(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞付着能力および細胞増殖能力を改善するために生物学的実験器具の表面の生物活性を改善する方法であって、
減圧室の中でガスクラスターイオンビームを形成する工程と、
生物学的実験器具用品である物体を減圧室の中に導入する工程と、
前記ガスクラスターイオンビームを前記物体の表面の少なくとも第一の部分に照射することによって細胞付着能力および細胞増殖能力を改善する工程と、
を備えており、
前記ガスクラスターイオンビームを、約３０ｋＶの加速電圧を使用して加速されたアルゴンの約５×１０１４イオン／ｃｍ２と同等の照射量で照射することを特徴とする生物学的実験器具の表面の生物活性を改善する方法。
【請求項２】
前記物体の表面の少なくとも第二の部分がガスクラスターイオンビームによって照射されないことを特徴とする請求項１に記載の生物学的実験器具の表面の生物活性を改善する方法。
【請求項３】
細胞を物体に付着させる方法であって、
物体の表面の少なくとも一部分を選択する工程と、
減圧室の中でガスクラスターイオンビームを形成する工程と、
前記減圧室の中に前記物体を導入する工程と、
前記ガスクラスターイオンビームを前記表面の前記少なくとも一部分に照射することによって細胞付着能力および細胞増殖能力を改善する工程と、
前記減圧室から前記物体を取り出す工程と、
前記表面の前記少なくとも一部分を生きている細胞に暴露する工程と、
を備えており、
前記ガスクラスターイオンビームを、約３０ｋＶの加速電圧を使用して加速されたアルゴンの約５×１０１４イオン／ｃｍ２と同等の照射量で照射することを特徴とする細胞を物体に付着させる方法。
【請求項４】
前記暴露する工程は、前記表面の前記少なくとも一部分で細胞成長を開始させるため必要な期間に亘って実行されることを特徴とする請求項３に記載の細胞を物体に付着させる方法。
【請求項５】
前記表面の前記少なくとも一部分を照射する工程の前に、前記表面の前記少なくとも一部分を洗浄する工程を更に備えていることを特徴とする請求項３に記載の細胞を物体に付着させる方法。
【請求項６】
前記表面の前記少なくとも一部分は、
金属と、酸化物と、金属合金と、プラスチックと、重合体と、共重合体と、固体樹脂と、ゴムと、ガラスと、石英と、セラミックと、サファイアと、ガラス状材料と、チタンと、チタニアと、チタン合金と、アルミナと、ジルコニウムと、ジルコニウム合金と、ジルコニアと、コバルト−クロム合金と、コバルト−クロム−モリブデン合金と、タンタルと、タンタル合金と、生物学的材料と、重合体織物と、共重合体織物と、シリコンと、骨と、コラーゲンと、絹と、天然繊維と、
からなる群より選択された材料を含むことを特徴とする請求項３に記載の細胞を物体に付着させる方法。
【請求項７】
前記物体は、医療用人工器官、外科的インプラント、外科的移植片、医療用人工器官の構成要素、外科的インプラントの構成要素、外科的移植片の構成要素、又は、哺乳類の身体への移植を対象とする別の物体であることを特徴とする請求項３に記載の細胞を物体に付着させる方法。
【請求項８】
前記外科的移植片は、織物、編み物、又は、不織布を含むことを特徴とする請求項７に記載の細胞を物体に付着させる方法。
【請求項９】
前記物体の表面は、非晶質材料を含むことを特徴とする請求項３に記載の細胞を物体に付着させる方法。
【請求項１０】
前記物体の表面は、結晶質材料を含むことを特徴とする請求項３に記載の細胞を物体に付着させる方法。
【請求項１１】
前記物体は、生物学的実験器具用品であることを特徴とする請求項３に記載の細胞を物体に付着させる方法。
【請求項１２】
前記物体は、環境試験装置であることを特徴とする請求項３に記載の細胞を物体に付着させる方法。
【請求項１３】
細胞が付着した物品であって、
細胞を付着させるために対象物の表面の少なくとも一部分を選択する工程と、
減圧室の中でガスクラスターイオンビームを形成する工程と、
前記減圧室の中に前記物品を導入する工程と、
前記ガスクラスターイオンビームを前記表面の前記少なくとも一部分に照射することによって細胞付着能力および細胞増殖能力を改善する工程と、
前記減圧室から前記対象物を取り出す工程と、
前記表面の前記少なくとも一部分を生きている細胞に暴露する工程と、
を備えている方法によって作られており、
前記表面の前記少なくとも一部分に照射する前記ガスクラスターイオンビームを、約３０ｋＶの加速電圧を使用して加速されたアルゴンの約５×１０１４イオン／ｃｍ２と同等の照射量で照射することを特徴とする方法によって作られた細胞が付着した物品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連技術の相互参照
本願は、２００９年４月１４日付けで出願され、名称が「表面の生物活性特性を改善する方法とこの方法によって改善された表面をもつ物体（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ａ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  Ｏｂｊｅｃｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｔｈｅｒｅｂｙ）」である米国仮出願第６１／１６８，９７１号と、２００９年６月１８日付けで出願され、名称が「表面の生物活性特性を改善する方法とこの方法によって改善された表面をもつ物体（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ａ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  Ｏｂｊｅｃｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｔｈｅｒｅｂｙ）である米国仮出願第６１／２１８，１７０号と、２００９年８月３１日付けで出願され、名称が「表面の生物活性特性を改善する方法とこの方法によって改善された表面をもつ物体（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ａ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  Ｏｂｊｅｃｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｔｈｅｒｅｂｙ）」である米国仮出願第６１／２３８，４６２号と、２００９年３月１１日付けで出願され、名称が「ガスクラスターイオンビームの適用によって生物学的材料の表面の湿潤性と他の生物的適合特性を改善する方法とこの方法によって製造された生物学的材料（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｗｅｔｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｂｉｏｃｏｍｐａｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ａ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇａｓ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉｏｎ  Ｂｅａｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｍａｄｅ  Ｔｈｅｒｅｂｙ）」である米国仮出願第６１／１５９，１１３号との優先権を主張し、これらの出願のすべては、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、物体の表面の生物活性特性を改善する方法と、生物活性が改善された表面の少なくとも一部分を有している物体の製造とに関する。より具体的には、本発明は、ガスクラスターイオンビーム技術の使用によって表面の生物活性を増加させることにより表面を改善する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
特定の物体（対象物）は、多くの場合、生きている生体細胞の成長、付着、及び、増殖を呼び込み、そして、受け入れる能力が増大した表面を有していることが望ましい。このことは、例えば、組織培養皿と、フラスコ及び回転フラスコと、ウェル及びチャンバースライドと、プレートと、ペトリ皿などを含むある一定の生物学的実験器具の場合に概ね該当する。このことは、埋設物（インプラント）として意図された医療用物体と、空中汚染物質又は水質汚染物質を試験するため使用される環境試験装置の場合にも概ね該当する。
【０００４】
本明細書中で使用されるように、表面、物体、又は、物体の一部分に関連して使用される用語「生物活性」は、生きている細胞を表面、物体、若しくは、物体の一部分に呼び込むか、表面、物体、若しくは、物体の一部分での細胞及び／又は組織活性を改善するか、生きている細胞を表面、物体、若しくは、物体の一部分に付着するか、表面、物体、若しくは、物体の一部分での生きている細胞の成長を促進するか、又は、表面、物体、若しくは、物体の一部分での生きている細胞の増殖を促進する表面、物体、若しくは、物体の一部分の適合性を意味することが意図されている。本明細書中で使用されるように、用語「チタニア」は、セラミック形式を含むすべての形式のチタンの酸化物と、（限定されることなく、ＴｉＯ２、及び／又は、不完全な化学量論をもつＴｉＯ２を含む）元素チタンを含む天然酸化物又はその他の酸化物の表面コーティングと共にチタン金属自体（又は、チタン金属の合金）とを含むことが意図されている。移植可能な医療器具は、多くの場合に、（天然酸化物、もしくは、意図的に酸化された表面のいずれかであり、又は、別のものでもよい）チタニア表面を典型的に有しているチタン金属（又は合金）から製造される。
【０００５】
生物学的実験器具は、細胞培養、組織培養、外殖培養、組織工学の用途（例えば）で用いられることがあり、一般に、ガラス、石英、プラスチック、及び、重合体のような概ね不活性及び／又は生体適合性材料と、ある一定の金属及びセラミックとから形成される。多くの場合、生物活性を向上させるためこのような生物学的実験器具の表面の一部分を改質できることが望ましい。
【０００６】
例えば、医療用人工器官又は外科的インプラント若しくは移植片のような（ヒトを含む）哺乳類の身体又は身体組織への移植用の医療用物体は、限定されることなく、様々な金属、金属合金、（織機で織られた織物、編み物、及び、不織重合体／共重合体の織物を含む）プラスチック若しくは重合体若しくは共重合体材料、固体樹脂材料、ガラス及びガラス状材料、骨及びコラーゲンのような生物学的材料、絹及びその他の天然繊維、この用途に適当であり、そして、適切に生体適合性をもつことがある（限定されることなく、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸共重合体）、及び、ポリ（Ｌ−ラクチド）を含む）その他の材料、のいずれかを含む種々の材料から製造されることがある。実施例として、ある一定のステンレス鋼合金と、（可能性のある天然酸化物コーティングを含む）チタン及びチタン合金と、コバルト−クロム合金と、コバルト−クロム−モリブデン合金と、タンタルと、タンタル合金と、ジルコニウムと、（可能性のある天然酸化物コーティングを含む）ジルコニウム合金と、ポリエチレン及びその他の不活性プラスチックと、チタンセラミック、アルミナセラミック、及び、ジルコニアセラミックとを含む様々なセラミックと、のうちのいずれかが用いられる。重合体／共重合体織物は、例えば、（ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴＥ）を含む）ポリエステル、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、アラミド、ポリアミド、又は、その他の適当な繊維から形成されることがある。移植用の医療用物体は、例えば、限定されることなく、血管ステントと、血管用及びその他の移植片と、歯科用インプラントと、人工的な関節人工器官及び天然由来の関節人工器官と、冠状動脈ペースメーカーと、移植（埋設）可能なレンズと、その他と、これらの構成要素とを含む。多くの場合、このような器具は、意図された目的のための理想より低い細胞付着特性及び細胞増殖特性をもつ天然表面状態を有することがある。このような場合、多くの場合、物体の表面を移植用途のためにより適したものとするため、細胞付着を向上させるために物体の表面の少なくとも一部分を改質できることが望ましい。
【０００７】
環境試験装置は、多くの場合、例えば、金属、プラスチック及び重合体、ガラス及び石英等のような材料を含む。
【０００８】
ガスクラスターイオンビーム（ＧＣＩＢ）照射は、ナノスケールの表面改質のために使用されている。同時係属中であり、本出願人により維持される米国特許出願第１２／２１０，０１８号、名称「ガスクラスターイオンビーム技術の適用によって医療器具の表面の湿潤特性とを改善する方法とこの方法によって製造された医療器具（Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｗｅｔｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ａ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｅｖｉｃｅ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇａｓ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｉｏｎ  Ｂｅａｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｍａｄｅ  Ｔｈｅｒｅｂｙ）」には、ＧＣＩＢ照射が非生物学的材料表面の親水性特性を改質することが示されている。線維芽細胞及び骨芽細胞のような付着依存性細胞を含むが、これらに限定されることがない細胞は、十分に付着、成長、又は、分化するために親水性表面を好むこと、そして、これらの細胞は、生理学的ｐＨにおける被帯電表面を同様に好むことが、一般に知られている。サンドブラスト法、酸エッチング法と、サンドブラスト−酸エッチング法（ＳＬＡ）と、被膜（コーティング）のプラズマ溶射と、ＣＯ２レーザー平滑化と、機械的洗浄技術、超音波洗浄技術、プラズマ洗浄技術、及び、化学的洗浄技術を含む種々の形式の洗浄法とのような多くの方法が非生物学的表面上の親水性を増加させるか、又は、電荷を変化させるために用いられている。その他のアプローチは、界面活性剤の添加、又は、異なる湿潤性特性を有している薄膜（フィルム）若しくは被膜の塗布を含んでいる。ＵＶ処理と、ＵＶ及びオゾン処理と、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）の共有結合付着と、抗ＣＤ３４抗体、及び、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸ペプチド（ＲＧＤペプチド）のようなタンパク質生成物の塗布のような様々な方法が表面の細胞付着特性を向上させるため用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許公開第２００９００７２８３４号公報（米国特許出願第１２／２１０，０１８号）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明の目的は、表面の少なくとも一部分が生物活性を改善させるためＧＣＩＢ加工によって改質された表面及び物体を提供することである。
【００１１】
本発明の更なる目的は、ＧＣＩＢ技術を用いることにより生物活性を改善させるため表面の少なくとも一部分が改質された表面又は物体を形成する方法を提供することである。
【００１２】
本発明の更に別の目的は、医療移植の前に、ＧＣＩＢ加工によって表面の少なくとも一部分が改質され、細胞がインビトロ付着（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ付着、人工的に作られた環境の中で付着）された医療移植のための物体を提供することである。
【００１３】
本発明の更なる目的は、医療移植の前に、ＧＣＩＢ技術によって、及び細胞のインビトロ付着によって、表面の少なくとも一部分が改質された医療移植のための物体を形成する方法を提供することである。
【００１４】
本発明の上記目的と、更なる目的及びその他の目的と、利点とは、以下に説明される発明によって実現される。
【００１５】
組織工学における基本的な課題のうちの１つは、異なる系統からの細胞が人体において見られる仕方で成長し、相互作用することを可能にする能力である。表面のＧＣＩＢ照射は、細胞付着及び増殖を著しく改善し、同時に細胞分化を維持する。上皮細胞、内皮細胞、間葉細胞、又は、神経細胞から由来する組織及び器官の中の創傷修復は、これらの細胞がＧＣＩＢ照射によって表面改質された不活性又は生物活性材料上で成長させられたとき、恩恵を受けることができる。下にある骨と歯科用インプラントとの間の統合、靱帯と付着骨との間の細胞浸潤及び統合、皮膚若しくは毛髪移植片統合の増強、又は、シナプスを再び起こすための神経再生のいずれを達成することが目標であろうと、ＧＣＩＢ照射の使用は、組織工学及び創傷修復の進行において有用なプロセスである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、細胞付着を目的として、細胞の成長、付着、及び／又は、増殖を容易に実現するために生物活性特性が改善された表面領域を物体に形成するためのＧＣＩＢ加工の使用を対象とする。本発明は、更に、医療移植／外科的移植の前に、医療用物体のＧＣＩＢ加工された表面領域に細胞をインビトロ付着することを対象とする。付着させられた細胞は、医療移植／外科的移植が予定されている個体の身体に由来することがあり、又は、その他の適合する供給源に由来することがある。
【００１７】
細胞付着が意図された物体の表面のある一定の選択された部分が生物活性特性を改善していることが意図されているとき、及び、物体の表面のその他の部分が細胞付着処理に関連しないことが意図されているとき、ＧＣＩＢ加工は、選択された部分だけの生物活性特性を増加させるために、ＧＣＩＢ加工を物体の表面の選択された部分だけに制限することにより、選択された部分に制限されることがある。ＧＣＩＢの照射の広がりを選択された部分だけに制限するために、ＧＣＩＢ断面積を制御し、ＧＣＩＢの走査及び／又は偏向を制御することは、選択された領域へのＧＣＩＢ加工の制限を達成することがある。代替的に、従来の遮蔽技術（マスキング技術）は、ＧＣＩＢ加工が望ましくない表面部分を覆い、ＧＣＩＢ加工が必要とされる選択された表面部分を暴露するため使用されることがある。その後、遮蔽物（マスク）と、遮蔽物を通して暴露された表面部分とは、ＧＣＩＢの拡散、又は、走査型ＧＣＩＢを用いて照射される。ＧＣＩＢ照射を表面の選択された領域又は物体の表面の選択された領域に限定する様々なその他の方法は、当業者に周知であり、本発明に包含されることが意図されている。
【００１８】
高エネルギー従来型のイオン、電気的に加速された帯電原子、又は、分子のビームは、半導体装置接合を形成し、スパッタリングによって表面を改質させ、そして、薄膜の特性を改質させるために広範に利用される。従来型のイオンと異なって、ガスクラスターイオンは、標準的な温度及び圧力の条件下でガス状である材料（一般に、酸素、窒素、又は、例えば、アルゴンのような不活性ガスであるが、どのような凝縮性ガスでもガスクラスターイオンを生成するため使用できる）の多数の（典型的な分布が数百個乃至数千個であり、平均値が数千個である）弱結合原子又は分子のクラスターから形成され、各クラスターは、１つ以上の電荷を共有し、高い総エネルギーをもつために（約３ｋＶ乃至約７０ｋＶ以上のような）高電圧を通じて一緒に加速される。ガスクラスターイオンが形成され、加速された後、ガスクラスターイオンの電荷状態は、変更されてもよく、又は、変更状態にされてもよく（中和状態にされてもよく）、そして、ガスクラスターイオンは、より小さいクラスターイオン、及び／又は、中和されたより小さいクラスターに断片化されることがあるが、高電圧によって加速されることによって比較的高い総エネルギーを維持する傾向がある。緩く結合されるので、ガスクラスターイオンは、表面との衝突時に崩壊し、加速されたガスクラスターイオンの総エネルギーは、構成原子の間で共有される。このエネルギー共有のため、クラスターの中の原子は、従来型のイオンの場合より、（崩壊後に）個別に遙かに低エネルギーであり、その結果、加速されたガスクラスターイオンが高エネルギーであるにもかかわらず、原子は、遙かに浅い深さまでしか侵入しない。本明細書中で使用されるように、用語「ＧＣＩＢ」、「ガスクラスターイオンビーム」及び「ガスクラスターイオン」は、全部又は一部が加速後に改質された（中和状態を含む）電荷状態を有している加速されたビーム及びイオンを包含することが意図される。用語「ＧＣＩＢ」及び「ガスクラスターイオンビーム」は、クラスター化されていない粒子を更に含むことがたとえあるとしても、加速されたガスクラスターを含むすべてのビームを包含することが意図される。
【００１９】
ガスクラスターイオンの内部の個々の原子のエネルギーは、非常に小さく、典型的に、数ｅＶ乃至数十ｅＶであるので、原子は、多くても衝突中にターゲット表面の数層の原子層にしか侵入しない。この衝突原子の浅い侵入（典型的には、ビーム加速に依存して、数ナノメートル乃至約１０ナノメートル）は、クラスターイオン全体によって運ばれるエネルギーのすべてが１マイクロ秒未満の期間中に非常に浅い表面層において極端に小さい体積の中で必然的に分散されることを意味する。このことは、材料への侵入が時には数百ナノメートルであって、材料の表面の下の深くにおいて変化及び材料改質を生じる従来のイオンビームとは異なる。ガスクラスターイオンの高い総エネルギーと、極端に小さい相互作用体積とのため、衝突場所での付着エネルギー密度は、従来のイオンによる衝撃の場合より遙かに大きい。従って、表面のＧＣＩＢ加工は、表面の特性を向上させ、後に続く細胞成長、付着及び増殖のための適合性の改善をもたらす改質を生じることができる。
【００２０】
特定の理論に拘束されたくないが、本発明の方法によるＧＣＩＢ照射によって加工された表面で観察された生物活性の増加は、ＧＣＩＢで照射された表面の構造の物理的な変形によって生じることがある。
【００２１】
ガスクラスターイオンビームは、内容全体が参照によって本明細書中に組み込まれた、例えば、Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ外らによる米国特許出願公開第２００９／００７４３８４Ａ１号において教示されるような既知の技術によって加工対象物（workpiece, ワークピース）を照射する目的のため生成され、運ばれる。基本的な工程は、ガスクラスターがガスの膨張中に形成される噴出（ジェット）を形成するため、高圧ガスを減圧室に注入する工程と、噴出の中の大部分のクラスター化されていないガスからガスクラスターを分離する工程と、ガスクラスターイオンを形成するため、ガスクラスターをイオン化する工程と、ＧＣＩＢ照射による加工のため減圧環境の中で、ガスクラスターイオンのビームを形成し、加速し、加工対象物の上へ向ける工程とを含む。加工対象物は、当業者に知られている技術によって、減圧室を排気する前に、又は、大気−真空ロードロックを介して、減圧室の中へ導入されることがある。照射用のＧＣＩＢの経路の中で物体を保持し、物体の多数の部分の照射を可能にさせるため物体を操作する様々な型のホルダが技術的に知られている。
【００２２】
本発明によるＧＣＩＢで表面が改善された物体は、（例えば、限定のためではなく）細胞培養、組織培養、外殖片培養、組織工学、又は、その他の細胞付着若しくは成長用途）を対象とする生物学的実験器具で用いられることがあるか、哺乳類若しくはその他の生物学的実体の身体若しくは身体組織の中若しくは上に医療的／外科的に移植されるか、又は、環境試験用途などのため用いられることがある。場合によっては、物体は、例えば、医療的／外科的移植における適用の前に、ＧＣＩＢ加工された表面への細胞のインビトロ付着を実施するため更に加工されることがある。
【００２３】
本発明は、移植可能な物体の表面の生物活性を改善する方法を提供する。この方法は、減圧室の中でガスクラスターイオンビームを形成する工程と、減圧室の中に物体を導入する工程と、ガスクラスターイオンビームを上記物体の表面の少なくとも第一の部分に照射する工程とを含む。この方法における物体は、医療用人工器官、外科的インプラント、外科的移植片、医療用人工器官の構成要素、外科的インプラントの構成要素、外科的移植片の構成要素、又は、移植を対象とする別の物体である。
【００２４】
本発明は、生物学的実験器具の表面の生物活性を改善する方法を更に提供する。この方法は、減圧室の中でガスクラスターイオンビームを形成する工程と、減圧室の中に物体を導入する工程と、ガスクラスターイオンビームを物体の表面の少なくとも第一の部分に照射する工程とを含む。この方法の物体は、生物学的実験器具用品である。
【００２５】
本発明は、細胞を物体に付着させる方法を更に提供する。この方法は、物体の表面の少なくとも一部分を選択する工程と、減圧室の中でガスクラスターイオンビームを形成する工程と、上記減圧室の中に上記物体を導入する工程と、上記ガスクラスターイオンビームを上記表面の上記少なくとも一部分に照射する工程と、上記減圧室から上記物体を取り出す工程と、上記表面の上記少なくとも一部分を生きている細胞に暴露する工程とを含む。
【００２６】
本発明は、医療移植用の物体を調製する方法を更に提供する。この方法は、物体の表面の少なくとも一部分を選択する工程と、減圧室の中でガスクラスターイオンビームを形成する工程と、減圧室の中に物体を導入する工程と、少なくとも一部分の生物活性を増加させるためにガスクラスターイオンビームを選択された少なくとも一部分に照射する工程とを含む。この方法の物体は、医療用インプラント（医療移植片）である。
【００２７】
本発明は、細胞を付着するため物体の表面の少なくとも一部分を選択する工程と、減圧室の中でガスクラスターイオンビームを形成する工程と、上記減圧室の中に上記物品を導入する工程と、ガスクラスターイオンビームを上記表面の上記少なくとも一部分に照射する工程と、上記減圧室から上記物体を取り出す工程と、上記表面の上記少なくとも一部分を生きている細胞に暴露する工程とを含む方法によって作られた細胞が付着された物品を更に提供する。
【００２８】
医療移植片の表面の少なくとも一部分を選択する工程と、減圧室の中でガスクラスターイオンビームを形成する工程と、上記減圧室の中に上記インプラントを導入する工程と、上記表面の上記少なくとも一部分の生物活性を増加させるためにガスクラスターイオンビームを上記表面の上記少なくとも一部分に照射する工程とを含む方法によって作られた医療移植片の物品を更に提供する。
【００２９】
本発明のその他の目的及び更なる目的と共に、本発明をより良く理解するため、添付図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、細胞付着及び増殖のレートを比較するグラフ１００である。
【図２】図２は、表面への細胞の付着を示す未処理チタン箔の表面の一部分の走査型電子顕微鏡写真２００である。
【図３】図３は、表面への細胞の付着／増殖の改善を示す本発明の実施形態によるＧＣＩＢ照射によって加工されたチタン箔の表面の一部分の走査型電子顕微鏡写真３００である。
【図４ａ】図４ａは、本発明の実施形態によるＧＣＩＢ照射後の表面上での細胞の付着／増殖の改善を示す、対照と被ＧＣＩＢ照射との両方に関するガラス基板の表面の一部分の光学顕微鏡写真である。
【図４ｂ】図４ｂは、本発明の実施形態によるＧＣＩＢ照射後の表面上での細胞の付着／増殖の改善を示す、対照と被ＧＣＩＢ照射との両方に関するガラス基板の表面の一部分の光学顕微鏡写真である。
【図４ｃ】図４ｃは、本発明の実施形態によるＧＣＩＢ照射後の表面上での細胞の付着／増殖の改善を示す、対照と被ＧＣＩＢ照射との両方に関するガラス基板の表面の一部分の光学顕微鏡写真である。
【図４ｄ】図４ｄは、本発明の実施形態によるＧＣＩＢ照射後の表面上での細胞の付着／増殖の改善を示す、対照と被ＧＣＩＢ照射との両方に関するガラス基板の表面の一部分の光学顕微鏡写真である。
【図４ｅ】図４ｅは、本発明の実施形態によるＧＣＩＢ照射後の表面上での細胞の付着／増殖の改善を示す、対照と被ＧＣＩＢ照射との両方に関するガラス基板の表面の一部分の光学顕微鏡写真である。
【図４ｆ】図４ｆは、本発明の実施形態によるＧＣＩＢ照射後の表面上での細胞の付着／増殖の改善を示す、対照と被ＧＣＩＢ照射との両方に関するガラス基板の表面の一部分の光学顕微鏡写真である。
【図５ａ】図５ａは、本発明の実施形態によるＧＣＩＢ照射を受けた表面上での細胞の付着／増殖の改善を示す、対照と被ＧＣＩＢ照射と処理済みの市販細胞培養とを含むポリスチレン基板の表面の一部分の光学顕微鏡写真である。
【図５ｂ】図５ｂは、本発明の実施形態によるＧＣＩＢ照射を受けた表面上での細胞の付着／増殖の改善を示す、対照と被ＧＣＩＢ照射と処理済みの市販細胞培養とを含むポリスチレン基板の表面の一部分の光学顕微鏡写真である。
【図５ｃ】図５ｃは、本発明の実施形態によるＧＣＩＢ照射を受けた表面上での細胞の付着／増殖の改善を示す、対照と被ＧＣＩＢ照射と処理済みの市販細胞培養とを含むポリスチレン基板の表面の一部分の光学顕微鏡写真である。
【図５ｄ】図５ｄは、本発明の実施形態によるＧＣＩＢ照射を受けた表面上での細胞の付着／増殖の改善を示す、対照と被ＧＣＩＢ照射と処理済みの市販細胞培養とを含むポリスチレン基板の表面の一部分の光学顕微鏡写真である。
【図５ｅ】図５ｅは、本発明の実施形態によるＧＣＩＢ照射を受けた表面上での細胞の付着／増殖の改善を示す、対照と被ＧＣＩＢ照射と処理済みの市販細胞培養とを含むポリスチレン基板の表面の一部分の光学顕微鏡写真である。
【図５ｆ】図５ｆは、本発明の実施形態によるＧＣＩＢ照射を受けた表面上での細胞の付着／増殖の改善を示す、対照と被ＧＣＩＢ照射と処理済みの市販細胞培養とを含むポリスチレン基板の表面の一部分の光学顕微鏡写真である。
【図５ｇ】図５ｇは、本発明の実施形態によるＧＣＩＢ照射を受けた表面上での細胞の付着／増殖の改善を示す、対照と被ＧＣＩＢ照射と処理済みの市販細胞培養とを含むポリスチレン基板の表面の一部分の光学顕微鏡写真である。
【図５ｈ】図５ｈは、本発明の実施形態によるＧＣＩＢ照射を受けた表面上での細胞の付着／増殖の改善を示す、対照と被ＧＣＩＢ照射と処理済みの市販細胞培養とを含むポリスチレン基板の表面の一部分の光学顕微鏡写真である。
【図５ｉ】図５ｉは、本発明の実施形態によるＧＣＩＢ照射を受けた表面上での細胞の付着／増殖の改善を示す、対照と被ＧＣＩＢ照射と処理済みの市販細胞培養とを含むポリスチレン基板の表面の一部分の光学顕微鏡写真である。
【図６ａ】図６ａは、照射されていない遮蔽された部分とＧＣＩＢが照射された部分との隣り合わせの比較を示し、そして、ＧＣＩＢが照射された部分上の細胞の付着／増殖の改善を示す基板の一部分がＧＣＩＢ照射中に遮蔽されたポリスチレン基板の表面の一部分の光学顕微鏡写真である。
【図６ｂ】図６ｂは、照射されていない遮蔽された部分とＧＣＩＢ照射がされた部分との隣り合わせの比較を示し、そして、ＧＣＩＢが照射された部分上の細胞の付着／増殖の改善を示す基板の一部分がＧＣＩＢ照射中に遮蔽されたポリスチレン基板の表面の一部分の光学顕微鏡写真である。
【図７ａ】図７ａは、イオンビーム照射されていない対照部分を示すＰＴＦＥ基板の表面の部分の電子顕微鏡写真である。
【図７ｂ】図７ｂは、対照部分と比較して細胞付着及び／又は増殖の著しい改善を明らかにするＧＣＩＢが照射された部分を示すＰＴＦＥ基板の表面の部分の電子顕微鏡写真である。
【図８】図８は、表面の一部分がＧＣＩＢ照射中に遮蔽され、照射されていない遮蔽された部分とＧＣＩＢが照射された部分との隣り合わせの比較を示し、そして、ＧＣＩＢが照射された部分と照射されていない部分との両方に高度の細胞の付着／増殖を示す非晶質石英基板の表面の部分の光学顕微鏡写真である。
【図９】図９は、表面の一部分がＧＣＩＢ照射中に遮蔽され、照射されていない遮蔽された部分とＧＣＩＢが照射された部分との隣り合わせの比較を示し、そして、ＧＣＩＢが照射された部分に高度の細胞の付着／増殖を示す結晶質サファイア基板の表面の部分の光学顕微鏡写真である。
【図１０】図１０は、織物表面の一部分がＧＣＩＢ照射中に遮蔽され、照射されていない遮蔽された部分とＧＣＩＢが照射された部分との隣り合わせの比較を示し、そして、ＧＣＩＢが照射された部分への細胞の優先的な付着を示すＰＥＴＥ織物表面の部分の走査型電子顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
好適な方法と例示的な実施形態の詳細な説明
生物活性を向上させるために本発明のＧＣＩＢ加工方法の利益を享受することができる広範囲かつ多種多様の材料表面を示すためいくつかの例示的な実施形態が開示される。これらの実施例は、本発明の用途が広く、かつ、１個乃至数個の材料に限定されることはなく、広範囲の材料表面のため幅広く利用できることを例示するため選択された。
【００３２】
チタンの例示的な実施形態
チタン表面改善は、第一の例示的実施形態に開示される。チタンは、哺乳類への移植を目的とする医療用物体で用いられることがよくある材料である。厚さ０．０１ｍｍのチタン箔標本は、最初に７０％イソプロパノールで２時間に亘って洗浄され、そして、次に、生物学的安全キャビネットの中で、一晩空気乾燥された。洗浄されたチタン箔サンプルは、通常の大気条件に暴露されたどのチタンとも同様に、不完全であること、及び、欠陥を含むことがある非常に薄い天然のチタニア表面コーティングを有することがあり得ることが理解される。箔標本は、その後、３０ｋＶ加速電圧を使用して加速されたアルゴンＧＣＩＢを用いて照射量５×１０１４イオン／ｃｍ２までＧＣＩＢ照射されるか、又は、対照として照射されないままにされた。チタン箔（被照射標本及び対照標本の両方）は、その後、０．９ｃｍ×０．９ｃｍの正方形に切断され、２４ウェルＭｕｌｔｉｗｅｌｌＴＭポリスチレンプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ  ３５１１４７）の個々のウェル（８個の対照正方形及び８個のＧＣＩＢ被放射正方形）の底部に置かれた。骨に由来するヒト胎児骨芽細胞（ｈＦＯＢ  １．１９、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１３７２）は、継代培養され、約３５００個の細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び０．３ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８抗生物質（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎとしても知られている）が追加された（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）ダルベッコ改変イーグル培地栄養混合物Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）１ｍｌ中で各チタン箔正方形の頂部に載置され、３７℃、ＣＯ２濃度５％の空気中で加湿培養器の中で培養された。培養１日後及び５日後に、培地標本が取り出され、細胞は、製造元の指示に従って使用されたプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社が提供するＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙを使用してアッセイされ、波長４９０ｎｍでＤｙｎｅｘ  ＯｐｓｙｓＭＲプレートリーダを使用して測定が行われた。アッセイ溶液は、その後、ウェルから取り出され、チタン箔及び細胞は、その後、−２０℃冷凍メタノールを少なくとも３０分間、ウェルの中のチタン箔正方形に置くことにより固定された。固定に続いて、チタン箔正方形は、その後、空気乾燥され、チタン箔正方形に付着する骨芽細胞は、日立（Ｈｉｔａｃｈｉ）  ＴＭ１０００走査型電子顕微鏡を使用して撮像された。結果は、培養１日後に箔に付着した骨芽細胞が対照箔上で６９４．５細胞±１６４．８細胞であり、ＧＣＩＢが照射された箔上で、２０８２．３細胞±６０９．２細胞まで増加したことを示した（Ｐ＜０．００３）。骨芽細胞は増殖し、培養５日後、ＧＣＩＢが照射された箔上の３８９８．０細胞±９４０．９細胞と比べて、対照群上では１５９８．７細胞±７２８．４細胞であった。
【００３３】
図１は、ｈＦＯＢ１．１９ヒト胎児骨芽細胞が対照チタン箔と比べてＧＣＩＢが照射されたチタン箔に高められたレートで付着し増殖することを示すグラフ１００である。
【００３４】
図２は、培養５日後の対照チタン箔の走査型電子顕微鏡写真２００である。図３は、培養５日後のＧＣＩＢが照射されたチタン箔の走査型電子顕微鏡写真３００である。図２及び図３は、両方共に同じ倍率及び表面積の等しい画像で示される。図２及び図３の比較は、ＧＣＩＢ被放射チタン箔（図３）の骨芽細胞付着の程度が増加したことと、より多くの骨芽細胞が広がり、骨芽細胞及び線維芽細胞のような付着依存性細胞の間では細胞増殖を開始する際に重要な因子であることが知られている細胞間接触を行うように見えることとを示す。哺乳類の身体への医療用／外科的移植のための物体を形成する際に用いられる材料（例えば、チタン）のＧＣＩＢ照射は、表面が細胞付着及び増殖をより多く招くようにさせるため表面の改質を生じる。
【００３５】
物体の表面が細胞付着及び増殖をより多く招くようにさせることにより哺乳類の身体若しくは身体組織の中、又は、身体上への移植を対象とする医療用物体の統合を改善するためこの効果を利用することは、１）統合を増強させるために望ましい移植用の物体を特定する工程と、２）物体の全表面がこのような増強を必要とするか、又は、この増強を（例えば、骨に付着する部分が改善された付着から恩恵を受け、ボール又は寛骨臼カップが細胞付着の増加から恩恵を受けない人工股関節のような）物体の表面の一部分だけに制限することが好ましいかどうかを判定する工程と、３）統合が増強されることが望ましい医療用物体の表面の部分だけにＧＣＩＢ照射する工程と、最終的に、この物体（統合を増強するために改質された）を哺乳類の身体の中へ医療用／外科的移植する工程とを含む。当然ながら、医療用物体の表面のすべての部分が統合の増強から恩恵を受ける場合、表面のすべての部分は、好ましくは、ＧＣＩＢ照射される。
【００３６】
場合によっては、照射する工程の後、かつ、移植する工程の前に、統合は、医療用物体の表面上で細胞を成長させ、そして、（インビトロで）付着する工程を組み入れることにより更に増強されることがある。この統合は、医療用物体が移植されることが意図された特有の個体からの細胞の分離と、培養と、インビトロ付着とを含むことがあり、又は、（哺乳類の中の同じ種又は別の種のいずれかからの）別の個体、幹細胞、若しくは、その他の多能性細胞から取得された細胞を使用することを含むことがある。
【００３７】
照射する工程は、場合によっては、ＧＣＩＢ加工を物体の選択された部分に制限する遮蔽物、有向ビーム、又は、その他の方法の使用を含むことがある。
【００３８】
従来技術では、微小粗面化されたチタン表面は、骨芽細胞付着に優先的であることが明らかにされた。ＳＬＡチタンは、骨インプラントのため広く用いられる材料である。ＳＬＡ処理は、親水性を改善すると共に、表面を微小粗面化する。ＧＣＩＢ照射あり及びＧＣＩＢ照射なしの両方を含んでいるＳＬＡチタン標本と対照（平滑機械加工された）チタン標本とが比較された。
【００３９】
平滑機械加工された表面及びＳＬＡ表面の両方を含み、アルゴンＧＣＩＢ照射あり及びなしの両方を含むチタン標本（１ｃｍ×１ｃｍ×０．６ｍｍ）が比較された。平滑機械加工された表面及びＳＬＡ表面は、原子間力顕微鏡測定技術によって粗さに関して特徴付けられた。１平方マイクロメートルの面積に亘って評価された、２種類の表面の平均粗さ（Ｒａ）値が表１に示される。
【００４０】
【表１】
0005701783.tif 000002
【００４１】
平滑機械加工された表面及びＳＬＡ表面は、加速電圧３０ｋＶにおいて照射量５×１０１４アルゴンクラスター／ｃｍ２でＧＣＩＢ照射されるか、又は、対照として照射されないままにされるかのいずれかであった。チタン片（条件毎に９標本ずつ、全部で３６個の標本）が２４個のウェル皿の中の個別のウェルに置かれ、約２５００個の初代ヒト骨芽細胞が１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンが追加された（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）ダルベッコ改変イーグル培地栄養混合物（ＤＭＥＭ）１ｍｌ中で各チタン標本に載置され、３７℃、ＣＯ２濃度５％の空気中において加湿培養器の中で培養された。培養３日後、７日後、及び、１０日後に、条件毎の３個の標本が培地から取り出され、細胞は、製造元の指示に従って使用されたＰｒｏｍｅｇａが提供するＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙを使用してアッセイされ、標本への細胞付着を評価するため、波長４９０ｎｍでＤｙｎｅｘ  ＯｐｓｙｓＭＲプレートリーダを使用して測定が行われた。結果が表２に示される。
【００４２】
【表２】
0005701783.tif 000003
【００４３】
表２に示された結果は、照射されていない平滑機械加工されたチタン表面と、照射されていないＳＬＡチタン表面との間で、細胞増殖に殆ど差異がないことを明らかにする。これに反して、両方（平滑機械加工された表面及びＳＬＡ表面）の場合に、増殖は、ＧＣＩＢ被放射表面上で実質的に高められる。更に、増殖の改善は、ＳＬＡ（Ｒａ＝２０．０８ｎｍ）表面と比べて、平滑加工（Ｒａ＝８．３８ｎｍ）表面上で著しく大きい。ＳＬＡプロセスにより提供される微小粗さは、従来での細胞付着及び増殖のための好ましい表面条件と見なされているとしても、ＧＣＩＢ照射は低い粗さ値（Ｒａ＜１０ｎｍ）であっても優れた結果を提供することが明白である。
【００４４】
ガラスの例示的な実施形態
ガラス表面の改善は、第二の例示的実施形態に開示される。ガラスは、生物学的実験器具で用いられることがよくある材料である。ガラスと、ガラス状又はガラスのような材料は、哺乳類への移植を対象とする医療用物体を製造する際にも用いられる。ガラスカバースリップの形をした薄いガラス基板（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｇｌａｓｓ  ２８６５−２５）は、最初に、７０％イソプロパノール中で２時間洗浄され、次に、空気乾燥された。ガラス標本は、次に、加速電圧３０ｋＶを使用して加速されたアルゴンＧＣＩＢを使用して、照射量５×１０１４イオン／ｃｍ２までＧＣＩＢ照射されるか、又は、対照として照射されないままにされた。ガラスカバースリップ（被照射標本及び対照標本の両方）は、次に、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンが追加されたダルベッコ改変イーグル培地栄養混合物（ＤＭＥＭ）中、１ｃｍ２当たり４０，０００細胞の初期密度において初代ヒト骨芽細胞でシードされ、そして、３７℃、ＣＯ２濃度５％の空気中において加湿培養器の中で培養された。ガラスカバースリップは、細胞付着を観測するため、最初の４時間に亘り１時間毎に観察され、撮像された（光学顕微鏡）。４時間後、栄養混合物及び非付着細胞は、次に、取り出され、新しい、追加された栄養混合物で置き換えられ、そして、培養が継続された。追加的な顕微鏡画像がシード後の２４時間目及び４８時間目に撮影された。
【００４５】
図４ａ、４ｃ、及び４ｅは、細胞をシードした後、４時間、２４時間、及び４８時間の（それぞれの）間隔で撮影された対照ガラスカバースリップの光学顕微鏡写真である。図４ｂ、４ｄ、及び４ｆは、細胞を植えた（シードした）後、４時間、２４時間、及び４８時間の（それぞれの）間隔で同様に撮影されたＧＣＩＢが照射されたガラスカバースリップの光学顕微鏡写真である。各時点で対照をＧＣＩＢが照射された表面と比較することにより、照射されていない対照と比べて、ヒト胎児骨芽細胞がＧＣＩＢが照射されたガラスカバースリップ表面上でより多く付着し、より良く増殖することが明らかである。
【００４６】
重合体の例示的な実施形態
第一の重合体の表面改善は、第三の例示的実施形態に開示される。重合体材料は、生物学的実験器具で用いられることがよくある材料であり、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレンなどである。重合体材料は、哺乳類への移植を対象とする医療用物体を製造する際にも用いられる。ペトリ皿の形をしたポリスチレン基板（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ  ０８−７５７−１２）は、３０ｋＶ加速電圧を使用して加速されたアルゴンＧＣＩＢを用いて照射量５×１０１４イオン／ｃｍ２までＧＣＩＢ照射されるか、又は、対照として照射されないままにされた。付加的に、細胞培養皿の形をしたポリスチレン基板（ＢＤ  Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅｓ  ３５３００３）が比較のため代替的なポリスチレン表面として用いられた。細胞培養皿は、細胞成長を高めることを対象とする特殊加工された表面が商業的に供給される。３つのポリスチレン標本（被照射ペトリ皿標本及び対照ペトリ皿標本と、照射されていない代替的な細胞培養皿と）は、次に、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンが追加されたダルベッコ改変イーグル培地栄養混合物（ＤＭＥＭ）中、１ｃｍ２当たり２，５００細胞の初期密度において初代ヒト骨芽細胞がシードされ、そして、３７℃、ＣＯ２濃度５％の空気中において加湿培養器の中で培養された。３個のポリスチレン標本は、細胞付着を観測するため、最初の４時間に亘り１時間毎に観察され、撮像された（光学顕微鏡）。４時間後、栄養混合物及び非付着細胞は、次に、取り出され、新しい、追加された栄養混合物で置き換えられ、そして、培養が継続された。追加的な顕微鏡画像が植え付け（シード）後の２４時間目及び４８時間目に撮影された。
【００４７】
図５ａ、５ｄ、及び５ｇは、細胞をシードした後、４時間、２４時間、及び４８時間の（それぞれの）間隔で撮影された対照ポリスチレンペトリ皿の表面の光学顕微鏡写真である。図５ｂ、５ｅ、及び５ｈは、細胞をシードした後、４時間、２４時間、及び４８時間の（それぞれの）間隔で同様に撮影されたＧＣＩＢが照射されたポリスチレンペトリ皿の光学顕微鏡写真である。図５ｃ、５ｆ、及び５ｉは、細胞をシードした後、４時間、２４時間、及び４８時間の（それぞれの）間隔で同様に撮影されたＧＣＩＢが照射されたポリスチレン細胞培養皿の光学顕微鏡写真である。各時点で、ペトリ皿対照群を、ＧＣＩＢが照射されたペトリ皿表面及び照射されていない細胞培養皿の表面と比較することにより、照射されていないペトリ皿対照群又は照射されていない細胞培養皿表面と比べて、ヒト胎児骨芽細胞はＧＣＩＢが照射されたガラスカバースリップ表面上でより多く付着し、より良く増殖することが明らかである。
【００４８】
更に、ペトリ皿の形をしたポリスチレン基板（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ  ０８−７５７−１２）が部分的に遮蔽され、次に、３０ｋＶ加速電圧を使用して加速されたアルゴンＧＣＩＢを用いて照射量５×１０１４イオン／ｃｍ２までＧＣＩＢが照射された。用いられた遮蔽物は、ポリスチレン表面に近接した非接触シャドーマスクであった。遮蔽されていない部分は、全部のＧＣＩＢ照射量を受け、一方、遮蔽された部分は、ＧＣＩＢ照射を受けなかったので、対照表面としての役割を果たす。ペトリ皿は、次に、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンが追加されたダルベッコ改変イーグル培地栄養混合物（ＤＭＥＭ）中、１ｃｍ２当たり２，５００細胞の初期密度において初代ヒト骨芽細胞でシードされ、そして、３７℃、ＣＯ２濃度５％の空気中において加湿培養器の中で培養された。ポリスチレンペトリ皿は、細胞付着を観測するため、最初の４時間に亘り１時間毎に観察された（ＧＣＩＢが照射された領域と照射されていない領域との間の境界面にある光学顕微鏡）。４時間後、栄養混合物及び非付着細胞は、次に、取り出され、新しい、追加された栄養混合物で置き換えられ、そして、培養が継続された。顕微鏡画像がシード後の２４時間目及び４８時間目に撮影された。
【００４９】
図６ａ及び６ｂは、細胞をシードした後、２４時間及び４８時間の（それぞれの）間隔で撮影され、遮蔽された照射されていない領域及び遮蔽されていないＧＣＩＢが照射された領域との間の境界面で観察された、部分的に遮蔽されたポリスチレンペトリ皿の光学顕微鏡写真である。ＧＣＩＢが照射された領域は、図６ａ及び６ｂのそれぞれの左側にあり、照射されていない対照領域は、図６ａ及び６ｂのそれぞれの右側にある。両方の時点で照射されていない領域とＧＣＩＢが照射された領域とを比較することにより、照射されていない（遮蔽された）部分と比べて、ヒト胎児骨芽細胞がポリスチレン表面のＧＣＩＢが照射された部分により多く付着し、より良く増殖することが明らかである。
【００５０】
第二の重合体の表面改善は、第四の例示的実施形態に開示される。細長い片（長さ３０ｍｍ×幅１０ｍｍ×厚さ１．５ｍｍ）の形をしたポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）基板は、半分が遮蔽され、そして、３０ｋＶ加速電圧を使用して加速されたアルゴンＧＣＩＢを用いて照射量５×１０１４イオン／ｃｍ２までＧＣＩＢ照射されるか、又は、対照として、照射されないままにされた。用いられた遮蔽物は、ＰＴＦＥ表面に近接した非接触シャドーマスクである。遮蔽されていない表面部分は、全部のＧＣＩＢ照射量を受け、一方、遮蔽された表面部分は、ＧＣＩＢ照射を受けなかったので、対照表面としての役割を果たす。初代ブタ線維芽細胞が新鮮な前靱帯から採取された。全体（被照射部分及び対照部分）のＰＴＦＥ表面は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンが追加されたダルベッコ改変イーグル培地栄養混合物（ＤＭＥＭ）中、初代ブタ線維芽細胞は１ｃｍ２当たり５０００細胞の初期密度でシードされ、付着するまで２４時間放置され、そして、３７℃において加湿培養器の中で培養された。２４時間後、培地が取り出され、細胞は、１倍のリン酸緩衝生理食塩水で手短く洗い流され、−２０℃で１時間に亘って予め冷却されたメタノール中に固定された。ＧＣＩＢが照射された部分でのＰＴＦＥの表面、及び、ＧＣＩＢが照射されていない対照部分での表面は、それぞれ、Ｈｉｔａｃｈｉ  ＴＭ−１０００  走査型電子顕微鏡を使用して撮像された。結果は、ＰＴＦＥ表面のＧＣＩＢが照射された部分とＧＣＩＢ照射されていない部分との間に細胞付着の明らかな差異があることを示した。
【００５１】
図７ａは、細胞をシードした後の２４時間目に撮影されたＰＴＦＥ基板のＧＣＩＢ照射されていない対照表面の走査型電子顕微鏡写真である。図７ｂは、同様に、細胞をシードされた後の２４時間目に撮影されたＰＴＦＥ基板のＧＣＩＢが照射された表面の走査型電子顕微鏡写真である（両方共に固定後）。
【００５２】
図７ａは、細胞がＰＴＦＥ表面のＧＣＩＢ照射されていない対照部分の１％未満にしか付着しなかったことを示す。
【００５３】
図７ｂは、細胞がＰＴＦＥ表面のＧＣＩＢが照射された部分のほぼ１００％に付着したことを示す。
【００５４】
この表面への細胞付着に影響を与える能力は、細胞成長が限定されたエリアだけで望まれる多くの用途で極めて役に立つことがある。実施例には、平滑筋成長及びプラーク形成を抑制するために、管腔表面でＧＣＩＢ照射することができ、反管腔表面で再内皮化を可能にさせ、そのままの（照射されていない）ＰＴＦＥ表面を維持するＰＴＦＥ心臓血管ステントと、神経再生のためのシリコンゴム管のＧＣＩＢ照射と、その他とが含まれる。
【００５５】
非晶質石英の例示的な実施形態
非晶質石英の表面加工は、第五の例示的実施形態に開示される。非晶質石英材料は、生物学的実験器具で頻繁に用いられ、更に、哺乳類への移植を対象とする医療用物体を製造する際に用いられる材料である。非晶質石英は、細胞の表面付着及び増殖のため非常に有利な材料であることが知られている。清潔かつ無菌の非晶質石英基板は、部分的に遮蔽され、次に、３０ｋＶ加速電圧を使用して加速されたアルゴンＧＣＩＢを用いて照射量５×１０１４イオン／ｃｍ２までＧＣＩＢが照射された。用いられた遮蔽物は、石英表面に近接した非接触シャドーマスクである。遮蔽されていない部分は、全部のＧＣＩＢ照射量を受け、一方、遮蔽された部分は、ＧＣＩＢ照射を受けなかったので、対照表面としての役割を果たす。初代ブタ線維芽細胞が新鮮な前靱帯から採取された。非晶質石英表面は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンが追加されたダルベッコ改変イーグル培地栄養混合物（ＤＭＥＭ）中、初代ブタ線維芽細胞は１ｃｍ２当たり５，０００細胞の初期密度でシードされ、そして、３７℃、ＣＯ２濃度５％の空気中において加湿培養器の中で培養された。４時間後、培地及び非付着細胞が取り出され、新しい培地で置き換えられ、培養が続けられた。表面は、最初の４時間は１時間毎に、そして、更に、初期シード後の６、２４及び４８時間目に観察され、撮像された。
【００５６】
図８は、細胞をシードした後の２４時間目に撮影され、遮蔽された照射されていない領域と遮蔽されていないＧＣＩＢが照射された領域との間の境界面で観察された部分的に遮蔽された非晶質石英基板の光学顕微鏡写真である。結果は、表面がＧＣＩＢが照射されたか、照射されなかったかにかかわらず、線維芽細胞が非晶質石英表面に優先的に付着することを示す。ＧＣＩＢが照射された領域は、図８の左側にあり、照射されていない対照領域は、図８の右側にある。
【００５７】
結晶質サファイアの例示的な実施形態
（単結晶）結晶質サファイアの表面改善は、第六の例示的実施形態に開示される。清潔かつ無菌の結晶質サファイア基板は、部分的に遮蔽され、次に、３０ｋＶ加速電圧を使用して加速されたアルゴンＧＣＩＢを用いて照射量５×１０１４イオン／ｃｍ２までＧＣＩＢが照射された。用いられた遮蔽物は、サファイア表面に近接した非接触シャドーマスクである。遮蔽されていない部分は、全部のＧＣＩＢ照射量を受け、一方、遮蔽された部分は、ＧＣＩＢ照射を受けなかったので、対照表面としての役割を果たす。初代ブタ線維芽細胞が新鮮な前靱帯から採取された。結晶質サファイアの表面は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンが追加されたダルベッコ改変イーグル培地栄養混合物（ＤＭＥＭ）中、初代ブタ線維芽細胞を１ｃｍ２当たり５，０００細胞の初期密度でシードされ、そして、３７℃、ＣＯ２濃度５％の空気中において加湿培養器の中で培養された。４時間後、培地及び非付着細胞が取り出され、新しい培地で置き換えられ、培養が続けられた。表面は、最初の４時間は１時間毎に、そして、更に、初期シード後の６、２４及び４８時間目に観察され、撮像された。
【００５８】
図９は、細胞をシードした後の２４時間目に撮影され、遮蔽された照射されていない領域と遮蔽されていないＧＣＩＢが照射された領域との間の境界面で観察された部分的に遮蔽された結晶質サファイア基板の光学顕微鏡写真である。ＧＣＩＢが照射された領域は、図９の左側にあり、照射されていない対照領域は、図９の右側にある。照射されていない領域とＧＣＩＢが照射された領域とを比較することにより、照射されていない（遮蔽された）部分と比べて、ブタ線維芽細胞が結晶質サファイア表面のＧＣＩＢが照射された部分により多く付着し、より良く増殖することが明らかである。
【００５９】
サファイアのような結晶質材料のＧＣＩＢ照射は、非常に薄い表面層（数十オングストローム）の部分的又は完全な非晶質化をもたらすと考えられる。特定の理論に拘束されたくないが、照射による影響を受けた非晶質化表面改質は、細胞付着及び増殖の改善に寄与することが考えられる。改善に寄与することがあるその他の考えられるメカニズムは、材料の表面湿潤性、親水性、及び／又は、表面電荷状態の改質を高める。
【００６０】
重合体フィラメント／重合体織物の例示的実施形態
織物は、織り、編み、及び／又は、その他の不織技法によって、重合体又は共重合体繊維から形成することができる。ある一定の重合体織物（最も顕著には、ポリエチレンテレフタレート）は、血管移植片を製作するため特に適した織物である。織機によって織られたポリエチレンテレフタレート（ポリ（エチレンテレフタレート）と表記されること、及び、ＰＥＴ又はＰＥＴＥと略記されることがある）繊維の織物は、この織物の商標のうちの１つを用いて、Ｄａｃｒｏｎと呼ばれることもあり、血管移植片を製作する材料として広く用いられている。第七の例示的実施形態では、表面改善は、織機によって織られたポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴＥ）織物に関して開示される。ＰＥＴＥ織物から製作された血管移植片は、場合によっては、血液損失を低減するため（コラーゲン又はアルブミンのような）タンパク質でコーティングされ、及び／又は、移植片感染を防止するため抗生物質でコーティングされる。薬理学的又は生物学的試薬の使用により再狭窄を軽減するため設計された殆どの戦略は、織物表面上での血管平滑筋細胞増殖の直接的な阻害を伴う。しかし、代替案として、平滑筋細胞増殖は、損傷部位及び移植片部位での再内皮化の特定の促進によって間接的に阻害されることがある。従来、再内皮化は、ゆっくりであること、又は、不完全であることがよくあった。本実施形態では、ＧＣＩＢ照射が材料の生物活性をより高め、かつ、再内皮化を促進するため材料をより好適にすることを示すため、コーティングされていない織機で織られたＰＥＴＥ織物材料のＧＣＩＢ照射を評価した。
【００６１】
製織ＰＥＴＥ織物は、１５ｍｍ×３０ｍｍ片に切断された。これらの片は、半分が遮蔽され、そして、３０ｋＶ加速電圧を使用して加速されたアルゴンＧＣＩＢを用いて照射量５×１０１４イオン／ｃｍ２までＧＣＩＢが照射された。用いられた遮蔽物は、ＰＴＦＥ織物表面に近接した非接触シャドーマスクであり、各織物片の一方側の半分を覆う。遮蔽されていない表面部分は、全部のＧＣＩＢ照射量を受け、一方、遮蔽された表面部分は、ＧＣＩＢ照射を受けなかったので、対照表面としての役割を果たす。織物片は、個別のペトリ皿に置かれ、生きているマウスの内皮細胞（ＥＯＭＡ細胞株）が織物片１個あたりに５０，０００細胞の初期密度でＰＥＴＥ織物表面全体（照射された部分及び対照部分）にシードされ、３７℃での加湿培養器における培養の間に、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンが追加されたダルベッコ改変イーグル培地栄養混合物（ＤＭＥＭ）中、付着するまで２４時間放置された。２４時間後、培地及び非付着細胞が取り出された。−２０℃で１時間予め冷却されたメタノールは、付着細胞を固定するためＰＥＴＥ織物に１０分間置かれた。織物及び付着したマウス内皮細胞は、その後、走査型電子顕微鏡によって撮像された。マウス内皮細胞が付着したＰＥＴＥ織物のＧＣＩＢが照射された部分及び照射されていない対照部分の両方の表面領域は、Ｈｉｔａｃｈｉ  ＴＭ−１０００走査型電子顕微鏡を使用して撮像された。結果は、織機で織られたＰＥＴＥ織物の表面のＧＣＩＢが照射された部分とＧＣＩＢが照射されていない部分との間に細胞付着の明らかな差異があることを示した。
【００６２】
図１０は、（メタノール固定に続いて）マウス内皮細胞によるシード後の２４時間目に行われたＰＥＴＥ織物表面の処理片の走査型電子顕微鏡写真である。画像の左側にあるＰＥＴＥ織物の部分は、シード前に照射されなかったＰＥＴＥ織物の遮蔽された部分である。画像の右側にあるＰＥＴＥ織物の部分は、細胞によるシード前にＧＣＩＢ照射を受けた部分である。
【００６３】
図１０は、ＰＥＴＥ織物の照射されていない対照部分よりＧＣＩＢ照射がなされた部分で著しく進行したマウス内皮細胞による再内皮化を示す。ＥＯＭＡ細胞は、ＧＣＩＢ照射を受けたＰＥＴＥ織物の部分に優先的に付着した。
【００６４】
上述のいくつかの実施形態では、本発明の方法は、限定されることなく、サンドブラスト法、酸エッチング法と、塗布膜のプラズマ溶射と、ＣＯ２レーザー平滑化と、機械的洗浄技術、超音波洗浄技術、プラズマ洗浄技術、及び、化学的洗浄技術を含む種々の形式の洗浄法と、界面活性剤の使用、又は、異なる湿潤性特性を有している薄膜若しくは被膜の塗布と、ＵＶ処理と、ＵＶ及びオゾン処理と、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）の共有結合付着と、抗ＣＤ３４抗体、及び／又は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸ペプチド（ＲＧＤペプチド）、及び／又は、コラーゲン、及び／又は、アルブミンのようなタンパク質生成物の塗布と、を含む表面を改善する、及び／又は、生物活性及び統合を増強するその他の既知の方法との組み合わせを更に含むことがある。このような組み合わせは、本発明の範囲に含まれることが意図される。
【００６５】
本発明は、例示の目的のため、チタン箔、ガラス、ポリスチレン、ＰＴＦＥ、石英、サファイア、及び、ＰＥＴＥ織物表面のいずれかを用いるものとして説明されたが、医療用インプラントのための物体は、チタン及び／又はチタン合金（酸化物コーティングの有無を問わない）、コバルト−クロム合金、コバルト−クロム−モリブデン合金、タンタル、タンタル合金、様々なその他の金属及び金属合金、ポリエチレン及びその他の不活性プラスチックのいずれか含むプラスチック又は重合体若しくは共重合体材料と、固体樹脂材料と、ガラス状材料と、織機で織られた織物と、編み物と、不織重合体／共重合体織物と、骨、コラーゲン、絹、及び、その他の天然繊維のような生物学的材料と、チタニアを含む様々なセラミックと、塗布のために適しており、そして適宜生物学的適合性があるその他の材料と、から選択される素材から形成されることが理解される。本発明は、医療移植用の物体の分野における様々な実施形態及び用途に関して説明されたが、本発明の用途がこの分野に限定されることはないことと、細胞成長、付着及び付着を表面により多くもたらすための表面へのＧＣＩＢ照射の考え方が当業者に明らかである分野により広範な用途を有していることとが発明者によって理解される。このようなより広範な用途は、本発明の範囲に包含されることが意図されている。本発明は、本発明及び請求項に記載された事項の趣旨及び範囲の中で多種多様の更なる実施形態及びその他の実施形態もまた可能であることが認められるべきである。
【図１】
0005701783.tif 000004
【図２】
0005701783.tif 000005
【図３】
0005701783.tif 000006
【図４ａ】
0005701783.tif 000007
【図４ｂ】
0005701783.tif 000008
【図４ｃ】
0005701783.tif 000009
【図４ｄ】
0005701783.tif 000010
【図４ｅ】
0005701783.tif 000011
【図４ｆ】
0005701783.tif 000012
【図５ａ】
0005701783.tif 000013
【図５ｂ】
0005701783.tif 000014
【図５ｃ】
0005701783.tif 000015
【図５ｄ】
0005701783.tif 000016
【図５ｅ】
0005701783.tif 000017
【図５ｆ】
0005701783.tif 000018
【図５ｇ】
0005701783.tif 000019
【図５ｈ】
0005701783.tif 000020
【図５ｉ】
0005701783.tif 000021
【図６ａ】
0005701783.tif 000022
【図６ｂ】
0005701783.tif 000023
【図７ａ】
0005701783.tif 000024
【図７ｂ】
0005701783.tif 000025
【図８】
0005701783.tif 000026
【図９】
0005701783.tif 000027
【図１０】
0005701783.tif 000028