(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む抗癌活性ポリペプチド、及び前記抗癌活性ポリペプチドのアミノ酸に対して1つ又は複数のアミノ酸を置換、挿入又は欠失したことによって得られる、配列番号１に示されているアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗癌活性ポリペプチド。
【請求項２】
アミノ酸配列が配列番号２で示されることを特徴とする請求項１に記載の抗癌活性ポリペプチド。
【請求項３】
アミノ酸配列が配列番号３で示されることを特徴とする請求項１に記載の抗癌活性ポリペプチド。
【請求項４】
アミノ酸配列が配列番号４で示されることを特徴とする抗癌活性ポリペプチド。
【請求項５】
アミノ酸配列が配列番号５で示されることを特徴とする抗癌活性ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗癌活性ペプチドに関わるもので、詳しく言うと新疆（中国の新疆ウイグル自治区）の穴居タランチュラの粗毒から分離した抗癌活性を有するポリペプチドに関わるものである。
【背景技術】
【０００２】
ポリペプチド抗癌薬物は、茲数年来抗癌薬物研究開発のブームとなっているが、活性が低く、毒性の強いなどの原因によって、今まで臨床上に使われるポリペプチド抗癌薬物は非常に少なく、日に日に増えつつある抗癌薬物市場のニーズを満たすことができなくなっている。そのため、活性の高く、毒性の弱い抗癌ポリペプチドを見付けて、抗癌薬物の大量開発のニーズを満たすと言うことは、目下急に解決しなければならない問題となっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は高効率で毒性の弱い抗癌活性ペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明より提供されるこの抗癌活性ペプチドのアミノ酸配列は次の通りである。
【０００５】
配列番号１
Arg Lys Gly Trp Phe Lys Ala Met Lys Ser Ile Ala Lys Phe Ile Ala Lys Glu Lys Leu 
1                5                  10                  15                  20
Lys Glu His Leu-NH2  (ポリペプチドC-末端は酸アミド化修飾)
本発明の抗癌活性ペプチドは24ペプチドで、新疆の穴居タランチュラの粗毒から分離・純化したもので、人工的な化学合成によることもできる。このポリペプチドは細胞の死亡を誘導して数種の癌細胞を殺滅するだけでなく、癌細胞の増殖を抑えることができるが、正常細胞と動物に対する毒性は比較的に弱い。それと同時に、低酸素誘導因子HIFαの転写活性を抑えることによって、腫瘍組織の血管の再生を抑え、実体腫瘍の生長を効果的に抑制することもできる。その抗癌活性の特徴としては高効率と毒性の弱いと言うことで、肺癌や、肝癌、子宮頚管癌などの実体腫瘍薬物の開発に優れた応用将来性を有する。また、人工的な化学合成技術によって大規模の調製ができるので、将来の薬物開発における低コスト・高生産率調製の基盤にもなる。
【発明の効果】
【０００６】
本発明に関わる活性ペプチドは、配列番号１の配列の他にも、本発明の活性ペプチド分子のアミノ酸に対して1つ又は複数のアミノ酸を置換、挿入又は欠失したことによって得られる機能が類似し、本発明の活性ペプチドの効果に達成できるものも含まれる。そのため、本発明には配列番号１に示されているアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するものも含まれる。特に次のアミノ酸配列が含まれる。
【０００７】
配列番号２
Lys Gly Trp Phe Lys Ala Met Lys Ser Ile Ala Lys Phe Ile Ala Lys Glu Lys Met Lys  Glu His Leu-NH2
配列番号３
Lys Gly Trp Phe Lys Ala Met Lys Ser Ile Ala Lys Phe Ile Ala Lys Glu Lys Leu Lys Glu His Leu-NH2
配列番号４
Trp Phe Lys Ala Met Lys Ser Ile Ala Lys Phe Ile Ala Lys Glu Lys Leu Lys
配列番号５
Lys Ala Met Lys Ser Ile Ala Lys Phe Ile Ala Lys-NH2
配列番号２は新疆の穴居タランチュラの粗毒から類似物で、配列番号１に比べて2つのアミノ酸残基だけが異なり、即ち、配列番号１のN−末端の残基Argが欠けており、Leu19がMet19に突然変異されているが、両者の活性は同じである。
【０００８】
配列番号３〜５は配列番号１を原とし、配列番号１に対する分子デザインと抗癌活性の研究を通じて、得られた変異体（アロステリック）で、その中、配列番号３と配列番号４の活性は配列番号１と同じで、配列番号５の活性は10倍もアップされているが、それと同時に配列番号１より強い溶血活性を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】穴居タランチュラの粗毒の反相―高効率液相クロマトグラフィによる分離・純化グラフである。矢印は目的ピークである。
【図２】本発明の抗癌活性ペプチドの化学合成際の反相―高効率液相クロマトグラフィによる分離・純化グラフである。矢印は目的ピークである。
【図３】MTT法を利用して本発明ポリペプチドの細胞毒性を検査した結果であるが、40μmolの本発明ポリペプチドは5種の細胞株に対していずれも明らかな殺滅作用がある。
【図４】イソチオシアン酸蛍光素―Annexin V/沃化プロピジウムのダブル染色法による本発明ポリペプチドのHela細胞の誘導死亡を示した測定結果である。この図はダブル変量・流式細胞計のポイント分布図で、その中、右下の象限は死亡早期細胞である。
【図５】本発明ポリペプチドの腫瘍生長に対する効果的な抑制作用を示し、腫瘍生長の体積変化を測定したもので、●は投与組で、〇は対照組である。その結果、対照組は持続的に生長していたが、投与組は腫瘍の生長が抑制されていた。
【図６】本発明ポリペプチドの腫瘍生長に対する効果的な抑制作用を示し、左図は投与前及び最後の投与後の体積変化を示したもので、図には投与組と対照組の全てのヌードマウスの体積平均値を示されているが、黒は投与前で、グレーは投与後である。右図は対照組と投与組との腫瘍重量の比較であるが、対照組の腫瘍の平均重量は投与組の約5倍である。
【図７】本発明ポリペプチドの腫瘍生長に対する効果的な抑制作用を示し、5種のポリペプチドのHela細胞活性に対する抑制作用を比較したものである。
【図８】本発明ポリペプチドの腫瘍生長に対する効果的な抑制作用を示し、配列番号１と配列番号５の溶血活性を比較したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の抗癌活性ペプチドは、先ず高感度の分析型反相高効率液相クロマトグラフィ技術を通じて、新疆の穴居タランチュラの粗毒から分離・純化することによって得られるが、Edman生分解技術を利用して本発明ポリペプチドのアミノ酸配列を測定した結果、本品は既存の抗癌活性ペプチドに比べてアミノ酸配列の相似性が比較的低く、全く新しいポリペプチド分子であった。その具体的な操作は次の通りである。
【００１１】
新疆の穴居タランチュラの粗毒粉末を2重蒸留水で溶かして、5mg/mlの毒素溶液に調製し、8000rpm遠心器にて5分間分離し、上清液をMILLIPORE社の一回使い捨てのフィルター（0.22μmol）でろ過してから、4℃にて保存する。粗毒は直接分析型反相高効率液相クロマトグラフィ（Vydac, C18, 218TP54, 4.6×250mm）で分離するが、上清液量は0.5mgで、溶離液はそれぞれ0.1％のトリフルオロ酢酸/水と0.1％のトリフルオロ酢酸/アセト二トリル（B液）で、溶離の勾配は0〜60分間、0〜60％B液、1ml/分間、40℃である。波長の215nmの下でピーク値成分を収集するが、基質補助解離飛行時間質量分析計で分子量を測定してから乾燥することによって、本発明の抗癌活性ペプチドが得られる。
【００１２】
本発明の抗癌活性ペプチドは人工的な化学合成方法によっても得られるが、具体的な操作方法は次の通りである。
【００１３】
フルオレニルメトキシカルボニルアミノ酸とTBTU/HOBｔとのカップリングによる固相ポリペプチドの合成方法によって、本発明ポリペプチドを合成するが、固相キャリアはRink樹脂で、PS3自動合成計（PTI）にて合成する。合成中、フルオレニルメトキシカルボニルアミノ酸の使用量は5倍の過量（0.5mm）にし、それぞれの合成残基のカップリング時間を30分間にし、20％のピペリジン/ジメチルホルムアミド（体積比）で末端のフルオレニルメトキシカルボニル基グループを除去する。全てのアミノ酸のカップリングが完了され、最後のアミノ酸残基のフルオレニルメトキシカル基グループを除去してから、メタノールでペプチド樹脂を十分洗浄する。それから、凍乾済ペプチド樹脂を篩板付きのBIO−RAD反応カラムに入れて、分裂分解試料K（成分：トリフルオロ酢酸：水：フェノール：チオアニソール：ジチオルエタン＝82.5：5：5：5：2.5（体積比）を使って、2時間反応させて、サイドチェーン保護グループの保護を除去してから、樹脂から分裂分解する。冷やしたエーテルでポリペプチドを沈殿させて、数回洗浄してから、冷凍・真空乾燥によって合成のポリペプチド粗品が得られる。半調製型反相高効率液相クロマトグラフィ（反相カラム：10×250mm  Elite  C18カラム、線形勾配B液15％〜45％30分間、流速3ml/分間）で、溶離ピークを分離収集し、冷凍乾燥してから使用に備える。
【００１４】
本発明ポリペプチド（新疆の穴居タランチュラの粗毒から得られた天然ポリペプチド又は人工合成ポリペプチド）が抗癌活性を有するかどうかを検証するために、MTT法を使ってその細胞の毒性を測定し、ヌードマウス担腫瘍試験によって、実体腫瘍の生長に対する抑制作用を測定する。
【００１５】
１．主な器具と材料
穴居タランチュラは新疆のハミ地方から採集し、湖南師範大学生命科学学院タンパク質化学研究室の動物室にて人工飼養する。電気ショック方法で粗毒を採集し、粗毒を凍乾してから-20℃にて保管する。ヌードマウスは上海から購入する。あらゆる配列測定試料は、いずれもアメリカの応用生物システム社から購入し、個相化学合成試料はアメリカのChemassist社から購入し、MTT[3-（4,5-ジメチル-2-チアゾール）-2,5-ジフェニルブロミルテトラゾール]、イソチオシアン酸蛍光素はアメリカのシグマ社から購入し、Annexin V-イソチオシアン酸蛍光素/沃化プロピジウムのダブル染色キットは南京KeyGen社から購入し、小牛血清は四季青公司から購入し、DMEMとRPMI1640培地はGibico社から購入し、その他試料はいずれも国産分析純試料である。癌細胞株：Hela、HT1080、JB6及びHNEIで、器具：基質補助レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析の491A型気相配列測定器、蛍光顕微鏡、蛍光分光光度計、流動式細胞計である。
【００１６】
２．試験結果の分析
２．１  穴居タランチュラ粗毒の分離純化及びその生物性質の分析
分析型反相高効率液相クロマトグラフィ法で穴居タランチュラの粗毒（図1を参照）を分離純化するが、標記されたクロマトグラムピークは質量鑑定による単一分子量ピークであり、その単一同位元素の分子量（M+H+）は2886.754Daである。Edman生分解の測定によると、本発明ポリペプチドの1級構造は24個のアミノ酸残基で、システイン残基はなく、試験分子量と理論計算分量の比較によって当該ポリペプチドC-末端シアン化修飾を決める。配列分析結果によると、当該ポリペプチドの典型的な特徴としては7つのリジン残基を有すると言うことで、その理論pIは約10.78で、しかも、Lysは全体のアミノ酸配列に均一に分布されて、いわゆるKXnK(Xは疎水性アミノ酸残基を示す)ファントムを形成する。円2色スペクトルは本発明ポリペプチドがα―螺旋構造を形成できることを示しており、本発明ポリペプチドの螺旋リングを描くことによってα―螺旋の一側は極性のアミノ酸残基で、反対側は疎水性アミノ酸で構成されるので、両親媒性のα―螺旋であることが明らかになる。
【００１７】
２．２  本発明ポリペプチドの人工化学合成
穴居タランチュラの粗毒はその量が少なく、穴居タランチュラの粗毒中の本発明ポリペプチド含有量も比較的低いので、化学合成によって十分なサンプルを得なければならない。本発明ポリペプチドには24個のアミノ酸残基だけが含まれているので、その合成も相対的に容易である。我々は0.1mmの規模で本発明ポリペプチドを合成したが、質量鑑定によると、純度が高く、その単一同位元素の分子量（M+H+）は2886.621Da（図2を参照）で、天然ポリペプチドの分子量と同じであった。
【００１８】
２．３  本発明ポリペプチドの癌細胞に対する選択性殺滅
MTT分析法を通じて本発明ポリペプチドのHela、HT1080、HNEI、CNEI及びJB6など5種の細胞株の毒性を測定した。40μmolの本発明ポリペプチドは5種の細胞株に対していずれも明らかな殺滅作用（図3を参照）があり、その中、HT1080、Hela細胞に対する毒性が最も強いが、JB6細胞に対する毒性は相対的に弱くて、細胞の殺滅率はそれぞれ98％及び36％であった。と言うことは、異なる細胞の本発明ポリペプチドに対する感度は相違しており、HT1080とHelaはそれぞれ繊維腫瘍と子宮頚管癌細胞株で、JB6は永生化ネズミの上皮細胞株であり、これらの細胞株は世代伝えの培養が可能であるが、癌細胞の悪性増殖の特徴はないと言うことを説明している。上記結果によって、本発明ポリペプチドの癌細胞に対する殺滅作用は一定の選択性を有すると言うことを説明している。
【００１９】
更なる検証のために、溶血試験によって本発明ポリペプチドの正常細胞に対する毒性を測定したが、その結果、200μmolの本発明ポリペプチドは約20％だけの赤血球を分裂分解することができなかった。と言うことは本発明ポリペプチドの正常細胞に対する毒性は比較的弱いことを説明している。我々は全体動物レベルにおける本発明ポリペプチドの毒性をも測定したが、200mg/kg体重の皮下注射の場合、ネズミに明らかな毒性反応（48時間内）はなかった。と言うことは本発明ポリペプチドの毒性は比較的低く、癌細胞に対しては比較的強い選択性を有することを説明している。
【００２０】
Annexin V−イソチオシアン酸蛍光素/沃化プロピジウムのダブル染色法を使って、本発明ポリペプチドの癌細胞殺滅のメカニズムを測定した。その結果、本発明ポリペプチドはHela細胞死亡を誘導できることが発言された。添付図4に示されている通り、薬物投与のないHela細胞の死亡は少ないが、20μmolの本発明ポリペプチド処理後は、約25.6％のHela細胞が死亡した。と言うことは本発明ポリペプチドは細胞の死亡を誘導することによって癌細胞を殺滅することを説明している。
【００２１】
２．４  本発明ポリペプチドのヌードマウス担腫瘍生長の抑制作用
上記試験から見れば、本発明ポリペプチドは比較的強い癌細胞に対する抑制作用があるが、本発明ポリぺプチドの体内における抗実体腫瘍作用があるかどうかについては更なる確認が必要とするので、ヌードマウス担腫瘍モデル研究を行った。試験結果から見れば、本発明ポリペプチドは明らかな抗実体腫瘍作用がある。図5に示されている通り、薬物投与前（0日）に、対照組と投与組の実体腫瘍の体積は相似していたが、薬物関与の時間内に、生理塩水は対照組の腫瘍体積を速やかに増大させていた。と言うことはその腫瘍が続けて生長していることを説明する。投与組の腫瘍の体積は明らかな変化がなかく、その中の1匹のヌードマウスの腫瘍は投与3回後に完全に消えていた。と言うことは腫瘍の生長を抑制することを説明する。第10日目の薬物投与が完成された後、対照組の腫瘍体積は投与組の5倍（P＜0.05）（図6を参照）で、ヌードマウスを殺して実体腫瘍を剥離した結果、投与組の腫瘍は対照組より明らかに小さかった。重量を量った結果、対照組の腫瘍重量は投与組の5倍（P＜0.03）であった（図6を参照）。上記結果は本発明ポリペプチドは腫瘍の生長を効果的に抑制できることを説明している。
【００２２】
腫瘍切片ヘマトキシリンとEosin Y染色方法によって、本発明ポリペプチドの腫瘍生長メカニズムを測定した。その結果、対照組の腫瘍組織細胞は緊密且つ規則的に排列しており、細胞核はアリスブルーに染色されていたが、投与組の腫瘍組織は細胞の排列が分散されていて、細胞核は濃縮され、ディープブルーに染色されていた。と言うことは、本発明ポリペプチドは腫瘍細胞の死亡を誘導してその生長を抑制できることを説明している。
【００２３】
２．５  本発明ポリペプチドのHela細胞活性抑制作用の比較
上記試験結果から見れば、本発明ポリペプチドはいずれも比較的強い癌細胞抑制及び抗実体腫瘍作用を有するが、異なる配列のポリペプチドの腫瘍細胞に対する抑制程度の確認を必要とするので、Hela細胞活性の測定によって比較研究を行う（図７を参照）。
【００２４】
図７から見ると、配列番号１〜４は、40μmol/Ｌ濃度の下で、Hela細胞の抑制率はいずれも90％ぐらいで、20μmol/Ｌ濃度の下で、Hela細胞の抑制率はいずれも50％ぐらいで、5μmol/Ｌ濃度の下で、Hela細胞の抑制率はいずれも2％ぐらいであった。これから見れば、配列番号１〜４はHela細胞活性に対する抑制作用はほぼ同じぐらいで、ほとんど差異がない。しかし、配列番号５は40μmol/Ｌ、20μmol/Ｌ、5μmol/Ｌ濃度の下で、いずれも80％以上のHela細胞に対する抑制作用を示し、その活性は配列番号１〜４に比べて約10倍もアップされていた。配列番号１と配列番号５は200μmolの下で、それぞれ19％と37％の赤血球を溶解していた（図8を参照）。と言うことは配列番号５の溶血活性は配列番号１より強いと言うことを説明している。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
天然毒液からの分離・純化及び人工合成によって大量の高効率・低毒の本発明の抗癌活性ペプチドが得られる。発明人は大量の薬理学研究を通じて、本発明ポリペプチドは、肺癌や肝癌、子宮頚管癌など実体腫瘍の治療薬物開発において、優れた応用の将来性を有すると表明した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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