(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＰタンパク質のポリペプチド配列内に変異を含むＨ−１ラットパルボウイルス（Ｈ−１ＰＶ）であって、前記変異はＨ−１ＰＶのＶＰ２タンパク質におけるＩ３６７Ｓおよび／またはＨ３７３Ｒの変異であるＨ−１ラットパルボウイルス。
【請求項２】
前記パルボウイルスは、腫瘍細胞中で発現した受容体に対する高い親和性を備える異種ペプチドまたはタンパク質をさらに含む請求項１に記載のＨ−１ラットパルボウイルス。
【請求項３】
前記異種ペプチドまたはタンパク質は、アミノ酸配列ＲＧＤを含む請求項２に記載のＨ−１ラットパルボウイルス。
【請求項４】
前記異種ペプチドまたはタンパク質は、前記パルボウイルスのＶＰ２タンパク質のＡ４４１位（ＶＰ１タンパク質のＡ５８３に対応する）で挿入される請求項２または３に記載のＨ−１ラットパルボウイルス。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のＨ−１ラットパルボウイルスを含有する医薬組成物。
【請求項６】
癌治療に使用するための請求項１〜４のいずれか一項に記載のＨ−１ラットパルボウイルス。
【請求項７】
前記使用は、メラノーマ、脳腫瘍、乳癌または子宮頸癌を治療するためであることを特徴とする請求項６に記載の使用のための請求項１〜４のいずれか一項に記載のＨ−１ラットパルボウイルス。
【請求項８】
前記使用は、膠芽細胞腫を治療するためであることを特徴とする請求項６に記載の使用のための請求項１〜４のいずれか一項に記載のＨ−１ラットパルボウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パルボウイルス、特に、癌療法において有用であり、そのカプシドの改変により遺伝的に再標的化可能なＨ−１ＰＶを提供する。
【背景技術】
【０００２】
パルボウイルス（ＰＶ）は、昆虫からヒトにまでの極めて広い範囲の動物種に感染する、エンベロープを有さない小さな一本鎖ＤＮＡウイルスである（非特許文献１（１））。マウスのパルボウイルス微小ウイルス（ＭＶＭ）が形質転換ヒト細胞を殺滅可能であるという最初の観察（非特許文献２（２））以降、他の自律性の齧歯類パルボウイルス、例えばラットＨ−１ＰＶは、ヒトに対して非病原性でありながら、様々な細胞培養および動物モデルにおいて腫瘍崩壊および腫瘍抑制活性を有すると報告されてきた（非特許文献３、４（３）、（４））。
【０００３】
ＰＶの抗悪性腫瘍作用は、形質転換細胞による優れたウイルス取り込みに起因するのではなく、これらの細胞におけるより効率的なウイルス複製に起因する。これは主として、ＰＶの複製およびウイルス遺伝子発現が細胞性因子、例えば全てが癌細胞においてアップレギュレートされることが公知であるＥ２Ｆ、ＣＲＥＢ、ＡＴＦ、サイクリンＡ（非特許文献５（５））等に依存するという事実による。さらに、ＰＶは、細胞性の抗ウイルス防衛機構に対抗可能な戦略を展開しなかった（非特許文献６（６））。癌細胞はこれらの抗ウイルス経路に欠陥を有することが多く、ウイルスのライフサイクルにとってより好都合な環境を提供する。
【０００４】
その抗悪性腫瘍作用に加えて、癌療法において齧歯類ＰＶを使用するまた別の肯定的な態様は、一般にヒトが以前にパルボウイルス感染に曝されていないということであり、これは先在する抗ウイルス免疫の結果として生じる迅速なウイルス除去の問題を回避する（非特許文献７（７））。これによりＰＶはヒト病原体（例えば、アデノウイルス、ＨＳＶ、ＶＳＶ等）をベースとする、癌療法において使用される他のベクターと比較して良好な立場に位置付けられる。要するに、これらの特性のためにこれらのウイルスは極めて魅力的な抗癌薬となる。
【０００５】
Ｈ−１ＰＶの抗癌能力は極めて多数の前臨床試験によって支持されているが、有効性は臨床用途における限定要因であると予測することができる。１の主要な制限に、ＰＶが依然として正常細胞に侵入し得るという事実がある。非腫瘍細胞によるこのウイルスの取り込みは、投与されたウイルス用量のかなりの部分を腫瘍標的から遠ざける。そこでＰＶ侵入の腫瘍細胞への標的化は、パルボウイルスをベースとする治療の有効性を高め、正常細胞への起こり得る副作用に対して追加の安全性を提供する。
【０００６】
ＰＶの自然細胞への侵入を改変するために、細胞培養（８）またはｉｎ  ｖｉｖｏ（９、１０）実験における天然系統の新規細胞タイプへの順応に基づいて幾つかの試みが実施されてきた。しかしこれらのアプローチには予測可能性が欠けており、従来の半許容性の細胞系および既存のウイルスの指向性に限定される。または、変化した指向性を備えるＰＶも、カプシド全体を関連ウイルスの１つと置換することによって産生されてきた（１１）。しかしこの戦略には、この改変が遺伝性ではない、および子孫ウイルスが初期ウイルス投与と同一の再標的化能力を維持しないという制限が設けられる。ウイルスの腫瘍指向性を増加させるアプローチは、このウイルスの細胞侵入を癌細胞特異的受容体へ遺伝的に再標的化することであろう。この戦略は、遺伝子治療または腫瘍治療のために他のエンベロープを有さないウイルス、例えば関連性アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（１２〜１５）またはアデノウイルス（１６〜１８）を用いた再標的化の成功は証明したが、自律性パルボウイルスサブグループのメンバーを再標的化する試みについてはまだ報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Siegl G. Biology and pathogenicity of autonomous parvoviruses. In: Berns KI, editor. The parvoviruses. New York, N.Y.: Plenum Press, Inc.; 1983. p. 297-362.
【非特許文献２】Mousset S, Rommelaere J. Minute virus of mice inhibits cell transformation by simian virus 40. Nature 1982;300 (5892):537-9.
【非特許文献３】Cornells JJ, Becquart P, Duponchel N, Salome N, Avalosse BL, Namba M, et al. Transformation of human fibroblasts by ionizing radiation, a chemical carcinogen, or simian virus 40 correlates with an increase in susceptibility to the autonomous parvoviruses H-1 virus and minute virus of mice. J Virol 1988;62 (5):1679-86.
【非特許文献４】Telerman A, Tuynder M, Dupressoir T, Robaye B, Sigaux F, Shaulian E, et al.  A model for tumor suppression using H-1 parvovirus.  Proc Natl Acad Sci U S A 1993;90 (18):8702-6.
【非特許文献５】Rommelaere J, Geletneky K, Angelova AL, Daeffler L, Dinsart C, Kiprianova I, et al.  Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics.  Cytokine Growth Factor Rev 2010;21 (2-3):185-95.
【非特許文献６】Grekova S, Zawatzky R, Horlein R, Cziepluch C, Mincberg M, Davis C, et al.  Activation of an antiviral response in normal but not transformed mouse cells: a new determinant of minute virus of mice oncotropism. J Virol 2010;84 (1):516-31.
【非特許文献７】Cornells JJ, Deleu L, Kock U, Rommelaere J. Parvovirus oncosuppression. London: Arnold E Ltd; 2006.
【非特許文献８】Etingov I, Itah R, Mincberg M, Keren-Naus A, Nam HJ, Agbandje-McKenna M, et al.  An extension of the Minute Virus of Mice tissue tropism.  Virology 2008;379 (2):245-55.
【非特許文献９】Rubio MP, Lopez-Bueno A, Almendral JM.  Virulent variants emerging in mice infected with the apathogenic prototype strain of the parvovirus minute virus of mice exhibit a capsid with low avidity for a primary receptor. J Virol 2005;79 (17):11280-90.
【非特許文献１０】Lopez-Bueno A, Rubio MP, Bryant N, McKenna R, Agbandje- McKenna M, Almendral JM.  Host-selected amino acid changes at the sialic acid binding pocket of the parvovirus capsid modulate cell binding affinity and determine virulence.  J Virol 2006;80 (3):1563-73.
【非特許文献１１】Kruger L, Eskerski H, Dinsart C, Cornells J, Rommelaere J, Haberkorn U, et al.  Augmented transgene expression in transformed cells using a parvoviral hybrid vector.  Cancer Gene Ther 2008;15(4):252-67.
【非特許文献１２】Muller OJ, Kaul F, Weitzman MD, Pasqualini R, Arap, Kleinschmidt JA, et al.  Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors.  Nat Biotechnol 2003;21 (9):1040-6.
【非特許文献１３】Girod A, Ried M, Wobus C, Lahm H, Leike K, Kleinschmidt J, et al.  Genetic capsid modifications allow efficient retargeting of adeno-associated virus type 2.  Nat Med 1999;5 (9):1052-6.
【非特許文献１４】Michelfelder S, Kohlschutter J, Skorupa A, Pfennings S, Muller 0, Kleinschmidt JA, et al.  Successful expansion but not complete restriction of tropism of adeno-associated virus by in vivo biopanning of random virus display Peptide libraries. PLoS One 2009;4 (4):e5122.
【非特許文献１５】Waterkamp DA, Muller OJ, Ying Y, Trepel M, Kleinschmidt JA.  Isolation of targeted AAV2 vectors from novel virus display libraries. J Gene Med 2006;8 (11):1307-19.
【非特許文献１６】Krasnykh V, Dmitriev I, Mikheeva G, Miller CR, Belousova N, Curiel DT. Characterization of an adenovirus vector containing a heterologous peptide epitope in the HI loop of the fiber knob.  J Virol 1998;72 (3):1844-52.
【非特許文献１７】Gonzalez R, Vereecque R, Wickham TJ, Vanrumbeke M, Kovesdi I, Bauters F, et al.  Increased gene transfer in acute myeloid leukemic cells by an adenovirus vector containing a modified fiber protein.  Gene Ther 1999;6 (3):314-20.
【非特許文献１８】Coughlan L, Vallath S, Saha A, Flak M, McNeish IA, Vassaux G, et al. In vivo retargeting of adenovirus type 5 to alphavbeta6 integrin results in reduced hepatotoxicity and improved tumor uptake following systemic delivery.  J Virol 2009;83 (13):6416-28.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで本発明の目的は、パルボウイルスをベースとする治療の有効性を高め、正常細胞への起こり得る副作用に対して更なる安全性を提供する再標的化パルボウイルスを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によると、この目的は、特許請求の範囲に規定された主題によって達成される。そこで本発明は、ヒト腫瘍細胞に対する親和性を改良するために遺伝的に再プログラミングされたＨ−１ＰＶを提供する。密接に関連するパルボウイルスＭＶＭの分解結晶構造から類推して、Ｈ−１ＰＶ野生型カプシドのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ３Ｄモデルが開発された。このモデルに基づき、細胞膜の認識およびウイルス侵入のためのアミノ酸は、いわゆる「ディンプル」領域内の、カプシドの２回対称軸のレベルで同定された。これらの残基のｉｎ  ｓｉｔｕ変異生成は、Ｈ−１ＰＶの許容細胞への結合および侵入を有意に減少させた。次に、侵入欠損性ウイルスカプシドを遺伝子操作により作製し、３回軸スパイクである環状４Ｃ−ＲＧＤペプチドのレベルで挿入した。このペプチドは、癌細胞や成長の血管内で過剰発現することが公知であるαｖβ３およびαｖβ５インテグリンに結合する。このペプチドの挿入は、再遺伝子組み換えウイルスによって効率的に殺滅されるαｖβ５インテグリンを過剰発現する細胞に向かうウイルス感染性をレスキューした。
【００１０】
本発明の一実施形態は、例えば脳（１９）、結腸（２０）、子宮頸部（２１）、乳房（２２、２３）起源の数多くのヒト腫瘍細胞系に感染して殺滅し、そして、現在、再発性多発性膠芽腫の患者を治療するためのフェーズＩおよびＩＩ臨床試験（５）下にあるラットＨ−１ＰＶに関する。細胞のタイプおよび実験条件に依存して、Ｈ−１ＰＶは、非形質転換細胞には影響を及ぼすことなく、壊死（２４）、アポトーシス（２５〜２８）からリソソーム依存性細胞死（２９）までの癌細胞における様々な細胞死経路を誘導する能力を有する。本発明者らは、ウイルスが癌細胞において酸化的ストレスを誘導し、ＤＮＡ損傷、細胞周期停止およびアポトーシスを引き起こす能力について報告した。これらの作用は、非構造的ＮＳ１タンパク質によって媒介される（２８）。
【００１１】
本発明の方法は、２つの工程からなる。第１に、該ウイルスがその元来の許容細胞に侵入することを防止するウイルスの天然の指向性が阻止される。これは、細胞の認識および結合に関係するカプシド残基を改変することによって達成可能である。第２に、該ウイルスは、癌細胞内でのみ、または優先的に発現する受容体に対して高い親和性を備える異種ペプチドを該ウイルスカプシド内へグラフト化することによって癌細胞へ特異的に再標的化される。この工程には、該ペプチドの挿入を容認し、その腫瘍崩壊能力を維持しながら該ウイルスの再標的化を可能にする該ウイルスカプシド内の位置を同定する必要がある。どちらの工程にも、該ウイルスの正２０面体カプシドが課する構造的拘束により極めて多くの課題がある。実際にカプシド内の変化は、効率的な粒子アセンブリと不適合であることが多い。再標的化工程は、さらにまた全部がＨ−１ＰＶにおいて、これまで研究されていなかった、カプシドの構造的および機能的要素、ならびに1つ以上の特異的細胞受容体への結合に関係する領域に関する正確な知識を含んでいる。
【００１２】
パルボウイルスファミリーのカプシドは、Ｔ＝１正２０面体対称で組立てられた６０コピーの２〜３のネステッドポリペプチド配列からなる（３０）。Ｈ−１ＰＶの場合、カプソマーＶＰ−１およびＶＰ−２は、Ｃ末端コア配列を共有するが長さの異なるＮ末端伸長部を有する選択的にスプライシングされた転写産物によってコードされる。古典的なパルボウイルスカプシドの外側構造は、３回対称軸では「スパイク」様突起部、２回軸では「ディンプル」と呼ばれる陥凹部、５回対称軸ではビリオンの内側を該粒子の外側に連絡する孔隙を示す（３０）。パルボウイルスファミリーのメンバーに対する細胞受容体は、細胞侵入がトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）への結合によって媒介されるネコ（ＦＰＶ）血清型およびそのイヌ指向性変異体ＣＰＶについて記載されてきた（３１）。ＡＡＶの様々な血清型は、ヘパリン硫酸プロテオグリカン（３２）、αｖβ５インテグリン（３３）、線維芽細胞成長因子受容体（３４）または血小板由来成長因子受容体α（３５）への結合を介して侵入する。グロボシド（Ｇｂ４Ｃｅｒ）（３６）、Ｋｕ８０自己抗原（３７）およびαｖβ１インテグリン（３８）は、ヒト病原体Ｂ１９に対する細胞受容体／共受容体と同定されている。それでもこのファミリーのメンバーの細胞受容体の大部分は、特に齧歯類パルボウイルスについては依然として不明である（３９）。シアル酸への結合がＭＶＭによる細胞表面受容体認識のために必要であることは、細胞膜付着および感染がどちらもノイラミニダーゼ感受性であるため公知である。シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）に浸漬したＭＶＭｐカプシドのＸ線結晶構造は、糖が残基Ｉ３６２およびＫ３６８に直接隣接する、ウイルスカプシドの正２０面体の２回対称軸を取り囲んでいるディンプル凹部内に位置することを明らかにしている。これらの残基の点突然変異は、細胞受容体のシアル酸成分に対する低い親和性を生じさせる（１０、４０〜４２）。
【００１３】
化学薬品、診断ツールまたはウイルス性抗癌剤の特異的腫瘍標的化に適切なペプチドのうち、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドが最も広く研究されている（４３〜４６）。ＲＧＤ配列は、多数の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質、例えばフィブロネクチン、ビトロネクチンに見られ、これらのＥＣＭタンパク質のそれらの細胞受容体への結合の原因となる（４７）。ＲＧＤペプチド、特にその環状形における、ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（ＲＧＤ−４Ｃと称する）は、典型的には癌細胞および血管新生血管内で過剰発現するαｖβ３およびαｖβ５インテグリン（５０、５１）へ強固に結合する（４８、４９）。ＲＧＤ−４Ｃ／インテグリン相互作用は、アデノウイルス（５２〜５４）およびアデノ随伴ウイルス（１３）を癌細胞に再標的化するために活用され成功を収めている。
【００１４】
要するに、本発明は、そのカプシドの改変により遺伝的に再プログラミングされたＨ−１ＰＶ侵入を提供する。構造的データの非存在下で、本発明者らは、その結晶構造が解明されている関連性の高いＭＶＭのカプシドとのホモロジーに基づいてＨ−１ＰＶカプシドをモデリングした。このモデルは、細胞の認識および侵入に関係する候補アミノ酸の同定を許容した。これらの残基の変異は細胞侵入を無効にし、このカプシドの３回軸スパイクのレベルでの突出しているＲＧＤ−４Ｃペプチドの挿入は、新規の癌特異的指向性を遺伝子組み換えウイルスに与え、ウイルス感染性および細胞殺滅をレスキューした。結論として、本発明は、臨床用途におけるＨ−１ＰＶをより効率的およびより安全に使用するための道を開く。
【００１５】
以下の実施例では、本発明による遺伝的に再プログラミングされたＨ−１ＰＶの生成について記載する。４つの独創的な工程から構成された方法を追及した。
１）パルボウイルスＨ−１ＰＶカプシドのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏモデリング。これは、該カプシドの構造的および機能的要素、例えば細胞膜の認識および侵入に関係するアミノ酸ならびに再標的化ペプチドの挿入を容認する場所の同定についての正確な知識を獲得するために重要である。
２）シアル酸がＨ−１ＰＶ細胞膜の結合および侵入のために必要とされるという発見。これは、ウイルス感染がシアル酸を細胞表面から開裂する公知の化合物であるノイラミニダーゼに感受性であることを示すことにより証明された。ノイラミニダーゼを用いた前処置は、Ｈ−１のＮＢＫおよびＨｅＬａ細胞（Ｈ−１に対する２つの高度に許容性の細胞系）に結合して侵入する能力を劇的に減少させ、シアル酸がウイルス受容体の重要な構成成分であるという証拠を提供した。
３）脱標的化工程。この工程は、元来の許容細胞へのウイルス侵入を妨害するパルボウイルスの天然の指向性を無効にした。この工程は、シアル酸への結合に関係するアミノ酸（各々ＶＰ１タンパク質内のＩ５０９およびＲ５１５に対応するＶＰ２タンパク質のＩ３６７およびＨ３７３）をコードする位置内でウイルスゲノム（カプシドタンパク質コーディング領域）を変異させることから構成された。シアル酸認識に関係する候補アミノ酸は、本発明者らの構造モデルおよび関連する自律性パルボウイルスＭＶＭとの機能的ホモロジーに基づいて見いだされた。詳細には、残基３７３の改変（Ｈ→Ｒ）は、該ウイルスが細胞に結合して侵入する能力を強度に損傷させた（Ｈ−１野生型と比較して９０％超の減少）。
４）再標的化工程。再標的化は、ウイルスカプシド内へ、典型的には癌細胞および血管新生血管内で過剰発現するαｖβ３およびαｖβ５インテグリン（４８、４９）に対する高い親和性を有するＲＧＤ−４Ｃ再標的化ペプチドを挿入することによって達成された（５０、５１）。この工程には、該ペプチドの挿入を容認し、該ウイルスの腫瘍崩壊能力に影響を及ぼさずにその再標的化特性を維持する該ウイルスカプシド内の位置の同定を必要とした。ウイルスゲノム内へのこの位置は本発明者らのモデルのおかげで同定され、ＶＰ２カプシドタンパク質のＡ４４１をコードするヌクレオチドに対応する（ＶＰ１タンパク質のＡ５８３に対応する）。この位置内でのＲＧＤ−４Ｃペプチドのグラフト化は、侵入欠損性変異体のウイルス感染性をレスキューした。この新規ウイルスは、シアル酸によらずに、野生型ウイルスに使用される経路とは別の経路により細胞に侵入することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ｈ−１ＰＶ  ＶＰ２カプシドタンパク質のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏモデル。Ｈ−１（赤）およびＭＶＭｐｂ（青）ＶＰ２のリボンダイヤグラムの重ね書き（ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）スーパーインポーズであり、β鎖、ヘリックスおよびループ領域を示している。保存されたβ鎖、βＢ〜βＩ、ヘリックスαＡ、第１にＮ末端残基（ＭＶＭについてのＧ３９に対応するＨ−１ＰＶについてのＧ３８）および最後にＣ末端残基（ＭＶＭについてのＹ５８７に対応するＨ−１ＰＶについてのＹ５９２）の位置が示されている。正２０面体の２回、３回および５回転軸の概位は、各々塗りつぶしの楕円形、三角形および五角形として示されている。この図は、材料および方法の項に記載したように、デンマーク工科大学の生物学配列分析センター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｅｎｍａｒｋ（ＤＴＵ））においてＣＰＨｍｏｄｅｌｓ  ３．０  Ｓｅｒｖｅｒを使用して作成した。
【図２】Ｈ−１およびＭＶＭｐｂパルボウイルスカプシドのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏモデル。（Ａ）Ｈ−１ＰＶ（左）のカプシドは、材料および方法の項に記載したようにＰｙＭｏｌソフトウエアを使用して、利用可能なＭＶＭｐｂ（右）カプシドの結晶構造モデルをテンプレートとして取り上げてモデリングした。正２０面体の５回（５ｆ）、３回（３ｆ）および２回（２ｆ）対称軸の概位を１つのウイルス非対称ユニットについて示した。（Ｂ〜Ｄ）５回（Ｂ）、３回（Ｖ）および２回（Ｄ）正２０面体の回転軸でのＨ−１（左）およびＭＶＭｐｂ（右）カプシド表面の拡大図である。一番下のパネルは、該粒子のウイルス中心からの深さを手がかりとする距離についての色範囲を（Åで）示している。粒子のカラーコーディングは企業内で開発したアルゴリズムによって生成し、画像は材料および方法の項に記載したようにＰｙＭｏｌソフトウエアを用いて作成した。
【図３】Ｈ−１ＰＶおよびＭＶＭｐｂ  ＶＰ２の３Ｄ構造アラインメントおよび潜在的Ｈ−１ＰＶシアル酸結合残基の同定。モデル１Ｚ１４（ピンク）およびＨ−１野生型ＶＰ２モデル（薄い青）からのＭＶＭｐｂ  ＶＰ２をＰｙＭｏｌソフトウエアで実施される「アライン（整列）」ルーチンを使用してアラインメントした。ＭＶＭ中でシアル酸に結合することが公知であるアミノ酸Ｉｌｅ−３６２およびＬｙｓ−３６８（濃い青で表示）を含有する領域３６１〜３６９のみを表示した。Ｈ−１野生型ＶＰ２配列３６６〜３７４内の対応する残基Ｉｌｅ−３６７およびＨｉｓ−３７３は赤で表示した。
【図４】シアル酸はＨ１ＰＶ細胞膜の認識および侵入に関係している。ＨｅＬａ細胞を２４ウエルプレート内において１０５ｃｅｌｌｓ／ウエルの密度で培養し、３７℃で３時間０．１Ｕ／ｍＬのノイラミニダーゼを加えて（＋）、または加えずに（−）処理した。細胞培地は、次に精製Ｈ−１ＰＶを含有する培地と置換した。感染工程は、ウイルス結合アッセイのために４℃で１時間、ウイルス侵入アッセイのために３７℃で２時間実施した。細胞を５００μＬのＰＢＳで洗浄し、次に１００μＬのトリプシン［０．２５％（結合）および０．０５％（侵入）］を用いて処理し、この反応を２００μＬの完全培地を用いて停止させた。次に細胞を採取し、ウイルス粒子は、３回の急速冷凍／解凍サイクルで細胞を溶解し抽出した。ウイルスＤＮＡは、実施例１に記載したようにＱｉａＡｍｐ  ＭｉｎＥｌｕｔｅウイルスキットを使用して投入および細胞分画から精製し、パルボウイルス特異的ｑＰＣＲを用いて定量した。結果は、投入ウイルスに比較して細胞によって取り込まれた粒子のパーセンテージとして表示した。棒およびバーの上方の数字は、各々３回の測定からの平均値および標準偏差を示している。
【図５】Ｉ３６７ＳおよびＨ３７３Ｒ置換によるＨ−１ＰＶの脱標的化。（Ａ）導入された突然変異がＶＰタンパク質のカプシドを形成する能力を変化させないことを証明している電子顕微鏡観察分析。（Ｂ）結合／侵入アッセイ。ＮＢＫ細胞を４８ウエルプレート内で増殖させた。２４時間後、細胞を１０４Ｖｇ／ｃｅｌｌの濃度でＨ−１ＰＶ野生型（ｗｔ）またはＨ−１ＰＶ変異体（Ｉ３６７ＳおよびＨ３７３Ｒ）により感染させ、４℃で３０分間インキュベートした（ウイルス結合アッセイ）。次にプレートを洗浄して未結合ウイルス粒子を除去し、さらに２時間３７℃でインキュベートした（ウイルス侵入アッセイ）。５００μＬのＰＢＳで洗浄した後、１００μＬの０．０５％トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、独国）を用いて処理し、その後にこの反応を１００μＬの完全培地の添加により停止させた。次に、図４の説明文に記載したように細胞を収集し処理した。（Ｃ）ウイルス感染性は、ＮＢＫおよびＨＥＫ  ２９３Ｔ指標細胞内で実施例１に記載したように感染単位およびプラークアッセイによって評価した。ＩＵ、感染単位（ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって決定した）。ＰＦＵ、プラーク形成単位（プラークアッセイによって決定した）。全ての数値は、ウイルス投入量に対して標準化した。（Ｄ）ウイルスの産生。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、指標ウイルスプラスミドを用いてトランスフェクトし、計５日間増殖させた。細胞ＤＮＡおよび非カプシド化ウイルスＤＮＡを消化するためのベンゾナーゼ処理後、粗細胞抽出物を完全ビリオンの存在について分析した。ウイルス粒子は、カプシド化ウイルスゲノムのＰＣＲ定量によって決定した。棒は、産生された粒子の数をＤＮＡトランスフェクションの前に播種された細胞数で割った数を表している。（Ｅ）取り込み。ＨｅＬａ細胞は、指示された時間および温度でＨ−１ＰＶ野生型（Ｈ−１ＰＶ）またはＨ−１ＰＶ変異体（Ｉ３６７ＳおよびＨ３７３Ｒ）を用いて感染させた。細胞取り込みは、上述したように決定した。（Ｆ）感染性。野生型および変異Ｈ−１ＰＶを実施例１に記載したようにＮＢ３２４Ｋ、ＨｅＬａおよびＨＥＫ２９３Ｔ指標細胞において感染中心を形成する能力について試験した。ＩＵ、感染単位。数値は、１ＩＵを生成するために接種しなければならない細胞１個当たりの精製粒子（カプシド化Ｖｇとして表示）の数を示している。（Ｇ）プラークの形成。野生型および変異Ｈ−１ＰＶをＮＢ３２４Ｋ指標細胞においてプラークを形成する能力について試験した。ＰＦＵ、プラーク形成単位。数値は、１つのプラークを生成するために必要とされる精製粒子（細胞１個当たりのカプシド化Ｖｇとして表示）の量を表している。
【図６】Ｈ−１ＰＶカプシド内への再標的化ペプチドの挿入を容認する候補部位についてのモデルに基づく探索。（Ａ）ＶＰ２構造モデルは、ウイルスカプシドの表面に露出したループの存在を明らかにする。ペプチド挿入のためにより適合する親水性領域についてのこれらのループのスクリーニングは、白で示した２つの最適位置Ｓ１およびＳ２を明らかにする。Ｈ−１ＰＶを脱標的化するためにＨ３７３と置換されたアミノ酸Ｒ３７３は、レッドで示した。（Ｂ）再標的化ペプチドを挿入するために最も好都合な位置として選択されたＳ２部位（緑）の位置を示しているウイルスカプシドの３Ｄモデル（３つのカプソマーが示されている）。（Ｃ）Ｓ２位内へのＲＧＤ−４Ｃペプチド（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ）の挿入のシミュレーション。３つのカプソマーは異なる色、マゼンタ、シアンおよびオレンジで表示し、挿入された配列は、各々赤、青および黄で示した。このモデルによると、ＲＧＤ−４Ｃリガンドは外側の表面に明確に露出したままである。
【図７】ＲＧＤ−４ＣペプチドのＨ−１ＰＶ−Ｈ３７３Ｒ変異体のウイルスカプシド内への遺伝的挿入はウイルス感染性をレスキューした。（Ａ）Ｈ−１ＰＶ−Ｈ３７３Ｒ−ＲＧＤ−４Ｃ変異体の適正なカプシドアッセンブリを示している電子顕微鏡観察分析。（Ｂ）ウイルスの産生。ＨＥＫ２９３細胞内でのウイルスＤＮＡのトランスフェクション後、類似量でビリオンが形成されたが、これはこの位置での挿入がウイルスアッセンブリもパッケージングも損傷させなかったことを示している。（Ｃ）ＮＢ３２４Ｋの表面上のαｖβ３およびαｖβ５インテグリンのタンパク質レベルを示しているＦＡＣＳ分析。（Ｄ）感染性。ＮＢ３２４Ｋ細胞を精製野生型またはＲＧＤ−４Ｃ含有（ＲＧＤ−４Ｃ）Ｈ−１ＰＶウイルスを用いて感染させた。細胞は感染７日後（ｐｉ）に収集し、感染単位を形成するウイルス粒子（カプシド化Ｖｇとして表示）の能力を評価するためのウイルスＤＮＡハイブリダイゼーションのために処理した。ＮＢ３２４Ｋ細胞の表面上のαｖβ３およびαｖβ５インテグリンの欠損と一致して、Ｈ−１ＲＧＤはＨ３７３Ｒ脱標的化ウイルスに類似して挙動し、これらの細胞を効率的に感染させなかった。（Ｅ）ウイルス侵入アッセイ。ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞を２４ウエルプレート内において１０５ｃｅｌｌｓ／ウエルの密度で培養し、３７℃で３時間０．１Ｕ／ｍＬのノイラミニダーゼを加えて（＋）、または加えずに（−）処理した。次に細胞を３７℃で６時間かけ３回ずつ、５００Ｖｇ／ｍＬの濃度で使用して、指示されたウイルスで感染させた。洗浄して未結合ウイルスを除去した後、図４の説明文に記載したように細胞を採取し、３回の急速冷凍／解凍サイクルを通して溶解させ、ウイルスＤＮＡを精製し、定量した。棒は、取り込まれた投入ビリオンのパーセンテージを表している。棒の上方の数は、未処理対ノイラミニダーゼ処理細胞における細胞関連ビリオンの比率を示している。（Ｆ）Ｈ−１ＰＶ変異体の毒性をＨ−１ＰＶ感染に許容性であり、αｖβ３およびαｖβ５インテグリンを過剰発現するＳＫ−ＭＥＬ−２８２８細胞上で評価した。生存細胞は、実施例１に記載したＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）によって決定し、未処理細胞内で得られるルミネセント値を１００％生存と見なした相対細胞生存率（％）として表示した（図１２も参照されたい）。
【図８】クローンＨ−１ＰＶ  Ｉ３６７Ｓの制限地図。
【図９】クローンＨ−１ＰＶ  Ｈ３７３Ｒの制限地図。
【図１０】クローンＲＧＤ−４Ｃ−Ｈ−１ＰＶ  Ｈ３７３Ｒの制限地図。
【図１１】それらの表面上でαｖβ５インテグリンを呈するＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞の優先的Ｈ−１ＲＧＤ感染。（Ａ）インテグリンの含量。子宮頸癌由来ＨｅＬａ細胞、ＳＫ−ＭＥＬ−２８メラノーマ細胞およびそれらの正常対応物（一次正常ケラチノサイトおよびメラノサイト）を４８時間増殖させ、実施例１に記載したようにＦＡＣＳによってαｖβ３およびαｖβ５インテグリンの表面発現について分析した。（Ｂ）上記の細胞を３７℃で３時間０．１Ｕ／ｍＬのノイラミニダーゼを加えて（＋）または加えずに（−）処理し、ＭＯＩ５００Ｖｇ／ｃｅｌｌにて指標ウイルスで感染させ、図２の説明文に記載したように細胞関連ビリオン（細胞表面結合および内在化ウイルスの両方を含む）を測定するために処理した。棒は、取り込まれた投入ビリオンのパーセンテージを表している。棒の上方の数は、未処理対ノイラミニダーゼ処理細胞における細胞関連ビリオンの比率を示している。
【図１２】Ｈ−１ＰＶの再標的化。細胞生存率。Ｈ−１ＰＶ変異体および親ウイルスの毒性をメラノーマＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞および正常一次メラノサイト内で評価した。感染した細胞の生存率は、実施例１に記載したように決定し、モック処理培養と比較したパーセンテージとして表示した。棒は、３回ずつ形成された１回の典型的実験からの標準偏差バーとともに、３回の測定の平均値を示している。ＲＧＤ−４Ｃペプチドの挿入は、該ウイルスが癌細胞を殺滅する能力を損傷させない。詳細な説明については実施例６を参照されたい。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、ＶＰタンパク質のポリペプチド配列内に変異を含むＨ−１ラットパルボウイルス（Ｈ−１ＰＶ）であって、該突然変異がＨ−１ＰＶのＩ３６７位および／またはＨ３７３位および／またはＡ４４１位（ＶＰ２タンパク質）に存在するＨ−１ＰＶを提供する。当業者であれば、出発材料としてＨ−１ＰＶの公表されたヌクレオチド配列を用いて当該技術分野において周知の方法を使用してそのような改変パルボウイルスを産生することができる（６１、６２、さらに実施例１（Ｃ）に記載した実験方法も参照されたい）。
【００１８】
用語「Ｈ−１ＰＶ」はさらに、その治療有用性に実質的に影響を及ぼす本発明の変異以外の追加の変異を含む可能性があるウイルスならびにそのようなウイルスをベースとするベクターに関する。前記パルボウイルスを活発に産生するために使用可能な、および治療に有用である適切なまた別の改変パルボウイルス、ベクターならびに細胞は、無用な実験努力無しで、当業者が備える技術の範囲内で本明細書の開示に基づいて容易に決定することができる。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態では、Ｈ−１ＰＶの変異は、Ｉ３６７Ｓ変異および／またはＨ３７３Ｒ変異である。
【００２０】
さらに好ましい実施形態では、本発明のＨ−１ラットパルボウイルスは、Ａ４４１位で挿入される腫瘍細胞内で発現する受容体に対する高い親和性を備える異種タンパク質をさらに含んでいる。そのような異種ペプチドの例は、ＲＧＤファミリーメンバーであり、ＲＧＤ−４Ｃペプチド、公知のヒト特異的受容体、例えばアデノウイルスを神経膠腫へ再標的化するために使用され成功を収めている上皮成長因子受容体（５５）のペプチドリガンド、ペプチドアプタマー、ペプチドライブラリーまたはファージ提示スクリーニングアプローチにより選択された他のペプチドを含む。
【００２１】
本発明のＨ−１ＰＶの特に好ましい実施形態では、異種タンパク質はアミノ酸配列ＲＧＤを含んでいる（６３）。当業者であれば、該異種タンパク質を挿入するために、例えば下記の実施例２および５に記載したアプローチを適用して、カプシドＶＰ１およびＶＰ２タンパク質内の適切な部位を選択することができる。ペプチドをグラフト化すべき位置の同定は、他の再標的化ペプチドの挿入を可能にする。一例として（他のペプチドの使用を排除しないが）、神経膠腫においても高頻度に過剰発現するペプチド標的化δ−ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）（７０）、または、例えば、アデノウイルスを子宮頸癌細胞へ再標的化すると報告された子宮頸癌特異的ペプチド（７１）の挿入が挙げられる。
【００２２】
本発明のＨ−１ＰＶのいっそうより好ましい実施形態では、異種タンパク質が、ＶＰ１タンパク質のＡ５８３に対応するパルボウイルスのＶＰ２タンパク質のＡ４４１位で挿入される。
【００２３】
本発明は、本発明のＨ−１ＰＶを含有する医薬組成物をさらに提供する。
【００２４】
好ましくは、該パルボウイルスは前記医薬組成物中に有効量で存在し、薬学的に許容される担体と結合されている。「薬学的に許容される」は、ウイルスの生物活性の有効性を妨害しない、およびそれが投与される患者にとって毒性ではない任意の担体を含むことを意図する。適切な医薬担体の例は当該技術分野において周知であり、リン酸緩衝食塩液、水、エマルジョン、例えば油／水型エマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、無菌溶液などが含まれる。そのような担体は、従来法によって調製することができ、被験者に有効量で投与することができる。
【００２５】
「有効量」は、疾患の経過および重症度に影響を及ぼすのに十分であり、そのような病態の減少または寛解をもたらす有効成分の量を意味する。これらの疾患または障害の治療および／または予防に有用な「有効量」は、当業者には公知の方法を使用して決定することができる（７２）。
【００２６】
本発明のパルボウイルスについての好ましい用量は、約１０８〜１０９ｐｆｕである（単回注射）。
【００２７】
追加の医薬上適合する担体には、ゲル、生体吸収性マトリックス材料、該治療薬を含有する移植要素または任意の他の適切なビヒクル、送達もしくは分注手段もしくは材料を含むことができる。
【００２８】
本発明のＨ−１ＰＶの投与は、様々な方法、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内投与によって実施することができる。投与経路は、当然ながら、療法の種類および該医薬組成物中に含有されるまた別の化合物の種類に左右される。好ましい投与経路は、静脈内投与である。パルボウイルスの投与レジメンは、当該者が備えている技術の範囲内で、主治医が患者データ、観察所見および例えば患者のサイズ、体表面積、年齢、性別を含む他の臨床因子、投与の時間および経路、腫瘍のタイプおよび特性、患者の一般的健康状態ならびに該患者が受ける他の薬物療法に基づいて容易に決定することができる。
【００２９】
本発明のパルボウイルスが血液−脳関門を通って進入する能力を備える感染性ウイルス粒子を含む場合、治療は、該パルボウイルスの静脈内注射によって実施できる、または少なくとも開始できる。好ましい投与経路は、腫瘍内投与である。
【００３０】
長期静脈内治療はパルボウイルスに対する中和抗体が形成されることにより無効力になり易いため、静脈内ウイルス投与の初期レジメン後に様々な投与様式を採用することができる、または代わりにそのような様々な投与技術、例えば頭蓋内もしくは腫瘍内ウイルス投与をパルボウイルス治療の全経過を通して使用することができる。
【００３１】
また別の特殊な投与技術として、Ｈ１−ＰＶ含有組成物を患者に移植された起源から該患者に投与することができる。例えば、シリコーンもしくは他の生体適合性材料製のカテーテルを腫瘍除去手術中もしくは別個の手技によって該患者内に設置された小型の皮下リザーバー（Ｒｉｃｋｈａｍリザーバー）に接続することができ、それ以上の外科的インターベンションを行わずに様々な時点でのパルボウイルス含有組成物の局所注入が可能になる。パルボウイルスもしくはパルボウイルス由来ベクター含有組成物は、定位外科的手法またはニューロナビゲーション標的化技術によって腫瘍内に注射することもできる。
【００３２】
本発明のＨ−１ＰＶ含有組成物の投与は、適切なポンプシステム、例えば蠕動式注入ポンプまたは対流強化送達（ＣＥＤ）ポンプを使用して、移植されたカテーテルを通して低流量でのウイルス粒子もしくはウイルス粒子を含有する流体の連続注入によって実施することもできる。
【００３３】
今までのところ、本発明のパルボウイルスを含有する組成物を投与するまた別の方法は、所望の癌組織へ該パルボウイルス含有組成物を分注するために構築および配置された移植製品からである。例えば、パルボウイルス含有組成物を含浸させたウエハーであって、外科的腫瘍切除の終了時に切除腔の辺縁に付着させるウエハーを使用することができる。そのような治療的インターベンションにおいて複数のウエハーを使用することができる。
【００３４】
本発明の医薬組成物の適用に基づく療法は、癌、特にメラノーマ、脳腫瘍、乳癌または子宮頸癌の治療的処置に有用である。しかし本発明による療法は、原則として、パルボウイルスに感染し得る任意の腫瘍に適用することができる。本発明のパルボウイルスＨ１は腫瘍細胞を殺滅することができるが正常細胞に悪影響をもたらすことはなく、そのような感染は、例えば、ウイルスもしくはそのようなウイルスに基づくベクターの大脳内使用によって、有害な神経学的もしくは他の副作用を及ぼすことなく腫瘍特異的療法を達成するために実施することができる。
【００３５】
本発明によるＨ−１ＰＶによって治療可能な患者には、ヒトならびに非ヒト動物が含まれる。後者の例には、制限なく、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌおよびネコなどの動物が含まれる。
【００３６】
以下では実施例によって本発明を詳細に説明する。
【実施例】
【００３７】
（実施例１）
材料および方法
（Ａ）ＶＰ２ホモロジーモデリング
Ｈ−１  ＶＰ２カプソマーのホモロジーモデリングは、デンマーク工科大学生物学的配列分析センターのＣＰＨｍｏｄｅｌｓ  ３．０サーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＣＰＨｍｏｄｅｌｓ／）で、テンプレートとして３８〜５９３配列内のＨ−１  ＶＰ２カプソマーとの６６．４％ホモロジーを共有する既に３．２５Å分解されたＭＶＭｐｂ  ＶＰ２  １  Ｚ１４  ３Ｄ結晶構造モデル（４１）を用いて実施した。次に得られたモデルを立体化学的性質について検証し、さらにＰＲＯＣＨＥＣＫ（５６）、ＷＨＡＴ−ＣＨＥＣＫ（５７）、ＥＲＲＡＴ（５８）、ＶＥＲＩＦＹ−３Ｄ（５９）およびＰＲＯＶＥ（６０）を使用して精密に分析したが、全て全カプソマーが特に高い信頼性でモデリングされたことを証明した。
【００３８】
（Ｂ）Ｈ−１カプシドの３Ｄモデル
Ｈ−１ＰＶカプシドの３Ｄモデルを生成するために、６０コピーのＶＰ２モデルをＰｙＭｏｌ（６１）で組み立て、バックボーンのＣαに焦点を当てたＭＶＭｐｂ  １Ｚ１４モデル上でアラインメントした。アラインメントは、最初に配列アラインメント、次に構造アラインメントを実施し、次にフィット中に見いだされた構造的異常を拒絶するために改良サイクルを実施するルーチンツールを用いて達成した。該カプシド表面の「トポグラフィー」特徴を得るために、ホームメードアプリケーションを開発した（補足情報）。このアプリケーションは、カプシドＰＤＢファイルからビリオンの質量中心の場所を計算し、次に質量中心と該カプシドを形成する各原子との距離を計算する。各「質量−原子中心」距離をｂ−係数フィールドに代えて元のＰＤＢファイルにロードし、最後にＰｙＭｏｌプログラムを使用して色付き勾配として表示する。
【００３９】
（Ｃ）Ｈ−１ＰＶ変異体の生成
Ｈ−１ＰＶ変異体を構築するために、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｐａＩを用いてｐＳＲ１９クローン（６２）を消化して得たＶＰ遺伝子単位を含有するウイルスゲノムのフラグメントを最初にｐＢＳＫ−ＨｐａＩベクターにサブクローニングしてｐＶＰｓｕｂ構築体を生成した。ｐＢＳＫ−ＨｐａＩは、５’−ＡＧＣ  ＴＴＡ  ＴＣＧ  ＡＴＡ  ＣＣＧ  ＴＣＧ  ＡＣＧ  ＴＴＡ  ＡＣＣ−３’および５’−ＴＣＧ  ＡＧＧ  ＴＴＡ  ＡＣＧ  ＴＣＧ  ＡＣＧ  ＧＴＡ  ＴＣＧ  ＡＴＡ−３’オリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって得られるＨｐａＩ制限部位を含有するアダプターとＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩを置換することによって構築される改変ポリリンカーを備えるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）である。ｉｎ  ｓｉｔｕ変異生成は、以前に記載されたようにテンプレートとしてｐＶＰｓｕｂ（６３）を使用して、下記のプライマー（導入された変異は下線で表示）、クローンｐＶＰｓｕｂ  Ｉ３６７Ｓには５’−ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＧＣＴ  ＡＧＡ  ＣＡＧ ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＣＧＡ  ＧＧ−３’および５’−ＣＣＴ  ＣＧＣ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＣＴＡ  ＧＣＧ  ＧＴＡ  ＣＣ−３’、クローンｐＶＰｓｕｂ  Ｈ３７３Ｒには５’−ＧＣＴ  ＧＧＣ  ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＣＧＴ  ＧＡＴ  ＧＣＡ  ＡＡＣ  ＧＧＡ  ＧＣ−３’および５’−ＧＣＴ  ＣＣＧ  ＴＴＴ  ＧＣＡ  ＴＣＡ  ＣＧＧ  ＴＣＣ  ＴＣＧ  ＣＣＡ  ＧＣ−３’ を用いて実施した。改変ＶＰ２は最後に、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＨｐａＩ制限酵素を使用して、ｐＨ−１ＰＶ−Ｉ３６７ＳおよびｐＨ−１ＰＶ−Ｈ３７３Ｒ脱標的化変異体を生成するためにそれらの親ｐＳＲ１９バックボーンへクローニングし戻した。Ｈ−１ＰＶ−Ｈ３７３Ｒ−ＲＧＤ−４Ｃ再標的化変異体は、ＲＧＤ−４Ｃ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ）ペプチド（６４）をｐＨ−１ＰＶ  Ｈ３７３Ｒ変異体のＶＰ２カプシドタンパク質のＡ４４１（ＶＰ１タンパク質のＡ５８３に対応する）内へ挿入することによって構築した（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０３１３６．１配列にしたがって）。このために、オーバーラップ・エクステンションＰＣＲ（６５）を下記のプライマー、ＲＧＤ  １、５’−ＧＣＣ  ＧＣＧ  ＧＡＧ  ＡＣＴ  ＧＴＴ  ＴＣＴ  ＧＣＧ  ＧＣＡ  ＧＡＡ  ＣＴＡ  ＡＣＡ  ＴＧＣ  Ａ−３’、ＲＧＤ  ２：５’−ＡＡＣ  ＡＧＴ  ＣＴＣ  ＣＧＣ  ＧＧＣ  ＡＧＴ  ＣＡＣ  ＡＡＧ  ＣＴＡ  ＴＧＧ  ＣＧＴ  ＣＴＴ  ＣＴＣ−３’（ＲＧＤ−４Ｃ関連配列は下線で表示した）、Ｅｘｔｅｒｎａｌ  １、５’−ＣＧＡ  ＡＧＡ  ＴＴＧ  ＧＧＣ  ＣＡＡ  ＡＣ−３’およびＥｘｔｅｒｎａｌ  ２、５’−ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＣＣＡ  ＡＡＴ  ＴＴＧ  ＴＣＣ−３’ を用いて実施した。生じたＰＣＲフラグメントを次にＭｆｅＩ−ＤｒａＩＩＩ制限酵素を用いてｐＨ−１ＰＶ  Ｈ３７３Ｒクローンにクローニングした。
【００４０】
（Ｄ）細胞
ＨＥＫ２９３Ｔ（形質転換ヒト胚腎）、ＮＢ３２４Ｋ（新生児ヒト腎）およびＳＫ−ＭＥＬ−２８（皮膚メラノーマ）細胞系は、ＡＴＣＣ（ＬＧＳ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ社、独国ウェーゼル）から入手した。ＨｅＬａ（子宮頸癌）細胞は、Ａｌｏｎｓｏ博士（ドイツがん研究センター、独国ハイデルベルク）より寄贈された。一次ケラチノサイトおよび軽度の色素性一次ヒト成人メラノサイト（ＨＥＭａ−ＬＰ）は、各々ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社（独国ハイデルベルク）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（現在はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、独国ダルムシュタットの一部）から購入した。２９３Ｔ、ＨｅＬａおよびＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞は、１０％のＦＢＳを補給したダルベッコの改良イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、独国ダルムシュタット）中で増殖させた。ＮＢ３２４Ｋ細胞は、５％のＦＢＳを補給した最小必須培地中で増殖させた。一次メラノサイトは、ＨＭＧＳを補給した培地２５４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で増殖させた。一次ケラチノサイトは、ヒトケラチノサイト補給物（ＨＫＧＳ）（ＣＡＳｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ社、オレゴン州ポートランド）を含有するＥｐｉＬｉｆｅをベースとする培地中で増殖させた。全培地は、一次メラノサイトおよびケラチノサイトの培地を除き、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有していた。細胞は、３７℃の５％のＣＯ２中および９２％湿度で維持した。
【００４１】
（Ｅ）細胞ウイルスの結合および侵入アッセイ
５×１０４ｃｅｌｌｓ／ウエルを２４ウエルプレート内に播種し、１ｍＬの完全培地中で増殖させた。２１時間後、細胞をさらに３時間３７℃で０．１Ｕ／ｍＬのノイラミニダーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ社、独国シュタインハイム）を含めて、または含めずに増殖させた。次に培養培地を取り除き、５００Ｖｇ／ｃｅｌｌのＭＯＩ（感染多重度）でＨ−１ＰＶ野生型または変異ウイルスを含有する０．５ｍＬの無血清培地と置換した。結合アッセイのために、ウイルスが細胞表面受容体に結合することができるが細胞内には進入することができないように１または２時間４℃で３回ずつ感染を実施した。取り込みアッセイのために、感染は、結合ウイルス粒子の内在化を可能にするウイルス細胞取り込みアッセイのために、３７℃で２時間（ＮＢ３２４Ｋ、正常ケラチノサイトおよびＨｅＬａ）または６時間（正常メラノサイトおよびＳＫ−ＭＥＬ−２８）実施した。感染細胞は、５００μＬのＰＢＳで洗浄し、トリプシン（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、独国ダルムシュタット）を用いた処理により採取し、２００μＬの完全培地中に再懸濁させ、これは細胞表面からの検出可能なウイルス剥離が全く付随しないことを証明した（データは示していない）。細胞を次にウイルス粒子を遊離させるため３回の急速冷凍／解凍サイクルにかけた。ウイルスＤＮＡは、オリジナルのウイルス接種菌および細胞溶解液からＱｉａＡｍｐ  ＭｉｎＥｌｕｔｅウイルスキット（Ｑｉａｇｅｎ社、独国ヒルデン）を製造業者の取扱説明書にしたがって使用して精製し、上述したパルボウイルス特異的ｑＰＣＲを使用して定量した。
【００４２】
図５Ｂに記載した結果については、幾つかの改変を導入した。特に、細胞は４８ウエルプレート内の２００μＬの完全培地中に播種した。２４時間後、培地を取り除き、１０４Ｖｇ／ｃｅｌｌのＭＯＩの濃度で精製ウイルス調製物を含有する２００μＬの無血清培地と置換した。４℃で３０分後、プレートは未結合粒子を除去するために無血清培地で洗浄し、次にさらに３７℃で２時間インキュベートした。５００μＬのＰＢＳで洗浄した後、細胞を１００μＬのトリプシン０．０５％を用いて処理し、この反応は１００μＬの完全培地を用いて停止させた。
【００４３】
（Ｆ）細胞のトランスフェクションおよびウイルス産生
６×１０６個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１７５ｃｍ２のフラスコ内でプレーティングし、Ｒｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．（６６）にしたがって１５μｇのウイルスプラスミド／フラスコを用いて一過的にトランスフェクトした（６６）。３日後、細胞を採取し、ウイルス粒子を３回の冷凍／解凍サイクルで細胞懸濁液から遊離させた。粗細胞抽出物を５０Ｕ／ｍＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅヌクレアーゼ（超高純度グレード）（Ｓｉｇｍａ社）を用いて３７℃で３０分間かけ消化した。ウイルスはＺｏｌｏｔｕｋｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（６７）にしたがってイオジキサノール（Ｉｏｄｉｘａｎｏｌ）不連続勾配を使用して精製した。産生したウイルス粒子は、ｑＰＣＲにより定量し（下記を参照）、カプシド化ウイルスゲノム（Ｖｇ）として表示した。ウイルスストックの更なる増幅は、１００Ｖｇ／ｃｅｌｌのＭＯＩで使用したＮＢ３２４Ｋ細胞系の感染によって実施した。細胞は感染５〜７日後に採取し、上述のように処理した。
【００４４】
（Ｇ）ウイルスの滴定
定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）およびプラークアッセイは、以前に記載されたように（６８）実施した。感染単位（ＩＵ）アッセイは、７．５×１０３ｃｅｌｌｓ／ウエル（ＮＢ３２４ＫもしくはＨＥＫ２９３Ｔ）または５×１０３ｃｅｌｌｓ／ウエル（ＨｅＬａ）で播種した９６ウエルプレート内で実施した。播種１日後、細胞をウイルスストックの１０倍連続希釈液で感染させ、３７℃で７２時間、５％のＣＯ２でインキュベートした。感染細胞のアルカリ溶解（０．７５ＭのＮａＯＨ）後、ＤＮＡをナイロン膜へ移し、架橋させ、ｐＭＶプラスミドのＥｃｏＲＶ（ｎｔ３８５）−ＥｃｏＲＩ（ｎｔ１０８４）フラグメントに対応する３２Ｐ−放射性標識ＮＳ−１−特異的プローブへハイブリダイズさせた。オートラジオグラフィーのためにブロットをＸ線フィルムに曝露させた。滴定実験は、常に少なくとも２回ずつ実施した。
【００４５】
（Ｈ）定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）
粗細胞抽出物は、ゲノムＤＮＡおよび残留しているトランスフェクトしたプラスミドを除去するために、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ（超高純度グレード［Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ社、独国シュタインハイム］、５０Ｕ／ｍＬ、３７℃で３０分間）を用いて消化した。ウイルスＤＮＡをビリオンから遊離させるために、１０μＬの細胞抽出物を３０μＬのアルカリ性溶解バッファー（ＴＥバッファー中１ＭのＮａＯＨ）と５６℃で３０分間混合した。溶解は、９６０μＬの４０ｍＭのＨＣｌを加えることによって停止させた。ウイルスＤＮＡの定量は、ＮＳｌ−特異的ＴａｑＭａｎ（商標）プローブである５’−６−ＦＡＭ  ＡＴＧ  ＣＡＧ  ＣＣＡ  ＧＡＣ  ＡＧＴ  ＴＡ−ＭＧＢ−３’（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、独国ダルムシュタット）を用いたリアルタイムｑＰＣＲによって、以下のプライマーＮＳ１−ＦＯＲ、５’−ＧＣＧ  ＣＧＧ  ＣＡＧ  ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＡＡＣ  Ｔ−３’およびＮＳ１−ＲＥＶ  ５’−ＣＣＡ  ＣＣＴ  ＧＧＴ  ＴＧＡ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＡＴ−３’を使用して実施した。ＰＣＲは、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、独国ダルムシュタット）を用いて実施し、ＳＤＳ  ２．１ソフトウエア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）によって分析した。ＮＳ１配列を含有するプラスミドを１０１〜１０８コピー／反応で連続希釈し、ｑＰＣＲの標準化に使用した。個々の反応混合物（２０μＬ）は、１×ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、０．３μＭの標識ＮＳ１−ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、０．３μＭの各プライマーおよび３μＬのテンプレートから構成された。
【００４６】
（Ｉ）電子顕微鏡観察
カーボンコートした３００メッシュの銅グリッドを２分間ウイルス懸濁液の５μＬアリコート上に表面を下にして配置し、２％酢酸ウラニルを用いて３０秒間染色し、およそ１分間乾燥させた。顕微鏡写真は、２０、１００倍の倍率でＺｅｉｓｓ  １０Ａ電子顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社、独国オーバーコッヘン）を用いて８０ｋＶの加速電圧で撮影した。倍率インジケータは、グレーティング・レプリカとの比較によって定期的に調節した。
【００４７】
（Ｊ）細胞生存度アッセイ
一次メラノサイトおよびＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞のウイルス毒性は、代謝的に活性な生存細胞の指標として培養のＡＴＰ含量を測定するＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、独国マンハイム）を用い、決定した。つまり、細胞を不透明な壁に囲まれた９６ウエルプレート内の５０μＬの培地中で２，０００ｃｅｌｌｓ／ウエルの密度で播種した。２４時間のインキュベーション後、細胞を５０μＬの培地中に希釈した精製ウイルス（一次メラノサイトについては２００，０００Ｖｇ、ＳＫ−ＭＥＬ−２８については５００，０００Ｖｇ）で感染させた。感染５日後、８０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を細胞培地に直接加えた。２分間のオービタルに攪拌した後、培養をさらに室温で１０分間インキュベートした。細胞増殖シグナルを次にプレート読取りルミノメーターＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ（Ａｓｃｅｎｔ  ＦＬ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社、独国ドライアイヒ）を使用して測定した。培地のみを含有するウエルをバックグラウンド評価のために使用した。細胞生存性のパーセンテージは、バックグラウンド減算後のウイルス感染対モック処理培養のルミネセント値の比率から計算した。
【００４８】
（Ｋ）プラークアッセイ
単層中で増殖させたＮＢＫ細胞は、粗ウイルス懸濁液の連続希釈液を用いて１時間感染させ、その後接種菌を５％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有する最小必須培地［＋］Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、独国ダルムシュタット）中０．６８％のＢａｃｔｏ（商標）寒天（Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社）のオーバーレイと置換した。感染５日後、生存細胞はＰＢＳ中に希釈したニュートラルレッド（０．２  ｍｇ／ｍＬ）含有Ｂａｃｔｏ（商標）寒天（０．８５％）を添加し１８時間染色した。プラークを計数し、力価をプラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍＬで表示した。
【００４９】
（Ｌ）感染単位アッセイ
ＮＢＫまたは２９３Ｔ／１７指標細胞は、５×１０５ｃｅｌｌｓ／皿の密度で６ｃｍ皿内に播種した。２４時間後、（１：１０段階で）連続的に希釈した粗ウイルス懸濁液を使用して総量４００μＬ中の指標細胞を感染させた。３７℃での１時間のインキュベーションおよび１０分毎のプレートの攪拌後、５ｍＬの培地を各培養皿に加えた。感染７２時間後、細胞層をＰＢＳで洗浄し、径２５ｍｍのニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ社、独国ダッセル）を細胞の上部に適用し、１００μＬのＰＢＳで湿らせた。フィルターを続いて５分間変性バッファー（０．５ＭのＮａＯＨおよび１．５ＭのＮａＣｌ）を用いて飽和させたワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）紙上に上下を逆にして配置した。次にフィルターをさらに５分間、中和バッファー（０．５ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ［ｐＨ７．２］、１．５ＭのＮａＣｌおよび１ｍＭのＥＤＴＡ）で飽和させたワットマン紙へ移した。ＤＮＡは、８０℃で２時間フィルターを焼成し固定した。プレハイブリダイゼーションは、３×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌ＋０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム）、１％のＳＤＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１０×のデンハルト液および１００ｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡ中において６５℃で１時間実施した。ハイブリダイゼーションは、ｐＭＶＭプラスミドのＥｃｏＲＶ（ｎｔ３８５）−ＥｃｏＲＩ（ｎｔ１０８４）フラグメントに対応する放射性プローブの添加によって実施し、アガロースゲル電気泳動法によって精製し、Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ標識システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用する［３２Ｐ］ｄＣＴＰを用いて標識した。６５℃での一晩にわたるインキュベーション後、フィルターを最初に６５℃で３０分間３×ＳＳＣ（ｐＨ７）、１％のＳＤＳ中で、次に６５℃で３０分間０．３×ＳＳＣ（ｐＨ７）中で洗浄した。続いてフィルターをワットマン紙上に置き、プラスチック箔中に包み、−８０℃でＸ線撮影用フィルムに一晩曝露させた。ウイルスＤＮＡ増幅を支持する細胞は、放射性標識ウイルスＤＮＡを用いたハイブリダイゼーションに起因してフィルム上の黒色ドットとして出現する。ウイルス力価は、黒色ドット×希釈係数×７．５の数として計算し、感染単位（ＩＵ）／ｍＬで表示した。
【００５０】
（Ｍ）フローサイトメトリーによるインテグリン発現の決定
細胞を採取し、室温で５分間１，５００ｒｐｍで遠心した。ペレットを新鮮培地中に再懸濁させ、氷上で冷却し、次に４℃のＦＡＣＳバッファー（１０％のＦＣＳおよび０．０１％のＮａＮ３が補給されたＰＢＳ）中で洗浄した。２×１０５ｃｅｌｌｓを氷上の総量１００μＬ中、以下の抗体のいずれかとともに９０分間インキュベートした（全てＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社、カリフォルニア州テメキュラ）、（ｉ）希釈率１：５０のマウスＩｇＧ１−ＦＩＴＣイソタイプコントロール、クローンＣｉ４、（ｉｉ）４μｇ／ｍＬのマウスαｖβ３−ＦＩＴＣ、クローンＬＭ６０９、および（ｉｉｉ）４μｇ／ｍＬのマウスαｖβ５−ＦＩＴＣ、クローンＰ１Ｆ６。細胞は１ｍＬのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、最後に７００μＬのＦＡＣＳバッファー中に再懸濁させた。細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳｏｒｔ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、北アイルランド、フランクリンレークス）により分析し、データはＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓバージョン３（Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、カリフォルニア州ロサンゼルス）を使用して評価した。
【００５１】
（実施例２）
Ｈ−１ＰＶカプシドのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏモデリング
Ｈ−１ＰＶカプシドの結晶構造は未だ解明されていないため、本発明者らは、密接に関連するＭＶＭパルボウイルスの分解結晶構造とのホモロジーによってＨ−１カプシドのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ３Ｄモデルを構築した。本発明者らは、最初にＨ−１ＰＶ  ＶＰ２カプシドタンパク質の構造をモデリングした。図１に示したように、モデリングされたＨ−１ＰＶ  ＶＰ２のトポロジーは他のパルボウイルスカプシドタンパク質に類似している。八本鎖のβ−バレルモチーフ（βＢ〜βＩ）は、β鎖間のループ挿入によって装飾されたコア隣接カプシドを形成する。他の小さなβ二次構造は、ループ内においてＣＰＶまたはＭＶＭにおけるのと同様に異なる場所で見いだすこともできる。本発明者らのモデルによると、Ｈ−１ＰＶ  ＶＰ２タンパク質は、これまでに決定された全てのパルボウイルス構造内で保存されている配列である（６９）正二十面体２回軸の近くで残基１２６〜１３７にわたる小さなα−ヘリックス（αＡ）ドメインを含有している（図１）。
【００５２】
ＶＰ２タンパク質は、６０Ｈ−１ＶＰ単位の９０％超を表す。ＭＶＭの場合、ＶＰ２のみから作成されたウイルス様粒子が全野生型ビリオンから得られたモデルとは有意に相違にしなかったことが記載されている（４３）。このため、本発明者らは、ＶＰ２のみに基づきＨ−１ＰＶカプシドをモデリングすることを決定した。完全Ｈ−１カプシド３Ｄモデルを形成するために、６０コピーのＶＰ２モデルをＰｙＭｏｌ内でクローニングし、ＭＶＭｐｂ結晶構造モデル上でアラインメントした（モデリングのために採用したパラメーターの詳細については実施例１を参照されたい）。結果として生じたＴ＝１正二十面体カプシドモデルは、特徴的な哺乳動物自律性パルボウイルスカプシドの全ての主要構造特徴、例えば（ｉ）５本の対称性関連リボンのクラスタリングによって形成されるキャニオンによって取り囲まれた５回軸ポア、（ｉｉ）６つの大きな表面ループ（各３回対称軸関連ＶＰ２サブユニットから２つずつ）のクラスタリングの結果として生じる３回軸スパイク、および（ｉｉｉ）２回軸ディンプル（図２Ａ）を示す。Ｈ−１およびＭＶＭカプシドは、この態様では極めて類似しており、匹敵する形状を備える。両方のカプシドにおいて、５回軸ポア構造は該カプシドの仮想中心からおよそ１３０Å離れているが（図２Ｂ）、他方３回軸スパイク（図２Ｃ）および２回軸ディンプル（図２Ｄ）は各々該中心から１４５および１００Å離れている。３回軸スパイクの中心は、ＭＶＭと比較してＨ−１における突出がわずかに少ないと思われ（約１３０Å対約１３５Å）、この中心はＧＬＵ  ２３３の露出した側鎖に起因して３つの偏心先端に取り囲まれている。
【００５３】
（実施例３）
シアル酸はＨ−１ＰＶ細胞膜の認識および侵入に関係している
このモデルの分析は、２回軸ディンプルがＭＶＭおよびＨ−１ＰＶ中で保存されることを示唆している（図３）。ＭＶＭではこの領域はシアル酸に結合し、これは細胞侵入にとって重要であると思われる（１０）。特にＭＶＭカプソマーの２つの残基は、この領域の表面でシアル酸に結合することが証明されている（４０〜４２）。ノイラミニダーゼを用いたシアル酸を表面タンパク質から開裂する処理は、ＭＶＭ細胞侵入を大きく損傷させることが証明された。シアル酸はＨ−１カプシドの細胞膜への結合にも関係している。２つのＨ−１ＰＶ高許容細胞系であるＨｅＬａおよびＮＢＫをＨ−１ＰＶ感染前にノイラミニダーゼの存在下または非存在下で増殖させた。ノイラミニダーゼを用いた前処理は、ＨｅＬａおよびＮＢ３２４Ｋ細胞両方のウイルスを取り込む能力を劇的に（およそ９５％）減少させ、これはＭＶＭに類似して、Ｈ−１ＰＶがシアル酸と相互作用し、この結合がパルボウイルス感染にとって重要であることを示している（図４およびデータは示していない）。
【００５４】
（実施例４）
ｉｎ  ｓｉｔｕ突然変異生成によるＨ−１ＰＶの脱標的化
受容体の認識レベルでウイルスの指向性を再方向付けるためには、該ウイルスのその天然受容体への結合を無効にすること（再標的化）がまず重要である。シアル酸はＭＶＭおよびＨ−１ＰＶの細胞表面認識を媒介すると思われるため、本発明者らはＭＶＭと同様、Ｈ−１ＰＶのディンプル領域もまた糖との相互作用に関係している可能性がある。ＭＶＭ内では、Ｉ３６２およびＫ３６８の両方がシアル酸への結合に関係している。質量および電荷特性ならびにｉｎ  ｓｉｌｉｃｏモデリングに基づいて、本発明者らは、Ｉ３６７およびＨ３７３を各々ＳおよびＲと単独で置換することを決定し、Ｈ−１ＰＶ  Ｉ３６７ＳおよびＨ１ＰＶ  Ｈ３７３Ｒ変異体を生成した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中でのウイルスＤＮＡトランスフェクション後、見かけは正常な形態のウイルス粒子が形成された（図５Ａ）。
【００５５】
しかし変異はＮＢＫおよびＨｅＬａ細胞の両方におけるウイルスの結合および侵入に大きく影響し（図５Ｂ）、残基３７３での改変を有するウイルスについては９０％超の減少が観察された。感染単位およびプラークアッセイは、突然変異が導入された結果細胞に侵入した感染粒子の数の減少を確証した（図５Ｃ）。さらに、変異ウイルスは野生型Ｈ−１ＰＶと比較して低い力価で生成されたが（図５Ｄ）、異なるウイルスバッチ間で安定性に関する差は観察されなかった（データは示していない）。さらに、ＮＢ３２４Ｋ細胞と同様、突然変異は、ウイルスのＨｅＬａ細胞への結合および侵入に残基３７３での改変を有するウイルスについて観察された９０％の減少より多く、大きく影響した（図５Ｅ）。ＮＢ３２４Ｋ、ＨｅＬａおよびＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で実施されたウイルスＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイは、導入された置換の結果、それらの複製周期を開始するために細胞に侵入することができる変異粒子の数が大幅に減少することを確証した（図５Ｆ）。以前の結果と一致して、Ｈ３７３Ｒ変異体についての阻害はＩ３６７Ｓ変異体についての阻害よりもはるかに明白であった。一貫して、どちらの変異体もウイルスがＮＢ３２４Ｋ内でプラークを形成する能力を損傷させ、Ｈ３７３Ｒ置換について強度の作用が観察された（図５Ｇ）。２つの変異ウイルスは、さらにＬＤＨおよびＭＴＴアッセイ各々によって測定されるように、細胞を溶解してそれらの増殖を停止させる能力の低下も表示した（データは示していない）。
【００５６】
（実施例５）
環状ＲＧＤペプチドのそのカプチド内への挿入による侵入欠陥性Ｈ−１ＰＶ  Ｈ３７３Ｒ変異体のα５β５インテグリンへの再標的化
上記に提示した結果は、ＶＰタンパク質内のＨ３７３Ｒ置換が、該タンパク質が適正に組み立てられ、カプシドを形成する能力を維持しながら、ウイルス細胞膜の認識および侵入の両方を劇的に減少させることを示した。Ｈ−１ＰＶの遺伝的再プログラミングの第２工程は、ウイルス侵入のレベルで該ウイルスに明確な腫瘍親和性を付与可能な癌特異的再標的化ペプチドをそのカプシド内へ挿入することによってこの侵入欠損性変異体をさらに改変することであった。
【００５７】
αｖβ３およびαｖβ５インテグリンは癌細胞内で過剰発現することが多い。これらのインテグリンは、ＲＧＤモチーフを含有するペプチドによって効率的に認識される。詳細には、４つのシステイン残基（２つのジスルフィド結合を形成することにより該ペプチドを構造的に安定させる）によって取り囲まれた中心ＲＧＤモチーフから構成される、ＲＧＤ−４Ｃとして公知である環状ＲＧＤ含有ペプチド（アミノ酸配列、ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ）は、αｖβ３およびαｖβ５インテグリンの認識において最も強力なペプチドであり（４８、４９）、アデノウイルスおよびＡＡＶの再標的化に使用され成功を収めてきた（５２〜５４）。本発明者らは、その再標的化特徴を保存しながらカプシドの外表面でのペプチドの露出を保証するであろうウイルスカプシド内の位置の同定を開始した。本発明者らは、本発明者らのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏカプシドモデルに依存して、カプシド表面の２つの態様、（ｉ）突出のレベル、および（ｉｉ）該ペプチドが外側に露出させられる機会を増加させる親水性の性質へ特に注意を払いながら、潜在的挿入部位をスクリーニングした。特にこれらの基準を満たした２つのＶＰ残基（図６にＳ１およびＳ２部位として表示した）が存在した。それらはＶ２配列内のＧｌｙ  ２３４およびＡｌａ  ４４１に対応し、３回対称軸のスパイクに存在する２つのループ内に位置する（図６ＡおよびＢ）。本発明者らは、これらの位置で挿入されたＲＧＤ−４Ｃペプチドが外表面へ良好に露出され（図６Ｃ）、ＶＰ２タンパク質配列のＡｌａ  ４４１のニトロカルボキシ基（Ｓ２部位）の隣にＲＧＤ−４Ｃが挿入されるとＨ−１ＰＶ  Ｈ３７３Ｒ−ＲＧＤ−４Ｃ変異体（Ｈ−１ＲＧＤと略記する）が生成されると予測した。
【００５８】
ＨＥＫ２９３細胞内でのウイルスＤＮＡのトランスフェクション後、ビリオンが類似量で形成され、野生型ビリオンと同一の形態学的外観を有していたが、これはこの位置での挿入がウイルスアッセンブリもパッケージングも損傷させなかったことを示している（図７ＡおよびＢ）。本発明者らは、次にＨ−１ＲＧＤが野生型ウイルスと比較してＮＢ３２４Ｋに感染する能力を試験した。αｖβ３およびαｖβ５インテグリンの発現は、これらの細胞内では本発明者らの検出限界を下回った（図７Ｃ）。ＮＢ３２４Ｋ細胞の表面上のαｖβ３およびαｖβ５インテグリンの欠損と一致して、Ｈ−１ＲＧＤはＨ３７３Ｒ脱標的化ウイルスに類似して挙動し、これらの細胞に効率的には感染しなかった（図７Ｄ）。
【００５９】
次に、細胞侵入アッセイは、αｖβ３およびαｖβ５インテグリンを過剰発現することが公知であるＳＫ−ＭＥＬ−２８皮膚メラノーマ細胞を使用して実施した（７０、７１）。図７Ｅに示したように、野生型ウイルスはこれらの細胞に侵入することができ、このウイルス侵入は該細胞をノイラミニダーゼで前処理することによってほぼ完全に無効されたが、これはＨｅＬａおよびＮＢＫ細胞内と同様、ウイルスがＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞に侵入するためには細胞表面シアル酸を必要とすることを示唆している。予想通り、侵入欠損性Ｈ−１ＰＶ  Ｈ３７３Ｒ変異体は、ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞に感染することができなかった。注目すべきことに、ＲＧＤ−４Ｃペプチドのこの変異体への挿入は、該細胞内への侵入の大部分をレスキューした。重要なことには、ウイルス侵入はノイラミニダーゼ処理に対して部分的にのみ感受性であったが、これはＲＧＤ−４Ｃ含有ウイルスがシアル酸からは独立した代替経路を通して細胞に感染することを示している（図７Ｅ）。さらにウイルスの抗腫瘍特徴がカプシド改変によって影響を受けるかどうかについても、ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞を殺滅するＲＧＤ−４Ｃ含有ウイルスの有効性を評価することによって調査した。細胞生存度アッセイは、Ｈ−１ＰＶ  Ｈ３７３Ｒが細胞に感染し得ないのはそれらを殺滅できないことと極めて明確に関連することを証明した。反対に、ＲＧＤ−４Ｃ含有ウイルスはＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞を効果的に殺滅した（図７Ｆ）。これらをまとめると、これらの実験は、Ｈ−１ＰＶウイルスカプシドを本発明によって改変することでウイルス侵入のレベルでの癌細胞に対する親和性を増加させることができることを証明している。
【００６０】
（実施例６）
αｖβ５インテグリンを発現するメラノーマ細胞に対するＨ−１ＲＧＤ特異性
本実施例では、実施例５と類似の結果を追加のコントロールを用いて証明した。
【００６１】
ＲＧＤ−４Ｃの挿入がヒト癌細胞対ヒト正常一次細胞へのウイルス再標的化をもたらすかどうかについて試験した。内在化アッセイは、αｖβ３およびαｖβ５インテグリンを過剰発現するＳＫ−ＭＥＬ−２８皮膚メラノーマ細胞を使用して実施した（７０、７１）。比較のために、ＨｅＬａ細胞をさらに非形質転換ヒトメラノサイトおよびケラチノサイトの一次培養と一緒に試験した。フローサイトメトリー分析は、ＳＫ−ＭＥＬ−２８内でのαｖβ３およびαｖβ５インテグリンの高い発現を確証した。さらに、一次メラノサイトはαｖβ３インテグリンを優先的に発現することがわかったが、αｖβ３およびαｖβ５インテグリン両方の発現は一次ケラチノサイトおよびＨｅＬａ細胞においてほとんど検出されなかった（図１１Ａ）。図１１Ｂに示したように、ウイルス侵入がノイラミニダーゼを用いた前処理培養によって劇的に減少させられたため、野生型ウイルスはシアル酸依存方法でこれらの相違する培養全てによって取り込まれた。これらの結果はさらに、野生型ウイルスの取り込みが表面シアル酸に依存することを証明したＨｅＬａおよびＮＢ３２４Ｋ細胞において以前に得られたデータを確証した。予想通り、Ｈ３７３Ｒ脱標的化ウイルスはＨｅＬａ細胞の膜に結合して侵入することができなかった。類似の無効性は、ＳＫ−ＭＥＬ−２８および正常細胞培養中でも見いだされた。注目すべきことに、ＲＧＤ−４Ｃペプチドの脱標的化ウイルス内への挿入は、αｖβ３＋／αｖβ５＋メラノーマ細胞内への侵入を大きくレスキューした。Ｈ−１ＲＧＤの結合および侵入はノイラミニダーゼ処理に対して部分的にのみ感受性であったが、これはＨ−１ＲＧＤウイルスがシアル酸からは独立した代替経路を通して細胞に感染することを示している。Ｈ−１ＲＧＤウイルス上で表示されたＲＧＤペプチドはまたαｖβ３＋正常メラノサイトの一部の、メラノーマ細胞と比較してはるかに低いレベルのレスキューと相関していた。これとは対照的に、ＲＧＤ挿入依存性レスキューは、インテグリン陰性ＨｅＬａ細胞および正常ケラチノサイトにおいては有意ではなかった。これらをまとめると、これらのデータは、細胞表面でのαｖβ３およびαｖβ５インテグリンの存在が各々低効率および高効率でのＨ−１ＲＧＤ取り込みを可能にすることを示している（図１１ＡおよびＢ）。
【００６２】
次に、インテグリン陽性メラノーマ（ＳＫ−ＭＥＬ−２８）細胞上へのＨ−１ＲＧＤのＲＧＤ媒介性再標的化が脱標的化Ｈ３７３Ｒ変異体と比較してこのウイルスの強化された腫瘍崩壊能力に反映されるかどうかを調査した。図１２に示したように（左のパネル）、正常メラノサイトは、パルボウイルス細胞毒性の腫瘍特異性と一致して、改変ウイルスならびに野生型Ｈ−１ＰＶの両方を用いた感染に抵抗した。これとは対照的に、Ｈ−１ＲＧＤおよび親ウイルスは、Ｈ３７３Ｒ変異体と、メラノーマ細胞を効果的に殺滅する能力によって識別することができた（図１２、右のパネル）。Ｈ３７３Ｒ変異体内へのＲＧＤ挿入はメラノーマ細胞内でのこのウイルスの侵入だけではなく（上記参照）、細胞変性作用もレスキューしたが、これは内在化後にＨ−１ＲＧＤがウイルス毒性タンパク質の発現に対して競合的であることを示唆している。実際、パルボウイルス誘導性細胞障害の主要エフェクターであることが公知のＮＳ１の産生は、Ｈ−１ＲＧＤ（および野生型）ウイルスで感染させたメラノーマ細胞中では高レベルで検出することができたがＨ３７３Ｒ変異体で感染させた場合は検出することができなかった（データは示していない）。結論として、これらの実験は、Ｈ−１ＰＶカプシドを、ウイルス腫瘍崩壊能力を保存しながらこのウイルスを個別癌細胞の表面に方向付けるために遺伝的に改変可能なことを証明している。
【００６３】
参照文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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