(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＤＥＰを用いて検査対象物を捕捉し、ＥＰを用いて前記検査対象物を破砕するための、基板上に形成される対向電極を含み、該電極が底部に形成されたマイクロウェルを有するマイクロウェルアレイと、
（ｂ）前記検査対象物を含有する溶液または前記検査対象物成分の生化学的解析用の溶液を導入するためのマイクロ流体チャネルと、
（ｃ）前記マイクロウェルの限定された容積に前記検査対象物内物質を閉じ込めるため、前記検査対象物の破砕の前に前記マイクロウェルを密閉する膜とを具備し、
（ｄ）前記対向電極は互いに噛み合ったＩＤＥ（交差指状電極）からなり、かつインジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）からなることを特徴とする電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置。
【請求項２】
請求項１記載の電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置において、前記検査対象物が単一の細胞であることを特徴とする電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置。
【請求項３】
請求項１記載の電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置において、前記検査対象物が小胞であることを特徴とする電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置。
【請求項４】
請求項１記載の電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置において、前記検査対象物が微小区画を形成する脂質二重膜であることを特徴とする電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置。
【請求項５】
請求項２記載の電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置において、前記マイクロウェルは前記細胞のサイズにあわせて直径２０−３５マイクロメートルであり、そのマイクロウェルの数が数百から数万個形成されたマイクロウェルアレイであることを特徴とする電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置。
【請求項６】
請求項１記載の電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置において、前記マイクロウェルの壁がフォトレジストで作られることを特徴とする電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置。
【請求項７】
請求項１記載の電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置において、前記基板がガラス基板であることを特徴とする電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置。
【請求項８】
（ａ）基板上に形成される対向電極を含み、該対向電極が底部に形成された互いに噛み合ったＩＤＥ（交差指状電極）からなり、かつインジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）からなる、マイクロウェルを有するマイクロウェルアレイと、
（ｂ）検査対象物を含有する溶液または前記検査対象物成分の生化学的解析用の溶液を導入するためのマイクロ流体チャネルと、
（ｃ）前記マイクロウェルの限定された容積に前記検査対象物内物質を閉じ込めるため、前記検査対象物破砕の前に前記マイクロウェルを密閉する膜とを備え、
（ｄ）前記マイクロウェルの寸法、前記溶液の流量、および前記対向電極に印加される電界を調整したＤＥＰによって前記各マイクロウェルに１個の前記検査対象物を位置付けし、
（ｅ）前記マイクロ流体チャネルによって前記溶液を交換するフローが存在する場合でも、前記マイクロウェル内で前記検査対象物の位置を一定に保ち、
（ｆ）前記マイクロウェル内で前記対向電極に短パルスを印加することにより、ＥＰを用いて前記検査対象物を破砕し、
（ｇ）前記マイクロウェルの寸法が前記検査対象物破砕後に該検査対象物内物質の解析を妨げる前記検査対象物内物質の希釈を防ぐのに十分に小さい状態で前記検査対象物を解析することを特徴とする電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置を用いた検査対象物解析方法。
【請求項９】
請求項８記載の電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置を用いた検査対象物解析方法において、単一細胞がＤＥＰを用いて捕捉されることを特徴とする電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置を用いた検査対象物解析方法。
【請求項１０】
請求項８記載の電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置を用いた検査対象物解析方法において、小胞がＤＥＰを用いて捕捉されることを特徴とする電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置を用いた検査対象物解析方法。
【請求項１１】
請求項８記載の電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置を用いた検査対象物解析方法において、微小区画を形成する脂質二重膜がＤＥＰを用いて捕捉されることを特徴とする電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置を用いた検査対象物解析方法。
【請求項１２】
請求項９記載の電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置を用いた検査対象物解析方法において、前記単一細胞が細胞内物質を含有することを特徴とする電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置を用いた検査対象物解析方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置を用いた検査対象物解析方法において、前記細胞内物質がＤＮＡ分子であることを特徴とする電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置を用いた検査対象物解析方法。
【請求項１４】
請求項１２記載の電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置を用いた検査対象物解析方法において、前記細胞内物質がＲＮＡ分子であることを特徴とする電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置を用いた検査対象物解析方法。
【請求項１５】
請求項１２記載の電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置を用いた検査対象物解析方法において、前記細胞内物質が生成物を合成するのに用いられることを特徴とする電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置を用いた検査対象物解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置およびそれを用いた検査対象物解析方法に係り、特に、単一細胞解析を行うための電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置およびそれを用いた単一細胞解析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞単位でのバイオアッセイは、細胞集団を精査するが、その場合、関連する個々の細胞の特性は完全に平均化され、また場合によっては、細胞の性質が誤って解釈されることもある（下記非特許文献１〜３参照）。したがって、近年は、ゲノミクス、プロテオミクス、およびトランスクリプトミクスに関する新たなかつ興味深い研究の分野で、単一細胞解析方法に対する関心が高まってきている。単一細胞を解析するため、細胞パターニング（下記非特許文献２，４参照）、光ピンセット（下記非特許文献５参照）、およびマイクロフルイディクス（下記非特許文献６〜８参照）などのいくつかの方法が開発されてきた。空間的に不均一な電場で分極した粒子に力を作用させる誘電泳動（ＤＥＰ）は、特定の位置で細胞をパターニングする有力なツールの１つである（下記非特許文献９参照）。この方法は、選択的かつ安定的な細胞の処理を可能とする。また、Ａｌｂｒｅｃｈｔらにより、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）でコーティングしたスライドガラス上にフォトレジストマイクロウェルアレイをパターニングしたＤＥＰ細胞パターニングチャンバー法が発表されている（下記非特許文献１０参照）。この方法によって、正確に定義された３次元細胞ネットワークが得られる。
【０００３】
一方、単一細胞毎の細胞内の核酸、タンパク質、または他の成分の解析は、多様な生物学的機能の研究にとって非常に有望である。これらを直接解析するために細胞内物質を得るには、細胞膜を開く必要がある。これは、電位を膜に印加することによってプラスミドＤＮＡまたは小分子を細胞内に導入することができる電気穿孔法（ＥＰ）を用いることで、効率的に実現することができる（下記非特許文献１１参照）。印加する電界の強度が十分に強いと、不可逆的な膜の機械的分解が生じて、細胞破砕がもたらされる。マイクロ流体デバイスを用いれば、電極間の距離を短くすることによって電位を比較的低くした状態でも高電界強度を形成することが可能になるので、ＥＰによる細胞破砕を行うのに有用である。この種のマイクロ流体デバイスがこれまでにいくつか発表されており（下記非特許文献１２〜１５参照）、それに加えて、現在、細胞破砕後に細胞内成分を回収し精製するための、より統合されたシステムが作られてきている（下記非特許文献１６参照）。
【０００４】
この取組みを単一細胞レベルにスケールダウンすることは、単一細胞解析にとって非常に有用である。近年、ＥＰを用いた単一細胞破砕の方法が発表されている。例えば、Ｇａｏらにより、細胞破砕後に細胞内成分を検出するためのマイクロ流体デバイスが提案されている（下記非特許文献１７参照）。さらに、Ｋｈｉｎｅらにより、捕捉工程において水力学的な力を用いる単一細胞電気穿孔デバイスが提案されている（下記非特許文献１８参照）。しかしながら、これらのこれまでの研究では、細胞膜崩壊の直後に、閉じ込めがないために、細胞内物質の拡散と希釈が起こる。解析に役立ち得るほとんどの酵素がマイクロモル範囲の濃度の基質を必要とすることが知られているが、単一細胞からの細胞物質の量は少ないので、それが希釈された状態で解析するのは困難である。よって、密閉された微小区画（下記非特許文献１９，２０参照）を使用することが、生体分子の単離および高スループットの解析にとって理想的である（下記非特許文献２１，２２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００４−５３５１７６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｌｉｄｓｔｒｏｍ，Ｍ．Ｅ．  ａｎｄ  Ｍｅｌｄｒｕｍ，Ｄ．Ｒ．，“Ｌｉｆｅ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ”，Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１５８−１６４（２００３）
【非特許文献２】Ｄｉ  Ｃａｒｌｏ，Ｄ．，Ａｇｈｄａｍ，Ｎ．  ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｌ．Ｐ．，“Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，Ｋｉｎｅｔｉｃｓ，ａｎｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ａｒｒａｙｓ”，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．７８，Ｎｏ．１４，ｐｐ．４９２５−４９３０（２００６）
【非特許文献３】Ｓｉｍｓ，Ｃ．Ｅ．  ａｎｄ  Ａｌｌｂｒｉｔｔｏｎ，Ｎ．Ｌ．，“Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｏｎ−ｃｈｉｐ”，Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ，Ｖｏｌ．７，ｐｐ４２３−４４０（２００７）
【非特許文献４】Ｅｌ−Ａｌｉ，Ｊ．，Ｓｏｒｇｅｒ，Ｐ．Ｋ．  ａｎｄ  Ｊｅｎｓｅｎ，Ｋ．Ｆ．，“Ｃｅｌｌｓ  ｏｎ  ｃｈｉｐｓ”，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４４２，ｐｐ．４０３−４１１（２００６）
【非特許文献５】Ｈｅｌｌｍｉｃｈ，Ｗ．，Ｐｅｌａｒｇｕｓ，Ｃ．，Ｌｅｆｆｈａｌｍ，Ｋ．，Ｒｏｓ，Ａ．  ａｎｄ  Ａｎｓｅｌｍｅｔｔｉ，Ｄ．，“Ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，ａｎａｌｙｔｉｃｓ，ａｎｄ  ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｅｖｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｎａｎｏｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｖｏｌ．２６，ｐｐ．３６８９−３６９６（２００５）
【非特許文献６】Ｃｈａｏ，Ｔ．Ｃ．，  ａｎｄ  Ｒｏｓ，Ａ．，“Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ／ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｖｏｌ．５，Ｓｕｐｐｌ．２，ｐｐ．Ｓ１３９−１５０（２００８）
【非特許文献７】Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｍ．Ｒ．，  ａｎｄ  Ｈａｓｔｙ，Ｊ．，“Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｅｖｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ”，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ，Ｖｏｌ．１０，ｐｐ．６２８−６３８（２００９）
【非特許文献８】Ｂｅｎ−Ｙａｋａｒ，Ａ．，Ｃｈｒｏｎｉｓ，Ｎ．，  ａｎｄ  Ｌｕ，Ｈ．，“Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｂｅｈａｖｉｏｒ，ｎｅｒｖｅ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ”，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９，ｐｐ．５６１−５６７（２００９）
【非特許文献９】Ｖｏｌｄｍａｎ，Ｊ．“Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ”，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｌｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．８，ｐｐ．４２５−４５４（２００６）
【非特許文献１０】Ａｌｂｒｅｃｈｔ，Ｄ．Ｒ．，Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ，Ｇ．Ｈ．，Ｗａｓｓｅｒｍａｎｎ，Ｔ．Ｂ．，Ｓａｈ，Ｒ．Ｌ．  ａｎｄ  Ｂｈａｔｉａ，Ｓ．Ｎ．，“Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．５，ｐｐ．３６９−３７５（２００６）
【非特許文献１１】Ｔｓｏｎｇ，Ｔ．Ｙ．“Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｃｅｓ”，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．６０，ｐｐ．２９７−３０６（１９９１）
【非特許文献１２】Ｌｅｅ，Ｓ．Ｗ．，  ａｎｄ  Ｔａｉ，Ｙ．Ｃ．，“Ａ  ｍｉｃｒｏ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ｄｅｖｉｃｅ”，Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ，Ｖｏｌ．７３，ｐｐ．７４−７９（１９９９）
【非特許文献１３】Ｌｕ，Ｈ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｍ．Ａ．  ａｎｄ  Ｊｅｎｓｅｎ，Ｋ．Ｆ．，“Ａ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ”，  Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ，Ｖｏｌ．５，ｐｐ．２３−２９（２００５）
【非特許文献１４】Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｙ．  ａｎｄ  Ｌｕ，Ｃ．，“Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃｈａｎｎｅｌ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ”，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．７８，Ｎｏ．１４，ｐｐ．５１５８−５１６４（２００６）
【非特許文献１５】Ｒａｍａｄａｎ，Ｑ．，Ｓａｍｐｅｒ，Ｖ．，Ｐｏｅｎａｒ，Ｄ．，Ｌｉａｎｇ，Ｚ．，Ｙｕ，Ｃ．  ａｎｄ  Ｌｉｍ，Ｔ．Ｍ．，“Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｅａｄ  ｔｒａｐｐｉｎｇ  ｉｎ  ａ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｆｌｏｗ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｅｖｉｃｅ”，Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ，Ｖｏｌ．１１３，ｐｐ．９４４−９５５（２００６）
【非特許文献１６】Ｎａｋａｙａｍａ，Ｔ．，Ｎａｍｕｒａ，Ｍ．，Ｔａｂａｔａ，Ｋ．Ｖ．，Ｎｏｊｉ，Ｈ．  ａｎｄ  Ｙｏｋｏｋａｗａ，Ｒ．，“Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ  ｅｎａｂｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｆ1 −ＡＴＰａｓｅ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ａｓｓａｙ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ”，Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ，Ｖｏｌ．９，ｐｐ．３５６７−３５７３（２００９）
【非特許文献１７】Ｇａｏ，Ｊ．，Ｙｉｎ，Ｘ．Ｆ．  ａｎｄ  Ｆａｎｇ，Ｚ．Ｌ．，“Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ，ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ  ｏｎ  ａ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｃｈｉｐ”，Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ，Ｖｏｌ．４，ｐｐ．４７−５２（２００４）
【非特許文献１８】Ｋｈｉｎｅ，Ｍ．，Ｌａｕ，Ａ．，Ｉｏｎｅｓｃｕ−Ｚａｎｅｔｔｉ，Ｃ．，Ｓｅｏ，Ｊ．  ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｌ．Ｐ．，“Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｃｈｉｐ”，Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ，Ｖｏｌ．５，ｐｐ．３８−４３（２００５）
【非特許文献１９】Ｎａｇａｉ，Ｈ．，Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｙ．，Ｍｏｒｉｔａ，Ｙ．，Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｋ．  ａｎｄ  Ｔａｍｉｙａ，Ｅ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａ  Ｍｉｃｒｏｃｈａｍｂｅｒ  Ａｒｒａｙ  ｆｏｒ  Ｐｉｃｏｌｉｔｅｒ  ＰＣＲ”，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．７３，Ｎｏ．５，ｐｐ．１０４３−１０４７（２００１）
【非特許文献２０】Ｋｉｎｐａｒａ，Ｔ．Ｍｉｚｕｎｏ，Ｒ．，Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｙ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｍ．，Ｙａｍａｕｒａ，Ｓ．，Ｈａｓａｎ，Ｑ．，Ｍｏｒｉｔａ，Ｙ．，Ｎａｋａｎｏ，Ｈ．，Ｙａｍａｎｅ，Ｔ．  ａｎｄ  Ｔａｍｉｙａ，Ｅ．，“Ａ  Ｐｉｃｏｌｉｔｅｒ  Ｃｈａｍｂｅｒ  Ａｒｒａｙ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１３６，Ｎｏ．２，ｐｐ．１４９−１５４（２００４）
【非特許文献２１】Ｒｏｎｄｅｌｅｚ，Ｙ．，Ｔｒｅｓｓｅｔ，Ｇ．，Ｔａｂａｔａ，Ｋ．Ｖ．，Ａｒａｔａ，Ｈ．，Ｆｕｊｉｔａ，Ｈ．，Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｓ．  ａｎｄ  Ｎｏｊｉ，Ｈ．，“Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  ａｒｒａｙｓ  ｏｆ  ｆｅｍｔｏｌｉｔｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒｓ  ａｌｌｏｗ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．３，ｐｐ．３６１−３６５（２００５）
【非特許文献２２】Ｒｉｓｓｉｎ，Ｄ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｗａｌｔ，Ｄ．Ｒ．，“Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  Ｒｅａｄｏｕｔ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｆｅｍｔｏｍｉｔｅｒ  Ａｒｒａｙｓ  ａｎｄ  Ｐｏｉｓｏｎ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ”，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．３，ｐｐ．５２０−５２３（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上のように従来技術では、マイクロウェル内において誘電泳動（ＤＥＰ）と細胞破砕（ＥＰ）とは別個の手段により実施されており、細胞操作と処理が複雑なものにならざるを得なかった。
【０００８】
本発明は、上記状況に鑑みて、区画化用の単一デバイスマイクロウェルに検査対象物操作（ＤＥＰおよびＥＰ）用の電極を統合することにより、簡便な装置とそれを用いた方法で検査対象物解析を行うことができる電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置およびそれを用いた検査対象物解析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ＤＥＰおよびＥＰに基づく検査対象物の捕捉と、それに続く検査対象物の破砕を行い、その後に検査対象物解析を行うためのデバイスおよび方法を提供する。デバイスは、多数のアレイ状マイクロウェルを含み、それにより、細胞集団を並列的に操作し解析することが可能になっている。マイクロ流体デバイスは、成形したポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）膜をマイクロウェルアレイ基板に接合することによって作製する。マイクロウェルアレイは、ネガティブ型のフォトレジストを用いて、相互に噛み合ったインジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）電極上に作製した。電界は、マイクロウェルの底部にある電極の縁部に高度に局在化させた。このように構成すると、検査対象物をマイクロウェル内に引き込むためのＤＥＰ力と、検査対象物破砕のためのＥＰとが効率的に誘導される。本発明では、マイクロウェルの直径、および検査対象物搬送に用いられる溶液の流量などの実験パラメーターを制御することによって捕捉検査対象物の数を単一検査対象物に調整できる。本発明のデバイスを用いた検査対象物破砕では、電界がチャンバー内で高度に局在化されているので、非常に高効率である。
【００１０】
本発明は、上記目的を達成するために、
〔１〕電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置において、ＤＥＰを用いて検査対象物を捕捉し、ＥＰを用いて前記検査対象物を破砕するための、基板上に形成される対向電極を含み、この電極が底部に形成されたマイクロウェルを有するマイクロウェルアレイと、前記検査対象物を含有する溶液または前記検査対象物成分の生化学的解析用の溶液を導入するためのマイクロ流体チャネルと、前記マイクロウェルの限定された容積に前記検査対象物内物質を閉じ込めるため、前記検査対象物の破砕の前に前記マイクロウェルを密閉する膜とを具備し、前記対向電極は互いに噛み合ったＩＤＥ（Ｉｎｔｅｒ−Ｄｉｇｉｔａｔｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ）電極からなり、かつインジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）からなることを特徴とする。
【００１１】
〔２〕上記〔１〕記載の電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置において、前記検査対象物が単一の細胞であることを特徴とする。
【００１２】
〔３〕上記〔１〕記載の電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置において、前記検査対象物が小胞であることを特徴とする。
【００１３】
〔４〕上記〔１〕記載の電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置において、前記検査対象物が微小区画を形成する脂質二重膜であることを特徴とする。
【００１４】
〔５〕上記〔２〕記載の電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置において、前記マイクロウェルは前記細胞のサイズにあわせて直径２０−３５マイクロメートルであり、そのマイクロウェルの数が数百から数万個形成されたマイクロウェルアレイであることを特徴とする。
【００１５】
〔６〕上記〔１〕記載の電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置において、前記マイクロウェルの壁がフォトレジストで作られることを特徴とする。
【００１６】
〔７〕上記〔１〕記載の電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置において、前記基板がガラス基板であることを特徴とする。
【００１７】
〔８〕電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置を用いた検査対象物解析方法において、基板上に形成され対向電極を含み、この対向電極が底部に形成された互いに噛み合ったＩＤＥ（交差指状電極）からなり、かつインジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）からなる、マイクロウェルを有するマイクロウェルアレイと、検査対象物を含有する溶液または前記検査対象物成分の生化学的解析用の溶液を導入するためのマイクロ流体チャネルと、前記マイクロウェルの限定された容積に前記検査対象物内物質を閉じ込めるため、前記検査対象物破砕の前に前記マイクロウェルを密閉する膜とを備え、前記マイクロウェルの寸法、前記溶液の流量、および前記対向電極に印加される電界を調整したＤＥＰによって前記各マイクロウェルに１個の前記検査対象物を位置付けし、前記マイクロ流体チャネルによって前記溶液を交換するフローが存在する場合でも、前記マイクロウェル内で前記検査対象物の位置を一定に保ち、前記マイクロウェル内で前記対向電極に短パルスを印加することにより、ＥＰを用いて前記検査対象物を破砕し、前記マイクロウェルの寸法が前記検査対象物破砕後に該検査対象物内物質の解析を妨げる前記検査対象物内物質の希釈を防ぐのに十分に小さい状態で前記検査対象物を解析することを特徴とする。
【００１８】
〔９〕上記〔８〕記載の電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置において、単一細胞がＤＥＰを用いて捕捉されることを特徴とする。前記基板がガラス基板であることを特徴とする。
【００１９】
〔１０〕上記〔８〕記載の電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置において、小胞がＤＥＰを用いて捕捉されることを特徴とする。
【００２０】
〔１１〕上記〔８〕記載の電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置を用いた検査対象物解析方法において、微小区画を形成する脂質二重膜がＤＥＰを用いて捕捉されることを特徴とする。
【００２１】
〔１２〕上記〔９〕記載の電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置を用いた検査対象物解析方法において、前記単一細胞が細胞内物質を含有することを特徴とする。
【００２２】
〔１３〕上記〔１２〕記載の電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置を用いた検査対象物解析方法において、前記細胞内物質がＤＮＡ分子であることを特徴とする。
【００２３】
〔１４〕上記〔１２〕記載の電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置を用いた検査対象物解析方法において、前記細胞内物質がＲＮＡ分子であることを特徴とする。
【００２４】
〔１５〕上記〔１２〕記載の電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置を用いた検査対象物解析方法において、前記細胞内物質が生成物を合成するのに用いられることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、誘電泳動（ＤＥＰ）を用いて検査対象物を捕捉するのに使用される、電気的機能を持つマイクロウェルを必要とする。誘電泳動力を加えることによって、検査対象物はマイクロウェルの底部に位置づけられる。マイクロウェルの寸法により、検査対象物を非常に効率的に捕捉することが可能になる。また、ＤＥＰを停止し液体を流しても、マイクロウェル内での検査対象物の位置が維持される。この性質は、ＤＥＰ緩衝液を、検査対象物内成分を解析するために後で用いられる溶液と交換する場合に利用される。検査対象物破砕は、短い電気パルスを印加することによって実現される。この装置および方法を用いて、検査対象物毎のＡＴＰの検査対象物内濃度を解析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の実施例を示す単一細胞の捕捉および破砕の実験概念を示す図である。
【図２】本発明の実施例を示すマイクロ流体デバイスの分解概略図である。
【図３】本発明の実施例を示すマイクロ流体デバイスのマイクロウェルアレイを示す図である。
【図４】本発明のシミュレーションによる電界強度分布（Ｖ／ｍ）および電界強度勾配（▽Ｅ2）（Ｖ／ｍ2 ）ベクトルを示す図である。
【図５】本発明の実施例を示すマイクロウェルアレイの製造工程図である。
【図６】本発明の実施例を示すＰＤＭＳ膜の製造工程図である。
【図７】本発明の実施例を示すマイクロウェルアレイとＰＤＭＳ膜が組み合わされたマイクロ流体デバイスの断面図である。
【図８】本発明のマイクロウェルアレイへの細胞捕捉の状態を示す図である。
【図９】本発明のマイクロウェルの個数の割合を捕捉された細胞数毎にマイクロウェルの直径に対してプロットした図である。
【図１０】本発明のマイクロチャンバー内で細胞破砕する様子を示す図である。
【図１１】本発明の細胞内ＡＴＰ濃度の測定を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置は、ＤＥＰを用いて細胞を捕捉し、ＥＰを用いて細胞を破砕するための、基板上に形成される対向電極を含み、この電極が底部に形成されたマイクロウェルを有するマイクロウェルアレイと、細胞を含有する溶液または細胞成分の生化学的解析用の溶液を導入するためのマイクロ流体チャネルと、前記マイクロウェルの限定された容積に細胞物質を閉じ込めるため、細胞破砕の前に前記マイクロウェルを密閉する膜とを具備し、前記対向電極は互いに噛み合ったＩＤＥ電極からなり、かつインジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）からなる。
【００２８】
また、電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置を用いた検査対象物解析方法において、基板上に形成され対向電極を含み、この対向電極が底部に形成された互いに噛み合ったＩＤＥ（交差指状電極）からなり、かつインジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）からなる、マイクロウェルを有するマイクロウェルアレイと、検査対象物を含有する溶液または前記検査対象物成分の生化学的解析用の溶液を導入するためのマイクロ流体チャネルと、前記マイクロウェルの限定された容積に前記検査対象物内物質を閉じ込めるため、前記検査対象物破砕の前に前記マイクロウェルを密閉する膜とを備え、前記マイクロウェルの寸法、前記溶液の流量、および前記対向電極に印加される電界を調整したＤＥＰによって前記各マイクロウェルに１個の前記検査対象物を位置付けし、前記マイクロ流体チャネルによって前記溶液を交換するフローが存在する場合でも、前記マイクロウェル内で前記検査対象物の位置を一定に保ち、前記マイクロウェル内で前記対向電極に短パルスを印加することにより、ＥＰを用いて前記検査対象物を破砕し、前記マイクロウェルの寸法が前記検査対象物破砕後にこの検査対象物内物質の解析を妨げる前記検査対象物内物質の希釈を防ぐのに十分に小さい状態で前記検査対象物を解析する。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明の実施例について図面を用いて詳細に説明する。なお、実施例中では検査対象物として主に単一細胞を例に述べているが、後述する種々の検査対象物に適用可能である。
【００３０】
図１は本発明の実施例を示す単一細胞の捕捉および破砕の実験概念を示す図、図２はそのマイクロ流体デバイスの分解概略図、図３はそのマイクロ流体デバイスのマイクロウェルアレイを示す図であり、図３（ａ）はその平面図、図３（ｂ）はその断面図である。また、図４はシミュレーションによる電界強度分布（Ｖ／ｍ）および電界強度勾配（▽Ｅ2）（Ｖ／ｍ2 ）ベクトルを示す図である。
【００３１】
これらの図において、１は基板（ガラス基板）、２は基板１上に形成された相互に噛み合ったＩＤＥ（交差指状電極：Ｉｎｔｅｒ−Ｄｉｇｉｔａｔｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ）であり、その材料はＩＴＯからなる。３はそのＩＴＯ電極２上に形成されるマイクロウェル、３Ａはフォトレジスト、４はそのマイクロウェル３が配列されたマイクロウェルアレイ、５はマイクロ流体チャネル、６はＰＤＭＳ膜、７はマイクロウェル３を閉じることにより形成されるマイクロチャンバー、８は細胞、９は細胞８を含有する溶液、１０は細胞内物質である。
【００３２】
まず、図１（ａ）に示すように、細胞８を含有する溶液（ＤＥＰ緩衝液）９は、マイクロ流体チャネル５内へと連続的に導入され、図１（ｂ）に示すように、マイクロウェル３の周りの細胞８は対向電極２によるＤＥＰを用いて捕捉される。その後、図１（ｃ）に示すように、マイクロウェル３はＰＤＭＳ膜６が押し付けられることによって閉じられ、マイクロチャンバー７を構成する。最後に、図１（ｄ）に示すように、細胞８はＩＴＯ電極２によるＥＰを用いて、閉じたマイクロチャンバー７の内部で破砕され、マイクロチャンバー７の内部は細胞内物質１０で満たされる。
【００３３】
本発明のマイクロ流体デバイスは、図２に示すように、マイクロウェルアレイ４と、その上に接合されたＰＤＭＳ膜６からなる。
【００３４】
マイクロウェルアレイ４においては、図３（ａ）に示すように、フォトレジスト３Ａを用いて作製されたマイクロウェル３が、基板１上にパターニングされた相互に噛み合ったＩＴＯ電極と位置合わせが行われている。
【００３５】
本発明では、パターニングしたＩＴＯ電極２により、ＤＥＰを用いて細胞８を引き付け、ＥＰを用いてマイクロチャンバー７内部で破砕を行うようにした。図３（ｂ）に示すように、隣り合うＩＴＯ電極２間の距離は６μｍであり、これは細胞８の直径約１２．５μｍよりも短い。フォトレジスト３Ａを用いて作製したマイクロウェル３は、相互に噛み合ったＩＴＯ電極２と位置合わせされるが、これは、陽極および陰極が両方ともマイクロウェル３の内部に突出するようにするためである。このマイクロウェル３の深さは１５μｍであり、これは対象の細胞８の直径よりもわずかに長い。マイクロウェルアレイ４には、３ｍｍ×３ｍｍの正方形領域内に配置された６０×６０個のマイクロウェル３が配置されている。フォトレジスト３Ａは絶縁性の良い材料なので、電場は、マイクロウェル３がパターニングされた領域を除いて良好に阻害される。さらに、相互に噛み合ったＩＴＯ電極２がマイクロウェル３の底部に位置するので、電場は各マイクロウェル３の内部で高度に局在化される。マイクロウェル３は、ＤＥＰを用いた捕捉中に、細胞８が占有することが可能な空間を物理的に制限するだけではなく、マイクロウェル３が閉じられたときに、マイクロチャンバー７から細胞８破砕後の細胞内物質１０が拡散することを防ぐ。マイクロウェル３は、マイクロ流体チャネル５の役割を果たすＰＤＭＳ膜６を押し付けることによって緊密に閉じられ、マイクロチャンバー７を構成する。
【００３６】
本発明のマイクロ流体デバイスのＤＥＰ力を評価するため、市販のコード（Ｃｏｍｓｏｌ  Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓ，ＣＯＭＳＯＬ  ｇｒｏｕｐ）を使用して電場の二次元シミュレーションを行った。図４は、シミュレーションによる電界強度分布（Ｖ／ｍ）および電界強度勾配（▽Ｅ2）（Ｖ／ｍ2 ）ベクトルを示しており、この計算では、電位は電極の境界線に与えられている。電極の縁部ではその周りの電界が強いので、電界強度勾配（▽Ｅ2）のベクトルの方向はマイクロウェル３の内部に向いている。したがって、マイクロウェル３の上方にある溶液９中の細胞８は、ＤＥＰ力によってマイクロウェル３の底部に引き込まれる。
【００３７】
図５はマイクロウェルアレイの製造工程図、図６はＰＤＭＳ膜の製造工程図、図７はマイクロウェルアレイとＰＤＭＳ膜が組み合わされたマイクロ流体デバイスの断面図である。
【００３８】
マイクロウェルアレイ４の作製プロセスを図５に示す。
【００３９】
まず、図５（ａ）に示すように、基板１上にＩＴＯ電極膜２′が形成される。次に、ＩＴＯ電極膜２′をパターニングしてＩＴＯ電極２を形成する。このＤＥＰおよびＥＰのための相互に噛み合ったＩＴＯ電極２は、従来のフォトリソグラフィーを用いて作製する。厚さ５００ｎｍのＩＴＯ電極膜２′をガラス基板１上にスパッタリングし、電極２の形状をポジティブ型のフォトレジスト（Ｓ−１８１３，Ｓｈｉｐｌｅｙ  ｆａｒ  Ｌｔｄ．）を用いてパターニングし、次に、ＨＮＯ3＋ＨＣｌ＝１＋１溶液によって室温で２５分間、ＩＴＯをエッチングする。マイクロウェルアレイ４は、パターニングしたＩＴＯ電極２上でネガティブ型のフォトレジスト（ＳＵ−８  ２０１０，ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ  Ｃｏ．）３Ａを用いて作製している。フォトレジスト３Ａは、ＩＴＯ電極２が形成された基板１上にスピン塗布し、予備焼成する。パターニングしたマイクロウェルアレイ用のクロムフォトマスクを、パターニングしたＩＴＯ電極２と位置合わせし、フォトレジスト３Ａにフォトマスクを通してＵＶ（紫外）光を照射した後、現像およびすすぎを行う。
【００４０】
一方、ＰＤＭＳ膜６の作製プロセスを図６に示す。まず、図６（ａ）に示すように、鋳型の役割を果たすネガティブ型のフォトレジスト（ＳＵ−８  ２０５０，ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ  Ｃｏ．）１２を、シリコンウェハ１１上にパターニングする。なお、鋳型は、イソプロピルアルコールおよび脱イオン水を用いて十分に洗浄するようにする。また、製作したＰＤＭＳ膜を容易に離型できるように、反応性イオンエッチング装置（ＲＩＥ−１０ＮＲ，Ｓａｍｃｏ  Ｃｏ．）を用いて、鋳型にＣＨＦ3プラズマを照射し、フッ化炭素層でコーティングする。その後、図６（ｂ）に示すように、ＰＤＭＳのポリマー前駆体（Ｓｉｌｏｐｔ  １８４，Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｔｏｒａｙ，Ｃｏ．Ｌｔｄ．）１３′を硬化剤と質量比１０：１で混合して、鋳型に流し込み、ＰＤＭＳのポリマー前駆体１３′から泡を除去するため、混合物を約０．０２ＭＰａで３０分間乾燥機に入れて保持した。次に、ＰＤＭＳ膜１３を７５℃で２時間硬化させ、その後、重合したＰＤＭＳ膜１３を型から剥離する。最後に、図６（ｃ）に示すように、マイクロ流体チャネル５へのアクセスポートとしての役割を果たす、細胞８を含む溶液９又は細胞成分の生化学的解析用の溶液の流入穴１４および排出穴１５を打ち抜き開口し、ＰＤＭＳ膜１３とする。
【００４１】
図５に示すマイクロウェルアレイ４と図６に示すＰＤＭＳ膜１３を図７に示すように組み立てるため、ＲＩＥ装置を用いてそれらにＯ2プラズマを照射して表面を活性化させた。両方を位置合わせして接触させ、外圧を加えることなく自発的に接合させた。Ｏ2プラズマ処理によって、ＳＵ−８マイクロウェルアレイ４およびＰＤＭＳ膜１２が親水性になり、そのことにより、ＰＤＭＳチャネルだけでなくマイクロウェル３に対しても試薬の注入が容易になる。
【００４２】
次に、本発明における単一細胞の捕捉とアレイ上での細胞破砕について説明する。
【００４３】
まず、実験に用いた装置について説明する。
【００４４】
細胞８として、理研バイオリソースセンターから入手したＵ−９３７細胞を、培養器内のＣＯ2を５％含有する加湿雰囲気において３７℃で培養した。培地は、ＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）であり、これにＦＢＳ（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）１０％とペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）１％を補った。細胞の細胞質からの蛍光を観察するため、Ｕ−９３７細胞をカルセインＡＭ（和光純薬工業）で染色した。ＤＥＰおよびＥＰ実験に先立って、ｐＤＥＰ（ポジティブＤＥＰ）向けに細胞懸濁液９の導電性（２１．４ｍＳ  ｍ-1）を調節するため、培地をＤＥＰ緩衝液（ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ、ＣａＣｌ2 ０．１ｍＭ、Ｄ−グルコース５９ｍＭ、およびスクロース２３６ｍＭ、ｐＨ７．３５）と交換した。培地中の細胞を１９０ｇで３分間遠心分離し、静かに培地を除去し、ＤＥＰ緩衝液を添加した。細胞８の直径は１２．５±１．６μｍ、細胞８の濃度は約１×１０6個／ｍｌであった。
【００４５】
上記したマイクロ流体デバイスは、倒立顕微鏡（ＩＸ  ７１、オリンパス）上に配置したｘ−ｙ並進ステージ上に載置した。細胞８は、顕微鏡上に設置した電子増倍電荷結合素子（ＥＭＣＣＤ）カメラ（ｉＸｏｎEM  ＋８８５  ＥＭＣＣＤ  Ｃａｍｅｒａ，Ａｎｄｏｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｌｃ）を用いてモニターした。細胞８の捕捉後にマイクロウェルアレイ４を閉じるため、ステージコントローラー（ＳＨＯＴ−２０２ＡＭ；シグマ光機）によって制御される、電動ステージ（ＳＧＡＭ２０；シグマ光機）に接続した丸いプラスチック製チップを用いてＰＤＭＳ膜６を押し付けた。ＤＥＰおよびＥＰのための電位は、増幅器（ＨＳＡ４０１０；エヌエフ回路設計）を用いて振幅を増幅した後、ファンクションジェネレーター（ＷＦ１９７４；エヌエフ回路設計）を用いて、相互に噛み合ったＩＴＯ電極２に印加した。
【００４６】
上記したマイクロ流体デバイスを用いた実験において、単一細胞の捕捉と、それに続く細胞破砕を実証した。細胞８を含む溶液９としての細胞懸濁液は、細胞供給の連続フローにより、アクセスポートとしての流入穴１３を介してマイクロ流体チャネル５に導入される。実験により、１つのマイクロウェル３に捕捉される細胞の数が、マイクロウェル３の直径（２０，２５，３０，または３５μｍ）と細胞８を含む溶液９の流量（２または４μｌ／ｍｉｎ）とに依存することを見出している。電場の振幅と周波数が変動することによって複雑さが増すことを回避するため、印加電位の振幅および周波数は２Ｖｐ−ｐおよび１ＭＨｚで一定に保っている。単一の細胞８は、２μｌ／ｍｉｎの流量で、相互に噛み合ったＩＴＯ電極２に正弦電位を印加することによって、２５μｍのマイクロウェル３内へと成功裡に捕捉される。
【００４７】
図８は、ＩＴＯ電極に正弦ＡＣ電圧１ＭＨｚで２Ｖp-p を印加した場合の、直径２５μｍのマイクロウェルアレイへの細胞捕捉の状態を示す図である。
【００４８】
図８（ａ）は、細胞捕捉中のマイクロウェルアレイのｔ＝０ｍｉｎ，ｔ＝２．０ｍｉｎ，ｔ＝３．０ｍｉｎそれぞれの時間経過画像を示す。マイクロ流体チャネル５には、細胞８を含む溶液９が２μｌ／ｍｉｎの流量で導入されており、破線で示す。マイクロウェル３には徐々に細胞が入り、３分後にはほとんど全てのマイクロウェル３が単一の細胞８を保持している。この図に示されるように、２個の細胞が入った、または空のマイクロウェルは数個のみであった。なお、図８（ｂ）は捕捉中のＵ−９３７（リンパ球）細胞の時間経過画像、図８（ｃ）は細胞捕捉中に観察された細胞の軌跡を示す模式図である。
【００４９】
捕捉する細胞の数はマイクロウェルの直径と大きく関連している。捕捉に対してマイクロウェルの直径が及ぼす効果を、直径２０，２５，３０，および３５μｍのマイクロウェル３を有するマイクロウェルアレイ４を用いて調査した。本発明では、正弦電位を３分間印加することによって細胞を捕捉し、その後、電位を遮断して捕捉を停止した。次に、ランダムに選択したマイクロウェル１０×１０個の領域で、０個、１個、２個、３個、または４個の細胞を含有するマイクロウェルの数を計数した。図９（ａ）では、２μｌ／ｍｉｎの流量で、内部に捕捉された細胞数が０個、１個、２個、３個または４個となったマイクロウェルの個数の全体に対する割合をマイクロウェルの直径に対してプロットしている。プロットしたデータはすべて、同じ実験条件下で試験した３つのマイクロウェルアレイにおいて測定した３つのデータ系列の平均値である。図９（ａ）に示されるように、２５μｍのマイクロウェルアレイ４は、単一細胞８に関して非常に優れた捕捉効率（約９５％）を示している。２個または３個の細胞を含有するマイクロウェル３の数の割合は、マイクロウェルの直径に伴って増加した。
【００５０】
流量もまた、細胞捕捉効率における別の重要なパラメーターである。本発明のデバイスでは、図４のシミュレーション結果に示されるように、ＤＥＰ力はマイクロウェル３の周りに非常に集中している。したがって、フローの速度が増加した場合、細胞がマイクロウェルの上を流れるときに電場に触れる時間が短くなる。図９（ｂ）は、流量が４μｌ／ｍｉｎであったことを除いて図９（ａ）のデータと実験条件は同じである。この場合、３０μｍのマイクロウェルアレイが最良の捕捉結果を示している。図９に示す２つのヒストグラムは、実験条件を制御することによって、異なるサイズのマイクロウェルに単一細胞を捕捉できることを示している。破砕後の細胞内物質の希釈係数はマイクロウェルのサイズによって決まるので、このことは重要である。
【００５１】
図１０はマイクロチャンバー内で細胞を破砕する様子を示す図である。
【００５２】
単一細胞から得られる細胞内物質の閉じ込めは、閉じたマイクロチャンバー７内で細胞８を破砕することによって実現される。細胞破砕では、３０Ｖ，１０μｓのローレンツパルスを１０Ｈｚで１０秒間印加した。図１０（ａ）は、パルス印加前後の閉じたチャンバーアレイを示す蛍光画像であり、破線の左側と右側はそれぞれ直径２５μｍと３０μｍのチャンバーアレイである。２個の細胞が入ったマイクロチャンバーは、単一細胞が入ったマイクロチャンバーよりも明るい光を発している。細胞破砕の成功率は非常に高く、マイクロチャンバー７内の細胞はほぼ１００％が同時に破砕している。これは、全ての細胞８が電極の縁部に位置付けられているので、各細胞に均一な高い電場を印加することができるためである。
【００５３】
図１０（ｂ）は、ｔ＝０においてパルスが印加されたときの、単一細胞破砕の間の時間経過画像を示し、図１０（ｃ）は、図１０（ｂ）の画像における白い破線に沿って得られる蛍光強度を示す。電気パルスを印加すると、細胞内物質１０の漏れ出しにより、細胞８の蛍光強度は減少した。他方では、細胞内物質１０が細胞外に拡散することによって、マイクロチャンバー７の内部は徐々に蛍光で満たされる。マイクロチャンバー７と細胞８との体積比は約７：１なので、図１０（ｃ）に示されるように、細胞の蛍光強度はパルス印加から３秒後には約１／７に減少する。このように、経過時間に応じたマイクロチャンバー７内の蛍光分布を調査することによって、マイクロチャンバー７内での細胞内物質１０の拡散および希釈を評価することができる。
【００５４】
図１１は細胞内ＡＴＰ濃度の測定を示す図であり、ＡＴＰ消費酵素であるルシフェラーゼによって発生する発光信号を示している。
【００５５】
本発明の汎用性を実証するため、ヒトＵ９３７およびＨｅｐＧ２を含む異なる細胞タイプを捕捉した。図１１（ａ）はマイクロウェルアレイへの多数の細胞を捕捉した様子を示す図であり、図１１（ｂ）はその捕捉した細胞が生きているか死んでいるかをチェックする様子を示す図である。
【００５６】
誘電泳動は生体細胞を損傷する恐れがある。誘電泳動による細胞の捕捉は膜の一体性に依存しているので、本発明のシステムは、無傷の生きた細胞を優先的に捕らえることができる〔図１１（ａ）および図１１（ｂ）〕。実験パラメーターを最適化することによって、本発明では、生きた細胞の高い捕捉効率（ほぼ１００％）を得ることができる。図１１（ｂ）では、ＤＥＰ中における細胞の生存率を、カルセイン−ＡＭ（緑）およびヨウ化プロピジウム（赤）蛍光マーカーによって評価した。細胞内ＡＴＰ解析に先立って、捕捉緩衝液９を、ホタルルシフェラーゼアッセイ試薬を含有する溶液と交換した。ＡＴＰはルシフェリンの二段階酸化を触媒するルシフェラーゼと反応し、それによって５６０ｎｍの光が得られる。１００ｍｓのＥＰパルスによって細胞膜崩壊が引き起こされた直後に細胞内ＡＴＰが放出され、ルシフェラーゼアッセイ試薬と自由に反応した。図１１（ｃ）は、膜崩壊の数秒後に検出された生物発光信号を、発光強度の時間依存性とともに示す図である。類似の曲線が得られることから単一細胞測定の妥当性を裏付けている。デバイスの測定値を校正し、マイクロチャンバー内に存在するＡＴＰの濃度を発光量から推測するため、ケージドＡＴＰを使用した。細胞内ＡＴＰ濃度は、細胞内体積（細胞は類似のサイズを有する；Ｕ９３７，１２．５±１．６μｍ）の平均値から計算することができ、またはマイクロチャンバー内の個々の細胞それぞれの評価から直接計算することもできる。デバイス上の解析から得られるＡＴＰの細胞内濃度レベルに関して見出した結果（細胞直径は１２．５±１．６μｍ）を、バルク測定で得られた値と直接比較した。図１１（ｄ）は、両方の方法によって得られた濃度レベルが類似していることを示している。
【００５７】
なお、本発明の電気的機能を持つマイクロチャンバーアレイ装置を用いた検査対象物解析方法では、微小区画を形成する脂質二重膜や細胞をＤＥＰを用いて捕捉する。つまり、本発明では、検査対象物は細胞だけでなく、小胞（ベシクル：Ｖｅｓｉｃｌｅ）や微小区画を形成する脂質二重膜（リポソーム）など内部に液体を含み、なおかつＤＥＰやＥＰで操作できるものをも対象とし、それらの内部に含有される物質を解析することも可能である。
【００５８】
上記脂質二重膜構造もしくは細胞は、生体分子などの検体（例えば、ＡＴＰ）を含有しており、これらの検体の解析を生化学反応又は化学反応による放射線（ルミネセンス、蛍光、リン光など）を用いて行う。なお、検体によって放射される放射線を用いて解析を行ってもよい。また、検体の生化学反応を用いて解析を行ってもよい。また、解析の対象となる単一細胞は、細胞内物質としてリボソーム、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子を含有しており、この細胞内物質が生成物を合成するのに用いられる。
【００５９】
上記したように、本発明において、アレイ形式のＤＥＰおよびＥＰに基づくマイクロ流体デバイスを用いた、単一細胞の捕捉および破砕を成功裡に実証した。マイクロウェルの寸法、および流量などの他の実験パラメーターを調節することによって、本発明は、良好な単一細胞捕捉効率（約９５％）を実現することができる。さらに、密閉されたマイクロチャンバーを使用することで、膜崩壊後の細胞内物質の拡散および希釈が物理的に制限される。多くのプロセス、特に細胞内成分の解析に用いられるような多くの生化学反応は、マイクロモル以上の濃度状態においてのみ効率的に発生するので、このことは重要である。したがって、本発明のデバイスは、単一細胞毎の細胞内物質を解析するための有用なプラットフォームとなる。高度に統合されたマイクロデバイスは、生物医学および薬学の基礎研究にとって有望であり、堅牢な携帯型のポイントオブケアデバイスは臨床現場で用いることができる。本発明のデバイスにより、細胞の単純な操作と、それに続く破砕およびデバイス上での解析が可能になる。
【００６０】
なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づき種々の変形が可能であり、これらを本発明の範囲から排除するものではない。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明は、区画化用のマイクロウェル上に細胞操作（ＤＥＰおよびＥＰ）用の電極を統合することにより、単一細胞解析を行うことができるツールとして利用可能である。
【符号の説明】
【００６２】
１    基板（ガラス基板）
２    ＩＴＯ電極
２′    ＩＴＯ電極膜
３    マイクロウェル
３Ａ，１２    フォトレジスト
４    マイクロウェルアレイ
５    マイクロ流体チャネル
６，１３    ＰＤＭＳ膜
７    マイクロチャンバー
８    細胞
９    溶液
１０    細胞内物質（細胞内容物）
１１    シリコンウェハ
１３′    ＰＤＭＳのポリマー前駆体
１４    流入穴
１５    排出穴
【図１】
0005804620.tif 000002
【図２】
0005804620.tif 000003
【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図４】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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