(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖に反応して生体内蛍光を示す形質転換エレガンス線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）を利用することを特徴とする、糖代謝調節候補遺伝子をスクリーニングする方法であって、当該方法は、
（ａ）ｆａｒ−３に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を付着したｆａｒ−３：：ＧＦＰ  ＤＮＡが染色体上に融合された形質転換エレガンス線虫に糖を摂取させる工程と、
（ｂ）ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）を利用して、糖代謝調節候補遺伝子の発現を低下させる工程と、
（ｃ）形質転換エレガンス線虫の生体内における蛍光強度の変化を確認する工程と、
を含むことを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖に反応して蛍光を示す形質転換エレガンス線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）を製造し、これを利用して糖代謝を調節することができる遺伝子をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エレガンス線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）は、遺伝子操作が非常に容易であり、サイズが小さいため、実験室で同時に多い数を比較的低費用で育てることができる。卵から孵化し、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４の４段階を通じて成虫になるのに約３日程度だけが所要され、早い実験に適している。身の構造が単純で、生殖細胞を除けば、全体細胞数が９５９個に過ぎず、身が透明で、顕微鏡などで内部を直接観察することが容易である。
【０００３】
また、受精卵から成虫に至る細胞系譜が完全に明らかにされている。ゲノムプロジェクトの結果によれば、エレガンス線虫は、酵母の３倍、人間の１／３〜１／５程度のゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）を有する。これらのうち４０％が人間のものと類似していて、今まで知られた人間疾病遺伝子５，０００個のうち７５％を共有していて、人間疾病研究のための良いモデルシステムとして広く認識されている。
【０００４】
最近、代謝及び代謝関連疾患に対する関心が集中的に高くなることによって、エレガンス線虫の遺伝学を利用した代謝研究が急速に進行されている。これらの研究を通じて発掘された多くの遺伝子がまた哺乳類にも保存されている。例えば、哺乳類の代謝に重要な遺伝子、例えばインスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）信号伝逹体系の遺伝子、ｍＴＯＲ信号伝達体系上の遺伝子、Ｔｕｂｂｙ、ＳＲＥＢＰ、ＰＰＡＲγ、ＢＡＲ（ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）などの遺伝子に対する相同遺伝子がエレガンス線虫に存在し、これらの全般的な代謝での役目が活発に研究されている。
【０００５】
糖分は、人間を含めた地球上のほぼすべての生命体の必須なエネルギー源である。しかし、糖分の多い食べ物は、肥満、心臓病、そして特に血中ブドウ糖の異常をもたらす２型糖尿病（ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｄｉａｂｅｔｅｓ）と密接な連関があるので、深刻な医療的問題をもたらすことがある。
【０００６】
２００３年に糖尿病の死亡率は、韓国の場合、人口十万名当たり２５名であり、１９９４年の人口十万名当たり１７名から１０年でほぼ４７％増加した。糖尿病の社会的費用は、米国の場合、１９９７年に約９８０億ドルに達するものと推定されるほどに莫大である。したがって、社会経済的な費用節減のために、糖尿病に対する研究は非常に重要である。しかし、糖尿病は、遺伝的、環境的要因の複雑な相互作用によって決定されるので、その原因を正確に探すことが容易ではない。したがって、糖尿病に作用する遺伝子のネットワーク究明及び糖代謝調節が可能な物質を探すためには、エレガンス線虫のように、簡単なモデル動物を利用することが効率面において優れている。しかし、現在までエレガンス線虫を利用して糖代謝及び糖尿病に対する候補遺伝子及び候補薬物をスクリーニングするために利用した研究結果は全くない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、エレガンス線虫の低費用高効率の特性を利用してリアルタイムで生体内の糖の変化を蛍光で見られる形質転換エレガンス線虫を製造し、これを利用して糖代謝を調節することができる候補遺伝子及び候補薬物をスクリーニングする方法などを提供する。
【０００８】
具体的に、本発明は、糖及び脂質代謝と関連した遺伝子を操作したとき、上記形質転換エレガンス線虫で蛍光変化が起きることを示すことによって、生体内の糖のリポーターとしての形質転換エレガンス線虫の有用性を確立しようとする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、糖に反応して生体内蛍光を示す形質転換エレガンス線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）を提供する。上記糖はブドウ糖を含む。
【００１０】
本発明の一具現例において、上記形質転換エレガンス線虫は、糖摂取によって発現が増加する遺伝子であるｆａｒ−３に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を付けたｆａｒ−３：：ＧＦＰ  ＤＮＡが染色体上に融合されたことを特徴とする。
【００１１】
また、本発明は、紫外線を加えてｆａｒ−３：：ＧＦＰ  ＤＮＡを染色体上に融合する段階を含む、形質転換エレガンス線虫を製造する方法を提供する。
【００１２】
また、本発明は、糖に反応して生体内蛍光を示す形質転換エレガンス線虫を利用することを特徴とする、糖代謝調節候補遺伝子及び候補薬物をスクリーニングする方法を提供する。
【００１３】
本発明の一具現例において、上記スクリーニング方法は、形質転換エレガンス線虫に糖を摂取させると同時に、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）方法を利用して糖代謝調節遺伝子の発現を低下させる段階を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の形質転換エレガンス線虫は、実体蛍光顕微鏡で糖の変化をリアルタイムで容易に観察することができるように製造されたもので、迅速且つ正確に糖代謝調節物質の発掘を可能にする。また、エレガンス線虫の特性上、低い費用で高効率の研究が可能である。したがって、本発明は、肥満、糖尿病などの代謝と関連した多様な難病を治療するための研究に大きく寄与することができるものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、形質転換エレガンス線虫を製造するときのＤＮＡ融合過程を示す模式図である。
【図２】図２Ａは、ｆａｒ−３：：ＧＦＰ形質転換エレガンス線虫を２％ブドウ糖が含まれた培地で育てたとき、対照群に比べて明るい蛍光を示すことを示す結果であり、図２Ｂは、これを定量化した結果を示す図である。
【図３】図３Ａは、ブドウ糖がある条件でｇｐｉ−１  ＲＮＡｉで解糖過程（ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ）を遮断したとき、対照群に比べてブドウ糖によって増加された蛍光がさらに増加することを示す結果であり、図３Ｂは、これを定量化した結果を示す図である。
【図４】図４Ａは、ブドウ糖がある条件でｐｏｄ−２  ＲＮＡｉやｆａｓｎ−１  ＲＮＡｉで脂肪酸合成過程を遮断したとき、対照群に比べてブドウ糖によって増加した蛍光がさらに増加することを示す結果であり、図４Ｂは、これを定量化した結果を示す図である。
【図５】図５Ａは、ブドウ糖がある条件で、予測されたブドウ糖輸送体Ｈ１７Ｂ０１．１の発現をＲＮＡｉで抑制したとき、ブドウ糖によって増加した蛍光が対照群に比べて減少したことを示す結果であり、図５Ｂは、これを定量化した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、糖に反応して蛍光を示す形質転換エレガンス線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）を提供する。
【００１７】
本発明において使用された用語「エレガンス線虫」は、学名としてはＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓであり、土でバクテリアを食べて成長する線虫類であって、遺伝学、分子生物学、細胞生物学実験において広く使用される。
【００１８】
本発明において使用された用語「形質転換」は、外部から注入したＤＮＡによって生物の遺伝的な性質が変わったことを意味する。
【００１９】
また、本発明は、紫外線を加えてｆａｒ−３：：ＧＦＰ  ＤＮＡを染色体上に融合する段階を含む、形質転換エレガンス線虫の製造方法を提供する。
【００２０】
本発明において使用された用語「ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、細胞内で発現され、強い緑色蛍光を発するタンパク質であって、特に観察が容易であるという長所を有するため、遺伝子の発現の有無を測定する多様な分野において使用されている。
【００２１】
本発明において使用された用語「形質転換エレガンス線虫」は、ブドウ糖の摂取によって発現が増加する遺伝子であるｆａｒ−３に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を付着したｆａｒ−３：：ＧＦＰ  ＤＮＡを融合して製造された糖リポーター蛍光エレガンス線虫を意味する。
【００２２】
また、本発明は、糖に反応して生体内蛍光を示す形質転換エレガンス線虫を利用して糖代謝調節候補遺伝子及び候補薬物をスクリーニングする方法を提供する。上記スクリーニング方法は、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）方法を利用することを特徴とする。
【００２３】
上記方法は、形質転換エレガンス線虫に糖を摂取させると同時に、ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）方法を利用してエレガンス線虫の遺伝子の発現を低下させる段階を含む。上記本発明の一実施例において、脂質及び糖代謝遺伝子を低下させたとき、緑色蛍光の強度が顕著に変わることを観察し、これは、形質転換エレガンス線虫を利用して代謝調節関連の新しい遺伝子を発掘することができることを示唆する（図３〜図５参照）。
【００２４】
具体的に、本発明者は、図１に示されたように、ブドウ糖の摂取によって発現が増加する遺伝子であるｆａｒ−３に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を付着して製造された蛍光を示すｆａｒ−３：：ＧＦＰ形質転換エレガンス線虫を製造し、ｆａｒ−３：：ＧＦＰ形質転換エレガンス線虫を２％ブドウ糖が含まれた培地で成長させたとき、対照群に比べて明るい蛍光を示すことを確認した（図２参照）。
【００２５】
次に、本発明者は、ブドウ糖がある条件で糖の分解過程である解糖過程（ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ）をｇｐｉ−１  ＲＮＡｉで遮断したとき、対照群に比べてブドウ糖によって増加した蛍光がさらに増加することを確認した（図３参照）。
【００２６】
また、本発明者は、ブドウ糖がある条件で脂肪酸合成過程をｐｏｄ−２  ＲＮＡｉやｆａｓｎ−１  ＲＮＡｉで遮断したとき、対照群に比べてブドウ糖によって増加した蛍光がさらに増加することを確認した（図４参照）。
【００２７】
これに加えて、本発明者は、ブドウ糖がある条件で、予測されたブドウ糖輸送体Ｈ１７Ｂ０１．１の発現をＲＮＡｉで抑制したとき、ブドウ糖によって増加した蛍光が対照群に比べて減少することを示すことを確認した（図５参照）。
【００２８】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をさらに容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【実施例】
【００２９】
実施例１．形質転換エレガンス線虫を製造する方法−ＤＮＡ融合（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）
エレガンス線虫に挿入されたｆａｒ−３：：ＧＦＰ  ＤＮＡは、染色体に含まれていない形態であるから、エレガンス線虫の子孫にすべて伝達されるものではない。このような形態の形質転換エレガンス線虫で実験を行うためには、形質転換されたエレガンス線虫を選別しなければならないという不都合があり、ｆａｒ−３：：ＧＦＰの発現が一定ではない問題がある。
【００３０】
したがって、安定的な形質転換エレガンス線虫を得るために、紫外線を加えてＤＮＡに変化を与えることによって、外部で流入されたｆａｒ−３：：ＧＦＰ  ＤＮＡが染色体上に融合され得るようにした。紫外線を用いたＤＮＡ融合は、非常に低い確率で行われるので、多数のエレガンス線虫に紫外線を加えることによって、成功率を高めることができた。
【００３１】
ｆａｒ−３：：ＧＦＰ  ＤＮＡは、短い体形の突然変異（ｄｐｙ−５）を長い体形に回復させる遺伝子とともに挿入されているので、光学顕微鏡で形質転換可否を確認することができた。本ＤＮＡ融合過程でも、これを利用して形質転換されたエレガンス線虫を区分した。ＤＮＡ融合過程に先立って、ｆａｒ−３：：ＧＦＰ  ＤＮＡの子孫伝達頻度を測定した結果、約５０％の子孫にＤＮＡが伝達されることを確認することができ、紫外線処理後、約５０％の生存率を示す紫外線の強度を探した結果、３００Ｊ／ｍ２であることが分かった。
【００３２】
成功的なＤＮＡ融合実験のためには、紫外線処理後、６００匹以上の形質転換されたエレガンス線虫が必要であるから、２００匹のＬ４段階形質転換エレガンス線虫に３００Ｊ／ｍ２の紫外線を加えた。６日後、紫外線を処理したエレガンス線虫で生まれた子孫エレガンス線虫（Ｆ１）６００匹をそれぞれ６００個のプレートに移し、子孫を生むようにした。４日後６００匹のエレガンス線虫で生まれた子孫エレガンス線虫（Ｆ２）を各プレートで二匹ずつ１，２００個のプレートにそれぞれ移し、子孫を生むようにした。約４日後、１，２００個のプレートを確認した。ＤＮＡ融合が成功的に行われる場合、形質転換されたエレガンス線虫が１００％として現われるので、各プレートを観察し、１００％正常体形のエレガンス線虫があるプレートを探索した。１００％の正常体形を有する形質転換エレガンス線虫をブドウ糖が含まれた培地で蛍光を観察し、ＤＮＡ融合可否を確認した（図１参照）。
【００３３】
実施例２．ブドウ糖がある条件でｆａｒ−３：：ＧＦＰの形質転換エレガンス線虫の蛍光測定
実施例１で製造されたｆａｒ−３：：ＧＦＰ形質転換エレガンス線虫を２％ブドウ糖が含まれた培地で成長させた後、下記の方法で蛍光を測定した。
【００３４】
具体的に、スライドグラスの上に２％アガロース（ａｇａｒｏｓｅ）一滴を滴下し、他のスライドグラスで覆ってアガロースを薄く広げ、アガロースが固くなった後、覆ったスライドグラスを引き離してパッドを作った後、アガロースパッドの上に５０ｍＭ濃度のＮａＮ３を１滴滴下し、エレガンス線虫約１５匹を移して麻酔させた。空気滴が生じないように、カバーグラスを注意深く覆った後、蛍光顕微鏡を利用して写真を撮って、ｆａｒ−３：：ＧＦＰの蛍光を観察した。蛍光顕微鏡は、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｓｃｏｐｅ  Ａ１を利用した。ＩｍａｇｅＪプログラムを利用してエレガンス線虫の全身で現われる蛍光を定量し、３回の独立的な実験を通じて２０匹以上のエレガンス線虫の蛍光を分析した。
【００３５】
図２に示されたように、ブドウ糖が含まれていない培地で成長させたｆａｒ−３：：ＧＦＰ形質転換エレガンス線虫対照群に比べて明るい蛍光を示すことを確認した（＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１，ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ'ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）。
【００３６】
実施例３．ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）を利用して糖代謝遺伝子を検索する方法
本発明者は、特定遺伝子の発現を抑制し、ｆａｒ−３：：ＧＦＰの蛍光を観察するためにＪｕｌｉｅ  Ａｈｒｉｎｇｅｒ  ＲＮＡｉバクテリアｌｉｂｒａｒｙを使用した。Ｌｉｂｒａｒｙで得たバクテリアをＬＢ／アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）プレートに掻いて移した後、３７℃培養器で１２〜１６時間培養し、プレートに成長したバクテリアコロニーを１つ選択し、液体ＬＢ／アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）培地に移し、３７℃回転培養器で１２時間培養した。培養１２時間が経過した後、バクテリアが成長した液体ＬＢ／アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）培地を２％ブドウ糖とアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）が含まれたＮＧ培地に１００μＬずつ分注した後、３７℃培養器で１２〜１６時間培養した。インダクション（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）反応のために１００ｍＭ濃度のＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）５０μＬをバクテリアの上に分注し、常温で１日間反応させた後、ｆａｒ−３：：ＧＦＰ形質転換エレガンス線虫の成体二匹をＲＮＡｉバクテリアが成長したプレートに移して、卵を生むようにした。約１２時間後、成体ｆａｒ−３：：ＧＦＰ形質転換エレガンス線虫を除去し、３日後、卵で成長したエレガンス線虫が成体になったとき、上記に記載されたｆａｒ−３：：ＧＦＰの蛍光を測定する方法を利用して蛍光顕微鏡で蛍光の発現を観察した。
【００３７】
実施例３−１．ｇｐｉ−１  ＲＮＡｉ利用
本発明者は、ｇｐｉ−１  ＲＮＡｉを利用して解糖過程（ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ）に関連したものとして知られたｇｐｉ−１遺伝子発現を遮断したとき、形質転換エレガンス線虫の蛍光強度の変化を観察した。
【００３８】
ブドウ糖が細胞内に流入されれば、ヘキソキナーゼ（ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ）によってグルコース−６−リン酸（ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に変換され、引き続いて、ｇｐｉ−１（ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）によってフルクトース−６−リン酸（ｆｒｕｃｔｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に変換される。ｇｐｉ−１は、解糖過程（ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ）上位段階で重要な役目をしているので、ｇｐｉ−１の発現抑制を通じて解糖過程を遮断することができる。
【００３９】
図３に示されたように、ブドウ糖がある条件でｇｐｉ−１の発現が減少しない形質転換エレガンス線虫対照群に比べてｇｐｉ−１遺伝子発現を遮断したとき、ブドウ糖によって増加された蛍光がさらに増加することが分かる（＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１，ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ'ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）。
【００４０】
実施例３−２．ｐｏｄ−２  ＲＮＡｉまたはｆａｓｎ−１  ＲＮＡｉ利用
本発明者は、ｐｏｄ−２  ＲＮＡｉやｆａｓｎ−１  ＲＮＡｉを利用して脂肪酸合成に関連したものと知られたｐｏｄ−２またはｆａｓｎ−１を遮断したとき、形質転換エレガンス線虫の蛍光強度変化を観察した。
【００４１】
ｐｏｄ−２（ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）は、脂肪酸合成の最上位段階に位置する酵素であって、アセチルＣｏＡ（ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ）をマロニルＣｏＡ（ｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ）に変換する役目をする。ｆａｓｎ−１（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）は、ｐｏｄ−２の次の段階でａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡとｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡを利用して脂肪酸を合成するのに関与する。ｐｏｄ−２とｆａｓｎ−１は、脂肪酸合成の開始段階を調節する重要な酵素なので、ｐｏｄ−２とｆａｓｎ−１を遮断することによって、脂肪酸合成を大きく低下させることができる。
【００４２】
図４に示されたように、ブドウ糖がある条件でｐｏｄ−２またはｆａｓｎ−１の発現が減少しない形質転換エレガンス線虫対照群に比べてｐｏｄ−２またはｆａｓｎ−１遺伝子の発現を遮断したとき、ブドウ糖によって増加した蛍光がさらに増加することが分かる（＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１，ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ'ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）。
【００４３】
実施例３−３．Ｈ１７Ｂ０１．１  ＲＡＮｉ利用
本発明者は、Ｈ１７Ｂ０１．１  ＲＡＮｉを利用して予測されたブドウ糖輸送体Ｈ１７Ｂ０１．１の発現を遮断したとき、形質転換エレガンス線虫の蛍光強度変化を観察した。
【００４４】
Ｈ１７Ｂ０１．１は、人間のブドウ糖輸送体ＧＬＵＴ１と最も類似な塩基配列を有するエレガンス線虫の遺伝子であって、エレガンス線虫においてブドウ糖を細胞内に輸送する役目をするものと予測される。
【００４５】
図５に示されたように、ブドウ糖がある条件でＨ１７Ｂ０１．１を遮断しない形質転換エレガンス線虫対照群に比べてＨ１７Ｂ０１．１を遮断したとき、ブドウ糖によって増加した蛍光が減少することが分かる（＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１，ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ'ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）。
【００４６】
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須な特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であるということを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例及び実験例は、すべての面において例示的なものであって、限定的なものではないことを理解しなければならない。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の形質転換エレガンス線虫は、迅速且つ正確に糖代謝調節物質の発掘を可能にし、ひいては肥満、糖尿病などの代謝と関連した多様な難病を治療するための研究に大きく寄与することができるものと期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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