(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
モラクセラ・カタラーリス、ヘモフィラス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、及びストレプトコッカス・サングイスから選択される1種又は複数種の細菌からの抽出物であって、前記抽出物の調製の間に、前記1種又は複数種の細菌株が12を超えるpHで溶解され、前記抽出物が100μg/mL未満の核酸及び少なくとも0.3 mg/mLの糖類を含み、前記抽出物のタンパク質の1種又は複数種のアミノ酸がLからDにラセミ化されており、前記1種又は複数種のアミノ酸が、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、メチオニン、ヒスチジン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、リジン、バリン及びスレオニンから選択される、呼吸器障害又はアレルギー性状態に罹患している対象を治療するため、及び／又は呼吸器障害又はアレルギー性状態を予防するための抽出物。
【請求項２】
ヘモフィラス、クレブシエラ、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス及びモラクセラの属のそれぞれから得られる請求項1に記載の抽出物。
【請求項３】
以下の細菌種：モラクセラ・カタラーリス、ヘモフィラス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、及びストレプトコッカス・サングイスのそれぞれの少なくとも1つの株から得られる請求項1又は2に記載の抽出物。
【請求項４】
ヘモフィラス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス及びストレプトコッカス・ビリダンスから得られる細菌の溶解生成物を含む請求項1又は2に記載の抽出物。
【請求項５】
以下の細菌株：モラクセラ・カタラーリス3622、モラクセラ・カタラーリス3625、モラクセラ・カタラーリスI-045、ヘモフィラス・インフルエンザ8467、クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシズ・オゼネ5050、クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシズ・ニューモニエ204、クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシズ・ニューモニエ5056、スタフィロコッカス・アウレウスI-049、スタフィロコッカス・アウレウスI-050、スタフィロコッカス・アウレウスI-051、スタフィロコッカス・アウレウスI-052、スタフィロコッカス・アウレウスI-053、スタフィロコッカス・アウレウスI-054、ストレプトコッカス・ニューモニエ7465、ストレプトコッカス・ニューモニエ7466、ストレプトコッカス・ニューモニエ7978、ストレプトコッカス・ニューモニエ10319、ストレプトコッカス・ピオゲネス8191、ストレプトコッカス・サングイスI-046、ストレプトコッカス・サングイスI-047、及びストレプトコッカス・サングイスI-048のそれぞれから得られる請求項4に記載の抽出物。
【請求項６】
0.3 mg/mLと4.5 mg/mLの間の糖類を含む請求項1に記載の抽出物。
【請求項７】
少なくとも1種の糖類が、単糖類、二糖類及び多糖類からなる群より選択される請求項6に記載の抽出物。
【請求項８】
少なくとも1種の多糖類が、分岐多糖類である請求項7に記載の抽出物。
【請求項９】
少なくとも1種の糖類が、化学修飾されている請求項6又は7に記載の抽出物。
【請求項１０】
溶解が、pH 12.6〜13.4で行われる請求項1〜9のいずれか1項に記載の抽出物。
【請求項１１】
粒子状及び／又は不溶性の成分を除去するように処理される請求項1〜10のいずれか1項に記載の抽出物。
【請求項１２】
それぞれの細菌株が、動物種に由来する材料を含まない培地中で培養される請求項1〜11のいずれか1項に記載の抽出物。
【請求項１３】
1.5 mg/mLと2.5 mg/mLの間の遊離アミノ酸を含む請求項1〜12のいずれか1項に記載の抽出物。
【請求項１４】
アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、ヒスチジン、アラニン、アルギニン、チロシン、メチオニン、フェニルアラニン及びリジンから選択される少なくとも1種のアミノ酸が、少なくとも10%ラセミ化されている請求項1〜13のいずれか1項に記載の抽出物。
【請求項１５】
抽出物中の遊離アミノ酸が、1%と80%の間、10%と45%の間又は25%と35%の間のD-アミノ酸を含む請求項14に記載の抽出物。
【請求項１６】
抽出物が、6 mg/mLと8 mg/mLの間の1種又は複数種のタンパク質を含む請求項1〜15のいずれか1項に記載の抽出物。
【請求項１７】
1種又は複数種のタンパク質が、30 kDa未満又は10 kDa未満の分子量を有する請求項16に記載の抽出物。
【請求項１８】
リムルス変形細胞分解産物(LAL)色素産生試験により5000 ng未満のLPS等量を含む請求項1〜17のいずれか1項に記載の抽出物。
【請求項１９】
請求項1〜18のいずれか1項に記載の抽出物を含む医薬組成物。
【請求項２０】
呼吸器障害又はアレルギー性状態に罹患している対象を治療するため、及び／又は呼吸器障害又はアレルギー性状態を予防するための請求項19に記載の組成物。
【請求項２１】
対象がヒト又は家畜哺乳動物である請求項20に記載の組成物。
【請求項２２】
呼吸器障害又はアレルギー性状態が、上下気道感染、アトピー性皮膚炎、鼻咽頭炎、副鼻腔炎、咽頭炎、扁桃炎、喉頭炎、気管炎、喉頭咽頭炎、インフルエンザ、肺炎、気管支肺炎、気管支炎、下気道感染、アレルギー性鼻炎、アレルギー性喘息、鼻炎、喉頭気管炎、急性下気道感染を伴う閉塞性肺疾患、又は急性憎悪を伴う閉塞性肺疾患である請求項20又は21に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、2007年3月5日にファイルされた米国仮出願第60/904,789号の優先権を主張する。
本発明は、呼吸器障害のような適応症の治療に有用な細菌株からの抽出物、該抽出物を含む組成物及びプリオン疾患の危険性がない培地を用いて抽出物を作製する方法に関する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
本発明は、呼吸器障害のような医療状態を治療するのに有用な細菌抽出物を含む組成物に関する。抽出物は、以下の種から選択される培養物からの細菌溶解物を含み得る。
モラクセラ(ブランハメラ)・カタラーリス(Moraxella (Branhamella) catarrhalis)、モラクセラ(モラクセラ)・カタラーリス(Moraxella (Moraxella) catarrhalis)、ヘモフィラス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・サングイス(Streptococcus sanguinis)、スタフィロコッカス・ヘモリチカス(Staphylococcus Hemolyticus)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・アンギノーサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・ミチス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・サリバリウス(Streptococcus salivarius) (別名ストレプトコッカス・ビリダンス(Streptococcus viridans))、ナイセリア・シッカ(Neisseria sicca)、ヘモフィラス・パラインフルエンザ(Hemophilus parainfluenzae)、アクチノバチルス(ヘモフィラス)・アクチノミセテムコミタンス(Actinobacillus (Hemophilus) actinomycetemcomitans)及びエイケネラ・コロデンス(Eikenella corrodens)。
【０００３】
いくつかの実施形態において、抽出物は、上記の細菌種のそれぞれからの少なくとも1種の株を含むが、他の実施形態において、上記のリストからの1種若しくは複数種の株が除かれるか、又は1種若しくは複数種の異なる株で置換される。本発明のいくつかの実施形態は、以下の細菌株のそれぞれから得られる抽出物を含む：モラクセラ(ブランハメラ)・カタラーリス3622、モラクセラ (ブランハメラ)・カタラーリス3625、モラクセラ (ブランハメラ)カタラーリスI-045、ヘモフィラス・インフルエンザ8467、クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシズ・オゼネ(Klebsiella pneumoniae ssp. ozaenae) 5050、クレブシエラ・ニューモニエ204、クレブシエラ・ニューモニエ 5056、スタフィロコッカス・アウレウス I-049、スタフィロコッカス・アウレウスI-050、スタフィロコッカス・アウレウスI-051、スタフィロコッカス・アウレウスI-052、スタフィロコッカス・アウレウスI-053、スタフィロコッカス・アウレウスI-054、ストレプトコッカス(ジプロコッカス)・ニューモニエ7465、ストレプトコッカス(ジプロコッカス)・ニューモニエ7466、ストレプトコッカス(ジプロコッカス)・ニューモニエ7978、ストレプトコッカス(ジプロコッカス)・ニューモニエ10319、ストレプトコッカス・ピオゲネス8191、ストレプトコッカス・サングイスI-046、ストレプトコッカス・サングイスI-047、ストレプトコッカス・サングイスI-048、スタフィロコッカス・ヘモリチカス11042、エンテロコッカス・フェカリス103015、ストレプトコッカス・ミュータンス10449、ストレプトコッカス・アンギノーサス10713、ストレプトコッカス・ミチス12261、ストレプトコッカス・サリバリウス102503、ナイセリア・シッカ103345、ヘモフィラス・パラインフルエンザ7857、アクチノバチルス(ヘモフィラス)・アクチノミセテムコミタンス52.105、及びエイケネラ・コロデンス10596。これらの株は、ブダペスト条約の下で寄託されている。Iの番号でリストに示される株は、フランス、パリ、75724、リュ  デュ  ドクトール  ル  25(25 rue du Dr. Roux, 75724 Paris, France)のインスティティ・パスツール(Institut Pasteur)の国立微生物カルチャーコレクション(Collection Nationale de Culture des Microorganismes)で索引に示された。他の全ての株は、ロンドンの国立タイプカルチャーコレクションで索引に示された。
【０００４】
いくつかの実施形態において、上記で列挙された1つ又は複数の特定の株は、省くことができるか、又は細菌の同じ種からの異なる株若しくは異なる種からの異なる株で置換できる。例えば、いくつかの実施形態において、スタフィロコッカス・ヘモリチカス11042、エンテロコッカス・フェカリス103015、ストレプトコッカス・ミュータンス10449、ストレプトコッカス・アンギノーサス10713、ストレプトコッカス・ミチス12261、ストレプトコッカス・サリバリウス102503、ナイセリア・シッカ103345、ヘモフィラス・パラインフルエンザ7857、アクチノバチルス(ヘモフィラス)・アクチノミセテムコミタンス52.105及びエイケネラ・コロデンス10596の1つ若しくは複数又は全ての株さえも省くことができる。他の実施形態において、モラクセラ、クレブシエラ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス又はストレプトコッカス・サングイスの1つ又は複数の株を省くことができる。さらに、消化を助けるために、ラクトバチルス(Lactobacillus)株又は別の細菌株を用いることもできる。
【０００５】
抽出物は、細胞が培養培地中で適切な光学密度まで成長した後に、アルカリ溶解プロセスにより得ることができる。いくつかの実施形態において、細菌は、プリオン関連疾患の危険性又は動物ベースの培地から得られる生成物を摂取することにより伝達され得るその他の疾患の危険性がない培地上でそれぞれ成長させる。例えば、いくつかの実施形態において、大豆ベースの培地のような植物ベースの培地を用いて細胞を成長させる。別の実施形態において、合成培地を細胞成長のために用いる。さらに他の実施形態において、培地は、これもまたそのような疾患の危険性がない酵母エキス及びウマ血清のような生物学的抽出物を含み得る。
【０００６】
溶解物は、核酸及びより大きい細胞破砕物を除去するためにろ過することもできる。ろ過の結果、いくつかの実施形態において、抽出物中に存在する核酸の量は、100μg/ml未満である。いくつかの実施形態において、細胞壁破砕物及び分解が不十分なリポ多糖(LPS)のような不溶性化合物も、ろ過により除去される。よって、いくつかの実施形態において、得られる抽出物は、可溶性分子成分を含み、不溶性又は粒子状物質を著しい量では含有しない。
リポ多糖(LPS)成分を含む糖成分は、抽出物中に保持され得る。溶解プロセスの間に、糖類は、化学修飾を受け、例えば、より小さい構造に切断されるか、又は他の官能基で置換され得る。
【０００７】
溶解プロセスの間のアミノ酸のラセミ化も、天然タンパク質で見出される天然に存在するL-アミノ酸からD-アミノ酸を創出する。D-アミノ酸で主に又は部分的に構成されるタンパク質は、哺乳動物の腸管で効率的に消化されないので、D-アミノ酸は、抽出物のバイオアベイラビリティーを増大させることにおいて有利であり得る。つまり、溶解の間に化学修飾されてD-アミノ酸を含有する抽出物中の抗原性分子は、患者の体内により長い時間残存して、より強い免疫刺激作用を潜在的に可能にする。
【０００８】
細菌抽出物は、呼吸器疾患に対する免疫系を刺激するために、従来技術において用いられているが、それらをより安全に、より有効に、そしてより長く持続するようにするために、これらの抽出物をよりよく標準化し、制御する必要性があった。例えば、潜在的に毒性のリポ多糖(LPS)成分を含む糖成分は、安全性の理由から、細菌抽出物から除去されるべきであると以前は考えられていた(例えば米国特許第5,424,287号を参照)。しかし、本発明は、糖類が安全に保持されるLPS成分の充分な化学修飾をもたらす方法を提供する。これらの成分が保持されることにより、効力が改善され、抽出物に付加的な抗原が提供できる。
【０００９】
例えば、本発明者らは、pH及び溶解時間を調整することにより、潜在的にアレルゲン性又は毒性である細胞壁成分を充分に分解することが可能になることを見出した。より低いpH又はより短い時間の従来の溶解条件は、対照的に、細胞壁成分及び糖類が充分に化学修飾されない抽出物を生成した(例えばGB 2 021 415 Aを参照)。得られた抽出物は、患者に安全に投与するにはアレルゲン性が高すぎた。全般に、本発明者らは、低すぎるpH及び／又は短すぎる時間で溶解された生成物は、より高い毒性、より低いタンパク質抽出及びより低いろ過性(filterability)を有したことを見出した。
【００１０】
ろ過プロセスも、フィルタの孔径及びときにはフィルタ表面の化学特性が、除去及び保持される物質の型を変化させるので、得られる抽出物の特性に影響し得る。例えば、本発明のいくつかの実施形態は、糖類を保持するが、核酸のようなその他の分子成分を除去するように設計されたろ過プロセスを用いる。
よって、本発明は、一定の安全性及び効力を維持する助けとなる、細菌抽出物を標準化するパラメーターを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】細菌の溶解の後の細菌抽出物の調製のためのタンジェンシャルフローろ過(TFF)システムの図。この図は、フィルタの異なる2つの配置を示す：全てのフィルタが同時に働く並行モード、及びフィルタが直列モードで配置される蛇行モード。
【図２】実施例2.2、3.6、3.7、3.8、3.9及び3.10からの抽出物の精製混合物の系列希釈とインキュベートしたヒトPBMCによるIL-6及びTNF-αの生成。
【図３】感染後3週間の間のウイルスH1N1で攻撃されたマウスの生存。McNemar検定：対照に対する10 mgの処置について*p=0.023。
【図４】マウスマクロファージでの酸化窒素バイオアッセイにおける精製HAIN 8467抽出物(実施例2.1、2.5、2.8)の生物活性に対する、NaOH濃度、バイオマスの量(ミリリットルあたりのグラム乾燥重量で表す)及び溶解期間(時間)の影響。
【図５】ジプロコッカス・ニューモニエ抽出物の精製混合物(実施例3.6)の、マウスマクロファージでの酸化窒素バイオアッセイ。
【図６】マウスマクロファージでの酸化窒素バイオアッセイにおける、実施例3.1及び実施例3.3 (それぞれ3a及び3cと名称をつける)の抽出物の生物活性。
【図７】マウスマクロファージでの酸化窒素バイオアッセイにおける、実施例2.2、3.6、3.7、3.8、3.9及び3.10からの抽出物の精製混合物の生物活性。
【図８】化合物48/80で刺激されたラット肥満細胞からのヒスタミン分泌に対する、本発明による抽出物の影響。
【図９】異なる実験群についての(a)膀胱及び(b)腎臓の組織での平均合計コロニー形成単位 (CFU)の値。
【図１０】LPS非感受性マウス株の大腸菌(Escherichia coli)感染モデルでの本発明の実施形態の効果。この図は、(a)マーカーCD14対FoxP3、及び(b) TCR対FoxP3を用いるフラックスサイトメトリーのデータを示す。左のパネルは、未処置の組織を示し、右のパネルは、処置された組織を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
定義
抽出物：本明細書で定義される抽出物は、1種又は複数種の細菌株の溶解の後に得られる物質を意味する。抽出物は、1つの株のみから得られる場合もあり、いくつかの異なる株の混合物から得られる場合もある。
アルカリ溶解：これは、塩基性条件下で細菌細胞を溶解する方法である。
溶解物：本明細書において、この用語は、細胞溶解手順から得られる細菌の抽出物を意味する。
【００１３】
ろ過：本明細書で定義されるろ過プロセスは、抽出物又は抽出物の混合物の、マイクロフィルタ(すなわち微細ろ過)又は限外ろ過フィルタ(すなわち限外ろ過)のような1つ又は複数のフィルタを通しての通過を意味する。このようなろ過は、除去するとされた成分を100%除去することを必要としない。ろ過は、数回の通過又はサイクルで反復される場合がある。
当初のpH：この用語は、細菌溶解又はろ過のような手順の開始時に測定されるpHを意味する。
【００１４】
糖類：本明細書で定義される糖は、単糖類、二糖類、並びに直鎖状及び分岐鎖状の多糖類のようなより大きい糖類を含む。糖類は、置換(substituted)又は化学修飾された糖、例えばリポ多糖(LPS)及びそれらの化学修飾された変異体も含む。
D-アミノ酸：この用語は、生合成により生成する、左旋性異性体の形で存在するL-アミノ酸とは反対に、右旋性異性体の形で存在するアミノ酸のことをいう。
ラセミ化：この用語は、L-アミノ酸からD-アミノ酸への少なくとも部分的な化学修飾のことである。
【００１５】
プリオンベースの疾患の危険性を回避する培地とは、ウシ若しくはヒツジのような動物、又はプリオンベースの疾患を伝達し得るいずれの他の動物から採取された血清又は肉抽出物のような材料を含まない、抽出物の製造の任意の段階で用いられる培養培地を意味する。このような培地の例は、植物ベース培地又は合成培地、及びウマ血清を用いる培地又はプリオン疾患を伝達しない動物種から採取された材料を含む培地を含む。プリオンベースの疾患の例は、例えば、狂牛病、スクラピー及びクロイツフェルト-ヤコブ病を含む。
非動物性培地は、動物に由来する成分を含まない培地である。その例は、植物ベース(すなわち植物性)培地、例えば大豆培地、及び合成培地を含む。
【００１６】
本明細書で用いる場合、治療は、例えば現在の感染の治療と、例えば新しい感染の発生からの予防又は防御との両方を意味する。
本明細書で用いる場合、対象とは、哺乳動物対象、例えばヒト及び家畜哺乳動物を含む任意の動物対象を意味する。
【００１７】
本明細書で同定され、本発明で用いられる具体的な細菌株は、本明細書に記載される原寄託、又は異なる寄託コード名で後から再寄託されたが、原寄託されたものと遺伝子的に同じ株であると考えられる株を含む、その遺伝子クローンから得られる株を含み得る。
本明細書で用いられる全ての数値は、測定に固有の誤差、丸め及び有効数字を考慮に入れた近似である。
【００１８】
抽出物の調製
本発明の細菌抽出物は、発酵、その後の熱不活性化及びアルカリ溶解及びろ過により調製できる。各株について、充分量の物質を得るために、発酵培養は、作業用シードロットから出発し、その後、より大きい発酵容器への接種を行うことができる。
【００１９】
用いられる培地は、それぞれの種について同じであり得る。しかし、補充の成長因子を導入して、いくつかの種の成長を増進させることができる。いくつかの実施形態において、プリオンベースの疾患の危険性を回避する培地は、少なくともいくつか、又は全ての株の成長に用いることができる。その例は、植物ベース培地及び合成培地のような非動物性培地を含む。他の例は、このような危険性を有し得るウシ血清又は肉抽出物の存在下で成長した株とは対照的に、プリオン疾患の脅威がない種の動物から採取されたウマ血清又は別の動物性抽出物を含む培地を含む。いくつかの実施形態において、Ala-Glnジペプチドを培地に加えることができる。本発明者らは、いくつかの実施形態において、Ala-Glnジペプチドが、細菌培養の成長刺激因子として働くことを観察した。
【００２０】
発酵の後に、それぞれの株又は一連の株から得られるバイオマスは、熱処理、濃縮及び凍結により不活性化できる。細胞性物質は、NaOHからのような水酸化物イオンを用いて溶解できる。ある実施形態において、2〜130 g/Lの細菌乾燥重量、例えば20〜120 g/L、又は5〜90 g/L、又は10〜50 g/L、又は40〜90 g/Lのバイオマス濃度を溶解できる。(バイオマス濃度は、本明細書において、溶解のリットルあたりの細菌乾燥重量として示される。バイオマス濃度は、5 mLの物質を、小さい磁製皿で、105℃にて、一定質量になるまで乾燥させ、次いで、リットル当たりの質量をグラムで記録することにより測定される。)例えば、ヘモフィラス株は、15〜90 g/L、例えば40〜90 g/L、例えば40、50、60、70、80若しくは90 g/L、又はこれらの濃度により結ばれるより小さい範囲(すなわち40〜50、70〜90など)のバイオマス濃度で溶解できる。例えば、ストレプトコッカス株は、10〜90 g/L、例えば10、20、30、40、50、60、70、80若しくは90 g/L、又はこれらの濃度により結ばれるより小さい範囲で溶解できる。モラクセラ株は、例えば、5〜60 g/L、又は10〜60 g/L、又は15〜40 g/L、例えば5、10、20、30、40、50若しくは60 g/L又はこれらの濃度により結ばれるより小さい範囲で溶解できる。クレブシエラ株は、例えば、10〜50 g/L、例えば25〜50 g/L、又は10、20、30、40若しくは50 g/L、又はこれらの濃度により結ばれるより小さい範囲で溶解できる。スタフィロコッカス株は、例えば、30〜90 g/L、例えば30、40、50、60、70、80若しくは90 g/L、又はこれらの濃度により結ばれるより小さい範囲で溶解できる。ナイセリア株は、例えば、5〜60 g/L、例えば5、10、20、30、40、50若しくは60 g/L、又はこれらの濃度により結ばれるより小さい範囲で溶解できる。
【００２１】
いくつかの実施形態において、溶解のために、0.01 N〜1.2 Nの水酸化物イオン濃度、例えば0.1〜1 N、又は0.05 N〜0.4 N、例えば0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35若しくは0.4 N、又はこれらの濃度により結ばれるより小さい範囲、又は0.5 N〜1.0 N、例えば0.5、0.6、0.7、0.8、0.9若しくは1.0 N、又はこれらの濃度により結ばれるより小さい範囲を用いることができる。塩基の濃度は、12以上の当初のpH、12を超えるpH、12.5を超えるpH、又はpH 12.0〜pH 13.4若しくはpH 12.6〜13.4のようなpHを達成するように用いることができる。例えば、ストレプトコッカス株について、水酸化物濃度は、0.1〜0.7 N、又は0.2〜0.5 N、例えば0.2、0.3、0.4若しくは0.5 N、又はこれらの濃度により結ばれるより小さい範囲であり得る。モラクセラ又はヘモフィラス株について、これは、0.05〜0.7 N、又は0.15〜0.5 N、例えば0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45若しくは0.5 N、又はこれらの濃度により結ばれるより小さい範囲であり得る。クレブシエラ又はスタフィロコッカス株について、これは、0.1〜0.7 N、又は0.15〜0.4 N、例えば0.15、0.2、0.25、0.3、0.35若しくは0.4 N、又はこれらの濃度により結ばれるより小さい範囲であり得る。
【００２２】
溶解温度は、30〜60℃、例えば30〜40℃、又は35〜40℃、例えば37℃であり得る。溶解時間は、20時間から若しくは40時間から数日、例えば2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10日、又は15日まででさえ変動し得る。例えば、ヘモフィラス、ストレプトコッカス、モラクセラ及びスタフィロコッカス株について、5〜9日間の時間を用いることができ、7〜10日間の時間を、クレブシエラ及びナイセリア株について用いることができる。いくつかの実施形態において、30〜40℃、又は35〜40℃、例えば37℃の溶解温度を、それぞれの株について用いることができ、溶解は、72〜210時間(3〜9日)の期間にわたって、例えば3日間、4、5、6、7、8及び9日間、又はこれらの時間により結ばれる時間又は日数の範囲(例えば3〜4日、8〜9日など)で行い得る。これらの時間の範囲は、その中の任意の端数の日、時間又は分を含むことが理解される。
いくつかの実施形態において、同じ細菌の属の複数の株を用いる場合、これらの株は、一緒に又は別々に溶解させ得る。株は、溶解の前又は後に混合できる。
【００２３】
抽出物は、遠心分離及び／又はろ過により精製できる。例えば、溶解物は、9000×重力で遠心分離し、その後、0.2ミクロンフィルタで1回又は複数回ろ過できる。より大きい孔のフィルタでの連続する回のろ過の後に、0.2ミクロンフィルタでのろ過を行うことができる場合もある。可溶性物質を抽出物から抽出するのを助けるために例えば限外ろ過法を行って、限外ろ過透過物をさらなる微細ろ過のために再循環することもできる。
【００２４】
いくつかの実施形態において、タンジェンシャルフローろ過(TFF)法を用いて、抽出物をろ過し、より大きい細胞破砕物から可溶化された分子を抽出できる(図1を参照) (例えば、Separations Technology, Pharmaceutical and Biotechnology Applications, Wayne P. Olson編 Interpharm Press, Inc., Buffalo Grove, IL, U.S.A., p.126〜135 ISBN:0-935184-72-4を参照)。このようなプロセスの初めには、希釈細菌溶解物を、第1タンクに貯蔵できる。微細ろ過(MF)ループを開始し、生成物をポンピングする。得られたMF濃縮液(retentate)は再循環させ、MF透過液は第2タンクに移す。
【００２５】
適切な範囲の濃度に到達した後に、限外ろ過(UF)ループを開始できる。UF透過液は、溶解物からの可溶化された化合物の連続的な抽出のために第1タンクに再循環して戻すことができるが、UF濃縮液は、第2タンクに貯蔵する。連続抽出の間に、タンク1及び2中の容量は、微細ろ過及び限外ろ過の透過液の流速の調節により調整できる。
このようないくつかの抽出サイクルを、TFF又は別のろ過方法を用いて行うことができる。TFFを用いる実施形態において、最後のサイクルの最後に、限外ろ過ループを閉じ、微細ろ過ループのみを運転し、MF透過液をタンク2に移すことができる。
【００２６】
微細ろ過ループは、1.2ミクロン〜0.1ミクロンのフィルタ、例えば0.65〜0.2ミクロン、又は0.45ミクロンのフィルタに適合させることができる。クロスフローは、0.6〜2バール、例えば0.8と1.5バールの間、又は1.0バールのトランスメンブレン圧力(TMP)で、1000リットル/時 m2 (LHM)と3000 LHMの間、例えば1500と2500 LHMの間、又は2000 LHMであり得る。限外ろ過ループは、10 KDa〜1000 KDa、例えば10 KDa〜100 KDa、又は10 KDa〜30 KDa、又は30 KDa〜100 KDaのフィルタに適合させることができる。クロスフローは、0.2〜1.5バール、例えば0.4と1.2バールの間、又は0.5バールのTMPで、30 LHMと1000 LHMの間、例えば20と500 LHMの間であり得る。
【００２７】
5と20の間のダイアフィルトレーション容量を用いて、細菌細胞壁から可溶化された化合物を抽出できる。いくつかの実施形態において、8容量と15容量の間を用いる。よって、例えば、いくつかの実施形態において、5サイクルと15サイクルの間のろ過、ある場合には8サイクルと15サイクルの間、例えば8、9、10、11、12、13、14又は15サイクルを用い得る。
【００２８】
ろ過の後に、抽出物は、所望により、さらに希釈、濃縮又は遠心分離できる。精製工程は、粒子状物質を抽出物から除去することも含み得る。例えば、より小さい孔のフィルタ、例えば0.2ミクロンのフィルタを用いるさらなる微細ろ過を行うことができる。ろ過の後に、Lowryにより測定される可溶化されたタンパク質の収率は、例えば50%を超えるか、又は60%を超えるか、又は50〜90%であるか、又は60〜90%であることができる。ろ過の後に、抽出物は、使用のために製剤化する前に凍結乾燥させることができる。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態において、溶解条件の群を選択して、1種又は複数種の細菌株に用いることができる。40〜90 g/L、又は40、50、60、70、80若しくは90 g/Lのヘモフィラス・インフルエンザNCTC 8467を、72〜200時間、例えば72、96、120、150若しくは200時間溶解できる。10〜95 g/Lの1種又は複数種のストレプトコッカス株、例えば10、20、40、60、80、90又は95 g/Lを、72〜210時間、例えば72、96、120、150又は200時間溶解できる。15〜80 g/Lの1種又は複数種のジプロコッカス株、例えば15、20、30、40、50、60、70又は80 g/Lを、72〜210時間、例えば72、96、120、150若しくは200時間溶解できる。10〜50 g/Lの1種又は複数種のクレブシエラ株、例えば10、15、20、25、30、35、40、45又は50 g/Lを、72〜210時間、例えば72、96、120、150若しくは200時間溶解できる。5〜60 g/Lの1種又は複数種のナイセリア株、例えば5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55又は60 g/Lを、72〜210時間、例えば72、96、120、150又は200時間溶解できる。30〜90 g/Lの1種又は複数種のスタフィロコッカス株、例えば30、40、50、60、70、80又は90 g/Lを、72〜210時間、例えば72、96、120、150、200時間溶解できる。これらの実施形態のそれぞれにおいて、溶解は、35〜40℃、例えば37℃にて行うことができる。さらに、「穏やかな」又は「強い」溶解条件を、抽出物を形成するそれぞれの株又は類似の株の群について用いることができる。本明細書で用いる場合、「穏やかな」溶解条件は、それぞれの型の株について上述したバイオマス、時間及び温度のパラメーター(例えば、ヘモフィラス・インフルエンザNCTC 8467について35〜40℃、40〜90 g/Lのバイオマス及び72〜200時間)とともに、0.05〜0.4 N、例えば0.1、0.2、0.3又は0.4 Nの水酸化物イオン濃度のことをいう。本明細書で用いる場合、「強い」溶解条件とは、それぞれの株について上述した時間、温度及びバイオマスのパラメーターとともに、0.5〜1 N、例えば0.5、0.6、0.7、0.8、0.9及び1 Nの水酸化物イオン濃度のことをいう。いくつかの実施形態において、強い溶解及び穏やかな溶解を両方行って、得られた生成物を一緒に混合することができる。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態において、抽出物は、複数種の細菌株、例えば少なくとも1種のグラム陰性及び少なくとも1種のグラム陽性株から得ることができる。同じ又は異なる種からの細菌株は、溶解の前又は後に混合できる。いくつかの実施形態において、株は、例えば、混合物中にそれぞれ1〜40容量%、又は15〜30容量%のそれぞれの属の細菌を得るように混合できる。いくつかの実施形態において、抽出物は、例えば、2、3、4、5又は10種の異なる属の細菌からの溶解生成物を含み得る。例えば、5つの属の混合物は、ヘモフィラス、モラクセラ、クレブシエラ、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス・サングイス、ピオゲネス及びニューモニエを含むストレプトコッカス株を含み得る。いくつかのストレプトコッカス・ニューモニエ株は、例えば、ジプロコッカス株としても知られる。このような5つの属の実施形態のいくつかにおいて、混合物は、5〜15容量%のヘモフィラス、例えば7〜10%、又は7、8若しくは9%；5〜15容量%のジプロコッカス、例えば7〜10%、又は7、8若しくは9%；5〜20容量%のストレプトコッカス、例えば7〜15%、又は8、9、10、11若しくは12%；10〜30容量%のクレブシエラ、例えば15〜25%、又は16、17、18、19、20、21、22、23若しくは24%；10〜30容量%のスタフィロコッカス、例えば15〜25%、又は16、17、18、19、20、21、22、23若しくは24%；及び20〜40容量%のナイセリア、例えば25〜35%、又は26、27、28、29、30、31、32、33若しくは34%を含有し得る。
【００３１】
細菌抽出物の化学的特性
本発明によるいくつかの実施形態は、例えば、5〜75 mg/mLのタンパク質、又は10〜65 mg/mL、又は20〜45 mg/mL、又は5〜40 mg/mL、又は5〜20 mg/mL、又は5〜10 mg/mL、又は6〜8 mg/mLのタンパク質、又は5、6、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70若しくは75 mg/mLで始まるか又は終わる範囲；グルタミン酸(147.1 g/mol)から算出される、1.5〜2.5 mg/mLの遊離アミノ酸(A.A.)、又は1.5〜2 mg/mL、又は2〜2.5 mg/mLの遊離A.A.、又は1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4若しくは2.5 mg/mLで始まるか又は終わる範囲の遊離A.A.；並びに0.3〜4.5 mg/mLの多糖類及び単糖類、又は0.3〜4 mg/mL、又は0.4〜4 mg/mL、又は0.5〜3.5 mg/mL、又は0.6〜3 mg/mL、又は0.3〜1 mg/mL、又は0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0若しくは4.5 mg/mLで始まるか又は終わる範囲の多糖類及び単糖類、例えば0.4〜0.5 mg/mLを含有し得る。例えば、いくつかの実施形態は、約6〜8 mg/mLのタンパク質、グルタミン酸(147.1 g/mol)から算出される1.5〜2.5 mg/mLの遊離アミノ酸(A.A.)、及び／又は約0.4〜0.5 mg/mLの多糖類及び単糖類を含有する。タンパク質濃度は、欧州薬局方2.5.33の方法2に従うLowryアッセイにより測定される。糖濃度は、D. Herbertら、Meth. Microbiol. 5B: 266以降(1971)に従って、酸加水分解及び誘導体化の後にアッセイされる。グルタメート(グルタミン酸)の濃度は、Roth M.、Fluorescence reaction for amino acids、Anal.Chem.、43、880〜882(1971)に従って、アミノ酸をイソインドール誘導体に変換し、340 nmでの吸光度を測定することにより、測定される。
【００３２】
いくつかの実施形態において、リムルス変形細胞分解産物(LAL)色素産生試験に基づくLPS等量の濃度は、1000 ng/ml未満、又は500 ng/ml未満、200 ng/ml未満、又は100 ng/ml未満である。
【００３３】
本発明による細菌の溶解は、タンパク質の部分的加水分解、及び脱アミノ化、アミド分解、及びLからDへのアミノ酸の部分的ラセミ化ももたらし得る。本発明による抽出物のある分析研究において、D-アスパラギン酸、D-グルタミン酸、D-セリン、D-メチオニン、D-ヒスチジン、D-アラニン、D-アルギニン、D-フェニルアラニン、D-チロシン、D-ロイシン、及びD-リジンを表すピークがそれぞれ観察された。この研究におけるこれらの種のD-アミノ酸のパーセンテージは、3%〜40%の範囲であった。よって、本発明のいくつかの実施形態は、上記の全てのアミノ酸のようなセリン、スレオニン、ヒスチジン、アラニン、アルギニン、チロシン、フェニルアラニン、ロイシン及びリジンの1つ又は複数、又は1つより多く上記のアミノ酸の全てより少ない選択、例えばアラニン、フェニルアラニン及びリジンのラセミ化を可能にする。いくつかの実施形態において、上記のアミノ酸の1つ又は複数の少なくとも10%が、DからLにラセミ化され得る。別の実施形態において、上記のアミノ酸の1つ又は複数の少なくとも40%がラセミ化され得る。
【００３４】
本発明による細菌の溶解は、加水分解により、0〜300 kDaから0〜100 kDaへ、又は0〜60 kDaへの成分の分子の分子量の減少をもたらし得る。
【００３５】
細菌抽出物の生物活性
本発明による抽出物は、呼吸器障害及びアレルギー性反応又は状態などの医療状態に罹患したか又はそれらを発生する危険性がある患者の治療に有効であり得る。本発明による抽出物は、例えば、上下気道感染、アトピー性皮膚炎、鼻咽頭炎、副鼻腔炎、咽頭炎、扁桃炎、喉頭炎、気管炎、喉頭咽頭炎、インフルエンザ、肺炎、気管支肺炎、気管支炎、下気道感染、アレルギー性鼻炎、アレルギー性喘息、鼻炎、鼻咽頭炎、咽頭炎、副鼻腔炎、扁桃炎、喉頭炎、喉頭気管炎、気管支炎、急性下気道感染を伴う閉塞性肺疾患及び急性憎悪を伴う閉塞性肺疾患を治療するのに有効であり得る。
【００３６】
抽出物の生物活性は、いくつかのアッセイにより決定できる。例えば、末梢血単核細胞(PBMC)アッセイは、PBMCからのサイトカインIL-6の生成を試験し、抽出物が免疫系を刺激する能力についてスクリーニングできる。例えば、いくつかの実施形態において、本発明の抽出物で刺激したPBMCの上清中で測定されるインビトロIL-6濃度は、2000 pg/ml〜70,000 pg/ml、2000 pg/ml〜50,000 pg/ml、2000 pg/ml〜30,000 pg/ml、2000 pg/ml〜20,000 pg/ml、2000 pg/ml〜10,000 pg/ml又は5000 pg/ml〜70,000 pg/ml、5000 pg/ml〜50,000 pg/ml、5000 pg/ml〜30,000 pg/ml、5000 pg/ml〜25,000 pg/ml、又は5000 pg/ml〜10,000 pg/ml、又は15,000 pg/ml〜25,000 pg/mlの範囲であった。LPSをアゴニスト対照として用いた場合(0.01μg/mlで)、得られた値は、提供者に応じて、5,000 pg/ml〜70,000 pg/mlの範囲であった。
【００３７】
マウス酸化窒素(NO)試験は、マウスマクロファージによる、免疫刺激を示すNOの生成を測定する。例えば、マクロファージは、侵入した細菌を殺すためにNOを生成する。いくつかの実施形態において、0.001 mg/ml〜10 mg/mlの範囲の濃度の可溶性乾燥重量で試験した本発明の実施形態についてのインビトロ亜酸化窒素(NO)活性は、3μM〜100μM酸化窒素、又は3μM〜90μM、3μM〜80μM、3μM〜70μM、3μM〜60μM、3μM〜50μM、3μM〜40μM、3μM〜30μM、3μM〜20μM、3μM〜10μM、又は5μM〜80μM、5μM〜60μM、5μM〜40μM、5μM〜20μM、又は10μM〜80μM、10μM〜70μM、10μM〜50μM、10〜30μM、又は10μM〜15μMの範囲、又は3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95若しくは100μMで始まるか又は終わる範囲の最大応答を与えた。
【００３８】
ヒト末梢血単核細胞及びマウスマクロファージに対してインビトロで観察される活性は、溶解される細菌乾燥重量バイオマスの量、すなわち溶解のための「出発原料」、アルカリ溶解の期間、及び溶解において用いるNaOHの当初のパーセンテージ又は当初のpHのような変数に依存し得る。
PBMC及びNOのようなインビトロ活性試験を、LALによるようなLPS濃度の決定と組み合わせることによっても、ある細菌抽出物の活性と毒性危険性とのバランスに関する情報を得ることができる。
【００３９】
本発明の抽出物は、エアゾールインフルエンザウイルス感染、例えばA/PR/8/34 (H1N1) 感染に対しても活性であり得る。ある研究において、例えば、本発明による抽出物は、マウスにおいて、死亡率、肺ウイルス力価、臨床症状及び抗体力価により判断して、10 mg/マウスの用量で完全な免疫防御を与えることができた。対照的に、対照の動物の70%しか感染から生存できなかった。
【００４０】
別の例として、野生型LPS感受性を有する少なくとも8匹のマウスをサルモネラ・チフィムリウム(Salmonella thyphimurium)で攻撃した13日後の生存率は、これらのマウスをまず本発明のいくつかの実施形態の有効量で10日間処置した場合に、少なくとも60%である。攻撃のためのサルモネラ・チフィムリウムの用量は、未処置のマウス、又は水、若しくは賦形剤を含有するが抽出物を含有しないブランク製剤対照で処置されたマウスの生存率が60%以下、例えば50%以下になるように選択できる。抽出物で処置されたマウスの生存率は、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の場合がある。
【００４１】
さらに、本発明の実施形態は、以下にさらに詳細に示すように、化合物48/80により刺激された肥満細胞によるヒスタミンの分泌を、統計的に有意な程度に阻害することもできる。例えば、本発明の実施形態は、化合物48/80刺激肥満細胞アッセイにおいて、例えば、0.0005と0.01 mg/mLの間、例えば0.0005と0.005 mg/mLの間、又は0.001と0.01 mg/mLの間、又は0.002と0.008 mg/mLの間、又は0.004と0.006 mg/mLの間のIC-50値を示し得る。
【００４２】
細菌抽出物を含む組成物
凍結乾燥された抽出物混合物は、最終的な投与のためにいくつかの異なる方式で製剤化できる。例えば、経口の錠剤、カプセル及び丸剤、並びに液体製剤又はエアゾール剤を調製できる。点滴又は注射用の製剤も調製できる。本発明の実施形態は、例えば、固体投与形態又は液体投与形態として製剤化できる。例示的な固体投与形態は、抽出物を含有する、例えば、錠剤、例えば被覆錠剤、チュアブル錠剤、発泡錠剤、舌下錠剤、顆粒剤、散剤、又はカプセル剤、並びに任意に、1つ又は複数の栄養及び／又は食餌補助剤を含み得る。固体投与形態は、希釈剤、充填剤及び／又はその他の賦形剤も含み得る。例えば防腐剤、着色剤、香料及び甘味料のようなその他の賦形剤成分を加えることができる。散剤又は顆粒剤の製剤を調製することも可能である。液剤、シロップ剤、懸濁剤又はドロップのような液体投与形態も、経口経路用に用いることができる。
【実施例】
【００４３】
実施例1：細菌培養
実施例1.1：ヘモフィラス・インフルエンザNCTC 8467の培養
当初の培養条件
培養培地は、以下の成分を精製水に溶解することにより調製した：塩化ナトリウム: 3 g/L；リン酸一水素ナトリウム: 2 g/L；酢酸ナトリウム: 0.5 g/L；大豆ペプトン40 g/L；グルコース: 6 g/L；イノシン: 0.1 g/L；塩化カルシウム: 0.02 g/L；塩化カリウム: 0.1 g/L；重炭酸ナトリウム: 0.6 g/L；ピルビン酸ナトリウム: 0.06 g/L；金属溶液(硫酸銅: 3 mg/l；塩化鉄: 830 mg/l；硫酸亜鉛: 860 mg/l；硫酸: 1.1 mg/L): 0.5 mL/L；ヘミン: 25 mg/l；NADH (β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド 2ナトリウム塩還元型3水和物) 25 mg/l。溶解の後に、pHを7.2に調整した。培地を滅菌した後に、小さいエルレンマイヤーフラスコのそれぞれに、凍結バイアル(凍結細菌1.5 mLを含有)の内容物を個別に接種し、37℃にて8時間インキュベートした。次いで、この培養物の部分標本を、150 mLの培養培地を含有するより大きいエルレンマイヤーフラスコに移し、同じ条件下で再びインキュベートした。1000 mLの培養培地を用いる別の発酵工程を、50 mg/Lのヘミン及び50 mg/LのNADHを接種前に加える以外は同じ条件で行った(700 nmでのODが、10 ml培養1について10時間後に3.7、1000 ml培養について11時間後に13.5)。次いで、1000 ml培養物の全体を、予備発酵槽に移した。
【００４４】
予備発酵槽での培養条件
培養培地は、以下の成分を精製水に溶解することにより調製した：塩化ナトリウム: 3 g/L；リン酸一水素ナトリウム2 g/L；酢酸ナトリウム: 0.5 g/L；大豆ペプトン40 g/L；グルコース6 g/L；イノシン0.1 g/L；塩化カルシウム0.02 g/L；塩化カリウム0.1 g/L；重炭酸ナトリウム0.6 g/l；ピルビン酸ナトリウム0.06 g/l；金属溶液: 0.5 mL/L；ヘミン: 1 mg/L；NADH: 10mg/L、ポリプロピレングリコール: 0.06〜0.10 mL/L。インキュベーション温度は、撹拌及び曝気をしながら30℃に調節した。pHは、培養の間調節しなかった。13時間後に、2つの予備発酵槽を発酵槽に移した(700 nmでのOD 6時間後の培養1: 1.53；8.5時間後の培養2: 1.90)。予備発酵槽の培養物を、滅菌条件下で発酵槽に移した。
【００４５】
発酵槽での培養条件
培養培地は、以下の成分を精製水に溶解することにより調製した：塩化ナトリウム: 3 g/l、リン酸一水素ナトリウム: 2 g/L；酢酸ナトリウム0.5 g/L、大豆ペプトン40 g/L；イノシン0.1 g/L；塩化カルシウム0.02 g/L；塩化カリウム0.1 g/L、重炭酸ナトリウム0.6 g/L；ピルビン酸ナトリウム:0.06 g/L；金属溶液:0.5 mL/L；ヘミン 1.5 mg/l；NADH: 15 mg/l；ポリプロピレングリコール: 0.02〜0.04 mL/L。
【００４６】
滅菌の後に、培養に15 g/Lのグルコースを加えた。インキュベーション温度は、撹拌及び曝気をしながら35℃に調節した。pHは、培養の間、6.8に調節した。8時間後に、培養物(700 nmでのOD、7.25時間後の培養1: 3.69；8.75時間後の培養2: 3.55)を、90〜100℃の熱処理により不活性化し、採集タンクに移した。一旦不活性化すると、バイオマスを培養培地から分離して濃縮するために、遠心分離機に培養物を移した。採集されたバイオマスを、遠心分離機に連結されたタンク内に貯蔵した。遠心分離機の残留物(1000 l/h)は、貯蔵タンクに再利用し、ここで透過物を除いた。バイオマスを濃縮し、滅菌タンク内で採集した。3.25時間後に、31,768 gのバイオマスを採集した。濃縮バイオマスのODは、700nmにて237.4であった。バイオマスを、425 gの乾燥重量バイオマスを含有する一連の部分標本に分配した。部分標本を、次いで、-15℃で凍結した。
【００４７】
実施例1.2：スタフィロコッカス培養
エルレンマイヤーフラスコでの培養条件
スタフィロコッカス・アウレウス049 (StAu 049)、スタフィロコッカス・アウレウスI-050 (StAu 050)、スタフィロコッカス・アウレウスI-051 (StAu 051)、スタフィロコッカス・アウレウスI-052 (StAu 052)、スタフィロコッカス・アウレウスI-053 (StAu 053)及びスタフィロコッカス・アウレウスI-054 (StAu 054)についての培養培地は、以下の成分を精製水に溶解することにより調製した：塩化ナトリウム2 g/L；リン酸一水素ナトリウム2 g/L；酢酸ナトリウム0.5 g/L；大豆ペプトン40 g/L；グルコース6 g/L。次いで、0.012 Lの培地に、1.5 mLの凍結細菌を接種した。培養を、37℃にて7時間、180 rpm及びpH 6.9にて撹拌しながらインキュベートした。12 mLから1000 mLの連続培養工程を行った。
【００４８】
予備発酵槽での培養条件
ポリプロピレングリコール0.06〜0.10 mL/Lを添加する以外は前工程と同じ培地を、予備発酵槽のために調製した。培地を、その場で123℃にて30分間滅菌した。1000 mlの前工程からの培養物を、撹拌及び曝気しながら予備発酵槽に移した。インキュベーション温度は、37±2℃に調節した。pHは、培養の間調節しなかった。6時間後に、2つの予備発酵槽を、発酵槽に移した。
【００４９】
発酵槽での培養
StAu 049のための培養培地を、以下の成分を精製水に溶解することにより調製した：塩化ナトリウム2 g/L；リン酸一水素ナトリウム2 g/L；酢酸ナトリウム0.5 g/L；大豆ペプトン40 g/L；ポリプロピレングリコール0.04 mL/L。培地をその場で滅菌した。グルコース(14 g/L)を培養に加えた。インキュベーション温度は、撹拌及び曝気しながら37℃に調節した。pHは、6.4±0.5に調節した。7時間後に、培養物を、90〜100℃の熱処理により不活性化し、採集タンクに移した。バイオマスを、次いで、遠心分離により培養培地から分離した。バイオマスを、ある量の乾燥重量バイオマスを含有する一連の部分標本に分けた。
各部分標本中のバイオマス乾燥重量は、StAu 049：327 g、StAu 050：297 g、StAu 051：375 g、StAu 052：363 g、StAu 053：446 g及びStAu 054: 365 gであった。
【００５０】
実施例1.3：クレブシエラの培養
最初の培養条件
クレブシエラ・ニューモニエNCTC 5050 (Klba 5050)、クレブシエラ・ニューモニエNCTC 5056 (Klba 5056)及びクレブシエラ・ニューモニエNCTC 204 (Klba 204)のための培養培地を、以下の成分を精製水に溶解することにより調製した：塩化ナトリウム2 g/L；リン酸一水素ナトリウム2 g/L；酢酸ナトリウム0.5 g/L；大豆ペプトン40 g/L；グルコース6 g/L。0.012 Lの培地に、1.5 mLの凍結細菌を接種した。培養を、37℃にて10時間、撹拌しながらインキュベートし、最初のpHを6.9に設定した。0.012リットルから1.0リットルの連続培養工程を行った。
【００５１】
予備発酵槽中でのKlba 5050の培養条件
ポリプロピレングリコール0.06 mL/Lを加える以外は前工程と同じ培地を予備発酵槽のために調製した。前工程からの培養物1リットルを、予備発酵槽に移した。インキュベーション温度は、撹拌及び曝気しながら37℃に調節した。pHは、培養の間調節しなかった。6時間後に、2つの予備発酵槽を、発酵槽に移した。
【００５２】
発酵槽での培養条件
Klba 5050のための培養培地を、以下の成分を精製水に溶解することにより調製した：塩化ナトリウム2 g/L；リン酸一水素ナトリウム2 g/L；酢酸ナトリウム0.5 g/L；大豆ペプトン40 g/L及びポリプロピレングリコール0.02 mL/L。培地をその場で滅菌し、21 g/Lのグルコースを加えた。インキュベーション温度は、撹拌及び曝気しながら37℃に調節した。pHは、培養の間、6.6に調節した。8時間後に、培養物を、90〜100℃の熱処理により不活性化し、採集タンクに移した。バイオマスを、次いで、遠心分離により培養培地から分離した。各部分標本中のバイオマス乾燥重量は、Klba 5050：393 g、Klba 5056：455 g及びKlba 204：440 gであった。
【００５３】
実施例1.4：モラクセラ・カタラーリスの培養
最初の培養条件
モラクセラ・カタラーリスNCTC 3622 (NeCa 3622)；モラクセラ・カタラーリスNCTC 3625 (NeCa 3625)及びモラクセラ・カタラーリスI-045 (NeCa 045)のための培養培地を、以下の成分を精製水に溶解することにより調製した：塩化ナトリウム：3 g/L；リン酸一水素ナトリウム: 2 g/L；酢酸ナトリウム: 0.5 g/L；大豆ペプトン: 40 g/L；デンプン: 0.1 g/L；イノシン: 0.1 g/L；塩化カルシウム: 0.02 g/L；塩化カリウム: 0.1 g/L；重炭酸ナトリウム: 0.6 g/L；ピルビン酸ナトリウム: 0.06 g/L；金属溶液: 0.5 mL/L (金属溶液組成：硫酸銅3 mg/L；塩化鉄: 830 mg/L；硫酸亜鉛: 860 mg/L；硫酸: 1.1 mg/L)；ジペプチドALA-GLN (0.9% NaCl溶液中に200mg/mL): 10 mg/L (最初の培養工程について50 mg/L；1リットル培養工程について10 mg/L)。0.012 Lの培地に、1.5 mLの凍結細菌を接種した。培養を、37℃にて10時間、撹拌しながらインキュベートした。最初のpHを7.2に設定した。0.012から1.0 Lの連続培養工程を、同じ条件で行った。
【００５４】
予備発酵槽での培養
ポリプロピレングリコール0.06〜0.10 mL/Lを加え、ALA-GLNの濃度を4 mg/Lに調整した以外は前工程と同じ培地を、予備発酵槽のために調製した。培地を、その場で滅菌した。前工程からの培養物1リットルを、予備発酵槽に移した。インキュベーション温度は、撹拌及び曝気しながら33℃に調節した。pHは、培養の間調節しなかった。10時間後に、2つの予備発酵槽を、発酵槽に移した。
【００５５】
発酵槽での培養条件
ポリプロピレングリコール0.06 mL/Lを加え、ALA-GLN又はグルコース加えない以外はエルレンマイヤー工程と同じ培地を、予備発酵槽のために調製した。インキュベーション温度は、撹拌及び曝気しながら33℃に調節した。pHは、培養の間、調節しなかった。10.5時間後に、培養を、90〜100℃の熱処理により不活性化し、採集タンクに移した。バイオマスを、次いで、遠心分離により培養培地から分離した。各部分標本中のバイオマス乾燥重量は、NeCa 3622: 361 g、NeCa 3625: 351 g及びNeCa 045: 223 gであった。
【００５６】
実施例1.5：ストレプトコッカスの培養
最初の培養条件
ストレプトコッカス・ニューモニエNCTC7465 (StPn 7465)、ストレプトコッカス・ニューモニエNCTC 7466 (StPn 7466)、ストレプトコッカス・ニューモニエNCTC 7978 (StPn 7978)、ストレプトコッカス・ニューモニエNCTC 10319 (StPn 710319)、ストレプトコッカス・サングイスI-046 (StSa 046)、ストレプトコッカス・サングイスI-047 (StSa 047)、ストレプトコッカス・サングイスI-048 (StSa 048)及びストレプトコッカス・ピオゲネスNCTC 8191 (StPy 8191)のための培養培地を、以下の成分を精製水に溶解することにより調製した：塩化ナトリウム: 2 g/L；リン酸一水素ナトリウム: 2 g/L；酢酸ナトリウム: 0.5 g/L；大豆ペプトン: 40 g/L；グルコース: 6 g/L；ウマ血清: 50 mL/L。滅菌の後に、0.012 Lの培地に、1.5 mLの凍結細菌を接種した。培養を、37℃にて14時間、撹拌しながらインキュベートした。次いで、10 mLのこの培養物を、150 mLの培養培地を含有するフラスコに移し、同じ条件下で10時間、再びインキュベートした。最終工程を、20 mL/L ウマ血清を含む培地1000 mLを含むより大きいフラスコで、同じ条件下で行った後に、予備発酵槽に加えた。
【００５７】
予備発酵槽での培養
ポリプロピレングリコール0.06 mL/L及び8 mL/Lの濃度のウマ血清を加える以外は前工程と同じ培地を、予備発酵槽のために調製した。前の培養物1リットルを、2つの予備発酵槽に移した。インキュベーション温度は、撹拌しながら30℃に調節した。pHは、培養の間調節しなかった。14時間後に、2つの予備発酵槽を、発酵槽に移した。
【００５８】
発酵槽での培養
ポリプロピレングリコール0.06 mL/L及び1.2 mL/Lの濃度のウマ血清を加えた以外はエルレンマイヤー工程と同じ培地を、予備発酵槽のために調製した。15.75 kgのグルコースを、培養の間に加えた。インキュベーション温度は、撹拌しながら37℃に調節した。pHは、濃KOHを用いて6.4に調節した。9.25時間後に、培養物を、90〜100℃の熱処理により不活性化し、採集タンクに移した。バイオマスを、次いで、遠心分離により培養培地から分離した。StSa 046、StSa 047、StSa 048及びStPy 8191に、滅菌空気を曝気し、培養のためにウマ血清を必要としなかった。各部分標本中のバイオマス乾燥重量は、StPn 7465: 134 g、StPn 7466: 142 g StPn 7978: 134 g StPn 10319: 153 g   StSa 046: 246 g、StSa 047: 232 g、StSa 048: 353 g及びStPy 8191: 269 gであった。
【００５９】
実施例2：細菌の溶解
HAIN 8467 実施例2.1
発酵実施例1.1の細菌バイオマスからのHaIn 8467の部分標本を、室温にて融解し、塩溶液(8 g/L NaCl)で79 g/L乾燥重量に達するまで希釈した。0.2 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて120時間インキュベートした。溶解の間、pHは、0.5 pH単位を超えて減少しないように監視した。結果：82.2 mg/mLの可溶化乾燥重量(SDW)、及び32.4 mg/mLのタンパク質(Prot)、及び6.2 mg/mLのグルタミン酸(147.1 g/mol)で算出したOPAにより測定される全アミノ酸(A.A)、2.40 mg/mLのOPAにより測定される還元糖(炭水化物)。
【００６０】
タンパク質濃度(Prot)は、Lowryアッセイにより測定した(欧州薬局方2.5.33、「全タンパク質−方法2」を参照)。合計の遊離アミノ酸濃度(A.A)は、Roth M.、Fluorescence reaction for amino acids、Anal.Chem.、43、880〜882(1971)に従って、アミノ酸をイソインドール誘導体に変換し、340 nmでの吸光度を測定することにより測定した。結果は、グルタミン酸の等量で示す。糖(炭水化物)濃度は、D. Herbertら、Meth. Microbiol. 5B: 266以降(1971)に従って、酸加水分解及び誘導体化の後にアッセイした。
【００６１】
HAIN 8467 実施例2.2
実施例1.1によるバイオマスを、58.2 g/Lに希釈した。0.2 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて5日間インキュベートした。(可溶性乾燥重量(SDW): 70.0 mg/ml; Lowryタンパク質(Prot): 30.0 mg/ml; アミノ酸(A.A): 6.0 mg/ml; 炭水化物: 2.60 mg/ml)。mgの活性乾燥重量/mLでのNOx生成、0.02 mg/mL (C1)、0.2 mg/mL (C2)及び2.0 mg/mL (C3):  C1: 18.7μM、C2: 20.8μM、C3: 12.1μM。
【００６２】
HAIN 8467 実施例2.3
実施例1.1によるバイオマスを、20 g/Lに希釈した。0.045 M NaOH でのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて5日間インキュベートした。(SDW: 29.99 mg/ml. Prot: 4.8 mg/ml; 炭水化物: 0.2 mg/ml)。
【００６３】
HAIN 8467 実施例2.4 (OP0662L)
実施例1.1によるバイオマスを、12.5 g/Lに希釈した。0.05 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて2日間インキュベートした。(SDW: 11.2 mg/ml; Prot: ＜0.2 mg/ml; A.A: 2.0 mg/ml; 炭水化物: 0.4 mg/ml)。D-アミノ酸パーセンテージ: 15% D-Ala、9 % D-Leu、45 % D-Ser、21 % D-Asx、15 % D- Met、11 % D-Phe、9 % D-Glx。
【００６４】
HAIN 8467 実施例2.5
実施例1.1によるバイオマスを、127 g/Lに希釈した。0.7 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて2日間インキュベートした。(SDW: 157.2 mg/ml; Prot: 86 mg/ml; A.A: 20.0 mg/ml; 炭水化物: 4.0 mg/ml)。D-アミノ酸パーセンテージ: 22% D-Ala、11 % D-Leu、54 % D-Ser、41 % D-Asx、35 % D-Met、32 % D-Phe、29 % D-Glx、6 % D-Tyr。mgの活性乾燥重量/mLでのNOx生成、0.02 mg/mL (C1)、0.2 mg/mL (C2)及び2.0 mg/mL (C3):  C1: 9.1μM、C2: 18.5μM、C3: 3.1μM。
【００６５】
HAIN 8467 実施例2.6
実施例1.1によるバイオマスを、12.5 g/Lに希釈した。0.05 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて3日間インキュベートした。(SDW: 10.8 mg/ml; Prot: 0.5 mg/ml未満; A.A: 2.0 mg/ml; 炭水化物: 0.4 mg/ml)。D-アミノ酸パーセンテージ: 10% D-Ala、9 % D-Leu、56 % D-Ser、22 % D-Asx、16 % D- Met、13 % D-Phe、11 % D-Glx。mgの活性乾燥重量/mLでのNOx生成、0.02 mg/mL (C1)、0.2 mg/mL (C2)及び2.0 mg/mL (C3): C1: 20.2μM、C2: 26.7μM、C3: 4.3μM。
【００６６】
HAIN 8467 実施例2.7
実施例1.1によるバイオマスを、127 g/Lに希釈した。0.7 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて3日間インキュベートした。(SDW: 168.8 mg/ml; Prot: 90 mg/ml; A.A: 22 mg/ml; 炭水化物: 4.2 mg/ml)。D-アミノ酸パーセンテージ: 36% D-Ala、8 % D-Leu、9 % D-Ser、44 % D-Asx、42 % D-Met、37 % D-Phe、37 % D-Glx、37 % D-Tyr。
【００６７】
HAIN 8467 実施例2.8
実施例1.1によるバイオマスを、12.5 g/Lに希釈した。0.7 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて10日間インキュベートした。(SDW: 47.2 mg/ml; Prot: 0.2 mg/ml未満; A.A: 4.0 mg/ml; 炭水化物: 0.2 mg/ml)。D-アミノ酸パーセンテージ: 3% D-Ala、13 % D-Leu、54 % D-Ser、45 % D-Asx、43 % D- Met、42 % D-Phe、41 % D-Glx。mgの活性乾燥重量/mLでのNOx生成、0.02 mg/mL (C1)、0.2 mg/mL (C2)及び2.0 mg/mL (C3) : C1: 7.5μM、C2: 16.0μM、C3: 8.6μM。
【００６８】
HAIN 8467 実施例2.9
実施例1.1によるバイオマスを、127 g/Lに希釈した。0.05 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて196時間インキュベートした。D-アミノ酸パーセンテージ: 14% D-Ala、5 % D-Asx、11 % D- Met、5 % D-Glx。
【００６９】
STPY 8191 実施例2.10
269 gの細菌性物質を含有する実施例1.5からのStPy 8191の1つの部分標本を、室温にて融解し、塩溶液(8 g/L NaCl)で59.8 g/L乾燥重量に達するまで希釈した。0.2 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて192時間インキュベートした。溶解の間、pHは、0.5 pH単位を超えて減少しないように監視した。(SDW:  61.92 mg/mL; Prot: 31.68 mg/mL; A.A.: 7.2 mg/mL; 炭水化物: 7.2 mg/mL)。D-アミノ酸パーセンテージ: 22% D-Ala、11 % D-Leu、54 % D-Ser、41 % D-Asx、35 % D- Met、32 % D-Phe、29 % D-Glx、6 % D-Tyr。mgの活性乾燥重量/mLでのNOx生成、0.02 mg/mL (C1)、0.2 mg/mL (C2)及び2.0 mg/mL (C3): C1: 4.9μM、C2: 11.8μM、C3: 6.7μM。
【００７０】
STSA 046 実施例2.11
実施例1.5によるバイオマスを、30 g/Lに希釈した。0.022 N NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。
STPY 8191 実施例2.12
実施例1.5によるバイオマスを、100 g/Lに希釈した。0.7 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて2日間インキュベートした。(SDW: 120.2 mg/ml; Prot: 45.6 mg/ml; A.A: 15.2 mg/ml; 炭水化物: 2.8 mg/ml)。D-アミノ酸パーセンテージ: 35% D-Ala、13 % D-Leu、57 % D-Ser、44 % D-Asx、40 % D- Met、39 % D-Phe、43 % D-Glx。
【００７１】
STPY 8191 実施例2.13
実施例1.5によるバイオマスを、12.7 g/Lに希釈した。0.1 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて2日間インキュベートした。(SDW: 12.5 mg/ml; Prot: ＜0.2 mg/ml; A.A: 0.8 mg/ml; 炭水化物: 0.1 mg/ml)。D-アミノ酸パーセンテージ: 24% D-Ala、13 % D-Leu、52 % D-Ser、28 % D-Asx、8 % D- Met、8 % D-Phe、23 % D-Glx、6 % D-Tyr。
STPY 8191 実施例2.14
実施例1.5によるバイオマスを、100 g/Lに希釈した。0.1 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。(SDW: 41.4 mg/ml; Prot: 3.2 mg/ml; A.A: 4 mg/ml; 炭水化物: 1.5 mg/ml)。
【００７２】
STPY 8191 実施例2.15
実施例1.5によるバイオマスを、12.7 g/Lに希釈した。0.7 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。(SDW: 52.5 mg/ml; Prot: 0.8 mg/ml; A.A: 3.2 mg/ml; 炭水化物: 0.6 mg/ml)。
STPY 8191 実施例2.16
実施例1.5によるバイオマスを、100 g/Lに希釈した。0.7 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて10日間インキュベートした。SDW: 147.2 mg/ml; Prot: 53.6 mg/ml; A.A: 24.8 mg/ml; 炭水化物: 5.4 mg/ml)。D-アミノ酸パーセンテージ: 44% D-Ala、26 % D-Leu、11 % D-Ser、45 % D-Asx、43 % D- Met、42 % D-Phe、46 % D-Glx。mgの活性乾燥重量/mLでのNOx生成 : 0.02 mg/mL (C1)、0.2 mg/mL (C2)及び2.0 mg/mL (C3) : C1 :9.7μM、C2 :17.4μM、C3 :2.5μM。
【００７３】
STPY 8191 実施例2.17
実施例1.5によるバイオマスを、12.7 g/Lに希釈した。0.1 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて10日間インキュベートした。(SDW: 14.7 mg/ml; Prot: 0 mg/ml; A.A: 0.8 mg/ml; 炭水化物: 0.2 mg/ml)。D-アミノ酸パーセンテージ: 28% D-Ala、9 % D-Ser、36 % D-Asx、33 % D- Met、32 % D-Phe、31 % D-Glx。mgの活性乾燥重量/mLでのNOx生成、0.02 mg/mL (C1)、0.2 mg/mL (C2)及び2.0 mg/mL (C3):  C1: 5.8μM、C2: 12.1μM、C3: 6.8μM。
【００７４】
STSA 046 実施例2.18
実施例1.5によるバイオマスを、68 g/Lに希釈した。0.25 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。(SDW: 90.72 mg/ml; Prot: 47.68 mg/ml; A.A: 9.36 mg/ml; 炭水化物: 2.48 mg/ml)。
STSA 047 実施例2.19
実施例1.5によるバイオマスを、68 g/Lに希釈する。0.25 M NaOHでのアルカリ化を行う。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートする。
STSA 047 実施例2.20
実施例1.5によるバイオマスを、60 g/Lに希釈する。0.33 M NaOHでのアルカリ化を行う。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて2日間インキュベートする。
【００７５】
STSA 048 実施例2.21
実施例1.5によるバイオマスを、62 g/Lに希釈する。0.33 M NaOHでのアルカリ化を行う。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートする。
STPY 8191 実施例2.22
実施例1.5によるバイオマスを、55 g/Lに希釈する。0.33 M NaOHでのアルカリ化を行う。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて4日間インキュベートする。
STPN 7978 実施例2.23
実施例1.5によるバイオマスを、38.7 g/Lに希釈した。0.25 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。(SDW: 66.4 mg/ml; Prot: 25.4 mg/ml; A.A: 6.0 mg/ml; 炭水化物: 2.5 mg/ml)。mgの活性乾燥重量/mLでのNOx生成、0.02 mg/mL (C1)、0.2 mg/mL (C2)及び2.0 mg/mL (C3): C1: 10.2μM、C2: 20.7μM、C3: 20.8μM。
【００７６】
STPN 7978 実施例2.24
実施例1.5によるバイオマスを、30 g/Lに希釈した。0.022 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。(SDW: 30.4 mg/ml; Prot: 2.20 mg/ml; 炭水化物: 0.40 mg/ml)。
STPN 7978 実施例2.25
実施例1.5によるバイオマスを、60 g/Lに希釈した。0.7 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて2日間インキュベートした。(SDW: 59 mg/ml; Prot: 17 mg/ml; A.A: 7.0 mg/ml; 炭水化物 1.8 mg/ml)。mgの活性乾燥重量/mLでのNOx生成、0.02 mg/mL (C1)、0.2 mg/mL (C2)及び2.0 mg/mL (C3): C1: 9.1μM、C2: 13.4μM、C3: 1.4μM。
【００７７】
STPN 7978 実施例2.26
実施例1.5によるバイオマスを、12.5 g/Lに希釈した。0.1 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて2日間インキュベートした。(SDW: 17.8 mg/ml; Prot: ＜0.2 mg/ml; A.A: 2.0 mg/ml; 炭水化物: 0.7 mg/ml)。
STPN 7978 実施例2.27
実施例1.5によるバイオマスを、60 g/Lに希釈した。0.1 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。(SDW: 43.6 mg/ml; Prot: 6 mg/ml; A.A: 10 mg/ml; 炭水化物: 1.5 mg/ml)。
STPN 7978 実施例2.28
実施例1.5によるバイオマスを、12.5 g/Lに希釈した。0.7 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。(SDW: 55.4 mg/ml; Prot: 2 mg/ml; A.A: 4 mg/ml; 炭水化物 0.7 mg/ml)。
【００７８】
STPN 7978 実施例2.29
実施例1.5によるバイオマスを、60 g/Lに希釈した。0.7 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて10日間インキュベートした。(SDW: 118.4 mg/ml; Prot: 31 mg/ml; A.A: 19 mg/ml; 炭水化物: 4.1 mg/ml)。mgの活性乾燥重量/mLでのNOx生成、0.02 mg/mL (C1)、0.2 mg/mL (C2)及び2.0 mg/mL (C3): C1: 5.8μM、C2: 12.1μM、C3: 2.8μM。
STPN 7978 実施例2.30
実施例1.5によるバイオマスを、12.5 g/Lに希釈した。0.1 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて10日間インキュベートした。(SDW: 18.4 mg/ml; Prot: ＜0.2 mg/ml; A.A: 2 mg/ml; 炭水化物: 0.5 mg/ml)。
STPN 7465 実施例2.31
実施例1.5によるバイオマスを、52.5 g/Lに希釈した。0.25 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。(SDW: 69.4 mg/ml; Prot: 32.3 mg/ml; A.A: 6.0 mg/ml; 炭水化物: 1.7 mg/ml)。
【００７９】
STPN 7466 実施例2.32
実施例1.5によるバイオマスを、40.0 g/Lに希釈した。0.25 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。(SDW: 60.6 mg/ml; Prot: 29.0 mg/ml; A.A: 6.0 mg/ml; 炭水化物: 1.50 mg/ml)。
STPN 10319 実施例2.33
実施例1.5によるバイオマスを、41.2 g/Lに希釈した。0.25 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。(SDW: 60.4 mg/ml; Prot: 28.4 mg/ml; A.A: 6.0 mg/ml; 炭水化物 1.1 mg/ml)。
【００８０】
STSA 046 実施例2.34
実施例1.5によるバイオマスを、58.9 g/Lに希釈した。0.25 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。(SDW: 83.2 mg/ml; Prot: 7.2 mg/ml; A.A: 8.39 mg/ml; 炭水化物: 2.16 mg/ml)。
STSA 047 実施例2.35
実施例1.5によるバイオマスを、50.4 g/Lに希釈した。0.25 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。(SDW: 60.64 mg/ml; Prot: 27.92 mg/ml; A.A: 7.2 mg/ml; 炭水化物: 3.52 mg/ml)。
STSA 048 実施例2.36
実施例1.5によるバイオマスを、66.2 g/Lに希釈した。0.25 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。(SDW: 72.96 mg/ml; Prot: 36.16 mg/ml; A.A: 7.2 mg/ml; 炭水化物: 3.28 mg/ml)。
【００８１】
NECA I045 実施例2.37
実施例1.4からのNeCa I045の223 gの細菌性物質を含有する1つの部分標本を、室温にて融解し、塩溶液(8 g/L NaCl)で22.8 g/Lに達するまで希釈した。0.2 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて192時間インキュベートした。溶解の間、pHは、0.5 pH単位を超えて減少しないように監視した。(SDW: 41.29 mg/mL; Prot: 17.45 mg/mL; A.A.: 3.41 mg/mL; 炭水化物: 3.4 mg/mL)。mgの活性乾燥重量/mLでのNOx生成、0.02 mg/mL (C1)、0.2 mg/mL (C2)及び2.0 mg/mL (C3): C1: 4.2μM、C2: 14.8μM、C3: 13.4μM。
【００８２】
NECA I045 実施例2.38
実施例1.4によるバイオマスを、20.5 g/Lに希釈した。0.2 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて3日間インキュベートした。(SDW: 36.6 mg/ml; Prot: 16.4 mg/ml; A.A: 3.63 mg/ml; 炭水化物: 0.77 mg/ml)。
NECA I045 実施例2.39
実施例1.4によるバイオマスを、51.0 g/Lに希釈した。0.7 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて2日間インキュベートした。(SDW: 75.69 mg/ml; Prot: 30.8 mg/ml; A.A: 10.8 mg/ml; 炭水化物: 1.14 mg/ml)。D-アミノ酸パーセンテージ: 40 % D-Ala、45 % D-Asx、42 % D- Met、40 % D-Phe、46 % D-Glx、48 % D-Lys。mgの活性乾燥重量/mLでのNOx生成、0.02 mg/mL (C1)、0.2 mg/mL (C2)及び2.0 mg/mL (C3): C1: 4.9μM、C2: 14.3μM、C3: 3.6μM。
【００８３】
NECA I045 実施例2.40
実施例1.4によるバイオマスを、13 g/Lに希釈した。0.1 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて2日間インキュベートした。(SDW: 15.08 mg/ml; Prot: 7.7 mg/ml; A.A: 1.5 mg/ml; 炭水化物: 0.28 mg/ml)。D-アミノ酸パーセンテージ: 21 % D-Ala、67 % D-Ser、31 % D-Asx、25 % D- Met、12 % D-Lys。
NECA I045 実施例2.41
実施例1.4によるバイオマスを、51.0 g/Lに希釈した。0.1 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。(SDW: 41.23 mg/ml; Prot: 26.2 mg/ml; A.A: 4.6 mg/ml; 炭水化物: 0.98 mg/ml)。
NECA I045 実施例2.42
実施例1.4によるバイオマスを、13 g/Lに希釈した。0.7 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。(SDW: 48.43 mg/ml; Prot: 7.7 mg/ml; A.A: 4.3 mg/ml; 炭水化物: 0.22 mg/ml)。
【００８４】
NECA I045 実施例2.43
実施例1.4によるバイオマスを、51.0 g/Lに希釈した。0.7 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて10日間インキュベートした。(SDW: 83.02 mg/ml; Prot: 28.9 mg/ml; A.A: 15 mg/ml; 炭水化物: 1.11 mg/ml)。D-アミノ酸パーセンテージ: 44 % D-Ala、48 % D-Ser、47 % D-Asx、45 % D- Met、43 % D-Phe、50 % D-Glx。mgの活性乾燥重量/mLでのNOx生成、0.02 mg/mL (C1)、0.2 mg/mL (C2)及び2.0 mg/mL (C3): C1: 5.1μM、C2: 12.0μM、C3: 7.5μM。
【００８５】
NECA I045 実施例2.44
実施例1.4によるバイオマスを、13 g/Lに希釈した。0.1 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて10日間インキュベートした。(SDW: 15.26 mg/ml; Prot: 8.6 mg/ml; A.A: 1.8 mg/ml; 炭水化物 0.22 mg/ml)。D-アミノ酸パーセンテージ: 31 % D-Ala、42 % D-Ser、38 % D-Asx、36 % D- Met、35 % D-Phe、37 % D-Glx。mgの活性乾燥重量/mLでのNOx生成、0.02 mg/mL (C1)、0.2 mg/mL (C2)及び2.0 mg/mL (C3) : C1: 4.1μM、C2: 13.9μM、C3: 6.0μM。
NECA I045 実施例2.45
実施例1.4によるバイオマスを、9 g/Lに希釈した。0.066 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。(SDW: 20.62 mg/ml; Prot: 5.57 mg/ml; 炭水化物: 0.06 mg/ml)。
【００８６】
NECA NCTC3622 実施例2.46
実施例1.4によるバイオマスを、20.1 g/Lに希釈した。0.2 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。(SDW: 35.69 mg/ml; Prot: 14.25 mg/ml; A.A: 3.4 mg/ml; 炭水化物: 0.71 mg/ml)。
NECA NCTC3625 実施例2.47
実施例1.4によるバイオマスを、9.7 g/Lに希釈した。0.2 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。(SDW: 38.83 mg/ml; Prot: 15.54 mg/ml; A.A: 3.4 mg/ml; 炭水化物: 0.95 mg/ml)。
【００８７】
KLPN 204 実施例2.48
KlPn 204 実施例1.3の440 gの細菌性物質を含有する1つの部分標本を、室温にて融解し、塩溶液(8 g/L NaCl)で37.7 g/Lに達するまで希釈した。0.2 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて192時間インキュベートした。溶解の間、pHは、0.5 pH単位を超えて減少しないように監視した。(SDW: 51.77 mg/mL; Prot: 27.66 mg/mL; A.A.: 4.2 mg/mL; 炭水化物: 1.03 mg/mL)。mgの活性乾燥重量/mLでのNOx生成、0.02 mg/mL (C1)、0.2 mg/mL (C2)及び2.0 mg/mL (C3) : C1: 0.6μM、C2: 2.8μM、C3: 1.8μM。
【００８８】
KLPN 204 実施例2.49
実施例1.3によるバイオマスを、9 g/Lに希釈した。0.013 N NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。(SDW: 25.71 mg/ml; Prot: 4.91 mg/ml; 炭水化物 0.51 mg/ml)。
KLPN 204 実施例2.50
実施例1.3によるバイオマスを、99 g/Lに希釈した。0.1 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて2日間インキュベートした。(SDW: 50.63 mg/ml; Prot: 15.4 mg/ml; A.A: 2.9 mg/ml; 炭水化物: 2.1 mg/ml)。D-アミノ酸パーセンテージ: 5 % D-Ala、6 % D-Asx。
【００８９】
KLPN 204 実施例2.51
実施例1.3によるバイオマスを、13 g/Lに希釈した。0.7 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて2日間インキュベートした。(SDW: 52.69 mg/ml; Prot: 5.7 mg/ml; A.A: 2.3 mg/ml; 炭水化物: 0.3 mg/ml)。D-アミノ酸パーセンテージ: 36 % D-Ala、8 % D-Ser、45 % D-Asx、7 % D- Met、27 % D-Phe、40 % D-Glx、29 % D- Lys。mgの活性乾燥重量/mLでのNOx生成、0.02 mg/mL (C1)、0.2 mg/mL (C2)及び2.0 mg/mL (C3): C1: 0.5μM、C2: 0.8μM、C3: 6.0μM。
KLPN 204 実施例2.52
実施例1.3によるバイオマスを、99 g/Lに希釈した。0.7 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。(SDW: 136.34 mg/ml; Prot: 58.9 mg/ml; A.A: 20.6 mg/ml; 炭水化物: 3.4 mg/ml)。
KLPN 204 実施例2.53
実施例1.3によるバイオマスを、13 g/Lに希釈した。0.1 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。(SDW: 18.06 mg/ml; Prot: 6.3 mg/ml; A.A: 1.1 mg/ml; 炭水化物: 0.3 mg/ml)。mgの活性乾燥重量/mLでのNOx生成、0.02 mg/mL (C1)、0.2 mg/mL (C2)及び2.0 mg/mL (C3): C1: 0.5μM、C2: 1.6μM、C3: 1.9μM。
【００９０】
KLPN 204 実施例2.54
実施例1.3によるバイオマスを、99 g/Lに希釈した。0.1 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて10日間インキュベートした。(SDW: 58.06 mg/ml; Prot: 20 mg/ml; A.A: 4.6 mg/ml; 炭水化物 2.7 mg/ml)。
KLPN 204 実施例2.55
実施例1.3によるバイオマスを、13 g/Lに希釈した。0.7 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて10日間インキュベートした。(SDW: 52.57 mg/ml; Prot: 5.7 mg/ml; A.A: 4.0 mg/ml; 炭水化物: 0.3 mg/ml)。D-アミノ酸パーセンテージ: 43 % D-Ala、25 % Val、5 % D-Ser、46 % D-Asx、46 % D- Met、45 % D-Phe、44 % D-Glx、38% D-Lys。mgの活性乾燥重量/mLでのNOx生成、0.02 mg/mL (C1)、0.2 mg/mL (C2)及び2.0 mg/mL (C3): C1: 0.5μM、C2: 0.6μM、C3: 2.6μM。
【００９１】
KLPN 5056 実施例2.56
実施例1.3によるバイオマスを、39.4 g/Lに希釈した。0.2 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。(SDW: 52.69 mg/ml; Prot: 27.83 mg/ml; A.A: 4.0 mg/ml; 炭水化物: 1.09 mg/ml)。
KLPN 5050 実施例2.57
実施例1.3によるバイオマスを、34.2 g/Lに希釈した。0.2 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。(SDW: 48.23 mg/ml; Prot: 26.57 mg/ml; A.A: 4.0 mg/ml; 炭水化物: 1.03 mg/ml)。
【００９２】
STAU I051 実施例2.58
375 gの細菌性物質を含有する実施例1.2からのStAu I051の1つの部分標本を、室温にて融解し、塩溶液(8 g/L NaCl)で55.2 g/Lに達するまで希釈した。0.2 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて192時間インキュベートした。溶解の間、pHは、0.5 pH単位を超えて減少しないように監視した。(SDW: 66.4 mg/mL; Prot: 34.08 mg/mL; A.A.: 6.4 mg/mL; 炭水化物: 0.64 mg/mL)。mgの活性乾燥重量/mLでのNOx生成、0.02 mg/mL (C1)、0.2 mg/mL (C2)及び2.0 mg/mL (C3): C1: 0.6μM、C2: 0.8μM、C3: 1.4μM。
【００９３】
STAU I051 実施例2.59
実施例1.2によるバイオマスを、51 g/Lに希釈した。0.2 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて9日間インキュベートした。(SDW: 65.31 mg/ml; Prot: 25.56 mg/ml; A.A: 6.57 mg/ml; 炭水化物: 0.98 mg/ml)。
STAU I051 実施例2.60
実施例1.2によるバイオマスを、81 g/Lに希釈した。0.7 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて2日間インキュベートした。(SDW: 137.2 mg/ml; Prot: 51.2 mg/ml; A.A: 20.8 mg/ml; 炭水化物: 1.6 mg/ml)。D-アミノ酸パーセンテージ: 51 % D-Ala、11 % D-Ser、43 % D-Asx、37 % D- Met、35 % D-Phe、43 % D-Glx。mgの活性乾燥重量/mLでのNOx生成、0.02 mg/mL (C1)、0.2 mg/mL (C2)及び2.0 mg/mL (C3): C1: 0.6μM、C2: 0.8μM、C3: 1.3μM。
STAU I051 実施例2.61
実施例1.2によるバイオマスを、13 g/Lに希釈した。0.7 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。(SDW: 55.7 mg/ml; Prot: 4.8 mg/ml; A.A: 4.8 mg/ml; 炭水化物: 0.2 mg/ml)。
【００９４】
STAU I051 実施例2.62
実施例1.2によるバイオマスを、81 g/Lに希釈した。0.7 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。(SDW: 130.1 mg/ml; Prot: 47.2 mg/ml; A.A: 24.8 mg/ml; 炭水化物: 1.4 mg/ml)。
STAU I051 実施例2.63
実施例1.2によるバイオマスを、13 g/Lに希釈した。0.1 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。(SDW: 18.4 mg/ml; Prot: 4.8 mg/ml; A.A: 2.4 mg/ml; 炭水化物: 0.2 mg/ml)。mgの活性乾燥重量/mLでのNOx生成、0.02 mg/mL (C1)、0.2 mg/mL (C2)及び2.0 mg/mL (C3): C1: 0.5μM、C2: 0.6μM、C3: 1.3μM。
【００９５】
STAU I051 実施例2.64
実施例1.2によるバイオマスを、81 g/Lに希釈した。0.7 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて10日間インキュベートした。(SDW: 134.6 mg/ml; Prot: 48 mg/ml; A.A: 25.6 mg/ml; 炭水化物: 1.5 mg/ml)。D-アミノ酸パーセンテージ: 56 % D-Ala、10 % D-Ser、45 % D-Asx、42 % D- Met、39 % D-Phe、73% D-Tyr、49 % D-Glx。mgの活性乾燥重量/mLでのNOx生成、0.02 mg/mL (C1)、0.2 mg/mL (C2)及び2.0 mg/mL (C3): C1: 0.6μM、C2: 0.7μM、C3: 1.1μM。
STAU I051 実施例2.65
実施例1.2によるバイオマスを、13 g/Lに希釈した。0.1 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて10日間インキュベートした。(SDW: 17.9 mg/ml; Prot: 5.6 mg/ml; A.A: 2.4 mg/ml; 炭水化物: 0.2 mg/ml)。mgの活性乾燥重量/mLでのNOx生成、0.02 mg/mL (C1)、0.2 mg/mL (C2)及び2.0 mg/mL (C3): C1: 0.5μM、C2: 0.6μM、C3: 3.7μM。
STAU I049 実施例2.66
実施例1.2によるバイオマスを、52.8 g/Lに希釈した。0.2 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。(SDW: 70.08 mg/ml; Prot: 34.4 mg/ml; A.A: 6.4 mg/ml; 炭水化物: 0.64 mg/ml)。
【００９６】
STAU I050 実施例2.67
実施例1.2によるバイオマスを、47.5 g/Lに希釈した。0.2 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。(SDW: 64.32 mg/ml; Prot: 32.24 mg/ml; A.A: 6.4 mg/ml; 炭水化物: 0.64 mg/ml)。
STAU I050 実施例2.68
実施例1.2によるバイオマスを、48.5 g/Lに希釈した。0.033 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。
STAU I052 実施例2.69
実施例1.2によるバイオマスを、56.9 g/Lに希釈した。0.2 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。(SDW: 62.72 mg/ml; Prot: 30.8 mg/ml; A.A: 6.4 mg/ml; 炭水化物: 0.72 mg/ml)。
STAU I053 実施例2.70
実施例1.2によるバイオマスを、67.3 g/Lに希釈した。0.2 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。(SDW: 68.8 mg/ml; Prot: 32.24 mg/ml; A.A: 6.4 mg/ml; 炭水化物: 1.2 mg/ml)。
STAU I050 実施例2.71
実施例1.2によるバイオマスを、63.6 g/Lに希釈した。0.2 M NaOHでのアルカリ化を行った。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて8日間インキュベートした。(SDW: 68.96 mg/ml; Prot: 24.56 mg/ml; A.A: 6.4 mg/ml; 炭水化物: 2.56 mg/ml)。
【００９７】
実施例3：溶解物の精製
実施例3.1：グラム陰性及びグラム陽性株の澄明にした抽出物
2 Lの実施例2.57及び2 Lの実施例2.66を一緒に混合し、pHを、濃HClの添加により12.0に調整し、混合物を2 Lの8 g/L NaCl溶液で希釈した。希釈混合物を、微細ろ過(MF)タンクに移した。微細ろ過ユニットは、0.45ミクロンのタンジェンシャルフローろ過フィルタ(PALL Procette PES 0.45ミクロン)を蛇行モードで用いた(図1を参照)。クロスフローは、2000 L/h m2 (LHM)及び1.3バールのトランスメンブレン圧力(TMP)に調整した。微細ろ過透過物を、限外ろ過(UF)タンクに移した。
【００９８】
微細ろ過タンク内の混合物の容量が、最初の容量の半分に一旦達すると、UFユニットを開始した。限外ろ過ユニットは、30 kDaのタンジェンシャルフローろ過フィルタ(PALL Centrasette PES 30kD)を用いた。クロスフローは、1000 LHM及び0.5バールのTMPに調整した。
【００９９】
MF及びUFタンク内の容量は、同じレベルに維持した。それぞれのダイアフィルトレーション容量にて、タンパク質濃度を、Bradford法により測定した。[Bradford法は、当該技術において標準的である。この方法を行う異なる様式が著しく異なる結果を与えない限り、参考文献を引用する必要がない]。UFタンクにおいて、Bradfordタンパク質含量は、1ダイアフィルトレーション容量(DFV)の後に26.8 mg/mL、4 DFVの後に34.8 mg/mL、及び9 DFVの後に37.2 mg/mLであった。ダイアフィルトレーションの間の微細ろ過の透過物フラックスは、15 LHMであった。14ダイアフィルトレーション容量の後にUFを停止し、生成物をMFタンク内で濃縮した。生成物は、15.9 mg/mLのタンパク質を含有した。次いで、生成物を、7.4 mg/mLまで希釈し、0.2ミクロンの滅菌フィルタを通してろ過した。(可溶化乾燥残渣(SDR): 21.0 mg/mL、Prot: 7.4 mg/mL、A.A.: 1.2 mg/mL、糖質(炭水化物): 0.3 mg/mL、塩化物: 4.6 mg/ml)。Lowryタンパク質mg/mLのmgでのNOx生成、0.03 mg/mL (C1)、0.3 mg/mL (C2)及び3.0 mg/mL (C3): C1: 5.8μM、C2: 11.4μM、C3: 1.2μM。
【０１００】
実施例3.2：Klba単一株
4 kgの実施例2.57をpH 12.0に調整し、4 Lの8 g/L NaCl溶液で希釈した。希釈した溶解物を、微細ろ過タンクに移した。
微細ろ過パラメーターは、クロスフロー2000 LHM、TMP 1.3バール、カットオフ: 0.45μmであった。限外ろ過パラメーターは、クロスフロー1000 LHM、TMP 0.5バール、カットオフ: 30 kDa、ダイアフィルトレーション容量の数: 8であった。
【０１０１】
生成物を7.0 mg/mLに希釈し、0.2ミクロン滅菌フィルタを通してろ過した。(SDR: 18.0 mg/mL、Prot: 7.0 mg/mL、A.A.: 0.8 mg/mL、炭水化物: 0.3 mg/mL)。Lowryタンパク質mg/mLのmgでのNOx生成、0.03 mg/mL (C1)、0.3 mg/mL (C2)及び3.0 mg/mL (C3): C1: 5.2μM、C2: 9.8μM、C3: 1.1μM。
【０１０２】
実施例3.3：モラクセラ単一株
2 kgの実施例2.37をpH 10.7に調整し、3 Lの8 g/L NaCl溶液で希釈した。希釈された溶解物を、微細ろ過タンクに移した。
微細ろ過パラメーターは、クロスフロー2000 LHM、TMP 1.3バール、カットオフ: 0.45μmであった。限外ろ過パラメーターは、クロスフロー1000 LHM、TMP 0.5 bar、カットオフ: 30 kDa、ダイアフィルトレーション容量の数: 8であった。
生成物を7.0 mg/mLに希釈し、0.2ミクロン滅菌フィルタを通してろ過した。(SDR: 19.4 mg/mL、Prot: 6.8 mg/mL)。
【０１０３】
実施例3.4：ニューモニエ単一株
5.0 kgの実施例2.32をpH 12.27に調整し、5.0リットルの8 g/L NaCl溶液で希釈した。希釈された溶解物を、微細ろ過タンクに移した。
微細ろ過パラメーターは、クロスフロー2000 LHM、TMP 1.3バール、カットオフ: 0.45μmであった。限外ろ過パラメーターは、クロスフロー1000 LHM、TMP 0.5バール、カットオフ: 30 kDa、ダイアフィルトレーション容量の数: 8であった。
生成物を7.0 mg/mLに希釈し、0.2ミクロン滅菌フィルタを通してろ過した。(SDR: 23.3 mg/mL、Prot: 4.3 mg/ml)。
【０１０４】
実施例3.5
500 mlの実施例2.45、500 mlの実施例2.47及び500 mlの実施例2.37を混合し、9000×gにて遠心分離する。上清を、0.8μm、0.45μm及び0.2μmの孔径のフィルタに連続的に通してろ過する。pHを、HClを用いて10.5に調整する。
【０１０５】
実施例3.6
300 mlの実施例2.23の溶解物、300 mlの実施例2.31、300 mlの実施例2.32、及び300 mlの実施例2.33を混合し、9000×gにて30分間遠心分離した。上清を、0.8μm、0.45μm及び0.2μmの孔径のフィルタに連続的に通してろ過した。pHを、HClを用いて10.5に調整した。分析結果: (SDR: 63.60 mg/mL、Prot: 23.00 mg/mL、A.A.: 6.00 mg/mL、炭水化物: 1.60 mg/ml)。
【０１０６】
実施例3.7
300 mlの実施例2.48、300 mlの実施例2.56、及び300 mlの実施例2.57を混合し、9000×gにて遠心分離した。上清を、0.8μm、0.45μm及び0.2μmの孔径のフィルタに連続的に通してろ過した。pHを、HClを用いて10.5に調整した。(SDR: 50.40 mg/mL、Prot: 22.30 mg/mL、A.A.: 4.0 mg/mL、炭水化物: 0.97 mg/ml)。mgの可溶化乾燥重量/mLでのNOx生成、0.01 mg/mL (C1)、0.1 mg/mL (C2)及び1.0 mg/mL (C3): C1: 1.06μM、C2: 3.19μM、C3: 7.62μM。
【０１０７】
実施例3.8:
200 mlの実施例2.58、200 mlの実施例2.66、200 mlの実施例2.67、200 mlの実施例2.69、200 mlの実施例2.70及び200 mlの実施例2.71を混合し、9000×gにて遠心分離した。上清を、0.8μm、0.45μm及び0.2μmの孔径のフィルタに連続的に通してろ過した。pHを、HClを用いて10.5に調整した。(SDR: 65.12 mg/mL、Prot: 24.80 mg/mL、A.A.: 7.2mg/mL、炭水化物: 1.12 mg/ml)。mgの可溶化乾燥重量/mLでのNOx生成、0.01 mg/mL (C1)、0.1 mg/mL (C2)及び1.0 mg/mL (C3): C1: 0.76μM、C2: 1.16μM、C3: 3.79μM。
【０１０８】
実施例3.9:
500 mlの実施例2.46、500 mlの実施例2.47及び500 mlの実施例2.37を混合し、9000×gにて遠心分離した。上清を、0.8μm、0.45μm及び0.2μmの孔径のフィルタに連続的に通してろ過した。pHを、HClを用いて10.5に調整した。(SDR: 38.15 mg/mL、Prot: 13.5 mg/mL、A.A.: 3.4 mg/mL、炭水化物: 0.80 mg/ml)。mgの可溶化乾燥重量/mLでのNOx生成、0.01 mg/mL (C1)、0.1 mg/mL (C2)及び1.0 mg/mL (C3): C1: 2.25μM、C2: 5.25μM、C3: 14.21μM。
【０１０９】
実施例3.10
500 mlの実施例2.34、500 mlの実施例2.35、500 mlの実施例2.36及び500 mlの実施例2.10を混合し、9000×gにて遠心分離した。上清を、0.8μm、0.45μm及び0.2μmの孔径のフィルタに連続的に通してろ過した。pHを、HClを用いて10.5に調整した。(SDR: 69.6 mg/mL、Prot: 28.00 mg/mL、A.A.: 7.2 mg/mL、炭水化物: 2.48 mg/ml)。mgの可溶化乾燥重量/mLでのNOx生成、0.01 mg/mL (C1)、0.1 mg/mL (C2)及び1.0 mg/mL (C3): C1: 0.95μM、C2: 1.21μM、C3: 4.44μM。
【０１１０】
実施例3.11
10 mlの実施例2.61の溶解物及び10 mlの実施例2.27を、別々に9000×gにて遠心分離した。上清を、0.8μm、0.45μm及び0.2μmの孔径のフィルタに連続的に通してろ過した。それぞれの上清3mLを混合した。pHを、HClを用いて7.2に調整した。mgの可溶化乾燥重量/mLでのNOx生成、0.01 mg/mL (C1)、0.1 mg/mL (C2)及び1.0 mg/mL (C3): C1: 0.34μM、C2: 0.66μM、C3: 1.33μM。
【０１１１】
実施例3.12
10 mlの実施例2.58及び10 mlの実施例2.61を、別々に9000×gにて遠心分離した。上清を、0.8μm、0.45μm及び0.2μmの孔径のフィルタに連続的に通してろ過した。それぞれの上清3mLを一緒に混合した。pHを、HClを用いて7.6に調整した。mgの可溶化乾燥重量/mLでのNOx生成、0.01 mg/mL (C1)、0.1 mg/mL (C2)及び1.0 mg/mL (C3): C1: 0.40μM、C2: 0.44μM、C3: 0.71μM。
【０１１２】
実施例3.13
10 mlの実施例2.9及び10 mlの実施例2.8を、別々に9000×gにて遠心分離した。上清を、0.8μm、0.45μm及び0.2μmの孔径のフィルタに連続的に通してろ過した。1.5mLの第1の上清(実施例2.9)を、4.5 mLの第2の上清(実施例2.8)と混合した。pHを、HClを用いて7.2に調整した。mgの可溶化乾燥重量/mLでのNOx生成、0.01 mg/mL (C1)、0.1 mg/mL (C2)及び1.0 mg/mL (C3): C1: 8.7μM、C2: 16.90μM、C3: 21.1μM。
【０１１３】
実施例3.14
10 mlの実施例2.2及び10 mlの実施例2.8を、を、別々に9000×gにて遠心分離した。上清を、0.8μm、0.45μm及び0.2μmの孔径のフィルタに連続的に通してろ過した。それぞれの上清3mLを一緒に混合した。pHを、HClを用いて7.5に調整した。mgの可溶化乾燥重量/mLでのNOx生成、0.01 mg/mL (C1)、0.1 mg/mL (C2)及び1.0 mg/mL (C3): C1: 9.2μM、C2: 11.3μM、C3: 17.2μM。
【０１１４】
実施例3.15
13.2 Lの実施例2.2からの溶解物、48.6 Lの実施例3.9からの混合溶解物、36.6 Lの実施例3.7からの混合溶解物、36 Lの実施例3.8からの混合溶解物、14.4 Lの実施例3.6、及び18.4 Lの実施例3.10を一緒に混合し、8g/L NaCl溶液を用いて334.4 Lに希釈した。溶液を、実施例3.1に記載されるようにして、微細ろ過及び限外ろ過の二重のループシステム内でタンジェンシャルフローろ過により精製した。(SDW: 21.0 mg/ml; Prot: 6.4 mg/ml; A.A: 1.9 mg/ml; 炭水化物 0.45 mg/ml)。D-アミノ酸パーセンテージ: 42 % D-Ala、12 % Leu、53% D-Ser、37 % D-Asx、35 % D-Met、32 % D-Phe、28 % D-Glx、8 % D-Tyr、16 % Lys。Lowryタンパク質mg/mLのmgでのNOx生成、0.03 mg/mL (C1)、0.3 mg/mL (C2)及び3.0 mg/mL (C3): C1: 9.3μM、C2: 14.3μM、C3: 11.5μM。
【０１１５】
実施例4：より低いpH条件での細菌溶解の比較例
実施例4は、本発明の範囲外のアルカリ条件で行った方法を示す。細菌の溶解を行うために用いたNaOH濃度は、0.1%未満であり、より低いpHの値を導いた。
以下の溶解物を混合した：1.18 kgの実施例2.24、3.0 kgの実施例2.49、2.95 kgの実施例2.69、1.08 Kgの実施例2.4、1.51 kgの実施例2.11、及び3.98 kgの実施例2.45。6キログラムの混合物を、NaCl溶液8 g/Lを用いて12 kgに希釈し、pHをpH 12.0に調整した。微細ろ過パラメーターは、クロスフロー2000 LHM、TMP 1.3バール、カットオフ: 0.45μmであった。限外ろ過パラメーターは、クロスフロー1000 LHM、TMP 0.5バール、カットオフ: 30 kDa、ダイアフィルトレーション容量の数: 12であった。(SDR: 19.4 mg/ml、Prot: 3.1 mg/ml、A.A.:  2.0 mg/ml、炭水化物: 0.1 mg/ml、LAL: 20140 EU/ml)。mgの活性乾燥重量/mLでのNOx生成、0.03 mg/mL (C1)、0.3 mg/mL (C2)及び3.0 mg/mL (C3): C1: 9.3μM C2: 14.3μM C3: 11.5μM。
【０１１６】
実施例5：ラクトバチルス・ヘルヴェティカス(Lactobaccilus helveticus)の溶解
植物性培地での発酵により得られたラクトバチルス・ヘルヴェティカスの細菌バイオマスの部分標本を室温にて融解し、精製水で80 g/Lの乾燥濃度に達するまで希釈する。0.2 M NaOHでのアルカリ化を行う。溶解は、連続撹拌下で、35〜40℃にて2日間インキュベートする。溶解の間に、溶解の間、pHは、0.5 pH単位を超えて減少しないように監視した。
【０１１７】
実施例6：マウスでのエアゾールインフルエンザウイルス感染に対する免疫防御
この実験は、本発明のいくつかの実施形態の非特異的免疫活性を、ウイルス、すなわちH1N1に対するそれらの効力を評価することにより調べることを目的とした。6週齢の雌性BALB/cマウスをBundesinstitut fur Risikobewertung、Berlinから購入し、全ての実験について用いた。動物を、22℃の周囲温度及び60±5%の相対湿度の通常条件下で維持した。光条件は、12：12時間の明暗サイクルに設定した。動物に、ペレットの標準食餌(Altromin 1314、Altromin、Lage、Germany)を供給し、水道水を自由に与えた。
【０１１８】
前処置
合計で60匹のマウスを、それぞれ20匹の3群に分け、2つは処置群で、1つは対照群であった。動物(2群)を、マウスあたり1 mg又は10 mgで1日1回10日間連続、又はPBS対照(1群)で前処置した。前処置の最後に、全てのマウスに、マウス適合A/PR/8/34 (H1N1)インフルエンザウイルスのエアゾールを与えた。この株を用いたマウスのLD50は、通常、鼻腔内で10-4.5及びエアゾール経路で10-1.7である。これらの実験における攻撃感染に用いた用量は、明確なインフルエンザウイルス感染の徴候を引き起こすことができるが、100%の致死率はもたらさない希釈を提供するように選択した。
【０１１９】
死亡率は、10匹のマウスの群において10日間毎日観察した。図3に示す結果は、この実験の投与条件下での10 mg/マウスの用量の抽出物は、再感染に対して完全な防御を与えることができたことを示す。対照的に、対照マウスの70%しか、インフルエンザウイルス感染から生存できなかった。1 mg/マウスの薬物を投与された群の生存率は70%であった。
【０１２０】
インフルエンザウイルス感染後の処置マウスで観察される臨床症状
10匹のマウスの群のそれぞれを、インフルエンザウイルス感染の臨床症状について毎日観察した。臨床症状スコアは、以下の表に示す。10 mgの用量の抽出物を投与された動物は、2日後に穏やかな臨床症状を示し、対照群のマウスより早期に明らかに健康であった。このことは、より高い用量の有益な効果を示す。1 mg用量で処置された群と対照との間に臨床スコアの有意差はなかった。
【０１２１】
【表１】
0005693010.tif 000002
【０１２２】
血清を、1回目及び2回目の感染の後の群あたり3匹のマウスから、インフルエンザウイルス攻撃後10日目に採取した。免疫されたマウスから得た血清を、-20℃にて貯蔵した。全ての血清を、受容体破壊性酵素で前処理して、非特異的阻害物質を除去した。インフルエンザ血球凝集阻害(HI)試験を、世界保健機関(WHO、2002)により推奨される標準的手順を用いて、0.5%ニワトリ赤血球及び4血球凝集単位を用いてマイクロタイタープレートで行った。インフルエンザ A/PR/8/34 (H1N1)ウイルスに対する幾何平均HI抗体力価を示す結果を、以下の表に示す。1回目の感染後に、処置群と対照との間に有意差はなかった。
【０１２３】
【表２】
0005693010.tif 000003
【０１２４】
よって、マウスに、2回目(ブースター)の攻撃感染を、1回目(1次)の感染の21日後に、A/PR/8/34インフルエンザウイルスを用いて行った。抗体力価の大きさは、上記のようなA/PR/8/34 (H1N1)ウイルスでの攻撃後に増加させた。より高いレベルのHI抗体力価が、10 mg/マウス用量のOM-85 BVで観察された。対照的に、1 mg/マウス用量は、10 mg/マウスの用量の薬物よりも抗体力価が低かった。
【０１２５】
検出された肺ウイルスは、処置群と対照との間に有意差はなかった。それにもかかわらず、本発明による抽出物を10 mgの用量で投与された動物におけるマウス病原性インフルエンザA/PR/8/34ウイルスでのエアゾール感染の後の臨床症状は、対象よりも少なくとも丸1日遅く生じ、実験群は、対照マウスよりも明らかに早期に回復した。しかし、1 mg用量で処置された群と対照との間に臨床スコアの有意差はなく、抽出物の効果が用量依存的であることを示唆する。1回目の感染の3日後に、処置群と対照との間に、インフルエンザ血球凝集阻害抗体レベルの有意差はなかった。しかし、1回目の感染の3週間後のA/PR/8/34インフルエンザウイルスでの2回目の感染により、10 mg/マウス用量群で、より高い有意な大きさの抗体誘導が観察された。
【０１２６】
本実施例は、マウスあたり10 mgの投与量での本発明による抽出物が、複数のパラメーターにより決定されたように、マウス病原性エアゾールインフルエンザA/PR/8/34 (H1N1)ウイルス感染に対する防御を付与できたことを示す。本発明の実施形態は、よって、ウイルスに対する免疫応答をインビボで活性化し得る。いくつかの実施形態においては、本実施例で試験された抽出物のように、抽出物は病原性細菌のみから製造されるので、このことは、本発明の実施形態が、先天免疫系を活性化し得ることを示唆する。
【０１２７】
実施例7：マウス酸化窒素試験での本発明の実施形態の活性
6週齢雄性C57/BL6マウス(6週齢雄性、SPFクオリティ、Charles Rivier、FR)を、CO2吸入により屠殺した。股関節部、大腿骨及び後肢からの脛骨を回収した。骨髄を内腔から、骨の末端部分を切断後に骨にダルベッコ改変イーグル培地(DH)を注入することにより抽出した。洗浄後に、20%ウマ血清及び30% L929細胞上清を補ったDH培地中に幹細胞を再懸濁した(40,000細胞/mL)。細胞懸濁物を、8日間、37℃のインキュベーター中で8% CO2及び飽和水分雰囲気下でインキュベートした。マクロファージを、次いで、氷冷PBSを用いてはがし、5%ウシ胎児血清(FCS)、アミノ酸及び抗生物質を補ったDH培地(DHE培地)で洗浄して再懸濁した。細胞密度を、700000細胞/mLに調整した。生成物の水溶液を、マイクロタイタープレート内で直接、DHE培地中で系列希釈した。生成物は、3重に試験し、各マイクロタイタープレートは、培地で構成される陰性対照を含んだ。各ウェル中の最終容量は、100μLであった。100μLの細胞懸濁物を、希釈した生成物に加え、細胞を、22時間、37℃のインキュベーター中で、8% CO2及び飽和水分雰囲気下でインキュベートした。インキュベーション期間の最後に、100μLの上清を別のマイクロタイタープレートに移し、各上清中で生成された亜硝酸塩を、グリエス(Griess)反応を行うことにより決定した。2.5%リン酸水溶液中の100μLのグリエス試薬(5 mg/mLのスルファニルアミド+ 0.5 mg/mLのN-(1-ナフチル)エチレン-ジアミン塩酸塩)を、各ウェルに加えた。マイクロタイタープレートを、分光光度計(SpectraMax Plus、Molecular Devices)で、562 nmにて、690 nmの参照に対して読み取った。亜硝酸塩濃度は、形成された酸化窒素含量に比例した。亜硝酸塩含量を、標準曲線に基づいて決定した。結果を、μM酸化窒素(NO)で、平均値±標準偏差として得て、用量応答曲線としてプロットした(図4〜7を参照)。
【０１２８】
実施例8：リムルス変形細胞分解色素産生(LAL)試験
エンドトキシン様分子の存在を決定するために、LAL試験を、Bio-Whittakerの色素産生性のLALキットを用いて行った。
この試験は、LALに存在する酵素カスケードによるリポ多糖(LPS)又は同等の構造の生成物による活性化に基づく。この酵素活性化は、ペプチドに連結された色原体のプロテアーゼによる分解により示される。酵素反応は、37℃にて行い、経時的な色原体の形成を、405 nmにて測定する。0.2単位のD.O.に到達するために必要な時間を記録し、エンドトキシン活性を、LPS標準(標準曲線)との関係で算出する。
【０１２９】
本発明の抽出物に対するこのような実施例実験の結果を、以下の表に、EU (エンドトキシン単位)で、大腸菌LPSの標準調製物との関係で表す(1 EUは、0.09 ng LPS等量に相当する)。
【０１３０】
【表３】
0005693010.tif 000004
【０１３１】
実施例9：ヒスタミン分泌の阻害
肥満細胞脱顆粒のインビトロラットモデル(CRO CEREPにより提案、カタログ番号2006: 771-c、ref Hakanson R、Ronnberg AL、Sjolund K. Anal Biochem、1972 Jun 47(2):356〜70)を用いて、本発明の実施形態(21種の細菌株を含む)が化合物48/80に刺激された肥満細胞によるヒスタミン分泌を阻害する様式を調べた。プロトコル及び実験条件は、以下の表に簡単にまとめる。
【０１３２】
【表４】
0005693010.tif 000005
【０１３３】
結果の分析及び表現
結果は、試験化合物の存在下で得られた、対照の比活性のパーセントとして表す：(測定された比活性/対照比活性)×100。IC50値(対照比活性の最大阻害の半分を引き起こす濃度)を、Hill等式曲線フィッティング(Y = D + [(A − D)/(1 + (C/C50)nH)] (式中、Y = 比活性、D = 最小比活性、A = 最大比活性、C = 化合物濃度、C50 = IC50、及びnH = 勾配係数)を用いて、反復実験平均値を用いて作製した阻害曲線の非線形回帰解析により決定した。この解析は、Cerep (Hillソフトウェア)で開発されたソフトウェアを用いて行い、市販のソフトウェアSigmaPlot (登録商標) 4.0 for Windows (登録商標) ((C) 1997 by SPSS Inc.)により作成したデータとの比較により確認した。
【０１３４】
各実験において、アッセイの適合性を評価するために、参照を、試験抽出物と同時に試験した。いくつかの濃度を試験し(IC50値の決定のため)、データを、Cerepにて決定した今までの(historical)値と比較した。アッセイは、対応する標準処理手順に従って、適合性基準に適合すれば有効であるとみなした。試験抽出物及び参照(2回測定)について決定されたIC50値を、以下の表に示す。参照についてのIC50値は、今までの平均±0.5 log単位の許容限界内であった。
試験抽出物を用いて得られた対応する阻害曲線を、図8に示す。
【０１３５】
【表５】
0005693010.tif 000006
【０１３６】
結果は、試験された抽出物が、化合物48/80により刺激された肥満細胞により誘導されるヒスタミン分泌の有効な阻害剤であることを示す。
【０１３７】
実施例10：マウスのLPS非感受性株での大腸菌感染モデルにおける本発明の実施形態の効果
本発明による実施形態を、大腸菌感染の承認されたインビボモデルにおいて試験した(Hopkinsら、Inheritance of susceptibility to induced Escherichia coli bladder and kidney infections in female C3H/HeJ mice.、J Infect Dis. 2003 Feb 1;187(3):418〜23を参照)。C3H/HeJマウスは、toll様受容体遺伝子(TLR4)に変異を有し、LPSのようなTLR4アゴニストに非感受性である。よって、このモデルは、TLR4以外の経路により作用する薬剤の効果を検出するのに適する。
【０１３８】
10〜12週齢雌性C3H/HeJマウスの1群(8匹のマウス)を、実施例3.15と同様の抽出物で、10日間経口的に処理した後に、大腸菌に感染させた。
動物は、18〜26℃の周囲温度及び30〜70%の相対湿度での通常条件下で維持した。光条件は、12:12時間の明暗サイクルに設定した。
動物に、Harlan Sprague Dawley (Indianapolis、IN)実験室から提供される標準食餌を供給した。水道水は、本明細書で特に記載しない限りは、自由に摂取させた。
処置動物は、抽出物の投与あたり動物あたりに凍結乾燥物143 mg (すなわち25 mg (17.5%)の細菌抽出物及び118 mg (82.5%)の賦形剤)を経口投与された。
【０１３９】
接種
腎臓の逆流関連接種の可能性を低減し、全ての接種された動物に感染を誘導する最小接種プロトコルに従って、マウスに、PBS又は尿路疾患性大腸菌を、膀胱内で接種した。熱性UTIの女性の尿から単離された大腸菌1677株を、これらの実験に用いた。接種物を調製するために、細菌を、凍結ストックから、トリプトースブロス(Difco Laboratories)中で2継代により成長させ、PBSで洗浄し、2×1010細菌/mLの濃度に再懸濁した。マウスは、1時間水を与えず、接種の直前に、尿を膀胱から除去した。10マイクロリットルの細菌接種物を、イソフルラン麻酔の下で尿道カテーテルにより膀胱に注入し、マウスあたり2×108の大腸菌の用量をもたらした。動物を麻酔から回復させ、水を1時間後に与え出した。
【０１４０】
マウスを、接種の10日後に屠殺し、膀胱及び腎臓感染の強さを評価した。各動物の膀胱及び両方の腎臓を回収し、秤量し、滅菌PBS中でホモジナイズし、その後、ホモジネートをLevineのエオシン-メチレンブルーアガー(Difco Laboratories)上に系列的に置いた。各プレート上の大腸菌コロニーの数を、37℃の一晩のインキュベーションの後に計数し、各膀胱又は腎臓の対の中の細菌の総数を算出するのに用いた。
フィッシャーの保護(protected)最小有意差検定を用いて、マウスの異なる群(PBS、未処置感染群、及び処置感染群)の間での平均合計コロニー形成単位(CFU)の値の統計的な有意差を決定した。膀胱及び腎臓の感染データを、合計CFU = log10 [(CFU + 100)/mg組織](式中、CFUは組織試料あたりで算出されたコロニー形成単位の合計数である)を用いて変換した。
【０１４１】
得られた結果を、膀胱及び腎臓についてそれぞれ図9a及び9bに示す。マウスを、接種の10日後に屠殺し、膀胱及び腎臓感染の強さを評価した。各動物の膀胱及び両方の腎臓を回収し、秤量し、滅菌PBS中でホモジナイズし、その後、ホモジネートをLevineのエオシン-メチレンブルーアガー(Difco Laboratories)上に系列的に置いた。各プレート上の大腸菌コロニーの数を、37℃の一晩のインキュベーションの後及び100 CFUの添加の後に計数して、結果を得て、膀胱又は腎臓についての細菌の平均合計数+/- SEMを算出するために、それぞれの場合で得られた合計を、組織のmgで除した(すなわち、合計CFU = log10 [(CFU + 100)/mg組織]。細菌抽出物は、＞3(膀胱)及び＞2(腎臓)の係数で、得られた対数値が減少し、膀胱及び腎臓から培養されたコロニーの数が、それぞれ少なくとも1000及び100の係数で減少したことを示唆する。これらの結果は、本発明の実施形態の免疫活性を示す。
【０１４２】
実施例11：C57/blマウスでの腹腔内サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurim)感染のマウスモデルにおける本発明の実施形態の効果
本発明の実施形態を、腹腔内サルモネラ・チフィムリウム感染のマウスモデルでも試験した。C57BL/6マウスを、経口処置の前に7日間維持した。処置動物は、投与あたり、動物あたりに85 mgの凍結乾燥物(すなわち15 mg (17.5%)の細菌抽出物及び70 mg (82.5%)の賦形剤)を投与された。実験は、実施例3.15と同様の抽出物で処置される20匹のマウスの1つの実験群と、水対照物で処置される20匹のマウスの対照群とからなった。処置のために、抽出物を、0.5 mlの最終容量中に単回容量を有するように、蒸留水に毎日溶解した。この0.5 mlの容量を、それぞれのマウスに、1日1回、10日間連続で経口的に与えた後に、全てのマウスをサルモネラ・チフィムリウム415株(I. Mechnokov Institute for Vaccines and Sera、Russian Academy of Medical Sciences)で腹腔内攻撃した。
【０１４３】
抽出物は、マウスあたり85 mgの単回用量で導入された(すなわち15 mgの有効成分と82.5%の賦形剤)。対照群のマウスは、0.5 mlの水を毎日、10日間経口投与する擬似処置を受けた。予備的な用量確認攻撃は、マウスあたり102〜105 CFUのサルモネラの範囲であった。104 CFUの用量を、主実験のために選択した。なぜなら、この用量が、未処置動物において約50%の生存をもたらしたからである。
攻撃の後に、マウスを、実験動物についての標準的な条件下で維持した。感染後21日間にわたって、観察及び死亡の記録を毎日行った。抽出物の抗感染効力(以下の表を参照)は、各実験群について算出された感染後生存率(SR)、感染後の平均生存期間(ADL)、防御係数(defense factor) (DF)、及び調製物効力指数(preparation efficacy index) (EI)に従って評価した。SRを、感染後21日目での実験群での生存動物のパーセンテージとして得た。
ADL、DF及びEIを、以下の式を用いて算出した：
ADL = (X1 + X2 +・・・+ Xn)：N
(式中、ADLは、平均生存期間であり、X1〜Xnは、実験マウス＃1〜＃nについての感染後生存期間であり、Nは、実験群中の動物の総数である)。
DF = CD：ED
(式中、DFは、防御係数であり、CDは、対照群での死亡のパーセントであり、EDは、実験群での死亡のパーセントである)。
EI = [(DF − 1)：DF]×100%
(式中、EIは、調製物効力指数であり、DFは、防御係数である)。
【０１４４】
【表６】
0005693010.tif 000007
【０１４５】
【表７】
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【０１４６】
実験の間に、抽出物はよく耐性があったことが示された。水で前処置されたマウスの対照群では、観察期間の間(21d)の生存率は58%であり、生じるADLは15.3日であった。対照的に、本発明による抽出物を投与された全てのマウスは、攻撃から生存した。これらの結果は、本発明の実施形態が、ヒトにおけるある細菌感染に対して有益であり得ることを示唆する。
【０１４７】
実施例12：アレルゲン攻撃の間の粘膜気管における調節性T細胞の生成に対する本発明の実施形態の影響
急性アレルギー性炎症のモデルでの本発明の実施形態の免疫調節性の能力を試験した。実験は、PVGラットにおいて、本発明による抽出物の投与が、利用可能な粘膜-ホーミングT調節性(Treg)細胞のプールサイズを増大させて、偶発的な炎症の間の気道粘膜組織でのTregの数を増大させるかを決定するために行った。
近交PVGラットを飼育し、通常のラット病原体なしに維持した。両方の性別の8〜13週齢の無作為に選択した動物を、実験を通して用いた。
【０１４８】
400ugの投与凍結乾燥物/g体重(又は400 mg/kg/日)を用いて、毎日連続で供給(強制栄養)を行った。PVGラットの気道組織でのTreg集団を、研究群において表現型で同定した。ラット気管組織の表現型の特徴付けのために、分析のための充分な細胞が得られるようにプールされた5〜10匹の動物の群のサイズが必要であった。気管組織を、コラゲナーゼ/DNアーゼ中で消化して単細胞懸濁物を得て、その後、CD4、CD25、Foxp3及びTCRαβの表面発現をフローサイトメトリーで分析した。まず、動物を、OVAで第0日(d0)に感作し、実施例3.15と同様の抽出物又はプラセボをd10〜d17に供給した。d18に、これらをエアゾールOVAで攻撃して、得られたTh細胞/ Treg (FoxP3)応答を24時間後に測定した。Fox p3の細胞内染色のために、eBioscience (San Diego、CA)からの抗マウス/ラットFoxP3-FLR染色キットを、製造業者により記載されるようにして用いた。データは、FACSCaliburフローサイトメーター(BD Biosciences)で得て、Flowjoソフトウェア(バージョン4.6.1、Tree Star Inc)を用いて解析した。OVAは、Sigma Chemicals Co. (St Louis、Missouri)からであった。
【０１４９】
図10a及び10bは、元のフラックスサイトメトリーのデータを示す(図10aでは、マーカーがCD14対FoxP3であり、図10bでは、マーカーがTCR対FoxP3であった)。細胞は、OVA感作ラット(第0日にi.p.)及びエアゾールOVA攻撃(第18日)の24時間後において気道粘膜から得た。図10a及び10bの右パネルは、動物に、10〜18日目に抽出物を経口投与すると、FoxP3陽性CD4細胞(及びTCR、それぞれ)のパーセンテージが、左パネルに示す対照(OVAで感作した未処置動物及びOVA攻撃動物)と比較すると増大したことを示す。
この実施例は、本発明の実施形態が、炎症性アレルギーの発症の場合に、治療において価値があり得ることを示す。
【０１５０】
さらなる例は、以下のことを含む。
モラクセラ・カタラーリス、ヘモフィラス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・サングイス、スタフィロコッカス・ヘモリチカス、エンテロコッカス・フェカリス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・アンギノーサス、 ストレプトコッカス・ミチス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ナイセリア・シッカ、ヘモフィラス・パラインフルエンザ、アクチノバチルス(ヘモフィラス)・アクチノミセテムコミタンス及びエイケネラ・コロデンスから選択される1種又は複数種の細菌からの抽出物であって、前記抽出物の調製の間に、前記1種又は複数種の細菌株が12を超えるpHで溶解され、前記抽出物が、核酸を除去するように処理され、かつ前記抽出物が、患者への投与でプリオン疾患の危険性を有さない抽出物。
【０１５１】
以下の細菌種：モラクセラ・カタラーリス、ヘモフィラス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・サングイス、スタフィロコッカス・ヘモリチカス、エンテロコッカス・フェカリス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・アンギノーサス、ストレプトコッカス・ミチス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ナイセリア・シッカ、ヘモフィラス・パラインフルエンザ、アクチノバチルス(ヘモフィラス)・アクチノミセテムコミタンス及びエイケネラ・コロデンスのそれぞれの少なくとも1つの株から得られる、前段落の抽出物。
【０１５２】
以下の細菌株：モラクセラ(モラクセラ)・カタラーリス3622、モラクセラ(モラクセラ)・カタラーリス3625、モラクセラ(モラクセラ)・カタラーリスI-045、ヘモフィラス・インフルエンザ8467、クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシズ・オゼネ5050、クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシズ・ニューモニエ204、クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシズ・ニューモニエ5056、スタフィロコッカス・アウレウスI-049、スタフィロコッカス・アウレウスI-050、スタフィロコッカス・アウレウスI-051、スタフィロコッカス・アウレウスI-052、スタフィロコッカス・アウレウスI-053、スタフィロコッカス・アウレウスI-054、ストレプトコッカス・ニューモニエ7465、ストレプトコッカス・ニューモニエ7466、ストレプトコッカス・ニューモニエ7978、ストレプトコッカス・ニューモニエ10319、ストレプトコッカス・ピオゲネス8191、ストレプトコッカス・サングイスI-046、ストレプトコッカス・サングイスI-047、ストレプトコッカス・サングイスI-048、スタフィロコッカス・ヘモリチカス11042、エンテロコッカス・フェカリス103015、ストレプトコッカス・ミュータンス10449、ストレプトコッカス・アンギノーサス10713、ストレプトコッカス・ミチス12261、ストレプトコッカス・サリバリウス102503、ナイセリア・シッカ103345、ヘモフィラス・パラインフルエンザ7857、アクチノバチルス(ヘモフィラス)・アクチノミセテムコミタンス52.105、及びエイケネラ・コロデンス10596のそれぞれから得られる、前段落の抽出物。
【０１５３】
抽出物が、100μg/mL未満の核酸を含む、前の3つの段落のいずれかの抽出物。
抽出物が、少なくとも0.3 mg/mLの糖類を含む、前の3つの段落のいずれかの抽出物。
抽出物が、0.3 mg/mLと4.5 mg/mLの間の糖類を含む、前の3つの段落のいずれかの抽出物。
少なくとも1種の糖類が、単糖類、二糖類及び多糖類からなる群より選択される、前段落のいずれかの抽出物。
少なくとも1種の多糖類が、分岐多糖類である、前段落の抽出物。
少なくとも1種の糖類が、化学修飾されている、前段落のいずれかの抽出物。
抽出物が、1.5 mg/mLと2.5 mg/mLの間の遊離アミノ酸を含む、前段落のいずれかの抽出物。
溶解が、pH 12.6〜13.4で行われる、前段落のいずれかの抽出物。
【０１５４】
抽出物が、粒子状及び／又は不溶性の成分を除去するように処理される、前段落のいずれかの抽出物。
それぞれの細菌株が、プリオン疾患の危険性がない培地中で培養される、前段落のいずれかの抽出物。
アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、ヒスチジン、アラニン、アルギニン、チロシン、メチオニン、フェニルアラニン及びリジンから選択される少なくとも1種のアミノ酸が、少なくとも10%ラセミ化されている、前段落のいずれかの抽出物。
抽出物の遊離アミノ酸が、1%と80%の間のD-アミノ酸を含む、前段落のいずれかの抽出物。
抽出物の遊離アミノ酸が、10%と45%の間のD-アミノ酸を含む、前段落のいずれかの抽出物。
抽出物の遊離アミノ酸が、25%と35%の間のD-アミノ酸を含む、前段落の抽出物。
【０１５５】
抽出物が、D-アスパラギン酸及びD-アスパラギン、D-グルタミン酸及びD-グルタミン、D-セリン、D-メチオニン、D-ヒスチジン、D-アラニン、D-アルギニン、D-フェニルアラニン、D-チロシン、D-ロイシン、D-リジン、D-バリン、及びD-スレオニンから選択される少なくとも1種のD-アミノ酸を含む、前段落のいずれかの抽出物。
いずれの1つのD-アミノ酸の濃度が、遊離アミノ酸の濃度の1%と50%の間である、前段落の抽出物。
いずれの1つのD-アミノ酸の濃度が、遊離アミノ酸の濃度の10%と40%の間である、前段落の抽出物。
いずれの1つのD-アミノ酸の濃度が、遊離アミノ酸の濃度の15%と35%の間である、前段落の抽出物。
【０１５６】
抽出物が、6 mg/mLと75 mg/mLの間の1種又は複数種のタンパク質を含む、前段落のいずれかの抽出物。
抽出物が、6 mg/mLと8 mg/mLの間の1種又は複数種のタンパク質を含む、前段落の抽出物。
1種又は複数種のタンパク質が、30 kDa未満の分子量を有する、前段落のいずれかの抽出物。
1種又は複数種のタンパク質が、10 kDa未満の分子量を有する、前段落のいずれかの抽出物。
【０１５７】
サルモネラ・チフィムリウムでの攻撃の13日後の少なくとも8匹の野生型LPS感受性マウスの生存率が、少なくとも70%であり、サルモネラ・チフィムリウムの用量が、少なくとも8匹の対照マウスの生存率が60%以下となるように選択される、前段落のいずれかの抽出物。
生存率が、少なくとも80%である、前段落の抽出物。
生存率が、少なくとも90%である、前段落の抽出物。
抽出物が、リムルス変形細胞分解産物(LAL)色素産生試験により5000 ng未満のLPS等量を含む、前段落のいずれかの抽出物。
前段落のいずれかの抽出物を含む医薬組成物。
【０１５８】
前段落のいずれの抽出物の有効量を、呼吸器障害に罹患しているか又は該障害を生じる危険性がある対象に投与することを含む、前記対象を治療する方法。
対象がヒト又は家畜哺乳動物である、前段落の方法。
呼吸器障害又はアレルギー性状態が、上下気道感染、アトピー性皮膚炎、鼻咽頭炎、副鼻腔炎、咽頭炎、扁桃炎、喉頭炎、気管炎、喉頭咽頭炎、インフルエンザ、肺炎、気管支肺炎、気管支炎、下気道感染、アレルギー性鼻炎、アレルギー性喘息、鼻炎、鼻咽頭炎、咽頭炎、副鼻腔炎、扁桃炎、喉頭炎、喉頭気管炎、気管支炎、急性下気道感染を伴う閉塞性肺疾患、又は急性憎悪を伴う閉塞性肺疾患である前2つの段落のいずれかの方法。
【０１５９】
モラクセラ・カタラーリス、ヘモフィラス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・サングイス、スタフィロコッカス・ヘモリチカス、エンテロコッカス・フェカリス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・アンギノーサス、 ストレプトコッカス・ミチス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ナイセリア・シッカ、ヘモフィラス・パラインフルエンザ、アクチノバチルス(ヘモフィラス)・アクチノミセテムコミタンス、及びエイケネラ・コロデンスから選択される1種又は複数種の細菌から得られる抽出物を製造する方法であって：
(a) 各細菌株を、プリオン疾患の危険性がない培地で培養し；
(b) 各株を、12を超える当初のpHで溶解し；
(c) (b)の生成物を、少なくとも1回マイクロフィルタ及び少なくとも1回限外ろ過フィルタに通す
ことを含む方法。
【０１６０】
抽出物が、以下の細菌種：モラクセラ・カタラーリス、ヘモフィラス・インフルエンザ、クレブシエラ・ニューモニエ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・サングイス、スタフィロコッカス・ヘモリチカス、エンテロコッカス・フェカリス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・アンギノーサス、 ストレプトコッカス・ミチス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ナイセリア・シッカ、ヘモフィラス・パラインフルエンザ、アクチノバチルス(ヘモフィラス)・アクチノミセテムコミタンス、及びエイケネラ・コロデンスのそれぞれの少なくとも1種の株から得られる、前段落の方法。
【０１６１】
抽出物が、以下の細菌株：モラクセラ(モラクセラ)・カタラーリス3622、モラクセラ(モラクセラ)・カタラーリス3625、モラクセラ(モラクセラ)・カタラーリスI-045、ヘモフィラス・インフルエンザ8467、クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシズ・オゼネ5050、クレブシエラ・ニューモニエ204、クレブシエラ・ニューモニエ5056、スタフィロコッカス・アウレウスI-049、スタフィロコッカス・アウレウスI-050、スタフィロコッカス・アウレウスI-051、スタフィロコッカス・アウレウスI-052、スタフィロコッカス・アウレウスI-053、スタフィロコッカス・アウレウスI-054、ストレプトコッカス・ニューモニエ7465、ストレプトコッカス・ニューモニエ7466、ストレプトコッカス・ニューモニエ7978、ストレプトコッカス・ニューモニエ10319、ストレプトコッカス・ピオゲネス8191、ストレプトコッカス・サングイスI-046、ストレプトコッカス・サングイスI-047、ストレプトコッカス・サングイスI-048、スタフィロコッカス・ヘモリチカス11042、エンテロコッカス・フェカリス103015、ストレプトコッカス・ミュータンス10449、ストレプトコッカス・アンギノーサス10713、ストレプトコッカス・ミチス12261、ストレプトコッカス・サリバリウス102503、ナイセリア・シッカ103345、ヘモフィラス・パラインフルエンザ7857、アクチノバチルス(ヘモフィラス)・アクチノミセテムコミタンス52.105、及びエイケネラ・コロデンス10596のそれぞれから得られる、前段落の方法。
溶解が、12.5を超える当初のpHで行われる、前段落のいずれかの方法。
溶解が、12.6〜13.4の当初のpHで行われる、前段落のいずれかの方法。
溶解が、40時間〜10日間、30〜60℃の温度で行われる、前段落のいずれかの方法。
マイクロフィルタが0.45ミクロンであり、限外ろ過フィルタが30 KDaである、前段落のいずれかの方法。
工程(c)が、タンジェンシャルフローろ過を含む、前段落のいずれかの方法。
タンジェンシャルフローろ過が、5〜15サイクル行われる、前段落の方法。
【０１６２】
(c)の生成物を、0.2ミクロンの第2のマイクロフィルタを通過させることをさらに含む、前段落のいずれかの方法。
工程(b)が、10〜120 g/lの細菌乾燥重量の原料で行われる、前段落のいずれかの方法。
タンジェンシャルフローろ過が、図1に示すようにして行われる、前段落のいずれかの方法。
タンジェンシャルフローろ過が、蛇行モードで、図1に示すようにして行われる、前段落のいずれかの方法。
前の段落のいずれかの方法により得られる生成物。
前段落のいずれかの方法のいずれかの生成物の有効量を、呼吸器障害に罹患しているか又は該障害を生じる危険性がある対象に投与することを含む、前記対象を治療する方法。
対象がヒト又は家畜動物である、前段落の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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