(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳変性疾患の予防または治療、あるいは虚血性疾患の治療のための活性成分として、分離されたアラビノキシラン、分離されたアラビノースおよび分離されたキシロースからなる群から選ばれる少なくとも１つの成分を含む医薬組成物。
【請求項２】
前記虚血性疾患が、心筋梗塞、脳梗塞、虚血性急性腎不全、虚血性急性肝不全、糖尿病性足潰瘍、糖尿病性腎症、または外科手術の副作用や臓器組織傷害に起因する虚血性疾患である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
外科手術の副作用に由来する前記虚血性疾患が、心不全、虚血性腎不全、虚血性肝不全または虚血性脳卒中から選ばれる、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記臓器組織傷害が臓器手術または移植または事故によって切断された体の部分の再結合により生じ、そのいずれもが虚血再灌流を伴う、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記臓器が、腎臓、肝臓、すい臓、肺または心臓から選ばれる、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記脳変性疾患が、アルツハイマー病、血管性痴呆、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、ピック病、クロイツェルヤコブ病または脊髄傷害から選ばれる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記活性成分が、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｌｅｖｉｓ  ｓｅｍｅｎ、Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅＬ．、Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ  Ｌ．（コメ）、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  ｖａｒ．ｈｅｘａｓｔｉｃｈｏｎ  ＡＳＣＨ．、ｍａｌｔ、Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ、Ｚｅａｍａｙｓ  Ｌ．、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ  ＭＯＥＮＣＨ、Ｃｏｉｘ  ｌａｃｒｙｍａ−ｊｏｂｉ  ｖａｒ．ｍａｙｕｅｎ  ＳＴＡＰＦ、Ｐａｎｉｃｕｍ  ｍｉｌｉａｃｅｕｍ  Ｌ．または、Ｓｅｔａｒｉａ  ｉｔａｌｉｃａ  Ｂｅａｕｖ．から選ばれるイネ科植物（Ｇｒａｍｉｎｅａｅｐｌａｎｔ）から精製される、請求項１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、虚血性疾患および脳変性疾患を予防および治療するためのでんぷんまたは総食物繊維を含む組成物およびその使用に関する。
【０００２】
本発明は、アラビノキシラン、ベータグルカン、アラビノースおよびキシロースからなる群から選ばれる少なくとも１つの成分を含む虚血性疾患および脳変性疾患を予防および治療するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
代表的な虚血性疾患である、脳梗塞および心筋梗塞は、高血圧、高脂血症、糖尿病または喫煙などの各種の因子によって既に狭窄した脳動脈または環動脈の血栓による目詰によっても引き起こされる周囲組織の壊死によって引き起こされる。
【０００４】
毎年、世界の死因に一位である心血管疾患は、全体の死亡の約30%を占め、その75%を脳梗塞および心筋梗塞が占める。従って、これらの２疾患と癌が最高の疾病率を有する３つの代表的疾患である。心筋梗塞および脳梗塞によって生じる疾病率を下げる方法は、二群に分けられる: 一つは、高血圧および高脂血症の治療による血管閉塞の予防であり、他の一つは血管閉塞が生じた時に周囲組織の壊死を減らすことである。
【０００５】
壊死領域を減らす最良の方法は、可急的速やかに閉塞した動脈を再灌流することであり、それには血栓または栓塞を溶解するために、ついで閉塞動脈を再灌流するために血栓溶解薬が用いられている。
【０００６】
しかし、一度心臓および脳の組織が閉塞３−６時間後に壊死に至る場合は、血栓溶解薬による再灌流さえも梗塞の予防に有効でないであろう。実際、患者は閉塞後３−６時間以内に病院に到着できないので、迅速な再灌流は困難である更に、既に損傷した心臓および脳はうまく再生しない。従って、病院で閉塞動脈が再灌流されるまで、組織の損傷を予防することが治療効果を上げるもう一つの方法であり、それに対して、脳梗塞および心筋梗塞における細胞死の原因の１つはアポトーシスであるので抗アポトーシス薬は１つの選択枝になり得る（Ｃｒｏｗ  ＭＴ  ｅｔ  ａｌ  ．  ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，９５（１０），ｐｐ９５７−９７０，２００４、Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ  ＲＭ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４８（１４），ｐｐｌ３６５−１３７５，２００３．）
【０００７】
また、腎臓移植による移植組織の損傷（Ｄａｅｍｅｎ  ＭＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，７３（１１），ｐｐｌ６９３−１７００，２００２）および整形外科による移植組織の損傷（Ｇａｓｔｍａｎ  ＢＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．，Ｉｌｌ，ｐｐｌ４８１−１４９６，２００３）は、虚血再灌流後のアポトーシスによって誘導される。
【０００８】
更に、心筋傷害は酸素の要求量がポンプ、即ち人工心肺によって供給される酸素の量よりもさらに過剰である場合に起こり、または心臓停止で手術が行われる場合、その後の脳傷害は低血圧で起き得る。例えば、環動脈の閉塞の場合に行われる環動脈バイパス移植術の場合および脳動脈、大動脈、その他に動脈瘤が起きる時に行われる動脈瘤手術の場合などの手術が血管の一部の閉塞を伴う場合、心筋傷害による心不全および脳損傷による片麻痺が、起こり得る。実際、大動脈の動脈瘤に対する手術またはインターベンション治療中、患者の３−１６％に虚血性心疾患、腎不全、対麻痺などの副作用が起きる。従って、このような副作用は術前に抗アポトーシス薬が投与されれば、減らし得るであろう。
【０００９】
アポトーシス性神経細胞死の原因は、十分解明されていないが、アポトーシス性神経細胞死が、脳への酸素とグルコースの供給の遮断後の一過性虚血が起きる場合に生じるＡＴＰ濃度の減少および浮腫の生成によって起きることが報告されている。
【００１０】
脳虚血におけるアポトーシス性神経細胞死は、二つの機序で誘発されることが報告されている：一つは、興奮性神経細胞死の機構であり、それによって、脳虚血が細胞外のグルタミン酸塩の過剰な蓄積、細胞へのグルタミン酸塩の流入および細胞内のカルシウムイオンの過剰な蓄積を誘発し（Ｋａｎｇ  Ｔ  Ｃｅｔａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ．，３０（１２），ｐｐ９４５−９５５，２００１）、もう一つは酸化的細胞死の機構であり、それによって、虚血−再灌流における突然の酸素供給によって発生するフリーラジカルの増加が、ＤＮＡおよび細胞質に対する傷害を誘発する（Ｗｏｎ  Ｍ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，８３６（１−２），ｐｐ７０−７８，１９９９）。これらの機構研究に基づいて、これまでアポトーシス性神経細胞死の阻害剤のスクリーニングまたはその機構解明の努力がなされてきた。しかし、アポトーシス性神経細胞死の有効な阻害剤は未だ見出されていない。
【００１１】
虚血状態下のアポトーシスを阻害するテトラサイクリン抗生物質であるミノサイクリンが、例えば、脳梗塞（Ｙｒｊａｎｈｅｉｋｋｉ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６（２３），ｐｐｌ３４９６−１３５００，１９９９）、心筋梗塞（Ｓｃａｒａｂｅｌｌｉ  ＴＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，４３（５），ｐｐ８６５−８７４，２００４）、虚血性急性腎不全（Ｗａｎｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（１９），ｐｐ１９９４８−１９９５４，２００４）などの虚血性疾および例えばアルツハイマー病（Ｈｕｎｔｅｒ  ＣＬ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９（１２），ｐｐ３３０５−３３１６，２００４）、パーキンソン病（Ｗｕ  ＤＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２２（５），ｐｐｌ７６３−１７７１，２００２）、筋萎縮性側索硬化症（Ｚｈｕ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１７（６８８４）、ｐｐ７４−７８、２００２）、ハンチントン病（Ｃｈｅｎ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，６（７），ｐｐ７９７−８０１，２０００）および脊髄傷害（Ｔｅｎｇ  ＹＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１（９），ｐｐ３０７１−３０７６，２００４）などの神経細胞アポトーシスによって生じる脳変性疾患の治療に有効であることが報告されている。本発明の発明者らはまた、テトラサイクリンが本研究に使用される類似の虚血状態下で細胞の生存能力を改善することも確認した（韓国特許登録番号第０４０４１３４、米国特許登録番号第６７１６８２２および６８１８６２５）。更に、アミノグリコシド、キノロンなどの他の抗生物質もまた虚血状態下における細胞の生存を改善し、アミノグリコシドの１つであるＧ４１８（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）は特に心筋梗塞の治療において有効性を示した（米国特許登録番号６７１６８２２）。次の実験において、Ｇ４１８は虚血状態下でアポトーシスを阻害し、同じく脳梗塞の治療においても有効性を示した。これらの結果に基づいて、虚血状態下でＧ４１８と同じ細胞生存効果を示す試料が心筋梗塞などの虚血性疾患の治療において有効であり得ること、およびアポトーシスにより生じる変性性脳疾患の予防および治療にも有効であることが期待された。スクリーニングにより、本発明は、最終的にＴｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．を含むイネ科植物（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ  ｐｌａｎｔ）の粗抽出物が、虚血状態下で細胞の生存性を改善することを見出し、ついで粗抽出物が、脳梗塞および心筋梗塞などの虚血性疾患の治療およびアルツハイマー病などの脳変性疾患の治療におけて有効性を有することを示し、それは虚血および脳変性疾患動物モデルを用いて証明された（韓国特許登録第１０−０７２３９５０号、およびＰＣＴ／ＲＲ２００６／００００２７）。
【００１２】
Ｇｒａｍｉｎｅａｅ種に属する代表的な植物の種は、  約１０％の水分、５０−６０％のでんぷん（オオムギの場合２５％）を含む炭水化物成分、１０−２０％の蛋白質、２−８％の脂質および１−３％の可溶性食物繊維（オオムギの場合９％）を含む１０−２０％の総食物繊維（オオムギの場合４０％）（Ｒａｎｈｏｔｒａ  ＧＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６８（５），ｐｐ５５６−５５８，１９９１）、または５０−６０％のでんぷん、１０−２０％の蛋白質、１−５％の脂質および１０−２０％の総食物繊維（Ｇｒａｕｓｇｒｕｂｅｒ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐｌａｎｔ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ（Ｖｏｌｌｍａｎｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．）），ｐｐ２３−２６，Ｅｕｃａｒｐｉａ  ＆  Ｂｏｋｕ，Ｖｉｅｎｎａ，２００４）を含むことが報告されている。
【００１３】
アラビノキシランおよびベータグルカンは、胚乳細胞の細胞壁を構成する二つの主要な植物繊維であり（Ｉｚｙｄｏｒｃｚｙｋ  ＭＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，２８，ｐｐ３３−４８，１９９５、Ｚｅｋｏｖｉｃ  ＤＢ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２５，ｐｐ２０５−２３０，２００５）、それによって小麦の細胞壁（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．）（Ｐｈｉｌｉｐｐｅ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ、２２４（２）、ｐｐ４４９−４６１、２００６）およびライ麦の細胞壁が（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ  Ｌ．）（Ｖｉｎｋｘ  ＣＪＡ ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉ．，２４，ｐｐｌ−１４、１９９６）ベータグルカンよりもより多くのアラビノキシランを含み、一方、オーツ麦およびオオムギのそれは（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）（Ｍｉｌｌｅｒ  ＳＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍ．，７２（５），ｐｐ４２１−４２７，１９９５）（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  Ｌ．）（Ｋａｎａｕｃｈｉ  Ｍ  ａｎｄ  Ｂａｍｆｏｒｔｈ  ＣＷ，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍ．，７８（２），ｐｐｌ２１−１２４，２００１）アラビノキシランよりもより多くのベータグルカンを含むことが報告されている。一般に、アラビノキシランは、アラビノースおよびキシロースで構成されており、ベータグルカンはグルコースで構成されている（Ｉｚｙｄｏｒｃｚｙｋ  ＭＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｐｏｌｙｍ．，２８，ｐｐ３３−４８，１９９５）。
【００１４】
アラビノキシランおよびベータグルカンなどのポリマーに加えて、細胞壁はまた、高い抗酸化作用を示す化合物、即ち、アラビノキシラン分子の架橋に関与するフェルラ酸  （Ａｄａｍｓ  ＥＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，３４０，ｐｐｌ８４１−１８４５，２００５），クマリン酸、バニリン酸，ｐ−ＯＨ安息香酸およびシリンガ酸なども含む（Ｚｈｏｕ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，５２，ｐｐ６１０８−６１１４，２００４、Ｃｌｉｆｆｏｒｄ  ＭＮ，Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ，７９，ｐｐ３６２−３７２，１９９９）。
【００１５】
クロロフィルを豊富に含む緑色植物の種子、根、幹、球根、果実等中の主要保存物質であるでんぷんは、高等動物に対して炭化水素源として重要である。それは、１，０００，０００から１０，０００，０００の範囲の分子量および１．６５の比重を有する無色および無臭の白色粉末であり、植物によって、異なった大きさおよび形態を有する顆粒の形で存在し、数種類のでんぷん中殆ど一定の比率、一般に２０−３０％のアミロースおよび７０−８０％のアミロペクチンの混合物である（Ｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ  ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，４９，ｐｐ２９７−３０５，２００２）。しかし、もち米、ワキシーとうもろこし等はアミロースは少なく、主にアミロペクチンを含む。
【００１６】
本発明の発明らは、動物の疾患モデルを用いて小麦を含むイネ科植物（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ  ｐｌａｎｔｓ）の粗抽出物が、虚血条件下で細胞の生存能力を改善し、虚血性疾患および  脳変性疾患の改善と治療における有効性を有することを報告した（韓国特許登録第１０−０７２３９５０号、およびＰＣＴ／ＫＲ２００６／００００２７）が，イネ科植物（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ  ｐｌａｎｔｓ）から単離された精製でんぷんまたは総食物繊維およびアラビノキシラン、アラビノース、キシロースおよびベータグルカンなどの植物繊維の成分が上で引用しいずれかの文献において、虚血性疾患および脳変性疾患の改善および治療において有効性を有することは開示されていない（その開示を参考により本明細書に組み入れる。）。
【００１７】
従って、本発明の発明者らは本発明はイネ科植物（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ  ｐｌａｎｔｓ）から単離したでんぷんまたは総食物繊維が虚血条件下およびベータ−アミロイドまたは６−ヒドロキシドパミンの存在下で細胞の生存能を改善することおよび
動物の疾患モデルを用いてでんぷんまたは総食物繊維がまた虚血性疾患および脳変性疾患の改善および治療において有効性を有することを調査し、確認して本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】韓国特許登録番号第０４０４１３４号
【特許文献２】米国特許登録番号第６７１６８２２号
【特許文献３】米国特許登録番号第６８１８６２５号
【特許文献４】米国特許登録番号６７１６８２２号
【特許文献５】韓国特許登録第１０−０７２３９５０号
【特許文献６】ＰＣＴ／ＲＲ２００６／００００２７
【特許文献７】韓国特許登録第１０−０７２３９５０号
【特許文献８】ＰＣＴ／ＫＲ２００６／００００２７
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｃｒｏｗ  ＭＴ  ｅｔ  ａｌ  ．  ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，９５（１０），ｐｐ９５７−９７０，２００４
【非特許文献２】Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ  ＲＭ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４８（１４），ｐｐｌ３６５−１３７５，２００３．
【非特許文献３】Ｄａｅｍｅｎ  ＭＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，７３（１１），ｐｐｌ６９３−１７００，２００２
【非特許文献４】Ｇａｓｔｍａｎ  ＢＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．，Ｉｌｌ，ｐｐｌ４８１−１４９６，２００３
【非特許文献５】Ｋａｎｇ  Ｔ  Ｃｅｔａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ．，３０（１２），ｐｐ９４５−９５５，２００１
【非特許文献６】Ｗｏｎ  Ｍ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，８３６（１−２），ｐｐ７０−７８，１９９９）
【非特許文献７】Ｙｒｊａｎｈｅｉｋｋｉ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６（２３），ｐｐｌ３４９６−１３５００，１９９９
【非特許文献８】Ｓｃａｒａｂｅｌｌｉ  ＴＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，４３（５），ｐｐ８６５−８７４，２００４
【非特許文献９】Ｗａｎｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（１９），ｐｐ１９９４８−１９９５４，２００４
【非特許文献１０】Ｈｕｎｔｅｒ  ＣＬ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９（１２），ｐｐ３３０５−３３１６，２００４
【非特許文献１１】Ｗｕ  ＤＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２２（５），ｐｐｌ７６３−１７７１，２００２
【非特許文献１２】Ｚｈｕ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１７（６８８４）、ｐｐ７４−７８、２００２
【非特許文献１３】Ｃｈｅｎ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，６（７），ｐｐ７９７−８０１，２０００
【非特許文献１４】Ｔｅｎｇ  ＹＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１（９），ｐｐ３０７１−３０７６，２００４
【非特許文献１５】Ｒａｎｈｏｔｒａ  ＧＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６８（５），ｐｐ５５６−５５８，１９９１
【非特許文献１６】Ｇｒａｕｓｇｒｕｂｅｒ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐｌａｎｔ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ（Ｖｏｌｌｍａｎｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．）），ｐｐ２３−２６，Ｅｕｃａｒｐｉａ  ＆  Ｂｏｋｕ，Ｖｉｅｎｎａ，２００４
【非特許文献１７】Ｉｚｙｄｏｒｃｚｙｋ  ＭＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，２８，ｐｐ３３−４８，１９９５
【非特許文献１８】Ｚｅｋｏｖｉｃ  ＤＢ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２５，ｐｐ２０５−２３０，２００５
【非特許文献１９】Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．）（Ｐｈｉｌｉｐｐｅ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ、２２４（２）、ｐｐ４４９−４６１、２００６
【非特許文献２０】Ｖｉｎｋｘ  ＣＪＡｅｔ  ａｌ．Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉ．，２４，ｐｐｌ−１４、１９９６
【非特許文献２１】Ｍｉｌｌｅｒ  ＳＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍ．，７２（５），ｐｐ４２１−４２７，１９９５
【非特許文献２２】Ｋａｎａｕｃｈｉ  Ｍ  ａｎｄ  Ｂａｍｆｏｒｔｈ  ＣＷ，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍ．，７８（２），ｐｐｌ２１−１２４，２００１
【非特許文献２３】Ｉｚｙｄｏｒｃｚｙｋ  ＭＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｐｏｌｙｍ．，２８，ｐｐ３３−４８，１９９５
【非特許文献２４】Ａｄａｍｓ  ＥＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，３４０，ｐｐｌ８４１−１８４５，２００５
【非特許文献２５】Ｚｈｏｕ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，５２，ｐｐ６１０８−６１１４，２００４、Ｃｌｉｆｆｏｒｄ  ＭＮ，Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ，７９，ｐｐ３６２−３７２，１９９９
【非特許文献２６】Ｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ  ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，４９，ｐｐ２９７−３０５，２００２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の目的は、虚血状態下でアポト−シスにより誘発された虚血性疾患および脳変性疾患を予防し治療するためにでんぷんまたは総食物繊維を含む医薬組成物およびその使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
従って、本発明の目的は、虚血性疾患および脳変性疾患の予防および治療のための活性成分としてでんぷんまたは総食物繊維を含む医薬組成物を提供することである。
【００２２】
本発明の目的はまた、虚血性疾患および脳変性疾患の予防および改善のためのでんぷんまたは総食物繊維を含む健康食品の提供でもある。
【００２３】
本発明はまたそれを必要とする哺乳動物またはヒトにおけるアポトーシスによって生じる虚血性疾患および脳変性疾患の予防および治療のための医薬組成物の製造のためのでんぷんまたは総食物繊維の使用の提供である。
【００２４】
本発明は、薬学的に許容できる担体またはその助剤と共に、でんぷんまたは総食物繊維の有効量を投与することによる虚血性疾患および脳変性疾患を患っているヒトまたは哺乳動部における虚血性疾患および脳変性疾患を予防および治療する方法を提供する。
【００２５】
本発明はまた、虚血性疾患および脳変性疾患の予防および治療のための活性成分としてアラビノキシラン、ベータグルカン、アラビノースおよびキシロースからなる群から選ばれる少なくとも１つの成分を含む医薬組成物も提供する。
【００２６】
本発明はまた、虚血性疾患および脳変性疾患の予防および治療のための活性成分としてアラビノキシラン、ベータグルカン、アラビノースおよびキシロースからなる群から選ばれる少なくとも１つの成分を含む健康食品も提供する。
【００２７】
本発明はまた、それを必要とする哺乳動物またはヒトにおけるアポトーシスにより生じる虚血性疾患および脳変性疾患の予防および治療のための医薬組成物の製造のためのアラビノキシラン、ベータグルカン、アラビノースおよびキシロースからなる群から選ばれる少なくとも１つの成分の使用も提供する。
【００２８】
本発明は虚血性疾患および脳変性疾患を患っているヒトまたは哺乳動物におけるアラビノキシラン、ベータグルカン、アラビノースおよびキシロースからなる群から選ばれる少なくとも１つの成分の有効量を、薬学的に許容できる担体またはその助剤と共に投与することによる、虚血性疾患および脳変性疾患を予防および治療する方法を提供する。
【００２９】
本明細書に開示する用語「虚血性疾患」は、好適には心筋梗塞、脳梗塞などの手術または臓器傷害の副作用から生じる心筋梗塞、脳梗塞、虚血性急性腎不全、虚血性急性肝不全、糖尿病性足潰瘍、糖尿病性腎症および虚血性疾患などの様々な虚血性疾患を含む。
【００３０】
本明細書に開示する用語「手術の副作用から生じる虚血性疾患」は、虚血性心疾患、虚血性腎疾患、虚血性肝疾患または虚血性卒中、好適には虚血性心疾患、虚血性卒中等を含む。
【００３１】
本明細書に開示する用語「臓器組織傷害」は、臓器手術または移植または事故で切断された体の部分の再結合が行われる時に起きる虚血−再灌流傷害である。
【００３２】
上に記載の「臓器」は内臓、例えば、腎臓、肝臓、すい臓、肺、心臓などを含む。
【００３３】
本明細書に開示する用語「脳変性疾患」は、アルツハイマー病、血管性痴呆、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、ピック病、クロツエルヤコブ病または脊髄傷害などの様々な脳変性疾患を含み、好適にはアルツハイマー病、血管性痴呆、パーキンソン病などである。
【００３４】
本明細書に開示する用語「でんぷん」は、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．，Ｔｒｉｔｉｃｉ  ｌｅｖｉｓ  ｓｅｍｅｎ，Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ  Ｌ．，Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．（コメ），Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  ｖａｒ．ｈｅｘａｓｔｉｃｈｏｎ  ＡＳＣＨ．，ｍａｌｔ，Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ，Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．，Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ  ＭＯＥＮＣＨ，Ｃｏｉｘ  ｌａｃｒｙｍａ−ｊｏｂｉ  ｖａｒ．ｍａｙｕｅｎ  ＳＴＡＰＦ，Ｐａｎｉｃｕｍ  ｍｉｌｉａｃｅｕｍ  Ｌ．などのイネ科植物（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ  ｐｌａｎｔｓ）またはＳｅｔａｒｉａ  ｉｔａｌｉｃａ  Ｂｅａｕｖ．またはポテトから精製された各種でんぷん、好適には，Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．、Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  ｖａｒ．ｈｅｘａｓｔｉｃｈｏｎ  ＡＳＣＨ．、コメまたはポテトから精製されたでんぷん、より好適には，Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．から精製されたでんぷん、Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．から精製されたでんぷん、コメから精製されたでんぷんまたはポテトから精製された可溶性でんぷん，更に好適には、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．から精製されたでんぷん、Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．から精製されたでんぷん、コメから精製されたでんぷんまたはポテトから精製された可溶性でんぷんなどの各種でんぷんを含み、これらはすべて１，０００，０００から１０，０００，０００の範囲の分子量を有する。
【００３５】
本明細書に開示する用語「総食物繊維」は、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．、Ｔｒｉｔｉｃｉ  ｌｅｖｉｓ  ｓｅｍｅｎ、Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ  Ｌ．、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  ｖａｒ．
ｈｅｘａｓｔｉｃｈｏｎ  ＡＳＣＨ．、ｍａｌｔ、Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ、Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ  ＭＯＥＮＣＨ、Ｃｏｉｘ  ｌａｃｒｙｍａ−ｊｏｂｉ  ｖａｒ．ｍａｙｕｅｎ  ＳＴＡＰＦ、Ｐａｎｉｃｕｍ  ｍｉｌｉａｃｅυｍ  Ｌ．、Ｓｅｔａｒｉａ  ｉｔａｌｉｃａ  Ｂｅａｕｖなどのイネ科植物（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ  ｐｌａｎｔｓ  ）またはジャガイモから精製された総食物繊維、好適には、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．、Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ  Ｌ．、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  ｖａｒ．ｈｅｘａｓｔｉｃｈｏｎ  ＡＳＣＨ．、Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．またはＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．から精製された総食物繊維、より好適にはアラビノキシラン、ベータグルカンおよびアラビノガラクタンを相対重量％で５〜２０：  １：  １−１０含むＴｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．から精製された総食物繊維、更により好適には、５０，０００から４００，０００ダルトンの範囲の分子量を有するアラビノキシランおよびベータグルカンからなるＴｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．から精製された総食物繊維である。
【００３６】
本明細書に開示する用語「アラビノース」および「キシロース」は、Ｌ−型およびＤ−型の両方を含み、好適には、天然で作られる型、即ち、アラビノースはＬ−型、およびキシロースはＤ−型を含む。
【００３７】
以下に，本発明をより詳細に記載する。
【００３８】
本発明のでんぷんは，以下の手順により詳細に調製され得る。
【００３９】
イネ科植物（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ  ｐｌａｎｔｓ）、好適にはＴｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．、Ｔｒｉｔｉｃｉ  ｌｅｖｉｓ  ｓｅｍｅｎ、Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ  Ｌ．、玄米、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  ｖａｒ．ｈｅｘａｓｔｉｃｈｏｎ  ＡＳＣＨ．、ｍａｌｔ、Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ、Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ  ＭＯＥＮＣＨ、Ｃｏｉｘ  ｌａｃｒｙｍａ−ｊｏｂｉ  ｖａｒ．ｍａｙｕｅｎ  ＳＴＡＰＦ、Ｐａｎｉｃｕｍ  ｍｉｌｉａｃｅｕｍ  Ｌ．またはＳｅｔａｒｉａ  ｉｔａｌｉｃａ  Ｂｅａｕｖ、より好適にはＴｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍＬ．の種子を乾燥および粉砕して粉末にし、その粉末を１０から１００％、好適には約５０から７０％容量の蒸留水と混合して生地を作成し、その生地をナイロンのふるい絹で包み、その生地を流水下で圧縮してでんぷんを溶出し、溶出物を遠心分離して沈澱を集め、最後に、沈澱を蒸留水に懸濁して一緒に遠心分離して、本発明のでんぷんを精製し、本発明のでんぷんを集める。
【００４０】
本発明の総食物繊維はまた、以下の手順によって詳細に調製され得る。
【００４１】
イネ科植物（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ  ｐｌａｎｔｓ）、好適にはＴｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．、Ｔｒｉｔｉｃｉ  ｌｅｖｉｓ  ｓｅｍｅｎ、Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ  Ｌ．、玄米、Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  ｖａｒ．ｈｅｘａｓｔｉｃｈｏｎ  ＡＳＣＨ．、ｍａｌｔ、Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ、Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ  ＭＯＥＮＣＨ、Ｃｏｉｘ  ｌａｃｒｙｍａ−ｊｏｂｉ  ｖａｒ．ｍａｙｕｅｎ  ＳＴＡＰＦ、Ｐａｎｉｃｕｍ  ｍｉｌｉａｃｅｕｍ  Ｌ．またはＳｅｔａｒｉａ  ｉｔａｌｉｃａ  Ｂｅａｕｖ、より好適には、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．、玄米またはＺｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．の種子を乾燥および粉砕して粉末にし、その粉末を約１から１５−倍、好適には、約５から１０−倍容量の蒸留水、メタノール、エタノール、ブタノールなどのＣ１−Ｃ４の低級アルコールまたはその混合物、好適には、蒸留水または約１：０．１から１：１０の範囲の比率の水とＣ１−Ｃ４低級アルコールの混合物、より好適には、蒸留水または約１：０．１から１：１０の範囲の比率の水とエタノールの混合物と混合し、冷水、温水、超音波還流冷却、電子醸造ポット抽出などの抽出方法を用いて２０°Ｃから１００°Ｃ、好適には２５０Ｃから１００°Ｃの範囲の温度で、０．５から４８時間、好適には１から２４時間の期間に亘って、好適には１から１２回好適には、３から４回の抽出に付し、ろ過し、ろ液を２０°Ｃから１００°Ｃ、好適には４０°Ｃから７０°Ｃの範囲の温度で、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮し、ついで濃縮物を真空凍結乾燥を用いて乾燥して乾燥粗抽出物粉末を得、糖をエタノール（糖含量が粗抽出物の全乾燥の５０％を超す場合は、好適には８５％エタノール）を用いて除去し、エタノール洗浄残渣および乾燥残渣を１０から７０−倍、好適には、３０から５０−倍緩衝溶液に溶解し、ついでアルファーアミラーゼで１０から６０分間、好適には、２５から４５分間、５０°Ｃから１２０°Ｃの範囲の温度、好適には７０°Ｃから９０°Ｃで処理し、３０°Ｃから９０°Ｃ、好適には５０°Ｃから７０°Ｃの範囲の温度でプロテアーゼ処理して蛋白質を除き、酢酸を用いて溶液をｐＨ４．１−４．５、好適には、ｐＨ４．２−４．４に調整後、２０°Ｃから１００°Ｃ、好適には５０°Ｃから７０°Ｃの範囲の温度でアミログルコシダーゼで処理し、最後に１−７倍、好適には、３−５倍容量のエタノールを加えて溶液を沈澱させ、沈澱した本発明の総食物繊維を得る。
【００４２】
本発明は、虚血性および脳変性疾患の予防および治療のための、上に記載の調製方法で調製された活性成分としてでんぷんまたは総食物繊維を含む医薬組成物を提供する。
【００４３】
本発明のでんぷん、総食物繊維、アラビノキシラン、ベータグルカン、アラビノースおよびキシロースは、本技術分野で周知の単離または精製方法により、または商業市場または会社から入手し得る。
【００４４】
本発明のでんぷんまたは総食物繊維は、殆ど副作用がなく、無毒性であるので、長期間安全に用いられ得る。
【００４５】
本発明のでんぷんまたは総食物繊維を含む医薬組成物はまた、医薬組成物の製造に通常用いられる、適正な担体、助剤および希釈剤も含み得る。
【００４６】
本発明のでんぷんまたは総食物繊維を含む医薬組成物に含まれ得る薬学的に許容できる担体、助剤または希釈剤は、ラクトース、デキストロース、サッカロース、ソルビトール、マニトール、キシリトール、エリスリトール、マニトール、アラビアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ステアリン酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシル安息香酸塩、プロピルヒドロキシ安息香酸塩、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油である。
【００４７】
この製剤は更に、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、芳香剤、乳化剤、保存剤等を含み得る。本発明の組成物は、本技術分野で周知のいずれかの手順を採用して患者への投与後、活性成分の速放性の、徐放性のまたは遅放性の遊離を提供するように製剤され得る。
【００４８】
例えば、本発明の組成物は、注射液を製造するために通常用いられる油、プロピレングリコールまたは他の溶媒に溶解され得る。
【００４９】
この担体の適切な例は、生理食塩水、プロピレングリコール、エタノール、植物油、イソプロピルミリステートなどを含むが、これらに限定されない。局所投与のために、本発明の抽出物は、軟膏およびクリームの形に製剤され得る。
【００５０】
本組成物を含む医薬製剤は、経口剤型（粉末、錠剤、カプセル、軟カプセル、水性薬、シロップ、エリキシル剤、ピル、粉末、小袋、顆粒）または局所製剤（クリーム、難航、ローション、ゲル、香油、パッチ、ペースト、スプレー、溶液、エアゾールなど）または注射製剤（溶液、懸濁液、乳濁液）などのいずれの形にも調製され得る。
【００５１】
医薬剤型本発明の組成物は、それらの薬学的に許容できる塩の形で用いられ得、また単独でまたは適切な組み合わせおよび他の医薬活性化合物と組み合わせて用いられ得る。
【００５２】
本発明の抽出物または組成物の望ましい用量は被験者の状態および体重、重症度、剤型、投与経路および期間によって変わり、また当業者によって選択され得る。しかしながら、望ましい効果を得るために、本発明の抽出物を通常１０ｍｇ／ｋｇの範囲、好適には、０．１から１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日で投与するのが好ましい。投与量は一日単回または数回の分割投与であってよい。
【００５３】
本発明の医薬組成物は、哺乳動物（ラット、マウス、家畜またはヒト）などの対象動物に様々な経路で投与され得る。投与のすべてのモードが、熟慮され、例えば、経口、経直腸または静脈内、筋肉内、皮下、皮内、くも膜下、硬膜外または脳室内注射で投与され得る。
【００５４】
本発明は、虚血性疾患および脳変性疾患の予防および改善のための活性成分としてでんぷんまたは総食物繊維を含む健康食品を提供する。
【００５５】
本明細書に開示する用語「健康食品」は、ヒトの健康に有用な機能を示す活性成分または成分を含む製造されたおよび加工された食品を意味し、ここで、「ヒトの健康に対する機能」は、人体の構造と機能に従ってヒトでのその生理学的活性または抑制を介するヒトの健康への有益な作用または有利な作用を意味する。
【００５６】
虚血性疾患および脳変性疾患の予防および改善のための本発明の健康食品は、上記でんぷんまたは総食物繊維を該組成物の合計重量に基づいて０．０１から９５重量％、好適には１から８０重量％含む。
【００５７】
また、虚血性疾患および脳変性疾患の予防および改善のための粉末、顆粒、カプセル、錠剤、懸濁液、乳濁液、シロップなどの医薬品の投与剤型または健康飲料などの健康食品が製造され加工され得る。
【００５８】
本発明の健康飲料組成物が、上に記載の成分を必須成分として指示された割合で含んでいても、通常の飲料における他の液体成分についての特別な制限はなく、その他の成分は様々なデオドラントまたは天然の炭水化物などでありえる。先述の天然の炭水化物の例は、グルコース、フラクトースなどの単糖、マルトース、サッカロースなどの二糖、デキストリン、シクロデキストリンなどの通常の糖、およびキシリトールなどの糖アルコールおよびエリスリトール等である。先述以外の他のデオドラントとして、タウマチン（ｔａｕｍａｔｉｎ）などの天然デオドラント、ｌｅｖａｕｄｉｏｓｉｄｅ  Ａ、ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎなどのステビア抽出物およびサッカリン、アスパルタムなどの合成デオドラントが有利に用いられ得る。上に記載の天然炭水化物の量は、本飲料組成物の１００ｍｌ中、通常約１から２０ｇ、好適には５から１２ｇの範囲である。
【００５９】
先述の成分以外の成分は様々な栄養剤、即ち、ビタミン、ミネラルまたは電解質、合成フレーバー、着色剤およびチーズチョコレートなどの場合は改善剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護コロイド粘着剤、ｐＨ調整剤、安定剤、保存剤、グリシン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などである。先述以外の他の成分は、天然果実ジュース、果実ジュース飲料および野菜飲料を調製するための果実であり得、ここで該成分は、単独でまたは組み合わせて用いられ得る。該成分の割合はあまり重要でないが、通常、本組成物１００ｗ／ｗ％あたり約０から２０ｗ／ｗ％の範囲である。
【００６０】
また、本明のでんぷんおよび総食物繊維は、食品、添加物または飲料に虚血性疾患および脳変性疾患の予防のために加えられ得、ここで食品または飲料中の上に記載の抽出物の量は、通常、健康食品の合計重量の約０．０１から１５ｗ／ｗ％の範囲であり、健康飲料１００ｍｌ中０．０２から５ｇ、好適には０．３から１ｇの範囲である。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本発明のＴＤＦを含むアラビノキシランおよびベータグルカンその他の糖組成物の分析データを示す図である。
【図２ａ】イネ科植物（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ  ｐｌａｎｔｓ）（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．、玄米およびＺｅａｍａｙｓＬ．）から単離された粗抽出物および本発明のでんぷんの各種濃度の添加の虚血状態下で培養されたＨｅｐＧ２細胞の生存率への改善効果を示す図である。
【図２ｂ】Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．の粗抽出物から精製された本発明のＴＤＦの各種濃度の添加の虚血状態下で培養されたＨｅｐＧ２の細胞生存率への影響を示す図である。
【図３ａ】Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．から精製された本発明のでんぷんの各種濃度の添加のベータ−アミロイドの各種濃度を用いて培養したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞生存率への改善効果を示す図である。
【図３ｂ】本可溶性 でんぷんの各種濃度の添加のベータ−アミロイドの各種濃度を用いて培養したSH-SY5Y細胞の生存率への改善効果を示す図である。
【図３ｃ】Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．（ＨＹ６２２８）の粗抽出物およびイネ科植物（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ  ｐｌａｎｔｓ）から精製された本発明のでんぷん（ＳＣ：  ｃｏｒｎ、ＳＲ：ｒｉｃｅ、ＳＳ：可溶性でんぷん、ＳＷ：Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．）の各種濃度の添加のベータ−アミロイドの２５  μＭを用いて培養したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の生存率への改善効果を示す図である。
【図３ｄ】灰分成分を含む本発明の総食物繊維の各種濃度の添加のベータ−アミロイドの１０μＭを用いて培養したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の生存率への改善効果を示す図である。
【図３ｅ】総食物繊維を含むアラビノキシランおよびベータグルカンおよびアラビノキシランを含むアラビノースおよびキシロースの添加のベータ−アミロイドの１５μＭを用いて培養したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の生存率への改善効果を示す図である。
【図４】Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．（ＨＹ６２２８）の粗抽出物の各種濃度の添加の２５０μＭの６−ヒドロキシドパミンと培養したＳＨ−ＳＹ５Ｙの細胞生存率への改善効果を示す図である。
【図５ａ】Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．から精製された本発明のでんぷんを経口投与された動物モデルにおける心筋梗塞への阻害効果を示す図である
【図５ｂ】Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．から精製された本発明のＴＤＦを経口投与された心筋梗塞動物モデルにおける心筋梗塞への阻害効果を示す図である
【図５ｃ】ベータグルカン、アラビノキシラン、アラビノースおよびキシロースを経口投与された心筋梗塞動物モデルにおける心筋梗塞への阻害効果を示す図である
【図６】Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌから精製された本発明のでんぷんを経口投与された脳梗塞動物モデルにおける脳梗塞への阻害効果を示す図である
【図７ａ】Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．から精製された本発明のでんぷんを経口投与された痴呆誘発動物モデルにおける水迷路テストによって測定された記憶障害への阻害効果を示す図である
【図７ｂ】Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．から精製された本発明のＴＤＦを経口投与された痴呆誘発動物モデルにおける水迷路テストによって測定された記憶障害への阻害効果を示す図である。
【図８ａ】本発明の粗抽出物（ＨＹ６２２８）を経口投与された血管性痴呆動物モデルにおける、水迷路テストによって測定された痴呆への阻害効果を示す図である。
【図８ｂ】経口投与された本発明のでんぷんおよびＴＤＦの血管性痴呆動物モデルにおける水迷路テストによって測定された痴呆への阻害効果を示す図である。
【図８ｃ】アラビノキシランを経口投与された血管性痴呆動物モデルにおける水迷路テストによって測定された痴呆への阻害効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
本発明を以下の実施例により、より具体的に説明する。しかし、本発明はこれらの実施例にいずれの仕方においても制限されないことが理解されるべきである。
【００６３】
次の参考実施例、実施例および実験的実施例は、その範囲を制限することなく、本発明を更に説明することを意図している。
（参考実施例１）
【００６４】
材料
【００６５】
コーン（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．）（カタログ番号．Ｓ４１８０、以降「ＳＣ」と言う。）、コメ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．），（カタログ番号  Ｓ７２６０、以降「ＳＲ」と言う。）から精製したでんぷん、精製可溶性でんぷん（カタログ番号Ｓ９７６５、以降「ＳＳ」と言う。）およびアラビノース（カタログ番号．Ａ３２５６：Ｌ（＋）型，ＭＷ１５０．１３）をＳｉｇｍａ（ＵＳＡ）から購入した。中粘度のアラビノキシラン（カタログ番号．Ｐ−ＷＡＸＹＭ、麦から，粘度：２５ｃＳｔ，ＭＷ：２７０，０００ダルトン），中粘度のベータグルカン（カタログ番号．Ｐ−ＢＧＢＭ：大麦から，粘度：２８ｃＳｔ，ＭＷ：２６０，０００ダルトン）をＭｅｇａｚｙｍｅ（Ｉｒｅｌａｎｄ）から購入した。キシロース（カタログ番号９５７２９：Ｄ（＋）型，ＭＷ１５０．１３）は，Ｆｌｕｋａ（ドイツ）から購入した。
（参考実施例２）
【００６６】
実験動物の調製
【００６７】
２５０−３００ｇの体重の雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットをＨｙｏｃｈａｎｇＳｃｉｅｎｃｅＣｏ．（Ｋｏｒｅａ）から購入し、２１±２°Ｃで昼／夜の１２時間サイクル下の動物飼育室で、水および動物の餌に自由にアクセスさせて飼育した。
動物は，実験の前１０分間手で触れられた。
【実施例１】
【００６８】
イネ科植物（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ  ｐｌａｎｔｓ）の粗抽出物の調製
【００６９】
市場から購入したＴｒｉｔｉｃｕｍ    ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．１００ｇを洗浄し、水２ｌと混合し、漢方薬電子醸造ポット（Ｄａｅｗｏｏｎｇ  ｏｒｉｅｎｔａｌ  ｈｅｒｂ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｂｒｅｗｉｎｇ  ｐｏｔ  ＤＷＰ−２０００、Ｄａｅｗｏｏｎｇ）を用いて２回抽出物した。溶液を濾過し、得られたろ過抽出物２ｌを凍結乾燥しＴｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌの乾燥粗抽出物（以降「ＨＹ６２２８」と言う。）２２ｇを得た。上に記載した同じ手順をそれぞれ１００ｇの乾燥玄米およびコーン（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ）に適用し、玄米、およびコーン（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ）の粗抽出物それぞれ２０ｇおよび９ｇを得た。（以降、「ＨＹ６２２８Ａ」および  「ＨＹ６２２８Ｆ」と言う。）
【００７０】
Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌの抽出物から６、０００から８，０００ダルトン未満の分子量の低分子量物質を除去するために、ＨＹ６２２８の１０ｇを蒸留水１００ｍｌに懸濁し、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  １−１３２６７５、Ｓｐｅｃｔｒｕｒｎ  ｌａｂｓ）に注ぎ、３日間、新鮮な蒸留水５００ｍｌで３回置換し、４°Ｃで蒸留水５００ｍｌ中で２４時間に亘って攪拌して透析した。膜中の溶液を凍結乾燥し、高分子量物質（以降、「ＨＹ６２２８ｄ」と言う。）を含むＴｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌの精製水抽出物６．６６ｇを得た。
【実施例２】
【００７１】
イネ科植物（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ  ｐｌａｎｔｓ）の本発明の総食物繊維の調製
【００７２】
文献  （Ｌｅｅ  Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｓｓｏｃ，ｏｆｆ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７５，ｐｐ３９５−４１６，１９９２、Ｐｒｏｓｋｙ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｓｓｏｃ．Ｏｆｆ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７１，ＰＰ１０１７−１０２３）に開示されている手順およびＭｅｇａｚｙｍｅ  Ｃｏ．Ｌｔｄ（ＴＤＦＲ０６／１０）のマニュアルに従って、灰分を含む総食物繊維を粗抽出物を実施例１において調製したＴｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．（ＨＹ６２２８）の粗抽出物から単離した。
【００７３】
実施例１において調製したＨＹ６２２８の１０ｇを５００ｍｌの瓶に注ぎ、それにＭＥＳ／ＴＲＩＳ緩衝溶液（それぞれ０．０５Ｍ、ｐＨ８．０、２４°Ｃ）４００ｍｌを加えた。溶液を完全に混合し、ついでそれにアルファアミラーゼ７０マイクロリッター（２３ｍｇ／ｍｌ  Ｔｅｒｍａｍｙｌ、９３０Ｕ／ｍｇ、２４°Ｃ）を加え、水浴中で８０°Ｃで３５分間反応させた。反応後、溶液を６０°Ｃに冷却し、それにプロテアーゼ  （−３５０Ｕ／ｍｌ  Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ−ＢＳＰＲＴ）１０００マイクロリッターを加え、水浴中で６０°Ｃで３０分間反応させた。該溶液を３Ｍ酢酸でｐＨ４．３に調製し、それにアミログルコシダーゼ（３３００Ｕ／ｍｌ、Ｍｅｇａｚｙｍｅ．Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ−ＡＭＧＤＦ）の２０００マイクロリッターを加え、水浴中で６０°Ｃで３０分間反応させた。
【００７４】
溶液を予め６０°Ｃに加熱された９５％ＥｔＯＨ１６００ｍｌと混合し、室温で６０分間、攪拌せずに放置した。溶液を遠心分離して沈澱を集め、該沈澱を乾燥して総食物繊維（ＴＤＦ）．２．３ｇを得た。
【実施例３】
【００７５】
アラビノキシランおよびベータグルカンなどを含むＴＤＦの糖成分の分析
【００７６】
アラビノキシラン（アラビノースおよびキシロース）およびベータグルカンを含むＴＤＦの組成物を決定するために、ＴＤＦ中のアラビノース、キシロース、グルコースおよびガラクトースの量が炭水化物  Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｅｏｊｅｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｒｂｏ．ｏｒ．ｋｒ）の炭水化物物質研究室で分析された。
【００７７】
ＴＤＦの２ｍｇ／ｍｌをトリフルオロ酢酸を用いて４時間、酸加水分解に処した。加水分解された溶液１０マイクロリッター（合計０．２マイクログラム）をＣａｒｂｏＰａｃ（商標）ＰＡｌカラム（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤｓｙｓｔｅｍ、Ｄｉｏｎｅｘ、ＵＳＡ）に注入し、１．０ｍｌ／ｍｉｎの流速で１８ｍＭＮａＯＨを用いて溶出した（Ｈｏｕｂｅｎ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ  ＳｃＬ，２６，ｐｐ３７−４６，１９９７）。
【００７８】
図１に示すように、アラビノキシラン（Ａｒａ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、グルコース（ＧＩｃ）およびキシロース（ＸｙＩ）が、溶出の順番で検出され、これは糖標準の溶出時間との比較によって確認された。ピーク面積から計算されたそれぞれの成分の量は６９．５ｐｍｏｌ（１０．４ｎｇ）、２７．０ｐｍｏｌ（４．９ｎｇ）、６５２．７ｐｍｏｌ（１１７．５ｎｇ）および８１．６ｐｍｏｌ（１２．２ｎｇ）にそれぞれ対応する。ガラクトースは、アラビノガラクタンから誘導され、アラビノガラクトン中のアラビノースの量は、ガラクトースのそれの０．７−倍（Ｖｉｒｋｋｉ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、３４３，ｐｐ５２１−５２９，２００８）に対応し、アラビノースの量は、アラビノガラクタン（３．４ｎｇ）中のアラビノースの量を測定したアラビノース（１０．４ｎｇ）のそれから差し引いた後７ｎｇになった。従って、Ａｒａ／ＸｙＩの重量比は０．５８であり、これは、参考文献に開示されたデータと同一である。（Ｏｒｄａｘ−Ｏｒｔｉｚ  ＪＪ  ｅｔ  ａｌ．，／．Ｃｅｒａｌ  ＳｃＬ，４２，ｐｐｌｌ９−１２５，２００５）。最後に、ＴＤＦ０．２マイクログラム（２００ｎｇ）中のアラビノキシランの量は、１９．２ｎｇ（９．６％、重量比）であり、アラビノガラクタンの量は８．３ｎｇ（４．１％、重量比）であった。
【００７９】
他方、ＴＤＦ中のグルコースは、ベータグルカンからだけでなく、セルロースおよびレジスタントスターチからも誘導されるので、ＴＤＦ中のベータグルカンの量は、混合連鎖ベータグルカンアッセイ手順（ＭｃＣｌｅａｒｙ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて測定され、これには混合連鎖ベータグルカンアッセイキット（ＭｅｇａｚｙｍｅＫ−ＢＧＬＵ０４／０６）が用いられた。この方法において、リケナーゼはベータグルカンを部分的に加水分解し、ついでベータグルコシダーゼが部分的に加水分解したベータグルカンを完全にグルコースに加水分解する。生成したグルコースの量は、グルコースが、グルコースオキシダーゼおよびパーオキシダーゼと反応された後、５１０ｎｍにおける吸収を測定して決定された。この実験から、ＴＤＦ内のベータグルカンが約１．１％（ｗ／ｗ％）と測定された。
【００８０】
上記結果を要約すると、アラビノキシラン（ａｒａ／ｘｙｌ＝０．５８）、ベータグルカおよびアラビノガラクタンは、それぞれ９．６、１．１および４．１％（ｗ／ｗ％）であり、ベータグルカン以外のグルコースは、１１５．３ｎｇ（５７．７％、ｗ／ｗ％）であった。
【実施例４】
【００８１】
イネ科植物（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ  ｐｌａｎｔｓ）からの本発明のでんぷんの調製
【００８２】
本発明のでんぷん（ＳＷ）は、文献（Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｂｏｒｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉ．４１，ｐｐ２２１−２３７、２００５）に開示されている手順に従って小麦粉から単離された。
【００８３】
小麦粉５０ｇに水を加え、水含量５０％の生地を作り、その生地を５０マイクロメーターのナイロンふるい絹で包んだ。ふるい絹中の生地を、流水下で、濁った水が出なくなるまで圧縮した。溶出物を遠心分離し、沈澱を集め、本発明のでんぷんを得た（以降、「ＳＷ」と言う。）。
（実験的実施例１）
【００８４】
虚血状態下の細胞生存率（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）へのでんぷんの改善効果の測定
【００８５】
発明の粗抽出物、それから精製されたでんぷんおよび総食物繊維の虚血状態下のＨｅｐＧ２の細胞生存率への効果を調べるために、次のＭＴＴアッセイを文献（Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｒ．Ｍ．，  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣｅＩｉｓ  ＪＥ  （Ｅｄ．）、Ｖｏｌ．ｌ，ｐｐ３６９−３７０，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４）に開示された手順を僅かに修正して実施した。
【００８６】
＜ｉｉ６＞ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌細胞系、ＡＴＣＣ  ＨＢ  ８０６５、２Ｘ１０５細胞／８００μl）を１２−ウエルプレートの各ウエルに播種し、（Ｅａｇｌｅ’ｓ  最小必須培地、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）ペニシリンＧナトリウム（１００Ｕｎｉｔｓ／Ｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）、ストレプトマイシン硫酸塩（１００ｍｇ／Ｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）および１０％（ｗ／ｖ）ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を補給したＥＭＥＭ中で培養し、３７°Ｃで４８時間５％ＣＯ２培養器中で培養した。培地を新鮮培地に変えた後、その培地に１００％ＤＭＳＯ中に溶解した本発明の粗抽出物およびでんぷんを各種濃度で加えた。でんぷんの最終濃度：１００、２００、４００および８００マイクログラム／ｍｌおよびＴＤＦの最終濃度：１００および１０００マイクログラム／ｍｌとしたものを試験群とし、また何も加えないものを陰性対照群とした。細胞を虚血状態下（酸素濃度：１％）でさらにもう２日間培養した。最後に、ＭＴＴアッセイの結果を図２ａおよび２ｂに示すように得た。
ｔ＜ｉｉ７＞図２ａに示すように、２００マイクログラム／ｍｌを超すＳＲ、ＨＹ６２２８Ａ、ＳＷおよびＨＹ６２２８ｄ、４００マイクログラム／ｍｌを超すＨＹ６２２８、ＳＣおよびＨＹ６２２８Ｆ、および８００マイクログラム／ｍｌを超すＳＳが、それぞれ、細胞生存率を改善した。
【００８７】
更に、図２ｂに示すように、ＨＹ６２２８は、１０００マイクログラム／ｍｌの濃度で細胞生存率の強い改善効果を示した。
【００８８】
上述のように、本発明のＴｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．、玄米およびＺｅａｍａｖｓ  Ｌ．の粗抽出物だけでなく、それから精製されたでんぷんが、虚血状態下の細胞生存率に強力な改善効果を示した。しかし、ＴＤＦは虚血状態下の細胞生存率を改善しなかった。先行技術（韓国登録特許番号第１０−０７２３９５０号および  ＰＣＴ／ＫＲ２００６／００００２７）によると、虚血状態下の細胞生存率を改善するＴｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．の粗抽出物は、脳梗塞などの虚血性疾患に対してだけでなく、アルツハイマー病などの脳変性疾患に対しても治療効果を示す。これらの結果に基づいて、虚血状態下の細胞生存率も改善するイネ科植物（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ  ｐｌａｎｔｓ）からの本発明のでんぷんは、これらの疾患を治療するのに有効であることが予想され得る。
（実験的実施例２）
【００８９】
実験的実施例２．ベータ−アミロイド−誘発細胞毒性（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）へのでんぷんおよび総食物繊維の影響
【００９０】
本発明の粗抽出物、でんぷんおよび総食物繊維のアルツハイマー病の主な原因の１つと見なされるベータ−アミロイドによって誘発される細胞毒性への神経保護作用を特定するために、次のＭＴＴアッセイを文献に開示された手順（Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｒ．Ｍ．，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｃｅｌｉｓ  ＪＥ  （Ｅｄ．），Ｖｏｌ．ｌ，ｐｐ３６９−３７０，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４）を僅かに修正して実施した。
【００９１】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（ヒト神経芽細胞腫細胞系、ＡＴＣＣＣＲＬ−２２６６、４Ｘ１０＊細胞／３００マイクロリッター／ウエル）が４８ウエルプレートに藩種され、ペニシリンＧナトリウム（１００Ｕｎｉｔｓ／Ｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）、ストレプトマイシン硫酸塩（１００ｍｇ／Ｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）および１０％（ｗ／ｖ）ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）で補給したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ／Ｆ１２９０％培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）中、３７°Ｃで５％ＣＯ２−９５％の空気培養器中で４８時間培養した。培地を交換後、細胞を、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．から単離した本発明のでんぷんの存在下または不存在下（以降、Ａβ２ｓ−３５単独群と言う。）でベータ−アミロイドで２４時間処理し、０、２．５、７．５および２５μＭの最終濃度にした。（最終濃度：１２５マイクログラム／ｍｌ、以降Ａ２５−３５＋ＳＷ群と言う。）または可溶性でんぷん（最終濃度：１２５マイクログラム／ｍ１、以降Ａ２５−３５＋ＳＳ群と言う。）（これは、ＤＭＳＯ中の５０マイクログラム／ｍｌストック溶液から作成された。）（図３ａおよび３ｂ参照）。培養後、細胞をＭＴＴ溶液で２時間処理した（１ｍｇ／ｍｌの最終濃度）。可視細胞中の暗青色のホルマザンをＤＭＳＯ中に溶解し、５４０ｎｍの吸収をマイクロプレートリーダー（ＦＬＵＯｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡ、ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ、ドイツ）によって測定した。
【００９２】
上記の結果に基づき、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．の粗抽出物またはＧｒａｍｎｉｅａｅ  ｐｌａｎｔｓから単離されたでんぷんのベータ−アミロイド誘発細胞毒性に対する保護作用を更に検討するために、ベータ−アミロイドの濃度を２５μＭに固定した。Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．の粗抽出物（ＨＹ６２２８、ＨＹ図３ｃ中ＨＹと示す、２５０マイクログラム／ｍｌ）およびＧｒａｍｎｉｅａｅ  ｐｌａｎｔｓから単離されたでんぷん（ＳＳ、ＳＣ、ＳＲおよびＳＷ、１２５マイクログラム／ｍｌ）をそれに加えて培養した（図３ｃ参照）。われわれは、総食物繊維（ＴＤＦ、５００、１０００マイクログラム／ｍｌ）のベータ−アミロイドの１０μＭの存在下における細胞の生存率の改善効果も検討した（図３ｄ参照）。
【００９３】
更に、アラビノキシラン（ＡＸ、５００マイクログラム／ｍｌ）、アラビノース（Ａｒａ、２５０マイクログラム／ｍｌ）、キシロース（ＸｙＩ、２５０マイクログラム／ｍｌ）およびベータグルカン（ｂ−グル、２０マイクログラム／ｍｌ）を１５μＭのベータ−アミロイドの存在下で培地に加えた（図３ｅ参照）。
【００９４】
結果として、図３ａおよび図３ｂに示すように、ＳＷ（図３ａ参照）またはＳＳ（図３ｂ参照）の１２５マイクログラム／ｍｌと組み合わせた０−２５μＭのベータ−アミロイドで処理された群は、２．５μＭを超す濃度において、ベータ−アミロイド誘発細胞毒性を有意に減少した［ｐ＜０．０５（＊）ｏｒ０．０１（＊＊）］。更に、ベータ−アミロイドと共に本発明のでんぷんおよびＴＤＦで処理された群は、細胞生存率を有効に改善した（図３ｃおよび図３ｄ参照）。また、図３ｅに示すように、細胞生存率細胞が、１５μＭのベータ−アミロイド単独で処理された場合、細胞生存率は、６０．４％であったが、培地にアラビノキシラン、アラビノース、キシロースおよびベータグルカンが存在する場合、細胞生存率はそれぞれ７５．５、７１．１、７２．１および７０％に改善された［ｐ＜０．０５］。
【００９５】
上記の結果から、本発明のでんぷんおよび本発明の総食物繊維はＴｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．の粗抽出物ＨＹ６２２８）と同様（ベータ−アミロイドによって生じる細胞毒性を減少させることによって、細胞生存率への改善作用を示すことが確認された。従って、本発明のでんぷんおよび本発明の総食物繊維はベータ−アミロイドの蓄積によって生じるアルツハイマー病の治療に有用であり得る。
（実験的実施例３）
【００９６】
６−ヒドロキシドパミン誘発細胞毒性への粗抽出物の作用（インビトロ）
【００９７】
パーキンソン病の実験的誘発因子として周知（Ｇｕｏ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，３９（５），ｐｐ６８２−６９５，２００５）の６−ヒドロキシドパミンによって誘導される細胞毒性への本発明の粗抽出物（ＨＹ６２２８）の神経保護作用を特定するために実験的実施例２に開示したのと類似の方法で次のＭＴＴアッセイを実施した。
【００９８】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（ヒト神経芽細胞腫細胞系、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２２６６、６Ｘ１０４細胞／３００マイクロリッター／ウエル）４８ウエルプレートに藩種し、ペニシリンＧナトリウム（１００Ｕｎｉｔｓ／Ｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）、ストレプトマイシン硫酸塩（１００ｍｇ／Ｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）および１０％（ｗ／ｖ）  ウシ胎仔血清  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）で補給されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  修正Ｅａｇｌｅ培地／Ｆ１２  ９０％培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）中、３７°Ｃで５％ＣＯ２−９５％の空気培養器中で４８時間培養した。
【００９９】
培地交換後、細胞を６−ヒドロキシドパミンを用いて処理し（６−ＯＨＤＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）２５０μＭの最終濃度とし、２４時間培養した。本発明のＴｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．（ＨＹ６２２８）の粗抽出物を、６−ＯＨＤＡによる処理に先立て３０分間処理し、最終濃度０．２５、０．５、１ｍｇ／ｍｌとした。培養後、細胞をＭＴＴ溶液（１ｍｇ／ｍｌの最終濃度）で２時間処理した。可視細胞中の暗青色のホルマザンを  ＤＭＳＯに溶解し、５４０ｎｍの吸収をマイクロプレートリ−ダーによって測定した（ＦＬＵＯｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡ、ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ、ＧＥＲＭＡＮＹ）。
【０１００】
結果において、図４に示すように、６−ＯＨＤＡと組み合わせてｌｍｇ／ｍｌＨＹ６２２８で処理された群は、−ＯＨＤＡ単独群と比べて有意な細胞生存率の増加を示した［ｐ０．０ｌ］。
【０１０１】
要約するとＴｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．から抽出された本発明の粗抽出物は、細胞生存率６−ヒドロキシドパミンによって生じた細胞毒性を減少することによって、細胞生存率への改善作用を示すことが確認され、従って、それはパーキンソン病の治療に有効であり得る。
（実験的実施例４）
【０１０２】
経口投与したでんぷんおよび総食物繊維の心筋梗塞への作用（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
【０１０３】
本発明のでんぷんおよび総食物繊維の心筋梗塞への治療効果を参考実施例１において調製した実験ラットを用いて、僅かに修正した文献に記載の手順（Ｈａｉｓｏｎｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９７，ｐｐ８９２−８９９，１９９８）に従って、心筋梗塞誘発ラットモデルにおいて測定した。
【０１０４】
参考実施例１で調製したＳＤラットを１０ｍｇ／ｋｇケタミン（Ｙｕｈａｎ  Ｃｏｒｐ．，ＫＯＲＥＡ）および５ｍｇ／ｋｇキシラジン（Ｓｉｇｍ，ＵＳＡ）で麻酔し、気管内に挿管した。ラットを気管切開により呼吸装置に接続し、心臓を左開胸および心臓周囲切開により素早く露出した。左環動脈（ＬＡＤ）の上部をＬＡＤ下で５−０のプロレン糸を通して結紮し、ポリエチレンチューブ５０（ＰＥ５０）で固く締め、虚血にした。虚血の３０分後、固めたＰＥ５０を解除後再灌流を３時間続けた。虚血−再灌流後、ＰＥ５０を再度固く締め虚血を作り、ついで、１％Ｅｖａｎｓ青色染料溶液２ｍｌを静脈内注入し全身を循環させた。ついで、心臓を単離し、右心房および右心室を除去後、２−３ｍｍの厚みに切断した。ついで、断面を切断した組織の染色した（ＬＶ−ＡＡＲ）および染色していない領域（ＡＡＲ）を画像解析システムを用いて測定し（Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ  ４．２，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＵＳＡ）、危険領域  （ＡＡＲ／ＬＶ、％）を計算した。ついで組織を１％ＴＴＣ（２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を用いて３７°Ｃで１５分間染色し、１０％ホルマリン溶液で固定した。壊死した白い領域ＩＡ）および全左心室領域（ＬＶ）を測定して梗塞領域（ＩＡ／ＬＶ、％）を決定した。試験試料および対象群のＡＡＲに対するＩＡの比を試験効率と比較した。
【０１０５】
食品と混合した本発明のでんぷん、総食物繊維および  繊維のそれぞれの成分を経口投与し、梗塞領域の大きさを測定した。安全および最大の有効性を同時に有する適正な用量を決定するために、実験的実施例１で得られた結果から計算した最少用量を出発点として設定し、用量を倍増法、即ち、１００、２００および４００ｍｇ／ｋｇに増加した。
【０１０６】
虚血の誘導の３日前に、ＨＹ６２２８または本発明のでんぷんの４００ｍｇ／ｋｇ／日または発明の総食物繊維の１０ｍｇ／ｋｇ／日またはアラビノキシラン、ベータグルカン、アラビノースおよびキシロースなどのその成分の１０ｍｇ／ｋｇ／日を食品の２０ｇと共に自由に摂取させた。３時間の再灌流を行った心筋梗塞の誘発後、梗塞領域を測定し、ＩＡ（％ＡＡＲ）の値を計算し、ついで本発明のでんぷんおよび総食物繊維の有効性を相互に比較した。
【０１０７】
上の実験の結果、ＨＹ６２２８治療群（ｎ＝９）およびでんぷん治療群（ｎ＝８、ＳＷ）のＩＡ（％ＡＡＲ）は、それぞれ、４２．３および４０．６％であったが、対照群（ｎ＝５７）のそれは５１．８％であった。この結果は、梗塞領域の大きさがＨＹ６２２８治療群およびでんぷん治療群で、それぞれ１８．３および２１．６％（ｐ＜０．０５）だけ低下したことを示し、でんぷんが心筋梗塞の予防において粗抽出物と同じ高い有効性を有することを確認する（図５ａ参照）。更に、本発明の食物繊維処理群（ｎ＝９、ＴＤＦ）のＩＡ（％ＡＡＲ）は４０．２％であり、これは、対照群のそれと比べて梗塞領域の大きさが２２．４％（ｐ＜０．０５）だけ減少したことを示す。従って、食物繊維がまた、心筋梗塞の予防において粗抽出物と同じ高い有効性を有することが確認された（図５ｂ参照）。
【０１０８】
また、ベータグルカン治療群（ｎ＝１２、ｂ−ｇｌｕ１０）、アラビノキシラン治療群（ｎ＝６、ＡＸ１０）、アラビノース治療群（ｎ＝ｌｌ、ａｒａ１０）およびキシロース治療群（ｎ＝６、ｘｙｌ１０）のＩＡ（％ＡＡＲ）はそれぞれ、４３．８、４２．３、４３．４および４２．１％であり、一方対照群（ｎ＝２９）は５０．６％であった。結果は、梗塞領域の大きさが、ベータグルカン、アラビノキシラン、アラビノースおよびキシロースで治療された群に対してそれぞれ１３．４、１６．４、１４．２および１６．８％だけ減少したことを示し（ｐ＜０．０５）、総食物繊維の代表的な成分が、心筋梗塞の予防において粗抽出物と同じ高い有効性を有することを確認した（図５ｃ参照）。
（実験的実施例５）
【０１０９】
経口投与されたでんぷんおよび総食物繊維の脳梗塞への作用（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
【０１１０】
本発明のでんぷんおよび総食物繊維の脳梗塞の治療効果が、参考実施例１において調製された実験ラットを用いて、脳梗塞誘発ラットモデルにおいて、僅かに修正された文献に開示された手順（Ｈａｎ  ＨＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２２、ＰＰ３９２１−３９２８，２００２）に従って測定された。
【０１１１】
参考実施例１において調製されたＳＤラットがエンフルラン（ｅｎｆｌｕｒａｎｅ）（Ｃｈｏｏｎｇｗａｅ  Ｐｈａｒｍ．Ｃｏｒｐ．＜ＫＯＲＥＡ）を用いる吸入により麻酔された。ラットの頸部を切開し、頸動脈を露出し、頸動脈および外頸動脈を結紮した。ついで、３−０ナイロンを内頸動脈に挿入し、中大脳動脈（ＭＣＡ）を閉塞し、虚血を得た。実施例１で調製されたＨＹ６２２８４００ｍｇ／ｋｇ／日（０．５ｍｌ）および実施例２で調製された本発明のでんぷんおよび実施例２で調製された本発明の総食物繊維５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ（０．５ｍｌ）が、手術によって虚血が誘導される前７日から１日にそれに経口投与された。虚血２時間後、抜糸してＭＣＡ血流が回復した。再灌流２２時間後、脳梗塞ラット安楽死させ、脳をＴＴＣ溶液を用いて染色した。大脳半球の梗塞容積を画像解析システムを用いて測定した（Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ  ４．２，Ｂｉｏ−ｒａｄ，ＵＳＡ）。有効性を数式１に示したように計算した虚血指数（％）を用いて比較した。
【０１１２】
（数式  １）
虚血指数（％）＝Ａ／Ｂｘ１００
Ａ：大脳半球の梗塞容積（ｍｍ３）
Ｂ：大脳半球の容積（ｍｍ３）
【０１１３】
結果として、本発明のでんぷんで治療した群（ｎ＝６、ＳＷ）の虚血指数は７４．５％であり、一方対照群のそれは（ｎ＝１２、対照）９３％であった。
【０１１４】
結果は、梗塞領域の大きさが１９．７％（ｐ＜０．０５）だけ減少したことを示し、本発明のでんぷんが脳梗塞の予防に有効性を有することを確認した（図６参照）。
（実験的実施例６）
【０１１５】
経口投与されたでんぷんおよび総食物繊維の経口投与によるスコポラミンによって誘導された痴呆への作用（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
【０１１６】
本発明の粗抽出物、でんぷんおよび総食物繊維の記憶障害への治療効果が、僅かに修正された文献（Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．３７４，ｐｐ２２２−２２６，２００５）に引用された手順にしたがって、スコポラミンがアセチルコリン受容体に対して拮抗薬として作用するスコポラミン誘導痴呆動物モデルを用いて測定された。
【０１１７】
実施例において調製された本発明のでんぷんおよび総食物繊維が、試験群として参考実施例１において調製されたラットに１２日間連続して経口投与された。生理食塩水が陰性対照群として処理された。本発明のでんぷんおよび繊維の投与の８日目から、更に５日間ラットにスコポラミン０．５ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射を開始した。本発明のでんぷんおよび繊維の投与の同じ８日目から、毎日、水迷路テストも実施し、さらに５日間記憶の程度を測定した。
【０１１８】
水迷路テストは、約２２−２３°Ｃの水で充填された円形風呂（内寸法：直径１８０ｃｍ、深さ：５０ｃｍ）および水面下２ｃｍに沈んだ逃避プラットフォーム（直径：１０ｃｍ、高さ：２５ｃｍ）からなる水タンク中で行った。ラットの運動をビデオ追跡システム  （ＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎ，Ｎｏｌｄｕｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で自動的に記録した。
【０１１９】
試験において、「逃避潜時」は、ラットが沈んだプラットフォームを見つけ、逃避するために要する時間であり、測定された逃避潜時の内、ラットがプラットフォーム上に３０秒を超えて滞在する逃避潜時を有効として、カウントした。「平均逃避潜時」は、ラットあたり１日３回の試験の平均時間である。従って、水迷路テストの５日の期間にラットあたり１５の試験が行われた。平均逃避潜時が９０秒を超す場合に、９０秒の同じカット・オフ・タイムが設定された。
【０１２０】
痴呆の誘導の前に、実施例１において調製された本発明のＨＹ６２２８の２００ｍｇ／ｋｇおよび実施例４で調製された本発明のでんぷんおよび実施例２（試験群）で調製された本発明の総食物繊維の５０ｍｇ／ｋｇまたは食塩水（疑似群）が経口投与された。本発明のでんぷんおよび繊維の投与の８日目から、ラットへのスコポラミンの０．５ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射が開始され、水迷路テストも毎日実施され、いずれも更に５日間実施された。
【０１２１】
その結果、６日の訓練期間の内４日および５日目に陰性対照（ＳＣ、ｎ＝５）として使用されたスコポラミン単独治療群と比べて、本発明のでんぷんおよびスコポラミンで治療された試験群（ＳＣ＋ＳＷ、ｎ＝４）の平均逃避潜時の有意な減少が見られた（ｐ＜０．０５、図７ａ）。（ただし、試験群の平均逃避潜時は、疑似群（Ｎｏｒｍａｌ、ｎ＝３）のそれよりも少し長かった。）更に、５日の試験の内４日および５日目に陰性対照（ＳＣ、ｎ＝４）として使用されたスコポラミン単独治療群に比べて、ＴＤＦおよびスコポラミンで治療された試験群（ＳＣ＋ＴＤＦ、ｎ＝７）の平均逃避潜時の有意な減少が見られた（ｐ＜０．０５、図７ｂ）。従って、本発明のでんぷんおよび総食物繊維は、記憶障害を阻害することによって、痴呆を改善し得ることが確認された。
（実験的実施例７）
【０１２２】
経口投与された小麦由来でんぷんおよび総食物繊維の血管性痴呆への作用（ｉｎ  ｖｉｖｏ）。
【０１２３】
本発明のでんぷんおよび本発明の総食物繊維の血管性痴呆の治療効果が、僅かに修正された文献（ＣｈｏＫＯｅ  ｔａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，８３，ｐｐ２８５−２９１，２００６）に開示されている手順に従って、参考実施例１において調製された実験ラットを用いて、血管性痴呆誘発ラットモデルにおいて測定された。
【０１２４】
参考実施例１において調製されたＳＤラットが、エンフルラン（ｅｎｆｌｕｒａｎｅ）（Ｃｈｏｏｎｇｗａｅ  Ｐｈａｒｍ．Ｃｏｒｐ．、ＫＯＲＥＡ）を用いる吸入により麻酔された。２つの総頸動脈が手術によって曝露され、ＢＣＣＡＯ（両側総頸動脈閉塞）法を用いて糸で結び、４週間に亘って脳への血流速度を減らした。ついで、実験的実施例６に開示した水迷路テストを５日間実施した。
【０１２５】
２つの総頸動脈が結ばれた７日後、ラットにＨＹ６２２８（２００ｍｇ／ｋｇ）、本発明のでんぷん（ＳＷ、２００ｍｇ／ｋｇ）、ＴＤＦ（５０ｍｇ／ｋｇ）およびアラビノキシラン（５０ｍｇ／ｋｇ）の１週間の投与を開始し、それに対して平均逃避潜時を測定した。
【０１２６】
結果として、１日目にＨＹ６２２８（ＶＤ＋ＨＹ６２２８）で治療された群の平均逃避潜時は、陰性対照（ＶＤ）と類似していた。しかし、それは３日目に正常群（対照）のそれと類似し、これはＨＹ６２２８で治療した群が、陰性対照（ＶＤ）のそれよりもより急速に環境に慣れたことを示す（図８ａ参照）。
【０１２７】
更に、ＳＷ、ＴＤＦおよびアラビノキシランで治療した群は、平均逃避潜時（図８ｂおよび８ｃ参照）が低下し、これはこれらが血管性痴呆の治療に有効であることを確認する。
【０１２８】
（実験的実施例８）
【０１２９】
毒性試験          
【０１３０】
実施例２で調製した発明のでんぷん（ＳＷ）を用いて、Ｓｐａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（平均体重３２０±２０ｇ）での急性毒性試験を実施した。５匹のラットからなる２つの群にそれぞれ試験試料５００ｍｇ／ｋｇおよび５０００ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与および経口投与した。
【０１３１】
ラットを２４時間観察した時、死亡、臨床兆候、体重の変化および肉眼所見への治療に関連した作用はなかった。これらの結果は、本発明において調製された本発明のでんぷんが安全であることを示唆する。
【０１３２】
以下、製剤方法および賦形剤の種類を記載するが、本発明は、これらに限定されない。代表的な調製実施例は、以下に記載の通りである。
粉末の調製
【０１３３】
実施例のＴＤＦ２３００ｍｇ
ラクトース１００ｍｇ
タルク１０ｍｇ
粉末の調製は、上記成分を混合し、シールした包を充填して調製された。
錠剤の調製
【０１３４】
実施例のＳＷ３５０ｍｇ
コーンでんぷん１００ｍｇ
ラクトース１００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム２ｍｇ
錠剤の調製は、上記成分を混合し、錠剤化して調製された。
カプセルの調製
【０１３５】
実施例のＳＣ３５０ｍｇ
コーンでんぷん１００ｍｇ
ラクトース１００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム２ｍｇ
カプセルの調製は、上記成分を混合し、通常のゼラチンの調製方法によってゼラチンカプセルを充填して調製された。
注射剤の調製
【０１３６】
実施例のＳＲ３５０ｍｇ
注射剤用蒸留水の至適量
ｐＨ調整剤の至適量
注射剤の調製は、活性成分を溶解し、ｐＨを約７．５に調整しついですべての成分を２ｍｌのアンプルに充填し、通常の注射剤調製方法によって滅菌して調製された。
液体の調製
【０１３７】
実施例のＴＤＦ２１００ｍｇ
異性化糖１０ｇ
マニトール５ｇ
蒸留水の至適量
液体の調製は、活性成分を溶解し、すべての成分を充填し通常の液体の調製方法によって滅菌して調製された。
健康食品の調製
【０１３８】
実施例のＳＷ３１０００ｍｇ
ビタミン混合物の至適量
ビタミンＡ酢酸塩７０マイクログラム
ビタミンＥ  １．０ｍｇ
ビタミンＢｌ  ０．１３ｍｇ
ビタミンＢ２  ０．１５ｍｇ
ビタミンＢ６  ０．５ｍｇ
ビタミンＢ１２  ０．２マイクログラム
ビタミンＣ１０ｍｇ
ビオチン１０マイクログラム
ニコチン酸アミド１．７ｍｇ
葉酸５０マイクログラム
パントテン酸カルシウム０．５ｍｇ
ミネラル混合物至適量
硫酸鉄１．７５ｍｇ
酸化亜塩０．８２ｍｇ
炭酸マグネシウム２５．３ｍｇ
一カリウムリン酸塩１５ｍｇ
二カリウムリン酸塩５５ｍｇ
クエン酸カリウム９０ｍｇ
炭酸カルシウム１００ｍｇ
塩化マグネシウム２４．８ｍｇ
上述のビタミンおよびミネラル混合物は、多様に変化し得る。このような変化は本発明の精神と範囲を逸脱するものと見なされない。
健康飲料の調製
【０１３９】
実施例のＴＤＦ２１０００ｍｇ
クエン酸１０００ｍｇ
オリゴ糖１００ｇ
アプリコット濃縮物２ｇ
タウリン１ｇ
蒸留水９００ｍｌ
健康飲料の調製は、活性成分を溶解し、混合し、８５°Ｃで１時間攪拌し、ろ過し、ついですべての成分を１０００ｍｌのアンプルに充填し、通常の健康飲料調製方法によって滅菌し調製された。
【０１４０】
本発明は、このように記載されており、本発明が多様に変化することは明らかであろう。このような変化は、本発明の精神と範囲を逸脱するものと見なされず、当業者に明白であろうすべてのこのような修正が、次の請求項の範囲内に含まれることが意図されている。
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
（有利な作用）
本発明でんぷんまたは総食物繊維は、それぞれの細胞が虚血状態下で、またはベータ−アミロイドおよび６−ヒドロキシドパミンの存在下で培養された場合、細胞生存率を改善し、また心筋梗塞、脳梗塞および血管性痴呆を予防および治療し、または記憶障害を軽減したが、これらはすべてそれぞれの動物モデルとしてラットを用いて証明された。従って、本発明のでんぷんまたは総食物繊維は、虚血性疾患または脳変性疾患の予防および治療のための治療薬または健康食品として用いられ得る。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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