(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式：
Ｂ−Ｌ−Ａ
〔式中、Ｂは、標的細胞受容体に結合する１つ以上の葉酸受容体結合リガンドを表し、Ｌは、３つのポリヒドロキシル基を含む多価リンカーであり、そしてＡは、望ましくは細胞に送達される、１つ以上の診断、治療又は画像化剤を表す〕
で示される化合物。
【請求項２】
薬剤Ａのうちの少なくとも１つが、治療剤、診療剤又は画像化剤である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
薬剤Ａのうちの少なくとも１つが、癌を治療するための治療剤である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ａが、癌を治療するための複数の治療剤を表す、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
結合リガンドＢが、葉酸である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｌが、１つ以上のアスパラギン酸、１つ以上のグルタミン酸、１つ以上のアルギニン、若しくは１つ以上のベータアミノアラニン、又はそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｌが１つ以上のベータアミノアラニンをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｌが１つ以上の二価１，４−ピペラジンをさらに含み、１，４−ピペラジンの少なくとも一部が、結合リガンド（Ｂ）のうちの少なくとも１つと薬剤（Ａ）のうちの少なくとも１つとを連結する原子の鎖に含まれている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｌが少なくとも１つのアルギニンをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｌが１つ以上のトリアゾール結合ポリヒドロキシル基含有リンカーをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｌが１つ以上のアミド結合ポリヒドロキシル基含有リンカーをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｌが１つ以上のＥＤＴＡ誘導体をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｌが、下記からなる群より選択される式：
【化１】
0005690589.tif 000194
〔式中、ｍは、それぞれの場合に１〜８から独立して選択される整数であり、ｐは、それぞれの場合に１〜１０から選択される整数であり、そしてｎは、それぞれの場合に１〜３から独立して選択される整数である〕
をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１４】
３つのポリヒドロキシル基が、下記からなる群：
【化２】
0005690589.tif 000195
〔式中、Ｒは、Ｈ、アルキル、シクロアルキル又はアリールアルキルであり、ｍは、それぞれの場合に１〜３から独立して選択される整数であり、ｎは、１〜５から選択される整数であり、ｐは、１〜５から選択される整数であり、そしてｒは、１〜３から選択される整数である〕
より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１５】
３つのポリヒドロキシル基が、下記からなる群：
【化３】
0005690589.tif 000196
〔式中、ｐは１〜５から選択される整数である〕
より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１６】
３つのポリヒドロキシル基が、下記からなる群：
【化４】
0005690589.tif 000197
〔式中、ｎは、それぞれの場合に２〜５から独立して選択される整数であり、ｐは、１〜５から選択される整数であり、そしてｒは、それぞれの場合に１〜４から独立して選択される整数であり、ただし、ｎはｒ＋１以下である〕
より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１７】
３つのポリヒドロキシル基が、下記からなる群：
【化５】
0005690589.tif 000198
〔式中、ｎ及びｒは、それぞれ、１〜３から選択される整数であり、ただし、ｎはｒ以下である〕
より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１８】
３つのポリヒドロキシル基が、下記からなる群：
【化６】
0005690589.tif 000199
より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１９】
３つのポリヒドロキシル基が、下記からなる群：
【化７】
0005690589.tif 000200
〔式中、ｎ、ｍ及びｒは、整数であり、それぞれ独立して、それぞれの場合に１〜５から選択される〕
より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２０】
３つのポリヒドロキシル基が、下記からなる群：
【化８】
0005690589.tif 000201
〔式中、ｎ及びｒは、整数であり、それぞれ独立して、それぞれの場合に１〜５から選択され、そしてｐは、それぞれの場合に１〜４から選択される整数である〕
より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２１】
３つのポリヒドロキシル基が、下記からなる群：
【化９】
0005690589.tif 000202
〔式中、ｎは、それぞれの場合に１〜３から選択される整数であり、そしてｍは、１〜２２から選択される整数である〕
より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２２】
３つのポリヒドロキシル基が、下記からなる群：
【化１０】
0005690589.tif 000203
〔式中、ｎ及びｒは、整数であり、それぞれ独立して、それぞれの場合に１〜５から選択され、そしてｐは、１〜４から選択される整数である〕
より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２３】
３つのポリヒドロキシル基が、下記からなる群：
【化１１】
0005690589.tif 000204
〔式中、Ｒは、Ｈ、アルキル、シクロアルキル又はアリールアルキルであり、ｍは、それぞれの場合に１〜３から独立して選択される整数であり、ｎは、それぞれの場合に１〜６から独立して選択される整数であり、ｐは、１〜５から選択される整数であり、そしてｒは、１〜３から選択される整数である〕
より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２４】
３つのポリヒドロキシル基が、下記からなる群：
【化１２】
0005690589.tif 000205
〔式中、ｎ１及びｎ２は、それぞれの場合に０〜３から独立して選択される整数であって、ただし、ｎ１及びｎ２が同時に０とはならず、ｎ３は、それぞれの場合に０〜３から独立して選択される整数である〕
より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｌが、下記からなる群より選択される式：
【化１３】
0005690589.tif 000206
〔式中、ｎは、それぞれの場合に１〜３から独立して選択される整数である〕
をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２６】
Ｌが、下記からなる群より選択される式：
【化１４】
0005690589.tif 000207
〔式中、ｎは、それぞれの場合に１〜３から独立して選択される整数である〕
をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２７】
リンカーＬが、１つ以上の放出型リンカーを更に含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２８】
リンカーＬが、１つ以上の放出型ジスルフィドリンカーを更に含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２９】
３つのポリヒドロキシル基が、下記からなる群：
【化１５】
0005690589.tif 000208
〔式中、ｍは、それぞれの場合に１〜３から独立して選択される整数であり、ｎは、それぞれの場合に１〜６から独立して選択される整数であり、ｐは、１〜５から選択される整数であり、そしてｒは、１〜３から選択される整数である〕
より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３０】
３つのポリヒドロキシル基が、下記からなる群：
【化１６】
0005690589.tif 000209
〔式中、ｍは、それぞれの場合に１〜３から独立して選択される整数であり、ｐは、１〜５から選択される整数であり、そしてｒは、１〜３から選択される整数である〕
より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３１】
治療有効量の請求項１〜５のいずれか１項に記載の１つ以上の化合物、及び、場合によりその担体、希釈剤及び／又は賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項３２】
疾患又は状態を画像化する、治療する、診断する、又はそれらの組み合わせを行うための医薬の製造における、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物、又は請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物を含む医薬組成物を使用する方法であって、画像化、治療、診断、又はそれらの組み合わせが、少なくとも１つの葉酸受容体結合リガンドＢに結合することができる受容体を発現又は過剰発現している細胞を標的にすることを含む方法。
【請求項３３】
疾患又は状態を画像化する、治療する、診断する、又はそれらの組み合わせを行うための医薬組成物であって、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物を含むか、又は、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物と、場合によりその担体、希釈剤及び／又は賦形剤のうちの１つ以上とを含み、画像化、治療、診断、又はそれらの組み合わせが、少なくとも１つの葉酸受容体結合リガンドＢに結合することができる受容体を発現又は過剰発現している細胞を標的にすることを含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的薬剤送達に使用される組成物及び方法に関する。より詳細には、本発明は、病原性細胞集団により引き起こされる疾患状態を治療するのに使用される、親水性スペーサーリンカーを含有する薬剤送達結合体に結合する細胞表面受容体、並びにそのような結合体を使用する及び含む方法及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類の免疫系は、腫瘍細胞、他の病原性細胞及び侵入外来性病原体の認識及び排除の手段を提供する。免疫系は、通常、強力な防衛線を提供するが、癌細胞、他の病原性細胞又は感染因子は、宿主免疫反応を避け、宿主の病原性を伴って繁殖するか又は存続する場合が多い。化学療法剤及び放射線療法は、例えば複製新生物を排除するために開発されてきた。しかし、現在利用可能な化学療法剤及び放射線療法レジメンの多くは、病原性細胞を破壊するばかりでなく、造血系の細胞のような正常な宿主細胞にも影響を与えるので、有害な副作用を有する。これらの抗癌剤の有害な副作用は、病原性細胞集団に対して選択的であって宿主毒性の低減した、新たな療法を開発する必要性を強調している。
【０００３】
研究者らは、病原性細胞を破壊するために、そのような細胞を標的にする細胞毒性化合物の治療プロトコールを開発してきた。これらのプロトコールの多くは、毒素を正常細胞へ送達するのを最小限にする試みとして、病原性細胞に特有の又はそれらにより過剰発現された抗原に結合する抗体と結合させた毒素を利用する。この手法を使用して、病原性細胞の特定の抗原に対する抗体から構成され、この抗体がリシン、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素及び腫瘍壊死因子のような毒素に結合している、特定の免疫毒素が開発されてきた。これらの免疫毒素は、抗体により認識される特定の抗原を有する腫瘍細胞のような病原性細胞を標的にする（Olsnes, S., Immunol. Today, 10, pp. 291-295, 1989; Melby, E.L., Cancer Res., 53(8), pp. 1755-1760, 1993; Better, M.D., ＰＣＴ公報番号ＷＯ９１／０７４１８、１９９１年５月３０日公開）。
【０００４】
宿主における癌細胞又は外来性病原体のような病原性細胞の集団を標的にする別の手法は、独立した宿主毒性も示す場合がある化合物を投与する必要性を回避するために、病原性細胞に対する宿主の免疫反応を増強することである。一つの報告されている免疫療法の戦略は、細胞表面に抗体の定常部領域を表すため、腫瘍細胞の表面に、抗体、例えば遺伝子操作された多量体抗体を結合させ、それによって、多様な免疫系仲介プロセスにより腫瘍細胞の死滅を誘導することである（De Vita, V.T., Biologic Therapy of Cancer, 2d ed. Philadelphia, Lippincott, 1995; Soulillou, J.P., U.S. Patent 5,672,486）。しかし、これらの手法は、腫瘍特異性抗原を限定する困難さによって複雑なものとなっていた。したがって、追加の化合物及び方法が、病原性細胞集団を選択的に標的にするために必要となる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
治療剤、診断剤及び画像化剤を、他の化合物と結合して、それらのインビボにおける挙動、体内分布、代謝及び／又はクリアランスを制御又は変えうることが発見されている。本発明の一つの例示的な実施態様において、化合物の結合体は、親水性スペーサーリンカーを含むものとして記載される。一つの態様において、化合物の結合体は、親水性スペーサーリンカー及び標的リガンドの両方を含むものとして記載される。そのような結合体の例示は、以下の式：
Ｂ−Ｌ−Ａ
〔式中、Ｂは、標的細胞受容体に結合する受容体結合リガンドであり、Ｌは、１つ以上の親水性スペーサーリンカーを含むリンカーであり、そしてＡは、望ましくは細胞に送達される、診断、治療又は画像化剤である〕で示される、本明細書に記載される化合物である。
【０００６】
別の実施態様において、以下の式：
Ｌ−Ａ
〔式中、Ｌは、１つ以上の親水性スペーサーリンカーを含むリンカーであり、そしてＡは、診断、治療又は画像化剤である〕で示される非受容体結合標的化合物が、本明細書において記載される。一つの変形態様において、リンカーＬは、放出型リンカーを含まない。別の変形態様において、リンカーＬは、放出型リンカーを含む。別の実施態様において、親水性スペーサーリンカーのうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの炭水化物から形成されるか又はそれを含む。一つの変形態様において、炭水化物は、ＢとＡを連結するリンカー鎖の一部を形成する。別の変形態様において、炭水化物は、ＢとＡを連結するリンカー鎖に結合している側鎖の一部を形成する。
【０００７】
上記の実施態様のそれぞれにおいて、２つ以上の受容体結合リガンドＢが、本明細書に記載されるリンカーに結合できることが理解される。２つ以上の        が、本明細書に記載されるリンカーに結合できることが更に理解される。そのような多リガンド及び／又は多剤結合体も本明細書に記載され、ここでリンカーは、親水性スペーサーリンカーを含む。
【０００８】
別の実施態様において、肝臓への取り込みが低減され、肝臓により取り除かれる可能性が少ない化合物が、本明細書に記載される。一つの態様において、そのような化合物は、肝臓プロセスと比べて、腎臓プロセスにより優先的に取り除かれる。
【０００９】
薬剤Ａには、望ましくは又は有利に、細胞受容体を標的にすることにより細胞に送達される、治療薬、診断剤、画像化剤及び任意の他の化合物が含まれる。例示的な薬剤には、細胞毒性薬、抗炎症剤などが含まれる。例示的な診断剤及び画像化剤には、ＰＥＴ画像化剤、蛍光画像化剤、ラジオリガンド及びラジオリガンド複合体形成剤などが含まれる。
【００１０】
本明細書に記載される化合物、組成物及び方法の実施態様において、治療、診断及び／又は画像化剤Ａにより標的にされうる細胞には、癌細胞、細菌細胞、腫瘍細胞、単球、活性化マクロファージ、血管内皮前駆細胞のような前駆細胞、他の炎症性細胞、アテローム硬化プラーク、炎症などの、ただしこれらに限定されない多種多様なものが含まれる。細胞を標的化することは、細胞受容体結合リガンドＢの適切な選択により達成される。インビボにおける細胞の選択的又は特異的標的化は、標的細胞により優先的に発現されているか又は過剰発現されている受容体を選択することによって達成できることが理解される。例示的には、標的細胞は、葉酸受容体のようなビタミン受容体を優先的に発現又は過剰発現する。
【００１１】
別の実施態様において、本明細書に記載される結合体は、細胞の病原性集団と関連する疾患又は疾患状態を治療する有効量で医薬組成物に含まれる。
【００１２】
別の実施態様において、本明細書に記載される結合体及びそれを含有する医薬組成物は、細胞の病原性集団と関連する疾患又は疾患状態を治療する方法に使用される。
【００１３】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００７年６月２５日及び２００８年３月１３日にそれぞれ出願した、米国仮出願第６０／９４６，０９２号及び同第６１／０３６，１８６号（これらの開示の全体を参照により本明細書に組み込む）の米国特許法１１９条（ｅ）に基づく優先権の利益を請求する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＥＣ２３４の相対的結合親和性、葉酸（●）及びＥＣ０２３４（■）のＤＰＭを示す。
【図２】ＥＣ２５８（●）及びＥＣ２５８＋過剰葉酸（○）における、ＫＢ細胞に対するＥＣ０２５８の活性（パルス２時間／チェース７２時間）を示す。
【図３Ａ】マウスのＭ１０９腫瘍に対するＥＣ０２３４及びＥＣ０２４６の効果を、未処置対照（■）、ＥＣ１４５標準（ＴＩＷ  ３μmol/kg、３週間）（●）、ＥＣ０２３４（ＴＩＷ  ３μmol/kg、３週間）（▼）及びＥＣ０２４６（ＴＩＷ  ３μmol/kg、３週間）（▲）により示す。
【図３Ｂ】体重変化率に対するＥＣ０２３４及びＥＣ０２４６の効果を、未処置対照（■）、ＥＣ１４５標準（ＴＩＷ  ３μmol/kg、３週間）（●）、ＥＣ０２３４（ＴＩＷ  ３μmol/kg、３週間）（▼）及びＥＣ０２４６（ＴＩＷ  ３μmol/kg、３週間）（▲）で示し、総毒性は処置期間中には観察されなかったことを示唆している。
【図４Ａ】２μmol/kgをＴＩＷで２週間投与した、ＥＣ０３９６（▼）、ＥＣ１４５（▲）及びＰＢＳ対照（■）のマウスのＫＢ腫瘍容量に対する効果を示す（縦線は最終投与日を示す）。
【図４Ｂ】２μmol/kgをＴＩＷで２週間投与した、ＥＣ０３９６（▼）、ＥＣ１４５（▲）及びＰＢＳ対照（■）の体重変化率に対する効果を示し（縦線は最終投与日を示す）、総毒性は処置期間中には観察されなかったことを示唆している。
【図５Ａ】２μmol/kgをＴＩＷで２週間投与した、ＥＣ０４００（●）、ＥＣ１４５（▲）及びＰＢＳ対照（■）のＫＢ腫瘍容量に対する効果を示す（縦線は最終投与日を示す）。
【図５Ｂ】２μmol/kgをＴＩＷで２週間投与した、ＥＣ０４００（●）、ＥＣ１４５（▲）及びＰＢＳ対照（■）の体重変化率に対する効果を示し（縦線は最終投与日を示す）、総毒性は処置期間中には観察されなかったことを示唆している。
【図６Ａ】Balb/cマウスのＭ１０９腫瘍において、未処置対照（●）と比較した、２μmol/kgをＴＩＷで２週間投与したＥＣ０４２９（▽）及びＥＣ１４５（▲）の腫瘍容量に対する効果を示す（縦線は最終投与日を示す）。
【図６Ｂ】未処置対照（●）と比較した、２μmol/kgをＴＩＷで２週間投与したＥＣ０４２９（▽）及びＥＣ１４５（▲）の体重変化率に対する効果を示し（縦線は最終投与日を示す）、総毒性は処置期間中には観察されなかったことを示唆している。
【図７Ａ】Balb/cマウスの皮下Ｍ１０９腫瘍において、未処置対照（●）と比較した、２μmol/kgをＴＩＷで２週間投与したＥＣ０４３４（△）及びＥＣ１４５（▲）の腫瘍容量に対する効果を示す（縦線は最終投与日を示す）。
【図７Ｂ】未処置対照（●）と比較した、２μmol/kgをＴＩＷで２週間投与したＥＣ０４３４（△）及びＥＣ１４５（▲）の体重変化率に対する効果を示し（縦線は最終投与日を示す）、総毒性は処置期間中には観察されなかったことを示唆している。
【図８Ａ】Balb/cマウスの皮下Ｍ１０９腫瘍において、２μmol/kgをＴＩＷで２週間投与したＥＣ０３０５（●）、ＥＣ０４３６（▼）及びＰＢＳ対照（■）の腫瘍容量に対する効果を示す（縦線は最終投与日を示す）。
【図８Ｂ】２μmol/kgをＴＩＷで２週間投与した、ＥＣ０３０５（●）、ＥＣ０４３６（▼）及びＰＢＳ対照（■）の体重変化率に対する効果を示し（縦線は最終投与日を示す）、総毒性は処置期間中には観察されなかったことを示唆している。
【図９】ＰＢＳ（未処置対照）（●）、ＥＣ０４３６（ＴＩＷ  ２μmol/kg）（▲）、ＥＣ０４３６（ＴＩＷ  ２．５μmol/kg）（▼）、ＥＣ０４３６（ＴＩＷ  ３μmol/kg）（■）、ＥＣ０３０５（ＴＩＷ  ２μmol/kg）（■）、ＥＣ０３０５（ＴＩＷ  ２．５μmol/kg）（■）及びＥＣ０３０５（ＴＩＷ  ３μmol/kg）（□）により週に３回で１週間の静脈内投与により処置された、皮下Ｍ１０９腫瘍を有するBalb/cマウスの体重変化率を示す。
【図１０Ａ】ＰＢＳ処置対照（■）と比較した、ＥＣ０５６５の３μmol/kg（毎日×５回を２週間）（●）によるｎｕ／ｎｕマウスの皮下ＫＢ腫瘍に対する効果を示す。データから、Ｌｏｇ細胞死滅（ＬＣＫ）値の１．２を決定することができる（約０．７を超える値は、抗癌活性を有する化合物であることを示唆している）。
【図１０Ｂ】ＰＢＳ処置対照（■）と比較した、ＥＣ０５６５の３μmol/kg（毎日×５回を２週間）（●）による体重変化率に対する効果を示し、総毒性は処置期間中には観察されなかったことを示唆している。
【図１１】カニューレ挿入ラットの胆管アッセイの肝胆汁排泄における、２μmol/kg静脈内ボーラス投与による多様なＤＡＶＬＢＨ結合体からの総ＤＡＶＬＢＨ胆汁排泄を示す。胆汁の総用量の率を測定して、ＥＣ１４５＝８．７％（●）、ＥＣ０４０９＝７．９％（◆）、ＥＣ０４２９＝８．６％（■）、ＥＣ０４３４＝２．８％（▼）であった。加えて、ＥＣ１４５はＡＵＣ＝１０９２（●）を示し、収集最終時点は１３９分であり、ＥＣ０４３４はＡＵＣ＝２６０（■）を示し、１２０、１３５及び３６０分の時点では、定量化のレベルよりも全て低く、すなわち＜０．６５μMであった。
【図１２】リボースに基づくスペーサーの胆汁クリアランスに対する効果及び長期誘導体化の影響を示す。棒線の上の数字は、リンカーにおける親水性スペーサーの数に相当する。
【図１３】３０分間のカメラ露出を使用して、ＥＣ０５６５が、ＫＢ細胞におけるＲＰＳ６及びｐ７００Ｓ６Ｋの用量依存性阻害を誘発すること（パルス１時間／チェース４時間）を示し、ここで、Ｃ＝対照（未処置細胞）、ＦＡＣ＝葉酸対照（１００μM）である。
【図１４】メチルチオールボルテゾミブ誘導体（ＥＣ０５０１）に対するボルテゾミブの細胞毒性を示す。ＩＣ５０  ボルテゾミブ２０nM（●）、ＥＣ０５０１  ２４０nM（■）。
【図１５】親水性スペーサーリンカーが、ＲＡＷ２６４．７細胞に対するモノ−及びビス−チオ−ベルケイド葉酸結合体の特異的活性を可能にすることを示す。パルス５時間、続いてチェース７２時間の後の細胞生存率（ＭＴＴ）：ボルテゾミブ（■）、ＥＣ０５０１（□）、ＥＣ０５２２（▲）、ＥＣ０５２２＋過剰葉酸（▽）。
【図１６】ＥＣ０５９５（１３nM  ＩＣ５０）（▼）、ＥＣ０５９５＋過剰葉酸（■）、ボルテゾミブ（■）、ＥＣ０５２５（４６nM  ＩＣ５０）（●）、ＥＣ０５２５＋過剰葉酸（○）による処置の後の細胞生存率（パルス５時間／チェース７２時）（ＸＴＴ）を示す。
【図１７】ボルテゾミブ（■）、ＥＣ０５８７（●）、ＥＣ０５８７＋過剰葉酸（○）と共に２４時間インキュベートした後の細胞生存率（ＸＴＴ）を示す。
【図１８】ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＬＰＳ１００ng/mL、３０分２０秒のプロテオソーム／基質の反応時間でのＬＰＳ刺激プロテオソーム活性（パルス５時間／チェース２４時間）の、ボルテゾミブ（■）、ＥＣ０５２２（▼）、ＥＣ０５２２＋過剰葉酸（■）、ＥＣ０５２５（●）、ＥＣ０５２５＋過剰葉酸（○）、ＥＣ０５９５（◆）、ＥＣ０５９５＋過剰葉酸（□）による阻害を示し、ＩＣ５０は、ＥＣ０５９５及びＥＣ０５２５では約３０nMである。
【図１９】α−アマニチン（■）、ＥＣ０５９２（ＩＣ５０  ３．７nM）（●）、ＥＣ０５９２＋過剰葉酸（○）による処理の後のＲＡＷ細胞に対する活性（パルス５時間／チェース７２時間）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
受容体結合リガンド（Ｂ）、１つ以上の親水性スペーサーリンカーを含む多価リンカー（Ｌ）、及び、望ましくは細胞に送達される、診断、治療又は画像化剤（Ａ）、から構成される薬剤送達結合体が、本明細書に記載される。結合リガンド（Ｂ）は、多価リンカー（Ｌ）に共有結合しており、診断、治療若しくは画像化剤（Ａ）又はそれらの類似体若しくは誘導体も多価リンカー（Ｌ）に共有結合している。診断、治療又は画像化剤（Ａ）には、リンカー（Ｌ）に結合しているそれらの類似体及び誘導体が含まれることが理解されるべきである。多価リンカー（Ｌ）は、１つ以上のスペーサーリンカー及び／又は放出型リンカー、並びにそれらの組み合わせを、任意の順番で含む。一つの変形態様において、放出型リンカー及び任意のスペーサーリンカーは、互いに共有結合してリンカーを形成する。別の変形態様において、放出型リンカーは、薬剤（Ａ）又はその類似体若しくは誘導体に直接結合している。別の変形態様において、放出型リンカーは、結合リガンドに直接結合している。別の変形態様において、結合リガンド及び薬剤（Ａ）又はその類似体若しくは誘導体は、そのいずれか又は両方が、１つ以上のスペーサーリンカーを介して放出型リンカーに結合している。別の変形態様において、結合リガンド及び薬剤（Ａ）又はその類似体若しくは誘導体は、それぞれ放出型リンカーに結合しており、それぞれ互いに直接結合するか又は１つ以上のスペーサーリンカーを介して共有結合してもよい。
【００１６】
前述から、結合リガンドと、薬剤（Ａ）又はその類似体若しくは誘導体と、多様な放出型リンカー及び任意のスペーサーリンカーとの配置は、広範囲に変わりうることが理解されるべきである。一つの態様において、結合リガンド及び薬剤（Ａ）又はその類似体若しくは誘導体と多様な放出可能で任意のスペーサーリンカーとは、窒素、酸素、硫黄、リン、ケイ素などのヘテロ原子を介して互いに結合している。変形態様において、酸素を除くヘテロ原子は、Ｎ（ＯＨ）、Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）２、Ｐ（Ｏ）、Ｐ（Ｏ）２、Ｐ（Ｏ）３のように多様な酸化状態であってもよい。別の変形態様において、ヘテロ原子は、集まって、例えば式：−（ＮＨＲ１ＮＨＲ２）−、−ＳＯ−、−（ＳＯ２）−及び−Ｎ（Ｒ３）Ｏ−〔式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、互いに独立して、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、置換アリール、置換アリールアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール及びアルコキシアルキルから選択される〕のラジカルを含む、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、ヒドラゾン、スルホネート、ホスフィネート、ホスホネートなどのような、二価ラジカルを形成することができる。別の変形態様において、２つ以上の結合リガンドが多価リンカーに結合している。別の変形態様において、２つ以上の薬剤（Ａ）が多価リンカーに結合している。別の変形態様において、２つ以上の結合リガンド及び２つ以上の薬剤（Ａ）が多価リンカーに結合している。
【００１７】
一つの実施態様において、受容体結合リガンドは、ビタミン受容体に結合することができるビタミン又はその類似体若しくは誘導体のような、ビタミン受容体結合リガンドである。別の実施態様において、結合リガンドは、１つ以上のスペーサーリンカー及び／又は放出型リンカー及び／又は親水性スペーサーリンカーから形成されるリンカーを介して薬剤に結合している放出型リンカーに結合している、ビタミン又はその類似体若しくは誘導体である。一つの変形態様において、薬剤及びビタミン又はその類似体若しくは誘導体は、両方とも、それぞれスペーサーリンカーに結合することができ、スペーサーリンカーは、１つ以上の放出型リンカーを介して互いに結合している。加えて、薬剤及びビタミン又はその類似体若しくは誘導体は、両方とも、それぞれ１つ以上の放出型リンカーに結合することができ、放出型リンカーは、スペーサーリンカーを介して互いに結合している。これらのラジカルは、それぞれ、既存の又は追加のヘテロ原子を介して、結合リガンド、薬剤Ａ又は放出型親水性スペーサー若しくは追加のスペーサーリンカーに連結することができる。
【００１８】
結合リガンド（Ｂ）の結合部位は、受容体に特異的に結合することができるあらゆる結合リガンド（Ｂ）又はその誘導体若しくは類似体のための受容体を含んでもよく、ここで、受容体又は他のタンパク質は、病原性細胞の集団により独自に発現、過剰に発現又は優先的に発現している。病原性細胞の集団により独自に発現、過剰に発現又は優先的に発現している表面提示タンパク質は、典型的には、非病原性細胞には表れないか又は低い密度でしか表れない受容体であり、病原性細胞の選択的排除、標識化又は診断の手段を提供する。結合リガンド薬剤送達結合体は、癌細胞又は他の種類の病原性細胞の受容体に対して高い結合親和性で結合してもよい。高親和性の結合は結合リガンドにとって固有のものであってもよいし、あるいは、化学的に修飾したリガンド（例えば、ビタミンの類似体又は誘導体）の使用により結合親和性を増強することもできる。
【００１９】
本明細書に記載されている結合リガンド薬剤送達結合体は、例えば、多種多様なビタミン又は受容体結合ビタミン類似体／誘導体、リンカー及び薬剤から形成することができる。本明細書に記載されている結合リガンド薬剤送達結合体は、リガンド結合に利用可能な、ビタミンのような結合リガンドに対する受容体の病原性細胞上での優先的な発現のおかげで、宿主動物において病原性細胞集団を選択的に標的にすることができる。結合リガンド（Ｂ）として使用することができる例示的なビタミン部分には、カルニチン、イノシトール、リポ酸、ピリドキサール、アスコルビン酸、ナイアシン、パントテン酸、葉酸、リボフラビン、チアミン、ビオチン、ビタミンＢ１２、他の水溶性ビタミン、ビタミンＢ、並びに脂溶性ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ及びＫが含まれる。これらのビタミン、並びにその受容体結合類似体及び誘導体は、二価リンカー（Ｌ）により薬剤と結合して本明細書に記載されている結合リガンド（Ｂ）薬剤送達結合体を形成することができる、例示的な標的実体を構成する。ビタミンという用語には、特に別段の指示のない限りビタミン類似体及び／又は誘導体が含まれることが理解される。例示的には、葉酸の誘導体であるプテロイン酸、ビオシチン、ビオチンスルホキシド、オキシビオチン及び他のビオチン受容体結合化合物のようなビオチン類似体などが、ビタミン類、ビタミン類似体及びビタミン誘導体であると考慮される。本明細書に記載されているビタミン類似体又は誘導体は、それを介してビタミン類似体又は誘導体が二価リンカー（Ｌ）に共有結合しているヘテロ原子を組み込むビタミン類を意味することが、理解されるべきである。
【００２０】
例示的なビタミン部分には、葉酸、ビオチン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ１２及びこれらのビタミン分子の受容体結合類似体及び誘導体、並びに他の関連するビタミン受容体結合分子が含まれる。
【００２１】
別の実施態様において、細胞受容体は葉酸受容体であり、標的リガンドＢは葉酸受容体結合リガンドである。別の実施態様において、Ｂは、葉酸、又は葉酸受容体に結合する葉酸の類似体若しくは誘導体のような、葉酸（folate、フォレート）である。本明細書に使用されるとき、葉酸（folate）という用語は、個別的及び集合的の両方において、葉酸それ自体を意味するため、並びに／又は、葉酸受容体に結合することができる葉酸の類似体及び誘導体を意味するために使用されることが、理解されるべきである。別の実施態様において、Ｂは、抗体のような、葉酸受容体に選択的又は特異的に結合することができる化合物である。
【００２２】
葉酸類似体及び／又は誘導体の例示的実施態様には、フォリン酸、プテロポリグルタミン酸、及びテオラヒドロプテリン、ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸のような葉酸受容体結合プテリジン、並びにこれらのデアザ及びジデアザ類似体が含まれる。用語「デアザ」及び「ジデアザ」類似体は、天然に生じる葉酸構造又はその類似体若しくは誘導体において炭素原子が１又は２個の窒素原子で置換されている、当該技術で確認されている類似体を意味する。例えば、デアザ類似体には、葉酸の１−デアザ、３−デアザ、５−デアザ、８−デアザ及び１０デアザ類似体が含まれる。ジデアザ類似体には、例えば、葉酸の１，５−ジデアザ、５，１０−ジデアザ、８，１０−ジデアザ及び５，８−ジデアザ類似体が含まれる。複合体形成リガンドとして有用な他の葉酸には、葉酸受容体結合類似体のアミノプテリン、アメトプテリン（メトトレキセート）、Ｎ１０−メチルフォレート、２−デアミノ−ヒドロキシフォレート、１−デアザメトプテリン又は３−デアザメトプテリンのようなデアザ類似体及び３′，５′−ジクロロ−４−アミノ−４−デオキシ−Ｎ１０−メチルプテロイルグルタミン酸（ジクロロメトトレキセート）が含まれる。前述の葉酸類似体及び／又は誘導体は、葉酸受容体に結合する能力を反映して慣用的に葉酸（folate）と呼ばれ、そのようなリガンドは、外来分子と結合された場合、本明細書に記載されている葉酸仲介エンドサイトーシスを介するような膜貫通輸送を増強するのに効果的である。葉酸受容体に結合して複合体の受容体仲介エンドサイトーシス輸送を開始することができる他の適切な結合リガンドには、葉酸受容体に対する抗体が含まれる。葉酸受容体の抗体と複合体化した外来分子が、複合体の膜貫通輸送を誘発するために使用される。
【００２３】
葉酸受容体に結合する追加的な葉酸の類似体は、米国特許出願公開第２００５／０２２７９８５号及び同第２００４／０２４２５８２号に記載されており、これらの開示は参照として本明細書に組み込まれる。例示的に、そのような葉酸類似体は、一般式：
【化１】
0005690589.tif 000002
〔式中、Ｘ及びＹは、それぞれ独立して、ハロ、Ｒ２、ＯＲ２、ＳＲ３及びＮＲ４Ｒ５からなる群より選択され；
Ｕ、Ｖ及びＷは、それぞれ独立して、−（Ｒ６ａ）Ｃ＝、−Ｎ＝、−（Ｒ６ａ）Ｃ（Ｒ７ａ）−及び−Ｎ（Ｒ４ａ）−からなる群より選択され；Ｑは、Ｃ及びＣＨからなる群より選択され；Ｔは、Ｓ、Ｏ、Ｎ及び−Ｃ＝Ｃ−からなる群より選択され；
Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、酸素、硫黄、−Ｃ（Ｚ）−、−Ｃ（Ｚ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｚ）−、−Ｎ（Ｒ４ｂ）−、−Ｃ（Ｚ）Ｎ（Ｒ４ｂ）−、−Ｎ（Ｒ４ｂ）Ｃ（Ｚ）−、−ＯＣ（Ｚ）Ｎ（Ｒ４ｂ）−、−Ｎ（Ｒ４ｂ）Ｃ（Ｚ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ４ｂ）Ｃ（Ｚ）Ｎ（Ｒ５ｂ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ４ａ）Ｓ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｒ６ｂ）（Ｒ７ｂ）−、−Ｎ（Ｃ≡ＣＨ）−、−Ｎ（ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）−、Ｃ１〜Ｃ１２アルキレン及びＣ１〜Ｃ１２アルキレンオキシからなる群より選択され、ここでＺは、酸素又は硫黄であり；
Ｒ１は、水素、ハロ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル及びＣ１〜Ｃ１２アルコキシからなる群より選択され；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ５、Ｒ５ｂ、Ｒ６ｂ及びＲ７ｂは、それぞれ独立して、水素、ハロ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ１２アルカノイル、Ｃ１〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ１〜Ｃ１２アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ）カルボニル及び（Ｃ１〜Ｃ１２アルキルアミノ）カルボニルからなる群より選択され；
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立して、水素、ハロ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル及びＣ１〜Ｃ１２アルコキシからなる群より選択されるか、又はＲ６及びＲ７は、一緒になって、カルボニル基を形成し；Ｒ６ａ及びＲ７ａは、それぞれ独立して、水素、ハロ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル及びＣ１〜Ｃ１２アルコキシからなる群より選択されるか、又はＲ６ａ及びＲ７ａは、一緒になって、カルボニル基を形成し；
Ｌは、本明細書に記載されている二価リンカーであり、そして
ｎ、ｐ、ｒ、ｓ及びｔは、それぞれ独立して、０又は１である〕
を有する。
【００２４】
本明細書に使用されるとき、葉酸（folate）という用語は、独立して、結合体を形成するのに使用される葉酸、又は代替的に、葉酸受容体に結合することができるその葉酸類似体又は誘導体、の両方を意味することが理解される。
【００２５】
そのような葉酸類似体の一つの態様において、ｓが１である場合、ｔは０であり、ｓが０である場合、ｔは１である。そのような葉酸類似体の別の態様において、ｎとｒは両方とも１であり、そしてリンカーＬａは、アミド結合を介してアルファ−アミノ基のＡ２に共有結合している天然に生じるアミノ酸である。例示的なアミノ酸には、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、システインなどが含まれる。
【００２６】
ビタミンは、窒素を含む葉酸であってもよく、この実施態様において、スペーサーリンカーは、アルキレンカルボニル、シクロアルキレンカルボニル、カルボニルアルキルカルボニル、１−アルキレンスクシンイミド−３−イル、１−（カルボニルアルキル）スクシンイミド−３−イルであってもよく、ここで、スペーサーリンカーは、それぞれ場合により置換基Ｘ１で置換されており、スペーサーリンカーは、葉酸窒素と結合してイミド又はアルキルアミドを形成する。この実施態様において、置換基Ｘ１は、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、スルフヒドリルアルキル、アルキルチオアルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、グアニジノアルキル、Ｒ４−カルボニル、Ｒ５−カルボニルアルキル、Ｒ６−アシルアミノ及びＲ７−アシルアミノアルキルであってもよく、ここで、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、アミノ酸、アミノ酸誘導体及びペプチドから選択され、そしてＲ６及びＲ７は、それぞれ独立して、アミノ酸、アミノ酸誘導体及びペプチドから選択される。
【００２７】
ビタミン類似体及び／又は誘導体の例示的な実施態様には、ビオシチン、ビオチンスルホキシド、オキシビオチン及び他のビオチン受容体結合化合物などのようなビオチンの類似体及び誘導体も含まれる。本明細書に記載される他のビタミン類の類似体及び誘導体も、本明細書において考慮されることが理解される。一つの実施態様において、本明細書に記載されている薬剤送達結合体において結合リガンド（Ｂ）として使用することができるビタミン類には、葉酸又は本明細書に記載されているその類似体若しくは誘導体に結合する、葉酸受容体のような活性化マクロファージに特異的に発現するビタミン受容体に結合するものが含まれる。
【００２８】
本明細書に記載されているビタミン類に加えて、他の結合リガンドも、本明細書に記載され考慮されている薬剤及びリンカーに結合して、所望の標的への薬剤の送達を促進できる結合リガンドリンカー薬剤結合体を形成しうることが理解される。記載されているビタミン類、並びにその類似体及び誘導体に加えて、これらの他の結合リガンドを使用して、標的細胞に結合できる薬剤送達結合体を形成することができる。一般に、細胞表面受容体の任意の結合リガンド（Ｂ）を、リンカー薬剤結合体が結合できる標的リガンドとして有利に使用することができる。
【００２９】
本明細書に記載されている他の例示的なリガンドには、ライブラリースクリーンから同定されるペプチドリガンド、腫瘍細胞特異的ペプチド、腫瘍細胞特異的アプタマー、腫瘍細胞特異的炭水化物、腫瘍細胞特異的モノクローナル又はポリクローナル抗体、例えば転移性癌細胞に特異的に発現しているか又は独自に利用可能であるＥｐｈＡ２又は他のタンパク質に対する抗体のＦａｂフラグメントのような、抗体のＦａｂ又はｓｃＦｖ（すなわち、単鎖可変部）フラグメント、コンビナトリアルライブラリーから誘導される小型有機分子、ＥＧＦ、ＦＧＦ、インスリン及びインスリン様成長因子のような成長因子、相同性ポリペプチド、ソマトスタチン及びその類似体、トランスフェリン、リポタンパク質複合体、胆汁酸塩、セレクチン、ステロイドホルモン、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ含有ペプチド、レチノイド、多様なガレクチン、δ−オピオイド受容体リガンド、コレシストキニンＡ受容体リガンド、アンギオテンシンＡＴ１又はＡＴ２受容体に特異的なリガンド、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体λリガンド、ペニシリンのようなβ−ラクタム抗体、腫瘍細胞又は炎症性生物の表面に優先的に発現する受容体に特異的に結合する、抗菌薬を含む小型有機分子及び他の分子、受容体又は他の細胞表面タンパク質の結晶構造に基づいて特定の受容体の結合ポケットに適合するように設計された、抗菌薬及び他の薬剤、腫瘍抗原への又は腫瘍細胞の表面に優先的に発現した他の分子への結合リガンド、或いは以上の分子のいずれかのフラグメント、が含まれる。
【００３０】
結合リガンド薬剤送達結合体の結合部位として機能することができる腫瘍特異的抗原には、ＥｐｈＡ２のようなエフリンファミリータンパク質のメンバーの細胞外エピトープが含まれる。正常な細胞においてはＥｐｈＡ２発現は細胞−細胞接合部に限定されているが、ＥｐｈＡ２は、転移性腫瘍細胞の細胞表面全体にわたって分布している。したがって、転移性細胞のＥｐｈＡ２は、例えば薬剤と結合した抗体のＦａｂフラグメントと結合することができる一方で、このタンパク質は、正常細胞上ではＦａｂフラグメントと結合することができないので、転移性癌細胞に特異的な結合リガンド薬剤送達結合体をもたらす。
【００３１】
リンカーＬは、１つ以上の親水性スペーサーリンカーを含む。加えて、他の任意のスペーサーリンカー及び／又は放出型リンカーをＬに含めることができる。予め決定された長さを、薬剤Ａから結合リガンドＢを分離するために選択する場合、追加的なスペーサーリンカーが含まれうることが理解される。特定の形態において、放出型リンカーが含まれうることも、理解される。例えば、本明細書に記載されているように、一つの実施態様において、標的リガンド結合体を、病原性細胞が関わる癌又は他の疾患を治療する薬剤を送達するために使用できる。そのような実施態様において薬剤は、いったん送達されると、望ましくは結合体から放出されることが理解される。例えば、標的リガンドが葉酸又はその類似体若しくは誘導体である形態において、結合体は、葉酸受容体に結合することができる。結合体は、いったん結合すると、多くの場合にエンドサイトーシスのプロセスを受け、結合体は細胞の内部に送達される。細胞機構が結合体を生物学的に分解して、薬剤「積載物」を放出させ、葉酸化合物を放出させてもよい。
【００３２】
代替的な形態において、標的結合体を免疫療法に使用することができる。この形態では、放出型リンカーは一般に含まれない。例えば、葉酸又は他のビタミン受容体結合化合物と免疫原の結合体は、いったん送達されると、適切な受容体に結合し、抗原性積載物により細胞を装飾又はマークする。別の代替的な形態において、標的結合体を診断療法に使用することができる。この形態では、放出型リンカーを含んでも含まなくてもよい。例えば、画像化剤を含む結合体を、葉酸又は他のビタミン受容体結合化合物のような適切な細胞受容体結合リガンドを使用して、標的細胞に送達することができる。一つの態様において、結合体は、画像化のために細胞の表面に留まる。別の形態において、複合体はエンドサイトーシスを受けて細胞の内部に入ることができる。後者の場合では、放出型リンカーを含めることができる。
【００３３】
したがって、別の態様において、本明細書に記載されている結合体Ｂ−Ｌ−Ａは、以下の一般式：
Ｂ−ＬＳ−ＬＨ−Ａ
Ｂ−ＬＨ−ＬＳ−Ａ
Ｂ−ＬＳ−ＬＨ−ＬＳ−Ａ
Ｂ−ＬＲ−ＬＨ−Ａ
Ｂ−ＬＨ−ＬＲ−Ａ
Ｂ−ＬＲ−ＬＨ−ＬＲ−Ａ
Ｂ−ＬＳ−ＬＲ−ＬＨ−Ａ
Ｂ−ＬＲ−ＬＨ−ＬＳ−Ａ
Ｂ−ＬＲ−ＬＳ−ＬＨ−ＬＲ−Ａ
Ｂ−ＬＨ−ＬＳ−ＬＨ−ＬＲ−Ａ
〔式中、Ｂ、Ｌ及びＡは、本明細書に記載されたとおりであり、ＬＲは、リンカーＬの放出型リンカー部分であり、ＬＳは、スペーサーリンカー部分であり、そしてＬＨは、親水性リンカー部分である〕も含む。前述の式は単なる例示であり、親水性スペーサーリンカー部分、放出型リンカー部分及びスペーサーリンカー部分の他の配置も本明細書に含まれることが、理解されるべきである。加えて、複数の親水性スペーサーリンカー及び／又は複数の放出型リンカー及び／又は複数のスペーサーリンカーを含む追加の結合体が考慮されることが、理解されるべきである。
【００３４】
同様に、別の態様において、本明細書に記載されている結合体Ｌ−Ａは、以下の一般式：
ＬＳ−ＬＨ−Ａ
ＬＨ−ＬＳ−Ａ
ＬＳ−ＬＨ−ＬＳ−Ａ
ＬＲ−ＬＨ−Ａ
ＬＨ−ＬＲ−Ａ
ＬＲ−ＬＨ−ＬＲ−Ａ
ＬＳ−ＬＲ−ＬＨ−Ａ
ＬＲ−ＬＨ−ＬＳ−Ａ
ＬＲ−ＬＳ−ＬＨ−ＬＲ−Ａ
ＬＨ−ＬＳ−ＬＨ−ＬＲ−Ａ
〔式中、Ｌ及びＡは、本明細書に記載されたとおりであり、ＬＲは、リンカーＬの放出型リンカー部分であり、ＬＳは、スペーサーリンカー部分であり、そしてＬＨは、親水性リンカー部分である〕も含む。前述の式は単なる例示であり、親水性スペーサーリンカー部分、放出型リンカー部分及びスペーサーリンカー部分の他の配置も本明細書に含まれることが、理解されるべきである。加えて、複数の親水性スペーサーリンカー及び／又は複数の放出型リンカー及び／又は複数のスペーサーリンカーを含む追加の結合体が考慮されることが、理解されるべきである。
【００３５】
多様な親水性リンカーの配置及び／又は配向は、直鎖若しくは分岐鎖の様式であるか又はその両方であってもよい。例えば、親水性リンカーは、葉酸と薬剤、画像化剤又は診断剤との結合体を形成するリンカーの主鎖を、形成することができる。あるいは、リンカーの親水性部分は、結合リガンドＢと薬剤Ａとを連結している原子鎖の主鎖の側鎖であってもよいし又はそれに結合していてもよいることができる。この後者の配置において、親水性部分は、原子の主鎖から遠位であっても近位であってもよいあってもよい。
【００３６】
別の実施態様において、リンカーは、おおよそ直鎖状であり、親水性基は、ほぼ直列に配置されて、結合体において鎖様リンカーを形成する。別の方法では、親水性基は、この直鎖状の実施態様においてリンカーの主鎖の幾つか又は全てを形成する。
【００３７】
別の実施態様において、リンカーは親水性基により分岐している。この分岐鎖状の実施態様において、親水性基は、主鎖から遠位であってもよく、又は主鎖に近位であってもよいあってもよい。これらのそれぞれの配置において、リンカーは、より球状又は円筒状の形状である。一つの変形態様において、リンカーは瓶洗いブラシのような形状である。一つの態様において、リンカーの主鎖は、直鎖列のアミドにより形成され、リンカーの親水性部分は、例えば連結単糖、スルホン酸塩など、並びにそれらの誘導体及び類似体による、分岐側鎖の並列配置により形成される。
【００３８】
リンカーは、インビボにおいて遭遇する生理学的条件のような特定の条件下で、中性又はイオン性であってもよい。イオン性リンカーでは、選択された条件下において、リンカーは脱プロトン化されて陰性イオンを形成しうるか又はあるいは脱プロトン化されて陽性イオンを形成しうる。２つ以上の脱プロトン化又はプロトン化事象が起こりうることが理解される。加えて、同じリンカーが脱プロトン化及びプロトン化されて、内塩又は双性イオン性化合物を形成しうることが理解される。
【００３９】
別の実施態様において、親水性スペーサーリンカーは中性である、すなわち生理学的条件下において、リンカーは著しくプロトン化も脱プロトン化もされない。別の実施態様において、親水性スペーサーリンカーは、プロトン化されて１つ以上の正電荷を有することができる。プロトン化能力は条件依存性であることが理解される。一つの態様において、この条件とは生物学的条件であり、リンカーはインビボでプロトン化される。別の実施態様において、スペーサーは、中性の領域と、プロトン化されて１つ以上の正電荷を有しうる領域の両方を含む。別の実施態様において、スペーサーは、脱プロトン化されて１つ以上の負電荷を有しうる領域と、プロトン化されて１つ以上の正電荷を有しうる領域の両方を含む。この後者の実施態様において、双性イオン性又は内塩が形成されうることが理解される。
【００４０】
一つの態様において、脱プロトン化されて負電荷を有しうるリンカーの領域には、アスパラギン酸、グルタミン酸のようなカルボン酸、より長鎖のカルボン酸基及び硫酸のアルキルエステルのような硫酸エステルが含まれる。別の態様において、プロトン化されて正電荷を有しうるリンカーの領域には、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、ブチレンジアミンなどを含むポリアミノアルキレンのようなアミノ基、及び／又はピロリジン、ピペリジン、ピペラジンを含む複素環、並びに他のアミノ基が含まれ、これらはそれぞれ場合により置換されている。別の実施態様において、中性であるリンカーの領域には、糖、炭水化物、糖類、イノシトールなどのようなポリヒドロキシル基、及び／又はポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレンなどを含むポリオキシアルキレン基のようなポリエーテル基が含まれる。
【００４１】
一つの実施態様において、本明細書に記載されている親水性スペーサーリンカーは、主に炭素、水素及び酸素から形成され、約３：１以下又は約２：１以下の炭素／酸素比を有する。一つの態様において、本明細書に記載されている親水性リンカーは、複数のエーテル官能基を含む。別の態様において、本明細書に記載されている親水性リンカーは、複数のヒドロキシル官能基を含む。そのようなリンカーを形成するのに使用できる例示的なフラグメントには、炭水化物のようなポリヒドロキシル化合物、ポリエチレングリコール単位のようなポリエーテル化合物、並びにカルボン酸及びアルキル硫酸のような酸基が含まれる。一つの変形態様において、オリゴアミドスペーサーなどもリンカーに含まれうる。
【００４２】
例示的な炭水化物スペーサーには、ペプチドの特徴と糖の特徴の両方を含む本明細書に記載されているサッカロペプチド；クリック化学としても知られている〔２＋３〕ヒュスゲン（Huisgen）環化により組み込まれうるグルクロニド；例えば２−デオキシヘキサピラノース（２−デオキシグルコース、２−デオキシグルクロニドなど）のβ−アルキルグリコシド；及びβ−アルキルマンノピラノシド、が含まれる。例示的なＰＥＧ基には、約４〜約２０個のＰＥＧ基の範囲の特定の長さのものが含まれる。例示的なアルキル硫酸エステルをクリック化学により主鎖に直接導入することもできる。例示的なオリゴアミドスペーサーには、ＥＤＴＡ及びＤＴＰＡスペーサー、β−アミノ酸などが含まれる。
【００４３】
別の実施態様において、本明細書に記載されている親水性スペーサーリンカーには、以下の式：
【化２】
0005690589.tif 000003
〔式中、ｍは、独立して、それぞれの場合に１〜約８から選択される整数であり、ｐは、１〜約１０から選択される整数であり、そしてｎは、独立して、それぞれの場合に１〜約３から選択される整数である〕で示されるリンカーのようなポリエーテルが含まれる。一つの態様において、ｍは、独立して、それぞれの場合に１〜約３である。別の態様において、ｎは、それぞれの場合に１である。別の態様において、ｐは、独立して、それぞれの場合に約４〜約６である。例示的には、前述に対応して、対応するポリプロピレンポリエーテルが本明細書において考慮され、親水性スペーサーリンカーとして結合体に含まれうる。加えて、ポリエチレンポリエーテルとポリプロピレンポリエーテルの混合が親水性スペーサーリンカーとして結合体に含まれうることが理解される。更に、前述のポリエーテル化合物の環状の変形態様、例えばテトラヒドロフラニル、１，３−ジオキサン、１，４−ジオキサンなどを含むものが、本明細書において考慮される。
【００４４】
別の例示的な実施態様において、本明細書に記載されている親水性スペーサーリンカーは、複数のヒドロキシル官能基を含み、例えば単糖、オリゴ糖、多糖などを組み込んだリンカーである。ポリヒドロキシル含有スペーサーリンカーは、複数の−（ＣＲＯＨ）−基（ここでＲは、水素又はアルキルである）を含むことが理解されるべきである。
【００４５】
別の実施態様において、スペーサーリンカーは、以下のフラグメント：
【化３】
0005690589.tif 000004
〔ここで、Ｒは、Ｈ、アルキル、シクロアルキル又はアリールアルキルであり、ｍは、１〜約３の整数であり、ｎは、１〜約５の整数であり、ｐは、１〜約５の整数であり、そしてｒは、１〜約３から選択される整数である〕のうちの１つ以上を含む。一つの態様において、整数ｎは、３又は４である。別の態様において、整数ｐは、３又は４である。別の態様において、整数ｒは１である。
【００４６】
別の実施態様において、スペーサーリンカーは、以下の環状ポリヒドロキシル基：
【化４】
0005690589.tif 000005
〔ここで、ｎは、２〜約５の整数であり、ｐは１〜約５の整数であり、そしてｒは、１〜約４の整数である〕のうちの１つ以上を含む。一つの態様において、整数ｎは、３又は４である。別の態様において、整数ｐは、３又は４である。別の態様において、整数ｒは、２又は３である。リンカーのそのような部分の全ての立体化学形態が、本明細書において考慮されることが理解される。例えば、上記の式において、この部分を、リボース、キシロース、グルコース、マンノース、ガラクトース又は他の糖から誘導することができ、これらの分子に存在する側鎖ヒドロキシル及びアルキル基の立体化学配置を保持することができる。加えて、前述の式において、多様なデオキシ化合物も考慮されることが理解されるべきである。例示的に、以下の式の化合物が考慮され：
【化５】
0005690589.tif 000006
式中、ｎは、ｒ以下であり、例えばｒが２又は３である場合、ｎは、それぞれ、１若しくは２、又は１、２若しくは３である。
【００４７】
別の実施態様において、スペーサーリンカーは、以下の式：
【化６】
0005690589.tif 000007
〔式中、ｎ及びｒは、それぞれ、１〜約３から選択される整数である〕で示されるポリヒドロキシル化合物を含む。一つの態様において、スペーサーリンカーは、以下の式のポリヒドロキシル化合物のうちの１つ以上を含む：
【化７】
0005690589.tif 000008
リンカーのそのような部分の全ての立体化学形態が、本明細書において考慮されることが理解される。例えば、上記の式において、この部分を、リボース、キシロース、グルコース、マンノース、ガラクトース又は他の糖から誘導することができ、これらの分子に存在する側鎖ヒドロキシル及びアルキル基の立体化学配置を保持することができる。
【００４８】
別の形態において、本明細書に記載されている親水性リンカーＬは、リンカーの主鎖から離れているポリヒドロキシル基を含む。一つの実施態様において、そのような炭水化物基又はポリヒドロキシル基は、トリアゾール基により主鎖と連結しており、トリアゾール結合親水性スペーサーリンカーを形成する。例示的には、そのようなリンカーは、以下の式：
【化８】
0005690589.tif 000009
〔式中、ｎ、ｍ及びｒは、整数であり、それぞれ独立して、それぞれの場合に１〜約５から選択される〕で示されるフラグメントを含む。一つの例示的な態様において、ｍは、独立して、それぞれの場合に２又は３である。別の態様において、ｒは、それぞれの場合に１である。別の態様において、ｎは、それぞれの場合に１である。一つの変形態様において、ポリヒドロキシル基をリンカーの主鎖に連結する基は、ピロール、ピラゾール、１，２，４−トリアゾール、フラン、オキサゾール、イソオキサゾール、チエニル、チアゾール、イソチアゾール、オキサジアゾールなどの、ただしこれらに限定されない異なるヘテロアリール基である。同様に、二価６員環ヘテロアリール基が考慮される。前述の例示的親水性スペーサーリンカーの他の変形態様には、以下の式：
【化９】
0005690589.tif 000010
〔式中、ｎ及びｒは、整数であり、それぞれ独立して、それぞれの場合に１〜約５から選択され、そしてｐは、１〜約４から選択される整数である〕で示されるようなオキシアルキレン基が含まれる。
【００４９】
別の実施態様において、そのような炭水化物基又はポリヒドロキシル基は、アミド基により主鎖と連結しており、アミド結合親水性スペーサーリンカーを形成する。例示的には、そのようなリンカーは、以下の式：
【化１０】
0005690589.tif 000011
〔式中、ｎは、１〜約３から選択される整数であり、そしてｍは、１〜約２２から選択される整数である〕で示されるフラグメントを含む。一つの例示的な態様において、ｎは、１又は２である。別の例示的な態様において、ｍは、約６〜約１０から選択され、例示的には８である。一つの変形態様において、ポリヒドロキシル基をリンカーの主鎖に連結する基は、エステル、尿素、カルバメート、アシルヒドラゾンなどの、ただしこれらに限定されない異なる官能基である。同様に、環状の変形態様も考慮される。前述の例示的親水性スペーサーリンカーの他の変形態様には、以下の式：
【化１１】
0005690589.tif 000012
〔式中、ｎ及びｒは、整数であり、それぞれ独立して、それぞれの場合に１〜約５から選択され、そしてｐは、１〜約４から選択される整数である〕で示されるようなオキシアルキレン基が含まれる。
【００５０】
別の実施態様において、スペーサーリンカーは、以下のフラグメント：
【化１２】
0005690589.tif 000013
〔ここで、Ｒは、Ｈ、アルキル、シクロアルキル又はアリールアルキルであり、ｍは、１〜約３から独立して選択される整数であり、ｎは、１〜約６の整数であり、ｐは、１〜約５の整数であり、そしてｒは、１〜約３から選択される整数である〕のうちの１つ以上を含む。一つの変形態様において、整数ｎは、３又は４である。別の変形態様において、整数ｐは、３又は４である。別の変形態様において、整数ｒは１である。
【００５１】
別の実施態様において、スペーサーリンカーは、以下のフラグメント：
【化１３】
0005690589.tif 000014
〔ここで、ｍは、１〜約３から独立して選択される整数であり、ｎは、１〜約６の整数であり、ｐは、１〜約５の整数であり、そしてｒは、１〜約３から選択される整数である〕のうちの１つ以上を含む。一つの変形態様において、整数ｎは、３又は４である。別の変形態様において、整数ｐは、３又は４である。別の変形態様において、整数ｒは１である。
【００５２】
別の実施態様において、スペーサーリンカーは、以下のフラグメント：
【化１４】
0005690589.tif 000015
〔ここで、ｍは、１〜約３から独立して選択される整数であり、ｎは、１〜約６の整数であり、ｐは、１〜約５の整数であり、そしてｒは、１〜約３から選択される整数である〕のうちの１つ以上を含む。一つの変形態様において、整数ｎは、３又は４である。別の変形態様において、整数ｐは、３又は４である。別の変形態様において、整数ｒは１である。
【００５３】
別の実施態様において、親水性スペーサーリンカーは、主鎖と、以下の式：
【化１５】
0005690589.tif 000016
〔式中、ｎは、それぞれの場合に０〜約３から独立して選択される整数である〕により例示されるような分岐側鎖モチーフとの組み合わせである。上記の式は、４員、５員、６員、さらに大きな員の環状糖を表すことが意図される。加えて、上記の式を修飾してデオキシ糖を表すことができ、ここで式に存在する１つ以上のヒドロキシ基は、水素、アルキル又はアミノで置換されていることが理解されるべきである。加えて、１つ以上のヒドロキシル基が酸化されて対応するカルボニルになっている対応するカルボニル化合物が、上記の式により考慮されることが理解されるべきである。加えて、この例示的な実施態様において、ピラノースは、カルボキシルとアミノの両方の官能基を含み、（ａ）主鎖に挿入することができ、（ｂ）この実施態様の変形態様において分岐側鎖に合成ハンドルを提供することができる。側鎖ヒドロキシル基のいずれかを使用して、対応するオリゴ糖を調製する追加の糖を含む、他の化学フラグメントを結合することができる。ピラノース又は他の糖を単一炭素で主鎖に挿入すること、すなわちジェルミナル対の炭素でのスピロ配置及び同様の配置を含む、この実施態様の他の変形態様も考慮される。例えば、リンカー又は薬剤Ａ又は結合リガンドＢの１又は２つの末端を糖に連結して、１，１、１，２、１，３、１，４、２，３又は他の配置で主鎖に挿入することができる。
【００５４】
別の実施態様において、本明細書に記載されている親水性スペーサーリンカーは、主に炭素、水素及び窒素から形成され、炭素／窒素比の約３：１以下又は約２：１以下を有する。一つの態様において、本明細書に記載されている親水性リンカーは、複数のアミノ官能基を含む。
【００５５】
別の実施態様において、スペーサーリンカーは、以下の式：
【化１６】
0005690589.tif 000017
〔式中、ｎは、それぞれの場合に１〜約３から独立して選択される整数である〕で示される１つ以上のアミノ基を含む。一つの態様において、整数ｎは、独立して、それぞれの場合に１又は２である。別の態様において、整数ｎは、それぞれの場合に１である。
【００５６】
別の実施態様において、親水性スペーサーリンカーは、硫酸のアルキルエステルのような硫酸エステルである。例示的には、スペーサーリンカーは、以下の式：
【化１７】
0005690589.tif 000018
〔式中、ｎは、それぞれの場合に１〜約３から独立して選択される整数である〕で示されるものである。例示的に、ｎは、独立して、それぞれの場合に１又は２である。
【００５７】
ヘテロ原子に結合している遊離水素を含む、そのようなポリヒドロキシル、ポリアミノ、カルボン酸、硫酸などのリンカーにおいて、１つ以上の遊離水素原子を適切なヒドロキシル、アミノ又は酸保護基でそれぞれ保護してもよいし、あるいは対応するプロドラッグとしてブロックしてもよく、後者は、一般的な又は特定の生理学的条件下で母体薬剤を放出するプロドラッグのような、特定の使用にために選択される、ということが理解される。
【００５８】
前述のそれぞれの例示的なリンカーＬの例において、幾つかの場合では、追加的なスペーサーリンカーＬＳ及び／又は追加的な放出型リンカーＬＲも含まれる。これらのスペーサーリンカー及び放出型リンカーも、不斉炭素原子を含むことができる。本明細書に示される立体化学配置は単なる例示であり、他の立体化学配置が考慮されることが、更に理解されるべきである。例えば、一つの変形態様において、以下のような対応する非天然のアミノ酸配置を、本明細書に記載されている結合体に含めることができ：
【化１８】
0005690589.tif 000019
ここで、上記に記載されているように、ｎは、２〜約５の整数であり、ｐは１〜約５の整数であり、そしてｒは、１〜約４の整数である。
【００５９】
前述の実施態様において、（＊）原子のような開放された部位は、結合リガンド（Ｂ）又は送達される薬剤（Ａ）の結合する位置であることが、更に理解されるべきである。加えて、Ｂ及びＡのいずれか又は両方の結合は、直接的であってもよいし又は介在リンカーを介するものであってもよいことが、理解されるべきである。介在リンカーには、他のスペーサーリンカー及び／又は放出型リンカーが含まれる。本明細書に記載されている結合体に含まれる例示的な追加のスペーサーリンカー及び放出型リンカーは、米国特許出願第１０／７６５，３３５号に記載されており、この開示は参照として本明細書に組み込まれる。
【００６０】
一つの実施態様において、親水性スペーサーリンカーは、１つ以上の炭水化物含有又はポリヒドロキシル基含有リンカーを含む。別の実施態様において、親水性スペーサーリンカーは、少なくとも３つの炭水化物含有又はポリヒドロキシル基含有リンカーを含む。別の実施態様において、親水性スペーサーリンカーは、１つ以上の炭水化物含有又はポリヒドロキシル基含有リンカー及び１つ以上のアスパラギン酸を含む。別の実施態様において、親水性スペーサーリンカーは、１つ以上の炭水化物含有又はポリヒドロキシル化合物基含有リンカー及び１つ以上のグルタミン酸を含む。別の実施態様において、親水性スペーサーリンカーは、１つ以上の炭水化物含有又はポリヒドロキシル基含有リンカー、１つ以上のグルタミン酸、１つ以上のアスパラギン酸及び１つ以上のベータアミノアラニンを含む。一連の変形態様において、前述のそれぞれの実施態様において、親水性スペーサーリンカーは、１つ以上のシステインも含む。別の一連の変形態様において、前述のそれぞれの実施態様において、親水性スペーサーリンカーは、少なくとも１つのアルギニンも含む。
【００６１】
別の実施態様において、親水性スペーサーリンカーは、少なくとも１つの結合リガンド（Ｌ）と少なくとも１つの薬剤（Ａ）とを連結する原子の鎖に含まれている、１つ以上の二価１，４−ピペラジンを含む。一つの変形態様において、親水性スペーサーリンカーは、１つ以上の炭水化物含有又はポリヒドロキシル基含有リンカーを含む。別の変形態様において、親水性スペーサーリンカーは、１つ以上の炭水化物含有又はポリヒドロキシル基含有リンカー及び１つ以上のアスパラギン酸を含む。別の変形態様において、親水性スペーサーリンカーは、１つ以上の炭水化物含有又はポリヒドロキシル基含有リンカー及び１つ以上のグルタミン酸を含む。一連の変形態様において、前述のそれぞれの実施態様において、親水性スペーサーリンカーは、１つ以上のシステインも含む。前述のそれぞれの実施態様の他の一連の変形態様において、親水性スペーサーリンカーは、少なくとも１つのアルギニンも含む。
【００６２】
別の実施態様において、親水性スペーサーリンカーは、例えばアミノエチルピペラジニルアセトアミドなどの、ただしこれに限定されない１つ以上のオリゴアミド親水性スペーサーを含む。
【００６３】
別の実施態様において、親水性スペーサーリンカーは、１つ以上のトリアゾール結合炭水化物含有又はポリヒドロキシル基含有リンカーを含む。別の実施態様において、親水性スペーサーリンカーは、１つ以上のアミド結合炭水化物含有又はポリヒドロキシル基含有リンカーを含む。別の実施態様において、親水性スペーサーリンカーは、１つ以上のＰＥＧ基及び１つ以上のシステインを含む。別の実施態様において、親水性スペーサーリンカーは、１つ以上のＥＤＴＥ誘導体を含む。
【００６４】
別の実施態様において、追加のスペーサーリンカーは、場合により、下記に定義される置換基Ｘ１で置換されている１−アルキレンスクシンイミド−３−イルであってもよく、放出型リンカーは、メチレン、１−アルコキシアルキレン、１−アルコキシシクロアルキレン、１−アルオキシアルキレンカルボニル、１−アルコキシシクロアルキレンカルボニルであってもよく、ここで、放出型リンカーは、それぞれ場合により、下記に定義される置換基Ｘ２で置換されており、スペーサーリンカー及び放出型リンカーは、それぞれスペーサーリンカーに結合して、スクシンイミド−１−イルアルキルアセタール又はケタールを形成する。
【００６５】
追加のスペーサーリンカーは、カルボニル、チオノカルボニル、アルキレン、シクロアルキレン、アルキレンシクロアルキル、アルキレンカルボニル、シクロアルキレンカルボニル、カルボニルアルキルカルボニル、１−アルキレンスクシンイミド−３−イル、１−（カルボニルアルキル）スクシンイミド−３−イル、アルキレンスルホキシル、スルホニルアルキル、アルキレンスルホキシルアルキル、アルキレンスルホニルアルキル、カルボニルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラニル、カルボニルテトラヒドロフラニル、１−（カルボニルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラニル）スクシンイミド−３−イル及び１−（カルボニルテトラヒドロフラニル）スクシンイミド−３−イルであってもよく、ここでスペーサーリンカーは、それぞれ場合により、下記に定義される置換基Ｘ１で置換される。 この実施態様において、スペーサーリンカーは、追加の窒素を含むことができ、スペーサーリンカーは、アルキレンカルボニル、シクロアルキレンカルボニル、カルボニルアルキルカルボニル、１−（カルボニルアルキル）スクシンイミド−３−イルであってもよく、ここで、スペーサーリンカーは、それぞれ場合により、下記に定義される置換基Ｘ１で置換されており、スペーサーリンカーは、窒素と結合してアミドを形成する。あるいは、スペーサーリンカーは、追加の硫黄を含むことができ、スペーサーリンカーは、アルキレン及びシクロアルキレンであってもよく、ここで、スペーサーリンカーは、場合によりカルボキシで置換されており、スペーサーリンカーは、硫黄と結合してチオールを形成する。別の実施態様において、スペーサーリンカーは、硫黄を含むことができ、スペーサーリンカーは、１−アルキレンスクシンイミド−３−イル及び１−（カルボニルアルキル）スクシンイミド−３−イルであってもよく、スペーサーリンカーは、硫黄と結合してスクシンイミド−３−イルチオールを形成する。
【００６６】
上記記載の実施態様の代替案として、追加のスペーサーリンカーは、窒素を含むことができ、放出型リンカーは、アルキレンアジリジン−１−イル、カルボニルアルキルアジリジン−１−イル、スルホキシルアルキルアジリジン−１−イル又はスルホニルアルキルアジリジン−１−イルを含む二価ラジカルであってもよく、ここで放出型リンカーは、それぞれ場合により、下記に定義される置換基Ｘ２で置換されている。この代替的な実施態様において、スペーサーリンカーは、カルボニル、チオノカルボニル、アルキレンカルボニル、シクロアルキレンカルボニル、カルボニルアルキルカルボニル、１−（カルボニルアルキル）スクシンイミド−３−イルであってもよく、ここで、スペーサーリンカーは、それぞれ場合により、下記に定義される置換基Ｘ１で置換されており、スペーサーリンカーは、放出型リンカーと結合してアジリジンアミドを形成する。
【００６７】
置換基Ｘ１は、アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ハロ、ハロアルキル、スルフヒドリルアルキル、アルキルチオアルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルキルカルボキシレート、アルキルアルカノエート、グアニジノアルキル、Ｒ４−カルボニル、Ｒ５−カルボニルアルキル、Ｒ６−アシルアミノ及びＲ７−アシルアミノアルキルであってもよく、ここで、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、アミノ酸、アミノ酸誘導体及びペプチドから選択され、そしてＲ６及びＲ７は、それぞれ独立して、アミノ酸、アミノ酸誘導体及びペプチドから選択される。この実施態様において、スペーサーリンカーは、窒素を含むことができ、置換基Ｘ１及びスペーサーリンカーは、それに結合して複素環を形成する。
【００６８】
別の実施態様において、放出型リンカーは、アルキレンアジリジン−１−イル、アルキレンカルボニルアジリジン−１−イル、カルボニルアルキルアジリジン−１−イル、アルキレンスルホキシルアジリジン−１−イル、スルホキシルアルキルアジリジン−１−イル、スルホニルアルキルアジリジン−１−イル又はアルキレンスルホニルアジリジン−１−イルを含む二価ラジカルであってもよく、ここで放出型リンカーは、それぞれ場合により、下記に定義されている置換基Ｘ２で置換されている。
【００６９】
例示的な追加の放出型リンカーには、メチレン、１−アルコキシアルキレン、１−アルコキシシクロアルキレン、１−アルコキシアルキレンカルボニル、１−アルコキシシクロアルキレンカルボニル、カルボニルアリールカルボニル、カルボニル（カルボキシアリール）カルボニル、カルボニル（ビスカルボキシアリール）カルボニル、ハロアルキレンカルボニル、アルキレン（ジアルキルシリル）、アルキレン（アルキルアリールシリル）、アルキレン（ジアリールシリル）、（ジアルキルシリル）アリール、（アルキルアリールシリル）アリール、（ジアリールシリル）アリール、オキシカルボニルオキシ、オキシカルボニルオキシアルキル、スルホニルオキシ、オキシスルホニルアルキル、イミノアルキリデニル、カルボニルアルキリデンイミニル、イミノシクロアルキリデニル、カルボニルシクロアルキリデンイミニル、アルキレンチオ、アルキレンアリールチオ及びカルボニルアルキルチオが含まれ、放出型リンカーは、それぞれ場合により、下記に定義されている置換基Ｘ２で置換されている。
【００７０】
前述の実施態様において、放出型リンカーは、酸素を含むことができ、放出型リンカーは、メチレン、１−アルコキシアルキレン、１−アルコキシシクロアルキレン、１−アルコキシアルキレンカルボニル及び１−アルコキシシクロアルキレンカルボニルであってもよく、ここで、放出型リンカーは、それぞれ場合により、下記に定義されている置換基Ｘ２で置換されており、放出型リンカーは、酸素と結合してアセタール又はケタールを形成する。あるいは、放出型リンカーは、酸素を含むことができ、放出型リンカーは、メチレンであってもよく、ここで、メチレンは、場合により置換されているアリールで置換されており、放出型リンカーは、酸素と結合してアセタール又はケタールを形成する。更に、放出型リンカーは、酸素を含むことができ、放出型リンカーは、スルホニルアルキルであってもよく、放出型リンカーは、酸素と結合してアルキルスルホネートを形成する。
【００７１】
上記の放出型リンカーの実施態様の別の実施態様において、放出型リンカーは、窒素を含むことができ、放出型リンカーは、イミノアルキリデニル、カルボニルアルキリデンイミニル、イミノシクロアルキリデニル及びカルボニルシクロアルキリデンイミニルであってもよく、ここで、放出型リンカーは、それぞれ場合により、下記に定義されている置換基Ｘ２で置換されており、放出型リンカーは、窒素と結合してヒドラゾンを形成する。代替的な形態では、ヒドラゾンは、カルボン酸誘導体、オルトギ酸誘導体又はカルバモイル誘導体でアシル化されて、多様なアシルヒドラゾン放出可能リンカーを形成することができる。
【００７２】
あるいは、放出型リンカーは、酸素を含むことができ、放出型リンカーは、アルキレン（ジアルキルシリル）、アルキレン（アルキルアリールシリル）、アルキレン（ジアリールシリル）、（ジアルキルシリル）アリール、（アルキルアリールシリル）アリール及び（ジアリールシリル）アリールであってもよく、ここで、放出型リンカーは、それぞれ場合により、下記に定義されている置換基Ｘ２で置換されており、放出型リンカーは、酸素と結合してシラノールを形成する。
【００７３】
上記の放出型リンカーの実施態様において、薬剤は、窒素原子を含むことができ、放出型リンカーは、窒素を含むことができ、放出型リンカーは、カルボニルアリールカルボニル、カルボニル（カルボキシアリール）カルボニル、カルボニル（ビスカルボキシアリール）カルボニルであってもよく、放出型リンカーは、ヘテロ原子の窒素と結合してアミドを形成することができ、また、薬剤の窒素と結合してアミドを形成することもできる。
【００７４】
上記の放出型リンカーの実施態様において、薬剤は、酸素原子を含むことができ、放出型リンカーは、窒素を含むことができ、放出型リンカーは、カルボニルアリールカルボニル、カルボニル（カルボキシアリール）カルボニル、カルボニル（ビスカルボキシアリール）カルボニルであってもよく、放出型リンカーは、アミドを形成することができ、また、薬剤の窒素と結合してエステルを形成することもできる。
【００７５】
置換基Ｘ２は、アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ハロ、ハロアルキル、スルフヒドリルアルキル、アルキルチオアルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルキルカルボキシレート、アルキルアルカノエート、グアニジノアルキル、Ｒ４−カルボニル、Ｒ５−カルボニルアルキル、Ｒ６−アシルアミノ及びＲ７−アシルアミノアルキルであってもよく、ここで、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、アミノ酸、アミノ酸誘導体及びペプチドから選択され、そしてＲ６及びＲ７は、それぞれ独立して、アミノ酸、アミノ酸誘導体及びペプチドから選択される。この実施態様において、放出型リンカーは、窒素を含むことができ、置換基Ｘ２及び放出型リンカーは、複素環を形成することができる。
【００７６】
複素環は、ピロリジン、ピペリジン、オキサゾリジン、イソオキサゾリジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、ピロリジノン、ピペリジノン、オキサゾリジノン、イソオキサゾリジノン、チアゾリジノン、イソチアゾリジノン及びスクシンイミドであってもよい。
【００７７】
薬剤Ａは、窒素原子を含むことができ、放出型リンカーは、場合により、置換基Ｘ２で置換されているハロアルキレンカルボニルであってもよく、放出型リンカーは、薬剤の窒素と結合してアミドを形成する。
【００７８】
薬剤Ａは、酸素原子を含むことができ、放出型リンカーは、場合により、置換基Ｘ２で置換されているハロアルキレンカルボニルであってもよく、放出型リンカーは、薬剤の酸素と結合してエステルを形成する。
【００７９】
薬剤Ａは、二重結合窒素原子を含むことができ、この実施態様において、放出型リンカーは、アルキレンカルボニルアミノ及び１−（アルキレンカルボニルアミノ）スクシンイミド−３−イルであってもよく、放出型リンカーは、薬剤の窒素と結合してヒドラゾンを形成することができる。
【００８０】
薬剤Ａは、硫黄原子を含むことができ、この実施態様において、放出型リンカーは、アルキレンチオ及びカルボニルアルキルチオであってもよく、放出型リンカーは、薬剤の硫黄と結合してジスルフィドを形成することができる。
【００８１】
薬剤Ａは、マイトマイシン、マイトマイシン誘導体又はマイトマイシン類似体であってもよく、この実施態様において、放出型リンカーは、カルボニルアルキルチオ、カルボニルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラニル、カルボニルテトラヒドロフラニル、１−（カルボニルテトラヒドロ−２Ｈ−ピラニル）スクシンイミド−３−イル及び１−（カルボニルテトラヒドロフラニル）スクシンイミド−３−イルであってもよく、ここで、放出型リンカーは、それぞれ場合により、置換基Ｘ２で置換されており、マイトマイシンのアジリジンは、放出型リンカーと結合してアシルアジリジンを形成する。
【００８２】
結合リガンドＢは、窒素を含む葉酸であってもよく、この実施態様において、スペーサーリンカーは、アルキレンカルボニル、シクロアルキレンカルボニル、カルボニルアルキルカルボニル、１−アルキレンスクシンイミド−３−イル、１−（カルボニルアルキル）スクシンイミド−３−イルであってもよく、ここで、スペーサーリンカーは、それぞれ場合により、置換基Ｘ１で置換されており、スペーサーリンカーは、葉酸窒素と結合してイミド又はアルキルアミドを形成する。この実施態様において、置換基Ｘ１は、アルキル、ヒドロキシアルキル、アミノ、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、スルフヒドリルアルキル、アルキルチオアルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、グアニジノアルキル、Ｒ４−カルボニル、Ｒ５−カルボニルアルキル、Ｒ６−アシルアミノ及びＲ７−アシルアミノアルキルであってもよく、ここで、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、アミノ酸、アミノ酸誘導体及びペプチドから選択され、そしてＲ６及びＲ７は、それぞれ独立して、アミノ酸、アミノ酸誘導体及びペプチドから選択される。
【００８３】
本明細書で使用されるとき、シクロアルキレンという用語は、炭素原子の二価鎖を意味し、その一部は、シクロプロパ−１，１−ジイル、シクロプロパ−１，２−ジイル、シクロヘキサー１，４−ジイル、３−エチルシクロペンタ−１，２−ジイル、１−メチレンシクロヘキサ−４−イルなどのような環を形成する。
【００８４】
本明細書で使用されるとき、複素環という用語は、炭素及びヘテロ原子の一価鎖を意味し、ここでヘテロ原子は、窒素、酸素及び硫黄から選択され、少なくとも１つのヘテロ原子を含むその一部は、アジリジン、ピロリジン、オキサゾリジン、３−メトキシピロリジン、３−メチルピペラジンなどのような環を形成する。
【００８５】
本明細書で使用されるとき、アリールという用語は、フェニル、ナフチルなどのような、炭素原子の芳香族単環式又は多環式の環を意味する。加えて、アリールにはヘテロアリールも含まれうる。
【００８６】
本明細書で使用されるとき、ヘテロアリールという用語は、ピリジニル、ピリミジニル、インドリル、ベンゾオキサゾリルなどのような、炭素原子と、窒素、酸素、硫黄から選択される少なくとも１個のヘテロ原子とからなる芳香族単環式又は多環式の環を意味する。
【００８７】
本明細書で使用されるとき、場合により置換されているという用語は、一般に炭素上で、１つ以上の水素原子を、対応する数の、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、アルキル又はジアルキルアミノ、アルコキシ、アルキルスルホニル、シアノ、ニトロなどのような置換基で置き換えることを意味する。加えて、同じ炭素上の、隣接する炭素上の、又は近接の炭素上の２個の水素を１個の二価置換基で置き換えて、対応する環状構造を形成することができる。
【００８８】
本明細書で使用されるとき、イミノアルキリデニルという用語は、本明細書に定義されているアルキレン及び窒素原子を含有する二価ラジカルを意味し、ここでアルキレンの末端炭素は、式：−（ＣＨ）＝Ｎ−、−（ＣＨ２）２（ＣＨ）＝Ｎ−、−ＣＨ２Ｃ（Ｍｅ）＝Ｎ−などのように、窒素原子に二重結合している。
【００８９】
本明細書で使用されるとき、アミノ酸という用語は、一般に、セリン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などのような天然に生じるアミノ酸に対応する基を含むアミノアルキルカルボキシレートを意味し、ここでアルキルラジカルは、場合により、例えばアルキル、ヒドロキシアルキル、スルフヒドリルアルキル、アミノアルキル、カルボキシアルキルなどで置換されている。そのようなアミノ酸は、単一立体化学のものであるか又はラセミ混合物を含む立体化学の特定の混合物であってもよい。加えて、アミノ酸は、ベータ、ガンマ及びより長いアミノ酸、例えば下記の式：
−Ｎ（Ｒ）−（ＣＲ′Ｒ″）ｑ−Ｃ（Ｏ）−
〔式中、Ｒは、水素、アルキル、アシル又は適切な窒素保護基であり、Ｒ′及びＲ″は、水素又は置換基であり、それぞれ現れるときに、それぞれ独立して選択され、そしてｑは、１、２、３、４又は５のような整数である〕で示されるアミノ酸を意味する。例示的に、Ｒ′及び／又はＲ″は、独立して、水素に対応するか、又は、メチル、ベンジル、ヒドロキシメチル、チオメチル、カルボキシル、カルボキシルメチル、グアニジノプロピルなどの、ただしこれらに限定されない天然に生じるアミノ酸に存在する側鎖、並びにその誘導体及び保護誘導体に対応する。上記に記載された式は、全ての立体化学的変形態様を含む。例えば、アミノ酸は、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、リシン、グルタミン、アルギニン、セリン、オルニチン、トレオニンなどから選択することができる。本明細書に記載されているビタミン受容体結合薬剤送達結合体の中間体の別の例示的態様において、薬剤又はその類似体若しくは誘導体は、アルキルチオール求核剤を含む。
【００９０】
上記記載の用語を組み合わせて、メチルオキシメチル、エチルオキシエチルなどを意味するアルコキシアルキル、トリフルオロメチルオキシエチル、１，２−ジフルオロ−２−クロロエタ−１−イルオキシプロピルなどを意味するハルアルコキシアルキル、ベンジル、フェネチル、α−メチルベンジルなどを意味するアリールアルキルのような、化学的に関連する基を生じうることを理解するべきである。
【００９１】
本明細書で使用されるとき、アミノ酸誘導体という用語は、一般に、場合により置換されているアミノアルキルカルボキシレートを意味し、ここでアミノ基及び／又はカルボキシレート基は、それぞれ場合により、例えばアルキル、カルボキシアルキル、アルキルアミノなどで置換されているか、又は場合により保護されている。加えて、場合により置換されている介在二価アルキルフラグメントは、保護基などのような追加の基を含むことができる。
【００９２】
本明細書で使用されるとき、ペプチドという用語は、一般に、アミド結合により互いに共有結合している、一連のアミノ酸及び／又はアミノ酸類似体及び誘導体を意味する。
【００９３】
本明細書で使用されるとき、用語「放出型リンカー」は、生理学的条件下で分断されうる少なくとも１つの結合（例えば、ｐＨ不安定性、酸不安定性、酸化不安定性又は酵素不安定性の結合）を含むリンカーを意味する。結合分断をもたらすような生理学的条件には、例えば生理学的ｐＨにおいて生じるか、又は細胞基質のｐＨよりも低いｐＨを有するエンドソームのような細胞オルガネラへの区画化の結果により生じる標準的化学加水分解反応が含まれることが、理解されるべきである。
【００９４】
切断しうる結合は、切断しうるリンカーの内部及び／又は切断しうるリンカーの一端若しくは両端に存在することができる。切断しうる結合の不安定性は、そのような結合分断を補助する、又は促進することができる官能基又はフラグメントを多価リンカーＬに含めることによって調整できることが理解され、これは隣接基補助とも呼ばれる。加えて、放出型リンカーの結合分断後に受容体結合リガンド剤結合体の追加的な断片化を補助する、又は促進することができる追加の官能基又はフラグメントを、多価リンカーＬに含めうることが理解される。切断しうる結合の不安定性は、例えば、切断しうるジスルフィド結合に隣接してアルファ分岐を含むこと、加水分解しうるケイ素酸素結合を有する部分のケイ素の置換基の疎水性を増加すること、加水分解しうるケタール又はアセタールの一部を形成するアルコキシ基を同族体化することなどのような、切断しうる結合上の又はその近傍における置換変化により調整することができる。
【００９５】
切断しうる結合は、２つの隣接する原子を放出型リンカー内で連結できること、並びに／或いは、他のリンカー又は本明細書に記載されているＶ及び／若しくはＤを、放出型リンカーのどちらか又は両方の末端で連結できること、が理解される。切断しうる結合が２つの隣接する原子を放出型リンカー内で連結する場合、結合の分断の後、放出型リンカーは、２つ以上のフラグメントに分断される。あるいは、切断しうる結合が、放出型リンカーと、追加のヘテロ原子、追加のスペーサーリンカー、別の放出型リンカー、薬剤Ａ又はその類似体若しくは誘導体、又は結合リガンドＢ又はその類似体若しくは誘導体のような別の部分との間にある場合、結合の分断の後、放出型リンカーは、他の部分から分離される。
【００９６】
追加のスペーサー及び放出型リンカーは、それぞれ二価であることが理解される。それぞれの多様な追加のスペーサー及び放出型リンカーそれ自体の間の連結、並びに多様な追加のスペーサー及び放出型リンカーと、本明細書で定義されているＡ及び／又はＢとの間の連結は、多様な追加のスペーサー又は放出型リンカーにおいて見出される任意の原子において生じうることが、更に理解されるべきである。
【００９７】
本明細書に記載されている多様な受容体結合薬剤送達結合体の一つの態様において、多価リンカーは、一緒になって３−チオスクシンイミド−１−イルアルキルオキシメチルオキシを形成する、追加のスペーサーリンカー及び放出型リンカーを含み、ここでメチルは、場合により、アルキル又は置換アリールで置換されている。
【００９８】
別の態様において、多価リンカーは、一緒になって３−チオスクシンイミド−１−イルアルキルカルボニルを形成する、追加のスペーサーリンカー及び放出型リンカーを含み、ここでカルボニルは、薬剤Ａと共に、アシルアジリジン又はその類似体若しくは誘導体を形成する。
【００９９】
別の態様において、多価リンカーは、一緒になって１−アルコキシシクロアルキレンオキシを形成する、追加のスペーサーリンカー及び放出型リンカーを含む。
【０１００】
別の態様において、多価リンカーは、一緒になってアルキレンアミノカルボニル（ジカルボキシルアリーレン）カルボキシレートを形成する、追加のスペーサーリンカー及び放出型リンカーを含む。
【０１０１】
別の態様において、多価リンカーは、一緒になってジチオアルキルカルボニルヒドラジドを形成する、放出型リンカー、追加のスペーサーリンカー及び放出型リンカーを含み、ここでヒドラジドは、薬剤Ａと共に、ヒドラゾン又はその類似体若しくは誘導体を形成する。
【０１０２】
別の態様において、多価リンカーは、一緒になって３−チオスクシンイミド−１−イルアルキルカルボニルヒドラジドを形成する、追加のスペーサーリンカー及び放出型リンカーを含み、ここでヒドラジドは、薬剤Ａと共に、ヒドラゾン又はその類似体若しくは誘導体を形成する。
【０１０３】
別の態様において、多価リンカーは、一緒になって３−チオアルキルスルホニルアルキル（二置換シリル）オキシを形成する、追加のスペーサーリンカー及び放出型リンカーを含み、ここで二置換シリルは、アルキル又は場合により置換されているアリールで置換されている。
【０１０４】
別の態様において、多価リンカーは、天然に生じるアミノ酸及びその立体異性体からなる群より選択される複数の追加のスペーサーリンカーを含む。
【０１０５】
別の態様において、多価リンカーは、一緒になって３−ジチオアルキルオキシカルボニルを形成する、放出型リンカー、追加のスペーサーリンカー及び放出型リンカーを含み、ここでカルボニルは、薬剤Ａと共に、カーボネート又はその類似体若しくは誘導体を形成する。
【０１０６】
別の態様において、多価リンカーは、一緒になって３−ジチオアリールアルキルオキシカルボニルを形成する、放出型リンカー、追加のスペーサーリンカー及び放出型リンカーを含み、ここでカルボニルは、薬剤Ａと共に、カーボネート又はその類似体若しくは誘導体を形成し、そしてアリールは場合により置換されている。
【０１０７】
別の態様において、多価リンカーは、一緒になって３−チオスクシンイミド−１−イルアルキルオキシアルキルオキシアルキリデンを形成する、追加のスペーサーリンカー及び放出型リンカーを含み、ここでアルキリデンは、薬剤Ａと共に、ヒドラゾン又はその類似体若しくは誘導体を形成し、アルキルは、それぞれ独立して選択され、そしてオキシアルキルオキシは、場合により、アルキル又は場合により置換されているアリールで置換されている。
【０１０８】
別の態様において、多価リンカーは、一緒になって３−ジチオアルキルオキシカルボニルヒドラジドを形成する、放出型リンカー、追加のスペーサーリンカー及び放出型リンカーを含む。
【０１０９】
別の態様において、多価リンカーは、一緒になって３−ジチオアルキルアミノを形成する、放出型リンカー、追加のスペーサーリンカー及び放出型リンカーを含み、ここでアミノは、薬剤Ａと共に、ビニル系アミド又はその類似体若しくは誘導体を形成する。
【０１１０】
別の態様において、多価リンカーは、一緒になって３−ジチオアルキルアミノを形成する、放出型リンカー、追加のスペーサーリンカー及び放出型リンカーを含み、ここでアミノは、薬剤Ａと共に、ビニル系アミド又はその類似体若しくは誘導体を形成し、そしてアルキルはエチルである。
【０１１１】
別の態様において、多価リンカーは、一緒になって３−ジチオアルキルアミノカルボニルを形成する、放出型リンカー、追加のスペーサーリンカー及び放出型リンカーを含み、ここでカルボニルは、薬剤Ａと共に、カルバメート又はその類似体若しくは誘導体を形成する。
【０１１２】
別の態様において、多価リンカーは、一緒になって３−ジチオアルキルアミノカルボニルを形成する、放出型リンカー、追加のスペーサーリンカー及び放出型リンカーを含み、ここでカルボニルは、薬剤Ａと共に、カルバメート又はその類似体若しくは誘導体を形成し、そしてアルキルはエチルである。
【０１１３】
別の態様において、多価リンカーは、一緒になって３−ジチオアリールアルキルオキシカルボニルを形成する、放出型リンカー、追加のスペーサーリンカー及び放出型リンカーを含み、ここでカルボニルは、薬剤Ａと共に、カルバメート又はカルバモイルアジリジン、又はその類似体若しくは誘導体を形成する。
【０１１４】
別の実施態様において、多価リンカー（Ｌ）は、ジスルフィド放出可能リンカーを含む。別の実施態様において、多価リンカー（Ｌ）は、ジスルフィド放出可能リンカーではない少なくとも１つの放出型リンカーを含む。
【０１１５】
一つの態様において、放出型リンカー及びスペーサーリンカーを、多価リンカーの結合の切断の後、放出された官能基が追加の結合の分断又は切断を化学的に補助するように配置することができ、これは隣接基補助切断又は分断とも呼ばれる。そのような多価リンカー又はその一部の例示的な実施態様には、以下の式：
【化１９】
0005690589.tif 000020
〔式中、Ｘは、窒素、酸素若しくは硫黄のようなヘテロ原子、又はカルボニル基であり；ｎは、０〜４から選択される整数であり、例示的には２であり；Ｒは、水素、又は正電荷を誘導的に又はメトキシを含むアルコキシのようなアリール環の共鳴により安定化することができる置換基を含む、置換基であり；そして符号（＊）は、追加のスペーサー、ヘテロ原子又は多価リンカーを形成する放出型リンカーの結合点、あるいは薬剤又はその類似体若しくは誘導体、又はビタミン又はその類似体若しくは誘導体の結合点を示す〕を有する化合物が含まれる。一つの実施態様において、ｎは２であり、そしてＲはメトキシである。ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ハロなどの、ただしこれらに限定されない他の置換基が、アリール環、ベンジル炭素、アルカン酸又はメチレン架橋に存在できることが、理解される。補助切断は、ベンジリニウム中間体、ベンジン中間体、ラクトン環化、オキソニウム中間体、ベータ脱離などを伴う機構を含むことができる。放出型リンカーの切断の後の断片化に加えて、放出型リンカーの最初の切断を隣接基補助機構により促進できることが、更に理解される。
【０１１６】
そのようなリンカーを形成するのに有用な中間体の例示的な例には、下記が含まれ：
【化２０】
0005690589.tif 000021
ここで、Ｘａは、マレイミド、ビニルスルホン、活性化カルボン酸誘導体などのような求電子基であり、Ｘｂは、ＮＨ、Ｏ又はＳであり、そしてｍ及びｎは、それぞれ、０〜４の整数から独立して選択される。一つの変形態様において、ｍ及びｎは、それぞれ０〜２の整数から独立して選択される。そのような中間体を、求電子基Ｘａへの求核攻撃を介して又はのエステル若しくはカルボン酸誘導体を形成することによって、薬剤、結合リガンド又は他のリンカーに結合することができる。一つの実施態様において、ベンジルヒドロキシル基は、ホスゲン又はホスゲン同等物により、対応する活性化ベンジルオキシカルボニル化合物に変換される。この実施態様を、活性化カルボニル基への求核攻撃を介して、薬剤、結合リガンド又は他のリンカーに結合することができる。
【０１１７】
本明細書に記載されている二価リンカーの切断の例示的な機構には、以下の１，４及び１，６断片化機構が含まれ：
【化２１】
0005690589.tif 000022
ここで、Ｘは、外来性又は内在性求核剤、グルタチオン又は生体内還元剤などであり、そしてＺ又はＺ′のいずれかは、ビタミン又はその類似体若しくは誘導体、又は薬剤又はその類似体若しくは誘導体、又は多価リンカーの他の部分と一緒にしたビタミン若しくは薬剤部分である。なお上記の断片化機構は協調的機構として描かれているが、任意の数の別個の工程が生じて、多価リンカーの、示されている最終生成物に至る最終的な断片化をもたらしてもよいことが、理解されるべきである。例えば、結合切断は、上記の例に例示されているベータ硫黄又はジスルフィドのいずれかのアリール基により提供される安定化によって隣接基補助されうる、カルバメート部分の酸触媒脱離によっても生じうることが理解される。本実施態様のこれらの変形態様において、放出型リンカーは、カルバメート部分である。あるいは、断片化は、ジスルフィド基への求核攻撃により開始され、切断を引き起こしてチオレートを形成することができる。チオレートは、炭酸又はカルバミン酸部分を分子間で置換して、対応するチアシクロプロパンを形成することができる。ベンジル含有多価リンカーの場合では、例示的なジスルフィド結合分断の後、得られたフェニルチオレートは、共鳴安定化中間体を形成することによって、更に断片化されて炭酸又はカルバミン酸部分を放出することができる。これらのいずれかの場合において、本明細書に記載されている例示的な多価リンカーの放出可能特性は、既存の化学的、代謝的、生理学的又は生物学的条件に関連しうるどのような機構によっても実現することができる。
【０１１８】
放出型リンカーの結合切断の他の例示的な機構には、以下のようなオキソニウム補助切断を含み：
【化２２】
0005690589.tif 000023
ここで、Ｚは、ビタミン又はその類似体若しくは誘導体、又は薬剤又はその類似体若しくは誘導体であるか、或いは、それぞれ、１つ以上のスペーサーリンカー及び／又は他の放出可能リンカーを含む薬剤又はビタミン部分のような、多価リンカーの他の部分と一緒にしたビタミン若しくは薬剤部分である。理論に束縛されることなく、この実施態様において、例えばエンドソーム内にある酸触媒は、ウレタン基のプロトン化を介して切断を開始することができる。加えて、カルバメートの酸触媒脱離は、ＣＯ２及びＺに結合している窒素含有部分の放出をもたらし、水又は他の任意のルイス酸により捕捉されうるベンジルカチオンの形成をもたらす。
【０１１９】
他の例示的なリンカーには、下記の式：
【化２３】
0005690589.tif 000024
〔式中、Ｘは、ＮＨ、ＣＨ２又はＯであり；Ｒは、水素、又は正電荷を誘導的に又はメトキシを含むアルコキシのようなアリール環の共鳴により安定化することができる置換基を含む、置換基であり；そして符号（＊）は、追加のスペーサー、ヘテロ原子又は多価リンカーを形成する放出型リンカーの結合点、あるいは薬剤又はその類似体若しくは誘導体、又はビタミン又はその類似体若しくは誘導体の結合点を示す〕で示される化合物が含まれる。
【０１２０】
本明細書に記載されているそのような多価リンカーの切断の例示的な機構には、以下の１，４及び１，６断片化機構が含まれ、それらに続くのはヒドラジド基による環化を介したアシル化Ｚ′の隣接基補助切断である：
【化２４】
0005690589.tif 000025
ここで、Ｘは、外来性又は内在性求核剤、グルタチオン又は生体内還元剤などであり、そしてＺ又はＺ′のいずれかは、ビタミン又はその類似体若しくは誘導体、又は薬剤又はその類似体若しくは誘導体、又は多価リンカーの他の部分と一緒にしたビタミン若しくは薬剤部分である。なお上記の断片化機構は協調的機構として描かれているが、任意の数の別個の工程が生じて、多価リンカーの、示されている最終生成物に至る最終的な断片化をもたらしてもよいことが、理解されるべきである。例えば、結合切断は、上記の例に例示されているベータ硫黄又はジスルフィドのいずれかのアリール基により提供される安定化によって隣接基補助されうる、カルバメート部分の酸触媒脱離によっても生じうることが理解される。本実施態様のこれらの変形態様において、放出型リンカーは、カルバメート部分である。あるいは、断片化は、ジスルフィド基への求核攻撃により開始され、切断を引き起こしてチオレートを形成することができる。チオレートは、炭酸又はカルバミン酸部分を分子間で置換して、対応するチアシクロプロパンを形成することができる。ベンジル含有多価リンカーの場合では、例示的なジスルフィド結合分断の後、得られたフェニルチオレートは、共鳴安定化中間体を形成することによって、更に断片化されて炭酸又はカルバミン酸部分を放出することができる。これらのいずれかの場合において、本明細書に記載されている例示的な多価リンカーの放出可能特性は、既存の化学的、代謝的、生理学的又は生物学的条件に関連しうるどのような機構によっても実現することができる。理論に束縛されることなく、この実施態様において、例えばエンドソーム内にある酸触媒は、ウレタン基のプロトン化を介して切断を開始することもできる。加えて、カルバメートの酸触媒脱離は、ＣＯ２及びＺに結合している窒素含有部分の放出をもたらし、水又は他の任意のルイス酸により捕捉されうるベンジルカチオンの形成をもたらし、本明細書に同じように記載されている。
【０１２１】
一つの実施態様において、本明細書に記載されている多価リンカーは、以下の式：
【化２５】
0005690589.tif 000026
〔式中、ｎは、１〜約４から選択される整数であり；Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立して、水素及び場合により分岐鎖であるＣ１〜Ｃ４アルキルのような低級アルキルを含むアルキルからなる群より選択されるか、或いはＲａ及びＲｂは、結合している炭素原子と一緒になって炭素環を形成し；Ｒは、場合により置換されているアルキル基、場合により置換されているアシル基又は適切に選択された窒素保護基であり；そして（＊）は、薬剤、ビタミン、画像化剤、診断剤、他の多価リンカー又は結合体の他の部分の結合点を示す〕で示される化合物である。
【０１２２】
別の実施態様において、本明細書に記載されている多価リンカーは、以下の式：
【化２６】
0005690589.tif 000027
〔式中、ｍは、１〜約４から選択される整数であり；Ｒは、場合により置換されているアルキル基、場合により置換されているアシル基又は適切に選択された窒素保護基であり；そして（＊）は、薬剤、ビタミン、画像化剤、診断剤、他の多価リンカー又は結合体の他の部分の結合点を示す〕で示される化合物を含む。
【０１２３】
別の実施態様において、本明細書に記載されている多価リンカーは、以下の式：
【化２７】
0005690589.tif 000028
〔式中、ｍは、１〜約４から選択される整数であり；Ｒは、場合により置換されているアルキル基、場合により置換されているアシル基又は適切に選択された窒素保護基であり；そして（＊）は、薬剤、ビタミン、画像化剤、診断剤、他の多価リンカー又は結合体の他の部分の結合点を示す〕で示される化合物を含む。
【０１２４】
別の例示的な機構は、放出型リンカー及びスペーサーリンカーを、多価リンカーの結合の切断の後、放出された官能基が追加の結合の分断又は切断を化学的に補助するように配置することを伴い、これは隣接基補助切断又は分断とも呼ばれる。そのような多価リンカー又はその一部の例示的な実施態様には、下記の式：
【化２８】
0005690589.tif 000029
〔式中、Ｘは、窒素、酸素又は硫黄のようなヘテロ原子であり、ｎは、０、１、２及び３から選択される整数であり、Ｒは、水素、又は正電荷を誘導的に又はアルコキシなどのようなアリール環の共鳴により安定化することができる置換基を含む、置換基であり、Ｚ又はＺ′のいずれかは、ビタミン又はその類似体若しくは誘導体、又は薬剤又はその類似体又は誘導体、又は多価リンカーの他の部分と一緒にしたビタミン若しくは薬剤部分である〕を有する化合物が含まれる。ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ハロなどの、ただしこれらに限定されない他の置換基が、アリール環、ベンジル炭素、カルバメート窒素、アルカン酸又はメチレン架橋に存在できることが、理解される。補助切断は、ベンジリニウム中間体、ベンジン中間体、ラクトン環化、オキソニウム中間体、ベータ脱離などを伴う機構を含むことができる。放出型リンカーの切断の後の断片化に加えて、放出型リンカーの最初の切断を隣接基補助機構により促進できることが、更に理解される。
【０１２５】
この実施態様において、環化されてもよいヒドロキシアルカン酸は、例えばオキソニウムイオンによりメチレン架橋の切断を促進し、結合切断を促進するか又は放出型リンカーの結合切断の後に続く断片化を促進する。あるいは、メチレン架橋の酸触媒オキソニウムイオン補助切断は、この例示的な多価リンカー又はそのフラグメントの断片化カスケードを開始することができる。あるいは、カルバメートの酸触媒加水分解は、環化してもよいヒドロキシアルカン酸のベータ脱離を促進することができ、例えばオキソニウムイオンによるメチレン架橋の切断を促進することができる。本明細書に記載されている代謝的、生理学的又は細胞条件下での結合分断又は切断の、その他の化学的機構が、そのような断片化のカスケードを開始してもよいことが理解される。本明細書に記載されている代謝的、生理学的又は細胞条件下での結合分断又は切断の、その他の化学的機構が、そのような断片化のカスケードを開始してもよいことが理解される。
【０１２６】
本明細書に記載されているリンカーの別の例示的な実施態様には、ベータ脱離を伴う化学的機構により本明細書に記載されている条件下で切断する放出型リンカーが含まれる。一つの態様において、そのような放出型リンカーには、ベータ−チオ、ベータ−ヒドロキシ及びベータ−アミノ置換カルボン酸、並びにエステル、アミド、カーボネート、カルバメート及び尿素のようなその誘導体が含まれる。別の態様において、そのような放出型リンカーには、２−及び４−チオアリールエステル、カルバメート及びカーボネートが含まれる。
【０１２７】
別の実施態様において、多価リンカーは、連結して多価３−チオスクシンイミド−１−イルアルキルオキシメチルオキシ基を形成する、追加のスペーサーリンカー及び放出型リンカーを含み、以下の式により例示される：
【化２９】
0005690589.tif 000030
式中、ｎは、１〜６の整数であり、アルキル基は、場合により置換されており、メチルは、場合により、追加のアルキル又は場合により置換されているアリール基で置換されており、それぞれ、基Ｒから独立して選択されて表されている。符号（＊）は、本明細書に記載されている結合体の他の部分への多価リンカーフラグメントの結合点を示す。
【０１２８】
別の実施態様において、多価リンカーは、連結して多価３−チオスクシンイミド−１−イルアルキルカルボニル基を形成する、追加のスペーサーリンカー及び放出型リンカーを含み、以下の式により例示される：
【化３０】
0005690589.tif 000031
式中、ｎは、１〜６の整数であり、アルキル基は場合により置換されている。符号（＊）は、本明細書に記載されている結合体の他の部分への多価リンカーフラグメントの結合点を示す。別の態様において、多価リンカーは、連結して多価３−チオアルキルスルホニルアルキル（二置換シリル）オキシ基を形成する、スペーサーリンカー及び放出型リンカーを含み、ここで二置換シリルは、アルキル及び／又は場合により置換されているアリール基で置換されている。
【０１２９】
別の実施態様において、多価リンカーは、連結して多価ジチオアルキルカルボニルヒドラジド基又は多価３−チオスクシンイミド−１−イルアルキルカルボニルヒドラジドを形成する、追加のスペーサーリンカー及び放出型リンカーを含み、以下の式により例示される：
【化３１】
0005690589.tif 000032
式中、ｎは１〜６の整数であり、アルキル基は、場合により置換されており、ヒドラジドは、（Ｂ）、（Ｄ）又は多価リンカー（Ｌ）の別の部分と共にヒドラゾンを形成する。符号（＊）は、本明細書に記載されている結合体の他の部分への多価リンカーフラグメントの結合点を示す。
【０１３０】
別の実施態様において、多価リンカーは、連結して多価３−チオスクシンイミド−１−イルアルキルオキシアルキルオキシアルキリデン基を形成する、追加のスペーサーリンカー及び放出型リンカーを含み、以下の式により例示される：
【化３２】
0005690589.tif 000033
式中、ｎは、それぞれ、１〜６から独立して選択される整数であ、アルキル基は、それぞれ独立して選択され、場合により、例えばアルキル又は場合により置換されているアリールで置換されており、アルキリデンは、（Ｂ）、（Ｄ）又は多価リンカー（Ｌ）の他の部分と共にヒドラゾンを形成する。符号（＊）は、本明細書に記載されている結合体の他の部分への多価リンカーフラグメントの結合点を示す。
【０１３１】
追加のスペーサーリンカーの追加的な例示には、アルキレン−アミノ−アルキレンカルボニル、アルキレン−チオ−カルボニルアルキルスクシンイミド−３−イルなどが含まれ、以下の式により更に例示されている：
【化３３】
0005690589.tif 000034
式中、整数ｘ及びｙは、１、２、３、４又は５である。
【０１３２】
別の例示的な実施態様において、リンカーは１つ以上のアミノ酸を含む。一つの変形態様において、リンカーは、単一のアミノ酸を含む。別の変形態様において、リンカーは、２〜約５０個、２〜約３０個、又は２〜約２０個のアミノ酸を有するペプチドを含む。別の変形態様においてリンカーは、約４〜約８個のアミノ酸を有するペプチドを含む。そのようなアミノ酸は、天然に生じるアミノ酸又はその立体異性体から例示的に選択される。アミノ酸は、他の任意のアミノ酸であってもよく、例えば、下記の一般式：
−Ｎ（Ｒ）−（ＣＲ′Ｒ″）ｑ−Ｃ（Ｏ）−
〔式中、Ｒは、水素、アルキル、アシル又は適切な窒素保護基であり、Ｒ′及びＲ″は、水素又は置換基であり、それぞれ現れるときに、それぞれ独立して選択され、そしてｑは、１、２、３、４又は５のような整数である〕を有する任意のアミノ酸であってもよい。例示的に、Ｒ′及び／又はＲ″は、独立して、水素に対応するか又はメチル、ベンジル、ヒドロキシメチル、チオメチル、カルボキシル、カルボキシルメチル、グアニジノプロピルなどの、ただしこれらに限定されない天然に生じるアミノ酸に存在する側鎖、並びにその誘導体及び保護誘導体に対応する。上記に記載された式は、全ての立体化学的変形態様を含む。例えば、アミノ酸は、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、リシン、グルタミン、アルギニン、セリン、オルニチン、トレオニンなどから選択することができる。一つの変形態様において、放出型リンカーは、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、リシン、グルタミン、アルギニン、セリン、オルチニン及びトレオニンから選択される少なくとも２個のアミノ酸を含む。別の変形態様において、放出型リンカーは、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、リシン、グルタミン、アルギニン、セリン、オルチニン及びトレオニンから選択される２〜約５個のアミノ酸を含む。別の変形態様において、放出型リンカーは、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、リシン、アルギニン及びオルニチン、並びにこれらの組み合わせから選択されるアミノ酸から構成される、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド又はヘキサペプチドを含む。
【０１３３】
本明細書に記載されているビタミン受容体結合薬剤送達結合体の中間体の別の例示的態様において、薬剤又はその類似体若しくは誘導体は、アルキルチオール求核剤を含む。
【０１３４】
追加のリンカーが以下の表に記載されており、（＊）原子は、追加のスペーサー若しくは放出型リンカー、薬剤及び／又は結合リガンドの結合点である。
【０１３５】
以下の例示的なスペーサーリンカーを記載する。
【表１】
0005690589.tif 000035
【０１３６】
以下の例示的な放出型リンカーを記載する。
【表２】
0005690589.tif 000036
【０１３７】
そのような親水性リンカーは、特に米国特許出願第１０／７６５，３３６号に記載されているペプチドに基づいた形態のような他の結合体の形態と比較すると、結合体の安定性、代謝性及び組織分布性を変えてもよいことが理解される。例えば、特定の条件下では、炭水化物タンパク質相互作用は、ペプチドタンパク質相互作用よりも弱いことが理解される。したがって、本明細書に記載されている多様な実施態様において、結合体は、血清タンパク質のより低い結合をもたらしうる。本明細書に記載されている結合体の、他の既に報告されているものと間のこれらのような違い及び他の物理化学的な違いには、標的細胞への増強された標的指向性、及び、改善された、すなわちより選択的又は差次的に選択的な体内分布プロフィールを含むことができる。細胞毒性の増加は、血清タンパク質結合の減少、又はより良好な若しくは差次的な体内分布（すなわち、非特異的区画において無駄になる薬剤が少ない）の当然の結果でありうる。このことは、親水性だが中性のスペーサーの使用に特に当てはまる。理論に束縛されることなく、本明細書に記載されている親水性スペーサーリンカーは、少なくとも部分的に非特異的結合相互作用に起因しうる毒性を減少できることも示唆される。
【０１３８】
代替的実施態様において、薬剤を、親水性スペーサーリンカーに、直接的又は間接的に結合して、肝臓クリアランスを減少する目標を達成する。本明細書において、放出可能であってもなくても、親水性基、より詳細には親水性中性基の結合は、腎臓特異的送達を増加することが見出されている。
【０１３９】
ジスルフィドリンカー及びペプチドスペーサーを有する葉酸−薬剤結合体の肝臓クリアランスは、残留的な、時には著しく不都合な毒性プロフィールを保持することが、観察されている。本明細書に記載されている親水性スペーサーを含めることは、腎臓特異的送達のために、ベクターにも導入される。したがって、標的化薬剤結合体にそのようなリンカーを含めることは、全体的な肝臓取り込みを減少し、したがって全体的な毒性を減少することが理解される。理論に束縛されることなく、例えばビンカアルカノイド結合体によるＭＴＤでの毒性は、非特異的肝臓クリアランスにより引き起こされ、代謝を引き起こし、ＤＡＶＬＢＨのような遊離薬剤の胆汁への、次に腸への放出をもらしうることが理解される。局在性の毒性と同様に全身性の毒性（再吸収に起因する）が次に生じうる。本明細書に記載されている標的化及び非標的化結合体に親水性リンカーを含めることによって、腎臓からのクリアランスが優先的に生じ、したがって、同時に生じる肝臓代謝に基づく毒性を減少及び／又は回避することができると考えられる。したがって、一連の薬剤葉酸結合体からのＤＡＶＬＢＨのような薬剤成分の総胆汁クリアランスの測定を使用して、どの薬剤が最も毒性が少ないかを予測することができる。
【０１４０】
上記に記載したように、本明細書に記載されている結合体を使用して、標的薬剤Ａを選択的又は特異的な方法で細胞に送達することができる。そのような送達の一つの態様において、望ましくないクリアランス機構を回避することもできる。本明細書に記載されている親水性スペーサーリンカーは、受容体リガンドＢと薬剤Ａの結合体を形成するのに使用されると、肝臓からのクリアランスの量を減少できることが、発見されている。これらの親水性スペーサーリンカーは、腎臓のような腎経路を通したクリアランスを好む傾向があることが、更に発見されている。本明細書に記載されている結合体は、同じ方法で投与されたとき、母体薬剤Ａそれ自体よりも低い毒性を示すことが、更に発見されている。理論に束縛されることなく、より低い毒性は、腎臓クリアランス機構に対して肝臓クリアランス機構の減少が観察されたことから生じていることが示唆されている。
【０１４１】
別の実施態様において、肝臓への取り込みが低減され、肝臓により取り除かれる可能性が少ない化合物が、本明細書に記載される。一つの態様において、そのような化合物は、肝臓プロセスと比べて、腎臓プロセスにより優先的に取り除かれる。したがって、別の実施態様において、以下の式：
Ｌ−Ａ
〔式中、Ｌは、親水性スペーサーリンカーであり、そしてＡは、診断、治療又は画像化剤である〕で示される非標的化化合物が、本明細書に記載されている。そのような非標的化化合物は、受容体リガンドＢを使用して標的化されていないが、そうであっても、同じ方法で送達されたとき、母体薬剤Ａよりも減少した毒性を示しうることが理解される。非標的化化合物は、本明細書に記載されている標的化結合体と同様に、親水性スペーサーＬを含む。したがって、望ましく治療される細胞に到達しない薬剤は、通常の代謝及び生物学的経路により取り除かれる。しかし、親水性スペーサーリンカーＬの存在は、クリアランスを、肝臓経路ではなく腎臓経路を通すように導くことが理解される。
【０１４２】
別の実施態様において、多剤剤結合体が本明細書に記載される。そのような多剤結合体の幾つかの例示的な形態が本明細書において考慮され、ＰＣＴ国際公報ＷＯ２００７／０２２４９４に記載されている化合物及び組成物が含まれ、この開示は参照として本明細書に組み込まれる。例示的には、多価リンカーは、受容体リガンドＢと２つ以上の薬剤Ａとを、多様な構造的形態で連結してもよく、その形態としては、以下の例示的な一般式：
【化３４】
0005690589.tif 000037
〔式中、Ｂは、受容体結合リガンドであり、（Ｌ１）、（Ｌ２）及び（Ｌ３）は、それぞれ、親水性スペーサーリンカーを含み、場合により１つ以上の放出型リンカー及び／又は追加のリンカーを含む、本明細書に記載されている多価リンカーであり、そして（Ａ１）、（Ａ２）及び（Ａ３）は、それぞれ、薬剤Ａ又はその類似体若しくは誘導体である〕が含まれるが、これらに限定されない。追加の薬剤Ａ又はその類似体若しくは誘導体、追加のリンカー、及び（Ｂ）、（Ｌ）及び（Ａ）それぞれの配置の追加の形態を含む他の変形態様も、本明細書において考慮される。
【０１４３】
一つの変形態様において、２つ以上の結合リガンドＢが、本明細書に記載されている送達結合体に含まれ、その結合体としては、以下の例示的な一般式：
【化３５】
0005690589.tif 000038
〔式中、Ｂは、それぞれ受容体結合リガンドであり、（Ｌ１）、（Ｌ２）及び（Ｌ３）は、それぞれ、親水性スペーサーリンカーを含み、場合により１つ以上の放出型リンカー及び／又は追加のリンカーを含む、本明細書に記載されている多価リンカーであり、そして（Ａ１）、（Ａ２）及び（Ａ３）は、それぞれ、薬剤Ａ又はその類似体若しくは誘導体である〕が含まれるが、これらに限定されない。追加の薬剤Ａ又はその類似体若しくは誘導体、追加のリンカー、及び（Ｂ）、（Ｌ）及び（Ａ）それぞれの配置の追加の形態を含む他の変形態様も、本明細書において考慮される。一つの変形態様において、受容体結合リガンドＢは、同じ受容体のリガンドであり、別の変形態様では、受容体結合リガンドＢは、異なる受容体のリガンドである。
【０１４４】
別の例示的な実施態様において、薬剤は、特定の作用機構を有する病原性細胞の１つ以上の集団に対する活性に基づいて選択される。例示的な作用機構には、アルキル化剤、ベータ−チューブリン剤を含む微小管形成を安定化及び／又は不安定化するものを含む微小管インヒビター、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）インヒビター、トポイソメラーゼインヒビター、タンパク質合成インヒビター、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＰＫＣ、ＰＩ３Ｋなどのインヒビターを含むタンパク質キナーゼインヒビター、転写インヒビター、抗葉酸剤、熱ショックタンパク質ブロッカーなどが含まれる。
【０１４５】
例示的なアルキル化剤には、マイトマイシンＣＢＩなどが含まれるが、これに限定されない。例示的なサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）インヒビターには、ＣＹＣ２０２、セリシクリブ、Ｒ−ロスコビチン、ＡＧＭ−１４７０などが含まれるが、これらに限定されない。例示的なトポイソメラーゼインヒビターには、ドキソルビシン、他のアントラサイクリンなどが含まれるが、これらに限定されない。例示的なタンパク質合成インヒビターには、ブルセアンチンなどが含まれるが、これに限定されない。Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＰＫＣ、ＰＩ３Ｋなどのインヒビターを含む例示的なタンパク質キナーゼインヒビターには、Ｌ−７７９，４５０、Ｒ１１５７７７などが含まれるが、これらに限定されない。例示的な転写インヒビターには、αアマナチン、アクチノマイシンなどが含まれるが、これらに限定されない。例示的な抗葉酸剤には、メトトレキセートなどが含まれるが、これに限定されない。例示的な熱ショックタンパク質ブロッカーには、ゲルダナマイシンなどが含まれるが、これに限定されない。
【０１４６】
微小管形成を安定化及び／又は不安定化するものを含む例示的な微小管インヒビターには、βチューブリン剤、微小管毒などが含まれる。選択された受容体に結合する例示的な微小管毒には、アレナスタチン、ドラスタチン、ハリコンドリンＢ、マイタンシン、ホモプシンＡ、リゾキシン、ウスチロキシン、ビンブラスチン、ビンクリスチンなどのようなビンカ結合部位に結合するインヒビター、 ディスコデルモリド、エポチロン、タキソール、パクリタキソールなどのようなタキソール結合部位に結合する安定剤、コルヒチン、コンブレタスタチン、クラシンＡ、ポドフィロトキシン、ステガナシンなどのようなコルヒチン結合部位に結合するインヒビター、及びクリプトフィシン、チューブリシンなどのような未確定部位に結合する他のものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４７】
一つの実施態様において、チューブリシンは、天然に生じるチューブリシンである。別の実施態様において、チューブリシンは、合成又は半合成チューブリシンである。本明細書に記載されている結合体に含めることができる追加的なチューブリシンは、ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５６８２４に記載されており、その開示は参照として本明細書に組み込まれる。
【０１４８】
本明細書に記載されている薬剤送達結合体の一つの実施態様において、少なくとも１つの薬剤は、微小管インヒビター又はその類似体若しくは誘導体である。別の実施態様において、少なくとも１つの薬剤は、ＤＮＡアルキル化剤である。別の実施態様において、少なくとも１つの薬剤はＤＮＡアルキル化剤であり、少なくとも１つの他の薬剤は微小管インヒビターである。
【０１４９】
本明細書に記載されている薬剤送達結合体の別の実施態様において、薬剤のうちの少なくとも１つは、Ｐ−糖タンパク質（ＰＧＰ）インヒビターである。別の実施態様において、本明細書に記載されている薬剤送達結合体に含まれる薬剤のうちの少なくとも１つはＰＧＰインヒビターであり、薬剤送達結合体に含まれる薬剤のうちの他の少なくとも１つはＰＧＰ基質である。この後者の実施態様において、例示的には、ＰＧＰ基質はＤＮＡアルキル化剤である。この実施態様を参照すると、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡなどのような任意のマイトマイシンを含む、ただしこれらに限定されないＤＮＡアルキル化剤のようなＰＧＰ基質と、ＰＧＰインヒビターとを対合すると、そうでなければＰＧＰ基質である薬剤の全体的な機能を改善できることが理解される。本明細書に記載されている放出型結合体において、ＰＧＰインヒビター薬剤及びＰＧＰ基質薬剤は、両方とも、エンドサイトーシスの後で細胞内に放出される。この方法によって、ＰＧＰインヒビター薬剤は、ＰＧＰ基質薬剤の全体的な効能及び／又は効力を改善することができる。加えて、ＰＧＰインヒビターは、ＰＧＰ発現を低減することができ、次に本明細書に記載されている多剤結合体に含まれている１つ以上の薬剤の、病原性細胞からの流出を減少する。マイトマイシン又はマイトマイシンＣのようなその類似体若しくは誘導体は、ＰＧＰインヒビターとして又はＰＧＰの下方制御剤として作用しうることが理解される。ビンカアルカロイド又はビンブラスチン類似体及び誘導体のようなその類似体若しくは誘導体は、ＰＧＰインヒビター又は下方制御剤による病原性細胞からの流出が防止されているＰＧＰ基質でありうることが、更に理解される。
【０１５０】
本明細書に記載されている薬剤送達結合体の別の実施態様において、薬剤のうちの少なくとも１つは、ビンカアルカロイド又はその類似体若しくは誘導体である。本明細書に記載されているビンカアルカロイドには、ビンデシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、カタランチン、ビンドリン、ロイロシン、ビノレルビン、イミドカルブ、シブトラミン、トルトラズリル、ビンブラスチン酸など、並びにこれらの類似体及び誘導体などの、ただしこれらに限定されない、アルカロイド類のインドール−ジヒドロインドールファミリーの全てのメンバーが含まれる。
【０１５１】
別の実施態様において、病原性細胞の集団により引き起こされる又は証明される疾患を治療する方法が、本明細書に記載される。結合リガンド（Ｂ）薬剤送達結合体を使用して、宿主における病原性細胞集団の存在により特徴付けられる疾患状態を治療することができるが、この場合、病原性細胞集団のメンバーは、結合リガンド（Ｂ）又はその類似体若しくは誘導体により利用可能な結合部位を有し、結合部位は、病原性細胞により独自に発現、過剰に発現又は優先的に発現している。病原性細胞の選択的排除は、結合リガンド（Ｂ）又はその類似体若しくは誘導体に特異的に結合し、且つ病原性細胞により独自に発現、過剰に発現又は優先的に発現している、リガンド受容体、トランスポーター又は他の表面に現れるタンパク質に、結合リガンド（Ｂ）薬剤送達結合体のリガンド部分が結合することによって仲介される。病原性細胞の集団により独自に発現、過剰に発現又は優先的に発現している表面提示タンパク質は、非病原性細胞には表れないか又は低い密度でしか表れない受容体であり、病原性細胞の選択的排除の手段を提供する。
【０１５２】
例えば、高親和性葉酸受容体のような表面発現ビタミン受容体は、癌細胞に過剰発現している。卵巣、乳腺、結腸、肺、鼻、喉及び脳の上皮癌では、全て、上昇したレベルの葉酸受容体の発現が報告されている。事実、全てのヒト卵巣腫瘍の９０％超が、この受容体を大量に発現することが知られている。したがって、本明細書に記載されている結合リガンド（Ｂ）薬剤送達結合体を使用して、多様な種類の腫瘍細胞を、また、ビタミン受容体のようなリガンド受容体を優先的に発現し、したがってビタミン又はビタミン類似体若しくは誘導体のようなリガンドに利用可能な表面結合部位を有する感染因子のような他の種類の病原性細胞を治療することができる。一つの態様において、排除される病原性細胞への標的化を最大限にするための、結合リガンド−リンカー−薬剤結合体の標的化のための方法が本明細書に記載される。
【０１５３】
本発明は、更に、排除される病原性細胞への標的化を最大限にするための、結合リガンド−リンカー−薬剤結合体の組み合わせの使用を考慮する。
【０１５４】
本明細書に記載されている結合リガンド（Ｂ）薬剤送達結合体を、ヒト臨床医学及び獣医用途の両方に使用することができる。したがって、病原性細胞の集団を保有しており、結合リガンド（例えば、ビタミン）薬剤送達結合体で治療される宿主動物は、ヒトであってもよく、獣医用途の場合では、実験用、農業用、愛玩用又は野生の動物であってもよい。本明細書に記載されている方法を、ヒト、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスターなど）、ウサギ、サル、チンパンジーのような実験用動物、イヌ、ネコ及びウサギのような愛玩動物、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギのような農業用動物、並びにクマ、パンダ、ライオン、トラ、レオパード、ゾウ、シマウマ、キリン、ゴリラ、イルカ及びクジラのような捕獲された野生動物などの、ただしこれらに限定されない宿主動物に適用することができる。
【０１５５】
本方法は、これらの宿主動物において多様な病理を引き起こす病原性細胞の集団に適用可能である。病原性細胞という用語は、例えば、癌細胞、細菌及びウイルスのような感染因子、細菌感染又はウイルス感染細胞、疾患状態を引き起こす可能性がある活性化マクロファージ、及び、ビタミン受容体又はビタミンの類似体若しくは誘導体が結合する受容体のような結合リガンド受容体を独自に発現、優先的に発現又は過剰発現している、他の任意の種類の病原性細胞を意味する。病原性細胞には、本明細書に記載される結合リガンド薬剤送達結合体の治療が疾患の症状の低減をもたらす疾患状態を引き起こす任意の細胞を含めることもできる。例えば、病原性細胞は、移植片対宿主疾患の原因であるが、他の条件下では病原性ではない免疫系の細胞のような、ある条件下で病原性である宿主細胞であってもよい。
【０１５６】
したがって、病原性細胞の集団は、良性腫瘍及び悪性腫瘍を含む腫瘍形成性の癌細胞集団であってもよく、非腫瘍形成性の癌細胞集団であってもよい。癌細胞集団は、自然に生じうる又は宿主動物の生殖細胞系に存在する突然変異若しくは体細胞突然変異のようなプロセスにより生じてもよいし、或いは化学的、ウイルス的又は放射線により誘発されてもよい。本方法を、癌腫、肉腫、リンパ腫、ホジキン病、黒色腫、中皮腫、バーキットリンパ腫、鼻咽腔癌、白血病及び骨髄腫のような癌の治療に利用することができる。癌細胞集団には、口腔癌、甲状腺癌、内分泌性癌、皮膚癌、胃癌、食道癌、咽頭癌、膵癌、結腸癌、膀胱癌、骨癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮癌、乳癌、精巣癌、前立腺癌、直腸癌、腎癌、肝癌及び肺癌を含めることができるが、これらに限定されない。
【０１５７】
病原性細胞集団が癌細胞集団である実施態様において、結合体投与の効果は、腫瘍体積の低減若しくは排除、又は腫瘍細胞繁殖の阻害により測定される治療反応である。腫瘍の場合では、排除は、原発性腫瘍の細胞若しくは転移した細胞の排除でありうるか、又は原発性腫瘍から解離させるプロセスである。腫瘍の外科的除去、放射線療法、化学療法又は生物学的療法を含む任意の治療手法により除去された後で腫瘍が戻るのを予防するための、結合リガンド（Ｂ）薬剤送達結合体（例えば、結合リガンドとして使用されるビタミン）による予防的治療も、記載される。予防的治療は、多回用量１日レジメンによる治療のような、結合リガンド（Ｂ）薬剤送達結合体による初期治療であってもよいし、及び／又は初期治療の後に数日若しくは数か月の間隔を置いた追加的な治療若しくは一連の治療であってもよい。したがって、記載されている方法を使用して治療される病原性細胞集団のいずれかの排除には、病原性細胞の数の低減、病原性細胞の繁殖の阻害、病原性細胞が戻るのを予防する予防的治療、又は疾患の症状の低減をもたらす病原性細胞の治療が含まれる。
【０１５８】
癌細胞が排除される場合、本方法を、腫瘍の外科的除去、放射線療法、化学療法、又はモノクローナル抗体療法、免疫調節剤による治療、免疫効果細胞の養子移入、造血成長因子による治療、サイトカイン及びワクチン接種などの、ただしこれらに限定されない他の免疫療法のような生物学的療法と組み合わせて使用することができる。
【０１５９】
本方法は、多様な感染性疾患を引き起こす病原性細胞の集団にも適用可能である。例えば、本方法は、細菌、酵母菌を含む真菌、ウイルス、ウイルス感染細胞、マイコプラズマ及び寄生虫のような病原性細胞の集団に適用可能である。本明細書に記載されている結合リガンド（Ｂ）薬剤送達結合体により治療することができる感染性生物は、動物に病原を引き起こす当該技術で認められている任意の感染性生物であり、細菌としてそのような生物に含まれるものは、グラム陰性又はグラム陽性の球菌又は桿菌である。例えば、プロテウス種、クレブシエラ種、プロビデンシ種、エルシニア種、エルウィニア種、エンテロバクター種、サルモネラ種、セラチア種、アエロバクター種、エシェリキア種、シュードモナス種、シゲラ種、ビブリオ種、アエロモナス種、カンピロバクター種、レンサ球菌種、ブドウ球菌種、乳酸桿菌種、ミクロコッカス種、モラクセラ種、バチルス種、クロストリジウ種、コリネバクテリウム種、エベルセラ（Eberthella）種、ミクロコッカス種、マイコバクテリウム種、ナイセリア種、ヘモフィルス種、バクテロイデス種、リステリア種、エリジペロトリックス種、アシネトバクター種、ブルセラ種、パスツレラ種、ビブリオ種、フラボバクテリウム種、フソバクテリウム種、ストレプトバチルス種、 カリマトバクテリウム種、レジオネラ種、トレポネーマ種、ボレリア種、レプトスピラ種、アクチノマイセス種、ノカルジア種、ケッチア種及び宿主に疾患を引き起こす他の任意の細菌は、本明細書に記載されている結合リガンド薬剤送達結合体により治療することができる。
【０１６０】
特に興味深いものは、抗生物質耐性レンサ球菌種及びブドウ球菌種のような抗生物質に耐性を持つ細菌であるか、又は抗生物質に感受性はあるが、抗生物質により治療される再発性の感染を引き起こし、それにより最終的に耐性生物が生じる細菌である。抗生物質に感受性はあるが、抗生物質により治療される再発性の感染を引き起こし、それにより最終的に耐性生物が生じる細菌を、これらの抗生物質耐性細菌株の発生を回避するために、抗生物質の不在下で、又は患者に通常投与するよりも低い用量の抗生物質と組み合わせて、本明細書に記載されている結合リガンド（Ｂ）薬剤送達結合体本により治療することができる。
【０１６１】
ＤＮＡ及びＲＮＡウイルスのようなウイルスも、記載されている方法により治療することができる。そのようなウイルスには、パピローマウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス及びワクチニアウイルのようなＤＮＡウイルス、並びにアレナウイルス、コロナウイルス、ライノウイルス、呼吸器合胞体ウイル、インフルエンザウイルス、ピコルナウイルス、パラミクソウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス及びラブドウイルスのようなＲＮＡウイルスが含まれるが、これらに限定されない。
【０１６２】
本方法は、酵母菌を含むあらゆる真菌、マイコプラズマ種、寄生虫又は動物に疾患を引き起こす他の感染性生物にも適用可能である。本方法及び組成物で治療できる真菌の例には、例えば、白癬、ヒストプラズマ症、ブラストミセス症、アスペルギルス症、クリプトコッカス症、スポロトリクム症、コクシジオイデス症、パラコクシジオイデス症、ムーコル症、黒色分芽菌症、皮膚糸状菌症、プロトテカ症、フサリウム症、粃糠疹、菌腫、パラコクシジオイデス症、黒色菌糸症、シュードアレシェリア症、スポロトリクス症、トリコスポロン、ニューモシスティス感染及びカンジダ症のような疾患を引き起こす真菌を含む、カビとして成長する真菌、又は酵母菌様の真菌が含まれる。
【０１６３】
本方法は、テニア、ヒメノレピス、ジフィロボスリウム及びエキノコックス種のような条虫、ファシオロプシス、異形吸虫、メタゴニムス、肝吸虫、ファスキオラ、肺吸虫及びシトソーマ（Schitosoma）種のような吸虫、エンテロビウス、トリチュリス、アスカリス、アンキロストマ、ネカトール、ストロンギロイデス、トリキネラ、ブケレリア、ブルギア、ロアオンコセルカ及びドラクンクルス種のような回虫、ネグレリア及びアカントアメーバ種のようなアメーバ、並びにプラスモジウム、トリパノソーマ、リーシュマニア、トキソプラズマ、エントアメーバ、ジアルジア、イソスポーラ、クリプトスポリジウム及びエンテロシトゾーン種のような原生動物により引き起こされる炎症などの、ただしこれらに限定されない寄生虫炎症の治療に利用することもできる。
【０１６４】
本明細書に記載されている結合リガンド薬剤送達結合体が対象とする病原性細胞は、これらの細胞がビタミン受容体のようなリガンド受容体を優先的に発現する場合、ウイルス感染、マイコプラズマ感染、寄生虫感染又は細菌感染細胞のような内在性病原体を保持する細胞であることもできる。
【０１６５】
一つの実施態様において、リガンドに特異的に結合でき、且つ病原性細胞により優先的に発現している、受容体、トランスポーター又は他の表面提示タンパク質に、結合リガンド薬剤送達結合体の結合リガンド部分が結合すると、結合体は標的病原性細胞に内部移行することができる。そのような内部移行は、例えば、受容体仲介エンドサイトーシスによって生じることができる。結合リガンド（Ｂ）薬剤送達結合体が放出型リンカーを含有する場合、結合リガンド部分及び薬剤は、細胞内で解離することができ、薬剤は、細胞内標的に対して作用することができる。
【０１６６】
代替的な実施態様において、薬剤送達結合体の結合リガンド部分は、病原性細胞に結合して、薬剤を病原性細胞の表面と近接関係に置くことができる。次に薬剤を、放出型リンカーの切断により放出することができる。例えば、放出型リンカーがジスルフィド基である場合、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼにより、薬剤を放出することができる。次に薬剤は、結合リガンド（Ｂ）薬剤送達結合体が結合している病原性細胞により取り込まれることができるか、又は薬剤は、近接している別の病原性細胞により取り込まれることができる。あるいは、放出型リンカーがジスルフィド基である場合、細胞内のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼにより、薬剤を放出することができる。特定のベータ脱離機構について上記に記載した酸触媒加水分解のような加水分解機構により、又はオキソニウムイオン若しくはラクトニウムイオン生成機構を介する隣接基補助切断により、薬剤を放出することもできる。放出型リンカーの選択は、薬剤が結合体から放出される機構を決定する。そのような選択は、薬剤結合体が使用される条件によって予め確定されうることが理解される。あるいは、薬剤送達結合体は、結合すると標的細胞に内部移行することができ、結合リガンドと薬剤が細胞内で結合したまま、薬剤がビタミン部分から解離することなくその効果を示すことができる。
【０１６７】
結合リガンドがビタミンであるなお別の実施態様において、ビタミン薬剤送達結合体は、細胞ビタミン受容体と無関係の機構を介して作用することができる。例えば、薬剤送達結合体は、血清に存在する可溶性ビタミン受容体に又はアルブミンのような血清タンパク質に結合することができ、その結果、非結合薬剤の場合と比較して、より長時間の結合体の循環と、結合体の病原性細胞集団に対するより高い活性をもたらすことができる。
【０１６８】
リンカーが放出型リンカーを含まない別の実施態様において、薬剤送達結合体のビタミン部分は、病原性細胞に結合し、薬剤を病原性細胞の表面に設置して、病原性細胞を、薬剤に結合することができる他の分子による攻撃の標的にすることができる。あるいは、この実施態様において、薬剤送達結合体は、結合したときに標的細胞に内部移行することができ、ビタミン部分と薬剤は、細胞内で関連したままでいることができ、薬剤は、ビタミン部分から解離することなくその効果を示すことができる。
【０１６９】
本発明の別の実施態様において、一般式：Ｂ−Ｌ−Ａの細胞受容体結合送達結合体が提供され、式中、Ｌは、本明細書で定義されたとおりであり、そしてＡは、免疫原のような薬剤である。免疫原は、ヘプテン、例えばフルオレセイン、ジニトロフェニルなどであってもよい。この実施態様において、ビタミン受容体結合薬剤送達結合体は、病原性細胞の表面に結合し、免疫源により細胞を「標識」し、それによって標識化病原性細胞集団に対する免疫反応を誘発する。受動免疫法により宿主に投与された抗体、又は既存の先天的若しくは後天的免疫によって宿主系に存在する抗体は、免疫源に結合し、内因性免疫反応を誘発する。細胞結合ビタミン免疫原結合体に抗体が結合することによって、補体仲介細胞毒性、抗体依存性細胞仲介細胞毒性、抗体のオプソニン化及びファゴサイトーシス、細胞死若しくは静止をシグナル伝達する抗体誘導受容体クラスター化、又は細胞結合リガンド免疫原結合体に結合する抗体により刺激される他の任意のホルモン若しくは細胞免疫反応がもたらされる。免疫原が事前の抗体オプソニン化なしに免疫細胞により直接認識されうる場合、病原性細胞の直接的な死滅を生じることができる。この実施態様は、米国特許出願第０９／８２２，３７９号により詳細に記載されており、参照として本明細書に組み込まれる。薬剤が免疫原であるこの実施態様の特定の変形態様において、多価リンカーは、Ｌが１つ以上の親水性スペーサーリンカー及び放出型リンカーを含むリンカーである一般式：Ｂ−Ｌ−Ａのビタミン受容体結合薬剤送達結合体のような、上記に記載されている放出型リンカーを含むこともできることが理解される。
【０１７０】
本明細書に記載されている結合リガンド（Ｂ）薬剤送達結合体は、結合リガンド、多価リンカー（Ｌ）、薬剤、及び、場合により、結合リガンド及び薬剤を多価リンカー（Ｌ）に結合するヘテロ原子リンカーを含む。多価リンカー（Ｌ）は、スペーサーリンカー、放出型（すなわち、切断しうる）リンカー及びヘテロ原子リンカー又はこれらの組み合わせを含むことができる。
【０１７１】
薬剤は、細胞機能を調節、そうでなければ修飾することができる任意の分子であってもよく、薬学的に活性な化合物が含まれる。適切な分子には、ペプチド、オリゴペプチド、レトロ−インバースオリゴペプチド、タンパク質、ペプチド架橋が少なくとも１つの非ペプチド架橋に代わっているタンパク質類似体、アポタンパク質、糖タンパク質、酵素、補酵素、酵素インヒビター、アミノ酸及びそれらの誘導体、受容体及び他の膜タンパク質；抗原及びその抗体；ヘプテン及びその抗体；ホルモン、脂質、リン脂質；リポソーム；毒素；抗生物質；鎮静薬；気管支拡張剤；ベータ−ブロッカー；抗菌剤；抗高血圧剤；抗不整脈薬、強心配糖体、抗狭心症薬及び血管拡張薬を含む心血管剤；興奮薬、向精神薬、抗躁薬及び抑制薬を含む中枢神経剤；抗ウイルス剤；抗ヒスタミン薬；化学療法剤を含む癌薬；精神安定薬；抗抑鬱薬；Ｈ−２アンタゴニスト；抗痙攣薬；制吐薬；プロスタグランジン及びプロスタグランジン類似体；筋弛緩薬；抗炎症性物質；刺激薬；充血除去薬；鎮吐薬；利尿薬；鎮痙薬；抗喘息薬；抗パーキンソン剤；去痰剤；鎮咳薬；粘液溶解薬；並びにミネラルおよび栄養添加物を含めることができるが、これらに限定されない。
【０１７２】
更に、薬剤は、細胞毒性があるか、腫瘍浸透性を増強するか、腫瘍細胞繁殖を阻害するか、アポトーシスを促進するか、標的細胞の抗アポトーシス活性を減少させるか、感染因子により引き起こされる疾患の治療に使用されるか、病原性細胞に対する内因性免疫反応を増強するか、又は、任意の種類の病原性細胞により引き起こされる疾患状態の治療に有用であるような、当該技術において既知の任意の薬剤であってもよい。本発明の使用に適切な薬剤には、アドレノコルチコイド及びコルチコステロイド、アルキル化剤、抗アンドロゲン、抗エストロゲン、アンドロゲン、アクラマイシン及びアクラマイシン誘導体、エストロゲン、抗代謝物、例えばシトシンアラビノサイド、プリン類似体、ピリミジン類似体及びメトトレキセート、ブスルファン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン及び他の白金化合物、タモキシフェン、タキソール、パクリタキセル、パクリタキセル誘導体、Taxotere（登録商標）、シクロホスファミド、ダウノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、リゾキシン、Ｔ２毒素、植物アルカノイド、プレドニゾン、ヒドロキシ尿素、 テニポシド、マイトマイシン、ディスコデルモリド、微小管インヒビター、エポチロン、ツブリシン、シクロプロピルベンズ〔ｅ〕インドロン、セコ−シクロプロピルベンズ〔ｅ〕インドロン、Ｏ−Ａｃ−セコ−シクロプロピルベンズ〔ｅ〕インドロン、ブレオマイシン及び他の任意の抗生物質、ナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素、ビンクリスチン、ビンブラスチン、それらの類似体及び誘導体、例えばデアセチルビンブラスチンモノヒドラジド、並びに、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２００７／０２２４９３に記載されているものを含む他のビンカアルカロイド（その開示は参照として本明細書に組み込まれる）、コルヒチン、コルヒチン誘導体、 アロコルヒチン、チオコルヒチン、トリチルシステイン、ハリコンドリンＢ、ドラスタチン、例えばドラスタチン１０、 アマニチン、例えばαアマニチン、カンプトテシン、イリノテカン及び他のカンプトテシン誘導体、マイタンシン、ゲルダナマイシン及びゲルダナマイシン誘導体、エストラムスチン、ノコダゾール、ＭＡＰ４、コルセミド、炎症剤及び炎症誘発剤、ペプチド及び ペプチド模倣信号伝達インヒビター、並びに他の任意の当該技術で認められている薬剤又は毒素が含まれる。本発明に使用できる他の薬剤には、ペニシリン、セファロスポリン、バンコマイシン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、クロラムフェニコール、アミノ配糖体抗生物質、ゲンタマイシ、アンフォテリシンＢ、アシクロビル、トリフルリジン、ガンシクロビル、ジドブジン、アマンタジン、リバビリン、及び、当該技術で認められている任意の他の抗菌化合物が含まれる。
【０１７３】
別の実施態様において、薬剤（Ａ）は、ＤＡＶＬＢＨのようなビンカアルカロイド、クリプトフィシン、ボルテゾミブ、チオボルテゾミブ、チューブリシン、 アミノプテリン、ラパマイシン、パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、 エベロリムス、αアマナチン、ベルカリン、ジデムニンＢ、ゲルダナマイシン、プルバラノールＡ、エベロリムス、イスピネシブ、ブデソニド、ダサチニブ、エポチロン、マイタンシン、及び、チロシンキナーゼインヒビター（以上の類似体及び誘導体を含む）から選択される薬剤である。別の実施態様において、結合体は、ＤＡＶＬＢＨのようなビンカアルカロイド、クリプトフィシン、ボルテゾミブ、チオボルテゾミブ、チューブリシン、アミノプテリン、ラパマイシン、パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エベロリムス、αアマナチン、ベルカリン、ジデムニンＢ、ゲルダナマイシン、プルバラノールＡ、エベロリムス、イスピネシブ、ブデソニド、ダサチニブ、エポチロン、マイタンシン、及び、チロシンキナーゼインヒビター（以上の類似体及び誘導体を含む）から選択される、少なくとも２つの薬剤（Ａ）を含む。一つの変形態様において、複数の薬剤（Ａ）は同一である。別の変形態様において、複数の薬剤（Ａ）は異なっている。
【０１７４】
一つの実施態様において、本明細書に記載される方法に使用される薬剤は、血清中で少なくとも４時間安定した状態を保つ。別の実施態様において、薬剤はナノモル範囲のＩＣ５０を有し、別の態様では、薬剤は水溶性である。薬剤が水溶性ではない場合、多価リンカー（Ｌ）を誘導体化して水溶性を増強することができる。用語「薬剤」は、本明細書の上記に記載されている薬剤の任意の類似体又は誘導体も意味する。本発明によると、薬剤類似体又は誘導体とは、ヘテロ原子を組み込み、それを介して多価リンカー（Ｌ）と共有結合している薬剤を意味しうることが理解されるべきである。
【０１７５】
結合リガンド薬剤送達結合体は、結合リガンド（Ｂ）、多価リンカー（Ｌ）、薬剤、及び、場合により、結合リガンド（Ｂ）受容体結合部分及び薬剤を二価リンカー（Ｌ）に結合するヘテロ原子リンカーを含むことができる。一つの例示的な実施態様において、ビタミン類似体又は誘導体とは、ヘテロ原子を組み込み、それを介して二価リンカー（Ｌ）と共有結合しているビタミンを意味しうることが理解されるべきである。したがって、この例示的な実施態様において、ビタミンは、ヘテロ原子リンカーを介して二価リンカー（Ｌ）と共有結合することができるか、又は、ビタミン類似体若しくは誘導体（すなわち、ヘテロ原子を組み込んでいる）は、二価リンカー（Ｌ）に直接結合することができる。同様の例示的な実施態様において、薬剤類似体又は誘導体は薬剤であり、薬剤類似体又は誘導体とは、ヘテロ原子を組み込み、それを介して二価リンカー（Ｌ）と共有結合している薬剤を意味することができる。したがって、これらの例示的な態様において、薬剤は、ヘテロ原子リンカーを介して二価リンカー（Ｌ）と共有結合することができるか、又は、薬剤類似体若しくは誘導体（すなわち、ヘテロ原子を組み込んでいる薬剤）は、二価リンカー（Ｌ）に直接結合することができる。二価リンカー（Ｌ）は、スペーサーリンカー、放出型（すなわち、切断しうる）リンカー、及び、これらの種類のリンカーを両方とも含有する結合体においてスペーサーリンカーを放出型リンカーに結合するヘテロ原子リンカーを含んでもよい。
【０１７６】
一般に、二価リンカー（Ｌ）と結合リガンド（Ｂ）、又はこれらの類似体若しくは誘導体、二価リンカー（Ｌ）と、薬剤又はその類似体若しくは誘導体との間の結合体（任意の介在ヘテロ原子リンカーを含む）を形成するために、あらゆる方法を利用することができる。また、スペーサーリンカーと、放出型リンカーと、二価リンカー（Ｌ）を形成するヘテロ原子リンカーとの間の結合体を形成するための当該技術で認められたあらゆる方法を使用することができる。結合体は、これらの分子のいずれかの直接結合、例えば複合体形成を介する結合、又は水素、イオン若しくは共有結合により形成することができる。共有結合は、例えば、酸、アルデヒド、ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル又はヒドラゾ基の間のアミド、エステル、ジスルフィド又はイミノ結合の形成を介して生じることができる。
【０１７７】
別の実施態様において、二価リンカー（Ｌ）は、結合リガンド（Ｂ）、親水性リンカー及び／又は薬剤（Ａ）を共有結合する、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ及びＰから選択される原子の鎖を含む。リンカーは、約２〜約１００個の原子の範囲のように、多種多様な長さを有することができる。リンカーを形成するのに使用される原子を、全ての化学的に関連する方法によって組み合わせることができ、その例としては、アルキレン、アルケニレン及びアルキニレン基などを形成する炭素原子の鎖；エーテル、ポリオキシアルキレン基を形成する、又はカルボニル基と組み合わせる場合はエステル及びカーボネートなどを形成する、炭素及び酸素原子の鎖；アミン、イミン、ポリアミン、ヒドラジン、ヒドラゾンを形成する、又はカルボニル基と組み合わせる場合はアミド、尿素、セミカルバジド、カルバジドなどを形成する、炭素及び窒素原子の鎖；アルコキシアミン、アルコキシルアミンを形成する、又はカルボニル基と組み合わせル場合はウレタン、アミノ酸、アシルオキシアミン、ヒドロキサム酸などを形成する、炭素、窒素及び酸素原子の鎖；などが挙げられる。加えて、前述の例示的な実施態様のそれぞれにおける鎖を形成する原子は、例えばアルカン、アルケン、アルキン、イミンなどがリンカーに含まれるラジカルでありうるように、飽和又は不飽和でありうることが理解されるべきである。加えて、リンカーを形成する原子は、また、互いに環化して、リンカーにおいて、シクロアルカン、環状エーテル、環状アミン、アリーレン、ヘテロアリーレンなどを含む、リンカーを形成する二価環状構造を形成しうることが理解されるべきである。
【０１７８】
別の実施態様において、１回以上の用量が投与されたときに宿主動物において病原性細胞の集団を排除するのに有効な量の結合リガンド（Ｂ）薬剤送達結合体を含む、医薬組成物が記載される。結合リガンド薬剤送達結合体は、好ましくは、宿主動物に非経口投与、例えば皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内又は鞘内投与される。あるいは、結合リガンド薬剤送達結合体を、経口のような他の医学的に有用な方法により宿主動物に投与することができ、任意の有効用量、及び持続放出投与形態を含む適切な治療投与形態を使用することができる。
【０１７９】
非経口投与形態の例には、等張食塩水、５％グルコース、又は液体アルコール、グリコール、エステル及びアミドのような周知の薬学的に許容される液体担体中の活性剤の水溶液が挙げられる。非経口投与形態は、薬剤送達結合体の用量を含む再構築可能な凍結乾燥物の形態であってもよい。本発明の実施態様の一つの態様において、例えば米国特許第４，７１３，２４９号、同第５，２６６，３３３号及び同第５，４１７，９８２号（これらの開示は、参照として本明細書に組み込まれる）に記載されている生分解性炭水化物マトリックスのような、当該技術で既知の数多くの持続放出投与形態のうちのいずれかを投与してもよいし、あるいは低速ポンプ（浸透圧ポンプ）を使用してもよい。
【０１８０】
一つの例示的な態様において、治療因子を含む少なくとも１つの追加の組成物を、上記に詳述した方法論と組み合わせて又はその佐剤として宿主に投与して、病原性細胞の集団の結合リガンド薬剤送達結合体仲介排除を増強してもよいし、又は２つ以上の追加の治療因子を投与してもよい。治療因子は、化学療法剤から、又は投与された結合リガンド薬剤送達結合体の効能を補うことができる他の治療因子から選択することができる。
【０１８１】
一つの例示的な態様において、これらの要素の治療的に有効な組み合わせを使用することができる。一つの実施態様において、例えば、治療因子の治療有効量、例えば、多回用量１日レジメンにおける約０．１MIU／m２／用量／日から約１５MIU／m２／用量／日の範囲の量、又は例えば、多回用量１日レジメンにおける約０．１MIU／m２／用量／日から７．５MIU／m２／用量／日の範囲の量を、結合リガンド薬剤送達結合体と共に使用して、病原性細胞を有する宿主動物において病原性細胞を排除、低減又は中和することができる（MIU＝ミリ国際単位；m２＝平均的なヒトの体表面積の概算）。
【０１８２】
別の実施態様において、例えばそれ自体は細胞毒性であるか又は腫瘍透過性を増強するように作用しうるような化学療法剤も、結合リガンド薬剤送達結合体と組み合わせて本明細書に記載されている方法において使用するのに適している。そのような化学療法剤には、アドレノコルチコイド及びコルチコステロイド、アルキル化剤、抗アンドロゲン、抗エストロゲン、アンドロゲン、アクラマイシン及びアクラマイシン誘導体、エストロゲン、代謝拮抗物質、例えばシトシンアラビノサイド、プリン類似体、ピリミジン類似体及びメトトレキセート、ブスルファン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン及び他の白金化合物、タモキシフェン、タキソール、パクリタキセル、パクリタキセル誘導体、Taxotere（登録商標）、シクロホスファミド、ダウノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、リゾキシン、Ｔ２毒素、植物アルカノイド、プレドニゾン、ヒドロキシ尿素、 テニポシド、マイトマイシン、ディスコデルモリド、微小管インヒビター、エポチロン、ツブリシン、シクロプロピルベンゾ〔ｅ〕インドロン、セコ−シクロプロピルベンゾ〔ｅ〕インドロン、Ｏ−Ａｃ−セコ−シクロプロピルベンゾ〔ｅ〕インドロン、ブレオマイシン及び他の任意の抗生物質、ナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素、ビンクリスチン、ビンブラスチン、それらの類似体及び誘導体、例えばデアセチルビンブラスチンモノヒドラジド、コルヒチン、コルヒチン誘導体、 アロコルヒチン、チオコルヒチン、トリチルシステイン、ハリコンドリンＢ、ドラスタチン、例えばドラスタチン１０、 アマニチン、例えばαアマニチン、カンプトテシン、イリノテカン及び他のカンプトテシン誘導体、マイタンシン、ゲルダナマイシン及びゲルダナマイシン誘導体、エストラムスチン、ノコダゾール、ＭＡＰ４、コルセミド、炎症剤及び炎症誘発剤、ペプチド及び ペプチド模倣信号伝達インヒビター、並びに、当該技術で認められている他の任意の薬剤又は毒素が含まれる。使用できる他の薬剤には、ペニシリン、セファロスポリン、バンコマイシン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、リファンピン、クロラムフェニコール、アミノ配糖体抗生物質、ゲンタマイシ、アンフォテリシンＢ、アシクロビル、トリフルリジン、ガンシクロビル、ジドブジン、アマンタジン、リバビリン、マイタンシン及びこの類似体及び誘導体、ゲムシタビン、並びに、当該技術で認められている他の任意の抗菌化合物が含まれる。
【０１８３】
治療因子を、結合リガンド薬剤送達結合体の投与の前、後、又はそれと同時に、宿主動物に投与することができ、治療因子を、結合リガンド薬剤送達結合体を含有する同じ組成物の一部として、又は結合リガンド薬剤送達結合体と異なる組成物の一部として投与することができる。治療因子を治療的に有効な用量で含有する任意のそのような治療組成物を使用することができる。
【０１８４】
加えて、２種類以上の結合リガンド薬剤送達結合体を使用することができる。例示的には、例えば、宿主動物を、ビタミンは異なるが同じ薬剤を有する複数の結合体の共投与プロトコールにより治療することができる。他の実施態様において、宿主動物を、異なる薬剤に結合している同じ結合リガンドを含む複数の結合体、又は多様な薬剤に結合している多様な結合リガンドを含む複数の結合体で治療することができる。別の例示的な実施態様において、同じ又は異なるビタミンを有する、並びに同じ薬剤送達結合体の一部として複数のビタミン及び複数の薬剤を含む、同じ又は異なる薬剤を有する結合リガンド薬剤送達結合体を使用することができる。
【０１８５】
結合リガンド薬剤送達結合体の１日投与単位は、宿主の状態、治療される疾患の状態、結合体の分子量、その投与経路及び組織分布、並びに放射線治療のような他の治療処置の併用の可能性に依存して、著しく変わりうる。患者に投与される有効量は、体表面積、患者の体重及び患者の状態に関する医師の評価に基づいている。例示的な実施態様において、有効用量は、例えば、約１ng/kg〜約１mg/kg、約１μg/kg〜約５００μg/kg、約１μg/kg〜約１００μg/kg、約１μg/kg〜約５０μg/kg及び約１μg/kg〜約１０μg/kgの範囲であってもよい。
【０１８６】
別の例示的な態様において、結合リガンド薬剤送達結合体を投与するための任意の有効なレジメンを使用することができる。例えば、結合リガンド薬剤送達結合体を、単回用量として投与してもよいし、多回用量１日レジメンとして分割投与してもよい。別の実施態様において、時差レジメン、例えば１週間あたり１〜３日を、連日治療の代替案として使用することができ、そのような断続的又は時差的な１日レジメンは、連日治療と同等であって、本明細書に記載されている方法の範囲内であると考慮される。一つの実施態様において、宿主を結合リガンド薬剤送達結合体の多回注射により治療して、病原性細胞の集団を排除する。別の実施態様において、宿主には、結合リガンド薬剤送達結合体を、例えば１２〜７２時間間隔又は４８〜７２時間間隔で複数回（好ましくは約２回から最大約５０回まで）注射する。他の実施態様において、結合リガンド薬剤送達結合体の追加の注射を、最初の注射の後、数日間又は数か月の間隔で患者に投与することができ、追加の注射は、病原性細胞により引き起こされる疾患状態の再発を防止する。
【０１８７】
一つの実施態様において、結合リガンド薬剤送達結合体に使用することができる、ビタミン又はその類似体若しくは誘導体には、葉酸又はその類似体若しくは誘導体に結合する葉酸受容体のような、活性化マクロファージに特異的に発現する受容体に結合するものが含まれる。例えば葉酸結合結合体を使用して、宿主に疾患を引き起こす活性化マクロファージを死滅させるか又はその活性を抑制することができる。そのようなマクロファージ標的結合体は、活性化マクロファージ仲介疾患状態に罹患している患者に投与されると、活性化マクロファージの集団の中で結合薬剤を濃縮し、会合させて、活性化マクロファージを死滅させる又はマクロファージの機能を抑制するように作用する。活性化マクロファージの集団の排除、低減又は不活性化は、治療される疾患状態の活性化マクロファージ仲介病因特性を停止又は低減するように作用する。活性化マクロファージにより仲介されることが知られている疾患の例には、リュウマチ様関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、乾癬、骨髄炎、多発性硬化症、アテローム動脈硬化症、肺線維症、サルコイドーシス、全身性硬化症、臓器移植拒否（ＧＶＨＤ）及び慢性炎症が挙げられる。薬剤送達結合体の投与は、典型的には、疾患状態の症状が低減又は排除されるまで続けられる。
【０１８８】
例示的には、活性化マクロファージを死滅させるため又は活性化マクロファージの機能を抑制するために投与される結合リガンド薬剤送達結合体を、薬学的に許容される担体と組み合わせて、疾患状態に罹患している動物又は患者に非経口投与することができ、例えば皮内、皮下、筋肉内、腹腔内又は静脈内投与することができる。別の実施態様において、結合リガンド薬剤送達結合体を、医学的に有用な他の手順により動物又は患者に投与することができ、有効用量を標準的又は持続放出投与形態で投与することができる。別の態様において、治療方法は、単独で、又は活性化マクロファージにより仲介される疾患状態の治療において認められている他の治療方法と組み合わせて、使用することができる。
【０１８９】
本明細書に記載されている薬剤送達結合体を、当該技術で認められている合成方法により調製することができる。合成方法は、場合により追加されるヘテロ原子又はスペーサーリンカーに既に存在しているヘテロ原子、放出型リンカー、薬剤及び／又は結合リガンドの選択に応じて選ばれる。一般に、関連する結合形成反応は、Richard C. Larock, “Comprehensive Organic Transformations, a guide to functional group preparations,” VCH Publishers, Inc. New York (1989)及びTheodora E. Greene & Peter G.M. Wuts, “Protective Groups ion Organic Synthesis,” 2d edition, John Wiley & Sons, Inc. New York (1991)に記載されており、これらの開示は参照として本明細書に組み込まれる。放出型リンカーを含むリンカーに含有されるアミド、及びエステル、ケタール及びアセタール、スクシンイミド、シリルオキシ、ヒドラゾン、アシルヒドラジン、セミカルバゾン、ジスルフィド、カーボネート、スルホネートなどを含む官能基を調製するための追加的な詳細は、米国特許出願公開第２００５／０００２９４２Ａ１号に記載されており、この全体が、参照として本明細書に組み込まれる。
【０１９０】
葉酸ペプチドの一般的形成。葉酸含有ペプチジルフラグメントのＰｔｅ−Ｇｌｕ−（ＡＡ）ｎ−ＮＨ（ＣＨＲ２）ＣＯ２Ｈ（３）は、下記のスキーム１に示されているように、酸感受性Ｆｍｏｃ−ＡＡ−Ｗａｎｇ樹脂のＦｍｏｃ戦略のような標準的方法を使用するポリマー支持逐次的方法により調製される。
【化３６】
0005690589.tif 000039
（ａ）２０％ピペリジン／ＤＭＦ；（ｂ）Ｆｍｏｃ−ＡＡ−ＯＨ、ＰｙＢｏｐ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ；（ｃ）Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、ＰｙＢｏｐ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ；（ｄ）１．Ｎ１０（ＴＦＡ）−Ｐｔｅ−ＯＨ；ＰｙＢｏｐ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＳＯ；（ｅ）ＴＦＡＡ、（ＣＨ２ＳＨ）２、ｉ−Ｐｒ３ＳｉＨ；（ｆ）ＮＨ４ＯＨ、ｐＨ１０．３。
【０１９１】
本明細書に記載される方法のこの例示的実施態様において、Ｒ１は、Ｆｍｏｃであり、Ｒ２は、所望の適切に保護されたアミノ酸側鎖であり、そしてＤＩＰＥＡは、ジイソプロピルエチルアミンである。標準的カップリング手順、例えばＰｙＢＯＰ及び本明細書に記載されている又は当該技術において既知である他の手順が使用され、ここで効果的なカップリングを確実にするために、例示的にはカップリング剤が活性化試薬として適用される。Ｆｍｏｃ保護基を、ピペリジン、フッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）などによる処理のような標準的条件下でのそれぞれのカップリング工程の後で除去する。Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ、Ｎ１０−ＴＦＡ−Ｐｔｅ−ＯＨなどのような適切に保護されたアミノ酸構成単位を、スキーム１に記載されたように使用し、スキーム１の工程（ｂ）においてはＦｍｏｃ−ＡＡ−ＯＨとして表されている。したがって、ＡＡは、適切に保護されている任意のアミノ酸出発物質を意味する。本明細書で使用されるとき、アミノ酸という用語は、１つ以上の炭素で隔てられたアミンとカルボン酸官能基の両方を有する任意の試薬を意味することが意図され、天然に生じるアルファ及びベータアミノ酸、並びにこれらのアミノ酸の誘導体及び類似体を含むことを、理解するべきである。特に、保護セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン酸などのような保護されている側鎖を有するアミノ酸を、本明細書に記載されている葉酸ペプチド合成に使用することもできる。更に、ガンマ、デルタ又はそれより長い同族アミノ酸を、本明細書に記載されている葉酸ペプチド合成に出発物質として含めることもできる。更に、ノルロイシン、イソバリン、β−メチルトレオニン、β−メチルシステイン、β，β−ジメチルシステインなどのような相同的側鎖又は交互分岐鎖構造を有するアミノ酸類似体を、本明細書に記載されている葉酸ペプチド合成に出発物質として含めることもできる。
【０１９２】
Ｆｍｏｃ−ＡＡ−ＯＨを伴うカップリングシーケンス（工程（ａ）及び（ｂ））を、「ｎ」回実施して、固体支持ペプチド２を調製するが、ここでｎは、整数であり、０〜約１００であってもよい。最終カップリング工程に続いて、残留Ｆｍｏｃ基を除去し（工程（ａ））、次にペプチドをグルタミン酸誘導体に結合し（工程（ｃ））、脱保護し、ＴＦＡ−保護プテロイン酸に結合する（工程（ｄ））。その後、ペプチドを、トリフルオロ酢酸、エタンジチール及びトリイソプロピルシランによる処理でポリマー支持体から切断する（工程（ｅ））。これらの反応条件によって、適切に保護されているアミノ酸側鎖の一部を形成することができるｔ−Ｂｕ、ｔ−Ｂｏｃ及びＴｒｔ保護基の同時の除去がもたらされる。ＴＦＡ保護基を、塩基による処理で除去して（工程（ｆ））、葉酸含有ペプチジルフラグメント３をもたらす。
【０１９３】
加えて、以下の例示的方法を使用して、本明細書に記載されている化合物を調製することができ、ここで  は１〜約１０の整数である。
【化３７】
0005690589.tif 000040
上記の合成方法は、示されている特定のサッカロペプチドのような選択された化合物により例示されているが、追加の類似化合物を、出発物質の慣用的な選択及び反応条件の慣用的な最適化により、同一又は同様の方法を使用して調製できることが、理解されるべきである。
【０１９４】
本明細書に記載されている化合物は、従来の合成有機化学を使用して調製することができる。加えて、以下の例示的方法を使用して、本明細書に記載されている化合物を調製することができ、ここで  は１〜約１０の整数である。
【化３８】
0005690589.tif 000041
上記の合成方法は、示されている特定のサッカロペプチドのような選択された化合物により例示されているが、追加の類似化合物を、出発物質の慣用的な選択及び反応条件の慣用的な最適化により、同一又は同様の方法を使用して調製できることが、理解されるべきである。
【０１９５】
加えて、以下の例示的方法を使用して、本明細書に記載されている化合物を調製することができる。
【化３９】
0005690589.tif 000042
上記の合成方法は、選択された化合物により例示されているが、追加の類似化合物を、出発物質の慣用的な選択及び反応条件の慣用的な最適化により同一又は同様の方法を使用して調製できることが、理解されるべきである。
【０１９６】
前述のそれぞれの合成方法において、中間体を、任意の追加の親水性スペーサーリンカー、他のスペーサーリンカー、放出型リンカー、又は薬剤Ａに結合することができる。前述のそれぞれの合成方法の変形態様において、追加の親水性スペーサーリンカー、他のスペーサーリンカー、又は放出型リンカーを、結合リガンドＢと指定の親水性スペーサーリンカーとの間に挿入することができる。加えて、二価親水性スペーサーリンカーの左から右への配置は限定的ではなく、したがって、薬剤Ａ、結合リガンドＢ、追加の親水性スペーサーリンカー、他のスペーサーリンカー、及び／又は放出型リンカーを、本明細書に記載されている親水性スペーサーリンカーのいずれの末端にも結合できることが、理解されるべきである。
【０１９７】
＜方法例＞
相対的親和性アッセイ。葉酸に対する葉酸受容体（ＦＲ）の親和性を、以前に記載された方法（Westerhof, G. R., J. H. Schornagel, et al. (1995) Mol. Pharm. 48: 459-471）を僅かに変更して決定した。簡潔には、ＦＲ陽性ＫＢ細胞を、２４ウエル細胞培養プレートに大量に接種し、１８時間かけてプラスチックに接着させた。指定されたウエル中の消費されたインキュベーション培地を、増加濃度の試験品又は葉酸の存在下又は不在下で、１００nMの３Ｈ−葉酸を補充した葉酸無含有ＲＰＭＩ（ＦＦＲＰＭＩ）で置換した。細胞を３７℃で６０分間インキュベートし、次にＰＢＳ、ｐＨ７．４で３回すすいだ。１ウエルあたり、５００マイクロリットルのＰＢＳ、ｐＨ７．４中１％ＳＤＳを加えた。次に細胞溶解産物を収集し、５mLのシンチレーションカクテルを含有する個々のバイアルに加え、次に放射能によって数えた。陰性対照のチューブは、ＦＦＲＰＭＩ中に３Ｈ葉酸のみを含有する（競合物質なし）。陽性対照のチューブは最終濃度１mMの葉酸を含有しており、これらの試料で測定したＣＰＭ（標識の非特異的結合を表す）を、全ての試料から差し引いた。特に、相対的親和性を、ＫＢ細胞のＦＲに結合した３Ｈ−葉酸結合の５０％を置き換えるのに必要な化合物の逆モル比として定義し、ＦＲへの葉酸の相対的親和性を１に設定した。
【０１９８】
細胞ＤＮＡ合成の阻害。本明細書に記載されている化合物を、葉酸受容体陽性ＫＢ細胞の増殖を阻害する薬剤の能力を予測するインビトロ細胞毒性アッセイを使用して評価した。化合物を、本明細書に記載されているプロトコールに従って調製した、対応する化学療法薬に結合した葉酸から構成した。ＫＢ細胞を、指定した濃度の葉酸−薬剤結合体に、１００倍の過剰葉酸の不在下又は存在下、３７℃で最大７時間まで暴露した。次に細胞を新たな培地で１回すすぎ、新たな培地により３７℃で７２時間インキュベートした。細胞生存率を、３Ｈ−チミジン組み込みアッセイを使用して評価した。
【０１９９】
インビトロ濃度依存性細胞毒性活性。細胞を２４ウエルFalconプレートに大量に接種し、一晩でほぼコンフルレントな単層を形成させた。試験品を添加する３０分前に、消費された培地を全てのウエルから吸引し、新たな葉酸無含有ＲＰＭＩ（ＦＦＲＰＭＩ）で置換した。過剰葉酸の存在下で生成される細胞毒性活性（ＦＲ結合との競合が可能）が、ＦＲ特異的送達と無関係であった総活性の一部を意味するので、１００μMの葉酸を含有する培地を入れた指示されたウエル及び後者のウエルの中の細胞を使用して、標的特異性を決定したことに留意すること。１０％熱不活性化ウシ胎児血清を含有する新たなＦＦＲＰＭＩの１mLで１回すすいだ後、各ウエルに、１００μMの遊離葉酸（結合部位競合物質）の存在下又は不在下で、試験品の増加濃度を含有する培地の１mLを入れた（試料１つあたり４つのウエル）。処理細胞を３７℃で２時間パルスし、０．５mLの培地で４回すすぎ、次に１mLの新たな培地で最大７０時間までチェイスした。消費された培地を全てのウエルから吸引し、５μCi/mLの３Ｈ−チミジンを含有する新たな培地で置換した。３７℃で２時間の更なるインキュベーションの後、細胞を、０．５mLのＰＢＳで３回洗浄し、次に１ウエルあたり０．５mLの氷冷５％トリクロロ酢酸で処理した。１５分後、トリクロロ酢酸を吸引し、細胞物質を、０．５mLの０．２５N水酸化ナトリウムの１５分間の添加により可溶化した。４５０μLの各可溶化試料を、３mLのEcolumeシンチレーションカクテルを含有するシンチレーションバイアルに移し、次に液体シンチレーションカウンターで数えた。表に示した最終結果は、未処理対照に対する３Ｈ−チミジン組み込みの百分率として表した。
【０２００】
本明細書の図に示されているように、用量依存性毒性を測定することができ、大部分の場合において、ＩＣ５０値（新たに合成されたＤＮＡへの３Ｈ−チミジン組み込みを５０％低減するのに必要な薬剤結合体の濃度）は、低ナノモル範囲内であった。更に、これらの結合体の細胞毒性は、過剰遊離葉酸の存在下で低減され、観察された細胞の死滅は、葉酸受容体への結合により仲介されたことを示唆している。以下の表は、ＫＢ細胞に対する及びＲＡＷ２６４．７細胞に対する選択された化合物についてのデータを例示した。
【０２０１】
【表３】
0005690589.tif 000043
【０２０２】
多様な癌細胞株に対するインビトロ試験。細胞を２４ウエルFalconプレートに大量に接種し、ほぼコンフルレントな単層を一晩形成させる。試験化合物を添加する３０分前に、消費された培地を全てのウエルから吸引し、新たな葉酸欠乏ＲＰＭＩ（ＦＦＲＰＭＩ）培地で置換する。ウエルのサブセットを、１００μMの葉酸を含有する培地を入れるように指定する。指定したウエルの中の細胞を使用して、標的特異性を決定する。理論に束縛されることなく、過剰葉酸の存在下で試験化合物により生成される細胞毒性活性（すなわち、ＦＲ結合への競合が存在する）は、ＦＲ特異的送達に無関係である総活性の一部に相当することが示唆される。１０％熱不活性化ウシ胎児血清を含有する新たなＦＦＲＰＭＩの１mLで１回すすいだ後、各ウエルに、示されているように、１００μMの遊離葉酸の存在下又は不在下で、試験化合物の増加濃度を含有する培地の１mLを入れる（試料１つあたり４つのウエル）。処理細胞を３７℃で２時間パルスし、０．５mLの培地で４回すすぎ、次に１mLの新たな培地で最大７０時間までチェイスする。消費された培地を全てのウエルから吸引し、５μCi/mLの３Ｈ−チミジンを含有する新たな培地で置換する。３７℃で２時間の更なるインキュベーションの後、細胞を、０．５mLのＰＢＳで３回洗浄し、次に１ウエルあたり０．５mLの氷冷５％トリクロロ酢酸で処理する。１５分後、トリクロロ酢酸を吸引し、細胞物質を、０．５mLの０．２５N水酸化ナトリウムの１５分間の添加により可溶化する。各可溶化試料の４５０μLのアリコートを、３mLのEcolumeシンチレーションカクテルを含有するシンチレーションバイアルに移し、次に液体シンチレーションカウンターで数える。表に示した最終結果は、未処理対照に対する３Ｈ−チミジン組み込みの百分率として表す。
【０２０３】
マウスにおける腫瘍増殖の阻害。４〜７週齢のマウス（Balb/c又はnu/nu系）をHarlan Sprague Dawley, Inc.（Indianapolis, IN）から購入した。通常の齧歯類用固形飼料は高濃度の葉酸を含有する（６mg/kg固形飼料）。そこで、正常なヒト血清の範囲に近い血清葉酸濃度を達成するため、使用するマウスは、腫瘍移植の前に、葉酸無含有食餌（Harlan diet #TD00434）により１週間維持した。腫瘍細胞の接種には、１００μL中の１×１０６個のＭ１０９細胞（Balb/c系）又は１×１０６個のＫＢ細胞（nu/nu系）を、背中央領域に注射した。腫瘍の大きさを、カリパスを使用して２〜３日毎に２つの垂直方向で測定し、その容量を、０．５×Ｌ×Ｗ２として算出したが、ここで、Ｌ＝最長軸の測定値（mm）であり、そしてＷ＝Ｌに対して垂直な軸の測定値（mm）である。次に細胞死滅Ｌｏｇ（ＬＣＫ）及び処置対対照（Ｔ／Ｃ）値を、発表されている手順に従って計算した（例えば、Lee et al., “BMS-247550: a novel epothilone analog with a mode of action similar to paclitaxel but possessing superior antitumor efficacy” Clin Cancer Res 7:1429-1437 (2001); Rose, “Taxol-based combination chemotherapy and other in vivo preclinical antitumor studies” J Natl Cancer Inst Monogr 47-53 (1993)を参照すること）。投与溶液は、ＰＢＳから毎日新たに調製し、マウスの尾側静脈を介して投与した。投与は、皮下腫瘍が５０〜１００mm３（ｔ０）の平均容量を有したときに開始し、典型的には、ＫＢ腫瘍では、腫瘍接種後（ＰＴＩ）から８日目であり、Ｍ１０９腫瘍ではＰＴＩから１１日目であった。
【０２０４】
一般的ＫＢ腫瘍アッセイ。腫瘍を有する動物に静脈内（i.v.）投与したときの本明細書に記載されている化合物の抗腫瘍活性を、皮下ＫＢ腫瘍を有するnu/nuマウスにおいて評価した。マウス（５匹／群）において、１×１０６個のＫＢ細胞による右腋窩の皮下組織への腫瘍接種後からおそよ８日目に（ｔ０の平均腫瘍容量＝５０〜１００mm３）、特に指示のない限り、５μmol/kgの薬剤送達結合体又は同等な投与量のＰＢＳ（対照）を、週に３回（ＴＩＷ）、３週間i.v.注射した。腫瘍増殖を、各処置群において２日又は３日間隔でカリパスを使用して測定した。腫瘍容量を、方程式：Ｖ＝ａ×ｂ２／２を使用して計算し、ここで、「ａ」は腫瘍の長さであり、そして「ｂ」は幅である（ミリメートルで表す）。
【０２０５】
一般的Ｍ１０９腫瘍アッセイ。腫瘍を有する動物に静脈内（i.v.）投与したときの本明細書に記載されている化合物の抗腫瘍活性を、皮下Ｍ１０９腫瘍（同系肺癌）を有するBalb/cマウスにおいて評価した。マウス（５匹／群）において、１×１０６個のＭ１０９細胞による右腋窩の皮下組織への腫瘍接種後からおよそ１１日目に（ｔ０の平均腫瘍容量＝６０mm３）、１５００nmol/kgの薬剤送達結合体又は同等な投与量のＰＢＳ（対照）を、週に３回（ＴＩＷ）、３週間i.v.注射した。腫瘍増殖を、各処置群において２日又は３日間隔でカリパスを使用して測定した。腫瘍容量を、方程式：Ｖ＝ａ×ｂ２／２を使用して計算し、ここで、「ａ」は腫瘍の長さであり、そして「ｂ」は幅である（ミリメートルで表す）。
【０２０６】
一般的４Ｔ−１腫瘍アッセイ。６〜７週齢のマウス（雌Balb/c系）をHarlan, Inc., Indianapolis, INから得た。マウスを、Harlanの葉酸無含有固形飼料により、この実験を開始する前及びその期間中、合計三週間維持した。葉酸受容体陰性４Ｔ−１腫瘍細胞（動物１匹あたり１×１０６個の細胞）を、右腋窩の皮下組織に接種した。４Ｔ−１腫瘍の平均容量が約１００mm３となる腫瘍接種後からおよそ５日目に、特に指示のない限り、マウス（５匹／群）に、３μmol/kgの薬剤送達結合体又は同等な投与量のＰＢＳ（対照）を、週に３回（ＴＩＷ）、３週間i.v.注射した。腫瘍増殖を、各処理群において２日又は３日間隔でカリパスを使用して測定した。腫瘍容量を、方程式：Ｖ＝ａ×ｂ２／２を使用して計算し、ここで、「ａ」は腫瘍の長さであり、そして「ｂ」は幅である（ミリメートルで表す）。
【０２０７】
図３Ａ、４Ａ、５Ａ、６Ａ、７Ａ、８Ａ及び１０Ａに示されているデータは、本明細書に記載されている結合体が、対応する非結合化合物と比較して腫瘍の処置において優れた効能を示すことを指摘している。ＥＣ０３９６及びＥＣ１４５による皮下Ｍ１０９腫瘍を有するBalb/cマウスの処置（図４Ａ）は、全ての処置動物において完全寛解をもたらした（ＥＣ０３９６では３／３匹及びＥＣ１４５では５／５匹）。加えて、ほぼ７０日後には、疾患の再発は観察されなかった。同様に、ＥＣ０４００（図５Ａ）による処置は、完全寛解をもたらし、ほぼ７０日後に疾患の再発はなかった。親水性スペーサーリンカーを含む本明細書に記載されている結合化合物（例えば、ＥＣ０４３６）による処置は、親水性スペーサーリンカーを欠いている比較結合体（例えば、ＥＣ０３０５）に対して優れており、優れた効能を示した（図８Ａ）。ＥＣ０４３６は、５／５匹の動物において完全寛解を示し、９０日後に疾患の再発がなかった。
【０２０８】
薬剤毒性決定。心臓穿刺により血液を回収し、血清を、Ani-Lytics, Inc.（Gaithersburg, MD）における、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン、総タンパク質、ＡＳＴ−ＳＧＯＴ、ＡＳＴ−ＳＧＯＴ、および標準的な血液細胞パネルについての独立した分析にかけることにより、残留薬剤毒性を評価した。加えて、ホルマリン固定した心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、腸、骨格筋及び骨（脛骨／腓骨）の組織病理学的評価を、Animal Reference Pathology Laboratories（ARUP; Salt Lake City, Utah）において、委員会により認可を受けた病理学者により実施した。
【０２０９】
体重減少により測定した毒性。体重の変化の率を、マウス（５匹のマウス／群）において腫瘍接種後（ＰＴＩ）の選択した日に決定し、対照と比較し、グラフで表した。図３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ、６Ｂ、７Ｂ、８Ｂ及び１０Ｂに示されているように、本明細書に記載されている結合化合物は、非結合化合物と比較して、同等かそれ以下の毒性しか示さなかったことが、体重の減少率から分かった。
【０２１０】
マウスに対する単回及び多回容量ＭＴＤａｐｐ。本明細書に記載されている化合物は、結合体に含まれる親水性スペーサーリンカーの数と単回用量によるマウスへの最大耐量との間の正の相関を示すことができる。例えば、対照結合体と比較した、本明細書に記載されている以下のビンブラスチン結合体を、以下の表に示す。
【０２１１】
【表４】
0005690589.tif 000044
＊溶解性により制限される用量；＊＊１／３匹のマウスが２０μmol/kgで死亡した。
【０２１２】
ＥＣ０４３６及び比較例ＥＣ０３０５もBalb/cマウスにＴＩＷで１週間i.v.投与した。多回用量で得られたＭＴＤは、ＥＣ０３０５（６mmol/kg）及びＥＣ０４３６（９mmol/kg）であった。データは、ＥＣ０４３６をＥＣ０３０５よりも５０％多いレベルで投与できることを示している。
【０２１３】
血清結合。親水性スペーサーリンカーを欠いた比較例ＥＣ１４５と比較した、親水性スペーサーリンカーを含む葉酸ＤＡＶＬＢＨ結合体の、３０Ｋ  ＮＷＷＬ濾過した血清中の５０μMの化合物の血清結合及びＨＰＬＣ−ＵＶ検出（ｎ＝３）による評価。
【表５】
0005690589.tif 000045
【０２１４】
胆汁クリアランス。非結合薬剤、親水性スペーサーリンカーを欠いている薬剤結合体及び本明細書に記載されている結合体の胆汁クリアランス（ＩＤ％）の比較。
【表６】
0005690589.tif 000046
【０２１５】
図１１及び１３に示されている結果は、ＥＣ１４５標準と比較して、本明細書に記載されている親水性スペーサーリンカーを含むＥＣ０４３４の肝臓クリアランスが７６％減少したことを示している。理論に束縛されることなく、これらの結果は非特異的肝臓クリアランスに相当すると考えられ、したがって、本明細書に記載されている親水性スペーサーリンカーを含むこれらの結合体を、そのようなリンカーを含まない対応する結合体と比較して、有意に低い用量で投与できることが示唆される。更に、理論に束縛されることなく、肝臓クリアランスは、一部の結合体において観察される用量制限的ＧＩ関連毒性をもたらすことが示唆される。
【０２１６】
ウエスタンブロット分析。図１３に示されているデータは、ＥＣ０５６５（葉酸−糖−エベロリムス）が、ｍＴＯＲの下流標的（エベロリムスの細胞内標的）の用量依存性の特異的ノックダウンを引き起こしうることを示している。理論に束縛されることなく、葉酸は、細胞内部にエベロリムスを送達し、そこでエベロリムスは、ラパマイシン及びｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼの哺乳類標的であるｍＴＯＲを阻害するすると考えられる。ウエスタンブロットにより示されているように、ｍＴＯＲの下流標的（Ｐ７０  Ｓ６−キナーゼ及びリボソームＳ６）の阻害がもたらされる。
【０２１７】
＜化合物例＞
【化４０】
0005690589.tif 000047
【０２１８】
実施例。（３，４），（５，６）−ビスアセトニド−Ｄ−グルコン酸メチルエステル。乾燥した２５０mLの丸底フラスコの中で、アルゴン下、δ−グルコラクトン（４．１４ｇ、２３．２４mmol）をアセトン−メタノール（５０mL）に懸濁した。この懸濁液に、ジメトキシプロパン（１７．１５mL、１３９．４４mmol）、続いて触媒量のｐ−トルエンスルホン酸（２００mg）を加えた。この溶液を室温で１６時間撹拌した。ＴＬＣ（石油エーテル中５０％ＥｔＯＡｃ）は、全ての出発物質が消費され、生成物が形成されたことを示した。アセトン−メタノールを減圧下で除去した。反応の残渣をＥｔＯＡｃに溶解し、水で洗浄した。有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮乾固した。次にこの物質をＳｉＯ２カラムに装填し、クロマトグラフィー（石油エーテル中３０％ＥＥｔＯＡｃ）に付して、純粋な（３，４），（５，６）−ビスアセトニド−Ｄ−グルコン酸メチルエステル（３．８ｇ、５６％）及び位置異性体（２，３），（５，６）−ビスアセトニド−Ｄ−グルコン酸メチルエステル（０．７１ｇ、１０％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲデータは、必要とされる生成物と一致した。Ｃ１３Ｈ２２Ｏ７；ＭＷ  ２９０．３１；精密質量：２９０．１４。
【０２１９】
【化４１】
0005690589.tif 000048
【０２２０】
実施例。（３，４），（５，６）−ビスアセトニド−２−ＯＴｆ−Ｄ−グルコン酸メチルエステル。乾燥した１００mLの丸底フラスコの中で、アルゴン下、（３，４），（５，６）−ビスアセトニド−Ｄ−グルコン酸メチルエステル（３．９ｇ、１３．４３mmol）を塩化メチレン（４０mL）に溶解し、−２０℃〜−２５℃に冷却した。この溶液に、ピリジン（３．２６mL、４０．２９mmol）、続いてトリフルオロメタンスルホン酸無水物（３．３９mL、２０．１５mmol）を加えた。この白色の濁った溶液を−２０℃で１時間撹拌した。ＴＬＣ（石油エーテル中２５％ＥｔＯＡｃ）は、全ての出発物質が消費され、生成物が形成されたことを示した。反応混合物を砕氷中に注ぎ、ジエチルエーテルで抽出した。有機層を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して、（３，４），（５，６）−ビスアセトニド−２−ＯＴｆ−Ｄ−グルコン酸メチルエステル（５．５ｇ、９７％）を得た。この物質を更に精製することなく次の反応に使用した。Ｃ１４Ｈ２１Ｆ３Ｏ９Ｓ；ＭＷ  ４２２．３７１；精密質量：４２２．０９。
【０２２１】
【化４２】
0005690589.tif 000049
【０２２２】
実施例。（３，４），（５，６）−ビスアセトニド−２−デオキシ−２−アジド−Ｄ−マンノン酸メチルエステル。乾燥した１００mLの丸底フラスコの中で、アルゴン下、（３，４），（５，６）−ビスアセトニド−２−ＯＴｆ−Ｄ−グルコン酸メチルエステル（５．５ｇ、１３．０２mmol）をＤＭＦ（２０mL）に溶解した。この溶液に、ＮａＮ３（０．９３ｇ、１４．３２mmol）を加えた。この溶液を室温で１時間撹拌した。ＴＬＣ（石油エーテル中８％ＥｔＯＡｃ、３回実施）は、全ての出発物質が消費され、生成物が形成されたことを示した。ＤＭＦを減圧下で除去した。反応混合物をブラインで希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮乾固した。次にこの粗物質をＳｉＯ２カラムに装填し、クロマトグラフィー（石油エーテル中２０％ＥｔＯＡｃ）に付して、純粋な（３，４），（５，６）−ビスアセトニド−２−デオキシ−２−アジド−Ｄ−マンノン酸メチルエステル（３．８ｇ、９３％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲデータは、生成物と一致した。Ｃ１３Ｈ２１Ｎ３Ｏ６Ｓ；ＭＷ  ３１５．３２；精密質量：３１５．１４。
【０２２３】
【化４３】
0005690589.tif 000050
【０２２４】
実施例。（３，４），（５，６）−ビスアセトニド−２−デオキシ−２−アミノ−Ｄ−マンノン酸メチルエステル。Parr水素化フラスコの中で、（３，４），（５，６）−ビスアセトニド−２−デオキシ−２−アジド−Ｄ−マンノン酸メチルエステル（３．５ｇ、１１．１０mmol）をメタノール（１７０mL）に溶解した。この溶液に、１０％Ｐｄ担持炭（８００mg、５mol％）を加えた。水素化を、Parr水素化装置を２５PSIで１時間使用して実施した。ＴＬＣ（塩化メチレン中１０％メタノール）は、全ての出発物質が消費され、生成物が形成されたことを示した。反応混合物を、セライトパッドで濾過し、濃縮乾固した。次にこの粗物質をＳｉＯ２カラムに装填し、クロマトグラフィー（塩化メチレン中２％メタノール）に付して、純粋な（３，４），（５，６）−ビスアセトニド−２−デオキシ−２−アミノ−Ｄ−マンノン酸メチルエステル（２．６１ｇ、８１％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲデータは、生成物と一致した。Ｃ１３Ｈ２３ＮＯ６Ｓ；ＭＷ  ２８９．３２；精密質量：２８９．１５。
【０２２５】
【化４４】
0005690589.tif 000051
【０２２６】
実施例。（３，４），（５，６）−ビスアセトニド−２−デオキシ−２−Ｆｍｏｃ−アミノ−Ｄ−マンノン酸。乾燥した１００mLの丸底フラスコの中で、（３，４），（５，６）−ビスアセトニド−２−デオキシ−２−アミノ−Ｄ−マンノン酸メチルエステル（１．２４ｇ、４．２９mmol）をＴＨＦ／ＭｅＯＨ（２０mL／５mL）に溶解した。この溶液に、水（５mL）中のＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（２１５．８mg、５．１４mmol）を加えた。この明黄色の溶液を室温で２時間撹拌した。ＴＬＣ（塩化メチレン中１０％メタノール）は、全ての出発物質が消費され、生成物が形成されたことを示した。ＴＨＦ／ＭｅＯＨを減圧下で除去した。水相を飽和ＮａＨＣＯ３（１０mL）に再懸濁した。この懸濁液に、１，４−ジオキサン（１０mL）中のＦｍｏｃ−ＯＳｕ（１．７４ｇ、５．１４mmol）を加えた。この不均質溶液を室温で１８時間撹拌した。ＴＬＣ（塩化メチレン中１０％メタノール）は、大部分の出発物質が消費され、生成物が形成されたことを示した。ジオキサンを減圧下で除去した。水層をジエチルエーテルで抽出して、低極性の不純物を除去した。次に水層を、０．２N  ＨＣｌを使用してｐＨ６に酸性化し、ＥｔＯＡｃで再抽出した。ＥｔＯＡｃ層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して、（３，４），（５，６）−ビスアセトニド−２−デオキシ−２−Ｆｍｏｃ−アミノ−Ｄ−マンノン酸（１．６ｇ、７６％）を得た。この物質を更に精製することなく次の反応に使用した。１Ｈ  ＮＭＲデータは、生成物と一致した。Ｃ２７Ｈ３１ＮＯ８；ＭＷ  ４９７．５４１；精密質量：４９７．２０。
【０２２７】
【化４５】
0005690589.tif 000052
【０２２８】
実施例。ＥＣ０２３３を、Ｈ−Ｃｙｓ（４−メトキシトリチル）−２−クロロトリチル樹脂、及び下記のＳＰＰＳ試薬から出発して、本明細書に記載されている一般的ペプチド合成手順に従って、３工程において、ＳＰＰＳにより合成した：
【表７】
0005690589.tif 000053
【０２２９】
カップリング工程。ペプチド合成容器の中に、樹脂を加え、アミノ酸溶液、ＤＩＰＥＡ及びＰｙＢＯＰを加える。アルゴンを１時間泡立て、ＤＭＦ及びＩＰＡで３回洗浄する。それぞれのアミノ酸をカップリングする前、Ｆｍｏｃの脱保護に、ＤＭＦ中２０％ピペリジンを３回（１０分間）使用する。３つのカップリング工程の全てが完了するまで続ける。終了時に、樹脂をＤＭＦ中２％ヒドラジンで３回（５分間）洗浄して、プテロイン酸のＴＦＡ保護基を切断する。
【０２３０】
切断工程。切断試薬：９２．５％（５０ml）ＴＦＡ、２．５％（１．３４ml）Ｈ２Ｏ、２．５％（１．３４ml）トリイソプロピルシラン、２．５％（１．３４ml）エタンジチオール。２５mlの切断試薬を加え、アルゴンを２０分間泡立て、排水し、残りの試薬で３回洗浄する。５ml残留するまでRotavapに付し、エチルエーテルに沈殿させる。遠心分離し、乾燥する。
【０２３１】
ＨＰＬＣ精製工程。カラム：Waters NovaPak C18  ３００×１９mm；緩衝液Ａ＝１０mM酢酸アンモニウム、ｐＨ５；Ｂ＝ＡＣＮ；方法：１％Ｂから２０％Ｂを１５ml/分で４０分間；収量約２０２mg、５０％。Ｃ２８Ｈ３５Ｎ９Ｏ１２Ｓ；ＭＷ  ７２１．７０；精密質量：７２１．２１。
【０２３２】
【化４６】
0005690589.tif 000054
【０２３３】
実施例。ビス−サッカロ−葉酸リンカーＥＣ０２４４。ＥＣ０２４４を、Ｈ−Ｃｙｓ（４−メトキシトリチル）−２−クロロトリチル樹脂、及び下記のＳＰＰＳ試薬から出発して、本明細書に記載されている一般的ペプチド合成手順に従って、５工程において、ＳＰＰＳにより合成した：
【表８】
0005690589.tif 000055
【０２３４】
カップリング工程、切断工程、切断試薬及びＨＰＬＣ精製工程は、上記に記載したものと同一である；収量約２８４mg、５０％。Ｃ３８Ｈ５１Ｎ１１Ｏ２０Ｓ；ＭＷ  １０１３．９４；精密質量：１０１３．３０。
【０２３５】
【化４７】
0005690589.tif 000056
【０２３６】
実施例。ＥＣ０２５７を、Ｈ−Ｃｙｓ（４−メトキシトリチル）−２−クロロトリチル樹脂、及び下記のＳＰＰＳ試薬から出発して、本明細書に記載されている一般的ペプチド合成手順に従って、６工程において、ＳＰＰＳにより合成した：
【表９】
0005690589.tif 000057
【０２３７】
カップリング工程、切断工程、切断試薬及びＨＰＬＣ精製工程は、上記に記載したものと同一である；収量約１７０mg、７１％。Ｃ４４Ｈ６２Ｎ１２Ｏ２５Ｓ；ＭＷ  １１９１．０９；精密質量：１１９０．３７。
【０２３８】
【化４８】
0005690589.tif 000058
【０２３９】
実施例。ＥＣ０２６１を、Ｈ−Ｃｙｓ（４−メトキシトリチル）−２−クロロトリチル樹脂及び下記のＳＰＰＳ試薬から出発して、本明細書に記載されている一般的ペプチド合成手順に従って、７工程において、下記のＳＰＰＳ試薬により合成した：
【表１０】
0005690589.tif 000059
カップリング工程、切断工程、切断試薬及びＨＰＬＣ精製工程は、上記に記載したものと同一である；収量約１７０mg、６５％。Ｃ４８Ｈ６７Ｎ１３Ｏ２８Ｓ；ＭＷ  １３０６．１８；精密質量：１３０５．３９。
【０２４０】
【化４９】
0005690589.tif 000060
【０２４１】
実施例。テトラ−サッカロ−トリス−Ａｓｐ−葉酸リンカーＥＣ０２６８。ＥＣ０２６８を、Ｈ−Ｃｙｓ（４−メトキシトリチル）−２−クロロトリチル樹脂、及び下記のＳＰＰＳ試薬から出発して、本明細書に記載されている一般的ペプチド合成手順に従って、９工程において、ＳＰＰＳにより合成した：
【表１１】
0005690589.tif 000061
【０２４２】
カップリング工程、切断工程、切断試薬及びＨＰＬＣ精製工程は、上記に記載したものと同一である；収量約１００mg、６３％。Ｃ９４Ｈ１２５Ｎ１９Ｏ３７Ｓ２；ＭＷ  ２１７７．２４；精密質量：２１７５．７９。
【０２４３】
以下の例示的な実施例は、ＥＣ０２６８の手順に従って調製することができる：
【化５０】
0005690589.tif 000062
【０２４４】
実施例。テトラ−サッカロ−Ａｓｐ−葉酸リンカーＥＣ０４６３。ＥＣ０４６３を、Ｈ−Ｃｙｓ（４−メトキシトリチル）−２−クロロトリチル樹脂、及び下記のＳＰＰＳ試薬から出発して、本明細書に記載されている一般的ペプチド合成手順に従って、７工程において、ＳＰＰＳにより合成した：
【表１２】
0005690589.tif 000063
【０２４５】
カップリング工程、切断工程、切断試薬及びＨＰＬＣ精製工程は、上記に記載したものと同一である；収量約６３mg、４６％。Ｃ５０Ｈ７３Ｎ１３Ｏ３０Ｓ；ＭＷ  １３６８．２５；精密質量：１３６７．４３。
【０２４６】
【化５１】
0005690589.tif 000064
【０２４７】
実施例。テトラ−サッカロ−ビス−α−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−葉酸リンカーＥＣ０４８０。ＥＣ０４８０を、Ｈ−Ｃｙｓ（４−メトキシトリチル）−２−クロロトリチル樹脂、及び下記のＳＰＰＳ試薬から出発して、本明細書に記載されている一般的ペプチド合成手順に従って、９工程において、ＳＰＰＳにより合成した：
【表１３】
0005690589.tif 000065
【０２４８】
カップリング工程、切断工程、切断試薬及びＨＰＬＣ精製工程は、上記に記載したものと同一である；収量約１００mg、３３％。Ｃ６２Ｈ９４Ｎ１８Ｏ２０Ｓ；ＭＷ  １６６７．５８；精密質量：１６６６．５９。
【０２４９】
実施例。テトラ−サッカロ−ビス−Ａｓｐ−葉酸リンカーＥＣ０４５２：
【化５２】
0005690589.tif 000066
【０２５０】
実施例。テトラ−サッカロ−ビス−Ａｓｐ−葉酸リンカーＥＣ０４５２。ＥＣ０４５２を、Ｈ−Ｃｙｓ（４−メトキシトリチル）−２−クロロトリチル樹脂、及び下記のＳＰＰＳ試薬から出発して、本明細書に記載されている一般的ペプチド合成手順に従って、９工程において、ＳＰＰＳにより合成した：
【表１４】
0005690589.tif 000067
【０２５１】
カップリング工程、切断工程及び切断試薬は、上記に記載したものと同一である。ＨＰＬＣ精製工程。カラム：Waters NovaPak C18  ３００×１９mm；緩衝液Ａ＝１０mM酢酸アンモニウム、ｐＨ５；Ｂ＝ＡＣＮ；方法：１％Ｂから２０％Ｂを２５ml/分で４０分間；収量約９８mg、４０％。Ｃ６２Ｈ９３Ｎ１７Ｏ３４Ｓ；ＭＷ  １６５２．５６；精密質量：１６５１．５８。
【０２５２】
【化５３】
0005690589.tif 000068
【０２５３】
実施例。テトラ−サッカロ−ビス−Ａｓｐ−葉酸リンカーＥＣ０４５７。ＥＣ０４５７を、Ｈ−Ｃｙｓ（４−メトキシトリチル）−２−クロロトリチル樹脂及び下記のＳＰＰＳ試薬から出発して、本明細書に記載されている一般的ペプチド合成手順に従って、８工程において、ＳＰＰＳにより合成した：
【表１５】
0005690589.tif 000069
【０２５４】
カップリング工程、切断工程及び切断試薬は、上記に記載したものと同一である。ＨＰＬＣ精製工程。カラム：Waters NovaPak C18  ３００×１９mm；緩衝液Ａ＝１０mM酢酸アンモニウム、ｐＨ５；Ｂ＝ＡＣＮ；方法：０％Ｂから２０％Ｂを２５ml/分で４０分間；収量約２１０mg、７１％。Ｃ５４Ｈ７８Ｎ１４Ｏ３３Ｓ；ＭＷ  １４８３．３４；精密質量：１４８２．４６。
【０２５５】
【化５４】
0005690589.tif 000070
【０２５６】
実施例。テトラ−サッカロ−トリス−Ｇｌｕ−葉酸リンカーＥＣ０４７７。ＥＣ０４７７を、Ｈ−Ｃｙｓ（４−メトキシトリチル）−２−クロロトリチル樹脂、及び下記のＳＰＰＳ試薬から出発して、本明細書に記載されている一般的ペプチド合成手順に従って、９工程において、ＳＰＰＳにより合成した：
【表１６】
0005690589.tif 000071
【０２５７】
カップリング工程、切断工程及び切断試薬は、上記に記載したものと同一である。ＨＰＬＣ精製工程。カラム：Waters NovaPak C18  ３００×１９mm；緩衝液Ａ＝１０mM酢酸アンモニウム、ｐＨ５；Ｂ＝ＡＣＮ；方法：０％Ｂから２０％Ｂを２５ml/分で４０分間；収量約２２０mg、６７％。Ｃ６１Ｈ８９Ｎ１５Ｏ３６Ｓ；ＭＷ  １６４０．５０；精密質量：１６３９．５３。
【０２５８】
【化５５】
0005690589.tif 000072
【０２５９】
実施例。ＥＣ０４５３を、Ｈ−Ｃｙｓ（４−メトキシトリチル）−２−クロロトリチル樹脂、及び下記のＳＰＰＳ試薬から出発して、本明細書に記載されている一般的ペプチド合成手順に従って、ＳＰＰＳにより合成した：
【表１７】
0005690589.tif 000073
【０２６０】
カップリング工程。ペプチド合成容器の中に、樹脂を加え、アミノ酸溶液、ＤＩＰＥＡ及びＰｙＢＯＰを加える。アルゴンを１時間泡立て、ＤＭＦ及びＩＰＡで３回洗浄する。それぞれのアミノ酸をカップリングする前、Ｆｍｏｃの脱保護に、ＤＭＦ中２０％ピペリジンを３回（１０分間）使用する。９つのカップリング工程の全てが完了するまで続ける。終了時に、樹脂をＤＭＦ中２％ヒドラジンで３回（５分間）洗浄して、プテロイン酸のＴＦＡ保護基を切断し、樹脂をＤＭＦ（３回）、ＩＰＡ（３回）、ＭｅＯＨ（３回）で洗浄し、樹脂をアルゴンで３０分間泡立てる。
【０２６１】
切断工程。切断試薬：９２．５％ＴＦＡ、２．５％Ｈ２Ｏ、２，５％トリイソプロピルシラン、２．５％エタンジチオール。樹脂を、アルゴンで泡立てながら、切断試薬で３回（１５分間、５分間、５分間）処理し、排水し、収集し、溶液をまとめる。５ml残留するまでRotavapに付し、ジエチルエーテル（３５mL）に沈殿させる。遠心分離し、ジエチルエーテルで洗浄し、乾燥する。粗固体をＨＰＬＣで精製した。
【０２６２】
ＨＰＬＣ精製工程。カラム：Waters Xterra Prep MS C18  １０μm  １９×２５０mm、溶媒Ａ：１０mM酢酸アンモニウム、ｐＨ５；溶媒Ｂ：ＡＣＮ；方法：２５mL/分により０％Ｂで５分間から２０％Ｂで４０分間；生成物を含有する画分を収集し、凍結乾燥して、約６０mgのＥＣ０４５３を得た（収率２３％）。１Ｈ  ＮＭＲ及びＬＣ／ＭＳは、生成物と一致した。Ｃ５８Ｈ８３Ｎ１５Ｏ３６Ｓ；ＭＷ  １５９８．４３；精密質量：１５９７．４８。Ｃ  ４３．５８；Ｈ  ５．２３；Ｎ  １３．１４；Ｏ  ３６．０３；Ｓ  ２．０１。
【０２６３】
【化５６】
0005690589.tif 000074
【０２６４】
実施例。（３，４），（５，６）−ビスアセトニド−２−デオキシ−２−Ｆｍｏｃ−アミノ−Ｄ−マンノン酸−ジアゾ−ケトン。乾燥した１００mLの丸底フラスコの中で、（３，４），（５，６）−ビスアセトニド−２−デオキシ−２−Ｆｍｏｃ−アミノ−Ｄ−マンノン酸（１．０ｇ、２．０１mmol）を、アルゴン雰囲気下、ＴＨＦ（１０mL）に溶解した（完全に溶解せず）。反応混合物を−２５℃に冷却した。この溶液に、ＮＭＭ（０．２３mL、２．１１mmol）及びクロロギ酸エチル（２２８．９８mg、２．１１mmol）を加えた。この溶液を−２０℃で３０分間撹拌した。得られた白色の懸濁液を０℃に温め、エーテル中のジアゾメタンの溶液を、黄色になるまで加えた。撹拌を、混合物が室温に温まるまで続けた。２時間撹拌し、過剰ジアゾメタンを、激しく撹拌しながら数滴の酢酸を添加することより破壊した。混合物をエーテルで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮乾固した。次にこの粗物質をＳｉＯ２カラムに装填し、クロマトグラフィー（石油エーテル中３０％ＥｔＯＡｃ）に付して、純粋な（３，４），（５，６）−ビスアセトニド−２−デオキシ−２−Ｆｍｏｃ−アミノ−Ｄ−マンノン酸−ジアゾ−ケトン（０．６ｇ、５７％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲデータは、生成物と一致した。Ｃ２８Ｈ３１Ｎ３Ｏ７；ＭＷ  ５２１．５６；精密質量：５２１．２２。
【０２６５】
【化５７】
0005690589.tif 000075
【０２６６】
実施例。（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−（４，５），（６，７）−ビスアセトニド−３−Ｆｍｏｃ−アミノ−ヘプタン酸。乾燥した２５mLの丸底フラスコの中で、（３，４），（５，６）−ビスアセトニド−２−デオキシ−２−Ｆｍｏｃ−アミノ−Ｄ−マンノン酸−ジアゾ−ケトン（０．１５ｇ、０．２９mmol）を、アルゴン雰囲気下、ＴＨＦ（１．６mL）に溶解した。この溶液に、水（０．４mL）中のトリフルオロ酢酸銀（６．６mg、０．０３mmol）を、暗黒中で加えた。得られた混合物を室温で１６時間撹拌した。ＴＬＣ（塩化メチレン中１０％ＭｅＯＨ）は、全ての出発物質が消費され、生成物が形成されたことを示した。溶媒（ＴＨＦ）を減圧下で除去し、残渣を水で希釈し（ｐＨは３．５〜４．０であった）、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮乾固した。次にこの粗物質をＳｉＯ２カラムに装填し、クロマトグラフィー（塩化メチレン中１％ＭｅＯＨから塩化メチレン中５％ＭｅＯＨの勾配溶離）に付して、純粋な（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）−（４，５），（６，７）−ビスアセトニド−３−Ｆｍｏｃ−アミノ−ヘプタン酸（０．１０ｇ、６８％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲデータは、生成物と一致した。Ｃ２８Ｈ３３ＮＯ８；ＭＷ  ５１１．５６；精密質量：５１１．２２。
【０２６７】
【化５８】
0005690589.tif 000076
【０２６８】
実施例。テトラ−ホモサッカロ−トリス−αＧｌｕ−葉酸スペーサーＥＣ０４７８。ＥＣ０４７８を、Ｈ−Ｃｙｓ（４−メトキシトリチル）−２−クロロトリチル樹脂、及び下記のＳＰＰＳ試薬から出発して、本明細書に記載されている一般的ペプチド合成手順に従って、９工程において、ＳＰＰＳにより合成した：
【表１８】
0005690589.tif 000077
【０２６９】
カップリング工程、切断工程及び切断試薬は、上記に記載したものと同一である。ＨＰＬＣ精製工程。カラム：Waters NovaPak C18  ３００×１９mm；緩衝液Ａ＝１０mM酢酸アンモニウム、ｐＨ５；Ｂ＝ＡＣＮ；方法：２６ml/分で、１００％Ａを５分間、次に０％Ｂから２０％Ｂを２０分間；収量約８８mg、５２％。Ｃ６５Ｈ９７Ｎ１５Ｏ３６Ｓ；ＭＷ  １６９６．６１；精密質量：１６９５．５９。
【０２７０】
【化５９】
0005690589.tif 000078
【０２７１】
実施例。（３，４），（５，６）−ビスアセトニド−Ｄ−グルコン酸アミド。２０ｇのメチルエスエルを１００mLのメタノールに溶解し、高圧反応容器においてドライアイス／アセトンにより冷却し、１００mLの液体アンモニアを投入し、室温まで温め、１６０℃／８５０PSIで２時間加熱した。反応容器を室温に冷却し、圧力を放出した。溶媒の蒸発によって褐色を帯びたシロップを得て、最少量のイソプロピルアルコールを加えて、還流しながら均質の溶液にした。溶液を−２０℃に冷却し、得られた固体を濾過して、８．３ｇの固体を得た。母液を蒸発させ、得られた残渣に、エーテルを加え、均質溶液を得るまで環流した。次に溶液を−２０℃に冷却し、得られた固体を濾過して、４．０ｇの生成物を得た。固体をまとめて、イソプロピルアルコールで再結晶させて、１１．２ｇ（５９％）の白色のアミド生成物を得た。Ｃ１２Ｈ２１ＮＯ６；ＭＷ  ２７５．３０；精密質量：２７５．１４。
【０２７２】
【化６０】
0005690589.tif 000079
【０２７３】
実施例。（３，４），（５，６）−ビスアセトニド−１−デオキシ−１−アミノ−Ｄ−グリシトール。乾燥した１００mLの丸底フラスコの中で、アルゴン下、ＬｉＡｌＨ４（４５０mg、１１．８６mmol）をＴＨＦ（１０mL）に溶解し、０℃に冷却した。この懸濁液に、ＴＨＦ（３０mL）中の（３，４），（５，６）−ビスアセトニド−Ｄ−グルコン酸アミド（１．０９ｇ、３．９６mmol）を、１５分間かけて非常にゆっくりと加えた。この混合物を５時間還流した。ＴＬＣ（塩化メチレン中１０％ＭｅＯＨ）は、全ての出発物質が消費され、生成物が形成されたことを示した。反応混合物を室温に冷却し、次に氷浴温度に冷却し、ジエチルエーテル（４０mL）で希釈し、０．５mLの水、０．５mLの１５％ＮａＯＨ水溶液をゆっくりと加え、次に１．５mLの水を加えた。反応混合物を室温に温め、３０分間撹拌した。ＭｇＳＯ４を加え、更に１５分間撹拌し、濾過した。有機層を濃縮乾固して、（３，４），（５，６）−ビスアセトニド−１−デオキシ−１−アミノ−Ｄ−グリシトールを得た。１Ｈ  ＮＭＲデータは、生成物と一致した。Ｃ１２Ｈ２３ＮＯ５；ＭＷ  ２６１．３１；精密質量：２６１．１６。
【０２７４】
【化６１】
0005690589.tif 000080
【０２７５】
実施例。ＥＣ０４７５。Ｏ−アリル保護Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（２．１７ｇ、１当量）、ＰｙＢＯＰ（２．８８ｇ、１当量）及びＤＩＰＥＡ（１．８３mL、２当量）を、無水ＤＭＦ（６mL）中の（３，４），（５，６）−ビスアセトニド−１−デオキシ−１−アミノ−Ｄ−グリシトール（１．４ｇ、５．３mmol）の溶液に加え、混合物をアルゴン下、室温で２時間撹拌した。溶液をＥｔＯＡｃ（５０mL）で希釈し、ブライン（１０mL×３）で洗浄し、有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮して、残渣を得て、それをフラッシュカラム（シリカゲル、６０％ＥｔＯＡｃ／石油エーテル）により精製して、１．７２ｇ（５０％）のアリル保護ＥＣ０４７５を固体として得た。Ｐｄ（Ｐｈ３）４（３００mg、０．１当量）を、ＮＭＭ／ＡｃＯＨ／ＣＨＣｌ３（２mL／４mL／７４mL）中のアリル保護ＥＣ０４７５（１．７２ｇ、２．８１mmol）の溶液に加えた。得られた黄色の溶液を、アルゴン下、室温で１時間撹拌し、それに第２のＰｄ（Ｐｈ３）４（３００mg、０．１当量）を加えた。更に１時間撹拌した後、混合物を１N  ＨＣｌ（５０mL×３）及びブライン（５０mL）で洗浄し、有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮して、黄色の泡状固体を得て、それをクロマトグラフィー（シリカゲル、１％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３、続いて３．５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）に付して、１．３ｇ（８１％）のＥＣ０４７５を固体物質として得た。ＭＷ  ６１２．６７；精密質量：６１２．２７。
【０２７６】
【化６２】
0005690589.tif 000081
【０２７７】
実施例。テトラ−サッカログルタメート−ビス−αＧｌｕ−葉酸スペーサーＥＣ０４９１。ＥＣ０４９１を、Ｈ−Ｃｙｓ（４−メトキシトリチル）−２−クロロトリチル樹脂、及び下記のＳＰＰＳ試薬から出発して、本明細書に記載されている一般的ペプチド合成手順に従って、８工程において、ＳＰＰＳにより合成した：
【表１９】
0005690589.tif 000082
【０２７８】
カップリング工程、切断工程及び切断試薬は、上記に記載したものと同一である。ＨＰＬＣ精製工程。カラム：Waters NovaPak C18  ３００×１９mm；緩衝液Ａ＝１０mM酢酸アンモニウム、ｐＨ５；Ｂ＝ＡＣＮ；方法：２６ml/分で、１００％Ａを５分間、次に０％Ｂから２０％Ｂを２０分間；収量約１００mg、５１％。Ｃ７６Ｈ１１８Ｎ１８Ｏ４１Ｓ；ＭＷ  １９７１．９１；精密質量：１９７０．７４。
【０２７９】
【化６３】
0005690589.tif 000083
【０２８０】
実施例。ＥＣ０４７９を、Ｈ−Ｃｙｓ（４−メトキシトリチル）−２−クロロトリチル樹脂、及び下記のＳＰＰＳ試薬から出発して、本明細書に記載されている一般的ペプチド合成手順に従って、ＳＰＰＳにより合成した：
【表２０】
0005690589.tif 000084
【０２８１】
カップリング工程。ペプチド合成容器の中に、樹脂を加え、アミノ酸溶液、ＤＩＰＥＡ及びＰｙＢＯＰを加える。アルゴンを１時間泡立て、ＤＭＦ及びＩＰＡで３回洗浄する。それぞれのアミノ酸をカップリングする前、Ｆｍｏｃの脱保護に、ＤＭＦ中２０％ピペリジンを３回（１０分間）使用する。９つのカップリング工程の全てが完了するまで続ける。終了時に、樹脂をＤＭＦ中２％ヒドラジンで３回（５分間）洗浄して、プテロイン酸のＴＦＡ保護基を切断し、樹脂をＤＭＦ（３回）、ＩＰＡ（３回）、ＭｅＯＨ（３回）で洗浄し、樹脂をアルゴンで３０分間泡立てる。
【０２８２】
切断工程。試薬：９２．５％ＴＦＡ、２．５％Ｈ２Ｏ、２．５％トリイソプロピルシラン、２．５％エタンジチオール。樹脂を、アルゴンで泡立てながら、切断試薬で１５分間処理し、排水し、樹脂を切断試薬で１回洗浄し、溶液をまとめる。５ml残留するまでRotavapに付し、ジエチルエーテル（３５mL）に沈殿させる。遠心分離し、ジエチルエーテルで洗浄し、乾燥する。粗固体をＨＰＬＣで精製した。
【０２８３】
ＨＰＬＣ精製工程。カラム： Waters Atlantis Prep T3 １０μm OBD １９×２５０mm；溶媒Ａ：１０mM酢酸アンモニウム、ｐＨ５；溶媒Ｂ：ＡＣＮ；方法：２６mL/分で０％Ｂを５分間から２０％Ｂを２０分間。生成物を含有する画分を収集し、凍結乾燥して、約７０mgのＥＣ０４７９（収率３５％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ及びＬＣ／ＭＳは、生成物と一致した。ＭＷ  ２１２８．１０；精密質量：２１２６．８４。
【０２８４】
【化６４】
0005690589.tif 000085
【０２８５】
ＥＣ０４８８。この化合物を、Ｈ−Ｃｙｓ（４−メトキシトリチル）−２−クロロトリチル樹脂、及び下記のＳＰＰＳ試薬から出発して、本明細書に記載されている一般的ペプチド合成手順に従って、ＳＰＰＳにより調製した：
【表２１】
0005690589.tif 000086
【０２８６】
カップリング工程。ペプチド合成容器の中に、樹脂を加え、アミノ酸溶液、ＤＩＰＥＡ及びＰｙＢＯＰを加える。アルゴンを１時間泡立て、ＤＭＦ及びＩＰＡで３回洗浄する。それぞれのアミノ酸をカップリングする前、Ｆｍｏｃの脱保護に、ＤＭＦ中２０％ピペリジンを３回（１０分間）使用する。９つのカップリング工程の全てが完了するまで続ける。終了時に、樹脂をＤＭＦ中２％ヒドラジンで３回（５分間）洗浄して、プテロイン酸のＴＦＡ保護基を切断し、樹脂をＤＭＦ（３回）、ＩＰＡ（３回）、ＭｅＯＨ（３回）で洗浄し、樹脂をアルゴンで３０分間泡立てる。
【０２８７】
切断工程。試薬：９２．５％ＴＦＡ、２．５％Ｈ２Ｏ、２．５％トリイソプロピルシラン、２．５％エタンジチオール。樹脂を、アルゴンで泡立てながら、切断試薬で３回（１０分間、５分間、５分間）処理し、排水し、樹脂を切断試薬で１回洗浄し、溶液をまとめる。５ml残留するまでRotavapに付し、ジエチルエーテル（３５mL）に沈殿させる。遠心分離し、ジエチルエーテルで洗浄し、乾燥する。約半分の粗固体（約１００mg）をＨＰＬＣにより精製した。
【０２８８】
ＨＰＬＣ精製工程。カラム： Waters Xterra Prep MS C18 １０μm OBD １９×２５０mm；溶媒Ａ:１０mM酢酸アンモニウム、ｐＨ５；溶媒Ｂ：ＡＣＮ；方法：２６mL/分で０％Ｂを５分間から２０％Ｂを２５分間。生成物を含有する画分を収集し、凍結乾燥して、４３mgのＥＣ０４８８（収率５１％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ及びＬＣ／ＭＳ（精密質量１６７８．６２）は、生成物と一致した。ＭＷ  １６７９．６３；精密質量：１６７８．６２。
【０２８９】
以下の結合リガンドリンカー中間体の実施例、ＥＣ０２３３、ＥＣ０２４４、ＥＣ０２５７及びＥＣ０２６１を、本明細書に記載されたとおりに調製した。
【化６５】
0005690589.tif 000087
ＥＣ０２３３：Ｃ２８Ｈ３５Ｎ９Ｏ１２Ｓ；ＭＷ  ７２１．７０；精密質量：７２１．２１。
【化６６】
0005690589.tif 000088
ＥＣ０２４４：Ｃ３８Ｈ５１Ｎ１１Ｏ２０Ｓ；ＭＷ  １０１３．９４；精密質量：１０１３．３０。
【化６７】
0005690589.tif 000089
ＥＣ０２５７：Ｃ４４Ｈ６２Ｎ１２Ｏ２５Ｓ；ＭＷ  １１９１．０９；精密質量：１１９０．３７。
【化６８】
0005690589.tif 000090
ＥＣ０２６１：Ｃ４８Ｈ６７Ｎ１３Ｏ２８Ｓ；ＭＷ  １３０６．１８；精密質量：１３０５．３９。
【０２９０】
以下の例示的な中間体の実施例を、本明細書に記載されたとおりに調製した。
【化６９】
0005690589.tif 000091
１，２，３−トリアゾールを形成するHuisgenアジド；（ａ）ＮａＮ３；（ｂ）Ａｇ２ＣＯ３、ＤＣＭ、モレキュラーシーブ；（ｃ）ＬｉＯＨ、ＭｅＯＨ、Ｈ２Ｏ。
【化７０】
0005690589.tif 000092
ＥＣ０５０１  チオボルテゾミブ
【化７１】
0005690589.tif 000093
ＥＣ０５３６  結合体中間体
【化７２】
0005690589.tif 000094
ＥＣ０６３２  結合体中間体。Ｃ５２Ｈ７２Ｎ１４Ｏ２８Ｓ、ＭＷ  １３７３．２７、精密質量：１３７２．４４、対応するtert−ブチル保護カルボキシレートから調製。
【化７３】
0005690589.tif 000095
ＥＣ０６６９  結合体中間体。Ｃ４９Ｈ７１Ｎ１３Ｏ２４Ｓ、ＭＷ  １２５８．２３、精密質量：１２５７．４５。
【０２９１】
【化７４】
0005690589.tif 000096
【０２９２】
実施例。カップリング試薬ＥＣ０３１１の合成。ＤＩＰＥＡ（０．６０mL）を、無水ＤＣＭ（５．０mL）中のＨＯＢｔ−ＯＣＯ２−（ＣＨ２）２−ＳＳ−２−ピリジンＨＣｌ（６８５mg、９１％）の懸濁液に０℃で加え、アルゴン下で２時間撹拌し、それに無水ヒドラジン（０．１０mL）を加えた。反応混合物をアルゴン下、０℃で１０分間、室温で更に３０分間撹拌し、濾過し、濾液をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中２％ＭｅＯＨ）により精製して、ＥＣ０３１１を明澄な濃油状物（３７１mg）として得て、放置して凝固させた。
【０２９３】
【化７５】
0005690589.tif 000097
【０２９４】
実施例。ビンブラスチンピリジニルジスルフィド。２−〔（ベンゾトリアゾール−１−イル−（オキシカルボニルオキシ）−エチルジスルファニル〕−ピリジンＨＣｌ（６０１mg）及び３７８μLのＤＩＰＥＡを、５mlのＤＣＭ中のデスアセチルビンブラスチンヒドラジド（６６８mg）の溶液に、連続して加えた。反応を室温に温め、３時間撹拌した。ＴＬＣ（ＤＣＭ中１５％ＭｅＯＨ）は、完全な変換を示した。混合物をシリカゲルクロマトグラフィー（１：９  ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により精製した。まとめた画分を蒸発させ、ＤＣＭに再溶解し、１０％Ｎａ２ＣＯ３、ブラインで洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、蒸発させて、５５０mg（８０％）にした；ＨＰＬＣ−ＲＴ  １２．６５１分、純度９１％、１Ｈ  ＨＭＲスペクトルは指定された構造と一致、ＭＳ（ＥＳＩ＋）：９８４．３、９８３．３、９８２．４、４９２．４、４９１．９、１４１．８。この手順の追加的な詳細は、米国特許出願公開第２００５／０００２９４２Ａ１号に記載されている。
【０２９５】
【化７６】
0005690589.tif 000098
【０２９６】
実施例。チューブリシンヒドラジドの調製。ＥＣ０３４７の調製により説明する。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、６．１μL）及びクロロギ酸イソブチル（３．０μL）を、シリンジを介して、同時に、無水ＥｔＯＡｃ（２．０mL）中のチューブリシンＢ（０．１５mg）の溶液に−１５℃で加えた。アルゴン下、−１５℃で４５分間撹拌した後、反応混合物を−２０℃に冷却し、それに無水ヒドラジン（５．０μL）を加えた。反応混合物をアルゴン下、−２０℃で３時間撹拌し、１．０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０、１．０mL）で停止させ、精製のために分取ＨＰＬＣに注入した。カラム： Waters XTerra Prep MS C18 １０μm、１９×２５０mm；移動相Ａ：１．０mMリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０；移動相Ｂ：アセトニトリル；方法：２０分間かけて１０％Ｂから８０％Ｂ、流速＝２５mL/分。１５．１４〜１５．５４分の画分を収集し、凍結乾燥して、ＥＣ０３４７を白色の固体（２．７mg）として生成した。以上の方法は、チューブリシン出発化合物の適切な選択によって、他のチューブリシンヒドラジドを調製するためにも同様に適用可能である。
【０２９７】
【化７７】
0005690589.tif 000099
【０２９８】
実施例。チューブリシンジスルフィドの調製（段階的方法）。ＥＣ０３１２により説明する。ＤＩＰＥＡ（３６μL）及びクロロギ酸イソブチル（１３μL）を、シリンジの助けを借りて、同時に、無水ＥｔＯＡｃ（２．０mL）中のチューブリシンＢ（８２mg）の溶液に−１５℃で加えた。アルゴン下、−１５℃で４５分間撹拌した後、反応混合物に、無水ＥｔＯＡｃ（１．０mL）中のＥＣ０３１１の溶液を加えた。得られた溶液をアルゴン下、−１５℃で１５分間、室温で更に４５分間撹拌し、濃縮し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中２〜８％ＭｅＯＨ）により精製して、ＥＣ０３１２を白色の固体（９８mg）として得た。以上の方法は、チューブリシン出発化合物の適切な選択によって、他のチューブリシン誘導体を調製するためにも同様に適用可能である。
【０２９９】
【化７８】
0005690589.tif 000100
【０３００】
実施例。チューブリシン結合体を含有するジスルフィドの一般的合成。 ＥＣ０３１２により説明する。チオール基を含有する結合リガンドリンカー中間体を、脱イオン水（約２０mg/mL、使用前にアルゴンで１０分間泡立てた）に取り、懸濁液のｐＨを飽和ＮａＨＣＯ３（使用前にアルゴンで１０分間泡立てた）により約６．９に調製する（懸濁液は、ｐＨが増加すると溶液になりうる）。必要であれば水溶液に追加の脱イオン水を加え（約２０〜２５％）、その直後、水溶液に、ＴＨＦ中のＥＣ０３１２（約２０mg/mL）の溶液を加える。反応混合物は急速に均質になる。アルゴン下、例えば４５分間撹拌した後、反応混合物を２．０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０、約１５０容量％）で希釈し、ＴＨＦを蒸発により除去する。得られる懸濁液を濾過し、濾液を分取ＨＰＬＣにより（本明細書に記載されているとおりに）精製することができる。画分を凍結乾燥して、結合体を単離する。以上の方法は、チューブリシン出発化合物の適切な選択によって、他のチューブリシン結合体を調製するためにも同様に適用可能である。
【０３０１】
【化７９】
0005690589.tif 000101
【０３０２】
ビンブラスチン比較例。親水性スペーサーリンカーを欠いているＥＣ１４５。ＴＨＦ中のペプチジルフラグメントＰｔｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ＯＨ（配列番号１）（実施例１３）を、チオスルホネート活性化ビンブラスチン又はビンブラスチンピリジニルジスルフィドのいずれかにより処理し、アルゴン下、ｐＨ＞６．５で０．１M  ＮａＨＣＯ３に溶解すると、黄色の溶液を得た。凍結乾燥及びＨＰＬＣにより、７０％の収率を得た；選択１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ８．６７（ｓ，１Ｈ，ＦＡ  Ｈ−７），７．５０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＶＬＢ  Ｈ−１１’），７．３０−７．４０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＶＬＢ  Ｈ−１４′），７．３５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，ＦＡ  Ｈ−１２＆１６），７．２５（ｍ，１Ｈ，ＶＬＢ  Ｈ−１３′），７．０５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＶＬＢ  Ｈ−１２′），６．５１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，ＦＡ  Ｈ−１３＆１５），６．４（ｓ，２Ｈ，ＶＬＢ  Ｈ−１４＆１７），５．７（ｍ，１Ｈ，ＶＬＢ  オレフィン），５．６５（ｍ，１Ｈ，ＶＬＢ  Ｈ−７），５．５（ｄ，１Ｈ，ＶＬＢ  オレフィン），５．５（ｍ，１Ｈ，ＶＬＢ  Ｈ−６），４．１５（ｍ，１Ｈ，ＶＬＢ  Ｈ−８′），３．８２（ｓ，３Ｈ，ＶＬＢ  Ｃ１８’−ＣＯ２ＣＨ３），３．６９（ｓ，３Ｈ，ＶＬＢ  Ｃ１６  −ＯＣＨ３），２．８（ｓ，３Ｈ，ＶＬＢ  Ｎ−ＣＨ３），１．３５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＶＬＢ  Ｈ−３′），１．１５（ｍ，１Ｈ，ＶＬＢ  Ｈ−２′），０．９（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ，ＶＬＢ  Ｈ−２１′），０．５５（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，ＶＬＢ  Ｈ−２１）；ＬＣＭＳ（ＥＳＩ，ｍ＋Ｈ＋）１９１８。
【０３０３】
【化８０】
0005690589.tif 000102
【０３０４】
実施例。親水性スペーサーリンカーを含むＥＣ０２３４（モノ−サッカロ−葉酸ビンブラスチン結合体）。ポリプロピレン遠心分離ボトルの中で、葉酸リンカー（ＥＣ０２３３、２２mg、０．０３０mmol）を２mLの水に溶解し、アルゴンで１０分間泡立てた。別のフラスコの中で、０．１N  ＮａＨＣＯ３溶液をアルゴンで１０分間泡立てた。リンカー溶液のｐＨを、０．１N  ＮａＨＣＯ３溶液を使用して６．９に注意深く調整した。２mLのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中のビンブラスチンピリジニルジスルフィド（２７mg、０．０２８mmol）を、上記の溶液にゆっくりと加えた。得られた明澄な溶液を、アルゴン下で１５分から１時間撹拌した。反応の進行を、分析ＨＰＬＣ（１０mM酢酸アンモニウム、ｐＨ＝７．０及びアセトニトリル）によりモニタリングした。ＴＨＦを減圧下で除去し、水溶液を濾過し、分取ＨＰＬＣカラム（X-terra Column C18、１９×３００mM）に注入した。１mMのリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０及びアセトニトリルで溶離することによって、生成物を含有する純粋な画分を得た。４８時間凍結乾燥した後、ビンブラスチン−サッカロ−葉酸結合体（ＥＣ０２３４）を単離した（３４mg、７６％）。１Ｈ  ＮＭＲデータは、葉酸結合体と一致した。Ｃ７４Ｈ９３Ｎ１５Ｏ２１Ｓ２；ＭＷ  １５９２．７５；精密質量：１５９１．６１。
【０３０５】
【化８１】
0005690589.tif 000103
【０３０６】
実施例。ＥＣ０２４６（ビス−サッカロ−葉酸ビンブラスチン結合体）。ポリプロピレン遠心分離ボトルの中で、葉酸リンカー（ＥＣ０２４４、３０mg、０．０３０mmol）を５mLの水に溶解し、アルゴンで１０分間泡立てた。別のフラスコの中で、０．１N  ＮａＨＣＯ３溶液をアルゴンで１０分間泡立てた。リンカー溶液のｐＨを、０．１N  ＮａＨＣＯ３溶液を使用して６．９に注意深く調整した。５mLのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中のビンブラスチンピリジニルジスルフィド（２７mg、０．０２８mmol）を、上記の溶液にゆっくりと加えた。得られた明澄な溶液を、アルゴン下で１５分から１時間撹拌した。反応の進行を、分析ＨＰＬＣ（１０mM酢酸アンモニウム、ｐＨ＝７．０及びアセトニトリル）によりモニタリングした。ＴＨＦを減圧下で除去し、水溶液を濾過し、分取ＨＰＬＣカラム（X-terra Column C18、１９×３００mM）に注入した。１mMのリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０及びアセトニトリルで溶離することによって、生成物を含有する純粋な画分を得た。４８時間凍結乾燥した後、ビンブラスチン−ビス−サッカロ−葉酸結合体（ＥＣ０２４６）を単離した（３４mg、６６％）。１Ｈ  ＮＭＲデータは、葉酸結合体と一致した。Ｃ８４Ｈ１０９Ｎ１７Ｏ２９Ｓ２；ＭＷ  １８８４．９９；精密質量：１８８３．７０。
【０３０７】
【化８２】
0005690589.tif 000104
【０３０８】
実施例。ＥＣ０２５８（トリス−サッカロ−Ａｓｐ−葉酸ビンブラスチン結合体）。ポリプロピレン遠心分離ボトルの中で、葉酸リンカー（ＥＣ０２５７、３７mg、０．０３１mmol）を５mLの水に溶解し、アルゴンで１０分間泡立てた。別のフラスコの中で、０．１N  ＮａＨＣＯ３溶液をアルゴンで１０分間泡立てた。リンカー溶液のｐＨを、０．１N  ＮａＨＣＯ３溶液を使用して６．９に注意深く調整した。５mLのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中のビンブラスチンピリジニルジスルフィド（２７．５mg、０．０２８mmol）を、上記の溶液にゆっくりと加えた。得られた明澄な溶液を、アルゴン下で１５分から１時間撹拌した。反応の進行を、分析ＨＰＬＣ（１０mM酢酸アンモニウム、ｐＨ＝７．０及びアセトニトリル）によりモニタリングした。ＴＨＦを減圧下で除去し、水溶液を濾過し、分取ＨＰＬＣカラム（X-terra Column C18、１９×３００mM）に注入した。１mMのリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０及びアセトニトリルで溶離することによって、生成物を含有する純粋な画分を得た。４８時間凍結乾燥した後、ビンブラスチン−トリス−サッカロ−Ａｓｐ−葉酸結合体（ＥＣ０２５８）を単離した（３６mg、６２％）。１Ｈ  ＮＭＲデータは、葉酸結合体と一致した。Ｃ９０Ｈ１２０Ｎ１８Ｏ３４Ｓ２；ＭＷ  ２０６２．１５；精密質量：２０６０．７７。
【０３０９】
【化８３】
0005690589.tif 000105
【０３１０】
実施例。ＥＣ０２６３（トリス−サッカロ−ビス−Ａｓｐ−葉酸ビンブラスチン結合体）。ポリプロピレン遠心分離ボトルの中で、葉酸リンカー（ＥＣ０２６１、３７mg、０．０２９mmol）を５mLの水に溶解し、アルゴンで１０分間泡立てた。別のフラスコの中で、０．１N  ＮａＨＣＯ３溶液をアルゴンで１０分間泡立てた。リンカー溶液のｐＨを、０．１N  ＮａＨＣＯ３溶液を使用して６．９に注意深く調整した。５mLのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中のビンブラスチンピリジニルジスルフィド（２５．５mg、０．０２６mmol）を、上記の溶液にゆっくりと加えた。得られた明澄な溶液を、アルゴン下で１５分から１時間撹拌した。反応の進行を、分析ＨＰＬＣ（１０mM酢酸アンモニウム、ｐＨ＝７．０及びアセトニトリル）によりモニタリングした。ＴＨＦを減圧下で除去し、水溶液を濾過し、分取ＨＰＬＣカラム（X-terra Column C18、１９×３００mM）に注入した。１mMのリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０及びアセトニトリルで溶離することによって、生成物を含有する純粋な画分を得た。４８時間凍結乾燥した後、ビンブラスチン−トリス−サッカロ−ビス−Ａｓｐ−葉酸結合体（ＥＣ０２６３）を単離した（３６mg、６４％）。１Ｈ  ＮＭＲデータは、葉酸結合体と一致した。Ｃ９４Ｈ１２５Ｎ１９Ｏ３７Ｓ２；ＭＷ  ２１７７．２４；精密質量：２１７５．７９。
【０３１１】
【化８４】
0005690589.tif 000106
【０３１２】
実施例。ＥＣ０４３４（トリス−サッカロ−トリス−Ａｓｐ−葉酸ビンブラスチン結合体）。ポリプロピレン遠心分離ボトルの中で、葉酸リンカー（ＥＣ０２６８、２０mg、０．０１２mmol）を３mLの水に溶解し、アルゴンで１０分間泡立てた。別のフラスコの中で、０．１N  ＮａＨＣＯ３溶液をアルゴンで１０分間泡立てた。リンカー溶液のｐＨを、０．１N  ＮａＨＣＯ３溶液を使用して６．９に注意深く調整した。３mLのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中のビンブラスチンピリジニルジスルフィド（１２mg、０．０１２mmol）を、上記の溶液にゆっくりと加えた。得られた明澄な溶液を、アルゴン下で１５分から１時間撹拌した。反応の進行を、分析ＨＰＬＣ（１０mM酢酸アンモニウム、ｐＨ＝７．０及びアセトニトリル）によりモニタリングした。ＴＨＦを減圧下で除去し、水溶液を濾過し、分取ＨＰＬＣカラム（X-terra Column C18、１９×３００mM）に注入した。１mMのリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０及びアセトニトリルで溶離することによって、生成物を含有する純粋な画分を得た。４８時間凍結乾燥した後、ビンブラスチン−テトラ−サッカロ−トリス−Ａｓｐ−葉酸結合体（ＥＣ０４３４）を単離した（２６mg、６２％）。１Ｈ  ＮＭＲデータは、葉酸結合体と一致した。Ｃ１０４Ｈ１４１Ｎ２１Ｏ４５Ｓ２；ＭＷ  ２４６９．４８；精密質量：２４６７．８８。
【０３１３】
【化８５】
0005690589.tif 000107
【０３１４】
実施例。ＥＣ０４５４（テトラ−サッカロ−ビス−Ａｓｐ−葉酸ビンブラスチン結合体）。ポリプロピレン遠心分離ボトルの中で、葉酸リンカー（ＥＣ０４５２、３４mg、０．０２mmol）を３mLの水に溶解し、アルゴンで１０分間泡立てた。別のフラスコの中で、０．１N  ＮａＨＣＯ３溶液をアルゴンで１０分間泡立てた。リンカー溶液のｐＨを、０．１N  ＮａＨＣＯ３溶液を使用して６．９に注意深く調整した。３mLのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中のビンブラスチンピリジニルジスルフィド（２０mg、０．０２mmol）を、上記の溶液にゆっくりと加えた。得られた明澄な溶液を、アルゴン下で１５分から１時間撹拌した。反応の進行を、分析ＨＰＬＣ（１０mM酢酸アンモニウム、ｐＨ＝７．０及びアセトニトリル）によりモニタリングした。ＴＨＦを減圧下で除去し、水溶液を濾過し、分取ＨＰＬＣカラム（X-terra Column C18、１９×３００mM）に注入した。１mMのリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０及びアセトニトリルで溶離することによって、生成物を含有する純粋な画分を得た。４８時間凍結乾燥した後、ビンブラスチン−テトラ−サッカロ−ビス−Ａｓｐ−葉酸結合体（ＥＣ０４５４）を単離した（３５mg、７０％）。１Ｈ  ＮＭＲデータは、葉酸結合体と一致した。Ｃ１０８Ｈ１５１Ｎ３３Ｏ４３Ｓ２；ＭＷ  ２５２３．６２；精密質量：２５２１．９８。
【０３１５】
【化８６】
0005690589.tif 000108
【０３１６】
実施例。ＥＣ０４５５（テトラ−サッカロ−ビス−Ａｓｐ−葉酸ビンブラスチン結合体）。ポリプロピレン遠心分離ボトルの中で、葉酸リンカー（ＥＣ０４５７、２０mg、０．０１３mmol）を１．５mLの水に溶解し、アルゴンで１０分間泡立てた。別のフラスコの中で、０．１N  ＮａＨＣＯ３溶液をアルゴンで１０分間泡立てた。リンカー溶液のｐＨを、０．１N  ＮａＨＣＯ３溶液を使用して６．９に注意深く調整した。１．５mLのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中のビンブラスチンピリジニルジスルフィド（１８mg、０．０１８mmol）を、上記の溶液にゆっくりと加えた。得られた明澄な溶液を、アルゴン下で３０分間撹拌した。反応の進行を、分析ＨＰＬＣ（１０mM酢酸アンモニウム、ｐＨ＝７．０及びアセトニトリル）によりモニタリングした。ＴＨＦを減圧下で除去し、水溶液を濾過し、分取ＨＰＬＣカラム（X-terra Column C18、１９×３００mM）に注入した。１mMのリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０及びアセトニトリルで溶離することによって、生成物を含有する純粋な画分を得た。４８時間凍結乾燥した後、ビンブラスチン−テトラ−サッカロ−ビス−Ａｓｐ−葉酸結合体（ＥＣ０４５５）を単離した（１９mg、６２％）。１Ｈ  ＮＭＲデータは、葉酸結合体と一致した。Ｃ１００Ｈ１３６Ｎ２０Ｏ４２Ｓ２；ＭＷ  ２３５４．３９。
【０３１７】
【化８７】
0005690589.tif 000109
【０３１８】
実施例。ＥＣ０４５６。ポリプロピレン遠心分離ボトルの中で、葉酸リンカー（ＥＣ０４５３、４６mg、０．０２９mmol）を３mLの水に溶解し、アルゴンで１０分間泡立てた。別のフラスコの中で、飽和ＮａＨＣＯ３溶液をアルゴンで１０分間泡立てた。リンカー溶液のｐＨを、アルゴンを泡立てながら、ＮａＨＣＯ３溶液を使用して６．９に注意深く調整した。３mLのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中のビンブラスチンピリジニルジスルフィド（３２mg、１．１当量）を、上記の溶液に素早く加えた。得られた明澄な溶液を、アルゴン下で撹拌した。反応の進行を、分析ＨＰＬＣ（２mMリン酸緩衝液、ｐＨ＝７．０及びアセトニトリル）によりモニタリングした。３０分後、反応液に、１２mLの２mMリン酸緩衝液（ｐＨ７）を加え、得られた濁った溶液を濾過し、濾液を分取ＨＰＬＣに注入した：カラム：Waters Xterra Prep MS C18  １０μm  １９×２５０mm、溶媒Ａ：２mMリン酸ナトリウム、ｐＨ７；溶媒Ｂ：ＡＣＮ；方法：２５mL／分により１％Ｂで５分間から８０％Ｂで４０分間。ＥＣ０４５６を含有する画分を収集し、凍結乾燥して、３０mgのＥＣ０４５６（収率４２％）及び１１．６mgのリン酸ナトリウム塩から構成される、４１．６mgの綿毛状の黄色固体を得た。１Ｈ  ＮＭＲ及びＬＣ／ＭＳは、生成物と一致した。Ｃ１０４Ｈ１４１Ｎ２１Ｏ４５Ｓ２；ＭＷ  ２４６９．４８；精密質量：２４６７．８８。Ｃ  ５０．５８；Ｈ  ５．７６；Ｎ  １１．９１；Ｏ  ２９．１５；Ｓ  ２．６０。
【０３１９】
【化８８】
0005690589.tif 000110
【０３２０】
実施例。ＥＣ０４８１。ポリプロピレン遠心分離ボトルの中で、葉酸リンカー（ＥＣ０４７９、１２mg、０．００５８mmol）を２．５mLの水に溶解し、アルゴンで１０分間泡立てた。別のフラスコの中で、飽和ＮａＨＣＯ３溶液をアルゴンで１０分間泡立てた。リンカー溶液のｐＨを、アルゴンを泡立てながら、ＮａＨＣＯ３溶液を使用して６．９に注意深く調整した。２．５mLのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中のビンブラスチンピリジニルジスルフィド（５．７mg、１．０当量）を、上記の溶液に素速く加えた。得られた明澄な溶液を、アルゴン下で撹拌した。反応の進行を、分析ＨＰＬＣ（２mMリン酸緩衝液、ｐＨ＝７．０及びアセトニトリル）によりモニタリングした。２０分後、反応液に、１２mLの２mMリン酸緩衝液（ｐＨ７）を加え、得られた濁った溶液を濾過し、濾液を分取ＨＰＬＣに注入した：カラム：Waters Atlantis Prep T3  １０μm  OBD  １９×２５０mm、溶媒Ａ：２mMリン酸ナトリウム、ｐＨ７；溶媒Ｂ：ＡＣＮ；方法：２６mL／分により１％Ｂで５分間から５０％Ｂで２５分間。ＥＣ０４８１を含有する画分を収集し、凍結乾燥して、１０．５mgのＥＣ０４５６（収率６０％）及び５．０mgのリン酸ナトリウム塩から構成される、１５．５mgの綿毛状の黄色固体を得た。１Ｈ  ＮＭＲ及びＬＣ／ＭＳは、生成物と一致した。ＭＷ  ２９９９．１５；精密質量：２９９７．２４。
【０３２１】
【化８９】
0005690589.tif 000111
【０３２２】
実施例。ＥＣ０４８４（テトラ−サッカロ−ビス−α−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−葉酸ビンブラスチン結合体）。ポリプロピレン遠心分離ボトルの中で、葉酸リンカー（ＥＣ０４８０、１５mg、０．００９mmol）を３mLの水に溶解し、アルゴンで１０分間泡立てた。別のフラスコの中で、０．１N  ＮａＨＣＯ３溶液をアルゴンで１０分間泡立てた。リンカー溶液のｐＨを、０．１N  ＮａＨＣＯ３溶液を使用して６．９に注意深く調整した。３mLのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中のビンブラスチンピリジニルジスルフィド（８．８mg、０．００９mmol）を、上記の溶液にゆっくりと加えた。得られた明澄な溶液を、アルゴン下で１５分から１時間撹拌した。反応の進行を、分析ＨＰＬＣ（１０mM酢酸アンモニウム、ｐＨ＝７．０及びアセトニトリル）によりモニタリングした。ＴＨＦを減圧下で除去し、水溶液を濾過し、分取ＨＰＬＣカラム（X-terra Column C18、１９×３００mM）に注入した。１mMのリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０及びアセトニトリルで溶離することによって、生成物を含有する純粋な画分を得た。４８時間凍結乾燥した後、ビンブラスチン−テトラ−サッカロ−ビス−α−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−葉酸結合体（ＥＣ０４８４）を単離した（１６mg、７０％）。１Ｈ  ＮＭＲデータは、葉酸結合体と一致した。Ｃ１０８Ｈ１５２Ｎ２４Ｏ４３Ｓ２；ＭＷ  ２５３８．６３；精密質量：２５３６．９９。
【０３２３】
【化９０】
0005690589.tif 000112
【０３２４】
実施例。ＥＣ０４８７（テトラ−サッカロ−Ａｓｐ−葉酸ビンブラスチン結合体）。ポリプロピレン遠心分離ボトルの中で、葉酸リンカー（ＥＣ０４６３、２１mg、０．０１５mmol）を３mLの水に溶解し、アルゴンで１０分間泡立てた。別のフラスコの中で、０．１N  ＮａＨＣＯ３溶液をアルゴンで１０分間泡立てた。リンカー溶液のｐＨを、０．１N  ＮａＨＣＯ３溶液を使用して６．９に注意深く調整した。３mLのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中のビンブラスチンピリジニルジスルフィド（１５mg、０．０１５mmol）を、上記の溶液にゆっくりと加えた。得られた明澄な溶液を、アルゴン下で１５分から１時間撹拌した。反応の進行を、分析ＨＰＬＣ（１０mM酢酸アンモニウム、ｐＨ＝７．０及びアセトニトリル）によりモニタリングした。ＴＨＦを減圧下で除去し、水溶液を濾過し、分取ＨＰＬＣカラム（Atlantis Column C18、１９×３００mM）に注入した。１mMのリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０及びアセトニトリルで溶離することによって、生成物を含有する純粋な画分を得た。４８時間凍結乾燥した後、ビンブラスチン−テトラ−サッカロ−Ａｓｐ−葉酸結合体（ＥＣ０４８７）を単離した（２８mg、８４％）。１Ｈ  ＮＭＲデータは、葉酸結合体と一致した。Ｃ９６Ｈ１３１Ｎ１９Ｏ３９Ｓ２；ＭＷ  ２２３９．３０；精密質量：２２３７．８３。
【０３２５】
【化９１】
0005690589.tif 000113
【０３２６】
実施例。ＥＣ０４８９。ポリプロピレン遠心分離ボトルの中で、葉酸リンカー（ＥＣ０４８８、２６mg、０．０１５mmol）を２．５mLの水に溶解し、アルゴンで１０分間泡立てた。別のフラスコの中で、飽和ＮａＨＣＯ３溶液をアルゴンで１０分間泡立てた。リンカー溶液のｐＨを、アルゴンを泡立てながら、ＮａＨＣＯ３溶液を使用して６．９に注意深く調整した。２．５mLのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中のビンブラスチンピリジニルジスルフィド（１５mg、１．０当量）を、上記の溶液に素速く加えた。得られた明澄な溶液を、アルゴン下で撹拌した。反応の進行を、分析ＨＰＬＣ（２mMリン酸緩衝液、ｐＨ＝７．０及びアセトニトリル）によりモニタリングした。２０分後、反応液に、１２mLの２mMリン酸緩衝液（ｐＨ７）を加え、得られた濁った溶液を濾過し、濾液を分取ＨＰＬＣに注入した：カラム：Waters Xterra Prep MS C18  １０μm  １９×２５０mm、溶媒Ａ：２mMリン酸ナトリウム、ｐＨ７；溶媒Ｂ：ＡＣＮ；方法：２６mL/分により１％Ｂで５分間から５０％Ｂで２５分間）。ＥＣ０４８９を含有する画分を収集し、凍結乾燥して、２７．５mgのＥＣ０４８９（収率７１％）及び７．５mgのリン酸ナトリウム塩から構成される、３５mgの綿毛状の黄色固体を得た。１Ｈ  ＮＭＲ及びＬＣ／ＭＳは、生成物と一致した。ＭＷ  ２５５０．６８；精密質量：２５４９．０１。
【０３２７】
【化９２】
0005690589.tif 000114
【０３２８】
実施例。ＥＣ０４９０（テトラ−ホモサッカロ−トリス−αＧｌｕ−葉酸ビンブラスチン結合体）。ポリプロピレン遠心分離ボトルの中で、葉酸リンカー（ＥＣ０４７８、２２mg、０．０１３mmol）を３mLの水に溶解し、アルゴンで１０分間泡立てた。別のフラスコの中で、０．１N  ＮａＨＣＯ３溶液をアルゴンで１０分間泡立てた。リンカー溶液のｐＨを、０．１N  ＮａＨＣＯ３溶液を使用して６．９に注意深く調整した。３mLのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中のビンブラスチンピリジニルジスルフィド（  mg、  mmol）を、上記の溶液にゆっくりと加えた。得られた明澄な溶液を、アルゴン下で１５分から１時間撹拌した。反応の進行を、分析ＨＰＬＣ（１０mM酢酸アンモニウム、ｐＨ＝７．０及びアセトニトリル）によりモニタリングした。ＴＨＦを減圧下で除去し、水溶液を濾過し、分取ＨＰＬＣカラム（X-terra Column C18、１９×３００mM）に注入した。１mMのリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０及びアセトニトリルで溶離することによって、生成物を含有する純粋な画分を得た。４８時間凍結乾燥した後、ビンブラスチン−テトラ−ホモサッカロ−トリス−Ｇｌｕ−葉酸結合体（ＥＣ０４９０）を、で単離した（１５mg、４５％）。１Ｈ  ＮＭＲデータは、葉酸結合体と一致した。Ｃ１１１Ｈ１５５Ｎ２１Ｏ４５Ｓ２；ＭＷ  ２５６７．６６；精密質量：２５６５．９９。
【０３２９】
【化９３】
0005690589.tif 000115
【０３３０】
実施例。ＥＣ０４９２（テトラ−ホモサッカロ−トリス−αＧｌｕ−葉酸ビンブラスチン結合体）。ポリプロピレン遠心分離ボトルの中で、葉酸リンカー（ＥＣ０４９１、２６mg、０．０１３mmol）を３mLの水に溶解し、アルゴンで１０分間泡立てた。別のフラスコの中で、０．１N  ＮａＨＣＯ３溶液をアルゴンで１０分間泡立てた。リンカー溶液のｐＨを、０．１N  ＮａＨＣＯ３溶液を使用して６．９に注意深く調整した。３mLのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中のビンブラスチンピリジニルジスルフィド（１３mg、０．０１３mmol）を、上記の溶液に加えた。得られた明澄な溶液を、アルゴン下で１５分から１時間撹拌した。反応の進行を、分析ＨＰＬＣ（１０mM酢酸アンモニウム、ｐＨ＝７．０及びアセトニトリル）によりモニタリングした。ＴＨＦを減圧下で除去し、水溶液を濾過し、分取ＨＰＬＣカラム（X-terra Column C18、１９×３００mM）に注入した。１mMのリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０及びアセトニトリルで溶離することによって、生成物を含有する純粋な画分を得た。４８時間凍結乾燥した後、ビンブラスチン−テトラ−ホモサッカロ−トリス−Ｇｌｕ−葉酸結合体（ＥＣ０４９２）を、で単離した（２２mg、６０％）。１Ｈ  ＮＭＲデータは、葉酸結合体と一致した。Ｃ１２２Ｈ１７６Ｎ２４Ｏ５０Ｓ２；ＭＷ  ２８４２．９７；精密質量：２８４１．１４。
【０３３１】
【化９４】
0005690589.tif 000116
【０３３２】
実施例。ＥＣ０４９３（テトラ−サッカロ−トリス−Ｇｌｕ−葉酸ビンブラスチン結合体）。ポリプロピレン遠心分離ボトルの中で、葉酸リンカー（ＥＣ０４７７、２５mg、０．０１５mmol）を１．５mLの水に溶解し、アルゴンで１０分間泡立てた。別のフラスコの中で、０．１N  ＮａＨＣＯ３溶液をアルゴンで１０分間泡立てた。リンカー溶液のｐＨを、０．１N  ＮａＨＣＯ３溶液を使用して６．９に注意深く調整した。１．５mLのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中のビンブラスチンピリジニルジスルフィド（２０mg、０．０２０mmol）を、上記の溶液にゆっくりと加えた。得られた明澄な溶液を、アルゴン下で３０分間撹拌した。反応の進行を、分析ＨＰＬＣ（１０mM酢酸アンモニウム、ｐＨ＝７．０及びアセトニトリル）によりモニタリングした。ＴＨＦを減圧下で除去し、水溶液を濾過し、分取ＨＰＬＣカラム（X-terra Column C18、１９×３００mM）に注入した。１mMのリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０及びアセトニトリルで溶離することによって、生成物を含有する純粋な画分を得た。４８時間凍結乾燥した後、ビンブラスチン−テトラ−サッカロ−トリス−Ｇｌｕ−葉酸結合体（ＥＣ０４９３）を単離した（２３mg、６１％）。１Ｈ  ＮＭＲデータは、葉酸結合体と一致した。Ｃ１０７Ｈ１４７Ｎ２１Ｏ４５Ｓ２；ＭＷ  ２５１１．５６；精密質量：２５０９．９３。
【０３３３】
【化９５】
0005690589.tif 000117
【０３３４】
実施例。ＥＣ０４２９。ＡＳｐ−Ａｓｐ−Ｃｙｓのアミノエチルピペラジニルアセトアミドにより表されるオリゴアミド親水性スペーサーを含むこの実施例は、本明細書に記載されている方法を使用して調製した。 
【０３３５】
糖類に基づいた基がクリック化学により例示的に導入されるグルクロニド化合物の例示的な実施例である以下のＥＣ０４００及びＥＣ０４２３も、本明細書に記載されているとおりに調製した。
【化９６】
0005690589.tif 000118
ＥＣ０４００
【化９７】
0005690589.tif 000119
ＥＣ０４２３
【０３３６】
ＰＥＧスペーサー化合物の例示的な実施例である以下のＥＣ０３６７及びＥＣ０４０９も、本明細書に記載されているとおりに調製した。
【化９８】
0005690589.tif 000120
ＥＣ０３６７
【化９９】
0005690589.tif 000121
ＥＣ０４０９
【０３３７】
硫酸フラグメントがクリック化学を介して例示的に導入される硫酸アルキルエステル化合物の例示的な実施例であるＥＣ０４１８及びＥＣ０４２８は、本明細書に記載されているとおりに調製した。
【化１００】
0005690589.tif 000122
ＥＣ０４１８  ＤＡＶＬＢＨの結合体
【化１０１】
0005690589.tif 000123
ＥＣ０４２８  ＤＡＶＬＢＨの結合体
【０３３８】
オリゴアミドがＥＤＴＥ誘導体を含む追加のオリゴアミドスペーサー化合物の以下の例示的な実施例は、本明細書に記載されているとおりに調製した。
【化１０２】
0005690589.tif 000124
ＥＣ０３９６  ＤＡＶＬＢＨの結合体
【０３３９】
２−デオキシヘキサピラノース化合物のβ−アルキルグルコシド及びＰＥＧ結合化合物の以下の例示的な実施例は、親水性基をスペーサーリンカーに結合するクリック化学を使用して、本明細書に記載されているとおりに調製することができる。
【化１０３】
0005690589.tif 000125
ＤＡＶＬＢＨ  β−アルキル２−デオキシグルコースを含む結合体
【化１０４】
0005690589.tif 000126
β−アルキル２−デオキシグルクロニドを含むＤＡＶＬＢＨの結合体
【化１０５】
0005690589.tif 000127
ＰＥＧを含むＤＡＶＬＢＨの結合体
【化１０６】
0005690589.tif 000128
β−アルキルマンノピラノシドを含むＤＡＶＬＢＨの結合体
【０３４０】
【化１０７】
0005690589.tif 000129
【０３４１】
チューブリシン比較例。親水性スペーサーリンカーを欠いているＥＣ０３０５。ＥＣ８９（８６mg）を、脱イオン水（約４．０mg/mL、使用前にアルゴンで１０分間泡立てた）に取り、懸濁液のｐＨを飽和ＮａＨＣＯ３（使用前にアルゴンで１０分間泡立てた）により約６．９に調整した（懸濁液は、ｐＨが増加すると溶液になった）。追加の脱イオン水を水溶液に加えて総容量を５．０mLにし、その直後、水溶液に、ＴＨＦ（５．０mL）中のＥＣ０３１２（９７mg）の溶液を加えた。反応混合物は急速に均質になった。アルゴン下で４５分間撹拌した後、反応混合物を２．０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０、１５mL）で希釈し、ＴＨＦをRotavaporで除去した得られた懸濁液を濾過し、濾液を精製のために分取ＨＰＬＣ（カラム： Waters XTerra Prep MS C18 １０μm、１９×２５０mm；移動相Ａ：２．０mMリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０；移動相Ｂ：アセトニトリル；方法：２５分間かけて５％Ｂから８０％Ｂ、流速＝２５mL/分）に注入した。１０．０４〜１１．９０分の画分を収集し、凍結乾燥して、ＥＣ０３０５を淡黄色の綿毛状固体（１１７mg）として得た。
【０３４２】
【化１０８】
0005690589.tif 000130
【０３４３】
実施例。親水性スペーサーリンカーを有する結合体を調製する一般的方法２（１ポット）。ＥＣ０５４３の調製により説明する。ＤＩＰＥＡ（７．８μL）及びクロロギ酸イソブチル（３．１μL）を、シリンジの助けを借りて、同時に、無水ＥｔＯＡｃ（０．５０mL）中のチューブリシンＡ（１８mg）の溶液に−１５℃で加えた。アルゴン下、−１５℃で３５分間撹拌した後、反応混合物に、無水ＥｔＯＡｃ（０．５０mL）中のＥＣ０３１１（５．８mg）の溶液を加えた。冷却器を取り外し、反応混合物をアルゴン下で更に４５分間撹拌し、濃縮し、真空に付し、残渣をＴＨＦ（２．０mL）に溶解した。一方、ＥＣ０４８８（４０mg）を脱イオン水（使用前にアルゴンで１０分間泡立てた）に溶解し、水溶液のｐＨを飽和ＮａＨＣＯ３で６．９に調整した。追加の脱イオン水をＥＣ０４８８溶液に加えて、総容量を２．０mLにし、その直後、それに、活性化チューブリシンを含有するＴＨＦ溶液を加えた。急速に均質になった反応混合物を、アルゴン下で５０分間撹拌し、２．０mMのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０、１５mL）で停止させた。得られた濁った溶液を濾過し、濾液を精製のために分取ＨＰＬＣに注入した。カラム： Waters XTerra Prep MS C18 １０μm、１９×２５０mm；移動相Ａ：２．０mMリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０；移動相Ｂ：アセトニトリル；方法：１％Ｂを５分間、次に１％Ｂから６０％Ｂを次の３０分間、流速＝２６mL/分。２０．７５〜２４．５０分の画分を収集し、凍結乾燥して、ＥＣ０５４３を淡黄色の綿毛状固体（２６mg）として得た。以上の方法は、チューブリシン出発化合物の適切な選択によって、他のチューブリシン結合体を調製するためにも同様に適用可能である。
【０３４４】
親水性スペーサーリンカーを含むチューブリシン結合体の以下の追加の例示的な例は、チューブリシンについて本明細書に記載された方法及び合成を使用して調製した。
【化１０９】
0005690589.tif 000131
ＥＣ０４３６  チューブリシンの結合体。
【化１１０】
0005690589.tif 000132
ＥＣ０４４４  チューブリシンの結合体。
【化１１１】
0005690589.tif 000133
ＥＣ０５３０  チューブリシンの結合体。
【化１１２】
0005690589.tif 000134
ＥＣ０５３１  チューブリシンの結合体。
【化１１３】
0005690589.tif 000135
ＥＣ０５３３  チューブリシンの結合体。
【０３４５】
以下の例も本明細書に記載されているとおりに調製した。
【化１１４】
0005690589.tif 000136
ＥＣ０２６２クリプトフィシン−カーボネート−ＣＨ２ＣＨ２−ＳＳ−Ｃｙｓ−サッカロ−Ａｓｐ−サッカロ−Ａｓｐ−サッカロ−葉酸結合体。Ｃ８７Ｈ１１５Ｃｌ２Ｎ１５Ｏ３８Ｓ２；ＭＷ  ２１１３．９６；精密質量：２１１１．６３。
【０３４６】
【化１１５】
0005690589.tif 000137
ＥＣ０２７８
【０３４７】
ボルテゾミブ比較例。親水性スペーサーリンカーを欠いているボルテゾミブ（ベルケイド）結合体（ＥＣ０５２２及びＥＣ０５８７）の以下の比較例も、本明細書及び米国特許出願公開第２００５／０００２９４２号に記載されているとおりに調製した。
【化１１６】
0005690589.tif 000138
ＥＣ０５２２  Ｃ５６Ｈ６９ＢＮ１８Ｏ１７Ｓ２、Ｃ  ５０．１５；Ｈ  ５．１９；Ｂ  ０．８１；Ｎ  １８．８０；Ｏ  ２０．２８；Ｓ  ４．７８、ＭＷ  １３４１．２０、精密質量：１３４０．４６。
【化１１７】
0005690589.tif 000139
ＥＣ０５８７  Ｃ７７Ｈ９０Ｂ２Ｎ２０Ｏ２３Ｓ４、ＭＷ  １８１３．５５、精密質量：１８１２．５６。
【０３４８】
親水性スペーサーリンカーを含むボルテゾミブ結合体の以下の実施例も、本明細書に記載されているとおりに調製した。
【化１１８】
0005690589.tif 000140
ＥＣ０５２５  ボルテゾミブ（ベルケイド）の結合体。Ｃ８５Ｈ１１９ＢＮ２０Ｏ３６Ｓ２、ＭＷ  ２０７１．９１、精密質量：２０７０．７６。理論に束縛されることなく、ベルケイド結合体において、ボロン酸及びリンカーは炭水化物側鎖と分子間相互作用を形成してもよいことが理解される。例示的には、ボロン酸は１又は２つのヒドロキシル基とボロン酸エステル錯体を形成する。そのようなエステル錯体は、近接のヒドロキシルと、また１，３−ヒドロキシルと形成してもよい。ボロン酸エステル錯体を、炭水化物フラグメントの末端又は炭水化物フラグメントの内部に形成してもよいことが理解される。水溶液中では、ボロン酸エステル錯体はボロン酸と平衡であってもよいことが、更に理解される。
【０３４９】
【化１１９】
0005690589.tif 000141
ＥＣ０５２５（水和）。Ｃ８５Ｈ１１９ＢＮ２０Ｏ３６Ｓ２、ＭＷ  ２０７１．９１、精密質量：２０７０．７６；ＥＣ０５２５（配位）。Ｃ８５Ｈ１２３ＢＮ２０Ｏ３８Ｓ２、ＭＷ  ２１０７．９４、精密質量：２１０６．７８。
【０３５０】
【化１２０】
0005690589.tif 000142
ＥＣ０５９５  ビス−ボルテゾミブ結合体。Ｃ１０８Ｈ１４５Ｂ２Ｎ２５Ｏ３９Ｓ４、ＭＷ  ２５６７．３４、精密質量：２５６５．９２。
【０３５１】
αアマニチン比較例。親水性スペーサーリンカーを欠いているαアマニチン結合体の以下の比較例も、本明細書及び米国特許出願公開第２００５／０００２９４２号に記載されているとおりに調製した。
【化１２１】
0005690589.tif 000143
ＥＣ０３２３は、葉酸と競合せず、過剰葉酸の存在あり及びなしでも同じＩＣ５０を示した。
【０３５２】
親水性スペーサーリンカーを含むαアマニチン結合体の以下の実施例も、本明細書に記載されているとおりに調製した。
【化１２２】
0005690589.tif 000144
ＥＣ０５９２  αアマニチンの結合体。Ｃ１０７Ｈ１５４Ｎ２６Ｏ５０Ｓ３、ＭＷ  ２７００．７１、精密質量：２６９８．９５。ＥＣ０５９２は、約３nMのＩＣ５０を示し、これは３Ｈ−チミジン組み込みアッセイにおいてＫＢ細胞に対して過剰葉酸と競合しうる。
【０３５３】
以下の例示的な結合体の実施例を、本明細書に記載されたとおりに調製した。
【化１２３】
0005690589.tif 000145
ＥＣ０５３５  ゲルダナマイシンの結合体。Ｃ９５Ｈ１３９Ｎ１９Ｏ４２Ｓ２、ＭＷ  ２２８３．３５、精密質量：２２８１．８８。
【化１２４】
0005690589.tif 000146
ＥＣ０５６８  ゲルダナマイシンの結合体。Ｃ９９Ｈ１４６Ｎ２０Ｏ４４Ｓ２、ＭＷ  ２３８４．４６、精密質量：２３８２．９２。
【化１２５】
0005690589.tif 000147
ＥＣ０５３９  アミノプテリンのリシン類似体の結合体。
【化１２６】
0005690589.tif 000148
ＥＣ０５４４  アミノプテリンのシステイン類似体の結合体。Ｃ８３Ｈ１１６Ｎ２４Ｏ３７Ｓ２、Ｃ  ４７．３３；Ｈ  ５．５５；Ｎ  １５．９６；Ｏ  ２８．１１；Ｓ  ３．０５、ＭＷ  ２１０６．０８、精密質量：２１０４．７４。
【化１２７】
0005690589.tif 000149
ＥＣ０５５１  アミノプテリンの結合体。Ｃ８６Ｈ１２０Ｎ２４Ｏ３９Ｓ２、Ｃ  ４７．４２；Ｈ  ５．５５；Ｎ  １５．４３；Ｏ  ２８．６５；Ｓ  ２．９４、ＭＷ  ２１７８．１４、精密質量：２１７６．７６。
【０３５４】
【化１２８】
0005690589.tif 000150
ＥＣ０５４３  チューブリシンＡの結合体。Ｃ１１１Ｈ１６７Ｎ２３Ｏ４５Ｓ３、Ｃ  ５０．５０；Ｈ  ６．３８；Ｎ  １２．２０；Ｏ  ２７．２７；Ｓ  ３．６４、ＭＷ  ２６３９．８４、ｍ／ｚ：２６３９．０７（１００．０％）、２６３８．０６（８０．８％）、２６４０．０７（７９．６％）。
【化１２９】
0005690589.tif 000151
ＥＣ０５４５  プルバラノールＡの結合体。Ｃ８７Ｈ１２５ＣｌＮ２２Ｏ３７Ｓ２、ＭＷ  ２１７０．６３６、精密質量：２１６８．７７。
【化１３０】
0005690589.tif 000152
ＥＣ０５６５  エベロリムスの結合体。Ｃ１２１Ｈ１８３Ｎ１７Ｏ５０Ｓ２、ＭＷ  ２７３９．９６；精密質量：２７３８．１７。
【化１３１】
0005690589.tif 000153
ＤＡＶＬＢＨの結合体。
【化１３２】
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ＥＣ０４００  ＤＡＶＬＢＨの結合体。対応するアルキン及びアジドエチル炭水化物；２当量のアスコルビン酸ナトリウム、１当量のＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ、ＴＨＦ／水（１：１）；５当量のアスコルビン酸ナトリウム、２．５当量のＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ、ＴＨＦ／水（９：１）；（１０mg）のHuisgen環化により調製。Ｃ８１Ｈ１００Ｎ１８Ｏ２４Ｓ２、Ｃ  ５４．８４；Ｈ  ５．６８；Ｎ  １４．２１；Ｏ  ２１．６５；Ｓ  ３．６２、ＭＷ  １７７３．９０、精密質量：１７７２．６６。
【０３５５】
【化１３３】
0005690589.tif 000155
ＤＡＶＬＢＨの結合体。ＥＣ０４１９から調製。Ｃ８２Ｈ９７Ｎ１７Ｏ２１Ｓ２、ＭＷ  １７２０．８８、精密質量：１７１９．６５．（９０mg）。
【化１３４】
0005690589.tif 000156
ＥＣ０４２３  ＤＡＶＬＢＨの結合体。Huisgen環化により調製； Ｃ９８Ｈ１２３Ｎ２３Ｏ３５Ｓ２、Ｃ  ５２．３８；Ｈ  ５．５２；Ｎ  １４．３４；Ｏ  ２４．９２；Ｓ  ２．８５、ＭＷ  ２２４７．２９、精密質量：２２４５．８０。
【化１３５】
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ＥＣ０６３７  ＤＡＶＬＢＨの結合体。Ｃ９８Ｈ１３０Ｎ２０Ｏ３７Ｓ２、ＭＷ  ２２４４．３２、精密質量：２２４２．８３。
【化１３６】
0005690589.tif 000158
ＤＡＶＬＢＨの結合体。
【化１３７】
0005690589.tif 000159
ＤＡＶＬＢＨの結合体。
【化１３８】
0005690589.tif 000160
ＤＡＶＬＢＨの結合体。
【０３５６】
【化１３９】
0005690589.tif 000161
ＥＣ０５８１  イスピネシブの結合体。Ｃ９８Ｈ１３３ＣｌＮ２０Ｏ３８Ｓ２、ＭＷ  ２２９８．８０、精密質量：２２９６．８２。
【化１４０】
0005690589.tif 000162
ＥＣ０５６１  パクリタセキルの結合体。Ｃ１２４Ｈ１５９Ｎ１９Ｏ５３Ｓ２、ＭＷ  ２８２７．８２；精密質量：２８２５．９８。
【化１４１】
0005690589.tif 000163
ＥＣ０５９４  ドセタキセルンの結合体。Ｃ１２０Ｈ１６１Ｎ１９Ｏ５３Ｓ２、ＭＷ  ２７８１．７９；精密質量：２７７９．９９。
【化１４２】
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ＥＣ０５９８  ベルカリンの結合体。Ｃ９５Ｈ１３４Ｎ１６Ｏ４５Ｓ２、ＭＷ  ２２８４．２９、精密質量：２２８２．８１。
【化１４３】
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ＥＣ０６００  ブデソニドの結合体。Ｃ９３Ｈ１３４Ｎ１６Ｏ４２Ｓ２、Ｃ  ５０．４９；Ｈ  ６．１１；Ｎ  １０．１３；Ｏ  ３０．３７；Ｓ  ２．９０、ＭＷ  ２２１２．２７、精密質量：２２１０．８３。
【化１４４】
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ＥＣ０６１０  ジデムニンＢの結合体。Ｃ１２５Ｈ１８９Ｎ２３Ｏ５１Ｓ２、ＭＷ  ２８９４．０９；精密質量：２８９２．２３。
【化１４５】
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ＥＣ０６３１  チロシンキナーゼインヒビターである４−〔（３−ブロモフェニル）アミノ〕−６−〔（２−ヒドロキシエチル）−アミノ〕−ピリド〔３，４−ｄ〕ピリミジンの結合体、Ｃ８３Ｈ１１４ＢｒＮ２１Ｏ３７Ｓ２、ＭＷ  ２１４１．９５、精密質量：２１３９．６３。
【化１４６】
0005690589.tif 000168
ＥＣ０６４０：４−〔（３−ブロモフェニル）アミノ〕−６−ヒドラジノ−ピリド〔３，４−ｄ〕ピリミジンの結合体。
【化１４７】
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ＥＣ０６６３  ダサチニブの結合体。Ｃ９０Ｈ１２６ＣｌＮ２３Ｏ３８Ｓ３、ＭＷ  ２２６９．７４、精密質量：２２６７．７５。
【０３５７】
【化１４８】
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ＥＣ０５９３  ２つの薬剤のための多剤中間体。Ｃ６８Ｈ１０３Ｎ１７Ｏ３５Ｓ２、ＭＷ  １７８２．７７、精密質量：１７８１．６２。
【化１４９】
0005690589.tif 000171
ＥＣ０６１３  ３つの薬剤のための多剤中間体。Ｃ９０Ｈ１４０Ｎ２２Ｏ４７Ｓ２、ＭＷ  ２４１０．４５、精密質量：２４０８．８１。
【化１５０】
0005690589.tif 000172
ＥＣ０５４２  ２つの薬剤のために任意に選択した多剤中間体。Ｃ８５Ｈ１１８Ｎ１８Ｏ３６Ｓ２、Ｃ  ５０．２４；Ｈ  ５．８５；Ｎ  １２．４１；Ｏ  ２８．３４；Ｓ  ３．１６、ＭＷ  ２０３２．０８、精密質量：２０３０．７４。
【化１５１】
0005690589.tif 000173
ＥＣ０５５９  ２つの薬剤のために任意に選択した多剤中間体。Ｃ９０Ｈ１２１Ｎ１９Ｏ３６Ｓ３、ＭＷ  ２１４１．２２、精密質量：２１３９．７４。
【化１５２】
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ＥＣ０６８２  ２つの薬剤のために任意に選択した多剤中間体。Ｃ９５Ｈ１３２Ｎ２０Ｏ４２Ｓ２、ＭＷ  ２２９０．３０、精密質量：２２８８．８２。
【化１５３】
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ＥＣ０６４６  アミノプテリンと多剤結合体用の中間体との結合体。Ｃ１０６Ｈ１４０Ｎ２６Ｏ４１Ｓ３、ＭＷ  ２５３０．５９、精密質量：２５２８．８８。
【０３５８】
【化１５４】
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ＥＣ０５５５  ボルテゾミブ（ベルケイド）と多剤結合体用の中間体との結合体。Ｃ１０５Ｈ１３９ＢＮ２２Ｏ３８Ｓ３、Ｃ  ５２．０２；Ｈ  ５．７８；Ｂ  ０．４５；Ｎ  １２．７１；Ｏ  ２５．０８；Ｓ  ３．９７、ＭＷ  ２４２４．３６、精密質量：２４２２．８９。
【化１５５】
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ＥＣ０６０６  エベロリムスと多剤結合体用の中間体との結合体。Ｃ１４１Ｈ２０３Ｎ１９Ｏ５２Ｓ３、Ｃ  ５４．７６；Ｈ  ６．６２；Ｎ  ８．６１；Ｏ  ２６．９０；Ｓ  ３．１１、ＭＷ  ３０９２．４２、精密質量：３０９０．３０。
【化１５６】
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ＥＣ０６３３  ＤＡＶＬＢＨと多剤結合体用の中間体との結合体。Ｃ１３１Ｈ１７６Ｎ２４Ｏ４５Ｓ３、ＭＷ  ２９０３．１３、精密質量：２９０１．１４。
【化１５７】
0005690589.tif 000179
ＥＣ０６６１  ４−〔（３−ブロモフェニル）アミノ〕−６−アミノ−ピリド〔３，４−ｄ〕ピリミジンと多剤結合体用の中間体との結合体。Ｃ１４５Ｈ２０９ＢｒＮ２４Ｏ５５Ｓ４、ＭＷ  ３３７６．５１、精密質量：３３７３．２４。
【化１５８】
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ＥＣ０６７９  ４−〔（３−ブロモフェニル）アミノ〕−６−ヒドラジノ−ピリド〔３，４−ｄ〕ピリミジンと多剤結合体用の中間体との結合体。Ｃ１０１Ｈ１３１ＢｒＮ２４Ｏ３８Ｓ３、ＭＷ  ２４６５．３６、精密質量：２４６２．７４。
【化１５９】
0005690589.tif 000181
ＥＣ０６９３  ドキソルビシンと多剤結合体用の中間体との結合体。Ｃ１１５Ｈ１４９Ｎ１９Ｏ４９Ｓ３、ＭＷ  ２６７７．７１；精密質量：２６７５．８９。
【０３５９】
【化１６０】
0005690589.tif 000182
ＥＣ０６４７  ビスアミノプテリン結合体。Ｃ１１０Ｈ１４７Ｎ３３Ｏ４５Ｓ４、ＭＷ  ２７７９．８０、精密質量：２７７７．９１１２、ｍ／ｚ：２７７８．９１（１００．０％）、２７７７．９１（７４．４％）、２７７９．９２（６２．２％）。
【化１６１】
0005690589.tif 000183
ＥＣ０６０５  ビス−ベルカリン結合体。
【化１６２】
0005690589.tif 000184
ＥＣ０５６３  ボルテゾミブ及びラパマイシンの結合体。
【化１６３】
0005690589.tif 000185
ＥＣ０５８２  ボルテゾミブ及びエベロリムスの結合体。Ｃ１４７Ｈ２１４ＢＮ２３Ｏ５４Ｓ４、Ｃ  ５３．４０；Ｈ  ６．５２；Ｂ  ０．３３；Ｎ  ９．７４；Ｏ  ２６．１３；Ｓ  ３．８８、ＭＷ  ３３０６．４７、精密質量：３３０４．３７。
【化１６４】
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ＥＣ０６３６  ＤＡＶＬＢＨ及びエベロリムスの結合体。Ｃ１７３Ｈ２５１Ｎ２５Ｏ６１Ｓ４、ＭＷ  ３７８５．２３、精密質量：３７８２．６２。
【化１６５】
0005690589.tif 000187
ＥＣ０６６４  エベロリムス及び４−〔（３−ブロモフェニル）アミノ〕−６−アミノ−ピリド〔３，４−ｄ〕ピリミジンの結合体。Ｃ１４５Ｈ２０９ＢｒＮ２４Ｏ５５Ｓ４、ＭＷ  ３３７６．５１、精密質量：３３７３．２４。
【化１６６】
0005690589.tif 000188
ＥＣ０６８０  エベロリムス及び４−〔（３−ブロモフェニル）アミノ〕−６−ヒドラジノ−ピリド〔３，４−ｄ〕ピリミジンの結合体。Ｃ１４３Ｈ２０６ＢｒＮ２５Ｏ５４Ｓ４、ＭＷ  ３３４７．４７、精密質量：３３４４．２２。
【０３６０】
【化１６７】
0005690589.tif 000189
ＥＣ０５８４  任意の非標的送達用の中間体。Ｃ６１Ｈ９１Ｎ９Ｏ３１Ｓ、ＭＷ  １４７８．４８、精密質量：１４７７．５５。
【化１６８】
0005690589.tif 000190
ＥＣ０６３４  任意の非標的送達用の中間体。Ｃ６３Ｈ９５Ｎ９Ｏ３０Ｓ２、ＭＷ  １５２２．６０、精密質量：１５２１．５６。
【化１６９】
0005690589.tif 000191
ＥＣ０５８６  任意の非標的送達用の中間体。Ｃ４８Ｈ８３Ｎ９Ｏ３０Ｓ、ＭＷ  １２９８．２８、精密質量：１２９７．５０。
【化１７０】
0005690589.tif 000192
ＥＣ０５８８  任意の非標的送達用のアミノプテリン結合体の中間体。Ｃ６９Ｈ１０５Ｎ１７Ｏ３５Ｓ２、ＭＷ  １７９６．７９、精密質量：１７９５．６４。
【化１７１】
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ＥＣ０５９１  任意の非標的送達用のラパマイシ結合体の中間体。Ｃ１０２Ｈ１６４Ｎ１０Ｏ４５Ｓ２、Ｃ  ５２．９３；Ｈ  ７．１４；Ｎ  ６．０５；Ｏ  ３１．１１；Ｓ  ２．７７、ＭＷ  ２３１４．５７、精密質量：２３１３．０３。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
0005690589.tif 000213
【図６Ａ】
0005690589.tif 000214
【図６Ｂ】
0005690589.tif 000215
【図７Ａ】
0005690589.tif 000216
【図７Ｂ】
0005690589.tif 000217
【図８Ａ】
0005690589.tif 000218
【図８Ｂ】
0005690589.tif 000219
【図９】
0005690589.tif 000220
【図１０Ａ】
0005690589.tif 000221
【図１０Ｂ】
0005690589.tif 000222
【図１４】
0005690589.tif 000223
【図１５】
0005690589.tif 000224
【図１６】
0005690589.tif 000225
【図１７】
0005690589.tif 000226
【図１８】
0005690589.tif 000227
【図１９】
0005690589.tif 000228
【図４Ａ】
0005690589.tif 000229
【図４Ｂ】
0005690589.tif 000230
【図５Ａ】
0005690589.tif 000231
【図５Ｂ】
0005690589.tif 000232
【図１１】
0005690589.tif 000233
【図１２】
0005690589.tif 000234
【図１３】
0005690589.tif 000235
【配列表】
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