(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
滲出性ＡＭＤ患者が高親和性の抗ＶＥＧＦ抗体を用いた治療の利益を得る見込みが増加しているかどうかを予測する方法において、ｒｓ１７６１１に対応する補体Ｃ５因子遺伝子（Ｃ５）Ｉ８０２Ｖアレルにおける前記患者から単離したサンプルの遺伝子多型のスクリーニングを含み、ここで、対応する遺伝子型がＡＡ又はＡＧを含む場合、該患者は、前記治療の利益を得る見込みが増加している方法。
【請求項２】
前記抗ＶＥＧＦ抗体がハイブリドーマＡＴＣＣ（登録商標）ＨＢ１０７０９によって産生されるモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１として同一のエピトープに結合する、請求項１の方法。
【請求項３】
前記抗ＶＥＧＦ抗体が、次の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列：ＣＤＲＨ１（ＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮ；配列番号：１）、ＣＤＲＨ２（ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ；配列番号：２）及びＣＤＲＨ３（ＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶ；配列番号：３）を含む重鎖可変ドメイン並びに次の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列：ＣＤＲＬ１（ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ；配列番号：４）、ＣＤＲＬ２（ＦＴＳＳＬＨＳ；配列番号：５）及びＣＤＲＬ３（ＱＱＹＳＴＶＰＷＴ；配列番号：６）を含む軽鎖可変ドメインを有する、請求項２の方法。
【請求項４】
前記抗ＶＥＧＦ抗体がＹ０３１７の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを有する請求項３の方法。
【請求項５】
前記抗ＶＥＧＦ抗体がラニビツマブである、請求項１の方法。
【請求項６】
対応する遺伝子型がＡＡを含む請求項１から５の何れか一項の方法。
【請求項７】
対応する遺伝子型がＡＧを含む請求項１から５の何れか一項の方法。
【請求項８】
滲出性ＡＭＤ患者が、ｒｓ１７６１１に対応するＣ５ Ｉ８０２ＶアレルにおけるＡ／Ｇ遺伝子多型を含む遺伝子多型領域に特異的にハイブリダイズすることができる第一のオリゴヌクレオチド及び第二のオリゴヌクレオチドを含む、抗ＶＥＧＦ抗体を用いた治療の利益を得る見込みが増加しているかどうかを予測するためのキット。
【請求項９】
前記第一のオリゴヌクレオチドが第一のプライマーであって、第二のオリゴヌクレオチドが第二のプライマーである請求項８のキット。
【請求項１０】
前記第一のオリゴヌクレオチドが第一のプローブであって、第二のオリゴヌクレオチドが第二のプローブである請求項８のキット。
【請求項１１】
前記第一のオリゴヌクレオチド及び前記第二のオリゴヌクレオチドを、Ｉ８０２Ｖ Ｃ５アレルにおけるＡ／Ｇ遺伝子多型を含むＣ５遺伝子の一部を増幅するために用いてもよい請求項８または９のキット。
【請求項１２】
患者が滲出性ＡＭＤ又はＧＡを伴う非滲出性ＡＭＤを発症する見込みが増加しているかどうかを予測する方法において、ｒｓ１７６１１に対応するＣ５ Ｉ８０２Ｖアレルにおける前記患者から単離したサンプルの遺伝子多型のスクリーニングを含み、ここで、対応する遺伝子型がアレルＴ（ｉｌｅ）含む場合、該患者は、ＡＭＤを発症する見込みが増加している方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
この出願は、２００８年１１月５日に出願された米国仮出願番号第６１／１１１６６７号及び２００９年５月１日に出願された米国仮出願番号第６１／１７４８５６号に基づく米国特許法第１１９条の優先権を主張するものであり、出典明示によりその内容がここに取り込まれる。
【０００２】
本発明は、ヒトの疾患の治療に関する。より具体的には、本発明は加齢黄斑変性（ＡＭＤ）に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＡＭＤは、高齢者の深刻で不可逆的な失明の主たる原因である。Bressler (2004) JAMA 291:1900-01。ドルーゼとして知られている淡黄色の染み、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の破壊、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、及び円板状黄斑変性を含む、臨床及び病理学的見解の広域なスペクトルによって特徴付けられる。病状は２つの形態：非滲出性（乾燥）及び滲出性（湿性又は血管新生）に分類される。最近、滲出性ＡＭＤの治療のための幾つかの治療が承認されている−ベルテポルフィン（Ｖｉｓｕｄｙｎｅ（登録商標））；ＶＥＧＦ−結合アプタマー、ペガプタニブ（Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標））；及び抗ＶＥＧＦ抗体断片、ラニビツマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））。
【０００４】
遺伝子の多型は、治療剤に対する疾患の発症又は進行及び応答を含み、特定の遺伝子における異なる遺伝子座が異なる遺伝子型を生ずる際に、集団において発生する。ＡＭＤの発症又は進行に関連する複数の多型が同定された（例えば、Despriet等(2007) Arch. Ophthalmol. 125:1270-71; Seddon等(2007) JAMA 297:1793-99, 2585; Boon等(2008) Am. J. Human Genet. 82:516-23）。以前の研究は、補体因子Ｈ（ＣＦＨ）遺伝子のアミノ酸位置４０２における特定の多型が、ベルテポルフィンを用いたＰＤＴ又はＡＭＤに対するラベルなしのベバシツマブ治療に関連することを示した(Brantley等(2008) Eye published online 22 February, pp. 1-6; Brantley等(2007) Ophthalmology 114:2168-73)。特定の治療の効率又は安全性を予測する多型の同定は、それらから最大の利益を得る患者に対するより優れたテーラー治療に使用され得る。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、一部は、ＡＭＤのリスク又は高親和性の抗ＶＥＧＦ抗体を用いた治療がＡＭＤを伴う患者に有益である見込みが増加していることを予測する遺伝子多型の同定に基づく。
【０００６】
一態様では、本発明は、滲出性ＡＭＤ患者が高親和性の抗ＶＥＧＦ抗体を用いた治療の利益を得る見込みが増加しているかどうかを予測する方法において、ｒｓ１０６１１７０に対応する補体Ｈ因子遺伝子（ＣＦＨ）Ｙ４０２Ｈアレルにおける前記患者から単離したサンプルの遺伝子多型のスクリーニングを含み、ここで、対応する遺伝子型がＣＣ又はＣＴを含む場合、該患者は、前記治療の利益を得る見込みが増加している方法を提供する。他の態様では、滲出性ＡＭＤ患者が抗ＶＥＧＦ抗体を用いた治療の利益を得る見込みが増加しているかどうかを予測する方法において、ｒｓ１７６１１に対応する補体Ｃ因子遺伝子（Ｃ５）Ｉ８０２Ｖアレルにおける前記患者から単離したサンプルの遺伝子多型のスクリーニングを含み、ここで、対応する遺伝子型がＡＡ又はＡＧを含む場合、該患者は、前記治療の利益を得る見込みが増加している方法を提供する。更に他の態様では、滲出性ＡＭＤ患者が抗ＶＥＧＦ抗体を用いた治療の利益を得る見込みが増加しているかどうかを予測する方法において、ｒｓ１０４９０９２４に対応するＨＴＲＡ１Ａ６９Ｓアレルにおける前記患者から単離したサンプルの遺伝子多型のスクリーニングを含み、ここで、対応する遺伝子型がＧＴを含む場合、該患者は、前記治療の利益を得る見込みが増加している方法を提供する。幾つかの実施態様では、該方法は更に抗ＶＥＧＦ抗体を用いた患者の治療を含む。
【０００７】
幾つかの実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体がハイブリドーマＡＴＣＣ（登録商標）ＨＢ１０７０９によって産生されるモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１として同一のエピトープに結合する。幾つかの実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体が、次の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列：ＣＤＲＨ１（ＧＹＤＦＴＨＹＧＭＮ；配列番号：１）、ＣＤＲＨ２（ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ；配列番号：２）及びＣＤＲＨ３（ＹＰＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦＤＶ；配列番号：３）を含む重鎖可変ドメイン並びに次の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列：ＣＤＲＬ１（ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ；配列番号：４）、ＣＤＲＬ２（ＦＴＳＳＬＨＳ；配列番号：５）及びＣＤＲＬ３（ＱＱＹＳＴＶＰＷＴ；配列番号：６）を含む軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体がＹ０３１７の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを有する。幾つかの実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体がラニビツマブである。
【０００８】
他の態様では、本発明は滲出性ＡＭＤ患者が、ｒｓ１０６１１７０に対応するＣＦＨ Ｙ４０２ＨアレルにおけるＣ／Ｔ遺伝子多型に特異的な第一のオリゴヌクレオチド及び第二のオリゴヌクレオチドを含む、ラニビツマブを用いた治療の利益を得る見込みが増加しているかどうかを予測するためのキットを提供する。幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチドを、ＣＦＨ Ｙ４０２ＨアレルにおけるＣ／Ｔ遺伝子多型を含むＣＦＨ遺伝子の一部を増幅するために用いてもよい。
【０００９】
他の態様では、本発明は滲出性ＡＭＤ患者が、ｒｓ１７２１６５２９に対応するＣ５ Ｉ８０２ＶアレルにおけるＡ／Ｇ遺伝子多型に特異的な第一のオリゴヌクレオチド及び第二のオリゴヌクレオチドを含む、抗ＶＥＧＦ抗体を用いた治療の利益を得る見込みが増加しているかどうかを予測するためのキットを提供する。幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチドを、Ｉ８０２Ｖ Ｃ５アレルにおけるＡ／Ｇ遺伝子多型を含むＣＦＨ遺伝子の一部を増幅するために用いてもよい。
【００１０】
他の態様では、本発明は滲出性ＡＭＤ患者が、ｒｓ１０４９０９２４に対応するＨＴＲＡ１ Ａ６９ＳアレルにおけるＧ／Ｔ遺伝子多型に特異的な第一のオリゴヌクレオチド及び第二のオリゴヌクレオチドを含む、抗ＶＥＧＦ抗体を用いた治療の利益を得る見込みが増加しているかどうかを予測するためのキットを提供する。幾つかの実施態様では、オリゴヌクレオチドを、ＨＴＲＡ１ Ａ６９ＳアレルにおけるＧ／Ｔ遺伝子多型を含むＣＦＨ遺伝子の一部を増幅するために用いてもよい。
【００１１】
他の態様では、本発明は患者がＡＭＤを発症する見込みが増加しているかどうかを予測する方法において、ｒｓ１７２１６５２９に対応するＣ５Ｉ１４５Ｖアレルにおける前記患者から単離したサンプルの遺伝子多型のスクリーニングを含み、ここで、対応する遺伝子型がＧＧ又はＡＧを含む場合、該患者は、ＡＭＤを発症する見込みが増加している方法を提供する。
【００１２】
他の態様では、本発明は患者が滲出性又はＧＡ ＡＭＤを伴う非滲出性ＡＭＤを発症する見込みが増加しているかどうかを予測する方法において、ｒｓ１７６１１に対応するＣ５ Ｉ８０２Ｖアレルにおける前記患者から単離したサンプルの遺伝子多型のスクリーニングを含み、ここで、対応する遺伝子型がアレルＴ（ｉｌｅ）含む場合、該患者は、ＡＭＤを発症する見込みが増加している方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の実施は、特に明記しない限り、当業者の技術範囲内の分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技術を使用して行う。このような技術は、例えば以下のような文献に完全に明記されている。「Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition」 (Sambrook et al., 1989)；「Oligonucleotide Synthesis」(M. J. Gait, ed., 1984)；「Animal Cell Culture」(R. I. Freshney, ed., 1987)；「Methods in Enzymology」(Academic Press, Inc.)；「Current Protocols in Molecular Biology」(F. M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates)；「PCR: The Polymerase Chain Reaction」(Mullis et al., ed., 1994)。
【００１４】
特に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は全て、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。Singleton 等, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2版, J. Wiley &amp; Sons (New York, N.Y. 1994)、及びMarch, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4版, John Wiley &amp; Sons (New York, N.Y. 1992)により当業者は本出願に使用した多くの用語の一般的な理解が得られる。
【００１５】
特許出願及び刊行物を含む本明細書において引用されるすべての文献は、出典明記によってその全体が援用される。
【００１６】
定義
ここで使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は文脈が明らかに他の意味になっていない限り、複数形を含む。例えば、「細胞("a" cell)」は複数の「細胞」を含む。
【００１７】
「含む」なる用語は、組成物及び方法が記載の要素を含むが、他を排除しないことを意図する。
【００１８】
「ＶＥＧＦ」及び「ＶＥＧＦ-Ａ」なる用語は交換可能に用いられ、Leung等 Science, 246:1306 (1989)、及びHouck等 Mol. Endocrin., 5:1806 (1991)により記載されているような、１６５アミノ酸の血管内皮細胞増殖因子及び関連する１２１、１８９、及び２０６アミノ酸の血管内皮細胞増殖因子を、その天然に生じる対立遺伝子及び加工型と共に、意味する。
【００１９】
「抗ＶＥＧＦ抗体」は十分な親和性及び特異性でＶＥＧＦに結合する抗体である。好ましくは、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体はＶＥＧＦ活性が関与している疾患又は状態をターゲティング及び干渉する場合の治療薬として使用できる。抗ＶＥＧＦ抗体は通常は他のＶＥＧＦ相同体、例えばＶＥＧＦ−Ｂ又はＶＥＧＦ−Ｃ、又は他の成長因子、例えばＰＩＧＦ、ＰＤＧＦ又はｂＦＧＦには結合しない。好ましい抗ＶＥＧＦ抗体はハイブリドーマＡＴＣＣ（登録商標）ＨＢ１０７０９により生産されるモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体である。「高親和性抗ＶＥＧＦ抗体」は、モノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１よりＶＥＧＦに対して少なくとも１０倍高い親和性を有する。好ましくは、抗ＶＥＧＦ抗体は、Ｙ０３１７のＣＤＲ又は可変領域を含む、国際公開第９８／４５３３１号に従って産生した組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体断片である。より好ましくは、抗ＶＥＧＦ抗体は、ラニビツマブ（Ｌｕｄｅｎｔｉｓ（登録商標））として知られる抗体断片である。
【００２０】
「抗体」という用語は最も広義に使用され、モノクローナル抗体（完全長又は無傷モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片を含む。
【００２１】
「治療」とは施療的な治療及び予防的又は防止的な手段の両方を指す。治療が必要なものはすでに障害を有する者並びに障害を防止すべき者を包含する。
【００２２】
「多型」なる用語は、集団において変化する配列の位置を指す。多型は異なる「アレル」から成る。このような多型の位置は、遺伝子中のその位置及びそこで見出される異なるアミノ酸又は塩基によって同定され得る。例えば、Ｙ４０２Ｈ ＣＦＨは、ＣＦＨ遺伝子中のアミノ酸位置４０２におけるチロシン（Ｙ）及びヒスチジン（Ｈ）の間に変異があることを示す。このアミノ酸変化は、２つの異なるアレルである、２つの可能な変異塩基、Ｃ及びＴの結果である。遺伝子型は、２つの離れたアレルから成るので、幾つかの可能な変異体の何れかは、任意の一つの固体で観察され得る（例えば、この例としては、ＣＣ、ＣＴ、又はＴＴ）。固体の多型はまた、当業者に知られた固有の識別子（「参照ＲＮＰ」、「ｒｅｆＳＮＰ」又は「ｒｓ＃」）を割り当てられ、例えば、ＮＣＢＩウェブサイト上で利用可能なSingle Nucleotide Polymorphism Database (dbSNP) of Nucleotide Sequence Variationにおいて使用される。
【００２３】
「遺伝子型」は、細胞又は組織サンプル中の特定の遺伝子の特定のアレルを指す。上の例では、ＣＣ、ＣＴ、又はＴＴは、Ｙ４０２Ｈ ＣＦＨ多型において可能な遺伝子型である。
【００２４】
「サンプル」なる用語は、患者の細胞又は組織の使用を含む。例えば、サンプルは、皮膚サンプル、頬細胞サンプル又は血液細胞を含み得る。
【００２５】
サンプル中の特定の遺伝子型の同定は、当業者によく知られた幾つかの方法の何れかによって実施され得る。例えば、多型の同定は、アレルのクローニング及び当業者によく知られた技術を用いてシークエンシングによって達成され得る。その代わりに、遺伝子配列は、ゲノムＤＮＡから、例えば、ＰＣＲ及びシークエンスシングした生成物を用いて増幅され得る。考慮する遺伝子座の変異について、患者のＤＮＡを解析する幾つかの非限定的な方法を下に記載する。
【００２６】
ＤＮＡマイクロテクノロジー、例えば、ＤＮＡチップ装置及びハイスループットスクリーニングアプリケーションのための高密度マイクロアレイ及び低密度マイクロアレイを使用し得る。マイクロアレイの製造方法は、当業者に知られ、種々のインクジェットとマイクロジェット蒸着又はスポッティング技術または方法、インサイツ又はチップ上のフォトリソグラフィーのオリゴヌクレオチド合成方法、及び電気ＤＮＡプローブアドレッシングプロセスを含む。ＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーションアプリケーションを、点変異、一塩基多型（ＳＮＰ）、及び縦列型反復配列（ＳＴＲ）の遺伝子発現解析及び遺伝子型決定の領域に首尾良く適用した。更なる方法は、干渉ＲＮＡマイクロアレイとマイクロアレイとレーザーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）及びクロマチン免疫沈降（Ｃｈｉｐ）のような他の方法の組み合わせを含む。He等(2007) Adv. Exp. Med. Biol. 593:117-133及びHeller (2002) Annu. Rev. Biomed. Eng. 4:129-153を参照されたい。他の方法は、ＰＣＲ、ｘＭＡＰ、インベイダーアッセイ、質量分析計、及びパイロシーケンスを含む(Wan等(2007) Microarray Technology and Cancer Gene Profiling Vol 593 of book series Advances in Experimental Medicine and Biology, pub. Springer New York)。
【００２７】
別の検出方法は、多型部位と重複し、多型部位の周辺に約５、又は１０、又は２０、又は２５、又は３０ヌクレオチドを有する、プローブを用いたアレル特異的ハイブリダイゼーションである。例えば、アレル変異体に特異的にハイブリダイズすることが可能な幾つかのプローブを、例えば「チップ」のような固相の支持体に結合させる。オリゴヌクレオチドは、リソグラフィーを含む種々の方法によって固体の支持体に結合し得る。また「ＤＮＡプローブアッセイ」と呼ばれオリゴヌクレオチドを含む、これらのチップを使用する変異体検出法は、例えば、Cronin等(1996) Human Mutation 7:244に記載されている。
【００２８】
他の検出方法では、アレル変異体を同定する前に遺伝子の少なくとも一部を最初に増幅する必要がある。増幅は、例えば、ＰＣＲ及び／又はＬＣＲ又は他の当該分野でよく知られた方法によって実施することができる。
【００２９】
幾つかの場合、検体のＤＮＡにおける特定のアレルの存在を、制限酵素解析によって示することができる。例えば、特定のヌクレオチド多型は、別のアレル変異体のヌクレオチド配列がない制限部位を含むヌクレオチド配列を生じ得る。
【００３０】
更なる実施態様では、切断剤（例えば、ヌクレアーゼ、ヒドロキシルアミン又は四酸化オスミウム及びピペリジン）からの保護を用いて、ＲＮＡ／ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＤＮＡ、又はＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖中のミスマッチした塩基を検出するもの（例えば、Myersら, (1985) Science 230:1242）が挙げられる。一般に、「ミスマッチ切断」技術は、遺伝子のアレル変異体のヌクレオチド配列を含む、標識してもよい、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡのようなコントロールの核酸を、サンプルの組織から得た例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡのようなサンプルの核酸とハイブリダイズすることによって形成されるヘテロ二重鎖を提供することからはじめる。二本鎖の二重鎖を、対照とサンプル鎖間の塩基対ミスマッチから生じるものなどの二重鎖の一本鎖領域を切断する薬剤で処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖をＲＮアーゼで処理し、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドをＳ１ヌクレアーゼで処理してミスマッチした領域を酵素的に消化してもよい。その代わりに、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のいずれかを、ミスマッチした領域を消化するためにヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムでおよびピペリジンで処理してもよい。ミスマッチ領域を消化した後、得られた物質を次いで変性ポリアクリルアミドゲルで大きさによって分離してコントロールとサンプルの核酸が同一のヌクレオチド配列を有するか又はそれらのヌクレオチドが異なるかを決定する。例えば、米国特許第６４５５２４９号、Cotton等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4397; Saleeba等(1992) Meth. Enzymol. 217:286-295を参照されたい。
【００３１】
特定のアレル変異体を同定するために、電気泳動移動度の変化を用いてもよい。例えば、突然変異体と野生型核酸間の電気泳動移動度の相違を検出するために一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）を用いてもよい（Orita等(1989) Proc Natl. Acad. Sci USA 86:2766; Cotton (1993) Mutat. Res. 285:125-144及びHayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79）。サンプルおよび対照核酸の一本鎖ＤＮＡ断片を変性させ、次いで再生させる。一本鎖核酸の二次構造は配列によって異なり、得られる電気泳動移動度の変化によって単一塩基の変化でさえも検出できる。ＤＮＡ断片を標識してもよいし、または標識したプローブで検出してもよい。アッセイの感度は、二次構造が配列変化により敏感であるＲＮＡ（ＤＮＡではなく）を用いることで増強され得る。別の好ましい実施態様では、この方法は二本鎖のヘテロ二重鎖分子を電気泳動移動度の変化を基に分離するためにヘテロ二重鎖解析を用いることもある（Keenら(1991) Trends Genet. 7:5）。
【００３２】
アレル変異体の種類を、変性勾配ゲル電気泳動（Myers等(1985) Nature 313:495）を用いてアッセイした、変性剤の勾配を含むポリアクリルアミドゲルの多型領域を含む核酸の移動を解析することによって得てもよい。ＤＧＧＥを解析の方法として使用する際、ＤＮＡを、例えば、ＰＣＲによって約４０ｂｐの高融点ＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプを付加することによって完全な変性を妨げるよう修飾する。更なる実施態様では、変性勾配の代わりに温度勾配を用いて、対照およびサンプルＤＮＡの移動度の相違を同定してもよい（Rosenbaum and Reissner (1987) Biophys. Chem. 265:1275）。
【００３３】
２つの核酸の間の少なくとも１のヌクレオチドの差異を検出するための技術の例は、限定されるものではないが、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長が挙げられる。例えば、既知の多型ヌクレオチドが中心に位置するオリゴヌクレオチドプライマーを調製し（アレル特異的プローブ）、次いで、完全なマッチが見られる場合にのみハイブリダイズが可能となる条件下で標的ＤＮＡとハイブリダイズさせればよい（Saiki等(1986) Nature 324:163); Saiki等(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230）。かかるアレル特異的オリゴヌクレオチドを、遺伝子の多型領域のヌクレオチド変化の検出に用いることができる。例えば、特定のアレル変異体のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをハイブリダイズ膜に結合させ、この膜を次いで標識化したサンプルの核酸とハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションシグナルの解析は次いでサンプルの核酸のヌクレオチドの種類を示し得る。
【００３４】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存するアレル特異的増幅技術を用いてもよい。特異的増幅用オリゴヌクレオチドプライマーに、（増幅がディファレンシャル・ハイブリダイゼーションに依存するように）分子の中心に注目する突然変異を保持させてもよいし（Gibbs等(1989) Nucl. Acids Res. 17:2437-2448）、または、適当な条件下でミスマッチがポリメラーゼ伸長を妨げ得るか、減少させ得る場合には、一方プライマーの３'末端に保持させてもよい（Prossner (1993) Tibtech 11:238 and Newton等(1989) Nucl. Acids Res. 17:2503）。この技術はまたProbe Oligo Baseの「ＰＲＯＢＥ」とも呼ばれる。更に、切断塩基検出のために、変異の領域に新しい制限部位を導入することが望ましいであろう（Gasparini 等 (1992) Mol. Cell. Probes 6:1）。
【００３５】
別の実施態様では、アレル変異体の同定は、例えば、米国特許第４９９８６１７号及びLaridegren, U.等Science 241:1077-1080 (1988)に記載の通り、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）を用いて実施される。ＯＬＡプロトコルは、標的の単一鎖の隣接配列にハイブリダイズすることができるように設計された２つのオリゴヌクレオチドを使用する。オリゴヌクレオチドの一つは、例えば、ビオチン化された分別マーカーに結合し、他は検出できるようにラベル化される。正確な相補配列が、標的分子上に見出された場合、オリゴヌクレオチドはその末端隣接にハイブリダイズし、ライゲーション基質をつくる。次いでライゲーションは、ラベル化ヌクレオチドを、アビジン、又は他のビオチンリガンドを使用して回収することを可能にする。Nickerson, D. A.等は、ＰＣＲとＯＬＡを組み合わせた核酸検出アッセイについて記載している(Nickerson, D. A.等(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8923-8927)。この方法では、ＰＣＲを、次にＯＬＡを使用して検出される標的ＤＮＡの指数関数的増加に達成するために使用される。
【００３６】
本発明は、ＣＦＨ及びＣ５における一塩基多型（ＳＮＰ）を検出するための方法を提供する。一塩基多型は、不変配列の側にあり、その分析は単一の変異体ヌクレオチドの種類の決定にすぎず、各患者の完全な遺伝子を決定する必要はない。幾つかの方法が、ＳＮＰの分析を容易にするために開発されている。
【００３７】
一塩基多型は、例えば、米国特許第４６５６１２７号に開示の通り、特定のエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを使用して検出され得る。該方法に従って、多型部位の直ぐ３’側のアレル配列に相補的なプライマーは、特定の動物又はヒトから得た標的分子にハイブリダイズし得る。標的分子上の多型部位が存在する特定のエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体に相補的であるヌクレオチドを含む場合、該誘導体は、ハイブリダイズしたプライマーの末端に取り込まれ得る。このような導入は、プライマーをエキソヌクレアーゼ耐性にし、よってその検出を可能にする。サンプルのエキソヌクレアーゼ耐性誘導体の種類は知られているので、プライマーがエキソヌクレアーゼに耐性であるという見解は、標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドが、反応に使用されるヌクレオチド誘導体に相補的であることを示す。この方法は、大量の抽出配列データを決定する必要が無いという利点を有する。
【００３８】
溶液ベースの方法を、多型部位のヌクレオチドの種類の決定に使用してもよい（国際公開第９１／０２０８７号）。上記の通り、多型部位の直ぐ３’側のアレル配列に相補的なプライマーが使用される。該方法は、多型部位のヌクレオチドに相補的な場合、プライマーの末端に挿入され得る、ラベル化したジデオキシヌクレオチド誘導体を使用して、その部位におけるヌクレオチドの種類を決定する。
【００３９】
代替の方法は、国際特許第９２／１５７１２号に記載される。この方法は、多型部位の３’配列に相補的なラベル化したターミネーターとプライマーの混合物を使用する。取り込まれるラベル化ターミネーターは、したがって評価する標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドによって決定され、相補的である。該方法は、通常、プライマー又は標的分子が固相に固定化される、異種相アッセイである。
【００４０】
ＤＮＡにおける多型部位をアッセイするための、多くの他のプライマー誘導ヌクレオチド導入方法が記載されている（Komher, J. S.等(1989) Nucl. Acids. Res. 17:7779-7784; Sokolov, B. P. (1990) Nucl. Acids Res. 18:3671; Syvanen, A.-C.,等(1990) Genomics 8:684-692; Kuppuswamy, M. N.等(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1143-1147; Prezant, T. R.等(1992) Hum. Mutat. 1: 159-164; Ugozzoli, L.等(1992) GATA 9:107-112; Nyren, P.等(1993) Anal. Biochem. 208:171-175）。これらの方法は、全て多型部位の塩基の区別をするためにラベル化したデオキシヌクレオチドを導入することに依存している。
【００４１】
また、遺伝子又は遺伝子産物又は多型誘導体における変化を検出するための上記の方法の何れかを、治療又は療法の過程を監視するために使用し得る。
【００４２】
ここに記載の方法は、例えば、患者がＡＭＤを発症する見込みが増加しているか、又は滲出性ＡＭＤの患者が、抗ＶＥＧＦ抗体を用いた治療の利益を得る見込みが増加してるかどうかを決定するために、便宜上使用され得る、少なくとも一のプローブ又はプライマー核酸を含む、例えば、下記に記載したような、プレパックした診断キットを用いて、実施し得る。
【００４３】
上記の診断及び予測法に使用するためのサンプルの核酸は、検体の任意の細胞型又は組織から得たサンプルから得ることができる。例えば、検体の体液（例えば、血液）は、知られている技術によって得ることができる。その代わりに、核酸試験は、乾燥サンプル（例えば、髪又は肌）において実施し得る。
【００４４】
ここに記載の発明は、Ｙ４０２Ｈ ＣＦＨ、Ｉ１４５Ｖ Ｃ５、及びＩ８０２Ｖ Ｃ５アレルを含む幾つかのアレルに存在するアレルを決定し、同定するための方法と組成物に関連する。プローブは、サンプルの遺伝子型を直接決定するために使用し得るか又は同時に若しくは増幅に続いて使用し得る。「プローブ」なる用語は、天然又は組み替えの一本鎖又は二本鎖核酸又は化学的に合成した核酸を含む。それらは、ニックトランスレーション、クレノーフィルイン反応、ＰＣＲ又は他の当該分野で知られた方法でラベル化し得る。本発明のプローブ、その調製及び／又はラベル化は、上掲のSambrook等(1989) に記載されている。プローブは、本発明の多型領域を含む核酸に選択的にハイブリダイズするために適切な任意の長さのポリヌクレオチドであり得る。プローブの長さは、部分的には、使用するアッセイの性質及び用いたハイブリダイゼーションの条件に依存し得る。
【００４５】
ラベル化したプローブはまた多型の増幅と組み合わせて使用し得る（Holland等(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280）。米国特許第５２１００１５号は、ＰＣＲ中の増幅産物のリアルタイムの測定を提供するための蛍光ベースのアプローチを記載する。このようなアプローチは、存在する二重鎖ＤＮＡの量を示ための、インターカレートする色素（例えばエチジウムブロマイド）を用いるか、又は濃度が存在する二重鎖ＤＮＡの量に比例する蛍光分子を放出するための増幅の過程でプローブが切断される、蛍光−クエンチャーペア（「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」アプローチとも呼ばれる）を含むプローブを用いる。増幅の過程で、蛍光分子のクエンチャー分子からの分離を引き起こすための標的配列にハイブリダイズした際、ポリメラーゼのヌクレアーゼ活性によって、プローブは消化され、レポーター分子からの蛍光が引き起こされる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アプローチは、多型を含む標的ポリヌクレオチド領域に特異的にアニールするレポーター分子−クエンチャー分子を含むプローブを用いる。
【００４６】
プローブは、「遺伝子チップ」として使用するために表面に取り付けることができる。このような遺伝子チップは、当業者に知られている幾つかの技術によって遺伝子変異を検出するために使用し得る。一つの技術では、米国特許第６０２５１３６号及び第６０１８０４１号に概説されるように、ハイブリダイゼーションアプローチによるシークエンシングによって、オリゴヌクレオチドをＤＮＡ配列を決定するための遺伝子チップ上に配置する。本発明のプローブはまた遺伝子配列の蛍光検出のために使用し得る。このような技術は、例えば、米国特許第５９６８７４０号及び５８５８６５９号に記載されている。プローブはまた、米国特許第５９５２１７２号及びKelley, S. O.等(1999) Nucl. Acids Res. 27:4830-4837に記載されるように、核酸配列の電気化学的検出のために電極表面に配置し得る。
【００４７】
更に、プローブ又はプライマーとして使用する単離した核酸は、より安定にするために改変し得る。改変された例示的な核酸分子は、ＤＮＡのホスホロアミデート、ホスホロチオエート及びメチルホスホネートアナログを含む（米国特許第５１７６９９６号；５２６４５６４号及び５２５６７７５号をまた参照されたい）。
【００４８】
ここで記載される通り、本発明は、ＣＦＨ又はＣ５中に存在する多型領域のアレル変異体の型を決定するための診断方法をまた提供する。幾つかの実施態様では、該方法は、ＣＦＨ又はＣ５の多型領域に相補的なヌクレオチド配列を含むプローブ又はプライマーを使用する。
【００４９】
幾つかの実施態様では、本発明は、高親和性抗ＶＥＧＦ抗体を含む、滲出性ＡＭＤ患者が、抗ＶＥＧＦ抗体を用いた治療の利益を得る見込みが増加しているかどうかを決定するためのキットを提供する。このようなキットは、ここに記載の一又は複数の組成物及び使用のための説明書を含む。例としてのみ、本発明は、滲出性ＡＭＤ患者が、第一のヌクレオチド及びＹ４０２Ｈ ＣＦＨアレル中のＣ／Ｔ多型に特異的な第二のオリゴヌクレオチドを含む、ラニビツマブを用いた治療の利益を得る見込みが増加しているかどうかを決定するためのキットをまた提供する。遺伝子座に「特異的な」オリゴヌクレオチドは、遺伝子座の多型領域又は遺伝子座の多型領域の周辺に結合する。増幅のためにプライマーとして使用し得るオリゴヌクレオチドについて、多型領域を含むポリヌクレオチドを産生するために使用するために十分に近接している場合、プライマーは隣接している。一実施態様では、例えば、多型より１ｋｂ未満のような、約１−２ｋｂ以内に結合する場合、オリゴヌクレオチドは隣接している。特定のオリゴヌクレオチドは、配列にハイブリダイズすることができ、適切な条件下で、単一のヌクレオチドによって区別される配列に結合し得ない。
【００５０】
キットはＣＦＨ又はＣ５の多型領域に特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１のプローブ又はプライマー及び使用のための説明書を含み得る。キットは通常、上記の核酸の少なくとも一を含む。少なくともＣＦＨ又はＣ５を増幅するためのキットは、２個のプライマーを含み、そのうちの少なくとも一つは、アレル変異体配列にハイブリダイズすることができる。このようなキットは、例えば、蛍光検出、電気化学的検出、又は他の検出によって遺伝子型を検出するために適切である。
【００５１】
プローブ又はプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、キット中で検出できるようにラベル化され得る。ラベルは、例えば、蛍光ラベルを直接検出するか、又は間接的に検出し得る。間接的な検出は、ビオチン−アビジン相互作用、抗体結合などを含む、当業者に知られている任意の検出方法を含み得る。蛍光でラベル化したオリゴヌクレオチドはまたクエンチする分子を含み得る。オリゴヌクレオチドは、表面に結合し得る。幾つかの実施態様では、表面はシリカ又はガラスである。幾つかの実施態様では、表面は金属電極である。
【００５２】
本発明の更に別のキットは、アッセイを実施するために必要な少なくとも一の試薬を含む。例えば、キットは酵素を含み得る。その代わりに、キットは、バッファー又は任意の他の必要な試薬を含み得る。
【００５３】
キットは、ＣＦＨ又はＣ５の多型領域における検体の遺伝子型を決定するための、ここに記載のポジティブコントロール、ネガティブコントロール、試薬、プライマー、シークエンシングマーカー、プローブ及び抗体の全て又は幾つかを含み得る。
【００５４】
以下の実施例は、本発明の実施を例証することだけを意図しており、限定を意図するものではない。
【実施例】
【００５５】
実施例１．ＣＦＨ、ＨＴＲＡ１及びＣ５における遺伝子多型及びＡＭＤ発症との関係及び治療の結果
多型
我々は、ラニビツマブを用いた抗ＶＥＧＦ治療の好ましい結果に関連する変化について、種々の多型を試験した。ＡＭＤ感受性に関連することが以前に報告されている５つの遺伝子座からの８つのアレルであるため、これらの多型を選択し、調べた（表１）。具体的には、補体因子Ｈ（ＣＦＨ）、ＨＴＲａセリンペプチダーゼ／加齢黄斑変性感受性２（ＨＴＲＡ１／ＡＲＭＳ２）、補体因子２／補体因子Ｂプレタンパク質（Ｃ２／ＢＦ）、補体因子３（Ｃ３）からの単一アレル、及びケモカイン（Ｃ−Ｘ３−Ｃモチーフ）レセプター（ＣＸＣＲ１）をＴａｑＭａｎ（登録商標）システムを介した定量ＰＣＲを用いたＤＡＷＮ試験からの３５２ＡＭＤサンプルにおいて遺伝子型を同定した。更に、我々は補体因子５（Ｃ５）の２つのアレルを調べた（表２）。表１の全てのアッセイの遺伝子型を調べるために、ＡＢＩに提供される標準的な実験プロトコルを使用した。簡潔には、アッセイは、次のサイクル条件：５０℃で２分、９５℃で１０分、次いで９２℃で１５秒及び６０℃で１分の４０サイクルを用いて、ＡＢＩ７５００装置で行った。
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【００５６】
サンプル
ＨＯＲＩＺＯＮ伸長試験のＤＡＷＮ遺伝子サブ試験に参加したＬｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）ピボタル試験（ＭＡＲＩＮＡ、ＡＮＣＨＯＲ、及びＦＯＣＵＳ）からの３５２個の未同定検体からの末梢血サンプルを回収し、ゲノムＤＮＡを単離した。全てのサンプルは血管新生ＡＭＤを診断で確認し６０％は女性の患者からのものであり、基底における平均年齢は、シャム／ＰＤＴについて７５．０歳であり、処置したラニビツマブについて７５．６歳であった。試験における全ての患者から書面でインフォームド・コンセントを得、試験プロトコルは、治験審査委員会によって承認を得た。ＤＮＡをＤＮｅａｓｙＴｉｓｓｕｅキット（Qiagen, Valencia, CA）を用いて抽出した。ＳＮＰをＴａｑＭａｎ（登録商標）−ベースのリアルタイム−ＰＣＲを用いて遺伝子型同定した。ＳＮＰの２つについては、カスタムプライマーを使用し（表４）、他の６つについては、ＡＢＩ所有権のプライマーを使用した（表３）。２Ｃ５ＳＮＰ（表５に示すオリゴヌクレオチド）をＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅプラットフォームを用いたカスタム９６ＳＮＰアッセイパネルの一部として同定した。
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【００５７】
臨床情報
ＭＡＲＩＮＡ、ＡＮＣＨＯＲ及びＦＯＣＵＳ Ｌｕｃｅｎｔｉｓ試験からの臨床情報を調べた。具体的には、自己同定された人種、性別、初期試験ベースラインにおける年齢に関する情報、初期試験治療グループ、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ投与、２年目における治療選択肢に対する交差、投与エラーの存在、試験眼の文字におけるベースライン（ＢＬ）の最良の矯正視力（ＶＡ）スコア、他眼のＢＬのＶＡスコア（文字）、１２ヶ月目における試験眼ＶＡスコア（文字）、１２ヶ月目における他眼のＶＡスコア（文字）、ＢＬの他眼における血管新生ＡＭＤの存在、及び試験眼のＢＬのＣＮＶ分類。
【００５８】
感受性分析に対する関係
公共で利用可能な資源から得たコントロールのサンプルに対するＤＡＷＮケースのアレルの頻度を比較することにより、８個のアレルの疾患感受性への関係を調べた。コントロールのアレルの頻度のｒｓ１０４９０９２４、ｒｓ１４１０９９６、ｒｓ９３３２７３９、及びｒｓ３７３２３７８情報について、アレル頻度は、Wellcome Trust Case Control consortium (WTCCC (2007) Nature 447:661-78)から無料で利用可能な要約統計から得た。コントロールのアレル頻度と残りのＳＮＰに対する遺伝子型のカウントを、ｒｓ１１２００６３８３、ｒｓ２２３０１９９６、ｒｓ５４７１５４１の関係を報告した論文から得た。関係統計は、標準の２ｘ２の結果表を使用して計算した。
【００５９】
ベースラインの臨床特徴に対する遺伝子型の関係
ベースラインの視力（ＶＡ）に対する８個のアレルの関係づけは、共変量としてベースラインに付加した年齢の存在下又は非存在下、定量特性として、ベースラインにおける試験眼のＶＡ（文字）を用いて実施した。３つの遺伝子型分類を、平均のベースラインＶＡにおける重大な差異について調べた。分析は、ＰＬＩＮＫソフトウェア (Purcell等 (2007) Am. J. Hum. Genet. 81:559-75)を用いて行った。他眼における血管新生ＡＭＤの存在に対する８個のアレルの関係と、ベースラインにおける試験眼の血管新生分類（minimally型、predominantly型、occultなし型）を調べた。臨床特性の頻度は、遺伝子型とｔ検定で決定した優位性で階層化した。
【００６０】
ＤＡＷＮにおけるＡＭＤリスクアレルの強化
以前に公表された見解を確認すると、全ての８遺伝子座からのアレルが、Ｐ＜０．０５で血管新生ＡＭＤのリスクに関係した。しかし、ＣＸ３ＣＲ１遺伝子座からのアレルだけが、当所の報告に一致した関係を示さなかった。ＤＡＷＮサンプルのうち、ＣＸ３ＣＲ１遺伝子座が１．１２のオッズ比を有し、当所の報告の３より大きいオッズ比に反する。有意な関係がｒｓ１７２１６５２９（Ｃ５ Ｉ１４５Ｖ）とＡＭＤを伴う個体の他眼における脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）の発生の間で観察された。更に、ｒｓ１７６１１（Ｃ５ Ｉ８０２Ｖ）と滲出性ＡＭＤ、ＧＡ ＡＭＤを伴う非滲出性、又は両者の発生との間で関係が観察された（表７）。その関係はＧＡ ＡＭＤの場合よりもＡＭＤの場合（ｐ＝０．００１４）によりも強固であった。
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【００６１】
ベースラインの臨床特性に対するアレルの関係
ベースラインにおける視力に対する８アレルの有意な関係性は見出されなかった。ＣＦＨ Ｙ４０２ＨアレルとＨＴＲＡ１ Ａ６９Ｓアレルのリスクアレルの数は、サンプルの他眼の血管新生ＡＭＤの有病率に関連し、これらの遺伝子座の遺伝子型と疾患の重大さの関係を示唆した。ＣＦＨ Ｙ４０２Ｈアレルは、ベースラインの試験眼の血管新生ＡＭＤの「predminantly型」サブタイプに関係した。ｒｓ１４１０９９６のイントロンＣＦＨアレルは、ＣＮＶと古典的ＣＮＶにおける損傷の領域に関係し、Ｃ５ Ｉ８０２Ｖアレルは古典的ＣＮＶの損傷の領域に関連した。
【００６２】
遺伝子型のラニビツマブ治療に対する応答との関係
ＤＡＷＮサンプルをＭＡＲＩＮＡ、ＡＮＣＨＯＲ及びＦＯＣＵＳ試験の間の治療状況に基づき３つのグループに分類した。ラニビツマブで処理したグループは、０．３ｍｇ、０．５ｍｇ又は０．５ｍｇ＋ＰＤＴの投与を受ける患者を含んだ。ＳＨＡＭ／ＰＤＴグループは、モック注射（ＳＨＡＭ）又は光線力学療法（ＰＤＴ）のみを受ける個体から構成された。１２ヶ月の治療後の視力（ＶＡ、文字で測定した）の変化の関係を８個のアレルのそれぞれの遺伝子型に対する関係について試験した。治療応答における有意な差がＣＦＨ Ｙ４０２Ｈ、Ｃ５ Ｉ８０２Ｖ、及びＨＴＲＡ１ Ａ６９Ｓ遺伝子座における遺伝子型と関係した（表８、９及び１０）。これらの変化は、毎月ラニビツマブで処理した患者のＶＡの変化に関連した。１２ヶ月目のＶＡの平均の変化は、Ｙ４０２Ｈ ＣＣ、ＣＴ及びＴＴの遺伝子型についてそれぞれ、＋１４．５、＋１０．８及び＋７．０文字；Ｉ８０２Ｖ ＡＡ、ＡＧ及びＧＧの遺伝子型についてそれぞれ、＋１５．６、＋１２．２及び＋８．８；Ａ６９Ｓ ＧＧ、ＧＴ及びＴＴの遺伝子型についてそれぞれ＋９．３、＋１４．１及び＋１０．５であった。ＣＦＨ Ｙ４０２Ｈアレルについて、１２ヶ月目におけるＹ４０２Ｈ ＣＣ、ＣＴ、及びＴＴについてのそれぞれ−４．８、−１０．２及び−１１．５のＢＣＶＡの平均変化を伴うコントロールグループ（ＳＨＡＭ／ＰＤＴ）における、逆対応する傾向が観察された。コントロールとラニビツマブ治療グループの間の平均ＢＣＶＡ１２ヶ月の結果における差異は、Ｙ４０２Ｈリスク遺伝子型の全てで同じであった。
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【配列表】
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