(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｗｎｔシグナルアゴニスト、形質転換因子βシグナル阻害剤、及び線維芽細胞増殖因子シグナルアゴニストを含み、多能性幹細胞を神経上皮細胞に分化させることに用いられることを特徴とする神経細胞への分化誘導培地。
【請求項２】
前記Ｗｎｔシグナルアゴニストは、Ｗｎｔリガンドおよびグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β阻害剤からなる群から選ばれるものであることを特徴とする請求項１に記載の神経細胞への分化誘導培地。
【請求項３】
前記Ｗｎｔシグナルアゴニストは、濃度が０．０５μＭ〜５０μＭの前記グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β阻害剤を含み、
前記グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β阻害剤は構造式１で表されるものであることを特徴とする請求項１または２に記載の神経細胞への分化誘導培地。
【化１】
0005823925.tif 000007
【請求項４】
前記形質転換因子βシグナル阻害剤は、骨形成タンパク質阻害剤、コーディンタンパク質、ノギンタンパク質、ドルソモルフィンタンパク質、Ｓｍａｄ１阻害剤、Ａｃｔｉｖｉｎ／Ｎｏｄａｌ受容体阻害剤、及びＳｍａｄ２／３阻害剤からなる群から選ばれるものであることを特徴とする請求項１に記載の神経細胞への分化誘導培地。
【請求項５】
前記形質転換因子βシグナル阻害剤は、濃度が１μＭ〜１００μＭの前記Ａｃｔｉｖｉｎ／Ｎｏｄａｌ受容体阻害剤を含み、
前記Ａｃｔｉｖｉｎ／Ｎｏｄａｌ受容体阻害剤は、構造式２で表されるものであることを特徴とする請求項４に記載の神経細胞への分化誘導培地。
【化２】
0005823925.tif 000008
【請求項６】
前記線維芽細胞増殖因子シグナルアゴニストは、線維芽細胞増殖因子２、線維芽細胞増殖因子受容体のリガンド、活性化細胞外シグナル調節キナーゼアゴニスト、活性化ｃ−ｊｕｎ  Ｎ端タンパク質キナーゼアゴニスト、及び活性化ホスホイノシチド３キナーゼアゴニストからなる群から選ばれるものであることを特徴とする請求項１に記載の神経細胞への分化誘導培地。
【請求項７】
前記線維芽細胞増殖因子シグナルアゴニストは、濃度が１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬである前記線維芽細胞増殖因子２であることを特徴とする請求項６に記載の神経細胞への分化誘導培地。
【請求項８】
多能性幹細胞を懸濁培養して胚様体を形成するステップａと、
当該胚様体を神経細胞への分化誘導に用いられる第一培地中で培養して神経上皮細胞に分化するステップｂとを含む、多能性幹細胞を神経上皮細胞に分化させる方法であって、
前記第一培地は、請求項１〜７に記載の神経細胞への分化誘導培地からなる群から選ばれるものであることを特徴とする神経細胞への分化誘導方法。
【請求項９】
前記第一培地を神経細胞への分化誘導に用いられる第二培地に変更し、さらに神経上皮細胞に分化させるステップｃを、さらに含むことを特徴とする、請求項８に記載の神経細胞への分化誘導方法。
【請求項１０】
前記ステップａにおける多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞株及び誘導多能性幹細胞からなる群から選ばれるものであることを特徴とする請求項８または９に記載の神経細胞への分化誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞への分化誘導培地、および、神経細胞への分化誘導方法に関し、特に、多能性幹細胞から神経上皮細胞への分化誘導培地、及び、多能性幹細胞から神経上皮細胞への分化誘導方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞とは、分化が完全にされていなく、自己更新能力を備え、且つ二種類以上の成熟細胞に分化できる原始細胞である。分化能力によって幹細胞を分類すれば、全能性幹細胞（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、多能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）及び両能性幹細胞（ｂｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）に分類することができる。また、幹細胞の由来によって分類すれば、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、体性幹細胞（ｓｏｍａｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）及び誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）に分類することができる。中でも、ヒト胚性幹細胞は多能性幹細胞に属し、着床前の胚盤胞期に形成される細胞塊に由来し、多能性を有し、各種体細胞に分化することができる。また、誘導多能性幹細胞は、強制発現（ｅｎｆｏｒｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）操作により特定の遺伝子またはタンパク質を導入した、分化した体細胞であって、該体細胞は新たに再プログラム（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ）され、胚性幹細胞に類似したものとなる。
【０００３】
幹細胞は細胞分裂、再生更新の能力を有し、さらに特定の組織に誘導分化されることが可能である。このために、現在多くの研究者は幹細胞の分化に関する研究に尽力し、幹細胞が特定の細胞または組織、器官に分化した後、人類の疾患の治療または再生医療等の用途に用いられることが期待されている。例えば、分化培養したドーバミンニューロンをパキンソン病の治療に用いること、分化した器官を器官損傷の患者に用いることが可能である。特に神経発育、神経損傷及び神経退行性疾患、または関連薬品のスクリーニング等の生物医学研究おいて、さらには幹細胞の分化した後の神経細胞を用いる必要がある。
【０００４】
しかし、成熟神経細胞は神経上皮細胞からできるものであり、如何にして大量且つ純度の高い神経上皮細胞を取得するかが非常に重要となる。多くの研究者は、胚性幹細胞分化初期に線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ２）（Ｌｉ，Ｘ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｔｉｍｏｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｖａｌｌｉｅｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，２００５）を加えることによって、懸濁培養方式によって神経分化を誘導した。この分化方法によって神経管に似た発現を有する神経上皮細胞を得ることはできるが、約１４日以上の分化時間が必要であり、分化によって得られる細胞を貼り付けする過程において多くの非神経細胞が混ざり、酵素及び手動操作によって顕微鏡下で神経上皮細胞を選別して初めて、高純度の神経細胞を得ることができる。また、他の研究者は、神経分化時間の短縮のために、幹細胞の分化過程において、Ｎｏｇｇｉｎ及びＳＢ４３１５４２を含む、２種類のｓｍａｄ阻害剤（Ｅｌｋａｂｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）を加えた。また、遺伝子操作によって分化を誘導する、または他の細胞との共同培養による分化の誘導等を行う学者もいる（Ｐａｎｋｒａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）が、上記方法によって神経上皮細胞は得られるものの、大部分の胚性幹細胞を神経細胞に分化させることはできず、しかもその生産コストは高く、ウイルスによって遺伝子操作を行うことに対する安全上の懸念及び他の細胞と共同培養する等の不確定的な要素を有する等の欠点を有する。また、生産する神経上皮細胞にその他の非神経細胞または未分化細胞が混入している場合、その後の神経分化に影響を及ぼす可能性があり、しかもこのような未分化の多能性幹細胞を動物体内に移植した場合、奇形腫となる可能性がある。よって、高純度で、且つ大部分の神経マーカーが発現されている神経上皮細胞を効率的に分化させることは、将来の成熟神経細胞の分化に助けとなり、臨床応用における信頼性を高め、使用する際の危険度を低減することが可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−２７８６４１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｌｉ，Ｘ．Ｊ．，Ｄｕ，Ｚ．Ｗ．，Ｚａｒｎｏｗｓｋａ，Ｅ．Ｄ．，Ｐａｎｋｒａｔｚ，Ｍ．，Ｈａｎｓｅｎ，Ｌ．Ｏ．，Ｐｅａｒｃｅ，Ｒ．Ａ．，ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，Ｓ．Ｃ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｔｏｒｎｅｕｒｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５，２３：２１５−２０．
【非特許文献２】Ｔｉｍｏｔｈｙ，Ｍ．Ｌ．，Ｙｏｏ，Ｙ．Ｄ．，Ｐａｎｋｒａｔｚ，Ｍ．Ｔ．，Ｗｅｉｃｋ，Ｊ．Ｐ．，Ｇｅｒｓｔｎｅｒ，Ｊ．Ｒ．，ａｎｄ    Ｚｈａｎｇ，Ｓ．Ｃ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ＢＭＰ  ａｎｄ  ＦＧＦ．Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．２００９，２７：１７４１−４９．
【非特許文献３】Ｘｕ，Ｒ．Ｈ．，Ｐｅｃｋ，Ｒ．Ｍ．，Ｌｉ，Ｄ．Ｓ．，Ｆｅｎｇ，Ｘ．，Ｌｕｄｗｉｇ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．Ｂａｓｉｃ  ＦＧＦ  ａｎｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＢＭＰ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｓｕｓｔａｉｎ  ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００５，２：１８５−９０
【非特許文献４】Ｖａｌｌｉｅｒ，Ｌ．，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｒ．Ａ．Ａｃｔｉｖｉｎ／Ｎｏｄａｌ  ａｎｄ  ＦＧＦ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｃｏｏｐｅｒａｔｅ  ｔｏ  ｍａｉｎｔａｉｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  ｃｅｌｌ  ｓｃｉ．２００５，１１８：４４９５−４５０９．
【非特許文献５】Ｅｌｋａｂｅｔｚ，Ｙ．，Ｐａｎａｇｉｏｔａｋｏｓ，Ｇ．，Ｓｈａｍｌ，Ｇ．Ａ．，Ｓｏｃｃｉ，Ｎ．Ｄ．，Ｔａｂａｒ，Ｖ．，ａｎｄ  Ｓｔｕｄｅｒ，Ｌ．Ｈｕｍａｎ  ＥＳ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒａｌ  ｒｏｓｅｔｔｅｓ  ｒｅｖｅａｌ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｅａｒｌｙ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｓｔａｇｅ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２００８，２２：１５２−６５．
【非特許文献６】Ｌｅｅ，Ｈ．，Ｓｈａｍｌ，Ｇ．Ａ．，Ｅｌｋａｂｅｔｚ，Ｙ．，Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ，Ｃ．Ｍ．，Ｈａｒｒｓｉｏｎ，ＮＬ．，Ｐａｎａｇｉｏｔａｋｏｓ，Ｇ．，Ｓｏｃｃｉ，Ｎ．Ｄ．，Ｔａｂａｒ，Ｖ．，ａｎｄ  Ｓｔｕｄｅｒ，Ｌ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｏｔｏｒｎｅｕｒｏｎｓ．Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．２００７，２５：１９３１−３９．
【非特許文献７】Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｓ．Ｍ．，Ｆａｓａｎｏ，Ｃ．Ａ．，Ｐａｐａｐｅｒｔｒｏｕ，Ｅ．，Ｔｏｍｉｓｈｉｍａ，Ｍ．，Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｓｔｕｄｅｒ，Ｌ．Ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＥＳ  ａｎｄ  ｉＰＳ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｄｕａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＭＡＤ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９，２７：２７５−８０．
【非特許文献８】Ｐａｎｋｒａｔｚ，Ｍ．Ｔ．，Ｌｉ，Ｘ．Ｊ．，Ｔｉｍｏｔｈｙ，Ｍ．Ｌ．，Ｌｙｏｎｓ，Ｅ．Ａ．，Ｃｈｅｎ，Ｘ．，ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，Ｓ．Ｃ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｎｅｕｒａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ａｎ  ｏｂｌｉｇａｔｅｄ  ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｓｔａｇｅ．Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．２００７，２５：１５１１−２０．
【非特許文献９】Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｓ．Ｍ．，Ｆａｓａｎｏ，Ｃ．Ａ．，Ｐａｐａｐｅｒｔｒｏｕ，Ｅ．，Ｔｏｍｉｓｈｉｍａ，Ｍ．，Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｓｔｕｄｅｒ，Ｌ．Ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＥＳ  ａｎｄ  ｉＰＳ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｄｕａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＭＡＤ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９，２７：２７５−８０．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は多能性幹細胞から神経上皮細胞への分化時間を有効的に短縮可能であり、純度の高い神経上皮細胞が得られる、神経細胞への分化誘導培地、および、神経細胞への分化誘導方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の神経細胞への分化誘導培地は、Ｗｎｔシグナルアゴニスト（Ｗｎｔ−ｓｉｇｎａｌ  ａｇｏｎｉｓｔ）、形質転換因子βシグナル阻害剤（ＴＧＦβ−ｓｉｇｎａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）及び線維芽細胞増殖因子シグナルアゴニスト（ＦＧＦ−ｓｉｇｎａｌ  ａｇｏｎｉｓｔ）を含み、該神経細胞への分化誘導培地は幹細胞から高純度の神経上皮細胞を分化させることに用いられる。
【０００９】
本発明の神経細胞への分化誘導方法は、多能性幹細胞を懸濁培養して胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ）を形成するステップａと、該胚様体を第一神経細胞への分化誘導培地中で培養して神経上皮細胞に分化するステップｂとを主に含む、多能性幹細胞を神経上皮細胞に分化させる方法であって、
上記第一神経細胞への分化誘導培地は、Ｗｎｔシグナルアゴニスト（Ｗｎｔ−ｓｉｇｎａｌ  ａｇｏｎｉｓｔ）、形質転換因子βシグナル阻害剤（ＴＧＦβ−ｓｉｇｎａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）及び線維芽細胞増殖因子シグナルアゴニスト（ＦＧＦ−ｓｉｇｎａｌ  ａｇｏｎｉｓｔ）を含むことを特徴とする。
【００１０】
さらに、本発明の方法は、ステップｂの後に、該第一神経細胞への分化誘導培地を第二神経細胞への分化誘導培地に変更し、さらに培養細胞を神経上皮細胞に分化させるステップｃをさらに含む。
上記方法において、該多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞株及び誘導多能性幹細胞から選ばれるものである。
【００１１】
上記Ｗｎｔシグナルアゴニストは、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａ、薬品ＢＩＯ（６−ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ−３’−ｏｘｉｍｅ）のようなグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β阻害剤（ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３β・ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を用いることができる。
【００１２】
形質転換因子βシグナル阻害剤は、骨形成タンパク質阻害剤（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、コーディン（ｃｈｏｒｄｉｎ）タンパク質、ノギン（ｎｏｇｇｉｎ）タンパク質、ドルソモルフィン（ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）タンパク質、Ｓｍａｄ１阻害剤（Ｓｍａｄ１  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、薬品ＳＢ４３１５４２のようなＡｃｔｉｖｉｎ／Ｎｏｄａｌ受容体阻害剤、及びＳｍａｄ２／３阻害剤（Ｓｍａｄ２／３−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を用いることができる。
【００１３】
上記線維芽細胞増殖因子シグナルアゴニストは、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、線維芽細胞増殖因子受容体のリガンド（ｌｉｇａｎｄ）、活性化細胞外シグナル調節キナーゼ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌμｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅｓ、ＥＲＫ）アゴニスト、活性化ｃ−ｊｕｎ  Ｎ端タンパク質キナーゼ（ｃ−ｊｕｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｋｉｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ、ＪＮＫ）アゴニスト、及び活性化ホスホイノシチド３キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔａｌ−３  ｋｉｎａｓｅ、ＰＩ３Ｋ）アゴニストを用いることができる。
【００１４】
上記分化方法により、多能性幹細胞が神経上皮細胞に分化までの時間を有効的に短縮でき、且つより純度の高い神経上皮細胞を入手することができる。Ｎｅｓｔｉｎ、Ｓｏｘ１、Ｐａｘ６、Ｚｉｃ−１及びＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎのような神経マーカー、ＢＦ１のような前脳のマーカー分子を発現させることができる。
本発明の構成により、多能性幹細胞から神経上皮細胞への分化時間を有効的に短縮することができ、純度の高い神経上皮細胞を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】ヒト胚性幹細胞がフィーダー細胞のない環境下で、ｍＴＥＳＲ１培地中での成長形態を示す図である。
【図１Ｂ】ヒト胚性幹細胞がフィーダー細胞のない環境下で、ｍＴＥＳＲ１培地中での成長形態を示す図である。
【図１Ｃ】ヒト胚性幹細胞がフィーダー細胞のない環境下で、ｍＴＥＳＲ１培地中での成長形態を示す図である。
【図２】図２は、分化過程において薬品ＢＩＯ、薬品ＳＢ４３１５４２及び線維芽細胞増殖因子２を加えた第一神経細胞への分化誘導培地中に懸濁培養された細胞の形態を示す図である。
【図３Ａ】１００倍の顕微鏡下で観察した細胞の形態を示す図である。
【図３Ｂ】２００倍の顕微鏡下で観察した細胞の形態を示す図である。
【図３Ｃ】４００倍の顕微鏡下で観察した細胞の形態を示す図である。
【図４Ａ】分化後の神経上皮細胞を貼り付けた後の神経管状細胞の形態を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ａを二日間培養した後の細胞の伸展の形態を示す図である。
【図５Ａ】神経上皮細胞を一次抗体Ｏｃｔ４、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｚｏ−１で発現させた免疫蛍光発現図である。
【図５Ｂ】神経上皮細胞を一次抗体Ｓｏｘ１、Ｐａｘ６、Ｚｉｃ１、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎで発現させた免疫蛍光発現図である。
【図５Ｃ】神経上皮細胞を一次抗体ＢＦ１で発現させた免疫蛍光発現図である。
【図５Ｄ】神経上皮細胞を貼り付けた後に一次抗体Ｔｕｊ１で発現させた神経軸索の免疫蛍光発現図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（一実施例）
以下、本発明の一実施例による多能性幹細胞を神経上皮細胞に分化させる神経細胞への分化誘導方法を説明する。多能性幹細胞を凝集させて胚様体を形成した後、Ｗｎｔシグナルアゴニスト（Ｗｎｔ−ｓｉｇｎａｌ  ａｇｏｎｉｓｔ）、形質転換因子βシグナル阻害剤（ＴＧＦβ−ｓｉｇｎａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）及び線維芽細胞増殖因子シグナルアゴニスト（ＦＧＦ−ｓｉｇｎａｌ  ａｇｏｎｉｓｔ）を含む神経細胞への分化誘導培地を用いて該多能性幹細胞に作用させ、該多能性幹細胞を分化させて神経上皮細胞を形成させる。
【００１７】
本実施例が提供する多能性幹細胞を神経上皮細胞に分化させる分化方法、及びそれに用いる培地を用いることにより、９０％を超える未分化多能性幹細胞が一週間以内に成功的に分化し神経上皮細胞を形成し、且つ神経マーカーと前脳マーカー分子を高度に発現することができる。
【００１８】
本実施例に用いられる用語について、そのコアな意味は下記に述べる通りであるが、その意味の範囲はこれによって限定されない。
多能性幹細胞とは、哺乳類動物の胚性幹細胞、外来の遺伝子またはタンパク質の発現によって形成する誘導多能性幹細胞、またはその他のすべての体細胞に分化できる特性を有する多能性細胞である。下記の実施例で使用される多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞ＴＷ１であり、図１のＡ〜Ｃに示すとおりである。図１のＡ〜Ｃは、該ヒト胚性幹細胞がフィーダー細胞のない（ｎｏｎ−ｆｅｅｄｅｒ  ｃｅｌｌｓ）環境下で、ｍＴＥＳＲ１培地中での成長形態を示す。
【００１９】
神経マーカーとは、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｓｏｘ１、Ｐａｘ６、Ｚｉｃ−１及びＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎ等の遺伝子であり、神経上皮細胞内で発現されるものである。よって、該神経マーカーを分析することによって、多能性幹細胞が分化して神経上皮細胞を形成しているかについて判定することができる。
【００２０】
前脳マーカー分子とは、Ｂｒａｉｎ  ｆａｃｔｏｒ  １（ＢＦ１）のような、神経前脳細胞で発現される転写因子である。よって、前脳マーカー分子が発現されているかを分析することによって、多能性幹細胞が分化して神経上皮細胞を形成しているかについて判定することができる。
【００２１】
胚性幹細胞マーカー分子とは、Ｏｃｔ４及びｎａｎｏｇ等のような転写因子であって、胚性幹細胞中に大量に発現されるものである。よって、胚性幹細胞マーカー分子の発現を分析することによって、多能性幹細胞が神経上皮細胞に分化する効率について判定することができる。
【００２２】
神経上皮細胞は、その細胞は球状構造であって、辺縁は徐々に管状になって規則的かつ密に配列している構造となり、花びらのように配列し、ｎｅｕｒａｌ  ｒｏｓｓｅｔｔｅｓとも呼ばれている。
【００２３】
Ｗｎｔシグナルアゴニストとは、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β阻害剤を用いることができ、β−カテニン（β−ｃａｔｅｎｉｎ）を安定化させる。Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａ、薬品ＢＩＯ（６−ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ−３’−ｏｘｉｍｅ）のようなグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β阻害剤を含む。ここにおいて、下記実施例で使用するＷｎｔシグナルアゴニストは薬品ＢＩＯであり、その化学式はＣ16Ｈ10ＢｒＮ3Ｏ2であり、その構造式は式（１）に示すとおりである。
【化１】
0005823925.tif 000002
【００２４】
形質転換因子βシグナル阻害剤とは、胚性幹細胞の自己更新能力を減少させ、Ｏｃｔ４発現量を低下させるものであり、骨形成タンパク質阻害剤（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、コーディン（ｃｈｏｒｄｉｎ）タンパク質、ノギン（ｎｏｇｇｉｎ）タンパク質、ドルソモルフィン（ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）タンパク質、Ｓｍａｄ１阻害剤（Ｓｍａｄ１  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、薬品ＳＢ４３１５４２のようなＡｃｔｉｖｉｎ／Ｎｏｄａｌ受容体阻害剤、及びＳｍａｄ２／３阻害剤（Ｓｍａｄ２／３−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を含む。本明細書において、以下の実施例中で使用する形質転換因子βシグナル阻害剤は薬品ＳＢ４３１５４２であり、その化学式はＣ22−Ｈ16−Ｎ4−Ｏ3であり、その構造式は式（２）に示すとおりであり、Ａｃｔｉｖｉｎ／Ｎｏｄａｌ受容体の阻害剤である。
【化２】
0005823925.tif 000003
【００２５】
線維芽細胞増殖因子シグナルアゴニストは、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、線維芽細胞増殖因子受容体のリガンド（ｌｉｇａｎｄ）、活性化細胞外シグナル調節キナーゼ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌμｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅｓ、ＥＲＫ）アゴニスト、活性化ｃ−ｊｕｎ  Ｎ端タンパク質キナーゼ（ｃ−ｊｕｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｋｉｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ、ＪＮＫ）アゴニスト、及び活性化ホスホイノシチド３キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔａｌ−３  ｋｉｎａｓｅ、ＰＩ３Ｋ）アゴニストを含む。本明細書において、以下の実施例中で使用する線維芽細胞増殖因子シグナルアゴニストは線維芽細胞増殖因子２であって、細胞内のＲａｓ／Ｅｒｋシグナルを活性化させる。
【００２６】
＜実施手順１：胚性幹細胞を胚様体にする＞
ヒト胚性幹細胞ＴＷ１を３７℃、５％ＣＯ2下で培養し、培養した胚性幹細胞の小さな細胞塊を、２０％血清替代品（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｓｅｒｕｍ,ＫＳＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標），ＵＳＡ）を含むＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中で懸濁培養し、３７℃、５％ＣＯ2条件下で２日間培養し、該胚性幹細胞を凝集させ胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｉｅｓ）の細胞塊を形成させる。
【００２７】
＜実施手順２：神経上皮細胞誘導分化期＞
実施手順１中の該胚様体細胞塊を１５ｍＬの遠心用チューブに入れ、室温下で細胞を沈降させ、上澄み液を除去する。神経細胞への分化誘導に用いられる第一培地５００ｍＬを調製し、その組成は表１に示すとおりである。さらに、濃度０．５μＭの薬品ＢＩＯ、濃度１０μＭの薬品ＳＢ４３１５４２及び濃度１０ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞増殖因子２を加える。なお、該第一培地の組成成分のそれぞれの濃度は、上記説明に限定されるものではなく、具体的には、該薬品ＢＩＯの濃度範囲は０．０５μＭ〜５０μＭの範囲内、該薬品ＳＢ４３１５４２の濃度範囲は１μＭ〜１００μＭの範囲内、該線維芽細胞増殖因子２の濃度範囲は１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの範囲内とすることができる。
【００２８】
細胞を該第一培地中に入れて２日間懸濁培養し、細胞を分化させ
神経上皮細胞を形成させる。図２に示すように、その細胞は球状構造であって、辺縁は徐
々に管状になって規則的かつ密な構造となる。
第一培地の組成は表１に示すとおりである。
【表１】
0005823925.tif 000004
【００２９】
＜実施手順３：神経上皮細胞誘導分化期＞
実施手順２の神経上皮細胞を採取し、第一培地を第二培地に変更する。さらに濃度１０ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞増殖因子２を加える。２日間ごとに第二培地を新しくし、該神経上皮細胞の分化を続けさせる。ここにおいて、該第二培地の成分は表２に示すとおりである。
【００３０】
培養により分化が終わった細胞を顕微鏡下におき、１００倍、２００倍、４００倍の顕微鏡下で観察し、その結果は図３及び図４に示すとおりである。ここにおいて、図３Ａは細胞形態が均一であって、球状構造の周辺部に密な管状形態を示しているものである。図３Ｂは細胞が球状構造であって、その周辺部は密な管状構造を有しその中心部にバラ環状の類神経管細胞が形成されている。図３Ｃからわかるように、細胞の球状構造の中心部はバラ環状の類神経管細胞である。図４Ａは神経上皮細胞が貼り付けられた後の神経管状細胞の示す形態であり、図４Ｂは図４Ａを二日間培養した後の細胞の伸展の形態を示す。これによって、細胞形態観察分析によって、実施手順１〜実施手順３の分化培養によって得られたものは神経上皮細胞であることを確認した。
【００３１】
神経細胞への分化誘導に用いられる第二培地の組成は表２に示すとおりである。
【表２】
0005823925.tif 000005
【００３２】
＜実施手順４：神経上皮細胞の処理＞
まず、予めカバーガラスが設置されてある４ウェルプレートを、１％基底膜マトリックス（ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標），Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で覆い、約６時間後に基底膜マトリックスを除去して、リン酸塩バッファーで一回洗浄する。次に、実施例３中の分化した神経上皮細胞を機械処理で小さな細胞塊にし、上記のように処理された４ウェルプレート上に接種し、３７℃、５％ＣＯ2下で一日間培養して、該神経上皮細胞を貼り付けして且つ外に向かって伸展するバラ環状の類神経管細胞形態となるようにする。
【００３３】
＜実施手順５：一次抗体及び二次抗体を調製する＞
培養によって分化した細胞が神経上皮細胞であることをさらに検証するために、それぞれ異なる一次抗体及び二次抗体を利用して、免疫細胞染色法で観察を行う。
よって、使用する一次抗体を３％馬血清中において４℃で保存し、反応時間は２４時間である。一次抗体に対応する二次抗体をリン酸塩バッファー中で調製し、濃度を１：５００となるようにする。室温で光を避けた環境下で１時間反応させる。ここにおいて、使用する一次抗体、調製濃度及びそれに対応する二次抗体は表３に示すとおりである。
【００３４】
＜実施手順６：免疫細胞染色法で神経上皮細胞を判定する＞
実施手順４中の処理済細胞を採取し、細胞培地を除去し、リン酸塩バッファーで洗浄する。４％のトリオキサン２００μｌを細胞に加え、４℃で５分間作用させ細胞を固定した後、除去してリン酸塩バッファーで洗浄する。さらに０．３％抽出剤（Ｔｒｉｔｏｎ）のリン酸塩バッファー２００μｌを加え、４℃下で５〜１０分間作用させる。細胞膜に穴を空け、リン酸塩バッファーを除去した後に３回洗浄し、各回は５分間とする。５％馬血清を加え、室温下で１時間作用させブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）を行い、その後除去する。それぞれ実施手順５中で調製した一次抗体を加え、その後除去して洗浄を行った後、対応する二次抗体を加え、除去してから洗浄する。
【００３５】
さらに濃度１μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ蛍光染色剤２００μｌを細胞に加え、室温で光を避けた環境で１０分間反応させて、除去してから洗浄を行い、リン酸塩バッファーを加え、封止を行う。正立型蛍光顕微鏡下で観察し、さらにＡｌｐｈａＥａｓｅＦＣソフトウエアで発現量を計算する。
【００３６】
顕微鏡で観察した結果は図５に示すとおりである。ここにおいて、図５Ａは分化１０日目の神経上皮細胞をそれぞれ一次抗体Ｏｃｔ４、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｚｏ−１で発現させた免疫蛍光発現図であり、図５Ｂは分化１０日目の神経上皮細胞を一次抗体Ｓｏｘ１、Ｐａｘ６、Ｚｉｃ１、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎで発現させた免疫蛍光発現図であり、図５Ｃは分化１０日目の神経上皮細胞を一次抗体ＢＦ１で発現させた免疫蛍光発現図であり、図５Ｄは神経上皮細胞を貼り付けた後に一次抗体Ｔｕｊ１で発現させた神経軸索の免疫蛍光発現図である。また、ソフトウエア分析した後のそれぞれの遺伝子の発現量は表４に示すとおりであり、培養分化１０日目の細胞はいずれも神経マーカー及び前脳マーカー因子を高度に発現することができたことが分かった。
各遺伝子の発現量
【表４】
0005823925.tif 000006
【００３７】
よって、図５のＡ〜Ｄ及び表４の結果から分かるように、実施手順１〜３で培養分化した細胞では神経マーカー及び前脳マーカーが確かに発現し、胚性幹細胞マーカー分子の発現量を低減させ、且つ確かにに神経軸索の発現が見られた。よって、実施手順１〜３で培養分化した細胞は確かに神経上皮細胞であり、且つ該実施手順１〜３の培養分化方法によって高純度の神経上皮細胞を得ることができた。
【００３８】
上記一実施例から分かるように、本発明が開示した多能性幹細胞を神経上皮細胞に分化させる分化方法は、Ｗｎｔシグナルアゴニスト、形質転換因子βシグナル阻害剤及び線維芽細胞増殖因子シグナルアゴニストを添加している第一培地を使用するものであり、多能性幹細胞が神経上皮細胞に分化までの時間を短縮できるだけでなく、純度の高い神経上皮細胞が得ることができ、神経マーカーを高度に発現できる。よって、該神経上皮細胞を臨床上でさらに成熟神経細胞に分化させて、再生医療、神経疾患薬品のスクリーニング等に用いることができる。
【００３９】
以上は好適な実施例により本発明を詳細に説明するためのものであって、各実施例に対しいかなる簡単な修正または変化を加えたものも、いずれも本願の特許請求の範囲に属する。
本発明は、多能性幹細胞を純度の高い神経上皮細胞に分化させることに好適に応用することができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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