(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管障害が、アテローム性動脈硬化、血管形成術後の再狭窄、肺動脈高血圧および静脈移植片疾患からなる群から選択され、
平滑筋細胞の増殖または成長を阻害することによる前記血管障害の治療および／または予防のための、ＭＲＰ４阻害剤を有効成分として含む医薬組成物。
【請求項２】
ＭＲＰ４阻害剤がＭＲＰ４の選択的阻害剤である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ＭＲＰ４阻害剤がＭＲＰ４発現の阻害剤である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ＭＲＰ４発現の阻害剤が、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ分子、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡおよびリボザイムからなる群から選択される、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ＭＲＰ４阻害剤が、有機低分子、アプタマー抗体および抗体断片からなる群から選択される、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の医薬組成物を含む、平滑筋細胞の増殖を阻害するための医薬組成物。
【請求項７】
請求項１から５のいずれかに記載の医薬組成物を含む、血管障害を治療するための医薬組成物。
【請求項８】
ＰＤＥ３阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＰＤＥ５阻害剤およびそれらの混合物からなる群から選択される１種または複数のホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤をさらに含む、請求項６または７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
請求項７に記載の第１の医薬組成物、ならびにＰＤＥ３阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＰＤＥ５阻害剤およびそれらの混合物からなる群から選択される１種または複数のホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤を含む第２の医薬組成物を含む、血管障害を治療するためのキット。
【請求項１０】
前記第２の医薬組成物がＰＤＥ５阻害剤を含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
請求項１から５のいずれかに記載の医薬組成物を含む、生体物質または医療用送達デバイス。
【請求項１２】
ステント、バイパスグラフト、血管周辺の内部パッチ、血管周辺の外部パッチ、血管カフおよび血管形成カテーテルからなる群から選択される、請求項１１に記載の生体物質または医療用送達デバイス。
【請求項１３】
平滑筋細胞の成長および増殖を阻害する医薬品を製造するための、請求項１から５のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
【請求項１４】
血管障害を治療する医薬品を製造するための、請求項１から５のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アテローム性動脈硬化、血管形成術後の再狭窄、肺動脈高血圧および静脈移植片疾患などの血管障害の治療および／または予防のための多剤耐性タンパク質４（ＭＲＰ４）の阻害剤に関する。本発明は、平滑筋細胞における遺伝子調節および細胞生理に関する。具体的には、本発明は、細胞からの環状ヌクレオチド流出を遮断するためのＭＲＰ４阻害剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の増殖および成長は、様々な病理学的刺激に応じて血管筋細胞で通常認められる血管再構築を導く２種類の機構である。平滑筋細胞の過剰な増殖は、主要な動脈血管における損傷応答に関与する基本的なプロセスである。このようなプロセスは、アテローム性動脈硬化、血管形成術後の再狭窄、肺動脈高血圧および静脈移植片疾患を含む数多くの血管障害に関わっている（Ｄｚａｕ  ＶＪ他、２００２；Ｎｏｖａｋ  Ｋ．，１９９８）。したがって、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）増殖の調節剤を同定することは、心血管生物学および心血管医学における研究の重要な焦点である。
【０００３】
胎児遺伝子の再発現を含む遺伝子の発現には、一定の変化パターンが認められる。このような差異は、特定の基礎的なシグナル伝達経路によって制御される。病的な血管平滑筋細胞の増殖に関与するシグナリング経路の記述が増えたことによって、環状ヌクレオチドによって制御される調節経路が指摘されるようになってきた。環状ヌクレオチド、すなわち、アデノシン３’、５’−１リン酸（ｃＡＭＰ）および環状グアノシン３’、５’−１リン酸（ｃＧＭＰ）は、平滑筋細胞増殖の負の調節因子として作用する重要なセカンドメッセンジャーである。細胞における環状ＡＭＰの合成はアデニリルシクラーゼ酵素によって、環状ＧＭＰはグアニリルシクラーゼ酵素によって触媒される（ＭｃＤｏｎａｌｄ＆Ｍｕｒａｄ、１９９６；Ｓｕｎａｈａｒａ他、１９９６）。細胞内ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰ濃度のｃＡＭＰおよびｃＧＭＰ類似体による上昇は、いずれも独立してウサギの血管平滑筋細胞の増殖を阻害する（Ａｓｓｅｎｄｅｒ  ＪＷ他、１９９２）。構成的活性型タンパク質キナーゼＧ（ＰＫＧ）（またはｃＧＭＰで刺激された野生型ＰＫＧ）の再発現は、ＶＳＭＣ移動を阻害し、アポトーシスを増強し、増殖を抑え、血管損傷後の新生内膜形成を減少させる（Ｂｏｅｒｔｈ  ＮＪ他、１９９７；Ｓｉｎｎａｅｖｅ  Ｐ他、２００２）。
【０００４】
これらの結果を受けて、環状ヌクレオチド除去に関与するプロセスに焦点が当てられてきた。これらの環状ヌクレオチドは、細胞内ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの加水分解に関与するホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）スーパーファミリーの特定のメンバーによって分解され得る（Ｒｙｂａｌｋｉｎ他、２００３）。
【０００５】
最近、Ｃｈｅｎ他（ＪＢＣ；２００１）によって、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰはまた、能動的流出輸送体、すなわち、ＡＴＰ結合カセット輸送体Ｃ型（ＡＢＣＣ）４およびＡＢＣＣ５遺伝子によってそれぞれコードされる多剤耐性タンパク質（ＭＲＰ）ＭＲＰ４およびＭＲＰ５によって輸送され得ることが報告された。この輸送体ファミリーの中でも、ＭＲＰ４およびＭＲＰ５はｃＡＭＰおよびｃＧＭＰに高い親和性を示す。しかし、現在に至るまで、これらのタンパク質の生理学的機能は不明なままである。最近、ＭＲＰ４およびＭＲＰ５は環状ヌクレオチドのＡＴＰ依存性排出ポンプとして同定され（Ｊｅｄｌｉｔｓｃｈｋｙ他、２０００；Ｃｈｅｎ他、２００１）、ＭＲＰ４およびＭＲＰ５はブタの冠動脈および肺動脈で発現することが示された（Ｍｉｔａｎｉ他；２００３）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、平滑筋細胞増殖がＭＲＰ４を阻害することによって抑制され得ることを初めて正式に示す。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、平滑筋細胞の成長および増殖を抑制するためのＭＲＰ４阻害剤に関する。
【０００８】
本発明は、血管障害の治療のためのＭＲＰ４阻害剤に関する。ＭＲＰ４阻害剤で治療することができる血管障害の例は、アテローム性動脈硬化、血管術形成後の再狭窄、肺動脈高血圧および静脈移植片疾患である。
【０００９】
本発明は、ＭＲＰ４の阻害剤を含む医薬組成物を対象に治療有効量投与することを含む、対象における血管障害の治療方法に関する。
【００１０】
本発明はまた、平滑筋細胞の増殖を抑制する医薬品を製造するためのＭＲＰ４阻害剤の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ヒト冠状動脈平滑筋細胞（ｈＣＡＳＭＣ）におけるＭＲＰ４の発現を示した図である。（ａ）培養したｈＣＡＳＭＣにおけるＭＲＰ４およびβ−アクチンｍＲＮＡの検出を示した代表的なＲＴ−ＰＣＲ。（ｂ）ＭＲＰ４に対するアフィニティー精製ポリクローナル抗体を使用した、ＭＲＰ４ｃＤＮＡを形質移入したｈＣＡＳＭＣにおけるＭＲＰ４発現の免疫蛍光分析。（ｃ）ＭＲＰ４がカベオリン１の豊富な画分に存在することを示す、不連続スクロース勾配で精製したｈＣＡＳＭＣ膜におけるＭＲＰ４およびカベオリン１発現のウェスタンブロット分析。
【図２】増殖する平滑筋細胞におけるＭＲＰ４のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける上方制御を示した図である。（ａ）ＭＲＰ４発現は、５％または０．１％Ｓに７２時間曝露した培養ｈＣＡＳＭＣにおいて、ウェスタンブロッティングによって定量した。ＰＰ２Ｂ（カルシニューリン）は標準物質として、サイクリンＤは増殖のマーカーとして使用する。（＊＊：ｐ＜０．０１）。（ｂ）バルーンで損傷したラット頸動脈の、損傷して１４日後の代表的な断面図である。免疫染色によって、培地（ｍ）と比較して新生内膜（ｎｉ）においてＭＲＰ４の優位な発現が明らかになった。ＭＲＰ４（赤）の発現は、平滑筋細胞増殖の表現型マーカーであるＮＭ−Ｂの発現（緑）と相関している。
【図３】ｈＣＡＳＭＣにおけるｃＡＭＰおよびｃＧＭＰおよびＭＲＰ阻害剤の抗増殖性効果を示した図である。細胞の増殖は、プレーティングして７２時間後にＢｒｄＵの取り込みによって測定し、増殖補助剤を欠乏した（０．１％Ｓ）細胞と比較した相対的増加として表した。（ａ）浸透性環状ヌクレオチド８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（１００μＭ）および８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（２００μＭ）、ＳＮＰ（ＮＯドナー、１ｍＭ）およびフォルスコリン（ＦＳＫ、アデニル酸シクラーゼ活性の刺激剤、５μＭ）の存在下での細胞増殖。ｎ＝３、３連で実験。（ｂ）ｈＣＡＳＭＣ増殖に対するＭＲＰおよびＰＤＥ阻害剤（ＤＩＰ：ジピリダモール、ＩＢＭＸ、ＭＫ５７１およびＮＢＭＰＲ）の用量効果。ｎ＝３、３連で実験。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１。
【図４】ＭＲＰ４ｓｉＲＮＡを使用したｈＣＡＳＭＣ増殖の阻害を示した図である。（ａ）ＭＲＰ４の効果的なサイレンシングを示すＭＲＰ４ｓｉＲＮＡまたはスクランブルｓｉＲＮＡで７２時間形質移入したｈＣＡＳＭＣの全細胞溶解物のウェスタンブロット分析。タンパク質を抗ＭＲＰ４抗体または抗ＰＰ２Ｂ（カルシニューリン）抗体でインキュベートした。カルシニューリンは添加対照として使用する。ｎ＝３；ｐ≦０．００１。（ｂ）スクランブルｓｉＲＮＡと比較した（ＢｒｄＵ取り込みによって評価した）ｈＣＡＳＭＣ増殖に対するＭＲＰ４ｓｉＲＮＡおよびＭＲＰ５ｓｉＲＮＡの効果。ｎ＝５、３連で実験。＊＊＊ｐ≦０．００１スクランブルまたはＭＲＰ５と比較したＭＲＰ４。（ｃ）非損傷（ＮＩ）および損傷頸動脈の、手術して１４日後の代表的なヘマトキシリン−エオジン染色。（ｄ）上記３群の内膜中膜複合体厚の平均データ（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、Ａｄ−ｓｈＬｕｃ感染と比較）。ｍは中膜を示す。ｎｉは新生内膜を示す。ａｄは外膜を示す（非損傷頸動脈についてはｎ＝５、Ａｄ−ｓｈＬｕｃ感染ではｎ＝４およびＡｄ−ｓｈＭＲＰ４感染ではｎ＝６）。（ｅ）頸動脈に関するＰＣＲ。ラット頸動脈からＤＮＡを抽出し、アデノウイルス発現をＰＣＲによって測定した。
【図５】ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰ細胞レベルに対するＭＲＰ４ｓｉＲＮＡの効果を示した図である。ＭＲＰ４またはスクランブルｓｉＲＮＡで７２時間形質移入し、特異的競合的酵素免疫測定法によって測定したｈＣＡＳＭＣに対する（ａ）ｃＡＭＰまたは（ｂ）ｃＧＭＰの細胞内／細胞外比のレベル（＊＊ｐ＜０．０１、ｎ＝３）。（ｃ、ｄ）スクランブルｓｉＲＮＡ（ｃ）またはＭＲＰ４ｓｉＲＮＡ（ｄ）で形質移入した２種類の代表的なｈＣＡＳＭＣにおいて、ＦＲＥＴをベースにしたセンサーＥｐａｃ２−ｃａｍｐｓによって測定した細胞内ｃＡＭＰに対する、濃度を増加させて（０．５μＭから１００μＭ）灌流したフォルスコリンの効果。両細胞において４４０±２０ｎｍでＣＦＰ励起して得られた生画像および対応する細胞平均化修正ＣＦＰ／ＹＦＰ比の時間経過が記録されている。ＣＦＰおよびＹＦＰの蛍光は、両方の細胞においてＥｐａｃ２−ｃａｍｐｓは主に細胞基質中に局在することを示した。スクランブルｓｉＲＮＡで形質移入した細胞（ｃ）では、フォルスコリン５μＭを適用することによって、基底ＣＦＰ／ＹＦＰ比の増加によって反映されたｃＡＭＰ上昇がもたらされた。ＭＲＰ４ｓｉＲＮＡ形質移入細胞（ｄ）においては、０．５μＭの低いフォルスコリン濃度で既に著しいｃＡＭＰ増加が生じた。（ｅ）ＭＲＰ４ｓｉＲＮＡ（ｎ＝１１）またはスクランブルｓｉＲＮＡ（ｎ＝１２）で形質移入した、およびＥｐａｃ２−ｃａｍｐｓで一過性形質移入したｈＣＡＳＭＣにおけるＦＲＥＴ測定値の濃度反応曲線（対数目盛）。基底ＣＦＰ／ＹＦＰ比は、両方の細胞群で類似していた。実線はヒル公式によってデータ点に合わせている（方法参照）。ｈＣＡＳＭＣにおけるＭＲＰ４ＲＮＡ干渉は、２群の実験において薬剤によって有意に異なるＥＣ５０値が得られたことによって示されるように、フォルスコリンに対する濃度応答曲線の左への移動を引き起こした。
【図６】ＭＲＰ４阻害は、ｈＣＡＳＭＣ増殖に対するｃＡＭＰ効果を増強することができるが、ｃＧＭＰ効果は増強できないことを示した図である。ＭＲＰ４またはスクランブルｓｉＲＮＡで７２時間形質移入した細胞における（ａ）ｃＡＭＰシグナル伝達の活性化剤、フォルスコリン、または（ｂ）ｃＧＭＰシグナル伝達の活性化剤、ＳＮＰ（ｎ＝５）の用量依存性抗増殖性効果。（ｃ、ｄ）ＰＫＡまたはＰＫＧの特異的阻害剤の存在下で、（ｃ）ＭＲＰ４またはスクランブルｓｉＲＮＡで形質移入するか、または（ｄ）ＭＲＰ阻害剤ＮＭＢＰＲ（１００μＭ）およびＭＫ５７１（３７．５μＭ）で処理した細胞における、ｈＣＡＳＭＣ増殖の評価。両方の場合において、Ａｄ−ＰＫＩ（特異的ＰＫＡ阻害剤）の存在下ではｈＣＡＳＭＣ増殖に対するＭＲＰ４阻害の効果の逆転で認められたが、ＫＴ５８２３（特異的ＰＫＧ阻害剤）の存在下では認められなかった。群当たりｎ＝３。＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１。（ｅ）ＭＲＰ４またはスクランブルｓｉＲＮＡで形質移入した増殖するｈＣＡＳＭＣにおけるリン酸化ＣＲＥＢ（ｐＣＲＥＢ）の代表的ウェスタンブロットおよび定量的評価（ｎ＝３、＊＊ｐ≦０．０１）。（ｆ）スクランブルまたはＭＲＰ４ｓｉＲＮＡで形質移入した増殖するｈＣＡＳＭＣにおける、ルシフェラーゼレポーターＣＲＥ−Ｌｕｃによって測定したｃＡＭＰ応答エレメントＣＲＥの活性の定量的評価（ｎ＝３、＊＊ｐ＜０．０１）。
【図７】環状ヌクレオチドの平滑筋細胞に対する抗増殖性効果におけるＭＲＰ４の関与を表した図である。
【図８】肺組織におけるＭＲＰ４染色を示した図である。ヒト肺動脈におけるＭＲＰ４発現の免疫蛍光分析。（Ａ）正常な肺動脈における免疫染色では、中膜でのＭＲＰ４発現（赤）が明らかである（緑：自己蛍光）。（Ｂ＆Ｃ）（肺高血圧の患者２人から得た）病的肺動脈における免疫染色によって、ＭＲＰ４は中膜および新生内膜（Ｂ）または肥大性中膜（Ｃ）において発現していることが示されている。
【図９】ヒト肺動脈から単離された平滑筋細胞におけるＭＲＰ４発現を示した図である。０％Ｓまたは５％Ｓに７２時間曝露した培養平滑筋細胞におけるウェスタンブロット分析で、増殖状態で増加する基礎発現を示している。
【図１０】ＭＲＰ４ｓｉＲＮＡによるｈＰＡＳＭＣ（ヒト肺動脈平滑筋細胞）増殖の阻害を示した図である。（ＢｒＤＵ取り込みによって評価した）スクランブルｓｉＲＮＡと比較した細胞増殖に対するＭＲＰ４ｓｉＲＮＡの効果で、有意な減少を示している。
【図Ｓ１】ｈＣＡＳＭＣにおけるＭＲＰ５およびＭＲＰ４の発現を示した図である。（ａ）ＲＴ−ＰＣＲを用いたｈＣＡＳＭＣにおけるＭＲＰ５およびβ−アクチンｍＲＮＡの検出。（ｂ）全溶解物（１）および膜溶解物（２）におけるＭＲＰ４およびＭＲＰ５発現のウェスタンブロット分析。（ｃ）ヒト冠状動脈におけるＭＲＰ５の免疫蛍光検出で、内皮層での優位な発現を示している。
【図Ｓ２】ヒト冠状動脈におけるＭＲＰ４の発現を示した図である。ＭＲＰ４および平滑筋細胞合成／増殖表現型のマーカーであるＮＭ−Ｂで染色した虚血性心筋症のヒト冠状動脈外植片の代表的な部分を示した図である。
【図Ｓ３】ｓｉＲＮＡサイレンシング効果の評価を示した図である。ＭＲＰ４、ＭＲＰ５またはスクランブルｓｉＲＮＡで７２時間形質移入したｈＣＡＳＭＣに対するＭＲＰ４（ａ）またはＭＲＰ５（ｂ）の遺伝子特異的プライマーによる定量的リアルタイムＰＣＲ（ｎ＝３、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図Ｓ４】アデノウイルスｓｈＲＮＡ  ＭＲＰ４を示した図である。（ａ）Ａｄ−ｓｈＭＲＰ４ベクターおよびＭＲＰ４ｓｈＲＮＡ配列の地図。（ｂ、ｃ）Ａｄ−ｓｈＭＲＰ４またはＡｄ−ｓｈＬｕｃで７２時間形質移入したラット平滑筋細胞の定量的リアルタイムＰＣＲ（ｂ）およびウェスタンブロット（ｃ）。（ｎ＝３、＊＊＊ｐ＜０．００１）。ウイルスは、感染効率（ＭＯＩ）３０で使用した。
【図Ｓ５】ＭＲＰ４サイレンシングはｈＣＡＳＭＣにおけるアポトーシスと関連しないことを示した図である。ＭＲＰ４またはスクランブルｓｉＲＮＡは、ｈＣＡＳＭＣに７２時間形質移入し、アポトーシスはＴＵＮＥＬ染色（ＡｐｏｐＴａｇ  Ｒｅｄ、Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐ．）によって分析した。陽性対照のために、細胞をスタウロスポリン（１０μＭ）で処理した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
定義
「ＭＲＰ４」という用語は、当技術分野における一般的な意味を有し、多剤耐性タンパク質４のことである。ＭＲＰ４はまた当技術分野において、ＡＢＣＣ４タンパク質、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＣ（ＣＦＴＲ／ＭＲＰ）、メンバー４、ＥＳＴ１７０２０５、ＭＲＰ／ｃＭＯＡＴ関連ＡＢＣ輸送体（ＭＯＡＴ−Ｂ）、多特異性有機陰イオン輸送体−Ｂ（ＭＯＡＴＢ）、多剤耐性関連タンパク質４と称される。この用語には、天然に存在するＭＲＰ４ならびにその変異体およびそれの修飾された形を含めることができる。この用語はまた、少なくとも１種のＭＲＰ４活性を保持したＭＲＰ４のドメインが、例えば、他のポリペプチド（例えば、当技術分野で一般的であるポリペプチドタグ）に融合した融合タンパク質を意味することができる。ＭＲＰ４はいかなる原料由来であってもよいが、通常は哺乳類（例えば、ヒトおよびヒト以外の霊長類）のＭＲＰ４、特にヒトのＭＲＰである。天然のＭＲＰ４アミノ酸配列の一例は、ＧｅｎＰｅｐｔデータベースにおいて受入番号ＡＡＨ４１５６０として提供され、ＭＲＰ４をコードする天然のヌクレオチド配列の一例はＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて受入番号ＮＭ＿００５８４５として提供されている。
【００１３】
「ＭＲＰ４の阻害剤」という表現は、広義に理解するべきで、以後ＭＲＰ４活性と称する環状ヌクレオチドのＭＲＰ４媒介性細胞流出の阻害剤およびＭＲＰ４発現の阻害剤を包含する。
【００１４】
「発現の阻害剤」とは、遺伝子の発現を阻害する、または有意に抑制する生物学的効果を有する天然の、または合成された化合物を意味する。したがって、「ＭＲＰ４発現の阻害剤」とは、ＭＲＰ４遺伝子をコードする遺伝子の発現を阻害する、または有意に抑制する生物学的効果を有する天然の、または合成された化合物を意味する。
【００１５】
本明細書で使用されるように、「ＭＲＰ４の選択的阻害剤」という用語は、ＭＲＰ１、ＭＲＰ２、ＭＲＰ３、ＭＲＰ５、ＭＲＰ６、ＭＲＰ７、ＭＲＰ８、ＭＲＰ９、ＭＲＰ１０、ＭＲＰ１１、ＭＲＰ１２およびＭＲＰ１３などのその他の多剤耐性タンパク質（ＭＲＰ）と比較してＭＲＰ４に選択的な阻害剤を意味する。「選択的」とは、阻害剤のＭＲＰ４に対するＫｉがその他のＭＲＰに対するＫｉの５分の１倍、好ましくは１０分の１倍、より好ましくは２５分の１倍、さらに好ましくは１００分の１以下であることを意味する。ＭＲＰ４の阻害剤のＫｉは、当技術分野で周知の種々の方法を使用して測定することができる。
【００１６】
「有機低分子」という用語は、医薬品で一般的に使用される有機分子と同程度の大きさの分子のことである。この用語は、生物学的高分子（例えば、タンパク質、核酸など）は除外する。好ましい有機低分子の大きさは、約５０００Ｄａまで、より好ましくは２０００Ｄａまで、最も好ましくは約１０００Ｄａまでの範囲である。
【００１７】
本明細書で使用されるように、「対象」という用語は、哺乳類、例えば、齧歯類、ネコ、イヌおよび霊長類を意味する。好ましくは、本発明による対象は、ヒトである。
【００１８】
最も広義の意味において、「治療すること」または「治療」という用語は、このような用語が適用される障害もしくは症状、またはこのような障害もしくは症状の１種または複数の徴候の進行の改善、緩和、阻害または予防を意味する。
【００１９】
「薬学的な」または「薬学的に許容される」とは、哺乳類、特にヒトに適切に投与されたとき、副作用、アレルギー作用またはその他の有害作用を生じない分子実体および組成物を意味する。薬学的に許容される担体または賦形剤とは、非毒性の固形、半固形または液体の注入剤、希釈剤、カプセル化物質または任意の種類の製剤補助物を意味する。
【００２０】
「生体適合性の」とは、例えば、血栓形成および／または炎症を含む負の組織反応を全くまたは最小限しか惹起しない物質を意味する。
【００２１】
治療方法および用途
本発明は、平滑筋細胞、特に動脈平滑筋細胞の増殖を阻害するための方法および組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。本発明はまた、アテローム性動脈硬化、血管形成術後の再狭窄、肺動脈高血圧および静脈移植片疾患などの血管障害を治療および／または予防するための方法および組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。
【００２２】
したがって、本発明の目的は、好ましくは選択的に、平滑筋細胞の増殖を阻害するためのＭＲＰ４の阻害剤である。ＭＲＰ４の阻害剤は、アテローム性動脈硬化、血管形成術後の再狭窄、肺動脈高血圧および静脈移植片疾患などの血管障害の治療および／または予防のために使用することができる。
【００２３】
好ましい実施形態では、ＭＲＰ４の阻害剤は、ＭＲＰ４の選択的阻害剤である。
【００２４】
一実施形態では、ＭＲＰ４の阻害剤は、低分子量の阻害剤、例えば、有機低分子であってよい。ＭＲＰ４の例は、米国特許第２００６／０，２８６，０４１号、Ｒｅｉｄ他（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、６３：１０９４〜１１０３、２００３）およびＲｅｍｏｎ他（Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １３：５９５〜６０３、２００２）に記載されている。
【００２５】
本発明によって使用できる有機低分子のＭＲＰ４阻害剤には、場合によってラセミ体、鏡像異性体、ジアステレオマーの形態のＮ−アセチル−ジニトロフェニル−システイン、ベンズブロマロン、コール酸塩、ジクロフェナク、ジピリマドール、デヒドロエピアンドロステロン３−グルクロニド、デヒドロエピアンドロステロン３−サルフェート、ジラゼプ、ジニトロフェニル−５−グルタチオン、エストラジオール１７−[ベータ]−グルクロニド、エストラジオール３，１７−ジサルフェート、エストラジオール３−グルクロニド、エストラジオール３−サルフェート、エストロン３−サルフェート、フルルビプロフェン、葉酸塩、Ｎ５−ホルミル−テトラヒドロフォレート、グリココール酸、グリコーソコール酸（Ｇｌｙｃｏｈｔｈｏｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）サルフェート、イブプロフェン、インドメタシン、インドプロフェン、ケトプロフェン、リソコール酸サルフェート、メトトレキセート、ＭＫ５７１（（［パウンド］）−３−［［［３−［２−（７−クロロ−２−キノーニル（ｑｕｉｎｏｈｎｙｌ））エテニル］フェニル］−［［３−ジメチルアミノ）−３−オキソプロピル］チオ］メチル］チオ］プロパン酸、［アルファ］−ナフチル−［ベータ］−Ｄ−グルクロニド、ニトロベンジルメルカプトプリン［ピ］ボシド、プロベネシド、ＰＳＣ８３３、スルフィンピラゾン、タウロケノデオキシコール酸塩、タウロコール酸塩、タウロデオキシコール酸塩、タウローソコール酸塩（Ｔａｕｒｏｈｔｈｏｃｈｏｌａｔｅ）、タウロリソコール酸硫酸塩、トポテカン、トレキンシン、ベラパミルおよびザプ［ピ］ナスト（Ｚａｐ［ｐｉ］ｎａｓｔ）からなる群から選択される化合物ならびに場合によって薬理学的に許容されるそれらの酸付加塩および水和物が含まれるが、それだけに限らない。
【００２６】
好ましい実施形態では、ＭＲＰ４の阻害剤は、ＰＤＥ３阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＰＤＥ５阻害剤からなる群から選択されるホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤ではない。
【００２７】
薬理学的に許容される酸によるＭＲＰ４阻害剤の酸付加塩とは、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、ヒドロ硫酸塩、ヒドロリン酸塩、ヒドロメタンスルホン酸塩、ヒドロ硝酸塩、ヒドロマレイン酸塩、ヒドロ酢酸塩、ヒドロ安息香酸塩、ヒドロクエン酸塩、ヒドロフマル酸塩、ヒドロ酒石酸塩、ヒドロシュウ酸塩、ヒドロコハク酸、ヒドロ安息香酸塩およびヒドロ−ｐ−トルエンスルホン酸塩、好ましくは塩酸塩、臭化水素酸塩、ヒドロ硫酸塩、ヒドロリン酸塩、ヒドロフマル酸塩およびヒドロメタンスルホン酸塩を含む群から選択される塩を意味する。本発明によれば、前述の酸付加塩の中で、塩酸、メタンスルホン酸、安息香酸および酢酸の塩が特に好ましい。
【００２８】
他の実施形態では、ＭＲＰ４阻害剤は、ＭＲＰ４輸送活性を部分的に、または完全に遮断できる抗体または抗体断片（すなわち、部分的または完全なＭＲＰ４遮断抗体または抗体断片）である。
【００２９】
特に、ＭＲＰ４阻害剤は、ＭＲＰ４を対象とする抗体であってよく、その結果、前記抗体がＭＰＲ４の活性を遮断する。
【００３０】
ＭＲＰ４を対象とする抗体は、適切な抗原またはエピトープを、特にブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジおよびマウスから選択される宿主動物に投与することによって、公知の方法に従って産生することができる。抗体産生を増強するために、当技術分野で公知の様々なアジュバントを使用することができる。本発明を実施するのに有用な抗体はポリクローナルであってよいが、モノクローナル抗体が好ましい。ＭＲＰ４に対するモノクローナル抗体は、培養した連続継代性細胞系による抗体分子の産生を実現する任意の技術を使用して調製し、単離することができる。産生および単離のための技術には、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）によって最初に記述されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｃｏｔｅ他、１９８３）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ他、１９８５）を含めることができるが、それだけに限らない。あるいは、単鎖抗体産生のために記述された技術（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号参照）は、抗ＭＲＰ４単鎖抗体の産生に適合し得る。本発明の実施に有用なＭＲＰ４阻害剤にはまた、完全な抗体分子をペプシン消化することによって生じ得るＦ（ａｂ’）２断片およびＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド結合を還元することによって生じ得るＦａｂ断片が含まれるが、それだけに限らない抗ＭＲＰ４断片が含まれる。あるいは、Ｆａｂおよび／またはｓｃＦｖ発現ライブラリーは、ＭＲＰ４に対して所望する特異性を備えた断片の迅速な同定を可能にするために構築することができる。
【００３１】
ヒト化抗ＭＲＰ４抗体およびその抗体断片はまた、公知の技術に従って調製することができる。「ヒト化抗体」は、非ヒト免疫グロブリンから得られた最小配列を含有する非ヒト（例えば、齧歯類）キメラ抗体の形態である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域（ＣＤＲ）の残基が所望する特異性、親和性および能力を備えたマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の高頻度可変領域の残基によって置換されている非ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見出されない残基を含むことができる。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練するために行う。一般的に、ヒト化抗体は、高頻度可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの高頻度可変ループに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである、少なくとも１種、通常２種の可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、場合によってまた免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、通常ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。ヒト化抗体の作製方法は、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ（米国特許第５，２２５，５３９号）およびＢｏｓｓ（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ、米国特許第４，８１６，３９７号）に記載されている。
【００３２】
さらに他の実施形態では、ＭＲＰ４の阻害剤はアプタマーである。
【００３３】
アプタマーとは、分子認識に関して抗体の代わりとなる分子種である。アプタマーとは、高い親和性および特異性で、事実上いかなる種類の標的分子でも認識する能力を備えたオリゴヌクレオチドまたはオリゴペプチド配列である。このようなリガンドは、Ｔｕｅｒｋ  Ｃ．およびＧｏｌｄ．Ｌ．、１９９０に記載されたように、ランダム配列ライブラリーの試験管内進化法（ＳＥＬＥＸ）によって単離することができる。ランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成によって得ることができる。このライブラリーでは、各メンバーは最終的に化学修飾された固有配列の直鎖オリゴマーである。この種類の分子の可能な改変、用途および利点は、Ｊａｙａｓｅｎａ  Ｓ．Ｄ．、１９９９に概説されている。ペプチドアプタマーは、２種類のハイブリッド法によってコンビナトリアルライブラリーから選択される大腸菌チオレドキシンＡなどのプラットフォームタンパク質によって表された、立体構造的に制約のある抗体可変領域から構成される（Ｃｏｌａｓ他、１９９６）。
【００３４】
本発明の他の態様は、ＭＲＰ４発現の選択的阻害剤に関する。
【００３５】
低い配列同一性（＜６０％）を示すＭＲＰ配列、本発明によって有利に使用できるＭＲＰ４発現の阻害剤は、その他のＭＲＰ発現と比較してＭＲＰ４発現の選択的な阻害剤となる。
【００３６】
本発明で使用するためのＭＲＰ４発現の阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド構築物をベースにすることができる。アンチセンスＲＮＡ分子およびアンチセンスＤＮＡ分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＭＲＰ４ｍＲＮＡに結合することによってＭＲＰ４ｍＲＮＡの翻訳を直接遮断し、したがってタンパク質翻訳を阻止するか、またはｍＲＮＡ分解を増加させ、そうして細胞内のＭＲＰ４のレベル、要するに活性を減少させるように作用する。例えば、少なくとも約１５塩基で、ＭＲＰ４をコードするｍＲＮＡ転写配列の固有領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、従来のホスホジエステル技術によって合成することができ、例えば、静脈内注射または注入によって投与することができる。配列が知られている遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するためにアンチセンス技術を使用する方法は、当技術分野では周知である（例えば、米国特許第６，５６６，１３５号、第６，５６６，１３１号、第６，３６５，３５４号、第６，４１０，３２３号、第６，１０７，０９１号、第６，０４６，３２１号および第５，９８１，７３２号参照）。
【００３７】
低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）はまた、本発明で使用するためのＭＲＰ４発現の阻害剤として作用することができる。ＭＲＰ４発現は、ＭＲＰ４発現を特異的に阻害するように、対象または細胞を低分子２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）または低分子２本鎖ＲＮＡの産生を引き起こすベクターもしくは構築物と接触させることによって減少させることができる（すなわち、ＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉ）。配列が知られている遺伝子について、適切なｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡをコードしているベクターの選択方法は当技術分野では周知である（例えば、Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．他（１９９９）；Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．他（２００１）；Ｈａｎｎｏｎ，ＧＪ．（２００２）；ＭｃＭａｎｕｓ，ＭＴ．他（２００２）；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，ＴＲ．他（２００２）；米国特許第６，５７３，０９９号および第６，５０６，５５９号；および国際特許公開ＷＯ０１／３６６４６、ＷＯ９９／３２６１９およびＷＯ０１／６８８３６を参照）。ＭＲＰ４を効果的にサイレンシングするｓｉＲＮＡが開発された。このｓｉＲＮＡは、いくつかのＭＲＰ４スプライシング変異体を標的とする（ＮＭ＿００５８４５、ＢＣ０４１５６０、ＡＹ０８１２１９、ＡＦ５４１９７７、ＡＹ１３３６８０、ＡＹ１３３６７９、ＡＹ１３３６７８）。センス配列は５’−ＣＡＧＵＧＵＵＣＵＵＡＣＡＣＵＵＣＣＵＴＴ−３’（配列番号７）であり、アンチセンスは５’−ＡＧＧＡＡＧＵＧＵＡＡＧＡＡＣＡＣＵＧＴＴ−３’（配列番号８）である。
【００３８】
ｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピンＲＮＡ）はまた、本発明で使用するためのＭＲＰ４発現の阻害剤として機能することができる。本発明による低分子ヘアピンＲＮＡの一例は、配列番号９：ＧＣＡＡＡＴＧＴＧＧＡＴＣＣＧＡＧＡＡに示す配列を含むｓｈＲＮＡである。
【００３９】
リボザイムはまた、本発明で使用するためのＭＲＰ４発現の阻害剤として機能することができる。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイム作用の機構には、リボザイム分子の相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーション、その後のエンドヌクレオチド鎖切断が関与する。ＭＲＰ４ｍＲＮＡ配列のエンドヌクレオチド切断を特異的かつ効率的に触媒する、操作されたヘアピンまたはハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は、そのため本発明の範囲内で有用である。任意の可能性のあるＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、最初に、一般的に以下の配列、ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣを含むリボザイム切断部位について標的分子を調べることによって同定する。同定した後、切断部位を含有する標的遺伝子の領域に対応する約１５個から２０個のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列が、オリゴヌクレオチド配列を不適切な状態にする可能性がある予測構造特性、例えば２次構造について調べることができる。
【００４０】
ＭＲＰ４発現の阻害剤として有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムの両方は、公知の方法によって調製することができる。これらには、例えば、固相ホスホラミダイト化学合成などによって化学合成するための技術が含まれる。あるいは、アンチセンスＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ転写によって生成することができる。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込んだ多種多様なベクターに組み込むことができる。本発明のオリゴヌクレオチドに対する様々な改変は、細胞内での安定性および半減期を高める手段として導入することができる。有望な改変には、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの隣接配列の分子の５’および／または３’末端への付加、またはオリゴヌクレオチド主鎖内のホスホジエステラーゼ結合よりもホスホロチオエートもしくは２’−Ｏ−メチルの使用が含まれるが、それらだけに限らない。
【００４１】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびリボザイムは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて単独で、またはベクターと結合して送達させることができる。最も広義には、「ベクター」とは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの、ｓｉＲＮＡの、ｓｈＲＮＡのまたはリボザイム核酸の細胞、好ましくはＭＲＰ４を発現する細胞への輸送を容易にすることができる任意の媒体である。好ましくは、ベクターは、ベクター不在で生じるであろう分解の範囲と比較して少ない分解で核酸を細胞に輸送する。一般的に、本発明に有用なベクターには、プラスミド、ファージミド、ウイルス、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはリボザイム核酸配列の挿入または組み込みによって操作されたウイルスもしくは細菌原料から得られたその他の媒体が含まれるが、それだけに限らない。ウイルスベクターには、好ましいベクターの種類であり、以下のウイルス、レトロウイルス、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルスおよびラウス肉腫ウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス、；ポリオーマウイルス；エプスタイン−バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルスならびにレトロウイルスなどのＲＮＡウイルスの核酸配列が含まれるが、それだけに限らない。指定はされていないが、当技術分野で公知のその他のベクターも容易に使用することができる。
【００４２】
好ましいウイルスベクターは、非必須遺伝子が関心のある遺伝子と置換された非細胞変性真核生物ウイルスをベースにしている。非細胞変性ウイルスには、生活環がゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写、その後の宿主細胞ＤＮＡへのプロウイルスの組み込みに関与するレトロウイルス（例えば、レンチウイルス）が含まれる。レトロウイルスは、ヒトの遺伝子治療試験のために承認された。最も有用なのは、複製が欠損した（すなわち、所望するタンパク質の合成を対象とすることができるが、感染粒子を生成することができない）レトロウイルスである。このように遺伝子改変レトロウイルス発現ベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける遺伝子の高効率形質導入に一般的有用性を備えている。複製欠損レトロウイルスの標準的な作製方法（外来性遺伝子物質をプラスミドに組み込むステップと、パッケージ細胞系をプラスミドで形質移入するステップと、パッケージ細胞系によって組換えレトロウイルスを産生するステップと、組織培養培地からウイルス粒子を収集するステップと、標的細胞をウイルス粒子で感染させるステップを含む）は、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０およびＭｕｒｒｙ、１９９１で入手できる。
【００４３】
特定の適用に好ましいウイルスは、遺伝子治療でヒトに使用することが既に承認されている２本鎖ＤＮＡウイルスである、アデノウイルスおよびアデノ随伴（ＡＡＶ）ウイルスである。実際に、１２種類の異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１から１２）が知られており、それぞれ異なる組織指向性を備えている（Ｗｕ，Ｚ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２００６；１４：３１６〜２７）。組換えＡＡＶは、依存性パルボウイルスＡＡＶ２から得られる（Ｃｈｏｉ、ＶＷ  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２００５；７９：６８０１〜０７）。アデノ随伴ウイルス１型から１２型までは、複製欠損になるように操作することができ、広範囲の細胞型および種に感染することができる（Ｗｕ、Ｚ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２００６；１４：３１６〜２７）。さらに、熱および脂質溶媒安定性、造血細胞を含む異なる系列の細胞における高い形質導入頻度、ならびに重複感染の欠如、したがって多様な形質導入の可能性の欠如などの利点を有する。報告によれば、アデノ随伴ウイルスは部位特異的な形でヒト細胞ＤＮＡに組み込むことができ、それによって挿入変異の可能性およびレトロウイルス感染に特徴的な挿入遺伝子発現の変動性を最小限に抑えることができる。さらに、野生型アデノ随伴ウイルスが感染した後、組織培養では選択圧なしに１００回超継代されるので、アデノ随伴ウイルスのゲノムへの組み込みは比較的安定した現象であることが示唆される。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外でも機能を果たすことができる。
【００４４】
その他のベクターには、プラスミドベクターが含まれる。プラスミドベクターは、当技術分野で広範囲にわたって記載されており、当業者には周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９参照のこと。ここ数年は、プラスミドベクターはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて抗原をコードする遺伝子を送達するためのＤＮＡワクチンとして使用されている。ウイルスベクターの多くと同様の安全上の心配がないので、このために特に有利である。しかし、宿主細胞に適合したプロモーターを有するこれらのプラスミドは、プラスミド内で操作可能にコードされた遺伝子からペプチドを発現することができる。通常使用されるいくつかのプラスミドには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０およびｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが含まれる。その他のプラスミドは、当業者にとって周知である。さらに、プラスミドは、ＤＮＡの特異的な断片を除去および付加する制限酵素および連結反応を使用して特別に設計することができる。プラスミドは、様々な非経口的、粘膜的および局所的な経路によって送達することができる。例えば、ＤＮＡプラスミドは、筋肉内、皮内、皮下またはその他の経路によって注射することができる。鼻腔内スプレーまたは点鼻、直腸座薬および経口的にも投与することができる。遺伝子銃を使用して表皮または粘膜表面に投与することもできる。プラスミドは、水性溶液で、金粒子上に乾燥させて、またはリポソーム、デンドリマー、コクリエートおよびマイクロカプセル化を含むがそれだけに限らない他のＤＮＡ送達系に関連して投与することができる。
【００４５】
好ましい実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはリボザイム核酸配列は、異種調節領域、例えば、異種プロモーターの制御化にある。プロモーターは、例えば、平滑筋アルファアクチンプロモーター、ＳＭ２２αプロモーターなどの平滑筋特異的プロモーターであってよい。プロモーターはまた、例えば、ウイルスプロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーターまたは任意の合成プロモーターであってよい。
【００４６】
ＭＲＰ４活性および／または発現の選択的阻害剤は、以下に定義したように、医薬組成物の形態で投与することができる。
【００４７】
好ましくは、前記阻害剤は治療有効量で投与する。
【００４８】
「治療有効量」とは、いかなる医療処置にも適用できる適切な対危険便益比で血管障害を治療および／または予防するためのＭＲＰ４の阻害剤の十分な量を意味する。
【００４９】
本発明の化合物および組成物の一日全使用量は、健全な医学的判断の範囲内で、主治医によって決定されることを理解されたい。任意の特定の患者の特定の治療有効用量のレベルは、治療する障害および障害の重症度、使用する特定の化合物の活性、使用する特定の組成物、患者の年齢、体重、一般的健康状態、性別および食事、投与時間、投与経路ならびに使用する特定の化合物の排泄率、治療期間、使用する特定のポリペプチドと組み合わせて、または同時に使用される薬物、ならびに医療分野で周知のファクターを含む様々なファクターに左右される。例えば、所望する治療効果を実現するために必要なレベルよりも低いレベルで化合物投与を開始し、所望する効果が実現するまで投薬量を徐々に増加させることは十分当業者の範囲内である。しかし、生成物の１日用量は、成人１日当たり０．０１から１０００ｍｇの広い範囲で変化させることができる。好ましくは、組成物は、治療する患者の症状に合わせて投薬するために、活性成分を０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０および５００ｍｇを含有する。医薬品は通常、活性成分を約０．０１ｍｇから約５００ｍｇ、好ましくは活性成分を１ｍｇから約１００ｍｇ含有する。薬物の有効量は通常、１日当たり０．０００２ｍｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重まで、特に１日当たり約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から７ｍｇ／ｋｇ体重までの投薬レベルで供給される。
【００５０】
スクリーニング方法
本発明の阻害剤はさらに、従来技術で記載されたスクリーニング方法によって同定することができる。本発明のスクリーニング方法は、公知の方法に従って実施することができる。
【００５１】
スクリーニング方法は、候補化合物に直接的に、または間接的に結合させた標識によって、候補化合物のＭＲＰ４またはＭＲＰ４を有する細胞もしくは膜、またはそれらの融合タンパク質に対する結合を評価することができる。あるいは、スクリーニング方法には、候補化合物と標識した競合相手（例えば、阻害剤または基質）の受容体に対する競合結合の測定または定性的もしくは定量的な検出が関与し得る。
【００５２】
例えば、ＭＲＰ４ｃＤＮＡは、挿入したコード配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含有する発現ベクターに挿入することができる。以下のベクター／宿主系、例えば、バキュロウイルス／Ｓｆ９昆虫細胞レトロウイルス／哺乳類細胞系、例えば、ＨｅｐＢ３、ＬＬＣ−ＰＫ１、ＭＤＣＫＩＩ、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、発現ベクター／哺乳類細胞系、例えば、ＨｅｐＢ３、ＬＬＣ−ＰＫ１、ＭＤＣＫＩＩ、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３を利用することができる。次に、このようなベクターは、前記細胞が膜で組換えＭＲＰ４を発現するように細胞を形質移入するために使用することができる。内在性ＭＲＰ４タンパク質を発現する細胞系（ＴＨＰ−１、Ｕ９３７、ＷＩ−３８、ＷＩ−３８（ＶＡ−１３亜系統）、ＩＭＲ−９０、ＨＥＫ−２９３）を使用することも可能である。
【００５３】
前述のように得られた細胞は、試験化合物と予めインキュベートし、その後細胞性ｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰ産生を高めることが知られている化合物（例えば、ｃＡＭＰにはフォルスコリン、イソプレナリン、ｃＧＭＰにはＳＮＰ）で刺激することができる。試験化合物は、細胞内ｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰレベルを高め、細胞外ｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰレベルを減じる能力についてスクリーニングする。
【００５４】
他の実施形態では、膜小胞は、前述のように得られた細胞系から調製することができる。次に、膜小胞を試験化合物と予めインキュベートする。その後、ｃＡＭＰ、ＡＴＰおよびＡＴＰ再生系（クレアチンキナーゼおよびクレアチンリン酸）を膜小胞に添加し、化合物が膜小胞内でのｃＡＭＰ蓄積を阻害する能力についてスクリーニングする。
【００５５】
医薬組成物
本発明の他の目的は、アテローム性動脈硬化、血管形成術後の再狭窄、肺動脈高血圧および静脈移植片疾患などの血管障害を治療および／または予防するための組成物であって、前記組成物はＭＲＰ４発現および／または活性の選択的阻害剤を含む組成物に関する。
【００５６】
ＭＲＰ４阻害剤は、治療組成物を形成するために、薬学的に許容される賦形剤および場合によって徐放性マトリクス、例えば生分解性ポリマーと一緒にすることができる。
【００５７】
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所または直腸投与のための本発明の医薬組成物では、活性成分は単独または他の活性成分と組み合わせて、単位投与形態で、通常の医薬支持物との混合物として、動物およびヒトに投与することができる。適切な単位投与形態には、錠剤、ジェルカプセル、粉末、顆粒および経口用懸濁液または溶液などの経口用形態、舌下および頬側投与形態、エアロゾル、植込錠、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下、経皮、クモ膜下腔内および鼻腔内投与形態および直腸投与形態が含まれる。
【００５８】
好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤にするための薬学的に許容される賦形剤を含有する。これらは特に、等張性滅菌生理食塩水溶液（リン酸１ナトリウムもしくはリン酸２ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムなど、またはこのような塩の混合物）であってよく、あるいは、場合に応じて、滅菌水または生理食塩水を添加することによって注射可能な溶液を構成することが可能な乾燥した、特に凍結乾燥した組成物であってよい。
【００５９】
注射用途に適した剤形には、滅菌水性溶液または分散液、ゴマ油、ピーナツ油または水性プロピレングリコールを含む製剤および滅菌注射用溶液または分散液を即時調製するための滅菌粉末が含まれる。いずれの場合においても、この形態は滅菌されていなければならず、容易な注射針通過性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで流体でなければならない。これは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、微生物、例えば細菌および真菌の汚染作用から保護されなければならない。
【００６０】
遊離塩基または薬理学的に許容される塩として本発明の化合物を含む溶液は、ヒドロキシ−プロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中において調製することができる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中および油中で調製することができる。通常の保存および使用の条件下において、これらの調製物は微生物の成長を防ぐための保存剤を含有する。
【００６１】
本発明のＭＲＰ４阻害剤は、中性または塩形態の組成物中に製剤化することができる。薬学的に許容される塩には、例えば、塩化水素酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸で形成される酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）が含まれる。遊離カルボキシル基で形成された塩はまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化鉄などの無機塩基およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から得ることができる。
【００６２】
担体はまた、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、適切なそれらの混合物および植物油を含有する溶媒または分散媒体であってよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合には必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用の防御は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に使用することによってもたらすことができる。
【００６３】
滅菌した注射可能な溶液は、上記に列挙した様々なその他の成分を含む適切な溶媒中に必要な量の活性ポリペプチドを組み入れ、必要であれば、その後滅菌濾過することによって調製する。一般的に、分散液は、様々な滅菌活性成分を、基本的な分散溶媒および上記に列挙したものから必要なその他の成分を含有する滅菌媒体に組み入れることによって調製する。滅菌した注射可能な溶液を調製するための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、活性成分および任意の所望される追加的な成分の粉末をそれらの既に滅菌濾過した溶液から生成する真空乾燥技術および凍結乾燥技術である。
【００６４】
製剤化した後、溶液は、薬剤製剤化に適合した形で、治療に有効な量で投与される。製剤は、様々な剤形、例えば、前述した注射可能な溶液の形態で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども使用することができる。
【００６５】
水性溶液での非経口投与のために、例えば、溶液は必要であれば適切に緩衝化するべきであり、液体希釈剤は最初に十分な生理食塩水またはグルコースで等張にする。これらの特定の水性溶液は特に、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に適している。これに関連して、使用することができる滅菌水性媒体は、本開示に関する当業者にとって公知である。例えば、１投薬量は、等張なＮａＣｌ溶液１ｍｌに溶解し、皮下点滴療法液１０００ｍｌを添加するか、または計画した注入部位に注射することができる。治療する対象の状態に応じて、投薬量のいくらかの変動は必要であれば生じる。投与に関与する人が、いずれにしても、個々の対象に適切な用量を決定する。
【００６６】
本発明のＭＲＰ４阻害剤は、用量当たり約０．０００１から１．０ミリグラム、または約０．００１から０．１ミリグラム、または約０．１から１．０もしくは約１０ミリグラムでも含まれるように、治療用混合物内に製剤化することができる。複数回用量も投与することができる。
【００６７】
非経口投与、例えば、静脈内または筋肉内注射のために製剤化された本発明の化合物に加えて、その他の薬学的に許容される形態には、例えば、錠剤または経口投与用のその他の固形物、リポソーム製剤、徐放型カプセルおよび最近使用されているその他の形態が含まれる。
【００６８】
本発明の医薬組成物は、環状ヌクレオチド（ｃＧＭＰ  ｃＡＭＰ）排出を制限することができる他の任意の薬剤を含むことができる。このような薬剤には、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４およびＰＤＥ５阻害剤を含む特異的ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）スーパーファミリー阻害剤を含めることができるが、それだけに限らない。ＰＤＥ４阻害剤の例には、ロリプラムおよび特許文献、米国特許第２０００５２３４２３８号、ＤＥ１０１５６２２９、ＤＥ１０１３５００９およびＷＯ０１４６１５１に記載されたものが含まれる。ＰＤＥ５阻害剤の例には、シルデナフィル、バルデナフィルおよびタダラフィルが含まれる。特に好ましいのは、市販されているＰＤＥ５阻害剤、例えば、クエン酸シルデナフィルであり、この形態で投与することができるＶＩＡＧＲＡ（登録商標）である。ＰＤＥ５阻害剤のその他の例にはまた、特許文献、ＷＯ２００５０１２３０３および米国特許第２００６１０６０３９号に記載されたものが含まれる。
【００６９】
本発明の医薬組成物は、平滑筋細胞増殖を抑制するその他の任意の抗増殖剤を含むことができる。例えば、抗増殖剤は、ラパマイシン、ラパマイシン誘導体、パクリタキセル、ドセタキセル、４０−Ｏ−（３−ヒドロキシ）プロピル−ラパマイシン、４０−Ｏ−［２−（２−ヒドロキシ）エトキシ］エチル−ラパマイシンおよび４０−Ｏ−テトラゾール−ラパマイシン、ＡＢＴ−５７８、エベロリムスおよびそれらの組み合わせであってよい。
【００７０】
本発明の医薬組成物は、抗体、受容体リガンド、酵素、接着性ペプチド、オリゴ糖、オリゴヌクレオチドなどからなる群から選択される化合物を含んでよい。このような化合物は、血液凝固因子阻害剤または血栓溶解剤、例えば、ストレプトキナーゼおよび組織プラスミノーゲン活性化因子であってよい。このような薬剤はまた、平滑筋細胞の増殖が制御されており、細胞外マトリクスの蓄積が制御されていて、管腔が（未損傷の健康な内膜と同様に）表現型が機能的で（未損傷の健康な内膜と同様に）形態学的に正常な内皮細胞によって完全に覆われていることを特徴とする良性の新生内膜応答をもたらす治癒促進薬を含むことができる。このような化合物はまた、抗悪性腫瘍物質、細胞分裂停止物質、抗炎症性物質、抗血小板物質、抗凝固物質、抗繊維素物質、アンチトロンビン物質、有糸分裂阻害物質、抗生物質、抗アレルギー物質および抗酸化物質の部類に入れることができる。このような抗悪性腫瘍物質および／または有糸分裂阻害物質の例には、パクリタキセル（例えば、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏ．、Ｓｔａｍｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．製のＴＡＸＯＬ（登録商標））、ドセタキセル（例えば、Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｓ．Ａ．、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ製のＴａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、メトトレキセート、アザチオプリン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、フルオロウラシル、ドキソルビシン塩酸塩（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ、Ｐｅａｐａｃｋ  Ｎ．Ｊ．製のＡｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標））およびマイトマイシン（例えば、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏ．、Ｓｔａｍｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．製のＭｕｔａｍｙｃｉｎ（登録商標））が含まれる。このような抗血小板物質、抗凝固物質、抗繊維素物質およびアンチトリロンビン（ａｎｔｉｔｌｉｒｏｍｂｉｎｓ）の例には、ヘパリノイド、ヒルジン、ヒルジン組換体、アルガトロバン、フォルスコリン、バピプロスト、プロスタサイクリンおよびプロスタサイクリン類似体、デキストラン、Ｄ−ｐｈｅ−ｐｒｏ−ａｒｇ−クロロメチルケトン（合成アンチトロンビン）、ジピリダモール、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ血小板膜受容体アンタゴニスト、抗体、およびＡｎｇｉｏｍａｘ（登録商標）（Ｂｉｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）などのトロンビン阻害剤が含まれる。細胞分裂停止剤の例には、アンギオペプチン、カプトプリル（例えば、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏ．、Ｓｔａｍｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．製のＣａｐｏｔｅｎおよびＣａｐｏｚｉｄｅ（登録商標））などのアンジオテンシン変換酵素阻害剤、シラザプリルまたはリシノプリル（例えば、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．、Ｉｎｃ．、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ製のＰｒｉｎｖｉｌ（登録商標）およびＰｒｉｎｚｉｄｅ（登録商標））、アクチノマイシンＤまたはそれらの誘導体および類似体が含まれる。アクチノマイシンＤの異名には、ダクチノマイシン、アクチノマイシンＩＶ、アクチノマイシンＩ１、アクチノマイシンＸ１およびアクチノマイシンＣｉが含まれる。その他の化合物には、カルシウムチャネル遮断薬（例えば、ニフェジピン）、コルヒチン、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）アンタゴニスト、魚油（オメガ３−脂肪酸）、ヒスタミンアンタゴニスト、ロバスタチン（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の阻害剤、コレステロール低下剤、商品名はＭｅｒｃｋ＆Ｃｏ．、Ｉｎｃ．、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ製のＭｅｖａｃｏｒ（登録商標））、モノクローナル抗体（例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体に特異的なもの）、ニトロプルシド、プロスタグランジン阻害剤、スラミン、セロトニン遮断薬、ステロイド、チオプロテアーゼ阻害剤、トリアゾロピリミジン（ＰＤＧＦアンタゴニスト）および一酸化窒素が含まれる。抗アレルギー薬の一例は、ペミロラストカリウムである。適切であり得るその他の治療物質または薬剤には、アルファ−インターフェロン、遺伝子操作された上皮細胞、ＣＤ−３４抗体などの抗体、アブシキシマブ（ＲＥＯＰＲＯ）および抗体を捕捉する前駆細胞、正常で、生理学的に穏和な組成物および合成生成物によって筋肉細胞の制御された増殖を促進する治癒促進薬、酵素、抗炎症薬、抗ウイルス薬、抗癌剤、抗凝固剤、フリーラジカル捕捉剤、ステロイド抗炎症薬、非ステロイド抗炎症薬、抗生物質、一酸化窒素ドナー、スーパーオキシドジスムターゼ、スーパーオキシドジスムターゼ模倣体、４−アミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（４−アミノ−ＴＥＭＰＯ）、デキサメタゾン、クロベタゾール、アスピリン、それらのプロドラッグ、それらのコドラッグならびにそれらの組み合わせが含まれる。前記の物質は、例示のために挙げられており、限定を意味しない。その他の現在使用できるか、または将来開発され得るその他の活性薬剤も同様に使用可能である。
【００７１】
本発明はまた、ＭＲＰ４の阻害剤を含む第１の医薬組成物、ならびにＰＤＥ３阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＰＤＥ５阻害剤およびそれらの混合物からなる群から選択される１種または複数のホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤を含む第２の医薬組成物を含む、血管障害を治療するためのキットに関する。
【００７２】
生体物質
本発明はまた、血管内人工器官、例えば、ステント、バイパスグラフト、血管周辺の内部パッチ、血管周辺の外部パッチ、血管カフおよび血管形成カテーテルの中から選択される生体物質または医療用送達デバイスを調製するためのＭＲＰ４阻害剤の使用に関する。
【００７３】
これに関して、本発明はさらに詳細に、前記で定義したようなＭＲＰ４の発現および／または活性の阻害剤でコーティングされた前述のような生体物質または医療用送達デバイスであって、血管内人工器官、例えば、ステント、バイパスグラフト、血管周辺の内部パッチ、血管周辺の外部パッチ、血管カフおよび血管形成カテーテルから選択される生体物質または医療用送達デバイスに関する。このような局所的生体物質または医療用送達デバイスは、血管狭窄または再狭窄を減少させるために、冠状動脈、頸動脈、腎動脈、末梢動脈、脳動脈または任意のその他の動脈もしくは静脈位置を含む任意の血管位置で実施する血行再建、バイパスまたは移植手術の補助として、動静脈透析法の場合などにおける吻合性狭窄を減少させるために、ポリテトラフルオロ−エチレン移植と一緒に、または一緒にせずに、ステント術と一緒に、または一緒にせずに、あるいは任意のその他の心臓手術または移植手術、あるいは先天的血管インターベンションと併用して使用することができる。
【００７４】
例示のために、このような血管内人工器官およびそれらに選択的阻害剤をコーティングする方法は、ＷＯ２００５０９４９１６により詳細に記載されているか、または当技術分野で最近使用されているものである。人工器官のコーティングに使用される化合物は、前記阻害剤の制御された放出を優先的に可能にしなければならない。前記化合物は、ポリマー（例えば、縫合糸、ポリカーボネート、ＨｙｄｒｏｎおよびＥｌｖａｘ）、生体ポリマー／生体基質（例えば、アルギン酸塩、フカン、コラーゲンをベースにした基質、ヘパラン硫酸）または合成ヘパラン硫酸様分子などの合成化合物またはそれらの組み合わせであってよい（Ｄａｖｉｅｓ他、１９９７；Ｄｅｓｇｒａｎｇｅｓ他、２００１；Ｄｉｘｉｔ他、２００１；Ｉｓｈｉｈａｒａ他、２００１；Ｌｅｔｏｕｒｎｅｕｒ他、２００２；Ｔａｎｉｈａｒａ他、２００１；Ｔａｓｓｉｏｐｏｕｌｏｓ  ａｎｄ  Ｇｒｅｉｓｌｅｒ、２０００）。ポリマー材料のその他の例には、生体適合性で分解可能な材料、例えば、ラクトンをベースにしたポリエステルまたはコポリエステル、例えば、ポリラクチド、ポリラクチド−グリコリド、ポリカプロラクトン−グリコリド、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリアミノ酸、多糖、ポリホスファ−ゼン、ポリ（エーテル−エステル）コポリマー、例えば、ＰＥＯ−ＰＬＬＡまたはそれらの混合物、および生体適合性で非分解性の材料、例えば、ポリジメチルシロキサン、ポリ（エチレン−酢酸ビニル）、アクリル酸塩をベースにしたポリマーまたはコポリマー、例えば、ポリブチルメタクリレート、ポリ（ヒドロキシエチルメチル−メタクリレート）、ポリビニルピロリジノン、ポリテトラフルオエチレンなどのフッ素化ポリマー、セルロースエステルを含めることができる。重合体基質を使用するとき、２層、例えば、前記阻害剤が組み込まれた基層、例えば、エチレン−コ−酢酸ビニルおよびポリブチルメタクリレート、ならびに前記阻害剤の拡散制御として作用する保護膜、例えば、ポリブチルメタクリレートを含んでよい。あるいは、前記阻害剤は、基層に含まれていてよく、補助物は外層に組み込まれていてよく、その逆であってもよい。
【００７５】
このような生体物質または医療用送達デバイスは生体分解可能であってよく、あるいは永久使用を目的したとき、金属もしくは合金、例えば、ＮｉおよびＴｉ、または他の安定な物質であってよい。本発明の阻害剤はまた、ミクロポアまたはチャネルを含有するように改変されたステントまたは移植体の金属に封入してよい。また、血管周辺の内部パッチ、血管周辺の外部パッチまたは本発明の阻害剤を含有する前記で開示したようなその他の生体適合材料も局所送達に使用することができる。
【００７６】
前記生体物質または医療用送達デバイスは、前記生体物質または医療用送達デバイスから徐々に阻害剤を放出させ、周囲の組織に侵入させる。前記放出は、１ヶ月から１年の間生じることができる。本発明による局所送達は、低濃度の化合物を循環させて疾患部位における本発明の阻害剤を高濃度にすることが可能である。このような局所送達適用に使用される前記阻害剤の量は、使用する化合物、治療すべき症状および所望する効果に応じて変化する。本発明の目的のために、治療有効量が投与される。
【００７７】
前記生体物質または医療用送達デバイスの局所投与は、血管病変部位で、またはその近くで行うことが好ましい。以下の経路、カテーテルまたはその他の血管内送達系、鼻腔内、気管支内、腹腔内または食道の１種または複数によって投与してよい。ステントは通常、閉塞を軽減するために管の管腔内に放置するチューブ構造として使用される。ステントは、非拡張型で管腔内に挿入され、その後自発的に拡張するか（自己拡張ステント）、または生体位で第２のデバイス、例えば、血管の壁成分と関連した妨害物を切除して破壊するため、および拡張した管腔を得るため、狭窄した血管または体内経路内で膨張する血管形成バルーンを装着したカテーテルを用いて拡張することができる。
【００７８】
本発明の生体物質は、ＰＤＥ３、ＰＤ４および／またはＰＤＥ５阻害剤を含む医薬組成物のために前述したような任意のその他の化合物でコーティングすることができる。
【００７９】
本発明を、以下の図面および実施例に照らしてさらに例示する。
【実施例】
【００８０】
概要
環状ヌクレオチドは、特定のホスホジエステラーゼによって分解され、能動的流出輸送体、すなわち多剤耐性タンパク質、ＭＲＰ４およびＭＲＰ５によって除去されると仮定されている。細胞シグナル伝達におけるＭＲＰ４／５の役割を研究するために、モデルとして動脈平滑筋細胞を使用した。ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、動脈平滑筋細胞の増殖中に、ＭＲＰ４は上方制御されるが、ＭＲＰ５はされないことが示された。ＭＲＰ４の阻害は、細胞内ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰレベルの有意な増加を引き起こし、損傷したラット頸動脈における増殖を遮断し、新生内膜成長を阻止するのに十分であった。ＭＲＰ４阻害の抗増殖性効果は、ＰＫＡ／ＣＲＥＢ経路の活性化に関連している。ＭＲＰ４が細胞内環状ヌクレオチドレベルの独立した内在性調節因子として作用することの証拠を初めて提供し、血管平滑筋増殖性疾患を予防する新たな方法としてＭＲＰ４の阻害を同定した。
【００８１】
序論
環状アデノシン１リン酸（ｃＡＭＰ）および環状グアノシン１リン酸（ｃＧＭＰ）は、下流の重要なエフェクタータンパク質に外部シグナルを中継するセカンドメッセンジャーである。最も一般的な標的は、標的タンパク質をリン酸化することによって多数のプロセスを調節するｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＡ）およびｃＧＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＧ）であるが、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰはまた、ある種のイオンチャネル１および交換タンパク質２に結合することによって機能を発揮する。細胞外刺激に応じたシグナル伝達現象は、産生と排出の間の平衡から生じる細胞内環状ヌクレオチドレベルの巧妙な調節によって生じる。古典的に、環状ヌクレオチド排出は、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）によって媒介される加水分解と関連してきた。ＰＤＥは、多数のスプライシング変異体を組織特異的に発現するいくつかの遺伝子によってコードされる酵素の大きなスーパーファミリーを構成する３。血管平滑筋細胞を含むいくつかのモデルにおいて、ＰＤＥは細胞内環状ヌクレオチドシグナル伝達の大きさおよび持続期間を調節することが示された４。例えば、ｃＧＭＰ利用性を高めることによってヒトの勃起不全を治療するために使用される選択的ＰＤＥ５阻害剤、シルデナフィルは、心肥大に関連した複数のシグナル伝達経路（カルシニューリン／ＮＦＡＴ、ＰＩ３Ｋ／ＡｋｔおよびＥＲＫ１／２シグナル伝達経路）および血管平滑筋細胞の増殖を不活性化し、肺動脈高血圧の治療においていくつかの治療上の成功を納めている５、６。しかし、アイソフォームまたは変異体に特異的な阻害剤が欠如していること、および環状ヌクレオチドシグナル伝達が区画化されていること４によって、選択的治療効果実現の複雑さのレベルが追加されている。さらに、ＰＤＥが環状ヌクレオチド経路の特有の調節因子となり得るかどうかはあまり理解されていない。
【００８２】
基質の細胞外への能動的輸送に関与する膜貫通タンパク質の大きなファミリー（ＡＴＰ結合カセット輸送体ファミリーＣ型）のメンバーである多剤耐性関連タンパク質ＭＲＰ４（ＡＢＣＣ４）は、哺乳類細胞からヌクレオチド１リン酸類似体を能動的に流出させることが発見された７。ＡＢＣＣファミリーの別のメンバーであるＭＲＰ４およびＭＲＰ５（ＡＢＣＣ５）は、その後、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰのエネルギー依存性輸送体として機能を果たすことが示された８、９。ＭＲＰ４およびＭＲＰ５の発現は、平滑筋細胞を含むいくつかの組織で報告されたが１０〜１２、その生理学的機能は不明なままである。特に、これらの輸送体による環状ヌクレオチドの直接的排出が、環状ヌクレオチド代謝の上流に作用する追加的または代替的機構となり得るかどうかはまだ分かっていない。
【００８３】
環状ヌクレオチド依存性生物学的プロセスにおけるＭＲＰ４／５の機能を正確に説明するために、環状ヌクレオチドレベルの増加が一方では収縮／静止平滑筋細胞の弛緩の誘導において、他方では合成／活性化平滑筋細胞の増殖阻害において、よく確立された役割を果たすので３、動脈平滑筋細胞を使用した。ＭＲＰ４／５の発現および機能は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて分析した。ＭＲＰ４が環状ヌクレオチドの細胞内レベルの独立した内在性調節因子として作用し、したがって、媒介されたシグナル伝達の活性化を制限することの証拠を初めて提供する。その後、我々の結果によって、このシグナル伝達経路を増強するための新たな方法としてＭＲＰ４の阻害が同定された。
【００８４】
結果
ＭＲＰ４は冠状動脈平滑筋細胞において発現する。
【００８５】
ヒト冠状動脈平滑筋細胞（ｈＣＡＳＭＣ）の初代培養において、ＭＲＰ４およびＭＲＰ５の発現を初めて分析した。ＲＴ−ＰＣＲによって、ＭＲＰ４およびＭＲＰ５ｍＲＮＡがｈＣＡＳＭＣにおいて検出された（図１ａおよび補足図１ａ）。ＭＲＰ４を形質移入したｈＣＡＳＭＣの免疫蛍光分析によって、タンパク質が原形質膜の位置に優勢であることが示される（図１ｂ）。免疫ブロッティングによって、予測１６０ｋＤａ  ＭＲＰ４タンパク質は平滑筋細胞の全細胞抽出物および膜調製物の両方に検出されたが、その一方でＭＲＰ５タンパク質は膜の豊富な画分でのみ検出された（補足図１ｂ）。ＭＲＰ５は、冠状動脈の内皮層に存在した（補足図１ｃ）。平滑筋細胞タンパク質を５％から４０％の不連続スクロース勾配で分離することによって、さらにＭＲＰ４の位置を調べた。図１ｃに示したように、１６０ｋＤａ  ＭＲＰ４タンパク質の発現は、ラフト関連タンパク質カベオリン１が発現した低密度画分に限定された。
【００８６】
増殖する平滑筋細胞におけるＭＲＰ４の上方制御。
【００８７】
ＭＲＰ４およびＭＲＰ５の発現は、静止状態のｈＣＡＳＭＣ（０．１％補給、Ｓ）および５％Ｓによって刺激した増殖中のｈＣＡＳＭＣにおいてウェスタンブロッティングによって調べた。ｈＣＡＳＭＣ培養において、ＭＲＰ４発現の増加は認められたが（３．７±０．４２、ｐ＝０．０１、図２ａ）、ＭＲＰ５の増加は認められなかった（データは示さず）。この過剰発現は、平滑筋細胞増殖のマーカーであるサイクリンＤ１と相関していた（図２ａ）。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるこの増加の有意性を決定するために、平滑筋細胞増殖のよく特徴付けられたモデルであるバルーン損傷後のラット頸動脈で、ＭＲＰ４の分布を分析した。図２ｂに示したように、新生内膜で高度に増殖した平滑筋細胞は、ＭＲＰ４タンパク質の強い発現を表したが、一方で中膜でのＭＲＰ４発現は限定的であった。アテローム硬化性の冠状動脈において増殖しているｈＣＡＳＭＣにおいて、ＭＲＰ４の類似の過剰発現が発見された（補足図２）。いずれのモデルにおいても、ＭＲＰ４の発現は、平滑筋細胞の静止表現型から増殖表現型への切り換えのマーカーであるＮＭ−Ｂの発現と相関していた（図２ｂおよび補足図２）。全体的に見て、これらのデータは、ＭＲＰ４の発現は静止状態の動脈平滑筋細胞では低レベルであり、増殖刺激に応答して上方制御されることを示唆している。
【００８８】
ＭＲＰの薬理学的阻害は、平滑筋細胞の増殖を阻害する。
【００８９】
最初に、我々のモデルにおけるｈＣＡＳＭＣ増殖に対するｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの影響を調べた。浸透性８−ブロモ−ｃＡＭＰ（１００μＭ）またはアデニル酸シクラーゼ活性化剤フォルスコリン（５μＭ）でｈＣＡＳＭＣを処理すると、血清誘導性増殖の有意な阻害が生じた（図３ａ、ｐ＜０．００１）。同様の結果が、８−Ｂｒｏｍｏ−ｃＧＭＰ（２００μＭ）（ｐ＝０．００１）またはＮＯドナーＳＮＰ（１ｍＭ）（ｐ＜０．００１）を使用して認められ、血管平滑筋細胞における環状ヌクレオチドの既に記載された抗増殖性効果が確かめられた（図３ａ）。ｈＣＡＳＭＣ増殖中のＭＲＰ４およびＭＲＰ５の役割を定義するために、次にホスホジエステラーゼおよびＭＲＰの薬理学的阻害剤（ジピリダモール）、ホスホジエステラーゼの阻害剤であるがＭＲＰの阻害剤ではない（ＩＢＭＸ）、およびＭＲＰ４および５の阻害剤（ＭＫ５７１）またはＭＲＰ４の阻害剤であるがＰＤＥの阻害剤ではない（ＮＢＭＰＲ）を使用した。各薬物で処理したとき、ｈＣＡＳＭＣ増殖の用量依存的阻害が認められた（図３ｂ）。阻害剤がないと、５％Ｓによる刺激によって、ｈＣＡＳＭＣ増殖は０．１％Ｓと比較して２４０±１５．８％増加した。この増加は、ＭＫ５７１およびＮＢＭＰＲによって、これらの阻害剤を最大用量で使用したとき、それぞれ１５３±１１％（ｐ＜０．００１）および１４０±１５％（ｐ＜０．００１）まで用量依存的に有意に減少した。補給物の混合物によって誘導される増殖はまた、ＰＤＥ阻害剤ＩＢＭＸによって阻害されたが（ＩＢＭＸ  １００μＭ：１７０±１２％、５％Ｓと比較してｐ＜０．００１）、ＭＲＰ阻害剤で認められた阻害よりも低い範囲であった（ＭＫ５７１  ３７．５μＭと比較してｐ＜０．０４、およびＮＢＭＰＲ  １００μＭと比較してｐ＝０．００７）。他方で、ＭＫ５７１またはＮＢＭＰＲと比較して全体的な阻害剤ジピリダモールでは有意な差は認められなかった。これらのデータは、ＭＰＲ阻害はｈＣＡＳＭＣ増殖を阻害することができるが、ＰＤＥ阻害剤単独よりも強い効果を有することを示唆している。
【００９０】
ＭＲＰ４低分子干渉ＲＮＡによるｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける動脈平滑筋細胞増殖の阻害
ｈＣＡＳＭＣにおけるＭＲＰ４およびＭＲＰ５の役割をさらに調べるために、ＭＲＰ４および／またはＭＲＰ５発現を特異的にサイレンスするＲＮＡ干渉計画を使用した。ヒトＭＲＰ４に対する低分子干渉ＲＮＡを設計し、ｈＣＡＳＭＣに形質移入すると、形質移入して７２時間後に、スクランブルｓｉＲＮＡと比較してＭＲＰ４ｍＲＮＡの７５±１％（ｐ＜０．００１）（補足図３）およびタンパク質レベルの７４±６．８％（ｐ＜０．００１）（図４ａ）の減少がもたらされた。類似のサイレンシング効果がヒトＭＲＰ５に対するｓｉＲＮＡで得られた（補足図３）。補給物の混合物によって誘導された増殖は、ＭＲＰ４ｓｉＲＮＡで形質移入されたｈＣＡＳＭＣのほうがスクランブルｓｉＲＮＡで形質移入されたｈＣＡＳＭＣよりも有意に低下していた（０．１％Ｓと比較した相対的増加：それぞれ１８３±２７％および３１３±３５％、ｐ＜０．００１、図４ｂ）。類似の結果が、代替的に設計され、確認されたＭＲＰ４ｓｉＲＮＡによって得られた（データは示さず）。さらに、ＭＲＰ４ｓｉＲＮＡは、ｈＣＡＳＭＣにおけるアポトーシスと関連がなかった（補足図５）。他方で、ｈＣＡＳＭＣ増殖に対するＭＲＰ５ｓｉＲＮＡの影響は認められなかったので（図４ｂ）、ＭＲＰ４の特異的阻害がｈＣＡＳＭＣ増殖を阻止するのに十分であることが確認された。
【００９１】
特異的ＭＲＰ４ｓｈＲＮＡを発現するアデノウイルスベクターはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて新生内膜形成を予防する
ｉｎ  ｖｉｖｏでの血管平滑筋細胞増殖の予防におけるＭＲＰ４の役割を評価するために、ラットＭＲＰ４ｍＲＮＡに対して設計された低分子ヘアピンＲＮＡを発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ−ｓｈＭＲＰ４）を使用して、バルーン損傷ラット頸動脈に感染させた。最初に、ＭＲＰ４発現をサイレンシングするＡｄ−ｓｈＭＲＰ４の効果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてラット動脈平滑筋細胞を制御した。ＭＲＰ４ｍＲＮＡを感染させてから７２時間後では、タンパク質レベルはルシフェラーゼｓｈＲＮＡ（Ａｄ−ｓｈＬｕｃ）を発現するアデノウイルスで感染した細胞で認められるものよりも低かった（補足図４）。
【００９２】
損傷し、Ａｄ−ｓｈＭＲＰ４またはＡｄ  ｓｈＬｕｃのいずれかのＤＮＡ粒子１０１１個で感染させて２週間後に、ラットを屠殺し、損傷した頸動脈の形態計測分析をヘマトキシリン／エオジン染色断面図で実施した（図４ｃ）。再狭窄の程度は、内膜および中膜の厚さを測定し、内膜中膜複合体（Ｉ／Ｍ）厚を算出することによって決定した。Ａｄ−ｓｈＭＲＰ４感染動脈のＩ／Ｍ比は、Ａｄ−ｓｈＬｕｃ感染頸動脈よりも有意に低かった（ｐ＜０．０３、図４ｄ）。アデノウイルス感染を調べるために、ラット頸動脈のＤＮＡを各試料から抽出し、アデノウイルス発現を特異的なプライマーを用いたＰＣＲによって測定した（図４ｅ）。これらの結果は、ＭＲＰ４活性の減少がｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける血管平滑筋細胞増殖およびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるバルーン損傷誘導性新生内膜形成も阻害することを示している。
【００９３】
ＭＲＰ４阻害はｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの細胞レベルを増加させる
ＭＲＰ４ｓｉＲＮＡで形質移入した細胞は、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰレベルの著しい変化を表し、細胞内／細胞外比が著しく増加しており（それぞれ、スクランブルｓｉＲＮＡと比較して２８９±１２．５％および２３０±５．５％）、ｈＣＡＳＭＣからの環状ヌクレオチド流出の減少を示唆している（図５ａおよび図５ｂ）。
【００９４】
ｃＡＭＰレベルに対するＭＲＰ４阻害の影響をさらに分析するために、ＭＲＰ４またはスクランブルｓｉＲＮＡのいずれかで形質移入したｈＣＡＳＭＣを、生細胞におけるリアルタイムｃＡＭＰイメージングのための蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）をベースにしたセンサーである１３Ｅｐａｃ２−ｃａｍｐｓをコードするアデノウイルスで感染させ、次に濃度を増加させたフォルスコリンに曝露した。図５ｃおよびｄに示したように、フォルスコリンの濃度を増加させて適用すると、ＣＦＰとＹＦＰの間のＦＲＥＴ変化を示すＣＦＰ／ＹＦＰ比の増加によって反映されたｃＡＭＰの上昇が惹起された。しかし、低用量のフォルスコリンによる刺激では、ＭＲＰ４ｓｉＲＮＡで形質移入したｈＣＡＳＭＣにおいてＦＲＥＴのより大きな変化がもたらされた。図５ｅに示したように、ＭＲＰ４サイレンシングは、薬物の最大効果に影響を与えずにフォルスコリンに対する濃度応答曲線の左への移動を引き起こす。データをヒルに当てはめると、最大ｃＡＭＰ形成の５０％をもたらすフォルスコリンの用量は、スクランブルｓｉＲＮＡで形質移入した細胞よりもＭＲＰ４ｓｉＲＮＡで形質移入した細胞のほうが有意に低いことが示された（ＥＣ５０：３．０±０．６μＭ対１３．３±２．２μＭ、ｐ＜０．００１）。この結果によって、ＭＲＰ４阻害下の細胞ではアデニル酸シクラーゼ刺激に応答した速やかなｃＡＭＰ利用が確認された。
【００９５】
ＭＲＰ４阻害は、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）活性化によるｈＣＡＳＭＣ増殖に対するｃＡＭＰの効果を増強する
以前の結果を踏まえて、フォルスコリンの用量依存性抗増殖効果は、スクランブルｓｉＲＮＡと比較してＭＲＰ４ｓｉＲＮＡで形質移入したｈＣＡＳＭＣにおいて有意に増強されることを観察した（図６ａ）。ＭＲＰ４ｓｉＲＮＡで形質移入した細胞では、少量のフォルスコリンでｈＣＡＳＭＣ増殖を阻止するのに十分であり、阻害定数（Ｋｉ）はスクランブルｓｉＲＮＡにおける０．７９±０．５６μＭからＭＲＰ４ｓｉＲＮＡで形質移入ｈＣＡＳＭＣにおける０．１１±０．０１μＭに減少した。ｃＧＭＰ活性化剤ＳＮＰを使用したとき、同様の効果は認められなかった：ＫｉはスクランブルｓｉＲＮＡでは１８２±９５μＭであり、ＭＲＰ４ｓｉＲＮＡで形質移入した細胞では１６６±９０μＭであった（図６ｂ）。
【００９６】
これらの結果は、ＭＲＰ４阻害は、増殖に対するｃＡＭＰ効果を増強するが、ｃＧＭＰ効果は増強しないことを示している。ｈＣＡＳＭＣ増殖に対するＭＲＰ４ｓｉＲＮＡの阻害効果は、Ａｄ−ＰＫＩ（ＰＫＡの特異的阻害剤）の感染によるｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）の阻害によって完全に逆転したが、薬理学的阻害剤ＫＴ５８２３を使用したｃＧＭＰ依存性タンパク質キナーゼＧ（ＰＫＧ）の阻害によっては逆転しなかった（図６ｃ）。ＭＲＰ４薬理学的阻害剤ＭＫ５７１およびＮＭＢＰＲのｈＣＡＳＭＣ増殖に対する効果はまた、Ａｄ−ＰＫＩの感染によるＰＫＡの阻害によって逆転したが、ＫＴ５８２３によっては逆転しなかった（図６ｄ）。これらの結果は、ＭＲＰ４阻害は、ＰＫＡ依存性シグナル伝達経路を活性化することによってｈＣＡＳＭＣ増殖に対するｃＡＭＰの効果を増強することを示している。
【００９７】
ＰＫＡは、環状ＡＭＰ応答因子結合タンパク質（ＣＲＥＢ）の活性化およびリン酸化を調節し、ＣＲＥＢは増殖の阻害に関与するので、スクランブルｓｉＲＮＡまたはＭＲＰ４ｓｉＲＮＡで形質移入した増殖するｈＣＡＳＭＣにおけるリン酸化ＣＲＥＢ（ｐＣＲＥＢ）のレベルを分析した。ｐＣＲＥＢのレベルは、ＭＲＰ４阻害で３２９±１５％（ｐ＝０．００３）増加し、一方、総ＣＲＥＢのレベルは両条件で類似していた（図６ｅ）。さらに、ＣＲＥＢの活性は、ＣＲＥ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子で形質移入した細胞で測定した。ルシフェラーゼ活性は、スクランブルｓｉＲＮＡで形質移入した細胞と比較してＭＲＰ４ｓｉＲＮＡで有意に高かった（５５３±２５％、ｐ＜０．０１、図６ｆ）。したがって、ＭＲＰ４阻害の抗増殖性効果は、ＰＫＡ／ＣＲＥＢ経路の活性化に関連していると結論づけられる。
【００９８】
ＭＲＰ４および肺高血圧
ヒト肺動脈におけるＭＲＰ４発現の免疫蛍光分析によって、正常な肺動脈の中膜におけるＭＲＰ４発現が明らかである。（肺高血圧の患者２人から得た）病的肺動脈における免疫染色によって、ＭＲＰ４は中膜および新生内膜または肥大性中膜において発現していることが示される（図８参照）。０％Ｓまたは５％Ｓに７２時間曝露した培養平滑筋細胞におけるウェスタンブロット分析によって、ヒト肺動脈から単離された平滑筋細胞における基礎ＭＲＰ４発現は増殖状態において増加すること示された（図９参照）。細胞上のＭＲＰ４ｓｉＲＮＡは、ヒト肺動脈平滑筋細胞増殖を阻害する（図１０参照）。
【００９９】
考察
これは、血管系において環状ヌクレオチドによって媒介されるシグナル伝達の修飾因子として、エネルギー依存性流出ポンプであるＭＲＰ４を同定した初めての研究である。我々の結果によって、ＭＲＰ４は動脈平滑筋細胞における環状ヌクレオチドシグナル伝達の大きさを制限する負の調節因子として作用することが示された。この効果は、細胞からの環状ヌクレオチドの能動的膜貫通流出によって発揮され、そうして媒介されたシグナル伝達の活性化を制限する。動脈平滑筋細胞において、ＭＲＰ４を特異的に阻害すると、環状ヌクレオチドの細胞内含量が変更され、したがってｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるそれらの抗増殖効果の劇的な増強が可能になる。したがって、ＭＲＰ４の阻害は、血管増殖性障害の治療のための魅力的な新規手法である。
【０１００】
今日まで、ＭＲＰ４は内因性または外来性グルタチオン、グルクロン酸塩および硫酸結合体の膜貫通排出を媒介する生理学的輸送体として主に考えられてきた１４。例えば、ＭＲＰ４は尿酸排出経路の重要な主役であることが期待されている１５。ＭＲＰ４はまた、環状ヌクレオチドの活性化輸送体として報告されてきた１６〜１８。その他の研究は、ＭＲＰ４が抗ウイルス性１９、２０または抗癌性１６プリンヌクレオチド類似体の流出を媒介することができ、ＭＲＰ４はまた、血小板濃染顆粒のＡＤＰの貯留および放出に関与する２１。しかし、これらの以前の研究は、環状ヌクレオチド媒介シグナル伝達経路の上流調節因子としてＭＲＰ４を同定してきた。平滑筋細胞において薬理学的ＭＲＰ４阻害剤またはＭＲＰ４のＲＮＡ干渉媒介性ノックダウンを使用することによって、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰ細胞内レベルが有意に増加すると伴に、基礎条件下で細胞外レベルが減少することを観察した。これらの結果と一致して、アデニル酸シクラーゼ活性化剤、フォルスコリンによって刺激した後２２、２３、ＭＲＰ４を欠如した細胞において細胞内ｃＡＭＰ利用性が劇的に増強された。これらのデータはホスホジエステラーゼを阻害せずに得られたので、細胞内環状ヌクレオチド含量は２種類の独立した機構、１つはＭＲＰ４による流出、もう１つはＰＤＥによる代謝によって決定されることを示唆している（図７）。
【０１０１】
ＭＲＰ４阻害は、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰレベルの両方の変化と関連していた。しかし、ＰＫＩ（タンパク質キナーゼＡの特異的阻害剤）を添加すると、ＭＲＰ４阻害の抗増殖性効果が完全に逆転する一方、ＰＫＧ遮断は影響を及ぼさなかったので、血清誘導性増殖の阻害は、プロテインキナーゼＡの増加と関連していることが認められた。ｃＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達経路の核標的であるＣＲＥＢのリン酸化および活性の増加２４は、ＰＫＡ経路の活性化と一致している。ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの細胞種特異的抗増殖性効果は、関与する機構はわかりにくいままであるが、よく報告されている。特に、ｃＡＭＰレベルの増加は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＶＳＭＣ増殖を阻害し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて動脈損傷後の新生内膜病変形成を減少させることが知られている２５〜２７。これらは、同じｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて得られた、ＭＲＰ４に特異的な低分子ヘアピンＲＮＡを発現するアデノウイルス構築物を使用することによって新生内膜形成の有意な阻害を示した結果と一致している。他方で、ｃＧＭＰはまた、ｃＡＭＰよりも効率は低いが、分裂促進剤に応答したＶＳＭＣ増殖を阻害することが示された。構成的活性型ＰＫＧの発現は、ラットにおけるバルーン損傷後の新生内膜形成を減少させる１方法として報告された２８。ｃＧＭＰシグナル伝達経路の重要な主役であるタンパク質キナーゼＧを阻害した後、ＭＲＰ４阻害効果の回復は認められず、ＭＲＰ４阻害はｃＡＭＰシグナル伝達経路を選択的に調節できるが、ｃＧＭＰシグナル伝達経路は調節できないかどうかについて疑問が生じた。しかし、以前の知見は、ｃＧＭＰがＰＫＡを通じて作用することを示唆している２９。それと一致して、近年、ｃＧＭＰの抗増殖性効果がタンパク質キナーゼＡの活性化によるＳ期キナーゼ関連タンパク質２発現の阻害と関連することが示された３０。ｃＧＭＰは直接ＰＫＡを交差活性化することはできないが、増殖する血管平滑筋細胞において示されたように、むしろｃＡＭＰを加水分解するホスホジエステラーゼ３を阻害することによってｃＡＭＰレベルを増加させるものと考えられる３１。さらに、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの細胞内エフェクターは、高分子複合体内に区画化され、ＭＲＰ４はこれらの複合体に付加される相手となることができる。我々の実験では、ＭＲＰ４はカベオリンの豊富な膜画分に局在した。カベオラ／脂質ラフトは、シグナル伝達分子の多分子複合体がカベオリン−１との相互作用によって区画化されている特殊な膜微小領域である３２。ＭＲＰ４のＣ末端タンパク質配列は、コンセンサスＰＤＺドメイン結合モチーフを含有しており３３、ＭＲＰ４が膜シグナル伝達複合体のその他の相手と緊密に相互作用できることを示唆している。このことは、ＭＲＰ４が特定の細胞内ドメインで作用することができ、したがって、環状ヌクレオチド媒介性シグナル伝達の初期活性化段階を調節することを示している。
【０１０２】
この研究は、平滑筋細胞増殖の調節因子としてのＭＲＰ４を同定した。ＭＲＰ４は、静止状態の平滑筋細胞では弱く発現したが、その発現は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて増殖状態下で誘導された。これは、環状ヌクレオチド産生後の内在性の正のフィードバックを意味し得るが、ＭＲＰ４発現を調節する因子は現時点では知られていない。したがって、ＭＲＰ４は、その発現が平滑筋細胞の病的な応答に関連するので、特に見込みのある標的となる。これは、ＭＲＰ４が平滑筋細胞の増殖応答中に機能的な重要性を獲得することを示唆している。これは、ＭＲＰ４ノックアウトマウスでは血管の欠陥がないことによって支持される３４。我々の結果とは対照的に、以前の研究では、ヒト平滑筋細胞におけるＭＲＰ５の発現が報告されたが１０、１２、ＭＲＰ４は探求されなかった。我々の場合、ＭＲＰ５は血管平滑筋細胞において低レベルで存在していた。しかし、ＶＳＭＣ増殖モデルにおいてＭＲＰ５発現にいかなる変化も認められず、ＭＲＰ５の効果的なサイレンシングによってＶＳＭＣ増殖に影響は及ばなかったので、ＭＲＰ５がＭＲＰ４と類似性を有するとは思われない。しかし、その他のＭＲＰ例えばＭＲＰ８などが環状ヌクレオチドの放出に関与することを排除することはできない３５。
【０１０３】
我々の結果は、環状ヌクレオチドの細胞内ホメオスタシスの調節因子としてのホスホジエステラーゼに加えて、選択的または相補的な機構としてのＭＲＰ４を指摘している。最も興味ある結果の１つは、ＭＲＰ４阻害はそれ自身細胞内環状ヌクレオチドレベルを変更するのに十分であり、シグナル伝達を媒介したことである。血清誘導性増殖の抑制が一般的なホスホジエステラーゼ阻害剤であるＩＢＭＸよりもＭＲＰ４阻害剤で強かったことがｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験で認められた。ホスホジエステラーゼが複合体の細胞内時空間的機構と一体化して４、環状ヌクレオチドの特異的細胞内プールを制御することは今日ではよく知られている。ホスホジエステラーゼの中には、増殖する平滑筋細胞において細胞質から核に移動できるものもあることも報告された３６。対照的に、カベオリンの豊富な画分にＭＲＰ４が局在することは、ＭＲＰ４が新規に合成されたｃＡＭＰおよびｃＧＭＰのレベルを密接した形で制御できることを示している３７、３８。ＭＲＰ４が環状ヌクレオチド産生の失活剤として作用できるかどうか、一方、ホスホジエステラーゼが細胞内の環状ヌクレオチドのより特異的なプールを調節するかどうかは、さらに調査するべきである（図７）。
【０１０４】
最後に、過剰な平滑筋細胞の増殖は、主要な動脈血管における傷害応答に関与する基本的なプロセスである。このようなプロセスは、アテローム性動脈硬化、血管形成術後の再狭窄、肺動脈高血圧および静脈移植片疾患を含む数多くの血管障害に関与する３９、４０。ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰレベルを調節するために、アデニリル／グアニル酸シクラーゼの活性化またはホスホジエステラーゼの薬理学的阻害剤の使用などのいくつかの方法が使用されてきた。血管増殖性障害、例えば、原発性肺高血圧の治療にＰＤＥ５Ａ阻害剤、シルデナフィルの使用が広がっていることは、この方法を支持している。シルデナフィルは、ＭＲＰ４阻害剤として興味深く報告されている４１。その治療効果がＰＤＥ５ＡまたはＭＲＰ４阻害剤（またはその両方）に関係し得るかどうか、現在もまだ決定されていない。
【０１０５】
結論として、我々の結果は、ＭＲＰ４がｃＡＭＰおよびｃＧＭＰシグナル伝達の重要かつ独立した調節因子であることを意味している。したがって、ＭＲＰ４の阻害は、多くの病的状態に関与する重要な機構である平滑筋細胞の増殖を制限する新たな治療方法である。
【０１０６】
材料および方法
試薬
ＭＫ５７１は、Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。ＮＢＭＰＲ、ジピリダモール、ＩＢＭＸ、８Ｂｒ−ｃＡＭＰ、８Ｂｒ−ｃＧＭＰ、ＳＮＰ、フォルスコリンはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｆｒａｎｃｅ）製であった。タンパク質キナーゼ阻害剤ＫＴ５８２３は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した。アデノウイルスＰＫＩ（Ａｄ−ＰＫＩ）は、Ｄｒ  Ｈａｚｅｌ  Ｌｕｍ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、Ｃｈｉｃａｃｏ）によって提供された４２。
【０１０７】
ヒトＶＳＭＣを培養するための培地および血清は、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）から購入し、抗生物質はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃｅｒｇｙ  Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。
【０１０８】
ヒト試料およびヒト血管平滑筋細胞の培養
心室間の冠状動脈の断片は、外植した心臓から切り取った。取り出した後、動脈部分をすぐに生理学的食塩水溶液に浸漬し、４℃に静置して数時間以内に使用した。ヒト冠状動脈平滑筋細胞（ｈＣＡＳＭＣ）は、酵素消化によって中膜層から単離した。切り出した後、中膜の断片をコラゲナーゼ（ＣＬＳ２、５０Ｕ／ｍＬ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）および膵エラスターゼ（０．２５ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）を含む平滑筋細胞基礎培地２（ＳＭＣＢＭ２、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）中で３７℃で４〜７時間インキュベートした。３０分後、懸濁液を１０００ｒｐｍで３分間遠心し、細胞を収集し、ＳＭＣＢＭ２＋２０％Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｍｉｘ（Ｓ）（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）中で静置した。最初の２０分間で得られた細胞は廃棄した。他の操作で得られたものを収集し、５％のＳおよび抗生物質を含有するＳＭＣＢＭ２中で３７℃で５％のＣＯ２中で培養した。細胞は、２回と６回の継代の間で研究した。
【０１０９】
ラット頸動脈の損傷
動物は、研究所の指針に従って処理した。体重３５０ｇから４００ｇのウィスターラットのオス成体（ＣＥＲＪ、Ｆｒａｎｃｅ）の左の外頸動脈を既に記載されたように傷つけた４３。手術して２週間後に頸動脈を採取した。内膜中膜複合体厚は、ヘマトキシリンおよびエオジン染色した断面からコンピュータをベースにしたソフトウェア（Ｌｕｃｉａ、Ｎｉｋｏｎ）で測定した。標準的手順を用いて（Ｇｅｎｔｒａ（ＵＳ）のＰｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）ＤＮＡ精製キット）、ラットの損傷した頸動脈からＤＮＡを抽出した。次に、アデノウイルス発現は、挿入された発現カセットを標的とするセンスプライマー（５’−ＴＣＴＴＧＴＧＧＡＡＡＧＧＡＣＧＡＧＧＡ−３’（配列番号１０）およびアデノウイルスＤＮＡ内のアンチセンスプライマー（５’−ＡＴＣＡＡＡＣＧＡＧＴＴＧＧＴＧＣＴＣＡ−３’（配列番号１１）を使用してＰＣＲによって測定した。
【０１１０】
定量的リアルタイムＰＣＲ
全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して調製し、１μｇは標準的プロトコルを使用して逆転写した。得られたｃＤＮＡの１０分の１は、９４℃で３０秒、Ｔｍで３０秒（ＭＲＰ４、ＭＲＰ５およびＲＰＬ３２には３０℃）および７２℃で３０秒を３５回、引き続き最後に７２℃で１０分、ＢＩＯＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）１単位および以下のプライマーそれぞれ２００ｐｍｏｌを使用して増幅した。
【０１１１】
ヒトＭＲＰ４センスプライマー：５’−ＴＧＧＴＧＣＡＧＡＡＧＧＧＧＡＣＴＴＡＣ−３’（配列番号１）およびアンチセンスプライマー、５’−ＧＣＴＣＴＣＣＡＧＡＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴ−３’（配列番号２）；ヒトＭＲＰ５センスプライマー５’−ＣＴＧＧＧＣＴＴＴＴＴＴＣＣＴＧＴＡＴＧＡ−３’（配列番号３）およびアンチセンスプライマー、５’−ＴＣＴＴＧＣＣＡＣＡＧＴＣＴＣＴＣＴＡＧＴＣＴＴ−３’（配列番号４）；ヒトＲＰＬ３２センスプライマー、５’−ＧＣＣＣＡＡＧＡＴＣＧＴＣＡＡＡＡＡＧＡ−３’（配列番号５）およびアンチセンスプライマー、５’−ＧＴＣＡＡＴＧＣＣＴＣＴＧＧＧＴＴＴ−３’（配列番号６）、ベータ−アクチンセンスプライマー５’−ＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＣＴＧＴＧＣＴＴＧＣ−３’（配列番号１２）およびアンチセンスプライマー５’−ＴＧＡＴＣＣＡＣＡＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＴＧＧＣ−３’（配列番号１３）。
【０１１２】
遺伝子特異的プライマーは、Ｍ×４０００装置（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のｑＰＣＲによってＱｉａｇｅｎ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘを使用してｍＲＮＡを増幅するために使用した。各プライマー組の特異性は、解離曲線を分析することによってモニターした。各測定には、ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘの１×最終濃度、遺伝子特異的プライマー４００ｎＭおよび鋳型５μｌを含有する試料量２５μｌを使用した。
【０１１３】
スクロース勾配分離およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ
タンパク質は、プロテアーゼ阻害剤のカクテル（Ｓｉｇｍａ）を添加したＴＮＥ溶液（ｍＭで）（Ｔｒｉｓ２０、ＮａＣｌ１５０、ＥＤＴＡ１、ｐＨ７．４）２ｍｌ中で細胞を掻き取ることによって単離し、次に氷上においてガラスポッターでホモゲナイズした。その後、原形質膜の大半に局在するタンパク質を可溶化するために、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を全タンパク質画分に最終濃度の１％で添加した。タンパク質抽出段階は全て４℃で実施され、この温度で脂質ラフトは１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００に不溶性であることに注意されたい。氷上で３０分間インキュベーションした後、タンパク質濃度はＢｉｏ−ｒａｄタンパク質アッセイ（Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して測定した。８０％スクロース溶液の２ｍｌをＳＷ４１遠心管（Ｂｅｃｋｍａｎ）に入れ、全抽出物の２ｍｌをスクロース溶液の上に載せ、調製物を混合した。３５％スクロース溶液４ｍｌをゆっくり混合物上に注ぎ、次に５％スクロース溶液４ｍｌを注いだ。その後、勾配を４℃で４００００ｒｐｍで１８時間中断することなく遠心した。１ｍｌの画分を勾配の上部から底部まで集め、−８０℃で維持した。各試料画分を超音波処理し、６０μｌを１２．５％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲルに添加し、ウェスタンブロットによって分析した。
【０１１４】
ウェスタンブロット分析および免疫蛍光法
全細胞溶解物は、標準的方法に従って調製した（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。膜タンパク質は、緩衝液Ａ（Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ５ｍｍｏｌ／Ｌ、スクロース２５０ｍｍｏｌ／Ｌおよびエチレンジアミン四酢酸０．１ｍｍｏｌ／Ｌにプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）を補給）中で細胞を掻き取ることによって単離した。溶解物は、４℃で１００００ｇで１０分間遠心し、上清はさらに４℃で１０００００ｇで１時間遠心した。得られたペレットを緩衝液Ａに再懸濁した。タンパク質（５０μｇ）は、ＳＤＳ１２％ＰＡＧＥによって分離し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にブロットし、種々の抗体でインキュベートした。抗ＭＲＰ４抗体は既に記載されている１７。その他の抗体は、抗ＭＲＰ５抗体（１：２５０；Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗カベオリン１（１：５０００、Ａｂｃａｍ）、抗サイクリンＤ１（１：５００、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＰＰ２Ｂ（カルシニューリン）（１：２５０；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＲＥＢ（１：１０００；Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗リン酸化ＣＲＥＢ（１：１０００；Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）であった。免疫反応性タンパク質は、ＥＣＬ（登録商標）（増強化学ルミネセンス）検出系（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して視覚化した。光学密度は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使用して定量した。免疫蛍光のために、タンパク質を抗ＭＲＰ４抗体または抗ＮＭ−Ｂ（１：３０００、Ａｂｃａｍ）でインキュベートし、Ａｌｅｘａ−５４６またはＡｌｅｘａ−４８８のいずれかに直接結合させた二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して視覚化した。
【０１１５】
ＲＮＡ干渉
サイレンシングＲＮＡは、ヒトＭＲＰ４に対して特異的に設計した。ｓｉＲＮＡの配列は、いくつかのＭＲＰ４スプライシング変異体（ＮＭ＿００５８４５、ＢＣ０４１５６０、ＡＹ０８１２１９、ＡＦ５４１９７７、ＡＹ１３３６８０、ＡＹ１３３６７９、ＡＹ１３３６７８）を標的化するために設計した。センス配列は、５’−ＣＡＧＵＧＵＵＣＵＵＡＣＡＣＵＵＣＣＵＴＴ−３’（配列番号７）であり、アンチセンス配列は５’−ＡＧＧＡＡＧＵＧＵＡＡＧＡＡＣＡＣＵＧＴＴ−３’（配列番号８）である。第２のＭＲＰ４ｓｉＲＮＡのための標的配列は、５’−ＣＡＡＡＴＧＴＧＧＡＴＣＣＧＡＧＡＡ−３’であった。ヒトＭＲＰ５に対するｓｉＲＮＡはＡｍｂｉｏｎから購入した（カタログ番号ＡＭ１６８１０）。哺乳類遺伝子に対して相同性のない非サイレンシングｓｉＲＮＡ（Ａｌｌ  Ｓｔａｒｓ陰性対照、Ｑｉａｇｅｎ）は、陰性対照（スクランブルｓｉＲＮＡ）として使用した。
【０１１６】
細胞は、血清を含まない培地中で６時間かけてｓｉＲＮＡ（５０ｎＭ）で形質移入し、その後さらに６６時間かけて培地を血清含有培地に置換した。形質移入は、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはａｍａｘａ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを用い、製造元の指示に従ったエレクトロポレーションを使用して実施した。
【０１１７】
Ａｄ−ｓｈＲＮＡの構築
ｓｈＲＮＡは、ラットＭＲＰ４に対して特異的に設計した。このｓｈＲＮＡはまた、ヒトＭＲＰ４を標的とする。ｓｈＲＮＡは、ノックアウトＲＮＡｉ系（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩを介してｐＳＩＲＥＮベクターにアニーリングし、連結した。次に、組換えｐＳＩＲＥＮは、Ｆｕｓｉｏｎ−Ｂｌｕｅコンピテント細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して大腸菌に形質転換した。その後、ＰＩ−ＳｃｅＩ／Ｉ−Ｃｅｕ  Ｉで断片を切断し、Ａｄｅｎｏ−Ｘ発現系１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用してＰＩ−ＳｃｅＩ／Ｉ−Ｃｅｕ  Ｉを介してＡｄｅｎｏ−ＸウイルスＤＮＡに挿入した。得られたアデノウイルスは、ＨＥＫ２９３細胞に形質移入し、増殖させ、Ａｄ―ｓｈＭＲＰ４（補足図４）およびＡｄ−ｓｈＬｕｃと称するＡｄＶを生成した。
【０１１８】
アデノウイルス構築物の効率を試験するために、ＶＳＭＣをオスのウィスターラットの胸部大動脈の中膜から単離し、以前に記載されたように培養した４４。
【０１１９】
平滑筋細胞におけるブロモデオキシウリジンの取り込み
ヒト平滑筋細胞は、９６ウェル組織培養プレートで、５％Ｓを補給した平滑筋細胞基礎培地２中で３日間培養した。０．１％Ｓを含有する培地は増殖停止対照として使用した。細胞は、薬理学的薬剤またはｓｉＲＮＡと共に５％Ｓを含有する培地中で７２時間インキュベートした。ＢｒｄＵは最後の１６時間添加した。この細胞培養プレートを洗浄し、比色分析によるＢｒｄＵ細胞増殖アッセイを製造元の指示（Ｒｏｃｈｅ）に従って実施した。
【０１２０】
環状ＧＭＰおよびＡＭＰアッセイ
環状ＧＭＰおよびＡＭＰは、細胞培養上清およびスクランブルｓｉＲＮＡまたはＭＲＰ４ｓｉＲＮＡのいずれかで７２時間トランスフェクトしたｈＣＡＳＭＣの細胞溶解物中で、製造元（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）によって記載されたように、特異的競合酵素免疫測定法によって測定した。
【０１２１】
一過性形質移入およびレポーター遺伝子アッセイ
細胞は、ａｍａｘａ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ技術を使用し、製造元の指示に従って、エレクトロポレーションによってｓｉＲＮＡ（５０ｎＭ）およびＣＲＥ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で同時共形質移入した。６時間後、培地を補給物含有培地に置換した。細胞は、５％Ｓの存在下で６６時間増殖させた。結果は、３連で実施した独立した３回の実験の平均である。ルシフェラーゼ活性は、「ルシフェラーゼ測定キット」（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。相対的ルシフェラーゼ単位で対照のパーセントとして表した。
【０１２２】
ｃＡＭＰの蛍光共鳴エネルギー移動イメージング
ｈＣＡＳＭＣは、培地を補給物含有培地に置換する前に、補給物を含まない培地中で６時間かけてスクランブルｓｉＲＮＡまたはＭＲＰ４に対するｓｉＲＮＡ（それぞれ５０ｎＭ）で形質移入した。形質移入して２４時間後、細胞にＦＲＥＴをベースにしたｃＡＭＰセンサーＥｐａｃ２−ｃａｍｐｓをコードするアデノウイルスを感染させた。このＦＲＥＴをベースにしたｃＡＭＰセンサーは、ＹＦＰおよびＣＦＰ蛍光タンパク質に融合させたＥｐａｃ２の１個のｃＡＭＰ結合ドメインを含有する。フォルスコリンを添加するとき、細胞内のｃＡＭＰ濃度を増加させると、Ｅｐａｃ２−ｃａｍｐｓの可逆的な立体的変化が生じ、ＣＦＰとＹＦＰの間のＦＲＥＴの減少が引き起こされ、その結果ＣＦＰ／ＹＦＰ比が生じる１３。イメージング実験は、７２時間後に室温で実施した。細胞は、（ｍｍｏｌ／Ｌで）ＮａＣｌ１２１．６、ＫＣｌ５．４、ＭｇＣｌ２１．８、ＣａＣｌ２１．８、ＮａＨＣＯ３４、ＮａＨ２ＰＯ４０．８、Ｄ−グルコース５、ピルビン酸ナトリウム５、ＨＥＰＥＳ１０を含有し、ｐＨ７．４に調節したＫ＋リンゲル溶液中で維持した。画像は、ソフトウェアで制御した（Ｍｅｔａｆｌｕｏｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）冷却電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ（Ｓｅｎｓｉｃａｍ  ＰＥ、ＰＣＯ、Ｋｅｌｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に連結したＮｉｋｏｎ  ＴＥ３００倒立顕微鏡の４０×油浸対物レンズを使用して５秒ごとに取り込んだ。ＣＦＰは、キセノンランプ（１００Ｗ、Ｎｉｋｏｎ、Ｃｈａｍｐｉｇｎｙ−ｓｕｒ−Ｍａｒｎｅ、Ｆｒａｎｃｅ）によって、４４０／２０ＢＰフィルターおよび４５５ＬＰ２色性ミラーを使用して、１５０〜３００ｍｓ間励起した。ＣＦＰおよびＹＦＰの２色発光イメージングは、４９５ＬＰ２色性ミラーおよびＢＰフィルター４７０／３０および５３５／３０それぞれを装備したＯｐｔｏｓｐｌｉｔ  ＩＩ発光スプリッター（Ｃａｉｒｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｆａｖｅｒｓｈａｍ、ＵＫ）を使用して実施した。平均蛍光強度は、細胞全体を含む関心のある領域で測定した。バックグラウンドは差し引いて、ＹＦＰ強度はＣＦＰ／ＹＦＰ比を計算する前にＣＦＰ漏出について５３５ｎｍチャネルに修正した。比画像は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（国立衛生研究所）で得た。
【０１２３】
完全長ヒトＭＲＰ４の単離
全ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してヒト組織から単離し、１μｇは標準的プロトコルを使用して逆転写した。ＭＲＰ４ｃＤＮＡを増幅するために、プライマーを公開されているヒト配列（ヌクレオチド１から３９７９、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号（ＡＦ０７１２０２））に基づいて設計した。得られたｃＤＮＡの１０分の１は、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒および７２℃で３０秒を３５回、引き続き最後に７２℃で１０分間、ＢＩＯＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）１単位および以下のプライマーそれぞれ２００ｐｍｏｌを使用して増幅した。得られた断片はｐＩＲＥＳ−ＧＦＰプラスミドにクローニングした。
【０１２４】
統計学的分析
定量的データは全て、平均±ＳＤで表す。統計学的分析はＰｒｉｓｍソフトウェアパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ  ｖ３）を使用して実施した。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）は、各パラメータを比較するために使用した。ポストホックｔ検定比較は、どの群差がＡＮＯＶＡ全体の有意性の原因となるかを確認するために実施した。正規化したＣＦＰ／ＹＦＰ比に対するフォルスコリンの効果の濃度応答曲線（Ｒ）は、ヒル式：Ｒ＝Ｅｍａｘ／（１＋ＥＣ５０／［ｆｏｒｓｋ］ｎ）（式中、ＥＣ５０は最大刺激の半分を生じるのに必要な薬剤濃度、Ｅｍａｘは最大効果およびｎはＨｉｌｌ係数）に当てはめた。ｐが＜０．０５のとき、有意であると見なした。
参考文献
【０１２５】
【表１】
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【０１２６】
【表２】
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【０１２７】
【表３】
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【０１２８】
【表４】
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【０１２９】
【表５】
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【０１３０】
【表６】
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【０１３１】
【表７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図Ｓ１】
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【図Ｓ２】
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【図Ｓ３】
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【図Ｓ４】
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【図Ｓ５】
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【配列表】
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