(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との融合タンパク質の製造方法であって、下記（１）〜（４）の工程：
（１）融合タンパク質を含む溶液を調製する工程、
（２）工程（１）で得られた溶液のｐＨを、下記計算式：
回収率（％）＝［工程（４）で得られた溶液における融合タンパク質の量／｛
工程（４）で得られた溶液における融合タンパク質の量＋工程（３）の固体分
離後の溶液における融合タンパク質の量｝］×１００
で計算される回収率を１０％以上にするｐＨへと調節する工程、
（３）工程（２）で得られた溶液から固体を分離する工程、及び、
（４）工程（３）で分離した固体を、工程（２）で得られた溶液のｐＨよりも０．１以上高く、かつ、１２以下のｐＨを有する溶液中に溶解させる工程
を含み、
自己組織化能を有するタンパク質が、配列番号３記載のアミノ酸配列のＮ末端から６〜２５０アミノ酸残基を含むタンパク質である、融合タンパク質の製造方法。
【請求項２】
自己組織化能を有するタンパク質が、配列番号３記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
自己組織化能を有するタンパク質が、配列番号３記載のアミノ酸配列のＮ末端から６〜２５０アミノ酸残基からなる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
自己組織化能を有するタンパク質が、配列番号３記載のアミノ酸配列のＮ末端から６、１７、５０又は２５０のいずれかのアミノ酸残基からなる、請求項３記載の方法。
【請求項５】
目的タンパク質のアミノ酸残基数が１０〜１０００である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との間に、さらに、酵素的切断又は化学的切断に使用されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との間にある酵素的切断に使用されるアミノ酸配列が、ＰｒｏＴＥＶプロテアーゼ認識配列、トリプシンの認識配列又はＦａｃｔｏｒ  Ｘａプロテアーゼの認識配列である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
工程（２）のｐＨが９以下である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
工程（２）のｐＨ調節を、硫酸、塩酸、酢酸、リン酸及びトリフルオロ酢酸からなる群より選ばれる酸を用いて行う、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
工程（３）の分離を、遠心分離及び／又は膜ろ過により行う、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
工程（１）で得られた溶液が、融合タンパク質を発現する遺伝子構築物を有するコリネ型細菌の培養液の上清である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
工程（２）に規定される回収率が３０％以上である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
目的タンパク質の製造方法であって、下記（１）〜（５）の工程：
（１）自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との融合タンパク質を含む溶
液を調製する工程であって、該融合タンパク質が、自己組織化能を有するタン
パク質と目的タンパク質との間に、酵素的切断又は化学的切断に使用されるアミ
ノ酸配列を含んでいる工程、
（２）工程（１）で得られた溶液のｐＨを、下記計算式：
回収率（％）＝［工程（４）で得られた溶液における融合タンパク質の量／｛
工程（４）で得られた溶液における融合タンパク質の量＋工程（３）の固体分
離後の溶液における融合タンパク質の量｝］×１００
で計算される回収率を１０％以上にするｐＨへと調節する工程、
（３）工程（２）で得られた溶液から固体を分離する工程、及び、
（４）工程（３）で分離した固体を、工程（２）で得られた溶液のｐＨよりも０．１以
上高く、かつ、１２以下のｐＨを有する溶液中に溶解させる工程、
（５）工程（４）と同時、工程（４）の途中、または工程（４）の後に、融合タンパク
質を、自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との間にあるアミノ
酸配列部位で酵素的切断又は化学的切断する処理に付する工程、
を含み、
自己組織化能を有するタンパク質が、配列番号３記載のアミノ酸配列のＮ末端から６〜２５０アミノ酸残基を含むタンパク質である、目的タンパク質の製造方法。
【請求項１４】
融合タンパク質を切断する処理に付する工程が、酵素的切断処理に付する工程である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
自己組織化能を有するタンパク質が、配列番号３記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
自己組織化能を有するタンパク質が、配列番号３記載のアミノ酸配列のＮ末端から６〜２５０アミノ酸残基からなる、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
自己組織化能を有するタンパク質が、配列番号３記載のアミノ酸配列のＮ末端から６、１７、５０又は２５０のいずれかのアミノ酸残基からなる、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
目的タンパク質のアミノ酸残基数が１０〜１０００である、請求項１３〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
目的タンパク質がテリパラチドである、請求項１３〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
目的タンパク質が配列番号９３で示されるビバリルジン中間体である、請求項１３〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との間にある酵素的切断に使用されるアミノ酸配列が、ＰｒｏＴＥＶプロテアーゼ認識配列、トリプシンの認識配列又はＦａｃｔｏｒ  Ｘａプロテアーゼの認識配列である、請求項１３〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
工程（２）のｐＨが９以下である、請求項１３〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
工程（２）のｐＨ調節を、硫酸、塩酸、酢酸、リン酸及びトリフルオロ酢酸からなる群より選ばれる酸を用いて行う、請求項１３〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
工程（３）の分離を、遠心分離及び／又は膜ろ過により行う、請求項１３〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
工程（１）で得られた溶液が、融合タンパク質を発現する遺伝子構築物を有するコリネ型細菌の培養液の上清である、請求項１３〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
工程（４）及び／又は工程（５）の後に、（６）融合タンパク質または目的タンパク質を精製する工程を含む、請求項１３〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
工程（６）をカラムクロマトグラフィーにより行う、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
工程（２）に規定される回収率が３０％以上である、請求項１３〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との融合タンパク質を含む溶液のｐＨを９以下に調節することによって固体を発生させた後、該固体を分離すること、及び、自己組織化能を有するタンパク質が、配列番号３記載のアミノ酸配列のＮ末端から６〜２５０アミノ酸残基を含むタンパク質であることを特徴とする、融合タンパク質の固体を発生させ分離する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の沈殿による製造方法に関する。より詳しくは、本発明は、自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との融合タンパク質を含む溶液のｐＨを調節することによる、融合タンパク質及び目的タンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多様な機能を有するタンパク質は、医薬品や産業用酵素といった商業用途のものから、様々な生命現象の解明に用いられる研究用途のものに至るまで広く利用されており、生活向上や科学進歩に欠かせない物質である。これら様々なタンパク質を安価、大量且つ再現性良く製造するための手段として、組換え生物によるタンパク質生産技術およびタンパク質の精製技術が開発されてきた。
組換え生物によるタンパク質生産技術では、動物細胞（非特許文献１）や微生物（非特許文献１）が利用されており、動物細胞ではCHO細胞（非特許文献２）、微生物では大腸菌や酵母（非特許文献３）などが用いられている。例えば、微生物としてCorynebacterium glutamicum（以下、C. glutamicumと略すこともある）を用いたタンパク質分泌生産系がある（特許文献１）。【０００３】
組換え生物により生産されたタンパク質を精製する主な方法としては、タンパク質そのものの性質を利用する方法と、タンパク質に精製用の配列を付加しその付加配列の性質を利用する方法とがある。【０００４】
タンパク質そのものの性質を利用する方法としては、クロマトグラフィーと固液分離法が挙げられる。
クロマトグラフィーでは、様々な性質を有するクロマトグラフィー用基材が用いられる。クロマトグラフィーでは、タンパク質とクロマトグラフィー用基材との相互作用や、クロマトグラフィー基材が有する分子ふるい効果が利用される（非特許文献４）。タンパク質とクロマトグラフィー用基材との相互作用としては、静電相互作用、水素結合、疎水性相互作用や、特異的相互作用などが挙げられる（非特許文献４及び５）。
固液分離は、可溶化状態にあるタンパク質を、溶液条件を変化させることによって不溶化（すなわち固体化）し、遠心分離などの簡便な方法によって固体部分を取得し、これを再び可溶化状態に導くことで分離する方法である。タンパク質を不溶化させる手段の具体例としては、等電点沈殿（非特許文献６）、塩析（非特許文献７）、有機溶媒による沈殿（非特許文献８）や、水溶性高分子による沈殿（非特許文献９）などが挙げられる。
等電点沈殿は、タンパク質がその等電点において溶解度が最も低くなることを利用する。塩析、有機溶媒による沈殿および水溶性高分子による沈殿は、タンパク質の溶解度がそれぞれ高濃度の塩、有機溶媒、および水溶性高分子の存在によって低下することを利用する。その他の不溶化手段としては、タンパク質の凝集（非特許文献１０及び非特許文献１１）が挙げられる。タンパク質の凝集は、精製するタンパク質が可溶化状態にあり且つ精製するタンパク質以外のタンパク質が凝集するような条件を選べる場合に特に有効な手段となり得る。【０００５】
タンパク質に精製用の配列を付加しその付加配列の性質を利用する方法としては、付加配列そのものの性質を利用する方法と、付加配列と付加配列以外の物質との相互作用を利用する方法が挙げられる。
付加配列そのものの性質を利用する方法では、温度変化によって相転移を起し不溶化するエラスチンを利用する方法（非特許文献１２）や、pH変化によって可溶性の会合体を形成するMISTICを利用する方法（特許文献２）などがある。
付加配列と付加配列以外の物質との相互作用を利用する方法では、付加配列以外の物質がクロマトグラフィー用基材上に設置されることが多い（非特許文献１３）。付加配列と付加配列以外の物質の相互作用としては、静電相互作用、水素結合、疎水性相互作用や、特異的相互作用などが挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第2005/103278号
【特許文献２】欧州特許出願公開第2423217号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Demain AL, Vaishnav P., Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms. Biotechnol Adv. 2009 May-Jun;27(3):297-306. Epub 2009 Jan 31. Review.
【非特許文献２】Omasa T, Onitsuka M, Kim WD., Cell engineering and cultivation of chinese hamster ovary (CHO) cells. Curr Pharm Biotechnol. 2010 Apr;11(3):233-40. Review.
【非特許文献３】Mattanovich D, Branduardi P, Dato L, Gasser B, Sauer M, Porro D., Recombinant protein production in yeasts. Methods Mol Biol. 2012;824:329-58. Review.
【非特許文献４】Watanabe E, Tsoka S, Asenjo JA., Selection of chromatographic protein purification operations based on physicochemical properties. Ann N Y Acad Sci. 1994 May 2;721:348-64.
【非特許文献５】Hober S, Nord K, Linhult M., Protein A chromatography for antibody purification. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007 Mar 15;848(1):40-7. Epub 2006 Oct 9. Review.
【非特許文献６】Garcia, F. A. P., Protein precipitation. Recovery Processes Biol. Mater. (1993), 355-67.
【非特許文献７】A. A. Green : J. Biol. Chem., 95, 47 (1932)
【非特許文献８】McCord JM, Fridovich I., Superoxide dismutase. An enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein). J Biol Chem. 1969 Nov 25;244(22):6049-55.
【非特許文献９】Ingham KC., Protein precipitation with polyethylene glycol. Methods Enzymol. 1984;104:351-6.
【非特許文献１０】Cromwell ME, Hilario E, Jacobson F., Protein aggregation and bioprocessing. AAPS J. 2006 Sep 15;8(3):E572-9
【非特許文献１１】Mahler HC, Friess W, Grauschopf U, Kiese S., J Pharm Sci. 2009 Sep;98(9):2909-34. Protein aggregation: pathways, induction factors and analysis.
【非特許文献１２】Hassouneh W, Christensen T, Chilkoti A., Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins. Curr Protoc Protein Sci. 2010 Aug;Chapter 6:Unit 6.11.
【非特許文献１３】Smyth DR, Mrozkiewicz MK, McGrath WJ, Listwan P, Kobe B., Crystal structures of fusion proteins with large-affinity tags. Protein Sci. 2003 Jul;12(7):1313-22.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
タンパク質そのものの性質を利用する方法では、目的タンパク質の性質に応じた精製方法を個別に構築することになるため、或るタンパク質の精製方法をそのまま他のタンパク質の精製方法に適用することは一般には不可能である。
一方、タンパク質に精製用の配列を付加しその付加配列の性質を利用する方法では、同じ付加配列を利用すれば、複数のタンパク質の精製に同じまたは類似の精製方法を適用できることが多く、汎用性の高い方法と言える。
しかし、付加配列の性質を利用する方法でも、エラスチンを利用した方法は熱により失活しやすい目的タンパク質には適用できないという課題や、MISTICを利用した方法は生じた会合体の分離が困難であるなどの課題がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、予期せぬことに、付加配列として自己組織化能を有するタンパク質を用いた場合、当該付加配列と目的タンパク質との融合タンパク質が、溶液中で、ｐＨに依存して可溶化状態と不溶化状態とに可逆的に変化する性質を見いだした。本発明はこの知見に基づいてなされたものである。
すなわち、本発明は、下記の［１］〜［３３］に関するものである。
［１］自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との融合タンパク質の製造方法であって、下記（１）〜（４）の工程：
（１）融合タンパク質を含む溶液を調製する工程、
（２）工程（１）で得られた溶液のｐＨを、下記計算式：
回収率（％）＝［工程（４）で得られた溶液における融合タンパク
質の量／｛工程（４）で得られた溶液における融合タンパク質の量
＋工程（３）の固体分離後の溶液における融合タンパク質の量｝］
×１００
で計算される回収率を１０％以上にするｐＨへと調節する工程、
（３）工程（２）で得られた溶液から固体を分離する工程、及び、
（４）工程（３）で分離した固体を、工程（２）で得られた溶液のｐＨよ
りも０．１以上高く、かつ、１２以下のｐＨを有する溶液中に溶解
させる工程
を含む、融合タンパク質の製造方法。
［２］自己組織化能を有するタンパク質が細胞表層タンパク質である、前記［１］記載の方法。
［３］細胞表層タンパク質がＣｓｐＢ成熟タンパク質又はその一部である、前記［２］記載の方法。
［４］ＣｓｐＢ成熟タンパク質又はその一部が下記(ａ)または(ｂ)である、前記［３］記載の方法。
(a)配列番号３記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号３記載のアミノ酸配列と95%以上の相同性を有するタンパク質
［５］ＣｓｐＢ成熟タンパク質の一部が、ＣｓｐＢ成熟タンパク質のＮ末端から６〜２５０アミノ酸残基からなる配列である、前記［３］記載の方法。
［６］ＣｓｐＢ成熟タンパク質の一部が、ＣｓｐＢ成熟タンパク質のＮ末端から６、１７、５０又は２５０のいずれかのアミノ酸残基からなる配列である、前記［５］記載の方法。
［７］目的タンパク質のアミノ酸残基数が１０〜１０００である、前記［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との間に、さらに、酵素的切断又は化学的切断に使用されるアミノ酸配列を含む、前記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との間にある酵素的切断に使用されるアミノ酸配列が、ＰｒｏＴＥＶプロテアーゼ認識配列、トリプシンの認識配列又はＦａｃｔｏｒ  Ｘａプロテアーゼの認識配列である、前記［８］記載の方法。
［１０］工程（２）のｐＨが９以下である、前記［１］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］工程（２）のｐＨ調節を、硫酸、塩酸、酢酸、リン酸及びトリフルオロ酢酸からなる群より選ばれる酸を用いて行う、前記［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］工程（３）の分離を、遠心分離及び／又は膜ろ過により行う、前記［１］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］工程（１）で得られた溶液が、融合タンパク質を発現する遺伝子構築物を有するコリネ型細菌の培養液の上清である、前記［１］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］工程（２）に規定される回収率が３０％以上である、前記［１］〜［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］目的タンパク質の製造方法であって、下記（１）〜（５）の工程：
（１）自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との融合タン
パク質を含む溶液を調製する工程であって、該融合タンパク質が、
自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との間に、酵
素的切断又は化学的切断に使用されるアミノ酸配列を含んでいる
工程、
（２）工程（１）で得られた溶液のｐＨを、下記計算式：
回収率（％）＝［工程（４）で得られた溶液における融合タンパ
ク質の量／｛工程（４）で得られた溶液における融合タンパク質
の量＋工程（３）の固体分離後の溶液における融合タンパク質の
量｝］×１００
で計算される回収率を１０％以上にするｐＨへと調節する工程、
（３）工程（２）で得られた溶液から固体を分離する工程、及び、
（４）工程（３）で分離した固体を、工程（２）で得られた溶液のｐＨ
よりも０．１以上高く、かつ、１２以下のｐＨを有する溶液中に
溶解させる工程、
（５）工程（４）と同時、工程（４）の途中、または工程（４）の後に
、融合タンパク質を、自己組織化能を有するタンパク質と目的タ
ンパク質との間にあるアミノ酸配列部位で酵素的切断又は化学的
切断する処理に付する工程、
を含む、目的タンパク質の製造方法。
［１６］融合タンパク質を切断する処理に付する工程が、酵素的切断処理に付する工程である、前記［１５］記載の方法。
［１７］自己組織化能を有するタンパク質が細胞表層タンパク質である、前記［１５］記載の方法。
［１８］細胞表層タンパク質がＣｓｐＢ成熟タンパク質又はその一部である、前記［１７］記載の方法。
［１９］ＣｓｐＢ成熟タンパク質又はその一部が下記(ａ)または(ｂ)である、前記［１８］記載の方法。
(a)配列番号３記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号３記載のアミノ酸配列と95%以上の相同性を有するタンパク質
［２０］ＣｓｐＢ成熟タンパク質の一部が、ＣｓｐＢ成熟タンパク質のＮ末端から６〜２５０アミノ酸残基からなる配列である、前記［１８］記載の方法。
［２１］ＣｓｐＢ成熟タンパク質の一部が、ＣｓｐＢ成熟タンパク質のＮ末端から６、１７、５０又は２５０のいずれかのアミノ酸残基からなる配列である、前記［２０］記載の方法。
［２２］目的タンパク質のアミノ酸残基数が１０〜１０００である、前記［１５］〜［２１］のいずれかに記載の方法。
［２３］目的タンパク質がテリパラチドである、前記［１５］〜［２２］のいずれかに記載の方法。
［２４］目的タンパク質が配列番号９３で示されるビバリルジン中間体である、前記［１５］〜［２２］のいずれかに記載の方法。
［２５］自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との間にある酵素的切断に使用されるアミノ酸配列が、ＰｒｏＴＥＶプロテアーゼ認識配列、トリプシンの認識配列又はＦａｃｔｏｒ  Ｘａプロテアーゼの認識配列である、前記［１５］〜［２４］のいずれかに記載の方法。
［２６］工程（２）のｐＨが９以下である、前記［１５］〜［２５］のいずれかに記載の方法。
［２７］工程（２）のｐＨ調節を、硫酸、塩酸、酢酸、リン酸及びトリフルオロ酢酸からなる群より選ばれる酸を用いて行う、前記［１５］〜［２６］のいずれかに記載の方法。
［２８］工程（３）の分離を、遠心分離及び／又は膜ろ過により行う、前記［１５］〜［２７］のいずれかに記載の方法。
［２９］工程（１）で得られた溶液が、融合タンパク質を発現する遺伝子構築物を有するコリネ型細菌の培養液の上清である、前記［１５］〜［２８］のいずれかに記載の方法。
［３０］工程（４）及び／又は工程（５）の後に、（６）融合タンパク質または目的タンパク質を精製する工程を含む、前記［１５］〜［２９］のいずれかに記載の方法。
［３１］工程（６）をカラムクロマトグラフィーにより行う、前記［３０］記載の方法。
［３２］工程（２）に規定される回収率が３０％以上である、前記［１５］〜［３１］のいずれかに記載の方法。
［３３］自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との融合タンパク質を含む溶液のｐＨを９以下に調節することによって固体を発生させた後、該固体を分離することを特徴とする、融合タンパク質の固体を発生させ分離する方法。
【発明の効果】
【００１０】
後述の実施例で示されるように、本発明により、目的タンパク質を含む融合タンパク質又は目的タンパク質を、当該融合タンパク質を含む溶液から簡便かつ高い回収率で得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１−Ａ】図１−Ａは、実施例１の「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨと、融合タンパク質CspB50TEV-Teriparatide(略して50-Teri)の回収率との関係を示している。
【図１−Ｂ】図１−Ｂは、実施例１の「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨと、「ｐＨ調節済み培養液上清」及び対応する「沈殿溶解液」の各電気泳動図における融合タンパク質50-Teriのバンド部分の写真と、回収率とを示している。
【図１−２Ａ】図１−２Ａは、実施例１−２の「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨと、融合タンパク質50-Teriの回収率との関係を示している。
【図１−２Ｂ】図１−２Ｂは、実施例１−２の「ｐＨ調節済み培養液」及び対応する「沈殿溶解液」の各電気泳動図と、融合タンパク質50-Teriのバンド部分を抽出した写真を示している。
【図１−２Ｃ】図１−２Ｃは、実施例１−２のpH4.9に調節した「ｐＨ調節済み培養液上清」及び対応する「沈殿溶解液」を逆相HPLCに供して得られたクロマトグラムを示している。
【図１−２Ｄ】図１−２Ｄは、実施例１−２のpH4.9に調節した「ｐＨ調節済み培養液」から得た「沈殿溶解液」、「酵素切断液」及び「標品Teriparatide」を逆相HPLCに供して得られたクロマトグラムを示している。
【図１−２Ｅ】図１−２Ｅは、実施例１−２のpH4.9に調節した「ｐＨ調節済み培養液」から精製した「精製物質」及び「標品Teriparatide」を質量分析に供して得られた質量スペクトルのチャートを示している。
【図２−Ａ】図２−Ａは、実施例２の「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨと、融合タンパク質CspB50Lys-Bivalirudin18（略して50-Biva18）の回収率との関係を示している。
【図２−Ｂ】図２−Ｂは、実施例２の「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨと、「ｐＨ調節済み培養液上清」及び対応する「沈殿溶解液」の各電気泳動図における融合タンパク質50-Biva18のバンド部分の写真と、回収率とを示している。
【図２−Ｃ】図２−Ｃは、実施例２のpH2.9に調節した「ｐＨ調節済み培養液上清」及び対応する「沈殿溶解液」を逆相HPLCに供して得られたクロマトグラムを示している。
【図２−Ｄ】図２−Ｄは、実施例２のpH2.9に調節した「ｐＨ調節済み培養液」から得た「沈殿溶解液」及び「酵素切断液」を逆相HPLCに供して得られたクロマトグラムを示している。
【図２−Ｅ】図２−Ｅは、Biva18のアミノ酸配列から計算した質量（上左）及び当該計算値を図示した理論質量スペクトル（上右）と、実施例２のpH2.9に調節した「ｐＨ調節済み培養液」から精製した「精製物質」を質量分析に供して得られた質量スペクトルのチャート（下）とを示している。
【図２−Ｆ】図２−Ｆは、実施例２のpH2.9に調節した「ｐＨ調節済み培養液」から得た「酵素切断液」を強陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーに供して得られたクロマトグラムを示している。
【図２−Ｇ】図２−Ｇは、実施例２のpH2.9に調節した「ｐＨ調節済み培養液」から得た「酵素切断液」を強陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーに供して得られた溶出液（95%B付近）を逆相HPLCに供して得られたクロマトグラムを示している。
【図３−Ａ】図３−Ａは、実施例３の「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨと、融合タンパク質CspB50TEV-Proinsulin(略して50-PIns)の回収率との関係を示している。
【図３−Ｂ】図３−Ｂは、実施例３の「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨと、「ｐＨ調節済み培養液上清」及び対応する「沈殿溶解液」の各電気泳動図における融合タンパク質50-PInsのバンド部分の写真と、回収率とを示している。
【図４−Ａ】図４−Ａは、比較例１の「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨと、プロインスリン(略してPIns)の回収率との関係を示している。
【図４−Ｂ】図４−Ｂは、比較例１の「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨと、「ｐＨ調節済み培養液上清」及び対応する「沈殿溶解液」の各電気泳動図におけるPInsのバンド部分の写真と、回収率とを示している。
【図５−Ａ】図５−Ａは、実施例４の「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨと、融合タンパク質CspB250TEV-Proinsulin(略して250-PIns)の回収率との関係を示している。
【図５−Ｂ】図５−Ｂは、実施例４の「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨと、「ｐＨ調節済み培養液上清」及び対応する「沈殿溶解液」の各電気泳動図における融合タンパク質250-PInsのバンド部分の写真と、回収率とを示している。
【図６−Ａ】図６−Ａは、実施例５の「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨと、融合タンパク質CspB17TEV-Proinsulin(略して17-PIns)の回収率との関係を示している。
【図６−Ｂ】図６−Ｂは、実施例５の「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨと、「ｐＨ調節済み培養液上清」及び対応する「沈殿溶解液」の各電気泳動図における融合タンパク質17-PInsのバンド部分の写真と、回収率とを示している。
【図７−Ａ】図７−Ａは、実施例６の「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨと、融合タンパク質CspB6TEV-Proinsulin(略して6-PIns)の回収率との関係を示している。
【図７−Ｂ】図７−Ｂは、実施例６の「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨと、「ｐＨ調節済み培養液上清」及び対応する「沈殿溶解液」の各電気泳動図における融合タンパク質6-PInsのバンド部分の写真と、回収率とを示している。
【図８−Ａ】図８−Ａは、実施例７の「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨと、融合タンパク質CspB50TEV-Teriparatide(略して50-Teri)の回収率との関係を示している。
【図８−Ｂ】図８−Ｂは、実施例７の「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨと、「ｐＨ調節済み培養液上清」及び対応する「沈殿溶解液」の各電気泳動図における融合タンパク質50-Teriのバンド部分の写真と、回収率とを示している。
【図９−Ａ】図９−Ａは、実施例８の「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨと、融合タンパク質CspB50TEV-Teriparatide(略して50-Teri)の回収率との関係を示している。
【図９−Ｂ】図９−Ｂは、実施例８の「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨと、「ｐＨ調節済み培養液上清」及び対応する「沈殿溶解液」の各電気泳動図における融合タンパク質50-Teriのバンド部分の写真と、回収率とを示している。
【図１０−Ａ】図１０−Ａは、実施例９の「菌体除去済み培養液」（「工程（１）で得られた溶液」に相当）及び沈殿溶解液（「工程（４）で得られた溶液」に相当）を逆相HPLC（測定波長：280 nm）に供して得られたクロマトグラムを示している。
【図１０−Ｂ】図１０−Ｂは、実施例９の「菌体除去済み培養液」（「工程（１）で得られた溶液」に相当）及び沈殿溶解液（「工程（４）で得られた溶液」に相当）を逆相HPLC（測定波長：220 nm）に供して得られたクロマトグラムを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の製造方法は、タンパク質に精製用の配列（以下、「付加配列」ということもある）を付加し、その付加配列の性質を利用する方法のうち、付加配列そのものの性質を利用する方法に類するものである。本発明では、付加配列として、自己組織化能を有するタンパク質の配列を用いる。
【００１３】
本発明は、自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との融合タンパク質の製造方法であって、下記（１）〜（４）の工程：
（１）融合タンパク質を含む溶液を調製する工程、
（２）工程（１）で得られた溶液のｐＨを、下記計算式：
回収率（％）＝［工程（４）で得られた溶液における融合タンパ
ク質の量／｛工程（４）で得られた溶液における融合タンパク質
の量＋工程（３）の固体分離後の溶液における融合タンパク質の
量｝］×１００
で計算される回収率を１０％以上にするｐＨへと調節する工程、
（３）工程（２）で得られた溶液から固体を分離する工程、及び、
（４）工程（３）で分離した固体を、工程（２）で得られた溶液のｐＨ
よりも０．１以上高く、かつ、１２以下のｐＨを有する溶液中に
溶解させる工程
を含む、融合タンパク質の製造方法である。
【００１４】
本発明の製造方法の工程（１）では、自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との融合タンパク質を含む溶液を調製する。
「融合タンパク質」は、「自己組織化能を有するタンパク質」と「目的タンパク質」とから構成される。「自己組織化能を有するタンパク質」は「目的タンパク質の」上流（Ｎ末端側）にあってもよく、下流（Ｃ末端側）に有ってもよい。なお、後述するように、融合タンパク質は「自己組織化能を有するタンパク質」のアミノ酸配列と「目的タンパク質」のアミノ酸配列との間に「切断に使用されるアミノ酸配列」を含んでいてもよい。
「自己組織化能」とは、適当な環境条件下でタンパク質自身が集合し、生理的に意味のある高次構造を形成する能力をいう。
「自己組織化能を有するタンパク質」は、自己組織化能を保持している限り、完全長配列であってもよく、部分配列であってもよい。
「自己組織化能を有するタンパク質」は、自己組織化能を保持している限り、その大きさ（アミノ酸残基数）に特に制限はないが、アミノ酸残基数は、好ましくは5〜1000アミノ酸、より好ましくは5〜700アミノ酸、さらに好ましくは5〜500アミノ酸である。
「自己組織化能を有するタンパク質」は、自己組織化能を保持している限り、天然タンパク質のバリアントであってもよい。例えば、天然タンパク質のアミノ酸配列中に、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたものであってもよい。前記の「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
【００１５】
アミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加は、タンパク質の自己組織化能が正常に維持される保存的変異であることがある。保存的変異の代表的なものは保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合にはPhe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合にはLeu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合にはGln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合にはLys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合にはAsp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合にはSer、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、アミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加には、当該タンパク質をコードする遺伝子が由来する細菌の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じるバリアントによって生じるものも含まれる。
【００１６】
天然タンパク質のバリアントは、当該バリアントが自己組織化能を有している限り、天然タンパク質のアミノ酸配列全体に対して、95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するものであってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を指すことがある。
【００１７】
また、「自己組織化能を有するタンパク質」をコードする遺伝子は、コードされるタンパク質が自己組織化能を有している限り、公知の遺伝子配列から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。
【００１８】
上記ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1%SDSが挙げられる。
【００１９】
「自己組織化能を有するタンパク質」をコードする遺伝子は、天然型のままでも使用できるが、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変してもよい。
【００２０】
「自己組織化能を有するタンパク質」の具体例としては、細胞表層タンパク質、ウイルス外皮タンパク質や、各種モータータンパク質等が挙げられる。
細胞表層タンパク質は、細菌に広く見出されるS-layerと呼ばれる細胞表層構造の構成タンパク質であり、生理条件において自己組織化して層状の構造を形成することが知られている（Ilk N, Egelseer EM, Sleytr UB. S-layer fusion proteins--construction principles and applications. Curr Opin Biotechnol. 2011 Dec;22(6):824-31. Epub 2011 Jun 21.）。
細胞表層タンパク質の具体例としては、コリネ型細菌であるC. glutamicumに由来するPS1及びCspB（PS2）（特表平６−５０２５４８号公報）や、Corynebacterium ammoniagenesに由来するSlpA（CspA）（特開平１０−１０８６７５号公報）等が挙げられる。
これらのうち、CspB（PS2）（４９９アミノ酸残基）が好ましい。なお、CspBはPS2と同義である。
【００２１】
CspBは、C. glutamicumで見出された細胞表層タンパク質である（Peyret JL, Bayan N, Joliff G, Gulik-Krzywicki T, Mathieu L, Schechter E, Leblon G., Characterization of the cspB gene encoding PS2, an ordered surface-layer protein in Corynebacterium glutamicum. Mol Microbiol. 1993 Jul;9(1):97-109.）。
CspBについては、界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含む溶液を菌体に作用させると、自己組織化した層状の構造が破壊され、SDS溶液中にCspBが抽出されてくることが種々のC. glutamicumで見出されている（Hansmeier N, Bartels FW, Ros R, Anselmetti D, Tauch A, Puhler A, Kalinowski J. Classification of hyper-variable Corynebacterium glutamicum surface-layer proteins by sequence analyses and atomic force microscopy. J Biotechnol. 2004 Aug 26; 112(1-2):177-93.）。
【００２２】
CspBの具体例として、例えば、C. glutamicum ATCC13869のCspBが挙げられる。C .glutamicum ATCC13869のcspB遺伝子の塩基配列を配列番号１に、CspBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。配列番号２に示すアミノ酸配列中、１〜３０位のアミノ酸残基がシグナルペプチドに相当し、３１〜４９９位のアミノ酸残基がCspB成熟タンパク質（以下、「成熟CspB」または「CspB成熟タンパク質」ともいう）に相当する。シグナルペプチド部分３０アミノ酸残基を除いた、C. glutamicum ATCC13869のCspB成熟タンパク質のアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【００２３】
配列番号３
Gln Glu Thr Asn Pro Thr Phe Asn Ile Asn Asn Gly Phe Asn Asp Ala 
Asp Gly Ser Thr Ile Gln Pro Val Glu Pro Val Asn His Thr Glu Glu 
Thr Leu Arg Asp Leu Thr Asp Ser Thr Gly Ala Tyr Leu Glu Glu Phe 
Gln Tyr Gly Asn Val Glu Glu Ile Val Glu Ala Tyr Leu Gln Val Gln 
Ala Ser Ala Asp Gly Phe Asp Pro Ser Glu Gln Ala Ala Tyr Glu Ala 
Phe Glu Ala Ala Arg Val Arg Ala Ser Gln Glu Leu Ala Ala Ser Ala 
Glu Thr Ile Thr Lys Thr Arg Glu Ser Val Ala Tyr Ala Leu Lys Ala 
Asp Arg Glu Ala Thr Ala Ala Phe Glu Ala Tyr Leu Ser Ala Leu Arg 
Gln Val Ser Val Ile Asn Asp Leu Ile Ala Asp Ala Asn Ala Lys Asn 
Lys Thr Asp Phe Ala Glu Ile Glu Leu Tyr Asp Val Leu Tyr Thr Asp 
Ala Asp Ile Ser Gly Asp Ala Pro Leu Leu Ala Pro Ala Tyr Lys Glu 
Leu Lys Asp Leu Gln Ala Glu Val Asp Ala Asp Phe Glu Trp Leu Gly 
Glu Phe Ala Ile Asp Asn Asn Glu Asp Asn Tyr Val Ile Arg Thr His 
Ile Pro Ala Val Glu Ala Leu Lys Ala Ala Ile Asp Ser Leu Val Asp 
Thr Val Glu Pro Leu Arg Ala Asp Ala Ile Ala Lys Asn Ile Glu Ala 
Gln Lys Ser Asp Val Leu Val Pro Gln Leu Phe Leu Glu Arg Ala Thr 
Ala Gln Arg Asp Thr Leu Arg Val Val Glu Ala Ile Phe Ser Thr Ser 
Ala Arg Tyr Val Glu Leu Tyr Glu Asn Val Glu Asn Val Asn Val Glu 
Asn Lys Thr Leu Arg Gln His Tyr Ser Ser Leu Ile Pro Asn Leu Phe 
Ile Ala Ala Val Gly Asn Ile Asn Glu Leu Asn Asn Ala Asp Gln Ala 
Ala Arg Glu Leu Phe Leu Asp Trp Asp Thr Asp Leu Thr Thr Asn Asp 
Glu Asp Glu Ala Tyr Tyr Gln Ala Lys Leu Asp Phe Ala Ile Glu Thr 
Tyr Ala Lys Ile Leu Ile Asn Gly Glu Val Trp Gln Glu Pro Leu Ala 
Tyr Val Gln Asn Leu Asp Ala Gly Ala Arg Gln Glu Ala Ala Asp Arg 
Glu Ala Glu Arg Ala Ala Asp Ala Ala Tyr Arg Ala Glu Gln Leu Arg 
Ile Ala Gln Glu Ala Ala Asp Ala Gln Lys Ala Leu Ala Glu Ala Leu 
Ala Asn Ala Gly Asn Asn Asp Asn Gly Gly Asp Asn Ser Ser Asp Asp 
Lys Gly Thr Gly Ser Ser Asp Ile Gly Thr Trp Gly Pro Phe Ala Ala 
Ile Ala Ala Ile Ile Ala Ala Ile Ala Ala Ile Phe Pro Phe Leu Ser 
Gly Ile Val Lys Phe 
【００２４】
本発明で用いるCspBは、好ましくはCspB成熟タンパク質、より好ましくはCspB成熟タンパク質の一部である。特に、CspB成熟タンパク質のN末端から６〜２５０アミノ酸残基からなる配列であることが融合タンパク質の回収率の点で好ましい。「N末端から６〜２５０アミノ酸残基からなる配列」とは、N末端の１位のアミノ酸残基から、６〜２５０位（同N末端から６〜２５０番目）のアミノ酸残基までのアミノ酸配列をいう。
例えば、CspB成熟タンパク質が、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である場合、「N末端から６〜２５０アミノ酸残基からなる配列」とは、配列番号３の１位（N末端）のアミノ酸残基から、６〜２５０位（同N末端から６〜２５０番目）のアミノ酸残基までのアミノ酸配列をいう。
さらに好ましくは、CspB成熟タンパク質のN末端から６、１７、５０又は２５０のいずれかのアミノ酸残基からなる配列である。
なお、アミノ酸配列における「Ｘ位（Ｘは、例えば、６、１７、５０又は２５０である）」とは、同アミノ酸配列のN末端からＸ番目までを意味し、N末端のアミノ酸残基が１位のアミノ酸残基である。すなわち、上記各アミノ酸残基の位置は相対的な位置を示すものであって、アミノ酸の欠失、挿入、付加などによってその位置は前後することがある。
例えば、CspB成熟タンパク質が配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である場合、「N末端からの５０位のアミノ酸残基」とは、配列番号３における５０位に相当するアミノ酸残基を意味し、５０位よりもN末端側の１アミノ酸残基が欠失している場合は、N末端から４９番目までのアミノ酸残基が「N末端からの５０位のアミノ酸残基」であるものとする。また、５０位よりもN末端側に１アミノ酸残基が挿入されている場合、N末端から５１番目のアミノ酸残基が「N末端からの５０位のアミノ酸残基」であるものとする。
【００２５】
コリネ型細菌が属する種又は菌株によっては、cspB遺伝子の核酸配列に差異が存在することがある。したがって、cspB遺伝子は、コードされるタンパク質が自己組織化能を有している限り、上記核酸配列のバリアントであってもよい。cspB遺伝子のバリアントには、同遺伝子のホモログが含まれる。cspB遺伝子のホモログは、例えば、上記のC. glutamicum ATCC13869のcspB遺伝子（配列番号１）を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができ、また、コリネ型細菌の染色体を鋳型にして、これら公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより取得することができる。
【００２６】
「目的タンパク質」には、微生物、植物、動物又はウイルス由来の天然タンパク質全般や、人工的にアミノ酸配列をデザインしたタンパク質が含まれ、特に限定されない。
また「目的タンパク質」は、当該タンパク質を産生する宿主との関係において同種タンパク質であってもよく、異種タンパク質であってもよい。
【００２７】
目的タンパク質は、単量体タンパク質であってもよく、多量体（multimer）タンパク質であってもよい。
多量体タンパク質とは、２またはそれ以上のサブユニットからなる多量体として存在しうるタンパク質をいう。多量体において、各サブユニットは、ジスルフィド結合等の共有結合で連結されていてもよく、水素結合や疎水性相互作用等の非共有結合で連結されていてもよく、それらの組み合わせにより連結されていてもよい。多量体は、単一の種類のサブユニットからなるホモ多量体であってもよく、２またはそれ以上の種類のサブユニットからなるヘテロ多量体であってもよい。なお、多量体タンパク質がヘテロ多量体である場合には、多量体を構成するサブユニットの内、少なくとも１つのサブユニットが異種タンパク質であってもよい。すなわち、全てのサブユニットが異種由来であってもよく、一部のサブユニットのみが異種由来であってもよい。
目的タンパク質は、天然で分泌性であるタンパク質であってもよく、天然では非分泌性であるタンパク質であってもよいが、天然で分泌性であるタンパク質であるのが好ましい。
【００２８】
本発明により製造される目的タンパク質は、１種類のみであってもよく、２以上の種類であってもよい。また、目的タンパク質がヘテロ多量体である場合には、１種類のサブユニットのみが生産されてもよく、２種類以上のサブユニットが生産されてもよい。
【００２９】
目的タンパク質は、使用する宿主において発現可能である限り、その大きさ（アミノ酸残基数）に特に制限はないが、アミノ酸残基数は、好ましくは１０〜１０００、より好ましくは１０〜５００、さらに好ましくは１０〜３００である。
【００３０】
目的タンパク質は、天然のタンパク質のバリアントであってもよい。上述の「自己組織化能を有するタンパク質」に関するバリアントの記載は、目的タンパク質およびそれをコードする遺伝子にも準用できる。
また、目的タンパク質をコードする遺伝子は、必要により宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンに変換されていてもよい。
【００３１】
目的タンパク質としては、例えば、生理活性タンパク質、レセプタータンパク質、ワクチンとして使用される抗原タンパク質や、酵素が挙げられる。
【００３２】
生理活性タンパク質としては、例えば、成長因子（増殖因子）、ホルモン、サイトカインや、抗体関連分子が挙げられる。
【００３３】
成長因子（増殖因子）として、具体的には、例えば、上皮成長因子（Epidermal growth factor；EGF）、インスリン様成長因子-1（Insulin-like growth factor-1；IGF-1）、トランスフォーミング成長因子（Transforming growth factor；TGF）、神経成長因子（Nerve growth factor；NGF）、脳由来神経栄養因子（Brain-derived neurotrophic factor；BDNF）、血管内皮細胞増殖因子（Vesicular endothelial growth factor；VEGF）、顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte-colony stimulating factor；G-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Granulocyte-macrophage-colony stimulating factor；GM-CSF）、血小板由来成長因子（Platelet-derived growth factor；PDGF）、エリスロポエチン（Erythropoietin；EPO）、トロンボポエチン（Thrombopoietin；TPO）、酸性線維芽細胞増殖因子（acidic fibroblast growth factor；aFGFまたはFGF1）、塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor；bFGFまたはFGF2）、角質細胞増殖因子（keratinocyto growth factor；KGF-1またはFGF7, KGF-2またはFGF10）や、肝細胞増殖因子（Hepatocyte growth factor；HGF）が挙げられる。
【００３４】
ホルモンとして、具体的には、例えば、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン（somatostatin）、ヒト成長ホルモン（human growth hormone；hGH）、副甲状腺ホルモン(parathyroid hormone；PTH)や、カルシトニン(calcitonin)が挙げられる。
【００３５】
サイトカインとして、具体的には、例えば、インターロイキン、インターフェロンや、腫瘍壊死因子（Tumor Necrosis Factor；TNF）が挙げられる。
【００３６】
なお、成長因子（増殖因子）、ホルモン、およびサイトカインは互いに厳密に区別されなくともよい。例えば、生理活性タンパク質は、成長因子（増殖因子）、ホルモン、およびサイトカインから選択されるいずれか１つのグループに属するものであってもよく、それらから選択される複数のグループに属するものであってもよい。
【００３７】
また、生理活性タンパク質は、タンパク質完全長であってもよく、その一部であってもよい。タンパク質の一部としては、例えば、生理活性を有する部分が挙げられる。生理活性を有する部分として、具体的には、例えば、副甲状腺ホルモン(parathyroid hormone；PTH)の成熟体のN末端３４アミノ酸残基からなるテリパラチド（Teriparatide）が挙げられる。
なお、目的タンパク質は、生理活性タンパク質の一部であるが、生理活性を有しないものであってもよい。この場合、目的タンパク質を取得後、必要な修飾（例えば、アミノ酸配列の付加）を行うことで、生理活性タンパク質とすることができる。具体例としては、生理活性タンパク質であるビバリルジン（Bivariludin）（２０アミノ酸）の一部（１８アミノ酸残基）であるペプチド（Biva18）（配列番号９３：Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu）が挙げられる。
【００３８】
抗体関連分子として、具体的には、例えば、完全抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｃ、重鎖（Ｈ鎖）と軽鎖（Ｌ鎖）からなる二量体、Ｆｃ融合タンパク質、重鎖（Ｈ鎖）や、軽鎖（Ｌ鎖）が挙げられる。
【００３９】
レセプタータンパク質は、特に制限されず、例えば、生理活性タンパク質やその他の生理活性物質に対するレセプタータンパク質であってよい。その他の生理活性物質としては、例えば、ドーパミン等の神経伝達物質が挙げられる。また、レセプタータンパク質は、対応するリガンドが知られていないオーファン受容体であってもよい。
【００４０】
ワクチンとして使用される抗原タンパク質は、免疫応答を惹起できるものであれば特に制限されず、想定する免疫応答の対象に応じて適宜選択すればよい。
【００４１】
酵素としては、例えば、トランスグルタミナーゼ、プロテアーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、コラゲナーゼやキチナーゼ等が挙げられる。
【００４２】
目的タンパク質は、プロ構造部が付加したタンパク質（プロタンパク質）であってもよい。目的タンパク質がプロタンパク質である場合、そのプロ構造部が切断することで成熟タンパク質とすることができる。
プロ構造部の切断は、本発明の製造方法の工程（４）と同時、工程（４）の途中、または工程（４）の後に行うことができる。
「工程（４）と同時」とは、工程（４）で用いる「工程（２）で得られた溶液のｐＨよりも０．１以上高く、かつ、１２以下のｐＨを有する溶液」に、プロ構造部の切断に用いる試薬（例えば、後述のプロテアーゼ）を予め添加しておき、この溶液を用いて工程（４）とプロ構造部の切断とを同時に行うことをいう。
「工程（４）の途中」とは、工程（４）で用いる「工程（２）で得られた溶液のｐＨよりも０．１以上高く、かつ、１２以下のｐＨを有する溶液」へプロ構造部の切断に用いる試薬を添加せずに工程（４）を開始し、工程（４）の途中で前記試薬を添加して、プロ構造部の切断を行うことをいう。
「工程（４）の後」とは、工程（４）が終了した後に、プロ構造部の切断に用いる試薬を用いて、プロ構造部の切断を行うことをいう。
プロ構造部の切断は、例えば、プロテアーゼにより行うことができる。プロテアーゼを使用する場合は、最終的に得られるタンパク質の活性という観点から、プロタンパク質は一般には天然のタンパク質とほぼ同じ位置で切断されることが好ましく、天然のタンパク質と完全に同じ位置で切断され天然のものと同一の成熟タンパク質が得られるのがより好ましい。従って、一般には、天然に生じる成熟タンパク質と同一のタンパク質を生じる位置でプロタンパク質を切断する特異的プロテアーゼが最も好ましい。
プロテアーゼには、proTEVprotease（プロメガ社製）のような商業的に入手できるものの他、微生物の培養液、例えば放線菌の培養液等から得られるものが含まれる。そのようなプロテアーゼは未精製状態で使用することもでき、必要に応じて適当な純度まで精製した後に使用してもよい。
【００４３】
自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との融合タンパク質は、当該融合タンパク質の発現用の遺伝子構築物を宿主中で発現させることで得ることができる。
【００４４】
「宿主」としては、融合タンパク質を発現することができるものであれば、特に制限なく、あらゆる種類の細菌や、細菌以外の微生物、昆虫細胞や動物細胞などを用いることができる。
融合タンパク質を菌体内に蓄積する宿主を用いた場合、工程（１）の溶液を調製するためには菌体を破砕する処理を行う。融合タンパク質を細胞外へ分泌することができる宿主は、かかる破砕処理が不要になるので好ましい。
細菌としては、例えば、コリネ型細菌や大腸菌等を用いることができる。
細菌以外の微生物としては、例えば、酵母等を用いることができる。
昆虫細胞としてはカイコ等、動物細胞ではCHO細胞等を用いることができる。
これらのなかでは、コリネ型細菌が好ましい。
【００４５】
「コリネ型細菌」とは好気性のグラム陽性かん菌をいう。具体例としては、コリネバクテリウム属細菌、ブレビバクテリウム属細菌、およびミクロバクテリウム属細菌等が挙げられる。なお、コリネ型細菌には、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在コリネバクテリウム属に統合された細菌(Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991))も含まれる。
コリネ型細菌を使用することの利点としては、従来から目的タンパク質の分泌生産に利用されている糸状菌、酵母、Bacillus属細菌等と比べ、もともと菌体外に分泌される不純物タンパク質が極めて少なく、融合タンパク質を分泌生産した場合の精製工程の簡略化や省略化が期待できること、また、糖、アンモニア、および無機塩等を含有するシンプルな培地で良く生育し、培地代や培養方法、培養生産性で優れていること、等が挙げられる。
【００４６】
コリネ型細菌としては、具体的には、下記のような菌種が挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebacterium acetoglutamicum）
コリネバクテリウム・アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）
コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）
コリネバクテリウム・リリウム（Corynebacterium lilium）
コリネバクテリウム・メラセコーラ（Corynebacterium melassecola）
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（コリネバクテリウム・エフィシエンス）（Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens)）
コリネバクテリウム・ハーキュリス（Corynebacterium herculis）
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（Brevibacterium divaricatum）
ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）
ブレビバクテリウム・イマリオフィラム（Brevibacterium immariophilum）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・ロゼウム（Brevibacterium roseum）
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum）
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（Brevibacterium thiogenitalis）
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）
ブレビバクテリウム・アルバム（Brevibacterium album）
ブレビバクテリウム・セリナム（Brevibacterium cerinum）
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Microbacterium ammoniaphilum）
【００４７】
コリネ型細菌としては、具体的には、下記のような菌株が挙げられる。
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060，ATCC 13869，FERM BP-734
Corynebacterium lilium ATCC 15990
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Brevibacterium divaricatum ATCC 14020
Brevibacterium flavum ATCC 13826, ATCC 14067, FERM BP-2205
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871, ATCC 6872
Brevibacterium album ATCC 15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
【００４８】
野生株コリネバクテリウム・グルタミカム（C. glutamicum）ATCC13869よりストレプトマイシン(Sm)耐性変異株として分離したコリネバクテリウム・グルタミカムFERM BP-734は、その親株（野生株）に比べ、タンパク質の分泌に関わる機能遺伝子に変異が存在することが予測され、異種タンパク質の分泌生産能が至適培養条件下での蓄積量としておよそ２〜３倍と極めて高く、宿主菌として好適である。
【００４９】
上述のコリネ型細菌を親株として、突然変異法や遺伝子組換え法を利用してタンパク質の分泌生産能が高まった株を選抜し、宿主として利用してもよい。例えば、紫外線照射またはN-メチル-N'-ニトロソグアニジン等の化学変異剤による処理を行なった後、タンパク質の分泌生産能が高まった株を選抜することができる。
【００５０】
さらに、このような菌株から細胞表層タンパク質を生産しないように改変した菌株を宿主として使用すれば、培地中または菌体表層に分泌された異種タンパク質の精製が容易となり、特に好ましい。そのような改変は、突然変異法または遺伝子組換え法により染色体上の細胞表層タンパク質のコード領域またはその発現調節領域に変異を導入することにより行うことができる。細胞表層タンパク質を生産しないように改変されたコリネ型細菌としては、C. glutamicum AJ12036(FERM BP-734)の細胞表層タンパク質CspB(PS2)の欠損株であるC. glutamicum YDK010株（WO2004/029254）が挙げられる。
【００５１】
「融合タンパク質の発現用の遺伝子構築物」は、自己組織化能を有するタンパク質を目的タンパク質の上流に配置する場合は、宿主で機能するプロモーター配列、該プロモーター配列の下流に接続された宿主で機能するシグナルペプチドをコードする核酸配列、該シグナルペプチドをコードする核酸配列の下流に接続された自己組織化能を有するタンパク質をコードする核酸配列および該自己組織化能を有するタンパク質をコードする核酸配列の下流に接続された目的タンパク質をコードする核酸配列を含んでいる。また、自己組織化能を有するタンパク質を目的タンパク質の下流に配置する場合は、宿主で機能するプロモーター配列、該プロモーター配列の下流に接続された宿主で機能するシグナルペプチドをコードする核酸配列、該シグナルペプチドをコードする核酸配列の下流に接続された目的タンパク質をコードする核酸配列および該目的タンパク質をコードする核酸配列の下流に接続された自己組織化能を有するタンパク質をコードする核酸配列を含んでいる。なお、融合タンパク質を菌体内に蓄積させる場合には、シグナルペプチドをコードする核酸配列は不要である。
【００５２】
シグナルペプチドをコードする核酸配列は、プロモーター配列の下流に、同プロモーターによる制御を受けてシグナルペプチドが発現するよう連結されていればよい。
自己組織化能を有するタンパク質を目的タンパク質の上流に配置する場合は、自己組織化能を有するタンパク質をコードする核酸配列は、シグナルペプチドをコードする核酸配列の下流に、該自己組織化能を有するタンパク質が該シグナルペプチドと接続して発現するよう連結されていればよい。さらに、目的タンパク質をコードする核酸配列は、自己組織化能を有するタンパク質をコードする核酸配列の下流に、該目的タンパク質が該自己組織化能を有するタンパク質と接続して発現するよう連結されていればよい。
自己組織化能を有するタンパク質を目的タンパク質の下流に配置する場合は、目的タンパク質をコードする核酸配列は、シグナルペプチドをコードする核酸配列の下流に、該目的タンパク質が該シグナルペプチドと接続して発現するよう連結されていればよい。さらに、自己組織化能を有するタンパク質をコードする核酸配列は、目的タンパク質をコードする核酸配列の下流に、該自己組織化能を有するタンパク質が該目的タンパク質と接続して発現するよう連結されていればよい。
遺伝子構築物は、宿主で融合タンパク質遺伝子を発現させるために有効な制御配列（オペレーターやターミネーター等）を、それらが機能し得るように適切な位置に有していてもよい。
【００５３】
「プロモーター」は、使用する宿主で機能するプロモーターである限り特に限定されず、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。
例えば、宿主としてコリネ型細菌を用いる場合、プロモーターは、コリネ型細菌で機能するプロモーターである。
「コリネ型細菌で機能するプロモーター」とは、コリネ型細菌においてプロモーター活性を有するプロモーターをいう。
コリネ型細菌由来のプロモーターとしては、例えば、細胞表層タンパク質のPS1、CspB（PS2ともいう）、SlpA（CspAともいう）の遺伝子のプロモーターや、各種アミノ酸生合成系遺伝子のプロモーターが挙げられる。
各種アミノ酸生合成系遺伝子のプロモーターとして、具体的には、例えば、グルタミン酸生合成系のグルタミン酸脱水素酵素遺伝子、グルタミン合成系のグルタミン合成酵素遺伝子、リジン生合成系のアスパルトキナーゼ遺伝子、スレオニン生合成系のホモセリン脱水素酵素遺伝子、イソロイシンおよびバリン生合成系のアセトヒドロキシ酸合成酵素遺伝子、ロイシン生合成系の2-イソプロピルリンゴ酸合成酵素遺伝子、プロリンおよびアルギニン生合成系のグルタミン酸キナーゼ遺伝子、ヒスチジン生合成系のホスホリボシル-ATPピロホスホリラーゼ遺伝子、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニン等の芳香族アミノ酸生合成系のデオキシアラビノヘプツロン酸リン酸（DAHP）合成酵素遺伝子、イノシン酸およびグアニル酸のような核酸生合成系におけるホスホリボシルピロホスフェート(PRPP)アミドトランスフェラーゼ遺伝子、イノシン酸脱水素酵素遺伝子、およびグアニル酸合成酵素遺伝子のプロモーターが挙げられる。
コリネ型細菌に対して異種のプロモーターとして、具体的には、例えば、tacプロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、およびaraBADプロモーター等のE. coli由来のプロモーターが挙げられる。その中で、tacプロモーター等の強力なプロモーターが好ましく、araBADプロモーター等の誘導型のプロモーターも好ましい。
【００５４】
各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得し利用してもよい。例えば、プロモーター領域内の−３５、−１０領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第００／１８９３５号）。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。さらに、リボソーム結合部位（RBS）と開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列(5'-UTR)における数個のヌクレオチドの置換、あるいは挿入、あるいは欠失がmRNAの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。
【００５５】
本発明において、好ましくは、宿主は融合タンパク質を分泌性タンパク質（secretory protein）として産生する。
分泌性タンパク質は、一般に、プレタンパク質（プレペプチドともいう）またはプレプロタンパク質（プレプロペプチドともいう）として翻訳され、その後、プロセッシングにより成熟タンパク質（mature protein）になることが知られている。具体的には、分泌性タンパク質は、一般に、プレタンパク質またはプレプロタンパク質として翻訳された後、プレ部分であるシグナルペプチドがプロテアーゼ（一般にシグナルペプチダーゼと呼ばれる）によって切断され成熟タンパク質またはプロタンパク質に変換されて分泌され、プロタンパク質はプロテアーゼによってさらにプロ部分が切断されて成熟タンパク質になる。
したがって、本発明では、宿主による融合タンパク質の分泌生産のためにシグナルペプチドを利用する。なお、本明細書において、分泌性タンパク質のプレタンパク質およびプレプロタンパク質を総称して「分泌性タンパク質前駆体」という場合がある。
【００５６】
「シグナルペプチド」（以下、「シグナル配列」ということもある）とは、分泌性タンパク質前駆体のN末端に存在し、かつ、通常、天然の成熟タンパク質には存在しないアミノ酸配列をいう。
本発明で使用されるシグナルペプチドは、宿主で機能するシグナルペプチドである限り特に限定されず、宿主由来のシグナルペプチドであってもよく、異種由来のシグナルペプチドであってもよい。
例えば、宿主としてコリネ型細菌を用いる場合、シグナルペプチドは、コリネ型細菌で機能するシグナルペプチドである。
「コリネ型細菌で機能するシグナルペプチド」とは、融合タンパク質のN末端に連結した際に、コリネ型細菌が融合タンパク質を分泌することができるペプチドをいう。
コリネ型細菌で機能するシグナルペプチドとして、宿主であるコリネ型細菌の分泌性タンパク質のシグナルペプチドであるのが好ましく、コリネ型細菌の細胞表層タンパク質のシグナルペプチドであるのがより好ましい。コリネ型細菌の細胞表層タンパク質としては、C. glutamicumに由来するPS1及びCspB（PS2）（特表平６−５０２５４８号公報）、及びC. ammoniagenesに由来するSlpA（CspA）（特開平１０−１０８６７５号公報）が挙げられる。PS1のシグナルペプチドのアミノ酸配列を配列番号４に、CspB（PS2）のシグナルペプチドのアミノ酸配列を配列番号５に、SlpA（CspA）のシグナルペプチドのアミノ酸配列を配列番号６に示す。また、米国特許第4965197号明細書によれば、コリネ型細菌由来のDNaseにもシグナルペプチドがあると言われており、そのようなシグナルペプチドも本発明に利用することができる。
【００５７】
シグナルペプチドは生物種を越えて一定の共通した配列上の特徴を有するが、ある生物種で分泌機能を示すシグナルペプチドが他の生物種において必ずしも分泌機能を発揮するわけではない。よって、異種由来のシグナルペプチドを利用する場合には、適宜、使用する宿主で機能するものを選択すればよい。あるシグナルペプチドが使用する宿主で機能するかどうかは、例えば、目的のタンパク質を当該シグナルペプチドと融合させて発現させ、当該タンパク質が分泌されるかを試験することで確認できる。
【００５８】
シグナル配列は、一般に、翻訳産物が菌体外に分泌される際にシグナルペプチダーゼによって切断される。シグナルペプチダーゼは宿主が元々有しているものを利用してもよく、使用する宿主において機能するシグナルペプチダーゼをコードする遺伝子を宿主へ組み込んでもよい。
シグナルペプチドをコードする遺伝子は、天然型のままでも使用できるが、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変してもよい。
【００５９】
融合タンパク質を分泌発現させる遺伝子構築物では、自己組織化能を有するタンパク質を目的タンパク質の上流に配置する場合は、シグナルペプチドをコードする核酸配列と目的タンパク質をコードする核酸配列との間に、自己組織化能を有するタンパク質をコードする核酸配列（付加配列）が挿入されている。自己組織化能を有するタンパク質を目的タンパク質の下流に配置する場合は、目的タンパク質をコードする核酸配列の下流に自己組織化能を有するタンパク質をコードする核酸配列（付加配列）が挿入されている。
なお、付加配列をコードする核酸配列と目的タンパク質をコードする核酸配列との間に、さらに、酵素的または化学的切断に使用されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含んでいてもよい。酵素的または化学的切断に使用されるアミノ酸配列を融合タンパク質へ挿入することで、発現した融合タンパク質を酵素的または化学的に切断して、目的タンパク質を得ることができる。
切断は、定法に従い酵素的または化学的に行うことができる。
切断工程は、工程（４）と同時、工程（４）の途中、または工程（４）の後に行うことができる。
「工程（４）と同時」とは、工程（４）で用いる「工程（２）で得られた溶液のｐＨよりも０．１以上高く、かつ、１２以下のｐＨを有する溶液」に、切断試薬（例えば、後述の酵素的切断に用いるプロテアーゼ）を予め添加しておき、この溶液を用いて工程（４）と切断工程とを同時に行うことをいう。
「工程（４）の途中」とは、工程（４）で用いる「工程（２）で得られた溶液のｐＨよりも０．１以上高く、かつ、１２以下のｐＨを有する溶液」へ切断試薬を添加せずに工程（４）を開始し、工程（４）の途中で前記試薬を添加して、切断工程を行うことをいう。
「工程（４）の後」とは、工程（４）が終了した後に、切断試薬を用いて、切断工程を行うことをいう。
切断工程の後、当該技術分野において周知慣用の方法を用いることで、自己組織化能を有するタンパク質から目的タンパク質を容易に分離することができる。この際、工程（２）と同様にして、切断工程に付した溶液のｐＨを調節して自己組織化能を有するタンパク質のみを沈殿させ、工程（３）と同様にして自己組織化能を有するタンパク質のみを固体として分離しても良い。
【００６０】
酵素的切断に使用されるアミノ酸配列は、ペプチド結合を加水分解する酵素により認識され切断される配列であれば特に制限されず、目的タンパク質のアミノ酸配列に応じて使用可能な配列を適宜選択すればよい。酵素的切断に使用されるアミノ酸配列をコードする核酸配列は、同アミノ酸配列に基づいて適宜設定すればよく、また、例えば、宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを用いればよい。
【００６１】
酵素的切断に使用されるアミノ酸配列は、基質特異性の高いプロテアーゼの認識配列であることが好ましい。そのようなアミノ酸配列として、具体的には、例えば、Factor Xaプロテアーゼの認識配列、proTEVプロテアーゼの認識配列やトリプシンの認識配列が挙げられる。Factor Xaプロテアーゼはタンパク質中のIle-Glu-Gly-Arg（=IEGR）（配列番号７）のアミノ酸配列を、proTEVプロテアーゼはタンパク質中のGlu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln（=ENLYFQ）（配列番号８）のアミノ酸配列を認識し、各配列のC末端側を特異的に切断する。トリプシンはタンパク質中のLysおよびArgを認識し、LysおよびArgのC末端側を特異的に切断する。
【００６２】
化学的切断に使用されるアミノ酸配列は、採用する化学反応条件下で切断される配列であれば特に制限されず、目的タンパク質のアミノ酸配列に応じて使用可能な配列を適宜選択すればよい。化学的切断に使用されるアミノ酸配列をコードする核酸配列は、同アミノ酸配列に基づいて適宜設定すればよく、また、例えば、宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを用いればよい。
【００６３】
化学的切断に使用されるアミノ酸配列は、特異性の高い切断が起こる配列であることが好ましい。そのようなアミノ酸配列の切断部位として、具体的には、例えばMetが挙げられる。臭化シアン分解法を利用すると、MetのC末端側で切断が起こる。
【００６４】
「融合タンパク質の発現用の遺伝子構築物」は、当該技術分野で周知慣用の手法に従い構築することができる。
【００６５】
遺伝子構築物を宿主へ導入する手法は特に制限されず、一般に使用される手法、例えば、プロトプラスト法(Gene, 39, 281-286(1985))や、エレクトロポレーション法(Bio/Technology, 7, 1067-1070)(1989))等を使用することができる。
宿主が細菌である場合、遺伝子構築物は、プラスミドのように染色体外で自律増殖するベクター上に存在していてもよく、染色体上に組み込まれていてもよい。
例えば、遺伝子構築物を、宿主としてのコリネ型細菌へ、ベクターを用いて導入する場合、ベクターは、コリネ型細菌で自律複製可能なものであれば特に制限されず、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミドや、ファージミド等であってよい。ベクターとしては、コリネ型細菌由来のプラスミドが好ましい。コリネ型細菌で自律複製可能なベクターとして、具体的には、pHM1519(Agric, Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984))；pAM330（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；これらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド；特開平3-210184号公報に記載のプラスミドpCRY30；特開平2-72876号公報及び米国特許5,185,262号明細書公報に記載のプラスミドpCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE及びpCRY3KX；特開平1-191686号公報に記載のプラスミドpCRY2およびpCRY3；特開昭58-192900号公報に記載のpAJ655、pAJ611及びpAJ1844；特開昭57-134500号公報に記載のpCG1；特開昭58-35197号公報に記載のpCG2；特開昭５7-183799号公報に記載のpCG4およびpCG11等が挙げられる。
【００６６】
遺伝子構築物の導入には、人工トランスポゾン等を利用することもできる。トランスポゾンを使用する場合、相同組換えまたはそれ自身の転移能によって遺伝子構築物が染色体上に導入される。その他、相同組換えを利用する導入法としては、例えば、直鎖状ＤＮＡ、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドや、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクター等を用いる方法が挙げられる。なお、融合タンパク質遺伝子が染色体上に導入される場合、遺伝子構築物が染色体上に構成される限り、同遺伝子構築物に含まれるプロモーター配列、シグナルペプチドをコードする核酸配列、および付加配列をコードする核酸配列から選択される１以上の配列は宿主の染色体上にもともと存在するものであってもよい。例えば、宿主の染色体上にもともと存在するプロモーター配列と同プロモーター配列の下流に接続されたシグナルペプチドをコードする核酸配列をそのまま利用し、同シグナルペプチドをコードする核酸配列の下流に接続された遺伝子のみを付加配列と目的タンパク質との融合タンパク質をコードする核酸配列に置換することによって、染色体上に遺伝子構築物を構成することができる。
【００６７】
２種類以上の目的タンパク質を製造する場合、各タンパク質の発現用の遺伝子構築物は、各タンパク質の発現が達成できるように宿主に保持されていればよい。例えば、各タンパク質の発現用の遺伝子構築物は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、各タンパク質の発現用の遺伝子構築物は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。なお、２種類以上の目的タンパク質には、ヘテロ多量体タンパク質が含まれる。
【００６８】
遺伝子構築物を導入した宿主を培養し、融合タンパク質を発現させ、菌体外へ分泌又は菌体内へ蓄積させることにより、融合タンパク質を含む培養液が調製される。
【００６９】
宿主は通常用いられる方法および条件に従って培養することができる。例えば、宿主として細菌を用いる場合、炭素源、窒素源及び無機イオンを含有する通常の培地で培養することができる。さらに高い増殖を得るために、ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を必要に応じて添加することもできる。
【００７０】
炭素源としてはグルコースおよびシュークロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、アルコール類、その他を使用することができる。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、その他が使用できる。無機イオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リン酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン等を必要に応じて適宜使用することができる。
培養は、使用する宿主に適切な条件で行うことができる。例えばコリネ型細菌の場合、pH5.0〜8.5、15℃〜37℃の適切な範囲にて好気的条件下で行い、１〜７日間程度培養する。また、コリネ型細菌のＬ−アミノ酸生産における培養条件や、その他Sec系、Tat系のシグナルペプチドを用いたタンパク質の製造法に記載の条件を用いることが出来る（WO01/23591、WO2005/103278参照）。
融合タンパク質の発現のために誘導型プロモーターを用いた場合は、培地にプロモーター誘導剤を添加して培養を行うこともできる。
【００７１】
融合タンパク質が生産されたことは、培養上清（融合タンパク質が菌体内に蓄積している場合には細胞破砕物も含む）を含む画分を試料として、SDS-PAGEを行い、分離されたタンパク質バンドの分子量から確認することができる。また、培養上清（前記の細胞破砕物も含む）を含む画分を試料として、抗体を用いたウェスタンブロットによって確認できる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。また、プロテインシークエンサーを用いて産生タンパク質のN末端アミノ酸配列を決定することによって確認できる。さらに、質量分析計を用いて、産生タンパク質の質量を決定することによっても確認できる。
また、場合により、融合タンパク質（更には目的タンパク質）は、逆相HPLCを用いて濃度測定や純度測定をすることもできる。
【００７２】
融合タンパク質が宿主菌体外に分泌された場合、「融合タンパク質を含む溶液」は、前述の融合タンパク質を含む培養液そのもの（菌体を含む培養液）であってもよく、前記培養液から宿主菌体を分離した培養上清（除菌培養液）であってもよい。すなわち、「融合タンパク質を含む溶液」（以下、「工程（１）で得られた溶液」ともいう）には、融合タンパク質を含む培養液から菌体を除菌して得られる培養上清だけでなく、融合タンパク質を含む培養液そのものも含まれる。本発明では、培養上清を用いることが好ましい。
培養液からの菌体の分離は、当該技術分野で周知慣用の方法、例えば、遠心分離、膜ろ過等により実施することができる。菌体分離工程は、通常、融合タンパク質（又は目的タンパク質）の回収率及び純度の向上の観点から工程（１）で実施される。しかし、諸般の事情により他の工程で行うことが好ましい場合には、工程（１）以外の任意の工程で行ってもよい。
【００７３】
融合タンパク質が宿主菌体内に可溶性タンパク質として蓄積された場合、菌体を破砕し、破砕物から固形物を分離することにより、「工程（１）で得られた溶液」を調製することができる。菌体の破砕は当該技術分野において周知慣用の方法、例えばホモジナイズ法により実施することができる。
【００７４】
融合タンパク質が宿主菌体内に不溶性タンパク質として蓄積された場合、菌体を破砕し、破砕物から固形物を集め、この固形物を周知慣用の方法、例えば尿素やグアニジンなどのタンパク質変性剤やSDSなどの界面活性剤を用いた可溶化処理に供した後に固形物を分離することにより、「工程（１）で得られた溶液」を調製することができる。菌体の破砕は当該技術分野において周知慣用の方法、例えばホモジナイズ法により実施することができる。
【００７５】
本発明の製造方法の工程（２）では、工程（１）で得られた溶液のｐＨを、下記計算式：
回収率（％）＝［工程（４）で得られた溶液における融合タン
パク質の量／｛工程（４）で得られた溶液における融合タンパ
ク質の量＋工程（３）の固体分離後の溶液における融合タンパ
ク質の量｝］×１００
で計算される回収率を１０％以上にするｐＨへと調節する。
なお、以下の説明で用いられる「沈殿」に関する用語（例えば、「沈殿物」や「沈殿溶解液」等）は、特段の記載がない限り、融合タンパク質を対象とするものである。沈殿が宿主菌体を対象とする場合には、その旨を記載する。
また、融合タンパク質又は目的タンパク質の分析に関する記載は、除菌したサンプルに対するものである。
【００７６】
回収率の計算式における「工程（４）で得られた溶液における融合タンパク質の量」及び「工程（３）の固体分離後の溶液における融合タンパク質の量」は、当該技術分野において周知慣用のタンパク質定量法、例えば、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥや逆相ＨＰＬＣ等を用いて測定することができる。
還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる融合タンパク質の定量は、当該技術分野において周知慣用の方法、例えば実施例１に記載された還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の融合タンパクのバンドの濃さを指標として行うことができる。この場合、回収率の計算式は、下記の通りとなる。
回収率（％）＝［工程（４）で得られた溶液における融合タンパク質のバンドの濃さ／｛工程（４）で得られた溶液における融合タンパク質のバンドの濃さ＋工程（３）の固体分離後の溶液における融合タンパク質のバンドの濃さ｝］×１００
逆相ＨＰＬＣによる融合タンパク質の定量は、当該技術分野において周知慣用の方法、例えば実施例１−２に記載された逆相ＨＰＬＣにより得られたクロマトグラムの融合タンパク質のピークエリアに基づく定量法を用いて行うことができる。
回収率は、目的タンパク質の種類及び用途や、必要な量等によって変動しうるが、10％以上、好ましくは20％以上、さらに好ましくは30%以上である。
【００７７】
なお、１０％以上の回収率を達成するためのｐＨ上限値の決定は、後述の実施例１に示すように、工程（２）を実施するｐＨを変化させて複数の試験（各試験とも工程（１）〜（４）を含む）を行い、各試験の回収率を算出し、算出した回収率とｐＨとの関係図を作成することで容易に決定することができる。
【００７８】
上記の計算式により決定したｐＨ値は、工程（２）で用いることのできるｐＨ（回収率を１０％以上にするｐＨ）の上限値である。したがって、工程（２）は、上記で決定したｐＨ上限値以下のｐＨで実施することができる。また、ｐＨの下限値は、融合タンパク質の不可逆的な酸変性を引き起こさない限り特に制限されるものではないが、ｐＨ調節操作にかかるコストと所望の回収率を考慮して決定する。
工程（２）で用いるｐＨ値は、目的タンパク質の種類及び用途や、必要な量等によって変動しうるが、９以下が好ましい。例えば、−０．５〜９、好ましくは１．５〜９である。
【００７９】
ｐＨ調節に用いる物質は、特に制限なくあらゆる種類の酸やアルカリを用いることができる。酸として、例えば、硫酸、塩酸、酢酸、リン酸やトリフルオロ酢酸(TFA)等が挙げられる。これらの中では、硫酸、塩酸及び酢酸が好ましい。酸は１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。塩基として、例えば、水酸化ナトリウム、アンモニアやトリスヒドロキシメチルアミノメタン(Tris)等が挙げられる。塩基は１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。
【００８０】
工程（２）では、ｐＨ調節後、溶液中に固体を生じる。固体は主に融合タンパク質から構成されている。この融合タンパク質は酸変性を実質的に起こしていない。固体生成を促進するために、ｐＨ調節後の溶液を撹拌又は静置することが好ましい。
【００８１】
なお、工程（１）で得られた溶液のｐＨが、既に工程（２）のｐＨ調節操作により達成されるべき値となっている場合、工程（２）のｐＨ調節操作は不要であり、工程（１）で得られた溶液を、適宜撹拌又は静置した後、工程（３）に付することができる。
つまり、本発明の融合タンパク質の製造方法は、下記（Ａ）〜（Ｃ）の工程：
（Ａ）融合タンパク質を含む溶液を調製する工程であって、該溶液のｐＨが、下記計算式：
回収率（％）＝［工程（Ｃ）で得られた溶液における融合タンパ
ク質の量／｛工程（Ｃ）で得られた溶液における融合タンパク質
の量＋工程（Ｂ）の固体分離後の溶液における融合タンパク質の
量｝］×１００
で計算される回収率を１０％以上にするｐＨである工程、
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた溶液から固体を分離する工程、及び、
（Ｃ）工程（Ｂ）で分離した固体を、工程（Ａ）で得られた溶液のｐＨよりも０．１以上高く、かつ、１２以下のｐＨを有する溶液中に溶解させる工程、
を含むものとなる。
なお、上述の工程（１）及び（２）に関する説明は、工程（Ａ）に適用される。また、後述の工程（３）及び（４）に関する説明は、工程（Ｂ）及び（Ｃ）に適用される。
【００８２】
本発明の製造方法の工程（３）では、工程（２）で得られた溶液から固体を分離する。
工程（２）で得られた溶液中には、融合タンパク質以外の様々な菌体由来成分（例えば色素や脂質や不純物タンパク質）や培地由来成分（たとえば色素や無機塩類）が残存しているが、工程（３）によってこれらを除くことができ、結果として融合タンパク質の純度を簡便に向上させることができる。
分離は、当該技術分野において周知慣用の方法により実施することができる。例えば、遠心分離や膜ろ過等を用いることができる。複数の方法を組み合わせ（例えば、遠心分離と膜ろ過との組合せ）を実施してもよい。
【００８３】
工程（３）で得られた固体には、除去しきれなかった液体（不純物）が付着していることがある。この不純物の付着した固体に、工程（２）で用いることのできるｐＨの上限値（すなわち、融合タンパク質の回収率を１０％にするｐＨ）以下のｐHを有する溶液を添加すると、固体と溶液（液体（不純物）を含む）との混合物（懸濁液）が得られる。この懸濁液から再び固体を分離することで、付着した不純物の量が減少した固体を得ることができる。工程（３）の後に、この操作を一回または複数回行っても良い。
【００８４】
本発明の製造方法の工程（４）では、工程（３）で分離した固体を、工程（２）で得られた溶液のｐＨよりも０．１以上高く、かつ、１２以下のｐＨを有する溶液中に溶解させる。
【００８５】
工程（４）で用いる溶液のより好ましいｐＨは、対象となる融合タンパク質の回収率を１０％にするｐＨ（すなわち、工程（２）で用いることのできるｐＨの上限値）よりも０．１以上高いｐＨ、より好ましくは０．２以上高いｐＨ、さらに好ましくは１以上高いｐＨである。これらの好ましいｐＨを用いると、当該溶液中に融合タンパク質を充分に溶解させることができる。
【００８６】
この好ましいｐＨは、自己組織化能を有するタンパク質の種類と目的タンパク質の種類により変動しうるが、例えば、自己組織化能を有するタンパク質がＣｓｐＢ成熟タンパク質又はその一部の場合、好ましくは１２以下、より好ましくは１１以下、さらに好ましくは１０以下である。
【００８７】
工程（３）で分離した固体の溶解に用いる溶液は、上述のｐＨを有するものであれば特に制限なくあらゆる種類の物質を用いることができる。具体例としては、緩衝液が挙げられる。緩衝液は、ｐＨの変動が起こりにくいので好ましい。緩衝液としては、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、リン酸ナトリウムや、クエン酸等を用いたものが挙げられ、Ｔｒｉｓが好ましい。
【００８８】
工程（４）を実施することにより、融合タンパク質を溶液として得ることができる。この工程で用いる溶液の量を増減させることで、融合タンパク質の濃度を任意に調節することができる。また、工程（４）で用いる溶液の組成は、次に実施する工程を考慮して決定することができる。したがって、工程（２）乃至工程（４）を経ることで、融合タンパク質の純度向上、及び／又は、融合タンパク質溶液の濃縮及び／又は溶媒置換を簡便に実施することが可能となる。
【００８９】
なお、工程（２）の固体発生時に、融合タンパク質以外の物質が不純物として固体中に巻き込まれ、工程（４）で得られる溶液に持ち込まれることがある。このような場合、工程（４）で得られた溶液を工程（１）で得られた溶液として扱い、再度工程（２）乃至工程（４）を実施することで、この不純物の量を減少させることができる。工程（４）の後に実施されるこの操作は、一回または複数回行っても良い。
【００９０】
工程（４）で得られた溶液中には融合タンパク質が溶解している。
融合タンパク質から自己組織化能を有するタンパク質を切断することにより、目的タンパク質を得ることができる。
切断は、当該技術分野で周知慣用の方法に従って実施することができる。切断方法としては、例えば、酵素的切断や化学的切断等が挙げられる。切断の特異性に優れる点で酵素的切断が好ましい。切断工程は、工程（４）で得られた融合タンパク質を含む溶液に対して行ってもよく、工程（４）で得られた溶液から融合タンパク質を分離した後に行ってもよい。工程（４）で得られた融合タンパク質を含む溶液に対して行う場合、切断工程は、工程（４）と同時、工程（４）の途中、工程（４）の後のいずれでも良い。
【００９１】
酵素的切断は、自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との間に基質特異性の高いプロテアーゼの認識配列（例えば、前記のFactor Xaプロテアーゼの認識配列やproTEVプロテアーゼの認識配列、トリプシン認識配列）を含めておくことにより、好適に実施することができる。
【００９２】
工程（４）で得られた融合タンパク質または融合タンパク質の切断により得られた目的タンパク質は、当該技術分野で周知慣用の方法に従って溶液から精製することができる。
例えば、融合タンパク質または目的タンパク質を含む溶液を、カラムクロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相クロマトグラフィー（例えば逆相ＨＰＬＣ）、中高圧液体クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニーティークロマトグラフィー）、アルコール沈殿法、限外濾過膜法等の既知の適切な方法、またはこれらの組合せに付することにより、融合タンパク質または目的タンパク質を精製することができる。
なお、融合タンパク質の切断工程後に得られた溶液を、工程（２）と同様の工程に付すると、自己組織化能を有するタンパク質が沈殿する。この工程を行うことで、目的タンパク質の精製をより効率的に行うことができる。
【００９３】
目的タンパク質が得られたことは、当該技術分野において周知慣用の分析方法に従い確認することができる。例えば、試料をSDS-PAGEに付して、分離されたタンパク質バンドの分子量を確認することにより確認することができる。その他、抗体を用いたウェスタンブロットによっても確認できる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。また、プロテインシークエンサーを用いて目的タンパク質のN末端アミノ酸配列を決定することによっても確認出来る。また、質量分析計を用いて、目的タンパク質の質量を決定することによっても確認出来る。更に、目的タンパク質が酵素や何らかの測定可能な生理活性を有するものである場合には、その酵素活性または生理活性を指標として確認することもできる。
【００９４】
本発明に従い得られた目的タンパク質はそのまま用いてもよく、更に修飾を行ってもよい。修飾としては、化学合成法によるアミノ酸付加やPEG化（Biotechnol J., Jan;5(1):113(2010)）等が挙げられる。例えば、目的タンパク質としてBiva18（生理活性タンパク質ビバリルジン（２０アミノ酸）からＮ末端側の２アミノ酸残基（D-Phe-L-Pro）を削除したペプチド）を製造した場合、Biva18のＮ末端側に２アミノ酸残基（D-Phe-L-Pro）を化学合成法により付加することにより、生理活性を有する完全長ビバリルジンとすることができる。具体的には、Biva18のＮ末端に活性化した特定のアミノ酸残基を作用させる化学合成反応を行うことで完全長ビバリルジンとすることができる。
修飾した目的タンパク質は、当該技術分野で周知慣用の方法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ、疎水クロマトグラフィー等により精製することができる。
【実施例】
【００９５】
以下、本発明を実施例および比較例により更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００９６】
〔実施例１〕
生理活性ペプチド  テリパラチド（Teriparatide）を有する融合タンパク質の製造
実施例１では、目的タンパク質として生理活性ペプチドであるTeriparatide（３４アミノ酸残基）（Teri）を用い、自己組織化能を有するタンパク質としてＣｓｐＢ成熟タンパク質のＮ末端から５０アミノ酸残基からなる配列（CspB50）を用い、酵素的切断に使用されるアミノ酸配列としてｐｒｏＴＥＶプロテアーゼ認識配列を用い、宿主として、コリネ型細菌であるC. glutamicumを用いた。【００９７】
（１）Teriparatide分泌発現プラスミドpPKK50TEV-Teriの構築
(i)プロインスリン遺伝子の全合成と、C. glutamicum ATCC13869の細胞表層タンパク質CspBのシグナル配列を用いたプロインスリン分泌発現プラスミドpPKPInsの構築
プロインスリン（以下、PIns と表記する）のアミノ酸配列は既に決定されている（Genbank Accession No. NP_000198.1）。この配列とC. glutamicumのコドン使用頻度を考慮して、<配列番号９>〜<配列番号１６>に示したDNAを合成した。これらのDNAを鋳型とし、<配列番号１７>と<配列番号１８>に示したDNAをプライマーとして用いて、PInsをコードする遺伝子をPCR法によって増幅し、<配列番号１９>に示した約0.3kbpのDNA断片を得た。
このDNA断片をクローニングベクターpHSG398（タカラバイオ社製）のSma I部位に挿入する事によりpHSG-PInsを得た。このpHSG-PInsを鋳型にして、<配列番号１７>と<配列番号１８>に示したDNAをプライマーとして用いて、PIns遺伝子領域をPCR法によって増幅し、約0.3kbpのPIns遺伝子断片を得た。【００９８】
一方、C. glutamicumの細胞表層タンパク質であるCspBをコードしている遺伝子の塩基配列は既に決定されている（Mol. Microbiol., 9, 97-109(1993)）。この配列を参考にして、WO01/23591に記載のpPKPTG1（pPKPTG1は、プロトランスグルタミナーゼ（プロ構造部付きトランスグルタミナーゼ）の分泌発現用ベクターであって、C. glutamicum ATCC13869株由来のcspB遺伝子のプロモーター、同プロモーターの下流に発現可能に連結されたC. glutamicum ATCC13869株由来のCspBのシグナルペプチド30アミノ酸残基をコードするDNA、および同シグナルペプチドをコードするDNAの下流に同シグナルペプチドとの融合タンパク質として発現するよう連結された放線菌Streptoverticillium mobaraense由来のプロトランスグルタミナーゼ遺伝子を有する）を鋳型に、<配列番号２０>と<配列番号２１>に示したプライマーを用いて、C. glutamicum ATCC13869株由来のCspBのプロモーター領域とシグナルペプチドをコードする領域をPCR法にて増幅し、約0.7kbpのDNA断片を得た。【００９９】
更に、増幅した両DNA断片（PIns遺伝子断片と、プロモーター領域とシグナルペプチドをコードする領域の断片）を鋳型に、<配列番号２０>と<配列番号１８>に記載のDNAをプライマーとして用いたPCR法により、両DNA断片が融合した約0.9kbpのDNA断片を得た。なお、<配列番号２０>と<配列番号１８>のプライマーには制限酵素Kpn Iの認識配列がデザインしてある。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase（タカラバイオ社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。このDNA断片を制限酵素Kpn I処理後に、特開平9-322774に記載のpPK4のKpnI部位に挿入することによって、pPKPInsを得た。
挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。なお、塩基配列の決定はBigDye（登録商標）Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社製）と3130 ジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。【０１００】
(ii)C. glutamicum ATCC13869の細胞表層タンパク質CspBの成熟タンパク質N末端の1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 20, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 440アミノ酸残基を融合したプロインスリンの分泌発現プラスミドの構築
上述の通り、C. glutamicumの細胞表層タンパク質であるCspBをコードしている遺伝子の塩基配列は既に決定されている（Mol. Microbiol., 9, 97-109(1993)）。C. glutamicumにおいてCspBは細胞表層に局在し、S-layerと呼ばれる層を形成しているが、その局在にはC末端側の疎水性に富んだアミノ酸残基領域が関与している事が知られている（Mol. Microbiol., 9, 97-109(1993)）。この配列を参考にして、<配列番号２０>と<配列番号２２>に記載のプライマーを合成し、常法に従って（斉藤、三浦の方法[Biochem. Biophys. Act., 72, 619(1963)]）調製したC. glutamicum ATCC13869の染色体DNAを鋳型として、CspBをコードする遺伝子のプロモーターを含む5'-上流域（以下、CspBプロモーター領域ともいう）、ならびにCspBのN末端のシグナルペプチド30アミノ酸残基およびCspB成熟タンパク質のN末端440アミノ酸残基をコードする領域をPCR法にて増幅した。なお、CspB成熟タンパク質のN末端440アミノ酸残基とは、C. glutamicum ATCC13869のCspB成熟タンパク質全長469アミノ酸（配列番号３）からC末端側の疎水性領域である29アミノ酸を除いたものである。PCR反応にはPyobest DNA polymerase（タカラバイオ社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。【０１０１】
次に、C. glutamicumの細胞表層タンパク質CspBの成熟タンパク質N末端のアミノ酸残基をそれぞれ1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 20, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 440残基融合させたプロインスリンを分泌発現させるプラスミドを構築する目的で、上記にて増幅したPCR反応産物を鋳型とし、それぞれ<配列番号２０>と<配列番号２３>、<配列番号２０>と<配列番号２４>、<配列番号２０>と<配列番号２５>、<配列番号２０>と<配列番号２６>、<配列番号２０>と<配列番号２７>、<配列番号２０>と<配列番号２８>、<配列番号２０>と<配列番号２９>、<配列番号２０>と<配列番号３０>、<配列番号２０>と<配列番号３１>、<配列番号２０>と<配列番号３２>、<配列番号２０>と<配列番号３３>、<配列番号２０>と<配列番号３４>、<配列番号２０>と<配列番号３５>、<配列番号２０>と<配列番号３６>、<配列番号２０>と<配列番号３７>、<配列番号２０>と<配列番号３８>、<配列番号２０>と<配列番号３９>、<配列番号２０>と<配列番号４０>、<配列番号２０>と<配列番号４１>、<配列番号２０>と<配列番号４２>、<配列番号２０>と<配列番号４３>、<配列番号２０>と<配列番号４４>、<配列番号２０>と<配列番号４５>、<配列番号２０>と<配列番号４６>、<配列番号２０>と<配列番号４７>、<配列番号２０>と<配列番号４８>に示した各合成DNAをプライマーとして、CspBプロモーター領域、ならびにCspBのN末端のシグナルペプチド30アミノ酸残基およびCspB成熟タンパク質のN末端の1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 20, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 440アミノ酸残基をコードする領域をPCR法にてそれぞれ増幅した。一方、前記(i)で構築したプラスミドpPKPInsを鋳型とし、<配列番号１７>と<配列番号４９>に示した合成DNAをプライマーとして、PIns遺伝子領域をPCR法にて増幅し、PIns遺伝子断片を得た。【０１０２】
更に、増幅させた両DNA断片（CspBプロモーター領域、ならびにCspBシグナルペプチドおよび成熟CspBのN末端の1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 20, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 440アミノ酸残基をコードする領域の断片と、PIns遺伝子断片）を鋳型に、<配列番号２０>と<配列番号４９>に記載のDNAをプライマーとして用いたPCR法により、両DNA断片が融合したDNA断片を得た。なお、<配列番号２０>と<配列番号４９>のプライマーは制限酵素Kpn Iの認識配列がデザインされており、<配列番号２３>〜<配列番号４８>のプライマーは、CspB成熟タンパク質のN末端をコードする領域とPIns遺伝子との融合遺伝子を構築するためにPInsのN末端側のアミノ酸配列をコードする配列を含んでいる。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase（タカラバイオ社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。これらのDNA断片を制限酵素Kpn I処理後に、特開平9-322774に記載のpPK4のKpn I部位に挿入することによって、それぞれpPKK1PIns, pPKK2PIns, pPKK3PIns, pPKK4PIns, pPKK5PIns, pPKK6PIns, pPKK7PIns, pPKK8PIns, pPKK9PIns, pPKK10PIns, pPKK11PIns, pPKK12PIns, pPKK13PIns, pPKK14PIns, pPKK15PIns, pPKK17PIns, pPKK20PIns, pPKK50PIns, pPKK100PIns, pPKK150PIns, pPKK200PIns, pPKK250PIns, pPKK300PIns, pPKK350PIns, pPKK400PIns, pPKK440PInsを得た。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。なお、塩基配列の決定はBigDye（登録商標）Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社製）と3130 ジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。【０１０３】
(iii)プラスミドpPKK17Xa-Pins及びpPKK50Xa-PInsの構築
前記(ii)で構築したpPKK17PInsおよびpPKK50PInsを鋳型として、<配列番号２０>と<配列番号５０>、<配列番号２０>と<配列番号５１>に示した各合成DNAをプライマーとして、CspBプロモーター領域、ならびにCspBのN末端のシグナルペプチド30アミノ酸残基およびCspB成熟タンパク質のN末端17または50アミノ酸残基をコードする領域に、さらにFactor Xaプロテアーゼにより認識されるIEGRをコードする領域が付加された断片をPCR法にてそれぞれ増幅した。一方、前記(i)で構築したプラスミドpPKPInsを鋳型とし、<配列番号５２>と<配列番号４９>、<配列番号５３>と<配列番号４９>に示した各合成DNAをプライマーとして、PIns遺伝子領域をPCR法にて増幅し、PIns遺伝子断片を得た。更に、増幅させた両DNA断片（CspBプロモーター領域、ならびにCspBシグナルペプチド、成熟CspBのN末端17または50アミノ酸残基（QETNPT）、およびIEGRをコードする領域の断片と、PIns遺伝子断片）を鋳型に、<配列番号２０>と<配列番号４９>に記載のDNAをプライマーとして用いたPCR法により、両DNA断片が融合したDNA断片を得た。なお、<配列番号２０>と<配列番号４９>のプライマーは制限酵素Kpn Iの認識配列がデザインされており、<配列番号５０>と<配列番号５１>のプライマーはIEGRをコードする塩基配列とPIns遺伝子との融合遺伝子を構築するためのPInsのN末端側のアミノ酸配列をコードする配列がデザインされている。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase（タカラバイオ社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。これらのDNA断片を制限酵素Kpn I処理後に、特開平9-322774に記載のpPK4のKpn I部位に挿入することによって、それぞれpPKK17Xa-PIns, pPKK50Xa-PInsを得た。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。なお、塩基配列の決定はBigDye（登録商標）Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社製）と3130ジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。【０１０４】
(iv)CspB成熟タンパク質のN末端アミノ酸配列とプロインスリン配列との間にFactor XaプロテアーゼもしくはProTEVプロテアーゼの認識配列を挿入した融合プロインスリンの分泌発現プラスミドの構築
ある目的タンパク質を、当該目的タンパク質以外のアミノ酸配列と融合させた形で発現させる場合、目的タンパク質のアミノ酸配列と、融合させたアミノ酸配列との間に特定の基質特異性の高いプロテアーゼ認識配列を配位する事により、発現した融合タンパク質を特定のプロテアーゼで切断し、簡便に目的タンパク質を得る方法が広く知られている。一方、基質特異性の高いプロテアーゼとして、Factor XaプロテアーゼやProTEVプロテアーゼなどが知られており、それぞれタンパク質中のIle-Glu-Gly-Arg（=IEGR）（配列番号７）およびGlu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln（=ENLYFQ）（配列番号８）の配列を認識して各配列のC末端側を特異的に切断する。よって、例えば、CspB融合PInsにおいて、CspB成熟タンパク質のN末端アミノ酸残基をコードする塩基配列とプロインスリンをコードする塩基配列との間にFactor Xaプロテアーゼの認識配列（IEGR）もしくはProTEVプロテアーゼの認識配列（ENLYFQ）をコードする塩基配列を挿入した融合PIns遺伝子を構築し、融合PInsを分泌発現させる事によって、これらのプロテアーゼを用いて、簡便に融合PInsからPInsを得る事が可能となる。【０１０５】
前記(ii)構築したpPKK6PInsを鋳型として、<配列番号２０>と<配列番号５４>、<配列番号２０>と<配列番号５５>に示した各合成DNAをプライマーとして、CspBプロモーター領域、ならびにCspBのN末端のシグナルペプチド30アミノ酸残基およびCspB成熟タンパク質のN末端6アミノ酸残基（QETNPT）をコードする領域に、さらにFactor Xaプロテアーゼにより認識されるIEGRまたはProTEVプロテアーゼにより認識されるENLYFQをコードする領域が付加された断片をPCR法にてそれぞれ増幅した。一方、前記(i)で構築したプラスミドpPKPInsを鋳型とし、<配列番号５２>と<配列番号４９>、<配列番号５３>と<配列番号４９>に示した各合成DNAをプライマーとして、PIns遺伝子領域をPCR法にて増幅し、PIns遺伝子断片を得た。更に、増幅させた両DNA断片（CspBプロモーター領域、ならびにCspBシグナルペプチド、成熟CspBのN末端6アミノ酸残基（QETNPT）、およびIEGRまたはENLYFQをコードする領域の断片と、PIns遺伝子断片）を鋳型に、<配列番号２０>と<配列番号４９>に記載のDNAをプライマーとして用いたPCR法により、両DNA断片が融合したDNA断片を得た。なお、<配列番号２０>と<配列番号４９>のプライマーは制限酵素Kpn Iの認識配列がデザインされており、<配列番号５４>のプライマーはIEGRをコードする塩基配列とPIns遺伝子との融合遺伝子を構築するためのPInsのN末端側のアミノ酸配列をコードする配列がデザインされており、<配列番号５５>のプライマーはENLYFQをコードする塩基配列とPIns遺伝子との融合遺伝子を構築するためのPInsのN末端側のアミノ酸配列をコードする配列がデザインされている。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase（タカラバイオ社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。これらのDNA断片を制限酵素Kpn I処理後に、特開平9-322774に記載のpPK4のKpn I部位に挿入することによって、それぞれpPKK6Xa-PIns, pPKK6TEV-PInsを得た。【０１０６】
同様に、前記(ii)で構築したpPKK17PInsおよびpPKK50PInsを鋳型として、<配列番号２０>と<配列番号５０>、<配列番号２０>と<配列番号５１>に示した各合成DNAをプライマーとして、CspBプロモーター領域、ならびにCspBのN末端のシグナルペプチド30アミノ酸残基およびCspB成熟タンパク質のN末端17または50アミノ酸残基をコードする領域に、さらにFactor Xaプロテアーゼにより認識されるIEGRをコードする領域が付加された断片をPCR法にてそれぞれ増幅した。一方、前記(i)で構築したプラスミドpPKPInsを鋳型とし、<配列番号５２>と<配列番号４９>、<配列番号５３>と<配列番号４９>に示した各合成DNAをプライマーとして、PIns遺伝子領域をPCR法にて増幅し、PIns遺伝子断片を得た。更に、増幅させた両DNA断片（CspBプロモーター領域、ならびにCspBシグナルペプチド、成熟CspBのN末端17または50アミノ酸残基（QETNPT）、およびIEGRをコードする領域の断片と、PIns遺伝子断片）を鋳型に、<配列番号２０>と<配列番号４９>に記載のDNAをプライマーとして用いたPCR法により、両DNA断片が融合したDNA断片を得た。なお、<配列番号２０>と<配列番号４９>のプライマーは制限酵素Kpn Iの認識配列がデザインされており、<配列番号５０>と<配列番号５１>のプライマーはIEGRをコードする塩基配列とPIns遺伝子との融合遺伝子を構築するためのPInsのN末端側のアミノ酸配列をコードする配列がデザインされている。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase（タカラバイオ社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。これらのDNA断片を制限酵素Kpn I処理後に、特開平9-322774に記載のpPK4のKpn I部位に挿入することによって、それぞれpPKK17Xa-PIns, pPKK50Xa-PInsを得た。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。なお、塩基配列の決定はBigDye（登録商標）Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社製）と3130ジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。【０１０７】
(v)ヒト成長ホルモンhGH遺伝子の全合成とC. glutamicumにおけるヒト成長ホルモンhGH分泌発現プラスミドの構築
ヒト成長ホルモン（human growth hormone；hGH）のアミノ酸配列は既に決定されている（Genbank Accession No. CAA23779.1）。この配列のうちN末端のシグナル配列26残基を除いた成熟型hGHのアミノ酸配列とC. glutamicumのコドン使用頻度を考慮して、<配列番号５６>〜<配列番号６９>に示したDNAを合成した。これらのDNAを鋳型とし、別途合成した<配列番号７０>と<配列番号７１>に示したDNAをプライマーとして用いて、hGH遺伝子をPCR法によって増幅し、<配列番号７２>に記した約0.6kbpのDNA断片を得た。このDNA断片をクローニングベクターpHSG398（タカラバイオ社製）のSmaI部位に挿入する事によりpHSG-hGHを得た。このpHSG-hGHを鋳型にして、<配列番号７０>と<配列番号７１>に示したDNAをプライマーとして用いて、hGH遺伝子領域をPCR法によって増幅し、約0.6kbpのhGH遺伝子断片を得た。次にWO01/23591記載のpPKSPTG1（pPKSPTG1は、プロトランスグルタミナーゼ（プロ構造部付きトランスグルタミナーゼ）の分泌発現用ベクターであって、C. glutamicum ATCC13869株由来のcspB遺伝子のプロモーター、同プロモーターの下流に発現可能に連結されたC. ammoniagenes ATCC6872株由来のCspA（SlpA）＜Genbank Accession No. BAB62413.1＞のシグナルペプチド25アミノ酸残基をコードするDNA、および同シグナルペプチドをコードするDNAの下流に同シグナルペプチドとの融合タンパク質として発現するよう連結されたS. mobaraense由来のプロトランスグルタミナーゼ遺伝子を有する）、およびWO01/23591記載のpPKPTG1（C. glutamicum ATCC13869株由来のCspBのプロモーター領域とシグナルペプチドをコードするDNAを含む）を鋳型として、<配列番号２０>と<配列番号７３>、または<配列番号２０>と<配列番号７４>に示したプライマーを用いて、C. glutamicum ATCC13869由来CspBのプロモーター領域、およびC. ammoniagenes ATCC6872株由来CspAまたはC. glutamicum ATCC13869株由来CspBのシグナルペプチドをコードする領域をPCR法にて増幅し、それぞれ約0.7kbpのDNA断片を得た。更に、増幅させた両DNA断片（hGH遺伝子断片と、CspBプロモーター領域および各シグナルペプチドをコードする領域の断片）を鋳型に、<配列番号２０>と<配列番号７１>に記載のDNAをプライマーとして用いたPCR法により、両DNA断片が融合したそれぞれ約1.2kbpのDNA断片を得た。なお、配列番号<配列番号２０>と<配列番号７１>のプライマーには制限酵素Kpn Iの認識配列がデザインされており、<配列番号７３>、<配列番号７４>の各プライマーは各シグナルペプチドをコードする領域とhGH遺伝子との融合遺伝子を構築するためのhGHのN末端アミノ酸残基をコードする配列がデザインされている。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase（タカラバイオ社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。これらのDNA断片を制限酵素Kpn I処理後に、特開平9-322774に記載のpPK4のKpn I部位に挿入することによって、それぞれpPS-hGH, pPK-hGHを得た。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。なお、全ての塩基配列の決定はBigDye（登録商標）Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社製）と3130 ジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。【０１０８】
(vi)C. glutamicum ATCC13869の細胞表層タンパク質CspBのシグナルペプチドおよび成熟タンパク質N末端アミノ酸残基、ならびにFactor Xaプロテアーゼ認識配列を融合したヒト成長ホルモンhGHの分泌発現プラスミドの構築
前記(iv)で構築したpPKK6Xa-PIns、pPKK17Xa-PIns、pPKK50Xa-PInsのそれぞれを鋳型として、<配列番号２０>と<配列番号７５>、<配列番号２０>と<配列番号７６>、<配列番号２０>と<配列番号７７>のそれぞれに示した各合成DNAをプライマーとして、CspBプロモーター領域、ならびにCspBのN末端のシグナルペプチド30アミノ酸残基、CspB成熟タンパク質のN末端アミノ酸残基（6、17、50残基）、およびFactor Xaプロテアーゼ認識配列（IEGR）をコードする領域をPCR法にて増幅した。一方、前記(v)で構築したプラスミドpPS-hGHを鋳型とし、<配列番号７０>と<配列番号７１>に示した合成DNAをプライマーとして、hGH遺伝子領域をPCR法にて増幅した。更に、増幅させた両DNA断片（CspBプロモーター領域、ならびにCspBシグナルペプチド、成熟CspBのN末端アミノ酸残基、およびIEGRをコードする領域の各断片と、hGH遺伝子断片）を鋳型に、<配列番号２０>と<配列番号７１>に記載のDNAをプライマーとして用いたPCR法により、両DNA断片が融合したDNA断片を得た。なお、<配列番号２０>と<配列番号７１>のプライマーは制限酵素Kpn Iの認識配列がデザインされており、<配列番号７５>、<配列番号７６>、<配列番号７７>の各プライマーはFactor Xaプロテアーゼ認識配列（IEGR）をコードする領域とhGH遺伝子との融合遺伝子を構築するためのhGHのN末端アミノ酸残基をコードする配列がデザインされている。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase（タカラバイオ社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。これらのDNA断片を制限酵素Kpn I処理後に、特開平9-322774に記載のpPK4のKpn I部位に挿入することによって、それぞれpPKK6Xa-hGH, pPKK17Xa-hGH, pPKK50Xa-hGHを得た。【０１０９】
(vii)Teriparatide分泌発現プラスミドpPKK6Xa-Teriの構築
ヒトの副甲状腺ホルモンPTHの成熟体のアミノ酸配列は既に決定されている（Genbank Accession No. AAA60215.1）。このヒトの副甲状腺ホルモンPTHのN末端1-34残基までのペプチドは、骨粗鬆症薬としての生理活性を有するペプチドTeriparatideとして知られている。このTeriparatideのアミノ酸配列とC. glutamicumのコドン使用頻度を考慮して、<配列番号７８>と<配列番号７９>に示したDNAを合成した。このDNAを鋳型とし、別途合成した<配列番号８０>と<配列番号８１>に示したDNAをプライマーとして用いて、<配列番号８２>に記したTeriparatide遺伝子をPCR法によって増幅した。このDNA断片をクローニングベクターpHSG398（タカラバイオ社製）のSma I部位に挿入する事によりpHSG-Teriを得た。このpHSG-Teriを鋳型にして、<配列番号８０>と<配列番号８１>に示したDNAをプライマーとして用いて、Teriparatide遺伝子領域をPCR法によって増幅した。次にWO01-23591記載のpPKSPTG1（C. glutamicum ATCC13869株由来のCspBのプロモーター領域と、C. ammoniagenes ATCC6872株由来のCspA（SlpA）シグナルペプチドをコードするDNAを含む）、およびWO01/23591記載のpPKPTG1（C. glutamicum ATCC13869株由来のCspBのプロモーター領域とシグナルペプチドをコードするDNAを含む）を鋳型として、<配列番号２０>と<配列番号８３>もしくは<配列番号２０>と<配列番号８４>に示したプライマーを用いて、C. glutamicum ATCC13869由来CspBのプロモーター領域、およびC. ammoniagenes ATCC6872株由来CspAまたはC. glutamicum ATCC13869株由来CspBのシグナルペプチドをコードする領域をPCR法にて増幅した。更に、増幅させた両DNA断片（Teriparatide遺伝子断片と、CspBプロモーター領域および各シグナルペプチドをコードする領域の断片）を鋳型に、<配列番号２０>と<配列番号８１>に記載のDNAをプライマーとして用いたPCR法により、両DNA断片が融合したそれぞれ約0.8kbpのDNA断片を得た。なお、<配列番号２０>と<配列番号８１>のプライマーには制限酵素Kpn Iの認識配列がデザインされており、<配列番号８３>と<配列番号８４>の各プライマーは各シグナルペプチドをコードする領域とTeriparatide遺伝子との融合遺伝子を構築するためのTeriparatideのN末端アミノ酸残基をコードする配列がデザインされている。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase（タカラバイオ社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。これらのDNA断片を制限酵素Kpn I処理後に、特開平9-322774に記載のpPK4のKpn I部位に挿入することによって、それぞれpPS-Teri, pPK-Teriを得た。【０１１０】
次に、上記pHSG-Teriを鋳型にして、<配列番号８５>と<配列番号８１>に示したDNAをプライマーとして用いて、Teriparatide遺伝子領域をPCR法によって増幅した。また、前記(vi)で構築したpPKK6Xa-hGHを鋳型として、<配列番号２０>と<配列番号８６>、に示したプライマーを用いて、CspBプロモーター領域、ならびにCspBのN末端のシグナルペプチド30アミノ酸残基、CspB成熟タンパク質のN末端6アミノ酸残基、およびFactor Xaプロテアーゼ認識配列（IEGR）をコードする領域をPCR法にて増幅した。更に、増幅させた両DNA断片（Teriparatide遺伝子断片と、CspBプロモーター領域、ならびにCspBシグナルペプチド、CspB成熟タンパク質のN末端6アミノ酸残基、およびIEGRをコードする領域の断片）を鋳型に、<配列番号２０>と<配列番号８１>に記載のDNAをプライマーとして用いたPCR法により、両DNA断片が融合した約0.8kbpのDNA断片を得た。なお、<配列番号２０>と<配列番号８１>のプライマーには制限酵素Kpn Iの認識配列がデザインされており、<配列番号８５>のプライマーはFactor Xaプロテアーゼ認識配列（IEGR）をコードする領域とTeriparatide遺伝子との融合遺伝子を構築するためのFactor Xaプロテアーゼ認識配列（IEGR）をコードする配列がデザインされている。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase（タカラバイオ社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。これらのDNA断片を制限酵素Kpn I処理後に、特開平9-322774に記載のpPK4のKpn I部位に挿入することによって、pPKK6Xa-Teriを得た。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。なお、全ての塩基配列の決定はBigDyeR Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社製）と3130 ジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。【０１１１】
(viii)Teriparatide分泌発現プラスミドpPKK50TEV-Teriの構築
前記(iii)で構築したプラスミドpPKK50Xa-PInsを鋳型として、<配列番号２０>と<配列番号８７>に示した各合成DNAをプライマーとしてCspBのプロモーター領域を含む5’-上流域とN末端のシグナルペプチド30アミノ酸残基と成熟細胞表層タンパク質のN末端側50残基とproTEVプロテアーゼにより認識されるアミノ酸配列ENLYFQをコードする領域をPCR法にて増幅した。一方、前記(vii)で構築したプラスミドpPKK6Xa-Teriを鋳型とし、<配列番号８８>と<配列番号８９>に示した合成DNAをプライマーとしてTeriparatide遺伝子領域をPCR法にて増幅した。更に、増幅させた各DNA断片（CspBプロモーターとCspBシグナルペプチドならびにCspBのN末端アミノ酸配列50残基とアミノ酸配列ENLYFQをコードする領域の断片と、Teriparatide遺伝子断片）を鋳型に、<配列番号２０>と<配列番号８９>に記載のDNAをプライマーとして用いたPCR法により、各DNA断片が融合したDNA断片を得た。なお、<配列番号２０>と<配列番号８９>のプライマーは制限酵素Kpn Iの認識配列がデザインされており、<配列番号８８>のプライマーはENLYFQをコードする塩基配列とTeriparatideとの融合遺伝子を構築するためのTeriparatideのN末端側のアミノ酸配列をコードする配列がデザインされている。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase（タカラバイオ社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。これらのDNA断片を制限酵素Kpn I処理後に、特開平9-322774記載のpPK4のKpn I部位に挿入することによって、プラスミドpPKK50TEV-Teriを得た。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。なお、塩基配列の決定はBigDye（登録商標） Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社製）と3130ジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。【０１１２】
（２）pPKK50TEV-Teriを用いた融合タンパク質CspB50TEV-Teriparatide（略して50-Teri）の分泌発現
（１）で構築したpPKK50TEV-Teriを用いて、WO01/23591記載のC. glutamicum YDK010株を形質転換した。得られた形質転換株を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地（グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 0.4 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1 g、硫酸鉄七水和物 0.01 g、硫酸マンガン五水和物 0.01 g、チアミン塩酸塩 200 μg、ビオチン 500 μg、DL−メチオニン 0.15 g、炭酸カルシウム 50 g、水で1LにしてpH7.5に調節）で、それぞれ30 ℃で72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を還元SDS-PAGEに供してからCBB R-250（バイオラッド社製）にて染色を行い、目的の融合タンパク質50-Teriのバンドを確認した。
一方、得られた形質転換株を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地（グルコース 120 g、塩化カルシウム2 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 3 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03g、チアミン塩酸塩 450 μg、ビオチン 450 μg、DL−メチオニン 0.15 g、炭酸カルシウム 50 g、水で1LにしてpH6.7に調節）を１Ｌ容量のジャーファーメンターに３００ｍＬ張り込み、アンモニアガスを添加してｐＨ６．７に維持しながら、３０℃で３日間、通気攪拌培養を行なった。【０１１３】
（３）培養液からの菌体除去と、菌体除去済み培養液の保存
培養終了後、培養液をマイクロチューブに移し、遠心機を用いて12000 Gで10分間遠心し、菌体を分離した。得られた遠心上清を、細孔径0.22 μmの除菌フィルターでろ過し、得られたろ液を「菌体除去済み培養液」（「工程（１）で得られた溶液」に相当）とし、-80℃で凍結保存した。【０１１４】
（４）pH変化に伴う融合タンパク質（50-Teri）の沈殿および可溶化
凍結保存した菌体除去済み培養液を25℃で解凍し、遠心機を用いて12000 Gで1分間遠心し、凍結保存中に生成した主に無機塩からなる沈殿を分離した。4本のマイクロチューブのそれぞれに、0、5、10、30 μLの0.5 M 硫酸水溶液と30、25、20、0μLのMilliQ水を添加し均一にした後に、得られた遠心上清100 μLずつを分注し、容量をすべて130μLに調製した。
これらを撹拌後、10分間静置することで、pH7.4、pH6.6、pH3.8、pH1.7の「ｐＨ調節済み培養液」を得た（「工程（２）で得られた溶液」に相当）。pH6.6、pH3.8及びpH1.7の「ｐＨ調節済み培養液」は白濁し、沈殿生成を確認した。これら「ｐＨ調節済み培養液」を、遠心機を用いて12000 Gで5分間遠心し、pH変化により生成した沈殿を分離した（「工程（３）で分離した固体」に相当）。得られた遠心上清をそれぞれ別のマイクロチューブに移し、「ｐＨ調節済み培養液上清」とした（「工程（３）の固体分離後の溶液」に相当）。残った沈殿に、除いた遠心上清と同じ容量の緩衝液（100 mM Tris-HCl, pH8.5）を添加し、撹拌すると、沈殿は速やかに溶解し、「沈殿溶解液」を得た（「工程（４）で得られた溶液」に相当）。沈殿溶解液のpHはいずれも中性付近で、それぞれpH8.3、pH8.3、pH8.1、pH7.8であった。上記、沈殿が発生したｐH範囲と、生じた沈殿が中性付近で可逆的に速やかに再溶解したことを考慮すると、工程（２）において見られた沈殿現象は、一般的に不可逆であるタンパク質の酸変性現象とは全く異なる現象であることがわかった。
上記操作により得られたpH7.4、pH6.6、pH3.8、pH1.7の「ｐＨ調節済み培養液上清」と、「沈殿溶解液」を還元SDS-PAGEに供し、50-Teriのバンドを確認することで、pH変化に伴う50-Teriの沈殿および可溶化を分析評価した。なお、還元SDS-PAGEはAny kDTM ミニプロティアン（登録商標） TGXTM プレキャストゲル（バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社）を用いて行い、SYPRO（登録商標）Ruby（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）で染色することで、融合タンパク質50-Teriのバンドを検出した。続いて、各pHでのバンドの濃さをソフトウェア・Multi Gauge (FUJIFILM社製)を用いて数値化し、以下の計算式により各pHでの50-Teriの回収率を算出した。【０１１５】
回収率（％）＝［工程（４）で得られた溶液における融合タンパク質のバンドの濃さ／｛工程（４）で得られた溶液における融合タンパク質のバンドの濃さ＋工程（３）の固体分離後の溶液における融合タンパク質のバンドの濃さ｝］×１００
なお、後述の実施例及び比較例でも還元SDS-PAGEによって回収率計算を行う場合は、実施例１と同様にして実施した。【０１１６】
算出されたpH7.4、pH6.6、pH3.8、pH1.7の「ｐＨ調節済み培養液」の50-Teri回収率は、それぞれ1%、95%、99%、99%であった。図１−Ａに、算出した回収率と「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨとの関係を示す。この図から、工程（２）において見られた沈殿現象は、タンパク質がその等電点において溶解度が最も小さくなる等電点沈殿現象とは全く異なる現象で有ることがわかった。
図１−Ｂに、「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨと、「ｐＨ調節済み培養液上清」及び対応する「沈殿溶解液」の各電気泳動図における融合タンパク質50-Teriのバンド部分と、回収率を示す。
pH7.4の「ｐＨ調節済み培養液上清」に存在していた50-Teriは、pH6.6、pH3.8及びpH1.7で検出されず、代わりに「沈殿溶解液」で検出された。【０１１７】
〔実施例１−２〕
生理活性ペプチドTeriparatideを有する融合タンパク質50-Teriの製造および目的タンパク質Teriparatideの製造
実施例１−２では、実施例１と同様に、目的タンパク質として生理活性ペプチドであるTeriparatide（３４アミノ酸残基）（Teri）を用い、自己組織化能を有するタンパク質としてＣｓｐＢ成熟タンパク質のＮ末端から５０アミノ酸残基からなる配列（CspB50）を用い、酵素的切断に使用されるアミノ酸配列としてｐｒｏＴＥＶプロテアーゼ認識配列を用い、宿主として、コリネ型細菌であるC. glutamicumを用いた。【０１１８】
（１）Teriparatide分泌発現プラスミドpPKK50TEV-Teriの構築
実施例１の（１）に記載の手順に従い構築した。【０１１９】
（２）pPKK50TEV-Teriを用いた融合タンパク質の分泌発現
実施例１の（２）に記載の手順に従い、pPKK50TEV-Teriで形質転換したC. glutamicum YDK010株を培養した。【０１２０】
（３）培養液からの菌体除去と、菌体除去済み培養液の保存
実施例１の（３）に記載の手順に従い実施した。【０１２１】
（４）pH変化に伴う融合タンパク質50-Teriの沈殿および可溶化
凍結保存した菌体除去済み培養液を25℃で解凍し、遠心機を用いて12000 Gで1分間遠心し、凍結保存中に生成した主に無機塩からなる沈殿を分離した。８本のマイクロチューブのそれぞれに、0μL、5μL、10μL、15μL、20μL、30μL、40μL、50μLの0.5 M 硫酸水溶液と、50μL、45μL、40μL、25μL、30μL、20μL、10μL、0μLのMilliQ水を添加し均一にした後に、得られた遠心上清600μLずつを分注して、容量をすべて650μLに調製した。
これらを撹拌後、10分間静置することで、pH7.9、pH7.6、pH7.3、pH7.1、pH6.6、pH4.9、pH4.1、pH3.7の「ｐＨ調節済み培養液」を得た（「工程（２）で得られた溶液」に相当）。pH7.1、pH6.6、pH4.9、pH4.1、pH3.7の「ｐＨ調節済み培養液」は白濁し、沈殿生成を確認した。これら「ｐＨ調節済み培養液」を、遠心機を用いて12000 Gで5分間遠心し、pH変化により生成した沈殿を分離した（「工程（３）で分離した固体」に相当）。得られた遠心上清をそれぞれ別のマイクロチューブに移し、「ｐＨ調節済み培養液上清」とした（「工程（３）の固体分離後の溶液」に相当）。残った沈殿に、除いた遠心上清と同じ容量の緩衝液（100 mM Tris-HCl, pH8.5）を添加し、撹拌すると、沈殿は速やかに溶解し、「沈殿溶解液」を得た（「工程（４）で得られた溶液」に相当）。「沈殿溶解液」のpHはいずれも中性付近で、それぞれpH8.0、pH8.0、pH8.0、pH8.0、pH8.0、pH7.9、pH7.7、pH7.6であった。
上記操作により得られたpH7.9、pH7.6、pH7.3、pH7.1、pH6.6、pH4.9、pH4.1、pH3.7の「ｐＨ調節済み培養液上清」と「沈殿溶解液」を還元SDS-PAGE及び逆相HPLCに供し、pH変化に伴う50-Teriの沈殿および可溶化を分析評価した。なお、50-Teri回収率の算出は逆相HPLCを用いて以下の計算式により行った。
回収率（％）＝［工程（４）で得られた溶液における融合タンパク質の量／｛工程（４）で得られた溶液における融合タンパク質の量＋工程（３）の固体分離後の溶液における融合タンパク質の量｝］×１００
各融合タンパク質の量は、逆相HPLCにおける該当ピークエリアから定量した。具体的には、既知物質（IGF-1）を用いた検量線作成を行い、各測定サンプルの該当ピークエリアをこの検量線に当てはめることで、融合タンパク質の量を算出した。逆相HPLC条件を以下に示す。
System: ウォーターズアライアンスPDAシステム一式
Column:  YMC-Triart C18 φ4.6 x 100mm, 粒子径5μm, 細孔径12nm
Column temp.: 30 ℃
Mobile phaseA: 10 mM 酢酸アンモニウム水溶液, 10% アセトニトリル水溶液, pH7.0
Mobile phaseB: 10 mM 酢酸アンモニウム水溶液, 80% アセトニトリル水溶液, pH7.0
Flow rate: 1.0 mL/min
Detection: 220 nm
Injection volume: 30 μL
0005673986.tif 000002
【０１２２】
pH7.9、pH7.6、pH7.3、pH7.1、pH6.6、pH4.9、pH4.1、pH3.7の「ｐＨ調節済み培養液」の50-Teri回収率は、それぞれ0%、0%、0%、63%、95%、96%、98%、100%であった。算出した回収率と「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨとの関係図を図１−２Ａに示す。
図１−２Ｂに、各「ｐＨ調節済み培養液」及び対応する「沈殿溶解液」の各電気泳動図と、融合タンパク質50-Teriのバンド部分を抽出した図を示す。
pH7.9、pH7.6、pH7.3、pH7.1の「ｐＨ調節済み培養液上清」に存在していた50-TeriはpH6.6、pH4.9、pH4.1、pH3.7で検出されなかった一方、対応する「沈殿溶解液」で著量検出された。【０１２３】
また、pH4.9の「ｐＨ調節済み培養液上清」と「沈殿溶解液」を逆相HPLC分析に供し、それぞれに含まれる融合タンパク質50-Teri及び不純物等を比較した結果、「ｐＨ調節済み培養液上清」中には培養液由来の不純物（例えば保持時間0分から5分のピーク群）が大量に検出されたのに対して、「沈殿溶解液」中には目的とする融合タンパク質50-Teri以外の不純物ピークがほとんど検出されなかった（図１−２Ｃ）。このことから、本発明の沈殿による融合タンパク質の固液分離が粗精製プロセスとして採用可能であることがわかった。【０１２４】
（５）融合タンパク質50-Teriの酵素的切断及び目的タンパク質Teriparatideの取得
上記（４）において、pH4.9に調節した「ｐＨ調節済み培養液」から得た沈殿物である融合タンパク質50-Teriを２０mＭ Tris HCl緩衝液（pH5.0）で洗浄し、沈殿物に付着した培養液を除去した。次に、沈殿物を６Ｍ尿素＋２０mＭ Tris HCl緩衝液（pH8.0）で溶解し「沈殿溶解液」を調製した。この「沈殿溶解液」に超純水を加えることで10倍希釈したのちにProTEVプロテアーゼ（融合タンパク質中のアミノ酸配列：ENLYFQを認識。プロメガ社。V6102）を添加することで、融合タンパク質を、自己組織化能を有するタンパク質を含むCspB50TEVと目的タンパク質Teriparatideとに酵素的に切断し、酵素切断液を得た。
この酵素切断液を逆相ＨＰＬＣで分析したところ、Teriparatideと思われるピークを検出した（図１−２Ｄ）。
続いて、酵素切断液中に生じた物質がTeriparatideであることを確認するために、「酵素切断液」を逆相HPLCに供し、上記で示した逆相HPLC条件における保持時間１８．６分付近の溶出液を取得することでTeriparatideと思われる物質を精製した。この精製物質をＮ末端アミノ酸配列分析及び質量分析に付し、標品Teriparatide（BACHEM, cat# H-4835）と対比した。
Ｎ末端アミノ酸配列分析は、エドマン分解法を基にしたプロテインシーケンサーPPSQ-10(島津製作所製)を用い、島津製作所推奨の方法（取扱い説明書）にしたがって行った。
質量分析は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法を基にしたＡＸＩＭＡ−ＴＯＦ２（島津製作所製）を用いて、島津製作所推奨の方法（取扱い説明書）にしたがって行った。
Ｎ末端アミノ酸分析結果について、精製物質のＮ末端側１０アミノ酸残基は、標品TeriparatideのＮ末端側１０アミノ酸残基と一致していた。
質量分析の結果について、精製物質を供した測定では4118.9の測定質量（測定誤差は±0.1%）が検出され、標品Teriparatideを供した測定では4118.1の測定質量（測定誤差は±0.1%）が検出された（図１−２Ｅ）。つまり、精製物質と標品Teriparatideの測定質量が一致しており、精製物質が目的タンパク質のTeriparatideであることがわかる。本実施例で得られたTeriparatideの純度を、逆相HPLCを用いて検出したピーク面積を基に、以下の式を用いて算出したところ、９４％であった。
純度 (%)＝(Teriparatideのピーク面積/すべてのピーク面積の合計)x100
なお、逆相HPLCは以下の条件で実施した。
System: ウォーターズアライアンスPDAシステム一式
Column:  YMC-Pack C8 φ4.6 x 100mm, 粒子径5μm, 細孔径30nm
Column temp.: 30 ℃
Mobile phaseA: 10 mM 酢酸アンモニウム水溶液, 10% アセトニトリル水溶液, pH7.0
Mobile phaseB: 10 mM 酢酸アンモニウム水溶液, 80% アセトニトリル水溶液, pH7.0
Flow rate: 1.0 mL/min
Detection: 220 nm
Injection volume: 30 μL
0005673986.tif 000003
これらの結果より、精製物質がTeriparatideであること、及び、融合タンパク質から目的タンパク質を取得できることを確認した。【０１２５】
〔実施例２〕
生理活性ペプチドBivariludin（ビバリルジン）の一部を有する融合タンパク質（CspB50Lys-Bivalirudin18(略して50-Biva18)の製造および目的タンパク質Bivalirudin18（略してBiva18）の製造
実施例２では、目的タンパク質として生理活性ペプチドであるBivariludin（ビバリルジン）の一部（１８アミノ酸残基）（Biva18）を用い、自己組織化能を有するタンパク質としてＣｓｐＢ成熟タンパク質のＮ末端から５０アミノ酸残基からなる配列（CspB50）を用い、宿主として、コリネ型細菌であるC. glutamicumを用いた。【０１２６】
（１）C. glutamicumにおけるBiva18分泌発現プラスミドpPKK50Lys-Biva18の構築
トロンビン阻害活性を持つ抗血液凝固薬として知られている生理活性ペプチドBivariludinは、N末端にD体のフェニルアラニン残基を持つ全長20残基からなるペプチドである。
このN末端のD-フェニルアラニン残基とL-プロリン残基を除いた18残基のペプチド(=Biva18)のアミノ酸配列とC. glutamicumのコドン使用頻度を考慮して、Biva18遺伝子を含む<配列番号９０>を全合成した。
次に、実施例１（１）(iii)に記載のプラスミドpPKK50Xa-PInsを鋳型として、<配列番号２０>と<配列番号９１>に示した各合成DNAをプライマーとしてCspBのプロモーター領域を含む5’-上流域とN末端のシグナルペプチド30アミノ酸残基と成熟細胞表層タンパク質のN末端側50残基とリジン残基をコードする領域をPCR法にて増幅した。更に、増幅させた
DNA断片（CspBプロモーターとCspBシグナルペプチドならびにCspBのN末端アミノ酸配列50残基とリジン残基をコードする領域の断片）と、Biva18遺伝子断片である<配列番号９０>を鋳型に、<配列番号２０>と<配列番号９２>に記載のDNAをプライマーとして用いたPCR法により、各DNA断片が融合したDNA断片を得た。なお、<配列番号２０>と<配列番号９２>のプライマーは制限酵素Kpn Iの認識配列がデザインされており、<配列番号９１>のプライマーはCspBのN末端アミノ酸配列50残基とリジン残基をコードする塩基配列とBiva18との融合遺伝子を構築するためのBiva18のN末端側のアミノ酸配列をコードする配列がデザインされている。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase（タカラバイオ社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。これらのDNA断片を制限酵素Kpn I処理後に、特開平9-322774記載のpPK4のKpn I部位に挿入することによって、プラスミドpPKK50Lys-Biva18を得た。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。なお、塩基配列の決定はBigDye（登録商標） Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社製）と3130ジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。【０１２７】
（２）pPKK50Lys-Biva18を用いた融合タンパク質CspB50Lys-Bivalirudin18（略して50-Biva18）の分泌発現
（１）で構築したpPKK50Lys-Biva18用いて、WO01/23591記載のC. glutamicum YDK010株を形質転換した。得られた形質転換株を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地（グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 0.4 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム1 g、硫酸鉄七水和物 0.01 g、硫酸マンガン五水和物 0.01 g、チアミン塩酸塩 200 μg、ビオチン 500 μg、DL−メチオニン 0.15 g、炭酸カルシウム 50 g、水で1LにしてpH7.5に調節）で、それぞれ30 ℃で72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を還元SDS-PAGEに供してからCBB R-250（バイオラッド社製）にて染色を行い、目的のタンパク質Bivalirudin18のバンドを確認した。
一方、得られた形質転換株を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地（グルコース 120 g、塩化カルシウム2 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 3 g、リン酸二水素カリウム1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03g、チアミン塩酸塩 450 μg、ビオチン 450 μg、DL−メチオニン 0.15 g、炭酸カルシウム 50 g、水で1LにしてpH6.7に調節）をを１Ｌ容量のジャーファーメンターに３００ｍＬ張り込み、アンモニアガスを添加してｐＨ６．７に維持しながら、３０℃で３日間、通気攪拌培養を行なった。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を還元SDS-PAGEに供してからCBB R-250（バイオラッド社製）にて染色を行い、目的のタンパク質バンドを確認した。【０１２８】
（３）培養液からの菌体除去と、菌体除去済み培養液の保存
実施例１と同様に実施した。【０１２９】
（４）pH変化に伴う融合タンパク質50-Biva18の沈殿および可溶化
凍結保存した菌体除去済み培養液を25℃で解凍し、遠心機を用いて12000 Gで1分間遠心し、凍結保存中に生成した主に無機塩からなる沈殿を分離した。4本のマイクロチューブのそれぞれに、0、5、10、30 μLの0.5 M 硫酸水溶液と30、25、20、0μLのMilliQ水を添加し均一にした後に、得られた遠心上清100 μLずつを分注し、容量をすべて130μLに調製した。
これらを撹拌後、10分間静置することで、pH7.8、pH4.7、pH2.9、pH1.6の「ｐＨ調節済み培養液」を得た（「工程（２）で得られた溶液」に相当）。pH2.9、pH1.6の「ｐＨ調節済み培養液」は白濁し、沈殿生成を確認した。これら「ｐＨ調節済み培養液」を、遠心機を用いて12000 Gで5分間遠心し、pH変化により生成した沈殿を分離した（「工程（３）で分離した固体」に相当）。得られた遠心上清をそれぞれ別のマイクロチューブに移し、「ｐＨ調節済み培養液上清」とした（「工程（３）の固体分離後の溶液」に相当）。分離した沈殿に、ｐＨ調節済み培養液上清と同じ容量の緩衝液（100 mM Tris-HCl, pH8.5）を添加し、撹拌すると、沈殿は速やかに溶解し、「沈殿溶解液」を得た（「工程（４）で得られた溶液」に相当）。「沈殿溶解液」のpHはいずれも中性付近で、それぞれpH8.3、pH8.3、pH8.1、pH7.8であった。
上記操作により得られたpH7.8、pH4.7、pH2.9、pH1.6の「ｐＨ調節済み培養液上清」と、「沈殿溶解液」を還元SDS-PAGEに供し、融合タンパク質50-Biva18のバンドを確認することで、pH変化に伴う融合タンパク質50-Biva18の沈殿および可溶化を評価した。
pH7.8、pH4.7、pH2.9、pH1.6の「ｐＨ調節済み培養液」の算出された50-Biva18回収率は、それぞれ3%、5%、65%、63%であった。図２−Ａに、算出した回収率と「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨとの関係を示す。
図２−Ｂに、「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨと、「ｐＨ調節済み培養液上清」及び対応する「沈殿溶解液」の各電気泳動図における融合タンパク質50-Biva18のバンド部分と、回収率を示す。
pH7.8及びpH4.7で「ｐＨ調節済み培養液上清」に存在していた50-Biva18はpH2.9、pH1.6で薄いバンドとなり、代わりに「沈殿溶解液」で濃いバンドとして検出された。【０１３０】
次に、上記と同様の操作により、図２−Ａから求めた回収率１０％を達成するｐＨ（工程（２）で用いることのできるｐＨの上限値）であるｐＨ値：約4.5よりも低いpH3.0の「ｐＨ調節済み培養液」を調製し、遠心分離に付した。得られた「ｐＨ調節済み培養液上清」と「沈殿溶解液」を逆相HPLC分析に供し、それぞれに含まれる融合タンパク質50-Biva18及び不純物等を比較した結果、「ｐＨ調節済み培養液上清」中には培養液由来の不純物（例えば保持時間0分から10分のピーク群）が大量に検出されたのに対して、「沈殿溶解液」中には目的とする融合タンパク質50-Biva18以外の不純物ピークがほとんど検出されなかった（図２−Ｃ）。
なお、逆相HPLCは以下の条件で実施した。
System: ウォーターズアライアンスPDAシステム一式
Column:  YMC-Triart C18 φ4.6 x 100mm, 粒子径5μm, 細孔径12nm
Column temp.: 30 ℃
Mobile phaseA: 10 mM 酢酸アンモニウム水溶液, 10% アセトニトリル水溶液, pH7.0
Mobile phaseB: 10 mM 酢酸アンモニウム水溶液, 80% アセトニトリル水溶液, pH7.0
Flow rate: 1.0 mL/min
Detection: 220 nm
Injection volume: 30 μL
0005673986.tif 000004
【０１３１】
（５）融合タンパク質50-Biva18の酵素的切断及び目的タンパク質Biva18の取得
上記（４）において、pH3.0に調節した「ｐＨ調節済み培養液」から得た沈殿物である融合タンパク質50-Biva18をpH3.0の硫酸溶液で洗浄し、沈殿に付着した培養液を除去した。次に、沈殿物を50 mM 炭酸水素ナトリウム緩衝液(pH8.3)で溶解し「沈殿溶解液」を調製した。この沈殿溶解液に、Trypsin（融合タンパク質中のアミノ酸配列：Lysを認識。SIGMA-ALDRICH社。T-303-10G）を添加することで、「酵素切断液」を得た。この酵素切断液を逆相HPLCに供したところ、酵素添加前に見られた融合タンパク質50-Biva18のピークは検出されず、代わりに新たなピークが検出されたことから、切断反応が良好に進行したことがわかった（図２−Ｄ）。
続いて、酵素切断液中に生じた物質がBiva18であることを確認するために、「酵素切断液」を逆相HPLCに供し、保持時間５分付近の溶出液を取得することでBiva18と思われる物質を精製した。
この精製物質を質量分析に供し、質量を測定した結果、monoisotopic m/z で1935.8の測定質量（測定誤差は±0.1%）が検出された。一方、Biva18のアミノ酸配列から計算されるmonoisotopic m/z理論値は、Biva18の配列をMS-Isotope (http://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msisotope)に入力することで取得した結果、1935.9であり、精製物質で検出された測定質量1935.8（測定誤差は±0.1%）と一致することを確認した（図２−Ｅ）。つまり、精製物質が目的タンパク質のBiva18であることが確認された。
本実施例で得られたBiva18の純度を、逆相HPLCを用いて検出したピーク面積を基に、以下の計算式を用いて算出したところ、９２％であった。
純度(%)＝(Biva18のピーク面積/すべてのピーク面積の合計)x100
なお、逆相HPLCは以下の条件で実施した。
System: ウォーターズアライアンスPDAシステム一式
Column:  YMC-Triart C18 φ4.6 x 100mm, 粒子径5μm, 細孔径12nm
Column temp.: 30 ℃
Mobile phaseA: 10 mM 酢酸アンモニウム水溶液, 10% アセトニトリル水溶液, pH7.0
Mobile phaseB: 10 mM 酢酸アンモニウム水溶液, 80% アセトニトリル水溶液, pH7.0
Flow rate: 1.0 mL/min
Detection: 220 nm
Injection volume: 30 μL
0005673986.tif 000005
これらの結果より、精製物質がBiva18であること、及び、融合タンパク質から目的とするタンパク質を取得できることを確認した。
次に逆相HPLCに代わり、「酵素切断液」を強陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーに供し、Biva18を精製した。
＜クロマトグラフィー条件＞
カラム：強陰イオン交換樹脂(HiTrap Q FF, 1 mL, GE healthcare)
A buffer (binding) 25 mM リン酸Na水溶液, pH7.0
B buffer (elution) 250 mM リン酸Na水溶液, pH7.0
流速：1 mL/min
検出：280 nm
サンプル通液量：0.3 mg-Biva18 (酵素切断液 250 μL + A buffer 750 μLで調製)
グラジエント溶出：linear gradient, 0-100%B over 20 Column Volumes (CV)
強陰イオンクロマトグラフィーの結果、酵素切断液中に含まれるBiva18はすべて樹脂に吸着し、続くグラジエント溶出において、95%B付近の溶出液を取得することでBiva18を精製した(図２−Ｆ)。得られたBiva18の純度を、逆相HPLCを用いて検出したピーク面積を基に、前述の計算式を用いて算出したところ、８３％であった（図２−Ｇ）。【０１３２】
〔実施例３〕
プロインスリンを有する融合タンパク質CspB50TEV-Proinsulin(略して50-PIns)の製造
実施例３では、目的タンパク質として生理活性ペプチドであるインスリンのプロタンパク質であるプロインスリン（８６アミノ酸残基）（PIns）を用い、自己組織化能を有するタンパク質としてＣｓｐＢ成熟タンパク質のＮ末端から５０アミノ酸残基からなる配列（CspB50）を用い、宿主として、コリネ型細菌であるC. glutamicumを用いた。【０１３３】
（１）pPKK50PInsを用いた融合タンパク質50-PInsの分泌発現
実施例１（１）(ii)に記載のプラスミドpPKK50PIns用いて、WO01/23591記載のC. glutamicum YDK010株を形質転換した。得られた各形質転換株を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地（グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 0.4 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム1 g、硫酸鉄七水和物 0.01 g、硫酸マンガン五水和物 0.01 g、チアミン塩酸塩 200 μg、ビオチン 500 μg、DL−メチオニン 0.15 g、炭酸カルシウム 50 g、水で1LにしてpH7.5に調節）で、それぞれ30 ℃で72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を還元SDS-PAGEに供してからCBB R-250（バイオラッド社製）にて染色を行い、目的のタンパク質バンドを確認した。【０１３４】
（２）培養液からの菌体除去と、菌体除去済み培養液の保存
実施例１と同様に実施した。【０１３５】
（３）pH変化に伴う融合タンパク質50-PInsの沈殿および可溶化
凍結保存した菌体除去済み培養液を25℃で解凍し、遠心機を用いて12000 Gで1分間遠心し、凍結保存中に生成した沈殿を分離した。4本のマイクロチューブそれぞれに、0、5、10、30 μLの0.5 M 硫酸水溶液と30、25、20、0μLのMilliQ水を添加し均一にした後に、得られた遠心上清100 μLずつを分注し、容量をすべて130μLに調製した。
これらを撹拌後、10分間静置することで、pH7.8、pH4.8、pH4.0、pH2.0の「ｐＨ調節済み培養液」を得た（「工程（２）で得られた溶液」に相当）。pH4.8、pH4.0、pH2.0の「ｐＨ調節済み培養液」は白濁し、沈殿生成を確認した。これら「ｐＨ調節済み培養液」を、遠心機を用いて12000 Gで5分間遠心し、pH変化により生成した沈殿を分離した（「工程（３）で分離した固体」に相当）。得られた遠心上清をそれぞれ別のマイクロチューブに移し、「ｐＨ調節済み培養液上清」とした（「工程（３）の固体分離後の溶液」に相当）。残った沈殿に、除いた遠心上清と同じ容量の緩衝液（100 mM Tris-HCl, pH8.5）を添加し、撹拌すると、沈殿は速やかに溶解し、「沈殿溶解液」（「工程（４）で得られた溶液」に相当）を得たが、pH2.0で生じた沈殿の一部は不溶であった。「沈殿溶解液」のpHはいずれも中性付近で、それぞれpH8.3、pH8.3、pH8.3、pH8.3であった。
上記操作により得られたpH7.8、pH4.8、pH4.0、pH2.0の「ｐＨ調節済み培養液上清」と、「沈殿溶解液」を還元SDS-PAGEに供し、50-PInsのバンドを確認することで、pH変化に伴う50-PInsの沈殿および可溶化を評価した。
算出されたpH7.8、pH4.8、pH4.0、pH2.0の「ｐＨ調節済み培養液」の50-PIns回収率は、それぞれ1%、54%、58%、60%であった。図３−Ａに、算出した回収率と「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨとの関係を示す。
図３−Ｂに、「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨと、「ｐＨ調節済み培養液上清」及び対応する「沈殿溶解液」の各電気泳動図における融合タンパク質50-PInsのバンド部分と、回収率を示す。
pH7.8で「ｐＨ調節済み培養液上清」に存在していた50-PInsはpH4.8、pH4.0、pH2.0で薄いバンドとなり、代わりに「沈殿溶解液」で濃いバンドとして検出された。【０１３６】
〔比較例１〕
自己組織化能を有するタンパク質を用いない、プロインスリンの製造
比較例１では、目的タンパク質としてプロインスリン（８６アミノ酸残基）（PIns）を用い、宿主として、コリネ型細菌であるC. glutamicumを用いた。しかし、自己組織化能を有するタンパク質は用いなかった。【０１３７】
（１）pPK-PInsを用いたプロインスリンの分泌発現
実施例１（１）(i)に記載のプラスミドpPKPIns用いて、WO01/23591記載のC. glutamicum YDK010株を形質転換した。得られた各形質転換株を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地（グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 0.4 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム1 g、硫酸鉄七水和物 0.01 g、硫酸マンガン五水和物 0.01 g、チアミン塩酸塩 200 μg、ビオチン 500 μg、DL−メチオニン 0.15 g、炭酸カルシウム 50 g、水で1LにしてpH7.5に調節）で、それぞれ30 ℃で72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を還元SDS-PAGEに供してからCBB R-250（バイオラッド社製）にて染色を行い、目的のタンパク質バンドを確認した。【０１３８】
（２）培養液からの菌体除去と、菌体除去済み培養液の保存
実施例１と同様に実施した。【０１３９】
（３）pH変化に伴うプロインスリン（PIns）の沈殿および可溶化
凍結保存した菌体除去済み培養液を25℃で解凍し、遠心機を用いて12000 Gで1分間遠心し、凍結保存中に生成した沈殿を分離した。4本のマイクロチューブのそれぞれに、0、5、10、30 μLの0.5 M 硫酸水溶液と30、25、20、0μLのMilliQ水を添加し均一にした後に、得られた遠心上清100 μLずつを分注し、容量をすべて130μLに調製した。
これらを撹拌後、10分間静置することで、pH7.5、pH4.6、pH4.0、pH2.2の「ｐＨ調節済み培養液」を得た。pH2.2の「ｐＨ調節済み培養液」は白濁し、沈殿生成を確認した。これら「ｐＨ調節済み培養液」を、遠心機を用いて12000 Gで5分間遠心し、pH変化により生成した沈殿を分離した。得られた遠心上清をそれぞれ別のマイクロチューブに移し、「ｐＨ調節済み培養液上清」とした。残った沈殿に、除いた遠心上清と同じ容量の緩衝液（100 mM Tris-HCl, pH8.5）を添加し、撹拌したが、pH2.0で生じた沈殿の一部は不溶であった。得られた「沈殿溶解液」のpHはいずれも中性付近で、それぞれpH8.4、pH8.3、pH8.3、pH8.1であった。
上記操作により得られたpH7.5、pH4.6、pH4.0、pH2.2の「ｐＨ調節済み培養液上清」と、「沈殿溶解液」を還元SDS-PAGEに供し、PInsのバンドを確認することで、pH変化に伴うPInsの沈殿および可溶化を評価した。
pH7.5、pH4.6、pH4.0、pH2.2の「ｐＨ調節済み培養液」のPIns回収率は、それぞれ7%、6%、0%、7%であった。図４−Ａに、算出した回収率と「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨとの関係を示す。
図４−Ｂに、「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨと、「ｐＨ調節済み培養液上清」及び対応する「沈殿溶解液」の各電気泳動図における融合タンパク質PInsのバンド部分と、回収率を示す。
pH7.5で「ｐＨ調節済み培養液上清」に存在していたPInsはpH4.6、pH4.0、pH2.2でも検出され、「沈殿溶解液」では検出されなかった。【０１４０】
〔実施例４〕
プロインスリンを有する融合タンパク質の製造
実施例４では、目的タンパク質としてプロインスリン（８６アミノ酸残基）（PIns）を用い、自己組織化能を有するタンパク質としてＣｓｐＢ成熟タンパク質のＮ末端から２５０アミノ酸残基からなる配列CspB250を用い、宿主として、コリネ型細菌であるC. glutamicumを用いた。【０１４１】
（１）pPKK250PInsを用いた融合タンパク質CspB250TEV-Proinsulin(略して250-PIns)の分泌発現
実施例１（１）(ii)に記載のプラスミドpPKK250PIns用いて、WO01/23591記載のC. glutamicum YDK010株を形質転換した。得られた各形質転換株を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地（グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 0.4 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム1 g、硫酸鉄七水和物 0.01 g、硫酸マンガン五水和物 0.01 g、チアミン塩酸塩 200 μg、ビオチン 500 μg、DL−メチオニン 0.15 g、炭酸カルシウム 50 g、水で1LにしてpH7.5に調節）で、それぞれ30 ℃で72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を還元SDS-PAGEに供してからCBB R-250（バイオラッド社製）にて染色を行い、目的のタンパク質バンドを確認した。【０１４２】
（２）培養液からの菌体除去と、菌体除去済み培養液の保存
実施例１と同様に実施した。【０１４３】
（３）pH変化に伴う融合タンパク質250-PInsの沈殿および可溶化
凍結保存した菌体除去済み培養液を25℃で解凍し、遠心機を用いて12000 Gで1分間遠心し、凍結保存中に生成した沈殿を分離した。4本のマイクロチューブのそれぞれに、0、5、10、30 μLの0.5 M 硫酸水溶液と30、25、20、0μLのMilliQ水を添加し均一にした後に、得られた遠心上清100 μLずつを分注し、容量をすべて130μLに調製した。
これらを撹拌後、10分間静置することで、pH7.8、pH4.4、pH3.0、pH1.7のｐＨ調節済み培養液を得た（「工程（２）で得られた溶液」に相当）。各「ｐＨ調節済み培養液」は白濁せず、目視による沈殿生成は確認できなかった。これら「ｐＨ調節済み培養液」を、遠心機を用いて12000 Gで5分間遠心したところ、pH4.4以下の「ｐＨ調節済み培養液」で沈殿（「工程（３）で分離した固体」に相当）を確認した。これらpH変化により生成した沈殿を遠心分離後、得られた遠心上清をそれぞれ別のマイクロチューブに移し、ｐＨ調節済み培養液上清とした（「工程（３）の固体分離後の溶液」に相当）。残った沈殿に、除いた遠心上清と同じ容量の緩衝液（100 mM Tris-HCl, pH8.5）を添加し、撹拌すると、沈殿は速やかに溶解し、「沈殿溶解液」を得た（「工程（４）で得られた溶液」に相当）。「沈殿溶解液」のpHはいずれも中性付近で、すべてpH8.3であった。
上記操作により得られたpH7.8、pH4.4、pH3.0、pH1.7の「ｐＨ調節済み培養液上清」と、「沈殿溶解液」を還元SDS-PAGEに供し、250-PInsのバンドを確認することで、pH変化に伴う250-PInsの沈殿および可溶化を評価した。
算出されたpH7.8、pH4.4、pH3.0、pH1.7の「ｐＨ調節済み培養液」の250-PIns回収率は、それぞれ7%、66%、70%、74%であった。図５−Ａに、算出した回収率と「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨとの関係を示す。
図５−Ｂに、「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨと、「ｐＨ調節済み培養液の上清」及び対応する「沈殿溶解液」の各電気泳動図における融合タンパク質250-PInsのバンド部分と、回収率を示す。
pH7.8で「ｐＨ調節済み培養液上清」に存在していた250-PInsはpH4.4、pH3.0、pH1.7で薄いバンドとなり、代わりに「沈殿溶解液」で濃いバンドとして検出された。【０１４４】
〔実施例５〕
プロインスリンを有する融合タンパク質の製造
実施例５では、目的タンパク質としてプロインスリン（８６アミノ酸残基）（PIns）を用い、自己組織化能を有するタンパク質としてＣｓｐＢ成熟タンパク質のＮ末端から１７アミノ酸残基からなる配列（CspB17）を用い、宿主として、コリネ型細菌であるC. glutamicumを用いた。【０１４５】
（１）pPKK17PInsを用いた融合タンパク質CspB17TEV-Proinsulin(略して17-PIns)の分泌発現
実施例１（１）(ii)に記載のプラスミドpPKK17PIns用いて、WO01/23591記載のC. glutamicum YDK010株を形質転換した。得られた各形質転換株を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地（グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 0.4 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム1 g、硫酸鉄七水和物 0.01 g、硫酸マンガン五水和物 0.01 g、チアミン塩酸塩 200 μg、ビオチン 500 μg、DL−メチオニン 0.15 g、炭酸カルシウム 50 g、水で1LにしてpH7.5に調節）で、それぞれ30 ℃で72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を還元SDS-PAGEに供してからCBB R-250（バイオラッド社製）にて染色を行い、目的のタンパク質バンドを確認した。【０１４６】
（２）培養液からの菌体除去と、菌体除去済み培養液の保存
実施例１と同様に実施した。【０１４７】
（３）pH変化に伴う融合タンパク質17-PInsの沈殿および可溶化
凍結保存した菌体除去済み培養液を25℃で解凍し、遠心機を用いて12000 Gで1分間遠心し、凍結保存中に生成した沈殿を分離した。4本のマイクロチューブのそれぞれに、0、5、10、30 μLの0.5 M 硫酸水溶液と30、25、20、0μLのMilliQ水を添加し均一にした後に、得られた遠心上清100 μLずつを分注し、容量をすべて130μLに調製した。
これらを撹拌後、10分間静置することで、pH7.8、pH4.6、pH3.7、pH2.0の「ｐＨ調節済み培養液」を得た（「工程（２）で得られた溶液」に相当）。pH2.0の「ｐＨ調節済み培養液」は白濁し、沈殿生成を確認した。これら「ｐＨ調節済み培養液」を、遠心機を用いて12000 Gで5分間遠心し、pH変化により生成した沈殿を分離した（「工程（３）で分離した固体」に相当）。得られた遠心上清をそれぞれ別のマイクロチューブに移し、「ｐＨ調節済み培養液上清」とした（「工程（３）の固体分離後の溶液」に相当）。残った沈殿に、除いた遠心上清と同じ容量の緩衝液（100 mM Tris-HCl, pH8.5）を添加し、撹拌すると、沈殿は速やかに溶解したが、pH2.0で生じた沈殿の一部は不溶であった。得られた「沈殿溶解液」（「工程（４）で得られた溶液」に相当）のpHはいずれも中性付近で、すべてpH8.5であった。
上記操作により得られたpH7.8、pH4.6、pH3.7、pH2.0の「ｐＨ調節済み培養液上清」と、「沈殿溶解液」を還元SDS-PAGEに供し、17-PInsのバンドを確認することで、pH変化に伴う17-PInsの沈殿および可溶化を評価した。
pH7.8、pH4.6、pH3.7、pH2.0の「ｐＨ調節済み培養液」の17-PIns回収率は、それぞれ9%、46%、43%、45%であった。図６−Ａに、算出した回収率と「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨとの関係を示す。
図６−Ｂに、ｐＨ調節済み培養液のｐＨと、「ｐＨ調節済み培養液上清」及び対応する「沈殿溶解液」の各電気泳動図における融合タンパク質17-PInsのバンド部分と、回収率を示す。
pH7.8で「ｐＨ調節済み培養液上清」に存在していた17-PInsは、pH4.6、pH3.7、pH2.0で、「沈殿溶解液」でも濃いバンドとして検出された。【０１４８】
〔実施例６〕
プロインスリンを有する融合タンパク質の製造
実施例６では、目的タンパク質としてプロインスリン（８６アミノ酸残基）（PIns）を用い、自己組織化能を有するタンパク質としてＣｓｐＢ成熟タンパク質のＮ末端から６アミノ酸残基からなる配列（CspB6）を用い、宿主として、コリネ型細菌であるC. glutamicumを用いた。【０１４９】
（１）pPKK6PInsを用いた融合タンパク質CspB6TEV-Proinsulin(略して6-PIns)の分泌発現  実施例１（１）(ii)に記載のプラスミドpPKK6PIns用いて、WO01/23591記載のC. glutamicum YDK010株を形質転換した。得られた各形質転換株を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地（グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 0.4 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム1 g、硫酸鉄七水和物 0.01 g、硫酸マンガン五水和物 0.01 g、チアミン塩酸塩 200 μg、ビオチン 500 μg、DL−メチオニン 0.15 g、炭酸カルシウム 50 g、水で1LにしてpH7.5に調節）で、それぞれ30 ℃で72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清を還元SDS-PAGEに供してからCBB R-250（バイオラッド社製）にて染色を行い、目的のタンパク質バンドを確認した。【０１５０】
（２）培養液からの菌体除去と、菌体除去済み培養液の保存
実施例１と同様に実施した。【０１５１】
（３）pH変化に伴う融合タンパク質6-PInsの沈殿および可溶化
凍結保存した菌体除去済み培養液を25℃で解凍し、遠心機を用いて12000 Gで1分間遠心し、凍結保存中に生成した沈殿を分離した。4本のマイクロチューブのそれぞれに、0、5、10、30 μLの0.5 M 硫酸水溶液と30、25、20、0μLのMilliQ水を添加し均一にした後に、得られた遠心上清100 μLずつを分注し、容量をすべて130μLに調製した。
これらを撹拌後、10分間静置することで、pH7.6、pH4.6、pH3.5、pH1.8の「ｐＨ調節済み培養液」を得た（「工程（２）で得られた溶液」に相当）。pH1.8の「ｐＨ調節済み培養液」は白濁し、沈殿生成を確認した。これら「ｐＨ調節済み培養液」を、遠心機を用いて12000 Gで5分間遠心し、pH変化により生成した沈殿を分離した（「工程（３）で分離した固体」に相当）。得られた遠心上清をそれぞれ別のマイクロチューブに移し、「ｐＨ調節済み培養液上清」とした（「工程（３）の固体分離後の溶液」に相当）。残った沈殿に、除いた遠心上清と同じ容量の緩衝液（100 mM Tris-HCl, pH8.5）を添加し、撹拌すると、沈殿は速やかに溶解したが、pH1.8で生じた沈殿の一部は不溶であった。得られた「沈殿溶解液」（「工程（４）で得られた溶液」に相当）のpHはいずれも中性付近で、すべてpH8.5であった。
上記操作により得られたpH7.6、pH4.6、pH3.5、pH1.8の「ｐＨ調節済み培養液上清」と、「沈殿溶解液」を還元SDS-PAGEに供し、6-PInsのバンドを確認することで、pH変化に伴う6-PInsの沈殿および可溶化を評価した。
算出されたpH7.6、pH4.6、pH3.5、pH1.8の「ｐＨ調節済み培養液」の6-PIns回収率は、それぞれ3%、34%、31%、45%であった。図７−Ａに、算出した回収率と「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨとの関係を示す。
図７−Ｂに、「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨと、「ｐＨ調節済み培養液上清」及び対応する「沈殿溶解液」の各電気泳動図における融合タンパク質6-PInsのバンド部分と、回収率を示す。
pH7.6で「ｐＨ調節済み培養液上清」に存在していた6-PInsは、pH4.6、pH3.5、pH1.8で、「沈殿溶解液」でもバンドとして検出された。【０１５２】
〔実施例７〕
Teriparatideを有する融合タンパク質の製造
実施例７では、実施例１と同様、目的タンパク質として生理活性ペプチドであるTeriparatide（３４アミノ酸残基）（Teri）を用い、自己組織化能を有するタンパク質としてＣｓｐＢ成熟タンパク質のＮ末端から５０アミノ酸残基からなる配列（CspB50）を用い、酵素的切断に使用されるアミノ酸配列としてｐｒｏＴＥＶプロテアーゼ認識配列を用い、宿主として、コリネ型細菌であるC. glutamicumを用いた。
但し、融合タンパク質を含む溶液のｐＨ調節に塩酸を用いた（実施例１では硫酸を使用）。【０１５３】
（１）Teriparatide分泌発現プラスミド（pPKK50TEV-Teri）の構築
実施例1と同様に実施した。【０１５４】
（２）pPKK50TEV-Teriを用いた融合タンパク質の分泌発現
実施例1と同様に実施した。【０１５５】
（３）培養液からの菌体除去と、菌体除去済み培養液の保存
実施例１と同様。【０１５６】
（４）pH変化に伴う融合タンパク質（TerとCspB50との融合タンパク質（50-Teri））の沈殿および可溶化
凍結保存した菌体除去済み培養液を25℃で解凍し、遠心機を用いて12000 Gで1分間遠心し、凍結保存中に生成した沈殿を分離した。4本のマイクロチューブのそれぞれに、0、3.5、5、10 μLの1M 塩酸水溶液と10、6.5、5、0μLのMilliQ水を添加し均一にした後に、得られた遠心上清100 μLずつを分注し、容量をすべて110μLに調製した。
これらを撹拌後、10分間静置することで、pH7.9、pH7.0、pH5.3、pH3.1の「ｐＨ調節済み培養液」を得た（「工程（２）で得られた溶液」に相当）。pH7.0以下の「ｐＨ調節済み培養液」は白濁し、沈殿生成を確認した。これら「ｐＨ調節済み培養液」を、遠心機を用いて12000 Gで5分間遠心し、pH変化により生成した沈殿を分離した（「工程（３）で分離した固体」に相当）。得られた遠心上清をそれぞれ別のマイクロチューブに移し、「ｐＨ調節済み培養液上清」とした（「工程（３）の固体分離後の溶液」に相当）。残った沈殿に、除いた遠心上清と同じ容量の緩衝液（100 mM Tris-HCl, pH8.5）を添加し、撹拌すると、沈殿は速やかに溶解し、「沈殿溶解液」を得た（「工程（４）で得られた溶液」に相当）。「沈殿溶解液」のpHはいずれも中性付近で、それぞれpH8.5、pH8.5、pH8.4、pH8.3であった。
上記操作により得られたpH7.9、pH7.0、pH5.3、pH3.1の「ｐＨ調節済み培養液上清」と、「沈殿溶解液」を還元SDS-PAGEに供し、50-Teriのバンドを確認することで、pH変化に伴う50-Teriの沈殿および可溶化を評価した。
算出されたpH7.9、pH7.0、pH5.3、pH3.1の「ｐＨ調節済み培養液」の50-Teri回収率は、それぞれ2%、80%、100%、99%であった。図８−Ａに、算出した回収率と「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨとの関係を示す。
図８−Ｂに、「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨと、「ｐＨ調節済み培養液の上清」及び対応する「沈殿溶解液」の各電気泳動図における融合タンパク質50-Teriのバンド部分と、回収率を示す。
pH7.9で「ｐＨ調節済み培養液上清」に存在していた50-TeriはpH7.0、pH5.3、pH3.1で検出されず、代わりに「沈殿溶解液」で検出された。【０１５７】
〔実施例８〕
Teriparatideを有する融合タンパク質の製造
実施例８では、実施例１と同様、目的タンパク質として生理活性ペプチドであるTeriparatide（３４アミノ酸残基）（Teri）を用い、自己組織化能を有するタンパク質としてＣｓｐＢ成熟タンパク質のＮ末端から５０アミノ酸残基からなる配列（CspB50）を用い、酵素的切断に使用されるアミノ酸配列としてｐｒｏＴＥＶプロテアーゼ認識配列を用い、宿主として、コリネ型細菌であるC. glutamicumを用いた。
但し、融合タンパク質を含む溶液のｐＨ調節に酢酸を用いた（実施例１では硫酸を使用）。【０１５８】
（１）Teriparatide分泌発現プラスミド（pPKK50TEV-Teri）の構築
実施例1と同様に実施した。【０１５９】
（２）pPKK50TEV-Teriを用いた融合タンパク質CspB50TEV-Teriparatide（略して50-Teri）の分泌発現
実施例1と同様に実施した。【０１６０】
（３）培養液からの菌体除去と、菌体除去済み培養液の保存
実施例１と同様に実施した。【０１６１】
（４）pH変化に伴う融合タンパク質50-Teriの沈殿および可溶化
凍結保存した菌体除去済み培養液を25℃で解凍し、遠心機を用いて12000 Gで1分間遠心し、凍結保存中に生成した沈殿を分離した。4本のマイクロチューブのそれぞれに、0、2、4、10 μLの10%酢酸水溶液と10、8、6、0μLのMilliQ水を添加し均一にした後に、得られた遠心上清100 μLずつを分注し、容量をすべて110μLに調製した。
これらを撹拌後、10分間静置することで、pH7.9、pH6.8、pH5.0、pH4.3の「ｐＨ調節済み培養液」を得た（「工程（２）で得られた溶液」に相当）。pH6.8以下の「ｐＨ調節済み培養液」は白濁し、沈殿生成を確認した。これら「ｐＨ調節済み培養液」を、遠心機を用いて12000 Gで5分間遠心し、pH変化により生成した沈殿を分離した（「工程（３）で分離した固体」に相当）。得られた遠心上清をそれぞれ別のマイクロチューブに移し、「ｐＨ調節済み培養液上清」とした（「工程（３）の固体分離後の溶液」に相当）。残った沈殿に、除いた遠心上清と同じ容量の緩衝液（100 mM Tris-HCl, pH8.5）を添加し、撹拌すると、沈殿は速やかに溶解し、「沈殿溶解液」を得た（「工程（４）で得られた溶液」に相当）。「沈殿溶解液」のpHはいずれも中性付近で、それぞれpH8.5、pH8.3、pH8.1、pH7.9であった。
上記操作により得られたpH7.9、pH6.8、pH5.0、pH4.3の「ｐＨ調節済み培養液上清」と、「沈殿溶解液」を還元SDS-PAGEに供し、50-Teriのバンドを確認することで、pH変化に伴う50-Teriの沈殿および可溶化を評価した。
pH7.9、pH6.8、pH5.0、pH4.3の「ｐＨ調節済み培養液」の回収率は、それぞれ2%、95%、99%、98%であった。図９−Ａに、算出した回収率と「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨとの関係を示す。
図９−Ｂに、「ｐＨ調節済み培養液」のｐＨと、「ｐＨ調節済み培養液上清」及び対応する「沈殿溶解液」の各電気泳動図における融合タンパク質50-Teriのバンド部分と、回収率を示す。
pH7.9で「ｐＨ調節済み培養液上清」に存在していた50-TeriはpH6.8、pH5.0、pH4.3で検出されず、代わりに「沈殿溶解液」で検出された。【０１６２】
〔実施例９〕
Teriparatideを有する融合タンパク質の製造
実施例９では、実施例１及び実施例１−２と同様、目的タンパク質として生理活性ペプチドであるTeriparatide（３４アミノ酸残基）（Teri）を用い、自己組織化能を有するタンパク質としてＣｓｐＢ成熟タンパク質のＮ末端から５０アミノ酸残基からなる配列（CspB50）を用い、酵素的切断に使用されるアミノ酸配列としてｐｒｏＴＥＶプロテアーゼ認識配列を用い、宿主として、コリネ型細菌であるC. glutamicumを用いた。【０１６３】
（１）Teriparatide分泌発現プラスミド（pPKK50TEV-Teri）の構築
実施例1と同様に実施した。【０１６４】
（２）pPKK50TEV-Teriを用いた融合タンパク質CspB50TEV-Teriparatide（略して50-Teri）の分泌発現
実施例1と同様に実施した。【０１６５】
（３）培養液からの菌体除去と、菌体除去済み培養液の保存
実施例１と同様に実施した。【０１６６】
（４）pH変化に伴う融合タンパク質50-Teriの沈殿および可溶化と純度向上評価
凍結保存した菌体除去済み培養液を25℃で解凍し、遠心機を用いて12000 Gで1分間遠心し、凍結保存中に生成した沈殿を分離した。マイクロチューブに50 μLの0.5M 硫酸水溶液と得られた遠心上清600 μLを添加した。
これを撹拌後、10分間静置することで、pH3.7の「ｐＨ調節済み培養液」を得た（「工程（２）で得られた溶液」に相当）。このpH3.7という値は、実施例１及び実施例１−２の結果に基づき「回収率を１０％以上にするｐＨ」として採用したものである。この「ｐＨ調節済み培養液」を、遠心機を用いて12000 Gで5分間遠心し、pH変化により生成した沈殿を分離した（「工程（３）で分離した固体」に相当）。得られた遠心上清を別のマイクロチューブに移し、「ｐＨ調節済み培養液上清」とした（「工程（３）の固体分離後の溶液」に相当）。残った沈殿に、除いた遠心上清と同じ容量の緩衝液（100 mM Tris-HCl, pH8.5）を添加し、撹拌すると、沈殿は速やかに溶解し、「沈殿溶解液」を得た（「工程（４）で得られた溶液」に相当）。「沈殿溶解液」のpHは中性付近で、pH7.4であった。このpH7.4という値は、実施例１及び実施例１−２の結果に基づき「工程（２）で得られた溶液のｐＨよりも０．１以上高く、かつ、１２以下のｐＨ」として採用したものである。
菌体除去済み培養液（操作前）と、上記操作により得られた「沈殿溶解液」とを逆相HPLCに供して50-Teri及びその他のピーク面積を求め、下記計算式を用いて純度を算出し対比することにより、上記操作に伴う50-Teriの純度向上を評価した。
純度 (%)=(50-Teriのピーク面積/すべてのピーク面積の合計)x100
なお、逆相HPLCは以下の条件で実施した。
System: ウォーターズアライアンスPDAシステム一式
Column:  YMC-Pack C8 φ4.6 x 100mm, 粒子径5μm, 細孔径30nm
Column temp.: 30 ℃
Mobile phaseA: 10 mM 酢酸アンモニウム, 10% アセトニトリル, pH7.0 (pH無調整)
Mobile phaseB: 10 mM 酢酸アンモニウム, 80% アセトニトリル, pH7.0 (pH無調整)
Flow rate: 1.0 mL/min
Detection: 280 nm, 220 nm
Injection volume: 30 μL
0005673986.tif 000006
各溶液の逆相HPLCの分析結果を図１０−Ａ及び１０−Ｂに示す。図１０−Ａは、280 nmの波長で検出したピークを示し、図１０−Ｂは、220 nmの波長で検出したピークを示す。
280 nmの波長で検出した場合、菌体除去済み培養液における50-Teriの純度が11%であるのに対し、沈殿溶解液における50-Teriの純度は46%へと向上した（図１０−Ａ）。同様に、220 nmの波長で検出した場合、菌体除去済み培養液における50-Teriの純度が46%であるのに対し、沈殿溶解液における50-Teriの純度は73%へと向上した（図１０−Ｂ）。
このことから、本発明に従う上記操作が、50-Teriを回収できるだけでなく純度も向上させることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１６７】
本発明は、目的タンパク質を製造する方法に使用できる。【０１６８】
〔配列表フリーテキスト〕
配列番号１：C.glutamicum ATCC13869のcspB遺伝子の塩基配列
配列番号２：C.glutamicum ATCC13869のCspBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３：C.glutamicum ATCC13869のCspB成熟タンパク質のアミノ酸配列
配列番号４：C. glutamicum由来PS1のシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号５：C. glutamicum由来PS2（CspB）のシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号６：C. ammoniagenes由来SlpA（CspA）のシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号７：Factor Xaプロテアーゼの認識配列
配列番号８：ProTEVプロテアーゼの認識配列
配列番号９〜１６：プロインスリン全合成用ＤＮＡの塩基配列
配列番号１７、１８：プライマー
配列番号１９：プロインスリン遺伝子の塩基配列
配列番号２０〜５５：プライマー
配列番号５６〜６９：ヒト成長ホルモンhGH全合成用ＤＮＡの塩基配列
配列番号７０、７１：プライマー
配列番号７２：hGH遺伝子の塩基配列
配列番号７３〜７７：プライマー
配列番号７８、７９：Teriparatide合成用ＤＮＡの塩基配列
配列番号８０、８１：プライマー
配列番号８２：Teriparatide遺伝子の塩基配列
配列番号８３〜８６：プライマー
配列番号８７〜８９：プライマー
配列番号９０：Biva18合成用ＤＮＡの塩基配列
配列番号９１、９２：プライマー
配列番号９３：Biva18のアミノ酸配列
【要約】
本発明は、目的タンパク質を、融合タンパク質として高い回収率で製造する方法を提供する。本発明は、自己組織化能を有するタンパク質と目的タンパク質との融合タンパク質の製造方法であって、下記（１）〜（４）の工程：
（１）融合タンパク質を含む溶液を調製する工程、
（２）工程（１）で得られた溶液のｐＨを、下記計算式：
回収率（％）＝［工程（４）で得られた溶液における融合タンパク質の量／｛工程（４）で得られた溶液における融合タンパク質の量＋工程（３）の固体分離後の溶液における融合タンパク質の量｝］×１００
で計算される回収率を１０％以上にするｐＨへと調節する工程、
（３）工程（２）で得られた溶液から固体を分離する工程、及び、
（４）工程（３）で分離した固体を、工程（２）で得られた溶液のｐＨよりも０．１以上高く、かつ、１２以下のｐＨを有する溶液中に溶解させる工程
を含む、融合タンパク質の製造方法である。【図１−Ａ】
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【図１−２Ａ】
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【図１−２Ｄ】
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【図１−２Ｅ】
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【図２−Ａ】
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【図２−Ｃ】
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【図２−Ｄ】
0005673986.tif 000013
【図２−Ｅ】
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【図２−Ｆ】
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【図２−Ｇ】
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【図３−Ａ】
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【図４−Ａ】
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【図５−Ａ】
0005673986.tif 000019
【図６−Ａ】
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【図７−Ａ】
0005673986.tif 000021
【図８−Ａ】
0005673986.tif 000022
【図９−Ａ】
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【図１０−Ａ】
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【図１０−Ｂ】
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【図１−Ｂ】
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【図１−２Ｂ】
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【図１−２Ｃ】
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【図２−Ｂ】
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【図３−Ｂ】
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【図４−Ｂ】
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【図５−Ｂ】
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【図６−Ｂ】
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【図７−Ｂ】
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【図８−Ｂ】
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【図９−Ｂ】
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【配列表】
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