(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑膿菌のゲノム上の、
（１）genomic isletを構成するオープンリーディングフレーム（ORF）、および
（２）ファージ由来遺伝子のORF、
の有無を任意の順で検出し、これらORFの有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを含む、緑膿菌の遺伝子型別分類法であって、
前記（１）のＯＲＦにおけるgenomic isletが、PSPA7_0045、PA2794 、PA14_20600 、PA1509、PA2119 、PA3065、PA4549、PA5264、PA1380およびPA14_10960からなる群より選ばれる少なくとも５種の遺伝子であり、前記（２）のＯＲＦにおける遺伝子が、PSPA7_0104、PLES_26051、PSPA7_5342、PSPA7_2363およびphage D3 p35からなる群より選ばれる少なくとも２種の遺伝子であり、
配列表の配列番号１と２、配列番号３と４、配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０、配列番号１７と１８、配列番号１９と２０、配列番号２１と２２、配列番号２３と２４、配列番号２５と２６に示された１０組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる１０組のプライマーのうちの少なくとも５組のプライマーを用いて、PCR（polymerase chain reaction）法により前記（１）のORFの検出を行い、配列表の配列番号１１と１２、配列番号１３と１４、配列番号１５と１６、配列番号２７と２８、配列番号２９と３０に示された５組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる５組のプライマーのうちの少なくとも２組のプライマーを用いて、PCR法により前記（２）のORFの検出を行う、
緑膿菌の遺伝子型別分類法。
【請求項２】
前記（１）のＯＲＦにおけるgenomic isletが、PSPA7_0045、PA2794、PA14_20600 、PA1509、PA2119 、PA3065、PA4549、PA5264、PA1380およびPA14_10960からなる１０種の遺伝子であり、前記（２）のＯＲＦにおける遺伝子が、PSPA7_0104、PLES_26051、PSPA7_5342、PSPA7_2363およびphage D3 p35からなる５種の遺伝子である、請求項１に記載の緑膿菌の遺伝子型別分類法。
【請求項３】
緑膿菌のゲノム上の、
（１）genomic isletを構成するオープンリーディングフレーム（ORF）、および
（２）ファージ由来遺伝子のORF、
の有無を任意の順で検出し、これらORFの有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを含む、緑膿菌の遺伝子型別分類法であって、
前記（１）のＯＲＦにおけるgenomic isletが、PSPA7_0045、PA2794 、PA14_20600 、PA1509、PA2119 、PA3065、PA4549、PA5264、PA1380およびPA14_10960からなる群より選ばれる少なくとも５種の遺伝子であり、前記（２）のＯＲＦにおける遺伝子が、PLES_26051、PSPA7_5342、PSPA7_2363およびphage D3 p35からなる群より選ばれる少なくとも２種の遺伝子である、
緑膿菌の遺伝子型別分類法。
【請求項４】
前記（２）のＯＲＦにおける遺伝子が、PLES_26051、PSPA7_5342、PSPA7_2363およびphage D3 p35からなる４種の遺伝子である、請求項３に記載の緑膿菌の遺伝子型別分類法。
【請求項５】
配列表の配列番号１と２、配列番号３と４、配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０、配列番号１７と１８、配列番号１９と２０、配列番号２１と２２、配列番号２３と２４、配列番号２５と２６に示された１０組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる１０組のプライマーのうちの少なくとも５組のプライマーを用いて、PCR（polymerase chain reaction）法により前記（１）のORFの検出を行い、配列表の配列番号１３と１４、配列番号１５と１６、配列番号２７と２８、配列番号２９と３０に示された４組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる４組のプライマーのうちの少なくとも２組のプライマーを用いて、PCR法により前記（２）のORFの検出を行う、請求項３又は４に記載の緑膿菌の遺伝子型別分類法。
【請求項６】
上記塩基配列が、塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していない、請求項１又は５に記載の緑膿菌の遺伝子型別分類法。
【請求項７】
前記PCR法がマルチプレックスPCR法である、請求項１又は５に記載の緑膿菌の遺伝子型別分類法。
【請求項８】
前記（１）〜（２）のORF有無の検出結果を、それぞれ１（有）と０（無）に置き換えて２進法コード化する、請求項１〜７の何れか１項に記載の緑膿菌の遺伝子型別分類法。
【請求項９】
前記２進法コード化した結果をさらに１０進法コード化する、請求項８に記載の緑膿菌の遺伝子型分類法。
【請求項１０】
配列表の配列番号１と２、配列番号３と４、配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０、配列番号１７と１８、配列番号１９と２０、配列番号２１と２２、配列番号２３と２４、配列番号２５と２６に示された１０組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる１０組のプライマーと、配列表の配列番号１１と１２、配列番号１３と１４、配列番号１５と１６、配列番号２７と２８、配列番号２９と３０に示された５組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる５組のプライマーとを含む、緑膿菌の遺伝子型別分類用プライマーセット。
【請求項１１】
上記塩基配列が、塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していない、請求項１０に記載の緑膿菌の遺伝子型別分類用プライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、緑膿菌の遺伝子型別分類法（菌株特定法）およびこれに用いるプライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
緑膿菌は病院で数多く分離される病原菌である。院内感染の原因菌であり感染管理が必要である。またカルバペネム、アミカシン、ニューキノロンに耐性を示すいわゆる多剤耐性化が問題となっており、感染管理の重要性が増している。
厚生労働省院内感染対策サーベイランス事業では、全国の主要な約7,600病院からの報告だけで、緑膿菌感染症は年間80,000件以上に及んでいる。
以上のことから緑膿菌は病院で非常に多く分離され、感染防止のための疫学調査が常に必要な病原菌であると考えられる。言い換えると、緑膿菌は院内感染原因菌として重要な菌である。院内感染を減少させるためには感染ルートの特定が重要である。
【０００３】
院内感染が疑われる場合には、感染ルートを特定するために、異なる患者から分離された菌株が同一か否かを判定する必要がある。そのために菌株が保有するゲノムの特徴を検出し菌株を特定するが、これを遺伝子型別分類という。
菌の遺伝子型別分類の方法としては、従来、パルスフィールドゲル電気泳動法（以下、PFGEという。）が多用されている。PFGEは菌のゲノムDNAを制限酵素で切断し、その断片の電気泳動パターンとして菌株の遺伝子型を決定する方法で、識別能力が高く、再現性があることから遺伝子型別分類の定法とされている。
【０００４】
しかし、PFGEは結果が出るまでに早くても菌株分離同定後３日程度と時間がかかり、検査結果が出たときにはすでに感染拡大が終了していることが多い。また複雑なバンドパターンにより判定する必要があることに加え、緑膿菌のPFGEパターンは変化しやすく同一集団感染由来株であってもバンドパターンが変化していることも多く、主観的な要素が入りがちである。そのため同時に泳動した菌株でさえも遺伝子型が同一か否かを判断するには精通した技術者が必要である。したがって、時間的あるいは距離的に隔たりのある（異なる時または別の場所で行った）PFGE解析結果間での遺伝子型の比較は実質上不可能であった。
さらに、PFGEは作業が煩雑で作業者の熟練を要するうえ、パルスフィールドゲル電気泳動装置などの特殊な装置を必要とし、コストが高い。したがって、より簡便かつ迅速に、幅広く緑膿菌を遺伝子型別分類することができる方法の開発が依然として強く望まれている。
【０００５】
他方、特許文献１には、黄色ブドウ球菌の遺伝子型別分類法およびこれに用いるプライマーセットが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１１−１２０５２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記実情に鑑みて、迅速に遺伝子型別分類する手法を開発し、より実際の産業（医療現場）利用に適した緑膿菌の遺伝子型別分類法を提供することを目的としている。また本発明は、さらに上記遺伝子型別分類法に用いるプライマーセットを提供することをもその目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、緑膿菌のゲノム上の、（１）genomic isletを構成するORF、（２）ファージ由来遺伝子のORFを構成するORFの有無を任意の順で検出し、これらORFの有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うことにより、より有効に緑膿菌の遺伝子型別分類を行うことができることを見出した。
【０００９】
即ち、本発明によれば、緑膿菌のゲノム上の、
（１）genomic isletを構成するオープンリーディングフレーム（ORF）、および
（２）ファージ由来遺伝子のORF、
の有無を任意の順で検出し、これらORFの有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを含む、緑膿菌の遺伝子型別分類法が提供される。
【００１０】
本発明の緑膿菌の遺伝子型別分類法においては、前記（１）のgenomic isletを構成するORFが、PSPA7_0045、PA2794 、PA14_20600 、PA1509、PA2119 、PA3065、PA4549、PA5264、PA1380 、PA14_10960からなる群より選ばれる少なくとも１種（より好ましくは少なくとも５種、特に好ましくは全ての１０種）の遺伝子であり、前記（２）のファージ由来遺伝子におけるＯＲＦがPSPA7_0104、PLES_26051、PSPA7_5342、PSPA7_2363、phage D3 p35からなる群より選ばれる少なくとも１種（より好ましくは少なくとも２種、特に好ましくは全ての５種）の遺伝子であることが好ましい。
【００１１】
また、本発明の遺伝子型別分類法は、配列表の配列番号１と２、配列番号３と４、配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０、配列番号１７と１８、配列番号１９と２０、配列番号２１と２２、配列番号２３と２４、配列番号２５と２６に示された１０組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる１０組のプライマーを用いて、PCR（polymerase chain reaction）法により前記（１）のORFの検出を行い、配列表の配列番号１１と１２、配列番号１３と１４、配列番号１５と１６、配列番号２７と２８、配列番号２９と３０に示された５組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる５組のプライマーを用いて、PCR法により前記（２）のORFの検出を行うことによって実施することができる。
【００１２】
上記の通り、上記プライマーには、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入が有ってもよいが、高精度に遺伝子型別分類する観点からは、前記プライマーに塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入はないことが好ましい。
【００１３】
前記PCR法としてマルチプレックスPCR法を採用すると、遺伝子型別分類のコストを抑えることができる。
【００１４】
前記（１）〜（２）のORF有無の検出結果を、それぞれ１（有）と０（無）に置き換えて２進法コード化すると、検出結果が見やすくなる。
前記２進法コード化した結果をさらに１０進法コード化することで、結果の桁数が少なくなり、結果がより見やすくなる。
【００１５】
さらに本発明によれば、配列表の配列番号１と２、配列番号３と４、配列番号５と６、配列番号７と８、配列番号９と１０、配列番号１７と１８、配列番号１９と２０、配列番号２１と２２、配列番号２３と２４、配列番号２５と２６に示された１０組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる１０組のプライマーと、配列表の配列番号１１と１２、配列番号１３と１４、配列番号１５と１６、配列番号２７と２８、配列番号２９と３０に示された５組の塩基配列の組み合わせ（但し、上記塩基配列は、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入を有していてもよい）からなる５組のプライマーとを含む、緑膿菌の遺伝子型別分類用プライマーセットが提供される。
【００１６】
上記の通り、上記プライマーには、２塩基以下の塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入が有ってもよいが、高精度に遺伝子型別分類する観点からは、前記プライマーに塩基の付加、置換、欠失及び／又は挿入はないことが好ましい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、緑膿菌の遺伝子型別分類を、特殊な装置や作業者の熟練を要さずに簡便に、迅速、客観的かつ高感度に行うことができるため、緑膿菌の院内感染の経路を速やかに決定し、院内感染の広がりを防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、実施例１の電気泳動写真を示す。図１において、「ＰＣ」はポジティブコントロールの略であり、「１ ２・・・・」などと記載された数値は菌株の番号を示している。また「Ｍ」は５０ｂｐラダーを示す。
【図２】図２は、実施例２の電気泳動写真を示す。図２において、「ＰＣ」はポジティブコントロールの略であり、「１ ２・・・・」などと記載された数値は菌株の番号を示している。また「Ｍ」は５０ｂｐラダーを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明について具体的に説明する。
本発明に係る緑膿菌の遺伝子型別分類法は、緑膿菌のゲノム上の、（１）genomic isletを構成するオープンリーディングフレーム（ORF）（２）ファージ由来遺伝子を構成するORFの保有の有無を任意の順で検出し、これら２種類の由来の異なるORFの保有の有無の組み合わせにより遺伝子型別分類を行うステップを有することを特徴としている。以下、これらのＯＲＦについて説明する。
【００２０】
［（１）genomic isletを構成するＯＲＦ］
（日本で分離される緑膿菌の遺伝的特徴）
緑膿菌の遺伝的バックグラウンドを系統的に分類する方法として、multilocus sequence typing（MLST）解析が利用されている。
【００２１】
MLST解析では7カ所のハウスキーピング遺伝子の塩基配列を決定し、sequence type(ST)を決定する。また近縁なSTを集めたclonal complex (CC)とすることで、遺伝的バックグラウンドが同一の株をまとめることが可能であり、疫学調査には欠かせない。なお、CCを推定するにはgenomic isletの保有パターンを検出することが有効であることが黄色ブドウ球菌では示されていたが、緑膿菌でも同様の手法が有効であるかどうかはこれまでの所不明であった。
【００２２】
緑膿菌にはさまざまな遺伝的バックグラウンドを持つものが存在する。実際の野生株における遺伝的バックグラウンドの調査結果（種々のＯＲＦの検出結果を含む）は文献として個々の研究施設における断片的な情報として利用できるが、最低限のＯＲＦの検出によって緑膿菌を分類できる遺伝子型別分類法を開発するには十分でない。
【００２３】
そこで本発明者は、日本で分離される緑膿菌を収集しMLST解析を行い、それらの遺伝的バックグラウンドの調査を行った。その結果、日本で分離される緑膿菌には多様なCCに分類される株が存在することが判明し、緑膿菌を遺伝子型別分類するにはCCを識別できる程度の菌株識別能を実現する必要がある。
【００２４】
（genomic isletを構成するＯＲＦ）
前記のCC型を区別するためには、緑膿菌においてもgenomic isletを構成するＯＲＦを検出することが有用であることがわかった（下記表１参照）。genomic isletとは、細菌のゲノム同士を比較した場合に、５ｋｂｐ程度、またはそれ以下の大きさで配列が異なる部分を言い、これはゲノム全体に散在しており、個体の生存確率に影響せず、進化の過程で取り残されたものと考えられる。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
表１からわかるように、緑膿菌のPAO1株(GenBank Accession Number AE004091)の遺伝子PA2794、PA1509、PA2119、PA3065、PA4549、PA5264、PA1380、UCBPP-PA14株(GenBank Accession Number CP000438)の遺伝子PA14_20600、PA14_10960、PA7株(GenBank Accession Number CP000744)の遺伝子PSPA7_0045を検出することで前記のCC型を区別可能であった。
【００２７】
なお、たとえば前記PA2794は、GenBankにおいて公開されているPAO1株の2794番目の遺伝子である、ということを意味するが、この遺伝子はPAO1株のみにしか存在しないわけではなく、例えばPA14_27990など、それから派生した菌株や、それとは異なる系統の緑膿菌においても存在する可能性がある。
【００２８】
なお、遺伝子PSPA7_0045は、配列表の配列番号１（フォワード）および２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子PA2794は、配列表の配列番号３（リバース）および４（フォワード）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子PA14_20600は、配列表の配列番号５（フォワード）および６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子PA1509は、配列表の配列番号７（フォワード）および８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
遺伝子PA2119は、配列表の配列番号９（フォワード）および１０（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能である。
【００２９】
遺伝子PA3065は、配列表の配列番号１７（フォワード）および１８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能である。
遺伝子PA4549は、配列表の配列番号１９（フォワード）および２０（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能である。
遺伝子PA5264は、配列表の配列番号２１（フォワード）および２２（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能である。
遺伝子PA1380は、配列表の配列番号２３（フォワード）および２４（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能である。
遺伝子PA14_10960は、配列表の配列番号２５（フォワード）および２６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能である。
上記ORFを検出することで、容易にＣＣ型の区別ができる。
【００３０】
【表２】
0005707641.tif 000003
0005707641.tif 000004
【００３１】
［（２）ファージ由来遺伝子のORF］
近年、ゲノム解読が進み、緑膿菌ゲノムはおよそ６０００個のＯＲＦから構成されていることが明らかとなった。
【００３２】
前記ゲノム上に存在するファージ由来遺伝子のORFをいくつか組み合わせて検出することが、緑膿菌の菌株識別にきわめて有効であることが実験から明らかとなった。
【００３３】
そこで本発明者はGenBankの緑膿菌ならびに緑膿菌関連ファージについての公開遺伝子情報を利用し、多くのファージ由来遺伝子のORFを検出するためのプライマーを設計し、多様な遺伝的バックグラウンドを持つ緑膿菌について、それらの保有するファージ由来遺伝子のORFについて検討した。
【００３４】
その結果、PSPA7_0104（GenBank Accession No. CP000744）、
PLES_26051（GenBank Accession No. FM209186）、
PSPA7_5342（GenBank Accession No. CP000744）、
PSPA7_2363（GenBank Accession No. CP000744）および
Phage D3 D3p35（GenBank Accession No. AF165214）を検出の対象とすると、緑膿菌の菌株を高精度で分類することができることを本発明者は見出した。
【００３５】
またこれらを、後述するＰＣＲおよび電気泳動を利用して検出した場合には、ＤＮＡが増幅しやすく、またエクストラバンドが現れにくい。
なお、PSPA7とは緑膿菌のPA7株の遺伝子であることを示し、PLESとはLESB58株の遺伝子であることを示し、D3とはファージD3の遺伝子であることを示す。また、PSPA7などの後に示される数字は、全ゲノムにおいて、その示された番号の遺伝子であることを示す。
【００３６】
上記PSPA7_0104は、配列表の配列番号１１（リバース）および１２（フォワード）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
ＳPLES_26051は、配列表の配列番号１３（リバース）および１４（フォワード）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
PSPA7_5342は、配列表の配列番号１５（フォワード）および１６（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
PSPA7_2363は、配列表の配列番号２７（フォワード）および２８（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能であり、
Phage D3 D3p35は、配列表の配列番号２９（フォワード）および３０（リバース）のプライマーを使用することで、ＰＣＲにより検出可能である。
【００３７】
以上では、ＰＣＲ法によりファージ由来遺伝子のＯＲＦ（２）を検出することを主に説明してきたが、ファージ由来遺伝子のＯＲＦ（２）はその他の方法によっても検出可能であり、たとえばハイブリダイゼーションによって検出可能である。
【００３８】
［ORF検出手段］
上述した、緑膿菌のゲノム上の、genomic isletを構成するORF（１）およびファージ由来遺伝子のORF（２）の保有の有無の検出は、任意の順で行うことができる。具体的には、これらORFを各ORF毎に任意の順に検出してもよく、複数のORF毎に任意の順にまとめて検出してもよく、全てのORFを同時に検出してもよい。ＯＲＦを検出する手段としては、ＰＣＲおよびハイブリダイゼーションが挙げられる。
【００３９】
＜ＰＣＲ＞
各ORF毎に別々に検出する場合には、たとえば、検出対象のORF毎にそれぞれ対応する１組のプライマー（フォワードプライマーおよびリバースプライマー）を用いて、独立した系で、緑膿菌のDNA抽出サンプルとともに、real time PCR反応を行い、PCR増幅産物の生成シグナル蛍光をリアルタイムに検出する。
【００４０】
また、複数のORF毎にまとめて検出する場合には、たとえば、緑膿菌マーカーとしてpotCを検出するプライマー（配列表の配列番号３１と３２）を加えた、複数のORFにそれぞれ対応する複数組のプライマー（フォワードプライマーおよびリバースプライマーの組）を混合し、同一の反応系に入れてPCR反応を行うマルチプレックスPCRが実施可能である。この場合には、各ORFに対応するPCR増幅産物の有無は、反応系を電気泳動、たとえば、アガロースゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動などで泳動して得られたバンドの有無によって確認する。
【００４１】
全てのORFを同時に検出する場合には、たとえばmicro arrayを応用してＯＲＦを検出する。micro arrayでは検出する各ＯＲＦとハイブリダイズするプローブをmicro arrayの各wellに作成しておき、培養菌からカラム抽出あるいはフェノール−クロロホルム抽出によって精製されたＤＮＡをハイブリダイズさせ、未反応のＤＮＡを洗浄した後、２本鎖ＤＮＡと結合する蛍光色素でラベルし、蛍光を捉える機械で測定することで目的のＯＲＦが検出可能となる。
これらのうちでは、複数のORFを簡易な装置で効率よくまとめて検出できる点から、マルチプレックスPCRが好ましい。
【００４２】
（プライマーの設計）
上記genomic isletを構成するORF（１）およびファージ由来遺伝子のORF（２）については塩基配列が90％程度相同なORFが臨床分離株やデータベース上に見られることから、これらの相同なORFも検出できるよう変異の少ない部分にプライマーを設計することで、ほとんどの緑膿菌に汎用的に使用できるとともに突然変異の影響を受けにくいプライマーとする。
【００４３】
上記genomic isletを構成するORF（１）およびファージ由来遺伝子のORF（２）に加え、緑膿菌マーカーとしてのpotC、カルバペネム耐性遺伝子であるvimおよびimpのそれぞれに対応するプライマーの設計にあたっては、プライマー自身が折れ曲がって相補的になっている部分が結合して２重鎖を形成したり、異なるプライマー同士が、互いに相補的になっている部分において結合して２量体またはそれ以上の結合体を形成したりしないような配列にする。
【００４４】
さらに、マルチプレックスPCRで検出することを考慮し、プライマーのGC比をおよそ50％とし、Tm値を合わせるよう工夫することが好ましい。また、増幅効率と、電気泳動の際に短時間で分離可能なよう、PCR増幅産物サイズがおよそ50bp〜700bp、好ましくは70bp〜600bpとなるように調整することが望ましい。なお、同じ反応系で検出するＯＲＦにおいては、ＰＣＲ増幅産物のサイズが同じにならないようにプライマーを設計することはもちろんである。
【００４５】
上記のような条件を設定することでマルチプレックスPCRにおいて再現性の高い増幅結果が得られるプライマーおよびプライマーセットを得ることができる。このようなプライマーの設計は、市販のソフトウェアにより行うことができる。
【００４６】
具体的には、上記（１）〜（２）のORFの項目でそれぞれ述べたように、
（１）genomic isletを構成するORFのためのプライマーとして１０組のプライマー（配列表の配列番号１〜１０、１７〜２６）
（２）ファージ由来遺伝子のORFのためのプライマーとして５組のプライマー（配列表の配列番号１１〜１６、２７〜３０）の合計１５組のプライマーを本発明者は設計した。
【００４７】
なお、上記プライマーセットを用いてマルチプレックスPCRを行う場合には、下記表３および表４にprimer mixture 1および2として示すように、８組および７組のプライマーセットに緑膿菌マーカーとしてのpotCを検出するプライマー（配列表の配列番号３１と３２）を各々に加え、primer mixture 1にvimを検出するプライマー（配列表の配列番号３３と３４）を加え、primer mixture 2にimpを検出するプライマー（配列表の配列番号３５と３６）を加えた１０組および９組のプライマーを組み合わせて混合し、二つの反応系にてＰＣＲを実施することが望ましい。
【００４８】
なお、配列番号３１および３２で示された増幅ＯＲＦのpotCとは、polyamine transport protein PotCをコードする遺伝子であり、緑膿菌に普遍的に見出されるので、緑膿菌マーカーとして用いられる。
【００４９】
【表３】
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【００５０】
【表４】
0005707641.tif 000006
【００５１】
以上に示した具体的なプライマーは、標的ＯＲＦを増幅するために最適化された配列であり、これらのプライマーに２塩基程度の付加、置換、欠失及び／又は挿入といった変更があっても、プライマーとしての機能は失われず、ＰＣＲによって標的ＯＲＦを増幅することができる。付加とは、表に示されたプライマーの５’側または３’側の末端に塩基が追加されることをいい、挿入とは、前記の末端ではなく、プライマーの内側において、塩基と塩基の間に塩基が追加されることを言う。
【００５２】
プライマーとして高い性能を発揮する観点からは、前記変更は、２塩基以下の付加、置換、欠失、挿入であることが好ましく、２塩基以下の付加または２塩基以下の５’側または３’側の末端における欠失であることがより好ましく、１塩基以下の標的ＯＲＦと相補的な塩基の付加または５’側または３’側の末端における１塩基以下の欠失であることが特に好ましい。一般的に、５’側の変更はプライマーとしての機能を失わせにくく、３’側の変更はプライマーの機能を失わせやすい傾向がある。
【００５３】
＜ハイブリダイゼーション＞
ハイブリダイゼーションによりＯＲＦを検出する場合には、まず培養菌（緑膿菌）からカラム抽出あるいはフェノール−クロロホルム抽出によって精製されたＤＮＡをアルカリ変性し、ナイロンメンブレン、セルロースメンブレンあるいはマイクロプレートに定着させる。本発明で検出する各々のＯＲＦとハイブリダイズするプローブを作成する。プローブは人工合成ＤＮＡでも、上記で説明したプライマーを利用したＰＣＲで作成しても良い。プローブはビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光色素などを用いてラベルしておく。菌抽出ＤＮＡとプローブをハイブリダイズし、プローブのラベルに応じて、酵素付加、発色、発光などさせ、シグナルを捉える。これを各々の検出ＯＲＦについて実施する。
【００５４】
［ORF検出遺伝子型別分類法実施方法］
以下、マルチプレックスPCRを行い、上記（１）〜（２）のＯＲＦのうち、上述した検出対象として好ましいＯＲＦを検出する場合を一例とし、本発明の緑膿菌の遺伝子型別分類法の手順を説明する。
【００５５】
（菌種の同定）
血液、痰、膿、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液などの患者由来の検体あるいは患者に使用したカテーテルやガーゼ等の医療器具などの材料から、NAC寒天培地（緑膿菌分離用）、血液寒天培地（一般細菌分離用）などの緑膿菌分離培地を用いて緑膿菌様の菌を分離する。その後、グラム染色による形態の確認、および生化学性状の確認により、緑膿菌と同定する。
【００５６】
緑膿菌であると同定された菌株を、緑膿菌を増殖可能な液体培地（Luria-Bertani broth、Brain Heart Infusion培地、トリプトソイブイヨン等）、あるいは寒天培地（Luria-Bertani寒天培地、Brain Heart Infusion寒天培地、トリプトソイ寒天培地、普通寒天培地等）を用いて37℃で一晩培養する。
【００５７】
（DNA抽出）
培養した菌体から、熱抽出、フェノール抽出、あるいは市販のDNA抽出キットを用いるなどの方法でDNAを抽出し、サンプルとする。
【００５８】
（PCR反応）
マルチプレックスPCRでORF（上記表３に記載の、genomic isletを構成するORF  10個およびファージ由来遺伝子のORF  5個の合計15個）に加えて緑膿菌マーカーとしてのpotC、カルバペネム耐性遺伝子としてvimおよびimpを検出する。具体的には、検出対象のORF群に対応する数のプライマーの組（フォワードプライマー及びリバースプライマー）を、１０組および９組の２群に分け、それぞれの組毎に同一の反応チューブに入れ（（１）〜（２）のＯＲＦ用のプライマー１５組、ポジティブコントロール用のプライマー、カルバペネム耐性遺伝子検出用プライマー２組をチューブ１つあたり１組なので、プライマーの合計は１９組である）、PCR反応を行う。
【００５９】
（電気泳動）
およそ50bp〜600bpのDNA断片が充分に分離されるようなアガロースゲルなどのゲルを用い、PCR増幅産物を電気泳動する。泳動距離は約5〜6 cmでよく、ミニゲルの場合100V、50分程度で充分分離可能である。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色して写真撮影を行う。
【００６０】
（結果判定）
１反応につき最大１０本のバンドが現れる。PFGEと異なり、本発明の遺伝子型別分類法ではバンドサイズがあらかじめわかっているため、それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定する。場合によっては目的のサイズ以外の非特異的なバンドが現れることがあるが、非特異バンドは無視する。目的のサイズのバンド（各ＯＲＦに対応するバンドおよびポジティブコントロールに対応するバンド）が増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として２進法のコードを作成する。
【００６１】
このコードは（１）〜（２）の各ＯＲＦごとに作成してもよいし、すべてをまとめて一つのコードとして作成してもよいし、あるいは（１）〜（２）のＯＲＦの一部をまとめて作成するなどしてもよい。本発明の遺伝子型別分類法が実際の医療の現場で使用される場合に、（１）〜（２）のＯＲＦすべてをまとめて一つのコードとして作成すると、桁数が大きくなって見にくいことから、いくつかのＯＲＦの結果はまとめて一つのコードとして作成することが好ましい。
【００６２】
ここで上述のとおり、遺伝子型の分類上、緑膿菌は、clonal complex (CC)型にまとめると理解がしやすい。（１）のＯＲＦはCC型との相関が高く、CCを推定するのに役立つ。
また、（２）のＯＲＦは、緑膿菌の薬剤耐性等に関するタンパク質をコードしているわけではなく、また分類学上重視されているわけではないが、菌株識別能力を高めるのに有用である。
【００６３】
さらにカルバペネム耐性遺伝子の有無はCCとの相関は無いが、菌株の遺伝情報として有用である。
したがって、（１）のＯＲＦ検出結果をまとめて一つのコードとし、（２）のＯＲＦ検出結果およびカルバペネム耐性遺伝子検出結果を一つのコードとして作成することが好ましい。
【００６４】
そして、たとえばこのようにして作成された２進法のコードを、より桁数を少なくして見やすくするため、たとえば１０進法に変換し、遺伝子型コードとする。以上のコード作成の一例を下記表５に示す。
【００６５】
【表５】
0005707641.tif 000007
【００６６】
まず、適切なプライマーを使用したＰＣＲおよび電気泳動により、試験対象の緑膿菌における各ＯＲＦの有無を検出し、それを２進法によりコード化する。そして、このコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードを得る（３８２（コード１）−０（コード２））。
【００６７】
表５に示された例において、コード１は（１）のＯＲＦの検出結果をまとめたものであるので、複数の緑膿菌株について遺伝子型コードを作成した場合に、まずコード１からその緑膿菌のCCを判断することができる。さらに複数の緑膿菌のコード１を比較することによって、複数の緑膿菌が同一の流行クローンであるかどうかを判断することができる。
【００６８】
コード２は（２）のＯＲＦの検出結果をまとめたものである。したがって、コード１でそのCC型を判断し、複数の緑膿菌について、コード１の比較で同一のクローンであるかどうかを判断したうえで、コード２を比較することで、より詳細に緑膿菌株を識別することができる。たとえば患者ＡとＢから採取した緑膿菌は、ともに同一CCであり、流行クローンは同一であるがコード２が異なるので感染経路が異なり、患者ＢとＣとは緑膿菌のCCが同一であり、しかもコード２がそれぞれ同一であるので、感染経路が同一である、などといった判定を行うことができる。したがって本発明の遺伝子型別分類法は、医療の現場において緑膿菌の感染経路を特定する手段として有用であると考えられる。
【００６９】
具体的には、たとえば、緑膿菌臨床分離株23株における17個のORF（ORF1〜22）の保有の有無を、上記と同様にして２進法コード化、さらに１０進法コード化すると、下記表６の通りである。
【００７０】
【表６】
0005707641.tif 000008
0005707641.tif 000009
0005707641.tif 000010
0005707641.tif 000011
【００７１】
表６において、一番左側の行は、菌株をサンプリングした患者の番号である。
このように判定結果をコード化し、得られた遺伝子型コード同士を比較することで、異なる時期や施設で分離された菌株の特定であっても、容易かつ客観的に行うことができる。したがって、本発明の緑膿菌の遺伝子型別分類法によれば、PFGEとは異なり、時間的あるいは距離的に隔たりのある遺伝子型別分類結果間での遺伝子型の比較も可能である。
【００７２】
また、上記表６より明らかであるが、カルバペネム耐性緑膿菌は、コード２の数値が通常の緑膿菌のもの（６４以上または奇数）と異なるので、上記のようにコード２から、対象の緑膿菌がカルバペネム耐性であるかまたは感受性であるかを判定することができる。
【００７３】
さらに、本発明で検出の対象としているＯＲＦは、緑膿菌の病原性等に関連しないＯＲＦである。病原性に関連するなど、特定の機能を有する遺伝子は、その緑膿菌が宿主内で増殖する確率を上げたり、あるいはその遺伝子産物が宿主の免疫システムのターゲットとなり、反対に生存確率を下げることがある。つまりこのような遺伝子は、緑膿菌の多くが持っている、あるいは反対にほとんど持っていないと考えられる。本発明では、このようなバイアスがかからないように適切なＯＲＦを選択して遺伝子型別分類を行っているのである。
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７４】
実施例１
ある病院で臨床分離された緑膿菌23株について、下記の手順により、ORF検出による遺伝子型別分類を行った。
【００７５】
＜ORF検出による遺伝子型別分類＞
（緑膿菌の培養）
緑膿菌であると同定された２３の菌株を、トリプトソイ寒天培地を用いて37℃で一晩培養した。
【００７６】
（DNA抽出）
培養した菌のおよそ１コロニーに相当する量を、1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた、トリス−ＥＤＴＡバッファー100μl中に懸濁し、100℃で10分間加熱した。次いで、チューブを12,000rpmで３分間遠心分離し、その上清をDNA熱抽出サンプルとした。
【００７７】
（PCR反応液の調製）
RocheのFastStart DNA polymeraseを説明書に従って使用した。その際、反応液量は20μlとした。反応液20μlの組成は、10×FastStart Taq Buffer 2μl、10mM dNTP Mix 0.4μl、DMSO 0.6μl、FastStart Taq DNA polymerase 0.2μl,、蒸留水14.1μlおよびprimer mixture 1もしくは2を0.2μlである。これに、上記のDNA熱抽出サンプルを2μl（反応液の1/10量）加えた。
【００７８】
プライマーは１０組あるいは９組（ポジティブコントロール用のプライマー１組およびカルバペネム耐性遺伝子検出用プライマー２組を含む）を組み合わせ２本の反応チューブを使用し、１９個のORFについて、マルチプレックスPCRを行った。プライマーの組み合わせ（primer mixture 1および2）、及びその最終濃度は下記表７および表８のとおりである。
【００７９】
【表７】
0005707641.tif 000012
【００８０】
【表８】
0005707641.tif 000013
【００８１】
（PCR反応）
サーマルサイクラー（Applied Biosytems社製、GeneAmp PCR System 9700）にサンプルをセットし、最初に95℃で４分間処理し、その後、95℃ 30秒、65℃ 2分30秒のサイクルを30回繰り返した。サイクル反応終了後、PCR産物を４℃で保存した。
【００８２】
（電気泳動）
アガロースゲル（4% NuSieve 3:1 in TBE buffer）を用い、ミニゲルを作成し、100Vで50分間、5μlのPCR産物を電気泳動した。泳動距離は約5cmであった。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影を行った。
【００８３】
（結果判定）
１反応につき最大１０本のバンドが現れた。それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定し、目的のサイズのバンドが増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として、上記表６と同様の２進法のコードを作成した。さらに２進法のコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードとした。
結果を図１および表６に示す。
【００８４】
表６において、前述のようにコード１が流行クローンを示すが、たとえば菌株１８〜２３はすべてコード１が２０７で同じであるが、コード２を比較すると、実際は異なる菌株であることがわかる。
【００８５】
実施例２
以下、プライマー配列に２塩基程度の変更があった場合の実施例についてさらに具体的に説明する。
先の実施例と同じ、ある病院で臨床分離された緑膿菌23株について、下記の手順により、ORF検出による遺伝子型別分類を行った。
【００８６】
＜ORF検出による遺伝子型別分類＞
（緑膿菌の培養）
緑膿菌であると同定された２３の菌株を、トリプトソイ寒天培地を用いて37℃で一晩培養した。
【００８７】
（DNA抽出）
培養した菌のおよそ１コロニーに相当する量を、1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた、トリス−ＥＤＴＡバッファー100μl中に懸濁し、100℃で10分間加熱した。次いで、チューブを12,000rpmで３分間遠心分離し、その上清をDNA熱抽出サンプルとした。
【００８８】
（PCR反応液の調製）
RocheのFastStart DNA polymeraseを説明書に従って使用した。その際、反応液量は20μlとした。反応液20μlの組成は、10×FastStart Taq Buffer 2μl、10mM dNTP Mix 0.4μl、DMSO 0.6μl、FastStart Taq DNA polymerase 0.2μl,、蒸留水14.1μlおよびprimer mixture 1もしくは2を0.2μlである。これに、上記のDNA熱抽出サンプルを2μl（反応液の1/10量）加えた。
【００８９】
プライマーは１０組あるいは９組（ポジティブコントロール用のプライマー１組およびカルバペネム耐性遺伝子検出用プライマー２組を含む）を組み合わせ２本の反応チューブを使用し、１９個のORFについて、マルチプレックスPCRを行った。プライマーの組み合わせ（primer mixture 1および2）、及びその最終濃度は下記表９および表１０のとおりである。
【００９０】
【表９】
0005707641.tif 000014
【００９１】
【表１０】
0005707641.tif 000015
【００９２】
なお、配列番号３７は配列番号１に対して2塩基を付加したものであり、配列番号３８は配列番号２に対して2塩基を付加したものであり、配列番号３９は配列番号３に対して1塩基を置換したものであり、配列番号４０は配列番号４に対して1塩基を置換したものであり、配列番号４１は配列番号５に対して2塩基を欠失させたものであり、配列番号４２は配列番号６に対して2塩基を置換したものであり、配列番号４３は配列番号７に対して2塩基を付加したものであり、配列番号４４は配列番号８に対して1塩基を付加したものであり、配列番号４５は配列番号９に対して2塩基を欠失させたものであり、配列番号４６は配列番号１０に対して1塩基を置換したものであり、配列番号４７は配列番号１１に対して2塩基を欠失させたものであり、配列番号４８は配列番号１２に対して2塩基を置換したものであり、配列番号４９は配列番号１３に対して1塩基を付加し、1塩基を置換したものであり、配列番号５０は配列番号１４に対して1塩基を付加したものであり、配列番号５１は配列番号１５に対して2塩基を置換したものであり、配列番号５２は配列番号１６に対して2塩基を付加したものであり、配列番号５３は配列番号１７に対して1塩基を欠失させたものであり、配列番号５４は配列番号１８に対して1塩基を欠失させたものであり、配列番号５５は配列番号１９に対して2塩基を付加したものであり、配列番号５６は配列番号２０に対して1塩基を付加し、1塩基を欠失させたものであり、配列番号５７は配列番号２１に対して1塩基を付加し、1塩基を置換したものであり、配列番号５８は配列番号２２に対して1塩基を付加し、1塩基を置換したものであり、配列番号５９は配列番号２３に対して2塩基を欠失させたものであり、配列番号６０は配列番号２４に対して2塩基を欠失させたものであり、配列番号６１は配列番号２５に対して2塩基を欠失させたものであり、配列番号６２は配列番号２６に対して1塩基を付加し、1塩基を置換したものであり、配列番号６３は配列番号２７に対して2塩基を付加したものであり、配列番号６４は配列番号２８に対して1塩基を付加し、1塩基を欠失させたものであり、配列番号６５は配列番号２９に対して2塩基を欠失させたものであり、配列番号６６は配列番号３０に対して2塩基を付加したものである。
【００９３】
（PCR反応）
サーマルサイクラー（Applied Biosytems社製、GeneAmp PCR System 9700）にサンプルをセットし、最初に95℃で４分間処理し、その後、95℃ 30秒、65℃ 2分30秒のサイクルを30回繰り返した。サイクル反応終了後、PCR産物を４℃で保存した。
【００９４】
（電気泳動）
アガロースゲル（4% NuSieve 3:1 in TBE buffer）を用い、ミニゲルを作成し、100Vで50分間、5μlのPCR産物を電気泳動した。泳動距離は約5cmであった。電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影を行った。
【００９５】
（結果判定）
１反応につき最大１０本のバンドが現れた。それぞれの菌株及び反応系において目的のサイズのバンドがあるか否かを判定し、目的のサイズのバンドが増幅していれば１、増幅が見られない場合を０として、上記表６と同様の２進法のコードを作成した。さらに２進法のコードを１０進法に変換し、遺伝子型コードとした。
結果を図２に示す。図1および表６と同様の結果が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明によれば、緑膿菌の遺伝子型別分類を、特殊な装置や作業者の熟練を要さずに簡便、迅速、客観的かつ高感度に行うことができるため、院内感染の経路を速やかに決定し、院内感染の広がりを防止することができる。
より具体的には、下記（１）〜（４）の効果を奏することができる。
（１）複雑なマルチプレックスPCRに使用可能なプライマー設計を行えば、1検体あたりのPCR反応チューブを2本に減らすことが可能となり、実施コストが削減される。
（２）プライマー配列の工夫により広範囲のテンプレート濃度に適用でき、増幅バンドの濃さにむらが生じにくく、判定が容易である。
（３）Genomic isletのORFを検出することで、ゲノムの遺伝的な由来を特定することが可能であり、緑膿菌すべてにおける菌株識別能力が向上している。
（４）ファージ由来遺伝子のORF検出プライマー配列を改良することで、緑膿菌すべてにおいて菌株識別能力向上が可能となった。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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