(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号９に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２】
（Ｉ）Ｍｅｔ−Ｘ−ｔａｇ、
（II）Ｍｅｔ−Ｘ、
（III）Ｘ−ｔａｇ、
（IV）Ｍｅｔ−ｔａｇ−Ｘ、
（Ｖ）ｔａｇ−Ｘ、
（VI）ｔａｇ−Ｘ−ｔａｇ、
（VII）Ｘ、および
（VIII）Ｍｅｔ−ｔａｇ−Ｘ−ｔａｇ
（式中、Ｘは配列番号９に示すアミノ酸配列であり、Ｍｅｔはメチオニンであり、ｔａｇはペプチドタグ配列である）
からなる群から選択される構造を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記Ｘ−ｔａｇ構造からなる請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記タグが配列番号１１に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項２または３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号７に示すアミノ酸配列を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号７に示すアミノ酸配列からなる請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
野生型Ｄｅｒ ｐ ２よりもアレルゲン活性が低いことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
アレルギー性疾患の治療または予防に使用するための請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記アレルギー性疾患がチリダニに対するアレルギーであることを特徴とする請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号８または１０に示す核酸配列を有する請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載のポリヌクレオチドを含むベクターまたはプラスミド。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項１０もしくは１１に記載のポリヌクレオチド、または請求項１２に記載のベクターもしくはプラスミドと、薬学的に許容される希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項１０もしくは１１に記載のポリヌクレオチド、または請求項１２に記載のベクターもしくはプラスミドと、必要に応じてアジュバントとを含むワクチン。
【請求項１５】
請求項１０もしくは１１に記載のポリヌクレオチド、または請求項１２に記載のベクターもしくはプラスミドを含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＩｇＥ媒介性アレルギーの免疫療法の分野に関し、特にチリダニ（ＨＤＭ）アレルギーの免疫療法に関する。より具体的には、本発明はＨＤＭアレルギーに対する新規な組換え低アレルゲン性ワクチンの設計に関する。
【背景技術】
【０００２】
チリダニ（ＨＤＭ）は、鼻炎、アトピー性皮膚炎、および喘息などのアレルギー性疾患の発症に関連する最も重要なリスク要因の１つであり（１，２）、世界中で５０％を超えるアレルギー患者がＨＤＭアレルギーに罹患している（３）。
【０００３】
これまでに２３種の異なるタンパク質がＨＤＭアレルゲンとして確認および同定されている（４，５）。ヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）由来のグループ１アレルゲンおよびグループ２アレルゲンは、ＩｇＥ反応頻度が８０％を超える臨床的に最も重要なＨＤＭアレルゲンであり（６〜９）、ダニおよびダニの糞中に高濃度に含まれている（１０，１１）。
【０００４】
アレルゲン特異的免疫療法（ＳＩＴ）は、長時間効果が持続する、原因アレルゲンのみを標的とした疾患修飾療法である（１２〜１６）。ＳＩＴは、疾患誘発アレルゲンの投与量を徐々に増加させることに基づく療法である。現在、ＳＩＴは天然アレルゲン抽出物を用いて行われている。しかしながら、最近のいくつかの研究では、花粉、動物のフケ、およびチリダニ由来の低品質な天然アレルゲン抽出物によって、ＳＩＴの臨床的有効性が制限されている可能性が明らかになっている（１７〜１９）。さらに、ＳＩＴはアレルギー患者に重篤な副作用を誘導することがあるため、幅広い適用、特にチリダニアレルギーへの適用が制限されている。
【０００５】
ＳＩＴの安全性および有効性を向上させるため、組換え低アレルゲン性誘導体を設計する様々な努力がなされてきた。その結果、グループ２ダニアレルゲンの低アレルゲン性誘導体がいくつか開発されており、免疫療法に適していることが示されている（２０〜２６）。これに対して、グループ１ダニアレルゲンの低アレルゲン性誘導体はわずかに存在するのみであり、その特性も明らかにされていない（２７，２８）。
【０００６】
低アレルゲン性誘導体を用いた治療戦略の大部分は、Ｄｅｒ ｐ １アレルギーまたはＤｅｒ ｐ ２アレルギーのいずれかしか治療することができないが、Ｄｅｒ ｐ １およびＤｅｒ ｐ ２の両方のアレルゲンに反応するＨＤＭアレルギー患者は５０％を超えている（２９）。ハイブリッド分子は１分子中にすべてのＴ細胞エピトープが含まれているという利点を有するが、これまでの研究において、ハイブリッド分子はこの分子を構成するより小さな個々の分子と比較してより強力かつより迅速なＩｇＧ応答を誘導することが示されている（３０，３１）。
【０００７】
国際公開第２００９／１１８６４２（Ａ２）号パンフレットには、アレルゲンであるＤｅｒ ｐ １およびＤｅｒ ｐ ２のフラグメントから構成された低アレルゲン性ハイブリッドタンパク質が記載されている。同様の記載はAsturiasら(2009), Clinical & Experimental Allegry 39, 1088-1098によっても開示されている。しかしながら、Asturiasにより記載された誘導体の１つであるＱＭ１は、天然アレルゲンとほぼ同じＩｇＥ反応性を示した。Asturiasにより記載された第２の誘導体であるＱＭ２はＩｇＥ反応性が低減されているが、この誘導体を用いた免疫化によって、アレルゲンＤｅｒ ｐ １に特異的なＩｇＧ抗体が誘導されたことは示されていない。さらに、抗ＱＭ２ ＩｇＧ抗体による、Ｄｅｒ ｐ １とＤｅｒ ｐ ２との混合物とチリダニアレルギー患者ＩｇＥとの結合に対する平均阻害率は２０％未満であった。
【０００８】
Bussieresら(2010), International archives of allergy and immunology 153/2, 141-151には、ヤケヒョウヒダニ由来のアレルゲンＤｅｒ ｐ １およびＤｅｒ ｐ ２を構築する組換え融合タンパク質に関する研究が記載されている。これらの誘導体は、Ｄｅｒ ｐ １およびＤｅｒ ｐ ２が有するアレルゲン活性がまったく低減されていないか、あるいはＤｅｒ ｐ １およびＤｅｒ ｐ ２が有するアレルゲン活性がせいぜい１０分の１程度低減したのみであった。また、これら誘導体を用いた免疫化によって、アレルギー患者ＩｇＥの結合を阻害するアレルゲン特異的ＩｇＧが誘導されるか否かについては調査されていない。
【０００９】
Chenら(2008), Molecular Immunology Volume 45, Issue 9, 2486-2498には、遺伝子操作によってＤｅｒ ｐ ２のアレルゲン性を低減した研究が記載されている。この誘導体は、Ｄｅｒ ｐ １を含まずＤｅｒ ｐ ２のみを含むため、Ｄｅｒ ｐ １アレルギー患者の治療に用いることはできない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者らは、ハイブリッド技術を用いてＨＤＭアレルギー免疫療法用の低アレルゲン性混合ワクチンを構築した。構築された２種のモザイクタンパク質はそれぞれ、Ｄｅｒ ｐ １由来フラグメントとＤｅｒ ｐ ２由来フラグメントとからなる。一方の構築物は、２種の野生型アレルゲンが元来有するアミノ酸配列を含むものであった（Ｄｅｒ ｐ ２／１Ｃ、本明細書においてＤｐ ２／１Ｃとも呼ぶ）。他方の構築物は、システイン残基がセリン残基で置換されたものであった（Ｄｅｒ ｐ ２／１Ｓ、本明細書においてＤｐ ２／１Ｓとも呼ぶ）。これら２種のモザイクタンパク質は、ＩｇＥ反応性およびアレルゲン活性がほとんど完全に欠失していることを特徴とする点で、Ａｓｔｕｒｉａｓにより記載されたＱＭ１やＢｕｓｓｉｅｒｅｓにより記載された誘導体とは異なるものである。これら２種の誘導体（すなわち、Ｄｅｒ ｐ ２／１ＣおよびＤｅｒ ｐ ２／１Ｓ）はいずれも、Ｄｅｒ ｐ １配列要素をすべて含む点でＣｈｅｎにより記載された誘導体とは異なるものである。これら２種の誘導体（すなわち、Ｄｅｒ ｐ ２／１Ｃ、Ｄｅｒ ｐ ２／１Ｓ）それぞれによって誘導されたＩｇＧ抗体は、２種のアレルゲンＤｅｒ ｐ １またはＤｅｒ ｐ ２とアレルギー患者ＩｇＥとの結合を阻害したが（表１）、このような阻害作用はＡｓｔｕｒｉａｓによって作製されたＱＭ２により誘導されたＩｇＧでは示されていない。
【００１１】
予想外にも、システイン残基がセリン残基に置換された点のみにおいて異なるＤｅｒ ｐ ２／１Ｓによって誘導されたＩｇＧ抗体は、Ｄｅｒ ｐ １とアレルギー患者ＩｇＥとの結合を、Ｄｅｒ ｐ ２／１Ｃを用いた免疫化により誘導されたＩｇＧ抗体の２倍を超える程度で阻害した（実施例６および表１のデータを参照）。したがって、本発明は、Ｄｅｒ ｐ ２／１Ｓのアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはＤｅｒ ｐ ２／１Ｓのアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を含むポリペプチドに特に関する。
【００１２】
本発明の第１の態様は、配列番号９または７に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００１３】
本発明の別の態様は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００１４】
本発明のさらなる別の態様は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターまたはプラスミドである。
【００１５】
本発明のさらなる別の態様は、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、または本発明のベクターもしくはプラスミドと、薬学的に許容される希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物である。
【００１６】
本発明のさらなる別の態様は、アレルギー、好ましくはチリダニアレルギーの予防および／または治療のための本発明のポリペプチドの使用である。また、本発明は、アレルギー、好ましくはチリダニアレルギーの予防用および／または治療用薬剤の製造のための本発明のポリペプチドの使用にも関する。
【００１７】
本発明のさらなる別の態様は、アレルギー性疾患の治療および／または予防が必要な個体に治療有効量の本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを投与することを含む、アレルギー性疾患の治療および／または予防方法である。本発明のさらなる別の態様は、アレルギー性疾患の治療および／または予防が必要な個体に治療有効量の本発明の医薬組成物またはワクチンを投与することを含む、アレルギー性疾患の治療および／または予防方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】Ｄｅｒ ｐ ２／１モザイクタンパク質をどのように構築したのかを示す図である。アミノ酸配列（ａａ）１〜８４、ａａ ８５〜１４３、およびａａ １４４〜２２２（１．１、１．２、および１．３）を含むＤｅｒ ｐ １由来の３つのフラグメントと、ａａ １〜５３およびａａ ５４〜１２９（２．１および２．２）を含むＤｅｒ ｐ ２由来の２つのフラグメントとを、１．３、２．２、１．２、２．１、１．１の順序で再構築した。Ｄｐ ２／１Ｃは、Ｄｅｒ ｐ １およびＤｅｒ ｐ ２元来のアミノ酸配列を含み、このアミノ酸配列は１２個のシステイン残基（破線）を有する。Ｄｐ ２／１Ｓについては、システイン残基をセリン残基で置換した。
【図１Ｂ−Ｃ】コドンを最適化したＤＮＡ配列であるＤｅｒ ｐ ２／１Ｃ（Ｂ）およびＤｅｒ ｐ ２／１Ｓ（Ｃ）のアミノ酸配列を示す。
【図２】Ｄｅｒ ｐ ２／１Ｃモザイクタンパク質およびＤｅｒ ｐ ２／１Ｓモザイクタンパク質を発現させたもの（レーン１）ならびにこれらを精製したもの（レーン２）を含むクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す（Ａ）。また、精製したＤｅｒ ｐ ２／１ＣおよびＤｅｒ ｐ ２／１Ｓを還元条件下（レーンｒ）および非還元条件下（レーンｎｒ）で分離したもの、ならびに分子マーカー（レーンＭ）を含むクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す（Ｂ）。
【図３】ｎＤｅｒ ｐ １モザイクタンパク質、ｒＤｅｒ ｐ ２モザイクタンパク質、およびＤｐ ２／１モザイクタンパク質の遠紫外線ＣＤスペクトルを示す。これらタンパク質の遠紫外線ＣＤ分析の結果は、所定の波長（ｘ軸）における平均残基楕円率（ｙ軸）で表す。
【図４】ｎＤｅｒ ｐ １、ｒＤｅｒ ｐ ２、およびモザイクタンパク質Ｄｐ ２／１のＩｇＥ反応性を示す。ｎＤｅｒ ｐ １、ｒＤｅｒ ｐ ２、２種のＤｐ ２／１モザイクタンパク質、およびＢＳＡをドットブロットし、２１名のＨＤＭアレルギー患者（患者１〜２１）の血清、非アレルギー者の血清（ＮＣ）、および血清を含まない緩衝液（ＢＣ）について上記のタンパク質に対するＩｇＥ反応性を試験した。結合したＩｇＥは、１２５Ｉ標識抗ヒトＩｇＥ抗体によって検出し、オートラジオグラフィーで可視化した。
【図５】Ｄｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ ２、およびモザイクタンパク質Ｄｅｒ ｐ ２／１のアレルゲン活性を示す。８名のダニアレルギー患者から得られた好塩基球を、様々な濃度のｎＤｅｒ ｐ １、ｒＤｅｒ ｐ ２、Ｄｅｒ ｐ ２／１Ｃ、およびＤｅｒ ｐ ２／１Ｓで刺激した（ｘ軸）。ＣＤ２０３ｃの発現はＦＡＣＳ分析によって測定し、刺激指数（ＳＩ）（ｙ軸）として示した。
【図６】Ｄｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ ２、およびモザイクタンパク質Ｄｐ ２／１でウサギを免疫化することにより誘導されたＩｇＧ抗体の応答を示す。ｎＤｅｒ ｐ １、ｒＤｅｒ ｐ ２、Ｄｅｒ ｐ ２／１Ｃ、およびＤｅｒ ｐ ２／１Ｓで免疫化する前（図中：前）および免疫化後（図中：免疫化後）にウサギから血清を得て、ドットブロットしたｎＤｅｒ ｐ １、ｒＤｅｒ ｐ ２、モザイクタンパク質Ｄｅｒ ｐ ２／１、またはＢＳＡに対するＩｇＧ反応性を試験した。結合したＩｇＧ抗体は、１２５Ｉ標識ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体で検出した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
表１は、ウサギ抗Ｄｅｒ ｐ １抗血清、ウサギ抗Ｄｅｒ ｐ ２抗血清、またはウサギ抗Ｄｅｒ ｐ ２／１抗血清による、ｎＤｅｒ ｐ １またはｒＤｅｒ ｐ ２とアレルギー患者のＩｇＥとの結合阻害を示す。結果はＩｇＥ結合阻害率（％）で示す。
【００２０】
本発明のポリペプチド
本発明のポリペプチドは、配列番号９に示すアミノ酸配列を含むか、または配列番号９に示すアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を含む。「実質的に同じ」とは、配列番号９において１〜５個のアミノ酸が置換されているが、実質的に同じ生物学的活性を有する変異体を指す。
【００２１】
本発明のポリペプチドは、必ずしも上記アレルゲン由来のアミノ酸配列のみからなる必要はない。フラグメント間（Ｄｅｒ ｐ １またはＤｅｒ ｐ ２由来の連続したアミノ酸配列のフラグメント）に外来配列（例えばスペーサー配列）を挿入することが可能である。また、本発明のポリペプチドは、宿主細胞において発現させたポリペプチドの精製を容易にするタグ配列を含んでいてもよい。本明細書において「タグ」とは、提供される上記のポリペプチドの検出または精製に用いることができる特徴的なアミノ酸配列を指し、タグ配列は本発明の組成物の本質的な機能に寄与することはない。タグ配列としては、ＦＬＡＧタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ｍｙｃタグ、およびポリヒスチジンタグが挙げられるが、これらに限定されない。他のタグも当業者には公知である。タグとしては、Ｎｉ２＋キレートクロマトグラフィーによる精製を可能とするヘキサヒスチジンタグが好ましい。さらに、宿主細胞において発現させた本発明のポリペプチドの１位のアミノ酸に外来メチオニン残基が含まれていてもよい。このようなメチオニン残基は、ポリペプチドのＮ末端部分が内部アレルゲンフラグメントまたはＣ末端アレルゲンフラグメントである場合に存在することが多い。さらに、提供される上記のポリペプチドにおいて、ポリペプチドの本質的な活性に寄与しないＮ末端アミノ酸、Ｃ末端アミノ酸、または中間アミノ酸が欠失していてもよい。
【００２２】
本発明の低アレルゲン性ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に記載された以下の構造（Ｉ）〜（VIII）：
（Ｉ）Ｍｅｔ−Ｘ−ｔａｇ、
（II）Ｍｅｔ−Ｘ、
（III）Ｘ−ｔａｇ、
（IV）Ｍｅｔ−ｔａｇ−Ｘ、
（Ｖ）ｔａｇ−Ｘ、
（VI）ｔａｇ−Ｘ−ｔａｇ、
（VII）Ｘ、および
（VIII）Ｍｅｔ−ｔａｇ−Ｘ−ｔａｇ
（式中、ＭｅｔはＮ末端メチオニン残基、Ｘは配列番号９に示すアミノ酸配列、ｔａｇはペプチドタグ配列（例えば（Ｈｉｓ）６）である）
のいずれか１つを含むか、またはこれらの構造のいずれか１つからなっていてもよい。
上記タグ配列は、通常５〜１５アミノ酸長である。
【００２３】
本発明のポリペプチドは、配列番号７および９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなっていてもよい。
【００２４】
ＩｇＥ反応性の測定
本発明のポリペプチドは、Ｄｅｒ ｐ １および／またはＤｅｒ ｐ ２よりもＩｇＥ反応性が低減されていることが好ましい。広義において「ＩｇＥ反応性」とは、物質がＩｇＥ抗体と結合する能力を意味する。より具体的には、本明細書において「ＩｇＥ反応性」は、本発明のポリペプチドのフラグメントが由来するアレルゲンの１つ以上に対してアレルギーを有する個体から得られたＩｇＥ抗体に本発明のポリペプチドが結合する能力を指す。
【００２５】
ＩｇＥ反応性は、（１）Ｄｅｒ ｐ １およびＤｅｒ ｐ ２の１つ以上に対してアレルギーを有する個体の血清ＩｇＥと、（２）本発明のポリペプチドとの結合の程度を求めることにより測定してもよい。この測定は参考文献（２６）に記載された方法によって行ってもよい。
【００２６】
あるいは、Ｄｅｒ ｐ １およびＤｅｒ ｐ ２の１つ以上に対してアレルギーを有する個体から単離したヒト好塩基球におけるＣＤ２０３ｃの発現を分析することにより、ＩｇＥ反応性およびアレルゲン活性を求めてもよい。実施例４および参考文献（３２）を参照されたい。
【００２７】
Ｔ細胞反応性の測定
本発明のポリペプチドはＴ細胞反応性を有することが好ましい。本明細書において「Ｔ細胞反応性」は、物質がＴ細胞レセプターに特異的に結合する能力を指す。より具体的には、「Ｔ細胞反応性」は、本発明のポリペプチドがＴ細胞の増殖を誘導する能力を意味する。
【００２８】
本発明のポリペプチドのＴ細胞反応性は、（１）本発明のポリペプチドのフラグメントが由来するアレルゲンの１つ以上に対してアレルギーを有する個体から単離した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を提供し、（２）ＰＢＭＣに含まれるＴ細胞の増殖の程度を求めることにより測定することができる。Ballら(2009),Allegry 64:569-80を参照されたい。
【００２９】
防御ＩｇＧ応答の誘導
本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドのフラグメントが由来するアレルゲンの１つ以上に対してＩｇＧ応答を誘導する能力を有することが好ましい。ＩｇＧ応答は、（１）非ヒト哺乳類（例えば、マウス、ラット、またはウサギ）を本発明のポリペプチドで免疫化し、（２）本発明のポリペプチドのフラグメントが由来するアレルゲンの１つ以上に特異的なＩｇＧ抗体の非ヒト哺乳類における産生量を測定することにより求めてもよい。測定されるＩｇＧ抗体はＩｇＧ１抗体であることが好ましい。工程（２）はＥＬＩＳＡアッセイを用いて行うことが好ましい。実施例５を参照されたい。
【００３０】
本発明のポリペプチドは、防御性ＩｇＧ応答を誘導する能力を有することが好ましい。防御性ＩｇＧ応答は、（１）本発明のポリペプチドを用いて非ヒト哺乳類（例えば、マウス、ラット、またはウサギ）を免疫化することにより得られたＩｇＧ抗体を含む組成物を提供し、（２）本発明のポリペプチドのフラグメントが由来するアレルゲンの１つ以上に対してアレルギーを有する個体から得られたＩｇＥ抗体を含む組成物を提供し、（３）上記ＩｇＧ抗体含有組成物が上記アレルゲンの１つ以上と上記ＩｇＥ抗体との結合を阻害することができるか否か、および／またはその阻害の程度を測定することにより求めてもよい。
【００３１】
上記の測定はＥＬＩＳＡアッセイを用いて行うことが好ましい。例えば、本発明のポリペプチドのフラグメントが由来する野生型アレルゲンをＥＬＩＳＡプレートに固相化してもよい。次いで、前処理したＥＬＩＳＡプレートと上記ＩｇＧ抗体含有組成物とを接触させ、ＩｇＧ抗体を固相化アレルゲンに結合させてもよい。洗浄後、上記ＩｇＥ抗体含有組成物をＥＬＩＳＡプレートに接触させる。洗浄後、ＩｇＥ抗体量を求める。実施例６を参照されたい。
【００３２】
本発明のさらなる態様
本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。遺伝コードの縮重のため、単一のポリペプチドが多数の異なるポリヌクレオチド分子によってコードされうる。本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞における発現によりポリペプチドを得るための発現構築物であることが好ましい。この発現構築物は当該技術分野で一般に知られている構成成分をさらに含んでもよく、このような構成成分として、プロモーター配列、抗生物質耐性因子をコードする遺伝子、複製起点などが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは配列番号１０に示す核酸配列を含むことが好ましい。本発明のポリヌクレオチドは配列番号８に示す核酸配列を含むことがより好ましい。
【００３３】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドでトランスフェクトまたは形質転換した細胞に関する。好適な細胞としては、真核細胞および原核細胞が挙げられる。真核細胞のトランスフェクションは当該技術分野において公知の方法により行ってもよく、このような方法としては、リン酸カルシウムによるトランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクションなどが挙げられる。
【００３４】
本発明はさらに、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、または細胞を含む医薬組成物またはワクチンに関する。本発明の医薬組成物は、緩衝剤や塩類溶液などの薬学的に許容される担体または希釈剤の１以上をさらに含んでいてもよい。本発明の医薬組成物はワクチン組成物であることが好ましい。特定の実施形態においては、本発明の医薬組成物は水酸化アルミニウムなどのアジュバントをさらに含んでいてもよい。
【００３５】
本発明はまた、本発明のポリペプチドの調製方法に関する。本発明の調製方法は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供すること、該ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入すること、得られた宿主細胞を本発明のハイブリッドポリペプチドの発現条件下において培養すること、および宿主細胞から発現産物を回収することを含む。本発明のポリヌクレオチドは当該技術分野で公知の方法により調製してもよい。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをＰＣＲ技術を使用して調製することが好ましい。
【００３６】
本発明はさらに、アレルギー性疾患、好ましくはチリダニアレルギーの治療用および／または予防用薬剤を調製するための、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、または細胞の使用に関する。このような薬剤は、Ｉ型アレルギーに対するＤＮＡベースワクチン接種に直接用いることができるワクチンをコードするポリヌクレオチドから構成されていてもよい。免疫療法において現在日常的に用いられているような、Ｉ型アレルギー性疾患を治療するための経口製剤、舌下製剤、または非経口製剤を調製するために、本発明の組換えポリペプチドまたは合成ポリペプチドを使用してもよい。このような製剤としては、舌下免疫療法用製剤、および注射免疫療法用のアジュバント結合ハイブリッドポリペプチドが挙げられる。可能な適用としては、細胞をベースとした免疫療法なども挙げられ、この療法に用いられる細胞は、例えば樹状細胞または他の抗原提示細胞であってもよい。これらの細胞はインビボにおいて形質転換されて抗原を発現する。好適なベクターで形質転換したオルソロガスな細胞を用いることが好ましい。
【００３７】
適用の一態様は、アジュバント結合ポリペプチドの皮下注射であってもよい。別の可能性として、本発明のポリペプチドを経口投与または経鼻投与して、該ポリペプチドの構成成分に対する免疫寛容またはアネルギーを誘導することができる。上述した用途に適用可能な製剤はすべて、当業者に公知の基準（アジュバントの用量および用法）に従って調製することができる。
【００３８】
本発明はさらに、ワクチン予防接種または寛容誘導に用いる薬剤を調製するための、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、または細胞の使用に関する。ハイブリッドポリペプチドの予防的投与とは、個体、好ましくはＩ型アレルギーに罹患したことのない子供にハイブリッドポリペプチドを投与し、このハイブリッドワクチンの構成成分に対する免疫寛容、アネルギー、もしくは不応答状態、または防御免疫を誘導することを意味する。このような状態への誘導は、確定診断されたアレルギー性疾患の治療を目的とした様々なプロトコルによって達成してもよい。この予防的な治療は、本明細書に記載のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを用いて行ってもよい。
【００３９】
さらなる別の実施形態において、本発明は、試料中のアレルゲン性タンパク質に対する抗体を検出するための、本明細書に記載のポリペプチドの使用に関する。この抗体は、ＩｇＭ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ抗体、またはＩｇＡ抗体であってもよい。抗体の濃度は体液から得られた試料を用いて測定してもよい。試料は動物由来またはヒト由来であってもよい。このような試験は、固相に固定化されたポリペプチドまたは液相に存在するポリペプチドに基づいて行ってもよい。このような試験として、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、固相化ポリペプチドを試料中の特異的抗体に結合させる他の試験などが挙げられる。あるいは、抗体を含有する液体にポリペプチドを直接加え、例えば競合免疫アッセイなどにおいて特異的抗体を吸着させてもよい。
【００４０】
本発明のポリペプチドは、Ｔ細胞増殖試験などの細胞試験に使用してもよい。
【００４１】
0005822938.tif 000002
【００４２】
以下の実施例により本発明をさらに説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【００４３】
実施例１：Ｄｅｒ ｐ ２／１モザイクタンパク質の構築
Ｄｅｒ ｐ ２／１モザイクタンパク質を構築するため、Ｄｅｒ ｐ １由来の３つのフラグメント（１．１ ａａ １〜８４；１．２ ａａ ８５〜１４３；１．３ ａａ １４４〜２２２）と、Ｄｅｒ ｐ ２由来の２つのフラグメント（２．１ ａａ １〜５３；２．２ ａａ ５４〜１２９）とを、１．３、２．２、１．２、２．１、１．１の順序で再構築した（図１Ａ）。２種のＤｅｒ ｐ ２／１モザイクタンパク質をそれぞれコードする２種の合成遺伝子は、Ｃ末端にヘキサヒスチジンタグを付加し、かつ大腸菌（ＡＴＧ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓ、ドイツ、メルツハウゼン）における発現のためにコドンを最適化して合成した。一方の遺伝子は、Ｄｅｒ ｐ １およびＤｅｒ ｐ ２元来のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含み、この配列は１２個のシステイン残基を有していた（Ｄｐ ２／１Ｃ）（図１Ｂ）。他方の遺伝子は、システイン残基をセリン残基で置換した（Ｄｐ ２／１Ｓ）（図１Ｃ）。これらの合成遺伝子を発現ベクターｐＥＴ１７ｂのマルチクローニング部位のＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントにクローン化し、ＤＮＡ配列をシークエンシング（ＡＴＧ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓ）により決定した。
【００４４】
実施例２：Ｄｅｒ ｐ ２／１モザイクタンパク質の発現および精製
Ｄｅｒ ｐ ２／１構築物を含有する発現ベクターを大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入して形質転換させた。培養液２５０ｍｌ中において、ＯＤ６００＝０．８、３７℃、４時間の条件下で０．５ｍＭイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導することによりタンパク質を発現させ、４℃下で４０００×ｇ、１５分間遠心分離を行い、細胞を採取した。２５０ｍｌの培養液から得られた細菌ペレットを、２５ｍＭイミダゾールおよび０．１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００を含む溶液（ｐＨ７．４）１０ｍｌ中に再懸濁した。凍結/融解サイクル（−７０℃／＋５０℃）を３回繰り返して細胞を溶解し、ＤＮａｓｅＩ １μｇとともに室温で１０分間インキュベーションすることによりＤＮＡを分解し、細胞残渣を遠心分離（４℃、１０，０００×ｇ、３０分間）にて除去した。６Ｍ塩酸グアニジン、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８において室温で４時間可溶化した封入体画分のペレットからＤｐ ２／１Ｃモザイクタンパク質およびＤｐ ２／１Ｓモザイクタンパク質を得た。不溶性残渣を遠心分離（４℃、１０，０００×ｇ、１５分間）にて除去し、変性条件下で２種のモザイクタンパク質をＮｉ−ＮＴＡ樹脂アフィニティーカラム（キアゲン、ドイツ、ヒルデン）で精製した。
【００４５】
上記２種の組換えタンパク質を９０％を超える純度で含有する複数の画分を、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ４．７）に対して透析し、タンパク質の終濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキット（ノバジェン、メルク、ドイツ、ダルムシュタット）で測定した。
【００４６】
実施例３：Ｄｅｒ ｐ ２／１モザイクタンパク質の特性解析
純度および分子質量を図２Ａに示すＳＤＳ−ＰＡＧＥによって調整した。２種のモザイクタンパク質のいずれにおいても、約３７ｋＤａにはっきりとしたバンドが認められた。これらのモザイクタンパク質の重合挙動に関する情報を得るために、還元条件下および非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図２Ｂに示す）。還元条件下においては、β−メルカプトエタノールを含有する試料緩衝液を使用し、試料を９５℃で５分間煮沸した。非還元条件下においては、β−メルカプトエタノールを含有しない試料緩衝液を使用した。還元条件下では、２種のＤｅｒ ｐ ２／１モザイクタンパク質は単量体タンパク質として出現した（図２Ｂ、レーンｒ）。これに対して、非還元条件では２種のＤｅｒ ｐ ２／１モザイクタンパク質は凝集体を形成したが、Ｄｅｒ ｐ ２／１ＳよりもＤｅｒ ｐ ２／１Ｃにおいてより多くの凝集体の形成が見られた（図２Ｂ、レーンｎｒ）。
【００４７】
タンパク質のフォールディングを分析するため、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ４．７）中のｎＤｅｒ ｐ １、ｒＤｅｒ ｐ ２、Ｄｅｒ ｐ ２／１Ｃ、およびＤｅｒ ｐ ２／１Ｓ（タンパク質濃度：０．１ｍｇ／ｍｌ）について、光路長０．２ｃｍの長方形石英キュベットを用いて円偏光二色性（ＣＤ）測定を行った。分解能０．５ｎｍおよび走査速度５０ｎｍ／分の条件下で１９０〜２６０ｎｍにおいてスペクトルを記録し、３回の走査により得られた値を平均した。対応する緩衝液（１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ４．７）を用いて同一条件下で得られたベースラインスペクトルを差し引くことにより、最終的に得られたスペクトルを補正した。結果を所定の波長における平均残基楕円率（θ）として表す。ｎＤｅｒ ｐ １のＣＤスペクトルにおいては、最小値が２０８ｎｍおよび２２２ｎｍに見られたことから、ｎＤｅｒ ｐ １はα−ヘリックスを多く含むことが示された（図３）。ｒＤｅｒ ｐ ２のＣＤスペクトルにおいては、β−シート構造に典型的な最小値２１５ｎｍおよび最大値１９７ｎｍのＣＤスペクトルが示された（図３）。Ｄｅｒ ｐ ２／１ＣのＣＤスペクトルとＤｅｒ ｐ ２／１ＳのＣＤスペクトルは非常に類似しており、最小値が２１５ｎｍにブロードに出現し、最大値が１９５ｎｍに示され、典型的な混合α／β−フォールドのＣＤスペクトルを示している（図３）。
【００４８】
実施例４：Ｄｅｒ ｐ ２／１モザイクタンパク質のＩｇＥ反応性およびアレルゲン活性
Ｄｅｒ ｐ ２／１モザイクタンパク質に対するダニアレルギー患者のＩｇＥ反応性を図４に示すドットブロット分析によって試験した。２μｌのｎＤｅｒ ｐ １、ｒＤｅｒ ｐ ２、および２種のモザイクタンパク質（Ｄｅｒ ｐ ２／１ＣおよびＤｅｒ ｐ ２／１Ｓ）、ならびに対照としてＢＳＡ（各０．１ｍｇ／ｍｌ）をニトロセルロース膜ストリップにドットブロットした。ドットブロットしたタンパク質に対する２１名のダニアレルギー患者および２種の対照（ＮＣ：非アレルギー者、ＢＣ：緩衝液対照）のＩｇＥ反応性を文献（２６）の記載に従い測定した。すべてのアレルギー患者がｎＤｅｒ ｐ １およびｒＤｅｒ ｐ ２に対してＩｇＥ反応陽性を示したが、そのうちの３名の患者のみ（患者１、８、および１８）がＤｅｒ ｐ ２／１Ｃに対してＩｇＥ反応性を示し、２名の患者（患者１および８）がＤｅｒ ｐ ２／１Ｓに対して弱いＩｇＥ反応性を示した。それ以外の患者はすべてＤｅｒ ｐ ２／１ＣおよびＤｅｒ ｐ ２／１Ｓのいずれに対しても検出可能なＩｇＥ反応性を示さなかった。非アレルギー者（ＮＣ）の血清または血清非含有緩衝液（ＢＣ）を用いた場合、ドットブロットしたいずれのタンパク質に対しても反応性は見られなかった（図４、レーンＮＣおよびＢＣ）。いずれの患者も対照タンパク質であるＢＳＡに対してＩｇＥ反応性を示さなかった（図４）。
【００４９】
８名のＨＤＭアレルギー患者から得られた好塩基球を上記２種の野生型アレルゲンまたは２種のＤｅｒ ｐ ２／１モザイクタンパク質で刺激し、好塩基球におけるＣＤ２０３ｃの発現を測定することにより、２種のＤｅｒ ｐ ２／１モザイクタンパク質のアレルゲン活性と上記２種の野生型アレルゲン（ｎＤｅｒ ｐ １およびｒＤｅｒ ｐ ２）のアレルゲン活性とを比較した（図５に示す）。インフォームドコンセントを行った後、８名のダニアレルギー患者からヘパリン添加血液試料を採取した。様々な濃度（０．０４〜４００ｎＭ）のｎＤｅｒ ｐ １、ｒＤｅｒ ｐ ２、Ｄｅｒ ｐ ２／１ＣおよびＤｅｒ ｐ ２／１Ｓ、ならびに対照としてモノクローナル抗ＩｇＥ抗体（１μｇ／ｍｌ）またはＰＢＳを使用して、好塩基球を１５分間刺激した（３７℃）。ＣＤ２０３ｃの発現を文献（３２）の記載に従って測定した。この分析から、０．４ｎＭ〜４００ｎＭの濃度の野生型アレルゲンｎＤｅｒ ｐ １およびｒＤｅｒ ｐ ２はいずれも、試験したすべてのＨＤＭアレルギー患者においてＣＤ２０３ｃの発現の強力なアップレギュレーションを誘導したが、４００ｎＭまでの濃度のＤｅｒ ｐ ２／１Ｃモザイクタンパク質およびＤｅｒ ｐ ２／１Ｓモザイクタンパク質では関連性のあるアップレギュレーションは見られなかったことが示された。抗ヒトＩｇＥ抗体を陽性対照として用いたところ、いずれの患者から得られた好塩基球においてもＣＤ２０３ｃ発現のアップレギュレーションが誘導されたが、緩衝液のみではこのようなアップレギュレーションは見られなかった（データ示さず）。
【００５０】
実施例５：２種のＤｅｒ ｐ ２／１モザイクタンパク質によるウサギの免疫化
上記２種のモザイクタンパク質が特異的Ｄｅｒ ｐ １抗体および特異的Ｄｅｒ ｐ ２ ＩｇＧ抗体を誘導できるか否かを示すため、ウサギをＤｅｒ ｐ ２／１ＣまたはＤｅｒ ｐ ２／１Ｓで５回免疫化した（２００μｇ／注射）。最初の免疫化においてはＣＦＡをアジュバントとして用い、残りの４回の免疫化にはＩＦＡをアジュバントとして用いた。これとは別に、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を１回使用し、残りの２回には不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を使用して、ウサギをｎＤｅｒ ｐ １またはｒＤｅｒ ｐ ２で３回免疫化し（２００μｇ／注射）、２種の野生型アレルゲンに対して特異的なＩｇＧ抗体を産生させた。いずれのＤｅｒ ｐ ２／１モザイクタンパク質も、Ｄｅｒ ｐ １またはＤｅｒ ｐ ２に特異的なＩｇＧ抗体を誘導することができた（図６）。対照として、抗Ｄｅｒ ｐ １ウサギ血清および抗Ｄｅｒ ｐ ２ウサギ血清を用いた。抗Ｄｅｒ ｐ １ウサギ血清は、ドットブロットしたｎＤｅｒ ｐ １のみに陽性反応を示したが、抗Ｄｅｒ ｐ ２ウサギ血清はｒＤｅｒ ｐ ２および上記２種のＤｅｒ ｐ ２／１モザイクタンパク質のいずれにも陽性反応を示した（図６）。ウサギ血清はいずれも、対照タンパク質であるＢＳＡには反応性を示さなかった（図６）。
【００５１】
実施例６：ウサギ抗Ｄｅｒ ｐ ２／１Ｃ抗体およびウサギ抗Ｄｅｒ ｐ ２／１Ｓ抗体による、ｎＤｅｒ ｐ １またはｒＤｅｒ ｐ ２とアレルギー患者ＩｇＥとの結合阻害
ＥＬＩＳＡ競合実験において、モザイクタンパク質Ｄｅｒ ｐ ２／１によって誘導されたＩｇＧ抗体を用いることにより、ｎＤｅｒ ｐ １またはｒＤｅｒ ｐ ２とＨＤＭアレルギー患者ＩｇＥとの結合を阻害できるか否かを調査した。
【００５２】
マキシソープＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）をｎＤｅｒ ｐ １またはｒＤｅｒ ｐ ２（ＰＢＳ中０．５μｇ／ウェル）を用いて４℃で一晩かけてコーティングした。次いで、ＰＢＳＴ（０．０５％［ｖ／ｖ］Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で２回洗浄し、ブロッキング緩衝液（１％［ｗ／ｖ］ＢＳＡ含有ＰＢＳＴ）を用いて室温で３時間かけてブロッキングした。ウサギ抗ｎＤｅｒ ｐ １抗血清、ウサギ抗ｒＤｅｒ ｐ ２抗血清、ウサギ抗Ｄｅｒ ｐ ２／１Ｃ抗血清、およびウサギ抗Ｄｅｒ ｐ ２／１Ｓ抗血清（０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＰＢＳＴで１：２０に希釈）ならびにこれらに対応する免疫化前の血清（０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＰＢＳＴで１：２０に希釈）を上記プレートに添加し、４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、ダニアレルギー患者血清（０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＰＢＳＴで１：１０に希釈）とともにプレートを４℃で一晩インキュベートした。文献（３３）の記載に従い、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＰＢＳＴで１：２５００に希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体（ＫＰＬ、米国メリーランド州ゲイザースバーグ）を用いて結合したヒトＩｇＥ抗体を検出した。ＩｇＥ結合阻害率（％）は、１００−（ＯＤｓ／ＯＤｐ）×１００より求めた。ＯＤｓはウサギ免疫血清とともにプレインキュベーションした後の吸光度を表し、ＯＤｐは免疫化前の血清とともにプレインキュベーションした後の吸光度を表す。
【００５３】
ウサギ抗Ｄｅｒ ｐ １抗体による患者ＩｇＥとｎＤｅｒ ｐ １との結合阻害率は、４９．１％〜９１．８％（平均７４．９％）であった。ウサギ抗Ｄｅｒ ｐ ２／１ＣによるｎＤｅｒ ｐ １結合阻害率（すなわち、０〜４８．７％；平均２４．１％）およびウサギ抗Ｄｅｒ ｐ ２／１ＳによるｎＤｅｒ ｐ １結合阻害率（すなわち、３１．９〜６６．０％；平均４９．９％）は、ウサギ抗Ｄｅｒ ｐ １による結合阻害率よりも低かった。ウサギ抗Ｄｅｒ ｐ ２抗体を用いた場合、患者ＩｇＥとｒＤｅｒ ｐ ２との結合阻害率は５０．３％〜９２．９％（平均７３．９％）であった。ウサギ抗Ｄｅｒ ｐ ２／１Ｃによる阻害率（すなわち、５６．９〜９３．４％；平均７８．１％）およびウサギ抗Ｄｅｒ ｐ ２／１Ｓによる阻害率（すなわち、７３〜９３．３％；平均８６．１％）は、ウサギ抗Ｄｅｒ ｐ ２抗体による阻害率とほぼ同等であった（表１）。
【００５４】
【表１】
0005822938.tif 000003
【００５５】
実施例７
当業者であれば、実施例１〜６において上述したものに相当する低アレルゲン性ポリペプチドをＤｅｒ ｐ １の変異体およびＤｅｒ ｐ ２の変異体から調製できることは明らかであろう。種々のＤｅｒ ｐ １イソアレルゲンおよびＤｅｒ ｐ ２イソアレルゲンの受託番号を以下の表に示す。
【００５６】
【表２】
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【００５７】
【表３】
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【００５８】
これらのアイソフォームのアミノ酸配列および核酸配列は、配列番号１〜４に示したものとわずかな置換により異なる。したがって、当業者であれば列記したイソアレルゲンに基づいて構築物を容易に提供することができる。
【００５９】
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【図１Ａ】
0005822938.tif 000006
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図４】
0005822938.tif 000009
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図３】
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【図５】
0005822938.tif 000013
【図６】
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【配列表】
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