(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アジュバンドに結合した治療的有効量の炭疽菌保護抗原（ＰＡ）を含んでなり、かつ３．５ｍＭ〜４．５ｍＭの範囲の濃度でホスフェート塩を含む、炭疽菌ワクチン。
【請求項２】
前記炭疽菌保護抗原（ＰＡ）が組換え炭疽菌保護抗原（ｒＰＡ）である、請求項１に記載の炭疽菌ワクチン。
【請求項３】
前記アジュバントが水酸化アルミニウムゲルである、請求項１に記載の炭疽菌ワクチン。
【請求項４】
前記ホスフェート塩の濃度が３．８ｍＭ〜４．２ｍＭの範囲である、請求項１に記載の炭疽菌ワクチン。
【請求項５】
前記ホスフェート塩の濃度が３．９ｍＭ〜４．１ｍＭの範囲である、請求項１に記載の炭疽菌ワクチン。
【請求項６】
前記ホスフェート塩の濃度が４．０ｍＭである、請求項１に記載の炭疽菌ワクチン。
【請求項７】
前記ワクチンのｐＨが７．０〜７．２である、請求項１に記載の炭疽菌ワクチン。
【請求項８】
前記水酸化アルミニウムゲルが０．１５〜０．３５％で存在する、請求項３に記載の炭疽菌ワクチン。
【請求項９】
前記水酸化アルミニウムゲルが０．２０〜０．３０％で存在する、請求項３に記載の炭疽菌ワクチン。
【請求項１０】
前記ｒＰＡが１０〜３００μｇ／ｍｌの範囲である、請求項２に記載の炭疽菌ワクチン。
【請求項１１】
前記ｒＰＡが１５０〜２５０μｇ／ｍｌの範囲である、請求項２に記載の炭疽菌ワクチン。
【請求項１２】
前記ｒＰＡが５０〜３００μｇ／ｍｌの範囲である、請求項２に記載の炭疽菌ワクチン。
【請求項１３】
前記ｒＰＡが１００〜３００μｇ／ｍｌの範囲である、請求項２に記載の炭疽菌ワクチン。
【請求項１４】
前記ｒＰＡが１００μｇ／ｍｌで存在し、前記ホスフェート塩が４．０ｍＭで存在し、前記水酸化アルミニウムゲルが０．２６重量％で存在し、かつ前記ワクチンのｐＨが７．１である、請求項２に記載の炭疽菌ワクチン。
【請求項１５】
アジュバンドに結合した治療的有効量の炭疽菌保護抗原（ＰＡ）を含んでなり、２．５ｍＭ〜４．５ｍＭの範囲の濃度でホスフェート塩を含み、かつ前記アジュバンドが水酸化アルミニウムゲルである、炭疽菌ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００８年１０月２日出願の米国仮特許出願第６１／１９４９６７号の優先権を主張し、当該出願の内容は、その全体を参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
政府の権利
本発明は、ＮＩＡＩＤ／ＮＩＨ（契約番号ＮＯＩ−ＡＩ−３００５３）での契約下で行われ、米国政府は、本発明の権利を有してよい。
【０００３】
本発明は、炭疽菌保護抗原を含有する製剤などのワクチン製剤、及びこうしたワクチンの分野に関するものであり、ワクチンの効率が維持されかつ高められる。
【背景技術】
【０００４】
ワクチンは、通常、アジュバントを用いて処方される。一般的なアジュバント様式は、アルミニウムを主成分とするコロイドであり、通常、ミョウバンと称される。より詳しくは、通常、これらは水酸化アルミニウム（別名アルハイドロゲル）及びリン酸アルミニウム（別名アジュホス）である。例えば、炭疽菌（バチルス・アントラシス）のような生命体に対する有用なワクチンは、通常、こうしたワクチンに使用される炭疽菌抗原を結合するアルハイドロゲルを用いて処方される（いわゆるサブユニット・ワクチン）。このようにして製造される製剤の１つの目的は、ミョウバンに対する組換え保護抗原（ｒＰＡ）の結合を最大限にすることである。リン酸イオンは、アルハイドロゲルのコロイドからの抗原を脱着することが知られているため、こうした製剤のホスフェート濃度は、意図的に低く維持されている（０．２５ｍＭ）。この濃度のホスフェート緩衝剤は、ｒＰＡがアルハイドロゲルのコロイドに結合することを妨げない。例えば、この製剤において、本発明者らは、組換え保護抗原（ｒＰＡ）の結合が９８％超であることを見出している。
【０００５】
この製剤処方のバッチは、第１相臨床試験と第２相臨床試験に使用され、ヒトにおける安全性と免疫原性が実証されている。
【０００６】
この元の製剤においては、少ないホスフェート緩衝剤の不十分な緩衝性能により、ｐＨは５．９である。ｒＰＡ製剤の安定性を高め、より生理学的なｐＨを得るためには、製剤のより高度なコントロールが必要と判断された。製剤処方の緩衝性能を改良するには、製剤処方のｐＨを７に高めることが必要と考えられる。ｐＨ７．０にコントロールするには、あり得る生理学的緩衝剤はホスフェートであり、これは７．２のｐＫａを有するが、製剤にホスフェートを使用すると、ｒＰＡとミョウバンの結合に阻害効果を及ぼすという欠点がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ｐＫａに基づくと、あり得る代替にはヒスチジン（ｐＫａ６．０４）が考えられるが、しかしながら、液体で貯蔵すると、酸化されて茶色になるという性質がある。さらに、ヒスチジンのような代替の緩衝剤の導入は、製剤における大きな変更を招くと考えられる。したがって、新たなアプローチが必要とされる。
【０００８】
その後、本発明者は、ホスフェート濃度を、ｐＨをコントロールすると同時にｒＰＡとアルハイドロゲルの結合には最小限の効果に過ぎないレベルまで高めることが可能であることを見出した。結果として、ホスフェート濃度は約４ｍＭまで高められ、この濃度では、製剤を約７．０のｐＨに維持することができ、未結合ｒＰＡの量は、有意に影響されず、アッセイ検出レベル未満（２％未満）に維持される。
【０００９】
また、このことは、こうしたホスフェート濃度が、ワクチン製剤の生物活性を大幅に高めるといった驚くべき結果をもたらす。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
１つの局面において、本発明は炭疽菌ワクチン組成物に関し、前記組成物は、薬学的に許容される担体中に治療的有効量の炭疽菌抗原を含み、かつ２ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは２．５ｍＭ〜７．５ｍＭ、より好ましくは３ｍＭ〜５ｍＭの範囲の濃度、又は３．５ｍＭ〜４．５ｍＭ、さらにより好ましくは３．８ｍＭ〜４．２ｍＭの範囲、又は３．９ｍＭ〜４．１ｍＭの範囲、最も好ましくは約４．０ｍＭの濃度のホスフェートを含む。
【００１１】
特定の態様において、前記ワクチンは、炭疽菌抗原、好ましくは保護抗原のような炭疽菌サブユニット、最も好ましくは組換え保護抗原（ｒＰＡ）を含む。別な態様において、前記ワクチンは、アジュバント、好ましくはミョウバン（アルハイドロゲル）をさらに含む。１つの態様において、前記ワクチン組成物は、凍結乾燥された粉末の形態である。もう１つの態様において、前記ワクチン組成物は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をさらに含んでもよい。
【００１２】
本発明のワクチン組成物又は製剤の別の例において、前記ワクチン組成物のｐＨは７．０〜７．２の範囲、好ましくは約７．１である。
【００１３】
別の例において、本発明の炭疽菌ワクチン組成物は、約０．１５〜０．３５％、好ましくは約０．２０〜０．３０％、より好ましくは約０．２４〜０．２８％のアルハイドロゲル（ミョウバン）を含み、最も好ましくは、アルハイドロゲル（ミョウバン）は約０．２６％で存在する。
【００１４】
好ましい態様において、本発明のワクチンは、サブユニットワクチンである。さらなる態様において、サブユニットワクチンは炭疽菌ワクチンであり、ｒＰＡは約２００μｇ／ｍｌ存在し、ここで、ホスフェートは約４ｍＭ存在し、アルハイドロゲルは約０．２６重量％存在し、前記ワクチンのｐＨは約７．１である。
【００１５】
本発明は、さらに、哺乳類における細菌感染症に対する保護方法に関するものであり、こうした感染症の恐れのある哺乳類に、本発明のワクチン組成物の治療的有効量を投与することを含む。さらなる態様において、細菌感染症は炭疽菌（バチルス・アントラシス）感染症であり、及び／又は哺乳類はヒトである。
【００１６】
本発明は、さらに、哺乳類における細菌感染症の治療方法に関するものであり、こうした感染症を患う哺乳類に、本発明のワクチン組成物の治療的有効量を投与することを含む。さらなる態様において、細菌感染症は炭疽菌（バチルス・アントラシス）感染症であり、及び／又は哺乳類はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】組換え保護抗原（ｒＰＡ）製剤の製造フローチャートを示す。
【図２】高ホスフェート製剤と低ホスフェート製剤のＥＤ５０比較の結果を示す。
【図３】アルハイドロゲル希釈剤と製剤のゼータ電位に及ぼすホスフェートの効果を示す。
【図４】非結合ｒＰＡに及ぼすホスフェートの効果を示す。
【図５】ラングミュア解析によって測定した、アルハイドロゲルに結合したｒＰＡの吸着能と吸着係数に及ぼすホスフェートの効果を示す。
【図６】処方された製剤におけるｒＰＡの二次構造に及ぼすホスフェートの効果を示す。
【図７】処方された製剤におけるｒＰＡの三次構造に及ぼすホスフェートの効果を示す。
【図８】ＤＳＣによって測定されたｒＰＡ溶融に及ぼすホスフェートの効果を示す。
【図９】熱変性／内部蛍光によって測定されたｒＰＡ溶融に及ぼすホスフェートの効果を示す。
【図１０】種々のホスフェート濃度で処方された製剤のエピトロープ認識を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、薬学的に許容される担体中に治療的有効量の炭疽菌保護抗原（ｒＰＡ）のような炭疽菌抗原、及び２〜１０ｍＭ、好ましくは３〜５ｍＭ、より好ましくは約４ｍＭの濃度のホスフェート塩を含み、アジュバントとしてアルハイドロゲルを使用する、炭疽菌サブユニットワクチン製剤を提供する。また、本発明は、治療的有効量の本発明のワクチンを投与することによって、細菌感染症、とりわけヒトにおける炭疽菌感染を治療又は予防する方法を提供する。
【００１９】
本願明細書における用語「有効量」又は「治療的有効量」は、細菌感染症、とりわけ炭疽菌感染症の１つ又は複数の症状を治療、抑制、又は軽減するのに十分な用量を意味する。正確な用量は、患者の年齢、免疫系の状況、全体的健康、環境状態、感染（又は予想される感染）の性質と範囲、及び以降の治療／ワクチン接種の利用可能性などの因子によって変わり得る。
【００２０】
一般に、ワクチンは、水溶液又は懸濁液の形態で注射可能に調製される。吸入用などのオイルベースのワクチンもまたよく知られている。使用前に溶解又は懸濁させる固体状物もまた処方することができる。一般に、活性成分に適合してかつ製薬学的用途に適用可能な薬学的に許容される担体、希釈剤、及び賦形剤もまた添加される。
【００２１】
また、本発明に有用な医薬組成物は、適切な希釈剤又は賦形剤を含む薬学的に許容される担体を含み、ただし、この担体は、前記組成物を受け入れる個体に有害な抗体の産生をそれ自身が惹起しない医薬品を含んでもよく、過度の毒性なしに投与され得るものである。薬学的に許容される担体には、限定されるものではないが、水、生理食塩水、グリセロール、及びエタノールなどが挙げられ、経鼻その他の気道送達又は眼部への送達のためのスプレーを形成するのに有用な担体が含まれる。薬学的に許容される担体、希釈剤、及びその他の賦形剤の全体的詳解を「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ  （Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．，  Ｎ．Ｊ．  現行版）」に見ることができる。
【００２２】
ワクチン組成物は、さらに、ｐＨを安定化させる付加的な物質、又はアジュバント、湿潤剤、もしくは乳化剤として機能する付加的な物質を含むことができ、これらは、前記ワクチンの有効性の改良に役立てることができる。
【００２３】
ワクチンは、一般に、非経口投与用に処方され、皮下又は筋肉内に注入される。また、こうしたワクチンは、当該技術で知られた方法を用いて、座薬として又は経口投与用に、あるいは、鼻ルート又は呼吸ルートを通した投与用に処方するができる。
【００２４】
病原菌、ウイルス、又は他の微生物に対する免疫を与えるのに十分なワクチンの量は、本明細書に記載のガイダンスを考慮し、当業者によく知られた方法によって見出すことができる。この量は、ワクチン接種者の特徴と必要な免疫レベル（上述のような）に基づいて見出すことができる。ワクチンが皮下注射又は筋肉注射によって投与される場合、０．５〜５００μｇ精製タンパク質の範囲を与えることができる。本発明に有用なものとして、免疫原性タンパク質、免疫原性ポリペプチド、又はこれらの免疫活性断片の約１μｇ、場合により１０μｇ、さらには５０μｇ、多くは１００μｇ、又は最大で５００μｇを与える量が通常は十分である。また、複数のこうした活性物質がワクチンに存在してもよい。即ち、複数の抗原構造が、ワクチン又はワクチン組成物を処方するのに使用され、本明細書に記載の方法に使用されてよい。この場合、個々に免疫原のタンパク質もしくはポリペプチド、又は組み合わされたときのみ免疫活性を示すタンパク質もしくはポリペプチドを含んでもよく、これらは、それぞれの濃度で量的に同じであってよく、又は明確なもしくは不明確なある比で存在するように処方されてもよい。
【００２５】
本明細書に記載の方法に使用されるワクチン組成物は、１つ又は複数の免疫原タンパク質、１つ又は複数の免疫原ポリペプチド、及び／又はこれらの免疫原タンパク質と免疫原ポリペプチドの抗原断片を含む１つ又は複数の免疫活性イムノゲンを含んでもよく、前記断片は、本発明の使用において選択される任意の割合で存在することができる。本発明の方法に有用な正確な構成成分、それぞれの量、ワクチンの形成、及びワクチン組成物は、とりわけ、治療又は予防されるべき疾病の性質、すでに発生している場合の症状の重症度、年齢、性別、受給者の全体的健康、及びこれらの方法を用いる研究者及び／又は臨床医の個人的及び専門的な経験と意向によって決められる。
【００２６】
炭疽菌に対して使用するためのサブユニットワクチンなどの本発明のワクチンに関し、本ワクチン組成物の特定の非限定的例として、前記ｒＰＡが、約１０〜３００μｇ／ｍｌ、好ましくは５０〜３００μｇ／ｍｌ存在し、又は前記ｒＰＡが、約１００〜３００μｇ／ｍｌ、より好ましくは１５０〜２５０μｇ／ｍｌ存在し、最も好ましくは、前記ｒＰＡが約２００μｇ／ｍｌ存在する。
【００２７】
別の例において、抗原、好ましくはｒＰＡの投与されるべき用量は、少なくとも約５μｇ、又は少なくとも約１０μｇ、又は少なくとも約２５μｇ、又は少なくとも約５０μｇ、又は少なくとも約７５μｇ、又は少なくとも約１００μｇ、又は少なくとも約１５０μｇ、又は少なくとも約２００μｇであり、好ましい投与量は約１００μｇである。好ましい投与量体積は約０．５ｍｌである。
【００２８】
本発明は、さらに、精製抗原、好ましくは炭疽菌抗原、より好ましくは炭疽菌保護抗原（ＰＡ）、最も好ましくは組換え炭疽菌保護抗原（ｒＰＡ）を含むワクチンに関するものであり、これらは、例えば、２００７年１１月１日公開のＷＯ２００７／１２２３７３の図２に記載されており、その開示事項は全体として本願に取り入れられており、あるいは、ＷＯ０２／０４６４６に記載のような、アジュバント、好ましくはミョウバンベースのアジュバントに結合したものなどを含むワクチンに関するものである。好ましい態様において、本発明は、ミョウバン結合ｒＰＡ、及び少なくとも約２ｍＭ、最も好ましくは約４ｍＭのホスフェート塩を含み、約ｐＨ７．１のサブユニットワクチンに関する。
【００２９】
ｒＰＡ製剤の製造方法の簡潔な説明を、プロセス図（図１）とともに下記に示す。薬剤原料を−７０℃の貯蔵から取り出し、２〜８℃で解凍する。多量の薬剤原料溶液を解凍している間に、３種類の溶液、即ち、溶液Ａ〜Ｃを製剤プロセスにおいて調製・使用する。溶液Ａは、原液の０．５Ｍホスフェート緩衝液であり、以降で溶液Ｃ（ホスフェート緩衝の０．９％生理食塩水、０．０４％のＴｗｅｅｎ２０を含む）を製造するために使用する。溶液Ｃは、ｒＰＡ製剤原料を必要濃度まで希釈するのに使用する。溶液Ｂは１．２２％生理食塩水を含み、アルハイドロゲルのオスモル濃度をバランスさせるのに使用する。元の低ホスフェートプロセスと改良された高ホスフェートプロセスとの間の相違は、溶液Ｃにおけるホスフェート濃度とｐＨである。
【００３０】
ｒＰＡ製剤原料を解凍し、製造過程分析でＡ２８０ｎｍによってｒＰＡタンパク質濃度を測定した後、この材料を、適切な量の溶液Ｂと溶液Ｃとともに無菌濾過に供し、製剤容器に入れる。混合した後、無菌アルハイドロゲルを添加し、連続的に混合して、製剤処方、即ち、ホスフェート緩衝の０．９％生理食塩水中の２００μｇ／ｍｌのｒＰＡと０．２６％アルハイドロゲルを産生する。この製剤処方を２時間にわたって撹拌した後、注射器その他の適切な容器に注入する。
【００３１】
低ホスフェート製剤については、臨床において使用される最終的物質の使用時のｐＨは５．９であることが分かっている。これに対し、高ホスフェート製剤のｐＨは使用時に約７．２であった。この結果、ホスフェート濃度の増加は、ｐＨを中性／生理学な値にコントロールする目的において満足されると判断できる。
【００３２】
マウスの効力挑戦アッセイを使用し、製剤の全バッチを試験・使用した。このアッセイは、製剤が全て製造後に効力があることを実証した。
【００３３】
バッチ効力の相対的評価を可能にする目的で、試験データからＥＤ５０値（有効用量の尺度）を導き出した。驚くことに、高ホスフェートのバッチは、低ホスフェートのバッチに比較して、効力において有意な向上を生じることが示された。さらに、高ホスフェート製剤のデータは、低ホスフェート製剤のデータよりもかなり一貫性があった（図２における短い誤差バーによって示されるように）。即ち、ホスフェート濃度の変更は、製剤効力の顕著な向上を予想外にもたらした。
【００３４】
ｒＰＡ製剤プロセス／処方におけるホスフェートの許容できる操作範囲を定めるため、タンパク質とミョウバンコロイドの双方に及ぼすホスフェート濃度の効果を評価する一連の検討を行った。これらの検討結果を下記に示す。
【００３５】
アルハイドロゲル粒子に及ぼすホスフェートの効果を評価するため、ミョウバンコロイド粒子のゼータ電位を測定した。製剤とミョウバン希釈剤を０．２５ｍＭ〜５ｍＭのホスフェート濃度範囲で新たに処方し、第０日と第７日にゼータ電位を測定した。この結果、ホスフェート濃度を高めるとゼータ電位はよりマイナスになり、２〜３ｍＭのホスフェートの間の点は変化がないことを示した（図３）。また、製剤と希釈剤の双方のゼータ電位は、処方する際に平行に達せず、７日間以上にわたって変化を続けることが分かった。このデータは、製剤の後にホスフェートとミョウバンの相互作用が継続することを示した。しかしながら、高ホスフェート製剤バッチが約−２０ｍＶのゼータ電位を有することを示す（図５）ゼータ電位の製剤バッチデータに外挿することにより、相互作用は第７日に完了させることができる。
【００３６】
ｒＰＡ製剤と希釈剤のゼータ電位値の比較は、低ホスフェートのレベル（０．２５ｍＭ）において、結合タンパク質は製剤のゼータ電位を改質するが、この効果はホスフェートを増加してゼータ電位が負になると顕著ではない、ことを示した。
【００３７】
ホスフェート濃度は、アルハイドロゲルに結合するｒＰＡの能力に顕著な効果を有することがよく分かっている。製剤開発の初期において、ｒＰＡとミョウバンの相互作用に及ぼすホスフェートの効果が評価されたが、これは、１０〜４００ｍＭの範囲のホスフェートを用いて行われた。この実験は、繰り返して行われたが、このときに１０ｍＭ以下の効果は評価されなかった。
【００３８】
ホスフェート濃度の増加は、ｒＰＡとミョウバンの結合を阻害した（図４）。１０ｍＭのレベルで未結合ｒＰＡは１２％であり、これは、３０％未結合抗原のＦＤＡガイドライン値の範囲内であった。
【００３９】
ラングミュア解析を用い、アルハイドロゲルに結合するｒＰＡに及ぼすホスフェートの効果を評価した。この解析は、粒子に結合する分子の吸着率（結合強度の尺度）と吸着能（結合能）を測定するために用いられる。
【００４０】
図５に示すように、アルハイドロゲルに結合するｒＰＡの吸着率は、二相曲線を生じるホスフェート濃度に影響された。値の急落の後、吸着率は、約３〜４ｍＭのホスフェートで水平域に達し、ホスフェートイオンがｒＰＡとミョウバンの結合の強度を調節可能なことを示唆した。確かに、ミョウバンの表面電荷をよりマイナスにするホスフェートイオンの効果は、この観察を支持するものと考えられる。ホスフェート改質のマイナス帯電粒子と異なり、ｒＰＡタンパク質は、プラス帯電のミョウバン粒子とより強い相互作用を有すると考えられる酸性タンパク質である。
【００４１】
また、ラングミュア解析から明らかなことは、ミョウバンの吸着能もまたホスフェート濃度の増加とともに変化したことである。この結合能パラメータは、約３〜４ｍＭで水平域に到達し始めた。留意すべきことは、この吸着能は、０．２６％アルハイドロゲルの濃度の２００μｇ／ｍｌにおいてｒＰＡに結合するために必要なものより過剰なことである。
【００４２】
特殊製剤の遠紫外線円二色法を用い、製剤のｒＰＡ二次構造に及ぼすホスフェート濃度の効果を評価した。０．２５ｍＭ〜１０ｍＭのホスフェート濃度の範囲でｒＰＡ製剤を処方し、１９０ｎｍ〜２５０ｎｍの間で二色スペクトルを測定した。生成したスペクトルは（図示せず）、いずれも２０８ｎｍでの最小値と約２１６ｎｍでの平坦域を特徴とした（図６）。さらに、全てのスペクトルが基本的に重なっており、ホスフェート濃度が、新たに処方される製剤におけるｒＰＡタンパク質の二次構造に影響を及ぼさないことを示唆した。
【００４３】
同様にして、内部蛍光を用い、製剤のｒＰＡ三次構造に及ぼすホスフェート濃度の効果を評価した。０．２５ｍＭ〜１０ｍＭのホスフェート濃度範囲でｒＰＡ製剤を処方し、蛍光発光スペクトルを測定した。図７に示すように、全てのスペクトルは、ホスフェート濃度に関わらず事実上相互に重なっており、λｍａｘ、したがって、タンパク質三次構造に、影響がないことを示した。
【００４４】
内部蛍光と遠紫外線円二色法の双方は、ホスフェート濃度が、新たに処方された製剤におけるｒＰＡの二次／三次構造に影響を及ぼさないことを示した。しかしながら、ｒＰＡタンパク質は、ミョウバン粒子に物理的に結合して固定されることが知られているため、ｒＰＡとミョウバンの結合に差異があるかどうかを測定するため、本発明者らは、結合時にｒＰＡ構造を有意に混乱させない熱変性アプローチを導入した。ｒＰＡとミョウバンの相互作用の代替的測定として、ＤＳＣ解析を用いた。ミョウバン上にｒＰＡが固定することは、タンパク質溶融に伴う熱容量変化を低減すると考えられ、この理由は、固定されたタンパク質の制限された動きのためであり、このことはＤＳＣによって検出されると考えられた。
【００４５】
示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）が、０．２５ｍＭ〜５０ｍＭのホスフェート濃度範囲にわたって、新たに処方された製剤に適用されたとき、０．２５ｍＭ製剤にについて融解転移は検出されなかった。ホスフェート濃度が２ｍＭまで増加すると、転移が検出され、ホスフェート濃度の増加とともにエンタルピーと溶融温度の双方が増加した（図８）。
【００４６】
概して、ＤＳＣは、タンパク質の熱容量の増加に示されるように、ホスフェートレベルの増加がミョウバンに対するｒＰＡの結合強度を低下させるといった観察をサポートする。また、そのデータは、溶融温度値の上昇に示されるように、タンパク質の安定性はミョウバンに対して結合した量に逆比例して増加することを示唆する。１０〜５０ｍＭのホスフェートの値について、未結合ｒＰＡからの信号は、有意になり始めると考えられるが、等温線に対して偏って寄与すると考えられる。
【００４７】
ＤＳＣデータに実証されるように、製剤中のｒＰＡ構造を評価するための熱変性アプローチの有効性は、これが内部蛍光にも適用可能なことを示唆した。このため、アルハイドロゲルに結合するタンパク質の溶融温度に及ぼすホスフェートの効果を測定するため、蛍光強度と熱変性を使用した（図９）。ＤＳＣについて示されたと同様に、低ホスフェートで処方された製剤は（０．２５ｍＭ〜２ｍＭ）、４０〜５０℃の範囲ではタンパク質の溶融温度に殆ど又は全く遷移を示さず、一方、３〜１０ｍＭでは約４６℃で遷移が検出された。ホスフェートに対する溶融温度としてデータをプロットすると（温度遷移の中間点）、二相曲線が３ｍＭのホスフェートで平坦域に到達し始めることが理解できる。
【００４８】
ホスフェートの増加が様々に又は配向して結合するｒＰＡタンパク質をもたらすか否かを評価する目的で、エピトープ認識アッセイ（製剤イムノアッセイとしても知られる）を用いて検討した。これは、特異的ｒＰＡドメイン４エピトープを認識する選択されたモノクローナル抗体の能力を測定する効果的なタンパク質構造アッセイである。ドメイン４を選択した理由は、このタンパク質領域が抗体保護を与えるのに重要であるとの証拠があるためである（Ｆｌｉｃｋ−Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．，  Ｖｏｌ．  ７０（３），  ｐｐ．  １６５３−６  （２００２））。炭疽菌の保護抗原の組換えカルボキシ末端ドメインは、炭疽菌感染に対してマウスを保護する。
【００４９】
別なｒＰＡドメイン４エピトープに対して増加した２つのモノクローナル抗体を使用し、ｒＰＡ結合を評価した：（１）安定性指示エピトープ（Ｃ３クローン）、及び（２）保護安定性指示エピトープ（２Ｄ４Ｊクローン）。２つの抗体のエピトープマッピングは、両方ともｒＰＡドメイン４の中の別なループ領域に結合することを実証し、さらに、２Ｄ４Ｊクローンは、受容体結合領域に明確に結合し、このことは、その保護性を説明するものと考えられる。
【００５０】
エピトープ認識解析を、ホスフェート濃度を増加させながら行った。両方のモノクローナルについて、ホスフェート濃度の増加の結果として、抗体結合の減少が生じた（図１０）。このアッセイについて、容量の制約により、多数のホスフェート濃度の評価はできなかった。しかしながら、限られた数のホスフェート濃度から、双方のモノクローナルについての免疫活性が、約２．５ｍＭの変曲点に至るまで急激に低下し、その後、免疫活性の低下速度が減少することが分かった。全てのｒＰＡがミョウバンに有効に結合していたため、この免疫活性の低下は、タンパク質の損失によるものではない。
【００５１】
上述の実験の１つの意外な結論は、ホスフェートの製剤特性と効能の双方に及ぼす効果により、ホスフェートは、今後は製剤処方の重要なパラメータとして考えなければならないことである。このことは、これまで、固定されたホスフェート濃度でｒＰＡ製剤を製造するように薬剤製造プロセスが考慮されていなかったため、特に重要である。この旧来のプロセスにおいては、ｒＰＡ製剤原料は、特定のｒＰＡタンパク質濃度になるまでホスフェート緩衝剤で希釈される。製剤原料のｒＰＡ濃度は、約１７％の係数で目標濃度から変化し得るため、希釈するホスフェート緩衝剤の量は、製剤原料の出発濃度によって変化した。全体のホスフェート濃度に影響するのはこのホスフェートの体積であったため、この無機イオンのレベルは適当に変動したものと考えられる。薬剤製造プロセスに対するその後の改良は、プロセスの出発時における製剤原料濃度にかかわらず、一定のホスフェート濃度が処方されることを確かにするようになされている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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