(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バシラス・（Ｂ．）メタノリカスにおいてＬ−リシンを生産する方法であって、アスパルトキナーゼＩＩＩ（ＡＫＩＩＩ）酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を該Ｂ．メタノリカスに導入し、ＡＫＩＩＩ酵素を過剰発現させるようにすることを含み、該ヌクレオチド配列が、
（ｉ）配列番号３にて示されるヌクレオチド配列、配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３と縮重するヌクレオチド配列であるか、
（ｉｉ）配列番号４にて示されるアミノ酸配列または配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である、
方法。
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列が、
（ｉ）配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であるか、
（ｉｉ）配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＡＫＩＩＩがアスパラギン酸経路の生産物によるフィードバック阻害に対して感受性がある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＡＫＩＩＩがアスパラギン酸経路の生産物によるフィードバック阻害に対して抵抗性がある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｂ．メタノリカスが、野生型のＢ．メタノリカスである、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｂ．メタノリカスが、栄養要求性株であるか、またはリシンアナログに対して抵抗性を有する変異体である、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＡＫＩＩＩが、前記Ｂ．メタノリカスにおける他の遺伝子の発現または過剰発現とともに、過剰発現される、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＡＫＩＩＩをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が、非ネイティブプロモーターから発現される、請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記プロモーターが、強力なプロモーターである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヌクレオチドの発現が、転写抑制に支配されていない、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
アスパルトキナーゼＩＩＩ（ＡＫＩＩＩ）酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を導入することによって改変されている、ＡＫＩＩＩ酵素を過剰発現するバシラス・（Ｂ．）メタノリカスであって、該ヌクレオチド配列が、
（ｉ）配列番号３にて示されるヌクレオチド配列、配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３と縮重するヌクレオチド配列であるか、
（ｉｉ）配列番号４にて示されるアミノ酸配列または配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である、
Ｂ．メタノリカス。
【請求項１２】
前記ヌクレオチド配列が、
（ｉ）配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列であるか、
（ｉｉ）配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である、
請求項１１に記載のＢ．メタノリカス。
【請求項１３】
前記ＡＫＩＩＩがアスパラギン酸経路の生産物によるフィードバック阻害に対して感受性がある、請求項１１または１２に記載のＢ．メタノリカス。
【請求項１４】
前記ＡＫＩＩＩがアスパラギン酸経路の生産物によるフィードバック阻害に対して抵抗性がある、請求項１１または１２に記載のＢ．メタノリカス。
【請求項１５】
前記Ｂ．メタノリカスが、野生型のＢ．メタノリカスである、請求項１１〜１４の何れか一項に記載のＢ．メタノリカス。
【請求項１６】
前記Ｂ．メタノリカスが、栄養要求性株であるか、またはリシンアナログに対して抵抗性を有する変異体である、請求項１１〜１４の何れか一項に記載のＢ．メタノリカス。
【請求項１７】
前記Ｂ．メタノリカスにおいて、前記ＡＫＩＩＩが、他の遺伝子の発現または過剰発現とともに、過剰発現される、請求項１１〜１６の何れか一項に記載のＢ．メタノリカス。
【請求項１８】
前記ＡＫＩＩＩをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が、非ネイティブプロモーターから発現される、請求項１１〜１７の何れか一項に記載のＢ．メタノリカス。
【請求項１９】
前記プロモーターが、強力なプロモーターである、請求項１８に記載のＢ．メタノリカス。
【請求項２０】
前記ヌクレオチドの発現が、転写抑制に支配されていない、請求項１８または１９に記載のＢ．メタノリカス。
【請求項２１】
アスパルトキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、
（ｉ）配列番号３にて示されるヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号３にて示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）配列番号３のヌクレオチド配列と縮重するヌクレオチド配列、
（ｉｖ）アミノ酸配列が配列番号４で示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｖ）配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および
（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖ）の何れか１つのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチドの配列を含む、または該配列からなる核酸分子。
【請求項２２】
前記ヌクレオチド配列が、
（ｉｉ）配列番号３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であるか、
（ｖ）配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である、
請求項２１に記載の核酸分子。
【請求項２３】
アスパルトキナーゼ活性を有し、
（ｉ）配列番号４で示されるアミノ酸配列、および
（ｉｉ）配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸の配列を含む、または該配列からなるポリペプチド。
【請求項２４】
配列番号４にて示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、または該配列からなる、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
非ネイティブプロモーターに作動可能なように連結されている、請求項２１または２２において規定された核酸分子を含む構築物。
【請求項２６】
請求項２１または２２において規定された核酸分子または請求項２５において規定された構築物を含むベクター。
【請求項２７】
請求項２１，２２，２５または２６の何れか一項に記載の核酸分子、構築物またはベクターが導入された宿主微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メタノールおよびその他の基質からのＬ−リシンの微生物生産に関し、特にこのような基質からのＬ−リシンの生産を向上することに関する。特に、本発明の方法は、生産する微生物において、アスパルトキナーゼＩＩＩ（ＡＫＩＩＩ）酵素の過剰発現を含むもので、上記微生物は好ましくはバシルスメタノカリスであってもよい。また、ＡＫＩＩＩをコードする遺伝子を発現するために、たとえば、当該遺伝子由来ではない （すなわち、異種である）プロモーターの制御下において、微生物を改変することで、このことは達成される。このように、該微生物は天然にて、（内在的な）ＡＫＩＩＩを発現するにもかかわらず、このＡＫＩＩＩまたはその他のＡＫＩＩＩの更なるコピー（つまり、より多く）が発現されてもよいし、または、たとえば、遺伝子変異および、ついで適切な選択によって、微生物が改変されて、ＡＫＩＩＩを過剰発現してもよい。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸は、量および価値において生物工学における主要な製品の一つであり、世界的な市場は拡大している。これらは、食品および飼料のサプリメント、医薬品、化粧品、ポリマー材料および農業化学品として使用される（Ikeda (2003) Amino acid productuin Processes In: Faurieら.、(Eds) Advances in Biochemical Engineering Biotechnology: Volume 79、Microbial production of L-amino acids. Springer:ベルリン、ハイデルベルグ、ニューヨーク; Marx ら.、 (2006) Protein line and amino acid-based product family trees. In: Kamm ら.、 Biorefineries - industrial processes and products. Status quo and future directions. Wiley- VCH:ベインハイムpp. 201-216）。微生物発酵は、工業的生産のために使用される主要な方法であり、現在、使用されている最も重要な微生物はコリネバクテリアであり、糖類を使用するものである。最も重要な工業上のアミノ酸の産生体は、現在では、バクテリアであるコリネバクテリウム・グルタミカムであり、該バクテリアは、年間約２００万トンのアミノ酸を生産し、１００万トン超、６０万トン超の、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リシンをそれぞれ生産する（Eggeling ら、(2005)、Handbook of Corynebacterium glutamicum. TaylorおよびFrancis: Boca Raton）。Ｃ．グルタミカム発酵のための基質は、通常、農作物に由来する糖類である。
【０００３】
アミノ酸に対する増加する世界的需要があり、それゆえ、発酵における原料としての代替基質を利用する可能性も、相当の関心が寄せられている。単炭素（Ｃ１）化合物は、幅広く自然界に存在しており、生物工学的観点および大規模化学的観点から、メタンおよびエタノールは、最も重要なＣ１化合物の２種である（Lintonら、(1987) Antonie Van Leeuwenhoek、53:55-63）。糖蜜と比べると、たとえば、メタノールは、バクテリアの発酵中において十分に利用できる純粋な原材料である。
【０００４】
メチロトローフ類は、メタンやメタノールなどのＣ−Ｃ結合を欠く還元された 化合物で増殖できる好気性または嫌気性の両方の微生物を幅広く含むものである（Anthony (1982) The biochemistry of methylotrophs. Academic Press: New York; Large ら、(1988) Methylotrophy and biotechnology. Wiley: ニューヨーク）。偏性メチロトローフ類は、Ｃ１化合物を唯一の炭素源およびエネルギー源として専ら利用できる一方、条件的 メチロトローフ類（facultative methylotrophs）はＣ１化合物および多炭素化合物の両方を利用できるものである。多くのメチロトローフ類のための遺伝学的ツールは確立されており、個別にアミノ酸の過剰発現に至らせるようなメチロトローフの応用は、Ｌ−セリン（Izumiら、(1993) Appl. Microbiol. Biotechnol.、39:427-432;Hagishitaら、(1996) Biosci. Biotechnol. Biochem.、60:1604-1610）、Ｌ−スレオニン（Motoyamaら、(1994) Appl. Microbiol. Biotechnol.、42: 67-72）、Ｌ−グルタミン酸（Motoyamaら、(1993) Biotechnol. Biochem.、57: 82-87）、およびＬ−リシン（Motayamaら、(2001) Appl. Environ. Microbiol.、 67: 3064-3070）を含めて、報告されている。たとえば、グラム陰性偏性メチトローフであるメチロフィラス・メチロトロファスでは、Ｌ−リシン阻害において制御解除されるジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする変異遺伝子の発現は、３７℃で約１ｇ／ｌまでＬ−リシン合成の増加を引き起こした（Tsujimotoら、(2006) J. Biotechnol.、124: 327-337）。Ｌ−リシントランスポーターをコードする変異遺伝子を共発現することで、メタノールからＬ−リシンを１１．３ｇ／ｌ分泌する組換え菌体である菌株ＡＳｌ（ｐＳＥＡ１０）を得た（Gunjiら (2006) J Biotechnol.、 127(1): 1-13）。グラム陰性偏性メチロトローフであるメチロバシラス・グリコゲネスの組換え変異体であるＡＬｌ１９（ｐＤＹＯＭ４−２）は、Ｌ−リシン阻害において部分的に制御解除されたジヒドロジピコリン酸合成酵素を過剰発現し、３７℃でメタノールから約８ｇ／ｌのＬ−リシンおよび３７ｇ／ｌのＬ−グルタミン酸を生産することが報告されている（Motayamaら、(2001）、上記)。このような先行技術にもかかわらず、商業的な、メタノールに基づくアミノ酸の工業生産方法は、現時点では存在していないと考えられている。
【０００５】
メチロトロフィック・サーモトレラント・バクテリウムであるＢ．メタノリカスは、メタノールをアミノ酸へ生物変換する有望な候補として挙げられる（Brautasetら、(2007) Appl. Microbiol. Biotechnol.、 74: 22-34）。Ｂ．メタノリカスの好適な特性としては、高い温度における芽胞形成の欠如、エネルギー源および炭素源としてのメタノールの利用、高いメタノール変換率および５０℃の好適な増殖温度が挙げられる。ランダム化学的変異発生によって生み出されたＢ．メタノリカス変異体は、Ｌ−リシンを３７ｇ／ｌまで生産することが報告されている（Schendel ら、(1990) Appl. Environ. Microbiol.、56: 963-970）。メタノールは魅力的な基質として挙げられるが、Ｂ．メタノリカスは、糖類（たとえば、マンニトール）のような、そのほかの多炭素基質も利用し得る。したがって、Ｂ．メタノリカスは、基質に関係なく（つまり、必ずしも基質としてメタノールを使用しないでも）、「宿主」すなわちＬ−リシン生産のための生物体としても関心がもたれる。
【０００６】
Ｌ−リシンは、Ｌ−メチオニンおよびＬ−スレオニンの生合成経路を含むアスパラギン酸経路の一部として、Ｌ−アスパラギン酸から合成される（図１）。アスパラギン酸経路の第一ステップは、  アスパルトキナーゼ（「ＡＫ」；ＡＴＰ：４−Ｌ−アスパラギン酸−４−ホスホトランスフェラーゼ）によって制御される。この酵素は、一般的に、アスパラギン酸経路の生産物によって、酵素活性（阻害）および酵素合成（抑制）の両方において、強くフィードバック制御されている。ＡＫの制御解除（つまり酵素活性阻害の除去）は、商業的なＬ−リシンを生産する菌株の開発においては最も重要なステップであることが報告され（Pfefferleら、 (2003) Biotechnological manufacture of lysine. In: Faurie ら.、 (Eds) Advances in Biochemical Engineering Biotechnology: Volume 79、 Microbial production of L-amino acids. Springer: Berlin、 Heidelberg、ニューヨーク、 pp. 59-112）、さらには、Ｂ．メタノカリスにおけるＬ−リシンの生産をさらに改善する代謝工学的手法が、Ｌ−リシン生合成経路の鍵となる酵素の制御解除に傾注すべき旨が言われている（Brautasetら、(2007)、上記）。事実、商業的なＬ−リシン生産体であるＣ．グルタミカムにおいて、ＡＫフィードバック阻害（つまり、アロステリック阻害への耐性）の制御解除を引き起こす多くの好適な変異体が報告されている（Ohnishiら、(2002) Appl. Microbiol. Biotechnol.、58:217-223; Eggelingら、(2005)上記; Jakobsenら、(2006) J. Bacterid.、 188(8): 3063-3072); Cremer ら、 (1991) Appl. Environ. Microbiol.、 57(6): 1746-1752; Jetten ら、 (1995) Appl. Microbiol. Biotechnol.、 43(1): 76-82）。
【０００７】
Ｃ．グルタミカムが単一のＡＫ酵素を有している一方、詳細に研究されたＢ．サブチルスは、３種類のＡＫアイソザイム、すなわちＡＫＩ、ＡＫＩＩおよびＡＫＩＩＩを有することが知られている。Ｂ．サブチルスでのＬ−リシン生産におけるＡＫに対する操作による効果についての研究へは、一般的に、殆ど注意がはらわれていなかった。典型的な変異導入とそれに続く選択操作によって微生物的Ｌ−リシンの過剰生産体を創出するのに、Ｌ−リシンアナログであるＳ−（２−アミノエチル）システイン（ＡＥＣ）は広く使用されてきた。Ｂ．サブチルスにおいてＡＫＩおよびＡＫＩＩにおけるフィードバック阻害の減少が実証されているが、Ｌ−リシン生産の改善は報告されていない（Zhang ら.、 (1990) J. Bacteriol.、172(8): 4690-4693）。一部のＡＥＣ−抵抗性のＢ．サブチルスにおける変異は、ｌｙｓＣ（ＡＫＩＩをコードする）の５´非翻訳ＲＮＡリーダー配列に位置しており、抑制の低減やＬ−リシン生産の増加に関連があるものである。しかしながら、このような変異によって顕著なＬ−リシンの生産（１ｇ／ｌを超える）は、報告されていない（Vold ら、 (1975) J. Bacteriol.、 121(3): 970-974）。本発明者らは、Ｌ−リシンの生産を増加に至るサブチルス中のＡＫＩＩＩの変異を開示する如何なる報告も知っていない。
【０００８】
現時点では、Ｂ．メタノリカスにおいては、ＡＫＩＩをコードするｌｙｓＣのみが知られている（Schendelら、 (1992) Appl. Environ. Microbiol.、 58(9): 2806-2814）。以下により詳細に議論するように、本発明者らによって、Ｂ．メタノリカスにおけるＡＫＩ（ｄａｐＧ）およびＡＫＩＩＩ（ｙｃｌＭ）をコードする遺伝子のクローニングおよび配列決定によって、本発明はさらに進展した。
【０００９】
上記にて議論されたように、Ｌ−リシンの微生物生産を増加させるための取り組みは、主に、経路の産物によるアロステリック阻害に抵抗性があるＡＫ変異体を用いることによる、ＡＫの制御 解除に集中したものであった。Ｌ−リシンの生産を顕著に増加させることにおいて、野生型のＡＫを使用して成功したという報告はない。野生型のＡＫをコードするＣ．グルタミカム遺伝子を、Ｃ．グルタミカムにおけるプラスミドから発現させた場合、Ｌ−リシンは全く生産されなかった。しかしながら、変異したフィードバック抵抗性のＡＫを発現するプラスミドで形質転換したＣ．グルタミカムにおいて、Ｌ−リシンは生産され、このことは、前者の場合では野生型のＡＫのフィードバック感受性がＬ−リシンの生産の欠如の原因となっている ことを示唆するものである（Cremerら、(1991)、上記）。別の研究においては、異種のプロモーターから野生型ＡＫをコードする遺伝子が発現されるプラスミドを保有するＣ．グルタミカムは、規定の培地にて増殖できなかった（Koffasら、(2003) Metab.Eng.、5(1): 32-41）。Ｃ．グルタミカム（Ｂ．フラバム と称されている）における、ネイティブなプロモーターからＡＫをコードする遺伝子を過剰発現させることに関する試験では、ＡＥＣ抵抗性でＬ−リシンを過剰発現しているＣ．グルタミカムにおいては、Ｌ−リシンの生産で３３％の増加が観察されたのに対し、野生型の菌株を使用した場合、増加が全くないことが報告されていた（Luら、(1994) Biotechnol. Lett.、16(5): 449-454）。フィードバックに感受性がある野生型ＡＫをネイティブに発現するＣ．グルタミカム菌株において、フィードバックに抵抗性のあるＡＫをコードする遺伝子を過剰発現した場合、Ｌ−リシン合成のフラックスに２０％の増加が観察された（Huaら、(2000) J. Biosc. Bioeng.、90(2):184-192）。したがってこれまでは、ＡＫの制御解除がＬ−リシンを過剰発現する菌株を開発する際に重要なステップとなるという、本技術分野における上述の見解に一致して、たとえば、ＡＫ酵素活性における経路生産物のフィードバック阻害効果のために、野生型のＡＫの過剰発現ではＬ−リシンの生産における顕著な増加を達成するには不十分であると考えられていた。上記にて言及したように、結果として抑制が低減されるにもかかわらず、変異がｌｙｓＣ（ＡＫＩＩをコードする）の５´ＵＴＲに位置するＢ．サブチルスＡＥＣ−抵抗性変異体には、高いＬ−リシンの生産が実証されなかった（Vold ら.、(1975)、上記; Mattioli ら.、(1979) J. Gen. Microbiol.、 114: 223-225）。
【発明の概要】
【００１０】
驚くべきことに、本発明者らは、ＡＫＩＩＩをコードするｙｃｌＭ遺伝子の過剰発現が、結果として、顕著なＬ−リシンの生産の増加に至ることを見出した。特筆すべきは、この結果は、フィードバック阻害に制御される酵素である野生型酵素をコードする遺伝子を用いても達成され得ることである。ＡＫＩＩＩ遺伝子に対して非ネイティブかつ強力なプロモーターを用いたｙｃｌＭ遺伝子（つまり、外来より導入されたｙｃｌＭ遺伝子）の発現によって、ｙｃｌＭを過剰発現させることで、ＡＫＩＩＩのフィードバック阻害−抵抗性変異体を使用するようなことは求められずに、６０倍に増加したＬ−リシンの生産が達成された。このような顕著な増加は、ＡＫＩ（ｄａｐＧ）またはＡＫＩＩ（ｌｙｓＣ）では観察されず、それらを用いたものは、Ｌ−リシンの生産においてずっと少ない増加（それぞれ、２倍および１０倍）が観察された。それゆえ、この効果は、ＡＫＩＩＩアイソフォームに特徴的なものである。ＡＫＩＩＩの過剰発現の効果は、特に、メタノールおよび糖類の両方の基質についてＢ．メタノリカスにおいて実証されている。それゆえ、ＡＫＩＩＩの過剰発現は、それがどのような方法で達成されようとも、微生物におけるリシン生産を増加するための機構を示すことが提案される。
【００１１】
以下に議論するように、本発明は、部分的には、Ｂ．メタノリカスのｙｃｌＭ（ＡＫＩＩＩをコードする）およびｄａｐＧ（ＡＫＩをコードする）遺伝子の本発明者らによるクローニングから生じたものである。Ｂ．メタノリカスのＡＫＩＩＩを使用して、Ｂメタノリカスの宿主生物体でもその他の生物体でも過剰発現を達成してもよい。野生型のＢ．メタノリカスにおいて強力かつ非ネイティブのプロモーターから野生型のＢ．メタノリカスＡＫＩＩＩを過剰発現した場合、特に、Ｌ−リシンの生産において目覚ましい増加が観察される。単一の遺伝子（ｙｃｌＭ）のみの過剰発現が、このような効果を達成することは驚くべきことである。かかる増加は、Ｌ−リシンの生産経路に関連するその他の改変または変異を含まない野生型の宿主において観察され得る。このことは、特にＡＫＩＩＩアイソフォームの発現でＬ−リシンの生産を増加することおよび、Ｂ．メタノリカスにおける任意の遺伝子のＬ−リシンの生産を増加することに成功した 過剰発現に関する最初の報告である。
【００１２】
野生型の宿主において観察されるように、たとえば６０倍までというような、得られうる増加の程度は驚くべきことであり、予期されることはできないものであった。本発明の以前は、３３％および２０％（すなわち、１．５倍未満）のＬ−リシンの生産における増加のみが、Ｃ．グルタミカムにおいて達成されているにすぎなかった。
【００１３】
上述のように、ＡＫＩＩＩ遺伝子の過剰発現は、結果として、Ｌ−リシンの生産において、一桁大きい 増加をもたらし、このことは予見できなかったものである。本発明は、このように、Ｌ−リシンの増加する需要を充足することに貢献するにあたって、明らかに大きな価値があるものである。特に、Ｂ．メタノリカスは、原料としてメタノールおよびその他の基質（すなわち、糖類のようなその他の炭素源）を用いてＬ−リシンを生産するための宿主として有益に使用され得る。
それゆえに、一態様においては、本発明は、Ｂ．メタノリカスにおいてＬ−リシンを生産させる方法であって、該方法は、該Ｂ．メタノリカスにおいてＡＫＩＩＩ酵素を過剰発現することを含むものである。ＡＫＩＩＩ酵素は、ｙｃｌＭ遺伝子にコードされるＡＫ活性を有する酵素として定義されてもよい。
【００１４】
別の視点で見ると、本発明のこの態様は、Ｂ．メタノリカスにおいてＬ−リシンの生産を増加させるための方法であって、該方法は、該Ｂ．メタノリカスにおいてＡＫＩＩＩ酵素を過剰発現することを含む。
【００１５】
このような本発明の態様の方法は、リシンが生産され得る条件下において、メタノールを含むがこれに限定されない、基質として所望の炭素源を使用して、Ｂ．メタノリカスを培養するか、または増殖させるものである。ＡＫＩＩＩを過剰発現するように改変された（たとえば、ＡＫＩＩＩが宿主細胞で過剰発現するように、たとえばＡＫＩＩＩ酵素をコードする遺伝子をＢ．メタノリカス宿主細胞に導入すること、
Ｂ．メタノリカス宿主細胞をランダムに変異させて、ＡＫＩＩＩを過剰発現する変異体を選択すること、または、内在性のＡＫＩＩＩの過剰発現を達成する部位特異的 またはその他の突然変異導入によって、改良されたまたは変異した）Ｂ．メタノリカス宿主細胞を使用してもよい。本発明の方法は、一実施態様においては、外来的に導入されたＡＫＩＩＩをコードする遺伝子、特にはｙｃｌＭ遺伝子を含むＢ．メタノリカス宿主細胞（すなわちＡＫＩＩＩをコードする遺伝子で形質転換されたＢ．メタノリカス）を培養するか、または増殖させることを含んでいてもよい。
【００１６】
その他の態様においては、本発明は、ＡＫＩＩＩ酵素を過剰発現するＢ．メタノリカス生物体を提供するものである。
【００１７】
より具体的には、本発明のこの態様は、ＡＫＩＩＩ酵素を過剰発よう改変されているＢ．メタノリカス生物体を提供する。特定の一実施態様においては、このような改変は、ＡＫＩＩＩ酵素をコードする遺伝子（より一般的に置き換えると、核酸遺伝子）、特にはｙｃｌＭ遺伝子を導入することを含んでもよい。
【００１８】
ＡＫＩＩＩ酵素は、任意の生物源に由来するＡＫＩＩＩ酵素であってもよく、、文献において報告された公知の酵素、所望の生物源からクローニングされた非公知の酵素、両方とも挙げられる。ＡＫＩＩＩに言及するときは 、Ｂ．メタノリカスのＡＫＩＩＩの機能または活性を有する酵素や、Ｂ．メタノリカスのｙｃｌＭに対して、アミノ酸配列の同一性もしくは類似性に基づいて、またはコードする核酸配列の同一性または類似性によって、Ｂ．メタノリカスに相同的に相当するものと考えられる酵素が挙げられる。一つの態様においては、上記ＡＫＩＩＩ酵素は、ｙｃｌＭ遺伝子によってコードされた、ＡＫ活性を有する酵素である。ここで、以下に詳説するように、Ｂ．メタノリカスのＡＫＩＩＩを使用してもよい。配列番号３および４にて示される、Ｂ．メタノリカスにおけるネイティブ（「野生型」）のＡＫＩＩＩ／ｙｃｌＭまたは、配列番号３および／または４に機能的に等価であるＡＫＩＩＩ／ｙｃｌＭ配列、たとえば、これらの配列に対して（たとえば、以下に示される％配列類似性または同一性によって表現される）相同性を有し、ＡＫＩＩＩ活性を有するポリペプチドを示すまたはコードする該配列が挙げられる。これには、ｙｃｌＭ／ＡＫＩＩＩの「バリアント」、たとえば、フィードバック抵抗性の変異体に例示されるＡＫＩＩＩ活性を保持している変異蛋白質をコードする、またはその変異蛋白質であるバリアントも含まれる。アスパルトキナーゼ活性が、本発明によって過剰発現された蛋白質の必須なものである一方、改変された特性を有するがＡＫ活性を保持している蛋白質配列の使用、たとえば、フィードバック阻害に抵抗性のあるＡＫＩＩＩ変異体の非野生型のＡＫＩＩＩの蛋白質配列の使用を通じて、Ｌ−リシン生産の増加における利点が得られることは明らかであろう。このように、本発明の驚くべき利点は、Ｌ−リシンの生産における予測しえない増加が、野生型のＡＫＩＩＩ配列の過剰発現、すなわち、野生型のＡＫＩＩＩの機能的特性を有するＡＫＩＩＩのフィードバック阻害、特には、（たとえば、アスパラギン酸経路の生産物、たとえばリシンおよび／またはスレオニンなどによる）フィードバック阻害に対して感受性があるＡＫＩＩＩの過剰発現によって得ることができる一方、特定のＡＫＩＩＩ「バリアント」の使用、たとえばフィードバック阻害に抵抗性があるバリアントの使用を通じて、この効果を向上させることが望ましい。ＡＫＩＩＩは、任意の適切な生物体、特に微生物またはバクテリアの生物体、さらに特にはバシラス属から、得られたものであってもよいし、またはこれらに由来するものであってもよい。本発明によって使用されてもよい代表的なＡＫＩＩＩは、Ｂ．サブチルス、Ｂ．リチェニホルミス、Ｂ．ハロドランス、Ｂ．アミロリクファシエンスまたはリステリア イノキュアから得られたものまたはこれらに由来するものである
（たとえば、以下を参照。
Kunstら、1997、Nature、390、249-256（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＣ＿０００９６４）にて開示されるバシラス サブチルス亜種サブチルス菌株１６８のＡＫＩＩＩ（配列番号：５）；
Reyら、2004、Genome Biol.、5、R77（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＣ＿００６２７０）にて開示されるバシラス リチェニホルミスＡＴＣＣ １４５８０（ＤＳＭ１３）のＡＫＩＩＩ（配列番号：６）；
Takamiら、2000、Nucleic Acids Res．、２８、４３１７−４３３１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＣ＿００２５７０）にて開示されるバシラス ハロドランス Ｃ−１２５（配列番号：７）；
Chen、ら、2007、Nat. Biotechnol.、２５、１００７−１０１４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＣＰ０００５６０）にて開示されるバシラス アミロリクファシエンス ＦＺＢ４２のＡＫＩＩＩ（配列番号：８）；または
Glaserら、2001、Science 294、849-852（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＬ５９６１７２）にて開示されるリステリア イノキュア Ｃｌｉｐｌ １２６２のＡＫＩＩＩ（配列番号：９））。
上記にて言及されたＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、全ゲノムのためのものであることから、ＡＫＩＩＩ配列の関連物については、特に、ＡＫＩＩＩをコードするそれらの一部、すなわち、ＧｅｎＢａｎｋの寄託において含まれる配列を参照すべきことが留意されよう。
【００１９】
このような公知のＡＫＩＩＩに「由来する」ＡＫＩＩＩとしては、上記遺伝子またはヌクレオチド配列のバリアントまたはフラグメント（一部）によって、たとえば、公開または寄託された配列に対して少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％またはこれら以上の配列同一性を有するバリアントによってコードされた酵素が挙げられる。代わりに、このようなＡＫＩＩＩは、公開／寄託されたアミノ酸配列すなわち公開／寄託された核酸配列のアミノ酸翻訳物に対して、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％またはこれら以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有しているものでもよい。公開／寄託されたヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の「部分体」は、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％またはこれら以上の連続的なヌクレオチドまたはアミノ酸を含有または含むものであってもよい。特には、ＡＫＩＩＩは、以下に詳説するような、Ｂ．メタノリカスのＡＫＩＩＩであるか、またはそれに由来するＡＫＩＩＩであってもよい。特に好ましくは、ＡＫＩＩＩは、野生型であるか、または、フィードバック阻害に対して感受性があるものであり、すなわち、酵素活性に関して規制解除された 酵素ではないものである。ＡＫＩＩＩ酵素が、温度安定性であること、たとえば、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃または８０℃までの温度において操作可能であるものも好ましい。
【００２０】
Ｂ．メタノリカスは、本発明によるリシンの生産のための好適な微生物であるが、リシン生産の増加におけるＡＫＩＩＩの過剰発現の効果は、この生物体に限られたことではなく、他の微生物宿主に広く当てはまる。換言すれば、任意の微生物がリシン生産のための生物体として使用され得る。
【００２１】
このように、別の態様においては、本発明は、微生物においてＬ−リシンを生産する方法であって、該微生物において、この微生物の内在的なＡＫＩＩＩ遺伝子または以下に規定されるＡＫＩＩＩ酵素を過剰発現させることを含む方法を提供するものである。
【００２２】
（ｉ）配列番号３にて示されるヌクレオチド配列の全てもしくは一部でコードされるか、または配列番号３に対して少なくとも５０％の同一性（特には、配列番号３に対して、少なくとも５５、６０、６５、７０または７５％の配列同一性）を有するヌクレオチドの全てもしくは一部でコードされるＡＫＩＩＩ、または
高いストリジェンシー条件（０．ｌｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、洗浄条件：２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、次いで、０．ｌｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃）の下で、配列番号３の相補体とハイブリダイズするヌクレオチド配列または配列番号３のヌクレオチド配列と縮重するヌクレオチド配列でコードされるＡＫＩＩＩ、
（ｉｉ）配列番号４にて示されるアミノ酸配列の全てもしくは一部を含むＡＫＩＩＩか、または、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性（特には、配列番号４に対して、５５、６０、６５、７０、７５または８０％の配列同一性）を有するアミノ酸配列のＡＫＩＩＩ。
【００２３】
本発明におけるこの態様の方法は、このように、ＡＫＩＩＩ酵素を過剰発現する所望の微生物を、リシンが生産され得る条件下において、所望の炭素源／基質を用いて培養するか、または増殖させる方法である。該微生物は、宿主細胞に、上記にて規定されたようなヌクレオチド配列を含む核酸分子または、上記にて規定されたようなＡＫＩＩＩをコードする核酸分子を導入することで、ＡＫＩＩＩを過剰発現するように改変されていてもよい。次いで、該微生物を、該ヌクレオチド配列が発現する条件下で培養するか、または増殖させてもよい。別の態様においては、本発明は、該微生物の内在的なＡＫＩＩＩ遺伝子または以下に規定されるＡＫＩＩＩ酵素を過剰発現する微生物を提供する。
（ｉ）配列番号３にて示されるヌクレオチド配列の全てもしくは一部でコードされるか、または配列番号３に対して少なくとも５０％の同一性（特には、配列番号３に対して、少なくとも５５、６０、６５、７０または７５％の配列同一性）を有するヌクレオチド でコードされるＡＫＩＩＩ、または
高いストリジェンシー条件（０．ｌｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、洗浄条件：２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、次いで、０．ｌｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃）の下で、配列番号３の相補体とハイブリダイズするヌクレオチド配列または配列番号３のヌクレオチド配列と縮重するヌクレオチド配列でコードされるＡＫＩＩＩであるか、
（ｉｉ）配列番号４にて示されるアミノ酸配列の全てもしくは一部を含むＡＫＩＩＩまたは、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性（特には、配列番号４に対して、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５または８０％の配列同一性）を有するアミノ酸配列の全てもしくは一部を含むＡＫＩＩＩ。
【００２４】
さらに、特には、本発明の本態様は、改変されて、上記にて規定したように、ＡＫＩＩＩ遺伝子すなわち酵素を過剰発現する微生物を提供する。特定の一実施態様に、このような改変は、上記にて規定したように、該微生物にＡＫＩＩＩ酵素をコードする核酸分子を導入することも含まれる。
【００２５】
したがって、このような核酸分子は、ＡＫＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードし、以下のヌクレオチド配列を含むものであってもよいし、該配列からなるものであってもよい。
（ｉ）配列番号３にて示されるヌクレオチド配列；
（ｉｉ）配列番号３にて示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも５０％の配列同一性、特には少なくとも、５０、５５、６０、６５、７０、７５、７７、７９、８０、８１、８３、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９３、９５、９７、９８または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）高いストリジェントなハイブリダイゼーション条件（０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６５℃および洗浄条件：２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、次いで、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃） 下、配列番号３の相補体とハイブリダイズするヌクレオチド配列
（ｉｖ）配列番号３のヌクレオチド配列と、縮合するヌクレオチド配列；
（ｖ）  配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｖｉ）上記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）または（ｖ）のヌクレオチド配列の一部であるヌクレオチド配列。
【００２６】
なお、核酸分子／ヌクレオチド配列およびＡＫＩＩＩのアミノ酸配列の部分体 は、さらに以下に規定される。
【００２７】
このように、改変されて（または「改良されて」）ＡＫＩＩＩを過剰発現する微生物は、上記にて規定されるような、外来的に導入されたＡＫＩＩＩをコードする核酸分子を含んでいてもよい（該生物体は、ＡＫＩＩＩをコードする核酸分子で形質転換されたものであってもよい）。該核酸分子は、上記宿主と同種または異種のもの（すなわち、ネイティブまたは非ネイティブ）であるＡＫＩＩＩをコードするものであってもよい。このように、宿主にネイティブである遺伝子の単一（または複数の）更なるコピーを、導入してもよい。導入される核酸分子は、ネイティブ遺伝子または異なる生物源に由来するヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
【００２８】
代わりに、生産する微生物における「内在性の」ＡＫＩＩＩを過剰発現してもよい。「内在性の」ＡＫＩＩＩとは、上記微生物において、内在性のＡＫＩＩＩをコードする遺伝子（すなわち、該生物体に存在する遺伝子）の発現の結果、生産されるＡＫＩＩＩを意味する。このように、この場合では、ＡＫＩＩＩをコードする外来性の核酸分子を導入せずに、微生物において天然に存在している遺伝子配列のみが発現する（この微生物は、もちろん、たとえばランダムまたは部位特異的な変異導入によって改変されていてもよいが）。ランダム変異導入および選択によって過剰発現を達成することは可能であり、ここで、ネイティブのＡＫＩＩＩ遺伝子（改変または変異されていない配列）を過剰発現する変異体が得られる。したがって、ＡＫＩＩＩを過剰発現する微生物を、このような方法で改変（たとえば変異）して、該生物体のゲノム中に天然に含まれるネイティブの遺伝子（改変されてもよいし、されていなくてもよい配列）の過剰発現を達成してもよい。これは、微生物における、たとえば、制御エレメント（たとえば、プロモーターもしくはその他の転写制御エレメントまたは翻訳制御エレメントや制御蛋白質等）の変異によるものであってもよく、このことは、たとえば、上記微生物におけるネイティブのＡＫＩＩＩをコードする遺伝子（たとえば、ｙｃｌＭ遺伝子）における転写の増加に至らしめる。
【００２９】
本発明の第一の態様に関連して、上記にて議論したように、過剰発現するＡＫＩＩＩは、野生型のバリアントであってもよいし、フィードバック阻害抵抗性の変異を含むネイティブ配列のバリアントであってもよい。
【００３０】
生産する微生物は、所望の、微生物、真核生物または原核生物であってもよいが、好ましくはバクテリアである。特には、限定はされないが、以下の綱または属で例示されるバクテリアであってもよい：バシラス、ゲオバシラス、メタノモナス、メチロバシラス、メチロフィリウス、シュードモナス、プロタミノバクター、メチロコッカスおよびリステリア。バシラス属 は、特に有益であり、限定はされないが、具体的には、Ｂ．メタノリカス、Ｂ．サブチルス、Ｂ．アミロリクファシエンス、Ｂ．クラウシィ、Ｂ．セレウス、Ｂ．ハロドランス、Ｂ．ｓｐ．ＮＲＲＬＢ−１４９１１およびＢ．リチェニホルミスが挙げられる。
【００３１】
該生物体は、耐熱性または好熱性であること、たとえば、５０〜７０℃で、たとえば５０〜６０℃で増殖できることが好ましい。
【００３２】
特に好適な実施態様においては、該微生物は、上記にて述べたように、Ｂ．メタノリカスである。該本発明によってＡＫＩＩＩが過剰発現されるＢ．メタノリカスまたはその他の微生物は、任意の生物体の菌株、たとえばＢ．メタノリカスの菌株であってもよい。このように、ネイティブまたは野生型の菌株でもあり得るし、改変または変異導入された菌株もあり得る。Ｂ．メタノリカスまたはその他の微生物は、たとえばＡＥＣのようなリシンアナログに対する栄養要求性体または抵抗性の変異体を含め、任意の遺伝的バックグラウンドを有するものもあり得る。特定の遺伝的バックグラウンドにおける、たとえばＬ−リシンの生産がすでに上昇している菌株、たとえばＡＥＣ抵抗性菌株や典型的な変異導入によって得られたリシンを過剰発現する変異体、またはその他の方法において改良された菌株における、本発明の使用を通じて、有利にＬ−リシンの生産は増加することが容易に理解されよう。しかしながら、上記にて議論したように、本発明は、宿主として野生型の微生物、具体的には野生型のＢ．メタノリカスを有益に使用せしめ、このことは、可能性のある実施態様の一つを例示するものである。代表的なＢ．メタノリカス菌株としては、Ｂ．メタノリカスＭＧＡ３が挙げられる。そのほかのＢ．メタノリカスの野生型菌株としては、以下のようなものが挙げられる：ＰＢ１（ＮＣＩＭＢ  １３１１３）、ＮＯＡ２(Schendelら.、(1990)、上記)、ＨＥＮ９、ＴＳＬ３２、ＤＦＳ２、ＣＦＳ、ＲＣＰ、ＳＣ６、ＮＩＷＡ、ＢＶＤ、ＤＧＳ、ＪＣＰ、Ｎ２（Brautasetら、(2004)J.BacterioL、186(5):1229-1238）およびＢ．メタノリカス変異体１３Ａ５２−８Ａ６６(Hansonら、(1996) Production of L-lysine and some other amino acids by mutants of B.methanocus. In: Lidstromら.、Microbial growth on C1 compounds.Kluwer Academic Publishers：ドートレヒト、オランダ国)。上記にて述べたように、リシンを過剰発現する変異体は、本技術分野において公知または開示される、典型的な変異導入法によって得られる。
【００３３】
微生物内でその他の遺伝子の発現または過剰発現と組み合わせて、ＡＫＩＩＩを発現してもよい。このようなその他の遺伝子は、図１で示されるリシンの生合成経路のその他の遺伝子、たとえば、ａｓｄ、ｄａｐＡ、ｌｙｓＡであってもよい。以下の実施例２において示されるように、この方法においては、リシンの生産をさらに向上させ得る。
【００３４】
本明細書にて言及されるように、「過剰発現」は、ＡＫＩＩＩをコードする遺伝子の発現が、本発明によって改変されていない微生物において生じる発現レベル、たとえば、微生物（たとえば、Ｂ．メタノリカス）におけるネイティブのＡＫＩＩＩをコードする（ｙｃｌＭ）ゲノム（たとえば染色体）の遺伝子座 から駆動される発現のレベル（それがネイティブのＡＫＩＩＩを発現するものであれば ）、またはコントロール菌株、たとえばコントロールとして改変されているがＡＫＩＩＩ遺伝子を過剰発現しない菌株（たとえば、「空」ベクターまたはコントロール配列を有するベクターを含む菌株）において見られる発現レベルに比べて、すなわち該発現レベルに相対して、増加されていることを意味する。遺伝子発現は、生産される蛋白質産物（ＡＫＩＩＩ）の量に関して考慮されるべきものであり、これは、本技術分野において知られた簡便な方法によって定量されてもよい。たとえば、発現は、蛋白質の活性（すなわち、発現されたＡＫＩＩＩ蛋白質の活性）を測定することで定量できる。代替法としては、生産された蛋白質の量を、たとえば、ウェスタンブロット法もしくはその他の抗体検出系または蛋白質を評価するまたは定量するような、任意方法によって測定して、発現のレベルを同定することができる。リアルタイムＰＣＲも使用されてもよい。このアッセイは、インビボでのアッセイであってもよいし、またはインビトロでのアッセイであってもよい。このように、発現（たとえば、ＡＫＩＩＩの比活性の検出によって同定された発現）は、ネイティブ（すなわち、内在的な）ＡＫＩＩＩをコードする遺伝子からの結果よりも２、３もしくは４倍またはそれ以上であってもよいが、その他の系またはそのほかの条件下においてはより少なくてもよい。
【００３５】
たとえば、以下の実施例にて詳述されたような本技術分野において知られ、かつ文献において開示された手順によりアスパルトキナーゼ活性を評価することで、ＡＫＩＩＩ活性を同定してもよい。このように、BlackおよびWright（Blackら.、(1955) J. Biol. Chem.、213:27-38）にて開示されるように、ヒドロキシアミンからアスパルチルヒドロキサム酸 の形成を評価することで、コード化された蛋白質のＡＫ活性を同定することができる。
【００３６】
本発明によれば、「過剰発現すること」とは、単に、宿主内に内在的に存在しているネイティブのＡＫＩＩＩ遺伝子（ｙｃｌＭ）を超えて、追加されたＡＫＩＩＩ遺伝子が、宿主内で発現していることを意味してもよいが、このような機構に限定されるものではない。また、このような遺伝子を先天的に含まない生物体の中でＡＫＩＩＩ遺伝子を発現することも含まれる。
【００３７】
本明細書において定義されるように、ＡＫＩＩＩ酵素を過剰発現することは、ＡＫＩＩＩをコードする遺伝子（または、より一般的には、ヌクレオチド配列を含む核酸分子）を、たとえば、ネイティブ遺伝子に対してより強力なまたは制御解除 されたプロモーターから発現させる上記遺伝子のコピーを導入すること、および／またはＡＫＩＩＩをコードする核酸分子／遺伝子の複数のコピーを導入することによるような、本技術分野において知られている手段によるものである。
【００３８】
本発明は、一つの実施態様において、ＡＫＩＩＩ遺伝子が、たとえばアスパラギン酸経路の生産物または内在的なＡＫＩＩＩ遺伝子の抑制因子による示される、転写抑制に支配されずに、発現する方法を提供するものであってもよい。
【００３９】
たとえば、転写抑制因子の認識エレメントを変異または欠失することや、ＡＫＩＩＩ遺伝子の発現を通常制御する、たとえばネイティブの状態において発現を制御する、転写制御因子（因子群）による転写制御で支配されていない発現制御エレメント（たとえばプロモーター）、例としてはアスパラギン酸経路の産物である転写抑制因子を用いることによって、転写抑制の解除されるように、導入された遺伝子（遺伝子群）を改変してもよい。このような方法で、またはより強力なプロモーターの追加によって、代替的または追加的に、内在的なＡＫＩＩＩをコードする遺伝子は改変されてもよい。したがって、変異導入（ランダムも部位特異的なものも含む）を、たとえば、内在的なＡＫＩＩＩ遺伝子の発現を増加する（たとえば、転写および／または翻訳を増加する）よう内在性の調節または制御 エレメントを変異させるために、使用してもよい。代わりに、生物体を改良して、代替のまたは追加の制御エレメントを導入してもよい。
【００４０】
特定の実施態様においては、ＡＫＩＩＩをコードする遺伝子は、非ネイティブすなわち異種のプロモーター（つまり、ＡＫＩＩＩをコードする遺伝子に対して異種であるプロモーター、すなわちネイティブでないＡＫＩＩＩ遺伝子のプロモーター）および特に強力な非ネイティブのプロモーターすなわち異種プロモーターから発現されるものであってもよい。したがって、本実施態様においては、ＡＫＩＩＩをコードする遺伝子は、そのネイティブなプロモーターとともに使用されるものではない。また、非天然プロモーターの制御下にあるＡＫＩＩＩをコードする遺伝子が導入されてもよい。本明細書にて言及するように、強力なプロモーターは、高いレベルで、または少なくともネイティブのプロモーターによって実施されるよりも高いレベルで、遺伝子を発現するものである。「強力なプロモーター」との用語は、本技術分野において周知かつ広く使用されている用語であり、多くの強力なプロモーターは、本技術分野においては公知のものであるか、あるいは、ルーチンな実験によって同定できるものである。
【００４１】
抑制エレメントの少なくとも一部は、ネイティブのプロモーター領域に位置するので、非天然プロモーターの使用は、転写抑制からＡＫＩＩＩをコードする遺伝子を解除する効果を有利に有する。ネイティブプロモーターを、経路産物の効果に応答する抑制エレメントを欠く非ネイティブプロモーターで置換することで、ＡＫＩＩＩをコードする遺伝子は、少なくとも部分的には、転写抑制が解除されるであろう。
【００４２】
好適な実施態様においては、非ネイティブプロモーターは、Ｂ．メタノリカスにネイティブなものである。代わりに、該プロモーターはメタノールデヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）プロモーターである。
【００４３】
特に好適な態様において、非ネイティブプロモーターはＢ．メタノリカスのメタノールデヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）プロモーターである。Ｂ．メタノリカスにおいて機能性があるその他のプロモーターついては、任意の公知のＢ．メタノリカス遺伝子のプロモーターが含まれる。以下のプロモーターは実験的に特性が調べられている。
既に開示のｐＢＭ１９の配列（Brautasetら、(2004)、上記）由来の、ｇｌｐＸ、ｆｂａ、ｐｆｋ、ｒｐｅプロモーター、既に開示のｈｐｓ＋ｐｈｉオペロンの配列（Brautasetら、(2004)、上記）由来の、ｈｐｓプロモーター。バシラス属については一般的に、近接種（例：バシリ目）に由来する任意のプロモーターが使用されてもよい。Ｂ．メタノリカスおよびその他の微生物の両方において使用され得るその他の微生物に由来するプロモーターは、本技術分野において周知なものであり、文献において広く記載されている。
【００４４】
代わりとして、ＡＫＩＩＩ遺伝子を、ネイティブのプロモーターを用いて発現してもよい。本発明は、内在的にＡＫＩＩＩ遺伝子を発現し得る微生物（Ｂ．メタノリカスなど）または発現しない微生物の使用も包含する。前者の場合、ネイティブの遺伝子もしくはその変異体または別のＡＫＩＩＩ遺伝子またはコーディング遺伝子の１以上の追加コピーを導入してもよく、ネイティブのまたは非ネイティブののプロモーターの下、これらを導入してもよい。ネイティブのプロモーターがあれば、たとえば、多コピーベクターを使用してもよい。後者の場合では、宿主に対しては異種なものであるＡＫＩＩＩ遺伝子（またはコードする核酸分子）を導入するが、その遺伝子は、コードする核酸分子が派生するＡＫＩＩＩ遺伝子に対してネイティブまたは非ネイティブであるプロモーターの制御下にあってもよい。
【００４５】
上述のように、外来性のＡＫＩＩＩ構築物を欠損する対照 に対して、６０倍まであるいはそれ以上のＬ−リシン生産における増加が、野生型Ｂ．メタノリカス宿主中のＢ．メタノリカスｍｄｈプロモーターに由来する、野生型Ｂ．メタノリカスＡＫＩＩＩの過剰発現によって得られ得る。しかしながら、この増加は、使用される具体的な系およびそのＬ−リシン生産の「ベースライン」のレベルに依存して、著しく変わってくることが理解されよう。このように、Ｌ−リシン生産における、６０、７０、８０、９０もしくは１００倍またはそれ以上の増加を得られ得る。同様に、Ｌ−リシンの生産のベースラインレベルが、たとえば、非野生型のＬ−リシン生産のバックグラウンドとの関係において、相対的に高い場合、得られ得る増加はあまり劇的なものではないものの、実用上の価値がある。したがって、Ｌ−リシンの生産は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０もしくは５０倍、またはそれよりも多いものであってもよい。
【００４６】
このように、本発明は、特に高い増加が見られ得る野生型の宿主を使用した場合、特に、得られるリシンの生産にて高い増加を可能にするものである。ＡＫＩＩＩ、特に本明細書において開示するようなＢ．メタリノカスのＡＫＩＩＩ（またはＡＫＩもしくはＡＫＩＩ）が微生物内で過剰発現された場合、驚くべきことに、Ｌ−リシンを専ら生産することが見出された。このことは、Ｂ．メタノリカスＡＫＩＩＩ遺伝子（ｙｃｌＭ）を用いたＢ．メタノリカスにおける以下の実施例において実証されている。Ｌ−スレオニンおよびＬ−メチオニンいずれもＬ−アスパラギン酸経路によって生産されるが、本発明の方法によりＬ−リシンが唯一合成されることは予期し得なかった ものであり、本発明の前においては予想 できなかったものである。理論に束縛されることを望まないが、本発明に基づくＬ−リシンの生産における驚くベき高い増加に関して、可能性のある説明としては、ＡＫＩＩＩは、特にＢ．メタノリカスのＡＫＩＩＩは、フィードバック阻害のためにＬ−リシンとＬ−スレオニンの両方を必要としているのかもしれないことが挙げられる。Ｂ．サブチルスにおけるＡＫＩＩＩは、フィードバック阻害のためにＬ−リシンとＬ−スレオニンとの両方を必要とするものとして、報告されている（Schendelら、(1992)上記）。Ｂ．メタノリカスのＡＫＩＩＩは精製されておらず、生化学的なキャラクタリゼーションがなされていなく、そのため、このことが、Ｂ．メタノリカスにおけるＡＫＩＩＩを含むＡＫの過剰発現によって専らＬ−リシンが生産されるという驚くべき観察を考慮した 場合、野生型ｙｃｌＭ遺伝子の使用にも関わらずフィードバック阻害が生じないかもしれない 、という事例であるとは、確証をもって 言えないことである。
【００４７】
遺伝子すなわち核酸分子を導入する方法は、本技術分野においては周知で、文献において広く開示されているものであり、所望の方法を使用してもよい。このように、遺伝子（核酸分子）はベクターを用いて導入されてもよく、該ベクターは、自己複製型のベクターであってもよいし、あるいは遺伝子（核酸分子）を宿主のゲノム（たとえば染色体）に組み込ませることのできるベクターであってもよい。発現される該遺伝子（核酸分子）を発現ベクターに導入し、該発現ベクターを、これらを宿主細胞に導入してもよい。発現ベクターを構築し、該ベクターを宿主細胞に導入する方法は、本技術分野では周知なものである。便宜的には、ＡＫＩＩＩをコードする遺伝子はプラスミドベクターを用いて導入してもよく、宿主微生物、たとえばメタノリカスは、たとえばエレクトロポレーションによって該プラスミドで形質転換してもよい。核酸およびベクターを微生物に導入する方法は周知で、文献において広く開示されている。方法の選択は使用される微生物に依存するものである。Brautasetら、2007（上記）において開示されているように、遺伝子をＢ．メタリノカスへ導入する方法および、このような方法において使用される適切なプラスミド等は、本技術分野においては公知であり、利用することができる。Jakobsenら、2006（上記）によって開示されたようなＥ．コリ―Ｂ．サブチルス・シャトルプラスミドｐＨＰ１３に基づいたベクターについて、特に言及することができる。Cueら、1997(Appl. Environ. Microbiol.、 63: 1406-1420)で報告されるプラスミドＰＤＱ５０３、ＰＤＱ５０７、ＰＤＱ５０８、およびＰＥＮ１も参考にしてもよい。本明細書にて例示されるように、Ｂ．メタノリカス宿主の場合、ｍｄｈ遺伝子を含んでいるものであるプラスミドｐＴＢ１．９ｍｄｈは、ｍｄｈプロモーターの制御下にある遺伝子の導入用のベクターとして、簡便に使用され得る。
【００４８】
リシンを生産するために、本発明に基づいて改変された宿主生物を、所望のまたは適切な基質を用いて、リシンを生産するようにする条件下で培養するか、または増殖させてもよい。基質または原資の存在下で、たとえば、基質を含むまたは基質が添加された増殖培地において、この宿主細胞を増殖させてもよい。Ｂ．メタノリカスを増殖させる方法および条件は、公知なものであり、本技術分野において説明されており、以下の実施例１において例示されている。リシン生産に使用される基質すなわち炭素源は、適宜選択された基質であり、使用される微生物によるものである。このように、適切な基質は、今日の技術分野において公知で使用される任意の炭素源であってもよく、たとえば、多糖類または単糖類（たとえば、グルコース、その他のヘキソース糖類、ペントース糖類）、酸（たとえば、酢酸）、アミノ酸（たとえば、グルタミン酸）、単炭素化合物（たとえば、メタノール、メタン）および複雑な粗製材料（たとえば、糖蜜、タンパク質加水分解物）が挙げられる。上記基質は、精製すなわち「単離」された状態で提供されてもよいし、あるいは、別の商業的または工業的過程における副生成物などのように、粗製の、すなわち未精製の混合物や部分的に精製された混合物の一部としてで提供されてもよい。Ｂ．メタノリカスのようなメチロトローフ系である場合、メタノールが基質として使用され得る。しかしながら、たとえば、マンニトール、グルコース、マルトース、リボース、酢酸、グルタミン酸、α―ケトグルタル酸といった、使用されてもよい糖類のような、その他の基質においても、Ｂ．メタノリカスは増殖する（Schendelら、1990、上記）。ＡＫＩＩＩを過剰発現するように改良されたＢ．メタノリカスの基質としてマンニトールを使用することが、以下に例示されている。高いレベルのリシン生産が達成され、メタノールを用いて得られるリシンのレベルさえも超越していることが見られる。
【００４９】
上述のように、初期の 発明は、Ｂ．メタノリカスノＡＫＩＩＩをコードする遺伝子であるｙｃｌＭの、本発明者らによる初めてのクローニングによって、部分的に可能になったものである。本発明者らは、Ｂ．メタノリカスのＡＫＩをコードする遺伝子であるｄａｐＧも初めてクローニングしている。このことは、Ｂ．メタノリカスのＡＫＩＩをコードする、ｌｙｓＣを結果として同定に至るような努力にもかかわらず、以前は達成されていなかったものである（Schendelら、(1992)、上記）。Ｂ．メタノリカスｄａｐＧおよびｙｃｌＭの核酸配列は、それぞれ配列番号１および３に示される一方、コードされた蛋白質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２および４に示される。
【００５０】
このように、本発明は、
（ｉ）配列番号１または３に示されるヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号１にて示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性、特には少なくとも８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号３にて示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも７５％の配列同一性、特には少なくとも７７、７９、８０、８１、８３、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９３、９５、９７、９８または９９％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｖ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃であるハイブリダイゼーション条件および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄条件、次いで、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃（高いストリジェントな条件）の下、（ｉ）の相補体とハイブリダイズするヌクレオチド配列、
（ｖ）配列番号１または３のヌクレオチド配列と縮重するヌクレオチド配列、
（ｖｉ）配列番号１もしくは３のヌクレオチド配列の一部、または配列番号１もしくは３の配列と縮重するヌクレオチド配列の一部であるヌクレオチド配列
（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）の何れか１つのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、または該配列からなる、ＡＫ活性を有するポリペプチド（または蛋白質）をコードする核酸分子を、好ましくは単離された該核酸分子を提供する。
【００５１】
別に表明すると、本発明は、
（ｉ）アミノ酸配列が配列番号２または４で示されるポリペプチドの全てまたは一部をコードするヌクレオチド配列；
（ｉｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドの全てまたは一部をコードするヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有するポリペプチドを全てまたは一部をコードするヌクレオチド配列；および
（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の何れか１つのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、または該配列からなる、ＡＫ活性を有するポリペプチド（または蛋白質）をコードする核酸分子を、好ましくは単離された該核酸分子を提供する。
【００５２】
上記核酸分子は、好ましくは、ＡＫＩまたはＡＫＩＩＩあるいはＡＫ活性を有するこれらの一部であるポリペプチドまたは蛋白質をコードするか、をコードするものである。
【００５３】
好ましくは、上記の（ｉ）〜（ｖ）部または（ｉ）〜（ｉｉｉ）部にて定義されたような核酸分子（すなわち、（ｖｉ）部または（ｉｖ）部の「相補」分子を含まない）は、配列番号２および４のアミノ酸配列によって定義されるような、ＡＫＩおよびＡＫＩＩＩ酵素の機能もしくは活性または特性を有するか、あるいは保持しているポリペプチドまたは蛋白質をコードするものである。
【００５４】
「ポリペプチド」および「蛋白質」との用語は、本明細書では交互に使用され、アミノ酸鎖の任意の長さのもの（すなわち、任意のアミノ酸のポリマーまたはオリゴマー）も含む。
【００５５】
上記にて注釈したように、本発明は、上記にて規定されたヌクレオチドの一部または機能的断片にも広く当てはまり、これらは、上記にて規定した全長タンパク質と同一または実質的に同一の活性を有する蛋白質またはポリペプチドをコードする部分体またはフラグメントを意味する。このような部分体またはフラグメントでコードされたタンパク質／ポリペプチドが、上記にて規定された全長のポリペプチド／蛋白質と同一のまたは実質的に同一の活性（例えば、触媒活性すなわち酵素活性）を有するか否かを決定するための試験は、上記にて議論した内容を含むものである。通常、核酸分子の部分体または機能的フラブメントは、たとえば、蛋白質のＮ末端をコードする５´末端、蛋白質のＣ末端をコードする３´末端、またはコード領域内部における、全長核酸分子に対して小さな欠失、たとえば５０、４０、３０、２０または１０よりも少ないヌクレオチドの欠失を有するものであるが、フラグメントが、上記にて記載された全長蛋白質と同一または実質的に同一の活性（たとえば、触媒活性すなわち酵素活性）を有するのであれば、たとえば少なくとも６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００もしくは７００ヌクレオチドより大きな欠失、または、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００もしくは７００ヌクレオチドよりも小さな欠失が実施されてもよい。コードされたポリペプチドまたは蛋白質の活性を容易に試験して、たとえば上記にて説明したような全長ポリペプチドまたは蛋白質と同一の活性を共有するか否かを決定できる。
【００５６】
代表的な部分体またはフラグメントは、配列番号１または３で示されるヌクレオチド配列における、少なくとも５０％、好ましくは示される少なくとも６０、７０、７５、８０、８５、９０または９５％の連続配列を含むものである。たとえば、配列番号３のｙｃｌＭ配列の場合、この部分体またはフラグメントは、少なくとも６８４、８２１、９５７、１０２６、１０９４、１１６３、１２３１または１３００のヌクレオチド長である。配列番号１のｄａｐＧ配列の場合、この部分体またはフラグメントは、少なくとも６２１、７４５、８６９、９３１、９９４、１０５６、１１１８または１１７８のヌクレオチド長である。例示される部分体またはフラグメントのサイズとしては、たとえば、６２０、７００、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０および１３００ヌクレオチドが挙げられる。
【００５７】
本発明にかかる核酸分子のより短いフラグメントを、たとえば、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーション・プロトコールのためのプローブとして使用することができる。このより短いフラグメントは、たとえば、１０〜３０、２０〜２５ヌクレオチドの長さであってもよい。このようなプローブは、本発明の核酸分子と相同性を共有する更なる核酸分子を同定するためのプロトコールにおいて有用である。
【００５８】
本明細書にて使用されるような「核酸分子」との用語は、単鎖または重鎖となっている、合成の、非天然のまたは改変されたヌクレオチド塩基を任意で 含む、ＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを指す。このようなポリヌクレオチドの例としては、とりわけ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびｄｓＲＮＡが挙げられる。好ましくは、核酸分子はＤＮＡである。
【００５９】
本明細書にて言及される核酸配列は、チミジン（「ｔ」）ヌクレオチドを含むものの、本発明は、チミジンがウリジン（「ｕ」）に置換された対応配列に関することも理解されよう。
【００６０】
本発明は、配列番号１および３の核酸分子のバリアントである核酸分子、特には機能的に等価なバリアントである核酸分子を含む。「バリアント」核酸分子は、配列番号１および３の核酸分子に比べて、単一または複数のヌクレオチドの変化を有する。たとえば、該バリアントは、１、２、３、４もしくは５またはそれ以上のヌクレオチドの付加、置換、挿入または欠失を有していてもよい。
【００６１】
さらなる態様においては、本発明は、ＡＫ活性を有し、
（ｉ）配列番号２または４で示されるアミノ酸配列の全てまたは一部；
（ｉｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性を、好ましくは少なくとも９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列の全てまたは一部；、および
（ｉｉｉ）配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性を、好ましくは少なくとも８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列の全てまたは一部；
からなる群から選択されるアミノ酸の配列を含むか、または該配列からなる蛋白質（またはポリペプチド）を提供するものである。
【００６２】
上記蛋白質またはポリペプチドは、好ましくは、ＡＫＩもしくはＡＫＩＩＩまたはＡＫ活性を有するそれらの部分体である。特には、該部分体は、該部分体が由来するＡＫＩまたはＡＫＩＩＩ（配列番号２および４のアミノ酸配列を参照して規定されるようなもの）における特性の機能または活性を保持している。
【００６３】
該蛋白質またはポリペプチドは、コードする核酸配列を参照して別に規定されていてもよく、そのような本発明の蛋白質またはポリペプチドは、上述された本発明の核酸分子の何れかにコードされ得る。
【００６４】
本発明は、全長タンパク質分子の機能的な部分体またはフラグメントにも広く当てはまり、該部分体またはフラグメントは、上記にて定義された全長タンパク質と同一または実質的に同一の活性を有することを意味する。すなわち、それらは機能的に等価なバリアントであるとみなされる。本明細書の何れかにて注釈されているように、該特性は、単純な手段によって、多様な方法で試験され得る。通常、これらの機能的フラグメントには、全長タンパク質分子に対して小さい、たとえば、５０、４０、３０、２０または１０アミノ酸未満のアミノ酸の欠失があるのみであるが、上記核酸分子に関して述べたように、大きな欠失、たとえば、６０、７０、８０、９０、１００、１５０または２００までの アミノ酸の欠失あるいは少なくとも ６０、７０、８０、９０、１００、１５０または２００までのアミノ酸の欠失も適切なものとなり得る 。すべての場合において、該フラグメントは、上記に規定したような全長タンパク質と同一のまたは実質的に同一の活性を有すべきであり、すなわち、これらは、機能的に等価なバリアントとしてみなされるべきものである。これらの欠失は、Ｎ末端、Ｃ末端におけるものであってもよいし、内部の欠失であってもよい。
【００６５】
代表的な部分体またはフラグメントは、配列番号２または４にて示されるアミノ酸配列における、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０、７０、７５、８０、８５、９０または９５％の連続的なアミノ酸を含むものである。たとえば、配列番号４のｙｃｌＭ配列の場合、この部分体またはフラグメントは、少なくとも、２２７、３１８、３４１、３６４、３８７、４０９または４３２のアミノ酸長である。配列番号２のＤａｐＧ配列の場合、この部分体またはフラグメントは、少なくとも２０６、２４８、２８９、３１０、３３０、３５１、３７２または３９２アミノ酸長である。例示される部分体またはフラグメントのサイズとしては、少なくとも、２００、２２０、２３０、２５０、３００、３３０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０および４３０のアミノ酸が挙げられる。
【００６６】
上記にて規定したような本発明の蛋白質としては、配列番号２および４の配列のバリアント、たとえば、列挙した配列に対してある程度の水準の同一性を有する配列が挙げられる。このようなバリアントは、同程度の蛋白質、すなわちその他の種において見出されるホモログ、特には、その他の微生物中に見出されるバリアント（本明細書の何れかの箇所にて規定したようなコード化された蛋白質の機能的特性を共有する。）のような天然バリアントであってもよい。
【００６７】
たとえば、本技術分野において公知である標準的な分子生物学的技術、たとえば部位特異的変異導入またはランダム変異導入（たとえば、遺伝子シャッフリングまたはエラープローンＰＣＲ）のような公知の変異導入技術 を用いて、本明細書にて規定されるような天然蛋白質のバリアントは、合成的に創出することができる。このような変異導入技術を、改善されたまたは異なる触媒特性を有する酵素を開発するために使用することができる。
【００６８】
本明細書にて規定されたような蛋白質の誘導体も使用され得る。誘導体とは、天然アミノ酸の代わりに、アミノ酸の構造的類似体 を含む上記にて説明したような蛋白質またはそのバリアントを意味する。該蛋白質の機能に悪影響を与えない限り、誘導体化や修飾（たとえば、蛋白質中におけるアミノ酸の標識化、糖化、メチル化）が生じていてもよい。
【００６９】
「構造的類似体」とは、非標準アミノ酸を意味するものである。使用され得るこのような非標準アミノ酸すなわち構造的類似体のアミノ酸は、Ｄアミノ酸、アミドイソエステル（Ｎ−メチルアミド、反転アミド、チオアミド、チオエステル、ホスホネート、ケトメチレン、ヒドロキシメチレン、フルオロビニル、（Ｅ）−ビニル、メチレンアミノ、メチレンチオまたはアルカンなど）、Ｌ−Ｎメチルアミノ酸、Ｄ−［α］メチルアミノ酸またはＤ−Ｎ−メチルアミノ酸である。
【００７０】
配列同一性は、簡便な方法によって評価されてもよい。しかしながら、配列間の配列同一性の程度を決定するためには、配列のマルチプルアラインメントをするコンピュータープログラム、たとえばＣｌｕｓｔａｌＷ（Thompson ら、 (1994)Nucleic Acids Res.22:4673-4680）が便利である。ＡＬＩＧＮ（Myersら、(1988) CABIOS、 4: 11-17)、ＦＡＳＴＡ（Pearsonら、(1988) PNAS、85:2444-2448; Pearson (1990)、Methods Enzymol.、 183: 63-98）およびギャップド ＢＬＡＳＴ（Altschul ら、 (1997) Nucleic Acids Res.、 25: 3389-3402）のような、配列のペアを対比してアラインするプログラムは、この目的のためには便利である。さらに、欧州生命情報学研究所におけるＤａｌｉサーバーは、蛋白質配列の構造に基づくアラインメントを提供するものである（Holm (1993) J. MoI. Biol.、233:123-38;Holm (1995) Trends Biochem. Sci.、20:478-480; Holm (1998) Nucleic Acid Res.、26: 316-9）。
【００７１】
マルチプル配列アラインメントおよびパーセント同一性の計算値は、標準的なＢＬＡＳＴパラメーターを用いて（利用可能な全生物からの配列、マトリックスＢｌｏｓｕｍ ６２、ギャップコスト：存在 １１、延長 １を用いて）決定される。それとは別に、以下のプログラムおよびパラメーターも使用される：
プログラム：Ａｌｉｇｎ Ｐｌｕｓ ４、バージョン４．１０（Sci Ed Central Clone Manager Professional Suite）
ＤＮＡ対比：全体対比、標準線形スコアリングマトリックス、ミスマッチペナルティー＝２、オープンギャップペナルティー＝４、拡張ギャップペナルティー＝１
アミノ酸対比：全体対比、ＢＬＯＳＵＭ ６２ スコアリングマトリックス。
【００７２】
本発明のさらなる態様は、非ネイティブプロモーター、特に強力な非ネイティブプロモーター、好ましくはＢ．メタノリカスのｍｄｈプロモーターに制御可能なように結合された、本発明の単離されたＡＫＩＩＩをコードする核酸分子（すなわち、配列番号３の核酸および上記にて規定の、関連配列または誘導配列）を含む構築物を提供する。所望により 、該構築物は、追加的に、更なる１つ以上の遺伝子および／または１つ以上の適切な制御配列を含むものである。任意の更なる１つ以上の遺伝子は、本発明のＡＫＩＩＩをコードする核酸分子と同様のプロモーターの制御下にあってもよい。好適な１つ以上の制御配列は、非ネイティブの制御配列である。
【００７３】
この発明の内容においては、「制御可能なように結合された」との用語は、一方の機能が他方を影響を与える、単一の核酸フラグメント中の２つ以上の核酸分子の関連を指す。たとえば、プロモーターは、コーディング配列の発現に影響を与えることができる場合（つまり、コーディング配列が、プロモーターの転写制御下にある場合）、コーディング配列に制御可能なように結合されている。コーディング配列は、制御配列に、センス方向またはアンチセンス方向にて制御可能なように結合されていてもよい。
【００７４】
「制御配列」との用語は、コーディング配列の上流（５´非コーディング配列）、内部、または下流（３´非コーディング配列）に位置するヌクレオチド配列であり、転写、ＲＮＡプロセッシングもしくはＲＮＡ安定性、または関連するコーディング配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。制御配列としては、プロモーター、オペレーター、エンハンサーおよび翻訳リーダー配列が挙げられる。本明細書にて使用されるように、「プロモーター」との用語は、コーディング配列またはＲＮＡの発現を制御できるヌクレオチド配列を指す。一般的に、コーディング配列は、プロモーター配列に対して３´位に位置する。プロモーターは、そのもの全体としてネイティブの遺伝子に由来するものであってもよいし、天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成されるものであってもよく、さらに、合成ヌクレオチドセグメントを含むものであってもよい。殆どの場合、制御配列の正確な境界は完全には特定できていないので、異なる長さの核酸フラグメントは、同一のプロモーター活性を保持し得ることが認識される。
【００７５】
本発明の更なる実施態様は、上記にて規定した核酸分子または公知物を含むベクターを提供する。
【００７６】
特には、本発明のＡＫＩＩＩをコードする核酸分子（または本発明の構築物）を含むベクターが構築され得る。ベクターの選択は、微生物、宿主細胞を形質転換するのに使用される方法、蛋白質発現に使用される方法またはその他のベクターの意図的な使用に依存するものである。当業者ならば、問題なく形質転換し、本発明のＡＫＩＩＩをコードする核酸分子または構築物を含む宿主細胞を選択して増殖させるために、ベクターに存在すべき遺伝子エレメントについては十分に認識しているものである。当業者ならば、形質転換イベントは結果として発現の異なるレベルおよびパターンに至り、そのため、所望の発現レベルおよびパターンを示す細胞を得るためには複数のイベントをスクリーニングしなければならないことも、認識しているものである。このようなスクリーニングは、とりわけ、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、蛋白質発現のウェスタン分析によって達成されてもよいことを当業者ならば認識するであろう。
【００７７】
本発明は、更に、本発明の核酸分子、構築物またはベクターの１以上を含む、特にはＡＫＩＩＩをコードする核酸分子を含み、それゆえＡＫＩＩＩを過剰発現することができる核酸分子、構築物またはベクターの１以上を含む微生物すなわち宿主、特にはＢ．メタノリカスを提供する。宿主微生物（たとえばＢ．メタノリカス）は、内在的に、本発明のＡＫＩＩＩをコードする核酸を含んでいてもよいし、あるいは含んでいなくてもよい。何れの場合においても、ＡＫＩＩＩの発現を変更するために遺伝的に操作される。このことは、たとえば、非ネイティブのプロモーター、好ましくは強力なプロモーター制御下にある、本発明におけるＡＫＩＩＩをコードする核酸の１以上のコピーを導入することで達成され得る。上記の両方の場合においても、遺伝的物質は、宿主の生物体に存在し、天然の生物体には存在していない（すなわち、外来性の遺伝的物質が存在している。）。
【００７８】
一般的に、外来性の遺伝的物質は、形質転換の工程を用いて導入される。この形質転換は、典型的には、形質転換できた微生物の同定を可能にするためのマーカー、たとえば抗生物質耐性遺伝子（たとえば、アンピシリンに対する遺伝子）も含む、プラスミドまたはその他のベクターを必要とするだろう 。形質転換体を選択するためのその他の方法は、当業者には公知であり、たとえば、光感受性ベクターであるｌｕｘ遺伝子の使用が挙げられ、この遺伝子は、暗下においてポジティブコロニーに発光させる。バクテリアの形質転換のための、その他の適切なビヒクルとしては、コスミドおよびバクテリオファージ分子が挙げられる。
【００７９】
上述したように、本発明の方法は、特に、Ｌ−リシンの商業的または工業的生産において有用性を見出すものである。好ましい態様においては、それゆえ、Ｌ−リシンの生産またはＬ−リシンの発現の増加の方法は、生産スケールの工程に関するものであり、すなわち、これらは研究室での試験よりもむしろ、生産スケールまたは工業的スケールにおいて実施される。これらの工程は、バイオリアクタ―または発酵槽、特には生産スケールでのバイオリアクタ―または発酵槽におけるものが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
本発明を、以下の限定するものではない実施例においてより詳細に説明するが、ここで、
【図１】図１は、アスパラギン酸経路の一般概要を示すものである（Paulus (1993) Biosynthesis of the Aspartate Family of amino acids. In: Sonenshein (Ed)  Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria: biochemistry,physiology and molecular genetics.American Society for Microbiology: ワシントンD.C.）。最終生産物の主要な代謝機能を括弧内に示す。本作業において配列決定され、提示されたＢ．メタノリカス遺伝子は下線で示される。；
【図２】図２は、Ｂ．メタノリカスＭＧＡ３における部分的なｄａｐオペロンおよびｙｃｌＭの遺伝子構成を、Ｂ．サブチルスにおける相当する遺伝子と比較して示す。；
【図３】図３は、Ｂ．メタノリカスＭＧＡ３とｄａｐＧ、ｌｙｓＣおよびｙｃｌＭを過剰発現する組換え菌株との振とうフラスコ培養の粗抽出物のＡＫの比活性を示す。全ての酵素比活性は、インビトロにおいて測定されて、コントロール菌株ＭＧＡ３（ｐＨＰ１３）（１として規定）の比活性に対して相対的なものである。ＭＧＡ３（ｐＨＰ１３）における測定されたＡＫの比活性は、０．０５Ｕ／ｍｇ蛋白質であった。；
【図４】さらに図４は、Ａ：野生型ＭＧＡ３およびコントロール菌株ＭＧＡ３（ｐＨＰ１３）の発酵トライアル、Ｂ：ｄａｐＧ、ｌｙｓＣまたはｙｃｌＭを過剰発現する組換えＭＧＡ３菌株の発酵トライアルにおける、増殖およびＬ−リシンの生産を示す。黒塗り記号（Filled symbols）：乾燥細胞重量、白塗り記号（Empty symbols）：Ｌ−リシンの生産（体積補正値）。発酵中では、メタノールを自動的に供給することで、培地のメタノールレベルを１５０ｍＭに維持した。
【実施例】
【００８１】
［実施例１］
材料および方法
生物学的材料、ＤＮＡ操作および増殖条件
本研究にて使用された菌株およびプラスミドを、表１にて列挙する。
【００８２】
エシェリヒア・コリＤＨ５ａを、標準的なクローニング宿主として使用し、クロラムフェニコール（１５μｇ／ｍｌ）が適宜添加された液状または固体状ルリア−ベルターニ培地において、組換え株を３７℃で増殖した。組換えＥ．コリの手順を、他に開示されたように実施した（Sambrookら、(1989)Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: コールドスプリングハーバー、ニューヨーク）。また、Ｂ．メタノリカスにおける形質転換を、以前より開示されているように、エレクトロポレーションにて実施した（Jakobsenら、(2006)、上記）。
【００８３】
また、振とうフラスコ培養物 に関しては、Ｂ．メタノリカス株を、２００ｍＭメタノールを含むＭｅＯＨ２００培地１００ｍｌにおいて、５０℃で増殖し（Jakobsenら、(2006)、上記）、細菌の増殖を、６００ｎｍ（ＯＤ６００）における光学密度を測定することで観察した。
【００８４】
初期体積０．９１でＡｐｐｌｉｋｏｎ３ｌ 発酵槽中にて、発酵を実施した。この培地は、ＵＭＮ１培地と定義されており、４．０９ｇ／ｌのＫ２ＨＰＯ４、１．３０ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４、２．１１ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２５ｇ／ｌの酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）、６ｍｇ／ｌのｄ−ビオチン、０．０１ｍｇ／ｌのビタミンＢ１２、１ｍＭのＭｇＳＯ４、１ｍｌ／ｌの濃縮金属溶液（Ｌｅｅら、１９９６）、１５０ｍＭのメタノールを含むものである。また、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍｌ）を適宜添加した。ＭｅＯＨ２００培地における振とうフラスコ培養物を、接種材料（ｉｎｏｃｕｌｕｍ）として使用し、ＯＤ６００＝１．１〜１．３で回収した。回収時における接種材料のＯＤ６００（１．１〜１．３）で除算された７５ｍｌに相当の培養体積で、発酵槽を接種した。また、４００ｒｐｍの初期攪拌および０．５ＶＶＭのエアレーションで、５０℃にて該発酵を実行した。該エアレーションは、段階的に１．０ＶＶＭまで増加され、酸素要求が上昇するに合せて、空気を段階的に６０％Ｏ２まで高めた。常に 、溶存酸素を、２，０００ｒｐｍまでの攪拌スピードの自動調節によって３０％飽和状態に維持した。また、１２．５％（ｗ／ｖ）ＮＨ３の自動添加（典型的には、２００〜２５０ｍｌ）によって、ｐＨを６．５に維持した。泡消剤（Sigma Antifoam 204）を、０．００５％（ｖ／ｖ）の初期濃度で添加し、必要に応じて、発酵中においても添加した（典型的には３ｍｌ）。発酵槽におけるメタノール濃度を、マススペクトロメーター（Balzers Omnistar GSD 300 02）によるヘッドスペースガスのオンライン分析によって観察した。また、６０℃まで加熱された絶縁ステンレス鋼管内で、発酵槽からマススペクトロメーターに、約３０ｍｌ／分の流速で、ヘッドスペースガスを移送した。該培地中におけるメタノール濃度を、メタノールの要求に応じて、ＭｅＯＨ供給液の自動添加によって１５０ｍＭに維持した。ＭｅＯＨ供給液は、１リットルのメタノールあたり、５０ｍｌのCKNFD Trace Metalsを含むものである。このCKNFD Trace Metalsは、344 mMのMgCl２、７８．５ｍＭのＦｅＣｌ２、５０．５ｍＭのＭｎＣｌ２、１．５３ｍＭのＣｕＣｌ２、１．６０ｍＭのＣｏＣｌ２、１．５７ｍＭのＮａ２ＭｏＯ２、３．２３ｍＭのＺｎＣｌ２、１００ｍｌ／ｌのＨＣｌを含む。乾燥細胞重量を、ＯＤ６００値当たり０．３１ｇ／ｌ乾燥細胞重量の変換係数に基づいて計算した（報告される発酵トライアルにおけるＯＤ６００値および乾燥細胞重量の測定に基づく平均値として計算した。）。指数増殖期（１５ｇ／ｌ未満の生物量濃度）からのデータ点に基づいた、生物量濃度対時間における片対数プロットの線形回帰によって、この比増殖速度を算出した。該発酵を、排気ガスのＣＯ２含量が零に近接する（細胞の呼吸が無い状況）まで、実行した。
【００８５】
発酵中における培養体積の著しい増加のために、最初の培養体積によって除算されたサンプリング時点の培養体積で測定濃度を乗算することで、全ての生物量およびアミノ酸の濃度を、体積増加および後の希釈について補正した。終点のサンプルに使用された補正率は、１．５と１．７との間であり、したがって、バイオリアクターにおいて測定されたアミノ酸および生物量の実際濃度はより低い。
【００８６】
【表１】
0005707318.tif 000002
【００８７】
アミノ酸およびアンモニアの測定
Skjerdalら（1996 (Appl. Micro. Biotechnol. 44(5): 635-642）に従い、０．０２Ｍ 酢酸Ｎａおよび２％テトラヒドロフランを含み、ｐＨ５．９である緩衝液を用いてアミノ酸を定量した。既に開示されたように、簡易的に洗浄および溶解された細胞培養物におけるアミノ酸含量の定量 、細胞内容量の理論的な推定 および、実験的に決定されたＯＤ６００当たり２．２ｘ１０８細胞／ｍｌの変換係数に基づいて、細胞内のアミノ酸濃度の計量を実施した（Brautasetら、(2003) Appl. Environ. Microbiol. 69(7): 3986-3995）。また、アンモニアを、製造元の使用説明）に従って（試料を１：１０００に希釈し、さらに分析前に１：１００００に希釈した、Spectroquant Ammonium-Test Kit (Merck)で測定した。
【００８８】
Ｂ．メタノリカスａｓｄ、ｄａｐＧ、ｄａｐＡおよびｌｙｓＣ遺伝子のＰＣＲ補助クローニング（PCR-assisted cloning）
Ｂ．リチェニホルミス、Ｂ．ハロドランス、Ｂ．セレウス、リステリア イノキュア、Ｌ．モノサイトゲンおよびＢ．サブチルスにおけるｙｃｌＭ、ｍｌｐＡ、ａｓｄ、ｄａｐＧおよびｙｍｆＡのＤＮＡ配列（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥ０１７３３３、ＢＡ０００００４、ＮＣ＿００４７２２、ＡＬ５９２０２２、ＡＬ５９１８２４およびＡＬ００９１２６）に基づく縮重プライマーを用いて、Ｂ．メタノリカスＭＧＡ３全ＤＮＡから推定ＡＫＩコーディング遺伝子およびＡＫＩＩＩコーディング遺伝子をＰＣＲ増幅した。プライマー対（表２）ｍｌｐＡ−ＰＰＳ−１ Ｆをａｓｄ−ＰＰＳ−１ Ｒととともに（３．９ｋｂフラグメントを産生する。）およびａｓｄ−ＰＰＳ−１ＦをｙｍｆＡ−ＰＰＳ−１Ｒとともに（３．３ｋｂフラグメントを産生する。）用いて、重複フラグメントとしてａｓｄ、ｄａｐＧおよびｄａｐＡを包含するＭＧＡ３のＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅した。また、これらのフラグメントの配列をプライマーウォーキング法によって決定した。
【００８９】
ｙｃｌＭの中心領域を、ＰＣＲ増幅して、ｙｃｌＭ内の保存領域に基づいた縮重プライマーを用いて、部分的に配列を決定した。ＭＧＡ３全ＤＮＡを、ＥｃｏＲＩで消化し、次いで、該制限酵素を熱失活に供した。このＤＮＡ材料を、希釈して、４℃、７２時間ライゲートした。プライマーｙｃｌＭ−ＰＰＳ−１ＦおよびｙｃｌＭ−ＰＰＳ−１Ｒは、両方とも、既にＰＣＲ増幅されたｙｃｌＭ領域から外側を向いており、テンプレートとしてライゲーション混合物を使用し、３ｋｂＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅するために用いた。また、このＤＮＡフラグメントの配列をプライマーウォーキング法によって決定した。
【００９０】
ベクターの構築
プライマーｍｄｈ−ＣＤＳ−Ｆ１ およびｐＴＢｌ．９−Ｒ１を用いて、ｐＴＢｌ．９ｍｄｈＬからメタノールデヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）コーディング領域を含むＤＮＡフラグメントＡをＰＣＲ増幅した。また、推定ｍｄｈプロモーター領域を、プライマーｍｄｈ−ｐｒｏｍ−Ｆ１およびｍｄｈ−ｐｒｏｍ−Ｒ１を用いて同じテンプレートからＰＣＲ増幅し、ＤＮＡフラグメントＢを調製した。ｐＴＢｌ．９ｍｄｈＬをＰｓｔＩ およびＢａｍＨＩで消化し、ベクターのバックボーンフラグメントを、ＢａｍＨＩ／Ｐｃｉｌ消化ＤＮＡフラグメントＢおよびＰｃｉｌ／ＰｓｔＩ 消化ＤＮＡフラグメントＡとともにライゲートした。また、２つのフラグメントと同じようにベクターのＰＣＲ増幅によって、２つのＰｃｉＩ部位を得られたベクターから除いた。フラグメント１では、プライマーｍｐ−ｍｄｈ−Ｐ２−Ｆ１およびｍｐ−ｍｄｈ−Ｐ２−Ｒ２を使用し、フラグメント２では、プライマーｍｐ−ｍｄｈ−Ｐ２−Ｆ２およびｍｐ−ｍｄｈ−Ｐ２−Ｒｌを使用した。該２つのフラグメントを、ＳｐｈＩおよびＫｐｎＩで末端消化しライゲートして、ｐＴＢｌ．９ｍｐ−ｍｄｈを調製した。該ｐＴＢｌ．９ｍｐ−ｍｄｈは、ｍｄｈの上流とコーディング領域との間において、ｍｄｈプロモーターへのコーディング領域の融合を簡易化させるためのＰｃｉＩ部位を保有する。このＰｃｉＩ部位の挿入によって、ｍｄｈ開始コドンの上流の４つのヌクレオチドを、原型のＡＡＧＡからＣＡＴＧへと変換させた。
【００９１】
ｄａｐＧ、ｌｙｓＣおよびｙｃｌＭのコーディング領域を、それぞれ、プライマーｄａｐＧ−ＣＤＳ−Ｆ１およびｄａｐＧ−ＣＤＳ−Ｒ１、ｌｙｓＣ−ＣＤＳ−Ｆ１およびｌｙｓＣ−ＣＤＳ−Ｒ１、ｙｃｌＭ−ＣＤＳ−Ｆ１およびｙｃｌＭ−ＣＤＳ−Ｒ１を用いて、Ｂ．メタノリカスＭＧＡ３の全ＤＮＡからＰＣＲ増幅した。得られた、ＧＴＧ開始コドンと部分的に重複するＰｃｉＩ部位をすべて保有するＰＣＲフラグメントを、ＰｃｉＩおよびＫｐｎＩで末端消化し、該フラグメントを使用して、ｐＴＢ１．９ｍｐ−ｍｄｈのｍｄｈコーディング領域を置換して、ベクターｐＴＢ１．９ｍｐ−ｄａｐＧ、ｐＴＢ１．９ｍｐ−ｌｙｓＣおよびｐＴＢ１．９ｍｐ−ｙｃｌＭをそれぞれ調製した。この工程において、ｄａｐＧおよびｙｃｌＭの原型であるＡＴＧ開始コドンは、ＣＴＧへと変更されている。また、ｐＴＢ１．９ｍｐ−ｌｙｓＣの、ｍｄｈプロモーターおよびｌｙｓＣコーディング領域を含むＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＨＰ１３の対応部位に挿入して、ｐＨＰ１３ｍｐ−ｌｙｓＣ（７．３ｋｂ）を調製した。ｐＨＰ１３ｍｐ−ｌｙｓＣの対応部位へ、ｐＴＢ１．９ｍｐ−ｄａｐＧのＰｓｔＩ／ＫｐｎＩフラグメントおよびｐＴＢ１．９ｍｐ−ｙｃｌＭのＳｐｅＩ／ＫｐｎＩフラグメントを挿入することで、ｐＨＰ１３ｍｐ−ｌｙｓＣのｌｙｓＣコーディング領域を、ｄａｐＧおよびｙｃｌＭコーディング領域と交換して、それぞれｐＨＰ１３ｍｐ−ｄａｐＧ（７．１ｋｂ）およびｐＨＰ１３ｍｐ−ｙｃｌＭ（７．２ｋｂ）を調製した。
【００９２】
【表２】
0005707318.tif 000003
【００９３】
粗細胞抽出物の調製およびＡＫアッセイ
Ｂｒａｕｔａｓｅｔら（２００４、上記）によって開示されたプロトコールに基づいて、粗細胞抽出物を調製した。すなわち、ＭｅＯＨ２００培地で、対数増殖期（ＯＤ６００＝１．９〜２．１）までＢ．メタノリカス細胞を増殖させ、２０ｍｌの細胞培養物を遠心分離（３，２００ｘｇ、１０分、１０℃）によって回収した。次いで、上清を捨て、２０ｍｌの高塩緩衝液（９倍濃度でのＭｅＯＨ２００培地の塩緩衝液、ｐＨ７．２）で細胞を再懸濁した。再懸濁された培養物３ｍｌを遠心分離し（３，２００ｘｇ、１０分、１０℃）、上清を捨てて、ペレットを凍結し、−２０℃にて保存した。該細胞を、氷上にて解凍して、ＡＫアッセイ緩衝液（５０ｍＭ リン酸カリウム、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、ｐＨ７．５）３ｍｌにて再懸濁して、３分間、超音波で分解した（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ２５０、出力制御３、３０％、負荷サイクル）。次いで、遠心分離（３，２００ｘｇ、２０分、４℃）によって、細胞残滓を除去し、上清を細胞抽出物として回収して、後の酵素活性および全細胞蛋白分析ために氷上にて保存した。ヒドロキシルアミンからのアスパルチルヒドロキサム酸の形成によって、ＡＫ活性を定量した（Ｂｌａｃｋら、（１９５５）上記）。該反応混合物は、４００μｌの反応緩衝液（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、２Ｍ ＫＣＩ、ｐＨ８．０）、２００μｌのヒドロキシルアミン溶液（２Ｍヒドロキシルアミン、ｐＨ８．０）、１００μｌのＡＡＭ溶液（０．１Ｍ Ｌ−アスパラギン酸、０．１Ｍ ＡＴＰ、０．１Ｍ ＭｇＣｌ２、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）およびＡＫアッセイ緩衝液中で希釈された３００μｌの試料を含んでいた。１ｍｌのＦｅ溶液（１０％（ｗ／ｖ）ＦｅＣｌ３、０．７Ｍ ＨＣｌ中の３％（ｖ／ｖ）トリクロロ酢酸、使用前に滅菌ろ過）の添加によって、反応を停止するまで、反応混合物を、５０℃、２０分インキュベートした。アスパラチルヒドロキサム酸の形成を、すぐに、分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、ＵＶｌ７００）を用いて、５４０ｎｍで測定した。該試料をアスパラチルヒドロキサム酸の標準物で交換したアッセイを実施して、吸光度をアスパラチルヒドロキサム酸濃度に関連付けた。ＡＫ活性の一単位を、上記条件下において、１分あたりアスパラチルヒドロキサム酸１μｍｏｌを産生するのに必要な酵素量として定義した（Ｂｌａｃｋ  ら、（１９５５）上記）。ウシ血清アルブミンを標準物として用いたＢｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって、蛋白濃度を定量した。ＡＫアッセイを３回行って、各蛋白濃度の測定においては、４並列で行った。測定ＡＫ活性値および蛋白濃度の平均値および標準偏差に基づき、General Formula for Error Propagation (Taylor (1997) An introduction to error analysis: the study of uncertainties in physical measurements. University Science Books: Sausalito、カリフォルニア. Section 3.11)を用いて、比ＡＫ活性の不確定度 を算出した。
【００９４】
結果
Ｂ．メタノリカスにおける推定ＡＫＩＩＩをコードするｙｃｌＭ
アミノ酸配列のアラインメントに基づいて、縮重プライマーのセットを設計し（材料および方法を参照）、ＭＧＡ３の全ＤＮＡをテンプレートとして該縮重プライマーのセットを用いて２ｋｂのＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅した。この方法を用いてＭＧＡ３の全ＤＮＡから、推定ｙｃｌＭ遺伝子をＰＣＲ増幅できた。２０１２ｂｐのＤＮＡフラグメントの配列を決定し、予想されるコーディング領域および上流配列の６０５ｂｐを含むことを見出した（図２）。ｙｃｌＭ遺伝子産物の推定一次配列（４５５アミノ酸）は、アミノ酸基準で、Ｂ．リチェニホルミスＡＫＩＩＩ（７４％）に対して全体の中で 最も高い同一性を示し、Ｂ．サブチルス菌株１６８のＡＫＩＩＩに対して７１％の同一性を有しており、これ ついては、ＡＫ活性が実験的に実証されている（Kobashiら、(2001) Biosci. Biotechnol. Biochem.、65(6):1391-1394）。また、この遺伝子産物は、Ｂ．サブチルスのＡＫＩとＡＫＩＩとの両方に対して、低い一次配列の同一性を有する（それぞれ、２３％、２５％）。同時に、これらのデータは、Ｂ．メタノリカスｙｃｌＭ遺伝子が、推定されるＡＫＩＩＩアイソザイムをコードすることを示唆している。
【００９５】
推定アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＡＫＩおよびジヒドロジピコリン酸シンターゼをそれぞれコードするａｓｄ、ｄａｐＧおよびｄａｐＡは、Ｂ．メタノリカスの推定ｄａｐオペロンにおいて構成化されている。
【００９６】
Ｂ．サブチルスにおいては、ａｓｄ、ｄａｐＧおよびｄａｐＡは、ｄａｐオペロン内部に位置している(Chenら、(1993) J. Biol. Chem.、 268(13): 9448-9465)。幾つかの類縁種における公知の配列をアライン することで（「材料および方法」の項を参照）、我々は、ｄａｐオペロンの上流、内部および下流における保存された遺伝子の構成の存在を見出し、この遺伝的構成はＢ．メタノリカスにおいて調査した類縁種と類似していることを仮定した。ｍｌｐＡ、ａｓｄ、ｄａｐＧおよびｙｍｆＡ内部の保存領域に基づく縮重プライマーを使用することで（図２）、我々は、部分的かつ推定されるＭＧＡ３のｄａｐオペロンをカバーするＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅した。全体的に、上流にある推定ｓｐｏＶＦＢおよび下流にある推定ｙｍｆＡの部分体とともに、推定遺伝子ａｓｄ、ｄａｐＧおよびｄａｐＡを含む、４４６５ｂｐのＤＮＡ領域を配列決定した（図２）。ａｓｄ、ｄａｐＧおよびｄａｐＡの推定遺伝子産物（それぞれ、３５１、４１３および２９０アミノ酸）は、バシラス種であるＮＲＲＬＢ−１４９１１のアスパラギン酸ヘミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＡＫＩおよびジヒドロジピコリン酸シンターゼ（それぞれ７６、８５および７９％）に対して最も高い一次配列の同一性を示す。推定ｄａｐＧ遺伝子産物は、Ｂ．サブチルス菌株１６８のＡＫＩに対して６８％の同一性を有し、これ ついては、ＡＫ活性が実験的に検証されている（Chen ら.、(1993)上記）一方、Ｂ．サブチルスノＡＫＩＩおよびＡＫＩＩＩに対する一次配列の同一性は低い（それぞれ、３８％および２４％）。このことは、Ｂ．メタノリカスｄａｐＧ遺伝子は、推定されるＡＫＩアイソザイムをコードすることを示唆している。
【００９７】
同じ方向性を有し、かつ短い遺伝子間領域（それぞれ３１および１４ヌクレオチド）を伴うａｓｄ、ｄａｐＧおよびｄａｐＡにおける構成は、Ｂ．サブチルスのそれとは類似しているものであり（図２）、そこでは、これら３つの遺伝子は、栄養増殖中において、一単位として転写される（Chenら.、(1993)上記）。推定ＭＧＡ３ｄａｐオペロンにおける短い遺伝子間領域は、ｍＲＮＡの二次構造を明らかに形成させなくする。このことは、Ｂ．サブチルスにおける９１ヌクレオチド長のａｓｄ−ｄａｐＧ遺伝子間転写物 における２つの採り得る二次構造とは対照的である。つまり、１６ＳリボソームＲＮＡと相互作用するためのｄａｐＧリボソーム結合部位の利用性において、これらの二次構造は相違し、ａｓｄに対して、ｄａｐＧ−ｄａｐＡ発現を負に制御する可能性のある機構を示すことを示唆する（Chen ら.、(1993)上記）。
【００９８】
カセットクローニングおよびＢ．メタノリカスの発現系の構築
我々は、ｍｄｈおよびＥ．コリ―Ｂ．メタノリカス間のシャトルベクターであるｐＨＰ１３に基づく、メタノリカスにおける、簡略化された遺伝子の過剰発現のためのツールとして、カセット発現系を構築した（Brautasetら、(2004)上記;Jakobsenら、(2006)上記）。ｍｄｈ開始コドンに部分的に重複する特異な 制限部位およびコーディング領域の下流にある特異な制限部位を挿入することによって、このカセット系は、ｍｄｈプロモーター領域およびリボソーム結合部位に、任意コーディング領域のインフレーム融合のための簡単なクローニングストラテジーを提供するものである。
【００９９】
ｄａｐＧおよびｙｃｌＭの組換え発現は、これらがＡＫ活性をコードすることを確証する。
【０１００】
Ｂ．メタノリカスにおけるＡＫ遺伝子の過剰発現のために、我々は、発現ベクターｐＨＰ１３ｍｐ−ｄａｐＧ、ｐＨＰ１３ｍｐ−ｌｙｓＣおよびｐＨＰ１３ｍｐ−ｙｃｌＭを構築し、これらにおいては、遺伝子ｄａｐＧ、ｌｙｓＣおよびｙｃｌＭは、ｍｄｈプロモーターおよびリボソーム結合部位の制御下にある。このように、これらの構築においては、ＡＫをコードする遺伝子は、アスパラギン酸経路における産物による、原型の転写制御から解放 されるものである。これらの発現ベクターを野生型ＭＧＡ３に導入し、我々はコントロール菌株として、ＭＧＡ３（ｐＨＰ１３）を構築した。我々は、ＭＧＡ３から調製された粗抽出物と規定されたメタノール培地における振とうフラスコ内で増殖した組換え菌株とで、ＡＫ活性を対比した。この結果（図３）は、推定ＡＫＩおよびＡＫＩＩＩ（それぞれｄａｐＧおよびｙｃｌＭによりコードされる）とＡＫＩＩ（ＬｙｓＣによってコードされている）とを過剰発現する組換え菌株の粗抽出物は、コントロール菌株のそれに比べて、インビトロにおいて、４から４０倍高いＡＫの比活性を示すことを証明している。これらの結果は、ｄａｐＧおよびｙｃｌＭ遺伝子産物において、推定される生化学的機能を確認するものである。予想されるように、野生型の菌株であるＭＧＡ３およびコントロール菌株であるＭＧＡ３（ｐＨＰ１３）は、同様のＡＫ活性を発現する。興味深いことに、ｌｙｓＣの過剰発現は、ｄａｐＧおよびｙｃｌＭに比べて、インビトロにおいて１０倍高いＡＫ活性を与える。このことが、インビトロにおいて測定されたＡＫ蛋白質の、より高い発現レベルによるものなのか、あるいは異なる生化学的特性によるものなのかは知られていない。全て試料について、粗抽出物の異なる希釈系で、同様なインビトロでの比活性を測定することができ（データ未表示）、つまり、フィードバック制御は酵素アッセイの結果に影響しないことを該非活性は示している。
【０１０１】
ｄａｐＧ、ｌｙｓＣおよびｖｃｌＭの過剰発現は、Ｂ．メタノリカスＭＧＡ３におけるＬ−リシン生産の増加に至る。
【０１０２】
野生型Ｂ．メタノリカスのＬ−リシン生産におけるｄａｐＧ、ｌｙｓＣおよびｙｃｌＭの発現増加の効果を評価するために、我々は、規定されたメタノール培地にて、構築された組換え菌株で高い細胞密度の流加バッチ式発酵のトライアルを実行した。アミノ酸の生産（増殖培地に分泌されたアミノ酸の量として規定）を、発酵中において監視した。異なるバイオリアクタ―でのトライアルを比べるにあたり、本明細書にて報告される全てのバイオマス濃度およびアミノ酸生産 は、発酵中において流加することによって生じる希釈について補正した（「材料および方法」の項を参照）。
【０１０３】
試験された条件下において、野生型ＭＧＡ３は、０．４９ｈ−１の初期比増殖速度で、２３時間で５８ｇ／ｌの最大のバイオマス濃度に達した。ＭＧＡ３の最終的なＬ−リシン生産は、以前の結果と一致して、０．１８ｇ／ｌであった（Schendelら、(1990)上記;Brautasetら、(2003)上記）。比増殖速度、最大細胞密度およびＬ−リシン生産に関しては、コントロール菌株ＭＧＡ３（ｐＨＰ１３）は、野生型と同様であり、ｐＨＰ１３は、これらの特性には影響を与えないことを示している（図４および表３）。興味深いことに、ｄａｐＧ、ｌｙｓＣまたはｙｃｌＭのいずれかを過剰発現する組換え菌株全ては、コントロール菌株よりもＬ−リシンを多く生産し、また、同様な比増殖速度側を保持していた（表３）。Ｌ−リシン生産における最も劇的な効果は、菌株ＭＧＡ３（ｐＨＰ１３ｍｐ−ｙｃｌＭ）にて観察され、かかる菌株は、コントロール菌株よりも６０倍を超えるＬ−リシン（１１ｇ／ｌ）を生産した（図４および表３）。ｄａｐＧおよびｌｙｓＣを過剰発現する組換え菌株は、Ｌ−リシンの生産において、それぞれ２倍および１０倍の増加を示した。すべての菌株は、Ｌ−グルタミン酸の生産に関しては同様なものであり（４８〜５２ｇ／ｌ）、アスパラギン酸経路におけるその他の最終生産物である、Ｌ−メチオニン（＜０．５ｇ／ｌ）およびＬ−スレオニン（＜０．１ｇ／ｌ）の生産は低いままであった。発酵のトライアルにおける再現性を検証するために、ＭＧＡ３（ｐＨＰ１３）およびＭＧＡ３（ｐＨＰ１３ｍｐ−ｙｃｌＭ）を２回、別個の発酵トライアルを実施した。光学密度およびアミノ酸濃度は、どのサンプリング点においても、並行する発酵トライアル間では、１０％未満で変化し、計測された比増殖速度は、＋／−０．０２ｈ−１以下で変化した。
【０１０４】
【表３】
0005707318.tif 000004
【０１０５】
［実施例２および３  材料および方法］
実施例１の材料および方法の項にて記載されていない追加情報
ＤＮＡ操作および培養条件
一般的なクローニング、ＰＣＲ、ＤＮＡシークエンシングおよび発酵を、実施例１で既に記載されたように実施した。また、Jakobsenら(2006) J Bacteriol.、188(8): 3063-3072において開示されたように、２×Ｍａｎｎ１０に等しいＭａｎｎ２０培地を用いて、マンニトールにおけるＢ．メタノリカスの増殖を行った。
【０１０６】
Ｌ−リシンの測定
Ｌ−リシンの測定を、実施例１にて説明されているようなＨＰＬＣを用いて実施した。
【０１０７】
１．リアルタイムＰＣＲ
Ｂ．メタノリカス培養物を、回収する前に、後期対数期（ＯＤ６００＝３）まで増殖させた。ＲＮＡ保護を含めた細胞溶解、全ＲＮＡ単離および、それに付随するｃＤＮＡ合成を、他の 文献に記載されているように実施した（Jakobsen ら、2006、上記）。全ＲＮＡ濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００分光光度計（NanoDrop Technologies）を用いて定量した。また、我々 は、コンピューターソフトウェアPrimer ExpressR v 2.0 (Applied Biosystems)を用いて、リアルタイムＰＣＲ試験のプライマーを設計した。以下のプロファイルの下、ABI 7500 System(Applied Biosystems)で、ＰＣＲ産物の検出を実施した。プライマー効率の試験のために、反応混合物を、９５℃、１０分間インキュベートして、ホットスタート型Ｔａｑポリメラーゼを活性化し、２段階のＰＣＲプロトコール（９５℃、１５秒の変性工程、次いで、６０℃、１分の複合型のアニーリング−伸長工程（蛍光データの獲得 を伴う））に供した。この工程を４０サイクル繰り返した。９５℃で１５秒、６０℃で１分の後サイクルと、９５℃１５秒の最終段階とによって、解離温度の決定をした。リアルタイム定量ＰＣＲによる比較研究のために、プライマーの効率試験に使用されたこの工程にプロファイルを準拠させた。データの獲得および分析を、ＳＹＢＲシグナルでの標準反応の下、Sequence Detectionソフトウェアーバージョン．１．２．３（Applied Biosystems Inc．）で実施した。
【０１０８】
発現ベクターの構築
ｐＴＨ１ｍｐ−ｌｙｓＣ
プラスミドｐＨＰ１３（Jakobsenら、２００６、上記）をＰｃｉＩで消化し、得られた粘着末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化し、該末端を再度ライゲートしてプラスミドｐＴＨ１を調製した。プラスミドｐＨＰ１３ｍｐ−ｌｙｓＣ（実施例１）をＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、２．６ｋｂフラグメントを単離し、ｐＴＨ１の対応部位にライゲートして、発現ベクターｐＴＨ１ｍｐ−ｌｙｓＣをクローニングするカセットを調製した。このベクターは、プラスミドＨＰ１３ｍｐ−ｌｙｓＣに類似しており、強力なｍｄｈプロモーターの下流域およびｍｄｈ ｒｂｓ領域のインフレームにあるの任意のコーディング遺伝子を一段階でクローニングするための、特異なＰｃｉＩ部位を有する。
【０１０９】
ｐＴＨ１ｍｐ−ａｓｄ、ｐＴＨ１ｍｐ−ｄａｐＡおよびｐＴＨ１ｍｐ−ｌｙｓＡ
以下のプライマー対を用いて、Ｂ．メタノリカス全ＤＮＡからａｓｄ（１１１７ｂｐ）、ｄａｐＡ（９０４ｂｐ）およびｌｙｓＡ（１３２２ｂｐ）のコーディング領域を有するＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅した。
ａｓｄ−Ｆ：５´−ＧＣＧＣＡＣＡＴＧＴＧＧＧＴＣＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＴＣＴＴＣ−３´（配列番号：３０）
ａｓｄ−Ｒ：５´−ＡＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＣＣＣＣＧＡＡＴＴＴＴＴＧＡＡＣ−３´（配列番号：３１）
ｄａｐＡ−Ｆ：５´−ＧＣＧＣＡＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＴＣＧＡＡＴＡＴＣ−３´（配列番号：３２）
ｄａｐＡ−Ｒ：５´−ＡＴＧＧＴＡＣＣＧＧＣＡＧＴＡＡＡＡＡＣＴＣＣＡＴＴＧＡＴ−３´（配列番号：３３）
ｌｙｓＡ−Ｆ：５´−ＧＣＧＣＡＣＡＴＧＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧＣＡＣＡＡＣＡ−３´（配列番号：３４）
ｌｙｓＡ−Ｒ：５´−ＡＴＧＧＴＡＣＣＧＣＡＧＣＴＴＡＧＴＡＴＣＴＴＡＣＴＣＴ−３´（配列番号：３５）
なお、ＰｃｉＩおよびＫｐｎＩ制限部位は、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーにおいて下線で示されている。得られたＰＣＲ産物を、ＰｃｉＩ／ＫｐｎＩで末端消化し、ｐＴＨ１ｍｐ−ｌｙｓＣの対応部位にライゲートし（ｌｙｓＣ遺伝子を置換する）、発現ベクターｐＴＨ１ｍｐ−ａｓｄ、ｐＴＨ１ｍｐ−ｄａｐＡ、ｐＴＨ１ｍｐ−ｌｙｓＡをそれぞれ調製した。全てのプラスミドにおけるインサートを、ＤＮＡシークエンシングによって検証した。
【０１１０】
ｐＨＰ１３ｍｐ−ｙｃｌＭ＋ｌｙｓＡ
プラスミドｐＴＨ１ｍｐ−ｌｙｓＡをＳｐｅＩ／ＮｃｏＩで消化し、１．８ｋｂフラグメントを精製し、ＸｂａＩ／ＮｃｏＩで消化されたｐＨＰ１３ｍｐ−ｙｃｌＭにライゲートして、発現ベクターｐＨＰ１３ｍｐ−ｙｃｌＭ＋ｌｙｓＡを調製した。
【０１１１】
ｐＴＨ１ｍｐ−ｄａｐＡ＋ｙｃｌＭ
プラスミドｐＨＰ１３ｍｐ−ｙｃｌＭをＳｐｅＩ／ＮｃｏＩで消化し、１．９ｋｂフラグメントを精製し、ｐＴＨ１ｍｐ−ｄａｐＡ ＸｂａＩ／ＮｃｏＩ部位にライゲートして、発現ベクターｐＴＨｍｐ−ｄａｐＡ＋ｙｃｌＭを調製した。
【０１１２】
そして、エレクトロポレーションによって上記ベクターをＢ．メタノリカス菌株のＭＧＡ３に形質転換した。
【０１１３】
［実施例２］
ｐＨＰ１３およびｍｄｈプロモーター用いた、追加のＢ．メタノリカス遺伝子の過剰発現ならびにＬ−リシン生産における効果
発酵槽において試験された、３つの異なるＡＫコードディング遺伝子（ｄａｐＧ、ｌｙｓＣ、およびｙｃｌＭ）の過剰発現および、ＭＧＡ３（野生型Ｂ．メタノリカス）でのＬ−リシン生産における効果は、実施例１にて説明されている。更なる研究において振とうフラスコ中で、同じ発現系（つまり、ｍｄｈプロモーターを有するｐＨＰ１３）を用いて、Ｌ−リシン生合成経路にて追加された遺伝子を過剰発現させた（表５）。単一の遺伝子から得られた全ての結果に基づいて、我々は、同一の発現系を用いて、組み合わされた２以上の過剰発現を有するベクターを構築し、ＭＧＡ３におけるＬ−リシン生産レベルの追加的な効果を証明した（表５参照）。
【０１１４】
【表４】
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【０１１５】
表４のコメント：
−  全ての発現遺伝子は、図１に記載され、ベクター構築物は、「材料および方法」の項において与えられている。
−  全ての組換え遺伝子については、ｍｄｈプロモーター（ｍｄｈＰ）によって転写が駆動される。
−  全ての組換え型遺伝子は、ｍｄｈリボソーム結合部位の翻訳制御下にある。
−  振とうフラスコにおける生産量は、該系統を発酵器において試験した場合に比べて、低いが、相対的な効果は同程度である。
【０１１６】
これらのデータは、実施例１と同様に、ｙｃｌＭの過剰発現は、結果として、ＡＫＩ（ｄａｐＧ）およびＡＫＩＩ（ｌｙｓＣ）遺伝子に見られる場合よりもより高いＬ−リシン生産になることを示している。ＡＫＩＩＩ過剰発現を、ｄａｐＡ（ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする）およびｌｙｓＡ（メソ-ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする）のようなリシン生合成におけるその他の遺伝子の過剰発現と組み合わせることで、リシン生産における改善効果が得られうることを更に示している。
【０１１７】
［実施例３］
糖類系増殖培地におけるＬ−リシン生産
我々は、マンニトール培地中における増殖でのＬ−リシン生産を、実施例３に記載の組換え菌株で、たとえば、ｌｙｓＡを過剰発現するＭＧＡ３（ｐＴＨ１ｍｐ−ｌｙｓＡ）で試験し、この結果は、メタノール培地において得られた類似データに比べて、これらの条件下では、生産レベルが同等か、さらに一層高いということを明確に示している（表５参照）。マンニトール培地およびメタノール培地の組成は、Ｃ源を除いては、同一である。
【０１１８】
【表５】
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【０１１９】
使用増殖培地に関するコメント：
ＭｅＯＨ２00：Jakobsenら（２００６）（上記）にて開示されている。
Ｍａｎｎ２０：Jakobsenら（２００６）（上記）にて開示されている２×Ｍａｎｎ１０に相当する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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