(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＰＶ１６に感染している被験体において（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別する方法であって、前記被験体は組み込み型でＨＰＶ１６ゲノムを含んでおらず、以下のステップ：
ａ）前記被験体の試料中の、８８０＾２５８２の遺伝子産物量を決定し、
ｂ）ステップａ）で決定された量を基準量と比較し、及び
ｃ）（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別すること、
を含んでなる、前記方法。
【請求項２】
前記８８０＾２５８２の遺伝子産物が、８８０＾２５８２ジャンクションを含んでなるスプライスされた転写物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記転写物の量が、前記転写物を特異的に検出するプローブ・オリゴヌクレオチドを用いることによって決定される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記転写物の量の決定が、前記転写物を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドを用いて前記転写物を増幅するステップ、及び、増幅された転写物の量を決定するステップを含んでなる、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記８８０＾２５８２の遺伝子産物がポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
基準量より多い８８０＾２５８２の遺伝子産物量が、重症型のＨＰＶ１６感染を示唆する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
基準量より少ない８８０＾２５８２の遺伝子産物量が、軽症型のＨＰＶ１６感染を示唆する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ＨＰＶ１６に感染している被験体において（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別する方法であって、以下のステップ：
ａ１）前記被験体の試料中、８８０＾２５８２の遺伝子産物量を決定し、
ａ２）ステップａ１）で決定された量を基準量と比較し、
ｂ）前記被験体の試料において、ＨＰＶ１６ゲノムの組み込み状況を評価し、及び、
ｃ）（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別すること、
を含んでなる、前記方法。
【請求項９】
前記基準量が、（ｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染に罹患していることが知られている被験体から得られるか、又は（ｉｉ）重症型のＨＰＶ１６感染に罹患しているのが知られている被験体から得られる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ＨＰＶ１６に感染している被験体において（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別する方法であって、以下のステップ：
ａ）前記被験体の試料中の第１遺伝子産物量を決定し、ここで、前記第１遺伝子産物は、８８０＾２５８２の遺伝子産物であり、
ｂ）前記被験体の試料中の第２遺伝子産物量を決定し、ここで、前記第２遺伝子産物は、３６３２＾５６３９の遺伝子産物、８８０＾３３５８の遺伝子産物、Ａｐｍ１の遺伝子産物、Ｕｂｃの遺伝子産物、Ｕ１Ａの遺伝子産物、Ｅ１の遺伝子産物、Ｅ５の遺伝子産物、Ｌ１の遺伝子産物、及びＥ６*Ｉの遺伝子産物から成る群から選択され、
ｃ）ステップａ）で決定された前記第１遺伝子産物量とステップｂ）で決定された前記第２遺伝子産物量の比を計算し、
ｄ）ステップｃ）で計算された比を基準比と比較し、並びに、
ｅ）（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別すること、
を含んでなる、前記方法。
【請求項１１】
ＨＰＶ１６に感染している被験体において（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別する方法であって、以下のステップ：
ａ）前記被験体の試料中の第１遺伝子産物量を決定し、ここで、前記第１遺伝子産物は、Ｅ６*ＩＩの遺伝子産物であり、
ｂ）前記被験体の試料中の第２遺伝子産物量を決定し、ここで、前記第２遺伝子産物は、Ａｐｍ１の遺伝子産物、Ｕｂｃの遺伝子産物、Ｕ１Ａの遺伝子産物、８８０＾３３５８の遺伝子産物、８８０＾２７０９の遺伝子産物、及びＥ５の遺伝子産物から成る群から選択され、
ｃ）ステップａ）で決定された前記第１遺伝子産物量とステップｂ）で決定された前記第２遺伝子産物量の比を計算し、
ｄ）ステップｃ）で計算された比を基準比と比較し、並びに、
ｅ）（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別すること、
を含んでなる、前記方法。
【請求項１２】
前記遺伝子産物がポリペプチドであり、並びに、第１ポリペプチド量及び第２ポリペプチド量が、前記第１ポリペプチド及び前記第２ポリペプチドのそれぞれを特異的に検出する抗体を使用することによって決定される、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１遺伝子産物量の、前記第２遺伝子産物量に対する比が計算され、並びに、（ｉ）基準比より高い比が重症型のＨＰＶ１６感染を示唆し、及び／又は、（ｉｉ）基準比より低い比が軽症型のＨＰＶ１６感染を示唆する、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ＨＰＶ１６に感染している被験体において（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別する方法であって、以下のステップ：
ａ）第１の比を計算し、ここで、前記計算は、以下のステップ：
ａ１）前記被験体の試料中の第１遺伝子産物量を決定し、ここで、前記第１遺伝子産物は、８８０＾２５８２の遺伝子産物であり、
ａ２）前記被験体の試料中の第２遺伝子産物量を決定し、ここで、前記第２遺伝子産物は、３６３２＾５６３９の遺伝子産物、８８０＾３３５８の遺伝子産物、Ａｐｍ１の遺伝子産物、Ｕｂｃの遺伝子産物、Ｕ１Ａの遺伝子産物、Ｅ１の遺伝子産物、Ｅ５の遺伝子産物、Ｌ１の遺伝子産物及びＥ６*Ｉの遺伝子産物から成る群から選択され、並びに、
ａ３）ステップａ１）で決定された前記第１遺伝子産物量とステップａ２）で決定された前記第２遺伝子産物量との第１の比を計算すること
を含んでなり、
ｂ）第２の比を計算し、ここで、前記計算は、以下のステップ：
ｂ１）前記被験体の試料中の第３遺伝子産物量を決定し、ここで、前記第３遺伝子産物は、Ｅ６*ＩＩの遺伝子産物であり、
ｂ２）前記被験体の試料中の第４遺伝子産物量を決定し、ここで、前記第４遺伝子産物は、Ａｐｍ１の遺伝子産物、Ｕｂｃの遺伝子産物、Ｕ１Ａの遺伝子産物、８８０＾３３５８の遺伝子産物、８８０＾２７０９の遺伝子産物、及びＥ５の遺伝子産物から成る群から選択され、並びに、
ｂ３）ステップｂ１）で決定された前記第３遺伝子産物量とステップｂ２）で決定された前記第４遺伝子産物量との第２の比を計算すること
を含んでなり、
ｃ）ステップａ）で決定された前記第１の比を第１の基準比と比較し、及びステップｂ）で決定された前記第２の比を第２の基準比と比較し、並びに、
ｄ）（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別すること
を含んでなる、前記方法。
【請求項１５】
前記基準比が、（ｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染に罹患していることが知られている被験体から得られるか、又は（ｉｉ）重症型のＨＰＶ１６感染に罹患しているのが知られている被験体から得られる、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
軽症型のＨＰＶ１６感染が、ＮＩＬ／Ｍ又はＬＳＩＬとして細胞学的に分類されるＨＰＶ１６感染の形態であり、重症型のＨＰＶ１６感染が、ＨＳＩＬ又は癌として細胞学的に分類されるＨＰＶ１６感染の形態であるか、或いは、
軽症型のＨＰＶ１６感染が、正常な子宮頚部組織又はＣＩＮ１として組織学的に分類されるＨＰＶ１６感染の形態であり、重症型のＨＰＶ１６感染が、ＣＩＮ２若しくはＣＩＮ３又は癌として組織学的に分類されるＨＰＶ１６感染の形態である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
プローブ・オリゴヌクレオチド混合物を含んでなる組成物であって、ここで、前記プローブ・オリゴヌクレオチド混合物が、請求項１０又は１１に記載の第１遺伝子産物を特異的に検出するプローブ・オリゴヌクレオチド、及び、請求項１０又は１１に記載の第２遺伝子産物を特異的に検出するプローブ・オリゴヌクレオチドを含んでなり、ここで、前記第１遺伝子産物及び第２遺伝子産物が転写物である、前記組成物。
【請求項１８】
ＨＰＶ１６に感染している被験体において（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別するための装置であって、８８０＾２５８２の遺伝子産物量を決定するための手段、及び前記量を基準量と比較するための手段を含んでなり、（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別することを可能にする、前記装置。
【請求項１９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法を実施するために適したキットであって、前記方法を実施するための使用説明書、並びに８８０＾２５８２の遺伝子産物量を決定するための手段、及び前記量を基準量と比較するための手段を含んでなり、（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別することを可能にする、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト・パピローマウイルス１６（ＨＰＶ１６）を患っている被験体において、試料中の単一の遺伝子産物（複数の遺伝子産物）の量の決定に基づいて（ｉ）重症型ＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型ＨＰＶ１６感染を判別する方法に関する。オリゴヌクレオチド混合物を含んでなる組成物が、本発明によってさらに想定される。本発明の方法を実施するために適合されたキット及び装置もまた、本発明によって想定される。
【背景技術】
【０００２】
子宮頚部の癌（ＣｘＣａ）は、世界の女性の間で２番目に多い悪性腫瘍であり、最も一般的なタイプであるＨＰＶ１６を含めた高リスク・ヒト・パピローマウイルスによって引き起こされる。先進国では、従来の細胞学的スクリーニングプログラムがこの種の癌の発症を実質的に減少させている。しかしながら、これらの細胞学的スクリーニングプログラムには、いくつかの欠点がある。
【０００３】
Ｐａｐ検査と呼ばれることも多いパパニコロー（Papanicolaou）検査は、子宮頚部における前癌状態及び悪性病変の検出のために設計された診断法である。パパニコロー検査のために、試料は子宮頚部から得られ、そして悪性又は前癌状態の細胞を示している細胞形態の変化に関して光学顕微鏡検査によってスクリーニングされる。そして、観察された病変の重症度によって試料が分類される。しかしながら、子宮頚部細胞診による診断は主観的方法であるので、その質はサービスを提供する研究所の基準に依存する。それ自体、病変分類が十分に再現可能なものではなく、そして膣鏡検査と比較して低い感度のものである（Baldwin, P., R. Laskey, and N. Coleman. 2003. Translational approaches to improving cervical screening. Nat Rev Cancer 3:217-26）。さらに、偽陽性の結果によって、多数の患者が余分な治療を受けている。
【０００４】
ここ２０年間の間に、ＨＰＶのためのさまざまな新しい診断検査が開発された。これらの方法は、ウイルスマーカー、分子マーカー及び生化学的マーカー、例えばＨＰＶタンパク質、ＤＮＡ及びＲＮＡなどの検出に基づいている。
【０００５】
ＦＤＡによって承認されたＨｙｂｒｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ ＩＩ Ｔｅｓｔ Ｓｙｓｔｅｍ（ＨＣ２）（旧Digene Corp., USA, now Qiagen, Germany）は臨床診療におけるＨＰＶ ＤＮＡ検査の優れた標準法であると見なされるが、しかしながら、それはいくつかの不都合な点を示す：ａ）遺伝子型決定を実施せずに、代わりに、ＨＰＶ感染が単に「低リスク」又は「高リスク」群に起因すると考える、ｂ）多重感染を特定できない、ｃ）それは、ＨＰＶ検出に関してＰＣＲベースの方法ほど高感度ではない（Birner et al. 2001. Mod. Pathol. 14:702-709）、及びｄ）それは、子宮頚部前癌病変と癌リスクの予測に関して中程度にしか特異的ではない。そのうちのいくつかは臨床的エンドポイントに関して非特異的であり、それは非発癌性ＨＰＶ遺伝子型との交差性によるものとみなされ得る（Castle, P. E., D. Solomon, C. M. Wheeler, P. E. Gravitt, S. Wacholder及びM. Schiffman. 2008. Human papillomavirus genotype specificity of hybrid capture 2. J Clin Microbiol 46:2595-604）。さらに、それは、被験体がＨＰＶに感染しているか否かの評価を可能にするだけである。この検査は、ＨＰＶ感染の重症度の評価を可能にすることはない。よって、ＨＰＶが診断された時点で、追加の検査が必要とされる。
【０００６】
ＨＰＶ感染のより正確な検出を可能にするいくつかのＰＣＲベースの方法がここ数年の間に開発された。これらのＰＣＲシステムの大部分が、ＨＰＶゲノムの高度に保存された領域、例えばＬ１領域内に結合するコンセンサス又は汎用プライマーを使用する。増幅されたＰＣＲ産物は、次に、特定の粘膜ＨＰＶ遺伝子型を特定するためにさらなる分析（例えば、配列決定、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析又はハイブリダイゼーション）にかけられる。経時的コホートの研究は、Ｐａｐ−ＨＰＶ併用検査が単独の細胞学的検査に比べてＣＩＮ３に対してより高い感度を示し、且つ、（両検査の正常な結果を得た女性の間での）より良好な長期保護を予測することを明らかにした（Bulkmans, N. W., J. Berkhof, L. Rozendaal, F. J. van Kemenade, A. J. Boeke, S. Bulk, F. J. Voorhorst, R. H. Verheijen, K. van Groningen, M. E. Boon, W. Ruitinga, M. van Ballegooijen, P. J. Snijders, and C. J. Meijer. 2007. Human papillomavirus DNA testing for the detection of cervical intraepithelial neoplasia grade 3 and cancer: 5-year follow-up of a randomised controlled implementation trial. Lancet 370:1764-72、Hoyer, H., C. Scheungraber, R. Kuehne-Heid, K. Teller, C. Greinke, S. Leistritz, B. Ludwig, M. Durst, and A. Schneider. 2005. Cumulative 5-year diagnoses of CIN2, CIN3 or cervical cancer after concurrent high-risk HPV and cytology testing in a primary screening setting. Int J Cancer 116:136-43）。しかしながら、ＨＰＶ ＰＣＲ検査の高感度はまた、臨床的に関連していない感染又は消退病変の同定につながる。そのため、個々の高リスクＨＰＶ ＤＮＡ陽性の結果に関して、進行性病変の存在又は子宮頚癌の発症に関する陽性適中率（ＰＰＶ）は低くなった。その結果生じた、検査で陽性であったが疾患陰性の診断の多くが、関係した女性に過剰処置、追加費用、及び大きな懸念を与えた（International Agency for Research on Cancer. 2005. Cervix Cancer Screening. IARC Press, Lyon）。
【０００７】
ＨＰＶ ＤＮＡ検査とは異なり、ＲＮＡ検出は転写活性のあるウイルスの同定と分析を可能にする。ＤＮＡ及び細胞形態は別として、ＲＮＡもまた保存する子宮頚部塗抹標本の保存媒質の最近の導入が、ＲＮＡ検出法の開発を促進した。これまでに、２種類の市販のＨＰＶ ＲＮＡ検出アッセイ：ｉ）ｈｒＨＰＶタイプ１６、１８、３１、３３、及び４５からのＥ６及びＥ７配列（Ｅ６／Ｅ７）を標的として初期完全長ｍＲＮＡを検出するＢｉｏｍｅｒｉｅｕｘ（旧ＮｏｒＣｈｉｐ）製のＰｒｅＴｅｃｔ ＨＰＶ Ｐｒｏｏｆｅｒ（登録商標）、及びｉｉ）ＧｅｎＰｒｏｂｅ製の広範囲のＥ６／Ｅ７完全長ｍＲＮＡ増幅法であるＡｐｔｉｍａ（登録商標）ＨＰＶ検査が導入された。これらの検査からの限られたデータは、ＨＰＶ ＤＮＡ単独よりむしろ完全長ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡに関する検査がわずかにだけ子宮頚癌の発症及びその前兆に関するＰＰＶを上げる一方でそれと同時に、感度そしてそれによる陰性適中率（ＮＰＶ）を下げることを示す（Cuschieri, K. S., M. J. Whitley, and H. A. Cubie. 2004. Human papillomavirus type specific DNA and RNA persistence--implications for cervical disease progression and monitoring. J Med Virol 73:65-70）。これらの技術の主な不都合は、それらが単一の完全長ウイルス癌遺伝子転写物の定性的決定のみにより疾患を予測できないことである。さらに、子宮頚部塗抹標本は、これらの技術によってそれを制御できない異なる量のＨＰＶ感染細胞を含み得る。
【０００８】
子宮頚癌の発症は、宿主細胞の染色体内へのＨＰＶゲノムの組み込みと密接に関連する。低グレードの病変では、ＨＰＶゲノムの大部分が、エピソーム状態で存在しているが、それに対して、高グレードの病変及び癌腫は、ＨＰＶゲノムが宿主ゲノム内に組み込まれ得る。しかしながら、すべての子宮頚癌においてではないが、ＨＰＶゲノムが組み込み型で存在していることが実証された（Vinokurova, S., N. Wentzensen, I. Kraus, R. Klaes, C. Driesch, P. Melsheimer, F. Kisseljov, M. Durst, A. Schneider, and M. von Knebel Doeberitz. 2008. Type-dependent integration frequency of human papillomavirus genomes in cervical lesions. Cancer Res 68:307-13.）。宿主ゲノム内へのＨＰＶ１６ゲノムの組み込みは、子宮頚部癌患者の約６０％に見られただけである。よって、ＨＰＶゲノムの組み込み状況のみを決定する診断手段は、リスク層別化に関して信頼できない。
【０００９】
膣鏡検査は、子宮頚部及び膣を観察することができる。この外観検査によって、これらの領域における多くの前癌状態の病変及び悪性病変が検出できる。この高い信頼性のため、膣鏡検査は、子宮頚部疾患を診断するための優れた標準法であると見なされている。しかしながら、この診断法は、コスト及び時間がかかる。膣鏡検査は、高度に訓練された人材を必要とし、且つ、侵襲的手技（その後の組織学的分析を伴った生検）を伴うことが多い。その結果、膣鏡検査を、子宮頚癌前兆スクリーニングプログラムには使用できない。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の基礎となる技術的問題点は、上述した欠点なしにＨＰＶ１６感染の軽症型と重症型を効率的、且つ、確実に判別する手段及び方法の提供と考えることもできる。さらに、手段及び方法は、ゲノム内に組み込まれたＨＰＶゲノムを持たない被験体の確実なリスク層別化に必要である。前記技術的問題点は、請求項及び本明細書中で以下に特徴づけた実施形態によって解決される。
【００１１】
従って、本発明は、ＨＰＶ１６に感染している被験体において（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別する方法であって、以下のステップ：
ａ）前記被験体の試料中の第１遺伝子産物量を決定し、ここで、前記第１遺伝子産物は、８８０＾２５８２の遺伝子産物であり、
ｂ）前記被験体の試料中の第２遺伝子産物量を決定し、ここで、前記第２遺伝子産物は、３６３２＾５６３９の遺伝子産物、８８０＾３３５８の遺伝子産物、Ａｐｍ１の遺伝子産物、Ｕｂｃの遺伝子産物、Ｕ１Ａの遺伝子産物、Ｅ１の遺伝子産物、Ｅ５の遺伝子産物、Ｌ１の遺伝子産物、及びＥ６*Ｉの遺伝子産物から成る群から選択され、
ｃ）ステップａ）で決定した前記第１遺伝子産物量とステップｂ）で決定した前記前記第２遺伝子産物量の比を計算し、
ｄ）ステップｃ）で計算した比を基準比と比較し、並びに、
ｅ）（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別すること、
を含んでなる方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＨＰＶ１６のゲノム構成、オープン・リーディング・フレーム、及び転写物種。ＯＲＦを、長方形（図の上部）としてそれらの固有のリーディング・フレームで示す。長方形の上部左隅の最初の数字は、最初のＡＴＧのヌクレオチド（ｎｔ）位置に対応している。それぞれのＯＲＦの終止コドンにおける最後のｎｔの位置を、長方形の上部右隅に表示している。ゲノムスケールの下に位置しているのは、スプライスされたｍＲＮＡ種のダイヤグラムである。エクソンを黒い長方形で例示し、同時にイントロンを黒い細線で示した。その線の下に表示した数字は、５’及び３’スプライスジャンクションの位置を示す。転写物種Ｏのプロモーターをマッピングしなかった。完全長Ｅ１タンパク質をコードする転写物を描いていない。Ｅ６及びＥ１の可能性のある、切断型遺伝子産物をアスタリスク（*）によって示し、Ｅ１とＥ４タンパク質の融合産物をＥ１＾Ｅ４と示す。Zheng, Z. M., and C. C. Baker. 2006. Papillomavirus genome structure, expression, and post-transcriptional regulation. Front Biosci 11:2286-302からの変法。
【図２】Ｑ‐ＲＮＡ量に対するｗｔ／ｑ‐ＲＮＡ比の依存度。ＮＡＳＢＡ反応あたり１０００〜１０００００コピー数の範囲にわたるＱ‐ＲＮＡを、Ｅ６*Ｉ ｗｔ‐ＲＮＡ希釈系列内に加え、ＮＡＳＢＡによって増幅し、そしてＬｕｍｉｎｅｘハイブリダイゼーションを使用して検出した。点線として表示したカットオフを、以下のとおり計算した：各プローブに関して、ハイブリダイゼーション混合物にアンプライマーを加えなかった反応におけるＭＦＩ値をバックグラウンド値と見なした。ハイブリダイズしたアンプライマーの正味のＭＦＩ値を、総ＭＦＩ値からの中央バックグラウンド値の１．１倍の引き算によって計算した。３ＭＦＩを上回る正味のＭＦＩ値を、陽性反応と規定した。２つのハイブリダイゼーション反応の標準誤差を示す。カーブ・スロープをより見やすくするために、データ点の間の線を加えた。
【図３】ＳｉＨａの全ＲＮＡを使用したＥ７のＮＡＳＢＡの検出限界。ＳｉＨａの全ＲＮＡの希釈系列を、ＮＡＳＢＡ反応あたり１００００個のＱ‐ＲＮＡ分子を使用したＥ７のＮＡＳＢＡ‐Ｌｕｍｉｎｅｘ分析にかけた。２つのハイブリダイゼーション反応の平均及び標準誤差を示す。カーブ・スロープをより見やすくするために、データ点の間の線を加えた。
【図４】Ｅ６*Ｉと*ＩＩ対Ｅ６ｆｌ発現のパターン。転写物Ｅ６*Ｉ（Ａ）、及び*ＩＩ（Ｂ）対Ｅ６ｆｌの比をＹ軸上にプロットし、そして細胞学的病変グレード及び病変群をＸ軸上に示す。点線は中央値を表す。
【図５】細胞転写物を用いたＥ６*ＩＩ発現の標準化。Ｅ６*ＩＩ対細胞転写物の比をＹ軸上にプロットし、そして細胞学的病変グレード並び病変群をＸ軸上に示す。点線は中央値を表す。
【図６】Ｅ６*ＩＩ対８８０＾３３５８、及びＥ６ｆｌ対Ｅ５ｆｌ発現のパターン。Ｅ６*ＩＩ対８８０＾３３５８（左側）及びＥ６ｆｌ対Ｅ５ｆｌ（右側）の比をＹ軸上にプロットし、そして細胞学的病変グレード及び病変群をＸ軸上に示す。点線は中央値を表す。
【図７】優れた標準法としての細胞診と比較したＢｉｏｍｅｒｉｅｕｘ ＨＰＶキット及びＤＫＦＺ ＮＡＳＢＡ‐Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイの性能。
【図８】患者の分類のためのスキーム。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の方法は、好ましくは、試験管内における方法である。さらに、それは、先に明確に言及したステップに加えて複数のステップを含み得る。一例を挙げれば、さらなるステップは、試料の前処理過程又は本方法によって得られた結果の評価に関連してもよい。本発明の方法は、ＨＰＶ１６に感染している被験体におけるＨＰＶ１６感染の軽症型と重症型を判別するために使用されことが好ましい。しかしながら、本発明の方法はさらに、前記被験体のモニタリング、確認、及び下位分類に使用することもできる。その方法は、手作業で実施されることもでき、自動化によって補助されることもできる。好ましくは、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、及び／又は（ｅ）は、全体又は一部が、自動化によって、例えばステップ（ａ）及び（ｂ）における決定に好適なロボット及びセンサー機器、ステップ（ｅ）におけるコンピューターに実装された計算ステップ又はステップ（ｄ）におけるコンピューターに実装された比較によって、補助されることもできる。
【００１４】
本明細書中で使用する「判別する」という用語は、（ｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）重症型のＨＰＶ１６感染を見分けることを意味する。本明細書中で使用する前記用語は、ＨＰＶ１６感染の軽症型と重症型を示差的に診断／検出することを包含するのが好ましい。
【００１５】
当業者には当然のことながら、通常、前記判別が、分析される被験体の１００％について正確であることを意図していない。しかしながら、前記用語は、評価が、分析される被験体のうちの統計的に有意な割合について有効であることを必要とする。割合が統計的に有意であるかどうかは、様々な周知の統計値評価ツール、例えば信頼区間の決定、ｐ値決定、スチューデントｔ‐検定である、マン・ホイットニー検定など、を使用することで余分な手間をかけることなく当業者によって判断されることができる。詳細は、Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983に記載されている。好ましい信頼区間は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％である。ｐ値は、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、又は０．００１であることが好ましい。好ましくは、本発明によって想定される確率は、判別が所定のコホートの被験体のうちの少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％で正しいことを見込んでいる。
【００１６】
本明細書中で使用する「被験体」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、そしてより好ましくはヒトに関する。しかしながら、被験体がＨＰＶ１６に感染していなければならないということが、本発明の前記方法に従って想定される。被験体がＨＰＶ１６に感染しているか否かを評価するための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、ＨＰＶ１６感染は、サザン及びドット・ブロット・ハイブリダイゼーション、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる被験体の試料中のＨＰＶ１６ ＤＮＡの遺伝子型決定、シグナル増幅アッセイ、又は様々なＰＣＲ法によって評価できる（Molijn, A., B. Kleter, W. Quint, and L. J. van Doorn. 2005. Molecular diagnosis of human papillomavirus (HPV) infections. J Clin Virol 32 Suppl 1:S43-51）。
【００１７】
ヒト・パピローマウイルスは、皮膚や粘膜に感染するＤＮＡウイルスである。１００を超えるＨＰＶ遺伝子型が記載されている（de Villiers, E. M., C. Fauquet, T. R. Broker, H. U. Bernard, and H. zur Hausen. 2004. Classification of papillomaviruses. Virology 324:17-27）。ＨＰＶ１６は高リスクＨＰＶ遺伝子型に属し、そして子宮頚癌の発症の主原因である。ＨＰＶ１６は外陰部、肛門、腟、陰茎、及び口咽頭の癌、並びに腟上皮内新生物、肛門上皮内新生物、外陰部上皮内新生物、及び陰茎上皮内新生物を引き起こすことも知られている。
【００１８】
ＨＰＶゲノムは、約７９０６塩基対（ｂｐ）の二本鎖であって、閉じた環状ＤＮＡの単一分子から成る。ＨＰＶ１６ゲノムの核酸配列であるＨＰＶ１６Ｒを配列番号１に示す（例えば、Myers, G., H. Delius, J. Icenogle, H. U. Bernard, M. Favre, M. van Ranst, and C. M. Wheeler. 1997. Human papillomaviruses 1997: a compilation and analysis of nucleic acid and amino acid sequences. Theoretical Biology and Biophysics, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, N.Mex.を参照のこと）。３つのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）が一本鎖上で見つかっている。３つの機能領域、長調節領域（ＬＣＲ）、並びに「初期」及び「後期」転写領域が規定されている。ＬＣＲは、ＤＮＡ複製及び転写の調整に関与する長さ８５０ｂｐの非コード上流領域である。それは、ウイルスＥ２及び他の細胞転写因子のためのいくつかの結合部位、並びにウイルスＥ１複製タンパク質のための結合部位を含んでいる。さらに、それは、サイレンサー及びエンハンサー配列を含み、そしてＥ６ ＯＲＦ付近にｐ９７コアプロモーターを持っている；それはウイルスゲノムの中でも変化の度合いが最も大きい領域である。「初期」領域は、ＯＲＦ Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、及びＥ７から成り、前記領域はウイルス複製と細胞の形質転換に関わる。「後期」領域は、ウイルスカプシドを形成するＬ１及びＬ２構造タンパク質をコードする。「初期」タンパク質の中でも、悪性疾患に関する２種類の最重要ＨＰＶタンパク質がＥ６及びＥ７であり、それらは正常状態から不死状態への細胞の形質転換に対して相乗的に作用する。ＨＰＶ１６トランスクリプトームが少なくとも１１個の別個のスプライスジャンクションをもたらす（ＨＰＶ１６Ｒ基準ゲノムの２２６、８８０、１３０２及び３６３２位のヌクレオチドにおける）いくつかのスプライス供与部位と、（ＨＰＶ１６Ｒ基準ゲノムの４０９、５２６、７４２、２５８２、２７０９、３３５８、及び５６３９位のヌクレオチドにおける）スプライス受容部位を示すことが、当該技術分野で知られている（Baker, C., and C. Calef. 1996. Maps of papillomavirus mRNA transcripts. Los Alamos National Laboratories, Los Alamos, NM, USA.; Zheng, Z. M., and C. C. Baker. 2006. Papillomavirus genome structure, expression, and post-transcriptional regulation. Front Biosci 11:2286-302.）。スプライシング産物は、産物を作り出すために使用されるスプライス供与部位と受容部位に基づいて、本明細書中において特徴づけられる。それぞれのスプライス供与部位と受容部位を「＾」によって区切っている。
【００１９】
ＨＰＶ１６の感染が様々な兆候により下位分類されることは、当該技術分野で知られている。子宮頚癌は、子宮頚部上皮内新生物１〜３（ＣＩＮ１〜ＣＩＮ３）として組織学的に分類される一連の明確に定義された病期を経た持続性ＨＰＶ感染領域から発症する。ＨＰＶ進行の病期はさらに、低グレード及び高グレードの扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ及びＨＳＩＬ）として細胞学的に知られている。ＬＳＩＬはＣＩＮ１と同等であり得る一方、ＣＩＮ２及びＣＩＮ３は、好ましくはＨＳＩＬと同等である。ＨＰＶ１６の初期感染は、上皮の下部三分の一における正常分化の阻害によって現れるＣＩＮ１の発症を引き起こし得る。免疫が保たれている人では、これらの病変の大部分は、おそらく細胞性免疫能によって媒介されて自然消退する。しかしながら、一部の人では、例えば遺伝性又は誘発性免疫不全により、ＨＰＶ１６の感染が持続する、及びＣＩＮ１病変がＣＩＮ２病変に進行するリスクがある。ＣＩＮ２病変はさらに、高い消退率を示すが、しかしながら、ＣＩＮ２病変はさらに、癌腫（上皮内癌腫はもちろん、さらには浸潤性癌腫）に進行することがある高グレードの疾患（ＣＩＮ３）に進行することもある。
【００２０】
本明細書中で意味する「軽症型のＨＰＶ感染」は、好ましくは、正常な子宮頚部組織又はＣＩＮ１（最小限若しくは軽症の子宮頚部形成異常）として組織学的に分類されるか、あるいは、ＮＩＬ／Ｍ（上皮内病変又は悪性腫瘍に関して陰性）又はＬＳＩＬ（低グレードの扁平上皮内病変）として細胞学的に分類されるＨＰＶ感染の形態を指す。よって、ＨＰＶ感染の軽症型は、好ましくは、良性子宮頚部病変を包含し、よって軽症グレードのＨＰＶ病変を包含する（総説のためにSmith, J. H. 2002. Bethesda 2001. Cytopathology 13:4-10を参照のこと）。
【００２１】
本明細書中で意味する「重症型のＨＰＶ感染」は、好ましくは、ＣＩＮ２（中程度の子宮頚部上皮形成異常）若しくはＣＩＮ３（重度の子宮頚部形成異常）又は癌（上皮内又は浸潤性）として組織学的に分類されるＨＰＶ感染の形態を指す。従って、「重症型のＨＰＶ１６感染」という用語は、好ましくは、ＨＳＩＬ又は癌として細胞学的に分類されるＨＰＶ１６感染の形態を指す。よって、重症型のＨＰＶ感染は、好ましくは、悪性子宮頚部病変を包含し、よって高グレードのＨＰＶ病変を包含する（総説のためにSmith, J. H. 2002. Bethesda 2001. Cytopathology 13:4-10を参照のこと）。
【００２２】
試料は、周知の技術で入手でき、且つ、本明細書中で言及した遺伝子産物を発現する若しくは産生するそれらの細胞、組織又は臓器からの試料を含む。好ましくは、試料は、泌尿生殖管又は口咽頭管からかき取るか又は生検採取する。そういった試料は、ブラシ、（綿）スワブ、スパチュラ、すすぎ／洗浄液、パンチ生検採取装置、針若しくは外科用器具類を用いた空洞穿刺の使用によって入手できる。好ましくは、かき取ったものは、粘膜細胞を含む。より好ましくは、試料は、子宮頚部塗抹標本又はＰａｐ塗抹標本である。分離された細胞は、例えば濾過、遠心分離若しくは細胞選別などの分離技術によって体液又は組織若しくは臓器から得ることもできる。さらに、試料は、本明細書中で言及した遺伝子産物をさらに濃縮及び／又は精製するために、周知の方法によってさらに処理されてもよい。遺伝子産物の更なる加工は、遺伝子産物の性質、すなわち、遺伝子産物がポリペプチドであるか、ＲＮＡ分子であるかに依存することが好ましい。好ましくは、遺伝子産物がポリペプチドであれば、ポリペプチドは、当業者で周知の方法によって濃縮及び／又は精製される。好ましくは、遺伝子産物がｍＲＮＡ分子であれば、前記ＲＮＡ分子は、当該技術分野で周知の方法によって濃縮及び／又は精製されてもよい。
【００２３】
本明細書中で使用する「遺伝子産物」という用語は、好ましくは、転写物に関連し、よってｍＲＮＡ若しくはポリペプチドに関連する。
【００２４】
前記方法は、第１遺伝子産物量と第２遺伝子産物量の比の計算を含んでなる。比の計算に使用される少なくとも一方の量が、ＨＰＶ１６のスプライスされたｍＲＮＡ（又は前記スプライスされたｍＲＮＡによってコードされるポリペプチド）の量である。本明細書中で以下に記載するとおり、ＨＰＶ１６のスプライスされたｍＲＮＡ（又は前記スプライスされたｍＲＮＡによってコードされるポリペプチド）の量の決定が、軽症型と重症型のＨＰＶ感染を判別するために特に有益である。
【００２５】
前記方法は、好ましくは、以下の比：８８０＾２５８２（好ましくはＨＰＶ１６Ｒの８８０＾２５８２スプライスされたｍＲＮＡ）の遺伝子産物量と３６３２＾５６３９（好ましくはＨＰＶ１６Ｒの３６３２＾５６３９スプライスされたｍＲＮＡ）の遺伝子産物量の比、又は８８０＾２５８２（好ましくはＨＰＶ１６Ｒの８８０＾２５８２スプライスされたｍＲＮＡ）の遺伝子産物量と８８０＾３３５８（好ましくはＨＰＶ１６Ｒの８８０＾３３５８スプライスされたｍＲＮＡ）の遺伝子産物量の比、又は８８０＾２５８２（好ましくはＨＰＶ１６Ｒの８８０＾２５８２スプライスされたｍＲＮＡ）の遺伝子産物量とＡｐｍ１（好ましくはＡｐｍ１ ｍＲＮＡ）の遺伝子産物量の比、又は８８０＾２５８２（好ましくはＨＰＶ１６Ｒの８８０＾２５８２スプライスされたｍＲＮＡ）の遺伝子産物量とユビキチンＣ（Ｕｂｃ）（好ましくはＵｂｃ ｍＲＮＡ）の遺伝子産物量の比、又は８８０＾２５８２（好ましくはＨＰＶ１６Ｒの８８０＾２５８２スプライスされたｍＲＮＡ）の遺伝子産物量とＵ１Ａ（好ましくはＵ１Ａ ｍＲＮＡ）の遺伝子産物量の比、又は８８０＾２５８２（好ましくはＨＰＶ１６Ｒの８８０＾２５８２スプライスされたｍＲＮＡ）の遺伝子産物量とＥ１（好ましくはＨＰＶ１６ＲのＥ１の完全長ｍＲＮＡ）の遺伝子産物量の比、又は８８０＾２５８２（好ましくはＨＰＶ１６Ｒの８８０＾２５８２スプライスされたｍＲＮＡ）の遺伝子産物量とＥ５（好ましくはＨＰＶ１６ＲのＥ５の完全長ｍＲＮＡ）の遺伝子産物量の比、又は８８０＾２５８２（好ましくはＨＰＶ１６Ｒの８８０＾２５８２スプライスされたｍＲＮＡ）の遺伝子産物量とＬ１（好ましくはＨＰＶ１６ＲのＬ１の完全長ｍＲＮＡ）の遺伝子産物量の比、又は８８０＾２５８２（好ましくはＨＰＶ１６Ｒの８８０＾２５８２スプライスされたｍＲＮＡ）の遺伝子産物量と２２６＾４０９（好ましくはＨＰＶ１６Ｒの２２６＾４０９スプライスされたｍＲＮＡ（Ｅ６*Ｉ））の遺伝子産物量の比の決定を想定する。
【００２６】
本発明の前記方法との関連において第１遺伝子産物は、好ましくは、８８０＾２５８２の遺伝子産物である。好ましくは、「８８０＾２５８２の遺伝子産物」という用語は、ＨＰＶ１６Ｒの８８０＾２５８２スプライスされたｍＲＮＡを指すか、又はＥ１Ｃポリペプチドを指す。８８０＾２５８２転写物は、あるいは８８０位と２５８２位にてスプライシングされたＨＰＶ１６Ｒのスプライシングされた転写物である（下記を参照のこと）。
【００２７】
Ｅ１Ｃポリペプチドは、ＨＰＶのＥ１ポリペプチドのＮ末端切断型変異体であり、ＬＣＲの転写活性化因子として機能すると考えられる。ＨＰＶ１６ＲのＥ１Ｃのアミノ酸配列を配列番号２に示す。ＨＰＶ１６Ｒの前記Ｅ１Ｃのポリペプチドをコードする核酸配列を、配列番号３に示す。
【００２８】
好ましくは、８８０＾２５８２スプライスされたｍＲＮＡは、８８０＾２５８２スプライスジャンクションを含んでなるＨＰＶ ｍＲＮＡである。よって、前記ｍＲＮＡは、８８０位（供与ヌクレオチド）と２５８２位（受容ヌクレオチド）の核酸にてＨＰＶ１６転写物をスプライシングし、そして供与ヌクレオチドを受容ヌクレオチドに接続した結果であるＨＰＶ１６ＲによってコードされるｍＲＮＡである。本発明との関連において、スプライスされたｍＲＮＡの最初の数字、ここでは８８０は、好ましくは、スプライシングのための供与ヌクレオチド、要するに５’スプライスジャンクションの位置を示し、それに対して２番目の数字、ここでは２５８２は、スプライシングのための受容ヌクレオチド、要するに３’スプライスジャンクションの位置を示す。示された位置は、配列番号１に示したとおりＨＰＶ１６Ｒの７９０６ｂｐのゲノムに線で描かれている。ＨＰＶの様々なｍＲＮＡ種が８８０＾２５８２スプライシングされた配列、例えば種Ｋ‐Ｎなど、を含んでなることが、当該技術分野で知られている。図１を参照のこと。従って、８８０＾２５８２スプライスされたｍＲＮＡの量の決定は、好ましくは、８８０＾２５８２を含有しているｍＲＮＡ種すべての累積量の決定を包含する。
【００２９】
本発明との関連において、第１遺伝子産物が、８８０位の供与ヌクレオチドを２５８２位の受容ヌクレオチドに連結することによって作り出される核酸配列、要するにスプライシング後にスプライスジャンクションを含んでなる配列を含んでなることが理解されるべきである。従って、８８０＾２５８２スプライスされたｍＲＮＡは、好ましくは、スプライシングによって作り出された前記スプライスジャンクションを含んでなる。好ましくは、前記スプライスされたｍＲＮＡは、配列番号４に示した核酸配列を含んでなる。
【００３０】
好ましくは、Ｅ１Ｃポリペプチドは、前記スプライスジャンクションを含んでなるポリヌクレオチドから翻訳される／それによってコードされる。従って、ＨＰＶ１６のＥ１Ｃポリペプチドは、配列番号５に示したアミノ酸配列を含んでなることが好ましい。本発明の前記方法との関連において、第２遺伝子産物は、好ましくは、３６３２＾５６３９の遺伝子産物、８８０＾３３５８の遺伝子産物、Ａｐｍ１の遺伝子産物、Ｕｂｃの遺伝子産物、Ｕ１Ａの遺伝子産物、Ｅ１の遺伝子産物、Ｅ５の遺伝子産物、Ｌ１の遺伝子産物、及びＥ６*Ｉの遺伝子産物から成る群から選択される。
【００３１】
３６３２＾５６３９、８８０＾３３５８及びＥ６*Ｉの遺伝子産物は、好ましくは、ＨＰＶ１６の選択的にスプライスされたｍＲＮＡ、又は前記選択的にスプライスされたｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドである。
【００３２】
本明細書中で使用する「３６３２＾５６３９の遺伝子産物」という用語は、好ましくは、ＨＰＶ１６の３６３２＾５６３９スプライスされたｍＲＮＡ又は前記３６３２＾５６３９スプライスされたｍＲＮＡによってコードされるＨＰＶ１６の、２６個のアミノ酸が切り詰められた、（それらによってコードされる）それぞれのＬ１ポリペプチドを指す。ＨＰＶのＬ１ポリペプチドは、カプシドタンパク質である。増殖感染の後期段階中、主要なカプシドタンパク質であるＬ１ポリペプチドは、上皮の上部近くの分化細胞内で発現され、そしてＨＰＶ１６のＬ２ポリペプチドと共に顆粒層内でウイルスカプシドを形成する。前記３６３２＾５６３９スプライスされたｍＲＮＡによってコードされる、２６個のアミノ酸が切り詰められた、Ｌ１ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号６に示す。前記Ｌ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、配列番号７に示す。
【００３３】
３６３２＾５６３９スプライスされたｍＲＮＡは、好ましくは、３６３２位の供与ヌクレオチドを５６３９位の受容ヌクレオチドに連結することによって作り出される核酸配列を含んでなる。従って、３６３２＾５６３９スプライスされたｍＲＮＡは、好ましくは、スプライスジャンクションを含めた前記核酸配列を含んでなる。好ましくは、前記スプライスされたｍＲＮＡは、配列番号８に示した核酸配列を含んでなる（対応するＤＮＡ配列が示される）。
【００３４】
本明細書中で使用する「８８０＾３３５８の遺伝子産物」という用語は、好ましくは、ＨＰＶ１６の８８０＾３３５８スプライスされたｍＲＮＡ又は前記８８０＾３３５８スプライスされたｍＲＮＡ、好ましくはＨＰＶ１６のＥ４ポリペプチドとＥ１ポリペプチドのＮ末端の融合ポリペプチドである前記ポリペプチド、によってコードされるＨＰＶのポリペプチドを指す。前記融合ポリペプチドは、Ｅ１＾Ｅ４と呼ばれることも多い。前記ポリペプチドは、ウイルス生活環の後期相で発現される。それは、有棘及び顆粒細胞層において検出され、そしてＨＰＶ１６の感染の後期にいくつかの機能を果たす。融合ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号９に示す。前記融合ペプチドをコードする核酸配列を、配列番号１０に示す。８８０＾３３５８の遺伝子産物は、図１に示した種Ａ‐Ｄ、及びＱ‐Ｓによってコードされることが示された。
【００３５】
８８０＾３３５８スプライスされたｍＲＮＡは、好ましくは、８８０位の供与ヌクレオチドを３３５８位の受容ヌクレオチドに連結することによって作り出される核酸配列を含んでなる。従って、８８０＾３３５８スプライスされたｍＲＮＡは、好ましくは、スプライスジャンクションを含めた前記核酸配列を含んでなる。好ましくは、前記スプライスされたｍＲＮＡは、配列番号１１に示した核酸配列を含んでなる。従って、ＨＰＶ１６のＥ１＾Ｅ４融合ポリペプチドは、配列番号１２に示したアミノ酸配列を含んでなることが好ましい。
【００３６】
本明細書中で使用する「Ｅ６*Ｉの遺伝子産物」という用語は、好ましくは、ＨＰＶ１６の２２６＾４０９スプライスされたｍＲＮＡ、又は前記２２６＾４０９スプライスされたｍＲＮＡによってコードされるＨＰＶのＥ６*Ｉポリペプチドを指す。Ｅ６*ＩポリペプチドがウイルスＬＣＲを転写活性化する可能性があることが示唆されている（Alloul, N., and L. Sherman. 1999. Transcription-modulatory activities of differentially spliced cDNAs encoding the E2 protein of human papillomavirus type 16. J Gen Virol 80 (Pt 9):2461-70.）。前記融合ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１３に示す。前記融合ペプチドをコードする核酸配列を、配列番号１４に示す。
【００３７】
２２６＾４０９スプライスされたｍＲＮＡは、好ましくは、２２６位の供与ヌクレオチドを４０９位の受容ヌクレオチドに連結することによって作り出される核酸配列を含んでなる。従って、２２６＾４０９スプライスされたｍＲＮＡは、好ましくは、前記核酸配列を含んでなる。好ましくは、前記スプライスされたｍＲＮＡは、配列番号１５に示した核酸配列を含んでなる。従って、ＨＰＶ１６のＥ６*Ｉポリペプチドは、配列番号１６に示したアミノ酸配列を含んでなることが好ましい。
【００３８】
Ｕｂｃ、Ｕ１Ａ、及びＡｐｍ１は、宿主細胞のゲノムによって含まれる遺伝子である。よって、前記遺伝子はＨＰＶ１６のゲノムによってコードされない。また、本発明との関連において、宿主特異的である前記遺伝子は、細胞遺伝子とも呼ばれる。Ｕｂｃ、Ｕ１Ａ、及びＡｐｍ１の遺伝子産物は、好ましくは、ｍＲＮＡ、及び前記遺伝子によってコードされるポリペプチドである。よって、本発明の方法は、Ｕｂｃ、Ｕ１Ａ及びＡｐｍ１ ｍＲＮＡ又はＵｂｃ、Ｕ１Ａ及びＡｐｍ１ポリペプチドの量の決定を企図する。
【００３９】
本明細書中で意味する「Ｕｂｃ」という用語は、好ましくは、ユビキチンＣ、好ましくはヒト・ユビキチンＣを指す。ヒトＵｂｃ１の核酸配列及びアミノ酸配列は、当該技術分野で周知であり、そして、例えばジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受入番号：ＮＭ＿０２１００９．４（核酸配列、配列番号１７）及びジェンバンク受入番号：ＮＰ＿０６６２８９．２（アミノ酸配列、配列番号１８）に示されている。
【００４０】
本明細書中で意味するＵ１Ａという用語は、好ましくは、Ｕ１小核リボ核タンパク質ポリペプチドＡのことを、好ましくはヒトのＵ１小核リボ核タンパク質ポリペプチドＡを指す。ヒトＵ１Ａの核酸配列及びアミノ酸配列は、当該技術分野で周知であり、そして、例えばジェンバンク受入番号：ＮＭ＿００４５９６．３（核酸配列、配列番号１９）及びジェンバンク受入番号：ＮＰ＿００４５８７．１（アミノ酸配列、配列番号２０）に示されている。
【００４１】
本明細書中で意味するＡｐｍ１という用語は、好ましくは、「ＭＥ１８０細胞内へのパピローマウイルスＤＮＡ組み込みによって影響を受けた」又は「ジンクフィンガー及びＢＴＢドメイン含有７Ｃ」（ＺＢＴＢ７Ｃ）を指す。ヒトＡｐｍ１の核酸配列及びアミノ酸配列は、当該技術分野で周知であり、そして、例えばジェンバンク受入番号：ＮＭ＿００１０３９３６０．１（核酸配列、配列番号２１）及びジェンバンク受入番号：ＮＰ＿００１０３４４４９．１（アミノ酸配列、配列番号２２）に示されている。
【００４２】
本発明の方法はさらに、Ｅ１転写物を含むポリヌクレオチドの量の決定、又はＥ１ポリペプチドの量の決定を企図する。前記ポリヌクレオチド及び前記ポリペプチドは、ＨＰＶ１６ゲノムによってコードされる。
【００４３】
Ｅ１ポリペプチドは、非スプライスＥ１ ＯＲＦ（オープン・リーディング・フレーム）含有転写物によってコードされる。Ｅ１は、ウイルス複製に不可欠であり、そしてＳＶ４０巨大腫瘍抗原と構造類似性を共有している。Ｅ１は、ＡＴＰアーゼ、ヘリカーゼ及びヌクレオチド結合活性を示し、細胞ＤＮＡポリメラーゼαと相互作用し、そしてＬＣＲにおける複製のウイルス起源に対して細胞複製開始機構を動員する。Ｅ１転写物の核酸配列を配列番号２３に示し、Ｅ１ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２４に示す。
【００４４】
本発明の方法はさらに、Ｅ５転写物を含めたポリヌクレオチドの量の決定、又はＥ５ポリペプチドの量の決定を企図する。前記ポリヌクレオチド及び前記ポリペプチドは、ＨＰＶ１６ゲノムによってコードされる。
【００４５】
Ｅ５ポリペプチドは、非スプライスＥ２／Ｅ５転写物（特に、種Ｆ‐Ｊ、Ｐ、図１を参照のこと）から発現されるが、Ｅ１＾Ｅ４／Ｅ５転写物（種Ａ‐Ｄ、Ｑ、Ｒ）からは発現されない。宿主ゲノム内へのＨＰＶ１６ゲノムの組み込みにより、Ｅ５ポリペプチドと転写物発現は、Ｅ２領域の断裂のため終わる。Ｅ５は、疎水性膜タンパク質であって、細胞内膜及び原形質膜内に見られる。Ｅ５二量体は、成長因子受容体であるＥＧＦ又はＰＤＧＦ受容体と相互作用し、そしてそれらのリガンド非依存性二量化とそれに続く細胞質チロシン残基のリン酸基転移と細胞シグナル伝達タンパク質の動員を引き起こすので、感染の初期経過において重要であると考えられる。配列番号２６にＥ５転写物の核酸配列は配列番号２５に示されており、Ｅ５ポリペプチドのアミノ酸配列は示されている。
【００４６】
本発明の方法はまた、完全長Ｌ１転写物を含めたポリヌクレオチドの量の決定又は完全長Ｌ１ポリペプチドの量の決定を企図する。前記ポリヌクレオチド及び前記ポリペプチドは、ＨＰＶ１６ゲノムによってコードされる。
【００４７】
先に記載したとおり、ＨＰＶのＬ１ポリペプチドは、カプシドタンパク質である。増殖感染の後期段階中、主要なカプシドタンパク質であるＬ１ポリペプチドは、上皮の上部近くの分化細胞内で発現され、そしてＨＰＶ１６のＬ２ポリペプチドと共に顆粒層内でウイルスカプシドを形成する。完全長Ｌ１転写物の核酸配列は配列番号２７に示されており、完全長Ｌ１ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２８に示す。
【００４８】
遺伝子産物量の決定は、好ましくは、遺伝子産物の性質、すなわち、遺伝子産物が転写物であるか、ポリペプチドであるかに依存する。
【００４９】
被験体の試料中の転写物の量、要するにｍＲＮＡの量の決定は、適当であると思われるあらゆる方法によっておこなわれることができる。
【００５０】
好ましくは、転写物の量は、分析すべき転写物を特異的に検出するプローブ・オリゴヌクレオチドを使用することによって決定される。
【００５１】
特異的なプローブ・オリゴヌクレオチドによる転写物又はその増幅産物の量の決定は、好ましくは、転写物又はその増幅産物（「増幅産物」の説明に関して、下記を参照のこと）を、前記転写物又はその増幅産物に特異的に結合するプローブ・オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるステップを含んでなる。本発明との関連においてプローブ・オリゴヌクレオチドは、好ましくは、前記転写物又はその増幅産物に特異的な１本鎖核酸分子である。当業者は、プローブ・オリゴヌクレオチドが標的に特異的にハイブリダイズする、要するに標的ポリヌクレオチドに相補的である一続きのヌクレオチドを含んでなることを知っている。前記一続きのヌクレオチドは、好ましくは、標的ポリヌクレオチドに含まれる配列領域に対して８５％、９０％、９５％、９９％、又はより好ましくは１００％同一である。
【００５２】
転写物又はその増幅産物の特異的検出を可能にするために、プローブ・オリゴヌクレオチドは、好ましくは、検出すべき転写物又は増幅産物には特異的に結合するが、前記試料に含まれる他のポリヌクレオチドには結合しない。好適なプローブ・オリゴヌクレオチドをどのように選択するかは、当該技術分野で知られている。
【００５３】
本発明のプローブ・オリゴヌクレオチドは、標識されても、転写物若しくはその増幅産物の量の決定を可能にする酵素を含めた他の修飾を含んでもよい。標識は、当該技術分野で周知であり、且つ、使用される標識による様々な技術によっておこなわれることができる。好ましい標識を、この明細書中の他の場所に記載する。
【００５４】
プローブ・オリゴヌクレオチドは、固体表面に結合させても、液相中に存在していてもよい。一例として、プローブ・オリゴヌクレオチドを、固体表面を提供する担体に結合させる。好ましくは、前記担体は小粒子又はビーズである。小粒子又はビーズの外形サイズは、好ましくは、マイクロメートル又はナノメートルの範囲内であり得る。前記ビーズ及び粒子を、特定の色素、より好ましくは特定の蛍光色素で染色してもよい。好ましくは、様々な色素で様々な担体を染色することによって、その担体は、互いに判別されることが可能になる。特定のプローブ・オリゴヌクレオチド（よって特定の配列の増幅ポリヌクレオチドを標的とする核酸）に関して特定の色素を含む担体を使用することによって、前記担体は、異なる色素を含むその他の担体と判別できる。１つの好ましい実施形態では、市販のＬｕｍｉｎｅｘミクロスフェア（Luminex Corp., Austin, Texas, USA）が使用される。よって、転写物又はその増幅産物の検出のために、プローブを、好適な条件下、好ましくはストリンジェント条件下、増幅産物とハイブリダイズさせる蛍光標識ポリスチレンビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ懸濁液アレイ技術）と対にする。さらに、増幅産物は、マイクロアレイ法、Ｒｅｖｅｒｓｅ‐Ｌｉｎｅ Ｂｌｏｔｓ（ＲＬＢ）法、Ｄｏｔブロット法又は好適な担体に連結された特定のオリゴヌクレオチドを含む同様の技術の使用によって識別されてもよい。液相中に存在するプローブ・オリゴヌクレオチドは、固定された標的核酸分子又は増幅ポリヌクレオチドに結合することができる。当業者によって知られる特定の標識又は修飾が、標的の検出又はシグナル増幅を可能にすることもある。加えて、増幅産物は、サイズ分離、例えばゲル又はキャピラリー電気泳動によって、例えば核磁気共鳴を使用したヌクレオチド組成によって、又は本明細書中の他の場所に記載したリアルタイム及びシグナル増幅によって検出されることもできる。
【００５５】
当業者は好適なプローブ・オリゴヌクレオチドを選択できる。スプライスされた転写物の決定のために、スプライスジャンクションに特異的に結合する、要するにそれぞれの特定のスプライス供与ヌクレオチドとスプライス受容ヌクレオチドをつなぐことによって作り出される核酸配列に結合するプローブ・オリゴヌクレオチドを使用することによって前記選択的にスプライスされたｍＲＮＡの量を決定することが特に企図される。
【００５６】
従って、８８０＾２５８２スプライスされたｍＲＮＡの決定のためのプローブ・オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号４に示した核酸配列を含んでなる。
【００５７】
さらに、３６３２＾５６３９スプライスされたｍＲＮＡの決定のためのプローブ・オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号８に示した核酸配列を含んでなる。
【００５８】
また、８８０＾３３５８スプライスされたｍＲＮＡの決定のためのプローブ・オリゴヌクレオチドは、好ましくは配列番号１１に示した核酸配列を含んでなる。
【００５９】
さらに、Ｅ６*Ｉ転写物、要するに２２６＾４０９スプライスされたｍＲＮＡの決定のためのプローブ・オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１５に示した核酸配列を含んでなる。
【００６０】
本明細書中で言及したその他の転写物の決定のための好ましいプローブ・オリゴヌクレオチドを、表１に示す。
【００６１】
好ましくは、転写物の量の決定は、前記転写物を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドを用いて前記転写物を増幅し、そしてそのようにして増幅された転写物の量を決定するステップを含んでなる。よって、転写物の量の決定のために、本明細書中の他の場所に記載した好適な方法によって転写物を増幅し、その後、その増幅産物の量を決定することが特に好ましい。あるいは、転写物の量の決定は、前記転写物に特異的に結合し、そして線形シグナル増幅とその後の増幅されたシグナルの決定を可能にするオリゴヌクレオチド・プローブを用いたシグナル増幅法によって達成される。
【００６２】
転写物をどのように増幅するかは、当該技術分野で周知である。転写物の増幅は、好ましくは、初期量に応じて対応する核酸分子の量の増大をもたらす鋳型依存性の過程である。増幅産物は、好ましくは、核酸、ＤＮＡ又はＲＮＡである。転写物の増幅が、周知の方法による転写物の逆転写過程などの追加ステップを含んでもよいことが理解されるべきである。
【００６３】
標的シグナルをどのように増幅するかは、当該技術分野で周知である。シグナルの増幅は、好ましくは、初期量に応じてレポーターシグナルの量の増大をもたらす鋳型依存性の過程である。そのレポーターシグナルは、好ましくは、可視光、蛍光、化学発光、及び発光である。シグナル増幅のための方法は、当該技術分野で周知であり、そしてチラミド（ｔｙｒａｍｉｄｅ）シグナル増幅法、分岐ＤＮＡ増幅法、Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ（登録商標）増幅法、ｐａｄｌｏｃｋ及びｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ増幅法、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）シグナル増幅法、及び他のシグナル増幅法を基にすることもできる。
【００６４】
目的の転写物の増幅は、周知の方法によって、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、逆転写酵素ＰＣＲによって、リアルタイムＰＣＲ、核酸配列ベースの増幅法（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介型増幅法（ＴＭＡ）、及びポリメラーゼとプライマーとして特異的なオリゴヌクレオチドを使用するその他の等温増幅法によって実施することもできる。ＰＣＲ法は当該技術分野で周知である。好ましくは、その増幅は、好適なオリゴヌクレオチド対を使用することによる。
【００６５】
本発明は、前記技術のいずれにも制限されない。転写物の増幅のための代表的な方法として、ＮＡＳＢＡ技術が簡潔に要約され得る。ＮＡＳＢＡは、単一温度での核酸の増幅のためのオリゴヌクレオチド依存型の技術である。増幅すべき転写物を含んでなる試料が、前記転写物の増幅のための少なくとも２種類の転写物特異的なオリゴヌクレオチドを含んでなる反応混合物に加えられる。Ｔ７ ＲＮＡプロモーター配列を含んでいる第１のオリゴヌクレオチドが、鋳型の３’末端の標的部位に結合する。逆転写過程によって、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドが作り出される。酵素ＲＮＡｓｅＨがＲＮＡ部分を分解する。ＲＮＡ鋳型の分解後に、第２のオリゴヌクレオチドが１本鎖ｃＤＮＡの３’末端に結合して、完全なＴ７ ＲＮＡプロモーターを含む二本鎖ＤＮＡが作り出される。そして、酵素Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼが、アンチセンスＲＮＡを線状に作り出す。それぞれの新たに合成されたアンチセンスＲＮＡ分子は、それ自体が第２のプライマーを含む鋳型として役割を果たすことができ、そして機能的なＴ７プロモーターを含むＤＮＡ中間体に変換される。しかしながら、この場合、新たに作り出されたＲＮＡ分子が本来の標的に対して向きが逆であり、且つ、得られたＤＮＡ中間体が一部だけ二本鎖であるので、オリゴヌクレオチド・プライマーは、逆順でアニーリングする。このように、等温条件下でのＲＮＡ産物の線状合成をもたらす反応に再度加わる多くのＲＮＡコピーがそれぞれのＲＮＡ標的から作り出される。約１０6倍〜１０9倍増幅が、９０分以内に得られる（Compton, J. 1991. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature 350:91-2）。
【００６６】
本明細書中に言及したスプライスされたｍＲＮＡを特異的に増幅するために、転写物の増幅のためのオリゴヌクレオチド対は、好ましくは、それぞれのスプライスジャンクションを含んでなる核酸領域を特異的に増幅できなくてはならない。そのため、増幅のためのオリゴヌクレオチドは、転写物（又はその相補鎖、特に本明細書中の他の場所に記載したアプローチによって作り出された相補的ＤＮＡ又はＲＮＡ鎖）のスプライスジャンクションの５’側と３’側（一方のプライマーが３’側、一方のプライマーが５’側）に特異的に結合しなくてはならない。前記オリゴヌクレオチドを使用することによって作り出される増幅産物は、それぞれのスプライスジャンクションを含み得る。
【００６７】
従って、８８０＾２５８２スプライスされたｍＲＮＡの増幅のための好ましいオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号２９及び配列番号３０に示した核酸配列を含んでなる。
【００６８】
３６３２＾５６３９スプライスされたｍＲＮＡの増幅のための好ましいオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号３１及び配列番号３２に示した核酸配列を含んでなる。
【００６９】
８８０＾３３５８スプライスされたｍＲＮＡの増幅のための好ましいオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号２９及び配列番号３３に示した核酸配列を含んでなる。
【００７０】
Ｅ６*Ｉ転写物、及び２２６＾４０９スプライスされたｍＲＮＡの増幅のための好ましいオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号３４及び配列番号３４に示した核酸配列を含んでなる。
【００７１】
本明細書中に言及したその他のｍＲＮＡの増幅のための好ましいオリゴヌクレオチドを、表３に示す。
【００７２】
本願発明で言及したポリヌクレオチド又はその増幅産物の量の決定は、量又は濃度を、好ましくは半定量的又は定量的に計測することに関する。好ましくは、前記決定は、転写物の定量のための標準化ステップを含む。典型的なものとして、この標準化の過程は、ＮＡＳＢＡ標的増幅法のために簡潔に記載され得る。標準化とそれによる定量化は、増幅混合物に所定の量のキャリブレーターＲＮＡ（Ｑ‐ＲＮＡ）を加えることによって達成されることが好ましい。前記キャリブレーターＲＮＡは、好ましくは、分析すべき転写物を特異的に増幅できる同じオリゴヌクレオチドによって増幅され得る試験管内転写ＲＮＡでなくてはならない。しかしながら、前記Ｑ‐ＲＮＡは、プローブ・オリゴヌクレオチドに特有の標的部位（すなわち、分析すべき転写物に含まれていない標的部位）を含んでいなくてはならない。前記特有の標的部位は、分析すべき転写物の増幅産物とＱ‐ＲＮＡの増幅産物を判別することを可能にしなくてはならない。標準化の原理は、同じオリゴヌクレオチド対を用いたＱ‐ＲＮＡと分析すべきｍＲＮＡとの拮抗同時増幅である（van Gemen et al. 1993: Quantification of HIV-1 RNA in plasma using NASBA during HIV-1 primary infection. J Virol Methods 43:177-87）。本発明との関連において、Ｑ‐ＲＮＡ量は、好ましくは、分析すべき各ｍＲＮＡに対して量を決定する必要があることが理解されるべきである。定量化のために、発現レベルは、試験管内転写ｍＲＮＡを使用した検量線又は好適な基準物質と比較される。これは、余分な手間をかけることなく当業者によっておこなわれることができる。
【００７３】
本発明との関連において、転写物の増幅のためのオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの一続きの配列に特異的に結合するために十分である多数のヌクレオチドを含んでいなくてはならない。好ましくは、本明細書中で意味するオリゴヌクレオチドは、１５〜３５ヌクレオチドの長さ、より好ましくは１８〜３０ヌクレオチドの長さ、そして最も好ましくは２０〜２７ヌクレオチドの長さを有する。本発明との関連において、プローブ・オリゴヌクレオチドは、本明細書中で言及した転写物、及び／又は前記転写物の増幅産物の検出を可能にする（本明細書中の他の部分を参照のこと）。転写物又はその増幅産物を検出することによって、特定の転写物の量を、ＨＰＶ１６に感染している被験体の試料中で評価できる。転写物若しくはその増幅産物の特異的検出を可能にするために、プローブ・オリゴヌクレオチドは、前記転写物若しくはその増幅産物に対して、又は前記転写物若しくは前記その増幅産物の一部に対して十分に相補的でなければならない。特に好ましいオリゴヌクレオチドは、本明細書中で言及した特定の配列及び／又は特性を有する。
【００７４】
特に、前記オリゴヌクレオチドは、ストレプトアビジンの表面又は蛍光コンジュゲートへの増幅産物の結合を可能にするためにビオチン化されることもできる。さらに、本発明との関連において使用される標識は、とりわけ蛍光色素、例えばＲ‐フィコエリトリン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、フルオレセイン、ローダミン、Ａｌｅｘａ、又はＴｅｘａｓ Ｒｅｄなどを含めた蛍光標識であってもよいが、これだけに限定されるものではない。しかしながら、標識はまた、酵素又は抗体であってもよい。標識として使用されるべき酵素は基質と反応することによって検出可能なシグナルを生じることが想定される。好適な酵素、基質、及び技術は、当該技術分野で周知である。標識として使用されるべき抗体は、直接的に（例えば、それ自体が蛍光である標的分子）又は間接的に（例えば、酵素などの検出可能なシグナルを発生する標的分子）検出されることができる標的分子を特異的に認識してもよい。さらに、オリゴヌクレオチドは、前記標識又は修飾のいずれかを含み得る相補的な検出プローブへのハイブリダイゼーションによって検出を可能にする一般的配列を含んでいてもよい。本発明のオリゴヌクレオチドはさらに、５’制限部位、ロックド核酸分子（ＬＮＡ）を含んでいても、又はペプチド核酸分子（ＰＮＡ）の一部であってもよい。かかるＰＮＡは、原則として、例えば抗体によってペプチド部分を介して検出されることができる。
【００７５】
本発明による転写物の量を決定するためのアレイ・ベースの技術の使用もまた、転写物（又はその増幅産物）の量の決定のために企図される。本明細書中で言及したアレイは、規則的パターンで配置された様々な固定されたポリヌクレオチドの試料を含んでいる、例えば、小さな膜、ナイロン膜、若しくはガラススライドを用いた固体支持体、例えばマイクロアレイを含んでなるシステムである。あるいは、ビーズ・アレイは、プローブ・オリゴヌクレオチドの多重化を可能にする明確に蛍光標識されたミクロスフェア又はビーズから成っていてもよい。オリゴヌクレオチド・プローブは、好ましくは、遺伝子を示し、すなわち、それらは示されるべき遺伝子の核酸配列から成るか又はそれを含んでなる。アレイを使用することによって、多くの転写物又は遺伝子を、好ましくは、たった一回の実験で決定することができる。自動リーダー装置などの好適な分析器の助けによって、アレイ内のプローブに結合した標的の量を正確に計測できる。
【００７６】
この明細書中で言及したペプチド又はポリペプチドの量の決定は、量又は濃度を、好ましくは半定量的に又は定量的に計測することに関する。計測は、直接的又は間接的におこなうことができる。直接計測は、ペプチド若しくはポリペプチド自身から得られるシグナル、及び試料中に存在するペプチドの分子数と直接相関する強度に基づくペプチド又はポリペプチドの量又は濃度の計測に関する。そういったシグナル‐本明細書中では強度シグナルとよばれることもある‐を、例えばペプチド又はポリペプチドの特有の物理的又は化学的特性の強度値を計測することによって、得ることもできる。間接計測には、二次的な成分（すなわち、成分はペプチド又はポリペプチド自体でない）、又は生物学的読み出しシステムから得られたシグナル、例えば計測可能な細胞応答、リガンド、標識、又は酵素反応産物から得られたシグナルを計測することを含む。
【００７７】
本発明によれば、ペプチド又はポリペプチドの量の決定は、試料中のペプチドの量を決定するあらゆる公知の手段によって達成できる。前記手段には、様々なサンドイッチアッセイ、競合アッセイ、又はその他のアッセイ形式で標識分子を利用することができるイムノアッセイ・装置及び方法が含まれる。前記アッセイは、ペプチド又はポリペプチドの存在又は不存在を示すシグナルを発する。さらに、シグナル強度は、好ましくは、試料中に存在しているポリペプチドの量に直接的又は間接的に相関（例えば、反比例）し得る。
【００７８】
更なる適切な方法には、ペプチド又はポリペプチドに特有な物理的又は化学的特性、例えば正確なその分子量又はＮＭＲスペクトルなどを計測することが含まれる。前記方法には、好ましくは、バイオセンサー、イムノアッセイと組み合わせた光装置、バイオチップ、分析装置、例えば質量分析計、ＮＭＲ分析器、又はクロマトグラフィー・装置などが含まれる。さらに、方法には、マイクロプレートＥＬＩＳＡに基づく方法、全自動又はロボット化イムノアッセイ（例えば、Ｅｌｅｃｓｙｓ（商標）分析器で使用可能）、ＣＢＡ（酵素コバルト結合アッセイ、例えばＲｏｃｈｅ‐Ｈｉｔａｃｈｉ（商標）分析器で使用可能）、及びラテックス凝集反応（例えば、Ｒｏｃｈｅ‐Ｈｉｔａｃｈｉ（商標）分析器で使用可能）が含まれる。
【００７９】
ポリペプチドの量の決定は、好ましくは、決定すべきポリペプチドに特異的に結合する抗体の使用を含んでなる。好ましくは、決定されるべきポリペプチドが、特異的にスプライスされたＨＰＶ転写物の翻訳から誘導される場合には、抗体は、スプライスジャンクションに隣接している核酸によってコードされるポリペプチドの領域に特異的に結合しなくてはならない。
【００８０】
好ましくは、（８８０＾２５８２スプライスされたｍＲＮＡによってコードされる）Ｅ１Ｃポリペプチドの量の決定のために、抗体は配列番号５に示したアミノ酸配列を持っているペプチドに特異的に結合しなくてはならない。
【００８１】
好ましくは、（２２６＾４０９スプライスされたｍＲＮＡによってコードされる）Ｅ６*Ｉポリペプチドの量の決定のために、抗体は配列番号１６に示したアミノ酸配列を持っているペプチドに特異的に結合しなくてはならない。
【００８２】
好ましくは、（８８０＾３３５８スプライスされたｍＲＮＡによってコードされる）Ｅ１＾Ｅ４融合ポリペプチドの量の決定のために、抗体は配列番号１２に示したアミノ酸配列を持っているペプチドに特異的に結合しなくてはならない。
【００８３】
本明細書中で使用する「量」という用語は、前記遺伝子産物の絶対量、前記遺伝子産物の相対量又は濃度、及びこれらと相関する又はそれに由来し得る任意の値又はパラメーターを包含する。そういった値又はパラメーターには、直接決定によって前記遺伝子産物から得られる特有の物理的又は化学的特性についてのすべての強度シグナル値が含まれる。さらに、この明細書中の他の場所で指定された間接計測によって得られるすべての値又はパラメーターが包含される。例えば、ポリペプチドに関して、反応レベルは、当該ペプチドに応答する生物学的読み出しシステムから、又は特異的に結合したリガンドから得られる強度シグナルから決定できる。前記量又はパラメーターと相関する値がさらに、すべての標準的な数学的操作によっても得られ得ることが理解されるべきである。
【００８４】
本明細書中で使用する「比較」という用語は、この明細書の他の場所に指定した好適な基準源に対して、本発明の方法のステップａ）で決定される第１遺伝子産物量と、本発明の方法のステップｂ）で決定される前記第２遺伝子産物量の比を計算することによって決定される値を比較することを包含する。本明細書中で使用する比較は、値の比較を指すことが理解されるべきである。本発明の方法のステップｄ）で言及する比較は、手動で実施してもコンピューターに補助されて実施してもよい。コンピューターに補助された比較では、決定された量の値は、コンピュータープログラムによってデータベース内に保存された好適な基準に相当する値と比較することもできる。コンピュータープログラムは、比較の結果をさらに評価することもできる、すなわち、好適な出力形式で所望の評価を自動的に提供することもできる。基準比と、本発明の方法のステップｃ）で計算された比の比較に基づいて、ＨＰＶ１６を患っている被験体において軽症型のＨＰＶ１６への感染と重症型のＨＰＶ１６への感染を判別することが可能である。そのため、基準は、比較した値の相違又は類似のいずれかが、軽症型のＨＰＶ１６への感染と重症型のＨＰＶ１６への感染を判別することか可能にするように選択されるべきである。
【００８５】
従って、本明細書中で使用する「基準」又は「基準比」という用語は、好ましくは、ＨＰＶ１６感染の軽症型と重症型の判別を可能にする値を指す。従って、基準は、本発明の方法のステップａ）及びｂ）を実施し、そして本発明の方法のステップａ）で決定される、ＨＰＶ１６感染を患っている被験体の試料中の第１遺伝子産物量と、本発明の方法のステップｂ）で決定される前記第２遺伝子産物量の比について計算することから得ることができ、ここで前記被験体は重症型のＨＰＶ１６感染、例えばＨＳＩＬ又は子宮頚癌などに罹患していることが知られる。また、基準は、本発明の方法のステップａ）及びｂ）を実施し、そして被験体において、本発明の方法のステップａ）で決定される、ＨＰＶ１６感染を患っている被験体の試料中の第１遺伝子産物量と、本発明の方法のステップｂ）で決定される、ＨＰＶ１６を患っている被験体の試料中の前記第２遺伝子産物量の比について計算することから得ることができ、ここで前記被験体は軽症型のＨＰＶ１６感染（例えば、ＬＳＩＬと分類される形態）を示すことが知られる。さらに、基準量は、好ましくは、閾値を規定する。好適な基準比又は閾値は、検査試料と一緒に、すなわち、同時に又はそれに続いて分析されるべき基準試料から本発明の方法によって決定することもできる。基準又は閾値の値は、遺伝子産物（転写物又はポリペプチド）の性質によって、又はどれ位の遺伝子産物量が試料中で決定されたかによって異なり得ることが理解されるべきである。例えば、第１及び第２遺伝子産物量の決定がＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）による遺伝子産物の増幅を伴う場合、例えば特定の遺伝子産物の増幅用の様々なオリゴヌクレオチド対の増幅効率が異なるので、遺伝子産物量の決定はＰＣＲ反応に使用されるオリゴヌクレオチドに依存することがある。しかしながら、当業者は、基準比について計算するときにこのことを考慮している。特に、当業者は、好ましくは、同じ手段と方法が基準試料中及び検査試料中の特定の遺伝子産物量を決定するために使用されなければならないことを知っている。
【００８６】
閾値としての役割を果たす好ましい基準比は、正常上限（ＵＬＮ）、すなわち、被験体（例えば臨床検査に登録された患者）の集団で見られる生理学的量の上限、から得ることができる。所定の被験体集団のＵＬＮは、様々な周知の技術によって決定できる。
【００８７】
好ましくは、本発明との関連において計算される比は、第１遺伝子産物量対第２遺伝子産物量の比である。また、第２遺伝子産物量対第１遺伝子産物の比もまた計算され得ることが理解されるべきである。
【００８８】
第１遺伝子産物量対第２遺伝子産物量の比が計算される場合、好ましくは、以下の事項が適用される：
【００８９】
好ましくは、基準比より高い、検査試料において計算された比は、重症型のＨＰＶ感染を示す。より好ましくは、基準比より著しく高い、検査試料において計算された比は、重症型のＨＰＶ感染を示す。最も好ましくは、基準比より統計的に有意に高い、検査試料において計算された比は、重症型のＨＰＶ感染を示す。重症型のＨＰＶ感染を示す好ましい比を表５に示す。
【００９０】
好ましくは、基準比より低い、検査試料において計算された比は、軽症型のＨＰＶ感染を示す。より好ましくは、基準比より著しく低い、検査試料において計算された比は、軽症型のＨＰＶ感染を示す。最も好ましくは、前記計算された比は、基準比より統計的に有意に低い。軽症型のＨＰＶ感染を示す好ましい比を表５に示す。
【００９１】
特に、基準比より著しく高い（若しくはより低い）又は統計的に有意に高い（若しくは低い）比は、本明細書中で言及した判別のために著しいと見なされる程度の比である。「より高い」、「著しく高い」、「統計的に有意に高い」、「低い」、「著しく低い」、及び「統計的に有意に低い」という用語は、当業者に知られている。よって、比が、高い（若しくは低い）、著しく高い（若しくは低い）、又は統計的に有意に高い（若しくは低い）かどうかは、様々な周知の統計的評価ツールを使用することで当業者によって余分な手間をかけることなく決定できる。
【００９２】
好ましくは、基準比より高い、検査試料中の第１遺伝子産物量対第２遺伝子産物量の比は、重症型のＨＰＶ感染を示す。好ましくは、前記第１遺伝子産物は、８８０＾２５８２の遺伝子産物、好ましくは８８０＾２５８２スプライスされたｍＲＮＡであり、好ましくは前記第２遺伝子産物は、３６３２＾５６３９の遺伝子産物、好ましくは３６３２＾５６３９スプライスされたｍＲＮＡである。
【００９３】
好ましくは、基準比より低い、検査試料中の第１遺伝子産物量対第２遺伝子産物量の比は、軽症型のＨＰＶ感染を示す。好ましくは、前記第１遺伝子産物は、８８０＾２５８２、好ましくは８８０＾２５８２スプライスされたｍＲＮＡの遺伝子産物であり、好ましくは前記第２遺伝子産物は、３６３２＾５６３９、好ましくは３６３２＾５６３９スプライスされたｍＲＮＡの遺伝子産物である。
【００９４】
第１遺伝子産物対その他の第２遺伝子産物量であって８８０＾２５８２を持つ好ましい基準比を、表５に要約する。
【００９５】
有益なことには、ＨＰＶ１６を患っている被験体の試料中の、本明細書中に示した第１遺伝子産物量を決定し、及び被験体の試料中の、本明細書中に示した第２遺伝子産物量を決定し、前記第１遺伝子産物の前記量と前記第２遺伝子産物の前記量の比を計算し、そして前記比を基準と比較することが、ＨＰＶ１６感染の軽症型と重症型を確実に判別するために必要であることが示された。特に、以下の比が、軽症型又は重症型のＨＰＶ感染に罹患しているＨＰＶ保菌被験体の合計８０個の試料において計算された（実施例もまた参照のこと）：ＨＰＶ１６の８８０＾２５８２スプライスされたｍＲＮＡの量対ＨＰＶ１６の３６３２＾５６３９スプライスされたｍＲＮＡの量の比、ＨＰＶ１６の８８０＾２５８２スプライスされたｍＲＮＡの量対ＨＰＶ１６の８８０＾３３５８スプライスされたｍＲＮＡの量の比、ＨＰＶ１６の８８０＾２５８２スプライスされたｍＲＮＡの量対Ａｐｍ１ ｍＲＮＡの量の比、ＨＰＶ１６の８８０＾２５８２スプライスされたｍＲＮＡの量対Ｕｂｃ ｍＲＮＡの量の比、ＨＰＶ１６の８８０＾２５８２スプライスされたｍＲＮＡの量対Ｕ１Ａ ｍＲＮＡの量の比、ＨＰＶ１６の８８０＾２５８２スプライスされたｍＲＮＡの量対ＨＰＶ１６の３６３２＾５６３９スプライスされたｍＲＮＡの量の比、ＨＰＶ１６の８８０＾２５８２スプライスされたｍＲＮＡの量対ＨＰＶ１６のＥ１ ｍＲＮＡの量の比、ＨＰＶ１６の８８０＾２５８２スプライスされたｍＲＮＡの量対ＨＰＶ１６のＥ１ ｍＲＮＡの量の比、ＨＰＶ１６の８８０＾２５８２スプライスされたｍＲＮＡの量対ＨＰＶ１６のＥ５ ｍＲＮＡの量の比、ＨＰＶ１６の８８０＾２５８２スプライスされたｍＲＮＡの量対ＨＰＶ１６のＬ１ ｍＲＮＡの量の比、ＨＰＶ１６の８８０＾２５８２スプライスされたｍＲＮＡの量対ＨＰＶ１６の２２６＾４０９スプライスされたｍＲＮＡの量の比。計算された比は、次第に軽症型のＨＰＶ１６感染（特にＮＩＬ／Ｍ）から重症型のＨＰＶ１６感染（特に子宮頚部癌）へと非常に著しい差異が示されたことが明らかになった。特に、完全長ＯＲＦ含有転写物の量の決定に比べて、スプライスされた転写物の発現レベルを決定することは、（ｐ値で示したように）ＨＰＶ関連疾患の病期を示していることが観察された。さらに、本発明の方法は、従来技術のものに比べて高い特異性と感度でＨＰＶ感染の軽症型と重症型を判別することを可能にする。
【００９６】
ＵＳ２００７０１５４８８４では、Ｅ６及び／又はＥ７の発現レベルとＬ１及び／又はＥ２の発現レベル、並びにＥ６及び／又はＥ７対Ｌ１及び／又はＥ２の比が決定され、ここでは、２より大きな比がＨＰＶ誘導細胞形質転換と新生物のリスクを示していた。同様に、ＷＯ／２００１／０７３１３５及びＷＯ／２００３／０５７９１４では、Ｅ６、Ｅ７又はＥ６／Ｅ７領域の転写物の存在又は不存在、並びにヒト・パピローマウイルスのＬ１、Ｌ２又はＬ１／Ｌ２領域の転写物の存在又は不存在を検出することによってヒト・パピローマウイルス感染の進行を判断するための方法が記載されており、ここで、Ｅ６、Ｅ７又はＥ６／Ｅ７領域の転写物の不存在及びＬ１、Ｌ２又はＬ１／Ｌ２領域の転写物の不存在が、ヒト・パピローマウイルス感染なしを意味し；Ｅ６、Ｅ７又はＥ６／Ｅ７領域の転写物の存在及びＬ１、Ｌ２又はＬ１／Ｌ２領域の転写物の存在が、早期ヒト・パピローマウイルス感染を意味し、そしてＥ６、Ｅ７又はＥ６／Ｅ７領域の転写物の存在及びＬ１、Ｌ２又はＬ１／Ｌ２領域の転写物の不存在が、末期ヒト・パピローマウイルス感染を意味する。
【００９７】
本発明で提示されたデータによると、完全長ＯＲＦ含有転写物の量の決定に比べて、スプライスされた転写物の発現レベルを決定することに基づいてＨＰＶ関連疾患の臨床的に有用な評価をすることが可能であり、そして（表６、ｐ値で示したように）ＨＰＶ関連疾患の病期をさらに示した。好ましくは、２種類の遺伝子産物の示す比において、少なくとも一方がスプライスされた転写物８８０＾２５８２であり；そして最も好ましくは両方の遺伝子産物がスプライスされた転写物に由来する。この方法は、技術的に簡単であり、好ましい実施形態では、高速大量処理形式による自動化に適している。さらに、本発明の方法を使用することで得られた結果に基づいて、患者の分類のための新たなスキームを、ＨＰＶ遺伝子発現のパターンにおける疾患関連分子変化と関係がある高グレード病変又は子宮頚癌を発症するリスクに基づいて規定した（図８、実施例８）。
【００９８】
よって、本発明の方法は、ＨＰＶ感染の軽症型と重症型の迅速で、確実で、安価な判別を可能にするので、特に有益である。特に、前記方法は、リスクが高い、要するに癌に罹りやすい被験体、及び／又は癌療法、癌検査、特に膣鏡検査や組織学的検査、及び潜在的治療法を必要としている被験体を特定することを可能にする。さらに、前記方法は、軽症型のＨＰＶ感染だけに罹患していて、且つ、追加的な徹底的な検査や治療法を必要としない被験体を特定することを可能にする。本発明の方法を適用することがなければ、前記被験体は、過剰な検査及び処置を受けたかもしれない（そして、不都合な副作用の高いリスクや高い医療費につながる）。
【００９９】
前記方法に関する定義は、別段の記述のない限り、必要な変更を加えて下記の事項に適用される。
【０１００】
さらに、本発明は、ＨＰＶ１６に感染している被験体において（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別する方法であって、以下のステップ：
ａ）前記被験体の試料中の第１遺伝子産物量を決定し、ここで、前記第１遺伝子産物は、Ｅ６*ＩＩの遺伝子産物であり、
ｂ）前記被験体の試料中の第２遺伝子産物量を決定し、ここで、前記第２遺伝子産物は、Ａｐｍ１の遺伝子産物、Ｕｂｃの遺伝子産物、Ｕ１Ａの遺伝子産物、８８０＾３３５８の遺伝子産物、及びＥ５の遺伝子産物から成る群から選択され、
ｃ）ステップａ）で決定した前記第１遺伝子産物量とステップｂ）で決定した前記第２遺伝子産物量の比を計算し、
ｄ）ステップｃ）で計算した比を基準比と比較し、そして、
ｅ）（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別すること、
を含んでなる方法に関する。
【０１０１】
前記方法は、好ましくは、以下の比の計算を想定する：Ｅ６*ＩＩ（好ましくはＨＰＶ１６の２２６＾５２６スプライスされたｍＲＮＡ）の遺伝子産物量とＡｐｍ１（好ましくはＡｍｐ１ ｍＲＮＡ）の遺伝子産物量の比、又はＥ６*ＩＩ（好ましくはＨＰＶ１６の２２６＾５２６スプライスされたｍＲＮＡ）の遺伝子産物量とＵｂｃ（好ましくはＵｂｃ ｍＲＮＡ）の遺伝子産物量の比、又はＥ６*ＩＩ（好ましくはＨＰＶ１６の２２６＾５２６スプライスされたｍＲＮＡ）の遺伝子産物量とＥ５（好ましくは非スプライスＥ５ ｍＲＮＡ）の遺伝子産物量の比、又はＥ６*ＩＩ（好ましくはＨＰＶ１６の２２６＾５２６スプライスされたｍＲＮＡ）の遺伝子産物量と８８０＾２７０９（好ましくは８８０＾２７０９スプライスされたｍＲＮＡ）の遺伝子産物量の比、又はＥ６*ＩＩ（好ましくはＨＰＶ１６の２２６＾５２６スプライスされたｍＲＮＡ）の遺伝子産物量と８８０＾３３５８（好ましくは８８０＾３３５８スプライスされたｍＲＮＡ）の遺伝子産物量の比。
【０１０２】
本明細書中で使用する「Ｅ６*ＩＩの遺伝子産物」という用語は、好ましくは、ＨＰＶ１６の２２６＾５２６スプライスされたｍＲＮＡ又は前記２２６＾５２６スプライスされたｍＲＮＡによってコードされるＨＰＶ１６のＥ６*ＩＩポリペプチドを指す。好ましくは、ｍＲＮＡ種Ｃ、Ｈ、Ｍ（図１を参照のこと）は、２２６＾５２６スプライスジャンクションを含んでなる。
【０１０３】
Ｅ６*ＩＩポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号３６に示す。前記Ｅ６*ＩＩポリペプチドをコードする核酸配列を、配列番号３７に示す。
【０１０４】
２２６＾５２６スプライスされたｍＲＮＡは、好ましくは、２２６位の供与ヌクレオチドを５２６位の受容ヌクレオチドに連結することによって作り出される核酸を含んでなる。従って、２２６＾５２６スプライスされたｍＲＮＡは、好ましくは、前記核酸配列を含んでなる。従って、前記スプライスされたｍＲＮＡは、配列番号３８に示した核酸配列を含んでなる。従って、ＨＰＶ１６のＥ６*ＩＩポリペプチドは、好ましくは、配列番号３９に示したアミノ酸配列を含んでなる。
【０１０５】
標的増幅法、例えばＰＣＲ又はＮＡＳＢＡを使用することで、２２６位の供与ヌクレオチドの５’側と５２６位の受容ヌクレオチドの３’側（比較図１）に結合するＥ６*ＩＩ特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用することによって、Ｅ６*Ｉの遺伝子産物量は、Ｅ６*ＩＩの遺伝子産物の検出と同時に検出できる。よって、本発明に記載のＥ６*ＩＩオリゴヌクレオチドプライマーもまた、Ｅ６*Ｉ転写物の得られた２６３ヌクレオチドの長さの断片にアニールし、そして増幅できる。Ｅ６*ＩＩプライマーによって増幅されたＥ６*Ｉ転写物断片は、Ｅ６*Ｉ特異的オリゴヌクレオチドプローブによって検出できる。
【０１０６】
ポリペプチドＥ７は、すべてがｎｔ２２６のスプライス供与部位そしてそれぞれｎｔ４０９又はｎｔ５２６のスプライス受容部位を使用する、選択的にスプライスされたＥ６*Ｉ ｍＲＮＡ（種Ｂ、Ｇ、Ｌ、図１を参照のこと）及びおそらく選択的にスプライスされたＥ６*ＩＩ ｍＲＮＡ（種Ｃ、Ｈ、Ｍ、図１を参照のこと）から翻訳される。Ｅ７はさらに、リーキースキャニング（ｌｅａｋｙ  ｓｃａｎｎｉｎｇ）によって完全長Ｅ６／Ｅ７ ｍＲＮＡから翻訳されるとも考えられている。Ｅ７は核タンパク質であり、感染細胞においてＧ1‐から‐Ｓフェーズへの進行を促進している。それは、網膜芽細胞腫の腫瘍抑制タンパク質（ｐＲＢ）に結合し、そしてそのユビキチン化とそれに続く分解を助けることによって機能する。Ｅ７の結合により、Ｅ２Ｆ転写因子のｐＲＢ介在性阻害が止まり、そして放出されたＥ２Ｆが細胞周期のＳ期の開始を刺激し、そして細胞複製につながるいくつかのタンパク質の発現を誘導する。加えて、Ｅ７は、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子、ｐ２１及びｐ２７の機能を阻害し、且つ、Ｓ期遺伝子のサイクリンＡ及びサイクリンＥを刺激する。Ｅ７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの核酸配列を、配列番号４０に示す。Ｅ７ポリペプチドのアミノ酸配列を、配列番号４１に示す。
【０１０７】
ポリペプチドＥ６*Ｉは、選択的にスプライスされたＥ６*Ｉ ｍＲＮＡ（種Ｂ、Ｇ、Ｌ、図１を参照のこと）から翻訳され、それに対しポリペプチドＥ６*ＩＩは、選択的にスプライスされたＥ６*ＩＩ ｍＲＮＡ（種Ｃ、Ｈ、Ｍ、図１を参照のこと）から翻訳される。Ｅ６*Ｉポリペプチドは、ＨＰＶ ＬＣＲの転写活性化因子として機能し得ると考えられている。今までのところ、Ｅ６*ＩＩポリペプチドに割り当てられている機能はない。Ｅ６*Ｉポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１３に示す。Ｅ６*ＩＩポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号３６に示す。
【０１０８】
好ましくは、（２２６＾５２６によってコードされる）Ｅ６*ＩＩポリペプチドのスプライスされたｍＲＮＡの量の決定のために、抗体は、配列番号３９に示したアミノ酸配列を持っているペプチドに特異的に結合しなくてはならない。
【０１０９】
さらに、２２６＾５２６スプライスされたｍＲＮＡ、要するにＥ６*ＩＩ ｍＲＮＡの量の決定のためのプローブ・オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号３８に示した核酸配列を含んでなる。
【０１１０】
２２６＾５２６スプライスされたｍＲＮＡの増幅のための好ましいオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号３４及び配列番号４２に示した核酸配列を含んでなる。
【０１１１】
前記方法との関連において言及したその他のポリペプチドの量の決定のための好ましい抗体、その他のｍＲＮＡの量の決定のための好ましいプローブ・オリゴヌクレオチド、及びその他のｍＲＮＡの増幅のための好ましいオリゴヌクレオチドを、本明細書中の他の場所（表１、表３、表７）に記載する。
【０１１２】
本明細書中で使用する「８８０＾２７０９の遺伝子産物」という用語は、好ましくは、ＨＰＶ１６の８８０＾２７０９スプライスされたｍＲＮＡ、及び前記８８０＾２７０９スプライスされたｍＲＮＡによってコードされるＨＰＶ１６のＥ２ポリペプチドを包含する。
【０１１３】
Ｅ２ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号７９に示す。前記Ｅ２ポリペプチドをコードする核酸配列を、配列番号８０に示す。
【０１１４】
８８０＾２７０９スプライスされたｍＲＮＡは、好ましくは、８８０位の供与ヌクレオチドを２７０９位の受容ヌクレオチドに連結することによって作り出される核酸配列を含んでなる。従って、８８０＾２７０９スプライスされたｍＲＮＡは、好ましくは、スプライスジャンクションを含む前記核酸配列を含んでなる。好ましくは、前記スプライスされたｍＲＮＡは、配列番号８１に示した核酸配列を含んでなる。
【０１１５】
好ましくは、第１遺伝子産物量対第２遺伝子産物量の比が決定される。前記比に関して、基準比より高い、検査試料において計算された比は、好ましくは、重症型のＨＰＶ感染を示す。より好ましくは、基準比より著しく高い、検査試料において計算された比は、重症型のＨＰＶ感染を示す。最も好ましくは、前記計算された比は、基準比より統計的に有意に高い。重症型のＨＰＶ感染を示す好ましい比を、表５に示す。
【０１１６】
好ましくは、基準比より低い、検査試料において計算された（第１遺伝子産物量対第２遺伝子産物量の）比は、軽症型のＨＰＶ感染を示す。より好ましくは、基準比より著しく低い、検査試料において計算された比は、軽症型のＨＰＶ感染を示す。最も好ましくは、前記計算された比は、基準比より統計的に有意に低い。軽症型のＨＰＶ感染を示す好ましい比を、表５に示す。
【０１１７】
有益なことには、ＨＰＶ１６を患っている被験体の試料中の、本明細書中に示した第１遺伝子産物量を決定し、及び被験体の試料中の、本明細書中に示した第２遺伝子産物量を決定し、前記第１遺伝子産物の前記量と前記第２遺伝子産物の前記量の比を計算し、そして前記比を基準と比較することが、ＨＰＶ１６感染の軽症型と重症型を確実に判別するために必要であることが示された。特に、以下の比が、軽症型又は重症型のＨＰＶ感染に罹患しているＨＰＶ保菌被験体の合計８０個の試料において計算された（実施例もまた参照のこと）：ＨＰＶ１６の２２６＾５２６スプライスされたｍＲＮＡの量対Ａｐｍ１ ｍＲＮＡの量の比、ＨＰＶ１６の２２６＾５２６スプライスされたｍＲＮＡの量対Ｕｂｃ ｍＲＮＡの量の比、ＨＰＶ１６の２２６＾５２６スプライスされたｍＲＮＡの量対Ｕ１Ａ ｍＲＮＡの量の比、ＨＰＶ１６の２２６＾５２６スプライスされたｍＲＮＡの量対ＨＰＶ１６の８８０＾３３５８スプライスされたｍＲＮＡの量の比、ＨＰＶ１６の２２６＾５２６スプライスされたｍＲＮＡの量対ＨＰＶ１６の８８０＾２７０９スプライスされたｍＲＮＡの量の比、及びＨＰＶ１６の２２６＾５２６スプライスされたｍＲＮＡの量対ＨＰＶ１６のＥ５ ｍＲＮＡの量の比。計算された比は、次第に軽症型のＨＰＶ１６感染から重症型のＨＰＶ１６感染へと非常に著しい差異が示されたことが明らかになった。さらに、本発明の方法は、従来技術のものに比べて高い特異性と感度でＨＰＶ感染の軽症型と重症型を判別することを可能にする。
【０１１８】
ＵＳ２００７０１５４８８４では、Ｅ６及び／又はＥ７の発現レベルとＬ１及び／又はＥ２の発現レベル、並びにＥ６及び／又はＥ７対Ｌ１及び／又はＥ２の比が決定され、ここでは、２より大きな比がＨＰＶ誘導細胞形質転換と新生物のリスクを示していた。
【０１１９】
本発明の方法で提示されたデータによると、第２遺伝子産物、例えばＵｂｃ転写物に対する比較において、Ｅ６又はＥ７の完全長ＯＲＦ含有転写物の量の決定に比べて、２２６＾５２６スプライスされた転写物の発現レベルを決定することが、（表６、ｐ値によって示したとおり）ＨＰＶベースの疾患の病期をより示している。驚いたことに、癌の進行中、２２６＾５２６（Ｅ６*ＩＩ）スプライスされた転写物の発現は、Ｅ６*Ｉ、Ｅ６又はＥ７の完全長ＯＲＦ含有転写物に比べて、より強く上方制御されることがわかった（図４）。その結果、２２６＾５２６スプライスされた転写物の遺伝子発現の決定は、ＨＰＶ１６感染の軽症型と重症型を判別するためにより有益である。好ましくは、Ｅ６*ＩＩ発現の決定値が、前記第２遺伝子産物と比較される。さらに、本発明は、ＨＰＶの組み込み状況の分析のために、第２遺伝子産物、例えば８８０＾３３５８、８８０＾２７０９又はＥ５の完全長ＯＲＦ含有転写物などと組み合わせたＥ６*ＩＩが好適であることを説明する（図６）。特に、組み込み状況を検出する際に、これらの組み合わせは、当該技術分野で知られている他の組み合わせに比べてより確実であった。
【０１２０】
さらに、本発明は、ＨＰＶ１６に感染している被験体において（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別する方法であって、以下のステップ：
ａ）第１の比を計算し、ここで、前記計算は以下のステップ：
ａ１）前記被験体の試料中の第１遺伝子産物量を決定し、ここで、前記第１遺伝子産物は、８８０＾２５８２の遺伝子産物であり
ａ２）前記被験体の試料中の第２遺伝子産物量を決定し、ここで、前記第２遺伝子産物は、３６３２＾５６３９の遺伝子産物、８８０＾３３５８の遺伝子産物、Ａｐｍ１の遺伝子産物、Ｕｂｃの遺伝子産物、Ｕ１Ａの遺伝子産物、Ｅ１の遺伝子産物、Ｅ５の遺伝子産物、Ｌ１の遺伝子産物、及びＥ６*Ｉの遺伝子産物から成る群から選択され、そして
ａ３）ステップａ１）で決定した前記第１遺伝子産物量とステップａ２）で決定した前記第２遺伝子産物量の第１の比を計算すること、
を含んでなり、
ｂ）第２の比を計算し、ここで、前記計算は、以下のステップ：
ｂ１）前記被験体の試料中の第３遺伝子産物量を決定し、ここで、前記第３遺伝子産物は、Ｅ６*ＩＩの遺伝子産物であり、
ｂ２）前記被験体の試料中の第４遺伝子産物量を決定し、ここで、前記第４遺伝子産物は、Ａｐｍ１の遺伝子産物、Ｕｂｃの遺伝子産物、Ｕ１Ａの遺伝子産物、８８０＾３３５８の遺伝子産物、８８０＾２７０９の遺伝子産物、及びＥ５の遺伝子産物から成る群から選択され、並びに
ｂ３）ステップｂ１）で決定した前記第３遺伝子産物量とステップｂ２）で決定した前記第４遺伝子産物量の第２の比を計算すること、
を含んでなり、
ｃ）ステップａ）で決定された前記第１の比を第１の基準比と比較し、及びステップｂ）で決定された前記第２の比を第２の基準比と比較し、並びに、
ｄ）（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別すること、
を含んでなる方法に関する。
【０１２１】
好ましくは、前記第２遺伝子産物は、３６３２＾５６３９の遺伝子産物であり、好ましくは、前記第４遺伝子産物は、８８０＾３３５８の遺伝子産物である。
【０１２２】
本発明との関連において、様々な遺伝子産物の好ましい基準比を、本明細書中の他の場所（表５）に記載する。
【０１２３】
好ましくは、第１遺伝子産物量対第２遺伝子産物の比、及び第３遺伝子産物量対第４遺伝子産物の比が計算される。
【０１２４】
好ましくは、（ｉ）前記第１の基準比より高い第１の比、及び／又は（ｉｉ）第２の基準比より高い第２の比は、重症型のＨＰＶ１６感染を示唆している。よって、重症型のＨＰＶ１６は、好ましくは、前記第１の比若しくは前記第２の比のいずれか、又はその両方が対応する基準比より高い場合に示唆される。
【０１２５】
好ましくは、（ｉ）前記第１の基準比より低い第１の比、及び（ｉｉ）第２の基準比より低い第２の比は、軽症型のＨＰＶ１６感染を示唆している。よって、軽症型のＨＰＶ１６感染は、好ましくは、前記第１の比と前記第２の比の両方が対応する基準比より低い場合に示唆される。
【０１２６】
本発明との関連において、（前記方法のステップａ）の）第１の比、及び前記方法の（ステップｂの）第２の比を計算し、そして前記第１の比と前記第２の比を基準比と比較することが、ＨＰＶ１６感染の重症型と軽症型を確実に判別することを可能にすることが分かった。特に、前記第１の比を計算し、そして前記第１の比を基準比と比較することが、エピソーム型（下記を参照のこと）でＨＰＶ１６ゲノムを含んでいるが、重症型のＨＰＶ感染を患っている（又はそのリスクがある）被験体を特定することを可能にすることがわかった。一般に、エピソーム型のみでＨＰＶ１６ゲノムを含んでいる被験体は、組み込み型（「エピソーム型」及び「組み込み型」という用語の説明については、本明細書中、下記を参照のこと）でＨＰＶ１６ゲノム含んでいる被験体に比べて、ＨＳＩＬ又は癌に罹患するリスクが低いと考えられている。しかしながら、エピソーム型のみでＨＰＶ１６ゲノムを含んでいるいくらかの被験体が、重症型のＨＰＶ１６感染に罹患しているか又はそれに罹患する高いリスクを有する徴候がある（Vinokurova, S., N. Wentzensen, I. Kraus, R. Klaes, C. Driesch, P. Melsheimer, F. Kisseljov, M. Durst, A. Schneider, and M. von Knebel Doeberitz. 2008. Type-dependent integration frequency of human papillomavirus genomes in cervical lesions. Cancer Res 68:307-13、Pett, M., and N. Coleman. 2007. Integration of high-risk human papillomavirus: a key event in cervical carcinogenesis? J Pathol 212:356-67）。先に記載したとおり第１の比を計算することによって、エピソーム型でＨＰＶ１６ゲノムを持ち、且つ、重症型のＨＰＶ１６感染に罹患している（又はそのリスクがある）被験体が、確実に特定できる。好ましくは、対応する第１の基準比より高い第１の比を有する被験体は、エピソーム型でＨＰＶ１６ゲノムを含んでいるが、重症型のＨＰＶ１６感染に罹患している（又はそのリスクがある）。好ましくは、基準比より低い第１の比は、前記罹患体は重症型のＨＰＶ１６感染に罹患していないことを示唆している（第２の比もまた対応する基準比より低い、要するに前記被験体が組み込み型でＨＰＶ１６ゲノムを含んでいない場合には、下記を参照のこと）。
【０１２７】
さらに、第２の比を計算し、そして前記第２の比を第２の基準比と比較することが、組み込み型でＨＰＶ１６ゲノムを含んでいる被験体を確実に特定することを可能にすることがわかった。特に、第２の基準比より高い第２の比は、被験体が組み込み型でＨＰＶ１６ゲノムを含んでいることを示唆し、それに対し、第２の基準比より低い第２の比は、前記被験体が組み込み型でＨＰＶ１６ゲノムを含んでいないことを示唆している。
【０１２８】
よって、対応する基準比より高い第１の比及び／又は第２の比は、好ましくは、被験体が重症型のＨＰＶ１６感染に罹患している（又はそのリスクがある）ことを示唆しているが、それに対して、対応する基準比より低い第１の比及び第２の比は、好ましくは、被験体が軽症型のＨＰＶ１６感染に罹患していることを示唆している。よって、第１の比と第２の比の計算は、診断の特異性と感度を著しく高める。
【０１２９】
さらに、８８０＾２５８２単独の遺伝子産物の決定は、エピソーム型でＨＰＶ１６を含んでおり、且つ、重症型のＨＰＶ１６感染に罹患している（又はそれに罹患するリスクがある）被験体を特定することを可能にすることが、本発明との関連において明らかになった。ＨＰＶ関連疾患のこの臨床的に有用な評価は、ＨＰＶ８８０＾２５８２含有ＲＮＡ転写物の発現の簡単な陽性又は陰性決定だけに基づいており、発現レベルの正確な定量決定又は２種類の転写物の発現レベルの相違の決定を必要としない（下記を参照のこと）。
【０１３０】
よって、本発明は、ＨＰＶ１６に感染している被験体において（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別する方法であって、以下のステップ：
ａ１）前記被験体の試料において、８８０＾２５８２の遺伝子産物量を決定し、
ａ２）ステップａ１）で決定した量を基準と比較し、
ｂ）前記被験体の試料において、ＨＰＶ１６ゲノムの組み込み状況を評価し、及び
ｃ）（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別すること、
を含んでなる方法に関する。
【０１３１】
好ましくは、前記方法のステップａ１）及びａ２）は、エピソーム型でＨＰＶ１６のゲノムを含んでいるが、重症型のＨＰＶ１６感染に罹患している（又はそのリスクがある）被験体を特定することを可能にする。好ましくは、前記方法のステップｂ）における評価は、組み込み型でＨＰＶ１６ゲノムを含んでいる被験体とそうでない被験体を特定する。組み込み型でＨＰＶ１６ゲノムを含んでいる被験体は、好ましくは、重症型のＨＰＶ１６感染に罹患している（又はその高いリスクがある）（Vinokurova, S., N. Wentzensen, I. Kraus, R. Klaes, C. Driesch, P. Melsheimer, F. Kisseljov, M. Durst, A. Schneider, and M. von Knebel Doeberitz. 2008. Type-dependent integration frequency of human papillomavirus genomes in cervical lesions. Cancer Res 68:307-13、Pett, M., and N. Coleman. 2007. Integration of high-risk human papillomavirus: a key event in cervical carcinogenesis? J Pathol 212:356-67）。組み込み型でＨＰＶ１６ゲノムを含んでいない被験体は、また、８８０＾２５８２の遺伝子産物量が基準より少ないのであれば、好ましくは、重症型のＨＰＶ１６感染に罹患していない（及びその高いリスクがない）。
【０１３２】
前記方法は、被験体の試料中のＨＰＶ１６ゲノムの組み込み状況を評価するステップを含んでなる。ＨＰＶ１６ゲノムが、組み込み型、エピソーム型、又はその両方で宿主細胞内に存在していることが当該技術分野で知られている。「組み込まれた」及び「エピソーム」という用語は、当業者に理解されている。前記ＨＰＶ１６ゲノムが宿主細胞の染色体ＤＮＡによって安定的に含まれている場合、ＨＰＶ１６ゲノムは、好ましくは、宿主細胞内に組み込み型で存在している。前記ゲノムが宿主細胞の染色体ＤＮＡ内に組み込まれることなしに前記宿主細胞内で複製している場合、ＨＰＶ１６ゲノムは、好ましくは、宿主細胞内にエピソーム型で存在している（Vinokurova, S., N. Wentzensen, I. Kraus, R. Klaes, C. Driesch, P. Melsheimer, F. Kisseljov, M. Durst, A. Schneider, and M. von Knebel Doeberitz. 2008. Type-dependent integration frequency of human papillomavirus genomes in cervical lesions. Cancer Res 68:307-13）。
【０１３３】
本明細書中で使用する「ＨＰＶ１６ゲノムの組み込み状況を評価する」という語句は、好ましくは、ＨＰＶ１６のゲノムが組み込み型で存在しているかどうか、要するに、前記ゲノムが宿主細胞の染色体ＤＮＡ内に組み込まれているかどうか評価することを意味する。ＨＰＶ１６ゲノムが被験体のゲノム内に組み込まれている場合、前記被験体の全細胞がそのゲノム内に組み込まれたＨＰＶ１６ゲノムをもっているわけではないことは、理解されるべきである。好ましくは、ＨＰＶ１６感染を受けた細胞だけが、組み込み型でＨＰＶ１６ゲノムを含んでいる可能性がある。好ましくは、前記細胞は、前記被験体の泌尿生殖器又は口咽頭管に存在している。「組み込み型」という用語はさらに、宿主細胞の染色体ＤＮＡ内へのＨＰＶ１６の一部の組み込みも包含する。好ましくは、Ｅ６、Ｅ７、及びＥ１のＮ末端の一部の遺伝子を含めたＨＰＶ１６ゲノムの初期領域が、宿主ゲノム内に組み込まれることは、理解されるべきである。しかしながら、Ｅ４、Ｅ５、及びＬ１遺伝子を含めたＨＰＶ１６ゲノムの後期領域もまた、宿主ゲノム内に組み込まれるかもしれないが、最も好ましくは、ゲノム再配列のため転写的に不活性であることは、理解されるべきである。さらに、通常、Ｅ２遺伝子は、組み込み又は転写的不活化の間に失われることが知られている（Pett, M., and N. Coleman. 2007. Integration of high-risk human papillomavirus: a key event in cervical carcinogenesis? J Pathol 212:356-67）。
【０１３４】
ＨＰＶ１６ゲノムの組み込み状況をどのように評価するかは、当該技術分野で周知である。好ましくは、組み込み状況は、被験体の試料において決定される。組み込み状況を決定するために好ましい方法は、（ｉ）ウイルス‐宿主融合転写物、特に、例えばパピローマウイルス癌遺伝子転写物の増幅（ＡＰＯＴアッセイ）及びＲＮＡインサイツ（in situ）ハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）による転写的に活性なウイルス成分を検出する方法；並びに（ｉｉ）その転写状況にかかわらず組み込まれたウイルスＤＮＡを検出する方法、例えば、サザンブロッティング、定量的リアルタイムＰＣＲ、制限部位ＰＣＲ、及びＤＮＡ ＩＳＨ、である（Pett, M., and N. Coleman. 2007. Integration of high-risk human papillomavirus: a key event in cervical carcinogenesis? J Pathol 212:356-67）。
【０１３５】
従って、本明細書中で使用する「基準量」という用語は、ＨＰＶ１６に感染している被験体において軽症型と重症型のＨＰＶ感染を判別することができる量を指す。従って、基準は、（ｉ）軽症型のＨＰＶ感染に罹患していることが知られている被験体、又は（ｉｉ）重症型のＨＰＶ感染に罹患しているのが知られている被験体のいずれかから得ることもできる。（ｉ）及び（ｉｉ）に関して、基準は、好ましくは、エピソーム型だけでＨＰＶを含んでいる被験体から得られる。さらに、８８０＾２５８２の遺伝子産物の基準量は、閾値量と規定することもでき、それにより、（前記被験体が組み込み型でＨＰＶ１６ゲノムを含んでいない場合、他の場所を参照のこと）それぞれの閾値より低い８８０＾２５８２の遺伝子産物量は、軽症型のＨＰＶ感染に罹患している被験体を示唆するものとし、それに対して、閾値より高い８８０＾２５８２の遺伝子産物量は、重症型のＨＰＶ１６感染に罹患している被験体を示唆するものとする。個々の被験体に適用できる基準量は、様々な生理学的パラメーター、例えば年齢、性別、又は下位個体群など、並びに本明細書中で言及した転写物又はポリペプチドの決定に使用した手段によって異なることがある。好適な基準量は、検査試料と一緒に、すなわち、同時又はそれに続いて分析されるべき基準試料から本発明の方法によって決定することもできる。
【０１３６】
好ましくは、基準量より多い８８０＾２５８２の遺伝子産物量、及び／又は組み込み型でのＨＰＶ１６ゲノムの存在は、重症型のＨＰＶ１６感染を示唆する。
【０１３７】
好ましくは、基準量より少ない８８０＾２５８２の遺伝子産物量、及びＨＰＶ１６ゲノムの組み込み型の不存在（要するに、ＨＰＶ１６ゲノムは染色体ＤＮＡ内に組み込まれていない）は、軽症型のＨＰＶ１６感染を示唆する。
【０１３８】
本発明との関連において、８８０＾２５８２の遺伝子産物の存在が重症型のＨＰＶ１６感染を示唆することが明らかにされた。ここで、ＨＰＶ１６ゲノムの組み込み型の不存在と共に、８８０＾２５８２の遺伝子産物の不存在は、軽症型のＨＰＶ１６感染を示唆する（次の段落もまた参照のこと）。よって、基準量は、好ましくは、検出限界である。従って、検出限界より多い８８０＾２５８２の遺伝子産物量、及び／又は組み込み型でのＨＰＶ１６ゲノムの存在は、好ましくは、重症型のＨＰＶ１６感染を示唆する。好ましくは、検出限界より少ない８８０＾２５８２の遺伝子産物量、及び組み込み型のＨＰＶ１６ゲノムの不存在（要するに、ＨＰＶ１６ゲノムは染色体ＤＮＡ内に組み込まれていない）は、軽症型のＨＰＶ１６感染を示唆する。当業者は検出限界を決定する方法を知っている。本明細書中で使用する「検出限界」という用語は、好ましくは、実施例に記載した８８０＾２５８２の決定のためのアッセイの検出限界を指す。
【０１３９】
有益なことには、８８０＾２５８２の遺伝子産物量を決定し、前記量を基準量と比較し、そしてＨＰＶ１６ゲノムの組み込み状況を評価することが、ＨＰＶ１６に感染している被験体において軽症型と、より重症型のＨＰＶ１６感染を確実に判別するために必要であることが、明らかにされた。具体的には、８８０＾２５８２スプライスされたｍＲＮＡの量は、細胞学的に規定された病変を持つ患者の子宮頚部剥離細胞を含んでいる試料において決定された（ＬＳＩＬ〜ＨＳＩＬ、子宮頚癌）。さらに、８８０＾２５８２スプライスされたｍＲＮＡは、ＳｉＨａ、ＣａｓＫｉ、ＭＲＩ‐Ｈ１９６、及びＭＲＩ‐Ｈ１８６を含めた様々な子宮頚癌細胞株に見られた。さらに、組み込み状況は、組み込まれたＨＰＶゲノムが細胞内に通常存在しない転写物の量を決定することによって評価された（例えば、８８０＾３３５８の不存在は、ＨＰＶゲノムが染色体に組み込まれているが、Ｅ１＾Ｅ４発現を欠くことを示唆する）。Ｅ１＾Ｅ４をコードする８８０＾３３５８転写物、Ｅ２をコードする８８０＾２７０９転写物又はＥ５をコードするＥ５の完全長転写物の検出に対する、Ｅ６*ＩＩをコードする転写物の検出が組み込み状況について示唆していることが、明らかにされた。よって、Ｅ６*ＩＩをコードする転写物と、例えばＥ１＾Ｅ４、Ｅ２又はＥ５をコードする転写物の比を決定することによって、転写物の既知の組み合わせ、例えばＥ２、Ｅ５、及び／又はＬ１と比較したＥ６及び／又はＥ７などを使用することによるのと比べて、より正確に組み込み状況が予測し得る（図６、表５）。
【０１４０】
適用されるのであれば、本発明の方法は有益である。なぜなら、当該方法は、ＨＰＶに感染した細胞の染色体ＤＮＡ内にＨＰＶゲノムが組み込まれていない患者のＨＰＶ感染の重症度を評価することを可能にするからである。従来技術では、宿主の染色体ＤＮＡ内へのＨＰＶゲノムの組み込みは、より悪い予後に関連することが知られており、且つ、子宮頚癌の発症における重要な役割を担っていると考えられている。しかしながら、子宮頚癌はＨＰＶゲノムが宿主の染色体ＤＮＡ内に組み込まれていなくても発症するという、いくつかの報告もまた存在する。組み込み型でＨＰＶゲノムを含んでいない被験体における軽症型と重症型のＨＰＶ１６感染を判別するための確実なＨＰＶマーカーベースの方法は、当該技術分野において説明されていない。
【０１４１】
本発明の方法の好ましい実施形態では、組み込み状況の評価は、以下のステップ：
ｂ１）被験体の試料において、Ｅ６*ＩＩの第１遺伝子産物量、及び８８０＾３３５８の遺伝子産物、８８０＾２７０９の遺伝子産物、及びＥ５の遺伝子産物から成る群から選択される第２遺伝子産物量を決定し、
ｂ２）前記第１遺伝子産物量と前記第２遺伝子産物量の比（好ましくは、第１遺伝子産物量対第２遺伝子産物量の比）を計算し、及び
ｂ３）前記比を基準比と比較すること、
を含んでなる。
【０１４２】
遺伝子産物量の決定及び基準比の計算のための好ましい方法、並びに好ましい基準比は、本明細書中の他の場所に記載されている（表５）。
【０１４３】
好ましくは、組み込み状況を評価するために決定されるべき比は、Ｅ６*ＩＩの遺伝子産物量対８８０＾３３５８の遺伝子産物量の比である。
【０１４４】
好ましくは、基準比より高い、Ｅ６*ＩＩの第１遺伝子産物量対、好ましくは８８０＾３３５８の、第２遺伝子産物量の比は、ＨＰＶのゲノムが組み込み型で存在していることを示唆する。
【０１４５】
好ましくは、基準比より低い、Ｅ６*ＩＩの第１遺伝子産物量対、好ましくは８８０＾３３５８の、第２遺伝子産物量の比は、ＨＰＶのゲノムが組み込み型で存在していないことを示唆する。
【０１４６】
従って、（ｉ）基準量より多い８８０＾３３５８の遺伝子産物量、及び／又は（ｉｉ）基準比より高い、Ｅ６*ＩＩの遺伝子産物量対８８０＾２５８２の遺伝子産物量の比は、重症型のＨＰＶ１６感染を示唆する。
【０１４７】
好ましくは、（ｉ）基準量より少ない８８０＾２５８２の遺伝子産物量、及び（ｉｉ）（組み込み型のＨＰＶ１６ゲノムの不存在を示唆する）基準比より低いＥ６*ＩＩの遺伝子産物量対８８０＾３３５８の遺伝子産物量の比は、軽症型のＨＰＶ１６感染を示唆する。
【０１４８】
有益なことには、ＨＰＶ１６ゲノムの組み込み状況は、ｂ１）被験体の試料において、Ｅ６*ＩＩの遺伝子産物量と第２遺伝子産物（好ましくは８８０＾３３５８）を決定し、ｂ２）Ｅ６*ＩＩの遺伝子産物量と第２遺伝子産物量の比（好ましくはＥ６*ＩＩの遺伝子産物量対第２遺伝子産物量の比）を計算し、そしてｂ３）前記比を基準比と比較すること、によって評価できることが、本発明の研究により明らかにされた。前記ステップを実施することによる組み込み状況の評価は有益である、なぜなら、一回の反応において８８０＾２５８２、３６３２＾５６３９、Ｅ６*ＩＩ、及び８８０＾３３５８の遺伝子産物を定量化することによって、８８０＾２５８２（ステップａ１を参照のこと）の遺伝子産物量の決定と組み込み状況の評価を同時におこなうことができるためである。
【０１４９】
本発明の前記方法のよりいっそう好ましい実施形態では、ステップａ１）は、更なる遺伝子産物量を決定し、ここで、前記更なる遺伝子産物は、３６３２＾５６３９の遺伝子産物、８８０＾３３５８の遺伝子産物、Ａｐｍ１の遺伝子産物、Ｕｂｃの遺伝子産物、Ｕ１Ａの遺伝子産物、Ｅ１の遺伝子産物、Ｅ５の遺伝子産物、Ｌ１の遺伝子産物、及びＥ６*Ｉの遺伝子産物から成る群から選択され、並びに、８８０＾２５８２の遺伝子産物量と前記更なる遺伝子産物量の比を計算することを更に含んでなる。よって、ステップａ２）では、（８８０＾２５８２の量を基準量と比較することの代わりに）決定された比が基準比と比較される。好ましい基準比は、本明細書中の他の場所に記載されている。
【０１５０】
好ましくは、前記更なる遺伝子産物は、３６３２＾５６３９の遺伝子産物である。
【０１５１】
好ましくは、８８０＾２５８２の遺伝子産物量と前記更なる遺伝子産物量の計算された比は、８８０＾２５８２の遺伝子産物量対前記更なる遺伝子産物量の比である。
【０１５２】
好ましくは、基準比より高い、前記８８０＾２５８２の遺伝子産物量対前記更なる遺伝子産物量の比、及び／又は組み込み型のＨＰＶ１６ゲノムの存在は、重症型のＨＰＶ１６感染を示唆する。
【０１５３】
より好ましくは、基準比より高い、前記８８０＾２５８２の遺伝子産物量対前記更なる遺伝子産物量の比、及び／又は組み込み型のＨＰＶ１６ゲノムの存在は、重症型のＨＰＶ１６感染を示唆する。
【０１５４】
最も好ましくは、（ｉ）基準比より高い、前記８８０＾２５８２の遺伝子産物量対前記更なる遺伝子産物量の比、及び／又は（ｉｉ）基準比より低い、Ｅ６*ＩＩの遺伝子産物量対８８０＾３３５８の遺伝子産物量の比（組み込み型のＨＰＶ１６ゲノムの不存在を示唆する）は、軽症型のＨＰＶ１６感染を示唆する。
【０１５５】
好ましくは、基準比より低い、８８０＾２５８２の遺伝子産物量対前記更なる遺伝子産物量の比、及び組み込み型のＨＰＶ１６ゲノムの不存在（よって、ＨＰＶ１６ゲノムは染色体ＤＮＡ内に組み込まれていない）は、軽症型のＨＰＶ１６感染を示唆する。
【０１５６】
より好ましくは、基準比より低い、８８０＾２５８２の遺伝子産物量対前記更なる遺伝子産物量の比、及び基準比より低い、Ｅ６*ＩＩの遺伝子産物量対８８０＾３３５８の遺伝子産物量の比（組み込み型のＨＰＶ１６ゲノムの不存在を示唆する）は、軽症型のＨＰＶ１６感染を示唆する。
【０１５７】
その他のＨＰＶ遺伝子型（ＨＰＶ１６の代わり、要するにその他のＨＰＶ遺伝子型に感染している被験体に関する）、特にＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ４５に関して本発明の方法を実施することもまた企図される。本明細書中に記載のＨＰＶ１６の遺伝子産物に対応するそれらの遺伝子産物の量が決定されることは、理解されるべきである。
【０１５８】
ＨＰＶ１６を除いた高リスクＨＰＶタイプは、全子宮頚癌の〜４５％に寄与していることは周知である。組み込みはすべての高リスクＨＰＶタイプの発癌において重要な役割を果たすことが実証された。しかしながら、高リスクＨＰＶタイプ１６、並びに系統学的に関連したタイプ３１及び３３については、組み込みは頻繁に起こらないので、例えばＬＣＲのＥ１Ｃ媒介型上方制御などの進行に関する第２のモードが示唆される。それにしても、これらのＨＰＶタイプによって引き起こされた子宮頚癌のうちの大部分に関して、及びＨＰＶ１８や４５を含めたその他のタイプによって引き起こされた子宮頚癌のうちの非常に高い割合に関して、組み込みは子宮頚癌の発症における重要事象である（Vinokurova, S., N. Wentzensen, I. Kraus, R. Klaes, C. Driesch, P. Melsheimer, F. Kisseljov, M. Durst, A. Schneider, and M. von Knebel Doeberitz. 2008. Type-dependent integration frequency of human papillomavirus genomes in cervical lesions. Cancer Res 68:307-13）。よって、本明細書中に記載した転写解析による組み込みの計測は、組み込まれたＨＰＶゲノムを持っている女性を容易に特定することを可能にする。好ましい実施形態では、組み込みは、ＨＰＶタイプ１８、３１、３３、３５、及び４５のＥ６*Ｉの遺伝子産物を定量化し、そしてそれをＥ１＾Ｅ４の第２遺伝子産物と比較することによって計測される。Ｅ６*Ｉをコードする転写物のそれぞれのスプライス供与部位は、ＨＰＶタイプ１８、３１、３３、３５、４５については、それぞれｎｔ２３３、２１０、２３１、２３２、及び２３０に位置している、そしてスプライス受容部位は、ＰＶタイプ１８、３１、３３、３５、及び４５については、それぞれｎｔ４１６、４１３、５０９、４１５、及び４１３に位置している。Ｅ１＾Ｅ４をコードする転写物のそれぞれのスプライス供与部位は、ＨＰＶタイプ１８、３１、３３、及び４５については、それぞれｎｔ９２９、８７７、８９４、及び９２９に位置し、そしてスプライス受容部位は、ＨＰＶタイプ１８、３１、３３、及び４５については、それぞれｎｔ３４３２、３２９５、３３５１、３４２１に位置している。当業者は、例えばＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅とその後の配列決定によって、ＨＰＶ３５のＥ１＾Ｅ４をコードする転写物のスプライスジャンクションを決定する方法を知っている。
【０１５９】
先に言及した様々なＨＰＶ遺伝子型のゲノムの配列には、以下のジェンバンク受入番号がある：
ＨＰＶ３１    Ｊ０４３５３．１        ＧＩ：３３３０４８
ＨＰＶ３３    Ｍ１２７３２．１        ＧＩ：３３３０４９
ＨＰＶ３５    Ｍ７４１１７．１        ＧＩ：３３３０５０
ＨＰＶ１８    ＮＣ＿００１３５７．１  ＧＩ：９６２６０６９
ＨＰＶ４５    Ｘ７４４７９．１        ＧＩ：３９７０２２
【０１６０】
さらに、本発明は、ＨＰＶ１６に感染している被験体において（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別する方法であって、以下のステップ：
ａ）前記被験体の試料において、８８０＾２５８２の遺伝子産物量を決定し、
ｂ）ステップａ１）で決定した量を基準量と比較し、
ｃ）（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別すること、
を含んでなり、ここで、前記被験体が、組み込み型でＨＰＶ１６ゲノムを含んでいない前記方法に関する。
【０１６１】
好ましくは、基準量より多い８８０＾２５８２の遺伝子産物量は、前記被験体における重症型のＨＰＶ１６感染を示唆する。
【０１６２】
好ましくは、基準量より少ない８８０＾２５８２の遺伝子産物量は、前記被験体における軽症型のＨＰＶ１６感染を示唆する。
【０１６３】
好ましい実施形態では、ステップａ）は、更なる遺伝子産物量を決定し、ここで、前記更なる遺伝子産物は、３６３２＾５６３９の遺伝子産物、８８０＾３３５８の遺伝子産物、Ａｐｍ１の遺伝子産物、Ｕｂｃの遺伝子産物、Ｕ１Ａの遺伝子産物、Ｅ１の遺伝子産物、Ｅ５の遺伝子産物、Ｌ１の遺伝子産物及びＥ６*Ｉの遺伝子産物から成る群から選択され（上記も参照のこと）、そして、８８０＾２５８２の遺伝子産物量対更なる遺伝子産物量、好ましくは３６３２＾５６３９の遺伝子産物量の比を計算することをさらに含んでなる。よって、ステップｂ）では、（８８０＾２５８２の遺伝子産物量を基準量と比較する代わりに）決定された比を基準比と比較する。
【０１６４】
好ましくは、８８０＾２５８２の遺伝子産物量対更なる遺伝子産物量の計算された比は、８８０＾２５８２の遺伝子産物量対更なる遺伝子産物量の比である。
【０１６５】
好ましくは、基準比より高い、８８０＾２５８２の遺伝子産物量対更なる遺伝子産物量の比は、前記被験体における重症型のＨＰＶ１６感染を示唆する。
【０１６６】
好ましくは、基準比より低い、８８０＾２５８２の遺伝子産物量対更なる遺伝子産物量の比は、前記被験体における軽症型のＨＰＶ１６感染を示唆する。
【０１６７】
好ましい基準比は、本明細書中の他の場所に記載されている。
【０１６８】
ＨＰＶ１６以外に、他の高リスクＨＰＶタイプが子宮頚癌を引き起こすことが知られている（Munoz, N., F. X. Bosch, S. de Sanjose, R. Herrero, X. Castellsague, K. V. Shah, P. J. Snijders, and C. J. Meijer. 2003. Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer. N. Engl. J. Med. 348:518-527）。それらの中でも、それらの発癌可能性の最も強い徴候は、ＨＰＶタイプ１８、３１、３３、３５、及び４５について知られている。ＨＰＶ１６のように、これらのタイプによって引き起こされた子宮頚癌のすべてのケースにおいて、組み込みは見られなった（Vinokurova, S., N. Wentzensen, I. Kraus, R. Klaes, C. Driesch, P. Melsheimer, F. Kisseljov, M. Durst, A. Schneider, and M. von Knebel Doeberitz. 2008. Type-dependent integration frequency of human papillomavirus genomes in cervical lesions. Cancer Res 68:307-13）。これは、ＨＰＶ１６様の８８０＾２５８２転写物又はそれぞれのＨＰＶ１６様のＥ１Ｃ（ウイルスＥ１タンパク質のＣ末端部分）ポリペプチドもまた、これらのＨＰＶタイプに存在することを示唆する。当業者は、例えばＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅とそれに続く配列決定によって、他の高リスクＨＰＶタイプのスプライスジャンクションをどのように決定するか知っている。従って、それぞれのＥ１Ｃ転写物の量を決定し、そして随意に組み込み状況を評価することにより、それぞれのｈｒＨＰＶ遺伝子型、特にＨＰＶ１８、３１、３３、３５、及び４５を持つｈｒＨＰＶ感染の軽症型と重症型を判別することが可能となる。
【０１６９】
また、本発明は、ＨＰＶ１６に感染している被験体において（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別する方法であって、以下のステップ：
ａ）前記被験体の試料中の第１遺伝子産物量を決定し、ここで、前記第１遺伝子産物はｐ１６INK4Aの遺伝子産物であり、
ｂ）前記被験体の試料中の第２遺伝子産物量を決定し、ここで、前記第２遺伝子産物は８８０＾３３５８の遺伝子産物であり、
ｃ）ステップａ）で決定した前記第１遺伝子産物量対ステップｂ）で決定した前記第２遺伝子産物量の比を計算し、
ｄ）ステップｃ）で計算した比を基準比と比較し、及び
ｅ）（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別すること、
を含んでなる方法に関する。
【０１７０】
ｐ１６INK4Aは、宿主細胞のゲノムに含まれる遺伝子である。よって、前記遺伝子は、ＨＰＶ１６のゲノムによってコードされていない。本発明の方法は、そのため、ｐ１６INK4AｍＲＮＡ又はｐ１６INK4Aポリペプチドの量の決定を企図する。
【０１７１】
本明細書中で意味する「ｐ１６INK4A」という用語は、好ましくは、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子２Ａアイソフォーム１を指す。ヒトｐ１６INK4Aのアミノ酸配列、及び核酸配列は、当該技術分野で周知であり、そして例えば、ジェンバンク受入番号：ＮＭ＿００００７７．３（核酸配列、配列番号７５）及びジェンバンク受入番号：ＮＰ＿００００６８．１（アミノ酸配列、配列番号７６）に示されている。
【０１７２】
Ｅ７によって媒介されたｐ１６INK4A過剰発現は、形質転換ｈｒＨＰＶ感染に関する貴重なマーカーであると考えられる。ｐ１６INK4Aの免疫染色は、子宮頚部細胞診及び組織学的標本において上皮内新生物又は浸潤性新生物に関連することが分かっている（Dallenbach-Hellweg, G., M. J. Trunk, and M. von Knebel Doeberitz. 2004. Traditional and new molecular methods for early detection of cervical cancer. Arkh Patol 66:35-9）。
【０１７３】
前記方法のいずれかを実施することによって被験体において重症型のHPV１６感染が診断された時点で、癌療法又は追加の癌診断を開始できる。
【０１７４】
従って、本発明は、癌療法に対して感受性を示す及び／又は癌診断に対して感受性を示すＨＰＶ１６に感染している被験体を特定する方法であって、以下のステップ：
ａ）前記被験体の試料中の第１遺伝子産物量を決定し、ここで、前記第１遺伝子産物は８８０＾２５８２の遺伝子産物であり、
ｂ）前記被験体の試料中の第２遺伝子産物量を決定し、ここで、前記第２遺伝子産物は、３６３２＾５６３９の遺伝子産物、８８０＾３３５８の遺伝子産物、Ａｐｍ１の遺伝子産物、Ｕｂｃの遺伝子産物、Ｕ１Ａの遺伝子産物、Ｅ１の遺伝子産物、Ｅ５の遺伝子産物、Ｌ１の遺伝子産物、及びＥ６*Ｉの遺伝子産物から成る群から選択され、
ｃ）ステップａ）で決定した前記第１遺伝子産物量対ステップｂ）で決定した前記第２遺伝子産物量の比を計算し、
ｄ）ステップｃ）で計算した比を基準比と比較し、並びに、
ｅ）癌療法に対して感受性を示す及び／又は癌診断に対して感受性を示す被験体を特定すること、
を含んでなる方法に関する。
【０１７５】
さらに、本発明は、癌療法に対して感受性を示す及び／又は癌診断に対して感受性を示すＨＰＶ１６に感染している被験体を特定する方法であって、以下のステップ：
ａ）前記被験体の試料中の第１遺伝子産物量を決定し、ここで、前記第１遺伝子産物はＥ６*ＩＩの遺伝子産物であり、
ｂ）前記被験体の試料中の第２遺伝子産物量を決定し、ここで、前記第２遺伝子産物は、Ａｐｍ１の遺伝子産物、Ｕｂｃの遺伝子産物、Ｕ１Ａの遺伝子産物、８８０＾３３５８の遺伝子産物、８８０＾２７０９の遺伝子産物、及びＥ５の遺伝子産物から成る群から選択され、
ｃ）ステップａ）で決定した前記第１遺伝子産物量対ステップｂ）で決定した前記第２遺伝子産物量の比を計算し、
ｄ）ステップｃで計算した比を基準比と比較し、並びに、
ｅ）癌療法に対して感受性を示す被験体を特定すること、
を含んでなる方法に関する。
【０１７６】
さらに、本発明は、癌療法に対して感受性を示す及び／又は癌診断に対して感受性を示すＨＰＶ１６に感染している被験体を特定する方法であって、以下のステップ：
ａ１）前記被験体の試料中の８８０＾２５８２の遺伝子産物量を決定し、
ａ２）ステップａ１）で決定した量を基準量と比較し、
ｂ）前記被験体の試料において、ＨＰＶ１６ゲノムの組み込み状況を評価し、並びに、
ｃ）癌療法に対して感受性を示す及び／又は癌診断に対して感受性を示す被験体を特定すること、
を含んでなる方法に関する。
【０１７７】
さらに、本発明は、癌療法に対して感受性を示す及び／又は癌診断に対して感受性を示すＨＰＶ１６に感染している被験体を特定する方法であって、以下のステップ：
ａ）前記被験体の試料中の８８０＾２５８２の遺伝子産物量を決定し、
ｂ）ステップａ１）で決定した量を基準量と比較し、
ｃ）癌療法に対して感受性を示す及び／又は癌診断に対して感受性を示す被験体を特定すること、
を含んでなり、ここで、前記被験体が組み込み型でＨＰＶ１６ゲノムを含んでいない前記方法に関する。
【０１７８】
さらに、本発明は、癌療法に対して感受性を示す及び／又は癌診断に対して感受性を示すＨＰＶ１６に感染している被験体を特定する方法であって、以下のステップ：
ａ）第１の比を計算し、ここで、前記第１の比の前記計算は、以下のステップ：
ａ１）前記被験体の試料中の第１遺伝子産物量を決定し、ここで、前記第１遺伝子産物は８８０＾２５８２の遺伝子産物であり、
ａ２）前記被験体の試料中の第２遺伝子産物量を決定し、ここで、前記第２遺伝子産物は、３６３２＾５６３９の遺伝子産物、８８０＾３３５８の遺伝子産物、Ａｐｍ１の遺伝子産物、Ｕｂｃの遺伝子産物、Ｕ１Ａの遺伝子産物、Ｅ１の遺伝子産物、Ｅ５の遺伝子産物、Ｌ１の遺伝子産物、及びＥ６*Ｉの遺伝子産物から成る群から選択され、並びに、
ａ３）ステップａ１）で決定した前記第１遺伝子産物量対ステップａ２）で決定した前記第２遺伝子産物量の第１の比を計算すること、
を含んでなり、
ｂ）第２の比を計算し、ここで、前記計算は、以下のステップ：
ｂ１）前記被験体の試料中の第３遺伝子産物量を決定し、ここで、前記第３遺伝子産物はＥ６*ＩＩの遺伝子産物であり、
ｂ２）前記被験体の試料中の第４遺伝子産物量を決定し、ここで、前記第４遺伝子産物は、Ａｐｍ１の遺伝子産物、Ｕｂｃの遺伝子産物、Ｕ１Ａの遺伝子産物、８８０＾３３５８の遺伝子産物、８８０＾２７０９の遺伝子産物、及びＥ５の遺伝子産物から成る群から選択され、並びに、
ｂ３）ステップｂ１）で決定した前記第３遺伝子産物量対ステップｂ２）で決定した前記第４遺伝子産物量の第２の比を計算すること、
を含んでなり、並びに、
ｃ）ステップａ）で決定された前記第１の比を第１の基準比と比較し、及びステップｂ）で決定された前記第２の比を第２の基準比と比較し、並びに、
ｄ）癌療法に対して感受性を示す及び／又は癌診断に対して感受性を示す被験体を特定すること、
を含んでなる、前記方法に関する。
【０１７９】
本明細書中で使用する「特定する」という用語は、被験体が癌療法に対して感受性を示すかどうか評価すること、又は被験体が癌診断に対して感受性を示すかどうか評価することを意味する。当業者には当然のことながら、こういった評価は、通常、特定されるべき被験体のすべて（すなわち１００％）について正確であることを意図していない。しかしながら、前記用語は、（例えば、コホート調査において）被験体のうちの統計的に有意な部分を特定できることを必要とする。割合が統計的に有意であるかどうかは、様々な周知の統計値評価ツール、例えば信頼区間の決定、ｐ値決定、スチューデントｔ‐検定である、マン・ホイットニー検定など、を使用することで余分な手間をかけることなく当業者によって判断されることができる。詳細は、Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983で見つけられる。好ましい信頼区間は、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％である。ｐ値は、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、又は０．００１であることが好ましい。より好ましくは、集団の中の被験体のうち少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％が、本発明の方法によって適切に特定され得る。
【０１８０】
好適な癌療法は、当該技術分野で周知である。好ましくは、「癌療法」という用語には、重症型のＨＰＶ１６感染、好ましくはＨＳＩＬ、ＣＩＮ２／３、及び子宮頚癌を処置することを目指すあらゆる治療法が含まれる。好ましくは、前記癌療法は、円錐切除術、電気外科的ループ切除術（ＬＥＥＰ）、子宮頚部切除術や子宮摘出術を含めた外科手術、化学療法、及び放射線化学療法から選択される。好ましくは、「癌診断」という用語は、膣鏡検査法、及びその後の組織化学的分析を伴う膣鏡診主導の生検から選択される。
【０１８１】
さらに、本発明は、プローブ・オリゴヌクレオチド混合物を含んでなる組成物に関連し、ここで、前記プローブ・オリゴヌクレオチド混合物は、本明細書中に規定した第１の転写物を特異的に検出するプローブ・オリゴヌクレオチド、及び本明細書中に規定した第２の転写物を特異的に検出するプローブ・オリゴヌクレオチドを含んでなる。好ましくは、前記組成物は、２種類のプローブ・オリゴヌクレオチドを含んでなる。好ましいプローブ・オリゴヌクレオチドの好ましい核酸配列は、本明細書中の他の場所に記載されている（表１）。
【０１８２】
さらに、本発明は、オリゴヌクレオチド混合物を含んでなる組成物に関し、そして、前記オリゴヌクレオチド混合物は、本発明の方法の第１遺伝子産物、好ましくは転写物を特異的に増幅するオリゴヌクレオチド、及び本発明の方法の少なくとも１つの第２遺伝子産物、好ましくは転写物を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドを含んでなる（表３）。
【０１８３】
さらに、本発明は、プローブ・オリゴヌクレオチド混合物を含んでなる第１の組成物、及びオリゴヌクレオチド混合物を含んでなる第２の組成物を含んでなる組成物に関連し、そして、前記オリゴヌクレオチド混合物は、本発明の方法の第１遺伝子産物、好ましくは転写物を特異的に増幅するオリゴヌクレオチド、及び本発明の方法の少なくとも１つの第２遺伝子産物、好ましくは転写物を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドを含んでなる（表１、３）。
【０１８４】
さらに、本発明は、（ｉ）第１のポリペプチドに含まれるペプチドに特異的に結合する抗体（好ましくは、本明細書中で言及したスプライスジャンクションに隣接している核酸によってコードされる第１のポリペプチド領域に結合する抗体）、及び（ｉｉ）第２のポリペプチドに含まれるペプチドに特異的に結合する抗体（好ましくは、本明細書中で言及したスプライスジャンクションに隣接する核酸によってコードされる第２のポリペプチド領域に結合する抗体）を含んでなる組成物に関する。
【０１８５】
さらに、本発明は、ＨＰＶ１６に感染している被験体において、ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別するか、又は癌療法に対して感受性を示す及び／又は癌診断に対して感受性を示す被験体を特定する装置であって、以下の：
ａ）オリゴヌクレオチド混合物を含んでなる組成物であって、前記オリゴヌクレオチド混合物が、本発明の方法の第１遺伝子産物、好ましくは転写物を特異的に増幅するオリゴヌクレオチド、及び本発明の方法の少なくとも１つの第２遺伝子産物、好ましくは転写物を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドを含んでなるもの、
ｂ）プローブ・オリゴヌクレオチド混合物を含んでなる組成物、又は
ｃ）プローブ・オリゴヌクレオチド混合物を含んでなる組成物、及びオリゴヌクレオチド混合物を含んでなる組成物であって、前記オリゴヌクレオチド混合物が、本発明の方法の第１遺伝子産物、好ましくは転写物を特異的に増幅するオリゴヌクレオチド、及び本発明の方法の少なくとも１つの第２遺伝子産物、好ましくは転写物を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドを含んでなるもの、
を含んでなる装置に関する。
【０１８６】
さらに、本発明は、ＨＰＶ１６に感染している被験体において（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別するか、又は癌療法に対して感受性を示す及び／又は癌診断に対して感受性を示す被験体を特定するための装置であって、被験体の試料中の第１遺伝子産物量を決定する手段、被験体の試料中の第２遺伝子産物量を決定する手段、前記第１遺伝子産物量対第２遺伝子産物量の比を計算するための手段、及び計算された比を基準比と比較するための手段を含んでなり、それによって、（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別するか、又はそれによって、癌療法に対して感受性を示す及び／又は癌診断に対して感受性を示す被験体を特定する、前記装置に関する。
【０１８７】
さらに、本発明は、ＨＰＶ１６に感染している被験体において（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別するか、又は癌療法に対して感受性を示す及び／又は癌診断に対して感受性を示す被験体を特定するための装置であって、被験体の試料中の８８０＾２５８２の遺伝子産物量を決定する手段、前記手段によって決定した量を基準量と比較する手段、及び前記被験体の試料中のＨＰＶ１６ゲノムの組み込み状況を評価する手段を含んでなり、それによって、（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別するか、又はそれによって、癌療法に対して感受性を示す及び／又は癌診断に対して感受性を示す被験体を特定する、前記装置に関する。
【０１８８】
さらに、本発明は、ＨＰＶ１６に感染している被験体において（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別するか、又は癌療法に対して感受性を示す及び／又は癌診断に対して感受性を示す被験体を特定するための装置であって、被験体の試料中の８８０＾２５８２の遺伝子産物量を決定する手段、前記手段によって決定した量を基準量と比較する手段、及び前記被験体の試料中のＨＰＶ１６ゲノムの組み込み状況を評価する手段を含んでなり、それによって、（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別するか、又はそれによって、癌療法に対して感受性を示す及び／又は癌診断に対して感受性を示す被験体を特定する、前記装置に関する。
【０１８９】
さらに、本発明は、ＨＰＶ１６に感染している被験体において（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別するか、又は癌療法に対して感受性を示す及び／又は癌診断に対して感受性を示す被験体を特定するための装置であって、前記被験体が組み込み型でＨＰＶ１６ゲノムを含んでおらず、ここで、被験体の試料中の８８０＾２５８２の遺伝子産物量を決定する手段、及び前記手段によって決定した量を基準量と比較する手段を含んでなり、それによって、（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）が軽症型のＨＰＶ１６感染を判別するか、又は癌療法に対して感受性を示す及び／又は癌診断に対して感受性を示す被験体を特定する、前記装置に関する。
【０１９０】
本明細書中で使用する「装置」という用語は、ＨＰＶ１６感染の軽症型と重症型を判別すること、又は癌療法に対して感受性を示す及び／又は癌診断に対して感受性を示す被験体を特定することを可能にするように互いに作動できるように連結された前記手段を少なくとも含んでなる手段のシステムに関する。遺伝子産物の量を決定する好ましい手段、比を計算する手段、及び比較を実施する手段が、本発明の方法に関連して先に開示されている。作動様式によりどのように手段を連結するかは、その装置内に組み込まれる手段のタイプによる。例えば、自動的に遺伝子産物量を決定する手段が適用される場合、前記自動的に作動する手段によって得られたデータを、例えば、所望の結果を得るためのコンピュータープログラムによって処理できる。好ましくは、前記手段は、このような場合、単独の装置に含まれる。従って、前記装置は、適用された試料中の遺伝子産物量の計測のための分析ユニット、及び評価のために得られたデータを処理するためのコンピューターユニットを含むこともできる。検出のための好ましい手段は、上記の発明の方法に関連する実施形態に関連して開示されている。このような場合には、システムのユーザーが、量の決定結果と、マニュアルに定められた指示及び解釈による診断値又は予後値をまとめるという点で、手段が作動できるように連結される。そのような態様では、手段は別々の装置のようであってもよいが、好ましくは、キットとして一緒にパッケージされている。当業者は、余分な手間をかけることなく、どのように手段を連結するか気付く。好ましい装置は、専門的な臨床医の特別な知識を必要とせずに適用されるもの、例えば、試験紙又は試料をただ添加するだけでよい電子装置である。結果は、臨床医による解釈を必要とする未処理データの出力として得ることもできる。しかしながら、好ましくは、装置の出力は、その解釈に臨床医を必要としない処理された生データ、すなわち、評価された生データである。さらに好ましい装置は、本発明の方法に従って先に言及した分析ユニット／装置（例えば、バイオセンサー、アレイ、その量が決定されるべきポリペプチド、ｍＲＮＡ、増幅された遺伝子産物を特異的に認識するリガンドが結合した固体支持体、表面プラズモン共鳴装置、ＮＭＲスペクトロメーター、質量分析計など）又は、評価ユニット／装置を含んでなる。
【０１９１】
さらに、本発明は、本発明の方法を実施するために適したキットに関し、前記キットは、前記方法を実施するための使用説明書、並びに
ａ）オリゴヌクレオチド混合物を含んでなる組成物、ここで、前記オリゴヌクレオチド混合物は、本発明の方法の第１遺伝子産物、好ましくは転写物を特異的に増幅するオリゴヌクレオチド、及び本発明の方法の少なくとも１つの第２遺伝子産物、好ましくは転写物を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドを含んでなる、
ｂ）プローブ・オリゴヌクレオチド混合物を含んでなる組成物、又は
ｃ）プローブ・オリゴヌクレオチド混合物を含んでなる組成物、及びオリゴヌクレオチド混合物を含んでなる組成物、ここで、前記オリゴヌクレオチド混合物は、本発明の方法の第１遺伝子産物、好ましくは転写物を特異的に増幅するオリゴヌクレオチド、及び本発明の方法の少なくとも１つの第２遺伝子産物、好ましくは転写物を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドを含んでなる、
を含んでなる。
【０１９２】
さらに、本発明は、本発明の方法を実施するために適したキットに関し、前記キットは、前記方法を実施するための使用説明書、並びに被験体の試料中の第１遺伝子産物量を決定する手段、被験体の試料中の第２遺伝子産物量を決定する手段、前記第１遺伝子産物量対第２遺伝子産物量の比を計算する手段、及び計算した比を基準比と比較する手段を含んでなり、それによって、（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別するか、又はそれによって、癌療法に対して感受性を示す及び／又は癌診断に対して感受性を示す被験体を特定する。
【０１９３】
さらに、本発明は、本発明の方法を実施するために適したキットに関し、前記キットは、前記方法を実施するための使用説明書、並びに被験体の試料中の８８０＾２５８２の遺伝子産物量を決定する手段、前記手段によって決定した量を基準量と比較する手段、及び前記被験体の試料中のＨＰＶ１６ゲノムの組み込み状況を評価する手段を含んでなり、それによって、（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別するか、又はそれによって、癌療法に対して感受性を示す及び／又は癌診断に対して感受性を示す被験体を特定する。
【０１９４】
さらに、本発明は、本発明の方法を実施するために適したキットに関し、前記キットは、前記方法を実施するための使用説明書、並びに被験体の試料中の８８０＾２５８２の遺伝子産物量を決定する手段、前記手段によって決定した量を基準量と比較する手段、及び前記被験体の試料中のＨＰＶ１６ゲノムの組み込み状況を評価する手段を含んでなり、それによって、（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染を判別するか、又はそれによって、癌療法に対して感受性を示す及び／又は癌診断に対して感受性を示す被験体を特定する。
【０１９５】
さらに、本発明は、本発明の方法を実施するために適したキットに関し、前記キットは、前記方法を実施するための使用説明書、並びに被験体の試料中の８８０＾２５８２の遺伝子産物量を決定する手段、及び前記手段によって決定した量を基準量と比較する手段を含んでなり、それによって、（ｉ）重症型のＨＰＶ１６感染と（ｉｉ）軽症型のＨＰＶ１６感染の間で判別するか、又はそれによって、癌療法に対して感受性を示す及び／又は癌診断に対して感受性を示す被験体を特定するが、ここで、前記被験体は、組み込み型でＨＰＶ１６ゲノムを含んでいない。
【０１９６】
本明細書中で使用する「キット」という用語は、一緒にパッケージされていても、そうでなくてもよい本発明の前記化合物、手段又は試薬の一群を指す。キットの成分は、別々のバイアルに（すなわち、別々の部分から成るキットとして）含まれていても、単一のバイアルにより提供されてもよい。さらに、本発明のキットが、本明細書中で先に言及した方法を実施するために使用されるべきであることは、理解されるべきである。全ての成分が、先に言及した方法を実施するためのすぐに使える様式で提供されることが、好ましくは、想定される。さらに、キットは、前記方法を実施するための使用説明書を含んでいることが好ましい。使用説明書は、紙形式又は電子形式のユーザー用マニュアルによって提供できる。一例を挙げれば、マニュアルは、本発明のキットを使用して前記方法を実施したときに得られた結果を解釈するための使用説明書を含んでなることもできる。
【０１９７】
この明細書中に引用したすべての参考文献を、その開示内容全体及びこの明細書で具体的に言及した開示内容に関して援用する。
【実施例】
【０１９８】
以下の実施例は、本発明を単に例示するものとする。それらは、どんな形であれ、本発明の範囲を限定すると解釈されないものとする。
【０１９９】
実施例１：アッセイ計画
最近の研究において、子宮頚部におけるスプライスＲＮＡ配列及び非スプライスＲＮＡ配列の検出と定量のための新しい手順が開発された。これらのＲＮＡパターンを、異なるグレードの子宮頚部病変におけるそれらの診断可能性に関して特徴づけた。そういったものとして、１０種類のスプライスされたＨＰＶ１６ ＲＮＡ配列（２２６＾４０９（Ｅ６*Ｉ）、２２６＾５２６（Ｅ６*ＩＩ）、２２６＾３３５８（Ｅ６*ＩＩＩ）、２２６＾２７０９（Ｅ６*ＩＶ）、８８０＾２５８２、８８０＾２７０９、８８０＾３３５８、１３０２＾３３５８、１３０２＾５６３９、３６３２＾５６３９）（Zheng, Z. M., and C. C. Baker. 2006. Papillomavirus genome structure, expression, and post-transcriptional regulation. Front Biosci 11:2286-302、図１に概説される）、及び５種類の完全長ＯＲＦ ＨＰＶ１６ ＲＮＡ配列（Ｅ６、Ｅ７、Ｅ１、Ｅ５、Ｌ１）、並びに２種類の細胞ハウスキーピング（ユビキチンＣ、Ｕ１Ａ）の転写物の検出のための新しいアッセイが開発された。
【０２００】
ＮＡＳＢＡは、３種類の酵素、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ‐ＲＴ）、ＲＮアーゼＨ、及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの同時反応を用いた等温標的増幅を使用する。ステップは、１本の反応管内で特定の温度（４１℃）にて行われる。検査の特徴は、第１のオリゴヌクレオチドプライマー（Ｐ１）がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター配列を含んでいることである。反応中、ＡＭＶ‐ＲＴが、標的ＲＮＡの単一ＤＮＡコピーを作り出す。ＲＮアーゼＨが、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分を分解し、そして第２のプライマー（Ｐ２）が残っているＤＮＡ鎖にアニーリングする。Ｌｕｍｉｎｅｘを使用したその後の検出のために、第２のプライマーは５’汎用配列を含んでいる。ＡＭＶ‐ＲＴのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性は、Ｐ２を伸長し、そして完全なＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを持つ本来の標的ＲＮＡのｄｓＤＮＡコピーを作り出す。このＴ７プロモーターは、大量のアンチセンスＲＮＡアンプライマーの転写を起こさせるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによって認識される。
【０２０１】
ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ Ｂａｓｉｃ Ｋｉｔ（BioMerieux Ltd., France）を、製造業者の使用説明書に従って使用した。簡単に言えば、２．５μＬのＲＮＡ鋳型を、８０ｍＭのＫＣｌ、０．２μｍｏｌｅの各プライマー、及び１ＸのＲｅａｇｅｎｔ Ｓｐｈｅｒｅを含むが、酵素を含んでいない５μｌの反応混合物に加え、そしてその混合物を６５℃にて２分間加熱し、その後４１℃にてさらに２分間置いた。次に、保存しておいた酵素２．５μＬを各反応に加え、そして増幅反応物を４１℃にて９０分間インキュベートした。
【０２０２】
アンチセンスＲＮＡは、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズに結合させたオリゴヌクレオチドプローブ（表１）とのハイブリダイゼーションによって特異的に検出できる。Ｐ２の汎用部分へのビオチン標識検出プローブのアニーリングにより、そのプローブがアンチセンスＲＮＡ内に組み込まれ、Ｓｔｒｅｐ‐ＰＥによって染色され、そしてＬｕｍｉｎｅｘ分析器により計測が行われた。
【０２０３】
ＮＡＳＢＡによって作り出されたＲＮＡ単位複製配列を、ビーズに結合させたオリゴヌクレオチドプローブ（表１）を使用して検出した。ＲＮＡ特異的プローブを、最近記載されたとおり結合させた（Schmitt, M., I. G. Bravo, P. J. Snijders, L. Gissmann, M. Pawlita, and T. Waterboer. 2006. Bead-based multiplex genotyping of human papillomaviruses. J Clin Microbiol 44:504-12）。すべての溶液及びバッファーは、ＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ不含であることが保証されている。ＮＡＳＢＡ反応では、１〜０．１μｌをＰＣＲプレートに移した。マルチチャンネル・ピペットを使用して、３３μｌの１．５Ｍ ＴＭＡＣ、７５ｍＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ８．０、６ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１．５ｇ／Ｌのサルコシル、１６μｌのＴＥバッファー、０．２μｍｏｌａｒの５’‐ビオチン化デコレータープローブ、及び１種類につき２０００個のハイブリダイゼーションプローブが結合したビーズの混合物から成る４９μｌのハイブリダイゼーション溶液を加えた。混合物全体を、９５℃にて５分間変性させ、そしてすぐに氷上に１分間置いた。ハイブリダイゼーション・プレートを、加熱したブロック振盪機に移し、そして４１℃にて３０分間ハイブリダイゼーションを実施した。それぞれのウェルの内容物を、マルチチャンネル・ピペットを使用することによって洗浄プレートに移した。それに続いて、ウェルを、洗浄ステーション上で１００μｌの洗浄バッファー（１×ＰＢＳ、０．０２％のＴｗｅｅｎ）によって洗浄した。振盪機により、ビーズを、１／１０００希釈したＳｔｒｅｐ‐ＰＥを含む検出溶液（２ＭのＴＭＡＣ、７５ｍＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ８．０、６ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１．５ｇ／Ｌのサルコシル）５０μｌ中、ＲＴにて２０分間再懸濁した。ビーズを、１００μｌの洗浄バッファーで二度洗浄し、そして振盪機により１００μｌの洗浄バッファー中、２分間再懸濁した。分析をＬｕｍｉｎｅｘ１００分析装置で実施した。
【０２０４】
完全長ＲＮＡ配列からスプライスされたものを識別するために、特異的プライマーよりむしろスプライス部位特異的Ｌｕｍｉｎｅｘプローブを使用した。異なるＨＰＶタイプのスプライス部位間の高度な相同性のため、追加のタイプ特異的な下流プローブを利用した。
【０２０５】
【表１】
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【０２０６】
実施例２：定量的ＮＡＳＢＡの開発
ＮＡＳＢＡアッセイにおける定量化及び内部性能対照は、ＮＡＳＢＡ混合物への既知濃度のインビトロ転写キャリブレーターＲＮＡ（Ｑ‐ＲＮＡ）の添加を必要とした。野生型（ｗｔ）とＱ‐ＲＮＡの唯一の相違点であるハイブリダイゼーションプローブ結合領域が、Ｌｕｍｉｎｅｘ技術を使用したアンプライマーの識別と定量化を可能にした。ｗｔ‐ＲＮＡ及びＱ‐ＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、両ＲＮＡの競合増幅を可能にする同じプライマーを用いた同時増幅をおこなった。増幅の終了時点の２種類のアンプライマーの比は、増幅開始時点で存在していた２種類の標的、ｗｔ及びＱの比を反映した。未知の試料中に存在しているｗｔ‐ｍＲＮＡを、外部検量線を使用することで定量化した。この検量線は、一定量のＱ‐ＲＮＡ中のインビトロ転写ＲＮＡの１０倍希釈系列によって形成された。インビトロ転写ｗｔ‐ＲＮＡは、ｗｔ‐ｍＲＮＡに類似したＮＡＳＢＡ特性を示すことが予想された。
【０２０７】
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｍ１３‐ＫＳベクター内にクローニングし、適当な制限酵素によって線状化したＱ‐ＲＮＡ鋳型を、融合ＰＣＲによって作り出した。Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼを使用してＱ‐ＲＮＡをインビトロで転写し、そしてＤＮａｓｅＩで処理して、プラスミドＤＮＡを取り出した。ＮＡＳＢＡ反応あたりのキャリブレーターＲＮＡ分子の投入レベルは、一連のｗｔ‐ＲＮＡ希釈系列内のＱ‐ＲＮＡの所定の数量をスパイクし、それに続くＮＡＳＢＡ‐Ｌｕｍｉｎｅｘの分析によるｗｔ‐ＲＮＡの正確な定量化のために最適化した。検量線を得るために、ｗｔ‐ＲＮＡ対Ｑ‐ＲＮＡの比を計算し、そしてｗｔ‐ＲＮＡコピー数に対してプロットした。１アッセイあたり１０6コピーのｗｔ‐ＲＮＡより多い投入量は、それらは臨床的に無関係であると思われたので試験しなかった。この開発は、Ｅ６*Ｉ ＮＡＳＢＡ‐Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイのために見本となるように示された（図２）。
【０２０８】
最適のＱ‐ＲＮＡ濃度を、あらゆるＮＡＳＢＡ標的について決定し、それを表２に要約する。一般に、すべてのＮＡＳＢＡ検量線が、４〜５ ｌｏｇの広いダイナミックレンジを示し、細長形よりむしろ多項式の形であった。多項式曲線の平坦な中間部分のため、未知試料におけるＲＮＡ濃度の補間は、この部分で不正確である。それにもかかわらず、すべてのＮＡＳＢＡアッセイが、１０倍のＲＮＡコピー数の相違に関して信頼できる同定を可能にした。定量化に加えて、ｗｔ‐ＮＡＳＢＡにおける同時陰性の結果を含めたＱ‐ＲＮＡ ＮＡＳＢＡの部分的又は完全な失敗は、エタノールなどのＮＡＳＢＡ阻害剤の存在を示唆した（データ未掲載）。
【０２０９】
総合すれば、定量的ＮＡＳＢＡ‐Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイは、試料中に存在するｗｔ‐ＲＮＡ量の１０倍の相違を４〜５桁にわたって定量化できた。
【０２１０】
【表２】
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【０２１１】
実施例３：ＮＡＳＢＡ反応の感度
ＨＰＶ１６からの種々でスプライスされたＲＮＡ及び完全長のＲＮＡ、並びに細胞転写物の検出は、スプライス部位に特異的なハイブリダイゼーションプローブとスプライス部位の上流や下流にアニーリングする転写物特異的プライマーの設計を必要とする（表１及び表３）。ＮＡＳＢＡプライマーの慎重な設計が、最適な感度のために重要であるように思われる。Ｕ１Ａハウスキーピング転写物の検出に関して、有効な高感度プライマー配列が記載された（米国特許番号第５８７６９３７号）。
【０２１２】
オリゴヌクレオチドプライマーを、ＨＰＶ１６のＲＮＡ標的からの、連続的に希釈したインビトロ転写ｗｔ‐ＲＮＡ、及び最適化したＱ‐ＲＮＡ投入量を用いた細胞転写物を使用したＮＡＳＢＡ‐Ｌｕｍｉｎｅｘ反応で検査した（表２を参照のこと）。検出限界は、陽性の結果を明らかにする最低ＲＮＡ量として定義された。異なる日に実施した３回の独立したアッセイのうち、最も高い検出限界を表示する（表２）。
【０２１３】
すべてのＮＡＳＢＡ標的の検出限界は、ＮＡＳＢＡ反応あたり２５〜２５００コピー数の範囲で変化した。唯一の例外は、２５０００ＲＮＡコピーを必要とする細胞ｐ１６INK4Aの検出であった。さらに、ＳｉＨａの全ＲＮＡを、精製し、連続的に希釈し、そして、Ｅ６*Ｉ、Ｅ６*ＩＩ、Ｅ７ｆｌ、Ｕ１Ａ、及びＵｂｃのＮＡＳＢＡと、それに続くＬｕｍｉｎｅｘハイブリダイゼーションによって検査した。最低０．３個のＳｉＨａ細胞等価物が、Ｅ６*Ｉ及びＥ７特異的ＮＡＳＢＡプライマーを使用して検出できたのに対し、Ｅ６*ＩＩ、Ｕｂｃ及びＵ１Ａ ＮＡＳＢＡプライマーは、３個の細胞を検出した（図３、Ｅ７ｆｌについて見本となるように示した）。全体的に見て、定量的ＮＡＳＢＡ反応は、ウイルス及び細胞転写物の検出に関して高感度であるように思われる。
【０２１４】
【表３】
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【０２１５】
実施例４：異なるグレードの病変におけるＨＰＶ１６ ＲＮＡパターン
異なるグレードの子宮頚部病変におけるＨＰＶ１６の完全長ＲＮＡ配列、及びスプライスされたＲＮＡ配列、並びに細胞ｐ１６INK4A、Ａｐｍ１、及びハウスキーピングＲＮＡ配列の発現を、表２に列挙した標的に関するｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘ定量的ＮＡＳＢＡ‐Ｌｕｍｉｎｅｘ検定法によって分析した。Ｃ．Ｃｌａｖｅｌ博士（Reims, France）との連携により、ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（商標）媒質中に保存した子宮頚部剥離細胞から精製したＲＮＡ試料を入手した。その群は、正常（ＮＩＬ／Ｍ、ｎ＝２５）、ＬＳＩＬ（ｎ＝２４）、ＨＳＩＬ（ｎ＝２４）及びＣｘＣａ（ｎ＝７）細胞診を受けたＨＰＶ１６ ＤＮＡ陽性塗抹標本から成った。このクロスセクション調査は、低又は高グレードの子宮頚部病変の存在を予測する転写物又は転写物パターンの同定を目的とした。
【０２１６】
ハウスキーピング転写物の分析は、ＲＮＡの完全性を判断するために主に使用した。合計７８個の試料は、Ｕ１Ａ及びＵｂｃによって一致して陽性であり、１つの試料が一致して陰性であり、そしてたった１つの試料だけが、Ｕ１Ａによって不明確な陽性であり、Ｕｂｃによって陰性であった（データ未掲載）。Ｕ１Ａ ＲＮＡ及びＵｂｃ ＲＮＡの二重陰性試料（共にＱ‐ＲＮＡは陽性であった）は、６５ｎｇ／μｌ全ＲＮＡを含んでいて、このＲＮＡが分解されたと解釈された。
【０２１７】
異なる病変タイプにおける１つの転写物の発現率（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）
スプライスされた転写物８８０＾２５８２は、病変においてほぼ例外なく検出され、そしてその発現率はＬＳＩＬ（３０％）からＣｘＣａ（５７％）へと次第に増強された。
【０２１８】
Ｅ６*Ｉは、ＮＩＬ／ｍ症例の７０％、ＬＳＩＬ症例の７５％、ＨＳＩＬ症例の８３％、及びＣｘＣａ症例の１００％で検出され、要するに、すべての群（ＮＩＬ／ｍ症例の５７％、ＬＳＩＬ症例の５５％、ＨＳＩＬ症例の７５％、及びＣｘＣａ症例の８６％）においてＥ６*ＩＩに比べてより頻繁に検出された。Ｅ６*ＩＩ ＮＡＳＢＡプライマーはさらに、２６３ヌクレオチド長のＥ６*Ｉ転写物にアニールし、そして増幅することができ、より大きなＲＮＡアンプライマーを作り出す。より大きなサイズにもかかわらず、Ｅ６*ＩＩプライマーは、Ｅ６*Ｉ（この組み合わせを*Ｉ（*ＩＩ）で略記した）を増幅するので、ＬＳＩＬ及びＨＳＩＬにおけるＥ６*Ｉのわずかに高い発現率を特定するためによりいっそう効果的であった。
【０２１９】
すべての病変タイプにおいて非常にであったＬ１完全長含有転写物とは対照的に、Ｌ１タンパク質をコードする３６３２＾５６３９スプライスされた転写物は、ＬＳＩＬで最も大量であり（６０％）、ＣｘＣａさらにＮＩＬ／ｍでそれほど頻繁でなかった（それぞれ４２及び３９％）。
Ｅ７完全長含有転写物はほとんどすべてのＮＩＬ／Ｍ症例に既に存在していたが、ｐ１６INK4A転写物は、この病期においてかなり希であり、しかしＨＳＩＬ〜ＣｘＣａにおいて非常に一般的であった。
【０２２０】
【表４】
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【０２２１】
単一転写物の発現レベル
上方制御された転写物の中で、初期癌遺伝子転写物Ｅ６*Ｉ、*Ｉ（*ＩＩ）、Ｅ６*ＩＩ、Ｅ６完全長、及びＥ７完全長は、ＮＩＬ／ｍとＣｘＣａの間のそれらの発現において非常に有意な上方制御を示した（データ未掲載）。スプライスされたＥ６転写物対完全長のＥ６転写物の比が発癌現象中に変化したどうかを分析するために、Ｅ６*ＩとＥ６*ＩＩ発現をＥ６完全長発現と相関させた。Ｅ６*Ｉと対照的に、Ｅ６*ＩＩ対Ｅ６完全長の比のメジアンだけがＬＳＩＬからＣｘＣａへの進行の間に上昇した（図４）。
【０２２２】
加えて、潜在的ＬＣＲ転写活性化因子をコードしている転写物８８０＾２５８２は、ＮＩＬ／Ｍに比べて高グレード病変（ＨＳＩＬ、ＣｘＣａ）において非常に有意により頻繁に発現された。細胞マーカー転写物ｐ１６INK4Aは、低グレード病変に対して高グレード病変において有意な上方制御を示した（ｐ＜＜０．０５）。
【０２２３】
逆に、ウイルス・カプシド形成と放出に必要とされ、しかし頻繁に存在している、タンパク質をコードする転写物、例えば８８０＾３３５８、３６３２＾５６３９及びＬ１完全長などの発現は、ＬＳＩＬからＣｘＣａへの進行中に下方制御された（データ未掲載）。この下方制御は、８８０＾３３５８発現において特に強く、ＬＳＩＬからＣｘＣａ病変へと非常に有意に減少した。Ｌ１完全長発現は、ＮＩＬ／ＭからＬＳＩＬで非常に有意に上方制御され（ｐ＜０．０１）、正常な細胞診を受けた感染において低いウイルス活性しか示さなかった。すべてのＣｘＣａで検出可能であったＬ１完全長配列は、ＬＳＩＬと比較して高グレード病変においてそれらの発現は下方制御される傾向があった（ｐ＞０．０５）。
【０２２４】
定量的な発現データは、癌の進行中の初期癌遺伝子転写物の既に知られている上方制御を確認した。癌遺伝子転写物とは対照的に、Ｌ１完全長及び８８０＾３３５８（Ｅ１＾Ｅ４）ＲＮＡは進行中に下方制御される。加えて、８８０＾２５８２転写物は、ほぼ例外なく子宮頚部病変において検出された。
【０２２５】
実施例５：転写物対のパターン
子宮頚部塗抹標本（実施例４）における定量的な転写解析の限界は、これらの試料が不定量のＨＰＶ感染細胞を含む可能性が高いという事実である。全ＲＮＡの標準化は、ＨＰＶ感染細胞の一部ではなく、細胞総量の変動及びＲＮＡの質を補正する。しかしながら、ＨＰＶ感染細胞の数は、ＨＰＶ ＲＮＡ濃度全体に強い影響力を持っている。異なる量のＨＰＶ感染細胞を標準化するために、ＨＰＶ転写物の対パターン分析を受けた。２以上の転写物のパターンは所定の病変群のＨＰＶ陽性細胞の大部分において同様であると仮定すると、これは１００個の細胞が分析されるかそれとも１０００個の細胞が分析されるかに関係しない。
【０２２６】
転写物対の発現レベルの比は病変群に関連した：高グレード病変対低グレード病変（ＣｘＣａ／ＨＳＩＬ対ＬＳＩＬ／ＮＩＬ／Ｍ）。目的の両転写物に関して二重陰性である試料を分析から除外した。相関関係を、ウィルコクソン順位和検定を使用して評価した。群間の転写物対発現レベル比の相違の有意性を、仕分けし、そして表５に要約した。
【０２２７】
【表５】
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【０２２８】
【表６】
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【０２２９】
正常（ＮＩＬ／Ｍ）からＣｘＣａへの進行中の統計的に有意な及び統計的に非常に有意な相違を示す転写物対転写物の比を、表５に提示する。一般に、少なくとも１つのスプライスされた転写物を含む比は、ＮＡＳＢＡ‐Ｌｕｍｉｎｅｘ検査で決定した完全長転写物だけを利用した比（従来技術）に比べて常により有意であった（表６）。
【０２３０】
【表７】
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【０２３１】
細胞転写物（Ａｐｍ１、Ｕ１Ａ、Ｕｂｃ）又はスプライスされたウイルス転写物（８８０＾３３５８、３６３２＾５６３９）で標準化したウイルス転写物のうちの限られた数のもの、例えばＥ６*ＩＩ、*Ｉ（*ＩＩ）及び８８０＾２５８２などが、高グレードのＣｘＣａ／ＨＳＩＬ病変対低グレード病変、ＬＳＩＬのみ又はＮＩＬ／ｍのみのいずれかの非常に有意な識別（ｐ＜０．０１）を可能にした。これらの比は、高グレード病変において８８０＾２５８２及びＥ６*ＩＩの顕著な上方制御によって促進された。ＨＳＩＬ／ＣｘＣａに対する比較において、ＬＳＩＬはＥ６*ＩＩ対８８０＾３３５８の非常に有意な発現の低下を示した。
【０２３２】
文献によると、ｐ１６INK4A発現は、ＣｘＣａ及びＨＳＩＬで上方制御されるように思われ、そして８８０＾３３５８に対する標準化が、ＣｘＣａ／ＨＳＩＬとＬＳＩＬ／ＮＩＬ／Ｍの非常に有意な識別を可能にした。
【０２３３】
Ａｐｍ１、並びにハウスキーピング転写物Ｕ１Ａ及びＵｂｃを含めた細胞転写物は、特にＥ６*ＩＩ発現を標準化するために有益であると分かった。得られた標準化は、使用される細胞転写物に依存することなく高グレード病変と低グレード病変を非常に有意に判別した（図５）。
【０２３４】
総合すれば、完全長転写物の分析よりむしろスプライスされた転写物の分析が、細胞学的群のさらに有意な相違を提供した。スプライスされた転写物の中で、Ｅ６*ＩＩ及び８８０＾２５８２は、群間の最も強い相違を示し、そしてさまざまな細胞及びウイルス転写物によって標準化することができた。さらに、８８０＾２５８２の発現は、特に高グレード病変の存在と強く関連した。よって、８８０＾２５８２は、癌発症中にこれまでに知られていない役割を果たし得るため、それが高グレード病変及び癌病変に関する新しいＨＰＶマーカー候補になっている。
【０２３５】
実施例６：組み込み状況の分析
ＨＰＶ１６の組み込みは、発癌中の重要因子であることが知られている。大抵の場合、腫瘍細胞に存在している組み込みは、Ｅ１／Ｅ２／Ｅ５領域の中で起こり、そしてウイルスＤＮＡの分裂につながる。Ｅ６／Ｅ７／Ｅ１の中の前半の配列は、組み込み中におそらく破壊されず、そのため、初期転写物対８８０＾３３５８、８８０＾２７０９又はＥ５ｆｌの比を、ウイルス組み込み事象を評価するために使用できた。
【０２３６】
Ｅ６*ＩＩ対８８０＾３３５８のメジアン発現は、低グレード病変と比較して、高グレード病変において最も有意に増加した。この知見は、既知の高グレード病変における高いＨＰＶ１６組み込み優勢と十分に一致している（図６）。Ｅ６*ＩＩ対８８０＾３３５８に１．５のカットオフを使用することで、合計６症例のＣｘＣａ及び５症例のＨＳＩＬが、組み込まれたＨＰＶ１６ゲノムを含むと予測できた。これらのうちの少なくとも３症例（２７％）は、８８０＾３３５８としての発現だけがこれらの症例の中で欠けていたが組み込みを含むことができ、その一方、その他の８症例はまたエピソームＤＮＡも含むことができる。８８０＾３３５８、８８０＾２７０９又はＥ５ｆｌのいずれかと比較される他の初期転写物、例えばＥ６*Ｉ、しかしＥ６ｆｌ、Ｅ７ｆｌ、及びＥ１ｆｌもまた、低い程度まで転写活性な組み込みの存在の予測することを可能にした（Ｅ６*ＩＩ対８８０＾３３５８及びＥ６ｆｌ対Ｅ５の見本として描く、図６）。
【０２３７】
結論として、ＲＮＡ配列を含む８８０＾３３５８又は８８０＾２７０９のいずれかと比較したＥ６*ＩＩ ＲＮＡ配列の検出及び定量化は、特に組み込まれたゲノムだけが関与するとき、ＨＰＶ１６組み込み状況の評価に非常に好適であるように思えた。加えて、８８０＾３３５８対Ｅ６*ＩＩの比又はＥ６*ＩＩ対８８０＾２７０９の比は、完全長転写物を含む他の比と比較して優れていた。
【０２３８】
実施例７：ＨＰＶ関連病変の高性能分子診断のための異なるＨＰＶ転写物マーカーの組み合わせ
実施例５及び６からのデータは、子宮頚部高グレード病変が、異なっているが独特の転写パターンで存在し得ることを示唆した。
【０２３９】
そのため、市販Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ ＨＰＶキットと比較して、（ｉ）８８０＾２５８２対３６３２＾５６３９と（ｉｉ）Ｅ６*ＩＩ対８８０＾３３５８の組み合わせが、高グレード病変又は低グレード病変の存在を予測する感度と特異性を顕著に増強したことがわかった。この組み合わせを使用することで、合計７症例のＣｘＣａ（１００％）、１５症例のＨＳＩＬ（６３％）が、高グレード（ＣｘＣａ／ＨＳＩＬ）と正しく特定され、そして１４症例のＬＳＩＬ（７０％）及び２１症例（９１％）の正常試料が低グレード（ＬＳＩＬ／ＮＩＬ／Ｍ）と正しく特定された。ＰｒｅＴｅｃｔ ＨＰＶ Ｐｒｏｏｆｅｒ（登録商標）との比較において、高グレード病変と低グレード病変を識別することに関するＮＡＳＢＡ‐Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイの特異性は、２３％から８３％に強力に高まった（図７）。得られたＨＰＶ Ｐｒｏｏｆｅｒ（登録商標）データは、予報と一致しており、ＮＩＬ／Ｍ試料の大部分がＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡに関して陽性であったことを裏付け、健常人の過剰処置に潜在的につながった。
【０２４０】
全体で、この研究は、子宮頚部病変の格付けのために診断ＨＰＶ１６ ＲＮＡパターンの存在の証拠を提供した。２０個の分析された転写物のうち、４個のウイルス・スプライス部位含有転写物と１個のハウスキーピング転写物（ＲＮＡ品質管理のため）だけが診断応用に十分であり得る。あるいは、特定のエピトープを検出するより短いオリゴヌクレオチド又はスプライス部位特異的抗体が、それぞれの遺伝子産物を検出するために使用できた（表７）。
【０２４１】
【表８】
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【０２４２】
実施例８：本発明を使用した患者の管理
３５歳の女性が、日常的な子宮頚癌前兆スクリーニングプログラムの間に担当の婦人科医に相談した。Ｐａｐ検査が、低グレード病変（ＬＳＩＬ）の存在を示すが、一方その後のＨＰＶ遺伝子型決定アッセイは、ＨＰＶ１６の存在を明らかにした。用心深い医師は、先に記載したようにＲＮＡプロファイリング検査を勧めた。結果は、８８０＾２５８２含有ｍＲＮＡの存在を示唆し、したがって高グレード病変を示唆した。医師は、１年後の経過観察を提案した。１年後、その女性は、Ｐａｐ検査によって再び検査されて、このとき、高グレード病変（ＨＳＩＬ）の存在が示唆され、そして女性は治療法について言及された。
【０２４３】
３７歳の別の女性が、日常的な子宮頚癌前兆スクリーニングプログラムの間に担当の婦人科医に相談した。Ｐａｐ検査が、高グレード病変（ＨＳＩＬ）の存在を示し、その後のＨＰＶ遺伝子型決定アッセイが、ＨＰＶ１６の存在を明らかにした。医師は、先に記載したようにＲＮＡプロファイリング検査を勧めた。結果は、低グレード病変の存在又は正常な細胞診を示唆した。医師は、低グレード病変を確認する膣鏡検査への委託を提案した。
【０２４４】
３５歳の女性の例は、先に記載したＲＮＡプロファイリング検査が高グレード病変の将来的な発症を予測できたことを説明する。３７歳の女性の例は、Ｐａｐ検査は不正確である場合が多いので、ＨＳＩＬ陽性と診断された女性の過剰処置をもたらすという事実を説明する。先に記載したようにＲＮＡプロファイリング検査を使用することで、膣鏡検査や治療法に対する不要な紹介を減らすことができた。
【０２４５】
好ましい実施形態では、女性の一次スクリーニングをＰａｐ検査及び／又はｈｒＨＰＶ ＤＮＡ遺伝子型決定アッセイでおこなう。ＨｒＨＰＶ陽性の女性を、続いて本発明の遺伝子産物を定量化するｈｒＨＰＶ ＲＮＡ検査によって分析する。第１ステップでは、Ｅ１Ｃ及び第２遺伝子、例えば３６３２＾５６３９からの遺伝子産物を評価する（評価基準１、実施例７に従う）。高グレードの結果を有する患者を治療に向かわせる。評価基準１に関して陰性である患者を、例えばＥ６*ＩＩから遺伝子産物の発現対、例えば８８０＾３３５８（実施例７による評価基準２）を評価することによって、ＨＰＶの組み込みについて分析する。基準２に関して陽性である女性を治療に向かわせる。基準１及び２に関して陰性の患者を、経過観察する（図８）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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