(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
真菌細胞の核酸を分析試験するために該真菌細胞を含むサンプルを調製する方法であり、該方法は、以下：
（ｉ）濾過可能な液体の形態の該サンプルを調製する工程；
（ii）該濾過可能な液体を、ガラスマイクロファイバーフィルターを使用して濾過する工程、ここで該サンプル由来の該真菌細胞は該ガラスマイクロファイバーフィルター上に保持物を形成する；
（iii）該ガラスマイクロファイバーフィルターを、機械的手段により該ガラスマイクロファイバーフィルターおよび該真菌細胞を破砕するのに
適切な容器に移す工程；
（iv）該真菌細胞および該ガラスマイクロファイバーフィルターを、該ガラスマイクロファイバーフィルターを微細粒子に破砕するのに十分な力を有する機械的手段を使用して、同時に破砕する工程；および
（ｖ）工程（iv）の破砕真菌細胞および破砕ガラスマイクロファイバーフィルターを分析試験する工程を含み、
ここで、該破砕ガラスマイクロファイバーフィルターの該微細粒子は、分析試験の前に該サンプルの該真菌細胞の核酸から除去されない、方法。
【請求項２】
真菌細胞が、酵母またはカビ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サンプルが、食品または飲料サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ガラスマイクロファイバーフィルターが、１．６μｍの公称孔径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
容器が、試験管または微小遠心管である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程（iv）における機械的手段が、ビーズ破砕である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
分析試験が、核酸のＰＣＲ増幅を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
分析試験が、ＰＣＲ増幅の産物の融解曲線分析を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
真菌細胞を増殖させるために、前記サンプルを富化する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法であり、該富化は、ａ）請求項１の工程（ii）における、前記濾過可能な液体の前記濾過の前；ｂ）請求項１の工程（ii）における、該濾過可能な液体の該濾過後であるが、請求項１の工程（iv）における、該真菌細胞の前記破砕の前；またはｃ）請求項１の工程（ii）における、該濾過可能な液体の該濾過の前、および請求項１の工程（ii）における該濾過可能な液体の該濾過後であるが、請求項１の工程（iv）における、該真菌細胞および該ガラスマイクロファイバーフィルターの該破砕の前の両方、のいずれかで行なわれる、方法。
【請求項１０】
同時破砕が、以下：
（ｉ）前記破砕容器中に破砕ビーズおよび液体を備え；そして
（ii）前記フィルターを懸濁ファイバーに破砕するのに十分な期間、前記破砕容器の内容物がビーズミルの力を受けることにより達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
濾過が、真空濾過を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
真菌細胞の核酸から生産されたＰＣＲ増幅産物の融解曲線分析のために、該真菌細胞を含む食品または飲料サンプルを調製する方法であり、該方法は、以下：
ａ．濾過可能な液体の形態の該サンプルを調製する工程；
ｂ．該濾過可能な液体を、ガラスマイクロファイバーフィルターに通す真空濾過を使用して濾過する工程、ここで該サンプル由来の該真菌細胞は該フィルター上に保持物を形成する；
ｃ．該フィルターを、ビーズ破砕を使用して該フィルターおよび該真菌細胞を破砕するのに適した容器に移す工程；
ｄ．該真菌細胞および該フィルターを、ビーズ破砕機を使用して該フィルターを個々の懸濁ガラスファイバーに破砕するのに十分な期間および力で該容器をビーズ破砕することにより、同時に破砕する工程；および
ｅ．工程ｄの破砕真菌細胞およびフィルターを分析試験する工程を含み、
ここで、該懸濁ガラスファイバーは、直接ＰＣＲ分析の前に該サンプルの該真菌細胞の核酸内容物から除去されない、方法。
【請求項１３】
真菌細胞を増殖させるために、前記サンプルを富化する工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法であり、該富化は、ａ）請求項１２の工程ｂにおける、前記濾過可能な液体の前記濾過の前；ｂ）請求項１２の工程ｂにおける、該濾過可能な液体の該濾過後であるが、請求項１２の工程ｄにおける、該真菌細胞の前記破砕の前；またはｃ）請求項１２の工程ｂにおける、該濾過可能な液体の該濾過の前、および請求項１２の工程ｂにおける該濾過可能な液体の該濾過後であるが、請求項１２の工程ｄにおける、該真菌細胞および該ガラスマイクロファイバーフィルターの該破砕の前の両方、のいずれかで行なわれる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００７年１１月１６日に出願された米国仮出願第６１／００３，３４５号からの優先権を主張するものであり、これはその全体が参照により本明細書に加入される。
本発明は、微生物学および分子生物学の分野における、サンプルの分析試験に関する。特に、本発明は、サンプルの細胞内の核酸成分の後の分析のために濾過可能な液体の形態にある、酵母および真菌細胞サンプルを調製することに関する。
【背景技術】
【０００２】
食品および他の種類のサンプル中の病原体の分析および検出は、多数の局面を含む。１つの局面は、しばしば、検出可能な（またはより容易に検出可能な）レベルになるまでサンプル中の標的微生物の数を増加させるために、食品サンプルを増殖させ、そして富化することを含む。例えば、特許文献１；特許文献２；特許文献３；特許文献４；および２００２年１０月３０日に公開された特許文献５は、このようなサンプルの富化および前富化（ｐｒｅ−ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を議論する。
【０００３】
食品および他の種類のサンプル中の病原体の分析および検出の別の局面は、このような細胞が好都合にさらに処理され得るような、サンプル中の細胞の単離または回収に関し、分析が細胞の細胞内成分に関する場合、この処理は細胞の破砕を含み得る。例えば、サンプルアリコートが酵母、真菌細胞または胞子を含み、そして細胞または胞子内に含まれる核酸を分析することが所望される場合、細胞または胞子は、場合により富化され、次いでそれらの細胞内内容物（核酸を含む）を放出させるために、回収され、そして粉砕されなければならない。分析前に真菌細胞を回収する方法は、しばしば、例えば、真空濾過を使用する濾過を含む。次いで、細胞および真菌細胞の胞子を含む回収された濾過保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）は、伝統的に、細胞破砕の前に、典型的に濾紙を含む濾過媒体の表面から取り出されなければならない。
【０００４】
細胞破砕の１つの方法は、溶液中に細胞内内容物を放出するために、細胞または胞子が細胞または胞子の細胞壁、細胞膜、および他の構造物成分を機械的に破砕する力を受けることを含む。例えば、参考文献  特許文献６および特許文献７に記載されるように「ビーズ破砕（ｂｅａｄ  ｂｅａｔｉｎｇ）」として当該分野で称される技術において、細胞または胞子を含むサンプル溶液は、物理的破砕要素を有する容器に導入される。細胞または胞子を破砕し、そしてそれらの内容物を放出するように十分に、サンプル溶液を細胞または胞子と破砕要素との間で破壊的接触が生じるように撹拌する。場合により、残っている細胞残屑の破砕またはさらなる消化を完結するために、このような機械的破砕の後に、化学的または酵素的溶解が続き得る。
【０００５】
典型的な先行技術方法において、場合により、前もって富化され、そして濾過されているサンプル溶液を、破砕ビーズを含む試験管に導入し得る。次いで、標的微生物およびビーズを含む混合溶液は、細胞を物理的に破砕する力の適用（例えば、遠心分離、ボルテックスなど）を受ける。次いで、破砕した細胞内容物（例えば、放出された核酸）を含む溶液は、ＰＣＲベースの検出分析を含む分析に適切である。
【０００６】
藻類に関するいくつかの先行技術方法において、まず始めに濾過媒体からフィルター保持物を取り出すことなく、濾過された細胞の破砕を実施する、すなわち、フィルター全体および付随する（ａｃｃｏｍｐａｎｙｉｎｇ）保持物を破砕する。例えば、まず始めに濾過媒体から保持物を取り出さない、濾過媒体上の藻類の細胞破砕に関する方法は、非特許文献１；非特許文献２；および非特許文献３に記載されている。これらの先行技術方法において、藻類を、ガラスファイバーフィルター（例えば、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）
ＧＦ／Ｆフィルター）上に濾過し、次いで、フィルターを物理的破砕容器（例えば、Ｖｉｂｒｏｇｅｎ  ＩＶビーズミル）に入れ、ここで、このフィルターおよび付随する細胞は、ビーズ破砕により破砕される。注目すべきは、濾過媒体から保持物を事前に取り出さずに藻類を破砕することを含む引用文献では、この技術は、特に、さらなる分析のために、クロロフィルおよび色素を放出させ、そしてキャラクタライズするのに利用されるが、核酸を放出させ、そして試験するのに利用するものではないことである。
【０００７】
食品および他の種類のサンプル中の病原体の分析および検出のさらなる局面は、細胞が得られた後に利用される実際的検出方法に関する。しばしば、検出方法は核酸増幅のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用するものが使用される。このような検出方法の１つは、ＰＣＲ増幅産物の融解曲線分析を含み、この方法は、ＰＣＴ公開番号特許文献８および特許文献９ならびに特許文献１０に詳細に記載される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第６，３１２，９３０号
【特許文献２】ＷＯ  ９８／２０１４８
【特許文献３】米国特許第５，８４３，６６９号
【特許文献４】米国特許第５，１４５，７８６号
【特許文献５】欧州特許第１  ２５３  ２０３号
【特許文献６】ＷＯ  ９８／１１２５７
【特許文献７】ＷＯ  ２００３００８６３６
【特許文献８】ＷＯ９７／１１１９７
【特許文献９】ＷＯ００／６６７７７
【特許文献１０】米国特許第６，３１２，９３０号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｓｃｈｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒｅｅｎ  ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ  ｃｏｌｏｎｉｚｉｎｇ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｆａｃａｄｅｓ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ  ＆  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，ｖｏｌ．５５，ｐｐ．２１３−２２（２００５）
【非特許文献２】Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｐｉｄ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ａｎｄ  ｔｒｏｐｈｉｃ  ｌｉｎｋａｇｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｈｙｔｏｐｌａｎｋｔｏｎ，ｚｏｏｐｌａｎｋｔｏｎ  ａｎｄ  ａｎｃｈｏｖｙ（Ｅｎｇｒａｕｌｉｓ  ｅｎｃａｓｉｃｏｌｕｓ）ｌａｒｖａｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＮＷ  Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｌａｎｋｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２８，ｐｐ．５５１−６２（２００６）
【非特許文献３】Ｅｉｋｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｌｏｒｅｎｃｉｅｌｌａ  ｐａｒｖｕｌａ  ｇｅｎ．ｅｔ  ａｐ．Ｎｏｖ．（Ｄｉｃｔｙｏｃｈｏｐｈｙｃａｅ，Ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔｏｐｈｙｔａ），ａ  ｓｍａｌｌ  ｆｌａｇｅｌｌａｔｅ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｅｎｇｌｉｓｈ  Ｃｈａｎｎｅｌ，Ｐｈｙｃｏｌｏｇｉａ，ｖｏｌ．４３，ｐｐ．６５８−６８（２００４）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の要旨
本発明は、分析試験のための食品または飲料サンプルを調製する先行技術方法における時間のかかる工程の排除を可能にするので、種々の媒体中、特に食品または飲料サンプル中の真菌細胞の検出および分析に有用である。特に、細胞内成分の分析のための機械的破砕の前に、細胞を捕集する方法として濾過を使用する場合、本発明を利用することにより、細胞の破砕の前に、濾過媒体から細胞保持物を取り出す必要がなく、そして破砕後のサンプルから濾過媒体の残っている微細粒子を取り除く必要がない。本発明の方法は、定性的検出（すなわち、標的真菌細胞またはこのような細胞の成分の存在または非存在）または定量的評価（すなわち、標的細胞数またはこのような細胞の成分が存在する量の列挙）のための分析方法に適用可能である。本発明は、特定の使用および許容限度に依存するが、いずれの真菌のサンプルを富化することなしに、サンプルの、短期間富化、または長期間富化で使用され得る。そして、このような富化は、細胞の濾過前、または細胞の濾過後、またはその両方の時点で、行なわれ得る。さらに、このような富化は、分析試験に使用される方法内の任意の適切な容器中、例えば濾紙が容器に置かれた後細胞の破砕に使用されるこのような容器中、または濾過の前濾過可能な液体を保持している容器中で行なわれ得る。本発明において、真菌富化工程は、しばしば、抗菌剤（例えば、静菌剤または殺菌剤）へのサンプルの暴露を含む。
【００１１】
１つの局面において、本発明は、分析試験のために真菌細胞を含むサンプルを調製するための方法に関し、該方法は、濾過可能な液体の形態の該サンプルを調製し、濾過可能な液体を、適切な濾過媒体を使用して濾過する工程（ここで該真菌細胞は該濾過媒体上に保持物を形成する）、機械的手段により濾過媒体を破砕するのに適切な容器に濾過媒体を移す工程；該濾過媒体を微細粒子に破砕するのに十分な力を有する機械的手段を使用して、該細胞保持物および前記濾過媒体を同時に破砕する工程、を包含し；ここで、細胞保持物の真菌細胞の核酸は、残っている濾過媒体の微細粒子を事前に取り出すことなく、分析試験するのに適する。
【００１２】
好ましい実施形態において、本発明は、分析試験のために真菌細胞を含むサンプルを調製するための方法に関し、該方法は、濾過可能な液体の形態の該サンプルを調製する工程、ガラスマイクロファイバーフィルターを使用して真空濾過により濾過可能な液体を濾過する工程（ここで該真菌細胞は、該フィルター上に保持物を形成する）、ビーズ破砕を含む機械的手段によりフィルターを破砕するのに適した容器に該フィルターを移す工程；該フィルターを懸濁液中の個々のガラスファイバーに破砕するのに十分な力を有するビーズ破砕により、該細胞保持物および該フィルターを同時に破砕する工程を包含し、ここで、細胞保持物の核酸は、フィルターのガラスファイバーを取り出すことなく、ＰＣＲおよび融解曲線分析に適している。
【００１３】
当然のことながら、本発明の方法の全ての実施形態において、試験しようとする初期サンプルがすでに濾過可能な液体の形態にない場合で、その限度においてのみ、濾過可能な液体の形態にサンプルを調製する工程が必要となる。
【００１４】
好ましい実施形態の説明
本明細書中に記載されるものに類似のまたは均等の方法および材料が本発明の実施または試験において使用され得るが、適した方法および材料は本明細書中に記載される。しかし、本明細書中の材料、方法、および実施例は例示に過ぎず、そして特に記述する場合を除いて、限定すべきことを意図するものではない。
【００１５】
定義
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾がある場合、定義を含む本明細書が支配する。
【００１６】
他の記述がない限り、全ての百分率、部、比などは、質量単位である。
【００１７】
量、濃度、または他の値もしくは因子が、範囲、好ましい範囲、または好ましい上限値および好ましい下限値のリストのいずれかとして示されている場合、これは、範囲が個別に開示されているかどうかに関係なく、一対の上限範囲または好ましい値および下限範囲または好ましい値から形成される全ての範囲を特に開示するものとして理解すべきである。数値の範囲を本明細書で列挙している場合、他の記述がない限り、範囲はその端点、および範囲内の全ての整数および分数を含むものとする。本発明の範囲は、範囲を規定する場合に列挙される特定の値に限定されないものとする。
【００１８】
用語「約」が範囲の値または端点を記載するのに使用される場合、開示は、言及される特定の値または端点を含むものと理解すべきである。
【００１９】
本明細書中で使用されるように、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（こと）（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含有（する）（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（こと）（ｈａｖｉｎｇ）」、またはそれらの任意の他の変化は、それだけに限られない包含をカバーするものとする。例えば、要素のリストを含む、プロセス、方法、物品または装置はそれらの要素のみに必ずしも限定されないが、このようなプロセス、方法、物品もしくは装置を明白に記載していない、またはこれらに固有である他の要素を含み得る。さらに、それとは反対に明確に規定されない限り、「または」は、包括的な「または」を意味し、それだけに限定される「または」を意味しない。例えば、条件ＡまたはＢは、以下のいずれか１つによって満たされる。Ａが真（または存在する）およびＢが偽（または存在しない）、Ａが偽（または存在しない）およびＢが真（または存在する）、およびＡとＢの両方が真（または存在する）。
【００２０】
本発明の要素または成分を記載するために、「ａ」または「ａｎ」の使用が利用される。これは単に便宜上行われ、そして本発明の一般的な意味を与えるために行われる。この記述は、１つまたは少なくとも１つを含むように読解されるべきであり、そして他の意味があることが明らかでない限り、単数形は複数形も含む。
【００２１】
本明細書に前述される各文献は、その全体が参照により加入される。
【００２２】
用語「濾過可能な液体」は、特定の液体サンプルの濾過に選択される系に機能的に依存することが当業者により十分に理解され、そしてそれ自体として「濾過可能な液体」は、任意の液体または少なくともいくつかの成分が、選択された条件で特定の濾過媒体を通過し得る部分的な液体形態を含み得る。例えば、出発液体の粘性および粒子レベルは、液体が所望の系に対して「濾過可能な液体」であるかどうかを決定する因子である。他の重要な因子としては、選択された濾過媒体の種類が挙げられる。濾紙媒体が選択される場合、このようなフィルターの構造的完全性および構造強度、このようなフィルターの多孔率、およびこのようなフィルターの細孔径は、液体サンプルがこのような系に対して「濾過可能な液体」であるかどうかを決定するのに重要である。「濾過可能な液体」の温度は、このような液体が「濾過可能」であるかどうかに影響を与え得、そしてフィルターを横切る系に適用される圧力はまた、液体サンプルが所望の系において「濾過可能な液体」であるかどうかに影響する。
【００２３】
用語「真菌細胞」は、これらの分類内で一般に公知である全ての生物を含み、特に酵母およびカビが挙げられる。
【００２４】
用語「真菌細胞を含むサンプル」とは、限定的でないものとし、そして真菌細胞が存在し得る任意の培地または組成物の部分、一部またはアリコートを含む。出発サンプルは、液体、半液体または固体の形態であり得、そしてほんの一例として、環境サンプル（例えば、河川水または土壌；劣化している住宅資材の一部（例えば、板壁または火炉のフィルター）；工業サンプル（例えば、ライニング管からの泥または工業廃液）；または好ましくは、食品または飲料サンプル（例えば、ジュース、食肉、香辛料、または清涼飲料水）を含み得る。用語「食品」および「飲料」は、ヒト食用または動物飼料用に適した全てのアイテム（液体、固体、半固体、および懸濁液製品を含む）を含む。
【００２５】
用語「細胞内成分」とは、真菌細胞内の成分、例えばタンパク質または核酸をいう。細胞内成分はまた、細胞が破砕される場合、試験のためにアクセス可能となる酵母およびカビ細胞の細胞壁および外膜の部分を含む。
【００２６】
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、および「核酸フラグメント」は、ヌクレオチド配列の全ての種類を含む。これは、場合により、合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を含む、１本鎖または２本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを含む。ＤＮＡがポリマーの形態である場合、これらは１本またはそれ以上の鎖のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはそれらの混合物を含み得る。
【００２７】
「ポリメラーゼ連鎖反応」は、ＰＣＲと省略される。
【００２８】
用語「増幅産物」とは、プライマー依存性増幅反応の間に生産される核酸フラグメントをいう。プライマー依存性増幅の典型的な方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、または鎖置換増幅（ＳＤＡ）が挙げられる。ＰＣＲ方法が選択される場合、複製組成物は、核酸複製のための成分、例えば：ヌクレオチド三リン酸、適切な配列を有する２つ（またはそれ以上）のプライマー、熱安定性ポリメラーゼ、緩衝液、溶質およびタンパク質を含み得る。これらの試薬および核酸の増幅におけるそれらの使用手順を記載する詳細は、米国特許第４，６８３，２０２号（１９８７、Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ  ａｌ．）および同第４，６８３，１９５号（１９８６、Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ  ａｌ．）において提供されている。ＬＣＲ方法が選択される場合、次に、核酸複製組成物は、例えば：熱安定性リガーゼ（例えば、Ｔ．アクアチカス（Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）リガーゼ）、近接するオリゴヌクレオチドの２つのセット（各セットのメンバーの１つが、各標的鎖に相補的である）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ＫＣｌ、ＥＤＴＡ、ＮＡＤ、ジチオスレイトールおよびサケ精子ＤＮＡを含み得る。例えば、Ｔａｂｏｒ  ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：１０７４−１０７８（１９８５））を参照のこと。
【００２９】
用語「プライマー」とは、オリゴヌクレオチド（合成または天然）をいい、これは、相補鎖の合成がポリメラーゼにより触媒される条件下に置かれる場合、核酸合成または相補鎖に沿った複製の開始点として作用し得る。
【００３０】
用語「プローブ」とは、目的のポリヌクレオチドに相補的であり（必ずしも完全に相補的である必要はない）、そして目的のポリヌクレオチドの少なくとも１つの鎖とのハイブリダイゼーションによって二本鎖構造を形成するオリゴヌクレオチド（合成または天然）をいう。
【００３１】
用語「分析試験」は、このような細胞の存在、このような細胞の数、このような細胞の同一性、またはこのような細胞の特性に関する他の局面を決定するために細胞に適用され得る任意の試験を含む。分析試験としては、プライマー依存性増幅アッセイ法、例えば、熱サイクル法（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、およびＬＣＲ）、等温法、および鎖置換増幅（ＳＤＡ）、さらに核酸ハイブリダイゼーション法が挙げられる。分析試験としては、さらにプライマー依存性増幅産物のホモジニアス検出（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）（例えば、融解曲線分析および５’ヌクレアーゼ検出）、標準非変性ゲル電気泳動（例えば、アクリルアミドまたはアガロース）検出、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動検出、および温度勾配ゲル電気泳動検出が挙げられる。
【００３２】
本発明の方法は、以下の工程を含む：
サンプル調製
特定の真菌細胞の存在または非存在について試験しようとする製品は、まず始めに濾過可能な液体の形態でなければならないか、またはその後に濾過され得る形態となるように、濾過可能な液体の形態に変換されなければならない。例えば、製品（例えば、オレンジジュースまたは甘い飲料）は、「そのまま」使用され得るか、または濾過し易いように水または他の不活性液体の添加により所望のレベルにまで希釈され得る。しかし、固体または半固体アイテム（例えば、スープの前駆体であるペースト、またはパーソナル化粧品（ｐｅｒｓｏｎａｌ  ｃｏｓｍｅｔｉｃ）として使用されるクリーム、または加工肉の一部）はまた、液体（例えば、水）を添加され、次いで単純な撹拌、または必要な場合、強い力を使用してサンプルを物理的にブレンド、混合または「液化」することにより濾過し易くして、出発サンプルを均一系または部分的に均一系の濾過可能な液体形態に分散させ、そして破砕し得る。用語「液体」は、本明細書中では溶液または均一系の液体のみを言及する厳密な化学的な意味で限定する様式で、使用されない。出願人は、本明細書中で任意の液体形態サンプルを挙げるために用語液体を使用し、この用語は、例えば純粋な液体、不均一系分散物、溶液、コロイド懸濁液または他の流動形態を含み得る。
【００３３】
濾過
濾過可能な液体サンプルのアリコート、または大容量の濾過可能な液体サンプルでさえ、適切な濾過媒体を通して濾過される。要件および要望に依存して、サンプルは濾過前に富化されても、されなくてもよい。本発明に使用される適切な濾過媒体としては、サンプル中の真菌細胞を保持し得る細孔径を有し、そしてまた、機械的破砕工程の間に物理的に破砕され得るものが挙げられる。本発明において、フィルターは、真菌細胞の破砕の前に細胞保持物から分離される必要がないように、この後者の要件が実行される。本発明の好ましい濾過媒体は、０．５〜４．０μｍの細孔径を有するガラスマクロファイバーフィルターである。通常のベンチトップ真空濾過を使用して、濾過し、そしてビーズ破砕を使用して細胞を破砕する場合、例えば、１．６μｍの公称孔径（ｎｏｍｉｎａｌ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ）を有するワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）  ＧＦ／Ａ  ２５ｍｍガラスマイクロファイバーフィルター（カタログ＃  １８２０−０２５）が、本発明の方法に首尾よく使用される。
【００３４】
濾過とは、濾過可能な液体の残りから「保持物」と呼ばれる成分の分離を意味し、これは保持物中の粒子の大きさに基づく。保持物は、濾過媒体中の細孔を通過し得ない微粒子を含む。濾過媒体を通過するサンプルの成分は、「透過物（ｐｅｒｍｅａｔｅ）」または「濾液」と呼ばれる。本発明の場合において、保持物は真菌細胞を含む。一般に利用される濾過方法としては、真空濾過、加圧濾過、遠心濾過、ボルテックス濾過、重力分離などが挙げられる。濾過方法（濾過可能な液体の温度および濾過媒体に適用される圧力のような変動要素を含む）は当該分野でよく知られており、そして本発明における使用の範囲内にあるとされる。好ましい濾過方法は、真空濾過および遠心濾過である。
【００３５】
本発明において、濾過後、標的微生物を含む保持物残渣を取り出し、そして捕集する代わりに、付随する保持物を含む濾過媒体全体を破砕のために破砕容器に移し、このようにして、試験工程において、時間節約、さらに向上した正確さおよび再現性を提供する。当然ながら多くの現在の分析形式において、複数のサンプルが一緒に処理される。従って、濾過媒体から保持物サンプルを取り出す分離工程の省略が注目に値する実用的な価値を有する大規模で反復的な試験プロセスにおいて、本発明は格別な適用性を見出す。さらに、フィルターが濾過工程中破砕容器にすでに存在する様式で濾過が行われる場合、任意のこのような移動の必要性がない。従って、濾過媒体が破砕に適切な容器中にすでに存在していない場合、このような移動が実施される場合のみ、破砕に適切な容器への移動が本明細書中で定義される。
【００３６】
富化および増殖
少なくとも一部のサンプルを試験しようとする真菌細胞の選択的増殖を最適化する条件で、培地中に入れることを意味する富化は、任意の工程である。それが必要とされ得るいくつかの実施形態において、多くの酵母またはカビ細胞が試験しようとする出発サンプルにどの程度存在するかによって、すなわち、「標的」微生物の初期の濃度が検出可能なレベル以下である場合、富化が必要とされ得る。さらに、富化の結果として、より高濃度の「標的」微生物は検出の可能性を増すので、少数の標的生物が初期のサンプル中に存在する場合、富化は、一般に、検出のロバスト性を増加させるために所望され得る。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、富化および／または増殖は、富化、増殖、前富化、選択富化、または任意のそれらの組み合わせを含むとして理解される。富化培地におけるサンプルの富化および／または増殖は、当業者によく知られている。さらに、富化および／または増殖のプロトコルが当該分野で公知であり、そしてまた、公表されているＦＤＡプロトコルに開示されている。
【００３８】
本発明に従って、富化が所望または必要とされる実施形態において、富化工程は、濾過工程に先行し得るか、濾過工程に続き得るか、または濾過工程の前および後の両方で行なわれ得る。
【００３９】
細胞または胞子および濾過媒体の破砕
濾過後、保持物と共に濾過媒体を破砕容器またはチャンバーに移す。破砕容器は破砕要素を含む。破砕要素は、適用される力の存在下、それらの細胞内内容物を放出するように組織、細胞、胞子およびこのような他の細胞または細胞内成分を破砕し得る物理的要素である。
【００４０】
要素としては、微粒子ガラス、プラスチック、金属、砂、または他のミネラルベースの材料が挙げられ得る。好ましい微粒子材料は、ガラスビーズである。
【００４１】
種々の形状の微粒子材料が、本発明に使用され得る。名目上球形の微粒子要素が好ましい。鋭いエッジ、ギザギザなエッジ、または破砕プロセスに役立つ鋭くとがった先を有する微粒子要素もまた好ましい。不揃いな形状を有する破砕要素もまた、使用され得る。
【００４２】
破砕要素の大きさは変更され得るが、ガラスビーズの場合において、約０．５ｍｍの平均直径が今までのところ好ましい。一般に、破砕要素は、サンプルおよび／またはサンプル中の真菌細胞の細胞内内容物が破砕容器に放出される程度まで、細胞、組織または胞子と接触するのに有効な量で存在する。この系について、好ましい破砕容器は、好ましいバイオスペック  プロダクツ（ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）「ミニ−ビーズビーター（Ｍｉｎｉ−ＢｅａｄＢｅａｔｅｒ）」デバイスと共に使用され得る無菌の２  ｍｌプラスチック微小遠心管であり、そして好ましいビーズは、バイオスペック  プロダクツ（ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）製の０．５ｍｍ直径のジルコニアシリカビーズである。十分な力が濾過媒体および真菌細胞を機械的に破砕するのに十分な期間適用され得、それにより、細胞および濾過媒体が全方向からできる限りの力を受けるように、ビーズの大きさ、フィルターの形および破砕管の形状が、破砕プロセスの間、ビーズの最大運動を
可能にする限り、他のビーズ破砕または細胞破砕系が使用され得る。
【００４３】
１）サンプルおよび／またはサンプル中の微生物の細胞内核酸内容物が破砕チャンバー中の液体に放出されるように、破砕要素を細胞、組織または胞子と接触させ、そして２）可視的な粒子または繊維が肉眼で見えないが、破砕サンプルの微視的な検査で個々の微視的なフィルター粒子（例えば、液体中に懸濁された小さなガラスファイバー）の存在が明らかとなるように、濾過媒体が全体的に破砕されるのに十分な程度および期間、容器に力を印加することにより、破砕が行なわれる。
【００４４】
場合により、化学的破砕（例えば、界面活性剤の使用）と組み合わせて、遠心分離、超音波処理、撹拌（ｓｔｉｒｒｉｎｇ）、ボルテックス、混合、振とうまたは他の撹拌（ａｇｉｔａｔｉｏｎ）により、力を容器に与え得る。
【００４５】
検出／試験／分析
サンプルの破砕後、破砕混合物またはその部分（核酸さらに破砕濾過媒体の粒子を含む）を回収し、そしてさらなる分析、例えば、融解曲線分析またはＰＣＲ増幅産物に供する。驚くべきことに、破砕濾過媒体の懸濁した微細粒子は、任意の有意な様式で細胞内成分の検出の続くプロセスを干渉するすることはなく、それにより、さらなる分析前にこれらの粒子を取り除く必要がなくなることが見出された。
【００４６】
破砕混合物の核酸の検出は、任意の入手可能な方法（プライマー依存性増幅アッセイ法および核酸ハイブリダイゼーション法を含む）により達成され得る。種々のプライマー依存性核酸増幅法が当該分野で公知であり、これらとしては、熱サイクル方法（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、およびＬＣＲ）、等温法、ならびに鎖置換増幅（ＳＤＡ）が挙げられる。ＰＣＲが好ましい検出法である。プライマー依存性増幅の後、増幅産物は、当該分野で公知の種々の方法を使用して分析され得、この方法としては、ホモジニアス検出（例えば、融解曲線分析および５’ヌクレアーゼ検出）、標準非変性ゲル電気泳動（例えば、アクリルアミドまたはアガロース）検出、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動検出、および温度勾配ゲル電気泳動検出が挙げられる。融解曲線分析が好ましい方法である。
【００４７】
本発明の好ましい方法であるＰＣＲベースの検出は、（ａ）適切なプライマー対を使用して、サンプルのＰＣＲ増幅を行ない、真菌核酸ＰＣＲ増幅結果を生産すること；および（ｂ）工程（ａ）のＰＣＲ増幅結果を試験し、プライマー対の増幅産物を検出し、それによりプライマー対の増幅産物の陽性検出がサンプル中の標的細胞の存在を示すことを含む。
【００４８】
ＰＣＲの実行において、任意の形式において、任意の適切な核酸複製組成物（「複製組成物」）が使用され得る。ＰＣＲ増幅のための典型的な複製組成物は、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、標的特異的プライマーおよび適切なポリメラーゼを含み得る。複製組成物が液体形態である場合、当該分野で公知の適切な緩衝液を使用し得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔａｌ．１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）。あるいは、複製組成物がタブレット形態中に含まれる場合、次いで、典型的なタブレット化試薬（例えば、安定剤および結合剤）を含み得る。好ましいタブレット化技術が、米国特許第４，７６２，８５７号および同第４，６７８，８１２号に説明され、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に加入される。本発明の好ましい複製組成物は、（ａ）真菌核酸の増幅に適切な少なくとも１つのプライマー対；および（ｂ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む。
【００４９】
場合により、複製組成物は内部陽性対照を含み得る。ＰＣＲ反応内に含まれる内部陽性対照の利点は、米国特許第６，３１２，９３０号およびＰＣＴ出願番号ＷＯ  ９７／１１１９７（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に加入される）で以前に記載されており、そして以下を含む：（ｉ）対照は単一プライマーを使用して増幅され得る；（ｉｉ）対照増幅産物の量はサンプル中に含まれるあらゆる標的ＤＮＡまたはＲＮＡから独立している；（ｉｉｉ）対照ＤＮＡは手動および自動試験手順の両方において、使用の容易さおよび高度な再現性のために、他の増幅試薬と共にタブレット化され得る；（ｉｖ）対照は均一検出と共に、すなわち反応物質からの生産ＤＮＡを分離することなく使用し得る；および（ｖ）内部対照は、反応中の他の可能な増幅生成物と区別される融解プロフィールを有する。対照ＤＮＡは、プライマー依存性増幅反応において増幅を可能にする適切な大きさおよび塩基組成である。対照ＤＮＡ配列は、真菌ゲノム、または別の供給源から得てもよいが、標的増幅産物の増幅を可能にする同一条件下、再現性よく増幅されなくてはならない。対照反応は、増幅反応の検証に有用である。対照ＤＮＡの増幅は試験されるサンプルと同一の反応管内で生じ、従って、サンプルが標的陰性である、すなわち標的増幅産物が生産されない場合に、成功した増幅反応を示す。増幅反応の有意な検証を達成するために、対照ＤＮＡの適切な数のコピーを各増幅反応に含まれていなければならない。
【００５０】
場合によっては、追加的な陰性対照複製組成物を含むことが有用であり得る。陰性対照複製組成物は、複製組成物と同一の試薬を含むが、ポリメラーゼを含まない。方法が蛍光性の検出手段を利用する場合、このような対照の主要な機能は、均一形式で偽バックグラウンド蛍光をモニターすることである。
【００５１】
それらが標的ＤＮＡまたは対照ＤＮＡを増幅するのに使用されるために設計されているかどうかによって、複製組成物は修飾され得る。標的ＤＮＡを増幅する複製組成物（試験複製組成物）は、（ｉ）ポリメラーゼ（一般に、熱安定性）、（ｉｉ）標的ＤＮＡにハイブリダイズし得るプライマー対および（ｉｉｉ）増幅反応が進行するのに必要な緩衝液を含み得る。対照ＤＮＡを増幅する複製組成物（陽性対照、または陽性複製組成物）は、（ｉ）ポリメラーゼ（一般に、熱安定性）；（ｉｉ）対照ＤＮＡ；（ｉｉｉ）対照ＤＮＡにハイブリダイズし得る少なくとも１つのプライマー；および（ｉｖ）増幅反応が進行するのに必要な緩衝液を含み得る。
【００５２】
ホモジニアス検出とは、プライマー依存性増幅産物の検出に好ましい方法をいい、鋳型またはプライマーから増幅産物の分離（例えば、ゲル電気泳動法による）が必要でない。典型的に、蛍光色素の存在下、反応混合物の蛍光レベルを測定することにより、ホモジニアス検出が達成される。ホモジニアス検出としては、「リアルタイム」プライマー依存性核酸増幅（例えば、「リアルタイム」ＰＣＲおよび「リアルタイム」ＲＴ−ＰＣＲ）が挙げられ、これらの方法は、米国特許第６，１７１，７８５号および同第５，９９４，０５６号に記載されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に加入される。
【００５３】
均一検出の１つの特定の形態である融解曲線分析は、選択された時点での各増幅サイクルの間の標的増幅産物（「標的単位複製配列」）の蛍光をモニターすることにより、２本鎖核酸分子（「ｄｓＤＮＡ」または「標的」）を検出し、そして定量化する。
【００５４】
当業者によく知られているように、ｄｓＤＮＡの２本の鎖は、温度がｄｓＤＮＡの融解温度より高い場合、分離または「融解」する。ｄｓＤＮＡ分子の融解はプロセスであり、そして所定の溶液条件下、融解が温度（本明細書中以下、ＴMSと表わされる）で開始し、そして別の温度（本明細書中以下、ＴMEと表わされる）で完了する。よく知られている用語、Ｔmは、融解が５０％完了する温度を表す。
【００５５】
典型的なＰＣＲサイクルは、標的ｄｓＤＮＡが融解される変性相、温度がプライマーがいまや１本鎖の標的に結合するのに最適である、プライマーアニーリング相、および温度がＤＮＡポリメラーゼが機能するのに最適である、鎖伸長相（温度ＴEにて）を含む。
【００５６】
本発明に従って、ＴMSはＴEより高くなければならず、そしてＴMEは、ＤＮＡポリメラーゼが加熱不活性化される温度より低く（しばしば、実質的に低い）なければならない。融解特徴は、所定のｄｓＤＮＡ分子の固有特性（例えば、デオキシヌクレオチドの組成およびｄｓＤＮＡの長さ）により影響される。
【００５７】
挿入色素は、２本鎖ＤＮＡに結合する。色素／ｄｓＤＮＡ複合体は、適当な励起波長の光（色素依存性である）に曝露される場合、蛍光を発し、そして蛍光強度は、ｄｓＤＮＡの濃度に比例し得る。ＤＮＡ挿入色素の使用を利用して、ｄｓＤＮＡを検出し、定量化する方法は、当該分野で公知である。多くの色素が公知であり、そしてこれらの目的のため当該分野で使用される。本方法もまた、このような関係を利用する。このような色素の例としては、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ−Ｉ(R)、エチジウムブロマイド、ヨウ化プロピジウム、ＴＯＴＯ(R)−１｛キノリニウム，１−１’−［１，３−プロパンジイルビス［（ジメチルイミニオ）−３，１−プロパンジイル］］ビス［４−［（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）メチル］］−，テトラヨード｝、およびＹｏＰｒｏ(R)｛キノリニウム，４−［（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾキサアゾリリデン）メチル］−１−［３−（トリメチルアンモニオ）−プロピル］，ジヨージド｝が挙げられるが、これらに限定されない。モレキュラー  プローブ  インク（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）により製造されるＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ−Ｉ(R)のような非不斉シアン化色素が、本発明に最も好ましい。
【００５８】
温度の上昇に伴った蛍光の変化をモニターすることにより、融解曲線分析は達成される。温度が標的単位複製配列に特異的なＴMSに達する場合、ｄｓＤＮＡは変性し始める。ｄｓＤＮＡが変性する場合、挿入色素は、ＤＮＡから解離し、そして蛍光が減少する。温度に対してプロットされた温度変化で除された、蛍光の対数値の変化の負の数理解析から、融解曲線として公知のグラフピークを得る。次々に融解曲線を使用して、標的ｄｓＤＮＡの存在および量を決定し得、ここから、標的生物の存在およびレベルを決定し得る。この方法は非常に特異的かつ高感度である。検出可能な標的ｄｓＤＮＡの最小数は、典型的な反応条件および体積下、１から１０の間である。
【００５９】
好ましい実施形態において、ＰＣＲおよびＤＮＡ融解曲線分析を使用して、特に、クアリコン  インク（Ｑｕａｌｉｃｏｎ  Ｉｎｃ）（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）製のバックス(R)システム（ＢＡＸ(R)Ｓｙｓｔｅｍ）ハードウェアおよび試薬タブレットを用いてホモジニアス検出を行なう。システムの詳細は、米国特許第６，３１２，９３０号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９７／１１１９７およびＷＯ  ００／６６７７７に公表され、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に加入される。
【００６０】
別のホモジニアス検出法は、米国特許第５，８０４，３７５号、同第５，５３８，８４８号、同第５，４８７，９７２号、および同第５，２１０，０１５号（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に加入される）に説明されるような５’ヌクレアーゼ検出法である。
【００６１】
種々の他のＰＣＲ検出法が当該分野で公知であり、これらとしては、標準非変性ゲル電気泳動（例えば、アクリルアミドまたはアガロース）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動、および温度勾配ゲル電気泳動が挙げられる。標準非変性ゲル電気泳動は、ＰＣＲ検出の単純かつ迅速な方法であるが、全ての適用に適切ではないかもしれない。
【００６２】
変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）は、小さいＤＮＡフラグメント（２００〜７００ｂｐ）の変性挙動における相違を検出する分離方法である。分離の原理は、フラグメント長およびヌクレオチド配列の両方に基づく。同じ長さのフラグメントにおいて、１つの塩基対ほどの小ささの相違が検出され得る。これは、非変性ゲル電気泳動と対照的であり、ＤＮＡフラグメントは、サイズによってのみ分離される。ＤＮＡ分子間の電荷密度の相違が中性に近く、そしてそれらの分離においてほとんど機能しないので、非変性ゲル電気泳動のこの制限が生じる。ＤＮＡフラグメントのサイズが増大するにつれ、ゲルを通るその速度が低下する。
【００６３】
ＤＧＧＥは、第一に、それらの変性プロファイルおよび配列に基づいて、同じサイズのＤＮＡフラグメントを分離するために使用される。加熱または化学的変性が適用される場合、ＤＧＧＥを使用して、ＤＮＡ分子の２本の鎖が分離または融解される。ＤＮＡ２本鎖の変性は、２つの因子により影響される：１）相補塩基対間で形成される水素結合（ＧＣリッチ領域は、ＡＴリッチである領域より高い変性条件で融解するため）；および２）同じ鎖の近接塩基間の誘引、または「スタッキング」。結果として、ＤＮＡ分子は、それらのヌクレオチド配列により決定される、各々、それらの個々の特徴的変性条件を有するいくつかの融解ドメインを有し得る。ＤＧＧＥは、特異的変性ドメイン内の１個のみのヌクレオチドを除いて、同じ長さおよびＤＮＡ配列を有する他の同一のＤＮＡ分子が、異なる温度またはＴｍで変性するという事実を利用する。従って、２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡフラグメントが、増加勾配の化学変性剤を通って電気泳動されると、変性し始め、構造変化および移動変化の両方を受ける。分子の１本鎖部分の分枝構造はゲルマトリックスにおいてもつれるので、ｄｓＤＮＡフラグメントは、変性１本鎖（ｓｓ）ＤＮＡフラグメントより速く移動する。変性環境が増大するにつれ、ｄｓＤＮＡフラグメントは完全に解離し、そしてゲルを通る分子の移動は、ＤＮＡ鎖の特定の低変性ドメインが解離する変性濃度で遅れる。実際には、電気泳動は一定温度（約６０℃）で実施され、そして化学変性剤は、変性されるＤＮＡ分子が１００％となる濃度で使用される（すなわち、４０％のホルムアミドおよび７Ｍの尿素）。この可変変性勾配は、各ＤＧＧＥゲルの組成が０％の変性剤から１００％の変性剤まで徐々に変化するよう、勾配マーカーを使用して作製される。もちろん、低減された範囲の変性剤（例えば、３５％〜６０％）を含む勾配もまた、ＤＮＡの分離の増大のためにかけられ得る。
【００６４】
ＤＧＧＥにおいて使用される原理はまた、化学的変性剤勾配の代わりに温度勾配を用いる第２の方法にも適用され得る。この方法は、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）として公知である。この方法は、ｄｓＤＮＡからｓｓＤＮＡへの構造変化を誘導し、異なる配列を有する等しい大きさのフラグメントを分離する温度勾配を使用する。ＤＧＧＥにおいて見られるように、異なるヌクレオチド配列を有するＤＮＡフラグメントは、ゲル中の異なる位置で固定される。プライマーデザインのバリエーションを有利なように利用して、ＰＣＲ産物の特性付けおよび同定のためのＤＧＧＥの有用性を増大し得る。プライマーデザインのバリエーションを使用するこれらの方法および原理は、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｅｎｒｙ  Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ  Ｅｄ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，７１〜８８頁（１９８８））に記載されている。
【００６５】
キット形式における本発明の包装
さらなる実施形態において、本発明は、「キット」形式に適しており、ここでキットは所定の量の選択された富化／増殖培地を含む容器を含む。所定の量の選択された富化／増殖培地は、富化される特定の種類のサンプルおよびそれらに関連する富化プロトコルに基づく。容易に破砕され易いガラスファイバーベースのフィルターもまた、「キット」に含まれる。さらに、「キット」は、有効量の破砕要素をさらに含む容器を含む。破砕要素の性質および量は、容器が受ける破壊的な力の適用により、サンプルを実質的に破砕するか、またはさらなる分析を模索する細胞内成分を実質的または完全に放出するのに有効であるべきである。場合により、キットは、核酸の分析を実施するのに必要な試薬（バックス（ＢＡＸ）(R)薬試タブレットを含む）をさらに含み得る。
【実施例】
【００６６】
本発明を、以下の実施例で説明する。実施例において言及される全ての部、百分率などは、他の指示がない限り質量単位である。
【００６７】
実施例１
濾過媒体およびビーズミル機（ｂｅａｄ  ｍｉｌｌｉｎｇ  ｍａｃｈｉｎｅ）の評価
種々の濾過媒体（例えば、膜）およびベンチトップビーズミル機を、標準ＢＡＸ  ＳｙｓｔｅｍTM酵母およびカビ破砕管を使用して、封入された真菌細胞の効率的な破壊を可能にするのに十分な濾過媒体（膜）を破砕するための機械／膜組合せ能力について評価した。
２５ｍｍ円形の膜濾過媒体を、酵母およびカビ破砕管に入れ（実施例２に記載されるように）、そして１５分間ビーズ破砕した（ｂｅａｄ−ｂｅａｔｅｎ）。
【００６８】
【表１】
0005659018.tif 000002
【００６９】
指示「Ｎｅｇ」とは、肉眼検査で、フィルターがプロセスによって破砕されていなかったことを意味する。指示「Ｐｏｓ」とは、肉眼検査で、管中の液体が乳状液体に見え、そして微視的検査により、懸濁液中の小さな個々のガラスファイバーが明らかにされたことを意味する。膜材料を破砕する唯一の組合せは、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）  ＧＦ／Ａフィルターとバイオスペック  プロダクツ（ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）製のミニ−ビーズビーター（Ｍｉｎｉ−ＢｅａｄＢｅａｔｅｒ）−１TMまたはミニ−ビーズビーター（Ｍｉｎｉ−ＢｅａｄＢｅａｔｅｒ）−９６TMのいずれかであった。
【００７０】
実施例２
酵母細胞濃度の検出および測定
酵母サッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を使用して、種々の汚染レベルでフレーバー水飲料を人工的に汚染した。フィルター上のこれらの酵母を捕獲した後、生じる核酸増幅産物の融解曲線分析の利用により、酵母の存在を検出した。特に、クアリコン  インク（Ｑｕａｌｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．）製のバックス（ＢＡＸ）(R)  システムハードウェアおよび試験タブレットを使用して、この融解曲線検出を行なった。
【００７１】
各汚染レベルからの飲料（３０ｍＬ）を、（ワットマン  インク（Ｗｈａｔｍａｎ，Ｉｎｃ．），Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）製の１．６μｍ  公称孔径を有する２５ｍｍ−ＧＦ／Ａガラスマイクロファイバーフィルターに通して濾過した。次いで、以下を含む２−ｍＬスクリューキャップ管にフィルターを入れた：
（ｉ）０．４〜０．６ｍｍジルコニア／シリカビーズ（セイント−ゴバイン（Ｓａｉｎｔ−Ｇｏｂａｉｎ）  Ｃｅｒａｍｉｃｓ  ＆  Ｐｌａｓｔｉｃｓ，Ｎｏｒｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，Ｍａｓｓから得たＥＲ１２０Ｓ）（１．０ｍＬ）；
（ｉｉ）バターフィールド（Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ）のリン酸緩衝化生理食塩水（１ｍＬ）；および
（ｉｉｉ）バックス（ＢＡＸ）TM  ＤＮＡ安定剤（０．０５ｍＬ）。
【００７２】
次いで、酵母細胞およびフィルターの両方を破砕するミニ−ビーズビーター（Ｍｉｎｉ−ＢｅａｄＢｅａｔｅｒ）（ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，Ｏｋｌａ）で管を５分間処理した。
【００７３】
続いて、液体（６００μＬ）を新しい容器に移し、そして製造者のプロトコルに従ってインビトロジエン  チャージスイッチ(R)（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ(R)）血清キット（インビトロジエン  コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ），Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ製）を使用して、破砕した酵母細胞由来のＤＮＡを捕集した。ＤＮＡをバックス（ＢＡＸ）TM溶解緩衝液（１００μＬ）中に溶出した。溶出したＤＮＡ（５０μＬ）を使用して、バックスシステム（ＢＡＸ  Ｓｙｓｔｅｍ）TM酵母およびカビタブレットを水和させた。次いで、増幅および分析をバックス（ＢＡＸ）TM機器で行なった。
【００７４】
【表２】
0005659018.tif 000003
【００７５】
これらの結果は、本発明の方法が陰性対照（０細胞／ｍＬ）サンプルについて偽陽性結果を示すことなく、利用される最も低レベルの真菌細胞（３３細胞／ｍＬ）に至るまで首尾良く検出可能であったことを実証する。
【００７６】
実施例３
本発明に従って調製されたサンプルのＰＣＲ分析
この実験において、富化されているおよび富化されていない（すなわち、直接試験）試験に有用な方法の例が決定された。第一の工程において、濾過可能な液体（サンプル）を２５−ｍｍ  ＧＦ／Ａ  ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）マイクロファイバーフィルターに通して濾過する。使い捨てのフィルター漏斗もまた使用し得る。干渉物質が存在することが疑われる場合、さらなる体積のバターフィールド（Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ）のリン酸緩衝化生理食塩水またはペプトン水をフィルターに通し、酵母およびカビを保持しながら干渉材料の洗い出しを実行し得る。
【００７７】
第二の工程において、清潔な（ゼロトレランス適用のための滅菌）鉗子を使用して、フィルターをユニットから取り出す。直接試験および富化試験のための特定のプロトコルを以下に示す。
【００７８】
直接試験
直接試験（すなわち、サンプルの富化なし）は、１０００細胞／ｍＬを超える濾過体積で定量的である。しかし、より感度の高い直接アッセイのために、バックスシステム（ＢＡＸ  Ｓｙｓｔｅｍ）TMＤＮＡ捕獲キットを使用し得る。内容物をビーズのみの破砕管に移す。ＤＮＡ  スタビライザープラス（Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ  Ｐｌｕｓ）（５０μＬ）を管に添加する。次いでバターフィールド（Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ）のリン酸緩衝液またはペプトン水（１．２ｍＬ）を管に添加し、そして管に蓋をする。管をミニ−ビーズビーター（Ｍｉｎｉ−ＢｅａｄＢｅａｔｅｒ）−９６TMの管ホルダーアダプターに置き、そして所定の位置に締め付ける。ビーズ破砕を１０分間行ない、次いで微小遠心管中で１分間回転させる。ビーズ破砕サンプル（２０μＬ）を溶解試薬（プロテアーゼを含む溶解緩衝液）（２００μＬ）に移し、次いで３７℃で２０分間、および９５℃で１０分間インキュベートする。サンプルを冷却ブロック（ｃｈｉｌｌｅｒ  ｂｌｏｃｋ）上で５分間冷却する。サンプル（５０μＬ）を、冷却ブロック上のバックスシステム（ＢＡＸ  Ｓｙｓｔｅｍ）TM酵母およびカビタブレットに添加する。管の蓋を閉め、次いで酵母およびカビ直接サイクルを実行する。
【００７９】
富化後試験
富化培地を含むバックス（ＢＡＸ）破砕管にフィルターを移し、そして２５℃で４４時間インキュベートする。ＤＮＡ  スタビライザープラス（Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ  Ｐｌｕｓ）（２５μＬ）を管に添加する。管をミニ−ビーズビーター（Ｍｉｎｉ−Ｂｅａｄ−Ｂｅａｔｅｒ）−９６TMの管ホルダーアダプターに置き、そして所定の位置に締め付ける。ビーズ破砕を１０分間行ない、次いで微小遠心管中で１分間回転させる。ビーズ破砕サンプル（２０  μＬ）を溶解試薬（プロテアーゼを含む溶解緩衝液）（２００μＬ）に移し、次いで３７℃で２０分間、および９５℃で１０分間インキュベートする。サンプルを冷却ブロック上で５分間冷却する。サンプル（５０μＬ）を、冷却ブロック上のバックスシステム（ＢＡＸ  Ｓｙｓｔｅｍ）TM  酵母およびカビタブレットに添加する。管の蓋を閉め、次いで酵母およびカビ直接サイクルを実行する。
【００８０】
実施例４
種々の型のフィルターを使用する液体サンプル中の酵母の検出
この実験において、酵母サッカロミセスセレビシエを使用して、種々の汚染レベルでフレーバー水飲料を人工的に汚染した。４つの汚染レベルを使用し、さらにスパイク（ｓｐｉｋｅ）していない酵母細胞を含む陰性対照を使用した。次いで、各々のこれらの汚染サンプルの二連（duplicate）のアリコート（５ｍＬ）をワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）  ＧＦ／Ａガラスマイクロファイバーフィルター（本発明の方法下で破砕されることが上記の表Ｉに示される）またはポールスーポア（Ｐａｌｌ  Ｓｕｐｏｒ）フィルター（本発明の方法下で適切に破砕されていないことが上記の表Ｉに示される）に通して濾過した。次いで、フィルターをバックス（ＢＡＸ）(R)酵母およびカビ破砕管に移し、そして上述実施例３の直接試験法で概説した破砕プロトコルに従って処理した。また、実施例３で記載したように、フィルター／サンプルから遊離したＤＮＡの量および各サンプル中の酵母の存在／非存在を核酸増幅産物の融解曲線分析を利用して検出した。
【００８１】
【表３】
0005659018.tif 000004
【００８２】
結果は、スーポア（Ｓｕｐｏｒ）フィルター媒体（これは、破砕の間、インタクトなままである）が破砕プロセス中、酵母細胞からの効率的なＤＮＡ放出に干渉したことを実証する。これはフィルター上に２，０００細胞またはそれ以下しか存在しない場合に得られる陰性結果によって証明されるように、出発サンプル中の生物のより低い検出感度を順に引き起こす。対称的に、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）ガラスマイクロファイバーフィルターは、破砕プロセス中に完全に破壊され、細胞からのより効率的なＤＮＡ放出を可能にし、その結果として、サンプル中の汚染細胞のより高い感度の検出を可能にし、これらのフィルターはフィルター上の２，０００細胞、または２００細胞でさえ検出可能にする。従って、検出感度は、ガラスマクロファイバーフィルターの使用により、１〜２桁増大する。
【００８３】
実施例５
濾過可能な液体中の酵母検出
この実験において、本発明の分析手順を参照手順と比較した。本発明において、酵母およびカビサンプル（すなわち、濾過可能な液体）は、４４時間  バックス（ＢＡＸ）TM−富化された。参照手順は、５日間の富化期間に従う。
【００８４】
ダサニ（Ｄａｓａｎｉ）TMブランドの無炭酸ラズベリーフレーバー水の８つのボトルを、５コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ボトルの標的レベルで、酵母サッカロミセスセレビシエでスパイクした。ボトルに１〜８のラベルを付けた。２つのボトルをスパイクせずに置いておいた。これらにＹ１およびＹ２のラベルを付けた。
【００８５】
参照手順
ボトル１〜４（スパイクした）および１つのスパイクしていないボトル（Ｙ１）の全ての内容物を、各々０．４５−μｍ細孔径、４７−ｍｍ直径ニトロセルロース膜に通して濾過した。
【００８６】
濾過後、フィルターをジクロランローズベンガルクロラムフェニコール（ＤＲＢＣ）寒天プレート上に置き、そして２５℃で５日間インキュベートした。５日後、コロニーを計数した。
【００８７】
本発明の手順
ボトル５〜８および１つのスパイクしていないボトル（Ｙ２）の全ての内容物を、各々滅菌２５−ｍｍ  ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）  ＧＦ／Ａフィルター（カタログ＃１８２０−０２５；２５−ｍｍガラスマイクロファイバー（ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｅ）フィルター）に通して濾過した。
【００８８】
濾過に続いて、フィルターをバックスシステム（ＢＡＸ  Ｓｙｓｔｅｍ）(R)酵母およびカビ破砕管に入れた。管は、増殖培地および破砕ビーズを含んだ。フィルターを２５℃で４４時間インキュベートした。続いて、バックスシステム（ＢＡＸ  Ｓｙｓｔｅｍ）TMＤＮＡ安定剤（５０μｌ）を各管に添加した後、バイスペック（ＢｉｏＳｐｅｃ）  ミニビーズビーター（Ｍｉｎｉ−ＢｅａｄＢｅａｔｅｒ）  ９６TMで１０分間ビーズ破砕した。
【００８９】
ビーズ破砕の工程に続いて、製造者によって説明されているように、バックスシステム（ＢＡＸ  Ｓｙｓｔｅｍ）TM酵母およびカビキットを使用して、真菌（酵母およびカビ）ＤＮＡの存在について、材料を分析した。
【００９０】
参照手順および本発明の手順を使用する分析結果を、表ＩＶに示す。
【００９１】
【表４】
0005659018.tif 000005
【００９２】
スパイクした４４時間富化サンプル（ボトル５〜８）の全ては陽性であり、そしてスパイクしていない（ブランク；Ｙ１およびＹ２））は陰性であった。バックスシステム（ＢＡＸ  Ｓｙｓｔｅｍ）TM酵母およびカビアッセイは、４４時間の富化後、大容量の濾過可能な液体中の低レベルの真菌を検出し得る。この結果は、参照手順を利用して得たものに匹敵する。
【００９３】
実施例６
濾過可能な液体中のカビ検出
この実験において、本発明の分析手順を参照手順と比較した。本発明において、酵母およびカビサンプル（すなわち、濾過可能な液体）は、４４時間  バックス（ＢＡＸ）(R)−富化された。参照手順は、５日間の富化期間に従う。
【００９４】
ボトル入りの濾過可能な飲料水の２０のボトルを、５  ＣＦＵ／ボトルの標的レベルで、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）でスパイクした。ボトルに１〜２０のラベルを付けた。２つのボトルをスパイクせずに置いておいた。これらにＭ１およびＭ２のラベルを付けた。
【００９５】
参照手順
ボトル１〜１０（スパイクした）および１つのスパイクしていないボトル（Ｍ１）の全ての内容物を、各々０．４５−μｍ細孔径、４７−ｍｍ直径ニトロセルロース膜に通して濾過した。
【００９６】
濾過後、フィルターをジクロランローズベンガルクロラムフェニコール（ＤＲＢＣ）寒天プレート上に置き、そして２５℃で５日間インキュベートした。５日後、コロニーを計数した。
【００９７】
本発明の手順
ボトル１１〜２０および１つのスパイクしていないボトル（Ｍ２）の全ての内容物を、各々滅菌２５−ｍｍ  ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）  ＧＦ／Ａフィルター（カタログ＃１８２０−０２５；２５−ｍｍガラスマイクロファイバー（ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｅ）フィルター）に通して濾過した。
【００９８】
濾過工程に続いて、フィルターをバックスシステム（ＢＡＸ  Ｓｙｓｔｅｍ）(R)酵母およびカビ破砕管に入れた。管は、増殖培地および破砕ビーズを含んだ。フィルターを２５℃で４４時間インキュベートした。続いて、バックスシステム（ＢＡＸ  Ｓｙｓｔｅｍ）TMＤＮＡ安定剤（５０μｌ）を各管に添加した後、バイオスペック（ＢｉｏＳｐｅｃ）  ミニ−ビーズビーター（Ｍｉｎｉ−Ｂｅａｄ−Ｂｅａｔｅｒ）  ９６TMで１０分間ビーズ破砕した。
【００９９】
ビーズ破砕の工程に続いて、製造者によって説明されているように、バックスシステム（ＢＡＸ  Ｓｙｓｔｅｍ）TM酵母およびカビキットを使用して、真菌（酵母およびカビ）ＤＮＡの存在について、材料を分析した。
【０１００】
参照手順および本発明の手順を使用する分析結果を、表Ｖに示す。
【０１０１】
【表５】
0005659018.tif 000006
【０１０２】
４〜１０の範囲の実際の数のＣＦＵ／ボトルは、従来のプレーティング結果に基づいた。新規なシステムで試験された全てのスパイクボトルは、陽性であった。バックスシステム（ＢＡＸ  Ｓｙｓｔｅｍ）TM酵母およびカビキットは、陰性（スパイクしていない）サンプルの偽陽性結果を示すことなく、濾過可能な液体中の少数の真菌胞子の存在を首尾良く検出した。この結果は、参照手順を利用して得られたものに匹敵する。