(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２記載のアミノ酸配列からなるペプチドもしくはその部分配列からなるペプチド又はその塩を有効成分として含有することを特徴とする神経保護作用剤であって、
配列番号２記載のアミノ酸配列の部分配列からなるペプチドが、配列番号２記載のアミノ酸配列のＮ末端側の３アミノ酸残基（Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ）を有するものであり、
神経保護作用が、βアミロイド蛋白誘発神経毒性及び／又はグルタミン酸神経毒性に対する保護作用である神経保護作用剤。
【請求項２】
配列番号２記載のアミノ酸配列の部分配列からなるペプチドが、配列番号３から１２のいずれか記載のアミノ酸配列からなる、又はＳｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏで表されるペプチドである、請求項１記載の神経保護作用剤。
【請求項３】
配列番号２記載のアミノ酸配列からなるペプチドもしくはその部分配列からなるペプチド又はその塩を有効性成分として含有することを特徴とする、神経変性疾患の予防又は治療剤であって、
配列番号２記載のアミノ酸配列の部分配列からなるペプチドが、配列番号２記載のアミノ酸配列のＮ末端側の３アミノ酸残基（Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ）を有するものであり、
神経変性疾患が、βアミロイド蛋白誘発神経毒性及び／又はグルタミン酸神経毒性に関連する疾患である神経変性疾患の予防又は治療剤。
【請求項４】
配列番号２記載のアミノ酸配列の部分配列からなるペプチドが、配列番号３から１２のいずれか記載のアミノ酸配列からなる、又はＳｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏで表されるペプチドである請求項３記載の予防又は治療剤。
【請求項５】
神経変性疾患が、脳神経変性疾患又は眼神経変性疾患である請求項３又は４記載の予防又は治療剤。
【請求項６】
脳神経変性疾患が、認知症、脳血管障害後亜急性期神経変性症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、脊髄小脳変性症、及び進行性核上性球麻痺から選択される少なくとも１の疾患である請求項５記載の予防又は治療剤。
【請求項７】
眼神経変性疾患が、網膜色素変性症、黄斑変性症及び緑内障から選択される少なくとも１の疾患である請求項５記載の予防又は治療剤。
【請求項８】
注射剤である請求項１〜７のいずれかに記載の剤。
【請求項９】
注射剤が静脈内注射用である請求項８に記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経保護作用を有するペプチド及び、そのペプチドを含む薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経障害又は神経毒性は、神経変性をもたらす可能性のあるものであって、特定の脳領域の進行性変性を次第に進行させる。アルツハイマー病（ＡＤ）は脳皮質に生じる神経変性疾患であり、疾患の進行に伴って徐々にニューロンが消失することから最終的には痴呆に至る。主な神経病理学的所見は、脳萎縮、老人斑、神経原線維集積物及びアミロイドアンギオパシーである。アルツハイマー病と脳の正常老化のいずれにおいても、ニューロンの喪失と、βアミロイド（以下、Ａβと略記することもある。）の異常沈着が出現する。このような病変は記憶と認知にかかわる海馬や大脳皮質の特定領域に主に認められる。
【０００３】
本発明者は、脳において発現しているプロテアーゼを、天然型脳β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の切断活性を指標に検索することで、天然型脳ＡＰＰを基質とする新規なプロテアーゼを同定した（特許文献１）。このプロテアーゼは、脳ＡＰＰを複数の部位で切断してＡβ含有ペプチドを生成する活性を有する約４０ｋＤａのタンパク質であり、カルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）ファミリーに属する新規プロテアーゼであることを明らかにした。このプロテアーゼは、ヒト脳カルボキシペプチダーゼＢ（ＨＢＣＰＢ）と同定された。ＨＢＣＰＢは、脳に特異的な選択的スプライシングにより発現しているＣＰＢであり、肝臓で産生される血漿型ＣＰＢとは異なる。ＨＢＣＰＢのアミノ酸配列はＣ末端１４アミノ酸が特有でその脳特異性に強く関連しており、またその配列は単一エクソンによりコードされている（Ｃ１４モジュール）。ＨＢＣＰＢは正常脳の神経細胞体、特に海馬錐体ニューロンや外側膝状体ニューロン等限られた神経細胞、全ての上衣細胞・脈絡膜細胞及び一部のミクログリア等グリア細胞の細胞質に発現を認め、特にニューロンではその主たる細胞内局在は小胞体であることを明らかにした。また、ＨＢＣＰＢが髄液及び血液中にも発現していることを明らかにした。さらに、孤発性アルツハイマー病患者の脳では、脳海馬におけるＨＢＣＰＢの発現が著しく低下していることを明らかにした。また、抗ＡβＮ端抗体及び同Ｃ端抗体を利用したウェスタン解析から、ＨＢＣＰＢが、ＡβペプチドをそのＣ末端から分解するエキソペプチターゼ活性を有することを明らかにし、併せて同活性によりＡβペプチドの２量体等オリゴマーを解離する活性を持つことも明らかにした（非特許文献１−１０）。
【０００４】
また、本発明者は、単離されたＨＢＣＰＢのエピトープ、特に脳のＣＰＢに特異的に発現しているＣ末端１４アミノ酸残基のエピトープの１つとして、Ｃ−ターミナル・エピトープ１（以下、ＥＰ１と略記することもある。）を特定した（非特許文献４、７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４５７９４２２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】松本明ら、ニューロレポート（NeuroReport）、 第８巻、３２９７−３３０１頁、１９９７年
【非特許文献２】松本明ら、ニューロサイエンス・レターズ（NeuroscienceLetters）、 第２４２巻、１０９−１１１頁、１９９８年
【非特許文献３】松本明ら、アクタ・ニューロパソロジカ（Acta Neuropathologica）、 第９８巻、５３０−５３２頁、１９９９年
【非特許文献４】松本明ら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス（European Journal of Neuroscience）、 第１２巻、２２７−２３８頁、２０００年
【非特許文献５】松本明、ニューロレポート（NeuroReport）、 第１１巻、３７３−３７７頁、２０００年
【非特許文献６】松本明ら、ニューロサイエンス・リサーチ（Neuroscience Research）、 第３９巻、３１３−３１７頁、２００１年
【非特許文献７】松本明ら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス（European Journal of Neuroscience）、 第１３巻、１６５３−１６５７頁、２００１年
【非特許文献８】松本明ら、アクタ・ヒストケミカ・サイトケミカ（Acta Histochemica Cytochemica）、 第３４巻、２７５−２８３頁、２００１年
【非特許文献９】松本明ら、ニューロサイエンス・リサーチ・コミュニケーションズ（Neuroscience Research Communications）、 第３１巻、７５−８４頁、２００２年
【非特許文献１０】松本明ら、アクタ・バイオロジカ・ハンガリカ（Acta Biologica Hungarica）、 第５４巻、５５−６２頁、２００３年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、神経保護作用、又は神経変性疾患の予防、治療効果を有するペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者により単離されたＨＢＣＰＢは、ＡＰＰプロセッシングにおいて生理的機能を果たしており、アルツハイマー病の病態生理にも重要である。また、ＨＢＣＰＢはそれ自体アルツハイマー病の予防、治療のための薬剤として、また、該予防や治療のための薬剤のスクリーニングへの利用が期待される。一方で、本発明者は、単離されたＨＢＣＰＢに関連して、ＨＢＣＰＢのＣ末端１４アミノ酸残基からなる特異的モジュールペプチド（単一エクソンにコードされるペプチドのことで、以下ＨＢＣＰＢ−Ｃ１４と略記することもある。）及びＨＢＣＰＢ−Ｃ１４のエピトープの１つであるＥＰ１に注目して鋭意研究を重ねた。その結果、ＨＢＣＰＢ−Ｃ１４及びＥＰ１を含むその部分配列、とりわけＨＢＣＰＢ−Ｃ１４のＮ末端のアミノ酸３残基（Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ）を有するペプチドが、胎児マウス大脳皮質由来初代培養細胞及び同海馬由来初代培養細胞に対する神経保護作用を有することを知見した。また、本発明者はＨＢＣＰＢ−Ｃ１４及びその部分配列を有するペプチドが、末梢血流から中枢神経系へ直接、あるいは脈絡膜細胞とトランスサイレチン（以下ＴＴＲと略す。プレアルブミンともいう。）を介する移行特性を駆使して、神経保護活性を発揮することを知見し、さらに研究を重ね、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、
［１］配列番号２記載のアミノ酸配列からなるペプチドもしくはその部分配列からなるペプチド又はその塩を有効成分として含有することを特徴とする神経保護作用剤；
［２］配列番号２記載のアミノ酸配列の部分配列からなるペプチドが、配列番号２記載のアミノ酸配列のＮ末端側の３アミノ酸残基（Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ）を有するものである前記［１］記載の神経保護作用剤；
［３］配列番号２記載のアミノ酸配列の部分配列からなるペプチドが、配列番号３から１２のいずれか記載のアミノ酸配列からなる、又はＳｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏで表されるペプチドである前記［１］又は［２］記載の神経保護作用剤；
［４］神経保護作用が、Ａβ蛋白誘発神経毒性及び／又はグルタミン酸神経毒性に対する保護作用である前記［１］〜［３］のいずれかに記載の神経保護作用剤；
［５］配列番号２記載のアミノ酸配列からなるペプチドもしくはその部分配列からなるペプチド又はその塩を有効性成分として含有することを特徴とする、神経変性疾患の予防又は治療剤；
［６］配列番号２記載のアミノ酸配列の部分配列からなるペプチドが、配列番号２記載のアミノ酸配列のＮ末端側の３アミノ酸残基（Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ）を有するものである前記［５］記載の予防又は治療剤；
［７］配列番号２記載のアミノ酸配列の部分配列からなるペプチドが、配列番号３から１２のいずれか記載のアミノ酸配列からなる、又はＳｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏで表されるペプチドである前記［５］又は［６］記載の予防又は治療剤；
［８］神経変性疾患が、Ａβ蛋白誘発神経毒性及び／又はグルタミン酸神経毒性に関連する疾患である前記［５］〜［７］のいずれかに記載の予防又は治療剤；
［９］神経変性疾患が、脳神経変性疾患、眼神経変性疾患、全身性ＡＬアミロイドーシス、神経芽細胞腫、褐色細胞腫及びアミロイド性糖尿病から選択される少なくとも１の疾患である前記［５］〜［８］のいずれかに記載の予防又は治療剤；
［１０］神経変性疾患が、脳神経変性疾患又は眼神経変性疾患である前記［５］〜［８］のいずれかに記載の予防又は治療剤；
［１１］脳神経変性疾患が、認知症、脳血管障害後亜急性期神経変性症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、脊髄小脳変性症、進行性核上性球麻痺、ハンチントン病、クロイツフェルド・ヤコブ病、狂牛病、神経線維腫瘍から選択される少なくとも１の疾患である前記［９］又は［１０］記載の予防又は治療剤；
［１２］眼神経変性疾患が、網膜色素変性症、黄斑変性症及び緑内障から選択される少なくとも１の疾患である前記［９］又は［１０］記載の予防又は治療剤；
［１３］注射剤である前記［１］〜［１２］のいずれかに記載の剤；及び
［１４］注射剤が静脈内注射用である前記［１３］に記載の剤；
に関する。
【００１０】
さらに、本発明は、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるペプチドもしくはその部分配列からなるペプチド又はその塩と、製薬学的に許容される添加物とを含有することを特徴とする神経保護作用用製剤、又は神経変性疾患の予防又は治療用製剤に関する。また、本発明は、神経保護作用用医薬、又は神経変性疾患の予防又は治療用医薬を製造するための配列番号２記載のアミノ酸配列からなるペプチドもしくはその部分配列からなるペプチド又はその塩の使用に関する。さらに、本発明は、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるペプチドもしくはその部分配列からなるペプチド又はその塩を哺乳類に投与することを特徴とする神経保護方法、又は神経変性疾患の予防又は治療方法に関する。
【００１１】
また、本発明は、
［１５］配列番号３から５、７から１２のいずれか記載のアミノ酸配列からなるペプチド、もしくはＳｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏで表されるペプチド、又はその塩；
［１６］神経保護作用又は神経変性疾患の予防もしくは治療作用を有する配列番号３から５、７から１２のいずれか記載のアミノ酸配列からなるペプチド、もしくはＳｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ、又はその塩；及び
［１７］配列番号３から５、７から１２のいずれか記載のアミノ酸配列からなるペプチド、もしくはＳｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ又はその塩を製造する方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係るペプチドは、Ａβの凝集により誘発される神経毒性や、グルタミン酸神経毒性に対して、極めて高い神経保護作用を有する。このため、本発明に係るペプチドは、神経毒性に関連する神経変性疾患、例えば、脳神経変性疾患、眼神経変性疾患、全身性ＡＬアミロイドーシス、神経芽細胞腫、褐色細胞腫又はアミロイド性糖尿病等の予防、治療薬として利用できる。
また、本発明に係るペプチドは、極めて高度な中枢神経移行性と安定性が期待できる。本発明に係るペプチドは、肝臓で合成される血清蛋白の１つであり、同時に脳脈絡膜細胞で産生される主要な髄液蛋白であり、甲状腺ホルモンやレチノイン酸の運搬を担うＴＴＲと複合体を形成し、血中運搬されると考えられる。このため、ＴＴＲに結合したペプチドは、従来のペプチド薬の欠点である血中プロテアーゼによる分解や、ペプチド自身のリンパ球感作による抗体産生等の副作用機序を原理的にブロックできる優位性を有する。一方、本発明に係るペプチドは、血中に投与した場合、短い物ほど神経脳関門や血液脳関門、血液眼関門を通過できる可能性が高いことは他のペプチド系薬物と同様である。一方ＴＴＲ結合能という本発明に係るペプチドの特殊性から、神経毒性により変性をきたした中枢神経部や網膜を含む眼底とは異なる遠位部に投与して血中から、変性をきたした中枢神経部や網膜を含む眼底に運搬できる。
さらに、上記ＴＴＲの作用効果は、ＴＴＲの結合ポケット（例えば、Ａβ、レチノイン酸や、甲状腺ホルモンのサイレキシン、本発明に係るペプチドとの結合ポケット）の解析・加工により、脳内移行性や眼内移行性に難点があった他の有用な低分子化合物の創薬展開が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、マウス胎児大脳皮質由来初代培養細胞におけるグルタミン酸（１０μＭ）神経毒性に対する配列番号４で示されるペンタペプチド（ＥＰ１Ｎ５）の神経保護効果を示す図である。細胞毒性（％）は、ネガティブコントロールの酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出量を１００％としたときの相対量を示す。
【図２】図２は、マウス胎児大脳皮質由来初代培養細胞におけるグルタミン酸（１０μＭ）神経毒性に対する配列番号５で示されるヘキサペプチド（ＥＰ１Ｎ６）の神経保護効果を示す図である。細胞毒性（％）は、ネガティブコントロールのＬＤＨの放出量を１００％としたときの相対量を示す。
【図３】図３は、マウス胎児大脳皮質由来初代培養細胞におけるグルタミン酸（１０μＭ）神経毒性に対する配列番号６で示されるヘプタペプチド（ＥＰ１）の神経保護効果を示す図である。細胞毒性（％）は、ネガティブコントロールのＬＤＨの放出量を１００％としたときの相対量を示す。
【図４】図４は、マウス胎児大脳皮質由来初代培養細胞におけるグルタミン酸（１０μＭ）神経毒性に対する配列番号２で示されるペプチド（ＨＢＣＰＢ−Ｃ１４）の神経保護効果を示す図である。細胞毒性（％）は、ネガティブコントロールのＬＤＨの放出量を１００％としたときの相対量を示す。
【図５】図５は、マウス胎児大脳皮質由来初代培養細胞におけるグルタミン酸（３０μＭ）神経毒性に対するＥＰ１の神経保護効果を示す図である。細胞毒性（％）は、ネガティブコントロールのＬＤＨの放出量を１００％としたときの相対量を示す。
【図６】図６は、マウス海馬由来初代培養細胞におけるグルタミン酸（１０μＭ及び３０μＭ）神経毒性に対するＨＢＣＰＢ−Ｃ１４及びＥＰ1の神経保護効果を示す図である。細胞毒性（％）は、ネガティブコントロール（Ｎ．Ｃ．）のＬＤＨの放出量を１００％としたときの相対量を示す。
【図７】図７は、マウス胎児大脳皮質由来初代培養細胞におけるＡβ４２蛋白（５μＭ）誘発神経毒性に対するＳｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏで表されるトリペプチド（ＥＰ１Ｎ３）の神経保護効果を示す図である。細胞毒性（％）は、ネガティブコントロールのＬＤＨの放出量を１００％としたときの相対量を示す。
【図８】図８は、マウス胎児大脳皮質由来初代培養細胞におけるＡβ４２蛋白（５μＭ）誘発神経毒性に対する配列番号３で示されるテトラペプチド（ＥＰ１Ｎ４）の神経保護効果を示す図である。細胞毒性（％）は、ネガティブコントロールのＬＤＨの放出量を１００％としたときの相対量を示す。
【図９】図９は、マウス胎児大脳皮質由来初代培養細胞におけるＡβ４２蛋白（５μＭ）誘発神経毒性に対するＥＰ１Ｎ５の神経保護効果を示す図である。細胞毒性（％）は、ネガティブコントロールのＬＤＨの放出量を１００％としたときの相対量を示す。
【図１０】図１０は、マウス胎児大脳皮質由来初代培養細胞におけるＡβ４２蛋白（５μＭ）誘発神経毒性に対するＥＰ１Ｎ６の神経保護効果を示す図である。細胞毒性（％）は、ネガティブコントロールのＬＤＨの放出量を１００％としたときの相対量を示す。
【図１１】図１１は、マウス胎児大脳皮質由来初代培養細胞におけるＡβ４２蛋白（５μＭ）誘発神経毒性に対するＥＰ１の神経保護効果を示す図である。細胞毒性（％）は、ネガティブコントロールのＬＤＨの放出量を１００％としたときの相対量を示す。
【図１２】図１２は、マウス海馬由来初代培養細胞におけるＡβ４２蛋白（５μＭ）誘発神経毒性に対するＥＰ１、ＥＰ１Ｎ６及びＥＰ１Ｎ３の神経保護効果を示す図である。細胞毒性（％）は、ネガティブコントロール（Ｎ．Ｃ．）のＬＤＨの放出量を１００％としたときの相対量を示す。
【図１３】図１３は、ラット脳の海馬及び脈絡膜の組織像と免疫染色所見の図である。（ａ）は、ラット脳海馬を抗Ｃ１４ＥＰ１  ｍａｂ−ｃｌ ６０を用いて染色された免疫組織像を示す図である。（ｂ）は、ラット脳海馬を、抗ＴＴＲポリクロナール抗体を用いて染色された免疫組織化学像を示す図である。（ｃ）は、ラット脳の脈絡膜を抗Ｃ１４ＥＰ１  ｍａｂ−ｃｌ ６０を用いて染色された免疫組織像を示す図である。（ｄ）は、ラット脳の脈絡膜を、抗ＴＴＲポリクロナール抗体を用いて染色された免疫組織像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
配列番号２のペプチド（ＨＢＣＰＢ−Ｃ１４）又はその部分配列からなるペプチド（以下、本発明に係るペプチドということもある。）は、脳カルボキシペプチダーゼＢ（ＨＢＣＰＢ）のアミノ酸配列（配列番号１）に含まれる部分ペプチドである。ＨＢＣＰＢは、脳で発現し、脳β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を複数の部位で切断してＡβ含有ペプチドを生成するペプチダーゼ活性を有する。またＨＢＣＰＢは、ＡβペプチドをそのＣ末端から分解するエキソペプチダーゼ活性を有する（特許第４５７９４２２号（対応する米国特許７０６０２６６号、米国特許７５２４９３４号、米国公開２０１０／０２１９５１号公報）；European Journal of Neuroscience, Vol. 12, pp. 227-238, 2000）。配列番号２のペプチドは、ＨＢＣＰＢのモジュールペプチドとして同定されたペプチドの一つ、Ｃ１４モジュールペプチドである（European Journal of Neuroscience, Vol. 12, pp. 227-238, 2000）。配列番号２のペプチドは、ＨＢＣＰＢのＣ末端１４アミノ酸残基（配列番号１の第３４７位Ｓｅｒ・・・第３６０位Ｌｙｓ）に相当する。
【００１５】
配列番号２の部分配列からなるペプチドとしては、配列番号２のＮ末端側の３アミノ酸残基（Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ）を有するものが好ましい。具体的には、表１に示すペプチドが好ましく、さらにＳｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏで表されるトリペプチド（ＥＰ１Ｎ３）、配列番号３のテトラペプチド（ＥＰ１Ｎ４）、配列番号４のペンタペプチド（ＥＰ１Ｎ５）、配列番号５のヘキサペプチド（ＥＰ１Ｎ６）又は配列番号６のへプタペプチド（ＥＰ１）がより好ましい。
【００１６】
【表１】
0005775356.tif 000002
【００１７】
ＥＰ１は、ＨＢＣＰＢのＣ末端１４アミノ酸残基を認識するＨＢＣＰＢ抗体が認識するＣ−ターミナル・エピトープとして同定されたエピトープ１に相当する（European Journal of Neuroscience, Vol. 13, pp. 1653-1657, 2001）。
【００１８】
本発明に係るペプチドの合成は、特に限定されず、公知の方法（例えば、ペプチド合成の基礎と実験、泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇道典著、丸善１９８５年等参照）を用いて実施できる。具体的方法としては、例えば、有機化学合成法、液相合成法又は固相合成法が挙げられる。ペプチドの合成は、Ｃ末端からＮ末端へ、又はＮ末端からＣ末端とペプチド鎖を伸長させて実施できる。好ましくは、Ｃ末端からＮ末端へのペプチド鎖伸長である。前記ペプチド鎖伸長は、例えば、以下のスキームに従って、行うことができる。
【００１９】
スキーム：
第１工程：ペプチドのＣ末端になるアミノ酸のα-アミノ基以外のすべての官能基を保護する。
第２工程：アミノ酸配列でその隣のアミノ酸の主鎖のカルボキシ基以外のすべての官能基を保護する。
第３工程：第２工程で調製したアミノ酸のカルボキシ基を活性化する。
第４工程：第１工程で調製したアミノ酸のアミノ基を第３工程で活性化されたカルボキシ基と反応させアミノ酸が結合したペプチドとする。
第５工程：第４工程で生成されたペプチドの、次のアミノ酸と反応させるα-アミノ基のみを脱保護する。
第６工程：Ｎ末端のアミノ酸に到達するまで、第２工程〜第５工程を繰り返す。
第７工程：すべての官能基を脱保護（Deprotection）する。
【００２０】
αアミノ基の保護基は限定されないが、好ましくは、ベンジルオキシカルボニル基（ＣｂｚあるいはＺ）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、又はアリルオキシカルボニル基(Ａｌｌｏｃ) 等が挙げられる。アミノ基への保護基の導入と脱保護の方法は特に限定されず、公知の方法で行うことができる。例えば、保護基がＺ基の場合、クロロギ酸ベンジル（ＺＣｌ）とのショッテン・バウマン反応で導入できる。Ｚ基の脱保護はフッ化水素酸等の処理の他、水素化等によっても行なうことができる。保護基がＢｏｃ基の場合、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（Ｂｏｃ２Ｏ）とのショッテン・バウマン反応で導入できる。Ｂｏｃ基の脱保護はトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）又は４Ｎ−ＨＣｌ／ＤＯＸ（４N-Hydrogen chloride in 1,4-Dioxane）等による処理で行なうことができる。保護基がＦｍｏｃ基の場合、Ｎ−（フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）コハク酸イミド（ＦｍｏｃＯＳｕ）とアミン存在下に反応させることで導入できる。Ｆｍｏｃ基の脱保護はピペリジンやトリフルオロ酢酸等による処理で行なうことができる。保護基がＡｌｌｏｃ基の場合、炭酸水素ナトリウム水溶液等を塩基として用い、クロロギ酸アリル（Ａｌｌｏｃ−Ｃｌ）とのショッテン・バウマン反応で導入できる。Ａｌｌｏｃ基はテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム（０）で処理することで脱保護される。
【００２１】
α-カルボキシ基の保護はＣ末端のアミノ酸で必要となる。該保護の方法としては、カルボキシ基のエステル化が挙げられる。エステルとしては、メチルエステルあるいはエチルエステル又はベンジルエステル（Ｂｚｌ又はＢｎ)等が挙げられるが、ベンジルエステルが好ましい。ベンジルエステルはベンジルアルコール中で酸触媒あるいは縮合剤を用いてエステル化することで導入できる。又はカルボキシ基をセシウム塩として臭化ベンジルと反応させても導入できる。保護基は。水素化反応又はトリフルオロ酢酸等で処理することで除去できる。α-カルボキシ基の保護基の除去は、本発明に係るペプチドの合成の最後に側鎖の保護基の脱保護と同時に実施してもよい。
【００２２】
本発明に係るペプチドを構成するアミノ酸のうち、リジンは側鎖にアミノ基を、グルタミン酸は側鎖にカルボキシ基を、アスパラギンは側鎖にアミド基を、及びセリンは側鎖にアルコール性ヒドロキシ基を官能基として有する。例えば、リジン側鎖のアミノ基の保護基としては、上記したαアミノ基の保護基を好ましく用いることができる。グルタミン酸側鎖のカルボキシ基の保護基としては、上記したα-カルボキシ基の保護基を好ましく用いることができる。アスパラギンのアミド基はトリチル基（Ｔｒｔ）やキサンチル基（Ｘａｎ）を用いることができる。セリンのアルコール性ヒドロキシ基はベンジル基やｔｅｒｔ−ブチル基等で保護できる。ベンジル基はフッ化水素酸処理や水素化、ｔｅｒｔ−ブチル基はトリフルオロ酢酸処理等で除去できる。
【００２３】
固相合成法によるペプチド合成では、最初に合成しようとするペプチドのＣ末端のアミノ酸を樹脂に結合させる。このときカルボキシル基末端のアミノ酸のアミノ基は上記保護基で保護したアミノ酸のカルボキシル基を介して樹脂（例えば、ポリスチレン樹脂、レジン等）に結合させる。好ましくはＦｍｏｃ基で保護したＦｍｏｃアミノ酸のカルボキシル基をクロロメチル化ポリスチレン樹脂又は２−クロロトリチル（2-Chlorotrityl）レジン等と反応させてＦｍｏｃアミノ酸と樹脂を結合（Coupling）させる。Ｆｍｏｃアミノ酸が樹脂結合した樹脂は、市販品、例えば、Ｆｍｏｃアミノ酸固定化ＰＬ−Ｒｉｎｋレジン（サイプレスインターナショナル社製）、Ｆｍｏｃアミノ酸固定化ＰＬ−Ｗａｎｇレジン（サイプレスインターナショナル社製）等を利用することもできる。カルボキシル基末端のＦｍｏｃアミノ酸を結合した樹脂をカラムにつめＦｍｏｃ保護基を取り除きアミノ基を遊離させる。次いでＣ末端から２番目のアミノ酸のαアミノ基を保護基で保護した、例えばＦｍｏｃアミノ酸の活性エステルを反応させてペプチド結合を形成させる。以上の脱保護と結合を繰り返すことで目的とするアミノ酸配列を持ったペプチドをＣ末端からＮ末端に向けて合成できる。ペプチド鎖の延長が終われば樹脂からアミノ酸の官能基が保護基で保護されたペプチドを切り出す。ペプチドの切り出しは、特に限定されず、例えばトリフルオロ酢酸やアニソール等の後処理試薬を適宜選択できる。ついでＦｍｏｃならびにアミノ酸側鎖の保護基を取り除くことにより、目的のペプチドを得ることができる。必要により、ＨＰＬＣで精製できる。
【００２４】
本発明に係るペプチドの合成は、自動合成装置により行ってもよい。自動合成装置は、公知の装置を利用することができる。公知の自動合成装置としては、例えば、Ｍｏｄｅｌ  ４３３Ａ  ペプチドシンセサイザ(アプライドバイオシステムイズ社製)、ペプチド合成装置ＰＳＳＭ−８（島津製作所製）、又はＡｐｅｘ３９６全自動マルチペプチド合成装置（ＡＡＰＰＴＥＣ社製）、Ａｐｏｇｅｅ全自動シングルペプチド合成装置（ＡＡＰＰＴＥＣ社製）又はＦｏｃｕｓ  ＸＣ全自動ペプチド合成装置（ＡＡＰＰＴＥＣ社製）等を挙げることができる。自動合成装置を使用する場合、装置の合成プログラムに従い製造することができる。
【００２５】
ペプチドのＣ末端は、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが挙げられる。
【００２６】
本発明に係るペプチドのうち７以上のアミノ酸配を有するぺプチドは、本発明の神経保護作用を保持する限りにおいて、そのアミノ酸配列の５アミノ酸以内、好ましくは、４、３、２又は１アミノ酸が、置換、欠失、および／または挿入により、配列番号２、６〜１２のペプチドに対してアミノ酸配列が異なるペプチドも本発明に含まれる。置換されるアミノ酸は、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましいと考えられる。例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有すると考えられる。また、非荷電性としては、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、ＡｓｐおよびＧｌｕが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓが挙げられる。
【００２７】
ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩又は酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが挙げられる。
【００２８】
本発明において、神経保護はグルタミン酸やカイニン酸等興奮性物質による神経毒性によるもの、ペプチド又はタンパク質の凝集体による神経毒性（Ａβ毒性、プリオン毒性を含む）によるもの、ＮＯ（一酸化窒素）や活性酸素種によるもの、中枢神経系の神経細胞に対する脳虚血等の虚血様作用によるもの等からの保護が含まれる。また、神経保護は、例えば、中枢神経系の神経細胞に対する負荷（例えば、ストレス、栄養障害、病気、外傷、手術等による体力低下、衰弱、老化等、恒常性維持に好ましくない物理的又は化学的な障害もしくは細胞毒性作用）による神経細胞死の予防や防止、神経細胞の機能低下の防止等も含まれる。神経保護作用は、神経障害又は神経毒性を抑制、阻害、抑止、コントロール、制御する作用等を含み、神経の変性を遅らせることや、障害を受けた神経を修復することを含む。神経障害、神経毒性は、特に大脳皮質又は海馬を含む脳の神経や網膜を含む眼神経における神経毒性が挙げられる。神経毒性誘発物質としては、例えば、アルツハイマー型認知症をはじめとする神経変性疾患に伴うニューロン死を惹起する危険因子が挙げられる。前記危険因子としては、例えば、興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸、アルツハイマー病因ペプチドであるＡβ等が挙げられる。Ａβは、Ａβ４０及びＡβ４２を含む。ＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸）受容体を介するグルタミン酸神経毒性には、アポトーシスとネクローシスの両者が含まれ、その両方のニュ−ロン死の過程において一酸化窒素（ＮＯ）とスーパーオキシドの関与するラジカル連鎖反応も含まれる。
【００２９】
本発明にかかる神経保護作用の評価は、例えば細胞死を測定することで評価できる。細胞死は例えば細胞膜の傷害等を定量する方法で評価できる。具体的には、例えば(i)トリパンブルーやプロピディウムイオダイド（ＰＩ）を用いて染色された細胞を顕微鏡観察によってカウントする方法；(ii)［51Ｃｒ］や［3Ｈ］−チミジン等のラジオアイソトープや、蛍光色素により，あらかじめ標識された細胞からの放出をアッセイする方法；又は、(iii)傷害細胞から放出される細胞質由来酵素活性を測定する方法等が挙げられる。(iii)には、例えばアルカリ又は酸性ホスファターゼ等の放出酵素活性や、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を測定する方法が挙げられる。なかでも、ＬＤＨは細胞に存在する細胞質由来の安定な酵素で，細胞膜が傷害をうけるとすみやかに培養上清中に放出されるので、ＬＤＨを測定する方法が好ましい。具体的には、例えば、実施例に示すように、胎児マウス又はラット等の海馬又は大脳皮質由来の初代培養神経細胞系において、例えばＡβ４２又はグルタミン酸と本発明に係るペプチドとを共に培養し、培養液に放出されるＬＤＨを測定することにより本発明に係るペプチドの神経保護作用を評価できる。
【００３０】
神経変性疾患は、神経の変性を伴う疾患をいい、例えば神経毒性に関連する神経変性疾患を含む。神経変性は、例えば神経細胞内部に異常蛋白質が蓄積し神経細胞に選択的な細胞死（ニューロン死）を生じさせることを含む。神経変性疾患としては、中枢神経の中の特定の神経細胞群が細胞死を引き起こす疾患が挙げられる。これらの神経変性疾患における細胞死の要因としては、種々の内在性物質、例えば、Ａβやグルタミン酸等が挙げられる。このため神経変性疾患としては、Ａβ誘発神経毒性及び／又はグルタミン酸神経毒性に関連する疾患が挙げられる。神経毒性に関連するには、神経毒性に誘発されること、起因すること、誘因となること、及びきっかけとなること等を含む。
【００３１】
神経変性疾患としては、神経毒性に関連する疾患であれば特に限定されないが、例えば、脳神経変性疾患、眼神経変性疾患、全身性ＡＬアミロイドーシス、神経芽細胞腫、褐色細胞腫又はアミロイド性糖尿病等が挙げられる。前記脳神経変性疾患としては、認知症、脳血管障害後亜急性期神経変性症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、脊髄小脳変性症、進行性核上性球麻痺、ハンチントン病、クロイツフェルド・ヤコブ病、狂牛病又は神経線維腫瘍等が挙げられる。認知症には、アルツハイマー病、軽度認知機能障害、レヴィ小体病、前頭側頭型痴呆症又は脳血管性痴呆等の血管性病態に随伴する神経変性疾患が含まれる。眼神経変性疾患としては、網膜色素変性症、黄斑変性症又は緑内障（例えば、正常眼圧緑内障等）等が挙げられる。
【００３２】
本発明に係るペプチドは、例えば、神経保護作用薬剤、神経変性疾患の予防薬や治療薬等医薬への応用が考えられる。本発明に係るペプチドを医薬として用いる場合には、本発明に係るペプチドを直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。製剤化は、例えば、薬理学的、製薬的に許容される水性液又は油性液に溶解補助剤等の添加物等と適宜組み合わせて注射剤とすることができる。水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等）等が挙げられ、溶解補助剤としては、例えば、アルコール（例えば、エタノール等）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン（５０）硬化ヒマシ油（ＨＣＯ−５０）等）等が挙げられる。油性液としては、例えばゴマ油、大豆油等が挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等が挙げられる。また、注射剤には、上記の他、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール等）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノール等）、酸化防止剤（例えば、亜硫酸水素ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム等）等を配合してもよい。調製された注射剤は、通常、適当なアンプル又はバイアル瓶に充填される。注射剤は、公知の方法で無菌的に製造される。また、注射剤は、例えば、凍結乾燥法等により、バイアル瓶中で乾燥製剤とされ、用時、注射用水や生理食塩水等の溶解液で溶解して用いる形態であってもよい。凍結乾燥製剤は、溶解液とのキット又はセットの包装形態とすることもできる。注射剤は、静脈内注射用、筋肉内注射用、皮下注射用、髄腔内又は脳室内注射用を含むが、静脈内注射用が好ましい。
【００３３】
また、本発明に係るペプチドは、例えば、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、マイクロカプセル剤等の形態で経口に供される製剤とすることもできる。例えば、本発明に係るポリペプチドを薬理学的、製薬的に許容される添加剤とともに公知の方法で製剤化できる。添加剤としては、特に限定されないが、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤；乳糖、デンプン、結晶性セルロース等の賦形剤；コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等の膨化剤；デンプン、セルロース等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；又は、ショ糖、乳糖又はサッカリン等の甘味剤等が挙げられる。本発明に係るペプチドを経口投与用製剤とする場合、腸溶性コーティング剤で、コーティングした顆粒剤又は錠剤、あるいは腸溶性カプセル剤とすることが好ましい。腸溶性コーティング剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸コポリマー、カルボキシメチルエチルセルロース等が挙げられる。
【００３４】
本発明に係るペプチドを含有する製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、神経変性疾患を患っている哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル等）に対して投与することができる。本発明に係るペプチドの投与量は、患者の体重や年齢、投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。例えば、アルツハイマー病の治療目的で本発明に係るポリペプチドを静脈内投与する場合の投与量は、通常、成人（６０ｋｇとして）一人当たり、本発明に係るペプチドを約０．３〜３．０ｍｇ／日が好ましい。
【００３５】
また、実施例５に示すように、ラット脳の免疫組織化学研究において、ＨＢＣＰＢ−Ｃ１４のエピトープの１つであるＥＰ１が脈絡膜及び海馬において検出された。また同時に脈絡膜では、ＥＰ１が検出された同位置にＴＴＲが検出された。しかし、ＴＴＲは海馬に検出されなかった。このことは、本発明に係るペプチドはＴＴＲを介する中枢神経系への移行特性を駆使して、脈絡膜上皮細胞に選択的に輸送され得ること示すものと考えられる。前記ＴＴＲを介するには、ＴＴＲを介在、仲介又は媒介すること、或いはＴＴＲと結合又は複合体を形成することを含む。脈絡膜は、脳脈絡膜及び網膜脈絡膜を含む。脈絡膜は、血液から必要な成分を脳内（例えば、海馬等を含む大脳辺縁系等）又は網膜に移行させ得る。従って、脈絡膜に輸送された本発明に係るペプチドは、脈絡膜から脳内又は網膜に移行され得る。このことから、本発明に係るペプチドの効果は、脳関門や、血液眼関門を通過できることを含む。このため、本発明に係るペプチドは、脳や眼内の神経変性部位に局所的に投与することなく、ボーラス投与や、点滴静注等によって、末梢血流から神経変性部位のある脳や眼内に、本発明に係るペプチドを到達させ得る。また、ＴＴＲと結合又は複合体を形成した本発明に係るペプチドは、血中プロテアーゼによる分解を受けにくく、投与された後も安定に体内で存在し得るし、さらに、ＴＴＲのポケットを介し包含されるため、リンパ球感作を受けにくくなり、当該ペプチドに対する抗体産生等の副作用もブロックし得るので、安全に使用できる。
【００３６】
本発明に係る脳内移行は、例えば脳バイオプシー等で得られる試料を、標識ペプチド(例えば、ＥＰ１又はＴＴＲ等)に対する抗体を用いて免疫組織化学的に光学顕微鏡、又は複数の抗体の反応性を同一組織切片上で行う共焦点レーザー顕微鏡、あるいは蛍光顕微鏡下で可視化して確認することができる。
【００３７】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、実施例は、本発明を限定するものではない。
なお、以下の略号は、アミノ酸を表す。
Ａｓｎ：Ｌ−アスパラギン
Ｇｌｕ：Ｌ−グルタミン酸
Ｌｅｕ：Ｌ−ロイシン
Ｌｙｓ：Ｌ−リジン
Ｐｒｏ：Ｌ−プロリン
Ｓｅｒ：Ｌ−セリン
Ｖａｌ：Ｌ−バリン
【００３８】
以下の略号は、対応する下記のアミノ酸の保護基及び側鎖保護アミノ酸を表す。
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
ｔＢｕ：ｔ−ブチル
Ｔｒｔ：トリチル
Ｂｏｃ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎ−γ−トリチル−Ｌ−アスパラギン
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−γ−ｔ−ブチルエステル
Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ：Ｎα−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−セリン
【００３９】
以下の略号は、対応する下記の反応溶媒、反応試薬等を表す。
ＨＢＴＵ：２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート
ＨＯＢｔ：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン（Bovine serum albumin）
【実施例１】
【００４０】
マウス胎児大脳皮質由来初代培養細胞におけるグルタミン酸神経毒性に対する各種ペプチドの効果
１．細胞培養用Plateのコーティング
（１）コーティング液の調整
ポリエチレンイミン２ｍＬを０．１５Ｍホウ酸緩衝液（ホウ酸１８．５４ｇ／２Ｌ純水（ＲＯ水））２００ｍLに加え、コーティング原液として４℃で保存した。保存したコーティング原液を０．１５Ｍホウ酸緩衝液で５倍に希釈してコーティング液とした。
（２）プレートのコーティング
クリーンベンチでコーティング液を滅菌フィルター(ポアサイズ：０．２２μｍ；ミリポア社製)を用い、フィルター滅菌した。滅菌したコーティング液を、プレート（４８穴プレート）に加え、一晩静置してコーティングした。コーティングしたプレートを滅菌水で２回洗浄した。アスピレータを用いてポリエチレンイミンを吸引し、滅菌水でプレートを洗浄し、紫外線ランプを照射しながら、クリーンベンチ内で、乾燥させた。
２．培地の調整
培地は、神経細胞培養用培地を用いた。具体的には、１％ペニシリン・ストレプトマイシン（イーライ・リリー社製）を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（インビトロジェン社製）５０ｍＬに、Ｂ−２７  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ギブコ社製）１ｍＬ及びＬ−グルタミン１２５μＬ（最終濃度：０．５ｍＭ）を加え、ＦＢＳを１０％濃度となるよう添加して調製した。
３．被験薬
被験薬として、インビトロジェン株式会社にて合成されたＨＢＣＰＢ／Ｃ１４、ＥＰ１、ＥＰ１Ｎ３、ＥＰ１Ｎ４、ＥＰ１Ｎ５及びＥＰ１Ｎ６を用いた。被験薬は、１０μＭ濃度となるようリン酸緩衝液（カルシウム無添加）に溶解したものを培地に添加した。陽性対象として、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストであるＭＫ８０１（マレイン酸ジゾシルピン；和光純薬社製）を用いた。
【００４１】
４．マウス胎児大脳皮質由来細胞の調製と、調製した細胞を用いたグルタミン酸神経毒性アッセイ
（１）マウス胎児大脳皮質由来細胞の調製
雌性マウス（妊娠１８日齢）にネンブタール麻酔を施した。クリーンベンチにアルミ箔をひき、その上に麻酔をしたマウスを置き、開腹して胎児を取り出し、１０ｃｍ細胞培養ディッシュに入れた。はさみで胎児の頭を切り取り、新しい１０ｃｍ細胞培養ディッシュに入れた。次いで、頭部をピンセットで抑え、はさみで頭を切り開き、薬さじで脳を取り出した。実体顕微鏡下で大脳皮質部を取り出した。大脳皮質部からピンセットで脳膜を除去し、大脳皮質（cortex）をハンクス液が入っている細胞培養ディッシュに入れた。前記大脳皮質（cortex）とハンクス液を５０ｍＬチューブに移し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心した上清を捨て、トリプシン溶液４ｍＬを入れ、３７℃で２０分間、トリプシン処理した。その後、培地１６ｍＬを入れ、細胞をよく懸濁させた後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を捨てた。細胞の入ったチューブに培地を加え、細胞を再懸濁させた後トリパンブルーを用いて染色されていない生細胞数をカウントし、コーティングした４８穴プレートに細胞数が１．２〜１．５×１０5細胞／ｗｅｌｌ（１ｗｅｌｌ当たりの用量：０．９−１．２ｍｌ）となるように、細胞を播種した。
（２）グルタミン酸神経毒性アッセイ
グルタミン酸神経毒性アッセイは、マウス胎児大脳皮質由来細胞の初代培養細胞を用いてその細胞毒性をＬＤＨアッセイで測定した。すなわち、調製した細胞の入ったｗｅｌｌに、本発明に係るペプチド及びグルタミン酸（最終濃度：１０μＭ又は３０μＭ）を添加し、３７℃で３日間、５％ＣＯ２インキュベータで培養した。培養３日目に、グルタミン酸を含まない培地に交換し、さらに培養を行った。培養７日又は８日目にグルタミン酸により障害を受けた細胞（又は溶解した細胞）から放出された乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）をＬＤＨアッセイ法で測定した。ＬＤＨアッセイは、ＬＤＨ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を用いた。陽性コントロールは、ＭＫ８０１（ジゾシルピン）１μＭを用いた。細胞毒性は、グルタミン酸及び被験薬フリーの培地で測定した細胞から放出されるＬＤＨ量（ネガティブコントロール）を１００％としたときのＬＤＨの相対量（％）で示した。
【００４２】
図１〜５に示すように、グルタミン酸による細胞の処理は、ＬＤＨ放出量がグルタミン酸無添加時に比較して大きく増加した。本発明に係るペプチドはいずれもグルタミン酸によるＬＤＨ放出量を大きく抑制した。本発明に係るペプチドはいずれも１０ｎＭ以下の低濃度でも神経保護作用を示した。
【実施例２】
【００４３】
マウス胎児海馬由来初代培養細胞におけるグルタミン酸神経毒性に対する各種ペプチドの効果
（１）マウス胎児海馬由来細胞の調製
ＩＣＲマウス（妊娠１５日齢）を頚椎脱臼法により屠殺した。クリーンベンチにアルミ箔をひき、その上にマウスを置き、開腹して胎児を取り出し、１０ｃｍ細胞培養ディッシュに入れた。はさみで胎児の頭を切り取り、新しい１０ｃｍ細胞培養ディッシュに入れた。次いで、実体顕微鏡下で脳を取り出し、脳の背側を上にして脳膜をはがした後、海馬を切り取り、カルシウム無添加リン酸緩衝液に入れた。前記海馬と等張緩衝液を５０ｍＬチューブに移し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心した上清を捨て、トリプシン溶液４ｍＬを入れ、３７℃で２０分間、トリプシン処理した。その後、培地１６ｍＬを入れ、細胞をよく懸濁させた後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を捨てた。細胞の入ったチューブに培地を加え、細胞を再懸濁させた後トリパンブルーを用いて染色されていない生細胞数をカウントし、コーティングした４８穴プレートに細胞数が１．２〜１．５×１０5細胞／ｗｅｌｌ（１ｗｅｌｌ当たりの用量：０．９−１．２ｍｌ）となるように、細胞を播種した。
（２）グルタミン酸神経毒性アッセイ
グルタミン酸神経毒性アッセイは、マウス胎児海馬由来細胞の初代培養細胞を用いてその細胞毒性をＬＤＨアッセイで測定した。すなわち、調製した細胞の入ったｗｅｌｌに、本発明に係るペプチド及びグルタミン酸（最終濃度：１０μＭ又は３０μＭ）を添加し、３７℃で３日間、５％ＣＯ２インキュベータで培養した。培養３日目に、グルタミン酸を含まない培地に交換し、さらに培養を行った。培養７日又は８日目にグルタミン酸により障害を受けた細胞（又は溶解した細胞）から放出された乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）をＬＤＨアッセイ法で測定した。ＬＤＨアッセイは、ＬＤＨ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＣａｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌ社製）を用い、キットに添付のマニュアルに従い測定した。陽性コントロールは、ＭＫ８０１（ジゾシルピン）１μＭを用いた。細胞毒性は、グルタミン酸及び被験薬フリーの培地で測定した細胞から放出されるＬＤＨ量（ネガティブコントロール）を１００％としたときのＬＤＨの相対量（％）で示した。
【００４４】
図６に示すように、グルタミン酸による細胞の処理は、ＬＤＨ放出量がグルタミン酸無添加時に比較して大きく増加した。本発明に係るペプチドはいずれもグルタミン酸によるＬＤＨ放出量を大きく抑制した。本発明に係るペプチドは、グルタミン酸（１０μＭ）細胞毒性に対していずれも１０ｎＭ以下の低濃度でも神経保護作用を示した。
【実施例３】
【００４５】
マウス胎児大脳皮質由来初代培養細胞におけるＡβ４２神経毒性に対する各種ペプチドの効果
実施例１の４．（２）におけるグルタミン酸（最終濃度：１０μＭ又は３０μＭ）の代わりにＡβ４２（最終濃度：５μＭ）を添加する以外は実施例１と同様に試験を行った。
【００４６】
図７〜１１に示すように、Ａβ４２による細胞の処理は、ＬＤＨ放出量がＡβ４２無添加時に比較して約２．５〜３．５倍に増加した。本発明に係るペプチドはいずれもＡβ４２によるＬＤＨ放出量を大きく抑制した。本発明に係るペプチドは、Ａβ４２（５μＭ）神経毒性に対していずれも１０ｎＭ以下の低濃度でも神経保護作用を示した。
【実施例４】
【００４７】
マウス胎児海馬由来初代培養細胞におけるＡβ４２神経毒性に対する各種ペプチドの効果
実施例２の（２）におけるグルタミン酸（最終濃度：１０μＭ又は３０μＭ）の代わりにＡβ４２（最終濃度：５μＭ）を添加する以外は実施例２と同様に試験を行った。
【００４８】
図１２に示すように、Ａβ４２による細胞の処理は、ＬＤＨ放出量がＡβ４２無添加時に比較して約２．５〜３．５倍に増加した。本発明に係るペプチドはいずれもＡβ４２によるＬＤＨ放出量を大きく抑制した。本発明に係るペプチドは、Ａβ４２（５μＭ）神経毒性に対していずれも１０ｎＭ以下の低濃度でも神経保護作用を示した。
【実施例５】
【００４９】
安全性試験
マウス尾静脈にＥＰ１を２０ｍｇ／ｋｇ、投与した。２カ月間飼育観察した。その結果、マウスの生活状況、習性、記憶学習機能等に変化を窺わせる所見はみられなかった。このことから、ＥＰ１は、安全に使用できる医薬になり得ると考えられた。
【実施例６】
【００５０】
２．免疫組織化学的研究
免疫組織化学的研究に使用されるサンプルは、ラット脳を用い、定法に従い、１０％ホルムアルデヒドで固定後、厚さ５μｍのパラフィン切片を調製した。免疫組織化学的分析は、アビジン・ビオチン・複合体（ＡＢＣ）法で行った。すなわち、パラフィン切片のパラフィンを除去し、３％過酸化水素水に５分間浸し、内因性ペルオキシダーゼ活性を抑制した。切片はクエン酸ナトリウム緩衝液に入れ、次いでリン酸緩衝生理食塩水に浸した。切片は一次抗体（１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水で１００倍希釈）とともにモイストチャンバー内で、４℃で一晩インキュベートした。反応生成物は、３，３−ジアミノベンジジンで呈色し、光学顕微鏡下で観察した。一次抗体は、ＥＰ１に対するモノクロナル抗体（ｍａｂ）の中から特異性の良好なクローン６０（ｃｌ６０）を選択し、抗ＥＰ１  ｍａｂ−ｃｌ．６０抗体（以下、抗ＥＰ１抗体という。）として用い、また、ＴＴＲに対する一次抗体は、抗ＴＴＲポリクロナール抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製又は和光純薬株式会社製）を使用した。
【００５１】
図１３（a）は、ラット海馬における抗ＥＰ１抗体による免疫組織化学的所見を示す。ＥＰ１は、ラット海馬に存在していることが分かる。図１３（b）は、ラット海馬における抗ＴＴＲ抗体による免疫組織化学的所見を示す。ＴＴＲは、ラット海馬に検出されなかった。図１３（c）は、ラット大脳皮質脈絡膜における抗ＥＰ１抗体による免疫組織化学的所見を示す。ＥＰ１は、ラット大脳皮質脈絡膜の脈絡膜上皮細胞に検出された。図１３（d）は、ラット大脳皮質脈絡膜における抗ＴＴＲ抗体による免疫組織化学的所見を示す。ＴＴＲは、ＥＰ１が検出された部位と同じラット大脳皮質脈絡膜の脈絡膜上皮細胞に検出された。これらの結果から、ＥＰ１がＴＴＲと親和性を介して、脳脊髄液（ＣＳＦ）に移行し、脈絡膜上皮細胞に選択的に輸送され、脈絡膜上皮細胞においてＴＴＲからＥＰ１が遊離され、脳内に移行したと考えられた。また、本結果から、ＥＰ１は脳血液関門（blood-brain barrier；ＢＢＢ）での透過性の制約を受けず、脳内に移行できることが示唆された。
【実施例７】
【００５２】
Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ（ＥＰ１Ｎ３）の合成の合成
Ｆｍｏｃ−ＮＨｌが結合した担体樹脂を自動合成機（島津製作所）の反応容器に入れ、ＤＭＦを加えて３分間攪拌し溶液を排出した後、島津製作所の合成プログラムに従い次の操作を行う。
（ａ）３０％ピペリジン−ＤＭＦ溶液を加えて混合物を４分間攪拌し、該溶液を排出し、この操作をもう１回繰り返す。
（ｂ）担体樹脂をＤＭＦで１分間洗浄し、該溶液を排出し、この操作を５回繰り返す。
（ｃ）Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、ＨＢＴＵ、ＨＯＢｔ・１水和物及びＤＩＥＡをＤＭＦ中で３分間攪拌し、得られた溶液を樹脂に加えて混合物を６０分間攪拌し、溶液を排出する。
（ｄ）担体樹脂を６００μＬのＤＭＦで１分間洗浄後溶液を排出し、これを５回繰り返した。こうして、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＮＨ  が担体上に合成される。
（ｅ）次に、（ａ）及び（ｂ）の工程の後、（ｃ）の工程でＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨを用いて縮合反応を行い、（ｄ）の洗浄工程を経て、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＮＨが担体上に合成される。
（ｆ）工程（ｃ）において、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを用いて、（ａ）〜（ｄ）を繰り返した後、（ａ）（ｂ）の脱保護、洗浄工程を経て、メタノール、ブチルエーテルで順次洗浄し、減圧下１２時間乾燥して、側鎖保護ペプチドの結合した担体樹脂を得る。これに、ＴＦＡ（９０％）、チオアニソール（５％）及び１，２−エタンジチオール（５％）からなる混合溶液を加えて室温で２時間放置し、側鎖保護基を除去するとともに樹脂よりペプチドを切り出る。樹脂を濾別後、得られた溶液にエーテルを加え、生成した沈澱を遠心分離及びデカンテーションにより回収し、粗ペプチドを取得する。この粗生成物全量を酢酸水溶液に溶解後、逆相カラム（資生堂製、ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ３０ｍｍＩ．Ｄ．Ｘ２５０ｍｍ）を用いたＨＰＬＣで精製する。０．１％ＴＦＡ水溶液に、ＴＦＡ０．１％を含む９０％アセトニトリル水溶液を加えていく直線濃度勾配法で溶出し、２２０ｎｍで検出し、ＥＰ１Ｎ３を含む画分を得る。この画分を凍結乾燥して、ＥＰ１Ｎ３を得る。
【実施例８】
【００５３】
Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（ＥＰ１Ｎ４；配列番号３）の合成
実施例７の工程（ｃ）のＦｍｏｃ−アミノ酸として、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨを用い、（ｅ）のＦｍｏｃ−アミノ酸として、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨを用い、工程（ｆ）のＦｍｏｃ−アミノ酸として、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを順次用いて実施例１と同様にペプチド鎖を合成し、精製しＥＰ１Ｎ４を得る。
【実施例９】
【００５４】
Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ（ＥＰ１Ｎ５；配列番号４）の合成
実施例７の工程（ｃ）のＦｍｏｃ−アミノ酸として、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨを用い、（ｅ）のＦｍｏｃ−アミノ酸として、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨを用い、工程（ｆ）のＦｍｏｃ−アミノ酸として、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを順次用いて実施例１と同様にペプチド鎖を合成し、精製しＥＰ１Ｎ５を得る。
【実施例１０】
【００５５】
Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ（ＥＰ１Ｎ６；配列番号５）の合成
実施例７の工程（ｃ）のＦｍｏｃ−アミノ酸として、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨを用い、（ｅ）のＦｍｏｃ−アミノ酸として、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨを用い、工程（ｆ）のＦｍｏｃ−アミノ酸として、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを順次用いて実施例１と同様にペプチド鎖を合成し、精製しＥＰ１Ｎ６を得る。
【００５６】
参考例１：Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（ＥＰ１）の合成
実施例７の工程（ｃ）のＦｍｏｃ−アミノ酸として、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨを用い、（ｅ）のＦｍｏｃ−アミノ酸として、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨを用い、工程（ｆ）のＦｍｏｃ−アミノ酸として、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを順次用いて実施例１と同様に順次ペプチド鎖を合成し、精製し、ＥＰ１を得る。
【００５７】
参考例１：Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ＨＢＣＰＢ−Ｃ１４）の合成
実施例７の工程（ｃ）のＦｍｏｃ−アミノ酸として、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨを用い、（ｅ）のＦｍｏｃ−アミノ酸として、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨを用い、工程（ｆ）のＦｍｏｃ−アミノ酸として、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを順次用いて実施例１と同様にペプチド鎖を合成し、精製しＨＢＣＰＢ−Ｃ１４を得る。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明に係るペプチドは、神経保護作用を有するので、これを含む製剤は、神経変性疾患の予防、治療用製剤として、医薬の分野に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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