(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Δ５デサチュラーゼ活性を有する変異ポリペプチドであって、前記変異ポリペプチドが配列番号９７のアミノ酸配列を含む、前記ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号８のポリペプチドのジホモ−γ−リノレン酸からアラキドン酸への転換効率を超えるジホモ−γ−リノレン酸からアラキドン酸への転換効率を有する、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載の変異ポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸分子で形質転換された微生物宿主細胞。
【請求項５】
微生物宿主が油性酵母である、請求項４記載の微生物宿主細胞。
【請求項６】
油性酵母がヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される、請求項５記載の微生物宿主細胞。
【請求項７】
油性酵母がヤロウィア・リポリティカである、請求項６記載の微生物宿主細胞。
【請求項８】
ジホモ−γ−リノレン酸の存在下で、請求項４〜７のいずれか1項記載の微生物宿主細胞を増殖させるステップを含んでなり、前記ジホモ−γ−リノレン酸がアラキドン酸に変換される、アラキドン酸を生成する方法。
【請求項９】
エイコサテトラエン酸の存在下で請求項４〜７のいずれか1項記載の微生物宿主細胞を増殖させるステップを含んでなり、前記エイコサテトラエン酸がエイコサペンタエン酸に変換される、エイコサペンタエン酸を生成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示全体を参照によって本明細書に援用する、２００８年９月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／０９８３３３号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は生物工学の分野にある。より具体的には本発明は変異Δ５脂肪酸デサチュラーゼ酵素（チトクロームｂ5様ドメインのＨＰＧＧモチーフ内で少なくとも１つの変異が起きる）をコードする核酸断片の作成、および長鎖多価不飽和脂肪酸［「ＰＵＦＡ」］の作成におけるこれらのデサチュラーゼの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
多価不飽和脂肪酸［「ＰＵＦＡ」］の商業的な生産手段として、植物、藻類、真菌、ストラメノパイル、および酵母をはじめとする多様な異なる宿主が調査されている。遺伝子操作は、いくつかの宿主の自然の能力を実質的に改変して（天然ではリノール酸［ＬＡ；１８：２  ω−６］およびα−リノレン酸［ＡＬＡ；１８：３  ω−３］脂肪酸産生に限定されるものでさえ）、様々な長鎖ω−３／ω−６ＰＵＦＡの高レベル産生をもたらし得ることを実証している。これが自然の能力または組換え技術の結果であるのかどうかに関わらず、アラキドン酸［ＡＲＡ；２０：４  ω−６］、エイコサペンタエン酸［ＥＰＡ；２０：５  ω−３］、およびドコサヘキサエン酸［ＤＨＡ；２２：６  ω−３］の産生は、全てΔ５デサチュラーゼの発現を要するかもしれない。
【０００４】
これまでに同定されたほとんどのΔ５デサチュラーゼ酵素は、ジホモ−γ−リノレン酸[ＤＧＬＡ；２０：３  ω−６]をＡＲＡに転換する主要能力を有し、エイコサテトラエン酸[ＥＴＡ；２０：４  ω−３]をＥＰＡに転換する二次的活性がある。公の文献および特許文献の双方で多数のΔ５デサチュラーゼが開示されている。デサチュラーゼ進化に基づくΔ５デサチュラーゼの一般的特徴は、Ｐ．Ｓｐｅｒｌｉｎｇら（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  Ｌｅｕｋｏｔ．Ｅｓｓｅｎｔ．Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ，６８：７３〜９５頁（２００３年））で詳述される。Δ６、Δ８、およびΔ４デサチュラーゼと並んでΔ５デサチュラーゼは、長鎖ＰＵＦＡ「フロントエンド」デサチュラーゼとして知られている（メチル依存性不飽和化とは対照的に、既存の二重結合と脂肪酸のアシル基のカルボキシル末端との間で不飽和化が起きる）。これらのデサチュラーゼは、３個のヒスチジンボックス[Ｈ（Ｘ）3-4Ｈ（配列番号１および２）、Ｈ（Ｘ）2-3ＨＨ（配列番号３および４）、およびＨ／Ｑ（Ｘ）2-3ＨＨ（配列番号５および６）]によって特徴付けられ、電子供与体として機能するそれらのＮ末端に融合チトクロームｂ5ドメインを有することから、チトクロームｂ5融合スーパーファミリーのメンバーである。残るチトクロームｂ5ドメイン配列の多様化にもかかわらず、チトクロームｂ5ドメインは、保存ヘム結合モチーフ（すなわちヒスチジン−プロリン−グリシン−グリシン配列または「ＨＰＧＧ」[配列番号１８０]配列）もまた含有する。これらのモチーフ配列は、米国特許第５，９７２，６６４号明細書の主題である。
【０００５】
いくつかの研究は、ＨＰＧＧモチーフが酵素活性に関係あることを示唆している。Ｓａｙａｎｏｖａ，Ｏ．ら（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１２１：６４１頁（１９９９年））は、部位特異的変異導入を実施して、ルリヂサのΔ６デサチュラーゼ中でＨＰＧＧモチーフのヒスチジン残基をアラニン残基で置換した。変異酵素はアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）中で発現されたが酵素活性は測定できず、デサチュラーゼのチトクロームｂ5ドメインが機能に重要であることが示唆された。同様の研究がラットΔ６デサチュラーゼで実施され、そこではＨＰＧＧモチーフ内でヒスチジンのアラニンによる置換が実施された。この変異タンパク質もまた活性を有さなかった（Ｇｕｉｌｌｏｕ，Ｈ．ら，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，４５：３２〜４０頁（２００４年））。ごく最近では、Ｈｏｎｇｓｔｈｏｎｇ，Ａ．ら（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７２：１１９２〜１２０１頁（２００６年））が、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）Δ６デサチュラーゼ中で、ＨＰＧＧモチーフのヒスチジン残基のアラニン残基による置換を報告した。以前の報告同様、変異によって変異酵素は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でＧＬＡを生成できなくなり、チトクロームｂ5ドメインが活性のために重要であり、このモチーフ内の変更が酵素活性低下をもたらすことが示唆された。Δ５デサチュラーゼ酵素は比較的一般的でよく特徴付けられているが、ＰＵＦＡを産生できる生産宿主細胞中において、高レベルで効率的に発現される酵素に対する必要性が残されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって解決すべき問題は、商業的に有用な宿主細胞中のＰＵＦＡ生合成経路に組み込むのに適した、高活性を有する新しいΔ５デサチュラーゼ酵素を発見することである。出願人らは、様々なΔ５デサチュラーゼのチトクロームｂ5ドメインのＨＰＧＧモチーフ内の変更が、ＤＧＬＡからＡＲＡへの転換に基づいて酵素活性の最高３８％の改善をもたらすという意外な発見を通じて、上記問題を解決した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、Δ５デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする新しい遺伝子構築物、およびＰＵＦＡ生成のための細菌、酵母、藻類、ユーグレナ属、ストラメノパイル、卵菌綱、および真菌中におけるそれらの使用に関する。
【０００８】
したがって本明細書で提供されるのは、配列番号１８３（Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＧｌｙまたはＨＧＧＧ）、配列番号１８４（Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−ＧｌｙまたはＨＨＧＧ）、配列番号１８６（Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＧｌｙまたはＨＣＧＧ）、配列番号１８７（Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−ＧｌｙまたはＨＷＧＧ）、および配列番号１８５（Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＳｅｒまたはＨＰＧＳ）からなる群から選択されるアミノ酸モチーフを含んでなり、Δ５デサチュラーゼ活性を有する変異ポリペプチドである。好ましい変異Δ５デサチュラーゼポリペプチドは、変異体がそれに由来する親ポリペプチドのジホモ−γ−リノレン酸からアラキドン酸への転換効率を超える、ジホモ−γ−リノレン酸からアラキドン酸への転換効率を実証するものである。
【０００９】
本明細書の第２の実施態様では、実質的に本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提供される。
【００１０】
本明細書の第３の実施態様では、本発明のポリペプチドを発現する微生物宿主細胞が提供される。
【００１１】
本明細書の第４の実施態様では、ジホモ−γ−リノレン酸の存在下で、請求項１のポリペプチドを発現する微生物宿主細胞を増殖させるステップを含んでなり、ジホモ−γ−リノレン酸がアラキドン酸に変換される、アラキドン酸を生成する方法が提供される。
【００１２】
本明細書の第５の実施態様では、エイコサテトラエン酸の存在下で、請求項１のポリペプチドを発現する微生物宿主細胞を増殖させるステップを含んでなり、エイコサテトラエン酸がエイコサペンタエン酸に変換される、エイコサペンタエン酸を生成する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路を示し、下記のこの経路の説明を検討する際に図１Ｂと合わせ見るべきである。
【図１Ｂ】ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路を示し、下記のこの経路の説明を検討する際に図１Ａと合わせ見るべきである。
【図２Ａ】ｐＤＭＷ３６９のプラスミドマップである。
【図２Ｂ】ｐＺＵＦ１７のプラスミドマップである。
【００１４】
本発明は、本明細書の一部を形成する以下の詳細な説明および添付の配列説明からより完全に理解できる。
【００１５】
次の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）、およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。
【００１６】
配列番号７〜１９、５８、９７〜１００、１３９、１４０、および１７９〜１９５は、表１で同定される遺伝子またはタンパク質（またはその一部）、またはプラスミドをコードするＯＲＦである。
【００１７】
表１：核酸およびタンパク質配列番号の要約
0005762291.tif 000002
0005762291.tif 000003
【００１８】
配列番号２０〜５７は、部位特異的変異導入によってＥｇＤ５ＳのＨＰＧＧモチーフのプロリン残基を個々に変異させるのに利用される、オリゴヌクレオチドプライマーに相当する。
【００１９】
配列番号５９〜９６は、部位特異的変異導入によってＥｇＤ５ＳのＨＰＧＧモチーフの第２のグリシン残基を個々に変異させるのに利用される、オリゴヌクレオチドプライマーに相当する。
【００２０】
配列番号１０１〜１３８は、部位特異的変異導入によってＥａＤ５ＳのＨＰＧＧモチーフのプロリン残基を個々に変異させるのに利用される、オリゴヌクレオチドプライマーに相当する。
【００２１】
配列番号１４１〜１７８は、部位特異的変異導入によってＲＤ５ＳのＨＰＧＧモチーフのプロリン残基を個々に変異させるのに利用される、オリゴヌクレオチドプライマーに相当する。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
健康に良いＰＵＦＡ製造のため生化学的経路を操作するために使用してもよい、新しい変異Δ５デサチュラーゼ酵素および同酵素をコードする遺伝子が、本明細書で開示される。これらの変異Δ５デサチュラーゼは、チトクロームｂ5ドメインのＨＰＧＧモチーフ（配列番号１８０）内に少なくとも１つの変異を有する。
【００２３】
ＰＵＦＡまたはその誘導体は、食餌代用物または栄養補給剤として、特に乳児用調製粉乳中で、静脈内栄養補給される患者のために、または栄養失調を予防しまたは治療するために使用される。代案としては、通常の使用において受容者が所望量の食事補給を受け入れるように調合された、料理用油、脂肪またはマーガリン中に、純化されたＰＵＦＡ（またはその誘導体）を組み込んでもよい。ＰＵＦＡはまた、乳児用調製粉乳、栄養補給剤またはその他の食品に組み込まれてもよく、抗炎症薬またはコレステロール低下剤としても用途があるかもしれない。組成物はヒト用または獣医学用どちらかの医薬用途のために使用されていてもよい。
【００２４】
本明細書で言及する全ての特許および非特許文献は、参照によって本明細書に援用する。
【００２５】
本開示では、いくつかの用語および略語を使用する。以下の定義が提供される。
「読み取り枠（オープンリーディングフレーム）」はＯＲＦと略記される。
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略記される。
「アメリカンタイプカルチャーコレクション」はＡＴＣＣと略記される。
「多価不飽和脂肪酸」はＰＵＦＡと略記される。
「トリアシルグリセロール」はＴＡＧと略記される。
「総脂肪酸」は「ＴＦＡ」と略記される。
【００２６】
「発明」または「本発明」という用語は、本明細書での用法では本発明の特定の一実施態様への限定は意図されず、一般に特許請求の範囲および明細書に記載されるあらゆる全ての本発明の実施態様に適用される。
【００２７】
「脂肪酸」という用語は、より長い、およびより短い鎖長の酸の双方も知られているが、約Ｃ12〜Ｃ22の様々な鎖長の長鎖脂肪族酸（アルカン酸）を指す。優勢な鎖長はＣ16〜Ｃ22の間である。脂肪酸の構造は簡易表記体系「Ｘ：Ｙ」によって表され、式中Ｘは特定の脂肪酸中の炭素［「Ｃ」］原子の総数であり、Ｙは二重結合の数である。「飽和脂肪酸」対「不飽和脂肪酸」、「一不飽和脂肪酸」対「多価不飽和脂肪酸」［「ＰＵＦＡ」］、および「ω６脂肪酸」［「ω−６」または「ｎ−６」］対ω３脂肪酸［「ω−３」または「ｎ−３」］の間の区別に関する追加的詳細は、参照によって本明細書に援用する米国特許第７，２３８，４８２号明細書中に提供される。
【００２８】
本明細書においてＰＵＦＡを既述するのに使用される命名法を下の表２に示す。「略記法」と題された欄では、オメガ−参照システムが使用されて炭素数、二重結合数、およびオメガ炭素（この目的では番号１）から数えて、オメガ炭素に最も近い二重結合の位置を示唆する。表の残りの部分は、ω−３およびω−６脂肪酸およびそれらの前駆物質の一般名、明細書の全体を通じて使用される略語、および各化合物の化学名を要約する。
【００２９】
表２：多価不飽和脂肪酸および前駆物質の命名法
0005762291.tif 000004
【００３０】
表２に列挙するω−３／ω−６ＰＵＦＡは、本明細書に記載される方法を使用して微生物宿主の油画分中に蓄積する可能性が最も高いが、この一覧は限定的または完全なものとみなすべきではない。
【００３１】
「油」という用語は、２５℃で液体であり、通常は多価不飽和である脂質物質を指す。油性の生物中では、油が総脂質の大部分を構成する。「油」は主にトリアシルグリセロール［「ＴＡＧ」］からなるが、その他の中性脂質、リン脂質、および遊離脂肪酸もまた含有してよい。油中の脂肪酸組成と総脂質の脂肪酸組成は、一般に類似している。したがって総脂質中のＰＵＦＡ濃度の増大または減少は、油中のＰＵＦＡ濃度の増大または減少に対応し、逆もまた然りである。
【００３２】
「中性脂質」とは貯蔵脂肪としての脂肪体の細胞中に一般に見られる脂質を指し、細胞のｐＨにおいて、脂質が荷電基を有さないことからこのように称される。一般にそれらは完全に非極性で、水に対する親和性がない。中性脂質とは、一般に脂肪酸によるグリセロールのモノ−、ジ−、および／またはトリエステルを指し、それぞれモノアシルグリセロール、ジアシルグリセロールまたはトリアシルグリセロールとも称され、または集合的にアシルグリセロールと称される。アシルグリセロールから遊離脂肪酸を放出する為には、加水分解反応が起きなくてはならない。
【００３３】
「トリアシルグリセロール」［「ＴＡＧ」］という用語は、グリセロール分子にエステル化された３つの脂肪酸アシル残基から構成される中性脂質を指す。ＴＡＧは、長鎖ＰＵＦＡおよび飽和脂肪酸、ならびにより短鎖の飽和および不飽和脂肪酸を含有し得る。
【００３４】
「総脂肪酸」［「ＴＦＡ」］という用語は、本明細書では、例えば生物由来資源または油であってもよい特定サンプル中で、（当該技術分野で知られているような）塩基エステル交換法によって脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］に誘導体化し得る細胞性脂肪酸の総和を指す。したがって総脂肪酸は、中性脂質画分（ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、およびＴＡＧをはじめとする）からの脂肪酸、および極性脂質画分（ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミン画分をはじめとする）からの脂肪酸を含むが、遊離脂肪酸は含まない。
【００３５】
細胞の「総脂質含量」という用語は、乾燥細胞質量［「ＤＣＷ」］の％としてのＴＦＡ測定値であるが、総脂質含量は、ＤＣＷの％としてのＦＡＭＥ測定値［「ＦＡＭＥ％ＤＣＷ」］として近似し得る。したがって総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］は、例えば１００ミリグラムのＤＣＷあたりの総脂肪酸のミリグラムに相当する。
【００３６】
総脂質中の脂肪酸濃度は、本明細書では、例えば１００ミリグラムのＴＦＡあたりの特定の脂肪酸のミリグラムのように、ＴＦＡの質量％［「％ＴＦＡ」］として表される。特に断りのない限り本開示では、総脂質を基準とする特定の脂肪酸の％への言及は、％ＴＦＡとしての脂肪酸濃度に相当する（例えば総脂質の％ＥＰＡはＥＰＡ％ＴＦＡに相当する）。
【００３７】
「脂質プロファイル」および「脂質組成物」と言う用語は置き替え可能であり、総脂質または油などの特定の脂質画分中に含有される個々の脂肪酸量を指し、量はＴＦＡの質量％として表される。混合物中に存在する個々の各脂肪酸の和は、１００になるべきである。
【００３８】
「ＰＵＦＡ生合成経路」という用語は、オレイン酸をＬＡ、ＥＤＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＴＡ、およびＤＰＡｎ−６などのω−６脂肪酸に；およびＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡなどのω−３脂肪酸に転換する代謝過程を指す。この過程については文献で十分に記載されている（例えば米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書を参照されたい）。簡単に述べるとこの過程は、小胞体膜内に存在する「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」と称される一連の特有な延長酵素および不飽和化酵素による、炭素原子の付加を通じた炭素鎖の延長、および二重結合の付加を通じた分子の不飽和化を伴う。より具体的には「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」とは、ＰＵＦＡの生合成と関連付けられている以下の酵素のいずれか（および上記酵素をコードする遺伝子）を指す。Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ14/16エロンガーゼ、Ｃ16/18エロンガーゼ、Ｃ18/20エロンガーゼおよび／またはＣ20/22エロンガーゼ。
【００３９】
「デサチュラーゼ」と言う用語は、不飽和化できる、すなわち１個もしくはそれ以上の脂肪酸に二重結合を導入して、対象とする脂肪酸または前駆物質を生じさせるポリペプチドを指す。特定の脂肪酸を指すために、本明細書全体を通じたω参照システムの使用にもかかわらず、デルタシステムを使用して基質のカルボキシル末端から数えることで、デサチュラーゼの活性を示す方が都合よい。本明細書で特に興味深いのは、分子のカルボキシル末端から数えて５番目と６番目の炭素原子間で脂肪酸を不飽和化するΔ５デサチュラーゼであり、それは例えばＤＧＬＡからＡＬＡへおよび／またはＥＴＡからＥＰＡへの転換を触媒し得る。その他の脂肪酸デサチュラーゼとしては、例えばΔ８デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、およびΔ９デサチュラーゼが挙げられる。当該技術分野では、Δ１５およびΔ１７デサチュラーゼはまた、時としてω−６脂肪酸をそれらのω−３対応物に転換する能力に基づいて、「オメガ−３デサチュラーゼ」、「ｗ−３デサチュラーゼ」、および／または「ω−３デサチュラーゼ」と称される（例えばそれぞれＬＡからＡＬＡ、およびＡＲＡからＥＰＡへの変換）。脂肪酸デサチュラーゼのための遺伝子によって適切な宿主を形質転換し、宿主の脂肪酸プロファイルに対するその影響を判定することで、特定の脂肪酸デサチュラーゼの特異性を経験的に判定することが望ましいであろう。
【００４０】
「ＥｇＤ５」という用語は、本明細書で配列番号７によってコードされる、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）から単離されたΔ５デサチュラーゼ酵素（配列番号８）を指す。同様に「ＥｇＤ５Ｓ」という用語は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、ミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来する合成Δ５デサチュラーゼを指す（すなわち配列番号９および１０）。ＥｇＤ５およびＥｇＤ５Ｓに関するさらなる詳細は、国際公開第２００７／１３６６７１号パンフレットに記載される。
【００４１】
「ＥａＤ５」という用語は、本明細書の配列番号１１によってコードされる、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ａｎａｂａｅｎａ）から単離されたΔ５デサチュラーゼ酵素（配列番号１２）を指す。同様に「ＥａＤ５Ｓ」という用語は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、Ｅ．アナベナ（ａｎａｂａｅｎａ）に由来する合成Δ５デサチュラーゼを指す（すなわち配列番号１３および１４）。ＥａＤ５およびＥａＤ５Ｓに関するさらなる詳細は、米国特許出願公開第２００８−０２７４５２１−Ａ１号明細書に記載される。
【００４２】
「ＲＤ５」という用語は、本明細書の配列番号１５によってコードされる、ペリディニウム（Ｐｅｒｉｄｉｎｉｕｍ）種ＣＣＭＰ６２６から単離されたΔ５デサチュラーゼ酵素（配列番号１６）を指す。同様に「ＲＤ５Ｓ」という用語は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、ペリディニウム（Ｐｅｒｉｄｉｎｉｕｍ）種ＣＣＭＰ６２６に由来する合成Δ５デサチュラーゼを指す（すなわち配列番号１７および１８）。ＲＤ５およびＲＤ５Ｓに関するさらなる詳細は、国際公開第２００７／１３６６４６号パンフレットに記載される。
【００４３】
「保存ドメイン」または「モチーフ」という用語は、進化的に関連したタンパク質の整合配列に沿った特定位置で保存される一組のアミノ酸を意味する。その他の位置のアミノ酸は相同タンパク質の間で変化し得るのに対し、特定位置の高度に保存されたアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性、または活性において必須のアミノ酸を示す。それらはタンパク質相同体ファミリーの整合配列中のそれらの高度な保存によって同定されるので、それらは新しく判定された配列があるタンパク質が、以前同定されたタンパク質ファミリーに属するかどうかを判定する識別子または「シグネチャー」として使用し得る。動物、植物、および真菌のΔ５デサチュラーゼ酵素中に普遍的に見られるモチーフとしては、３つのヒスチジンボックス（すなわちＨ（Ｘ）3-4Ｈ[配列番号１および２]、Ｈ（Ｘ）2-3ＨＨ[配列番号３および４]およびＨ／Ｑ（Ｘ）2-3ＨＨ[配列番号５および６]）、およびＮ−末端の融合チトクロームｂ5ドメイン内のヘム結合モチーフ（すなわちＨｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＧｌｙまたはＨＰＧＧ[配列番号１８０]）が挙げられる。
【００４４】
「変異Δ５デサチュラーゼ」という用語は、チトクロームｂ5ドメインのＨＰＧＧモチーフ（配列番号１８０）内に少なくとも１つの変異を有する、本明細書に記載されるようなΔ５デサチュラーゼを指し、前記変異は保存的または非保存的どちらかのアミノ酸置換をもたらす。変異はあらゆるアミノ酸置換を含んでもよいが、変異Δ５デサチュラーゼは好ましくは、Ｈｉｓ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙまたは「ＨＸＧＧ」（配列番号１８１）およびＨｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘａａまたは「ＨＰＧＸ」（配列番号１８２）からなる群から選択される変異モチーフを含んでなり、変異Δ５デサチュラーゼのΔ５デサチュラーゼ活性は、少なくとも野生型Δ５デサチュラーゼのΔ５デサチュラーゼ活性と機能的にほぼ同等である。より好ましくは変異モチーフは、配列番号１８３（Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙまたは「ＨＧＧＧ」）、配列番号１８４（Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙまたは「ＨＨＧＧ」）、配列番号１８６（Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙまたは「ＨＣＧＧ」）、配列番号１８７（Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙまたは「ＨＷＧＧ」）、および配列番号１８５（Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒまたは「ＨＰＧＳ」）からなる群から選択される。例えば配列番号５８、配列番号９７、配列番号１３９、および配列番号１７９に記載されるΔ５デサチュラーゼを参照されたい。
【００４５】
各「変異Δ５デサチュラーゼ」は、「対応する野生型Δ５デサチュラーゼ」を有する。具体的には、（上述のように）野生型がチトクロームｂ5ドメイン内にＨＰＧＧモチーフ（配列番号１８０）を含んでなり、変異体がこのモチーフ内に少なくとも１つの変異を含んでなることを除いて、変異Δ５デサチュラーゼおよび対応する野生型Δ５デサチュラーゼは、同一のアミノ酸配列を共有する。
【００４６】
変異Δ５配列の酵素活性および特異的選択性が、対応する野生型Δ５デサチュラーゼに匹敵する場合、変異Δ５デサチュラーゼは、対応する野生型Δ５デサチュラーゼと「少なくとも機能的にほぼ同等」である。したがって各酵素の「転換効率」を比較した場合、機能的に同等の変異Δ５デサチュラーゼは、対応する野生型Δ５デサチュラーゼと比較してΔ５デサチュラーゼ活性が実質的に低下していない（すなわち変異Δ５デサチュラーゼは、野生型Δ５デサチュラーゼの少なくとも約５０〜７５％、好ましくは少なくとも約７５〜８５％、より好ましくは少なくとも約８５〜９５％、最も好ましくは少なくとも約９５％の酵素活性を有する）。２つのポリペプチドのΔ５デサチュラーゼ活性は、実質的に同一であってもよい。好ましくは変異Δ５デサチュラーゼの酵素活性および特異的選択性は、対応する野生型Δ５デサチュラーゼとの比較で増大しており、すなわち野生型Δ５デサチュラーゼの少なくとも約１０１〜１０５％、より好ましくは少なくとも約１０６〜１１５％、最も好ましくは少なくとも約１１６〜１２５％の酵素活性を有する。
【００４７】
「変換効率」および「％基質変換」と言う用語は、それによって特定の酵素（例えばデサチュラーゼ）が基質から生成物に変換し得る効率を指す。変換効率は以下の式に従って測定される（［生成物］／［基質＋生成物］）＊１００。したがって「ＤＧＬＡからＡＲＡへの転換効率」とは、それによって基質ＤＧＬＡが生成物ＡＲＡに変換される転換効率を指す。
【００４８】
「エロンガーゼ」という用語は、脂肪酸炭素鎖を延長して、エロンガーゼが作用する脂肪酸基質よりも炭素２個分だけ長い酸を生成し得るポリペプチドを指す。この延長過程は、米国特許出願公開第２００５／０１３２４４２号明細書に記載されるように、脂肪酸シンターゼと結びついた多段階機序で起きる。エロンガーゼ系によって触媒される反応の例は、ＧＬＡからＤＧＬＡへ、ＳＴＡからＥＴＡへ、およびＥＰＡからＤＰＡへの変換である。
【００４９】
一般にエロンガーゼの基質選択性はいくぶん広いが、鎖長および不飽和度とタイプの双方によって差別される。例えばＣ14/16エロンガーゼはＣ14基質（例えばミリスチン酸）を利用し、Ｃ16/18エロンガーゼはＣ16基質（例えばパルミチン酸）を利用し、Ｃ18/20エロンガーゼはＣ18基質（例えばＧＬＡ、ＳＴＡ、ＬＡ、ＡＬＡ）を利用し、Ｃ20/22エロンガーゼ［Δ５エロンガーゼとも称される］はＣ20基質（例えばＡＬＡ、ＥＰＡ）を利用する。本明細書の目的では、２つの異なるタイプのＣ18/20エロンガーゼを定義し得る。Δ６エロンガーゼはそれぞれＧＬＡおよびＳＴＡからＤＧＬＡおよびＥＴＡへの転換を触媒する一方、Δ９エロンガーゼはそれぞれＬＡおよびＡＬＡからＥＤＡおよびＥＴｒＡへの転換を触媒し得る。
【００５０】
いくつかのエロンガーゼは広い特異性を有し、したがって単一酵素がいくつかのエロンガーゼ反応を触媒できてもよいことに留意することが重要である（例えばそれによってＣ16/18エロンガーゼおよびＣ18/20エロンガーゼの双方として機能する）。適切な宿主を脂肪酸エロンガーゼ遺伝子で形質転換して、宿主の脂肪酸プロファイルに対するその効果を判定することにより、脂肪酸エロンガーゼの特異性を経験的に判断することが望ましいかもしれない。
【００５１】
「油性」という用語は、それらのエネルギー源を油の形態で貯蔵する傾向がある生物を指す（Ｗｅｅｔｅ，Ｆｕｎｇａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版，Ｐｌｅｎｕｍ，１９８０年）。一般に油性微生物の細胞油分はＳ字形曲線に従い、脂質濃度は対数後期または定常期初期で最大に達するまで増大し、次に定常期後期および死滅期において徐々に減少する（ＹｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉおよびＷａｒｄ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５７：４１９〜２５（１９９１年））。油性微生物がそれらの乾燥細胞質量の約２５％以上を油として蓄積することは珍しくない。
【００５２】
「油性酵母」という用語は、油を生成し得る酵母に分類される微生物を指す。油性酵母の例としては、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属が挙げられるが、これに限定されるものではない。代案としては、乾燥細胞質量の２５％を超える油を作るように改変された、酵母に分類される生物もまた「油性」である。
【００５３】
「アミノ酸」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの基本的化学構造単位を指す。アミノ酸は、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３：３０２１〜３０３０頁（１９８５年）およびＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２１９（２）：３４５〜３７３頁（１９８４年）に記載される、ＩＵＰＡＣ−ＩＹＵＢ基準に準拠したアミノ酸のための一文字コードまたは三文字コードによって同定される。
【００５４】
「保存的アミノ酸置換」という用語は、タンパク質の化学的または機能的性質を変化させることなしに、特定のタンパク質中のアミノ酸残基を別のアミノ酸で置換することを指す。例えば特定の部位において化学的に等価なアミノ酸の生成をもたらす（しかしコードされた折り畳みタンパク質の構造および機能特性に影響しない）遺伝子中の変更が一般的であることは、当該技術分野でよく知られている。本明細書の目的で、「保存的アミノ酸置換」は次の５群の１つ内の交換と定義される。
１．小型脂肪族の非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ［Ａ］、Ｓｅｒ［Ｓ］、Ｔｈｒ［Ｔ］（Ｐｒｏ［Ｐ］、Ｇｌｙ［Ｇ］）
２．負に帯電した極性残基およびそれらのアミド：Ａｓｐ［Ｄ］、Ａｓｎ［Ｎ］、Ｇｌｕ［Ｅ］、Ｇｌｎ［Ｑ］
３．正に帯電した極性残基：Ｈｉｓ［Ｈ］、Ａｒｇ［Ｒ］、Ｌｙｓ［Ｋ］
４．大型脂肪族非極性残基：Ｍｅｔ［Ｍ］、Ｌｅｕ［Ｌ］、Ｉｌｅ［Ｉ］、Ｖａｌ［Ｖ］（Ｃｙｓ［Ｃ］）および
５．大型芳香族残基：Ｐｈｅ［Ｆ］、Ｔｙｒ［Ｙ］、Ｔｒｐ［Ｗ］
【００５５】
したがってわずかに疎水性のアミノ酸であるＡｌａは、別のより疎水性の低い残基（例えばＧｌｙ）によって置換されてもよい。同様に１個の負に帯電した残基による別の残基（例えばＡｓｐによるＧｌｕ）の置換または１個の正に帯電した残基による別の残基（例えばＬｙｓによるＡｒｇ）の置換をもたらす変化は、機能的に同等の生成物を生じることが予期し得る。したがって保存的アミノ酸置換は、置換領域内のポリペプチド主鎖構造；標的部位の分子の電荷または疎水性；または側鎖の大半を一般に保持する。さらに多くの場合、タンパク質分子のＮ末端とＣ末端部分の改変は、タンパク質活性を変更することが予期されない。
【００５６】
「非保存的アミノ酸置換」という用語は、タンパク質特性に最大変化を生じることが一般に予期されるアミノ酸置換を指す。したがって例えば非保存的アミノ酸置換は、次の１つである。１）親水性残基が疎水性残基を置換し、またはそれによって置換される（例えばＳｅｒまたはＴｈｒがＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌを置換し、またはそれによって置換される）、２）ＣｙｓまたはＰｒｏがあらゆるその他の残基を置換し、またはそれによって置換される、３）電気陽性側鎖を有する残基が電気陰性残基を置換し、またはそれによって置換される（例えばＬｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓがＡｓｐまたはＧｌｕを置換し、またはそれによって置換される）、または４）かさ高い側鎖を有する残基が側鎖を有さないものを置換し、またはそれによって置換される（例えばＰｈｅがＧｌｙを置換し、またはそれによって置換される）。時として５群中の２群間の非保存的アミノ酸置換は、コードされるタンパク質の活性に影響しない。
【００５７】
「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、「核酸断片」、および「単離された核酸断片」という用語は、本明細書で同義的に使用される。これらの用語は、ヌクレオチド配列などを包含する。ポリヌクレオチドは、合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基が含有されていてもよい、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであってもよい。ＤＮＡポリマーの形態のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはそれらの混合物の１つ以上のセグメントを含んでなってもよい。ヌクレオチド（通常それらの５’一リン酸の形態で見られる）は、次のような一文字名によって言及される。「Ａ」はアデニル酸またはデオキシアデニル酸（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡ）、「Ｃ」はシチジル酸またはデオキシシチジル酸、「Ｇ」はグアニル酸またはデオキシグアニル酸、「Ｕ」はウリジル酸、「Ｔ」はデオキシチミジル酸、「Ｒ」はプリン（ＡまたはＧ）、「Ｙ」はピリミジン（ＣまたはＴ）、「Ｋ」はＧまたはＴ、「Ｈ」はＡまたはＣまたはＴ、「Ｉ」はイノシン、および「Ｎ」はあらゆるヌクレオチドである。
【００５８】
核酸断片は、適切な温度および溶液イオン強度条件下で、核酸断片の一本鎖形態がその他の核酸断片とアニールできる場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの別の核酸断片と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は良く知られており、参照によって本明細書に援用するＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）の特に第１１章および表１１．１で例示される。温度およびイオン強度条件が、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を定める。ストリンジェントな条件は、（遠縁の生物からの相同的配列などの）中程度に類似の断片をスクリーニングするため、そして（近縁の生物からの機能性酵素を複製する遺伝子などの）高度に類似した断片をスクリーニングするために調節できる。ハイブリダイゼーション後の洗浄が、ストリンジェンシー条件を決定する。１つの好ましい条件のセットは、室温において６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで１５分間に始まり、次に４５℃において２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで３０分間を反復し、次に５０℃において０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを３０分間を２回反復する、一連の洗浄を使用する。より好ましいストリンジェントな条件のセットはより高い温度を使用し、そこでは洗浄は、最後の０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中での２回の３０分間の洗浄の温度を６０℃に増大させること以外は上述したのと同一である。別の好ましい高度にストリンジェントな条件のセットは、６５℃において０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での２回の最終洗浄を使用する。さらに別のストリンジェントな条件のセットは、例えば０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでのハイブリダイゼーションを含む。
【００５９】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー次第で塩基間のミスマッチは可能であるが、ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含有することを必要とする。核酸がハイブリダイゼーションする適切なストリンジェンシーは、当該技術分野で良く知られた変数である核酸の長さおよび相補性の程度に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高い程、これらの配列を有する核酸ハイブリッドの熱融点［「Ｔｍ」］値は大きくなる。より高いＴｍに対応する、核酸ハイブリダイゼーションの相対安定性は次の順で低下する。ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さがヌクレオチド１００個を超えるハイブリッドでは、Ｔｍを計算する式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出９．５０〜９．５１参照）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションのためにはミスマッチの配置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出１１．７〜１１．８参照）。一実施態様では、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくともヌクレオチド約１０個である。ハイブリダイズ可能な核酸の好ましい最小の長さは少なくともヌクレオチド約１５個、より好ましくは少なくともヌクレオチド約２０個、そして最も好ましくは長さが少なくともヌクレオチド約３０個である。さらに当業者は、プローブの長さなどの要因次第で、温度および洗浄液の塩濃度を必要に応じて調節してもよいことを認識する。
【００６０】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的部分」とは、当業者による配列の手動評価によって、あるいは基礎的局在性配列検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）［「ＢＬＡＳＴ」］（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９３年））などのアルゴリズムを使用したコンピュータ自動化アラインメントおよび同定によって、遺伝子またはポリペプチドの推定上の同定を得るのに十分なポリペプチドまたは遺伝子のヌクレオチド配列のアミノ酸配列を含んでなる部分である。一般に推定的にポリペプチドまたは核酸配列が既知のタンパク質または遺伝子に相同的であると同定するためには、１０個以上の隣接するアミノ酸または３０個以上のヌクレオチド配列が必要である。さらにヌクレオチド配列に関して、配列依存遺伝子同定法（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークの原位置ハイブリダイゼーション）において、２０〜３０個の隣接するヌクレオチドを含んでなる遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用しても良い。さらにプライマーを含んでなる特定の核酸断片を得るために、塩基１２〜１５個の短いオリゴヌクレオチドを増幅プライマーとしてＰＣＲで使用しても良い。したがってヌクレオチド配列の「実質的部分」は、配列を含んでなる核酸断片を特異的に同定、および／または単離できるようにする十分な配列を含んでなる。本明細書の開示は、特定の微生物タンパク質をコードする完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。本明細書で報告される配列の便益を有する当業者は、当業者に知られている目的のために、今や開示される配列の全てまたは実質的部分を使用できる。したがって添付の配列一覧に報告される完全な配列、ならびに上で定義される配列の実質的部分は本開示に包含される。
【００６１】
「相補的」という用語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係について述べるために使用される。例えばＤＮＡに関して、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって添付の配列一覧に報告される完全な配列に相補的な単離された核酸断片、ならびに実質的に同様の核酸配列は本開示に包含される。
【００６２】
「相同性」および「相同的な」という用語は、同義的に使用される。それらは１つ以上のヌクレオチド塩基の変化が、核酸断片が遺伝子発現を仲介する能力、または特定のフェノタイプを生じる能力に影響しない核酸断片を指す。これらの用語はまた、最初の無修飾断片と比較して得られる核酸断片の機能特性を実質的に改変しない、１つ以上のヌクレオチドの欠失または挿入などの核酸断片の修飾も指す。したがって当業者は、本発明が特定の例示的な配列以上のものを包含することを理解するであろう。
【００６３】
さらに当業者は、相同的な核酸配列がまた、例えば０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃の中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書に例証される配列と、または本明細書で開示されるヌクレオチド配列と機能的に同等のそのあらゆる部分とハイブリダイズする、それらの能力によって定義されることも認識する。ストリンジェンシー条件は、遠縁の生物からの相同的な配列などの中程度に類似した断片、および近縁関係にある生物からの機能性酵素を複製する遺伝子などの類似性の高い断片をスクリーニングするために調節し得る。
【００６４】
「選択的にハイブリダイズする」という用語は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下における、非標的核酸配列へのそのハイブリダイゼーションよりも検出可能な程度により高い程度の（例えばバックグラウンドの少なくとも２倍）核酸配列の特定の核酸標的配列へのハイブリダイゼーションへの、および非標的核酸の実質的排除への言及を含む。選択的にハイブリダイズする配列は、典型的に互いに約少なくとも８０％の配列同一性、または９０％の配列同一性、１００％以下の配列同一性（すなわち完全に相補的）を有する。
【００６５】
「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、その下でプローブがその標的配列と選択的にハイブリダイズする条件への言及を含む。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる状況において異なる。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件のストリンジェンシーを調節することで、プローブと１００％相補的な標的配列を同定し得る（相同プロービング）。代案としては、より低い程度の類似性が検出されるようにストリンジェンシー条件を調節して、配列中のいくらかのミスマッチを許容し得る（非相同プロービング）。一般にプローブは長さが約１０００未満のヌクレオチドであり、長さが５００未満のヌクレオチドとされていてもよい。
【００６６】
典型的にストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３において約１．５ＭのＮａイオン未満、典型的に約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン（またはその他の塩）濃度であり、短いプローブ（例えば１０〜５０個のヌクレオチド）では温度が少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば５０個のヌクレオチドを超える）では少なくとも約６０℃であるような条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成できる。低ストリンジェンシー条件の具体例としては、３７℃で３０〜３５％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ドデシル硫酸ナトリウム［「ＳＤＳ」］の緩衝溶液を用いたハイブリダイゼーション、および５０〜５５℃で１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０ＭＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中での洗浄が挙げられる。中程度のストリンジェンシー条件の具体例としては、３７℃で４０〜４５％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および５５〜６０℃で０．５×〜１×ＳＳＣ中での洗浄が挙げられる。高ストリンジェンシー条件の具体例としては、３７℃で５０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および６０〜６５℃で０．１×ＳＳＣ中での洗浄が挙げられる。追加的なストリンジェントな条件の組としては、例えば０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーションが挙げられる。
【００６７】
特異性は典型的にハイブリダイゼーション後洗浄の関数であり、重要な要因は最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドでは、Ｔｍは、Ｍｅｉｎｋｏｔｈら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８：２６７〜２８４頁（１９８４年）の式、Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ  Ｍ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌから近似でき、式中、Ｍは一価のカチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンおよびトシシンヌクレオチドの百分率であり、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの百分率であり、Ｌは塩基対中のハイブリッドの長さである。Ｔｍは相補的標的配列の５０％が、完全にマッチするプローブにハイブリダイズする（規定のイオン強度およびｐＨ下における）温度である。Ｔｍは１％のミスマッチあたり約１℃低下するので、Ｔｍ、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を調節して、所望の同一性がある配列にハイブリダイズさせることができる。例えば≧９０％同一の配列を求める場合、Ｔｍを１０℃低下できる。一般にストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列およびその相補体のＴｍよりも約５℃低いように選択される。しかし厳しいストリンジェントな条件は、Ｔｍよりも１、２、３または４℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用でき、中程度にストリンジェントな条件は、Ｔｍよりも６、７、８、９または１０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用でき、低ストリンジェンシー条件は、Ｔｍよりも１１、１２、１３、１４、１５または２０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用できる。数式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、および所望のＴｍを使用して、当業者は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーのバリエーションが、固有に述べられることを理解するであろう。所望のミスマッチ程度が、４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴｍをもたらす場合、より高い温度を使用できるようにＳＳＣ濃度を増大させることが好ましい。核酸ハイブリダイゼーションに関する広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，第１部，第２章，「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３年）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２章，Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５年）にある。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件は、少なくとも１０、３０、６０、９０、１２０または２４０分間適用できる。
【００６８】
核酸またはポリペプチド配列の文脈において「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウィンドウ間で最大一致のために整列させると同じになる、２つの配列中の核酸塩基またはアミノ酸残基を指す。
【００６９】
したがって「配列同一性百分率」または「％同一性」は、比較ウィンドウ間で最適に整列させた２つの配列を比較して判定される値を指し、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２配列の最適配列比較のために、（付加または欠失を含まない）基準配列との比較で付加または欠失（すなわちギャップ）を含んでなってもよい。百分率は、双方の配列内で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置数を判定して計算し、一致位置数を得て、一致する位置数を比較ウィンドウ内の総位置数で除して、結果に１００を乗じて同一性百分率を得る。
【００７０】
「％同一性」および「％類似性」を判定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムで体系化されている。％同一性および％類似性は、１）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８年）；２）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３年）；３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，第１部（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４年）；４）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７年）；および５）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１年）に記載されるものをはじめとするが、これに限定されるものではない、既知の方法で容易に計算し得る。
【００７１】
配列アラインメントおよび％同一性または類似性の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）をはじめとするが、これに限定されるものではない、相同的な配列を検出するようにデザインされた多様な比較法を使用して判定されてもよい。配列の多重アラインメントは、「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ法」および「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法」をはじめとするアルゴリズムのいくつかの変種を包含する「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法」を使用して実施される（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ，５：１５１〜１５３頁（１９８９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ら，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９〜１９１頁（１９９２年）により記載され、ＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）（バージョン８．０．２）プログラム（前出）にある）。どちらかのＣｌｕｓｔａｌプログラムを使用した配列のアラインメント後、プログラムの「配列距離」表を見ることで「％同一性」を得ることが可能である。
【００７２】
アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ法を使用した多重アラインメントでは、デフォルト値はＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に相当する。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ法を使用したタンパク質配列のペアワイズ配列比較および％同一性計算のデフォルトパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸ではこれらのパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４である。
【００７３】
アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法を使用した多重アラインメントのデフォルトパラメーターは、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢに相当する。
【００７４】
「配列比較のＢＬＡＳＴＮ法」が、デフォルトパラメーターを使用してヌクレオチド配列を比較する、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）が提供するアルゴリズムであるのに対し、「ＢＬＡＳＴＰアラインメント法」は、デフォルトパラメーターを使用してタンパク質配列を比較する、ＮＣＢＩによって提供されるアルゴリズムである。
【００７５】
その他の種から同一または同様の機能または活性を有するポリペプチドを同定する上で、多くのレベルの配列同一性が有用であることを当業者はよく理解している。適切な核酸断片、すなわち本明細書の開示に従った単離されたポリヌクレオチドは、本明細書で報告されるアミノ酸配列と少なくとも約７０〜８５％同一のポリペプチドをコードする一方、より好ましい核酸断片は少なくとも約８５〜９５％同一のアミノ酸配列をコードする。好ましい範囲は上述のようであるが、％同一性の有用な例としては、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％などの５０％〜１００％のあらゆる整数百分率が挙げられる。またこの単離されたヌクレオチド断片のあらゆる全長または部分的補体も興味深い。
【００７６】
適切な核酸断片は上述の相同性を有するだけでなく、典型的に少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０個のアミノ酸、なおもより好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【００７７】
「コドン縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼさないヌクレオチド配列のバリエーションを可能にする遺伝子コードの性質を指す。したがって本明細書に記載されるのは、配列番号５８、配列番号９７、配列番号１３９、および配列番号１７９に記載の本ポリペプチドをコードするアミノ酸配列の全てまたは実質的部分をコードするあらゆる核酸断片である。当業者は、所定のアミノ酸を特定するヌクレオチドコドン使用における、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」についてよく知っている。したがって宿主細胞中の改善された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好むコドン使用頻度に近くなるように遺伝子をデザインすることが望ましい。
【００７８】
「合成遺伝子」は、当業者に公知の手順を使用して化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成単位からアセンブルできる。これらのオリゴヌクレオチド構成単位はアニールされ、次にライゲートされて遺伝子セグメントを形成し、それは次に酵素的にアセンブリーされて遺伝子全体が構築される。したがって遺伝子をヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のために個別に調整し、宿主細胞のコドンバイアスを反映させることができる。当業者は、コドン利用が宿主によって好まれるコドンに偏っている場合の遺伝子発現成功の可能性を理解する。好ましいコドンの判定は、配列情報が利用できる宿主細胞由来の遺伝子の調査に基づくことができる。例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のコドン使用頻度プロファイルは、米国特許第７，１２５，６７２号明細書に提供される。
【００７９】
「遺伝子」とは特定のタンパク質を発現する核酸断片を指し、それはコード領域のみを指してもよく、またはコード配列に先行する（５’非コード配列）およびそれに続く（３’非コード配列）制御配列を含んでもよい。「天然遺伝子」とは、自然界にそれ自体の制御配列と共に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界に共に見られない制御およびコード配列を含んでなる天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる起源由来の制御配列およびコード配列、あるいは同一起源由来であるが、自然界に見られるのとは異なる様式で配列される制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物ゲノム中のその天然位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子とは、遺伝子移入によって宿主生物に導入される遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物中に挿入された天然遺伝子、天然宿主内の新しい位置に導入された天然遺伝子、あるいはキメラ遺伝子を含んでなることができる。「導入遺伝子」とは、形質転換によってゲノム中に導入された遺伝子である。「コドン最適化遺伝子」とは、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好むコドン使用頻度を模倣するようにデザインされた遺伝子である。
【００８０】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「制御配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、配列内、または下流（３’非コード配列）に位置して、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。制御配列としては、これらに限定されないが、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、５’非翻訳リーダー配列（例えば転写開始部位と翻訳開始コドンの間）、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位、およびステムループ構造が挙げられる。
【００８１】
「プロモーター」とは、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節できるＤＮＡ配列を指す。一般にコード配列はプロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターは、その全体を天然遺伝子に由来してもよく、または自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されてもよく、または合成ＤＮＡセグメントを含んでなってもよい。異なるプロモーターが、異なる組織または細胞型において、または発達の異なる段階で、または異なる環境条件に応えて、遺伝子発現を誘導してもよいことは当業者によって理解される。発達のほぼ全ての段階で遺伝子が発現されるようにするプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。ほとんどの場合、制御配列（特にそれらの５’末端）の正確な境界は完全に定義されていないので、いくつかの変異のＤＮＡ断片が同一プロモーター活性を有するかもしれないことがさらに認識されている。
【００８２】
「３’非コード配列」、「転写ターミネーター」および「終結配列」という用語は、コード配列下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これとしては、ｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響できる調節シグナルをコードするポリアデニル化認識配列およびその他の配列が挙げられる。ポリアデニル化シグナルは、通常ｍＲＮＡ前駆物質の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響することで特徴づけられる。３’領域は、随伴コード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響できる。
【００８３】
「ＲＮＡ転写物」は、ＲＮＡポリメラーゼが触媒するＤＮＡ配列の転写に起因する生成物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーであれば、それは一次転写物と称される。ＲＮＡ転写物は、それが一次転写物の転写後プロセッシングに由来するＲＮＡ配列であれば、成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」とは、イントロンがなく、細胞がタンパク質に翻訳できるＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡテンプレートに対して相補的で、酵素逆転写酵素を使用してそれから合成されるＤＮＡを指す。ｃＤＮＡは一本鎖であることができ、またはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片を使用して二本鎖形態に変換できる。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含んで、細胞中または生体外でタンパク質に翻訳できるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的で標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号明細書）。
【００８４】
「作動的に連結する」という用語は、一方の機能がもう一方によって影響されるような、単一核酸断片上の核酸配列の協合を指す。例えばプロモーターがそのコード配列の発現に影響できる、すなわちコード配列がプロモーターの転写制御下にある場合、それはコード配列と作動的に連結する。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列と作動的に連結できる。
【００８５】
「組換え」という用語は、例えば化学合成による、または遺伝子操作技術を通じた核酸の単離セグメントの操作による、２つのさもなければ別々の配列セグメントの人為的組み合わせを指す。
【００８６】
「発現」という用語は、本明細書での用法では、センス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡの（前駆または成熟どちらかの）タンパク質への翻訳を指してもよい。
【００８７】
「形質転換」とは、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす、宿主生物または宿主生物中への核酸分子の転移を指す。核酸分子は、例えば自律的に複製するプラスミドであってもよく、またはそれは宿主生物のゲノムに組み込まれてもよい。形質転換核酸断片を含有する宿主生物は、「組換え」、「リコンビナント」、「形質転換」または「形質転換体」生物と称される。
【００８８】
「プラスミド」および「ベクター」と言う用語は、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を運ぶことが多く、通常環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、あらゆる起源に由来する一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの直線または環状、自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってもよく、その中ではいくつかのヌクレオチド配列が結合または組換えされて、細胞に発現カセットを導入できるユニークな構造になる。
【００８９】
「発現カセット」という用語は、外来遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて、異種宿主中での遺伝子の増強された発現ができるようにする要素を有するＤＮＡ断片を指す。  一般に発現カセットは、選択された遺伝子のコード配列と、選択された遺伝子産物の発現に必要である、コード配列に先行する（５’非コード配列）およびそれに続く（３’非コード配列）制御配列とを含んでなる。したがって発現カセットは、典型的に１）プロモーター配列、２）コード配列［「ＯＲＦ」］、および３）真核生物では通常はポリアデニル化部位を含有する３’非翻訳領域（すなわちターミネーター）から構成される。発現カセットは通常はベクターに含まれて、クローニングおよび形質転換を容易にする。各宿主に対して妥当な制御配列を使用しさえすれば、異なる発現カセットを細菌、酵母、植物、および哺乳類細胞をはじめとする異なる生物に形質転換できる。
【００９０】
「組換え構築物」、「発現構築物」、「キメラ構築物」、「構築物」、および「組換えＤＮＡ構築物」という用語は、本明細書で同義的に使用される。組換え構築物は、例えば自然界に一緒には見られない、制御配列およびコード配列などの核酸断片の人為的組み合わせを含んでなる。例えば組換えＤＮＡ構築物は、異なる起源に由来する制御配列およびコード配列、または同一起源に由来する制御配列およびコード配列を含んでなってもよいが、自然界に見られるのとは異なる様式で配列される。このような構築物はそれ自体を使用してもよく、またはベクターと併せて使用してもよい。ベクターを使用する場合、当業者によく知られているように、ベクターの選択は宿主細胞を形質変換するのに使用される方法に左右される。例えばプラスミドベクターが使用できる。
【００９１】
当業者は、本明細書に記載の単離された核酸断片のいずれかを含んでなる宿主細胞を成功裏に形質変換し、選択し、増殖するためにベクター上に存在しなくてはならない遺伝的要素について十分承知している。当業者はまた、異なる独立した形質転換事象が、異なるレベルおよびパターンの発現をもたらし（Ｊｏｎｅｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２４１１〜２４１８頁（１９８５年）；Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１８：７８〜８６頁（１９８９年））、したがって所望の発現レベルおよびパターンを示す株を得るために多数の事象をスクリーンしなくてはならないことを認識する。このようなスクリーニングは特に、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のウェスタン分析または表現型分析によって達成されてもよい。
【００９２】
「配列分析ソフトウェア」と言う用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のために有用なあらゆるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、市販のものでも、あるいは独立して開発されても良い。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、１．）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのＧＣＧプログラム一式（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０）、２．）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０年））、および３．）ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）からのＤＮＡＳＴＡＲ、４．）Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）からのＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ、および５．）スミス−ウォーターマン・アルゴリズムを組み入れたＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、１９９２年会議、１１１〜２０、編集者：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。本説明中で分析のために配列分析ソフトウェアが使用される場合はいつでも、特に断りのない限り、分析結果は言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づく。本明細書での用法では「デフォルト値」とは、ソフトウェアを最初に初期化した際に、初めからロードされる値またはパラメーターのあらゆる組を意味する。
【００９３】
ここで使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術については当該技術分野で良く知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９年）；Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．、Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．およびＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８４年）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ）による出版（１９８７年）でさらに詳しく述べられている。
【００９４】
一般に油性微生物中の脂質蓄積は、増殖培地中に存在する総合的な炭素と窒素との比率に応えて始動する。油性微生物中における遊離パルミチン酸（１６：０）の新規合成をもたらすこの過程は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書で詳細に記載される。パルミチン酸は、長鎖飽和および不飽和脂肪酸誘導体の前駆物質である。
【００９５】
オレイン酸がω−３／ω−６脂肪酸に変換される代謝過程は、炭素原子の付加を通じた炭素鎖の延長、および二重結合の付加を通じた分子の不飽和化を伴う。これは小胞体膜中に存在する一連の特有な延長および不飽和化酵素を必要とする。しかし図１に示されまた下述するように、特定のω−３／ω−６脂肪酸生成のための複数の代案の経路が存在する。
【００９６】
具体的には、図１は下述の経路を描写する。全ての経路は、オレイン酸がΔ１２デサチュラーゼによって、第１のω−６脂肪酸であるリノール酸［「ＬＡ」］に最初に変換されることを要する。次に「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」および基質としてＬＡを使用して、長鎖ω−６脂肪酸が次のように形成される。１）ＬＡがΔ９エロンガーゼによってγ−リノレン酸［「ＥＤＡ」］に変換され；２）ＥＤＡがΔ８デサチュラーゼによってジホモ−γ−リノレン酸［「ＤＧＬＡ」］に変換され；３）ＤＧＬＡがΔ５デサチュラーゼによってアラキドン酸［「ＡＲＡ」］に変換され；４）ＡＲＡがＣ20/22エロンガーゼによってドコサテトラエン酸［「ＤＴＡ」］に変換され；５）ＤＴＡがΔ４デサチュラーゼによってドコサペンタエン酸［「ＤＰＡｎ−６」］に変換される。
【００９７】
「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」はまた、基質としてα−リノレン酸［「ＡＬＡ」］を使用して長鎖ω−３脂肪酸を次のように生成し得る。１）ＬＡがΔ１５デサチュラーゼによって第１のω−３脂肪酸ＡＬＡに変換され；２）ＡＬＡがΔ９エロンガーゼによってエイコサトリエン酸［「ＥＴｒＡ」］に変換され；３）ＥＴｒＡがΔ８デサチュラーゼによってエイコサテトラエン酸［「ＥＴＡ」］に変換され；４）ＥＴＡがΔ５デサチュラーゼによってエイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」］に変換され；５）ＥＰＡがＣ20/22エロンガーゼによってドコサペンタエン酸［「ＤＰＡ」］に変換され；６）ＤＰＡがΔ４デサチュラーゼによってドコサヘキサエン酸［「ＤＨＡ」］に変換される。ω−６脂肪酸がω−３脂肪酸に変換されていてもよい。例えばＥＴＡおよびＥＰＡはΔ１７デサチュラーゼ活性によって、それぞれＤＧＬＡおよびＡＲＡから生成される。
【００９８】
ω−３／ω−６脂肪酸の生合成のための代案の経路は、Δ６デサチュラーゼおよびＣ18/20エロンガーゼ（すなわち「Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路」）を利用する。より具体的にはΔ６デサチュラーゼによって、ＬＡおよびＡＬＡがそれぞれＧＬＡおよびステアリドン酸［「ＳＴＡ」］に変換されてもよい。次にＣ18/20エロンガーゼは、ＧＬＡをＤＧＬＡにおよび／またはＳＴＡをＥＴＡに変換する。下流ＰＵＦＡが、上述のように引き続いて形成される。
【００９９】
ω−３／ω−６脂肪酸を生成するために特定の宿主生物中に導入される必要がある特定の機能性は、宿主細胞（およびその天然ＰＵＦＡプロファイルおよび／またはデサチュラーゼ／エロンガーゼプロファイル）、基質可用性、および所望の最終産物に左右されることが考察される。Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路を通じて生じるＰＵＦＡはＧＬＡおよび／またはＳＴＡを欠いているので、Δ６エロンガーゼ／Δ６デサチュラーゼ経路の発現に対立するものとして、例えばΔ９デサチュラーゼ／Δ８エロンガーゼ経路の発現は、いくつかの実施態様では好ましいかもしれない。
【０１００】
当業者は、ω−３／ω−６脂肪酸生合成のために所望される各酵素をコードする、様々な候補遺伝子を同定できるであろう。有用なデサチュラーゼおよびエロンガーゼ配列はあらゆる供給源に由来してもよく、例えば天然供給源（細菌、藻類、真菌、植物、動物など）から単離され、半合成経路によって生成され、または新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）合成される。宿主中に導入されるデサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子の特定の供給源は重大でないが、デサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有する特異的ポリペプチド選択のための考慮事項としては以下が挙げられる。宿主中に導入されるデサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子の特定の供給源は重大でないが、デサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有する特異的ポリペプチド選択のために以下のことが配慮される。１）ポリペプチドの基質特異性、２）ポリペプチドまたはその構成要素が律速酵素であるかどうか、３）デサチュラーゼまたはエロンガーゼが所望のＰＵＦＡ合成に必須であるかどうか、４）ポリペプチドが必要とする補助因子および／または５）生成後にポリペプチドが（例えばキナーゼまたはプレニルトランスフェラーゼによって）修飾されるかどうか。発現されるポリペプチドは、好ましくは宿主細胞中のその位置の生化学的環境に適合するパラメーターを有する（追加的詳細については米国特許第７，２３８，４８２号明細書を参照されたい）。
【０１０１】
特定の各デサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼの変換効率を考慮することもまた有用であろう。より具体的には、各酵素が基質を生成物に変換するのに１００％の効率で機能することは稀なので、宿主細胞中に生成される未精製油の最終脂質プロファイルは、典型的に所望のω−３／ω−６脂肪酸、ならびに様々な上流中間ＰＵＦＡからなる様々なＰＵＦＡの混合物である。したがって所望の脂肪酸生合成を最適化する場合、各酵素の転換効率もまた考慮すべき変数である。
【０１０２】
上述のそれぞれの考慮を念頭に、公的に入手可能な報告（例えばＧｅｎＢａｎｋ）、特許文献、およびＰＵＦＡ生成能力を有する生物の実験的分析に従って、適切なデサチュラーゼおよびエロンガーゼ活性（例えばΔ６デサチュラーゼ、Ｃ18/20エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ14/16エロンガーゼ、Ｃ16/18エロンガーゼ、Δ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、およびＣ20/22エロンガーゼ）を有する候補遺伝子を同定できる。これらの遺伝子は、特定宿主生物に導入して、生物のＰＵＦＡ合成を可能にしまたは増強するのに適する。
【０１０３】
生物中でひとたび脂肪酸（飽和および不飽和脂肪酸および短鎖および長鎖脂肪酸をはじめとする）が合成されると、それらはトリアシルグリセリド［「ＴＡＧ」］に組み込まれることがある。脂肪酸の主要な貯蔵単位であるＴＡＧは、以下が関与する一連の反応によって形成される。１）アシル基転移酵素による１分子のアシル−ＣｏＡのグリセロール−３−リン酸塩へのエステル化がリゾホスファチジン酸を生じ；２）アシル基転移酵素による第２のアシル−ＣｏＡ分子のエステル化が１，２−ジアシルグリセロールリン酸塩（一般にホスファチジン酸として同定される）を生じ；３）ホスファチジン酸ホスファターゼによるリン酸塩の除去が１，２−ジアシルグリセロールを生じ；４）アシル基転移酵素の作用による第３の脂肪酸の付加がＴＡＧを形成する。
【０１０４】
Δ５デサチュラーゼは、いくつかの保存配列（すなわち３個のヒスチジンボックス[Ｈ（Ｘ）3-4Ｈ（配列番号１および２）、Ｈ（Ｘ）2-3ＨＨ（配列番号３および４）、およびＨ／Ｑ（Ｘ）2-3ＨＨ（配列番号５および６）]、そしてチトクロームｂ5ドメイン）を含有するが、ヘム結合モチーフ（すなわちＨｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＧｌｙまたはＨＰＧＧ[配列番号１８０]）のみが配列内の多様性を欠いている。最初に変異導入の標的として選択されたのはこのモチーフであった。文献は、ＨＰＧＧモチーフ内のヒスチジン残基が機能に重要であることを示唆する（Ｓａｙａｎｏｖａ，Ｏ．ら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１２１：６４１頁（１９９９年）；Ｇｕｉｌｌｏｕ，Ｈ．ら，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，４５：３２〜４０頁（２００４年）；Ｈｏｎｇｓｔｈｏｎｇ，Ａ．ら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７２：１１９２〜１２０１頁（２００６年））。したがってプロリンおよびグリシン残基の置換を優先して、ヒスチジン残基の置換は避けた。
【０１０５】
部位特異的変異導入は、いくつかのΔ５デサチュラーゼのＨＰＧＧモチーフ内のプロリンおよび第２のグリシンに対して独立して実施され、得られた変異ポリペプチドの発現、および野生型酵素と比較したそれらの活性判定がそれに続いた。意外にも、変異Δ５デサチュラーゼのΔ５デサチュラーゼ活性が、対応する野生型Δ５デサチュラーゼのΔ５デサチュラーゼ活性と機能的に同等である、ＨＸＧＧ（配列番号１８１）およびＨＰＧＸ（配列番号１８２）をはじめとするアミノ酸変異モチーフを含んでなる様々な変異Δ５デサチュラーゼが作り出された。
【０１０６】
オリゴヌクレオチド媒介部位特異的変異導入を利用して、様々な標的Δ５デサチュラーゼのＨＰＧＧモチーフ内に特定の点変異を作り出した。多数の部位特異的変異導入プロトコル（例えばＩｓｈｉｉ，Ｔ．Ｍ．ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２９３：５３〜７１頁（１９９８年）；Ｌｉｎｇ  Ｍ．Ｍ．およびＢ．Ｈ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５４：１５７〜１７８頁（１９９７年）；Ｂｒａｍａｎ  Ｊ．（編），Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，第２版，Ｈｕｍａｎｉａ：Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００２年）；Ｋｕｎｋｅｌ  Ｔ．Ａ．ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４：３６７〜３８２頁（１９８７年）；Ｓａｗａｎｏ  Ａ．およびＭｉｙａｗａｋｉ，Ａ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８：ｅ７８（２０００年））が存在するが、その容易な実行と高効率に基づいてＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的変異導入キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を使用のために選択した。基本的手順は、関心のある挿入断片がある超らせん二本鎖ＤＮＡベクター、および所望の変異を含有する２つの合成オリゴヌクレオチドプライマーを利用する。ＤＮＡポリメラーゼによって、ベクターの逆ストランドにそれぞれ相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを温度サイクル中に延長させる。オリゴヌクレオチドプライマーの組み込みによって、スタッガードニックを含有する変異プラスミドが生じる。温度サイクルに続いて親ＤＮＡテンプレートを消化し、新たに合成された変異ＤＮＡを選択する手段として、（メチル化およびヘミメチル化ＤＮＡに特異的な）ＤｐｎＩエンドヌクレアーゼで生成物を処理する。次に所望の変異を含有するニックのあるベクターＤＮＡを形質転換して、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）宿主中で増殖させる。
【０１０７】
キメラＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなるプラスミド構築物内で、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化されたミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来する合成Δ５デサチュラーゼ（すなわちＥｇＤ５Ｓ；配列番号１０；米国特許出願公開第２００７−０２７７２６６−Ａ１号明細書）中に、上述の技術を使用して部位特異的変異導入によって、あらゆる可能なアミノ酸置換を導入した。変異体を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換し配列決定してから、約１８％のＤＧＬＡを産生するようにあらかじめ改変されたリポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の適切な株に形質転換した。これによってＧＣ分析およびＡＲＡの産生に基づいて、Δ５デサチュラーゼ活性をスクリーニングできるようになった。
【０１０８】
完全に非機能性の変異Δ５デサチュラーゼ（すなわち検出可能なΔ５デサチュラーゼ活性を有さない）、または非変異野生型酵素と比較して、実質的にΔ５デサチュラーゼ活性が低下している変異Δ５デサチュラーゼをもたらす、多数の変異が同定された。しかし意外にも予備スクリーニングは、ＨＰＧＧモチーフ内のプロリンを置換でき、対応する野生型酵素（すなわちＥｇＤ５Ｓ）のΔ５デサチュラーゼ活性との比較で、ほぼ同等のまたは増大したΔ５デサチュラーゼ活性を変異体中にもたらす、３つのアミノ酸残基を同定した。したがってこの予備実験は、ＥｇＤ５ＳのΔ５デサチュラーゼ活性に顕著に影響を及ぼすことなく、ＨＰＧＧモチーフ内のプロリン残基をいくつかのアミノ酸で置換できることを示唆した。
【０１０９】
部位特異的変異導入反応におけるテンプレートとしてＥｇＤ５Ｓを使用して同様の実験を実施し、ＨＰＧＧモチーフの第２のグリシン残基を変異させた。上述のように、変異酵素の分析からは、野生型アミノ酸（すなわちグリシン）を置換するには２つのアミノ酸残基で十分であると判定され、同等のまたは改善されたΔ５デサチュラーゼ活性を有する変異ＥｇＤ５Ｓ酵素がもたらされた。
【０１１０】
ひとたびＥｇＤ５ＳのＨＰＧＧモチーフ中のアミノ酸置換の予備分析が上述のように完了したら、各変異ＥｇＤ５Ｓ含有プラスミドを宿主株ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に再度形質転換して、野生型ＥｇＤ５Ｓの転換率以上で機能する変異体の定量分析を実施した。生成した脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］のＧＣ分析は、最初の５つの変異体の内３つのΔ５デサチュラーゼ活性が、対応する野生型ＥｇＤ５Ｓ対照と比較して増大した活性で機能したことを立証した。
【０１１１】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ  Ａｎａｂａｅｎａ）に由来する合成Δ５デサチュラーゼ（すなわちＥａＤ５Ｓ；配列番号１４；米国特許出願公開第２００８−０２７４５２１−Ａ１号明細書）、およびＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、ペリディニウム（Ｐｅｒｉｄｉｎｉｕｍ）種ＣＣＭＰ６２６に由来する合成Δ５デサチュラーゼ（すなわちＲＤ５Ｓ；配列番号１８；米国特許出願公開第２００７−０２７１６３２−Ａ１号明細書）を使用して上の実験プロトコルを繰り返した。変異体中において、対応する野生型酵素（すなわちＥｇＤ５Ｓ、ＥａＤ５ＳまたはＲＤ５Ｓ）と比較して同等または増大したΔ５デサチュラーゼ活性をもたらした、全ての部位特異的変異導入の結果を下の表３に要約する（追加的詳細については実施例を参照されたい）。変異体は、１）野生型酵素；２）ハイフン（−）；３）変異体ＨＰＧＧモチーフを記述する、以下の命名法を使用して命名される。したがって例えばＨＰＧＧモチーフのアミノ酸２においてプロリンがヒスチジンで置換された（すなわちＰ２のＨ置換）合成のコドン最適化ＥｇＤ５Ｓ（すなわち配列番号１０）から作り出される変異酵素は、ＥｇＤ５Ｓ−ＨＨＧＧと同定される。
【０１１２】
表３：Δ５デサチュラーゼ活性増大をもたらすＨＰＧＧモチーフ変異体
0005762291.tif 000005
*対応する野生型非変異酵素と比較した変異酵素のΔ５デサチュラーゼの％活性増大は、定量分析でなく初回アッセイ結果に基づいて報告される。
【０１１３】
上のデータは、Δ５デサチュラーゼ活性が増大している変異ポリペプチドを生成するのに、どの特定のアミノ酸置換が十分であるのかに関して一致を示さない。しかし前述の当該技術分野の報告に反して、プロリンまたはグリシン残基どちらかの置換が、その野生型親よりもΔ５デサチュラーゼ活性がさらに高い酵素をもたらすかもしれないことを実証するデータは驚くべきである。したがって配列番号１８３（ＨＧＧＧ）、配列番号１８４（ＨＨＧＧ）、配列番号１８６（ＨＣＧＧ）、配列番号１８７（ＨＷＧＧ）、および配列番号１８５（ＨＰＧＳ）からなる群から選択されるアミノ酸モチーフを含んでなる、Δ５デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドを提供することが本発明の範囲内である。好ましくはポリペプチドは配列番号５８（ＥｇＤ５Ｓ−ＨＧＧＧおよびＥｇＤ５Ｓ−ＨＨＧＧ）、配列番号９７（ＥｇＤ５Ｓ−ＨＰＧＳ）、配列番号１３９（ＥａＤ５Ｓ−ＨＣＧＧ）、および配列番号１７９（ＲＤ５Ｓ−ＨＣＧＧおよびＲＤ５Ｓ−ＨＷＧＧ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。より好ましくは変異Δ５デサチュラーゼは、１）配列番号１８３（ＨＧＧＧ）、配列番号１８４（ＨＨＧＧ）、配列番号１８６（ＨＣＧＧ）、配列番号１８７（ＨＷＧＧ）、および配列番号１８５（ＨＰＧＳ）からなる群から選択される、変異アミノ酸モチーフを含んでなり；２）変異Δ５デサチュラーゼ活性はＨＰＧＧ（配列番号１８０）アミノ酸モチーフを有する対応する野生型Δ５デサチュラーゼと比較して増大している。
【０１１４】
当業者は、有用な変異Δ５デサチュラーゼが上述の変異に限定されるものではないことを理解するであろう。それよりむしろ結果は、チトクロームｂ5ドメイン内のＨＰＧＧ（配列番号１８０）モチーフを有するあらゆるΔ５野生型デサチュラーゼ酵素を使用して同様の実験法を実施し、それによってΔ５デサチュラーゼ活性が増大した変異Δ５デサチュラーゼを設計できることを示唆し、変異は変異ＨＸＧＧモチーフ（配列番号１８１）またはＨＰＧＸ（配列番号１８２）モチーフをもたらす。Δ５デサチュラーゼ活性が増大した変異酵素は、ω−３／ω−６脂肪酸産生を増大させるのに有用たり得る。
【０１１５】
例えば生体外変異導入および選択または変異性ＰＣＲ（Ｌｅｕｎｇら，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１：１１〜１５頁（１９８９年）；Ｚｈｏｕら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：６０５２〜６０５２頁（１９９１年）；Ｓｐｅｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：７７７〜７７８頁（１９９３年）；Ｍｅｌｎｉｋｏｖら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２７（４）：１０５６〜１０６２頁（１９９９年２月１５日））もまた、ＥｇＤ５Ｓ、ＥａＤ５ＳまたはＲＤ５Ｓなどの天然Δ５デサチュラーゼ遺伝子の変異を得る手段として採用でき、変異としては、欠失、挿入、および点変異、またはそれらの組み合わせが挙げられる。変異性ＰＣＲの主な利点は、この方法によって導入される全ての変異が所望のデサチュラーゼ遺伝子内にあり、ＰＣＲ条件を変更することであらゆる変更が容易に制御できることである。代案としては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ；Ｇｒｅｅｎｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｌａｈａｎ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，７：３２〜３４頁（１９９４年））からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｒｅｄ株およびＥｐｉｃｕｒｉａｎ  ｃｏｌｉＸＬ１−Ｒｅｄ  ｍｕｔａｔｏｒ株などの市販材料を使用した生体内変異導入を用いてもよい。この株は主要ＤＮＡ修復経路の３つ（ｍｕｔＳ、ｍｕｔＤ、およびｍｕｔＴ）が欠損しており、野生型より５０００倍高い変異率がもたらされる。生体内変異導入は（変異性ＰＣＲと同様に）ライゲーション効率に依存しない；しかし変異はベクターのあらゆる領域で起きるかもしれず、変異率は一般にはるかにより低い。
【０１１６】
改変または改善されたΔ５デサチュラーゼ活性がある変異Δ５デサチュラーゼ酵素を「遺伝子シャフリング」法（米国特許第５，６０５，７９３号明細書、米国特許第５，８１１，２３８号明細書、米国特許第５，８３０，７２１号明細書、米国特許第５，８３７，４５８号明細書）を使用して構築してもよいこともまた考察される。遺伝子シャッフリング法は、その容易な実行、および高率な変異導入のために特に魅力的である。遺伝子シャフリングのプロセスは、関心のある遺伝子との類似性または相違性を有するＤＮＡ領域の追加的集団存在下における、関心のある遺伝子の特定サイズの断片への制限を伴う。この断片のプールを変性させ再アニールして、変異遺伝子を作り出す。次に変異した遺伝子を変更された活性についてスクリーニングする。これらの方法のいずれかを使用して、置換されたモチーフＨＸＧＧ（配列番号１８１）およびＨＰＧＸ（配列番号１８２）を有するΔ５デサチュラーゼ変異酵素を作り出し、次にそれを本明細書に記載される方法によって改善された活性についてスクリーニングしてもよい。
【０１１７】
本明細書に記載される変異Δ５デサチュラーゼ（すなわち前記変異Δ５デサチュラーゼがＨＰＧＧアミノ酸モチーフをコードする領域内に少なくとも１つの変異を含んでなり、前記変異Δ５デサチュラーゼが対応する野生型Δ５デサチュラーゼと比較してΔ５デサチュラーゼ活性の増大を有する）をコードするキメラ遺伝子を適切なプロモーター制御下で導入することは、形質転換宿主生物、ＡＲＡおよび／またはＥＰＡ産生の増大をそれぞれもたらすことが予期される。したがって本明細書で開示されるのは、脂肪酸基質（すなわちＤＧＬＡおよび／またはＥＴＡ）が所望の脂肪酸生成物（すなわちそれぞれＡＲＡおよび／またはＥＰＡ）に変換されるように、基質を本明細書に記載される変異デサチュラーゼ酵素（例えば、配列番号５８[ＥｇＤ５Ｓ−ＨＧＧＧおよびＥｇＤ５Ｓ−ＨＨＧＧ]、配列番号９７[ＥｇＤ５Ｓ−ＨＰＧＳ]、配列番号１３９[ＥａＤ５Ｓ−ＨＣＧＧ]、配列番号１７９[ＲＤ５Ｓ−ＨＣＧＧおよびＲＤ５Ｓ−ＨＷＧＧ]）に曝すステップを含んでなる、ＰＵＦＡを直接生産する方法である。
【０１１８】
より具体的には、本明細書に記載されるのは、微生物宿主細胞（例えば細菌、酵母、藻類、ユーグレナ属、ストラメノパイル、卵菌綱、および真菌）中でＡＲＡを生成する方法であり、微生物宿主細胞は
ａ）配列番号１８３（ＨＧＧＧ）、配列番号１８４（ＨＨＧＧ）、配列番号１８６（ＨＣＧＧ）、配列番号１８７（ＨＷＧＧ）、および配列番号１８５（ＨＰＧＳ）からなる群から選択されるアミノ酸モチーフを含んでなるΔ５デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドと、
ｂ）ＤＧＬＡ源と
を含み、前記宿主細胞を変異Δ５デサチュラーゼが発現されてＤＧＬＡがＡＲＡに変換されるような条件下で増殖させて、ＡＲＡが回収されていてもよい。
【０１１９】
本明細書に記載される別の方法では、ＥＴＡのＥＰＡへの転換のために変異Δ５デサチュラーゼを使用してもよい。したがって記載されるのはＥＰＡを生成する方法であり、
宿主細胞は、
ａ）配列番号１８３（ＨＧＧＧ）、配列番号１８４（ＨＨＧＧ）、配列番号１８６（ＨＣＧＧ）、配列番号１８７（ＨＷＧＧ）、および配列番号１８５（ＨＰＧＳ）からなる群から選択されるアミノ酸モチーフを含んでなるΔ５デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドと、
ｂ）ＥＴＡ源と
を含み、前記宿主細胞は変異Δ５デサチュラーゼが発現されてＥＴＡがＥＰＡに変換されるような条件下で増殖させて、ＥＰＡが回収されていてもよい。
【０１２０】
代案としては、様々なω−６およびω−３ＰＵＦＡ生成のために、本明細書に記載される各変異Δ５デサチュラーゼ遺伝子およびその対応する酵素生成物を間接的に使用し得る（図１；米国特許第７，２３８，４８２号明細書；国際公開第２００７／１３６６７１号パンフレットおよび国際公開第２００７／１３６６４６号パンフレットを参照されたい）。ω−３／ω−６ＰＵＦＡの間接的生産は、脂肪酸基質が中間工程または経路中間体の手段を通じて所望の脂肪酸産物に間接的に転換されて起きる。したがってＰＵＦＡ生合成経路の酵素（例えばΔ６デサチュラーゼ、Ｃ18/20エロンガーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ14/16エロンガーゼ、Ｃ16/18エロンガーゼ、Δ９エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Ｃ20/22エロンガーゼ）をコードする追加的遺伝子と連動させて、本明細書に記載される変異Δ５デサチュラーゼを発現し、例えば、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＤＰＡおよび／またはＤＨＡなどのより長鎖のω−３／ω−６脂肪酸のより高レベルの生成をもたらしてもよいことが考察される。
【０１２１】
好ましくは本明細書に記載されるΔ５デサチュラーゼは、Δ９エロンガーゼおよびΔ８デサチュラーゼと併せて最低限発現される。Δ５デサチュラーゼもまた、Δ６デサチュラーゼおよびΔ６エロンガーゼと併せて最低限発現できる。しかし特定の発現カセット内に含まれる特定の遺伝子は、宿主細胞（そしてそのＰＵＦＡプロファイルおよび／またはデサチュラーゼ／エロンガーゼプロファイル）、基質可用性および所望の最終産物に左右される。
【０１２２】
変異Δ５デサチュラーゼ（すなわち前記変異体が、配列番号１８３（ＨＧＧＧ）、配列番号１８４（ＨＨＧＧ）、配列番号１８６（ＨＣＧＧ）、配列番号１８７（ＨＷＧＧ）、および配列番号１８５（ＨＰＧＳ）からなる群から選択されるアミノ酸モチーフを含んでなる）をコードするＯＲＦを含んでなる組換え構築物を作り出して、適切な宿主細胞に導入する必要がある。当業者は、１）ＤＮＡ分子、プラスミドなどの巨大分子の構築、操作、および単離のための特定の条件および手順；２）組換えＤＮＡ断片および組換え発現構築物の作成；および３）クローンのスクリーニングおよび単離について記載する標準的資料について認識している。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）（以下「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．およびＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４年）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪによる出版（１９８７年）を参照されたい。
【０１２３】
一般に構築物に含まれる配列の選択は、所望の発現産物、宿主細胞の性質、および形質転換細胞と非形質転換細胞とを分離する提案される手段に左右される。当業者は、キメラ遺伝子を含有する宿主細胞を成功裏に形質転換させ、選択し、増殖させるために、プラスミドベクター上に存在しなくてはならない遺伝的要素を知っている。しかし典型的にベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を導く配列、選択性標識、および自律性複製または染色体組み込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始を制御する遺伝子の５’領域、すなわちプロモーター、遺伝子コード配列および転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域、すなわちターミネーターを含んでなる。双方の制御領域は必ずしも生産宿主に天然の遺伝子に由来しなくてもよいが、それらが形質転換宿主細胞からの遺伝子に由来することが最も好ましい。
【０１２４】
所望の微生物宿主細胞中で本Δ５デサチュラーゼＯＲＦの発現を促進するのに有用な転写開始制御領域（また開始制御領域またはプロモーターも）は良く知られている。これらの制御領域は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、イントロン配列、３’ＵＴＲおよび／または５’ＵＴＲ領域、およびタンパク質および／またはＲＮＡ安定化要素を含んでもよい。このような要素はそれらの強度および特異性が異なっていてもよい。宿主種からの転写および翻訳領域が特に有用であるが、実質的に、選択された宿主細胞中でこれらの遺伝子の発現を指示できるあらゆるプロモーター、すなわち天然、合成、またはキメラが適切である。宿主細胞中の発現は、誘導的または構成的様式で達成できる。誘導的発現が関心のある遺伝子と作動的に連結する調節可能なプロモーターの活性を誘導することで起きるのに対し、構成的発現は構成的プロモーターの使用によって起きる。
【０１２５】
宿主細胞が酵母菌の場合、酵母菌細胞中で機能する転写および翻訳領域は、特に宿主種から提供される。例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で使用するための好ましい転写開始調節領域については、国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットに対応する、米国特許出願公開第２００６−００１１５８８１−Ａ１号明細書を参照されたい。構成的または誘導的転写が所望されるかどうか、対象とするＯＲＦを発現する上でのプロモーター効率、構築の容易さなど次第で、いくつかの調節配列のいずれか１つを使用できる。
【０１２６】
翻訳開始コドン「ＡＴＧ」周囲のヌクレオチド配列は、酵母細胞中での発現に影響することが分かっている。所望のポリペプチドが酵母中で不十分に発現される場合、外来性遺伝子のヌクレオチド配列を修正して効率的な酵母翻訳開始配列を含め、最適の遺伝子発現を得ることができる。酵母中での発現のためには、内在性酵母遺伝子、好ましくは高度に発現される遺伝子に、非効率的に発現される遺伝子を部位特異的変異導入してインフレームで融合させることにより実行できる。代案としては、宿主中のコンセンサス翻訳開始配列を判定して、対象の宿主中における異種遺伝子の最適発現のために、この配列を異種遺伝子中に遺伝子操作できる。
【０１２７】
転写終結領域をコードする３’非コード配列が組換え構築物中で提供されてもよく、それから開始領域が得られた遺伝子の３’領域からのもの、または異なる遺伝子からのものであってもよい。多数の終結領域が知られており、それらが由来するのと同じおよび異なる属と種のどちらで利用する場合も多様な宿主中で満足に機能する。終結領域は通常、特定の特質のためでなく、むしろ便宜上から選択される。終結領域はまた、好ましい宿主に天然の様々な遺伝子に由来してもよい。終結領域は、通常、特定の特質のためというよりむしろ便宜的に選択される。当業者は利用できる情報を使用して、転写ターミネーターとして機能する３’領域配列をデザインおよび合成し得るので、３’領域はまた合成し得る。終結部は不必要かもしれないが、高度に好ましい。
【０１２８】
遺伝子をクローニングベクターに単に挿入することは、所望の速度、濃度、量、その他でのその発現を保証しない。高発現率に対する必要に応えて、転写、ＲＮＡ安定性、翻訳、タンパク質安定性および位置、酸素制限、および微生物宿主細胞からの分泌を制御する、特定の特性を調節することにより、多数の特殊発現ベクターが作り出されている。これらの特性としては、次が挙げられる。関連する転写プロモーターおよびターミネーター配列の性質；クローン遺伝子コピー数（単一発現構築物中で追加的コピーをクローンしてもよく、および／またはプラスミドコピー数を増大させることで、またはゲノム中へのクローン遺伝子の複数の組み込みにより、追加的コピーを宿主細胞中に導入してもよい）；遺伝子がプラスミド由来であるかまたは宿主細胞ゲノム中に組み込まれているかどうか；合成外来性タンパク質の最終的細胞内所在；宿主生物中のタンパク質翻訳および正しい折りたたみの効率；宿主細胞中のクローン遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質の固有の安定性；およびその使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近くなるようなクローン遺伝子中のコドン使用頻度。これらのそれぞれを本明細書に記載される方法および宿主細胞中で使用して、変異Δ５デサチュラーゼの発現をさらに最適化してもよい。
【０１２９】
プロモーター、Δ５デサチュラーゼ（ＯＲＦ）、およびターミネーターを含んでなる、少なくとも１つのキメラ遺伝子を含んでなる組換え構築物を作り出した後、それを宿主細胞中で自律複製できるプラスミドベクターに入れ、または宿主細胞のゲノムに直接組み込む。発現カセットの組み込みは宿主ゲノム内で無作為に起きることができ、または宿主遺伝子座内の遺伝子組換えを標的とするのに十分な宿主ゲノムとの相同性領域を含有する構築物の使用を通じて標的を定めることができる。構築物が内在性遺伝子座を標的とする場合、全てまたはいくつかの転写および翻訳調節領域が、内在性遺伝子座によって提供できる。
【０１３０】
２つ以上の遺伝子が別個の複製ベクターから発現される場合、各ベクターが異なる選択手段を有し、その他の構築物との相同性を欠いて、安定した発現を保ち、構築物間の要素の再集合を妨げることが望ましい。全ての導入された遺伝子が、所望の生成物の合成を提供するのに必要なレベルで発現されるように、調節領域の賢明な選択、導入された構築物の選択手段および増殖法は、実験的に判定できる。
【０１３１】
対象の遺伝子を含んでなる構築物は、あらゆる標準技術によって微生物宿主細胞に導入されてもよい。これらの技術としては、形質転換（例えば酢酸リチウム形質転換（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：１８６〜１８７頁（１９９１年）））、微粒子銃衝撃、電気穿孔、マイクロインジェクション、または宿主細胞中に関心のある遺伝子を導入するその他のあらゆる方法が挙げられる。
【０１３２】
便宜上、例えば発現カセット中にＤＮＡ配列を取り込むように、あらゆる方法によって操作されている宿主細胞を「形質転換された」、形質転換体」または「組換え」と本明細書で称する。形質転換された宿主は発現構築物の少なくとも１つのコピーを有して、発現カセットがゲノム中に組み込まれるか、増幅されるか、または複数コピーを有する染色体外要素上に存在するかどうか次第で、２つ以上を有するかもしれない。形質転換された宿主細胞は、導入された構築物上に含有されるマーカーの選択によって同定できる。代案としては、多くの形質転換技術が多くのＤＮＡ分子を宿主細胞中に導入する場合、所望の構築物と共に別個のマーカー構築物を同時形質転換してもよい。
【０１３３】
典型的には、形質転換された宿主は、抗生物質が取り込まれていているかまたは栄養素または成長因子などの非形質転換宿主の増殖に必要な要素が欠如していてもよい選択的培地上で増殖するそれらの能力について選択される。導入されたマーカー遺伝子は、形質転換された宿主中で発現すると抗生物質抵抗性を与え、または必須成長因子または酵素をコードしてもよく、それによって選択培地上での増殖を可能にしてもよい。発現したマーカータンパク質を直接または間接に検出し得る場合にもまた、形質転換された宿主を選択し得る。追加的選択技術は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書、米国特許第７，２５９，２５５号明細書、および国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットに記載される。
【０１３４】
形質転換に続いて、変異Δ５デサチュラーゼ（場合により宿主細胞内で同時発現されるその他のＰＵＦＡ酵素）に適した基質が、宿主によって天然にまたは遺伝子導入的に生成されてもよく、またはそれらは外来的に提供されてもよい。
【０１３５】
細菌、酵母、藻類、ストラメノパイル、卵菌類、ユーグレナ属および／または真菌をはじめとする多様な真核生物が、それによって本明細書に記載されるΔ６デサチュラーゼを含んでなる形質転換体を生じる宿主として適切である。これは転写、翻訳、およびタンパク質生合成装置が高度に保存されていることから考察される。したがって適切な宿主は、広い温度およびｐＨ値範囲にわたり、単純または複合糖質、脂肪酸、有機酸、油、グリセロール、およびアルコール、および／または炭化水素をはじめとする多様な原材料上で増殖するものを含んでもよい。
【０１３６】
好ましい微生物宿主は、油性生物である。これらの油性生物は自然に油を合成および蓄積でき、総油分は乾燥細胞質量の約２５％を超え、より好ましくは乾燥細胞質量の約３０％を超え、最も好ましくは乾燥細胞質量の約４０％を超え得る。様々な細菌、藻類、ユーグレナ属、コケ、真菌、酵母、およびストラメノパイルが自然に油性に分類される。代案の実施態様では、例えばサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母非油性生物を遺伝子改変して、油性にし得る。
【０１３７】
より好ましい実施態様では、微生物宿主細胞は油性酵母である。典型的に油性酵母として同定された属としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。より具体的には、例証的な油合成酵母としては、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポマイセス・スターケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェラス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プリケリーマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プランズ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ・グルチヌス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前はカンジダ・リポリチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に分類された）が挙げられる。代案としては油生合成は、微生物宿主細胞（例えば酵母）が細胞乾燥質量の２５％を超える油を産生し得て、その結果油性と見なされるように遺伝子組換えされていてもよい。
【０１３８】
最も好ましいのは、油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である。さらなる実施態様では、最も好ましいのはＡＴＣＣ＃２０３６２、ＡＴＣＣ＃８８６２、ＡＴＣＣ＃１８９４４、ＡＴＣＣ＃７６９８２および／またはＬＧＡＭＳ（７）１と称されるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株である（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ  Ｓ．，およびＡｇｇｅｌｉｓ  Ｇ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，８２（１）：４３〜９頁（２００２年））。
【０１３９】
油性酵母（すなわちヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））の形質転換に応用できる特定の教示としては、米国特許第４，８８０，７４１号明細書および米国特許第５，０７１，７６４号明細書、およびＣｈｅｎ，Ｄ．Ｃ．ら（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４８（２）：２３２〜２３５（１９９７年））が挙げられる。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中でＡＲＡ、ＥＰＡおよびＤＨＡ産生を導くのに応用できる特定の教示は、それぞれ米国特許出願第１１／２６４７８４号明細書（国際公開第２００６／０５５３２２号パンフレット）、米国特許出願第１１／２６５７６１号明細書（国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット）、および米国特許出願第１１／２６４７３７号明細書（国際公開第２００６／０５２８７１号パンフレット）に提供される。
【０１４０】
この酵母中で遺伝子を発現する好ましい方法は、宿主ゲノム中への線状ＤＮＡ組み込みによるものである。遺伝子の高レベル発現が所望される場合、ゲノム中の複数位置への組み込みが特に有用であり得、例えばＵｒａ３遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ３０６４２１）、Ｌｅｕ２遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２６０２３０）、Ｌｙｓ５遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３４９２９）、Ａｃｏ２遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３００）、Ｐｏｘ３遺伝子遺伝子座（Ｐｏｘ３：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿５０３２４４；またはＡｃｏ３：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３０１）、Δ１２デサチュラーゼ遺伝子遺伝子座（米国特許第７，２１４，４９１号明細書）、Ｌｉｐ１遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ５００２０）、Ｌｉｐ２遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ０１２６３２）、ＳＣＰ２遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ４３１３６２）、Ｐｅｘ３遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７８５６５）、Ｐｅｘ１６遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７９６２２）および／またはＰｅｘ１０遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８１６０６）である。
【０１４１】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）で使用される好ましい選択方法は、カナマイシン、ハイグロマイシン、およびアミノグリコシドＧ４１８に対する抵抗性、ならびにウラシル、ロイシン、リジン、トリプトファンまたはヒスチジンが欠如している培地上で増殖する能力である。酵母Ｕｒａ-変異体を選択するために５−フルオロオロト酸（５−フルオロウラシル−６−カルボン酸一水和物；「５−ＦＯＡ」）が使用されてもよく（米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書）、または形質転換体を選択するためにスルホニル尿素除草剤抵抗性を与える天然アセトヒドロキシ酸シンターゼ（またはアセト乳酸シンターゼ；Ｅ．Ｃ．４．１．３．１８）が利用される（国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット）。部位特異的リコンビナーゼシステムの使用によって、複数逐次形質転換で使用するために好ましい選択マーカーのペアを「再利用する」ユニークな方法もまた、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書で教示される。
【０１４２】
上記に基づいて、本明細書ではＡＲＡまたはＥＰＡのいずれかを産生する方法であって、
（ａ）
（ｉ）少なくとも１つの制御配列と作動的に連結した、変異Δ５デサチュラーゼポリペプチドをコードする第１の組換えヌクレオチド分子、および
（ｉｉ）ＤＧＬＡおよび／またはＥＴＡからそれぞれ構成されるデサチュラーゼ基質源
を含んでなる油性酵母（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））を提供するステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）の酵母を適切な発酵性炭素源の存在下で増殖させるステップであって、前記変異Δ５デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子が発現されて、それぞれＤＧＬＡがＡＲＡに変換されおよび／またはＥＴＡがＥＰＡに変換されるステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）のＡＲＡおよび／またはＥＰＡがそれぞれ回収されていてもよいステップと
を含む方法を開示する。
【０１４３】
基質供給が必要かもしれない。好ましい実施態様では、変異Δ５デサチュラーゼポリペプチドは、配列番号５８、配列番号９７、配列番号１３９、および配列番号１７９からなる群から選択される。したがって例えば変異Δ５デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、例えば配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、および配列番号１９５からなる群から選択されてもよい。
【０１４４】
天然では油性酵母中で生成されるＰＵＦＡは、１８：２脂肪酸（すなわちＬＡ）と、一般的ではないが１８：３脂肪酸（すなわちＡＬＡ）に限定されるので、油性酵母を遺伝子改変し、本明細書に記載される変異Δ５デサチュラーゼに加えて長鎖ＰＵＦＡ生合成に必要な複数酵素を発現させて（それによって例えばＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡｎ−６、ＤＰＡ、およびＤＨＡを生成できるようにして）もよい。
【０１４５】
具体的には本明細書では、
（ａ）少なくとも１つの制御配列と作動的に連結した、変異Δ５デサチュラーゼポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを含んでなる第１の組換えＤＮＡ構築物；および
（ｂ）少なくとも１つの制御配列と作動的に連結した、Δ４デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ14/16エロンガーゼ、Ｃ16/18エロンガーゼ、Ｃ18/20エロンガーゼ、およびＣ20/22エロンガーゼからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを含んでなる少なくとも１つの追加的組換えＤＮＡ構築物
を含んでなる油性酵母が考察される。
【０１４６】
その他の適切な微生物宿主としては、油性細菌、藻類、ユーグレナ属、ストラメノパイル、卵菌綱、および真菌が挙げられる。この幅広い微生物宿主群の中で特に興味深いのは、ω−３／ω−６脂肪酸を合成する微生物、またはこの目的のために遺伝子改変し得るもの（例えばサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの別の酵母）である。したがって例えば誘導性プロモーターまたは調節プロモーター制御下における、本Δ５デサチュラーゼ遺伝子のいずれかによるモルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）（ＡＲＡ生成のために商業的に使用される）の形質転換は、増大した量のＡＲＡを合成できる形質転換体生物を生じ得る。Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）を形質転換させる方法は、Ｍａｃｋｅｎｚｉｅら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６６：４６５５頁（２０００年））に記載される。同様にヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）微生物（例えば、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）を形質転換させる方法が、米国特許第７，００１，７７２号明細書で開示される。
【０１４７】
本明細書に記載の変異Δ５デサチュラーゼの発現ために選択される宿主に関わりなく、複数の形質転換体をスクリーンして所望の発現レベル、制御、およびパターンを示す株を得なくてはならない。例えばＪｕｒｅｔｚｅｋら（Ｙｅａｓｔ，１８：９７〜１１３頁（２００１年））は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の組み込まれたＤＮＡ断片の安定性が、使用される個々の形質転換体、受容者株、および標的プラットフォームに左右されると述べた。このようなスクリーニングは、ＤＮＡブロットのサザン分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、９８：５０３頁（１９７５年））、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（Ｋｒｏｃｚｅｋ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．，６１８（１〜２）：１３３〜１４５頁（１９９３年））、タンパク質発現のウェスタンおよび／またはＥｌｉｓａ分析、ＰＵＦＡ生成物の表現型分析またはＧＣ分析によって達成されてもよい。
【０１４８】
変異Δ５デサチュラーゼの配列知識は、様々な宿主細胞中でω−３および／またはω−６脂肪酸生合成を操作する上で有用であろう。生化学的経路を操作する方法は当業者によく知られており、油性酵母中、特にヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中において、ω−３および／またはω−６脂肪酸生合成を最大化するために、多数の操作が可能であることが予期される。この操作は、ＰＵＦＡ生合成経路中の代謝エンジニアリング、または炭素からＰＵＦＡへの生合成経路に寄与する経路の追加的操作を必要とするかもしれない。望ましい生化学的経路のアップレギュレート、および望ましくない生化学的経路のダウンレギュレートに有用な方法は、当業者に良く知られている。
【０１４９】
例えばエネルギーまたは炭素についてω−３および／またはω−６脂肪酸生合成経路と競合する生化学的経路、または特定のＰＵＦＡ最終産物の生成を妨げる天然ＰＵＦＡ生合成経路酵素を遺伝子破壊によって排除し、または例えばアンチセンスｍＲＮＡなどのその他の手段によりダウンレギュレートしてもよい。
【０１５０】
ＡＲＡ、ＥＰＡまたはＤＨＡを増大させる手段としてのＰＵＦＡ生合成経路中の操作およびその関連技術の詳細な考察は、それぞれ国際公開第２００６／０５５３２２号パンフレット［米国特許出願公開第２００６−００９４０９２−Ａ１号明細書］、国際公開第号２００６／０５２８７０号パンフレット［米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書］、および国際公開第２００６／０５２８７１号パンフレット［米国特許出願公開第２００６−０１１０８０６−Ａ１号明細書］にあり、ＴＡＧ生合成経路およびＴＡＧ分解経路（およびその関連技術）において望ましい操作についても同様である。
【０１５１】
上述の戦略いずれか１つによって、脂肪酸生合成経路の発現を調節することが有用かもしれない。例えば本明細書ではω−３および／またはω−６脂肪酸を生成するために、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ生合成経路およびΔ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ生合成経路中の鍵酵素をコードする遺伝子を油性酵母中に導入する方法が提供される。天然ではω−３および／またはω−６脂肪酸生合成経路を保有しない油性酵母中で本変異Δ５デサチュラーゼ遺伝子を発現し、宿主生物の代謝エンジニアリングの様々な手段を使用して、これらの遺伝子の発現を連係させて、好ましいＰＵＦＡ生成物の産生を最大化することが特に有用であろう。
【０１５２】
形質転換された微生物宿主細胞は、キメラ遺伝子の発現（例えばデサチュラーゼ、エロンガーゼ）を最適化する条件下で増殖させて、最大かつ最も経済的な所望のＰＵＦＡ収率を生じさせる。一般に最適化されてもよい培地条件としては、炭素源のタイプおよび量、窒素源のタイプおよび量、炭素対窒素比、異なる無機イオン量、酸素レベル、増殖温度、ｐＨ、バイオマス生成相の長さ、油蓄積相の長さ、および細胞収穫時間および方法が挙げられる。油性酵母（例えばヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））などの関心のある微生物は、一般に複合培地（例えば酵母菌抽出物−ペプトン−デキストロース液体培地［「ＹＰＤ」］）で、または増殖に必要な構成要素が欠如することで所望の発現カセットの選択を強要する合成最少培地（例えばＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）からの酵母菌窒素ベース）上で増殖させる。
【０１５３】
本明細書に記載される方法および宿主細胞のための発酵培地は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書で開示されるような適切な炭素源を含有しなくてはならない。本明細書の方法で利用される炭素源は多種多様な炭素含有源を包含してもよいことが考察されるが、好ましい炭素源は糖（例えばグルコース）、グリセロール、および／または脂肪酸である。
【０１５４】
窒素は、無機（例えば（ＮＨ4）2ＳＯ4）または有機（例えば尿素またはグルタメート）源から供給されてもよい。適切な炭素および窒素源に加えて、発酵培地は、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、ビタミン、および油性宿主増殖とＰＵＦＡ生成に必要な酵素的経路促進とに適することが当業者に知られている、その他の構成要素もまた含有しなくてはならない。脂質およびＰＵＦＡ合成を促進するＦｅ+2、Ｃｕ+2、Ｍｎ+2、Ｃｏ+2、Ｚｎ+2、およびＭｇ+2などのいくつかの金属イオンが特に注目される（Ｎａｋａｈａｒａ，Ｔ．ら，Ｉｎｄ．Ａｐｐｌ．Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｏｉｌｓ，Ｄ．Ｊ．ＫｙｌｅおよびＲ．Ｃｏｌｉｎ編，６１〜９７頁（１９９２年））。
【０１５５】
本明細書に記載される方法および宿主細胞に好ましい増殖培地は、イーストニトロゲン基礎培地（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）などの一般的な商業的に調製された培地である。その他の規定培地または合成増殖培地もまた使用してよく、形質転換宿主細胞の増殖に適した培地は、微生物学または発酵化学当業者に知られている。発酵のための適切なｐＨ範囲は典型的に約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０の間であり、初期増殖条件範囲としてはｐＨ５．５〜ｐＨ７．５が好ましい。発酵は好気性または嫌気性条件下で実行されてもよく、微好気条件が好ましい。
【０１５６】
代謝状態は増殖と脂肪の合成／保存との間で「平衡状態」でなくてはならないので、典型的には、油性酵母細胞中のＰＵＦＡの高レベルの蓄積は二段階過程を必要とする。したがって最も好ましくは、油性酵母（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））中でのＰＵＦＡ生成のために二段階発酵過程が必要である。このアプローチは米国特許第７，２３８，４８２号明細書に記載され、様々な適切な発酵過程デザイン（すなわちバッチ、流加、および連続）および増殖中の配慮についても同様である。
【０１５７】
ＰＵＦＡは、宿主微生物中に遊離脂肪酸として、またはアシルグリセロール、リン脂質、スルホ脂質または糖脂質などのエステル化形態として存在してもよく、当該技術分野で良く知られている多様な手段を通じて宿主細胞から抽出されてもよい。酵母脂質の抽出技術、品質分析、および合格基準の１つの総説は、Ｚ．Ｊａｃｏｂｓ（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２（５／６）：４６３〜４９１頁（１９９２年））によるものである。Ａ．ＳｉｎｇｈおよびＯ．Ｗａｒｄ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４５：２７１〜３１２頁（１９９７年））による後処理プロセスに関する簡潔な概要もまた入手できる。
【０１５８】
一般にＰＵＦＡ精製のための手段としては、有機溶剤による抽出（例えば米国特許第６，７９７，３０３号明細書、および米国特許第５，６４８，５６４号明細書）、超音波処理、超臨界流体抽出（例えば二酸化炭素を使用する）、鹸化、および圧搾などの物理的手段、またはそれらの組み合わせが挙げられる。追加的詳細については、米国特許第７，２３８，４８２号明細書を参照されたい。
【０１５９】
ω−３および／またはω−６脂肪酸、特に例えばＡＬＡ、ＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡが組み込まれた多数の食品および飼料製品がある。長鎖ＰＵＦＡを含んでなる微生物バイオマス、ＰＵＦＡを含んでなる部分的に精製された微生物バイオマス、ＰＵＦＡおよび／または精製ＰＵＦＡを含んでなる精製微生物油は、食品および飼料製品中で機能して、現行の調合物に健康上の利点を与えることが考察される。より具体的にはω−３および／またはω−６脂肪酸を含有する油は、類似食品、肉製品、穀物製品、ベークド食品、スナック食品、および乳製品をはじめとするが、これに限定されるものではない、多様な食品および飼料製品中での使用に適する（より詳しくは米国特許出願公開第２００６−００９４０９２号明細書を参照されたい）。
【０１６０】
調合物中で本組成物を使用して、医療栄養物、健康補助食品、乳児用調製粉乳および医薬品をはじめとするメディカルフードに健康上の利点を与えてもよい。食品加工および食品調合の当業者は、本油の一定量および組成物をどのように食品または飼料製品に添加してもよいかを理解するであろう。このような量は本明細書で「有効」量と称され、食品または飼料製品、栄養補給することが意図される食餌、またはメディカルフードまたは医療栄養物が矯正しまたは治療することが意図される疾患によって決まる。
【実施例】
【０１６１】
本発明が具体的に完成することを例証するがその可能なバリエーションの全てを完全に定義するものではない、以下の実施例において本発明についてさらに詳述する。
【０１６２】
一般方法
実施例で使用する標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野でよく知られており、１．）Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）（Ｍａｎｉａｔｉｓ）；２．）Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ、Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ、およびＬ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４年）；および３．）Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ）による出版（１９８７年）で述べられる。
【０１６３】
微生物培養の維持および増殖に適した材料および方法は、当該技術分野でよく知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術については、次で述べられている。Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ、Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ、Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ、Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ、およびＧ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編、「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４年）、またはＴｈｏｍａｓ，Ｄ．Ｂｒｏｃｋ、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９年）。微生物細胞の増殖および維持のために使用される全ての試薬制限酵素および材料は、特に断りのない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は典型的にルリア・ベルターニ（ＬＢ）プレート上で３７℃で増殖させた。
【０１６４】
一般分子クローニングは、標準法に従って実施された（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）。ＤＮＡ配列は、ベクターおよび挿入断片特異的プライマーの組み合わせを使用して、染料ターミネーター技術（米国特許第５，３６６，８６０号明細書；欧州特許第２７２，００７号明細書）を使用して、ＡＢＩ自動配列決定装置上で作り出された。配列編集はシーケンチャー（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）内で実施された。全ての配列は、双方向に少なくとも２回のカバレッジに相当する。遺伝子配列の比較は、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して達成された。
【０１６５】
略語の意味は次のとおり。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」または「ｈｒ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリトルを意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」マイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋＢ」はキロ塩基を意味する。
【０１６６】
発現カセットの命名法
発現カセットの構造は簡易表記体系「Ｘ：：Ｙ：：Ｚ」で表され、Ｘはプロモーター断片を記載し、Ｙは遺伝子断片を記載し、Ｚはターミネーター断片を記載し、それらは全て互いに作動的に連結している。
【０１６７】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換および培養：
ＡＴＣＣ登録番号＃２０３６２、＃７６９８２、および＃９０８１２のヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入された。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、典型的に下に示すレシピに従ったいくつかの培地中で２８〜３０℃で増殖させた。寒天プレートは必要に応じて、標準法に従って各液体培地に２０ｇ／Ｌの寒天を添加して調製した。
【０１６８】
ＹＰＤ寒天培地（１Ｌあたり）：１０ｇの酵母抽出物［Ｄｉｆｃｏ］；２０ｇのＢａｃｔｏペプトン［Ｄｉｆｃｏ］；および２０ｇのグルコース。
【０１６９】
基礎最少培地（ＭＭ）（１Ｌあたり）：２０ｇグルコース；１．７ｇアミノ酸非含有イーストニトロゲン基礎培地；１．０ｇプロリン；およびｐＨ６．１（未調節）。
【０１７０】
最少培地＋ロイシン（ＭＭ＋ロイシンまたはＭＭＬｅｕ）（１Ｌあたり）：上記のようにＭＭ培地を調製して０．１ｇロイシンを添加する。
【０１７１】
高グルコース培地（ＨＧＭ）（１Ｌあたり）：８０グルコース、２．５８ｇ  ＫＨ2ＰＯ4、および５．３６ｇ  Ｋ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．５（調節不要）。
【０１７２】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換は、参照によって本明細書に援用する米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に記載されるように実施した。
【０１７３】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の脂肪酸分析：
脂肪酸分析のために、Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．およびＤｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．（Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、３７：９１１〜９１７頁（１９５９年））で述べられているように、遠心分離によって細胞を収集して脂質を抽出した。ナトリウムメトキシドによる脂質抽出物のエステル交換によって脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥＳ」］を調製し（Ｒｏｕｇｈａｎ，Ｇ．、およびＮｉｓｈｉｄａ，Ｉ．、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２７６（１）：３８〜４６頁（１９９０年））、引き続いて３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）カラムを装着したＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。オーブン温度は、３．５℃／分で１７０℃（２５分間保持）から１８５℃であった。
【０１７４】
直接塩基エステル交換のために、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）培養物（３ｍＬ）を採取して蒸留水で１回洗浄し、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ内において真空下で５〜１０分間乾燥させた。サンプルにナトリウムメトキシド（１％；１００μＬ）を添加して、次にサンプルをボルテックスして２０分間振盪した。３滴の１Ｍ  ＮａＣｌおよび４００μＬのヘキサンを添加した後、サンプルをボルテックスして遠沈した。上層を除去し、上述のようにＧＣによって分析した。
【０１７５】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０３６Ｕ株の構築
後述する実施例２〜４、６〜７、および９では、国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレット、に記載されるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０３６Ｕ株（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−）を宿主として使用した。
【０１７６】
Ｙ４０３６Ｕ株の開発には、Ｙ２２２４株（野生型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２株のＵｒａ３遺伝子の自律変異からのＦＯＡ抵抗性変異体）、Ｙ４００１株（Ｌｅｕ−表現型がある１７％ＥＤＡを産生する）、Ｙ４００１Ｕ１株（Ｌｅｕ−およびＵｒａ−表現型がある１７％ＥＤＡを産生する）、およびＹ４０３６株（Ｌｅｕ−表現型がある１８％ＤＧＬＡを産生する）の構築を必要とした。
【０１７７】
野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２と比較したＹ４０３６Ｕ株の最終遺伝子型は次のとおり。ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０（ＦｍＤ１２はフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子[国際公開第２００５／０４７４８５号パンフレット]であり；ＭＥ３Ｓはモルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）に由来するコドン最適化されたＣ16/18エロンガーゼ遺伝子[国際公開第２００７／０４６８１７号パンフレット]であり；ＥｇＤ９ｅはミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ遺伝子[国際公開第２００７／０６１７４２号パンフレット]であり；ＥｇＤ９ｅＳはミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来するコドン最適化されたΔ９エロンガーゼ遺伝子[国際公開第２００７／０６１７４２号パンフレット]であり；ＥｇＤ８Ｍはミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）[米国特許第７，２５６，０３３号明細書］に由来する合成変異Δ８デサチュラーゼ[国際公開第２００８／０７３２７１号パンフレット]である）。
【０１７８】
実施例１
ＥｇＤ５Ｓを含んでなるｐＤＭＷ３６９構築物
本実施例は、キメラＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなるプラスミドｐＤＭＷ３６９について記載する（プラスミド構築については国際公開第２００７／１３６６７１号パンフレットに記載されている）。プラスミドｐＤＭＷ３６９（図２Ａ；配列番号１９）は以下の構成要素を含有した。
【０１７９】
表７：プラスミドｐＤＭＷ３６９（配列番号１９）の構成要素
0005762291.tif 000006
【０１８０】
実施例２
ＥｇＤ５Ｓ中の改善されたΔ５デサチュラーゼ活性をもたらすＨＸＧＧ変異の同定
テンプレートとしてｐＤＭＷ３６９（実施例１）、プライマーとして１９対のオリゴヌクレオチド（配列番号２０〜５７；表８）を使用して単一アミノ酸変異を実施し、部位特異的変異導入（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）によってＥｇＤ５ＳのＨＰＧＧモチーフ（配列番号１０）のプロリン残基を個々に変異させ、それによってあらゆる可能なアミノ酸置換を発生させた（すなわちＨｉｓ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ[ＨＸＧＧ]変異体、Ｘａａはあらゆるアミノ酸である）。各変異を含んでなるプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ２Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。１９個の各形質転換から４個のコロニーを拾い、液体培地中において３７℃で一晩、個々に増殖させた。プラスミド（すなわち合計７６個）をこれらの培養物から単離し、個々に配列決定して変異を確認した。
【０１８１】
一般方法に記載されるように、野性型ｐＤＭＷ３６９プラスミドおよび単離された変異プラスミドをＹ４０３６Ｕ株に個々に形質転換した。形質転換体をＭＭＬｅｕプレート上で選択した。３０℃で２日間の増殖後、形質転換反応からの各２つの形質転換体を新しいＭＭＬｅｕプレート上に画線塗抹し、３０℃でさらに２日間インキュベートした。次にコロニーを使用して、２４ウェルＱｉａｇｅｎブロック内の３ｍＬのＭＭＬｅｕに接種した。３０℃の恒温器内でブロックを２００ｒｐｍで振盪しながら、インキュベートした。培養物を２日間インキュベートした後、ブロックを遠心分離して上清を除去し、３ｍＬのＨＧＭを添加した。ブロックを３０℃の恒温器内に戻しさらに５日間２００ｒｐｍで振盪した。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出してエステル交換によってＦＡＭＥを調製し、引き続いてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。
【０１８２】
ＨＰＧＧモチーフ内の各変異に起因するΔ５デサチュラーゼ活性を下の表８に要約する。ＥｇＤ５Ｓ変異体は変異ＨＸＧＧモチーフの配列に従って命名される（すなわち例えば変異ＥｇＤ５Ｓ−ＨＡＧＧ中のＨＰＧＧモチーフはＰ２からＡへの置換を有し、それによってＨｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ[ＨＡＧＧ]モチーフを生じる一方、変異ＥｇＤ５Ｓ−ＨＲＧＧはＰ２からＲへの置換を有した）。転換効率は次式に従って判定した（[生成物]／[基質＋生成物]）＊１００。結果はプラスミドｐＤＭＷ３６９内の野生型ＥｇＤ５Ｓ（配列番号１０）と比較され、ＧＣ分析は形質転換体によって総脂質の８．８％のＤＧＬＡおよび４．５％のＡＲＡが生成されると判定した（すなわち平均転換効率は３３．８％であった）。
【０１８３】
表８：ＥｇＤ５ＳおよびＨＸＧＧモチーフ変異体中のΔ５デサチュラーゼ活性
0005762291.tif 000007
*各ＥｇＤ５Ｓ遺伝子（変異体または野生型）はｐＤＭＷ３６９内で発現された。
**ＮＤ：この実験では変異体は得られなかった。
【０１８４】
上に基づいて、ＥｇＤ５ＳのΔ５デサチュラーゼ活性に実質的に影響を及ぼすことなく、ＨＰＧＧモチーフ内のプロリン残基がいくつかのアミノ酸で置換され得ることは明らかである。ＥｇＤ５Ｓと比較してΔ５デサチュラーゼ活性が等しく、または改善されている好ましいプロリン置換はＥｇＤ５Ｓ−ＨＧＧＧ（３３．６％転換）およびＥｇＤ５Ｓ−ＨＹＧＧ（３４．６％転換）中に存在した。ＥｇＤ５Ｓ−ＨＨＧＧ（３２．８％転換）は、ＥｇＤ５ＳのΔ５デサチュラーゼ活性の９７％で機能した。
【０１８５】
実施例３
ＥｇＤ５Ｓ中で改善されたΔ５デサチュラーゼ活性をもたらすＨＰＧＸ変異の同定
テンプレートとしてｐＤＭＷ３６９（実施例１）、プライマーとして１９対のオリゴヌクレオチド（配列番号５９〜９６；表９）を使用して単一アミノ酸変異を実施し、部位特異的変異導入によって（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＣＡ）、ＥｇＤ５ＳのＨＰＧＧモチーフ（配列番号１０）の第２のグリシン残基を個々に変異させ、それによってあらゆる可能なアミノ酸置換を発生させた（すなわちＨｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘａａ[ＨＰＧＸ]変異体）。変異導入に続いてプラスミドをＹ４０３６Ｕに形質転換し、形質転換体を選択してＭＭＬｅｕおよびＨＧＭ中で増殖させ、実施例２に記載されるようにＦＡＭＥを調製してＧＣによって分析した。
【０１８６】
ＨＰＧＧモチーフ内の各変異に起因するΔ５デサチュラーゼ活性を下の表９に要約する。ＥｇＤ５Ｓ変異体は変異ＨＰＧＸモチーフの配列に従って命名される（すなわち例えば変異ＥｇＤ５Ｓ−ＨＰＧＡ中のＨＰＧＧモチーフはＧ４からＡへの置換を有し、それによってＨｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ[ＨＰＧＡ]モチーフを生じる一方、変異ＥｇＤ５Ｓ−ＨＰＧＲはＧ４からＲへの置換を有した）。転換効率は実施例２に記載される式に従って判定した。結果はプラスミドｐＤＭＷ３６９内の野生型ＥｇＤ５Ｓ（配列番号１０）と比較され、ＧＣ分析は形質転換体によって総脂質の８．８％のＤＧＬＡａおよび４．５％のＡＲＡが生成されたと判定した（すなわち平均転換効率は３３．８％であった）。
【０１８７】
表９：ＥｇＤ５ＳおよびＨＰＧＸモチーフ変異体中のΔ５デサチュラーゼ活性
0005762291.tif 000008
*各EgD5S遺伝子(変異体または野生型)はpDMW369内で発現された。
**ND:この実験では変異体は得られなかった。
【０１８８】
結果は、ＥｇＤ５ＳのΔ５デサチュラーゼ活性に実質的に影響を及ぼすことなく、ＨＰＧＧモチーフ内の第２のグリシン残基が、いくつかのアミノ酸で置換され得ることを実証した。ＥｇＤ５Ｓと比較してΔ５デサチュラーゼ活性が等しく、または改善されている好ましいグリシン置換は、ＥｇＤ５Ｓ−ＨＰＧＳ（３７．３％転換）およびＥｇＤ５Ｓ−ＨＰＧＴ（３５．５％転換）中に存在した。
【０１８９】
実施例４
野生型ＥｇＤ５Ｓレベル以上で機能するＥｇＤ５変異体の定量分析
アミノ酸置換の予備分析が完結したら（実施例２および３）、野生型ＥｇＤ５Ｓのほぼ転換率以上で機能する変異体（すなわちＥｇＤ５Ｓ−ＨＧＧＧ、ＥｇＤ５Ｓ−ＨＨＧＧ、ＥｇＤ５Ｓ−ＨＹＧＧ、ＥｇＤ５Ｓ−ＨＰＧＳ、およびＥｇＤ５Ｓ−ＨＰＧＴ）の定量分析を実施した。上の変異を含有するプラスミドは、それぞれｐＤＭＷ３６９−ＨＧＧＧ、ｐＤＭＷ３６９−ＨＨＧＧ、ｐＤＭＷ３６９−ＨＹＧＧ、ｐＤＭＷ３６９−ＨＰＧＳ、およびｐＤＭＷ３６９−ＨＰＧＴと称する。これらのプラスミドをｐＤＭＷ３６９と共にＹ４０３６Ｕに再度形質転換して（一般方法）、ＭＭＬｅｕ上に播種した。プレートを３０℃で約４日間インキュベートした。各プレートからの１２個の形質転換体を新鮮なＭＭＬｅｕプレート上に再度画線塗抹し、３０℃で再度インキュベートした。２４ウェルブロック型内の３ｍＬのＭＭＬｅｕ中に、形質転換体を接種した。ブロックを２００ｒｐｍ、３０℃で２日間インキュベートした。２日間の増殖後、ブロックを遠心分離して上清を傾斜し、ペレットをＨＧＭに再懸濁した。ブロックを３０℃でさらに５日間インキュベートした。遠心分離によって細胞を収集して脂質を抽出し、エステル交換によってＦＡＭＥを調製して、引き続いてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。
【０１９０】
１２個のサンプルのＤＧＬＡからＡＲＡへの平均転換率を下の表１０に要約した。
【０１９１】
表１０：ＥｇＤ５Ｓ  ＨＸＧＸモチーフ変異体中のΔ５デサチュラーゼ活性
0005762291.tif 000009
*各ＥｇＤ５Ｓ遺伝子（変異体または野生型）はｐＤＭＷ３６９内で発現された。
【０１９２】
この実験は、ＥｇＤ５Ｓ−ＨＧＧＧおよびＥｇＤ５Ｓ−ＨＨＧＧ（配列番号５８）およびＥｇＤ５Ｓ−ＨＰＧＳ（配列番号９７）変異体のΔ５デサチュラーゼ活性が、野生型ＥｇＤ５Ｓ対照と比較して増大していることを確認した。ＥｇＤ５Ｓ−ＨＧＧＧをコードする適切なヌクレオチド配列は配列番号１９０で記載され、ＥｇＤ５Ｓ−ＨＨＧＧをコードする適切な配列は配列番号１９１で記載され、ＥｇＤ５Ｓ−ＨＰＧＳをコードする適切なヌクレオチド配列は配列番号１９２で記載される。
【０１９３】
実施例５
ＥａＤ５Ｓを含んでなる構築物ｐＺＵＦｍＥａＤ５Ｓの作成
本実施例は、キメラＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなるプラスミドｐＺＵＦｍＥａＤ５Ｓの構築について記載する。プラスミドｐＺＵＦｍＥａＤ５Ｓ（配列番号９８）は、ｐＺＵＦ１７のＮｃｏ  Ｉ／Ｎｏｔ  Ｉ  断片（図２Ｂ；配列番号９９）をｐＥａＤ５Ｓ（配列番号１００）からのＮｃｏ  Ｉ／Ｎｏｔ  Ｉ  ＥａＤ５Ｓ断片で置換することにより構築された[プラスミドｐＥａＤ５Ｓ（配列番号１００）は、ＥａＤ５Ｓ遺伝子（配列番号１３）をｐＵＣ５７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｙ１４８３７）中にクローンして作り出された]。このライゲーションの生成物はｐＺＵＦｍＥａＤ５Ｓであり、それは以下の構成要素を含有した。
【０１９４】
表１１：プラスミドｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ（配列番号９８）の構成要素
0005762291.tif 000010
【０１９５】
実施例６
ＥａＤ５Ｓ中において改善されたΔ５デサチュラーゼ活性をもたらすＨＸＧＧ変異の同定
テンプレートとしてｐＺＵＦｍＥａＤ５Ｓ（実施例５）、プライマーとして１９対のオリゴヌクレオチド（配列番号１０１〜１３８；表１２）を使用して単一アミノ酸変異を実施し、部位特異的変異導入によって（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）ＥａＤ５ＳのＨＰＧＧモチーフ（配列番号１４）のプロリン残基を個々に変異させ、それによってあらゆる可能なアミノ酸置換（すなわちＨｉｓ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ[ＨＸＧＧ]変異体）を発生させた。各変異を含んでなるプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ２Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。１９個の各形質転換から４個のコロニーを拾い、液体培地中において３７℃で一晩、個々に増殖させた。プラスミド（すなわち合計７６個）をこれらの培養物から単離し、個々に配列決定して変異を確認した。
【０１９６】
野性型ｐＺＵＦｍＥａＤ５Ｓプラスミドおよび単離された変異プラスミドを一般方法に記載されるようにＹ４０３６Ｕ株に個々に形質転換した。ＭＭＬｅｕプレート上で形質転換体を選択し、次に（恒温器の速度を２００から２５０ｒｐｍに増大させたこと以外は）実施例２に記載されるようにして、液体ＭＭＬｅｕおよびＨＧＭ培地中で増殖させた。細胞を遠心分離により収集して脂質を抽出し、エステル交換によりＦＡＭＥを調製して、引き続いてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。
【０１９７】
ＨＰＧＧモチーフ内の各変異に起因するΔ５デサチュラーゼ活性を下の表１２に要約する。ＥａＤ５Ｓ変異体は、変異ＨＸＧＧモチーフの配列に従って命名される（すなわち例えば変異ＥａＤ５Ｓ−ＨＡＧＧ中のＨＰＧＧモチーフはＰ２からＡへの置換を有し、それによってＨｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ[ＨＡＧＧ]モチーフを生じる一方、変異ＥａＤ５Ｓ−ＨＲＧＧはＰ２からＲへの置換を有した）。転換効率は次式に従って測定された。（[生成物]／[基質＋生成物）＊１００。結果はｐＺＵＦｍＥａＤ５Ｓプラスミド内の野生型ＥａＤ５Ｓ（配列番号１４）と比較され、ＧＣ分析は２つの形質転換体のＤＧＬＡからＡＲＡへの平均転換効率が２５％であると判定した。
【０１９８】
表１２：ＥａＤ５ＳおよびＨＸＧＧモチーフ変異体中のΔ５デサチュラーゼ活性
0005762291.tif 000011
*各ＥａＤ５Ｓ遺伝子（変異体または野生型）はｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ内で発現された。
**ＮＤ：この実験では変異体は得られなかった。
【０１９９】
上に基づいて、ＥａＤ５ＳのΔ５デサチュラーゼ活性に実質的に影響を及ぼすことなく、ＨＰＧＧモチーフ内のプロリン残基をいくつかのアミノ酸で置換し得ることが明らかである。ＥａＤ５Ｓと比較してΔ５デサチュラーゼ活性が改善されている好ましいプロリン置換は、ＥａＤ５Ｓ−ＨＡＧＧ（２６．３％転換）、ＥａＤ５Ｓ−ＨＣＧＧ（２６．２％転換）、ＥａＤ５Ｓ−ＨＫＧＧ（２５．２％転換）、およびＥａＤ５Ｓ−ＨＴＧＧ（２５．８％転換）中に存在した。
【０２００】
野生型ＥｇＤ５Ｓレベルでまたは野生型ＥｇＤ５Ｓレベルを超えて機能するＥａＤ５変異体の定量分析
野生型ＥａＤ５Ｓのほぼ転換率以上の活性で機能する変異体のさらなる定量分析を実施した（すなわちＥａＤ５Ｓ−ＨＡＧＧ、ＥａＤ５Ｓ−ＨＲＧＧ、ＥａＤ５Ｓ−ＨＮＧＧ、ＥａＤ５Ｓ−ＨＣＧＧ、ＥａＤ５Ｓ−ＨＨＧＧ、ＥａＤ５Ｓ−ＨＬＧＧ、ＥａＤ５Ｓ−ＨＫＧＧ、ＥａＤ５Ｓ−ＨＭＧＧ、ＥａＤ５Ｓ−ＨＦＧＧ、ＥａＤ５Ｓ−ＨＳＧＧ、およびＥａＤ５Ｓ−ＨＴＧＧ）。上の変異を含有するプラスミドは、それぞれｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ−ＨＡＧＧ、ｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ−ＨＲＧＧ、ｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ−ＨＮＧＧ、ｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ−ＨＣＧＧ、ｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ−ＨＨＧＧ、ｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ−ＨＬＧＧ、ｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ−ＨＫＧＧ、ｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ−ＨＭＧＧ、ｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ−ＨＦＧＧ、ｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ−ＨＳＧＧ、およびｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ−ＨＴＧＧと称された。これらのプラスミドをｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓと共にＹ４０３６Ｕ（一般方法）に再度形質転換して、ＭＭＬｅｕ上に播種した。プレートを３０℃で約４日間インキュベートした。各プレートからの６個の形質転換体を新鮮なＭＭＬｅｕプレート上に再度画線塗抹して、３０℃で再度インキュベートした。２４ウェルブロック型内の３ｍＬのＭＭＬｅｕ中に、形質転換体を接種した。ブロックを２００ｒｐｍ、３０℃で２日間インキュベートした。２日間の増殖後、ブロックを遠心分離して上清を傾斜し、ペレットをＨＧＭに再懸濁した。ブロックを３０℃でさらに５日間インキュベートした。遠心分離によって細胞を収集して脂質を抽出し、エステル交換によってＦＡＭＥを調製して、引き続いてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。
【０２０１】
６個のサンプルのＤＧＬＡからＡＲＡへの平均転換率を下の表１３に要約した。
【０２０２】
表１３：ＥａＤ５Ｓ  ＨＸＧＧモチーフ変異体中のΔ５デサチュラーゼ活性
0005762291.tif 000012
*各ＥａＤ５Ｓ遺伝子（変異体または野生型）はｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ内で発現された。
【０２０３】
この実験は、ＥａＤ５Ｓ−ＨＣＧＧ（配列番号１３９）変異体のΔ５デサチュラーゼ活性が、野生型ＥａＤ５Ｓ対照と比較して増大していることを確認した。ＥａＤ５Ｓ−ＨＣＧＧをコードする適切なヌクレオチド配列は、配列番号１９３で記載される。
【０２０４】
実施例７
ＲＤ５Ｓを含んでなる構築物ｐＺＵＦｍＲＤ５Ｓの作成
本実施例は、キメラＦＢＡＩＮ：：ＲＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を含んでなるプラスミドｐＺＵＲＤ５Ｓについて記載する（プラスミド構築については国際公開第２００７／１３６６４６号パンフレットに記載されている）。プラスミドｐＺＵＲＤ５Ｓ（配列番号１４０）は、ＥｇＤ５Ｓ（配列番号９）の代わりにＲＤ５Ｓ（配列番号１７）で置換されていることを除いては、ｐＤＭＷ３６９（実施例１；配列番号１９）と構造が同一である。
【０２０５】
実施例８
ＲＤ５Ｓ中で改善されたΔ５デサチュラーゼ活性をもたらすＨＸＧＧ変異の同定
テンプレートとしてｐＺＵＲＤ５Ｓ（実施例７）、プライマーとして１９対のオリゴヌクレオチド（配列番号１４１〜１７８；表１４）を使用して単一アミノ酸変異を実施し、部位特異的変異導入によって（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）、ＲＤ５Ｓ（配列番号１７）のＨＰＧＧモチーフのプロリン残基を個々に変異させ、それによってあらゆる可能なアミノ酸置換を作成した（すなわちＨｉｓ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ[ＨＸＧＧ]変異体）。各変異からのプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ２Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。１９個の各形質転換からの４個のコロニーを拾い、液体培地中において３７℃で一晩、個々に増殖させた。プラスミド（すなわち合計７６個）をこれらの培養物から単離し、個々に配列決定して変異を確認した。
【０２０６】
野性型ｐＺＵＲＤ５Ｓプラスミドおよび単離された変異プラスミドを一般方法に記載されるように、Ｙ４０３６Ｕ株に個々に形質転換した。形質転換体をＭＭＬｅｕプレート上で選択し、次に（恒温器の速度を２００から２５０ｒｐｍに増大させたこと以外は）実施例２に記載されるようにしてＭＭＬｅｕおよびＨＧＭ培地中で増殖させた。細胞を遠心分離により収集して脂質を抽出し、エステル交換によりＦＡＭＥを調製して、引き続いてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。
【０２０７】
ＨＰＧＧモチーフ内の各変異に起因するΔ５デサチュラーゼ活性を下の表１４に要約する。ＲＤ５Ｓ変異体は変異ＨＸＧＧモチーフの配列に従って命名された（すなわち例えば変異ＲＤ５Ｓ−ＨＡＧＧ中のＨＰＧＧモチーフは、Ｐ２からＡへの置換を有しそれによってＨｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ[ＨＡＧＧ]モチーフが生じる一方、変異ＲＤ５Ｓ−ＨＲＧＧはＰ２からＲへの置換を有した）。次式に従って転換効率を判定した（[生成物]／[基質＋生成物]）＊１００。結果はプラスミドｐＺＵＲＤ５Ｓ内の野生型ＲＤ５Ｓ（配列番号１８）と比較され、ＧＣ分析は、２つの形質転換体のＤＧＬＡからＡＲＡへの平均転換効率を２５．１％と判定した。
【０２０８】
表１４：ＲＤ５ＳおよびＨＸＧＧモチーフ変異体中のΔ５デサチュラーゼ活性
0005762291.tif 000013
*各ＲＤ５Ｓ遺伝子（変異体または野生型）はＺＵＲＤ５Ｓ中で発現された。
**ＮＤ：この実験では変異体を得られなかった。
【０２０９】
上記に基づいて、ＲＤ５ＳのΔ５デサチュラーゼ活性に実質的に影響を与えることなく、ＨＰＧＧモチーフ内のプロリン残基をいくつかのアミノ酸で置換し得ることは明らかである。Δ５デサチュラーゼ活性がＲＤ５Ｓと比較して改善されている好ましいプロリン置換が、ＲＤ５Ｓ−ＨＣＧＧ（３４．８％転換）およびＲＤ５Ｓ−ＨＷＧＧ（２８．５％転換）中に存在した。
【０２１０】
野生型ＲＤ５Ｓ（すなわちＲＤ５Ｓ−ＨＣＧＧおよびＲＤ５Ｓ−ＨＷＧＧ（配列番号１７９））の転換率以上に機能するこれらの変異の定量分析は、先にＥｇＤ５ＳおよびＥａＤ５Ｓ変異体について記載したように実施される。ＲＤ５Ｓ−ＨＣＧＧをコードする適切なヌクレオチド配列は配列番号１９４で記載され、ＲＤ５Ｓ−ＨＷＧＧをコードする適切なヌクレオチド配列は配列番号１９５で記載される。
本発明のいくつかの実施態様を以下に例示する。
（１）  Δ５デサチュラーゼ活性を有して、配列番号１８３（ＨＧＧＧ）、配列番号１８４（ＨＨＧＧ）、配列番号１８６（ＨＣＧＧ）、配列番号１８７（ＨＷＧＧ）、および配列番号１８５（ＨＰＧＳ）からなる群から選択されるアミノ酸モチーフを含んでなる、変異ポリペプチド。
（２）  配列番号５８（ＥｇＤ５Ｓ−ＨＧＧＧおよびＥｇＤ５Ｓ−ＨＨＧＧ）、配列番号９７（ＥｇＤ５Ｓ−ＨＰＧＳ）、配列番号１３９（ＥａＤ５Ｓ−ＨＣＧＧ）、および配列番号１７９（ＲＤ５Ｓ−ＨＣＧＧおよびＲＤ５Ｓ−ＨＷＧＧ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、（１）に記載の変異ポリペプチド。
（３）  親ポリペプチドのジホモ−γ−リノレン酸からアラキドン酸への転換効率を超えるジホモ−γ−リノレン酸からアラキドン酸への転換効率を有する、（１）に記載の変異ポリペプチド。
（４）  （１）に記載のポリペプチドを実質的にコードする、単離された核酸分子。
（５）  配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、および配列番号１９５からなる群から選択される、（４）に記載の単離された核酸。
（６）  （１）に記載のポリペプチドを発現する微生物宿主細胞。
（７）  細菌、酵母、藻類、ユーグレナ属、ストラメノパイル、卵菌綱、および真菌からなる群から選択される（６）に記載の微生物宿主細胞。
（８）  微生物宿主細胞が油性酵母である、（７）に記載の微生物宿主細胞。
（９）  油性酵母が、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される、（８）に記載の微生物宿主細胞。
（１０）  ジホモ−γ−リノレン酸の存在下で、（１）に記載のポリペプチドを発現する微生物宿主細胞を増殖させるステップを含んでなり、前記ジホモ−γ−リノレン酸がアラキドン酸に変換される、アラキドン酸を生成する方法。
（１１）  エイコサテトラエン酸の存在下で（１）に記載のポリペプチドを発現する微生物宿主細胞を増殖させるステップを含んでなり、前記エイコサテトラエン酸がエイコサペンタエン酸に変換される、エイコサペンタエン酸を生成する方法。
（１２）  宿主細胞がω−６脂肪酸およびω−３脂肪酸からなる群から選択される多価不飽和脂肪酸を産生する、（６）に記載の微生物宿主細胞。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【配列表】
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