(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内の対象の遺伝子の発現を非侵襲性で監視する方法であって、
ａ）
ａａ）メチル化プロモーター配列と、
ｂｂ）前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
ｃｃ）前記ｂｂ）の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を人体外又は動物体外の細胞内へ誘導するステップと、
ｂ）蛍光レポーターポリペプチドを励起させるために特定の波長で光を放射し、蛍光を発しているポリペプチドにより放射される特定の波長の光を検出する非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｃ）前記細胞をデメチル化薬と接触させるステップと、
ｄ）前記ステップｃ）の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｅ）前記ステップｂ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップｄ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
ｆ）前記ステップｅ）での比較に基づいて前記デメチル化薬により誘発された対象の前記遺伝子の発現についての増加を表すようにするステップとを少なくとも有し、対象のポリペプチドの前記遺伝子がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２のアミノ酸配列を持つＣＡＤＭ１である、方法。
【請求項２】
前記核酸分子が、正しいターゲッティング、識別及び位置決定又はこれらの組み合わせのため、ソノポレーション、局在注入、又は抗体を宿主細胞抗原へ搬送するリポソームのバッグの助けを借りて遺伝子移入により前記細胞へ導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞を対象の遺伝子の発現に影響する化合物と接触させる時間にわたって前記細胞内の対象の前記遺伝子の発現を監視し、よって前記化合物の効果を監視するための請求項１又は２に記載の方法の使用。
【請求項４】
種々異なるデメチル化薬を別々に又は組み合わせてテストして、最も効果があるデメチル化薬を識別するための請求項１に記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象の遺伝子の発現に影響する化合物と細胞を接触させるとき、細胞内の対象の遺伝子の発現を非侵襲的に監視する方法に関する。
【０００２】
このように、本発明は、デメチル化薬と細胞を接触させるとき、細胞内の対象の遺伝子の発現の増加を監視する方法に関する。本発明は、また、ＲＮＡｉと細胞を接触させるとき、細胞内の対象の遺伝子の発現の減少を監視することに関する。前記方法は、人体又は動物の体内又は体外で実施される。
【０００３】
本発明は、また、蛍光レポーターポリペプチド及び対象のポリペプチドの遺伝子をコード化する配列を有する異なる核酸分子と関連する。
【背景技術】
【０００４】
今日の薬の主要なタスクの１つは、間違って調整されたと疑われる、又は間違って調整されていると知られている遺伝子の発現に選択的に影響を与えることができる治療体系の開発である。影響を受ける遺伝子に依存して、これは、例えば癌のような重篤な疾患を明示する。この分野において、多くの努力がなされてきたが、ここまで得られた結果を改善し、結果を、例えば治療の効果及び／又は治療化合物の送出を容易に監視できるシステムと組み合わせるための必要性が依然ある。
【０００５】
概して、遺伝子発現の概念は、ＤＮＡレベルで、両方が特定機能を呈するタンパク質又はＲＮＡに対する特定の配列による符号化である、幾つかのステップを含んで要約できる。第１のステップにおいて、ＤＮＡは、対応するＲＮＡに転写される。転写に肯定的及び否定的に影響を与える転写ファクタ及び更に上流又は下流の調整ＤＮＡ要素だけでなく、しばしば５´末端でコード配列の近くに、いわゆるプロモーター領域を含むことにより、このステップは厳しく制御される。タンパク質が遺伝子の発現の最終製品である場合、転写されたＲＮＡはｍＲＮＡと呼ばれる。第２のステップにおいて、このｍＲＮＡはタンパク質に翻訳され、前記タンパク質は、後続のステップにおいて、更にオプションで、翻訳後に修正される。ＲＮＡが最終製品である場合、転写されたＲＮＡは、例えばタンパク質を有する複合体に含まれるだけでなく、再編成され、処理される。このように、例えば、第１のステップ、すなわち転写に影響を与えるファクタをターゲットとすることにより、ＤＮＡレベルで遺伝子発現に影響することが可能である。また、第２のステップがターゲットにされてもよい：最終製品としてタンパク質の場合、ｍＲＮＡの翻訳が、最終製品としてＲＮＡの場合、処理等がブロックされる。方法により最終的に転写されたＲＮＡの劣化と結果的になる場合、最終製品が得られず、よって、第２のステップが阻害される。
【０００６】
疾患が遺伝子の下方制御により、又は更にその完全な発現停止（サイレンシング）によって生じる場合、治療効果は、通常のレベルに対する内因性遺伝子の上方制御であるべきである。特定のタイプの癌に対して、例えば、顕著な癌抑制遺伝子は、発現停止されると知られていて、よって、これらの対応する腫瘍抑制機能を呈することができない。ＤＮＡメチル化は、遺伝子発現低下／発現停止のための主要な理由として識別された。前記メチル化は、対応する遺伝子のプロモーター領域でしばしば見つかる。これらの場合、遺伝子発現は、ＤＮＡからメチレン基を除去することにより回復する。遺伝子の発現低下／発現停止は、また、この遺伝子に対する負の転写制御因子として作用する転写制御因子の上方制御により、遺伝子の発現を妨害する。これらの場合、治療は、転写制御因子をコード化する遺伝子の発現低下、よって、転写制御因子のレベルを低下させることに向けられるべきである。
【０００７】
遺伝子の上方制御が疾患に対する原因である場合、治療効果はそれに応じて通常のレベルまで前記内因性遺伝子の発現低下でなければならない。ほとんど全てのタイプの癌において、遺伝子は、上方制御であることは知られている。これらは、一般に、癌遺伝子又は癌原遺伝子と呼ばれ、癌原遺伝子は、例えば細胞の激増に直接影響を及ぼさないが、例えば他の遺伝子が上方制御することにより間接的に影響を及ぼす。ＲＮＡｉ方法が、遺伝子発現を発現低下するために使用される。「ＤＮＡ―レベル」に直接作用する脱メチル化薬とは対照的に、ＲＮＡｉ方法は、典型的には、遺伝子発現の第２のステップ、すなわち、タンパク質への翻訳又は対応するＲＮＡへの処理に作用する。これらの方法は、最終的に転写されたＲＮＡの劣化につながる。よって、遺伝子発現のプロセス全体は、ＲＮＡｉにより阻止される。これは、ＲＮＡｉによる遺伝子の「発現停止（サイレンシング）」とも呼ばれる。機械学的に、人工的に導入された「ＲＮＡ」（例えば、ベクトルから転写され、ＲＮＡ―デュプレックス等として導入される）が処理され、１つの鎖が、配列に特有の態様で転写されたＲＮＡを認識する複合体に組み込まれる。よって、導入されたＲＮＡの配列は、目標とされた「停止されるべき遺伝子」を特定する。ハイブリダイゼーション、認識、複合体形成の後で、目標とされたＲＮＡは、他のメカニズムにより分解される。
【０００８】
遺伝子の発現に影響する治療システムの効果を監視する現在の方法は、主に、治療システムが適用される前後で、疾患、例えば腫瘍の状態を比較することに依存する。よって、例えば、Ｘ線又は超音波方法が、治療の前後の腫瘍のサイズを決定するために使用される。しかしながら、斯様なシステムでは、遺伝子発現上の前記治療の効果を直接監視することも、対応する化合物が本当に影響を受けた組織に局在したかどうかを分析することもできない。他の方法は、治療の結果を決定するために、組織サンプルを必要とする。このように、生検又は更に外科的ステップが必要であり、これは、しばしば感染症のような更なる課題を伴う。さらに、また、事後の分析だけが可能となっている。
【０００９】
結果として、非侵襲性の態様で、目標とされた遺伝子の発現についてのこれらの治療法の効果及びアプリケーションを監視可能にする方法と遺伝子発現に影響する治療法とを確立又は改善するニーズがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
細胞を対象の遺伝子の発現に影響する化合物と接触させるとき、細胞内の対象の遺伝子の発現を非侵襲性で監視するための化合物及び方法を提供することが、本発明の目的である。
【００１１】
後続の説明から明らかになるように、本発明のこれら及び他の目的は、独立請求項の主題により解決される。従属項は、本発明の好ましい幾つかの実施例に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一つの態様によると、
ａ）
ａａ）プロモーター配列と、
ｂｂ）動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
ｃｃ）動作的に前記ｂｂ）の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を前記細胞内へ誘導するステップと、
ｂ）非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｃ）前記細胞を対象の前記遺伝子の発現に影響する化合物と接触させるステップと、
ｄ）前記ステップｃ）の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｅ）前記ステップｂ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップｄ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
ｆ）前記ステップｅ）での比較に基づいて前記化合物により誘発された対象の前記遺伝子の発現についての変化を割り当てるステップとを少なくとも有する、細胞内の対象の遺伝子の発現を非侵襲性で監視する方法が提供される。
【００１３】
上述された方法に関係する好ましい実施例では、本発明は、
ａ）
ａａ）メチル化プロモーター配列と、
ｂｂ）動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
ｃｃ）動作的に前記ｂｂ）の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を前記細胞内へ誘導するステップと、
ｂ）非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｃ）前記細胞をデメチル化薬と接触させるステップと、
ｄ）前記ステップｃ）の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｅ）前記ステップｂ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップｄ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
ｆ）前記ステップｅ）での比較に基づいて前記デメチル化薬により誘発された対象の前記遺伝子の発現についての増加を割り当てるステップとを少なくとも有する、細胞内の対象の遺伝子の発現を体内で非侵襲性で監視する方法を記述する。
【００１４】
更に好ましい実施例では、本発明は、
ａ）
ａａ）メチル化プロモーター配列と、
ｂｂ）動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
ｃｃ）動作的に前記ｂｂ）の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を、人体外又は動物体外の細胞内へ誘導するステップと、
ｂ）非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｃ）前記細胞をデメチル化薬と接触させるステップと、
ｄ）前記ステップｃ）の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｅ）前記ステップｂ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップｄ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
ｆ）前記ステップｅ）での比較に基づいて前記デメチル化薬により誘発された対象の前記遺伝子の発現についての増加を割り当てるステップとを少なくとも有する、対象の遺伝子の発現を非侵襲性で監視する方法を記述する。
本発明の他の実施例は、
ａ）メチル化プロモーター配列と、
ｂ）動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
ｃ）動作的に前記ｂ）の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する前述の方法のために使用できる単離された核酸分子に関する。
【００１５】
蛍光リポータ・ポリペプチドをコード化する配列に融合される対象のポリペプチドの遺伝子をコード化する配列を有するコード配列は、５'末端で単一の開始コドン及び３'末端で単一の停止コドンを有する。ここで使用される用語「単一の開始コドン」は、他の内部ＡＴＧコドンの存在を除外しない。しかしながら、これら後者のコドンは、翻訳を開始してはならない。
【００１６】
本発明の好ましい実施例において、本発明のこの態様における対象の遺伝子は、そのサイレンシングのため、疾患の原因となる疑わしい遺伝子又は癌抑制遺伝子である。
【００１７】
よって、他の好ましい実施例では、本発明は、
ａ）メチル化プロモーター配列と、
ｂ）動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、ＣＡＤＭ１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）、Ｒｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）、ＺＭＹＮＤ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）、ＲＡＳＳＦ５（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）、ＰＴＥＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５）、ＳＥＲＰＩＮＢ５（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６）、ＥＰＢ４１Ｌ３（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）、及びＤＡＰＫ１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）を有するポリペプチドのグループから選択されたポリペプチドをコード化する配列と、
ｃ）動作的に前記ｂ）の配列と融合した、蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する単離された核酸分子であって、前記ｂ）及び前記ｃ）から成るコード配列が、５’末端で単一の開始コドンと、３’末端で単一の停止コドンとを有する前述の方法のために使用できる単離された核酸分子に関する。
【００１８】
好ましくは、上記項目ｂ）で参照される配列は、ＣＡＤＭ１（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）及び／又はＲｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）から選択される。
【００１９】
他の好ましい実施例では、本発明は、
ａ）
ａａ）プロモーター配列と、
ｂｂ）動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象の前記遺伝子の機能的でないポリペプチドをコード化する配列と、
ｃｃ）動作的に前記ｂｂ）の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を前記細胞内へ誘導するステップと、
ｂ）非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｃ）前記細胞を対象の前記遺伝子に対して調整されたＲＮＡｉと接触させるステップと、
ｄ）前記ステップｃ）の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｅ）前記ステップｂ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップｄ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
ｆ）前記ステップｅ）での比較に基づいて前記ＲＮＡｉにより誘発された対象の前記遺伝子の発現についての減少を割り当てるステップとを少なくとも有する生体内の細胞内の対象の遺伝子の発現の減少を非侵襲性で監視する方法を記述する。
【００２０】
本発明は、更に、
ａ）プロモーター配列と、
ｂ）動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象の遺伝子の機能的でないポリペプチドをコード化する配列と、
ｃ）動作的に前記ｂ）の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する斯様な方法に使用できる核酸分子に関する。
【００２１】
蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列に融合される対象の遺伝子の機能しないポリペプチドをコード化する配列を有するコード配列は、５'末端で単一の開始コドン及び３'末端で単一の停止コドンを有する。ここで使用される用語「単一の開始コドン」は、他の内部ＡＴＧコドンの存在を除外しない。しかしながら、これら後者のコドンは、翻訳を開始してはならない。
【００２２】
本発明のこの態様の好ましい実施例において、対象のポリペプチドの機能しない遺伝子をコード化する対象の配列の遺伝子は、対象の配列の全遺伝子の一部、又は少なくとも一つの挿入、少なくとも一つの削除、少なくとも一つのヌクレチオド交換、若しくはこれらの混合を含む対象の配列の全遺伝子の何れかを有する。これにより対象のポリペプチドの機能していない遺伝子が得られる。しかしながら、対象領域の遺伝子は停止コドンを有していない。
【００２３】
さらにまた、この態様のより好ましい実施例において、本発明は、対象の遺伝子が、癌遺伝子、癌原遺伝子、又は過剰発現のため疾患の原因となる疑いがある遺伝子である、上記２段落前に概説されるような拡散分子を記述する。
【００２４】
よって、更に好ましい実施例では、本発明は、
ａ）プロモーター配列と、
ｂ）動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、ＶＥＧＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０）、ＲＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１）、Ｗｎｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２）、ＭＹＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３）、ＥＲＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４）及びＴＲＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５）を有するポリペプチドのグループから選択された機能的でないポリペプチドをコード化する配列と、
ｃ）動作的に前記ｂ）の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する単離された核酸分子であって、前記ｂ）及び前記ｃ）から成るコード配列が、５’末端で単一の開始コドンと、３’末端で単一の停止コドンとを有する、前述の方法のために使用できる単離された核酸分子に関する。
【００２５】
好ましくは、上記項目ｂ）で参照される配列は、ＶＥＧＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０）及び／又はＷｎｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２）から選択される。
【００２６】
よって、本発明のこの態様の対応する好ましい実施例では、ＶＥＧＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０）、ＲＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１）、Ｗｎｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２）、ＭＹＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３）、ＥＲＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４）及びＴＲＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５）を有するポリペプチドのグループから選択された機能的でないポリペプチドをコード化する配列は、機能的でないポリペプチドを得るために、全配列の一部、又は少なくとも一つの挿入、少なくとも一つの削除、少なくとも一つのヌクレチオド交換、若しくはこれらの組み合わせを含む全配列の何れかを有する。しかしながら、前記配列は、停止コドンを有さない。
【００２７】
この態様に関係する他の実施例では、本発明は、
ａ）プロモーター配列と、
ｂ）機能的でないポリペプチドを得るために、少なくとも一つの挿入、少なくとも一つの核酸交換、若しくはこれらの組み合わせを含むＨｅｒ−２ｎｅｕ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９）の機能的でないポリペプチドをコード化する、動作的に前記プロモーター配列とリンクされた配列であって、停止コドンを有さない当該配列と、
ｃ）動作的に前記ｂ）の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する単離された核酸分子であって、前記ｂ）及び前記ｃ）から成るコード配列が、５’末端で単一の開始コドンと、３’末端で単一の停止コドンとを有する、核酸分子に関する。
【００２８】
本発明の更に他の態様では、
ａ）
ａａ）メチル化プロモーター配列と、
ｂｂ）動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
ｃｃ）動作的に前記ｂｂ）の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を、人体外又は動物体外の細胞内へ誘導するステップと、
ｂ）非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｃ）前記細胞を対象の前記遺伝子に対して調整されたＲＮＡｉと接触させるステップと、
ｄ）前記ステップｃ）の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｅ）前記ステップｂ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップｄ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
ｆ）前記ステップｅ）での比較に基づいて前記ＲＮＡｉにより誘発された対象の前記遺伝子の発現についての減少を割り当てるステップとを少なくとも有する、対象の遺伝子の発現の減少が人体外又は動物の体外の細胞内で非浸襲性で監視される方法が開示される。
【００２９】
上記概説された生体内の及び生体外の方法の実施例において、核酸分子及び／又はＲＮＡｉが、ソノポレーション、局所注射、又は正しいターゲッティング、識別及び局在化若しくはこれらの混合のための宿主細胞抗原に対する抗体を坦持するリポゾームバッグの助けを借りた遺伝子移入により、細胞へ導入される。
【００３０】
本発明の更に他の態様は、上述の方法の使用に関する。
【００３１】
上述の方法は、人体内外又は動物の体内外に適用されてもよい。一つの上述の方法は、対象の遺伝子の発現に影響する化合物と細胞を接触させるときの時間にわたって細胞内の対象の遺伝子の発現を監視し、よって前記化合物の効果を監視するために使用される。
【００３２】
他の実施例では、上述の方法は、細胞内の対象の遺伝子の発現に影響する化合物を送出し、前記化合物の送出を監視するだけでなく同時に前記化合物により誘発された対象の前記遺伝子の発現についての影響を監視するために使用される。また、これは、人体外又は動物対外の細胞に実施される方法だけでなく、生体内状況のためにも提供される。
【００３３】
他の好ましい実施例では、上述の方法は、人体内外又は動物体内外の何れにおいても、対象の遺伝子の発現における更なる変化を得るために、対象の遺伝子の発現に影響する化合物の投与量を調整するために使用される。
【００３４】
本発明の他の態様では、デメチル化薬の使用に関係する方法が、別々に又は組み合わせて、最も有力なデメチル化薬を識別するために、一つの実施例で、種々異なるデメチル化薬をテストするために使用される。
【００３５】
更に好ましい実施例では、この態様は、ＲＮＡｉを有する方法に関する。よって、当該方法は、別々に又は組み合わせて、最も有力なＲＮＡｉを識別するために、対象の一つの遺伝子に対して調整される種々異なるＲＮＡｉをテストするために使用される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、本発明の有り得るアプリケーション、すなわち、乳癌組織におけるＲＮＡｉ療法及びその監視の図式的且つ例示的ステップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
これらのステップは、本アプリケーションの例示的区分で詳細に説明される。
【００３８】
発明者らは、細胞内の対象の遺伝子の発現を非侵襲的に監視することが可能であることを見出した。このシステムは、対象の遺伝子の発現に影響する化合物と細胞を接触させるときに使用される。
【００３９】
本発明の例示的実施例を詳細に説明する一方、本発明を理解するために重要な定義が与えられる。
【００４０】
明細書及び添付の請求項に用いられているような、「ａ」及び「ａｎ」のような単数形式は、また、本文で明確に述べられていないならば、それぞれ複数も含む。
【００４１】
本発明の本文中において、用語「約」及び「およそ」は、当該特徴の技術的効果を依然保証するぐらいに当業者が理解する精度の間隔を示す。当該用語は、典型的には、示された数値の±１０％、好ましくは±５％の偏差を示す。
【００４２】
用語「有する」は、限定的ではないと理解されるべきである。本発明の目的のために、用語「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、用語「から成る（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｏｆ）」の好ましい実施例であると考えられる。これ以降、少なくとも特定数の実施例を有するグループが定義される場合、これは、また、好ましくはこれらの実施例のみから成るグループを包含することを意味する。
【００４３】
上述されたように、本発明は、対象の遺伝子の発現に影響する化合物と細胞を接触させるとき、対象の遺伝子の発現を非浸襲性で監視する方法を述べる。よって、一つの実施例では、本発明は、細胞内の対象の遺伝子の発現を非侵襲性で監視する方法であって、
ａ）
ａａ）プロモーター配列と、
ｂｂ）動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
ｃｃ）動作的に前記ｂｂ）の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を前記細胞内へ誘導するステップと、
ｂ）非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｃ）前記細胞を対象の前記遺伝子の発現に影響する化合物と接触させるステップと、
ｄ）前記ステップｃ）の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｅ）前記ステップｂ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップｄ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
ｆ）前記ステップｅ）での比較に基づいて前記化合物により誘発された対象の前記遺伝子の発現についての変化を割り当てるステップとを少なくとも有する方法に関する。
【００４４】
本発明の状況において、用語「非侵襲的に」監視することは、本発明の方法の検出ステップｂ）及びｄ）の間、患者の細胞及び／又は監視される組織との直接の物理的接触が、対象の遺伝子の発現を監視するために必要でないことを意味する。よって、検出ステップの間、細胞との接触を含む手術、生検、又は他の方法（体外分析のパッチクランピングのような）も必要とされない。
【００４５】
「監視」は、一般的な意味において、パラメータを決定し、時間とともにパラメータの経過を追うプロセスを指す。
【００４６】
ここで用いられる用語「対象の遺伝子の発現」は、少なくとも２つのステップを有する。対象の遺伝子を対応のＲＮＡへの転写が、遺伝子発現の一つのステップである。タンパク質が遺伝子によりコード化される場合には、ＲＮＡはｍＲＮＡと呼ばれる。ＲＮＡは更に処理され（例えば、接合され）、第２のステップにおいて、ｍＲＮＡはタンパク質へ翻訳される。このように、タンパク質は遺伝子発現の最終生成物である。最終生成物としてのタンパク質の量が、遺伝子発現のレベルと相関する。しかしながら、ＲＮＡ分子も遺伝子発現の最終生成物でもよい。前記ＲＮＡは、また、第２のステップの処理及び変更に従ってもよい。
【００４７】
ここで用いられる用語「遺伝子の発現に影響する化合物」は、内在性遺伝子発現について正又は負の影響を持つ化合物を有する。
【００４８】
斯様な化合物は、ＤＮＡレベルで動作する。これは、前記化合物が、例えば、ＤＮＡのメチル化状態に影響する、又はＤＮＡ配列に影響を与えることなく、例えば、閉構造から開構造へＤＮＡの構造再編成を導くことを意味する。ＤＮＡメチル化（特にプロモーター領域において）は、対応する遺伝子のサイレンシングを引き起こすことが知られているので、デメチル化薬として働く化合物が、ＤＮＡからメチル化グループを除去するので遺伝子発現を増大させることが知られている。ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）は、ＤＮＡからアセチル基を除去することで、遺伝子抑制に関係する。よって、ＨＤＡＣを阻害する化合物は、同様に遺伝子発現に対する正の影響を持つ。一般にＨＤＡＣ抑制剤と呼ばれるこれらの薬も、以下に述べられるだろう。しかしながら、本発明の一つの実施例では、遺伝子発現に正の影響を与える化合物が含まれる。
【００４９】
本発明の他の好ましい実施例において、遺伝子発現の第２のステップ、すなわち転写されたＲＮＡに働く化合物が使用される。前記ＲＮＡが分解される場合、遺伝子発現は負に影響される。本発明のこの実施例において、例えば、ＲＮＡｉは、翻訳ステップを阻害するために使用される。斯様なＲＮＡｉは、以下に詳細に説明されるように、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等を含む。
【００５０】
ここで用いられる「細胞を接触させる」は、細胞に効果を行使できるような化合物を供給するために、当業者に知られる何れの態様も有する。これは、例えば、静脈内注入、局所投与、吸入等により生体内でなされてもよい。細胞培養システムのために、デメチル化薬のような化合物が、培養のために使用される細胞培養基に単に加えられてもよい。しかしながら、また、以下に概説されるような遺伝子移入方法が、細胞と接触させる化合物を持ってくるために使用され、次のステップで、当該化合物が細胞に導入されてもよい。
【００５１】
用語「核酸分子」は、本発明の状況では、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はその誘導剤を指す。好ましくは、核酸分子は、２重鎖のＤＮＡ分子を指す。前記核酸分子を細胞へ導入するために使用されるメカニズムに依存して、前記核酸分子は、円形又は線形である。
【００５２】
本発明の状況において、用語「細胞へ導入」は、核酸分子、例えばＤＮＡ又はＲＮＡが当業者に知られている方法により対応する細胞へ導入されることを定める。更に、用語「導入する」は、どのような領域が調整されるかに依存して核酸分子に存在するコード配列が発現されるように、前記核酸分子が細胞内に存在することを意味する。この目的のため、以下に詳細に述べられるような遺伝子移入方法のような技術が、使用される。
【００５３】
本発明の状況において、用語「コード領域」又は「コード配列」は、開始コドン、すなわちＡＴＧを持って５'末端で開始するＤＮＡ配列を包含するように意味される。ｍＲＮＡの翻訳が開始されるとき、このトリプレットは、対応するタンパク質の第１のアミノ酸、メチオニンに対してコード化する。従って、コード領域は、タンパク質翻訳を終了するために、停止コドン、例えばＴＡＧを持って３'末端で終わる。本発明にとって、３末端での上述のもの以外で、停止コドンがコード配列内のどこにも存在しないことに留意することが重要である。よって、要約すると、全体のコード配列は、一つの対応するｍＲＮＡへ転写される。ｍＲＮＡの翻訳は、少なくとも２つの異なるドメイン／ポリペプチド／パーツから成る一つのタンパク質となる。しかしながら、以下に詳細に指摘されるように、前記ポリペプチドは必ずしも機能的である必要はないが、全てのコード配列に対して、少なくとも２つのポリペプチドのための少なくとも２つの配列コード化が、前記一つのコード配列内に存在する。
【００５４】
本発明の好ましい実施例では、核酸分子の前記コード配列は、５'末端で単一の開始コドンと、３'末端で単一の停止コドンとを有する。ここで用いられる用語「単一の開始コドン」は、配列が他の内部ＡＴＧコドンを有してもよいが、これが翻訳を開始するために使用されないことを意味する。
【００５５】
用語「対象の配列の遺伝子」、「対象の領域の遺伝子」及び「対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列」は、本発明の方法により監視されるべき対象の遺伝子のＤＮＡ配列を指す。本発明の状況において、タンパク質へ翻訳され、誤制御による特定の疾患の原因となる疑いがある遺伝子は、好ましくは前記用語により包含される。これは、以下に詳細に概説される。よって、斯様な配列は、遺伝子のコード領域だけ、すなわち、エキソンだけを持ちイントロンを持たない。しかしながら、特定の実施例では、対象の遺伝子のイントロン領域を使用することも適用できる。
【００５６】
以下に、用語「レポーター」だけでなく用語「レポーターポリペプチド」が、詳細に説明されるだろう。この段落は、本発明の全ての実施例、すなわち、本発明により包含される全ての核酸分子だけでなく、以下に詳細に述べられる全ての方法を参照する。対応するポリペプチドが常に正しく発現される、すなわち、機能的ポリペプチド／タンパク質が作られるように、レポーターポリペプチドをコード化する配列は、コード配列の５'末端で唯一のＡＴＧを持つフレーム内に常にある。更にまた、本発明の全ての実施例において、レポーターポリペプチドをコード化する核酸配列が、蛍光レポーターポリペプチドをコード化する。前記蛍光レポーターポリペプチドは、青、緑、シアン、赤又は赤外線蛍光タンパク質から選択される。本発明の特に好ましい実施例では、レポーター配列は、緑の蛍光タンパク質をコード化する。
【００５７】
本発明で用いられる用語「動作的に融合された（した）」は、少なくとも２つのＤＮＡ領域（例えば、レポーターポリペプチドをコード化する配列だけでなく対象のポリペプチドの遺伝子をコード化する配列）が、互いにリンクされていることを定める。このように、一つの好ましい実施例において、これらは、少なくとも２つの異なるドメイン／ポリペプチドから成る一つの発現生成物、すなわち一つのタンパク質に対する一つのコード配列を形成する。よって、上述されたように、機能的なレポーターポリペプチドを発現させるために、レポーターポリペプチドをコード化する配列が翻訳領域を持つフレーム内に常にある、対応するタンパク質に対してコード化するたった一つの翻訳領域がある。好ましくは、対象の配列の遺伝子は、蛍光レポーターポリペプチドにより後続される対象のポリペプチドの遺伝子で作られるタンパク質をコード化するために、レポーター配列と５'で融合される。
【００５８】
本発明の更に好ましい実施例では、斯様な核酸分子のコード領域は、対象及びレポーター配列の融合した遺伝子間にポリペプチドスペーサをコード化するスペーサ領域を、追加的に有する。この場合にはまた、スペーサ領域は、機能的なスペースポリペプチドを発現させるために、翻訳領域を持つフレーム内に常にある。
【００５９】
用語「動作的にリンクされる」は、上記で定められたコード化領域の発現が、プロモーター又はエンハンサのような他の領域により機械的に制御されることを意味する。これらの領域は、通常、核酸分子内にも存在する他のＤＮＡ領域である。斯様な動作的にリンクされる領域は、核酸分子のどこにあってもよいが、これらは、コード配列に５のプロモーターのような調整領域として好ましくは存在する。
【００６０】
コード配列の発現を制御する状況において、用語「プロモーター配列」又は単に「プロモーター」は、遺伝子の発現に影響する定められたＤＮＡ配列を指す。このように、典型的なプロモーター配列は、特定の細胞因子により認識される特定の長さの定められた塩基配列から成る。しばしば、これらの因子は、これらの保存配列と結合し、遺伝子発現の正の又は負のレギュレータとして働き、従って一般に「転写制御因子」と呼ばれる。多くのプロモーター配列が当業者に知られていて、人工核酸分子の異なるプロモーター配列の組合せさえ可能である。
【００６１】
本発明の方法に依存して、種々異なるプロモーターが使用されてもよい。このように、本発明による核酸分子は、好ましい実施例では、前記プロモーター配列が前記コード配列の発現を誘発する少なくとも一つのヒト転写制御因子により識別されるヒト・プロモーターであるプロモーター配列を有する。更にまた、前記ヒト・プロモーターは、強く構成的に活性のプロモーターである。他の実施例では、前記ヒト・プロモーターは、強く誘導可能な、例えば組織選択性のプロモーターである。特定の実施例では、前記ヒト・プロモーターは、ウィルス・プロモーターでもよい。本発明の最も好ましい実施例において、とりわけ対象の配列の遺伝子を有するコード配列の発現を調整する核酸分子のプロモーター配列は、内在性プロモーター配列（すなわち、対象の内因性遺伝子の発現を調整する配列）であり、よって、内在性状況を反映する。
【００６２】
用語「非侵襲性の光学的撮像により検出する方法」は、細胞内の蛍光レポーターポリペプチドを非侵襲的に検出するために、使用される方法を指す。当該方法がレポーターポリペプチドに依存するので、ポリペプチドが発現される細胞だけでなく、前記ポリペプチドの機能的及び生化学特性に対する洞察を得ることができる。「光学撮像」方法は、造影剤と一般に呼ばれるような薬品に通常依存し、本発明では、蛍光レポーターポリペプチドが前記造影剤を表わす。
【００６３】
好ましくは、本発明の方法による蛍光レポーターポリペプチドの検出は、蛍光顕微鏡検査、蛍光撮像、単一の光子及びマルチ光子共焦顕微鏡、レーザーに誘発される蛍光等によりなされる。蛍光タンパク質が、励起の際、特定の波長の色を放射するので、細胞内の蛍光タンパク質は、放射された波長の光の検出によりフォローされる特定の励起波長の光を使用することにより励起される必要がある（例えばＧＦＰは、紫外線により励起され、緑色に対応する波長の光を放射する）。このように、本発明で使用される撮像方法は、蛍光ポリペプチドを励起させるために特定の波長で光を放射し、蛍光を発しているポリペプチドにより放射される特定の波長の光を検出する装置を参照する。もちろん、当該装置は、通常の光学顕微鏡、モニタ、データ格納装置等に結合される。前記装置は、監視されるべき領域に従って配置される。前記領域は、例えば、単一の細胞、細胞培養皿の特定の領域の細胞集団、又は人間若しくは動物の細胞、好ましくは、本発明の方法により監視される人間又は動物の幾つかの細胞から成る組織でもよい。当業者に知られている蛍光ポリペプチドを検出できる何れの装置が使用されてもよい。
【００６４】
本発明の方法のステップｂ）において、細胞が、対象の遺伝子の発現に影響する化合物と接触される前に、蛍光レポーターポリペプチドのレベルが検出される。その後、後続のステップで、対象の遺伝子の発現に影響する前記化合物と接触された後で、レポーターポリペプチドが、再び検出される。このように、レポーターポリペプチドの２つの異なるレベルが検出される。ステップｅ）で概説されるように、これら２つのレベルを「比較する」ことは、このとき可能である。しかしながら、本発明は、２つの検出ステップに専ら依存するつもりではない。本発明の他の好ましい実施例において、時間にわたるデータを得るために、少なくとも２、３、４、５、６、１０又は１００回第２の検出ステップを繰り返すことが可能である。よって、一つの実施例では、本発明は、第２の検出ステップｄ）が、時間とともに対象の遺伝子の発現の変化を決定するために、数回実施される方法と関連する。よって、前記実施例では、時間とともにレポーターポリペプチドのレベルを分析することが可能である。
【００６５】
他の好ましい実施例では、読み出し、すなわち蛍光タンパク質の検出の動画を得るために、実時間で信号を記録することも可能である。このことは、「ライブ細胞撮像」又は「ライブ組織撮像」と呼ばれる。
【００６６】
もちろん、時点は、対象の遺伝子の発現に影響する化合物に従って調整される。例えば、化合物が対象の遺伝子の発現にゆっくりと働くことが知られている場合、前記化合物の導入の時点から例えば５、１０、２０、３０又は６０分の追加時間後に蛍光レポーターポリペプチドのレベルを検出することが有用であろう。速く働く化合物が使用される場合、第２の検出ステップは化合物導入に応じて数秒内で実行される。
【００６７】
更にまた、用語「比較する」は、少なくとも２つの検出ステップにおいて、レポーターポリペプチドの相対的な量を比較することとして理解されるべきである。一つの好ましい実施例では、本発明は、比較ステップｅ）が、ステップｂ）及びｄ）において検出されるレポーターポリペプチドの相対的な量を分析することによりされる上記に概説された方法を記述する。よって、前記ポリペプチドの絶対量を定量化することは必要でない。しかしながら、斯様な相対量を使用するとき、正規化された相対量を得るために、当該量が、少なくとも２つの検出ステップにおいて同一である値又はコントロールに対して正規化されることが保証される必要がある。
【００６８】
本発明の状況において用語「変化を割り当てる」は、前記比較の後、少なくとも２つの検出ステップの差が、例えばパーセンテージとして表わされることを意味する。これは、特定の検出時間にわたるレポーターポリペプチドのパーセンテージ減少、又はパーセンテージ増加を含む。少なくとも２つのレポーターポリペプチドを検出するとき、２つの時点間で又は時間にわたって、レポーターポリペプチドのレベルが変化しなかったという結論に至ってもよい。
【００６９】
本発明の方法が、生体内又は生体外で使用されてもよい。
【００７０】
「生体内状況」において、本発明の方法で述べられる細胞は、人間若しくは動物の組織の一部でもよいし、又は人間若しくは動物体内を循環している細胞でもよい。この状況において、単一の細胞だけでなく、好ましくは特定の疾患の原因となることが知られている又は疑わしい細胞又は特定の組織の細胞が、本発明のターゲットである。上記で概説されるように、特定の重要な細胞レギュレータ（例えば、ｐＲＢ、サイクリン、ＣｄＫ（サイクリン依存性キナーゼ）等のような細胞サイクルレギュレータ）の誤調整が、例えば癌のような疾患につながる。生体内のセットアップにおいて、本発明による方法は、発現に影響する化合物が投与されるとき、例えば癌組織又は腫瘍の対象の遺伝子の発現を監視するために使用される。本発明によるこの生体内状況の好ましい実施例が、以下に詳細に説明されるだろう。
【００７１】
よって、好ましい実施例では、本発明は、細胞内の対象の遺伝子の生体内での発現を非侵襲性で監視する方法であって、
ａ）
ａａ）プロモーター配列と、
ｂｂ）動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
ｃｃ）動作的に前記ｂｂ）の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を前記細胞内へ誘導するステップと、
ｂ）非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｃ）前記細胞を対象の前記遺伝子の発現に影響する化合物と接触させるステップと、
ｄ）前記ステップｃ）の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｅ）前記ステップｂ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップｄ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
ｆ）前記ステップｅ）での比較に基づいて前記化合物により誘発された対象の前記遺伝子の発現についての変化を割り当てるステップとを少なくとも有する、方法を記述する。
【００７２】
本発明は、この生体内設定の好ましい実施例において、前記核酸分子及び／又は前記ＲＮＡｉが、正しいターゲッティング、識別及び位置決定又はこれらの混合のため、ソノポレーション、局在注入、又は抗体を宿主細胞抗原へ搬送するリポソームバッグの助けを借りて遺伝子移入により前記細胞へ導入される、上記に概説したような方法を記述する。斯様な技術は、当業者に知られている。
【００７３】
更にまた、本発明は、好ましい生体内実施例において、レポーター配列によりコード化される蛍光レポーターポリペプチドが、監視されるべき組織の深さに依存して選択され、すなわち、表層性組織に対して、蛍光タンパク質が青、緑又はシアン蛍光タンパク質から選ばれ、深い組織に対して、赤又は赤外線蛍光タンパク質から選ばれる、方法を参照する。
【００７４】
本発明の方法は、生体外で用いられてもよい。斯様な生体外セットアップは、好ましくは、細胞／組織培養システム内で培養される哺乳動物細胞、又は人体若しくは動物の体から抽出され人体若しくは動物の体の外で使用される及び／又は処理される細胞を使用するシステムを指す。
【００７５】
本発明による「哺乳類の細胞培養システム」は、当業者により知られていて使用される全ての細胞系を含む。これらの細胞系は、人間、マウス、ラット、ハムスター又は鶏の細胞系でもよく、標準技術によって培養されてもよい。もちろん、例えばヒーラー細胞、２９３細胞、ＷＩ―３８細胞、Ｕ２ＯＳ細胞等のように、種々異なる人体の細胞系が使用されてもよい。
【００７６】
よって、本発明の一つの実施例は、
ａ）
ａａ）メチル化プロモーター配列と、
ｂｂ）動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
ｃｃ）動作的に前記ｂｂ）の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を、人体外又は動物体外の細胞内へ誘導するステップと、
ｂ）非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｃ）前記細胞を対象の前記遺伝子の発現に影響する化合物と接触させるステップと、
ｄ）前記ステップｃ）の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｅ）前記ステップｂ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップｄ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
ｆ）前記ステップｅ）での比較に基づいて前記化合物により誘発された対象の前記遺伝子の発現についての変化を割り当てるステップとを少なくとも有する、細胞内の対象の遺伝子の発現を非浸襲性で監視する方法を有する。
【００７７】
本発明は、この生体外設定の好ましい実施例において、前記核酸分子及び／又は前記ＲＮＡｉが、正しいターゲッティング、識別及び位置決定又はこれらの混合のため、ソノポレーション、局在注入、又は抗体を宿主細胞抗原へ搬送するリポソームバッグの助けを借りて遺伝子移入により前記細胞へ導入される、上記に概説したような方法を記述する。斯様な技術は、当業者に知られている。
【００７８】
本発明による方法によって監視される対象の遺伝子の発現の変化が、対象の前記遺伝子の上方制御又は下方制御でもよい。上述のように、これは生体内又は生体外で分析される。第１の状況又は疾患において、対象の遺伝子は下方制御されていて、よって、目標は、対象の前記遺伝子の上方制御及び当該上方制御の監視である。第２の状況は、対象の遺伝子が疾患において上方制御されることである。斯様な状況において、対応する遺伝子を下方制御し、本発明の方法による当該下方制御を監視することが目標である。各状況に対して本発明による方法だけでなく核酸分子の好ましい実施例が、以下に説明される。これらの実施例は、前記状況を例証することを意図する。よって、遺伝子の発現の下方制御又は上方制御何れかの同じ全体的な効果を持つ他の化合物が使用されてもよい。
【００７９】
対象の遺伝子が下方制御される場合、好ましい実施例では、本発明の方法は、斯様な遺伝子を上方制御するためにデメチル化薬の使用を含む。逆の状況では、対象の遺伝子の下方制御が目標であるとき、本発明の方法は、好ましい実施例では、ＲＮＡｉの使用を参照する。ここで、好ましい実施例のこれら２つのグループが、更に詳細に説明されるだろう。
【００８０】
遺伝子がＤＮＡメチル化のために下方制御／サイレンスされたかどうかを分析するために、差分メチル化調査が、治療を決定する前で本発明の監視の方法を利用する前になされる。これは、穿刺吸引細胞診を使用してなされる。ＤＮＡサンプルは、この微細な針吸引技術を使用して得られ、これらのメチル基のために分析される。斯様な方法は、当業者に知られている。
【００８１】
以下の段落では、対象の遺伝子の発現の増加を監視する方法及び核酸分子を参照する本発明の好ましい実施例が、述べられる。
【００８２】
よって、一つの実施例では、本発明は、
ａ）メチル化プロモーター配列と、
ｂ）動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
ｃ）動作的に前記ｂｂ）の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する単離された核酸分子を述べる。
【００８３】
前記ｂ）及び前記ｃ）から成るコード配列が、５’末端で単一の開始コドンと、３’末端で単一の停止コドンとを有する。ここで使用されるような用語「単一の開始コドン」は、配列が他の内部ＡＴＧコドンを有してもよいが、翻訳を開始するために使用されないことを意味する。
【００８４】
既に前述したように、ＤＮＡ、特にプロモーターのメチル化は、前記プロモーターにより制御される遺伝子の発現を禁止することが知られている。ＤＮＡのメチル化は、ベースのメチル化として、好ましくはシトシンのメチル化として好ましくは理解される。メチル化されたプロモーター配列に動作的に結合される遺伝子は説明されず、よって活性でない。上記核酸分子に対して、プロモーター配列がメチル化されたままである場合、ｂ）及びｃ）から成る対応するコード配列は発現されないだろう。しかしながら、前記領域がメチル基によりもはや修正されない場合、前記配列は、前記コード領域の発現を誘発する少なくとも一つのヒト転写制御因子により識別されるヒト・プロモーター配列である。よって、前記メチル化されプロモートされた領域のデメチル化は、前記領域に動作的に結合される遺伝子の発現を駆動できるメチル化されていない領域へと導く。本発明は、一つの実施例において、デメチル化薬の作用の際に、メチル化されていないプロモーター配列が、コード配列の発現を誘発する少なくとも一つのヒト転写制御因子により識別されるヒト・プロモーターであると正に説明されたような核酸分子を有する。好ましい実施例において、核酸分子の前記メチル化されたプロモーターは、対象の遺伝子の内在性メチル化プロモーターと同一である。
【００８５】
本発明の好ましい実施例において、上記段落で説明されたような請求の核酸分子は、対象の遺伝子が、癌抑制遺伝子、又はサイレンシングによる疾患の原因であると疑われる遺伝子である対象の配列の遺伝子を有する。斯様な実施例の１つの例において、対象の遺伝子は、ＲＢである。他の場合、対象の遺伝子は、ＣＡＤＭ１、ＺＭＹＮＤ１０、ＲＡＳＳＦ５、ＰＴＥＮ、ＳＥＲＰＩＮＢ５、ＥＰＢ４１Ｌ３、ＤＡＰＫ１等である。
【００８６】
前記の構成／核酸分子は、他の実施例では、本発明による生体内方法又は生体外方法の何れかで使用される。
【００８７】
ここで用いられる用語「デメチル化薬」又は「デメチル化化合物」は、ＤＮＡデメチル化できる、すなわち細胞内のＤＮＡから、好ましくはシトシンからメチル基の除去ができる何れの薬も包含することを意味する。前記化合物は、５―アザシチジン等を有する化合物のグループから選択される。５―アザシチジンの系統的ＩＵＰＡＣ名は、４―アミノ―１―［３，４―ジヒドロキシ―５―（ヒドロキシメチル）オキソラン―２―イル］―１、３、５−トリアジン―２―１である。シチジンの化学類似体は、それぞれ、ＤＮＡ複製及びＤＮＡ転写の間、ＤＮＡ及びＲＮＡに組み込まれる。この組込みは、例えばＤＮＭＴ１のようなメチル基転移酵素エンザイムの活動を阻害する。よって、組込みは、結果的にデメチル化となる。もちろん、当業者は、他のシチジン―類似体及び／又は５―アザ―２´デオキシチジン、１―（β―Ｄ―リボフラノシル）、デヒドロ―５―アザ―シチジン、Ｚｅｂｕｌａｒｉｎｅとしても知られている［１―（β―Ｄ―ｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ）―１，２―ジヒドロピリミジン―２―１］等のような５―アザシチジンと同様の働きをする化合物を知っている。働きのそれらのメカニズムは、複合物を形成することによりメチル基転移酵素を阻害し、及び／又はメチル基転移酵素の減少等に基づく。既に上述したように、メチル化されたプロモーター領域上の斯様な薬の効果は制御遺伝子の発動である。
【００８８】
よって、好ましい実施例において、本発明は、
ａ）
ａａ）メチル化プロモーター配列と、
ｂｂ）動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
ｃｃ）動作的に前記ｂｂ）の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を、細胞内へ誘導するステップと、
ｂ）非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｃ）前記細胞をデメチル化薬と接触させるステップと、
ｄ）前記ステップｃ）の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｅ）前記ステップｂ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップｄ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
ｆ）前記ステップｅ）での比較に基づいて前記デメチル化薬により誘発された対象の前記遺伝子の発現についての増加を割り当てるステップとを少なくとも有する、細胞内の対象の遺伝子の生体内での発現を非浸襲性で監視する方法に関する。
【００８９】
他の好ましい実施例において、本発明は、
ａ）
ａａ）メチル化プロモーター配列と、
ｂｂ）動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
ｃｃ）動作的に前記ｂｂ）の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を、人体外又は動物体外の細胞内へ誘導するステップと、
ｂ）非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｃ）前記細胞をデメチル化薬と接触させるステップと、
ｄ）前記ステップｃ）の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｅ）前記ステップｂ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップｄ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
ｆ）前記ステップｅ）での比較に基づいて前記デメチル化薬により誘発された対象の前記遺伝子の発現についての増加を割り当てるステップとを少なくとも有する、方法に関する。
【００９０】
生体内及び生体外状況において、本発明は、好ましい実施例において、デメチル化薬の量が上記にリストされたステップｆ）の割り当てによって増減される方法を記述する。更にまた、本発明は、好ましい実施例において、上記でリストされたステップｆ）での割り当てによって対象の遺伝子の発現の最も有力な増加を得るために、種々異なるデメチル化薬が、別々に又は組み合わせてテストされる方法を記述する。
【００９１】
対象の遺伝子の下方制御は、また、対応するＤＮＡ配列の立体配置的な制限にも起因する。特にプロモーター領域の閉じた立体配座が遺伝子発現に負に影響することが知られている。前記「閉じた」、すなわち「パックされた」ＤＮＡの立体配座は、ＤＮＡのアセチル化状態と相関するように見える。よって、ＤＮＡ上のアセチル基は、結果的により開いたＤＮＡ立体配座となって、よって明らかに遺伝子発現に影響すると思われる。斯様なアセチル基は、ヒストン―アセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）を介してＤＮＡへ転送され、ヒストン―脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）により、ＤＮＡから除去される。ＨＤＡＣを阻害することにより、ＤＮＡのアセチル化状態は増大し、よって、遺伝子発現が上方制御される。本発明の方法で使用される典型的ＨＤＡＣ抑制剤は、３―（１―メチル―４―フェニル・アセチル―１Ｈ―２―ピロール・イル）―Ｎ―ヒドロキシ―２―プロペナミド（ｐｒｏｐｅｎａｍｉｄｅ）、シクロ［（２Ｓ）―２―アミノ―８―オキソ・デカノイル―１―メトキシ―Ｌ―トリプトファニル（ｔｒｙｐｔｏｐｈｙｌ）―Ｌ―イソロイシル―（２Ｒ）―２―ピペリジンエクスカルボニル（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅｘｃａｒｂｏｎｙｌ）］、ソディウム酪酸（ＳｏｄｉｕｍＢｕｔｙｒａｔｅ）、４，５である：８，９―ジアンヒドロ（Ｄｉａｎｈｙｄｒｏ）―１，２，６，７，１１―ペンタデオキシ（ｐｅｎｔａｄｅｏｘｙ）―Ｄ―スレオ（ｔｈｒｅｏ）―Ｄ―イド（ｉｄｏ）―ウンデカ（ｕｎｄｅｃａ）―１，６―ディエニトル（ｄｉｅｎｉｔｏｌ）、６―（１，３―ディオキソ（Ｄｉｏｘｏ）―１Ｈ、３Ｈ―ベンゾ［デ］イソ・キノリン２―イル）―ヘキサン酸ヒドロキシ・アミド、２―［アミンの（２―ハイドロキシナフタレン（Ｈｙｄｒｏｘｙｎａｐｈｔｈａｌｅｎ）―１―イルメチレン（ｙｌｍｅｔｈｙｌｅｎｅ））］―Ｎ―（１―フェネチル）ベンズアミド、［Ｒ―（Ｅ，Ｅ）］―７―［４―（ジメチルアミノ）フェニル］―Ｎ―ヒドロキシ―４，６―ジメチル―７―オキソ―２，４―ヘプタジエナミド（ｈｅｐｔａｄｉｅｎａｍｉｄｅ）等である。これらの抑制剤は、例えば、SigmaAldrich(http://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Life_Science/Cell_Signaling/Product_Highlights/Histone_Deacetylase_Inhibitors.html参照)により供給される。ＨＤＡＣ抑制剤の他の例は、ＰＸＤ１０１（Belinostatとも呼ばれる）及びＳＡＨＡである。特に本発明のこの実施例において、本発明の方法で使用される核酸分子のプロモーター領域は、対象の遺伝子の内在性プロモーターに対応し、よって内在性プロモーターのＤＮＡ立体配座を反映する。
【００９２】
よって、好ましい実施例において、本発明は、細胞内の対象の遺伝子の生体内での発現を非侵襲性で監視する方法であって、
ａ）
ａａ）プロモーター配列と、
ｂｂ）動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
ｃｃ）動作的に前記ｂｂ）の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を前記細胞内へ誘導するステップと、
ｂ）非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｃ）前記細胞をＨＤＡＣ抑制剤と接触させるステップと、
ｄ）前記ステップｃ）の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｅ）前記ステップｂ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップｄ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
ｆ）前記ステップｅ）での比較に基づいて前記ＨＤＡＣ抑制剤により誘発された対象の前記遺伝子の発現についての増加を割り当てるステップとを少なくとも有する、方法に関する。
【００９３】
他の好ましい実施例において、本発明は、
ａ）
ａａ）プロモーター配列と、
ｂｂ）動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
ｃｃ）動作的に前記ｂｂ）の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を人体外又は動物の体外にある細胞内へ誘導するステップと、
ｂ）非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｃ）前記細胞をＨＤＡＣ抑制剤と接触させるステップと、
ｄ）前記ステップｃ）の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｅ）前記ステップｂ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップｄ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
ｆ）前記ステップｅ）での比較に基づいて前記ＨＤＡＣ抑制剤により誘発された対象の前記遺伝子の発現についての増加を割り当てるステップとを少なくとも有する、方法に関する。
【００９４】
以下の段落において、対象の遺伝子の発現の減少を監視するための方法及び核酸分子を参照する本発明の好ましい実施例が、述べられるだろう。
【００９５】
よって、一つの実施例では、本発明は、
ａ）プロモーター配列と、
ｂ）動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象の遺伝子の機能的でないポリペプチドをコード化する配列と、
ｃ）動作的に前記ｂ）の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有し、前記ｂ）及び前記ｃ）から成るコード領域が、少なくとも一つの５’末端で開始コドンと、３’末端で単一の停止コドンとを有する、本発明の生体内での方法の核酸分子を述べる。
【００９６】
本発明の好ましい実施例において、上記の段落で説明されたような請求項記載の核酸分子は、対象の遺伝子が癌遺伝子、癌原遺伝子、又は過剰発現のため疾患の原因であると疑われる遺伝子である対象の配列の遺伝子を有する。斯様な実施例の一つの例において、対象の遺伝子は、Ｈｅｒ−２ｎｅｕである。他の例では、対象の遺伝子は、ＶＥＧＦ、ＲＡＳ、Ｗｎｔ、ＭＹＣ、ＥＲＫ、ＴＲＫ等である。
【００９７】
本発明のこれらの好ましい実施例を参照すると、対象のポリペプチドの遺伝子がなぜ好ましくは生体内セットアップにおいて機能的でないかが明らかである。機能的であった場合、これは、対象の配列の外因性遺伝子及び内因性遺伝子の過剰発現からの結果である遺伝子（多くの場合、癌遺伝子）の更に増大された全体的発現に至るだろう。これは、細胞／組織に有害である。
【００９８】
よって、本発明の核酸分子及び体内での方法に関係する好ましい実施例において、機能的でないポリペプチドをコード化する対象の配列の遺伝子は、対象のポリペプチドの機能的でない遺伝子を得るために、対象の配列の全遺伝子の一部、又は少なくとも一つの挿入、少なくとも一つの削除、少なくとも一つのヌクレオチド交換若しくはこれらの混合を含む対象の配列の全遺伝子の何れかを有する。しかしながら、これは、停止コドンを有さない。このように、例えば、対象の配列の遺伝子において少なくとも一つの挿入又は少なくとも一つの削除からの結果であるフレームシフトにより、対象のポリペプチドの機能的でない遺伝子が得られる。これは、また、結果として生じるタンパク質の３次元構造体の破壊に至る、対応するポリペプチドのアミノ酸置換に結果的になる単一のヌクレオチド交換によっても得られる。癌遺伝子が対象の遺伝子である場合、（触媒領域、結合領域、二量体化領域等のような）結果として生じる癌遺伝子の機能的部分をコード化する配列を削除し、残ったコード配列を本発明の核酸分子の対象の配列の遺伝子として使用してもよい。この際、結果として生じるポリペプチドは、機能的でない。もちろん、当業者は、複数の配列が取り除かれ、取り除かれる配列の長さが対象の遺伝子に依存して変化することを知っている。
【００９９】
対象の遺伝子が転写制御因子をコード化する場合、本発明の本態様にて説明されたような核酸分子のプロモーター配列は、他の実施例において、対象の遺伝子によりコード化される前記ヒト転写制御因子によってだけ認識されるヒト・プロモーターである。このことにより、対象の前記遺伝子の下方制御が達成される場合、コード配列の発現（よって蛍光レポーターポリペプチド）もまた、対応する転写制御因子である対象のポリペプチドの遺伝子の減少したレベルのため下方制御される。
【０１００】
前記構成物／核酸分子は、他の実施例において、本発明による生体内での方法又は生体外での方法の何れかで使用される。
【０１０１】
この状況において、本発明は、対象の遺伝子の発現の減少を監視する方法を記述する。前記減少は、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又は一般に「ＲＮＡｉ」、「ＲＮＡ干渉」若しくは「抑制剤分子」と呼ばれる同等の機能の他の核酸分子を有する化合物／分子により達成される。加えて、前記分子は、例えばナノ粒子により修正される。
【０１０２】
斯様なＲＮＡ干渉戦略を使用して、特に対象の遺伝子の発現とだけ干渉し、他の関係がない細胞因子の発現とは干渉しない分子を使用することが重要である。斯様なＲＮＡベースの抑制剤の選択、識別及び生産は、当業者に良く知られている。
【０１０３】
典型的には、例えば、抑制ＲＮＡベースの分子とそれぞれのｍＲＮＡとの間の生体内相互作用に対して抑制的であるような第２の構成要素の欠如の観点から、アンチセンス戦略又はｓｉＲＮＡベースの手法に対してアクセス可能である対象の遺伝子のコード配列内の配列を識別する。核酸の斯様な伸展は、ＳＦＯＬＤのようなコンピュータプログラムを使用して識別される。
【０１０４】
第２のステップにおいて、斯様な配列は、その後、対象のそれぞれの遺伝子に対して固有かどうか決定するために、他の配列と比較される。これは、例えばバイオテクノロジー情報のためのナショナルセンター（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）でＢＬＡＳＴ検索を実行して、なされる。
【０１０５】
識別された固有の配列を持つと、アンチセンス又はｓｉＲＮＡ抑制剤は、識別された配列と好ましくは正確にマッチする補完的な配列を使用することにより、選択される。もちろん、アンチセンス又はｓｉＲＮＡ抑制剤と他の細胞因子のメッセンジャーＲＮＡとの間ではっきりしない相互作用が起こり得るレベルまで、補完性が減少しないならば、低い程度の補完性が使用されてもよい。
【０１０６】
典型的には、抑制ＲＮＡベースの分子と識別された特定の配列との間の補間的度合いは、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％である。
【０１０７】
用語「補完的（相補性）」は、シチジンとペアになるグアニジンと、チミン及びウラシルとペアになるアデノシンとの能力からみて、互いに交雑する核酸分子の基本的な特性と関係するので、もちろん、当業者に良く知られている。
【０１０８】
当業者は、もちろん、対象の遺伝子の完全なコード配列又はその一部と補完性を与える核酸配列が、補完的な配列が対象の遺伝子に対して実際に特有であることを確実にするために、特定の最小限の長さを持たなければならないことを理解している。
【０１０９】
従って、対象の遺伝子との相補性を与える抑制分子内の核酸配列は、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも３００又は少なくとも４００のヌクレチオド長であって、隣接する伸展を形成すべきである。
【０１１０】
当業者は、対象の遺伝子のコード配列又はその一部に相補性を与えている核酸配列の長さに依存して、補完的に付与する核酸配列が対象の遺伝子だけを実に特にターゲットとすることを確実にするために必要である最小程度の相補性が変化するだろうことも知るだろう。よって、３０、５０、６０、７５、１００のヌクレオチドのむしろ長い核酸分子が使用される場合、低い程度の相補性が使用されてもよいし、抑制分子と対象の遺伝子のコード配列又はその一部との間の特性を依然保証する一方、抑制分子内の補完的に付与する核酸配列が、例えば少なくとも１４、１５、１６、１７又は１９のヌクレオチドの伸展だけを有する場合、もちろん、高い程度の相補性が必要となるだろう。
【０１１１】
上述のように、対象の遺伝子の発現の減少は、上記で概説されたようにデザインされる「ＲＮＡｉ」、「ＲＮＡ干渉」又は「抑制剤分子」により達成される。
【０１１２】
従って、斯様な抑制剤分子の１つのクラスは、対象の遺伝子の完全なコード配列又はその一部と補完的である核酸配列を持つ組換え核酸分子を有する分子である。核酸配列分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は他の核酸系分子でできていてもよいが、結果として生じる分子が対象の遺伝子の完全なコード配列又はその一部と特に交雑できる限り、ヌクレオチドの代わりにヌクレオチド類似体を少なくとも部分的に有してもよい。
【０１１３】
好ましい実施例において、上記説明された抑制分子は、好ましくは、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又は対象の遺伝子と同等の機能の他の核酸分子を有する。
【０１１４】
これらの用語は、これらの分子がどのように合成されるか、どの程度の相補性が考慮されるべきか等を、当業者に明らかに示す。本発明によるｓｈＲＮＡ及びｓｉＲＮＡだけでなくアンチセンスＲＮＡが、これら核酸分子の長さ、相補性の程度等についての上述の基準を満たすことは理解されるべきである。
【０１１５】
アンチセンス分子は、典型的には、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、５０、７０、１００、１５０、２００、３００又はそれ以上のヌクレオチドの長さを有する。
【０１１６】
ＲＮＡ干渉目的のために、いわゆる短いヘアピンＲＮＡ又は合成二重鎖ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドが使用されてもよい。
【０１１７】
ｓｉＲＮＡ分子は、典型的には、２０、２１、２２、２３、２４又は２５のヌクレオチドの長さを有する。
【０１１８】
典型的には、ｓｈＲＮＡ分子が発現されるので、一本鎖ＲＮＡ分子が分子内ヘアピン構造を形成する。酵素Ｄｉｃｅｒを通じた細胞内処理により、ｓｉＲＮＡ分子が、そこから生成される。
【０１１９】
ｓｈＲＮＡ二重鎖の両方の鎖が単一のＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子の形で発現ベクターを使用して発現される場合、ｓｈＲＮＡ分子の細胞内転写が達成できる。この目的のために、転写されたＲＮＡ鎖は、理想的にはセンスｓｈＲＮＡ配列の１９乃至２１のヌクレチオド及び対応する補完的配列の理想的には１９乃至２１のヌクレチオドを有する。両方の配列は、例えば６つのヌクレオチド長のスペーサにより理想的には離隔される。
【０１２０】
細胞ターゲット転写のｓｉＲＮＡ仲介の抑制の効率が、適切なｓｉＲＮＡ配列の選択に依存することはよく知られている。ガイドラインが、効果的なｓｉＲＮＡ分子のデザインのために開発された。これらのガイドラインは、典型的には、合成ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに対して導かれたが、ｓｈＲＮＡ分子の処理形式に対しても適用するべきである。
【０１２１】
細胞内の発現及び処理の後でだけ得られるｓｈＲＮＡ分子以外に、合成ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、典型的には、１９乃至２１のヌクレオチド長さの間にある二重鎖ＲＮＡ分子から成る。これらのｓｉＲＮＡ分子は、上述されたように、例えば細胞系に遺伝子移入され、よってＲＮＡｉ処理を開始する。
【０１２２】
ｓｉＲＮＡ配列モチーフ及びターゲット配列の決定は、例えばＴｕｓｃｈｌらによる刊行物のような良く知られた刊行物に従って決定される。よって、適当なｓｉＲＮＡターゲット配列だけの識別のためにターゲットｍＲＮＡのコード領域を使用する。選択されたｓｉＲＮＡ配列モチーフがターゲットｍＲＮＡのコード領域に向けられることが好ましい一方、５’及び３’の未翻訳領域のような対象の遺伝子の調整領域に対して設計されてもよい。
【０１２３】
メッセンジャーＲＮＡのコード配列がターゲット配列として使用される場合、典型的には、開始コドンの下流７０のヌクレチオドで開始し、停止コドンの上流５０のヌクレチオドで終了する配列を使用する。
【０１２４】
この配列領域は、配列モチーフＡＡ（Ｎ１９）（Ｎはヌクレチオドを指定する）に対して検索される。結果としてのｓｉＲＮＡ配列は、モチーフＡＡに後続する１９のヌクレチオド及び好ましくは付加的に追加のウリジン又はチミジン残留を有する。合成ｓｉＲＮＡオリゴヌクレチオドの場合、ウリジン残留は、好ましくはチミジンにより置き換えられてもよい。
【０１２５】
他の手法では、Ｒｅｙｎｏｌｄｓらによるガイドラインが使用されてもよい。
【０１２６】
Ｒｅｙｎｏｌｄらは、ポテンシャルｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡターゲット配列を選択するための以下の基準を提案している：
１  ３０−５０％のグアニン−シトシン内容物
２  センス鎖の１５乃至１９の位置に少なくとも３個のアデニン又はウラシル
３  分子間のヘアピン構造の欠如
４  センス鎖の位置１９でのアデニン
５  センス鎖の位置３でのアデニン
６  センス鎖の位置１０でのウラシル
７  センス鎖の位置１９でグアニン又はシトシンがない
８  センス鎖の位置１３でグアニンがない
【０１２７】
これら８つの基準は、以下のスキームによって、重みづけられる：
（ｉ）基準１、３、４、５及び６に対して１ポイント
（ｉｉ）少なくとも３つの対応ベース、位置１５乃至１９の位置の各アデニン又はウリジンに対して１ポイント（基準２）
（ｉｉｉ）基準７−８の達成がない場合は各１ポイント。
【０１２８】
Ｒｅｙｎｏｌｄｓによると、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ配列だけが、このスキームによると、少なくとも６のポイント値を持つと考えられるべきである。斯様なｓｉＲＮＡ配列は、ＢＬＡＳＴプログラムを使用して、対応検索のために使用される。この手法に後続して、ｓｉＲＮＡ配列は、特別な抑制がないターゲット構造を導く。
【０１２９】
ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ配列がこのように識別された場合、これらが発現プラスミドへクローン化されてもよい。このように、ＲＮＡ配列は、プラスミドｐ抑圧（ｐＳＨＨ、Ｉｍｇｅｎｅｘ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）へクローン化される。ｓｉＲＮＡ配列をｐＳＨＨ構成へクローン化するために、ｓｉＲＮＡセンス配列、スペーサ、対応するアンチセンス配列及び中止配列を有するハイブリダイズＤＮＡオリゴヌクレチオドが使用できる。
【０１３０】
好ましい実施例において、本発明は、細胞内の対象の遺伝子の生体内での発現を非侵襲性で監視する方法であって、
ａ）
ａａ）プロモーター配列と、
ｂｂ）動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
ｃｃ）動作的に前記ｂｂ）の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を前記細胞内へ誘導するステップと、
ｂ）非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｃ）前記細胞を対象の前記遺伝子の発現に対して調整されたＲＮＡｉと接触させるステップと、
ｄ）前記ステップｃ）の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｅ）前記ステップｂ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップｄ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
ｆ）前記ステップｅ）での比較に基づいてＲＮＡｉにより誘発された対象の前記遺伝子の発現についての減少を割り当てるステップとを少なくとも有する、方法に関する。
【０１３１】
他の好ましい実施例において、本発明は、
ａ）
ａａ）プロモーター配列と、
ｂｂ）動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
ｃｃ）動作的に前記ｂｂ）の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を、人体外又は動物体外の細胞内へ誘導するステップと、
ｂ）非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｃ）前記細胞を対象の前記遺伝子に対して調整されたＲＮＡｉと接触させるステップと、
ｄ）前記ステップｃ）の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｅ）前記ステップｂ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップｄ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
ｆ）前記ステップｅ）での比較に基づいてＲＮＡｉにより誘発された対象の前記遺伝子の発現についての減少を割り当てるステップとを少なくとも有する、方法に関する。
【０１３２】
人体又は動物体外の細胞内のＲＮＡｉの効果を監視する状況において、本発明の一つの実施例は、レポーターポリペプチドをすでに発現した細胞へステップｃ）においてＲＮＡｉをターゲットにする方法に関し、よって、核酸分子は既に細胞へ導入されている。第２のコード配列が強い構成的なプロモーターに動作的に結合されている、この方法は、第２のコード配列を有する第２の核酸分子を有するか、又は第１の核酸分子上に第２のコード配列を有する。
【０１３３】
ＲＮＡｉを参照する本発明による何れの方法においても、当該方法で使用される核酸分子の対象の配列の遺伝子は、ＲＮＡｉが調整される対象の遺伝子の少なくとも領域を有する。
【０１３４】
生体内及び生体外の両方の状況において、本発明は、好ましい実施例において、ＲＮＡｉの量が、上記でリストされたようなステップｆ）での割り当てによって増大又は減少される方法を記述する。更にまた、本発明は、好ましい実施例において、対象の一つの遺伝子に対して調整される種々異なるＲＮＡｉが、上記でリストされたようなステップｆ）での割り当てによって対象の前記遺伝子の発現の最も強力な増大を得るために、別々に又は組み合わせてテストされる方法を記述する。
【０１３５】
他の態様において、本発明は、上述のような方法及び／又は核酸の使用に関する。
【０１３６】
生体内セットアップに関する一つの実施例において、本発明は、例えばデメチル化薬で疾患を処置するとき、生体内で時間にわたって例えばデメチル化薬により誘発される対象の遺伝子の発現の増大を監視するための方法の使用に関する。よって、デメチル化薬の治療効果を監視するための方法が使用される。同様に、本発明は、他の実施例において、ＲＮＡｉによって疾患を処置するとき、生体内の時間にわたってＲＮＡｉにより誘発される対象の遺伝子の発現の減少を監視するための方法の使用に関する。ここで、ＲＮＡｉの治療効果を監視するための方法が使用される。明らかに、ＲＮＡｉの場合に、第１の検出ステップは、光学的撮像方法で信号を生じ、さもなければ減少が検出できない。よって、第１の検出ステップで検出されるレポーターポリペプチドがない場合、先行するステップの状況が、検出が可能な最適な状況を見つけるために最適化される。このときだけ、治療化合物が投与される。
【０１３７】
対象のポリペプチドの機能的遺伝子が本発明の核酸分子により発現される場合、対象のポリペプチドの前記機能的遺伝子が治療として使用される。上記で概説されるように、例えば癌における遺伝子のサイレンシングの場合、癌抑制遺伝子は、しばしばサイレンスされるべきことが見出される。これは、デメチル化薬又はＨＤＡＣ反応抑制剤により処置され、本発明の方法により監視される。当該方法を使用するとき、機能的癌抑制ポリペプチドが、対象の配列の遺伝子によりコード化されて導入され、付加的な正の治療効果を発揮する。
【０１３８】
また、一つの実施例では、本発明による方法は、対象の遺伝子の発現の増加又は減少を得るために、デメチル化薬又はＲＮＡｉの量を調整するために使用される。更にまた、別々に、又は他のデメチル化薬及びＲＮＡｉとそれぞれ組み合わせて、最も有力なデメチル化薬／ＲＮＡｉを識別するために、種々異なるメチル化剤又はＲＮＡｉをテストする方法が使用される。これは、生体内及び生体外状況の両方に適用する。上述のような細胞培養システムのような生体外セットアップにおいて、本発明の方法は、対称の遺伝子の発現の変化に影響を持つ化合物をスクリーニングするために、好ましくは使用される。よって、当該方法は、遺伝子発現に働き得る薬をテストするための高速なスクリーニングシステムとして使用される。
【０１３９】
本発明による核酸分子又は方法は、一つの実施例では、薬の送出を監視し、同時に前記薬により誘発される対象の遺伝子の発現の増加を監視するだけでなく、デメチル化薬の送出のために使用される。同様に、本発明による核酸分子又は方法は、他の実施例では、ＲＮＡｉを送出し、同時に、ＲＮＡｉにより誘発される対象の遺伝子の発現の減少を監視するだけでなく、前記ＲＮＡｉの送出を監視するために使用される。これは、また、生体内及び生体外の両方の状況において適用する。
【０１４０】
本発明の他の好ましい実施例は、以下に関係している。
１．細胞内の対象の遺伝子の発現を非侵襲性で監視する方法であって、
ａ）
ａａ）プロモーター配列と、
ｂｂ）動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
ｃｃ）動作的に前記ｂｂ）の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を前記細胞内へ誘導するステップと、
ｂ）非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｃ）前記細胞を対象の前記遺伝子の発現に影響する化合物と接触させるステップと、
ｄ）前記ステップｃ）の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｅ）前記ステップｂ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップｄ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
ｆ）前記ステップｅ）での比較に基づいて前記化合物により誘発された対象の前記遺伝子の発現についての変化を割り当てるステップとを少なくとも有する、方法。
【０１４１】
２．細胞内の対象の遺伝子の発現を体内で非侵襲性で監視する前記１に記載の方法であって、
ａ）
ａａ）メチル化プロモーター配列と、
ｂｂ）動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
ｃｃ）動作的に前記ｂｂ）の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を前記細胞内へ誘導するステップと、
ｂ）非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｃ）前記細胞をデメチル化薬と接触させるステップと、
ｄ）前記ステップｃ）の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｅ）前記ステップｂ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップｄ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
ｆ）前記ステップｅ）での比較に基づいて前記デメチル化薬により誘発された対象の前記遺伝子の発現についての増加を割り当てるステップとを少なくとも有する、方法。
【０１４２】
３．ａ）
ａａ）メチル化プロモーター配列と、
ｂｂ）動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
ｃｃ）動作的に前記ｂｂ）の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を、人体外又は動物体外の細胞内へ誘導するステップと、
ｂ）非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｃ）前記細胞をデメチル化薬と接触させるステップと、
ｄ）前記ステップｃ）の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｅ）前記ステップｂ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップｄ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
ｆ）前記ステップｅ）での比較に基づいて前記デメチル化薬により誘発された対象の前記遺伝子の発現についての増加を割り当てるステップとを少なくとも有する、前記１に記載の方法。
【０１４３】
４．細胞内の対象の遺伝子の発現を体内で非侵襲性で監視する前記１に記載の方法であって、
ａ）
ａａ）プロモーター配列と、
ｂｂ）動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象の前記遺伝子の機能的でないポリペプチドをコード化する配列と、
ｃｃ）動作的に前記ｂｂ）の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を前記細胞内へ誘導するステップと、
ｂ）非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｃ）前記細胞を対象の前記遺伝子に対して調整されたＲＮＡｉと接触させるステップと、
ｄ）前記ステップｃ）の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｅ）前記ステップｂ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップｄ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
ｆ）前記ステップｅ）での比較に基づいて前記ＲＮＡｉにより誘発された対象の前記遺伝子の発現についての増加を割り当てるステップとを少なくとも有する、方法。
【０１４４】
５．ａ）
ａａ）プロモーター配列と、
ｂｂ）動作的に前記プロモーター配列とリンクされた、対象のポリペプチドの前記遺伝子をコード化する配列と、
ｃｃ）動作的に前記ｂｂ）の配列と融合した蛍光レポーターポリペプチドをコード化する配列とを有する核酸分子を人体外又は動物体外の細胞内へ誘導するステップと、
ｂ）非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｃ）前記細胞を対象の前記遺伝子に対して調整されたＲＮＡｉと接触させるステップと、
ｄ）前記ステップｃ）の際に、非侵襲性光学撮像方法により前記細胞内の前記蛍光レポーターポリペプチドを検出するステップと、
ｅ）前記ステップｂ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルと、前記ステップｄ）で検出された蛍光レポーターポリペプチドのレベルとを比較するステップと、
ｆ）前記ステップｅ）での比較に基づいて前記ＲＮＡｉにより誘発された対象の前記遺伝子の発現についての増加を割り当てるステップとを少なくとも有する、前記１に記載の方法。
【０１４５】
６．前記核酸分子及び／又は前記ＲＮＡｉが、正しいターゲッティング、識別及び位置決定又はこれらの混合のため、ソノポレーション、局在注入、又は抗体を宿主細胞抗原へ搬送するリポソームバッグの助けを借りて遺伝子移入により前記細胞へ導入される、前記１乃至５の何れか一項に記載の方法。
【０１４６】
７．ａ）メチル化プロモーター配列と、ｂ）対象のポリペプチドの遺伝子をコード化する動作的にリンクされた配列と、蛍光レポーターポリペプチドをコード化する動作的に融合される配列とを有し、前記ｂ）及び前記ｃ）から成るコード配列が、５'末端で単一の開始コドンと３'末端で単一の停止コドンとを有する、単離された核酸分子。
【０１４７】
８．対象の遺伝子が、腫瘍抑制遺伝子又はサイレンシングのため疾患の原因と疑われている遺伝子である、前記７に記載の核酸遺伝子。
【０１４８】
９．ａ）プロモーター配列と、ｂ）対象の遺伝子の機能的でないポリペプチドをコード化する動作的にリンクされた配列と、蛍光レポーターポリペプチドをコード化する動作的に融合される配列とを有し、前記ｂ）及び前記ｃ）から成るコード配列が、５'末端で単一の開始コドンと３'末端で単一の停止コドンとを有する、単離された核酸分子。
【０１４９】
１０．機能的でないポリペプチドをコード化する対象の配列の遺伝子が、対象のポリペプチドの機能的でない遺伝子を得るために、対象の配列の全遺伝子の一部、又は少なくとも一つの挿入、少なくとも一つの削除、少なくとも一つのヌクレチオド交換、若しくはこれらの組み合わせを含む対象の配列の全遺伝子の何れかを有し、対象の配列の遺伝子が停止コドンを有さない、前記９に記載の核酸分子。
【０１５０】
１１．対象の前記遺伝子が癌遺伝子、癌原遺伝子、又は過剰発現のために疾患の原因であると疑いがある遺伝子である、前記９及び１０に記載の核酸分子。
【０１５１】
１２．細胞を対象の遺伝子の発現に影響する化合物と接触させるときの時間にわたって前記細胞内の対象の前記遺伝子の発現を監視し、よって前記化合物の効果を監視するための前記１乃至６の何れか一項に記載の方法の使用。
【０１５２】
１３．細胞内の対象の遺伝子の発現に影響する化合物を送出し、前記化合物により誘発される対象の前記遺伝子の発現の影響を監視するだけでなく、同時に前記化合物の送出を監視するための前記１乃至６の何れか一項に記載の方法の使用。
【０１５３】
１４．対象の遺伝子の発現の他の変化を得るために、対象の前記遺伝子の発現に影響する化合物の量を調整するための前記１乃至６の何れか一項に記載の方法の使用。
【０１５４】
１５．別々に又は組み合わせて、最も有力なデメチル化薬を識別するために、種々異なるデメチル化薬をテストするための前記２及び３に記載の方法の使用。
【０１５５】
１６．別々に又は組み合わせて、最も有力なＲＮＡｉを識別するために、対象の一つの遺伝子に抗して調整される種々異なるＲＮＡｉをテストするための前記４及び５に記載の方法の使用。
【０１５６】
１７．細胞を対象の遺伝子の発現に影響する化合物と接触させるときの時間にわたって細胞内の対象の遺伝子の発現を監視し、よって、前記化合物の効果を監視するための前記７乃至１１に記載の核酸分子の使用。
【０１５７】
１３．細胞内の対象の遺伝子の発現に影響する化合物を送出し、同時に、前記化合物により誘発される対象の前記遺伝子の発現での影響を監視するだけでなく前記化合物の送出を監視するための前記７乃至１１の何れかに記載の核酸分子の使用。
【０１５８】
１４．対象の遺伝子の発現での他の変化を得るために、対象の前記遺伝子の発現に影響する化合物の量を調整するための前記７乃至１１の何れかに記載の核酸分子の使用。
【０１５９】
１５．別々に又は組み合わせて、最も有力なデメチル化薬を識別するために、種々異なるデメチル化薬をテストするための前記７乃至１１の何れかに記載の核酸分子の使用。
【０１６０】
１６．別々に又は組み合わせて、最も有力なＲＮＡｉを識別するために、対象の一つの遺伝子に対して調整される種々異なるＲＮＡｉをテストするための前記７乃至１１の何れかに記載の核酸分子の使用。
【０１６１】
例及び図面は、限定するものとして解釈されないことは理解される。当業者は、本願にある原理の更なる変形を明らかに把握することができる。
【実施例１】
【０１６２】
Ｈｅｒ−２ｎｅｕに対して調整されたＲＮＡｉを胸部癌組織へ遺伝子移入するとき前記胸部癌組織内の（胸部癌に過剰発現されていると知られている遺伝子）Ｈｅｒ−２ｎｅｕの発現を非侵襲性で監視する方法のためのプロトコル
【０１６３】
ステップの概略的図が図１に示されている。
【０１６４】
ステップ１：
ＤＮＡ構成物が準備される。前記構成物は、胸部癌組織内で活性していると知られているヒト・プロモーターを有する。動作的にリンクされた前記プロモーターは、コード領域である。このコード領域は、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）の遺伝子に融合されたＨｅｒ−２ｎｅｕ遺伝子から成る。Ｈｅｒ−２ｎｅｕ配列は、Ｈｅｒ−２ｎｅｕの機能的でないポリペプチドが、例えばフレームシフト変異により発現されるように変形される。３’末端では、蛍光タンパク質遺伝子の配列は、結果のタンパク質が一つの融合タンパク質として転写され、結果の蛍光ポリペプチドが機能的であるようにＨｅｒ−２ｎｅｕ配列に融合される。これは、現在の例において、Ｈｅｒ−２ｎｅｕ配列に誘発されるフレームシフト変異が、機能的蛍光タンパク質、例えばＧＦＰをコード化するために、蛍光タンパク質に対する配列コード化の始まりで誘導される他のフレームシフト変異により補償されることを意味する。
【０１６５】
ステップ２：
上述のような構成物は、例えば、当該構成物を坦持するリポソームのバッグ、好ましくはターゲットの手段のために胸部癌細胞の抗原に向けられる抗体を注入することにより、胸部癌組織へ遺伝子移入される。このターゲットステップは、癌にかかった組織だけが検出されるので、次の視覚化ステップに対して有益であることに留意されるべきである。しかしながら、これは、上述のプロモーターが胸部癌細胞内でのみ機能的であり、よって、コード領域（従って、蛍光タンパク質）がこれらの細胞内だけで発現される場合にも達成される。何れの場合でも、融合遺伝子は、機能的蛍光タンパク質ドメイン、例えばＧＦＰだけでなくＨｅｒ−２ｎｅｕの機能的でないドメインを有する癌にかかった細胞内で発現される。
【０１６６】
ステップ３：
蛍光タンパク質ドメインは、視覚化され、よって、胸部癌組織は光る。これは、対応する波長で放射された光の検出によりフォローされる特定の波長で蛍光タンパク質を励起する光学撮像装置を使用することによりなされる。紫外線光が、緑色として放射される光の検出によりフォローされるＧＦＰを励起するために使用される。好ましくは、赤外線により励起される化合物及び／又は近赤外の蛍光タンパク質のような化合物を使用してもよい（例えば、シェラボ  デーらによる「Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４、  ７４１−７４６（２００７）」に開示されている）。
【０１６７】
ステップ４：
Ｈｅｒ−２ｎｅｕに対して調整された２重鎖のＲＮＡｉが、胸部癌組織へ遺伝子移入される。これは、ＲＮＡｉ構成物を坦持するリポソームのバッグ、好ましくはターゲットの手段のために胸部癌細胞の抗原に向けられる抗体を注入することにより、再びなされる。
【０１６８】
ステップ５：
内在性Ｈｅｒ−２ｎｅｕ遺伝子の発現と同様にステップ２で紹介された融合遺伝子の発現がブロックされる。これは、対応するｍＲＮＡからの翻訳を選択的にブロックするＲＮＡｉにより達成される。Ｈｅｒ−２ｎｅｕ遺伝子を蛍光タンパク質に対する配列コード化へ融合するため、蛍光タンパク質の発現もブロックされる。よって、ＲＮＡｉの遺伝子移入の際に胸部癌組織内に、蛍光タンパク質が全く存在しないか、又はほんの少量の蛍光タンパク質が存在する。
【０１６９】
ステップ６：
再び、蛍光タンパク質ドメインが、対応する組織内で視覚化される。上述のように、紫外線光が、緑色として放射される光の検出によりフォローされるＧＦＰを励起するために使用される。好ましくは、赤外線により励起される化合物を使用してもよい。導入されたＲＮＡｉにより融合遺伝子から転写されるｍＲＮＡの全体の翻訳ブロックの場合、蛍光タンパク質は検出できない。よって、胸部癌組織はもはや視覚化できない。疾患の場合、信号がステップ３で検出された光と比較して弱い。全体的には、このことは、内在性Ｈｅｒ−２ｎｅｕもブロックされ、よって、腫瘍の退行が達成されたことを強く示唆する。
【０１７０】
要約すると、ＲＮＡｉの治療効果は、非侵襲性の態様で胸部癌組織の生体内で監視される。
【図１】
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【配列表】
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