(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非変異アンチトロンビンの抗凝固活性と比べて実質的に低下した抗凝固活性を有するか又は抗凝固活性を実質的に有さない変異アンチトロンビンを少なくとも含んでなる組成物であって、前記変異アンチトロンビンが更に、
−  実質的に低下したトロンビン阻害活性を有するか若しくはトロンビン阻害活性を実質的に失っている、又は
−  低下した第Xa因子阻害活性を有するか若しくは第Xa因子阻害活性を実質的に失っている、又は
−  実質的に低下したトロンビン阻害活性及び第Xa因子阻害活性を有するか若しくはトロンビン阻害活性及び第Xa因子阻害活性を実質的に失っており、
前記変異アンチトロンビンが、
−  配列番号２で表されるアンチトロンビンアミノ酸配列を参照する番号付けに従ってR393H、Pro394、ΔR393-S394、ΔR393、ΔS394、S394Q、S394E、N135Q-R393H、N135Q-S394Q、N135Q-S394E、N135Q-Pro394、N135Q-ΔR393-S394、N135Q-ΔR393及びN135Q-ΔS394により構成される群、又は
−  配列番号26で表されるアンチトロンビンアミノ酸配列を参照する番号付けに従ってR425H、Pro426、ΔR425-S426、ΔR425、ΔS426、S426Q、S426E、N167Q-R425H、N167Q-S426Q、N167Q-S426E、N167Q-Pro426、N167Q-ΔR425-S426、N167Q-ΔR425及びN167Q-ΔS426により構成される群
より選択される少なくとも１つの変異を含んでなる、
組成物の、敗血症の予防又は治療を意図する薬剤の製造のための使用。
【請求項２】
前記変異アンチトロンビンが、
−  配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号10、配列番号62及び配列番号64からなる群、又は
−  配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号66及び配列番号68からなる群
より選択されるアミノ酸配列である請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記変異アンチトロンビンが、
−  配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号70及び配列番号72からなる群より選択されるアミノ酸配列であるか、又は
−  配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号74及び配列番号76からなる群より選択されるアミノ酸配列である
請求項１に記載の使用。
【請求項４】
−  非変異アンチトロンビンの抗凝固活性と比べて実質的に低下した抗凝固活性を有するか又は抗凝固活性を実質的に有さない少なくとも１つの変異アンチトロンビンであって、更に、
−  実質的に低下したトロンビン阻害活性を有するか若しくはトロンビン阻害活性を実質的に失っている、又は
−  低下した第Xa因子阻害活性を有するか若しくは第Xa因子阻害活性を実質的に失っている、又は
−  実質的に低下したトロンビン阻害活性及び第Xa因子阻害活性を有するか若しくはトロンビン阻害活性及び第Xa因子阻害活性を実質的に失っており、
−  配列番号２で表されるアンチトロンビンアミノ酸配列を参照する番号付けに従ってR393H、Pro394、ΔR393-S394、ΔR393、ΔS394、S394Q、S394E、N135Q-R393H、N135Q-S394Q、N135Q-S394E、N135Q-Pro394、N135Q-ΔR393-S394、N135Q-ΔR393及びN135Q-ΔS394により構成される群、又は
−  配列番号26で表されるアンチトロンビンアミノ酸配列を参照する番号付けに従ってR425H、Pro426、ΔR425-S426、ΔR425、ΔS426、S426Q、S426E、N167Q-R425H、N167Q-S426Q、N167Q-S426E、N167Q-Pro426、N167Q-ΔR425-S426、N167Q-ΔR425及びN167Q-ΔS426により構成される群
より選択される少なくとも１つの変異を含んでなる変異アンチトロンビンからなる第１のアンチトロンビンと、
−  野生型アンチトロンビンのものと等価の抗凝固活性を有する少なくとも１つのアンチトロンビンからなる第２のアンチトロンビンと
を含んでなり、前記第１及び第２のアンチトロンビンが、所定の重量比である組合せの、敗血症の予防又は治療を意図する薬剤の製造のための組合せ製品としての使用。
【請求項５】
前記第１及び第２のアンチトロンビンが９:１〜１:４の重量比である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
−  前記第１のアンチトロンビンが、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号10、配列番号18、配列番号62、配列番号64からなる群より選択されるアミノ酸配列であり、前記第２のアンチトロンビンが配列番号２のアミノ酸配列であるか、又は
−  前記第１のアンチトロンビンが、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号42、配列番号70及び配列番号72からなる群より選択されるアミノ酸配列であり、前記第２のアンチトロンビンが配列番号26のアミノ酸配列である
請求項４又は５に記載の組合せの使用。
【請求項７】
前記第１のアンチトロンビンが、
−  配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号66及び配列番号68からなる群より選択されるアミノ酸配列であるか、又は
−  配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号74及び配列番号76からなる群より選択されるアミノ酸配列である
請求項４又は５に記載の組合せの使用。
【請求項８】
−  前記第１のアンチトロンビンが配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号66及び配列番号68からなる群より選択されるアミノ酸配列であり、前記第２のアンチトロンビンが配列番号78のアミノ酸配列からなるか、又は−  前記第１のアンチトロンビンが配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号74及び配列番号76からなる群より選択されるアミノ酸配列であり、前記第２のアンチトロンビンが配列番号80のアミノ酸配列からなる
請求項７に記載の組合せの使用。
【請求項９】
−  非変異アンチトロンビンの抗凝固活性と比べて実質的に低下した抗凝固活性を有するか又は抗凝固活性を実質的に有さない少なくとも１つの変異アンチトロンビンであって、更に、
−  実質的に低下したトロンビン阻害活性を有するか若しくはトロンビン阻害活性を実質的に失っている、又は
−  低下した第Xa因子阻害活性を有するか若しくは第Xa因子阻害活性を実質的に失っている、又は
−  実質的に低下したトロンビン阻害活性及び第Xa因子阻害活性を有するか若しくはトロンビン阻害活性及び第Xa因子阻害活性を実質的に失っており、
−  配列番号２で表されるアンチトロンビンアミノ酸配列を参照する番号付けに従ってR393H、Pro394、ΔR393-S394、ΔR393、ΔS394、S394Q、S394E、N135Q-R393H、N135Q-S394Q、N135Q-S394E、N135Q-Pro394、N135Q-ΔR393-S394、N135Q-ΔR393及びN135Q-ΔS394により構成される群、又は
−  配列番号26で表されるアンチトロンビンアミノ酸配列を参照する番号付けに従ってR425H、Pro426、ΔR425-S426、ΔR425、ΔS426、S426Q、S426E、N167Q-R425H、N167Q-S426Q、N167Q-S426E、N167Q-Pro426、N167Q-ΔR425-S426、N167Q-ΔR425及びN167Q-ΔS426により構成される群
より選択される少なくとも１つの変異を含んでなる変異アンチトロンビンからなる第１のアンチトロンビンと、
−  野生型アンチトロンビンのものと等価の抗凝固活性を有する少なくとも１つのアンチトロンビンからなる第２のアンチトロンビンと
を含んでなる、敗血症の予防又は治療を意図する薬剤の製造のための組合せ製品。
【請求項１０】
・  配列番号４；配列番号６、配列番号８、配列番号10、配列番号18、配列番号62若しくは配列番号64と配列番号２、
・  配列番号14、配列番号16、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号66若しくは配列番号68と配列番号２、
・  配列番号14、配列番号16、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号66若しくは配列番号68と配列番号78、
・  配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号42；配列番号70若しくは配列番号72と配列番号26、
・  配列番号38、配列番号40、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号74若しくは配列番号76と配列番号26、及び
・  配列番号38、配列番号40、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号74若しくは配列番号76と配列番号80
からなる群から選択されるアミノ酸配列の組合せを含んでなる請求項９に記載の組合せ製品。
【請求項１１】
活性成分として、非変異アンチトロンビンの抗凝固活性と比べて実質的に低下した抗凝固活性を有するか又は抗凝固活性を実質的に有さない少なくとも１つの変異アンチトロンビンであって、更に、
−  実質的に低下したトロンビン阻害活性を有するか若しくはトロンビン阻害活性を実質的に失っている、又は
−  低下した第Xa因子阻害活性を有するか若しくは第Xa因子阻害活性を実質的に失っている、又は
−  実質的に低下したトロンビン阻害活性及び第Xa因子阻害活性を有するか若しくはトロンビン阻害活性及び第Xa因子阻害活性を実質的に失っており、
−  配列番号２で表されるアンチトロンビンアミノ酸配列を参照する番号付けに従ってR393H、Pro394、ΔR393-S394、ΔR393、ΔS394、S394Q、S394E、N135Q-R393H、N135Q-S394Q、N135Q-S394E、N135Q-Pro394、N135Q-ΔR393-S394、N135Q-ΔR393及びN135Q-ΔS394により構成される群、又は
−  配列番号26で表されるアンチトロンビンアミノ酸配列を参照する番号付けに従ってR425H、Pro426、ΔR425-S426、ΔR425、ΔS426、S426Q、S426E、N167Q-R425H、N167Q-S426Q、N167Q-S426E、N167Q-Pro426、N167Q-ΔR425-S426、N167Q-ΔR425及びN167Q-ΔS426により構成される群
より選択される少なくとも１つの変異を含んでなる変異アンチトロンビンを、医薬的に許容され得るビヒクルと共に含んでなる医薬組成物。
【請求項１２】
前記変異アンチトロンビンが配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74及び配列番号76からなる群より選択されるアミノ酸配列である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
活性成分として、
−  非変異アンチトロンビンの抗凝固活性と比べて実質的に低下した抗凝固活性を有するか若しくは抗凝固活性を実質的に有さない少なくとも１つの変異アンチトロンビンからなる第１のアンチトロンビンと
−  野生型アンチトロンビンのものと類似の抗凝固活性を有する少なくとも１つのアンチトロンビンからなる第２のアンチトロンビンと
を含んでなる組合せであって、
−  配列番号４；配列番号６、配列番号８若しくは配列番号10、配列番号18、配列番号62若しくは配列番号64と配列番号２、
−  配列番号14、配列番号16、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号66若しくは配列番号68と配列番号２、
−  配列番号14、配列番号16、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号66若しくは配列番号68と配列番号78、
−  配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号42、配列番号70若しくは配列番号72と配列番号26、
−  配列番号38、配列番号40、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号74若しくは配列番号76と配列番号26、及び
−  配列番号38、配列番号40、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号74若しくは配列番号76と配列番号80
からなる群より選択されるアミノ酸配列の組合せ
を医薬的に許容されるビヒクルと共に含む医薬組成物。
【請求項１４】
配列番号２の394位のアミノ酸のグルタミン酸(Glu)又はグルタミン(Gln)によるアミノ酸
置換を少なくとも含んでなり、135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換である第２の置換を更に含んでなる変異アンチトロンビン。
【請求項１５】
配列番号66又は68のアミノ酸配列である請求項１４に記載の変異アンチトロンビン。
【請求項１６】
配列番号26の426位のアミノ酸のグルタミン酸(Glu)又はグルタミン(Gln)によるアミノ酸置換を少なくとも含んでなり、167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換である第２変異を更に含んでなる変異アンチトロンビン。
【請求項１７】
配列番号74又は76のアミノ酸配列である請求項１６に記載の変異アンチトロンビン。
【請求項１８】
請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の変異アンチトロンビンをコードし、DNA又はRNAであるポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異アンチトロンビン及び薬剤としてのその使用に関する。本発明は、変異アンチトロンビンの製造方法も開示する。
【背景技術】
【０００２】
生理学
血液凝固系の全身性活性化は、重症敗血症及び/又は敗血症性ショックの患者で頻繁に観察される。感染合併症としての重症敗血症は、全身性炎症、タンパク質分解カスケードの活性化、血液凝固異常(DIC)及び種々の臓器の機能不全により特徴付けられる。そのより重症の形態である敗血症性ショックは、加えて、血行動態の変化及び臓器灌流の欠陥と関連し、臓器不全を更に悪化させ、しばしば多臓器不全での死亡に至る。敗血症性ショックでの死亡率は高く(40％〜50％)、不全となった臓器数とともに甚だしく上昇する。すなわち、急性腎不全についての腎置換療法を必要とする患者は、80％を超える死亡率である。重症敗血症の発症の開始事象は、Toll様受容体表面への結合を介する微生物抗原(すなわち、グラム陰性細菌から遊離されるリポ多糖(LPS)、グラム陽性細菌からのリポテイコイン酸、真菌抗原)による単球/マクロファージの活性化である(Cohen J., The immunopathogenesis of sepsis., Nature, 2002; 420: 885-91)。
【０００３】
機序
単球/マクロファージの活性化(続いておそらく内皮細胞が活性化される)は、サイトカインメディエータの分泌をもたらす(例えばインターロイキン６(IL-6)、腫瘍壊死因子(TNFα)及びケモカイン、脂質メディエータ、細胞膜での接着分子及び組織因子の発現、一酸化窒素及び活性酸素種の形成)。このステップの後、血液凝固及び補体を含む、炎症反応及び血液凝固活性化の維持に貢献する生物学的カスケードが活性化される。これら事象は、感染部位で微生物病原体を根絶するために十分に適合しているのではあるが、それが広がり、調節されず維持されるようになると、有害な結果、すなわち種々の臓器不全をもたらす(Aird W., The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome., Blood, 2003; 101: 3765-77)。
【０００４】
組織因子発現は、前駆分子であるプロトロンビンからのトロンビンの無制御な産生を導く。内因性抗凝固因子、すなわちアンチトロンビン(AT)、プロテインＣ経路及び組織因子経路のインヒビター、並びに線溶系が活性化され、トロンビン産生及びその結果を調節するように機能する。しかし、内因性インヒビターの血液レベルは、基質による消費、合成の阻害及び幾つかのプロテアーゼによる切断に起因して減少する。実際、ATレベルは、重症敗血症の初期相で急激に減少する。フィブリン溶解は、プラスミノゲンアクチベーターインヒビター-１の生成により迅速に阻害される。こうして、凝血促進状態が敗血症患者で発生し、有害な影響を有する顕性播種性血管内凝固症候群(DIC)を導く可能性がある。微小循環全体における散在性血栓の形成は、危険臓器への組織灌流を損なうことがあり、種々の血液凝固タンパク質の細胞影響が全身性炎症症候群に関与する(Aird W., The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome., Blood, 2003; 101: 3765-77)。重症敗血症における血液凝固異常は不良な転帰と関連付けられることが証明されている。とりわけ、敗血症性ショックにおけるATの枯渇は不良な予後の前兆となる(Fourrier F., Septic shock, multiple organ failure, and disseminated intravascular coagulation: compared patterns of antithrombin III, protein C, and protein S deficiencies., Chest, 1992; 101: 816-823)。
【０００５】
アンチトロンビン
アンチトロンビンは、血液の流動性の維持で必須の役割を果たす。血液凝固は、一連のセリンプロテアーゼにより媒介される。アンチトロンビンは、血液凝固セリンプロテアーゼ、特に第IIa因子(トロンビン)、第Xa因子、第IXa因子及び第XIa因子の強力なインヒビターである。ATと内皮細胞上のヘパリン様グリコサミノグリカン(HGAG)との相互作用は、ATによるトロンビン阻害の加速に重要である(Rosenberg RD., Biochemistry of heparin antithrombin interactions, and the physiologic role of this natural anticoagulant mechanism., Am J Med, 1989; 87: 2S-9S)。実際、血栓エピソードが、先天性AT欠損症患者及びヘパリンへの親和性を欠く変異型ATを有する患者で観察された。このことは、内皮細胞表面のヘパリン様GAGとのATの相互作用が、ATによる血液凝固カスケードの調節に重要であることを示唆している(Kuhle S, Lane DA, Jochmanns K, Male C, Quehenberger P, Lechner K, Pabinger I, Homozygous antithrombin deficiency type II (99 Leu to Phe mutation) and childhood thromboembolism., Thromb Haemost., 2001; 86: 1007-11)。過剰な血液凝固の予防におけるアンチトロンビンの生理学的重要性は、アンチトロンビンレベルが遺伝的又は後天的な欠損に起因して減少している個体の研究により明らかにされている。このような人々は、血栓症を自然発症しやすく、関連して播種性血管内凝固症候群、心筋梗塞、脳血管発作及び肺塞栓症の危険にある。
【０００６】
加えて、ATは、内皮細胞表面に存在するグリコサミノグリカンへの結合を通じて、細胞保護特性を奏することが示されている。実際、ATは、NFkB活性化内皮細胞及び単球を阻害して、プロスタサイクリン合成の増加、炎症促進性サイトカイン生成の減少(IL6及びTNFα)、内皮細胞又は単球上の組織因子露出の低減、血小板凝集及び内皮細胞/好中球相互作用の低減をもたらす。この効果は、競合プロセスを通じて、ヘパリンにより停止される。これら細胞保護効果は、2.5〜40UI/mlの範囲(通常の循環ATレベルの2.5〜40倍に相当)のAT濃度について観察された。
【０００７】
敗血症のモデル
ATは、ヒヒ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ラット及びニワトリの胚で示されたように調べた種にかかわらず、敗血症及び敗血症性ショックの幾つかの実験モデルで有効であることが示されている。これらモデルにおいて、ATは、生細菌(大腸菌(Escherichia coli)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae))及び細菌性リポ多糖(LPS)を含む異なる病原体を用いた敗血症又は敗血症性ショックの誘導後に効果的であることが証明された。
モルモットモデルにおいて、ATがDIC及び臓器出血を予防し得、グラム陽性細菌である黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)での感染後の死亡率を改善し得ることが証明されている。
【０００８】
敗血症の間の血液凝固プロセスの誤調節に起因して、ヘパリン又はアンチトロンビンのような幾つかの抗凝固因子がヒトでアッセイされている。
治療用量のヘパリン(Corrigan JJ., Heparin therapy in bacterial septicemia., J Pediatr., 1977; 91: 695-700)又はアンチトロンビン(Schipper HG, Jenkins CSP, Kahl LH, ten Cate JW, Antithrombin III transfusion in disseminated intravascular coagulation., Lancet, 1978; 1: 854-856)は、効力の明確な証拠がないまま、播種性血管内凝固症候群及び敗血症の予防及び治療のために20年以上臨床で用いられている。
重症敗血症の間の血液凝固系の活性化及び抗凝固因子の消耗に対処するために、高用量のアンチトロンビンを用いる幾つかの研究が患者で行われている。
【０００９】
Warrenら(High dose Antithrombin III in severe sepsis, 2008, JAMA, 286(15), 1869-1878)は、30,000IU (４日間治療の累積用量)のAT投与の効果を無作為化管理下臨床試験で調べた。AT処置を受けた患者は、正常循環血液レベルの180％程度の血漿ATレベルであったが、このレベルは、細胞保護効果を達成するに必要な用量より低い。この研究は、患者生存に対するAT投与の有効性を証明できなかった。更に、著者らは、ATの投与が、この投薬量で、患者におけて出血リスクを増大させ、このリスクは、患者がヘパリンを並行投与されている場合に増加することを証明した。
重症敗血症に関連するDICに焦点を当てたこの研究の事後分析は、この投薬量(４日間で30,000IU)のATが、プラシーボで処置された対照と比較して、ヘパリン処置をしていない患者で出血リスクを増加させることを報告した(Treatment effects of high-dose antithrombin without concomitant heparin in patients with severe sepsis with or without disseminated intravascular coagulation, 2006, J. of Thrombosis and Haemostasis, 4: 90-97)。
【００１０】
別の研究(Eiseleら、Antithrombin III in patients with severe spesis, intensive care Med., 1998, 24: 663-672)は、18,000UI (５日間治療の累積用量)のATが、出血の問題なく患者の生存に幾らかの利益を有することを証明した。しかし、この投薬量のATが確かに出血に影響しないとするには、この研究で使用した患者パネルは小さすぎ、ATの投薬量は、良好な細胞保護効果を提供するに必要なアンチトロンビンの同定された有効投薬量を下回ったままである。実際、この研究において、AT処置を受けた患者は、ATレベルが正常循環ATレベルの70〜130％の範囲であった。
【００１１】
よって、患者において抗凝固系を増強するが出血アクシデントを引き起こさない、重症敗血症治療用の新たな医薬を提供する必要がある。
【００１２】
その他の抗凝固因子が、重症敗血症の治療で試験されている。
活性化プロテインＣ(ドロトレコギンα)は、最高の重症度スコアの患者で重症敗血症の死亡率を低減することが示されている[Bernard GR, Vincent JL, Laterre PF, LaRosa SP, Dhainaut JF, Lopez-Rodriguez A, Steingrub JS, Garber GE, Helterbrand JD, Ely EW, Fisher CJ Jr; Recombinant human protein C Worldwide Evaluation in severe sepsis (PROWESS) study group, Efficacy and safety of recombinant human activated protein C for severe sepsis., N Engl J Med, 2001; 344: 699-709]。この研究の結果にもかかわらず、活性化プロテインＣの使用は、とりわけ出血に関するこの薬剤の効力/安全性プロファイルに関してのもののような、議論の余地を残している。WO2005/007820は、抗凝固活性が低下している変異した活性化プロテインＣ変異型の、細胞性の細胞保護を必要とする病状の治療のための使用を開示するが、これら変異型は、臨床の場で試験されていない[Kerschen EJ, Fernandez JA, Cooley BC, Yang XV, Sood R, Mosnier LO, Castellino FJ, Mackman N, Griffin JH, Weiler H., Endotoxemia and sepsis mortality reduction by non-anticoagulant antivated protein C., J Exp Med., 2007年10月１日; 204(10): 2439-48]。
【００１３】
よって、患者において出血を発症することなく又は低減した出血の発症のみで、全ての形態の重症敗血症を治癒することができる新たな医薬を提供することが重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
よって、本発明の１つの目的は新たな薬剤を提供することである。
また、本発明の別の目的は、活性物質として改変アンチトロンビンを含んでなる新たな医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、
−  非変異アンチトロンビンの抗凝固活性と比べて実質的に低下した抗凝固活性を有するか、又は
−  抗凝固活性を実質的に有さない
変異アンチトロンビンを少なくとも含んでなる組成物の、感染、炎症又は低酸素傷害のような細胞傷害と関係する病状の予防又は治療を意図する薬剤の製造のための使用に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
用語「変異アンチトロンビン」とは、そのアミノ酸配列内に１以上のアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を少なくとも含んでなるアンチトロンビン、好ましくはヒトアンチトロンビンをいう。
上記変異アンチトロンビンは、実験の部Ｉに記載される方法に従って製造できる。
ヒトアンチトロンビン配列は、Olds R.J., Lane D.A., Chowdhury V., De Stefano V., Leone G.及びThein S.L., "Complete nucleotide sequence of the antithrombin gene: evidence for homologous recombination causing thrombophilia", Biochemistry, 32 (16), 4216-4224 (1993)に記載されている。
本発明のヒトアンチトロンビン配列は、ホモ・サピエンス(Homo sapiens)セルピンペプチダーゼインヒビター、クレードＣ(アンチトロンビン)、メンバー１(SERPINC1)、mRNAである。アクセッションNM 000488、バージョンNM 000488.2、GI:50541941。
【００１７】
上記DNA配列(シグナルペプチドを有する)を記載する文献は多くあるが、これらは、アンチトロンビンの多くの天然多型(一般に、アンチトロンビンの特性、すなわち抗凝固特性を変化させない)のために、断じて同一ではない。
アンチトロンビンのヒトアミノ配列は２つの形態を示す：シグナルペプチドを含まない「短形態」(配列番号２)及びシグナルペプチドを含んでなる「長形態」(配列番号26)である。
シグナルペプチドは32アミノ酸を含んでなり、アンチトロンビン分泌に必要である。これは、アンチトロンビンのプロセシングの間に除去され、血漿アンチトロンビンは「短形態」として循環する。
【００１８】
したがって、本発明において、配列番号２、４、６、８、10、12、14、16、18、20、22、24、62、64、66、68及び78で表される変異アンチトロンビンアミノ酸配列は、シグナルペプチドを含まず、配列番号26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、70、72、74、76及び80で表される変異アンチトロンビンアミノ酸配列は、シグナルペプチドを含む。
【００１９】
本明細書で用いる場合、用語「変異アンチトロンビン」とは、本発明の変異アンチトロンビンが低下した抗凝固活性を有するか又は抗凝固活性を有さず、グリコサミノグリカン結合について血漿アンチトロンビンとインビボで競合できる点で、当該技術において公知の天然で見出される変異アンチトロンビン(アンチトロンビン変異体ともいう)とは異なる変異アンチトロンビンをいう。
本発明による変異アンチトロンビンは、アンチトロンビンの抗凝固活性の副作用に起因する抗凝固の望まない合併症、特に出血を予防できることが、予想外にも見出された。
【００２０】
表現「活性を実質的に有さない変異アンチトロンビン」は、凝固を阻害する能力を喪失した変異アンチトロンビンをいう。
表現「非変異アンチトロンビンの抗凝固活性と比べて実質的に低下した抗凝固活性を有する変異アンチトロンビン」は、野生型アンチトロンビンと比較して、凝固を阻害する能力が低下した(２〜20分の１に低下した(2 to 20 fold reduced))変異アンチトロンビンをいう。
変異アンチトロンビンの抗凝固活性は精製した系で評価される。変異アンチトロンビンの抗Xa及び抗IIa阻害活性は、「材料及び方法」の章に記載されるように測定する。
【００２１】
本発明による変異アンチトロンビンは細胞保護活性を有する。この「細胞保護活性」は、損傷又は細胞傷害、例えば炎症、感染若又は虚血/低酸素により引き起こされる損傷に対して細胞を保護する変異アンチトロンビンの特性を参照する。
変異アンチトロンビンの細胞保護活性は、「材料及び方法」の章に記載されるように評価する。簡潔には、変異アンチトロンビンの存在下又は非存在下でLPSに曝露した全血中の炎症促進性サイトカインのレベル(IL6及びTNFα)を比較する。
【００２２】
表現「細胞傷害」は、物理的又は化学的であり得る作用因子により細胞の構造又は機能に対して引き起こされる損傷をいう。細胞傷害は、刺激に対する適応応答の限度を超えると生じる。
細胞傷害は、限定されないが、炎症、感染、低酸素症及び虚血/再灌流により引き起こされ得る。
虚血は、動脈硬化又は血栓により動脈流が妨害されると生じ、低酸素症の最も一般的な原因であり、心肺不全に起因する血液の不適切な酸素付加の間又は貧血若しくは一酸化炭素中毒のような血液の酸素運搬能力の喪失の間に生じる。
細胞傷害は可逆的又は不可逆的であり得る。不可逆的傷害の場合、多くの細胞がアポトーシス又は壊死を受ける。壊死は、細胞死の最も一般的なタイプであるが、極度の細胞膨張又は細胞破裂、細胞質タンパク質の凝固、リソソームのような細胞小器官の破壊などにより顕現する。
【００２３】
ヘパリンは、変異アンチトロンビンと細胞性ヘパリン様グリコサミノグリカンとの間の相互作用と競合し得るので、本発明による変異アンチトロンビンは、ヘパリン治療を受けている患者には投与しないのが好ましい。その他の抗凝固因子は、その組合せが変異アンチトロンビンの細胞保護活性を損なわないことを条件に、本発明の変異アンチトロンビンと共に使用することができる。
より好ましくは、本発明は、非変異アンチトロンビンの抗凝固活性と比べて実質的に低下した抗凝固活性を有するか又は抗凝固活性を実質的に有さない変異アンチトロンビンの、感染、炎症又は低酸素傷害のような細胞傷害と関係する病状の予防又は治療を意図する薬剤の製造のための使用であって、該変異アンチトロンビンが、必要とする患者に、血漿中約100％〜750％のATに達するように約0.5〜約15UI/ml、特に約１〜約7.5UI/mlの濃度で投与される使用に関する(細胞保護効果は、血漿ATに関して250％を超えるAT濃度について観察された)。１IUのアンチトロンビンは、１mLの血漿中に含まれるアンチトロンビンの量と規定され、約0.15g/L〜約0.3g/L血漿の範囲に相当する。
【００２４】
したがって、本発明によれば、変異ATは、約3000〜約22500IU (40〜300IU/kg)の負荷投薬量と、続く２〜７日間、好ましくは４日間の約3000〜約22500IU (40〜300IU/kg)の持続静脈内注入とを用いて投与するのが好ましい。
【００２５】
本発明は、感染、炎症、低酸素症又は虚血/再灌流傷害のような細胞傷害と関係する病状を予防又は治療する方法であって、必要とする患者に、
−  非変異アンチトロンビンの抗凝固活性と比べて実質的に低下した抗凝固活性を有するか、又は
−  抗凝固活性を実質的に有さない
変異アンチトロンビンを少なくとも含んでなる組成物を投与する工程を含んでなり、該組成物が、約20UI/kg/日〜約600UI/kg/日、好ましくは約40UI/kg/日〜約300UI/kg/日の投薬量で投与する方法に関する。
【００２６】
１つの好ましい実施形態において、本発明は、上記の変異アンチトロンビンを少なくとも含んでなる組成物の、細胞虚血/再灌流傷害に関連する病状、特に炎症性症候群、心血管疾患、神経若しくは脳の疾患、手術に関連する虚血/再灌流傷害、臓器移植、及び脳卒中に関連する虚血/再灌流傷害を含む群より選択される病状の治療又は予防、或いは感染に関連する病状、特に感染性疾患及び炎症関連疾患を含む群より選択される病状の治療又は予防を意図する薬剤の製造のための使用に関する。
【００２７】
本発明の１つの有利な実施形態は、上記の変異アンチトロンビンを少なくとも含んでなる組成物の使用であって、病状が、敗血症、重症敗血症又は敗血症性ショック、虚血性脳卒中、熱射病、急性心筋梗塞、四肢(extremity)の虚血、急性神経変性疾患、慢性神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、ダウン症候群、ハンチントン病及びパーキンソン病、臓器移植、化学療法及び放射線照射傷害、例えば放射線照射脳傷害からなる群より選択される使用に関する。
本発明によれば、「低酸素傷害」は、低酸素症又は虚血/再灌流を意味する。
重症敗血症の定義及び分類は、当該分野において公知であり、例えば、Levy, M.M.らに開示される(Levy, M.M.ら、Intensive Care Med, 2003, 29(4): 530-8)。
脳卒中(急性脳血管発作)は、脳への血流が減少するか又は停止すると生じる。
【００２８】
１つの好ましい実施形態において、本発明は、上記の変異アンチトロンビンの、敗血症、すなわち感染性疾患に伴う全身性炎症反応症候群(SIRS)の予防又は治療を意図する薬剤/医薬の製造のための使用に関する。敗血症の悪化により引き起こされる症候群の例は、重症敗血症、敗血症性ショック及び多臓器不全症候群を含む。
【００２９】
１つの特定の実施形態において、本発明は、上記の変異アンチトロンビンが、
−  実質的に低下したトロンビン阻害活性を有するか若しくはトロンビン阻害活性を実質的に失っている、又は
−  低下した第Xa因子阻害活性を有するか若しくは第Xa因子阻害活性を実質的に失っている、又は
−  実質的に低下したトロンビン阻害活性及び第Xa因子阻害活性を有するか若しくはトロンビン阻害活性及び第Xa因子阻害活性を実質的に失っている、
上記使用に関する。
アンチトロンビンの完全な抗凝固活性は、トロンビンと第Xa因子の凝固促進活性の阻害により達成される。したがって、アンチトロンビンの抗凝固活性を低下させるために、変異によってトロンビン及び/又は第Xa因子を阻害する能力を低下させることができる。好ましくは、アンチトロンビンの抗凝固活性を完全に低下させるために、アンチトロンビンのトロンビン及び第X因子阻害活性の両方を不活化する。
【００３０】
トロンビン又は第Xa因子阻害活性が「実質的に低下している」とは、トロンビン又は第Xa因子を阻害するアンチトロンビンの能力が、野生型アンチトロンビンの活性と比較して低下していることを意味する。好ましくは、本発明によれば、トロンビン又は第Xa因子阻害活性は、上記活性が野生型アンチトロンビンのトロンビン又は第Xa因子阻害活性の約50％〜約５％であるとき、低下したものとみなされる。
抗Xa及び抗IIa阻害活性は、「材料及び方法」の章に記載されるような精製された系で測定する。
【００３１】
トロンビン又は第Xa因子阻害活性を「実質的に失っている」とは、トロンビン又は第Xa因子を阻害するアンチトロンビンの活性が、野生型アンチトロンビンの活性と比較して存在しないことを意味する。
抗Xa及び抗IIa阻害活性は、「材料及び方法」の章に記載されるような精製された系で測定する。
【００３２】
１つの他の好ましい実施形態において、本発明は、変異アンチトロンビンが380位のアミノ酸から400位のアミノ酸までの領域内、特に390位のアミノ酸から397位のアミノ酸までの領域内、特に390位のアミノ酸から394位のアミノ酸までの領域内、特に393位又は394位に少なくとも１つの変異を含んでなり、該変異が置換、挿入又は欠失である、上記使用に関する。ここで、アミノ酸の番号付けは、配列番号２で表されるアンチトロンビンアミノ酸配列に関する。
【００３３】
380位のアミノ酸から400位のアミノ酸までの領域は、一般に、「反応中心ループ」(RCL)と命名される。RCL内の残基は、切断されやすいP1-P1'結合に対する位置に従って番号付けされる(プライムを付していない番号はセルピンのＮ末端に向かい、プライムを付した番号はＣ末端に向かう)。特に、P14からP4'に広がる領域(残基380〜397)は、標的プロテアーゼの活性部位に相補的である。特に、P4からP1'の残基(残基390〜394)は、プロテアーゼの触媒溝内で直接相互作用する。特に、残基P1 (393)は、プロテアーゼ阻害に不可欠である。
本発明の変異アンチトロンビンは、変異アンチトロンビンの上記特性に変化がないことを条件に、380位のアミノ酸から400位のアミノ酸までの領域外に、その他の変異を含んでなることができる。
【００３４】
１つの他の特定の実施形態において、本発明は、変異アンチトロンビンが、96位、135位、155位又は192位、特に135位のアミノ酸に位置するグリコシル化部位に少なくとも１つの変異を更に含んでなる上記使用に関する。ここで、アミノ酸の番号付けは、配列番号２で表されるアンチトロンビンアミノ酸配列に関する。
グリコシル化部位は、アンチトロンビンが真核生物で発現するとき、アンチトロンビンの分泌に必要である。しかし、１つの部位の除去は、アンチトロンビン分泌を損なわず、ヘパリン様グリコサミノグリカン結合を増加させる。実際、グリコシル化鎖は、アンチトロンビン-細胞性ヘパリン様グリコサミノグリカン結合に関与する。
【００３５】
細胞性ヘパリン様グリコサミノグリカンとの相互作用は、アンチトロンビンの細胞保護効果を増強し、本発明による変異アンチトロンビンの細胞保護活性を必要な変更を加えて増強する。
【００３６】
本発明の１つの有利な実施形態は、非変異アンチトロンビンの抗凝固活性と比べて実質的に低下した抗凝固活性を有するか又は抗凝固活性を実質的に有さない変異アンチトロンビンを少なくとも含んでなる組成物であって、
該変異アンチトロンビンが更に、
−  実質的に低下したトロンビン阻害活性を有するか若しくはトロンビン阻害活性を実質的に失っている、又は
−  低下した第Xa因子阻害活性を有するか若しくは第Xa因子阻害活性を実質的に失っている、又は
−  実質的に低下したトロンビン阻害活性及び第Xa因子阻害活性を有するか若しくはトロンビン阻害活性及び第Xa因子阻害活性を実質的に失っており、
該変異アンチトロンビンが、少なくとも１つの変異を
−  380位のアミノ酸から400位のアミノ酸までの領域内、特に393位若しくは394位(アミノ酸番号付けは、配列番号２で表されるアンチトロンビンアミノ酸配列に関する)、又は
−  412位のアミノ酸から432位のアミノ酸までの領域内、特に425位若しくは426位(アミノ酸の番号付けは、シグナルペプチドを含む配列番号26で表されるアンチトロンビンアミノ酸配列に関する)
に含んでなり、
該変異が置換、挿入又は欠失である
組成物の、感染、炎症又は低酸素傷害と関係する病状、特に敗血症及び脳卒中に関連した虚血/再灌流、手術に関連した虚血/再灌流、並びに臓器移植に関連した虚血/再灌流の予防又は治療を意図する薬剤の製造のための使用に関する。
【００３７】
本発明の１つの好ましい実施形態は、変異アンチトロンビンが、
−  配列番号４(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸のヒスチジン(His)による置換を含んでなる)、
−  配列番号６(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸と394位のアミノ酸との間のプロリン(Pro)の挿入を含んでなる)、
−  配列番号８(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸の欠失を含んでなる)、
−  配列番号10(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸の欠失を含んでなる)、
−  配列番号62(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、及び
−  配列番号64(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸のグルタミン酸(Glu)による置換を含んでなる)
からなる群より選択されるアミノ酸配列である、上記使用に関する。
【００３８】
本発明の別の好ましい実施形態は、変異アンチトロンビンが、
−  配列番号14(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸のヒスチジン(His)による置換及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
−  配列番号16(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸と394位のアミノ酸との間のプロリン(Pro)の挿入及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
−  配列番号18(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位及び394位のアミノ酸の欠失を含んでなる)、
−  配列番号20(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸の欠失及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
−  配列番号22(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸の欠失及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
−  配列番号24(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位及び394位のアミノ酸の欠失と、135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換とを含んでなる)、
−  配列番号66(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、及び
−  配列番号68(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸のグルタミン酸(Glu)による置換及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)
からなる群より選択されるアミノ酸配列である、上記の使用に関する。
【００３９】
本発明の別の好ましい実施形態は、変異アンチトロンビンが、412位のアミノ酸から432位のアミノ酸までの領域内、特に412位のアミノ酸から429位のアミノ酸までの領域内、特に422位のアミノ酸から426位のアミノ酸までの領域内、特に425位又は426位に少なくとも１つの変異を含んでなり、該変異が置換、挿入又は欠失である、上記使用に関する。ここで、アミノ酸の番号付けは、シグナルペプチドを含む配列番号26で表されるアンチトロンビンアミノ酸配列に関する。
本発明の変異アンチトロンビンは、変異アンチトロンビンの上記特性に変化がないことを条件に、412位のアミノ酸から432位のアミノ酸までの領域外に、その他の変異を含んでなることができる。
【００４０】
１つの好ましい実施形態において、本発明は、変異アンチトロンビンが、128位、167位、187位又は224位、特に167位のアミノ酸に位置するグリコシル化部位に少なくとも１つの変異を更に含んでなる、上記使用に関する。ここで、アミノ酸の番号付けは、配列番号26で表されるアンチトロンビンアミノ酸配列に関する。
【００４１】
本発明の１つのより好ましい実施形態は、変異アンチトロンビンが、
−  配列番号28(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸のヒスチジン(His)による置換を含んでなる)、
−  配列番号30(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸と426位のアミノ酸との間のプロリン(Pro)の挿入を含んでなる)、
−  配列番号32(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸の欠失を含んでなる)、又は
−  配列番号34(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸の欠失を含んでなる)、
−  配列番号70(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、及び
−  配列番号72(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸のグルタミン酸(Glu)による置換を含んでなる)、
からなる群より選択されるアミノ酸配列である、上記使用に関する。
【００４２】
本発明の別の好ましい実施形態は、変異アンチトロンビンが、
−  配列番号38(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸のヒスチジン(His)による置換及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
−  配列番号40(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸と426位のアミノ酸との間のプロリン(Pro)の挿入及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
−  配列番号42(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸及びと426位のアミノ酸の欠失を含んでなる)、
−  配列番号44(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸の欠失及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
−  配列番号46(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸の欠失及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
−  配列番号48(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸と426位のアミノ酸の欠失及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
−  配列番号74(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、及び
−  配列番号76(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸のグルタミン酸(Glu)による置換及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)
からなる群より選択されるアミノ酸配列である、上記使用に関する。
【００４３】
本発明は、
−  本明細書に記載される、実質的に低下した抗凝固活性を有するか又は抗凝固活性を実質的に有さない少なくとも１つの変異アンチトロンビンからなる第１のアンチトロンビンと、
−  野生型アンチトロンビンのものと類似の抗凝固活性を有する少なくとも１つのアンチトロンビンからなる第２のアンチトロンビンと
を含んでなる組合せの、感染、炎症又は低酸素傷害のような細胞傷害と関係する病状の予防又は治療を意図する薬剤の製造のための組合せ製品としての使用に関し、ここで、
該組合せ製品は同時、逐次的又は別々の投与に用いることができ、
前記第１及び第２のアンチトロンビンは、所定の重量比、好ましくは約９:１〜約１:４、好ましくは約４:１〜約１:２、より好ましくは約２:１〜約１:２のそれぞれの重量比である。
【００４４】
本発明によれば、用語「少なくとも１つの変異アンチトロンビンからなる第１のアンチトロンビン」は、上記のような変異アンチトロンビンをいう。
本発明によれば、用語「野生型アンチトロンビンのものと類似の抗凝固活性を有する少なくとも１つのアンチトロンビンからなる第２のアンチトロンビン」は、変異を有さず野生型アンチトロンビンに相当する任意のアンチトロンビン又は該第２のアンチトロンビンの抗凝固活性に影響しない少なくとも１つの変異を有するアンチトロンビンをいう。
【００４５】
よって、本発明の第２のアンチトロンビンは、１以上のグリコシル化部位に、特に配列番号２の配列の135位の残基又は配列番号26の167位の残基に変異を有していてもよい。これら「変異アンチトロンビン」(第２のアンチトロンビン)は、抗凝固活性を保持している。
ヘパリンは、変異アンチトロンビンと細胞性ヘパリン様グリコサミノグリカンとの間の相互作用と競合し得るので、本発明による変異アンチトロンビンは、ヘパリン治療を受けている患者には投与しないのが好ましい。その他の抗凝固因子は、その組合せが変異アンチトロンビンの細胞保護活性を損なわないことを条件に、本発明の変異アンチトロンビンと共に使用することができる。
【００４６】
本発明による第１のアンチトロンビンと第２のアンチトロンビンとの組合せは、約20UI/kg/日〜約600UI/kg/日、好ましくは約40UI/kg/日〜約300UI/kg/日の投薬量で投与する。
【００４７】
第１/第２のアンチトロンビンの比が９/１の比に相当する場合、該第１のアンチトロンビンは、約36IU/kg/日〜約270IU/kg/日の投薬量で投与し、該第２のアンチトロンビンは、約４IU/kg/日〜約30IU/kg/日の投薬量で投与する。
【００４８】
また、本発明による第１及び第２のアンチトロンビンの組合せは、必要とする患者に、血漿中約100％〜750％のATに達するように約0.5〜約15UI/ml、特に約１〜約7.5UI/mlの濃度で投与する。本発明は、感染、炎症又は低酸素傷害のような細胞傷害と関係する病状を予防又は治療する方法であって、必要とする患者に、
−  本明細書に記載される、実質的に低下した抗凝固活性を有するか又は抗凝固活性を実質的に有さない少なくとも１つの変異アンチトロンビンからなる第１のアンチトロンビンと、
−  野生型アンチトロンビンのものと類似の抗凝固活性を有する少なくとも１つのアンチトロンビンからなる第２のアンチトロンビンと
を含んでなる組合せを投与する工程を含んでなる方法にも関し、ここで、前記組合せは、約20UI/kg/日〜約600UI/kg/日、好ましくは約40UI/kg/日〜約300UI/kg/日の投薬量で投与される。
【００４９】
本発明による組合せは、第１のアンチトロンビンを介して細胞傷害に対する細胞保護活性を与え、第２のアンチトロンビンの存在が、出血アクシデントを減少させる。
【００５０】
１つの好ましい実施形態において、本発明は、細胞虚血/再灌流傷害に関連する病状、特に炎症性症候群、心血管疾患、神経若しくは脳の疾患、手術に関連する虚血/再灌流傷害及び臓器移植に関連する虚血/再灌流傷害を含む群より選択される病状の治療又は予防、或いは感染に関連する病状、特に感染性疾患及び炎症関連疾患を含む群より選択される病状の治療又は予防を意図する薬剤の製造のための組合せ製品としての上記組合せの使用に関する。
【００５１】
本発明の１つの好ましい実施形態は、病状が、敗血症、虚血性脳卒中、急性心筋梗塞、四肢の虚血、急性神経変性疾患、慢性神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、ダウン症候群、ハンチントン病及びパーキンソン病、臓器移植、化学療法及び放射線照射傷害、例えば放射線照射脳傷害を含んでなる群から選択される上記の組合せの使用に関する。
【００５２】
１つの好ましい実施形態において、本発明は、敗血症、すなわち感染性疾患に伴う全身性炎症反応症候群(SIRS)の予防又は治療を意図する薬剤/医薬の製造のための上記の組成物の使用に関する。敗血症の悪化により引き起こされる症候群の例は、重症敗血症、敗血症性ショック及び多臓器不全症候群を含む。
【００５３】
１つの特定の実施形態において、本発明は、上記の変異アンチトロンビンが、
−  実質的に低下したトロンビン阻害活性を有するか若しくはトロンビン阻害活性を実質的に失っている、又は
−  低下した第Xa因子阻害活性を有するか若しくは第Xa因子阻害活性を実質的に失っている、又は
−  実質的に低下したトロンビン阻害活性及び第Xa因子阻害活性を有するか若しくはトロンビン阻害活性及び第Xa因子阻害活性を実質的に失っている、
上記の組合せの使用に関する。
【００５４】
本発明の１つのより具体的な実施形態は、第１のアンチトロンビンが、380位のアミノ酸から400位のアミノ酸までの領域内、特に390位のアミノ酸から397位のアミノ酸までの領域内、特に390位のアミノ酸から394のアミノ酸までの領域内、特に393位又は394位に少なくとも１つの変異を含んでなり、該変異が置換、挿入又は欠失であり、第２のアンチトロンビンが野生型アンチトロンビンである、上記の組合せの使用に関する。ここで、アミノ酸の番号付けは、配列番号２で表されるアンチトロンビンアミノ酸配列に関する。
【００５５】
１つの有利な実施形態において、本発明は、
第１のアンチトロンビンが、
−  配列番号４(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸のヒスチジン(His)による置換を含んでなる)、
−  配列番号６(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸と394位のアミノ酸との間のプロリン(Pro)の挿入を含んでなる)、
−  配列番号８(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸の欠失を含んでなる)、
−  配列番号10(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸の欠失を含んでなる)、
−  配列番号18(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位及び394位のアミノ酸の欠失を含んでなる)、
−  配列番号62(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、及び
−  配列番号64(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸のグルタミン酸(Glu)による置換を含んでなる)
からなる群より選択されるアミノ酸配列であり、
第２のアンチトロンビンが配列番号２からなる、
上記の使用に関する。
【００５６】
上記の組合せは、アンチトロンビンの「反応中心ループ」内に１又は２つの変異を有する少なくとも１つの変異した第１のアンチトロンビンを、野生型アンチトロンビンと共に含有する。
【００５７】
１つの有利な実施形態において、本発明は、第１のアンチトロンビンが、96位、135位、155位又は192位、特に135位のアミノ酸に位置するグリコシル化部位に少なくとも１つの変異を更に含んでなる上記の組成物の使用に関する。ここで、アミノ酸の番号付けは、配列番号２で表されるアンチトロンビンアミノ酸配列に関する。
【００５８】
本発明の別の有利な実施形態は、
第１のアンチトロンビンが、
−  配列番号14(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸のヒスチジン(His)による置換及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
−  配列番号16(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸と394位のアミノ酸との間のプロリン(Pro)の挿入及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
−  配列番号20(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸の欠失及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
−  配列番号22(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸の欠失及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
−  配列番号24(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位及び394位のアミノ酸の欠失と、135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換とを含んでなる)、
−  配列番号66(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、及び
−  配列番号68(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸のグルタミン酸(Glu)による置換及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)
からなる群より選択されるアミノ酸配列であり、
第２のアンチトロンビンが配列番号２からなる、
上記の使用に関する。
【００５９】
上記の組合せは、アンチトロンビンの「反応中心ループ」内の１又は２つの変異及びグリコシル化部位での変異を有する少なくとも１つの変異した第１のアンチトロンビンを、野生型アンチトロンビンと共に含有する。
【００６０】
別の好ましい実施形態において、本発明は、第２のアンチトロンビンが、96位、135位、155位又は192位、特に135位のアミノ酸に位置するグリコシル化部位に少なくとも１つの変異を含む上記の組成物の使用に関する。ここで、アミノ酸の番号付けは、配列番号２で表されるアンチトロンビンアミノ酸配列に関する。
【００６１】
別の好ましい実施形態において、本発明は、
第１のアンチトロンビンが、
−  配列番号14(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸のヒスチジン(His)による置換及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
−  配列番号16(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸と394位のアミノ酸との間のプロリン(Pro)の挿入及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
−  配列番号20(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位のアミノ酸の欠失及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
−  配列番号22(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸の欠失及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
−  配列番号24(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、393位及び394位のアミノ酸の欠失と、135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換とを含んでなる)、
−  配列番号66(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、及び
−  配列番号68(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、394位のアミノ酸のグルタミン酸(Glu)による置換及び135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)
からなる群より選択されるアミノ酸配列であり、
第２のアンチトロンビンが配列番号78のアミノ酸配列(このアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中に、135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)からなる、
上記の使用に関する。
【００６２】
上記の組合せは、アンチトロンビンの「反応中心ループ」内の１又は２つの変異及びグリコシル化部位での変異を有する少なくとも１つの変異した第１のアンチトロンビンを、グリコシル化部位に変異を有するが抗凝固活性を保持する第２のアンチトロンビンと共に含有する。
【００６３】
１つの他の特定の実施形態において、本発明は、第１のアンチトロンビンが、412位のアミノ酸から432位のアミノ酸までの領域内、特に412位のアミノ酸から429位のアミノ酸までの領域内、特に422位のアミノ酸から426位のアミノ酸までの領域内、特に425位又は426位に少なくとも1つの変異を含んでなり、該変異が置換、挿入又は欠失であり、第２のアンチトロンビンが野生型アンチトロンビンである、上記の使用を開示する。ここで、アミノ酸の番号付けは、シグナルペプチドを含んでなる配列番号26で表されるアンチトロンビンアミノ酸配列に関する。
【００６４】
本発明の別の好ましい実施形態は、第１のアンチトロンビンが、
−  配列番号28(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸のヒスチジン(His)による置換を含んでなる)、又は
−  配列番号30(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸と426位のアミノ酸との間のプロリン(Pro)の挿入を含んでなる)、又は
−  配列番号32(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸の欠失を含んでなる)、又は
−  配列番号34(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸の欠失を含んでなる)、
−  配列番号42(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位及び426位のアミノ酸の欠失を含んでなる)、
−  配列番号70(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、及び
−  配列番号72(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸のグルタミン酸(Glu)による置換を含んでなる)、
からなる群より選択されるアミノ酸配列であり、
第２のアンチトロンビンが配列番号26からなる、上記の使用に関する。
【００６５】
上記の組合せは、アンチトロンビンの「反応中心ループ」内に１又は２つの変異を有する少なくとも１つの変異した第１のアンチトロンビンを、野生型アンチトロンビンと共に含有する。
【００６６】
また、別の好ましい実施形態において、本発明は、第１のアンチトロンビンが、128位、167位、187位又は224位、特に167位のアミノ酸に位置するグリコシル化部位に少なくとも１つの変異を更に含んでなる、上記の使用に関する。ここで、アミノ酸の番号付けは、配列番号26で表されるアンチトロンビンアミノ酸配列に関する。
【００６７】
本発明の別の好ましい実施形態は、
第１のアンチトロンビンが、
−  配列番号38(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸のヒスチジン(His)による置換及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
−  配列番号40(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸と426位のアミノ酸との間のプロリン(Pro)の挿入及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
−  配列番号44(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸の欠失及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
−  配列番号46(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸の欠失及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
−  配列番号48(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位及び426位のアミノ酸の欠失と、167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換とを含んでなる)、
−  配列番号74(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、及び
−  配列番号76(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸のグルタミン酸(Glu)による置換及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)
からなる群より選択されるアミノ酸配列であり、
第２のアンチトロンビンが配列番号26からなる、上記の使用に関する。
【００６８】
上記の組合せは、アンチトロンビンの「反応中心ループ」内の１又は２つの変異及びグリコシル化部位での変異を有する少なくとも１つの変異した第１のアンチトロンビンを、野生型アンチトロンビンと共に含有する。
【００６９】
本発明の別の好ましい実施形態は、第２のアンチトロンビンが、128位、167位、187位又は224位、特に167位のアミノ酸に位置するグリコシル化部位に少なくとも１つの変異を含んでなる、上記の使用に関する。ここで、アミノ酸の番号付けは、配列番号26で表されるアンチトロンビンアミノ酸配列に関する。
【００７０】
本発明の別の好ましい実施形態は、
第１のアンチトロンビンが：
−  配列番号38(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸のヒスチジン(His)による置換及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
−  配列番号40(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸と426位のアミノ酸との間のプロリン(Pro)の挿入及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
−  配列番号44(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位のアミノ酸の欠失及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
−  配列番号46(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸の欠失及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、
−  配列番号48(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、425位及び426位のアミノ酸の欠失と、167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換とを含んでなる)、
−  配列番号74(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、及び
−  配列番号76(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、426位のアミノ酸のグルタミン酸(Glu)による置換及び167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)
からなる群より選択されるアミノ酸配列であり、
第２のアンチトロンビンが配列番号80のアミノ酸配列(このアミノ酸配列は、配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中に、167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換を含んでなる)、上記の使用に関する。
【００７１】
上記の組合せは、アンチトロンビンの「反応中心ループ」内の１又は２つの変異及びグリコシル化部位での変異を有する少なくとも１つの変異した第１のアンチトロンビンを、グリコシル化部位に変異を有するが抗凝固活性を保持する第２のアンチトロンビンと共に含有する。
【００７２】
本発明は、
−  請求項１〜５又は９のいずれかに記載の、実質的に低下した抗凝固活性を有するか又は抗凝固活性を実質的に有さない少なくとも１つの変異アンチトロンビンからなる第１トロンビンと、
−  野生型アンチトロンビンのものと類似の抗凝固活性を有する少なくとも１つのアンチトロンビンからなる第２のアンチトロンビンと
を少なくとも含んでなる、感染、炎症又は低酸素傷害のような細胞傷害と関係する病状の予防又は治療を意図する薬剤の製造のための組合せ製品としての組成物に関し、ここで、
該組合せ製品は同時、逐次的又は別々の投与に用いることができ、
前記第１及び第２のアンチトロンビンは、所定の重量比、好ましくは約10:１〜約１:５、好ましくは約５:１〜約１:２、より好ましくは約２:１〜約１:２のそれぞれの重量比である。
【００７３】
１つの好ましい実施形態において、本発明は、細胞虚血/再灌流傷害に関連する病状、特に炎症性症候群、心血管疾患、神経若しくは脳の疾患、手術に関連する虚血/再灌流傷害及び臓器移植に関連する虚血/再灌流傷害を含む群より選択される病状の治療又は予防、或いは感染に関連する病状、特に感染性疾患及び炎症関連疾患を含む群より選択される病状の治療又は予防を意図する薬剤の製造のための組合せ製品としての上記の組合せを開示する。
【００７４】
別の好ましい実施形態において、本発明は、病状が、敗血症、虚血性脳卒中、急性心筋梗塞、四肢の虚血、急性神経変性疾患、慢性神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、ダウン症候群、ハンチントン病及びパーキンソン病、臓器移植、化学療法及び放射線照射傷害、例えば放射線照射脳傷害を含んでなる群から選択される上記の組合せに関する。
【００７５】
その他の具体的な実施形態において、本発明は、第１のアンチトロンビンが、
−  実質的に低下したトロンビン阻害活性を有するか若しくはトロンビン阻害活性を実質的に失っている、又は
−  低下した第Xa因子阻害活性を有するか若しくは第Xa因子阻害活性を実質的に失っている、又は
−  実質的に低下したトロンビン阻害活性及び第Xa因子阻害活性を有するか若しくはトロンビン阻害活性及び第Xa因子阻害活性を実質的に失っている、
上記の組合せに関する。
【００７６】
本発明の別の好ましい実施形態は、第１のアンチトロンビンが、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号10、配列番号18、配列番号62及び配列番号64からなる群より選択されるアミノ酸配列であり、第２のアンチトロンビンが配列番号２からなる上記の組合せに関する。
【００７７】
１つの他の特定の実施形態において、本発明は、第１のアンチトロンビンが、配列番号14、配列番号16、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号66及び配列番号68からなる群より選択されるアミノ酸配列であり、第２のアンチトロンビンが配列番号２又は配列番号78からなる上記の組合せに関する。
【００７８】
また、別の好ましい実施形態において、本発明は、第１のアンチトロンビンが、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号42、配列番号70及び配列番号72からなる群より選択され、第２のアンチトロンビンが配列番号26からなる上記の組合せに関する。
【００７９】
１つの他の特定の実施形態において、本発明は、第１のアンチトロンビンが、配列番号38、配列番号40、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号74及び配列番号76からなる群より選択され、第２のアンチトロンビンが配列番号26又は配列番号80からなる上記の組合せに関する。
【００８０】
本発明はまた、活性成分として少なくとも上記の変異アンチトロンビン、特に配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74及び配列番号76の変異アンチトロンビンを、医薬的に許容され得るビヒクルとと共に含んでなる医薬組成物に関する。
表現「医薬的に許容され得るビヒクル」とは、医薬組成物を製造するために製薬産業において通常用いられる医薬的に許容され得る固体又は液体の、希釈剤又はカプセル化剤、充填剤又は運搬剤を意味する。
【００８１】
医薬組成物の剤形は、即時放出、延長放出、パルス放出、可変放出、制御放出、持効性放出(timed release)、持続放出、遅延放出、長期作用性及びそれらの組合せを含む。
好ましくは、本発明による医薬組成物は、静脈内、腹腔内、皮下又は経口で送達できる。
１つの他の好ましい実施形態において、本発明は、好ましくは約80IU/kg/日〜約300IU/kg/日、好ましくは約100IU/kg/日〜約200IU/kg/日の投薬量で投与される上記の医薬組成物に関する。
【００８２】
本発明はまた、
活性成分として、
−  上記の、抗凝固活性が実質的に低下しているか若しくは抗凝固活性を実質的に有さない少なくとも１つの変異アンチトロンビンからなる第１のアンチトロンビンと、
−  野生型アンチトロンビンのものと類似の抗凝固活性を有する少なくとも１つのアンチトロンビンからなる第２のアンチトロンビンと
を含んでなる組合せであって、
−  配列番号４；配列番号６、配列番号８若しくは配列番号10、配列番号18、配列番号62若しくは配列番号64と配列番号２、
−  配列番号14、配列番号16、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号66若しくは配列番号68と配列番号２、
−  配列番号14、配列番号16、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号66若しくは配列番号68と配列番号78、
−  配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号42、配列番号70若しくは配列番号72と配列番号26、
−  配列番号38、配列番号40、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号74若しくは配列番号76と配列番号26、及び
−  配列番号38、配列番号40、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号74若しくは配列番号76と配列番号80
からなる群の組合せ
を医薬的に許容されるビヒクルと共に含む医薬組成物に関する。
【００８３】
好ましくは、本発明による医薬組成物は、静脈内、腹腔内、皮下又は経口で送達できる。
１つの他の好ましい実施形態において、本発明は、好ましくは約20UI/kg/日〜約600UI/kg/日、好ましくは約40UI/kg/日〜約300UI/kg/日の投薬量で投与される上記の医薬組成物に関する。
【００８４】
本発明はまた、配列番号２の394位のアミノ酸のグルタミン酸(Glu)又はグルタミン(Gln)によるアミノ酸置換を少なくとも含有する変異アンチトロンビン、特に配列番号62又は配列番号64で表される変異アンチトロンビンに関する。
【００８５】
本発明は、少なくとも２つの変異：
−  配列番号２で表されるアンチトロンビンの配列中の、394位のアミノ酸のグルタミン酸(Glu)又はグルタミン(Gln)による置換である第１の変異、及び
−  135位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による置換である第２の変異
を含有する変異アンチトロンビン、特に配列番号66又は68で表される変異アンチトロンビンに関する。
【００８６】
本発明はまた、配列番号26の426位のアミノ酸のグルタミン酸(Glu)又はグルタミン(Gln)によるアミノ酸置換を少なくとも含有する変異アンチトロンビン、特に配列番号70又は配列番号72で表される変異アンチトロンビンに関する。
【００８７】
本発明はまた、少なくとも２つの変異：
−  配列番号26で表されるアンチトロンビンの配列中の、426位のアミノ酸のグルタミン酸(Glu)又はグルタミン(Gln)による置換である第１の変異、及び
−  167位のアミノ酸のグルタミン(Gln)による変異である第２変異
を含有する変異アンチトロンビン、特に配列番号74又は76で表される変異アンチトロンビンに関する。
【００８８】
本発明はまた、上記の変異アンチトロンビンをコードする、DNA又はRNAであるヌクレオチド配列、特に配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73及び配列番号75又は前記核酸配列の相補配列からなる群より選択されるクレオチド配列に関する。
【００８９】
本発明を、以下の実施例及び図面により限定することなく説明する。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】全長アンチトロンビンcDNAを有するシャトルベクターの製造  短縮型AT cDNAを含有する２μgのpENTRベクター(レーン１及び２)、全長AT cDNAを含有するpCMV6ベクター(レーン３及び４)又はシャトルベクターpENTR-AT (レーン５及び６)を、SacII及びStuIの両方による完全消化の前(レーン１、３、５)又は後(レーン２、４、６)に、１％アガロースゲル上にロードする。分子量標準サイズを図の左手に示し、塩基対(bp)で表す。全長AT cDNAを含有するpCMV6ベクターのSacII/StuI消化により、短縮型AT cDNAを含有するpENTRベクターのSacII/StuI消化物から単離されたpENTRベクター中にクローニングされる、全長AT cDNAに相当する1182bpのバンドが遊離される。これらの２つのフラグメントのライゲーション後、最終生成物を効率的に再環化する。最終生成物は、SacII/StuI消化後にpENTR-ATについて予測されたプロフィールを示す。
【図２】AT発現ベクターの特徴決定  ２μgのpCDNA 3.2ベクター(レーン１、２、３)、全長AT cDNAを含有するpCDNA 3.2ベクター(レーン４、５、６)又は全長AT-N135Q-Pro394 cDNAを含有するpCDNA 3.2ベクター(レーン７、８、９)を、エンドヌクレアーゼ処理の前(レーン１、４、７)、StuIによる切断の後(レーン２、５、８)又はSacII及びStuIの両方による完全切断の後(レーン３、６、９)に、１％アガロースゲル上にロードする。分子量標準サイズを図の右手に示し、塩基対(bp)で表す。pCDNA 3.2ベクターには3189位及び4329位にそれぞれ１つのSacII切断部位及び１つのStuI切断部位が存在する。したがって、StuIのみによるpCDNA 3.2の切断は、ベクターの線状化(7711bpのバンド)を導く一方、StuI及びSacIIの両方によるpCDNA 3.2の切断は、ベクターを２つのフラグメント(6571bp及び1140bp)に切断する。組換えによるpCDNA 3.2中へのAT cDNAフラグメント(1448bp)による912〜3174フラグメントの置換は、1070位でもう１つのSacII部位及び2252位でもう１つのStuI部位をpcDNA-AT中に導入する。その後、StuIによるpCDNA-ATの切断は２つのフラグメント(5634bp及び1263bp)を生じ、両ヌクレアーゼによる切断は４つのフラグメント(4452bp、1182bp、1140及び123bp)を生じる。同じことが-N135Q-Pro394 cDNAについてもいえる。
【図３】細胞培養培地における組換えAT分泌についてのクローンスクリーニング  pCDNA-AT (レーン１〜５にそれぞれクローン１〜５)、pCDNA-AT-N135Q (レーン６〜９にそれぞれクローン１〜４)又はpCDNA-AT-N135Q-Pro394 (レーン10〜14にそれぞれクローン１〜５)でのトランスフェクション後に単離した各クローンについて、細胞との24時間の接触後に採集した30μlの馴化培地を、全長組換えアンチトロンビンを分泌する能力について、変性条件でのウェスタンブロッティングにより分析する。各クローンについて、組換えアンチトロンビンに対応する多様な強度の単一バンドが観察できる。組換え野生型アンチトロンビンは、血漿から精製した対照アンチトロンビン(レーン15、150ng/レーン)と同じレベルで移動し、発現レベルは、バンド強度測定によれば２mg/L程度と見積もられる。wt-ATについては、クローン４をセルファクトリー(cell factory)中での拡大培養用に選択する。なぜなら、発現レベルがその他のものよりもわずかにより高いようであるからである。変異体AT-N135Q及びAT-N135Q-Pro394は、血漿から精製し対照アンチトロンビン(レーン15)のすぐ下に移動する。このことにより、N135Qの置換に起因するグリコシル化部位の喪失が確証される。大規模なタンパク質生成用に選択した安定発現クローンは、AT-N135Q及びAT-N135Q-Pro394の両方についてクローン１である。
【図４】組換えアンチトロンビンの完全性及び純度  ヘパリン親和性精製及びイオン交換濃縮の後の組換えアンチトロンビンの完全性及び純度を検証するために、２μgのAT-N135Q-R393H (レーン１)、AT-N135Q-Pro394 (レーン２)又は対照の血漿アンチトロンビン(レーン３)を、SDS-PAGE及び続くクーマシー染色により分析する。予測されたように、２つの変異アンチトロンビンは、グリコシル化部位の喪失(置換N135Q)のために血漿アンチトロンビンよりわずかに低い分子量に移動し、これらは、ゲル上にロードした量に相当するバンド強度(吸光度評価に基づく)の単一バンドパターンを示す。組換えアンチトロンビンは純粋であるようであり、抗凝固性及びヘパリン誘導体に対する親和性について試験することが可能である。分子量標準サイズを図の右手に示し、キロダルトン(KD)で表す。
【図５】飽和ペンタサッカライド濃度での血漿アンチトロンビン又は変異アンチトロンビンの抗第Xa因子活性  図5A：ペンタサッカライド (１μM又は1.73mg/L)の存在下で、FXa (１nM)による色素産生性基質S2765 (200μM)の加水分解を阻害する能力について血漿AT (黒四角：80nM、白抜き四角：40nM、黒丸：20nM、白抜き丸：10nM)を連続アッセイで試験する。秒で表す時間を横座標にプロットし、405nmでの吸光度を縦座標にプロットする。等式３を用いて基質加水分解曲線をフィットさせて、動力学的速度定数(ｋ)を決定する(灰色線)。  図5B：図5aで決定した動力学的速度定数(ｋ)をAT濃度の関数としてプロットし、等式４を用いてフィットさせて、阻害速度定数konを決定する。血漿アンチトロンビン濃度(nM)を横座標にプロットし、s-1で表す動力学的速度定数(ｋ)を縦座標にプロットする。
【図６】FXa活性を阻害する能力についてAT-N135Q-R393H及びAT-N135Q-Pro394を不連続アッセイで試験する  １回目で、AT-N135Q-R393H (黒四角：200nM)又はAT-N135Q-Pro394 (白抜き四角：2.5μM)をFXa (20nM)と、ペンタサッカライド(10μM又は17.3mg/L)の存在下に０〜120分間(AT-N135Q-R393Hについて)又は０〜1400分間(AT-N135Q-Pro394について)インキュベートする。２回目で、190μlのS2765 (200μM)を10μlの前の混合物に加えることにより、FXa残存活性を測定する。次いで、基質加水分解の初速度をインヒビターとのインキュベーション時間の関数としてプロットし、曲線を等式１でフィットさせてkonを決定する(灰色線)。分で表す時間を横座標にプロットし、OD/s-1で表される基質加水分解速度を縦座標にプロットする。
【図７】LPS刺激血液細胞によるIL6生成を阻害する能力についてAT-Pro394を試験する  血液を、PBS (白色の箱)、AT-wt (Aclotine(登録商標)、1.6IU/mlの最終濃度、黒色の箱)又はAT-Pro394 (1.6IU/mlの最終濃度、灰色の箱)のいずれかと５分間37℃で前処理し、次いで10又は100μg/mLのLPSでの16時間の刺激に曝露する。次いで、血液を2300ｇで10分間12℃にて遠心分離し、血漿上清からのIL6タンパク質レベルを定量的に測定する。パーセンテージで表す血漿IL6濃度を縦座標にプロットする(100％はPBS対照のIL6レベルに相当する)。実験は２名の異なる健常対象者の血液を用いて行った。
【実施例】
【００９１】
実験の部
抗凝固活性、特に第Xa因子及び第IIa因子阻害活性を喪失しているか又は低下しており、ヘパリン及びペンタサッカライドに結合することができる変異アンチトロンビンを製造するため、種々のタイプの変異、特に反応中心ループ(アミノ酸380〜アミノ酸400の領域)内の変異、ループから遠隔でありプロテイナーゼ相互作用のために接近しやすいエキソサイト領域(Chuang YJ, Swanson R, Raja SM, Olson ST, Heparin enhances the specificity of antithrombin for thrombin and factor Xa independent of the reactive center loop sequence. Evidence for an exosite determinant of factor Xa specificity in heparin-activated antithrombin, J Biol Chem., 2001; 276: 14961-71)内の変異及びグリコシル化のコンセンサス配列(アミノ酸135〜137及び155〜157) (Fan B, Crews BC, Turko IV, Choay J, Zettlmeissl G, Gettins P., Heterogeneity of recombinant human antithrombin III expressed in baby hamster kidney cells., J Biol Chem., 1993; 268: 17588-96)内の変異が企図された。
【００９２】
変異アンチトロンビンを取得するため、幾つかの変異、特に
−  FXa及びFIIaのような任意の凝固プロテアーゼに対するアンチトロンビンの阻害活性を除去するための、アンチトロンビンの反応性ループ内の領域P4-P4' (Ala 391〜Asn 396)における欠失、
−  反応性ループの領域P4-P4' (Ala 391〜Asn 396)内のアミノ酸の置換、特に393位のアミノ酸(Arg)のヒスチジンによる置換又は394位のアミノ酸(Ser)のグルタミン酸若しくはグルタミンによる置換、
−  393位のアミノ酸と394位のアミノ酸との間のプロリンの挿入、及び
−  ヘパリン及びペンタサッカライドとの親和性を増大させるための、アンチトロンビンのグリコシル化領域内のアミノ酸の置換、特に135位のアミノ酸(Asp)のグルタミンによる置換
を行った。
【００９３】
材料及び方法
Ｉ  変異アンチトロンビンの製造
全長アンチトロンビンcDNAを有するシャトルベクターpENTR (pENTR-AT)の製造
pENTRベクター(Invitrogen, HORFクローンリファレンスIOH14497)中に最初にクローニングされたアンチトロンビンcDNA配列は、短縮型であることが判明し、pCMV6 (Origene, リファレンスTC110831)にクローニングされた全長アンチトロンビン配列で置き換えなければならない。全長アンチトロンビンcDNAを含有するプラスミドpCMV6を、SacII及びStuIの両エンドヌクレアーゼで消化する。1182塩基対のフラグメントを１％アガロースゲル上で単離し、QIAquickゲル抽出キットを用いて精製する。この1182塩基対のフラグメントは、アンチトロンビンcDNAのSacII-StuIフラグメントに相当するが、それを、SacII及びStuIにより線状化したpENTRベクター(2760bp)にライゲーションし、上記のように回収する。このカセット交換の結果は、１％アガロースゲル上での電気泳動(図１)及び配列決定により検証する。
【００９４】
アンチトロンビンcDNAに対する変異誘発：
野生型アンチトロンビンをコードするcDNAを有する得られたプラスミドpENTR (pENTR-ATwt)を、製造業者(Stratagene)の推奨に従ってQuickChange II部位特異的変異誘発キットを用いるPCRによる更なる変異誘発用の鋳型として用いる。野生型アンチトロンビンは、血漿アンチトロンビンと同じアミノ酸配列を有するが、組換え形態で生成する。変異誘発プライマー(表１)を用いて、アルギニン135のコドンの代わりにグルタミンのコドンを導入し(N135Q)、プラスミドpENTR-AT-N135Qを作製する。QuickChange II部位特異的変異誘発キットを鋳型としてのpENTR-ATwt及び表１に記載される変異誘発プライマーと共に用いるPCRにより、アルギニン393のヒスチジンによる単一アミノ酸置換(R393H)、セリン394のグルタミン酸若しくはグルタミンによる単一アミノ酸置換(それぞれS394Q、S394E)、アルギニン393とセリン394の間のプロリンの挿入(Pro394)又はアルギニン393、セリン394若しくはアルギニン393及びセリン394の両方の欠失(それぞれΔR393、ΔS394、ΔR393S394)を導入する。pENTR-AT-N135Qを鋳型として用いるPCR反応で同じ組の変異誘発プライマーを使用して、二重変異体及び三重変異体アンチトロンビンN135Q-R393H、N135Q-S394Q、N135Q-S394E、N135Q-Pro394、N135Q-ΔR393、N135Q-ΔS394及びN135Q-ΔR393S394をそれぞれコードするcDNAを有するプラスミドを製造する。次いで、各変異体カセット、すなわち上記の二重変異体又は三重変異体アンチトロンビンをコードするcDNAの完全性を、DNA配列決定により確立する。
【００９５】
シャトルベクターと発現ベクターとの間のカセット交換：
アンチトロンビン、単一変異アンチトロンビン又は二重変異アンチトロンビンをコードする上記cDNAの全てを、シャトルベクターpENTRから真核発現ベクターpCDNA 3.2中に、Gateway LR Clonase II酵素ミックス(Invitrogenにより開発された「Gatewayテクノロジー」)を用いる組換えによって移す。最終発現構築物は、１％アガロースゲル上での電気泳動及びトランスフェクション前の再度の配列決定により検証する(図２)。
【００９６】
真核細胞のトランスフェクション及びタンパク質生成
事前の組換えにより得られたpCDNA-ATwt、pCDNA-AT-N135Q、pCDNA-AT-R393H、pCDNA-AT-S394Q、pCDNA-AT-S394E、pCDNA-AT-Pro394、pCDNA-AT-ΔR393、pCDNA-AT-ΔS394、pCDNA-AT-ΔR393S394、pCDNA-AT-N135Q-R393H、pCDNA-AT-N135Q-S394Q、pCDNA-AT-N135Q-S394E、pCDNA-AT-N135Q-Pro394、pCDNA-AT-N135Q-ΔR393、pCDNA-AT-N135Q-ΔS394及びpCDNA-AT-N135Q-ΔR393S394と名付けたプラスミド構築物をそれぞれ、改変ヒト胚性腎臓細胞(HEK-293)又はベビーハムスター腎臓細胞(BHK-21)のトランスフェクションに用いる。細胞を、２mM L-グルタミン、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン及び５％胎仔ウシ血清を含有する「ダルベッコ改変イーグル培地/F-12」(Invitrogen)中で成長させ、リン酸カルシウム共沈によりおよそ106細胞に20μgのDNAをトランスフェクトする(Sambrookら、Molecular cloning: A laboratory manual, 第２版、16.33頁)。安定発現細胞株を、G418により選択し(クローン選択の間、G418濃度は細胞培養培地中0.8mg/mlであり、次いで0.4mg/mlに減少させて、クローン増殖の間、選択圧を維持する)、マウスモノクローナル抗体 抗アンチトロンビンを捕捉抗体として、セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ヒツジポリクローナル抗体 抗アンチトロンビンを検出抗体として用いるELISA (Antithrombine BioAssay (商標) ELISAキット(EUROMEDEX))により、アンチトロンビン分泌についてスクリーニングする。分泌されたアンチトロンビンの完全性は、ヒツジモノクローナル抗体 抗アンチトロンビン及びセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合ロバポリクローナル抗体 抗ヒツジ(The Binding Site、UK)を用いるウェスタンブロッティングにより確立する(図３)。各変異アンチトロンビンについて、単一安定発現クローンを「セルファクトリーヌンクロン(cell factories nunclon)」(Nunc)中で拡大培養し、２mM L-グルタミン、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン及び５μg/mlインスリン/トランスフェリン/セレンを含有する「ダルベッコ改変イーグル培地/F-12」(Invitrogen)を300μl/cm2 (製造業者により推奨されるように、6320cm2培養面積のセルファクトリーに適する最小容量は２リットルである)で用いて、大規模タンパク質生産を行う。毎日採集する馴化培地を3000ｇで４℃にて15分間遠心分離し、５mMベンズアミジン、５mM EDTAで処理し、-20℃にて保存する。
【００９７】
タンパク質精製：
馴化培地を融解し、プールして、塩濃度を0.4Ｍ NaClに調整し、次いで10mM Tris又は20mMリン酸緩衝液、0.4Ｍ NaCl及び0.1mM EDTA、pH7.4を用いて平衡化したヘパリン固定化カラム(Hitrap Heparin 5ml又はHeparin-sepharose CL6B 50ml、GE Biological)に適用する。結合したタンパク質を、0.4Ｍ〜２ＭのNaCl勾配の同じ緩衝液で溶出させる。0.8Ｍ NaCl以上で溶出した画分は、野生型アンチトロンビン又は高いヘパリン親和性を有する変異アンチトロンビンのみを含有していた。アスパラギン135のグルタミンによる置換を有する変異アンチトロンビン(AT-N135、ATN135Q-R393H、AT-N135Q-S394Q、AT-N135Q-S394E、AT-N135Q-Pro394、AT-N135Q-ΔR393、AT-N135Q-ΔS394、AT-N135Q-ΔR393S394)は、野生型アンチトロンビンより高いイオン強度にてアフィニティーカラムから溶出した。このことにより、135位のグリコシル化部位の破壊はヘパリンに対するアンチトロンビンの親和性を増大させることが確証された(90％が0.8Ｍ〜1.2Ｍ NaClに溶出する野生型アンチトロンビンと比較して、置換N135Qを有する変異アンチトロンビンの約90％は、１Ｍ〜1.4Ｍ NaClに溶出する)。採集した画分をプールし、10mM Tris又は20mMリン酸塩及び0.1Ｍ NaCl、pH7.4に対して４℃にて一晩透析するか、又は10mM Tris若しくは20mMリン酸塩及び0.1Ｍ NaCl、pH7.4で平衡化したHiPrep 26/10脱塩カラムに適用するかのいずれかにより、塩濃度を減少させる。次いで、アンチトロンビンを、10mM Tris又は20mMリン酸塩及び0.1Ｍ NaCl、pH7.4を用いて平衡化した「Resource Q」１mlカラム(GE, Biological)を用いるイオン交換クロマトグラフィーにより濃縮し、0.1mM〜0.5Ｍ又は20mM〜0.5ＭのNaCl勾配の同じ緩衝液中に溶出させる。
【００９８】
各溶出画分中のアンチトロンビン濃度は、280nmの吸光により、吸光係数ε = 0.65g-1.l.cm-1を用いて評価する。精製した野生型アンチトロンビン又は変異アンチトロンビンの完全性は、上記と同じ一組の抗体を用いるウェスタンブロッティングと、未変性及び変性条件下にて10％アクリルアミド/ビスアクリルアミドゲル上での電気泳動及び続くクーマシーブリリアントブルーR-250染色とにより試験する(図４)。次いで、アンチトロンビン調製物をアリコートに小分けし、機能的アッセイに用いるまで-80℃で保存する。同じ手順を用いて、ヒト血漿から血漿アンチトロンビン(内部参照として使用)を精製する。ヒト血漿から得られた市販のAT (Aclotine (登録商標)、LFB、France)も、以下の実験において対照として用いた。
【００９９】
【表１】
0005764499.tif 000002
【０１００】
II 変異アンチトロンビンのインビトロ特徴決定
変異アンチトロンビンの特徴決定は、以下のことを目的とする：
−  ａ)精製された系において、以下の変異アンチトロンビン：AT-R393H、S394Q、AT-S394E、AT-Pro394、AT-ΔR393-S394、AT-ΔR393、AT-ΔS394、AT-N135Q-R393H、AT-N135Q-S394Q、AT-N135Q-S394E、AT-N135Q-Pro394、AT-N135Q-ΔR393-S394、AT-N135Q-ΔR393及びAT-N135Q-ΔS394が、野生型アンチトロンビン(AT-wt)のもとのと比較して、低下した抗FXa活性及び抗FIIa活性をヘパリン誘導体の存在又は非存在下で示すことを証明すること、
−  ｂ)以下の変異アンチトロンビンAT-R393H、AT-S394Q、AT-S394E、AT-Pro394、AT-ΔR393-S394、AT-ΔR393、AT-ΔS394、AT-N135Q-R393H、AT-N135Q-S394Q、AT-N135Q-S394E、AT-N135Q-Pro394、AT-N135Q-ΔR393-S394、AT-N135Q-ΔR393、AT-N135Q-ΔS394又はこれら変異アンチトロンビンの少なくとも１つと野生型アンチトロンビンのものに類似する抗凝固活性を有するアンチトロンビンとを含んでなる組成物が、野生型アンチトロンビンと比較した場合、少なくとも同等の細胞保護特性を有することを証明すること。
【０１０１】
ａ)精製された系における変異アンチトロンビンの抗第Xa因子阻害活性
第Xa因子(FXa, Kordia)のアンチトロンビン阻害についての動力学的アッセイを、「動力学的」緩衝液(Hepes、20mMリン酸塩、pH7.4、0.15Ｍ NaCl、0.1％ PEG 8000及び１mg/mlウシ血清アルブミン)中で擬似一次反応条件で行う。簡潔には、第Xa因子を、過剰の試験アンチトロンビン(血漿アンチトロンビン又は野生型アンチトロンビン又は変異アンチトロンビンに相当し、行う各アッセイで変わる)とペンタサッカライド(フォンダパリヌクスナトリウム、Arixtra (登録商標)、GlaxoSmithKline)の存在下又は非存在下でインキュベートし、残存する第Xa因子活性を時間の関数として測定する。全ての試験アンチトロンビンがペンタサッカライドと結合するように、ペンタサッカライドを反応媒体中に過剰に加える。ペンタサッカライド非存在下では、反応媒体中に存在する可能性がある硫酸化グリコサミノグリカンを中和するために、ポリブレン(最終100μg/ml)を加える。残存第Xa因子活性を、色素産生性基質(S2765又はS2222、Chromogenix)の開裂に起因する405nmでの吸光度の増大として、マイクロプレートリーダー(Dynatech MR 5000)を用いて測定する。データの分析は、GraphPad Prismバージョン３ソフトウェアを用いて行う。吸光度の記録は、予測される阻害速度定数(kon)に応じて連続又は不連続である。
【０１０２】
阻害速度定数(kon)は、M-1.s-1で示される二次速度定数であり、プロテアーゼとアンチトロンビンとの間での安定な複合体形成の速度を規定する(konの値が高いほど、複合体がより速く形成される)。
予測されるkonが104 M-1.s-1より低いとき、不連続法を用いる。第Xa因子(２〜200nM)を、試験アンチトロンビン(20nM〜20μM)とペンタサッカライド又はポリブレンの存在下で、10μlの最終容量で10秒間〜５時間又は10秒間〜24時間インキュベートする。このインキュベーション期間の終時に、200μMの基質を含有する190μlの動力学的緩衝液を加え、405nmでの吸光度を記録する。
【０１０３】
動力学的速度定数(ｋ)は、非線形回帰を用いて、基質加水分解初速度曲線を等式(１)にフィットさせることにより見積もられる。ここで、v0及び v∞は、それぞれ時間t0又はt∞における基質加水分解速度である。
vt = (v0 + v∞). exp (-k.t)      (１)
【０１０４】
阻害速度定数(kon)は、速度定数(ｋ)から等式(２)を用いて算出される。ここで、ATは試験アンチトロンビンの濃度である。
ｋ = AT. kon      (２)
【０１０５】
予測されるkonが104 M-1.s-1より高いとき、連続法を用いる。試験アンチトロンビン(１nM〜１μM)を、基質(200μM)とペンタサッカライド又はポリブレンの存在下で190μlの最終容量でインキュベートし、10μLの第Xa因子(２〜200nM)を加えることにより反応を開始させる。速度定数(ｋ)は、基質加水分解曲線を等式(３)又は(３')に非線形回帰分析を用いてフィットさせることにより得られる。ここで、A0はt0での吸光度であり、vi及びvsはそれぞれ、試験アンチトロンビン非存在下での基質加水分解の初速度及び終速度である。
A405 = A0 + vi.(1 - exp (-k.t)) / k      (３)
等式(３')も、特に血漿の存在下で用いられる。
A405 = A0 + vs * t + (vi - vs) * (1 - exp (-kt)) / k
【０１０６】
阻害速度定数(kon)は、基質の競合効果を考慮した等式(４)を用いて動力学的定数(ｋ)から算出される。ここで、Ｓは基質の初期濃度であり、Kmは第Xa因子-基質相互作用についてのミカエリス定数であり、ATは試験アンチトロンビン濃度である。
ｋ = (kon / (１ + S / Km)). [AT]      (４)
変異アンチトロンビン及び野生型ATの阻害活性は、同じ条件下で測定し、血漿ATの阻害活性と比較する。
【０１０７】
ペンタサッカライドを用いたか又は用いなかった結果は、以下のとおりである：
−  野生型アンチトロンビン及びAT-N135Qの第Xa因子阻害活性は、血漿アンチトロンビンの第Xa因子阻害活性と同様である。
−  以下の変異アンチトロンビン：AT-R393H、AT-Pro394、AT-ΔR393-S394、AT-ΔR393、AT-ΔS394、AT-N135Q-R393H、AT-N135Q-Pro394、AT-N135Q-ΔR393-S394、AT-N135Q-ΔR393、AT-N135Q-ΔS394の第Xa因子阻害活性は、野生型アンチトロンビンの第Xa因子阻害活性と比較して無視できる。
−  以下の変異アンチトロンビン：AT-S394Q、AT-S394E、AT-N135Q-S394Q及びAT-N135Q-S394Eの第Xa因子阻害活性は、野生型アンチトロンビンの第Xa因子阻害活性と比較して２〜20分の１に減少する。
−  野生型アンチトロンビンと比較して２〜20分の１への第Xa因子阻害活性の減少は、以下の変異アンチトロンビン：AT-R393H、AT-S394Q、AT-S394E、AT-Pro394、AT-ΔR393-S394、AT-ΔR393、AT-ΔS394、AT-N135Q-R393H、AT-N135Q-S394Q、AT-N135Q-S394E、AT-N135Q-Pro394、AT-N135Q-ΔR393-S394、AT-N135Q-ΔR393又はAT-N135Q-ΔS394の１つとAT-wt又はAT-N135Qとを種々の比率で含有する組成物を用いて達成される。
【０１０８】
例えば、飽和量のペンタサッカライドの存在下での第Xa因子についての血漿ATの阻害速度定数(kon)は、連続法を用いて見積もる(図5a及び5b)。2.52×105 M-1.s-1の値が見出され、これは発表された値に匹敵する(Olson ST, Bjork I, Sheffer R, Craig PA, Shore JD, Choay J., J Biol Chem., 1992 Jun 25; 267(18): 12528-38, "Role of the antithrombin-binding pentasaccharide in heparin acceleration of antithrombin-proteinase reactions. Resolution of the antithrombin conformational change contribution to heparin rate enhancement)。この方法を用いて、AT-N135Q-R393H及びAT-N135Q-Pro394は、飽和ペンタサッカライド濃度の存在下でさえ、遅い第Xa因子インヒビターであることが見出される。よって、不連続法を行って、AT-N135Q-R393H及びAT-N135Q-Pro394によるペンタサッカライドの存在下での第Xa因子阻害についてのkon値を評価した(図６)。AT-N135Q-R393Hの抗凝固活性は大きく低下している一方、AT-N135Q-Pro394は抗第Xa因子活性がほとんどない。AT-N135Q-R393H及びAT-N135Q-Pro394のkon値は、それぞれ4415M-1.s-1及び33M-1.s-1と見積もられ、これは血漿ATより95倍及び少なくとも7600倍低い。
【０１０９】
ｂ)精製された系における変異アンチトロンビンの抗第IIa因子阻害活性
第IIa因子(FIIa、Kordia)のアンチトロンビン阻害についての動力学的アッセイを、「動力学的」緩衝液(Hepes、20mMリン酸塩、pH7.4、0.15Ｍ NaCl、0.1％ PEG 8000及び１mg/mlウシ血清アルブミン)中で擬似一次反応条件で行う。簡潔には、第IIa因子を、過剰の試験アンチトロンビン(血漿アンチトロンビン又は野生型アンチトロンビン又は変異アンチトロンビンに相当し、行う各アッセイで変わる)とヘパリン(ヘパリンナトリウム、Choay(登録商標))の存在下又は非存在下でインキュベートし、残存する第IIa因子活性を時間の関数として測定する。全ての試験アンチトロンビンがヘパリンと結合するように、ヘパリンを反応媒体中に過剰に加える。ヘパリン非存在下では、反応媒体中に存在する可能性がある硫酸化グリコサミノグリカンを中和するために、ポリブレン(最終100μg/ml)を加える。残存第IIa因子活性を、色素産生性基質(S2238、Chromogenix)の開裂に起因する405nmでの吸光度の増大として、マイクロプレートリーダー(Dynatech MR 5000)を用いて測定する。データの分析は、GraphPad Prismバージョン３ソフトウェアを用いて行う。吸光度の記録は、予測される阻害速度定数(kon)に応じて連続又は不連続である。
【０１１０】
阻害速度定数(kon)は、M-1.s-1で示される二次速度定数であり、プロテアーゼとアンチトロンビンとの間で安定な複合体形成の速度を規定する(konの値が高いほど、複合体がより速く形成される)。
予測されるkonが104 M-1.s-1より低いとき、不連続法を用いる。第IIa因子(２〜200nM)を、試験アンチトロンビン(20nM〜20μM)とヘパリン又はポリブレンの存在下で、10μlの最終容量で10秒間〜５時間又は10秒間〜24時間インキュベートする。このインキュベーション期間の終時に、200μMの基質を含有する190μlの動力学的緩衝液を加え、405nmでの吸光度を記録する。
【０１１１】
動力学的速度定数(ｋ)は、非線形回帰を用いて、基質加水分解初速度曲線を等式(１)にフィットさせることにより見積もられる。ここで、v0及び v∞は、それぞれ時間t0又はt∞における基質加水分解速度である。
vt = (v0 + v∞). exp (-k.t)      (１)
【０１１２】
阻害速度定数(kon)は、速度定数(ｋ)から等式(２)を用いて算出される。ここで、ATは試験アンチトロンビンの濃度である：
ｋ = AT. kon      (２)
【０１１３】
予測されるkonが104 M-1.s-1より高いとき、連続法を用いる。試験アンチトロンビン(１nM〜１μM)を、基質(200μM)とヘパリン又はポリブレンの存在下で、190μlの最終容量でインキュベートし、10μLの第IIa因子(２〜200nM)を加えることにより反応を開始させる。速度定数(ｋ)は、基質加水分解曲線を等式(３)又は(３')に非線形回帰分析を用いてフィットさせることにより得られる。ここで、A0はt0での吸光度であり、vi及びvsはそれぞれ、試験アンチトロンビン非存在下での基質加水分解の初速度及び終速度である。
A405 = A0 + vi.(1 − exp (-k.t)) / k      (３)
A405 = A0 + vs * t + (vi - vs) * (1 - exp (-kt)) / k      (３')
【０１１４】
阻害速度定数(kon)は、基質の競合効果を考慮した等式(４)を用いて動力学的定数(ｋ)から算出される。ここで、Ｓは基質の初期濃度であり、Kmは第IIa因子-基質相互作用についてのミカエリス定数であり、ATは試験アンチトロンビン濃度である。
ｋ = (kon / (１ + S / Km)). [AT]      (４)
変異アンチトロンビン及び野生型ATの阻害活性は、同じ条件下で測定し、血漿ATの阻害活性と比較する。
【０１１５】
ヘパリンを用いたか又は用いなかった結果は、以下のとおりである：
−  野生型アンチトロンビン及びAT-N135Q第IIa因子阻害活性は、血漿アンチトロンビン第IIa因子阻害活性と同様である。
−  以下の変異アンチトロンビン: AT-R393H、AT-Pro394、AT-ΔR393-S394、AT-ΔR393、AT-ΔS394、AT-N135Q-R393H、AT-N135Q-Pro394、AT-N135Q-ΔR393-S394、AT-N135Q-ΔR393、AT-N135Q-ΔS394の第IIa因子阻害活性は、野生型アンチトロンビンの第IIa因子阻害活性と比較して無視できる。
−  以下の変異アンチトロンビン：AT-S394Q、AT-S394E、AT-N135Q-S394Q及びAT-N135Q-S394Eの第IIa因子阻害活性は、野生型アンチトロンビンの第IIa因子阻害活性と比較して２〜20分の１に減少する。
−  野生型アンチトロンビンと比較して２〜20分の１への第IIa因子阻害活性の減少は、以下の変異アンチトロンビン：AT-R393H、AT-S394Q、AT-S394E、AT-Pro394、AT-ΔR393-S394、AT-ΔR393、AT-ΔS394、AT-N135Q-R393H、AT-N135Q-S394Q、AT-N135Q-S394E、AT-N135Q-Pro394、AT-N135Q-ΔR393-S394、AT-N135Q-ΔR393又はAT-N135Q-ΔS394の１つとAT-wt又はAT-N135Qとを種々の比率で含有する組成物を用いて達成される。
【０１１６】
ｃ)変異アンチトロンビンの細胞保護特性のインビトロ評価
c-1)ヒト全血での評価
変異アンチトロンビン(AT-R393H、AT-S394Q、AT-S394E、AT-Pro394、AT-ΔR393-S394、AT-ΔR393、AT-ΔS394、AT-N135Q-R393H、AT-N135Q-S394Q、AT-N135Q-S394E、AT-N135Q-Pro394、AT-N135Q-ΔR393-S394、AT-N135Q-ΔR393及びAT-N135Q-ΔS394)の細胞保護特性を、インビトロで、細菌性リポ多糖(LPS)に曝露したヒト全血で評価する。
【０１１７】
静脈血を、0.11mol/Lのクエン酸三ナトリウムを含有する試験管に採集した(１:10)。血液を、処理しないか又は１〜10IU/mLの範囲の種々の濃度の野生型若しくは変異ATと５又は30分間37℃にて前処理し、次いで10、50又は100μg/mLのLPSで５又は16時間刺激する。次いで、血液を、2300ｇで10分間12℃にて遠心分離し、血漿上清を用時まで-80℃にて保存する。血漿上清からのIL6及びTNFαタンパク質レベルを、市販の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)(IL-6 duoset及びTNFαduoset、R&D System、Minneapolis、MI、USA)を用いて定量的に測定する。
【０１１８】
このアッセイ条件下、AT-R393H、AT-S394Q、AT-S394E、AT-Pro394、AT-ΔR393-S394、AT-ΔR393、AT-ΔS394、AT-N135Q-R393H、AT-N135Q-Pro394、AT-N135Q-ΔR393-S394、AT-N135Q-ΔR393、AT-N135Q-ΔS394又はこれらAT変異型の少なくとも１つとAT-wt若しくはAT-N135Qとを含んでなる組成物を加えると、血液試料中でIL6及びTNFαレベルの著しい減少が生じる。
【０１１９】
c-2)マウス混合皮質培養物での評価
初代細胞の培養を、性交の16日後にマウスから単離した胚からの脳組織を用いることにより、記載されたように行う(Lubetzki, C., Demerens, C., Anglade, P., Villarroya, H., Frankfurter, A., Lee, V.M.Y., Zalc, B., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90, 6820-6824. Even in culture, oligodendrocytes myelinate solely axons)。胚の脳から大脳半球を切り出し、トリプシン消化により分離させて、単細胞懸濁物を、BioCoat (登録商標)ポリ-L-リジン被覆96ウェルプレート(Becton Dickinson、Bedford、MA 01730、USA)に、ウェルあたり200μlの培地中105細胞で播種する。１％ FCS、１％ペニシリン-ストレプトマイシン溶液(Seromed)及び10ng/mLの組換え血小板由来成長因子AA (PDGF-AA、R&D Systems)を補充したBottenstein-Sato培地(GIBCO Invitrogen)中で細胞を培養する。培養物を37℃及び10％ CO2にて数週間成長させる。
【０１２０】
LPS刺激
細胞を、処理しないか又は１〜10IU/mlの範囲の種々の濃度の野生型若しくは変異ATと３時間前処理し、10ng/mlのLPSと37℃及び10％ CO2にて48時間インキュベートする。次いで、細胞上清を2300ｇにて10分間12℃にて遠心分離し、用時まで-80℃にて保存する。細胞上清からのIL6及びTNFαタンパク質レベルを、市販の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)(IL-6 duoset及びTNFαduoset、R&D System、Minneapolis、MI、USA)を用いて定量的に測定する。
【０１２１】
このアッセイ条件下、AT-R393H、AT-S394Q、AT-S394E、AT-Pro394、AT-ΔR393-S394、AT-ΔR393、AT-ΔS394、AT-N135Q-R393H、AT-N135Q-Pro394、AT-N135Q-ΔR393-S394、AT-N135Q-ΔR393、AT-N135Q-ΔS394又はこれらAT変異型の少なくとも１つとAT-wt若しくはAT-N135Qとを含んでなる組成物を加えると、細胞培養上清中でIL6及びTNFαレベルの著しい減少が生じる。
【０１２２】
酸素-グルコース剥奪(OGD)
低酸素/再酸素負荷傷害を誘導するため、酸素-グルコース剥奪(OGD)実験を、グルコースを含まない無血清DMEM中95％ N2/５％ CO2で１〜12時間処理し、続いて５mMol/Lのグルコースを有する酸素正常条件に12〜24時間曝露することにより行った。野生型又は変異AT (１〜10IU/mLの範囲の濃度)は全研究期間を通じて加えた(13〜36時間)。
細胞損傷は、OGDへの曝露後24時間に細胞外流体中に傷害細胞から放出される乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の量を測定することにより評価した。バックグラウンドのLDH放出は、OGDに曝露していない対照培養で決定し、全実験値から減じた。
【０１２３】
このアッセイ条件下、AT-R393H、AT-S394Q、AT-S394E、AT-Pro394、AT-ΔR393-S394、AT-ΔR393、AT-ΔS394、AT-N135Q-R393H、AT-N135Q-Pro394、AT-N135Q-ΔR393-S394、AT-N135Q-ΔR393、AT-N135Q-ΔS394又はこれらAT変異型の少なくとも１つとAT-wt若しくはAT-N135Qとを含んでなる組成物を加えると、傷害細胞から細胞外流体中へのLDH放出の著しい減少が生じる。
【０１２４】
III 変異アンチトロンビンの細胞保護特性のインビボ評価
変異アンチトロンビンAT-R393H、AT-Pro394、AT-ΔR393-S394、AT-ΔR393、AT-ΔS394、AT-N135Q-R393H、AT-N135Q-S394Q、AT-N135Q-S394E、AT-N135Q-Pro394、AT-N135Q-ΔR393-S394、AT-N135Q-ΔR393、AT-N135Q-ΔS394の解毒剤(antidote)としての有効性を、マウスモデルで評価する。
【０１２５】
ａ)動物
少なくとも12週齢の野生型C57BL/6雄性マウス(JANVIER)を、血液凝固パラメータを改変しない、動物実験に関する欧州ガイドラインに従うプロトコルを用いて麻酔する。
全ての実験で、アンチトロンビン変異型又はプラシーボは、尾静脈に静脈内注射により投与する。
血液を、大静脈(cave vein)への穿刺により、0.105mol/Lクエン酸三ナトリウムを含有する試験管に採集する(１:10)。低血小板血漿を、2300gにて10分間12℃での遠心分離により取得し、用時まで-80℃にて保存する。
【０１２６】
ｂ)実験プロトコル
マウス実験は、２つの敗血症モデル：１)盲腸結紮及び穿刺(CLP)、２)リポ多糖(LPS)注射で行い、各アンチトロンビン変異型をプラシーボに対して評価する。各アンチトロンビン変異型について、第１セットの実験では、両敗血症モデルで敗血症に対する炎症及び血液凝固応答をプラシーボと比較する。第２セットの実験では、CLP及びLPS注射後の生存をアンチトロンビン注射マウスとプラシーボ注射マウスとの間で比較する。飼育及び実験は、フランスの規則及び欧州共同体実験ガイドラインに従う。
【０１２７】
１-敗血症モデル
CLP手順を、他に記載されるように行う(Wichterman KA, Baue AE, Chaudry IH., Sepsis and septic shock- a review of laboratory models and a proposal., J Surg Res, 1980; 29: 189-201)。簡潔には、イソフルラン麻酔下に、１cmの正中切開により腹壁を開く。盲腸を露出させ、盲腸端(cecal pole)から15mm付近を5/0 Prolene糸(Ethicon、Somerville、NJ、USA)で回盲弁を狭窄させずに結紮する。次いで、結紮した盲腸を21ゲージ針で１回穿刺する。少量の便が現れるまで盲腸を穏やかに圧迫する。偽操作動物及びCLP動物で、閉腹直前に１mlの0.9％正常食塩水を腹腔内に注入する。更なる蘇生法は実施せず、抗生物質は投与しない。次いで腹壁を閉じる(２層、筋肉及び皮膚; 5/0 Ethilon糸)。対照として、盲腸を結紮も穿刺もしない以外はCLP手順に従って偽手術を行う。
【０１２８】
LPS敗血症モデルで、LPS注射(５又は10mg/kg)を腹腔内に行う。対照動物には溶媒のみを注射する。
両モデルで、ATを、約40〜約300IU/kg/日の用量で、尾静脈に静脈内注射により投与する。
【０１２９】
２-生存分析
各試験アンチトロンビン変異型について、各15匹のマウスからなる２群をCLP敗血症モデルに用いる。
−  第１の群では、マウスにアンチトロンビン変異型を与え、マウスをCLPに供する。
−  第２の群では、マウスにプラシーボを与え、マウスをCLPに供する。
【０１３０】
各試験アンチトロンビン変異型について、各10匹のマウスからなる２群をLPS敗血症モデルに用いる。
−  第１の群では、マウスにアンチトロンビン変異型を与え、LPSを注射する。
−  第２の群では、マウスにプラシーボを与え、溶媒を注射する。
【０１３１】
一対にした全てのマウスに同日に手術又は注射をする。術後又はLPS注射後の生存を、48時間にわたり２時間毎、その後全てのマウスが死亡するまで８時間毎に評価する。
これらの実験条件下、プラシーボ注射マウスと比較して、アンチトロンビン変異型注射マウスで、より長い生存が観察される。
【０１３２】
３-炎症応答及び凝固応答の評価
各試験アンチトロンビン変異型について、各５匹のマウスからなる４群を各敗血症モデルに用いる。
CLPモデル：
−  第１の群では、マウスにアンチトロンビン変異型を与え、マウスをCLPに供する。
−  第２の群では、マウスにプラシーボを与え、マウスをCLPに供する。
−  第３の群では、マウスにアンチトロンビン変異型を与え、マウスを偽手術する。
−  最後の群では、マウスにプラシーボを与え、マウスを偽手術する。
【０１３３】
LPSモデル：
−  第１の群では、マウスにアンチトロンビン変異型を与え、LPSを注射する。
−  第２の群では、マウスにプラシーボを与え、LPSを注射する。
−  第３の群では、マウスにアンチトロンビン変異型を与え、溶媒を注射する。
−  最後の群では、マウスにプラシーボを与え、溶媒を注射する。
【０１３４】
血液を手術の１週間前と16時間後に採取する。
出血性の傾向に対する変異AT投与の影響を、偽手術及びCLP手術を行ったマウスで、術後採血に続いて犠牲にした後、腹腔検査により評価する。
アンチトロンビン抗原レベルを、ELISA試験(Antithrombin BioAssay(商標) ELISAキット(EUROMEDEX))を用いて測定し、マウス血漿におけるアンチトロンビンの第Xa因子阻害活性を、Biophen(登録商標) ATキット(Hyphen BiMed, France)を用いて決定する。アンチトロンビン変異型を注射したマウスでの敗血症に対する炎症応答及び凝血促進応答を、幾つかのパラメータの測定により評価する。白血球数及び血小板数並びにヘモグロビンレベルの決定は自動で行う(Sci Vet ABC Animal Blood Counter, ABX Diagnostics, Montpellier, France)。血漿インターロイキン-６(IL-6)及びTNFα濃度は、マウスIL-6及びTNFα Quantikineキット(R&D Systems, Minneapolis, MI, USA)を用いて評価する。血液凝固活性化はF1+2測定により評価する。
【０１３５】
更に、血管内フィブリン沈着も、フィブリノゲンに対するポリクローナル抗体を用いて免疫組織化学的に評価する。フィブリノゲン/フィブリン結合抗体は、直接免疫蛍光で検出する。一次抗体なしで処理した切片を、陰性対照として用いる。
【０１３６】
これらの実験条件を用いて、発明者らは、プラシーボ注射マウスと比較して、アンチトロンビン変異型注射マウスで、敗血症に対する炎症応答及び凝血促進応答の減少を観察した：とりわけ、IL-6及びTNFαの濃度低下、血小板数及び白血球数の低下の軽減、フラグメントF1+2の低下により証明されるトロンビン産生の減少、腎臓中のフィブリン沈着の減少。AT変異型の投与は、AT循環抗原レベルの１〜7.5倍増加をもたらす。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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