(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のストレスタンパク質とポリペプチドとの間で形成される標的ストレスタンパク質複合体の精製方法であって、
（ｉ）前記標的ストレスタンパク質複合体を含む供給源混合物を準備する工程と、
（ｉｉ）前記標的ストレスタンパク質複合体の等電点（ｐＩ）を決定する工程と、
（ｉｉｉ）前記ストレスタンパク質複合体を含む前記供給源混合物から、浄化された細胞可溶化液を調製する工程と、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の前記浄化された細胞可溶化液を、イオン交換を使用する精製にかける工程であって、イオン交換の間、前記浄化された細胞可溶化液は、少なくとも１つの二価の陽イオンを含む一次バッファーを用いて、前記標的ストレスタンパク質複合体のｐＩの２単位以内のｐＨまで緩衝化され、前記標的ストレスタンパク質複合体の混合物を溶出するために塩勾配を与える二次バッファーが使用される工程と、
を含む方法。
【請求項２】
溶出される前記標的ストレスタンパク質複合体は、異なるストレスタンパク質のクラスの複数のストレスタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｉｖ）の前記一次バッファーは、アデノシン二リン酸をさらに含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記アデノシン二リン酸は、０．１ｍＭ〜１００ｍＭの濃度で与えられ、前記二価の陽イオンは、０．１ｍＭ〜１００ｍＭの濃度で与えられる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの二価の陽イオンはマグネシウム塩および／またはマンガン塩を含む、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記一次バッファーは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ＡＴＰアーゼおよび／またはカリウムまたはカリウム塩のうちの少なくとも１つを欠く、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記一次バッファーは、カオトロープ、界面活性剤、尿素または両性電解質を含まない、請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記標的ストレスタンパク質複合体は、４．５〜６．５のｐＩを有する複合体を含む分画として溶出される、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記標的タンパク質複合体の前記ポリペプチドは、典型的に感染症を引き起こす病原生物に由来する、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の方法によって得られる精製された標的ストレスタンパク質複合体を含む溶出物分画または可溶化液を含むワクチン組成物。
【請求項１１】
感染症または癌性状態または悪性状態の処置のためのワクチン組成物の調製における、請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の方法によって得られる精製された標的ストレスタンパク質複合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質複合体の精製のための新規な方法論に関する。特に、ペプチド断片に結合された熱ショックタンパク質を含むタンパク質複合体の精製方法が提供される。本発明は、さらに、ワクチン組成物の調製、ならびに感染症および癌の予防および処置のためのそのワクチン組成物の使用における、精製されたタンパク質複合体の使用に及ぶ。
【背景技術】
【０００２】
ワクチン接種は、感染症および癌という全世界的なヘルスケア上の負担に対処するための好ましいアプローチとして広く受け容れられている。しかしながら、感染症および癌に関する分子生物学の理解における著しい進歩にもかかわらず、これらの領域における有効なワクチンの開発は限られている。開発された最も有効なワクチンは、生の、弱毒化された生物を使用するが、しかしながら、病原性に復帰するこのような弱毒化された病原体に関連する安全性リスクは、それらの使用の広がりを制限してきた。より効果的なワクチンの広い規模での開発および使用を妨げるさらなる主要な障害は、微生物病原体のバリアント株に対して特異的に幅広い防御免疫を引き出すであろう、候補となる病原体由来のタンパク質を特定する能力が限られていることである。
【０００３】
幅広い、防御免疫をもたらす見込みを示す１つの特定のアプローチは、ストレスタンパク質複合体を感染症および癌に対するワクチンとして使用することである（非特許文献１および非特許文献２）。熱ショックタンパク質／抗原ペプチド複合体が、特定の癌に対するワクチンとして有効であるということについても、すでに数多い文書がある（特許文献１；特許文献２、特許文献３、特許文献４および特許文献５）。熱ショックを与えたＢＣＧ細胞から単離された病原体由来のストレスタンパク質複合体は、ワクチン接種を受けた宿主において１型ヘルパーＴ（Ｔｈ１）リンパ球介在性免疫応答を誘導し、これより、肺結核のマウスのエアロゾル抗原投与モデルにおいて生の抗原投与に対する防御免疫をもたらすということが示されている（特許文献６）。さらに、特許文献７、特許文献８および特許文献９において、病原体または病原体に感染した細胞から単離されたストレスタンパク質複合体は、感染症に対するワクチン内の免疫原決定基として有効であるということが示されている。
【０００４】
熱ショックタンパク質（ｈｓｐ、ＨＳＰ）は、植物界および動物界全体にわたって広く分布している高度に保存されたタンパク質のファミリーを形成する。それらの分子量に基づいて、主要な熱ショックタンパク質は、以下の６つの異なるファミリーにグループ分けされる：低分子（ｓｍａｌｌ）（ｈｓｐ２０−３０ｋＤａ）；ｈｓｐ４０；ｈｓｐ６０；ｈｓｐ７０；ｈｓｐ９０；およびｈｓｐ１００。熱ショックタンパク質は、熱ストレスに曝された細胞においてもともと特定されたが、熱ショックタンパク質は、感染、浸透ストレス、サイトカインストレスなどの多くの他の形態のストレスと関連するということが見出された。従って、熱ショックタンパク質は、それらの発現は単に熱ストレスによってのみ引き起こされるわけではないということに基づいて、一般に、ストレスタンパク質（ＳＰ）とも呼ばれる。ｈｓｐ６０ファミリーのメンバーとしては、主要なシャペロンＧｒｏＥＬが挙げられる。これらは、ＧｒｏＥＳなどのシャペロン補助因子と多量体複合体を形成する。多くの微生物病原体は、ＧｒｏＥＬとは別個の複合体を形成するさらなるｈｓｐ６０ファミリーを有し、いくつかのｈｓｐ６０ファミリーのメンバーは、マイコバクテリウムのｈｓｐ６５など、より免疫原性でありうる。ｈｓｐ７０ファミリーのメンバーとしては、ＤｎａＪなどのシャペロン補助因子と多量体複合体を形成することができるＤｎａＫが挙げられる。他の主要なｈｓｐとしては、ＡＡＡ  ＡＴＰアーゼ（ＡＴＰａｓｅ）、Ｃｌｐタンパク質、Ｔｒｉｇｇｅｒ  ｆａｃｔｏｒ（トリガーファクター）、Ｈｉｐ、ＨｔｐＧ、ＮＡＣ、Ｃｌｐ、ＧｒｐＥ、ＳｅｃＢおよびｐｒｅｆｏｌｄｉｎ（プレフォルジン）が挙げられる。
【０００５】
ストレスタンパク質は、原核細胞および真核細胞の両方において遍在的に発現され、原核細胞および真核細胞において、ストレスタンパク質は、ポリペプチドの折り畳みおよびアンフォールディング（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）においてシャペロンとして機能する。ストレスタンパク質のさらなる役割は、ペプチドを１つの細胞区画から別の細胞区画へと同伴して運ぶ（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ）ことであり、罹患した細胞の場合は、ストレスタンパク質は、シャペロンウイルスペプチドまたは腫瘍関連ペプチドを細胞表面へと同伴して運ぶことも知られている。
【０００６】
ストレスタンパク質のシャペロン機能は、ストレスタンパク質とシャペロンポリペプチドとの間の複合体の形成を通して成し遂げられる。シャペロンポリペプチドは、ペプチド断片を含んでもよく、このような複合体の形成はＡＴＰ依存性ヌクレオチド交換系によって制御され、これは、細菌性Ｈｓｐ７０相同体、ＤｎａＫについて最も明確に示された（非特許文献３）。簡潔に言えば、その静止期の細胞状態において、ＤｎａＫはＡＴＰ（アデノシン三リン酸）に結合されており、基質に対する低い親和性を有する（非特許文献４）。ＡＴＰ加水分解は、ＤｎａＫから高親和性ＡＤＰ（アデノシン二リン酸）状態への変換を生じ、ＤｎａＫ−ＡＤＰ−基質複合体の形成を生じる。ここでは、基質は、典型的にはポリペプチドまたはタンパク質である。ＡＤＰ解離後、ＡＴＰはＤｎａＫに再結合して、立体構造変化を生じ、これが、正しく折り畳まれた基質タンパク質を当該複合体から遊離させるということを誘発する（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献３）。基質の遊離を生じるこの最後の工程は、ＡＴＰの結合に加えて、カリウム（Ｋ＋）およびマグネシウム（Ｍｇ２＋）を必要とするということが示されている（非特許文献６；非特許文献７）。
【０００７】
このストレスタンパク質と複合体を形成している異種のポリペプチドまたはポリペプチド断片は、ストレスタンパク質−ペプチド複合体を形成する。これは、熱ショックタンパク質複合体（ＨｓｐＣ）と呼ばれることがある。ＨｓｐＣは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって捕捉され、免疫系のＴリンパ球への細胞表面提示のための主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子上へと負荷されうる抗原ペプチドの源を提供する。
【０００８】
熱ショックタンパク質／抗原ペプチド断片複合体（ＨｓｐＣ）は、癌ワクチンとして広く研究されてきており（例えば特許文献１および特許文献２を参照）、従って腫瘍細胞からのＨｓｐＣの単離のための方法が、そのような腫瘍に対する有効なワクチンとして使用するために、開発されてきた。例えば、特許文献１０は、ヘパリンに対する熱ショックタンパク質の結合親和性に基づいて、タンパク質複合体を精製する際に使用するための方法を開示する。この２工程アプローチには、ヘパリン親和性クロマトグラフィ、およびその後の、ストレスタンパク質複合体調製物を得るためには任意であるイオン交換クロマトグラフィ工程が関与する。特許文献１１は、Ｃｏｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを使用するＨＳＰ７０ストレスタンパク質複合体の精製に関する。しかしながら、これらの方法は、熱ショックタンパク質の個々のファミリーの単離に終わり、それゆえ複数のシャペロンタンパク質をワクチンとして使用することを念頭に置いていない。
【０００９】
ＨｓｐＣを癌ワクチンとして使用することは、複数のシャペロンタンパク質、特に熱ショックタンパク質の使用によって著しく改善される可能性があり（Ｂｌｅｉｆｕｓｓら、２００８）、従って複数のシャペロンタンパク質およびシャペロンタンパク質複合体の精製のための方法が、ワクチンにおける使用のために、開発されてきた。例えば特許文献１２は、癌ワクチンとして使用するために、腫瘍からＨｓｐＣを精製するための、フリー溶液（ｆｒｅｅ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ）等電点電気泳動法（ＦＳ−ＩＥＦ）の使用を開示する。フリーフロー等電点電気泳動法（ＦＦ−ＩＥＦ）は、感染症の予防および処置のためのワクチン組成物の中の免疫原決定基として使用するために病原体および感染した細胞から熱ショックタンパク質／ペプチド複合体を単離するために使用することができる。しかしながら、その技術の重大な限界は、大きい、工業的規模の、ＧＭＰ対応のワクチン製造のために必要とされるであろう量の熱ショックタンパク質／ペプチド複合体（ＨｓｐＣ）を生産するための大規模なＦＦ−ＩＥＦ機器の開発に伴う困難であった。さらに、ＦＦ−ＩＥＦプロセスの際に必要とされるｐＨ勾配を生成するための両性電解質（アンフォライン）の使用は、得られた、精製されたＨｓｐＣ含有調製物の中への、カオトロープに加えて、さらなる混入物質の導入を生じる。このような混入物質は、監督官庁には受け容れられないので、ＨｓｐＣ含有ワクチン組成物の製造におけるＦＦ−ＩＥＦ方法論の使用に重大な障壁となる。興味深いことに、これらの発明者らは、プロセスバッファーの中の二価の陽イオンおよびＡＤＰの不存在下であっても、ＦＦ−ＩＥＦ精製の際に使用される尿素および洗浄剤などのカオトロープを使用する際でさえも、ＨｓｐＣの安定性を報告する（Ｂｌｅｉｆｕｓｓら、２００８）。加えて、フリーフロー等電点電気泳動法のプロセスは遅く、典型的な実行時間は４時間であり、この間に高レベルのタンパク質分解が生じ、これが、精製されたタンパク質複合体の大規模な生産におけるＦＦ−ＩＥＦの使用を大きく制限する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５，９９７，８７３号明細書
【特許文献２】米国特許第５，９３５，５７６号明細書
【特許文献３】米国特許第５，７５０，１１９号明細書
【特許文献４】米国特許第５，９６１，９７９号明細書
【特許文献５】米国特許第５，８３７，２５１号明細書
【特許文献６】国際公開第０１／１３９４４号パンフレット
【特許文献７】国際公開第０２／２００４５号パンフレット
【特許文献８】国際公開第００／１０５９７号パンフレット
【特許文献９】国際公開第０１／１３９４３号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第０２／２８４０７号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第０２／３４２０５号パンフレット
【特許文献１２】米国特許第６，８７５，８４９号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｃｏｌａｃｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ、２００４年、第３２巻、６２６−６２８頁
【非特許文献２】Ｚｅｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、２００６年、第５５巻、３２９−３３８頁
【非特許文献３】Ｓｚａｂｏら、ＰＮＡＳ、１９９４年、第９１巻、１０３４５−１０３４９頁
【非特許文献４】Ｐａｌｌｅｒｏｓら、ＰＮＡＳ、１９９１年、第８８巻、５７１９−５７２３頁
【非特許文献５】Ｐａｌｌｅｒｏｓら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、１９９２年、第２６７巻、第８号、５２７９−５２８５頁
【非特許文献６】Ｐａｌｌｅｒｏｓら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９３年、第３６５巻、第６４４７号、６６４−６頁
【非特許文献７】Ｐａｌｌｅｒｏｓら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９３年、第３３６巻、第１号、１２４−１２８頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
精力的な実験ののち、本発明者らは、ワクチン製造のために安全に使用することができる複数のストレスタンパク質−ペプチド複合体を精製するために使用することができる熱ショックタンパク質／ペプチド複合体（ＨｓｐＣ）などのストレスタンパク質−ペプチド複合体の改善された精製方法を特定した。この方法論は、等電点よりはむしろ表面電荷に基づいてタンパク質複合体を分離する。特に、ペプチド断片と複合体を形成している熱ショックタンパク質などのストレスタンパク質を含むタンパク質複合体の迅速精製を可能にする精製方法であって、精製された産物の収量が、商業的に許容できる量の、ワクチン組成物の調製における使用のためのタンパク質複合体の調製を許容するに十分である、ある精製方法が特定された。有利なことに、この精製されたタンパク質複合体は、薬学的に許容できないまたは望ましくない添加剤または成分が精製プロセスの間に導入されないため、ワクチン調製物の調製において使用することができる。具体的には、本発明者らは、当該ストレスタンパク質複合体に関する分解、または部分的解離を防止する特定のバッファー条件の必要性を特定した。それゆえ、この精製方法は、有利なことに、当該精製されたタンパク質複合体に対する免疫応答を引き出すためにワクチン組成物の中で使用されるとき、精製されたタンパク質複合体の解離および機能喪失を減少または改善し、他方で、同時に、精製を受けているタンパク質複合体の溶解性を増大させるためのカオトロープまたは他の化学物質（界面活性剤など）を使用する必要性を取り除く。非常に驚くべきことに、本発明の方法論を使用して精製された熱ショックタンパク質／抗原ペプチド複合体（ＨｓｐＣ）富化調製物（ＨＥＰ）は、本発明のバッファー条件を使用しない標準的な方法論を使用して単離された類似の複合体に対して引き出された免疫と比較して、ワクチン接種を受けた被験者において著しく増進された免疫を引き出した。本発明者らは、ワクチン調製物の調製における使用のための本発明の精製されたタンパク質複合体の有用性は、細胞可溶化液が、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）および少なくとも１つの二価の陽イオンを含有するバッファーの中で緩衝化され、または特定の実施形態では、少なくとも１つの二価の陽イオンのみを使用するバッファーの中で緩衝化されるとき、さらに増進されうるということをさらに特定した。さらには、少なくとも１つの二価の陽イオンおよび任意にアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を含むバッファーと併用した、本発明の改善された方法を使用して精製された熱ショックタンパク質／抗原ペプチド複合体（ＨｓｐＣ）富化調製物（ＨＥＰ）は、当該複合体が投与された被験者において、さらに大きい防御免疫応答を引き出した。
【００１３】
本発明の第１の態様によれば、ストレスタンパク質とポリペプチドとの間で形成されるストレスタンパク質複合体の、供給源混合物からの精製方法が提供される。この方法は、
（ｉ）ポリペプチドと複合体を形成しているストレスタンパク質を含む少なくとも１つの標的ストレスタンパク質複合体を含む供給源混合物を準備する工程と、
（ｉｉ）この供給源混合物から精製されることになる少なくとも１つの標的ストレスタンパク質複合体の等電点（ｐＩ）を決定する工程と、
（ｉｉｉ）特定されたこの標的ストレスタンパク質複合体を含む供給源混合物から、浄化された細胞可溶化液を調製する工程と、
（ｉｖ）この細胞可溶化液を、イオン交換を使用する精製にかける工程であって、この細胞可溶化液は、少なくとも１つの二価の陽イオンを含む一次バッファーを用いて、当該標的ストレスタンパク質複合体のｐＩの２単位以内のｐＨまで緩衝化され、二次バッファーが、標的ストレスタンパク質複合体の混合物を溶出するために使用される塩勾配を与える工程と、
を含む。
【００１４】
特定の実施形態では、この一次バッファーは、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）および／またはアデノシン二リン酸模倣物をさらに含む。特定のさらなる実施形態では、この少なくとも１つの二価の陽イオンは、マグネシウム塩、典型的には塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、またはマンガン塩である。なおさらなる実施形態では、この二価の陽イオンは、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度で与えられる。１つの実施形態では、当該バッファーは、二価の陽イオンとしてマグネシウム塩、典型的には塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）のみを含む。特定の実施形態では、アデノシン二リン酸は、約０．１ｍＭ〜１００ｍＭの濃度で与えられる。
【００１５】
特定の実施形態では、この一次バッファーは、少なくとも１ｍＭの濃度の塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）および少なくとも１ｍＭの濃度のアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を含む。特定の実施形態では、このバッファーは、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）をさらに含み、これは、約５０ｍＭの濃度で存在してもよい。このバッファーは、約ｐＨ  ６．８のｐＨを有してもよい。
【００１６】
特定のさらなる実施形態では、この一次バッファーは、少なくとも１つの二価の陽イオンを含むが、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ＡＴＰアーゼおよび／またはカリウムもしくはカリウム塩のうちの少なくとも１つを欠く。１つの実施形態では、このバッファーは、二価の陽イオンとしてマグネシウム塩、典型的には塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）のみを含む。
【００１７】
特定のさらなる実施形態では、この一次バッファーは、カオトロープ、界面活性剤および／または両性電解質のうちの少なくとも１つを欠く。カオトロープ（カオトロピック剤、またはカオトロピック試薬としても知られる）としては、尿素、グアニジン塩酸塩および過塩素酸リチウムが挙げられる。カオトロープは、タンパク質変性剤として作用し、タンパク質を折り畳まれていない状態にさせてその結果生じる三次元構造の変化を引き起こすことが知られている。両性電解質は、酸性基および塩基性基の両方を含有する分子である。両性電解質は、特定範囲のｐＨでは、ほとんど双性イオン（正味電荷はゼロである化合物）として存在する。界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤（ＳＤＳなど）、陽イオン性界面活性剤（ＣＴＡＣ、ＨＴＡＢおよびＤＴＡＢなど）、非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ  ２０など）、および双性イオン性界面活性剤（ＤＡＰＳなど）を挙げてもよい。特定の実施形態では、当該一次バッファーは、さらに、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ＡＴＰアーゼ、カリウム、またはカリウム塩のうちの少なくとも１つを欠く。
【００１８】
特定の実施形態では、溶出される標的ストレスタンパク質複合体の混合物は、異なる熱ショックタンパク質のクラスの複数のストレスタンパク質を含む調製物として提供される。
【００１９】
従って、有利なことに、本発明の方法論は、精製されたストレスタンパク質複合体の混合物であって、このストレスタンパク質の混合物は異なるストレスタンパク質複合体を含む、混合物を提供する。つまり、このストレスタンパク質複合体のストレスタンパク質成分は、複数の（すなわち１より多い）熱ショックタンパク質のクラスまたはファミリー由来の混合物であり、例えば、それは、クラスＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０および／またはＨＳＰ９０由来、または真核細胞もしくは病原細胞の中に存在する任意の他の熱ショックタンパク質のクラス由来の熱ショックタンパク質の混合物であってもよい。具体的には、病原体細胞、または病原体に感染した細胞の細胞可溶化液の中に存在する任意のストレスタンパク質複合体は、本発明の方法によって精製することができ、それゆえ最終の精製された生成物の中に存在する。この異なる熱ショックタンパク質の混合物は、後のワクチン組成物の中の免疫原決定基としてのこの精製された複合体の投与により、免疫化された宿主によって当該ワクチン組成物に対して引き出される増進された免疫応答を生じるので、重要である。この増進された免疫応答は、被験者が免疫化されつつある病原体に対して改善された長期の防御免疫をもたらす。
【００２０】
従って、特定の態様では、本発明は、病原細胞、病原体に感染した細胞、または腫瘍細胞から得られる細胞可溶化液から、複数のストレスタンパク質複合体を精製および／または単離する方法に及ぶ。典型的には、このストレスタンパク質複合体は、異なるストレスタンパク質のクラスのストレスタンパク質を含む。その後、この精製および／もしくは単離されたストレスタンパク質複合体、またはこの精製および／もしくは単離されたストレスタンパク質複合体を含む調製物もしくは混合物は、典型的には、当該可溶化液が由来する病原体または腫瘍細胞に対する、または当該可溶化液が由来する細胞を感染させている病原体に対する免疫応答および関連する防御免疫を引き出すためのワクチン組成物の中の免疫原決定基として使用することができる。従って、このような方法は、
（ｉ）当該特定された標的ストレスタンパク質複合体を含む供給源混合物由来の浄化された細胞可溶化液を準備する工程と、
（ｉｉ）この細胞可溶化液を、イオン交換を使用する精製にかける工程であって、この細胞可溶化液は、少なくとも１つの二価の陽イオンを含むバッファーを使用して、標的ストレスタンパク質複合体のｐＩの２単位以内のｐＨまで緩衝化され、この標的ストレスタンパク質複合体を溶出するために塩勾配が使用される工程と、
（ｉｉｉ）複数のストレスタンパク質複合体を含む富化調製物を得る工程と、
を含むことになろう。
【００２１】
特定の実施形態では、複数のストレスタンパク質複合体または複数のストレスタンパク質複合体を含む調製物もしくは混合物を精製および／または単離することは、ストレスタンパク質の異なるファミリー由来のストレスタンパク質を含み、従って当該精製された産物は、ストレスタンパク質複合体の混合物を含有し、このストレスタンパク質は、異なるストレスタンパク質ファミリーに由来してよく、例えば、この精製された混合物は、ペプチドと複合体を形成する複数の異なる熱ショックタンパク質のタイプを含んでもよい。
【００２２】
特定のさらなる態様では、本発明は、ワクチン組成物を調製するための、ワクチン組成物の中の免疫原決定基としての、本発明の方法に従って実施される精製方法論、典型的にはイオン交換精製、特にイオン交換クロマトグラフィ、または本発明に係るバッファー溶液を使用する精製方法論から得られる精製された分画または混合物の使用に及ぶ。
【００２３】
バッファー溶液
特定のさらなる態様では、本発明は、タンパク質精製方法、特にイオン交換クロマトグラフィなどのイオン交換を実施することにおける使用のためのバッファー溶液に及ぶ。ここで、当該精製方法論は、複数のストレスタンパク質複合体を細胞または細胞培養液由来のタンパク質性の混合物から単離および／または分離するために、その細胞または細胞培養液由来のタンパク質性の混合物の精製、単離および／または分離に基づき、当該バッファー溶液は、少なくとも１つの二価の陽イオンを含む。特定の実施形態では、この少なくとも１つの二価の陽イオンは、マグネシウム塩、典型的には塩化マグネシウムである。さらなる適切な二価の陽イオンは本願明細書に開示される。特定の実施形態では、当該バッファーは、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）をさらに含む。特定の実施形態では、当該バッファーは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ＡＴＰアーゼ、カリウム、またはカリウム塩、カオトロープ、両性電解質および界面活性剤のうちの少なくとも１つ、またはすべてを欠く。
【００２４】
ワクチン組成物
種々のさらなる態様では、本発明は、ワクチン組成物、または免疫応答を媒介するもしくは引き出す組成物であって、本発明の方法によって得られる精製されたＨｓｐＣ富化可溶化液または精製および／もしくは単離された複数のストレスタンパク質複合体、あるいは本発明の方法によって得られる精製されたＨｓｐＣ富化可溶化液または精製および／もしくは単離された複数のストレスタンパク質複合体を含む調製物もしくは混合物を含む、ワクチン組成物または免疫応答を媒介するもしくは引き出す組成物に及ぶ。このワクチン組成物は、病原体に対する防御免疫をもたらすために、典型的には、哺乳動物、特にヒトに投与される。しかしながら、異なる種由来のストレスタンパク質間の広く認められた高レベルの相同性に起因して、ワクチン組成物は、実に様々な動物にワクチン接種をするために使用されてもよい。
【００２５】
従って、本発明のさらなる態様は、免疫原決定基として、本発明によって得られる精製されたＨｓｐＣ富化溶出物分画または可溶化液を含むワクチン組成物を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、本発明の精製方法によって得られる精製されたストレスタンパク質−ポリペプチド複合体（ＨｓｐＣ）富化溶出物分画または可溶化液を含むワクチン組成物であって、当該可溶化液は、少なくとも１つの二価の陽イオンを含むバッファーの中で緩衝化されているワクチン組成物を提供する。当該バッファーは、アデノシン二リン酸をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、このバッファーは、ＡＴＰおよび／またはカリウムを欠く。
【００２６】
なおさらなる態様は、被験者において免疫応答を引き出すことにおける使用のためのワクチン組成物であって、免疫原決定基は、本発明の精製方法を使用して得られる精製および／もしくは単離された複数のストレスタンパク質複合体またはその精製および／もしくは単離された複数のストレスタンパク質複合体を含む調製物もしくは混合物である、ワクチン組成物を提供する。具体的には、本発明の精製方法は、源となるタンパク質性の混合物から精製されたストレスタンパク質複合体の安定性およびそれゆえ抗原性を改善するための本願明細書に記載されるバッファー溶液を使用する等電点クロマトグラフィを含む。
【００２７】
特定の実施形態では、当該精製された複数のストレスタンパク質複合体は、当該ワクチン組成物が、免疫原決定基として、当該ワクチン組成物の免疫原決定基としての精製および単離された複合体を含むように、単離されてもよい。
【００２８】
特定のさらなる態様では、本発明は、医薬における使用のための、本発明に係るワクチン組成物の使用、または本発明の方法論を使用して得られるストレスタンパク質／ペプチド複合体の精製および／もしくは単離された混合物の使用を提供する。
【００２９】
特定のさらなる態様では、本発明は、感染症または癌性状態もしくは悪性状態の処置のための医薬の調製における、ストレスタンパク質−ペプチド複合体の精製された混合物またはストレスタンパク質−ペプチド複合体の精製された混合物を含む調製物の使用を提供する。
【００３０】
特定のさらなる態様では、本発明は、感染症または癌性状態もしくは悪性状態の処置または予防のためのワクチン組成物における使用のための、本発明の第１の態様の方法によって精製される複数のストレスタンパク質−ペプチド複合体またはその複数のストレスタンパク質−ペプチド複合体を含む調製物もしくは混合物を提供する。
【００３１】
特定の実施形態では、この精製および単離されたストレスタンパク質複合体またはこの精製および単離されたストレスタンパク質複合体を有するワクチン組成物は、予防的ワクチンとして投与される。特定のさらなる実施形態では、この精製されたストレスタンパク質複合体、この精製されたストレスタンパク質複合体を含む調製物、またはこの精製されたストレスタンパク質複合体を含有するワクチン組成物は、治療ワクチンとして投与される。
【００３２】
種々のさらなる態様では、本発明は、典型的には感染によってまたは一次ワクチンの以前の投与に起因して被験者がこれまでに曝露されたことがある病原体または癌抗原に対して、宿主において生成された免疫応答を増進させるための追加免疫ワクチン（ｂｏｏｓｔｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅ）としての、当該精製および単離されたストレスタンパク質複合体の使用、または当該精製および単離されたストレスタンパク質複合体を含む調製物もしくは混合物、または当該精製および単離されたストレスタンパク質複合体を含有するワクチン組成物、に及ぶ。
【００３３】
本発明の組成物は、凍結乾燥されてもよいし、または水性形態、すなわち溶液もしくは懸濁液の状態にあってもよい。この種の液体製剤によって、当該組成物を、水系媒体の中で再構成する必要なしにその包装された形態から直接投与することが可能になり、従って、この種の液体製剤は注入にとっては理想的である。組成物は、バイアルの中で提供されてもよいし、または組成物は、充填済み注射器（ｒｅａｄｙ  ｆｉｌｌｅｄ  ｓｙｒｉｎｇｅ）の中で提供されてもよい。この注射器は、針とともにまたは針なしで供給されてもよい。注射器は、当該組成物の単回投与分を含むことになろうが、他方でバイアルは、単回投与または複数回投与分（例えば、２回投与分）を含んでもよい。
【００３４】
特定の実施形態では、本発明に係るワクチン組成物が、ヒト被験者の許容できる百分率のための各抗原成分についての抗体保有率（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）の基準をしのぐ抗体価をもたらすように、本発明に係るワクチン組成物は、被験者へのインビボ投与用に製剤化される。これは、その集団全体にわたるワクチンの有効性の評価において重要な試験である。超えると宿主がその抗原に対して抗体陽転すると考えられる関連抗体価を有する抗原は周知であり、そのような抗体価は、ＷＨＯなどの機関によって公開されている。１つの実施形態では、被験者の統計的に有意な試料のうちの８０％超が抗体陽転し、別の実施形態では、被験者の統計的に有意な試料のうちの９０％超が抗体陽転し、さらなる実施形態では、被験者の統計的に有意な試料のうちの９３％超が抗体陽転し、なお別の実施形態では、被験者の統計的に有意な試料のうちの９６〜１００％が抗体陽転する。各ワクチン用量の中の抗原の量は、典型的なワクチンにおいて著しい有害な副作用なしに免疫防御反応を引き起こす量として選択される。このような量は、どの特定の免疫原が用いられるかに応じて変わるであろう。特定の実施形態では、当該ワクチン組成物は、Ｔｈ１リンパ球細胞介在性免疫応答も引き出してよい。このような免疫応答は、細胞内病原体から被験者を防御するとき、望ましい。特定の実施形態では、本発明の精製されたストレスタンパク質複合体を含むワクチン組成物は、細胞介在性および体液性（抗体介在性）免疫応答の両方を含む、宿主における免疫応答を引き出す。
【００３５】
種々のさらなる態様では、本発明は、ワクチン組成物を製造するための方法であって、本発明の精製されたストレスタンパク質複合体または当該精製されたストレスタンパク質複合体を含む調製物もしくは混合物を、少なくとも１つの薬学的に許容できる賦形剤、担体または希釈剤と一緒に混合する工程を含む方法を提供する。本発明の１つの実施形態では、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（ボルデテラ・パータシス、百日咳菌）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ（破傷風菌、クロストリジウム・テタニ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（クロストリジウム・ディフィシル）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（ジフテリア菌、コリネバクテリウム・ジフテリエ）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ヘモフィルス・インフルエンザエ、インフルエンザ菌）  ｂ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、結核菌）およびライ菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ（サルモネラ・チフィ、チフス菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ（ストレプトコッカス・ニューモニエ、肺炎球菌）、Ｖｉｂｒｉｏ  Ｃｈｏｌｅｒａｅ（ビブリオ・コレラエ、コレラ菌）およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ（ナイセリア・メニンギティディス、髄膜炎菌）を含む（が、これらに限定されない）群から選択される病原性バクテリアによる感染によって引き起こされる疾患などの病原性疾患の処置または予防のための医薬における使用のためのワクチン組成物が提供される。本発明のさらなる実施形態では、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、ＨＰＶ、ＲＳＶ、ポリオーマウイルス、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ロタウイルス、ノロウイルスおよびＳＡＲＳウイルスを含む（が、これらに限定されない）群から選択される病原性ウイルスまたは発癌性ウイルスによる感染によって引き起こされる疾患などの病原性疾患の処置または予防のための医薬における使用のためのワクチン組成物が提供される。本発明のなおさらなる実施形態では、癌および腫瘍性疾患の処置または予防のための医薬における使用のためのワクチン組成物が提供される。
【００３６】
加えて、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（ボルデテラ・パータシス、百日咳菌）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ（破傷風菌、クロストリジウム・テタニ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（クロストリジウム・ディフィシル）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（コリネバクテリウム・ジフテリエ、ジフテリア菌）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ヘモフィルス・インフルエンザエ、インフルエンザ菌）  ｂ型、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、結核菌）およびライ菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ（サルモネラ・チフィ、チフス菌）、Ｖｉｂｒｉｏ  Ｃｈｏｌｅｒａｅ（コレラ菌、ビブリオ・コレラエ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ（ストレプトコッカス・ニューモニエ、肺炎球菌）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ナイセリア・メニンギティディス、髄膜炎菌）ならびに病原性ウイルスおよび発癌性ウイルスによって引き起こされる疾患に対して被験者、典型的にはヒトを免疫化する方法であって、その宿主に免疫防御用量の本発明のワクチンを投与することを含む方法が、さらに提供される。
【００３７】
各ワクチン用量の中の抗原（すなわち免疫原決定基）の量は、ワクチン接種を受けた被験者において著しい有害な副作用なしに免疫防御反応を誘導する量として選択される。抗原の量は、どの特定の免疫原が用いられるか、およびその特定の免疫原がどのように提示されるかに応じて変わるであろうが、しかしながら、本発明の精製された複合体に対して媒介される増進された免疫応答は、当該技術分野で公知の精製方法を使用して得られるある量のタンパク質複合体を含むワクチン組成物と比較して、同様の量の本発明の方法論を使用して精製された複合体に対して、増進された免疫応答が介在されるであろうということを意味することになる、ということは理解されるであろう。
【００３８】
本発明は、病原体由来の感染症または癌性状態もしくは悪性状態に対する免疫を誘導するために被験者にワクチン接種する方法における、当該精製されたＨｓｐＣ富化可溶化液、または当該精製されたＨｓｐＣ富化可溶化液由来の単離されたストレスタンパク質の使用をさらに提供する。
【００３９】
従って、本発明のなおさらなる態様は、病原体由来の感染症または癌性状態に対して被験者にワクチン接種する方法であって、
免疫原決定基として、本発明の方法に従って得られる精製されたストレスタンパク質複合体富化調製物を含むワクチン組成物を準備する工程であって、この精製されたストレスタンパク質富化調製物は、癌性細胞、病原体、または防御免疫が所望される病原体に感染した細胞に由来し、かつ当該精製された調製物の中に混合物として異なるストレスタンパク質の種類を含む、工程と、
このストレスタンパク質複合体富化調製物を含むワクチン組成物を、当該ストレスタンパク質複合体富化調製物に対して当該被験者において免疫応答を引き出すのに十分な治療上有効量または予防上有効量で被験者に投与する工程と、
を含む方法を提供する。
【００４０】
本願明細書で使用する場合、用語「ワクチン組成物」は、のちの抗原投与（ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ）、病原性バクテリア感染または腫瘍形成に対して免疫系がより良好に反応することができるように、免疫系を刺激する免疫原決定基を含有する任意の組成物を意味する。ワクチンは、通常、免疫原決定基および任意に佐剤を含有し、この佐剤は、免疫原決定基に対する免疫応答を非特異的に増進させる役割を果たすということはわかるであろう。
【００４１】
特定の実施形態では、上記被験者は、動物、典型的にはヒトである。また本発明の方法は、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタおよび鳥類などの他の動物の処置のためのワクチン組成物における使用のためのストレスタンパク質複合体を精製するために使用することもできる。
【００４２】
特定の実施形態では、本発明の精製されたストレスタンパク質複合体（ＨｓｐＣ富化調製物）が由来する微生物病原体は、その微生物病原体が疾患または感染を引き起こすことに基づいて選択されてもよい。本発明によって提供されるワクチン組成物は、予防的にまたは治療的に使用されてもよい。しかしながら、本発明者らは、当該組成物は、それらの生産の経済性ならびに当該ペプチド、またはペプチドおよびストレスタンパク質が由来する病原体に対して防御免疫応答を引き出す高い能力に起因して、予防的ワクチンとして特に有用である可能性があるということを認識している。
【００４３】
本発明者らは、さらに驚くべきことに、本発明の方法を使用して得られるストレスタンパク質−ペプチド複合体は、「追加免疫」ワクチン接種として使用することができ、この追加免疫ワクチン接種は、病原体または癌性状態に対して被験者においてもたらされる免疫を増進するということを特定した。この場合の初期免疫は、生ワクチンまたは弱毒化ワクチンを用いたワクチン接種によって、または免疫原決定基がストレスタンパク質−ペプチド複合体であるワクチン組成物によってもたらされたものである。
【００４４】
従って、本発明のなおさらなる態様は、病原体由来の感染症または癌性状態に対して、被験者において防御免疫応答を追加免疫する方法であって、この防御免疫応答は、生ワクチンもしくは弱毒化ワクチンの以前の投与または免疫が所望される病原体に由来するペプチドを含むストレスタンパク質−ペプチド複合体の以前の投与によって引き出されたものであり、当該方法は、
本発明の方法に従って得られるストレスタンパク質／ペプチド複合体富化調製物を含む組成物を準備する工程であって、この精製されたストレスタンパク質／ペプチド複合体富化調製物は、癌性細胞、病原体に感染した細胞または防御免疫が所望される病原体に由来し、かつ当該精製された調製物の中に混合物として異なるストレスタンパク質の種類を含む、工程と、
このストレスタンパク質／ペプチド複合体富化調製物を含む組成物を、当該ストレスタンパク質／ペプチド複合体富化調製物に対して当該被験者において免疫応答を引き出すのに十分な量で被験者に投与する工程と、
を含む方法を提供する。
【００４５】
特定のさらなる実施形態では、本発明のストレスタンパク質／ペプチド複合体含有ワクチンは、他のサブユニット、多サブユニット、炭水化物または結合型ワクチンで以前に免疫化されたことがある動物における、免疫応答の追加免疫のために使用されてもよい。なおさらなる実施形態では、本発明のストレスタンパク質／ペプチド複合体ワクチンは、核酸または生ワクチンで以前に免疫化されたことがある動物における、標的抗原に対する免疫応答を追加免疫するために使用することができる。なおさらなる実施形態では、本発明のワクチン組成物を含有するストレスタンパク質／ペプチド複合体は、病原体または癌特異的抗原に対して以前に免疫化されたことがある被験者において介在される免疫応答の追加免疫を提供する。
【００４６】
特定のさらなる態様では、本発明は、少なくとも１つの病原体由来の抗原、病原体、特に弱毒化された病原体、または癌特異的抗原を含むワクチン組成物で以前にワクチン接種を受けたことがある動物において免疫応答を追加免疫することにおける使用のための、本発明によって精製されるストレスタンパク質−ペプチド複合体を含むワクチン組成物に及ぶ。典型的には、このペプチド成分は、最初のワクチン接種のための免疫原決定基として与えられたものと同じ病原体または癌性細胞に由来する。
【００４７】
特定のなおさらなる態様では、本発明は、以前に当該ストレスタンパク質複合体の中に存在する抗原を発現する病原体または癌に曝露されたことがある動物において免疫応答を追加免疫することにおける使用のための、本発明によって精製されるストレスタンパク質−ペプチド複合体を含むワクチン組成物に及ぶ。
【００４８】
特定のさらなる実施形態では、本発明は、本発明の精製されたストレスタンパク質／ペプチド複合体富化調製物でパルス的刺激を受けた（ｐｕｌｓｅｄ）ことがある樹状細胞（ＤＣ）などの細胞性ワクチンの調製のための組成物を提供する。このようなパルス的刺激を受けた樹状細胞を被験者に投与することは、ストレスタンパク質／抗原細胞複合体に向けられるＴ細胞介在性応答を生じることになる。このような治療は、癌性状態または悪性状態を有する被験者を処置するときに、特に有効である可能性がある。このような実施形態では、典型的には、当該ストレスタンパク質／ペプチド複合体は癌性細胞に由来する。
【００４９】
特定の実施形態では、本発明のワクチン組成物は、免疫応答を誘導するための組成物、または免疫応答を引き出すための組成物で置き換えてもよく、これらの組成物は、典型的には、本願明細書に記載されるワクチン組成物の中に提供される免疫原決定基と同じ免疫原決定基を含む。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ＢＣＧバクテリア細胞可溶化液からのタンパク質複合体の精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（Ａ）ならびにウエスタンブロット法によるＨｓｐ７１およびＨｓｐ６５タンパク質についてのこれらの試料の分析（Ｂ）を示す。Ｖ１は、ＢＣＧ由来の元の高速回転可溶化液であり、これをさらに処理してＶ２、つまり従来の等電点電気泳動法を使用して精製されたＨｓｐＣ、およびＶ３、つまり本発明の第１の方法を使用して精製されたＨＥＰが得られる。
【図２】元の可溶化液（ＬＳＳ）および従来の等電点電気泳動法（ＩＥＦ）を使用して単離されたＨｓｐＣと比較して、本発明の第１の方法を使用してＢＣＧから単離されたＨＥＰ（ＩＥＸ）の免疫原性を示す。
【図３】段階的塩勾配によって溶出された、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ナイセリア・メニンギティディス、髄膜炎菌）由来のタンパク質複合体の精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（Ａ）ならびにウエスタンブロット法によるＨｓｐ７０、Ｈｓｐ６５およびＰｏｒＡタンパク質についてのこれらの試料の分析（Ｂ）を示す。
【図４】従来の等電点電気泳動法を使用してＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ナイセリア・メニンギティディス、髄膜炎菌）から単離されたＨＥＰ（ＩＥＦ  ＨｓｐＣ）と比較して、本発明の等電点クロマトグラフィベースの精製方法を使用してＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ナイセリア・メニンギティディス、髄膜炎菌）から単離されたＨＥＰ（ＩＥＣ  ＨｓｐＣ）の免疫原性を示す。両者のＨｓｐＣは、異種株に対して、現在の外膜小胞ワクチン（Ｈ４４／７６  ＯＭＶ）よりも有意に良好なオプソニン化活性を示したが、ＩＥＣ  ＨｓｐＣは、ＩＥＦ  ＨｓｐＣよりも良好な系株間免疫原性を示した。
【図５】図５Ａは、ＡＤＰ  ＋  二価の陽イオンの存在下で精製されたＢＣＧバクテリア細胞可溶化液から得たＨＥＰのウエスタンブロット解析を示す。レーン１は、クーマシーブルーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し、他方、レーン２〜４は、それぞれ、ウエスタンブロットによるＨｓｐ６５、Ｈｓｐ７１およびＡｇ８５の認識を示す。図５Ｂは、二価の陽イオン（ＢＣＧ  ００１／０９）、＋  ＡＤＰ（ＨｓｐＣ  Ｖａｃ）またはＡＴＰ（ＢＣＧ  ００２／０９）の存在下で精製されたＢＣＧバクテリア細胞可溶化液から得たＨＥＰのクーマシーブルーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図６】図６Ａは、ＢＣＧから単離されたＨＥＰの免疫原性を示す。特にこの図は、ＡＤＰ  ＋  二価の陽イオンの不存在（ＩＥＣ（２  ｖａｃｃｓ）またはＡＤＰ  ＋  二価の陽イオンの存在（ＩＥＣ（２ｖａｃｃｓ）＋ＡＤＰ／Ｍｇ２＋）のいずれかで、ＢＣＧバクテリア細胞可溶化液から単離されたＨＥＰワクチンによって誘導される細胞介在性免疫を、生ＢＣＧでのワクチン接種（ＢＣＧ  Ｗｋ  ８）およびＨｓｐＣ追加免疫（ｂｏｏｓｔ）で予備刺激したＢＣＧ（ＢＣＧ／ＩＥＣ）と比較して示す。図６Ｂは、ＢＣＧから単離されたＨＥＰの免疫原性を示す。特にこの図は、ＡＤＰおよび二価の陽イオンの存在下（Ｖ１）、ＡＴＰおよび二価の陽イオンの存在下（Ｖ２）または二価の陽イオン単独の存在下（Ｖ３）のいずれかで、ＢＣＧバクテリア細胞可溶化液から単離されたＨＥＰワクチンによって誘導されるＴｈ１優位型の（ｂｉａｓｅｄ）体液性免疫、ならびにＨｓｐＣワクチン（ＢＣＧおよびＶ１）で追加免疫することによる、現在の生ＢＣＧワクチン（ＢＣＧ）への抗体応答の有意な増進を示す。
【図７】図７Ａは、生ＴＢで抗原投与されたＨＥＰで免疫化された動物における肺コロニー数の減少を示す。動物は、陰性対照としての生理食塩水、生ＢＣＧ細菌（ＢＣＧ）、ＡＤＰ  ＋  二価の陽イオンの不存在下（ＩＥＣ）もしくはＡＤＰ  ＋  二価の陽イオンの存在下（ＩＥＣ）のいずれかでＢＣＧバクテリア細胞可溶化液から単離されたＨＥＰで免疫化されたか、または生ＢＧＣで予備刺激しかつ本発明の改善された方法によって単離されたＨＥＰで追加免疫された（ＢＣＧ＋ＩＥＣ）。図７Ｂは、ＨＥＰで免疫化または追加免疫されかつ生ＴＢで抗原投与された動物における肺コロニー数の減少を示す。動物は、陰性対照としての生理食塩水、生ＢＣＧワクチン（ＢＣＧ）、ＡＤＰ  ＋  二価の陽イオン（Ｖ１）、二価の陽イオン単独（Ｖ３）もしくは二価の陽イオン  ＋  ＨｓｐＣ複合体を崩壊させるためのＡＴＰ（Ｖ２）の存在下でＢＣＧバクテリア細胞可溶化液から単離されたＨＥＰで免疫化されたか、またはＢＣＧで予備刺激されかつ当該ＨＥＰワクチンで追加免疫された（ＢＣＧ  ＋  Ｖ１）。
【図８】ＡＤＰおよび二価の陽イオンの不存在下（レーン１〜３）またはＡＤＰおよび二価の陽イオンの存在下（レーン４〜６）のいずれかでＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ナイセリア・メニンギティディス、髄膜炎菌）から精製されたＨＥＰにおける、クーマシーブルーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（レーン１、４）およびＨｓｐ６０およびＨｓｐ７０のウエスタンブロット解析を示す。
【図９】段階的塩勾配によって溶出された、ＣＨＯ細胞由来のＨＥＰの精製のクーマシーブルーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（Ａ）ならびにウエスタンブロット法によるＨｓｐ７０（Ｂ）およびＨｓｐ６０（Ｃ）タンパク質についてのこれらの試料の分析を示す。レーン１：Ｍｗマーカー、レーン２：素通り画分、レーン３：洗浄、レーン４：１５０ｍＭ溶出、レーン５：１５０ｍＭ溶出、レーン６：２５０ｍＭ溶出、レーン７：２５０ｍＭ溶出、レーン８：３５０ｍＭ溶出、レーン９：３５０ｍＭ、レーン１０：５００ｍＭ溶出、レーン１１：５００ｍＭ溶出、レーン１２：１Ｍ溶出。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本発明は、供給源混合物、典型的には細胞可溶化液からの、ペプチドまたはペプチド断片と複合体を形成しているストレスタンパク質を含む複合体の混合物の改善された精製方法を提供する。本発明の改善された方法は、精製方法論においてカオトロープ、界面活性剤および両性電解質（アンフォライン）などの化学物質を使用する必要がなく、イオン交換ベースの方法を使用して精製されることになるタンパク質複合体を提供する。医薬調剤の中に外来性の成分が存在するとストレスタンパク質／ペプチド複合体の不安定性および解離が引き起こされ、このことでストレスタンパク質複合体が免疫原性がより低いものになる可能性があるので、医薬調剤の中に外来性の成分が存在することは一般に望ましくないため、このような方法は有利である。従って、本発明の方法を使用して得られる精製された複合体は、当該ワクチン組成物が投与される被験者において増進された免疫応答を引き出す改善されたワクチン調製物を生産するために使用することができる。さらには、ＡＴＰは、ストレスタンパク質／ペプチド複合体の解離を引き起こすことが知られている。しかしながら、ＡＴＰの不存在下では、洗浄剤および７Ｍ  Ｕｒｅａなどのカオトロピック剤がＨｓｐＣの精製において使用されるときであっても、ＨｓｐＣは、一般に、非常に安定であると考えられている。本発明者らは、驚くべきことに、従来の等電点電気泳動法（ＩＥＦ）などの精製技術を使用して得られる類似の複合体よりも免疫原性であるＨｓｐＣを得るための精製の際に、ストレスタンパク質複合体の安定化の必要性を特定した。本発明者らは、マグネシウム塩などの少なくとも１つの二価の陽イオンだけでなく、任意にアデノシン二リン酸（これは、ストレスタンパク質複合体の解離を最小にする濃度で存在する当該バッファーの中に存在する）もが当該バッファーの中に存在することに起因して、ストレスタンパク質複合体の解離を防ぐ改善されたイオン交換クロマトグラフィ方法論を提供した。安定なストレスタンパク質複合体の存在、および異なる種類のストレスタンパク質の混合物の提供によって、ワクチン組成物の中で免疫原決定基として使用することができ、かつ当該技術分野で公知の方法を使用して精製されたストレスタンパク質複合体によって引き出された免疫反応に勝って、増進された免疫応答を引き出すであろう混合物が提供される。
【００５２】
本発明の方法は等電点電気泳動法などの、ストレスタンパク質複合体の精製のためのこれまで使用されたタンパク質精製技術よりも大きい最大生産量を有する精製方法を提供し、そのため、このような複合体を含有するワクチンを大規模に、商業的に実現可能に、費用効率が高く生産することが可能になりうるという点で、本発明の方法は、さらに有利である。
【００５３】
さらには、本発明者らは、驚くべきことに、本発明の方法を使用して精製されるストレスタンパク質複合体は、従来からの等電点電気泳動法（ＩＥＦ）などの精製技術を使用して得られる類似の複合体よりも、免疫原性がより高いということを特定した。本発明の改善された方法は、増進された免疫を示すＨＥＰを与える特定のバッファー組成および条件を使用して精製されることになるタンパク質複合体を提供する。従って、本発明の方法により得られるＨｓｐＣ複合体は、当該技術分野で公知の標準的な精製方法を使用して精製されたＨｓｐＣ複合体よりも免疫原性が高く、改善されたワクチン調製物を製造するために使用することができる。
【００５４】
供給源混合物
典型的には、本発明のストレスタンパク質複合体は、供給源混合物から精製または単離される。特定の実施形態では、この供給源混合物は、少なくとも１つのストレスタンパク質／ペプチド断片複合体（精製が所望される）および１以上の混入物質を含む混合物である。この供給源混合物の中に存在する混入物質の非限定的な例としては、ストレスタンパク質またはストレスタンパク質複合体以外の宿主細胞タンパク質、宿主細胞代謝産物、宿主細胞の構成的タンパク質、核酸、内毒素、化学的生成物関連の混入物質、脂質、培地添加剤および培地誘導体を挙げてもよい。
【００５５】
特定の実施形態では、この供給源混合物はタンパク質性の混合物であるか、または細胞可溶化液、もしくは細胞ホモジネートに由来する。特定の実施形態では、この細胞可溶化液またはホモジネートは、原核細胞、典型的には病原性原核細胞に由来し、この原核細胞は細胞内または細胞外の病原性バクテリアであってもよい。特定のさらなる実施形態では、この細胞可溶化液は、原核細胞に感染した細胞由来であってもよい。さらなる実施形態では、この細胞可溶化液またはホモジネートは、真核細胞、例えば病原体、例えば原核生物病原体に感染した真核細胞に由来する。特定の実施形態では、この細胞可溶化液またはホモジネートは、腫瘍細胞、癌性の細胞塊もしくは組織、または生検に由来する細胞に由来する。特定の実施形態では、この細胞は、細胞培養液由来の細胞であり、この細胞は、形質転換されまたは形質移入される。特定のさらなる実施形態では、当該細胞可溶化液またはホモジネートは、宿主細胞または病原生物から、または病原生物によって感染した細胞から直接得ることができる。この病原生物は、（ｉ）ウイルス、例えば、インフルエンザ、パピローマウイルス、単純ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス（Ａ型、Ｂ型もしくはＣ型）、ＨＩＶ、麻疹など、（ｉｉ）細胞内原虫、例えばトリパノソーマ、または（ｉｉｉ）原核生物、特に細胞内細菌、例えばＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｒａ（マイコバクテリウム）種またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ（ナイセリア）種の細菌に感染した細胞、からなる群から選択されてもよいが、これらに限定されない。本発明の方法を使用して精製することができる供給源混合物のさらなる例としては、回収された細胞培養液流体、細胞培養液上清および馴化（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）細胞培養液上清が挙げられる。さらには、この細胞可溶化液は、腫瘍細胞由来であることができる。
【００５６】
この供給源混合物が細胞可溶化液に由来するか、または細胞可溶化液から構成される実施形態では、その可溶化液は、（ｉ）超音波処理、キャビテーション、凍結−解凍サイクル、細胞ホモジナイザー（Ｆｒｅｎｃｈプレス、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーもしくはモーター駆動のガラス／TEFLON（登録商標）ホモジナイザーなど）の使用などの機械的手段；（ｉｉ）洗浄剤を使用する細胞溶解；または（ｉｉｉ）必要に応じて細胞を低張性バッファーまたは高張性バッファーと接触させることによる浸透圧溶解が挙げられる（これらに限定されない）、任意の適切な当業者に公知の手段によって得てよい。供給源混合物を製造するために細胞溶解が使用される特定の実施形態では、プロテイナーゼ阻害剤がその供給源混合物にさらに添加されてもよい。
【００５７】
供給源混合物がホモジナイズされた細胞調製物（細胞可溶化液または組織試料など）に由来する特定の実施形態では、そのホモジネートは、少なくとも１回、例えば１０，０００ｇで３０分間、遠心分離されてもよい。次いで上清を集めてさらなる遠心分離にかけることができ、または本願明細書に記載されるイオン交換ベースの方法論を使用する精製のために調製することができる。特定のさらなる実施形態では、この遠心分離工程は、濾過工程によって置き換えられてもよいし、または濾過工程によって補完されてもよい。
【００５８】
特定の実施形態では、当該供給源混合物は、タンパク質のタンパク質性の混合物、典型的には複数のタンパク質から構成される溶液である。特定のさらなる実施形態では、この供給源混合物は、癌性細胞、病原生物、病原生物に感染した細胞、または病原生物、もしくは病原生物に感染した細胞を含む細胞培養液に由来する細胞可溶化液である。
【００５９】
特定の実施形態では、本発明の方法は、タンパク質複合体を天然のまたは生合成の源から抽出、精製および／または入手するために使用されてもよい。特定のさらなる実施形態では、この方法は、合成のまたは組み換えのストレスタンパク質複合体を細胞培養液または他のタンパク質混合物から精製するために使用されてもよい。
【００６０】
特定の実施形態では、当該精製された複合体は、溶出物分画などの少なくとも１つの分画の内に存在する。典型的には、この少なくとも１つの分画は、１以上のストレスタンパク質／ペプチド複合体を含む。この分画は、精製された産物または精製産物と呼ばれてもよく、そしてさらに熱ショックタンパク質／抗原ペプチド複合体（ＨｓｐＣ）富化調製物（ＨＥＰ）と呼ばれることがある。
【００６１】
理論に結び付けられることは望まないが、本発明者らは、癌性細胞、病原細胞、病原生物に感染した細胞、または原核細胞もしくは真核細胞であって、その原核細胞もしくは真核細胞が、癌性細胞に、または宿主において感染症を引き起こす病原体に由来する異種タンパク質を発現するように遺伝子組み換えされており、その異種タンパク質は被験者に投与されたときに異種タンパク質に対して免疫応答が誘発される（ｍｏｕｎｔｅｄ）ようにする原核細胞もしくは真核細胞に由来するストレスタンパク質／抗原ペプチド断片複合体を免疫原決定基として含むワクチン組成物を投与される被験者において増進された免疫応答が引き出されうるということを特定した。従って、特定の実施形態では、この精製された産物は、典型的には、抗原ペプチド／熱ショックタンパク質複合体の混合物を含む。
【００６２】
ストレスタンパク質
特定の実施形態では、このストレスタンパク質複合体は、ペプチド断片と複合体を形成している熱ショックタンパク質を含む熱ショックタンパク質複合体（ＨｓｐＣ）であることができる。
【００６３】
特定の実施形態では、この熱ショックタンパク質は、精製されることになる細胞可溶化液に由来するいずれの適切な熱ショックタンパク質であってもよい。特定の実施形態では、この熱ショックタンパク質は、ｈｓｐ２０−３０ｋＤ；ｈｓｐ４０；ｈｓｐ６０；ｈｓｐ７０；ｈｓｐ９０；およびｈｓｐ１００を含む（が、これらに限定されない）群のファミリーのうちのいずれか１つから選択されてもよい。特定のさらなる実施形態では、このストレスタンパク質は、シャペロンタンパク質として分類されるタンパク質であってもよい。このようなタンパク質として、限定はされないが、以下からなる群から選択されるタンパク質を挙げてもよい：ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ｈｓｐＸ、ａｃｒ２、ＡＡＡ＋、ｃｌｐＡ／Ｂ、ＨｔｐＧ、ＴＲＩＣ、ＣＣＴ、ＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、カルレチクリン（ｃａｌｒｅｃｔｉｃｕｌｉｎ）、ｈｓｐ４０、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ７２、ｈｓｐ９０、ｇｒｐ９４、ｇｒｐ７５、ＢｉＰ／ｇｒｐ７８、ｇｒｐ７５／ｍｔ、ｇｐ９６および低分子（ｓｍａｌｌ）ｈｓｐ。
【００６４】
特定の実施形態では、当該標的ストレスタンパク質複合体は、ストレスタンパク質遺伝子を構成的に発現し、かつ／または抗原ペプチドもしくはペプチド断片などの異種タンパク質を発現するように遺伝子組み換えされた宿主細胞由来の熱ショックタンパク質／抗原ペプチド断片複合体を含む。特定のさらなる実施形態では、当該細胞は、異種遺伝子を発現する宿主細胞、例えば注目する抗原遺伝子を含むバキュロウイルスベクター構築物に感染した昆虫細胞であってもよい。なおさらなる実施形態では、当該細胞は、ヒトまたは動物被験者由来の癌性細胞であってもよい。
【００６５】
複合体の混合物が与えられる特定の実施形態では、これは、１つの特定のファミリー、例えばｈｓｐ７０またはｈｓｐ６０ファミリーの熱ショックタンパク質を含んでもよいが、その混合物が異なるファミリーに由来する異なる熱ショックタンパク質複合体を含むことが好ましい。本発明の方法は、（抗原）ペプチドまたはペプチド断片の個性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、分子量またはサイズの如何によらず、（抗原）ペプチド断片と複合体を形成している熱ショックタンパク質を含むすべての複合体の精製方法を提供することになろう。
【００６６】
特定のさらなる実施形態では、この熱ショックタンパク質／抗原ペプチド複合体（ＨｓｐＣ）富化調製物（ＨＥＰ）は、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ６５、ｈｓｐ７０およびｈｓｐ９０などの異なるストレスタンパク質ファミリーまたはクラス由来の熱ショックタンパク質を含み、このファミリーは、本発明の方法を使用して混合物として同時精製される。
【００６７】
特定のさらなる実施形態では、当該熱ショックタンパク質／抗原ペプチド複合体（ＨｓｐＣ）富化調製物（ＨＥＰ）は、特定の分子量の熱ショックタンパク質／ペプチド断片複合体であってもよい。特定の実施形態では、このストレスタンパク質複合体は、５０ＫＤａ〜９００ＫＤａの範囲の分子量を有する。
【００６８】
抗原ペプチド断片
特定の実施形態では、ストレスタンパク質に結合されてストレスタンパク質複合体（ＨｓｐＣ）を形成するポリペプチドは、ペプチド断片である。つまり、このペプチド断片は、より大きいポリペプチドまたはタンパク質の断片である。典型的には、このペプチドは、抗原ペプチドである。つまり、当該ペプチドが投与される宿主において、このポリペプチドに対して炎症促進反応が媒介されるであろう。このペプチドまたは抗原ペプチドは、当該ストレスタンパク質複合体が投与される宿主において、そのペプチドまたは抗原ペプチドに対してＴ細胞介在性（細胞介在性）または抗体介在性（体液性）免疫応答が惹起されるようにするのに、適切であるべきである。典型的には、このポリペプチドは、免疫応答が所望される病原体、または病原細胞に感染した細胞に由来する。特定のさらなる実施形態では、このポリペプチドは、悪性細胞もしくは癌性細胞、または悪性細胞もしくは癌性細胞を含有する細胞可溶化液に由来し、このポリペプチドまたはペプチド断片は腫瘍特異的抗原である。
【００６９】
特定の実施形態では、このペプチドは、上記ストレスタンパク質と、非共有結合的に複合体を形成している。特定のさらなる実施形態では、当該ペプチドは、上記ストレスタンパク質と、共有結合によって複合体を形成している。
【００７０】
特定の実施形態では、このペプチド断片は、典型的には宿主において感染症を引き起こす病原生物由来の抗原ペプチド断片である。特定の実施形態では、当該病原細胞は、グラム陽性バクテリアまたはグラム陰性バクテリアなどの原核細胞、または細胞内もしくは細胞外の細菌性病原体であってもよい。特定のさらなる実施形態では、この病原体は、ウイルス性病原体、またはウイルス性病原体由来のペプチド断片である。特定のさらなる実施形態では、この病原体は、原虫、寄生生物または真菌（酵母など）であってもよい。
【００７１】
特定の実施形態では、この抗原ペプチドが由来する病原細胞は、属Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（エシェリキア、大腸菌類）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ストレプトコッカス、連鎖球菌）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（スタフィロコッカス、ブドウ球菌）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ（ボルデテラ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（コリネバクテリウム）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（マイコバクテリウム）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（ナイセリア）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ（ヘモフィルス）、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ（アクチノマイセテス、放線菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ（ストレプトマイセテス）、Ｎｏｃａｒｄｉａ（ノカルジア）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ（エンテロバクター）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ（エルシニア）、Ｆａｎｃｉｓｅｌｌａ（フランシセラ）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ（パスツレラ）、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ（モラクセラ）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ（アシネトバクター）、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ（エリシペロスリクス）、Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ（ブランハメラ）、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ（アクチノバチルス）、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ（ストレプトバチルス）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ（リステリア）、Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（カリマトバクテリウム）、Ｂｒｕｃｅｌｌａ（ブルセラ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（バチルス）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（クロストリジウム）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ（トレポネーマ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（サルモネラ）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ（クレブシエラ）、Ｖｉｂｒｉｏ（ビブリオ）、Ｐｒｏｔｅｕｓ（プロテウス）、Ｅｒｗｉｎｉａ（エルウィニア）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ（ボレリア）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ（レプトスピラ）、Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ（スピリルム）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ（カンピロバクター）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ（赤痢菌）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ（レジオネラ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（シュードモナス）、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ（エロモナス）、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ（リケッチア）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ（クラミジア）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ（ボレリア）およびＭｙｃｏｐｌａｓｍａ（マイコプラズマ）のメンバーからなる群から選択される（これらに限定されない）原核生物であってもよい。
【００７２】
特定の実施形態では、上記抗原ペプチド断片は、ウイルスペプチドであってもよい。ペプチドが由来しうるウイルスは、以下からなる群から選択されてもよいが、これらに限定されない：ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）、任意の他の肝炎関連ウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、とりわけ高リスク型の発癌性ヒトパピローマウイルスの各種、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）（ヒトヘルペスウイルス−８（ＨＨＶ−８）としても公知）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（いずれかのサブタイプ）、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）および関連する呼吸器ウイルス、インフルエンザウイルス（鳥インフルエンザおよびブタインフルエンザ、特にこれらがヒトへの伝染性を有する場合、を含む）、コロナウイルス（ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）を含む）、ライノウイルス、アデノウイルス、ＳＩＶ、ロタウイルス、ヒトパピローマウイルス、アルボウイルス、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、パポーバウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、水痘ウイルス、ハンタウイルスおよび任意の新興ウイルス、特にエボラウイルス、マールブルグウイルス、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）、セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ）、リフトバレー熱ウイルス（ＲＶＦＶ）ならびにＢｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ（ブニヤウイルス科）の他のメンバー。
【００７３】
抗原ペプチド断片が原虫性の病原体に由来する特定の実施形態では、その原虫は、典型的には、リーシュマニアまたはトリパノソーマなどの細胞内原虫であってもよい。
【００７４】
抗原ペプチド断片が酵母または真菌に由来する実施形態では、この真菌は、以下を含む群から選択される属に由来してもよい：Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ（アクレモニウム属）、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ（アルテルナリア属）、Ａｍｙｌｏｍｙｃｅｓ（アミロマイセス属）、Ａｒｔｈｏｄｅｒｍａ（アルトロデルマ科）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（アスペルギルス属）、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ（アウレオバシジウム属）、Ｂｌａｓｔｏｃｈｉｚｏｍｙｃｅｓ（ブラストシゾマイセス属）、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ（ボトリチス属）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ（クラドスポリウム族）、Ｃｒｙｔｏｃｏｃｃｕｓ（クリトコッカス属）、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ（ディクチオステリウム属）、Ｅｍｍｏｎｓｉａ（エモンシア属）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ（フザリウム属）、Ｇｅｏｍｙｃｅｓ（ジオマイセス属）、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ（ゲオトリクム属）、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ（ミクロスポルム属）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ（アカパンカビ属）、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ（ペシロマイセス属）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ（アオカビ属）、Ｐｉｌａｉｒａ（ピライラ属）、Ｐｉｔｙｒｏｓｐｏｒｕｍ（ピチロスポルム属）、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ（クモノスカビ属）、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ（ロドトルラ属）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（酵母菌属、サッカロマイセス属）、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ（スタキボトリス属）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ（白癬菌属、トリコフィトン属）、Ｔｒｉｃｈｏｐｏｒｏｎ（トリコスポロン属）、またはＹａｒｒｏｗｉａ（ヤロウイア属）。
【００７５】
特定の実施形態では、この抗原ペプチド断片は、腫瘍細胞に由来してもよい。このような実施形態では、典型的には、抗原ペプチド断片は、腫瘍特異的抗原または腫瘍特異的抗原の断片である。特定の実施形態では、腫瘍細胞は、急性骨髄性白血病および慢性骨髄性白血病（ＡＭＬ、ＣＭＬ）、濾胞性非ホジキンリンパ腫、悪性黒色腫、ヘアリー細胞白血病、多発性骨髄腫、カルチノイド症候群ならびに肝転移およびリンパ節転移を伴うカルチノイド腫瘍）、ＡＩＤＳ関連カポジ肉腫、腎細胞癌、大腸腺癌、頭頸部扁平上皮癌を含む（これらに限定されない）群から選択される癌性状態または悪性状態に由来してもよい。さらには、いくつかの感染症は、その感染症が感染した被験者において癌を引き起こす可能性があるということは当業者にとっては周知であろう。従って、ポリペプチドがある感染症に由来する、本発明の方法論に従って精製された複合体の投与は、癌を処置または予防するために使用することができる。例えば、ヒトパピローマウイルスに由来するポリペプチドを含む複合体は、適切な被験者において子宮頸癌を処置または予防するために使用することができる。
【００７６】
特定のさらなる実施形態では、上記ストレスタンパク質と複合体を形成している抗原ペプチド断片は、組み換え手段によって、例えば、ベクターまたは類似の構築物の宿主細胞の中への導入によって宿主細胞の中で発現される異種のタンパク質またはペプチド断片である。特定の実施形態では、異種抗原は、細菌性病原体、ウイルス性病原体に由来してもよいし、または腫瘍特異的抗原である。
【００７７】
特定のさらなる実施形態では、宿主細胞は、細胞内病原体に感染した真核細胞であってもよい。このような実施形態では、当該ストレスタンパク質複合体は、細胞内病原体に由来する抗原ペプチド断片と複合体を形成している宿主細胞に由来する熱ショックタンパク質を含んでもよいし、または、ともに細胞内病原体に由来するストレスタンパク質およびペプチド断片を含んでもよい。
【００７８】
本発明の特定の実施形態では、当該供給源混合物は、ストレスタンパク質、典型的には熱ショックタンパク質の（恒常的ではなく）誘導された発現を引き起こすのに適切である刺激を誘導するストレスに曝露されたことがある細胞集団から製造される細胞可溶化液である。特定の実施形態では、このストレスを誘導する刺激は、以下を含む（が、これらに限定されない）群から選択される：熱ショック、浸透圧ショック、圧力および栄養欠乏。特定の他の実施形態では、ストレスの誘導は、熱ショックタンパク質遺伝子の恒常的発現を引き起こすための細胞の遺伝子修飾によって成し遂げられる。１つのこのような実施形態では、遺伝子修飾は、微生物病原体の中のｈｓｐＲおよびＨｒｃＡ抑制遺伝子などの、ストレスタンパク質の発現を抑制する抑制遺伝子の不活化である。他のこのような遺伝子修飾は、国際公開第２００２／０２００４５号パンフレットおよびその中で参照される引用文献に記載されている。
【００７９】
ストレスタンパク質の非遺伝子的誘導のために、ストレスタンパク質を誘導するための最適の条件は、ストレス刺激の変化の効果が、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９９７に記載されている技術などの従来の技術を使用してストレスタンパク質産生のレベルに関して評価される、単純な試行錯誤によって容易に決定することができる。他のこのような条件は、国際公開第２００１／０１３９４４号パンフレットおよびその中で参照される引用文献に記載されている。
【００８０】
１つの実施形態では、本発明の方法を使用して精製される少なくとも１つの熱ショックタンパク質／抗原ペプチド複合体（ＨｓｐＣ）富化調製物（ＨＥＰ）は、ｈｓｐＣ６５、ｈｓｐＣ７０、ｈｓｐＣ９０およびｈｓｐＣ１００が挙げられる（しかし、これらに限定されない）熱ショックタンパク質／抗原ペプチド断片複合体（ＨｓｐＣ）を含む。
【００８１】
イオン交換条件
本発明の方法は、イオン交換クロマトグラフィに基づく方法論を使用してタンパク質を分離することに基づく。しかしながら、本願明細書中で記載されている方法は、典型的にはバッファー溶液の中に存在し、タンパク質構造および完全性に悪影響を及ぼす可能性があり、タンパク質複合体の解離または部分的解離を引き起こす可能性があり、または精製された分画の中に存在している混入物質を生じる可能性がある、このような化学物質の除去によって、標準的なイオン交換クロマトグラフィプロトコルおよび当該技術分野で現在使用されている手順よりも改善された。それゆえ、当該方法は、ストレスタンパク質複合体を含む富化されたまたは精製された調製物を製造するための改変されたイオン交換方法論を用いる。このストレスタンパク質複合体を含む富化されたまたは精製された調製物は、ＨＥＰ（ＨｓｐＣ富化調製物）と呼ばれることもある。
【００８２】
イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）は、試料混合物（細胞可溶化液）の中に存在するタンパク質と使用される樹脂またはマトリクス上に固定化された電荷との間の電荷−電荷相互作用に依拠する。イオン交換クロマトグラフィは、正に帯電したイオンが負に帯電した樹脂に結合する陽イオン交換クロマトグラフィ、またはタンパク質結合イオンが負電荷を有し、かつ固定化された官能性マトリクスまたは樹脂が正電荷を有する陰イオン交換クロマトグラフィの形態をとってもよい。試料混合物の中に存在するタンパク質が樹脂に結合されると、カラムを出発バッファーと平衡化するために、カラムは洗浄される。典型的には、このバッファーは、低イオン強度である。本発明の方法では、本発明者らは、少なくとも１つの二価の陽イオン（マグネシウムまたはマンガンなど）を含むバッファーの使用を採用する。この二価の陽イオンは、典型的には、塩形態（塩化マグネシウムなど）で与えられる。このバッファーは、アデノシン二リン酸をさらに含んでもよく、このアデノシン二リン酸は、ストレスタンパク質／ペプチド複合体の解離を顕著に抑制するであろうレベルで、バッファーの中に存在する。このようなバッファーはストレスタンパク質複合体の構造安定性を保護すると、本発明者らは特定した。なぜなら、このバッファーは、精製プロセスの間のストレスタンパク質−ペプチド複合体の解離を防止するからである。本発明の方法は、その後、結合されたストレスタンパク質複合体は、典型的には、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）または塩化ナトリウムベースの溶液などの第２のバッファー溶液の使用を通して、カラムの中に存在する塩勾配を変えることにより、分画の中に溶出されるということをもたらす。溶出された分画は集められ、異なるｐＩ（等電点）で溶出された画分は、異なるストレスタンパク質複合体を含有する。所望のタンパク質複合体のｐＩが特定されたときには、注目する複合体を含有する溶出された分画は、容易に特定可能であろう。典型的には、本発明の方法論は、ストレスタンパク質複合体の精製された（または単離された）混合物を生じるであろう。１つのファミリー（ＨＳＰ７０など）のストレスタンパク質複合体の回収を生じる従来からのイオン交換クロマトグラフィベースの精製方法とは異なり、本発明の方法論は、異なるストレスタンパク質の混合物が存在する精製された産物（単離された産物と呼ばれることもある）を与える。例えば、当該細胞可溶化液が病原体に感染した真核細胞に由来する場合、得られた精製された産物は、ストレスタンパク質がＨＳＰ６０またはＨＳＰ７０の少なくとも２つであるストレスタンパク質複合体を含んでもよい。この細胞可溶化液内で見出されるいずれの他の熱ショックタンパク質も、精製された産物の中に存在してよい。さらには、細胞可溶化液の調製の際、この真核細胞を感染させている病原体も可溶化される場合、本発明の方法は、さらに、病原体由来のストレスタンパク質／ペプチド複合体が、精製された産物の中に存在することを可能にする。例えば、この精製された産物は、ストレスタンパク質複合体の混合物を含んでもよく、このストレスタンパク質は、ＨＳＰ４０、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ８４、ＨＳＰ９０、Ｄｎａ−ＫおよびＤｎａ−Ｊを含む群から選択されてもよい。
【００８３】
等電点（ｐＩ）は、本発明のタンパク質複合体などの特定の分子が正味の電荷を有しないｐＨである。タンパク質またはタンパク質複合体のｐＩ値は、その一次配列から、または従来の等電点電気泳動法技術および市販の設備を使用して実験的に決定することができる。タンパク質複合体のｐＩ値は、特定のｐＨでのそのタンパク質の溶解度に影響を及ぼすために使用することができる。タンパク質分子は、酸性官能基および塩基性官能基の両方を含有する。さらに、アミノ酸は、電荷が正、負または中性でありうる。これらの因子は、タンパク質にその全体電荷を与える。ｐＩよりも低いｐＨでは、タンパク質は正味の正電荷を保有する。ｐＩよりも高いｐＨでは、タンパク質は正味の負電荷を保有する。タンパク質は、ｐＩに相当するｐＨで、塩溶液に対する最小の溶解度を有する。これは、タンパク質複合体が溶液から沈殿するということにつながる可能性がある。それゆえ、本発明の方法に従って塩勾配を変えるとき、ｐＨは初期のｐＨから下がらないことが望ましい。なぜなら、ｐＨが初期のｐＨから下がると、タンパク質複合体が溶液から沈殿するということを生じる可能性があるからである。それゆえ典型的には、ひとたびｐＨが設定されると、ｐＨは増加しない。特定の実施形態では、塩勾配の増加は、ｐＨの上昇を生じる。
【００８４】
従って、特定の実施形態では、当該方法は、例えば塩化ナトリウムを含むバッファー溶液を使用することにより、カラムマトリクスで使用されるバッファー溶液の塩濃度を変えることを含む。典型的には、バッファーの塩勾配のこの変動により、当該ストレスタンパク質複合体は、典型的には塩濃度の変化と対応する分画の中で溶出されるようになる。従って、特定の実施形態では、溶出バッファーの段階的な添加は、塩勾配をもたらす。典型的には、この溶出バッファーは塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含有し、この塩勾配は、マトリクスが曝露される溶出バッファーの中の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の存在を変えることにより変えることができる。特定の実施形態では、塩化ナトリウムは、１５０ｍＭ、２５０ｍＭ、３５０ｍＭ、または５００ｍＭの濃度で、当該バッファーの中に存在してもよい。特定の実施形態では、この溶出バッファーは、バッファーの構成成分が変わるにつれて変わりうるｐＨ勾配を与える。特定の実施形態では、この溶出バッファーは、少なくとも１つの二価の陽イオン、および任意にアデノシン二リン酸を含む。
【００８５】
特定の実施形態では、ストレスタンパク質複合体は、溶出されかつｐＩ  ４〜ｐＩ  ８の範囲のｐＩを有する集められた分画の中に存在する。特定の実施形態では、精製されることになるストレスタンパク質のｐＩは、等電点電気泳動法によって最初に決定されてもよい。
【００８６】
特定の実施形態では、当該精製方法論は、尿素または類似の化合物もしくは溶液の存在下では実施されない（すなわち当該精製方法論は、尿素または類似の化合物もしくは溶液の不存在下で実施される）。特定の他の実施形態では、両性電解質、カオトロープおよび／または界面活性剤は、当該精製方法論では使用されない。特定の好ましい実施形態では、当該バッファーは、少なくとも１つの二価の陽イオンを含有し、そしてアデノシン二リン酸をさらに含有してもよい。
【００８７】
典型的には、当該方法は、（ｉ）当該供給源混合物をイオン交換マトリクスに付与する工程と、（ｉｉ）ｐＨを調整して、イオン交換マトリクスにわたる塩勾配を変える工程と、（ｉｉｉ）溶出された分画を集める工程とを含み、この分画は精製されたまたは富化されたストレスタンパク質複合体を含み、このストレスタンパク質複合体の溶出は、特定の条件下で塩勾配を変えることにより引き起こされる。特定の実施形態では、当該マトリクスは樹脂である。さらなる実施形態では、このマトリクスは膜である。典型的には、このマトリクスは荷電粒子から構成される。
【００８８】
特定の実施形態では、このイオン交換は、複合体タンパク質混合物を塩基性分画および酸性分画へと分離する働きをするイオン交換膜吸収体を使用して実施される。本発明者らは、この形態のイオン交換は、簡便で、高速で、再現性があり、かつそれゆえ一貫して高収率の安定なストレスタンパク質複合体を生成することができ、かつこの安定なストレスタンパク質複合体はその完全性を維持する方法をもたらすということを特定した。この安定なストレスタンパク質複合体がその完全性を維持することは、免疫原決定基としてストレスタンパク質−ペプチド複合体などのタンパク質成分を含む商業的な量のワクチン調製物の生産に必要とされるであろう。さらには、ストレスタンパク質複合体がワクチン組成物の調製における免疫原決定基としての使用のためのものであり、かつ当該ストレスタンパク質複合体が少なくとも１つの二価の陽イオン（そして特定の好ましい実施形態では、アデノシン二リン酸）を含むバッファーの存在下で精製される特定の実施形態で、当該複合体はより安定な状態に留まるので、つまり、この複合体は、解離して別々のストレスタンパク質およびペプチド断片となることはないので、このようなストレスタンパク質複合体は、このようなワクチンの使用によって引き出された免疫応答を媒介または増進することにおいてより優れた有用性を有するということを、本発明者らは特定した。特定の実施形態では、当該バッファーは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ＡＴＰアーゼ、カリウム、またはカリウム塩、カオトロープ、両性電解質および界面活性剤のうちの少なくとも１つを欠く。
【００８９】
１つの実施形態では、当該熱ショックタンパク質／抗原ペプチド複合体（ＨｓｐＣ）富化調製物（ＨＥＰ）は、タンパク質の完全性を維持するために、当業者に公知の任意の適切な溶出バッファーを使用してそのイオン交換クロマトグラフィ媒体から溶出させることができる。典型的には、この溶出バッファーは、本願明細書にこれまでに記載されたように、塩化ナトリウムなどの塩を含む。この溶出バッファーは、リン酸塩またはＴＲＩＳ系バッファー、酢酸塩、クエン酸塩または水素イオンバッファーをさらに含んでもよい。
【００９０】
本願明細書で使用する場合の用語「イオン交換」および「イオン交換クロマトグラフィ」は、イオン化できる注目する溶質（例えば、細胞可溶化液の中で与えられる注目するタンパク質複合体）がｐＨおよび電気伝導率の適切な条件下で、固相イオン交換材料に結合された反対の電荷を帯びたリガンドと相互作用し、その結果、注目する溶質が、電荷を帯びた化合物と、混合物中の溶質不純物または混入物質よりも多くまたは少なく非特異的に相互作用するクロマトグラフィによるプロセスを指す。この混合物の中の混入する溶質は、そのイオン交換材料のカラムから洗浄することができ、あるいはその樹脂に結合されることができるし、またはその樹脂から、注目する溶質よりも速くもしくは遅く排出されることができる。「イオン交換クロマトグラフィ」としては、具体的には、陽イオン交換、陰イオン交換、および混合モードクロマトグラフィが挙げられる。
【００９１】
特定の実施形態では、イオン交換クロマトグラフィ媒体としてはイオン交換カラムが挙げられる。典型的には、このイオン交換カラムとしては、アガロースまたはセファロース（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）大流量ベースなどの大流量ベース（ｈｉｇｈ  ｆｌｏｗ  ｂａｓｅ）が挙げられる。任意に、この大流量ベースは、動物由来原料を含まないデキストランなどの表面積拡張成分（ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｘｔｅｎｄｅｒ）を含む。適切なイオン交換媒体としては、第四級アンモニウム塩およびスルホン酸部分で誘導体化されたもの、例えばＣＡＰＴＯＱ（商標）  カラムおよびＣＡＰＴＯＳ（商標）  樹脂（ジーイー・ヘルスケア社（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ））などの陽イオン交換樹脂および陰イオン交換樹脂ならびに陽イオン交換カラムおよび陰イオン交換カラムの両方が挙げられる。さらなる実施形態では、このイオン交換クロマトグラフィ媒体としては、混合多モード用イオン交換樹脂、例えばＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣおよびＣＡＰＴＯ（商標）Ａｄｈｅｒｅカラム（ジーイー・ヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））が挙げられる。
【００９２】
特定の実施形態では、細胞可溶化液は、５０ｍＭリン酸塩バッファーｐＨ  ６．８へとバッファー交換される。特定の実施形態では、イオン交換カラムとしては、大流量ベース、好ましくはアガロース大流量ベースが挙げられる。特定の実施形態では、この大流量ベースは表面積拡張成分（例えば、動物由来原料を含まないデキストラン）、およびＱリガンド（例えば、第四級アンモニウム塩）を含む。
【００９３】
語句「イオン交換材料」は、負に帯電している固相（すなわち、陽イオン交換樹脂）または正に帯電した固相（すなわち、陰イオン交換樹脂）を指す。１つの実施形態では、電荷は、例えば、共有結合により結合することによって、１以上の電荷を帯びたリガンド（または吸着剤）を固相に取り付けることにより、与えることができる。あるいは、または加えて、電荷は、（例えば、全体として負電荷を有するシリカの場合のように）その固相の固有の特性であってもよい。
【００９４】
イオン交換クロマトグラフィが陽イオン交換クロマトグラフィである特定の実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィ工程は、スルホネート、カルボン酸、カルボキシメチルスルホン酸、スルホイソブチル、スルホエチル、カルボキシル、スルホプロピル、スルホニル、スルホキシエチルおよびオルトホスフェートを含む（が、これらに限定されない）群から選択されるリガンドが用いられる。
【００９５】
「陽イオン交換樹脂」は、負に帯電している固相であって、かつその固相にわたってまたはその固相を通って通過させた水溶液の中の陽イオンとの交換のためのフリーの陽イオンを有する固相を指す。陽イオン交換樹脂を形成するのに適切な固相に取り付けられたいずれの負に帯電したリガンド、例えば、後述するようにカルボキシレート、スルホネートなども使用することができる。市販の陽イオン交換樹脂としては、例えば、以下の基を有する陽イオン交換樹脂が挙げられるが、これらに限定されない：スルホネートベースの基（例えば、ジーイー・ヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）製のＭｏｎｏＳ、ＭｉｎｉＳ、Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｓおよび３０Ｓ、ＳＰ  セファロース（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）  ＦＡＳＴ  ＦＬＯＷ（商標）、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、トーソー（Ｔｏｓｏｈ）製のＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳＰ−６５０ＳおよびＳＰ−６５０Ｍ、バイオ・ラッド（ＢｉｏＲａｄ）製のＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓ、ポール・テクノロジーズ（Ｐａｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）製のＣｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ  Ｓ、Ｔｈｓａｃｒｙｌ  ＭおよびＬＳ  ＳＰおよびＳｐｈｅｒｏｄｅｘ  ＬＳ  ＳＰ）；スルホエチルベースの基（例えば、イーエムディー（ＥＭＤ）製のＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＥ、またはアプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製のＰｏｒｏｓ  Ｓ−１０およびＳ−２０）；スルホプロピルベースの基（例えば、トーソー（Ｔｏｓｏｈ）製のＴＳＫ  Ｇｅｌ  ＳＰ  ５ＰＷおよびＳＰ−５ＰＷ−ＨＲ、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製のＰｏｒｏｓ  ＨＳ−２０およびＨＳ  ５０）；スルホイソブチルベースの基（例えば、イーエムディー（ＥＭＤ）製のＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＯ３）；スルホキシエチルベースの基（例えば、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）製のＳＥ５２、ＳＥ５３およびＥｘｐｒｅｓｓ−Ｉｏｎ  Ｓ）；カルボキシメチルベースの基（例えば、ジーイー・ヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）製の  ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、バイオクロム・ラブズ社（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）製のＨｙｄｒｏｃｅｌｌ  ＣＭ、バイオ・ラッド（ＢｉｏＲａｄ）製のＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ＣＭ、ポール・テクノロジーズ（Ｐａｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）製のＣｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ  ＣＭ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ  Ｍ  ＣＭ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ  ＬＳ  ＣＭ、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）製のＭａｔｒｅｘ  Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ｃ５００およびＣ２００、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）製のＣＭ５２、ＣＭ３２、ＣＭ２３およびＥｘｐｒｅｓｓ  −  Ｉｏｎ  Ｃ、トーソー（Ｔｏｓｏｈ）製のＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＣＭ−６５０Ｓ、ＣＭ−６５０ＭおよびＣＭ−６５０Ｃ）；スルホン酸およびカルボン酸ベースの基（例えば、ジェイティー・ベーカー（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）製の  ＢＡＫＥＲＢＯＮＤ（商標）Ｃａｒｂｏｘｙ−Ｓｕｌｆｏｎ）；カルボン酸ベースの基（例えば、Ｊ．Ｔ  Ｂａｋｅｒ製のＷＰ  ＣＢＸ、ダウ・リキッド・セパレーションズ（Ｄｏｗ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）製のＤＯＷＥＸ  Ｍ���Ｃ−３、シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）製のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  Ｗｅａｋ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ、ＤＯＷＥＸ（商標）  Ｗｅａｋ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒ、およびＤｉａｉｏｎ  Ｗｅａｋ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓならびにイーエムディー（ＥＭＤ）製のＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＣＯＯ−）；スルホン酸ベースの基（例えば、バイオクロム・ラブズ社（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）製のＨｙｄｒｏｃｅｌｌ  ＳＰ、ダウ・リキッド・セパレーションズ（Ｄｏｗ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）製のＤＯＷＥＸ（商標）  Ｆｉｎｅ  Ｍｅｓｈ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ａｃｉｄ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｉｎ、ジェイティー・ベーカー（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）製のＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｓ、ＷＰ  Ｓｕｌｆｏｎｉｃ、ザルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）製のＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓ膜、シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）製のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ、ＤＯＷＥＸ（商標）  Ｓｔｒｏｎｇ  ＣａｔｉｏｎおよびＤｉａｉｏｎ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒ）；ならびにオルトホスフェートベースの基（例えば、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）製のｐｌ  １）。
【００９６】
望ましい場合、例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓ（ザルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）；ニューヨーク州、エッジウッド（Ｅｄｇｅｗｏｏｄ））などの陽イオン交換膜を、陽イオン交換樹脂の代わりに使用することができる。
【００９７】
イオン交換クロマトグラフィが陰イオン交換クロマトグラフィである特定の実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィ工程は、第四級アンモニウムまたはアミン、ジエチルアミン、ジエチルアミノプロピル、アミノ、トリメチルアンモニウムエチル、トリメチルベンジルアンモニウム、ジメチルエタノールベンジルアンモニウム、ポリアミンからなる群から選択されるリガンドを採用してもよい。
【００９８】
「陰イオン交換樹脂」は、正に帯電している固相であって、従ってその固相に取り付けられた１以上の正に帯電したリガンドを有する固相を指す。陰イオン交換樹脂を形成するのに適切な固相に取り付けられたいずれの正に帯電したリガンド、例えば第四級アミノ基なども、使用することができる。例えば、ＡＥＣで使用されるリガンドは、第四級アルキルアミンおよび第四級アルキルアルカノールアミン、またはアミン、ジエチルアミン、ジエチルアミノプロピル、アミノ、トリメチルアンモニウムエチル、トリメチルベンジルアンモニウム、ジメチルエタノールベンジルアンモニウム、およびポリアミンなどの第四級アンモニウムであることができる。あるいは、ＡＥＣ用に、正に帯電したリガンド、例えば上に記載されたリガンドを有する膜を、陰イオン交換樹脂の代わりに使用することができる。
【００９９】
市販の陰イオン交換樹脂としては、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製のＤＥＡＥ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、Ｐｏｒｏｓ  ＰＩ  ２０、ＰＩ  ５０、ＨＱ  １０、ＨＱ  ２０、ＨＱ  ５０、Ｄ  ５０、ジーイー・ヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）製のＭｏｎｏＱ、ＭｉｎｉＱ、Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｑおよび３ＯＱ、Ｑ、ＤＥＡＥおよびＡＮＸ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＱＡＥ  ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）およびＦＡＳＴ  Ｑ  セファロース（ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ）（商標）、ジェイティー・ベーカー（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）製のＷＰ  ＰＥＩ、ＷＰ  ＤＥＡＭ、ＷＰ  ＱＵＡＴ、バイオクロム・ラブズ社（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）製のＨｙｄｒｏｃｅｌｌ  ＤＥＡＥおよびＨｙｄｒｏｃｅｌｌ  ＱＡ、バイオ・ラッド（Ｂｉｏｒａｄ）製のＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑ、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ＤＥＡＥおよびＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｑ、ポール・テクノロジーズ（Ｐａｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）製のＣｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ  Ｑ、ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ  ＤＥＡＥ、Ｑ  ＨｙｐｅｒＺ、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ  ＭおよびＬＳ  ＤＥＡＥ、Ｓｐｈｅｒｏｄｅｘ  ＬＳ  ＤＥＡＥ、ＱＭＡ  Ｓｐｈｅｒｏｓｉｌ  ＬＳ、ＱＭＡ  Ｓｐｈｅｒｏｓｉｌ  Ｍ、ダウ・リキッド・セパレーションズ（Ｄｏｗ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）製のＤＯＷＥＸ  Ｆｉｎｅ  Ｍｅｓｈ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｂａｓｅ  Ｔｙｐｅ  ＩおよびＴｙｐｅ  ＩＩ  Ａｎｉｏｎ  ＲｅｓｉｎｓおよびＤＯＷＥＸ  ＭＯＮＯＳＰＨＥＲ  Ｅ  ７７、ｗｅａｋ  ｂａｓｅ  ａｎｉｏｎ、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）製のＭａｔｒｅｘ  Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  Ａ２００、Ａ５００、Ｑ５００、およびＱ８００、イーエムディー（ＥＭＤ）製のＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ３  Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＤＥＡＥおよびＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＤＭＡＥ、シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）製のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ｗｅａｋ  ａｎｄ  ｓｔｒｏｎｇ  ａｎｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ、ＤＯＷＥＸ  ｗｅａｋ  ａｎｄ  ｓｔｒｏｎｇ  ａｎｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ、Ｄｉａｉｏｎ  ｗｅａｋ  ａｎｄ  ｓｔｒｏｎｇ  ａｎｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ、Ｄｕｏｌｉｔｅ、トーソー（Ｔｏｓｏｈ）製のＴＳＫ  ゲル  ＱおよびＤＥＡＥ  ５ＰＷおよび５ＰＷ−ＨＲ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｓ、６５０Ｍおよび６５０Ｃ３  ＱＡＥ−５５０Ｃおよび６５０Ｓ、ＤＥＡＥ−  ６５０Ｍおよび６５０Ｃ、ならびにワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）製のＱＡ５２、ＤＥ２３、ＤＥ３２、ＤＥ５１、ＤＥ５２、ＤＥ５３、Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｉｏｎ  ＤおよびＱが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１００】
望ましい場合、陰イオン交換膜は、陰イオン交換樹脂の代わりに使用することができる。市販の陰イオン交換膜としては、ザルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）製のＳＡＲＴＯＢＩＮＤ  Ｑ（商標）、ポール・テクノロジーズ（Ｐａｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）製のＭＵＳＴＡＮＧ  Ｑ（商標）およびミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）製のＩＮＴＥＲＣＥＰＴ  Ｑ（商標）  膜が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
特定の実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィは、約ｐＨ  ５．０〜約ｐＨ  ９．０のｐＨおよび約０．５〜約５ｍＳ／ｃｍの電気伝導率で行われる。特定の実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィは、約ｐＨ  ４．０〜約ｐＨ  ９．０のｐＨおよび約０．５〜約１５ｍＳ／ｃｍの電気伝導率で行われる。特定の実施形態では、混合モードクロマトグラフィは、約ｐＨ  ４．０〜約ｐＨ  ９．０のｐＨおよび約０．５〜約１５ｍＳ／ｃｍの電気伝導率で行われる。
【０１０２】
ポリペプチドの「ｐＩ」または「等電点」は、ポリペプチドの正電荷がその負電荷と均衡するｐＨを指す。このｐＩは、種々の従来の方法論に従って、例えば、ポリペプチド上のアミノ酸残基および／またはシアル酸残基の正味電荷から算出することができるし、または等電点電気泳動法技術を使用して実験的に決定することができる。
【０１０３】
このクロマトグラフィバッファーのｐＨおよび電気伝導率は、注目するＨｓｐＣが使用されるＩＥＣ樹脂に結合されるように、選択される。溶出バッファーとしての使用に適したバッファーの例としては、リン酸塩またはＴＲＩＳ系バッファー、酢酸塩、クエン酸塩および水素イオンバッファー（Ｇｏｏｄら、１９６６  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５：４６７−４７７）を挙げてもよい。
【０１０４】
用語「溶出バッファー」は、本願明細書で使用する場合、注目するタンパク質複合体を上記樹脂から溶出させるために使用されるバッファーを指す。この溶出バッファーのｐＨおよび電気伝導率は、注目するタンパク質複合体が当該プロセスで使用されるＣＥＣ樹脂から溶出されるように、選択される。溶出バッファーとしての使用に適したバッファーの例としては、リン酸塩またはＴＲＩＳ系バッファー、酢酸塩、クエン酸塩、グリシン、ヒスチンおよびグッドバッファー（Ｇｏｏｄ  ｂｕｆｆｅｒｓ）を挙げてもよい。
【０１０５】
特定の実施形態では、この溶出バッファーは、約５０ｍＭ〜約１５００ｍＭの濃度で使用されてもよい塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）である。特定のさらなる実施形態では、この溶出バッファーは、少なくとも１つの二価の陽イオン、および特定の実施形態では、アデノシン二リン酸を含む。特定の実施形態では、このバッファーは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ＡＴＰアーゼ、カリウム、またはカリウム塩、カオトロープ、両性電解質および界面活性剤のうちの少なくとも１つ欠く。
【０１０６】
この溶出バッファーのｐＨは、約ｐＨ  ３〜約ｐＨ  １０、より好ましくはｐＨ  約ｐＨ  ４〜約ｐＨ  ９であることができる。特定の実施形態では、バッファーのｐＨは約ｐＨ  ６．８である。
【０１０７】
本発明は、本発明の方法に従って精製されるＨｓｐＣ富化可溶化液（ＨＥＬ）にさらに及ぶ。このＨｓｐＣ富化可溶化液は、ＨｓｐＣ富化分画（ＨＥＦ）またはＨｓｐＣ富化組成物（ＨＥＣ）としても知られている場合がある。従って、本発明のさらなる態様は、ワクチン組成物の調製における使用のための、本発明の方法によって精製される少なくとも１つのＨｓｐＣ富化可溶化液を提供する。典型的には、このＨｓｐＣ富化可溶化液は、本発明のイオン交換方法から得られる少なくとも１つの溶出された分画に由来する。
【０１０８】
特定の実施形態では、このＨｓｐＣ富化可溶化液は、ストレスタンパク質（熱ショックタンパク質）とポリペプチドまたはペプチド断片、特に抗原ペプチド断片との間で形成される複合体を含む。特定の実施形態では、この精製されたＨｓｐＣ富化可溶化液は、微生物宿主、原核性、ウイルス性または原虫病原体、病原体に感染した真核生物の宿主細胞に、または悪性細胞もしくは癌性細胞に由来する。好ましい実施形態では、この精製された複合体は、ストレスタンパク質の混合物を含むストレスタンパク質／ペプチド複合体であり、このストレスタンパク質は、低分子（ｓｍａｌｌ）ｈｓｐ、ｈｓｐ６５、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０およびｈｓｐ１００からなる群から選択することができる。
【０１０９】
イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）は、試料中のタンパク質と選択した樹脂上に固定化された電荷との間の電荷−電荷相互作用に依拠する。一般に、ＩＥＣは、陽イオン交換クロマトグラフィまたは陰イオン交換クロマトグラフィに細分することができる。例えば、ＣａｐｔｏＱ（商標）（正に帯電した陰イオン交換体）は、標的タンパク質複合体がｐＨ  ６．８で負に帯電していると予想されるときに利用されてもよく（表１を参照）、ＣａｐｔｏＳ（商標）（負に帯電した陰イオン交換体）は、標的タンパク質複合体がｐＨ  ６．８で正に帯電していると予想されるときに利用されてもよい。
【０１１０】
【表１】
0005778666.tif 000002
【０１１１】
さらに、プロテオーム中のタンパク質の等電点（ｐＩ）の分布は、すべての原核生物について共通し、そのタンパク質のうちのおよそ６０％がｐＩ≦７を有し、およびそのプロテオームのうちの４０％がｐＩ≧８を有する（表１を参照）ような、二峰性分布または「バタフライ効果」として表すことができる。例えば、マイコバクテリア培養液由来のストレスタンパク質複合体を使用して細胞可溶化液が生成される場合、ｐＨ  ６．８で、そのマイコバクテリアが混入したプロテオームのうちの少なくとも４０％は、ＣａｐｔｏＱ（商標）  ＩＥＣを使用して、その精製された複合体から、従ってワクチン産物からも直ちに除去されるだろうということが予想されるであろう。本発明の方法は、高性能媒体である任意の適切なイオン交換媒体を使用して実施されてもよいということを、当業者は直ちに理解するであろう。
【０１１２】
確固たるタンパク質精製戦略を開発するときに考慮されるべき重要な技術的項目としては、短いプロセス実行時間およびバッファー組成の慎重な考慮が挙げられる。本発明者らは、タンパク質複合体の精製方法を提供し、そしてそれを行う際、精製プロセスの間のタンパク質複合体のタンパク質分解、修飾または崩壊に関連する課題を克服した。免疫原性のＨｓｐＣ富化ワクチンはフリーフロー等電点電気泳動法（ＦＦ−ＩＥＦ）を用いて調製されてきたが、典型的な実行時間は４時間であり、尿素などのカオトロープを用いてタンパク質の溶解性を維持することも必要であった。このカオトロープは、巨大分子構造およびタンパク質機能の両方に対して不安定化効果を有するということが示されている。ありがたいことに、ＣａｐｔｏＱ（商標）は、大流量の「タンパク質に優しい」マトリクスの化学安定性に起因して、より短い実行時間をもたらし、バッファーの選択に関してより大きい融通性を与える。本発明は、１０ｍｇの出発の可溶化液から３ｍｇのＨｓｐＣ（ストレスタンパク質複合体）富化調製物を調製するのにかかる時間を、驚くべきことに、およそ２時間まで短縮した。さらにタンパク質溶解性は、カオトロープまたは界面活性剤の必要性なしに、維持された。加えて、タンパク質分解のレベルは低下した。本発明のバッファー組成物は、精製プロセスの間のタンパク質複合体の崩壊を最小にし、本発明の方法によって製造されたＨＥＰは、免疫原性および感染に対する防御の増進を示した。好ましいバッファーは、少なくとも１つの二価の陽イオンおよび任意にアデノシン二リン酸を含む。
【０１１３】
本発明の方法は、結核症（ＴＢ）、髄膜炎およびインフルエンザに対する潜在的なワクチンを調製するためにすでに使用され、簡単で、予測可能で、かつ直接的であり、このプロセスの性能は、ほとんどもっぱら標的タンパク質の等電点およびバッファーのｐＨによって決められる。このワクチン組成物は、宿主において防御免疫を引き出す上で重要と考えられる主要な熱ショックタンパク質、具体的には、Ｈｓｐ６０またはＧｒｏＥＬ、およびＨｓｐ７０またはＤｎａＫファミリーおよび相同体のうちの少なくとも２つの２つを含んでもよい。
【０１１４】
本発明の方法は、規模拡大可能であるおよび迅速であるという利点を有し、Ｋｇ量の精製されたタンパク質複合体およびワクチン組成物を生成するための数リットルの可溶化液を処理する可能性を有する。
【０１１５】
ワクチン組成物の投与
特定の実施形態では、本発明のワクチン組成物は、少なくとも１つの佐剤をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、この佐剤は、フロインド不完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、Ｑｕｉｌ  Ａ、Ｄｅｔｏｘ、ＩＳＣＯＭおよびスクアレンからなる群から選択されるが、これらに限定されない。さらに適切な佐剤としては、鉱物ゲルまたはアルミニウム塩（水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムなど）が挙げられるが、この適切な佐剤は、カルシウム、鉄または亜鉛の塩であってもよいし、またはアシル化されたチロシン、もしくはアシル化糖の不溶性懸濁液であってもよいし、または陽イオンとしてまたは陰イオンとして誘導体化された糖類、ポリフォスファゼン、生分解性ミクロスフェア、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、リピドＡ誘導体（例えば、低毒性のリピドＡ誘導体）、３−０−脱アシル化ＭＰＬ、ｑｕｉｌ  Ａ、サポニン、ＱＳ２１、フロイント不完全アジュバント（ディフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ミシガン州、デトロイト）、Ｍｅｒｃｋ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ６５（メルク社（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．）、米国）、ＡＳ−２、ＡＳ０１、ＡＳ０３、ＡＳ０４、ＡＳ１５（ＧＳＫ、米国）、ＭＦ５９（カイロン（Ｃｈｉｒｏｎ）、イタリア、シエーナ（Ｓｉｅｎｎａ））、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、生物接着因子（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ）および粘膜接着因子（ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅ）、微小粒子、リポソーム、外膜小胞、ポリオキシエチレンエーテル製剤、ポリオキシエチレンエステル製剤、ムラミルペプチドまたはイミダゾキノロン化合物であってもよい。
【０１１６】
本発明のワクチン組成物または精製および／もしくは単離されたストレスタンパク質複合体は、いずれかの適切な経路を介して、処置を必要とする被験者に投与されてもよい。典型的には、当該組成物は、非経口投与される。非経口投与のための他の可能な経路の例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない；静脈内、心臓内、動脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下、経粘膜、吸入または経皮。投与経路としては、局所経路および経腸経路、例えば粘膜経路（肺経路を含む）、経口経路、鼻内経路、直腸経路をさらに挙げてもよい。当該製剤は、液体、例えばｐＨ  ６．８〜７．６の非リン酸塩バッファーを含有する生理食塩溶液、または凍結乾燥粉末もしくはフリーズドライ化された粉末であってもよい。
【０１１７】
特定の実施形態では、この組成物は、注入可能組成物として送達可能である。静脈内注入のために、当該ストレスタンパク質複合体は、発熱物質を含まずかつ適切なｐＨ、等張性および安定性を有する、非経口的に許容できる水溶液の形態にあることになろう。当該技術分野の当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液または、乳酸加リンゲル液などの等張性媒体を使用して、適切な溶液を調製することは十分にできる。防腐剤、安定剤、バッファー、抗酸化物質および／または他の添加剤を、必要に応じて含めてよい。
【０１１８】
特定の実施形態では、注入方法は、不必要であることがあるし、または真皮を貫通する針を使用してもよい。特定のさらなる実施形態では、当該ワクチンは経口投与に適しているか、または経皮的に、もしくは肺送達によって投与することができる。特定の実施形態では、当該ワクチン組成物は予防的ワクチンとして投与される。特定の実施形態では、このワクチン組成物は治療ワクチンとして投与される。なおさらなる実施形態では、このワクチン組成物は、一次免疫スケジュールによって介在される任意の以前に投与されたワクチンへの追加免疫ワクチンとして投与される。
【０１１９】
経口投与用の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、粉末または液体の形態にあってもよい。錠剤は、ゼラチンまたは佐剤などの固体担体を含んでもよい。液体医薬組成物は、一般に、水、石油、動物油または植物油、鉱油または合成油などの液体担体を含む。生理食塩水溶液、デキストロースまたは他の糖類溶液またはグリコール（エチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）が含まれてもよい。
【０１２０】
上で触れた技術およびプロトコル、ならびに本発明に従って使用されてもよい他の技術およびプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ；第２０版、ＩＳＢＮ  ０−９１２７３４−０４−３およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ａｎｓｅｌ，Ｈ．Ｃ．ら、第７版、ＩＳＢＮ  ０−６８３３０５−７２−７（これらの文献の開示全体を、参照により本願明細書に援用したものとする）に見出すことができる。
【０１２１】
また、本発明のワクチン組成物または精製および／もしくは単離されたストレスタンパク質複合体は、特定の組織（血液を含む）に配置されるミクロスフェア、リポソーム、他の微粒子送達システムまたは徐放性製剤を介して、投与されてもよい。
【０１２２】
投薬治療方式としては、本発明の組成物の単回投与、または組成物の複数回投与用量を挙げることができる。当該組成物は、さらに、本発明の組成物が処置のために投与されている状態の処置のために使用される他の治療学および医薬と連続的またはそれらとは別々に、投与することができる。
【０１２３】
投与される実際の量、ならびに投与の速度および経時変化は、処置しようとしているものの特質および重症度に依存することになろう。処置の処方、例えば、投薬量の決定などは、最終的には一般医および他の医師の責任および判断の範囲内であり、典型的には処置対象の障害、個々の患者の状態、送達の部位、投与方法および医師に知られた他の要因を考慮する。
【０１２４】
定義
特段の記載がない限り、本願明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明の技術分野の当業者が一般に理解する意味を有する。
【０１２５】
本願明細書を通して、文脈と矛盾する場合を除いて、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの変化形が、記載された整数または整数の群の包含を意味するが、いずれの他の整数または整数の群の排除も意味しないということは理解されよう。
【０１２６】
本願明細書で使用する場合、「１つの（ａ、ａｎ）」および「その、当該（ｔｈｅ）」などの用語は、文脈と明らかに矛盾する場合を除いて、単数および複数の指示対象を包含する。従って、例えば、「１つの活性薬剤」または「１つの薬理学的に活性薬剤」との言及は、単独の活性薬剤、および組み合わせられた２以上の異なる活性薬剤を包含し、他方で、「１つの担体」との言及は、２以上の担体の混合物ならびに単独の担体を包含する、などである。
【０１２７】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合によって共有結合された一連の少なくとも２つのアミノ酸（同配体など）を記述するために、互換的に本願明細書で使用される。ペプチドまたはタンパク質を構成しうるアミノ酸の最大数は、限定されない。さらには、用語「ポリペプチド」は、ペプチドの断片、類似体および誘導体に及び、この断片、類似体または誘導体は、この断片、誘導体または類似体が由来するペプチドと同じ生物学的機能活性を保持する。
【０１２８】
本願明細書で使用する場合、用語「処置」および「処置する」および「処置すること」などの関連する用語は、ワクチン組成物の免疫原決定基が由来する病原体または癌細胞に対する長期の防御免疫をもたらすために、免疫原決定基に対する防御免疫応答を引き出すことを意味する。それゆえ用語「処置」は、被験者に恩恵を与えることができる任意のレジメンを指す。この処置は、すでに存在する状態に関するものであってもよいし、または予防的（防止的処置）であってもよい。処置は、治癒効果、緩和効果または予防効果を含んでもよい。
【０１２９】
本願明細書で使用する場合、用語「治療上有効量」は、感染症または癌性状態に対して防御免疫応答を誘導するために必要とされる本発明のストレスタンパク質複合体またはワクチン組成物の量を意味する。本願明細書で使用する場合、用語「予防上有効量」は、感染症または癌性状態の最初の発症、進行または再発を防止するために必要とされる複数のストレスタンパク質複合体またはワクチン組成物の量に関する。用語「治療的」は、被験者が完全回復まで処置されるということを必ずしも意味しない。同様に、「予防的」は、被験者は最終的に疾患状態にかからないであろうということを必ずしも意味しない。
【０１３０】
本発明に関しては、「被験者」は、ヒト、霊長類および家畜（例えば、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ）；実験室での試験用動物（マウス、ウサギ、ラットおよびモルモットなど）；ならびにコンパニオンアニマル（イヌおよびネコなど）などの哺乳動物が挙げられ、そしてこれらを包含する。哺乳動物がヒトであることが、本発明の目的のために好ましい。用語「被験者」は、本願明細書で使用する場合の用語「患者」と互換である。
【０１３１】
本願明細書で使用する場合、免疫応答に関して使用される場合の用語「誘発する（ｍｏｕｎｔ）」、「誘発された（ｍｏｕｎｔｅｄ）」、「引き出す」または「引き出された」は、被験者に投与されるワクチン組成物の免疫原決定基に対して惹起される免疫応答を意味する。典型的には、当該ワクチン組成物の免疫原決定基は、本発明の方法を使用して得られる単離されかつ／または精製されたストレスタンパク質複合体を含む。
【０１３２】
本願明細書で使用する場合、用語「免疫応答」は、Ｔ細胞の同時刺激の調節によって影響を受けるＴ細胞介在性および／またはＢ細胞介在性免疫応答を包含する。用語「免疫応答」は、Ｔ細胞活性化（抗体産生（体液性応答）など）およびサイトカイン応答性細胞（マクロファージなど）の活性化によって間接的にもたらされる免疫応答をさらに包含する。
【実施例】
【０１３３】
本発明は、これより、以下の実施例を参照して説明される。以下の実施例は、説明の目的で提示され、本発明を限定するものと解釈されることは意図されていない。
【０１３４】
実施例１：ＢＣＧ細胞可溶化液からのＨｓｐＣ富化調製物の調製
対数期中期の熱ショックを加えた培養物由来のＢＣＧ細胞ペレットを可溶化し、遠心分離によって浄化した。細胞ペレットを、ＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する滅菌したＰＢＳの中に再懸濁した。再懸濁した細胞を、超音波処理を使用して可溶化するか（Ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ）、またはＥｍｕｌｓｉｆｌｅｘ  Ｃ５高圧ホモジナイザーに通し、滅菌した袋の中に集めた。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（２５０Ｕ／ｍＬ）を、上記可溶化液に加えた。次いでこの試料をさらに２回ホモジナイズし、その細胞可溶化液を遠心管に移し、６０００ｇで２０分間の遠心分離によって細胞片を除去した。浄化した可溶化液を集め、１４０００ｇでさらに６０分間遠心分離し、上清を除去し、高速浄化した可溶化液として参照した。１０ｍｌの浄化した可溶化液を脱塩し、ｐＨ  ６．８の５０ｍＭリン酸塩バッファーへとバッファー交換した。この試料のタンパク質濃度を決定し、ＩＥＣ（イオン交換クロマトグラフィ）  ＨｓｐＣ富化調製物を、カラムクロマトグラフィによって以下のとおりにして調製した。１０ｍｇのタンパク質を、０．５ｍｌ／分の流量でＣａｐｔｏＱ（商標）  カラムにロードした。このカラムをｐＨ  ６．８の５０ｍＭリン酸塩バッファーで十分に洗浄した後、ＮａＣｌの濃度を上昇させながら（１５０ｍＭ、３００ｍＭ、５００ｍＭおよび１Ｍ）、タンパク質を一括溶出した。Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ６５を含有する溶出された分画を、ＤｎａＫおよびＧｒｏＥＬに対する市販の抗血清を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法を使用して分析した。調製したＨＥＰの例を図１Ａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）および図１Ｂ（ウエスタンブロット法）に示す。いくつかの調製物では、混合モード用のＭＭＣカラムを使用し、ｐＨ  ５の５０ｍＭ酢酸塩、１Ｍ  ＮａＣｌ、ＩｍＭ  ＭｇＣｌ２中でロードし、ｐＨ  ８．０の同じバッファーの中で溶出した。
【０１３５】
実施例２：ＢＣＧ細胞可溶化液からのＨｓｐＣ富化調製物の調製における複合体安定性の増進
対数期中期の熱ショックを加えた培養物由来のＢＣＧ細胞ペレットを可溶化し、遠心分離によって浄化した。細胞ペレットを、ＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する滅菌したＰＢＳの中に再懸濁した。再懸濁した細胞を、超音波処理を使用して可溶化するか（Ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ）、またはＥｍｕｌｓｉｆｌｅｘ  Ｃ５高圧ホモジナイザーに通し、滅菌した袋の中に集めた。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（２５０Ｕ／ｍＬ）を、上記可溶化液に加えた。次いでこの試料をさらに２回ホモジナイズし、その細胞可溶化液を遠心管に移し、６０００ｇで２０分間の遠心分離によって細胞片を除去した。浄化した可溶化液を集め、１４０００ｇでさらに６０分間遠心分離し、上清を除去し、高速浄化した可溶化液として参照した。１０ｍｌの浄化した可溶化液を脱塩し、１ｍＭ  ＡＤＰを含めてまたは含めずに、ｐＨ  ６．８の５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２へとバッファー交換した。当該ＨｓｐＣ富化調製物は、ＣａｐｔｏＱ（商標）  カラムでのカラムクロマトグラフィを使用して単離した。１ｍＭ  ＡＤＰを含むまたは含まないｐＨ  ６．８の５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２でこのカラムを十分に洗浄した後、ＮａＣｌの濃度を上昇させながら（１５０ｍＭ、３５０ｍＭ、５００ｍＭおよび１Ｍ）、タンパク質を一括溶出した。Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ６５を含有する溶出された分画を、ＤｎａＫ（Ｈｓｐ７０）、ＧｒｏＥＬ（Ｈｓｐ６５）およびＡｇ８５に対する市販の抗血清を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法を使用して分析した。調製したＨＥＰの例を図５Ａに示す。ＡＴＰでＡＤＰを置き換えたバッファー組成物を使用して、崩壊したＨｓｐＣ複合体を含有する対照ＨＥＰを調製した（図５Ｂ）。種々のバッファーの中で調製したＨＥＰは、それらのクーマシーブルーで染色されたタンパク質の特性において有意差を示さなかったが（図５Ｂ）、それらのタンパク質は、下記の実施例３に示すように、免疫原性が大きく異なった。
【０１３６】
実施例３：ＢＣＧ由来のＨｓｐＣ富化調製物の免疫原性
ＢＣＧ  ＨＥＰを使用して、ＢａｌｂＣマウスを免疫化し、免疫から２８日後、免疫化された動物から脾臓を回収した。脾臓をＲＰＭＩ−１６４０に集め、５ｍＬのシリンジプランジャーを使用して７０μｍのセルストレーナーに通して５０ｍＬのファルコンチューブ（Ｆａｌｃｏｎ  ｔｕｂｅ）の中へと脾臓を押し出すことにより、ただ１つの細胞懸濁液を作製した。ＫＯＶＡ  ｇｌａｓｓｔｉｃスライド  血球計算板でトリパンブルー色素排除を使用して細胞を数え、インターフェロン  γ（ＩＦＮ−γ）の産生をＴＢ抗原に対するリコール反応（ｒｅｃａｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）でアッセイした。
【０１３７】
２４穴の組織培養プレート（Ｎｕｎｃ）の中で、１ｍＬ培地中に、各ウェルに２×１０６の脾細胞を加え、各ウェルに、以下の抗原のうちの１つを加えた：ＢＳＡ（１０μｇ／ｍｌ）、Ｃｏｎ  Ａ（１０μｇ／ｍｌ）、ＴＢホールセル可溶化液（５０〜１．５６μｇ／ｍＬのＷＣＬ）、ＨＥＰ、ＩＥＦ  ＨｓｐＣまたはＡｇ８５（１０μｇ／ｍＬ）。
【０１３８】
製造業者のプロトコル（アールアンドディー・システムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ））に従ってマウス用ＥＬＩＳＡキットを使用して、再刺激したウェルからの培養液の上清を、ＩＦＮ−γ  ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−５について試験した。図２は、インビトロで、ＷＣＬで再刺激した免疫化されたマウス由来の脾臓細胞を用いて得た典型的な結果を示す。これらの結果は、ＢＣＧから単離されたＨＥＰ（ＩＥＸ）が、免疫化された動物において強いＩＦＮ−γ反応を誘導し、その強さは、元のＢＣＧ可溶化液（ＬＳＳ）よりも強く、複数のＨｓｐＣファミリーの単離のためにこれまでに記載された従来のフリーフロー等電点電気泳動法（ＩＥＦ）を使用して単離されたＨｓｐＣよりもはるかに強いということを示した。ＷＣＬに対するリコール反応は、Ｃｏｎ  Ａに関して見られたリコール反応と同程度であり、Ａｇ８５に対しては、有意であるがより小さい反応が見られた。またインビトロでのＩＦＮ−γ反応は、マウスエアロゾル抗原投与モデルにおいて、生ＴＢの抗原投与に対するインビボでの防御へと反映された。図６は、詳細なＢＣＧから単離されたＨＥＰの免疫原性を示す。図６Ａは、インビトロで、ＷＣＬで再刺激した免疫化されたマウス由来の脾臓細胞を用いてアッセイして得た細胞介在性免疫についての典型的な結果を示す。これらの結果は、実施例２でのようにＢＣＧから単離されたＨＥＰは、この免疫化された動物において、ＡＤＰおよび二価の陽イオンの存在下で（ＩＥＣ（２  ｖａｃｃｓ）およびＡＤＰ／Ｍｇ）、強いＩＦＮ−γ反応を誘導し、その強さは、実施例１でのようにＢＣＧから単離されたＨＥＰ（ＩＥＣ（２  ｖａｃｃｓ）よりも強く、生ＢＣＧで免疫化されかつこれらのＨＥＰで追加免疫された動物（ＢＣＧ／ＩＥＣ（２  ｖａｃｃｓ））で見られた反応と同程度であるということを示した。
【０１３９】
図６Ｂは、ＡＤＰ  ＋  二価の陽イオン（Ｖ１）、ＡＴＰ  ＋  二価の陽イオン（Ｖ２）または二価の陽イオン単独（Ｖ３）のいずれかの存在下でＢＣＧバクテリア細胞可溶化液から単離されたＨＥＰワクチンによって誘導される体液性免疫のＴｈ１の優位性（ｂｉａｓ）を示し、本発明の改善されたバッファー組成物を使用して単離されたＨＥＰの増進された免疫原性を実証する。また図６Ｂは、本発明の改善された方法によって調製されたＨｓｐＣワクチン（ＢＣＧ  ＋  Ｖ１）で追加免疫することによる、現在の生ＢＣＧワクチン（ＢＣＧ）に対するＴｈ１が誘導するＩｇＧ２ａ抗体応答の有意な増進を示す。
【０１４０】
実施例４：ＢＣＧ  ＨｓｐＣワクチンによって誘導される防御免疫
実施例１（ＩＥＣ）および実施例２（ＩＥＣ  ｍｏｄ）でＢＣＧから単離されたＨＥＰを使用して、８〜１０匹のナイーブなまたは生ＢＣＧで予備刺激したＢａｌｂＣマウスの群を免疫化した。対照動物を、生理食塩水または生ＢＣＧワクチン（ステイテンス・セラム・インスティテュート（Ｓｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））のいずれかで免疫化した。予備刺激と追加免疫ワクチン接種との間に４週間の間隔を空けてＨｓｐＣワクチンを７５μｇで投与し、最終の免疫化から４週間後に、これらの動物に５０〜１００ＣＦＵの生ＴＢ株Ｈ３７Ｒｖを抗原投与した。抗原投与後２８日目にこの免疫化された動物から肺を回収し、ＴＢによる肺コロニー形成を定量化するために、肺ホモジネートを三重にプレーティングした。図７は、抗原投与から４週間後に肺から回収した典型的なＣＦＵを示す。本発明の改善されたバッファー組成物を使用して精製されたＨＥＰで免疫化した動物は、生抗原投与に対する肺Ｃｆｕの減少によって評価されるとおり（図７Ａ、ＩＥＣ  ｍｏｄ  対  ＩＥＣ）、有意に増進された防御を示し、また現在の生ＢＣＧワクチンによって誘導される防御を追加免疫した（図７Ａ、ＢＣＧ  対  ＢＣＧおよびＩＥＣ）。ＡＤＰおよび二価の陽イオンの存在下で実施例２でのように単離されたＨｓｐＣを使用して調製したＨＥＰワクチン（ＩＥＣ  ｍｏｄ）は、肺コロニー数の減少によってアッセイすると、有意な防御を示し、この防御は、生ＢＣＧワクチン（ＢＣＧ）によってもたらされる防御よりもはるかに良好であった。生ＢＣＧで免疫化した動物をＨｓｐＣワクチンで追加免疫すること（ＢＣＧおよびＩＥＣ）は、Ｈ３７Ｒｖ抗原投与後の肺コロニー数のさらなる減少によって評価されるとおり、ＢＣＧだけを投与された動物（ＢＣＧ）と比較して、有意に改善された防御を示した。
【０１４１】
観察される増進された防御的免疫原性のためにＨｓｐＣ複合体の安定化が絶対的に必要であるということを実証するために、本発明の改善されたバッファー組成物を使用して単離されたＨＥＰを、ＨｓｐＣ複合体を崩壊させるためにＡＴＰの存在下で単離したＨＥＰと比較した。得られた結果を図７Ｂに示すが、これらの結果は、ＨｓｐＣ複合体を崩壊させるためにＡＴＰの存在下で精製したＨＥＰ（Ｖ２）と比較して、二価の陽イオン（Ｖ３）およびＡＤＰ（Ｖ１）の存在下で単離したＨＥＰで免疫化した動物において有意な防御を示す。これらの結果は、現在のＢＣＧ生ワクチン（ＢＣＧ）で予備刺激し、ＨＥＰワクチンで免疫化した動物（ＢＣＧおよびＶ１）の追加免疫も示した。
【０１４２】
実施例５：Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（ナイセリア）由来のＨＥＰの調製
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ナイセリア・メニンギティディス、髄膜炎菌）株ＭＣ５８の無莢膜変異株（Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１９９５年１１月；１８（４）：７４１−５４）の培養物に４４℃で熱ショックを加え、抗生物質ゲンタマイシンを用いた処置により死滅させた。細胞を処理し、実施例１および２に記載したようにしてＨＥＰを製造した。簡潔に言えば、細胞を、凍結および解凍のサイクル、または超音波処理によって可溶化し、６，０００ｇで２０分間の遠心分離によって浄化した。浄化した抽出液を、ＣａｐｔｏＱイオン交換樹脂を充填したカラム上へとロードした。このカラムをｐＨ  ６．８の５０ｍＭリン酸塩バッファーで十分に洗浄した後、ＮａＣｌの濃度を上昇させながら（１５０ｍＭ、３５０ｍＭ、５００ｍＭ）、タンパク質を一括溶出した。Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ６５を含有する溶出された分画を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分析した（図３Ａ）。１５０ｍＭおよび３５０ｍＭ  ＮａＣｌによって溶出された分画を合わせ、ＰＢＳ中へと透析した。ワクチンを、主要なｈｓｐファミリーおよび外膜ポリン、ＰｏｒＡの存在について、ゲル電気泳動およびウエスタンブロット法によって評価した。結果を図３Ｂに示す。
【０１４３】
図８は、実施例１における方法に従ってＡＤＰおよび二価の陽イオンの不存在下で（Ａ）、および実施例２における方法に従ってＡＤＰおよび二価の陽イオンの存在下で（Ｂ）精製され、ＧｒｏＥＬ（ｈｓｐ６０）およびＤｎａＫ（ｈｓｐ７０）の存在についてウエスタンブロットにかけたＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ナイセリア・メニンギティディス、髄膜炎菌）株ＭＣ５８由来のＨＥＰを示す。
【０１４４】
実施例６：Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（ナイセリア）のＨＥＰの免疫原性
系株間反応（ｃｒｏｓｓ  ｓｔｒａｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の評価のための血清を生成するために、実施例３の方法に従ってＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ナイセリア・メニンギティディス、髄膜炎菌）株ＭＣ５８またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ（ナイセリア・ラクタミカ）から調製したＨＥＰを使用してマウスを免疫化した。免疫化された動物由来の血清をプールし、それらが系株間の抗体介在性オプソニン化貪食作用を引き出す能力を、以下の臨床用ナイセリアの株を使用して評価した；ＭＣ５８、Ｈ４４／７６−ＳＬ、Ｍ０１−２４０１０１、Ｍ０１−２４００１３、Ｍ０１−２４０１４９、Ｍ０１−２４０１８５およびＭ０１−２４０３５５。アッセイのために、血清試料を、死滅させた蛍光標識した細菌およびＩｇＧを欠失した仔ウサギ補体とともに３７℃で７．５分間、インキュベーションした。０．８％ＤＭＦを用いて分化させたＨＬ６０細胞を加え、試料を７．５分間インキュベーションし、その後、氷冷したＤＰＢＳを加えて反応を停止した。試料をフローサイトメトリによって分析し、データを蛍光指数値（Ｆｌ−Ｃ’）として表した。すべての株について、ＭＣ５８由来のＨＥＰでワクチン接種を受けたマウスから得た血清は、ワクチン接種を受けていない対照由来および従来の等電点電気泳動法を使用して精製されたｈｓｐＣまたは市販の外膜小胞（Ｈ４４／７６  ＯＭＶ）ワクチン候補で免疫化した動物由来の血清を用いて得たオプソニン化反応よりも、有意に大きいオプソニン化反応を誘導した。異種株Ｍ０１−２４０１０１を用いて得た結果を図４に示すが、この結果は、ＨＥＰ（ＩＥＣ  ＨｓｐＣ）、従来の方法で精製されたｈｓｐＣ（ＩＥＦ  ＨｓｐＣ）およびＯＭＶワクチン（Ｈ４４／７６  ＯＭＶ）を用いて得られた系株間防御を示す。このＨＥＰワクチンは、また、ＭＣ５８およびこのＯＭＶワクチンが由来するＨ４４／７６株の両方に対して、ＩＥＦ  ＨｓｐＣワクチンよりも高いオプソニン化値を生成した。実施例１および実施例２の方法を使用して共生ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａ（ナイセリア・ラクタミカ）から単離したＨＥＰは、致死的抗原投与研究においてマウスの有意な交差血清型防御を示し、生ＭＣ５８の腹腔注入に対して、すべてのマウスが完全に生存した。
【０１４５】
実施例７：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ストレプトコッカス・ニューモニエ、肺炎連鎖球菌）由来のＨＥＰの精製および免疫原性
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ（ストレプトコッカス・ニューモニエ、肺炎球菌）株Ｄ３９をＨｏｅｐｒｉｃｈの培地中で成長させ、４２℃で４５分間熱ショックを加え、５６℃で１５分間熱殺菌した。細胞を遠心分離によって回収し、ｐＨ  ６．８の５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＤＰの中に再懸濁し、Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ  Ｃ５の中で崩壊させた。この可溶化液を遠心分離によって浄化し、ＣａｐｔｏＱカラムにロードし、３００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する溶解バッファーの中で溶出した。精製したＨＥＰを使用してＢａｌｂＣマウスを免疫化し、血清を、種々のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ストレプトコッカス・ニューモニエ）株に対する抗体についてＥＬＩＳＡによって分析した。当該ＨＥＰワクチンは、免疫化株Ｄ３９に対し良好な抗体を誘導し、ならびに株２３ＦおよびＴＩＧＲ４との交差反応を誘導した。誘導された体液性応答は、さらに、ＩｇＧ１サブタイプ抗体の産生よりも大きいＩｇＧ２ａサブタイプ抗体の産生を伴って、Ｔｈ１リンパ球細胞の優位性を示した。
【０１４６】
実施例８：バキュロウイルスに感染した昆虫細胞由来のＨＥＰの精製および免疫原性
インフルエンザ  Ｈ３  Ｐａｎａｍａ  ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｔｉｎｉｎ（パナマ・ヘマグルチニン）を発現する組み換えバキュロウイルスおよびヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片との融合タンパク質としてのＣ型肝炎ウイルスＥ１およびＥ２ポリペプチドを使用して、Ｓｆ９昆虫細胞を感染させた。感染した細胞をＩｎｓｅｃｔ−Ｘｐｒｅｓｓ無タンパク質培地中で７２時間成長させ、Ｊｏｕａｎ  ＧＲ４  ２２遠心分離機の中で、４，５００ｒｐｍで１０分間、細胞をペレット化した。細胞ペレットを再懸濁し、加圧型細胞破砕装置（ｄｏｕｎｃｅ  ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）を使用して０．２％  ＮＰ４０、１ｍｇ／ｍｌペプスタチンおよび０．２ｍＭ  ＰＭＳＦを含有するｐＨ  ６．８の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの中で、氷上で可溶化した。この可溶化液を１２，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清を１００，０００ｇで３０分間遠心分離し、浄化した可溶化液を得て、次いでこの可溶化液をＣａｐｔｏＱ（商標）  カラムにロードした。このカラムを、１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するｐＨ  ６．８の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの中で洗浄し、１５０〜３５０ｍＭのＮａＣｌ塩勾配を用いてＨＥＰを溶出した。この精製されたＨＥＰを使用してマウスおよびウサギを免疫化し、これらの免疫化した動物からの血清を、ウエスタンブロット法および赤血球凝集反応の阻害によってアッセイした。
【０１４７】
実施例９：腫瘍細胞由来のＨＥＰの精製および免疫原性
ＥＬ４およびＡ２０細胞をＲＰＭＩ培地中で成長させ、Ｐｏｔｔｅｒホモジナイザーを使用して、非イオン性物質を含有するバッファーの中で可溶化し、腫瘍細胞ＨＥＰを精製し、実施例６におけるように、ウエスタンブロット法によって免疫原性について試験した。
【０１４８】
実施例１０：異種抗原を発現するＣＨＯ細胞由来のＨＥＰの精製および免疫原性
ＣＨＯ細胞およびＦｃ融合タンパク質を発現するＣＨＯ細胞を、ＣＨＯ  ＣＤ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で成長させた。ＣＨＯ細胞を回収し、ＰＢＳの中で洗浄し、１ｍＭ  ＡＤＰおよび１ｍＭ  ＭｇＣｌを伴うかまたは伴わないかのいずれかのｐＨ  ６．８の５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌの中に再懸濁し、超音波処理によって可溶化した。この可溶化液を遠心分離によって浄化し、その後、０．８μＭ次いで０．２μＭのフィルターに通して濾過し、ｐＨ  ６．８の５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳの中で１０倍希釈し、ＨＥＰを、１ｍｌ  ＣａｐｔｏＱカラムを具えたＡＫＴＡクロマトグラフィシステムを使用して精製した。このカラムを、１ｍＭ  ＡＤＰおよび１ｍＭ  ＭｇＣｌが添加されているかまたは添加されていないかのいずれかの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ６．８およびＢ、ｐＨ  ６．８の５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する２０ｍｌバッファーで洗浄し、ＨＥＰを、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３５０ｍＭおよび５００ｍＭ  ＮａＣｌという上昇する塩濃度を含有する洗浄バッファーの中で溶出した。ＨＥＰをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に流し、タンパク質をクーマシーで染色するか（図９Ａ）、またはｈｓｐ６０（抗体ＳＰＡ−８７５、ストレスジーン（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎｅ））もしくはＨｓｐ７０（抗体  ＳＰＡ−８１１、ストレスジーン（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎｅ））（それぞれ図９Ｂおよび図９Ｃ）のいずれかについてウエスタンブロットにかけた。このクーマシー染色は、上記ＣＨＯ可溶化液からＣａｐｔｏＱ樹脂によって捕捉されたタンパク質、および段階勾配溶出によるこれらのタンパク質の良好な分離を実証する。このウエスタンブロットは、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを用いた、ＣａｐｔｏＱカラムからのＨＥＰの溶出を実証する。
【０１４９】
本願明細書中で参照されたすべての文書は、参照により本願明細書に援用したものとする。本発明の記載された実施形態に対する種々の改変および変更は、本発明の範囲から逸脱せずに、当業者には明らかであろう。本発明は具体的な好ましい実施形態に関連して記載されたが、請求項に係る本発明は、このような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないということを理解されたい。実際、当業者には自明である、本発明を実施する記載された態様の種々の改変は、本発明に包含されることが意図されている。本願明細書中のいずれの先行技術への言及も、その先行技術がいずれかの国で普通の一般の知識の一部を形成するということの同意またはいずれかの形態の示唆として解釈されないし、解釈されるべきでもない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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