(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
突然変異タンパク質であって、該アミノ酸配列が、
・置換：
○PIV-5 Ｆタンパク質の配列中の22位のアミノ酸のアミノ酸Ｐによる置換；及び
○PIV-5 Ｆタンパク質の配列中の132位のアミノ酸のアミノ酸Ｅによる置換；及び
○PIV-5 Ｆタンパク質の配列中の290位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；及び
○PIV-5 Ｆタンパク質の配列中の449位のアミノ酸のアミノ酸Ｐによる置換；
又は、
置換：
○PIV-5 Ｆタンパク質の配列中の22位のアミノ酸のアミノ酸Ｐによる置換；及び
○PIV-5 Ｆタンパク質の配列中の132位のアミノ酸のアミノ酸Ｅによる置換；及び
○PIV-5 Ｆタンパク質の配列中の290位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；及び
○PIV-5 Ｆタンパク質の配列中の449位のアミノ酸のアミノ酸Ｐによる置換；及び
○前記Ｆタンパク質の天然の切断サイトの、他の酵素的切断サイトによる置換、及び／又は、前記Ｆタンパク質の天然の切断サイト以外の酵素的切断サイトの、前記Ｆタンパク質への挿入；
によって、PIV-5ウイルスのＦタンパク質の配列から導き出される（derivable）配列を含む突然変異タンパク質であって、
前記Ｆタンパク質の配列が、
・配列番号31の配列、又は、443位のアミノ酸が（配列番号31のＰの代わりに）Ｓであることを除いて配列番号31の配列と同じである代替配列；又は
・この配列番号31の配列又は前記代替配列の変異配列であって、
○配列番号31のものと同じアミノ酸長であるか、又は、配列番号31のものより最大でＣ−末端の７アミノ酸だけ大きいアミノ酸長であり；及び
○配列番号31の配列又は前記代替配列に対して、９５％を超える配列同一性を有し、この同一性は、配列番号31の配列の長さ、又は、前記代替配列の長さを用いてそれぞれ算出される、変異配列；
からなるPIV-5ウィルスのＦタンパク質の配列であり、PIV-5 Ｆタンパク質の膜融合能力を有する、突然変異タンパク質。
【請求項２】
PIV-5ウイルスの前記Ｆタンパク質の配列が、配列番号34の配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の突然変異タンパク質。
【請求項３】
前記Ｆタンパク質の配列が、
・配列番号31の配列、又は、443位のアミノ酸が（配列番号31のＰの代わりに）Ｓであることを除いて配列番号31の配列と同じである代替配列；又は
・この配列番号31の配列又は前記代替配列の変異配列であって、
○配列番号31のものと同じアミノ酸長であるか、又は、配列番号31のものより最大でＣー末端の７アミノ酸だけ大きいアミノ酸長であり；及び
○配列番号31の配列又は前記代替配列に対して、少なくとも９６％の配列同一性を有し、この同一性は、配列番号31の配列の長さ、又は、前記代替配列の長さを用いてそれぞれ算出される、変異配列；
から成るPIV-5ウィルスのＦタンパク質の配列であり、PIV-5 Ｆタンパク質の膜融合能力を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の突然変異タンパク質。
【請求項４】
前記配列同一性のパーセンテージが少なくとも９７％である請求項３の突然変異タンパク質。
【請求項５】
前記Ｆタンパク質は、配列番号35および39の配列の一つから成ることを特徴とする、請求項１〜４の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項６】
そのアミノ酸配列が前記PIV-5 Ｆタンパク質配列に対して他の突然変異を含まないことを特徴とする、請求項１〜５の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項７】
前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列が、配列番号65の配列であることを特徴とする、請求項６に記載の突然変異タンパク質。
【請求項８】
前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列が、
・以下から選択される少なくとも一つの突然変異：
○49位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○402位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○443位のアミノ酸のアミノ酸Ｐによる置換；
○447位のアミノ酸のアミノ酸Ｐによる置換；
及び／又は
・以下から選択される少なくとも一つの突然変異：
○147位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
○158位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
によって、前記Ｆタンパク質配列からさらに導き出されることを特徴とする、請求項１〜５の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項９】
前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列が、配列番号67〜79の配列から選択される配列であることを特徴とする、請求項１〜５および８の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１０】
前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列が、
○147位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；及び
○158位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
によって、前記Ｆタンパク質配列からさらに導き出されることを特徴とする、請求項１〜５及び８〜９の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１１】
前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列が、配列番号78の配列である、請求項１０に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１２】
前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列が、
・以下から選択される少なくとも一つの突然変異：
○147位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
○158位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
及び
・463位のアミノ酸のＶ、Ｉ又はＬによる置換；
によって、前記Ｆタンパク質配列からさらに導き出されることを特徴とする、請求項１〜５及び８〜１０の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１３】
前記の463位のアミノ酸が、Ｖにより置換される請求項１２の突然変異タンパク質。
【請求項１４】
前記疎水性アミノ酸が、Ｖ、Ｉ、又はＬである請求項８，１０，１２の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１５】
前記疎水性アミノ酸が、Ｖである請求項８，１０，１２の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１６】
前記Ｆタンパク質の天然の切断サイトの、他の酵素的切断サイトによる置換によって、及び／又は、前記Ｆタンパク質の天然の切断サイト以外の酵素的切断サイトの、前記Ｆタンパク質への挿入によって、PIV-5ウイルスのＦタンパク質の配列から導き出される配列を含むことを特徴とする、請求項１〜１３の何れか一項に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１７】
天然の切断サイト以外の前記切断サイトが、組織特異的切断サイトであることを特徴とする、請求項１６に記載の突然変異タンパク質。
【請求項１８】
請求項１〜１７の何れか一項に記載の突然変異タンパク質をコードする、核酸、DNA若しくはRNA、又はそのような核酸の相補的核酸。
【請求項１９】
請求項１８に記載の少なくとも一つの核酸を含む、トランスフェクション、形質導入又は形質転換ベクター。
【請求項２０】
発現ベクターである請求項１９のベクター。
【請求項２１】
腫瘍崩壊性のアデノウイルスベクターであることを特徴とする、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２２】
請求項１〜１７の何れか一項に記載の少なくとも一つの突然変異タンパク質、及び／又は、請求項１８に記載の核酸、DNA又はRNAの少なくとも一つ、及び／又は、請求項１９〜２１の何れか一項に記載の少なくとも一つのベクターを含むことを特徴とする細胞。
【請求項２３】
請求項２２の細胞であって、ヒト又は非−ヒト動物の免疫系の細胞であり、請求項１〜１７の何れか一項に記載の少なくとも一つの突然変異タンパク質をその表面で発現する細胞。
【請求項２４】
ヒト又は非−ヒト動物の樹状細胞である請求項２２又は２３の細胞。
【請求項２５】
請求項１〜１７の何れか一項に記載の少なくとも一つの突然変異タンパク質を含み、及び／又は、請求項１８に記載の少なくとも一つの核酸を含み、及び／又は、請求項１９〜２１の何れか一項に記載の少なくとも一つのベクターを含む、腫瘍細胞。
【請求項２６】
骨髄腫細胞である請求項２５の腫瘍細胞。
【請求項２７】
前記少なくとも一つの突然変異タンパク質は、前記腫瘍細胞の表面上に含まれる請求項２５又は２６の腫瘍細胞。
【請求項２８】
ハイブリドーマの産生において使用するための、請求項２５〜２７の何れか一項に記載の腫瘍細胞。
【請求項２９】
請求項１〜１７の何れか一項に記載の少なくとも一つの突然変異タンパク質、及び／又は、請求項１８に記載の少なくとも一つの核酸、及び／又は、請求項１９〜２１の何れか一項に記載の少なくとも一つのベクターを含むことを特徴とするハイブリドーマ。
【請求項３０】
筋細胞への分化能力を有する幹細胞又は前駆細胞であって、請求項１〜１７の何れか一項に記載の少なくとも一つの突然変異タンパク質を含み、及び／又は、請求項１８に記載の少なくとも一つの核酸を含み、及び／又は、請求項１９〜２１の何れか１項に記載の少なくとも一つのベクターを含むことを特徴とし、前記細胞はヒト胚細胞ではない、幹細胞又は前駆細胞。
【請求項３１】
前記少なくとも一つの突然変異タンパク質が前記幹細胞又は前駆細胞の表面上に含まれる請求項３０の幹細胞又は前駆細胞。
【請求項３２】
筋繊維幹細胞又は前駆細胞としての使用のための、請求項３０又は３１の幹細胞又は前駆細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、現在、５型PIV（PIV-5又はPIV5）及び２型PIV（PIV-2又はPIV2）として表示されている、パラインフルエンザウイルス（PIV）の融合タンパク質（Ｆタンパク質）の突然変異タンパク質に関する。
【０００２】
本願は、それらに由来する生成物、例えば：
・核酸、ベクター、細胞；
・抗体、アプタマー、干渉ＲＮＡタイプの融合阻害剤；
・骨髄腫、ハイブリドーマ；
・幹細胞及び前駆細胞
に関する。
【０００３】
本願はまた、医学的及び生物工学的な適用において使用するための、これらの突然変異タンパク質及びそれらに由来する生成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
現在、５型PIV（PIV-5又はPIV5）として表示されているパラインフルエンザウイルス（PIV）は、パラミクソウイルス科のルブラウイルス属のエンベロープに包まれたウイルスである。PIV-5は、最初にサル細胞の初代培養物から単離されたため、従来はＳＶ５（シミアンウイルス５）という名で知られていた。しかしながら、PIV-5の自然なホストはイヌであると思われ、イヌにおいてケンネルコフ（kennel cough）として知られる咳を引き起こす。
【０００５】
その後に、幾つかのPIV-5単離体が、ヒトから収集されたが動物細胞で培養されたサンプルから得られた。さらに、ヒトにおいては、何の症状又は疾病もPIV-5に付随しなかった。このように、ヒトが実際にPIV-5のホストであるかどうかという問題は今なお熱く討論されている。
【０００６】
何れにせよ、PIV-5ウイルスは現在、動物ウイルスであると考えられている。
【０００７】
２型PIV（PIV-2又はPIV2）として現在表示されているパラインフルエンザウイルス（PIV）もまた、パラミクソウイルス科のルブラウイルス属のエンベロープに包まれたウイルスである。
【０００８】
現在、PIV-2のヒト単離体のみが同定されており（hPIV-2）、そのため、PIV-2はヒトウイルスであると考えられている。
【０００９】
PIV-5及びPIV-2ウイルスは、核酸配列、タンパク質配列、組織、構造及び形態の点から互いに極めて類似している。
【００１０】
ヒトパラインフルエンザウイルスの中で、PIV-2は、ヒトにおいて発見されたPIV-5に最も近いウイルスである。
【００１１】
PIV-2は、PIV-5のヒト同等物であると考えることができ、少なくとも本発明者らによってそのように考えられている。
【００１２】
PIV-5又はPIV-2による感染は、シンシチウムとして知られる多核性構造体の形成を導き、これは、感染したホスト由来の細胞が融合した結果である。
【００１３】
PIV-5及びPIV-2ウイルスは、ウイルスエンベロープと細胞膜との融合によってホスト細胞へ入る。
【００１４】
この融合は、赤血球凝集素ノイラミニダーゼ結合タンパク質（HN）及び融合タンパク質（Ｆ）の二つのウイルス糖タンパク質を関与させる。
【００１５】
PIV-5及びPIV-2の融合タンパク質Ｆは、単純な前駆体（F0）の形態で合成され、グリコシル化ホモトリマーの形態である。PIV-5及びPIV-2の融合タンパク質Ｆは、ジスルフィド架橋を介して連結した二つのサブユニット（大カルボキシ末端サブユニットＦ１及び小アミノ末端サブユニットＦ２）から成る「前活性化」形態を生成するために、ホストのフューリン（furines）によるタンパク分解性の切断を必要とする。
【００１６】
サブユニットＦ１は、疎水性融合ペプチド（FP）並びにコイルドコイル型のコンフォメーションを有する二つの７アミノ酸繰り返しドメイン（heptade repeat domains）（HR-1及びHR-2）で構成される。ＨＮによる活性化の後、融合タンパク質は、一連のコンフォメーション変化を起こし、結果として、融合ペプチドの標的細胞膜への挿入を生じる。次に、HR-1及びHR-2ドメイン間の相互作用が生じ、ウイルスエンベロープを細胞膜に近づける（Russell et al, 2006）。これらのドメインは、三つのHR-1ドメインが三つのHR-2ドメインに非平行配向で連結された三量体コイルドコイル構造で構成された６らせん体の極めて安定な束を形成することが知られている。このコンフォメーションは、Ｆタンパク質の融合後形態を表す（Baker et al, 1999, Sergel-Germano et al, 2000, West et al, 2005）。
【００１７】
PIV-5及びPIV-2の融合タンパク質Ｆは、融合の促進のために、同じウイルス型に由来するＨＮタンパク質を必要とする(Yao et al, 1997)。しかしながら、ＦとＨＮの間に存在する相互作用の詳細な性質は未だに正しく知られていない。
【００１８】
しかし、幾つかの研究が、PIV-5及びPIV-2のある株が、融合を引き起こすためのＨＮの必要性において相違していることを示している。
【００１９】
例として、Ito et al（1997）は、そのＦタンパク質が３つのアミノ酸（残基２２、４４３及び５１６）によってのみ相違している「ＳＶ５」（PIV-5）の二つの株、即ち、Ｗ３Ａ及びＷＲを開示している。Ｗ３Ａ株のＦタンパク質は、自律的な（autonomous）様式で、即ち、ＨＮタンパク質の非存在下で融合を誘導することができ、一方、ＷＲ株のＦタンパク質はその能力を有していない。
【００２０】
Ito et al（1997）は、ＷＲ株のＦタンパク質の膜融合（fusogenic）活性が、このタンパク質の２２位のアミノ酸をアミノ酸プロリンで置換することによって回復され得ることを示している。
【００２１】
Ito et al（2000）は、Ｗ３Ａ及びＷＲ株のＦタンパク質の132位のアミノ酸Ｅ及び290位のアミノ酸Ａが、これらの株のＦタンパク質がＨＮタンパク質に自律的である能力に関与し得ることを示唆している。
【００２２】
Paterson et al（2000）は、Ｗ３Ａ株のＦタンパク質の２２位のアミノ酸プロリンの存在、及び、ＷＲ株のＦタンパク質のアミノ酸４４３の存在が、これらのウイルス株の膜融合能力を上昇させ得ることを示している。
【００２３】
Russell et al（2003）は、Ｗ３Ａ株のＦタンパク質の残基Ｌ４４７及びＩ４４９を芳香族アミノ酸によって置換することにより、このウイルス株のＦタンパク質の膜融合活性が上昇され得ることを示している。
【００２４】
Gardner及びDutch（2007）は、野生型「SV5」（PIV-5）ウイルスのＦタンパク質の突然変異Ｉ４９Ａが、膜融合促進効果（pro-fusogenic effect）を有するであろうことを示している。
【００２５】
Gardner et al（2007）は、野生型「SV5」（PIV-5）ウイルスのＦタンパク質の突然変異Ｖ４０２Ａが、膜融合促進効果を有するであろうことを示している。
【００２６】
タンパク質PIV-2に関しては、このウイルスのＦタンパク質の配列に突然変異を導入し、それによって自律性及び膜融合能力を上昇させるタイプの試みを記載した従来技術文献は見当たらない。
【００２７】
さらに、インフルエンザタンパク質HA1/HA2、ラブドウイルスＧタンパク質、又はHIVのgp41/gpl20タンパク質などの融合能力を有するウイルスタンパク質が他に多くある。
【００２８】
これらの種々のウイルスタンパク質の膜融合性能力及び自律性に関する現在の知識は、今なお極めて限られている。
【００２９】
いずれにせよ、ウイルス融合タンパク質に関する現在の知識は、有効な医学的及び／又は生物工学的適用を構想するのに十分な技術的ノウハウを提供しない。
【発明の概要】
【００３０】
本発明者らは、高い膜融合性であり、且つ、その融合能力における実質的な自律性を示す融合タンパク質を利用可能にすることが、幾つかの医学的及び生物工学的な状況の解決を提供し得ると考えた。
【００３１】
本発明者らは、従って、例えばインフルエンザのHA1/HA2タンパク質、ラブドウイルスのＧタンパク質、又はHIVのgp41/gpl20タンパク質などの、他の一連のウイルス融合タンパク質から、PIV-5及び／又はPIV-2のＦタンパク質を精選して選択した。
【００３２】
次いで、本発明者らは、ＨＮタンパク質の非存在下における膜融合能力を有する突然変異Ｆタンパク質を構築及び生産した。
【００３３】
本発明の突然変異タンパク質は、高い膜融合能力と高い自律性を有することが証明された。それらは、細胞融合を誘導するためにＨＮタンパク質の存在を必要とせず、また、シンシチウムの形成を必要としなかった。
【００３４】
また、本発明者らは、これらの突然変異タンパク質に、Ｆタンパク質が天然の状態で示しているものとは異なる切断サイト、より具体的には組織特異的切断サイトを導入することが可能であることを示した。
【００３５】
また、本発明者らは、本発明の突然変異タンパク質及び／又はそれらに由来するか又はそれらから得られる生成物の医学的適用（治療的、予防的、緩和的、また診断的)及び／又は生物工学的適用を提案する。
【００３６】
より具体的には、本発明者らは、癌（より具体的には転移性の癌、好ましくは転移性黒色腫）又は胎盤の発達不全などの、シンシチウムの形成を誘導または増加することが望まれる疾病又は機能障害を生体内で又は生体外で治療、予防又は緩和するための、本発明の突然変異タンパク質又はそれらをコードする核酸の使用を提案する。
【００３７】
本発明者らはさらに、エンベロープに包まれたウイルスの感染、アレルギー、自己免疫疾患又は移植片拒絶などの、シンシチウムの形成を阻害又はブロックすることが望まれる疾病又は機能障害を生体内で又は生体外で治療、予防又は緩和するための、抗体、組換え樹状細胞、アンチセンス、siRNA、核酸アプタマーなどの、PIV-5及び／又はPIV-2のＦタンパク質をブロッキングする薬剤を提案する。
【００３８】
本発明者らはさらに、シンシチウムの過剰な形成、又は反対に不十分な形成を検出するための診断手段を提案する。
【００３９】
本発明者らはさらに、他の生物工学的手段、特に、シンシチウムの形成を減少させることができる活性成分をスクリーニングするための手段を提案する。
【００４０】
本発明者らはさらに、本発明の突然変異タンパク質を含む、癌細胞、より具体的には骨髄腫を提案する。本発明者らはさらに、本発明の突然変異タンパク質を含むハイブリドーマを提案する。本発明の癌細胞、より具体的には骨髄腫は、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)も、エレクトロポレーションも、他のいずれの融合誘導手段も用いることなく、別の細胞と、より具体的にはＢリンパ球と融合することができる。本発明の癌細胞、より具体的には骨髄腫は、自律的な融合能力を有する。
【００４１】
本発明のハイブリドーマは、ポリエチレングリコール(PEG)も、エレクトロポレーションも、他のいずれの融合誘導手段も必要とせずに、（Ｂリンパ球の骨髄腫への)融合によって生産され得る。本発明のハイブリドーマは、本発明の少なくとも一つの癌細胞、より具体的には少なくとも一つの骨髄腫を用いることによって実際に生産され得る。
【００４２】
本発明者らはさらに、本発明の突然変異タンパク質を発現する組換え幹細胞又は前駆細胞、及び、筋繊維の生産におけるそれらの適用を提案する。
【００４３】
本発明の他の側面は、下記の「詳細な説明」の項において説明される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
ファイルされた出願の図面セットは、カラーでファイルされた。これは、特許庁でファイルを閲覧することによりアクセスすることができる。
【図１Ａ】PIV-5のＦタンパク質の基準配列 (配列番号31；ＷＲ単離体のＦタンパク質の配列) 及び対応するCDS配列 (配列番号30；配列番号31のタンパク質をコードする核酸配列)。配列番号31の配列において、ボールドで下線付きの文字は、以下の位置のアミノ酸を示す：  - 22 (L)、  - 49 (I)、  - 132 (E、この単離体に予め存在する突然変異)、  - 147 (T)、  - 158 (T)、  - 290 (A、この単離体に予め存在する突然変異)、  - 402 (V)、  - 443 (P、この単離体に理論的に予め存在する突然変異)、  - 447 (L)、  - 449 (I)、及び  - 463 (A)。
【図１Ｂ】PIV-2のＦタンパク質の基準配列 (配列番号33；Greer単離体のＦタンパク質の配列) 及び対応するCDS配列 (配列番号32；配列番号33のタンパク質をコードする核酸配列)。配列番号33の配列において、ボールドで下線付きの文字は、以下の位置のアミノ酸を示す：  - 24 (I)、  - 53 (I)、  - 133 (K)、  - 151 (T)、  - 162 (S)、  - 294 (I)、  - 406 (A)、  - 428 (S)、  - 439 (S)、  - 445 (I)、  - 474 (S)。
【図２Ａ】PIV-2のＦタンパク質 (配列番号33のアミノ酸8〜533) に対するPIV-5のＦタンパク質 (配列番号31のアミノ酸4〜529) のアラインメント：これら2つのタンパク質の間で、タンパク質同一性は47.7%である。このアラインメントから得られるコンセンサス配列は、配列番号34として参照される。
【図２Ｂ】PIV-5のＦタンパク質のアミノ酸及び突然変異に対応する、PIV-2のＦタンパク質のアミノ酸及び突然変異。
【図３】PIV-5のＦタンパク質の天然の切断サイト (配列番号23) の、組織特異的切断サイト、この場合、転移性腫瘍組織により特異的に発現される酵素、すなわちマトリクス金属プロテアーゼ9 (MMP-9) のサイトによる置換の図解。  MMP-9サイトのコンセンサスサイト：配列番号27の配列 (PXXhyS/Tサイト、ここで、X = 任意のアミノ酸、及びHy = 任意の疎水性アミノ酸、すなわちF、M、V、L、Iから選択される任意のアミノ酸)。  MMP-9サイトの例示的配列：配列番号28の配列、配列番号29の配列。
【図４】PIV-5のＦタンパク質をコードする配列がクローニングされているプラスミドpcDNA3.1の構造。  Amp：アンピシリン耐性遺伝子  pCMV：サイトメガロウイルスプロモーター  MCS：マルチプルクローニングサイト  F PIV5：PIV-5のＦタンパク質  BGHpolyA：ウシ成長ホルモンpolyA。
【図５Ａ】PIV-5のＦタンパク質において本発明者らにより作成された突然変異の視覚化。
【図５Ｂ】PIV-5のＦタンパク質において本発明者らにより作成された突然変異の視覚化。
【図５Ｃ】PIV-5のＦタンパク質において本発明者らにより作成された突然変異の視覚化。
【図５Ｄ】PIV-5のＦタンパク質において本発明者らにより作成された突然変異の視覚化。
【図６Ａ】半定量的融合テストの間に行われた顕微鏡観察の写真 (本発明者らにより作成された突然変異体の大きな一群)。
【図６Ｂ】半定量的融合テストの後に得られた融合スコアを示す図 (本発明者らにより作成された突然変異体の大きな一群)。
【図７Ａ】半定量的融合テストの間に行われた顕微鏡観察の写真 (本発明者らにより作成された突然変異体の選択物)。
【図７Ｂ】半定量的融合テストの後に得られた融合スコアを示す図 (本発明者らにより作成された突然変異体の選択物)。
【図８Ａ】定量的融合テストの結果(本発明者らにより作成された突然変異体の選択物)。
【図８Ｂ】定量的融合テストの結果(本発明者らにより作成された突然変異体の選択物)。
【図８Ｃ】定量的融合テストの結果(本発明者らにより作成された突然変異体の選択物)。
【図９】PIV-5 タンパク質の天然の切断サイト以外の切断サイトを有する、本発明の突然変異タンパク質について免疫螢光法を用いて作製した共焦点顕微鏡観察の図（本発明の突然変異タンパク質 Fus8M及びFus8.7M、これは、配列番号28の切断サイト MMP-9による、天然の切断サイトの置換によって、本発明の突然変異タンパク質 Fus8及びFus8.7と相違する）。
【詳細な説明】
【００４５】
本願発明において、「タンパク質」という用語は、「糖タンパク質」という用語をその範囲に包含する。これは特に、実際に糖タンパク質であるＦタンパク質及びＨＮタンパク質の場合である。
【００４６】
PIV-5及びPIV-2のＦタンパク質（非突然変異タンパク質）：
PIV-5のＦタンパク質の配列を図１Ａに示す（配列番号31のタンパク質配列；配列番号30のコーディング核酸配列）。これは、サル単離体（isolate）であるＷＲ単離体の配列である。それらの配列は、ジーンバンクデータベースから受入れ番号AB021962により入手可能である。
【００４７】
本発明者らがATCCから入手し、下記の実施例に記載した突然変異タンパク質の構築及び生産に用いたＷＲ単離体のサンプルは、しかしながら、Ｆタンパク質の443位において、（ジーンバンクから入手可能な配列の点から見て予想されるものとは対照的に）アミノ酸Ｐを有しておらず、アミノ酸Ｓを有している。従って、このＷＲ単離体のＦタンパク質の代替配列は、443位のアミノ酸がＳでありＰではないことを除いて、配列番号31の配列と同一である。簡略のために、ここではこの代替配列を「443位にＳを有する配列番号31」と記載する。
【００４８】
配列番号31の配列及び代替配列「443位にＳを有する配列番号31」、好ましくは代替配列「443位にＳを有する配列番号31」は、本特許出願の文脈においては、PIV-5のＦタンパク質のための基準配列として作用する。
【００４９】
しかしながら、ＷＲ単離体以外の単離体、特に、
・例えばＷ３Ａ単離体などの他のサル単離体；
・他の非ヒト動物からの単離体、例えば、
○イヌ単離体、例えば、イヌ単離体ＣＰＩ＋、ＣＰＩ−、Ｈ２２１、７８５２４、Ｔｌ；
○ブタ単離体、例えば、ブタ単離体ＳＥＲ；
・ヒトから採取されたサンプルに由来するが、動物細胞で培養された（上記導入部分を参照）「ヒト」単離体と名付けられた単離体、例えば、ＭＩＬ単離体、ＤＥＮ単離体、ＬＮ単離体、ＭＥＬ単離体、及びWO 02 077211において「クリプトウイルス」であると記載されている単離体；
が明らかに存在する。
【００５０】
それらの種々のPIV-5単離体のＦタンパク質の配列における変異は極めてわずかである。
【００５１】
それらの変異の記述は、Chatziandreou et al,（2004）（その内容並びに特に表３及び該論文中でそれに付随しているコメントは、参照により本特許出願に援用される）によって与えられる。
【００５２】
該論文の表３をここに再現する：
【表Ａ−１】
0005823296.tif 000002
【表Ａ−２】
0005823296.tif 000003
【表Ａ−３】
0005823296.tif 000004
【表Ａ−４】
0005823296.tif 000005
【００５３】
上記の表１において、空欄は、関係するＦタンパク質が左側のカラムに示されているＷ３Ａ株のＦタンパク質と同じアミノ酸を有することを示す。その位置がこの表に明確に収載されていないアミノ酸ももちろん、Ｗ３ＡのＦタンパク質の配列中におけるそれらに対応するものと同じである。それらのアミノ酸自体は、ＷＲ単離体のＦタンパク質についての配列中におけるそれらに対応するものと同じである（配列番号31の配列を参照）。
【００５４】
それ故、配列番号35〜46の配列は、表１に示された配列番号31のアミノ酸の配列中の、それらの配列のそれぞれの置換（及び、適切であれば、示された配列番号31のアミノ酸の配列のＣ−末端部分における付加）の結果の配列である。
【００５５】
Ｗ３Ａ単離体のＦタンパク質、並びに、上記の他の単離体のＦタンパク質は、
・147位における、アミノ酸Ｔ；
・158位における、アミノ酸Ｔ；
・447位における、アミノ酸Ｌ；及び
・449位における、アミノ酸Ｉ
を有する。
【００５６】
このように、Ｗ３Ａ及びＷＲ単離体は、他の単離体において５２９位を超えて伸長する細胞質伸長（cytoplasmin extension）を有さない。関係する単離体に依存して、この細胞質伸長は、２から７のアミノ酸を含有する。
【００５７】
また、それらの単離体のＦタンパク質の配列は、ＷＲ株のＦタンパク質の配列と比較して５％未満（特には、最大で３％）で変化していることが分かる（細胞質伸長を考慮にいれない、即ち、この割合はＷＲのＦタンパク質の長さから算出される）；Chatziandreou et al.（2004）による論文の第85頁の終わりを参照されたい。
【００５８】
PIV-5のＦタンパク質は、従って、
・配列番号31の配列、又は前記代替配列「443位にＳを有する配列番号31」；又は
・この配列番号31の配列又は前記代替配列「443位にＳを有する配列番号31」の変異配列であって、
○配列番号31のものと同じサイズであるか、又は、配列番号31のものより最大で７アミノ酸だけ小さいサイズであるか、又は、配列番号31のものより最大で７アミノ酸だけ大きいサイズであり［前記代替配列「443位にＳを有する配列番号31」は、配列番号31の配列と同じサイズである］、好ましくは配列番号31のものと同じサイズを有し、又は、配列番号31のものより最大で７アミノ酸だけ大きい；及び
○配列番号31の配列又は前記代替配列「443位にＳを有する配列番号31」に対して、９５％を超える配列同一性、好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有する（この同一性は、配列番号31の配列又は適切であれば前記代替配列「443位にＳを有する配列番号31」の配列の長さを用いて算出される)、
として定義され得る変異配列；
から成る。
【００５９】
配列番号31のPIV-5のＦタンパク質についての変異配列は、特に、上記の単離体Ｗ３Ａ、ＭＩＬ、ＤＥＮ、ＬＮ、ＭＥＬ、クリプトウイルス、ＣＰＩ＋、ＣＰＩ−、Ｈ２２１、７８５２４、Ｔｌ及びＳＥＲのＦタンパク質についての配列を含む（上記表１及びChatziandreou et al,（2004）の論文を参照されたい）。
【００６０】
同様に、本願においてPIV-2 Ｆタンパク質のための基準として作用する配列は、図１Ｂに提示されたGreer株の配列である（配列番号33のタンパク質配列、配列番号32のコーディング核酸配列）。
【００６１】
例えば、Ｖ９８、Ｖ９４ Toshiba 単離体などのGreer 単離体以外のPIV-2 単離体があることが明らかである。
【００６２】
それらの他のPIV-2単離体のＦタンパク質の配列は、Greer単離体のものと極めて近いが、単離体間の変異である幾つかの小さい変異を有する。
【００６３】
それ故、PIV-2 Ｆタンパク質は、
・配列番号33の配列；又は
・配列番号33の配列の変異配列であって、
○配列番号33の配列と同じサイズであるか、又は、配列番号33の配列より最大で２アミノ酸だけ小さいサイズであるか、又は、配列番号33の配列より最大で２アミノ酸だけ大きいサイズであり、好ましくは配列番号33のものと同じサイズを有し、好ましくは配列番号33のものとサイズが同じである；及び
○配列番号33の配列に対して、９５％を超える配列同一性、好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有する（この同一性は、配列番号33の配列の長さを用いて算出される）
で定義される変異配列；
から成りうる。
【００６４】
PIV-5(配列番号31)のＦタンパク質の配列をPIV-2(配列番号33)のものにおいてアラインメントした結果のコンセンサス配列(配列番号34)は、以下の通りであり、図２Ａに見出される。このコンセンサス配列は、以下のように書き換えられる。
【化１】
0005823296.tif 000006
【００６５】
シンボル「-」は、PIV-5のＦタンパク質とPIV-2のＦタンパク質がその位置において異なるアミノ酸を有することを示す。
【００６６】
このコンセンサス配列は、以下のように形式化することもできる：
【化２】
0005823296.tif 000007
【００６７】
PIV-5のＷＲ単離体のＦタンパク質の配列は、Ｎ−末端においてアミノ酸ＭＧＴにより先行される配列番号34の配列である（図１Ａ及び２Ａを参照）。
【００６８】
PIV-2のGreer単離体のＦタンパク質の配列は、Ｎ−末端においてアミノ酸ＭＨＨＬＨＰＭ（配列番号86）により先行され、Ｃ−末端においてアミノ酸ＥＮＰＡＦＦＳＫＮＮＨＧＮＩＹＧＩＳ（配列番号87）が続く配列番号34の配列である（図１Ｂ及び２Ａを参照）。
【００６９】
PIV-5及びPIV-2のＦタンパク質の配列は、配列番号34の配列を含む配列であり、好ましくは配列番号34の配列を含むPIVウイルスのＦタンパク質の配列であると考えられ得る。より具体的には、PIV-5及びPIV-2のＦタンパク質の配列は、以下のように考えられ得る：
a)配列番号34の配列：
・Ｎ−末端において3〜７のアミノ酸によって先行され、特にはＮ−末端において３アミノ酸（例えばＭＧＴ）に先行され又は７アミノ酸（例えばＭＨＨＬＨＰＭ）に先行され；及び
・任意に、Ｃ−末端において１８アミノ酸が続き、特にはＣ−末端においてアミノ酸ＥＮＰＡＦＦＳＫＮＮＨＧＮＩＹＧＩＳが続き；又は
b) 上記a）で記載された配列の変異配列であって、
・下記の何れか: 
i.  配列番号31のものと同じサイズを有するか、又は、配列番号31のものより最大で７アミノ酸だけ小さいサイズであるか、又は、配列番号31のものより最大で７アミノ酸だけ大きいサイズであり；及び好ましくは配列番号31のものと同じサイズを有し、又は、配列番号31のものより最大で７アミノ酸だけ大きいサイズである;及び
ii.  配列番号31の配列又は前記代替配列「443位にＳを有する配列番号31」に対して、９５％を超える配列同一性、好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有する（この同一性は、配列番号31の配列の長さ、又は、適切であれば前記代替配列「443位にＳを有する配列番号31」の長さを用いて算出される）；
・又は：
i.  配列番号33のものと同じサイズを有するか、又は、配列番号33のものより最大で２アミノ酸だけ小さいサイズであるか、又は、配列番号33のものより最大で２アミノ酸だけ大きいサイズであるか、好ましくは配列番号33のものと同じサイズを有する；及び
ii.  配列番号33の配列に対して、９５％を超える配列同一性、好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有する（この同一性は、配列番号33の配列の長さを用いて算出される）；
である変異配列。
【００７０】
本発明の突然変異タンパク質：
本願は、突然変異タンパク質であって、該アミノ酸配列が、
・置換：
○PIV-5 Ｆタンパク質の配列中の２２位のアミノ酸、又は、PIV-2 Ｆタンパク質の配列中の24位のアミノ酸の、アミノ酸Ｐによる置換(PIV-5のＦにおける突然変異２２Ｐ；PIV-2のＦにおける突然変異24P)；及び
○PIV-5 Ｆタンパク質の配列中の132位のアミノ酸、又は、PIV-2 Ｆタンパク質の配列中の133位のアミノ酸の、アミノ酸Ｅによる置換（PIV-5のＦにおける突然変異１３２Ｅ；PIV-2のＦにおける突然変異133E）；及び
○PIV-5 Ｆタンパク質の配列中の290位のアミノ酸、又は、PIV-2 Ｆタンパク質の配列中の２９４位のアミノ酸の、アミノ酸Ａによる置換（PIV-5のＦにおける突然変異290A；PIV-2のＦにおける突然変異294A）；及び
○PIV-5 Ｆタンパク質の配列中の449位のアミノ酸、又は、PIV-2 Ｆタンパク質の配列中の439位のアミノ酸の、アミノ酸Ｐによる置換（PIV-5のＦにおける突然変異449P；PIV-2のＦにおける突然変異439P）；
・並びに、任意に：
○前記Ｆタンパク質の天然の（又は自然な）切断サイトの、他の酵素的切断サイトによる置換、及び／又は、前記Ｆタンパク質の天然の（又は自然な）切断サイト以外の酵素的切断サイトの、前記Ｆタンパク質への挿入；及び／又は
○前記Ｆタンパク質のＣ−末端部分であって、該タンパク質のＣ−末端にある最後のアミノ酸からＮ−末端方向に伸張するが、前記Ｆタンパク質のHR2ドメインを超えては伸張しないＣ−末端部分の欠失；
によって、PIV-5又はPIV-2ウイルスのＦタンパク質の配列から導き出される（derivable）配列を含む突然変異タンパク質に関する。
【００７１】
前記アミノ酸の位置は、前記Ｆタンパク質の前駆体形態（F0）の配列（即ち、切断前のＦタンパク質の配列）に対して算出され、その位置はＮ−末端からＣ−末端へカウントされる。
【００７２】
PIV-2 Ｆタンパク質において示された位置は、PIV-5のＦタンパク質において示されたものと対応する位置である（位置の対応の表を示す図２Ｂを参照されたい）。
【００７３】
PIV-5又はPIV-2ウイルスの前記Ｆタンパク質の配列は上記で定義されたとおりである。よって、それは特に配列番号34の配列（PIV-5及びPIV-2のＦタンパク質のコンセンサス配列）を含むと定義され得る。
【００７４】
PIV-5 Ｆタンパク質の突然変異タンパク質：
本発明の一つの側面に従って、本発明の突然変異タンパク質はPIV-5ウイルスのＦタンパク質の配列から導き出される配列を含む。
【００７５】
PIV-5の前記Ｆタンパク質の配列は上記で定義されたとおりである。それは特に、  
・配列番号31の配列（図１Ａに示されたPIV-5のＷＲ単離体のＦタンパク質の配列）、又は、前記代替配列「443位にＳを有する配列番号31」の配列；又は
・この配列番号31の配列又は前記代替配列「443位にＳを有する配列番号31」の変異配列であって、
○配列番号31のものと同じサイズであるか（即ち、529アミノ酸から成る)、又は、配列番号31のものより最大で７アミノ酸だけ大きいサイズであるか（即ち、530, 531, 532, 533, 534, 535又は536 アミノ酸から成る)、又は、配列番号31のものより最大で７アミノ酸だけ小さいサイズであり（即ち、522, 523, 524, 525, 526, 527又は528 アミノ酸から成る)；及び
○配列番号31の配列又は前記代替配列「443位にＳを有する配列番号31」に対して、９５％を超える配列同一性、好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有し、この同一性は、配列番号31の配列の長さ、又は、（適切であれば）前記代替配列「443位にＳを有する配列番号31」の長さを用いて算出される、変異配列；
から成り得る。
【００７６】
好ましくは、PIV-5の前記Ｆタンパク質の配列は、以下から成る：
・配列番号31の配列（図１Ａに示されたPIV-5のＷＲ単離体のＦタンパク質の配列）、又は、前記代替配列「443位にＳを有する配列番号31」の配列；又は
・この配列番号31の配列又は前記代替配列「443位にＳを有する配列番号31」の変異配列であって、
○配列番号31のものと同じサイズであるか（即ち、529アミノ酸から成る)、又は、配列番号31のものより最大で７アミノ酸だけ大きいサイズである（即ち、530, 531, 532, 533, 534, 535又は536 アミノ酸から成る)；及び
○配列番号31の配列又は前記代替配列「443位にＳを有する配列番号31」に対して、９５％を超える配列同一性、好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有し、この同一性は、配列番号31の配列の長さ、又は、適切であれば、前記代替配列「443位にＳを有する配列番号31」の長さを用いて算出される、変異配列。
【００７７】
そのような変異配列の具体的な例は、本願の表１に示されているＷ３Ａ、ＭＩＬ、ＤＥＮ、ＬＮ、ＭＥＬ、クリプトウイルス、ＣＰＩ＋、ＣＰＩ−、Ｈ２２１、７８５２４、Ｔｌ及びＳＥＲの単離体の一つのＦタンパク質（上記を参照）の配列、即ち、配列番号３５〜４６の配列の一つを含む。
【００７８】
好ましくは、PIV-5の前記Ｆタンパク質の配列は、配列番号31の配列（図１Ａに示されたPIV-5のＷＲ単離体のＦタンパク質の配列）から成り、又は、前記代替配列「443位にＳを有する配列番号31」の配列から成り、極めて好ましくは、前記代替配列「443位にＳを有する配列番号31」中の配列から成る。
【００７９】
PIV-5のＦタンパク質の配列から導き出される前記配列は、PIV-5の前記Ｆタンパク質配列に対して、上記の突然変異２２Ｐ、１３２Ｅ、２９０Ａ、４４９Ｐ以外の突然変異を含まなくてもよい。これは特に、配列番号６５(Fus8)の配列の場合である。
【００８０】
或いは、PIV-5のＦタンパク質の配列から導き出される前記配列は、このＦタンパク質配列から、上記の突然変異２２Ｐ、１３２Ｅ、２９０Ａ、４４９Ｐによって、及び、それらの上記突然変異２２Ｐ、１３２Ｅ、２９０Ａ、４４９Ｐ以外の少なくとも一つの突然変異によって、好ましくは、
・以下から選択される少なくとも一つの融合前突然変異：
○49位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○402位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○443位のアミノ酸のアミノ酸Ｐによる置換；
○447位のアミノ酸のアミノ酸Ｐによる置換；
及び／又は
・以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異：
○147位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
○158位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換。
【００８１】
によって導き出され得る。
【００８２】
好ましくは、PIV-5の前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列は、上記の突然変異22P、132E、290A、449Pによって、及び、
・以下から選択される少なくとも一つの融合前突然変異：
○49位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○402位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
及び／又は
・以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異：
○147位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
○158位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換。
【００８３】
によって、このＦタンパク質の配列から導き出される。
【００８４】
前記疎水性アミノ酸は、Ｖ、Ｉ、Ｌから有利に選択され、好ましくはＶである。
【００８５】
好ましくは、PIV-5の前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列は、上記の突然変異22P、132E、290A、449Pによって、及び、
・以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異：
○147位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
○158位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
及び、
・少なくとも一つの他の融合後突然変異、即ち、463位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換、好ましくはＶ、Ｉ又はＬ、より好ましくはＶによる置換；
によって、このＦタンパク質の配列から導き出される。
【００８６】
前記Ｆタンパク質の配列から導き出されるそのような配列は、特に、配列番号67〜79（それぞれ、Fus10、Fus10.4、Fus10.5、Fus11、Fus8.1、Fus8.2、Fus8.4、Fus8.5、Fus8.6、Fus8.7、Fus10.1、Fus10.2、Fus10.3）の配列（下記表４を参照）から選択される配列であってよい。
【００８７】
好ましくは、PIV-5の前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列は、上記の突然変異22P、132E、290A、449Pによって、及び、以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異：
○147位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
○158位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
によって、このＦタンパク質の配列から導き出される。
【００８８】
前記Ｆタンパク質の配列から導き出されるそのような配列は、特に、配列番号６８〜７９（それぞれ、Fus10.4、Fus10.5、Fus11、Fus8.1、Fus8.2、Fus8.4、Fus8.5、Fus8.6、Fus8.7、Fus10.1、Fus10.2、Fus10.3）の配列（下記表４を参照）から選択される配列であってよい。
【００８９】
好ましくは、PIV-5の前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列は、上記の突然変異22P、132E、290A、449Pによって、及び、
・以下から選択される少なくとも一つの融合前突然変異：
○49位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○402位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
及び
・以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異：
○147位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
○158位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
によって、このＦタンパク質の配列から導き出される。
【００９０】
前記Ｆタンパク質の配列から導き出されるそのような配列は、特に、配列番号68、69、70（それぞれ、Fus10.4、Fus10.5、Fus11）の配列（下記表４を参照）から選択される配列であってよい。
【００９１】
好ましくは、PIV-5の前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列は、上記の突然変異22P、132E、290A、449Pによって、及び、二つの融合後突然変異、即ち、
○147位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
○158位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
によって、このＦタンパク質の配列から導き出される。
【００９２】
前記Ｆタンパク質の配列から導き出されるそのような配列は、特に、配列番号76、78（それぞれ、Fus8.7、Fus10.2）の配列（下記表４を参照）から選択される配列であってよい。
【表Ｂ】
0005823296.tif 000008
【００９３】
表４に示した突然変異は、任意のPIV-5単離体、即ち、ＷＲ単離体又は変異体の単離体のＦタンパク質に導入され得る。
【００９４】
より具体的には、それらは、図１Ａに示された配列番号31のＦタンパク質（ジーンバンクデータベースから受入れ番号AB021962で入手可能なＷＲＦタンパク質）の配列中に導入され得る。
【００９５】
しかしながら、上記のように、本発明者らがATCCから受領し、下記の実施形態に記載した突然変異タンパク質の構築及び生産に用いたＷＲ単離体のサンプルは、（ジーンバンクから入手可能な配列の点から見て予想されるものとは対照的に）Ｆタンパク質の443位のアミノ酸Ｐを有しておらず、アミノ酸Ｓを有していた。表４に示した突然変異は、従って、前記代替配列「443位にＳを有する配列番号31」（配列番号６５、６７〜７９）中に導入され得る。
【００９６】
PIV-2 Ｆタンパク質の突然変異タンパク質：
本発明の他の側面に従って、本発明の突然変異タンパク質は、PIV-2ウイルスのＦタンパク質の配列から導き出される配列を含む。
【００９７】
前記PIV-2 Ｆタンパク質の配列は、上記で定義されたとおりである。特にそれは、
・配列番号33の配列（図１Ｂに示したPIV-2のGreer 単離体のＦタンパク質の配列）；又は
・配列番号33の配列の変異配列であって、
○配列番号33の配列と同じサイズであるか（即ち、551アミノ酸から成る)、又は、配列番号33の配列より最大で２アミノ酸だけ大きいサイズであるか（即ち、552又は553アミノ酸から成る)、又は、配列番号33の配列より最大で２アミノ酸だけ小さいサイズであり（即ち、549又は550アミノ酸から成る)；及び
○配列番号33の配列に対して、９５％を超える配列同一性、好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有し、この同一性は、配列番号33の配列の長さを用いて算出される、変異配列；
から成り得る。
【００９８】
好ましくは、PIV-2の前記Ｆタンパク質の配列は、
・配列番号33の配列（図１Ｂに示したPIV-2のGreer 単離体のＦタンパク質の配列）；又は
・配列番号33の配列の変異配列であって、
○配列番号33の配列と同じサイズであるか（即ち、551アミノ酸から成る)、又は、配列番号33の配列より最大で２アミノ酸だけ大きいサイズであり（即ち、552又は553アミノ酸から成る)；及び
○配列番号33の配列に対して、９５％を超える配列同一性、好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有し、この同一性は、配列番号33の配列の長さを用いて算出される、変異配列；
からなる。
【００９９】
さらに好ましくは、PIV-2の前記Ｆタンパク質の配列は、
・配列番号33の配列（図１Ｂに示したPIV-2のGreer 単離体のＦタンパク質の配列）；又は
・配列番号33の配列の変異配列であって、
○配列番号33の配列と同じサイズであり（即ち、５５１アミノ酸から成る)；及び
○配列番号33の配列に対して、９５％を超える配列同一性、好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有し、この同一性は、配列番号33の配列の長さを用いて算出される、変異配列；
からなる。
【０１００】
特に好ましくは、前記Ｆタンパク質の配列は、配列番号33の配列（図１Ｂに示したPIV-2のGreer 単離体のＦタンパク質の配列）からなる。
【０１０１】
PIV-2のＦタンパク質の配列から導き出される前記配列は、PIV-2の前記Ｆタンパク質配列に対して、上記の突然変異24P、133E、294A、439P以外の突然変異を含まなくて良い。これは、例えば、配列番号90の配列を含むか又は該配列からなる突然変異タンパク質の場合である。
【０１０２】
或いは、PIV-2のＦタンパク質の配列から導き出される前記配列は、上記の突然変異24P、133E、294A、439Pによって、及び、上記の突然変異24P、133E、294A、439P以外の少なくとも一つの突然変異によって、好ましくは、
・以下から選択される少なくとも一つの融合前突然変異：
○53位アミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○406位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○428位のアミノ酸のアミノ酸Ｐによる置換；
○445位のアミノ酸のアミノ酸Ｐによる置換；
及び／又は
・以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異：
○151位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
○162位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
によって、このＦタンパク質配列から導き出され得る。
【０１０３】
これは、例えば、配列番号91〜103の配列の一つを含む（又は、前記配列の一つからなる)、突然変異タンパク質の場合である。
【０１０４】
好ましくは、前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列は、上記の突然変異24P、133E、294A、439Pによって、及び、
・以下から選択される少なくとも一つの融合前突然変異：
○53位アミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○406位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
及び／又は
・以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異：
○151位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
○162位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
によって、このＦタンパク質配列と相違する。
【０１０５】
これは、例えば、配列番号91〜103の配列の一つを含む（又は、前記配列の一つからなる)、突然変異タンパク質の場合である。
【０１０６】
有利には、前記疎水性アミノ酸は、Ｖ、Ｉ、Ｌから選択され、好ましくはＶである。
【０１０７】
好ましくは、前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列は、上記の突然変異24P、133E、294A、439Pによって、及び、
・以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異：
○151位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
○162位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
及び、
・少なくとも一つの他の融合後突然変異、即ち、474位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換、好ましくは、Ｖ、Ｉ又はＬ、より好ましくはＶによる置換；
によって、このＦタンパク質の配列と相違する。
【０１０８】
これは、例えば、配列番号92、93、98、99、100、103の配列の一つを含む（又はそれらの配列の一つからなる）突然変異タンパク質の場合である。
【０１０９】
好ましくは、前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列は、上記の突然変異24P、133E、294A、439Pによって、及び、以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異：
○151位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
○162位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
によって、このＦタンパク質の配列と相違する。
【０１１０】
これは、例えば、配列番号92、93及び94〜103の配列の一つを含む（又はそれらの配列の一つからなる）突然変異タンパク質の場合である。
【０１１１】
好ましくは、前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列は、上記の突然変異24P、133E、294A、439Pによって、及び、
・以下から選択される少なくとも一つの融合前突然変異：
○53位アミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○406位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
及び、
・以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異：
○151位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
○162位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
によって、このＦタンパク質の配列と相違する。
【０１１２】
これは、例えば、配列番号92、93の配列の一つを含む（又はそれらの配列の一つからなる）突然変異タンパク質の場合である。
【０１１３】
好ましくは、前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列は、上記の突然変異24P、133E、294A、439Pによって、及び、二つの融合後突然変異、即ち、
○151位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
○162位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
によって、このＦタンパク質の配列と相違する。
【０１１４】
これは、例えば、配列番号92、93、97、100、102、103の配列の一つを含む（又はそれらの配列の一つからなる）突然変異タンパク質の場合である。
【０１１５】
本願は、より具体的には、図２Ｂに示されているわけではないが、PIV-5について上記表４に示されているものに対応するPIV-2 Ｆタンパク質の突然変異タンパク質を想定している：
・Ｆ PIV-5の突然変異49Aは、Ｆ PIV-2の突然変異53Aに対応する;
・Ｆ PIV-5の突然変異402Aは、Ｆ PIV-2の406Aに対応する;
・Ｆ PIV-5の突然変異147Vは、Ｆ PIV-2の151Vに対応する;
・Ｆ PIV-5の突然変異158Vは、Ｆ PIV-2の162Vに対応する;
・Ｆ PIV-5の突然変異463Vは、Ｆ PIV-2の474Vに対応する。
【表Ｃ】
0005823296.tif 000009
【０１１６】
表５に示した突然変異は、任意のPIV-2単離体、即ち、Greer単離体又は変異体の単離体のＦタンパク質に導入され得る。従って、より具体的には、それらは、図１Ｂに示した配列番号33のＦタンパク質配列中に導入され得る(GreerのＦタンパク質；配列番号90〜103）。
【０１１７】
切断サイト：
本発明に従って、本発明の突然変異タンパク質は、
・上述の突然変異；及び更に
・前記Ｆタンパク質の天然の切断サイトの、別の酵素的切断サイトによる置換、及び/または前記Ｆタンパク質の天然の切断サイト以外の酵素的切断サイトの前記Ｆタンパク質への挿入、好ましくは、前記Ｆタンパク質の天然の切断サイトの、別の酵素的切断サイトによる置換
によって、PIV-5またはPIV-2ウイルスのＦタンパク質の配列から導き出される配列を含み得る。
【０１１８】
PIV-5またはPIV-2のＦタンパク質の切断サイトは、このＦタンパク質の2つのサブユニット（F1及びF2）の切断サイトである。Ｆタンパク質の図解のための図９を参照されたい。
【０１１９】
PIV-5及びPIV-2のＦタンパク質の天然型において、この切断サイトは、フューリン（furines）により切断されるサイトである。
【０１２０】
PIV-5のＦタンパク質の天然型において、この切断サイトは、配列RRRRR (配列番号23) からなる。これは、PIV-5のＦタンパク質の天然型の98〜102位にある (図１Ａ、図９を参照)。PIV-5のＦタンパク質の天然（または自然）の切断サイトを含むPIV-5のＦタンパク質配列の断片の例は、以下のとおりである：
IGENLETIRNQLIPTRRRRRFAGVVIGL (配列番号24)。
【０１２１】
PIV-2のＦタンパク質の天然型において、切断サイトは、配列KTRQKR (配列番号25) からなる。これは、PIV-2のＦタンパク質の天然型の101〜106位にある (図１Ｂ参照)。PIV-2のＦタンパク質の天然（または自然）の切断サイトを含むPIV-2のＦタンパク質配列の断片の例は、LTPLIENLSKISTVTDTKTRQKRFAGVVVGLAALGVA (配列番号26) である。
【０１２２】
好ましくは、天然の切断サイト以外の前記切断サイトは、組織特異的切断サイトである。
【０１２３】
好ましくは、天然の切断サイト以外の前記切断サイトは、一または複数の腫瘍組織によって特異的に発現される酵素の切断サイトであり、更に好ましくは、一または複数の転移性組織によって酵素特異的に発現される酵素の切断サイトである。
【０１２４】
一例として、天然の切断サイト以外の前記切断サイトは、金属プロテアーゼの切断サイト、たとえばマトリクス金属プロテアーゼ9 (MMP-9) の切断部位であり得る；下記の例２を参照。
【０１２５】
マトリクス金属プロテアーゼ9 (MMP-9) の切断サイトは、配列PXXHy S/T (配列番号27)｛ここでX = 任意のアミノ酸、Hy = 任意の疎水性アミノ酸 (すなわち、F, M, V, L, Iから選択される任意のアミノ酸)｝を含んでいてもよいし、この配列からなっていてもよい。
【０１２６】
一例として、マトリクス金属プロテアーゼ9 (MMP-9) の切断サイトは、配列PRRIT (配列番号28) 及び/または配列
IGENLETIRNQLIPTPRRITFAGVVIGL (配列番号29)
を含んでいてもよいし、この配列からなっていてもよい。
【０１２７】
そのような切断サイトを（天然の切断サイトの置換によって）含む本発明の突然変異タンパク質の例は、Ｆタンパク質（PIV-5の）に導き出される配列が配列番号８８又は８９の配列である、突然変異タンパク質（それぞれ、Fus8M及びFus8.7M；下記の実施例２を参照）を含む。
【０１２８】
本発明の核酸：
また本出願は、本発明による突然変異タンパク質をコードする核酸、DNAまたはRNA (普遍的な遺伝暗号に従って、この遺伝暗号の縮重を許容する)、並びにかかる核酸の相補的核酸（同じ長さの完全に相補的な核酸）に関する。
【０１２９】
かかる核酸は、配列番号30の配列 (天然のPIV-5 Ｆタンパク質をコードする配列)、または前記代替配列「443にSを有する配列番号31」をコードする代替配列、または変異Ｆタンパク質をコードする変異配列、あるいは、配列番号32の配列 (天然のPIV-2 Ｆタンパク質をコードする配列)、または変異Ｆタンパク質をコードする変異配列から導き出される。
【０１３０】
本発明のベクター：
また本出願は、本発明による少なくとも一つの核酸を含む核酸ベクター、より具体的には、トランスフェクション、形質導入または形質転換ベクターに関する。
【０１３１】
有利には、かかるベクターは、発現ベクターであり得る。
【０１３２】
好ましくは、これは、動物細胞 (非ヒト動物細胞及び/またはヒト細胞) において、より好ましくは、
・ヒト細胞、有利には病的なヒト細胞、より具体的にはヒト腫瘍細胞、より好ましくは転移性黒色腫細胞において；または
・胎盤細胞において、
前記少なくとも一つの核酸の発現を許容するベクターである。
【０１３３】
かかる発現ベクターは、有利には、アデノウイルスベクターであり得る。
【０１３４】
前記アデノウイルスベクターは、前記核酸の発現を調節するためのエレメント、好ましくはプロモーターを含んでいてもよく、腫瘍細胞、好ましくは転移性細胞、より好ましくは転移性黒色腫細胞において前記核酸の発現を許容する。
【０１３５】
好ましくは、この発現は特異的である。有利には、この発現は、非腫瘍 (または非転移性) 細胞において有意な発現は存在しないが、前記腫瘍細胞または転移性細胞において前記核酸の発現を許容するように十分に特異的である。
【０１３６】
有利には、かかるアデノウイルスベクターは、腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターである。
【０１３７】
有利には、本発明の発現ベクターは、前記核酸の発現を調節するためのエレメント、好ましくはプロモーターを含み、胎盤細胞、好ましくは不十分な膜融合性 (fusogenicity) を有する病的な胎盤細胞において前記核酸の発現を許容する、アデノウイルスベクターであり得る。
【０１３８】
好ましくは、この発現は特異的である。有利には、この発現は、非胎盤細胞において有意な発現は存在しないが、前記胎盤細胞において前記核酸の発現を許容するように十分に特異的である。
【０１３９】
本発明のベクターは、択一的または補足的に、動物細胞 (非ヒト動物細胞及び/またはヒト細胞)、より好ましくはヒト細胞、有利には病的なヒト細胞、より具体的にはヒト腫瘍細胞、好ましくは転移性ヒト細胞、より好ましくは転移性黒色腫細胞のゲノムへの、前記少なくとも一つの核酸の挿入を許容するベクターであり得る。かかるベクターは、より具体的には、腫瘍、具体的には転移性腫瘍、より具体的には転移性黒色腫の遺伝子治療のために向けられる。
【０１４０】
また本出願は、本発明の少なくとも一つの核酸を含み、動物細胞 (非ヒト動物細胞及び/またはヒト細胞)、より好ましくはヒト細胞、有利には胎盤細胞、好ましくはヒトの胎盤細胞のゲノムへの、前記少なくとも一つの核酸の挿入を許容する、ベクターに関する。かかるベクターは、より具体的には、不完全な胎盤の発達を伴う疾病または状態の遺伝子治療のために向けられる。
【０１４１】
本発明の細胞：
また本出願は、本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質、及び/または本発明による少なくとも一つの核酸、DNAまたはRNA、及び/または本発明による少なくとも一つのベクターを含む細胞に関する。
【０１４２】
かかる細胞は、ヒト細胞または非ヒト動物細胞であり得る。
【０１４３】
好ましくは、かかる細胞は、腫瘍細胞、好ましくは転移性細胞、より好ましくは転移性黒色腫細胞である。
【０１４４】
かかる細胞は、後述されるとおり、シンシチウムの形成を誘導することができる膜融合 (fusogenic) 能力を備えた細胞としての適用を見出す。
【０１４５】
あるいは、本発明の細胞は、ヒトまたは非ヒト動物の免疫系の非腫瘍細胞、好ましくは非腫瘍性のヒトまたは非ヒト動物の樹状細胞であってもよく、前記細胞は、本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質をその表面で発現している。かかる細胞は、後述されるとおり、たとえば活性な免疫処置により、細胞融合阻害剤の産生を誘導することができる薬剤としての適用を見出す。
【０１４６】
医学的適用 (融合促進(pro-fusion))：
本発明の突然変異タンパク質、及び/または本発明の核酸、DNAまたはRNA、及び/または本発明のベクター、及び/または本発明の細胞は、病的な細胞及び/または生物の健康に好ましくない細胞の存在及び/または増殖を伴う疾病または状態の治療及び/または予防及び/または緩和において、より具体的には、不十分な細胞の膜融合性 (cellular fusogenicity) を伴う疾病または状態の治療及び/または予防及び/または緩和において、好ましくは疾病または腫瘍形成状態、たとえば腫瘍、転移性腫瘍、有利には転移性黒色腫の治療及び/または予防及び/または緩和において使用され得る。
【０１４７】
かかる疾病または状態は、これらの病的な細胞及び/または好ましくない細胞の低減または除去により、治療及び/または予防及び/または緩和され得る。
【０１４８】
かかる細胞の表面で発現される本発明の突然変異タンパク質は、これら細胞の融合を誘導し、その結果、シンシチウムの形成を誘導し、これら細胞の破壊（または少なくとも数の減少）につながる。
【０１４９】
本発明の突然変異タンパク質、及び/または本発明の核酸、DNAまたはRNA、及び/または本発明のベクター、及び/または本発明の細胞は、胎盤の発達不全を伴う疾病または状態の治療及び/または予防及び/または緩和において使用され得る。
【０１５０】
かかる疾病または状態は、胎盤細胞の融合の誘導または刺激により、治療及び/または予防及び/または緩和され得る。
【０１５１】
よって、本出願はまた、本発明の少なくとも一つの突然変異タンパク質、及び/または本発明の少なくとも一つの核酸、DNAまたはRNA、及び/または本発明の少なくとも一つのベクター、及び/または本発明の細胞を含む、薬学的組成物または薬に関する。
【０１５２】
かかる薬学的組成物またはかかる薬は、上述のような病的な細胞及び/または生物の健康に好ましくない細胞の存在及び/または増殖を伴う疾病または状態 (例として、腫瘍、転移性腫瘍、転移性黒色腫) の治療及び/または予防及び/または緩和、あるいは不十分な細胞の膜融合性 (cellular fusogenicity) を伴う疾病または状態 (例として、胎盤の発達不全) の治療及び/または予防及び/または緩和に向けられてもよい。
【０１５３】
かかる薬学的組成物またはかかる薬は、少なくとも一つの薬学的及び/または生理学的に許容可能な賦形剤を更に含んでもよい。
【０１５４】
本発明の突然変異タンパク質 (または本発明の核酸、DNA、RNA、または発現ベクター) は、ヒト細胞または非ヒト動物細胞により発現されるように、好ましくはかかる細胞の表面で発現されるように使用され得る。
【０１５５】
この細胞は、病的な細胞、好ましくは腫瘍細胞、より好ましくは転移性細胞、より好ましくは転移性黒色腫細胞であってもよいし、非腫瘍細胞、たとえば健康な細胞であってもよい。
【０１５６】
より具体的には、ヒト患者または病気の非ヒト動物被検体から取り出された病的な細胞を、本発明の少なくとも一つの突然変異タンパク質、及び/または本発明の少なくとも一つの核酸、DNAまたはRNA、及び/または本発明の少なくとも一つの発現ベクターと、本発明の突然変異タンパク質を発現させるように接触させることにより、エクスビボで(ex vivo)(またはインビトロで) 処理してもよい。
【０１５７】
択一的または補足的に、患者または被検体の病的な細胞の近くに局在するが病的でない細胞を、当該処理を行うために取り出してもよい。
【０１５８】
このようにエクスビボで(またはインビトロで)処理された細胞は、その後、前記患者または被検体に再投与するように向けられてもよい。
【０１５９】
かかる細胞は、前記患者または被検体が冒されている病状、たとえば腫瘍、転移性腫瘍、転移性黒色腫の治療及び/または予防及び/または緩和のために有用である。
【０１６０】
あるいは、この細胞は、胎盤の細胞、より具体的には、不十分な膜融合性(fusogenicity)に罹患している胎盤の細胞であり得る。かかる細胞は、本発明の突然変異タンパク質をその表面で発現させることにより一旦処理されると、胎盤の発達不全の治療及び/または予防及び/または緩和に向けられてもよい。
【０１６１】
よって本出願は、より具体的には、疾病または腫瘍形成状態、好ましくは腫瘍、より好ましくは転移性腫瘍、更に好ましくは転移性黒色腫の治療及び/または予防及び/または緩和において使用するための、本発明による突然変異タンパク質、本発明による核酸、DNAまたはRNA、本発明によるベクター、本発明による細胞に関する。
【０１６２】
また本出願は、より具体的には、胎盤の発達不全の治療及び/または予防及び/または緩和において使用するための、本発明による突然変異タンパク質、本発明による核酸、DNAまたはRNA、本発明によるベクター、本発明による細胞に関する。
【０１６３】
本発明による融合阻害剤：
また本出願は、細胞融合を減少させるかまたは遮断する能力を有する生成物に関する。これら生成物は、本発明の一または複数の突然変異タンパク質の阻害剤である。
【０１６４】
かかる阻害剤は、過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態の治療及び/または予防及び/または緩和において、好ましくはエンベロープに包まれたウイルスの感染（たとえばHIV、インフルエンザ、パラインフルエンザまたはラブドウイルスの感染）、アレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶の治療及び/または予防及び/または緩和において使用され得る。
【０１６５】
好ましくは、本発明による阻害剤は、以下のとおりである：
・本発明による突然変異タンパク質に対する抗体、またはかかる抗体のFabもしくはF(ab’)2断片；または
・本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質に、または本発明による核酸、DNA、RNAに、特異的に結合する核酸アプタマーまたはペプチドアプタマー；または
・本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質をその表面で発現する、組換え免疫系細胞、好ましくは組換え樹状細胞；または
・本発明による核酸のアンチセンス核酸；または
・19〜22のヌクレオチドを含有する二本鎖ＲＮＡを含み、かつ本発明による核酸に結合する（ハイブリダイズする）ことができる、低分子干渉（small interfering）RNA、siRNA。
【０１６６】
よって、本出願はまた、ヒトまたは非ヒト動物の免疫系の非腫瘍細胞、好ましくはヒトまたは非ヒト動物の樹状細胞であって、本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質をその表面で発現する細胞に関するとともに、過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態の治療及び/または予防及び/または緩和における、好ましくはエンベロープに包まれたウイルスの感染（たとえばHIV、インフルエンザ、パラインフルエンザまたはラブドウイルスの感染）、アレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶の治療及び/または予防及び/または緩和における、この細胞の使用に関する。
【０１６７】
また本出願は、本発明による突然変異タンパク質または本発明の幾つかの突然変異タンパク質に対する抗体に関する。好ましくは、この抗体は、本発明の一つ又は複数の前記突然変異タンパク質に特異的な抗体である。有利には、この抗体はモノクローナル抗体である。本発明の阻害剤は、かかる抗体の保存された断片、たとえばFabまたはF(ab')2断片であり得る。
【０１６８】
かかる抗体または抗体断片は、たとえば、それを必要とする患者または被検体に前記抗体または抗体断片を投与することにより、細胞融合メカニズムを遮断または阻害するように向けられてもよい。
【０１６９】
択一的または補足的に、本発明の突然変異タンパク質は、このタンパク質に対して活性な免疫化を誘導するために、すなわち、前記患者または被検体による抗−突然変異タンパク質抗体の産生を誘導するために、前記患者または被検体にそれ自体投与するように向けられてもよい。必要な場合または所望の場合、一または複数のワクチンアジュバントが、前記突然変異タンパク質の一または複数と一緒に、または異なる時間で投与されてもよい。
【０１７０】
よって、本出願はまた、免疫原性剤としての本発明の少なくとも一つの突然変異タンパク質、及び有利には少なくとも一つの免疫化アジュバントを含む、治療用及び/または予防用及び/または緩和用ワクチンに関する。かかるワクチンは、過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態の治療及び/または予防及び/または緩和のため、好ましくは、エンベロープに包まれたウイルスの感染（たとえば、HIV、インフルエンザ、パラインフルエンザまたはラブドウイルスの感染）、アレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶の治療及び/または予防及び/または緩和のために向けられてもよい。
【０１７１】
また本出願は、以下のものに関する：
・本発明の少なくとも一つの突然変異タンパク質に、または本発明の核酸、DNA、RNAに、特異的に結合する核酸アプタマーまたはペプチドアプタマー；
・本発明の少なくとも一つの突然変異タンパク質をその表面で発現する、組換え免疫系細胞、好ましくは組換え樹状細胞；
・本発明の核酸のアンチセンス核酸；
・19〜22のヌクレオチドを含有する二本鎖ＲＮＡを含み、かつ本発明の核酸に結合する（ハイブリダイズする）ことができ、有利には前記核酸の転写を遮断または阻害することができる、低分子干渉（small interfering）RNA、siRNA。
【０１７２】
また、かかる生成物は、本発明の阻害剤でもある。よって、これらは、上述のような過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態の治療及び/または予防及び/または緩和のために向けられてもよい。より具体的には、これらは、Ｆタンパク質の発現または過剰発現について少なくとも一つの遺伝子を伴う疾病または状態の治療及び/または予防及び/または緩和のために向けられる。
【０１７３】
よって、本出願はまた、本発明の少なくとも一つの阻害剤を含む薬学的組成物または薬に関する。
【０１７４】
かかる薬学的組成物または薬は、とりわけ、上述のような過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態の治療及び/または予防及び/または緩和のために向けられてもよい。
【０１７５】
かかる薬学的組成物または薬は、少なくとも一つの薬学的及び/または生理学的に許容可能な賦形剤を更に含んでもよい。
【０１７６】
本出願は、より具体的には、過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態の治療及び/または予防及び/または緩和において使用するための本発明による阻害剤であって、前記疾病または状態が、エンベロープに包まれたウイルスの感染（好ましくは、HIV及び/またはインフルエンザ及び/またはパラインフルエンザ及び/またはラブドウイルスの感染）、アレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶である阻害剤に関する。
【０１７７】
本出願は、より具体的には、過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態の治療及び/または予防及び/または緩和において免疫原性剤として使用するための本発明による突然変異タンパク質であって、前記疾病または状態が、エンベロープに包まれたウイルスの感染（好ましくは、HIV及び/またはインフルエンザ及び/またはパラインフルエンザ及び/またはラブドウイルスの感染）、アレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶である突然変異タンパク質に関する。
【０１７８】
本出願は、より具体的には、ワクチンまたはワクチン組成物、より具体的には、過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態の治療及び/または予防及び/または緩和のために向けられたワクチンまたはワクチン組成物であって、前記疾病または状態が、エンベロープに包まれたウイルスの感染（好ましくは、HIV及び/またはインフルエンザ及び/またはパラインフルエンザ及び/またはラブドウイルスの感染）、アレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶であるワクチンまたはワクチン組成物に関する。かかるワクチンまたはワクチン組成物は、少なくとも本発明による突然変異タンパク質を含み、少なくとも一つの生理学的に許容可能なアジュバントを任意に含む。
【０１７９】
診断及び予後の適用：
また本出願は、
・不十分なシンシチウムの形成、たとえば、腫瘍、転移性腫瘍、転移性黒色腫または胎盤の発達不全；あるいは対照的に
・過剰なシンシチウムの形成、たとえば、エンベロープに包まれたウイルスの感染（好ましくは、HIV及び/またはインフルエンザ及び/またはパラインフルエンザ及び/またはラブドウイルスの感染）、アレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶
を伴う疾病または状態の診断または予後のための方法、より具体的にはインビトロでの方法に関する。
【０１８０】
本発明の診断または予後の方法は、たとえば、診断または予後を受ける患者または被検体から採取された生物学的サンプルなどの生物学的サンプルにおいて、本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質または本発明による少なくとも一つの核酸を検出することを含む。
【０１８１】
この検出は、たとえば、前記サンプル中に含有されるタンパク質または核酸の配列を決定することにより行ってもよい。
【０１８２】
この検出は、たとえば、前記少なくとも一つの突然変異タンパク質に結合する抗体、ペプチドアプタマーまたはオリゴヌクレオチドアプタマーを用いて、より具体的には、本発明の抗体、ペプチドアプタマーまたはオリゴヌクレオチドアプタマーを用いて、本発明の前記少なくとも一つの突然変異タンパク質を検出することにより行ってもよい。
【０１８３】
この検出は、たとえば、前記少なくとも一つの核酸に結合する核酸、ペプチドアプタマーまたはオリゴヌクレオチドアプタマーを用いて、より具体的には、本発明の核酸に相補的な核酸、本発明のペプチドアプタマーまたはオリゴヌクレオチドアプタマーを用いて、本発明の前記少なくとも一つの核酸を検出することにより行ってもよい。
【０１８４】
また本出願は、不十分なシンシチウムの形成または対照的に過剰なシンシチウムの形成の診断または予後のための方法で使用するための、前記抗体、ペプチドアプタマー、オリゴヌクレオチドアプタマー、相補的な核酸に関する。
【０１８５】
生物工学的適用 (スクリーニング)：
また本出願は、シンシチウムの形成を減少させるかまたは遮断することができる化合物をスクリーニングするための方法、より具体的にはインビトロでの方法に関する。本発明の方法は、(たとえば、候補化合物の存在下で達成される融合度を、その非存在下で達成される融合度と比較することにより) 候補化合物が前記細胞の融合を減少させるかまたは遮断するかどうかを決定するために、候補化合物を、本発明の少なくとも一つの突然変異タンパク質を発現する細胞と接触させることを含む。
【０１８６】
かかる化合物は、過剰な細胞の膜融合性（cellular fusogenicity）を伴う疾病または状態、たとえば、エンベロープに包まれたウイルスの感染、アレルギー、自己免疫疾患または移植片拒絶の治療及び/または予防及び/または緩和のための有効成分候補である。
【０１８７】
生物工学的適用 (骨髄腫、ハイブリドーマ)：
また本出願は、本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質を含む、好ましくは少なくとも一つのかかる突然変異タンパク質をその表面に含む、及び/または本発明による少なくとも一つの核酸を含む、及び/または本発明による少なくとも一つのベクター、より具体的には本発明による発現ベクターを含む、腫瘍細胞、より具体的には骨髄腫に関する。
【０１８８】
かかる腫瘍細胞、より具体的にはかかる骨髄腫は、とりわけ、(この腫瘍細胞とBリンパ球との融合による)ハイブリドーマの産生、より具体的には抗体産生ハイブリドーマの産生に使用され得る。
【０１８９】
また本出願は、本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質、及び/または本発明による少なくとも一つの核酸、及び/または本発明による少なくとも一つのベクターを含む、ハイブリドーマ、より具体的には抗体産生ハイブリドーマに関する。かかるハイブリドーマは、とりわけ、本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質を含む、好ましくは少なくとも一つのかかる突然変異タンパク質をその表面に含む、及び/または本発明による少なくとも一つの核酸を含む、及び/または本発明による少なくとも一つのベクターを含む、少なくとも一つの腫瘍細胞、より具体的には骨髄腫と、少なくとも一つのBリンパ球を接触させることにより産生され得る。かかる腫瘍細胞は、固有の膜融合 (fusogenic) 能力を有する：よって、かかる腫瘍細胞は、従来技術においてハイブリドーマの産生を目的として腫瘍細胞とBリンパ球との融合を誘導するために慣用的に使用されるポリエチレングリコール(PEG)またはエレクトロポレーション法または任意の他の方法を使用することなく、前記少なくとも一つのBリンパ球と融合することができる。
【０１９０】
生物工学的適用 (幹細胞または前駆細胞)：
また本出願は、本発明による少なくとも一つの突然変異タンパク質を含む、好ましくは少なくとも一つのかかる突然変異タンパク質をその表面に含む、及び/または本発明による少なくとも一つの核酸を含む、及び/または本発明による少なくとも一つのベクター、より具体的には本発明による発現ベクターを含む、幹細胞または前駆細胞に関する。
【０１９１】
かかる幹細胞または前駆細胞は、固有の膜融合 (fusogenic) 能力を有する：よって、かかる幹細胞または前駆細胞は、融合によりシンシチウムを形成することができる。
【０１９２】
この幹細胞または前駆細胞が、筋細胞への分化能力を有している場合、(細胞の融合及びシンシチウムの形成により) 筋繊維を形成することができる。
【０１９３】
よって、本出願はまた、筋繊維の産生、たとえばインビトロでの産生において使用するための、かかる幹細胞または前駆細胞に関する。
【０１９４】
この産生は、たとえば、複数の前記幹細胞または前駆細胞を、互いに接触させて、幹細胞、または適切な場合には前駆細胞の増殖を許容する培地上または培地中に置くことにより行ってもよく、その結果、前記幹細胞または前駆細胞の膜融合(fusogenic)能力が発揮され、これによりシンシチウム、より具体的には筋繊維の形成を誘導することができる。幹細胞、または適切な場合には前駆細胞の増殖を許容し、かつ筋細胞、より具体的には筋繊維への可能な分化能力の発現に適している培地の例は、当業者に公知であり；一例は、MCDB培地である。
【０１９５】
幹細胞または前駆細胞の、筋細胞、より具体的には筋繊維への分化を観察することを許容する細胞マーカーの例は、当業者に公知であり、たとえばCD56である。
【０１９６】
本出願において、“含む(comprising)”の用語は、“包含する(including)”または“含有する(containing)”と同義であり、明示的に指摘されない一または複数の追加のエレメント、成分または工程の存在を除外しないオープンな用語であり、一方、“からなる(consisting)”または“構成される(constituted)”の用語は、明示的に開示されない任意の他の追加のエレメント、工程または成分の存在を除外するクローズした用語である。“から本質的になる(essentially consisting of)”または“により本質的に構成される(essentially constituted by)”の用語は、追加のエレメント、成分または工程が、発明に基づいて特徴に重大な影響を及ぼさない限り、一または複数の追加のエレメント、成分または工程の存在を除外しない部分的にオープンな用語である。
【０１９７】
その結果、“含む(comprising)”(または“comprise(s)”)の用語は、“からなる(consisting of)”、“により構成される（constituted by）”の用語、並びに“から本質的になる(essentially consisting of)”及び“により本質的に構成される(essentially constituted by)”の用語を包含する。
【０１９８】
本出願で引用される文献及び参照文献の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９９】
以下の実施例は、例示のために純粋に記載され、本発明を何ら限定するものではない。
【実施例】
【０２００】
例１：突然変異体の構築及びそれらの膜融合性（fusogenicity）の測定
材料及び方法及び：
細胞及びウイルス
細胞株LLC-MK2 (Macaca mulatta腎臓細胞株) は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション (American Type Culture Collection (ATCC)) から受入れ番号CCL-7で入手可能である。
【０２０１】
細胞株A549 (ヒト肺癌細胞株) は、ATCCから受入れ番号CCL-185で入手可能である。
【０２０２】
組換え株HuH7-Tat (ヒト肝癌細胞株) は、HIV-1 TatによるHuH-7株の細胞の形質導入により入手可能である。
【０２０３】
HuH-7株は、ジャパニーズ・コレクション・オブ・リサーチ・バイオリソース（Japanese Collection of Research Bioresources）からリファレンス番号JCRB0403で入手可能である。
【０２０４】
HIV-TatによるHuH-7株の形質導入は、レトロウイルスベクターLXSN-tatを用いて行い、Tatプラスミドを形質導入した。
【０２０５】
細胞LLC-MK2、A549及びHuH7-Tatは、5%ウシ胎仔血清を含むEMEM (イーグル最小必須培地) またはDMEM (ダルベッコ/フォークト改変イーグル最小必須培地) で培養した。
【０２０６】
PIV-5 WR株は、ATCC (ATCC番号VR-288) から入手し、Terrier et al, 2008に記載されるとおりLLC-MK2細胞上で培養した。
【０２０７】
RNAの抽出、RT-PCR及びクローニング
ウイルスRNAは、PIV-5によるLLC-MK2細胞の感染から得られた上清から、Absolutely RNA(登録商標) Microprep Kit (Stratagene, USA) を用いて、供給業者により提供される説明書に従って抽出した。逆転写は、pd(N)6ランダムヘキサマー (Amersham Biosciences, GB) 及び鳥類骨髄芽球症ウイルスAMVの逆転写酵素 (Reverse Transcriptase; RT) (Promega から入手可能なAMV-RT逆転写酵素) を用いて行った。
【０２０８】
PIV-5 Fの全配列の増幅は、データベースから入手可能なPIV-5のヌクレオチド配列 (GenBank受入れ番号AB021962) から設計されたプライマー対を用いて行った。
【０２０９】
使用されたプライマー対は、以下のとおりであった：
センスプライマー (配列番号 1)：
5' TTGCGGCCGCATGGGTACTATAA 3'
アンチセンスプライマー (配列番号 2)：
5' CCGCTCGAGTTATGATAAACAAAATTCTCC 3'。
【０２１０】
増幅は、以下のプロトコールに従って行った：95℃で2 min、その後39サイクル (95℃/30s、55℃/1 min、72℃/3 min)、及び72℃で10 minの最後の伸長。
【０２１１】
PIV-5 Fの相補的DNAは、マルチプルクローニングサイトにあるNotI及びXhoIサイトで、発現プラスミドpcDNA3.1(+) にクローニングした (図４参照)。
【０２１２】
PCR産物及びプラスミドは、それぞれ、Nucleospin(登録商標) ExtractIIキット及びNucleospin(登録商標) プラスミドキット (Macherey Nagel, Germany) を用いて、供給業者により提供される説明書に従って精製した。
【０２１３】
この研究における配列決定のシリーズは、MWG Biotech (Ebersberg, Germany) により実行した。
【０２１４】
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いた指定突然変異誘発
PIV-5のＦタンパク質の突然変異タンパク質は、PIV-5 F融合タンパク質をコードするプラスミドpcDNA3.1において、指定突然変異により産生した。突然変異は、供給業者により提供されるプロトコール (Stratageneから入手可能なQuickChange(登録商標) Site-Directed Mutagenesis System) に従って、相補的プライマーを用いたPCRにより作成した。使用されたプライマーのリストは、下記表２に示す。プラスミドのアセンブリは、配列決定により確認した。
【表Ｄ−１】
0005823296.tif 000010
【表Ｄ−２】
0005823296.tif 000011
【０２１５】
突然変異443Pは、理論的には、WR単離体のＦタンパク質に予め存在する。しかし、発明者らがATCCから受領したこの単離体のサンプルに、この突然変異は実際に存在しなかった。このため、発明者らはそれを導入しなければならなかった。
【０２１６】
細胞のトランスフェクション
試薬ExGen500 (Fermentas) を用いて、供給業者により提供される説明書に従って、細胞をプラスミドによりトランスフェクトした。1〜3マイクログラムのプラスミドDNAを、48hの間、細胞 (70〜80% コンフルエンス) に添加した。トランスフェクションの効率は、緑色蛍光タンパク質GFPをコードするプラスミドを用いて評価した。
【０２１７】
共焦点顕微鏡による免疫蛍光法
トランスフェクトされた細胞は、リン酸緩衝生理食塩水PBS中のパラホルムアルデヒド (1% v/v) を用いて固定し、その後、2回洗浄した。PBSで1/10に希釈された、PIV-5 Ｆタンパク質に対するモノクローナル抗体の存在下で、この場合、Randall et al, 1987に記載されるモノクローナル抗体F1aの存在下で、細胞マットを3hの間インキュベートした。モノクローナル抗体F1aは、PIV-5の単離体 (この場合、LN単離体) に対するマウスの免疫処置、ハイブリドーマの調製、及び特異的な抗F抗体の選択により得た。
【０２１８】
その後、細胞マットを洗浄し、PBSで1/200に希釈された抗マウスIgG-Alexa Fluor(登録商標) 633二次抗体 (Invitrogen) とともに30分間インキュベートした。細胞を、すすいだ後、1/1000のDapi (4',6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール) とともに、リン酸緩衝生理食塩水PBS中1/200の、Alexa Fluor(登録商標) 488に結合した小麦胚凝集素 (WGA) (Invitrogenから入手可能なWGA-Alexa Fluor(登録商標)) と混合するか、または混合せずに、10分間インキュベートした。TCS SP2共焦点顕微鏡 (Leica) を用いて、画像を取得した。
【０２１９】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーは、文献 (Horvat and Lamb 1992) に記載されるとおり行った。A549細胞を、種々のFusをコードするプラスミドによりトランスフェクトし、氷上に置いた。細胞マットを、1 %のアジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水PBSですすいだ。その後、そのマットに、抗PIV-5 Ｆタンパク質モノクローナル抗体 (この場合、モノクローナル抗体F1a) を添加し (1% ウシ胎仔血清を含む1/500 PBSリン酸緩衝液)、4℃で30分間インキュベートした。その後、そのマットをすすぎ、1/1000のAlexa Fluor(登録商標) 488 に結合した抗マウス二次抗体 (Invitrogen) の存在下でインキュベートした。細胞を、すすいだ後、500μLのPBSリン酸緩衝液、EDTA (エチレンジアミンジアミン四酢酸) 中0.5mMを用いて穏やかに引き離した。細胞を、500μLの1 %パラホルムアルデヒド溶液を含有する専用のフローサイトメトリー管に移した。5000細胞の蛍光強度を、蛍光活性化細胞ソーティングFACSを用いて、この場合、Becton DickinsonからのFACSVantageTM SEフローを用いて測定した。
【０２２０】
半定量的融合テスト (シンシチウムのサイズ及び核の数の関数として確立した融合スコア)
種々のFus発現プラスミドによりトランスフェクトし、免疫蛍光法で観察したマットに、半定量的分析を行った。この分析は、以下の基準を用いて突然変異体の各々について融合スコアを決定することから構成される：
・融合または融合なし (単純な集合)、-/+で表示; 
・シンシチウムのサイズ、1〜5のスケールで表示; 
・核の数、1〜5のスケールで表示。
【０２２１】
これにより計算されるスコアを、2つの点数を足すことにより得た：このため、最大の理論的点数は、10であり、最大数の核をもつ最大サイズのシンシチウムに相当する。
【０２２２】
定量的融合テスト (ルシフェラーゼ活性の測定) 
細胞−細胞融合を定量するために、“ドナー”A549細胞 (6ウェルプレートのウェルあたり2.5百万の細胞) を、種々のFus突然変異タンパク質をコードする2μgのプラスミドpcDNA3.1、並びに長い末端反復配列LTRに依存してルシフェラーゼを発現する50 ngのプラスミドで、同時トランスフェクトした (Lavillette et al, 2007)。
【０２２３】
ネガティブコントロールは、2μgの空のプラスミドpcDNA3.1で同時トランスフェクトした細胞により提供した。
【０２２４】
トランスフェクションから12時間後、“ドナー”細胞を、リン酸緩衝液 (PBS)、EDTA中0.5 mMを用いて引き離し、カウントした後に、新たな6ウェルプレート(105細胞/ウェル)に置き換えた。“インジケーター”HuH7-Tat細胞 (4 × 105細胞/ウェル) を、PBS-EDTA緩衝液を用いて引き離し、その後、すすいで“ドナー”細胞に添加した。
【０２２５】
ルシフェラーゼ活性は、共培養 (co-culture) の72時間後に、ルシフェラーゼ活性測定キットを用いて、この場合、PromegaからのLuciferase Assay System (E1500) キットを用いて、供給業者により提供される指示書に従って測定した。
【０２２６】
結果：
本発明者らにより構築され産生された突然変異タンパク質は、上記表３に示される。
【０２２７】
この表３において、本発明者らは、種々の突然変異を、それらが属する機能に従ってまとめた。すなわち、
・HNに対する自律性の機能への関与： PIV-5のＦタンパク質の22、132及び290位；
・融合前の機能への関与：PIV-5のＦタンパク質の49、402、443、447及び449位；
・融合後の機能への関与：PIV-5のＦタンパク質の147、158及び463位。
【０２２８】
図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ及び５Ｄは、表３の突然変異の位置を図示する。
【０２２９】
このように、本発明者らは、突然変異タンパク質を構築し、産生し、試験した。
【表Ｅ−１】
0005823296.tif 000012
【表Ｅ−２】
0005823296.tif 000013
【表Ｅ−３】
0005823296.tif 000014
【表Ｅ−４】
0005823296.tif 000015
【表Ｅ−５】
0005823296.tif 000016
【表Ｅ−６】
0005823296.tif 000017
【表Ｅ−７】
0005823296.tif 000018
【０２３０】
これら突然変異タンパク質の構築及び産生の間に使用されたPIV-5のＦタンパク質配列は、WR単離体の代替Ｆタンパク質配列であった。この代替配列は、443位のアミノ酸がPでなくSであることを除いて、配列番号31の配列 (Genbank配列) と同じであった (代替配列「443にSを有する配列番号31」)。
【０２３１】
このため、配列番号47〜79の配列は、前述の代替配列「443にSを有する配列番号31」内におけるアミノ酸の置換から得られる配列であり、このアミノ酸の置換は、上記表３に、これら配列の各々について示される。
【０２３２】
半定量的融合テストの間に顕微鏡下で行われた観察の写真を、図６Ａに示す。
【０２３３】
半定量的融合テストの最後に得られたスコアを、図６Ｂに示す。
【０２３４】
突然変異タンパク質Fus6、Fus 6.1、Fus 6.2及びFus 6.3は、多くの細胞の凝集という結果につながったが、細胞融合という結果につながらなかった。
【０２３５】
突然変異タンパク質Fus 3.3、Fus 3.1、Fus2、Fus 1.1、Fus 1.2及びFus 1は、ゼロの融合スコアを得た。
【０２３６】
突然変異タンパク質Fus 9、Fus7、Fus 3、Fus 5及びFus 4は、低い融合スコアを得た。
【０２３７】
Fus 4の融合スコアを超えて、有意な融合スコアを有する一連の突然変異タンパク質が分離した。すなわち、
・自律性の3つの突然変異及び融合前の突然変異449Pを共通に含む突然変異タンパク質のグループ、たとえば、突然変異タンパク質Fus8、Fus10、Fus10.4、Fus10.5、Fus11、Fus8.l、Fus8.2、Fus8.4、Fus8.5、Fus8.6、Fus8.7、Fus10.l、Fus10.2、Fus10.3；及び
・自律性の3つの突然変異、融合前の突然変異447P、及び少なくとも一つの融合後の突然変異 (147Vまたは158V) を共通に含む突然変異タンパク質のグループ、たとえば、Fus7.1、Fus7.2またはFus7.3。
【０２３８】
図７Ａ及び７Ｂは、テストされた突然変異タンパク質の選択物について、顕微鏡観察の写真を示し、融合スコアを示す。すなわち、自律性の３つの突然変異と融合前の突然変異449Pを共通に含む突然変異タンパク質のグループ、例えば、突然変異タンパク質Fus7.1、Fus7Fus8、Fus10、Fus10.4、Fus10.5、Fus11、Fus8.l、Fus8.2及びFus7、Fus8.4、Fus8.5、Fus8.6、Fus8.7、Fus10.l、Fus10.2、Fus10.3。
【０２３９】
図８Ａ、８Ｂ及び８Ｃは、「定量的」融合テスト（ルシフェラーゼによるテスト）を用いて得られた結果の図を示す。
【０２４０】
図８Ａ及び８Ｃは、自律性の３つの突然変異と融合前の突然変異449Pを共通に含む突然変異タンパク質、例えば突然変異タンパク質Fus8が、タンパク質Fus3よりも、天然の状況の模倣として、糖タンパクＨＮを伴っている場合でさえ、高い膜融合能力を有することを示す（実際に、３倍以上高い）（図８Ａ）。
【０２４１】
突然変異タンパク質Fus8.7は、突然変異タンパク質Fus8より高い膜融合能力を有し（ほぼ２倍高い）、それは、Fus3が天然の状況の模倣として糖タンパクＨＮを伴っている場合でさえ、タンパク質Fus3より高い（６倍以上高い）（図８Ｃ）。
【０２４２】
図８Ｂは、自律性の３つの突然変異と融合前の突然変異449Pを共通に含む突然変異タンパク質のグループの膜融合能力が、得られた表面発現の程度との単純な関連によるものではない事実を示している。実際に、Fus8の発現は、Fus3の発現の半分未満であった（図８Ｂ）。
【０２４３】
例２：転移性腫瘍組織により特異的に発現される酵素のサイトによる天然の切断サイトの置換
本発明の突然変異タンパク質、及びとりわけ上記表１に記載されるものは、天然のＦタンパク質の天然の切断サイトの置換により、たとえば、それを組織特異的な切断サイトで置換することにより、予め改変された。
【０２４４】
例として、ここで提示される本発明の突然変異タンパク質は、天然の切断サイトが転移性腫瘍組織により特異的に発現される酵素、すなわちマトリクス金属プロテアーゼ9 (MMP-9) のサイトにより置換されたものである。
【０２４５】
図９は、PIV-5 Ｆタンパク質の突然変異タンパク質について実行された置換を示す。
【０２４６】
PIV-5のＦタンパク質の天然の切断サイトは、以下のとおりである：
RRRRR (配列番号 23)。
【０２４７】
PIV-5のＦタンパク質の天然の切断サイトを含むＦタンパク質配列の断片の例は、以下のとおりである：
IGENLETIRNQLIPTRRRRRFAGVVIGL (配列番号 24)。
【０２４８】
MMP-9切断サイトのコンセンサス配列は、以下のとおりである：
PXXHyS/T (配列番号 27)
ここでX = 任意のアミノ酸、及び
ここでHy = 任意の疎水性アミノ酸 (すなわち、F、M、V、L、Iから選択される任意のアミノ酸)。
【０２４９】
MMP-9切断サイトの例は、以下のとおりである：
PRRIT (配列番号 28)。
【０２５０】
MMP-9切断サイトを含む本発明の突然変異Ｆタンパク質配列の断片の例は、以下のとおりである：
IGENLETIRNQLIPTPRRITFAGVVIGL (配列番号 29)。
【０２５１】
材料及び方法：
PIV-5のＦタンパク質の突然変異タンパク質は、上記例１に記載されるとおり産生した。
【０２５２】
選択された切断サイト、この場合、配列番号28のMMP-9切断サイトによる天然の切断サイトの置換は、以下のとおり行った：
切断サイトの置換は、融合タンパク質F PIV-5をコードするプラスミドpcDNA3.1において、3つの連続的な指定突然変異誘発により行った。突然変異は、供給業者により提供されるプロトコール (Stratageneから入手可能なQuickChange(登録商標) Site-Directed Mutagenesis System) に従って、相補的プライマーを用いたPCRにより作成した。プラスミドのアセンブリは、配列決定により確認した。
【０２５３】
1st 突然変異 R98P
センス 5' CCAGTTGATTCCAACTCCGAGGAGACGCCGGTTTGC 3' (配列番号80)
アンチセンス 5' GCAAACCGGCGTCTCCTCGGAGTTGGAATCAACTGG 3' (配列番号81)
2nd 突然変異 R101I
センス 5 ' GATTCCAACTCCGAGGAGAATCCGGTTTGCAGGAGTGGTG 3 ' (配列番号82)
アンチセンス 5 ' CACCACTCCTGCAAACCGGATTCTCCTCGGAGTTGGAATC 3' (配列番号83)
3rd 突然変異 R102T
センス 5' GATTCCAACTCCGAGGAGAATCACGTTTGCAGGAGTGGTGATTGG 3' (配列番号84) 
アンチセンス 5' CCAATCACCACTCCTGCAAACGTGATTCTCCTCGGAGTTGGAATC 3' (配列番号85)。
【０２５４】
細胞のトランスフェクション
試薬ExGen500 (Fermentas) を用いて、供給業者により提供される説明書に従って、細胞をプラスミドによりトランスフェクトした。1〜3マイクログラムのプラスミドDNAを、48hの間、細胞 (70〜80% コンフルエンス) に添加した。トランスフェクションの効率は、緑色蛍光タンパク質GFPをコードするプラスミドを用いて評価した。
【０２５５】
共焦点顕微鏡による免疫蛍光法
トランスフェクトされた細胞は、リン酸緩衝生理食塩水PBS中のパラホルムアルデヒド (1% v/v) を用いて固定し、その後、2回洗浄した。PBSで1/10に希釈された、融合タンパク質PIV-5 Fに対するモノクローナル抗体の存在下で、この場合、Randall et al, 1987に記載されるモノクローナル抗体F1aの存在下で、細胞マットを3hの間インキュベートした。モノクローナル抗体F1aは、PIV-5の単離体 (この場合、LN単離体) に対するマウスの免疫処置、ハイブリドーマの調製、及び特異的な抗F抗体の選択により得た。
【０２５６】
その後、細胞マットを洗浄し、PBSで1/200に希釈された抗マウスIgG-Alexa Fluor(登録商標) 633二次抗体 (Invitrogen) とともに30分間インキュベートした。細胞を、すすいだ後、1/1000のDapi (4',6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール) とともに、リン酸緩衝生理食塩水PBS中1/200の、Alexa Fluor(登録商標) 488に結合した小麦胚凝集素 (WGA) (Invitrogenから入手可能なWGA-Alexa Fluor(登録商標)) と混合するか、または混合せずに、10分間インキュベートした。TCS SP2共焦点顕微鏡 (Leica) を用いて、画像を取得した。
【０２５７】
結果：
本発明者らはこのように、突然変異タンパク質、例えば、その天然の切断サイトが配列番号28のMMP-9サイトにより置換されることにより、突然変異タンパク質Fus8及びFus8.7と相違する、タンパク質Fus8M及びFus8.7M（それぞれ、配列番号88及び89）を得た。
【０２５８】
Fus8 (配列番号65):
【化３】
0005823296.tif 000019
【０２５９】
天然の切断サイトは、98位から102位(RRRRR)である。
【０２６０】
Fus8M (配列番号88)：
【化４】
0005823296.tif 000020
【０２６１】
天然の切断サイトRRRRRは、サイトPRRIT (MMP-9のサイト)によって置換された。
【０２６２】
Fus8.7 (配列番号76)：
【化５】
0005823296.tif 000021
【０２６３】
天然の切断サイトは、98位から102位(RRRRR)である。
【０２６４】
Fus8.7M (配列番号89):
【化６】
0005823296.tif 000022
【０２６５】
天然の切断サイトRRRRRは、サイトPRRIT (MMP-9のサイト)によって置換された。
【０２６６】
得られた突然変異タンパク質は、それが由来する天然の切断サイトを有する突然変異タンパク質と同様に機能する（多数の核を含む大きいシンシチウム、表面発現及び高い膜融合性度の定量化の誘導）。
【０２６７】
その結果を図９に示す（実施例１に記載したような共焦点顕微鏡による免疫蛍光法）。
【０２６８】
切断サイトの修飾は、本発明の突然変異タンパク質の膜融合能力（極めて近い融合スコア）及び機能性を著しく改変しないように見える。
【０２６９】
PIV-2 Ｆタンパク質に由来する本発明の突然変異タンパク質に関して、同様の切断サイトの導入又は置換の操作が実行され得る。
【０２７０】
PIV-2のＦタンパク質の天然の切断サイトは、KTRQKR (配列番号25)であり；PIV-2 Ｆタンパク質の天然の切断サイトを含むＦタンパク質配列の断片の例は、LTPLIENLSKISTVTDTKTRQKRFAGVVVGLAALGVA (配列番号26)である。本発明の突然変異タンパク質において、この天然の切断サイト以外の切断サイトは、導入され得るか、又は、例えば組織特異的切断サイト、より具体的には転移性腫瘍組織によって特異的に発現される酵素、例えばマトリクス金属プロテアーゼ9 (MMP-9；例えば、配列番号27又は28のサイト)の切断サイトで置換され得る。
【０２７１】
参照文献
Baker et al, 1999, Mol Cell. 3(3):309-19. 
Chatziandreou et al, 2004, Journal of General Virology 85: 3007-3016. 
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Lavillette D. et al, 2007, J. Virol. 81(16): 8752-8765 
Paterson et al, 2000, Virology 270(l):17-30. 
Randall et al, 1987, J . Gen. Virol. 68(Pt 1l): 2769-2780 
Russell et al, 2003, J. Cell Biol. 163(2):363-74. 
Terrier et al, 2008, Journal of Clinical Virology, 2008, 43(1): 86-92. 
West et al, 2005, J Virol. 79(3):1543-1551.
以下に、本願出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］  前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列が、
・以下から選択される少なくとも一つの融合前突然変異：
○49位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○402位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
及び／又は
・以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異：
○147位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
○158位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
によって、前記Ｆタンパク質配列からさらに導き出されることを特徴とする突然変異タンパク質。
［２］  前記疎水性アミノ酸が、Ｖ、Ｉ、Ｌから選択され、好ましくはＶであることを特徴とする、［１］に記載の突然変異タンパク質。
［３］  前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列が、
○147位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
○158位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
から選択される少なくとも一つの融合後突然変異によって前記Ｆタンパク質配列からさらに導き出されることを特徴とする、［１］又は［２］に記載の突然変異タンパク質。
［４］  前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列が、配列番号68〜79の配列から選択される配列であることを特徴とする、［３］に記載の突然変異タンパク質。
［５］  前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列が、
・以下から選択される少なくとも一つの融合前突然変異：
○49位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○402位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
及び、
・以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異：
○147位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
○158位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
によって、前記Ｆタンパク質配列からさらに導き出されることを特徴とする、［１］、又は［２］に記載の突然変異タンパク質。
［６］  前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列が、配列番号68、69、70の配列から選択される配列である、［５］に記載の突然変異タンパク質。
［７］  前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列が、
・以下から選択される少なくとも一つの融合前突然変異：
○53位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○406位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
及び／又は
・以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異：
○151位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
○162位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
によって、前記Ｆタンパク質配列からさらに導き出されることを特徴とする、上記に記載の突然変異タンパク質。
［８］  前記疎水性アミノ酸が、Ｖ、Ｉ、Ｌから選択され、好ましくはＶである、［７］に記載の突然変異タンパク質。
［９］  前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列が、
○151位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
○162位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
から選択される少なくとも一つの融合後突然変異によって、前記Ｆタンパク質配列からさらに導き出されることを特徴とする、［７］又は［８］に記載の突然変異タンパク質。
［１０］  前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列が、
・以下から選択される少なくとも一つの融合前突然変異：
○53位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
○406位のアミノ酸のアミノ酸Ａによる置換；
及び、
・以下から選択される少なくとも一つの融合後突然変異：
○151位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
○162位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
によって、前記Ｆタンパク質配列からさらに導き出されることを特徴とする、［７］〜［９］の何れかに記載の突然変異タンパク質。
［１１］  前記Ｆタンパク質の配列から導き出される前記配列が、
○151位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換；
○162位のアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換
によって、前記Ｆタンパク質配列からさらに導き出されることを特徴とする、［７］〜［１０］の何れかに記載の突然変異タンパク質。
［１２］  天然の切断サイト以外の前記切断サイトが、一または複数の腫瘍組織によって酵素特異的に発現される切断サイトであることを特徴とする、上記の突然変異タンパク質。
［１３］  天然の切断サイト以外の前記切断サイトが、一または複数の転移性組織によって特異的に発現される酵素の切断サイトであることを特徴とする、［１２］に記載の突然変異タンパク質。
［１４］  天然の切断サイト以外の前記切断サイトが、金属プロテアーゼの切断サイトであることを特徴とする、［１２］又は［１３］のいずれかに記載の突然変異タンパク質。
［１５］  天然の切断サイト以外の前記切断サイトが、マトリクス金属プロテアーゼ９（ＭＭＰ−９）の切断サイトであることを特徴とする、［１２］〜［１４］のいずれかに記載の突然変異タンパク質。
［１６］  天然の切断サイト以外の前記切断サイトが、配列PXXHyS/T（配列番号27）を含み、ここで、X ＝ 任意のアミノ酸であり、Hy=F、M、V、L、Iから選択される任意のアミノ酸であることを特徴とする、［１２］〜［１５］のいずれかに記載の突然変異タンパク質。
［１７］  天然の切断サイト以外の前記切断サイトが、配列PRRIT（配列番号28）及び／又は配列IGENLETIRNQLIPTPRRITFAGVVIGL（配列番号29）を含むことを特徴とする、［１２］３０〜３６のいずれかに記載の突然変異タンパク質。
［１８］  配列番号８８又は８９の配列を含むことを特徴とする、［１２］〜［１７］の何れかに記載の突然変異タンパク質。
［１９］  発現ベクターであることを特徴とする、［１８］に記載のベクター。
［２０］  アデノウイルスベクターであることを特徴とする、［１９］に記載の発現ベクター。
［２１］  前記核酸の発現を制御するためのエレメントを含み、且つ、腫瘍細胞、好ましくは転移性細胞、より好ましくは転移性黒色腫細胞中の前記核酸の発現を可能にする、アデノウイルスベクターであることを特徴とする、［１９］又は［２０］に記載の発現ベクター。
［２２］  動物細胞、好ましくはヒト細胞、特にヒト腫瘍細胞、好ましくは転移性ヒト細胞のゲノムへの、より好ましくは転移性黒色腫細胞への、前記少なくとも一つの核酸の挿入を可能にするベクターであることを特徴とする、上記に記載のベクター。
［２３］  ヒト細胞又は非ヒト動物細胞であることを特徴とする、上記に記載の細胞。
［２４］  腫瘍細胞であり、好ましくは転移性細胞であり、より好ましくは転移性黒色腫細胞である、［２３］に記載の細胞。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【配列表】
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