(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
陰イオン交換クロマトグラフィーによってＡ群連鎖球菌（ＧＡＳ）炭水化物を精製する工程を含む、ＧＡＳおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を調製する方法。
【請求項２】
前記精製されたＧＡＳ炭水化物が約１０ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記糖が部分的にまたは完全に脱Ｎ−アセチル化されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
出発原料が、ヒアルロン酸および／またはポリラムノースをさらに含むＧＡＳ炭水化物の水性懸濁物である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記懸濁物が、前記ＧＡＳ炭水化物が還元的酸処理により放出されるようにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓを処理することにより調製される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記陰イオン交換クロマトグラフィー工程に先だって、１回または複数回の濾過工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記濾過が０．６５μｍフィルタを使用する直交濾過である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記陰イオン交換クロマトグラフィー工程に先だって、１回または複数回の限外濾過工程を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記限外濾過が３０ｋＤａカットオフ膜を使用するタンジェンシャルフロー濾過である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、陰イオン交換マトリックスとしてＱ樹脂を使用して実施される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、ＧＡＳ炭水化物１ｍｇ当たり１ｍＬの陰イオン交換マトリックス樹脂を使用して実施される、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、前記ＧＡＳ炭水化物の貫流を可能にする条件下で実施される、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記陰イオン交換クロマトグラフィーの移動相緩衝液がアルコールを含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記移動相緩衝液中の最終アルコール濃度が１５％と２５％との間である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記アルコールがエタノールである、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記陰イオン交換クロマトグラフィー工程の後に１回または複数回のゲル濾過工程を含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記ゲル濾過工程が、ゲル濾過マトリックスとしてデキストランゲルを使用して実施される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ゲル濾過工程が、ＧＡＳ炭水化物０．２ｍｇ当たり１ｍＬのゲル濾過マトリックスを使用して実施される、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ゲル濾過工程が、前記陰イオン交換クロマトグラフィー工程と同じ移動相緩衝液を使用して実施される、請求項１６から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記ゲル濾過工程が、請求項１３から１５のいずれかに記載の移動相緩衝液を使用して実施される、請求項１６から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記陰イオン交換クロマトグラフィー工程の後に前記ＧＡＳ炭水化物を濃縮する１回または複数回の工程を含む、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記濃縮工程が、５または１０ｋＤａカットオフ膜を使用してタンジェンシャルフロー濾過により実施される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記精製されたＧＡＳ炭水化物を担体分子と結合体化するさらなる工程を含む、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
ＧＡＳ炭水化物を含む組成物であって、ａ）８０ｎｇ／ｍｌ未満；またはｂ）ＧＡＳ炭水化物の重量に対してヒアルロン酸１重量％未満のレベルのヒアルロン酸汚染を含む、組成物。
【請求項２５】
ＧＡＳ炭水化物の重量に対してポリラムノース２０重量％未満のレベルのポリラムノース汚染を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
ＧＡＳ炭水化物の重量に対してタンパク質約２重量％のレベルのタンパク質汚染を含む、請求項２４または２５に記載の組成物。
【請求項２７】
ＧＡＳ炭水化物の重量に対して核酸１重量％未満のレベルの核酸汚染を含む、請求項２４から２６のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００８年１０月２７日に出願された米国仮出願番号６１／１０８，７６３の利益を主張し、上記米国仮出願は、その全容が参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、細菌の多糖類、特にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓの多糖類を、特にワクチンの調製において使用するために精製する分野におけるものである。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
細菌由来の多糖類は、多年にわたりワクチンに使用されてきた。しかしながら、糖類はＴ非依存性抗原であるから、それらは免疫原性に乏しい。担体への結合体化は、Ｔ非依存性抗原をＴ依存性抗原に変換して、それにより記憶応答を増強し、保護免疫が発達するのを可能にすることができる。最も有効な糖ワクチンは、それ故、複合糖質に基づくものであり、プロトタイプの結合体化ワクチンはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタイプｂ（「Ｈｉｂ」）に対するものであった［例えば参考文献９５の第１４章を参照されたい］。
【０００４】
結合体化ワクチンについて記載された別の細菌は、「Ａ群連鎖球菌」、または単に「ＧＡＳ」としても公知のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓである。該結合体化ワクチンは、ＧＡＳ炭水化物を含み、それは細菌の細胞壁の成分である。この研究の多くはＪｏｈｎ  Ｚａｂｒｉｓｋｉｅおよび共同研究者により実施され、参考文献１、２および３などの文献において論じられている。
【０００５】
糖系ワクチンへの出発点は糖それ自体であり、一般にこれが標的細菌から精製される。ＧＡＳ炭水化物の精製のためのＺａｂｒｉｓｋｉｅ法は、参考文献４および５の方法に基づき、参考文献６（特許文献１）に詳細に記載されている。Ｚａｂｒｉｓｋｉｅにより使用された別の方法は、参考文献８および９に記載された参考文献７と同様な方法に基づく。別の方法は参考文献１０に記載されている。これらの方法は、還元的酸処理によるＧＡＳ炭水化物の抽出を含む。具体的には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓの細胞が亜硝酸ナトリウムおよび氷酢酸と組み合わされて、細胞が溶解し、それによりＧＡＳ炭水化物が放出される。次に、生成した細胞溶解産物懸濁物は、サイズ排除クロマトグラフィーにより（参考文献１０に記載のように）、例えば、溶離液としてリン酸緩衝生理食塩水を使用するゲル濾過により（参考文献６（特許文献１）に記載のように）、またはタンジェンシャルフロー濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）により（参考文献８に記載のように）精製され、その後、ＧＡＳ炭水化物が適当な担体タンパク質と結合体化される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，８６６，１３５号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
参考文献６および８〜１０は、使用された精製方法によりＧＡＳ炭水化物のどのような収率が達成されるかを示していない。その上、参考文献６および８は、生じたＧＡＳ炭水化物調製物が「１％（ｗ／ｗ）未満のタンパク質および核酸を含有する」［６］または「タンパク質および核酸を含まない」［８］と述べているが、タンパク質または核酸以外の不純物を除去する提案がない。それ故、ＧＡＳ炭水化物を精製するためのさらなる改善された方法、特により高い収率および純度を達成する方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の開示）
本発明は、糖が陰イオン交換クロマトグラフィーに供される精製方法に基づく。本発明者らは、陰イオン交換クロマトグラフィーがＧＡＳ炭水化物の良好な収率を提供することを見出した。その上、陰イオン交換クロマトグラフィーは、特に純粋なＧＡＳ炭水化物調製物を提供する。特に、本発明者らは、ＧＡＳ炭水化物がＧＡＳ莢膜多糖に由来するヒアルロン酸でしばしば汚染されることを見出した。陰イオン交換クロマトグラフィーは、ＧＡＳ炭水化物のヒアルロン酸汚染を減少させるのに特に有効である。これは、ヒアルロン酸はそれ自体で免疫原性であることが公知であるので［１１］、ＧＡＳ炭水化物がワクチンにおける使用を意図されるときに特に有利である。したがって、ヒアルロン酸の存在は、ＧＡＳ炭水化物に対する免疫応答に干渉し得る。その上、ヒアルロン酸は、ヒト組織と交差反応性である抗体を誘発すると考えられており（［１２］および［１３］）、そのため医薬製品中のその存在は、健康にとって有害であり得る。陰イオン交換クロマトグラフィーは、ＧＡＳ炭水化物のタンパク質および核酸汚染を減少させるのにも特に有効である。
【０００９】
さらなる利点として、本発明者らは、陰イオン交換クロマトグラフィー中に、不純物は陰イオン交換マトリックスに結合するが、一方ＧＡＳ炭水化物は系を素通りして溶離物中に流入する、すなわち、糖が「貫流する」ことを可能にする条件下でＧＡＳ炭水化物の精製を実施することができることを見出した。これらの条件を使用すると、ＧＡＳ炭水化物をマトリックスから溶離するために、イオン強度を増大させるかまたはｐＨを上昇させる移動相緩衝液その他を使用する必要がないので、精製方法は簡単になる。
【００１０】
本発明者らは、ＧＡＳ炭水化物がしばしばＧＡＳ炭水化物のポリラムノシル改変体で汚染されることも見出した。本発明の精製方法は、ＧＡＳ炭水化物のポリラムノース汚染を減少させるために特に有効である。
【００１１】
したがって、本発明は、陰イオン交換クロマトグラフィーの工程を含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓのＧＡＳ炭水化物を精製するための方法を提供する。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓのＧＡＳ炭水化物は、ヒアルロン酸、連鎖球菌性タンパク質および核酸の少なくとも１つを含む懸濁物に含まれることがある。特に、本発明は、陰イオン交換クロマトグラフィーの工程を含む、ＧＡＳ炭水化物をヒアルロン酸から分離する方法を提供する。ヒアルロン酸は、典型的にはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓの莢膜多糖に由来する。この方法中で、他の精製工程を、陰イオン交換クロマトグラフィー工程の前または後のいずれかに含めることもできる。例えば、濾過工程（単数または複数）は、高分子量の汚染物質（細胞残渣など）を除去するために含めることができる。同様に、低分子量の汚染物質（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ多糖類のフラグメントなど）を除去するために、特に前記濾過工程（単数または複数）後に、限外濾過工程（単数または複数）を含めることができる。また、ゲル濾過工程（単数または複数）は、特定の長さのＧＡＳ炭水化物分子を選択し、且つ汚染、特にタンパク質による汚染を低減するために含めることができる。ゲル濾過工程（単数または複数）に加えて、またはその代わりに、本発明の方法は、ＧＡＳ炭水化物を濃縮する１回または複数回の工程を含むことができる。濾過および／または限外濾過工程（単数または複数）は、典型的には陰イオン交換クロマトグラフィー工程の前に実施され、一方、ゲル濾過工程（単数または複数）および／または濃縮工程（単数または複数）は、典型的には陰イオン交換クロマトグラフィー工程の後に実施される。ＧＡＳ炭水化物の糖は、その後のワクチン調製のために加工することができる。したがって、透析および／または凍結乾燥工程などの種々の加工工程を方法中に含めることができる。この方法は、精製されたＧＡＳ炭水化物を担体分子と結合体化する工程も含むこともできる。典型的には、この結合体化工程は、上記精製工程（単数または複数）の後に実施される。
【００１２】
したがって、本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓのＧＡＳ炭水化物を精製するための方法において、陰イオン交換クロマトグラフィーの使用からなる改善を提供する。陰イオン交換クロマトグラフィーの結果として、ヒアルロン酸、タンパク質および核酸による汚染が限定されたＧＡＳ炭水化物が、良好な収率で生じる。
【００１３】
陰イオン交換クロマトグラフィー工程の収率は、典型的には７０％を超える（例えば＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％）。実用的限界は、収率が９０％を超えないこともあることを意味する（例えば、＜９０％、＜８０％、＜７５％その他であることもある）。
【００１４】
本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ菌からＧＡＳ炭水化物を精製するための方法であって、２００ｎｇ／ｍｌ未満（例えば≦１５０ｎｇ／ｍｌ、≦１００ｎｇ／ｍｌ、≦９０ｎｇ／ｍｌ、≦８０ｎｇ／ｍｌ、≦７５ｎｇ／ｍｌ、≦６０ｎｇ／ｍｌ、≦５０ｎｇ／ｍｌ、≦４０ｎｇ／ｍｌ、≦２５ｎｇ／ｍｌ、≦２０ｎｇ／ｍｌ、≦１０ｎｇ／ｍｌその他）のレベルのヒアルロン酸汚染を含む組成物を提供する方法も提供する。典型的には、ヒアルロン酸汚染のレベルは、１００ｎｇ／ｍｌ未満、特に８０ｎｇ／ｍｌ未満である。ヒアルロン酸汚染のレベルは、精製された試料中に存在するＧＡＳ炭水化物の重量に対するヒアルロン酸の重量によって表すこともできる。この方法では、本発明は、ＧＡＳ炭水化物の重量に対してヒアルロン酸５重量％未満（例えば≦４％、≦３％、≦２％、≦１％、≦０．７５％、≦０．５％、≦０．２５％、≦０．１％その他）のヒアルロン酸汚染のレベルを含む組成物を提供する、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ菌からＧＡＳ炭水化物を精製するための方法を提供する。典型的には、ヒアルロン酸汚染のレベルは、ＧＡＳ炭水化物の重量に対してヒアルロン酸１重量％未満である。これより低いレベル、例えばＧＡＳ炭水化物の重量に対してヒアルロン酸０．００５重量％以下も得ることが可能である。
【００１５】
本発明は、ＧＡＳ炭水化物の重量に対してポリラムノース５０重量％未満（例えば≦４０％、≦３０％、≦２５％、≦２０％、≦１５％、≦１０％、≦８％、≦６％、≦５％、≦４％、≦２％、≦１％その他）のポリラムノース汚染のレベルを含む組成物を提供する、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ菌由来のＧＡＳ炭水化物を精製するための方法も提供する。典型的には、ポリラムノース汚染のレベルは、ＧＡＳ炭水化物の重量に対してポリラムノース２０重量％未満である。これより低いレベル、例えばＧＡＳ炭水化物の重量に対してポリラムノース５重量％以下も得ることが可能である。
【００１６】
本発明は、ＧＡＳ炭水化物の重量に対してタンパク質４．０重量％未満（例えば、≦３．５％、≦３．１％、≦３．０％、≦２．５％、≦２．０％、≦１．５％、≦１．０％、その他）のタンパク質汚染のレベルを含む組成物を提供する、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ菌からＧＡＳ炭水化物を精製するための方法も提供する。典型的には、タンパク質汚染のレベルは、ＧＡＳ炭水化物の重量に対してタンパク質およそ２重量％である。
【００１７】
本発明は、ＧＡＳ炭水化物の重量に対して核酸５重量％未満（例えば≦４％、≦３％、≦２％、≦１％、≦０．７５％、≦０．５％、≦０．２５％、≦０．１％その他）の核酸汚染のレベルを含む組成物を提供する、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ菌由来のＧＡＳ炭水化物を精製するための方法も提供する。典型的には、核酸汚染のレベルは、ＧＡＳ炭水化物の重量に対して核酸１重量％未満である。これより低いレベル、例えば、ＧＡＳ炭水化物の重量に対して核酸０．５重量％未満を得ることも可能である。
【００１８】
本発明は、（ａ）ヒアルロン酸汚染のレベルが２００ｎｇ／ｍｌまたは５％未満（上記の通り）である；（ｂ）ポリラムノース汚染のレベルが５０％未満（上記の通り）である；（ｃ）タンパク質汚染のレベルが４．０％未満（上記の通り）である、および（ｄ）核酸汚染のレベルが５％未満（上記の通り）である、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ菌由来のＧＡＳ炭水化物を精製するための方法も提供する。
【００１９】
本発明は、本発明の方法により得ることができる、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＧＡＳ炭水化物を含む組成物も提供する。
【００２０】
本発明は、２００ｎｇ／ｍｌ未満（例えば≦１５０ｎｇ／ｍｌ、≦１００ｎｇ／ｍｌ、≦９０ｎｇ／ｍｌ、≦８０ｎｇ／ｍｌ、≦７５ｎｇ／ｍｌ、≦６０ｎｇ／ｍｌ、≦５０ｎｇ／ｍｌ、≦４０ｎｇ／ｍｌ、≦２５ｎｇ／ｍｌ、≦２０ｎｇ／ｍｌ、≦１０ｎｇ／ｍｌその他）のヒアルロン酸汚染のレベルを含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＧＡＳ炭水化物を含む組成物も提供する。典型的には、ヒアルロン酸汚染のレベルは、１００ｎｇ／ｍｌ未満、特に８０ｎｇ／ｍｌ未満である。ヒアルロン酸汚染のレベルは、組成物の合計重量に対してヒアルロン酸の重量により表すこともできる。この方法で、本発明は、ＧＡＳ炭水化物の重量に対してヒアルロン酸５重量％未満（例えば≦４％、≦３％、≦２％、≦１％、≦０．７５％、≦０．５％、≦０．２５％、≦０．１％その他）のヒアルロン酸汚染のレベルを含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＧＡＳ炭水化物を含む組成物を提供する。典型的には、ヒアルロン酸汚染のレベルは、ＧＡＳ炭水化物の重量に対してヒアルロン酸１重量％未満である。これより低いレベル、例えば、ＧＡＳ炭水化物の重量に対してヒアルロン酸０．００５重量％以下も得ることも可能である。
【００２１】
本発明は、ＧＡＳ炭水化物の重量に対してポリラムノース５０重量％未満（例えば≦４０％、≦３０％、≦２５％、≦２０％、≦１５％、≦１０％、≦８％、≦６％、≦５％、≦４％、≦２％、≦１％その他）のポリラムノース汚染のレベルを含むＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＧＡＳ炭水化物を含む組成物も提供する。典型的には、ポリラムノース汚染のレベルは、ＧＡＳ炭水化物の重量に対してポリラムノース２０重量％未満である。これより低いレベル、例えば、ＧＡＳ炭水化物の重量に対してポリラムノース５重量％以下も得ることも可能である。
【００２２】
本発明は、ＧＡＳ炭水化物の重量に対してタンパク質４．０重量％未満（例えば≦３．５％、≦３．１％、≦３．０％、≦２．５％、≦２．０％、≦１．５％、≦１．０％、その他）のタンパク質汚染のレベルを含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＧＡＳ炭水化物を含む組成物も提供する。典型的には、タンパク質汚染のレベルは、ＧＡＳ炭水化物の重量に対してタンパク質およそ２重量％である。
【００２３】
本発明は、ＧＡＳ炭水化物の重量に対して核酸５重量％未満（例えば≦４％、≦３％、≦２％、≦１％、≦０．７５％、≦０．５％、≦０．２５％、≦０．１％その他）の核酸汚染のレベルを含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＧＡＳ炭水化物を含む組成物も提供する。典型的には、核酸汚染のレベルは、ＧＡＳ炭水化物の重量に対して核酸１重量％未満である。これより低いレベル、例えば、ＧＡＳ炭水化物の重量に対して核酸０．５重量％未満も得ることが可能である。
【００２４】
本発明は、（ａ）ヒアルロン酸汚染のレベルが２００ｎｇ／ｍｌまたは５％未満（上記の通り）である；（ｂ）ポリラムノース汚染のレベルが５０％未満（上記の通り）である；（ｃ）タンパク質汚染のレベルが４．０％未満（上記の通り）である、および（ｄ）核酸汚染のレベルが５％未満（上記の通り）である、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＧＡＳ炭水化物を含む組成物も提供する。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
陰イオン交換クロマトグラフィーの工程を含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓのＧＡＳ炭水化物を精製するための方法。
（項目２）
上記精製されたＧＡＳ炭水化物が約１０ｋＤａの分子量を有する、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記糖が部分的にまたは完全に脱Ｎ−アセチル化されている、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
出発原料が、ヒアルロン酸および／またはポリラムノースをさらに含むＧＡＳ炭水化物の水性懸濁物である、前述の項目のいずれかに記載の方法。
（項目５）
上記懸濁物が、上記ＧＡＳ炭水化物が放出されるようにＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓを処理することにより調製される、項目４に記載の方法。
（項目６）
上記ＧＡＳ炭水化物が還元的酸処理により放出される、項目５に記載の方法。
（項目７）
上記陰イオン交換クロマトグラフィー工程に先だって、１回または複数回の濾過工程を含む、前述の項目のいずれかに記載の方法。
（項目８）
上記濾過が０．６５μｍフィルタを使用する直交濾過である、項目７に記載の方法。
（項目９）
上記陰イオン交換クロマトグラフィー工程に先だって、１回または複数回の限外濾過工程を含む、前述の項目のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
上記限外濾過が３０ｋＤａカットオフ膜を使用するタンジェンシャルフロー濾過である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
上記陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、陰イオン交換マトリックスとしてＱ樹脂を使用して実施される、前述の項目のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
上記陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、ＧＡＳ炭水化物１ｍｇ当たり１ｍＬの陰イオン交換マトリックス樹脂を使用して実施される、前述の項目のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
上記陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、上記ＧＡＳ炭水化物の貫流を可能にする条件下で実施される、前述の項目のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
上記陰イオン交換クロマトグラフィーの移動相緩衝液がアルコールを含む、前述の項目のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
上記移動相緩衝液中の最終アルコール濃度が１５％と２５％との間である、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
上記アルコールがエタノールである、項目１４または１５に記載の方法。
（項目１７）
上記陰イオン交換クロマトグラフィー工程の後に１回または複数回のゲル濾過工程を含む、前述の項目のいずれかに記載の方法。
（項目１８）
上記ゲル濾過工程が、ゲル濾過マトリックスとしてデキストランゲルを使用して実施される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
上記ゲル濾過工程が、ＧＡＳ炭水化物０．２ｍｇ当たり１ｍＬのゲル濾過マトリックスを使用して実施される、項目１７または１８に記載の方法。
（項目２０）
上記ゲル濾過工程が、上記陰イオン交換クロマトグラフィー工程と同じ移動相緩衝液を使用して実施される、項目１７から１９のいずれかに記載の方法。
（項目２１）
上記ゲル濾過工程が、項目１４から１６のいずれかに記載の移動相緩衝液を使用して実施される、項目１７から２０のいずれかに記載の方法。
（項目２２）
上記陰イオン交換クロマトグラフィー工程の後に上記ＧＡＳ炭水化物を濃縮する１回または複数回の工程を含む、前述の項目のいずれかに記載の方法。
（項目２３）
上記濃縮工程が、５または１０ｋＤａカットオフ膜を使用してタンジェンシャルフロー濾過により実施される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
上記精製されたＧＡＳ炭水化物を担体分子と結合体化するさらなる工程を含む、前述の項目のいずれかに記載の方法。
（項目２５）
項目１から２４のいずれかに記載の方法により得ることができる、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＧＡＳ炭水化物を含む組成物。
（項目２６）
ａ）８０ｎｇ／ｍｌ未満；またはｂ）ＧＡＳ炭水化物の重量に対してヒアルロン酸１重量％未満のレベルのヒアルロン酸汚染を含む、項目２５に記載の組成物。
（項目２７）
ＧＡＳ炭水化物の重量に対してポリラムノース２０重量％未満のレベルのポリラムノース汚染を含む、項目２５または２６に記載の組成物。
（項目２８）
ＧＡＳ炭水化物の重量に対してタンパク質約２重量％のレベルのタンパク質汚染を含む、項目２５から２７のいずれかに記載の組成物。
（項目２９）
ＧＡＳ炭水化物の重量に対して核酸１重量％未満のレベルの核酸汚染を含む、項目２５から２８のいずれかに記載の組成物。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＧＡＳ炭水化物の構造を例示する。
【図２】図２は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＧＡＳ炭水化物の構造とＡ群改変体連鎖球菌からのＧＡＳ炭水化物の構造とを比較する。
【図３】図３は、ＧＡＳ炭水化物について典型的ＮＭＲスペクトルを示す。
【図４】図４は、ゲル濾過後のＧＡＳ炭水化物についての典型的ＮＭＲスペクトルを示す。
【図５】図５は、陰イオン交換、カチオン交換および疎水性相互作用クロマトグラフの方法を使用して得られたＧＡＳ炭水化物調製物のヒアルロン酸汚染と３ｋＤａカットオフ膜を用いる限外濾過のみの後に見られた汚染とを比較する。
【図６】図６は、ＧＡＳ炭水化物を精製するための最適化された方法のまとめである。
【図７】図７は、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅでの陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製されたＧＡＳ炭水化物についての典型的クロマトグラムを示す。
【図８】図８は、タンジェンシャルフロー濾過による濃縮後のＧＡＳ炭水化物についての典型的ＨＰＬＣ−ＳＥプロファイルを示す。
【図９】図９は、ゲル濾過後のＧＡＳ炭水化物についての注を付けたＮＭＲスペクトルを示す。
【図１０】図１０は、ゲル濾過後のＧＡＳ炭水化物についての典型的クロマトグラムを示す。
【図１１】図１１は、１）陰イオン交換クロマトグラフィー工程および２）１０ｋＤａタンジェンシャルフロー濾過工程の後のＧＡＳ炭水化物に対して実施された分析ゲル濾過クロマトグラムを示す。
【図１２】図１２は、１０ｋＤａタンジェンシャルフロー濾過；１０ｋＤａタンジェンシャルフロー濾過およびゲル濾過；ならびにゲル濾過のみの後のＧＡＳ炭水化物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１３】図１３は、ＧＡＳ炭水化物−ＣＲＭ１９７結合体を得るための反応スキームを例示する。
【図１４】図１４は、ＧＡＳ炭水化物−ＣＲＭ１９７結合体のＳＤＳ−Ｐａｇｅゲル分析を示す。
【図１５】図１５は、リンカーを含むＧＡＳ炭水化物−ＣＲＭ１９７結合体の、１）ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲル分析および２）ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（ＧＡＳ炭水化物）
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＧＡＳ炭水化物（ＧＡＳ細胞壁多糖、またはＧＡＳＰとしても公知）は、典型的には、交互のα−（１→２）結合およびα−（１→３）結合からなるＬ−ラムノピラノース（Ｒｈａｐ）骨格および交互のラムノース環にβ−（１→３）結合したＤ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃｐＮＡｃ）残基を有する分岐構造（図１および［１４］）を特徴とする。Ｒｈａｐ骨格は存在するがＧｌｃｐＮＡｃ分岐がないＡ群改変体連鎖球菌は記載されている（すなわちポリラムノース、図２および［６］）。本発明は、好ましくは、Ａ群改変体連鎖球菌よりもむしろＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＧＡＳ炭水化物を含む。実際、本発明の精製方法は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＧＡＳ炭水化物のポリラムノース汚染を減少させるのに特に有効である。
【００２７】
本発明により精製された糖類は、一般にそれらの天然型であるが、それらは改変されていてもよい。例えば、糖は天然のＧＡＳ炭水化物より短くても、または化学的に改変されていてもよい。
【００２８】
したがって、本発明により使用される糖は、自然界で見出される実質的に全長のＧＡＳ炭水化物であってもよく、天然の長さより短くてもよい。全長の多糖類は、本発明で使用するために、例えば弱酸中の加水分解により、加熱により、サイズで分けるクロマトグラフィーその他により、より短いフラグメントを生じるように解重合することができる。ＧＡＳ炭水化物上の末端ユニットに相当すると考えられる短いフラグメントが、ワクチンで使用するために提案されている［１５］。したがって、短いフラグメントは本発明において予見されている。しかしながら、実質的に全長の糖類を使用することが好ましい。本発明により精製された糖類は、典型的には、約１０ｋＤａ、特に約７．５〜８．５ｋＤａの分子量を有する。分子量は、ＨＰＬＣ、例えばＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷカラム（Ｓｉｇｍａ）を使用するＳＥＣ−ＨＰＬＣにより、プルラン標準、例えばＰｏｌｙｍｅｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅ［１６］から入手できるものなどに比較して測定することができる。この測定の典型的条件は、１００ｍＭ  ＮａＰｉ、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび５％アセトニトリルを含む溶離緩衝液を０．５ｍｌ／分の流速で用いる定組成溶離を含む。ＧＡＳ炭水化物の存在は、２１４ｎｍにおける吸光度を測定することにより検出することができる。
【００２９】
糖は、天然に見出されるＧＡＳ炭水化物に比較して化学的に改変されていてもよい。例えば、糖は、脱Ｎ−アセチル化（部分的にまたは完全に）、Ｎ−プロピオニル化（部分的にまたは完全に）その他を受けていてもよい。脱アセチル化その他の、例えば免疫原性に対する効果は、日常的アッセイにより評価することができる。
【００３０】
（出発原料）
本発明の方法は、典型的には、水性形態にあるＧＡＳ炭水化物で、例えば水性懸濁物として、ヒアルロン酸および／またはポリラムノースをさらに含んで出発する。連鎖球菌のタンパク質および／または核酸が懸濁物中に存在してもよい。通常、懸濁物は、ヒアルロン酸、ポリラムノース、タンパク質および核酸を含む。ヒアルロン酸は、通常、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓの莢膜多糖に由来する。
【００３１】
典型的には、出発原料は、ＧＡＳ炭水化物が放出されるように細菌自体（または細菌の細胞壁を含有する材料）を処理することにより調製される。例えば、細菌は、好ましくは定常相における細菌の培養液から採収することができる。培養液は、採収に先だって熱不活化することができる。例えば、本発明者らは、９０℃で６０分間の熱処理が培養液の不活化に適することを見出した。採収は、培養液を遠心分離して細菌のペレットを例えば水または生理食塩水緩衝液中に再懸濁させることを含むことができる。遠心分離に先だって、培養液は、タンジェンシャルフロー濾過により、例えば０．２μｍの中空繊維カートリッジフィルタを使用して処理することができる［８］。遠心分離は、任意の適当な速度で、例えば１００ｇと１０，０００ｇとの間で実施することができる。３００ｇの速度は、有効であることが見出された。３０００ｇの速度は参考文献８で言及されている。細菌が生理食塩水緩衝液中に再懸濁される場合、懸濁物を、さらなる処理の前に水で希釈することができる［８］。
【００３２】
ＧＡＳ炭水化物は、化学的、物理的または酵素的処理を含む種々の方法により細菌から放出させることができる。典型的な化学的処理は、例えば亜硝酸ナトリウムおよび氷酢酸を使用する還元的酸処理［例えば参考文献４、５、７および１０に記載されている］であり、それは細菌からＧＡＳ炭水化物を放出させる。典型的には、等容積の４Ｎ硝酸ナトリウムおよび氷酢酸を細菌の懸濁物に加えて、混合物を適当な長さの時間、例えば１時間攪拌する。処理は適当な温度、例えば３７℃で実施する。混合物の最終ｐＨは典型的にはおよそ３．０である。混合物のｐＨは、例えば４Ｍ水酸化ナトリウムを使用しておよそ６から７に中和することができる。混合物は水で希釈することができる［８］。
【００３３】
（濾過および限外濾過）
培養後に例えば上で論じた還元的酸処理により得られたＧＡＳ炭水化物は、一般に不純であり、ヒアルロン酸および／またはポリラムノースで汚染されている。連鎖球菌のタンパク質および／または核酸も存在することがある。高分子量種を除去することによりＧＡＳ炭水化物を精製するために、１回または複数回の濾過工程を使用することができる。例えば、本発明者らは、直交濾過（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を含む濾過工程は、濾液中に保持される、ＧＡＳ炭水化物からの不純物を除去するために使用することができることを見出した。典型的には、直交濾過は、０．６５μｍのフィルタを使用して実施される。例えば、Ｓａｒｔｏｐｕｒｅ  ＧＦ２ＴＭ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）カプセル（面積は０．２ｍ２）を使用することができる。しかし、０．２μｍのフィルタも使用することができる。収率を改善するために、いかなる残留濾液も、フィルタから取り出して濾液の残部と併せることができる。この取り出しは、例えば、推進力（例えば蠕動性推進力または圧力）をフィルタに加えることにより、または系に蒸留水を供給することにより行うことができる。
【００３４】
低分子量種を除去することによりＧＡＳ炭水化物を精製するために、１回または複数回の限外濾過工程を使用することもできる。限外濾過は、ＧＡＳ炭水化物を濃縮することもできる。好ましくは、１回または複数回の限外濾過工程は、上記の濾過工程（単数または複数）の後に実施される。本発明者らは、例えばタンジェンシャルフロー濾過による透析濾過工程が、濃縮物中に保持される、ＧＡＳ炭水化物から不純物を除去するために特に有効であることを見出した。ＧＡＳ炭水化物溶液は、透析濾過に先だって例えば約１５〜２０倍濃縮することができる。タンジェンシャルフロー濾過は、１Ｍ  ＮａＣｌに対して（例えば約１０倍の容積に対して）、および次に水に対して（例えばさらなる１０倍の容積に対して）実施するのが適当である。タンジェンシャルフロー濾過は、３、５、１０または３０ｋＤａカットオフ膜を使用して水に対して実施することができる。例えば、ＨｙｄｒｏｓａｒｔＴＭ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）５ｋＤａカットオフ膜（膜面積０．１ｍ２）を使用することができる。ＨｙｄｒｏｓａｒｔＴＭは、安定化されたセルロース膜であり、親水性で且つ広いｐＨ範囲にわたって安定である。しかしながら、本発明者らは、３０ｋＤａカットオフ膜を使用するタンジェンシャルフロー濾過が、大規模方法に、より適することを見出した。このタンジェンシャルフロー濾過も、ＧＡＳ炭水化物の実質的損失なしでよりよいタンパク質汚染除去およびより短い濾過時間を可能にする。タンジェンシャルフロー濾過後に、濃縮物は、例えば約５倍濃縮され得る。収率を改善するために、膜を例えば２回、膜のデッドボリュームに対応する蒸留水で洗浄して、洗液を濃縮物に加えることができる。
【００３５】
濾過および／または限外濾過の後、ＧＡＳ炭水化物調製物を濃縮することができる。典型的には、ＧＡＳ炭水化物調製物は、さらなる処理の前に水に対して透析濾過される。
【００３６】
（陰イオン交換クロマトグラフィー）
本発明の方法は、陰イオン交換クロマトグラフィーの工程を含む。本発明者らは、陰イオン交換クロマトグラフィーが、糖の良好な収率を保ちながら、ＧＡＳ炭水化物のヒアルロン酸、タンパク質および核酸汚染の除去に特に有効であることを見出した。
【００３７】
陰イオン交換クロマトグラフィー工程は、上で論じた濾過および／または限外濾過工程の後に実施することができる。
【００３８】
陰イオン交換クロマトグラフィーは、任意の適当な陰イオン交換マトリックスを使用して実施することができる。普通に使用される陰イオン交換マトリックスは、Ｑ樹脂（第四級アミンに基づく）およびＤＥＡＥ樹脂（ジエチルアミノエタンに基づく）などの樹脂である。本発明者らは、Ｑ樹脂（例えばＱ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭＸＬまたはＱ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭＦＦ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））が特に適当であることを見出したが、他の樹脂も使用することができる。精製されるべき材料の量に対して適当な樹脂の量は、過度の負担なしに日常的実験により決定することができる。例えば、本発明者らは、ＧＡＳ炭水化物０．５ｍｇまたは１ｍｇ当たり１ｍＬの樹脂が効果的であり得ることを見出した。
【００３９】
陰イオン交換クロマトグラフィーのための適当な開始緩衝液および移動相緩衝液も、過度の負担なしに日常的実験により決定することができる。陰イオン交換クロマトグラフィーにおいて使用するための典型的な緩衝液には、Ｎ−メチルピペラジン、ピペラジン、Ｌ−ヒスチジン、ビストリス、ビストリスプロパン、トリエタノールアミン、トリス、Ｎ−メチル−ジエタノールアミン、ジエタノールアミン、１，３−ジアミノプロパン、エタノールアミン、ピペリジンおよびリン酸緩衝液が含まれる。本発明者らは、有利なことに、不純物が陰イオン交換マトリックスに結合し、一方、ＧＡＳ炭水化物は系を素通りして溶離物に流入する、ＧＡＳ炭水化物の「貫流」を可能にする条件下で、陰イオン交換クロマトグラフィー工程を実施することができることを見出した。これら条件の使用により、マトリックスからＧＡＳ炭水化物を溶離するために、イオン強度を増大させるかまたはｐＨを上昇させる移動相緩衝液その他を使用する必要がないので、精製方法は簡単になる。貫流陰イオン交換クロマトグラフィーのための適当な条件は、過度の負担なしに日常的実験により決定することができる。リン酸緩衝液、例えばリン酸ナトリウム緩衝液は、陰イオン交換クロマトグラフィーのための移動相に適当であり得る。緩衝液は任意の適当な濃度であってよい。例えば、１０ｍＭリン酸ナトリウムは適当であることが見出されている。
【００４０】
本発明者らは、アルコールを移動相緩衝液に加えるとＧＡＳ炭水化物の収率を増加させることができることを見出した。本発明者らは、移動相緩衝液中のアルコールがＧＡＳ炭水化物調製物における濁りを減少させ得ることも見出した。しかしながら、本発明者らは、少しもアルコールを含有しない移動相緩衝液を使用することが大規模方法に、より適することを見出した。使用されるときは、任意の適当な濃度のアルコールが移動相緩衝液中に存在してもよい。例えば、アルコールは、移動相緩衝液に添加されて５容積％と５０容積％との間の最終アルコール濃度（例えばおよそ１０容積％、１５容積％、２０容積％、２５容積％、３０容積％）を与えることができる。典型的には、アルコールは、移動相緩衝液に１５容積％と２５容積％との間、特に２０容積％の最終アルコール濃度を与えるように添加される。アルコールは好ましくは低級アルコール、例えば、メタノール、エタノール、プロパン−１−オール、プロパン−２−オール、ブタン−１−オール、ブタン−２−オール、２−メチル−プロパン−１−オール、２−メチル−プロパン−２−オール、ジオール、その他である。適当なアルコールの選択は、過度の負担なしに経験的に試験することができるが、フェノールなどのアルコールよりもむしろエタノールおよびイソプロパノール（プロパン−２−オール）などのアルコールが好ましい。典型的には、アルコールはエタノールである。アルコールは、純粋な形態で添加することもまたは混和性溶媒（例えば水）で希釈された形態で添加することもできる。好ましい溶媒混合物は、およそ７０：３０とおよそ９５：５との間の好ましい比（例えば７５：２５、８０：２０、８５：１５、９０：１０）のアルコール：水混合物である。
【００４１】
溶離物のＧＡＳ炭水化物を含有する画分は、２１５ｎｍにおけるＵＶ吸収を測定することにより決定することができる。溶離した材料は、陰イオン交換クロマトグラフィー工程前のＧＡＳ炭水化物調製物と比較して高度に精製されていた。ＧＡＳ炭水化物を含有する全ての画分を合わせてさらに処理することができる。
【００４２】
陰イオン交換クロマトグラフィー工程は、例えば１、２、３、４または５回繰り返すことができる。しかしながら、典型的には、陰イオン交換クロマトグラフィー工程は１回実施されるであろう。
【００４３】
（ゲル濾過）
本発明の方法は、１回または複数回のゲル濾過の工程を含むことができる。このゲル濾過は、特定の長さのＧＡＳ炭水化物分子を選択し且つ特にタンパク質による汚染をさらに減少させるために使用される。しかしながら、本発明者らは、参考文献６とは反対に、ゲル濾過工程は、高純度のＧＡＳ炭水化物を得るために必要とされないことを見出した。したがって、この工程は、本発明の方法から省略することができる。この工程を省略すると、該方法を大規模に実現することの可能性を促進し得る。
【００４４】
例えば、ゲル濾過工程（単数または複数）は、上で論じた陰イオン交換クロマトグラフィー工程の後に実施することができる。
【００４５】
ゲル濾過工程（単数または複数）は、任意の適当なゲル濾過マトリックスを使用して実施することができる。普通使用されるゲル濾過マトリックスは、デキストランゲル、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、ポリアクリロイルモルホリンゲル、およびポリスチレンゲルその他をベースとする。架橋デキストランゲルおよび混合ポリアクリルアミド／アガロースゲルも使用することができる。本発明者らは、デキストランゲル（例えばＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ１００ゲルまたはＳｅｐｈａｄｅｘＴＭＧ５０ゲル（両方ともＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））が特に適当であることを見出したが、他のゲルも使用することができる。精製されるべき材料の量に対してゲルの適当な量は、過度の負担なしに日常的実験により決定することができる。例えば、本発明者らは、ＧＡＳ炭水化物０．２ｍｇ当たり１ｍＬのゲルが有効であり得ることを見出した。同様に、任意の所与のゲル濾過カラムに対して適当なＧＡＳ炭水化物調製物の容積は、過度の負担なしに日常的実験により決定することができる。通常、ゲル濾過カラムに適用されるＧＡＳ炭水化物調製物の容積は、カラム容積の５％を超えない。
【００４６】
ゲル濾過のために適当な移動相緩衝液は、過度の負担なしに日常的実験により決定することができる。ゲル濾過で使用するための典型的な緩衝液には、Ｎ−メチルピペラジン、ピペラジン、Ｌ−ヒスチジン、ビストリス、ビストリスプロパン、トリエタノールアミン、トリス、Ｎ−メチル−ジエタノールアミン、ジエタノールアミン、１，３−ジアミノプロパン、エタノールアミン、ピペリジンおよびリン酸緩衝液が含まれる。例えば、リン酸緩衝液、例えばリン酸ナトリウム緩衝液は、移動相に適し得る。緩衝液は任意の適当な濃度であってよい。例えば、１０ｍＭリン酸ナトリウムは移動相として使用することができる。
【００４７】
本発明者らは、有利なことに、ゲル濾過は、陰イオン交換クロマトグラフィー工程と同じ移動相緩衝液を使用して実施することができることを見出した。この緩衝液を使用すると、異なった緩衝液を調製する必要がないので、精製方法が簡単になる。例えば、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液は、両工程の移動相として使用することができる。
【００４８】
またしても、ゲル濾過のための移動相緩衝液にアルコールを添加することは好ましい。この添加は、ＧＡＳ炭水化物の収率を増大させる、および／またはＧＡＳ炭水化物調製物中の濁りを減少させることができる。任意の適当な濃度のアルコールを移動相緩衝液中で使用することができる。例えば、アルコールは、移動相緩衝液に、５容積％と５０容積％との間の最終アルコール濃度（例えばおよそ１０容積％、１５容積％、２０容積％、２５容積％、３０容積％）を与えるように添加することができる。典型的には、アルコールは、移動相緩衝液に、１５容積％と２５容積％との間、特に２０容積％の最終アルコール濃度を与えるように添加される。アルコールは、好ましくは低級アルコール、例えばメタノール、エタノール、プロパン−１−オール、プロパン−２−オール、ブタン−１−オール、ブタン−２−オール、２−メチル−プロパン−１−オール、２−メチル−プロパン−２−オール、ジオールなどである。適当なアルコールの選択は、過度の負担なしに経験的に試験することができるが、フェノールなどのアルコールよりもむしろエタノールおよびイソプロパノール（プロパン−２−オール）などのアルコールが好ましい。典型的には、アルコールはエタノールである。アルコールは、純粋な形態で添加することもまたは混和性溶媒（例えば水）で希釈された形態で添加することもできる。好ましい溶媒混合物は、およそ７０：３０とおよそ９５：５との間の好ましい比（例えば７５：２５、８０：２０、８５：１５、９０：１０）のアルコール：水混合物である。
【００４９】
溶離物のＧＡＳ炭水化物を含有する画分は、２１５ｎｍにおけるＵＶ吸収を測定することにより決定することができる。本発明者らは、ＧＡＳ炭水化物が溶離物に２本のピークとして存在し得ることを見出した。１本のピークは高分子量ＧＡＳ炭水化物糖類に対応し、他の（しばしば、より小さい）ピークは低分子量ＧＡＳ炭水化物糖類に対応する。ＧＡＳ炭水化物調製物がその後ワクチン調製物として加工されることになっていれば、通常、高分子量ＧＡＳ炭水化物糖類を含有する画分が選択される。あるいは、高分子量および低分子量両方のＧＡＳ炭水化物糖類を含有する画分を、さらなる処理の前にプールすることもできる。
【００５０】
ＧＡＳ炭水化物調製物は、さらなる処理の前に、水に対して透析濾過することもできる。
【００５１】
（濃縮）
本発明の方法は、１回または複数回のゲル濾過工程に加えて、またはその代わりに、ＧＡＳ炭水化物を濃縮する１回または複数回の工程を含むことができる。この濃縮は、下で記載するように、その後のＧＡＳ炭水化物の担体分子との結合体化のために適当な濃度の試料を得るために有用である。しかしながら、本発明者らは、この濃縮工程は、高純度のＧＡＳ炭水化物を得るために必要とされないことを見出した。したがって、この工程は、本発明の方法から省略することができる。
【００５２】
本発明者らは、大規模方法のためには、ＧＡＳ炭水化物を濃縮する１回または複数回の工程の使用が、ゲル濾過の使用より適当であることを見出した。ＧＡＳ炭水化物を上記のように３０ｋＤａカットオフ膜を使用してタンジェンシャルフロー濾過により精製するときに、ＧＡＳ炭水化物を濃縮する１回または複数回の工程の使用は特に適当である。本発明者らは、このタンジェンシャルフロー濾過工程の使用が、ＧＡＳ炭水化物から不純物、特にポリラムノースを除去するために、方法中にゲル濾過工程（単数または複数）を含める必要のないことを意味することを見出した。
【００５３】
例えば、濃縮工程（単数または複数）は、上で論じた陰イオン交換クロマトグラフィー工程の後に実施することができる。上で論じたゲル濾過工程（単数または複数）に加えて使用される場合、濃縮工程（単数または複数）は、上で論じたゲル濾過工程（単数または複数）の前または後に実施することができる。しかしながら、通常、濃縮工程（単数または複数）は、ゲル濾過工程（単数または複数）の代わりに使用される。
【００５４】
濃縮工程（単数または複数）は、任意の適当な方法により実施することができる。例えば、本発明者らは、濃縮工程（単数または複数）は、上記のように、限外濾過工程（単数または複数）、例えば５または１０ｋＤａカットオフ膜を使用するタンジェンシャルフロー濾過であってよいことを見出した。例えば、ＨｙｄｒｏｓａｒｔＴＭ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）１０ｋＤａカットオフ膜（膜面積２００ｃｍ２）を使用することができる。通常は、ＨｙｄｒｏｓａｒｔＴＭ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）５ｋＤａカットオフ膜（膜面積２００ｃｍ２）が使用される。本発明者らは、５ｋＤａカットオフ膜が１０ｋＤａカットオフ膜よりも高い収率を提供し得ることを見出した。理論に束縛されることは望まず、５ｋＤａ膜は、ＧＡＳ炭水化物の質量から遠いカットオフを提供し、その結果、より高い収率を提供すると考えられる。
【００５５】
ＧＡＳ炭水化物調製物は、さらなる処理の前に水に対して透析濾過することができる。しかしながら、本発明者らは、さらなる透析濾過は、透過物中のＧＡＳ炭水化物の損失を生じ得ることを見出した。
【００５６】
（ＧＡＳ炭水化物のさらなる処理）
精製後、糖を、汚染物質を除去するためにさらに処理することができる。これは、少しの汚染でさえ許容されない状況で（例えば、ヒト向けワクチン生産用）、特に重要である。
【００５７】
糖は、真空乾燥に供することができる。この処理は、通常は、貯蔵のために糖を安定化するためではなくて、糖を乾燥していかなる残留アルコールも除去するために使用される。
【００５８】
濾過をさらに繰り返すこともできる。
【００５９】
精製されたＧＡＳ炭水化物は、典型的には、１０と３０との間、例えば２０と２４との間の重合度（精製された試料におけるアルデヒド基の濃度により測定される［１７］）を有する。しかしながら、この多糖は解重合してオリゴ糖を形成することができる。オリゴ糖は、ワクチンに使用するための多糖類にとって好ましいことがある。多糖からオリゴ糖への解重合は、陰イオン交換クロマトグラフィー工程の前または後に起こり得る。解重合が実施されれば、生成物は、一般に、短い長さのオリゴ糖を除去するために、サイズで分けられる。これは、限外濾過に続くイオン交換クロマトグラフィーなどの種々の方法で達成することができる。本発明の組成物が解重合された糖を含む場合、解重合はいかなる結合体化にも先行することが好ましい。
【００６０】
天然のＧＡＳ炭水化物中のＤ−Ｎ−アセチルグルコサミン残基が脱Ｎ−アセチル化されているならば、その場合、本発明の方法は、再Ｎ−アセチル化の工程を含むことができる。制御された再Ｎ−アセチル化は、例えば５％重炭酸アンモニウム中で、無水酢酸（ＣＨ３ＣＯ）２Ｏなどの試薬を使用して、便利に実施することができる［１８］。
【００６１】
これらの付加的工程は、一般に室温で実施することができる。
【００６２】
（貯蔵）
ＧＡＳ炭水化物調製物は、精製方法中の任意の段階で、貯蔵のために、例えば、真空下の凍結乾燥により凍結乾燥するか、または溶液中で（例えば、最終濃縮工程が含まれた場合にはそれからの溶離物として）凍結することができる。したがって、調製物は方法の１つの工程から他の工程へ直ちに移される必要がない。例えば、ＧＡＳ炭水化物調製物が濾過および／または限外濾過により精製されることになっていれば、その場合、それは、この精製に先だって、凍結乾燥するかまたは溶液中で凍結することができる。同様に、ＧＡＳ炭水化物は、陰イオン交換クロマトグラフィー工程に先だって凍結乾燥するかまたは溶液中で凍結することができる。ＧＡＳ炭水化物調製物がゲル濾過により精製されることになっていれば、それは、この工程に先だって凍結乾燥するかまたは溶液中で凍結することができる。同様に、ＧＡＳ炭水化物調製物が濃縮されることになっていれば、それは、この工程に先だって凍結乾燥するかまたは溶液中で凍結することができる。凍結乾燥された調製物は、さらなる処理に先だって適当な溶液中で再構成される。同様に、凍結された溶液は、さらなる処理に先だって解凍される。
【００６３】
本発明の方法により得られた精製されたＧＡＳ炭水化物は、任意の適当な方法で貯蔵のために処理することができる。例えば、糖は、上記のように凍結乾燥することができる。あるいは、糖は、水溶液中で、典型的には低温で、例えば−２０℃で貯蔵することができる。便利なことに、糖は陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過または濃縮工程からの溶離物として貯蔵することができる。
【００６４】
（結合体化）
本発明の最終精製されたＧＡＳ炭水化物は、さらに改変することなく、例えばインビトロ診断用のアッセイで使用するために、免疫化その他で使用するために、抗原として使用することができる。
【００６５】
しかしながら、免疫化目的のためには、糖をタンパク質などの担体分子と結合体化することが好ましい。一般的に、糖類の担体への共有結合による結合体化は、そのことがそれらをＴ非依存性抗原からＴ依存性抗原へと変換するので、糖類の免疫原性を増強して、その結果、免疫学的記憶のための初回刺激を可能にする。結合体化は、小児科用ワクチンのために特に有用であり［例えば参考文献１９］、周知の技法である［例えば参考文献２０から２８において論評されている］。したがって、本発明の方法は精製されたＧＡＳ炭水化物を担体分子、例えば担体タンパク質と結合体化するさらなる工程を含むことができる。
【００６６】
一態様において、本発明は、それ故、（ｉ）本発明の方法により得ることができるＧＡＳ炭水化物と（ｉｉ）担体分子との結合体を提供する。
【００６７】
担体分子は、ＧＡＳ炭水化物と直接的にかまたはリンカーを通して共有結合で結合体化することができる。
【００６８】
ＧＡＳ炭水化物の担体タンパク質への直接結合は、例えば参考文献６および８で報告されている。ＧＡＳ炭水化物結合体化の典型的な先行技術の方法は、破傷風トキソイド（ＴＴ）などの担体タンパク質に対する精製された糖の還元的アミノ化［例えば参考文献２９への参照により参考文献８で論じられたような］を含む。還元的アミノ化には、担体中のアミノ酸の側鎖上のアミン基と糖中のアルデヒド基とが関わる。ＧＡＳ炭水化物の糖は末端残基にアルデヒド基を含む。したがって、この基は担体への結合体化のために使用することができる［例えば参考文献８で論じられたように］。あるいは、追加のアルデヒド基を、例えば糖の非還元性末端の酸化により、結合体化前に発生させることもできる。
【００６９】
リンカー基による結合は、任意の公知の手順、例えば、引用文献３０および３１に記載された手順を使用して行うことができる。好ましいタイプの結合は、アジピン酸リンカーであり、それは、遊離−ＮＨ２基（例えばアミノ化によりＧＡＳ炭水化物に導入された）とアジピン酸とをカップリングして（例えば、ジイミド活性化を使用して）、次にタンパク質と生じた糖−アジピン酸中間生成物とをカップリングすることにより形成することができる［３２、３３、３４］。他の好ましいタイプの結合は、カルボニルリンカーであり、それは、改変されたＧＡＳ炭水化物の遊離ヒドロキシル基のＣＤＩとの反応［３５、３６］、続いてタンパク質との反応によりカルバメート結合を形成することにより形成され得る。他のリンカーには、β−プロピオンアミド［３７］、ニトロフェニル−エチルアミン［３８］、ハロゲン化ハロアシル［３９］、グリコシド結合［４０］、６−アミノカプロン酸［４１］、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）［４２］、アジピン酸ジヒドラジドＡＤＨ［４３］、Ｃ４からＣ１２の部分［４４］、その他が含まれる。カルボジイミド縮合も使用することができる［４５］。別の結合体化方法は、ＧＢＳ莢膜の糖について参考文献４６で記載されたように、糖中の−ＮＨ２基を（脱Ｎ−アセチル化によるか、またはアミン導入後のいずれか）二官能性リンカーと併せて使用することを含む。
【００７０】
ＧＡＳ炭水化物結合体化のための他の適当な方法は、参考文献６で論じられている。
【００７１】
好ましい担体タンパク質は、ジフテリア毒素または破傷風毒素、またはそれらのトキソイドまたは変異体などの細菌毒素である。通常、これらが結合体ワクチンに使用される。ＣＲＭ１９７ジフテリア毒素変異体は特に好ましい［４７］。
【００７２】
他の適当な担体タンパク質には、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質複合体［４８］、合成ペプチド［４９、５０］、ヒートショックタンパク質［５１、５２］、百日咳タンパク質［５３、５４］、サイトカイン［５５］、リンホカイン［５５］、ホルモン［５５］、増殖因子［５５］、ヒト血清アルブミン（好ましくは組み替え）；種々の病原体由来抗原に由来する複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［５６］、例えば、Ｎ１９［５７］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のタンパク質Ｄ［５８〜６０］、ニューモリシン［６１］またはその無毒性誘導体［６２］、肺炎球菌の表面タンパク質ＰｓｐＡ［６３］、鉄取り込みタンパク質［６４］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素ＡまたはＢ［６５］、組み替えＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの外毒素Ａ（ｒＥＰＡ）［６６］、ＧＢＳタンパク質［１１２］、ＧＡＳタンパク質［６７］などが含まれる。
【００７３】
担体への結合は、好ましくは、例えば、担体タンパク質中のリシン残基、またはアルギニン残基の側鎖中の−ＮＨ２基を通してである。結合は例えばシステイン残基の側鎖中の−ＳＨ基を通してであってもよい。
【００７４】
例えば担体抑制の危険性を減ずるために、ＧＡＳ炭水化物抗原に対して２種以上の担体タンパク質を使用することが可能である。したがってＧＡＳ炭水化物の糖類は、ＣＲＭ１９７と結合体化した一部および破傷風トキソイドと結合体化した他のものを有する２群にあることもできる。しかし一般的には、全ての糖類に同じ担体タンパク質を使用することが好ましい。
【００７５】
単一の担体タンパク質が２種以上の糖抗原を担持することもできる［６８、６９］。
【００７６】
１：１０（すなわちタンパク質過剰）と１０：１（すなわち糖過剰）との間の糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）を有する結合体が好ましい。１：５と１：２．５との間の比のように、１：５と５：１との間の比が好ましい。
【００７７】
結合体は、遊離の担体と併せて使用することもできる［７０］。所与の担体タンパク質が、本発明の組成物中で、遊離のものと結合体化したものとの両方の形態で存在するとき、結合体化していない形態は、好ましくは、全体としての組成物中の担体タンパク質の総量の５重量％以下であり、およびより好ましくは２重量％未満で存在する。
【００７８】
結合体化後、遊離の糖類と結合体化した糖類とは分離することができる。疎水性クロマトグラフィー、タンジェンシャル限外濾過、透析濾過その他を含む多くの適当な方法がある［参考文献７１および７２、その他も参照されたい］。
【００７９】
（結合体と他の抗原との組合せ）
本発明の方法により調製された糖類（特に上記のように結合体化後）は、例えば互いにおよび／または他の抗原と混合することができる。したがって、本発明の方法は、糖を１種または複数種のさらなる抗原と混合するさらなる工程を含むことができる。
【００８０】
複数の異なったＧＡＳ炭水化物結合体を混合することもできる。組成物は、別々の結合体を調製して、それからその結合体を組み合わせることにより製造される。
【００８１】
さらなる抗原（単数または複数）は、非ＧＡＳ病原体由来の抗原を含むことができる。したがって、本発明の組成物は、追加の細菌性、ウイルス性または寄生性抗原を含む１種または複数種の非ＧＡＳ抗原をさらに含むことができる。これらは以下から選択することができる。
【００８２】
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ由来のタンパク質抗原、例えば参考文献７３から７９におけるタンパク質抗原で、特に好ましくはタンパク質「２８７」（下を見られたい）および誘導体（例えば「ΔＧ２８７」）。
【００８３】
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ由来の外膜小胞（ＯＭＶ）調製物、例えば参考文献８０、８１、８２、８３その他に開示されたものなど。
【００８４】
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹ由来の糖抗原、例えば、血清型Ｃ由来の参考文献８４で開示されたオリゴ糖または参考文献８５のオリゴ糖など。
【００８５】
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからの糖抗原［例えば参考文献８６〜８８；参考文献９５の第２２および２３章］。
【００８６】
−Ａ型肝炎ウイルスからの抗原、例えば、不活化ウイルス［例えば８９、９０；参考文献９５の第１５章］など。
【００８７】
−Ｂ型肝炎ウイルスからの抗原、例えば、表面および／またはコア抗原［例えば９０、９１；参考文献９５の第１６章］など。
【００８８】
−Ｃ型肝炎ウイルスからの抗原［例えば９２］。
【００８９】
−Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓからの抗原、例えば、百日咳ホロトキシン（ＰＴ）およびＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓからの線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、場合により、さらにペルタクチンおよび／または凝集原２および３との組合せ［例えば参考文献９３および９４；参考文献９５の第２１章］など。
【００９０】
−ジフテリア抗原、例えば、ジフテリアトキソイド［例えば参考文献９５の第１３章］など。
【００９１】
−破傷風抗原、例えば、破傷風トキソイド［例えば参考文献９５の第２７章］など。
【００９２】
−Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ由来の糖抗原［例えば参考文献９５の第１４章］
−Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の抗原［例えば７３、７４、７５］。
【００９３】
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原［例えば９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２］。
【００９４】
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原［例えば１０３］。
【００９５】
−Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の抗原［例えば１０４］。
【００９６】
−ポリオ抗原（単数または複数）［例えば１０５、１０６；参考文献９５の第２４章］、例えばＩＰＶなど。
【００９７】
−狂犬病抗原（単数または複数）［例えば１０７］、例えば、凍結乾燥不活化ウイルスなど［例えば１０８、ＲａｂＡｖｅｒｔＴＭ］。
【００９８】
−はしか、おたふく風邪、および／または風疹抗原［例えば参考文献９５の第１９、２０および２６章］。
【００９９】
−インフルエンザ抗原（単数または複数）［例えば、参考文献９５の第１７および１８章］、例えば、赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質など。
【０１００】
−Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓからの抗原［例えば１０９］。
【０１０１】
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅからの抗原（Ｂ群連鎖球菌）［例えば６７、１１０〜１１２］。
【０１０２】
糖または炭水化物抗原が使用される場合、免疫原性を増強するために、それは、好ましくは、担体と結合体化される。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ、髄膜炎菌および肺炎球菌の糖抗原の結合体化は周知である。
【０１０３】
毒性のタンパク質抗原は、必要な場合には無毒化され得る（例えば、化学的および／または遺伝的手段による百日咳毒素の無毒化［９４］）。
【０１０４】
ジフテリア抗原が組成物中に含まれる場合、破傷風抗原および百日咳抗原も含むことが好ましい。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原も含むことが好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原も含むことが好ましい。
【０１０５】
抗原はアルミニウム塩に吸着させることができる。
【０１０６】
組成物中の各抗原は、典型的には、少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般的に、任意の所与の抗原の濃度は、その抗原に対する免疫応答を誘起するのに十分なものである。
【０１０７】
本発明の組成物中においてタンパク質抗原を使用する代わりに、その抗原をコードする核酸を使用することもできる［例えば参考文献１１３から１２１］。したがって、本発明の組成物のタンパク質成分は、該タンパク質をコードする核酸（好ましくは例えばプラスミドの形態にあるＤＮＡ）で置き換えることができる。
【０１０８】
実際問題として、本発明の組成物中に含まれる抗原の数には上限があり得る。本発明の組成物中の抗原の数は、２０未満、１９未満、１８未満、１７未満、１６未満、１５未満、１４未満、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満、または３未満であってよい。
【０１０９】
（医薬組成物および方法）
本発明は、（ａ）本発明の糖（場合により、結合体の形態で）を（ｂ）薬学的に許容される担体と混合する工程を含む、医薬組成物を調製する方法を提供する。そのような担体の詳細な議論は引用文献１２２で参照できる。
【０１１０】
本発明の組成物は、種々の形態で調製することができる。例えば、組成物は、液体溶液または懸濁物のいずれかで注射用として調製することができる。注射に先だって液体ビヒクルにおける溶液または懸濁物にするのに適した固体形態も調製することができる。組成物は、局所投与用に、例えば、軟膏、クリーム剤または散剤として調製することもできる。組成物は、経口投与用に、例えば、錠剤またはカプセル剤として、またはシロップ剤として（場合により風味を付けて）調製することもできる。組成物は、肺投与用に、例えば、微細粉末またはスプレーを使用する吸入薬として調製することもできる。組成物は、座剤またはペッサリーとして調製することもできる。組成物は、鼻用、耳用または眼用の投与のために、例えば、滴剤として、スプレーとして、または散剤として調製することもできる［例えば１２３］。
【０１１１】
医薬組成物は、好ましくは無菌である。それは好ましくは発熱物質を含まない。
【０１１２】
その組成物は、好ましくは、例えば、ｐＨ６とｐＨ８との間、一般にはおよそｐＨ７に緩衝化されている。組成物は水性であっても、凍結乾燥されていてもよい。
【０１１３】
本発明は、本発明の医薬組成物を含有する送達デバイスも提供する。該デバイスは、例えば、注射器または吸入器であってよい。
【０１１４】
本発明の医薬組成物は、免疫学的に有効な量のＧＡＳ炭水化物免疫原を含む、好ましくは免疫原性組成物である。「免疫学的に有効な量」は、単回用量または一連の一部としてのいずれかでのその量の個体への投与が、処置または予防に有効であることを意味する。この量は、処置されるべき個体の健康および身体的状態、年齢、処置されるべき個体の分類学上の群（例えばヒトでない霊長類、霊長類、その他）、個体の免疫系の抗体合成能力、所望の保護の程度、ワクチンの処方物、主治医の医学的状況評価、および他の関連要因によって変化する。その量は、日常的試行により決定することができる比較的広い範囲に入ると期待される。
【０１１５】
処方されれば、本発明の組成物は、被験体に直接投与することができる。処置されるべき被験体は動物であってもよく、特に、ヒト被験体を処置することができる。
【０１１６】
本発明の免疫原性組成物は、治療的に（すなわち現存の感染を処置するために）または予防的に（すなわち将来の感染を予防するために）使用することができる。
【０１１７】
医薬組成物は、バイアルまたは注射器中に詰めることができる。注射器は針を付けてかまたは針なしで供給することができる。注射器は、単回用量の組成物を含み、それに対してバイアルは、単回用量または複数回の用量を含むことができる。
【０１１８】
本発明の糖類の水性組成物は、他のワクチンを、凍結乾燥された形態から再構成するのに適する。本発明の組成物がそのような即時再構成のために使用されることになっている場合、本発明は、凍結乾燥された材料を本発明の水性組成物と混合する工程を含む、そのような凍結乾燥されたワクチンを再構成するための方法を提供する。再構成された材料は、注射用に使用することができる。
【０１１９】
（一般的事項）
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘのみからなってもよく、または何かを付け加えて、例えばＸ＋Ｙを含んでもよい。
【０１２０】
数値ｘに関係する「約」という用語は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１２１】
「実質的に」という用語は、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを全く含まなくてもよい。必要な場合、「実質的に」という用語は、本発明の定義から省いてもよい。
【０１２２】
本発明が複数の逐次的工程を含む方法を提供する場合、本発明は、その全工程より少ない工程数を含む方法も提供することができる。例えば、糖が汚染核酸および／またはタンパク質を除去することにより部分的に既に精製されているならば、その場合、この工程は、本発明の方法から省略することができる。同様に、汚染物質を除去する工程を実施して陰イオン交換クロマトグラフィーに使える材料を与えることはできるが、陰イオン交換クロマトグラフィー工程は実施される必要はない。前処理した材料は、糖調製における中間体として有用であり、後の使用のために、例えば後の陰イオン交換クロマトグラフィーのために使用、貯蔵、移出その他をすることができるので、陰イオン交換クロマトグラフィー工程は、本発明の範囲内にあるように実施する必要はない。これらの異なった工程は、大きく異なったときに異なった人達により異なった場所（例えば異なった国で）で実施することができる。
【０１２３】
糖環は開環および閉環した形態で存在することができて、本明細書中の構造式では閉環した形態が示されるが、開環した形態も本発明により包含されることは理解される。同様に、糖類は、ピラノースおよびフラノースの形態で存在することができること、および本明細書中の構造式ではピラノース形態が示されるが、フラノース形態も包含されることは理解される。糖類の異なったアノマー形態も包含される。
【実施例】
【０１２４】
（本発明を実施する様式）
（実施例１）
（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＧＡＳ炭水化物の精製）
各精製工程の後、ＧＡＳ炭水化物構造をＮＭＲ分析により検証した（下を見られたい）。ＧＡＳ炭水化物について典型的ＮＭＲスペクトルを図３に提示する。
【０１２５】
（工程１：ＧＡＳ炭水化物抽出）
４ＬのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ菌の増殖培養物を８０℃で熱不活化して３００ｇで遠心分離した。ペレット化した細菌を生理食塩水緩衝液中に再懸濁して、ＧＡＳ炭水化物を還元的酸処理により放出させた。簡単に説明すると、０．１容積の４Ｎ亜硝酸ナトリウムおよび０．１容積の氷酢酸を、細菌の懸濁物に攪拌しながら、混合物が最終ｐＨがおよそ３．０になるまで加えた。次にｐＨがおよそ６〜７になるまで中和した。
【０１２６】
（工程２：濾過および限外濾過）
混合物を０．６μｍフィルタ（Ｓａｒｔｏｐｕｒｅ  ＧＦ２、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して濾過し、次に３ｋＤａカットオフ膜（膜面積０．１ｍ２）を使用して限外濾過した。調製物はその容積が約２００ｍＬになるまで濃縮し、約１０容積の水を使用して水に対して透析した。ＧＡＳ炭水化物調製物のこの段階におけるタンパク質汚染を測定すると、約２０〜３０％であることが示された。
【０１２７】
（工程３および４：クロマトグラフィー工程）
以下のクロマトグラフィー工程をＡＫＴＡＴＭシステム（Ｆａｒｍａｃｉａ）で実施した。ＧＡＳ炭水化物は、溶離物の画分で２１５ｎｍのＵＶ吸収を測定することにより検出した。
【０１２８】
Ｑ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭＸＬ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＧＡＳ炭水化物調製物を陰イオン交換クロマトグラフィーにより処理した。ＧＡＳ炭水化物はカラム貫流物において集めた。ＧＡＳ炭水化物０．５ｍｇ当たり１ｍＬの樹脂を使用した。移動相緩衝液は、２０容積％エタノールを補充した１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液であった。ＧＡＳ炭水化物は貫流物中に単独ピークとして現れた。ＧＡＳ炭水化物を含有する全ての画分をプールした。ＧＡＳ炭水化物調製物のタンパク質汚染をこの段階で測定し、約５％であることが示された。
【０１２９】
次に、ＳｅｐｈａｄｅｘＴＭＧ５０ゲル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＧＡＳ炭水化物調製物をゲル濾過により処理した。ＧＡＳ炭水化物０．２ｍｇ当たり１ｍＬのゲルを使用した。ＧＡＳ炭水化物調製物の容積がゲル濾過カラムの容積の５％を超えることを許容しなかった。移動相緩衝液は、２０容積％エタノールを補充した１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液であった。ＧＡＳ炭水化物は、貫流物中に２本のピークとして現れた：ａ）高分子量ＧＡＳ炭水化物種の大きいピーク；およびｂ）低分子量ＧＡＳ炭水化物種の小さいピークである。第一のピークをワクチンの調製で使用するために選択した。ＧＡＳ炭水化物調製物のタンパク質汚染をこの段階で測定し、約２〜３％であることが示された。ＧＡＳ炭水化物の収率は５０〜９０％であった。
【０１３０】
ゲル濾過後のＧＡＳ炭水化物について典型的ＮＭＲスペクトルを図４に提示する。ＮＭＲスペクトルピークの積分によりＧＡＳ炭水化物が正しい構造を有することが確認される（表Ｉ）。
【０１３１】
【表１】
0005689064.tif 000002
（貯蔵）
ＧＡＳ炭水化物調製物は−２０℃で貯蔵した。
【０１３２】
（異なったクロマトグラフィー法の有効度の比較）
ＧＡＳ炭水化物調製物の汚染を減少させる、異なったタイプのクロマトグラフィーの有効度を比較した。クロマトグラフィーのタイプは、ゲル濾過（ＳｅｐｈａｄｅｘＴＭＧ５０ゲルを使用）；陰イオン交換（Ｑ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭＸＬ樹脂を使用）；カチオン交換（ＳＰ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭＸＬ樹脂を使用）；および疎水性相互作用（フェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ６Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂を使用）であった。全ての樹脂およびゲルは、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手した。各タイプのクロマトグラフィーから得られたＧＡＳ炭水化物の最終収率（ＣＨＯ）およびＧＡＳ炭水化物調製物のタンパク質汚染を測定した（表ＩＩ）。
【０１３３】
【表２】
0005689064.tif 000003
これらのデータは、陰イオン交換クロマトグラフィーが、特に参考文献６で使用されたゲル濾過と比較して高いＧＡＳ炭水化物の収率を生じることを示す。陰イオン交換クロマトグラフィーは、試験した全ての方法の中でタンパク質汚染の量も最小となる。
【０１３４】
陰イオン交換、カチオン交換および疎水性相互作用クロマトグラフィー法により得られたＧＡＳ炭水化物調製物のヒアルロン酸汚染を、３ｋＤａカットオフ膜を用いた限外濾過単独後に見られた汚染と比較した（図５）。これらのデータは、陰イオン交換クロマトグラフィーが、試験した全ての方法の中でヒアルロン酸汚染の量が最小になることを示す。
【０１３５】
（分析方法）
（ＧＡＳ炭水化物濃度測定）
パルス電流測定検出を用いる高速陰イオン交換クロマトグラフィーを、ＤＩＯＮＥＸＴＭシステムを使用して実施した。ＧＡＳ炭水化物調製物は、４Ｍトリフルオロ酢酸中で加水分解した。５０ｍＭ  ＮａＯＨを移動相緩衝液として、ＣａｒｂｏＰａｃＴＭＰＡ１分析カラムを使用した。カラムを再生するために５００ｍＭ  ＮａＯＨを使用した。Ｎ−アセチル−グルコサミンおよびラムノースに対する保持時間は、それぞれ５．３分および７．２分であった。ラムノースおよびＮ−アセチル−グルコサミンのピークを積分して、ＧＡＳ炭水化物の量を標準較正曲線に基づいて計算した。
【０１３６】
（タンパク質濃度）
タンパク質汚染はＭｉｃｒｏＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して測定した。
【０１３７】
（核酸濃度）
核酸濃度は２６０ｎｍにおける吸光度（Ａ）により測定した。濃度は、Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｂｅｅｒ則、Ａ＝εｂｃ（ｃは試料の濃度であり；ｂは試料の長さであり（１ｃｍ）およびεは０．０２０（μｇ／ｍｌ）−１ｃｍ−１である（ＤＮＡ２本鎖に対する文献値））を使用して定量した。多糖の溶液は、石英キュベット中１ｍｇ／ｍｌ（水または緩衝液）で、対応する水または緩衝液で機器をリセットして、分光光度計（分光光度計Ｌａｍｂｄａ  ２５  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で読んだ。核酸の濃度は、ｃ＝Ａ／εｂとして計算した。この値から、核酸濃度を多糖濃度で除し、結果に１００を乗じることにより、核酸汚染の％を計算した。
【０１３８】
（ＮＭＲ分析）
試料（約１ｍｇの多糖）を、プロトン化したＨ２Ｏ溶媒を排除するために、凍結乾燥により調製した。次に生成物を重水（Ｄ２Ｏ、９９．９％Ｄ原子、Ａｌｄｒｉｃｈから）に溶解して均一溶液を生成させた。本発明者らは、凍結乾燥が糖部分の物理化学構造に影響しないことを見出した。
【０１３９】
１Ｈ  ＮＭＲ実験を、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡｖａｎｃｅＴＭ６００ＭＨｚ分光計で、５ｍｍ広帯域プローブ（Ｂｒｕｋｅｒ）を使用して２５℃で記録した。ＸＷＩＮＮＭＲＴＭソフトウェアパッケージ（Ｂｒｕｋｅｒ）をデータ取得および処理のために使用した。３２ｋのデータポイントをプロトンスペクトルについて１０ｐｐｍのスペクトル幅にわたって集めた。発信機は参照シグナル（４．７９ｐｐｍ）としても使用するＨＤＯ周波数に設定した。
【０１４０】
１−ＤプロトンＮＭＲスペクトルを標準ワンパルス実験を使用して取得した。
【０１４１】
（ヒアルロン酸（ＨＡ）残存含有率の推定）
残存ヒアルロン酸含有率はＣｏｒｇｅｎｉｘ  Ｉｎｃの市販キット（製品番号０２９−００１）により推定した。このＨＡ試験キットは、ヒアルロン酸に結合するタンパク質（ＨＡＢＰ）として公知の捕捉分子を使用する酵素連結結合タンパク質アッセイ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ）である。適当に希釈された血清または血漿およびＨＡ参照溶液をＨＡＢＰでコートしたマイクロウェル中でインキュベートして、試料中に存在するＨＡを固定化された結合性タンパク質（ＨＡＢＰ）と反応させた。結合していない試料分子の洗浄による除去後、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合したＨＡＢＰ溶液がマイクロウェルに加えられて、結合したＨＡと複合体を形成する。別の洗浄工程に続いて、色素形成基質のテトラメチルベンジジンおよび過酸化水素が添加されて反応混合物に色変化を生じさせる。色の強度を、分光光度計を用いて４５０ｎｍで光学的密度（ＯＤ）単位により測定する。未知のおよび対照試料のＨＡレベルを、ブランク試薬（０ｎｇ／ｍＬ）とキットで提供されたＨＡ参照溶液（５０、１００、２００、５００、８００ｎｇ／ｍＬ）とから調製された参照曲線に対して決定した。
【０１４２】
（実施例２）
（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＧＡＳ炭水化物精製の最適化）
培養後に得られたＧＡＳ炭水化物は、一般に不純であり、ヒアルロン酸、タンパク質、ポリラムノースおよび核酸で汚染されている。タンジェンシャルフロー濾過、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ゲル濾過）に基づく実施例１の精製方法は、大規模化可能性を促進して且つ純度を改善するために最適化されている。
【０１４３】
最適化された精製方法（図６にまとめた）は、ヒアルロン酸を除去し、ポリラムノース汚染を＜２０％に減少させて、残存タンパク質汚染を＜４％に減少させる。この方法の逐次工程は下でより詳細に記載する。
【０１４４】
（０．６５μｍ直交濾過）
この最初の精製工程は、０．６５μｍの直交濾過を使用して粒子状汚染を除去する。濾過前に、硝酸ナトリウムおよび氷酢酸処理後に得られたＧＡＳ炭水化物懸濁物のｐＨを約６から７に中和した。次に、Ｓａｒｔｏｐｕｒｅ  ＧＦ２ＴＭカプセル０．６５μｍ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して混合物を濾過した。５Ｌの発酵物から得られた約２Ｌの懸濁物に対して、通常０．２ｍ２の濾過表面を使用して、作業は約３０〜４０分で完了した。
【０１４５】
表ＩＩＩは、この工程からの濾液について典型的なＧＡＳ炭水化物濃度を示す。
【０１４６】
【表３】
0005689064.tif 000004
（３０ｋＤａタンジェンシャルフロー濾過）
第２の工程は低分子量種（例えばタンパク質、核酸およびヒアルロン酸）を除去するためのタンジェンシャルフロー濾過である。異なったカットオフ膜を、精製を改善し処理時間を短縮するために比較した。
【０１４７】
０．１ｍ２の膜面積を有するＨｙｄｒｏｓａｒｔＴＭ３ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａおよび３０ｋＤａカットオフ膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用し、５Ｌの発酵物からの材料を処理した。粗多糖溶液を約１５〜２０倍濃縮し、最初に約１０容積の１Ｍ  ＮａＣｌに対して、続いて約１０容積を使用する水に対して透析した。タンジェンシャルフロー濾過工程は、蠕動ポンプ（ＷａｔｓｏｎＭａｒｌｏｗ）を備えた０．１ｍ２のカセット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）のためのホルダーを使用して実施した。使用した加圧条件は、Ｐｉｎ＝１．０バールおよびＰｏｕｔ＝０．４バールであり、透過物の流量を、カットオフ膜に応じて、１８から１００ｍｌ／分で以下のように変化させた。
３ｋＤａ、流量＝１８ｍＬ／分
５ｋＤａ、流量＝４０ｍＬ／分
１０ｋＤａ、流量＝５０ｍＬ／分
３０ｋＤａ、流量＝８０〜１００ｍＬ／分。
【０１４８】
３０ｋＤａカットオフ膜は、濃縮物からのＧＡＳ炭水化物の実質的損失なしに、タンパク質汚染および濾過時間のよりよい減少を提供することが見出された（表ＩＶ）。
【０１４９】
【表４】
0005689064.tif 000005
（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー）
陰イオン交換クロマトグラフィー工程は、ＧＡＳ炭水化物のヒアルロン酸汚染ならびにタンパク質および核酸含有率を減少させるのに特に有効である。
【０１５０】
該工程はＡｋｔａＴＭシステム（Ｇ  ＆  Ｅ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実施され、ＧＡＳ炭水化物は２１５ｎｍでのＵＶ吸収により検出される。限外濾過工程からの濃縮物には、ＮａＰｉの最終緩衝液濃度を１０ｍＭ、ｐＨを７．２にするために、ｐＨ７．２の１００ｍＭ  ＮａＰｉ緩衝液を添加した。次に、このＧＡＳ炭水化物調製物を、１０ｍＭ  ＮａＰｉ緩衝液（ｐＨ７．２）中で平衡化させたＱ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭＸＬ樹脂（Ｇ  ＆  Ｅ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、陰イオン交換クロマトグラフィーにより処理した。典型的には、１ｍｇのＧＡＳ炭水化物に対して１ｍＬの樹脂を使用した。陰イオン交換クロマトグラフィーは、ＧＡＳ炭水化物の「貫流」が可能になるように設定することができ、ここで、不純物は陰イオン交換マトリックスに結合する。
【０１５１】
ＧＡＳ炭水化物は、カラム貫流の画分で集められ、主として単独ピークとして現れた（図７）。該画分をプールした（図７中に示されるピークの尾の画分は除外して）。
【０１５２】
方法のこの段階における、例示的なプール画分に対する多糖回収率、タンパク質含有率およびヒアルロン酸含有率（％）を表Ｖに示す。
【０１５３】
【表５】
0005689064.tif 000006
別の方法において、ＧＡＳ炭水化物調製物は、ｐＨ７．２の１００ｍＭ  ＮａＰｉ緩衝液中でｐＨ７．２に達するまで予備平衡化させ、次にｐＨ７．２の１０ｍＭ  ＮａＰｉ緩衝液中で１．８〜２．０ｍＳ／ｃｍの導電率に達するまで平衡化させたＱ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭＦＦ樹脂（Ｇ  ＆  Ｅ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、陰イオン交換クロマトグラフィーにより処理した。クロマトグラフィーは表ＶＩにより実施した。
【０１５４】
【表６】
0005689064.tif 000007
（１０ｋＤａまたは５ｋＤａタンジェンシャルフロー濾過）
タンジェンシャルフロー濾過工程は、ＧＡＳ炭水化物溶液の濃縮をもたらす。これはＧＡＳ炭水化物の濃度がそれに続く結合体化のために最適化されることを可能にする。
【０１５５】
この方法が５Ｌの発酵物について実施されたとき、タンジェンシャルフロー濾過工程は、膜面積２００ｃｍ２のＨｙｄｒｏｓａｒｔＴＭ１０ｋＤａカットオフ膜を備えたＴａｎｄｅｍｍｏｄ．１０８２ＴＭシステム（両方ともＳａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して実施した。加圧条件は、Ｐｉｎ＝０．５バールおよびＰｏｕｔ＝０．０バールであり、流量は４〜５ｍＬ／分に設定した。濾過はＧＡＳ炭水化物の所望の濃度に達するまで継続した。この濃縮工程後の透析濾過は、透過物中のＧＡＳ炭水化物の損失を生じ得るので回避した。
【０１５６】
あるいは、タンジェンシャルフロー濾過工程は、ＨｙｄｒｏｓａｒｔＴＭの膜面積２００ｃｍ２の５ｋＤａカットオフ膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して実施した。加圧条件は、Ｐｉｎ＝０．７バールおよびＰｏｕｔ＝０．０バールであり、流量は２ｍＬ／分に設定した。
【０１５７】
濃縮工程後の精製されたＧＡＳ炭水化物の最終回収量は、最初の５Ｌの発酵物から約３００ｍｇであることが見出された。
【０１５８】
方法のこの段階における例示的試料に対する多糖回収率ならびにタンパク質、ポリラムノース、ヒアルロン酸および核酸の含有率（％）を表ＶＩＩに示す。精製されたＧＡＳ炭水化物のＨＰＬＣ−ＳＥプロファイルを図８に示す。
【０１５９】
【表７】
0005689064.tif 000008
理論に束縛されることは望まず、タンパク質含有率（ＭｉｃｒｏＢＣＡアッセイ（Ｐｅａｒｃｅ）により測定した）は、ＧＡＳ炭水化物試料中のラムノース種の存在が原因の干渉のために人為結果として高い可能性があると考えられる。ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲル（ＮｕＰＡＧＥＴＭ７％トリスアセテートゲル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、還元性および非還元性条件で、過剰のＧＡＳ炭水化物試料（６３０μｇ、タンパク質汚染レベルが２％ならば約１２．６μｇを意味する）について測定されたときに、この高レベルのタンパク質は検出されない。
【０１６０】
（分析方法）
（残存ポリラムノース含有率の推定）
ＮＭＲピークの帰属（図９）に基づいて、ポリラムノースの残存含有率を積分比：
ポリラムノース（％）＝［Ｈ１ＲｈａＢＶＡＲ／（Ｈ１ＲｈａＡ＋Ｈ１ＲｈａＡＶＡＲ）］×１００
により推定した。
【０１６１】
（実施例３）
（１０ｋＤａまたは５ｋＤａタンジェンシャルフロー濾過工程とゲル濾過工程との比較）
実施例１においては、汚染をさらに減少させるために、陰イオン交換クロマトグラフィー工程に続いて、ゲル濾過工程を実施した。対照的に、実施例２の最適化された方法は、方法のこの段階でゲル濾過の代わりに、タンジェンシャルフロー濾過（５ｋＤａまたは１０ｋＤａ）を含む。この２つの選択手段により、おおよそ同じレベルのＧＡＳ炭水化物を回収できる。しかしながら、タンジェンシャルフロー濾過は、より低いレベルのポリラムノース汚染を生じるように思われる（１ＨＮＭＲにより測定した）。
【０１６２】
（ゲル濾過工程）
クロマトグラフィーはＡｋｔａＴＭシステム（Ｇ  ＆  Ｅ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施し、ゲル濾過はＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ１００ゲル（Ｇ  ＆  Ｅ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施した。ＧＡＳ炭水化物調製物の容積が、ゲル濾過カラムの容積の５％を超えることは許容しなかった。移動相緩衝液はｐＨ７．２の１０ｍＭ  ＮａＰｉ緩衝液であった。
【０１６３】
多糖は貫流物中に２本のピーク：ａ）ＧＡＳ炭水化物の大きいピーク、およびｂ）ポリラムノースの小さいピーク（図１０）として現れた。ポリラムノースの量は非常に多く、全多糖試料の約４０〜５０％であった。
【０１６４】
（タンジェンシャルフロー濾過工程）
対照的に、最適化された方法で得られたＧＡＳ炭水化物の純度はそれより高い。
【０１６５】
図１１は、１）最適化された方法の陰イオンクロマトグラフィー工程の後の、および２）陰イオンクロマトグラフィーの後に行うこの方法の１０ｋＤａタンジェンシャルフロー濾過工程の後の、ＧＡＳ炭水化物試料の分析ゲル濾過クロマトグラムを示す。
【０１６６】
ポリラムノース汚染のレベルを測定するために、これらのおよび他のゲル濾過から得られた材料を、１ＨＮＭＲにより比較した。図１２は、１）最適化された方法の１０ｋＤａタンジェンシャルフロー濾過工程の後；２）最適化された方法の１０ｋＤａタンジェンシャルフロー濾過工程に続くゲル濾過のさらなる工程の後；および３）１０ｋＤａタンジェンシャルフロー濾過工程がゲル濾過工程で置き換えられた、最適化された方法の改変版の後、に得られた試料のスペクトルを示す。スペクトルは非常に類似しており、３０ｋＤａタンジェンシャルフロー濾過および陰イオンクロマトグラフィー工程が、ＧＡＳ炭水化物を精製してポリラムノース汚染を低くする（＜２０％）のに十分であることを示す。ゲル濾過工程は必要とされず、一方、１０ｋＤａまたは５ｋＤａタンジェンシャルフロー濾過で実施された濃縮工程は、ＧＡＳ炭水化物のさらなる加工、例えば担体分子との結合体化にとって単に便利なだけである。
【０１６７】
（実施例４）
（結合体調製物）
（直接還元的アミノ化反応）
精製されたＧＡＳ炭水化を、直接還元的アミノ化反応により担体タンパク質ＣＲＭ１９７と結合体化させた（図１３）。還元的アミノ化反応には、担体タンパク質中のリシンの側鎖のアミン基と、糖中、特にＧＡＳ炭水化物多糖の還元性末端にあるアルデヒド基とが関わる。
【０１６８】
結合体化に先だって、精製されたＧＡＳ炭水化物をｒｏｔａｖａｐｏｒシステムで乾燥した。次に、乾燥したＧＡＳ炭水化物をｐＨ８．０のＮａＰｉ  ２００ｍＭ緩衝液中に溶解して最終濃度を１０ｍｇ／ｍＬにした。担体タンパク質ＣＲＭ１９７を、ｐＨ８．０のＮａＰｉ  ２００ｍＭ緩衝液中のＧＡＳ炭水化物溶液に加え、ＮａＢＨ３ＣＮ（Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。多糖：タンパク質比は４：１（重量／重量）であり、多糖：ＮａＢＣＮＨ３比は２：１（重量／重量）であった。反応後、溶液を０．２２μｍで濾過して３７℃に２日間保った。
【０１６９】
これら２日間の後、ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲル分析（ＮｕＰＡＧＥＴＭ７％トリスアセテートゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を実施して共有結合の結合体形成を検証した。結果を図１４に示す。
【０１７０】
（別法による結合体化反応）
ＧＡＳ炭水化物は担体分子とリンカーを介して結合体化することもできる。精製されたＧＡＳ炭水化物を担体タンパク質ＣＲＭ１９７と、アジピン酸リンカーを介して結合体化した。
【０１７１】
最初の工程で、ＧＡＳ炭水化物多糖の還元性末端にあるアルデヒド基の還元的アミノ化を実施した。精製されたＧＡＳ炭水化物を水に溶解して最終濃度を４ｍｇ／ｍＬにした。ＡｃＯＮＨ４を３００ｇ／Ｌの濃度になるまで加え、ＮａＢＨ３ＣＮをＡｃＯＮＨ４とのモル比が１：５になるまで加えた。混合物を混合し、混合物のｐＨを確認しておよそ７．０〜７．５にした。次に、混合物を３７℃に６０時間保った。最後に、反応混合物を１０ｋＤａタンジェンシャルフロー濾過で精製し、約１０容積を使用するＮａＣｌ  ０．１Ｍに対して、次に約１０容積を使用する水に対して透析した。
【０１７２】
第２の工程においては、アミノ化されたＧＡＳ炭水化物をリンカーにより活性化した。アミノ化されたＧＡＳ炭水化物は、先ずｒｏｔａｖａｐｏｒシステム（Ｂｕｃｈｉ）を使用して濃縮し、次に水中に溶解して濃度４０μｍｏｌ／ｍＬアミノ基にした。ＤＭＳＯを混合物中の水の量の９倍に等しい量で加え、Ｅｔ３Ｎをアミノ基と１０：１のモル比になるように加えた。最後に、ＳＩＤＥＡ（アジピン酸のスクシンジエステル）をアミノ基とのモル比が１２：１になるように加えた。混合物を室温で２時間混合した。ＡｃＯＥｔ（最終反応容積の８０％）および１ＭのＮａＣｌ（最終反応容積の１．５％）を混合物に一滴ずつ加え、溶液を氷上に１時間保つと、その時間中に活性化されたＧＡＳ炭水化物が白色固体として沈殿する。次に、懸濁物を４０００ｒｐｍ（１７８０×ｇ）で１５分間遠心分離し、ペレット化した沈殿物を沈殿用容積（ＧＡＳ炭水化物を沈殿させるのに使用したＡｃＯＥｔの最初の容積）の３分の１に等しい量のＡｃＯＥｔで５回洗浄した。各洗浄は５分間の混合、次に４０００ｒｐｍでさらに５分間の遠心分離からなる。洗浄後、沈殿物は終夜乾燥させた。
【０１７３】
最終工程では、活性化されたＧＡＳ炭水化物をＣＲＭ１９７タンパク質と結合体化した。この反応は、活性化されたＧＡＳ炭水化物中の活性エステル基のモル数とＣＲＭ１９７のモル数とが２０：１の結合体比を使用して実施した。ＣＲＭ１９７は、ｐＨ７．２のＮａＰｉ  １００ｍＭ緩衝液を使用して最終濃度が２０ｍｇ／ｍＬになるように希釈した。それに続いて、活性化されたＧＡＳ炭水化物粉末を、タンパク質溶液に穏やかに攪拌しながら徐々に加えた。次に、反応混合物を穏やかな混合下で３時間室温に保った。
【０１７４】
ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲル分析（ＮｕＰＡＧＥＴＭ７％トリスアセテートゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を実施して、共有結合の結合体形成を検証した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析も実施した。結果を図１５に示す。ＳＤＳ−ＰａｇｅゲルおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析は、リンカーを含む結合体と直接還元的アミノ化により得られた結合体との間にいかなる有意差も示唆しなかった。
【０１７５】
（実施例５）
（マウスによる研究）
直接還元的アミノ化反応によりＣＲＭ１９７と結合体化した精製ＧＡＳ炭水化物の効果を、腹腔内ＧＡＳチャレンジアッセイで試験した。明礬アジュバントと共に腹腔内投与することにより、結合体で（１０μｇ糖の用量で）マウスを免疫化した。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓのＭ１株でチャレンジしたとき、マウスの５１％が生存したのに対し、免疫化しなかった対照は１６％の生存であった。別の試験では、マウスをＭ１またはＭ２３株のいずれかでチャレンジした。この研究では、Ｍ１株でチャレンジした免疫化マウスの５６％が生存したのに対し、免疫化しなかった対照は２０％であり、一方、Ｍ２３株でチャレンジしたマウスの４１％が生存したのに対し、対照は１１％であった。したがって、本発明の方法により精製されたＧＡＳ炭水化物は保護免疫を提供する。
【０１７６】
本発明は単に例として記載され、本発明の範囲および精神内に留まりながら、改変をなすことが可能であることは理解される。
【０１７７】
（参考文献）
【０１７８】
【数１】
0005689064.tif 000009
【０１７９】
【数２】
0005689064.tif 000010
【０１８０】
【数３】
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【０１８１】
【数４】
0005689064.tif 000012
【図４】
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【図１１】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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