(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉ）（１）ペルヒドロリシス活性を有する少なくとも１つの酵素触媒であって、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて配列番号１と整列させる炭水化物エステラーゼ族７（ＣＥ−７）シグネチャーモチーフを有する酵素を含み、該シグネチャーモチーフが
（Ａ）配列番号１の１１８〜１２０と整列させるアミノ酸位置でＲＧＱモチーフ；
（Ｂ）配列番号１の１７９〜１８３と整列させるアミノ酸位置でＧＸＳＱＧモチーフ；および
（Ｃ）配列番号１の２９８〜２９９と整列させるアミノ酸位置でＨＥモチーフ
を含み；
該酵素が配列番号１と少なくとも３０％のアミノ酸同一性を含む
酵素触媒；および
（２）少なくとも１つの賦形剤；
を含む酵素粉末；
（ii）（１）構造
［Ｘ］mＲ5
（式中、
Ｘは、式Ｒ6Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり；
Ｒ6は、任意選択的に、ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換される、Ｃ１〜Ｃ７の線状、分岐または環式ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ6は、Ｒ6がＣ２〜Ｃ７である場合に任意選択的に、１つ以上のエーテル結合を含み；
Ｒ5は、任意選択的に、ヒドロキシル基で置換されるＣ１〜Ｃ６の線状、分岐または環式ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ5中の各炭素原子はそれぞれ、１つより多くないヒドロキシル基または１つより多くないエステル基を含み、そしてここでＲ5は、任意選択的に、１つまたはそれ以上のエーテル結合を含み；
ｍは、１からＲ5中の炭素原子の数までである）
を有する１つまたはそれ以上のエステルであって、
２５℃で少なくとも５ｐｐｍの水への溶解度を有する、該エステル；
（２）構造
【化１】
0005701762.tif 000037
（式中、Ｒ1は、任意選択的に、ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されるＣ１〜Ｃ７の直鎖または分岐鎖のアルキルであり、Ｒ3およびＲ4はそれぞれ、ＨまたはＲ1Ｃ（Ｏ）である）を有する１つまたはそれ以上のグリセリド；
（３）式
【化２】
0005701762.tif 000038
（式中、Ｒ1は、任意選択的に、ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されるＣ１〜Ｃ７の直鎖または分岐鎖のアルキルであり、Ｒ2は、Ｃ１〜Ｃ１０の直鎖または分岐鎖のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、もしくは（ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）−Ｏ）nＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つまたはそれ以上のエステル；
（４）１つ以上のアセチル化単糖類、アセチル化二糖類、もしくはアセチル化多糖類；および
（５）（１）〜（４）の任意の組み合わせ
からなる群から選択されるカルボン酸エステル基質であって、
第１の成分中のカルボン酸エステル基質の量が、第１および第２の成分を組み合わせることによって形成される反応調合物中０．５質量％〜１０質量％の最終濃度を与えるように設計される、該カルボン酸エステル基質；
（iii）重炭酸、クエン酸、酢酸、リン酸、ピロリン酸、メチルホスホン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、酒石酸、およびマレイン酸からなる群から選択される緩衝剤；
（iv）トリプロピレングリコールメチルエーテル、ジプロピレングリコールメチルエーテル、プロピレングリコールメチルエーテル、ジエチレングリコールブチルエーテル、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、１，２−プロパンジオール、Ｎ−エチル−２−ピロリジノン、イソプロパノール、エタノール、乳酸エチル、１，３−プロパンジオール、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される共溶媒；および
（ｖ）任意選択的に少なくとも１つの界面活性剤；
を含む第１の成分と：
（ｂ）水、過酸化水素、および過酸化水素安定剤を含む第２の成分と：
を含むペルオキシカルボン酸を生成させるための多成分調合物。
【請求項２】
少なくとも１つの賦形剤が、酵素粉末の９５質量％〜２５質量％の範囲である請求項１に記載の多成分調合物。
【請求項３】
（ａ）カルボン酸エステル基質がトリアセチンであり；ここで、第１の成分中のトリアセチンの量が、第１および第２の成分を組み合わせることによって形成される反応調合物中０.５質量％〜１０質量％トリアセチンの最終濃度を与え；
（ｂ）緩衝剤が第１の成分の０.１質量％〜１０質量％であり、ここで、該緩衝剤は、
重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、重炭酸ナトリウムと重炭酸カリウムとの混合物、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、およびリン酸ナトリウムとリン酸カリウムとの混合物
からなる群から選択され；
（ｃ）共溶媒がトリプロピレングリコールメチルエーテルであり、第１の成分の最大で８０質量％までの濃度にあり；
（ｄ）ポリソルベート  ８０である界面活性剤が存在し；そして
（ｅ）第２の成分中の過酸化水素が、第１および第２の成分を組み合わせることによって形成される反応調合物中０.３３質量％〜３０質量％の最終濃度を与える量で存在する、
請求項１または請求項２に記載の多成分調合物。
【請求項４】
第１の成分を、重さで１：１〜１：１０の比で第２の成分と組み合わせる請求項１または請求項２に記載の多成分調合物。
【請求項５】
（ａ）（ｉ）（１）ペルヒドロリシス活性を有する少なくとも１つのＣＥ−７酵素であって、配列番号６、配列番号７、配列番号１９および配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号６、配列番号７、配列番号１９もしくは配列番号２０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、該ＣＥ−７酵素；および
（２）少なくとも１つの賦形剤
を含む酵素粉末；
（ii）モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、およびそれらの混合物からなる群から選択されるカルボン酸エステル基質であって、第１の成分中のカルボン酸エステル基質の量が、第１および第２の成分を組み合わせることによって形成される反応調合物中０．５質量％〜１０質量％の最終濃度を与えるように設計される、該カルボン酸エステル基質；
（iii）重炭酸、クエン酸、酢酸、リン酸、ピロリン酸、メチルホスホン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、酒石酸、およびマレイン酸からなる群から選択される緩衝剤；
（iv）トリプロピレングリコールメチルエーテル、ジプロピレングリコールメチルエーテル、プロピレングリコールメチルエーテル、ジエチレングリコールブチルエーテル、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、１，２−プロパンジオール、Ｎ−エチル−２−ピロリジノン、イソプロパノール、エタノール、乳酸エチル、１，３−プロパンジオール、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される共溶媒；および
（iv）任意選択的に少なくとも１つの界面活性剤；
を含む、第１の成分と：
（ｂ）水、過酸化水素、および過酸化水素安定剤を含む、第２の成分と：
を含むペルオキシカルボン酸を生成させるための２成分調合物。
【請求項６】
（ａ）少なくとも１つのＣＥ−７酵素が、配列番号６、配列番号７、配列番号１９および配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列であって、配列番号１９または配列番号２０のアミノ酸残基２７７が、アラニン、バリン、セリン、およびスレオニンからなる群から選択される、該アミノ酸配列を含み；
（ｂ）カルボン酸エステル基質がトリアセチンであり、ここで、第１の成分中のトリアセチンの量が、第１および第２の成分を組み合わせることによって形成される反応調合物中０.５質量％〜１０質量％の最終濃度を与えるように設計され；
（ｃ）緩衝剤が第１の成分の０.１質量％〜１０質量％の濃度にあり；ここで、緩衝剤が、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、重炭酸ナトリウムと重炭酸カリウムとの混合物、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、およびリン酸ナトリウムとリン酸カリウムとの混合物からなる群から選択され；
（ｄ）共溶媒がトリプロピレングリコールメチルエーテルであり、第１の成分の最大で８０質量％までの濃度にあり；
（ｅ）ポリソルベート  ８０である界面活性剤が存在し；そして
（ｆ）第２の成分中の過酸化水素が、第１および第２の成分を組み合わせることによっ
て形成される反応調合物中０.３３質量％〜３０質量％の最終濃度を与える量で存在する、
請求項５に記載の２成分調合物。
【請求項７】
第１の成分を、ペルオキシカルボン酸を生成させるために重さで１：１〜１：１０の比で第２の成分と組み合わせる請求項５または請求項６に記載の２成分調合物。
【請求項８】
（ａ）（ｉ）（１）少なくとも１つのＣＥ−７酵素を含み、ペルヒドロリシス活性を有する２０質量％〜３３質量％の酵素粉末であって、該少なくとも１つのＣＥ−７酵素が、配列番号６、配列番号７、配列番号１９および配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、該酵素粉末；
（２）少なくとも１２５０の数平均分子量および少なくとも９０００の質量平均分子量を有する少なくとも１つのオリゴ糖賦形剤を含む６７質量％〜８０質量％の酵素粉末であって、該少なくとも１つのオリゴ糖賦形剤が、マルトデキストリン、キシラン、マンナン、フコイダン、ガラクトマンナン、キトサン、ラフィノース、スタキオース、ペクチン、イヌリン、レバン、グラミナン、アミロペクチン、およびそれらの混合物からなる群から選択される、該酵素粉末を含む、第１の成分の０.１質量％〜５質量％である酵素粉末；
（ii）モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、およびそれらの混合物からなる群から選択されるカルボン酸エステル基質であって、第１の成分中のカルボン酸エステル基質の量が、２つの反応成分を組み合わせることによって形成される反応調合物中０.５質量％〜１０質量％の最終濃度を与えるように設計される、該カルボン酸エステル基質；
（iii）重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、重炭酸ナトリウムと重炭酸カリウムとの混合物、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、およびリン酸ナトリウムとリン酸カリウムとの混合物からなる群から選択される第１の成分の０.１質量％〜１０質量％を含む緩衝剤；
（iv）トリプロピレングリコールメチルエーテル、ジプロピレングリコールメチルエーテル、プロピレングリコールメチルエーテル、ジエチレングリコールブチルエーテル、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、１，２−プロパンジオール、Ｎ−エチル−２−ピロリジノン、イソプロパノール、エタノール、乳酸エチル、１，３−プロパンジオール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、２未満のｌｏｇ  Ｐ値を有する、第１の成分の最大で８０質量％までを含む共溶媒；および
（ｖ）酵素粉末中に存在する全タンパク質の質量に基づいて０.１質量％〜５質量％の範囲での少なくとも１つの界面活性剤；
の調合物を含む第１の成分と：
（ｂ）（ｉ）少なくとも７０質量％の水；
（ii）０.３３質量％〜３０質量％の範囲での反応調合物中の過酸化水素の最終濃度を与える量での過酸化水素；および
（iii）０.０１質量％〜１質量％の過酸化水素安定剤；
を含む第２成分と：
を含み、
ここで該第１および第２の反応成分を組み合わせることにより過酢酸の水性調合物が生成する、ペルオキシカルボン酸を生成させるための２成分調合物。
【請求項９】
表面、衣料品もしくは繊維製品の漂白、汚れ除去、脱臭、衛生化または殺菌方法であって、
（ａ）請求項１、請求項５または請求項８のいずれか一項に記載の調合物を備える工程と；
（ｂ）第１の成分を第２の成分と組み合わせ、それによってペルオキシカルボン酸を含む反応調合物を生成させる工程と；
（ｃ）漂白、汚れ除去、臭気低減、衛生化、殺菌、またはそれらの組み合わせのために反応調合物を表面、衣料品または繊維製品の物品に適用する工程と；
を含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、それらのそれぞれが全体を本明細書に参照により援用される、それぞれ２００８年１０月３日出願の、米国仮特許出願第６１／１０２，５０５号明細書、同第６１／１０２，５１２号明細書、同第６１／１０２，５１４号明細書、同第６１／１０２，５２０号明細書、同第６１／１０２，５３１号明細書、および同第６１／１０２，５３９号明細書の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、酵素的ペルオキシカルボン酸合成およびその場酵素触媒作用の分野に関する。具体的には、ペルオキシカルボン酸の水溶液を酵素的に生成するための多成分調合物が提供される。少なくとも１つのペルオキシカルボン酸が、表面の消毒または殺菌、医療機器滅菌、食品加工設備滅菌のために有効であり、かつ、漂白、防汚、脱臭、および滅菌などのランドリーケア用途での使用に好適であるような十分な濃度で生成する。
【背景技術】
【０００３】
ペルオキシカルボン酸組成物は、有効な抗菌剤であると報告されてきた。硬表面、肉製品、生きている植物組織、および望ましくない微生物増殖に抗する医療装置をきれいにする、消毒する、および／または殺菌するための方法が記載されてきた（例えば、特許文献１〜５）。ペルオキシカルボン酸はまた洗濯洗剤用途向けの漂白組成物を調製するのに有用であると報告されてきた（例えば、特許文献６〜８）。
【０００４】
ペルオキシカルボン酸は、カルボン酸と過酸化水素との化学反応によって製造することができる（非特許文献１を参照されたい）。この反応は通常、濃硫酸などの、強い無機酸によって触媒される。過酸化水素とカルボン酸との反応は平衡反応であり、ペルオキシカルボン酸の生成は、過剰濃度の過酸化物および／またはカルボン酸の使用によって、または水の除去によって有利に働く。
【０００５】
幾つかのペルオキシカルボン酸ベースの消毒剤または漂白剤は、ペルオキシカルボン酸、過酸化水素、および相当するカルボン酸の平衡混合物からなる。これらの市販ペルオキシカルボン酸クリーニングシステムの一欠点は、時間とともに溶液中で多くの場合不安定であることである。安定性問題を克服するための一方法は、長期間個別に安定である多反応成分を組み合わせることによって使用前にペルオキシカルボン酸を発生させることである。好ましくは、個々の反応成分は、貯蔵するのが容易であり、取り扱うのに比較的安全であり、かつ、混合すると有効濃度のペルオキシカルボン酸を迅速に生成することができるものである。
【０００６】
化学的ペルオキシカルボン酸生成の欠点を克服するための一方法は、過加水分解活性を有する酵素触媒を使用することである。ＤｉＣｏｓｉｍｏらに付与される特許文献９ならびに１０、１１および１２は、消毒剤および／または漂白剤としての使用に十分な濃度でペルオキシカルボン酸へ（過酸化水素などの、好適な過酸素源の存在下に）カルボン酸エステルを転化するための顕著な過加水分解活性によって特徴づけられる炭水化物エステラーゼのＣＥ−７族のメンバーとして構造上分類される酵素（すなわち、セファロスポリンＣデアセチラーゼ［ＣＡＨ］およびアセチルキシランエステラーゼ［ＡＸＥ］）を開示している。炭水化物エステラーゼのＣＥ−７族の幾つかのメンバーは、いったん反応成分が混合されたら、アルコール、ジオール、およびグリセロールのアセチルエステルから１分で４０００〜５０００ｐｐｍ、５分から３０分の間に９０００ｐｐｍまでの過酢酸を生成するのに十分な過加水分解活性を有することが実証された（ＤｉＣｏｓｉｍｏら、特許文献１２）。
【０００７】
引用された特許出願公開のそれぞれにＤｉＣｏｓｉｍｏらによって記載されている酵素的ペルオキシカルボン酸発生システムは、各成分が使用まで別個の区画に貯蔵される、２成分系に基づくものであってもよい。典型的には、過加水分解活性を有する酵素触媒は、カルボン酸エステル基質と共に一区画に貯蔵され、過酸素源（典型的には過酸化水素の水溶液使用）は第２区画に貯蔵される。２つの区画の多反応成分は、ペルオキシカルボン酸の所望の水溶液を生成するために混合される。
【０００８】
しかしながら、多成分酵素的過酸発生システムはまた、ある種の問題に悩まされる可能性がある。１つの問題は、２つの成分の混合後に水中に不溶であるかまたは部分的に不溶である１つ以上のカルボン酸エステル基質の使用であるかもしれない。ある種のカルボン酸エステル基質の制限された溶解性は、ペルオキシカルボン酸生成物を有効に生成し、送出する能力を妨げる少なくとも３つの状態をもたらし得る：第１に、酵素触媒／基質成分の粘度は、過酸素源を含む第２成分との効率的な混合を可能にするには余りにも高いものであり得る；第２に、酵素触媒／基質成分の粘度は、噴霧などの、酵素触媒／基質成分と過酸素源との混合物を含む生成物のある種のモードの送出を可能にするには余りにも高いものであり得る；第３に、酵素／基質成分への基質の溶解速度は、水溶液に過酸素源を含む第２成分との混合後にペルオキシカルボン酸の満足のいく生成速度を可能にするには余りにも低い。カルボン酸エステル溶解性の問題はまた、過酸素の水性源を含む成分対酵素触媒／基質成分を含む成分の特有の比の使用が望ましい状況で明白になる。従って、所望の反応時まで過酸素源とは別々に過加水分解活性を有する酵素触媒および基質の貯蔵を含む多成分系の商業的使用は、幾つかの用途向けにはこれまで実用的でないままであった。
【０００９】
混合を高めるおよび／または水中のカルボン酸エステルの粘度を変えるための有機共溶媒の使用は問題のある可能性がある。有機溶媒は、酵素が直接有機溶媒中に懸濁されるとき、または混和性の有機／水性単一相溶媒が用いられるときのどちらかに、酵素の活性に有害であり得る。酵素活性および構造への有機溶媒の影響をレビューしている２つの文献刊行物は、非特許文献２および３である。ＣｏｗａｎおよびＰｌａｎｔは、（８７ページに）有機相システムで細胞内酵素を安定化させるためにｌｏｇ  Ｐ≦２を有する有機溶媒を使用することにほとんどまたは全く価値がないと指摘している。２〜４のｌｏｇ  Ｐを有する有機溶媒は、酵素安定性に依存してケース−バイ−ケースで使用することができ、ｌｏｇ  Ｐ＞４を有するものは一般に、有機相システムで有用である。
【００１０】
ＣｏｗａｎおよびＰｌａｎｔ（上記を参照）は、（９１ページに）単一相有機−水性溶媒に溶解された酵素の直接暴露の影響が溶媒濃度、溶媒／酵素表面基相互作用、および溶媒／酵素水和殻相互作用に依存するとさらに指摘している。溶媒のｌｏｇ  Ｐ値は、溶媒が水相と完全に混和して単一相を生成するように十分に低くなければならないので、低いｌｏｇ  Ｐの有機溶媒を含有する単一相有機−水性溶媒は通常、低い有機溶媒濃度用途でを除いて酵素安定性に負の影響を有する。
【００１１】
過加水分解活性を有するＣＥ−７酵素の貯蔵安定性は、カルボン酸エステル基質またはカルボン酸エステルと２以下の分配係数（ｌｏｇ  Ｐ値、すなわち、Ｐが［溶質］オクタノール／［溶質］水に等しい、オクタノールと水との間の物質の分配係数の対数によって測定されるような）を有する１つ以上の共溶媒との混合物中で貯蔵されるときに懸念事項である。特許文献１２にＤｉＣｏｓｉｍｏらによって記載されている有機エステル基質の幾つかは、２未満のｌｏｇ  Ｐ値を有する。例えば、トリアセチンは、エタノールのそれ（ｌｏｇ  Ｐ  −０．２６）およびイソプロパノール（ｌｏｇ  Ｐ  ０．１５）（ＣｏｗａｎおよびＰｌａｎｔ）のそれに類似の、０．２５のｌｏｇ  Ｐを有すると報告されており（非特許文献４）；それ故、トリアセチン中での酵素粉末の貯蔵は、ｌｏｇ  Ｐ＜２の追加の共溶媒（例えば、シクロヘキサノン、ｌｏｇ  Ｐ＝０．９４）（ＣｏｗａｎおよびＰｌａｎｔ）；１，２−プロパンジオール、ｌｏｇ  Ｐ＝−１．４１（Ｇｕｎｎｉｎｇら）；１，３−プロパンジオール、ｌｏｇ  Ｐ＝−１．３（非特許文献５；ジエチレングリコールブチルエーテル、ｌｏｇ  Ｐ＝０．５６（非特許文献６；トリエチレングリコール、ｌｏｇ  Ｐ＝−１．７５（非特許文献７）の使用のように、酵素活性の受け入れられない損失をもたらすと予期されるであろう。
【００１２】
「ＥＮＺＹＭＡＴＩＣ  ＰＥＲＡＣＩＤ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＵＳＩＮＧ  Ａ  ＣＯＳＯＬＶＥＮＴ」という表題の代理人整理番号ＣＬ４２０５  ＵＳ  ＮＡのもとでの共同所有される、共同出願された、そして同時係属の米国特許出願は、酵素触媒の過加水分解活性の実質的な損失を引き起こすことなく基質含有成分の粘度を制御するためにおよび水性反応混合物への基質の溶解性を高めるために約２以下のｌｏｇ  Ｐ値を有する有機共溶媒の使用を記載している。
【００１３】
それぞれが表題「ＳＴＡＢＩＬＩＺＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＥＲＨＹＤＲＯＬＡＳＥＳ」を有する、代理人整理番号ＣＬ４３８６  ＵＳ  ＮＡおよびＣＬ４３８７  ＵＳ  ＮＡのもとでの共同所有される、共同出願された、そして同時係属の米国特許出願は、多成分ペルオキシカルボン酸発生システムのカルボン酸エステル基質成分中に存在するときに酵素粉末の酵素的加水分解活性を安定化させるための様々な方法を記載している。
【００１４】
代理人整理番号ＣＬ４３９２  ＵＳ  ＮＡのもとでの共同所有される、共同出願された、そして同時係属の米国特許出願（「ＩＭＰＲＯＶＥＤ  ＰＥＲＨＹＤＲＯＬＡＳＥＳ  ＦＯＲ  ＥＮＺＹＭＡＴＩＣ  ＰＥＲＡＣＩＤ  ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ」）は、改善された過加水分解活性を有する変異株ＣＥ−７酵素を記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第６，５４５，０４７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，１８３，８０７号明細書
【特許文献３】米国特許第６，５１８，３０７号明細書
【特許文献４】米国特許第５，６８３，７２４号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００３／００２６８４６号明細書
【特許文献６】米国特許第３，９７４，０８２号明細書
【特許文献７】米国特許第５，２９６，１６１号明細書
【特許文献８】米国特許第５，３６４，５５４号明細書
【特許文献９】米国特許出願第１１／６３８，６３５号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００８／０１７６７８３号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第２００８／０１７６２９９号明細書
【特許文献１２】米国特許出願公開第２００９／０００５５９０号明細書
【００１６】
【非特許文献１】Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｅｒｏｘｉｄｅｓ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｓｗｅｒｎ，ｅｄ．，Ｖｏｌ．１，ｐｐ  ３１３−５１６；Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７１
【非特許文献２】Ｃ．Ｌａａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．３０：８１−８７（１９８７）
【非特許文献３】Ｃｏｗａｎ，Ｄ．Ａ．ａｎｄ  Ｐｌａｎｔ，Ａ．，Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．，Ｃｈ．７  ｉｎ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ａｔ  Ｅｘｔｒｅｍｅ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ、Ｋｅｌｌｙ，Ｒ．Ｗ．Ｗ．ａｎｄ  Ａｄａｍｓ，Ｍ．ｅｄｓ．，Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ  ８６−１０７（１９９２）
【非特許文献４】Ｙ．Ｍ．Ｇｕｎｎｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．４８：３９５−３９９（２０００）
【非特許文献５】Ｓ−Ｊ．Ｋｕｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７３：１４２７−１４３３（１９９６）
【非特許文献６】Ｎ．Ｆｕｎａｓａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．８８：５７８６−５７９０（１９８４）
【非特許文献７】Ｌ．Ｂｒａｅｋｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＰｈｙｓＣｈｅｍ  ６：１６０６−１６１２（２００５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
解決されるべき問題は、ＣＥ−７触媒の過加水分解活性の高められた貯蔵安定性ならびに／またはカルボン酸エステル基質含有成分の改善された混合および／もしくは粘度特性によって特徴づけられる原料の組み合わせを含む多成分ペルオキシカルボン酸発生調合物を提供することである。さらなる実施形態では、多成分ペルオキシカルボン酸発生調合物は好ましくは、改善された過加水分解活性を有する変異株ＣＥ−７酵素を含む。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
述べられた問題は、高められた貯蔵安定性および／または改善された混合特性によって特徴づけられる多成分調合物を提供することによって解決された。
【００１９】
一実施形態では、
（ａ）（ｉ）（１）過加水分解活性を有する少なくとも１つの酵素触媒であって、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて配列番号１と一致する炭水化物エステラーゼ族７（ＣＥ−７）シグネチャーモチーフを有する酵素を含み、前記シグネチャーモチーフが
（Ａ）配列番号１の１１８〜１２０と一致するアミノ酸位置にＲＧＱモチーフ；
（Ｂ）配列番号１の１７９〜１８３と一致するアミノ酸位置にＧＸＳＱＧモチーフ；および
（Ｃ）配列番号１の２９８〜２９９と一致するアミノ酸位置にＨＥモチーフ
を含み；
前記酵素が配列番号１と少なくとも３０％アミノ酸同一性を含む
酵素触媒；ならびに
（２）少なくとも１つの賦形剤
を含む酵素粉末；
（ｉｉ）（１）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、
Ｘは、式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり；
Ｒ６は、ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で任意選択的に置換された、Ｃ１〜Ｃ７の線状、分岐または環式ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６は、Ｒ６がＣ２〜Ｃ７である場合に１つ以上のエーテル結合を任意選択的に含み；
Ｒ５は、ヒドロキシル基で任意選択的に置換されたＣ１〜Ｃ６の線状、分岐または環式ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個別に、１つ以下のヒドロキシル基または１つ以下のエステル基を含み、かつ、Ｒ５は１つ以上のエーテル結合を任意選択的に含み；
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までである）
を有する１つ以上のエステルであって、
２５℃で少なくとも５ｐｐｍの水への溶解度を有するエステル；
（２）構造
【化１】
0005701762.tif 000002
（式中、Ｒ１は、ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で任意選択的に置換されたＣ１〜Ｃ７の直鎖または分岐鎖のアルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個別に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有する１つ以上のグリセリド；
（３）式
【化２】
0005701762.tif 000003
（式中、Ｒ１は、ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で任意選択的に置換されたＣ１〜Ｃ７の直鎖または分岐鎖のアルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０の直鎖または分岐鎖のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、もしくは（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つ以上のエステル；
（４）１つ以上のアセチル化単糖類、アセチル化二糖類、もしくはアセチル化多糖類；ならびに
（５）（１）〜（４）の任意の組み合わせ
からなる群から選択されるカルボン酸エステル基質であって、
第１成分中の前記カルボン酸エステル基質の量が、前記第１および第２成分を組み合わせることによって形成される反応調合物中で０．５重量％〜１０重量％の最終濃度を提供するように設計されるカルボン酸エステル基質；
（ｉｉｉ）重炭酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、ピロリン酸塩、メチルホスホン酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、およびマレイン酸塩からなる群から選択される緩衝剤；
（ｉｖ）トリプロピレングリコールメチルエーテル、ジプロピレングリコールメチルエーテル、プロピレングリコールメチルエーテル、ジエチレングリコールブチルエーテル、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、１，２−プロパンジオール、Ｎ−エチル−２−ピロリジノン、イソプロパノール、エタノール、乳酸エチル、１，３−プロパンジオール、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される共溶媒；ならびに
（ｖ）任意選択的に少なくとも１つの界面活性剤
を含む第１成分と；
（ｂ）水、過酸化水素、および過酸化水素安定剤を含む第２成分と
を含むペルオキシカルボン酸を生成するための多成分調合物が提供される。
【００２０】
別の実施形態では、
（ａ）（ｉ）（１）過加水分解活性を有する少なくとも１つのＣＥ−７酵素であって、配列番号６、配列番号７、配列番号１９および配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号６、配列番号７、配列番号１９もしくは配列番号２０に実質的に類似のアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＥ−７酵素；ならびに
（２）少なくとも１つの賦形剤
を含む酵素粉末；
（ｉｉ）モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、およびそれらの混合物からなる群から選択されるカルボン酸エステル基質であって、前記第１成分中の前記カルボン酸エステル基質の量が、前記第１および第２成分を組み合わせることによって形成される反応調合物中０．５重量％〜１０重量％の最終濃度を提供するように設計されるカルボン酸エステル基質；
（ｉｉｉ）重炭酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、ピロリン酸塩、メチルホスホン酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、およびマレイン酸塩からなる群から選択される緩衝剤；
（ｉｖ）トリプロピレングリコールメチルエーテル、ジプロピレングリコールメチルエーテル、プロピレングリコールメチルエーテル、ジエチレングリコールブチルエーテル、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、１，２−プロパンジオール、Ｎ−エチル−２−ピロリジノン、イソプロパノール、エタノール、乳酸エチル、１，３−プロパンジオール、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される共溶媒；ならびに
（ｉｖ）任意選択的に少なくとも１つの界面活性剤
を含む第１成分と；
（ｂ）水、過酸化水素、および過酸化水素安定剤を含む第２成分と
を含むペルオキシカルボン酸を生成するための２成分調合物が提供される。
【００２１】
別の実施形態では、
（ａ）（ｉ）（１）少なくとも１つのＣＥ−７酵素を含み、過加水分解活性を有する酵素粉末の約２０重量％〜約３３重量％であって、前記少なくとも１つのＣＥ−７酵素が、配列番号６、配列番号７、配列番号１９および配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む約２０重量％〜約３３重量％；
（２）少なくとも約１２５０の数平均分子量および少なくとも約９０００の重量平均分子量を有する少なくとも１つのオリゴ糖賦形剤を含む酵素粉末の約６７重量％〜約８０重量％であって、前記少なくとも１つのオリゴ糖賦形剤が、マルトデキストリン、キシラン、マンナン、フコイダン、ガラクトマンナン、キトサン、ラフィノース、スタキオース、ペクチン、イヌリン、レバン、グラミナン、アミロペクチン、およびそれらの混合物からなる群から選択される約６７重量％〜約８０重量％
からなる酵素粉末である第１成分の約０．１重量％〜約５重量％；
（ｉｉ）モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、およびそれらの混合物からなる群から選択されるカルボン酸エステル基質であって、前記第１成分中の前記カルボン酸エステル基質の量が、前記２つの反応成分を組み合わせることによって形成される反応調合物中で０．５重量％〜１０重量％の最終濃度を提供するように設計されるカルボン酸エステル基質；
（ｉｉｉ）重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、重炭酸ナトリウムと重炭酸カリウムとの混合物、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、およびリン酸ナトリウムとリン酸カリウムとの混合物からなる群から選択される緩衝剤からなる第１成分の約０．１重量％〜約１０重量％；
（ｉｖ）トリプロピレングリコールメチルエーテル、ジプロピレングリコールメチルエーテル、プロピレングリコールメチルエーテル、ジエチレングリコールブチルエーテル、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、１，２−プロパンジオール、Ｎ−エチル−２−ピロリジノン、イソプロパノール、エタノール、乳酸エチル、１，３−プロパンジオール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、２未満のｌｏｇ  Ｐ値を有する共溶媒からなる第１成分の８０重量％以下；ならびに
（ｖ）前記酵素粉末中に存在する全タンパク質の重量を基準として約０．１重量％〜約５重量％の範囲での少なくとも１つの界面活性剤
の調合物を含む第１成分と；
（ｂ）（ｉ）少なくとも７０重量％の水；
（ｉｉ）０．３３重量％〜約３０重量％の範囲での前記反応調合物中の過酸化水素の最終濃度を提供する量での過酸化水素；ならびに
（ｉｉｉ）約０．０１重量％〜約１重量％の過酸化水素安定剤
を含む第２成分と
を含むペルオキシカルボン酸を生成するための２成分調合物であって、
前記第１および前記第２反応成分が過酢酸の水性調合物を生成する調合物が提供される。
【００２２】
一態様では、酵素粉末は噴霧乾燥によって形成される。
【００２３】
別の実施形態では、賦形剤は、酵素粉末、好ましくは噴霧乾燥酵素粉末の約９５重量％〜約２５重量％の範囲である。好ましい態様では、賦形剤はオリゴ糖賦形剤である。さらに好ましい態様では、オリゴ糖賦形剤は、少なくとも約１２５０の数平均分子量および少なくとも約９０００の重量平均分子量からなる。さらなる態様では、賦形剤はマルトデキストリンである。
【００２４】
好ましい態様では、緩衝剤は、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、重炭酸ナトリウムと重炭酸カリウムとの混合物、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、およびリン酸ナトリウムとリン酸カリウムとの混合物からなる群から選択される。
【００２５】
本発明の別の態様では、表面、衣料品もしくは織物の漂白、脱臭、除汚または消毒方法が提供され、前記方法は、
（ａ）上にリストされた調合物を提供する工程と；
（ｂ）第１成分を第２成分と組み合わせ、それによってペルオキシカルボン酸を含む反応調合物が生成する工程と；
（ｃ）漂白、汚れ除去、臭い低減、殺菌、消毒、またはそれらの組み合わせのために反応調合物を表面、衣料品もしくは織物に適用する工程と
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ａ−ｂは、２区画スプレー・ボトルを使用する本発明に従ったペルオキシカルボン酸を生成するための例示的なシステムを描写する。図１ａについて言及すると、一般的なスプレー・ボトルシステムは、第１成分［２］を含有する第１室［１］と第２成分［４］を含有する第２室［３］とを含む。移送チューブ材料［５］が、第１および第２成分を、２つの成分が所望のｖ／ｖまたはｗ／ｗ比で混合されることを可能にする単一調節制御ノブ［８］を好ましくは有する、流量調節要素［６］および［７］に運ぶために使用される。図１ａは、両液体成分をポンプ送液し、噴射ノズル［１０］を出る前にそれらを混合するポンプ［９］を描写する。図１ｂは、ポンプ［９］およびノズル［１０］が噴射ノズルでのまたはターゲット表面上での第１および第２成分の混合を遅らせるように配置構成されることを除いて図１ａに似ている。
【図２】ａ−ｂは、多区画パケットを使用するペルオキシカルボン酸を生成するための例示的なシステムを描写する。バリア材は、第１成分［２］と第２成分［４］とを分離する多区画システムの外部バリア［１１］および／または内部区画バリア［１２］を形成し、水性ペルオキシカルボン酸混合物を発生させるために（機械的に、化学的に、および／または熱的に）容易に分解できる／破壊できるように設計される。図２ａについて言及すると、送出システムは、破壊できる外部バリア［１１］と第２成分［４］で取り囲まれている第１成分［２］を含む内部区画バリア［１２］を有する内部区画とを含む溶解性パッケージを含む。内部区画バリア［１２］は、２つの成分を混合して所望のペルオキシカルボン酸を生成するために破壊できるおよび／または分解できるように設計される。図２ｂは、２つの区画を平行に分離された溶解できるパケットを例示する。図２ｂに描写されるように、２区画パケットは、溶解できるおよび／または破壊できる外部バリア［１１］とそれぞれ成分［２］、［４］を含有する第１および第２区画［１］および［３］とを含む。第１および第２区画はバリア［１３］を使用して分離される。
【図３】ａ−ｂは、多区画の、柔軟な圧搾パケット／ボトルを使用する、本発明に従ってペルオキシカルボン酸を生成するための例示的なシステムを描写する。図３ａについて言及すると、手動で変形可能な容器［１６］は非剛性壁［１４］を含む。容器［１６］内に、区画［１５］が第２成分［４］で取り囲まれている、第１成分を含有する手動で崩壊できる／破壊できる内部区画［１５］がある。内部区画［１５］の崩壊は、混合および活性化物質の発生を可能にする。図３ａに示されるように、手動で変形可能な容器（例えば、プラスチック圧搾ボトル）は、除去可能なストッパー［１７］付きの指向性吐出口をさらに含む。図３ｂは、２つの区画が平行配置で分離されている、第１成分［２］を含む第１区画［１］と第２成分［４］を含む第２区画［３］とを含む非剛性容器［１６］を描写する。図３ｂの手動で変形可能なボトルはまた、指向性吐出口［１８］と除去可能なストッパー［１７］とを有するように描写されており、ここで、２つの成分はボトルの外側で混合される。
【００２７】
生物学的配列の簡単な説明
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１−１．８２５（「Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ」）に従っており、Ｗｏｒｌｄ  Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＩＰＯ）Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＳＴ．２５（１９９８）およびＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ（ＥＰＣ）およびＰａｔｅｎｔ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  Ｔｒｅａｔｙ（ＰＣＴ）Ｒｕｌｅｓ  ５．２  ａｎｄ  ４９．５（ａ−ｂｉｓ）の配列表規定、ならびにＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ  ＩｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓのＳｅｃｔｉｏｎ  ２０８およびＡｎｎｅｘ  Ｃと一致している。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データについて用いられる記号およびフォーマットは、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に記述されている規則に従う。
【００２８】
配列番号１は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４ＴＭからのセファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００２９】
配列番号２は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）６６３３ＴＭからのセファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００３０】
配列番号３は、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）１４５８０ＴＭからのセファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００３１】
配列番号４は、Ｂ．プミラス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）ＰＳ２１３からのアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００３２】
配列番号５は、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ＡＴＣＣ（登録商標）２７４０５ＴＭからのアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００３３】
配列番号６は、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）からのアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００３４】
配列番号７は、サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８からのアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号８は、サーモアナエロバクテリウム種（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＪＷ／ＳＬ  ＹＳ４８５からのアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００３６】
配列番号９は、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−１４９１１からのセファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列である。ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＺＰ＿０１１６８６７４に報告されているようなバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−１４９１１からのセファロスポリンＣデアセチラーゼをエンコードする核酸配列は、他のセファロスポリンＣデアセチラーゼとの配列アラインメントおよび報告される長さ（３４０アミノ酸）対他のＣＡＨ酵素の観察される長さ（典型的には長さが３１８〜３２５アミノ酸；参照により本明細書に援用される、「ＥＮＺＹＭＡＴＩＣ  ＰＥＲＡＣＩＤ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＵＳＩＮＧ  Ａ  ＣＯＳＯＬＶＥＮＴ」という表題の代理人整理番号ＣＬ４２０５  ＵＳ  ＮＡのもとでの共同所有される、共同出願された、そして同時係属の米国特許出願を参照されたい）の比較に基づいて間違っているらしい１５アミノ酸Ｎ−末端付加をエンコードするように思われることが指摘されるべきである。従って、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＮＲＲＬ  Ｂ−１４９１１からのセファロスポリンＣデアセチラーゼ配列について本明細書で報告される推定アミノ酸配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＺＰ＿０１１６８６７４のもとで報告されているようなＮ−末端１５アミノ酸を含まない。
【００３７】
配列番号１０は、バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）Ｃ−１２５からのセファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００３８】
配列番号１１は、バチルス・クラウジ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）ＫＳＭ−Ｋ１６からのセファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００３９】
配列番号１２は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）２９２３３ＴＭセファロスポリンＣデアセチラーゼ（ＣＡＨ）の推定アミノ酸配列である。
【００４０】
配列番号１３は、サーモアネアロバクテリウム・サッカロリチクム（Ｔｈｅｒｍｏａｎｅａｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）セファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号１４は、サーモトガ・レッチンガエ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ）アセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００４２】
配列番号１５は、サーモトガ・ペトロフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ）アセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号１６は、本明細書で「ＲＱ２（ａ）」と称されるサーモトガ種（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｓｐ．）ＲＱ２からの第１アセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００４４】
配列番号１７は、本明細書で「ＲＱ２（ｂ）」と称されるサーモトガ種（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｓｐ．）ＲＱ２からの第２アセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００４５】
配列番号１８は、配列番号１のアミノ酸残基１１８〜２９９を包含する領域のアミノ酸配列である。
【００４６】
配列番号１９は、「ＩＭＰＲＯＶＥＤ  ＰＥＲＨＹＤＲＯＬＡＳＥＳ  ＦＯＲ  ＥＮＺＹＭＡＴＩＣ  ＰＥＲＡＣＩＤ  ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ」という表題の共同所有される、共同出願された、そして同時係属の米国特許出願代理人整理番号ＣＬ４３９２  ＵＳ  ＮＡ（全体を参照により本明細書に援用される）からのサーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）アセチルキシランエステラーゼ変異株の推定アミノ酸配列であり、ここで、位置２７７でのＸａａ残基は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
【００４７】
配列番号２０は、共同所有される、共同出願された、そして同時係属の米国特許出願代理人整理番号ＣＬ４３９２  ＵＳ  ＮＡからのサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８アセチルキシランエステラーゼ変異株の推定アミノ酸配列であり、ここで、位置２７７でのＸａａ残基は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
【００４８】
配列番号２１は、共同所有される、共同出願された、そして同時係属の米国特許出願代理人整理番号ＣＬ４３９２  ＵＳ  ＮＡからのサーモトガ・レッチンガエ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ）アセチルキシランエステラーゼ変異株の推定アミノ酸配列であり、ここで、位置２７７でのＸａａ残基は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
【００４９】
配列番号２２は、共同所有される、共同出願された、そして同時係属の米国特許出願代理人整理番号ＣＬ４３９２  ＵＳ  ＮＡからのサーモトガ・ペトロフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ）アセチルキシランエステラーゼ変異株の推定アミノ酸配列であり、ここで、位置２７７でのＸａａ残基は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
【００５０】
配列番号２３は、共同所有される、共同出願された、そして同時係属の米国特許出願代理人整理番号ＣＬ４３９２  ＵＳ  ＮＡからの「ＲＱ２（ａ）」に由来するサーモトガ種（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｓｐ．）ＲＱ２アセチルキシランエステラーゼ変異株の推定アミノ酸配列であり、ここで、位置２７７でのＸａａ残基は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
【００５１】
配列番号２４は、共同所有される、共同出願された、そして同時係属の米国特許出願代理人整理番号ＣＬ４３９２  ＵＳ  ＮＡからの「ＲＱ２（ｂ）」に由来するサーモトガ種（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｓｐ．）ＲＱ２アセチルキシランエステラーゼ変異株の推定アミノ酸配列であり、ここで、位置２７８でのＸａａ残基は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
【００５２】
配列番号２５は、サーモアナエロバクテリウム種（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＪＷ／ＳＬ  ＹＳ４８５からのアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
【００５３】
配列番号２６は、ストレプトミセス・カナマイセティカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｋａｎａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）からのカナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎ）のコーディング領域である。
【００５４】
配列番号２７は、カナマイシン耐性遺伝子を含有する、プラスミドｐＫＤ１３である。
【００５５】
配列番号２８は、プラスミドｐＫＤ１３からのｋａｔＧをクローニングするために使用される前進プライマー（ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）である。
【００５６】
配列番号２９は、プラスミドｐＫＤ１３からのｋａｔＧをクローニングするために使用される逆プライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）である。
【００５７】
配列番号３０は、配列番号２８および配列番号２９のプライマーを使用するプラスミドｐＫＤ１３からのｋａｔＧ増幅のＰＣＲ生成物である。
【００５８】
配列番号３１は、カタラーゼ−ペルオキシダーゼ遺伝子（ｋａｔＧ）のコーディング領域である。
【００５９】
配列番号３２は、ｋａｔＧの推定アミノ酸配列である。
【００６０】
配列番号３３は、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ遺伝子を含有する、プラスミドｐＫＤ４６である。
【００６１】
配列番号３４は、ｋａｔＧの崩壊を確認するために使用される前進プライマーである。
【００６２】
配列番号３５は、ｋａｔＧの崩壊を確認するために使用される逆プライマーである。
【００６３】
配列番号３６は、ＦＬＰリコンビナーゼを含有する、温度感受性プラスミドｐＣＰ２０である。
【００６４】
配列番号３７は、プラスミドｐＫＤ１３からのｋａｔＥをクローニングするために使用される前進プライマーである。
【００６５】
配列番号３８は、プラスミドｐＫＤ１３からのｋａｔＥをクローニングするために使用される逆プライマーである。
【００６６】
配列番号３９は、配列番号３７および配列番号３８のプライマーを使用するプラスミドｐＫＤ１３からのｋａｔＥ増幅のＰＣＲ生成物である。
【００６７】
配列番号４０は、カタラーゼＨＰＩＩ遺伝子（ｋａｔＥ）のコーディング領域である。
【００６８】
配列番号４１は、ｋａｔＥの推定アミノ酸配列である。
【００６９】
配列番号４２は、ｋａｔＥの崩壊を確認するために使用される前進プライマーである。
【００７０】
配列番号４３は、ｋａｔＥの崩壊を確認するために使用される逆プライマーである。
【００７１】
配列番号４４は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）（登録番号ＡＥ０００５１２）に報告されているようなサーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）からのアセチルキシランエステラーゼをエンコードする遺伝子のコーディング領域である。
【００７２】
配列番号４５は、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）からのアセチルキシランエステラーゼ遺伝子を増幅するために使用される前進プライマーである。
【００７３】
配列番号４６は、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）からのアセチルキシランエステラーゼ遺伝子を増幅するために使用される逆プライマーである。
【００７４】
配列番号４７は、配列番号４５および配列番号４６のプライマーを使用するアセチルキシランエステラーゼ増幅のＰＣＲ生成物である。
【００７５】
配列番号４８は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）（登録番号ＮＰ＿２２７８９３．１）に報告されているようなサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）からのアセチルキシランエステラーゼをエンコードする遺伝子である。
【００７６】
配列番号４９は、サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）からのアセチルキシランエステラーゼ遺伝子を増幅するために使用される前進プライマーである。
【００７７】
配列番号５０は、サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）からのアセチルキシランエステラーゼ遺伝子を増幅するために使用される逆プライマーである。
【００７８】
配列番号５１は、配列番号４９および配列番号５０のプライマーを使用するアセチルキシランエステラーゼ増幅のＰＣＲ生成物である。
【００７９】
配列番号５２および５３は、実施例２５に記載されるような前進および逆プライマーである。
【００８０】
配列番号５４は、プラスミドｐＳＷ２０７を調製するために使用された配列番号５２および５３によって増幅された核酸生成物の核酸配列である。
【００８１】
配列番号５５および５６は、実施例２５に記載されるような前進および逆プライマーである。
【００８２】
配列番号５７は、プラスミドｐＳＷ２２８を調製するために使用されるコドン最適化サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）コード配列である。
【００８３】
配列番号５８〜６５は、実施例２６でサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）変異株のコード配列を調製するために使用される前進および逆プライマーである。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
本開示では、多数の用語および省略形が用いられる。以下の定義が、特に明確に記載しない限り適用される。
【００８５】
本明細書で用いるところでは、本発明の要素または成分に先行する冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、要素または成分の事例（すなわち、発生）の数に関して非制限的であることを意図される。それ故「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、１つまたは少なくとも１つを含むと読まれるべきであり、要素または成分の単数語形はまた、数が単数形であることを明確に意図されない限り複数形も含む。
【００８６】
本明細書で用いるところでは、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、述べられる特徴、整数、工程、または成分の存在を特許請求の範囲に言及されるように意味するが、それは、１つ以上の他の特徴、整数、工程、成分またはそれらのグループの存在または追加を排除しない。用語「含む」は、用語「本質的にからなる」および「からなる」によって包含される実施形態を含むことを意図される。同様に、用語「本質的にからなる」は、用語「からなる」によって包含される実施形態を含むことを意図される。
【００８７】
本明細書で用いるところでは、用いられる原料または反応剤の量を修飾する用語「約」は、例えば、現実の世界でコンセントレートの製造または溶液の使用のために用いられる典型的な測定および液体ハンドリング手順によって；これらの手順における不注意な誤差によって；組成物を製造するまたは方法を実施するために用いられる原料の製造、源、または純度における差などによって起こり得る数量の変動に関する。用語「約」はまた、特定の初期混合物から生じる組成物について異なる平衡条件のために異なる量を包含する。用語「約」で修飾されていてもされていなくても、特許請求の範囲はそれらの量の等価物を含む。
【００８８】
存在する場合、全ての範囲は包含的であり、合体できる。例えば、「１〜５」の範囲が列挙されるとき、この列挙される範囲は、範囲「１〜４」、「１〜３」、「１〜２」、「１〜２および４〜５」、「１〜３および５」などを含むと解釈されるべきである。
【００８９】
本明細書で用いるところでは、用語「基質」、「好適な基質」、および「カルボン酸エステル基質」は同じ意味で具体的には：
（ａ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、
Ｘは、式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり；
Ｒ６は、ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で任意選択的に置換された、Ｃ１〜Ｃ７の線状、分岐または環式ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６は、Ｒ６がＣ２〜Ｃ７である場合には１つ以上のエーテル結合を任意選択的に含み；
Ｒ５は、ヒドロキシル基で任意選択的に置換されたＣ１〜Ｃ６の線状、分岐または環式ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個別に、１つ以下のヒドロキシル基または１つ以下のエステル基を含み、かつ、Ｒ５は１つ以上のエーテル結合を任意選択的に含み；
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までである）
を有する１つ以上のエステルであって、
２５℃で少なくとも５ｐｐｍの水への溶解度を有するエステル；または
（ｂ）構造
【化３】
0005701762.tif 000004
（式中、Ｒ１は、ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で任意選択的に置換されたＣ１〜Ｃ７の直鎖または分岐鎖のアルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個別にＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有する１つ以上のグリセリド；または
（ｃ）式
【化４】
0005701762.tif 000005
（式中、Ｒ１は、ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で任意選択的に置換されたＣ１〜Ｃ７の直鎖または分岐鎖のアルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０の直鎖または分岐鎖のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、もしくは（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
１つ以上のエステル；または
（ｄ）１つ以上のアセチル化単糖類、アセチル化二糖類、もしくはアセチル化多糖類；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせ
を意味する。
【００９０】
前記カルボン酸エステル基質の例には、モノアセチン；トリアセチン；モノプロピオニン；ジプロオピオニン；トリプロピオニン；モノブチリン；ジブチリン；トリブチリン；グルコースペンタアセテート；キシローステトラアセテート；アセチル化キシラン；アセチル化キシラン断片；β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート；トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール；トリ−Ｏ−アセチル−グルカール；プロピレングリコールジアセテート；エチレングリコールジアセテート；１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、２，５−ペンタンジオール、１，６−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、２，５−ヘキサンジオール、１，６−ヘキサンジオール、またはそれらの任意の組み合わせのモノエステルまたはジエステルが挙げられてもよい。
【００９１】
本明細書で用いるところでは、用語「過酸」は、ペルオキシ酸、ペルオキシカルボン酸、ペルオキシ酸、過カルボン酸およびペルオキソイック酸（ｐｅｒｏｘｏｉｃ  ａｃｉｄ）と同じ意味である。
【００９２】
本明細書で用いるところでは、用語「過酢酸」は、「ＰＡＡ」と略記され、ペルオキシ酢酸、エタンペルオキソイック酸およびＣＡＳ登録番号７９−２１−０の全ての他の同義語と同じ意味である。
【００９３】
本明細書で用いるところでは、用語「モノアセチン」は、グリセロールモノアセテート、グリセリンモノアセテート、およびグリセリルモノアセテートと同じ意味である。
【００９４】
本明細書で用いるところでは、用語「ジアセチン」は、グリセロールジアセテート、グリセリンジアセテート、グリセリルジアセテート、およびＣＡＳ登録番号２５３９５−３１−７の全ての他の同義語と同じ意味である。
【００９５】
本明細書で用いるところでは、用語「トリアセチン」は、グリセリントリアセテート、グリセロールトリアセテート、グリセリルトリアセテート、１，２，３−トリアセトキシプロパン；１，２，３−プロパントリオールトリアセテートおよびＣＡＳ登録番号１０２−７６−１の全ての他の同義語と同じ意味である。
【００９６】
本明細書で用いるところでは、用語「モノブチリン」は、グリセロールモノブチレート、グリセリンモノブチレート、およびグリセリルモノブチレートと同じ意味である。
【００９７】
本明細書で用いるところでは、用語「ジブチリン」は、グリセロールジブチレートおよびグリセリルジブチレートと同じ意味である。
【００９８】
本明細書で用いるところでは、用語「トリブチリン」は、グリセロールトリブチレート、１，２，３−トリブチリルグリセロール、およびＣＡＳ登録番号６０−０１−５の全ての他の同義語と同じ意味である。
【００９９】
本明細書で用いるところでは、用語「モノプロピオニン」は、グリセロールモノプロピオネート、グリセリンモノプロピオネート、およびグリセリルモノプロピオネートと同じ意味である。
【０１００】
本明細書で用いるところでは、用語「ジプロピオニン」は、グリセロールジプロピオネートおよびグリセリルジプロピオネートと同じ意味である。
【０１０１】
本明細書で用いるところでは、用語「トリプロピオニン」は、グリセリルトリプロピオネート、グリセロールトリプロピオネート、１，２，３−トリプロピオニルグリセロール、およびＣＡＳ登録番号１３９−４５−７の全ての他の同義語と同じ意味である。
【０１０２】
本明細書で用いるところでは、用語「酢酸エチル」は、アセチックエーテル、アセトキシエタン、エタン酸エチル、酢酸エチルエステル、エタン酸エチルエステル、エチル酢酸エステルおよびＣＡＳ登録番号１４１−７８−６の全ての他の同義語と同じ意味である。
【０１０３】
本明細書で用いるところでは、用途「乳酸エチル」は、乳酸エチルエステルおよびＣＡＳ登録番号９７−６４−３の全ての他の同義語と同じ意味である。
【０１０４】
本明細書で用いるところでは、用語「アセチル化糖」および「アセチル化糖類」は、少なくとも１つのアセチル基を含む単−、二−および多糖類を意味する。例には、グルコースペンタアセテート；キシローステトラアセテート；アセチル化キシラン；アセチル化キシラン断片；β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート；トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール；およびトリ−Ｏ−アセチル−グルカールが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１０５】
本明細書で用いるところでは、用語「ヒドロカルビル」、「ヒドロカルビル基」、および「ヒドロカルビル部分」は、単、二重、もしくは三重炭素−炭素結合でおよび／またはエーテル結合で連結された、そしてそれに応じて水素原子で置換された炭素原子の直鎖、分岐もしくは環式配置を意味する。かかるヒドロカルビル基は、脂肪族および／または芳香族であってもよい。ヒドロカルビル基の例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、シクロプロピル、シクロブチル、ペンチル、シクロペンチル、メチルシクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル、ベンジル、およびフェニルが挙げられる。好ましい実施形態では、ヒドロカルビル部分は、炭素−炭素単結合でおよび／またはエーテル結合で連結された、そしてそれに応じて水素原子で置換された炭素原子の直鎖、分岐もしくは環式配置である。
【０１０６】
本明細書で用いるところでは、用語１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、２，５−ペンタンジオール、１，６−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、２，５−ヘキサンジオール、１，６−ヘキサンジオール、およびそれらの混合物の「モノエステル」および「ジエステル」は、式ＲＣ（Ｏ）Ｏ（式中、ＲはＣ１〜Ｃ７の線状ヒドロカルビル部分である）の少なくとも１つのエステル基を含む前記化合物を意味する。一実施形態では、カルボン酸エステル基質は、プロピレングリコールジアセテート（ＰＧＤＡ）、エチレングリコールジアセテート（ＥＤＧＡ）、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【０１０７】
本明細書で用いるところでは、用語「プロピレングリコールジアセテート」は、１，２−ジアセトキシプロパン、プロピレンジアセテート、１，２−プロパンジオールジアセテート、およびＣＡＳ登録番号６２３−８４−７の全ての他の同義語と同じ意味である。
【０１０８】
本明細書で用いるところでは、用語「エチレングリコールジアセテート」は、１，２−ジアセトキシエタン、エチレンジアセテート、グリコールジアセテート、およびＣＡＳ登録番号１１１−５５−７の全ての他の同義語と同じ意味である。
【０１０９】
本明細書で用いるところでは、用語「好適な酵素反応混合物」、「ペルオキシカルボン酸のその場発生に好適な成分」、「好適な反応成分」、「好適な水性反応混合物」、および「反応混合物」は、その中で反応剤と酵素触媒とが接触する材料および水を意味する。好適な水性反応混合物の成分は本明細書に提供され、当業者は、このプロセスに好適な成分変動の範囲を十分に理解している。一実施形態では、好適な酵素反応混合物は、反応成分を組み合わせるとその場でペルオキシカルボン酸を生成する。従って、反応成分は、反応成分が使用まで別個のままである多成分系として提供されてもよい。多数の活性成分を分離するおよび組み合わせるためのシステムおよび手段の設計は、当該技術分野で公知であり、個々の反応成分の物理的形態に一般に依存するであろう。例えば、多数の活性流体（液体−液体）システムは、所望の漂白剤が反応性流体を混合すると生成する幾つかの漂白用途に見いだされるなどの、多室分配ボトルまたは２相システム（例えば、米国特許出願公開第２００５／０１３９６０８号明細書；米国特許第５，３９８，８４６号明細書；同第５，６２４，６３４号明細書；同第６，３９１，８４０号明細書；欧州特許第０８０７１５６Ｂ１号明細書；米国特許出願公開第２００５／０００８５２６号明細書；およびＰＣＴ公開国際公開第００／６１７１３号パンフレット）を典型的には用いる。ペルオキシカルボン酸を発生させるために用いられる多成分系の他の形態には、粉末（例えば、米国特許第５，１１６，５７５号明細書）、多層状錠剤（例えば、米国特許第６，２１０，６３９号明細書）、多区画を有する水溶解性パケット（例えば、米国特許第６，９９５，１２５号明細書）および水の添加時に反応する固体塊（例えば、米国特許第６，３１９，８８８号明細書）などの、１つ以上の固体成分または固体−液体成分の組み合わせのために設計されたものが含まれてもよいが、それらに限定されない。
【０１１０】
別の実施形態では、第１成分中のカルボン酸エステルは、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、第１成分中のカルボン酸エステルは、アセチル化糖類である。別の実施形態では、第１成分中の酵素触媒は粒状固体である。別の実施形態では、第１反応成分は固体錠剤または粉末である。
【０１１１】
本明細書で用いるところでは、用語「過加水分解」は、ペルオキシカルボン酸を形成するための選択された基質と過酸化物との反応と定義される。典型的には、無機過酸化物がペルオキシカルボン酸を生成するために触媒の存在下に選択された基質と反応させられる。本明細書で用いるところでは、用語「化学的過加水分解」には、基質（ペルオキシカルボン酸前駆体）が過酸化水素源と組み合わせられる過加水分解反応であって、ペルオキシカルボン酸が酵素触媒の不存在下に形成される反応が含まれる。
【０１１２】
本明細書で用いるところでは、用語「ペルヒドロラーゼ活性」は、タンパク質の単位質量、乾燥細胞重量、または固定化触媒重量（例えば、ミリグラム）当たりの触媒活性を意味する。
【０１１３】
本明細書で用いるところでは、「酵素活性の１単位」または「活性の１単位」または「Ｕ」は、指定温度で毎秒１μモルのペルオキシカルボン酸生成物の生成のために必要とされるペルヒドロラーゼ活性の量と定義される。
【０１１４】
本明細書で用いるところでは、用語「酵素触媒」および「ペルヒドロラーゼ触媒」は、過加水分解活性を有する酵素を含む触媒を意味し、全微生物細胞、透過処理微生物細胞、微生物細胞抽出物の１つ以上の細胞成分、部分精製酵素、または精製酵素の形態にあってもよい。酵素触媒はまた、（例えば、ペグ化によってまたは架橋反応剤との反応によって）化学修飾されてもよい。ペルヒドロラーゼ触媒はまた、当業者に周知の方法を用いて可溶性または不溶性担体に固定化されてもよく；例えば、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ；Ｇｏｒｄｏｎ  Ｆ．Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ，Ｅｄｉｔｏｒ；Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ＵＳＡ；１９９７を参照されたい。本明細書に記載されるように、過加水分解活性を有する本酵素の全てが構造上、炭水化物族エステラーゼ族７（ＣＥ−７族）のメンバーである（Ｃｏｕｔｉｎｈｏ，Ｐ．Ｍ．，Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ａｃｔｉｖｅ  ｅｎｚｙｍｅｓ：ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｄａｔａｂａｓｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ」ｉｎ  Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈ．Ｊ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｇ．Ｄａｖｉｅｓ，Ｂ．Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ  ａｎｄ  Ｂ．Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  ｅｄｓ．，（１９９９）  Ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ｐｐ．３−１２を参照されたい）。ＣＥ−７族の酵素は、過酸素源と組み合わせられたときに様々なカルボン酸エステル基質からペルオキシカルボン酸を生成するために特に有効であることが実証されてきた（それぞれが全体を参照により本明細書に援用される、ＤｉＣｏｓｉｍｏらに付与される国際公開第２００７／０７０６０９号パンフレットならびに米国特許出願公開第２００８／０１７６２９９号明細書、同第２００８／１７６７８３号明細書、および同第２００９／０００５５９０号明細書）。
【０１１５】
ＣＥ−７族のメンバーには、セファロスポリンＣデアセチラーゼ（ＣＡＨ；Ｅ．Ｃ．３．１．１．４１）およびアセチルキシランエステラーゼ（ＡＸＥ；Ｅ．Ｃ．３．１．１．７２）が含まれる。ＣＥ−７エステラーゼ族のメンバーは、保存シグネチャーモチーフを共有している（Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３０：５９３−６０６（２００３））。ＣＥ−７シグネチャーモチーフおよび／または実質的に類似の構造を含むペルヒドロラーゼは、本発明での使用のために好適である。実質的に類似の生物学的分子を同定するための手段は、当該技術分野でよく知られている（例えば、配列アラインメント・プロトコル、核酸ハイブリッド化および／または保存シグネチャーモチーフの存在）。一態様では、ペルヒドロラーゼには、ＣＥ−７シグネチャーモチーフおよび本明細書に提供される配列の１つと少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３３％、より好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも４２％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％アミノ酸同一性を含む酵素が含まれる。
【０１１６】
本明細書で用いるところでは、用語「セファロスポリンＣデアセチラーゼ」および「セファロスポリンＣアセチルヒドロラーゼ」は、セファロスポリンＣおよび７−アミノセファロスポラン酸などのセファロスポリンの脱アセチル化を触媒する酵素（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４１）を意味する（Ｍｉｔｓｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１（６）：２２２４−２２２９））。本明細書に記載されるように、顕著な過加水分解活性を有する幾つかのセファロスポリＣデアセチラーゼが提供される。
【０１１７】
本明細書で用いるところでは、「アセチルキシランエステラーゼ」は、アセチル化キシランおよび他のアセチル化糖類の脱アセチル化を触媒する酵素（Ｅ．Ｃ．３．１．１．７２；ＡＸＥ）を意味する。本明細書に例示されるように、顕著な過加水分解活性を有する、アセチルキシランエステラーゼとして分類される幾つかの酵素が提供される。
【０１１８】
本明細書で用いるところでは、用語「枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４ＴＭ」は、国際預託登録番号ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４ＴＭを有するＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に預託されたバクテリア細胞を意味する。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４ＴＭは、２〜８個の炭素アシル基を有するグリセロールエステルを加水分解することができるエステルヒドロラーゼ（「ジアセチナーゼ」）活性を有すると報告されている（全体を参照により本明細書に援用される、米国特許第４，４４４，８８６号明細書）。本明細書に記載されるように、顕著なペルヒドロラーゼ活性を有する酵素は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４ＴＭから単離され、配列番号１として提供される。単離酵素のアミノ酸配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡＡ０１７２９．１によって提供されるセファロスポリンＣデアセチラーゼと１００％アミノ酸同一性を有する（Ｍｉｔｓｕｓｈｉｍａら、上記を参照）。
【０１１９】
本明細書で用いるところでは、用語「枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）２９２３３ＴＭ」は、国際預託登録番号ＡＴＣＣ（登録商標）２９２３３ＴＭを有するＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に預託された枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の菌株を意味する。本明細書に記載されるように、顕著なペルヒドロラーゼ活性を有する酵素は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）２９２３３ＴＭから単離され、配列を決定され、配列番号１２として提供される。
【０１２０】
本明細書で用いるところでは、用語「クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ＡＴＣＣ（登録商標）２７４０５ＴＭは、国際預託登録番号ＡＴＣＣ（登録商標）２７４０５ＴＭを有するＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に預託されたクロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）の菌株を意味する。Ｃ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ＡＴＣＣ（登録商標）２７４０５ＴＭからのペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号５として提供される。
【０１２１】
本明細書で用いるところでは、用語「枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）６６３３ＴＭは、国際預託登録番号ＡＴＣＣ（登録商標）６６３３ＴＭを有するＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に預託されたバクテリア細胞を意味する。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）６６３３ＴＭは、セファロスポリンアセチルヒドロラーゼ活性を有すると報告されている（米国特許第６，４６５，２３３号明細書）。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）６６３３ＴＭからのペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号２として提供される。
【０１２２】
本明細書で用いるところでは、用語「バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）１４５８０ＴＭ」は、国際預託登録番号ＡＴＣＣ（登録商標）１４５８０ＴＭを有するＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に預託されたバクテリア細胞を意味する。バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）１４５８０ＴＭは、セファロスポリンアセチルヒドロラーゼ活性を有すると報告されている。Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）１４５８０ＴＭからのペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号３として提供される。
【０１２３】
本明細書で用いるところでは、用語「バチルス・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）ＰＳ２１３」は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有すると報告されているバクテリア細胞を意味する（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＡＪ２４９９５７）。バチルス・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）ＰＳ２１３からのペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号４として提供される。
【０１２４】
本明細書で用いるところでは、用語「サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）」は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有すると報告されているサーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）の菌株を意味する（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＡＡＢ７０８６９）。サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）からのペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号６として提供される。
【０１２５】
本明細書で用いるところでは、用語「サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８」は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有すると報告されているバクテリア細胞を意味する（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＮＰ＿２２７８９３．１）。サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８からのペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号７として提供される。
【０１２６】
本明細書で用いるところでは、「バチルス・クラウジ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）ＫＳＭ−Ｋ１６」は、セファロスポリンＣデアセチラーゼ活性を有すると報告されているバクテリア細胞を意味する（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＹＰ＿１７５２６５）。バチルス・クラウジ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）ＫＳＭ−Ｋ１６からのペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号１１として提供される。
【０１２７】
本明細書で用いるところでは、「サーモアネアロバクテリウム・サッカロリチクム（Ｔｈｅｒｍｏａｎｅａｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有すると報告されているバクテリア菌株を意味する（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）Ｓ４１８５８）。サーモアネアロバクテリウム・サッカロリチクム（Ｔｈｅｒｍｏａｎｅａｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）からのペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号１３として提供される。
【０１２８】
本明細書で用いるところでは、用語「サーモトガ・レッチンガエ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ）」は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有すると報告されているバクテリア細胞を意味する（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＣＰ０００８１２）。サーモトガ・レッチンガエ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ）からのペルヒドロラーゼ活性を有する酵素の推定アミノ酸配列は、配列番号１４として提供される。
【０１２９】
本明細書で用いるところでは、用語「サーモトガ・ペトロフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ）」は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有すると報告されているバクテリア細胞を意味する（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＣＰ０００７０２）。サーモトガ・ペトロフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ）からのペルヒドロラーゼ活性を有する酵素の推定アミノ酸配列は、配列番号１５として提供される。
【０１３０】
本明細書で用いるところでは、用語「サーモトガ種（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｓｐ．）ＲＱ２」は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有すると報告されているバクテリア細胞を意味する（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＣＰ０００９６９）。２つの異なるアセチルキシランエステラーゼは、サーモトガ種（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｓｐ．）ＲＱ２からとして同定され、本明細書では「ＲＱ２（ａ）」（配列番号１６として提供される推定アミノ酸配列）および「ＲＱ２（ｂ）」（配列番号１７として提供される推定アミノ酸配列）と言われる。
【０１３１】
本明細書で用いるところでは、「単離核酸分子」、「単離ポリヌクレオチド」、および「単離核酸断片」は、同じ意味で用いられてもよく、一本鎖または二本鎖の、任意選択的に合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを意味する。ＤＮＡのポリマーの形態での単離核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントからなってもよい。
【０１３２】
用語「アミノ酸」は、タンパク質またポリペプチドの基本的な化学構造単位を意味する。次の省略形が本明細書では特有のアミノ酸を同定するために用いられる。
【０１３３】
【表１】
0005701762.tif 000006
【０１３４】
本明細書で用いるところでは、「実質的に類似の」は、１つ以上のヌクレオチド塩基の変化が１つ以上のアミノ酸の付加、置換、または削除をもたらすが、ＤＮＡ配列でエンコードされたタンパク質の機能特性（すなわち、過加水分解活性）に影響を及ぼさない核酸分子に関する。本明細書で用いるところでは、「実質的に類似の」はまた、生じた酵素が本機能特性（すなわち、過加水分解活性）を保持している、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３３％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、その上さらにより好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が本明細書に報告される配列と同一であるアミノ酸配列を有する酵素に関する。「実質的に類似の」はまた、本明細書に報告される核酸分子に厳しい条件下でハイブリッド化する核酸分子でエンコードされた過加水分解活性を有する酵素に関してもよい。それ故、本発明は特有の例示的配列より多くを包含すると理解される。
【０１３５】
例えば、所与のサイトで化学的に等価のアミノ酸の生成をもたらすが、エンコードされたタンパク質の機能特性に影響を及ぼさない遺伝子の変更は一般的であることが当該技術分野ではよく知られている。本発明の目的のためには、置換は、次の５グループの１つ内の交換と定義される：
１．小さな脂肪族の、非極性または僅かに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）；
２．極性の、負に帯電した残基およびそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
３．極性の、正に帯電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
４．大きな脂肪族の、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）；ならびに
５．大きな芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐ。
【０１３６】
こうして、アミノ酸アラニン、疎水性アミノ酸のためのコドンは、別のより少ない疎水性の残基（グリシンなどの）またはより多い疎水性の残基（バリン、ロイシン、もしくはイソロイシンなどの）をエンコードするコドンで置き換えられてもよい。同様に、別のものに代えて１つの負に帯電した残基の置換（グルタミン酸に代えてアスパラギン酸など）または別のものに代えて１つの正に帯電した残基の置換（アルギニンに代えてリジンなど）をもたらす変化はまた、機能的に等価の生成物を生成すると予期することができる。多くの場合に、タンパク質分子のＮ−末端およびＣ−末端部分の変更をもたらすヌクレオチド変化はまた、タンパク質の活性を変更すると予期されないであろう。
【０１３７】
提案される変性のそれぞれは、エンコードされた生成物の生物学的活性の保持の測定がそうであるように、十分に、当該技術分野での所定の技能内である。さらに、当業者は、実質的に類似の配列が本発明によって包含されることを認める。一実施形態では、実質的に類似の配列は、厳しい条件（０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃および２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄され、引き続き０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃）下で、本明細書に例示される配列とハイブリッド化するそれらの能力で定義される。
【０１３８】
本明細書で用いるところでは、核酸分子は、第１分子の一本鎖が温度および溶液イオン強度の適切な条件下に他の分子にアニールすることができるとき、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの、別の核酸分子に「ハイブリッド化可能」である。ハイブリッド化および洗浄条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（２００１）に例示されている。温度およびイオン強度の条件がハイブリッド化の「厳しさ」を決定する。厳しさ条件は、遠縁の有機体からの相同の配列などの、適度に類似の分子を、密に関係する有機体からの機能性酵素を複製する遺伝子などの、高度に類似の分子へと選別するために調節することができる。ポスト−ハイブリッド化洗浄が典型的には厳しさ条件を決定する。１セットの好ましい条件は、室温で１５分間の６ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＳから出発して、次に４５℃で３０分間の２ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで繰り返され、次に５０℃で３０分間の０．２ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで２回繰り返される一連の洗浄を用いる。より好ましいセットの条件は、０．２ＸＳＳＣ、０．５ＳＤＳ％での最後の２回の３０分洗浄の温度が６０℃に上げられることを除いて洗浄が上記のものに同一であるより高い温度を用いる。別の好ましいセットの厳しいハイブリッド化条件は、本明細書に例示される配列で０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃であり、２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、引き続き０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃の最終洗浄で洗浄される。
【０１３９】
ハイブリッド化は、ハイブリッド化の厳しさに依存するが、２つの核酸が相補的配列を含有することを必要とし、塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリッド化するための適切な厳しさは、核酸の長さおよび相補性の程度、当該技術分野で周知の変数に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きければ大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドについてのＴｍの値は大きくなる。核酸ハイブリッド化の相対的な安定性（より高いＴｍに相当する）は、次の順に低下する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００個超のヌクレオチドのハイブリッドについては、Ｔｍを計算するための方程式が誘導された（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、上記を参照）。より短い核酸、すなわち、オリゴヌクレオチドとのハイブリッド化については、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、上記を参照）。一態様では、ハイブリッド化可能な核酸についての長さは、少なくとも約１０のヌクレオチドである。好ましくは、ハイブリッド化可能な核酸についての最小長さは、長さが少なくとも約１５ヌクレオチド、より好ましくは長さが少なくとも約２０ヌクレオチド、さらにより好ましくは長さが少なくとも３０ヌクレオチド、さらにより好ましくは長さが少なくとも３００ヌクレオチド、最も好ましくは長さが少なくとも８００ヌクレオチドである。さらに、当業者は、温度および洗浄液塩濃度がプローブの長さなどの因子に従って必要に応じて調節されてもよいことを認めるであろう。
【０１４０】
本明細書で用いるところでは、用語「パーセント同一性」は、配列を比較することによって測定されるような、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該技術分野では、「同一性」はまた、場合によっては、かかる配列のストリング間のマッチによって測定されるような、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」および「類似性」は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．）  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ｅｄ．）  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９１）に記載されているものを含むがそれらに限定されない、公知の方法によって容易に計算することができる。同一性および類似性を測定するための方法は、公に利用可能なコンピュータプログラムに体系化されている。配列アラインメントおよびパーセント同一性計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ生物情報学コンピュータ計算スーツのＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｔｈｅ  ＡｌｉｇｎＸ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｏｆ  Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ｖ．７．０（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）、またはＥＭＢＯＳＳ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ；Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６，（６）：２７６−２７７（２０００））を用いて行われてもよい。配列の多重アラインメントは、デフォルトパラメータを使ったＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅを経由してＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手可能な、アラインメントのＣＬＵＳＴＡＬ法（ＣＬＵＳＴＡＬＷ；例えばバージョン１．８３などの）（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ，５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０（１９９４）；およびＣｈｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（１３）：３４９７−５００（２００３））を用いて行うことができる。ＣＬＵＳＴＡＬＷタンパク質アラインメントのための好適なパラメータには、ＧＡＰ  Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅペナルティ＝１５、ＧＡＰエクステンション＝０．２、マトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ（例えば、Ｇｏｎｎｅｔ２５０）、タンパク質ＥＮＤＧＡＰ＝−１、タンパク質ＧＡＰＤＩＳＴ＝４、およびＫＴＵＰＬＥ＝１が含まれる。一実施形態では、速いまたは遅いアラインメントがデフォルト設定で用いられ、ここで、遅いアラインメントが好ましい。あるいはまた、ＣＬＵＳＴＡＬＷ法（例えば、バージョン１．８３）を用いるパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰエクステンション＝１、マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６４）、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＴＯＰ  ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５をまた用いるために修正されてもよい。
【０１４１】
一態様では、好適な単離核酸分子は、本明細書に報告されるアミノ酸配列と少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも３３％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをエンコードする。好適な核酸分子は上記の相同性を有するのみならず、約３００〜約３４０個のアミノ酸、より好ましくは約３１０〜約３３０個のアミノ酸、最も好ましくは約３１８〜約３２５個のアミノ酸を有するポリペプチドを典型的にはエンコードする。
【０１４２】
本明細書で用いるところでは、用語「シグネチャーモチーフ」、「ＣＥ−７シグネチャーモチーフ」、および「診断モチーフ」は、規定の活性を有する酵素の族の間で共有される保存構造を意味する。シグネチャーモチーフは、規定の族の基質に対して類似の酵素活性を有する構造上関連する酵素の族を明確にするおよび／または同定するために用いることができる。シグネチャーモチーフは、単一隣接アミノ酸配列またはシグネチャーモチーフを一緒に形成する非接触の保存モチーフの集まりであることができる。典型的には、保存モチーフはアミノ酸配列で表される。
【０１４３】
本明細書に記載されるように、過加水分解活性を有する本酵素（「ペルヒドロラーゼ」）は、ＣＥ−７炭化水素エステラーゼの族に属する（ＤｉＣｏｓｉｍｏら、米国特許出願公開第２００９／０００５５９０号明細書）。本明細書で用いるところでは、フレーズ「酵素はＣＥ−７酵素として構造上分類される」、「ＣＥ−ペルヒドロラーゼ」または「炭水化物エステラーゼ族７酵素として構造上分類される」は、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼとして構造上分類される、過加水分解活性を有する酵素を意味するために用いられるであろう。この族の酵素は、シグネチャーモチーフの存在によって定義することができる（Ｖｉｎｃｅｎｔら、上記を参照）。ＣＥ−７エステラーゼについてのシグネチャーモチーフは、３つの保存モチーフを含む（基準配列配列番号１に関連しての残基位置番号）：
ａ）Ａｒｇ１１８−Ｇｌｙ１１９−Ｇｌｎ１２０；
ｂ）Ｇｌｙ１７９−Ｘａａ１８０−Ｓｅｒ１８１−Ｇｌｎ１８２−Ｇｌｙ１８３；および
ｃ）Ｈｉｓ２９８−Ｇｌｕ２９９。
【０１４４】
典型的には、アミノ酸残基位置１８０でのＸａａは、グリシン、アラニン、プロリン、トリプトファン、またはスレオニンである。触媒三つ組に属する３つのアミノ酸残基のうちの２つは肉太である。一実施形態では、アミノ酸残基位置１８０でのＸａａは、グリシン、アラニン、プロリン、トリプトファン、およびスレオニンからなる群から選択される。
【０１４５】
ＣＥ−７炭水化物エステラーゼ族内の保存モチーフのさらなる解析は、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼ族に属するペルヒドロラーゼをさらに定義するために用いられてもよい追加の保存モチーフ（配列番号１のアミノ酸位置２６７〜２６９でのＬＸＤ）の存在を示唆する。さらなる実施形態では、上に定義されたシグネチャーモチーフには、
Ｌｅｕ２６７−Ｘａａ２６８−Ａｓｐ２６９
と定義される第４の保存モチーフが含まれる。
【０１４６】
アミノ酸残基位置２６８でのＸａａは典型的には、イソロイシン、バリン、またはメチオニンである。第４モチーフには、触媒三つ組（Ｓｅｒ１８１−Ａｓｐ２６９−Ｈｉｓ２９８）に属するアスパラギン酸残基（肉太）が含まれる。
【０１４７】
多くの周知のグローバルアラインメントアルゴリズム（すなわち、配列解析ソフトウェア）が、ペルヒドロラーゼ活性を有する酵素を表す２つ以上のアミノ酸配列を整列させて酵素が本シグネチャーモチーフからなるかどうかを判定するために用いられてもよい。整列させられた配列は、本シグネチャーモチーフの存在を判定するために基準配列（配列番号１）と比較される。一実施形態では、基準アミノ酸配列（本明細書で使用されるところでは枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４ＴＭからのペルヒドロラーゼ配列（配列番号１））を使用するＣＬＵＳＴＡＬアラインメント（ＣＬＵＳＴＡＬＷなどの）がＣＥ−７エステラーゼ族に属するペルヒドロラーゼを同定するために用いられる。保存アミノ酸残基の相対的な番号付けは、整列させられた配列内での小さな挿入または削除（例えば、５つのアミノ酸またはそれ未満）を説明するために基準アミノ酸配列の残基番号付けに基づいている。
【０１４８】
（基準配列と比較されるときに）本シグネチャーモチーフを含む配列を同定するために用いられてもよい他の好適なアルゴリズムの例には、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８、４４３−４５３（１９７０）；グローバルアラインメントツール）およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１）；ローカルアラインメントツール）が挙げられるが、それらに限定されない。一実施形態では、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアラインメントは、デフォルトパラメータを使用して実施される。好適なデフォルトパラメータの例には、ＧＡＰオープンペナルティ＝１０およびＧＡＰエクステンションペナルティ＝０．５のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスの使用が挙げられる。
【０１４９】
本明細書に例示されるペルヒドロラーゼ間の全体的パーセント同一性の比較は、（本シグネチャーモチーフを保持しながら）配列番号１と３３％ほどに少ない同一性を有する酵素が顕著なペルヒドロラーゼ活性を示し、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼとして構造上分類されることを示す。一実施形態では、好適なペルヒドロラーゼには、ＣＥ−７シグネチャーモチーフおよび配列番号１と少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３３％、より好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも４２％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％アミノ酸同一性を含む酵素が含まれる。
【０１５０】
あるいはまた、本保存モチーフを包含する領域を含む隣接アミノ酸配列はまた、ＣＥ−７族メンバーを同定するために用いられてもよい。
【０１５１】
本明細書で用いるところでは、「コドン縮退」は、エンコードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなくヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝コードの本質に関する。従って、本発明は、本微生物ポリペプチドをエンコードするアミノ酸配列の全てまたはかなりの部分をエンコードする任意の核酸分子に関する。当業者は、所与のアミノ酸を特定するためのヌクレオチドコドンの利用で特異的な宿主細胞によって示される「コドンバイアス」をよく知っている。それ故、宿主細胞での向上した発現のための遺伝子を合成するとき、コドン利用のその頻度が宿主細胞の好ましいコドン利用の頻度に近づくように遺伝子を設計することが望ましい。
【０１５２】
本明細書で用いるところでは、用語「最適化されたコドン」は、それが様々な宿主の形質転換のための核酸分子の遺伝子またはコーディング領域に関するので、ＤＮＡがコードするポリペプチドを変更することなく宿主有機体の典型的なコドン利用を反映するための核酸分子の遺伝子またはコーディング領域でのコドンの変更を意味する。
【０１５３】
本明細書で用いるところでは、「合成遺伝子」は、当業者に公知の手順を用いて化学合成されるオリゴヌクレオチド構成要素から組み立てることができる。これらの構成要素は、遺伝子セグメントを形成するために結合され、アニールされ、遺伝子セグメントは次に全体遺伝子を構築するために酵素的に組み立てられる。ＤＮＡ配列に関するように、「化学合成された」は、成分ヌクレオチドがインビトロで組み立てられたことを意味する。ＤＮＡの手動化学合成は、十分に確立された手順を用いて成し遂げられてもよいし、または自動化化学合成は、多くの商業的に入手可能な機械の１つを用いて行うことができる。従って、遺伝子は、宿主細胞のコドンバイアスを反映するためのヌクレオチド配列の最適化に基づいて最適遺伝子発現のために調整することができる。当業者は、宿主によって有利にされるそれらのコドンの方へコドン利用がバイアスをかけられる場合に成功する遺伝子発現の可能性を十分に理解している。好ましいコドンの決定は、配列情報が入手可能である宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づくことができる。
【０１５４】
本明細書で用いるところでは、「遺伝子」は、コーディング配列に先行する調節配列（５’非コーディング配列）およびコーディング配列後の調節配列（３’非コーディング配列）を含む、特異的タンパク質を発現する核酸分子を意味する。「野生遺伝子」は、それ自体の調節配列で自然界に見いだされるような遺伝子を意味する。「キメラ遺伝子」は、自然界で一緒に見いだされない調節配列およびコーディング配列を含む、野生遺伝子ではない任意の遺伝子を意味する。従って、キメラ遺伝子は、異なる出所に由来する調節配列およびコーディング配列、または同じ出所に由来するが、自然界で見いだされるものとは異なるやり方で配置された調節配列およびコーディング配列を含んでもよい。「内在性遺伝子」は、有機体のゲノムにおいてその自然の位置の野生遺伝子を意味する。「外来」遺伝子は、宿主有機体中に普通は見いだされないが、遺伝子導入によって宿主有機体へ導入される遺伝子を意味する。外来遺伝子は、外来種有機体へ挿入された野生遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むことができる。「トランス遺伝子」は、形質転換法によってゲノムへ導入された遺伝子である。
【０１５５】
本明細書で用いるところでは、「コード配列」は、特有のアミノ酸配列についてコードするＤＮＡ配列を意味する。「好適な調節配列」は、コード配列の上流（５’−非コード配列）、内、または下流（３’−非コード配列）に配置された、そして転写、ＲＮＡプロセッシングもしくは安定性、または関連コード配列のトランスレーションに影響を及ぼすヌクレオチド配列を意味する。調節配列には、プロモーター、トランスレーションリーダー配列、ＲＮＡプロセッシングサイト、エフェクター結合サイトおよびステムループ構造が含まれてもよい。
【０１５６】
本明細書で用いるところでは、「プロモーター」は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を意味する。一般に、コード配列は、プロモーター配列に３’位で配置される。プロモーターは、全体が野生遺伝子に由来してもよいし、または自然界に見いだされる異なるプロモ−ターに由来する異なる要素からなってもよいし、またはさらに合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。異なるプロモーターが増殖の異なる段階で、または異なる環境もしくは生理学的条件に応じて遺伝子の発現を指図してもよいことは当業者によって理解される。ほとんどの時間に遺伝子を発現させるプロモーターは一般に「構成的プロモーター」と言われる。ほとんどの場合に調節配列の正確な境界は完全には画定されなかったので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有する可能性があることがさらに認められる。
【０１５７】
本明細書で用いるところでは、「３’非コード配列」は、コード配列の下流に配置されたＤＮＡ配列を意味し、ポリアデニル化認識配列（普通は真核生物に限定される）およびｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる調節シグナルをエンコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’端へのポリアデニル酸トラクトの付加（普通は真核生物に限定される）に影響を及ぼすことで特徴づけられる。
【０１５８】
本明細書で用いるところでは、用語「操作できるように結合した」は、１つの機能が他によって影響を及ぼされるように単一核酸分子上での核酸配列のつながりを意味する。例えば、プロモーターは、コード配列と、それが当該コード配列の発現に影響を及ぼすことができるとき、すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にあるとき、操作できるように結合する。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向に調節配列に操作できるように結合することができる。
【０１５９】
本明細書で用いるところでは、用語「発現」は、本発明の核酸分子に由来するセンスＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定蓄積を意味する。発現はまた、ポリペプチドへのｍＲＮＡのトランスレーションを意味してもよい。
【０１６０】
本明細書で用いるところでは、「形質転換」は、遺伝子的に安定な遺伝的形質をもたらす、宿主有機体のゲノムへの核酸分子の導入を意味する。本発明では、宿主細胞のゲノムは、染色体のおよび染色体外の（例えば、プラスミド）遺伝子を含む。形質転換した核酸分子を含有する宿主有機体は、「遺伝子組み換えの（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）」または「組み換えの」または「形質転換された」有機体と言われる。
【０１６１】
本明細書で用いるところでは、「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」は、細胞の中央代謝の部分ではなく、通常環状二本鎖ＤＮＡ分子の形にある遺伝子を多くの場合に所持する染色体外要素を意味する。かかる要素は、自己複製配列、ゲノム統合配列、多数のヌクレオチド配列がプロモーター断片を導入することができるユニークな構造へ結合したまたは再結合した、任意の出所に由来する、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの、線状もしくは環状の、ファージまたはヌクレオチド配列ならびに細胞への適切な３’非翻訳配列と一緒に選択される遺伝子産物のためのＤＮＡ配列であってもよい。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含有する、かつ、外来遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の形質転換を容易にする要素を有する特有のベクターを意味する。「発現カセット」は、外来遺伝子を含有する、かつ、外来遺伝子に加えて、外来宿主で当該遺伝子の高められた発現を可能にする要素を有する特有のベクターを意味する。
【０１６２】
本明細書で用いるところでは、用語「配列解析ソフトウェア」は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の解析のために有用である任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを意味する。「配列解析ソフトウェア」は、商業的に入手可能であってもまたは独立して開発されてもよい。典型的な配列解析ソフトウェアには、ＧＣＧスーツのプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ），ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、およびＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．１２２８  Ｓ．Ｐａｒｋ  Ｓｔ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１５  ＵＳＡ）、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（例えば、バージョン１．８３；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２（２２）：４６７３−４６８０（１９９４））、およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ），Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ  ｖ．４．０５が含まれるであろうが、それらに限定されない。本出願の脈略の中で、配列解析ソフトウェアが解析のために使用される場合、解析の結果は、特に明記されない限り、参照プログラムの「デフォルト値」をベースとしていることが理解されるであろう。本明細書で用いるところでは、「デフォルト値」は、最初に初期化されるときにソフトウェアを元々ロードするソフトウェア製造業者による任意のセットの値またはパラメータセットを意味するであろう。
【０１６３】
本明細書で用いるところでは、用語「生物学的汚染物質」は、微生物、胞子、ウィルス、プリオン、およびそれらの混合物を含むが、それらに限定されない１つ以上の望まれないおよび／または病原性の生物学的実体を意味する。本方法は、生存する生物学的汚染物質の存在を低減するおよび／または排除するために有用な、有効濃度の少なくとも１つの過カルボン酸を生成する。好ましい実施形態では、生物学的汚染物質は、生存する病原性微生物である。
【０１６４】
本明細書で用いるところでは、用語「消毒する」は、生物学的汚染物質の増殖の破壊または防止のプロセスを意味する。本明細書で用いるところでは、用語「消毒剤」は、生物学的汚染物質の増殖を破壊する、中和する、または抑制することによって消毒する試剤を意味する。典型的には、消毒剤は、無生物物体または表面を処理するために使用される。本明細書で用いるところでは、用語「消毒」は、消毒の行為またはプロセスを意味する。本明細書で用いるところでは、用語「防腐剤」は、病気運搬微生物の増殖を抑制する化学剤を意味する。一態様では、生物学的汚染物質は病原性微生物である。
【０１６５】
本明細書で用いるところでは、用語「衛生の」は、典型的には健康に有害である可能性がある作用因子を除去する、防ぐまたは制御することによって、健康の回復または保持を意味するまたはそれらに関係する。本明細書で用いるところでは、用語「殺菌する」は、衛生的にすることを意味する。本明細書で用いるところでは、用語「殺菌剤」は、殺菌試剤を意味する。本明細書で用いるところでは、用語「殺菌」は、殺菌の行為またはプロセスを意味する。
【０１６６】
本明細書で用いるところでは、用語「殺ウィルス剤（ｖｉｒｕｃｉｄｅ）」は、ウィルスを抑制するまたは破壊する試剤を意味し、「殺ウィルス剤（ｖｉｒｉｃｉｄｅ）」と同じ意味である。ウィルスを抑制するまたは破壊する能力を示す試剤は、「殺ウィルス」活性を有すると記載される。ペルオキシカルボン酸は、殺ウィルス活性を有することができる。本発明での使用に好適である可能性がある当該技術分野で公知の典型的な代わりの殺ウィルス剤には、例えば、アルコール、エーテル、クロロホルム、ホルムアルデヒド、フェノール類、ベータプロピオラクトン、ヨウ素、塩素、水銀塩、ヒドロキシルアミン、エチレンオキシド、エチレングリコール、第四級アンモニウム化合物、酵素、および洗剤が含まれる。
【０１６７】
本明細書で用いるところでは、用語「殺生物剤」は、微生物を不活性化するまたは破壊する化学剤、典型的には広いスペクトルを意味する。微生物を不活性化するまたは破壊する能力を示す化学剤は、「殺生物」活性を有すると記載される。ペルオキシカルボン酸は殺生物活性を有することができる。本発明での使用に好適である可能性がある、当該技術分野で公知の典型的な代わりの殺生物剤には、例えば、塩素、二酸化塩素、クロロイソシアヌレート、次亜塩素酸塩、オゾン、アクロレイン、アミン、塩素化フェノール化合物、銅塩、オルガノ硫黄化合物、および第四級アンモニウム塩が含まれる。
【０１６８】
本明細書で用いるところでは、フレーズ「最低殺生濃度」は、特定の接触時間で、標的微生物の生存する個体群の所望の致死の、不可逆的減少をもたらすであろう殺生剤の最低濃度を意味する。有効性は、処理後の生存する微生物のｌｏｇ１０減少によって測定することができる。一態様では、処理後の生存する微生物の目標減少は、少なくとも３−ｌｏｇ減少、より好ましくは少なくとも４−ｌｏｇ減少、最も好ましくは少なくとも５−ｌｏｇ減少である。別の態様では、最低殺生濃度は、生存する微生物細胞の少なくとも６−ｌｏｇ減少である。
【０１６９】
本明細書で用いるところでは、用語「過酸素源」および「過酸素の源」は、過酸化水素、過酸化水素付加体（例えば、尿素−過酸化水素付加体（カルバミドペルオキシド））、過ホウ酸塩、および過炭酸塩を含むが、それらに限定されない水溶液中のときに約１ｍＭ以上の濃度で過酸化水素を提供することができる化合物を意味する。本明細書に記載されるように、水性反応調合物中の過酸素化合物によって提供される過酸化水素の濃度は、反応成分を組み合わせると最初は少なくとも１ｍＭ以上である。一実施形態では、水性反応調合物中の過酸化水素濃度は、少なくとも１０ｍＭである。別の実施形態では、水性反応調合物中の過酸化水素濃度は、少なくとも１００ｍＭである。別の実施形態では、水性反応調合物中の過酸化水素濃度は、少なくとも２００ｍＭである。別の実施形態では、水性反応調合物中の過酸化水素濃度は、５００ｍＭ以上である。さらに別の実施形態では、水性反応調合物中の過酸化水素濃度は、１０００ｍＭ以上である。水性反応調合物中の過酸化水素対酵素基質、例えば、トリグリセリド（Ｈ２Ｏ２：基質）のモル比は、約０．００２〜２０、好ましくは約０．１〜１０、最も好ましくは約０．５〜５であってもよい。
【０１７０】
「オリゴ糖」とは、グリコシド結合によって結び付けられた２〜少なくとも２４個の単糖単位を含有する化合物を意味する。用語「単糖」は、実験式（ＣＨ２Ｏ）ｎ（式中、ｎ≧３である）の化合物を意味し、炭素骨格は非分岐であり、１個を除いて各炭素原子はヒドロキシル基を含有し、残りの炭素原子は炭素原子２でアルデヒドまたはケトンである。用語「単糖」はまた、細胞内の環状ヘミアセタールまたはヘミケタール形を意味する。
【０１７１】
本明細書で用いるところでは、用語「賦形剤」は、活性原料の貯蔵安定性などの、調合物中の活性成分を安定化させるために使用される不活性物質を意味する。賦形剤はまた時々、活性原料を含有する調合物を嵩高くするために使用される。本明細書に記載されるように、「活性原料」は、過加水分解活性を有する少なくとも１つの酵素を含む酵素触媒である。一実施形態では、活性原料は、過加水分解活性を有する少なくとも１つのＣＥ−７炭水化物エステラーゼである。
【０１７２】
本明細書で用いるところでは、用語「オリゴ糖賦形」は、水性酵素溶液に加えられたときに、噴霧乾燥後の活性酵素（すなわち、ペルヒドロラーゼ活性）の回収率／保持率を向上させるおよび／または生じた噴霧乾燥酵素粉末もしくは酵素粉末と有機基質との調合物の貯蔵安定性を向上させるオリゴ糖を意味する。一実施形態では、噴霧乾燥前のオリゴ糖賦形剤の添加は、カルボン酸エステル（すなわち、水を実質的に含まない貯蔵混合物）中で貯蔵されたときに酵素の貯蔵安定性を向上させる。カルボン酸エステルは、非常に低い濃度の水を含有してもよく、例えば、トリアセチンは典型的には１８０ｐｐｍ〜３００ｐｐｍの水を有する。本明細書で用いるところでは、フレーズ「水を実質的に含まない」は、カルボン酸エステル中に存在するときに酵素粉末の貯蔵安定性に悪影響を及ぼさない酵素粉末およびカルボン酸エステルの調合物中の水の濃度を意味するであろう。さらなる実施形態では、「水を実質的に含まない」は、酵素粉末およびカルボン酸エステルを含む調合物中の２０００ｐｐｍ未満、好ましくは１０００ｐｐｍ未満、より好ましくは５００ｐｐｍ未満、さらにより好ましくは２５０ｐｐｍ未満の水を意味してもよい。
【０１７３】
多成分ペルオキシカルボン酸発生システム
ペルオキシカルボン酸は非常によく反応し、一般に時間とともに濃度が低下する。これは、多くの場合長期安定性を欠く市販の予め形成されたペルオキシカルボン酸組成物についてとりわけ真実である。予め形成されたペルオキシカルボン酸の水溶液はまた、とりわけ大きいコンテナおよび／または高濃度のペルオキシカルボン酸溶液をより長い距離にわたって輸送するときに、ハンドリングおよび／または輸送困難性を提示する可能性がある。さらに、予め形成されたペルオキシカルボン酸溶液は、特定の目標用途向けに所望濃度のペルオキシカルボン酸を提供することができない可能性がある。従って、とりわけ液体調合物について、様々な反応成分を別々に保つことが非常に望ましい。
【０１７４】
所望のペルオキシカルボン酸を生成するために組み合わせられる２つ以上の成分を含む多成分ペルオキシカルボン酸発生システムの使用がこれまで報告されてきた。個々の成分は、ハンドリングするのに安全であり、輸送するのに容易であり、かつ、長期間安定であるべきである（すなわち、混合すると生成するペルオキシカルボン酸の濃度によって測定されるように）。一実施形態では、多成分酵素的ペルオキシカルボン酸発生システムの貯蔵安定性は、酵素触媒安定性の観点から測定されてもよい。
【０１７５】
多数の活性成分を分離するおよび組み合わせるためのシステムおよび手段の設計は、当該技術分野で公知であり、個々の反応成分の物理的形態に一般に依存するであろう。例えば、多数の活性流体（液体−液体）システムは典型的には、所望の漂白剤が反応性流体を混合すると生成する幾つかの漂白用途で見いだされるなどの、多室分配ボトルまたは２相システムを用いる（例えば、米国特許出願公開第２００５／０１３９６０８号明細書；米国特許第５，３９８，８４６号明細書；同第５，６２４，６３４号明細書；同第６，３９１，８４０号明細書；欧州特許第０８０７１５６Ｂ１号明細書；米国特許出願公開第２００５／０００８５２６号明細書；およびＰＣＴ公開国際公開第００／６１７１３号パンフレット）。ペルオキシカルボン酸を発生させるために用いられる多成分系の他の形態には、粉末（例えば、米国特許第５，１１６，５７５号明細書）、多層状錠剤（例えば、米国特許第６，２１０，６３９号明細書）、多区画を有する水溶解性パケット（例えば、米国特許第６，９９５，１２５号明細書）および水の添加時に反応する固体塊（例えば、米国特許第６，３１９，８８８号明細書）などの、１つ以上の固体成分または固体−液体成分の組み合わせのために設計されたものが含まれてもよいが、それらに限定されない。
【０１７６】
Ｓｃｉａｌｌａらに付与される米国特許出願公開第２００４／０１２７３８１号明細書は、水性２成分ランドリー製品を記載している。２部ランドリー製品の１つの部分は液体クリーニング組成物を含むが、第２の部分は、カルボン酸、過酸素源、および相当するペルオキシカルボン酸を含む平衡ペルオキシカルボン酸溶液を含む、漂白組成物を含む。
【０１７７】
所望のペルオキシカルボン酸濃度を有する水性ペルオキシカルボン酸溶液を迅速に生成するための酵素触媒を使用する多成分ペルオキシカルボン酸発生調合物が本明細書に提供される。混合は、使用の直前におよび／または適用のサイトで（その場で）起こってもよい。調合物は、使用まで別々のままである少なくとも２つの成分からなるであろう。成分の混合は、水性ペルオキシカルボン酸溶液を迅速に形成する。各成分の組成は、生じた水性ペルオキシカルボン酸溶液が、意図される最終用途（例えば、消毒、汚れ除去、臭い低減または漂白用途）向けに好適な有効なペルオキシカルボン酸濃度を含むように設計される。個々の成分の組成は、（１）延ばされた貯蔵安定性を提供するおよび（２）ペルオキシカルボン酸からなる好適な水性反応調合物の形成を高める能力を提供するように設計されるべきである。
【０１７８】
一実施形態では、多成分ペルオキシカルボン酸発生調合物は、２成分調合物を含む。様々な２成分調合物がこれまで報告されてきた。別の実施形態では、２成分調合物は実質的に２液体成分調合物である。最低でも、成分を組み合わせると所望のペルオキシカルボン
酸を酵素的に生成する、本多成分ペルオキシカルボン酸調合物は、（１）過加水分解活性を有する少なくとも１つの酵素触媒であって、前記少なくとも１つの酵素がＣＥ−７エステラーゼとして構造上分類される酵素触媒、（２）カルボン酸エステル基質、および（３）過酸素の水性源を含む。
【０１７９】
２成分調合物内の原料（例えば、水性反応混合物へのエステル基質の溶解性を高める原料および／または液体成分の少なくとも１つ［すなわち、酵素の過加水分解活性に有意な悪影響を持たない少なくとも１つの共溶媒］の粘度および／または濃度を修正する原料）および原料の濃度は、注意深く選択され、かつ、（１）各成分の貯蔵安定性、とりわけ酵素触媒の過加水分解活性、および（２）溶解性および／または所望の水性ペルオキシカルボン酸溶液を効果的に形成する能力を高める物理的特性を提供するようバランスをとられるべきである。
【０１８０】
多成分ペルオキシカルボン酸調合物が本明細書に提供される。この多成分調合物は、少なくとも２つの実質的に液体の成分からなる。一実施形態では、多成分調合物は、２成分調合物であり、第１液体成分と第２液体成分とを含む。用語「第１」または「第２」液体成分の使用は、指定の原料を含む２つの異なる液体成分が使用まで別々のままであるという条件で相対的である。
【０１８１】
「ＥＮＺＹＭＡＴＩＣ  ＰＥＲＡＣＩＤ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＵＳＩＮＧ  Ａ  ＣＯＳＯＬＶＥＮＴ」という表題の共同所有される、共同出願された、そして同時係属の米国特許出願代理人整理番号ＣＬ４２０５  ＵＳ  ＮＡは、エステル基質の溶解性および／または混合特性を高めるための少なくとも１つの共溶媒の使用を記載している。カルボン酸エステル基質およびペルヒドロラーゼ触媒を含む成分は、Ｌｏｇ  ＰがＰ＝［溶質］オクタノール／［溶質］水と表される、オクタノールと水との間の基質の分配係数の対数と定義される、約２未満のＬｏｇ  Ｐ値を有する有機溶媒を含む。酵素活性に有意な悪影響を持たない２以下のｌｏｇ  Ｐ値を有する幾つかの共溶媒が記載されている。一実施形態では、共溶媒は、カルボン酸エステル基質および酵素を含む反応成分内で約２０重量％〜約７０重量％である。
【０１８２】
「ＳＴＡＢＩＬＩＺＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＥＲＨＹＤＲＯＬＡＳＥＳ」という表題の共同所有される、共同出願された、そして同時係属の米国特許出願代理人整理番号ＣＬ４３８６  ＵＳ  ＮＡは、第１成分が液体カルボン酸エステルと（ａ）過加水分解活性を有する少なくとも１つのＣＥ−７エステラーゼおよび（ｂ）少なくとも１つのオリゴ糖賦形剤の調合物を含む固体酵素との調合物を含み；第２成分が過酸素源および過酸化水素安定剤を有する水を含む、２成分系の使用を記載している。一実施形態では、少なくとも１つのオリゴ糖は、少なくとも約１２５０の数平均分子量および少なくとも約９０００の重量平均分子量を有する。別の実施形態では、オリゴ糖賦形剤は、少なくとも約１７００の数平均分子量および少なくとも約１５０００の重量平均分子量を有する。別の実施形態では、オリゴ糖はマルトデキストリンである。
【０１８３】
「ＳＴＡＢＩＬＩＺＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＥＲＨＹＤＲＯＬＡＳＥＳ」という表題の共同所有される、共同出願された、そして同時係属の米国特許出願代理人整理番号ＣＬ４３８７  ＵＳ  ＮＡは、第１成分が液体カルボン酸エステルと（ａ）過加水分解活性を有する少なくとも１つのＣＥ−７エステラーゼおよび少なくとも１つのオリゴ糖賦形剤および少なくとも１つの界面活性剤；ならびに（ｂ）少なくとも１つの緩衝剤（ここで、好ましい実施形態では緩衝剤は別個の（すなわち酵素粉末とは別個の）不溶性成分としてカルボン酸エステル基質に加えられる）の調合物を含む固体酵素との調合物を含み；第２成分が過酸素源および過酸化水素安定剤を有する水を含む、２成分系の使用を記載している。一実施形態では、少なくとも１つの賦形剤は、少なくとも約１２５０の数平均分子量および少なくとも約９０００の重量平均分子量を有するオリゴ糖である。別の実施形態では、少なくとも１つの賦形剤は、少なくとも約１７００の数平均分子量および少なくとも約１５０００の重量平均分子量を有するオリゴ糖である。別の実施形態では、オリゴ糖はマルトデキストリンである。さらなる実施形態では、ｐＨ緩衝剤は重炭酸塩緩衝剤である。その上さらなる実施形態では、過酸化水素安定剤はＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬである。
【０１８４】
組成物および過加水分解活性を有する、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼ族のメンバーであるとして構造上分類される酵素の使用方法はこれまで報告されてきた。これらの「ペルヒドロラーゼ」酵素は、過酸素源と組み合わせられたときに様々なエステル基質からペルオキシカルボン酸を生成するのに特に有効である（それぞれが全体を参照により本明細書に援用される、ＤｉＣｏｓｉｍｏらに付与される同時係属の、共同所有される公開国際特許出願国際公開第２００７／０７０６０９号パンフレットならびに米国特許出願公開第２００８／０１７６２９９号明細書、同第２００８／１７６７８３号明細書、および同第２００９／０００５５９０号明細書を参照されたい）。ＤｉＣｏｓｉｍｏらに付与される公開特許出願に記載されているペルヒドロラーゼは全て、以前に報告されたＣＥ−７エステラーゼから報告されるアミノ酸配列をベースにするものであった（このグループには、アセチルキシランエステラーゼ（ＡＸＥ）およびセファロスポリンアセチルヒドロラーゼ（ＣＡＨ）が含まれる）。共同所有される、共同出願された、そして同時係属の米国特許出願代理人整理番号ＣＬ４３９２  ＵＳ  ＮＡは、改善された過加水分解活性および／または改善された過加水分解活性対加水分解活性比（すなわち、Ｐ／Ｈ比）を有する幾つかのサーモトガ種（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｓｐ．）ＣＥ−７エステラーゼの変異株を開示している。一実施形態では、２つの変異株ＣＥ−７ペルヒドロラーゼは、配列番号１９および配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【０１８５】
酵素粉末
一実施形態では、多成分調合物は、ＣＥ−７酵素として構造上分類され、過加水分解活性を有する少なくとも１つの酵素と少なくとも１つの賦形剤との調合物を含む酵素粉末を含む。一実施形態では、酵素粉末は噴霧乾燥によって形成される（すなわち、噴霧乾燥調合物である）。一実施形態では、賦形剤は、酵素粉末の約９５重量％〜約２５重量％の範囲の量で酵素粉末中に存在する。さらなる態様では、賦形剤はオリゴ糖賦形剤である。さらなる態様では、オリゴ糖賦形剤は、少なくとも約１２５０の数平均分子量および少なくとも約９０００の重量平均分子量を有し、任意選択的に少なくとも１つの界面活性剤を有する。
【０１８６】
少なくとも１つの酵素は、本明細書に記載されるＣＥ−７炭水化物エステラーゼのいずれかであることができるか、または共同所有される、同時係属の米国特許出願公開第２００８／０１７６２９９号明細書（全体を参照により本明細書に援用される）に記載されているＣＥ−７炭水化物エステラーゼのいずれかであることができる。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの酵素は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、および２５からなる群から選択される。一実施形態では、少なくとも１つの酵素は、配列番号６、７、１９、または２０に実質的に類似のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、少なくとも１つの酵素は、配列番号６、７、１９、および２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１８７】
少なくとも１つの酵素は、酵素粉末の乾燥重量を基準として約５重量パーセント（重量％）〜約７５重量％の範囲の量で酵素粉末中に存在する。酵素粉末／噴霧乾燥混合物中の酵素の好ましい重量パーセント範囲は、約１０重量％〜５０重量％であり、酵素粉末／噴霧乾燥混合物中の酵素のより好ましい重量パーセント範囲は、約２０重量％〜３３重量％である。
【０１８８】
一実施形態では、酵素粉末は賦形剤をさらに含む。一態様では、賦形剤は、酵素粉末の乾燥重量を基準として約９５重量％〜約２５重量％の範囲の量で提供される。酵素粉末中の賦形剤の好ましい重量％範囲は、約９０重量％〜５０重量％であり、酵素粉末中の賦形剤のより好ましい重量％範囲は、約８０重量％〜６７重量％である。
【０１８９】
その上さらなる実施形態では、賦形剤は少なくとも１つのオリゴ糖賦形剤である。さらにさらなる実施形態では、少なくとも１つのオリゴ糖賦形剤は、少なくとも約１２５０の数平均分子量および少なくとも約９０００の重量平均分子量を有する。幾つかの実施形態では、オリゴ糖賦形剤は、少なくとも約１７００の数平均分子量および少なくとも約１５０００の重量平均分子量を有する。本発明に有用な具体的なオリゴ糖には、マルトデキストリン、キシラン、マンナン、フコイダン、ガラクトマンナン、キトサン、ラフィノース、スタキオース、ペクチン、イヌリン、レバン、グラミナン、アミロペクチン、サッカロース、ラクツロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、ニゲロトリオース、マルトトリオース、メレジトース、マルトトリウロース、ラフィノース、ケストース、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、オリゴ糖賦形剤はマルトデキストリンである。本発明に有用なオリゴ糖ベースの賦形剤には、ヒドロキシメチルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース、ならびにそれらの混合物などの、水溶性の非イオン性セルロースエーテルが含まれてもよいが、それらに限定されない。その上さらなる実施形態では、賦形剤は、次の化合物の１つ以上から選択されるが、それらに限定されない：トレハロース、ラクトース、サッカロース、マンニトール、ソルビトール、グルコース、セロビオース、α−シクロデキストリン、カルボキシメチルセルロース。
【０１９０】
幾つかの実施形態では、酵素粉末を調製するために使用される調合剤は、任意選択的に少なくとも１つの界面活性剤を含む。好ましい態様では、少なくとも１つの界面活性剤が存在する。有用な界面活性剤には、エトキシル化ヒマシ油、ポリグリコール化グリセリド、アセチル化モノグリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル、ポロキサマー、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン誘導体、それらのモノグリセリドまたはエトキシル化誘導体、それらのジグリセリドまたはポリオキシエチレン誘導体、ドキュセート・ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、コール酸またはそれの誘導体、レシチン、リン脂質、エチレングリコールとプロピレングリコールとのブロックコポリマー、および非イオン性オルガノシリコーンなどの、イオン性および非イオン性界面活性剤または湿潤剤が含まれてもよいが、それらに限定されない。好ましくは、界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０がより好ましい。
【０１９１】
調合物の一部が酵素粉末を調製するために使用されるとき、界面活性剤は、酵素粉末中に存在するタンパク質の重量を基準として約５重量％〜０．１重量％、好ましくは酵素粉末中に存在するタンパク質の重量を基準として約２重量％〜０．５重量％の範囲の量で存在する。
【０１９２】
酵素粉末は、１つ以上の緩衝剤（例えば、重炭酸、クエン酸、酢酸、リン酸、ピロリン酸、メチルホスホン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、酒石酸、およびマレイン酸のナトリウムおよび／またはカリウム塩）、ならびに酵素安定剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸、（１−ヒドロキシエチリデン）ビスホスホン酸）をさらに含んでもよい。
【０１９３】
酵素粉末を形成するための調合物の噴霧乾燥は、例えば、Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｉｎｇ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、５ｔｈ  ｅｄ．，Ｋ．Ｍａｓｔｅｒｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  
Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．（１９９１）に、およびＰｌａｔｚ，Ｒ．らに付与されるＰＣＴ特許公開国際公開第９７／４１８３３号パンフレットおよび同第９６／３２１４９号パンフレットに概して記載されるように実施される。
【０１９４】
一般に、噴霧乾燥は、高度に分散された液体と、液体小滴の蒸発および乾燥をもたらすのに十分な容量の熱風とを一緒にすることからなる。典型的には供給物は、溶媒を蒸発させ、乾燥生成物をコレクターに搬送する暖かい濾過空気の流れ中へ噴霧される。使用済み空気は次に溶媒と共に排出される。当業者は、幾つかの異なるタイプの装置が所望の生成物を提供するために使用されてもよいことを十分理解するであろう。例えば、Ｂｕｃｈｉ  Ｌｔｄ．（Ｐｏｓｔｆａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）またはＧＥＡ  Ｎｉｒｏ  Ｃｏｒｐ．（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）によって製造される市販の噴霧乾燥機が所望のサイズの粒子を効果的に生成するであろう。これらの噴霧乾燥機、および特にそれらの噴霧器が、ダブルノズル技法を用いる２つの溶液の同時噴霧などの、特殊用途向けに改造されてもまたは特注生産されてもよいことはさらに十分理解されるであろう。より具体的には、油中水エマルジョンは１ノズルから噴霧され、マンニトールなどの非付着剤を含有する溶液は第２ノズルから共噴霧することができる。他の場合には、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ポンプを使用する特注設計のノズルを通して供給溶液を押し通すことが望ましいかもしれない。正しいモルホロジーを含む微細構造物および／または組成物が製造されるという条件で、装置の選択は決定的に重要であるわけではなく、本明細書の教示を考慮して当業者には明らかであろう。
【０１９５】
噴霧材料を乾燥させるために使用されるガスの入口および出口の両方の温度は、それが噴霧材料中の酵素の分解を引き起こさないようなものである。かかる温度は、一般には、入口温度が約５０℃〜約２２５℃の範囲であり、一方出口温度が約３０℃〜約１５０℃の範囲であるが、典型的には実験で決定される。好ましいパラメータには、約２０〜１５０ｐｓｉ（０．１４ＭＰａ〜１．０３ＭＰａ）、好ましくは約３０〜４０から１００ｐｓｉまで（０．２１〜０．２８ＭＰａから０．６９ＭＰａまで）の範囲の噴霧圧力が含まれる。典型的には、用いられる噴霧圧力は、次の（ＭＰａ）０．１４、０．２１、０．２８、０．３４、０．４１、０．４８、０．５５、０．６２、０．６９、０．７６、０．８３以上の１つであろう。
【０１９６】
酵素粉末またはカルボン酸エステル中の酵素粉末の調合物は、周囲温度で貯蔵されるときに長期間その酵素活性を実質的に保持することを要求される。酵素粉末またはカルボン酸エステル中の酵素粉末の調合物は、短期間高められた温度でその酵素活性を実質的に保持する。一実施形態では、「その酵素活性を実質的に保持する」は、カルボン酸エステルと酵素粉末とからなる調合物の調製前の酵素粉末の初期酵素活性と比べて、酵素粉末またはカルボン酸エステル中の酵素粉末の調合物が、カルボン酸エステルと酵素粉末とからなる調合物において周囲温度での延長された貯蔵期間後におよび／または高められた温度（周囲温度より上）で短い貯蔵期間後に酵素粉末または酵素粉末の調合物中の酵素の酵素活性の少なくとも約７５パーセントを保持することを意味する。延長された貯蔵期間は、周囲温度で約１年〜約２年の期間である。一実施形態では、短い貯蔵期間は、高められた温度でであり、カルボン酸エステルと酵素粉末とからなる調合物が４０℃で製造されるときから４０℃で約８週間までの期間である。別の実施形態では、高められた温度は約３０℃〜約５２℃の範囲にある。好ましい実施形態では、高められた温度は約３０℃〜約４０℃の範囲にある。
【０１９７】
幾つかの実施形態では、酵素粉末は、４０℃でカルボン酸エステルと酵素粉末とからなる調合物の調製前の酵素粉末の初期酵素活性と比べて、カルボン酸エステルと酵素粉末とからなる調合物において４０℃で８週間の貯蔵後に少なくとも１つの酵素の酵素活性の少なくとも７５パーセントを有する。他の実施形態では、酵素粉末は、４０℃でカルボン酸エステルと酵素粉末とからなる調合物の調製前の酵素粉末の初期酵素活性と比べて、カルボン酸エステルと酵素粉末とからなる調合物において４０℃で８週間の貯蔵後に少なくとも７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセントを有する。好ましくは、過加水分解活性は、以下に、実施例８〜１３に記載されるように測定されるが、過加水分解活性を測定する任意の方法を本発明の実施で用いることができる。
【０１９８】
幾つかの実施形態では、述べられた期間にわたる酵素活性のさらなる向上は、約５．５〜約９．５のｐＨ範囲で緩衝能力を有する緩衝剤を、カルボン酸エステルと噴霧乾燥酵素粉末とからなる調合物に添加することによって達成することができる。本調合物での使用のための好適な緩衝剤には、重炭酸、ピロリン酸、リン酸、メチルホスホン酸、クエン酸、酢酸、リンゴ酸、フマル酸、酒石酸、マレイン酸またはコハク酸のナトリウム塩、カリウム塩、またはナトリウムもしくはカリウム塩の混合物が含まれてもよいが、それらに限定されない。カルボン酸エステルと噴霧乾燥酵素粉末とからなる本調合物での使用のための好ましい緩衝剤には、重炭酸、ピロリン酸、リン酸、メチルホスホン酸、クエン酸、酢酸、リンゴ酸、フマル酸、酒石酸、マレイン酸またはコハク酸のナトリウム塩、カリウム塩、またはナトリウムもしくはカリウム塩の混合物が含まれる。好ましい実施形態では、緩衝剤は、重炭酸のナトリウムおよび／またはカリウム塩を含む。
【０１９９】
緩衝剤がカルボン酸エステルおよび酵素粉末調合物中に存在する実施形態では、緩衝剤は、カルボン酸エステルと酵素粉末とからなる調合物中のカルボン酸エステルの重量を基準として約０．０１重量％〜約５０重量％の範囲の量で存在してもよい。緩衝剤は、カルボン酸エステルと酵素粉末とからなる調合物中のカルボン酸エステルの重量を基準として約０．１０重量％〜約１０重量％のより好ましい範囲で存在してもよい。さらに、これらの実施形態では、酵素の過加水分解活性間の比較は、カルボン酸エステルと、約５．５〜約９．５のｐＨ範囲で緩衝能力を有する緩衝剤と、酵素粉末とからなる調合物の調製前の酵素粉末の初期過加水分解活性と比べて、カルボン酸エステルと、約５．５〜約９．５のｐＨ範囲で緩衝能力を有する緩衝剤と、酵素粉末とからなる調合物において４０℃で８週間の貯蔵後に少なくとも１つの酵素の過加水分解活性の少なくとも７５パーセントを保持する酵素粉末間として測定される。
【０２００】
噴霧乾燥酵素粉末は、トリアセチンなどの、少なくとも１つの酵素用の基質である有機化合物中の調合物として貯蔵されることが意図される。添加される過酸化水素の不存在下では、トリアセチンは通常、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼによって水溶液中で加水分解されてジアセチンおよび酢酸を生成し、酢酸の生成は反応混合物のｐＨの低下をもたらす。トリアセチン中の酵素の長期貯蔵安定性のための一要件は、トリアセチンとトリアセチン中に存在する可能性がある任意の水との有意な反応が存在しないことであり；一市販トリアセチン（Ｔｅｓｓｅｎｄｅｒｌｏ  Ｇｒｏｕｐ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって供給される）中の含水率についての規格は０．０３重量％水（３００ｐｐｍ）である。トリアセチン中の酵素の貯蔵中に起こるトリアセチンのいかなる加水分解も、酢酸を生成するであろうし、酢酸は、ＣＥ−７ペルヒドロラーゼの活性の低下または不活性化をもたらし得るし；ペルヒドロラーゼは５．０のｐＨ以下で典型的には不活性化される（ＤｉＣｏｓｉｍｏ，Ｒ．らに付与される米国特許出願公開第２００９／０００５５９０号明細書を参照されたい）。本出願での使用のために選択される賦形剤は、酢酸が調合物中の低濃度の水の存在のために発生する可能性がある条件下で酵素用の有機基質中の酵素の安定性を提供しなければならない。
【０２０１】
カルボン酸エステルおよび過酸化水素からのペルオキシカルボン酸の酵素触媒による調製のための好適な反応条件
本発明の一態様では、過加水分解活性を有する酵素触媒の存在下に、カルボン酸エステルを、過酸化水素、過ホウ酸ナトリウムまたは過炭酸ナトリウムを含むが、それらに限定されない過酸素源と反応させることによってペルオキシカルボン酸を含む水性調合物を生成するための方法が提供される。一実施形態では、酵素触媒は、ペルヒドロラーゼ活性を有する少なくとも１つの酵素であって、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼ族（ＣＥ−７；Ｃｏｕｔｉｎｈｏ，Ｐ．Ｍ．およびＨｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．、上記を参照）のメンバーとして構造上分類される酵素を含む。別の実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒は、セファロスポリンＣデアセチラーゼとして構造上分類される。別の実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒は、アセチルキシランエステラーゼとして構造上分類される。
【０２０２】
一実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒は、過加水分解活性と
ａ）アミノ酸残基１１８〜１２０でＲＧＱモチーフ；
ｂ）アミノ酸残基１７９〜１８３でＧＸＳＱＧモチーフ；および
ｃ）ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて基準配列配列番号１に整列させられるときにアミノ酸残基２９８〜２９９にＨＥモチーフ
を含むシグネチャーモチーフとを有する酵素を含む。
【０２０３】
さらなる実施形態では、シグネチャーモチーフはＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて基準配列配列番号１に整列させられるときにアミノ酸残基２６７〜２６９にＬＸＤモチーフと定義される第４保存モチーフをさらに含む。
【０２０４】
別の実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒は、本シグネチャーモチーフおよび配列番号１に付与される少なくとも３０％アミノ酸を有する酵素を含む。
【０２０５】
別の実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、および２５からなる群から選択されるペルヒドロラーゼ活性を有する酵素を含む。
【０２０６】
別の実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒は、配列番号１８と定義される隣接シグネチャーモチーフと少なくとも４０％アミノ酸同一性を有する酵素であって、上記の保存モチーフ（すなわち、ＲＧＱ、ＧＸＳＱＧ、およびＨＥ、ならびに任意選択的に、ＬＸＤ）が保存されている酵素を含む。
【０２０７】
別の実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、および２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する酵素であって、シグネチャーモチーフが保存され、ペルヒドロラーゼ活性が保持される限り１つ以上の付加、削除、または置換を有してもよい酵素を含む。
【０２０８】
好適なカルボン酸エステル基質には、次式を有するエステル：
（ａ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、
Ｘは、式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり；
Ｒ６は、ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で任意選択的に置換された、Ｃ１〜Ｃ７の線状、分岐または環式ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６は、Ｒ６がＣ２〜Ｃ７である場合に１つ以上のエーテル結合を任意選択的に含み；
Ｒ５は、ヒドロキシル基で任意選択的に置換されたＣ１〜Ｃ６の線状、分岐または環式ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個別に、１つ以下のヒドロキシル基または１つ以下のエステル基を含み、かつ、Ｒ５は１つ以上のエーテル結合を任意選択的に含み；
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までである）
を有する１つ以上のエステルであって、
２５℃で少なくとも５ｐｐｍの水への溶解度を有するエステル；または
（ｂ）構造
【化５】
0005701762.tif 000007
（式中、Ｒ１は、ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で任意選択的に置換されたＣ１〜Ｃ７の直鎖または分岐鎖のアルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個別に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有する１つ以上のグリセリド；または
（ｃ）式
【化６】
0005701762.tif 000008
（式中、Ｒ１は、ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で任意選択的に置換されたＣ１〜Ｃ７の直鎖または分岐鎖のアルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０の直鎖または分岐鎖のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、もしくは（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つ以上のエステル；または
（ｄ）１つ以上のアセチル化単糖類、アセチル化二糖類、もしくはアセチル化多糖類；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせ
が含まれてもよい。
【０２０９】
前記カルボン酸エステル基質の例には、モノアセチン；トリアセチン；モノプロピオニン；ジプロピオニン；トリプロピオニン；モノブチリン；ジブチリン；トリブチリン；グルコースペンタアセテート；キシローステトラアセテート；アセチル化キシラン；アセチル化キシラン断片；β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート；トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール；トリ−Ｏ−アセチル−グルカール；プロピレングリコールジアセテート；エチレングリコールジアセテート；１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、２，５−ペンタンジオール、１，６−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、２，５−ヘキサンジオール、１，６−ヘキサンジオール、またはそれらの任意の組み合わせのモノエステルまたはジエステルが挙げられてもよい。
【０２１０】
好ましい実施形態では、カルボン酸エステルは、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、およびそれらの組み合わせ（すなわち、混合物）からなる群から選択される液体基質である。カルボン酸エステルは、酵素触媒過加水分解すると所望濃度のペルオキシカルボン酸を生成するのに十分な濃度で反応調合物中に存在する。カルボン酸エステルは反応調合物に完全に溶ける必要はないが、相当するペルオキシカルボン酸へのペルヒドロラーゼ触媒によるエステルの転化を可能にするのに十分な溶解性を有する。カルボン酸エステルは、反応調合物の０．０５重量％〜４０重量％の濃度で、好ましくは反応調合物の０．１重量％〜２０重量％の濃度で、より好ましくは反応調合物の０．５重量％〜１０重量％の濃度で反応混合物中に存在する。
【０２１１】
過酸素源には、過酸化水素、過酸化水素付加体（例えば、尿素−過酸化水素付加体（カルバミドペルオキシド））、過ホウ酸塩および過炭酸塩が含まれてもよいが、それらに限定されない。反応調合物中の過酸素化合物の濃度は、０．００３３重量％〜約５０重量％、好ましくは０．０３３重量％〜約４０重量％、より好ましくは０．３３重量％〜約３０重量％の範囲であってもよい。
【０２１２】
多くのペルヒドロラーゼ触媒（全細胞、透過処理全細胞、および部分精製全細胞抽出物）はカタラーゼ活性を有するとこれまで報告されてきた（ＥＣ  １．１１．１．６）。カタラーゼは、酸素および水への過酸化水素の転化を触媒する。一態様では、過加水分解触媒はカタラーゼ活性を欠く。別の態様では、カタラーゼ阻害剤が反応調合物に添加される。カタラーゼ阻害剤の例には、アジ化ナトリウムおよび硫酸ヒドロキシルアミンが挙げられるが、それらに限定されない。当業者は、必要に応じてカタラーゼ阻害剤の濃度を調節することができる。カタラーゼ阻害剤の濃度は、典型的には０．１ｍＭ〜約１Ｍ，好ましくは約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、より好ましくは約１ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲である。一態様では、アジ化ナトリウム濃度は、典型的には約２０ｍＭ〜約６０ｍＭの範囲であるが、硫酸ヒドロキシルアミン濃度は、典型的には約０．５ｍＭ〜約３０ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭである。
【０２１３】
別の実施形態では、酵素触媒は、顕著なカタラーゼ活性を欠くかまたはカタラーゼ活性を低下させるまたは排除するために操作される。宿主細胞におけるカタラーゼ活性は、トランスポゾン突然変異生成、ＲＮＡアンチセンス発現、標的突然変異生成、およびランダム突然変異生成を含むが、それらに限定されない周知の技法を用いてカタラーゼ活性に関与する遺伝子の発現を崩壊させることによって下方制御するかまたは排除することができる。好ましい実施形態では、内在性カタラーゼ活性をエンコードする遺伝子は、下方制御されるかまたは崩壊させられる（すなわち、不活性化される）。本明細書で用いるところでは、「崩壊」遺伝子は、修飾遺伝子でエンコードされたタンパク質の活性および／または機能がもはや存在しないものである。遺伝子を崩壊させるための手段は、当該技術分野でよく知られており、相当するタンパク質の活性および／または機能がもはや存在しない限り、挿入、削除、または遺伝子への突然変異を含んでもよいが、それらに限定されない。さらに好ましい実施形態では、生産宿主は、ｋａｔＧおよびｋａｔＥからなる群から選択される崩壊カタラーゼ遺伝子を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）生産宿主である（米国特許出願公開第２００８／０１７６２９９号明細書を参照されたい）。別の実施形態では、生産宿主は、ｋａｔＧおよびｋａｔＥカタラーゼ遺伝子の両方で下方制御および／または崩壊を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株である。
【０２１４】
水性調合物中の触媒の濃度は、触媒の特有の触媒活性に依存し、反応の所望の速度を得るために選択される。過加水分解反応における触媒の重量は典型的には、全反応容積の１ｍＬ当たり０．０００１ｍｇ〜１０ｍｇ、好ましくは１ｍＬ当たり０．００１ｍｇ〜２．０ｍｇの範囲である。触媒はまた、当業者に周知の方法を用いて可溶性または不溶性担体上に固定化されてもよい；例えば、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ；Ｇｏｒｄｏｎ  Ｆ．Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ，Ｅｄｉｔｏｒ；Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ＵＳＡ；１９９７を参照されたい。固定化触媒の使用は、触媒の回収およびその後の反応での再使用を可能にする。酵素触媒は、全微生物細胞、透過処理微生物細胞、微生物細胞抽出物、部分精製または精製酵素、およびそれらの混合物の形態にあってもよい。
【０２１５】
一態様では、カルボン酸エステルの化学的過加水分解と酵素的過加水分解との組み合わせによって発生するペルオキシカルボン酸の濃度は、所望のｐＨでの漂白、汚れ除去、臭い低減、殺菌または消毒のための有効濃度のペルオキシカルボン酸を提供するのに十分である。別の態様では、本方法は、所望の有効濃度のペルオキシカルボン酸を生成するための酵素と酵素基質との組み合わせを提供し、ここで、添加される酵素の不存在下では、生成するペルオキシカルボン酸の濃度は顕著により低い。幾つかの場合には、無機過酸化物と酵素基質との直接化学反応による酵素基質のかなりの化学的過加水分解があるが、所望の用途での有効濃度のペルオキシカルボン酸を提供するのに十分な濃度のペルオキシカルボン酸の発生はない可能性があり、全ペルオキシカルボン酸濃度の顕著な増加は、反応調合物への適切なペルヒドロラーゼ触媒の添加によって達成される。
【０２１６】
少なくとも１つのカルボン酸エステルの過加水分解によって発生するペルオキシカルボン酸（例えば過酢酸）の濃度は、過加水分解反応の開始の１０分以内に、好ましくは５分以内に、少なくとも約２０ｐｐｍ、好ましくは少なくとも１００ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも約２００ｐｐｍペルオキシカルボン酸、より好ましくは少なくとも３００ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも５００ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも７００ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも約１０００ｐｐｍペルオキシカルボン酸、最も好ましくは少なくとも２０００ｐｐｍペルオキシカルボン酸である。ペルオキシカルボン酸を含む生成物調合物は、所望のより低い濃度のペルオキシカルボン酸の調合物を生成するために、水、または主として水からなる溶液で任意選択的に希釈されてもよい。一態様では、所望濃度のペルオキシカルボン酸を生成するために必要とされる反応時間は、約２時間以下、好ましくは約３０分以下、より好ましくは約１０分以下、最も好ましくは約５分以下である。他の態様では、ある濃度の生物学的汚染物質で汚染された硬表面または無生物物体は、前記反応成分の組み合わせから約５分〜約１６８時間内に、または約５分〜約４８時間内に、または前記反応成分の組み合わせから約５分〜２時間内に、またはその中での任意のかかる時間間隔で本明細書に記載される方法に従って形成されるペルオキシカルボン酸と接触させられる。
【０２１７】
別の態様では、本明細書に記載される方法に従って形成されるペルオキシカルボン酸は、ペルオキシカルボン酸が、消毒、漂白、防汚、殺菌、脱臭／臭い低減またはそれらの組み合わせなどの、利益を提供するために織物と接触させられる、ランドリーケア用途に使用される。ペルオキシカルボン酸は、織物プレウォッシュ処理剤、洗濯洗剤、汚れ除去剤、漂白組成物、脱臭組成物、およびリンス剤を含むが、それらに限定されない様々なランドリーケア製品に使用されてもよい。一実施形態では、標的表面向けのペルオキシカルボン酸を生成するための本方法は、その場で行われる。
【０２１８】
過酸が、漂白、汚れ除去、および臭い低減の１つ以上のために発生するランドリーケアのための本調合物に関連して、少なくとも１つのカルボン酸エステルの過加水分解によって発生する過酸（例えば、過酢酸）の濃度は、少なくとも約２ｐｐｍ、好ましくは少なくとも２０ｐｐｍ、好ましくは少なくとも１００ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも約２００ｐｐｍ過酸であってもよい。過酸が、消毒または殺菌のために発生するランドリーケアのための本システムおよび方法に関連して、少なくとも１つのカルボン酸エステルの過加水分解によって発生する過酸（例えば、過酢酸）の濃度は、過加水分解反応の開始から１０分以内、好ましくは５分以内、最も好ましくは１分以内に少なくとも約２ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも２０ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも２００ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも５００ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも７００ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも約１０００ｐｐｍ過酸、最も好ましくは少なくとも２０００ｐｐｍ過酸であってもよい。過酸を含む生成物混合物は、所望のより低い濃度の過酸の混合物を生成するために、水、または主として水からなる溶液で任意選択的に希釈されてもよい。本方法およびシステムの一態様では、所望濃度の過酸を生成するために必要とされる反応時間は、約２時間以下、好ましくは約３０分以下、より好ましくは約１０分以下、さらにより好ましくは約５分以下、最も好ましくは約１分以下である。
【０２１９】
反応の温度は、反応速度および酵素触媒活性の安定性の両方を制御するように選択される。反応の温度は、５℃〜約７５℃の好ましい範囲、約５℃〜約５５℃の反応温度のより好ましい範囲で、反応調合物の凝固点（おおよそ０℃）のすぐ上から約９５℃の範囲であってもよい。
【０２２０】
ペルオキシカルボン酸を含有する最終反応調合物のｐＨは、約２〜約９、好ましくは約３〜約８、より好ましくは約５〜約８、さらにより好ましくは約５．５〜約８、その上さらにより好ましくは約６．０〜約７．５である。別の実施形態では、反応調合物のｐＨは酸性（ｐＨ＜７）である。反応液の、および最終反応調合物のｐＨは、リン酸塩、ピロリン酸塩、重炭酸塩、酢酸塩、またはクエン酸塩を含むが、それらに限定されない好適な緩衝剤の添加によって任意選択的に調整されてもよい。用いられるとき、緩衝剤の濃度は、典型的には０．１ｍＭ〜１．０Ｍ、好ましくは１ｍＭ〜３００ｍＭ、最も好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭである。
【０２２１】
別の態様では、酵素的過加水分解反応調合物は、反応調合物へのカルボン酸エステルの溶解の速度を高めるための分散剤として働く有機溶媒を含有してもよい。かかる溶媒には、プロピレングリコールメチルエーテル、アセトン、シクロヘキサノン、ジエチレングリコールブチルエーテル、トリプロピレングリコールメチルエーテル、ジエチレングリコールメチルエーテル、プロピレングリコールブチルエーテル、ジプロピレングリコールメチルエーテル、シクロヘキサノール、ベンジルアルコール、イソプロパノール、エタノール、プロピレングリコール、およびそれらの混合物が含まれるが、それらに限定されない。
【０２２２】
別の態様では、酵素的過加水分解生成物は、望ましい機能性を提供する追加の成分を含有してもよい。これらの追加の成分には、緩衝剤、洗剤ビルダー、増粘剤、乳化剤、界面活性剤、湿潤剤、腐食防止剤（例えば、ベンゾトリアゾール）、酵素安定剤、および過酸化物安定剤（例えば、金属イオンキレート剤）が含まれるが、それらに限定されない。追加の成分の多くは、洗剤工業でよく知られている（例えば、参照により本明細書によって援用される、米国特許第５，９３２，５３２号明細書を参照されたい）。乳化剤の例には、ポリビニルアルコールまたはポリビニルピロリドンが挙げられるが、それらに限定されない。増粘剤の例には、ＬＡＰＯＮＩＴＥ（登録商標）ＲＤ、コーンスターチ、ＰＶＰ、ＣＡＲＢＯＷＡＸ（登録商標）、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）、ＣＡＢＯＳＩＬ（登録商標）、ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ２０、ＰＶＡ、およびレシチンが挙げられるが、それらに限定されない。緩衝系の例には、リン酸ナトリウム一塩基性／リン酸ナトリウム二塩基性；スルファミン酸／トリエタノールアミン；クエン酸／トリエタノールアミン；酒石酸／トリエタノールアミン；コハク酸／トリエタノールアミン；および酢酸／トリエタノールアミンが挙げられるが、それらに限定されない。界面活性剤の例には、ａ）エチレンオキシドとプロピレンオキシドとのブロックコポリマー、エトキシル化もしくはプロポキシル化線状もしくは分岐の第一級および第二級アルコール、ならびに脂肪族ホスフィンオキシドなどの非イオン界面活性剤；ｂ）第四級アンモニウム化合物、特に、さらに３つのＣ１〜Ｃ２アルキル基に結合した窒素原子に結合したＣ８〜Ｃ２０アルキル基を有する第四級アンモニウム化合物などの陽イオン界面活性剤；ｃ）アルカンカルボン酸（例えば、Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸）、アルキルホスホネート、アルカンスルホネート（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム「ＳＤＳ」）または線状もしくは分岐のアルキルベンゼンスルホネート、アルケンスルホネートなどの陰イオン界面活性剤；ならびにｄ）アミノカルボン酸、アミノジカルボン酸、アルキルベタイン、およびそれらの混合物などの両性および双性イオン界面活性剤が挙げられるが、それらに限定されない。追加の成分には、香料、染料、過酸化水素の安定剤（例えば．、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸（ＤＥＱＵＥＳＴ（登録商標）２０１０、Ｓｏｌｕｔｉａ  Ｉｎｃ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート剤）、ＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬ（ＣＡＳ＃２８０９−２１−４）、ＤＥＱＵＥＳＴ（登録商標）０５２０、ＤＥＱＵＥＳＴ（登録商標）０５３１、酵素活性の安定剤（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、ならびに洗剤ビルダーが含まれてもよい。
【０２２３】
ペルヒドロラーゼ触媒を使用するペルオキシカルボン酸のその場生成
セファロスポリンＣデアセチラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４１；系統名セファロスポリンＣアセチルヒドロラーゼ；ＣＡＨ）は、セファロスポリンＣ、７−アミノセファロスポラン酸、および７−（チオフェン−２−アセトアミド）セファロスポラン酸などのセファロスポリン上に結合したアセチルエステルを加水分解する能力を有する酵素である。Ａｂｂｏｔｔ，Ｂ．ａｎｄ  Ｆｕｋｕｄａ，Ｄ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０（３）：４１３−４１９（１９７５））。ＣＡＨは、炭水化物エステラーゼ族７と言われる構造上関連したより大きい族の酵素に属する（ＣＥ−７；Ｃｏｕｔｉｎｈｏ，Ｐ．Ｍ．，Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．、上記を参照）。
【０２２４】
ＣＥ−７族には、ＣＡＨおよびアセチルキシランエステラーゼ（ＡＸＥ；Ｅ．Ｃ．３．１．１．７２）の両方が含まれる。ＣＥ−７族メンバーは、共通の構造モチーフを共有し、それらが典型的にはアセチル化キシロオリゴ糖およびアセチル化セファロスポリンＣの両方に対してエステル加水分解活性を示すという点において完全に異常であり、ＣＥ−７族が様々な小さな基質に対して多機能のデアセチラーゼ活性を持った単一クラスのタンパク質を表すことを示唆する（Ｖｉｎｃｅｎｔら、上記を参照）。Ｖｉｎｃｅｎｔらは、この族のメンバー間での構造類似性を記載しており、ＣＥ−７族のシグネチャー配列モチーフ特性を定義している。
【０２２５】
ＣＥ−７族のメンバーは、植物、真菌類（例えば、セファロスポリジウム・アクレモニウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ））、酵母（例えば、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ））、およびサーモアナエロバクテリウム種（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）などのバクテリア；ノルカディア・ラクタムデュランス（Ｎｏｒｃａｒｄｉａ  ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ）、ならびに属バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の様々なメンバー（Ｐｏｌｉｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６３（１２）：４８０７−４８１１（１９９７）；Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．８５：５３−５７（１９９８）；Ｌｏｒｅｎｚ，Ｗ．ａｎｄ  Ｗｉｅｇｅｌ，Ｊ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７９：５４３６−５４４１（１９９７）；Ｃａｒｄｏｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５４（３）：４０６−４１２（２０００）；Ｍｉｔｓｕｓｈｉｍａら、上記を参照；Ａｂｂｏｔｔ，Ｂ．ａｎｄ  Ｆｕｋｕｄａ，Ｄ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０（３）：４１３−４１９（１９７５）；Ｖｉｎｃｅｎｔら、上記を参照；Ｔａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ，２８（２１）：４３１７−４３３１（２０００）；Ｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．，５（１０）：ａｒｔｉｃｌｅ  ７７（２００４）；Ｄｅｇｒａｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．，１４６：１５８５−１５９１（２０００）；米国特許第６，６４５，２３３号明細書；同第５，２８１，５２５号明細書；同第５，３３８，６７６号明細書；および国際公開第９９／０３９８４号パンフレット）に見いだされる。
【０２２６】
ＤｉＣｏｓｉｍｏらに付与される国際公開第２００７／０７０６０９号パンフレットならびに米国特許出願公開第２００８／０１７６２９９号明細書、同第２００８／１７６７８３号明細書および同第２００９／０００５５９０号明細書は、過酸素源と組み合わせられたときに様々なカルボン酸エステル基質から有効濃度のペルオキシカルボン酸を生成するために好適な過加水分解活性を有するＣＥ−７酵素として構造上分類される様々な酵素を開示している。改善された過加水分解活性を有する変異株ＣＥ−７酵素はまた、共同出願された、共同所有される、そして同時係属の米国特許出願（全体を参照により本明細書に援用される、「ＩＭＰＲＯＶＥＤ  ＰＥＲＨＹＤＲＯＬＡＳＥＳ  ＦＯＲ  ＥＮＺＹＭＡＴＩＣ  ＰＥＲＡＣＩＤ  ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ」という表題の代理人整理番号ＣＬ４３９２  ＵＳ  ＮＡ）に記載されている。
【０２２７】
本方法は、ＣＥ−７族の炭水化物エステラーゼに属する酵素のペルヒドロラーゼ活性を用いて水性反応条件下にその場で工業的に有用な、有効濃度のペルオキシカルボン酸を生成する。
【０２２８】
ペルオキシカルボン酸および過酸化水素の濃度を測定するためのＨＰＬＣアッセイ方法
滴定、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、質量分析法（ＭＳ）、キャピラリー電気泳動法（ＣＥ）、Ｕ．Ｋａｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．によって記載されている分析手順（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、６９（１７）：３６２３−３６２７（１９９７））、および本実施例に記載されるような２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン）−６−スルホネート（ＡＢＴＳ）アッセイ（Ｓ．Ｍｉｎｎｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．、Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３７８：２９３−２９８（１９９９）および国際公開第２００４／０５８９６１  Ａ１号パンフレット）を含むが、それらに限定されない様々な分析方法を、反応剤および生成物を分析するために本方法に用いることができる。
【０２２９】
ペルオキシカルボン酸の最低殺生濃度の測定
Ｊ．Ｇａｂｒｉｅｌｓｏｎ、ｅｔ  ａｌ．によって記載されている方法（Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５０：６３−７３（２００２））を、ペルオキシカルボン酸の、または過酸化水素および酵素基質の最低殺生濃度（ＭＢＣ）の測定のために用いることができる。このアッセイ方法は、ＸＴＴ還元阻害に基づいており、ここで、ＸＴＴ（（２，３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル］−５−［（フェニルアミノ）カルボニル］−２Ｈ−テトラゾリウム、分子内塩、モノナトリウム塩）は、４９０ｎｍまたは４５０ｎｍで測定される光学密度（ＯＤ）の変化によって微生物呼吸活性を示すレドックス染料である。しかしながら、生存プレートカウント、直接顕微鏡カウント、乾燥重量、濁度測定、吸光度、およびバイオルミネセンス（例えば、Ｂｒｏｃｋ，Ｓｅｍｏｕｒ  Ｓ．，Ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ；２００１を参照されたい）を含むが、それらに限定されない、消毒剤および防腐剤の活性を試験するために利用可能な様々な他の方法がある。
【０２３０】
酵素的に調製されたペルオキシカルボン酸組成物の使用
本方法に従って生成した酵素触媒発生ペルオキシカルボン酸は、医療機器（例えば、内視鏡）、織物（例えば、衣料品、衣服、カーペット）、食品調理表面、食品貯蔵および食品包装設備、食品の包装のために使用される材料、鶏孵化場および養鶏設備、動物囲い地、ならびに微生物および／または殺ウィルス活性を有する使用済みプロセス廃水の除染などの、生物学的汚染物質の濃度の低減のための様々な硬表面／無生物物体用途に使用することができる。酵素発生ペルオキシカルボン酸は、殺生物活性をさらに提供するためにプリオン（例えば、ある種のプロテアーゼ）を不活性化するように設計された調合物に使用されてもよい。好ましい態様では、本ペルオキシカルボン酸組成物は特に、オートクレーブ処理できない医療機器および食品包装設備用の消毒剤として有用である。本ペルオキシカルボン酸含有調合物はＧＲＡＳまたは食品グレード成分（酵素、酵素基質、過酸化水素、および緩衝剤）を使用して調製できるので、本酵素発生ペルオキシカルボン酸はまた、動物死骸、肉、果物および野菜の除染のために、または調理食品の除染のために使用されてもよい。本酵素発生ペルオキシカルボン酸は、その最終形態が粉末、液体、ゲル、フィルム、固体またはエアゾールである製品へ組み込まれてもよい。本酵素発生ペルオキシカルボン酸は、有効な除染を依然として提供する濃度に希釈されてもよい。
【０２３１】
有効濃度のペルオキシカルボン酸を含む組成物は、生物学的汚染物質で汚染された（または汚染されていると疑われる）表面および／または物体を、表面または物体を本方法によって生成する生成物と接触させることによって消毒するまたは殺菌するために使用することができる。本明細書で用いるところでは、「接触させること」は、有効濃度のペルオキシカルボン酸を含む消毒組成物を、きれいにするおよび消毒するのに十分な期間、生物学的汚染物質での汚染が疑われる表面または無生物物体と接触させることを意味する。接触させることには、有効濃度のペルオキシカルボン酸を含むペルオキシカルボン酸溶液もしくは組成物、または有効濃度のペルオキシカルボン酸を形成する溶液もしくは組成物を、ある濃度の微生物個体群で汚染されていると疑われる表面または無生物物体と、噴霧する、処理する、浸漬する、フラッシングする、上または中へ注ぐ、混合する、組み合わせる、塗装する、コートする、塗布する、貼り付けるおよび別のやり方で伝えることが含まれる。本消毒組成物は、クリーニングおよび消毒の両方を提供するためにクリーニング組成物と組み合わせられてもよい。あるいはまた、クリーニング剤（例えば、界面活性剤または洗剤）は、単一組成物でクリーニングおよび消毒の両方を提供するために本調合物中へ組み入れられてもよい。
【０２３２】
有効濃度のペルオキシカルボン酸を含む組成物はまた、少なくとも１つの追加の抗菌剤、プリオン分解プロテアーゼの組み合わせ、殺ウィルス剤、殺胞子剤、または殺生物剤を含有することができる。これらの試剤と本特許請求される方法によって生成するペルオキシカルボン酸との組み合わせは、生物学的汚染物質で汚染された（または汚染されていると疑われる）表面および／または物体をきれいにするおよび消毒するために使用されるとき増加した効果および／または相乗効果を提供することができる。好適な抗菌剤には、所望の程度の微生物防護を提供するのに十分な量での、カルボン酸エステル（例えば、ｐ−ヒドロキシアルキルベンゾエートおよびアルキルシンナメート）；スルホン酸（例えば、ドデシルベンゼンスルホン酸）；ヨード化合物または活性ハロゲン化合物（例えば、元素状ハロゲン、酸化ハロゲン（例えば、ＮａＯＣｌ、ＨＯＣｌ、ＨＯＢｒ、ＣｌＯ２）、ヨウ素、インターハロゲン化合物（例えば、一塩化ヨウ素、二塩化ヨウ素、三塩化ヨウ素、四塩化ヨウ素、塩化臭素、一臭化ヨウ素、または二臭化ヨウ素）、ポリハロゲン化物、次亜塩素酸塩、次亜塩素酸、次亜臭素酸塩、次亜臭素酸、クロロ−およびブロモ−ヒダントイン、二酸化塩素、および亜塩素酸塩）；ベンゾイルペルオキシド、アルキルベンゾイルペルオキシドを含む有機過酸化物、オゾン、一重項酸素発生剤、およびそれらの混合物；フェノール誘導体（例えば、ｏ−フェニルフェノール、ｏ−ベンジル−ｐ−クロロフェノール、第三アミルフェノールおよびＣ１〜Ｃ６アルキルヒドロキシベンゾエート）；第四級アンモニウム化合物（例えば、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウムおよびそれらの混合物）；ならびにかかる抗菌剤の混合物が含まれる。有効量の抗菌剤は、約０．００１重量％〜約６０重量％抗菌剤、約０．０１重量％〜約１５重量％抗菌剤、または約０．０８重量％〜約２．５重量％抗菌剤を含む。
【０２３３】
一態様では、本方法によって形成されるペルオキシカルボン酸は、場所上におよび／または場所に適用されたときに（生存する微生物個体群などの）生物学的汚染物質の濃度を低下させるために使用することができる。本明細書で用いるところでは、本発明の「場所」は、消毒または漂白に好適な標的表面の一部または全てを含む。標的表面には、生物学的汚染物質で潜在的に汚染され得る全ての表面が含まれる。非限定的な例には、食品もしくは飲料工業で見いだされる設備表面（タンク、コンベヤ、床、下水設備、クーラー、フリーザー、設備表面、壁、バルブ、ベルト、パイプ、下水設備、ジョイント、クレバス、それらの組み合わせなどの）；建物表面（壁、床および窓などの）；水処理施設、プールおよび健康施設、ならびに発酵タンクを含む、非食品工業関連パイプおよび下水設備；病院または動物病院表面（壁、床、ベッド、設備（内視鏡）、衣類、手術着、靴、および他の病院または動物病院表面を含む、病院／動物病院または他の医療の場で使い古しの衣類などの）；レストラン表面；浴室表面；トイレ；クロスおよび靴；家禽、畜牛、乳牛、ヤギ、ウマおよびブタなどの、家畜用の家畜小屋またはきゅう舎の表面；家禽用のまたはエビ用の孵化場；ならびに医薬品もしくは生物医薬品表面（例えば、医薬品もしくは生物医薬品製造設備、医薬品もしくは生物医薬品原料、医薬品もしくは生物医薬品賦形剤）が挙げられる。追加の硬表面にはまた、牛肉、鶏肉、豚肉、野菜、果物、シーフード、それらの組み合わせなどの食品が含まれてもよい。この場所にはまた、汚染されたリンネルまたは他の織物などの水吸収材料が含まれ得る。この場所にはまた、種子、球茎、根茎、果物、および野菜を含む収穫された植物もしくは植物生成物、成育中の植物、ならびにとりわけ、穀物、葉野菜およびサラダ作物、根菜、マメ科植物、ベリー果物、柑橘果物およびハードフルーツを含む、作物成育中植物が含まれる。
【０２３４】
硬表面材料の非限定的な例は、金属（例えば、スチール、ステンレススチール、クロム、チタン、鉄、銅、真ちゅう、アルミニウム、およびそれらの合金）、鉱物（例えば、コンクリート）、ポリマーおよびプラスチック（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンなどの、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリブタジエン、ポリ（アクリロニトリル，ブタジエン，スチレン）、ポリ（アクリロニトリル，ブタジエン）、アクリロニトリルブタジエン；ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル；およびナイロンなどのポリアミド）である。追加の表面には、煉瓦、タイル、セラミック、磁器、木材、ビニル、リノリウム、およびカーペットが含まれてもよい。
【０２３５】
本方法によって形成されるペルオキシカルボン酸は、漂白、臭い低減、汚れ除去、殺菌、および消毒を含むが、それらに限定されない利益を衣料品もしくは織物に提供するために使用されてもよい。本方法によって形成されるペルオキシカルボン酸は、織物／衣類プレウォッシュ処理剤、洗濯洗剤、汚れ除去剤、漂白組成物、脱臭組成物、およびリンス剤を含むが、それらに限定されないかなり多数のランドリーケア製品に使用されてもよい。
【０２３６】
ランドリーケア用途との関連で、用語「衣料品もしくは織物を接触させること」は、衣料品もしくは織物が本明細書に開示される調合物に暴露されることを意味する。この目的のために、多数のフォーマットがあり、調合物は、液体、固体、ゲル、ペースト、棒、錠剤、噴霧液、発泡体、粉末、または顆粒を含むが、それらに限定されない調合物が衣料品もしくは織物を処理するために使用されてもよいし、手動定量供給、装置定量供給、基質からの定量供給、ランドリー洗濯機または乾燥機からの噴霧および自動定量供給によって送出することができる。顆粒状組成物はまたコンパクト形であることができ；液体組成物はまた濃縮形にあることができる。
【０２３７】
本明細書に開示される調合物が洗濯機で使用されるとき、調合物は、洗濯洗剤に典型的な成分をさらに含有することができる。例えば、典型的な成分には、界面活性剤、漂白剤、漂白活性化剤、追加の酵素、石鹸泡抑制剤、分散剤、石灰石鹸分散剤、土壌懸濁剤および再付着防止剤、軟化剤、腐食防止剤、変色防止剤、殺菌剤、ｐＨ調整剤、非ビルダーアルカリ源、キレート剤、有機および／または無機フィラー、溶媒、ヒドロトロープ、蛍光増白剤、染料、および香料が含まれるが、それらに限定されない。
【０２３８】
本明細書に開示される調合物はまた、固体または液体形で洗剤添加物製品として使用することができる。かかる添加物製品は、通常の洗剤組成物の性能を補足するまたは強化することを意図され、クリーニングプロセスの任意の段階で添加することができる。
【０２３９】
組み換え微生物発現
インスタント配列の遺伝子および遺伝子生成物は、異種宿主細胞で、特に微生物宿主の細胞で生産されてもよい。インスタント遺伝子および核酸分子の発現のための好ましい異種宿主細胞は、真菌類またはバクテリア族内に見いだすことができ、かつ、広範囲の温度、ｐＨ値、および溶媒耐性にわたって増殖する微生物宿主である。例えば、バクテリア、酵母、および糸状菌のいずれかが本核酸分子の発現を好適にホストする可能性があると考えられる。ペルヒドロラーゼは、細胞内に、細胞外に、または細胞内および細胞外の両方の組み合わせで発現されてもよく、ここで、細胞外発現は、発酵生成物から所望のタンパク質の回収を、細胞内発現によって生産されるタンパク質の回収のための方法より容易なものにする。転写、トランスレーションおよびタンパク質生合成装置は、細胞バイオマスを発生させるために使用される細胞供給原料に関連して変わらないままであり；機能性遺伝子はとにかく発現されるであろう。宿主菌株の例には、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ヤロワイヤ（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ジモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリスロバクター属（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロロビウム属（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サイトファガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクレリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ディノコックス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルヴィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロシナス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロミクロビウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスチス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバチルス属（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、およびミキソコッカス属（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）などのバクテリア種、真菌種または酵母種が挙げられるが、それらに限定されない。一実施形態では、バクテリア宿主菌株には、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）が含まれる。好ましい実施形態では、バクテリア宿主細胞は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。
【０２４０】
大規模微生物増殖および機能性遺伝子発現は、広範囲の単純または複雑な炭水化物、有機酸およびアルコールもしくはメタンなどの、飽和炭化水素または光合成のもしくは化学的自己栄養宿主の場合には二酸化炭素、窒素、リン、硫黄、酸素、炭素または小さな無機イオンを含む任意の微量の微量栄養素の形および量を使用してもよい。増殖速度の調節は、栄養素またはエネルギー源と典型的には考えられない、特有の調節分子の添加または不添加によって影響を受ける可能性がある。
【０２４１】
好適な宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはカセットは、当該技術分野でよく知られている。典型的にはベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写およびトランスレーションを指示する配列、選択できるマーカー、および自律複製または染色体統合を可能にする配列を含有する。好適なベクターは、転写開始制御の場を提供する遺伝子の領域５’と転写終了を制御するＤＮＡ断片の領域３’とを含む。それは、両方の制御領域が形質転換した宿主細胞に相同のおよび／または生産宿主生まれの遺伝子から誘導されるときに最も好ましいが、かかる制御領域はそのように誘導される必要はない。
【０２４２】
本セファロスポリンＣデアセチラーゼコーディング領域の発現を所望の宿主細胞で推進するために有用である開始制御領域またはプロモーターは非常に多く、当業者にはおなじみである。ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）での発現のために有用な）；ＡＯＸ１（ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）での発現のために有用な）；ならびにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）での発現のために有用なａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーターおよび様々なファージプロモーターだけでなくｌａｃ、ａｒａＢ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）での発現のために有用な）を含むがそれらに限定されない、これらの遺伝子を推進することができる実質的にいかなるプロモ−ターも本発明に好適である。
【０２４３】
終了制御領域はまた、好ましい宿主細胞生まれの様々な遺伝子に由来してもよい。一実施形態では、終了制御領域の包含は随意である。別の実施形態では、キメラ遺伝子は、好ましい宿主細胞に由来する終了制御領域を含む。
【０２４４】
工業生産
様々な培養方法論がペルヒドロラーゼ触媒を製造するために適用されてもよい。例えば、組み換え微生物宿主から過剰発現された特有の遺伝子生成物の大規模生産は、回分、流加、および連続培養方法論によって生み出されてもよい。回分および流加培養法は当該技術分野で一般的であり、よく知られており、例は、Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９）およびＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６：２２７−２３４（１９９２）に見いだされる可能性がある。
【０２４５】
所望のペルヒドロラーゼ触媒の商業生産はまた、連続培養で成し遂げられてもよい。連続培養は、ある規定の培地が連続的にバイオリアクターに加えられ、等量の馴化培地が同時に処理のために取り出されるオープンシステムである。連続培養は一般に、細胞が主として対数期増殖にある一定の高い液相密度を維持する。あるいはまた、連続培養は、炭素および栄養素が連続的に加えられ、そして貴重な生成物、副生物または廃棄物が細胞集団から連続的に取り出される固定化触媒で実施されてもよい。細胞固定化は、天然および／または合成材料からなる広範囲の固体担体を使用して行われてもよい。
【０２４６】
回分発酵、流加発酵、または連続培養からの所望のペルヒドロラーゼ触媒の回収は、当業者に公知である方法のいずれかによって成し遂げられてもよい。例えば、酵素触媒が細胞内で生産されるとき、細胞ペーストは、遠心分離または膜濾過によって培地から分離され、水または所望のｐＨの水性緩衝液で任意選択的に洗浄され、次に所望のｐＨの水性緩衝液中の細胞ペーストの懸濁液は、所望の酵素触媒を含有する細胞抽出物を生成するために均質にされる。細胞抽出物は、望ましくないタンパク質を酵素触媒溶液から沈澱させるための熱処理工程の前に細胞破片を除去するためにセライトまたはシリカなどの適切な濾過助剤を通して任意選択的に濾過されてもよい。所望の酵素触媒を含有する溶液は次に、膜濾過または遠心分離によって沈澱細胞破片およびタンパク質から分離されてもよく、追加の膜濾過によって濃縮された生じた部分精製酵素触媒溶液は次に、適切なキャリア（例えば、マルトデキストリン、リン酸塩緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、またはそれらの混合物）と任意選択的に混合され、所望の酵素触媒を含む固体粉末を生成するために噴霧乾燥される。
【０２４７】
量、濃度、または他の値もしくはパラメータが、ある範囲、好ましい範囲として、または好ましい上方値と好ましい下方値とのリストとしてのどちらかで与えられるとき、これは、範囲が別々に開示されているかどうかに関係なく、任意の上方範囲限界または好ましい値と任意の下方範囲限界または好ましい値との任意のベアから形成される全ての範囲を具体的に開示するとして理解されるべきである。数値の範囲が本明細書で列挙される場合、特に明記しない限り、この範囲は、それの終点、およびこの範囲内の全ての整数および分数を含むことが意図される。範囲がある範囲を画定するときに列挙された具体的な値に限定されることは意図されない。
【０２４８】
一般的な方法
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために提供される。実施例に開示される技法が本発明の実施にうまく機能する技法に従っており、従ってその実施のための好ましいモードを構築すると考え得ることは、当業者によって十分理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示を踏まえて、今開示される方法および実施例の精神および範囲から逸脱することなく多くの変更を開示される具体的な実施形態で行うことができ、同様のまたは類似の結果を依然とし得ることを十分理解するべきである。
【０２４９】
全ての試薬および材料は、特に明記しない限り、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ＴＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）またはＳｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
【０２５０】
本明細書で以下の省略形は、次の通り測定の単位、技法、特性、または化合物に対応する：「ｓｅｃ」または「ｓ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」または「ｈｒ」は時間を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍＭ」はミルモルのを意味し、「Ｍ」はモルのを意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「ｐｐｍ」は百万当たりの部を意味し、「ｗｔ」は重量を意味し、「ｗｔ％」は重量パーセントを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｇ」は重力を意味し、「ＨＰＬＣ」は高性能液体クロマトグラフィーを意味し、「ｄｄ  Ｈ２Ｏ」は蒸留および脱イオン水を意味し、「ｄｃｗ」は乾燥細胞重量を意味し、「ＡＴＣＣ」または「ＡＴＣＣ（登録商標）」はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を意味し、「Ｕ」はペルヒドロラーゼ活性の単位を意味し、「ｒｐｍ」は回転数毎秒を意味し、「Ｔｇ」はガラス転移温度を意味し、そして「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を意味する。
【実施例】
【０２５１】
実施例１
ｋａｔＧカタラーゼ崩壊大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株の構築
カナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎ；配列番号２６）のコーディング領域を、配列番号３０として同定されるＰＣＲ生成物を発生させるために配列番号２８および配列番号２９として同定されるプライマーを使用してＰＣＲ（９４℃で０．５分、５５℃で０．５分、７０℃で１分、３０サイクル）によってプラスミドｐＫＤ１３（配列番号２７）から増幅した。ｋａｔＧ核酸配列は配列番号３１として提供され、相当するアミノ酸配列は配列番号３２である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ（登録商標）４７０７６ＴＭ）を、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ遺伝子（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｗａｎｎｅｒ，（２０００），ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９７：６６４０−６６４５）を含有する、温度感受性プラスミドｐＫＤ４６（配列番号３３）で形質転換し、３０℃で２４時間ＬＢ−ａｍｐプレート上で選択した。ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６を、エレクトロポレーション（ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ、０．２ｃｍキュベット、２．５ｋＶ、２００Ｗ、２５μＦ）による５０〜５００ｎｇのＰＣＲ生成物で形質転換し、３７℃で２４時間ＬＢ−ｋａｎプレート上で選択した。幾つかのコロニーをＬＢ−ｋａｎプレート上へ筋状にし(ｓｔｒｅａｋｅｄ)、ｐＫＤ４６プラスミドを硬化させるために４２℃で一晩培養した。コロニーを、ｋａｎＲ／ａｍｐＳの表現型を確認するためにチェックした。ゲノムＤＮＡを、ＰＵＲＥＧＥＮＥ（登録商標）ＤＮＡ精製システム（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて幾つかのコロニーから単離し、配列番号３４および配列番号３５として同定されるプライマーを使用してｋａｔＧ遺伝子の崩壊を確認するためにＰＣＲによってチェックした。幾つかのｋａｔＧ−崩壊菌株を、ＦＬＰリコンビナーゼを含有する、温度感受性プラスミドｐＣＰ２０（配列番号３６）で形質転換し、ｋａｎ遺伝子を削除するために使用し、３７℃で２４時間ＬＢ−ａｍｐプレート上で選択した。幾つかのコロニーをＬＢプレート上へ筋状にし、ｐＣＰ２０プラスミドを硬化させるために４２℃で一晩培養した。２つのコロニーを、ｋａｎＳ／ａｍｐＳの表現型を確認するためにチェックし、ＭＧ１６５５  ＫａｔＧ１およびＭＧ１６５５  ＫａｔＧ２と呼ぶ。
【０２５２】
実施例２
ｋａｔＥカタラーゼ崩壊大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株の構築
カナマイシン耐性遺伝子（配列番号２６）を、配列番号３９として同定されるＰＣＲ生成物を発生させるために配列番号３７および配列番号３８として同定されるプライマーを使用してＰＣＲ（９４℃で０．５分、５５℃で０．５分、７０℃で１分、３０サイクル）によってプラスミドｐＫＤ１３（配列番号２７）から増幅した。ｋａｔＥ核酸配列は配列番号４０として提供され、相当するアミノ酸配列は配列番号４１である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ（登録商標）４７０７６ＴＭ）を、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ遺伝子を含有する、温度感受性プラスミドｐＫＤ４６（配列番号３３）で形質転換し、３０℃で２４時間ＬＢ−ａｍｐプレート上で選択した。ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６を、エレクトロポレーション（ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ、０．２ｃｍキュベット、２．５ｋＶ、２００Ｗ、２５μＦ）による５０〜５００ｎｇのＰＣＲ生成物で形質転換し、３７℃で２４時間ＬＢ−ｋａｎプレート上で選択した。幾つかのコロニーをＬＢ−ｋａｎプレート上へ筋状にし、ｐＫＤ４６プラスミドを硬化させるために４２℃で一晩培養した。コロニーを、ｋａｎＲ／ａｍｐＳの表現型を確認するためにチェックした。ゲノムＤＮＡを、ＰＵＲＥＧＥＮＥ（登録商標）ＤＮＡ精製システムを用いて幾つかのコロニーから単離し、配列番号４２および配列番号４３として同定されるプライマーを使用してｋａｔＥ遺伝子の崩壊を確認するためにＰＣＲによってチェックした。幾つかのｋａｔＥ−崩壊菌株を、ＦＬＰリコンビナーゼを含有する、温度感受性プラスミドｐＣＰ２０（配列番号３６）で形質転換し、ｋａｎ遺伝子を削除するために使用し、３７℃で２４時間ＬＢ−ａｍｐプレート上で選択した。幾つかのコロニーをＬＢプレート上へ筋状にし、ｐＣＰ２０プラスミドを硬化させるために４２℃で一晩培養した。２つのコロニーを、ｋａｎＳ／ａｍｐＳの表現型を確認するためにチェックし、ＭＧ１６５５  ＫａｔＥ１およびＭＧ１６５５  ＫａｔＥ２と呼ぶ。
【０２５３】
実施例３
ｋａｔＧカタラーゼおよびｋａｔＥカタラーゼ崩壊大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株（ＫＬＰ１８）の構築
カナマイシン耐性遺伝子（配列番号２６）を、配列番号３９として同定されるＰＣＲ生成物を発生させるために配列番号３７および配列番号３８として同定されるプライマーを使用してＰＣＲ（９４℃で０．５分、５５℃で０．５分、７０℃で１分、３０サイクル）によってプラスミドｐＫＤ１３（配列番号２７）から増幅した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５  ＫａｔＧ１（実施例１）を、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ遺伝子を含有する、温度感受性プラスミドｐＫＤ４６（配列番号３３）で形質転換し、３０℃で２４時間ＬＢ−ａｍｐプレート上で選択した。ＭＧ１６５５  ＫａｔＧ１／ｐＫＤ４６を、エレクトロポレーション（ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ、０．２ｃｍキュベット、２．５ｋＶ、２００Ｗ、２５μＦ）による５０〜５００ｎｇのＰＣＲ生成物で形質転換し、３７℃で２４時間ＬＢ−ｋａｎプレート上で選択した。幾つかのコロニーをＬＢ−ｋａｎプレート上へ筋状にし、ｐＫＤ４６プラスミドを硬化させるために４２℃で一晩培養した。コロニーを、ｋａｎＲ／ａｍｐＳの表現型を確認するためにチェックした。ゲノムＤＮＡを、ＰＵＲＥＧＥＮＥ（登録商標）ＤＮＡ精製システムを用いて幾つかのコロニーから単離し、配列番号４２および配列番号４３として同定されるプライマーを使用してｋａｔＥ遺伝子の崩壊を確認するためにＰＣＲによってチェックした。幾つかのｋａｔＥ−崩壊菌株（ΔｋａｔＥ）を、ＦＬＰリコンビナーゼを含有する、温度感受性プラスミドｐＣＰ２０（配列番号３６）で形質転換し、ｋａｎ遺伝子を削除するために使用し、３７℃で２４時間ＬＢ−ａｍｐプレート上で選択した。幾つかのコロニーをＬＢプレート上へ筋状にし、ｐＣＰ２０プラスミドを硬化させるために４２℃で一晩培養した。２つのコロニーを、ｋａｎＳ／ａｍｐＳの表現型を確認するためにチェックし、ＭＧ１６５５  ＫａｔＧ１ＫａｔＥ１８．１およびＭＧ１６５５  ＫａｔＧ１ＫａｔＥ２３と呼ぶ。ＭＧ１６５５  ＫａｔＧ１ＫａｔＥ１８．１は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８と称される。
【０２５４】
実施例４
サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）からのペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）（登録番号ＡＥ０００５１２；領域８０４８１−８１４５８；配列番号４４）に報告されるようなサーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）からのアセチルキシランエステラーゼをエンコードする遺伝子のコーディング領域を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＮＡ  ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）での発現のために最適化されたコドンを使用して合成した。遺伝子のコーディング領域をその後、配列番号４５および配列番号４６として同定されるプライマーを使用してＰＣＲ（９４℃で０．５分、５５℃で０．５分、７０℃で１分、３０サイクル）によって増幅した。生じた核酸生成物（配列番号４７）を、ｐＳＷ１９６として同定されるプラスミドを発生させるためにｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（登録商標）へサブクローン化した。プラスミドｐＳＷ１９６を使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８（実施例３）を形質転換して菌株ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６を発生させた。ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６を、ＯＤ６００ｎｍ＝０．４〜０．５まで振盪しながら３７℃でＬＢ培地で増殖させ、その時点でＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度まで添加し、培養を２〜３時間続行した。細胞を遠心分離によって収穫し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、全可溶性タンパク質の２０〜４０％でペルヒドロラーゼの発現を確認するために行った。
【０２５５】
実施例５
サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８からのペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）（登録＃ＮＰ＿２２７８９３．１；配列番号４８）に報告されるようなサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８からのアセチルキシランエステラーゼをエンコードする遺伝子のコーディング領域を合成した（ＤＮＡ  ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ．ＣＡ）。遺伝子のコーディング領域をその後、配列番号４９および配列番号５０として同定されるプライマーを使用してＰＣＲ（９４℃で０．５分、５５℃で０．５分、７０℃で１分、３０サイクル）によって増幅した。生じた核酸生成物（配列番号５１）を制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａＩでカットし、ｐＳＷ２０７として同定されるプラスミドを発生させるためにｐＵＣ１９中のＰｓｔＩおよびＸｂａＩサイトの間でサブクローン化した。プラスミドｐＳＷ２０７を使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８（実施例３）を形質転換してＫＬＰ１８／ｐＳＷ２０７として同定される菌株を発生させた。ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２０７を、ＯＤ６００ｎｍ＝０．４〜０．５まで振盪しながら３７℃でＬＢ培地で増殖させ、その時点でＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度まで添加し、培養を２〜３時間続行した。細胞を遠心分離によって収穫し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、全可溶性タンパク質の２０〜４０％でペルヒドロラーゼ酵素の発現を確認するために行った。
【０２５６】
実施例６
ペルヒドロラーゼを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８形質転換体の発酵
発酵槽種培養物を、酵母抽出物（Ａｍｂｅｒｅｘ  ６９５、５．０ｇ／Ｌ）、Ｋ２ＨＰＯ４（１０．０ｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（７．０ｇ／Ｌ）、クエン酸ナトリウム二水和物（１．０ｇ／Ｌ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（４．０ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４七水和物（１．０ｇ／Ｌ）およびクエン酸第二鉄アンモニウム（０．１０ｇ／Ｌ）を含有する０．５Ｌの種培地を２Ｌの振盪フラスコに装入することによって調製した。培地のｐＨを６．８に調整し、培地をフラスコ中で滅菌した。ポスト滅菌添加物は、グルコース（５０重量％、１０．０ｍＬ）および１ｍＬアンピシリン（２５ｍｇ／ｍＬ）原液を含んだ。種培地を、２０％グリセロール中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２０７の１ｍＬ培養物で植菌し、３５℃および３００ｒｐｍで培養した。種培養物を、ＫＨ２ＰＯ４（３．５０ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４七水和物（０．０５ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４七水和物（２．０ｇ／Ｌ）、クエン酸ナトリウム二水和物（１．９０ｇ／Ｌ）、酵母抽出物（Ａｍｂｅｒｅｘ  ６９５、５．０ｇ／Ｌ）、Ｂｉｏｓｐｕｍｅｘ１５３Ｋ消泡剤（０．２５ｍＬ／Ｌ、Ｃｏｇｎｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｏｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＮａＣｌ（１．０ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ２二水和物（１０ｇ／Ｌ）、およびＮＩＴ微量要素溶液（１０ｍＬ／Ｌ）を含有する３５℃での８Ｌの培地と共に約１〜２ＯＤ５５０ｎｍで１４Ｌ発酵槽（Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ，ＰＡ）に移した。微量要素溶液は、クエン酸一水和物（１０ｇ／Ｌ）、ＭｎＳＯ４水和物（２ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（２ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４七水和物（０．５ｇ／Ｌ）、ＺｎＳＯ４七水和物（０．２ｇ／Ｌ）、ＣｕＳＯ４五水和物（０．０２ｇ／Ｌ）およびＮａＭｏＯ４二水和物（０．０２ｇ／Ｌ）を含有した。ポスト滅菌添加物は、グルコース溶液（５０％ｗ／ｗ、８０．０ｇ）およびアンピシリン（２５ｍｇ／ｍＬ）原液（１６．００ｍＬ）を含んだ。グルコース溶液（５０％ｗ／ｗ）を流加のために使用した。グルコース供給は、グルコース濃度が０．５ｇ／Ｌに低下したときに開始し、０．３１ｇ供給／分でスタートし、漸次それぞれ毎時０．３６、０．４２、０．４９、０．５７、０．６６、０．７７、０．９０、１．０４、１．２１、１．４１、および１．６３ｇ／分に増やし；速度はその後一定のままであった。培地中のグルコース濃度を監視し、その濃度が０．１ｇ／Ｌを超えた場合、供給速度を下げるかまたは一時的に停止した。誘導は、様々な菌株について１６ｍＬのＩＰＴＧ（０．５Ｍ）の添加でＯＤ５５０ｎｍ＝５６とＯＤ５５０ｎｍ＝８０との間で開始した。溶解酸素（ＤＯ）濃度を、空気飽和の２５％で制御した。ＤＯは、先ず羽根車かき混ぜ速度（４００〜１４００ｒｐｍ）によって、その後曝気速度（２〜１０ｓｌｐｍ）によって制御した。ｐＨを６．８に調整した。ＮＨ４ＯＨ（２９％ｗ／ｗ）およびＨ２ＳＯ４（２０％ｗ／ｖ）をｐＨ調整のために使用した。頭部圧力は０．５バールであった。細胞をＩＰＴＧ添加１６時間後に遠心分離によって収穫した。
【０２５７】
実施例７
ＣＥ−７エステラーゼ／ペルヒドロラーゼ熱処理細胞抽出物の調製
サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６）またはサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８（ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２０７）からのペルヒドロラーゼを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体の細胞抽出物を、ジチオスレイトール（１ｍＭ）を含有する０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中の細胞ペーストの懸濁液（２０重量％湿潤細胞重量）を２回、１６，０００ｐｓｉ（約１１０ＭＰａ）の作動圧力を有するＦｒｅｎｃｈプレスに通すことによって調製した。粗抽出物を次に、２０，０００×ｇで遠心分離して細胞破片を除去し、浄化細胞抽出物を生成し、それを全可溶性タンパク質についてアッセイした（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ＃  ＢＣＡ１−ＫＴ）。浄化サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８またはサーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼ含有抽出物を７５℃で２０分間加熱し、引き続き氷／水浴中で５℃に直ちに冷却した。生じた混合物を遠心分離して沈澱タンパク質を除去し、上澄液を集め、全可溶性タンパク質について前述の通り分析した。熱処理上澄液のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ペルヒドロラーゼが上澄液中に存在する全可溶性タンパク質の少なくとも約９０％を構成することを示した。
【０２５８】
実施例８
Ｔ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼ／トレハロース噴霧乾燥酵素粉末の温度安定性
重炭酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ＝８．１）中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６の様々な濃度の熱処理細胞抽出物タンパク質（ＰＡＧＥにより≧９０％Ｔ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼ）、トレハロース（Ｃａｒｇｉｌｌ）、および、任意選択的に、界面活性剤としてのｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０（ｐ８０）を含有する１０セットの水性混合物を調製した（表１）。これらの溶液を、Ｂｕｃｈｉ  Ｂ−２９０ガラス室噴霧乾燥機（入口温度＝１７０℃、出口温度＝９０℃、供給速度＝３ｍＬ／分〜１０ｍＬ／分）を用いて噴霧乾燥して１０個の噴霧乾燥酵素粉末を製造し；粉末中の重量パーセントタンパク質を、ＢＣＡ（ビシンコニン酸）タンパク質アッセイを用いて測定し、これらの粉末のガラス転移温度（Ｔｇ）を、変調示差走査熱量測定法を用いて測定した（表１）。
【０２５９】
【表２】
0005701762.tif 000009
【０２６０】
噴霧乾燥酵素粉末を４０℃で密封バイアル中に貯蔵し、１週間間隔でサンプリングし、サンプルを、２５℃で重炭酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．２）中にＴ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼ（５０μｇタンパク質／ｍＬ）、Ｈ２Ｏ２（１００ｍＭ）、トリアセチン（１００ｍＭ）およびＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬ（５００ｐｐｍ）を含有する反応液にて５分で生成した過酢酸の濃度についてアッセイし、Ｋａｒｓｔら（下記）によって報告された分析方法の修正を用いて過酢酸の生成について分析した。
【０２６１】
反応混合物のサンプル（０．０４０ｍＬ）を予定の時間（５分）に取り出し、水中の５ｍＭリン酸の０．９６０ｍＬと直ちに混合し、希釈したサンプルのｐＨをｐＨ４未満に調整することによって反応を停止させた。生じた溶液を、ＵＬＴＲＡＦＲＥＥ（登録商標）ＭＣ−フィルター装置（３０，０００  Ｎｏｒｍａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｌｉｍｉｔ（標準分子量限界）（ＮＭＷＬ），Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ；カタログ＃ＵＦＣ３ＬＫＴ  ００）を使用して１２，０００ｒｐｍで２分間の遠心分離によって濾過した。得られた濾液のアリコート（０．１００ｍＬ）を、０．３００ｍＬの脱イオン水を含有する１．５ｍＬスクリューキャップＨＰＬＣバイアル（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ；＃５１８２−０７１５）に移し、次に０．１００ｍＬのアセトニトリル中２０ｍＭのＭＴＳ（メチル−ｐ−トリルスルフィド）を加え、バイアルに蓋をし、光の不存在下での約２５℃で１０分の定温放置前に内容物を短く混合した。バイアルに次に、０．４００ｍＬのアセトニトリルと０．１００ｍＬのアセトニトリル中トリフェニルホスフィンの溶液（ＴＰＰ、４０ｍＭ）とを加え、バイアルに再び蓋をし、生じた溶液を混合し、光の不存在下に約２５℃で３０分間定温放置した。バイアルに次に、０．１００ｍＬの１０ｍＭのＮ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルアミド（ＤＥＥＴ；ＨＰＬＣ内部標準）を加え、生じた溶液を、ＭＴＳＯ（メチル−ｐ−トリルスルホキシド）、ＭＴＳと過酢酸との反応によって生成する化学量論的酸化生成物についてＨＰＬＣによって分析した。対照反応を、バックグランドＭＴＳ酸化に関して過酢酸生成の速度を補正するための、過酸化水素によるアッセイ混合物におけるＭＴＳの酸化の速度を測定するために、添加された抽出物タンパク質またはトリアセチンの不存在下に行った。ＨＰＬＣ法：Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｓｕｐｅｌｇｕａｒｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ８プレカラム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ＃５９５９０−Ｕ）付きＳｕｐｅｌｃｏ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ８カラム（１０ｃｍ×４．０ｍｍ、５μｍ）（カタログ＃５６９４２２−Ｕ）；１０マイクロリットル注入容量；１．０ｍＬ／分および周囲温度でＣＨ３ＣＮ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ＃２７０７１７）および脱イオン水でのグラジエント法。
【０２６２】
【表３】
0005701762.tif 000010
【０２６３】
Ｔ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼ／トレハロース噴霧乾燥粉末の過加水分解活性は、４０℃で８週間の貯蔵にわたって安定であった（表２）。
【０２６４】
【表４】
0005701762.tif 000011
【０２６５】
実施例９
Ｔ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼ／トレハロース噴霧乾燥酵素粉末の酵素粉末とトリアセチンとの混合物中での温度安定性
実施例８に記載されるように調製された噴霧乾燥酵素粉末を、トリアセチン中の噴霧乾燥粉末の混合物として４０℃で８週間貯蔵されたときの安定性について評価した。噴霧乾燥酵素粉末をトリアセチンに加えて８７．２ｇのトリアセチン中に０．２００ｇのタンパク質を含有する混合物を生成した。生じた混合物を４０℃で貯蔵し、十分撹拌された混合物の２．１９ｇサンプルを、トリアセチンおよびタンパク質の生じた濃度が、それぞれ、１００ｍＭおよび５０μｇ／ｍＬである、ｐＨ７．２の５０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液中に１００ｍＭ過酸化水素およびＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬ（５００ｐｐｍ）を含有する１００ｍＬ反応液中２５℃で毎週アッセイした。表４のデータと実施例８、表３のデータとの比較は、トリアセチンとの混合物として貯蔵されたときにＴ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼ／トレハロース噴霧乾燥酵素粉末の不安定性を実証する。
【０２６６】
【表５】
0005701762.tif 000012
【０２６７】
実施例１０
Ｔ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼ／マルトデキストリン噴霧乾燥酵素粉末の温度安定性
５０ｍＭ重炭酸ナトリウム（ｐＨ＝８．１）中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６の熱処理細胞抽出物タンパク質（３４ｇタンパク質／Ｌ、ＰＡＧＥにより≧９０％Ｔ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼ）および賦形剤としてのマルトデキストリン（６６．７ｇ／ＬのＭＡＬＴＲＩＮ（登録商標）Ｍ１００マルトデキストリン、１４．７ｇ／ＬのＭＡＬＴＲＩＮ（登録商標）Ｍ２５０、１４．７ｇ／ＬのＭＡＬＴＲＩＮ（登録商標）Ｍ０４０、Ｇｒａｉｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｕｓｃａｔｉｎｅ，ＩＡ）を含有する水性混合物を調製した。この溶液を、噴霧乾燥機（ＧＥＡ  Ｎｉｒｏ、３−フィート直径、入口温度＝２２６℃、出口温度＝７６℃、供給速度＝６０ｇ／分）を用いて噴霧乾燥して噴霧乾燥酵素粉末を製造し；粉末中の重量パーセントタンパク質（２０．３重量％）を、ＢＣＡ（ビシンコニン酸）タンパク質アッセイを用いて測定し、この粉末のガラス転移温度（Ｔｇ＝５４℃）を、変調示差走査熱量測定法を用いて測定した。この溶液を噴霧乾燥して粉末を製造し、それを次に４０℃で９週間貯蔵中の安定性について試験した。噴霧乾燥酵素粉末（４０℃で貯蔵される）を１週間間隔でサンプリングし、２５℃で５０ｍＭ重炭酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）中の５０μｇタンパク質／ｍＬのＴ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼ、Ｈ２Ｏ２（１００ｍＭ）、トリアセチン（１００ｍＭ）およびＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬ（５００ｐｐｍ）を使用して活性についてアッセイし、Ｋａｒｓｔら（上記を参照）によって報告された分析方法の修正を用いて過酢酸の生成について分析した。Ｔ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼ／マルトデキストリン噴霧乾燥粉末の過加水分解活性は、４０℃での８週間の貯蔵にわたって
安定であった（表５）。
【０２６８】
【表６】
0005701762.tif 000013
【０２６９】
実施例１１
酵素粉末とトリアセチンとの混合物中で貯蔵されるＴ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼ／マルトデキストリン噴霧乾燥酵素粉末の温度安定性
実施例１０に記載されるように調製された噴霧乾燥酵素粉末を、トリアセチン中の噴霧乾燥粉末の混合物として４０℃で２１週間貯蔵されたときの安定性について評価した。噴霧乾燥酵素粉末（１．２３５ｇ、２０．３重量％タンパク質）を１０９ｇのトリアセチンに加えた。生じた混合物を４０℃で貯蔵し、十分撹拌された混合物の２．１９ｇサンプルを、トリアセチンおよびタンパク質の生じた濃度が、それぞれ、１００ｍＭおよび５０μｇ／ｍＬである、ｐＨ７．２の５０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液中に過酸化水素（１００ｍＭ）およびＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬ（５００ｐｐｍ）を含有する１００ｍＬ反応液中２５℃で二重反復試験でアッセイした。表６のデータと実施例１０、表５のデータとの比較は、トリアセチンとの混合物として貯蔵されたときにＴ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼ／マルトデキストリン噴霧乾燥酵素粉末の安定性を実証する。
【０２７０】
【表７】
0005701762.tif 000014
【０２７１】
実施例１２
酵素粉末、重炭酸ナトリウムおよびトリアセチンの混合物中で貯蔵されるＴ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼ／マルトデキストリン噴霧乾燥酵素粉末の温度安定性
実施例１０に記載されるように調製された噴霧乾燥酵素粉末を、トリアセチンと重炭酸ナトリウムとの混合物中の噴霧乾燥粉末の混合物として４０℃で２１週間貯蔵されたときの安定性について評価した。噴霧乾燥酵素粉末（０．９８８ｇ、２０．３重量％タンパク質）を、８７．２ｇのトリアセチンと１６．８ｇの重炭酸ナトリウム（グレード３ＤＦ（粉末）、Ｃｈｕｒｃｈ  ＆  Ｄｗｉｇｈｔ）との混合物に加えた。生じた混合物を４０℃で貯蔵し、十分撹拌された混合物の２．６２ｇサンプルを、トリアセチン、重炭酸ナトリウムおよびタンパク質の生じた濃度が、それぞれ、１００ｍＭ、５０ｍＭ（ｐＨ７．２）および５０μｇ／ｍＬである、過酸化水素（１００ｍＭ）およびＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬ（５００ｐｐｍ）を含有する１００ｍＬ反応液中２５℃で二重反復試験でアッセイした。表７のデータと実施例１１、表６のデータとの比較は、トリアセチンおよび固体重炭酸ナトリウムとの混合物として４０℃で２１週間貯蔵されたときのＴ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼ／マルトデキストリン噴霧乾燥酵素粉末の安定性がトリアセチン単独との混合物として４０℃で２１週間貯蔵されたときのＴ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼ／マルトデキストリン噴霧乾燥酵素粉末の安定性と比較したときに改善されることを実証する。２１週などの、より長い貯蔵時間で、ペルヒドロラーゼは、トリアセチンと重炭酸ナトリウムとの混合物中で初期活性の約１００％を依然として保持する。
【０２７２】
【表８】
0005701762.tif 000015
【０２７３】
実施例１３
Ｔ．マリチマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼ／マルトデキストリン噴霧乾燥酵素粉末の温度安定性
５０ｍＭ重炭酸ナトリウム（ｐＨ＝８．１）中に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２０７の熱処理細胞抽出物タンパク質（２１ｇタンパク質／Ｌ、ＰＡＧＥにより≧９０％Ｔ．マリチマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼ）および賦形剤としてのマルトデキストリン（３１ｇ／ＬのマルトデキストリンＤＥ  １３−１７および３１ｇ／ＬのマルトデキストリンＤＥ  ４−７、Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する水性混合物を調製した。この溶液を、Ｂｕｃｈｉ  Ｂ−２９０ガラス室噴霧乾燥機（入口温度＝１７０℃、出口温度＝９０℃、供給速度＝４．５ｍＬ／分）を用いて噴霧乾燥して噴霧乾燥酵素粉末を製造し；粉末中の重量パーセントタンパク質（１８．０重量％）を、ＢＣＡ（ビシンコニン酸）タンパク質アッセイを用いて測定し、この粉末のガラス転移温度（Ｔｇ＝９０℃）を、変調示差走査熱量測定法を用いて測定した。この溶液を噴霧乾燥して粉末を製造し、それを次に４０℃で７週間の貯蔵中の安定性について試験した。噴霧乾燥酵素粉末（４０℃で貯蔵される）を１週間間隔でサンプリングし、２５℃で５０ｍＭ重炭酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）中の５０μｇタンパク質／ｍＬのＴ．マリチマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼ、Ｈ２Ｏ２（１００ｍＭ）、トリアセチン（１００ｍＭ）およびＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬ（５００ｐｐｍ）を使用して活性についてアッセイし、Ｋａｒｓｔら（上記を参照）によって報告された分析方法の修正を用いて過酢酸の生成について分析した。Ｔ．マリチマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼ／マルトデキストリン噴霧乾燥粉末の過加水分解活性は、４０℃での７週間の貯蔵にわたって安定であった（表８）。
【０２７４】
【表９】
0005701762.tif 000016
【０２７５】
実施例１４
酵素粉末とトリアセチンとの混合物中で貯蔵されたＴ．マリチマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼ／マルトデキストリン噴霧乾燥酵素粉末の温度安定性
実施例１３に記載されるように調製された噴霧乾燥酵素粉末を、トリアセチン中の噴霧乾燥粉末の混合物として４０℃で７週間貯蔵されたときの安定性について評価した。噴霧乾燥酵素粉末（０．５５６ｇ、１８．０重量％タンパク質）を４３．６ｇのトリアセチンに加えた。生じた混合物を４０℃で貯蔵し、十分撹拌された混合物の２．２１ｇサンプルを、トリアセチンおよびタンパク質の生じた濃度が、それぞれ、１００ｍＭ、５０μｇ／ｍＬである、ｐＨ７．２の５０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液中に過酸化水素（１００ｍＭ）およびＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬ（５００ｐｐｍ）を含有する１００ｍＬ反応液中２５℃で二重反復試験でアッセイした。表９のデータと実施例１３、表８のデータとの比較は、トリアセチンとの混合物として貯蔵されたときにＴ．マリチマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼ／マルトデキストリン噴霧乾燥酵素粉末の安定性を実証する。
【０２７６】
【表１０】
0005701762.tif 000017
【０２７７】
実施例１５
酵素粉末、重炭酸ナトリウムおよびトリアセチンの混合物中で貯蔵されたＴ．マリチマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼ／マルトデキストリン噴霧乾燥酵素粉末の温度安定性
実施例１３に記載されるように調製された噴霧乾燥酵素粉末を、トリアセチンと重炭酸ナトリウムとの混合物中の噴霧乾燥粉末の混合物として４０℃で７週間貯蔵されたときの安定性について評価した。噴霧乾燥酵素粉末（０．５５６ｇ、１８．０重量％タンパク質）を、４３．６ｇのトリアセチンおよび８．４ｇの重炭酸ナトリウム（グレード３ＤＦ（粉末）、Ｃｈｕｒｃｈ  ＆  Ｄｗｉｇｈｔ）に加えた。生じた混合物を４０℃で貯蔵し、十分撹拌された混合物の２．６３ｇサンプルを、トリアセチン、重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）およびタンパク質の生じた濃度が、それぞれ、１００ｍＭ、５０ｍＭおよび５０μｇ／ｍＬである、過酸化水素（１００ｍＭ）およびＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬ（５００ｐｐｍ）を含有する１００ｍＬ反応液中２５℃で二重反復試験でアッセイした。表１０のデータと実施例１４、表９のデータとの比較は、トリアセチン単独との混合物として４０℃で５、６および７週間貯蔵されたときのＴ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼ／マルトデキストリン噴霧乾燥酵素粉末の安定性と比較したとき、トリアセチンおよび固体重炭酸ナトリウムとの混合物として４０℃で５、６および７週間貯蔵されたときのＴ．マリチマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼ／マルトデキストリン噴霧乾燥酵素粉末の改善された安定性を実証する。
【０２７８】
【表１１】
0005701762.tif 000018
【０２７９】
実施例１６Ａ
サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼによる過酢酸生成への添加された溶媒の影響
９０．０ｇの脱イオン水、０．３５０ｇのＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬ（（１−ヒドロキシ−１−ホスホノエチル）ホスホン酸、水中６０重量％；Ｔｈｅｒｍｐｈｏｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、および３．２０ｇの水中３０重量％過酸化水素の第１混合物（第２の成分に相当。）を５０％水性水酸化ナトリウムでｐＨ７．２に調整し、混合物の最終重量を脱イオン水で１００．０ｇに調節した。５５．７６ｇのトリアセチン、４．２０ｇの重炭酸ナトリウム、２．５０ｇのＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ（登録商標）Ｍ５（Ｃａｂｏｔ）、０．２７０ｇの噴霧乾燥サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼ（実施例１０）、ならびにトリプロピレングリコールメチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＴＰＭ）、ジプロピレングリコールメチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＤＰＭ）、プロピレングリコールメチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＰＭ）、ジエチレングリコールブチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＤＢ）、ジプロピレングリコール（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＤＰＧ）、トリエチレングリコール、１，２−プロパンジオール、Ｎ−エチル−２−ピロリジノン、イソプロパノール、エタノール、乳酸エチル、または１，３−プロパンジオールからなる群から選択される３７．４３ｇの１つの有機溶媒の第２混合物（第１の成分に相当。）を調製した。（未溶解固形分を懸濁させるために）速く撹拌しながら第２混合物の１．０ｇアリコートを取り出し、水（ｐＨ７．２）中の過酸化水素とＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬとの９．００ｍＬの第１混合物と混合し、２５℃で撹拌しながら加え；生じた混合物は、２５５ｍＭトリアセチン、２５４ｍＭ過酸化水素および０．０５５ｍｇタンパク質／ｍＬの噴霧乾燥ペルヒドロラーゼを含有した。各溶媒についての対照反応をまた、添加されたタンパク質の不存在下での過酸化水素によるトリアセチンの化学的過加水分解によって生成する過酢酸の濃度を測定するために行った。
【０２８０】
反応混合物中の過酢酸の濃度の測定は、Ｋａｒｓｔらによって記載された方法に従って行った。反応混合物のアリコート（０．０４０ｍＬ）を予定の時間に取り出し、０．９６０ｍＬの水中５ｍＭリン酸と混合し；ｐＨ４未満への希釈サンプルのｐＨの調整は反応を直ちに停止させた。生じた溶液を、ＵＬＴＲＡＦＲＥＥ（登録商標）ＭＣ−フィルター装置（３０，０００  Ｎｏｒｍａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｌｉｍｉｔ（ＮＭＷＬ），Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ＃ＵＦＣ３ＬＫＴ  ００）を使用して１２，０００ｒｐｍで２分間の遠心分離によって濾過した。得られた濾液のアリコート（０．１００ｍＬ）を、０．３００ｍＬの脱イオン水を含有する１．５ｍＬスクリューキャップＨＰＬＣバイアル（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ；＃５１８２−０７１５）に移し、次に０．１００ｍＬのアセトニトリル中２０ｍＭのＭＴＳ（メチル−ｐ−トリル−スルフィド）を加え、バイアルに蓋をし、光の不存在下での約２５℃で１０分の定温放置前に内容物を短く混合した。各バイアルに次に、０．４００ｍＬのアセトニトリルと０．１００ｍＬのアセトニトリル中トリフェニルホスフィンの溶液（ＴＰＰ、４０ｍＭ）とを加え、バイアルに再び蓋をし、生じた溶液を混合し、光の不存在下に約２５℃で３０分間定温放置した。各バイアルに次に、０．１００ｍＬの１０ｍＭのＮ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルアミド（ＤＥＥＴ；ＨＰＬＣ内部標準）を加え、生じた溶液を表２に記載されるようにＨＰＬＣによって分析した。
【０２８１】
ＨＰＬＣ法：
Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ８カラム（１０ｃｍ×４．０ｍｍ、５μｍ）（カタログ＃５６９４２２−Ｕ）ｗ／プレカラムＳｕｐｅｌｃｏ  Ｓｕｐｅｌｇｕａｒｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ＃５９５９０−Ｕ）；１０マイクロリットル注入容量；；１．０ｍＬ／分および周囲温度でＣＨ３ＣＮ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；＃２７０７１７）および脱イオン水でのグラジエント法：
【０２８２】
【表１２】
0005701762.tif 000019
【０２８３】
上記の反応について０．５分、１分、２分、５分および１０分で生成した過酢酸濃度を下の表１１にリストする。
【０２８４】
【表１３】
0005701762.tif 000020
【０２８５】
トリアセチンと有機溶媒との混合物中の噴霧乾燥酵素の安定性を実証するために、トリアセチン、重炭酸ナトリウム、ＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ（登録商標）Ｍ５（Ｃａｂｏｔ）、噴霧乾燥サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼ（実施例１０）、および上記のトリプロピレングリコールメチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＴＰＭ）または１，２−プロパンジオールのどちらかの混合物を、周囲温度で２４時間貯蔵し、次に（未溶解固形分を懸濁させるために）速く撹拌しながらこれらの混合物のそれぞれの１．０ｇアリコートを取り出し、２５℃で撹拌しながら水（ｐＨ７．２）中の過酸化水素とＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬとの（上記の通り）新鮮に調製された９．００ｍＬの混合物と混合し；生じた混合物は、２５５ｍＭトリアセチン、２５４ｍＭ過酸化水素および０．０５５ｍｇタンパク質／ｍＬの噴霧乾燥ペルヒドロラーゼを含有した。各溶媒についての対照反応をまた、添加されたタンパク質の不存在下での過酸化水素によるトリアセチンの化学的過加水分解によって生成する過酢酸の濃度を測定するために行った。反応混合物中の過酢酸の濃度の測定は、Ｋａｒｓｔらによって記載された方法に従って行った（表１２）。
【０２８６】
【表１４】
0005701762.tif 000021
【０２８７】
実施例１６Ｂ
添加された溶媒の存在下または不存在下でのサーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼによる過酢酸生成の比較
４０．０ｇの脱イオン水、０．１５７５ｇのＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬ（（１−ヒドロキシ−１−ホスホノエチル）ホスホン酸、水中６０重量％；Ｔｈｅｒｍｐｈｏｓ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、および１．４４ｇの水中３０重量％過酸化水素の第１混合物（第２の成分に相当。）を５０％水性水酸化ナトリウムでｐＨ７．２に調整し、混合物の最終重量を脱イオン水で４６．８７ｇに調節した。２．７８ｇのトリアセチン、０．２１０ｇの重炭酸ナトリウム、０．１２５ｇのＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ（登録商標）Ｍ５（Ｃａｂｏｔ）および０．０１３５ｇの噴霧乾燥サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼ（実施例１０）の第２混合物（第１の成分に相当。）を調製し、水（ｐＨ７．２）中の過酸化水素とＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬとの第１混合物を、２５℃で撹拌しながら第２混合物に加え；得られた生じた混合物は、２５５ｍＭトリアセチン、２５４ｍＭ過酸化水素および０．０５５ｍｇタンパク質／ｍＬの噴霧乾燥ペルヒドロラーゼを含有した。反応混合物中の過酢酸の濃度の測定は、Ｋａｒｓｔら（上記を参照）によって記載された方法に従って行った。対照反応をまた、添加されたペルヒドロラーゼの不存在下での過酸化水素によるトリアセチンの化学的過加水分解によって生成する過酢酸の濃度を測定するために行った。
【０２８８】
１．８７２ｇのプロピレングリコールモノメチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＰＭ）またはジプロピレングリコールモノメチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＤＰＭ）のどちらかが反応混合物中の等量の水と置き換わった、上記の反応を繰り返した。４０．０ｇの脱イオン水、０．１７５ｇのＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬ、および１．６０ｇの水中３０重量％過酸化水素の第１混合物を５０％水性水酸化ナトリウムでｐＨ７．２に調整し、混合物の最終重量を脱イオン水で５０．０ｇに調節した。２．７８ｇのトリアセチン、１．８７２ｇのプロピレングリコールモノメチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＰＭ）またはジプロピレングリコールモノメチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＤＰＭ）のどちらか、０．２１０ｇの重炭酸ナトリウム、０．１２５ｇのＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ（登録商標）Ｍ５（Ｃａｂｏｔ）および０．０１３５ｇの噴霧乾燥サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼ（実施例１０）の第２混合物を調製し、水（ｐＨ７．２）中の過酸化水素とＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬの４５．０ｇの第１混合物を、２５℃で撹拌しながら第２混合物に加え；生じた混合物（ｐＨ６．５）は、２５５ｍＭトリアセチン、２５４ｍＭ過酸化水素および０．０５５ｍｇタンパク質／ｍＬの噴霧乾燥ペルヒドロラーゼを含有した。対照反応をまた、添加された抽出物タンパク質の不存在下での過酸化水素によるトリアセチンの化学的過加水分解によって生成する過酢酸の濃度を測定するために行った。上記の３つの反応について０．５分、１分、２分、５分および１０分で生成した過酢酸濃度を下の表１３にリストする。
【０２８９】
【表１５】
0005701762.tif 000022
【０２９０】
実施例１７
撹拌反応と比較して２区画スプレー・ボトルを使用するその場ペルオキシカルボン酸発生のための溶媒の使用
２０００ｐｐｍのＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬ（（１−ヒドロキシ−１−ホスホノエチル）ホスホン酸、水中６０重量％；Ｔｈｅｒｍｐｈｏｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を含有する１００ｇの０．２０Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液；２８０ｇの脱イオン水、および５．２０ｇの水中３０重量％過酸化水素の第１混合物（第２の成分に相当。）を５０％水性水酸化ナトリウムでｐＨ７．２に調整し、混合物の最終重量を脱イオン水で４００ｇに調節した。８３．４ｇのトリアセチン、３．７５ｇのＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ（登録商標）Ｍ５（Ｃａｂｏｔ）、０．７５０ｇの噴霧乾燥サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）ペルヒドロラーゼ（実施例１０）、ならびにプロピレングリコールメチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＰＭ）、トリプロピレングリコールメチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＴＰＭ）、ジエチレングリコールメチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＤＭ）、プロピレングリコールｎ−ブチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＰＮＢ）、プロピレングリコールｎ−プロピルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＰｎＰ）、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＰＭＡ）、ジプロピレングリコール、エタノール、イソプロパノール、および１，２−プロパンジオールから選択される６２．１ｇの単一溶媒を含有する、第２混合物（第１の成分に相当。）を別々に調製した。２５℃での第１反応で、１．０ｇの第１混合物を９．０ｇの第２混合物と反応の最初の３０〜６０秒間撹拌し（６．５〜６．０の反応ｐＨ）、サンプルを抜き取り、過酢酸生成について分析し；生じた反応混合物は、２５５ｍＭトリアセチン、１０３ｍＭ過酸化水素および１００μｇタンパク質／ｍＬの噴霧乾燥ペルヒドロラーゼを含有した。反応混合物中の過酢酸の濃度（下の表１４）の測定は、Ｋａｒｓｔら（上記を参照）によって記載された方法に従って行った。対照反応をまた、添加されたペルヒドロラーゼの不存在下での過酸
化水素によるトリアセチンの化学的過加水分解によって生成する過酢酸の濃度を測定するために行った。
【０２９１】
上記の通り調製された第１混合物および第２混合物を、ボトルが９重量部の第１混合物と１重量部の第２混合物との混合物を噴霧するようにセットされている、２区画スプレー・ボトル（Ｔａｋｅ５（Ｒｏｇｕｅ  Ｒｉｖｅｒ，ＯＲ）によって製造された、Ｃｕｓｔｏｍ  Ｄｕａｌ−Ｌｉｑｕｉｄ  Ｖａｒｉａｂｌｅ−Ｒａｔｉｏ  Ｓｐｒａｙｅｒ，Ｍｏｄｅｌ  ＤＬＳ  ２００）の２区画の１つにそれぞれ別々に装入した。２つの混合物を１２．５ｃｍ直径結晶皿へ噴霧し、生じた反応混合物（６．５〜６．０の反応液ｐＨ）は、２５５ｍＭトリアセチン、１００ｍＭ過酸化水素および０．１００ｍｇタンパク質／ｍＬの噴霧乾燥ペルヒドロラーゼを含有した。噴霧された反応混合物を予定の時間にサンプリングし、Ｋａｒｓｔら（上記を参照）によって記載された方法に従って過酢酸について分析した（下の表１４）。
【０２９２】
【表１６】
0005701762.tif 000023
【０２９３】
【表１７】
0005701762.tif 000024
【０２９４】
【表１８】
0005701762.tif 000025
【０２９５】
実施例１８
酵素触媒としてサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼを使用するペルオキシカルボン酸生成
サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）からのペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現は、実施例１〜３および５に記載された方法に従って成し遂げる。サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼを発現するバクテリア形質転換体の発酵は、先行実施例６に従って行い、噴霧乾燥サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼの調製は、実施１３に記載された方法を用いて成し遂げる。サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼのクローニング、発現、および調製のための技法に関する追加情報は、２００８年６月２０日出願の米国特許出願第１２／１４３，３７５号明細書で入手可能である。
【０２９６】
添加された溶媒の存在下および不存在下でのサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼによる過酢酸生成の比較を行う。４０．０ｇの脱イオン水、０．１５７５ｇのＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬ（（１−ヒドロキシ−１−ホスホノエチル）ホスホン酸、水中６０重量；Ｔｈｅｒｍｐｈｏｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、および１．４４ｇの水中３０重量％過酸化水素の第１混合物（第２の成分に相当。）を５０％水性水酸化ナトリウムでｐＨ７．２に調整し、混合物の最終重量を脱イオン水で４６．８７ｇに調節する。２．７８ｇのトリアセチン、０．２１０ｇの重炭酸ナトリウム、０．１２５ｇのＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ（登録商標）Ｍ５（Ｃａｂｏｔ）および０．０１３５ｇの噴霧乾燥サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼの第２混合物（第１の成分に相当。）を調製し、水（ｐＨ７．２）中の過酸化水素とＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬとの第１混合物を、２５℃で撹拌しながら第２混合物に加え；生じた混合物は、２５５ｍＭトリアセチン、２５４ｍＭ過酸化水素および０．０５５ｍｇタンパク質／ｍＬの噴霧乾燥ペルヒドロラーゼを含有する。反応混合物中の過酢酸の濃度の測定は、Ｋａｒｓｔら（上記を参照）によって記載された方法に従って行う。対照反応をまた、添加されたペルヒドロラーゼの不存在下での過酸化水素によるトリアセチンの化学的過加水分解によって生成する過酢酸の濃度を測定するために行う。
【０２９７】
１．８７２ｇのプロピレングリコールモノメチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＰＭ）またはジプロピレングリコールモノメチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＤＰＭ）のどちらかが反応混合物中の等量の水と置き換わっている、上記の反応を繰り返す。４０．０ｇの脱イオン水、０．１７５ｇのＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬ、および１．６０ｇの水中３０重量％過酸化水素の第１混合物を５０％水性水酸化ナトリウムでｐＨ７．２に調整し、混合物の最終重量を脱イオン水で５０．０ｇに調節する。２．７８ｇのトリアセチン、１．８７２ｇのプロピレングリコールモノメチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＰＭ）またはジプロピレングリコールモノメチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＤＰＭ）のどちらか、０．２１０ｇの重炭酸ナトリウム、０．１２５ｇのＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ（登録商標）Ｍ５（Ｃａｂｏｔ）および０．０１３５ｇの噴霧乾燥サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼの第２混合物を調製し、水（ｐＨ７．２）中の過酸化水素とＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬとの第１混合物４５．０ｇを、２５℃で撹拌しながら第２混合物に加え；生じた混合物（ｐＨ６．５）は、２５５ｍＭトリアセチン、２５４ｍＭ過酸化水素および０．０５５ｍｇタンパク質／ｍＬの噴霧乾燥ペルヒドロラーゼを含有する。対照反応をまた、添加された抽出物タンパク質の不存在下での過酸化水素によるトリアセチンの化学的過加水分解によって生成する過酢酸の濃度を測定するために行う。上記の３つの反応について０．５分、１分、２分、５分および１０分で生成する過酢酸濃度を測定し、報告する。
【０２９８】
実施例１９
撹拌反応と比較して２区画スプレー・デバイスを使用するおよびサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼを使用するその場ペルオキシカルボン酸発生のための溶媒の使用
２０００ｐｐｍのＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬ（（１−ヒドロキシ−１−ホスホノエチル）ホスホン酸、水中６０重量％；Ｔｈｅｒｍｐｈｏｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を含有する１００ｇの０．２０Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液、２８０ｇの脱イオン水、および５．２０ｇの水中３０重量％過酸化水素の第１混合物（第２の成分に相当。）を５０％水性水酸化ナトリウムでｐＨ７．２に調整し、混合物の最終重量を脱イオン水で４００ｇに調節する。８３．４ｇのトリアセチン、３．７５ｇのＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ（登録商標）Ｍ５（Ｃａｂｏｔ）、０．７５０ｇの噴霧乾燥サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼ（実施例１３）、ならびにプロピレングリコールメチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＰＭ）、トリプロピレングリコールメチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＴＰＭ）、ジエチレングリコールメチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＤＭ）、プロピレングリコールｎ−ブチルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＰＮＢ）、プロピレングリコールｎ−プロピルエーテル（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＰｎＰ）、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート（ＤＯＷＡＮＯＬ（登録商標）ＰＭＡ）、ジプロピレングリコール、エタノール、イソプロパノール、および１，２−プロパンジオールから選択される６２．１ｇの単
一溶媒を含有する、第２混合物（第１の成分に相当。）を別々に調製する。２５℃での第１反応では、１．０ｇの第１混合物を９．０ｇの第２混合物と反応の最初の３０〜６０秒間撹拌し（６．５〜６．０の反応ｐＨ）、サンプルを抜き取り、過酢酸生成について分析し；生じた反応混合物は、２５５ｍＭトリアセチン、１０３ｍＭ過酸化水素および１００μｇタンパク質／ｍＬの噴霧乾燥ペルヒドロラーゼを含有する。反応混合物中の過酢酸の濃度の測定は、Ｋａｒｓｔら（上記を参照）によって記載された方法に従って行う。対照反応をまた、添加されたペルヒドロラーゼの不存在下での過酸化水素によるトリアセチンの化学的過加水分解によって生成する過酢酸の濃度を測定するために行う。
【０２９９】
上記の通り調製された第１混合物および第２混合物を、ボトルが９重量部の第１混合物と１重量部の第２混合物との混合物を噴霧するようにセットされている、２区画スプレー・ボトル（Ｔａｋｅ５（Ｒｏｇｕｅ  Ｒｉｖｅｒ，ＯＲ）によって製造された、Ｃｕｓｔｏｍ  Ｄｕａｌ−Ｌｉｑｕｉｄ  Ｖａｒｉａｂｌｅ−Ｒａｔｉｏ  Ｓｐｒａｙｅｒ，Ｍｏｄｅｌ  ＤＬＳ  ２００）の２区画の１つにそれぞれ別々に装入する。２つの混合物を１２．５ｃｍ直径結晶皿へ噴霧し、生じた反応混合物（６．５〜６．０の反応液ｐＨ）は、２５５ｍＭトリアセチン、１００ｍＭ過酸化水素および０．１００ｍｇタンパク質／ｍＬの噴霧乾燥ペルヒドロラーゼを含有する。噴霧された反応混合物を予定の時間にサンプリングし、Ｋａｒｓｔら（上記を参照）によって記載された方法に従って過酢酸について分析する。
【０３００】
実施例２０
例示的な２成分系
２成分その場ペルオキシカルボン酸消毒調合物の一例を以下に記載する。
【０３０１】
【表１９】
0005701762.tif 000026
【０３０２】
上記の２成分その場ペルオキシカルボン酸消毒調合物について、成分Ａは、成分Ａと成分Ｂとの総合重量の約２．６重量％を占め、成分Ｂ対成分Ａの重量比は約３８：１である。２成分その場ペルオキシカルボン酸消毒調合物のためのある種の用途では、成分Ｂ対成分Ａの比は、１０部〜１部（重量による）の成分Ｂが、消毒のために有効な濃度でペルオキシカルボン酸を生成するために１部（重量による）の成分Ａと混合される、１：１〜１０：１の範囲内にあることが望ましいかもしれない。例えば、第１用途では、１０：１の成分Ｂ対成分Ａの最大比が用いられる場合、デュアル液体固定比噴霧器（Ｍｏｄｅｌ  ＤＬＳ１００、Ｔａｋｅ５）またはデュアル液体可変比噴霧器（Ｍｏｄｅｌ  ＤＬＳ２００、Ｔａｋｅ５）などの２区画スプレー・ボトルが利用される。第２用途では、破壊できるシールで分離された２つの別個の区画を含有する単一ボトルが用いられ、ここで、２つの別個の区画の容積の比は１：１、または５：１もしくは１０：１である。これらの用途のそれぞれにおいて、２成分調合物を、所望の濃度の反応剤および最終濃度の生成物を提供するために成分Ａ対成分Ｂの所望の比で混合することができない。
【０３０３】
実施例２１
サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）アセチルキシランエステラーゼ変異株のペルヒドロラーゼ活性アッセイ
サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）突然変異体のライブラリーを、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｐｅｒｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ  ｆｏｒ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｐｅｒａｃｉｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」という表題の代理人整理番号ＣＬ４３９２  ＵＳ  ＮＡを有する共同所有される、共同出願された、そして同時係属の米国特許出願の実施例４に記載されているように調製した。手短に言えば、飽和突然変異生成は、他の１９個の可能なアミノ酸のそれぞれが各指定位置に個別に導入されるように、配列番号６のアミノ酸残基Ｆ２１３、Ｉ２７６、Ｃ２７７、およびＮ９３で行った。
【０３０４】
突然変異は、製造業者の指示書に従ってＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）キットを使用して行った。増幅されたプラスミドを、３７℃で１時間１ＵのＤｐｎＩで処理した。処理したプラスミドを使用して化学的に有能な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（残基２１３、２７６および２７７）または化学的に有能な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０Ｆ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）（残基９３）を形質転換した。形質転換体を、０．１ｍｇアンピシリン／ｍＬが補足されるＬＢ−寒天上で平板培養し、３７℃で一晩増殖させた。５つ以下の個々のコロニーを選別し、予期される突然変異を確認するためにプラスミドＤＮＡの配列を決定した。
【０３０５】
突然変異体の個々のコロニーを、０．１ｍｇアンピシリン／ｍＬ入りの０．１ｍＬのＬＢを含有する９６ウェルプレートへ選別し、振盪することなく３７℃で一晩増殖させた。０．００３ｍＬの一晩培養物を、０．３ｍＬのＬＢ、０．５ｍＭのＩＰＴＧおよび０．１ｍｇのアンピシリン／ｍＬを含有する「誘導プレート」（９６ディープウェル）に移した。誘導プレートを、振盪しながら３７℃で一晩増殖させた。０．０１ｍＬの誘導培養物を、０．０９ｍＬの５６ｍｇ／ｍＬのＣＥＬＹＴＩＣＴＭ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有する「Ｌｙｓｉｓプレート」（９６ウェル）に移した。プレートを、２５℃で３０分間定温放置する前に、先ずわずかにかき混ぜた。おおよそ０．０１ｍＬのＬｙｓｉｓ培養物を、０．０９ｍＬの「アッセイ溶液ｐＨ５．０」（１００ｍＭトリアセチン、１００ｍＭ過酸化水素、５０ｍＭ酢酸ｐＨ５．０）を含有する「アッセイプレート」（９６ウェル）に移した。おおよそ０．０１ｍＬのＬｙｓｉｓ培養物をまた、０．０９ｍＬの「アッセイ溶液ｐＨ７．５」（１００ｍＭトリアセチン、１００ｍＭ過酸化水素、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５）を含有する「アッセイプレートｐＨ７．５」（９６ウェル）に移した。プレートを、周囲温度で１０分間定温放置する前に３０秒間穏やかにかき混ぜた。アッセイを、０．１ｍＬの「停止緩衝液」（１００ｍＭオルト−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、５００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ２．０）の添加によってクエンチした。プレートを、２５℃で３０分間定温放置する前に３０秒間ゆっくりかき混ぜた。吸光度を、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）Ｐｌｕｓ３８４プラス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して蓋なしで４５８ｎｍで読み取った。結果の解析は、野生型酵素と比較して顕著により大きいペルヒドロラーゼ活性を実証する４つの変異株を示した（表１５および１６）。全４つは、残基２７７（Ｃ２７７Ａ、Ｃ２７７Ｖ、Ｃ２７７Ｓ、およびＣ２７７Ｔ；配列番号１９を参照されたい）でのシステインの変化である。
【０３０６】
【表２０】
0005701762.tif 000027
【０３０７】
【表２１】
0005701762.tif 000028
【０３０８】
実施例２２
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８でのサーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）アセチルキシランエステラーゼ変異株の発現
確認されたアセチルキシランエステラーゼ突然変異のプラスミドを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８（実施例３）を形質転換した。形質転換体を、ＬＢ−アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）プレート上へ延ばし、３７℃で一晩培養した。細胞を、２０％（ｖ／ｖ）グリセロールを補足された２．５ｍＬのＬＢ培地を使用してプレートから収穫し、生じた細胞懸濁液の１．０ｍＬアリコートを−８０℃で凍結させた。１ｍＬの解凍した細胞懸濁液を、ＫＨ２ＰＯ４（５．０ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４七水和物（０．０５ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４七水和物（１．０ｇ／Ｌ）、クエン酸ナトリウム二水和物（１．９０ｇ／Ｌ）、酵母抽出物（Ａｍｂｅｒｅｘ  ６９５、５．０ｇ／Ｌ）、Ｂｉｏｓｐｕｍｅｘ１５３Ｋ消泡剤（０．２５ｍＬ／Ｌ、Ｃｏｇｎｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＮａＣｌ（１．０ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ２二水和物（０．１ｇ／Ｌ）、およびＮＩＴ微量要素溶液（１０ｍＬ／Ｌ）を含有する０．７Ｌ培地と共に１ＬのＡＰＰＬＩＫＯＮ（登録商標）Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（Ａｐｐｌｉｋｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に移した。微量要素溶液は、クエン酸一水和物（１０ｇ／Ｌ）、ＭｎＳＯ４水和物（２ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（２ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４七水和物（０．５ｇ／Ｌ）、ＺｎＳＯ４七水和物（０．２ｇ／Ｌ）、ＣｕＳＯ４五水和物（０．０２ｇ／Ｌ）およびＮａＭｏＯ４二水和物（０．０２ｇ／Ｌ）を含有した。ポスト滅菌添加物は、グルコース溶液（５０％ｗ／ｗ、６．５ｇ）およびアンピシリン（２５ｍｇ／ｍＬ）原液（２．８ｍＬ）を含んだ。グルコース溶液（５０％ｗ／ｗ）をまた流加のために使用した。グルコース供給は、グルコース濃度が０．５ｇ／Ｌより下に低下した４０分後に開始し、０．０３ｇ供給／分でスタートし、漸次それぞれ毎時０．０４、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１２、および０．１４ｇ／分に増やし；速度はその後一定のままであった。培地中のグルコース濃度を監視し、濃度が０．１ｇ／Ｌを超えた場合、供給速度を下げるかまたは一時的に停止した。誘導は、０．８ｍＬのＩＰＴＧ（０．０５Ｍ）の添加でＯＤ５５０＝５０で開始した。溶解酸素（ＤＯ）濃度は、先ずかき混ぜ（４００〜１０００ｒｐｍ）によって、引き続き曝気（０．５〜２ｓｌｐｍ）によって、空気飽和の２５％で制御した。温度を３７℃に制御し、ｐＨを６．８に調整し；ＮＨ４ＯＨ（２９％ｗ／ｗ）およびＨ２ＳＯ４（２０％ｗ／ｖ）をｐＨ調整のために使用した。細胞をＩＰＴＧ添加２０時間後に遠心分離（５，０００×ｇ１５分間）によって収穫した。
【０３０９】
実施例２３
半精製されたＴ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）アセチルキシランエステラーゼまたはＴ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）変異株アセチルキシランエステラーゼを含有する細胞溶解液の調製
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６（サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）野生型ペルヒドロラーゼ）の細胞培養物を実施例６に記載されるように増殖させた。生じた細胞ペーストを、１．０ｍＭのＤＴＴで補足された５０ｍＭリン酸塩緩衝液ｐＨ７．０中に再懸濁させた（２０％ｗ／ｖ）。再懸濁細胞を、＞９５％細胞溶解を確実にするために２回Ｆｒｅｎｃｈ圧力セルに通した。溶解細胞を１２，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上澄液を７５℃で２０分間加熱し、引き続き氷浴中で２分間急冷した。沈澱タンパク質を１１，０００×ｇで１０分間の遠心分離によって除去した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＣＥ−７酵素が熱処理抽出物上澄液中の全タンパク質のおおよそ８５〜９０％を占めることを示した。
【０３１０】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ｓ（サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）Ｃ２７７Ｓ変異体ペルヒドロラーゼ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ｖ（サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）Ｃ２７７Ｖ変異体ペルヒドロラーゼ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ａ（サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）Ｃ２７７Ａ変異体ペルヒドロラーゼ）、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ｔ（サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）Ｃ２７７Ｔ変異体ペルヒドロラーゼ）の細胞培養物をそれぞれ、実施例２２に記載されるように増殖させた。生じた細胞ペーストを、１．０ｍＭのＤＴＴで補足された５０ｍＭリン酸塩緩衝液ｐＨ７．０中に再懸濁させた（２０％ｗ／ｖ）。再懸濁細胞を、＞９５％細胞溶解を確実にするために２回Ｆｒｅｎｃｈ圧力セルに通した。溶解細胞を１２，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上澄液を７５℃で２０分間加熱し、引き続き氷浴中で２分間急冷した。沈澱タンパク質を１１，０００×ｇで１０分間の遠心分離によって除去した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＣＥ−７酵素が熱処理抽出物上澄液中の全タンパク質のおおよそ８５〜９０％を占めることを示した。
【０３１１】
実施例２４
Ｔ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）アセチルキシラン野生型エステラーゼおよびＣ２７７エステラーゼ変異株の比活性度および過加水分解／加水分解比
反応（４０ｍＬ総容積）を、トリアセチン（１００ｍＭ）、過酸化水素（１００ｍＭ）および次のアセチルキシランエステラーゼ突然変異体の１つを含有するリン酸塩緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．２）中２５℃で行った：（実施例２３に記載された通り調製された）Ｔ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）Ｃ２７７Ｓ変異株ペルヒドロラーゼ（０．０１０ｍｇ／ｍＬの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ｓからの熱処理抽出物全タンパク質）、Ｔ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）Ｃ２７７Ｔ変異株ペルヒドロラーゼ（０．０１０ｍｇ／ｍＬの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ｔからの熱処理抽出物全タンパク質）、Ｔ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）Ｃ２７７Ａ変異株ペルヒドロラーゼ（０．０１２５ｍｇ／ｍＬの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ａからの熱処理抽出物全タンパク質）、およびＴ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）Ｃ２７７Ｖ変異株ペルヒドロラーゼ（０．０１２５ｍｇ／ｍＬの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６／Ｃ２７７Ｖからの熱処理抽出物全タンパク質）。反応液は、反応剤および酵素を初めに混合するために反応の最初の３０秒だけ撹拌した。
【０３１２】
反応は、０．０５０ｍｇ／ｍＬの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ１９６から単離された熱処理抽出物全タンパク質（サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）野生型アセチルキシランエステラーゼ（実施例１）を発現する）を使用して直前に記載されたものと同一の条件下に行い、ここで、熱処理抽出物上澄液は実施例２３の手順に従って調製した。
【０３１３】
上記の反応混合物のそれぞれからの２サンプルを、各反応の最初の１分後に、およびその後１５分間２分毎に同時に抜き取り、ここで、２サンプルの１つは過酢酸について分析し、第２サンプルは、トリアセチンの酵素的加水分解からおよびメチル−ｐ−トリルスルフィド（ＭＴＳ、下記を参照されたい）との反応による酢酸へのサンプル中での過酢酸のその後の転化からの両方から生成した全酢酸について分析した。
【０３１４】
反応混合物中の過酢酸生成速度の測定は、Ｋａｒｓｔら（上記を参照）によって記載された方法の修正を用いて行った。反応混合物のサンプル（０．０４０ｍＬ）を予定の時間に取り出し、０．９６０ｍＬの水中５ｍＭリン酸と直ちに混合して、希釈したサンプルのｐＨをｐＨ４未満に調整することによって反応を停止させた。生じた溶液を、ＵＬＴＲＡＦＲＥＥ（登録商標）ＭＣ−フィルター装置（３０，０００  Ｎｏｒｍａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｌｉｍｉｔ（ＮＭＷＬ），Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ；カタログ＃ＵＦＣ３ＬＫＴ  ００）を使用して１２，０００ｒｐｍで２分間の遠心分離によって濾過した。得られた濾液のアリコート（０．１００ｍＬ）を、０．３００ｍＬの脱イオン水を含有する１．５ｍＬスクリューキャップＨＰＬＣバイアル（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ；＃５１８２−０７１５）に移し、次に０．１００ｍＬのアセトニトリル中２０ｍＭのＭＴＳ（メチル−ｐ−トリルスルフィド）を加え、バイアルに蓋をし、光の不存在下での約２５℃で１０分の定温放置前に内容物を短く混合した。バイアルに次に、０．４００ｍＬのアセトニトリルと０．１００ｍＬのアセトニトリル中トリフェニルホスフィンの溶液（ＴＰＰ、４０ｍＭ）とを加え、バイアルに再び蓋をし、生じた溶液を混合し、光の不存在下に約２５℃で３０分間定温放置した。バイアルに次に、０．１００ｍＬの１０ｍＭのＮ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルアミド（ＤＥＥＴ；ＨＰＬＣ内部標準）を加え、生じた溶液を、ＭＴＳＯ（メチル−ｐ−トリルスルホキシド）、ＭＴＳと過酢酸との反応によって生成する化学量論的酸化生成物についてＨＰＬＣによって分析した。対照反応を、バックグランドＭＴＳ酸化に関して過酢酸生成の速度を補正するための、過酸化水素によるアッセイ混合物におけるＭＴＳの酸化の速度を測定するために、添加された抽出物タンパク質またはトリアセチンの不存在下に行った。ＨＰＬＣ法：Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｓｕｐｅｌｇｕａｒｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ８プレカラム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ＃５９５９０−Ｕ）付きＳｕｐｅｌｃｏ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ８カラム（１０ｃｍ×４．０ｍｍ、５μｍ）（カタログ＃５６９４２２−Ｕ）；１０マイクロリットル注入容量；１．０ｍＬ／分および周囲温度でＣＨ３ＣＮ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ＃２７０７１７）および脱イオン水でのグラジエント法（表１７）。
【０３１５】
【表２２】
0005701762.tif 000029
【０３１６】
反応でのペルヒドロラーゼ触媒酢酸生成速度の測定のために、反応混合物のサンプル（０．９００ｍＬ）を予定の時間に取り出し、０．０４０ｍＬの０．７５Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を含有する１．５ｍＬの微小遠心管に直ちに加え、生じた溶液をちょっとの間混合してｐＨ３．０〜４．０で反応を停止させた。この管に次に０．０２０ｍＬの５０ｍＭリン酸塩緩衝液ｐＨ（７．２）中１０ｍｇ／ｍＬのアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）カタラーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｃ３５１５）の溶液を加え、生じた溶液を混合し、未反応過酸化水素を水および酸素に不均化するために周囲温度で１５分間反応するに任せた。この管に次に０．０４０ｍＬの０．７５ＭのＨ３ＰＯ４を加え、生じた溶液を混合し、ＵＬＴＲＡＦＲＥＥ（登録商標）ＭＣ−フィルター装置（３０，０００  Ｎｏｒｍａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｌｉｍｉｔ（ＮＭＷＬ），Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．、カタログ＃ＵＦＣ３ＬＫＴ  ００）を使用して１２，０００ｒｐｍで２分間の遠心分離によって濾過した。生じた濾液のアリコート（０．１００ｍＬ）を、０．１５０ｍＬのアセトニトリル中２０ｍＭのＭＴＳ（メチル−ｐ−トリルスルフィド）と混合し、生じた溶液を光の不存在下に約２５℃で１０分間定温放置した。トリアセチンの酵素的加水分解およびＭＴＳとの反応による酢酸への過酢酸の転化の両方によって生成したサンプル中の酢酸の濃度を、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）およびＤＢ−ＦＦＡＰカラム（長さ、１５ｍ；ＩＤ、０．５３０ｍｍ；フィルム厚さ、１．００μｍ）を備えたガスクロマトグラフ（ＧＣ）を用いて測定し；新鮮な注入口ライナーを各速度測定（合計８サンプル分析）のために用いて時間にわたった注入口ライナーでのリン酸の蓄積を回避した。
【０３１７】
サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）アセチルキシランエステラーゼ変異株は、野生型エステラーゼより顕著に高いトリアセチンの過加水分解に対する比活性度を有した（表１８）。Ｔ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）アセチルキシランエステラーゼ変異株についての過加水分解／加水分解比は、酢酸へのトリアセチンの加水分解の速度（加水分解速度）（ＰＡＡおよび酢酸の両方からのアッセイ法での全酢酸生成の速度から計算され、過酢酸生成の速度について補正された）でＰＡＡ生成の速度（過加水分解速度）を割ることによって求められ；Ｔ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）アセチルキシランエステラーゼ変異株のＰ／Ｈ比は、Ｔ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）野生型アセチルキシランエステラーゼについてのＰ／Ｈ比とほぼ等しいかまたはそれより大きかった（表１８）。
【０３１８】
【表２３】
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【０３１９】
実施例２５
サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）からのアセチルキシランエステラーゼのクローニングおよび発現
ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）（登録＃ＮＰ＿２２７８９３．１）に報告されているようなＴ．マリチマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）からのアセチルキシランエステラーゼをエンコードする遺伝子を合成した（ＤＮＡ  ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ  ＣＡ）。この遺伝子をその後、配列番号５２および配列番号５３として同定されるプライマーを使用してＰＣＲ（９４℃で０．５分、５５℃で０．５分、７０℃で１分、３０サイクル）によって増幅した。生じた核酸生成物（配列番号５４）を制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａＩでカットし、ｐＵＣ１９でのＰｓｔＩサイトとＸｂａＩサイトとの間にサブクローンしてｐＳＷ２０７として同定されるプラスミドを発生させた。ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）（登録番号ＮＰ＿２２７８９３．１）に報告されているようなＴ．マリチマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８からのアセチルキシランエステラーゼをエンコードする遺伝子を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現のために最適化されたコドンを使用して合成した（ＤＮＡ  ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ  ＣＡ）。この遺伝子をその後、配列番号５５および配列番号５６として同定されるプライマーを使用してＰＣＲ（９４℃で０．５分、５５℃で０．５分、７０℃で１分、３０サイクル）によって増幅した。生じた核酸生成物を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩでカットし、ｐＴｒｃ９９Ａ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）登録番号Ｍ２２７４４）でのＥｃｏＲＩサイトとＰｓｔＩサイトとの間にサブクローンしてｐＳＷ２２８として同定されるプラスミド（コドン最適化Ｔ．マリチマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）コード配列配列番号５７を含有する）を発生させた。プラスミドｐＳＷ２０７およびｐＳＷ２２８を使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８を形質転換し（米国特許出願公開第２００８／０１７６２９９号明細書）、それぞれ、ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２０７およびＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８として同定される菌株を発生させた。ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２０７およびＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８を、ＯＤ６００ｎｍ＝０．４〜０．５まで振盪しながら３７℃でＬＢ培地で増殖させ、その時点でＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度まで添加し、培養を２〜３時間続行した。細胞を遠心分離によって収穫し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、全可溶性タンパク質の２０〜４０％でペルヒドロラーゼの発現を確認するために行った。
【０３２０】
実施例２６
残基Ｃ２７７でのサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼ変異株の構築
Ｔ．マリチマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼのＣ２７７（Ｃｙｓ２７７）位置を、プラスミドｐＳＷ２２８でのＴ．マリチマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼ（配列番号５７）のコドン最適化配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプライマー・ペア（表１９）を使用してＶａｌ、Ａｌａ、ＳｅｒおよびＴｈｒのそれぞれに変更した。突然変異は、製造業者の指示書に従ってＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して行った。増幅されたプラスミドを、３７℃で１時間１ＵのＤｐｎＩで処理した。処理したプラスミドを使用して化学的に有能な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換した。形質転換体を、０．１ｍｇアンピシリン／ｍＬが補足されるＬＢ−寒天上で平板培養し、３７℃で一晩増殖させた。５つ以下の個々のコロニーを選別し、予期される突然変異を確認するためにプラスミドＤＮＡの配列を決定した。
【０３２１】
【表２４】
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【０３２２】
実施例２７
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８でのサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼ変異株の発現
確認されたアセチルキシランエステラーゼ突然変異のプラスミドを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８（実施例３）を形質転換した。形質転換体を、ＯＤ６００ｎｍ＝０．４〜０．５まで振盪しながら３７℃でＬＢ培地で増殖させ、その時点でＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度まで添加し、培養を２〜３時間続行した。細胞を遠心分離によって収穫し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、全可溶性タンパク質の２０〜４０％でアセチルキシランエステラーゼの発現を確認するために行った。
【０３２３】
実施例２８Ａ
半精製Ｔ．マリチマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼ突然変異体を含有する細胞溶解液の調製
細胞培養物（実施例２７に記載されるように調製された）を、１Ｌ規模（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）で実施例７に記載されるものと類似の発酵手順を用いて増殖させた。細胞を５，０００×ｇで１５分間の遠心分離によって収穫し、次に１．０ｍＭのＤＴＴで補足された５０ｍＭリン酸塩緩衝液ｐＨ７．０中に再懸濁させた（２０％ｗ／ｖ）。再懸濁細胞を、＞９５％細胞溶解を確実にするために２回Ｆｒｅｎｃｈ圧力セルに通した。溶解細胞を１２，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上澄液を７５℃で２０分間加熱し、引き続き氷浴中で２分間急冷した。沈澱タンパク質を１１，０００×ｇで１０分間の遠心分離によって除去した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＣＥ−７酵素が調製物中の全タンパク質のおおよそ８５〜９０％を占めることを示した。
【０３２４】
実施例２８Ｂ
Ｔ．マリチマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシラン野生型エステラーゼおよびＣ２７７エステラーゼ変異株の比活性度および過加水分解／加水分解比
反応（４０ｍＬ全容積）は、トリアセチン（１００ｍＭ）、過酸化水素（１００ｍＭ）および以下のアセチルキシランエステラーゼ変異株の１つを含有するリン酸塩緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．２）中２５℃で行った：Ｔ．マリチマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）Ｃ２７７Ｓ変異株ペルヒドロラーゼ（０．０１０ｍｇ／ｍＬの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８／Ｃ２７７Ｓからの熱処理抽出物全タンパク質）、Ｔ．マリチマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）Ｃ２７７Ｔ変異株ペルヒドロラーゼ（０．０１０ｍｇ／ｍＬの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８／Ｃ２７７Ｔからの熱処理抽出物全タンパク質）、Ｔ．マリチマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）Ｃ２７７Ａ変異株ペルヒドロラーゼ（０．０１２５ｇ／ｍＬの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８／Ｃ２７７Ａからの熱処理抽出物全タンパク質）、およびＴ．マリチマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）Ｃ２７７Ｖ変異株ペルヒドロラーゼ（０．０１２５ｍｇ／ｍＬの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８／Ｃ２７７Ｖからの熱処理抽出物全タンパク質）（実施例２７に記載されるように調製された）。反応液は、反応剤および酵素を初めに混合するために反応の最初の３０秒だけ撹拌した。
【０３２５】
反応をまた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８／ｐＳＷ２２８から単離された０．０５０ｍｇ／ｍＬの熱処理抽出物全タンパク質（サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）野生型アセチルキシランエステラーゼを発現する（実施例２５））を使用して直前に記載されたものと同一の条件下に行い、ここで、熱処理抽出物上澄液は実施例２７の手順に従って調製した。
【０３２６】
上記の反応混合物のそれぞれからの２サンプルを、各反応の最初の１分後に、およびその後１５分間２分毎に同時に抜き取り、ここで、２サンプルの１つは、Ｋａｒｓｔら（上記を参照）によって記載された方法の修正を用いて過酢酸について分析し、第２サンプルは、トリアセチンの酵素的加水分解からおよびメチル−ｐ−トリルスルフィド（ＭＴＳ）との反応による酢酸へのサンプル中での過酢酸のその後の転化からの両方から生成した全酢酸について分析した（実施例８を参照されたい）。
【０３２７】
サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼ突然変異体は、野生型エステラーゼより顕著に高いトリアセチンの過加水分解に対する比活性度を有した（表２０）。Ｔ．マリチマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼ変異株についての過加水分解／加水分解比は、酢酸へのトリアセチンの加水分解の速度（加水分解速度）（ＰＡＡおよび酢酸の両方からのアッセイ法での全酢酸生成の速度から計算され、過酢酸生成の速度について補正された）でＰＡＡ生成の速度（過加水分解速度）を割ることによって求められ；Ｔ．マリチマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼ変異株のＰ／Ｈ比は、Ｔ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）野生型アセチルキシランエステラーゼについてのＰ／Ｈ比とほぼ等しいかまたはそれより大きかった（表２０）。
【０３２８】
【表２５】
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【０３２９】
実施例２９
ペルヒドロラーゼを使用する過酢酸生成
トリアセチン（２ｍＭ）、過酸化水素（１０ｍＭ）および０．１μｇ／ｍＬ〜２．０μｇ／ｍＬの熱処理細胞抽出物タンパク質（熱処理が８５℃で２０分間行われ、上記の通り調製された）を含有する反応（１００ｍＬ全容積）を、２０℃で１０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液（初期ｐＨ８．１）中で行った。反応混合物中の過酢酸の濃度の測定は、Ｋａｒｓｔら（上記を参照）によって記載された方法に従って行った。１分、５分、２０分、４０分および６０分で生成した過酢酸濃度を表２１にリストする。
【０３３０】
【表２６】
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【０３３１】
実施例３０
ペルヒドロラーゼを使用する過酢酸生成
トリアセチン（２０ｍＭ）、過酸化水素（１０ｍＭ）および０．１μｇ／ｍＬ〜２．０μｇ／ｍＬの熱処理細胞抽出物タンパク質（熱処理が８５℃で２０分間行われ、上記の通り調製された）を含有する反応（１００ｍＬ全容積）を、２０℃で１０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液（初期ｐＨ８．１）中で行った。反応混合物中の過酢酸の濃度の測定は、Ｋａｒｓｔら（上記を参照）によって記載された方法に従って行った。１分、５分、２０分、４０分および６０分で生成した過酢酸濃度を表２２にリストする。
【０３３２】
【表２７】
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【０３３３】
実施例３１
ペルヒドロラーゼを使用する過酢酸生成
反応（４０ｍＬ全容積）は、トリアセチン（１００ｍＭ）、過酸化水素（１００ｍＭ）および１０μｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬの熱処理Ｔ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）またはＴ．マリチマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）野生型またはＣ２７７変異株ペルヒドロラーゼ（熱処理が７５℃で２０分間行われ、上記の通り調製された熱処理細胞抽出物タンパク質のような）を含有するリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．２）中２５℃で行った。反応液は、反応剤および酵素を初めに混合するために反応の最初の３０秒だけ撹拌した。反応混合物中の過酢酸の濃度の測定は、Ｋａｒｓｔら（上記を参照）によって記載された方法に従って行った。１分、５分、および３０分で生成した過酢酸濃度を表２３にリストする。
【０３３４】
【表２８】
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【０３３５】
実施例３２
ペルヒドロラーゼを使用する過酢酸生成
反応（１０ｍＬ全容積）は、トリアセチン（１００ｍＭまたは１５０ｍＭ）、過酸化水素（１００ｍＭ、２５０ｍＭまたは４２０ｍＭ）および熱処理Ｔ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）またはＴ．マリチマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）野生型、Ｃ２７７ＳまたはＣ２７７Ｔ変異株ペルヒドロラーゼ（熱処理が７５℃で２０分間行われ、上記の通り調製された熱処理細胞抽出物タンパク質のような；表２４にリストされるような濃度）を含有する重炭酸ナトリウム緩衝液（１ｍＭ、初期ｐＨ６．０）中２５℃で行った。反応は、５００ｐｐｍのＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬをさらに含有する４２０ｍＭ過酸化水素を使用して行った。反応液は、反応剤および酵素を初めに混合するために反応の最初の３０秒だけ撹拌した。反応混合物中の過酢酸の濃度の測定は、Ｋａｒｓｔら（上記を参照）によって記載された方法に従って行った。１分、５分、および３０分で生成した過酢酸濃度を表２４にリストする。
【０３３６】
【表２９】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
0005701762.tif 000044
【配列表】
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