(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体物質を保持するための複数のウェル及び少なくとも２対の整列孔を規定するボディーを含有しているマルチウェルプレート、ここで、１対の整列孔はボディー上に非対称的に形成された第１及び第２の整列孔からなり、第１及び第２の整列孔はボディーの対向する側にあり、第１の整列孔は第２の整列孔よりボディーの外周に隣接している、；及び
複数のチップ及びチップよりも相対的に長い少なくとも１対の整列ピンを有しているチップマニホールド、ここで、チップの数の倍数がマルチウェルプレートのウェルの数であり、チップの間隔はウェルの間隔に対して少なくとも２倍である：
を含有してなり、
ここで、チップマニホールドはマルチウェルの面と平行な面にある軸に沿って前後左右に移動し、少なくとも１対の整列ピンが少なくとも１対の整列孔と整列したときに複数のチップがマルチウェルプレートのウェルと整列する、生体物質をスクリーニングする装置。
【請求項２】
１対の整列孔のうち一方の整列孔が細長い、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
８対の整列孔がボディーに形成されている、請求項１又は２に記載の装置。
【請求項４】
チップマニホールドが、マルチウェルプレートのウェルの間隔に対して３倍又は４倍の間隔でチップを有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５】
マルチウェルプレートを支持するためのテーブル；及び
チップマニホールドを動かして、チップマニホールドのチップをマルチウェルプレートの少なくとも一部のウェルに整列させるために整列ピンを整列孔に挿入するための、ロボット部材：
をさらに含有してなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６】
少なくとも１つのチップが、電極、ピペット、光誘導部材及びそれらの組み合わせよりなる群から選ばれる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７】
チップマニホールドがエレクトロポレーションチップマニホールドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項８】
それぞれのウェルが実質的に平らな底を有し、そして少なくとも１つのチップがバネで留められ且つ平らな底に接触するように下げられる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項９】
少なくとも１つのチップが：
外部電極接触を有する近接末端、及び遠位末端を有しており、第１内部を規定する外部電極；
実質的に第１内部にあり、第２内部を規定する電極スペーサー；
内部電極接触を有する近接末端、及び遠位末端を有しており、実質的に第２内部の中にある内部電極；
部分的に遠位末端の内部にあり、遠位部が表面に隣接したときに、表面と電極の間の空間が所定の大きさになるように、所定の大きさの遠位部を有しているチップ基底部：を包含し；そして
更に、電気接続のバイアス盤に従属しているそれぞれのチップに対して二叉のバイアスピンアセンブリを有している電気接続のバイアス盤を含有し、電気接続のバイアス盤の第１突起部が外部電極接触部をはめ込み、そして第２突起部が内部電極アセンブリをはめ込んで、電極と電気的に接触をして、それぞれのチップ遠位に弾性バイアスをかける、請求項１〜８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１０】
ウェルの数がチップの数と等しく、複数のウェルが６、１２、２４、４８、９６、３８４、１５３６又は３４５６のウェルを含有してなる、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
ウェルの数が３８４であり、チップの数が９６であり、ボディーが１６の整列孔を規定している、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
外部電極がバンキング表面を形成してプレートに対する正常な位置を設定する、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１３】
工程：
ウェルの数がチップの数の少なくとも２倍であるマルチウェルプレートに少なくとも２対の整列孔を提供すること、ここで、１対の整列孔のうち少なくとも１つの整列孔がマルチウェルプレートの第１辺上に形成されていて、少なくとも１つがマルチウェルプレートの第２辺上に形成されている；
ウェルの間隔に対して少なくとも２倍の間隔でチップを有しているチップマニホールドに、少なくとも２つの整列ピンを提供すること、ここで、整列ピンの少なくとも１つはチップマニホールドの第１側面と連結していて、整列ピンの少なくとも１つはチップマニホールドの第２側面と連結している；
少なくとも２つの整列ピンを少なくとも１対の整列孔に挿入して、マルチウェルプレートをチップマニホールドに整列させること；
少なくとも２つの整列ピンの挿入後に、複数のチップを複数のウェル内へ誘導すること；
少なくとも２つの整列ピンを少なくとも１対の整列孔から抜き出し、チップマニホールドをマルチウェルの面と平行な面にある軸に沿って前後左右に移動して、整列ピンをもう１対の整列孔に挿入して、マルチウェルプレートをチップマニホールドと再整列させること；及び
少なくとも２つの整列ピンを再挿入した後、複数のチップを第２の複数のウェル内へ誘導すること：
を含有してなる、チップマニホールドの複数のチップをマルチウェルプレートの複数のウェルと整列させる方法。
【請求項１４】
整列ピンを１対の整列孔に挿入して、複数のチップを複数のウェル内へ誘導する工程が、チップの数に対するウェルの数の倍数に等しい回数反復される、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
チップアセンブリを用いるマルチウェルにおける生体物質の自動スクリーニング及び操作。
【背景技術】
【０００２】
リボ核酸干渉（ＲＮＡｉ）は、現代における生物学の最も刺激的な発見の一つであって、遺伝子機能の分析における革命を示している。今のところ、ゲノム規模のスクリーニングは、標的発見の過程においてますます重要な部分となってきている。しかしながら、十分な処理能力で、生体関連細胞型の効率的なトランスフェクションを行う装置及び方法が不足している。例えば、脂質ベースの方法は、処理能力をもたらすことはできるが、殆どの生体関連細胞型を効果的にトランスフェクトすることができない。従来のエレクトロポレーション（電気穿孔法）に基づく方法は、初代及びトランスフェクトしにくい細胞型をトランスフェクトできるが、必要とする費用、効率及び処理能力でそれを行うことができない。
【０００３】
エレクトロポレーションは、外部から加えられた電場によって引き起こされる細胞膜の導電率及び透過性を増大するものである。分子生物学において、エレクトロポレーションは細胞中に物質を導入するために用いられている。例えば、細胞の機能を変えるために核酸を細胞内へ導入することができる。エレクトロポレーションは一般に、核酸又は化学物質或いは物理的物質を、哺乳動物の細胞及び生体内の標的臓器を含む、組織培養細胞内へ導入するために有用である。エレクトロポレーションの適用は、癌治療、遺伝子治療、細胞に基づいた治療、及び薬物の発見を包含する。
【０００４】
従来のエレクトロポレーション技術においては、エレクトロポレーターは電流を発生させて、それが例えばその側面に二つの金属電極を含有しているキュベット中の細胞溶液を通過するようにする。キュベットに含まれている細胞懸濁液をプラスミドと混合して細胞中に導入する。キュベットをエレクトロポレーター中に挿入し、エレクトロポレーターが電極に電圧（例えば、２４０ボルト）を加えて、細胞溶液に電場を与えてプラスミドを細胞内に入れる。細胞溶液をエレクトロポレートした後は、再生されたプラスミドを含有している新しい細胞を産生するような分割の可能性を細胞が有するまで、細胞を注意深く扱わなくてはならない。
【０００５】
現在のエレクトロポレーション操作の多くにおいては、細胞を細胞培養容器から剥離し、懸濁液に入れて、上記の様にエレクトロポレーションを行うためにキュベットに移している。この工程は大きな労働力を要して、処理能力及び有効性を限定している。更に、エレクトロポレーションの工程自体が、そして剥離、消化、移送、ピペット操作等のような細胞の複雑な操作と相まって、細胞に有意なストレスを引き起こし得る。結果として、高い比率の細胞罹患率及び死亡率がしばしば観察されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的及び利点が、以下の詳細な説明に述べられ、そしてそこから明らかになるだろう。本発明の更なる利点は、本明細書の詳細な説明及び特許請求の範囲に特に指摘されている、更には図面から明らかな、装置及び方法によって実現及び達成されるだろう。本発明の多くの実施態様が、チップマニホールド及びマルチウェルプレート整列装置、並びにチップマニホールドのチップを整列させ、下げて、そしてマルチウェルプレート中のウェルの床上で培養されている接着細胞の表面に極く接近して入れることができる方法を提供する。エレクトロポレーションの適用において、主題技術は、ウェルの底と中空チップ電極の間の電場に焦点を合わせることができる。この方法で、接着（固定化）細胞をそれらの自然状態で直接エレクトロポレーションする。
【０００７】
本発明のその他の重要な利点は、整列装置及び方法が、ハイスループットなスクリーニングを促進し、生体関連細胞型に対するゲノム規模でのＲＮＡｉスクリーニングを可能にする多数の研究処理へと拡張可能なことである。その他のハイスループット／大規模な適用は、ｃＤＮＡスクリーニング、細胞内標的の特性化、信号伝達経路の生物システムの探索(interrogation)、及び細胞内薬物の投与を包含する。更に、本発明の多様な実施態様の装置は比較的容易に且つ廉価に製造することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書で具体化されているように、本発明の目的に従ってこれら及びその他の利点を達成するために、本発明は、チップマニホールドの少なくとも一つのチップをマルチウェルプレートのウエルに整列させる方法を包含している。この方法は、少なくとも一つの整列孔を提供することを包含している。好ましい方法は、十分な角度精度を与える十分な間隔で離してある二つの整列孔を有している。
【０００９】
例えば、二つの整列孔をマルチウェルプレートの両端に形成することができる。方法は更に、少なくとも１つの整列孔と並んで位置している、少なくとも１つの整列ピンを提供する工程を含んでいる。方法は更に、少なくとも１つの整列ピンを少なくとも１つの整列孔に挿入して、複数のウェルの少なくとも１つの中に少なくとも１つのチップを誘導する工程を含んでいる。整列孔／ピンの数、大きさ及び配置は、ウェルに対するチップ軸の線形化の目的に有利に働くことを考慮して、柔軟性があると想定される。
【００１０】
本発明の更なる態様によると、その少なくとも１つのチップはエレクトロポレーションチップである。
【００１１】
本発明の別の態様によると、その少なくとも１つのチップはマルチウェルプレートのウェルの数と等しく複数である。
【００１２】
本発明の更なる態様によると、その少なくとも１つのチップはマルチウェルプレートの多数のウェルの一部と等しく複数である。
【００１３】
本発明の別の態様によると、その少なくとも１つのチップは多数のチップが複数集まったものであり、ウェルの複数(plurarity)はウェルの数(number)であり、ウェルの数はチップの数の倍数(multiple)である。好ましくは、この方法が誘導工程の反復を更に包含し、そこでは誘導工程を実施する合計回数が、ウェルの複数の全て又は一部の中にそのチップの複数を挿入できるように、最大でチップの数に対するウェルの数の倍数に等しい。
【００１４】
本発明は、マニホールドの少なくとも１つのチップを受け入れるためのマルチウェルプレートも提供する。マルチウェルプレートは、生体物質を保持する複数のウェル、第１整列孔及び第２整列孔を規定するボディーを含んでいて、第２整列孔は第１整列孔に対向している。一般に、第１及び第２整列孔はマルチウェルプレート上に非対称的に形成されている。好ましくは、マルチウェルプレートのウェルは無孔である。
【００１５】
本発明の更なる態様によると、マルチウェルプレートは更に第１整列スロット及び第２整列スロットを形成している。第１及び第２整列スロットは、それぞれ第１及び第２整列孔に隣接して形成することができる。
【００１６】
本発明の更なる態様では、ボディーは長方形を有している。第１整列孔及び第１整列スロットをボディーの第１短辺上に形成することができ、そして第２整列孔及び第２整列スロットをボディーの第２短辺上に形成することができる。ボディーが側面を有し、第１整列スロットが第１整列孔よりも側面近くに形成されいて、そして第２整列スロットが第２整列孔よりも側面近くに形成されいることが好ましい。
【００１７】
本発明の更なる態様では、整列孔及び整列スロットは、０．２〜１０．０ミリメートルの例示的範囲内の直径の円として形成され、それぞれの整列スロットは整列スロットの中心内に形成されたスロット中心点を有し、それぞれの整列孔は整列孔の中心内に形成される孔中心点を有し、そしてそれぞれのスロット中心点はそれぞれの隣接する孔の中心点から０．２〜１０．０ミリメートルの例示的範囲内又はそれ以上離して形成される。
【００１８】
本発明の更なる態様によると、ボディーは、金属、セラミック、プラスチック、ゴム、ガラス及びこれらの組み合わせよりなる群から選ばれる材料から加工される。ウェルの複数は６、１２、２４、４８、９６、３８４、１５３６、又３４５６ウェルであってよい。
【００１９】
本発明はマルチウェルプレートを含有している装置も提供する。マルチウェルプレートは、生体材物質を保持するための複数のウェル、少なくとも１つの整列孔を規定するボディーを含んでいる。ある実施態様では、第２整列孔は第１整列孔に対向している。装置は、テーブル、及びテーブル上に配置されているマルチウェルプレートをチップマニホールドに整列させるためのロボット部材を含んでいる。チップマニホールドが少なくとも１つのチップを含有していて、さらにロボット部材がマルチウェルプレートをテーブルに対して垂直に整列させることが好ましい。
【００２０】
本発明の更なる実施態様によれば、マルチウェルプレートは更に少なくとも１つの整列スロットを形成する。好ましくは、その少なくとも１つの整列スロットは、テーブル上でマルチウェルプレートの位置を確保するための第１及び第２整列スロットである。
【００２１】
本発明は、チップマニホールドを含んでいる装置も提供する。チップマニホールドは、プレート、プレートに従属している少なくとも１つのチップ、プレートに従属している少なくとも１つの整列ピンを含んでいる。第２チップ整列ピンは第１チップ整列ピンと対向していてよい。
【００２２】
本発明の更なる実施態様によれば、少なくとも１つのチップは、電極、光誘導部材、分注用の使い捨てプラスチックチップなどを包含している。
【００２３】
本発明の別の実施態様によれば、チップマニホールドはエレクトロポレーションチップマニホールドである。
【００２４】
本発明の更なる実施態様によれば、装置は更にマルチウェルプレートを含んでいる。マルチウェルプレートは、生体物質を保持する複数のウェル（例えば、無孔ウェル）、第１整列孔、及び第２整列孔を規定するボディーを含んでいる。好ましくは第２整列孔は第１整列孔に対向している。本発明の更なる実施態様では、少なくとも１つのチップが、非伝導性毛細管壁を有している少なくとも１つの電解質を満たした毛細管電極から成っていて、そこで少なくとも１つのチップがそれぞれのウェル中に下げられている。それぞれのウェルはウェルの底によって規定される表面を有しており、そして少なくとも１つのチップをそれぞれのウェルの表面から所定距離下げることができる。ある実施態様では、所定距離は７５マイクロメートルであるが、１あるいは数ミリメートルからマイクロメートルあるいはサブマイクロメートルにわたる変更も考えられる。
【００２５】
本発明の更なる実施態様によれば、整列孔は円を形成し、そして整列ピンは円形断面を有していて整列孔にぴったり収まるように作られている。単一の整列孔を単一の整列ピンと共に使用する場合は、ピンと受入孔は、ｘ−ｙ方向の整列ができるような幾何学的形態を有している。例えば、受入孔が星形、十字型、及び三角形であって、それぞれピンの断面を星形、十字型、及び三角形にすることができる。好ましくは、第１及び第２整列ピンがあるピンの長さを有し、そして少なくとも１つのチップがあるチップの長さを有している。ピンの長さはチップの長さより長く、精密な整列のために少なくとも１つのチップをそれぞれのウェル中に挿入する前に、整列ピンをそれぞれの整列孔に挿入できるようにチップマニホールドが構成されている。
【００２６】
本発明の別の実施態様によれば、整列ピン（複数も）が整列孔（複数も）に挿入できるように、整列ピン（複数も）は整列孔（複数も）に向いている丸い先端を有しており、整列ピン（複数も）が整列孔（複数も）に挿入されるまでマルチウェルプレートが横方向にスライドする。
【００２７】
本発明の更なる実施態様では、チップがプレートと接触すると、垂直性コンプライアンスを持たせるためにチップがバネで留められる。ウェルは更にウェルの底で底表面を規定すて、バイアスボディーがバネからの力で通常は末端に広がるが、ウェルに挿入されて底表面と接触すると、近位に移動してマルチウェルプレートボディーの平面に垂直な方向にコンプライアンスをもたらす。好ましくは、チップがエレクトロポレーションチップである。
【００２８】
本発明の更なる実施態様によれば、ロボット部材がチップマニホールドと連結している。ロボット部材は、整列ピンの整列孔との整列、及びチップマニホールドの少なくとも１つのチップをそれぞれのウェル内に下げることを支援する。
【００２９】
本発明の別の実施態様によれば、少なくとも１つのチップは多数のチップの配列であり、配列のチップは少なくとも１つのチップを含む少なくとも１列中に配列されている。チップの数はマルチウェルプレートのウェルの数と等しくてよい。ウェルの数は、これに限定されないが、６、１２、２４、４８、９６、３８４、１５３６、又は３４５６ウェルであってよい。
【００３０】
本発明の更なる実施態様によれば、ウェルの数はチップの数の倍数と等しいので、少なくとも１つのチップは、それぞれのウェルの部分と整列してそれぞれのウェルの部分に挿入されるように構成される。
【００３１】
本発明の別の実施態様によれば、チップは、多数のチップを含有している少なくとも１つのチップのマトリクス状に整列している。ウェルの複数性が多数のウェルを含んでいるウェルのマトリクスを形成する。ウェルの数はチップの数の倍数である。ウェルのマトリクスは少なくとも１群のウェルに分けられる。整列孔の総数は、ウェルに対するチップの倍数に等しくてよい。整列孔の半分をマルチウェルプレートの一方の対向する側に形成し、整列孔のあとの半分をマルチウェルプレートの他方の対向する側に形成することができる。整列ピンは、それぞれの整列孔と整列して、孔に挿入するように構成され、浸漬回数はチップに対するウェルの数と等しい。
【００３２】
当然のことながら、前記の一般的記載及び以下の記載は、例示的なものであって請求されている発明の更なる説明を提供するように意図されている。
【００３３】
本明細書に組み込まれていて、その一部を構成している添付図面は、本発明の装置及び方法を説明して、更なる理解を提供するために挙げられている。記述と共に、図面は、本発明の理念を説明するために役立つ。本明細書中の左、右、上方、下方、前方、及び後方のような、全ての相対的記載は図面を参照していて、限定的な意味を指すものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
例として挙げられているが、発明を記載されている特定の実施態様に限定することを意図していない、以下の記載は、参照により本明細書に取り込まれている添付図面と関連させて理解される。本発明の多数の好ましい実施態様は、非限定的な例として、そして添付図面を参照して記載される。
【図１】図１は、本発明を実施することができるシステムを説明している。
【図２】図２は、図１で説明されている環境の部分上面概略図である。
【図３】図３は、整列ピン及びエレクトロポレーションチップを包含しているエレクトロポレーションチップマニホールド、及び整列孔とスロットの８対を包含しているマルチウェルプレートを示している主題技術の実施態様を説明している。
【図４】図４は、図１に示されている主題技術の実施態様のマルチウェルプレートの透視図を説明している。
【図５Ａ】図５Ａは、図１に示されている本発明の実施態様のマルチウェルプレートの詳細な上面図又は平面図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、図５Ａに示されている幾つかの整列孔及び整列スロットを示しているサークルＢの詳細な部分図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、図５Ａで示されているマルチウェルプレートの側面図である。
【図６】図６は、図１に示されている本発明の実施態様のエレクトロポレーションチップマニホールドの透視図である。
【図７Ａ】図７Ａは、マルチウェルプレートの整列孔に隣接して丸い先端を有しているチップマニホールドの整列ピンの実施態様を説明している。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図７Ａの整列孔に下げられているピンを説明している。
【図８】図８は、図１に示されている４８チップマニホールドを有する３８４マルチウェルプレートをカバーするための１つの可能な挿入配列を説明している。
【図９Ａ】図９Ａは、整列ピン及び９６のエレクトロポレーションチップを包含している別のエレクトロポレーションチップマニホールドの分解図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、その中の構成要素を示すためにカバーを外した、図９Ａのエレクトロポレーションチップマニホールドの正面図である。
【図９Ｃ】図９Ｃは、図９Ａのエレクトロポレーションチップマニホールドの側面図である。
【図９Ｄ】図９Ｄは、図９Ａのエレクトロポレーションチップマニホールドの上面図である。
【図９Ｅ】図９Ｅは、図９Ｄの線Ｅ−Ｅに沿ったエレクトロポレーションチップマニホールドの断面図である。
【図９Ｆ】図９Ｆは、エレクトロポレーションチップアセンブリの分解図である。
【図９Ｇ】図９Ｇは、図９Ｆのエレクトロポレーションチップアセンブリの透視図である。
【図９Ｈ】図９Ｈは、図９Ｆのエレクトロポレーションチップアセンブリの上面図である。
【図９Ｉ】図９Ｉは、図９Ｈの線Ｉ−Ｉに沿ったエレクトロポレーションチップアセンブリの断面図である。
【図９Ｊ】図９Ｊは、マルチウェルプレートのウェルに挿入されている図９Ａのバネで留められているチップを説明している。
【図１０】図１０は、本発明の実施態様を実施する方法に関するフローチャートである。
【図１１】図１１は、主題技術を用いたプラスミドトランスフェクションアッセイの結果を示している。そして
【図１２】図１２は、本明細書の開示に従ったｓｉＲＮＡトランスフェクションアッセイの結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
Ｉ．定義
用語「マルチウェルプレート」は、スクリーニング工程のために生物、化学、又は物理的物質を保持するための、あらゆる数のウェルを規定する構造を包含することが意図されている。
【００３６】
用語「無孔」は、ボディー材料を介して物質が漏出することなく、ウェル内に配置される物質を保持するためのボディー材料の特徴を述べることが意図されている。例えば、プラスチックのボディー材料は、プラスチックボディー材料を介して生体物質が漏出することなく生体物質を保持できるので、無孔と言うことができる。
【００３７】
用語「チップマニホールド」は、液体を含む生体物質をウェル中に保持及び／又は分注するように、及び／又は生体試料をエレクトロポレーションするように構造されているあらゆる数のチップを保持するための構造を包含することが意図されている。チップマニホールドのチップは、一般的にウェルと共に整列するように構成され配置されている。
【００３８】
用語「エレクトロポレーション」は、適用された電場に起因して細胞膜のような細胞二重膜を透過させる、有意な電圧の適用を包含することが意図されている。エレクトロポレーションは、その他の適用のうちでもとりわけ、分子生物学において、ある基質（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、小分子、ペプチド、タンパク質、抗体）を細胞内へ導入する方法として、例えば細胞を分子プローブ、細胞機能を変化できる薬剤、又は核酸を細胞に取り込むことのように用いられている。
【００３９】
用語「生体物質」は、生命体から形成された或いは最近形成された何れかの物質を包含することが意図されている。例えば、生体物質は、細胞組織、植物、生細胞中に生じる化合物、加工生体物質、生存可能な物質、及び土壌及びその他の有機物質のような有機的に形成された物質を包含することができる。
【００４０】
用語「スクリーニング」は、特定の問題又は特徴を有するものを見つけ出すために多数のもの（例えば、生体物質試料）を探査することを包含するように意図されている。これに限定されないが、薬理学、医薬その他を包含している、本発明を実施できる多数の分野でスクリーニングを実施することができる。例えば、薬理学において、創薬期間における薬理活性の探索（例えば、化学化合物の細胞に対する生物活性（例えば細胞増殖）を検出）するためにスクリーニングを実施することができる。
【００４１】
用語「核酸」は、ヌクレオチド鎖からなる巨大分子を包含することが意図されている。例えば、分子は、遺伝情報を担持するか或いは細胞内に構造を形成することができる。一般的な核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を包含する。
【００４２】
ＩＩ．システム及び方法
マルチウェルプレートにおける生体物質の自動スクリーニング及び操作は、プレートウェルに対するチップアセンブリの位置調整が必要である。例えば、本発明のシステム及び方法は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、及び電解質を満たした毛細管（ＥＦＣｓ）を用いるエレクトロポレーションに基づく相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ハイスループットスクリーニングトランスフェクションの実施に適切である。
【００４３】
本発明のマルチウェルプレートは、多数のスクリーニング用途に用いることができる。ある一般的な用途は、プレート中のそれぞれのウェルが制御された所定量の作用物質を受け取れるように、マルチウェルプレートに液体を分注することである。このような作用物質の例は、遺伝物質、タンパク質、ペプチド、薬剤、増強剤、生物活性化合物全般、阻害剤、及び染料を包含する。マルチウェルプレートへの液体の分注は、それぞれのピペットチップがウェルプレート中の所定のウェルに対応している、ピペットチップマニホールドを用いて実施できる。
【００４４】
例えば、９６ウェルのマルチウェルプレート中の９６ウェル全てが、チップマニホールドの９６の異なったピペットチップから、それぞれのウェルに各追加液が行き渡るように、９６までの異なった溶液を同時に受け取る。それぞれののチップの配置（例えば、各チップの間隔）をマルチウェルプレートのウェルの配置と対応するように、チップマニホールド中でチップを配列することができる。
【００４５】
ウェルは、例えば、底面で生育した細胞、懸濁液中の細胞を収容でき、或いは試薬又は酵素のような化学種を収容することができる。ウェルに添加される溶液は、薬剤を異なった濃度でウェルに添加すると細胞に対する結合親和性の情報が得られるように、薬剤を含有することができる。溶液は、酵素を収容しているウェルに基質を添加すると反応速度に関する情報が得られるように、基質を含有することができる。
【００４６】
本発明のマルチウェルプレートは、キャピラリーエレクトロポレーションを含む、多くのロボットスクリーニング用途、及び例えば、各ウェルの底面で生育した細胞層に対するチップの正確な配置が実験結果に対して極めて重要である、幾つかの電気化学的、及び光学的用途に用いることができる。
【００４７】
図１は、生体物質の自動スクリーニング及び操作を本発明に従って実施することができるシステム（１００）を示す。システム（１００）は、本明細書に記載の方法に適しているパラメータを促進するために、密閉され、温度及び湿度が制御され、フィルター処理された空間を設けることができる。システム（１００）はチップマニホールド（２００）及びマルチウェルプレート（３００）を設けている。ロボット部材（１１０）は、チップマニホールド（２００）の一般的な位置決めのためにある。ロボット部材（１１０）は、多様なチップマニホールドを選択的に組み合わせるように適合され構成されている下端（１１１）を有している。未使用の時は、チップマニホールドをパークステーション（１１３）に置いておける。
【００４８】
マルチウェルプレート（３００）をテーブル（１２０）の上に配置できる。チップマニホールド（２００）を、ロボット部材（１１０）に取り付けて、マルチウェルプレート（３００）に対していろいろな方向に移動させることができる。例えば、図１に示されている軸（１１２）、（１１４）、（１１６）に対して、チップマニホールド（２００）をマルチウェルプレートの面と平行な面にある軸（１１２）に沿って前方及び後方に、マルチウェルプレートの面と平行な面にある軸（１１４）に沿って左及び右に、そしてマルチウェルプレート（２００）又はテーブル（１２０）の面と直角な面にある軸（１１６）に沿って上方及び下方に移動することができる。また、ロボット部材（１１０）は、チップマニホールド（２００）の一般的な位置決めのために、マルチウェルプレート（２００）又はテーブル（１２０）に取り付けることができる。
【００４９】
ここで図２を参照すると、システム（１００）の部分上面概略図が示されている。システム（１００）はスクリーニングのための多様な構成要素及び物質を保持するためにステーション（１３２）、（１３４）、（１３６）、（１３８）、（１４０）を設けている。例えば、ステーション（１３２）、（１３４）、（１３６）、（１３８）、（１４０）は、緩衝化合物（１３２）、コントロール化合物（１３４）、多様な培地（１３６）、供給源（１３８）、及び細胞物質（１４０）を保持することができる。その他のステーション（１４２）、（１４４）、（１４６）は、チップブロック（１４２）、洗浄ステーション（１４４）、及びチップマニホールド（１４６）を保持することができる。チップマニホールド（２００）に取り付けられているロボット部材（１１０）を、スクリーニングのための１つ又はそれ以上の物質、例えば、緩衝液（１３２）、コントロール（１３４）、及び細胞培養物（１４０）を組合せるために操作ができる。ロボット部材（１１０）を、スクリーニング工程での必要に応じて、チップブロック（１４２）を捕捉して、洗浄ステーション（１４４）で洗浄するようにプログラミングすることができる。
【００５０】
図３を参照すると、本発明は、チップマニホールド（２００）の複数のチップ（２０２）で受け止めるためのマルチウェルプレート（３００）を提供する。マルチウェルプレート（３００）は、図４、５Ａ、５Ｂ、及び５Ｃにも示されていて、生体物質を保持するための複数の無孔ウェル（３０２）を規定するボディー（３０４）を設けている。生体物質は、ウェル（３０２）の底面で生育した細胞又は懸濁液中の細胞を含有することができる。
【００５１】
マルチウェルプレート（３００）は、テーブル（１２０）上でマルチウェルプレート（３００）の最初の位置決めのために１つ又はそれ以上のバンキング表面（３１５）を有することができる。チップ（２０２）をウェル（３０２）内に正確にはめ込むために、チップマニホールド（２００）は、整列開口（３１０ａ−ｈ）、（３１２ａ−ｈ）をマルチウェルプレート（３００）内に最初にはめ込む整列ピン（２１０）、（２１２）を有している。
【００５２】
マルチウェルプレート（３００）内には、８対の整列開口（３１０ａ−ｈ）、（３１２ａ−ｈ）がある。それぞれ対において、整列スロット（３１０ａ−ｈ）は円形整列孔（３１２ａ−ｈ）と向かい合っている。整列スロットと孔の対（３１０ａ−ｈ）、（３１２ａ−ｈ）を、マルチウェルプレート（３００）の上に非対称的に形成することができる。例えば、整列孔（３１０ａ）、（３１２ａ）をボディー（３０４）の両側に形成することができる。それとは別に、整列開口の対を、ボディー（３０４）の隣辺に、互いに近づけて、又はチップマニホールド（２００）との正確な整列を可能にするスクリーニング工程に適切な何れかの構造に、形成することができる。示されている構造では、整列開口は４群で配置されていて、各群は、外周近くに２つのスロット（３１０）及び隣接スロット（３１０）から内部に位置している２つの孔（３１２）を有している。
【００５３】
マルチウェルプレート（３００）のボディー（３０４）は、マルチウェルプレート（３００）の構造、チップマニホールド（２００）、及びスクリーニング用途の必要性に応じて、１６個以上又は以下の整列開口（３１０）、（３１２）、例えば、１、２、３、４、５個等の装置を規定することができる。
【００５４】
図３、４、５Ａ〜Ｃ、及び６で示されているように、マルチウェルプレート（３００）は１６個の整列開口を有し、そしてチップマニホールド（２００）は４〜１２配列のチップを有している。従って、チップマニホールド（２００）の４８個のチップを用いて３８４個のウェルをカバーするために、マルチウェルプレート（３００）のボディー（３０４）を、チップマニホールド（２００）の合計８個の異なったディップのために、１６個の開口（３１０ａ−ｈ）、（３１２ａ−ｈ）（例えば、８対）を規定するように構成することができる。このように、それぞれのディップが整列開口（３１０）、（３１２）の異なった対を利用することになる。チップマニホールド（２００）は、マルチウェルプレート（３００）中のウェル（３０２）の４．５ｍｍ間隔に対して９ｍｍ間隔を有する４×１２列のチップ（２０２）を有するエレクトロポレーションチップマニホールドであることが好ましい。
【００５５】
本発明の更なる実施態様によると、マルチウェルプレート（３００）は、底面部に特徴があり、或いはテーブル（１２０）の上にマルチウェルプレート（３００）を設置するために整列開口（３１０）、（３１２）を完全に、部分的に又は一時的に使用することができる。更に、バンキング表面（３１５）又はマルチウェルプレート（３００）の別の部分を、マルチウェルプレート（３００）の大まかな位置決めを行うために、テーブル（１２０）上の相補的表面に容易に隣接させることができる。マルチウェルプレート（３００）は、底面側に、マルチウェルプレート（３００）を高精密な方法で６本の軸（軸１１２、１１４、１１６及び同軸の回転）内に配置するために、平坦部、ギザギザ部及びセミドーム部のような３点と相互作用するように、３点（示していない）を有していてよい。底部が、構造安定性を増大するために支持ビームを設けていることも好ましい。１つの態様では、縁まで平行して伸びている複数の長い支持ビーム及び縁まで垂直に伸びている複数のより短い支持ビームを有している。支持ビームの数及び構造は、所望によって変更できる。
【００５６】
好ましくは、整列開口（３１０）、（３１２）をマルチウェルプレート（３００）の別の部分に、例えばマルチウェルプレートの角に形成できる。マルチウェルプレート（３００）は、用途の必要性に応じて、様々な大きさ及び形状の３つの、４つの、又はあらゆる数の整列開口を更に形成することができる。例えば、より大きい機械部品は安定性を増大するために２つ以上のスロットを必要とするだろう。別の例では、単一の孔のみが「＋」又は「−」整列ピンと組み合わさってマルチウェルプレート（３００）を横方向及び回転して配置できるように、１つ又はそれ以上のスロットを「＋」又は「−」形状にすることができる。その他の多くの形状の整列ピン及び孔の組み合わせは、三角形、鍵穴等の形のような、三次調節（図１に関して、軸１１２、軸１１４及び回転軸１１６）を提供できる。
【００５７】
図５Ａで最もよく分かるように、ボディー３０４は長方形の形状を有している。整列開口（３１０）、（３１２）を、整列スロット（３１０）を整列孔（３１２）よりも外周（３３６）の近くに形成して、ボディー（３０４）の第１短辺に形成することができる。ボディー（３０４）は、スクリーニング用途のために、長方形の形状に限定されず、正方形、円形、多角形、楕円形、又はその他の何れかの適切な形状、又はこれらの組み合わせを有していてよい。また、整列スロット（３１０）を外周の近くに形成する必要はなく、例えば、孔（３１２）よりも外周から離して、例えばボディー（３０４）のほぼ中心のボディー（３１０）の部位に形成することができる。
【００５８】
整列開口（３１０）、（３１２）をマルチウェルプレートボディー（３０４）の離れた部分に形成することができる。また、テーブル（１２０）は、マルチウェルプレート（３００）を最初に誘導配置して、整列ピン（２１０）を受け止めるのに役立つ、直立した突起又は類似の構造を有することができる。従って、マルチウェルプレート（３００）は整列開口を必要としないだろう。更に別の実施態様では、テーブル（１２０）は、整列開口（３１０）、（３１２）を介してマルチウェルプレート（３００）を最初に整列させる移動ピンを包含していてよく、次いでこの移動ピンは後退して整列開口（３１０）、（３１２）を用いてチップマニホールド（２００）を整列可能にする。
【００５９】
本発明の更なる実施態様では、整列開口（３１０）、（３１２）の両方を円形として形成する。また、それぞれの整列開口（３１０）、（３１２）は、形成された孔中心点を有している。整列孔（３１０）、（３１２）を、その他の形状、例えば、正方形及び４辺以上の形状、例えば六角形として形成することができる。更に、整列孔の直径及び整列孔の中心点（３２５）の間の距離をスクリーニング用途の必要に応じて変えることができる。ある実施態様では、ボディー（３０４）は射出成形で製造される。このような製造過程で、排出ピン（示していない）を用いて、ボディー（３０４）を鋳型（示していない）から取り外す。その結果、排出ピンの跡が、複数の円（３１９）としてボディー（３０４）の上に現れるかもしれない。この円（３１９）は孔を通過しておらず陥没さえもしていない。
【００６０】
ボディー（３０４）は、金属、セラミック、プラスチック、ゴム、ガラス、等、更にこれらの組み合わせからも作ることができる。ウェルの数は、６、１２、２４、４８、９６、３８４、１５３６又は３４５６ウェルを含んでいる。ウェルの数は偶数でも奇数でもよい。
【００６１】
システム（１００）は、チップマニホールド（２００）も包含していて、その実施態様は図６に示されている。チップマニホールドは、プレート（２０４）、及びプレート（２０４）に従属している複数のチップ（２０２）を包含している。第１及び第２チップ整列ピン（２１０）、（２１２）もプレート（２０４）に従属している。対向している整列開口（３１０）、（３１２）の対を整列のために用いることができるように、第２チップ整列ピン（２１２）は第１チップ整列ピン（２１０）と対向している。
【００６２】
チップ（２０２）は、電極又は導光部材、又は使い捨てプラスチックピペットチップのような分注チップを包含している。電極は生体物質のエレクトロポレーションのために用いることができ、チップは電解質を満たした毛細管又はチップであってよい。電極は、酸化過程又は還元過程を測定するために、固体、例えば円柱電極であってもよい。導光部材は生体物質を光に曝すために用いられ、チップは、光を導くため、又はウェル及び／又は細胞から放出される光、例えば蛍光又はルミネッセンスを測定するための光ファイバールーメンであってよい。使い捨てチップを、高度な正確性及び清浄度が必要な、液体を添加及び回収する多くの適用に用いることができる。
【００６３】
ここで図７Ａ及び７Ｂを参照すると、チップ（２０２）とウェル（３０２）を整列させるための並びが、工程を説明するために部分的に示されている。特に図７Ａは、マルチウェル（３００）の整列スロット（３１０）に近接している、先端が丸いチップマニホールドの整列ピン（２１０）を説明している。上記のように、チップマニホールド（２００）はロボット部材（１１０）と選択的に連結している。軸（１１２）、（１１４）、（１１６）に沿って移動することにより、ロボット部材（１１０）は上記整列ピン（２１０）、（２１２）を整列孔（３１０）、（３１２）にそれぞれ位置付ける。単純化するために、ピン（２１０）と整列スロット（３１０）のみが図７Ａ及び７Ｂに示されている。
【００６４】
整列ピンは、整列開口（３１０）、（３１２）の方を向いている丸い先端を有している。マルチウェルプレート（３００）をテーブル（１２０）の上に配置して最初に位置決めできるが、マルチウェルプレート（３００）を上記のように自由に移動することができる。マルチウェルプレート（３００）は最初に、チップマニホールド（２００）の整列ピン（２１０）、（２１２）が少なくとも部分的に整列開口（３１０）、（３１２）と整列するように配置されるが、マルチウェルプレート（３００）のチップマニホールド（２００）への、そしてそれによるチップ（２０２）のウェル（３０２）への最終的な整列は、整列ピン（２１０）、（２１２）を整列開口（３１０）、（３１２）内へ挿入することによって達成される。
【００６５】
ここで図７Ｂを参照すると、ピン（２１０）が整列孔（３１０）に十分に挿入されている。図１の軸（１１２）、（１１４）、（１１６）が基準方向のために再生されている。ピン（２１０）、（２１２）を挿入するために、チップマニホールド（２００）がマルチウェルプレート（３００）の方へ軸（１１６）に沿って下げられる。ピン（２１０）、（２１２）が整列開口（３１０）、（３１２）に入るにつれて、整列ピン（２１０）、（２１２）の丸い先端（２８０）が、マルチウェルプレート（３００）を軸（１１２）、（１１４）によって規定される水平面内を横方向に移動させる。２つのピン（２１０）、（２１２）によって移動される２つの整列開口（３１０）、（３１２）が存在するので、マルチウェルプレート（３００）は軸１１６まわりの回転方法についても調整できる、例えば、３軸調整。チップ（２１０）、（２１２）は比較的長く、マルチウェルプレート（３００）に密接に依存しているので、チップ（２０２）がウェル（３０２）に到達する前に整列が起こる。この方法で、全てのチップ（２０２）及びウェル（３０２）は、チップ（２０２）がウェル（３０２）内に挿入されるのに備えて、完全に位置決めされて整列する。また、三角形のピンと１つの三角形の孔を３軸調整等に用いることができる。その他の例としては、マルチウェルプレートがテーブル（１２０）から垂直に伸びている壁によって正確に整列を保持していて、マルチウェルプレート（３００）がバンキング表面（３１５）又は別の位置に接触している場合は、回転整列を妨げることができる。従って、ピンを孔へ挿入することによって側面調整のみを必要とすることができる。
【００６６】
図８を参照すると、図１に示されている４８チップマニホールド（２００）によって、３８４ウェルプレート（３００）のあらゆるウェルをカバーするための１つの可能な挿入パターンが説明されている。マルチウェルプレート（３００）は、２４ウェル／列の１６列に配列されている３８４個のウェル（３０２）を有している。チップマニホールド（２００）は、ウェル（３０２）の２倍分間隔をあけた、１２チップ／列の４列を有している。従って、各ウェル（３０２）にアクセスするためにチップマニホールド（２００）の８個の整列ディップを必要とする。対向する整列孔（３１０ａ−ｈ）、（３１２ａ−ｈ）の８対が８個のディップに向かい合って形成されている。主題技術は、この構造に限定されず、例えば、チップの列を、スクリーニング工程の必要に基づいて、各信号ウェル列毎に、ウェル列を３列おきに、ウェル列を４列おきに等に間隔を空けることができる。
【００６７】
より詳細には、スクリーニングを遂行するために、ロボット部材（１１０）は、チップマニホールド（２００）を８対の整列孔（３１０ａ−ｈ）、（３１２ａ−ｈ）の間を移動させることによって、チップ（２０２）をあらゆるウェル（３０２）に挿入する。例えば、チップマニホールド（２００）のピン（２１０）、（２１２）を上記のように整列孔（３１０ａ）、（３１２ａ）内に整列させると、チップ（２０２）が「ａ」と標識したウェル（３０２）内に整列され挿入される。チップマニホールド（２００）のピン（２１０）、（２１２）を上記のように整列孔（３１０ｂ）、（３１２ｂ）内に整列させると、チップ（２０２）が「ｂ」と標識したウェル（３０２）内に整列され挿入されるなどである。孔（３１０ｄ）、３１２（ｄ）に整列させることによって４番目のディップが完了した後、ロボット部材（１１０）は、整列孔の下の対（３１０ｅ−ｈ）、（３１２ｅ−ｈ）の上に飛び降りて続行する。以上のように、ロボット部材（１１０）は、チップマニホールドを、ａ〜ｈで標識したウェル（３０２）に示される、２段階ボーストロヘドニック（boustrophedonic）パターンで移動させる。
【００６８】
実施態様では、チップ（２０２）は９ｍｍの横列間隔及び９ｍｍの縦列間隔を有し、そしてウェル（３０２）は４．５ｍｍの横列間隔及び４．５ｍｍの縦列間隔を有している。従って、チップマニホールド（２００）のチップ（２０２）は、ウェルの列の隔横列分空いている横列に、及びウェル列の隔縦列分空いている縦列に整列している。
【００６９】
ある実施態様では、主題技術はマルチウェルプレート（３００）を包含する装置を含んでいる。マルチウェルプレートは、生体物質を保持するための複数の無孔ウェル（３０２）、第１整列孔（３１０）、及び第２整列孔（３１２）を規定するボディー（３０４）を含んでいて、第２整列孔（３１２）は第１整列孔（３１０）と対向している。この装置は、テーブル（１２０）、及びテーブル（１２０）上に配置されているマルチウェルプレート（３００）をチップマニホールド（２００）と整列させるためのロボット部材（１１０）を含んでいる。チップマニホールド（２００）が少なくとも１つのチップ（２０２）を含んでいて、ロボット部材（１１０）が更にマルチウェルプレートをテーブル（１２０）の平面に対して垂直（１１６）に（上下方向に）整列させるのが好ましい。
【００７０】
本発明の更なる実施態様によると、マルチウェルプレートは更に、テーブル（１２０）上のマルチウェルプレートの位置を確保してチップマニホールドを整列させるのに役立つ、１対の整列孔（３１０）、（３１２）を形成する。
【００７１】
ある実施態様では、主題技術は、チップマニホールド（２００）の少なくと１つのチップ（２０２）をマルチウェルプレート（３００）の複数のウェル（３０２）と整列させる方法を含んでいる。ある方法は、整列孔の少なくとも１つがマルチウェルプレート（３００）の片側上に形成され、そして整列孔の少なくとも１つがマルチウェルプレート（３００）の反対側上に形成されている、少なくとも２つの整列孔（３１０）、（３１２）を提供することを含んでいる。方法は、整列ピンの少なくとも１つがチップマニホールド（２００）の片側に連結していて、整列ピンの少なくとも１つがチップマニホールド（２００）の反対側に連結している、少なくとも２つの整列ピン（２１０）、（２１２）を提供する。方法は、チップマニホールドの片側に連結している少なくとも１つの整列ピンを整列孔の少なくとも１つに挿入することにより、及びチップマニホールドの反対側に連結している少なくとも１つの整列ピンをその他の整列孔の少なくとも１つに挿入することによって、少なくとも１つのチップ（２０２）を複数のウェル（３０２）の少なくとも１つ中へ誘導することを含んでいる。本発明の更なる態様によると、少なくとも１つのチップはエレクトロポレーションチップである。
【００７２】
本発明の別の実施態様によると、チップマニホールド（２００）は多数のチップ（２０２）の配列を有している。配列のチップ（２０２）は少なくとも１つのチップを含んでいる少なくとも１列に配置されている（チップ（２０２）の４×１２列を有している図６を参照されたい）。チップ（２０２）の数はウェル（３０２）の数と等しくてよい。ウェル（３０２）の複数は、６、１２、２４、４８、９６、３８４、１５３６又は３４５６個のようなあらゆるウェルの数を含んでいる。本発明の更なる実施態様では、少なくとも１つのチップを、それぞれのウェルの１部と整列して、そのそれぞれのウェルの１部の中に挿入できるように構成するために、ウェルの数はチップの数の倍数と等しい。適切なエレクトロポレーションチップ及び使用方法は当該技術分野で公知である。例えば、米国特許第６，５２１，４３０号及び米国特許出願公開第２００５／００４８６５１号及び同第２００５／００３６２８３号（これらの全ては、その全体を参照して本明細書に取り込まれている）に記載されているエレクトロポレーションチップを、本発明の装置の使用に適用することができる。
【００７３】
図９Ａを参照すると、整列ピン及び９６個のバネで留められているエレクトロポレーションチップを含んでいる、別のエレクトロポレーションチップマニホールド（４００）の分解図が示されている。更に明確にするために、以下の記載は、エレクトロポレーションチップマニホールド（４００）の正面図、側面図、上面図及び断面図を示している、図９Ｂ〜９Ｅも参照している。このマニホールドは、８×１２列に配置された９６個のバネで留められているエレクトロポレーションチップアセンブリ（４０２）を有している。また、エレクトロポレーションチップアセンブリ（４０２）の間隔はウェルのそれの２倍である。従って、３４８ウェルプレートはマニホールド（４００）が４回通過するとカバーされる。バネで留めたエレクトロポレーションチップを有することによって、チップ（４０２）の四次調節（すなわち、図１の軸１１６に沿った調節）が生じる。
【００７４】
マニホールド（４００）は、チップ誘導プレート（４０８）に対する開口部（４０６）を形成するカバー（４０４）を含んでいる。チップ誘導プレート（４０８）は、それぞれのエレクトロポレーションアセンブリ（４０２）に対して開口（４１０）を提供する。チップ誘導プレート（４０８）は、マルチウェルプレートをエレクトロポレーションチップアセンブリ（４０２）に整列させるために２つの第１整列ピン（４１２）を保持している。チップ誘導プレート（４０８）は、更なる安定性及び位置決めを提供するようにマルチウェルプレート上の整列孔に浅くはめ込むための任意の第２整列ピン（４１４）も保持している。
【００７５】
チップ誘導プレート（４０８）は、合わせピン（４１８）によって相互接続プリント基板（ｐｃｂ）（４１６）と位置合わせされる。ｐｃｂ（４１６）は、チップ誘導プレート（４０８）と共に、それぞれのエレクトロポレーションチップアセンブリ（４０２）と連結して、エレクトロポレーションチップアセンブリ（４０２）に電気相互接続及び機械的バネ荷重をもたらす。ｐｃｂ（４１６）は、それらに従属している二又のピンアセンブリ（４２０）を有している。ｐｃｂ（４１６）は、それぞれの二又ピンアセンブリに対して下方向のエネルギーを提供するために、バネ（示していない）のようなバイアス要素を保持している孔を規定している。
【００７６】
ここで図９Ｆ〜９Ｉを参照すると、エレクトロポレーションチップアセンブリ（４０２）の多様な図が示されている。それぞれのエレクトロポレーションチップアセンブリ（４０２）は、上位部（４２６）より比較的狭い下位部（４２４）を有する外部電極（４２２）を有している。上位部と下位部（４２４）、（４２６）の中間に、外部電極（４２２）は狭窄部（４２８）を有している。外部電極（４２２）は、実質的に上位部（４２６）において電極スペーサ（４３２）を受け入れるための内部（４３０）を規定している。外部電極（４２２）及びスペーサ（４３２）は、それらの間の関係を確立するために、それぞれが、相補的な長方形の環（４３４）、（４３６）を有している。外部電極の環（４３４）は、バンキング表面（４３８）（図９Ｉで最もよく見える）も形成し、これはエレクトロポレーションチップアセンブリ（４０２）がチップ誘導プレート（４０８）のそれぞれの孔を通過することを阻止する。従って、エレクトロポレーションチップアセンブリ（４０２）は、チップ誘導プレート（４０８）の中で単に静止していて、上方に移動できる。外部電極（４２２）上の環（４３４）に隣接して電極接触部（４４０）もある。
【００７７】
外部電極（４２２）の下位部（４２４）は実質的にチップ基底部（４４２）を収容する。スペーサ（４３２）及びチップ基底部（４４２）の両方は、それぞれが外部電極に、締まりばめ、溶接、接着等によりしっかりと連結できるように、狭窄領域（４２８）内に広がっている。チップ基底部（４４２）は所定の大きさの末端部（４４４）を有しているので、末端部（４４４）がウェルの底に隣接すると、ウェルのそこにある物質とチップ電極の操作部位の間に間隔を設定することができる。末端部(４４４)は、下位部（４２４）の終端となるショルダー（４４５）を形成する。スペーサ（４３２）は、内部電極（４４８）を受け入れる内部（４４６）も規定する。内部電極（４４８）は、スペーサ環内に位置する内部電極接触部（４５０）も有している。内部電極（４４８）が外部電極内部（４３０）内に深く広がるにつれて、内部電極（４４８）も狭窄部（４２８）でその中に固定される。
【００７８】
再び図９Ａ〜Ｅを参照すると、組み立てられると、ｐｃｂ（４１６）に従属する二叉ピンアセンブリ(４２０)が、エレクトロポレーションチップアセンブリ（４０２）を連結する。特に、二叉突起の一方が外部電極接触部（４４０）と電気的に接触するように構成され、それに対して突起の他方が内部電極接触部（４５０）と電気的に接触するように構成され、それによってコネクター（４５３）を介する電気回路が完成する。更に、二叉ピンアセンブリ（４２０）はバネ付勢されているので、上方エネルギーがエレクトロポレーションチップアセンブリ（４０２）に作用すると、エレクトロポレーションチップアセンブリ（４０２）は上方に移動してもよいが接触は保持される。
【００７９】
例えば、ウェルプレートが不規則なウェルの深さを有している場合に、エレクトロポレーションチップアセンブリ（４０２）を、深さに関わりなく挿入できる。上方移動が可能なこと及びスペーサ（４４２）を有していることによって、それぞれのエレクトロポレーションチップアセンブリ（４０２）をウェルの底から同じ距離に都合良く位置付けることができる。図９Ｊを参照すると、例示的なエレクトロポレーションチップアセンブリ（４０２）が例示的なウェル（３０２）中に配置されて示されている。バネで留められているエレクトロポレーションチップアセンブリ（４０２）がマルチウェルプレート（３００）のウェル（３０２）内に挿入されている。エレクトロポレーションチップアセンブ（４０２）を吸引及び／又はエレクトロポレーションを実施するために適用できる。
【００８０】
図１に示されている軸（１１６）に沿ったロボット部品（１１０）の移動によって、エレクトロポレーションチップアセンブリ（４０２）がそれぞれのウェル（３０２）内に下げられる。好ましくは、それぞれのウェル（３０２）はウェル（３０２）の底に実質的に平らな面を有している。エレクトロポレーションチップアセンブリ（４０２）を、それぞれのウェル（３０２）内に及びスペーサ（４４２）が底に接触する地点を超えて、下げる。結果として、バネ荷重を、それぞれのウェル（３０２）の底（３６０）とエレクトロポレーションチップアセンブリ（４０２）の操作部位の間の所定距離をセットするために用いる。ある実施態様では、この所定距離が約７５マイクロメートルである。
【００８１】
エレクトロポレーション液をウェル（３０２）の中で処理し、そしてエレクトロポレートする生体物質（例えば、細胞）をウェル（３０２）の底で処理することが好ましい。生体物質は哺乳動物細胞でよいが、その他の適切な基質（例えば、脂肪小胞）を包含することができる。生体物質はウェル（３０２）の底にあっても又は底に付着させてもよい。マルチウェルプレートボディー（３０４）において規定されるウェル(３０２)は通常、スペーサ（４４２）の形状にぴったり合っている正方形である。
【００８２】
再び図９Ａ〜９Ｅを参照すると、マニホールド（４００）は、エレクトロポレーションチップアセンブリ（４０２）と液体接続プレートアセンブリ（４５４）の間に液体流路を確立するためのチューブ（４５２）も含んでいる。液体接続プレートアセンブリ（４５４）は、液体分配プレート（４５８）を支持する外枠（４５６）を有している。マニホールド（４００）を別の部品と連結できるように、液体接続プレートアセンブリ（４５４）の外枠（４５６）に２つの担体支持アセンブリ（４６０）を備え付ける。複数の留め具（４６２）及びワッシャー（４６４）が、（便宜上それらの一部のみを示してある）マニホールド部品を共に固定する。
【００８３】
図１０は、本発明方法の工程を有するフローチャートを説明している。特に、このフローチャートは、点線の枠で囲まれて規定されるエレクトロポレーション工程Ｓ１０２〜Ｓ１１６を用いてエレクトロポレーションを説明している。しかしながら、この方法は、エレクトロポレーション法に限定されておらず、その他のスクリーニング実験のために用いることができる。エレクトロポレーション法を開始する前に、チップ（２０２）内に培地を調製するために、工程Ｓ１５０〜Ｓ１６０を実施できる。
【００８４】
最初に、マルチウェルプレートを調製しなければならない。工程Ｓ１５０で、ロボット部材（１１０）は、ステーション（１３２）、（１３４）、（１３６）、（１３８）、（１４０）に保管されている液体源を回収するために液体処理チップを捕捉できる。
【００８５】
説明のために、図１０は、ポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）に特異的なｓｉＲＮＡでのＨｅＬａ細胞のトランスフェクションに関して説明している。ここにおいては、成功裏のトランスフェクションは、ポストトランスフェクション培養の７２時間後に、コントロールと比較して、生存能力の完全な喪失をもたらす。最初に、１０００個のＨｅＬａ-Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２．２）を、マルチウェルプレート（３００）の各ウェルの、１０％ウシ胎仔血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補完した、ＤＭＥＭ培地（Invitrogen of Carlsbad, California から商品番号３２４３０−０２７として入手可能）４０μｌ中に播種する。播種したのち、マルチウェルプレート（３００）を５％ＣＯ２中、３７℃で２４時間培養する。
【００８６】
培養後、マルチウェルプレート（３００）はトランスフェクションの準備が整う。工程Ｓ１５２で、ロボット部材（１１０）はチップマニホールド上の適切な液体処理チップを使える状態になっている。細胞培養培地を除去する（通常は１０μｌの残余培地を残して）。
【００８７】
工程Ｓ１５４では、エレクトロポレーション培地をウェル（３０２）に添加する。
工程Ｓ１５６では、供給源プレートから核酸（例えば、ＰＬＫ１に対して特異的ｓｉＲＮＡ）を、コントロールプレートからのコントロールと共に添加することができる。例えば、ｓｉＲＮＡとエレクトロポレーション緩衝液を添加する。ある実施態様では、ｓｉＲＮＡとエレクトロポレーション緩衝液は総計２７μｌの添加となって、各ウェル（３０２）中が合計３７μｌとなる。工程Ｓ１５４、Ｓ１５６の中間体を洗浄するために、ロボット部材（１１０）は、液体処理チップを洗浄ステーションに移動することができる。
工程Ｓ１５８では、ロボット部材（１１０）は、液体処理チップを切り離して、エレクトロポレーションチップマニホールド（ＥＴＭ）（２００）と連結することに備える。
【００８８】
工程Ｓ１６０では、ＥＴＭ（２００）がロボット部材（１１０）に捕捉されてエレクトロポレーション操作の準備が整う。
工程Ｓ１０２では、ロボット部材（１１０）がＥＴＭ（２００）を、テーブル（１２０）の上に配置されているマルチウェルプレート（ＭＷＰ）（３００）の上の位置に移動する。工程Ｓ１０２の終了時に、ＥＴＭ（２００）を次の工程における正確な整列に備えてＭＷＰ（３００）の上にざっと整列させる。
工程Ｓ１０４では、ＥＴＭピン（２１０）、（２１２）をＭＷＰ整列孔（３１０ａ）、（３１２ａ）とより正確に整列させる。
【００８９】
工程Ｓ１６０では、ＥＴＭピン（２１０）、（２１２）を整列孔（３１０ａ）、（３１２ａ）内に挿入して、ＭＷＰ（３００）を上記のようにＥＴＭ（２００）と正確に整列させる。
【００９０】
工程Ｓ１０８では、液体を吸引して電流又は電気回路を作り出す。例えば、チップ（２０２）が合計で１５μｌの液体を回収して、それぞれのウェル（３０２）に２２μｌを残す。次いで、チップ（２０２）をウェル（３０２）の中に下ろして、ウェルの底（３６０）から２ｍｍ上で止める。チップ（２０２）内に吸引された１５μｌの液体を有することで、エレクトロポレーションチップのそれぞれの内部電極及び外部電極の間に電気的接触を作り出す。例えば、チップの電気回路が閉鎖する。チップ（２０２）の電極は、高電圧パルスをチップに伝えることができる矩形波パルス発生器（示していない）に接続している。
【００９１】
工程Ｓ１１０では、チップ（２０２）を、それぞれのウェルの底（３６０）に接触するように動かす。チップ（２０２）を、上記のようにバネで留めることが好ましい。
工程Ｓ１１２では、パルスプロトコールを加える。パルスプロトコールを細胞の型によって大幅に変えることができる。ＰＬＫ１に対しては、適切なパルスプロトコールは、印加電圧１３０Ｖで、０．１秒間隔でのパルス長が２５ｍｓの２５パルスである。
【００９２】
工程Ｓ１１４では、チップ（２０２）をウェル（３０２）の底面（３６０）の上に持ち上げて、液体の大部分を分配することができる。または、チップ（２０２）を、液体を分配して廃棄する洗浄ステーションに直接進めることができる。
【００９３】
工程Ｓ１１６では、ＥＴＭチップ（２０２）はＭＷＰウェル（３０２）の外へ移動する。エレクトロポレーション操作は、ウェルの別の部分をチップでカバーするために繰り返してよいし（１２０）、又は工程（１２２）で中止して培養することができる。３８４ウェル（３０２）及び４８チップ（２０２）の実施態様では、３８４個全てのウェル（３０２）上でエレクトロポレーション操作を実施するために、整列孔の対（３１０ｂ−ｈ）、（３１２ｂ−ｈ）に対して処理工程Ｓ１０６〜Ｓ１１６を更に７回実施することになる。ウェルの一部が異なったスクリーニング物質を包含できるように、処理中にチップを洗浄して置き換えて新しい生体物質を採取することも更に可能である。
【００９４】
エレクトロポレーション操作が完了したら、エレクトロポレートした細胞をトランスフェクトした分子の存在下で培養できる。例えば、ＰＬＫ−１アッセイにおいては、エレクトロポレーション後に２８μｌの培地を添加する。追加の培地を１５％のウシ胎仔血清及び１．５％のペニシリン／ストレプトマイシンで補完して、１０％のウシ胎仔血清及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンを有する最終容量５０μｌとし、次いで、５％ＣＯ２中、３７℃で７２時間培養する。
【００９５】
培養後に、トランスフェクション効率及び生存率を評価できる。このシステム（１００）は評価を促進できるか、或いは評価をシステムの外で実施できる。ＰＬＫ１の例では、システムは、ＭＷＰ（３００）から一部の培地を取り出すことができる。ロボット部材(１１０)に連結している液体処理マニホールド（示していない）を使用して、システム（１００）は２％ウシ胎仔血清を補完したＤＭＥＭ培地に４０μｌの１０％アラマブルー（Alamar Blue）試薬を添加することができる。室温で遮光して２時間培養した後、トランスフェクション効率及び生存率を、Tecan Trading Group AG in Lausanne, Switzerland から入手できるＳＡＦＩＲＥ２（登録商標）プレートリーダーを用い、製造会社の使用説明書に従って、評価する。
【００９６】
図１１及び１２は、本発明の装置及び方法を用いる自動スクリーニングの結果を示す。図１１は、プラスミドトランスフェクションによる生存率及び効率の結果を示す。細胞型ＤＲＧ、シュワン細胞（Schwann cells）、ＰＣ−１２、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、内皮症（ヒト）、Ａ５４９、及びＮｅｕｒｏ−２ａについての、効率及び生存率の百分率が示されている。図１２は、ＨｅＬａ、ＨｅＬａ−Ｓ３、及びＨＥＫ２３９細胞型のｓｉＲＮＡトランスフェクションの生存率及び効率の百分率を示している。
【００９７】
本主題技術の１つの利点は、高精度な配置をもたらす整列ピンを備えたエレクトロポレーションチップマニホールドを提供することである。
【００９８】
本主題技術の別の利点は、チップを整列させ、下げ、そして細胞培養ウェルの表面にごく接近して配置することができる、エレクトロポレーションチップマニホールド及びマルチウェルプレート整列装置、並びに方法を提供することである。エレクトロポレーションの間に、電場の焦点をウェルの底とチップ毛管電極の間に合わせることができるので、実質的なエレクトロポレーションキュベットを作ることができる。この方法により、細胞をそれらの固有状態で、改善された生存率で、直接エレクトロポレーションできる。
【００９９】
その他の利点は、整列装置及び方法がハイスループットなスクリーニングを促進することである。生体関連細胞型に対するゲノム規模でのＲＮＡｉスクリーニングのような適用を有効にする多数の研究処理へと拡張可能である。その他のハイスループット／大規模な適用は、ｃＤＮＡスクリーニング、細胞内標的の特性化、信号伝達経路の生物システムの探索(interrogation)、及び細胞内薬物の投与を包含する。更に、本発明の多様な実施態様の装置を比較的容易に且つ安価で製造することができる。
【０１００】
当然のことながら、上記の一般的な記載及び以下の記載の両方は例示的及び請求されている発明の更なる説明を提供することを意図している。
【０１０１】
本願に組み込まれてその一部を構成している添付の図面は、本発明の装置及び方法を説明して、更なる理解を提供するために含まれている。記載と共に、図面は、本発明の理念を説明するのに役立つ。
【０１０２】
本発明の理念、態様、及び実施態様を記述する明細書、更にそれらの具体的な実施例は、それらの構造的及び機能的な均等物の両方を包含するように意図されている。また、このような均等物は、現在公知の均等物、更に将来的に改良される均等物、すなわち、構造にかかわらず、同じ機能を達成する改良された何れかの構成要素、の両方を包含するように意図されている。
【０１０３】
上記の発明は、明瞭性及び理解を目的とする説明及び実施例の手段としていくらか詳しく記載されているが、当業者には、幾らかの変更及び修正を実施できることは明らかであろう。従って、記載及び実施例は、添付した番号付けされた特許請求の範囲で詳しく説明されている、本発明の範囲を限定するように解釈すべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【図９Ｊ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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