(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
底面が導電性材料で形成された１個又は複数個の凹部を有する基板であって、前記凹部の底面以外の表面が絶縁性材料で形成されている基板と、リポソーム形成性脂質溶液を収納し、先端部にノズルを有する容器とを、前記ノズルが前記基板に対向するように配置した状態で、前記脂質溶液と前記底面との間に直流電圧を印加しながら前記ノズルから前記基板に前記脂質溶液を噴霧して、前記底面上に脂質溶液をコーティングする工程と、
前記凹部に水系媒体を加えて該凹部においてリポソームを生成させる工程とを含む、リポソームの製造方法。
【請求項２】
前記直流電圧の大きさが１〜５kV/cmである請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記基板が、前記凹部を複数個有する請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記基板が、導電性材料から成る底板と、該底板上に被着された、絶縁膜から形成されたものであり、前記絶縁膜には、１個又は複数の透孔が形成されており、該透孔の側面が前記凹部の側面を構成し、該透孔から露出する前記底板が前記凹部の底面を構成する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記凹部の直径が３μm〜１００μmである請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
生成したリポソームを回収する工程をさらに含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
底面が導電性材料で形成された１個又は複数個の凹部を有する基板であって、前記凹部の底面以外の表面が絶縁性材料で形成されている基板と、リポソーム形成性脂質溶液を収納し、先端部にノズルを有する容器であって前記ノズルが前記基板に対向するように配置した容器と、前記凹部の底面と前記容器内に収容される前記リポソーム形成性脂質溶液にそれぞれ接続される直流電圧電源とを具備するリポソーム製造装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、直径の均一なリポソームを簡便に製造することができる、リポソームの製造方法並びにそのための器具及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームは、球状の脂質二重膜内に溶液が包合された自己組織化構造である。直径が数μm〜数百μmのものはジャイアント（巨大）リポソームと呼ばれる（非特許文献１）。ジャイアントリポソームは、内部に種々の物質を包合することができるので、薬剤送達系(DDS)や化粧料に広く用いられている。また、生体膜は、リポソームと同様、脂質二重膜から形成されているので、生体膜に担持される各種タンパク質を模してリポソームに各種タンパク質を担持させ、それらのタンパク質に対する結合性や作用を調べることが創薬スクリーニングにおいて行われている。すなわち、リポソームは、創薬スクリーニングにおいて、模擬細胞として用いられている（非特許文献２）。
【０００３】
従来、リポソームの製造方法としては、穏やかな水和法（gentle hydration)やエレクトロフォーメーション(electroformation)法が広く用いられている（非特許文献１、３）。しかしながら、これらの方法により製造されるリポソームは、直径のバラツキが大きいという問題がある。また、有機溶媒と水の界面において、脂質の自己組織化能を利用してリポソームを形成する方法も知られている（非特許文献４）。しかしながら、この方法では、有機溶媒がリポソーム中に包合されてしまう恐れがあるという問題がある。
【０００４】
一方、フォトリソグラフィーの手法を用い、基板上に形成した凹部の開口の外周縁部にのみ選択的に脂質溶液をコーティングし、形成された脂質膜からエレクトロフォーメーション法によりリポソームを生成させる方法（特許文献１）や、フォトリソグラフィーの手法を用い、基板上に脂質溶液をパターニングし、形成された脂質膜からエレクトロフォーメーション法によりリポソームを生成させる方法（特許文献２）も知られている。これらの方法は、均一な直径を有するリポソームを製造する上で有効であるが、脂質溶液のパターニングのためのフォトリソグラフィープロセスが煩雑であるため、手間とコストがかかるという問題がある。また、基板に設けられたマイクロチャネルに脂質溶液を塗布して脂質膜をコーティングし、形成された脂質膜からエレクトロフォーメーション法によりリポソームを生成させる方法も知られている（非特許文献３）。この方法は簡便であるが、形成されたリポソームの直径のバラツキが大きいという問題がある。また、種々の表面形状や置換基を有するシリコン基板上でエレクトロフォーメーション法によりリポソームを生成させる方法（非特許文献４）も知られているが、やはりリポソームのサイズの均一性において満足することができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO 2009/069609 A1
【特許文献２】特開2007-98323号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】P.L. Luisi, et al., Giant Liposomes, John Willy and Sons Ltd., New York, 2000
【非特許文献２】A. Karlsson, et al., Nature 2001, 409, 150-2
【非特許文献３】K. Kuribayashi, et al., Meas. Sci. Technol. 2006, 17, 3121-6
【非特許文献４】M . Le Berre, et al., Langmuir 2008, 24, 2643-9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、直径のバラツキが小さいリポソームを簡便に製造することができる、リポソームの製造方法並びにそのための器具及び装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、底面が導電性材料で形成された凹部を有し、凹部の底面以外の表面部分は絶縁性材料で形成した基板を準備し、凹部の底面と脂質溶液との間に直流高電圧を印加しながらこの基板に対向するノズルから脂質溶液を噴霧する（エレクトロスプレー）ことにより、脂質溶液が導電性の凹部底面に選択的に飛んで凹部底面を脂質溶液でコーティングすることができ、コーティングされた脂質膜を原料として、凹部内で水和法やエレクトロフォーメーション法によりリポソームを生成させることにより、直径のバラツキが小さいリポソームを簡便に製造することができることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、底面が導電性材料で形成された１個又は複数個の凹部を有する基板であって、前記凹部の底面以外の表面が絶縁性材料で形成されている基板と、リポソーム形成性脂質溶液を収納し、先端部にノズルを有する容器とを、前記ノズルが前記基板に対向するように配置した状態で、前記脂質溶液と前記底面との間に直流電圧を印加しながら前記ノズルから前記基板に前記脂質溶液を噴霧して、前記底面上に脂質溶液をコーティングする工程と、
前記凹部に水系媒体を加えて該凹部においてリポソームを生成させる工程とを含む、リポソームの製造方法を提供する。
【００１０】
また、本発明は、底面が導電性材料で形成された１個又は複数個の凹部を有する基板であって、前記凹部の底面以外の表面が絶縁性材料で形成されている基板と、リポソーム形成性脂質溶液を収納し、先端部にノズルを有する容器であって前記ノズルが前記基板に対向するように配置した容器と、前記凹部の底面と前記容器内に収容される前記リポソーム形成性脂質溶液にそれぞれ接続される直流電圧電源とを具備するリポソーム製造装置を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法によれば、エレクトロスプレー法により噴霧された脂質溶液は、凹部の導電性底面に選択的にコーティングされ、凹部底面以外にの部分にはほとんど付着せず、また、凹部というサイズがはっきりと規定されている場所の中でリポソームが形成されるので、サイズのバラツキが小さいリポソームを効率良く製造することができる。また、本発明の方法によれば、脂質溶液をエレクトロスプレー法により基板に噴霧し、次いで、常法である水和法又はエレクトロフォーメンション法によりリポソームを生成させるだけでリポソームを製造することができ、特許文献１や特許文献２に記載されている公知の方法に比べて簡便にリポソームを製造することができる。また、操作が簡便で手間がかからないのみならず、底面のみが導電性材料で形成された凹部を有する基板は、一旦作製すれば洗浄して繰り返し利用できるので、この点でも特許文献１や特許文献２に記載された方法と比較して低コストでリポソームを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の製造方法に用いられる基板の作製方法を説明するための模式断面図である。
【図２】本発明の製造方法で行われるエレクトロスプレー法を説明するための模式図である。
【図３】本発明の製造方法で行われる水和法を説明するための模式断面図である。
【図４】(a)は、本発明の実施例で得られた、脂質膜が各凹部の底面上にコーティングされた基板の顕微鏡写真である。(b)は、本発明の実施例で得られた、各凹部において生成したリポソームを示す顕微鏡写真である。(c)は、本発明の実施例で得られたリポソームの粒度分布を示す図である。
【図５】(a)は、本発明の実施例で得られた、脂質膜が各凹部の底面上にコーティングされた基板の顕微鏡写真である。(b)は、本発明の実施例で得られた、各凹部において生成したリポソームを示す顕微鏡写真である。(c)は、本発明の実施例で得られたリポソームの粒度分布を示す図である。
【符号の説明】
【００１３】
１０  ITOプレート
１２  パリレン樹脂膜
１４  アルミニウム膜
１６  フォトレジスト膜
１８  凹部
２０  容器
２２  脂質溶液
２４  エレクトロスプレー
２６  コーティングされた脂質膜
２８  ウェル
３０  水系媒体
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のリポソームの製造方法においては、底面が導電性材料で形成された１個又は複数個の凹部を有する基板であって、前記凹部の底面以外の表面が絶縁性材料で形成されている基板を用いる。ここで、「表面」は、後述するエレクトロスプレー法において、脂質溶液を噴霧するノズルに対向する側の表面を意味する。導電性材料としては、導電性であれば何ら限定されないが、ITO（インジウムスズオキサイド）、単結晶シリコン、各種金属等を挙げることができる。絶縁性材料としては、絶縁性であれば何ら限定されず、各種樹脂やガラス、シリコン酸化物等の半導体や金属の酸化物を挙げることができる。絶縁性材料としては、後述のようにフォトリソグラフィーによりパターニングすることができるものが好ましく、パリレン（ポリ-p-キシリレン）樹脂やシリコン酸化物等が好ましい材料として例示できるがこれらに限定されるものではない。
【００１５】
基板に設けられている凹部の数は１個でもよいが、リポソームの生産性を高めるために１枚の基板に複数の凹部を設けることが好ましく、数十個から数十万個の凹部を設けることが好ましい。
【００１６】
製造されるリポソームの直径は、凹部の直径とほぼ同じ（わずかに大きい）になるので、凹部の直径は、製造するリポソームの目的とする直径とほぼ同じでよく、従って、通常３μm〜１００μm、好ましくは５μm〜３０μm程度である。また、凹部が複数形成されている場合には、各凹部において生成されるリポソームの直径を均一にするためには、当然ながら凹部の直径を均一にしておく必要がある。凹部の深さは、特に限定されないが、通常0.5μm〜5μm、好ましくは0.5μm〜2μm程度である。凹部を複数設ける場合、隣接する凹部間の距離は、形成されたリポソーム同士の融合を防ぐために凹部の直径よりも大きくすることが好ましい。
【００１７】
上記した基板は、導電性材料から成る底板と、該底板上に被着された、絶縁膜から形成されたものであり、前記絶縁層には、１個又は複数の透孔が形成されており、該透孔の側面が前記凹部の側面を構成し、該透孔から露出する前記底板が前記凹部の底面を構成するものであってよい。
【００１８】
このような基板は、周知のフォトリソグラフィーにより容易に作製することができる。導電性材料から成る底板としてITOプレート、絶縁性材料としてパリレン樹脂を用いた場合の作製方法の一例を図１に基づき説明する。
【００１９】
まず、図１の(1)に示すように、ITOプレート１０上にパリレン樹脂膜１２を化学蒸着等によりコーティングする。次に、アルミニウム膜１４及びフォトレジスト膜１６を順次コーティングする(図１(2))。次に凹部を形成する部分に選択的に紫外線を露光し、現像してフォトレジスト膜１６に透孔を形成し、このフォトレジスト膜１６をマスクとして下層のアルミニウム膜１４を混酸アルミ液を用いたウェットエッチング法等により食刻してアルミニウム膜１４に透孔を形成する(図１(3))。次に酸素プラズマエッチングによりパリレン樹脂膜に透孔を形成して凹部１８を形成する(図１(4))。形成された凹部は、底面が導電性のITOプレートから成り、側面が絶縁性のパリレン樹脂から成るものであり、凹部の底面以外の表面は全て絶縁性のパリレン樹脂で被覆されている。このような基板を本発明の方法において好ましく使用することができる。なお、基板は必ずしもフォトリソグラフィーにより作製する必要はなく、例えば樹脂フィルムにマイクロドリル等により機械的に孔を開けたものを導電性底板上に貼り付けて基板を作製することも可能である。
【００２０】
本発明の方法では、エレクトロスプレー法により、上記基板に向かってリポソーム形成性脂質溶液（単に「脂質溶液」と呼ぶことがある）を噴霧する。すなわち、脂質溶液を収納し、先端部にノズルを有する容器とを、前記ノズルが前記基板に対向するように配置する。リポソーム形成性脂質は、リポソーム形成に従来から用いられている周知のリン脂質等でよく、例えば、ジオレイルフォスファチジルコリン(DOPC)等である。溶媒としては、従来から用いられている各種有機溶媒でよく、例えばクロロホルム／アセトニトリル混合溶媒等を挙げることができる。溶液中のリポソーム形成性脂質の濃度は、通常0.05mg/mL〜5mg/mL程度、好ましくは0.1mg/mL〜1mg/mL程度である。なお、リポソームの脂質二重膜にタンパク質等を担持させたい場合には、この脂質溶液中に担持させるべきタンパク質を加えておくことができる。
【００２１】
ノズルとしては、単に内径が細くなったキャピラリーでよく、従って、容器としては先端をキャピラリー状に細くしたガラス管であってよい。このようなノズルの内径は、特に限定されないが、通常、5μm〜300μm程度、好ましくは10μm〜100μm程度である。ノズルの先端と基板との距離は、特に限定されないが、通常、5mm〜5cm程度、好ましくは5mm〜2cm程度である。
【００２２】
エレクトロスプレー法では、各凹部の底面と、脂質溶液との間に直流高電圧を印加した状態で脂質溶液を基板に向かって噴霧する。電圧は、底面を構成する導電性材料を一方の電極とし、他方の電極を脂質溶液と接触させた状態で印加する。脂質溶液側の電極としては、例えば、金属から成る棒状や板状の電極でよく、これを脂質溶液中に浸漬することができる。印加する電圧の大きさは、ノズルの先端と基板との距離1cm当たり通常0.5kV〜10kV程度、好ましくは1kV〜5kV程度である。電圧は電圧は、溶液側をプラスにして、底面側をマイナスにする。底面側はさらにアースすることが好ましい。噴霧は、電圧の印加と、容器内の脂質溶液を、シリンジ等によりゆっくりノズルから押し出すことにより行うことができる。噴霧量は、特に限定されないが、通常、0.1μL/分〜5μL/分程度、好ましくは0.5μL/分〜2μL/分程度である。噴霧の時間も適宜設定することができるが、通常、３０秒〜５分程度、好ましくは３０秒〜２分程度である。
【００２３】
上記したエレクトロスプレー法により脂質溶液を基板に向かって噴霧すると、霧状の脂質溶液（エレクトロスプレー）は、電圧が印加されている導電性の凹部底面に選択的にコーティングされ、凹部以外の基板上にはほとんど付かない。従って、エレクトロスプレー法により、凹部の底面上に脂質溶液が選択的にコーティングされる。脂質溶液は、溶媒が有機溶媒であり、コーティング量も少ないので、凹部の底面上にコーティングされた脂質溶液の溶媒はすぐに蒸発し、凹部底面上には乾燥した脂質膜がコーティングされる。なお、ノズルの先端が基板から1cm離れている場合、エレクトロスプレー法により、直径1cm程度の範囲内にある凹部の底面に脂質溶液をコーティングすることが可能である。凹部がこれよりも広い範囲に形成されている場合には、基板とノズルの相対位置をずらして複数回エレクトロスプレー法を行えばよい。
【００２４】
上記したエレクトロスプレー法の一例を図２に模式的に示す。図２中、図１と同じ参照番号のものは図１と同じものを示す。２０が容器、２２が脂質溶液、２４がエレクトロスプレー、２６が凹部の底面に選択的にコーティングされた脂質膜である。
【００２５】
次に、凹部に水系媒体を加え、該凹部においてリポソームを生成させる。リポソームの生成方法は、周知の方法をそのまま適用することができ、すなわち、水和法やエレクトロフォーメーション法を適用することができる。水和法でもエレクトロフォーメーション法でも、凹部に水系媒体を加える。ここで、水系媒体としては純水でもよいし、水を主たる溶媒とする緩衝液等の各種水溶液でもよい。リポソームの内部に送達すべき所望の薬剤を包合させる場合には、水系媒体に該薬剤等を溶解することができる。凹部に水系媒体を加える操作は、基板をウェル内に置き、ウェルに水系媒体を加えて、基板全体を水系媒体中に浸漬することが簡便で好ましい。水和法では、この状態でリポソームの生成を待つ。リポソームは、通常、１０秒〜１０分程度で生成される。エレクトロフォーメーション法では、基板を水系媒体中に浸漬した状態で、導電性底面と水系媒体との間に交流電圧を印加する。交流電圧の周波数は、通常、5Hz〜20Hz程度、電圧の大きさは、0.1〜3V程度である。エレクトロフォーメーション法では、リポソームは、通常、１０秒〜２分程度で生成される。
【００２６】
上記した水和法の操作方法を図３に模式的に示す。２８はウェル、３０はウェル内に加えられた水系媒体である。
【００２７】
上記方法により、各凹部内で１個ずつリポソームが生成する。生成されるリポソームの直径は各凹部の直径とほぼ同じ（わずかに大きい）であるので、凹部の直径を均一にしておけば、生成するリポソームの直径のバラツキも非常に小さく抑えることができる。
【００２８】
生成されたリポソームは、凹部内に保持したまま利用することも可能であるし（創薬スクリーニング等の場合）、凹部から分離してDDSや化粧料に用いることもできる。リポソームを凹部から分離する場合には、基板を水系媒体中に浸漬した状態でスポイト等で水系媒体ごと回収すれば、リポソームが浮遊した水系媒体を回収することができる。なお、上記したリポソームの製造方法の全ての工程は、室温で行うことができる。
【００２９】
本発明は、上記した基板から成るリポソーム製造器具をも提供する。なお、各凹部の底面上に乾燥脂質膜がコーティングされた状態で保存や輸送が可能であり、リポソームは各ユーザーが使用時に生成させることも可能である。従って、本発明は、上記本発明の方法により凹部の底面上にコーティングされたリポソーム形成性脂質をさらに具備する上記本発明のリポソーム製造器具をも提供する。
【００３０】
さらに本発明は、上記した基板と、脂質溶液を収納した上記容器であって前記ノズルが前記基板に対向するように配置した容器とを具備するリポソーム製造装置をも提供する。
【００３１】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３２】
１．  基板の作製
図１に模式的に示す方法により、本発明のリポソームの製造方法に用いる上記基板を作製した。すなわち、ITOプレート１０上に化学蒸着により厚さ１μmのパリレン樹脂膜１２をコーティングした（図１(1))。次いで、パリレン樹脂膜１２上にアルミニウム膜１４を蒸着し、さらにその上にフォトレジスト膜１６をコーティングした（図１(2))。直径が約１０μm又は約２０μmの円形の透孔を多数有するフォトマスクをフォトレジスト膜上に置き、紫外線で露光、現像してフォトレジストとアルミニウム膜を選択除去した（図１(3))。次いで、酸素プラズマエッチングにより、パリレン樹脂を選択除去し、底面がITOプレート１０、側面が厚さ１μmのパリレン樹脂１２から成る凹部１８を形成した（図１(4))。
【００３３】
２．  エレクトロスプレー法
図２に模式的に示すエレクトロスプレー法により、脂質溶液を噴霧した。容器２０は、先端部が内径１５μmのキャピラリー状になったガラス製シリンジであり、先端を基板から1cm離した位置で、先端が基板に対向するように配置した。容器２０内に収容した脂質溶液２２は、DOPCをクロロホルムとアセトニトリルの混合溶媒(95:5)中に0.5mg/mLの濃度で溶解した溶液であった。脂質溶液内に電極を浸漬し、この電極を直流電圧電源のプラス極に接続し、一方、各凹部の底面を形成しているITOプレート１０を直流電圧電源のマイナス極に接続し、かつアースした。2kV/cmの直流電圧を印加しながら、容器内の脂質溶液をシリンジにて押し出して１分間にわたり噴霧した。噴霧量は、約1μLであった。これにより、脂質溶液は、電圧が印加されている凹部底面に選択的にコーティングされた。コーティングされた脂質溶液の溶媒は直ぐに蒸発し、その結果、各凹部底面は乾燥した脂質膜がコーティングされた。
【００３４】
次に図３に模式的に示す水和法により、リポソームを生成させた。すなわち、基板をウェル内に載置し、純水（MilliQ（商品名）水）をウェルに加えて基板を純水中に浸漬した。そのまま約１分間放置すると各凹部においてリポソームが１個ずつ生成した。凹部の直径が約２０μmの基板を用いた場合の結果を図４に、凹部の直径が約１０μmの基板を用いた場合の結果を図５に示す。図４及び図５中、(a)は各凹部底面に脂質膜がコーティングされた状態を示し、(b)は水和法により各凹部において生成されたリポソームを示す。図４及び図５中、(c)は、生成したリポソームの粒度分布を示す。図４及び図５の(c)に示されるように、上記方法で製造されたリポソームの直径の変動係数(CV)は、それぞれ８％及び１１％であり、非常に均一な直径のリポソームが製造されたことがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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