(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも神経組織でＧｉｒｄｉｎ遺伝子の機能が失われ、且つ、以下の（１）及び（２）及び（３）の表現型を示し、
ゼリー状の餌で飼育する３０日齢以上のノックアウトマウス。
（１）海馬硬化をもつこと。
（２）海馬外の脳損傷が限定的であること。
（３）海馬起源といえる自発的なてんかんがあること。
【請求項２】
少なくとも神経組織でＧｉｒｄｉｎ遺伝子の機能が失われ、ゼリー状の餌で飼育する３０日齢以上のノックアウトマウス。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のノックアウトマウスに、
候補物質を投与する工程、
内側側頭葉てんかんを抑制する物質を選択する工程、
を含む内側側頭葉てんかんを抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のノックアウトマウスに、
内側側頭葉てんかんを抑制する手法を実施する工程、
内側側頭葉てんかんを抑制する手法を選択する工程、
を含む内側側頭葉てんかんを抑制する手法の選択方法。
【請求項５】
前記内側側頭葉てんかんを抑制する物質を選択する工程が、
ノックアウトマウスをビデオ観察し、発作の発生頻度及び／又は発症程度の抑制により物質を選択する請求項３に記載の内側側頭葉てんかんを抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記内側側頭葉てんかんを抑制する手法を選択する工程が、
ノックアウトマウスをビデオ観察し、発作の発生頻度及び／又は発症程度の抑制により手法を選択する請求項４に記載の内側側頭葉てんかんを抑制する手法の選択方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ノックアウトマウス、内側側頭葉てんかんを抑制する物質のスクリーニング方法、及び内側側頭葉てんかんを抑制する手法の選択方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
内側側頭葉てんかん（ＭＴＬＥ；  ｍｅｓｉａｌ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｅｐｉｌｅｐｓｙ）は成人の代表的な薬剤治療抵抗性のてんかんで、海馬歯状回を発作焦点とする。意識を失い転倒しひきつけるいわゆるてんかん発作（強直間代発作＝大発作）だけでなく、夢うつつの状態で行動する自動症が自動車運転者におこると暴走事故につながる重大な病気である。
【０００３】
発作間欠期にもＭＴＬＥ患は特有の「感覚−辺縁系過剰結合症候群  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｏｆ  ｓｅｎｓｏｒｙ−ｌｉｍｂｉｃ  ｈｙｐｅｒｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ」（Ｂｅａｒ  ＤＭ  １９７９）と表現されるすべての感覚（視覚、触覚、聴覚、味覚、嗅覚）に対して過敏で衝動的な異常性格を呈する。ＭＴＬＥ発症の根本原因はよく分かっておらず、現状では、海馬扁桃核切除以外に有効な治療がない。そのため、薬物治療標的の同定が求められており、薬物治療標的同定や治療薬のスクリーニング、及び治療手法の選択を行うために、人間のＭＴＬＥを正確に模した動物モデルが必要である。
【０００４】
権威ある専門書であるＪｏｈｎ  Ｌｉｂｂｅｙ  Ｅｕｒｏｔｅｘｔ出版  Ｆｅｌｉｘ  Ｒｏｓｅｎｏｗ，  Ｐｈｉｌｉｐｐｅ  Ｒｙｖｌｉｎ，  Ｈａｎｓ  Ｌuｄｅｒｓ編、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  “Ｔｈｅ  Ｍｅｓｉａｌ  Ｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｌｏｂｅ  Ｅｐｉｌｅｐｓｉｅｓ”では、ＭＴＬＥ動物モデルに求められる条件は、
（１）海馬硬化をもつこと。
（２）海馬外の脳損傷が限定的であること。
（３）海馬起源といえる自発的なてんかんがあること。
となっている。
【０００５】
ＭＴＬＥ動物モデルとしては、ＥＬマウス（非特許文献１参照）やＩｈａｒａラット（非特許文献２参照）など自然発症てんかんモデル、カイニン酸(非特許文献３参照)、ピロカルピン（非特許文献４参照）、ＰＴＺ（非特許文献５参照）、電撃（非特許文献６参照）等を用いた誘発性モデルマウスが知られている。しかしながら、自然発症のものは原因遺伝子が分からないので生まれたときにどの仔マウスが将来てんかんになるのか予測できず、薬剤や電撃による誘発性マウスは、薬や電撃の用量の調節が難しいという問題がある。また、誘発が海馬歯状回以外を広く傷害するという難点があり、発作回数を予め期待することができず、さらに発作が海馬から始まる保証がないという問題がある。現在のところ、Ｆｅｌｉｘ  Ｒｏｓｅｎｏｗらが求める条件を満たしたマウスは知られていない。
【０００６】
また、ＭＴＬＥを含むてんかん患者の治療に求められる治療薬（治療法）は、「自動症」、「大発作」が消失又は減少することである。意識の有無の判定や定義が難しい「自動症」に比べて、「大発作」は他覚的な定義が容易で、開始と終了が明確なため回数を数えることができる。大発作を経時的に観察する主な技術として、脳波とビデオ観察の２つが挙げられる。マウスを用いた脳波測定は、マウスの頭皮を開いて電極を頭蓋骨から刺入する熟練の技術と高価な測定システム及び解析システムが必要である。これに対して、ビデオ撮影による大発作判定は、熟練の技術を必要とせずに、比較的簡単に行うことができ且つ治療薬や手法の効果の有無を明確に確認することができる。しかしながら、何れの方法においても、Ｆｅｌｉｘ  Ｒｏｓｅｎｏｗらが求める条件を満たしたマウスが知られていないことから、治療薬や手法の効果の有無を、長期間に渡り観察することができないという問題がある。
【０００７】
ところで、アクチン結合タンパク質Ｇｉｒｄｉｎ（Ｇｉｒｄｅｒｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｎ  ｆｉｌａｍｅｎｔ）というタンパク質が知られている。このタンパク質は、生体内では未熟な血管内皮細胞、海馬の神経細胞、嗅球の形成に重要な脳室下帯やＲＭＳ（ｒｏｓｔｒａｌ  ｍｉｇｒａｔｏｒｙ  ｓｔｒｅａｍ）を構成する神経細胞で強く発現することが知られている。また、Ｇｉｒｄｉｎのノックアウトマウスを作製し、生体内における役割を解析した結果、ノックアウトマウスは生まれた直後においては野生型との間に明瞭な肉眼的な変化を認めないものの、組織学的には生後形成される網膜および大脳の血管ネットワークと海馬および嗅球の構造異常が認められることが知られている（非特許文献７参照）。
【０００８】
上記非特許文献７に記載されているＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスは、Ｇｉｒｄｉｎ遺伝子のＥｘｏｎ２にＬａｃＺを挿入してＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスを作製しているが、本発明者らも、Ｇｉｒｄｉｎ遺伝子のＥｘｏｎ３をＬｏｘＰ配列で囲み（ｆｌｏｘ）、Ｎｅｓｔｉｎプロモータにより作動された組換えタンパクＣｒｅのｔｒａｎｓｇｅｎｉｃマウスを交配させることでＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスの作製に成功している（非特許文献８参照）。非特許文献７に記載されているＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスは、後述するヘテロ接合型の両親からメンデルの法則により、１／４の確率で野生型、１／２の確率でヘテロ型、１／４の確率でホモ型のＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスが生まれる。非特許文献８で記載されているＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスも、Ｃｒｅ陽性かつヘテロｆｌｏｘ型の親とＣｒｅ陰性かつホモｆｌｏｘ型の親の交配で、Ｃｒｅ陽性かつホモｆｌｏｘ型であるノックアウトマウスは１／４の確率で生まれる。
【０００９】
上記のとおり、Ｇｉｒｄｉｎノックアウトマウス自体は既に知られている。しかしながら、このＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスは乳児期の間に全て死亡してしまい、成獣が得られないという問題がある。
【００１０】
図１は非特許文献７のＦｉｇｕｒｅ  Ｓ５．Ｃに記載されているグラフで、図１（１）は、野生型（ｎ＝１４）、ヘテロ型（ｎ＝３２）、ホモ型（Ｇｉｒｄｉｎノックアウトマウス、ｎ＝１７）の体重曲線を示し、図１（２）は、生存率を示している。図１（１）及び（２）から明らかなように、ホモ型は生後８日頃から野生型やヘテロ型の同腹兄弟マウスより生育が遅れ始めている。また、離乳期である生後約３０日において、野生型ではほぼ１００％、ヘテロ型では約９０％の同腹兄弟マウスが生存していたのに対して、ホモ型では、生後２５日で全て死亡している。
【００１１】
図２は非特許文献８のＦｉｇ．４に記載されているグラフで、図２（１）は体重曲線を示し、図２（２）は、生存率を示している。図２（１）及び（２）から明らかなように、↓で示されるＧｉｒｄｉｎノックアウトマウス（ｎ＝１４）は生後５日頃から他の同腹兄弟マウス（ｎ＝５３）より生育が遅れ始めている。また、離乳期である生後約３０日において、他の同腹兄弟マウスでは約９０％が生存していたのに対して、Ｇｉｒｄｉｎノックアウトマウスでは、生後２９日で全て死亡している。
【００１２】
したがって、Ｇｉｒｄｉｎノックアウトマウス自体は知れているものの、成獣になる前に全て死亡してしまうため、当該ノックアウトマウスを使用した実験等には応用し難いという問題がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】今泉清，伊藤昭吾，沓掛源四郎，滝沢隆安，藤原公策，土川清、「マウスのてんかん様異常について」、１９５８  ４月、実験動物  ８（１）：ｐ６−１０
【非特許文献２】Ａｍａｎｏ  Ｓ  ｅｔ．ａｌ  “Ｍｉｃｒｏｄｙｓｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｈａｒａ’ｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ  Ｒａｔｓ  （ＩＧＥＲ）：Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ＩＧＥＲ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ｏｒｉｇｉｎａｌ  Ｓｔｒａｉｎ  ＩＣＲ  ａｎｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｉｎ  ＩＧＥＲ／ｃ（−）”，  Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ，１９９７  Ｖｏｌ．３８  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｐ６１
【非特許文献３】Ｂｅｎ−Ａｒｉ，  Ｙ．  “Ｋａｉｎａｔｅ  ａｎｄ  Ｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｌｏｂｅ  Ｅｐｉｌｅｐｓｉｅｓ：  Ｔｈｒｅｅ  ｄｅｃａｄｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ“，  Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ，２０１０  ５１（Ｓｕｐｐｌ．  ５），ｐ４０
【非特許文献４】Ｃｕｒｉａ  Ｇ，  Ｌｏｎｇｏ  Ｄ，  Ｂｉａｇｉｎｉ  Ｇ，  Ｊｏｎｅｓ  ＲＳ，  Ａｖｏｌｉ  Ｍ．“Ｔｈｅ  ｐｉｌｏｃａｒｐｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｌｏｂｅ  ｅｐｉｌｅｐｓｙ．“Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００８  Ｊｕｌ  ３０，Ｖｏｌ．１７２（２−４）：ｐ１４３−５７
【非特許文献５】Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒ．  Ｃｒａｉｇ  ｅｔ．ａｌ  “Ａ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｔｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｚｏｌ  Ｋｉｎｄｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｒａｔｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｅ”  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｅｈａｖｉｏｒ，１９８９，Ｖｏｌ．３１，ｐ８６７−７０
【非特許文献６】Ｊｏｓe  Ｍ．  Ｒ．  Ｄｅｌｇａｄｏ，Ｍａｎｕｅｌ  Ｓｅｖｉｌｌａｎｏ．“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｓｅｉｚｕｒｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃａｔ”Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒａｐｈｙ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．，  １９６１，Ｖｏｌ．１３，ｐ７２２-３３
【非特許文献７】Ｋｉｔａｍｕｒａ．Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＶＥＧＦ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ａｋｔ／ＰＫＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｇｉｒｄｉｎ”，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．１０，  Ｎｏ．３，  Ｍａｒｃｈ  ２００８，  ｐ３２９−３３７  ＆  ＳＵＰＰＬＥＭＥＮＴＡＲＹ  ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ，  ｐ１−７
【非特許文献８】Ｍａｓａｔｏ．Ａ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｓｉｍｉｌａｒ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ  Ｇｉｒｄｉｎ  ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ  ａｎｄ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｉｃｅ  ｉｎｄｉｃａｔｅ  ａ  ｃｒｕｃｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  Ｇｉｒｄｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｅｓｔｉｎ  ｌｉｎｅａｇｅ”，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０１２  Ｏｃｔ  ５；Ｖｏｌ．４２６（４）：ｐ５３３−８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、上記従来の問題を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、（１）マウスの給餌方法を変えることで、Ｇｉｒｄｉｎノックアウトの成獣マウスが得られること、（２）成獣マウスの観察の過程でＭＴＬＥを発症することが明らかとなり、更にマウスの脳組織分析の結果、Ｇｉｒｄｉｎノックアウトマウスは上記のＭＴＬＥ動物モデルに求められる条件を満たすこと、（３）Ｇｉｒｄｉｎノックアウトの成獣マウスが得られることで、ＭＴＬＥを抑制する物質のスクリーニング、及びＭＴＬＥを抑制する手法の選択が可能となること、（４）本発明により得られたＧｉｒｄｉｎノックアウトは生存期間が長いため、熟練の技術が不要で且つビデオ観察により、ＭＴＬＥを抑制する物質の長期間に渡るスクリーニング、及びＭＴＬＥを抑制する手法の長期間に渡る選択が可能となること、を新たに見出した。
【００１５】
すなわち、本発明の目的は、ノックアウトマウス、内側側頭葉てんかんを抑制する物質のスクリーニング方法、及び内側側頭葉てんかんを抑制する手法の選択方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、以下に示す、ノックアウトマウス、内側側頭葉てんかんを抑制する物質のスクリーニング方法、及び内側側頭葉てんかんを抑制する手法の選択方法に関する。
【００１７】
［１］少なくとも神経組織でＧｉｒｄｉｎ遺伝子の機能が失われ、且つ、以下の（１）及び（２）及び（３）の表現型を示し、
ゼリー状の餌で飼育する３０日齢以上のノックアウトマウス。
（１）海馬硬化をもつこと。
（２）海馬外の脳損傷が限定的であること。
（３）海馬起源といえる自発的なてんかんがあること。
［２］少なくとも神経組織でＧｉｒｄｉｎ遺伝子の機能が失われ、ゼリー状の餌で飼育する３０日齢以上のノックアウトマウス。
［３］上記［１］又は［２］に記載のノックアウトマウスに、
候補物質を投与する工程、
内側側頭葉てんかんを抑制する物質を選択する工程、
を含む内側側頭葉てんかんを抑制する物質のスクリーニング方法。
［４］上記［１］又は［２］に記載のノックアウトマウスに、
内側側頭葉てんかんを抑制する手法を実施する工程、
内側側頭葉てんかんを抑制する手法を選択する工程、
を含む内側側頭葉てんかんを抑制する手法の選択方法。
［５］前記内側側頭葉てんかんを抑制する物質を選択する工程が、
ノックアウトマウスをビデオ観察し、発作の発生頻度及び／又は発症程度の抑制により物質を選択する上記［３］に記載の内側側頭葉てんかんを抑制する物質のスクリーニング方法。
［６］前記内側側頭葉てんかんを抑制する手法を選択する工程が、
ノックアウトマウスをビデオ観察し、発作の発生頻度及び／又は発症程度の抑制により手法を選択する上記［４］に記載の内側側頭葉てんかんを抑制する手法の選択方法。
【発明の効果】
【００１８】
従来のＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスは、乳児期である生後２９日までしか生存することができなかったが、本発明のＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスは成獣として１年以上飼育することができた。したがって、Ｇｉｒｄｉｎノックアウトマウスを利用した様々な実験に用いることができる。
従来の薬剤や電撃による誘発マウスは、ＭＴＬＥの原因となる海馬以外も広く傷害してしまう欠点があったが、本発明のＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスは、ＭＴＬＥ動物モデルに求められる条件を全て満たしている。したがって、Ｇｉｒｄｉｎノックアウトマウスを、ＭＴＬＥを抑制する物質のスクリーニング、及びＭＴＬＥを抑制する手法の選択に使用することができる。
本発明のＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスは、Ｇｉｒｄｉｎ遺伝子の機能を失わせることでてんかんを発症するため、作製したマウスのてんかん発症メカニズムは同じである。そのため、作製したＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスの個体差による影響がほとんどないことから、てんかんを抑制する物質のスクリーニング、及びてんかんを抑制する手法の選択を効率化することかできる。
本発明のＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスは、生存期間が長いため、ＭＴＬＥを抑制する物質のスクリーニング、及びＭＴＬＥを抑制する手法の選択の効能を長期間に渡り観察することができる。
本発明のＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスは生存期間が長いことから、ビデオ観察によりＭＴＬＥを抑制する物質のスクリーニング、及びＭＴＬＥを抑制する手法の選択を行うことができ、脳波測定に要する熟練の技術と高価な測定システム及び解析システムを用いることなく、市販のビデオ装置を用いることができる。また、ビデオ撮影は脳波に比べて、睡眠、摂食、それ以外の行動を明確に区別して観察することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、非特許文献７のＦｉｇｕｒｅ  Ｓ５．Ｃに記載されているグラフで、図１（１）は、野生型（○印、Ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ、ｎ＝１４）、ヘテロ型（■印、Ｇｉｒｄｉｎ  ＋／−、ｎ＝３２）、ホモ型（◆印、Ｇｉｒｄｉｎ  −／−、Ｇｉｒｄｉｎノックアウトマウス、ｎ＝１７）の体重曲線を示し、図１（２）は、生存率を示している。
【図２】図２は、非特許文献８のＦｉｇ．４に記載されているグラフで、図２（１）は↓がＣｒｅ陽性かつホモｆｌｏｘ型、すなわちＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスの体重曲線を示し、△、●、▲はその他の核型マウスを示す。図２（２）は、図２（１）と同じシンボルで各核型のマウスの生存率を示している。
【図３】図３は、非特許文献７に記載されているＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスの遺伝子改変図を示している。
【図４】図４は、非特許文献８に記載されているＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスの遺伝子改変図を示している。
【図５】図５は、図面代用写真で、図５（１）は餌を切り替える前の給餌方法を示す写真で、図５（２）は餌を切り替えた後の給餌方法を示す写真である。
【図６】図６（１）は実施例２で飼育したＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスの体重曲線を示すグラフで、図６（２）は生存率を示すグラフである。
【図７】図７は、図面代用写真で、実施例２で飼育した、２８０日齢のＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスの写真である。
【図８】図８は、図面代用写真で、比較例１の方法で飼育した８日齢で死亡したＧｉｒｄｉｎノックアウトマウス（矢印）と同腹兄弟の写真である。
【図９】図９は、実施例４で作製したビデオ観察システムの概略を示す図である。
【図１０】図１０は、図面代用写真で、大発作の瞬間の動画像データから切り抜いた画像である。
【図１１】図１１は、図面代用写真で、図１１（１）は、実施例１及び野生型マウスの脳の矢状断パラフィン切片を、ＧＦＡＰ抗体を用いて免疫染色してヘマトキシリン核染色した切片の写真で、図１１（２）は、図１１（１）の□部分を拡大した写真である。
【図１２】図１２は、図面代用写真で、図１２（１）は、実施例２及び野生型マウスの脳の冠状断パラフィン切片を、ＧＦＡＰ抗体を用いて免疫染色してヘマトキシリン核染色した切片の写真で、図１２（２）は、図１２（１）の□部分を拡大した写真である。
【図１３】図１３は、マウスの頭蓋骨に電極（ＥＥＧ１、ＥＥＧ２、ＥＥＧ３）を埋めた位置を示す。
【図１４】図１４（１）は野生型の安静時、図１４（２）は実施例２のマウスの安静時、図１４（３）は実施例２のマウスの大発作時の脳波を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下に、本発明のノックアウトマウス、内側側頭葉てんかんを抑制する物質のスクリーニング方法、及び内側側頭葉てんかんを抑制する手法の選択方法について詳しく説明する。
【００２１】
先ず、本発明のＭＬＴＥ動物に求められる条件の内、
（１）「海馬硬化をもつこと」とは、内側側頭葉てんかんの病変の代表であり、海馬アンモン角の特にＣＡ１領域の錐体細胞層や、海馬歯状回顆粒細胞層で神経細胞脱落、活性化アストロサイトの増生を認めることを意味する。
（２）「海馬外の脳損傷が限定的であること」とは、ＧＦＡＰ抗体による染色で、活性化アストロサイトで特徴づけられる硬化が海馬外に無いこと、又は海馬外の硬化があっても、扁桃体や頭頂大脳皮質など海馬隣接部位であることを意味する。
（３）「海馬起源といえる自発的なてんかんがあること」とは、薬剤や電撃等による薬理的、物理的誘発無しでてんかん発作を起こすことを意味する。
【００２２】
本発明における「内側側頭葉てんかんを抑制する物質」、「内側側頭葉てんかんを抑制する手法」とは、内側側頭葉てんかんの発症を完全に抑制することのみならず、種々のレベルのてんかん発作の頻度及び／又はてんかんの症状を軽減する物質、手法を意味する。内側側頭葉てんかんを抑制する物質としては、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、抗体、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等を挙げることができる。また、前記物質は、経口投与、皮膚への貼着、又は注射等による体内投与等、ノックアウトマウスの体内に取り込まれるものであれば特に制限は無い。
【００２３】
内側側頭葉てんかんを抑制する手法としては、例えば、迷走神経刺激法（ＶＮＳ）などのようなてんかん発作治療法や、マッサージ、装具、生活習慣（食事量、食事の種類、運動等）に関する処置等が挙げられる。本発明のＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスを用いて、内側側頭葉てんかんを抑制する物質又は手法を夫々スクリーニングを行ってもよいし、物質及び手法を組合せてスクリーニングを行ってもよい。
【００２４】
マウス、ヒトのＧｉｒｄｉｎ遺伝子情報、ｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は公知である。例えば、マウスについては、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：ＣＣＤＣ８８Ａの遺伝子情報、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１７６８４１に記載のｃＤＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ５ＳＮＺ０に記載のアミノ酸配列情報を入手することができる。また、ヒトについては、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：ＣＣＤＣ８８Ａの遺伝子情報、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１８０８４．４に記載のｃＤＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ３Ｖ６Ｔ２に記載のアミノ酸配列情報を入手することができる。
【００２５】
Ｇｉｒｄｉｎ遺伝子の機能が失われたノックアウトマウスは、公知の方法で作製すればよく、例えば、以下の手順で作製すればよい。
（ａ）ノックアウトする遺伝子をマウスのゲノムから分離する。そして、その遺伝子と周辺部分を含む塩基配列を創り出すが、全く同じではなく、不活性化するように一部変更する。一般的には、観察可能な差異（色や蛍光など）をもたらすマーカー遺伝子を組み込むことで、一部変更を行う。
（ｂ）マウスの胚盤胞（初期のマウスの胚であり、球状の未分化細胞が胚体外細胞に囲まれている）由来の胚性幹細胞を分離する。胚性幹細胞は、例えば、白色マウスの胚性幹細胞を用い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞培養ができる。
（ｃ）上記（ｂ）で得られた胚性幹細胞に、上記（ａ）で作製した塩基配列を、電気穿孔法等の手段を用いて遺伝子導入する。次に、上記（ａ）で組み入れたマーカー遺伝子を利用し、実際に新しい塩基配列へ組換えを起こした胚性幹細胞（ヘテロ接合型）を分離する。
（ｄ）上記（ｃ）で分離した相同組換えを起こした胚性幹細胞を、例えば、グレー色のマウスの胚盤胞に注入し、当該胚盤胞は雌マウスの子宮に注入され、子マウスが出産される。この子マウスは、体の一部がオリジナルの胚盤胞に由来し、他の部分は遺伝子操作された細胞に由来する２つの細胞を含んだキメラになる。そのため、毛色は白とグレーのまだらになる。
（ｅ）新たに生まれたマウスのうち、生殖細胞（卵子もしくは精子）が、遺伝子操作された細胞由来のものだけが利用される。これらのマウスを白色マウスと掛け合わせると、全身が白色のマウスが生まれる。これらのマウスはまだ、機能的な遺伝子を１個以上持っている（ヘテロ接合型）が、同系交配によってオリジナルの機能的な遺伝子を持たない（すなわち、ホモ接合型の）マウスを創り出す。
【００２６】
図３は非特許文献７に記載されているＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスの遺伝子改変図を示しており、図４は非特許文献８に記載されているＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスの遺伝子改変図を示している。Ｇｉｒｄｉｎ遺伝子は３３個のＥｘｏｎで構成されており、遺伝子上流側のＥｘｏｎを改変することで、当該Ｅｘｏｎ以下の下流側の遺伝子の読み枠をずらすことでアミノ酸配列やストップコドンの位置を変更し、作製したマウスのＧｉｒｄｉｎの機能を失わせることができる。なお、図３及び図４に示す遺伝子改変図は単なる例示に過ぎず、例えば、Ｅｘｏｎ４、Ｅｘｏｎ５を改変したり、ＬａｃＺ遺伝子やＮｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子等のマーカー遺伝子をノックインする等、作製したマウスからＧｉｒｄｉｎの機能を失わせることができれば、Ｇｉｒｄｉｎ遺伝子の他の部分を改変してもよい。
【００２７】
本発明では、マウスの給餌方法を工夫することでＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスの成獣が得られることを新たに見出した。非特許文献７及び８に記載されているように、従来のＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスは、最長で２９日までしか飼育することができなかった。本発明者らは、従来の飼育ケージ天井の骨組みに固形状の餌を置く方法に換え、ゼリー状の餌を飼育ケージ内に置く方法を採用した。前記方法によりＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスの成獣が得られた原因は不明であるが、（１）育児中の親マウスが飼育ケージ天井の骨組みの餌を取って食べ、且つ授乳するというストレスが軽減すること、（２）ゼリー状の餌が飼育ケージ内に配置されていることから、Ｇｉｒｄｉｎノックアウトマウスの離乳から採餌までの過程がストレスなく移行できること、が要因ではと推測される。ゼリー状の餌としては、公知のマウス用の粉末状の餌を寒天で固めたものを用い、飼育ケージのおが屑上のプラスチック皿の上に配置しておけばよい。
【００２８】
内側側頭葉てんかんを抑制する物質のスクリーニングは、作製したＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスを飼育ケージに入れ、候補物質を含むゼリー状の餌を与える、又は餌とは別に注射等により体内に候補物質を投与し、ビデオ観察すればよい。なお、ビデオ観察システムは、公知のビデオ観察システムを用いればよいが、何日も２４時間連続観察するためには、暗視ができる観察システムを用いることが好ましい。
【００２９】
内側側頭葉てんかんを抑制する手法の選択方法は、作製したＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスを飼育ケージに入れ、迷走神経刺激法（ＶＮＳ）などのようなてんかん発作治療を実施、マッサージを実施、コルセット、音波や振動など刺激発生器等の装具を装着、生活習慣（食事量及び／又は種類の調整、運動の実施等）に関する療法を実施し、上記と同様にビデオ観察し、どの手法が効果を示すのか観察すればよい。物質のスクリーニングと併用する場合には、候補物質を投与しながら手法の選択を行えばよい。なお、内側側頭葉てんかんを抑制する物質のスクリーニング方法、及び内側側頭葉てんかんを抑制する手法の選択方法としては、上記のとおりビデオ観察を用いると２４時間連続観察を行うことができるが、ビデオ観察に限定はされない。本発明のＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスは１００％ＭＴＬＥを発症することから、候補物質を投与及び／又は内側側頭葉てんかんを抑制する手法を実施した後、病理組織観察、脳ＲＮＡ抽出・分析、赤外線ビームによる行動量測定などの方法により、内側側頭葉てんかんを抑制する物質のスクリーニング、及び内側側頭葉てんかんを抑制する手法の選択をしてもよい。
【００３０】
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
【実施例】
【００３１】
＜実施例１＞
［Ｇｉｒｄｉｎノックアウトマウスの作製］
上記非特許文献７に記載されている手順にしたがって、Ｇｉｒｄｉｎノックアウトマウスを作製した。
【００３２】
＜実施例２＞
上記非特許文献８に記載されている手順にしたがって、Ｇｉｒｄｉｎノックアウトマウスを作製した。
【００３３】
＜実施例３＞
［Ｇｉｒｄｉｎノックアウトマウスの飼育］
実施例１において、親マウスの出産後８日目に、それまで与えていた固形状の餌（日本クレア社製、ＣＬＥＡ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ  ＣＥ−２）から、以下の配合のゼリー状の餌に切り替えた。また、Ｇｉｒｄｉｎノックアウトマウスの離乳後は、そのまま同じゼリー状の餌を与え続けた。
【００３４】
・粉寒天（森田商店、型番７３０１７）：２３４ｇ
・粉末餌（日本クレア社、ＣＬＥＡ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ  ＣＡ−１）：２，７５４ｇ
・水道水：１８Ｌ
【００３５】
図５（１）は、餌を切り替える前の給餌方法を示す写真で、飼育ケージの外側に固形状の餌を置いた。また、図５（２）は、餌を切り替えた後の給餌方法を示す写真で、ゼリー状の餌を飼育ケージのおが屑の上のプラスチック皿の上に置いた。
【００３６】
図６（１）は、実施例３で飼育したＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスの体重曲線を示すグラフで、日数と共にマウスの体重は順調に増加した。また、図６（２）は生存率を示すグラフで、１２日目に１匹、１６日目に更に１匹が死亡したものの、それ以外のマウスは、成獣にまで成長した。
【００３７】
なお、実施例３と同様の手法で別途育てたＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスは、平成２６年９月３０日現在、１３０日齢で生存している。また、同様の手法で育てたさらに別のＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスの中には、３８２日齢、３５３日齢までそれぞれ健康に生きて実験のために屠殺されたマウスもいた。図７は、実施例３と同様の手法で育てた２８０日齢時点のＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスの写真である。
【００３８】
＜比較例１＞
実施例２のマウスを用い、親マウスが出産後も餌を切り替えずに固形状の餌を与え続けた以外は、実施例３と同様にＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスの飼育を行った。図８は、比較例１の方法で飼育した８日齢のマウスの写真である。写真に示すように、同腹兄弟は順調に生存していたが、矢印のＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスは、非常に小さい体で死亡しているのが確認された。また、他のＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスも、図２に示すとおり、生後１０日頃から体重がほとんど増加せず、２９日までに全ての死亡が確認された。
【００３９】
以上の結果より、給餌方法を調整することで、Ｇｉｒｄｉｎノックアウトマウスの成獣が得られることが明らかとなったので、非特許文献７及び８に記載されている実験目的の他、様々な実験にＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスを用いることができる。
また、飼育の過程で、Ｇｉｒｄｉｎノックアウトマウスが、ＭＴＬＥの症状を示したことから、以下に、ＭＴＬＥの症状についてより詳しく調べた。
【００４０】
＜実施例４＞
〔ＭＴＬＥを抑制する物質のスクリーニング及びＭＴＬＥを抑制する手法の選択用のビデオ監視システムの構築、並びにスクリーニング方法及び選択方法〕
次に、本発明のＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスを用い、ＭＴＬＥを抑制する物質のスクリーニング及びＭＴＬＥを抑制する手法の選択を行うためのビデオ観察システムを構築した。図９は、実施例４で作製したビデオ観察システムの概略を示す図である。
【００４１】
具体的には、ネットワークカメラ２台（Ｉ−Ｏ  ＤＡＴＡ社；型番ＴＳ−ＷＬＣ２及び型番ＴＳ−ＷＰＴＣＡＭ）、ＮＡＳ（Ｉ−Ｏ  ＤＡＴＡ社；型番ＨＤＬ−ＸＲ４．０）、ルーター（Ｉ−Ｏ  ＤＡＴＡ社；ＬＡＮ  Ｇｉｇａｂｉｔルーター  型番ＷＮ−ＡＣ１６００ＤＧＲ）、大容量ＨＤＤ（ＷＥＳＴＥＲＮＤＩＧＩＴＡＬ社；ＷＤ  Ｍｙ  Ｂｏｏｋ  ４．０ＴＢ  型番ＷＤＢＦＪＫ００４０ＨＢＫ−ＳＥＳＮ）、ハブ（ＥＬＥＣＯＭ社；ギガビットスイッチングＨＵＢ５ポートメタル  白  型番ＬＡＮ−ＧＳＷ０５Ｐ）を組み合わせて撮影装置を構築した。また故障時の遠隔再起動用に、リブーター（明京電機社；ＷＡＴＣＨ  ＢＯＯＴ  ｌｉｇｈｔ、型番  ＲＰＣ−Ｍ５Ｃ）を組み込んだ。マウスケージ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ社；マウス用  ＥＥＧ／ＥＭＧ測定ケージ  型番８２２８）にマウスを入れ、通気性のよい金網ケージをかぶせ、カメラをその内側に装着した。装置全体を動物飼育室に設置し、ＬＡＮケーブルを用いて学内ネットワークと接続し、ＶＰＮ（Ｖｉｒｔｕａｌ  Ｐｒｉｖａｔｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ）を通じて学内の実験室、あるいは学外からの画像解析やリブート（再起動）を可能にした。Ｇｉｒｄｉｎノックアウトマウスは、通常のマウス飼育条件である摂氏２５℃、１２時間点灯（９ＡＭ−９ＰＭ）、１２時間消灯（９ＰＭ−９ＡＭ）の照明サイクルのもとに置かれた。２台のカメラによる撮影は、Ｉ−Ｏ  ＤＡＴＡ社のブラウザー上のソフト（ＱＷＡＴＣＨ）を用いてコントロールし、連続撮影（Ｍａｎｕａｌ  ｆｉｌｅ）とマウスが動いた時だけ画像を蓄積する動体検知撮影（Ｅｖｅｎｔ  ｆｉｌｅ）の両方のモードを並列で撮影した。動体検知は感度を７０％、閾値７０に固定した。動体検知の感度を点灯時と消灯時で一定にするために２４時間赤外線による暗視モードで撮影した。すべてのファイルは大容量ＨＤＤに蓄積した。Ｍａｎｕａｌ  ｆｉｌｅ解析は、ノートパソコン（Ａｐｐｌｅ社  ＭａｃＢｏｏｋ  Ｐｒｏ  １５−ｉｎｃｈ，  Ｍｉｄ  ２０１，  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ  ２．８  ＧＨｚ  Ｉｎｔｅｌ  Ｃｏｒｅ  ｉ７，  ＭａｃＯＳＸ  Ｌｉｏｎ  １０．７．５）を用いて行った。画像ソフト  ＱｕｉｃｋＴｉｍｅ  Ｐｌａｙｅｒ  ７（Ａｐｐｌｅ社  ＯＳＸ用）を用い、大発作の場面は前後数十秒を含めてトリミングして別に保存し、発作時刻をリストにまとめた。Ｅｖｅｎｔ  ｆｉｌｅ解析は、ＶｉｄｅｏＬＡＮ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ社のフリーウェア  ＶＬＣ  ｍｅｄｉａ  ｐｌａｙｅｒ  （Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．１．４  Ｒｉｎｃｅｗｉｎｄ  ｉｎｔｅｌ  ６４ｂｉｔ）を用いて解析した。
【００４２】
実施例１及び２のＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスを、実施例３の手順により３３−２９０日齢まで飼育した。実施例１のＥｘｏｎ２を改変したＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスを８匹、実施例２のＥｘｏｎ３を改変したＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスを６匹、合計１４匹を実施例４で作製したビデオ監視システムのマウスケージに別々に入れ、常時カメラを稼働させ約半年間観察を行った。約半年の間で、全てのマウスで合計８７３回の大発作を撮影記録し、大発作に伴うさまざまな付帯条件（明期に多い、睡眠中に発症する、餌を摂食している間に発症するのは稀など）を発見した。図１０は、大発作の瞬間の動画像データから切り抜いた代表的な画像である。また、死の直前まで順調に餌を食べて元気でいたマウスが１０分近く続く大発作の末に死ぬ「てんかん重積死」の撮影にも成功した。
【００４３】
上記のとおり、実施例１及び実施例２のＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスは、１００％ＭＴＬＥの症状を示すことから、ＭＴＬＥを抑制する物質のスクリーニング、及びＭＴＬＥを抑制する手法の選択に用いることができる。ＭＴＬＥを抑制する物質のスクリーニングは、例えば、候補物質を餌に含ませ、実施例４で作製したビデオ観察システムを用いて、発作の発生頻度及び／又は発症程度を抑制するか否かを判断すればよい。ＭＴＬＥを抑制する手法の選択は、迷走神経刺激法（ＶＮＳ）などのようなてんかん発作治療を実施、マッサージを実施、コルセット、音波や振動など刺激発生器等の装具を装着、生活習慣（食事量及び／又は種類の調整、運動の実施等）に関する療法を実施した後、ビデオ観察システムを用いて、発作の発生頻度及び／又は発症程度を抑制するか否かを判断すればよい。
【００４４】
＜実施例５＞
〔ＭＴＬＥ動物モデルに求められる条件の確認〕
実施例４のビデオ観察により、本発明のＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスがＭＴＬＥを発症することが明らかとなったため、脳組織の分析を行った。分析には、実施例３に記載の方法で飼育した、生後数ヶ月の実施例１及び２のＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスを用い、以下の手順により行った。
【００４５】
＜脳組織の染色＞
成獣マウス脳を取り出し、常法により作製したパラフィン切片を抗ＧＦＡＰ抗体で染色して、ヘマトキシリンで核を染色した。また、対照として野生型のマウスについても、同様の手順で染色を行った。図１１（１）は、実施例１及び野生型マウスの脳の矢状断部分を染色した切片写真で、図１１（２）は、図１１（１）の□部分を拡大した写真である。図１２（１）は、同様の手順で実施例２及び野生型マウスの脳の冠状断部分を染色した切片写真で、図１２（２）は、図１２（１）の□部分を拡大した写真である。
【００４６】
図１１及び図１２に示す写真中、茶色のシグナルがＧＦＡＰで染まるアストロサイトを示している。実施例１及び２のいずれのタイプのＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスの成獣も、茶色のシグナルが海馬に集中し、海馬は肥大化していた。また、図１１（２）及び図１２（２）の拡大写真から、実施例１及び２のマウスには、野生型では見られないほど巨大で腫大化した突起をもつ活性化アストロサイトが見られた。これは、海馬硬化を示している。また、写真を観察した結果、海馬硬化は海馬に隣接する大脳皮質、扁桃体以外には認められなかった。
【００４７】
＜脳波の測定＞
実施例２の成獣マウス脳の頭頂頭皮を除去し、頭蓋骨に電極を埋め込み樹脂で固めた状態で脳波を測定した。図１３は、電極（ＥＥＧ１、ＥＥＧ２、ＥＥＧ３）を埋めた位置を示す。図１４（１）は野生型の安静時、図１４（２）は実施例２のマウスの安静時、図１４（３）は実施例２のマウスの大発作時の脳波を示す。その結果、実施例２のマウスでは、いずれの電極でも野生型には見られない高振幅の脳波が２４時間絶え間なく観察され、特に海馬直上にある電極（ＥＥＧ３）は最も大きい振幅を示した。このＥＥＧ３からは大発作に同期して背景に比べて高振幅、高周波の脳波（バースト）が観察され、病理組織が常に海馬を中心に病変が見られることを考え合わせれば、大発作は海馬を起源にした発作が全般化したものだと推定できる。
【００４８】
以上の＜脳組織の染色＞及び＜脳波の測定＞から明らかなように、本発明のＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスは、Ｆｅｌｉｘ  Ｒｏｓｅｎｏｗらが求める、
（１）海馬硬化をもつこと。
（２）海馬外の脳損傷が限定的であること。
（３）海馬起源といえる自発的なてんかんがあること。
との要件を満たすことが確認できた。
【００４９】
従来からＧｉｒｄｉｎノックアウトマウス自体は知られていたが、実施例４のビデオ観察及び実施例５の脳組織の分析及び脳波測定の結果より、ＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスがＭＴＬＥ動物モデルに求められる表現型を有することが、今回初めて明らかとなった。また、本発明のＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスは１００％ＭＴＬＥを発症することも明らかとなった。したがって、本発明で作製したＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスは、ＭＴＬＥを抑制する物質のスクリーニング、及びＭＴＬＥを抑制する手法の選択に極めて有用であることが確認された。更に、実施例３及び比較例１に示すように、給餌方法を変えることで、従来技術では存在しなかった３０日齢以上のＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスが得られることから、ＭＴＬＥを抑制する物質のスクリーニング、及びＭＴＬＥを抑制する手法の選択の他、様々な動物実験に用いることができる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明のＧｉｒｄｉｎノックアウトマウスは、ＭＴＬＥを抑制する物質のスクリーニング、及びＭＴＬＥを抑制する手法の選択用動物に求められる（１）海馬硬化をもつこと、（２）海馬外の脳損傷が限定的であること、（３）海馬起源といえる自発的なてんかんがあること、の全ての要件を満たし、且つ、３０日齢以上の成獣に飼育することができる。
したがって、ＭＴＬＥを抑制する物質のスクリーニング、及びＭＴＬＥを抑制する手法の選択の他、成獣を用いた実験に使用することができるので、大学、医療機関、製薬会社等におけるＭＴＬＥ治療薬や治療手法の開発に有用である。
【要約】      （修正有）【課題】内側側頭葉てんかんを抑制する物質及び／又は手法をスクリーニングするために用いられるノックアウトマウスの提供。【解決手段】Ｇｉｒｄｉｎ遺伝子の機能が失われ、且つ、以下の（１）〜（３）の表現型を示す内側側頭葉てんかんを抑制する物質及び／又は手法をスクリーニングするために用いられるノックアウトマウス。（１）海馬硬化をもつこと。（２）海馬外の脳損傷が限定的であること。（３）海馬起源といえる自発的なてんかんがあること。【選択図】図６【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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