ分子としては、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）；また、低分子干渉ヘアピンも挙げられる。ｓｈＲＮＡ分子は、ループによって接続された標的遺伝子由来のセンス配列およびアンチセンス配列を含む。ｓｈＲＮＡは、核から細胞質に輸送され、ｍＲＮＡとともに分解される。Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターまたはＵ６プロモーターを用いて、ＲＮＡｉのためのＲＮＡを発現させることができる。本発明のいくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、レンチウイルスベクター（例えば、ｐＬＬ３．７）から発現される。
【０２３１】
ＲＮＡｉは、それらの「標的」ｍＲＮＡに対する配列特異的相同性を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子によって媒介される（Ｃａｐｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９８：９７４２−９７４７  （２００１））。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の無細胞ライセートでの生化学的実験により、ＲＮＡ依存性の遺伝子サイレンシングのメディエーターが２１〜２５個のヌクレオチドの「低分子干渉」ＲＮＡ二重鎖（ｓｉＲＮＡ）であることが示されている。したがって、ｓｉＲＮＡ分子は、本発明の方法において有利に使用される。ｓｉＲＮＡは、ＤＩＣＥＲとして知られるリボヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの処理に由来する（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：  ３６３−３６６  （２００１））。ｓｉＲＮＡ二重鎖産物はＲＩＳＣ（ＲＮＡによって誘導されるサイレンシング複合体）と呼ばれる多タンパク質ｓｉＲＮＡ複合体に動員されるようである。任意の特定の理論に束縛されることを望まないが、ＲＩＳＣは標的ｍＲＮＡに導かれ、そこでは、ｓｉＲＮＡ二重鎖が配列特異的に相互作用して、触媒様式で切断を媒介すると考えられる（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：  ３６３−３６６  （２００１）；  Ｂｏｕｔｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １１：  １７７６−１７８０  （２００１））。
【０２３２】
ＲＮＡｉは、遺伝子機能を解析するため、および非限定的な例としてニューロン（Ｋｒｉｃｈｅｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９９：１１９２６−１１９２９  （２００２））を含む哺乳動物細胞の必須の遺伝子を同定するために使用されている（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６：１９９−２１３  （２００２）；Ｈａｒｂｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１４：４５５７−４５６５  （２００１））。ＲＮＡｉは、治療法、例えば、ポリオウイルス（Ｇｉｔｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：３７９−３８０  （２００２））およびＨＩＶ（Ｃａｐｏｄｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：５１９６−５２０１  （２００２））を含むが、これらに限定されない、ウイルスの感染、複製、および／もしくは増殖の阻害または阻止、ならびにオンコジーン（例えば、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子；Ｓｃｈｅｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １０１（４）：  １５６６−９  （２００２））の発現の低下についても評価されている。ＲＮＡｉは、哺乳動物（マウス）および両生類（ゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ））の胚（それぞれ、Ｃａｌｅｇａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９９：１４２３６−１４２４０  （２００２）；およびＺｈｏｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：１６６４−１６６９  （２００２））、ならびに出生後のマウス（Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３２：１０７−１０８  （２００２））において遺伝子発現を調節するために、ならびに成体トランスジェニックマウスにおいてトランス遺伝子の発現を低下させるために（ＭｃＣａｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：３８−３９  （２００２））使用されている。細胞培養物中でおよびインビボで、ｓｉＲＮＡの効力および特異性を決定する方法が記載されている（例えば、Ｂｅｒｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２９６：１０００−１００４  （２００２）；Ｌａｓｓｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉ  ＳＴＫＥ  ２００２（１４７）：ＰＬ１３  （２００２）；およびＬｅｉｒｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２９５：７４４−７４８  （２００２）を参照されたい）。
【０２３３】
ＲＮＡｉを媒介する分子（ｓｉＲＮＡを含むが、これに限定されない）は、化学合成によって（Ｈｏｈｊｏｈ，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５２１：１９５−１９９  （２００２））、ｄｓＲＮＡの加水分解によって（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９９：９９４２−９９４７  （２００２））、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写によって（Ｄｏｎｚｅｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：ｅ４６，  （２００２）；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：６０４７−６０５２  （２００２））、および大腸菌リボヌクレアーゼＩＩＩのようなヌクレアーゼを用いた二本鎖ＲＮＡの加水分解によって（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：９９４２−９９４７  （２００２））、インビトロで産生することができる。  
【０２３４】
ｓｉＲＮＡ分子はまた、２つのオリゴヌクレオチドを互いにアニーリングさせることによって形成させてもよく、典型的には、以下の一般的構造を有する。この構造は、二本鎖部分と一本鎖部分の両方を含む。
【０２３５】
【化１】
0005674469.tif 000018
式中、Ｎ、Ｘ、およびＹはヌクレオチドであり；ＸとＹは水素結合しており；「：」は２塩基間の水素結合を示し；ｘは１〜約１００の間の値を有する自然数であり；かつｍとｎは、０〜約１００の間の値を独立して有する整数全体である。いくつかの実施形態において、Ｎ、Ｘ、およびＹは、独立して、Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴまたはＵである。非天然の塩基およびヌクレオチドは、特に、合成のｓｉＲＮＡ（すなわち、アニーリングする２つのオリゴヌクレオチドの産物）の場合に存在することができる。二本鎖の中心部分は「コア」と呼ばれ、測定単位として塩基対（ｂｐ）を有する。一本鎖部分は突出であり、測定単位としてのヌクレオチド（ｎｔ）を有する。示される突出は３’突出であるが、５’突出を有する分子もまた本発明の範囲に含まれる。突出を有さないｓｉＲＮＡ分子（すなわち、ｍ＝０およびｎ＝０）、ならびにコアの一方に突出を有するが、他方には有さない（例えば、ｍ＝０およびｎ≧１、またはその逆の）ｓｉＲＮＡ分子もまた、本発明の範囲に含まれる。
【０２３６】
最初、ＲＮＡｉ技術は、哺乳動物系に容易に適用できると思われていなかった。これは、哺乳動物では、ｄｓＲＮＡがｄｓＲＮＡによって活性化されるタンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）を活性化し、アポトーシスのカスケードと細胞死とを生じさせるからである（Ｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４：３２７９−３２８３  （１９９７））。さらに、ｄｓＲＮＡが哺乳動物細胞のインターフェロンカスケードを活性化し、これもまた、細胞生理学の変化をもたらすことができることが以前から知られている（Ｃｏｌｂｙ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２５：３３３  （１９７１）；Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ４１：５１７  （１９７２）；Ｌａｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ５８Ｌ７８２  （１９６７）；Ｌｏｍｎｉｃｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８：５５  （１９７０）；およびＹｏｕｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ９２：８６２  （１９６６））。しかしながら、ｄｓＲＮＡによって媒介されるＰＫＲとインターフェロンカスケードの活性化には、約３０塩基対よりも長いｄｓＲＮＡが必要である。対照的に、３０塩基対未満の長さのｄｓＲＮＡは、哺乳動物細胞でＲＮＡｉを生じることが示されている（Ｃａｐｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：  ９７４２−９７４７  （２００１）。したがって、より長いｄｓＲＮＡ分子と関連する望ましくない非特異的効果は、より長いｄｓＲＮＡを実質的に含まない短いＲＮＡを調製することによって回避することができると期待される。
【０２３７】
ｓｉＲＮＡに関する参考文献：Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３−３６６  （２００１）；Ｂｏｕｔｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １１：１７７６−１７８０  （２００１）；Ｃｕｌｌｅｎ，  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３：５９７−５９９  （２００２）；Ｃａｐｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９８：９７４２−９７４７  （２００１）；Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：９５０−９５２  （１９９９）；Ｎａｇａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ＤＮＡ  Ｒｅｓ．  ６：６３−７０  （１９９９）；Ｎａｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：２７９−２８９  （１９９０）；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｍｍ．  Ｇｅｎｏｍｅ  １３：６７−７３  （２００２）；Ｐａｒｒｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ６：１０７７−１０８７  （２０００）；Ｒｏｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６：３３４３−３３５３  （１９９２）；Ｔａｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ９９：１２３−１３２  （１９９９）；およびＴｕｓｃｈｌ，  Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．  ２：２３９−２４５  （２００１）。
【０２３８】
Ｐａｄｄｉｓｏｎら（Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．  １６：９４８−９５８  （２００２））は、ＲＮＡｉを生じさせるための手段として、折り畳まれてヘアピンになった小さいＲＮＡ分子を使用した。したがって、このような低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子もまた、本発明の方法で有利に使用される。機能的なｓｈＲＮＡのステムおよびループの長さは様々である。ステムの長さは、約２５〜約３０ｎｔの範囲であることができ、ループのサイズは、４〜約２５ｎｔの範囲であることができ、サイレンシング活性には影響を及ぼさない。任意の特定の理論によって束縛されることを望まないが、これらのｓｈＲＮＡは、ＤＩＣＥＲ  リボヌクレアーゼのｄｓＲＮＡ産物に似ており、いずれにしても、特異的遺伝子の発現を阻害する同じ能力を有すると考えられる。
【０２３９】
アンチセンス技術を用いて、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを介して、または三重らせんの形成を介して遺伝子発現を制御することができる。アンチセンス技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ５６：５６０  （１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ＦＬ  （１９８８）で議論されている。三重らせんの形成は、例えば、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：３０１３  （１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：４５６  （１９８８）；およびＤｅｒｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３００  （１９９１）で議論されている。この方法は、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく。
【０２４０】
例えば、ＬＩＮＧＯ−１をコードするポリヌクレオチドの５’コード部分を用いて、約１０〜４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計し得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計され、それにより、転写および標的タンパク質の産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、ｍＲＮＡ分子の標的ポリペプチドへの翻訳を阻止する。
【０２４１】
１つの実施形態において、ＬＩＮＧＯ−１遺伝子に特異的なアンチセンス核酸は、外因性配列からの転写によって細胞内で産生される。例えば、ベクターまたはその一部が転写されて、アンチセンス核酸（ＲＮＡ）が産生される。このようなベクターは、転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを産生することができる限りは、エピソームのままであることができ、または染色体に組み込まれるようになることができる。このようなベクターは、当技術分野で標準的な組換えＤＮＡ技術の方法によって構築することができる。ベクターは、脊椎動物細胞内での複製および発現に使用される、プラスミド、ウイルス、または当技術分野で公知のその他のものであることができる。アンチセンス分子の発現は、脊椎動物、特に、ヒト細胞（例えば、本明細書の他の場所に記載されている細胞）で作用することが当技術分野で公知の任意のプロモーターによることができる。
【０２４２】
アンチセンス分子の完全な相補性は必要とされない。ＬＩＮＧＯ−１をコードするＲＮＡの少なくとも一部に相補的な配列とは、ＲＮＡとハイブリダイズし、安定な二重鎖を形成することができるのに十分な相補性を有する配列を意味する。または、三本鎖の形成がアッセイされる場合もある。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度とアンチセンス核酸の長さの両方に依存する。一般に、ハイブリダイズする核酸が長ければ長いほど、より多くの塩基ミスマッチを含み得るが、依然として安定な二重鎖（または場合によっては三重鎖）を形成し得る。当業者は、標準的な手順を使用することによって許容できるミスマッチの程度を特定し、ハイブリダイズした複合体の融点を決定することができる。
【０２４３】
メッセンジャーＲＮＡの５’末端に相補的であるオリゴヌクレオチド（例えば、５’非翻訳配列までで、ＡＵＧ開始コドンを含む）は、翻訳を阻害するのに最も効率よく作用するはずである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的な配列も、同様に、ｍＲＮＡの翻訳を阻害するのに効果的であることが示されている。例えば、一般に、Ｗａｇｎｅｒ，  Ｒ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３３３−３３５  （１９９４）を参照されたい。したがって、５’または３’のいずれかの非翻訳非コード領域に相補的なオリゴヌクレオチドをアンチセンスアプローチで用いて、ＬＩＮＧＯ−１の翻訳を阻害することができる。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドには、ＡＵＧ開始コドンの相補体が含まれるべきである。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、あまり有効ではない翻訳阻害因子であるが、本発明に従って使用することができる。アンチセンス核酸は、少なくとも、６ヌクレオチド長であるべきであり、いくつかの実施形態において、６〜約５０ヌクレオチド長の範囲のオリゴヌクレオチドである。特異的な態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０２４４】
また別の実施形態において、本明細書に開示される方法で使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、α−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的ＲＮＡとの特異的な二本鎖ハイブリッドを形成するが、このハイブリッドの中では、通常の状況とは反対に、鎖が互いに並行に走る（Ｇａｕｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １５：６６２５−６６４１（１９８７））。オリゴヌクレオチドは、２’−０−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １５：６１３１−６１４８（１９８７））、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ２１５：３２７−３３０  （１９８７））である。
【０２４５】
本明細書に開示される方法で使用されるポリヌクレオチド組成物には、触媒ＲＮＡ、またはリボザイムがさらに含まれる（例えば、１９９０年１０月４日に公開されたＰＣＴ国際公開ＷＯ  ９０／１１３６４号；Ｓａｒｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１２２２−１２２５  （１９９０）を参照のこと）。本発明のいくつかの実施形態において、ハンマーヘッド型リボザイムが使用される。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡとの相補的塩基対を形成する隣接領域によって決定付けられる位置でｍＲＮＡを切断する。標的ｍＲＮＡが以下の２塩基の配列：５’−ＵＧ−３’を有することが唯一の必要条件である。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および産生は当技術分野で周知であり、Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１  （１９８８）に、より十分に記載されている。切断認識部位が標的ｍＲＮＡの５’末端付近に位置するように、すなわち、効率を増大させ、非機能的なｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を最小限に抑えるように、リボザイムを改変することができる。
【０２４６】
アンチセンスアプローチと同様に、本明細書に開示される方法で使用されるリボザイムは、（例えば、安定性、標的化などの向上のために）修飾されたオリゴヌクレオチドから構成されることができ、かつインビボでＬＩＮＧＯ−１を発現する細胞に送達されてもよい。リボザイムをコードするＤＮＡコンストラクトは、アンチセンスをコードするＤＮＡの導入について上で記載したのと同じ方法で細胞内に導入してもよい。１つの送達方法は、トランスフェクトされた細胞が、内因性ＬＩＮＧＯ−１のメッセージを破壊し、翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを産生するように、例えば、ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターまたはｐｏｌ  ＩＩプロモーターのような、強力な構成的プロモーターの制御下でリボザイムを「コードする」ＤＮＡコンストラクトを使用することを含む。リボザイムは、アンチセンス分子とは異なり、触媒的であるので、より低い細胞内濃度が効率に必要である。
【０２４７】
ＴｒｋＢアゴニストポリヌクレオチド
本発明の方法で使用されるＴｒｋＢアゴニストには、ＴｒｋＢポリペプチド、その断片、アイソフォーム、または変異体をコードする核酸分子を含むＴｒｋＢアゴニストポリヌクレオチドが含まれる。本発明のＴｒｋＢアゴニストポリヌクレオチドには、ＴｒｋＢリガンドポリペプチド、その断片、アイソフォーム、または変異体をコードする核酸分子も含まれる。いくつかの実施形態において、ＴｒｋＢアゴニストポリヌクレオチドは、ＢＤＮＦをコードする。ＴｒｋＢアゴニストポリヌクレオチドには、本発明のＴｒｋＢアゴニストポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドが含まれる。
【０２４８】
ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドおよび／またはＴｒｋＢアゴニストポリペプチド
本明細書に開示される方法で使用されるポリヌクレオチド（上記のアプタマーを含む）は、一本鎖もしくは二本鎖の、ＤＮＡまたはＲＮＡ、またはそのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは修飾バージョンであることができる。例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを向上させるために、ポリヌクレオチドを、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で修飾することができる。ポリヌクレオチドには、ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞受容体を標的化するため）、または細胞膜を横断する輸送を促進する薬剤（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８６：６５５３−６５５６  （１９８９）；Ｌｅｍａｉｔｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８４：６４８−６５２  （１９８７））；１９８８年１２月１５日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ８８／０９８１０号を参照のこと）もしくは血液脳関門を横断する輸送を促進する薬剤（例えば、１９８８年４月２５日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ８９／１０１３４号を参照のこと）、ハイブリダイゼーション誘発性の切断剤（例えば、Ｋｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６  （１９８８）を参照のこと）、または挿入剤（例えば、Ｚｏｎ，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ５：５３９−５４９（１９８８）を参照のこと）のような、その他の付加基が含まれてもよい。この目的を達成するために、ポリヌクレオチドを、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発性の架橋結合剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発性の切断剤など）に結合体化してもよい。
【０２４９】
本明細書に開示される方法で使用されるポリヌクレオチド（アプタマーを含む）は、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ−６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ−６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ−６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ウィブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３（３−アミノ−３−Ｎ２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含むが、これらに限定されない基からなる群より選択される少なくとも１つの修飾された塩基部分を含んでもよい。
【０２５０】
本明細書に開示される方法で使用されるポリヌクレオチド（アプタマーを含む）は、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースを含むが、これらに限定されない群より選択される少なくとも１つの修飾された糖部分も含んでよい。
【０２５１】
また別の実施形態において、本明細書に開示される方法で使用されるポリヌクレオチド（アプタマーを含む）は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタール、またはそれらの類似体を含むが、これらに限定されない群より選択される少なくとも１つの修飾されたリン酸骨格を含む。
【０２５２】
本発明の方法で使用されるポリヌクレオチド（アプタマーを含む）を、当技術分野で公知の標準的な方法によって、例えば、自動ＤＮＡ合成装置（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販されているもの）を使用することによって合成してもよい。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：３２０９  （１９８８）の方法によって合成し得、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドを、制御された孔ガラスポリマー支持体（Ｓａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ５５：７４４８−７４５１  （１９８８））などを使用することによって調製することができる。
【０２５３】
ベクターおよび宿主細胞
宿主発現系とは、それによって目的のコード配列が産生され、その後精製されるビヒクルを表すが、適当なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされたときに、インサイチュで本発明の抗体分子を発現し得る細胞をも表す。これらには、抗体コード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌、バチルス・スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ））のような微生物；抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ））；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染したかもしくは抗体コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現コンストラクトを持つ哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＬＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞）が含まれるが、これらに限定されない。細菌細胞（例えば、大腸菌）、または真核細胞（特に、組換え抗体分子全体の発現用のもの）が、組換え抗体分子の発現のために使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間初期遺伝子プロモーターエレメントのようなベクターと組み合わされた、哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ））は、抗体のための効果的な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ４５：１０１  （１９８６）；  Ｃｏｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２  （１９９０））。
【０２５４】
細菌系においては、発現される抗体分子に意図される用途に応じて、多数の発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、抗体分子の薬学的組成物の作製のために、大量のこのようなタンパク質が産生される場合には、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を導くベクターが望ましい場合がある。このようなベクターとしては、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２：１７９１  （１９８３））（この場合、融合タンパク質を産生するように、抗体コード配列は個々に、ｌａｃＺコード領域とインフレームでベクター中にライゲートされ得る）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ＆  Ｉｎｏｕｙｅ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ７３：３１０１−３１０９  （１９８５）；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２４：５５０３−５５０９  （１９８９））などが挙げられるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクターを用いて、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させてもよい。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合と、それに続く遊離グルタチオンの存在下での溶出によって、溶解させた細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物をＧＳＴ部分から放出することができるように、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【０２５５】
昆虫系においては、アウトグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして典型的に使用される。このウイルスはヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞内で増殖する。抗体コード配列をウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）中に個々にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置し得る。
【０２５６】
哺乳動物宿主細胞においては、多くのウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合には、目的の抗体コード配列を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーターおよびトリパータイトリーダー配列）に連結させ得る。その後、このキメラ遺伝子を、インビトロまたはインビボでの組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入し得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）での挿入によって、感染宿主内で生存可能でありかつ抗体分子を発現することができる組換えウイルスが得られる（例えば、Ｌｏｇａｎ  ＆  Ｓｈｅｎｋ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：３５５−３５９  （１９８４）を参照のこと）。また、特異的な開始シグナルが、挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳に必要とされる場合もある。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンと隣接配列が含まれる。さらに、挿入物全体の翻訳を確実にするために、開始コドンは、所望のコード配列のリーディングフレームと同調していなければならない。これらの外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源のものであり、天然でも合成でもあり得る。発現の効率は、適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることによって増強させ得る（Ｂｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５３：５１−５４４  （１９８７）を参照のこと）。
【０２５７】
さらに、挿入された配列の発現を調整するか、または所望される特異的な様式で遺伝子産物を修飾および処理する宿主細胞株を選定し得る。タンパク質産物のこのような修飾（例えば、グリコシル化）および処理（例えば、切断）は、タンパク質の機能に重要である場合がある。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後処理および修飾の特徴的かつ特異的な機構を有する。発現される外来タンパク質の正確な修飾および処理を確実にするよう、適切な細胞株または宿主系を選定することができる。この目的のために、一次転写物の適切な処理、遺伝子産物のグリコシル化、およびリン酸化のための細胞機構を保有する真核生物宿主細胞を使用し得る。このような哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、ならびに特に、例えば、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０、およびＴ４７Ｄなどの乳ガン細胞株、ならびに例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔなどの正常乳腺細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５８】
組換えタンパク質の長期にわたる高収率の産生のために、安定発現を使用し得る。例えば、抗体分子を安定に発現する細胞株を改変し得る。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するよりもむしろ、適当な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって制御されるＤＮＡ、および選択マーカーで、宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、改変された細胞を強化培地中で１〜２日間増殖させることが可能であり、その後、選択培地に移す。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がそれらの染色体にプラスミドを安定に組み込み、フォーカスを形成するまで増殖することを可能にし、次にそれをクローニングし、細胞株へと拡大することができる。この方法は、抗体分子を安定に発現する細胞株を改変するために有利に使用し得る。
【０２５９】
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １１：２２３  （１９７７））、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ４８：２０２  （１９９２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ２２：８１７  （１９８０））を含むが、これらに限定されない、多くの選択系を使用してもよく、それぞれ、ｔｋ−細胞、ｈｇｐｒｔ−細胞、またはａｐｒｔ−細胞で用いることができる。また、代謝拮抗物質耐性を、以下の遺伝子の選択の基礎として用いることができる：ｄｈｆｒ（メトトレキセートに対する耐性を付与する）（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：３５７  （１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８：１５２７  （１９８１）））；ｇｐｔ（ミコフェノール酸に対する耐性を付与する）（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８：２０７２  （１９８１））；ｎｅｏ（アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与する）（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５  （１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  ３２：５７３−５９６  （１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２  （１９９３）；およびＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６２：１９１−２１７  （１９９３）；ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５（１９９３年５月）；ならびに、ｈｙｇｒｏ（これは、ハイグロマイシンに対する耐性を付与する）（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ３０：１４７  （１９８４））。使用することができる組換えＤＮＡ技術についての当技術分野で一般に公知の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ  （１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ  （１９９０）；ならびにＤｒａｃｏｐｏｌｉら（編），  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ  （１９９４）の第１２章および第１３章；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５０：１  （１９８１）に記載されており、これらは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。  
【０２６０】
抗体分子の発現レベルは、ベクターの増幅によって増大させることができる（総説としては、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，  Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  第３巻  （１９８７）を参照されたい）。抗体を発現するベクター系中のマーカーが増幅可能である場合には、宿主細胞の培養液中に存在するインヒビターのレベルの増大により、マーカー遺伝子のコピー数が増大する。増幅される領域は抗体遺伝子と関連しているので、抗体の産生も増大する（Ｃｒｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３：２５７  （１９８３））。
【０２６１】
ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストまたはＴｒｋＢアゴニストをコードする核酸を含むベクターを用いて、本発明の方法で使用されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドも産生し得る。ベクターおよびそのような核酸が作動可能に連結される発現制御配列の選定は、所望される機能特性（例えば、タンパク質発現）、および形質転換される宿主細胞に依存する。
【０２６２】
作動可能に連結されたコード配列の発現を調節するのに有用な発現制御エレメントは、当技術分野で公知である。例として、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナル、およびその他の調節エレメントが挙げられるが、これらに限定されない。誘導性プロモーターが使用される場合、それは、例えば、宿主細胞培地中の栄養状態の変化、または温度の変化によって制御することができる。
【０２６３】
ベクターは、原核生物のレプリコン、すなわち、細菌宿主細胞において染色体外で組換えＤＮＡ分子の自律的複製および維持を導く能力を有するＤＮＡ配列を含むことができる。このようなレプリコンは当技術分野で周知である。さらに、原核生物のレプリコンを含むベクターは、その発現が検出可能なマーカー（例えば、薬物耐性）を付与する遺伝子も含み得る。細菌の薬物耐性遺伝子の例は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与する遺伝子である。
【０２６４】
原核生物のレプリコンを含むベクターは、細菌宿主細胞内でのコード遺伝子配列の発現を導くための原核生物またはバクテリオファージのプロモーターも含むことができる。細菌宿主と適合するプロモーター配列は、典型的には、発現されるＤＮＡセグメントの挿入のための好都合な制限部位を含むプラスミドベクター中に提供される。このようなプラスミドベクターの例は、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、およびｐＢＲ３２９（ＢｉｏＲａｄ）、ｐＰＬ、およびｐＫＫ２２３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。任意の好適な原核生物宿主を用いて、本発明の方法で使用されるタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を発現させることができる。
【０２６５】
本発明の目的のために、数多くの発現ベクター系を利用することができる。例えば、１つのクラスのベクターは、動物ウイルス（例えば、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ、もしくはＭＯＭＬＶ）、またはＳＶ４０ウイルス）に由来するＤＮＡエレメントを利用している。その他は、内部リボソーム結合部位を有するポリシストロン性の系の使用を含む。さらに、それらの染色体にＤＮＡを組み込んでいる細胞を、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することによって選択し得る。マーカーは、栄養要求性宿主に対する原栄養性（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｙ）、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）、または銅などの重金属に対する耐性を提供し得る。選択マーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に直接連結させることができるか、または共形質転換によって同じ細胞内に導入することができるかのいずれかである。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子が選択マーカー遺伝子の例である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ａｎａｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  １：３２７−３４１  （１９８２））。さらなるエレメントが、ｍＲＮＡの最適な合成に必要である場合もある。これらのエレメントとしては、シグナル配列またはスプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルが挙げられ得る。
【０２６６】
１つの実施形態において、ＮＥＯＳＰＬＡと呼ばれる発現ベクター（参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第６，１５９，７３０号）を使用し得る。このベクターは、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、マウスβ−グロビン主要プロモーター、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのエキソン１とエキソン２、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、およびリーダー配列を含む。このベクターは、ＣＨＯ細胞にトランスフェクションし、その後、Ｇ４１８を含有する培地で選択し、メトトレキセートで増幅させると、非常に高いレベルの発現をもたらすことが分かっている。もちろん、真核細胞内で発現を誘発することができる任意の発現ベクターを、本発明で使用し得る。好適なベクターの例としては、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、およびｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡから入手可能）、ならびにプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩから入手可能）が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる真核細胞発現ベクターは当技術分野で公知であり、市販されている。典型的には、このようなベクターは、所望のＤＮＡセグメントを挿入するための好都合な制限部位を含む。例示的なベクターとしては、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１、ｐｍｌ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ  ３１２５５）、レトロウイルス発現ベクターｐＭＩＧおよびｐＬＬ３．７、アデノウイルスシャトルベクターｐＤＣ３１５、ならびにＡＡＶベクターが挙げられる。その他の例示的なベクター系は、例えば、米国特許第６，４１３，７７７号に開示されている。
【０２６７】
一般に、好適に高いレベルのアンタゴニストを発現する細胞について、多数の形質転換細胞をスクリーニングすることは、例えば、ロボットによるシステムによって実行することができる日常的な実験である。
【０２６８】
哺乳動物宿主細胞発現のために頻繁に使用される調節配列としては、例えば、レトロウイルスＬＴＲに由来するプロモーターとエンハンサー、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するプロモーターとエンハンサー（例えば、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）に由来するプロモーターとエンハンサー（例えば、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルスに由来するプロモーターとエンハンサー（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄｍｌＰ））、ポリオーマに由来するプロモーターとエンハンサーのような、哺乳動物細胞内での高レベルのタンパク質発現を導くウイルスエレメント、ならびに例えば、ネイティブの免疫グロブリンおよびアクチンのプロモーターのような強力な哺乳動物プロモーターが挙げられる。ウイルスの調節エレメント、およびその配列のさらなる説明については、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉ、米国特許第５，１６８，０６２号；Ｂｅｌｌ、米国特許第４，５１０，２４５号；およびＳｃｈａｆｆｎｅｒ、米国特許第４，９６８，６１５号を参照されたい。
【０２６９】
組換え発現ベクターは、宿主細胞内でベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択マーカー遺伝子を運び得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞を選択しやすくする（例えば、Ａｘｅｌ、米国特許第４，３９９，２１６号；同第４，６３４，６６５号、および同第５，１７９，０１７号を参照のこと）。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、薬物（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキセート）に対する耐性を、ベクターが導入されている宿主細胞に付与する。頻繁に使用される選択マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅と共にｄｈｆｒ−細胞で使用される）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）が挙げられる。
【０２７０】
ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストまたはＴｒｋＢアゴニストをコードするベクターを好適な宿主細胞の形質転換に使用することができる。形質転換は、任意の好適な方法によるものであることができる。哺乳動物細胞に外因性ＤＮＡを導入する方法は当技術分野で周知であり、デキストランによって媒介されるトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレンによって媒介されるトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソームの中へのポリヌクレオチドのカプセル化を介するトランスフェクション、および核へのＤＮＡの直接的なマイクロインジェクションが含まれる。さらに、核酸分子をウイルスベクターによって哺乳動物細胞に導入してもよい。また、哺乳動物細胞は、哺乳動物細胞内に導入されるべき外来ＤＮＡを含む組換えウイルスによって形質導入されてもよい。
【０２７１】
本発明の方法で使用されるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストまたはＴｒｋＢアゴニストの発現のための宿主細胞は、原核生物であってもよく、または真核生物であってもよい。例示的な真核生物宿主細胞としては、酵母細胞ならびに哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＣＬ６１）、ＮＩＨ  Ｓｗｉｓｓマウス胚細胞ＮＩＨ−３Ｔ３（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ１６５８）、およびベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）が挙げられるがこれらに限定されない。その他の有用な真核生物宿主細胞としては、昆虫細胞および植物細胞が挙げられる。例示的な原核生物宿主細胞は、大腸菌およびストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）である。
【０２７２】
宿主細胞の形質転換は、利用されるベクターおよび宿主細胞に適している従来の方法によって遂行することができる。原核生物宿主細胞の形質転換については、エレクトロポレーションおよび塩処理方法を利用することができる（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ６９：２１１０−１４  （１９７２））。脊椎動物細胞の形質転換については、エレクトロポレーション、陽イオン性脂質、または塩処理方法を利用することができる。例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６−４６７  （１９７３）；Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７６：１３７３−７６  （１９７９）を参照されたい。
【０２７３】
ある実施形態において、タンパク質発現のために使用される宿主細胞株は、哺乳動物起源のものであることができる。当業者は、所望の遺伝子産物がその中で発現されるのに最も適している特定の宿主細胞株を決定する能力があると考えられる。例示的な哺乳動物宿主細胞株としては、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲ−）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０  Ｔ抗原を有するＣＶＩの派生物）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、ならびに２９３（ヒト腎臓）が挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明の方法で使用されるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストまたはＴｒｋＢアゴニストの発現のための宿主細胞は、原核生物であってもよい。例示的な原核生物宿主細胞は、大腸菌およびストレプトミセス属である。宿主細胞株は、典型的には、商業サービス、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、または発表された文献から入手可能である。
【０２７４】
産生細胞株からのポリペプチドの発現を、公知の技術を用いて増強させることができる。例えば、グルタミン合成酵素（ＧＳ）系は、ある条件下で発現を増強させるのに一般に用いられる。例えば、欧州特許第０  ２１６  ８４６号、同第０  ２５６  ０５５号、および同第０  ３２３  ９９７号、ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４を参照されたい。
【０２７５】
遺伝子治療
ＬＩＮＧＯ−１およびある種のＴｒｋＢアゴニスト（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、およびアプタマー）は、ニューロンの変性、死、もしくは再生欠如と関連する疾患、障害、または損傷の処置に対する遺伝子治療アプローチを用いて、哺乳動物（例えば、ヒト患者）においてインビボで産生させることができる。これには、好適な発現制御配列に作動可能に連結された好適なＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストおよび／またはＴｒｋＢアゴニストをコードする核酸の投与が含まれる。通常、これらの配列は、ウイルスベクターに組み込まれる。このような遺伝子治療のための好適なウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター（例えば、エプスタイン・バーウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクター）、パポバウイルスベクター、ポックスウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルスベクター）、およびパルボウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターは、複製欠損ウイルスベクターであることができる。それらのＥ１遺伝子またはＥ３遺伝子に欠失を有するアデノウイルスベクターが、典型的に使用される。アデノウイルスベクターが使用される場合、ベクターは通常、選択マーカー遺伝子を有さない。
【０２７６】
薬学的組成物および投与法
本発明の方法で使用されるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストまたはＴｒｋＢアゴニストは、哺乳動物（ヒトを含む）に投与される薬学的組成物に処方されてもよい。本発明の方法で使用される薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を含み、これには、例えば、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）、緩衝物質（例えば、リン酸塩）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質（例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩）、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂が含まれる。
【０２７７】
本発明の方法で使用される組成物は、任意の好適な方法で（例えば、非経口的に、脳室内に、経口的に、吸入噴霧によって、局所的に、直腸に、鼻腔に、舌下に、膣に、または埋め込まれたリザーバーを介して）投与してもよい。本明細書で使用される場合の用語「非経口」には、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、髄腔内、肝臓内、病変内、および頭蓋内への注射または注入技術が含まれる。先に記載されたように、本発明の方法で使用されるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストまたはＴｒｋＢアゴニストは、神経系で作用し、ニューロンの生存を促進する。したがって、本発明の方法においては、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストまたはＴｒｋＢアゴニストは、それらが血液脳関門を横断するような方法で投与される。この横断は、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト分子もしくはＴｒｋＢアゴニスト分子自体に固有の物理化学的特性によって、薬学的組成物中のその他の成分によって、または血液脳関門を破るための機械的装置（針、カニューレ、もしくは外科手術用の器具）の使用からもたらされ得る。ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストまたはＴｒｋＢアゴニストが血液脳関門を本来横断しない分子（例えば、横断を促進する部分に対する融合体）である場合、好適な投与経路は、例えば、髄腔内または頭蓋内であり、例えば、ＭＳの慢性病変内に直接である。ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストまたはＴｒｋＢアゴニストが血液脳関門を本来横断する分子である場合、投与経路は、以下に記載される様々な経路のうちの１つ以上であり得る。
【０２７８】
本発明の方法で使用される組成物の滅菌注射可能形態は、水性懸濁液であってもよく、または油性懸濁液であってもよい。これらの懸濁液は、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて当技術分野で公知の技術に従って処方し得る。滅菌注射可能調製物はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤もしくは溶媒中の、滅菌注射可能溶液または滅菌注射可能懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール中の懸濁液）であってもよい。利用し得る許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー溶液、および等張性の塩化ナトリウム溶液が含まれる。さらに、滅菌不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として従来利用されている。この目的のために、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の無刺激性の不揮発性油を利用し得る。脂肪酸（例えば、オレイン酸およびそのグリセリド誘導体）は、特に、ポリオキシエチレン化されたバージョンの薬学的に許容される天然油（例えば、オリーブ油またはヒマシ油）がそうであるように、注射可能物の調製に有用である。これらの油の溶液または懸濁液は、長鎖アルコールの希釈剤または分散剤（例えば、カルボキシメチルセルロースまたは乳濁液および懸濁液を含む薬学的に許容される投薬形態の製剤で一般に使用される同様の分散剤）も含んでよい。その他の一般に使用されるサーファクタント（例えば、Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎ、およびその他の乳化剤）またはバイオアベイラビリティー増強剤（薬学的に許容される固体、液体、もしくはその他の投薬形態の製造で一般に使用されるもの）も、処方の目的のために使用してよい。
【０２７９】
非経口製剤は、単回ボーラス投与量、注入、または負荷ボーラス投与量と、それに続く維持投与量であってもよい。これらの組成物は、特定の固定された間隔もしくは可変の間隔（例えば、１日に１回）、または「必要に応じた」基準で投与してもよい。
【０２８０】
本発明の方法で使用されるある薬学的組成物を、許容される投薬形態（例えば、カプセル、錠剤、水性懸濁液または溶液を含む）で経口投与してもよい。また、ある薬学的組成物を、鼻腔用のエアロゾルまたは吸入により投与してもよい。このような組成物を、ベンジルアルコールもしくその他の好適な防腐剤、バイオアベイラビリティー増強するための吸収促進剤、および／またはその他の従来の可溶化剤もしくは分散剤を利用して、生理食塩水中の溶液として調製してもよい。
【０２８１】
単回投薬形態を産生するために担体材料と組み合わせ得るＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストおよび／またはＴｒｋＢアゴニストの量は、処置される宿主、使用されるアンタゴニストの種類、および特定の投与様式によって異なる。組成物は、単回用量、複数回用量として、または設定された期間にわたって注入として投与し得る。また、投薬レジメンを調整して、最適な所望の応答（例えば、治療応答または予防応答）を提供し得る。
【０２８２】
本発明の方法は、「治療有効量」もしくは「予防有効量」のＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストまたはＴｒｋＢアゴニストを使用する。このような治療有効量または予防有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重のような要因によって異なり得る。治療有効量または予防有効量は、治療的に有益な効果がいかなる毒性効果または有害効果をも上回る量でもある。
【０２８３】
任意の特定の患者についての具体的な投薬量および処置レジメンは、様々な要因に依存し、これらには、使用される特定のＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストまたはＴｒｋＢアゴニスト、患者の年齢、体重、全般的な健康、性別、および食事、ならびに投与の時機、排出の速度、薬剤の併用、ならびに処置されている特定の疾患の重症度が含まれる。医療介護者によるそのような要因の判断は、当業者の能力の範囲内である。この量は、処置される個々の患者、投与の経路、製剤の種類、使用される化合物の特徴、疾患の重症度、および所望の効果にも依存する。使用される量は、当技術分野で周知の薬理学的および薬物動態的原理によって決定することができる。
【０２８４】
本発明の方法において、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストまたはＴｒｋＢアゴニストは、通常、神経系に、脳室内にまたは髄腔内に（例えば、ＭＳの慢性病変内に）直接的に投与される。本発明の方法による投与のための組成物は、１日当たり０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量のＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリペプチドが投与されるように処方することができる。本発明のいくつかの実施形態において、投薬量は、１日当たり０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇ体重である。いくつかの実施形態において、投薬量は、１日当たり０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０２８５】
ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト抗体またはＴｒｋＢアゴニスト抗体による処置のために、投薬量は、例えば、宿主体重に対して、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より通常は、０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇなど）の範囲であり得る。例えば、投薬量は、体重に対して、１ｍｇ／ｋｇもしくは１０ｍｇ／ｋｇ、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、任意で少なくとも１ｍｇ／ｋｇであり得る。上記の範囲の中間の用量もまた、本発明の範囲内にあることが意図される。対象は、このような用量を毎日、１日おきに、毎週、または実験的解析によって決定された任意のその他のスケジュールに従って投与することができる。例示的な処置は、例えば、少なくとも６か月間の長期にわたる複数回投薬での投与を伴う。さらなる例示的な処置レジメンは、２週間に１回または１か月に１回または３〜６か月に１回の投与を伴う。例示的な投薬スケジュールとしては、連日の１〜１０ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇ、１日おきに３０ｍｇ／ｋｇまたは毎週６０ｍｇ／ｋｇが挙げられる。いくつかの方法において、異なる結合特異性を有する２つ以上のモノクローナル抗体が同時に投与される。この場合、投与される各々の抗体の投薬量は、示された範囲内に収まる。
【０２８６】
ある実施形態において、対象は、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストポリヌクレオチドまたはＴｒｋＢアゴニストポリヌクレオチドをコードする核酸分子で処置することができる。核酸の用量は、患者１人当たり約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇ、または３０〜３００μｇ  ＤＮＡの範囲である。感染性ウイルスベクターの用量は、投与１回当たり１０〜１００ビリオン、またはそれより多くで変化する。
【０２８７】
ある実施形態において、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストは、競合アッセイまたは免疫沈降アッセイで測定された場合、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストの非存在下でのＬＩＮＧＯ−１とＴｒｋＢの相互作用と比較して、ＬＩＮＧＯ−１とＴｒｋＢの相互作用を少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％阻止するのに有効な量で投与され得る。
【０２８８】
ある実施形態において、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストは、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストの非存在下でのリン酸化ＴｒｋＢの量と比較して、ＴｒｋＢのリン酸化を少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％促進するのに有効な量で投与され得る。
【０２８９】
ある実施形態において、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストは、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストの非存在下でのリン酸化ＪＮＫの量と比較して、ＪＮＫのリン酸化を少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％減少させるのに有効な量で投与され得る。
【０２９０】
ある実施形態において、ＴｒｋＢアゴニストおよびＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストは、未処置のＣＮＳニューロンまたは哺乳動物における生存ニューロンの数と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、９５０％、または１０００％の生存ニューロンの数の増大によってＣＮＳニューロンの生存を促進するのに有効な量で投与され得る。
【０２９１】
補助的な活性化合物もまた、本発明の方法で使用される組成物に組み入れることができる。例えば、可溶性ＬＩＮＧＯ−１ポリペプチドもしくはＴｒｋＢアゴニストポリペプチドまたは可溶性ＬＩＮＧＯ−１融合タンパク質もしくはＴｒｋＢアゴニスト融合タンパク質を、１つ以上のさらなる治療剤と一緒に処方し、かつ／または一緒に投与し得る。
【０２９２】
本発明は、選択された標的組織へのＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストまたはＴｒｋＢアゴニストの任意の好適な送達方法を包含し、これには、水性溶液のボーラス注射または制御放出システムの埋め込みが含まれる。制御放出インプラントの使用は、反復注射の必要性を低下させる。
【０２９３】
本発明の方法で使用されるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストまたはＴｒｋＢアゴニストは、脳に直接注入し得る。化合物の脳への直接的な注入のための様々なインプラントが公知であり、神経学的障害に苦しむヒト患者への治療用化合物の送達に有効である。これらには、ポンプを使用する脳への慢性的注入、定位固定されて埋め込まれた一時的な侵入カテーテル、永久的な頭蓋内カテーテルインプラント、および外科的に埋めこまれた生体分解性インプラントが含まれる。例えば、Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  上記；Ｓｃｈａｒｆｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  「Ｈｉｇｈ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｏｄｉｎｅ−１２５  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔ  Ｆｏｒ  Ｇｌｉｏｍａｓ」，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｌ．  Ｐｈｙｓ．  ２４（４）：５８３−５９１  （１９９２）；Ｇａｓｐａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  「Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ  １２５１  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ」，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｌ．  Ｐｈｙｓ．  ４３（５）：９７７−９Ｓ２  （１９９９）；  Ｂｅｌｌｅｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，  「Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｂｒａｃｈｙｔｈｅｒａｐｙ」（Ｇｉｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  （１９９８）），  第６６章，  ５７７−５８０頁；およびＢｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，  「Ｔｈｅ  Ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ＢＣＮＵ−Ｌｏａｄｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｅｗｌｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｅｄ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｇｌｉｏｍａｓ：  Ｐｈａｓｅ  Ｉ  Ｔｒｉａｌ」，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２６：１１１−２３  （１９９５）を参照されたい。
【０２９４】
組成物はまた、化合物の好適な送達系または支持系として機能する生体適合性担体材料に分散されたＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストまたはＴｒｋＢアゴニストを含んでもよい。徐放性担体の好適な例としては、坐剤またはカプセルのような成型された製品の形態の半透性ポリマーマトリックスが挙げられる。埋め込み可能なマトリックスまたはマイクロカプセル型の徐放性マトリックスとしては、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，３１９号；欧州特許第５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５６  （１９８５））；ポリ（２−ヒドロキシエチル−メトアクリレート）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．  １５：１６７−２７７  （１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，  Ｃｈｅｍ．  Ｔｅｃｈ．  １２：９８−１０５  （１９８２）、またはポリ−Ｄ−（−）−３ヒドロキシ酪酸（ＥＰ  １３３，９８８）が挙げられる。
【０２９５】
本発明のいくつかの実施形態において、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストまたはＴｒｋＢアゴニストは、脳の適当な領域への直接的注入によって患者に投与される。例えば、Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  「Ｄｉｒｅｃｔ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ」，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．９：５８９−９５  （２００３）を参照されたい。代替の技術が利用可能であり、本発明によるＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストを投与するために適用し得る。例えば、カテーテルまたはインプラントの定位固定設置を、Ｒｉｅｃｈｅｒｔ−ＭｕｎｄｉｎｇｅｒユニットおよびＺＤ（Ｚａｍｏｒａｎｏ−Ｄｕｊｏｖｎｙ）の多目的局在化ユニットを用いて遂行することができる。１２０ｍｌのオムニパーク、３５０ｍｇのヨウ素／ｍｌを注射する、コントラスト増強型コンピュータ断像撮影法（ＣＴ）スキャン（２ｍｍのスライス厚を有する）は、三次元多平面処理プラニング（ＳＴＰ，  Ｆｉｓｃｈｅｒ，  Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を可能にすることができる。この機器は、明確な標的確認のためにＣＴとＭＲＩの標的情報を統合し、磁気共鳴イメージング検討に基づくプラニングを可能にする。
【０２９６】
ＧＥ  ＣＴスキャナー（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，  ＷＩ）と共に使用するために修正されたＬｅｋｓｅｌｌ定位固定システム（Ｄｏｗｎｓ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ，  Ｉｎｃ．，  Ｄｅｃａｔｕｒ，  ＧＡ）およびＢｒｏｗｎ−Ｒｏｂｅｒｔｓ−Ｗｅｌｌｓ（ＢＲＷ）定位固定システム（Ｒａｄｉｏｎｉｃｓ，  Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，  ＭＡ）をこの目的のために使用することができる。したがって、埋め込みをする日の朝に、ＢＲＷ定位固定フレームの輪状の基部リングを患者の頭蓋骨に取り付けることができる。連続ＣＴ切片は、基部プレートにクランプで固定されたグラファイト製のロッドローカライザーフレームを用いて（標的組織）領域全体にわたって３ｍｍの間隔で得ることができる。コンピュータ化された処置プラニングプログラムを、グラファイト製のロッドイメージのＣＴ座標を用いて、ＶＡＸ  １１／７８０コンピュータ（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｍａｙｎａｒｄ，  Ｍａｓｓ．）で実行し、ＣＴ空間とＢＲＷ空間の間をマップすることができる。
【０２９７】
本明細書に記載されるような障害の処置方法は、典型的には、ヒトで使用される前に、所望の治療活性または予防活性について、インビトロで試験され、その後、許容される動物モデルにおいてインビボで試験される。好適な動物モデル（トランスジェニック動物を含む）は当業者に周知である。例えば、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストまたはＴｒｋＢアゴニストの生存効果を実証するためのインビトロアッセイが本明細書に記載されている。最後に、インビボ試験は、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストもしくはＴｒｋＢアゴニストを発現するトランスジェニックマウスを作製することによるかまたはＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストもしくはＴｒｋＢアゴニストを本明細書に記載されるようなモデルにおいてマウスもしくはラットに投与することによって行なうことができる。
【０２９８】
本発明の実施は、別途示されない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技術（これらは、当業者の能力の範囲内である）を利用する。このような技術は文献で十分に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （３巻セット），  Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｄ．  Ｗ．  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （２００１）；Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩＩ，  Ｂ．  Ｌｅｗｉｎ，  Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ  （２００３）；ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ，  ＣＷ．  Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｇ．Ｓ．  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，  ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ  （２００３）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｄ．  Ｎ．  Ｇｌｏｖｅｒ編，  第Ｉ巻および第ＩＩ巻  （１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），  Ｐ．  Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ  （編），  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  （２００４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，  第４版，  Ｒ．  Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ  （２０００）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｇａｉｔ  （編），  （１９８４）；  Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，  Ｂ．  Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．  Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編．  （１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，  Ｍ．  Ｌ．  Ｍ．  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  （１９９９）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  第２版，  Ｍ．  Ｂｕｔｌｅｒ，  ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  （２００４）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ），  Ｊ．  Ｗｏｏｄｗａｒｄ，  ＩｒＩ  Ｐｒ  （１９９２）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，  Ｂ．  Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．  Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ  （編）  （１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｒ．  Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  （１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  （１９８６）；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  第３版，  Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．  （１９８８）；専門書，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎ．  Ｙ．；  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｊ．  Ｈ．  Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｐ．  Ｃａｌｏｓ編，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  第１５４巻および第１５５巻，  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．  （編）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，  （編），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ  （１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  第Ｉ−ＩＶ巻，  Ｄ．  Ｍ．  Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  （編），  （１９８６）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ：  Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  （４巻セット），  初版，  Ｉ．  Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９７）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第３版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （２００２）；ならびにＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ  （１９８９）を参照されたい。
【０２９９】
抗体工学の一般的な原理は、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），  Ｂ．Ｌ．  Ｌｏ  （編），  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  （２００３）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｒ．  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｄｕｂｅｌ  （編），  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  （２００１）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  第２版，  Ｃ．Ａ．Ｋ．  Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  （編），  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ  （１９９５）  に示されている。タンパク質工学の一般的な原理は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  （編），  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｅｎｇ．  （１９９５）  に示されている。抗体および抗体−ハプテン結合の一般的な原理は、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｅ．  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｌａｎｅ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８８）；Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，  Ａ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  第２版，  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，  ＭＡ  （１９８４）；およびＳｔｅｗａｒｄ，  Ｍ．  Ｗ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｔｈｅｉｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，  Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ  （１９８４）  に示されている。さらに、当技術分野で公知の、具体的には記載されない標準的な免疫学の方法は、通常、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （編）  ，  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），  第２版，  Ｊ．  Ｄ．  Ｐｏｕｎｄ  （編），  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９８），  Ｗｅｉｒ’ｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  第５版，  Ｄ．  Ｍ．  Ｗｅｉｒ  （編），  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  （１９９６），  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  第２版，  Ｒ．  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｂｏｔｒａｎ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  （２００１）；Ｂａｓｉｃ，  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  第８版，  Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，  Ｎｏｒｗａｌｋ，  ＣＴ  （１９９４）、およびＭｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ  （編），  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８０）に記載のものと同様である。
【０３００】
免疫学の一般的な原理を示す標準的な参考文献としては、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｋｌｅｉｎ，  Ｊ．；  Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  第４版，  Ｒ．  Ａ．  Ｇｏｌｄｓｂｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．  （２０００）；Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｍ．  Ｐｅａｋｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ  （１９９７）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  第６版，  Ｉ．  Ｒｏｉｔｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｓｂｙ，  Ｌｏｎｄｏｎ  （２００１）；Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  第５版；Ａ．Ｋ．  Ａｂｂａｓ，  Ａ．Ｈ．  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  −  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  （２００５）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ：  Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  （４巻セット），  初版，  Ｉ．  Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９７）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  第５版，  Ｒ．Ａ．  Ｇｏｌｄｓｂｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  （２００２）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  第３版，  Ｊ．Ｗ．  Ｇｏｄｉｎｇ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９６）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８２）；Ｋｅｎｎｅｔｔ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  （編），  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：  Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８０）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  Ａ．，  「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（Ｂｕｒｄｅｎ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  （編），  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  第１３巻，  Ｅｌｓｅｖｅｒｅ，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  （１９８４）が挙げられる。  
【０３０１】
上で引用されている全ての参考文献、および本明細書に引用されている全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０３０２】
材料および方法
組換えＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃおよび抗ＬＩＮＧＯ−１モノクローナル抗体の作製
ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ（ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃタンパク質）を以前に記載されているように調製した（Ｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ７：２２１−２２８  （２００４））。ヒトＬＩＮＧＯ−１の残基１〜５３２をヒトＩｇＧ１のヒンジおよびＦｃ領域に融合し、ＣＨＯ細胞で発現させた。ヒトＩｇＧ１（対照タンパク質）は、Ｐｒｏｔｏｓ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ）から購入した。抗ＬＩＮＧＯ−１  ｍａｂ  １Ａ７を、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃで免疫化したマウスで作製した。ハイブリドーマ細胞株をＤＭＥＭ中で増殖させ、抗体をプロテインＡセファロースにより精製した。ＭＯＰＣ２１マウスＩｇＧ（対照タンパク質）は、Ｐｒｏｔｏｓ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ）から購入した。
【０３０３】
高眼圧モデル
実験は、実験動物の管理および使用に関する米国国立衛生研究所指針（ＮＩＨ刊行物第８０−２３号）（１９９６年改訂）に従って行ない、香港大学動物倫理委員会の承認を受けた。体重約２５０ｇの成体メスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットを使用した。標準的な実験ケージ当たり３匹でラットを飼育し、餌と水を自由に与えて１２時間の明暗周期（午前７：００／午後７：００）で維持した。全ての操作は、ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（８ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射で麻酔した動物で行なった。全ての操作の前に０．５％アルカイン（Ａｌｃｏｎ−Ｃｏｕｖｒｅｕｒ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）を眼に適用し、処置後の感染を防止するために殺菌目薬（Ｔｏｂｒｅｓ［トブラマイシン  ０．３％］，  Ａｌｃｏｎ−Ｃｏｕｖｒｅｕｒ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用した。手術後７日間、痛みを和らげるために、飲料水中のリマディル（０．０２５ｍｇ／ｍｌ）を使用した。
【０３０４】
慢性高血圧モデルを用いて、実験的緑内障を誘導した。ＳＤラットは、右眼の上強膜静脈および角膜縁静脈に、出力１０００ｍＷ、スポットサイズ５００〜１００μｍ、および持続時間０．１秒で、アルゴンレーザー光凝固を受けた（Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １９：２６５−２１２  （２００４）；ＷｏｌｄｅＭｕｓｓｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．  ４２：２８４９−２８５５  （２００１））。約９０個のスポットを３つの上強膜静脈に当て、７０個のスポットを角膜縁静脈周辺に当てた。７日後に、再接続した血流を遮断するために２回目のレーザー手術を行なった。動物の左眼を対側対照として用い、それに対しては操作を行なわなかった。動物を、最初のレーザー被爆後、２週間または４週間生存させた後、屠殺した。Ｔｏｎｏｐｅｎ  ＸＬ  Ｔｏｎｏｍｅｔｅｒをレーザー手術後の異なる時点で用いて、右眼および左眼のＩＯＰを測定した。各眼について、１０回の測定の平均値を得た。屠殺の４日前に、ＲＧＣのＦＧ標識を行なった。頭蓋骨および皮質の小片を取り除いた後、両方の上丘（ＳＣ）を剥き出しにし、ＦＧ（６％ｖ／ｖ、Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ、Ｄｅｎｖｅｒ、ＣＯ）で浸した１枚のＧｅｌｆｏａｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＆  Ｕｐｊｏｈｎ）をＳＣの表面に置いた。ＦＧは、無傷のＲＧＣを逆行性標識した。１２匹の動物をＰＢＳで処置し、最初のレーザー被爆後４週間、生存させた。その他の実験群の全てにおいて、１０匹の動物を使用した。緑内障モデルの手順を図１にまとめる。
【０３０５】
１回目のレーザー処置の後、動物はすぐに、２μｇのＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ、２μｇの１Ａ７、または２μｇの対照タンパク質を含むＰＢＳの硝子体内注射を受けた。４週間の緑内障モデルでは、タンパク質を、週に１回再注射した。ＲＧＣの計数の間、研究者の先入観を避けるために、処置が分からないようにした。動物は全て、麻酔の過剰摂取により安楽死させた。
【０３０６】
所定の時点で、ラットを麻酔の過剰摂取により屠殺した。各動物の両眼を摘出し、４％パラホルムアルデヒド中で６０分間固定した。網膜をフラットマウント標本として調製し、ＦＧ標識されたＲＧＣを、記載されているような紫外フィルター（励起波長＝３３０〜３８０ｎｍ）を用いて蛍光顕微鏡下で計数した（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２５：３８３−３９３  （２００４）；Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １９：２６５−２７２  （２００４））。ＲＧＣを、２００×２００μｍ２の接眼レンズグリッド下で、各４半分の正中線に沿って、視神経円板からその境界まで５００μｍ間隔で定量した（図２）。各４半分の８つの顕微鏡視野、および４つの４半分について網膜当たり合計３２個を計数したが、これは、各網膜面積の約３〜３．２％に相当した。ＲＧＣの損失パーセントを測定し、異なる処置の生存効果を調べた。データは、対側の無傷の眼と比較した損傷した眼のＲＧＣ損失の相対的割合（対側％、平均＋標準偏差）に換算して表した。
【０３０７】
透過電子顕微鏡法のための組織処理
２ｍｍの網膜の断片を、ＰＢＳ、可溶性ＬＩＮＧＯ−１、または１Ａ７で処置した正常群および２週間の緑内障群から得た。それらを、Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ電子顕微鏡（ＥＭ）固定液中に４℃で２〜４時間置いた。０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ）中で洗浄した後、組織試料を０．１Ｍ  ＰＢ中の１％四酸化オスミウム中で後固定し、その後、エタノール中で脱水し、Ｅｐｏｎに包埋した。半薄（１μｍ）切片を、ＬＫＢナイフメーカーで作製されたガラスナイフ付きのＲｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇウルトラミクロトームを用いて各々のブロックから得た。これらの切片をトルイジンブルーで染色した。銀色の干渉色を有する超薄切片を得、Ｒｅｙｎｏｌｄｓクエン酸鉛と酢酸ウラニルで染色し、電子顕微鏡で調べた。
【０３０８】
初代ＲＧＣ培養
Ｐ７  Ｌｏｎｇ−Ｅｖａｎｓラットの眼を取り除き、解離培地（ＤＭ；９０ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４、３０ｍＭ  Ｋ２ＳＯ４、５．８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．００１％フェノールレッド）（Ｆｕｒｓｈｐａｎ  ａｎｄ  Ｐｏｔｔｅｒ，  １９８９）中に置いた。眼から網膜を取り除き、１５Ｕ／ｍｌパパイン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，  ＮＪ）、１ｍＭ  Ｌ−システイン、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  ＤＮアーゼＩを含有する２ｍｌのＤＭ中、３７℃で３０分間インキュベートした。網膜をＤＭ中で２回すすぎ、１０ｍｇ／ｍｌオボムコイドプロテアーゼ阻害剤、１０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（両方ともＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ製）を含有する２ｍｌのＤＭに再懸濁し、２ｍｌの血清学的ピペットを用いて１０〜１５回穏やかにすり潰した。解離した細胞を１０００ｒｐｍで５分間ペレット化し、Ｍｅｙｅｒ−Ｆｒａｎｋｅら（Ｍｅｙｅｒ−Ｆｒａｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｎ  １５：８０５−８１９  （１９９５））（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製の１ｘ  Ｂ２７、５μＭフォルスコリン、６０ｎＭ  Ｔ３、１ｍＭピルビン酸塩、２ｍＭグルタミン酸塩）から改変された２ｍｌの増殖培地に再懸濁し、血球計で計数した。細胞を、５０，０００細胞／ｃｍ２の密度で、ポリ−Ｄ−リジンとラミニン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）でコーティングされたＢＤ  Ｂｉｏｃｏａｔ  ９６ウェル組織培養プレート中にプレーティングし、ＣＯ２インキュベーター中で３日間増殖させた。プレーティングの時点で、ヒトＩｇＧ１（１０μｇ／ｍｌ）、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ）のみ、ヒトＩｇＧ１と２５ｎｇ／ｍｌ  ＢＤＮＦ、またはＬＩＮＧＯ−１  ＦｃとＢＤＮＦの４通りのウェルで細胞を処置した。
【０３０９】
細胞を、−２０℃、メタノール中で、１５分間固定し、ＰＢＳ中で２回すすぎ、５％正常ヤギ血清を含有するＰＢＳ中で１時間ブロッキングした。細胞を、Ｔｈｙ  １．１抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ、クローンＯＸ−７、ＰＢＳ中１：４０）中で、一晩４℃でインキュベートし、ＰＢＳ中で５分間、３回すすぎ、Ａｌｅｘａ５９４が結合体化されたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｅｕｇｅｎｅ，  ＯＲ；  １：１０００）中で１時間インキュベートし、ＰＢＳ中で５分間、３回すすいだ。
【０３１０】
Ｚｅｉｓｓ  ａｘｉｏｖｅｒｔ倒立顕微鏡を用いた落射蛍光顕微鏡法によりＲＧＣを同定した。各ウェルの表面全体を落射蛍光下に目視で見渡し、生存しているＲＧＣを計数した。ニューロンの形態を有しかつ細胞体直径の３倍の最小長を有する少なくとも１つの突起を持つＴｈｙ  １．１陽性細胞のみを計数した。
【０３１１】
ＬＩＮＧＯ−１およびｐ−ＴｒｋＢの免疫組織化学
屠殺の４日前に、ＲＧＣをＦＧで逆行性標識した。０．９％生理食塩水の経心腔的灌流に続いて損傷させた２週間後に眼を摘出し、次に４％ＰＦＡ中で４時間、後固定した。１０ミクロン厚の凍結切片をマウス抗ＬＩＮＧＯ−１抗体（Ｂｉｏｇｅｎ）、ウサギ抗−ホスホＴｒｋＢ（Ｔｙｒ７８５）抗体（Ｂ．  Ｓｕｎ博士，  Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓｈａｎｇｈａｉ，  Ｃｈｉｎａからの贈呈品）  （Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ８：１６４−１７２  （２００５））とインキュベートし、次いでＡｌｅｘａ標識二次抗体で処置した。洗浄後、これらの切片を、蛍光マウント媒体（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を用いて標本作製し、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  ＭＥＴＡ共焦点顕微鏡の下で解析した。
【０３１２】
ウェスタンブロッティング
網膜のＬＩＮＧＯ−１、ＢＤＮＦ、またはｐ−ＴｒｋＢを測定するために、動物を、レーザー凝固の２週間後に安楽死させた。Ａｋｔリン酸化の時間的プロファイルを評価するために、ＬＩＮＧＯ−１−ＦｃまたはＰＢＳで処置した動物を、レーザー凝固の６時間後、１日後、および５日後に、安楽死させた。ＴｒｋＢリン酸化に対する損傷、ＢＤＮＦ、およびＬＩＮＧＯ−Ｆｃまたは１Ａ７の効果を測定するために、本発明者らは、ＢＤＮＦ（５μｇ／眼、組換えヒトＢＤＮＦ；Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，  Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，  ＮＹ）またはＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃもしくは１Ａ７（２μｇ／眼）と組み合わせたＢＤＮＦを、レーザー凝固と同じ時点で硝子体内に注射し、その後、５日後に、動物を安楽死させた。網膜を解剖し、１０％プロテアーゼ阻害剤カクテルと１％ホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ製）が補充された溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ）中でホモジナイズした。１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して細胞残屑を除去した後、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＤＣタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を用いて、上清のタンパク質濃度を測定した。個々の動物からの４０〜８０μｇアリコートのタンパク質を、６〜１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて、ＰＶＤＦ膜に転写した。この膜を、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）中の５％脱脂粉乳と２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で、室温で１時間ブロッキングした。マウス抗ＬＩＮＧＯ−１抗体（Ｂｉｏｇｅｎ）、ウサギ抗ＢＤＮＦ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、マウス抗ホスホＡｋｔ抗体（１：１０００）、ウサギトータルＡｋｔ抗体（１：１０００）、抗ホスホＪＮＫ抗体（１：１０００）、トータルＪＮＫ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギ抗ホスホＴｒｋＢ抗体（Ｔｙｒ７８５）（１：１０００）（Ｂ．  Ｓｕｎ博士，  Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓｈａｎｇｈａｉ，  Ｃｈｉｎａからの贈呈品）（Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ８：１６４−１７２  （２００５））、およびニワトリＩｇＹトータルＴｒｋＢ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ）（１：１００）とのインキュベーションを一晩４℃で行なった。洗浄後、この膜を、５％脱脂粉乳と２％ＢＳＡとを含有するＴＢＳＴ中の西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体二次抗体と室温で１時間インキュベートした。増強化学発光法（ＥＣＬ，  Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて免疫反応性のタンパク質を検出した。アクチンに対するモノクローナルヤギ抗体（１：１０００、Ｃ−１１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、タンパク質ローディングを制御した。Ｌａｂｗｏｒｋｓゲルドキュメンテーション（ＵＶＰ，  Ｉｎｃ，  Ｕｐｌａｎｄ，  ＣＡ）を用いたデンシトメトリースキャニングによって、各バンドの強度を定量した。ウェスタンブロッティング用の実験は全て、各群につき３〜５匹の動物を用いて行ない、個々の動物として試料��ゲル上に走らせた。タンパク質レベルを、最終的には、正常な網膜の総タンパク質と比較した相対値として表した。
【０３１３】
ＬＩＮＧＯ−１およびＴｒｋＢの免疫沈降およびウェスタンブロッティング
ＨＡタグ付き全長ヒトＬＩＮＧＯ−１、ｍｙｃタグ付き全長ヒトＴｒｋＢ、またはＬＩＮＧＯ−１／ＴｒｋＢの組み合わせを２９３Ｔ細胞（１００ｍｍディッシュ）にトランスフェクトした。４８時間後に細胞を回収し、１ｍｌ  ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．２、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５％グリセロール）中で、４℃で３０分間溶解させた。１４，０００ｘｇで１５分間遠心分離した後、上清を、プロテインＡ／Ｇプラスセファロースビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ＣＡ）と４℃で１時間インキュベートした。その後、プレクリアーしたライセートを抗ＬＩＮＧＯ−１抗体（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）と４℃で１時間インキュベートし、次いでプロテインＡ／Ｇセファロースビーズを１時間添加した。ビーズを、１％Ｔｒｉｔｏｎ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および１０％グリセロール）で３回洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液中で煮沸し、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、抗ＴｒｋＢ抗体（Ｍｙｃ，  Ｒｏｃｈｅ）または抗ＬＩＮＧＯ−１抗体（ＨＡ，  Ｒｏｃｈｅ）を用いたウェスタンブロッティングにより解析した。また、正常ラットまたは２週間の高眼圧ラット由来の網膜ライセートを、抗ＴｒｋＢ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、抗ＬＩＮＧＯ−１抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ）、または非特異的抗体を用いて４℃で一晩免疫沈降し、抗ＬＩＮＧＯ−１抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ）を用いたウェスタンブロッティングにより解析した。
【０３１４】
Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ−１細胞（ＰＣ１２細胞のサブクローン株、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）または過剰発現された安定なＨＡ−ＬＩＮＧＯ１を有するＮｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ細胞に、ＴｒｋＢレンチウイルスを２日間感染させた。細胞を一晩血清飢餓状態にした後、無血清培地中で０分間または３０分間、ＢＤＮＦにさらした。細胞ライセートをｐａｎ−Ｔｒｋ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  ｓｃ−１３９）により免疫沈降し、その後、ホスホＴｒｋＢ用の抗ホスホＴｙｒ抗体またはトータルＴｒｋＢ用の抗ＴｒｋＢ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）のいずれかを用いたウェスタンブロッティングにより評価した。また、細胞ライセートを、ＬＩＮＧＯ−１発現（ＨＡ，  Ｒｏｃｈｅ）についてのウェスタンブロッティングによって評価した。
【０３１５】
統計
２群間の比較のためのスチューデントのｔ検定を用いるか、または３群以上の比較のための一方向の分散分析（ＡＮＯＶＡ）と、それに続く事後検定（スチューデント−ニューマン−クールズ）によって、統計解析を行なった。
【０３１６】
実施例１
ラット緑内障モデルにおけるＬＩＮＧＯ−１の発現増大
ＬＩＮＧＯ−１の発現をラット緑内障モデルで調べた。このモデルでは、アルゴンレーザーを用いて、角膜縁と上強膜のドレナージ血管（ｄｒａｉｎａｇｅ  ｖｅｓｓｅｌ）の光凝固によって房水の流れを遮断し、眼圧（ＩＯＰ）の確実な増大をもたらした（図１参照）。
【０３１７】
高眼圧状態を発生させるために、角膜縁静脈および３つの上強膜静脈に、アルゴンレーザーを用いて７日間の間隔で２回光凝固を施した。レーザー光凝固の前および直後の房水静脈の検討により、図３に示すような、静脈血流の顕著な減少が明らかとなった。
【０３１８】
正常なラット網膜切片および損傷したラット網膜切片でＬＩＮＧＯ−１発現を調べた。正常な網膜神経節細胞（ＲＧＣ）は、低レベルのＬＩＮＧＯ−１の染色を表したが、レーザー凝固の２週間後に、はるかに強いＬＩＮＧＯ−１に対する免疫反応性がＲＧＣで生じた。標識されたＲＧＣの数と標識の強度は両方とも増大した（図４参照）。（用語「レーザー凝固後」とは、「１回目のレーザー凝固後」を意味する。）
これらの知見をウェスタンブロッティングで確認し、これにより、ＬＩＮＧＯ−１発現は、正常網膜では低かったが、損傷の２週間後に１．６倍にまで増大することが示された（Ｐ＜０．０５）（図５参照）。
【０３１９】
実施例２
ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストは眼圧に影響を及ぼすことなく神経保護剤として作用する
圧力またはニューロンの生存の変化を測定することによって、実験的高眼圧をモニタリングすることができる。したがって、眼圧とＲＧＣ生存の両方に対するＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストの効果を調べた。動物に、上記のような、レーザー処置を受けさせ、その直後にＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ、１Ａ７、または対照タンパク質の硝子体内注射を受けさせた。
【０３２０】
処置した眼および処置していない眼の眼圧（ＩＯＰ）をモニタリングした。処置した動物の対側左眼のＩＯＰは、約１３ｍｍＨｇであり（図６参照）、実験を通して同じレベルのままであった。４つの群全てのレーザー処置した右眼のＩＯＰは、最初のレーザー手術後に増大し、約２２ｍｍＨｇに達し、屠殺するまでこのレベルのままであった。これらの実験条件下では、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃおよび中和抗ＬＩＮＧＯ−１抗体ｍＡｂ  １Ａ７による処置は、ＩＯＰを下げなかった（図６参照）。
【０３２１】
ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストは、実際、ニューロンの生存に影響を及ぼした。まず、レーザー損傷の２週間後に生存しているＲＧＣを定量した。両眼の網膜を調製し、生存しているＲＧＣを計数した。ＰＢＳ処置群および対照タンパク質処置群における、レーザー凝固の２週間後のＲＧＣ損失は、それぞれ、１３．９３±１．４４％および１２．３７±１．８４％であった（図７Ａ参照）。ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃの注射は、ＲＧＣ損失を防いだ。ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃで処置した網膜は、０．０９±１．４７％のＲＧＣ損失しか有さなかった（ＰＢＳ対照群およびヒトＩｇＧ対照群と比較して、Ｐ＜０．００１）。同様に、ｍＡｂ  １Ａ７処置は、ＲＧＣ損失を１．４６±１．３２％に制限した（対照群と比較して、Ｐ＜０．００１）。
【０３２２】
ＲＧＣの長期生存に対するＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストの効果を調べるために、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃおよび中和ＬＩＮＧＯ−１抗体１Ａ７を、週に１回、硝子体内に注射し、動物を４週間生存させた。この結果（図７Ａ参照）により、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃアンタゴニストによる処置は、レーザー凝固の４週間後、損傷したＲＧＣの損失を、２０．０９±１．３６％（ＰＢＳ対照）から、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃについては５．９８±０．８３％（Ｐ＜０．００１）に、１Ａ７については４．７３±１．７２％（Ｐ＜０．００１）に有意に低下させるということが示された。
【０３２３】
ＲＧＣ生存に関するデータを、各群についての平均密度（細胞数／ｍｍ２）としても示す（図７Ｂ参照）。レーザー凝固の２、４、８、および１２週間後の本発明者らのラット緑内障モデルにおけるＲＧＣの死に関するこれまでの研究により、ＲＧＣの損失が、４週間後に最大レベルに達するということが示された（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．  Ｖｉｓ．  Ｓｃｉ．  ４７：２９５１−２９５８  （２００６））。対照的に、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃおよび１Ａ７の顕著な神経保護は、レーザー凝固の４週間後に観察された。毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）処置（図示せず）とは異なり、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃも抗ＬＩＮＧＯ−１抗体も、長期生存実験で白内障を引き起こさなかった。
【０３２４】
また、電子顕微鏡法を用いて、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストの効果を評価した。図８Ａに示されているように、眼圧上昇の２週間後、ＰＢＳで処置したＲＧＣの中には、不規則な核または壊れてさえもいる核を有し、ミトコンドリアが膨張および溶解しているものがあった。粗面小胞体（ＥＲ）とゴルジ体の損失を示すものもあった。対照的に、可溶性ＬＩＮＧＯ−１および１Ａ７で処置した眼は、典型的な網膜神経節細胞の特徴を維持し、正常なＥＲとゴルジ体を有していた。ＲＧＣ、アマルシン（ａｍａｒｃｉｎｅ）細胞、および双極細胞が接続している、内網状層（ＩＰＬ）の細胞のオルガネラも調べた。ＬＩＮＧＯ−１または１Ａ７で処置した動物は、ほとんど正常な軸索と樹状突起を維持していたが、これに比べて、ＰＢＳで処置した動物の細胞は、より膨張した軸索と樹状突起の内部にオルガネラが少なかった（図８Ｂ参照）。さらに、ＰＢＳで処置した動物のシナプスが、細くはなるが、分かれていない状態のままであるのに対し、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃまたは１Ａ７の処置を受けた網膜は、正常なシナプスの特徴を維持した。
【０３２５】
実施例３
ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニスト単独ではインビトロでの網膜神経節細胞の生存が促進されない  
ＲＧＣ生存に対するＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ  の効果をさらに研究するために、ＲＧＣ初代培養系を用いた（Ｍｅｙｅｒ−Ｆｒａｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｎ，  １５：８０５−８１９  （１９９５））。解離した網膜培養物を、対照タンパク質またはＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ  の存在下で３日間増殖させた。ＲＧＣのマーカーである、Ｔｈｙ１．１免疫染色によって、初代ＲＧＣを同定し、計数した。これらの実験条件下における、インビボでの明白な神経保護活性とは異なり、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ処置単独では、培養ＲＧＣの生存が促進されなかった（図９参照）。
【０３２６】
実施例４
ＬＩＮＧＯ−１はＢＤＮＦ経路に作用する
脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の存在下におけるインビトロでのＲＧＣの生存に対するＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストの効果も調べた。ＢＤＮＦの存在下で、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストは、ＲＣＧの生存を促進することができた。ＲＧＣを実施例３と同様に増殖させ、ＢＤＮＦと対照タンパク質またはＢＤＮＦとＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃのいずれかで処置した。ＢＤＮＦの存在下では、対照タンパク質で処置した細胞でよりも有意に大きいパーセンテージの、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ  で処置した細胞での細胞生存。インビボでは、動物の網膜が内因性ＢＤＮＦにさらされているのに対し、ＲＧＣ培養物はいかなるＢＤＮＦも有さなかったという事実に加えて、この結果は、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ  が、ＢＤＮＦに対する応答を調整することによって、ＲＧＣを救済するということ、および／またはＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃが、ニューロトロフィン受容体を増強することによって、生存を間接的に増大させることを示す。
【０３２７】
したがって、網膜でのＬＩＮＧＯ−１−ＦｃとＢＤＮＦの関係を調べるために、ウェスタンブロッティングを用いて、高眼圧ラットの網膜でＢＤＮＦを測定した。これまでの研究により、正常なラット網膜は、ＢＤＮＦを発現するということが示された（Ｒｕｄｚｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．  ５８：３４１−３５１  （２００４））。本結果により、正常網膜での低レベルのＢＤＮＦが示された（Ｐ＜０．０５、図１０）。しかしながら、ＢＤＮＦレベルは、レーザー凝固の２週間後に、３倍よりも大きく増大し（Ｐ＜０．０５）、これまでの報告結果（Ｒｕｄｚｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．  ５８：３４１−３５１  （２００４））と一致した。したがって、レーザー凝固は、内因性のニューロトロフィン応答を活性化した。しかしながら、図７に示されているように、この応答は、ニューロンの損傷を完全に保護するには不十分であった。眼圧上昇後のＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃおよび１Ａ７による処置は、ＰＢＳ対照群と比較してＢＤＮＦの高いレベルを変化させなかった（正常と比較してＰ＜０．０５、図１０）。これらの結果とインビトロのデータにより、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃまたは１Ａ７が、ＢＤＮＦに対する応答を調整し、緑内障網膜の内因性ＢＤＮＦの神経保護活性を強化するということが示される。
【０３２８】
ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃおよび１Ａ７の存在下で、中和抗ＢＤＮＦ抗体も注射した。これらの実験では、０日目にレーザー凝固および／または２μｇのＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃもしくは１Ａ７を１回投与した後、０、３、７、および１０日目に、３μｇの抗ＢＤＮＦ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を、実験用の眼に硝子体内注射した。このラットを２週間で安楽死させ、ＦＧ標識されたＲＧＣを計数した。
【０３２９】
抗ＢＤＮＦ抗体は、レーザー凝固の２週間後に、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ（Ｐ＝０．００２）または１Ａ７（Ｐ＝０．００４）の保護機能を有意に覆した。ＰＢＳ群と抗ＢＤＮＦ抗体群の間またはＰＢＳ群とＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃもしくは１Ａ７と組み合わせた抗ＢＤＮＦ抗体群の間でＲＧＣ損失に差はなかった（図１１Ａ）。このデータを、ＲＧＣの平均密度（細胞数／ｍｍ２）としても示す（図１１Ｂ参照）。各群におけるタンパク質は、眼圧に対して効果がない。これらの結果により、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃまたは１Ａ７が、網膜の増大した内因性ＢＤＮＦを強化することによって、損傷したＲＧＣを救済するということがさらに確認された。
【０３３０】
実施例５
ＬＩＮＧＯ−１はＴｒｋＢに結合し、これを負に調節する
図４に示されているように、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃは、ＢＤＮＦに対する応答を調整することによって、その神経保護活性を発揮する。ＬＩＮＧＯ−１とＢＤＮＦ受容体ＴｒｋＢの関係を、免疫沈降法とイムノブロッティング法を用いて調べた。ニューロトロフィンは、２つの異なるクラスの受容体である、Ｔｒｋファミリーの受容体チロシンキナーゼおよびｐ７５ＮＴＲを活性化し、次にこれらが多くの下流のシグナル伝達経路を活性化する。Ｔｒｋ受容体には、ＴｒｋＡ、Ｂ、およびＣが含まれる。ＢＤＮＦはＴｒｋＢを活性化する（Ｈｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｉｃｈａｒｄｔ，  ２００３，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７２：６０９−６４２；Ｈｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｉｃｈａｒｄｔ，  ２００１，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２４：６７７−７３６）。網膜で優位を占めるＴｒｋ受容体はＴｒｋＢであるということが、これまでに示されている（Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．  Ｖｉｓ．  Ｓｃｉ．  ４３：１９５４−１９６４  （２００２））。
【０３３１】
ＬＩＮＧＯ−１がＴｒｋＢと直接相互作用するかどうかを明らかにするために、ＴｒｋＢとＬＩＮＧＯ−１とを共発現するトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞由来の細胞ライセートを調べた。ライセートを抗ＬＩＮＧＯ−１抗体で免疫沈降し、抗ＴｒｋＢ抗体または抗ＬＩＮＧＯ−１抗体をウェスタンブロッティングに用いた。本発明者らの結果は、ＴｒｋＢが、抗ＬＩＮＧＯ−１抗体によって、ＴｒｋＢとＬＩＮＧＯ−１の両方を共発現する２９３Ｔ細胞から免疫沈降されるということを示した（図１２Ａ）。これは、ＬＩＮＧＯ−１がＴｒｋＢに結合することを示す。さらに、ＬＩＮＧＯ−１発現細胞株にＴｒｋＢレンチウイルスを２日間トランスフェクトし、この細胞をＢＤＮＦで処置した。ライセートを汎Ｔｒｋ抗体を用いて免疫沈降し、その後、ホスホＴｒｋＢ（ｐ−ＴｒｋＢ）とトータルＴｒｋＢのレベルをウェスタンブロッティングによって評価した。トータルＴｒｋＢは、全ての群でほぼ同じレベルのままであった（図１２Ｂ）。ＢＤＮＦ刺激は、ＬＩＮＧＯ−１の非存在下でリン酸化ＴｒｋＢの増大をもたらした（図１２Ｂのレーン３および４）。しかしながら、ｐ−ＴｒｋＢのレベルは、ＢＤＮＦ刺激後、ＬＩＮＧＯ−１の存在下でより低かった（図１２Ｂのレーン７および８、Ｐ＜０．０５）  。これらの結果は、ＬＩＮＧＯ−１がＴｒｋＢに結合し、ニューロトロフィンがＴｒｋＢに結合した後のＴｒｋＢの活性化を制限するということを示す。ＬＩＮＧＯ−１はこのようにＴｒｋＢ受容体の機能を調整し、ＢＤＮＦ−ＴｒｋＢ系の神経保護活性の負の調節因子として作用する。
【０３３２】
ＬＩＮＧＯ−１とＴｒｋＢがインビボでＲＧＣから共免疫沈降するかどうかを明らかにするために、正常ラットまたは２週間の高眼圧ラット由来の網膜ライセートを、抗ＴｒｋＢ抗体、抗ＬＩＮＧＯ−１抗体、または非特異的抗体で免疫沈降し、抗ＬＩＮＧＯ−１抗体をウェスタンブロッティングに用いた。ＬＩＮＧＯ−１は、抗ＴｒｋＢ抗体で網膜ライセートから共免疫沈降され、ＬＩＮＧＯ−１が正常網膜でＴｒｋＢと相互作用することを示した。さらに、高眼圧を誘導した２週間後、ＬＩＮＧＯ−１はＴｒｋＢに構成的に結合していた（図１３）。ＲＧＣにおけるＬＩＮＧＯ−１とＴｒｋＢの共局在も調べた。ＬＩＮＧＯ−１とｐ−ＴｒｋＢを、ＦＧで逆行性標識したＲＧＣに共発現させた。図１３Ｂは、高眼圧の誘導と１Ａ７による処置の２週間後の網膜におけるＬＩＮＧＯ−１とｐ−ＴｒｋＢの共局在の代表的な写真を示す。
【０３３３】
高眼圧モデルにおけるＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃおよび１Ａ７の機構をさらに評価するために、ＴｒｋＢ活性化に対するＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃおよび１Ａ７の効果をウェスタンブロッティングで評価した。正常なラット網膜は、高レベルのトータルＴｒｋＢを発現していた（図１４Ａ）。このトータルＴｒｋＢレベルは、高眼圧を誘導した２週間後、対照群とＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ  群または１Ａ７群の間で差がなかった（図１４Ａ）。しかしながら、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃまたは１Ａ７の投与は、レーザー処置の２週間後、対照タンパク質よりも有意に大きくｐ−ＴｒｋＢレベルを上方調節し（図１４Ａ）、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃおよび１Ａ７処置が、内因性レベルのＢＤＮＦの存在下でＴｒｋＢの活性化を可能にするということを示した。レーザー凝固後、ＢＤＮＦを注射した。トータルＴｒｋＢレベルは、眼をＢＤＮＦ単独で処置したか、またはＢＤＮＦをＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃもしくは１Ａ７と組み合わせて処置したかにかかわらず、網膜のレーザー凝固の５日後まで、同じレベルにとどまった（図１４Ｂ）。ＢＤＮＦ処置単独で、ｐ−ＴｒｋＢレベルは増大したが、その変化は、処置の５日後に、統計的有意ではなかった。しかしながら、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃまたは１Ａ７と組み合わせたＢＤＮＦは、網膜のｐ−ＴｒｋＢレベルを有意に増大させた（図１４Ｂ）。
【０３３４】
これらの知見は、ＢＤＮＦ刺激単独ではＴｒｋＢ受容体の限られた活性化しか生じないということを示す。これは、外因性ＢＤＮＦを添加したときにも当てはまった。しかしながら、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃまたは１Ａ７で処置することによりこの制限が緩和された。これらの結果は、ＬＩＮＧＯ−１がＴｒｋＢと結合し、ＢＤＮＦがＴｒｋＢに結合した後のＴｒｋＢ活性化を負に調節するということを示すインビトロの結果と一致する。ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃおよび１Ａ７処置は、ＢＤＮＦによるＴｒｋＢ受容体の活性化を増大させることによって、神経保護活性を促進する。
【０３３５】
実施例６
ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストは眼圧上昇後のＡｋｔ活性化を増大させる
ＢＤＮＦによるＴｒｋＢ受容体の活性化は、ＰＩ−３キナーゼ（ＰＩＫ３）を含むいくつかの下流のシグナル伝達経路を開始させる。ＰＩ３Ｋ  によるセリン４７３とトレオニン３０８のリン酸化は、ニューロンにとっての重要な生存シグナルである（Ｂｒａｚｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １１１：２９３−３０３  （２００２））。実施例４および５に示されているように、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃおよび１Ａ７は、ＢＤＮＦおよびそのコグネート受容体ＴｒｋＢの機能を調節する。さらに、レーザー凝固手術後の様々な時点でのトータルＡｋｔとｐＡｋｔ（活性型のＡｋｔ）を測定することによって、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路に対するＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃの効果を調べた。ウェスタンブロット解析により、トータルＡｋｔレベルはレーザー凝固の５日後まで変化しない状態のままであることが明らかとなった（図１５）。ｐＡｋｔレベルは、正常対照網膜では低かったが、レーザー処置の６時間後までに５倍に増大し、その後、レーザー凝固後１日目から５日目にかけて下落した。ｐＡｋｔレベルにおける同様のベル型応答は、視神経切断後に、これまでに報告されている（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２５：３８３−３９３  （２００４））。ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃで処置した網膜において、ｐＡｋｔのレベルは、同様のパターンに従い、レーザー凝固後６時間でピークに達し、その後、５日間かけて下落した。しかしながら、５日目のｐＡｋｔのレベルは、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃで処置した網膜の方が、ＰＢＳで処置した対照網膜よりも有意に高かった（Ｐ＜０．０５、図１５）。したがって、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ  による処置は、Ａｋｔシグナル伝達に影響を及ぼす。
【０３３６】
ｐＡｋｔレベルの変化が、ＲＧＣには生じるが、網膜のその他の細胞には生じないことを確認するために、ｐＡｋｔ局在を網膜の免疫組織化学的研究によって調べた。ｐＡｋｔ免疫反応性は、ＦＧで逆行性標識されたＲＧＣのみで見られ、ｐＡｋｔ局在は、レーザー損傷とＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃによる処置の後、変化しなかった。図１６は、レーザー凝固とＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃによる処置の６時間後の網膜のｐＡｋｔ免疫標識の代表的な写真を示す。
【０３３７】
損傷後のＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃの神経保護活性におけるｐＡｋｔの役割をさらに調べるために、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の阻害剤ＬＹ２９４００２（ＬＹ，  Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の効果を観察した。これらの実験では、１０ｍＭ  ＬＹ２９４００２を１００％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ｓｉｇｍａ）に溶かし、次に、滅菌ＰＢＳを用いて２ｍＭに希釈した。最初のレーザー光凝固を右眼に施した後、０、３、７、および１０日目に、２ｍＭ  ＬＹ２９４００２または２μｌビヒクル（ＰＢＳ中の２０％  ＤＭＳＯ）を硝子体内に注射した。動物を１４日目に安楽死させ、ＦＧ標識されたＲＧＣを計数した。
【０３３８】
ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃが、眼圧上昇後２週間でＲＧＣ生存を促進したのに対し、ＬＩＮＧＯ−１−ＦｃとＬＹ２９４００２の組み合わせは、神経保護活性の効果を無効にした（図１７Ａ）。ＲＧＣの損失は、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃで処置した眼における０．０９±１．４７％からＬＩＮＧＯ−１−ＦｃおよびＬＹ２９４００２で処置した眼における９．０±１．６％まで増大した（Ｐ＝０．００４）。データを、ＲＧＣの密度によっても示す（図１７Ｂ）。ＬＹ２９４００２単独でも、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃとの組み合わせでも、眼圧が下がらなかった（図１８）。
【０３３９】
実施例７
ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストは眼圧上昇後のｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ活性を減少させる
ＪＮＫ経路は、種々の細胞ストレスによって活性化することができる。つい最近、リン酸化ＪＮＫがヒトおよび実験的なラット緑内障網膜で検出され、ＪＮＫの活性化がＲＧＣの死と時間的に関連していた（Ｔｅｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｏｐｔｈａｍｏｌ．Ｖｉｓ．  Ｓｃｉ．  ４４：３０２５−３０３３  （２００３））。最近の知見により、リン酸化ＪＮＫが、ＩＯＰ上昇後、ＲＧＣにあるということも確認された。トータルのＪＮＫ−１およびＪＮＫ−２のレベルは、眼圧上昇の５日後まで変化しない状態のままであった（図１９）。リン酸化ＪＮＫ−１、２は正常網膜では少なく、その後、５日後に、８倍を上回わるまで増大する。ラット緑内障モデルでのＩＯＰ上昇後のｐ−ＪＮＫレベルにおける同様の応答が、免疫組織化学によってこれまでに報告されている。ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃまたは１Ａ７による処置後、ＪＮＫの活性化はほぼ正常レベルまで低下した（Ｐ＜０．０１）（図１９）。これらの結果は、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストが、ＪＮＫシグナル伝達経路の活性化を阻害することによって、損傷したＲＧＣを救済し得るということを示す。
【０３４０】
実施例８
ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストは眼圧上昇後のＲｈｏＡ活性化を減少させる
ＲｈｏはＮｇＲ１−ＬＩＮＧＯ−１−ｐ７５／ＴＲＯＹ複合体の下流で作用し、ＪＮＫはＲｈｏ活性化の下流の結果としてリン酸化されるので、ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストが眼圧上昇後のＲｈｏの活性に影響を及ぼすかどうかを明らかにするための実験も行なった。Ｒｈｏ活性は、ＧＴＰ−ＲｈｏＡレベルを評価することによって評価することができ、その場合、ＧＴＰ−ＲｈｏＡレベルの増大は、Ｒｈｏ活性の増大と関連する。低レベルのＧＴＰ−ＲｈｏＡが正常網膜で観察され、ＧＴＰ−ＲｈｏＡレベルは、レーザー凝固の５日後にほぼ２倍に増大した（正常群と比較してｐ＜０．０５）（図２１）。対照的に、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃで処置した網膜は、高レベルのＧＴＰ−ＲｈｏＡを基礎レベルまで有意に低下させた（ＰＢＳ群と比較してｐ＜０．０５）（図２１）。これらの結果は、ＬＩＮＧＯ−１−ＦｃがＲｈｏＡ活性化を阻害することによって神経保護活性を発揮するということを示唆する。
【０３４１】
本発明は、記載される具体的な実施形態により範囲を限定されるべきではなく、これらの実施形態は、本発明の個々の態様の１つの例証であることが意図されており、機能的に等価な任意の組成物または方法が本発明の範囲内である。実際、本明細書に示されかつ記載されている修正のほかに、本発明の様々な修正が、前述の説明および添付の図から当業者には明白となるであろう。このような修正は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【０３４２】
本明細書に言及される刊行物および特許出願は全て、各個別の刊行物または特許出願が具体的かつ個別的に参照により組み入れられることが示されるのと同じ程度まで参照により本明細書に組み入れられる。
【０３４３】
発明の詳細な説明の項は、特許請求の範囲を解釈するために用いられることが意図されるが、発明の概要および要旨の項は、そのように意図されないということが理解されるべきである。発明の概要および要約の項は、本発明らによって企図されるような本発明の１つ以上の例示的な実施形態を示し得るが、必ずしもその全てを示すわけではなく、したがって、本発明および添付の特許請求の範囲を限定することが決して意図されない。
【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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