(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）と特異的に結合し、
（ａ）ＮＹＧＩＴ（配列番号３０のアミノ酸残基３１〜３５）のアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＷＩＳＡＹＮＧＮＴＮＹＡＱＫＬＱＤ（配列番号３０のアミノ酸残基５０〜６６）のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２、およびＤＲＶＰＲＩＰＶＴＴＥＡＦＤＩ（配列番号３０のアミノ酸残基９９〜１１３）のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３；ならびに
（ｂ）ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＹＦＶＹ（配列番号３２のアミノ酸残基２３〜３５）のアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＲＮＮＱＲＰＳ（配列番号３２のアミノ酸残基５１〜５７）のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２、およびＡＡＷＤＤＳＬＳＧＨＷＶ（配列番号３２のアミノ酸残基９０〜１０１）のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３
を含む単離した抗体またはその結合断片。
【請求項２】
前記抗体が完全ヒトモノクローナル抗体又は完全ヒト抗体の結合断片である、請求項１に記載の抗体またはその結合断片。
【請求項３】
前記抗体またはその結合断片がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはｄＡｂである、請求項１に記載の抗体またはその結合断片。
【請求項４】
請求項１に記載の抗体またはその断片を含む組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の抗体またはその断片を含む医薬組成物。
【請求項６】
デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）と特異的に結合し、
配列番号３０のアミノ酸配列、または表５のいずれかの行の６つの置換を含むことにより配列番号３０のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）配列；および
配列番号３２のアミノ酸配列、または表６のいずれかの行の５つの置換を含むことにより配列番号３２のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）配列
を含む単離した抗体またはその結合断片。
【請求項７】
ＶＨ配列が配列番号３０または配列番号７５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の抗体またはその結合断片。
【請求項８】
ＶＬ配列が配列番号３２または配列番号５０または配列番号７６に示されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の抗体またはその結合断片。
【請求項９】
ＶＬ配列が配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体またはその結合断片。
【請求項１０】
ＶＬ配列が配列番号５０に示されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の抗体またはその結合断片。
【請求項１１】
ＶＨ配列が配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の抗体またはその結合断片。
【請求項１２】
ＶＬ配列が配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の抗体またはその結合断片。
【請求項１３】
前記抗体が完全ヒトモノクローナル抗体又は完全ヒトモノクローナル抗体の結合断片である、請求項１２に記載の抗体またはその結合断片。
【請求項１４】
前記抗体またはその結合断片がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはｄＡｂである、請求項１２に記載の抗体またはその結合断片。
【請求項１５】
請求項１２に記載の抗体またはその断片を含む組成物。
【請求項１６】
請求項１２に記載の抗体またはその断片を含む医薬組成物。
【請求項１７】
ＶＬ配列が配列番号５０に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の抗体またはその結合断片。
【請求項１８】
前記抗体が完全ヒトモノクローナル抗体又は完全ヒトモノクローナル抗体の結合断片である、請求項１７に記載の抗体またはその結合断片。
【請求項１９】
前記抗体またはその結合断片がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはｄＡｂである、請求項１７に記載の抗体またはその結合断片。
【請求項２０】
請求項１７に記載の抗体またはその断片を含む組成物。
【請求項２１】
請求項１７に記載の抗体またはその断片を含む医薬組成物。
【請求項２２】
治療有効量の、デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）と特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む、動物における悪性腫瘍を治療するための組成物であって、該抗体またはその抗原結合断片が：（ａ）配列番号３０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに（ｂ）配列番号３２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）または配列番号５０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む、上記組成物。
【請求項２３】
前記動物がヒトである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記悪性腫瘍が、黒色腫、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、グリオーマ、肝細胞（肝臓）ガン、甲状腺腫瘍、胃ガン、前立腺ガン、乳ガン、卵巣ガン、膀胱ガン、肺ガン、グリア芽腫、子宮内膜ガン、腎臓ガン、結腸ガン、膵臓ガン、食道ガン、頭頸部ガン、中皮腫、肉腫、胆管（ｂｉｌｉａｒｙ）ガン（胆管ガン（ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ））、小腸腺ガン、小児悪性腫瘍および扁平上皮ガンからなる群から選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記抗体またはその抗原結合断片が、（ａ）配列番号３０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）配列番号３２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２６】
前記抗体またはその抗原結合断片が、（ａ）配列番号３０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに（ｂ）配列番号５０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含むＶＬを含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２７】
ＤＬＬ４と特異的に結合する抗体またはその結合断片をコードする単離した核酸分子であって、該抗体が：
（ａ）配列番号３０の重鎖可変領域（ＶＨ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；ならびに
（ｂ）配列番号３２の軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３
を含む、上記核酸分子。
【請求項２８】
抗体またはその結合断片が配列番号３０または配列番号７５に示されるＶＨアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の核酸分子。
【請求項２９】
抗体またはその結合断片が配列番号３２または配列番号５０または配列番号７６に示されるＶＬアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の核酸分子。
【請求項３０】
抗体またはその結合断片が配列番号３０に示されるＶＨアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載の核酸分子。
【請求項３１】
抗体またはその結合断片が配列番号３２に示されるＶＬアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の核酸分子。
【請求項３２】
抗体またはその結合断片が配列番号５０に示されるＶＬアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の核酸分子。
【請求項３３】
抗体またはその結合断片が配列番号３２に示されるＶＬアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の核酸分子。
【請求項３４】
抗体またはその結合断片が配列番号５０に示されるＶＬアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の核酸分子。
【請求項３５】
ＶＨが配列番号２９に示されるヌクレオチド配列によりコードされ、ＶＬが配列番号４９に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、請求項２７に記載の核酸分子。
【請求項３６】
ＶＨが配列番号２９に示されるヌクレオチド配列によりコードされ、ＶＬが配列番号３１に示されるヌクレオチド配列によりコードされる、請求項２７に記載の核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＬＬ４に対する標的結合剤およびかかる薬剤の使用に関する。さらに具体的には、本発明は、ＤＬＬ４を指向する完全ヒトモノクローナル抗体に関する。記載したこれらの標的結合剤は、ＤＬＬ４の活性および／または過剰生産と関連する疾患の治療において、ならびに診断として有用である。
【背景技術】
【０００２】
ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）シグナル伝達カスケードは、発生中の多くの組織中の細胞運命決定、幹細胞の維持および分化に関わってきた進化的に保存された経路である。これまで、４つのノッチ受容体リガンド（Ｎｏｔｃｈ１〜４）および５つのリガンド（Ｊａｇｇｅｄ−１/２およびデルタ様リガンド（Ｄｌｌ）１／３／４）が、哺乳動物において同定された。ノッチ受容体は、ヘテロダイマーとして存在し、２つの非共有結合で結合した細胞外サブユニットおよび膜貫通サブユニットから成る。細胞外サブユニットへのリガンド結合は、ＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）およびγ−セクレターゼのような酵素によるタンパク質切断を引き起こし、その結果ノッチ細胞内領域（ＮＩＣＤ）の生成をもたらし、それは核に移行し転写因子と結合し、最終的に下流標的遺伝子の活性化をもたらす（Ｂｒａｙ,２００６,Ｎａｔ. Ｒｅｖ.Ｍｏｌ.Ｃｅｌｌ.Ｂｉｏｌ.,７,６７８参照）。
【０００３】
多数のノッチ経路構成成分が血管構造中で発現すること、および正常のノッチシグナル伝達の異常が血管表現型に起こり得ることを新たな証拠が示唆する。例えば、Ｊａｇｇｅｄ１およびＮｏｔｃｈ３の変異は、各々、アラジール症候群、ならびに皮質下梗塞および白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症をもたらし、２つの疾患は血管障害を示す。さらに、マウスのＮｏｔｃｈ１およびＤＬＬ４の遺伝子欠失は、すべて血管異常を伴う胚性致死をもたらす。さらに、マウスのＤＬＬ４の１つの対立遺伝子の欠失は、ほとんどの遺伝的背景に深刻な血管障害を伴う胚性致死をもたらす（Ｄｕａｒｔｅ ｅｔ ａｌ.,２００４,Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ.,１８,２４７４；Ｇａｌｅ ｅｔ ａｌ.,２００４,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.,１０１,１５９４９）。この表現型は、ＶＥＧＦ−Ａについて以前に唯一報告され、ＤＬＬ４が血管発生に重要な役割を担い得ることを示唆する。
【０００４】
ＤＬＬ４発現は、ヒト腎明細胞ガン、グリア芽腫ならびに乳ガンおよび膀胱ガンの腫瘍の血管構造においても報告された（Ｍａｉｌｈｏｓ ｅｔ ａｌ.,２００１,Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ,６９,１３５；Ｐａ ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ ｔｅｌ ｅｔ ａｌ.,２００５,Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.,６５,８６９０；Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ.,２００６,Ｃｌｉｎ.Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.,１２,４８３６；Ｌｉ ｅｔ ａｌ.,２００７,Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.,６７,１１２４４）。最近の研究は、ＤＬＬ４がヒトグリア芽腫の腫瘍細胞の一部において発現し得ることも示唆した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ.,２００７,Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.,６７,１１２４４）。ＤＬＬ４シグナル伝達遮断の腫瘍増殖への効果も、腫瘍細胞系が免疫不全マウスの皮下で増殖するガンのいくつかの前臨床モデルを用いて評価された（Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ.,２００６,Ｎａｔｕｒｅ,４４４,１０８３；Ｎｏｇｕｅｒａ−Ｔｒｏｉｓｅ ｅｔ ａｌ.,Ｎａｔｕｒｅ,４４４,１０３２）。これらの研究において、腫瘍増殖の減少が報告された。これらの抗腫瘍効果は、低酸素症の深刻化に付随して、腫瘍における不十分な機能の血管密度の増加と関連した。総合すると、これらのデータは、血管発生における役割に加えて、ＤＬＬ４が腫瘍血管構造の発生にも役割を担い得ることを示唆する。
【０００５】
血管新生における効果に加えて、ノッチシグナル伝達は多数の腫瘍型由来のガン幹細胞にも関わっている（Ｄｏｎｔｕ ｅｔ ａｌ.,２００４,Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎ.Ｒｅｓ.,６,Ｒ６０５；Ｗｉｌｓｏｎ ＆ Ｒａｄｔｋｅ,２００６,ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ.,５８０,２８６０）。ガン幹細胞が様々な造血器腫瘍および固形ガンから単離され（Ａｌ−Ｈａｊｊ ｅｔ ａｌ.,２００３,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.,１００,３９８３；Ｌａｐｉｄｏｔ ｅｔ ａｌ.,１９９４,Ｎａｔｕｒｅ,１７,６４５；Ｔａｎ ｅｔ ａｌ.,２００６,Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ,８６,１２０３）、小集団の腫瘍細胞内におけるＤＬＬ４の存在は、ＤＬＬ４がガン幹細胞生物学にも関与し得ること、ならびにＤＬＬ４アンタゴニストがこれらの細胞型との相互作用を介して抗腫瘍効果を部分的に媒介し得ることをさらに示唆する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｒａｙ,２００６,Ｎａｔ. Ｒｅｖ.Ｍｏｌ.Ｃｅｌｌ.Ｂｉｏｌ.,７,６７８
【非特許文献２】Ｄｕａｒｔｅ ｅｔ ａｌ.,２００４,Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ.,１８,２４７４
【非特許文献３】Ｇａｌｅ ｅｔ ａｌ.,２００４,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.,１０１,１５９４９
【非特許文献４】Ｍａｉｌｈｏｓ ｅｔ ａｌ.,２００１,Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ,６９,１３５
【非特許文献５】Ｐａ ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ ｔｅｌ ｅｔ ａｌ.,２００５,Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.,６５,８６９０
【非特許文献６】Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ.,２００６,Ｃｌｉｎ.Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.,１２,４８３６
【非特許文献７】Ｌｉ ｅｔ ａｌ.,２００７,Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ.,６７,１１２４４
【非特許文献８】Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ.,２００６,Ｎａｔｕｒｅ,４４４,１０８３
【非特許文献９】Ｎｏｇｕｅｒａ−Ｔｒｏｉｓｅ ｅｔ ａｌ.,Ｎａｔｕｒｅ,４４４,１０３２
【非特許文献１０】Ｄｏｎｔｕ ｅｔ ａｌ.,２００４,Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎ.Ｒｅｓ.,６,Ｒ６０５
【非特許文献１１】Ｗｉｌｓｏｎ ＆ Ｒａｄｔｋｅ,２００６,ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ.,５８０,２８６０
【非特許文献１２】Ａｌ−Ｈａｊｊ ｅｔ ａｌ.,２００３,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.,１００,３９８３
【非特許文献１３】Ｌａｐｉｄｏｔ ｅｔ ａｌ.,１９９４,Ｎａｔｕｒｅ,１７,６４５
【非特許文献１４】Ｔａｎ ｅｔ ａｌ.,２００６,Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ,８６,１２０３
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ＤＬＬ４に特異的に結合し、ＤＬＬ４の生物活性を阻害する標的結合剤に関する。本発明の実施形態は、ＤＬＬ４に特異的に結合し、Ｎｏｔｃｈ受容体（例えばＮｏｔｃｈ１、２、３または４）へのＤＬＬ４の結合を阻害する標的結合剤に関する。
【０００８】
本発明の実施形態は、ＤＬＬ４に特異的に結合し、Ｎｏｔｃｈ受容体、（例えばＮｏｔｃｈ１または４）へのＤＬＬ４の結合を阻害する標的結合剤に関する。一実施形態において、標的結合剤は、ＤＬＬ４特異的に結合し、Ｎｏｔｃｈ受容体、例えばＮｏｔｃｈ１への結合を阻害する。一実施形態において、この標的結合剤は、この標的結合剤の無い状態で生じる結合と比較して、ＤＬＬ４のＮｏｔｃｈ受容体（例えばＮｏｔｃｈ１）への結合を、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％阻害する。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態において、この標的結合剤は、５ナノモル濃度（ｎＭ）未満の結合親和性（ＫＤ）でＤＬＬ４と結合する。他の実施形態において、この標的結合剤は、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭまたは１ｎＭ未満のＫＤで結合する。本発明のいくつかの実施形態において、この標的結合剤は、９５０ピコモル（ｐＭ）未満のＫＤでＤＬＬ４と結合する。本発明のいくつかの実施形態において、この標的結合剤は、９００ｐＭ未満のＫＤでＤＬＬ４と結合する。他の実施形態において、この標的結合剤は、８００ｐＭ、７００ｐＭまたは６００ｐＭ未満のＫＤで結合する。本発明のいくつかの実施形態において、この標的結合剤は、５００ｐＭ未満のＫＤでＤＬＬ４と結合する。他の実施形態において、この標的結合剤は、４００ｐＭ未満のＫＤで結合する。さらに他の実施形態において、この標的結合剤は、３００ｐＭ未満のＫＤで結合する。いくつかの他の実施形態において、この標的結合剤は、２００ｐＭ未満のＫＤで結合する。いくつかの他の実施形態において、この標的結合剤は、１５０ｐＭ未満のＫＤで結合する。さらに別の実施形態において、この標的結合剤は、１００ｐＭ未満のＫＤで結合する。別の実施形態において、この標的結合剤は、５０ｐＭ未満のＫＤで結合する。具体的な一実施形態において、本発明の標的結合剤は、１０ｐＭ未満の親和性ＫＤでヒトＤＬＬ４と結合し得る。別の具体的な実施形態において、本発明の標的結合剤は、１ｐＭ未満の親和性ＫＤでヒトＤＬＬ４と結合し得る。ＫＤは、本明細書記載の方法または当業者に知られた方法（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ）（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して評価し得る。
【００１０】
本発明の標的結合剤または抗体の結合特性は、解離速度または会合速度（各々、ｋｏｆｆおよびｋｏｎ）を参照することによっても測定し得る。
【００１１】
本発明の一実施形態において、標的結合剤または抗体は、少なくとも１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも２×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１ｓ−１、または少なくとも１０８Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎ速度（抗体（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）ｋｏｎ→Ａｂ−Ａｇ）を有し得る。
【００１２】
本発明の別の実施形態において、標的結合剤または抗体は、５×１０−１ｓ−１未満、１０−１ｓ−１未満、５×１０−２ｓ−１未満、１０−２ｓ−１未満、５×１０−３ｓ−１未満、１０−３ｓ−１未満、５×１０−４ｓ−１未満、４×１０−４ｓ−１未満、３×１０−４ｓ−１未満、２×１０−４ｓ−１未満、１０−４ｓ−１未満、５×１０−５ｓ−１未満、１０−５ｓ−１未満、５×１０−６ｓ−１未満、１０−６ｓ−１未満、５×１０−７ｓ−１未満、１０−７ｓ−１未満、５×１０−８ｓ−１未満、１０−８ｓ−１未満、５×１０−９ｓ−１未満、１０−９ｓ−１未満、または１０−１０ｓ−１未満のｋｏｆｆ速度（（Ａｂ―Ａｇ）ｋｏｆｆ→抗体（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ））を有し得る。
【００１３】
本発明の標的結合剤は、ヒトＤＬＬ４と結合する。一部の例において、本発明の標的結合剤は、他の種由来の他のＤＬＬ４タンパク質と交差反応性を示す。一実施形態において、本発明の標的結合剤は、カニクイザルＤＬＬ４と交差反応性を示す。別の実施形態において、本発明の標的結合剤は、カニクイザルＤＬＬ４と交差反応性を示すが、他の種に由来するＤＬＬ４タンパク質、例えばマウスＤＬＬ４とわずかに交差反応性を示し、例えば標的結合剤はＢＩＡｃｏｒｅ技術により評価されるように、３６０ｎＭを上回るＫＤでマウスＤＬＬと結合する。
【００１４】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤は、他の種由来のＤＬＬ４タンパク質に対してほぼ同等の親和性を有する。一つの具体例において、本発明のヒトＤＬＬ４標的結合剤は、カニクイザルＤＬＬ４に対してほぼ同等の親和性を有する。同等レベルの親和性とは、ヒトＤＬＬ４に関する親和性が１である時、カニクイザルＤＬＬ４に関する抗体の親和性は０．２〜５または０．２〜２であることを意味する。
【００１５】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤は、ヒトＤＬＬ４に特異的であるが、他のＮｏｔｃｈリガンドと結合しない。一例において、本発明の標的結合剤は、ヒトＤＬＬ４に特異的であるが、ＤＬＬ１に著しく結合せず、例えばＤＬＬ１／偽（ｍｏｃｋ）率は、本明細書に記載するように、標的結合剤（１５〜３００μｇ／ｍｌ）がヒトＤＬＬ１を一過的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞に、またはＤＬＬ１を安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞に結合する能力を試験することにより測定されるように、２．５未満である。別の例において、本発明の標的結合剤は、ヒトＤＬＬ４に特異的であるが、Ｊａｇｇｅｄ１に著しく結合せず、例えばＤＬＬ１／偽率は、本明細書に記載するように、標的結合剤（５μｇ／ｍｌ）がヒトＪａｇｇｅｄ１を一過的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞に、またはヒトＪａｇｇｅｄ１を安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞に結合する能力を試験することにより測定されるように、１．５未満である。
【００１６】
さらに別の実施形態において、本発明の標的結合剤は、ＤＬＬ４−Ｎｏｔｃｈ１受容体−リガンド結合を阻害する。一例において、この標的結合剤の保有する活性は、１０μＭ未満のＩＣ50濃度（５０％阻害に達する濃度）で示すことができる。別の例において、本発明の標的結合剤は、５０、４０、３０、２０、１０、５、４、２、１、０．８、０．７、０．６、０．５または０．４ｎＭ未満のＩＣ50濃度を有し得る。
【００１７】
さらに別の実施形態において、本発明の標的結合剤は、インビトロおよびインビボの活性の両方を有することができる。１つの具体例において、この標的結合剤は、二次元培養においてＨＵＶＥＣ細胞増殖のＤＬＬ４刺激による阻害を逆転する。一実施例において、本発明の抗体は、（ＤＬＬ４を加えない実施例９のアッセイを使用する）対照と比較して、７０％以上、例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、ＨＵＶＥＣ細胞増殖のＤＬＬ４刺激による阻害を逆転することができる。
【００１８】
さらに別の実施形態において、この標的結合剤、例えば、本発明の抗体は、二次元培養のＨＵＶＥＣ管形成を阻害することができる。例えば、本発明の抗体は、対照（この対照は、２０μｇ／ｍｌの同じ抗体を使用して測定した最大阻害効果）に対して、０．０８μｇ／ｍｌの濃度において５０％超の阻害、例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の阻害を示すことができる。
【００１９】
さらに別の実施形態において、本発明の標的結合剤は、時間が０の時の対照に対して、４時間の時点で、５０％未満、例えば、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％の内部移行を示すことができる。別の実施形態において、本発明の標的結合剤は、時間が０の時の対照に対して、４時間の時点で、５〜５０％、１０〜４０％または２０〜４０％の内部移行を示すことができる（実施例１５参照）。
【００２０】
一実施形態において、特異的にＤＬＬ４と結合する本発明の標的結合剤は１つまたは複数の以下の特性を示すことができ、その特性には、２００ｐＭ未満のＫＤでヒトＤＬＬ４と結合する；カニクイザルＤＬＬ４と交差反応する；マウスＤＬＬ４と弱い交差反応をする；ほぼ同等の親和性でカニクイザルＤＬＬ４と結合する；ＤＬＬ１またはＪａｇｇｅｄ１と顕著に結合しない；対照と比較して、二次元培養のＨＵＶＥＣ細胞増殖のＤＬＬ４刺激による阻害の８５％超の逆転を示す；対照と比較して、０．０８μｇ／ｍｌの濃度において、二次元培養のＨＵＶＥＣ細胞管形成の５０％超の阻害を示す；ならびに時間が０の時の対照に対して、４時間の時点で５０％未満の内部移行を示すことが含まれる。
【００２１】
別の実施形態において、本明細書に開示される標的結合タンパク質は、有益で有効な代謝特性および／または薬力学的特性を保有する。
【００２２】
本発明の別の実施形態において、この標的結合剤は、Ｎｏｔｃｈ１への結合に対して、任意の１つの完全ヒトモノクローナル抗体４Ｂ４、２Ｈ１０、２１Ｆ７、１２Ａ１、１７Ｆ３、９Ｇ８、２０Ｇ８、２１Ｈ３、１Ｅ４、３Ａ７、４Ｂ３、１Ｄ４または２１Ｈ３ＲＫと競合する。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態において、この標的結合剤は、哺乳動物の腫瘍増殖および／もしくは転移を阻害する。別の実施形態において、この標的結合剤は、血管新生に関連する疾患を治療することができる。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態において、この標的結合剤は抗体である。本発明のいくつかの実施形態において、この標的結合剤はモノクローナル抗体である。本発明の一実施形態において、この標的結合剤は完全ヒトモノクローナル抗体である。本発明の別の実施形態において、この標的結合剤は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプの完全ヒトモノクローナル抗体である。本発明の別の実施形態において、この標的結合剤は、ＩｇＧ２アイソタイプの完全ヒトモノクローナル抗体である。ＩｇＧ２アイソタイプは、他のアイソタイプと比較してエフェクター機能を引き出す可能性を減少させ、これは毒性を減少させ得る。本発明の別の実施形態において、この標的結合剤は、ＩｇＧ１アイソタイプの完全ヒトモノクローナル抗体である。ＩｇＧ１アイソタイプは、他のアイソタイプと比較してＡＤＣＣを引き出す可能性を増加させ、これは有効性を改善し得る。ＩｇＧ１アイソタイプは、他のアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ４と比較して安定性を改善し、これは生物学的利用能を改善し、もしくは製造の容易さを改善し得、または半減期がより長くなり得る。一実施形態において、ＩｇＧ１アイソタイプの完全ヒトモノクローナル抗体は、z、zaまたはfのアロタイプの抗体である。
【００２５】
さらなる実施形態は、ＤＬＬ４へ特異的に結合し、表２に示される相補性決定領域（ＣＤＲ）配列のうちの１つを含む配列を含む標的結合剤または抗体である。本発明の実施形態は、表２に示されるような任意の１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列を含む配列を含む標的結合剤または抗体を含む。さらなる実施形態は、ＤＬＬ４へ特異的に結合し、表２に示されるような２つのＣＤＲ配列を含む配列を含む標的結合剤または抗体である。別の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、表２に示されるようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含む。別の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、表２に示されるようなＣＤＲ配列のうちの１つを含む配列を含む。本発明の実施形態は、表２に示されるような任意の１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３配列を含む配列を含む標的結合剤または抗体を含む。別の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、表２に示されるような２つのＣＤＲ配列を含む配列を含む。別の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、表２に示されるようなＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含む。別の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、表２に示されるような可変重鎖配列または可変軽鎖配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列を含み得る。いくつかの実施形態において、この標的結合剤は抗体である。特定の実施形態において、この標的結合剤は、完全ヒトモノクローナル抗体である。特定の他の実施形態において、この標的結合剤は、完全ヒトモノクローナル抗体の結合断片である。
【００２６】
別の実施形態において、この標的結合剤は、表２に示されるようなＶＨ ＣＤＲ１と同一のまたはＶＨ ＣＤＲ１に対して１、２、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する表２に示されるようなＶＨ ＣＤＲ１、表２に示されるようなＶＨ ＣＤＲ２と同一のまたはＶＨ ＣＤＲ２に対して１、２、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する表２に示されるようなＶＨ ＣＤＲ２、表２に示されるようなＶＨ ＣＤＲ３と同一のまたはＶＨ ＣＤＲ３に対して１、２、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する表２に示されるようなＶＨ ＣＤＲ３、表２に示されるようなＶＬ ＣＤＲ１と同一のまたはＶＬ ＣＤＲ１に対して１、２、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する表２に示されるようなＶＬ ＣＤＲ１、表２に示されるようなＶＬ ＣＤＲ２と同一のまたはＶＬ ＣＤＲ２に対して１、２、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する表２に示されるようなＶＬ ＣＤＲ２、表２に示されるようなＶＬ ＣＤＲ３と同一のまたはＶＬ ＣＤＲ３に対して１、２、または３つのアミノ酸残基置換を含むアミノ酸配列を有する表２に示されるようなＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【００２７】
一実施形態において、この標的結合剤は、表２に示されるようなＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、表２に示されるようなＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３とを含む。
【００２８】
さらに別の実施形態において、この標的結合剤は免疫特異的にＤＬＬ４と結合し、表２に示されるようなアミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有する表２に示されるような重鎖可変領域を含み、表２に示されるようなアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する表２に示されるような軽鎖可変領域を含み、ここで前記抗体はＤＬＬ４に対する結合活性を有する。
【００２９】
別の実施形態において、この標的結合剤は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０２、ＰＴＡ−９５１７、ＰＴＡ−９５０１、またはＰＴＡ−９５０８という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ２Ｈ１０ ＶＨＯＰ、Ｍａｂ９Ｇ８ＶＨ、Ｍａｂ２１Ｈ３ＶＨ、およびＭａｂ４Ｂ４ＶＨと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる可変重鎖配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３のうちの任意の１つを含む配列を含み得る。別の実施形態において、この標的結合剤は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５１６、ＰＴＡ−９５００、またはＰＴＡ−９５２０という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ９Ｇ８ＶＬＯＰＴ１、Ｍａｂ２１Ｈ３ＶＬＯＰ、およびＭａｂ４Ｂ４ＶＬ、並びに２００９年７月７日にＰＴＡ−１０１８１に寄託されたＭａｂ２Ｈ１０ＶＬＯＰ１と命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる可変軽鎖配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３のうちの任意の１つを含む配列を含み得る。
【００３０】
一実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０２という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ２Ｈ１０ＶＨＯＰと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされるＣＤＲ３を含む可変重鎖アミノ酸配列を含む。
【００３１】
一実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０２という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ２Ｈ１０ＶＨＯＰと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされるＣＤＲ３を含む可変重鎖アミノ酸配列を含み、２００９年７月７日にＰＴＡ−１０１８１という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ２Ｈ１０ＶＬＯＰ１と命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされるＣＤＲ３を含む可変軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００３２】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０２という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ２Ｈ１０ＶＨＯＰと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣＤＲを含む可変重鎖アミノ酸配列を含む。
【００３３】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００９年７月７日にＰＴＡ−１０１８１という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ２Ｈ１０ＶＬＯＰ１と命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣＤＲを含む可変軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００３４】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０２という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ２Ｈ１０ＶＨＯＰと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣＤＲを含む可変重鎖アミノ酸配列を含み、２００９年７月７日にＰＴＡ−１０１８１という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ２Ｈ１０ＶＬＯＰ１と命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣＤＲを含む可変軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００３５】
一実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、ＰＴＡ−９５１７という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ９Ｇ８ＶＨと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされるＣＤＲ３を含む可変重鎖アミノ酸配列を含む。
【００３６】
一実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５１７という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ９Ｇ８ＶＨと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされるＣＤＲ３を含む可変重鎖アミノ酸配列を含み、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５１６という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ９Ｇ８ＶＬＯＰＴ１と命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされるＣＤＲ３を含む可変軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００３７】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５１７という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ９Ｇ８ＶＨと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣＤＲを含む可変重鎖アミノ酸配列を含む。
【００３８】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５１６という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ９Ｇ８ＶＬＯＰＴ１と命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣＤＲを含む可変軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００３９】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５１７という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ９Ｇ８ＶＨと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣＤＲを含む可変重鎖アミノ酸配列を含み、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５１６という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ９Ｇ８ＶＬＯＰＴ１と命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣＤＲを含む可変軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００４０】
一実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０１という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ２１Ｈ３ＶＨと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされるＣＤＲ３を含む可変重鎖アミノ酸配列を含む。
【００４１】
一実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０１という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ２１Ｈ３ＶＨと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされるＣＤＲ３を含む可変重鎖アミノ酸配列を含み、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５００という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ２１Ｈ３ＶＬＯＰと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされるＣＤＲ３を含む可変軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００４２】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０１という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ２１Ｈ３ＶＨと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣＤＲを含む可変重鎖アミノ酸配列を含む。
【００４３】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５００という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ２１Ｈ３ＶＬＯＰと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣＤＲを含む可変軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００４４】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０１という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ２１Ｈ３ＶＨと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣＤＲを含む可変重鎖アミノ酸配列を含み、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５００という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ２１Ｈ３ＶＬＯＰと命名されたプラスミドの中に、ポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣＤＲを含む可変軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００４５】
一実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０８という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ４Ｂ４ＶＨと命名されたプラスミドの中のポリヌクレオチドによってコードされるＣＤＲ３を含む可変重鎖アミノ酸配列を含む。
【００４６】
一実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０８という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ４Ｂ４ＶＨと命名されたプラスミドの中のポリヌクレオチドによってコードされるＣＤＲ３を含む可変重鎖アミノ酸配列を含み、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５２０という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ４Ｂ４ＶＬと命名されたプラスミドの中のポリヌクレオチドによってコードされるＣＤＲ３を含む可変軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００４７】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０８という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ４Ｂ４ＶＨと命名されたプラスミドの中のポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣＤＲを含む可変重鎖アミノ酸配列を含む。
【００４８】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５２０という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ４Ｂ４ＶＬと命名されたプラスミドの中のポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣＤＲを含む可変軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００４９】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０８という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ４Ｂ４ＶＨと命名されたプラスミドの中のポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣＤＲを含む可変重鎖アミノ酸配列を含み、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５２０という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ４Ｂ４ＶＬと命名されたプラスミドの中のポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＣＤＲを含む可変軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００５０】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０２という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ２Ｈ１０ＶＨＯＰと命名されたプラスミドの中のポリヌクレオチドによってコードされる抗体の可変重鎖を含む。
【００５１】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５１７という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ９Ｇ８ＶＨと命名されたプラスミドの中のポリヌクレオチドによってコードされる抗体の可変重鎖を含む。
【００５２】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０１という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ２１Ｈ３ＶＨと命名されたプラスミドの中のポリヌクレオチドによってコードされる抗体の可変重鎖を含む。
【００５３】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０８という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ４Ｂ４ＶＨと命名されたプラスミドの中のポリヌクレオチドによってコードされる抗体の可変重鎖を含む。
【００５４】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００９年７月７日にＰＴＡ−１０１８１という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ２Ｈ１０ＶＬＯＰ１と命名されたプラスミドの中のポリヌクレオチドによってコードされる抗体の可変軽鎖を含む。
【００５５】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５１６という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ９Ｇ８ＶＬＯＰＴ１と命名されたプラスミドの中のポリヌクレオチドによってコードされる抗体の可変軽鎖を含む。
【００５６】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５００という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ２１Ｈ３ＶＬＯＰと命名されたプラスミドの中のポリヌクレオチドによってコードされる抗体の可変軽鎖を含む。
【００５７】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５２０という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ４Ｂ４ＶＬと命名されたプラスミドの中のポリヌクレオチドによってコードされる抗体の可変軽鎖を含む。
【００５８】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０２という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ２Ｈ１０ＶＨＯＰと命名されたプラスミドの中のポリヌクレオチドによってコードされる抗体の可変重鎖を含み、２００９年７月７日にＰＴＡ−１０１８１という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ２Ｈ１０ＶＬＯＰ１と命名されたプラスミドの中のポリヌクレオチドによってコードされる抗体の可変軽鎖を含む。
【００５９】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５１６という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ９Ｇ８ＶＬＯＰＴ１と命名されたプラスミドの中のポリヌクレオチドによってコードされる抗体の可変軽鎖を含み、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５１７という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ９Ｇ８ＶＨと命名されたプラスミドの中のポリヌクレオチドによってコードされる抗体の可変重鎖を含む。
【００６０】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５０１という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ２１Ｈ３ＶＨと命名されたプラスミドの中のポリヌクレオチドによってコードされる抗体の可変重鎖を含み、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５００という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ２１Ｈ３ＶＬＯＰと命名されたプラスミドの中のポリヌクレオチドによってコードされる抗体の可変軽鎖を含む。
【００６１】
別の実施形態において、本発明の標的結合剤または抗体は、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５２０という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ４Ｂ４ＶＬと命名されたプラスミドの中のポリヌクレオチドによってコードされる抗体の可変軽鎖を含み、２００８年９月１７日にＰＴＡ−９５２０という番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたＭａｂ４Ｂ４ＶＬと命名されたプラスミドの中のポリヌクレオチドによってコードされる抗体の可変軽鎖を含む。
【００６２】
当業者は容易にＣＤＲ決定をすることができることに留意されたい。例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ,Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２、Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１）、ｖｏｌｓ.１−３を参照されたい。カバット（Ｋａｂａｔ）は、多数の種の抗体アイソタイプから免疫グロブリン鎖の多重配列アライメントを提供している。この整列された配列は、シングル付番方式（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）であるカバット付番方式（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）に従って番号が付けられる。カバット配列は、１９９１年の発表以来アップデートされており、電子配列データベースとして利用できる（最新のダウンロード可能バージョンは１９９７）。任意の免疫グロブリン配列は、カバットに従って、カバット参照配列を用いて整列させることによって番号が付けられ得る。従って、カバット付番方式は、免疫グロブリン鎖の番号付けのための統一システムを提供する。
【００６３】
一実施形態において、この標的結合剤または抗体は、表２に示される任意の１つの重鎖配列を含む配列を含む。別の実施形態において、この標的結合剤および抗体は、抗体２０Ｇ８、２１Ｈ３、１４Ｂ１、１８Ｂ７、１７Ｂ６、１７Ｆ３、１２Ａ１、１７Ｇ１２、１９Ｇ９、２１Ｆ７、２０Ｄ６、１Ｄ４、４Ｂ４、２Ｈ１０もしくは２１Ｈ３ＲＫの任意の１つの重鎖配列を含む配列、または表５、表７、表９、表１１もしくは表１３に示されるようなこれらの抗体の重鎖配列のうち任意の最適な変形を含む。軽鎖の混在は、当該技術分野において十分に確立されており、従って、標的結合剤または抗体は、抗体４Ｂ４、２Ｈ１０、２１Ｆ７、１２Ａ１、１７Ｆ３、９Ｇ８、２０Ｇ８、２１Ｈ３、１Ｅ４、３Ａ７、４Ｂ３、１Ｄ４、もしくは２１Ｈ３ＲＫの任意の１つの軽鎖配列を含む配列、または表６、表８、表１０、表１２もしくは表１３に示されるようなこれらの抗体の軽鎖配列のうち任意の最適な変形、または本明細書に開示される任意の別の抗体を含む。一実施形態では、この標的結合剤または抗体は表２に示されるような任意の１つの重鎖配列、または表５、表７、表９、表１１もしくは表１３に示されるようなこれらの抗体の重鎖配列のうち任意の最適な変形を含む配列を含み、表６、表８、表１０、表１２または表１３に示される任意の１つの軽鎖配列、または本明細書に開示される任意の別の抗体をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００６４】
いくつかの実施形態において、この標的結合剤は、４Ｂ４、２Ｈ１０、２１Ｆ７、１２Ａ１、１７Ｆ３、９Ｇ８、２０Ｇ８、２１Ｈ３、１Ｅ４、３Ａ７、４Ｂ３、１Ｄ４、または２１Ｈ３ＲＫからなる群から選択されるモノクローナル抗体である。一実施形態において、この標的結合剤は、１つまたは複数の完全ヒトモノクローナル抗体４Ｂ４、２Ｈ１０、２１Ｆ７、１２Ａ１、１７Ｆ３、９Ｇ８、２０Ｇ８、２１Ｈ３、１Ｅ４、３Ａ７、４Ｂ３、１Ｄ４、または２１Ｈ３ＲＫを含む。特定の実施形態において、この標的結合剤は、モノクローナル抗体４Ｂ４である。特定の実施形態において、この標的結合剤は、モノクローナル抗体２１Ｈ３である。特定の実施形態において、この標的結合剤は、モノクローナル抗体２Ｈ１０である。特定の実施形態において、この標的結合剤は、モノクローナル抗体９Ｇ８である。特定の他の実施形態において、この標的結合剤は、モノクローナル抗体２１Ｈ３ＲＫである。
【００６５】
一実施形態において、標的結合剤または抗体は、表２に示される任意の１つの配列から選択される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む配列を含み得る。
【００６６】
一実施形態において、標的結合剤または抗体は、表２に示される任意の１つの配列から選択される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む配列を含み得る。一実施形態において、標的結合剤または抗体は、抗体４Ｂ４、２Ｈ１０、２１Ｆ７、１２Ａ１、１７Ｆ３、９Ｇ８、２０Ｇ８、２１Ｈ３、１Ｅ４、３Ａ７、４Ｂ３、１Ｄ４、または２１Ｈ３ＲＫの任意の１つのＣＤＲから選択される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む配列を含み得る。一実施形態において、標的結合剤または抗体は、抗体４Ｂ４、２Ｈ１０、２１Ｆ７、１２Ａ１、１７Ｆ３、９Ｇ８、２０Ｇ８、２１Ｈ３、１Ｅ４、３Ａ７、４Ｂ３、１Ｄ４または２１Ｈ３ＲＫの任意の１つのＣＤＲから選択される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む配列を含み得る。
【００６７】
別の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、表２に示されるような任意の１つの完全ヒトモノクローナル抗体４Ｂ４、または２１Ｈ３、２Ｈ１０、９Ｇ８、もしくは２１Ｈ３ＲＫの可変重鎖配列のうち、任意の１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３を含む配列を含み得る。別の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、表２に示されるような任意の１つの完全ヒトモノクローナル抗体４Ｂ４、または２１Ｈ３、２Ｈ１０、９Ｇ８、もしくは２１Ｈ３ＲＫの可変軽鎖配列のうち、任意の１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３を含む配列を含み得る。別の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、表２に示されるような完全ヒトモノクローナル抗体４Ｂ４、または２１Ｈ３、２Ｈ１０、９Ｇ８、もしくは２１Ｈ３ＲＫのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む配列、並びに表２に示されるような完全ヒトモノクローナル抗体４Ｂ４、または２１Ｈ３、２Ｈ１０、９Ｇ８、もしくは２１Ｈ３ＲＫのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み得る。いくつかの実施形態において、この抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００６８】
別の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、表２に示されるような完全ヒトモノクローナル抗体４Ｂ４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列、並びに完全ヒトモノクローナル抗体４Ｂ４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。別の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、表２に示されるような完全ヒトモノクローナル抗体２１Ｈ３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列、並びに表２に示されるような完全ヒトモノクローナル抗体２１Ｈ３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。別の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、表２に示されるような完全ヒトモノクローナル抗体２Ｈ１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む配列、並びに表２に示されるような完全ヒトモノクローナル抗体２Ｈ１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態において、この抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００６９】
本発明のさらなる実施形態は、表２または表１３に示されるような任意の１つの配列のフレームワーク領域およびＣＤＲ、具体的にはＦＲ１〜ＦＲ４またはＣＤＲ１〜ＣＤＲ３に及ぶ近接配列を含む配列を含む標的結合剤または抗体である。一実施形態において、この標的結合剤または抗体は、表２または表１３に示されるようなモノクローナル抗体４Ｂ４、または２１Ｈ３、２Ｈ１０、９Ｇ８、もしくは２１Ｈ３ＲＫの任意の１つの配列のフレームワーク領域およびＣＤＲ、具体的にはＦＲ１〜ＦＲ４またはＣＤＲ１〜ＣＤＲ３に及ぶ近接配列を含む配列を含む。いくつかの実施形態において、この抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００７０】
別の実施形態において、この薬剤もしくは抗体、またはその抗原結合部分は、配列番号２の配列を含む重鎖ポリペプチドを含む。一実施形態において、この薬剤もしくは抗体、またはその抗原結合部分は、配列番号４の配列を含む軽鎖ポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、この抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００７１】
一実施形態は、配列番号６の配列を含む重鎖ポリペプチドを含む標的結合剤または抗体、またはその抗原結合部分を提供する。一実施形態において、この薬剤もしくは抗体、またはその抗原結合部分は、配列番号８の配列を含む軽鎖ポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、この抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００７２】
別の実施形態において、この薬剤もしくは抗体、またはその抗原結合部分は、配列番号２２の配列を含む重鎖ポリペプチドを含む。別の実施形態において、この薬剤もしくは抗体、またはその抗原結合部分は、配列番号２４の配列を含む軽鎖ポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、この抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００７３】
別の実施形態において、この薬剤もしくは抗体、またはその抗原結合部分は、配列番号３０の配列を含む重鎖ポリペプチドを含む。別の実施形態において、この薬剤もしくは抗体、またはその抗原結合部分は、配列番号３２の配列を含む軽鎖ポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、この抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００７４】
別の実施形態において、この薬剤もしくは抗体、またはその抗原結合部分は、配列番号３０の配列を含む重鎖ポリペプチドを含む。別の実施形態において、この薬剤もしくは抗体、またはその抗原結合部分は、配列番号５０の配列を含む軽鎖ポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、この抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００７５】
一実施形態において、この標的結合剤または抗体は、開示されたＣＤＲまたは重鎖もしくは軽鎖配列の中に、２０、１６、１０、９以下、例えば、１、２、３、４、もしくは５個ほどのアミノ酸の付加、置換、欠失、および／または挿入を含む。かかる修飾は、ＣＤＲの中の任意の残基で潜在的に行い得る。いくつかの実施形態において、この抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００７６】
一実施形態において、この標的結合剤または抗体は、本明細書に開示されたＣＤＲのバリアントもしくは誘導体、フレームワーク領域およびＣＤＲ（具体的にはＦＲ１〜ＦＲ４またはＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）に及ぶ近接配列、本明細書に開示された軽鎖もしくは重鎖配列、または本明細書に開示された抗体を含む。バリアントは、表２または表１３に示されるような任意のＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３の中に、２０、１６、１０、９以下、例えば、１、２、３、４、５もしくは６個ほどのアミノ酸の付加、置換、欠失、および／または挿入を有する配列、表２または表１３に示されるようなフレームワーク領域およびＣＤＲ（具体的にはＦＲ１〜ＦＲ４またはＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）に及ぶ近接配列、本明細書に開示された軽鎖もしくは重鎖配列、または本明細書に開示されたモノクローナル抗体を含む標的結合剤または抗体を含む。バリアントは、表２または表１３に示されるような任意のＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３と少なくとも約６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８もしくは約９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列、表２または表１３に示されるようなフレームワーク領域およびＣＤＲ（具体的にはＦＲ１〜ＦＲ４またはＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）に及ぶ近接配列、本明細書に開示された軽鎖もしくは重鎖配列、または本明細書に開示されたモノクローナル抗体を含む標的結合剤または抗体を含む。２つのアミノ酸配列の同一性パーセントは、ペアワイズタンパク質アライメントを含むがそれに限定されない、当業者に知られる任意の方法によって決定できる。一実施形態において、バリアントは、天然に存在する、または組換えＤＮＡ法もしくは突然変異誘発法を使用する天然配列のインビトロ操作によって導入される本明細書に開示されたＣＤＲ配列または軽鎖もしくは重鎖ポリペプチドの中に変化を含む。天然に存在するバリアントは、外来抗原に対する抗体の産生中に、対応する生殖系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）ヌクレオチド配列中にインビボで生成されるバリアントを含む。一実施形態において、誘導体は、２つ以上の抗体が共に連結された抗体である異種抗体であり得る。誘導体は、化学的に修飾された抗体を含む。例として、水溶性ポリマーのような１つまたは複数のポリマー、Ｎ−結合もしくはＯ−結合炭水化物、糖、リン酸、および／または他のかかる分子の共有結合が挙げられる。誘導体は、結合される分子の種類または位置のいずれかの点で、天然に存在する抗体もしくは開始抗体とは異なる方法で修飾される。誘導体は、抗体上に天然に存在する１つまたは複数の化学基の欠失をさらに含む。
【００７７】
一実施形態において、この標的結合剤は、２重特異性抗体である。２重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。２重特異性抗体を作製する方法は、当該技術分野において知られている（例えば、Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ,Ｎａｔｕｒｅ,３０５：５３７−５３９（１９８３）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ,ＥＭＢＯ Ｊ,１０：３６５５−３６５９（１９９１）；Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ, Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ,１２１：２１０（１９８６）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ,Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ,１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ,９０：６４４４−６４４８（１９９３）；Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ,Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ,１５２：５３６８（１９９４）；米国特許第４，４７４，８９３号；同第４，７１４,６８１号；同第４，９２５，６４８号；同第５，５７３，９２０号；同第５，６０１，８１号；同第９５，７３１，１６８号；同第４，６７６，９８０号；および同第４，６７６，９８０号；ＷＯ９４／０４６９０号；ＷＯ９１／００３６０号; ＷＯ９２／２００３７３号；ＷＯ９３／１７７１５号；ＷＯ９２／０８８０２号；および欧州特許第０３０８９号を参照されたい）。
【００７８】
本発明のいくつかの実施形態において、この標的結合剤または抗体は、非生殖系列残基を生殖系列残基に変異させるか、および／または構造的障害を取り除くかにより最適化されたその配列を有する。一実施形態では、本発明は配列番号６を含む配列を含む。特定の実施形態において、配列番号６は、表７の各行に示される生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、配列番号６は、表７に示されるような任意の１つ、任意の２つ、任意の３つ、任意の４つ、任意の５つ、任意の６つ、または６つ全部の生殖系列残基を含む。特定の実施形態において、配列番号６は、表７の各行に示される生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの固有の組み合わせを含む。
【００７９】
他の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、ＶＨ３〜３３、６〜１３、およびＪＨ４領域を持つ生殖系配列に由来し、ここで１つ以上の残基がその位置で対応する生殖系残基をもたらすように変異する。特定の実施形態において、配列番号２４は構造的障害を取り除くことを含む改変をさらに含むことができる。例えば、生殖系に加え、Ｃ３３をＳに変異させることができる。従って、配列番号２４は、表１０の各行に示される生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの固有の組み合わせを含むことができ、Ｃ３３のＳへの変異をさらに含むことができる。
【００８０】
本発明のさらなる実施形態は、ＤＬＬ４への結合を求めて競合する標的結合剤または抗体である。本発明の別の実施形態において、本発明は、Ｎｏｔｃｈ １またはＮｏｔｃｈ ４受容体への結合を求めて天然ＤＬＬ４と競合する標的結合剤または抗体を目的とする。別の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、任意の１つの完全ヒトモノクローナル抗体４Ｂ４、または２１Ｈ３、２Ｈ１０、９Ｇ８、もしくは２１Ｈ３ＲＫとＮｏｔｃｈ １への結合を求めて競合する。「競合する」とは、この標的結合剤または抗体が任意の１つの完全ヒトモノクローナル抗体４Ｂ４、２Ｈ１０、２１Ｆ７、１２Ａ１、１７Ｆ３、９Ｇ８、２０Ｇ８、２１Ｈ３、１Ｅ４、３Ａ７、４Ｂ３、１Ｄ４、または２１Ｈ３ＲＫとＮｏｔｃｈ １への結合を求めて競合する、すなわち競合は一方向であることを示す。
【００８１】
本発明の実施形態は、任意の１つの完全ヒトモノクローナル抗体４Ｂ４、２Ｈ１０、２１Ｆ７、１２Ａ１、１７Ｆ３、９Ｇ８、２０Ｇ８、２１Ｈ３、１Ｅ４、３Ａ７、４Ｂ３、１Ｄ４、または２１Ｈ３ＲＫとＤＬＬ４への結合を求めて相互に競合する標的結合剤または抗体を含む。「相互に競合する」とは、この標的結合剤または抗体が、任意の１つの完全ヒトモノクローナル抗体４Ｂ４、２Ｈ１０、２１Ｆ７、１２Ａ１、１７Ｆ３、９Ｇ８、２０Ｇ８、２１Ｈ３、１Ｅ４、３Ａ７、４Ｂ３、１Ｄ４、または２１Ｈ３ＲＫとＮｏｔｃｈ １への結合を求めて競合し、逆もまた同様である、すなわち競合が両方向であることを示す。
【００８２】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の標的結合剤または抗体と同じＤＬＬ４上のエピトープと結合する標的結合剤または抗体である。本発明の実施形態は、任意の１つの完全ヒトモノクローナル抗体４Ｂ４、２Ｈ１０、２１Ｆ７、１２Ａ１、１７Ｆ３、９Ｇ８、２０Ｇ８、２１Ｈ３、１Ｅ４、３Ａ７、４Ｂ３、１Ｄ４、または２１Ｈ３ＲＫと同じＤＬＬ４上のエピトープと結合する標的結合剤または抗体も含む。本発明の抗体が異なるエピトープまたは部分的に重なるエピトープを有することは交差競合解析（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）から明らかである。例えば、４Ｂ４は、２１Ｈ３ＲＫおよび２１Ｈ３と交差競合する。また、４Ｂ４および２１Ｈ３は還元および変性条件下でＤＬＬ４と結合しないが、９Ｇ８および２Ｈ１０は結合し、異なるエピトープへの結合を示唆する。
【００８３】
特定の実施形態において、このエピトープは少なくとも１つのＤＬＬ４の細胞外部分を含む。少なくとも１つの特定のエピトープ（例えば、２１Ｈ３または２１Ｈ３ＲＫまたは４Ｂ４）は、ＤＬＬ４のアミノ酸１４７〜２２４間、すなわちＩＣＳＤＮＹＹＧＤＮＣＳＲＬＣＫＫＲＮＤＨＦＧＨＹＶＣＱＰＤＧＮＬＳＣＬＰＧＷＴＧＥＹＣＱＱＰＩＣＬＳＧＣＨＥＱＮＧＹＣＳＫＰＡＥＣＬＣＲＰＧＷＱＧＲＬＣ（配列番号９０）に存在する連続したアミノ酸の全特定部分の、少なくとも３つのアミノ酸残基を有する少なくとも１つのアミノ酸配列の任意の組み合わせを含むことができる。一実施形態において、このエピトープは、配列番号９０の少なくとも４アミノ酸残基、少なくとも５アミノ酸残基、少なくとも６アミノ酸残基、少なくとも７アミノ酸残基、少なくとも８アミノ酸残基、少なくとも９アミノ酸残基、少なくとも１０アミノ酸残基、少なくとも１５アミノ酸残基、少なくとも２０アミノ酸残基、少なくとも２５アミノ酸残基、少なくとも３０アミノ酸残基、少なくとも４０アミノ酸残基、少なくとも５０アミノ酸残基、少なくとも６０アミノ酸残基、少なくとも７０アミノ酸残基、少なくとも７５アミノ酸残基、少なくとも７６アミノ酸残基、または７７アミノ酸残基である。別の実施形態において、このエピトープは、ヒトＤＬＬ４のアミノ酸１８７〜２０１のＴＧＥＹＣＱＱＰＩＣＬＳＧＣＨ（配列番号９１）に存在する。一実施形態において、このエピトープは、配列番号９１の少なくとも４アミノ酸残基、少なくとも５アミノ酸残基、少なくとも６アミノ酸残基、少なくとも７アミノ酸残基、少なくとも８アミノ酸残基、少なくとも９アミノ酸残基、少なくとも１０アミノ酸残基、少なくとも１１アミノ酸残基、少なくとも１２アミノ酸残基、少なくとも１３アミノ酸残基、少なくとも１４アミノ酸残基、または１５アミノ酸残基である。
【００８４】
一実施形態において、本発明は、本明細書に開示される抗体の中のマウス交差反応性抗体を含む。一実施形態において、これらの抗体がマウスＤＬＬ４と結合することができるように、これらの抗体の可変領域は改変される。一般的に、マウス交差反応性抗体は、本明細書に開示される抗体と同様の特性を有し、例えば、ＤＬＬ４と結合することができ、ＤＬＬ４のノッチ受容体への結合を阻害することができる。一実施形態において、２１Ｈ３ＲＫ抗体の可変領域は、マウスＤＬＬ４と結合できるように改変され、例えば、この重鎖は以下の変更を有する：Ｈ３１のＡｓｎをＬｙｓへ、Ｈ５２ａのＡｌａをＰｒｏへ、Ｈ９７のＶａｌをＴｈｒへ、Ｈ１００ｂのＶａｌをＴｒｐへ、およびＨ１００ｅのＧｌｕをＡｌａへ変更（配列番号８４参照）ならびにこの軽鎖は以下の変更を有する：Ｌ３０のＳｅｒをＡｓｎへおよびＬ９３のＡｓｐをＳｅｒへ変更（配列番号８５参照）。別の実施形態において、この重鎖は以下の変更を有する：Ｈ３０のＴｈｒをＩｌｅへ、Ｈ３１のＡｓｎをＭｅｔへ、Ｈ５２ａのＡｌａをＰｒｏへ、Ｈ１００ｂのＶａｌをＴｒｐへおよびＨ１００ｅのＧｌｕをＡｌａへ変更（配列番号８６参照）ならびにこの軽鎖は以下の変更を有する：Ｌ９３のＡｓｐをＳｅｒへ変更（配列番号８７参照）。さらに別の実施形態において、この重鎖は以下の変更を有する：Ｈ３０のＴｈｒをＩｌｅへ、Ｈ３１のＡｓｎをＨｉｓへ、Ｈ１００ｂのＶａｌをＴｒｐへおよびＨ１００ｅのＧｌｕをＡｌａへ変更（配列番号８８参照）ならびにこの軽鎖は以下の変更を有する：Ｌ３０のＳｅｒをＡｓｎへおよびＬ９３のＡｓｐをＳｅｒへ変更（配列番号８９参照）。
【００８５】
本発明の他の実施形態は、本明細書記載の任意の標的結合剤または抗体をコードする単離した核酸分子、本明細書記載の標的結合剤または抗体をコードする単離した核酸分子を有するベクターまたはかかる任意の核酸分子で形質転換した宿主細胞を含む。本発明の実施形態は、特異的にＤＬＬ４と結合し、ＤＬＬ４のＮｏｔｃｈ受容体への結合を阻害する完全なヒトの単離した標的結合剤をコードする核酸分子を含む。本発明は、本明細書において定義されるようなストリンジェントなまたはストリンジェントが低いハイブリダイゼーションの条件下、本明細書記載の任意の標的結合剤または抗体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドも含む。本発明の実施形態は、この結合剤をコードする核酸分子を含むベクターも含む。追加の実施形態は、この核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を含む。
【００８６】
当該技術分野において知られるように、抗体は、有利に、例えば、ポリクローナル抗体、オリゴクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および／または完全ヒト抗体であり得る。
【００８７】
本発明の実施形態が、いずれの特定の型の抗体または産生方法もしくは生産方法にも限定されないことが理解されるであろう。本発明のいくつかの実施形態において、この標的結合剤は完全ヒトモノクローナル抗体の結合断片である。例えば、この標的結合剤は、（例えば、インタクトなヒトＦｃ領域を有する）完全長の抗体または抗体結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’もしくはＦ（ａｂ’）２、ＦＶまたはｄＡｂ）であり得る。さらに、これらの抗体は、ｄＡｂ断片のような、ＤＬＬ４に結合するラクダまたはヒトの単一ＶＨもしくはＶＬ領域のような単一領域抗体であり得る。
【００８８】
本明細書記載の本発明の実施形態は、これらの抗体を産生するための細胞も提供する。細胞の例として、ＤＬＬ４に対する抗体を産生するハイブリドーマ、またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ細胞のバリアント（例えば、ＤＧ４４）およびＮＳ０細胞のような組換え細胞が挙げられる。ＣＨＯ細胞のバリアントの詳細情報は、Ａｎｄｅｒｓｅｎ ａｎｄ Ｒｅｉｌｌｙ（２００４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１５、４５６−４６２の中で見出し得、これは参照により本明細書にその全体が組み込まれる。この抗体は、この抗体を分泌するハイブリドーマから、またはこの抗体をコードする１つまたは複数の遺伝子で形質転換またはトランスフェクトされている組換え操作された細胞から製造し得る。
【００８９】
さらに、本発明の一実施形態は、本発明の抗体を産生するために核酸分子を発現させてからこの抗体を回収する条件下、宿主細胞を培養することによって本発明の抗体を産生する方法である。本発明の実施形態は、抗体産生のために宿主細胞にトランスフェクトした時、抗体または抗体の断片の収率を増加させるために最適化された核酸配列を含む、本発明の抗体または抗体の断片をコードする任意の核酸分子も含むことを認識されたい。
【００９０】
本明細書のさらなる実施形態は、ヒトＤＬＬ４を発現する細胞、ヒトＤＬＬ４を含む単離した細胞膜、精製したヒトＤＬＬ４、もしくはその断片、および／または１つまたは複数のそのオルソロガスな配列もしくはその断片を用いて哺乳動物を免疫化することによって、特異的にＤＬＬ４と結合し、ＤＬＬ４の生物活性を阻害する抗体を産生する方法を含む。
【００９１】
他の実施形態において、本発明は、本発明の標的結合剤もしくは抗体、またはその結合断片、および製薬上許容可能な担体もしくは希釈剤を含む組成物を提供する。
【００９２】
本発明のさらなる実施形態は、治療有効量の、ＤＬＬ４に特異的に結合する標的結合剤を動物に投与することによって、増殖性疾患、血管新生疾患を患う動物を効果的に治療する方法を含む。特定の実施形態において、この方法は、腫瘍、ガン、および／または細胞増殖性疾患の治療を必要としている動物を選択し、治療有効量の、ＤＬＬ４に特異的に結合する標的結合剤をその動物に投与することをさらに含む。
【００９３】
本発明のさらなる実施形態は、治療有効量の、ＤＬＬ４に特異的に結合する標的結合剤を動物に投与することによって、腫瘍性疾患を患う動物を効果的に治療する方法を含む。特定の実施形態において、この方法は、腫瘍性疾患の治療を必要としている動物を選択し、治療有効量の、ＤＬＬ４に特異的に結合する標的結合剤をその動物に投与することをさらに含む。
【００９４】
本発明のさらなる実施形態は、治療有効量の、ＤＬＬ４に特異的に結合する標的結合剤を動物に投与することによって、悪性腫瘍を患う動物を効果的に治療する方法を含む。特定の実施形態において、この方法は、悪性腫瘍の治療を必要としている動物を選択し、治療有効量の、ＤＬＬ４に特異的に結合する標的結合剤をその動物に投与することをさらに含む。
【００９５】
本発明のさらなる実施形態は、治療有効量の、ＤＬＬ４に特異的に結合する標的結合剤を動物に投与することによって、ＤＬＬ４発現と関連する疾患または症状を患う動物を効果的に治療する方法を含む。特定の実施形態において、この方法は、ＤＬＬ４発現と関連する疾患または症状の治療を必要としている動物を選択し、治療有効量の、ＤＬＬ４に特異的に結合する標的結合剤をその動物に投与することをさらに含む。
【００９６】
悪性腫瘍は、黒色腫、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、グリオーマ、肝細胞（肝臓）ガン、甲状腺腫瘍、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））ガン、前立腺ガン、乳ガン、卵巣ガン、膀胱ガン、肺ガン、グリア芽腫、子宮内膜ガン、腎臓ガン、結腸ガン、膵臓ガン、食道ガン、頭頸部ガン、中皮腫、肉腫、胆管（ｂｉｌｉａｒｙ）ガン（胆管ガン（ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ））、小腸腺ガン、小児悪性腫瘍および扁平上皮ガンからなる群から選択され得る。
【００９７】
治療可能な増殖性疾患または血管新生疾患は、黒色腫、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、グリオーマ、肝細胞（肝臓）ガン、甲状腺腫瘍、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））ガン、胆嚢ガン、前立腺ガン、乳ガン、卵巣ガン、膀胱ガン、肺ガン、グリア芽腫、子宮内膜ガン、腎臓ガン、結腸ガン、膵臓ガン、卵巣、食道ガン、頭頸部ガン、中皮腫、肉腫、胆管（ｂｉｌｉａｒｙ）ガン（胆管ガン（ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ））、小腸腺ガン、小児悪性腫瘍、扁平上皮ガンならびに慢性骨髄性白血病を含む白血病のような腫瘍性疾患を含む。
【００９８】
一実施形態において、本発明は、ＤＬＬ４のみに依存する、またはＤＬＬ４に部分的に依存する腫瘍患者のＤＬＬ４の阻害における使用に適している。
【００９９】
本発明のさらなる実施形態は、増殖性関連疾患または血管新生関連疾患を患う動物の治療のための薬剤調製における、本発明の標的結合剤または抗体の使用を含む。特定の実施形態において、この使用は、増殖性関連疾患または血管新生関連疾患の治療を必要としている動物を選択することをさらに含む。
【０１００】
本発明のさらなる実施形態は、腫瘍性疾患を患う動物の治療のための薬剤調製における、本発明の標的結合剤または抗体の使用を含む。特定の実施形態において、この使用は、腫瘍性疾患の治療を必要としている動物を選択することをさらに含む。
【０１０１】
本発明のさらなる実施形態は、非腫瘍性疾患を患う動物の治療のための薬剤調製における、本発明の標的結合剤または抗体の使用を含む。特定の実施形態において、この使用は、非腫瘍性疾患の治療を必要としている動物を選択することをさらに含む。
【０１０２】
本発明のさらなる実施形態は、悪性腫瘍を患う動物の治療のための薬剤調製における、本発明の標的結合剤または抗体の使用を含む。特定の実施形態において、この使用は、悪性腫瘍の治療を必要としている動物を選択することをさらに含む。
【０１０３】
本発明のさらなる実施形態は、ＤＬＬ４発現に関連する疾患または症状を患う動物の治療のための薬剤調製における、本発明の標的結合剤または抗体の使用を含む。特定の実施形態において、この使用は、ＤＬＬ４発現に関連する疾患または症状の治療を必要としている動物を選択することをさらに含む。
【０１０４】
本発明のさらなる実施形態は、増殖性関連疾患または血管新生関連疾患を患う動物の治療のための薬剤として使用するための本発明の標的結合剤または抗体を含む。
【０１０５】
本発明のさらなる実施形態は、腫瘍性疾患を患う動物の治療のための薬剤として使用するための本発明の標的結合剤または抗体を含む。
【０１０６】
本発明のさらなる実施形態は、悪性腫瘍を患う動物の治療のための薬剤として使用するための本発明の標的結合剤または抗体を含む。
【０１０７】
本発明のさらなる実施形態は、ＤＬＬ４発現に関連する疾患または症状を患う動物の治療のための薬剤として使用するための本発明の標的結合剤または抗体を含む。
【０１０８】
本発明のさらなる実施形態は、ＤＬＬ４誘発性疾患を患う動物の治療のための薬剤として使用するための本発明の標的結合剤または抗体を含む。
【０１０９】
一実施形態において、
増殖性または血管新生性疾患
腫瘍性疾患；
悪性腫瘍；または
ＤＬＬ４発現に関連する疾患または症状
の治療は、任意の前述の疾患または症状を管理する、改善する、予防することを含む。
【０１１０】
一実施形態において、腫瘍性疾患の治療は、腫瘍増殖の阻害、腫瘍増殖の遅延化、腫瘍の軽減、腫瘍の縮小、治療中断時の腫瘍再増殖までの時間の延長、腫瘍再発までの時間の延長、疾患進行の緩徐化を含む。
【０１１１】
本発明のいくつかの実施形態において、治療される動物はヒトである。
【０１１２】
本発明のいくつかの実施形態において、この標的結合剤は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【０１１３】
本発明のいくつかの実施形態において、この標的結合剤は、完全ヒトモノクローナル抗体４Ｂ４、２Ｈ１０、２１Ｆ７、１２Ａ１、１７Ｆ３、９Ｇ８、２０Ｇ８、２１Ｈ３、１Ｅ４、３Ａ７、４Ｂ３、１Ｄ４、または２１Ｈ３ＲＫからなる群から選択される。
【０１１４】
本発明の実施形態は、本明細書記載の標的結合剤および治療薬を含む結合体を含む。本発明のいくつかの実施形態において、この治療薬は毒素である。他の実施形態において、この治療薬は放射性同位体である。さらに他の実施形態において、この治療薬は医薬組成物である。
【０１１５】
別の態様において、患者のガン性細胞を選択的に殺す方法を提供する。この方法は、患者に完全ヒト抗体結合体を投与することを含む。この完全ヒト抗体結合体は、ＤＬＬ４と結合し得る抗体および薬剤を含む。この薬剤は毒素、放射性同位体、またはガン細胞を殺す別の物質のいずれかである。従って、この抗体結合体は、選択的にガン細胞を殺す。
【０１１６】
一態様において、ＤＬＬ４へ特異的に結合する接合された完全ヒト抗体を提供する。抗体に薬剤が付着し、この抗体が細胞に結合すると、この薬剤がこの細胞へ送達される。一実施形態において、上記の接合された完全ヒト抗体は、ＤＬＬ４の細胞外領域に結合する。別の実施形態において、この抗体および接合された毒素は、ＤＬＬ４を発現する細胞によって内部に移行する。別の実施形態において、この薬剤は細胞毒性剤である。別の実施形態において、この薬剤は、例えば、サポリン、またはアウリスタチン、緑膿菌外毒素、ゲロニン、リシン、カリケアマイシンもしくはマイタンシンに基づく免疫結合体などである。さらに別の実施形態において、この薬剤は放射性同位体である。
【０１１７】
本発明の標的結合剤または抗体は、単独で投与することもでき、追加的抗体もしくは化学療法薬または放射線治療と組み合わせて投与することもできる。例えば、細胞の接着、浸潤、血管新生、または増殖を阻止するＤＬＬ４抗体のモノクローナル、オリゴクローナルまたはポリクローナル混合物は、腫瘍細胞増殖を阻害することが示された薬剤と組み合わせて投与することができる。
【０１１８】
本発明の別の実施形態は、疾患または症状を診断する方法を含み、ここで本明細書に開示された抗体は患者または患者試料中のＤＬＬ４量を検出するために利用される。一実施形態において、患者試料は血液または血清または尿である。さらなる実施形態において、危険因子の同定、疾患の診断、および疾患の病期分類の方法が提供され、この方法は、抗ＤＬＬ４抗体を使用するＤＬＬ４の発現および／または過剰発現の同定を含む。いくつかの実施形態において、この方法は、細胞上のＤＬＬ４に選択的に結合する完全ヒト抗体結合体を患者に投与することを含む。この抗体結合体は、ＤＬＬ４に特異的に結合する抗体および標識を含む。この方法は、患者における標識の存在を観察することをさらに含む。相対量の多い標識は、相対的リスクの高い疾患を示し、相対量の少ない標識は、相対的リスクの低い疾患を示す。一実施形態において、この標識は緑色蛍光タンパク質である。
【０１１９】
本発明は、患者試料中のＤＬＬ４量をアッセイする方法をさらに提供し、この方法は本明細書に開示される抗体を患者由来の生体試料と接触させることと、前記試料中のＤＬＬ４と前記抗体との結合量を検出することを含む。より具体的な実施形態において、生体試料は血液、血漿または血清である。
【０１２０】
本発明の別の実施形態は、血清または細胞を本明細書に開示された抗体と接触させ、その後、ＤＬＬ４の存在を検出することによって、細胞内のＤＬＬ４発現と関連する症状を診断する方法を含む。一実施形態において、この症状は、腫瘍性疾患を含むがそれに限定されない増殖性、血管新生、細胞接着、または浸潤に関連する疾患であり得る。
【０１２１】
別の実施形態において、本発明は、ＤＬＬ４関連疾患を選別するために、哺乳動物の組織、細胞、または体液中のＤＬＬ４を検出するアッセイキットを含む。このキットは、本明細書に開示される抗体、および存在する場合、抗体のＤＬＬ４との反応を示すための手段を含む。一実施形態において、この抗体はモノクローナル抗体である。一実施形態において、ＤＬＬ４に結合する抗体は標識される。別の実施形態において、この抗体は標識されない一次抗体であり、このキットはこの一次抗体を検出する手段をさらに含む。一実施形態において、検出するための手段は、抗免疫グロブリンである標識された二次抗体を含む。この抗体は、蛍光色素、酵素、放射線核種および放射線不透過物質からなる群から選択されたマーカーで標識され得る。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される標的結合剤または抗体は、補体に結合し、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）に関与する能力を高めるように修飾できる。他の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、エフェクター細胞を活性化し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与する能力を高めるように修飾できる。さらに他の実施形態において、本明細書に開示される標的結合剤または抗体は、エフェクター細胞を活性化して抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与する能力を高めることと、補体に結合して補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）に関与する能力を高めることの両方のために修飾できる。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される標的結合剤または抗体は、補体に結合し、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）に関与する能力を低下させるように修飾できる。他の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、エフェクター細胞を活性化し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与する能力を低下させるように修飾できる。さらに他の実施形態において、本明細書に開示される標的結合剤または抗体は、エフェクター細胞を活性化して抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与する能力を低下させることと、補体に結合して補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）に関与する能力を低下させることの両方のために修飾できる。
【０１２４】
特定の実施形態において、本明細書に開示される標的結合剤または抗体の半減期および本発明の組成物の半減期は、少なくとも約４〜７日間である。特定の実施形態において、本明細書に開示される標的結合剤または抗体の平均半減期および本発明の組成物の平均半減期は、少なくとも約２〜５日間、３〜６日間、４〜７日間、５〜８日間、６〜９日間、７〜１０日間、８〜１１日間、８〜１２日間、９〜１３日間、１０〜１４日間、１１〜１５日間、１２〜１６日間、１３〜１７日間、１４〜１８日間、１５〜１９日間、または１６〜２０日間である。他の実施形態において、本明細書に開示される標的結合剤または抗体の平均半減期および本発明の組成物の平均半減期は、少なくとも約１７〜２１日間、１８〜２２日間、１９〜２３日間、２０〜２４日間、２１〜２５日間、２２〜２６日間、２３〜２７日間、２４〜２８日間、２５〜２９日間、または２６〜３０日間である。さらなる実施形態において、本明細書に開示される標的結合剤または抗体の半減期および本発明の組成物の半減期は、最長約５０日間であり得る。特定の実施形態において、本発明の抗体および組成物の半減期は、当該技術分野において知られる方法によって延長できる。かかる延長は、次に、抗体組成物の投与量および／または投与頻度を減少させ得る。インビボ半減期が改善された抗体およびそれらの抗体を調製する方法は、米国特許第６，２７７，３７５号、ならびに国際公開ＷＯ９８／２３２８９号およびＷＯ９７／３４６１号に開示されている。
【０１２５】
別の実施形態において、本発明は容器を含む製品を提供する。この容器は、本明細書に開示される標的結合剤または抗体を含む組成物を含み、ＤＬＬ４の発現または過剰発現によって特徴付けられる疾患を含むがそれらに限定されない細胞接着、浸潤、血管新生、および／または増殖関連疾患を治療するために、この組成物が使用できることを示す添付文書または表示を含む。
【０１２６】
他の実施形態において、本発明は、本明細書に開示される標的結合剤もしくは抗体を含む組成物、ならびに治療を必要としている被験体にこの組成物を投与するための使用説明書を含むキットを提供する。
【０１２７】
本発明は、バリアントＦｃ領域を含むタンパク質の製剤を提供する。これは、天然に存在しないＦｃ領域、例えば、１つまたは複数の天然に存在しないアミノ酸残基を含むＦｃ領域である。アミノ酸の欠失、付加および／または修飾を含むＦｃ領域も、本発明のバリアントＦｃ領域に含まれる。
【０１２８】
Ｆｃ領域を含むタンパク質の血清半減期は、このＦｃ領域のＦｃＲｎに対する結合親和性を増加することによって増加し得る。一実施形態において、このＦｃバリアントタンパク質は類似分子と比べて血清半減期が高まっている。
【０１２９】
別の実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域がカバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２３９、３３０および３３２からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸を含むＦｃバリアントを提供する。具体的な実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域がカバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２３９Ｄ、３３０Ｌおよび３３２Ｅからなる群から選択される少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸を含むＦｃバリアントを提供する。任意で、このＦｃ領域は、カバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２５２、２５４、および２５６からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、天然に存在しない追加的アミノ酸をさらに含み得る。具体的な実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域がカバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２３９Ｄ、３３０Ｌおよび３３２Ｅからなる群から選択される少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸、ならびにカバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅからなる群から選択される１つまたは複数の位置で、少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸を含むＦｃバリアントを提供する。
【０１３０】
別の実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域がカバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２３４、２３５および３３１からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸を含むＦｃバリアントを提供する。具体的な実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域がカバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２３４Ｆ、２３５Ｆ、２３５Ｙおよび３３１Ｓからなる群から選択される少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸を含むＦｃバリアントを提供する。さらに具体的な実施形態において、本発明のＦｃバリアントは、カバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２３４Ｆ、２３５Ｆ、および３３１Ｓの天然に存在しないアミノ酸残基を含む。別の具体的な実施形態において、本発明のＦｃバリアントは、カバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２３４Ｆ、２３５Ｙ、および３３１Ｓの天然に存在しないアミノ酸残基を含む。任意で、このＦｃ領域は、カバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２５２、２５４、および２５６からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、天然に存在しない追加的アミノ酸をさらに含み得る。具体的な実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域がカバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２３４Ｆ、２３５Ｆ、２３５Ｙおよび３３１Ｓからなる群から選択される少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸を含み、１つまたは複数の位置にある少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸がカバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅからなる群から選択されるＦｃバリアントを提供する。
【０１３１】
別の実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域がカバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２３９、３３０および３３２からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸を含むＦｃバリアントタンパク質製剤を提供する。具体的な実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域がカバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２３９Ｄ、３３０Ｌおよび３３２Ｅからなる群から選択される少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸を含むＦｃバリアントタンパク質製剤を提供する。任意で、このＦｃ領域は、カバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２５２、２５４、および２５６からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、天然に存在しない追加的アミノ酸をさらに含み得る。具体的な実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域がカバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２３９Ｄ、３３０Ｌおよび３３２Ｅからなる群から選択される少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸を含み、１つまたは複数の位置にある少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸がカバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅからなる群から選択されるＦｃバリアントタンパク質製剤を提供する。
【０１３２】
別の実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域がカバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２３４、２３５および３３１からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸を含むＦｃバリアントタンパク質製剤を提供する。具体的な実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域がカバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２３４Ｆ、２３５Ｆ、２３５Ｙおよび３３１Ｓからなる群から選択される少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸を含むＦｃバリアントタンパク質製剤を提供する。任意で、このＦｃ領域は、カバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２５２、２５４、および２５６からなる群から選択される１つまたは複数の位置で、天然に存在しない追加的アミノ酸をさらに含み得る。具体的な実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域がカバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２３４Ｆ、２３５Ｆ、２３５Ｙおよび３３１Ｓからなる群から選択される少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸を含み、１つまたは複数の位置にある少なくとも１つの天然に存在しないアミノ酸がカバットに説明されるＥＵインデックスによって番号付けされた２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅからなる群から選択されるＦｃバリアントタンパク質製剤を提供する。
【０１３３】
天然に存在しないＦｃ領域を生成する方法は、当該技術分野において知られている。例えば、アミノ酸の置換および／または欠失は、部位特異的変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ８２：４８８−４９２（１９８５））、ＰＣＲ変異誘発（Ｈｉｇｕｃｈｉ,ｉｎ“ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”,Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ,Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ,ｐｐ.１７７−１８３（１９９０））、ならびにカセット式変異誘発（Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ,Ｇｅｎｅ３４：３１５−３２３（１９８５））を含むがそれらに限定されない突然変異誘発法によって生成し得る。好ましくは、部位特異的変異誘発は、オーバーラップ伸長ＰＣＲ法によって行い得る（Ｈｉｇｕｃｈｉ,ｉｎ“ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ”,Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ,Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ,ｐｐ.６１−７０（１９８９））。オーバーラップ伸長ＰＣＲの技術（前記Ｈｉｇｕｃｈｉ）は、標的配列（開始ＤＮＡ）に任意の所望の（１つまたは複数の）変異を導入するためにも使用できる。例えば、オーバーラップ伸長法におけるＰＣＲの第１段階は、外側プライマー（プライマー１）および内部変異誘発プライマー（プライマー３）を用いて、ならびに第２外側プライマー（プライマー４）と内部プライマー（プライマー２）を用いて別個に標的配列を増幅し、２つのＰＣＲ断片（断片Ａおよび断片Ｂ）を得ることを含む。内部変異誘発プライマー（プライマー３）は、標的配列に対して所望の（１つまたは複数の）変異を特定するミスマッチを含むように設計される。ＰＣＲの第２段階において、ＰＣＲの第１段階の産物（断片Ａおよび断片Ｂ）は、２つの外側プライマー（プライマー１および４）を使用するＰＣＲによって増幅される。生成した全長ＰＣＲ断片（断片Ｃ）は制限酵素で切断され、生成した制限断片は適切なベクターにクローニングされる。変異誘発の第１ステップとして、（例えば、Ｆｃ融合タンパク質、抗体または単にＦｃ領域をコードする）開始ＤＮＡは、変異誘発ベクターに動作可能にクローニングされる。これらプライマーは、所望のアミノ酸置換を反映するように設計される。バリアントＦｃ領域を生成する有用な他の方法が、当該技術分野において知られている（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号、同第５，８８５，５７３号、同第５，６７７，４２５号、同第６，１６５，７４５号、同第６，２７７，３７５号、同第５，８６９，０４６号、同第６，１２１，０２２号、同第５，６２４，８２１号、同第５，６４８，２６０号、同第６，５２８，６２４号、同第６，１９４，５５１号、同第６，７３７，０５６号、同第６，８２１，５０５号、同第６，２７７，３７５号、米国特許公開第２００４／０００２５８７号、ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９４／２９３５１号、ＷＯ９９／５８５７２号、ＷＯ００／４２０７２号、ＷＯ０２／０６０９１９号、ＷＯ０４／０２９２０７号、ＷＯ０４／０９９２４９号、ＷＯ０４／０６３３５１号参照）。
【０１３４】
本発明のいくつかの実施形態において、本明細書に提供される抗体の糖鎖付加パターンは、ＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター機能を高めるために修飾される。Ｓｈｉｅｌｄｓ ＲＬ ｅｔ ａｌ,（２００２）ＪＢＣ.２７７：２６７３３；Ｓｈｉｎｋａｗａ Ｔ ｅｔ ａｌ,（２００３）ＪＢＣ.２７８：３４６６およびＯｋａｚａｋｉ Ａ ｅｔ ａｌ,（２００４）Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.,３３６：１２３９を参照されたい。いくつかの実施形態において、Ｆｃバリアントタンパク質は、１つまたは複数の改変した（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）グリコフォーム、すなわちＦｃ領域を含む分子と共有結合している炭水化物組成物を含む。改変したグリコフォームは、エフェクター機能を高めるまたは低下させることを含むがそれらに限定されない様々な目的に有用であり得る。改変したグリコフォームは、当業者に知られる任意の方法によって、例えば、改変したもしくはバリアントの発現系を使用することによって、１つもしくは複数の酵素、例えば、ＤＩＮ‐アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴＩ１１）と共発現することによって、様々な生物もしくは様々な生物由来の細胞系の中でＦｃ領域を含む分子を発現することによって、またはＦｃ領域を含む分子の発現後に（１つまたは複数の）炭水化物を修飾することによって産生し得る。改変したグリコフォームを生成する方法は、当該技術分野において知られており、Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ,１９９９,Ｎａｔ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７：１７６−１８０；Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ,２００１７ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ７４：２８８−２９４；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ,２００２,Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２６７３３−２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ,２００３,Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３４６６−３４７３、米国特許第６，６０２，６８４号;米国特許出願第１０／２７７，３７０号;米国特許出願第１０／１１３，９２９号;ＰＣＴＷＯ００／６１７３９Ａ１号;ＰＣＴＷＯ０１／２９２２４６Ａ１号;ＰＣＴＷＯ０２／３１１１４０Ａ１号;ＰＣＴＷＯ０２／３０９５４Ａ１号;Ｐｏｔｉｌｌｅｇｅｎｔ（商標）技術（Ｂｉｏｗａ,Ｉｎｃ.Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ,Ｎ.Ｊ.）；ＧｌｙｃｏＭＡｂ（商標）糖鎖付加遺伝子工学技術（ＧＬＹＣＡＲＴ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＡＧ,Ｚｕｒｉｃｈ,Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に記載される方法を含むがそれらに限定されない。例えば、ＷＯ０００６１７３９号;ＥＡ０１２２９１２５号;米国特許公開第２００３０１１５６１４号;Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ,２００４,ＪＭＢ,３３６：１２３９−４９を参照されたい。
【０１３５】
Ｆｃ領域の糖鎖付加は、エフェクター機能を増加させるまたは減少させるように修飾できることも当該技術分野において知られている（例えば、Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ,１９９９,Ｎａｔ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１７：１７６−１８０；Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ,２００１,Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ７４：２８８−２９４；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ,２００２,Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２７７：２６７３３−２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ,２００３,Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２７８：３４６６−３４７３、米国特許第６，６０２，６８４号；米国特許出願第１０／２７７，３７０号；米国特許出願第１０／１１３，９２９号；ＰＣＴＷＯ００／６１７３９Ａ１号、ＰＣＴＷＯ０１／２９２２４６Ａ１号；ＰＣＴＷＯ０２／３１１１４０Ａ１号；ＰＣＴＷＯ０２／３０９５４Ａ１号；Ｐｏｔｉｌｌｅｇｅｎｔ（商標）技術（Ｂｉｏｗａ,Ｉｎｃ.Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ,Ｎ.Ｊ.）；ＧｌｙｃｏＭＡｂ（商標）糖鎖付加遺伝子工学技術（ＧＬＹＣＡＲＴ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＡＧ,Ｚｕｒｉｃｈ,Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）参照）。従って、一実施形態において、本発明の抗体のＦｃ領域は、アミノ酸残基の改変した糖鎖付加を含む。別の実施形態において、アミノ酸残基の改変した糖鎖付加は、エフェクター機能の低下をもたらす。別の実施形態において、アミノ酸残基の改変した糖鎖付加は、エフェクター機能を増加させる。具体的な実施形態において、このＦｃ領域は、フコシル化を減少させている。別の実施形態において、このＦｃ領域はアフコシル化される（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２２６８６７号参照）。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】ＨＵＶＥＣ増殖のＤＬＬ４刺激による阻害に対するＩｇＧ１ ＤＬＬ４抗体の効果を示す棒グラフを示す。データは、ｎ＞２の独立実験の代表的なものである。
【図２】血管の長さ（ｍｍ）および＃分枝の測定によって評価した時のインビトロのＨＵＶＥＣ管形成に対するＩｇＧ２/４ ＤＬＬ４抗体の効果を示す棒グラフを示す。
【図３】ＦＡＣＳ解析によって測定した時の０．１μｇ/ｍｌ濃度におけるＡｌｅｘａ−６４７標識２１Ｈ３ＲＫの結合を置換する非標識抗ＤＬＬ４抗体の効果を示す棒グラフを示す。
【図４】１２個のキメラＤＬＬ４/ＤＬＬ１バリアントの直線状の図解を示す。全バリアントは、示したように個々のサブ領域または結合領域の部分を置換するヒトＤＬＬ１を有するヒトＤＬＬ４の細胞外領域をコードする。
【図５】対応するＤＬＬ１領域と置換される細胞外領域の部分を有するＤＬＬ４をコードするキメラノックアウト（「ＫＯ」）バリアントへの２１Ｈ３ＲＫの結合を示す折れ線グラフを示す。
【図６】対応するＤＬＬ１領域と置換される細胞外領域の部分を有するＤＬＬ４をコードするキメラノックアウト（「ＫＯ」）バリアント、およびＤＬＬ４対応物と置換される領域を有するＤＬＬ１をコードするキメラノックイン（「ＫＩ」）バリアントへの２１Ｈ３ＲＫの結合を示す折れ線グラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１３７】
本発明の実施形態は、例えば、Ｎｏｔｃｈ受容体シグナル伝達を阻害する抗体のような新規セットのＤＬＬ４ブロッキング分子に関する。かかる分子は、単剤として、あるいは、他の結合抗体／結合剤と組み合わせて使用できる。これらの分子は、任意の標準的なまたな新規の抗ガン剤と組み合わせても使用できる。
【０１３８】
本発明の実施形態は、ＤＬＬ４に結合する標的結合剤に関する。いくつかの実施形態において、この標的結合剤はＤＬＬ４に結合し、ＤＬＬ４のＮｏｔｃｈ受容体（Ｎｏｔｃｈ １、Ｎｏｔｃｈ ２、Ｎｏｔｃｈ ３、および／またはＮｏｔｃｈ ４など）へのＤＬＬ４の結合を阻害する。いくつかの実施形態において、この結合は、ＤＬＬ４関連作用の１つまたは複数の態様を中和、阻止、阻害、無効、または干渉し得る。一実施形態において、この標的結合剤は、モノクローナル抗体、またはその結合断片である。かかるモノクローナル抗体は、本明細書において抗ＤＬＬ４抗体と称され得る。
【０１３９】
本発明の他の実施形態は、治療に有効な完全ヒト抗ＤＬＬ４抗体および抗体製剤を含む。一実施形態において、本発明の抗ＤＬＬ４抗体の調製は、ＤＬＬ４に対する強い結合親和性、ＤＬＬ４受容体―リガンド相互作用を阻止する能力、ＤＬＬ４媒介シグナル伝達を阻止する能力、内皮細胞増殖および非機能的血管の形成を促進する能力、血管への周皮細胞の動員を調節する能力、腫瘍増殖を阻害する能力、腫瘍の低酸素／壊死を高める能力、内皮先端／柄（ｓｔａｌｋ）細胞の運命を変える能力、並びに腫瘍細胞の生存または癌幹細胞の生存、および自己再生を調節する能力を含む所望の治療特性を有する。
【０１４０】
さらに、本発明の実施形態は、疾患を治療するために本明細書に記載する抗体を使用する方法を含む。本発明の抗ＤＬＬ４抗体は、ＤＬＬ４媒介性腫瘍形成および健康組織への腫瘍浸潤を予防するのに有用である。さらに、ＤＬＬ４抗体は、ＡＭＤのような眼疾患などの血管新生、関節リウマチのような炎症性疾患、および心血管疾患および敗血症とともに腫瘍性疾患に関する疾患を治療するのに役立ち得る。転移ガン、リンパ腫瘍、および血液ガンを含む任意のタイプの悪性腫瘍によって特徴付けられる任意の疾患は、この阻害機序によっても治療することができる。ヒトの典型的なガンは、膀胱腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、基底細胞ガン、胆道ガン、膀胱ガン、骨肉腫、脳およびＣＮＳガン（例えば、グリオーマ腫瘍）、子宮頸ガン、絨毛ガン、結腸および直腸ガン、結合組織ガン、消化器ガン；子宮内膜ガン、食道ガン；眼ガン；頭頸部ガン；胃ガン；上皮内新生物；腎ガン；喉頭ガン；白血病；肝臓ガン（例えば、小細胞および非小細胞）肺ガン、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫；黒色腫；骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔（例えば、唇、舌、口、および咽頭）ガン、卵巣ガン；膵臓ガン、網膜芽腫；横紋筋肉腫；直腸ガン、腎ガン、呼吸器系ガン；肉腫、皮膚ガン；胃ガン、精巣ガン、甲状腺ガン；子宮ガン、泌尿器系ガン、ならびに他のガンおよび肉腫を含む。イヌ、ネコ、および他のペットにおいて一般に診断される悪性疾患は、リンパ肉腫、骨肉腫、乳腺腫瘍、肥満細胞腫、脳腫瘍、黒色腫、腺扁平上皮ガン、カルチノイド肺腫瘍、気管支腺腫瘍、気管支腺ガン、線維腫、粘液軟骨腫、肺肉腫、神経肉腫、骨腫、乳頭腫、網膜芽腫、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、バーキットリンパ腫、小膠細胞腫、神経芽細胞腫、骨巨細胞腫、口腔腫瘍、線維肉腫、骨肉腫および横紋筋肉腫、生殖扁平上皮細胞ガン、伝染性の性病の腫瘍、精巣腫瘍、精上皮腫、セルトリ細胞腫瘍、血管周囲細胞腫、組織球腫、緑色腫（例えば、顆粒球性肉腫）、角膜乳頭腫、角膜扁平上皮細胞ガン、血管肉腫、胸膜中皮腫、基底細胞腫、胸腺腫、胃腫瘍、副腎ガン、口腔乳頭腫、血管内皮腫および嚢胞腺腫、濾胞性リンパ腫、腸リンパ肉腫、線維肉腫および肺扁平上皮細胞ガンを含むがそれらに限定されない。フェレットのようなげっ歯類の典型的なガンは、インスリノーマ、リンパ腫、肉腫、神経腫、膵島細胞腫瘍、胃ＭＡＬＴリンパ腫および胃腺ガンを含む。農業家畜に影響を与える腫瘍は、ウシにおいて白血病、血管周囲細胞腫およびウシの眼の腫瘍；ウマにおいて包皮線維肉腫、潰瘍扁平上皮細胞ガン、包皮ガン、結合組織腫瘍および肥満細胞腫；ブタにおいて肝細胞ガン；ヒツジにおいてリンパ腫および肺腺腫症；鳥類において肺肉腫、リンパ腫、ラウス肉腫、細網内皮症、線維肉腫、腎芽細胞腫、Ｂ‐細胞リンパ腫およびリンパ性白血病；魚において網膜芽腫、肝臓異常増殖、リンパ肉腫（リンパ芽球性リンパ腫）、形質細胞白血病および浮袋肉腫；乾酪性リンパ節炎（ＣＬＡ）（細菌のコリネバクテリウム偽結核菌によって引き起こされるヒツジおよびヤギの慢性疾患、感染性疾患、伝染性疾患）ならびにヤーグジークテによって引き起こされるヒツジの伝染性肺腫瘍を含む。
【０１４１】
本発明の他の実施形態は、生体試料中のＤＬＬ４量を具体的に決定するための診断アッセイを含む。このアッセイキットは、かかる抗体を検出するために必要な標識と共に本明細書に開示された標的結合剤または抗体を含み得る。これらの診断アッセイは、腫瘍性疾患を含むがそれに限定されない細胞接着、細胞浸潤、血管新生、または増殖関連疾患をスクリーニングするのに有用である。
【０１４２】
本発明の別の態様は、ＤＬＬ４の生物活性のアンタゴニストであり、このアンタゴニストはＤＬＬ４に結合する。一実施形態において、このアンタゴニストは抗体のような標的結合剤である。このアンタゴニストは、本明細書記載の抗体、例えば、抗体４Ｂ４、２Ｈ１０、２１Ｆ７、１２Ａ１、１７Ｆ３、９Ｇ８、２０Ｇ８、２１Ｈ３、１Ｅ４、３Ａ７、４Ｂ３、１Ｄ４、または２１Ｈ３ＲＫから選択され得る。
【０１４３】
一実施形態において、ＤＬＬ４の生物活性のアンタゴニストはＤＬＬ４に結合し、その結果ＤＬＬ４がＮｏｔｃｈに結合するのを阻害または抑制し、その結果、細胞接着および／または細胞浸潤および／または血管新生および／または増殖が阻害され得る。
【０１４４】
一実施形態は、完全ヒトモノクローナル抗体４Ｂ４、２Ｈ１０、２１Ｆ７、１２Ａ１、１７Ｆ３、９Ｇ８、２０Ｇ８、２１Ｈ３、１Ｅ４、３Ａ７、４Ｂ３、１Ｄ４、または２１Ｈ３ＲＫと同じ１つまたは複数のエピトープに結合する標的結合剤である。
【０１４５】
一実施形態は、完全ヒトモノクローナル抗体４Ｂ４、２Ｈ１０、２１Ｆ７、１２Ａ１、１７Ｆ３、９Ｇ８、２０Ｇ８、２１Ｈ３、１Ｅ４、３Ａ７、４Ｂ３、１Ｄ４、または２１Ｈ３ＲＫと同じ１つまたは複数のエピトープに結合する抗体である。
【０１４６】
一実施形態は、本明細書で上記した標的結合剤を産生するハイブリドーマである。一実施形態は、本明細書で上記した抗体の軽鎖および／または重鎖を産生するハイブリドーマである。一実施形態において、このハイブリドーマは、完全ヒトモノクローナル抗体の軽鎖および／または重鎖を産生する。別の実施形態において、このハイブリドーマは、完全ヒトモノクローナル抗体４Ｂ４、２Ｈ１０、２１Ｆ７、１２Ａ１、１７Ｆ３、９Ｇ８、２０Ｇ８、２１Ｈ３、１Ｅ４、３Ａ７、４Ｂ３、１Ｄ４、または２１Ｈ３ＲＫの軽鎖および／または重鎖を産生する。あるいは、このハイブリドーマは、完全ヒトモノクローナル抗体４Ｂ４、２Ｈ１０、２１Ｆ７、１２Ａ１、１７Ｆ３、９Ｇ８、２０Ｇ８、２１Ｈ３、１Ｅ４、３Ａ７、４Ｂ３、１Ｄ４、または２１Ｈ３ＲＫと同じ１つまたは複数のエピトープに結合する抗体を産生し得る。
【０１４７】
別の実施形態は、本明細書で上記した標的結合剤をコードする核酸分子である。一実施形態において、核酸分子は、本明細書で上記した抗体の軽鎖または重鎖をコードする。一実施形態において、この核酸分子は、完全ヒトモノクローナル抗体の軽鎖または重鎖をコードする。さらに別の実施形態は、抗体４Ｂ４、２Ｈ１０、２１Ｆ７、１２Ａ１、１７Ｆ３、９Ｇ８、２０Ｇ８、２１Ｈ３、１Ｅ４、３Ａ７、４Ｂ３、１Ｄ４、または２１Ｈ３ＲＫから選択される完全ヒトモノクローナル抗体の軽鎖または重鎖をコードする核酸分子である。
【０１４８】
本発明の別の実施形態は、本明細書で上記した１つまたは複数の核酸分子を含むベクターであり、このベクターは、上記に定義される標的結合剤をコードする。本発明の一実施形態において、ベクターは本明細書で上記した１つまたは複数の核酸分子を含み、このベクターは、上記に定義される抗体の軽鎖および／または重鎖をコードする。
【０１４９】
本発明のさらに別の実施形態は、本明細書で上記したベクターを含む宿主細胞である。あるいは、この宿主細胞は、２つ以上のベクターを含み得る。
【０１５０】
さらに、本発明の一実施形態は、核酸分子が標的結合剤を産生するために発現し、その後この標的結合剤を回収する条件下、宿主細胞を培養することによって本発明の標的結合剤を産生する方法である。本発明の一実施形態は、核酸分子が抗体を産生するために発現し、その後この抗体を回収する条件下、宿主細胞を培養することによって本発明の抗体を産生する方法である。
【０１５１】
一実施形態において、本発明は、本明細書で上記した標的結合剤をコードする少なくとも１つの核酸分子で、少なくとも１つの宿主細胞をトランスフェクトし、宿主細胞の中でこの核酸分子を発現させ、この標的結合剤を単離することによって標的結合剤を作製する方法を含む。一実施形態において、本発明は、本明細書で上記した抗体をコードする少なくとも１つの核酸分子で、少なくとも１つの宿主細胞をトランスフェクトし、宿主細胞の中でこの核酸分子を発現させ、この抗体を単離することによって抗体を作製する方法を含む。
【０１５２】
別の態様に従って、本発明は、本明細書で上記したアンタゴニストを投与することによって、ＤＬＬ４の生物活性と拮抗する方法を含む。この方法は、疾患に関連した細胞の接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖の治療を必要としている動物を選択し、ＤＬＬ４の生物活性の治療有効量のアンタゴニストをその動物に投与することを含み得る。
【０１５３】
本発明の別の態様は、本明細書で上記した標的結合剤を投与することによってＤＬＬ４の生物活性と拮抗する方法を含む。この方法は、疾患に関連した細胞の接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖の治療を必要としている動物を選択し、ＤＬＬ４の生物活性と拮抗する治療有効量の標的結合剤を、その動物に投与することを含み得る。
【０１５４】
本発明の別の態様は、本明細書で上記した抗体を投与することによってＤＬＬ４の生物活性と拮抗する方法を含む。この方法は、疾患に関連した細胞の接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖の治療を必要としている動物を選択し、ＤＬＬ４の生物活性と拮抗する治療有効量の抗体を、その動物に投与することを含み得る。
【０１５５】
本発明の別の態様によると、ＤＬＬ４の生物活性の治療効果のある量のアンタゴニストを投与することによって、動物における疾患関連の細胞の接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖を治療する方法を提供する。この方法は、疾患に関連した細胞の接着および／または浸潤および／または血管新生および／または細胞増殖の治療を必要としている動物を選択し、ＤＬＬ４の生物活性の治療有効量のアンタゴニストを、その動物に投与することを含み得る。
【０１５６】
本発明の別の態様によると、ＤＬＬ４の生物活性と拮抗する治療効果のある量の標的結合剤を投与することによって、動物における疾患関連の細胞の接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖を治療する方法を提供する。この方法は、疾患関連の細胞の接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖の治療を必要としている動物を選択し、ＤＬＬ４の生物活性と拮抗する治療有効量の標的結合剤を、その動物に投与することを含み得る。この標的結合剤は単独で投与できる、または追加的抗体もしくは化学療法薬もしくは放射線治療と組み合わせて投与できる。
【０１５７】
別の態様によると、ＤＬＬ４の生物活性と拮抗する治療効果のある量の抗体を投与することによって、動物における疾患関連の細胞の接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖を治療する方法を提供する。この方法は、疾患関連の細胞の接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖の治療を必要としている動物を選択し、ＤＬＬ４の生物活性と拮抗する治療有効量の抗体を、その動物に投与することを含み得る。この抗体は単独で投与できる、または追加的抗体もしくは化学療法薬もしくは放射線治療と組み合わせて投与できる。
【０１５８】
別の態様によると、ＤＬＬ４の生物活性の治療効果のある量のアンタゴニストを投与することによって、動物におけるガンを治療する方法を提供する。この方法は、ガンの治療を必要としている動物を選択し、ＤＬＬ４の生物活性と拮抗する治療有効量のアンタゴニストをその動物に投与することを含み得る。このアンタゴニストは単独で投与できる、または追加的抗体もしくは化学療法薬もしくは放射線治療と組み合わせて投与できる。
【０１５９】
別の態様によると、ＤＬＬ４の生物活性と拮抗する治療効果のある量の標的結合剤を投与することによって、動物におけるガンを治療する方法を提供する。この方法は、ガンの治療を必要としている動物を選択し、ＤＬＬ４の生物活性と拮抗する治療有効量の標的結合剤を、その動物に投与することを含み得る。この標的結合剤は単独で投与できる、または追加的抗体もしくは化学療法薬もしくは放射線治療と組み合わせて投与できる。
【０１６０】
別の態様によると、ＤＬＬ４の生物活性と拮抗する治療効果のある量の抗体を投与することによって、動物におけるガンを治療する方法を提供する。この方法は、ガンの治療を必要としている動物を選択し、ＤＬＬ４の生物活性と拮抗する治療有効量の抗体を、その動物に投与することを含み得る。この抗体は単独で投与できる、または追加的抗体もしくは化学療法薬もしくは放射線治療と組み合わせて投与できる。
【０１６１】
別の態様によると、ＤＬＬ４の生物活性と拮抗する治療有効量の抗体を投与することによって動物における腫瘍細胞増殖、接着、浸潤および／もしくは血管新生を減少させるまたは阻害する方法を提供する。この方法は、増殖、細胞接着、浸潤および／もしくは血管新生の減少または阻害を必要としている動物を選択すること、ならびにＤＬＬ４の生物活性を拮抗する治療有効量の抗体を動物に投与することを含み得る。この抗体は単独で投与できる、または追加的抗体もしくは化学療法薬もしくは放射線治療と組み合わせて投与できる。
【０１６２】
別の態様によると、ＤＬＬ４の生物活性と拮抗する治療効果のある量の抗体を投与することによって、動物における腫瘍増殖および／または転移を減少させる方法を提供する。この方法は、腫瘍増殖および／または転移の減少を必要としている動物を選択し、ＤＬＬ４の生物活性と拮抗する治療有効量の抗体を、その動物に投与することを含み得る。この抗体は単独で投与できる、または追加的抗体もしくは化学療法薬もしくは放射線治療と組み合わせて投与できる。
【０１６３】
本発明の別の態様によると、疾患関連細胞の接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖の治療のための薬剤の製造のために、ＤＬＬ４の生物活性のアンタゴニストを使用することを提供する。一実施形態において、ＤＬＬ４の生物活性のアンタゴニストは、本発明の標的結合剤である。一実施形態において、ＤＬＬ４の生物活性のアンタゴニストは、本発明の抗体である。
【０１６４】
本発明の別の態様によると、疾患関連細胞の接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖の治療の薬剤として使用するための、ＤＬＬ４の生物活性のアンタゴニストを提供する。一実施形態において、ＤＬＬ４の生物活性のアンタゴニストは、本発明の標的結合剤である。一実施形態において、ＤＬＬ４の生物活性のアンタゴニストは、本発明の抗体である。
【０１６５】
本発明の別の態様によると、疾患関連細胞の接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖の治療のための薬剤の製造のために、ＤＬＬ４の生物活性と拮抗する標的結合剤または抗体を使用することを提供する。
【０１６６】
本発明の別の態様によると、疾患関連細胞の接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖の治療の薬剤として使用するための、ＤＬＬ４の生物活性と拮抗する標的結合剤または抗体を提供する。
【０１６７】
本発明の別の態様によると、疾患関連細胞の接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖の治療のための薬剤の製造のために、ＤＬＬ４の生物活性と拮抗する標的結合剤または抗体を使用することを提供する。
【０１６８】
本発明の別の態様によると、疾患関連細胞の接着および／または浸潤および／または血管新生および／または増殖の治療の薬剤として使用するための、ＤＬＬ４の生物活性と拮抗する抗体を提供する。
【０１６９】
本発明の別の態様によると、哺乳動物のガン治療のための薬剤の製造のために、ＤＬＬ４の生物活性のアンタゴニストを使用することを提供する。一実施形態において、ＤＬＬ４の生物活性のこのアンタゴニストは、本発明の標的結合剤である。一実施形態において、ＤＬＬ４の生物活性のこのアンタゴニストは、本発明の抗体である。
【０１７０】
本発明の別の態様によると、哺乳動物のガン治療の薬剤として使用するための、ＤＬＬ４の生物活性のアンタゴニストを提供する。一実施形態において、ＤＬＬ４の生物活性のこのアンタゴニストは、本発明の標的結合剤である。一実施形態において、ＤＬＬ４の生物活性のこのアンタゴニストは、本発明の抗体である。
【０１７１】
本発明の別の態様によると、哺乳動物のガン治療のための薬剤の製造のために、ＤＬＬ４の生物活性と拮抗する標的結合剤を使用することを提供する。
【０１７２】
本発明の別の態様によると、哺乳動物のガン治療の薬剤として使用するための、ＤＬＬ４の生物活性と拮抗する標的結合剤を提供する。
【０１７３】
本発明の別の態様によると、哺乳動物のガン治療のための薬剤の製造のために、ＤＬＬ４の生物活性と拮抗する抗体を使用することを提供する。
【０１７４】
本発明の別の態様によると、哺乳動物のガン治療の薬剤として使用するための、ＤＬＬ４の生物活性と拮抗する抗体を提供する。
【０１７５】
別の態様によると、動物における増殖、細胞接着、浸潤、および／または血管新生を減少させるもしくは阻害する薬剤の製造のために、ＤＬＬ４の生物活性と拮抗する標的結合剤または抗体を使用することを提供する。
【０１７６】
別の態様によると、動物における増殖、細胞接着、浸潤、および／または血管新生を減少させるもしくは阻害する薬剤として使用するための、ＤＬＬ４の生物活性と拮抗する標的結合剤または抗体を提供する。
【０１７７】
別の態様によると、動物における腫瘍増殖および／または転移を減少させる薬剤の製造のために、ＤＬＬ４の生物活性と拮抗する標的結合剤または抗体を使用することを提供する。
【０１７８】
別の態様によると、動物における腫瘍増殖および／または転移を減少させる薬剤として使用するための、ＤＬＬ４の生物活性と拮抗する標的結合剤または抗体を提供する。
【０１７９】
一実施形態において、本発明は、ＤＬＬ４のみに依存する、または部分的に依存する腫瘍を有する患者において、ＤＬＬ４と拮抗するのに特に適している。
【０１８０】
本発明の別の態様によると、ＤＬＬ４の生物活性のアンタゴニストおよび製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、このアンタゴニストは抗体を含む。本発明の別の態様によると、ＤＬＬ４の生物活性のアンタゴニストおよび製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、このアンタゴニストは抗体を含む。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、ＤＬＬ４に特異的に結合する抗体の投与後、循環している過剰の抗体を血液から除去するために、洗浄剤が投与される。
【０１８２】
抗ＤＬＬ４抗体は、患者試料中のＤＬＬ４の検出に有用であり、従って、本明細書で上記した病状の診断として有用である。さらに、（以下の実施例で示されるように）ＤＬＬ４媒介性シグナル伝達活性を顕著に阻害する能力に基づいて、抗ＤＬＬ４抗体はＤＬＬ４発現に起因する徴候および症状を治療することに治療的効果を有する。具体的な実施形態において、本明細書の抗体および方法は、ＤＬＬ４によって誘発される細胞接着、浸潤、血管新生、増殖および／または細胞内シグナル伝達に起因する徴候の治療に関する。さらなる実施形態は、黒色腫、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、グリオーマ、肝細胞（肝臓）ガン、甲状腺腫瘍、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））ガン、前立腺ガン、乳ガン、卵巣ガン、膀胱ガン、肺ガン、グリア芽腫、子宮内膜ガン、腎臓ガン、結腸ガン、および膵臓ガンのような腫瘍性疾患を含む細胞接着、浸潤、血管新生および／または増殖関連疾患を治療するために、本明細書で上記した抗体および方法を使用することを含む。抗体は、関節炎における細胞接着および／または浸潤、アテローム性動脈硬化症および血管新生に関与する疾患にも役立つ。
【０１８３】
特定の実施形態において、抗ＤＬＬ４抗体または標的結合剤は、さらなる腫瘍幹細胞、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および乳房腫瘍を増殖させ、効率的に生じさせる能力を備えた小規模集団の幹細胞にて発達する固形腫瘍の治療に治療効果を有し得る。
【０１８４】
本発明の別の実施形態は、細胞接着、浸潤、血管新生、または増殖関連疾患をスクリーニングするために、哺乳動物の組織、細胞、または体液において、ＤＬＬ４を検出するアッセイキットを含む。このキットは、ＤＬＬ４と結合する標的結合剤、および存在する場合、この標的結合剤とＤＬＬ４の反応を示す手段を含む。一実施形態において、ＤＬＬ４と結合する標的結合剤は標識されている。別の実施形態において、この標的結合剤は標識されていない薬剤で、このキットはこの標的結合剤を検出するための手段をさらに含む。好ましくは、この標的結合剤は、蛍光色素、酵素、放射線核種および放射線不透過物質からなる群から選択されるマーカーで標識される。
【０１８５】
本発明の別の実施形態は、細胞接着、浸潤、血管新生、または増殖関連疾患をスクリーニングするために、哺乳動物の組織、細胞、または体液において、ＤＬＬ４を検出するアッセイキットを含む。このキットは、ＤＬＬ４に結合する抗体、および存在する場合、この抗体とＤＬＬ４の反応を示すための手段を含む。この抗体は、モノクローナル抗体であり得る。一実施形態において、ＤＬＬ４に結合する抗体は標識されている。別の実施形態において、この抗体は標識されていない一次抗体で、このキットはこの一次抗体を検出するための手段をさらに含む。一実施形態において、この手段は、抗免疫グロブリンである標識された二次抗体を含む。好ましくは、この抗体は、蛍光色素、酵素、放射線核種および放射線不透過物質からなる群から選択されるマーカーで標識される。
【０１８６】
本明細書に開示された抗体に関するさらなる実施形態、特徴などは、以下の追加的な詳細の中で提供される。
【０１８７】
配列表
本発明の実施形態は、以下の表１に記載した特異的抗体を含む。この表は、対応する重鎖および軽鎖の遺伝子ならびにポリペプチド各々の可変領域の配列番号と共に、各々の抗ＤＬＬ４抗体の認識番号を示す。各々の抗体に認識番号を与えた。
【表１】
0005778577.tif 000002
0005778577.tif 000003
【０１８８】
表２は同種生殖細胞の重鎖領域に対する抗体重鎖領域と、同種生殖細胞の軽鎖領域に対するκ軽鎖領域とを比較した表である。
【表２】
0005778577.tif 000004
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【０１８９】
定義
特に定義されない限り、本明細書において使用する科学および専門用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。さらに、本文が特に必要としない限り、単数用語は複数形を含み、複数用語は単数形を含む。一般に、本明細書で上記した細胞および組織の培養、分子生物学、およびタンパク質化学、オリゴまたはポリヌクレオチド化学、およびハイブリダイゼーションに関連して利用される命名法および技術は、当該技術分野においてよく知られており、一般に使用されているものである。
【０１９０】
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のために標準的な技術が使用される。酵素反応および精製技術は製造業者の取扱説明書に従って、または当該技術分野において一般に達成されるようにまたは本明細書で上記したように行われる。前述の技術および手順は、一般に、当該技術分野においてよく知られている従来方法に従って、ならびに本明細書全体を通して引用および説明される一般的およびより具体的な様々な参考文献の中に記載されたように行った。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄ. Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ,Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ, Ｎ.Ｙ.（２００１））を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込まれる。本明細書記載の分析化学、有機合成化学、および医薬化学と関連して利用される命名法ならびにそれらの検査法および検査技術は、当該技術分野においてよく知られており、一般に使用されるものである。標準的技術は、化学合成、化学分析、医薬調製、医薬処方、および医薬送達、ならびに患者の治療に使用される。
【０１９１】
本開示に従って利用されるように、以下の用語は、特に示されない限り、以下の意味を有するものと理解される。
【０１９２】
アンタゴニストまたは阻害剤は、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、低分子量化合物、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、アンチセンス、組換えタンパク質、抗体、またはそれらの断片もしくはそれらの接合体もしくはそれらの融合タンパク質であり得る。ＲＮＡｉの総説としてＭｉｌｈａｖｅｔ Ｏ，Ｇａｒｙ ＤＳ，Ｍａｔｔｓｏｎ ＭＰ．（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ.２００３ Ｄｅｃ：５５（４）：６２９−４８.Ｒｅｖｉｅｗ）を、アンチセンスの総説としてＯｐａｌｉｎｓｋａ ＪＢ，Ｇｅｗｉｒｔｚ ＡＭ．（Ｓｃｉ ＳＴＫＥ.２００３ Ｏｃｔ ２８：２００３（２０６）：ｐｅ４７.）を参照されたい。
【０１９３】
化合物とは、約２０００ダルトン未満の分子量を有する任意の低分子量化合物を表す。
【０１９４】
「ＤＬＬ４」という用語は、ＤＬＬ４タンパク質、またデルタ様タンパク質４前駆体、ショウジョウバエデルタホモログ４、ｈデルタ２、ＭＧＣ１２６３４４、またはＵＮＱ１８９５／ＰＲＯ４３４１として知られる分子を表す。「中和する」または「阻害する」という用語は、抗体のような標的結合剤を表す時、標的抗原の活性を除去する、減少させる、または顕著に減少させる抗体の能力に関連する。従って、本発明の「中和」抗ＤＬＬ４抗体は、ＤＬＬ４活性を除去するまたは顕著に減少させることができることである。中和ＤＬＬ４抗体は、例えば、ＤＬＬ４受容体Ｎｏｔｃｈ、例えば、Ｎｏｔｃｈ−１またはＮｏｔｃｈ−４への天然ＤＬＬ４の結合を阻止することによって作用し得る。この結合を阻止することによって、ＤＬＬ４シグナル伝達に仲介される活性は顕著に、または完全に除去される。理想的には、ＤＬＬ４拮抗作用に対する中和抗体は、ＥＣ増殖を促進させる。中和ＤＬＬ４抗体は、例えば非機能的血管新生を促進させることにより血管新生を高める。
【０１９５】
「ＤＬＬ４の生物活性のアンタゴニスト」は、ＤＬＬ４活性を除去する、減少させるまたは顕著に減少させることができる。「ＤＬＬ４の生物活性のアンタゴニスト」は、ＤＬＬ４シグナル伝達を除去する、減少させるまたは顕著に減少させることができる。「ＤＬＬ４の生物活性のアンタゴニスト」は、血管新生および／または増殖を除去し得るまたは顕著に減少させ得る。
【０１９６】
「ＤＬＬ４シグナル伝達を減少する」とは、本発明の標的結合剤、抗体またはアンタゴニストが存在しない場合におけるシグナル伝達量と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％のＤＬＬ４シグナル伝達の減少を含む。
【０１９７】
「最適化」された配列は、非生殖系列配列が生殖系列配列に対して１つ以上の残基に変異し戻されるために変異させた抗体配列（本明細書に記載される任意の抗体の可変重鎖または可変軽鎖）であり、糖鎖付加部位または対になっていないシステインのような配列からの構造的障害の除去をさらに含み得る。
【０１９８】
「ポリペプチド」という用語は、ポリペプチド配列を有する天然のタンパク質、断片、または類似体を表すために、一般用語として本明細書において使用される。それゆえ、天然のタンパク質、断片、および類似体は、ポリペプチド属の種である。本発明に従った好ましいポリペプチドは、κまたはλ軽鎖免疫グロブリン分子のような軽鎖免疫グロブリン分子、ならびにそれらの断片および類似体と重鎖免疫グロブリン分子を含む組み合わせによって、ならびに逆もまた同様に形成されるヒト重鎖免疫グロブリン分子およびヒトκ軽鎖免疫グロブリン分子、および抗体分子を含む。本発明に従った好ましいポリペプチドは、単に、ヒト重鎖免疫グロブリン分子またはその断片も含み得る。
【０１９９】
物に適用され、本明細書において使用される時、「天然」または「天然に存在する」という用語は、物が自然界で見つけられ得る事実を表す。例えば、自然界の供給源から単離できる（ウイルスを含む）生物に存在し、実験室でヒトによってまたは別の方法によって意図的に修飾されていないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は天然に存在する。
【０２００】
本明細書において使用される時、「動作可能に連結する」という用語は、構成成分の目的とする方法でそれらの構成成分が機能できる関係にあると表される構成成分の位置を表す。例えば、コード配列に「動作可能に連結された」対照配列は、対照配列と両立する条件下、コード配列が発現するという方法で結合される。
【０２０１】
本明細書において表される時、「ポリヌクレオチド」という用語は、少なくとも１０塩基長のヌクレオチド（リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか）の重合体型、またはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾型、またはＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ２本鎖を意味する。この用語は、ＤＮＡの１本鎖および２本鎖型を含む。
【０２０２】
本明細書において表される時、「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然に存在する、および天然に存在しない結合によって共に連結された天然に存在する、および修飾されたヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、一般に２００塩基以下の塩基長を含むポリヌクレオチドサブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは１０〜６０塩基長であり、最も好ましくは１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０塩基長である。オリゴヌクレオチドは、通常、例えばプローブの場合は１本鎖であるが、オリゴヌクレオチドは、例えば、遺伝子変異体の構築で使用する場合は２本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかであり得る。
【０２０３】
本明細書において表される時、「天然に存在するヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。本明細書において表される時、「修飾されたヌクレオチド」という用語は、修飾または置換された糖基などを有するヌクレオチドを含む。本明細書において表される時、「オリゴヌクレオチド結合」という用語は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロジセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホラニラデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）、ホスホロアミデートなどのオリゴヌクレオチド結合を含む。例えば、ＬａＰｌａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ.Ｎｕｃｌ.Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ.１４：９０８１（１９８６）；Ｓｔｅｃ ｅｔ ａｌ.Ｊ.Ａｍ. Ｃｈｅｍ. Ｓｏｃ.１０６：６０７７（１９８４）；Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ.Ｎｕｃｌ.Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ.１６：３２０９（１９８８）；Ｚｏｎ ｅｔ ａｌ.Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ６：５３９（１９９１）；Ｚｏｎ ｅｔ ａｌ.Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ,ｐｐ.８７−１０８（Ｆ. Ｅｃｋｓｔｅｉｎ, Ｅｄ,Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ,Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９１））；Ｓｔｅｃ ｅｔ ａｌ. 米国特許第５，１５１，５１０号；Ｕｈｌｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｅｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ９０：５４３（１９９０）を参照されたく、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。必要な場合、オリゴヌクレオチドは検出のための標識を含み得る。
【０２０４】
本明細書において表される時、「選択的にハイブリダイズする」という用語は、検出可能なおよび特異的な結合を意味する。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびそれらの断片は、非特異的な核酸への相当量の検出可能な結合を最小限にするハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件下、核酸鎖と選択的にハイブリダイズする。ストリンジェントの高い条件は、当該技術分野において知られており、本明細書において説明されるような選択的ハイブリダイゼーション条件を達成するために使用できる。一般に、所望のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、または抗体断片と核酸配列との間の核酸配列相同性は少なくとも８０％で、より一般的に、好ましくは、少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、および１００％と相同性が高くなる。
【０２０５】
ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、約４５℃、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）（０．９Ｍ塩化ナトリウム、９０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）の中での膜結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション、続いて約５０〜６５℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの中での１回または複数回の洗浄を含み、より高いストリンジェント条件は、約４５℃、６×ＳＳＣの中での膜結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション、続いて約６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳの中での１回または複数回の洗浄であり、または当該技術分野において知られている任意の他のストリンジェントハイブリダイゼーション条件が含まれるがそれらに限定されない（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ,Ｆ.Ｍ.ｅｔ ａｌ,ｅｄｓ.１９８９ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ,ｖｏｌ.１,Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ,Ｉｎｃ.ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ,Ｉｎｃ,ＮＹ ｐ６．３．１〜６．３．６および２．１０.３参照）。２つのアミノ酸配列間に部分的または完全な同一性がある場合、２つのアミノ酸配列は「相同」である。例えば、８５％の相同性は、２つの配列を最大一致するように整列させた時、アミノ酸の８５％が同一であることを意味する。（一致させられた２つの配列のいずれかに存在する）ギャップは一致を最大化させることができ、５以下のギャップ長が好ましく、２以下のギャップ長がより好ましい。あるいはおよび好ましくは、もし２つのタンパク質配列が、変異データ行列および６以上のギャップペナルティを用いるＡＬＩＧＮプログラムを使用して、（標準偏差単位で）５より大きい整列スコアを有する場合、２つのタンパク質配列（または少なくとも約３０アミノ酸長のそれらに由来のポリペプチド配列）は、この用語が本明細書において使用される場合に、相同である。Ｄａｙｈｏｆｆ,Ｍ.Ｏ,ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ,ｐｐ.１０１−１１０（Ｖｏｌｕｍｅ ５,Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ （１９７２））およびこの巻に対するＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２,ｐｐ.１−１０を参照されたい。２つの配列またはそれらの一部は、ＡＬＩＧＮプログラムを使用して最適に整列させた時、これらのアミノ酸が５０％以上同一である場合は、より好ましくは相同である。２つのオルソロガスな配列の中の相同性のある異なる領域があり得ることを理解されたい。例えば、マウスおよびヒトのオルソログの機能部位が、非機能部位よりも高い相同性を有し得る。
【０２０６】
本明細書において使用される時、「に対応する」という用語は、ポリヌクレオチド配列が参考ポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部と相同である（すなわち、同一で、厳密に進化的に関係はない）こと、またはポリペプチド配列が参考ポリペプチド配列と同一であることを意味する。
【０２０７】
対照的に、本明細書において使用される時、「と相補的」という用語は、相補的な配列が参考ポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部と相同であることを意味する。例として、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は、参照配列「ＴＡＴＡＣ」に相当し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」と相補的である。
【０２０８】
「配列同一性」という用語は、比較枠上で、２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列が（すなわち、ヌクレオチド対ヌクレオチドまたは残基対残基の基準で）同一であることを意味する。「配列同一性のパーセンテージ」という用語は、比較枠上で最適に整列させられた２つの配列を比較し、一致した位置数を得るために同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、もしくはＩ）またはアミノ酸残基が両配列内で生じる位置数を決定し、一致した位置数を比較枠（すなわち、枠サイズ）の中の合計の位置数で割り、配列同一性のパーセンテージを得るためにその結果に１００をかけることによって計算される。本明細書において使用される時、「実質的同一性」という用語は、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の特性を示し、少なくとも１８ヌクレオチド（６アミノ酸）の位置の比較枠上の参照配列と比較して、高い頻度で、少なくとも２４〜４８ヌクレオチド（８〜１６アミノ酸）の位置の枠上の参照配列と比較して、ポリヌクレオチドおよびアミノ酸は、少なくとも８５％配列同一性、好ましくは少なくとも９０〜９５％配列同一性、より好ましくは少なくとも９９％配列同一性を有する配列を含み、配列同一性のパーセンテージは、比較枠上で合計２０％以下の参照配列の欠失または付加を含み得る配列と参照配列を比較することによって計算される。参照配列は、より長い配列のサブセットであり得る。
【０２０９】
本明細書において使用されるように、２０個の標準的アミノ酸およびそれらの略称は、標準的利用に従う。Iｍｍｕｎｏｌｏｇｙ―Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ,Ｅ.Ｓ.Ｇｏｌｕｂ ａｎｄ Ｄ.Ｒ.Ｇｒｅｎ,Ｅｄｓ.,Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ,Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ,Ｍａｓｓ.（１９９１））を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込まれる。２０個の標準的アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、α−、α−２基置換アミノ酸のような非天然アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の非標準的アミノ酸は、本発明のポリペプチドの適切な構成成分でもあり得る。非標準的アミノ酸の例として、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、ならびに他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書において使用されるポリペプチド表記の中で、標準的利用および習慣に従い、左手方向はアミノ末端方向であり、右手方向はカルボキシ末端方向である。
【０２１０】
同様に、特に特定されない限り、１本鎖ポリヌクレオチド配列の左手末端は５’末端であり、２本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は５’方向として称される。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’方向の付加は、転写方向として称され、ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域およびＲＮＡ転写物の５’末端側の配列領域は「上流配列」と称され、ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域およびＲＮＡ転写物の３’末端側の配列領域は「下流配列」と称される。
【０２１１】
ポリペプチドに適用されるように、「実質的に同一」という用語は、例えば、ギャップウェイト（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）初期値を使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによって最適に整列させた場合、２つのペプチド配列が、少なくとも８０％配列同一性、好ましくは少なくとも９０％配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９％配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基の位置は、同類アミノ酸置換によって異なる。同類アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の互換性を表す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。好ましい同類アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。
【０２１２】
本明細書において説明したように、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列内の少数の変化は本発明に含まれるように意図され、アミノ酸配列内の変化は、本明細書に記載された抗体または免疫グロブリン分子に対して少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、および最も好ましくは９９％配列同一性を維持する。特に、同類アミノ酸置換を意図する。同類な置換は、関連側鎖を有するアミノ酸ファミリーの中で置き換わる置換である。遺伝的にコードされるアミノ酸は、一般に、（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）無電荷極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシンのファミリーに分けられる。より好ましいファミリー類：セリンおよびスレオニンは脂肪族ヒドロキシファミリーであり、アスパラギンおよびグルタミンはアミド含有ファミリーであり、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンは脂肪族ファミリーであり、ならびにフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは芳香族ファミリーである。例えば、ロイシンのイソロイシンもしくはバリンとの、アスパラギン酸のグルタミン酸との、スレオニンのセリンとの単独置換（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、またはアミノ酸と構造的に関係があるアミノ酸との類似置換は、もし置換がフレーム部位内のアミノ酸を巻き込まない場合、生じる分子の結合機能もしくは特性に深刻な影響を与えないことを期待することは理にかなっている。アミノ酸変化が機能的ペプチドをもたらすが否かは、ポリペプチド誘導体の特異的活性をアッセイすることによって容易に決定することができる。アッセイを本明細書に詳細に記載する。抗体または免疫グロブリン分子の断片もしくは類似体を、当業者は容易に調製することができる。複数の断片または類似体の好ましいアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能領域の境界近くに存在する。構造的および機能的領域は、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データと公共のまたは私有の配列データベースとを比較することによって同定できる。好ましくは、コンピューター制御の比較方法を、既知の構造および／または機能を有する他のタンパク質の中に存在する配列モチーフまたは予測タンパク質立体構造領域を同定するために使用する。既知の三次元構造の中に折りたたまれたタンパク質配列を同定する方法は知られている。Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ.Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１６４（１９９１）。従って、前述の例は、当業者が、本明細書記載の抗体に従って、構造的および機能的領域を定義するために使用できる配列モチーフおよび構造的立体構造を認識することができることを示す。
【０２１３】
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、高い頻度で脱アミド化され、各々対応するグルタミルおよびアスパルチル残基になる。これらの残基は、中性または塩基性条件下、脱アミド化される。これらの残基の脱アミド化型は、本発明の範囲に含まれる。
【０２１４】
一般に、タンパク質のシステイン残基は、システイン−システインジスルフィド結合に関わるか、またはそれらが折りたたまれたタンパク質領域の一部である時、ジスルフィド結合形成から立体的に保護されるかのいずれかである。タンパク質のジスルフィド結合形成は、環境の酸化還元電位およびチオールジスルフィド交換の専門酵素によって決定される複雑な工程である（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ,Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ.１０７,３０５−３２９,１９８４；Ｈｏｕｅｅ−Ｌｅｖｉｎ,Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ.３５３,３５−４４，２００２）。システイン残基がタンパク質構造中にペアを持たず、折りたたまれることによって立体的に保護されていない時、それは、ジスルフィドシャッフリング（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）として知られる工程で、溶液の遊離システインとジスルフィド結合を形成することができる。ジスルフィドスクランブリング（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｓｃｒａｍｂｌｉｎｇ）として知られる別の工程で、遊離システインは、また、天然に存在するジスルフィド結合（例えば、抗体構造の中に存在するジスルフィド結合）と干渉し、弱い結合、低い生物活性および／または低い安定性を示す。
【０２１５】
好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する脆弱性を減少させる（２）酸化に対する脆弱性を減少させる（３）タンパク質複合体形成の結合親和性を変える（４）結合親和性を変える、ならびに（４）その類似体の他の物理化学的または機能的特性を与えるまたは修飾する置換である。類似体は、天然に存在するペプチド配列以外の配列の様々な変異を含み得る。例えば、１つまたは多数のアミノ酸置換（好ましくは同類アミノ酸置換）は、天然に存在する配列の中で（好ましくは、分子間接触を形成する領域の外側のポリペプチドの部分で）起こり得る。同類アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質的に変化させるべきではない（例えば、置換アミノ酸は親配列に生じるヘリックスを切断するか、または親配列を特徴づける他の種類の二次構造を破壊する傾向にあるべきではない）。当該技術分野において承認されているポリペプチドの二次および三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ,Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ,Ｅｄ,Ｗ.Ｈ.Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ,Ｎｅｗ Ｙｏｒk（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ.Ｂｒａｎｄｅｎ ａｎｄ Ｊ.Ｔｏｏｚｅ,ｅｄｓ,Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ,Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ,Ｎ.Ｙ.（１９９１））；およびＴｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａ.Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１０５（１９９１）に記載されており、各々参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１６】
さらに、かかる方法は、鎖内のジスルフィド結合に関わる、可変領域の１つまたは複数のシステイン残基のアミノ酸の置換または欠失を行い、鎖内の１つまたは複数のジスルフィド結合が無い抗体分子を産生するために使用できる。
【０２１７】
「ＣＤＲ領域」または「ＣＤＲ」という用語は、抗体に抗原結合特異性を与える抗体の重鎖および軽鎖の超可変領域を示すことを意図する。ＣＤＲは、カバットシステム（Ｋａｂａｔ,Ｅ.Ａ.ｅｔ ａｌ.（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ,５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ.ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ,Ｐｕｂｌｉｃ Ｓｅｒｖｉｃｅ,ＮＩＨ,Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）および最新版に従って定義され得る。抗体は、一般的に、３つの重鎖ＣＤＲおよび３つの軽鎖ＣＤＲを含む。この場合、ＣＤＲまたはＣＤＲ類という用語は、抗体が認識する抗原またはエピトープに対する抗体の親和性による結合に関与するアミノ酸残基の大部分を含むこれらの領域の１つまたはこれらの領域のいくつかもしくは全体を示すために本明細書において使用される。
【０２１８】
重鎖の３番目のＣＤＲ（ＨＣＤＲ３）はより大きなサイズの変動性（基本的に、それを引き起こす遺伝子配列の機序によるより大きな多様性）を有する。既知の最長サイズは２６個であるが、ＨＣＤＲ３は２個のアミノ酸ほどの短さでもよい。ＣＤＲ長は、特に基本的なフレームワークによって収容できる長さによっても変化し得る。機能的には、ＨＣＤＲ３は、抗体の特異性の決定に、部分的に重要な役割を担う（Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．,ＰＮＡＳ,７１：４２９８−４３０２,１９７４,Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．,Ｓｃｉｅｎｃｅ,２３３：７４７−７５３,１９８６,Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ,Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ．,１９６：９０１−９１７,１９８７,Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．,Ｎａｔｕｒｅ,３４２：８７７−８８３,１９８９,Ｃａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．,Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ．,１４４：１９６５−１９６８,１９９０,Ｓｈａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．,ＰＮＡＳ,８７：４８１４−４８１７,１９９０,Ｓｈａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．,Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ．,１４４：４８６３−４８６９,１９９０,Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ,Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ．,１４７：１７０９−１７１９,１９９１）。
【０２１９】
本明細書で表される時、「ＣＤＲセット」という用語は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。従って、ＨＣＤＲセットは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲセットはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を表す。
【０２２０】
アミノ酸配列が本明細書において記載される、ならびにＤＬＬ４に対する標的剤および抗体に利用できるバリアントを含めて、本発明のＶＨおよびＶＬ領域ならびにＣＤＲのバリアントは、配列変化または配列変異の方法によっておよび所望の特徴を用いて標的にする抗原のスクリーニングの方法によって入手できる。所望の特徴の例として、抗原に特異的な既知抗体に対する抗原の結合親和性の増加、活性が知られているのであれば、抗原に特異的な既知抗体に対する抗原活性の中和の増加、特異的なモル比での、抗原に対する既知の抗体またはリガンドの有する特定化された競合能力、リガンド−受容体複合体を免疫沈降する能力、特定化されたエピトープへの結合能力、直鎖状エピトープ、例えば、ペプチド結合スキャン（ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｃａｎ）、例えば、直鎖状のおよび／もしくは制限された立体構造にあるスクリーニングされたペプチドを使用して同定されたペプチド配列、不連続残基によって形成された立体構造エピトープへの結合能力、ＤＬＬ４もしくは下流の分子の新しい生物活性を調節する能力、ＤＬＬ４に結合するおよび／もしくはＤＬＬ４を中和する能力、ならびに／または任意の他の所望の特性が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２２１】
ＣＤＲ、抗体ＶＨまたはＶＬ領域および抗原結合部位のアミノ酸配列の中での置換を行うのに必要とされる技術は、当該技術分野において利用可能である。本明細書に開示される抗体分子のバリアントは、本発明において産生および使用できる。多変量データ解析技術を構造／活性相関（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｐｒｏｐｅｒｔｙ−ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）に適用することによる計算化学の先例（Ｗｏｌｄ,ｅｔ ａｌ. Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ.Ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃｓ−Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｅｄ．： Ｂ.Ｋｏｗａｌｓｋｉ）,Ｄ.Ｒｅｉｄｅｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ,Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ,Ｈｏｌｌａｎｄ,１９８４）に続いて、抗体の定量的活性−特性相関（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｐｒｏｐｅｒｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ）が、統計的回帰、パターン認識およびパターン分類のようなよく知られている数学的技法を使用して導かれる（Ｎｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ.Ａｐｐｌｉｅｄ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ.Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｐｒｉｌ １９９８）；Ｋａｎｄｅｌ,Ａｂｒａｈａｍ ＆ Ｂａｃｋｅｒ,Ｅｒｉｃ.Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｒｅａｓｏｎｉｎｇ ｉｎ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ.Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ ＰＴＲ,（Ｍａｙ １１, １９９５）；Ｋｒｚａｎｏｗｓｋｉ,Ｗｏｊｔｅｋ.Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｅｒｉｅｓ,Ｎｏ ２２（Ｐａｐｅｒ））．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０００）；Ｗｉｔｔｅｎ,Ｉａｎ Ｈ. ＆ Ｆｒａｎｋ,Ｅｉｂｅ. Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ Ｔｏｏｌｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｗｉｔｈ Ｊａｖａ Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ. Ｍｏｒｇａｎ Ｋａｕｆｍａｎｎ；（Ｏｃｔｏｂｅｒ １１,１９９９）：Ｄｅｎｉｓｏｎ Ｄａｖｉｄ Ｇ. Ｔ.（Ｅｄｉｔｏｒ）,Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｃ.Ｈｏｌｍｅｓ,Ｂａｎｉ Ｋ.Ｍａｌｌｉｃｋ,Ａｄｒｉａｎ Ｆ.Ｍ.Ｓｍｉｔｈ.Ｂａｙｅｓｉａｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ Ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）.Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：（Ｊｕｌｙ ２００２）；Ｇｈｏｓｅ, Ａｒｕｐ Ｋ. ＆ Ｖｉｓｗａｎａｄｈａｎ,Ｖｅｌｌａｒｋａｄ Ｎ.Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ,Ｓｏｆｔｗａｒｅ,Ｔｏｏｌｓ,ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）。場合によっては、抗体の特性は、抗体配列の経験および理論モデル（例えば、有望な接触残基または計算された物理化学特性の解析）から導き出すことができ、機能的構造および三次元構造ならびにこれらの特性は、単独でおよび組み合わせて考慮する��とができる。
【０２２２】
ＶＨ領域およびＶＬ領域から構成される抗体抗原結合部位は、一般に、ポリペプチドの６つのループ（軽鎖可変領域（ＶＬ）からの３つおよび重鎖可変領域（ＶＨ）からの３つ）によって形成される。既知の原子構造の抗体解析により、抗体結合部位の配列と三次元構造との関係が明らかにされている。これらの関係は、ＶＨ領域の第３の領域（ループ）を除いて、結合部位ループが少数の主鎖配座である正準構造の１つを有することを示唆する。特定のループの中で形成される正準構造は、そのサイズならびにそのループおよびフレームワーク領域の両方における重要部位での特定残基の存在によって決定されることが示されている。
【０２２３】
配列−構造関係のこの研究は、抗体のＣＤＲループの三次元構造を維持するのに重要で、従って結合特異性を維持する、既知配列であるが未知の三次元構造を有する抗体における残基の予測のために使用できる。これらの予測は、主要な最適化実験から得られる結果に対する予測の比較によって裏付けることができる。構造的アプローチにおいて、任意に自由に使用できるまたはＷＡＭのような市販パッケージを使用して抗体分子のモデルを作製できる。次いで、Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ,Ｉｎｃ.）またはＤｅｅｐ Ｖｉｅｗのようなタンパク質の視覚化および解析ソフトウェアパッケージを使用して、ＣＤＲの各位置において可能な置換を評価し得る。次いで、この情報は、活性に最小限のもしくは有益な効果をもたらすと思われるまたは他の所望の特性を与えると思われる置換を行うために使用し得る。
【０２２４】
本明細書において使用される時、「ポリペプチド断片」という用語は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列は、例えば全長ｃＤＮＡ配列から推定される天然に存在する配列の中の対応する位置と同一であるポリペプチドを表す。一般に、断片は、少なくとも５、６、８または１０個のアミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも１４個のアミノ酸の長さ、より好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸の長さ、通常、少なくとも５０個のアミノ酸の長さ、さらにより好ましくは少なくとも７０個のアミノ酸の長さである。本明細書において使用される時、「類似体」という用語は、一部の推定アミノ酸配列と実質的な同一性を有し、以下の少なくとも１つの特性：（１）適切な結合条件下のＤＬＬ４への特異的結合（２）適切なＶＥＧＦ／ＤＬＬ４結合を阻止する能力または（３）ＤＬＬ４受容体チロシン・キナーゼ活性を阻害する能力を有する、少なくとも２５個のアミノ酸の部分を含むポリペプチドを表す。一般に、ポリペプチド類似体は、天然に存在する配列に関して同類アミノ酸置換（または付加または欠失）を含む。一般に、類似体は、少なくとも２０個のアミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも５０個以上のアミノ酸の長さであり、多くの場合、天然に存在する全長ポリペプチドほどの長さであり得る。
【０２２５】
ペプチド類似体は、鋳型ペプチドの類似体に似た特性を有する非ペプチド薬として製薬業界において一般に使用される。これらの種類の非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」または「ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」と称される（Ｆａｕｃｈｅｒｅ,Ｊ.Ａｄｖ.Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ.１５：２９（１９８６）；Ｖｅｂｅｒ ａｎｄ Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ ＴＩＮＳ ｐ.３９２（１９８５）；およびＥｖａｎｓ ｅｔ ａｌ.Ｊ.Ｍｅｄ.Ｃｈｅｍ.３０：１２２９（１９８７）、これらは参照により本明細書に組み込まれる）。かかる化合物は、多くの場合、コンピューター制御の分子モデリングに支持されて発展した。治療に有用なペプチドに構造的に似たペプチド模倣体は、同等の治療効果または予防効果を生むために使用できる。一般に、ペプチド模倣体は、ヒト抗体のような模範ポリペプチド（すなわち、生化学的特性または薬理学的特性を有するポリペプチド）に構造的に似ているが、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−からなる群から選択される結合によって、当該技術分野においてよく知られる方法によって任意に置換される１つまたは複数のペプチド結合を有する。コンセンサス配列の１つまたは複数のアミノ酸の、同じ種類のＤ−アミノ酸との系統的な置換（例えばＬ−リジンの代わりのＤ−リジン）が、より安定なペプチドを産生するために使用できる。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列のバリエーションを含む制限されたペプチドを、当該技術分野において知られる方法（Ｒｉｚｏ ａｎｄ Ｇｉｅｒａｓｃｈ Ａｎｎ.Ｒｅｖ.Ｂｉｏｃｈｅｍ. ６１：３８７（１９９２）、参照により本明細書に組み込まれる）によって、例えば、ペプチドを環化する、分子内ジスルフィド架橋を形成することのできる内部システイン残基を付加することによって産生し得る。
【０２２６】
抗体は、オリゴクローナル、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ−接合抗体、多特異性抗体、２重特異性抗体、触媒抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、抗イディオタイプ抗体、ならびに、可溶型または結合型で標識され得る抗体、および、単独または周知の技術によって提供される他のアミノ酸配列と組み合わせた抗体の断片、バリアントもしくは誘導体であり得る。抗体はいずれの種に由来してもよい。
【０２２７】
本明細書において使用される時、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」および「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」（免疫グロブリン）という用語は、（完全長モノクローナル抗体を含む）モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ラクダ化抗体（ｃａｍｅｌｉｓｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）およびキメラ抗体を含む。本明細書において使用される時、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、抗原の抗原決定基の特性に相補的な内部表面形および電荷分布を有する三次元結合空間を有するポリペプチド鎖の折りたたみから形成される、少なくとも１つの結合領域を含むポリペプチドまたはポリペプチド群を表す。天然抗体は、通常、約１５０，０００ダルトンのヘテロ４量体の糖タンパク質であり、２本の同一の軽（Ｌ）鎖および２本の同一の重（Ｈ）鎖から成る。各々の軽鎖は１つの共有ジスルフィド結合により重鎖に連結され、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各々の重鎖および軽鎖は、規則的に間隔のあいた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各々の重鎖は、一端に可変領域（ＶＨ）を有し、続いて多くの定常領域を有する。各々の軽鎖は、一端に可変領域（ＶＬ）を他端に定常領域を有し、軽鎖の定常領域は重鎖の第１の定常領域と共に整列し、軽鎖可変領域は重鎖可変領域と共に整列する。軽鎖は、軽鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づいてλ鎖またはκ鎖のいずれかに分類される。κ軽鎖可変領域は、本明細書においてＶＫとも示され得る。「可変領域」という用語は、重鎖または軽鎖可変領域を記載するためにも使用できる。特定のアミノ酸残基が、軽鎖および重鎖可変領域の間の界面を形成すると考えられている。各々の軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。かかる抗体は、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウスなどを含むがそれらに限定されない任意の哺乳動物から生じ得る。
【０２２８】
「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、本発明の抗体の結合断片を含み、例示的な断片は、１本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、１本鎖抗体、単一領域抗体、領域抗体、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、所望の生物活性を示す抗体断片、ジスルフィド固定可変領域（ｄｓＦｖ）、２量体可変領域（２重特異性抗体）、（例えば、本発明の抗体に対する抗−Ｉｄ抗体を含む）抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、細胞内抗体、直鎖状抗体、上記の任意の抗体断片およびエピトープ結合断片から形成される１本鎖抗体分子および多特異性抗体を含む。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性断片、すなわち抗原結合部位を含む分子を含む。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであり得る。
【０２２９】
抗体の酵素パパインによる切断は、抗原結合活性はないが、結晶化する能力を有する「Ｆａｂ」断片および「Ｆｃ」断片としても知られる２つの同一の抗原結合断片をもたらす。抗体の酵素ペプシンによる切断は、抗体分子の２つのアームが連結されたままの状態で、２つの抗原結合部位を含む「Ｆ（ａｂ’）２」断片をもたらす。Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗原を架橋する能力を有する。
【０２３０】
「Ｆｖ」とは、本明細書において使用される時、抗原認識および抗原結合部位の両方を保持する抗体の最小断片を表す。この領域は、堅固な非共有結合性または共有結合性の会合にある１つの重鎖および１つの軽鎖可変領域の２量体からなる。この配置で、各々の可変領域の３つのＣＤＲは、ＶＨ−ＶＬ２量体の表面上の抗原結合部位を定義するために相互作用する。合計６つのＣＤＲは抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一可変領域（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、全体の結合部位よりも低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を有する。
【０２３１】
「Ｆａｂ」とは、本明細書において使用される時、軽鎖の定常領域および重鎖のＣＨ１領域を含む抗体の断片を表す。
【０２３２】
「ｄＡｂ」とは、本明細書において使用される時、ヒト抗体の最小の機能的結合単位である抗体の断片を表す。「ｄＡｂ」は単一領域抗体であり、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ領域）または抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ領域）のいずれかを含む。各々のｄＡｂは６つの天然に存在するＣＤＲの３つを含む（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ,Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ.Ｎａｔｕｒｅ ３４１,５４４−５４６（１９８９）；Ｈｏｌｔ,ｅｔ ａｌ,Ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ,Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.２１,４８４−４９（２００３））。それらは１１〜１５ｋＤａの範囲の分子量を有し、抗原結合（Ｆａｂ）２断片よりも４倍小さく、１本鎖のＦｖ（ｓｃＦｖ）分子の半分のサイズである。
【０２３３】
「ラクダ化」とは、本明細書において使用される時、軽鎖を欠いているが、それにもかかわらず、広範な抗原結合レパートリーを有する重鎖２量体から成る抗体分子を表す（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ,Ａｔａｒｈｏｕｃｈ Ｔ,Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ,Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｇ,Ｈａｍｅｒｓ Ｃ,Ｓｏｎｇａ ＥＢ,Ｂｅｎｄａｈｍａｎ Ｎ,Ｈａｍｅｒｓ Ｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｅｖｏｉｄ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ.Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６−４４８）。
【０２３４】
「２重特異性抗体」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を表し、その断片は、同一ポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）の中に軽鎖可変領域（ＶＬ）に結合する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。あまりにも短すぎるために同一鎖上の２つの領域間で対を形成できないリンカーを使用することによって、それらの領域は別の鎖の相補領域と対を形成し、２つの抗原結合部位を作ることを余儀なくされる。２重特異性抗体は、例えば、欧州特許第４０４，０９７号、ＷＯ９３／１１１６１号、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ,９０：６４４４−６４４８（１９９３）により詳細に記載されている。
【０２３５】
完全な抗体の断片は、抗原を結合する機能を遂行し得ることが示された。結合断片の例として、（Ｗａｒｄ,Ｅ.Ｓ.ｅｔ ａｌ．,（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１,５４４−５４６）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１領域からなるＦａｂ断片、（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ,３４８,５５２−５５４）ＶＨおよびＣＨ１領域からなるＦｂ断片、（Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１,４８４−４９０）単一抗体のＶＬおよびＶＨ領域からなるＦｖ断片、（ｉｖ）ＶＨまたはＶＬ領域からなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ,Ｅ.Ｓ.ｅｔ ａｌ,Ｎａｔｕｒｅ ３４１,５４４−５４６（１９８９）,ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ,３４８,５５２−５５４,Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１,４８４−４９０）、（ｖ）単離したＣＤＲ領域、（ｖｉ）連結した２つのＦａｂ断片を含む二価断片、（ｖｉｉ）ＶＨ領域およびＶＬ領域は、２つの領域を会合し抗原結合部位の形成を可能にするペプチドリンカーによって連結された１本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ,（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ,２４２,４２３−４２６,Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ,（１９８８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ,８５,５８７９−５８８３）、（ｖｉｉｉ）２重特異性１本鎖Ｆｖ２量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）および、（ｉｘ）「２重特異性抗体」、遺伝子融合によって構築された多価または多特異性断片（ＷＯ９４／１３８０４号、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ,Ｐ.（１９９３）ｅｔ ａｌ,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ９０ ６４４４−６４４８）が挙げられる。Ｆｖ、ｓｃＦｖまたは２重特異性抗体分子は、ＶＨおよびＶＬ領域を連結するジスルフィド架橋の組み込みによって安定化し得る（Ｒｅｉｔｅｒ,Ｙ.ｅｔ ａｌ,Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ,１４,１２３９−１２４５,１９９６）。ＣＨ３領域に結合したｓｃＦｖを含む小型抗体も作製し得る（Ｈｕ,Ｓ.ｅｔ ａｌ,（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ,５６,３０５５−３０６１）。結合断片の他の例として、重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端におけるいくつかの残基の付加によってＦａｂ断片とは異なるＦａｂ’（抗体のヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインを含む）、および定常領域のシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片であるＦａｂ’−ＳＨが挙げられる。
【０２３６】
「可変」という用語は、可変領域の特定部分が抗体間の配列において大きく異なっており、その特定抗原に対する各々の特定抗体の結合特異性に関与するという事実を表す。しかしながら、可変性は、抗体の可変領域を通して均一に分布されていない。それは、軽鎖および重鎖可変領域の両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる区分に集中している。可変領域のより高度に保存されている部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の各々の可変領域は４つのＦＲ領域を含み、大部分はβシート配置をとり、βシート構造を結合しているループ、およびいくつかの場合において、βシート構造の部分を形成するループを形成する３つのＣＤＲにより結合されている。各々の鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域により、および他方の鎖のＣＤＲと共に近接でまとまり、抗体の抗原結合部位の形成に貢献する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ,Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ,５ｔｈ Ｅｄ.Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ,Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ,Ｂｅｔｈｅｓｄａ,ＭＤ（１９９１）参照）。定常領域は、一般に、抗原結合に直接には関わらないが、抗原結合親和性に影響を与え、抗体のＡＤＣＣ、ＣＤＣ、および／またはアポトーシスへの関与のような様々なエフェクター機能を示し得る。
【０２３７】
本明細書で使用される時、「超可変領域」という用語は、抗原への結合に関連する抗体のアミノ酸残基を表す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変領域の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変領域の残基３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ,Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａl Ｉｎｔｅｒｅｓｔ,５ｔｈ Ｅｄ.Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ,Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ,Ｂｅｔｈｅｓｄａ,ＭＤ（１９９１））および／または「超可変ループ」のそれらの残基（例えば、軽鎖可変領域の残基２６〜３２（Ｌｌ）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変領域の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ,Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ，１９６：９０１−９１７（１９８７））を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、ＣＤＲに隣接するそれらの可変領域の残基である。ＦＲ残基は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、領域抗体、２重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、ワクチン抗体（ｖａｃｃｉｂｏｄｉｅｓ）、直鎖状抗体、および２重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）の中に存在する。
【０２３８】
本明細書において使用されるように、標的結合剤、標的結合タンパク質、特異的結合タンパク質などの用語は、選択的に標的部位に結合する抗体、またはその結合断片を表す。一実施形態において、この標的結合剤は、唯一の標的部位に対して特異的である。他の実施形態において、この標的結合剤は２つ以上の標的部位に対して特異的である。一実施形態において、この標的結合剤はモノクローナル抗体であり、この標的部位はエピトープであり得る。
【０２３９】
抗体の「結合断片」は、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクトな抗体の酵素分解または化学分解によって産生される。結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂおよび１本鎖抗体を含む。「２重特異性」または「２機能性」抗体以外の抗体は、同一の各々のその結合部位を有すると理解される。抗体は、実質的に、受容体の対抗受容体への接着を阻害し、（インビトロ競合結合アッセイにおいて測定される時）過剰の抗体は、少なくとも約２０％、４０％、６０％もしくは８０％、および８０％超、通常約８５％超で対抗受容体と結合した受容体の量を減少させる。
【０２４０】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体への特異的結合ができる任意のタンパク質決定因子を含む。エピトープの決定因子は、通常、アミノ酸または糖の側鎖のような分子の化学的活性表面集団からなり、特異的三次元構造特性および特異的電荷特性を、必ずしもいつもではないが、有し得る。抗体は、解離定数が１μＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下および最も好ましくは１０ｎＭ以下の時、抗原に特異的に結合すると言われている。
【０２４１】
「薬剤」という用語は、化学化合物、化学化合物の混合物、生体高分子、または生体物質から作られた抽出物を示すために本明細書において使用される。
【０２４２】
ＤＬＬ４ポリペプチドに対して「活動的」または「活性」とは、天然ＤＬＬ４ポリペプチドの生物学的または免疫学的活性を有するＤＬＬ４ポリペプチドの一部を表す。本明細書において使用される時、「生物学的」とは、天然ＤＬＬ４ポリペプチドの活性に由来する生物学的機能を表す。好ましいＤＬＬ４生物学的活性は、例えば、ＤＬＬ４に誘発される細胞接着および細胞浸潤、および／または血管新生、および／または増殖を含む。
【０２４３】
「哺乳動物」とは、本明細書において使用される時、哺乳動物とみなされる任意の動物を表す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【０２４４】
「動物」とは、本明細書において使用される時、哺乳動物とみなされる動物を含む。好ましくは、動物はヒトである。
【０２４５】
「ｍＡｂ」という用語は、モノクローナル抗体を表す。
【０２４６】
「リポソーム」とは、本明細書において使用される時、本発明のＤＬＬ４ポリペプチドまたはかかるＤＬＬ４ポリペプチドに対する抗体を含み得る薬剤の哺乳動物への送達に有用であり得る小胞を表す。
【０２４７】
本明細書において使用される時、「標識」または「標識された」とは、ポリペプチドへの検出可能な部分、例えば、放射標識、蛍光標識、酵素標識、化学発光法により標識された基またはビオチニル基の付加を表す。放射性同位体または放射性核種は３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉを含み得、蛍光標識はローダミン、ランタニド蛍光体またはＦＩＴＣを含み得、酵素標識は西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼを含み得る。
【０２４８】
追加の標識は、例証として、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（「Ｇ６ＰＤＨ」）、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸脱水素酵素およびペルオキシダーゼのような酵素；色素；追加の蛍光標識または蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒｓ）、例えばフルオロセインおよびその誘導体、蛍光色素、ＧＦＰ（「緑色発光タンパク質」のＧＦＰ）、ダンシル、ウンベリフェロン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、およびフルオレスカミン、ランタニドクリプタートのようなフルオロフォアおよびキレート、例えば、ユウロピウムなど（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ａｎｄ Ｃｉｓ Ｂｉｏｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）；イソルミノ−ル、ルミノールおよびジオキセタンのような化学発光標識または化学ルミネセンス；感光薬；補酵素；酵素基質；ラテックスまたはカーボン粒子のような粒子；金属ゾル；結晶；リポソーム；色素、触媒または他の検出可能な基を用いてさらに標識し得る細胞など；ビオチン、ジゴキシゲニンまたは５−ブロモデオキシウリジンのような分子；例えば、緑膿菌外毒素（ＰＥまたは細胞毒性断片またはその変異体）、ジフテリア毒素または細胞毒性断片またはその変異体、ボツリヌス毒素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥまたはＦ、リシンまたはその細胞毒性断片、例えば、リシンＡ、アブリンまたはそれらの細胞毒性断片、サポリンまたはその細胞毒性断片、ヤマゴボウ抗ウイルス毒素またはその細胞毒性断片、およびブリオジン（ｂｒｙｏｄｉｎ）１またはその細胞毒性断片の群から選択される毒素部分のような毒素部分を含むがそれらに限定されない。
【０２４９】
本明細書において使用される時、「医薬品または調合薬」という用語は、適切に患者に投与される時、所望の治療効果を誘発することができる化学化合物または化学組成物を表す。本明細書における他の化学用語は、当該技術分野における従来の使用に従って使用され、例としてＴｈｅ ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ（Ｐａｒｋｅｒ,Ｓ,Ｅｄ,ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ,Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８５））が挙げられる（参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２５０】
本明細書において使用される時、「実質的に純粋」とは、対象種が優勢種として存在する（すなわち、モル基準で、組成物の中で任意の他の個々の種よりもより豊富である）ことを意味し、好ましくは、実質的精製画分は、対象種が（モル基準で）存在するすべての高分子種の少なくとも約５０％を含む組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種の約８０％超、より好ましくは約８５％、９０％、９５％、および９９％超を含む。最も好ましくは、対象種は、組成物が基本的に単一の高分子種からなる基本的同一性にまで精製される（混入物種は従来の検出方法によって組成物の中で検出されることができない）。
【０２５１】
「患者」という用語は、ヒトおよび獣医学の対象を含む。
【０２５２】
「抗体依存性細胞媒介細胞毒性」および「ＡＤＣＣ」とは、ＩｇＦｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、好中球、およびマクロファージ）が、標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応を表す。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介する初代細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ,Ａｎｎｕ.Ｒｅｖ.Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７−９２（１９９１）の４６４ページの表３にまとめられている。対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを行うことができる。かかるアッセイの有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。あるいは、また追加として、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボ、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ.ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９８８）に開示されている動物モデルにおいて評価できる。「補体依存性細胞傷害」および「ＣＤＣ」とは、抗体がその細胞死機能を実行する機序を表す。それは、補体の第１構成成分の成分であるＣ１ｑの、抗原と複合体の状態にあるＩｇ、ＩｇＧまたはＩｇＭのＦｃ領域への結合によって開始される（Ｈｕｇｈｓ−Ｊｏｎｅｓ， Ｎ．Ｃ， ａｎｄ Ｂ． Ｇａｒｄｎｅｒ． １９７９． ＭｏＩ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６：６９７）。Ｃ１ｑは、７０μｇ／ｍｌの濃度でヒト血清に存在する約４１０ｋＤａの大きな複雑な構造をもつ糖タンパク質である（Ｃｏｏｐｅｒ,Ｎ.Ｒ.１９８５.Ａｄｖ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.３７：１５１）。２つのセリンプロテアーゼＣ１ｒおよびＣ１ｓと共に、Ｃ１ｑは補体の第１の構成成分である複合体Ｃ１を形成する。Ｃ１ｑの少なくとも２つのＮ末端球状頭部は、Ｃ１活性化に対して、従って補体カスケードの開始に対してＩｇのＦｃに結合しなければならない（Ｃｏｏｐｅｒ,Ｎ.Ｒ.１９８５.Ａｄｖ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.３７：１５１）。
【０２５３】
本明細書において使用される時、「抗体半減期」という用語は、抗体投与後、抗体分子の平均生存時間の尺度である抗体の薬物動態特性を意味する。抗体半減期は、例えば、血清または血漿の中、すなわち循環する半減期、または他の組織の中で測定されるような患者の体もしくはその特異的区画からの免疫グロブリンの既知量の５０％を排除するのに必要とする時間として表すことができる。半減期は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンのクラスによって変化し得る。一般に、抗体半減期の増加は、投与される抗体の循環中の平均滞留時間（ＭＲＴ）の増加になる。
【０２５４】
「アイソタイプ」という用語は、抗体の重鎖または軽鎖の定常領域の分類を表す。抗体の定常領域は抗原への結合に関与しないが、様々なエフェクター機能を示す。重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、所定のヒトの抗体または免疫グロブリンは、５つの主要クラスの免疫グロブリンＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの１つに割り当てることができる。これらのクラスのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１（γ１）、ＩｇＧ２（γ２）、ＩｇＧ３（γ３）、およびＩｇＧ４（γ４）、ならびにＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分類し得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常領域は、各々α、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンの構造および三次元配置はよく知られている。様々なヒト免疫グロブリンクラスの中で、唯一ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＭだけが補体を活性化することが知られている。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、ヒトにおいて媒介することが知られている。ヒト軽鎖定常領域は、２つの主要クラス、κおよびλに分類し得る。
【０２５５】
所望の場合、ＤＬＬ４に特異的に結合する抗体のアイソタイプは、例えば、異なるアイソタイプの生物学的特性をうまく利用するためにスイッチできる。例えば、いくつかの状況において、ＤＬＬ４に対する治療用抗体としての抗体の産生に関連して、抗体が補体に結合し、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）に関与することができることが所望であり得る。これができる抗体のアイソタイプがいくつかあり、以下のマウスＩｇＭ、マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、マウスＩｇＧ３、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＡ、ヒトＩｇＧ１、およびヒトＩｇＧ３を含むがそれらに限定されない。他の実施形態において、ＤＬＬ４に対する治療用抗体としての抗体の産生に関連して、抗体は、エフェクター細胞上Ｆｃ受容体に結合し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に関与することができることが所望であり得る。これができる抗体のアイソタイプがいくつかあり、以下のマウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、マウスＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ１、およびヒトＩｇＧ３を含むがそれらに限定されない。産生される抗体は、初めはかかるアイソタイプを保有する必要はなく、代わりに、産生される抗体は任意のアイソタイプを保有することができ、その後、この抗体を当該技術分野においてよく知られている従来の技術を使用してアイソタイプをスイッチできることが理解されるであろう。かかる技術は、数ある中でも、組換え技術（例えば、米国特許第４，８１６，３９７号参照）、細胞融合技術（例えば、米国特許第５，９１６，７７１号および同第６，２０７，４１８号参照）の直接的な使用を含む。
【０２５６】
例として、本明細書において議論される抗ＤＬＬ４抗体は、完全ヒト抗体である。抗体がＤＬＬ４への所望の結合を保有する場合、この抗体はヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＧ1、またはヒトＩｇＧ３アイソタイプを産生するようにアイソタイプをすぐにスイッチできるが、（抗体の特異性および抗体の親和性の一部を定義する）同じ可変領域を依然として保有する。その後、かかる分子は、補体に結合し、ＣＤＣに関与することができるおよび／またはエフェクター細胞上のＦｃ受容体に結合し、ＡＤＣＣに関与することができる。
【０２５７】
「全血アッセイ」は、天然のエフェクターの供給源として未分画の血液を使用する。血液は、多形核細胞（ＰＭＮ）および単核細胞（ＭＮＣ）のようなＦｃＲを発現している細胞のエフェクターと共に血漿の中に補体を含む。従って、全血アッセイは、インビトロのＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター機序の両方の相乗効果を同時評価することができる。
【０２５８】
本明細書において使用される時、「治療有効」量とは、被験体にある程度の改善または恩恵をもたらす量である。別の方法で規定される「治療有効」量とは、少なくとも１つの臨床症状においてある程度の軽減、緩和、および／または減少をもたらす量である。本発明の方法によって治療することができる疾患と関連する臨床症状は、当業者によく知られている。さらに、ある程度の恩恵が被験体にもたらされる限り、治療効果は完全なまたは治癒的な効果である必要はないことを、当業者は理解するであろう。
【０２５９】
本明細書において使用される時、「および／または」という用語は、他のものがあろうとなかろうと、２つの特定化された特徴または構成成分の各々の具体的な開示として解釈されるべきである。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、あたかも各々が本明細書において個別に述べられているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢの各々の具体的な開示として解釈されるべきである。
【０２６０】
抗体構造
基本の抗体構造単位は４量体を含むことが知られている。各々の４量体は、２本の同一ポリペプチド鎖の対から成り、各々の対は１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗体認識に関与する約１００〜１１０またはそれより多いアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主としてエフェクター機能に関与する定常領域を定義する。ヒト軽鎖はκおよびλ軽鎖として分類される。重鎖は、μ、δ、γ、α、またはεとして分類され、各々ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして抗体のアイソタイプを定義する。軽鎖および重鎖の中で、可変および定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖はさらに約１０のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ.７（Ｐａｕｌ,Ｗ,ｅｄ.,２ｎｄ ｅｄ.Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ,Ｎ.Ｙ.（１９８９））を参照されたい（全目的のためにその全体が参照により組み込まれる）。各々の軽／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。
【０２６１】
従って、インタクトな抗体は２つの結合部位を有する。２機能性または２重特異性抗体の中を除いて、２つの結合部位は同じものである。
【０２６２】
鎖はすべて、３つの超可変領域（ＣＤＲとも呼ばれる）によって連結される相対的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ全体構造を示す。各々対の２本鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域のそばに整列し、特異的エピトープへの結合を可能にする。軽鎖および重鎖の両方のＮ末端〜Ｃ末端は、領域ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各々の領域に対するアミノ酸の配置は、ＫａｂａｔＳｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ,Ｂｅｔｈｅｓｄａ,Ｍｄ.（１９８７および１９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ.Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。
【０２６３】
２重特異性抗体または２機能性抗体は、２つの異なる重／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。２重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含む様々な方法によって産生できる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ＆ Ｌａｃｈｍａｎｎ Ｃｌｉｎ. Ｅｘｐ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.７９：３１５−３２１（１９９０）,Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ.Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照されたい。２重特異性抗体は、単一結合部位を有する断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦｖ）の形態では存在しない。
【０２６４】
ＶＨまたはＶＬ領域は単独で使用して抗原に結合させることができるが、一般に、ＶＨ領域はＶＬ領域と対になって抗原結合部位を抗体に提供する。ＶＨ領域（表２参照）は、抗体の抗原結合部位がＶＨおよびＶＬ領域の両方を含んで形成されるように、ＶＬ領域（表２参照）と対になり得る。
【０２６５】
ヒト抗体および抗体のヒト化
ヒト抗体は、マウスまたはラットの可変および／または定常領域を保有する抗体に関連するいくつかの問題を避ける。かかるマウスまたはラット由来のタンパク質の存在は、抗体の迅速除去につながるか、または患者による抗体に対する免疫反応の発生につながり得る。マウスまたはラット由来の抗体の利用を避けるために、げっ歯類、他の哺乳動物または動物が完全ヒト抗体を産生できるように、機能的ヒト抗体の遺伝子座をげっ歯類、他の哺乳動物または動物の中に導入することを通して、完全ヒト抗体を産生することができる。
【０２６６】
完全ヒト抗体の産生のための１つの方法は、ヒト重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座の１０００ｋｂ以下のサイズの生殖系列で構成された断片を含むように操作されたマウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統を使用することである。Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ.Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１５：１４６−１５６（１９９７）およびＧｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ｊ.Ｅｘｐ.Ｍｅｄ.１８８：４８３−４９５（１９９８）を参照されたい。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統は、Ａｍｇｅｎ社（Ｆｒｅｍｏｎｔ,Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ,Ｕ.Ｓ.Ａ）から入手可能である。
【０２６７】
かかるマウスはヒト免疫グロブリンの分子および抗体を産生でき、マウス免疫グロブリンの分子および抗体は産生できない。この調製をなし遂げるために利用される技術は、１９９６年１２月３日に出願された米国特許出願第０８／７５９，６２０号および１９９８年６月１１日に公開されたＷＯ９８／２４８９３号および２０００年１２月２１日に公開されたＷＯ００／７６３１０号に開示されており、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１５：１４６−１５６（１９９７）も参照されたく、この開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２６８】
マウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統の作製は、１９９０年１月１２日に出願された米国特許出願第０７／４６６，００８号、１９９０年１１月８日に出願された同第０７／６１０，５１５号、１９９２年７月２４日に出願された同第０７／９１９，２９７号、１９９２年７月３０日に出願された同第０７／９２２，６４９号、１９９３年３月１５日に出願された同第０８／０３１，８０１号、１９９３年８月２７日に出願された同第０８／１１２，８４８号、１９９４年４月２８日に出願された同第０８／２３４，１４５号、１９９５年１月２０日に出願された同第０８／３７６，２７９号、１９９５年４月２７日に出願された同第０８／４３０,９３８号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４６４，５８４号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４６４，５８２号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４６３，１９１号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４６２，８３７号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４８６，８５３号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４８６，８５７号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４８６，８５９号、１９９５年６月５日に出願された同第０８／４６２，５１３号、１９９６年１０月２日に出願された同第０８／７２４，７５２号、１９９６年１２月３日に出願された同第０８／７５９，６２０号、２００１年１１月３０日に出願された米国特許公開第２００３／００９３８２０号、米国特許第６，１６２，９６３号、同第６，１５０，５８４号、同第６，１１４，５９８号、同第６，０７５，１８１号および同第５，９３９，５９８号ならびに日本特許第３ ０６８ １８０号、同第３ ０６８ ５０６号および同第３ ０６８ ５０７号にさらに説明され、詳述されている。１９９６年６月１２日に出願公開された欧州特許第０ ４６３ １５１号、１９９４年２月３日に公開されたＷＯ９４／０２６０２号、１９９６年１０月３１日に公開されたＷＯ９６／３４０９６号、１９９８年６月１１日に公開されたＷＯ９８／２４８９３号、２０００年１２月２１日に公開されたＷＯ００／７６３１０号も参照されたい。上記に引用された特許、特許出願、および参考文献の各々の開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２６９】
１つの代替的なアプローチにおいて、ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社を含む他者は、「ミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）」アプローチを利用している。ミニ遺伝子座アプローチでは、Ｉｇ遺伝子座からの複数の小片（個々の遺伝子）を含むことにより、外来性Ｉｇ遺伝子座を模倣する。従って、１つまたは複数のＶＨ遺伝子、１つまたは複数のＤＨ遺伝子、１つまたは複数のＪＨ遺伝子、μ定常領域、および通常、第２の定常領域（好ましくはγ定常領域）が動物に挿入するためのコンストラクトの中に形成される。このアプローチは、Ｓｕｒａｎｉｅｔ ａｌによる米国特許第５，５４５，８０７号、ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙによる各々の米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，６２５，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，７７０，４２９号、同第５，７８９，６５０号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８７７，３９７号、同第５，８７４，２９９号、および同第６，２５５，４５８号、ＫｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔおよびＢｅｒｎｓによる米国特許第５，５９１，６６９号および同第６，０２３．０１０号、Ｂｅｒｎｓｅｔ ａｌによる米国特許第５，６１２，２０５号、同第５，７２１，３６７号、および同第５，７８９，２１５号、ならびにＣｈｏｉおよびＤｕｎｎによる米国特許第５，６４３，７６３号、ならびに１９９０年８月２９日に出願されたＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの米国特許出願第０７／５７４，７４８号、１９９０年８月３１日に出願された同第０７／５７５，９６２号、１９９１年１２月１７日に出願された同第０７／８１０，２７９号、１９９２年３月１８日に出願された同第０７／８５３，４０８号、１９９２年６月２３日に出願された同第０７／９０４，０６８号、１９９２年１２月１６日に出願された同第０７／９９０，８６０号、１９９３年４月２６日に出願された同第０８／０５３，１３１号、１９９３年７月２２日に出願された同第０８／０９６，７６２号、１９９３年１１月１８日に出願された同第０８／１５５，３０１号、１９９３年１２月３日に出願された同第０８／１６１，７３９号、１９９３年１２月１０日に出願された同第０８／１６５，６９９号、１９９４年３月９日に出願された同第０８／２０９，７４１号に記載され、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。欧州特許第０ ５４６ ０７３号、ＷＯ９２／０３９１８号、ＷＯ９２／２２６４５号、ＷＯ９２／２２６４７号、ＷＯ９２／２２６７０号、ＷＯ９３／１２２２７号、ＷＯ９４／００５６９号、ＷＯ９４／２５５８５号、ＷＯ９６／１４４３６号、ＷＯ９７／１３８５２号、およびＷＯ９８／２４８８４号ならびに米国特許第５，９８１，１７５号も参照されたく、これらは参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。さらに、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ,１９９２,Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ,１９９３,Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ,１９９３,Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ,１９９３,Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ,（１９９４）,Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ,（１９９４）、およびＴｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ,（１９９５）,Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ,（１９９６）を参照されたく、これらは��照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０２７０】
Ｋｉｒｉｎは、ミクロ細胞融合によって、染色体の大きな一部、または染色体全体が導入されたマウスからのヒト抗体の産生も示した。欧州特許出願第７７３ ２８８号および同第８４３ ９６１号を参照されたく、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。さらに、ＫｉｒｉｎのＴｃマウスとＭｅｄａｒｅｘのミニ遺伝子座（Ｈｕｍａｂ）マウスの異種交配の結果得られたＫＭ（商標）マウスが作製された。これらのマウスは、ＫｉｒｉｎマウスのヒトＩｇＨトランス染色体（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）およびＧｅｎｐｈａｒｍマウスのκ鎖トランス遺伝子を保有する（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ,Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ,（２００２）４：９１−１０２）。
【０２７１】
ヒト抗体は、インビトロ方法によっても生成することができる。適切な例として、ファージディスプレイ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ,Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ,Ｄｙａｘ,Ｂｉｏｓｉｔｅ／Ｍｅｄａｒｅｘ,Ｘｏｍａ,Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ,Ａｌｅｘｉｏｎ（旧Ｐｒｏｌｉｆｅｒｏｎ）,Ａｆｆｉｍｅd）、リボソームディスプレイ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、酵母ディスプレイなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０２７２】
抗体の調製
本明細書記載の抗体を、下記のとおり、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を用いて調製した。かかるマウスはヒト免疫グロブリンの分子および抗体を産生でき、マウス免疫グロブリンの分子および抗体は産生できない。この調製をなし遂げるために利用される技術は、本明細書の背景項目に開示した特許、特許出願、および参考文献に開示されている。しかしながら、特に、その技術によるマウスおよび抗体の遺伝子導入生産の好ましい一実施形態は、１９９６年１２月３日に出願された米国特許出願第０８／７５９，６２０号および１９９８年６月１１日に公開された国際公開ＷＯ９８／２４８９３号および２０００年１２月２１日に公開されたＷＯ００／７６３１０号に開示されており、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６（１９９７）（本開示は参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。
【０２７３】
かかる技術を用いて、種々の抗原に対する完全ヒトモノクローナル抗体が生産されている。基本的には、マウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統を対象の抗原（例えばＤＬＬ４）で免疫化し、超免疫マウスからリンパ細胞（Ｂ細胞など）を回収し、回収したリンパ細胞を骨髄タイプの細胞系と融合して不死ハイブリドーマ細胞系を調製する。これらのハイブリドーマ細胞系をスクリーニングし、対象の抗原に対して特異的な抗体を生産するハイブリドーマ細胞系を選択して同定する。本明細書は、ＤＬＬ４に対して特異的な抗体を生産する複数のハイブリドーマ細胞系の生産方法を提供する。さらに、本明細書はかかる細胞系により生産された抗体の特性化（かかる抗体の重鎖および軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の分析を含む）を提供する。
【０２７４】
あるいは、骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを産生する代わりに、Ｂ細胞を直接アッセイできる。例えば、ＣＤ１９＋Ｂ細胞を超免疫ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウスから単離して、抗体分泌形質細胞を増殖および分化させることができる。次いで細胞上清由来の抗体のＤＬＬ４免疫原に対する反応性を、例えばＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、またはＦＭＡＴによりスクリーニングする。この上清もＤＬＬ４断片に対する免疫反応性についてスクリーニングして、さらにＤＬＬ４上の機能的な対象領域に結合する異なる抗体をマッピングしてもよい。抗体は、他の関連ヒトＤＬＬ４ならびにラット、マウス、および非ヒト霊長類（カニクイザルなど）に対して、ＤＬＬ４のオルソログについてスクリーニングして、最後に種交差反応を決定してもよい。対象の抗体を含むウェルからのＢ細胞は、各種方法（融合して個々のウェルもしくはプールしたウェルのいずれかから、またはＥＢＶ感染により、もしくは既知の不死化遺伝子によるトランスフェクトにより、ハイブリドーマを作製することを含む）により不死化してから、適切な培地に入れてよい。あるいは、所望の特異性を伴う単独の抗体分泌形質細胞を次いでＤＬＬ４特異性溶血性プラークアッセイを用いて単離する（例えばＢａｂｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７８４３−４８（１９９６）を参照されたい）。溶解を標的とした細胞は好ましくはＤＬＬ４抗原でコーティングしたヒツジ赤血球細胞（ＳＲＢＣ）である。
【０２７５】
対象の免疫グロブリンを分泌する形質細胞および補体を含むＢ細胞培養の存在下、プラーク形成は、特異的ＤＬＬ４媒介性の、対象の形質細胞を囲むヒツジ赤血球細胞の溶解を示す。プラーク中心の単独の抗原特異性形質細胞を単離することができ、抗体の特異性をコードする遺伝子情報は単形質細胞から単離される。逆転写を使用後、ＰＣＲを行って（ＲＴ−ＰＣＲ）、抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡをクローン化できる。かかるクローン化ＤＮＡは次いで適切な発現ベクター、好ましくはベクターカセット（ｐｃＤＮＡなど）、より好ましくは免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の定常領域を含むｐｃＤＮＡベクターなどにさらに挿入できる。この産生したベクターは次いで宿主細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞）にトランスフェクトして、転写の誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように改変した従来の栄養培地で培養できる。
【０２７６】
理解されるであろうとおり、ＤＬＬ４に対して特異的に結合する抗体はハイブリドーマ細胞系以外の細胞系で発現し得る。適切な哺乳動物の宿主細胞を形質転換させるために、特定の抗体をコードする配列を使用できる。形質転換は宿主細胞中へポリヌクレオチドを導入する任意の既知の方法（例えばウイルス内（またはウイルスベクター内）へのポリヌクレオチドの封入およびウイルス（またはベクター）による宿主細胞の形質導入を含む）により、または、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号、および同第４，９５９，４５５号（これらの特許は参照により本明細書に組み込まれる）に例示されているように当該技術分野において知られているトランスフェクション手順により可能である。使用した形質転換手順は形質転換される宿主に応じて変わる。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入する方法は当該技術分野においてよく知られており、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチド（１つまたは複数）のカプセル封入、およびＤＮＡの核への直接的なマイクロインジェクションが挙げられる。
【０２７７】
発現宿主として利用可能な哺乳動物細胞系は当該技術分野においてよく知られており、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）より入手可能な多くの不死化細胞系（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞ガン細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、ヒト上皮腎臓２９３細胞、およびいくつかの他の細胞系を含むがそれらに限定されない）が挙げられる。どの細胞系の発現値が高くて構成的ＤＬＬ４結合特性を有する抗体を生産するかの決定を通して、特に好ましい細胞系を選択する。
【０２７８】
細胞融合技術により、任意の所望のアイソタイプを伴う重鎖を有する骨髄腫、ＣＨＯ細胞または他の細胞系が調製され、軽鎖を有する別の骨髄腫、ＣＨＯ細胞または他の細胞系が調製される。その後、かかる細胞を融合して、インタクトな抗体を発現する細胞系を単離することができる。
【０２７９】
従って、抗体候補は上で議論したように所望の「構造性」特性を満たすように産生されるため、通常、アイソタイプのスイッチを介した所望の「機能的」特性を少なくともある程度伴う抗体候補を提供することができる。
【０２８０】
治療的投与および製剤
本発明の実施形態としては、疾患の治療に有用である抗ＤＬＬ４抗体の滅菌医薬品製剤が挙げられる。かかる製剤はＮｏｔｃｈ１またはＮｏｔｃｈ４受容体への天然ＤＬＬ４の結合を阻害し、それにより、例えば、血清または組織のＤＬＬ４発現が異常に上昇した症状を効果的に治療する。抗ＤＬＬ４抗体は、好ましくは天然ＤＬＬ４のＮｏｔｃｈ１またはＮｏｔｃｈ４受容体への結合を強力に阻害する適切な親和性を有し、好ましくは適切な作用持続時間を有して、ヒトに対する低頻度の投与を可能とする。延長した作用持続時間により、代替的な非経口経路（皮下または筋肉注射など）による、低頻度でより便利な投薬計画が可能となる。
【０２８１】
滅菌製剤は、例えば、滅菌濾過膜を通した濾過により、抗体の凍結乾燥および再構成の前または後に作製できる。この抗体は通常、凍結乾燥形態または溶液中に保存される。治療上の抗体組成物は、通常、滅菌アクセスポートを有する容器（例えば、静脈内溶液バッグ）、または製剤の回収を可能にするアダプター（皮下注射針によって穿通可能な栓など）を有するバイアルに入れられる。
【０２８２】
抗体の投与経路は、既知の方法（例えば、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、鞘内への注射もしくは注入、吸入もしくは病巣内経路、腫瘍部位への直接注射、または下記の徐放系）と一致する。抗体は好ましくは注入またはボーラス注射により持続投与される。
【０２８３】
治療上用いられる抗体の有効量は、例えば、治療目的、投与経路、および患者の症状に応じて変わる。従って、最適治療効果を得る上で必要とされるように療法士が投与量を滴定して投与経路を変更することが好ましい。典型的には、臨床医は投与量が所望の効果に達するまで抗体を投与する。この療法の進行は従来のアッセイにより、または本明細書記載のアッセイにより容易にモニタリングされる。
【０２８４】
本明細書記載の抗体は、製薬上許容可能な担体との混合物中で調製できる。この治療組成物は静脈内または鼻もしくは肺経由で、好ましくは液体または粉末エアゾール（凍結乾燥された）として投与できる。この組成物は所望により非経口または皮下投与してもよい。全身投与時、この治療組成物は、滅菌性で、発熱性物質を含まず、ｐＨ、等張性、および安定性に関して非経口的に許容可能な溶液中にあるべきである。これらの条件は当業者に知られている。簡単に述べると、本明細書記載の化合物の投薬製剤は、製薬上許容可能な担体、賦形剤、または安定剤と所望の純度を有する化合物とを混合することにより、保存または投与用に調製される。かかる材料は使用投与量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、緩衝液（トリスＨＣｌ、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩および他の有機酸塩など）；酸化防止剤（アスコルビン酸など）；低分子量（約１０残基未満）ペプチド（ポリアルギニンなど）、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど）；親水性ポリマー（ポリビニルピロリジノンなど）；アミノ酸（グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニンなど）；単糖類、二糖類、および他の炭水化物（セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（ＥＤＴＡなど）；糖類アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）；対イオン（ナトリウムなど）ならびに／または非イオン性界面活性剤（ＴＷＥＥＮ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳまたはポリエチレングリコールなど）を含む。
【０２８５】
注射用の滅菌組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｅｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（２００３））に記載されているような従来の製薬学的実践に従い製剤化できる。例えば、製薬上許容可能な担体（水、または胡麻油、落花生油、もしくは綿実油のような天然植物油、またはオレイン酸エチルのような合成脂肪ビヒクルなど）への活性化合物の溶解または懸濁が所望され得る。承認されている製薬学的実践に従い緩衝液、防腐剤、酸化防止剤などを組み入れることができる。
【０２８６】
徐放調製物の適切な例としては、ポリペプチドを含む固形疎水性ポリマーの半透性基質が挙げられ、これらの基質は造形品、フィルムまたはマイクロカプセル状である。徐放基質の例としては、Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ．，（１９８１） １５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ． Ｔｅｃｈ．，（１９８２） １２：９８−１０５により記載されているようなポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、欧州特許第５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー類（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，（１９８３） ２２：５４７−５５６）、非分解性エチレン−酢酸ビニル（前記Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー類（ＬＵＰＲＯＮ Ｄｅｐｏｔ（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフィア）など）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）が挙げられる。
【０２８７】
ポリマー（エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸など）が分子を１００日間に渡って放出し得るのに対し、特定のヒドロゲルはより短期間でタンパク質を放出する。体内に被包性タンパク質が長時間残る場合、それらは３７℃で湿気に曝露した結果、変性または凝集し、生物活性を喪失して免疫原性を変化させる可能性がある。タンパク質安定化のための合理的な戦略は、関与する機序に応じて考案できる。例えば、凝集機序がジスルフィド相互変換を介した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが見出された場合、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、含湿量の管理、適切な添加剤の使用、および特異性ポリマーマトリックス組成物の生成により安定化し得る。
【０２８８】
徐放組成物としては、懸濁液中の結晶を維持できる適切な製剤中で懸濁した抗体結晶の調製物も挙げられる。これらの調製物は皮下注射または腹腔内注射時に徐放効果をもたらし得る。他の組成物としては、リポソームに封入された抗体も挙げられる。かかる抗体を含むリポソームは基本的に既知の方法：ドイツ特許第３，２１８，１２１号；Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９８５） ８２：３６８８−３６９２；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９８０） ７７：４０３０−４０３４；欧州特許第５２，３２２号；欧州特許第３６，６７６号；欧州特許第８８，０４６号；欧州特許第１４３，９４９号；同第１４２，６４１号；日本特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号；ならびに欧州特許第１０２，３２４号により調製される。
【０２８９】
患者に投与される抗体製剤の投与量は、薬物作用を変更することが知られている各種要素（疾患の重症度および種類、体重、性別、食事、投与時間および投与経路、他剤ならびに他の関連ある臨床的要素を含む）を考慮して主治医により決定される。治療有効量はインビトロまたはインビボ方法のいずれかにより決定してよい。
【０２９０】
本明細書に記載の、治療上用いられる抗体の有効量は、例えば、治療目的、投与経路、および患者の症状に応じて変わる。従って、最適治療効果を得る上で必要とされるように療法士が投与量を滴定して投与経路を変更することが好ましい。典型的な１日投与量は患者の体重あたり約０．０００１ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇから最大１００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ、１００００ｍｇ／ｋｇ以上までの範囲でよく、上述した要素に応じて変わる。投与量は患者の体重あたり０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜２ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．２５ｍｇ／ｋｇまたは０．０１〜０．１０ｍｇ／ｋｇでよく、上述の要素に応じて変わる。典型的には、臨床医は投与量が所望の効果に達するまで治療抗体を投与する。この療法の進行は従来のアッセイにより、または本明細書記載のように容易にモニタリングされる。
【０２９１】
本発明の抗体の投与は反復してよく、この投与は少なくとも１日間、２日間、３日間、５日間、１０日間、１５日間、３０日間、４５日間、２ヶ月間、７５日間、３ヶ月間、または少なくとも６ヶ月間の間隔でよい。
【０２９２】
本明細書の組成物および方法による治療実体は、改善された移動、送達、忍容性などを得るために製剤に組み込まれた適切な担体、賦形剤、および他の薬剤と併用投与されることが理解されるであろう。これらの製剤としては、例えば、粉末剤、泥膏、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、小胞（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）など）を含む脂質（陽イオン性または陰イオン性）、ＤＮＡ結合体、無水吸収泥膏、水中油型および油中水型エマルション、エマルションカーボワックス（各種分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカーボワックスを含む半固体混合物が挙げられる。上記の混合物はいずれも、製剤中の活性成分が製剤によって不活性化されず、製剤が生理的に適合して投与経路に忍容である場合、本発明による治療および療法に適し得る。Ｂａｌｄｒｉｃｋ Ｐ． “Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ： ｔｈｅ ｎｅｅｄ ｆｏｒ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｇｕｉｄａｎｃｅ．” Ｒｅｇｕｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３２（２）：２１０−８（２０００），Ｗａｎｇ Ｗ． “Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．” Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． ２０３（１−２）：１−６０（２０００），Ｃｈａｒｍａｎ ＷＮ “Ｌｉｐｉｄｓ，ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ ｏｒａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ−ｓｏｍｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｃｏｎｃｅｐｔｓ．” Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ．８９（８）：９６７−７８（２０００），Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ． “Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ” ＰＤＡ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ． ５２：２３８−３１１（１９９８）ならびにそれらに引用されている製薬学的化学者によく知られている製剤、賦形剤および担体と関連する付加的情報も参照されたい。
【０２９３】
他の治療の設計および産生
本発明により、および本明細書でＤＬＬ４に関して生成され特性化された抗体の活性に基づき、抗体部分以外に他の治療様式の設計が容易になる。かかる様式は、高度抗体治療（２重特異性抗体、免疫毒素、および放射性標識化治療など）、単領域抗体、抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはｄＡｂなど）、ペプチド治療の産生、新規足場中のＤＬＬ４結合領域、遺伝子療法、特に細胞内抗体、アンチセンス治療、および低分子を含むがそれらに限定されない。
【０２９４】
抗原結合部位は、非抗体足場タンパク質（フィブロネクチンまたはシトクロムＢなど）上のＣＤＲ配列を用いて（Ｈａａｎ ＆ Ｍａｇｇｏｓ（２００４） ＢｉｏＣｅｎｔｕｒｙ，１２（５）： Ａ１−Ａ６；Ｋｏｉｄｅ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２８４： １１４１−１１５１；Ｎｙｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，７： ４６３−４６９）、または足場タンパク質内ループのアミノ酸残基を無作為化または変化して所望の標的に対する結合特異性を付与することによって提供し得る。タンパク質の新規結合部位の遺伝子工学のための足場はＮｙｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ． （Ｎｙｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，７： ４６３−４６９）により詳細に概説されている。抗体模倣体の足場タンパク質は参照により本明細書にその全体が組み込まれる国際公開第００３４７８４号に開示されており、この発明者らは少なくとも１つの無作為化ループを有するフィブロネクチンタイプＩＩＩ領域を含むタンパク質（抗体模倣体）について述べている。免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの任意の領域メンバーにより、１つまたは複数のＣＤＲ（例えば一群のＨＣＤＲ）を移植する適切な足場を提供し得る。この足場はヒトまたは非ヒトタンパク質でよい。非抗体足場タンパク質の長所は少なくともいくつかの抗体分子よりも製造する上でより小さなおよび／またはより容易な分子足場における抗原結合部位を提供してよい。小サイズの結合メンバーは有用な生理的特性（細胞に入る、組織内に深く浸透する、または他の構造内の標的に到達する、または標的抗原のタンパク質腔内で結合する能力など）を付与し得る。非抗体足場タンパク質内の抗原結合部位の使用についてはＷｅｓｓ，２００４（Ｗｅｓｓ，Ｌ． Ｉｎ： ＢｉｏＣｅｎｔｕｒｙ，Ｔｈｅ Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ ＢｉｏＢｕｓｉｎｅｓｓ，１２（４２），Ａ１−Ａ７，２００４）で概説されている。典型的なものは、安定した骨格および１つもしくは複数の可変ループを有するタンパク質であり、その中でこのループ（１つまたは複数）のアミノ酸配列は具体的にまたは無作為に変異して標的抗原と結合する抗原結合部位を形成する。かかるタンパク質としては、黄色ブドウ球菌、トランスフェリン、アルブミン、テトラネクチン、フィブロネクチン（例えば１０番目のフィブロネクチンタイプＩＩＩ領域）、リポカリンならびにγ−クリスタリンおよび他のＡｆｆｉｌｉｎ（商標）足場（Ｓｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）由来のプロテインＡのＩｇＧ結合領域が挙げられる。他のアプローチの例としては、分子内ジスルフィド結合を有するサイクロチド−小タンパク質に基づく合成「マイクロ体」、マイクロタンパク質（Ｖｅｒｓａｂｏｄｉｅｓ（商標）、Ａｍｕｎｉｘ）およびアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ）が挙げられる。
【０２９５】
抗体配列および／もしくは抗原結合部位に加えて、本発明による標的結合剤は、他のアミノ酸、例えばペプチドもしくはポリペプチド形態、折りたたまれた領域などを含み得、または抗原結合能に加えて分子の別の機能的特性を与え得る。本発明の標的結合剤は検出可能な標識を有してよく、あるいは、毒素または標的部分または酵素に結合してもよい（例えばペプチジル結合またはリンカーを介す）。例えば、標的結合剤は触媒作用部位（例えば酵素領域内）ならびに抗原結合部位（抗原に結合する抗原結合部位）を含み得、それにより触媒作用部位は抗原を標的とし得る。この触媒作用部位は抗原の生物学的機能を、例えば切断により阻害し得る。
【０２９６】
高度抗体治療薬の産生に関連して、補体結合は所望の特性であり、例えば、２重特異性抗体、免疫毒素、または放射線標識の使用を介した細胞死のための補体依存を回避することが可能であり得る。
【０２９７】
例えば、（ｉ）一方はＤＬＬ４に対して特異性を有し、他方は互いに結合している二番目の分子に対して特異性を有する２つの抗体、（ｉｉ）ＤＬＬ４に対して特異的である一鎖と第二分子に対して特異的である第二鎖を有する単抗体、または（ｉｉｉ）ＤＬＬ４および他の分子に対して特異性を有する単鎖抗体、を含む２重特異性抗体を産生できる。かかる２重特異性抗体は、例えば、（ｉ）および（ｉｉ）に関連して（例えば、Ｆａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４：７２−８１（１９９４）および前記Ｗｒｉｇｈｔ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓを参照されたい）、および（ｉｉｉ）に関連して（例えば、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ（Ｓｕｐｐｌ．） ７：５１−５２（１９９２）を参照されたい）よく知られている技術を用いて産生できる。各例において、第二の特異性はＣＤ１６またはＣＤ６４（例えば、Ｄｅｏ ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １８：１２７（１９９７）を参照されたい）またはＣＤ８９（例えば、Ｖａｌｅｒｉｕｓ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ ９０：４４８５−４４９２（１９９７）を参照されたい）を含むがそれらに限定されない重鎖活性化受容体に生成できる。
【０２９８】
抗体は、当該技術分野においてよく知られている技術を利用して、免疫毒素として作用するように修飾もできる。例えば、Ｖｉｔｅｔｔａ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １４：２５２（１９９３）を参照されたい。米国特許第５，１９４，５９４号も参照されたい。放射性標識化抗体の調製に関連して、かかる修飾抗体は当該技術分野においてよく知られている技術を利用しても容易に調製できる。例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６５５−６８６（２ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｆｎｅｒ ａｎｄ Ｌｏｎｇｏ，ｅｄｓ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｒａｖｅｎ（１９９６））を参照されたい。米国特許第４，６８１，５８１号、同第４，７３５，２１０号、同第５，１０１，８２７号、同第５，１０２，９９０号（ＲＥ３５，５００）、同第５，６４８，４７１号、および同第５，６９７，９０２号も参照されたい。各免疫毒素または放射性標識化分子は、所望の多重結合酵素サブユニットオリゴマー化領域を発現する細胞を殺す可能性がある。
【０２９９】
抗体が薬剤（例えば、放射性同位体、医薬品組成物、または毒素）と結合される時、この薬剤は、抗分裂剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗血管新生剤、アポトーシス剤、アルカロイド剤、ＣＯＸ−２剤、および抗生剤ならびにそれらの組み合わせの群から選択される製薬学的特性を保有すると意図される。薬剤はナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素、トリアゼン、葉酸類似体、アントラサイクリン、タキサン、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、代謝拮抗物質、抗生物質、酵素、エピポドフィロトキシン、白金配位錯体、ビンカアルカロイド、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、アンタゴニスト、エンドスタチン、タキソール、カンプトテシン、オキサリプラチン、ドキソルビシンおよびそれらの類似体、ならびにそれらの組み合わせの群から選択できる。
【０３００】
毒素の例としてはさらに、ゲロニン、緑膿菌外毒素（ＰＥ）、ＰＥ４０、ＰＥ３８、ジフテリア毒素、リシン、アブリン、α毒素、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、緑膿菌内毒素、分子のエンジインファミリーメンバー（カリケアマイシンおよびエスペラマイシンなど）、ならびにそれらの誘導体、組み合わせおよび修飾が挙げられる。化学的毒素はデュオカルマイシン（例えば、米国特許第５，７０３，０８０号および米国特許第４，９２３，９９０号を参照されたい）、メトトレキサート、ドキソルビシン、メルファラン、クロラムブシル、ＡＲＡ−Ｃ、ビンデシン、マイトマイシンＣ、シスプラチン（ｃｉｓ−ｐｌａｔｉｎｕｍ）、エトポシド、ブレオマイシンおよび５−フルオロウラシルからなる群から選択することもできる。化学治療薬の例としては、アドリアマイシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、チオテパ、タキソテール（ドセタキセル）、ブスルファン、シトキシン（Ｃｙｔｏｘｉｎ）、タキソール、メトトレキサート、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン（米国特許第４，６７５，１８７号を参照されたい）、メルファラン、および他の関連ナイトロジェンマスタードも挙げられる。適切な毒素および化学治療薬がＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ Ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． １９９５）およびＧｏｏｄｍａｎ Ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，７ｔｈ Ｅｄ．（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． １９８５）に記載されている。他の適切な毒素および／または化学治療薬は当業者に知られている。
【０３０１】
放射性同位体の例としては、局在化および／または療法に使用できるγ−放射体、陽電子放射体、およびＸ線放射体、ならびに療法に使用できるβ−放射体およびα−放射体が挙げられる。診断、予後および病期分類に有用として先に記載されている放射性同位体は、治療にも有用である。
【０３０２】
抗ガン剤または抗白血病剤の非限定的な例としては、アントラサイクリン、例えばドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、イダルビシン、デトルビシン、カルミノマイシン、エピルビシン、エソルビシン、およびモルホリノならびにそれらの置換誘導体、組み合わせおよび修飾が挙げられる。代表的な医薬品としては、シスプラチン、タキソール、カリケアマイシン、ビンクリスチン、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、プレドニゾン、ダウノルビシン、イダルビシン、フルダラビン、クロラムブシル、インターフェロンα、ヒドロキシ尿素、テモゾロミド、サリドマイド、およびブレオマイシン、ならびにそれらの誘導体、組み合わせおよび修飾が挙げられる。好ましくは、抗ガン剤または抗白血病剤はドキソルビシン、モルホリノドキソルビシン、またはモルホリノダウノルビシンである。
【０３０３】
本発明の抗体は、哺乳動物（好ましくはヒト）における半減期（例えば、血清半減期）が非修飾抗体の半減期より長期化した抗体も包含する。前記抗体の半減期は約１５日間超、約２０日間超、約２５日間超、約３０日間超、約３５日間超、約４０日間超、約４５日間超、約２ヶ月超、約３ヶ月超、約４ヶ月超、または約５ヶ月超でよい。哺乳動物（好ましくはヒト）における本発明の抗体またはその断片の長期化した半減期により、哺乳動物における前記抗体もしくは抗体断片のより高い血清力価に至り、それにより、前記抗体もしくは抗体断片の投与頻度を減らすおよび／または投与する前記抗体もしくは抗体断片の濃度を減少させる。長期化したインビボ半減期を有する抗体またはその断片は当業者に知られている技術により産生できる。例えば、長期化したインビボ半減期を有する抗体またはその断片は、Ｆｃ領域とＦｃＲｎ受容体間の相互作用に関わると同定されたアミノ酸残基を修飾（例えば、置換、欠失または付加）して産生できる（例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる国際公開ＷＯ９７／３４６３１号およびＷＯ０２／０６０９１９号を参照されたい）。前記抗体または抗体断片ポリマー分子（高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）に結合することにより長期化したインビボ半減期を有する抗体またはその断片を産生できる。ＰＥＧは、前記抗体もしくは抗体断片のＮもしくはＣ末端に対するＰＥＧの部位特異性接合またはリシン残基上に存在するイプシロン−アミノ基のいずれかを介した多機能リンカーを伴いまたは伴わず、前記抗体または抗体断片に結合できる。生物活性の喪失が最小限に抑えられる線形または分枝ポリマー誘導体化が使用される。この接合度はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析により密接にモニタリングされ、抗体に対するＰＥＧ分子の適切な接合を確実にする。無反応のＰＥＧは、例えば、サイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーにより抗体−ＰＥＧ結合体から分離できる。
【０３０４】
当業者に理解されるであろうとおり、上の実施形態において、親和性値は重要であるが、この抗体の特定の機能によって他の要素も同様にまたはより重要であり得る。例えば、免疫毒素（抗体関連毒素）において、この抗体の標的に対する結合作用は有用であり得る；しかしながら、いくつかの実施形態において、所望の最終結果はこの毒素の細胞内への内部移行である。従って、高い内部移行パーセントを有する抗体がこれらの状況において所望され得る。従って、一実施形態において、内部移行の高効率を伴う抗体が意図される。内部移行の高効率は内部抗体パーセントとして測定でき、低値から１００％までであり得る。例えば、様々な実施形態において、０．１〜５、５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜９９、および９９〜１００％が高効率であり得る。当業者に理解されるであろうとおり、所望の効率は、異なる実施形態において、例えば、関連剤、部位に投与できる抗体量、抗体−薬剤複合体の副作用、治療されるべき問題の種類（例えば、ガンの種類）および重症度によって異なり得る。
【０３０５】
他の実施形態において、本明細書に開示される抗体は、ＤＬＬ４発現変化と関連する疾患または障害をスクリーニングするために哺乳動物組織または細胞におけるＤＬＬ４発現の検出アッセイキットを提供する。このキットは、ＤＬＬ４と結合する抗体、および存在する場合、抗体抗原反応を示す手段を含む。
【０３０６】
併用
本明細書に定義した標的結合剤または抗体は単独療法として適用してもよいし、本発明の化合物に加えて、従来の外科手術または放射線療法または化学療法に関わってもよい。かかる化学療法としては、１種またはそれ以上の以下の種類の抗腫瘍剤を挙げ得る：
（ｉ）内科的腫瘍学において使用される、アルキル化剤（例えばシスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、テモゾロミドおよびニトロソ尿素）；代謝拮抗物質（例えばゲムシタビンおよび葉酸拮抗剤（５−フルオロウラシルおよびテガフルのようなフルオロピリミジンなど）、ラルチトレキセド、メトトレキサート、シトシンアラビノシド、およびヒドロキシ尿素）；抗腫瘍抗生物質（例えばアドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン−Ｃ、ダクチノマイシンおよびミトラマイシンのようなアントラサイクリン）；抗分裂剤（例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビンのようなビンカアルカロイドならびにタキソールおよびタキソテールのようなタキソイドならびにポロキナーゼ阻害剤）；ならびにトポイソメラーゼ阻害剤（例えばエトポシドおよびテニポシドのようなエピポドフィロトキシン、アムサクリン、トポテカンならびにカンプトテシン）のような他の抗増殖性／抗新生物剤およびそれらの組み合わせ；
（ｉｉ）抗エストロゲン剤（例えばタモキシフェン、フルベストラント、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェンおよびヨードキシフェン）、抗アンドロゲン剤（例えばビカルタミド、フルタミド、ニルタミドおよび酢酸シプロテロン）、ＬＨＲＨアンタゴニストもしくはＬＨＲＨアゴニスト（例えばゴセレリン、リュープロレリンおよびブセレリン）、プロゲストゲン（例えば酢酸メゲストロール）、アロマターゼ阻害剤（例えばアナストロゾール、レトロゾール、ボラゾールおよびエキセメスタンとして）ならびにフィナステリドなどの５α−還元酵素阻害剤のような細胞増殖抑制剤；
（ｉｉｉ）抗浸潤剤（例えば４−（６−クロロ−２，３−メチレンジオキシアニリノ）−７−［２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エトキシ］−５−テトラヒドロピラン−４−イルオキシキナゾリン（ＡＺＤ０５３０；国際公開ＷＯ０１／９４３４１号）およびＮ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−｛６−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］−２−メチルピリミジン−４−イルアミノ｝チアゾール−５−カルボキサミド（ダサチニブ、ＢＭＳ−３５４８２５；Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ，２００４，４７，６６５８−６６６１）のようなｃ−Ｓｒｃキナーゼファミリー阻害剤、ならびにマリマスタットのようなメタロプロテナーゼ阻害剤、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体機能阻害剤または、カテプシン阻害剤、セリンプロテアーゼ阻害剤、例えばマトリプターゼ、ヘプシン、ウロキナーゼ、ヘパラナーゼ阻害剤）；
（ｉｖ）細胞傷害性剤（フルダラビン、２−クロロデオキシアデノシン、クロラムブシルまたはドキソルビシンなど）およびそれらの組み合わせ（フルダラビン＋シクロホスファミド、ＣＶＰ：シクロホスファミド＋ビンクリスチン＋プレドニゾン、ＡＣＶＢＰ：ドキソルビシン＋シクロホスファミド＋ビンデシン＋ブレオマイシン＋プレドニゾン、ＣＨＯＰ：シクロホスファミド＋ドキソルビシン＋ビンクリスチン＋プレドニゾン、ＣＮＯＰ：シクロホスファミド＋ミトキサントロン＋ビンクリスチン＋プレドニゾン、ｍ−ＢＡＣＯＤ：メトトレキサート＋ブレオマイシン＋ドキソルビシン＋シクロホスファミド＋ビンクリスチン＋デキサメタゾン＋ロイコボリン、ＭＡＣＯＰ−Ｂ：メトトレキサート＋ドキソルビシン＋シクロホスファミド＋ビンクリスチン＋プレドニゾン固定用量＋ブレオマイシン＋ロイコボリン、またはＰｒｏＭＡＣＥ ＣｙｔａＢＯＭ：プレドニゾン＋ドキソルビシン＋シクロホスファミド＋エトポシド＋シタラビン＋ブレオマイシン＋ビンクリスチン＋メトトレキサート＋ロイコボリンなど）。
【０３０７】
（ｖ）成長因子機能の阻害剤、例えばかかる阻害剤としては、成長因子抗体および成長因子受容体抗体（例えば抗ｅｒｂＢ２抗体トラスツズマブ［ハーセプチン（商標）］、抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブ、抗ｅｒｂＢ１抗体セツキシマブ［アービタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、Ｃ２２５］およびＳｔｅｒｎ ｅｔ ａｌ． Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ／ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２００５，Ｖｏｌ． ５４，ｐｐ１１−２９により開示された任意の成長因子または成長因子受容体抗体）が挙げられ、かかる阻害剤としては、チロシンキナーゼ阻害剤、例えば上皮成長因子ファミリー阻害剤（例えばＮ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシ−６−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン（ゲフィチニブ、ＺＤ１８３９）、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６,７−ビス（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−４−アミン（エルロチニブ、ＯＳＩ−７７４）および６−アクリルアミド−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−（３−モルホリノプロポキシ）−キナゾリン−４−アミン（ＣＩ１０３３）のようなＥＧＦＲファミリーのチロシンキナーゼ阻害剤）、ｅｒｂＢ２チロシンキナーゼ阻害剤（ラパチニブなど）、肝細胞成長因子ファミリー阻害剤、血小板由来成長因子ファミリー阻害剤（イマチニブなど）、セリン／トレオニンキナーゼ阻害剤（例えばＲａｓ／Ｒａｆシグナル伝達阻害剤（ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、例えばソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６）など）、ＭＥＫおよび／またはＡＫＴキナーゼを介した細胞シグナル伝達阻害剤、肝細胞成長因子ファミリー阻害剤、ｃ−キット阻害剤、ａｂｌキナーゼ阻害剤、ＩＧＦ受容体（インスリン様成長因子）キナーゼ阻害剤、オーロラキナーゼ阻害剤（例えばＡＺＤ１１５２、ＰＨ７３９３５８、ＶＸ−６８０、ＭＬＮ８０５４、Ｒ７６３、ＭＰ２３５、ＭＰ５２９、ＶＸ−５２８およびＡＸ３９４５９）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤（ＣＤＫ２および／またはＣＤＫ４阻害剤など）、ならびに生存シグナル伝達タンパク質阻害剤（Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ例えばＡＢＴ−７３７など）も挙げられる；
（ｖｉ）血管内皮成長因子の効果を阻害するもののような抗血管新生薬［例えば抗血管内皮細胞成長因子抗体ベバシズマブ（アバスチン（商標））、アンジオポイエチン−２阻害剤、およびＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤、例えば４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−（１−メチルピペリジン−４−イルメトキシ）キナゾリン（ＺＤ６４７４；ＷＯ０１／３２６５１号内の実施例２）、４−（４−フルオロ−２−メチルインドール−５−イルオキシ）−６−メトキシ−７−（３−ピロリジン−１−イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ２１７１；ＷＯ００／４７２１２号内の実施例２４０）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７；ＷＯ９８／３５９８５号）およびＳＵ１１２４８（スニチニブ；ＷＯ０１／６０８１４号、スーテント（Ｓｕｔｅｎｔ）（商標））、ソラフェニブ（ネクサバール（Ｎｅｘｘａｖａｒ）（商標））、国際公開ＷＯ９７／２２５９６号、ＷＯ９７／３００３５号、ＷＯ９７／３２８５６号、ＷＯ９８／１３３５４号、ＷＯ００／４７２１２号およびＷＯ０１／３２６５１号に開示されている化合物ならびに他の機序によって働く化合物（例えばリノマイド、インテグリンαｖβ３機能阻害剤およびアンジオスタチン）］またはコロニー刺激因子１（ＣＳＦ１）またはＣＳＦ１受容体；
（ｖｉｉ）コンブレタスタチンＡ４および国際公開ＷＯ９９／０２１６６号、ＷＯ００／４０５２９号、ＷＯ００／４１６６９号、ＷＯ０１／９２２２４号、ＷＯ０２／０４４３４号およびＷＯ０２／０８２１３号に開示されている化合物のような血管傷害性薬剤；
（ｖｉｉｉ）アンチセンス療法（例えば、Ｇ−３１３９（ゲナセンス（Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ））、抗ｂｃｌ２アンチセンスなどの上に列挙する標的を指向するもの）；
（ｉｘ）例えば異常ｐ５３または異常ＢＲＣＡ１もしくはＢＲＣＡ２のような異常遺伝子の置換アプローチ、シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼもしくは細菌性ニトロ還元酵素を用いるもののようなＧＤＥＰＴ（遺伝子指向型酵素プロドラッグ療法）アプローチ、ならびに多剤耐性遺伝子療法のような化学療法もしくは放射線療法に対する患者の忍容性を高めるアプローチを含む遺伝子療法アプローチ；ならびに
（ｘ）例えばアレムツズマブ（キャンパス（ｃａｍｐａｔｈ）−１Ｈ（商標））による治療、ＣＤ５２指向のモノクローナル抗体、またはＣＤ２２指向の抗体による治療、サイトカイン（インターロイキン２、インターロイキン４または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子など）を用いるトランスフェクションのような患者の腫瘍細胞の免疫原性を高めるための生体外およびインビボアプローチ、Ｔ細胞アネルギーを減少させるアプローチ（ＣＴＬＡ−４機能を阻害するモノクローナル抗体治療など）、サイトカイントランスフェクト樹状細胞のようなトランスフェクト免疫細胞を用いるアプローチ、サイトカイントランスフェクト腫瘍細胞系を用いるアプローチおよび抗イディオタイプ抗体を用いるアプローチを含む免疫療法アプローチ。
【０３０８】
（ｘｉ）ベルケード（ボルテゾミブ）などのプロテアソーム阻害剤のようなタンパク質分解阻害剤。
【０３０９】
（ｘｉｉ）例えば、受容体リガンドの隔離、受容体結合リガンドの阻止または受容体シグナル伝達の減少（例えば増大した受容体分解または減少した発現値による）のいずれかを行うペプチドまたはタンパク質（抗体または溶解性外受容体領域構造など）を用いる生物治療学的治療アプローチ。
【０３１０】
一実施形態において、本明細書に定義した抗腫瘍治療は、本発明の化合物に加えて、内科的腫瘍学において使用される他の抗増殖性／抗新生物薬およびそれらの組み合わせによる治療（アルキル化剤（例えばシスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、テモゾロミドおよびニトロソ尿素）；代謝拮抗物質（例えばゲムシタビンおよび葉酸拮抗剤（５−フルオロウラシルおよびテガフルのようなフルオロピリミジン、ラルチトレキセド、メトトレキサート、シトシンアラビノシド、およびヒドロキシ尿素など）；抗腫瘍抗生物質（例えばアドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン−Ｃ、ダクチノマイシンおよびミトラマイシンのようなアントラサイクリン）；抗分裂剤（例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビンのようなビンカアルカロイドならびにタキソールおよびタキソテールのようなタキソイドならびにポロキナーゼ阻害剤）；ならびにトポイソメラーゼ阻害剤（例えばエトポシドおよびテニポシドのようなエピポドフィロトキシン、アムサクリン、トポテカンならびにカンプトテシン）など）を含んでよい。
【０３１１】
一実施形態において、本明細書に定義した抗腫瘍治療は、本発明の化合物に加えて、ゲムシタビンによる治療を含み得る。
【０３１２】
かかる併用治療（ｃｏｎｊｏｉｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）は、治療の個々の成分の同時、逐次または分割投与方法によりなし遂げ得る。産生物のかかる組み合わせは、本明細書に上記した投与量範囲の本発明の化合物、または製薬上許容可能なその塩、ならびに承認された投与量範囲の他の製薬的活性剤を使用する。
【実施例】
【０３１３】
下記の実施例（実施した実験および達した結果を含む）は例証的な目的のみで提供しており、本明細書の教示を制限する意図はない。
【実施例１】
【０３１４】
免疫化および力価測定（ｔｉｔｅｒｉｎｇ）
免疫原
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において一過的に発現させたヒトＤＬＬ４の細胞外領域（アミノ酸１〜５２４）および組換えヒトＤＬＬ４を免疫化のための抗原として使用した。ＣＨＯトランスフェクタントの生成のために、ヒト完全長ＤＬＬ４−ｃＤＮＡ（Ｙｏｎｅｙａ ｅｔ ａｌ.,２００１,Ｊ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.,１２９,２７−３４）をｐｃＤＮＡ３．１ベクターに挿入し、ＣＨＯ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ,カタログ#ＣＣＬ−６１）にリポフェクトした。免疫化の目的に適した量の細胞表面におけるヒトＤＬＬ４の発現を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）解析によって確認した。ヒトＤＬＬ４の細胞外領域を、順方向５’−ＡＡＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＧＣＧＡＡＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＣＣＧＧＡＧプライマーおよび逆方向５’−ＣＡＧＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＡＧＧＧＧＡＡＧＣＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣプライマーを使用して完全長ＤＬＬ４からサブクローニングした。ＰＣＲ産物を精製し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐＳｅｃＴａｇ発現ベクターに連結した。その後、２９３ｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬を使用して、このクローンを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。７日後、標的タンパク質を含む細胞上清を回収し、前もって平衡化したＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ,カタログ#１７−５２４７）に一晩通した。このカラムを２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウムおよび５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４を含む結合バッファーを用いて洗浄し、ｈｉｓタグタンパク質を２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウムおよび５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４を含む緩衝液で溶出した。このタンパク質試料を４℃で１時間、結合バッファーで透析し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で２時間さらに透析し、その後濾過滅菌、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる定量化および純度評価、続いてＧｅｌｃｏｄｅ（Ｐｉｅｒｃｅ,カタログ#２４９５０）を用いた染色を行った。
【０３１５】
免疫化
実施例１に記載したようなＤＬＬ４の細胞外領域または組換えヒトＤＬＬ４を過剰発現するＣＨＯ細胞のいずれかを用いて、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ系統：ＸＭＧ２（ＩｇＧ２κ／λ）およびＸＭＧ４（ＩｇＧ４κ／λ）Ａｍｇｅｎ,Ｉｎｃ.Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ,Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ,Ｃａｎａｄａ）マウスを連続して免疫することによって、ＤＬＬ４に対するモノクローナル抗体を作製した。全ての注入において、従来法を用いて腹腔内経路および尾根部経路により、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ動物を免疫した。アジュバントには、Ｔｉｔｅｒｍａｘ Ｇｏｌｄ（商標）（Ｓｉｇｍａ,カタログ#Ｔ２６８４）、リン酸アルミニウムゲルアジュバント、ＨＣＬバイオセクター（カタログ#１４５２−２５０）およびＩｍｍｕｎｅＥａｓｙマウスアジュバント（ｑＣｐＧ,Ｑｉａｇｅｎ カタログ#３０３１０５）が含まれる。可溶性免疫原に関して、１０μｇのＤＬＬ４細胞外領域の第１の注入をＴｉｔｅｒｍａｘ Ｇｏｌｄ（商標）（０日）を用いて行い、５μｇのＤＬＬ４細胞外領域と共に、リン酸アルミニウムゲルアジュバントおよびｑＣｐＧまたはリン酸アルミニウムゲルアジュバントおよびＴｉｔｒｅｍａｘ Ｇｏｌｄ（商標）のいずれかを使用して、代替追加免疫を行った。細胞ベースの免疫原に関して、リン酸アルミニウムゲルアジュバントおよび２Ｅ６細胞を用いて第１の注射を行った。次の追加免疫の間に、１Ｅ６細胞を同じアジュバントを使用して投与した。両方の免疫キャンペーンに対して、追加免疫は２、６、１０、１６、２３、３０、３７、４４、５０、６４、７１、７５、８９、１０４および１０８日目に行った。
【０３１６】
力価による回収のための動物選択
蛍光微量アッセイ技術（ＦＬＵＯＲＯＭＥＴＲＩＣ ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ ａｓｓａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＦＭＡＴ））細胞検出装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、２９３Ｔ細胞内で発現させたヒトおよびマウスＤＬＬ４への結合に関して、ヒトＤＬＬ４に対する抗体の力価を検査した。この解析は、ＤＬＬ４に特異的であると思われる、力価を有するマウスがいることを示した。従って、以下の実施例２に記載したように、免疫化プログラムの終わりに、１７匹のマウスを回収するために選択し、免疫化マウスの脾臓およびリンパ節からリンパ球を単離した。
【実施例２】
【０３１７】
リンパ球の回収、Ｂ細胞単離、ハイブリドーマの融合および作製
免疫化マウスを頸椎脱臼によって屠殺し、各コホートから流入領域リンパ節を回収し貯蔵した。リンパ系細胞を、組織から細胞を遊離するためＤＭＥＭ中ですりつぶすことによって解離し、その細胞をＤＭＥＭに懸濁した。Ｂ細胞を、ＣＤ１９標識Ｄｙｎａｌ ｂｅａｄｓを使用してポジティブ選択によって濃縮した。上記の洗浄濃縮したＢ細胞とＡＴＣＣから購入した非分泌性骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（カタログ#ＣＲＬ１５８０）とを１：１の割合で混合することによって融合を行った（Ｋｅａｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ.,Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.１２３，１９７９，１５４８−１５５０）。細胞混合物を８００×ｇでの遠心分離により穏やかにペレット状にした。上清を完全に除去した後、この細胞をわずか２分間、２〜４ｍｌのプロナーゼ溶液（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ, カタログ＃５３７０２；ＰＢＳ中０．５ ｍｇ/ｍｌ）で処理した。その後、酵素活性を停止するために、３〜５ｍｌのＦＢＳを加え、この懸濁液に電子細胞融合溶液ＥＣＦＳ（０．３Ｍ  ショ糖、Ｓｉｇｍａ、カタログ#Ｓ７９０３、０．１ｍＭ  酢酸マグネシウム、Ｓｉｇｍａ、カタログ#Ｍ２５４５,０．１ｍＭ 酢酸カルシウム、Ｓｉｇｍａ、カタログ#Ｃ４７０５）を使用して、全体積を４０ｍｌに調整した。遠心後、上清を除去し、細胞を４０ｍｌのＥＣＦＳで再懸濁した。この洗浄ステップを繰り返し、２Ｅ６細胞/ｍｌの濃度になるように、この細胞を再びＥＣＦＳで再懸濁した。融合発生装置、モデルＥＣＭ２００１、ジェネトロニック社、サンディエゴ、カリフォルニアを使用して、電子−細胞融合を行った。使用した融合チャンバーサイズは２．０ｍｌで、以下の装置設定：整列条件：電圧：５０Ｖ、時間：５０秒；膜破壊：電圧：３０００Ｖ、時間：３０μ秒；融合後の滞留時間：３秒を使用した。ＥＣＦ後、滅菌条件下、細胞懸濁液を注意深く融合チャンバーから取り出し、同じ量のハイブリドーマ培地（２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ, カタログ#Ｇ２１５０）、１０Ｕ/ｍｌ ペニシリン/０．１ｍｇ/ｍｌ  ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ, カタログ#Ｐ７５３９）、１バイアル/Ｌ  ＯＰＩ（オキザロ酢酸、ピルビン酸、ウシインスリン；Ｓｉｇｍａカタログ#Ｏ５００３）および１０Ｕ/ｍｌ組換えヒトＩＬ−６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ, カタログ#１１３１５６７）を補充したＤＭＥＭ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ），１５％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ））を含む滅菌チューブに移した。この細胞を３７℃で１５〜３０分間インキュベートし、その後、５分間４００×ｇで遠心分離した。この細胞を少量のハイブリドーマ選択培地（０．５×ＨＡ（Ｓｉｇｍａ, カタログ#Ａ９６６６）を補充したハイブリドーマ培地）に穏やかに再懸濁し、５Ｅ６  Ｂ細胞を１ウェルあたり２００μｌで９６−ウェルプレートに最終的にプレーティングすることに基づき、その量をさらにハイブリドーマ選択培地で適切に調整した。この細胞を穏やかに混合し、９６−ウェルプレートにピペットで入れ、増殖させた。全ての上清を、抗ＤＬＬ４抗体を潜在的に産生する細胞から収集し、次に、以下に例示したようなスクリーニングアッセイを行った。
【実施例３】
【０３１８】
細胞に結合したヒトおよびカニクイザルＤＬＬ４ならびにヒトＪＡＧＧＥＤ１への結合
回収した細胞から収集した上清を検査し、完全長ヒトもしくはカニクイザルＤＬＬ４またはヒトＪａｇｇｅｄ１のいずれかを一過的に過剰発現する２９３Ｔ細胞への分泌性抗体の結合能を評価した。偽トランスフェクト２９３Ｔ細胞系をネガティブコントロールとして使用した。２％ＦＢＳを含むＰＢＳで希釈した細胞を、３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ, カタログ#３７１２）に１ウェルあたり３０００個の発現細胞および１５０００個の偽トランスフェクト細胞の密度で播種した。プレーティング後すぐに、１５または２０μｌ／ウェルのハイブリドーマ上清および１０μｌ／ウェルの二次抗体（ヤギの抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ Ｃｙ５、最終濃度７５０ｎｇ/ｍｌ）を加え、このプレートを室温で３時間インキュベートし、ＦＭＡＴ ８２００装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で蛍光を読み取った。２．８６μｇ/ｍｌから１：２で希釈したヒトＮｏｔｃｈ１／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ, カタログ#３６４７−ＴＫ）の結合をＤＬＬ４のポジティブコントロールとして使用し、１０μｇ/ｍｌから希釈したヒトＮｏｔｃｈ３／ＦｃキメラをＪａｇｇｅｄ１への結合のポジティブコントロールとして使用した。ヒト／カニクイザルＤＬＬ４およびヒトＪａｇｇｅｄへのハイブリドーマ上清の結合を示す１２のハイブリドーマ上清の結果を表３に示す。
【表３】
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【実施例４】
【０３１９】
Ｎｏｔｃｈ１−ＤＬＬ４受容体−リガンド結合の阻害
上清を含む抗体の相対力価を測定するために、２９３Ｔ細胞に一過的に過剰発現させたヒトＤＬＬ４へのヒトＮｏｔｃｈ１／Ｆｃの結合を阻害する能力を評価した。トランスフェクトしたならびにトランスフェクトしていない２３９Ｔ細胞を２％ＦＣＳを含むＰＢＳで再構成し、５０００のトランスフェクトした細胞および１７５００のトランスフェクトしていない細胞を３８４ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ,カタログ＃３７１２）のウェルに２０μｌの量で播種した。その後、２０μｌのハイブリドーマ上清を加え、４℃で１時間、プレートをインキュベートし、その時に２０μｌのＡｌｅｘａ−６４７標識ヒトＮｏｔｃｈ１／Ｆｃを最終濃度６．７ｎｇ/ｍｌで加えた。４℃で３時間さらにインキュベートした後、ＦＭＡＴ ８２００装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、各ウェルの蛍光を読み取ることによって、Ｎｏｔｃｈ１／Ｆｃの結合量を測定した。１２のハイブリドーマ上清の結果を表４に示す。結果を実施例２で記載した方法と同様の方法で調製した非ＤＬＬ４結合上清の効果によって測定したアッセイ中の最小阻害、および飽和濃度の非標識Ｎｏｔｃｈ１／Ｆｃが存在する中で得られるシグナルとして定義される最大阻害を用いて阻害％として表した。Ｎ.Ｔ.は未検査を表す。
【表４】
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【実施例５】
【０３２０】
抗ＤＬＬ４抗体の構造分析
この抗体の可変重鎖および可変軽鎖の配列を解析してそれらのＤＮＡ配列を決定した。抗ＤＬＬ４抗体の完全な配列情報を、各γおよびκ鎖の組み合わせについてヌクレオチドとアミノ酸配列を載せた配列表に提示する。この可変重鎖配列を分析してＶＨファミリー、Ｄ領域配列およびＪ領域配列を決定した。次いでこの配列を翻訳して一次アミノ酸配列を決定し、生殖系列ＶＨ、ＤおよびＪ領域配列と比較して体細胞超変異を評価した。
【０３２１】
表２は、抗体重鎖領域をそれらの同族生殖系列の重鎖領域と比較し、κ軽鎖領域をそれらの同族生殖系列の軽鎖領域と比較した表である。免疫グロブリン鎖の可変（Ｖ）領域は、多様な生殖系列のＤＮＡ断片によりコードされ、これはＢ細胞発生において機能的可変領域（ＶＨＤＪＨまたはＶＫＪＫ）に接合される。ＤＬＬ４に対する抗体反応の分子的多様性および遺伝子的多様性を詳細に研究した。
【０３２２】
特定の抗体がその各生殖系列配列とアミノ酸レベルで異なる場合、抗体配列を変異させて生殖系列配列に戻すことができることも理解されたい。かかる矯正変異は、標準分子生物学的技術を用いて、１、２、３もしくはそれ以上の位置、または任意の変異した位置の組み合わせで起こり得る。非限定的な例として、１８位のＶからＡへの変異（変異１）、３２位のＶからＡ（変異２）、５０位のＥからＤ（変異３）、６５位のＳからＮ（変異４）、８９位のＴからＡ（変異５）、および９４位のＬからＴ（変異６）により、対応する生殖系列配列と異なる２Ｈ１０の軽鎖配列（配列番号６）を表８に示す（表２参照）。従って、アミノ酸または２Ｈ１０軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、任意の部位またはあらゆる部位を修飾することができる。２Ｈ１０、９Ｇ８、２１Ｈ３、および４Ｂ４の生殖系列のかかるバリエーションの位置を表２〜９に例証する。各行は太字で指定の位置の生殖系列および非生殖系列残基の固有の組み合わせを表す。
【０３２３】
別の実施形態において、本発明は、本発明の抗体の異質性に影響を及ぼし得る配列における任意の構造的障害の置換を含む。かかる障害としては、グリコシル化部位、不対システイン、表面曝露メチオニンなどが挙げられる。かかる異質性リスクを減らすために、１つまたは複数のかかる構造的障害を除去するように変化させることが提唱される。
【０３２４】
一例では、不対システインは単独でまたは他の構造的変化と接合して置換することができる。不対システインの例は、抗体２Ｈ１０または９Ｇ８の３３位の軽鎖ＣＤＲ１に発現する。この不対システインを、類似した側鎖特性を有する適切なアミノ酸（セリンなど）に変異させることができる。別の例では、不対システインは抗体２０Ｇ８の２０３位の重鎖ＦＲ４に発現する。この不対システインも同様に、類似した側鎖特性を有する適切なアミノ酸（セリンなど）に変異させることができる。
【表５】
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【０３２５】
本発明のいくつかの実施形態において、この標的結合剤または抗体は、配列番号３０を含む配列を含む。特定の実施形態において、配列番号３０は、表５の各行に示される生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、配列番号３０は、表５に示されるような生殖系列残基の任意の１つ、任意の２つ、任意の３つ、任意の４つ、任意の５つ、任意の６つ、または６つ全部を含む。特定の実施形態において、配列番号３０は、表５の各行に示される生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの固有の組み合わせを含む。他の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、ＶＨ１−１８、Ｄ２−１５およびＪＨ３領域を有する生殖系列配列に由来し、１つまたは複数の残基が、その位置において、対応する生殖系列残基をもたらすように変異している。特定の生殖系列配列に変異している２１Ｈ３重鎖可変領域の具体例としては、表１３に示される２１Ｈ３ ＶＨＯＰ（非生殖系列配列が４５位のＬおよび７０位のＭに変異して最適化されている）が挙げられる。
【表６】
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【０３２６】
本発明のいくつかの実施形態において、この標的結合剤または抗体は、配列番号３２を含む配列を含む。特定の実施形態において、配列番号３２は、表６の各行に示される生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、配列番号３２は、表６に示されるような生殖系列残基の任意の１つ、任意の２つ、任意の３つ、任意の４つ、任意の５つ、または５つ全部を含む。別の実施形態において、標的結合剤または抗体は、ＶＬ、１ｇ、ＪＬ２領域を備える生殖系列に由来し、１つ以上の残基が変異したことによりその位置の対応する生殖系列残基をもたらす。特定の生殖系列配列に変異している２１Ｈ３軽鎖可変領域の具体例としては、２１Ｈ３ＶＬＯＰ１（非生殖系列配列が１０７位のＫに変異して最適化されている）および２１Ｈ３ＶＬＯＰ２（非生殖系列配列が、６７位および１０７位のＫに変異して最適化されている）が挙げられる。表１３を参照されたい。
【表７】
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【０３２７】
本発明のいくつかの実施形態において、この標的結合剤または抗体は、配列番号２を含む配列を含む。特定の実施形態において、配列番号２は、表７の各行に示される生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、配列番号２は、表７に示されるような生殖系列残基の任意の１つ、任意の２つ、任意の３つ、任意の４つ、任意の５つ、任意の６つ、任意の７つ、任意の８つ、任意の９つ、任意の１０、任意の１１、または１１全部を含む。特定の実施形態において、配列番号２は、表７の各行に示される生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの固有の組み合わせを含む。他の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、ＶＨ１−１８、Ｄ７−２７およびＪＨ４領域を有する生殖系列配列に由来し、１つまたは複数の残基が、その位置において、対応する生殖系列残基をもたらすように変異している。
【表８】
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【０３２８】
本発明のいくつかの実施形態において、この標的結合剤または抗体は、配列番号４を含む配列を含む。特定の実施形態において、配列番号４は、表８の各行に示される生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、配列番号４は、表８に示されるような生殖系列残基の任意の１つ、任意の２つ、任意の３つ、任意の４つ、任意の５つ、または５つ全部を含む。特定の実施形態において、配列番号４は、表８の各行に示される生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの固有の組み合わせを含む。他の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、ＶＬ、３ｐ、ＪＬ２領域を有する生殖系列配列に由来し、１つまたは複数の残基が、その位置において、対応する生殖系列残基をもたらすように変異している。
【表９】
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【０３２９】
本発明のいくつかの実施形態のさらなる形態において、この標的結合剤または抗体は、配列番号６を含む配列を含む。特定の実施形態において、配列番号６は、表９の各行に示される生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、配列番号６は、表９に示されるような生殖系列残基の任意の１つ、任意の２つ、任意の３つ、任意の４つ、任意の５つ、任意の６つ、または６つ全部を含む。特定の実施形態において、配列番号６は、表９の各行に示される生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの固有の組み合わせを含む。他の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、Ｖｈ３−３３、Ｄ６−１３およびＪＨ４領域を有する生殖系列配列に由来し、１つまたは複数の残基が、その位置において、対応する生殖系列残基をもたらすように変異している。変異した配列の一例は２Ｈ１０ ＶＨＯＰであり、９３位のＭがＶに変異している。表１３を参照されたい。
【表１０】
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【０３３０】
本発明のいくつかの実施形態のさらなる実施形態において、この標的結合剤または抗体は、配列番号８を含む配列を含む。特定の実施形態において、配列番号８は、表１０の各行に示される生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、配列番号８は、表１０に示されるような生殖系列残基の任意の１つ、任意の２つ、任意の３つ、任意の４つ、任意の５つ、任意の６つ、または６つ全部を含む。特定の実施形態において、配列番号８は、表１０の各行に示される生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの固有の組み合わせを含む。他の実施形態において、この標的結合剤または抗体は、ＶＬ、３ｒおよびＪＬ２領域を有する生殖系列配列に由来し、１つまたは複数の残基が、その位置において、対応する生殖系列残基をもたらすように変異している。特定の実施形態では、配列番号８は構造障害の除去を含む修飾を備えることができる。例えば、生殖系列化に加えてＣ３３はＳに変異することができる。例えば表１３の２Ｈ１０ ＶＬＯＰ１を参照されたい。従って、配列番号８は、表１０の各行に示された生殖系列および非生殖系列残基の固有の組み合わせの任意の１つを含み、さらにＣ３３のＳへの変異を含むことができる。軽鎖の構造障害を除去するためにＣ３３において変異させ、生殖系列配列に戻ってさらに変異させた配列の例は、表１３に示した２Ｈ１０ ＶＬＯＰ２であり、Ｃ３３はＳに変異、１８位のＶをＡに変異、６５位のＳをＮに変異させた。
【表１１】
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【０３３１】
本発明のいくつかの実施形態において、この標的結合剤または抗体は、配列番号２２を含む配列を含む。特定の実施形態において、配列番号２２は、表１１の各行に示した生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、配列番号２２は、表１１に示した任意の１つ、任意の２つ、任意の３つ、任意の４つ、任意の５つ、任意の６つ、任意の７つ、または全７つの生殖系列残基を含む。特定の実施形態において、配列番号２２は、表１１の各行に示した生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの固有の組み合わせを含む。他の実施形態において、この標的結合剤または抗体はＶＨ４−３９、Ｄ４−２３およびＪＨ３領域を有する生殖系列配列に由来し、１つまたは複数の残基が、その位置において、対応する生殖系列残基をもたらすように変異している。重鎖をもとの生殖系列配列に変異させた配列の例は表１３に示した９Ｇ８ ＶＨＯＰ１であり、３８位のＬをＷに変異させた。重鎖をもとの生殖系列配列に変異させた配列の別の例は表１３に示した９Ｇ８ ＶＨＯＰ２であり、２１位のＳをＴに変異、３８位のＬをＷに変異、７０位のＳをＴに変異、および９６位のＦをＹに変異させた。
【表１２】
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【０３３２】
本発明のさらなるいくつかの実施形態において、この標的結合剤または抗体は配列番号８を含む配列を含む。特定の実施形態において、配列番号２４は表１２の各行に示した生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、配列番号２４は、表１２に示した任意の１つ、任意の２つ、任意の３つ、任意の４つ、任意の５つ、任意の６つ、任意の７つ、任意の８つ、任意の９つ、任意の１０、任意の１１、または全１１の生殖系列残基を含む。特定の実施形態において、配列番号２４は、表１２の各行に示した生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの固有の組み合わせを含む。他の実施形態において、この標的結合剤または抗体はＶＬ、３ｒおよびＪＬ２領域を有する生殖系列配列に由来し、１つまたは複数の残基が、その位置において、対応する生殖系列残基をもたらすように変異している。特定の実施形態において、配列番号２４は構造障害を除去することを含むさらなる修飾を含むことができる。例えば、配列番号２４は、表１２の各行に示した生殖系列および非生殖系列残基の任意の１つの固有の組み合わせを含むことができ、Ｃ３３のＳへの変異をさらに含むことができる。例は、９Ｇ８ ＶＬＯＰ１であり、軽鎖を変異させＣ３３の構造障害を除去し、７位でもとの生殖系列配列にさらに変異（ＳをＰに変異）させ、７９位のＶをＡに変異させた。別の例は９Ｇ８ ＶＬＯＰ２であり、Ｃ３３をＳに変異、２位のＳをＹに変異、７位のＳをＰに変異、１９位のＲをＳに変異、３９位のＴをＰに変異、７９位のＶをＡに変異させた。具体的には表１３を参照。
【０３３３】
当業者は、ＣＤＲ境界を定義する別の方法があることに気がつくであろう。表２および１３にあるすべてのＣＤＲ境界を、カバット定義に従って定義する。
【表１３】
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【実施例６】
【０３３４】
Ｎｏｔｃｈ１−ＤＬＬ４受容体−リガンド結合を阻害するＤＬＬ４抗体の力価測定
完全長組換えＤＬＬ４および可溶性Ｎｏｔｃｈ１／Ｆｃ間の相互作用を防ぐ能力に基づいて、精製した複数の抗体を区別するために以下のアッセイを行った。トランスフェクトしたおよびトランスフェクトしていない２３９Ｔ細胞を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳで再構成し、５０００のトランスフェクトした細胞および１７５００のトランスフェクトしていない細胞を、３８４ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ,カタログ＃３７１２）のウェルに３０μｌの量で播種した。その後、５μｇ／ｍｌのハイブリドーマ上清から段階希釈した３０μｌの精製抗体を加え、４℃で１時間、プレートをインキュベートし、その時に２０μｌの１００ｎｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ−６４７標識ヒトＮｏｔｃｈ１／Ｆｃを加えた。４℃で３時間さらにインキュベートした後、ＦＭＡＴ ８２００装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して各ウェルの蛍光を読み取ることによって、Ｎｏｔｃｈ１／Ｆｃの結合量を測定した。１２の精製抗体のデータを表１４に示し、組換え完全長ヒトＤＬＬ４とＮｏｔｃｈ１／Ｆｃキメラ間の相互作用を阻害する精製抗体の能力を示す。
【０３３５】
さらに、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）装置を使用して、同様の実験を行い、定量した。これらの実験に、親の２９３Ｔ細胞またはヒトＤＬＬ４で一過的にトランスフェクトした細胞を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳで再構成し、最終濃度１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌまたは０．１μｇ／ｍｌの精製抗体を含むウェルに、２５０００細胞／ウェルの濃度で加えた。４℃で１時間インキュベートした後、Ａｌｅｘａ−６４７標識ヒトＮｏｔｃｈ１／Ｆｃを最終濃度２２７ｎｇ／ｍｌで加え、４℃で２時間、プレートをインキュベートした。２％ＦＣＳを含むＰＢＳで洗浄後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置を使用して各ウェルの蛍光を読み取ることによって、Ｎｏｔｃｈ１／Ｆｃ結合量を測定した。これらの条件下、ＤＬＬ４−Ｎｏｔｃｈ１相互作用を阻害する２０の精製抗体の能力はＦＭＡＴ装置を使用して観察された能力と同様であった（データ示さず）。実験を、可溶性ヒトＤＬＬ４および可溶性ヒトＮｏｔｃｈ１を使用してＥＬＩＳＡフォーマットで行ったときにも、同様の結果を得た（データ示さず）。
【０３３６】
レトロウイルスコンストラクトを使用して、ヒト、マウスまたはカニクイザルＤＬＬ４のいずれかで安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を使用して、選択した抗体についてさらなる実験を行った。これらの実験の中で、２％ＦＣＳを含むＰＢＳで希釈した抗ＤＬＬ４抗体（最終濃度：１０〜０．０１μｇ／ｍｌ）を、ＤＬＬ４を発現するＨＥＫ２９３細胞（２％ＦＣＳを含むＰＢＳで希釈した５００００細胞／ウェル）に加え、４℃で１時間インキュベートした。その後、Ａｌｅｘａ−６４７標識ヒト、ラットまたはＡＰＣ標識マウスＮｏｔｃｈ１／Ｆｃ（例えば、各々、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ,カタログ＃３６４７−ＴＫ−０５０,１０５７−ＴＫ−０５０,５２６７−ＴＫ−０５０）を最終濃度０．０１〜０．５μｇ／ｍｌで加え、４℃でさらに２時間、プレートをインキュベートし、洗浄後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置で読み取った。ＦＡＣＳ解析によって測定した時の、組換え完全長ヒト、カニクイザルおよびマウスＤＬＬ４と、０．１もしくは０．２５μｇ／ｍｌの濃度のヒト、ラットまたは０．５μｇ／ｍｌ濃度のマウスのＮｏｔｃｈ１／Ｆｃキメラとの間の相互作用を阻害する異なるアイソトープの精製抗体の能力を表１５に示す。
【表１４】
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【表１５】
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【実施例７】
【０３３７】
ＤＬＬ４抗体のヒトＪＡＧＧＥＤ１およびＤＬＬ１への交差反応性
精製抗体のヒトＪａｇｇｅｄ１およびＤｌｌ１への結合能を、ＦＡＣＳ解析によって測定した。簡単に説明すると、リポフェクタミン２０００を使用して、２９３Ｔ細胞を偽トランスフェクトした、または、ヒトＪａｇｇｅｄ１（アクセッション＃：ＮＭ＿０００２１４）またはＤｌｌ１（アクセッション＃：ＮＭ＿００５６１８）のいずれかを用いて一過的にトランスフェクトした。細胞を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳで再懸濁し、Ｖ底プレートに５００００細胞／ウェルで播種した。２％ＦＣＳを含むＰＢＳで希釈した抗ＤＬＬ４抗体を、最終濃度５または１５μｇ／ｍｌで加え、４℃で１時間、プレートをインキュベートした。２％ＦＣＳを含むＰＢＳで洗浄後、二次抗体（ヤギ抗ヒトＦｃ Ｃｙ５,Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ, カタログ＃１０９−１７５−０９８,５μｇ／ｍｌ）および７−ＡＡＤ（５μｇ／ｍｌ）を加え、４℃で１５分間、プレートをインキュベートし、２％ＦＣＳを含むＰＢＳで再び洗浄後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置で読み取った。マウス抗ヒトＪａｇｇｅｄ１抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ,カタログ＃ｍＡＢ１２７７,抗マウスＦｃ Ｃｙ５の二次抗体（５μｇ／ｍｌ）で検出される,Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ カタログ＃１１５−１７５−１６４）、ヒトＮｏｔｃｈ３／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ, カタログ＃１５５９−ＮＴ−０５０,上記のヤギ抗ヒトＦｃ Ｃｙ５抗体で検出される）またはヤギ抗ヒトＤｌｌ１抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ｃａｔ＃ＡＦ１８１８,抗ヤギＦｃ Ｃｙ５で検出される,Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ, カタログ＃３０５−１７５−０４６（５μｇ／ｍｌ））を、トランスフェクションを確かめるための対照として使用した。偽トランスフェクトした細胞の蛍光の幾何平均の、Ｊａｇｇｅｄ１またはＤｌｌ１トランスフェクト細胞の蛍光の幾何平均へのシフトを比較することによってデータを解析した。そのデータを表１６および１７に示す。表１６は、ヒトＪａｇｇｅｄ１で一過的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞への精製抗体（５μｇ／ｍｌ）の結合能を示す。表１７は、ヒトＤｌｌ１で一過的にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞への精製抗体（１５μｇ／ｍｌ）の結合能を示す。最大３００μｇ／ｍｌの濃度で２１Ｈ３ＲＫ、４Ｂ４、９Ｇ８または２Ｈ１０を使用する追加のＦＡＣＳ結合試験は、ヒトＪａｇｇｅｄ１またはヒトＤｌｌ１のいずれかを安定して過剰発現するＨＥＫ−２９３細胞への最小限の結合（バックグラウンドに対して＜２．５倍）を示した。
【表１６】
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【表１７】
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【実施例８】
【０３３８】
ＤＬＬ４抗体のＤＬＬ４介在性ＨＵＶＥＣ増殖に対する効果の測定
ＨＵＶＥＣ増殖のＤＬＬ４刺激による阻害を遮断するＤＬＬ４抗体の能力を評価した。ＤＬＬ４の細胞外領域（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ,カタログ＃１５０６−Ｄ４/ＣＦ）を、５０μｇ／ｍｌストックとして、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで調製した。重炭酸緩衝液（Ｓｉｇｍａ＃Ｃ３０４１−５０ＣＡＰ）で１μｇ／ｍｌに希釈後、１００μｌ／ウェルを黒壁９６ウェルプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ, カタログ＃６００５１８２）に加え、４℃で一晩、プレートをインキュベートした。対照ウェルも、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで偽コートした。ＰＢＳで洗浄後、１０％ＦＣＳおよび２ｍＭグルタミンを含むＭＣＤＢ１１３（Ｇｉｂｃｏ カタログ＃１０３７２）に４Ｅ４細胞/ｍｌの濃度で１００μｌのＨＵＶＥＣ細胞を各ウェルに加えた。その後すぐに、段階希釈した抗ＤＬＬ４抗体（２０〜０．０２７μｇ/ｍｌ）をＤＬＬ４／偽コートウェルに３ウェルずつ加え、３７℃／５％ＣＯ２で９６時間、細胞をインキュベートした。このインキュベート後、１５μｌのＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ８（ＣＣＫ８,ＮＢＳ, カタログ＃ＣＫ−０４−１１）を各ウェルに加え、３７℃／５％ＣＯ２で４時間、プレートをインキュベートした。各ウェルの相対細胞数を測定するために、４５０ｎｍにおける吸光をプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ）で測定した。抗ＤＬＬ４抗体の効果を表１８に列挙した。さらに、４Ｂ４、２１Ｈ３および２１Ｈ３ＲＫは、ＩｇＧ１抗体としてフォーマットした時、ＤＬＬ４介在性効果の効果的な阻害剤でもあった（図１）。
【０３３９】
さらに、抗ＤＬＬ４抗体（１０μｇ/ｍｌ）のＮｏｔｃｈシグナル伝達を阻害する能力を、ウエスタンブロットによって評価した。簡単に説明すると、ＤＬＬ４−Ｈｉｓ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ, カタログ＃１５０６−Ｄ４−０５０/ＣＦ）を、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで５０μｇ/ｍｌに希釈した。その後、この溶液を５０ｍＭの重炭酸緩衝液ｐＨ９．６（Ｓｉｇｍａ カタログ＃Ｃ−３０４１）で１μｇ/ｍｌにさらに希釈し、１ウェルあたり１ｍｌを１２ウェルプレートに加え、４℃で一晩インキュベートした。ＤＬＬ４を含まない追加のウェルを、同じ方法を使用して偽コートした。ＰＢＳで洗浄後、ＭＣＤＢ１３１培地で調製したＨＵＶＥＣ細胞を１２０００細胞／ウェルで播種した。播種後すぐに、適切な処理（例えば、抗ＤＬＬ４抗体、１０μｇ/ｍｌ）を加え、プレートを３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。インキュベーションが完了した後、細胞をＲＩＰＡバッファーで回収した。その後、βメルカプトエタノールおよびブロモフェノールブルーを含む４×サンプルバッファーを加え、試料を７０℃で５分間煮沸し、ＭＯＰＳバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ カタログ＃ＮＰ０００１）中の４〜１２％ＮｕＰＡＧＥゲルにロードした。ニトロセルロースへの電気泳動転写後、ブロットを、５％ミルクを含むＰＢＳＴで１時間ブロッキングし、５％ミルクを含むＰＢＳで各々１：１０００または１：１０，０００希釈した切断した抗Ｎｏｔｃｈ１抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, カタログ＃２４２１）またはＧＡＰＤＨ抗体（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ,クローン６Ｃ５, カタログ＃２−ＲＧＭ２）のいずれかと共にインキュベートした。４℃で一晩、オービタルシェーカー上でインキュベートした後、ブロットをＰＢＳＴで洗浄し、室温で、１時間、５％ミルクを含むＰＢＳＴ中で、１：２０００の濃度で抗マウスＨＲＰ二次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, カタログ＃７０７２）と共にインキュベートした。ＰＢＳＴによる洗浄後、ブロットをＰｉｅｒｃｅ Ｐｉｃｏ（カタログ＃３４０８０；ＧＡＰＤＨ）またはＦｅｍｔｏ（カタログ＃３４０７５；切断Ｎｏｔｃｈ１）基質試薬を用いて現像し、結果をＣｈｅｍｉＧｅｎｉｕｓ装置で解析した。これらの研究から得られた結果は、抗ＤＬＬ４抗体がＨＵＶＥＣ細胞内においてＤＬＬ４促進性Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を遮断することができることを示す（データ示さず）。
【表１８】
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【実施例９】
【０３４０】
インビトロＨＵＶＥＣ管形成におけるＤＬＬ４抗体の効果
インビトロ共培養アッセイにおける内皮細胞管形成を減少させるＤＬＬ４阻害抗体の能力を試験した（例えば、ＴＣＳ Ｃｅｌｌ Ｗｏｒｋｓ Ｃａｔ ｎｏ.ＺＨＡ−１０００）。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびヒト２倍体線維芽細胞を、２４ウェルプレート（ＴＣＳ Ｃｅｌｌ ｗｏｒｋｓ Ｃａｔ ｎｏ.ＺＨＡ−１０００）の中での共培養として得るかまたはプレートを以下のように調製した：３７℃／５％ＣＯ２で４時間、２４ウェル組織培養プレートをコラーゲン（蒸留水での１：１０希釈；Ｓｉｇｍａ,カタログ＃Ｃ８９１９）でコートした。ＰＢＳで洗浄後、線維芽細胞（例えば、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ＃Ｃ−１２３００）を１５０００細胞／ウェルでＦＧＭ（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ＃Ｃ−２３０１０）に加えた。３７℃／５％ＣＯ２での３日間のインキュベーション後、培地をプレートから除去し、ＥＧＭ２（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ ＃Ｃ−２２１１１）中、３０，０００細胞／ウェルでＨＵＶＥＣ細胞を加えた。３７℃／５％ＣＯ２でのさらなる４日間のインキュベーション後、プレートを使用できる状態にあると見なし、これをアッセイの１日目と見なした。ＤＬＬ４阻害抗体を１日目の培養液へ導入し、２０〜０．０２７μｇ／ｍｌの範囲の濃度で１１日間にわたって定期的に導入した。培地を４日目、７日目および９日目に補充した。この共培養モデルを、（共培養アッセイに同梱されている）ＴＣＳ最適化培地または２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１％グルタミンおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＭＣＤＢ１３１培地（今後２％ ＦＳ ＭＣＤＢ１３１培地と称する）のいずれかで維持した。この共培養モデルを、３７℃、加湿した５％ＣＯ２／９５％空気雰囲気の中で維持した。細管形成を１１日目に調べ、メーカーの使用説明書に従って、細管染色キット（ＴＣＳ Ｃｅｌｌ Ｗｏｒｋｓ カタログ＃ＺＨＡ−１２２５）を使用してＣＤ３１の細管の固定および染色を行った。簡単に説明すると、細胞を室温（ＲＴ）で３０分間、氷冷７０％エタノールで固定した。細胞をブロッキングし、その後、細胞をＲＴで６０分間、抗ヒトＣＤ３１で処理した。プレートを洗浄後、ＲＴで６０分間、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と結合したヤギ抗マウスＩｇＧで処理した。ＡＰ結合型二次抗体とのインキュベーション後、これらのプレートを洗浄し、約１０分間、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸／ニトロ・ブルー・テトラゾリウム（ＢＣＩＰ/ＮＢＴ）基質を加えた。１０分間以内の濃い紫色の発色は管形成を反映した。その後、プレートを洗浄し、空気乾燥した。管成長の数量化を、Ｚｅｉｓｓ ＫＳ４００ ３．０イメージアナライザーを使用してウェル全体の画像解析方法論により行った。数量化方法論で測定した形態学的パラメーターは、管の全長であった。いくつかの実験において、管の分岐数も評価した。各２４ウェル中のすべての管形成は、端の退縮のアーティファクトを避けるために１００μｍ深度の縁を排除して測定した。
【０３４１】
図２で説明するように、これら抗体が、インビトロでの内皮細胞管形成を阻害するのに効果的であることを観察した。さらに、このアッセイにおいて、いくつかの抗体の力価を測定した。これらのデータを表１９にまとめる。総合すると、このデータは、これらの抗体が血管新生過程のモデルになる機能アッセイにおいて活性があることを示す。
【表１９】
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【実施例１０】
【０３４２】
精製抗体の結合親和性の測定
ＤＬＬ４に対する精製抗体の結合親和性を、ＦＡＣＳおよびＢＩＡｃｏｒｅ技術の両方を使用して測定した。ＦＡＣＳ親和性測定のために、ヒトまたはカニクイザルＤＬＬ４のいずれかを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を、約８５，０００〜１０４，０００細胞／ウェルで播種し、４℃で５時間、精製抗体のタイトレーション(ｔｉｔｒａｔｉｏｎ)と共にインキュベートした。その後、これらの細胞を洗浄し、４℃で３０分間、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ−Ｃｙ５および５μｇ／ｍＬの７−アミノ−アクチノマイシン（７ＡＡＤ）と共にインキュベートした。結合したＤＬＬ４を、ＦＡＣＳ解析を使用して検出し、データを以下の式（導出についてはＤｒａｋｅ ＆ Ｋｌａｋａｍｐ,２００７,Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.Ｍｅｔｈｏｄｓ,３１８,１５７−１６２参照）に当てはめた。
【数１】
0005778577.tif 000152
【０３４３】
この方程式において、Ｆは蛍光平均値、ＬＴは合計分子ｍＡｂ濃度、Ｐ’は任意の蛍光単位を結合したｍＡｂに関連付ける比例定数、Ｍはモル濃度の細胞濃度、ｎは細胞あたりの受容体数、Ｂはバックグラウンドシグナル、およびＫＤは平衡解離定数である。各ｍＡｂタイトレーション曲線に関して、ＫＤの推定値をＰ’として得、ｎ、Ｂ、およびＫＤは非線形解析で自由に変動できる。表２０に、上記の方法論を使用して得られたヒトおよびカニクイザルＤＬＬ４に対する抗ＤＬＬ４抗体の親和性推定値をまとめた。
【０３４４】
Ｂｉａｃｏｒｅ解析に関して、各精製した抗ＤＬＬ４抗体を、標準的なアミン結合を使用してＴ１００内のＣＭ５センサーチップ上に固定した。固定量を２００ＲＵ未満に保った。Ｐａｃｅら（Ｇ.Ｒ. Ｇｒｉｍｓｌｅｙ ａｎｄ Ｃ.Ｎ.Ｐａｃｅ（２００３） ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ,Ｉｎｃ.）,３．１．１−３．１.９）によって開発された方法を使用して、タンパク質の配列から計算した１１０,４４０Ｍ−１ｃｍ−１の２８０ｎｍにおけるモル吸光係数を使用するＵＶ−ＶＩＳ分光測定によって、ＤＬＬ４の濃度を測定した。抗原ＤＬＬ４（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ；ヒトカタログ＃１０５６−Ｄ４−０５０またはマウス,カタログ＃１３８９−Ｄ４−０５０）を３２〜６４ｎＭの開始濃度に希釈し、３倍の段階希釈で３回ずつ試験した。ランニングバッファーは０．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡを有するＨＢＳ−Ｐを含み、結合反応を２３℃で収集した。結合複合体を、１０ｍＭの水酸化ナトリウムの１５秒パルスを用いて再生した。ヒト可溶性ＤＬＬ４への結合を評価する時、反応データを単純な１：１相互作用モデルに全体的に当てはめ、抗ＤＬＬ４抗体に関して得られたｋａ、ｋｄおよびＫＤ推定値を表２０にまとめた。さらに、２１Ｈ３、２１Ｈ３ＲＫおよび４Ｂ４の可溶性マウスＤＬＬ４への親和性推定値も、ＢＩＡｃｏｒｅを使用して得、ＩｇＧ型のすべての抗体は、可溶性マウスＤＬＬ４に対して３６０ｎＭ以下の親和性を有した。
【表２０】
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【表２１】
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【実施例１１】
【０３４５】
ＦＡＣＳ解析によるＤＬＬ４に対する交差競合（ＣＲＯＳＳ−ＣＯＭＰＥＴＩＴＩＯＮ）の測定
ヒトＤＬＬ４への他のＤＬＬ４抗体の結合を阻害する精製ＤＬＬ４抗体の能力を、ＦＡＣＳアッセイを使用して評価した。簡単に説明すると、市販の標識キット（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ カタログ＃Ａ３０００９,Ａ−２０１８６）を使用して、メーカーの使用説明書により抗体をＡｌｅｘａ−６４７で直接標識した。交差競合量を測定するために、２％ＦＣＳを含むＰＢＳで希釈した非標識抗ＤＬＬ４抗体（最終濃度：１０〜０．０１μｇ／ｍｌ）を、ＤＬＬ４を発現するＨＥＫ２９３細胞（実施例６に記載のように；２％ＦＣＳを含むＰＢＳで希釈した５００００細胞／ウェル）に加え、４℃で１時間インキュベートした。その後、Ａｌｅｘａ−６４７標識抗ＤＬＬ４抗体を、最終濃度０．１μｇ／ｍｌで加え、４℃でさらに１時間、プレートをインキュベートし、洗浄後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置で読み取った。ヒトＤＬＬ４への結合に対して、標識２１Ｈ３ＲＫと競合する非標識抗体（１０、１、０．１μｇ／ｍｌ）の能力をまとめたデータを図３に含める。ヒトＤＬＬ４への結合に対して、標識２１Ｈ３ＲＫおよび４Ｂ４と競合する非標識抗体の能力をまとめた追加データを表２２に含める。
【０３４６】
さらに、ＨＥＫ２９３細胞内で発現させた組換えＤＬＬ４（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ, カタログ＃１５０６−Ｄ４−０５０/ＣＦ）および天然ＤＬＬ４を検出する抗体の能力も、標準的な技術を使用してウエスタンブロットにより測定した（実施例３参照）。簡単に説明すると、ＤＬＬ４を発現しているＨＥＫ２９３細胞を、１つのプロテアーゼ阻害剤の混合タブレット（Ｒｏｃｈｅ, カタログ＃１１８７３５８０００１）を含むＲＩＰＡバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ, カタログ＃８９９００）中で回収し、メーカーの使用説明書に従って、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ, カタログ＃２３２２７）を使用してタンパク質を定量した。ウエスタンブロットに関して、タンパク質試料を氷上で溶解し、２分間１００℃でインキュベートし、１０×Ｎｕｐａｇｅ試料還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ, カタログ＃ＮＰ０００４）および４×サンプルバッファーを加え、ＭＥＳバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ, カタログ＃ＮＰ０００２）中のプレキャストの４〜１２％ＮｕＰａｇｅ ＢｉｓＴｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ, カタログ＃ＮＰ０３２１Ｂ０Ｘ）にロードした。ニトロセルロースへの電気泳動転写後、ブロットを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝食塩水（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ,１５０ ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ ７．５）（ＴＢＳＴ）に５％ミルクを加えた溶液中で１時間ブロッキングし、５％ミルクを含むＴＢＳＴ中で、９Ｇ８、２Ｈ１０、２１Ｈ３、４Ｂ４または２０Ｇ８（すべて２μｇ／ｍｌ）または市販の抗ＤＬＬ４抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ, カタログ＃ＭＡＢ１３８９；Ａｂｃａｍ, カタログ＃ａｂ７２８０、両方とも１μｇ／ｍｌ）のいずれかとインキュベートした。４℃で一晩、オービタルシェーカー上でインキュベートした後、ブロットをＴＢＳＴで洗浄し、室温で、１時間、５％ミルクを含むＴＢＳＴの中で、抗ラット、抗ウサギまたは抗ヒトＨＲＰ結合二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ, カタログ＃１１２−０３５−００３および１１１−０３５−００３、１：２０，０００希釈またはＫＰＬ,カタログ＃０７４−１００６,１：１０，０００希釈）のいずれかと共にインキュベートした。過剰の抗体を上記のように洗浄により除去し、メーカーの使用説明書（Ｐｉｅｒｃｅ, カタログ＃３４０７６）に従って、免疫複合体を増強化学発光検出により視覚化し、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ, カタログ＃２８９０６８３９）またはＢｉｏｍａｘ ＭＲ（Ｋｏｄａｋ, カタログ＃８９５２８５５）フィルム上で検出した。これらの条件下、組換えおよび天然ＤＬＬ４の両方を市販の抗体および９Ｇ８/２Ｈ１０によって検出することはできるが、２１Ｈ３/２０Ｇ８または４Ｂ４では検出できないことをこれらの結果は示し、これらの抗体がＤＬＬ４上の異なるエピトープと相互作用し得ることを示唆する（データ示さず）。
【表２２】
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【実施例１２】
【０３４７】
９Ｇ８および２Ｈ１０の配列修飾
免疫グロブリン遺伝子は免疫反応成熟期間中に、可変領域のＶ、ＤおよびＪ遺伝子断片間での組換え、アイソタイプスイッチ、ならびに超変異を含む様々な修飾を行う。組換えおよび体細胞超変異は、抗体の多様性の生成および親和性の成熟化の基盤であるが、治療薬としてのかかる免疫グロブリンの産業生産を困難にさせ得る配列障害も生む可能性があり、または抗体の免疫原性リスクを上昇させる可能性がある。一般に、ＣＤＲ領域の変異は親和性および機能の改善に貢献する可能性が高いが、フレームワーク領域内の変異は、免疫原性リスクを上昇させ得る。このリスクは、フレームワーク変異を生殖系列に戻すことによって減少させることができ、抗体の活性に悪影響を及ぼさないことを保証する。いくつかの構造障害は多様化過程によって生まれ得るか、または重鎖および軽鎖可変領域に寄与する生殖系列配列内に存在し得る。出所に関わらず、不安定性、凝集、産物の不均一性、または免疫原性の上昇になり得る潜在的構造障害を除去することが望ましくあり得る。望ましくない障害の例として、（ジスルフィド結合スクランブリング、または可変スルフヒドリル付加物形成をもたらし得る）不対システイン、（構造および活性の不均一性になる）Ｎ−結合糖鎖付加部位、ならびに脱アミド化（例えば、ＮＧ、ＮＳ）、異性化（ＤＧ）、酸化（露出したメチオニン）および加水分解（ＤＰ）の部位が挙げられる。免疫原性のリスクを減少させ、リード抗体の医薬品特性を改善する試みにおいて、特定のバリアントを生成し、結合および活性の試験をした。部位特異的変異誘発を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ ＩＩ ｋｉｔを使用してメーカーが記載するように行った。バリアント配列を、（メーカーが推奨する手順に従って）一過的トランスフェクションによるＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ｓｙｓｔｅｍにより発現させ、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより精製した。
【０３４８】
変異抗体の活性を２つの方法により評価した：第１に、実施例３において記載したように、ＨＥＫ２９３細胞内で安定して発現させた完全長ヒトＤＬＬ４への可溶性Ｎｏｔｃｈ１／Ｆｃの結合を遮断する抗体の能力を測定し、第２に受容体−リガンド競合試験において使用される同じ細胞系への抗体の結合を測定した。結合試験に関して、ヒトＤＬＬ４を安定して過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞を、５０，０００細胞／ウェルの濃度で、２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中で再懸濁し、４℃で１時間、抗体のタイトレーション（最終濃度０．０１〜１０μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。その後、これらの細胞を洗浄し、４℃で３０分間、０．３１μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ−ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ,ｃａｔ＃５５５７８６）と共にインキュベートした。結合したＤＬＬ４を、ＦＡＣＳ解析を使用して検出した。未変異抗体と比較したヒトＤＬＬ４との結合におけるＮｏｔｃｈ１との競合、またはヒトＤＬＬ４との結合に関するこれらの抗体の能力について、９Ｇ８および２Ｈ１０の配列での特異的変異の効果を示すこれらの研究の結果を、表２３にまとめた。
【表２３】
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【実施例１３】
【０３４９】
球状体ベースのインビボ血管新生アッセイにおける血管新生阻害の有効性評価
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）球状体を、以前に記載されたように（Ｋｏｒｆｆ ａｎｄ Ａｕｇｕｓｔｉｎ：Ｊ.Ｃｅｌｌ.Ｂｉｏｌ.１４３：１３４１−５２,１９９８）、１００個の内皮細胞（ＥＣ）をプラスチック皿の上に懸滴法でピペット操作により垂らし、一晩、球状体を形成させることによって調製した。次の日、以前に記載された方法（Ａｌａｊａｔｉ ｅｔ ａｌ.,Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５：４３９−４４５,２００８）を使用してＥＣ球状体を回収し、単一ＨＵＶＥＣと共にマトリゲル／フィブリン溶液に混合し、最終的な数が球状体として１００，０００ＥＣおよび注入されたプラグあたり２００，０００単一ＥＣに達した。最終濃度１０００ｎｇ/ｍｌでＶＥＧＦ−ＡおよびＦＧＦ−２を加えた。マトリックスあたり５００μｌの細胞懸濁液をオスのＳＣＩＤマウス（５〜８週齢）の皮下に注射した。次の日（１日目）処置を始めた。２１日目に、この研究を終了した。マトリックスプラグを取り出し、４％ＰＦＡで固定した。組織学的検査のために、全マトリックスプラグをパラフィン包埋し、８〜１０μｍの厚さに切断した。ヒトＣＤ３４および平滑筋アクチン（ＳＭＡ）の染色により血管を視覚化し、ならびに血管の密度および周皮細胞被覆を測定した。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２の両抗体は、インビボの血管新生を調節し、周皮細胞の動員を阻害することに効果的である。得られたデータは、抗ＤＬＬ４抗体（２１Ｈ３ＲＫまたは４Ｂ４）を用いた処理が、１ｍｇ/ｋｇと同じくらい低い抗体濃度で、未処理の対照に対して少なくとも１００％のヒト血管新生の増加を誘導することを示唆する。さらに、ヒト血管新生の増加は、５ｍｇ/ｋｇの抗体投与量で、（αＳＭＡ発現の陽性細胞とも関連するヒトＣＤ３４陽性血管のパーセンテージによって評価する場合）少なくとも５０％の周皮細胞被覆の減少と関連した。１、０．２および０．０４ｍｇ/ｋｇの濃度で、週に２度腹腔内投与した２１Ｈ３ＲＫ ＩｇＧ１の効果をまとめたデータを表２４に示す。総合すると、このデータは、これらの抗体が血管新生のインビボアッセイにおいて活性があることを示す。
【表２４】
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【実施例１４】
【０３５０】
２１Ｈ３ＲＫのエピトープマッピング
モノクローナル２１Ｈ３ＲＫは、特異的にヒトＤＬＬ４と結合するが、ヒトＤＬＬ１を認識しない。この特異性を、ヒトＤＬＬ４に対するＭａｂ ２１Ｈ３ＲＫの結合エピトープを推定するのに使用する。キメラバリアントを遺伝子操作し、ＤＬＬ４の細胞外領域の部分をＤＬＬ１の対応する部分で置換した。組換えタンパク質の表面発現のためのＤＬＬ４膜貫通領域を含む一連のバリアントを構築するために、（Ｙｏｎｅｙａ ｅｔ ａｌ.,２００１,Ｊ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.,１２９,２７−３４,研究室内でクローニングされた）ヒトＤＬＬ４およびＤＬＬ１（アクセッション＃ＮＭ＿００５６１８,Ｏｒｉｇｅｎｅ,ＭＤ）をオーバーラップ伸長ＰＣＲ法の鋳型として使用した。得られたバリアントを、一過的哺乳動物発現のために、ヒトサイトメガロウイルス主要最初期（ｈＣＭＶｉｅ）エンハンサー、プロモーターおよび５’−非翻訳領域をコードする哺乳動物発現ベクターにクローニングした。フローサイトメトリー法によるＭａｂ ２１Ｈ３ＲＫの性質決定のために、キメラバリアントを、膜結合タンパク質として一過的にＨＥＫ２９３Ｆ細胞内で発現させた。トランスフェクションの４８時間後、ＨＥＫ２９３Ｆトランスフェクタントを氷上で１時間、ＰＢＳ中で１μｇ／ｍｌのＭａｂ ２１Ｈ３ＲＫとインキュベートし、洗浄し、その後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ （Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ,ＰＡ）とインキュベートし、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ,ＣＡ）を用いて解析した。（ヒトＤＬＬ４も認識する）ヤギ抗マウスＤＬＬ４およびヤギ抗ヒトＤＬＬ１ポリクローナル抗体（両抗体ともＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ., ＭＮ）の両方の混合物とインキュベートすることによって、全キメラバリアントの発現量を測定し、その後、ブタの抗ヤギＩｇＧ−ＰＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ,ＣＡ）を用いて検出した。
【０３５１】
ヒトＤｌｌ１およびＤｌｌ４は、アミノ酸レベルで５３％の同一性を共有するが、Ｍａｂ ２１Ｈ３ＲＫは特異的にＤｌｌ４と結合し、Ｄｌｌ１は認識しない。ヒトＤｌｌ１のごく一部をコードするヒトＤｌｌ４のキメラバリアントを、この特異性に関わる領域を同定するために構築した。ヒトＤｌｌ４のサブドメインとヒトＤｌｌ１の対応する残基とを置換することによって、１２のキメラノックアウトバリアントを構築した。図４は、ＤＬＬ４の細胞外部分を構造的に規定されたサブドメインにどのように分けるかを示す。成熟ＤＬＬ４タンパク質の大きなアミノ末端（Ｎ−ｔｅｒ）を２つの小さな部分に分けた。ＫＯバリアントＮ−ｔｅｒ１は、成熟ＤＬＬ４タンパク質の最初の８６個のアミノ酸（ＡＡ）をヒトＤＬＬ１と置き換え、ＫＯバリアントＮ−ｔｅｒ２は、８７〜１４６番目のアミノ酸をヒトＤＬＬ１と置き換える。図に示した他のノックアウトバリアントは、全Ｎ末端領域（ＡＡ１〜１４６）、ＤＳＬ領域（ＡＡ１４７〜１９１）、ＥＧＦ１領域（ＡＡ１９２〜２２４）、ＥＧＦ１および２の両方の領域（ＡＡ１９２〜２５５）、ＥＧＦ３および４の両方の領域（ＡＡ２５６〜３３３）、および４つのＥＧＦ５〜８領域（ＡＡ３３４〜５０３）のＤｌｌ１置換を含む。さらに、Ｎ末端およびＤＳＬ領域（ＡＡ１〜１９１）の両方、Ｎ末端とＤＳＬおよびＥＧＦ１〜２領域（ＡＡ１〜２５５）、ＤＳＬおよびＥＧＦ１〜２領域（ＡＡ１４７〜２５５）、ならびにＤＳＬおよびＥＧＦ１領域（ＡＡ１４７〜２２４）を組み合わせた領域置換バリアントを、遺伝子操作をして作製した。抗Ｄｌｌ４およびＤｌｌ１ポリクローナル抗体（図５、両方の行の上のパネル）を用いて測定した時、すべての組換えタンパク質は細胞表面上で十分に発現したが、Ｍａｂ ２１Ｈ３ＲＫは、ＤＳＬおよびＥＧＦ１ヒトＤｌｌ１領域の両方を含むコンストラクトのいずれも認識しなかった（図５、下のパネル）。さらに、Ｄｌｌ４ ＤＳＬおよびＥＧＦ１領域をコードするＤｌｌ１コンストラクト（ノックイン変異体）では、Ｍａｂ ２１Ｈ３ＲＫはＤｌｌ１と結合できる（図６）。従って、２１Ｈ３ＲＫの結合エピトープは、ＤＳＬおよびＥＧＦ１領域内に局在している。
【０３５２】
このタンパク質のこの部分の中の結合エピトープをさらに絞り込み、Ｍａｂ ２１Ｈ３ＲＫの結合特異性に関わる必須残基を同定するため、３つの追加のバリアントを、遺伝子操作をして作製した。Ｄｌｌ４のＤＳＬおよび／またはＥＧＦ１領域内の３つの１５個のアミノ酸部分を、Ｄｌｌ１およびＤｌｌ４配列が保存されていないわずかなアミノ酸置換をコードする対応するＤｌｌ１残基：断片Ａ（ＡＡ１８７〜２０１）、断片Ｂ（ＡＡ２００〜２１４）、および断片Ｃ（ＡＡ２１０〜２１４）と置換した。断片Ａは、ＤＳＬ領域の最後の５個のアミノ酸、ＤＳＬおよびＥＧＦ１の領域間の４個のアミノ酸リンカー、ならびにＥＧＦ１領域の６個のアミノ酸に及ぶ。Ｄｌｌ１残基とのこれらの１５個のアミノ酸の置換は、Ｍａｂ ２１Ｈ３ＲＫ結合の損失をもたらした。断片ＢおよびＣの中のＤｌｌ４残基をＤｌｌ１と置換した時、何の効果も観察されなかった。これらのデータは、ＤＳＬのＣ末端およびＥＧＦ１のＮ末端を含む１５個のアミノ酸（ＡＡ１８７〜２０１）が結合に重要であることを同定し、２１Ｈ３ＲＫに対するエピトープを、ＤＳＬのＣ末端およびＥＧＦ１のＮ末端（ＡＡ１８７〜２０１）に局在する必須領域と共に、ＤＳＬおよびＥＧＦ１領域（ＡＡ１４７−２２４）にマッピングした。
【実施例１５】
【０３５３】
ＤＬＬ４の内部移行を引き起こすＤＬＬ４抗体のＦＡＣＳ解析による測定
ＤＬＬ４の内部移行を誘導する精製抗体の能力をＦＡＣＳ解析により調べた。ＤＬＬ４を安定に過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ）で分離、洗浄し、Ｖ底プレートに１ウェルあたり５０，０００〜１００，０００細胞で播種した。一次抗体（抗ＤＬＬ４または適切なアイソタイプ対照）を、温かい３７℃のＦＡＣＳ緩衝液で最終濃度１０μｇ／ｍｌに希釈し、組織培養インキュベーター（３７℃／５％ＣＯ２）の中で３０、６０、１２０または２４０分間、これらの細胞に加えた。適切な時点で、前もって４℃に冷やした遠心機により５００ｇで細胞を沈殿させ、冷たいＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、氷上で１０分間、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧの二次抗体（１μｇ/ｍｌ,Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ,ｃａｔ＃１０９−０９６−０９８）とインキュベートした。インキュベーション後、前もって冷やした遠心機により５００ｇで細胞を再び沈殿させ、冷たいＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、２０分間、２％パラホルムアルデヒドで固定した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで読み取ることにより、内部移行を評価した。これらのアッセイ条件下、上記の時点で、２１Ｈ３ＲＫの＜１０％内部移行が生じた。内部移行は、二次抗ヒトＩｇＧ抗体のかわりに、交差競合しないＤＬＬ４に対する抗体とインキュベートすることによっても測定することができる。いくつかの実験において、ＦＡＣＳ緩衝液で希釈した一次抗体（１０μｇ/ｍｌ）を、上記のように氷上で３０分間ＤＬＬ４を過剰発現する細胞と共に前もってインキュベートし、温かい３７℃のＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、組織培養インキュベーター（３７℃／５％ＣＯ２）の中で３０、６０、１２０または２４０分間、細胞をインキュベートした。これらのインキュベーション後、細胞を洗浄し、二次抗体とインキュベートし、上記のように固定し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで読み取った。これらの条件下、０分の対照に対して、各々６０分および２４０分の時点で、２１Ｈ３ＲＫの＜１５％および４Ｂ４の＜３５％内部移行が観察された。上記のアッセイ条件下、内部移行は、二次抗ヒトＩｇＧ抗体のかわりに、交差競合しないＤＬＬ４に対する抗体とインキュベートすることによっても測定することができる。
【実施例１６】
【０３５４】
血管新生のマウスマトリゲルプラグモデルにおける抗ＤＬＬ４抗体の活性
血管新生を調節する抗ＤＬＬ４抗体の能力を、マトリゲルプラグアッセイを使用して評価することができる。このアッセイにおいて、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦまたは腫瘍細胞のような血管新生を誘導する化合物を液体のマトリゲルに導入することができ、これは、皮下注射後、凝固し、内皮および血管平滑筋の細胞によって浸潤させ、新しい血管が形成できるようにする。簡単に説明すると、４℃で、液体型のマトリゲルをビヒクル（例えば、ＰＢＳ）または増殖因子／腫瘍細胞（例えば、ＬＬ２、ＭＣＦ７、Ａ４３１、Ｃｏｌｏ２０５、ＫＮＲＫ、Ｃａｌｕ−６、ＳＷ６２０、Ｐａｎｃ１）と混合し、メスの１２９ｓ１/ＳｖｌｍＪマウス（６〜８週齢、１グループあたり５匹）の下腹部に０．５ｍｌを皮下注射することができる。抗ＤＬＬ４抗体を、週に２度、腹腔内注射により投与することができる。５〜１０日後、血管新生の評価のために動物を人道的に安楽死させ、プラグを回収し、例えば、ＣＤ３１およびα平滑筋アクチン（αＳＭＡ）の免疫染色、ヘモグロビン含有量の計測、ならびに例えばＦＩＴＣ−デキストランを使用する血管灌流の計測の評価により血管密度および壁細胞被覆率の組織学的点数化により血管新生を測定することができる。このようにして、血管新生を調節する抗ＤＬＬ４抗体の能力を測定する。
【実施例１７】
【０３５５】
原発性患者の腫瘍試料に由来するヒト腫瘍異種移植モデルにおける抗ＤＬＬ４抗体の活性
この実施例は、マウスにおいて異種移植片として増殖させた時、原発性患者試料由来の腫瘍の増殖を阻害または予防するために抗ＤＬＬ４抗体を使用することを記載する。簡単に説明すると、レシピエントマウスを、手術に必要な麻酔量に達するまでイソフルレン吸入によって麻酔することができる。その後、抗生物質および１０％ＦＣＳｉを補充したＲＰＭＩで原発性腫瘍をリンスし、「ドロドロの混合物」を生成するために外科用メスで細かく刻み、適切な移植量に分ける（例えば、３００ｍｇ腫瘍を４匹のマウスに移植することができる）。腫瘍混合物を１３ゲージのガン移植外套針にロードすることができる。外套針のシャフトを腫瘍混合物で完全に満たし、右わき腹に皮下注射し、背部脂肪体の下でその内容物を投薬することができる。その後、このマウスをケージに戻し、回復を監視することができる。
【０３５６】
一次継代において、一般に３〜５匹のマウスに原発性腫瘍混合物を移植する。腫瘍が８００〜１０００ｍｍ３に達する時、約３×３×３ｍｍ断片にスライスし、各マウスに１断片を用いて、５匹のマウスに二次継代する。残りの腫瘍物質を、Ｈ＆Ｅ染色およびＤＮＡ／ＲＮＡ抽出に加えて、Ｒｅｃｏｖｅｒｙ（商標）細胞培養凍結培地（Ｇｉｂｃｏ,カタログ＃１２６４８−０１０）で保管する。２回の継代を超えた腫瘍を、有効性研究のために移植に使用することができる。有効性実験において、１個の腫瘍断片を各動物に移植する。
【０３５７】
腫瘍増殖後、２つの垂直な直径を測定する。腫瘍測定および体重を、処置開始後２週間、週に２回記録することができる。腫瘍容積の計算式は以下のとおりである：（Ｌ×Ｗ２）/２。
【０３５８】
ＤＬＬ４拮抗性抗体を溶液として投与することができる。平均腫瘍容積が約１００〜２００ｍｍ３に達した時か、または腫瘍移植と同時に処置を開始することができる。処置期間は、合計２８日で構成することができる。ＤＬＬ４拮抗性抗体を、例えば、５、１０または２０ｍｇ/ｋｇ/日（ｉｐ、ｑｄ、２×/ｗｋ）の単剤または他の薬剤との併用で投与することができる。腫瘍測定および体重を処置開始後４週間、週に２回記録する。従って、ＤＬＬ４抗体単独または併用のいずれかによる、患者試料由来の腫瘍異種移植片の増殖を阻害するＤＬＬ４抗体の能力を測定する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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