(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の肝腫瘍組織の肝細胞癌（ＨＣＣ）サブタイプを試験する方法であって：
前記被験者からの肝腫瘍組織の試料を、ｍｉｒ−２２１（配列番号２５）を含む１つ以上のバイオマーカーの発現について解析し；そして
前記１つ以上のバイオマーカーの発現が上方制御されているか下方制御されているかを決定する、
ことを含み、前記試料中のｍｉｒ−２２１発現が上方制御されている場合は胆管上皮様肝細胞癌（ＢＤＥ−ＨＣＣ）を示し、前記試料中のｍｉｒ−２２１発現が下方制御されている場合は成熟肝細胞様肝細胞癌（ＭＨ−ＨＣＣ）を示す、前記方法。
【請求項２】
前記試料を、マイクロアレイ技術、ＰＣＲ増幅、ＲＮＡハイブリダイゼーション、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ゲル電気泳動、およびそれらの組み合わせから成る群より選択される１つ以上の方法によって解析する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
少なくともｍｉｒ−２２１（配列番号２５）よって特定されるバイオマーカーを解析する場合に、バイオマーカーの発現を胆管上皮様肝細胞癌（ＢＤＥ−ＨＣＣ）の存在と関連付ける、請求項１記載の方法。
【請求項４】
少なくともｍｉｒ−２２１（配列番号２５）によって特定されるバイオマーカーを解析する場合に、バイオマーカーの発現を成熟肝細胞様肝細胞癌（ＭＨ−ＨＣＣ）の存在と関連付ける、請求項１記載の方法。
【請求項５】
生物学的試料中のＢＤＥ−ＨＣＣ細胞またはＭＨ−ＨＣＣ細胞を検出する方法であって：
肝腫瘍組織、肝正常組織、またはそれらの組み合わせを含む試料をアッセイして、ｍｉｒ−２２１（配列番号２５）を含む少なくとも１つのバイオマーカーの有無を検出し；そして
前記少なくとも１つのバイオマーカーの発現を前記試料中のＢＤＥ−ＨＣＣ細胞またはＭＨ−ＨＣＣ細胞の有無と関連付ける、
ことを含み、前記試料中のｍｉｒ−２２１が過剰発現している場合はＢＤＥ−ＨＣＣ細胞の存在を示し、前記試料中のｍｉｒ−２２１が発現不足である場合はＭＨ−ＨＣＣ細胞の存在を示す、前記方法。
【請求項６】
前記ＨＣＣ細胞の存在を前記試料中の肝細胞癌の存在と関連付けることをさらに含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記試料中の前記少なくとも１つのバイオマーカーの有無を、マイクロアレイ技術、ＰＣＲ増幅、ＲＮＡハイブリダイゼーション、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ゲル電気泳動、およびそれらの組み合わせから成る群より選択される１つ以上の技術によって解析する、請求項５記載の方法。
【請求項８】
関連付けが、前記被験者の予後の決定に役立つ、請求項６記載の方法。
【請求項９】
関連付けが、ＨＣＣを有する被験者の予後の判断基準となる、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
関連付けが、ＨＣＣサブタイプについての前記被験者の処置に役立つ、請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】
関連付けが、ＨＣＣサブタイプを有する被験者の処置の基準となる、請求項８または９記載の方法。
【請求項１２】
前記処置が、肝切除、移植、経皮的エタノール注射、高周波アブレーション、化学塞栓術、化学療法、遺伝子治療、β−カテニン阻害、およびそれらの組み合わせから成る群より選択される少なくとも１つの手順を含む、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１３】
前記処置が、β−カテニン阻害剤を被験者に投与することを含む、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１４】
ＨＣＣを有する被験者の肝腫瘍組織の生物学的試料中のＨＳＣ−ＨＣＣサブタイプを検出する方法であって：
ＥｐＣＡＭ＋ＡＦＰ＋幹細胞が前記試料中に存在するかどうかを検出することを含み、
ＥｐＣＡＭ＋ＡＦＰ＋幹細胞の存在は、前記試料中のＨＳＣ−ＨＣＣサブタイプの存在を示す、前記方法。
【請求項１５】
少なくともｍｉｒ−２２１バイオマーカーについて前記試料をアッセイすることをさらに含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記幹細胞を、免疫蛍光、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、免疫組織化学解析、凍結アクチベーター細胞選別、サイドポピュレーション解析、細胞表面マーカー検出法、およびそれらの組み合わせから成る群より選択される方法によって検出する、請求項１５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
肝細胞癌（ＨＣＣ）は、世界中の癌死の３番目に主要な原因である。ＨＣＣは、その臨床像ならびにゲノムおよびトランスクリプトームのパターンの点から見て非常に不均質である。ＨＣＣの不均質性ならびにその検出およびサブタイプ同定のための適当なバイオマーカーの欠如によって、患者の予後および処置の階層化が妨げられている。
【０００２】
したがって、哺乳動物においてＨＣＣサブタイプを同定することができる１つ以上のバイオマーカーだけでなく、ＨＣＣサブタイプに基づいて適当な処置を提供する方法も望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第５，４２７，９１６号明細書
【特許文献２】米国公開特許出願第２００２／０１７３４７８号明細書
【特許文献３】米国特許第７，１４８，３４２号明細書
【特許文献４】米国特許第５，８４９，９０２号明細書
【特許文献５】米国特許第４，９８７，０７１号明細書
【特許文献６】米国特許第４，２３５，８７１号明細書
【特許文献７】米国特許第４，５０１，７２８号明細書
【特許文献８】米国特許第４，８３７，０２８号明細書
【特許文献９】米国特許第５，０１９，３６９号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，０７５，１０９号明細書
【特許文献１１】米国特許第４，４５２，７７５号明細書
【特許文献１２】米国特許第４，６６７，０１４号明細書
【特許文献１３】米国特許第４，７４８，０３４号明細書
【特許文献１４】米国特許第５，２３９，６６０号明細書
【特許文献１５】米国特許第３，８３２，２５３号明細書
【特許文献１６】米国特許第３，８５４，４８０号明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｌｅｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９４（５５４３）：８６２−８６４（２００１）
【非特許文献２】Ｌａｕ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９４（５５４３）：８５８−８６２（２００１）
【非特許文献３】Ｌａｇｏｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９４（５５４３）：８５３−８５８（２００１）
【非特許文献４】Ｙｉ、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１７（２４）：３０１１−３０１６（２００３）
【非特許文献５】Ｇｒｅｇｏｒｙ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６５（９）：３５０９−３５１２（２００５）
【非特許文献６】Ｌｅｅ、ＥＭＢＯ  Ｊ．、２１（１７）：４６６３−４６７０（２００２）
【非特許文献７】Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９７（５５８９）：２０５６−２０６０（２００２）
【非特許文献８】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９
【非特許文献９】Ｒｉｇｂｙら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１１３：２３７−２５１（１９７７）
【非特許文献１０】Ｆｉｅｎｂｅｒｇ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３２：６−１３（１９８３）
【非特許文献１１】Ｗｉｎｔｅｒ、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．、２８５（１）：５０−５８（２００３）
【非特許文献１２】Ｌｅｅ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、４０（３）：６６７−６７６（２００４）
【非特許文献１３】Ｌｅｅ、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１２（４）：４１０−４１６（２００６）
【非特許文献１４】Ｒｙｄｅｒ、Ｇｕｔ．、５２：１−８（２００３）
【非特許文献１５】Ｓｔｅｉｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１：１００４（１９９３）
【非特許文献１６】Ｗｅｒｎｅｒ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２３：２０９２−９６（１９９５）
【非特許文献１７】Ｈａｍｍａｎｎ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．、９：２５−３１（１９９９）
【非特許文献１８】Ｓｚｏｋａ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．、９：４６７（１９８０）
【非特許文献１９】Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ
【非特許文献２０】Ｖａｒｏｔｔｉ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．、３１（７）：７６０−７６７（２００５）
【非特許文献２１】Ｈｕａｎｇら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ．、２０（５）：７６５−７７１（２００５）
【非特許文献２２】Ｂｕｄｈｕ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、１０（２）：９９−１１１（２００６）
【非特許文献２３】Ｙｅ、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、９（４）：４１６−４２３（２００３）
【非特許文献２４】Ｃａｌｉｎ、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３５３（１７）：１７９３−１８０２（２００５）
【非特許文献２５】Ｌｅｗｉｓ、Ｃｅｌｌ、１２０（１）：１５−２０（２００５）
【非特許文献２６】Ｌｌｏｖｅｔ、Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ．、１９（３）：３２９−３３８（１９９９）
【非特許文献２７】“Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｉｖｅｒ  Ｉｔａｌｉａｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ”、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２８（３）：７５１−７５５（１９９８）
【非特許文献２８】Ｏｋｕｄａ、Ｃａｎｃｅｒ、５６（４）：９１８−９２８（１９８５）
【非特許文献２９】Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ（ＡＪＣＣ）／Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ（ＵＩＣＣ）’ｓ  ＴＮＭ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｔｕｍｏｕｒｓ、第６版、Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  ２００２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、被験者のＨＣＣサブタイプを決定する方法であって、ａ）被験者から試料を得、ｂ）試料をアッセイして少なくとも1つのバイオマーカーを検出し、そしてｃ）検出されたバイオマーカーを被験者のＨＣＣサブタイプと関連付ける、ことを含む方法を提供する。この点に関して、バイオマーカーは、配列番号１〜３９によって特定されるバイオマーカーから成る群より選択される。
【０００６】
本発明は、試料中のＨＣＣ幹細胞を検出する方法も提供する。１つの態様において、本発明の方法は、ａ）試料を得、ｂ）試料をアッセイしてｍｉｒ−１８１バイオマーカーの存在を検出し、そしてｃ）ｍｉｒ−１８１バイオマーカーの有無を試料中のＨＣＣ幹細胞の有無と関連付ける、ことを含む。
【０００７】
本発明は、ＨＣＣ幹細胞と関連するバイオマーカーを利用する、ＨＣＣ被験者を処置するための方法および組成物も提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１−１】図１Ａは、マイクロＲＮＡ解析に基づく、ＨＳＣ−ＨＣＣ細胞における（腫瘍対非腫瘍組織の）ｌｏｇ（２）比でのｍｉｒ−１８１ａ１の発現を示す。図１Ｂは、マイクロＲＮＡ解析に基づく、ＨＳＣ−ＨＣＣ、ＤＢＥ−ＨＣＣ、ＨＰ−ＨＣＣ、およびＭＨ−ＨＣＣ細胞における（腫瘍対非腫瘍組織の）ｌｏｇ（２）比でのｍｉｒ−１８１ａ２の発現を示す。
【図１−２】図１Ｃは、マイクロＲＮＡ解析に基づく、ＨＳＣ−ＨＣＣ、ＤＢＥ−ＨＣＣ、ＨＰ−ＨＣＣ、およびＭＨ−ＨＣＣ細胞における（腫瘍対非腫瘍組織の）ｌｏｇ（２）比でのｍｉｒ−１８１ｂ１の発現を示す。図１Ｄは、マイクロＲＮＡ解析に基づく、ＨＳＣ−ＨＣＣ、ＤＢＥ−ＨＣＣ、ＨＰ−ＨＣＣ、およびＭＨ−ＨＣＣ細胞における（腫瘍対非腫瘍組織の）ｌｏｇ（２）比でのｍｉｒ−１８１ｂ２の発現を示す。
【図１−３】図１Ｅは、マイクロＲＮＡ解析に基づく、ＨＳＣ−ＨＣＣ、ＤＢＥ−ＨＣＣ、ＨＰ−ＨＣＣ、およびＭＨ−ＨＣＣ細胞における（腫瘍対非腫瘍組織の）ｌｏｇ（２）比でのｍｉｒ−１８１ｃの発現を示す。図１Ｆは、ＲＴ−ＰＣＲで決定される、ＨＳＣ−ＨＣＣ、ＤＢＥ−ＨＣＣ、ＨＰ−ＨＣＣ、およびＭＨ−ＨＣＣ細胞における（腫瘍対非腫瘍組織の）ｌｏｇ（２）比でのｍｉｒ−１８１ａの発現を示す。
【図１−４】図１Ｇは、ＲＴ−ＰＣＲで決定される、ＨＳＣ−ＨＣＣ、ＤＢＥ−ＨＣＣ、ＨＰ−ＨＣＣ、およびＭＨ−ＨＣＣ細胞における（腫瘍対非腫瘍組織の）ｌｏｇ（２）比でのｍｉｒ−１８１ｂの発現を示す。図１Ｈは、ＲＴ−ＰＣＲで決定される、ＨＳＣ−ＨＣＣ、ＤＢＥ−ＨＣＣ、ＨＰ−ＨＣＣ、およびＭＨ−ＨＣＣ細胞における（腫瘍対非腫瘍組織の）ｌｏｇ（２）比でのｍｉｒ−１８１ｃの発現を示す。
【図１−５】図１Ｉは、ＲＴ−ＰＣＲで決定される、ＨＳＣ−ＨＣＣ、ＤＢＥ−ＨＣＣ、ＨＰ−ＨＣＣ、およびＭＨ−ＨＣＣ細胞における（腫瘍対非腫瘍組織の）ｌｏｇ（２）比でのｍｉｒ−１８１ｄの発現を示す。図１Ｊは、ＲＴ−ＰＣＲで決定される、ＨＳＣ−ＨＣＣ、ＤＢＥ−ＨＣＣ、ＨＰ−ＨＣＣ、およびＭＨ−ＨＣＣ細胞における（腫瘍対非腫瘍組織の）ｌｏｇ（２）比でのｍｉｒ−２１３の発現を示す。
【図２−１】図２Ａは、ｍｉｒ−１８１ａ１の散布図を示す。図２Ｂは、ｍｉｒ−１８１ａ２の散布図を示す。
【図２−２】図２Ｃは、ｍｉｒ−１８１ｂ１の散布図を示す。図２Ｄは、ｍｉｒ−１８１ｂ２の散布図を示す。
【図２−３】図２Ｅは、ｍｉｒ−１８１ｃの散布図を示す。
【図３−１】図３Ａは、通常培養液と対比した、ＥＳＣ培地における０日目、２日目、および８日目でのｍｉｒ−１８１ａ、ｍｉｒ−１８１ｂ、ｍｉｒ−１８１ｃ、およびｍｉｒ−１８１ｄの産生倍数を示すグラフである。図３Ｂは、通常培養液と対比した、ＥＳＣ培地における０日目、２日目、および８日目でのＣＡＲおよびＵＧＴ２Ｂ７の倍数を示すグラフである。図３Ｃは、通常培養液と対比した、ＥＳＣ培地における０日目、２日目、および８日目でのＣＣＮＤ１およびＴＡＣＳＴＤ１の産生倍数を示すグラフである。
【図３−２】図３Ｄは、ＥＳＣ培地の除去後０日目、１日目、２日目、および８日目でのｍｉｒ−１８１ａ、ｍｉｒ−１８１ｂ、ｍｉｒ−１８１ｃ、およびｍｉｒ−１８１ｄの産生倍数を示すグラフである。図３Ｅは、ＥＳＣ培地の除去後０日目、１日目、２日目、および８日目でのＣＡＲおよびＵＧＴ２Ｂ７の産生倍数を示すグラフである。図３Ｆは、ＥＳＣ培地の除去後０日目、１日目、２日目、および８日目でのＣＣＮＤ１およびＴＡＣＳＴＤ１の産生倍数を示すグラフである。
【図４】図４は、ｐＭＳＣＶ−ｈＴＲおよびｐＭＳＣＶ−ｍｉｒ−１８１ｂ１で処理したＨｕＨ１細胞におけるｍｉｒ−１８１ｂの相対発現のグラフである。
【図５】図５は、対照と対比した、２’−Ｏ−メチルアンチセンスをトランスフェクトしたＨｕＨ７細胞におけるｍｉｒ−１８１の相対発現のグラフである。
【図６−１】図６Ａは、ｐＭＳＣＶ−ｈＴＲおよびｐＭＳＣＶ−ｍｉｒ−１８１ｂ１で処理したＨｕＨ１細胞におけるＣＣＮＤ１の相対発現のグラフである。図６Ｂは、ｐＭＳＣＶ−ｈＴＲおよびｐＭＳＣＶ−ｍｉｒ−１８１ｂ１で処理したＨｕＨ１細胞におけるＴＡＣＴＤ１の相対発現のグラフである。
【図６−２】図６Ｃは、ｐＭＳＣＶ−ｈＴＲおよびｐＭＳＣＶ−ｍｉｒ−１８１ｂ１で処理したＨｕＨ１細胞におけるＤＫＫ１の相対発現のグラフである。図６Ｄは、対照およびアンチセンスで処理したＨｕＨ７細胞におけるＣＣＮＤ１の相対発現のグラフである。
【図６−３】図６Ｅは、対照およびアンチセンスで処理したＨｕＨ７細胞におけるＴＡＣＳＴＤ１の相対発現のグラフである。図６Ｆは、対照およびアンチセンスで処理したＨｕＨ７細胞におけるＤＫＫ１の相対発現のグラフである。
【図７】図７Ａは、ＤＫＫ１の６１１〜６３２位の３’−ＵＴＲにおけるｍｉｒ−１８１ａ、ｍｉｒ−１８１ｂ、ｍｉｒ−１８１ｃ、およびｍｉｒ−１８１ｄの予測結合部位を示す。図７Ｂは、ＤＫＫ１の７７１〜７９９位の３’−ＵＴＲにおけるｍｉｒ−１８１ａ、ｍｉｒ−１８１ｂ、ｍｉｒ−１８１ｃ、およびｍｉｒ−１８１ｄの予測結合部位を示す。
【図８】図８Ａは、ｍｉｒ−１８１ａ１およびｍｉｒ−１８１ｂ１の予測ＴＣＦ−４結合部位である。図８Ｂは、ｍｉｒ−１８１ａ２およびｍｉｒ−１８１ｂ２の予測ＴＣＦ−４結合部位である。図８Ｃは、ｍｉｒ−１８１ｃおよびｍｉｒ−１８１ｄの予測ＴＣＦ−４結合部位である。図８Ｄは、ｍｉｒ−１８１ｃおよびｍｉｒ−１８１ｄの別の予測ＴＣＦ−４結合部位である。
【図９】図９は、初代肝細胞と対比した、各細胞株（Ｈｅｐ３ｂタイプＢ（ＨＳＣ−ＨＣＣ）、ＭＨＣＣ９７タイプＣ（ＨＰ−ＨＣＣ）、Ｓｍｍｃ７７２１タイプＤ（ＭＨ−ＨＣＣ））におけるｍｉｒ−１８１ａ、ｍｉｒ−１８１ｂ、ｍｉｒ−１８１ｃ、およびｍｉｒ−１８１ｄの倍数のグラフである。
【図１０】図１０は、ＨＳＣ−ＨＣＣ、ＢＤＥ−ＨＣＣ、ＨＰ−ＨＣＣ、およびＭＨ−ＨＣＣサブタイプにおいて発現が増加および減少したｍｉＲＮＡ数のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
発明の詳細な説明
マイクロＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡ）は多くの生物に存在し、主に３’非翻訳領域におけるｍＲＮＡの部分的相補部位と塩基対を形成することによってｍＲＮＡの翻訳および分解に重要な調節的役割を果たす小さい非コードＲＮＡ遺伝子産物（例えば〜２２ヌクレオチド）である（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。ｍｉＲＮＡは、細胞ヌクレアーゼであるＤｒｏｓｈａによってプロセッシングされる長い前駆体ＲＮＡとして発現され、その後、エクスポーチン−５依存的な機構によって細胞質に輸送される（非特許文献４、非特許文献５）。その後、ｍｉＲＮＡはＤＩＣＥＲ酵素によって切断され、ＲＮＡ誘導サイレンシング様複合体と関連するおよそ１７〜２４ヌクレオチドのｍｉＲＮＡを生ずる（非特許文献６、非特許文献７）。
【００１０】
本発明は、ｍｉＲＮＡバイオマーカーがＨＣＣサブタイプと関連するという知見に基づくものである。本発明上、ＨＣＣサブタイプとは、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）＋α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）＋である肝幹細胞様ＨＣＣ（ＨＳＣ−ＨＣＣ）；ＥｐＣＡＭ＋ＡＦＰ−である胆管上皮様ＨＣＣ（ＢＤＥ−ＨＣＣ）；ＥｐＣＡＭ−ＡＦＰ＋である肝細胞前駆細胞様ＨＣＣ（ＨＰ−ＨＣＣ）；およびＥｐＣＡＭ−ＡＦＰ−である成熟肝細胞様ＨＣＣ（ＭＨ−ＨＣＣ）を表す。本発明は、各々のＨＣＣサブタイプを同定するのに有用な１組のバイオマーカーを提供する。
【００１１】
１つの態様において、本発明は、被験者のＨＣＣサブタイプを決定する方法であって、ａ）被験者から試料を得、ｂ）試料を１つ以上のバイオマーカーの発現について解析し、そしてｃ）１つ以上のバイオマーカーの発現を被験者のＨＣＣサブタイプと関連付ける、ことを含む方法を提供する。バイオマーカーの発現は、正常対照と比べて減少していても増加していてもよい。バイオマーカーは配列番号１〜３９（表１参照）によって特定される。本発明の方法では、２個以上、５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、または３５個以上のバイオマーカーを解析することが好ましい。より好ましくは、３９個全てのバイオマーカーを解析する。ＨＳＣ−ＨＣＣサブタイプを決定するには、少なくとも配列番号１〜１９によって特定されるバイオマーカーを解析することが好ましい。ＢＤＥ−ＨＣＣサブタイプを決定するには、少なくとも配列番号２、９〜１７、および１９〜３５によって特定されるバイオマーカーを解析することが好ましい。ＨＰ−ＨＣＣサブタイプを決定するには、少なくとも配列番号１〜８、１１〜１３、１７〜１８、２３、２８〜２９、および３３〜３９によって特定されるバイオマーカーを解析することが好ましい。ＭＨ−ＨＣＣサブタイプを決定するには、少なくとも配列番号１、８〜１２、１４〜１７、および１９〜３９によって特定されるバイオマーカーを解析することが好ましい。
【００１２】
さらに、成熟肝細胞とは対照的に、ＨＣＣ幹細胞が、ｍｉｒ−１８１ファミリーのｍｉＲＮＡバイオマーカー、特にｍｉｒ−１８１ａ１、ｍｉｒ−１８１ａ２、ｍｉｒ−１８１ｂ１、ｍｉｒ−１８１ｂ２、およびｍｉｒ−１８１ｃと関連する（すなわち発現する）こと、ならびに試料中のＨＣＣ肝細胞の存在が、不良な予後と関連するＨＳＣ−ＨＣＣサブタイプを示すことが発見された。したがって、１つの態様において、本発明は、試料中のＨＣＣ肝細胞の存在を検出する方法であって、ａ）試料を得、ｂ）試料をアッセイしてｍｉｒ−１８１バイオマーカーの存在を検出し、そしてｃ）ｍｉｒ−１８１バイオマーカーの有無を試料中のＨＣＣ幹細胞の有無と関連付ける、ことを含む方法を提供する。例えば、代わりに、ＥｐＣＡＭ＋ＡＦＰ＋ＨＣＣ幹細胞を、任意の好適な方法、例えば免疫蛍光、免疫組織化学、凍結アクチベーター細胞選別、サイドポピュレーション法、細胞表面マーカー検出法、またはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって検出してもよい。例えばサイドポピュレーション技術において、細胞透過性ＤＮＡ結合色素ヘキスト３３３４２を目的細胞集団に取り込ませる；その後、幹細胞および初期前駆細胞は、ＡＴＰ結合カセットの膜ポンプ依存性機構を介してこの色素を排出し、細胞をフローサイトメトリーで解析すると低蛍光の「尾部」を生じさせる。１つの態様において、本方法は、試料中のＨＣＣ幹細胞の存在を試料中のＨＳＣ−ＨＣＣサブタイプの存在と関連付けることをさらに含む。有利なことに、試料中のＨＣＣ幹細胞の検出によって、被験者のＨＳＣ−ＨＣＣサブタイプのより早期の検出が可能となり、したがって処置の成功および生存のより大きな可能性をもたらし得る。
【００１３】
本明細書において、「バイオマーカー」という用語は、「ｍｉＲＮＡ」と互換的に用いられ、表１中の少なくとも３９個のバイオマーカーを含めたＨＣＣ関連バイオマーカーを表す。本発明の方法において、幾つか（すなわち、１個、２個、３個、４個、５個、７個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、もしくは３５個）または３９個全てのバイオマーカーを検出してもよい。好ましくは、少なくとも２個以上、より好ましくは少なくとも５個以上のバイオマーカーを検出する。ｍｉｒ−１８１バイオマーカーを検出する態様において、バイオマーカーは、好ましくは１つ以上のｍｉｒ−１８１ａ１、ｍｉｒ−１８１ａ２、ｍｉｒ−１８１ｂ１、ｍｉｒ−１８１ｂ２、およびｍｉｒ−１８１ｃであってもよい。この点に関して、幾つか（すなわち、１個、２個、３個、もしくは４個）または５個全てのｍｉｒ−１８１バイオマーカーを検出する。
【００１４】
試料中のバイオマーカーの存在および発現レベルを決定するための好適な技術は、当業者の技術的範囲内にある。１つのそのような方法に従い、核酸抽出緩衝剤の存在下で細胞をホモジナイズし、その後遠心分離することによって全細胞ＲＮＡを細胞から精製することができる。核酸を沈殿させ、ＤＮａｓｅ処理および沈殿によってＤＮＡを除去する。その後、標準技術に従ったアガロースゲル上のゲル電気泳動によってＲＮＡ分子を分離し、例えばいわゆる「ノーザン」ブロッティング技術によってニトロセルロースフィルターに転写する。その後、加熱によってＲＮＡをフィルター上に固定する。特異的ＲＮＡの検出および定量化を、問題のＲＮＡに相補的な、適切に標識されたＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いて遂行する。例えば、その開示全体が参照により援用される非特許文献８の第７章を参照されたい。
【００１５】
標識されたＤＮＡおよびＲＮＡプローブの調製方法、ならびに標的ヌクレオチド配列に対するそのハイブリダイゼーションの条件は、その開示が参照により本明細書に援用される非特許文献８の第１０章および第１１章に記載されている。例えば、核酸プローブを、３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ、１４Ｃ、もしくは３５Ｓなどの放射性核種、重金属、または標識リガンドに対する特異的結合対メンバーとして機能することができるリガンド（例えば、ビオチン、アビジン、もしくは抗体）、蛍光分子、化学発光分子、酵素などで標識することができる。
【００１６】
その開示全体が参照により本明細書に援用される非特許文献９のニックトランスレーション法または非特許文献１０のランダムプライミング法によって高比放射能になるようにプローブを標識することができる。後者は、ＲＮＡ鋳型から高比放射能の３２Ｐ標識プローブを合成するための方法であり得る。例えば、ニックトランスレーション法に従って既存のヌクレオチドを高放射能のヌクレオチドと交換することにより、１０８ｃｐｍ／μｇを優に超えた比放射能を有する３２Ｐ標識核酸プローブを調製することが可能である。その後、ハイブリダイズしたフィルターを写真用フィルムに感光させることによってハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィーによる検出を行なうことができる。ハイブリダイズしたフィルターで感光された写真用フィルムの濃度スキャンによって、バイオマーカーレベルを正確に測定する。別のアプローチを用いて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ４００−Ｂ  ２Ｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（アマシャム  バイオサイエンス、ニュージャージー州ピスカタウェイ）などのコンピュータ画像撮影システムによりバイオマーカーレベルを定量することができる。
【００１７】
ＤＮＡまたはＲＮＡプローブの放射性核種標識が現実的でない場合には、ランダムプライマー法を用いて、類似体、例えばｄＴＴＰ類似体である５−（Ｎ−（Ｎ−ビオチニル−ε−アミノカプロイル）−３−アミノアリル）デオキシウリジン三リン酸をプローブ分子に組み込むことができる。ビオチン化プローブオリゴヌクレオチドは、蛍光色素または呈色反応をもたらす酵素と共役したアビジン、ストレプトアビジン、および抗体（例えば抗ビオチン抗体）などのビオチン結合タンパク質との反応によって検出することができる。
【００１８】
ノーザンブロッティングおよびその他のＲＮＡブロッティングハイブリダイゼーション技術に加えて、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術を用いてＲＮＡの発現レベルを決定することができる。この技術は、ノーザンブロッティング技術よりも少ない細胞を必要とし、細胞全体を顕微鏡のカバースリップ上に置き、放射性標識または別の方法で標識された核酸（例えばｃＤＮＡもしくはＲＮＡ）プローブを含む溶液で細胞の核酸含量を精査することを含む。この技術は、被験者から採取した組織生検試料を解析するのに特に適している。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術の実施は、その開示全体が参照により本明細書に援用される特許文献１により詳細に記載されている。
【００１９】
試料中のｍｉ−ＲＮＡの相対数を、逆転写とそれに続くポリメラーゼ連鎖反応による逆転写物の増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）によって決定することもできる。ＲＮＡ転写物のレベルを、内部標準、例えば同一試料中に存在する標準遺伝子由来のｍＲＮＡレベルと比較して定量化することができる。内部標準として使用するのに好適な遺伝子には、例えばミオシンまたはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）が含まれる。定量的ＲＴ−ＰＣＲのための方法およびその変形は、当業者の技術的範囲内にある。
【００２０】
ある例において、試料中の複数の異なるバイオマーカー遺伝子の発現レベルを同時に決定することが望ましい場合がある。場合によっては、ＨＣＣと相関がある全ての公知バイオマーカー遺伝子の転写物の発現レベルを決定することが望ましい場合がある。何百個ものバイオマーカー遺伝子について癌特異的発現レベルを評価するのは時間がかかり、かつ大量の全ＲＮＡ（各々のノーザンブロット用に少なくとも２０μｇ）および放射性同位体を必要とするオートラジオグラフィー技術を必要とする。これらの限界を克服するために、１組のバイオマーカー遺伝子に特異的な１組のプローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロチップ形式のオリゴライブラリーを構築してもよい。例えば、オリゴライブラリーは、ヒトゲノム由来の全ての公知バイオマーカーに対応するプローブを含んでいてもよい。ｍｉＲＮＡが発見されたときに、追加のｍｉＲＮＡを含むようにマイクロチップオリゴライブラリーを拡大してもよい。
【００２１】
マイクロチップを、公知のｍｉＲＮＡから作製された遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブから調製する。例えばアレイは各々のｍｉＲＮＡに対する２つの異なるオリゴヌクレオチドプローブを含んでいてもよく、一方が活性配列を含み、他方がｍｉＲＮＡ前駆体に特異的である。また、アレイは、ハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件の対照として役割を果たすことができる、ほんの数塩基だけヒトの相同分子種とは異なる１つ以上のマウス配列のような対照を含んでいてもよい。また、両方の種由来のｔＲＮＡをマイクロチップ上にプリントし、特異的ハイブリダイゼーション用の比較的安定な内部陽性対照を提供してもよい。また、非特異的なハイブリダイゼーション用の１つ以上の適当な対照をマイクロチップ上に含めてもよい。この目的のために、任意の公知ｍｉＲＮＡといかなる相同性もないことに基づいて配列を選択する。
【００２２】
マイクロチップを、当技術分野において公知の技術によって製作してもよい。例えば、適当な長さ、例えば２０ヌクレオチドのプローブオリゴヌクレオチドをＣ６位で５’−アミン修飾し、好適で利用可能なマイクロアレイ系、例えばＧＥＮＥＭＡＣＨＩＮＥ  ＯｍｎｉＧｒｉｄ  １００  ＭｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒおよびアマシャムＣｏｄｅＬｉｎｋで活性化したスライドを用いてプリントする。標的ＲＮＡに対応する標識ｃＤＮＡオリゴマーを、標識プライマーを用いて標的ＲＮＡを逆転写することによって調製する。第１鎖の合成後、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを変性させてＲＮＡ鋳型を分解する。その後、このように調製された標識標的ｃＤＮＡを、例えば６×ＳＳＰＥ／３０％ホルムアミド中、２５℃で１８時間というハイブリダイゼーション条件下でマイクロアレイチップとハイブリダイズさせ、その後０．７５×ＴＮＴ中、３７℃で４０分間洗浄する。固定プローブＤＮＡが試料中の相補的な標的ｃＤＮＡを認識するアレイ上の位置で、ハイブリダイゼーションが生ずる。標識標的ｃＤＮＡは、結合が生じたアレイ上の正確な位置に印を付け、自動的な検出および定量を可能にする。アウトプットは、ハイブリダイゼーション事象の一覧表から成り、被験者試料中の特異的ｃＤＮＡ配列の相対的存在量、したがって対応する相補的バイオマーカーの相対的存在量を示す。ある例では、標識ｃＤＮＡオリゴマーは、ビオチン標識プライマーから調製されるビオチン標識ｃＤＮＡである。その後、マイクロアレイを、例えばストレプトアビジン−アレクサ６４７結合体を用いてビオチン含有転写物を直接検出することによって処理し、従来のスキャニング法を利用してスキャンする。アレイ上の各スポットの画像強度は、被験者試料中の対応するバイオマーカーの存在量に比例する。
【００２３】
アレイの使用は、ｍｉＲＮＡ発現検出にとって１つ以上の利点を有する。第１に、数百個の遺伝子の全体的な発現を同一試料中で１つの時点で同定することができる。第２に、オリゴヌクレオチドプローブの注意深い設計によって、成熟分子と前駆体分子の発現を同定することができる。第３に、ノーザンブロット解析と比較して、チップは少量のＲＮＡを必要とし、わずか２．５μｇの少ない全ＲＮＡを用いて再現性のある結果をもたらす。比較的限られた数のｍｉＲＮＡ（種当たり２〜３百個）は、各々に対して別個のオリゴヌクレオチドプローブを有する、幾つかの種に共通のマイクロアレイの構築を可能にする。そのようなツールは、様々な条件下で各々の公知バイオマーカーの種を超えた発現解析を可能にすると考えられる。
【００２４】
被験者は、ＨＣＣの徴候が現れているヒトまたは動物であってもよい。好ましくは、被験者はヒトである。また、被験者は、Ｂ型肝炎または肝硬変（アルコール性、原発性胆汁性肝硬変、遺伝性ヘモクロマトーシス、自己免疫性肝炎、原発性硬化性胆管炎など）であってもそうでなくともよい。ＨＣＣは、単発性腫瘍、多結節性腫瘍、および／または転移性病変であってもよい。
【００２５】
被験者から採取される試料は肝組織であってもよく、腫瘍組織でも正常組織でもよい。あるいは、試料は、被験者の血清または血漿、凍結生検組織、パラフィン包埋生検組織、およびその組み合わせから得たものであってもよい。
【００２６】
本発明はさらに、被験者が、ＨＳＣ−ＨＣＣ、ＢＤＥ−ＨＣＣ、ＨＰ−ＨＣＣ、またはＭＨ−ＨＣＣサブタイプを有するかどうかを決定することによって、被験者の予後を決定するための方法を提供する。本発明の予後診断法を、現行の予後診断法の代わりに利用してもよい。あるいは、本発明の方法を、従来の予後診断法と併せて利用してもよい。組み合わせたアプローチを利用する場合、従来の予後診断アプローチには、肝臓および胸部のスパイラルコンピュータ断層撮影（ＣＴ）、リピオドール注射によるコントラスト増強および血管造影を伴う磁気共鳴画像撮影（ＭＲＩ）、ならびに生体組織検査だけでなく、現行の病期分類システムも含まれる。
【００２７】
本方法はさらに、被験者におけるＨＣＣサブタイプに基づいて被験者のために考案し得る治療計画を提供する。この点に関して、本発明の方法は、処置の侵襲性を被験者のＨＣＣサブタイプに合わせ得るので、より個別化された医療へのアプローチを可能にする。
【００２８】
１つの態様において、本発明は、バイオマーカーとＨＣＣサブタイプとの関連性を利用する。したがって、本発明は、ＨＳＣ−ＨＣＣ、ＢＤＥ−ＨＣＣ、ＨＰ−ＨＣＣ、またはＭＨ−ＨＣＣと関連するバイオマーカーのうち少なくとも１つに相補的な核酸を含む試薬を含む治療的有効量の組成物を投与することを含む処置方法を提供する。
【００２９】
別の態様において、本発明は、被験者のＨＣＣサブタイプを決定し、任意で患者のＨＣＣサブタイプを予後と関連付けるために、ｍｉｒ−１８１バイオマーカーとＨＣＣ幹細胞との関連性を利用する。ｍｉｒ−１８１バイオマーカーは、ＥｐＣＡＭ陽性ＡＦＰ陽性である肝幹細胞様（ＨＳＣ）ＨＣＣサブタイプと関連する。ＥｐＣＡＭは、３つの細胞外ドメインおよび１つの細胞質ドメインを含む膜貫通タンパク質である。ＥｐＣＡＭの機能およびその発現の調節機構はほとんど知られていないが、細胞−細胞接着に関与すると考えられている（非特許文献１１）。ＥｐＣＡＭおよびＡＦＰは、成熟肝組織では発現していない。ＨＳＣ−ＨＣＣサブタイプは、典型的には、予後および生存転帰が不良である（非特許文献１２、非特許文献１３）。したがって、本発明は、検出されたＨＣＣがＨＳＣ−ＨＣＣサブタイプであるかどうかを決定する方法を提供する。ＨＣＣサブタイプの決定は、特にＥＰＣＡＭ＋ＡＦＰ＋ＨＣＣがＷｎｔ−β−カテニンシグナル伝達と関連するため、被験者に対する適当な処置を決定するのに特に有用である。Ｗｎｔ−β−カテニンシグナル伝達は、幹細胞の機能を維持するのに決定的に重要な意味を持ち、異常な活性化は、ＨＣＣを含めた多くのヒトの癌と関連している。ｍｉｒ−１８１は、おそらく、Ｗｎｔ−β−カテニン経路の阻害因子であるＤｉｃｋｋｏｐｈ−１（すなわちＤＫＫ１）およびｎｅｍｏ様キナーゼ（すなわちＮＬＫ）を介したＷｎｔ−β−カテニンシグナル伝達の活性化に寄与することができる。本発明は、ｍｉｒ−１８１とＨＣＣ幹細胞の調節上の関係を利用し、予後診断法、およびそれに基づく処置を提供する。
【００３０】
処置の選択肢には、従来処置だけでなく、本明細書に記載のｍｉＲＮＡを特異的に標的とする遺伝子治療アプローチも含まれる。ＨＣＣの従来処置には、例えば、経皮的エタノール注射（ＰＥＩ）、高周波アブレーション、化学塞栓術、および化学療法が含まれる。処置は被験者の状態に基づいて決定され、指針は当技術分野において公知である（例えば、非特許文献１４参照）。
【００３１】
本発明はさらに、本発明の処置方法に使用するための医薬組成物を提供する。この点に関して、本発明は、配列番号１〜３９によって特定されるバイオマーカーより選択されるバイオマーカーのうち少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個に相補的な１つ以上の核酸、および薬学的に許容される担体を含む治療的有効量の試薬を含む組成物を提供する。あるいは、試薬は、少なくとも５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、または３５個以上のバイオマーカーに相補的な核酸を含んでいてもよい。試薬は、核酸のみを含んでいてもよく、または組換えプラスミド、ウイルスベクター、リポソームなどのような送達試薬と組み合わせた核酸を含んでいてもよい。好ましくは、ＨＳＣ−ＨＣＣの処置には、組成物は配列番号１〜１９によって特定されるバイオマーカーに相補的な核酸を含み、さらにより好ましくは、組成物はｍｉｒ−１８１ａ１、ｍｉｒ−１８１ａ２、ｍｉｒ−１８１ｂ１、ｍｉｒ−１８１ｂ２、およびｍｉｒ−１８１ｃに相補的な核酸ならびに薬学的に許容される担体を含む。好ましくは、ＢＤＥ−ＨＣＣの処置には、組成物は配列番号２、９〜１７、および１９〜３５によって特定される少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個のバイオマーカーに相補的な核酸ならびに薬学的に許容される担体を含む。好ましくは、ＨＰ−ＨＣＣの処置には、組成物は配列番号１〜８、１１〜１３、１７〜１８、２３、２８、２９、および３３〜３９によって特定される少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個のバイオマーカーに相補的な核酸ならびに薬学的に許容される担体を含む。好ましくは、ＭＨ−ＨＣＣの処置には、組成物は配列番号１、８〜１２、１４〜１７、および１９〜３９によって特定される少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個のバイオマーカーに相補的な核酸ならびに薬学的に許容される担体を含む。組成物は、バイオマーカーに結合し、および／またはバイオマーカーを無効（すなわち阻害）にしてもよく、あるいは、バイオマーカーをコードする遺伝子の発現を変化させ、それにより、産生されるバイオマーカーの量もしくはレベルを変化させてもよく、そのための技術は当技術分野において周知である。
【００３２】
本処置方法の実施において、バイオマーカーのうち少なくとも１つを阻害する有効量の少なくとも１つの組成物を被験者に投与することもできる。本明細書において、「阻害する」とは、処置後の癌細胞におけるバイオマーカーレベルおよび／または対応する遺伝子由来のバイオマーカー遺伝子産物の産生が、処理前の産生量よりも少ないことを意味する。別の態様において、1つ以上のバイオマーカーの発現を増加させる組成物を投与してもよい。当業者は、バイオマーカーレベルまたは遺伝子発現が癌細胞で阻害されているか増加しているかを、例えば上で考察したバイオマーカー転写物のレベルを決定するための技術を用いて、容易に決定することができる。
【００３３】
本明細書において、バイオマーカーまたはバイオマーカー遺伝子発現を阻害する組成物の「有効量」とは、ＨＣＣ被験者における癌細胞の増殖を阻害するのに十分な量である。当業者は、被験者の大きさおよび体重；疾患の進入範囲；被験者の年齢、健康状態、および性別；投与経路；ならびに投与が局部的であるか全身性であるかなどの要因を考慮することによって、所定の被験者に投与されるべき阻害性組成物の有効量を容易に決定することができる。
【００３４】
例えば、発現を変化させる組成物の有効量は、処置されるべき腫瘍塊のおおよその重さに基づくことができる。腫瘍塊のおおよその重さは、塊のおおよその体積を計算することによって決定することができ、ここで１ｃｍ３の体積は１ｇとほぼ同等である。それ故に、１つの態様において、腫瘍塊の重さに基づく有効量を利用することができる。あるいは、組成物の有効量は、処置されるべき被験者のおおよその体重または推定体重に基づくことができる。好ましくは、そのような有効量は非経口的にまたは経腸的に投与される。
【００３５】
当業者は、バイオマーカーレベルまたは遺伝子発現を変化させる組成物を所定の被験者に投与するための適当な投薬計画を容易に決定することもできる。例えば、組成物を被験者に（例えば単回注射または単回投入として）単回投与することができる。あるいは、組成物を、約３日〜約２８日、より好ましくは約７日〜約１０日の期間、被験者に１日に１回または２回投与することができる。あるいは、組成物を、１日に１回７日間投与してもよい。投薬計画が複数回投与を含む場合、被験者に投与される組成物の有効量は、投薬計画全体を通して投与される組成物の総量を含み得ることが理解される。
【００３６】
バイオマーカー遺伝子発現を阻害するための好適な組成物には、２本鎖ＲＮＡ（短いまたは小さい干渉ＲＮＡつまり「ｓｉＲＮＡ」など）、アンチセンス核酸、およびリボザイムなどのＲＮＡ酵素分子が含まれる。これらの組成物の各々を、所定のバイオマーカー遺伝子産物に標的化し、標的バイオマーカー遺伝子産物を破壊するかまたは破壊を誘導することができる。
【００３７】
例えば、バイオマーカー遺伝子産物の少なくとも一部と少なくとも９０％、例えば９５％、９８％、９９％、または１００％の配列相同性を有する単離された２本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）分子を用いてバイオマーカー遺伝子のＲＮＡ干渉を誘導することによって、所定のバイオマーカー遺伝子の発現を阻害することができる。好ましい態様において、ｄｓＲＮＡ分子は、「短いまたは小さい干渉ＲＮＡ」つまり「ｓｉＲＮＡ」である。
【００３８】
本方法に有用なｓｉＲＮＡは、長さ約１７ヌクレオチド〜約２９ヌクレオチド、好ましくは長さ約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドの短い２本鎖ＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡは、標準的なワトソン−クリック型の塩基対形成相互作用によって一緒にアニーリングした（以下「塩基対を形成した」）センスＲＮＡ鎖および相補的アンチセンスＲＮＡ鎖を含む。センス鎖は、標的バイオマーカー遺伝子産物内に含まれる核酸配列と実質的に同一の核酸配列を含む。
【００３９】
本明細書において、ｓｉＲＮＡは、標的核酸配列内に含まれる標的配列と「実質的に同一」であり、標的配列と同一であるか、または標的配列と１もしくは２ヌクレオチド異なる核酸配列である。ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、２つの相補的な１本鎖ＲＮＡ分子を含むことができ、または２つの相補的部分が塩基対を形成し、１本鎖の「ヘアピン」領域によって共有結合的に結合している単一分子を含むことができる。
【００４０】
ｓｉＲＮＡは、１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換、および／または改変によって天然のＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡでもあり得る。そのような改変には、ｓｉＲＮＡの末端もしくはｓｉＲＮＡの１つ以上の内側のヌクレオチドなどへの、非ヌクレオチド物質の付加、またはｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ消化耐性にする修飾、またはｓｉＲＮＡ中の１つ以上のヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドとの置換を含むことができる。
【００４１】
ｓｉＲＮＡの一方または両方の鎖は、３’突出を含むこともできる。本明細書において、「３’突出」とは、２重ＲＮＡ鎖の３’末端から伸びた、少なくとも１つの対を形成しないヌクレオチドを表す。したがって、１つの態様において、ｓｉＲＮＡは、長さ１〜約６ヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む）、好ましくは長さ１〜約５ヌクレオチド、より好ましくは長さ１〜約４ヌクレオチド、特に好ましくは長さ約２〜約４ヌクレオチドの少なくとも１つの３’突出を含む。好ましい態様において、３’突出は、ｓｉＲＮＡの両方の鎖に存在し、長さ２ヌクレオチドである。例えば、ｓｉＲＮＡの各々の鎖は、ジチミジル酸（「ＴＴ」）またはジウリジル酸（「ＵＵ」）の３’突出を含むことができる。
【００４２】
ｓｉＲＮＡは化学的もしくは生物学的に産生することができ、または単離されたバイオマーカー遺伝子産物用の組換えプラスミドもしくはウイルスベクターから発現させることができる。ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子を産生および試験するための例示的方法は、その開示全体が参照により本明細書に援用される特許文献２および特許文献３に記載されている。
【００４３】
所定のバイオマーカー遺伝子の発現を、アンチセンス核酸によって阻害することもできる。本明細書において、「アンチセンス核酸」とは、標的ＲＮＡの活性を変化させるＲＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ペプチド核酸の相互作用によって標的ＲＮＡに結合する核酸分子を表す。本方法で使用するのに好適なアンチセンス核酸は、バイオマーカー遺伝子産物中の連続した核酸配列と相補的な核酸配列を通常含む１本鎖核酸（例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ、ＰＮＡ）である。好ましくは、アンチセンス核酸は、バイオマーカー遺伝子産物中の連続した核酸配列と５０〜１００％相補的であり、より好ましくは７５〜１００％相補的であり、最も好ましくは９５〜１００％相補的である核酸配列を含む。
【００４４】
アンチセンス核酸は、標的特異性、ヌクレアーゼ耐性、送達または分子の有効性に関するその他の特性を向上させるために、核酸骨格かまたは糖および塩基部分（もしくはそれらの等価物）に修飾を含むこともできる。そのような修飾には、コレステロール部分、アクリジンなどの２重鎖挿入剤、または１つ以上のヌクレアーゼ耐性基の含有が含まれる。
【００４５】
アンチセンス核酸を、化学的もしくは生物学的に産生することができ、または単離されたバイオマーカー遺伝子産物用の上記のような組換えプラスミドもしくはウイルスベクターから発現させることができる。産生および試験のための例示的方法は、当業者の技術的範囲内にある。例えば、その開示全体が参照により本明細書に援用される非特許文献１５およびＷｏｏｌｆらに対する特許文献４を参照されたい。
【００４６】
所定のバイオマーカー遺伝子の発現を核酸酵素によって阻害することもできる。本明細書において、「核酸酵素」とは、バイオマーカー遺伝子産物の連続した核酸配列に相補的な基質結合領域を含み、バイオマーカー遺伝子産物を特異的に切断することができる核酸を表す。好ましくは、核酸酵素の基質結合領域は、バイオマーカー遺伝子産物中の連続した核酸配列と５０〜１００％相補的であり、より好ましくは７５〜１００％相補的であり、最も好ましくは９５〜１００％相補的である。核酸酵素は、塩基、糖、および／またはリン酸基に修飾を含むこともできる。本方法で使用するための例示的核酸酵素はリボザイムである。
【００４７】
核酸酵素を、化学的もしくは生物学的に産生することができ、または単離されたバイオマーカー遺伝子産物用の上記のような組換えプラスミドもしくはウイルスベクターから発現させることができる。ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子を産生および試験するための例示的方法は、その開示全体が参照により本明細書に援用される非特許文献１６、非特許文献１７、および特許文献５に記載されている。
【００４８】
少なくとも１つのバイオマーカーまたはバイオマーカー遺伝子の発現を阻害するための少なくとも１つの組成物の投与は、ＨＣＣ被験者の癌細胞の増殖を阻害すると考えられる。本明細書において、「癌細胞の増殖を阻害する」とは、細胞を死滅させるか、あるいは細胞の成長を永久的にもしくは一時的に停止または遅らせることを意味する。本発明の組成物を投与後、被験者のそのような細胞の数が一定または減少している場合、癌細胞増殖の阻害を推察することができる。そのような細胞の絶対数は増加しているが、腫瘍増殖速度が減少している場合にも、癌細胞増殖の阻害を推察することができる。
【００４９】
被験者の体内の癌細胞数を、直接的な測定で、または原発性もしくは転移性の腫瘍塊の大きさからの推定することよって決定することができる。例えば、被験者の癌細胞数を、免疫組織学的方法、フローサイトメトリー、または癌細胞の特徴的表面マーカーを検出するよう設計されたその他の技術によって測定することができる。
【００５０】
腫瘍塊の大きさを、直接的な目視観察で、またはＸ線、磁気共鳴画像、超音波、およびシンチグラフィーなどの画像診断法によって確認することができる。腫瘍塊の大きさを確認するために用いられる画像診断法を、当技術分野において公知のように、造影剤の有無により利用することができる。腫瘍塊の大きさを、組織塊の触診またはキャリパーなどの測定器具を用いた組織塊の測定のような物理的手段によって確認することもできる。
【００５１】
本発明の組成物を、これらの組成物を被験者の癌細胞に送達するのに好適な任意の方法によって被験者に投与することができる。例えば、これらの組成物で被験者の細胞をトランスフェクトするのに好適な方法によって組成物を投与することができる。好ましくは、少なくとも１つのバイオマーカー遺伝子産物もしくはバイオマーカー遺伝子の発現を阻害する組成物をコードする配列を含むプラスミドまたはウイルスベクターで細胞をトランスフェクトする。
【００５２】
真核細胞用のトランスフェクション法は当技術分野において周知であり、例えば細胞の核または前核への核酸の直接注入；エレクトロポレーション；リポソーム移入または親油性物質に介在される移入；受容体が介在する核酸送達；生体弾によるもの（ｂｉｏｂａｌｌｉｓｔｉｃ）または粒子加速；リン酸カルシウム沈殿法；およびウイルスベクターに介在されるトランスフェクションが含まれる。
【００５３】
例えば、リポソーム性移入組成物、例えばＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−メチル硫酸アンモニウム；ベーリンガー・マンハイム）またはリポフェクチンなどの同等物で細胞をトランスフェクトすることができる。使用される核酸の量は本発明の実施に決定的に重要な意味を持つわけではないが；０．１〜１００μｇの核酸／１０５細胞で許容可能な結果を達成し得る。例えば、１０５細胞当たり、３μｇのＤＯＴＡＰ中に約０．５μｇのプラスミドベクターの比率を用いることができる。
【００５４】
任意の好適な経腸的または非経口的投与経路によって組成物を被験者に投与することもできる。本方法のための好適な経腸投与経路には、例えば経口、経直腸、または鼻腔内送達が含まれる。好適な非経口投与経路には、例えば血管内投与（例えば静脈内ボーラス注射、静脈内注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入、および血管内へのカテーテルによる点滴）；組織周辺および組織内への注射（例えば腫瘍周辺および腫瘍内への注射、網膜内注射、または網膜下注射）；（浸透圧ポンプによるような）皮下注入を含めた皮下注射または皮下投入；例えばカテーテルまたはその他の留置装置（例えば網膜ペレットまたは坐薬または多孔質、非多孔質もしくはゼラチン質の材料を含むインプラント）による目的組織への直接適用；ならびに吸入が含まれる。好ましい投与経路は、注射、注入、および腫瘍への直接注射である。
【００５５】
本方法において、送達試薬と組み合わせた裸のＲＮＡとして、またはバイオマーカー遺伝子産物もしくはバイオマーカー遺伝子発現を阻害する組成物を発現する配列を含む核酸（例えば組換えプラスミドもしくはウイルスベクター）として、被験者に組成物を投与することができる。好適な送達試薬には、例えばＭｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ親油性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン（例えばポリリジン）、およびリポソームが含まれる。
【００５６】
バイオマーカーまたはバイオマーカー遺伝子発現を阻害する組成物を発現する配列を含む組換えプラスミドおよびウイルスベクター、ならびにそのようなプラスミドおよびベクターを癌細胞へ送達するための技術は、上述されている。
【００５７】
好ましい態様において、リポソームを用いて、バイオマーカーまたはバイオマーカー遺伝子発現を阻害する組成物（もしくはそれらをコードする配列を含む核酸）を被験者に送達する。リポソームは、遺伝子産物または核酸の血中半減期を増加させることもできる。
【００５８】
本発明で使用するのに好適なリポソームは標準的な小胞形成脂質から形成することができ、これらには通常、中性または負に荷電したリン脂質およびコレステロールなどのステロールが含まれる。脂質の選択は、所望のリポソームの大きさおよびリポソームの血中半減期などの要因を考慮することによって通常導き出される。例えばその開示全体が参照により本明細書に援用される非特許文献１８、ならびに特許文献６、特許文献７、特許文献８、および特許文献９に記載されるように、リポソームを調製するための様々な方法が公知である。
【００５９】
本方法で使用するためのリポソームは、リポソームを癌細胞へ標的化するリガンド分子を含むことができる。腫瘍細胞抗原に結合するモノクローナル抗体などの、癌細胞に広く見られる受容体に結合するリガンドが好ましい。
【００６０】
本発明の組成物は薬学的に許容される担体を含んでいてもよい。「薬学的に許容される担体」という用語は、本明細書において、ヒトまたは獣医学的な患者への投与に好適な１つ以上の適合性の固体または液体の充填剤、希釈剤、その他の賦形剤、または封入物質を意味する。「担体」という用語は、天然または合成の有機成分または無機成分を意味し、それと活性成分を組み合わせて適用を容易にする。医薬組成物の構成要素は、所望の医薬的有効性を実質的に損なわないような方法で、本発明の分子とおよび構成要素同士混合可能である。「薬学的に許容される」物質は、吐き気、めまい、発疹、または胃のむかつきなどの望ましくない生理的効果を生ずることなく患者へ投与可能である。例えば、治療目的でヒト患者に投与する場合、薬学的に許容される賦形剤を含む治療用組成物は免疫原性でないことが望ましい。
【００６１】
医薬組成物は、塩中の酢酸；塩中のクエン酸；塩中のホウ酸；および塩中のリン酸を含めた好適な緩衝剤を含んでいてもよい。また、医薬組成物は、任意で、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン、およびチメロザールなどの好適な防腐剤を含んでいてもよい。
【００６２】
医薬組成物を単位投薬形態で好都合に提供してもよく、薬学の技術分野で周知の任意の方法で調製してもよい。全ての方法には、１つ以上の補助成分を構成する担体と活性剤とを結びつける工程が含まれる。一般に、組成物は、液体担体、微細固体担体、またはその両方と活性組成物とを均一にかつ密接に結びつけ、その後必要であれば、産物を成形することによって調製される。
【００６３】
非経口投与に好適な組成物は本発明の組成物の滅菌水性調製物を好都合に含み、これはレシピエントの血液と等張であることが好ましい。この水性調製物を、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いる公知の方法に従って製剤化してもよい。また、滅菌注射用調製物は、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液のような、非毒性で非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液でもよい。利用可能である許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー溶液、および等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに、溶媒または懸濁媒体として滅菌固定油を慣用的に利用する。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含めた任意の無刺激性固定油を利用してもよい。さらに、オレイン酸などの脂肪酸を注射用調製物に用いてもよい。経口、皮下、静脈内、筋肉内などへの投与に好適な担体製剤は、その全体が参照により本明細書に援用される非特許文献１９に見出すことができる。
【００６４】
本発明の組成物の送達が、処置されるべき部位の感作を引き起こす前に十分な時間をもって起こるように、本発明の送達系を、時間放出送達系、遅延放出送達系、または持続放出送達系を含むように設計する。本発明の方法を、その他の治療薬剤または療法と併せて用いてもよい。そのような系は本発明の組成物の反復投与を避け、被験者および医師に便宜を増すことができ、本発明のある種の組成物に特に好適である場合がある。
【００６５】
多種の放出送達系が利用可能であり、当業者に公知である。それらには、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサラート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、およびポリ無水物などのポリマー基剤系が含まれる。薬物を含む上述のポリマーのマイクロカプセルは、例えば特許文献１０に記載されている。送達系には：コレステロール、コレステロールエステル、および脂肪酸などのステロール、またはモノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリドなどの中性脂肪を含む脂質；ヒドロゲル放出系；シラスティック（ｓｙｌａｓｔｉｃ）系；ペプチドに基づく系；ワックス被覆；従来の結合剤および賦形剤を用いた圧縮錠剤；部分的融合インプラント、などの非ポリマー系も含まれる。具体的な例として、（ａ）特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３、および特許文献１４に記載のようなマトリックス内の形態に活性組成物が含まれる侵食系；ならびに（ｂ）特許文献１５および特許文献１６に記載のようなポリマーから活性構成要素が制御された速度で浸透する分散系が含まれるが、これらに限定されない。さらに、ポンプに基づくハードウェア送達系を用いることができ、そのうちの幾つかはインプランテーションに適している。
【００６６】
本発明はさらに、一連の処置後に被験者の肝臓に残存するＨＣＣ幹細胞があるかどうかを決定することによって、被験者のＨＣＣの処置の有効性を評価する方法を提供する。この点に関して、試料を被験者から採取し、アッセイしてｍｉｒ−１８１バイオマーカーの有無を検出する。その後、ｍｉｒ−１８１バイオマーカーの有無を、被験者のＥｐＣＡＭ＋ＡＦＰ＋ＨＣＣの有無とそれぞれ関連付ける。この情報を用いて、被験者のＨＣＣの処置が効果的であったかどうかを決定する。
【００６７】
以下の実施例は本発明をさらに例説するが、当然ながら、決してその範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００６８】
以下の技術を下記実施例に利用した。
臨床標本
肝組織は、２００２年〜２００３年の間に肝臓ガン研究所および中山病院（復旦大学、上海、中国）で根治的切除を受けた被験者からインフォームドコンセントを行なった上で得られた。研究は、肝臓ガン研究所および国立衛生研究所の施設内倫理委員会により承認された。試料登録基準には、ＨＢＶ感染またはＨＢＶ関連肝硬変の既往歴、２人の独立した病理学者によって診断されたＨＣＣ、臨床像および病理学的特徴に関する詳細情報だけでなく、肝内再発、肝内静脈転移、リンパ節転移、肝外転移、無疾患、全生存、および死因を含めた少なくとも３年間の詳細な経過観察データを含む基準が含まれた。最新のＴＮＭ分類は、切除を受けたＨＣＣ被験者に関してＣＬＩＰおよびＯＫＵＤＡを含めたその他の病期診断システムよりも優れており、それ故に、ｍｉＲＮＡ予測能の解析用に初期の被験者（ＴＭＮ病期ＩおよびＩＩ）を階層化するために選ばれた（非特許文献２０、非特許文献２１）。前向き研究により、２００２年に更新された新しいＴＮＭ分類システムよりもＢＣＬＣシステムが優れていることが明らかとなり、それ故に、ＢＣＬＣによって類別された初期の被験者（病期０およびＡ）に基づくＣｏｘ比例ハザードモデリングも行なった。２４４人の中国人ＨＣＣ被験者由来の原発性ＨＣＣおよび対応する非癌肝組織で遺伝子発現プロファイルを実施した。それらの中で、９３％が肝硬変を基礎疾患に有し、６８％の血清α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）レベルが＞２０ｎｇ／ｍＬであった。合計１３４例の明確に定義された症例を練習群として用いた。それらの中で、３０例が、門脈の主要分岐（ｎ＝２５）、下大静脈（ｎ＝２）、または総胆管（ｎ＝４；１例は下大静脈中に腫瘍血栓も有する）に見られる腫瘍塞栓を伴う原発性ＨＣＣ病変を有しており、１０４例が、経過観察（３年）で見出される転移／再発が全くない単発性ＨＣＣを有していた。検証解析では、切除の時点で幾つかのＨＣＣ病期診断法により予後を正確に決定することができなかった１１０例の独立した症例の試験群を用いた。試験症例には、４３例の多結節性ＨＣＣおよび６７例の単発性ＨＣＣが含まれていた。４３例の多結節性ＨＣＣ症例のうち、１８例は肝内再発を発症し、１例は肝内再発に加えて肝外転移を発症した。６７例の単発性ＨＣＣ症例のうち、４例の被験者が凝集結節の出現を伴う単発性腫瘍を有し、１０例の被験者が肝内転移および／または肝外転移を発症した一方で、４９例の被験者は経過観察（３年）で確認される肝内再発を発症した。さらに、無疾患被験者から得た８つの正常肝組織（非特許文献２２に記載されている）を正常対照として含めた。
【００６９】
ＲＮＡの単離およびｍｉＲＮＡアレイ
ＲＮＡの単離およびｍｉＲＮＡアレイの方法論を、非特許文献２３および非特許文献２４に記載されたように実施した。２４４例のＨＣＣ症例の解析において、腫瘍組織または非腫瘍組織から対になるようにＲＮＡを単離し、群分けによる偏りを避けるために、ｍｉＲＮＡ解析用にランダムな順序で試料を選択した。合計４８８個のマイクロアレイを行なった。マイクロアレイプラットフォーム（Ｖ２．０）は、２５０個の非重複ヒトｍｉＲＮＡおよび２００個のマウスｍｉＲＮＡから構成された。ｍｉＲＮＡマイクロアレイプラットフォームの頑健性を検討するために、ｍｉＲＮＡを解析し、発現が２４４個の組織とそれらの対になる周辺非癌肝組織とを区別することができるかどうかを明らかにした。単変量の対応のあるｔ−検定を伴う教師あり分類比較法および１０００回のクラス標識の置換を伴う多変量検定を、≦１に設定した誤り発見率と９９％の信頼度で用いて、ＨＣＣ腫瘍組織（Ｔ）とそれらの対になる非腫瘍組織（ＮＴ）とを有意に見分けることができる２０９個の非重複ｍｉＲＮＡを同定した。これらの有意なｍｉＲＮＡは、Ｔ試料およびＮＴ試料を明瞭に分け、階層的クラスタリング解析で例証された。１０％の相互検証および１００回のランダム置換を伴う多変量のクラス予測アルゴリズム解析によって、これらのｍｉＲＮＡが、最近隣予測因子により９７％を越える精度で統計的に有意なＴ試料およびＮＴ試料を予測（ｐ＜０．０１）することができるということが示された。これらの最初の解析によって、ｍｉＲＮＡアレイが頑健であり、腫瘍と非癌肝組織の有意差を同定することができるということが示された。
【００７０】
統計解析
Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｓｔｕｒｎ（ＩＢＭＴ−ＴＵＧ、グラーツ、オーストリア）によって開発されたＧＥＮＥＳＩＳソフトウェアＶ１．５によって、教師なし階層的クラスタリング解析を行なった。ＢＲＢ  ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓソフトウェアＶ３．３を、以前に記載されたように（非特許文献２３、非特許文献２２）教師あり解析のために用いた。Ｅｘｃｅｌに基づくＷｉｎＳＴＡＴソフトウェアを用いて、予測結果に基づいて被験者の生存率を比較するために、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存解析を用いた。Ｃｏｘ−Ｍａｎｔｅｌのログランク検定により統計的ｐ値を作成した。ＳＴＡＴＡ  ９．２（テキサス州カレッジ・ステーション）を用いて、１６個の臨床的変数の、被験者の生存率または再発率に対する効果を解析するために、Ｃｏｘ比較ハザード回帰を用いた。統計的有意性は、ｐ＜０．０５と定義した。ターゲットスキャン解析は、Ｂｅｎ  Ｌｅｗｉｓ（非特許文献２５）によって開発されたウェブサイトツールに基づいた。年齢、性別、ＨＢＶ活性状況、切除前のＡＦＰ、肝硬変、アラニントランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、チャイルド・ピュー（Ｃｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ）スコア、腫瘍の大きさ、腫瘍の被包化、結節の種類、微小血管浸潤の状況、エドモンドソン（Ｅｄｍｏｎｄｓｏｎ）グレード、ならびにＢＣＬＣ病期診断（非特許文献２６）、ＣＬＩＰ分類（非特許文献２７）、Ｏｋｕｄａ病期診断（非特許文献２８）およびＴＮＦ分類（非特許文献２９）を含めた幾つかのＨＣＣ予後診断システムを含む、被験者の全生存率および無再発生存率に対する臨床的変数の効果を解析するために、Ｃｏｘ比較ハザード回帰を用いた。
【００７１】
ｑＲＴ−ＰＣＲ
ＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド）を用いて全ＲＮＡを抽出し、ＴＡＣＳＴＤ１、ＢＡＭＢＩ、ＤＫＫ１、ＣＣＮＤ１、ＣＴＮＮＢ１、およびＭＹＣの発現を、アプライドバイオシステムズ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて３通りで測定した。使用したプローブは以下であった：ＴＡＣＳＴＤ１、Ｈｓ００１５８９８０＿ｍ１；ＣＴＮＮＢ１、ＨＳ００１７００２５＿ｍ１；ＢＡＭＢＩ、ＨＳ００１８０８１８、ＤＫＫ１、Ｈｓ００１８３７４０＿ｍ１、ＣＣＮＤ１、Ｈｓ００２７７０３９＿ｍ１、ＣＴＮＮＢ１、ＭＹＣ、Ｈｓ００１５３４０８＿ｍ１；１８Ｓ、Ｈｓ９９９９９９９０１＿ｓ１（アプライドバイオシステムズ）。全ての手順を製造元のアドバイスに従って行なった。
【００７２】
免疫組織化学的解析
製造元の取扱説明書に従ってＥｎｖｉｓｉｏｎ＋キット（ダコＵＳＡ、カリフォルニア州カーピンテリア）を用いて免疫組織化学的解析を行なった。１次抗体を以下の通り用いた：抗β−カテニンモノクローナル抗体クローン１４（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州サンホセ）および抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体クローンＶＵ−１Ｄ９（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）。
【００７３】
免疫蛍光
細胞をチャンバースライド上で培養し、示した化学物質で４８時間処理した。その後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで１０分間、メタノールで２０分間固定し、リン酸緩衝化生理食塩水中でインキュベートした。試料を１０％正常ロバ血清で室温にて１時間ブロッキングし、１次抗体で３７℃にて１時間染色し、次いでアレクサ５６８  テキサスレッド結合抗マウス抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）で染色した。
【００７４】
ＥＭＳＡ
組換えＴｃｆ−４を大腸菌でＧＳＴ融合タンパク質として発現させ、抽出した。製造元の取扱説明書に従ってＬｉｇｈｔＳｈｉｆｔ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ＥＭＳＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）を用いてＥＭＳＡを行なった。ＥｐＣＡＭプロモーターの推定Ｔｃｆ結合部位ならびに上流および下流の１０個の隣接するヌクレオチドを含む２本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを構築し、プローブとして用いた。突然変異体ＴＢＥ１およびＴＢＥ２プローブも用いた。
【００７５】
細胞株、アンチセンス、およびプラスミド
公知のＨＣＣ細胞株、Ｈｅｐ３ＢタイプＢ、ＭＨＣＣ９７タイプＣ、Ｓｍｍｃ７７２１タイプＤ、ＨＵＨ１、およびＨＵＨ７を日常的に培養した。機能アッセイのために、細胞にｐＭＳＣＶ−ｍｉｒ−１８１ｂ−１をトランスフェクトした。ＨＵＨ７細胞を、ｍｉｒ−１８１の阻害剤である２’−Ｏ−メチルｍｉｒ−１８１アンチセンスでも処理した。
【００７６】
実施例１
本実施例は、ｍｉＲＮＡ発現が、ＨＣＣ組織と非癌組織とを区別することができ、ＨＣＣの４つのサブタイプを識別することができることを示す。
【００７７】
合計２３０人のＨＣＣ患者由来の対になるＨＣＣ組織および周辺非ＨＣＣ組織試料を利用して、合計２０９個の非重複ｍｉＲＮＡが、試料を正確に同定する際９７％精度を与えることが分かった（多変量ｐ＜０．０１）。試料の不均質性は明白であり、試料は４つのＨＣＣサブタイプ（ＨＳＣ、ＢＤＥ、ＨＰ、およびＭＨ）に基づいてクラスタリングされた。
【００７８】
４つのＨＣＣサブタイプ間で有意なｍｉＲＮＡの発現を探索した。階層的クラスタリングにより、予測精度を確定するための１０倍の相互検証を伴うクラス比較とクラス予測の両方に基づいて、３９個のプレｍｉ−ＲＮＡ遺伝子が４つのＨＣＣサブタイプにおいて重複遺伝子からの有意な発現変化（ｐ＜０．００２、ＦＤＲ＜０．０５）を示すことが明らかになった（表１）。３９個のｍｉＲＮＡの中で、各々のサブタイプで上方調節されるものもあれば、下方調節されるものもあった（図１０）。
【００７９】
【表１−１】
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【００８０】
【表１−２】
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【００８１】
【表１−３】
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【００８２】
【表１−４】
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【００８３】
【表１−５】
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【００８４】
【表１−６】
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【００８５】
【表１−７】
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【００８６】
【表１−８】
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【００８７】
【表１−９】
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【００８８】
実施例２
本実施例は、ｍｉｒ−１８１がＨＳＣ−ＨＣＣと関連し、肝癌幹細胞の機能に寄与することを示す。
【００８９】
前駆体ｍｉＲＮＡ（Ａ）および成熟ｍｉＲＮＡ（Ｂ）におけるｍｉｒ−１８１の発現レベルは、それらの対応する非ＨＣＣ組織と対比して、ＨＳＣ−ＨＣＣおよびＢＤＥ−ＨＣＣでは有意に増加しているが、ＨＰ−ＨＣＣおよびＭＨ−ＨＣＣでは減少している。ＨＳＣ−ＨＣＣおよびＢＤＥ−ＨＣＣは、それぞれ幹細胞様の特色および胆管上皮様の特色を有するＨＣＣを表す。２３０人の患者由来の対応する非ＨＣＣ組織と対比した各々のＨＣＣサブタイプにおけるｍｉＲＮＡ前駆体のｍｉＲＮＡマイクロアレイ解析に基づいたｍｉｒ−１８１発現を、ｍｉｒ−１８１ａ１、ｍｉｒ−１８１ａ２、ｍｉｒ−１８１ｂ１、ｍｉｒ−１８１ｂ２、およびｍｉｒ−１８１ｃについてそれぞれ図１Ａ〜図１Ｅに示す。遺伝子発現比をｌｏｇ２目盛りで示す（平均±９５％ＣＩ）。図１Ｆ〜図１Ｊは、４０例のＨＣＣおよび非ＨＣＣ試料対における全ての成熟ｍｉｒ−１８１のＲＴ−ＰＣＲ解析を示す。プレ−ｍｉｒ−１８１および成熟ｍｉｒ−１８１の散布図解析を、スピアマンの相関係数を表すｒ値と共に図２に示す。
【００９０】
次に、ｍｉｒ−１８１発現は、臨床標本と培養ＨＣＣ細胞株の両方においてＷｎｔ−β−カテニンシグナル伝達活性化と正に相関し、多くの成熟肝細胞遺伝子と負に相関していた。マイクロアレイデータおよびｍＲＮＡアレイデータの相関解析からその発現が互いに有意に相関する（ｐ＜０．００１）５個のプレ−ｍｉｒ−１８１、１５個の肝細胞特異的遺伝子、および５個のβ−カテニン関連遺伝子の階層的クラスタリングを実施した。３つの異なる種類のＨＣＣ細胞株において、ｍｉｒ−１８１発現は、β−カテニンタンパク質レベルと正に相関した（図９）。
【００９１】
未分化な胚性幹（ＥＳ）細胞の増殖に最適化された基礎培地であるＥＳＣ培養培地を用いてＨｕＨ１細胞を培養した後、ｑＲＴ−ＰＣＲ（図３Ａ〜図３Ｃ）、ならびにβ−カテニンおよび（対照としての）アクチンに対する抗体を用いたイムノブロッティングで解析した場合、ｍｉｒ−１８１およびβ−カテニン調節遺伝子の発現は増大し、肝細胞特異的遺伝子の発現は減少していた。ＥＳＣ培地の除去後、上記遺伝子の発現は、ｑＲＴ−ＰＣＲ（図３Ｄ〜図３Ｆ）で解析した場合、逆に変化した。遺伝子発現を３通りで測定し、平均±ＳＤとして示す。
【００９２】
実施例３
本実施例は、ｍｉｒ−１８１発現が、ｗｎｔ−β−カテニンシグナル伝達の活性化に関与することを示す。
【００９３】
ｐＭＳＣＶ−ｍｉｒ−１８１ｂ−１をＨｕＨ１細胞にトランスフェクトした後、ｍｉｒ−１８１ｂをＲＴ−ＰＣＲによって検出し、発現をｐＭＳＣＶ−ｈＴＲ細胞の発現と比較した。遺伝子発現を３通りで測定し、平均±ＳＤとして図４に示す。示したように、ｍｉｒ−１８１は、ＨｕＨ１細胞で過剰発現していた。
【００９４】
ＨｕＨ７細胞を２’−Ｏ−メチルｍｉｒ−１８１アンチセンスで処理し、その後、全てのｍｉｒ−１８１の発現を検出した。３通りで測定した（対照オリゴと比較した）遺伝子発現の顕著な減少を、平均±ＳＤとして図５に示す。
【００９５】
ＨｕＨ１細胞におけるｍｉｒ−１８１過剰発現の後、β−カテニン調節遺伝子（ＣＣＮＤ１、ＴＡＣＳＴＤ１、およびＤＫＫ１）の発現をＲＴ−ＰＣＲによって検出し、ｐＭＳＣＶ−ｈＴＲ細胞による発現と比較した（図６Ａ〜図６Ｃ）。細胞株の細胞溶解物もまた、β−カテニンおよびアクチンに対する抗体を用いたイムノブロットによって解析した。
【００９６】
ＨｕＨ７細胞におけるｍｉｒ−１８１下方調節の後、β−カテニン調節遺伝子（ＣＣＮＤ１、ＴＡＣＳＴＤ１、およびＤＫＫ１）の発現をＲＴ−ＰＣＲによって検出し、ｐＭＳＣＶ−ｈＴＲ細胞の発現と比較した（図６Ｄ〜図６Ｆ）。細胞株の細胞溶解物もまた、β−カテニンおよびアクチンに対する抗体を用いたイムノブロットによって解析した。
【００９７】
ｍｉｒ−１８１は、ｗｎｔ−β−カテニン発現に影響を及ぼす。これは機能的なフィードバックリンクを通じて起こることが可能である。ＤＫＫ１はβ−カテニンの阻害因子である。β−カテニンは、ｍｉｒ−１８１だけでなくＤＫＫ１も誘導し、ＤＫＫ１はその後β−カテニンを阻害する。ｍｉｒ−１８１はＤＫＫ１の阻害活性を阻害するように働くと考えられる。ＤＫＫ１  ３’−ＵＴＲ中の予測ｍｉｒ−１８１結合部位を図７Ａ〜図７Ｂに示す。ヒトｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ１  ｃＤＮＡであるＢＣ００１５３９を用いた。図７Ａは、ＤＫＫ１  ３’−ＵＴＲの６１１〜６３２位における結合部位を示す。図７Ｂは、ＤＫＫ１  ３’−ＵＴＲの７７１〜７９９位における予測結合部位を示す。
【００９８】
ｍｉｒ−１８１のプロモーター中の予測転写因子−４（ＴＣＦ−４）結合部位（（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｔ）ＣＡＡＡＧ）または（ＣＴＴＴＧ（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｔ））を図８Ａ〜図８Ｄに示す。６，０６０塩基対を転写開始点の上流で解析した。図８Ａは、第１番染色体中のｍｉｒ−１８１ａ１およびｍｉｒ−１８１ｂ１のプロモーターを示しており、そのためにヒト第１番染色体のゲノムコンティグであるＮＷ＿９２６１２８を用いた。図８Ｂは、第９番染色体中のｍｉｒ−１８１ａ２およびｍｉｒ−１８１ｂ２のプロモーターを示しており、そのためにヒト第９番染色体のゲノムコンティグであるＮＴ＿００８４７０を用いた。サンガーのデータベースでは、両方のＥＳＴ遺伝子が、ｍｉｒ−１８１ｃおよびｍｉｒ−１８１ｄが位置する領域の中に予測されており（図８Ｃ〜図８Ｄ）、その領域は異なる転写開始点を有している。図８Ｃの第１９番染色体中のｍｉｒ−１８１ｃおよびｍｉｒ−１８１ｄのプロモーターは、ＥＮＳＥＳＴＴ０００００２９０８１９由来のプロモーターである。図８Ｄの第１９番染色体中のｍｉｒ−１８１ｃおよびｍｉｒ−１８１ｄのプロモーターは、ＥＮＳＥＳＴＴ０００００２９０８１８由来のプロモーターである。
【００９９】
本明細書に引用された刊行物、特許出願、および特許を含む全ての参考文献は、各々の参考文献が参照により援用されることが個別具体的に示され、その全体が本明細書に示されているのと同じ程度まで、参照により本明細書に援用される。
【０１００】
本発明を記載する文脈における（とりわけ以下の特許請求の範囲の文脈における）「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」という用語ならびに同様の指示語の使用は、本明細書で別段指示されないかまたは文脈により明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方を含むと解釈されるべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、別段断らない限り、制限のない用語（すなわち、「を含むが、限定されない」という意味）であると解釈されるべきである。本明細書中の値の範囲の列挙は、別段本明細書中で指示されない限り、単に、該範囲内に収まる各々の別々の値に個々に言及する簡略な方法としての役割を果たすことを意図し、かつあたかもそれが本明細書中に個々に列挙されるかのように、各々の別々の値が本明細書に組み入れられる。本明細書に記載された全ての方法は、別段指示されない限り、または文脈により明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で行なうことができる。本明細書中に提供される、任意のおよび全ての例、または例示的な言い回し（例えば「などの（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、単に本発明をより良く例説することを意図し、別段請求されない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいかなる言い回しも、任意の請求されていない要素を本発明の実施に不可欠なものとして示すものと解釈されるべきではない。
【０１０１】
本発明の好ましい態様は、本発明を実施するために本発明者らが知る最良の様式を含めて本明細書に記載される。それらの好ましい態様の変形は、前述の説明を読めば当業者に明らかとなり得る。本発明者らは当業者がそのような変形を適宜用いることを予期し、かつ本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載されたのとは別の方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、準拠法で許されているように、本明細書に添付された特許請求の範囲に記載された被験者物の全ての改変および等価物を含む。さらに、本明細書で別段指示されない限り、または文脈により明らかに矛盾しない限り、その全ての可能な変形における上記要素の任意の組み合わせが、本発明によって包含される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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