(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列Xaa-Pro-Pro-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO:19)を含む精製されたポリペプチドを含有する、対象における免疫複合体形成の阻害における使用のための組成物であって、
配列中、Xaaが任意のアミノ酸であり、
かつ免疫複合体形成が、デング熱またはデングウイルス（DENV）による感染症の抗体依存性増強（ADE）に関連するか、またはDENV感染症の増強の一因となる、組成物。
【請求項２】
前記免疫複合体形成が、DENVによる感染症に関連し、前記ポリペプチドが、該DENV感染症の臨床的改善または組織学的改善、該DENV感染症の一つもしくは複数の組織学的特性の発症の改善もしくは遅延、または該DENV感染症のADEの減少をもたらす、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
前記免疫複合体形成が、DENVによる感染症に関連し、該DENVによる感染症が、デング出血熱（DHF）またはデングショック症候群（DSS）である、請求項1記載の組成物。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、FcγRに対する抗DENV異種IgG免疫複合体（IC）の結合、DENV感染症のADEの免疫病因をもたらすICの形成、IgG ICに対するDENVウイルス粒子の結合、またはIgG免疫複合体に対するDENVタンパク質の結合を阻害する、請求項1記載の組成物。
【請求項５】
前記ポリペプチドがIgG免疫複合体に対するDENVタンパク質の結合を阻害し、該DENVタンパク質がNS1である、請求項4記載の組成物。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、IgG ICに対するTNF-αの結合、FcγI、FcγIIa H131アレル、FcγIIa R131アレル、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa、もしくはFcyγIIIbに対するDENV-IgG ICの結合、またはmC1qもしくはsC1qに対するDENV-IgG ICの結合を阻害する、請求項1記載の組成物。
【請求項７】
前記ポリペプチドがアミノ酸配列Ala-Pro-Pro-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr (SEQ ID NO:20)を含む、請求項1記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、2008年7月18日に出願された米国特許仮出願第61/081,943号の優先権の恩典を主張する。
【０００２】
技術分野
本文書は、ウイルス感染症に関連する免疫複合体形成の阻害に関連する。例えば、本文書は、デング出血熱（DHF）およびデングショック症候群（DSS）を含むデング熱（DF）感染症における免疫複合体形成、およびDF感染症の抗体依存性増強（ADE）を阻害するための材料および方法を提供する。とりわけ、本文書は、ポリペプチドおよび他の小分子により免疫複合体形成を阻害することに関連する。
【背景技術】
【０００３】
背景
体液性免疫応答は抗原が抗体と特異的に結合した時に誘発される。抗体分子と抗原の合体は、小型で相対的に溶解性の高い免疫複合体を形成する。抗原は、ウイルス性もしくは細菌性のポリペプチドなどの外来性物質であってもよく、またはヒトの体内に通常認められるポリペプチドなどの「自己抗原」であってもよい。免疫系は通常、外来性抗原を自己抗原と識別する。しかし、この系が壊れて、免疫系が身体を攻撃して、組織または臓器系をそれらが外来性物質であるかのように破壊するようになると、「自己免疫」性疾患が起こる恐れがある。大型の免疫複合体であるほど、小型で相対的に溶解性の高い可溶性免疫複合体よりも病原性が高い。大型で相対的に溶解性の低い免疫複合体の形成は、抗体分子と抗原との相互作用、および抗体分子同士の相互作用の両方によって起こりうる。また、そのような免疫複合体は、抗原の不在下での抗体間の相互作用によっても起こりうる。
【０００４】
抗体はウイルスまたは細菌を覆うことによって感染を防止しうるが、他の点ではそれ自体は比較的無害である。これに対して、抗体が抗原と合体し、その結果生じた免疫複合体が体内の特定のエフェクター分子と結合すると、臓器特異的な組織損傷が起こる恐れがある。エフェクター分子は、免疫複合体の病的作用を実現させることからそのように命名されている。大型で不溶性の免疫複合体の形成を阻害することにより、または免疫複合体とエフェクター分子との結合を阻害することにより、免疫複合体の組織損傷作用を防止しうると考えられる。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本文書は、SEQ ID NO：2およびSEQ ID NO：20（本明細書において、NB-406とも称される）に示される配列に基づくアミノ酸配列を有するポリペプチドが、特異的に、かつ高い親和性で、免疫グロブリン分子のCH2-CH3ドメインに結合することが可能であり、したがって、抗体および抗原を含む不溶性の免疫複合体形成を阻害し、かつエフェクター分子に対するそのような複合体の結合を妨げるという発見に部分的に基づく。本文書は、そのようなポリペプチド、他のCH2-CH3結合化合物、ポリペプチドおよび/または化合物を含む組成物、ならびに免疫複合体形成を阻害するポリペプチドおよび組成物を使用するための方法、およびウイルス感染症の処置における治療的使用のための方法を提供する。
【０００６】
一つの局面において、本文書は、アミノ酸配列
0005806112.tif 000002
を含む精製されたポリペプチドを含有する組成物を対象に投与する段階を含む、対象において免疫複合体形成を阻害する方法であって、配列中、Xaa1が任意のアミノ酸であり、Xaa2がTrp、TyrもしくはPhe、5-ヒドロキシトリプトファン（5-HTP）、5-ヒドロキシトリプタミン（5-HT）、または別のアミノ酸誘導体であり、Xaa3が任意のアミノ酸であり、かつmおよびnが独立して、0、1、2、3、4または5であり、かつ免疫複合体形成がウイルス感染症に関連する方法を特徴とする。免疫複合体形成は、デング熱もしくはデングウイルス（DENV）によるデング感染症の抗体依存性増強（ADE）に関連し得るか、またはDENV感染症の増強の一因となる。前記ペプチドは、DENV感染症の臨床的改善または組織学的改善をもたらし得る。前記ペプチドは、DENV感染症の一つもしくは複数の組織学的特性の発症の改善または遅延をもたらし得る。前記ペプチドは、DENV感染症のADEを減少させ得る。
【０００７】
DENV感染症は、デング出血熱（DHF）またはデングショック症候群（DSS）であり得る。前記ペプチドは、FcγRに対する抗DENV異種IgG免疫複合体（IC）の結合を阻害し得る。前記ペプチドは、DENV感染症のADEの免疫病因をもたらすICの形成を阻害し得る。前記ペプチドは、IgG ICに対するDENVウイルス粒子の結合を阻害し得る。前記ペプチドは、IgG免疫複合体に対するDENVタンパク質（例えば、NS1等）の結合を阻害し得る。前記ペプチドは、IgG ICに対するTNF-αの結合を阻害し得る。前記ペプチドは、FcγI、FcγIIa H131アレル、FcγIIa R131アレル、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa、またはFcyγIIIbに対する、DENV-IgG ICの結合を阻害し得る。前記ペプチドは、mC1qまたはsC1qに対するDENV-IgG ICの結合を阻害し得る。
【０００８】
ポリペプチドは、末端安定化基（terminal stabilizing group）を含み得る。末端安定化基は、ポリペプチドのアミノ末端に存在し得、かつXaaが任意のアミノ酸（例えば、Ala）であるアミノ酸配列Xaa-Pro-Proを有するトリペプチドであり得る。末端安定化基は、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在し得、かつXaaが任意のアミノ酸（例えば、Ala）のアミノ酸配列Pro-Pro-Xaaを有するトリペプチドであり得る。
【０００９】
本方法は、出血熱の一つもしくは複数の臨床的特性、病理組織学的特性または分子的特性に関して、対象をモニタリングする段階をさらに含み得る。出血熱の一つもしくは複数の臨床的特性、病理組織学的特性または分子的特性は、血小板の減少、血液濃縮、またはFcγR＋エフェクター細胞の増加からなる群より選択され得る。
【００１０】
前記ポリペプチドは、Xaaが任意のアミノ酸である、アミノ酸配列
0005806112.tif 000003
を含み得る。前記ポリペプチドは、アミノ酸配列
0005806112.tif 000004
を含み得る。前記ポリペプチドは、アミノ酸配列
0005806112.tif 000005
を含み得る。
【００１１】
別に定義する場合を除き、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者が一般に理解しているものと同じ意味を持つ。本発明の実施のために本明細書に記載されたものと同様または同等の方法および材料を用いることができるが、好適な方法および材料は以下に説明するものである。本明細書で言及するすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み入れられる。対立が生じた場合には、定義を含め、本明細書が支配的であるものとする。さらに、材料、方法および例は例示のためのものであって限定を意図したものではない。
【００１２】
本発明の1つまたは複数の態様の詳細は、添付の図面および以下の説明に示されている。本発明のその他の特徴、目的および利点は、その説明および特許請求の範囲によって明らかになると考えられる。
[本発明1001]
アミノ酸配列
0005806112.tif 000006
を含む精製されたポリペプチドを含有する組成物を対象に投与する段階を含む、対象において免疫複合体形成を阻害する方法であって、
配列中、Xaa1が任意のアミノ酸であり、Xaa2がTrp、TyrもしくはPhe、5-ヒドロキシトリプトファン（5-HTP）、5-ヒドロキシトリプタミン（5-HT）、または別のアミノ酸誘導体であり、Xaa3が任意のアミノ酸であり、かつmおよびnが独立して、0、1、2、3、4または5であり、かつ免疫複合体形成がウイルス感染症に関連する、方法。
[本発明1002]
免疫複合体形成が、デング熱またはデングウイルス（DENV）による感染症の抗体依存性増強（ADE）に関連するか、またはDENV感染症の増強の一因となる、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記ポリペプチドが、DENV感染症の臨床的改善または組織学的改善をもたらす、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記ポリペプチドが、DENV感染症の一つもしくは複数の組織学的特性の発症の改善または遅延をもたらす、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記ポリペプチドが、DENV感染症のADEを減少させる、本発明1001の方法。
[本発明1006]
DENV感染症が、デング出血熱（DHF）またはデングショック症候群（DSS）である、本発明1002、1003、1004または1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記ポリペプチドが、FcγRに対する抗DENV異種IgG免疫複合体（IC）の結合を阻害する、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記ポリペプチドが、DENV感染症のADEの免疫病因をもたらすICの形成を阻害する、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記ポリペプチドが、IgG ICに対するDENVウイルス粒子の結合を阻害する、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記ポリペプチドが、IgG免疫複合体に対するDENVタンパク質の結合を阻害する、本発明1001の方法。
[本発明1011]
DENVタンパク質がNS1である、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記ポリペプチドが、IgG ICに対するTNF-αの結合を阻害する、本発明1001の方法。
[本発明1013]
前記ポリペプチドが、FcγI、FcγIIa H131アレル、FcγIIa R131アレル、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa、またはFcyγIIIbに対するDENV-IgG ICの結合を阻害する、本発明1001の方法。
[本発明1014]
前記ポリペプチドが、mC1qまたはsC1qに対するDENV-IgG ICの結合を阻害する、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記ポリペプチドが、末端安定化基（terminal stabilizing group）を含む、本発明1001の方法。
[本発明1016]
末端安定化基が前記ポリペプチドのアミノ末端に存在し、かつアミノ酸配列Xaa-Pro-Proを有するトリペプチドであり、配列中、Xaaが任意のアミノ酸である、本発明1015の方法。
[本発明1017]
XaaがAlaである、本発明1016の方法。
[本発明1018]
末端安定化基が前記ポリペプチドのカルボキシ末端に存在し、かつアミノ酸配列Pro-Pro-Xaaを有するトリペプチドであり、配列中、Xaaが任意のアミノ酸である、本発明1015の方法。
[本発明1019]
XaaがAlaである、本発明1018の方法。
[本発明1020]
出血熱の一つもしくは複数の、臨床的特性、病理組織学的特性、または分子的特性に関して、対象をモニタリングする段階をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1021]
出血熱の一つもしくは複数の、臨床的特性、病理組織学的特性、または分子的特性が、血小板の減少、血液濃縮、またはFcγR＋エフェクター細胞の増加からなる群より選択される、本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記ポリペプチドがアミノ酸配列
0005806112.tif 000007
を含み、配列中、Xaaが任意のアミノ酸である、本発明1001の方法。
[本発明1023]
前記ポリペプチドがアミノ酸配列
0005806112.tif 000008
を含む、本発明1001の方法。
[本発明1024]
前記ポリペプチドがアミノ酸配列
0005806112.tif 000009
を含む、本発明1001の方法。
【００１３】
詳細な説明
本文書は、免疫グロブリンと他の分子（例えば、エフェクターまたは他の免疫グロブリン）との相互作用が阻止されるように、免疫グロブリン分子のCH2-CH3クレフトと相互作用することのできるポリペプチドおよび他の化合物を提供する。そのようなポリペプチドおよび他の化合物を同定するための方法も、ポリペプチドおよび化合物を含む組成物および製造品と共に説明される。加えて、本文書は、ポリペプチドおよび化合物を、免疫複合体形成を阻害するため、ならびに膜結合型C1q（mC1q）、可溶性C1q（sC1q）、およびFcγR（FcγRI（およびFcγRのアイソフォーム）、FcγRIIa、FcγRIIb/c、FcγRIIIa、FcγRIIIb、およびFcRnが非限定的に含まれる）などのエフェクター分子とIgG免疫複合体が結合する疾患（例えば、デング熱などのウイルス疾患）を治療するために用いるための方法も提供する。
【００１４】
免疫グロブリン
免疫グロブリンは、抗体活性を示し、かつ他の分子（例えば、抗原およびある種の細胞表面受容体）に高度の特異性を伴って結合する、血漿および他の体液中に認められるタンパク質のクラスを構成する。その構造および生物活性に基づいて、免疫グロブリンは以下の5つのクラスに分けることができる：IgM、IgG、IgA、IgDおよびIgE。IgGは体内に最も多く存在する抗体クラスである；この分子はねじれた「Y」型の立体配置であると想定される。IgMを例外として、免疫グロブリンは、いくつかの鎖内および鎖間ジスルフィド結合によって連結された4つのペプチド鎖から主として構成される。例えば、IgGは2つのポリペプチド重鎖（H鎖）および2つのポリペプチド軽鎖（L鎖）から構成され、それらはジスルフィド結合および非共有結合によって連結されて、分子量が約150,000ダルトンであるタンパク質分子を形成する（Saphire et al., "Crystal Structure of a Neutralizing Human IgG Against HIV-I : A Template for Vaccine Design," Science, 2001 , 293 : 1155- 1159）。平均的なIgG分子は、約4.5個の鎖間ジスルフィド結合および約12個の鎖内ジスルフィド結合を含む（Frangione and Milstein (1968) J. Mol. Biol. 33:893-906）。
【００１５】
免疫グロブリン分子の軽鎖および重鎖は、定常領域および可変領域から構成される（例えば、Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169-217を参照）。例えば、IgG1分子の軽鎖はそれぞれ可変ドメイン（VL）および定常ドメイン（CL）を含む。重鎖は4つのドメイン、アミノ末端の可変ドメイン（VH）とそれに続く3つの定常ドメイン（CH1、CH2およびカルボキシ末端のCH3）を含む。ヒンジ領域はCH1ドメインとCH2ドメインの柔軟な接合部に対応する。完全なIgG分子のパパイン消化により、ヒンジの箇所でタンパク質分解切断が起こり、CH2およびCH3ドメインを含むFc断片、ならびにそれぞれがCH1、CL、VHおよびVLドメインを含む2つの同一なFab断片が生成される。Fc断片は補体結合活性および組織結合活性を有し、一方、Fab断片は抗原結合活性を有する。
【００１６】
免疫グロブリン分子は、種々の領域を介して他のポリペプチドと相互作用することができる。例えば、抗原結合の大半は、Fab断片のVL/VH領域を介して起こる。免疫学の定説では、Fc受容体（FcR）に対する結合部位がIgG分子のヒンジ領域に認められるとされており、ヒンジ領域も重要であると考えられている（例えば、Raghavan and Bjorkman (1996) Annu. Rev. Dev. Biol. 12:181-200を参照）。しかし、より最近の証拠は、主として免疫グロブリンが単量体である（すなわち、免疫複合体を形成していない）場合に、FcRがヒンジ領域と相互作用することを示唆している。そのような相互作用には典型的にはIg分子の234〜237位にあるアミノ酸がかかわる（Wiens et al. (2000) J. Immunol. 164:5313-5318）。
【００１７】
免疫グロブリン分子は、CH2-CH3ドメイン内部のクレフトを介して他のポリペプチドと相互作用することもできる。「CH2-CH3クレフト」は典型的には、CH2ドメイン内部の251〜255位にあるアミノ酸、およびCH3ドメイン内部の424〜436位にあるアミノ酸を含む。本明細書で用いる場合、番号付けは、Kabat et al.（Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda, MD）におけるような完全なIgG分子に対するものである。他の免疫グロブリンクラスにおける対応するアミノ酸は、当業者によって容易に決定されうる。
【００１８】
CH2-CH3クレフトは、溶媒の到達性が高いことおよび主として疎水性であることの両方を特徴とするという点で特異であり、このことは露出された疎水性表面が埋没されることがこの部位での結合の重要な推進力であることを示唆する。抗原結合が起こるとIgGのCH2-CH3クレフトで三次元的な変化が起こり、特定の残基（例えば、435位のヒスチジン）が露出されて結合を行えるようになる。抗原結合に応じて起こる三次元的な構造変化の直接的な証拠は、ヒトIgGのFc領域におけるコンフォメーション変化に対して感受性のあるモノクローナル抗体を用いた研究で見いだされている。5つのIgGエピトープが抗原結合によって変化し、うち2つはヒンジ領域内部にあり、3つはCH2-CH3クレフト内部にある（Girkontraite et al. (1996) Cancer Biother. Radiopharm. 11:87-96）。したがって、抗原結合は、免疫グロブリンがヒンジまたはFc CH2-CH3領域を介して他の分子と結合するか否かを決定するために重要である可能性がある。
【００１９】
Fc領域は、以下のものを含む、数多くのエフェクター分子および他のタンパク質と結合することができる：
（1）FcRn‐
新生児Fc受容体は全身循環中での抗体分子の半減期を決定する（Leach et al., (1996) J. Immunol. 157:3317-3322；Gheti and Ward (2000) Ann. Rev. Immunol. 18:739-766）。FcRnを遺伝的に欠損したマウスは、自己抗体の半減期の短縮のために、病原性自己抗体の有害な影響から防御される（Liu et al. (1997) J. Exp. Med. 186:777-783）。IgG Fcに対するFcRnの唯一の結合部位がIgG Fc CH2-CH3クレフトであり、HIS 435は3D構造およびアラニンスキャンによってFcRnとIgG Fcとの結合に必須であることが示されている（Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604、およびMartin et al., (2001)，Mol Cell, 7:867-877）。本明細書で説明するペプチドは高い親和性でCH2-CH3クレフトおよびHIS 435と結合するため、これらのペプチドは（免疫複合体を形成した）IgG FcのFcRnとの結合の直接的な阻害物質である。免疫複合体または病原性自己抗体とのFcRnの結合の阻害物質は、病原性の自己抗体および/または免疫複合体がかかわる疾患の治療において有用と考えられる。
（2）FcR‐
細胞Fc受容体は体液性免疫応答と細胞介在性エフェクター系との間をつないでいる（Hamano et al. (2000) J. Immunol. 164:6113-6119；Coxon et al. (2001) Immunity 14:693-704；Fossati et al. (2001) Eur. J. Clin. Invest. 31:821-831）。Fcγ受容体はIgG分子に対して特異的であり、これにはFcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb/cおよびFcγRIIIa/b（ならびにそれらのアレル、表現型、および遺伝子型）が含まれる。これらのアイソタイプは、単量体のおよび免疫複合体を形成したIgGと、さまざまに異なる親和性で結合する。
（3）C1q‐
古典的補体経路の第一成分はC1であり、これは血清中にC1q、C1rおよびC1sという3種のタンパク質の複合体として存在する。古典的補体経路は、C1qが、抗原と結合したIgGまたはIgMのFc領域と結合した時に活性化される。単一のFc領域に対するC1qの結合は弱いものの、C1qはFc領域のクラスターに対して強固な結合を形成する。この時点でC1はタンパク質分解が活性化する。
【００２０】
免疫グロブリンFc領域と他の抗体または他の因子（例えば、上記のもの）との間の相互作用を介した免疫複合体の形成を、本明細書では「Fcを介した免疫複合体形成」または「Fcを介した免疫複合体の形成」と称する。そのような相互作用を含む免疫複合体は「Fcを介した免疫複合体」と呼ばれる。Fcを介した免疫複合体には、抗原が結合したものと結合していないものの両方を含めることができ、これらは典型的には、単量体抗体に対するよりも免疫複合体を形成した抗体に対する結合特異性の方が高いCH2-CH3クレフト特異的リガンドを含む。
【００２１】
精製されたポリペプチド
本明細書で用いる場合、「ポリペプチド」とは、翻訳後修飾（例えば、リン酸化またはグリコシル化）の如何にかかわらず、任意のアミノ酸残基の鎖のことを指す。本明細書で提供するポリペプチドは、典型的には10〜50アミノ酸の長さである（例えば、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45または50アミノ酸の長さ）。長さが10〜20アミノ酸の間（例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20アミノ酸の長さ）であるポリペプチドが特に有用な可能性がある。
【００２２】
本明細書で提供されるポリペプチドのアミノ酸配列は、幾分は制約されるが、ある程度の可変性を有しうる。例えば、本明細書で提供されるポリペプチドは、典型的には、アミノ酸配列
0005806112.tif 000010
を含み、Xaanによって表される残基は可変性を呈しうる。例えば、Xaa1が存在しなくてもよく、または任意のアミノ酸（例えば、ArgまたはAsp）でもありうる。Xaa2は、Phe、Tyr、Trp、5-ヒドロキシトリプトファン（5-HTP）、またはArgでありうる。Xaa3は任意のアミノ酸でありうる。Xaa4はGlyまたはAlaでありえ、一方、Xaa5はGluまたはAlaでありうる。Xaa1と同様に、Xaa6は存在しなくてもよく、または任意のアミノ酸でもありうる。
【００２３】
1つの態様において、前記ポリペプチドは、アミノ酸配列
0005806112.tif 000011
を含みうる。あるいは、前記ポリペプチドはアミノ酸配列
0005806112.tif 000012
を含みうる。別の態様において、前記ポリペプチドはアミノ酸配列
0005806112.tif 000013
を含みうる。
【００２４】
別の態様において、ポリペプチドは、アミノ酸配列
0005806112.tif 000014
を含むことができ、配列中、XaaはPhe、Tyr、Trp、またはArgでありうる。例えば、本文書は、以下のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
0005806112.tif 000015
【００２５】
本明細書で提供するポリペプチドを、ポリペプチドのインビボでの存続性を助長するための安定化物質の、アミノ末端またはカルボキシ末端での付加により、インビボ使用のために修飾することができる。これは、ペプチド末端が細胞取込みの前にプロテアーゼにって分解される傾向がある状況では有用な可能性がある。このようなブロッキング物質には、ポリペプチドのアミノおよび/またはカルボキシ末端残基に結合した関連性のあるまたは関連性のない付加的な配列（例えば、N末端アミノ酸に結合したアセチル基またはC末端アミノ酸に結合したアミド基）が非限定的に含まれる。このような結合は、当業者が精通している方法を用いて、化学的に、ポリペプチドの合成中に、または組換えDNA技術によって実現することができる。または、ピログルタミン酸または当技術分野で公知の他の分子などのブロッキング物質をアミノおよび/またはカルボキシ末端残基に結合させること、または、アミノ末端のアミノ基もしくはカルボキシ末端のカルボキシ基を異なる部分に置き換えることもできる。
【００２６】
アミノ末端にあるプロリンまたはXaa-Pro-Pro（例えば、Ala-Pro-Pro）配列は特に有用である（例えば、WO 00/22112を参照）。例えば、前記ポリペプチドは、アミノ酸配列
0005806112.tif 000016
を含むことができ、配列中、Xaa1は任意のアミノ酸（例えば、Ala）であり、Xaa2はTrp、Tyr、Phe、またはArgである。例えば、前記ポリペプチドはアミノ酸配列
0005806112.tif 000017
を含みうる。あるいは、前記ポリペプチドはアミノ酸配列
0005806112.tif 000018
を含むこともあり、配列中、最初の位置のXaaは任意のアミノ酸である。
【００２７】
本明細書で提供するポリペプチドは、Pro-Pro-Xaa（例えば、Pro-Pro-Ala）配列をそのカルボキシ末端に有しうる。例えば、該ポリペプチドはアミノ酸配列
0005806112.tif 000019
を含み得、配列中、Xaaは任意のアミノ酸でありうる。
【００２８】
いくつかの態様において、本明細書で提供するポリペプチドは、付加的なアミノ酸配列を、SEQ ID NO：1に示された配列のアミノ末端、SEQ ID NO：1に示された配列のカルボキシ末端またはその両方に含みうる。例えば、該ポリペプチドはアミノ酸配列
0005806112.tif 000020
を含むことができ、配列中、Xaanによって表される残基は可変性を呈しうる。SEQ ID NO：1に示されたアミノ酸配列に関して、Xaa1は存在しなくてもよく、または任意のアミノ酸（例えば、ArgまたはAsp）でもありえ；Xaa2はPhe、Tyr、5-HTP、TrpまたはArgでありえ；Xaa3は任意のアミノ酸でありえ；Xaa4はGlyまたはAlaでありえ；Xaa5はGluまたはAlaでありえ；かつ、Xaa6は存在しなくてもよく、または任意のアミノ酸でもありうる。1つの態様において、前記ポリペプチドはアミノ酸配列
0005806112.tif 000021
を含み得、配列中、XaaはArg、Trp、5-HTP、TyrまたはPheである。例えば、前記ポリペプチドはアミノ酸配列
0005806112.tif 000022
を含みうる。
【００２９】
別の態様において、前記ポリペプチドは、アミノ酸配列
0005806112.tif 000023
からなる可能性があり、Xaaによって表される残基は可変性を呈する可能性があり、mおよびnは独立に0から10までの整数（例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10）でありうる。例えば、Xaa1は任意のアミノ酸でありえ；Xaa2は存在しなくてもよく、または任意のアミノ酸（例えば、ArgまたはAsp）でもありえ；Xaa3はPhe、Tyr、5-HTP、Trp、またはArgでありえ；Xaa4は任意のアミノ酸でありえ；Xaa5はGlyまたはAlaでありえ；Xaa6はGluまたはAlaでありえ；Xaa7は任意のアミノ酸でありえ；かつ、mおよびnは0から5まで（例えば、0、1、2、3、4または5）でありうる。あるいは、前記ポリペプチドはアミノ酸配列
0005806112.tif 000024
からなる可能性もあり、Xaa1は任意のアミノ酸であり、Xaa2はPheまたはArgであり、Xaa3は任意のアミノ酸であり、かつmおよびnは独立に0から5までの整数（例えば、0、1、2、3、4または5）である。これらの態様の範囲内にあるポリペプチドの例には、アミノ酸配列
0005806112.tif 000025
からなるポリペプチドが非限定的に含まれる。
【００３０】
本明細書に記載されるポリペプチドのアミノ酸配列は、典型的には2つのシステイン残基を含む。これらのアミノ酸配列を含むポリペプチドは、2つのシステイン残基間のジスルフィド結合の形成が原因で環化しうる。当業者は、複数のシステイン残基を含むペプチドが環化されているか否かを判定するために、例えば、エルマン試薬を用いることができる。いくつかの態様において、これらのシステイン残基は、ジスルフィド結合ではなくラクタム結合を形成しうる、他の天然または非天然のアミノ酸残基によって置換することができる。例えば、1つのシステイン残基をアスパラギン酸またはグルタミン酸で置換し、他のものをオルニチンまたはリジンで置換することができると考えられる。これらの組み合わせのいずれもがラクタム架橋を生じさせうると考えられる。ラクタム架橋を形成するアミノ酸を変更することにより、ポリペプチド中に2つのシステイン残基が存在するならば形成されると考えられるジスルフィド結合と長さがほぼ等しい架橋を含む、本明細書で提供するポリペプチドを作製することができる。
【００３１】
本明細書で提供するポリペプチドは、アミノ酸タグを含むことができる。「タグ」とは一般に、そのタグに対する抗体との相互作用を通じて、またはそのタグを認識する他の化合物もしくは分子を通じて、すぐに使える検出または精製の手段を提供する、短いアミノ酸配列のことである。例えば、c-myc、血球凝集素、ポリヒスチジンまたはFlag（登録商標）などのタグを、ポリペプチドの精製および検出を助けるために用いることができる。一例として、ポリヒスチジンタグを有するポリペプチドを、ヒスチジン残基のニッケルイオンに対する親和性に基づいて精製し（例えば、Ni-NTAカラムで）、ポリヒスチジンに対する抗体（例えば、Penta-His抗体；Qiagen, Valencia, CA）によるウエスタンブロットによって検出することができる。タグはポリペプチド配列内部の任意の箇所に挿入しうるが、アミノ末端またはカルボキシ末端での挿入が特に有用である。
【００３２】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸およびアミノ酸類似体であって、それらの構造が許容する場合、それらのDおよびL立体異性体のすべてのことを指す。天然アミノ酸には、アラニン（Ala）、アルギニン（Arg）、アスパラギン（Asn）、アスパラギン酸（Asp）、システイン（Cys）、グルタミン（Gln）、グルタミン酸（Glu）、グリシン（Gly）、ヒスチジン（His）、イソロイシン（Ile）、ロイシン（Leu）、リジン（Lys）、メチオニン（Met）、フェニルアラニン（Phe）、プロリン（Pro）、セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、トリプトファン（Trp）、チロシン（Tyr）およびバリン（Val）が含まれる。非天然アミノ酸には、5-ヒドロキシトリプトファン、アゼチジンカルボン酸、2-アミノアジピン酸、3-アミノアジピン酸、β-アラニン、アミノプロピオン酸、2-アミノ酪酸、4-アミノ酪酸、6-アミノカプロン酸、2-アミノヘプタン酸、2-アミノイソ酪酸、3-アミノイソ酪酸、2-アミノピメリン酸、2,4-ジアミノイソ酪酸、デスモシン、2,2'-ジアミノピメリン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸、N-エチルグリシン、N-エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリジン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロイソロイシン、N-メチルグリシン、N-メチルイソロイシン、N-メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチンおよびピペコリン酸が非限定的に含まれる。
【００３３】
「類似体」とは、別のものに構造的に類似しているが、（異なる元素の原子による1つの原子の置換、または特定の官能基の存在のように）組成の点で幾分違いのある化合物のことである。「アミノ酸類似体」は、このため、天然のポリペプチド中に典型的に認められる天然に存在するアミノ酸分子と構造的に類似しているが、C末端カルボキシ基、N末端アミノ基または側鎖官能基のいずれかが別の官能基へと化学的に修飾されるように組成の点で異なっている。アミノ酸類似体には、N末端アミノ基またはそれらの側鎖基が可逆的もしくは非可逆的に化学的にブロックされた、または修飾された天然および非天然のアミノ酸が含まれ、これには例えば、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、S-(カルボキシメチル)-システイン、S-(カルボキシメチル)-システインスルホキシドおよびS-(カルボキシメチル)-システインスルホンが含まれる。アミノ酸類似体は天然に存在してもよく、または合成的に調製することもできる。アミノ酸類似体の非限定的な例には、5-ヒドロキシトリプトファン（5-HTP）、アスパラギン酸の類似体であるアスパラギン酸-(β-メチルエステル)；グリシンの類似体であるN-エチルグリシン；および、アラニンの類似体であるアラニンカルボキサミドが含まれる。アミノ酸およびアミノ酸類似体の他の例は、Gross and Meienhofer, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Academic Press, Inc., New York (1983)に列記されている。
【００３４】
ポリペプチドの立体化学は、ポリペプチド骨格のまわりのアミノ酸残基の側鎖のトポケミカル配置に関して記載されえ、これはアミノ酸残基の間のペプチド結合および結合残基のα-炭素原子によって定義される。加えて、ポリペプチド骨格は、別個の末端、そしてそれ故に方向性を有する。天然に存在するアミノ酸の大部分はL-アミノ酸である。天然に存在するポリペプチドは、主としてL-アミノ酸で構成されている。
【００３５】
D-アミノ酸はL-アミノ酸の鏡像異性体であり、本明細書で「インバーソ（inverso）」ポリペプチド（すなわち、天然のペプチドに対応するものの、L-アミノ酸ではなくD-アミノ酸で構成されるペプチド）と称されるペプチドを形成することができる。「レトロ（retro）」ポリペプチドは、L-アミノ酸で構成されるものの、アミノ酸残基が天然のペプチド配列とは正反対の向きで組み立てられているアミノ酸配列を有する。
【００３６】
天然に存在するポリペプチドの「レトロ-インバーソ（retro-inverso）」修飾は、天然のポリペプチド配列に対して逆の順序である、対応するL-アミノ酸のものとは正反対のα-炭素立体化学を有するアミノ酸（すなわち、D-またはD-アロ-アミノ酸）の合成的組み立てを伴う。したがって、レトロ-インバーソ類似体は、逆転した末端および逆転した向きのペプチド結合を有し、その一方で、側鎖のトポロジーは天然ペプチド配列におけるものをほぼ維持している。「天然の」という用語は、部分的または完全なレトロ、インバーソまたはレトロ-インバーソ類似体の調製のための出発配列として用いられるL-アミノ酸の任意の配列のことを指す。
【００３７】
部分的レトロ-インバーソポリペプチド類似体とは、配列の一部のみが逆転し、かつ鏡像異性アミノ酸残基によって置換されているポリペプチドである。このような類似体のレトロ-インバーソ部分は逆転したアミノ末端およびカルボキシル末端を有するため、レトロ-インバーソ部分に隣接するアミノ酸残基をそれぞれ側鎖類似のα置換ジェミナルジアミノメタンおよびマロネートによって置換することができる。または、ポリペプチドが、全配列が逆転し、かつD-アミノ酸によって置換されている完全なレトロ-インバーソ類似体であることもできる。
【００３８】
本文書は、ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計されたペプチド模倣化合物も提供する。ペプチド模倣化合物とは、選択されたペプチドの三次元コンフォメーションと実質的に同じである三次元コンフォメーション（すなわち、「ペプチドモチーフ」）を有し、それ故に選択されたペプチドと同じまたは類似の機能を付与することのできる、合成性の非ペプチド化合物のことである。ペプチド模倣化合物は、本明細書に提供されるポリペプチドの任意のものを模倣するように設計することができる。
【００３９】
プロテアーゼ抵抗性であるペプチド模倣化合物は特に有用である。さらに、ペプチド模倣化合物が、例えば向上した細胞透過性および延長した生物学的半減期といった、治療的有用性を高める付加的な特徴を有してもよい。そのような化合物は、典型的には、部分的または完全に非ペプチド性であるが、ペプチド模倣化合物の基となったペプチド中に存在するアミノ酸残基の側基と同一または類似の側基を備えている。いくつかの種類の化学結合（例えば、エステル、チオエステル、チオアミド、レトロアミド、還元カルボニル、ジメチレンおよびケトメチレン）は、ペプチド模倣化合物の構築においてペプチド結合の有用な代替物となることが当技術分野で公知である。
【００４０】
本明細書に記載されるポリペプチドと免疫グロブリン分子との間の相互作用は、典型的には、免疫グロブリンのCH2-CH3クレフトを通じて起こる。このような相互作用は物理的近接によって発生し、例えば、疎水性相互作用によって媒介される。免疫グロブリン分子に対するポリペプチドの「結合親和性」とは、ポリペプチドと免疫グロブリンとの間の相互作用の強さのことを指す。結合親和性は典型的には、Kd＝koff/konとして算出される平衡解離定数（Kd）として表わされ、式中、koff＝反応の速度論的解離定数であり、kon＝反応の速度論的会合定数である。Kdは濃度として表わされ、低いKd値（例えば、100nM未満）ほど親和性が高い。免疫グロブリン分子と相互作用しうるポリペプチドは、典型的には、免疫グロブリンのCH2-CH3クレフトに対して少なくとも1μM（例えば、少なくとも500nM、少なくとも100nM、少なくとも50nM、または少なくとも10nM）の結合親和性を有する。
【００４１】
本明細書で提供するポリペプチドは、抗原に結合されている免疫グロブリン分子、および単量体免疫グロブリンに対して、実質的に等しい親和性で結合することができる。あるいは、本明細書に記載されるポリペプチドが、抗原に結合されている免疫グロブリン分子に対して、単量体免疫グロブリンに対するよりも高い結合親和性（例えば、少なくとも10倍、少なくとも100倍または少なくとも1000倍高い結合親和性）を有することもできる。Fab領域に対する抗原結合によって免疫グロブリン分子のFc領域内部に起こるコンフォメーション変化が、親和性の違いに関与している可能性が高い。結合型および非結合型のNC6.8 Fab（ネズミのモノクローナル抗体に由来）の結晶構造により、抗原/抗体複合体の結晶では、Fab重鎖の尾部が、非結合型Fabにおける位置と比較して19オングストローム変位していることが示されている（Guddat et al. (1994) J. Mol. Biol. 236-247-274）。Fab領域のC末端尾部は無傷の抗体においてFc領域と連結しているため、この推移はCH2-CH3クレフトのコンフォメーションに影響を及ぼすと予想される。さらに、無傷の免疫グロブリンのいくつかの三次元構造の検討により、Fab重鎖とFc CH2-CH3クレフトとの間の直接的な物理的連結が明らかにされている（Harris et al. (1997) Biochemistry 36:1581-1597；Saphire et al. (2001) Science 293:1155-1159）。
【００４２】
単量体（すなわち、非結合型）IgGおよび免疫複合体を形成したIgGのCH2-CH3クレフトの分子モデル化により、単量体FcのCH2-CH3クレフトが閉鎖状の立体配置を有し、それが決定的に重要なアミノ酸残基（例えば、His 435；例えば、O'Brien et al. (1994) Arch. Biochem. Biophys. 310:25-31；Jefferies et al. (1984) Immunol. Lett. 7:191-194；およびWest et al. (2000) Biochemistry 39:9698-9708を参照）に対する結合を妨げうることが明らかにされている。しかし、免疫複合体を形成した（抗原が結合した）IgGは、より開かれた立体配置を有し、それ故にリガンド結合をより導きやすい。例えば、免疫複合体を形成したIgGに対するRFの結合親和性は、単量体IgGに対するRFの結合親和性よりもはるかに大きい（Corper et al. (1997) Nat. Struct. Biol. 4:374；Sohi et al. (1996) Immunol. 88:636）。本明細書で提供するポリペプチドについても典型的には同じことが成り立つ。
【００４３】
本明細書に記載されるポリペプチドは免疫グロブリン分子のCH2-CH3クレフトと結合しうるため、それらは免疫グロブリンのFc領域に対する他の因子（例えば、FcRn、FcR、C1q、ヒストン、MBP、SOD1および他の免疫グロブリン）の相互作用を阻止するために有用な可能性があり、それ故にFcを介した免疫複合体形成を阻害しうる。「阻害する」とは、本明細書で提供されるポリペプチドの非存在下における免疫複合体形成のレベルと比較して、該ポリペプチドの存在下で、Fcを介した免疫複合体形成が低下することを意味する。このような阻害はインビトロ（例えば、試験管内）またはインビボ（例えば、個体の内部）のいずれでも起こりうる。免疫複合体形成のレベルを評価するためには任意の適した方法を用いることができる。多くのそのような方法が当技術分野で公知であり、これらのいくつかが本明細書に記載されている。
【００４４】
本明細書に記載されるポリペプチドは、典型的には、IgG Fcとペプチドが1：2という化学量論比で、単量体様式で免疫グロブリン分子のCH2-CH3クレフトと相互作用する（すなわち、1つの免疫グロブリン分子のみと相互作用し、このため2つまたはそれ以上の免疫グロブリン分子をともに結び付けることはない）。このため、Fc領域を通じての他の免疫グロブリン分子との相互作用は、ポリペプチドの存在によって妨げられる。Fcを介した免疫複合体形成の阻害は、例えば、ポリペプチドの存在下または存在下で、IgG分子を標識免疫グロブリン分子（例えば、蛍光的または酵素（ELISA）的に標識したFc受容体またはC1q）と共にインキュベートして、免疫複合体の中に組み入れられた標識免疫グロブリンの量を測定することによって、インビトロで評価することができる。以下に考察するように、免疫複合体形成を検出するために適した他の方法を用いることもできる。
【００４５】
ポリペプチドの調製および精製
ポリペプチドは、さまざまな方法によって産生することができ、その多くは当技術分野で周知である。例として、限定的ではないが、ポリペプチドを、天然の供給源から（例えば、単離された細胞、組織または体液から）の抽出によって、ポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって（例えば、以下に述べるように）、または化学合成（例えば、固相合成、またはABIペプチド合成装置；Applied Biosystems, Foster City, CAを用いた合成を含む、当技術分野で周知の他の方法により）によって入手することができる。レトロ-インバーソポリペプチド類似体を合成するための方法（Bonelli et al. (1984) Int. J. Peptide Protein Res. 24:553-556；およびVerdini and Viscomi (1985) J. Chem. Soc. Perkin Trans. I:697-701）および部分的レトロ-インバーソペプチド類似体の固相合成のためのいくつかの工程も記載されている（例えば、欧州特許第EP0097994号を参照）。
【００４６】
本文書は、本明細書に記載したポリペプチドをコードする、単離された核酸分子を提供する。本明細書で用いる場合、「核酸」とは、RNAおよびDNAの両方を指し、これにはcDNA、ゲノムDNAおよび合成（例えば、化学合成）DNAが含まれる。核酸は二本鎖でも一本鎖（すなわち、センスまたはアンチセンスの一本鎖）でもよい。
【００４７】
核酸に言及して本明細書で用いられる「単離された」という用語は、その由来となった生物体の天然に存在するゲノム中でそれと直に隣接している（一方は5'端側に、もう一方は3'端側に）配列のいずれとも直に隣接していない、天然に存在する核酸を指す。核酸に関して本明細書で用いられる「単離された」という用語はまた、任意の天然に存在しない核酸配列も、そのような天然に存在しない配列は天然に存在せず、天然に存在するゲノム中で直に隣接する配列を有しないことから、含む。
【００４８】
単離された核酸は、例えば、天然に存在するゲノム中のDNA分子と通常直に隣接している核酸配列の1つが除去されているかまたは欠如しているDNA分子でありうる。したがって、単離された核酸には、他の配列とは独立している別個の分子として存在するDNA分子（例えば、化学合成された核酸、またはPCRもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生じたcDNAもしくはゲノムDNA断片）、ならびにベクター、自律複製性プラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）中に、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNA中に組み入れられているDNAが、非限定的に含まれる。加えて、単離された核酸には、ハイブリッド核酸または融合核酸の一部である組換えDNA分子のような操作された核酸も含まれうる。例えば、cDNAライブラリーもしくはゲノムライブラリー、またはゲノムDNA制限消化物を含むゲル切片の内部の数百または数百万もの他の核酸の中に存在する核酸は、単離された核酸とはみなされない。
【００４９】
本文書はまた、本明細書に記載の核酸を含むベクターも提供する。本明細書で用いる場合、「ベクター」とは、挿入されたセグメントの複製を引き起こすために、別のDNAセグメントを挿入することのできる、プラスミド、ファージまたはコスミドなどのレプリコンのことである。ポリペプチドは、例えばファージディスプレイを使用して開発することができる。当業者に周知の方法は、本明細書に記載されるポリペプチドの開発にファージディスプレイを使用しうる。ベクターは例えば、発現制御配列に機能的に連結された開始メチオニンを有する、本明細書で提供されるポリペプチドをヌクレオチドがコードする発現ベクターであり得る。本明細書で用いる場合、「機能的に連結される」とは、発現制御配列が関心対象のコード配列の発現を有効に制御するように、遺伝子コンストラクト中に組み入れられていることを意味する。「発現制御配列」は、別のDNA配列の転写および翻訳を制御および調節するDNA配列であり、「発現ベクター」は、ベクター中に組み入れられた該当のDNAセグメントが転写および翻訳されるように発現制御配列を含むベクターである。コード配列は、RNAポリメラーゼがコード配列をmRNAへと転写する場合に、細胞内で転写および翻訳制御配列と「機能的に連結され」かつその「制御下に」あり、続いてそれはコード配列によってコードされるタンパク質へと翻訳される。
【００５０】
関心対象のポリペプチドをコードする単離された核酸分子を、該当のコード配列ならびに適切な転写/翻訳制御シグナルを含む発現ベクターにサブクローニングするためには、当業者に周知の方法を用いることができる。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual（2nd edition）, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)；およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, New York (1989)を参照されたい。発現ベクターは、本明細書に記載するように、種々の系において用いることができる（例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞）。適した発現ベクターの例には、例えば、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスに由来する、プラスミド性およびウイルス性ベクターが非限定的に含まれる。非常にさまざまな適した発現ベクターおよび系が市販されており、これにはpETシリーズの細菌発現ベクター（Novagen, Madison, WI）、Adeno-X発現系（Clontech）、Baculogoldバキュロウイルス発現系（BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA）およびpCMV-Tagベクター（Stratagene, La Jolla, CA）が含まれる。
【００５１】
本明細書に記載のポリペプチドをコードする発現ベクターを、ポリペプチドを産生するために用いることができる。ポリペプチドの小規模または大規模産生のために用いうる発現系には、以下のものが限定することなく含まれる：細菌などの微生物（例えば、本明細書で提供される核酸分子を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターによる形質転換を受けた大腸菌（E. coli）および枯草菌（B. subtilis））；本発明の核酸分子を含む組換え酵母発現ベクターによる形質転換を受けた酵母（例えば、S.セレビシエ（S. cerevisiae））；本明細書で提供される核酸分子を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、タバコモザイクウイルス）による感染もしくは本明細書で提供される核酸分子を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）による形質転換を受けた植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーターおよびサイトメガロウイルスプロモーター）由来のプロモーターを本明細書で提供される核酸と共に含む組換え発現コンストラクトを有する哺乳動物細胞系（例えば、初代細胞、またはCOS細胞、CHO細胞、HeLa細胞、HEK 293細胞および3T3 L1細胞などの不死化細胞株）。
【００５２】
本明細書で用いる「精製されたポリペプチド」という用語は、天然に存在しない対応物（例えば、ペプチド模倣物）を持たないか、もしくは化学合成されており、それ故に他のポリペプチドが混入していないポリペプチド、または天然に付随する他の細胞成分（例えば、他の細胞タンパク質、ポリヌクレオチドまたは細胞成分）から分離もしくは精製されているポリペプチドのことを指す。典型的には、ポリペプチドは、それに天然に付随するタンパク質および天然に存在する有機分子を除いた割合が乾燥重量比で少なくとも70％である場合に「精製されている」とみなされる。このため、精製されたポリペプチドの調製物は、例えば、乾燥重量比で少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも99％がポリペプチドである。ポリペプチドを精製するために適した方法には、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降、サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーが含まれうる。精製の程度は、以下のものを非限定的に含む、任意の適した方法によって測定することができる：カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィー。
【００５３】
化合物のモデル化、設計および同定の方法
本文書は、免疫グロブリン分子のCH2-CH3クレフトと結合することができ、それ故にFcを介した免疫複合体形成の阻害物質として役立つ化合物の設計、モデル化および同定のための方法も提供する。そのような化合物を本明細書では「リガンド」とも称する。これらの方法によって設計、モデル化および同定された化合物は、典型的にはCH2-CH3クレフトを通じて免疫グロブリン分子と相互作用することができ、かつ、免疫グロブリンのCH2-CH3クレフトに対して少なくとも1μM（例えば、少なくとも500nM、少なくとも100nM、少なくとも50nMまたは少なくとも10nM）の結合親和性を典型的に有する。そのような化合物は一般に、免疫複合体を形成した免疫グロブリン分子に対して、単量体免疫グロブリン分子に対するよりも高い結合親和性（例えば、少なくとも10倍、少なくとも100倍または少なくとも1000倍高い結合親和性）を有する。
【００５４】
化合物は、典型的に、免疫グロブリン分子のCH2-CH3クレフトと、単量体様式で相互作用する（すなわち、1つの免疫グロブリン分子とのみ相互作用し、したがって2つまたはそれ以上の免疫グロブリン分子を結びつけない）。化合物と免疫グロブリン分子との相互作用には、典型的に、免疫グロブリンの252位、253位、435位、および436位のアミノ酸残基（番号はKabat、前記に従う）が関与する。例えば、SEQ ID NO：20（NB-406）は、IgG FcのMet-252、Ile-253、Ser-254、His-435およびTyr-436との疎水性パッキングを有する可能性がある（例えば、SEQ ID NO：20中のTrp-14のインドール環は、IgG FcのHis-435との疎水性相互作用を有し得る）。IgG FcのAsn-434、His-435またはTyr-436のアラニン置換は、結合を破壊し得る（ΔΔG≧1.5 kcal/mol）。さらに、SEQ ID NO：20のVal-13またはTrp-14のアラニン置換は、結合の破壊をもたらし得る（ΔΔG≧2.0 kcal/mol）。
【００５５】
化合物とCH2-CH3クレフトとの間の相互作用は、他の因子（例えば、Fc：Fc相互作用、FcγR、FcRn、ヒストン、MBP、MOG、RF、タウタンパク質、α-シヌクレイン、SOD1、TNFおよびC1q）のCH2-CH3クレフトとの結合を阻止することにより、化合物が、Fcを介した免疫複合体の形成を阻害できるようにしている。
【００５６】
本明細書で提供する方法によって同定される化合物は、例えば、本明細書に記載したもののようなポリペプチドでありうる。または、化合物は、免疫グロブリン分子のCH2-CH3クレフトと特異的に結合できる任意の適した種類の分子である可能性もある。
【００５７】
「モデル化」とは、三次元構造情報および受容体-リガンド相互作用のモデルに基づく、受容体-リガンド構造/機能の量的および/または質的な分析のことを意味する。これには、従来の数値に基づく分子動力学およびエネルギー最小化モデル、インタラクティブコンピュータグラフィックモデル、修正型分子力学モデル、ディスタンスジオメトリー（distance geometry）ならびに他の構造に基づく制約モデルが含まれる。モデル化は典型的にはコンピュータを用いて行われ、公知の方法を用いてさらに最適化することができる。
【００５８】
抗原が結合した免疫グロブリン分子のCH2-CH3クレフトと特異的に（すなわち、高い親和性で）結合するリガンドを設計する方法は典型的にはコンピュータベースであり、原子モデルを生成できるプログラムを有するコンピュータの使用を伴う。Fc CH2-CH3クレフトと相互作用しうるリガンドを設計するためには、X線結晶学データを用いるコンピュータプログラムが特に有用である。例えば、RasMolなどのプログラムを、CH2-CH3クレフトの三次元モデルを生成するため、および/またはリガンド結合に関与する構造を決定するために用いることができる。INSIGHT（Accelrys, Burlington, MA）、GRASP（Anthony Nicholls, Columbia University）、Dock（Molecular Design Institute, University of California at San Francisco）およびAuto-Dock（Accelrys）などのコンピュータプログラムは、さらなる操作を可能にし、かつ新たな構造を導入する能力を与える。
【００５９】
方法には、例えば、コンピュータに対して、Fcを介した免疫複合体中の免疫グロブリン分子のCH2-CH3クレフト内部のアミノ酸残基（例えば、クレフトの252、253、435および436位にあるアミノ酸残基）に関する原子構造座標を提供する段階、コンピュータを用いてCH2-CH3クレフトの原子モデルを生成する段階、候補化合物の原子構造座標をさらに提供して、CH2-CH3クレフト内部に最適配置された化合物の原子モデルを生成する段階、ならびに化合物がクレフトの252、253、435および436位にあるアミノ酸残基と相互作用する場合に候補化合物を関心対象のリガンドとして同定する段階が含まれうる。コンピュータに対して提供されるデータが、252、253、435および436位のほかの位置にあるアミノ酸残基の原子座標を含むこともできる。「最適配置された」とは、候補化合物と、CH2-CH3クレフトの252、253、435および436位にあるアミノ酸残基との間の疎水性相互作用を最適化するように配置されていることを意味する。
【００６０】
あるいは、免疫グロブリン分子のCH2-CH3クレフトに対する特異的な結合親和性を有するリガンドを設計するための方法は、そのメモリ中にクレフトの原子モデルが保存されているコンピュータを利用することもできる。候補化合物の原子座標をコンピュータに提供し、最適配置された候補化合物の原子モデルを生成することができる。本明細書に記載した通り、候補化合物は、例えば、化合物がクレフトの252、253、435および436位にあるアミノ酸残基と相互作用するならば、免疫グロブリン分子のCH2-CH3クレフトに対して特異的な結合親和性を有するリガンドとして同定されうる。
【００６１】
このような方法は、単量体（抗原が結合していない）IgG Fcは、下部ヒンジ領域などのIgG Fc CH2-CH3クレフトとは異なる部位に結合し（Wines et al.(2000) J. Immunol. 164:5313-5318）、一方、免疫複合体を形成した（抗原が結合した）IgG FcのFcγIIaとの結合は、3D構造によってIgG Fc CH2-CH3境界クレフトのみと結合することが示されているIgMリウマチ因子（RF-AN）によって阻害されることを示している（Sohi et al., (1996), Immunology, 88:636-641; およびCorper et al., (1997), Nature Struct. Biol. 4(5):374-381）。可溶性FcγIIaは、免疫複合体を形成したIgG FcのRF-ANとの結合を阻害する（しかし、免疫複合体を形成していない単量体はそうでない）ことから（Wines et al., (2003), Immunol. 109:246-254）、本明細書に記載のペプチドのようにIgG Fc CH2-CH3クレフトと結合する阻害物質は、免疫複合体を形成した（抗原が結合した）IgG FcのFcγRとの結合を阻害する。
【００６２】
化合物を、本明細書に記載の化合物の構造情報から、構造に基づく設計/モデル化の他の手法を用いてインタラクティブに設計することもできる（例えば、Jackson (1997) Seminars in Oncology 24:L164-172；およびJones et al. (1996) J. Med. Chem. 39:904-917を参照）。
【００６３】
例えば、免疫グロブリン分子のCH2-CH3クレフト内に空間的および優先的（すなわち、高い親和性を伴って）に適合させてコンピュータモデル化し、続いてそのような化合物をFcを介した免疫複合体形成を阻害する能力に関してインビトロまたはインビボでスクリーニングすることによって候補化合物を同定することにより、化合物およびポリペプチドを同定することもできる。このようなインビトロおよびインビボのスクリーニングのために適した方法には、本明細書に記載するものが含まれる。
【００６４】
組成物および製造品
本文書は、Fcを介した免疫複合体形成の異常（例えば、Fcを介した免疫複合体の過剰産生）によって起こる病状を治療するための方法において使用され得る組成物および製造品を提供する。本明細書で提供されるポリペプチド、化合物、および組成物は、Fcを介した免疫複合体形成を調節することによって緩和されうる例えばウイルス感染症を有する対象（例えば、ヒトまたは別の哺乳動物）に対して投与されて、mC1q、sC1q、FcγR、およびFcRnに対する免疫複合体を形成したIgG Fcを阻害することができる。典型的には、1つまたは複数のポリペプチドまたは化合物を、免疫複合体形成と関連のある疾患または病状を有する疑いのある対象に対して投与することができる。組成物は概して、1つまたは複数の本明細書に記載のポリペプチドおよび化合物を含みうる。例えば、CH2-CH3結合性ポリペプチドを、薬学的に許容される担体または希釈剤に入れて、特定の疾患の性質、その重症度および対象の全般的状態に応じて変化する量および期間にて投与することができる。典型的には、ポリペプチドは、阻害量（すなわち、ポリペプチドが接触した細胞または組織における免疫複合体の産生を阻害するのに十分な量）で投与される。また、本明細書に記載のポリペプチドおよび方法を、例えば、免疫複合体の異常な産生または過剰産生のリスクのある対象（例えば、移植レシピエント）における免疫反応性を最小化するために、予防的に用いることもできる。
【００６５】
Fcを介した免疫複合体形成を阻害するポリペプチドの能力は、例えば、治療の前および後の対象における免疫複合体レベルを測定することによって評価することができる。組織または生物試料における免疫複合体レベルを測定するためには、当技術分野で周知のものを含む、さまざまな方法を用いることができる。対象が研究動物である場合には、例えば、関節中の免疫複合体レベルを、安楽死の後の免疫染色によって評価することができる。また、阻害性ポリペプチドの有効性を、血清試料中の循環免疫複合体のレベルを測定するといった直接的な方法によって評価することもできる。または、生きている対象におけるポリペプチドの有効性を評価するために間接的な方法を用いることもできる。例えば、免疫複合体形成の低下を、免疫介在性疾患の臨床的改善から推測することができ、またはそのインビトロもしくはインビボモデルがアテローム性動脈硬化の治療において治療的使用において必須であることが示されている。
【００６６】
治療用組成物の製剤化およびその後の投与のための方法は、当業者に周知である。投薬は一般に、治療しようとする疾患状態の重症度および反応性に依存し、治療過程は数日間ないし数カ月間にわたって、または治癒がもたらされるまで、もしくは疾病状態の軽減が達成されるまで続く。当業者は、最適な投与量、投薬方法および反復頻度をルーチンに決定する。最適な投与量は個々のポリペプチドの相対的効力に応じて異なり、一般に、インビトロおよびインビボの動物モデルで有効であると見いだされたEC50に基づいて推定される。典型的には、投与量は体重1kg当たり0.01μg〜100gであり、1日に1回もしくはそれ以上、週2回、毎週、毎月またはさらに低い頻度で投与することができる。治療の奏効後には、疾患状態の再発を防止するために患者は維持療法を受けることが望ましい。
【００６７】
本文書は、本明細書に記載のポリペプチドおよび/または化合物を含む薬学的組成物および製剤を提供する。取込み、分配および/または吸収を補助するために、ポリペプチドを、他の分子、分子構造、あるいは、例えばリポソーム、ポリエチレングリコール、受容体標的分子または経口用、直腸用、局所用もしくは他の製剤などの化合物の混合物と、混合、封入、結合または他の様式で随伴させることができる。
【００６８】
「薬学的に許容される担体（本明細書では「賦形剤」とも称する）とは、1つまたは複数の治療用化合物（例えば、CH2-CH3結合性ポリペプチド）を対象に送達するための、薬学的に許容される溶媒、懸濁化剤または任意の他の薬理学的に不活性な媒体のことである。薬学的に許容される担体は液体でも固体でもよく、所定の薬学的組成物の治療用化合物の1つまたは複数および任意の他の成分と組み合わせる時に、所望の嵩、粘稠度ならびに他の妥当な輸送特性および化学特性を得るために、計画している投与様式に念頭において選択することができる。アミノ酸と有害な反応をしない典型的な薬学的に許容される担体には、例えば以下が含まれるが、それらには限定されない：水；食塩水；結合剤（例えば、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、ゼラチンまたは硫酸カルシウム）；潤滑剤（例えば、デンプン、ポリエチレングリコールまたは酢酸ナトリウム）；崩壊剤（例えば、デンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；および湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）。
【００６９】
薬学的組成物は、局所治療または全身治療のいずれが望まれるかに応じて、および治療しようとする領域に応じて、さまざまな方法によって投与することができる。投与は例えば、局所的（例えば、皮内、舌下、眼または鼻腔内）；肺（例えば、粉末またはエアロゾルの吸入または吹入）；経口；または非経口的（例えば、皮下、髄腔内、脳心室内、筋肉内もしくは腹腔内注射による、または静脈内点滴による）。投与は急速（例えば、注射による）でもよく、またはある期間にわたってもよい（例えば、緩徐な注入または徐放性製剤の投与による）。中枢神経系内の組織を治療するためには、CH2-CH3結合性ポリペプチドを、好ましくは血液脳関門を越えてのポリペプチドの浸透を促すことができる1つまたは複数の作用物質と共に、注射または注入によって脳脊髄液中に投与することができる。
【００７０】
CH2-CH3結合性ポリペプチドの局所投与のための製剤には、例えば、無菌または非無菌の水溶液、アルコールなどの一般的な溶媒中にある非水性溶液、または液体もしくは固形の油基中の溶液が含まれる。このような溶液は、緩衝剤、希釈剤および他の適した賦形剤を含んでもよい。局所投与のための薬学的組成物および製剤には、経皮的パッチ、軟膏、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐薬、噴霧薬、液剤および粉剤が含まれうる。鼻内噴霧薬は特に有用であり、例えば、ネブライザーまたは別の鼻内噴霧デバイスによって投与することができる。吸入器による投与も特に有用である。従来の薬学的担体、水性、粉末または油性の基剤、増粘剤などが必要である場合も、または望ましい場合もある。
【００７１】
経口投与のための組成物および製剤には、例えば、粉剤または顆粒剤、水もしくは非水性媒質中にある懸濁液もしくは溶液、カプセル剤、サシェまたは錠剤が含まれる。このような組成物は、増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、崩壊剤または結合剤も組み込むことができる。
【００７２】
非経口的、髄腔内または脳心室内投与のための組成物および製剤には無菌水溶液が含まれ、これは緩衝液、希釈剤および他の適した賦形剤（例えば、浸透促進剤、担体化合物および他の薬学的に許容される担体）も含むことができる。
【００７３】
薬学的組成物には、溶液、乳液、水性懸濁液およびリポソーム含有製剤が非限定的に含まれる。これらの組成物は、例えば、あらかじめ調製された液体、自己乳化性固体および自己乳化性半固体を含む、種々の成分から作製することができる。乳濁液は多くの場合、2つの不混和性液相をよく混合して相互に分散させた二相系である；一般に、乳濁液は油中水（w/o）型または水中油型（o/w）である。乳濁液製剤は、製剤化の容易さならびに溶解、吸収および生物学的利用能の能力を理由として、治療薬の経口送達のために広く用いられている。
【００７４】
リポソームは、親油性材料で形成された膜、および送達しようとする組成物を含む水性内容物を有する小胞である。リポソームは、薬物送達の見地から、それらが提供する作用の特異性および持続時間のために特に有用な可能性がある。リポソーム組成物は、例えば、ホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルグリセロールまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミンから形成することができる。Lipofectin（登録商標）（Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, CA）およびEffectene（商標）（Qiagen, Valencia, CA）を含む、数多くの親油性物質が市販されている。
【００７５】
ポリペプチドはさらに、ヒトを含む動物に対する投与後に、生物活性のある代謝産物またはその残分を提供する（直接的または間接的に）ことのできる、任意の薬学的に許容される塩、エステル、またはそのような塩のエステル、または任意の他の化合物を包含しうる。したがって、例えば、本文書は、ポリペプチドの薬学的に許容される塩、プロドラッグ、およびそのようなプロドラッグの薬学的に許容される塩、および他の生物学的等価物を提供する。「プロドラッグ」は、不活性型として調製され、体内または細胞内で内因性酵素または他の化学物質の作用および/または条件によって活性型（すなわち、薬物）に変換される治療薬のことを示す。「薬学的に許容される塩」という用語は、本明細書で提供されるポリペプチドの生理的および薬学的に許容される塩（すなわち、望ましくない毒物学的影響を及ぼすことなく、親ポリペプチドの所望の生物活性を保っている塩）のことを指す。薬学的に許容される塩の例には、陽イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、またはスペルミンなどのポリアミン）と形成された塩；無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸または硝酸）と形成された酸付加塩；および有機酸（例えば、酢酸、クエン酸、シュウ酸、パルミチン酸またはフマル酸）と形成された塩が非限定的に含まれる。
【００７６】
本明細書で提供されるポリペプチドを含む薬学的組成物には、動物の皮膚へのポリペプチドの効率的な送達を促進する浸透促進剤を組み込むこともできる。浸透促進剤は、親油性薬物および非親油性薬物の両方の細胞膜を通しての拡散を向上させることができる。浸透促進剤は、5つの幅広いカテゴリーのうち1つに属するものと分類されうる。すなわち、表面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン-20-セチルエーテル）；脂肪酸（例えば、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸およびステアリン酸）；胆汁酸塩（例えば、胆汁酸、デヒドロコール酸およびデオキシコール酸）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、クエン酸およびサリチレート）；および非キレート性非表面活性剤（例えば、不飽和環状尿素）である。または、阻害性ポリペプチドをイオントフォレシスを介して送達することもでき、これは電荷を利用してポリペプチドを皮膚を通るように「駆動する」経皮パッチを伴う。
【００７７】
本明細書で提供されるいくつかの態様において、（a）1つまたは複数のポリペプチド、および（b）異なる機序によって働く1つまたは複数の他の作用物質を含む薬学的組成物が提供される。例えば、非ステロイド性抗炎症薬および副腎皮質ステロイドを非限定的に含む抗炎症薬、ならびにリビビリン（ribivirin）、ビダラビン、アシクロビルおよびガンシクロビルを非限定的に含む抗ウイルス薬を、組成物中に含めることができる。他の非ポリペプチド性剤（例えば、化学療法薬）も、本文書の範囲に含まれる。このような組み合わされた化合物は一緒に用いることもでき、または逐次的に用いることもできる。
【００７８】
組成物はさらに、薬学的組成物中に従来より認められる他の補助的成分を含むことができる。すなわち、組成物はまた、適合性のある薬学的活性のある材料、例えば、鎮痒薬、収斂薬、局麻剤もしくは抗炎症薬、または本明細書で提供する組成物のさまざまな剤形を物理的に製剤化する上で有用なそのほかの材料、例えば色素、香味剤、保存料、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤および安定化剤も含むことができる。さらに、組成物を助剤、例えば、潤滑剤、保存料、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝剤、着色剤、香味料および芳香性物質と混合することもできる。しかし、添加する場合に、このような材料が本明細書で提供する組成物の内部のポリペプチド成分の生物活性を不必要に妨害すべきではない。製剤は必要であれば滅菌することができる。
【００７９】
薬学的製剤は単位剤形として便利に提示することができ、これは製薬産業で周知の従来の技法に従って調製することができる。このような技法には、有効成分（例えば、本明細書で提供するCH2-CH3結合性ポリペプチド）を所望の薬学的担体または賦形剤と会合させる段階が含まれる。典型的には、製剤は、有効成分を液体担体または微細固体担体またはその両方と均質に緊密に会合させ、続いて、必要であれば生成物を成形することによって調製することができる。製剤は必要であれば滅菌することができるが、その場合、滅菌の方法は、製剤中に含まれるポリペプチドの有効性を妨害しないことを条件とする。
【００８０】
本明細書に記載される組成物は、考えられる多くの剤形の任意のものに製剤化することができ、これには錠剤、カプセル剤、液体シロップ剤、軟ゲル、坐薬および浣腸剤などがあるが、これらには限定されない。組成物を水性、非水性または混合性の媒質中にある懸濁液として製剤化することもできる。水性懸濁液はさらに、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび/またはデキストランを含む、懸濁液の粘性を高める物質を含むことができる。懸濁液は安定化剤を含むこともできる。
【００８１】
CH2-CH3結合性ポリペプチドをパッケージ化用の材料と組み合わせて、Fcを介した免疫複合体形成を低下させるためのキットとして販売することができる。製造品を製造するための構成要素および方法は周知である。製造品は、以上のセクションで詳述されたポリペプチドおよび化合物の1つまたは複数を併せ持つことができる。加えて、製造品がさらに、例えば、免疫複合体形成の低下または免疫複合体形成の低下のモニターのための緩衝剤または他の調整用試薬を含んでもよい。Fcを介した免疫複合体形成を低下させることに関して本ポリペプチドがいかに有効であるかを記した説明書をこのようなキットに含めることができる。
【００８２】
デング熱
デング熱は、世界で最も流行している蚊媒介性のウイルス性疾病であり、熱帯地域において、25億人を超える人々が感染のリスクにある。デング熱は、主に、都市に生息するアエデス・アエギプチ蚊（Aedes aegypti）（黄熱病ウイルスも伝達するステゴミア・アエギプチ（Stegomyia aegypti）とも呼ばれる）によって、ヒトに伝達される。黄熱病を駆除するための第二次世界大戦期のプログラムは、標的区域においてデング熱を制御するという利点をもたらした。しかしながら、過去30年において、これらのプログラムの中止、および熱帯区域における急速な都市化によって、再びデング熱が出現してきている。
【００８３】
デングウイルス（DENV）は4つの血清型を有し、各々が同一の人に感染することができる。デング感染症は無症候性であり得るか、または消耗性の熱から、ことによると致命的なデング出血熱（DHF）およびデングショック症候群（DSS）に及ぶ範囲の症状を引き起こし得る。デング熱の症例の約1％は、DHFへ進行する。
【００８４】
ヒトCD34＋造血性幹細胞を、新生仔のRAG2-/-γc-/-マウスに異種移植することによって、デング熱のインビボモデルが作製され、ヒト適応免疫系の主要な機能性細胞のデノボの発生がもたらされた（Kuruvilla et al. (2007) Virol. 369: 143-152）。DENV感染症に対する感受性（susceptibility）を評価するため、DEN-2血清型を用いてヒト化マウスに抗原投与した。106.3 RNAコピー/mlに達するウイルス力価で感染したマウスにおいて、最大3週間続くウイルス血症が検出され、かつデング熱に特徴的な熱も確認された。さらに、ヒト抗デング抗体の存在を評価する抗体捕捉ELISAは、感染後2週間までに抗デングIgMを示し、続いて6週間目にIgGを示した。感染した一部のマウス由来の血清は、デングウイルスの中和が可能であることも見出された。
【００８５】
マクロファージは、デング熱病因において重要であるが、DENV感染症の初発変化は、マクロファージの関与前に開始するように見受けられる。とりわけ、樹状細胞（DC）は、単球またはマクロファージよりも、DENV感染に関して10倍許容性であることが示されている。マスト細胞も真皮組織および皮下組織中に存在し、蚊咬傷後間もなくデングウイルス粒子と接触することが予測されると考えられる。DCおよび血液単球およびマクロファージに加えて、マスト細胞は、抗体増強されたデングウイルス感染に感受性であり、複数の炎症メディエーター（例えば、IL-1、IL-6およびCCL5）が産生される。抗体増強されたマスト細胞のデングウイルス感染に関与するFcRは、FcγRIIa/bであるように見受けられる。本明細書の実施例2の表3に示されるように、SEQ ID NO：20は、FcγRIIa/bに対する免疫複合体の結合の阻止において、約90％効果的であった。したがって、SEQ ID NO：20などのポリペプチドは、DC、マスト細胞、マクロファージおよび単球におけるDENV感染のADEに対して、顕著な影響を有する可能性がある。
【００８６】
循環免疫複合体（CIC）も、DHFの免疫病因において役割を担う場合がある。C1qにより、IgG被覆されたラテックス粒子の凝集に対するCICの阻害活性に基づいて、CICはDHF患者の血清中に検出されている（Agnello et al. (1970) Immunol. 19:909-919；およびAgnello et al. (1971) J. Exp. Med. 134：228-241）。このラテックス技術は、DHFの初期過程の間の患者の血清中でICの存在を実証し得る、簡単で半定量的な方法を提供する（Ruangjirachuporn et al. (1979) Clin. Exp. Immunol. 36:46-53）。さらに、大型のラージ細胞（Raji cell）免疫蛍光法（Theophilopoulous (1976）J. Clin. Invest. 57:169-82)は、大きいサイズのCICが、DHFの後期段階に発生することを示している。ラージ細胞を用いた吸着によるこれらの複合体の取り出しは、ラージ細胞免疫蛍光アッセイ、ならびにラテックス技術において反応性を減少させたか、または除去した。したがって、これらの研究は、DHF血清中のデング抗原-抗体複合体と、ラージ細胞表面との反応の特異性を確認した。さらに、ウイルスを含むICは、DHFを患う患者の解熱時に存続することが示されている。
【００８７】
本明細書の実施例3において検討されるように、不活性化されたDENV2ウイルス粒子（DENV-2 16681株）は、異種の、非DENV関連のペルオキシダーゼ-抗ペルオキシダーゼ免疫複合体に高度に（avidly）結合し得る。構造解析（Zhang et al. (2004) Structure 12:1607-1618）に基づく、高度な結合に関する可能性の高い理由は、DENVエンベロープタンパク質ドメインIIIが、同種IgGおよび異種IgGの免疫複合体の結合に関する役割を担う可能性があるというものである。弱くICに結合する第2のタンパク質は、非構造タンパク質1（NS1）であり、DENVに感染した個体の血清に多量に放出され、かつDENVウイルス粒子自体の内部に、およびDENVに感染した細胞の表面上にも見出される。非DENV関連の免疫複合体（PAP-IC）に対するDENV NS1の結合の結果、およびNB406
0005806112.tif 000026
によるICに対するNS1結合の阻害を、下記の実施例6に示す。さらに、実施例2の表3は、免疫複合体を形成したIgGに対する、FcyRIIaまたはFcyRIIbのいずれかの結合を、SEQ ID NO：20が90％を超えて阻害したことを示し、SEQ ID NO：20は、DENV抗体力価の部分中和により引き起こされるDCにおけるADEを抑制する可能性があることを示唆している。
【００８８】
Fc介在性免疫複合体形成を阻害するCH2-CH3結合ポリペプチドを使用するための方法
CH2-CH3結合ポリペプチドは、Fc介在性免疫複合体（IC）の形成のインビトロアッセイにおいて使用され得る。そのような方法は、例えば、Fc介在性IC形成を阻止するCH2-CH3クレフト結合ポリペプチドの能力を評価するために、有用である。インビトロの方法は、例えば、本明細書において提供されるポリペプチドの存在下および非存在下において、免疫グロブリン分子（例えば、抗原に結合した免疫グロブリン分子等）をエフェクター分子（例えば、mC1q、sC1q、FcR、およびFcRn、または別の抗体）に接触させる段階、および各試料においてIC形成レベルを決定する段階を包含し得る。IC形成レベルは、例えば、クマシーブルー染色もしくは銀染色を伴うポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、または免疫共沈降によって評価され得る。そのような方法は、当業者に公知であり、かつ例えば、感染性ウイルス疾患に関連するIC形成を阻害する候補ポリペプチドまたは候補化合物の能力を試験するために使用され得る。
【００８９】
本明細書において提供される方法はまた、Fc介在性IC形成を阻害することにより、対象においてIC形成を阻害するため、および対象において感染性ウイルス疾患を処置するためにも使用され得る。そのような方法は、例えば、本明細書に記載される任意のポリペプチド、または本明細書に記載される任意のポリペプチドを含有する組成物を、感染性ウイルス疾患（例えば、デング熱）を有する、または感染性ウイルス疾患を有するもしくは発症するリスクがある対象に投与する段階を包含し得る。例えば、ある方法は、アミノ酸配列
0005806112.tif 000027
を含むポリペプチドを含有する組成物を、個体に投与する段階を包含し得る。あるいは、ある方法は、アミノ酸配列
0005806112.tif 000028
を含むポリペプチドを、対象に投与する段階を包含し得る。
【００９０】
一部の態様において、ウイルス疾患がデング熱である場合、ポリペプチドは、DENVによるデング熱もしくはデング感染症のADEに関連するか、またはDENV感染症の増強の一因となるIC形成を阻害するために投与され得る。ポリペプチドは、例えば、DENV感染症の臨床的改善または組織学的改善もたらし得、DENV感染症の一つもしくは複数の組織学的特性の発症の改善または遅延をもたらし得、かつ/またはDENV感染症（例えば、DHFもしくはDSS等のDENV感染症）のADEを減少させ得る。一部の場合において、ポリペプチドは、FcγRに対する抗DENV異種IgG ICの結合を阻害し得、DENV感染症のADEの免疫病因をもたらすICの形成を阻害し得、IgG ICに対するDENVウイルス粒子の結合を阻害し得、IgG免疫複合体に対するDENVタンパク質（例えば、NS1）の結合を阻害し得、IgG ICに対するTNF-αの結合を阻害し得、FcγI、FcγIIa H131アレル、FcγIIa R131アレル、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa、もしくはFcyγIIIbに対するDENV-IgG ICの結合を阻害し得、かつ/またはmC1qもしくはsC1qに対するDENV-IgG ICの結合を阻害し得る。
【００９１】
本発明を、特許請求の範囲において記載される本発明の範囲を限定しない、以下に続く実施例においてさらに説明する。
【実施例】
【００９２】
CH2-CH3クレフトに対するリガンドの結合を測定するためのインビトロアッセイ
本明細書に記載されるポリペプチドおよび化合物による、FcR：（FcγRI、FcγIIa、FcγRIIb/c、FcγRIIIa/b）、FcRn、mC1qおよびsC1q等の免疫を調節する因子に対する、免疫複合体を形成したIgG Fcの結合の、（競合的）阻害を実証するため、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を包含するインビトロアッセイを使用した。例えば、本明細書の実施例、ならびに米国特許公報第20070225231号および同第20070276125号、およびPCT公報WO2007/030475号等を参照のこと。標準化された試薬およびELISAキットは、コストを減少させ、かつ実験の再現性を増加させるのに有用である。
【００９３】
標準的なELISAでは、抗原を合成樹脂製マイクロウェル上に免疫吸着させる。適切なブロッキングおよび洗浄の後に、抗原に対する特異性を有する一次抗体をマイクロウェルに添加する。もう1回の洗浄相の後に、一次抗体を対象とし、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）などの酵素マーカーを結合させた二次抗体をマイクロウェルに添加する。もう1回の洗浄サイクルの後に、適切な酵素基質を添加する。一次抗体に対する、二次抗体に対する、抗原/HRP結合物が形成されれば、結合した酵素が基質との発色化学反応を触媒し、それがマイクロプレートまたは分光光度計によって読み取られる。抗原および二次抗体/HRP結合物のレベルを標準化することにより、一次抗体の力価（可変）が確定される。標準的なELISAシステムでは、一次抗体は、Fabアームに位置するその相補性決定領域（CDR）を通して抗原と結合する。同様に、二次抗体/HRP結合物はそのCDR Fab領域を通して一次抗体と結合する。HRPは二次抗体のFc領域と結合されているため、直接的なFc結合は極めて限定的であるか無効化される。
【００９４】
この理由から、Fc領域の、免疫複合体を形成したIgG Fcと結合するリガンドとの結合を評価するために、「逆ELISA」法が使用されてきた。逆ELISAでは、酵素（例えばHRP）は二次抗体のFc部分と共有結合しない。その代わり、あらかじめ形成させたペルオキシダーゼ-ウサギ（またはマウス）抗ペルオキシダーゼIgG（「PAP」複合体）という免疫複合体を用いる。この方法において、HRPは抗原および酵素の両方のマーカーの役目を果たすが、Fc領域をブロックすることはない。この逆ELISAシステムにおいて、Fc CH2-CH3クレフト結合性リガンド（例えば、精製ヒトC1q）をマイクロウェルプレートと結合させた。競合物の非存在下では、PAP複合体が固定化リガンドと結合し、HRPとその基質との間の反応によってシグナルが生じる。このシグナルは、PAPの固定化リガンドとの結合を阻害したポリペプチドおよび化合物によって低下した。
【００９５】
実施例1 ‐ C1q結合の阻害
1ml蒸留水中で2μlのウサギ抗ペルオキシダーゼ抗体（Sigma Chemicals, 製品P7899）を50μlのペルオキシダーゼ（Sigma-Aldrich, P6782）と混合することによってPAP複合体を形成させた。PAP（100μl）は、100μlのペプチドと共に1時間プレインキュベートし、100μlは100μlのペプチドまたはヒトC1q（Quidel Corp.）と共に1時間プレインキュベートした。C1q/PAPおよびペプチド/PAP混合物（100μl）を、C1qをコーティングしたプレートを用いて30分間インキュベートした。洗浄の後に、プレートをATBS（Quidel Corp.）と共に15分間インキュベートし、405nmで読み取った。結果は表1に示されている。
【００９６】
【表１】
0005806112.tif 000029
【００９７】
0005806112.tif 000030
は、C1qの結合の最大の阻害をもたらし、これはC1q自体とほぼ等しかった。ペプチド
0005806112.tif 000031
はその次に優れた結果をもたらした。
【００９８】
実施例2 ‐ PAP-ICに対するFcR結合のSEQ ID NO:20による阻害
ひとたび逆ELISAプロトコールをC1qアッセイを用いて確立したところで、FcγIIa、FcγIIbおよびFcγIIIをC1qの代わりに用いるアッセイを再びデザインした。高精製FcγIIa、FcγIIbおよびFcγIII（R&D Systems, Minneapolis, MN）を合成樹脂製マイクロウェル上に免疫吸着させた。FcγR逆ELISAシステムを最適化した後に、精製FcγRに対する免疫複合体の結合を阻害する能力を調べるために、本明細書で提供されるポリペプチドを用いる簡単な競合阻害実験を実施した。
【００９９】
1：10希釈の高度に精製されたFcγIIa、FcγRIIbおよびFcγIIIを用いてFalconマイクロタイタープレートを被覆し、24時間インキュベートした。プレートを洗浄し、続いて5×BSAブロッキング溶液（Alpha Diagnostic International, San Antonio, Texas）で24時間ブロッキングした。実施例1に記載されるように、PAP免疫複合体を形成させた。100μlのペプチドと共に、PAP（100μl）を1時間プレインキュベートした。FcγR被覆されたプレートにPAP/ペプチド混合物を添加し、1時間インキュベートした。洗浄後、ABTS基質（Quidel Corp.）と共に、プレートを15分間インキュベートし、405 nmで読み取った。表2に結果を示す。
【０１００】
【表２】
0005806112.tif 000032
【０１０１】
ペプチド
0005806112.tif 000033
は、PAPとFcRとの結合に対して最も強い全体的な阻害をもたらすように見受けられ、ペプチド
0005806112.tif 000034
がそれに続いた。
【０１０２】
SEQ ID NO：20を用いた実験を繰り返した。1：10希釈の高度に精製されたFcγIIa（His131アレル、H161としても公知）、FcγIIbおよびFcγIIIbでCostarマイクロタイタープレートを被覆し、24時間インキュベートした。プレートを洗浄し、続いて10 mg/ml BSAブロッキング溶液で24時間ブロッキングした。実施例2に記載されるように、PAP免疫複合体を形成させた。100μlのペプチドと共に、PAP（100μl）を1時間プレインキュベートした。FcγR被覆されたプレートにPAP/ペプチド混合物を添加し、1時間インキュベートした。洗浄後、ABTS基質と共にプレートを15分間インキュベートし、405 nmで読み取った。表3に結果を示す。
【０１０３】
【表３】
0005806112.tif 000035
＊注意：（H131アレル）
【０１０４】
従って、SEQ ID NO：20は、可溶性PAP免疫複合体に対する、3つの全ての主要なFc受容体クラス（FcγI、FcγIIa/FcγIIbおよびFcγIII）の結合を阻害した。
【０１０５】
実施例3 - 不活性化されたDENV2ウイルス粒子は、非DENV免疫複合体に結合する
ELISA被覆緩衝剤（Alpha Diagnostic International）を使用して、約1 ngのDENV2（16681株；Microbix Corp.）をCostarマイクロタイタープレート上に、24時間4℃で被覆した。24時間後、ELISA洗浄溶液（Quidel Corp.）でプレートを5回洗浄し、高度に精製されたBSAで1時間ブロッキングした。5回の洗浄後、DENV被覆されたマイクロタイタープレートを用いて、PAP ICを1時間インキュベートした。1時間後、Quidel ELISA洗浄溶液でプレートを再度5回洗浄し、続いてABTS（Immunochem Corp.）と共に20分間インキュベートした。OD405 nmが高いほど、DENV2（16681）ウイルス粒子に対するDENV非関連免疫複合体（PAP-IC）の結合が高くなった。表4に結果を示す。
【０１０６】
【表４】
0005806112.tif 000036
【０１０７】
したがって、DENV2（16681）ウイルス粒子は、非DENV関連免疫複合体に高度に結合し、DENV流行地域に存在しうる非DENV、IC＋個体におけるDENVをADEにする。
【０１０８】
実施例4 - FcγIIa被覆されたプレートに対するDENV-IgG-ICの結合の阻害
ELISA被覆緩衝剤（Alpha Diagnostic International）を使用して、高度に精製された組換えヒトFcγIIa（R＆D Systems）を、プラスチックのマイクロウェル（Costarマイクロタイタープレート）上に、24時間 4℃で免疫吸着させた。24時間後、ELISA洗浄溶液（Quidel Corp.）でプレートを5回洗浄し、高度に精製されたBSAで1時間ブロッキングし、5回洗浄した。DENV回復期の個体に由来するポリクローナルの、プールされた、親和性精製された中和IgG（Calbiotech Dengue Fever IgG ELISA；Cat. No. DE050G4）と、不活性化されたDENV-2ウイルス粒子（16681株、Microbix Corp.）を組み合わせることによって、ヒト抗DENV2 ICを形成させた。1：250および1：500の段階希釈（ADEは、1：250〜1：500の血清希釈で最も明確であった）のDENV-IgG-ICの結果を、huFcγRIIa被覆されたマイクロタイターウェルに対するDENV-IgG-IC結合の阻害に対して試験した。阻害剤を含まない1：250希釈のDENV-IgG-IC、SEQ ID NO：20を含む1：250希釈のDENV-IgG-IC、阻害剤を含まない1：500希釈のDENV-IgG-IC、およびSEQ ID NO：20を含む1：500希釈のDENV-IgG-ICのいずれかを含む、huFcγRIIa被覆されたウェルを使用した結果を、表5に示す。
【０１０９】
【表５】
0005806112.tif 000037
【０１１０】
したがって、SEQ ID NO：20は、不活性化されたDENV2（16681株）-抗DENVポリクローナル回復期IgG-ICが含まれるICの、FcγIIa被覆されたプレートに対する結合を阻害する顕著な能力を示した。FcγIIaに対する、DENV-抗DENV（異種）ポリクローナル回復期IgG-ICの結合は、デング熱感染症のADEをもたらす主要な免疫学的機構であると見なされ、かつより深刻で、ことによると生命を脅かすDHF/DSSの主要な原因であると見なされることから、SEQ ID NO：20は、DHF/DSSの処置および/または予防の候補治療剤となる。
【０１１１】
実施例5 - DENV NS1に対する非DENV IC（PAP-IC）結合の阻害
ELISA被覆緩衝剤（Alpha Diagnostic International、San Antonio、Texas）を使用して、高度に精製された組換えDENV（100μgのデングウイルス組換えNS1；Prospec Tech）を、プラスチックのマイクロウェル（Costarマイクロタイタープレート）上に、24時間 4℃で免疫吸着させた。24時間後、ELISA洗浄溶液（Quidel Corp）でプレートを5回洗浄し、高度に精製されたBSAで1時間ブロッキングし、再度5回洗浄した。ペプチドなしで、またはSEQ ID NO：20と共に、1時間PAP ICをインキュベートした。1時間後、Quidel ELISA洗浄溶液でプレートを5回洗浄し、続いてABTS（Immunochem Corp.）と共に20分間インキュベートした。OD405 nmが高いほど、DENV NS1タンパク質に対するDENV非関連の免疫複合体（PAP-IC）の結合が高くなったことが観察された。表6に結果を示す。
【０１１２】
【表６】
0005806112.tif 000038
【０１１３】
したがって、SEQ ID NO：20は、PAP-ICが含まれるICの、組換えDENV NS1被覆されたプレートに対する結合を阻害する顕著な能力を示した。
【０１１４】
実施例6 - SEQ ID NO：20による、TNFα被覆されたプレートに対するPAP-IC結合の阻害
ELISA被覆緩衝剤（Alpha Diagnostic International）を使用して、高度に精製された組換えTNF-α（Sigma-Aldrich）を、プラスチックのマイクロウェル（Costarマイクロタイタープレート）上に、24時間4℃で免疫吸着させた。24時間後、ELISA洗浄溶液（Quidel Corp）でプレートを5回洗浄し、高度に精製されたBSAで1時間ブロッキングし、5回洗浄した。ペプチドなしで、またはペプチドSEQ ID NO：20と共に、1時間PAP ICをインキュベートした。1時間後、Quidel ELISA洗浄溶液でプレートを5回洗浄し、続いてABTS（Immunochem, Corp）と20分間インキュベートした。OD405 nmが高いほど、TNF-αに対するTNF-α非関連の免疫複合体（PAP-IC）の結合が強くなった。表7に結果を示す。
【０１１５】
【表７】
0005806112.tif 000039
【０１１６】
したがって、SEQ ID NO：20は、PAP-ICが含まれるICの、組換えTNFα被覆されたプレートに対する結合を阻害する顕著な能力を示した。
【０１１７】
実施例7 - DENV（2）に感染したインビボマウスモデルにおけるADEの実証
上に記載された、デングウイルス用のRAG2-/-γc-/-（RAG-hu）マウスモデルは、デングウイルス感染症および免疫性について、多くの重要かつ時宜を得た問題に対処するための他に例をみない研究手段を提供する（Kuruvilla et al. (2007) Virology 369: 143-152）。異種DENV IgG（すなわち、DENV1用の中和IgG；血清は、DENV1 IgGおよびDENV2感染性ウイルス粒子、またはDENV2 IgGおよびDENV1感染性ウイルス粒子等の、任意のDENV異種中和DENV感染症に由来し得る）を用いて、RAG-huマウスを受動的に免疫する。例えば、マウスを抗DENV1 IgGで受動的に免疫し、続いて、致死用量の、例えばDENV2ウイルスを接種する。配列
0005806112.tif 000040
を有するペプチドを、例えば1 mg/kg、10 mg/kg、100 mg/kg、および1,000 mg/kgの1日用量で、DENV感染時から腹腔内投与する。全体的な臨床徴候、体温等を毎日モニタリングする。DENV NS1もしくはDENVの複製、ならびにDENV NS1 ICおよびDENV-ICの存在に関する、血清ELISAまたはRT-PCRを毎日実施する。DENVに感染した瀕死マウスの部分集団を毎日屠殺し、上に記載されたDENV複製の測定値に加えて、血小板計測値、HCT/PCV値、AST/ALT値を確認する。DENVに感染し、
0005806112.tif 000041
で処置された同数のマウスを屠殺し、比較目的のため上記のように試験する。研究終了時に、全ての免疫学的プロファイルおよび複数のDENV許容組織の生検を含む剖検を実施する。ADE DENVに感染したマウスの最終的な解析を、ADE DENVに感染し、SEQ ID NO：20で処置されたマウスと比較する。
【０１１８】
その他の態様
本発明をその詳細な説明と共に説明してきたが、以上の説明は本発明を例示するためのものであって、その範囲を限定するものではなく、それは添付する特許請求の範囲によって規定されることが理解される必要がある。その他の局面、利点および変更は以下の特許請求の範囲に含まれる。
【配列表】
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