(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）単独のＯｃｔ４、Ｏｃｔ４とＳｏｘ２との組み合わせ、Ｏｃｔ４とＫｌｆ４との組み合わせ、またはＯｃｔ４とＫｌｆ４とＳｏｘ２との組み合わせである転写因子とＪｈｄｍ１ｂとを哺乳動物の成体細胞に転写し、フィーダー層細胞上で、ビタミンＣ、及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む誘導培地に培養して多能性幹細胞クローンを誘導獲得するステップと、
ｂ）誘導獲得した多能性幹細胞クローンを、フィーダー層細胞上で、白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む幹細胞培地に培養増幅させるステップと、
を含むことを特徴とする多能性幹細胞の誘導生成効率を高める方法。
【請求項２】
ａ）単独のＯｃｔ４、Ｏｃｔ４とＳｏｘ２との組み合わせ、Ｏｃｔ４とＫｌｆ４との組み合わせ、またはＯｃｔ４とＫｌｆ４とＳｏｘ２との組み合わせである転写因子とＪｈｄｍ１ｂとを哺乳動物の成体細胞に転写し、フィーダー層細胞上で、ビタミンＣ、及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む誘導培地に培養して多能性幹細胞クローンを誘導獲得するステップと、
ｂ）誘導獲得した多能性幹細胞クローンを、フィーダー層細胞上で、ビタミンＣ、及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む幹細胞培地に培養増幅させるステップと、
を含むことを特徴とする請求項１に記載の多能性幹細胞の誘導生成効率を高める方法。
【請求項３】
前記転写因子とＪｈｄｍ１ｂは多能性幹細胞誘導機能を有するコードされた、又はノンコードされたＲＮＡ、たんぱく質、或いはポリペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の多能性幹細胞の誘導生成効率を高める方法。
【請求項４】
哺乳動物の成体細胞へのＪｈｄｍ１ｂの転写は、Ｊｈｄｍ１ｂを発現できるベクターを細胞に導入することによって実現することを特徴とする請求項２又は３に記載の多能性幹細胞の誘導生成効率を高める方法。
【請求項５】
前記ベクターはウィルスベクター、プラスミドベクター、エピソームベクター、又はｍＲＮＡベクターであり、若しくは直接に化学合成されることを特徴とする請求項４に記載の多能性幹細胞の誘導生成効率を高める方法。
【請求項６】
前記ウィルスベクターはレトロウイルスであり、当該レトロウイルスはｐＭＸｓベクターであることを特徴とする請求項４に記載の多能性幹細胞の誘導生成効率を高める方法。
【請求項７】
前記Ｊｈｄｍ１ｂは脱メチル化修飾したポリペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の多能性幹細胞の誘導生成効率を高める方法。
【請求項８】
前記哺乳動物の成体細胞は線維芽細胞、神経細胞、造血細胞及び神経膠質細胞であることを特徴とする請求項１に記載の多能性幹細胞の誘導生成効率を高める方法。
【請求項９】
前記哺乳動物の成体細胞はマウス胎児線維芽細胞であることを特徴とする請求項１に記載の多能性幹細胞の誘導生成効率を高める方法。
【請求項１０】
ａ）単独のＯｃｔ４、Ｏｃｔ４とＳｏｘ２との組み合わせ、Ｏｃｔ４とＫｌｆ４との組み合わせ、またはＯｃｔ４とＫｌｆ４とＳｏｘ２との組み合わせである転写因子とＪｈｄｍ１ｂとＪｈｄｍ１ａを哺乳動物の成体細胞に転写し、フィーダー層細胞上で、ビタミンＣ、及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む誘導培地に培養して多能性幹細胞クローンを誘導獲得するステップと、
ｂ）誘導獲得した多能性幹細胞クローンを、フィーダー層細胞上で白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む幹細胞培地に培養増幅させるステップと、
を含むことを特徴とする多能性幹細胞の誘導生成効率を高める方法。
【請求項１１】
ａ）Ｏｃｔ４である転写因子とＪｈｄｍ１ｂとＪｈｄｍ１ａを哺乳動物の成体細胞に転写し、フィーダー層細胞上で、ビタミンＣ、及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む誘導培地に培養し多能性幹細胞クローンを誘導獲得するステップと、
ｂ）誘導獲得した多能性幹細胞クローンを、フィーダー層細胞上で、ビタミンＣ、及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む幹細胞培地に培養増幅させるステップと、
を含むことを特徴とする請求項１０に記載の多能性幹細胞の誘導生成効率を高める方法。
【請求項１２】
前記ａ）の誘導過程において用いられる培地が、ビタミンＣを含む幹細胞培地ｍＥＳであることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の誘導生成効率を高める方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞の誘導生成効率を高める方法に関し、特にヒストン修飾遺伝子ｊｈｄｍ１ｂとｊｈｄｍ１ａを使用して多能性幹細胞の誘導生成効率を高める方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
人口大国の中国では、毎年、負傷、病気、老化及び遺伝による器官の欠損、極度の疲労、機能障害なども世界一である。薬物と手術を基本的な支えとする伝統医学の治療手段は、もはや臨床医学の巨大な需要を満たさなくなった。そのために、幹細胞及び再生医学に対する研究が数多くの科学研究機構及び各界各層に重視されている。
【０００３】
細胞移植治療は再生医学研究の重要方向の一つであり、特定類型の細胞移植は心臓損傷、神経系退行性疾病、脊髄損傷、腎不全、血液系疾患などの治療に有用である。しかし、細胞移植治療は同種移植片拒絶や細胞源が限られるなどの解決し難い問題に直面している。
【０００４】
幹細胞は自己複製能を有する細胞の一種であり、特定な条件下において、複数の機能的な細胞に分化できる。幹細胞はその発育段階によって、胚性幹細胞と成体幹細胞に分けられ，幹細胞の発育潜在能力によって、分化全能性幹細胞、分化多能性幹細胞及び分化単能性幹細胞という三種類に分けられている。幹細胞は十分に分化していない未成熟細胞であり、各種の組織と器官及び人体を再生する潜在能力を有し、医学界では「万能細胞」と呼ばれている。
【０００５】
細胞移植治療の直面している問題を解決するために、細胞運命の転化はますます多くの科学研究者に重視されてきた。細胞の分化や運命によるものは、ずっと発育過程においては、不可逆かつ安定的な過程と認められたものの、体外においては、こういう過程は可逆的であると表明できる証拠はますます増える一方である。
【０００６】
細胞運命調節についての研究はまだ実験室研究の状態にあり、臨床実験からははるかに遠い。それらの転写因子の過発現を通して得られた形質転換細胞は、今までさまざまな応用上の難題がある。例えば、ウィルス挿入、潜在的発癌性、その得られた分化転換細胞の純度、機体内では正常な細胞を埋め合わせて当然の機能を発揮できるかどうかなどの問題がある。
【０００７】
誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ,ｉＰＳ）は、胚性幹細胞と類似する、発生全能性がある細胞であり、特定な遺伝子を導入することによって、体細胞を誘導し、幹細胞特徴を獲得させるわけである。２００６年、日本科学研究者Yamanakaは２４個候補遺伝子をレトロウィルスによってマウス線維芽細胞に導入し、ＦＢＸ１５陽性細胞を、Ｇ４１８耐性スクリーニングすることによって、胚性幹細胞に類似するｉＰＳクローンを分離させ、最終的に、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Mｙｃ、 Ｋｌｆ４という４つの因子は、マウスＦＢＸ１５-ｉＰＳ細胞の誘導生成に十分に足りるとまとめた。それらの細胞は胚性幹細胞と類似する形態、増殖能力及び奇形腫形成能力を有しているが、遺伝子ゲノム及びメチル化モードにおいては、胚性幹細胞と異なり、生体のキメラマウスを得ることもできない。そして、当該グループと他の二つのグループはスクリーニング方法を変えて、Ｎａｎｏｇ陽性細胞を基準にし、多方面において胚性幹細胞と類似するｉＰＳを獲得した。このような細胞はキメラマウスの子孫を作ることができる。最近、三つの研究グループは四倍体相補性試験を通じてマウスのｉＰＳ細胞が一つの個体に発育することができ、発生全能性を有するとそれぞれ単独で証明した。
【０００８】
マウスｉＰＳ誘導試験の方法に従って、２００７年、Yamanaka[8]と兪君英[9]との二つのグループは、それぞれヒトの体細胞をｉＰＳ細胞にリプログラムした。前者はレトロウイルスを用いて、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Mｙｃ及び Ｋｌｆ４をヒトの表皮線維芽細胞に導入するのに対し、後者はレンチウイルスを用いて、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、 Ｎａｎｏｇ、 Ｌｉｎ２８を包皮細胞に導入した。遺伝子発現プロファイリング分析でも、Ｏｃｔ３／４、 Ｎａｎｏｇ遺伝子のプロモーター領域のメチル化分析でも、ヒトのｉＰＳ細胞系は対応する胚性幹細胞系に非常に類似し、これらの細胞をヌードマウス体内に注射したら、いずれも3つの胚葉組織に発生することができると示した。また、マウスとヒトに限らず、ラット、ブタ及びサルも体細胞からｉＰＳへの誘導に成功できる。
【０００９】
リプログラムに成功できる細胞は線維芽細胞に限るのではなく、数多くの他の種類の成体細胞もｉＰＳ細胞に誘導されうる。例として、膵のβ細胞、成体神経幹細胞、肝細胞、胃細胞、成熟Ｂ細胞、造血細胞、髄膜組織球、脂肪幹細胞、臍帯血細胞、末梢血ＣＤ３４陽性細胞、角質細胞がある。異なる分化段階にある細胞なら、それを誘導してｉＰＳにリプログラムする難易度も異なるようになる。マウスの造血細胞を例にすると、造血幹細胞と造血前駆細胞のリプログラミング効率は２８％に達することができ、端末分化したＴ細胞やＢ細胞の３００倍にあたる。
【００１０】
ｉＰＳ誘導過程において、レトロウイルス及びレンチウイルスを介して外因性遺伝子を細胞に導入するのは、通常のことである。このような方法によって、高い遺伝子導入効率が得られる。しかし、ウイルス配列を細胞のゲノムに統合すると、遺伝子挿入の突然変異が起こり、ひいては発がん性を有する。そのために、このような潜在的な危険性を有する遺伝子導入法は再生医学分野におけるｉＰＳ技術の応用に明らかに不利である。従って、各研究グループはそれぞれ非統合ベクターを用いてｉＰＳを誘導して成功を獲得した。これらのベクターは、アデノウイルスベクター、通常の発現ベクター、トランスポゾン、エピソームベクター、及び環状ＤＮＡ（ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ ＤＮＡ）ベクターを含んでいる。
【００１１】
Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ３／４及びｃ−Ｍｙｃの組み合わせとＳｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ及び Ｌｉｎ２８の組み合わせはともにｉＰＳ細胞を誘導生成することができる。更なる研究により、ｃ−Ｍｙｃはリプログラミングに必要な要素ではなく、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＯｃｔ３／４という三つの転写因子だけではヒトやマウスの体細胞のリプログラミングの推進に十分である。神経幹細胞は高レベルのＳｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃを内因的にゲノムするので、外因性Ｏｃｔ３／４を導入するだけで、ｉＰＳ誘導に成功する。リプログラミングに用いられた転写因子のうち、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃはいずれも同類の他の遺伝子に取り替えられる。例えば、Ｋｌｆ４の代わりに、Ｋｌｆ２及びＫｌｆ５、Ｓｏｘ２の代わりに、Ｓｏｘ１及びＳｏｘ３、ｃ−Ｍｙｃの代わりに、N−Ｍｙｃ及びL−Mycを使用することができる。しかし、Ｏｃｔ１及びＯｃｔ６はＯｃｔ４にとってかわることができない。ＥｓｒｒｂはＯｃｔ３／４タンパクと直接に組み合わせて、幹細胞の自己再生及び全能性を調節する。リプログラミングの過程において、ＥｓｒｒｂはＫｌｆ４の代わりにＳｏｘ２、Ｏｃｔ３／４と組み合わせると、ｉＰＳ誘導に問題がない。Ｏｃｔ３／４はリプログラミングの過程における極めて重要な転写因子の一つである。最近の研究によると、核内受容体ＬＲＨ−１（Ｎｒ５ａ２)及びＮｒ５ａ１はＯｃｔ３／４に取って代わることができ、Ｋｌｆ４およびＳｏｘ２と組み合わせればマウス成体細胞をｉＰＳに誘導することができる。
【００１２】
しかし、現在、リプログラミング可能な転写因子の組み合わせは、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃの組み合わせ、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、 Ｌｉｎ２８およびＳｏｘ２の組み合わせ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびＬｒｈ１の組み合わせ、並びにＯｃｔ４及びｂｍi１の組み合わせなどの数種の組み合わせ、及びＥｓｒｒｂ、ｔｂｘ３などのリプログラミングに関する遺伝子がある。既存のリプログラム方法に必要な転写因子組み合わせに関して、３つ又は4つの転写因子を導入しなければならない。また、誘導効率が低い。いかにして転写因子を低減して高いリプログラミング効率を維持させるかは、リプログラミング細胞突然変異の蓄積の減少や、リプログラミング技術の操作性の向上に重要な意義がある。また、通常の転写因子の置換用遺伝子を探すことはリプログラミングメカニズム研究とリプログラミング技術の改善に有利である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、転写因子を低減して高いリプログラミング効率を維持し、リプログラミング細胞突然変異の蓄積を減少させて、リプログラミング技術の操作性を高める方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
当該目的を実現させるために、以下の技術案を採って多能性幹細胞の誘導生成効率を高める方法を提供する。当該方法は、
ａ、単独のＯｃｔ４、Ｏｃｔ４とＳｏｘ２との組み合わせ、Ｏｃｔ４とＫｌｆ４との組み合わせ、Ｏｃｔ４とＫｌｆ４とＳｏｘ２との組み合わせ、またはＯｃｔ４とＫｌｆ４とＳｏｘ２とｃ−ｍｙｃとの組み合わせである転写因子とＪｈｄｍ１ｂとを哺乳動物の成体細胞に転写し、フィーダー層細胞上で、ビタミンＣ、及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む誘導培地に培養して多能性幹細胞クローンを誘導獲得するステップと、
ｂ、誘導獲得した多能性幹細胞クローン、フィーダー層細胞上で、白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む幹細胞培地に培養増幅させるステップと、を含む。
【００１６】
好ましくは、上記のステップは、
ａ、単独のＯｃｔ４、Ｏｃｔ４とＳｏｘ２との組み合わせ、Ｏｃｔ４とＫｌｆ４との組み合わせ、またはＯｃｔ４とＫｌｆ４とＳｏｘ２との組み合わせである転写因子とＪｈｄｍ１ｂとを哺乳動物の成体細胞に転写し、フィーダー層細胞上で、ビタミンＣ、及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む誘導培地に培養して多能性幹細胞クローンを誘導獲得するステップと、
ｂ、誘導獲得した多能性幹細胞クローンを、フィーダー層細胞上で、ビタミンＣ、及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む幹細胞培地に培養増幅させるステップである。
【００１７】
好ましくは、前記転写因子とＪｈｄｍ１ｂは多能性幹細胞誘導機能を有するコードされた、又はノンコードされたＲＮＡ、たんぱく質、或いはポリペプチドである。
【００１８】
好ましくは、哺乳動物の成体細胞へのＪｈｄｍ１ｂの転写は、Ｊｈｄｍ１ｂを発現できるベクターを細胞に導入することによって実現する。
【００１９】
好ましくは、前記ベクターはウィルスベクター、プラスミドベクター、エピソームベクター、又はｍＲＮＡベクターであり、若しくは直接に化学合成される。
【００２０】
好ましくは、前記ウィルスベクターはレトロウイルスであり、当該レトロウイルスはｐＭＸｓベクターである。
【００２１】
好ましくは、前記Ｊｈｄｍ１ｂは脱メチル化修飾したポリペプチド、その機能的変異体及び機能的断片である。
【００２２】
好ましくは、前記哺乳動物の成体細胞は線維芽細胞、神経細胞、造血細胞及び神経膠質細胞である。
【００２３】
好ましくは、前記哺乳動物の成体細胞はマウス胎児線維芽細胞である。
【００２４】
また、本発明は、多能性幹細胞の誘導生成効率を高める方法を提供するもう一つの技術案を提供する。当該方法は、
ａ、単独のＯｃｔ４、Ｏｃｔ４とＳｏｘ２との組み合わせ、Ｏｃｔ４とＫｌｆ４との組み合わせ、またはＯｃｔ４とＫｌｆ４とＳｏｘ２との組み合わせである転写因子とＪｈｄｍ１ｂとＪｈｄｍ１ａを哺乳動物の成体細胞に転写し、フィーダー層細胞上で、ビタミンＣ、及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む誘導培地に培養して多能性幹細胞クローンを誘導獲得するステップと、
ｂ、誘導獲得した多能性幹細胞クローン、フィーダー層細胞上で、ビタミンＣ、及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む幹細胞培地に培養増幅させるステップと、を含む。
【００２５】
好ましくは、前記方法は、
ａ、Ｏｃｔ４である転写因子とＪｈｄｍ１ｂとＪｈｄｍ１ａを哺乳動物の成体細胞に転写し、ビタミンＣを含む誘導培地に培養して多能性幹細胞クローンを誘導獲得するステップと、
ｂ、誘導獲得した多能性幹細胞クローンを、フィーダー層細胞上で、ビタミンＣ、及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む幹細胞培地に培養増幅させるステップと、を含む。
好ましくは、前記ａ）の誘導過程において用いられる培地が、ビタミンＣを含む幹細胞培地ｍＥＳであってもよい。
【００２６】
本発明の有益な効果はヒストンを修飾するポリペプチドＪｈｄｍ１ｂ及びＪｈｄｍ１ａと幹細胞誘導因子を利用して、多能幹細胞の誘導効率を高めて誘導多能幹細胞の品質を高めることである。既存の多能性幹細胞誘導方法に比べて、本発明の方法は、比較的に少ない幹細胞誘導因子の種類でよりよい効果を達成した。本発明の方法においてＯｃｔ４とＫｌｆ４とＳｏｘ２との組み合わせ、Ｏｃｔ４とＫｌｆ４との組み合わせ、Ｏｃｔ４とＳｏｘ２との組み合わせ、及び単独のＯｃｔ４を使用することが好ましい。本発明の方法は、前記細胞をビタミンＣに暴露するステップをさらに含み、ビタミンＣを使用しない場合に比べて、多能幹細胞の誘導効率をさらに向上した。本発明の方法は、比較的に少ない幹細胞誘導因子を用いて潜在的発がん性を降下させると同時に、高い誘導効率を獲得し、高品質の生殖系伝送能力を有する誘導多能幹細胞を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】Ｊｈｄｍ１ａ又はＪｈｄｍ１ｂが、ＳＫＯによって媒介された多能性幹細胞の誘導効率を高めるデータを示す図であり、そのコントロールはいかなる遺伝子配列も挿入しないｐＭＸｓ−ＦＬＡＧ空ベクターである。
【図２】Ｊｈｄｍ１ａ又はＪｈｄｍ１ｂが、ＳＫＯＭによって媒介されたリプログラミング効率を促進するデータ図である。
【図３】ビタミンＣが存在する場合、ｊｈｄｍ１ａとｊｈｄｍ１ｂは共同して働き、ＳＯ、ＫＯ及びＯｃｔ４のみがある条件でリプログラムすることを示す図である。
【図４】の中、ａ、ｄは、Ｏｃｔ４＋ｊｈｄｍ１ｂ（ＯＢと略称する）が最終に形成した誘導多能性幹細胞の顕微鏡写真である；ｂ、ｅは、ＯＢが最終に形成した誘導多能性幹細胞を胞胚に注射してから形成したキメラ子孫の写真である；ｃ、ｆは、ＯＢが最終に形成した誘導多能性幹細胞を胞胚に注入してから形成したキメラと野生型マウス個体とを交配させて形成した子孫の写真である。
【図５】多能性幹細胞クローンのゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅する結果を示し、ＯＢ誘導の多能性幹細胞クローンＣ４、Ｃ１４、Ｃ１５及びＣ１６ゲノムにおいて、Ｏｃｔ４のみがＪｈｄｍ１ｂと統合され、コントロールはＳｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ４、ｃＭｙｃ及びＪｈｄｍ１ｂに感染した細胞から抽出されたゲノムＤＮＡであり、ＭＥＦはマウス胎児線維芽細胞から抽出されたゲノムＤＮＡを表すと表明した。
【図６】定量ＰＣＲの結果を示し、ＯＢ誘導の多能性幹細胞クローンＣ４、Ｃ１４、Ｃ１５およびＣ１６の外因性遺伝子がサイレント方式で発現され、その中、ＯＢ  Ｄ４コントロールはＯｃｔ４とＪｈｄｍ１ｂに感染して４日間培養して得られた細胞から抽出されたｍＲＮＡの逆転写によって獲得したｃＤＮＡテンプレートであり、ＭＥＦはマウス胎児線維芽細胞であると表明した。
【図７】リアルタイム定量ＰＣＲの結果を示し、ＯＢ誘導の多能性幹細胞クローンＣ４、Ｃ１４、Ｃ１５及びＣ１６は胚性幹細胞特異的遺伝子を発現し、その中、Ｒ１はマウス胚性幹細胞系であり、ＭＥＦはマウス胎児線維芽細胞であると表明した。
【図８】免疫蛍光の結果を示し、ＯＢ誘導の多能性幹細胞クローンＣ１４は胚性幹細胞特異的遺伝子Ｒｅｘ１と胚性幹細胞特異的表面標記物ＳＳＥＡ−１を発現し、その中Ｍａｒｋｅｒは幹細胞特異的標記分子（つまりＲｅｘ１又はＳＳＥＡ−１）を示すと表明した。
【図９】マウス胎児線維芽細胞と誘導の多能性幹細胞のＯｃｔ４の、プロモーターに隣接する領域中のＣｐＧｓメチル化の実際測定程度に対する分析結果を示す図である。
【図１０】マウス胎児線維芽細胞と誘導の多能性幹細胞のＮａｎｏｇの。プロモーターに隣接する領域中のＣｐＧｓメチル化の実際測定程度に対する分析結果を示す図である。
【図１１】Ｏｃｔ４とＪｈｄｍ１ｂの誘導による多能性幹細胞の核型図である。
【図１２】Ｊｈｄｍ１ｂの異なる変異の多能性幹細胞誘導効率を示す。Ｊｍｊｃ突然変異は２２１位のヒスチジン、２２２位のイソロイシン及び２２３位のアスパラギン酸を全部アラニンに突然異変し、ＣｘｘＣ突然変異は５８６、５８９及び５９２位のシステインを全部アラニンに突然異変した。
【図１３】ｐＭＸｓ−ＦＬＡＧプラスミド図譜を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本文が使用しているすべての科学技術用語は本分野の一般技術者が理解に当たる同意義である。本分野の定義及び用語に関しては、当業者は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ａｕｓｕｂｅｌ,  ｅｔ  ａｌ,  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ,２００９を参照することができる。アミノ酸残基の略称は、本分野で用いられる２０個の慣用Ｌ−アミノ酸の一つの標準３アルファベット及び／又は１アルファベットコードである。
【００２９】
本発明は広範囲で示す数字範囲及びパラメータ近似値を与えるが、具体的な実施例に示された数値はできる限り精確に記載するのである。しかし、いかなる数値でも一定の誤差があり、それは各自の測定における標準偏差によるものである。また、本文で開示されたすべての範囲はその中に含まれる任意／全てのサブ範囲をカバーすること。
【００３０】
本文に使用される用語「ポリペプチド」と「タンパク質」は、共有結合（例えばペプチド結合）を介して互いに結合したひとつながりの少なくとも２つのアミノ酸残基を交換可能に表す。それは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチド又は合成ポリペプチドであることが可能である。特に、本文に述べたポリペプチドはヒト及び／又はマウス由来のポリペプチドである。
【００３１】
本文に使用される「変異体」、「ポリペプチド変異体」、又は「類似物」は、１又は複数個の置換、欠失、挿入、融合、切詰若しくは任意の組み合わせによって、アミノ酸配列において元ポリペプチドと異なるポリペプチドを表す。変異体ポリペプチドは完全機能的であってもいいし、１又は数種の活性機能を欠けてもいい。本文に使用される用語「機能的変異体」とは、例えば単なる保守的変異又はノンクリティカル残基又はノンクリティカル区域の変異を含み、かつ元のポリペプチドの機能を保留すると表す。機能的変異体はまた類似するアミノ酸の置換を含み、それによって、機能変異がなく、又は目立たない。当該分野での既知の方法によって機能に重要なアミノ酸を鑑定することができる。前記方法の例としては、特定部位の突然変異誘発又はグリシンスキャニング突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．とＷｅｌｌｓ，Ｊ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１〜１０８５，１９８９）が挙げられる。結晶化、核磁気共鳴又は光親和性標識などのような構造解析によってポリペプチド活性にとって重要なサイトを確定することができる（Ｓｍｉｔｈ，Ｌ. et al., Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２４：８９９〜９０４（１９９２）、ｄｅ Ｖｏｓ，Ａ．et al., Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：３０６〜３１２（１９９２））。
【００３２】
本発明の実施方案において、Ｊｈｄｍ１ａの変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１にコードされたアミノ酸配列と少なくとも７０％（好ましくは８０％、９０％、９５％、９８％、９９％）のホモロジーを有するアミノ酸配列を含むポリペプチドから選ばれる。本発明の別の実施方案において、Ｊｈｄｍ１ｂの変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２にコードされたアミノ酸配列と少なくとも７０％（好ましくは８０％、９０％、９５％、９８％、９９％）のホモロジーを有するアミノ酸配列を含むポリペプチドから選ばれる。前記Ｊｈｄｍ１ａにコードされたアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７であり、前記Ｊｈｄｍ１ｂにコードされたアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８である。
【００３３】
本文に使用される「断片」という用語は全長配列の一部を有する分子を指す。例えば、Ｊｈｄｍ１ｂポリペプチド断片は切詰されたＪｈｄｍ１ｂである。断片は全長配列の任意の端からの配列を含んでもいいし、全長配列の中間からの配列を含んでもいい。断片は「機能的断片」、例えば、全長ポリペプチドの１種又は数種の機能を保留する断片であってよい。本文に使用される「機能的断片」という用語は前記断片が全長ポリペプチドの機能、例えば、多能性幹細胞を誘導し、又は多能性幹細胞の誘導効率を高めるという機能を補修することを表す。
【００３４】
特別に記述がない限り、本文にポリペプチド、核酸又は他の分子に言及した場合に、機能的変異体及び機能的断片が含まれると意味している。例えば、Ｊｈｄｍ１ｂとＪｈｄｍ１ａとは、それぞれ天然Ｊｈｄｍ１ｂとＪｈｄｍ１ａの機能的変異体及び機能的断片をさらに表す。
【００３５】
本文に使用される「Ｊｈｄｍ１ｂ」という用語はＪｍｊＣドメインを含むヒストン脱メチル化酵素（ＪｍｊＣ−ｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ・ｈｉｓｔｏｎｅ・ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ，ＪＨＤＭ）族の中で進化的保守性があり、且つ普通的に発現されるメンバーを表すことができ、Ｆｂｘｌ１０とも呼ばれている。特に、前記ポリペプチドはヒト及び／又はマウス由来である。
【００３６】
本文に使用される「Ｊｈｄｍ１ａ」という用語は、ＪｍｊＣドメインを含むヒストン脱メチル化酵素（ＪｍｊＣ−ｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ・ｈｉｓｔｏｎｅ・ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ，ＪＨＤＭ）族の中のもう一つのメンバーを表すことができ、Ｆｂｘｌ１１とも呼ばれている。特に、前記ポリペプチドはヒト及び／又はマウス由来である。
【００３７】
本文に使用される「誘導の多能幹細胞」「誘導の多能性幹細胞」「誘導性多能幹細胞」「誘導多能幹細胞」或いは「ｉＰＳ（ｉｎｄｕｃｅｄ・ｐｌｕｒｏｐｏｔｅｎｔ・ｓｔｅｍ・ｃｅｌｌｓ）」という用語は、同じ意味で使用でき、人工的に非多能性細胞（例えば体細胞）を誘導してなる多能性幹細胞を表す。前記誘導は通常、特定遺伝子を強制発現させることによって実現するのである。当該過程は本文において「細胞から多能性幹細胞への誘導」とも呼ばれている。
【００３８】
本文に使用される「幹細胞誘導因子」という用語は、単独、又は他の因子と組み合わせて細胞を多能性幹細胞に誘導生成させる因子を表す。例えば、たんぱく質、ポリペプチド、コードされた又はノンコードされたＲＮＡなどが挙げられる。好ましくは、前記幹細胞誘導因子は転写因子であり、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ族メンバー、Ｋｌｆ族メンバー、Ｍｙｃ族メンバー、Ｎａｎｏｇ、ＬＩＮ２８などを含む。好ましくは、前記幹細胞誘導因子はＯｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ｍｙｃから選ばれた１種又は数種であり、さらに好ましくは、前記幹細胞誘導因子は少なくともＯｃｔ４を含む。特に、前記ポリペプチドはヒト及び／又はマウス由来である。
【００３９】
本文に使用される「Ｏｃｔ４」という用語は、オクタマー転写因子族（ｔｈｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｏｃｔａｍｅｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ）の１つのメンバーを表し、それは細胞多能性の維持の面で重要な役割を果たしている。文献では、Ｏｃｔ４をＯｃｔ３と称したこともある。
【００４０】
本文に使用される「Ｋｌｆ４」という用語は、Ｋｒｕｅｐｐｅｌ様転写因子族（Ｋｒｕｅｐｐｅｌ−ｌｉｋｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ）の１つのメンバーを表す。
【００４１】
本文に使用される「Ｓｏｘ２」という用語は、Ｓｏｘ転写因子族の１つのメンバーを表す。
【００４２】
本文に使用される「ｃ−ｍｙｃ」という用語は、本分野の技術者が熟知した１種の転写因子を表し、それは複数の遺伝子発現を調節し、ヒストンアセチルトランスフェラーゼを募集し、その突然異変は多くのがん症に関わっている。
【００４３】
本文に使用される「ヒストン修飾」という用語は、多種のヒストンに対する修飾、例えば、アセチル化、メチル化、脱メチル化、リン酸化、アデニル化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化などを表す。特に、前記ヒストン修飾はヒストンの脱メチル化を含む。
【００４４】
本文に使用される「対象」という用語は、哺乳動物、例えば、ヒトを指すものの、他の動物、例えば家畜ペット（犬、猫など）、家畜（牛、羊、ブタ、馬など）又は実験用動物（サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなど）を指すことも可能である。
【００４５】
本文に使用される「一致性」、「百分比一致性」、「ホモロジー」、又は「同一性」という用語は、二つのアミノ酸配列の間或いは核酸配列の間の同一性を指す。二つの配列を対照することによって百分比一致性を確定することができる。百分比一致性は比較された配列の共有する位置の同じ残基（つまりアミノ酸又はヌクレオチド）の数量を指す。本分野の標準アルゴリズム（例えば、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ、１９８１、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ、１９７０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３、ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎ、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８５：２４４４）又はこれらのアルゴリズムのコンピュータ化バージョン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ・Ｇｅｎｅｔｉｃｓ・Ｓｏｆｔｗａｒｅ・Ｐａｃｋａｇｅ・Ｒｅｌｅａｓｅ・７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５・Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって、配列アライメントと比較を行うことができる。前記コンピュータ化バージョンはＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡとして公開に利用可能である。また、米国国家衛生研究院（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ）からの利用可能なＥＮＴＲＥＺは配列比較に使用できる。ＢＬＡＳＴ及びノッチＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合に、各プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＮ、米国国家生物技術情報センターのインターネットサイトにて使用できる）のデフォルトパラメータを使用することができる。一つの実施方案において、ノッチウェイトが１のＧＣＧを用いて二つの配列の百分比一致性を確定することができる。それによって、各アミノ酸ノッチにウェイトを与え、二つの配列の間の単一アミノ酸ミスマッチみたいである。一方、ＡＬＩＧＮプログラム（２．０バージョン）を使用することができる。それはＧＣＧ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）配列アライメントソフトパッケージの一部である。
【００４６】
本文に使用される「ベクター」という用語は、本分野の技術者が熟知した意味で使用され、発現ベクターであってもよい。前記ベクターはウィルス（例えば、ポックスウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルスなど）、酵母ベクター、ファージ、染色体、人工染色体、プラスミド、コスミッド、エピソームベクター、ｍＲＮＡベクターを含み、又は直接に化学合成される。好ましくは、前記ウィルスベクターはレトロウイルス及び／又はレンチウイルスベクターである。さらに好ましくは、前記レトロウイルスはｐＭＸｓベクターである。
【００４７】
本文に使用される「過量の」という用語は、正常レベルより著しく高く、特にポリペプチドの発現量は統計学上で正常細胞における発現量より著しく高いと表す。好ましくは、２０％、５０％、１００％、２００％又は５倍、１０倍若しくは１００倍まで超える。
【００４８】
本文に使用される「過発現」という用語は、発現レベルは正常レベルより著しく高いと表し、特にポリペプチドの発現量は統計学上で正常細胞における発現量より著しく高いと表す。好ましくは、２０％、５０％、１００％、２００％又は５倍、１０倍若しくは１００倍まで超える。
【００４９】
本文に使用される「導入」という用語は、外因性物質（例えば核酸又はタンパク質）を細胞に導入するアクセスを表し、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ウイルス感染、リポソームトランスフェクション、エレクトロポレーション又は遺伝子銃によって行われる。
【００５０】
本文では、外因性ポリペプチドは、多種の方式で細胞に送達することができる。例えば、トランスポーター及び/又はトランスポーター因子によって上記外因性ポリペプチドを細胞に送達し、好ましくはリポソーム、細菌ポリペプチド断片などによって送達する（ＷＯ２００２／０７９４１７参照。その内容は引用によって本文に組み込まれる）。
【００５１】
本発明の方法で使用可能な細胞は、好ましく哺乳動物細胞であり、さらに好ましくは、ヒト及びマウス細胞である。特に、前記細胞は体細胞、例えば、上皮細胞、神経細胞、線維芽細胞、内皮細胞、肌細胞、造血細胞、免疫細胞、リンパ細胞などである。さらに特に、前記細胞は膵のβ細胞、成体神経幹細胞、肝細胞、胃細胞、成熟Ｂ細胞、造血細胞、髄膜組織球、脂肪幹細胞、臍帯血細胞、末梢血ＣＤ３４陽性細胞、角質細胞などである。
【実施例】
【００５２】
実施例１：
１、Ｊｈｄｍ１aとＪｈｄｍ１ｂコード領域を含むベクターの構築：
a.クローニング用プライマーの設計
hｔｔｐ://www.ncbi.nlm.nih.gov/puｂmedからＪｈｄｍ１a及びＪｈｄｍ１ｂのｃＤＮＡの配列情報を取得した。その中、Ｊｈｄｍ１a ｃＤＮＡのクローン領域の配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１であり、Ｊｈｄｍ１ｂ ｃＤＮＡのクローン領域の配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２であり、特異的プライマーを設計することによって、Ｊｈｄｍ１a及びＪｈｄｍ１ｂのコード配列を増幅した。
【００５３】
Ｊｈｄｍ１a 上流プライマーの塩基配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で示される；
Ｊｈｄｍ１a 下流プライマーの塩基配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で示される；
Ｊｈｄｍ１ｂ上流プライマーの塩基配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で示される；
Ｊｈｄｍ１ｂ下流プライマーの塩基配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で示される。
【００５４】
ｂ.ＲＴ−ＰＣＲによるコード配列の増幅
下記の方法によって、分離されたＩＣＲマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）及びヒトＨ１胚性幹細胞から総ｍＲＮＡを抽出した。
【００５５】
まず、プレート中の培地を除去し、細胞を３-５ｍｌの生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ株式会社）で洗浄し、その洗浄液を除いた後、プレート中に細胞溶解剤Ｔｒｉｚｏｌ（Ｔａｋａｒａ株式会社）を１ｍｌ加え、混合液をピペットにて吸取って、細胞を完全に溶解剤に溶解するまで軽く吹いたり打ったりした。その後、それを清潔な１.５ｍｌの遠心管に移し、−８０℃に保存し或は直ちに以下の抽出ステップを行った。次に、クロロホルムを２００μｌ加え、約３０秒均一に転倒混合してから、１２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心した。上澄みを注意深く吸取って清潔な１.５ｍｌの遠心管へ移し、その後、同体積のイソプロパノ−ルを加えて均一に混合し、室温で５分間静置してから、１２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、試験管の底に小さな白い沈殿物が見られ、上澄みを注意深く除いてから、残るイソプロパノ−ルを除くために８０％のエタノール溶液を５００μｌ加えた。１２０００ｒｐｍで遠心し、エタノール溶液を除去し、試験管の底の白い総ｍＲＮＡを十分に幹燥するために、室温で３０分間静置した。その後、遠心管の中に再蒸留水を３０-５０μｌ加え、５５℃で孵化し、３０分間後それを取り出して総ｍＲＮＡの濃度を分光光度計を用いて測定した。その抽出された総ｍＲＮＡを−８０℃で保存し、或は直接に逆転写のｃＤＮＡの製造に使用した。
【００５６】
逆転写の具体的な過程及び方法は以下に説明する。通常的には、総ｍＲＮＡを１μｇ取って逆転写を行い、オリゴデオキシウラシルヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｄＴ、Ｔａｋａｒａ株式会社）、ｄＮＴＰ（Ｔａｋａｒａ株式会社）、ＲＴａｃｅ（Ｔｏｙｏｂｏ株式会社）、ＲＴ  ｂｕｆｆｅｒ及びＲＲＩ（ＲＮＡｓｅ抑制剤、Ｔａｋａｒａ株式会社）並びにＲＮａｓｅ/ＤＮａｓｅフリー水を加え、ＰＣＲ装置で４２℃で６０分間反応してから９８℃で５分間孵化し、その後、室温に冷却する。逆転写した後、その中から０.５μｌのものをテンプレートとして取り出し、前記の方法によって設計したプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によってターゲット遺伝子を増幅した。使用される試薬としてはハイファイのポリメラーゼＫＯＤ及びそのバッファー（Ｔｏｙｏｂｏ株式会社）、ｄＮＴＰ(Ｔａｋａｒａ株式会社)、及びプライマーがある。ＰＣＲ装置で下記のプロセスを行った：９６℃で５分間、９５℃で３０秒変性し、６０℃で２５秒アニ―ルし、６８℃で３.５分間延在し、２ないし４ステップを３２回繰り返した。
【００５７】
Ｃ.プラスミド構築
図１３を参照してください。増幅反応終了後、ＰＣＲ産物に対してアガロースゲル電気泳動して、ゲル抽出キット（天根株式会社、ＤＰ２１４-０３）を用いてＰＣＲ断片を抽出した。ｐＭＸｓベクター（ベクターがａｄｄｇｅｎｅから購入され、マルチクローニングサイト及びＦＬＡＧタグ配列が挿入された）を使った。改造後のｐＭＸｓベクターがｐＭＸｓ-ＦＬＡＧと呼ばれ、そのプラスミド図については図１３を参照すること。ベクターの自己連結を防止するためにｐｍｅｌ酵素切断で、ＣＩＡＰウシ腸アルカリフォスファターゼを応用してそれを脱燐酸化した。ゲル抽出キット（天根株式会社、ＤＰ２１４-０３）で処理済みのベクターを回収しておく。ｐＭＸ-ＦＬＡＧベクター及びＪｈｄｍ１a/Ｊｈｄｍ１ｂの遺伝子断片をライゲーションキット（Ｔａｋａｒａ株式会社、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）で縛ってからライゲーション産物によってコンピテント大腸菌を転化し、陽性クローンを選び、プラスミドを抽出してシークエンシングした。最後にプラスミドを大量に調製した。
【００５８】
２、Ｊｈｄｍ１a/Ｊｈｄｍ１ｂ及び多能性幹細胞誘導因子（転写因子）のコード配列のマウス胎児線維芽細胞への導入
特別な説明がない場合、マウスの体細胞リプログラミングを全部以下の方式で行った。
【００５９】
培地
フィーダー層細胞、ＭＥＦ細胞及びＰｌａｔＥ細胞の培地の組成は、高糖基礎培地ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）の上に、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＰＡＡ)を加えた。
【００６０】
誘導培地：本発明は実験室で慣用の誘導培地を使用し、好ましく使用する誘導培地の成分は、ＤＭＥＭ高糖培地（Ｇｉｂｃｏ）、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）、０.１ｍＭの非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭのL-グルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ、Ｇｉｂｃｏ）、５５μＭのβメルカプトエタノール（β-ＭＥ、Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン(５０Ｕ/ｍｌ)及びストレプトマイシン(５０μｇ/ｍｌ)、１０００Ｕ/ｍｌの白血病抑制因子（ＬＩＦ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含む。必要に応じて、ビタミンＣ（ｓｉｇｍａ）を添加した。その濃度は５０μｇ/ｍｌである。
【００６１】
幹細胞培地：本発明は実験室で慣用の幹細胞培地を使用し、ｍＥＳ幹細胞培地を使用することが好ましい。その組成については、高糖ＤＭＥＭ培地に１５％ウシ胎児血清、０.１ｍＭの非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭのL-グルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ、Ｇｉｂｃｏ）、５５μＭのβメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン(５０Ｕ/ｍｌ)及びストレプトマイシン(５０μｇ/ｍｌ)、１０００Ｕ/ｍｌの白血病抑制因子（ＬＩＦ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を添加した。必要に応じて、ビタミンＣ（ｓｉｇｍａ）を添加した。その濃度は５０μｇ/ｍｌである。
【００６２】
ＫＳＲ無血清培地：ＫＳＲはＫｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅの略称であり、商品化された、血清の代わりになる幹細胞培養用添加剤であり、幹細胞の培養或はｉＰＳクローンに用いられる完全なＫＳＲ無血清培地である。その組成成分は、ＫＮＯＣＫＯＵＴ ＤＭＥＤ（浸透圧が改善された幹細胞の培養に適用する基礎培地）、１５％ＫＳＲ添加剤、０.１ｍＭの非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭのL-グルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ、Ｇｉｂｃｏ）、５５μＭのβメルカプトエタノール（β-ＭＥ、Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン(５０Ｕ/ｍｌ)、ストレプトマイシン(５０μｇ/ｍｌ)、及び１０００Ｕ/ｍｌの白血病抑制因子（ＬＩＦ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含む。全部のｉＰＳ過程及びクローン培地にはマウスの白細胞抑制因子ＬＩＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、商品名はＥＳＧＲＯであり、マウス幹細胞分化を抑制する成長因子である）を添加し、添加の終濃度が１０００Ｕ/ｍｌである。
【００６３】
３、リプログラミング用細胞
リプログラミングに採用された体細胞の類型は全部でＯＧ２マウス胎児線維芽細胞（実験室自制）であり、その継代数が３代を超えない。幹細胞の特異的に発現するＯｃｔ４遺伝子のプロモーターの後に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をライゲーションすることがＯＧ２マウスの特徴の一つである。リプログラミングの過程において、ＯＧ２マウス胎児線維芽細胞の内因性Ｏｃｔ４が活性化された際には、同時に緑色蛍光タンパク質が発現され、蛍光マイクロスコープにおいて、リプログラミングに成功した細胞或はクローン細胞集塊は緑色を呈する。直接にリプログラミングクローン即ち緑色蛍光クローンの数を統計し或はフローサイトメータにて緑色蛍光細胞の比率を分析することにより、異なる条件下のリプログラミング効率を容易に比較することができる。
【００６４】
以下に述べたようにリプログラミング細胞を準備した。２００００個細胞/ウェルの密度で細胞を１２ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、細胞を播種してから６-１８時間後、その密度及び状態によって、マウスリプログラミング因子付きウイルスで感染した。
【００６５】
４、ウイルスの調製
リプログラミング用転写因子はマウスＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−ＭｙｃのｃＤＮＡのレトロウイルスベクターｐＭＸｓ（Ａｄｄｇｅｎｅ株式会社から入手し、番号はそれぞれＰｌａｓｍｉｄ １３３６６、Ｐｌａｓｍｉｄ １３３６７、Ｐｌａｓｍｉｄ １３３７０及びＰｌａｓｍｉｄ １３３７５である）を含む；Ｏｃｔ４,ＮＣＢＩの登録番号：ＮＭ_０１３６６３；Ｓｏｘ２,ＮＣＢＩの登録番号：ＮＭ_０１１４４３；Ｋｌｆ４,ＮＣＢＩの登録番号：０１０６３７；ｃ−Ｍｙｃ,ＮＣＢＩの登録番号：ＮＭ_００１１７７３５３。自製のリン酸カルシウムトランスフェクション試薬を用いてｐＭＸベクター上のリプログラミング因子プラスミドをウイルスパッケージング細胞（ＰｌａｔＥ）にトランスフェクトした。具体的な過程は以下の通りである。７５０万のＰｌａｔＥ細胞を直径１０センチメートルのプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に接種し、１２時間後、７.５ｍｌのペニシリン/ストレプトマイシンを含まれていない培地で古い培地を置換し、その後、細胞をインキュベータに放置した。次に、トランスフェクション混合物を準備した：プラスミド２５μｇを取って１５ｍｌの遠心管に加え、順次２Ｍの塩化カルシウム溶液１５６.２５μｌを加え、適量の水を入れて三者の総体積を１.２５ｍｌにして、均一に混合してからＨＢＳ溶液を１.２５ｍｌ加え、直ちに均一に混合してから２分間静置し、その後、ＰｌａｔＥプレート中に一滴ずつ加入し、均一に混合した。トランスフェクション後の９-１２時間、１０ｍｌの新鮮な培養液で置換し、トランスフェクション後の４８時間、その培養液を収集し、かつ０.４５μｍろ過膜で培養液をろ過し、第一次感染用ウイルス液とした。新鮮な培養液を添加し、２４時間後、このように培養液を再び収集して第二次感染ウイルス液とした。
【００６６】
５、ウイルスでＭＥＦ細胞を感染した：
感染は２回に分けて行った。使用されている誘導因子は全部で同時に細胞に感染した。１２ウェル板の各ウェルの感染ウイルスの用量が１ｍｌであり、第１回感染後の２４時間後に第２回の感染を行い、第２回感染後の２４時間後にウイルス液をｍＥS培地（前記）に置換した。液を取り替える日は第０日（Ｄ０）として記録された；感染後の異なる時点で、実験の必要に応じて、原ウェル内でＧＦＰ蛍光クローンの数を数え、又はＧＦＰ蛍光細胞の比率をフローサイトメータで分析した。
【００６７】
６、感染後の細胞を幹細胞クローンを形成するまで培養した：
形態が隆起し、周辺がはっきりしている胚性幹細胞のような単一のクローンをガラス針で選び、事前に準備したフィーダー層細胞（フィーダー層細胞は、マイトマイシンで処理したＩＣＲマウス線維芽細胞）の培養板(Ｃｏｒｎｉｎｇ）に直接的に移し、ＫＳＲ培地を用いて培養した。感染後の翌日、培養体系を新鮮な誘導培地で取り替え、以降は実験が終了するまで誘導培地を毎日取り替えた。
【００６８】
前記のような幹細胞クローン形成方法によって、異なる多能幹細胞誘導因子の組み合わせを用いて実験した。
【００６９】
各多能幹細胞誘導因子の組み合わせは以下の通り説明する：
Ｋｌｆ４とＳｏｘ２とｃ−ＭｙｃとＯｃｔ４との組み合わせは略してＳＫＯＭという。
【００７０】
Ｋｌｆ４とＳｏｘ２とＯｃｔ４との組み合わせは略してＳＫＯという。
【００７１】
Ｋｌｆ４とＯｃｔ４との組み合わせは略してＫＯという。
【００７２】
Ｓｏｘ２とＯｃｔ４との組み合わせは略してＳＯという。
【００７３】
Ｏｃｔ４とＪｈｄｍ１ｂの組み合わせは略してＯＢという。
【００７４】
Ｃ４、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６は、ＯＢに誘導されたリプログラミング細胞から選んだ四つのクローンである。
【００７５】
各幹細胞誘導因子の組み合わせを選択して使用する実験の結果は以下の通りである。
【００７６】
図１を参照してください。ビタミンＣが存在するか否かにもかかわらず、Ｊｈｄｍ１a又はＪｈｄｍ１ｂはリプログラミングの効率を著しく高めた。ビタミンＣが存在する場合、増加幅がより顕著である。図１は、Ｊｈｄｍ１a又はＪｈｄｍ１ｂがＳＫＯ媒介での多能性幹細胞の誘導効率を高めたデータを示している。その中、コントロールはいかなる遺伝子配列も挿入しないｐＭＸｓ-ＦＬＡＧ空ベクターである；
図２を参照してください。ビタミンＣが存在するか否かにもかかわらず、Ｊｈｄｍ１a又はＪｈｄｍ１ｂはリプログラミングの効率を著しく高めた。ビタミンＣが存在する場合、増加幅がより顕著である。図２は、Ｊｈｄｍ１a又はＪｈｄｍ１ｂがＳＫＯＭ媒介での多能性幹細胞の誘導効率を高めたデータを示している。その中、コントロールはいかなる遺伝子配列も挿入しないｐＭＸｓ-ＦＬＡＧ空ベクターである； 
図３を参照してください。ビタミンＣが存在する場合、Ｊｈｄｍ１aとＪｈｄｍ１ｂは共同して働き、ＳＯ、ＫＯ及びＯｃｔ４のいずれか一つのみが存在する場合にも多能性幹細胞を誘導することができるようにする。ｍＥＳＣ＋Ｖｃは誘導過程に用いられる培地が幹細胞培地ｍＥＳであり、また、５０μg/ｍｌのビタミンＣを加えることを表している。その中、コントロールはｐＭＸｓ-ＦＬＡＧ空ベクターである。
【００７７】
従って、本発明によって、Ｊｈｄｍ１a及びＪｈｄｍ１ｂは多能性幹細胞の誘導効率を著しく改善することができ、高いリプログラミング効率を維持すると同時に、導入しなければならない転写因子の種類を大幅に減少させ、リプログラミング細胞突然変異の蓄積の減少とその致癌性の減少に大きな役割を果たしている。また、本発明の方法はリプログラミング技術の可操作性を高め、操作の難度を低減させて後継ぎの医薬用途に便利さを提供することもできる。
【００７８】
実施例２：
実施例１で得られた誘導性多能幹細胞の同定：
図３及び図６〜１０に示されるように、ｉＰＳ細胞（誘導性多能幹細胞）であるかどうかを証明するため、Ｏｃｔ４及びＪｈｄｍ１ｂに誘導された多能幹細胞クローンに対して一連の同定実験を行った。同定実験は定量ＰＣＲ、その表面標識物に対する免疫蛍光分析、プロモーターメチル化程度の分析、核型の同定、キメラの形成などを含む。
【００７９】
定量ＰＣＲ実験：
定量ＰＣＲ実験は全部Ｔａｋａｒａ株式会社のキットを用いて、Ｂｉｏｒａｄ株式会社のＣＦＸ-９６型定量ＰＣＲ装置で終了した。反応条件は９５℃２分間、９５℃１０秒、６０℃３０秒であり、蛍光値を記録し、このように４０サイクルを実施した。
【００８０】
プロモーター領域のメチル化状况の分析
この分析は亜硫酸水素ナトリウムシークエンシング方法によって実施した。ターゲット細胞中のゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ株式会社、Ｗｉｚａｒｄ(登録商標)Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を抽出し、濃度値を測定し、約２uｇのＤＮＡを１.５ｍｌＥＰ管でｄｄＨ２Ｏを用いて５０μlに希釈し、新たに調製した３ＭのＮａＯＨを５.５uｌ加え、４２℃で水浴を３０分間行った。その後、溶液を取り出し、１０ｍＭハイドロキナン（ｓｉｇｍａ）を前記水浴後の混合液中に３０μl加えてから、前記水浴後の溶液中に３.６Ｍ亜硫酸水素ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、Ｓ９０００）を５２０μl加え、ＥＰ管の外側にアルミ箔紙で巻き、光を避けるように溶液を軽く転倒して均一に混合し、水分蒸発及び酸化を防止するように、パラフィンオイルを２００μｌ加えて５０℃で光を避けて水浴を１６時間行った。
【００８１】
その後、ピペットの先端をパラフィンオイル層の下に挿入し、混合液を吸い取って清潔な１.５ｍｌの遠心管に移し、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｗｉｚａｒｄ Ｃｌｅａｎｕｐ ＤＮＡ純化回収システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ａ７２８０）で修飾後のＤＮＡを回収し、-２０℃で保存し、又は次の実験を行った。前記抽出したＤＮＡ５０ｎｇをテンプレートとしてＰＣＲ反応を行い、その後、ＰＣＲ産物をゲル抽出（天根株式会社、ＤＰ２１４-０３）によって回収してからＰＣＲ産物とＴベクター（Ｔａｋａｒａ株式会社）を連結転化し、陽性クローンを選んでシークエンシング株式会社でシークエンシングした。その得られた結果を対照して、ＣｐＧ島のメチル化状態を統計した。
【００８２】
ｉＰＳ細胞の核型同定
ｉＰＳ細胞の核型同定は下記の方法に基づいて行った：核型分析しようとする細胞を、収穫前の２-３時間に５uｇ/ｍｌのコルキシン（市販、終濃度は０.１uｇ/ｍｌである）を０.１mlを加えて均一に混合する後、引き続き２-３時間培養してから１０ｍｌの遠心管へ移し、１５００-２０００ｒｐｍ/ｍｉｎで１０分間遠心し、上澄み液を除き、低張液（０.０７５Ｍ のＫＣｌ、３７℃で予熱する）を８ｍｌ加えて細胞沈殿物を均一になるまで吹いたり打ったりしてから、インキュベータに３７℃で半時間放置し、新たに調製した固定液（メタノール:氷酢酸の体積比が３:１の混合物であり、原材料は市販されている）を１ｍｌ加え、軽く均一に混合した後、前記のスピードと時間で遠心し、上澄み液を吸い取った。固定液を８ｍＬ加え、細胞を十分均一に混合し、室温で少なくとも半時間固定し、遠心を繰り返した後、上澄み液を除いて、新鮮な固定液を加えて再び少なくとも半時間（一晩放置するのが好ましい）固定した。遠心して上澄み液を除いた後の細胞沈殿物に新鮮な固定液を約０.２ｍｌ加えて、均一に混合し、細胞懸濁液を事前に冷却したスライドガラス（スライドガラス毎に３滴の細胞懸濁液が好適である）に点し、アルコールランプでガラスを乾かし、冷却後にバンディング処理を行った。
【００８３】
胞胚キメラテスト
胞胚キメラテストにおいて、ｉＰＳ細胞をドナーマウスの胞胚腔に注射し、注射後の胞胚を偽妊娠雌マウスの子宮に移植してキメラマウスを作成し、生まれたマウスの毛の色によって嵌合を生んだかどうかを判断した。
【００８４】
以上の方法に従って実験を行い、その結果を以下のように分析した。
【００８５】
図５は、多能幹細胞クローンのゲノムＤＮＡに対するＰＣＲ増幅の結果を示している。ＯＢ誘導の多能幹細胞クローンＣ４、Ｃ１４、Ｃ１５及びＣ１６ゲノムにおいて、Ｏｃｔ４のみがＪｈｄｍ１ｂと統合され、コントロールはＳｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ４、ＣＭｙｃ及びＪｈｄｍ１ｂに感染した細胞から抽出されたゲノムＤＮＡであり、ＭＥＦはマウス胎児線維芽細胞から抽出されたゲノムＤＮＡを表す。
【００８６】
図６は、定量ＰＣＲの結果を示している。ＯＢ誘導の多能性幹細胞クローンＣ４、Ｃ１４、Ｃ１５及びＣ１６の外因性遺伝子がサイレント方式で発現され、その中、ＯＢ  Ｄ４コントロールは、Ｏｃｔ４とＪｈｄｍ１ｂに感染して４日間培養して得られた細胞から抽出されたｍＲＮＡの逆転写によって獲得したｃＤＮＡテンプレートであり、ＭＥＦはマウス胎児線維芽細胞である。
【００８７】
図７を参照してください。図７は、リアルタイム定量ＰＣＲ結果を示している。図7に示すように、ＯＢ誘導の多能幹細胞クローンＣ４、Ｃ１４、Ｃ１５及びＣ１６は胚性幹細胞特異的遺伝子を発現し、その中、Ｒ１はマウス胚性幹細胞系であり、ＭＥＦはマウス胎児線維芽細胞であり、Ｏｃｔ４とＪｈｄｍ１ｂとの組み合わせを使用して得られる幹細胞の内因性胚性幹細胞転写因子等の発現量は胚性幹細胞の発現とほぼ一致である。これは、ＯＢ誘導の多能幹細胞クローンＣ４、Ｃ１４、Ｃ１５及びＣ１６が胚性幹細胞特異的遺伝子を発現することを表す。従って、本発明の方法によって誘導して得られる多能性幹細胞は多能性幹細胞の特征を有する。
【００８８】
図８を参照してください。図８に示されるように、免疫蛍光の結果によると、ＯＢから得られた多能幹細胞はＳＳＥＡ−１を表面で発現し、また、Ｒｅｘ１を発現した。
【００８９】
図９は、Ｏｃｔ４プロモーター領域のＣｐＧ島のメチル化状態分析を示している。ドナー細胞のＣｐＧ島はメチル化されていないのに対し、誘導多能幹細胞の対応する位置のＣｐＧ島は著しく脱メチル化を行った。
【００９０】
図１０は、Ｎａｎｏｇプロモーター領域のＣｐＧ島のメチル化状態分析を示している。ＯＢ-Ｃ１４、ＯＢ-Ｃ１５及びＯＢ-Ｃ１６は、それぞれＯｃｔ４及びＪｈｄｍ１ｂを誘導して得られる３つの多能幹細胞である。黒い部分はメチル化されたのを表し、白い部分はメチル化されていないと表す。ドナー細胞のＣｐＧ島はメチル化されていないのに対し、誘導多能幹細胞の対応する位置のＣｐＧ島は著しく脱メチル化を行った；Ｎａｎｏｇ及びＯｃｔ４は、胚性幹細胞に特異的に発現される遺伝子であり、発現状態は細胞の運命と緊密に関わっている。これらの結果によると、ＯＢグループを使用して得られた細胞は運命が変わって、つまり、多能性幹細胞に誘導された。
【００９１】
図１１に示されるように、本発明の方法によって得られた幹細胞の核型が正常であり、ＯＢ-Ｃ１４、ＯＢ-Ｃ１５及びＯＢ-Ｃ１６はそれぞれＯｃｔ４とＪｈｄｍ１ｂを誘導して得られる３つの多能幹細胞であり、正常の核型を有する。
【００９２】
図４を参照してください。図４に示されるように、a、dはＯｃｔ４+Ｊｈｄｍ１ｂ(ＯＢと略称する)が最終的に形成した誘導多能幹細胞の顕微鏡写真である；ｂ、eはＯＢが最終的に形成した誘導多能幹細胞を胞胚に注射した後に発育してなるキメラ子孫の写真である；ｃ、fはＯＢが最終的に形成した誘導多能幹細胞を胞胚に注射した後に発育してなるキメラと野生型マウスの個体とを交尾させて形成した子孫の写真である。本発明の方法によって得られた幹細胞はキメラを形成することができ、その中、ドナー細胞は誘導された多能幹細胞であり、その細胞はＯＧ２/１２９細胞に由来し、偽妊娠マウスは、実験に飼養したＩＣＲマウスである。その得られたキメラは本来のドナー細胞を生殖系によって次世代に伝送することができ、この幹細胞が良好な品質を有することが表明された。
【００９３】
Ｊｈｄｍ１ｂ変異体の機能性の測定：
図１２を参照してください。図１２に示されるように、突然変異が発生したＪｈｄｍ１ｂの変異体はリプログラミング効率を向上する活性を持っていない。従って、Ｊｈｄｍ１ｂのＤＮＡ結合ドメイン（ＣＸＸＣ）及び触媒ドメイン（Ｊｍｊｃ）はリプログラミングに対して必須的であり、いずれか一方がないと、リプログラミングを促進することができなくなる。そして、Ｏｃｔ４とＪｈｄｍ１ｂとの組み合わせは普通の培地条件下でリプログラミングを完成することができ、ビタミンＣが存在する場合により顕著な效果が得られる。
【００９４】
以上は本発明の実施例だけであり、本発明の特許範囲をこのように制限するのではない。本発明の明細書及び図面を利用して作った同等構造又は同等流れ変換、若しくは他の関連技術分野における直接的又は間接的な応用は、いずれも同様な理由で本発明の特許保護範囲内にある。
【００９５】
SEQUENCE LISTING
<110>  中国科学院広州生物医薬及び健康研究院
<120>  多能性幹細胞の誘導生成効率を高める方法
<160>  8     
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  3486
<212>  DNA
<213>  人工配列
<400>  1
atggaacctg aagaagaaag gattcggtac agccagagat tgcgtggtac catgcgtcgt     60
cgctatgaag atgatggcat ttcagatgat gaaattgaag ggaaaagaac ttttgacttg    120
gaagagaagc tccaaaccaa caaatataat gccaattttg ttacttttat ggagggaaaa    180
gattttaatg tagagtatat ccagcggggt ggcttgagag accctctcat tttcaagaat    240
tctgatggac ttggaataaa gatgccggat ccagacttca cagtgaatga tgtcaaaatg    300
tgtgtgggga gtcgtcggat ggtggatgtc atggatgtga acacacagaa ggggattgaa    360
atgaccatgg cacaatggac acgatactat gagactccag aggaagagcg agaaaaactc    420
tataatgtta tcagcctaga gtttagccac accaggcttg agaatatggt gcagcggcct    480
tccacggtgg atttcattga ctgggtagat aacatgtggc caaggcactt gaaagaaagt    540
cagacagaat caacaaatgc catcttagag atgcagtacc ctaaagtgca aaagtactgt    600
ctaatgagtg ttcgaggctg ctatactgac ttccatgtgg attttggagg tacttctgtt    660
tggtatcaca tccaccaagg tggaaaggtc ttctggctca tcccccctac agcccacaac    720
ctggagctgt acgagaattg gctgctatca gggaaacagg gagacatctt tctgggtgac    780
cgggtgtcag attgccaacg aattgagctc aagcagggct ataccttcgt tattccctca    840
ggttggattc atgctgtgta tactcctaca gacacattag tgtttggagg caattttttg    900
catagcttca acatccccat gcaattaaag atatacagca ttgaagatcg aacacgggtt    960
ccaaataaat tccgttaccc attttactat gaaatgtgtt ggtatgtgtt ggagcgctat   1020
gtatactgca taaccaaccg atcccaccta actaaggatt ttcagaaaga atcccttagc   1080
atggatatgg agttaaatga gttggagtct ggaaatggtg atgaggaagg ggtggacaga   1140
gaagcccgac gcatgaacaa taagcgatct gtgcttacca gccctgttgc taatggagtg   1200
aacctggatt acgatggact tggcaaagcc tgccgaagtc ttccaagtct gaagaaaact   1260
ttgtctggag actcatcctc agactctacc cggggatccc acaatggcca agtttgggat   1320
ccccaatgta gccctaaaaa ggataggcaa gtgcatctca cccattttga acttgaaggt   1380
cttcgatgtc ttgtagataa gttagagtca ctgccactgc acaagaagtg tgtccccaca   1440
ggaatagaag acgaagatgc tctgattgct gatgtaaaga ttttgctgga agaacttgcc   1500
agtagcgatc ccaagttagc cctcactgga gtccctatag tacagtggcc aaaaagggat   1560
aagcttaaat tccctaccag gccaaaggtg agggttccta caattcccat cacaaagcct   1620
cacaccatga agccagctcc acgcttaaca cctgtaaggc ctgctgcagc ctcccccatt   1680
gtgtcaggag ccaggcggag aagagtgcgg tgcaggaaat gcaaagcttg tgtgcaagga   1740
gaatgtggag tctgccacta ctgcagggac atgaagaaat ttggtggacc tggacgcatg   1800
aagcaatcct gtgtcctccg acagtgctta gcacccagac tgcctcattc agttacgtgt   1860
tctctctgtg gagaagtaga tcagaatgaa gagacccagg actttgaaaa gaaactcatg   1920
gaatgctgca tctgcaacga gatagttcat cctggctgcc tccagatgga tggagagggg   1980
ttgctgaacg aggaattgcc aaattgctgg gagtgtccaa agtgttacca ggaagacagc   2040
tcggacaaag cccagaagcg gaaaatagaa gagagtgatg aagaagctgt acaagccaaa   2100
gtcttacggc ccctgaggag ctgcgaggag cctctcacac ccccgcctca ctcacctact   2160
tccatgctgc agctcatcca cgacccggtt tctccccggg gtatggtgac tcggtcatcc   2220
cctggggctg gccccagcga ccaccacagt gccagccgtg atgaacgctt caaacggcgg   2280
cagttgctgc ggctacaagc caccgagcgc accatggtac gggaaaagga gaacaatccc   2340
agcggcaaaa aggagctgtc tgaagttgag aaagccaaga tccggggatc gtacctcact   2400
gtcactctac agaggcccac caaagagctc cacgggacat ccattgtgcc caagctgcag   2460
gccatcacgg cctcctctgc caaccttcgc cctaaccccc gcgtgctaat gcagcactgc   2520
ccagcccgaa acccccagca tggggatgag gaggggcttg ggggagagga ggaggaagag   2580
gaggaggagg aggaagatga cagtgcagag gaggggggtg cagccaggct gaatggccgg   2640
ggcagttggg ctcaggatgg agacgaaagc tggatgcagc gggaggtctg gatgtctgtc   2700
ttccgctacc tcagccgcaa agaactttgt gaatgtatgc gagtgtgcaa gacatggtat   2760
aaatggtgct gtgataaacg actttggaca aaaattgact tgagtaggtg taaggccatc   2820
gtaccacaag ctctcagtgg tatcatcaag cggcagccag taagcctcga cctcagctgg   2880
actaacatct ccaaaaagca gctgacatgg ctggtcaata ggctgccagg attaaaagac   2940
ctcctcctag caggctgttc ctggtctgca gtatctgccc tcagcacttc cagctgcccg   3000
cttctcagga cccttgatct tcggtgggca gtaggaatta aagaccctca aattcgggac   3060
ttgctgactc cacccacaga taagccaggt caagacaatc gaagcaaact ccggaacatg   3120
actgacttcc ggctggcagg ccttgacatc acagatgcta ctctccgact catcattcgc   3180
cacatgcccc ttttgtctcg acttgacctc agtcactgca gtcaccttac agatcagtcc   3240
tccaacctac taactgctgt cgggtcttcc actcgatact cccttacaga gctcaatatg   3300
gcaggttgca ataaattgac agaccagacc ctgttcttcc taaggcgaat tgctaatgtc   3360
accttgattg accttcgagg atgcaaacag atcacgagaa aagcctgtga gcacttcatc   3420
tcagacttgt ccatcaacag cctctactgc ctgtctgatg agaaactgat acagaagatt   3480
agctaa                                                              3486
<210>  2
<211>  3930
<212>  DNA
<213>  人工配列
<400>  2
atggaggcag agaaagactc tggaagaaga ttgcgtgcga ttgaccgcca gagatacgac     60
gagaacgaag acttgtcgga cgtggaggaa attgtcagcg tccgtggctt cagcctggag    120
gagaagctac gtagccagtt ataccagggg gacttcgtgc atgctatgga aggcaaagat    180
tttaactatg agtacgtaca gagagaagct ctcagggtcc ccctggtttt tcgggacaag    240
gatggactag ggatcaagat gccagaccct gatttcacag tccgagacgt caaactcctg    300
gtggggagcc gccgtttggt ggatgtcatg gacgtcaaca cccagaaggg taccgagatg    360
agcatgtccc agtttgtgcg ctactacgag acaccagagg cacagcggga taaactgtac    420
aacgtcatca gcctcgagtt cagccatacg aagctggagc atctggtcaa gcgtcccact    480
gtggtggacc tggtcgactg ggtggacaac atgtggcctc agcatctaaa ggaaaagcag    540
acagaagcca ccaatgccct tgcagagatg aagtacccca aagtgaaaaa gtactgtctg    600
atgagcgtga agggctgttt cactgacttc cacattgact ttggaggcac ctccgtgtgg    660
taccatgtgt tccgtggtgg caagatcttt tggctgatcc ctccaaccct gcacaacttg    720
gctttgtacg aggagtgggt gctgtctggc aaacagagcg acatctttct gggagaccgc    780
gtggaacgct gccaaagaat tgagctgaag caaggctaca cctttttcat cccttccggt    840
tggatccatg cggtttatac gcctgtggac tctctggtgt tcggcgggaa catcctgcat    900
agcttcaacg tgcccatgca gctgcggatc tacgagatcg aggacaggac ccgggttcag    960
cccaagttcc gttacccctt ctactatgag atgtgctggt atgtcttgga gagatatgtg   1020
tactgtgtga cccagcgctc ctacctcact caggaatacc agagagaatt aatgcttatt   1080
gatgccccaa gaaaaaccag tgtagacggc ttttcatccg actcctggct ggacatggag   1140
gaggagtcct gcgagcagca gccacaggag gaagaggagg aggaggagga caaggaggag   1200
gaaggagatg gtgcagataa aacacccaag ccacccaccg atgaccccac ctcacccacc   1260
agcaccccgc ccgaagacca ggacagcaca gggaagaagc ctaaagcccc tgccatacgg   1320
ttcctcaaga ggacgttgtc caatgagtca gaggaaagtg tcaagtcgac ctcgatgccc   1380
acggacgatc ccaagacgcc cacgggctcc ccggccaccg aggtttctac caagtggact   1440
caccttaccg aatttgaact gaagggcttg aaagccctgg ttgaaaagct agagtccctt   1500
ccggagaata agaagtgtgt ccctgaggga atcgaggacc cccaggccct cctggaaggt   1560
gtaaagaatg tactgaaaga gcacgtggat gacgacccca ccctggccat caccggggtc   1620
cctgtggtca gctggccaaa gaaaactgca aagaaccggg tggtgggtcg gcctaagggc   1680
aagttgggcc cggcctcagc ggtgaagttg gctgccaacc gaacaacagc aggagctcgc   1740
aggcgccgga cgcgatgccg caagtgcgag gcctgcctgc ggacggagtg tggagagtgc   1800
cacttttgca aggacatgaa gaagtttgga ggtcctgggc gcatgaagca gagctgcatc   1860
atgcggcagt gcatcgcgcc agtgctgccc cacaccgccg tgtgccttgt gtgtggcgag   1920
gcagggaagg aggacacagt ggaagaggaa gaaggcaagt ttaacctcat gctcatggaa   1980
tgctccatct gcaacgagat catccaccct ggatgcctta agattaagga atcggagggt   2040
gtggtcaacg atgagcttcc caactgctgg gagtgtccga agtgtaacca tgccggcaag   2100
accgggaaac aaaagcgtgg ccctggcttt aagtatgcct ccaacctgcc tggctccttg   2160
ctcaaggagc agaagatgaa ccgggacaac aaggaagggc aagagcctgc caagcggaga   2220
agtgagtgtg aagaggctcc ccgtcggagg tcagacgagc accccaaaaa ggtgcctgca   2280
gatggcatcc tccgccgaaa gtctgatgat gtgcacctga ggaggaagcg gaaatacgag   2340
aagccccaag agctgagtgg acgcaagcga gcctcgtcgc ttcaaacgtc ccccggttcc   2400
tcctctcacc tctcgccgag gccccctcta ggcagcagtc tcagcccttg gtggagatcc   2460
agtctcactt acttccagca gcagctaaaa cctggcaaag aagataagct tttcaggaaa   2520
aagcggcggt cctggaagaa cgctgaggat cgtctgtcac tggccaacaa gccccttcgg   2580
cgctttaagc aggaaccgga ggacgatctg cctgaggcac ctcctaagac ccgggagagt   2640
gatcagtcac gttccagctc acccactgct ggtcccagca ctgagggagc tgaaggccca   2700
gaagagaaga aaaaggtgaa gatgcgccgg aagcggcgac ttgttaacaa ggagctgagc   2760
aaagagctaa gcaaggagct caaccatgag atccaaaaga cggagagcac cctggctcac   2820
gagagccagc agcccatcaa gtcagagcct gagagcgaga acgacgagcc caagaggccc   2880
ttaagccact gcgagcgccc ccaccgcttc agcaaagggc tcaacggcac acctcgggag   2940
ctgcggcact cgctgggacc tggcctgcgt agtccacctc gtgttatgtc ccggcccccg   3000
ccctctgcat ccccacccaa gtgcatccag atggagcgtc acgtgatccg gccaccgccc   3060
atcagccccc cacctgactc gctgcccctg gatgatggag cagcccacgt catgcatagg   3120
gaggtgtgga tggcagtctt cagctacctc agccaccgag acctgtgtgt ctgcatgcgg   3180
gtctgcagga cctggaaccg ctggtgctgc gataagcggt tgtggacccg catcgacctg   3240
aaccgctgca agtccatcac acccctgatg ctgagcggta tcatccggcg acagcctgtc   3300
tcccttgacc tcagttggac caacatctcc aagaagcagc tgagttggct catcaaccgg   3360
ttgcctgggc tccgagactt ggtgctgtca ggctgctcat ggatcgctgt ctcagccctc   3420
tgtagctcca gttgtccatt gctccggacc ctggatgtcc agtgggtaga aggactaaag   3480
gatgcccaga tgagggatct cctgtctcca cccacagaca acaggccagg tcagatggac   3540
aatcggagca agctccggaa cattgtagag ctgcgcctag ctggcctgga catcacagat   3600
gtctccctgc ggctcattat tcgccatatg cccctgctct cgaagctcca actcagttac   3660
tgtaaccaca tcaatgacca gtccatcaac ctgctcactg ccgtcggcac caccacccga   3720
gactcgctga cagaggtcaa cctatcagac tgtaataagg taactgacct gtgcctgtcc   3780
ttcttcaaac gctgtggaaa tatctgtcat attgacctga ggtactgcaa gcaagtcacc   3840
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gaagagaaac tcctgcaaaa actaagttag                                    3930
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atggaggcag agaaagactc t                                               21
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<211>  23
<212>  DNA
<213>  人工配列
<400>  4
acttagtttt tgcaggagtt tct                                             23
<210>  5
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工配列
<400>  5
atggaacctg aagaagaaag gattc                                           25
<210>  6
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工配列
<400>  6
ttagctaatc ttctgtatca gtttc                                            25
<210>  7
<211>  1162
<212>  PRT
<213>  ヒト
<400>  7
Met Glu Pro Glu Glu Glu Arg Ile Arg Tyr Ser Gln Arg Leu Arg Gly 
1               5                   10                  15      
Thr Met Arg Arg Arg Tyr Glu Asp Asp Gly Ile Ser Asp Asp Glu Ile 
20                  25                  30          
Glu Gly Lys Arg Thr Phe Asp Leu Glu Glu Lys Leu His Thr Asn Lys 
35                  40                  45              
Tyr Asn Ala Asn Phe Val Thr Phe Met Glu Gly Lys Asp Phe Asn Val 
50                  55                  60                  
Glu Tyr Ile Gln Arg Gly Gly Leu Arg Asp Pro Leu Ile Phe Lys Asn 
65                  70                  75                  80  
Ser Asp Gly Leu Gly Ile Lys Met Pro Asp Pro Asp Phe Thr Val Asn 
85                  90                  95      
Asp Val Lys Met Cys Val Gly Ser Arg Arg Met Val Asp Val Met Asp 
100                 105                 110         
Val Asn Thr Gln Lys Gly Ile Glu Met Thr Met Ala Gln Trp Thr Arg 
115                 120                 125             
Tyr Tyr Glu Thr Pro Glu Glu Glu Arg Glu Lys Leu Tyr Asn Val Ile 
130                 135                 140                 
Ser Leu Glu Phe Ser His Thr Arg Leu Glu Asn Met Val Gln Arg Pro 
145                 150                 155                 160 
Ser Thr Val Asp Phe Ile Asp Trp Val Asp Asn Met Trp Pro Arg His 
165                 170                 175     
Leu Lys Glu Ser Gln Thr Glu Ser Thr Asn Ala Ile Leu Glu Met Gln 
180                 185                 190         
Tyr Pro Lys Val Gln Lys Tyr Cys Leu Met Ser Val Arg Gly Cys Tyr 
195                 200                 205             
Thr Asp Phe His Val Asp Phe Gly Gly Thr Ser Val Trp Tyr His Ile 
210                 215                 220                 
His Gln Gly Gly Lys Val Phe Trp Leu Ile Pro Pro Thr Ala His Asn 
225                 230                 235                 240 
Leu Glu Leu Tyr Glu Asn Trp Leu Leu Ser Gly Lys Gln Gly Asp Ile 
245                 250                 255     
Phe Leu Gly Asp Arg Val Ser Asp Cys Gln Arg Ile Glu Leu Lys Gln 
260                 265                 270         
Gly Tyr Thr Phe Val Ile Pro Ser Gly Trp Ile His Ala Val Tyr Thr 
275                 280                 285             
Pro Thr Asp Thr Leu Val Phe Gly Gly Asn Phe Leu His Ser Phe Asn 
290                 295                 300                 
Ile Pro Met Gln Leu Lys Ile Tyr Asn Ile Glu Asp Arg Thr Arg Val 
305                 310                 315                 320 
Pro Asn Lys Phe Arg Tyr Pro Phe Tyr Tyr Glu Met Cys Trp Tyr Val 
325                 330                 335     
Leu Glu Arg Tyr Val Tyr Cys Ile Thr Asn Arg Ser His Leu Thr Lys 
340                 345                 350         
Glu Phe Gln Lys Glu Ser Leu Ser Met Asp Leu Glu Leu Asn Gly Leu 
355                 360                 365             
Glu Ser Gly Asn Gly Asp Glu Glu Ala Val Asp Arg Glu Pro Arg Arg 
370                 375                 380                 
Leu Ser Ser Arg Arg Ser Val Leu Thr Ser Pro Val Ala Asn Gly Val 
385                 390                 395                 400 
Asn Leu Asp Tyr Asp Gly Leu Gly Lys Thr Cys Arg Ser Leu Pro Ser 
405                 410                 415     
Leu Lys Lys Thr Leu Ala Gly Asp Ser Ser Ser Asp Cys Ser Arg Gly 
420                 425                 430         
Ser His Asn Gly Gln Val Trp Asp Pro Gln Cys Ala Pro Arg Lys Asp 
435                 440                 445             
Arg Gln Val His Leu Thr His Phe Glu Leu Glu Gly Leu Arg Cys Leu 
450                 455                 460                 
Val Asp Lys Leu Glu Ser Leu Pro Leu His Lys Lys Cys Val Pro Thr 
465                 470                 475                 480 
Gly Ile Glu Asp Glu Asp Ala Leu Ile Ala Asp Val Lys Ile Leu Leu 
485                 490                 495     
Glu Glu Leu Ala Asn Ser Asp Pro Lys Leu Ala Leu Thr Gly Val Pro 
500                 505                 510         
Ile Val Gln Trp Pro Lys Arg Asp Lys Leu Lys Phe Pro Thr Arg Pro 
515                 520                 525             
Lys Val Arg Val Pro Thr Ile Pro Ile Thr Lys Pro His Thr Met Lys 
530                 535                 540                 
Pro Ala Pro Arg Leu Thr Pro Val Arg Pro Ala Ala Ala Ser Pro Ile 
545                 550                 555                 560 
Val Ser Gly Ala Arg Arg Arg Arg Val Arg Cys Arg Lys Cys Lys Ala 
565                 570                 575     
Cys Val Gln Gly Glu Cys Gly Val Cys His Tyr Cys Arg Asp Met Lys 
580                 585                 590         
Lys Phe Gly Gly Pro Gly Arg Met Lys Gln Ser Cys Val Leu Arg Gln 
595                 600                 605             
Cys Leu Ala Pro Arg Leu Pro His Ser Val Thr Cys Ser Leu Cys Gly 
610                 615                 620                 
Glu Val Asp Gln Asn Glu Glu Thr Gln Asp Phe Glu Lys Lys Leu Met 
625                 630                 635                 640 
Glu Cys Cys Ile Cys Asn Glu Ile Val His Pro Gly Cys Leu Gln Met 
645                 650                 655     
Asp Gly Glu Gly Leu Leu Asn Glu Glu Leu Pro Asn Cys Trp Glu Cys 
660                 665                 670         
Pro Lys Cys Tyr Gln Glu Asp Ser Ser Glu Lys Ala Gln Lys Arg Lys 
675                 680                 685             
Met Glu Glu Ser Asp Glu Glu Ala Val Gln Ala Lys Val Leu Arg Pro 
690                 695                 700                 
Leu Arg Ser Cys Asp Glu Pro Leu Thr Pro Pro Pro His Ser Pro Thr 
705                 710                 715                 720 
Ser Met Leu Gln Leu Ile His Asp Pro Val Ser Pro Arg Gly Met Val 
725                 730                 735     
Thr Arg Ser Ser Pro Gly Ala Gly Pro Ser Asp His His Ser Ala Ser 
740                 745                 750         
Arg Asp Glu Arg Phe Lys Arg Arg Gln Leu Leu Arg Leu Gln Ala Thr 
755                 760                 765             
Glu Arg Thr Met Val Arg Glu Lys Glu Asn Asn Pro Ser Gly Lys Lys 
770                 775                 780                 
Glu Leu Ser Glu Val Glu Lys Ala Lys Ile Arg Gly Ser Tyr Leu Thr 
785                 790                 795                 800 
Val Thr Leu Gln Arg Pro Thr Lys Glu Leu His Gly Thr Ser Ile Val 
805                 810                 815     
Pro Lys Leu Gln Ala Ile Thr Ala Ser Ser Ala Asn Leu Arg His Ser 
820                 825                 830         
Pro Arg Val Leu Val Gln His Cys Pro Ala Arg Thr Pro Gln Arg Gly 
835                 840                 845             
Asp Glu Glu Gly Leu Gly Gly Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 
850                 855                 860                 
Glu Glu Asp Asp Ser Ala Glu Glu Gly Gly Ala Ala Arg Leu Asn Gly 
865                 870                 875                 880 
Arg Gly Ser Trp Ala Gln Asp Gly Asp Glu Ser Trp Met Gln Arg Glu 
885                 890                 895     
Val Trp Met Ser Val Phe Arg Tyr Leu Ser Arg Arg Glu Leu Cys Glu 
900                 905                 910         
Cys Met Arg Val Cys Lys Thr Trp Tyr Lys Trp Cys Cys Asp Lys Arg 
915                 920                 925             
Leu Trp Thr Lys Ile Asp Leu Ser Arg Cys Lys Ala Ile Val Pro Gln 
930                 935                 940                 
Ala Leu Ser Gly Ile Ile Lys Arg Gln Pro Val Ser Leu Asp Leu Ser 
945                 950                 955                 960 
Trp Thr Asn Ile Ser Lys Lys Gln Leu Thr Trp Leu Val Asn Arg Leu 
965                 970                 975     
Pro Gly Leu Lys Asp Leu Leu Leu Ala Gly Cys Ser Trp Ser Ala Val 
980                 985                 990         
Ser Ala Leu Ser Thr Ser Ser Cys  Pro Leu Leu Arg Thr  Leu Asp Leu 
995                 1000                 1005             
Arg Trp  Ala Val Gly Ile Lys  Asp Pro Gln Ile Arg  Asp Leu Leu 
1010                 1015                 1020             
Thr Pro  Pro Ala Asp Lys Pro  Gly Gln Asp Asn Arg  Ser Lys Leu 
1025                 1030                 1035             
Arg Asn  Met Thr Asp Phe Arg  Leu Ala Gly Leu Asp  Ile Thr Asp 
1040                 1045                 1050             
Ala Thr  Leu Arg Leu Ile Ile  Arg His Met Pro Leu  Leu Ser Arg 
1055                 1060                 1065             
Leu Asp  Leu Ser His Cys Ser  His Leu Thr Asp Gln  Ser Ser Asn 
1070                 1075                 1080             
Leu Leu  Thr Ala Val Gly Ser  Ser Thr Arg Tyr Ser  Leu Thr Glu 
1085                 1090                 1095             
Leu Asn  Met Ala Gly Cys Asn  Lys Leu Thr Asp Gln  Thr Leu Ile 
1100                 1105                 1110             
Tyr Leu  Arg Arg Ile Ala Asn  Val Thr Leu Ile Asp  Leu Arg Gly 
1115                 1120                 1125             
Cys Lys  Gln Ile Thr Arg Lys  Ala Cys Glu His Phe  Ile Ser Asp 
1130                 1135                 1140             
Leu Ser  Ile Asn Ser Leu Tyr  Cys Leu Ser Asp Glu  Lys Leu Ile 
1145                 1150                 1155             
Gln Lys  Ile Ser 
1160  
<210>  8
<211>  1309
<212>  PRT
<213>  マウス
<400>  8
Met Glu Ala Glu Lys Asp Ser Gly Arg Arg Leu Arg Ala Ile Asp Arg 
1               5                   10                  15      
Gln Arg Tyr Asp Glu Asn Glu Asp Leu Ser Asp Val Glu Glu Ile Val 
20                  25                  30          
Ser Val Arg Gly Phe Ser Leu Glu Glu Lys Leu Arg Ser Gln Leu Tyr 
35                  40                  45              
Gln Gly Asp Phe Val His Ala Met Glu Gly Lys Asp Phe Asn Tyr Glu 
50                  55                  60                  
Tyr Val Gln Arg Glu Ala Leu Arg Val Pro Leu Val Phe Arg Asp Lys 
65                  70                  75                  80  
Asp Gly Leu Gly Ile Lys Met Pro Asp Pro Asp Phe Thr Val Arg Asp 
85                  90                  95      
Val Lys Leu Leu Val Gly Ser Arg Arg Leu Val Asp Val Met Asp Val 
100                 105                 110         
Asn Thr Gln Lys Gly Thr Glu Met Ser Met Ser Gln Phe Val Arg Tyr 
115                 120                 125             
Tyr Glu Thr Pro Glu Ala Gln Arg Asp Lys Leu Tyr Asn Val Ile Ser 
130                 135                 140                 
Leu Glu Phe Ser His Thr Lys Leu Glu His Leu Val Lys Arg Pro Thr 
145                 150                 155                 160 
Val Val Asp Leu Val Asp Trp Val Asp Asn Met Trp Pro Gln His Leu 
165                 170                 175     
Lys Glu Lys Gln Thr Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ala Glu Met Lys Tyr 
180                 185                 190         
Pro Lys Val Lys Lys Tyr Cys Leu Met Ser Val Lys Gly Cys Phe Thr 
195                 200                 205             
Asp Phe His Ile Asp Phe Gly Gly Thr Ser Val Trp Tyr His Val Phe 
210                 215                 220                 
Arg Gly Gly Lys Ile Phe Trp Leu Ile Pro Pro Thr Leu His Asn Leu 
225                 230                 235                 240 
Ala Leu Tyr Glu Glu Trp Val Leu Ser Gly Lys Gln Ser Asp Ile Phe 
245                 250                 255     
Leu Gly Asp Arg Val Glu Arg Cys Gln Arg Ile Glu Leu Lys Gln Gly 
260                 265                 270         
Tyr Thr Phe Phe Ile Pro Ser Gly Trp Ile His Ala Val Tyr Thr Pro 
275                 280                 285             
Val Asp Ser Leu Val Phe Gly Gly Asn Ile Leu His Ser Phe Asn Val 
290                 295                 300                 
Pro Met Gln Leu Arg Ile Tyr Glu Ile Glu Asp Arg Thr Arg Val Gln 
305                 310                 315                 320 
Pro Lys Phe Arg Tyr Pro Phe Tyr Tyr Glu Met Cys Trp Tyr Val Leu 
325                 330                 335     
Glu Arg Tyr Val Tyr Cys Val Thr Gln Arg Ser Tyr Leu Thr Gln Glu 
340                 345                 350         
Tyr Gln Arg Glu Leu Met Leu Ile Asp Ala Pro Arg Lys Thr Ser Val 
355                 360                 365             
Asp Gly Phe Ser Ser Asp Ser Trp Leu Asp Met Glu Glu Glu Ser Cys 
370                 375                 380                 
Glu Gln Gln Pro Gln Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Lys Glu Glu 
385                 390                 395                 400 
Glu Gly Asp Gly Ala Asp Lys Thr Pro Lys Pro Pro Thr Asp Asp Pro 
405                 410                 415     
Thr Ser Pro Thr Ser Thr Pro Pro Glu Asp Gln Asp Ser Thr Gly Lys 
420                 425                 430         
Lys Pro Lys Ala Pro Ala Ile Arg Phe Leu Lys Arg Thr Leu Ser Asn 
435                 440                 445             
Glu Ser Glu Glu Ser Val Lys Ser Thr Ser Met Pro Thr Asp Asp Pro 
450                 455                 460                 
Lys Thr Pro Thr Gly Ser Pro Ala Thr Glu Val Ser Thr Lys Trp Thr 
465                 470                 475                 480 
His Leu Thr Glu Phe Glu Leu Lys Gly Leu Lys Ala Leu Val Glu Lys 
485                 490                 495     
Leu Glu Ser Leu Pro Glu Asn Lys Lys Cys Val Pro Glu Gly Ile Glu 
500                 505                 510         
Asp Pro Gln Ala Leu Leu Glu Gly Val Lys Asn Val Leu Lys Glu His 
515                 520                 525             
Val Asp Asp Asp Pro Thr Leu Ala Ile Thr Gly Val Pro Val Val Ser 
530                 535                 540                 
Trp Pro Lys Lys Thr Ala Lys Asn Arg Val Val Gly Arg Pro Lys Gly 
545                 550                 555                 560 
Lys Leu Gly Pro Ala Ser Ala Val Lys Leu Ala Ala Asn Arg Thr Thr 
565                 570                 575     
Ala Gly Ala Arg Arg Arg Arg Thr Arg Cys Arg Lys Cys Glu Ala Cys 
580                 585                 590         
Leu Arg Thr Glu Cys Gly Glu Cys His Phe Cys Lys Asp Met Lys Lys 
595                 600                 605             
Phe Gly Gly Pro Gly Arg Met Lys Gln Ser Cys Ile Met Arg Gln Cys 
610                 615                 620                 
Ile Ala Pro Val Leu Pro His Thr Ala Val Cys Leu Val Cys Gly Glu 
625                 630                 635                 640 
Ala Gly Lys Glu Asp Thr Val Glu Glu Glu Glu Gly Lys Phe Asn Leu 
645                 650                 655     
Met Leu Met Glu Cys Ser Ile Cys Asn Glu Ile Ile His Pro Gly Cys 
660                 665                 670         
Leu Lys Ile Lys Glu Ser Glu Gly Val Val Asn Asp Glu Leu Pro Asn 
675                 680                 685             
Cys Trp Glu Cys Pro Lys Cys Asn His Ala Gly Lys Thr Gly Lys Gln 
690                 695                 700                 
Lys Arg Gly Pro Gly Phe Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Pro Gly Ser Leu 
705                 710                 715                 720 
Leu Lys Glu Gln Lys Met Asn Arg Asp Asn Lys Glu Gly Gln Glu Pro 
725                 730                 735     
Ala Lys Arg Arg Ser Glu Cys Glu Glu Ala Pro Arg Arg Arg Ser Asp 
740                 745                 750         
Glu His Pro Lys Lys Val Pro Ala Asp Gly Ile Leu Arg Arg Lys Ser 
755                 760                 765             
Asp Asp Val His Leu Arg Arg Lys Arg Lys Tyr Glu Lys Pro Gln Glu 
770                 775                 780                 
Leu Ser Gly Arg Lys Arg Ala Ser Ser Leu Gln Thr Ser Pro Gly Ser 
785                 790                 795                 800 
Ser Ser His Leu Ser Pro Arg Pro Pro Leu Gly Ser Ser Leu Ser Pro 
805                 810                 815     
Trp Trp Arg Ser Ser Leu Thr Tyr Phe Gln Gln Gln Leu Lys Pro Gly 
820                 825                 830         
Lys Glu Asp Lys Leu Phe Arg Lys Lys Arg Arg Ser Trp Lys Asn Ala 
835                 840                 845             
Glu Asp Arg Leu Ser Leu Ala Asn Lys Pro Leu Arg Arg Phe Lys Gln 
850                 855                 860                 
Glu Pro Glu Asp Asp Leu Pro Glu Ala Pro Pro Lys Thr Arg Glu Ser 
865                 870                 875                 880 
Asp Gln Ser Arg Ser Ser Ser Pro Thr Ala Gly Pro Ser Thr Glu Gly 
885                 890                 895     
Ala Glu Gly Pro Glu Glu Lys Lys Lys Val Lys Met Arg Arg Lys Arg 
900                 905                 910         
Arg Leu Val Asn Lys Glu Leu Ser Lys Glu Leu Ser Lys Glu Leu Asn 
915                 920                 925             
His Glu Ile Gln Lys Thr Glu Ser Thr Leu Ala His Glu Ser Gln Gln 
930                 935                 940                 
Pro Ile Lys Ser Glu Pro Glu Ser Glu Asn Asp Glu Pro Lys Arg Pro 
945                 950                 955                 960 
Leu Ser His Cys Glu Arg Pro His Arg Phe Ser Lys Gly Leu Asn Gly 
965                 970                 975     
Thr Pro Arg Glu Leu Arg His Ser Leu Gly Pro Gly Leu Arg Ser Pro 
980                 985                 990         
Pro Arg Val Met Ser Arg Pro Pro  Pro Ser Ala Ser Pro  Pro Lys Cys 
995                 1000                 1005             
Ile Gln  Met Glu Arg His Val  Ile Arg Pro Pro Pro  Ile Ser Pro 
1010                 1015                 1020             
Pro Pro  Asp Ser Leu Pro Leu  Asp Asp Gly Ala Ala  His Val Met 
1025                 1030                 1035             
His Arg  Glu Val Trp Met Ala  Val Phe Ser Tyr Leu  Ser His Arg 
1040                 1045                 1050             
Asp Leu  Cys Val Cys Met Arg  Val Cys Arg Thr Trp  Asn Arg Trp 
1055                 1060                 1065             
Cys Cys  Asp Lys Arg Leu Trp  Thr Arg Ile Asp Leu  Asn Arg Cys 
1070                 1075                 1080             
Lys Ser  Ile Thr Pro Leu Met  Leu Ser Gly Ile Ile  Arg Arg Gln 
1085                 1090                 1095             
Pro Val  Ser Leu Asp Leu Ser  Trp Thr Asn Ile Ser  Lys Lys Gln 
1100                 1105                 1110             
Leu Ser  Trp Leu Ile Asn Arg  Leu Pro Gly Leu Arg  Asp Leu Val 
1115                 1120                 1125             
Leu Ser  Gly Cys Ser Trp Ile  Ala Val Ser Ala Leu  Cys Ser Ser 
1130                 1135                 1140             
Ser Cys  Pro Leu Leu Arg Thr  Leu Asp Val Gln Trp  Val Glu Gly 
1145                 1150                 1155             
Leu Lys  Asp Ala Gln Met Arg  Asp Leu Leu Ser Pro  Pro Thr Asp 
1160                 1165                 1170             
Asn Arg  Pro Gly Gln Met Asp  Asn Arg Ser Lys Leu  Arg Asn Ile 
1175                 1180                 1185             
Val Glu  Leu Arg Leu Ala Gly  Leu Asp Ile Thr Asp  Val Ser Leu 
1190                 1195                 1200             
Arg Leu  Ile Ile Arg His Met  Pro Leu Leu Ser Lys  Leu Gln Leu 
1205                 1210                 1215             
Ser Tyr  Cys Asn His Ile Asn  Asp Gln Ser Ile Asn  Leu Leu Thr 
1220                 1225                 1230             
Ala Val  Gly Thr Thr Thr Arg  Asp Ser Leu Thr Glu  Val Asn Leu 
1235                 1240                 1245             
Ser Asp  Cys Asn Lys Val Thr  Asp Leu Cys Leu Ser  Phe Phe Lys 
1250                 1255                 1260             
Arg Cys  Gly Asn Ile Cys His  Ile Asp Leu Arg Tyr  Cys Lys Gln 
1265                 1270                 1275             
Val Thr  Lys Glu Gly Cys Glu  Gln Phe Ile Ala Glu  Met Ser Val 
1280                 1285                 1290             
Ser Val  Gln Phe Gly Gln Val  Glu Glu Lys Leu Leu  Gln Lys Leu 
1295                 1300                 1305             
Ser
【図４】
0005736052.tif 000002
【図５】
0005736052.tif 000003
【図８】
0005736052.tif 000004
【図９】
0005736052.tif 000005
【図１０】
0005736052.tif 000006
【図１１】
0005736052.tif 000007
【図１３】
0005736052.tif 000008
【図１】
0005736052.tif 000009
【図２】
0005736052.tif 000010
【図３】
0005736052.tif 000011
【図６】
0005736052.tif 000012
【図７】
0005736052.tif 000013
【図１２】
0005736052.tif 000014
【配列表】
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