(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシisoleucyl-tRNA synthetase（ＩＡＲＳ）遺伝子（配列番号２）の一部または全部を有する単離されたＤＮＡであって、
ＩＡＲＳｃＤＮＡ（配列番号１）の３０６番目の塩基を含み、
前記塩基がＣであることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項２】
ウシ個体において、子牛虚弱症候群に罹患していること、または、子牛虚弱症候群のキャリアであることを診断するためのマーカーであって、  ウシisoleucyl-tRNA synthetase（ＩＡＲＳ）遺伝子の一部または全部を有する単離されたポリヌクレオチドからなり、  前記ポリヌクレオチドは、前記ＩＡＲＳ遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号１）の３０６番目の塩基がＣである変異を含むことを特徴とするマーカー。
【請求項３】
ウシ個体において、子牛虚弱症候群に罹患していること、または、子牛虚弱症候群のキャリアであることを診断するためのマーカーであって、
機能欠失型isoleucyl-tRNA synthetase（ＩＡＲＳ）タンパク質、あるいは、機能欠失型ＩＡＲＳタンパク質をコードするｍＲＮＡであることを特徴とするマーカーであって、
前記機能欠失型ＩＡＲＳタンパク質が、ウシＩＡＲＳタンパク質（配列番号３）の７９番目のアミノ酸がＬｅｕである変異を有することを特徴とする、マーカー。
【請求項４】
ウシ個体において、子牛虚弱症候群に罹患していること、または、子牛虚弱症候群のキャリアであることを診断するためのキットであって、
isoleucyl-tRNA synthetase（ＩＡＲＳ）遺伝子の一部または全部を有する単離されたポリヌクレオチドにおいて、前記ＩＡＲＳ遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号１）の３０６番目の塩基がＣである変異を含む領域を増幅するためのプライマーペアを含むことを特徴とするキット。
【請求項５】
請求項４に記載のキットであって、
さらに制限酵素を含み、
前記制限酵素は、前記プライマーペアによって増幅された領域が前記遺伝子の機能欠失型変異を有するか否かに依存して、前記プライマーペアによって増幅された領域の切断様式が異なること特徴とするキット。
【請求項６】
請求項５のキットであって、
前記制限酵素がＨｉｎｃＩＩであることを特徴とするキット。
【請求項７】
ウシ個体において、子牛虚弱症候群に罹患していること、または、子牛虚弱症候群のキャリアであることを診断するための診断方法であって、
isoleucyl-tRNA synthetase（ＩＡＲＳ）遺伝子のジェノタイプを調べる工程と、
前記ウシ個体から単離されたゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡにおいて、isoleucyl-tRNA synthetase（ＩＡＲＳ）遺伝子が野生型であるか機能欠失型変異を有するかを調べる工程と、
を含む診断方法であって、
前記機能欠失型変異が、ウシＩＡＲＳｃＤＮＡ（配列番号１）における３０６番目の塩基がＣであることを特徴とする診断方法。
【請求項８】
請求項７に記載の診断方法であって、
前記ゲノムＤＮＡに野生型ＩＡＲＳ遺伝子が存在しない場合、または、前記ｍＲＮＡに野生型ＩＡＲＳ遺伝子から転写されたｍＲＮＡが存在しない場合、前記ウシ個体が、子牛虚弱症候群の罹患個体であると診断し、
前記ゲノムＤＮＡに野生型ＩＡＲＳ遺伝子と機能欠失型変異を有するＩＡＲＳ遺伝子が存在する場合、または、前記ｍＲＮＡに野生型ＩＡＲＳ遺伝子から転写されたｍＲＮＡと機能欠失型変異を有するＩＡＲＳ遺伝子から転写されたｍＲＮＡが存在する場合、前記ウシ個体が子牛虚弱症候群のキャリア個体であると診断する診断方法。
【請求項９】
ウシ個体において、子牛虚弱症候群に罹患していることを診断するための診断方法であって、
前記ウシ個体における、野生型isoleucyl-tRNA synthetase（ＩＡＲＳ）タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量、あるいは、野生型ＩＡＲＳタンパク質の発現量を測定する工程を含むことを特徴とする診断方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の診断方法であって、
前記発現量が検出できない場合に、前記ウシ個体が子牛虚弱症候群に罹患していると診断することを特徴とする診断方法。
【請求項１１】
子牛虚弱症候群のキャリアであるウシ個体の同定方法であって、
子牛虚弱症候群を発症していないウシ個体から単離されたゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡにおいて、isoleucyl-tRNA synthetase（ＩＡＲＳ）遺伝子の機能欠失型変異を有するか否かを調べる工程と、
前記ゲノムＤＮＡに野生型ＩＡＲＳ遺伝子と機能欠失型変異を有するＩＡＲＳ遺伝子が存在するウシ個体、または、前記ｍＲＮＡに野生型ＩＡＲＳ遺伝子から転写されたｍＲＮＡと機能欠失型変異を有するＩＡＲＳ遺伝子から転写されたｍＲＮＡが存在するウシ個体を同定する工程とを含むことを特徴とする同定方法であって、
前記機能欠失型変異が、ウシＩＡＲＳｃＤＮＡ（配列番号１）の３０６番目の塩基がＣであることを特徴とする同定方法。
【請求項１２】
子牛虚弱症候群に罹患したウシ個体において、isoleucyl-tRNA synthetase（ＩＡＲＳ）遺伝子が、前記子牛虚弱症候群の原因であるかどうかを決定する方法であって、
子牛虚弱症候群に罹患したウシ個体、または、子牛虚弱症候群のキャリアであるウシ個体において、ＩＡＲＳ遺伝子の塩基配列の一部または全部を決定する工程と、
決定された前記塩基配列と、野生型ＩＡＲＳ遺伝子（配列番号２）の塩基配列とを比較する工程と、
決定された前記塩基配列に機能欠失型変異が存在するか否かを決定する工程と、
を含むことを特徴とする方法であって、
前記機能欠失型変異が、ウシＩＡＲＳｃＤＮＡ（配列番号１）の３０６番目の塩基がＣであることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウシ個体における子牛虚弱症候群を診断するためのマーカー及びそれを用いたウシ個体における子牛虚弱症候群の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
子牛虚弱症候群とは、正常な子牛に比較してウシ個体が虚弱な症状を示す疾患の総称であり、その病態は、例えば、起立不能、自力哺乳困難、食欲不振、貧血、体温不正、虚脱、発育不良、易感染性など様々である。黒毛和種においては、出生牛に対する発症率は２〜５%とされ、出生直後に死亡したり治療が必要となったりするため、経済的な損失が大きい。子牛虚弱症候群は、例えば、先天性免疫機能不全（非特許文献１、２参照）、鉄欠乏性貧血（非特許文献２参照）、レストスピラ菌の感染（非特許文献３参照）等との関連が指摘されているものの、特定の遺伝病に起因する、あるいは近交退化の結果であるとの結論は示されていなかった。そのため、子牛の出生以前に子牛虚弱症候群の発症を予測すること、あるいは、罹患個体の発生を予防することができなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Takasu et al., J. Vet. Med. Sci. 70(11), 1173-1177, 2008
【非特許文献２】Watanabe et al., J. Vet. Med. Sci. 68(12), 1251-1255, 2006
【非特許文献３】Smyth et al., Vet. Rec. 145(19), 539-542, 1999
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ウシ個体における子牛虚弱症候群を診断するためのマーカー及びそれを用いたウシ個体における子牛虚弱症候群の診断方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、前記目的を達成するために研究を重ねた結果、本疾患は常染色体劣性遺伝病であることを明らかにし、密接に関連するウシイソロイシルtRNA合成酵素（isoleucyl-tRNA synthetase；ＩＡＲＳ）遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：５０９８８５）を同定することに成功した。このＩＡＲＳ遺伝子の翻訳領域における１塩基置換により、７９番目のアミノ酸残基のバリンがロイシンに置換され、ＩＡＲＳの機能が損なわれることはアミノ酸変異の影響を調べるソフトウェアであるPolyPhen-2によって予測された。また、上記のアミノ酸変異のホモ個体は子牛虚弱症候群と診断された個体に限って見出され、ランダムな正常牛群１４５１頭において見出されなかったことからこの変異は子牛虚弱症候群と密接に関連することが示され、本発明を完成するに至った。
【０００６】
本明細書において「ウシ」はBos属の動物を指し、例えば、Bos taurus種の家畜牛、Bos javanicus種のバンテン（野生牛）、Bos indicus種のコブウシなどが含まれる。
【０００７】
本明細書において、塩基の位置に関する記載は特記しない限り、ＤＮＡ２重鎖のうち、センス鎖の塩基によって示す。また、塩基の位置は、例えば、isoleucyl-tRNA synthetase （ＩＡＲＳ）ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＢＣ１５１４８４、配列番号１）の３０６番目というように、基準となる塩基配列中で、当該塩基配列の５’から３’側方向に数えることで特定されているが、実際のウシ個体の塩基配列中では、その塩基は、基準となる塩基配列中で特定した塩基に対応する位置にあればよく、その塩基が含まれるゲノムＤＮＡ上に塩基の欠失や挿入がある場合には、必ずしも塩基の位置を表わす数字まで一致する必要はない。
【０００８】
本発明に係るＤＮＡは、ウシisoleucyl-tRNA synthetase（ＩＡＲＳ）遺伝子（配列番号２）の一部または全部を有する単離されたＤＮＡであって、ＩＡＲＳｃＤＮＡ（配列番号１）の３０６番目の塩基を含み、前記塩基がＣであることを特徴とする。
【０００９】
本発明に係るマーカーは、ウシ個体において子牛虚弱症候群に罹患していること、または、子牛虚弱症候群のキャリアであることを診断するためのマーカーであって、ウシisoleucyl-tRNA synthetase（ＩＡＲＳ）遺伝子の一部または全部を有する単離されたポリヌクレオチドからなり、前記ポリヌクレオチドは、前記ＩＡＲＳ遺伝子の機能欠失型変異を含むことを特徴とする。ここで、本マーカーについて、前記ＩＡＲＳ遺伝子の機能欠失型変異が、ウシＩＡＲＳｃＤＮＡ（配列番号１）の３０６番目の塩基における変異であることが好ましい。
【００１０】
本発明に係るマーカーは、ウシ個体において子牛虚弱症候群に罹患していること、または、子牛虚弱症候群のキャリアであることを診断するためのマーカーであって、機能欠失型isoleucyl-tRNA synthetase（ＩＡＲＳ）タンパク質、あるいは、機能欠失型ＩＡＲＳタンパク質をコードするｍＲＮＡであることを特徴とする。ここで、本マーカーについて、前記機能欠失型ＩＡＲＳタンパク質が、ウシＩＡＲＳタンパク質（配列番号３）の７９番目のアミノ酸における変異を有することが好ましい。
【００１１】
本発明に係るキットは、ウシ個体において子牛虚弱症候群に罹患していること、または、子牛虚弱症候群のキャリアであることを診断するためのキットであって、isoleucyl-tRNA synthetase（ＩＡＲＳ）遺伝子の一部または全部を有する単離されたポリヌクレオチドにおいて、前記ＩＡＲＳ遺伝子の機能欠失型変異を含む領域を増幅するためのプライマーペアを含むことを特徴とする。ここで、本キットについて、前記機能欠失型変異が、ウシＩＡＲＳｃＤＮＡ（配列番号１）の３０６番目の塩基における変異であることが好ましく、さらに制限酵素を含み、前記制限酵素は、前記プライマーペアによって増幅された領域が前記遺伝子の機能欠失型変異を有するか否かに依存して、前記プライマーペアによって増幅された領域の切断様式が異なることがさらに好ましく、前記制限酵素がＨｉｎｃＩＩであることがより好ましい。
【００１２】
本発明に係る、ウシ個体において子牛虚弱症候群に罹患していること、または、子牛虚弱症候群のキャリアであることを診断するための診断方法は、isoleucyl-tRNA synthetase（ＩＡＲＳ）遺伝子のジェノタイプを調べる工程を含むことを特徴とする。ここで、本診断方法について、前記ウシ個体から単離されたゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡにおいて、isoleucyl-tRNA synthetase（ＩＡＲＳ）遺伝子が野生型であるか機能欠失型変異を有するかを調べる工程を含むことが好ましい。また、前記ゲノムＤＮＡに野生型ＩＡＲＳ遺伝子が存在しない場合、または、前記ｍＲＮＡに野生型ＩＡＲＳ遺伝子から転写されたｍＲＮＡが存在しない場合、前記ウシ個体が、子牛虚弱症候群の罹患個体であると診断し、前記ゲノムＤＮＡに野生型ＩＡＲＳ遺伝子と機能欠失型変異を有するＩＡＲＳ遺伝子が存在する場合、または、前記ｍＲＮＡに野生型ＩＡＲＳ遺伝子から転写されたｍＲＮＡと機能欠失型変異を有するＩＡＲＳ遺伝子から転写されたｍＲＮＡが存在する場合、前記ウシ個体が子牛虚弱症候群のキャリア個体であると診断することがさらに好ましい。さらに、本診断方法について、前記機能欠失型変異が、ウシＩＡＲＳｃＤＮＡ（配列番号１）における３０６番目の塩基の変異であることがより好ましく、前記機能欠失型変異が、ＧからＣへの変異であることがより好ましい。
【００１３】
本発明に係る、ウシ個体において子牛虚弱症候群に罹患していることを診断するための診断方法は、前記ウシ個体における、野生型isoleucyl-tRNA synthetase（ＩＡＲＳ）タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量、あるいは、野生型ＩＡＲＳタンパク質の発現量を測定する工程を含むことを特徴とする。ここで、本診断方法について、前記発現量が検出できない場合に、前記ウシ個体が子牛虚弱症候群に罹患していると診断することが好ましい。
【００１４】
本発明に係る、子牛虚弱症候群のキャリアであるウシ個体の同定方法は、子牛虚弱症候群を発症していないウシ個体から単離されたゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡにおいて、isoleucyl-tRNA synthetase（ＩＡＲＳ）遺伝子の機能欠失型変異を有するか否かを調べる工程と、前記ゲノムＤＮＡに野生型ＩＡＲＳ遺伝子と機能欠失型変異を有するＩＡＲＳ遺伝子が存在するウシ個体、または、前記ｍＲＮＡに野生型ＩＡＲＳ遺伝子から転写されたｍＲＮＡと機能欠失型変異を有するＩＡＲＳ遺伝子から転写されたｍＲＮＡが存在するウシ個体を同定する工程とを含むことを特徴とする。ここで、本同定方法について、前記機能欠失型変異が、ウシＩＡＲＳｃＤＮＡ（配列番号１）の３０６番目の塩基における、ＧからＣへの変異であることが好ましい。
【００１５】
本発明に係る、子牛虚弱症候群に罹患したウシ個体において、isoleucyl-tRNA synthetase（ＩＡＲＳ）遺伝子が、前記子牛虚弱症候群の原因であるかどうかを決定する方法は、子牛虚弱症候群に罹患したウシ個体、または、子牛虚弱症候群のキャリアであるウシ個体において、ＩＡＲＳ遺伝子の塩基配列の一部または全部を決定する工程と、決定された前記塩基配列と、野生型ＩＡＲＳ遺伝子の塩基配列とを比較する工程と、決定された前記塩基配列に機能欠失型変異が存在するか否かを決定する工程と、を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によると、ウシ個体における子牛虚弱症候群を診断するためのマーカー及びそれを用いたウシ個体における子牛虚弱症候群の診断方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の一実施形態において、ウシ、ヒト、チンパンジー、テナガザル、マウス、ラット、イヌ、ウマ、ジャイアントパンダ、ウサギ、ニワトリ、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュのＩＡＲＳタンパク質において、ウシＩＡＲＳタンパク質（配列番号３）の７９番目に対応するアミノ酸の周辺領域のアミノ酸配列を比較した図である。
【図２】本発明の一実施形態において、黒毛和種の大脳、小脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、骨格筋、舌、食道、第１胃、第２胃、第３胃、第４胃、十二指腸、回腸、直腸、盲腸、子宮、卵巣におけるＩＡＲＳｍＲＮＡの発現量を示す図である。
【図３】本発明の一実施形態において、子牛虚弱症候群のキャリア黒毛和種個体（レーン１、５）、子牛虚弱症候群の発症黒毛和種個体（レーン２、３）、健常黒毛和種個体（レーン４、６）のゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲ産物を制限酵素ＨｉｎｃＩＩで消化したＤＮＡ断片のパターンを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
【００１９】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.; M. A. Innis, D. M. Gelfaud, J. J. Snindky & T. J. White (Ed.), PCR protocols: a guide to methods and applications, Academic Press, Inc., New York (1990); M. J. McPherson, P. Quirke & G. R. Taylor (Ed.), PCR: a practical approach, IRL Press, Oxford (1991)等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００２０】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示または説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００２１】
＝＝マーカー＝＝
子牛虚弱症候群は、ウシのＩＡＲＳ遺伝子の機能を欠失させる変異（機能欠失型変異）に起因する疾患である。ゲノムＤＮＡ上に野生型ＩＡＲＳ遺伝子が存在しない場合、そのウシ個体は、子牛虚弱症候群に罹患する（本明細書では、罹患個体とも呼ぶ）。一方、その個体が少なくとも１つの野生型ＩＡＲＳ遺伝子を有すれば、そのウシ個体は、子牛虚弱症候群に罹患せず、子牛虚弱症候群を発症しないから、表現型は正常である（本明細書では、正常個体とも呼ぶ）。ただし、そのウシ個体が、野生型ＩＡＲＳ遺伝子を有する場合であっても、機能欠失型変異を有するＩＡＲＳ遺伝子（本明細書では、変異型ＩＡＲＳ遺伝子とも呼ぶ）を少なくとも１つ有していれば、そのウシ個体は、子牛虚弱症候群のキャリアとなり（本明細書では、キャリア個体とも呼ぶ）、変異型ＩＡＲＳ遺伝子を１つも有さなければ、そのウシ個体は、子牛虚弱症候群に罹患せず、キャリアにもならない（本明細書では、健常個体とも呼ぶ）。
【００２２】
従って、例えば、そのウシ個体がゲノム上のＩＡＲＳ遺伝子座に１つずつ、２コピーのＩＡＲＳ遺伝子のアリルを有する場合、すなわち、通常のＩＡＲＳ遺伝子以外に、余分な遺伝子コピーを有さない場合に、２つのアリルが機能欠失型変異を有すれば、そのウシ個体は子牛虚弱症候群の罹患個体となり、１つのアリルだけが機能欠失型変異を有すれば、そのウシ個体は子牛虚弱症候群のキャリア個体となり、２つのアリルが野生型であれば、その個体は健常個体となる。
【００２３】
本明細書において、ウシ個体が「子牛虚弱症候群に罹患している」とは、そのウシ個体が、子牛虚弱症候群を発症していてもしていなくてもよく、そのウシ個体が野生型ＩＡＲＳ遺伝子を１つも有さないことを意味する。なお、３コピー以上のＩＡＲＳ遺伝子のアリルを有する場合、全てのコピーが同じ変異型ＩＡＲＳ遺伝子であっても、または、異なる変異型ＩＡＲＳ遺伝子が含まれていてもよい。
【００２４】
また、本明細書において、ウシ個体が「子牛虚弱症候群を発症している」とは、そのウシ個体が子牛虚弱症候群に罹患していることに起因して、正常な個体では必要とされないケアや治療が必要とされる程度に虚弱症状を呈することを指し、虚弱症状の重軽により制限されない。虚弱症状の例として、起立不能、自力哺乳困難、食欲不振、貧血、体温不正、虚脱、発育不良、易感染性が挙げられる。
【００２５】
子牛虚弱症候群の罹患個体では、野生型ＩＡＲＳ遺伝子を１つも有さないので、ＩＡＲＳ遺伝子から転写されたｍＲＮＡ中に野生型ＩＡＲＳ遺伝子から転写されたｍＲＮＡが存在しない。子牛虚弱症候群のキャリア個体では、野生型ＩＡＲＳ遺伝子から転写されたｍＲＮＡと変異型ＩＡＲＳ遺伝子から転写されたｍＲＮＡが存在する。そして、健常個体では、野生型ＩＡＲＳ遺伝子から転写されたｍＲＮＡのみが存在し、変異型ＩＡＲＳ遺伝子から転写されたｍＲＮＡは存在しない。このように、子牛虚弱症候群は、ＩＡＲＳ遺伝子から転写されたｍＲＮＡの種類とも関連する。
【００２６】
従って、ＩＡＲＳ遺伝子の一部または全部を有する単離されたポリヌクレオチドであって、機能欠失型変異を含むポリヌクレオチドは、ウシ個体が子牛虚弱症候群の罹患個体であること、子牛虚弱症候群のキャリア個体であること、または、健常個体であることを診断するためのマーカーとして使用できる。
【００２７】
また、前述のように、そのウシ個体が少なくとも１つの野生型ＩＡＲＳ遺伝子を有していれば、子牛虚弱症候群に罹患せず、そのウシ個体が野生型ＩＡＲＳ遺伝子のみを有していれば、子牛虚弱症候群に罹患せず、キャリアにもならない。従って、野生型ＩＡＲＳ遺伝子を含むポリヌクレオチドは、ウシ個体が子牛虚弱症候群の罹患個体であること、子牛虚弱症候群のキャリア個体であること、または、健常個体であることを診断するためのマーカーとして使用できる。
【００２８】
ここで、ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡやｃＤＮＡ等のＤＮＡであっても、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであってもよい。
【００２９】
なお、本明細書において、野生型ＩＡＲＳ遺伝子とは、機能欠失型変異を有さないＩＡＲＳ遺伝子であって、個体内でその発現が失われた場合に子牛虚弱症候群を引き起こすウシＩＡＲＳ遺伝子を指し、機能欠失型変異以外の、塩基の置換、挿入、欠失などが生じた遺伝子であってもよい。野生型ＩＡＲＳ遺伝子は、配列番号２のウシＩＡＲＳ遺伝子（Ｇｅｎｅ ＩＤ：５０９８８５）、並びに、配列番号２のウシＩＡＲＳ遺伝子において、機能欠失型変異以外の、塩基の置換、挿入、欠失などが生じている遺伝子である。
【００３０】
本明細書において、ＩＡＲＳ遺伝子における機能欠失型変異とは、そのウシ個体におけるＩＡＲＳ遺伝子の全コピーがその機能欠失型変異を有する場合に、そのウシ個体が子牛虚弱症候群に罹患する、全ての変異を指す。従って、そのウシ個体におけるＩＡＲＳ遺伝子の全コピーが変異を有していても子牛虚弱症候群に罹患しない場合には、その変異は機能欠失型変異には含まれないものとする。一方、ＩＡＲＳ遺伝子の発現を事実上無くさせる変異は、機能欠失型変異に含まれる。機能欠失型変異は、遺伝子上の位置、塩基の種類によって限定されず、例えば、点突然変異、欠失突然変異、挿入突然変異等のいずれであってもよい。
【００３１】
ここで、ＩＡＲＳ遺伝子は、isoleucyl-tRNA synthetase（イソロイシルｔＲＮＡ合成酵素、ＩＡＲＳ）タンパク質をコードする遺伝子である。ウシ個体が、ＩＡＲＳ遺伝子の機能欠失型変異に起因して子牛虚弱症候群に罹患していれば、ＩＡＲＳタンパク質自体が生成されずそのウシ個体に存在しなくても、あるいは、機能欠失型変異を有するＩＡＲＳタンパク質（本明細書では、変異型ＩＡＲＳタンパク質とも呼ぶ）がそのウシ個体に存在していてもよい。
【００３２】
例えば、変異型ＩＡＲＳタンパク質を発現している場合、ＩＡＲＳ遺伝子における機能欠失型変異がアミノ酸置換を引き起こすものであって、翻訳により生成されるタンパク質が、このアミノ酸置換によって機能欠失型ＩＡＲＳタンパク質となる変異であってもよい。ウシであれば、ＩＡＲＳ遺伝子ｃＤＮＡ（配列番号１）の３０６番目の塩基のＧからＣへの変異は、ウシＩＡＲＳタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＤＡＡ２６５８６、配列番号３）の７９番目のアミノ酸のバリンからロイシンへの置換を引き起こす。あるいは、ＩＡＲＳ遺伝子における機能欠失型変異がナンセンス変異であって、翻訳によって生成される変異型ＩＡＲＳタンパク質が短鎖化される変異であってもよい。
【００３３】
ここで、ウシＩＡＲＳタンパク質の７９番目に対応するアミノ酸は、ヒトから魚類までの脊椎動物全般で広く保存され、このアミノ酸の周辺領域はＩＡＲＳタンパク質の正常な機能に不可欠である。このアミノ酸のバリンからロイシンへの置換は、ＩＡＲＳタンパク質の機能を欠失させる。
【００３４】
このように、子牛虚弱症候群に罹患したウシ個体、あるいは、子牛虚弱症候群のキャリアであるウシ個体において、変異型ＩＡＲＳ遺伝子が転写されてｍＲＮＡが生成し、変異型ＩＡＲＳタンパク質が発現する場合には、このような変異型ＩＡＲＳタンパク質、及び、変異型ＩＡＲＳタンパク質をコードするｍＲＮＡ（本明細書では、変異型ＩＡＲＳｍＲＮＡとも呼ぶ）等も、ウシ個体が子牛虚弱症候群の罹患個体であること、子牛虚弱症候群のキャリア個体であること、または、健常個体であることを診断するためのマーカーとして使用できる。
【００３５】
また、子牛虚弱症候群に罹患したウシ個体、あるいは、子牛虚弱症候群のキャリアであるウシ個体において、ＩＡＲＳ遺伝子における機能欠失型変異に起因し、野生型ＩＡＲＳタンパク質の発現量が、健常個体と比較して低下しているか、無くなっている場合には、野生型ＩＡＲＳタンパク質、及び、野生型ＩＡＲＳタンパク質をコードするｍＲＮＡ（本明細書では、野生型ＩＡＲＳｍＲＮＡとも呼ぶ）等も、ウシ個体が子牛虚弱症候群の罹患個体であること、子牛虚弱症候群のキャリア個体であること、または、健常個体であることを診断するためのマーカーとして使用できる。
【００３６】
なお、野生型ＩＡＲＳタンパク質とは、野生型ＩＡＲＳ遺伝子によってコードされるタンパク質である。野生型ＩＡＲＳタンパク質は、配列番号３のウシＩＡＲＳタンパク質、及びそのホモログ、並びに、配列番号３のウシＩＡＲＳタンパク質またはそのホモログにおいて、アミノ酸の置換、挿入、欠失などが生じているタンパク質であって、ウシ個体内で、そのタンパク質をコードするＩＡＲＳ遺伝子の発現が失われた場合に子牛虚弱症候群を引き起こすＩＡＲＳタンパク質を指す。
【００３７】
＝＝マーカーを用いた診断方法＝＝
これらのマーカーを用いて、以下のように、ウシ個体が子牛虚弱症候群の罹患個体であること、子牛虚弱症候群のキャリア個体であること、または、健常個体であることを診断することができる。
【００３８】
ウシ個体が、子牛虚弱症候群の罹患個体であること、子牛虚弱症候群のキャリア個体であること、または、健常個体であることは、まずウシ個体からゲノムＤＮＡを単離し、その単離されたゲノムＤＮＡについて、ＩＡＲＳ遺伝子が機能欠失型変異を有する変異型ＩＡＲＳ遺伝子であるか否かを調べることで診断できる。すなわち、（１）機能欠失型変異を有するＩＡＲＳ遺伝子の存在に関わらず、野生型ＩＡＲＳ遺伝子を有しない場合、その個体は子牛虚弱症候群の罹患個体であると診断でき、（２）変異型ＩＡＲＳ遺伝子と野生型ＩＡＲＳ遺伝子を有する場合、その個体は子牛虚弱症候群のキャリア個体であると診断でき、（３）野生型ＩＡＲＳ遺伝子を有し、機能欠失型変異を有するＩＡＲＳ遺伝子を有しない場合、健常個体であると診断できる。ここで、ＩＡＲＳ遺伝子が機能欠失型変異を有するか否かを調べる方法は特に限定されず、例えば、ＩＡＲＳ遺伝子の塩基配列を決定してもよく、変異部位を含む適当なＤＮＡ断片をプローブに用いるハイブリダイゼーション法、あるいは、既知である特定の塩基置換を検出する場合には、ＲＦＬＰ法などを利用してもよい。
【００３９】
特に、機能欠失型変異が、ウシＩＡＲＳ遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号１）の３０６番目の塩基におけるＧからＣへの変異である場合、ＰＣＲを用いて、当該塩基を含むゲノムＤＮＡ断片を増幅し、得られたＤＮＡ断片に対して制限酵素であるＨｉｎｃＩＩを反応させ、ＰＣＲ産物が切断されるかどうか調べてもよい。この場合、当該塩基がＧからＣに変異している場合にはＰＣＲ産物がＨｉｎｃＩＩで切断されないが、変異していない場合にはＨｉｎｃＩＩで切断されるため、当該塩基が野生型か変異型かを容易に決定することができる。例えば、酵素で切断後のＰＣＲ産物を、電気泳動で分離し、ＨｉｎｃＩＩで切断されたＰＣＲ産物のみが検出される場合、その個体は、子牛虚弱症候群のキャリアでなく罹患もしていない健常個体であり、ＨｉｎｃＩＩで切断されないＰＣＲ産物とＨｉｎｃＩＩで切断されたＰＣＲ産物とが検出される場合、その個体は子牛虚弱症候群のキャリア個体であり、ＨｉｎｃＩＩで切断されないＰＣＲ産物のみが検出される場合、その個体は子牛虚弱症候群の罹患個体であると診断できる。
【００４０】
あるいは、ウシ個体が子牛虚弱症候群に罹患していることは、そのウシ個体の組織における、野生型ＩＡＲＳタンパク質、または、野生型ＩＡＲＳｍＲＮＡの発現を調べることによって診断してもよい。組織は、例えば、胸腺、肺、膵臓、子宮、神経、腎臓、肝臓、大脳、小脳、脾臓、胃、盲腸、直腸が挙げられるが健常個体において野生型ＩＡＲＳタンパク質、または、野生型ＩＡＲＳｍＲＮＡが発現している組織である範囲で制限されない。その結果、野生型ＩＡＲＳタンパク質、または、野生型ＩＡＲＳｍＲＮＡの発現が検出されない場合には、その個体は、子牛虚弱症候群に罹患していると診断することができる。
【００４１】
また、ウシ個体が、子牛虚弱症候群のキャリア個体であることは、そのウシ個体の組織において、野生型ＩＡＲＳタンパク質と変異型ＩＡＲＳタンパク質、または、野生型ＩＡＲＳｍＲＮＡと変異型ＩＡＲＳｍＲＮＡの発現を調べることによって診断してもよい。組織は、例えば、胸腺、肺、膵臓、子宮、神経、腎臓、肝臓、大脳、小脳、脾臓、胃、盲腸、直腸が挙げられるが、健常個体において野生型ＩＡＲＳタンパク質、または、野生型ＩＡＲＳｍＲＮＡが発現している組織である範囲で制限されない。その結果、野生型ＩＡＲＳタンパク質と変異型ＩＡＲＳタンパク質、または、変異型ＩＡＲＳｍＲＮＡと野生型ＩＡＲＳｍＲＮＡが両方とも検出された場合には、そのウシ個体は、子牛虚弱症候群のキャリア個体であると診断することができる。
【００４２】
なお、野生型ＩＡＲＳタンパク質、または、野生型ＩＡＲＳｍＲＮＡの発現が検出され、変異型ＩＡＲＳタンパク質、または、変異型ＩＡＲＳｍＲＮＡの発現が検出されない場合には、そのウシ個体は、子牛虚弱症候群のキャリア個体または健常個体であると診断することができる。
【００４３】
ここで、タンパク質、またはそのタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現の検出方法は、野生型ＩＡＲＳタンパク質または変異型ＩＡＲＳタンパク質、あるいは、野生型ＩＡＲＳｍＲＮＡまたは変異型ＩＡＲＳｍＲＮＡを特異的に検出できる方法であればよく、タンパク質やｍＲＮＡの全長を検出する方法であっても、一部を検出する方法であってもよい。検出方法は、当業者に周知の方法を適宜用いればよく、ｍＲＮＡであればノザンブロット法や逆転写ＰＣＲ法、タンパク質であれば特異的抗体を用いたウエスタンブロット法やＥＬＩＳＡ法などが例示できる。
【００４４】
このようにして、ウシ個体を診断することにより、現段階で外見的には正常であっても、子牛虚弱症候群を発症するであろう罹患個体を特定できる。また、子牛虚弱症候群のキャリア個体は、表現型として虚弱症状が認められないが、以上の診断方法によってキャリア個体を同定し、キャリア個体を交配集団から隔離あるいは除去したり、キャリア個体同士を交配させないようにしたりすることによって、子牛虚弱症候群の罹患個体が発生することを未然に防ぐことが可能である。
【００４５】
＝＝子牛虚弱症候群の原因となる機能欠失型変異を特定する方法＝＝
子牛虚弱症候群に罹患したウシ個体、または、子牛虚弱症候群のキャリアであるウシ個体において、ＩＡＲＳ遺伝子の塩基配列の一部、または、全部を決定し、得られた塩基配列を、野生型ＩＡＲＳ遺伝子の塩基配列と比較し、ＩＡＲＳ遺伝子に機能欠失型変異が存在するか否かを決定することにより、そのウシ個体の子牛虚弱症候群の原因がＩＡＲＳ遺伝子にあるかどうか、また、そのウシ個体の子牛虚弱症候群の原因がＩＡＲＳ遺伝子にある場合、どのような変異が原因になっているのかを調べることができる。
【００４６】
例えば、子牛虚弱症候群の罹患個体、または、子牛虚弱症候群のキャリア個体において、ＩＡＲＳ遺伝子に変異が存在し、その変異が機能欠失型変異である場合には、そのウシ個体の子牛虚弱症候群はＩＡＲＳ遺伝子の変異に起因するものであると判定することができる。
【００４７】
この方法によって決定された機能欠失型変異を含む、ＩＡＲＳ遺伝子の一部または全部を有する単離されたポリヌクレオチドは、ウシ個体が子牛虚弱症候群の罹患個体であること、子牛虚弱症候群のキャリア個体であること、または、健常個体であることを診断するためのマーカーとして使用できる。
【００４８】
＝＝キット＝＝
本発明のキットは、ウシ個体において、子牛虚弱症候群に罹患していること、または、子牛虚弱症候群のキャリアであることを診断するためのキットであって、ＩＡＲＳ遺伝子の一部または全部を有する単離されたポリヌクレオチドにおいて、ＩＡＲＳ遺伝子の機能欠失型変異を含む領域を増幅するためのプライマーペアを含む。
【００４９】
増幅に用いるプライマーとしては、上記の機能欠失型変異を含むＤＮＡ断片を増幅できるものであれば、特に限定されない。例えば、１５〜５０個、好ましくは１５〜３５個のヌクレオチドを含有するものが挙げられるが、配列番号４または５のプライマーであってもよい。
【実施例】
【００５０】
[実施例１]  本実施例では、ウシＩＡＲＳ遺伝子における機能欠失型変異を検出することにより、その個体が子牛虚弱症候群に罹患していること、または、子牛虚弱症候群のキャリアであることを診断できることを示す。
【００５１】
子牛虚弱症候群のキャリアである黒毛和種の種雄牛１個体の産子について、子牛虚弱症候群を発症している黒毛和種１５個体、表現型が正常な黒毛和種１４６個体、及び、ランダムに選択した表現型が正常な黒毛和種１４５１個体（東京芝浦の屠場及び大阪南港の屠場より入手）の腎周囲脂肪組織から、フェノール／クロロフォルム法によりＤＮＡを単離した。このＤＮＡを鋳型とし、下記のプライマーペア（配列番号４、５）を用いたＰＣＲ法によって、ＩＡＲＳｃＤＮＡ（配列番号１）の３０６番の塩基を含む３９２ｂｐの領域を増幅し、塩基配列を決定した。プライマーの塩基配列について、配列番号４のIARS-Fと配列番号５のIARS-RはそれぞれＩＡＲＳ遺伝子のエクソン部分とイントロン部分に相補的である。
IARS-F：TTACCTTCTA TGATGGGCCT C（配列番号４）
IARS-R：TTAACATCCC TGCCCTATGA C（配列番号５）
【００５２】
その結果、表現型が正常な１４６個体のＩＡＲＳ遺伝子において、ＩＡＲＳｃＤＮＡの３０６番目に対応する塩基がＣのホモ接合である個体は認められず、Ｇのホモ接合である個体が７１個体、ＧとＣのヘテロ接合である個体が７５個体であった。また、子牛虚弱症候群を発症している１５個体のＩＡＲＳ遺伝子において、ＩＡＲＳｃＤＮＡの３０６番目に対応する塩基がＣのホモ接合である個体は１３個体であり、Ｇのホモ接合である個体が１個体、ＧとＣのヘテロ接合である個体が１個体であった。また、ランダムに選択した表現型が正常な黒毛和種１４５１個体のＩＡＲＳ遺伝子において、ＩＡＲＳｃＤＮＡの３０６番目に対応する塩基がＣのホモ接合である個体は認められず、Ｇのホモ接合である個体が１２３３個体、ＧとＣのヘテロ接合である個体が２１８個体であった。
【００５３】
このように、ＩＡＲＳ遺伝子においてＩＡＲＳｃＤＮＡの３０６番目に対応する塩基がＣのホモ接合の場合、その個体は１００％の確率で子牛虚弱症候群に罹患し、発症している。
【００５４】
[実施例２]  本実施例では、実施例１に記載のＩＡＲＳ遺伝子における機能欠失型変異が、脊椎動物全般で保存されるアミノ酸残基の置換を引き起こすものであること、そして、このアミノ酸置換がＩＡＲＳタンパク質の機能を欠失させることを示す。
【００５５】
図１に示すように、ヒトから魚類まで、ウシＩＡＲＳタンパク質（配列番号３）の７９番目に対応するアミノ酸はバリンであり、保存されている。また、このアミノ酸残基の周辺領域のアミノ酸配列も高度に保存されている。この事実は、ＩＡＲＳタンパク質が正常に機能するために、このポリペプチド領域が不可欠な領域であることを示している。
【００５６】
PolyPhen-2（Adzhubei et al., Nat. Methods 7(4), 248-249, 2010, http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）によってＩＡＲＳタンパク質を解析した結果、ウシＩＡＲＳタンパク質の７９番目のアミノ酸であるバリンからロイシンへの変異が有害であると判定された（スコア＝１，PROBABLY DAMAGING）。この結果は、ウシＩＡＲＳタンパク質の７９番目のバリンからロイシンへの変異によってＩＡＲＳタンパク質の正常な機能が失われることを示している。
【００５７】
[実施例３]  本実施例では、ウシの広範囲な組織において、ＩＡＲＳ遺伝子が発現していることを示す。
【００５８】
表現型が正常な黒毛和種の大脳、小脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、骨格筋、舌、食道、第１胃、第２胃、第３胃、第４胃、十二指腸、回腸、直腸、盲腸、子宮、卵巣（図２）からｍＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを合成した。各組織におけるＩＡＲＳ遺伝子の発現量を調べるため、このｃＤＮＡを鋳型とし、下記のプライマーを（配列番号６〜８）用いて定量ＰＣＲ（Applied Biosystems製  7900HT Sequence Detection System）を行った。
プライマーＦ：GGCTTACCCACCAAGGTCTTC（配列番号６）
プライマーＲ：CACAGTCTTCGTATTCAAAGTCTTC（配列番号７）
蛍光標識プライマー：ATGAAGCTGCCAAGATGTTTGGCCTCC（配列番号８）
【００５９】
図２に示すように、ＩＡＲＳ遺伝子はウシの広範囲な組織で発現していた。中でも、胸腺、肺、膵臓、子宮、卵巣では、発現が高かった。
【００６０】
この結果は、ウシ個体が子牛虚弱症候群に罹患しているか否かを診断するために、表現型が正常な個体でＩＡＲＳ遺伝子が発現しているこれらの組織において、野生型ＩＡＲＳｍＲＮＡの発現、あるいは、変異型ＩＡＲＳｍＲＮＡの発現を調べることにより、そのウシ個体が子牛虚弱症候群の罹患個体であること、または、子牛虚弱症候群のキャリア個体であることを診断できることを示している。
【００６１】
[実施例４]  本実施例では、ウシＩＡＲＳ遺伝子における機能欠失型変異の有無をＲＦＬＰ法により検出し、その個体が子牛虚弱症候群の罹患個体であること、または、子牛虚弱症候群のキャリア個体であることを診断できることを示す。
【００６２】
実施例１に記載の子牛虚弱症候群のキャリアである黒毛和種の種雄牛１個体の産子の中で、子牛虚弱症候群の発症個体２個体、キャリア個体１個体、及び、健常個体２個体の血液（抗凝固剤としてＥＤＴＡ、ヘパリンを含む）から、自動核酸分離装置NA-1000（クラボウ社製）を用いてゲノミックＤＮＡを調製した。このゲノミックＤＮＡを鋳型とし、プライマー（配列番号４、５）を用いてＰＣＲを行い（Ex-Taq polymerase（タカラバイオ社製）を使用、94 ℃で1分間、60 ℃で1分間、72 ℃で1分間からなる工程を1サイクルとした35サイクル反応）ＰＣＲ産物を得た。このＰＣＲ産物を制限酵素ＨｉｎｃＩＩを用いて消化した後、1.5%アガロースゲル（1 x TBE）を用いた電気泳動に供してＤＮＡ断片を分離し、泳動後のゲルをエチジムブロマイド染色した。なお、プライマーの塩基配列について、IARS-FとIARS-RはそれぞれＩＡＲＳ遺伝子のエクソン部分とイントロン部分に相補的である。
【００６３】
ここで、発症個体では両方のアリルで、キャリア個体では一方のアリルで機能欠失型変異が生じている。この機能欠失型変異は、ＩＡＲＳ遺伝子のコード領域の３０６番目の塩基におけるＧからＣへの変異であり、アミノ酸置換を引き起こす変異である。ＰＣＲにより増幅された増幅断片において、この変異を有する場合はＨｉｎｃＩＩで切断されるが、この変異を有さない場合はＨｉｎｃＩＩで切断されない。
【００６４】
図３に示すように、発症個体では、ＰＣＲ産物がＨｉｎｃＩＩで切断されず３９２ｂｐのバンドだけが検出された（レーン２、３）。一方、表現型が正常であるキャリア個体と健常個体について、ＰＣＲ産物がＨｉｎｃＩＩで切断され、２７６ｂｐ、及び１１６ｂｐのバンドが検出された健常個体（レーン４、６）と、ＰＣＲ産物がＨｉｎｃＩＩで切断された２７６ｂｐ、及び１１６ｂｐのバンドと、ＨｉｎｃＩＩで切断されない３９２ｂｐのバンドの両方が検出されたキャリア個体（レーン１、５）とが判別できた。
【００６５】
このように、ＩＡＲＳ遺伝子のコード領域の３０６番目の塩基のＧからＣへの変異を調べることで、その個体が子牛虚弱症候群の罹患個体であること、子牛虚弱症候群のキャリア個体であること、または、健常個体であることを診断できる。
【図１】
0005736562.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【配列表】
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