(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザワクチン組成物の安定化方法であって、季節性、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルス株由来のインフルエンザ抗原または抗原調製物を含む液体バルク組成物を、炭水化物、糖アルコールまたはそれらの混合物を含む水性溶液によって希釈して、得られた希釈組成物の炭水化物および／または糖アルコールの含有量を２％（ｗ／ｖ）から溶解限界までとする工程、希釈した組成物を層流噴流分解して直径２００μｍ〜１５００μｍの均一液滴を得る工程、この均一液滴を冷凍して、冷凍均一球状マイクロペレットまたは粒子を形成する工程、およびこの冷凍均一球状マイクロペレットまたは粒子を乾燥させて、直径２００μｍ〜１５００μｍの乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子を形成する工程を含む、方法。
【請求項２】
乾燥が凍結乾燥法によって行われることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
乾燥が大気凍結乾燥法、流動床乾燥法、真空回転ドラム乾燥法、撹拌式凍結乾燥法、振動式凍結乾燥法および超音波式凍結乾燥法からなる群から選択される方法によって行われることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項４】
炭水化物が二糖であることを特徴とする、請求項１〜３いずれか１項記載の方法。
【請求項５】
炭水化物がシュークロースであることを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
液体バルク組成物が、さらに、異なる季節性、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルス株由来の１種類以上のさらなるインフルエンザ抗原または抗原調製物を含んでいて、２種類以上の異なる季節性、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルス株由来の２種類以上のインフルエンザ抗原または抗原調製物を含む乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子が得られる、請求項１〜５いずれか１項記載の方法。
【請求項７】
さらに、乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子を１回分ずつに分けてバイアルまたは他の適当な容器中に充填する工程、または乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子をバイアルまたは他の適当な容器中に充填する工程を含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
液体バルク組成物が、１種類の季節性、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルス株由来の１種類以上のインフルエンザ抗原または抗原調製物を含んでいて、それぞれが同一の季節性、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルス株由来のインフルエンザ抗原または抗原調製物を含む乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子が得られる、請求項１〜５いずれか１項記載の方法。
【請求項９】
さらに、２種類以上のタイプの乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子を１回分ずつに分け、ブレンドしてバイアルまたは他の適当な容器に充填する工程を含み、各タイプのマイクロペレットまたは粒子がお互いに異なる季節性、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルス株由来のインフルエンザ抗原または抗原調製物を含むことを特徴とする、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
さらに、液体バルク抗原組成物に、１種類以上のアジュバントを含んでおり安定剤を含んでいてもよい水性溶液を添加する工程を含む、請求項１〜９いずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
さらに、安定剤を含む水性溶液によって１種類以上のアジュバントの別の液体バルク溶液またはエマルションを希釈する工程、この希釈されたアジュバント溶液またはエマルションを層流噴流分解して直径２００μｍ〜１５００μｍの均一液滴を形成する工程、該均一液滴を冷凍して冷凍均一球状マイクロペレットまたは粒子を形成する工程、冷凍均一球状マイクロペレットまたは粒子を乾燥して、直径２００μｍ〜１５００μｍの乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子を形成する工程、および抗原含有乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子と一緒にブレンドしてバイアルまたは他の適当な容器に充填する工程を含む、請求項１〜９いずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
アジュバントが、リポソーム、脂質または界面活性剤ミセルまたは他の脂質粒子、高分子ナノ粒子または微粒子、可溶性ポリマー、タンパク質粒子、鉱物ゲル、鉱物微粒子またはナノ粒子、ポリマー／アルミニウム・ナノハイブリッド、水中油型または油中水型エマルション、サポニン抽出物、細菌細胞壁抽出物、および自然免疫受容体の刺激物質からなる群から選択される、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１３】
自然免疫受容体の刺激物質が、天然または合成ＴＬＲアゴニスト、天然または合成ＮＯＤアゴニストおよび天然または合成ＲＩＧアゴニストからなる群から選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
インフルエンザウイルス株がＨ５Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１およびＨ１Ｎ１からなる群から選択される、請求項１〜１３いずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
インフルエンザウイルス株が季節性インフルエンザウイルス株からなる群から選択される、請求項１〜１３いずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
インフルエンザ抗原が精製した完全インフルエンザウイルス、不活化インフルエンザウイルス、およびインフルエンザウイルスのサブユニット成分からなる群から選択される形態である、請求項１〜１５いずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
不活化インフルエンザウイルスがスプリットインフルエンザウイルスである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
インフルエンザ抗原が細胞培養物由来のものである、請求項１〜１７いずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
インフルエンザ抗原が胚性卵中で産生される、請求項１〜１７いずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９いずれか１項記載の方法によって得られる直径２００μｍ〜１５００μｍの乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子の形態の安定化乾燥インフルエンザワクチン組成物。
【請求項２１】
均一球状マイクロペレットまたは粒子が各々１種類のインフルエンザウイルス株だけに由来する１種類以上のインフルエンザ抗原を含む、請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
均一球状マイクロペレットまたは粒子が各々１種類以上の異なるインフルエンザウイルス株由来の１種類以上のインフルエンザ抗原を含む、請求項２０記載の組成物。
【請求項２３】
さらに、アジュバントを含む、請求項２０〜２２いずれか１項記載の組成物。
【請求項２４】
アジュバントが別の乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子中に含有されている、請求項２３記載の組成物。
【請求項２５】
アジュバント含有ワクチン組成物の安定化方法であって、安定剤および１種類以上のアジュバントを含む水性溶液によって抗原または抗原調製物を含む液体バルク組成物を希釈する工程、該希釈組成物を層流噴流分解して直径２００μｍ〜１５００μｍの均一液滴を形成する工程、該均一液滴を冷凍させて、冷凍均一球状マイクロペレットまたは粒子を形成する工程、および、この冷凍均一球状マイクロペレットまたは粒子を乾燥させて、直径２００μｍ〜１５００μｍの乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子を形成する工程を含む、方法。
【請求項２６】
アジュバント含有ワクチン組成物の安定化方法であって、
安定剤を含む水性溶液によって抗原または抗原調製物を含む液体バルク組成物を希釈する工程、該希釈組成物を層流噴流分解して直径２００μｍ〜１５００μｍの均一液滴を形成する工程、該均一液滴を冷凍させて、冷凍均一球状マイクロペレットまたは粒子を形成する工程、および、この冷凍均一球状マイクロペレットまたは粒子を乾燥させて、直径２００μｍ〜１５００μｍの乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子を形成する工程を含み、
さらに、安定剤を含む水性溶液によって１種類以上のアジュバントの別の液体バルク溶液またはエマルションを希釈する工程、希釈したアジュバント溶液またはエマルションを層流噴流分解して直径２００μｍ〜１５００μｍの均一液滴を形成する工程、均一液滴を冷凍して、冷凍均一球状マイクロペレットまたは粒子を形成する工程、冷凍均一球状マイクロペレットまたは粒子を乾燥させて、直径２００μｍ〜１５００μｍの乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子を形成する工程、および抗原含有乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子と一緒にブレンドしてバイアルまたは他の適当な容器に充填する工程を含む、
方法。
【請求項２７】
液体バルク組成物が、さらに、それぞれが異なる病原体由来または一の病原体の異なる血清型由来の１種類以上のさらなる抗原または抗原調製物を含んでいて、それぞれが２種類以上の病原体由来または一の病原体の２種類以上の血清型由来の２種類以上の抗原または抗原調製物を含む乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子が得られる、請求項２５または２６記載の方法。
【請求項２８】
液体バルク組成物が単一の病原体由来または一の病原体の一の血清型由来の抗原または抗原調製物を含んでいて、それぞれが同一の病原体由来または一の病原体の同一の血清型由来の抗原または抗原調製物を含む乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子が得られる、請求項２５または２６記載の方法。
【請求項２９】
さらに、２種類以上のタイプの乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子を１回分ずつに分け、ブレンドしてバイアルまたは他の適当な容器に充填する工程を含み、各タイプのマイクロペレットまたは粒子が、お互いに異なる、同一の病原体由来または一の病原体の同一の血清型由来の抗原または抗原調製物を含むことを特徴とする、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
乾燥が凍結乾燥法によって行われる、請求項２５〜２９いずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
乾燥が、大気凍結乾燥法、流動床乾燥法、真空回転ドラム乾燥法、撹拌式凍結乾燥法、振動式凍結乾燥法および超音波式凍結乾燥法からなる群から選択される方法によって行われることを特徴とする、請求項２５〜２９いずれか１項記載の方法。
【請求項３２】
安定剤が単糖、オリゴ糖、糖アルコールまたはそれらの混合物を含むことを特徴とする、請求項２５〜３１いずれか１項記載の方法。
【請求項３３】
請求項２５〜３２いずれか１項記載の方法によって得ることができる直径２００μｍ〜１５００μｍの乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子の形態である、１種類以上の抗原を含む安定化アジュバント含有乾燥ワクチン組成物。
【請求項３４】
均一球状マイクロペレットまたは粒子が各々１種類のタイプだけの抗原を含む、請求項３３記載の組成物
【請求項３５】
均一球状マイクロペレットまたは粒子が各々１種類以上のタイプの抗原を含む、請求項３３記載の組成物。
【請求項３６】
アジュバントが別の乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子に含有されている、請求項３３〜３５いずれか１項記載の組成物。
【請求項３７】
抗原が、生菌弱毒化および不活化完全ウイルス、ウイルスの抗原成分、完全細菌、細菌蛋白質抗原および細菌多糖体抗原（結合型および非結合型）からなる群から選択される、請求項３３〜３６いずれか１項記載の組成物。
【請求項３８】
ウイルスが、ポリオウイルス、インフルエンザウイルス、ロタウイルス、サイトメガロウイルス、ならびにＡ型およびＢ型肝炎ウイルスからなる群から選択される、請求項３７記載の組成物。
【請求項３９】
抗原が、ヘモフィルス・インフルエンザエ、骨髄炎菌多糖体、破傷風、ジフテリア、細胞性および無細胞百日咳、ボツリヌス中毒、炭疽菌およびクロストリジウム・ディフィシルからなる群から選択される、完全細菌、細菌蛋白質または多糖体抗原（結合型または非結合型）である、請求項３７記載の組成物。
【請求項４０】
抗原の安定な乾燥バルクを貯蔵する方法であって、抗原が請求項１〜１９または２５〜３２のいずれか１項記載の方法によって安定化され、得られた安定化ワクチン組成物が、直径２００μｍ〜１５００μｍの乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子の形態で貯蔵した後、バイアルまたは注射器に液体充填する前に、適当な溶媒で再構成されるものであり、処方されてもよいものである、方法。
【請求項４１】
アジュバントを含む乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子を製造する方法であって、
ａ．１種類以上のアジュバントを含む液体バルクアジュバント溶液またはエマルションを、安定剤を含む水性溶液と混合する工程、
ｂ．この混合したアジュバント溶液またはエマルションを層流噴流分解して、直径２００μｍ〜１５００μｍの均一液滴を形成する工程、
ｃ．この均一液滴を冷凍して冷凍均一球状マイクロペレットまたは粒子を形成する工程、および
ｄ．この冷凍均一球状マイクロペレットまたは粒子を乾燥して、直径２００μｍ〜１５００μｍの乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子を形成する工程
を含む、方法。
【請求項４２】
アジュバントが、リポソーム、脂質または界面活性剤ミセルまたは他の脂質粒子、高分子ナノ粒子または微粒子、可溶性ポリマー、タンパク質粒子、鉱物ゲル、鉱物微粒子またはナノ粒子、ポリマー／アルミニウム・ナノハイブリッド、水中油型または油中水型エマルション、サポニン抽出物、細菌細胞壁抽出物、および自然免疫受容体の刺激物質からなる群から選択される、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
自然免疫受容体の刺激物質が、天然または合成ＴＬＲアゴニスト、天然または合成ＮＯＤアゴニストおよび天然または合成ＲＩＧアゴニストからなる群から選択される、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
アジュバントが、アルミニウム塩である、請求項４１〜４３いずれか１項記載の方法。
【請求項４５】
安定剤が、混合したアジュバント溶液中２％（ｗ／ｖ）から炭水化物の溶解限界までの濃度範囲内の炭水化物を含む水性溶液である、請求項４１〜４４いずれか１項記載の方法。
【請求項４６】
安定剤が単糖、オリゴ糖、糖アルコールまたはそれらの混合物を含むことを特徴とする、請求項４１〜４５いずれか１項記載の方法。
【請求項４７】
さらに、アジュバントの乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子をバイアルまたは他の適当な容器中に充填する工程を含む、請求項４１〜４６いずれか１項記載の方法。
【請求項４８】
請求項４１〜４７いずれか１項記載の方法によって得ることができる、直径２００μｍ〜１５００μｍの、アジュバントの乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子の形態である、１種類以上のアジュバントを含む安定化乾燥アジュバント組成物。
【請求項４９】
請求項４８記載の安定化乾燥アジュバント組成物が入っている容器を含むキット。
【請求項５０】
ワクチン組成物の安定化方法であって、安定剤を含む水性溶液によって抗原または抗原調製物を含む液体バルク組成物を希釈する工程、該希釈組成物を層流噴流分解して直径２００μｍ〜１５００μｍの均一液滴を形成する工程、該均一液滴を冷凍させて、冷凍均一球状マイクロペレットまたは粒子を形成する工程、および、この冷凍均一球状マイクロペレットまたは粒子を乾燥させて、直径２００μｍ〜１５００μｍの乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子を形成する工程を含む、方法。
【請求項５１】
液体バルク組成物が、さらに、それぞれが異なる病原体または一の病原体の異なる血清型由来の１種類以上のさらなる抗原または抗原調製物を含んでいて、それぞれが２種類以上の病原体または一の病原体の２種類以上の血清型由来の２種類以上の抗原または抗原調製物を含む乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子が得られる、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
液体バルク組成物が単一の病原体または一の病原体の一の血清型由来の抗原または抗原調製物を含んでいて、それぞれが同一の病原体または一の病原体の同一の血清型に由来する抗原または抗原調製物を含む乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子が得られる、請求項５０記載の方法。
【請求項５３】
さらに、２種類以上のタイプの乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子を１回分ずつに分け、ブレンドしてバイアルまたは他の適当な容器に充填することを含んでいて、各タイプのマイクロペレットまたは粒子が、お互いに異なる、同一の病原体由来または一の病原体の同一の血清型由来の抗原または抗原調製物を含むことを特徴とする、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
乾燥が凍結乾燥法によって行われる、請求項５０〜５３いずれか１項記載の方法。
【請求項５５】
乾燥が、大気凍結乾燥法、流動床乾燥法、真空回転ドラム乾燥法、撹拌式凍結乾燥法、振動式凍結乾燥法および超音波式凍結乾燥法からなる群から選択される方法によって行われることを特徴とする、請求項５０〜５３いずれか１項記載の方法。
【請求項５６】
安定剤が単糖、オリゴ糖、糖アルコールまたはそれらの混合物を含むことを特徴とする、請求項５０〜５５いずれか１項記載の方法。
【請求項５７】
安定剤が処方液体製剤中２％（ｗ／ｖ）から溶解限界までの範囲の炭水化物を含むことを特徴とする、請求項５０〜５５いずれか１項記載の方法。
【請求項５８】
請求項５０〜５７いずれか１項記載の方法によって得ることができる直径２００μｍ〜１５００μｍの乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子の形態である、１種類以上の抗原を含む安定化乾燥ワクチン組成物。
【請求項５９】
均一球状マイクロペレットまたは粒子が各々１種類のタイプだけの抗原を含む、請求項５８記載の組成物。
【請求項６０】
均一球状マイクロペレットまたは粒子が各々１種類以上のタイプの抗原を含む、請求項５８記載の組成物。
【請求項６１】
抗原が、生菌弱毒化および不活化完全ウイルス、ウイルスの抗原成分、完全細菌、細菌蛋白質抗原および細菌多糖体抗原（結合型および非結合型）からなる群から選択される、請求項５８〜６０いずれか１項記載の組成物。
【請求項６２】
ウイルスが、ポリオウイルス、インフルエンザウイルス、ロタウイルス、サイトメガロウイルス、ならびにＡ型およびＢ型肝炎ウイルスからなる群から選択される、請求項６１記載の組成物。
【請求項６３】
抗原が、ヘモフィルス・インフルエンザエ、骨髄炎菌多糖体、破傷風、ジフテリア、細胞性および無細胞百日咳、ボツリヌス中毒、炭疽菌およびクロストリジウム・ディフィシルからなる群から選択される、完全細菌、細菌蛋白質または多糖体抗原（結合型または非結合型）である、請求項６１記載の組成物。
【請求項６４】
水性溶液における請求項２３、２４および３３〜３９いずれか１項に記載の組成物の再構成の工程を含む、アジュバント含有ワクチンの製造方法。
【請求項６５】
水性溶液における請求項２０〜２２および５８〜６３いずれか１項記載の組成物の再構成の工程を含む、ワクチンの製造方法。
【請求項６６】
水性溶液がアジュバントを含む、請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
請求項２３、２４および３３〜３９いずれか１項記載の乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子の形態の安定化乾燥アジュバント含有ワクチン組成物が入っている第１の容器およびワクチンの再構成のための水性溶液が入っている第２の容器を含む、ワクチンキット。
【請求項６８】
請求項２０〜２２および５８〜６３いずれか１項記載の乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子の形態の安定化乾燥ワクチン組成物が入っている第１の容器およびワクチンの再構成のための水性溶液が入っている第２の容器を含む、ワクチンキット。
【請求項６９】
水性溶液がアジュバントを含む、請求項６８記載のワクチンキット。
【請求項７０】
乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子の形態の安定化乾燥アジュバント組成物が入っている第３の容器を含むことを特徴とする、請求項６８記載のワクチンキット。
【請求項７１】
抗原の安定な乾燥バルクを貯蔵する方法であって、抗原が請求項５０〜５７のいずれか１項記載の方法によって安定化され、得られた安定化ワクチン組成物が、直径２００μｍ〜１５００μｍの乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子の形態で貯蔵した後、バイアルまたは注射器に液体充填する前に、適当な溶媒で再構成されるものであり、処方されてもよいものである、方法。
【請求項７２】
アジュバントが水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムである、請求項４４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アジュバント含有ワクチン組成物の安定化方法、乾燥形態のアジュバント含有ワクチン組成物、および特にインフルエンザワクチン組成物の安定化方法、特に、乾燥形態のアジュバント含有インフルエンザワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１には、液体窒素のような冷凍媒体中で溶液の液滴を冷凍し、次いで、凍結乾燥させて凍結乾燥試薬含有微粒子、球状ビーズまたはリオスフィア（lyosphere）を得ることによる分析用試薬または免疫学的試薬をペレット化する方法が記載されている。特許文献２には、液滴よりも高密度の不活性液体冷凍媒体中にて液滴を冷凍し、液体冷凍媒体の表面から凍結粒子を取り外すことによる球状凍結粒子の製造方法が記載されている。特許文献３には、リオスフィア中のゴナドトロピンの安定化、かかるリオスフィアの製造方法およびこれを含む医薬製剤が記載されている。特許文献４（特許文献５）には、少なくとも１つが少なくとも０.２ｍｍの直径のリオスフィアまたは微粒子である、ワクチン成分を含有する１つ以上の凍結乾燥体が入っているワクチン容器を含むワクチンパックが記載されている。特許文献６（特許文献７）には、生成物の液滴を冷凍してペレットを形成し、該ペレットを凍結乾燥し、アッセイし、容器に入れる、凍結乾燥生成物を充填した容器の製造方法が記載されている。凍結粒子またはペレットを得るための他の技術は、食品産業における用途について知られている（例えば、特許文献８または特許文献９）。
【０００３】
凍結乾燥技術は、アジュバント含有ワクチンであってもアジュバント不含ワクチンであってもよい多くの生成物の安定性の向上を可能にする。例えば、特許文献１０には、凍結保護物質を含有していてもよいバッファー含有顕微鏡的生物材料懸濁液を保存する方法であって、該懸濁液を噴霧して微液滴とし、該微液滴を回転している低温面上で冷凍し、該微液滴を乾燥させることによる方法が記載されている。好ましくは、該液滴は直径が約２００μｍ以下である。
【０００４】
インフルエンザ抗原の凍結乾燥の研究をしている文献があり、詳細なレビューが入手可能である（非特許文献１）。特許文献１１には、本質的に、シュークロース含有水溶液中にウイルスを懸濁させ、該懸濁液を凍結乾燥させることによる、インフルエンザウイルスワクチンの安定化方法が記載されている。破傷風トキソイドおよびジフテリアトキソイドの安定化について検討している文献もある（例えば、非特許文献２を参照）。ごく最近、破傷風トキソイドを凍結乾燥させるための最適な製剤が提案された（非特許文献３）。
【０００５】
通常、凍結乾燥は、製薬工業では、バイアル、注射器または大型容器に充填する工程の後にくる最終工程である。この場合、乾燥製剤を使用前に再水和（本明細書における同義語：再構成または溶解）する必要がある。
【０００６】
マイクロペレットの形態での凍結乾燥は、単なる凍結乾燥だけの場合と同一の乾燥ワクチン製剤安定化を可能にするか、または貯蔵安定性を向上させる。さらにまた、マイクロペレット技術は、例えば、
乾燥製剤のブレンド後の充填（または連続充填）、
（貯蔵の場合に使用することができる）力価調整後の充填、
製剤間の相互作用（再水和後に唯一の製剤相互作用がある）の最小化、および
場合によっては安定性の向上
を可能にするので、現行の凍結乾燥と比べていくつかの利点をもたらす。
【０００７】
これらの理由のため、マイクロペレット技術の利点は、アジュバント含有ワクチンの乾燥のためのいくつかの方法を可能にする：
抗原をアジュバントと一緒に乾燥させること（同一相に存在する）：２つの成分（抗原およびアジュバント）を安定化することができ、全ての分子運動および化学反応が大きく妨げられるガラス状マトリックス中にそれらを捕捉することによってそれらの相互作用を安定化することができる。この固体状態により、貯蔵（高温であっても）の間じゅう、抗原の効力、アジュバントの物理的および免疫学的性質、ならびにこれら２つの成分の間の相互作用の性質および力を維持することができる。
抗原を乾燥させ、別にアジュバントを乾燥させ（抗原とアジュバントは別々の相に存在する）、次いで、これら２つの成分をブレンドした後に充填するかまたは連続充填すること。場合によっては、アジュバント単独の安定性は、＋５℃またはそれよりも高い温度もしくは低い温度での長期貯蔵について液体状態での問題であり得る（エマルションの化学的安定性、アルミニウムゲル、リポソームおよびその他のものの物理的安定性）。マイクロペレット技術は、抗原およびアジュバントの個別のマイクロペレットを生じさせることによりアジュバントワクチンの安定性の向上を可能にする。安定化製剤は、抗原およびアジュバントのそれぞれについて独立して最適化することができる。次いで、抗原およびアジュバントのマイクロペレットをバイアルに充填するか、またはブレンドした後にバイアルに充填することができる。分離した固体状態により、貯蔵（高温であっても）の間じゅう抗原とアジュバントの相互作用を回避することができ、抗原の効力ならびにアジュバントの物理的および免疫学的性質を維持することができる。このような形態において、バイアルの内容物は、抗原またはアジュバントのいずれか一方が液体状態である他の形態と比べて、または抗原およびアジュバントを同一ペレット内で乾燥させた場合と比べて、より安定であり得る。抗原とアジュバントの相互作用は、このように、注射用蒸留水、バッファーおよび安定化賦形剤を含み得る選択された希釈剤による乾燥コンビネーションの再水和後だけに生じるように標準化される。したがって、相互作用は、再水和とワクチン接種との間の短時間だけ制御すればよい。
【０００８】
したがって、２つの生成物の全体的な安定性（各生成物についての製剤の最適化であって、合わせた２つの生成物の妥協ではない）およびワクチン自体の安定性を向上させることができ、貯蔵後および充填前に２つの生成物のうち１つの力価を調整して、乾燥している２つの生成物の分離によって製造過程を促進することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第３,６５５,８３８号明細書
【特許文献２】欧州特許第００８１９１３号明細書
【特許文献３】国際公開第９４／２５００５号
【特許文献４】欧州特許第０７９９６１３号明細書
【特許文献５】米国特許第５,８９７,８５２号明細書
【特許文献６】国際公開第２００６／００８００６号
【特許文献７】米国特許出願公開第２００８／００６０２１３号明細書
【特許文献８】米国特許第５,０３６,６７３号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第２００７／０２８１０６７号明細書
【特許文献１０】欧州特許第０４７５４０９号明細書
【特許文献１１】米国特許第３,６７４,８６４号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Amorij et al. 2008: Development of stable Influenza vaccine powder formulations: challenges and possibilities. Pharmaceutical Research, Vol 25, 1256-1273
【非特許文献２】S.P. Schwendeman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 92, pp. 11234-11238, 1995
【非特許文献３】P. Matejtschuk et al. Biologicals 37 (2009) 1-7
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、アジュバント含有ワクチン組成物の安定化方法であって、安定剤を含む水性溶液によって抗原または抗原調製物を含む液体バルク組成物を希釈する工程、該希釈組成物を処理して直径約２００μｍ〜約１５００μｍの均一液滴を形成する工程、該均一液滴を冷凍媒体中で冷凍させて、冷凍均一球状マイクロペレットまたは粒子を形成する工程、および、この冷凍均一球状マイクロペレットまたは粒子を乾燥させて、直径約２００μｍ〜約１５００μｍの乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子を形成する工程を含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
（原文に記載なし）
【発明を実施するための形態】
【００１３】
好適なワクチン組成物は、例えば、完全ウイルスまたは抗原、例えば、インフルエンザ、ロタウイルス、サイトメガロウイルス、Ａ型およびＢ型肝炎、完全細菌または細菌蛋白質または多糖体抗原（結合型または非結合型）、例えば、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Haemophilus influenzae）、骨髄炎菌多糖体、破傷風、ジフテリア、細胞性および無細胞百日咳、ボツリヌス中毒、炭疽菌またはクロストリジウム・ディフィシル（C. Difficile）を含む組成物である。
【００１４】
液滴の冷凍は、例えば、希釈した組成物（すなわち、処方液体製剤）をプリル化して、非常に狭い粒度分布を有する直径２００μｍ〜１５００μｍの範囲に調整された液滴を生じさせることによって行われ得る。液体窒素の直接注入／噴霧によって、または、窒素、ＣＯ2もしくは空気のような非常に冷たい（Ｔ°＜−１１０℃）ガスを逆流させることによって、冷凍媒体によって温度が−１１０℃以下に維持されている低温チャンバー中にこれらの液滴を落とす。液滴は落ちる間に凍って、調整冷凍粒子を形成する。
【００１５】
超音波微粒化（Sindayihebura D., Dobre M., Bolle L., 1997 - Experimental study of thin liquid film ultrasonic atomization. ExHFT'97, Bruxelles.）のような調整液滴を得るための他の技術、そして、次いで、食品工業から知られている前記のような米国特許第５,０３６,６７３号に記載されているような特定の冷凍ドラムによって調整冷凍粒子を得るための他の技術が当該技術分野で知られている。
【００１６】
当該方法は、さらに、１種類以上のアジュバンを含有しており安定剤を含有していてもよい水性溶液を液体バルク抗原組成物に加えることを含むことができる。
【００１７】
別法として、本発明の方法は、さらに、安定剤を含む水性溶液によって１種類以上のアジュバントの別の液体バルク溶液またはエマルションを希釈する工程、この希釈されたアジュバント溶液またはエマルションを処理して直径約２００μｍ〜約１５００μｍの均一液滴を形成する工程、この均一液滴を冷凍媒体中で冷凍させて、冷凍均一球状マイクロペレットまたは粒子を形成する工程、冷凍均一球状マイクロペレットまたは粒子を乾燥させて、直径約２００μｍ〜約１５００μｍの乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子を形成する工程、および抗原含有乾燥均一球状マイクロペレットと一緒にブレンドしてバイアルまたは他の適当な容器に充填する工程を含む。
【００１８】
該液体バルク組成物は、それぞれが２種類以上の病原体または一の病原体の２種類以上の血清型由来の２種類以上の抗原または抗原調製物を含む乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子を得るために、さらに、それぞれが異なる病原体または一の病原体の異なる血清型由来である１種類以上のさらなる抗原または抗原調製物を含むことができる。
【００１９】
別法として、該液体バルク組成物は、それぞれが同一の病原体または一の病原体の同一の血清型に由来する抗原または抗原調製物を含む乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子を得るために、単一の病原体または一の病原体の単一の血清型由来の抗原または抗原調製物を含む。この場合、該方法は、所望により、さらに、各タイプのマイクロペレットまたは粒子が、お互いに異なる、同一の病原体由来または一の病原体の同一の血清型由来の抗原または抗原調製物を含むことを特徴とする、２種類以上のタイプの乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子を１回分ずつに分け、ブレンドしてバイアルまたは他の適当な容器に充填する工程を含むことができる。
【００２０】
本発明の方法は、さらに、乾燥が凍結乾燥法（すなわち、氷の昇華および結合水の脱着）によって行われることを特徴とすることができる。好適な乾燥方法はまた、大気凍結乾燥法、流動床乾燥法、真空回転ドラム乾燥法、撹拌式凍結乾燥法、振動式凍結乾燥法および超音波式凍結乾燥法である。
【００２１】
有利には、安定剤は、単糖、例えばマンノース、オリゴ糖、例えばシュークロース、ラクトース、トレハロース、マルトース、または糖アルコール、例えばソルビトール、マンニトールまたはイノシトール、またはこれらの安定剤のうちの２種類以上の成分の混合物、例えばシュークロースとトレハロースの混合物を含む。
【００２２】
有利には、炭水化物、糖アルコールおよび安定化賦形剤の濃度は、処方液体製剤中２％（ｗ／ｖ）からの溶解限界までの範囲である。一般に、炭水化物、糖アルコールおよび安定化賦形剤の濃度は、５％（ｗ／ｖ）〜４０％（ｗ／ｖ）、５％（ｗ／ｖ）〜２０％（ｗ／ｖ）、または２０％（ｗ／ｖ）〜４０％（ｗ／ｖ）の範囲である。例えば破傷風トキソイドまたはジフテリアトキソイドおよびアルミニウムゲル（ＡｌＯＯＨ）を含む処方液体製剤中のシュークロースとトレハロースとの１：１混合物の濃度の例は、それぞれ、１８.１％（ｗ／ｖ）および１７.５％（ｗ／ｖ）である。
【００２３】
本発明は、特に、インフルエンザワクチン組成物の安定化方法であって、季節性、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルス株由来のインフルエンザ抗原または抗原調製物を含む液体バルク組成物を、炭水化物および／または糖アルコールまたは２種類以上の異なる炭水化物および／または糖アルコールの混合物を含む水性溶液によって希釈して、得られた希釈組成物の炭水化物および／または糖アルコールの含有量を２％（ｗ／ｖ）から溶解限界までとする工程、希釈した組成物を処理して直径約２００μｍ〜約１５００μｍの均一液滴を形成する工程、この均一液滴を冷凍媒体中にて冷凍して、冷凍均一球状マイクロペレットまたは粒子を形成する工程、およびこの冷凍均一球状マイクロペレットまたは粒子を乾燥させて、直径約２００μｍ〜約１５００μｍの乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子を形成する工程を含む方法に関する。
【００２４】
季節性、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルス株由来のインフルエンザ抗原または抗原調製物を含む液体バルク組成物は、米国特許第６,０４８,５３７号（国際公開第９６／０５２９４号）に記載の方法によって得ることができる。
【００２５】
乾燥は、有利には、凍結乾燥法（すなわち、氷の昇華および結合水の脱着）によって行われる。冷凍マイクロペレットのさらなる好適な乾燥法は、噴霧式凍結乾燥法、流動床乾燥法、真空回転ドラム乾燥法、撹拌式凍結乾燥法、振動式凍結乾燥法および超音波式凍結乾燥法である。
【００２６】
有利には、炭水化物は、二糖、特に、シュークロースである。例えば、ラクトース、マルトースまたはトレハロースもまた好適な二糖類である。単糖類、例えばマンノース、または糖アルコール、例えばソルビトール、イノシトールまたはマンニトールもまたインフルエンザワクチン組成物を安定化するのに好適である。
【００２７】
有利には、炭水化物または糖アルコールの濃度は、処方液体製剤中、５％〜４０％（ｗ／ｖ）、別法としては、５％〜２０％（ｗ／ｖ）または２０％〜４０％の範囲である。例えば処方液体製剤中のシュークロースの濃度の例は、２％（ｗ／ｖ）、１０％（ｗ／ｖ）または１５.４％（ｗ／ｖ）である。
【００２８】
液体バルク組成物は、それぞれが２種類以上の季節性、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルス株由来の２種類以上のインフルエンザ抗原または抗原調製物を含む乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子を得るために、さらに、それぞれが異なる季節性、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルス株由来の１種類以上のさらなるインフルエンザ抗原または抗原調製物を含むことができる。この場合、当該方法は、所望により、さらに、乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子を１回分ずつに分け、バイアルまたは他の適当な容器に充填することを含む。
【００２９】
別法として、液体バルク組成物は、それぞれが同一の季節性、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルス株由来のインフルエンザ抗原または抗原調製物を含む乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子を得るために、１種類の季節性、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルス株由来の１種類以上のインフルエンザ抗原または抗原調製物を含む。この場合、当該方法は、所望により、さらに、それぞれのタイプのマイクロペレットが他のタイプと異なる季節性、プレパンデミックまたはパンデミックインフルエンザウイルス株由来のインフルエンザ抗原または抗原調製物を含むことを特徴とする、２種類以上のタイプの乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子を１回分ずつに分け、ブレンドしてバイアルまたは他の適当な容器に充填することを含んでいてもよい。
【００３０】
当該方法は、所望により、さらに、液体バルク抗原組成物に、１種類以上のアジュバントを含有しており所望により安定剤を含有していてもよい水性溶液を添加することを含む。
【００３１】
別法として、本発明の方法は、さらに、安定剤を含む水性溶液によって１種類以上のアジュバントの別の液体バルク溶液またはエマルションを希釈する工程、この希釈されたアジュバント溶液またはエマルションを処理して直径約２００μｍ〜約１５００μｍの均一液滴を形成する工程、該均一液滴を冷凍媒体中で冷凍して冷凍均一球状マイクロペレットまたは粒子を形成する工程、冷凍均一球状マイクロペレットまたは粒子を乾燥して、直径約２００μｍ〜約１５００μｍの乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子を形成する工程、および抗原含有乾燥均一球状マイクロペレットと一緒にブレンドしてバイアルまたは他の適当な容器に充填する工程を含む。
【００３２】
特に好適なアジュバントは、例えば、リポソーム、脂質または界面活性剤ミセルまたは他の脂質粒子、高分子ナノ粒子または微粒子、可溶性ポリマー、タンパク質粒子、鉱物ゲル、鉱物微粒子またはナノ粒子、ポリマー／アルミニウム・ナノハイブリッド、水中油型または油中水型エマルション、サポニン抽出物、細菌細胞壁抽出物、自然免疫受容体の刺激物質、特に、天然または合成ＴＬＲアゴニスト、天然または合成ＮＯＤアゴニストおよび天然または合成ＲＩＧアゴニストである。本発明の方法に適しているアジュバントは、例えば、国際公開第２００７／００６９３９号に記載されているものである。
【００３３】
インフルエンザウイルス株は、例えば、Ｈ５Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１およびＨ１Ｎ１である（Emergence of multiple genotypes of H5N1 avian influenza viruses in Hong Kong SAR: Y Guan et al., 8950-8955, PNAS - June 25, 2002 - vol 99 n 13；H9N2 Influenza A Viruses from Poultry in Asia have Human Virus-like Receptor Specificity: MN Matrosovich, S Krauss and R Webster, Virology 281, 156-162(2001)；Evolution and Ecology of Influenza A Viruses: R Webster et al., Microbiological ReviewsMar 1992, p. 152-179）。別法として、季節性インフルエンザウイルス株群から選択されるインフルエンザ株であり得る。
【００３４】
インフルエンザ抗原は、精製した完全インフルエンザウイルス、不活化インフルエンザウイルス、またはインフルエンザウイルスのサブユニット成分、またはスプリットインフルエンザウイルスからなる群から選択される形態のものであり得る。
【００３５】
該インフルエンザ抗原は、細胞培養物由来のものであってよい。別法として、インフルエンザ抗原は、胚性卵中で産生される。
【００３６】
本発明はまた、本発明の方法によって得られる直径約２００μｍ〜約１５００μｍの乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子の形態の、安定化乾燥ワクチン組成物、特に、安定化乾燥インフルエンザワクチン組成物、または他の抗原（例えば、不活化完全ウイルスまたはウイルスの抗原成分、インフルエンザ、ロタウイルス、サイトメガロウイルスおよびＡ型およびＢ型肝炎、および完全細菌または細菌タンパク質または多糖抗原（結合型または非結合型）、例えばヘモフィルス・インフルエンザエ、骨髄炎菌多糖体、破傷風、ジフテリア、細胞性および無細胞百日咳、ボツリヌス中毒、炭疽菌またはクロストリジウム・ディフィシル）を含む安定化乾燥ワクチン組成物に関する。
【００３７】
有利には、均一ビーズまたは粒子は各々、１種類のタイプだけの抗原、例えば、１種類のインフルエンザウイルス株だけに由来する１種類以上のタイプのインフルエンザ抗原、または例えば破傷風抗原だけもしくはジフテリア抗原だけを含む。別法として、均一ビーズまたは粒子は各々、１種類以上のタイプの抗原、例えば、１種類以上のインフルエンザウイルス株由来のインフルエンザ抗原、または例えば破傷風抗原およびジフテリア抗原を含む。
【００３８】
当該組成物は、さらに、別の乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子中に含有されていてもよいアジュバントを含むことができる。
【００３９】
本発明は、さらに、乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子の形態の安定化乾燥ワクチン組成物（例えば、上記の安定化乾燥インフルエンザワクチン組成物）の水性溶液中での再構成工程を含む、ワクチンの製造方法に関する。水性溶液は、アジュバントを含有していてもよい。
【００４０】
本発明は、さらに、乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子の形態の安定化乾燥ワクチン組成物（例えば、安定化乾燥インフルエンザワクチン組成物）が入っている第１の容器、およびワクチンの再構成のための水性溶液が入っている第２の容器を含む、ワクチンキットに関する。該キットは、さらに、アジュバントを含有する乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子が入っている容器を含むことができる。別法として、水性溶液は、アジュバントを含む。
【００４１】
本発明はまた、抗原の安定な乾燥バルクの貯蔵方法であって、上記方法によって抗原が安定化され、得られた安定化乾燥ワクチン組成物（例えば、インフルエンザ、ジフテリアまたは破傷風ワクチン組成物）が、直径約２００μｍ〜約１５００μｍの乾燥均一球状マイクロペレットまたは粒子の形態で貯蔵した後、バイアルまたは注射器に充填する前に、水性溶媒で再構成され、所望により処方されてもよい、方法に関する。
【００４２】
本発明のマイクロペレット形態の乾燥ワクチンの熱安定化方法を以下により詳しく説明する。
【００４３】
マイクロペレット技術により処理されるために、抗原のような生物学的物質を、プロセス全体を通して受けている物理的および化学的ストレスから保護するように処方する必要がある。
【００４４】
乾燥させようとする処方液体製剤は、得られた処方液体製剤が１ｍｌ当たりの目標量の安定化賦形剤および抗原を含有するように濃縮ワクチンバルク（抗原を含有する）ならびに少なくとも１種類の炭水化物および／または糖アルコールを含む安定化製剤を混合することによって得られる。炭水化物、糖アルコールおよび安定化賦形剤の濃度は、処方液体製剤中２％（ｗ／ｖ）から溶解限界までの範囲である。一例を挙げると、２０℃の水中のシュークロースの溶解限界濃度は約６６.７％（ｗ／ｖ）である。
【００４５】
図１は、一般的な製剤化および乾燥方法のフローチャートを示す。
図２に示されるプロセスは、乾燥マイクロペレットを得るために使用される。
【００４６】
層流噴流分解技術としても知られているプリル化は、生体触媒および生細胞固定化の分野で通常用いられる液体の調整液滴を得るための周知技術である（Hulst et al., 1985. A new technique for the production of immobilized biocatalyst and large quantities. Biotechnol. Bioeng. 27, 870-876；Gotoh et al., 1993. Mass production of biocatalyst-entrapping alginate gel particles by a forced oscillation method. Chem. Eng. Commun. 120, 73-84.；Seifert and Philips, 1997. Production of small, monodispersed alginate beads for cell immobilization. Biotechnol. Prog. 13, 562-568）。Lord Rayleighは、初めて、ニュートン流体について、ノズルから放出されるキャピラリー噴流の不安定さを分析し、そのモデルを提案した（Rayleigh L, 1978. On the stability of jets. Proc. London Math. Soc. 10, 4-13）。Weber（Weber C, 1931. Zum Zerfall eines Fluessigkeitsstrahles. Z. Angew. Math. Mech. 11, 136-154）は、粘性の効果を含む分析を拡大した。最も成長力が高い撹乱および噴流分解に最適な波長は
【数１】
0005689687.tif 000002
［式中、λoptは、噴流分解のための最適な波長であり、ｄjは、噴流の直径であり、ηは、流体の粘度であり、ρは、流体の密度であり、σは、流体の表面張力である］
によって示される。形成された液滴の直径ｄは、
【数２】
0005689687.tif 000003
によって算出することができる。
【００４７】
所望の結果を達するために該流体に施す回数ｆは、
【数３】
0005689687.tif 000004
によって噴流速度（したがって、流体の流速）ｕjおよび波長に関係づけられる。
【００４８】
したがって、最適条件は、既知のプロセスパラメーターおよび流体特性から算出することができる。しかしながら、均一液滴を形成するための回数および噴流速度は、ノズルの直径、流体の流動学および表面張力に依存してさまざまである（Meesters G., 1992. Mechanisms of droplet formation. Delft University Press, Delft, NL）。好適な操作回数は、液滴形成の安定性の肉眼による評価によって経験的に決定することもできる。標準的なプリル化装置は、液滴形成を観察するための光学ストロボスコープを装着している：所定の生成物および所定の操作条件について、このストロボスコープの光を用いて安定で穏やかな液滴が観察されるまで、手動で回数を調節することができる。
【００４９】
さらにまた、無菌プリル化用にマルチノズルシステムが開発された（Brandenberger H. et al.1998. A new multinozzle encapsulation/immobilization system to produce uniform beads of alginates. J. Biotechnol. 63, 73-80）。
【００５０】
結論として、操作回数は、利用可能な道具および製品の知識に依存して理論的かつ経験的に決定され得る。
【００５１】
プリル化プロセスは、粘稠液および糖飽和溶液に適用される。現在の供給者による最大許容粘度は約３００ｍＰａ.ｓである。したがって、製剤含有量は、非常に低い濃度から、室温または処理温度での選択された賦形剤の溶解限界までの範囲とすることができる。さらにまた、プロセス管およびノズル中の温度は、液滴形成前の糖または溶媒の結晶化を回避するように制御される必要がある。製剤化の技術分野における当業者は、賦形剤間の偶発的な相互作用を考慮して、非制御結晶化および所定の限界を超える粘度を回避するように生成物中の異なる賦形剤濃度を調整する。
【００５２】
処方液体製剤をプリル化して、非常に狭い粒度分布をもつ直径２００μｍ〜１５００μｍの範囲の調整液滴を得る。液体窒素の直接注入／噴霧によって、または窒素、ＣＯ2または空気のような非常に冷たい（Ｔ°＜−１１０℃）ガスを逆流させることによって、温度が−１１０℃以下に維持されている低温チャンバー中にこれらの液滴を落とす。液滴は落ちている間に凍結して、調整凍結粒子を形成する。液滴の凍結（すなわち、ペレットを固化する氷晶形成）のための落下する高さは、超冷却を制限することによって最低限にすることができる。超冷却は、液体窒素フォグもしくは液滴との接触（チャンバー内での液体窒素の直接注入）または微視的氷晶との接触（冷チャンバー内での水または過熱蒸気の直接噴霧）による液滴中でのシーディング氷核形成によって軽減することができる。
【００５３】
次いで、これら凍結粒子を回収し、−５０℃で前冷却したトレー上に移し、凍結乾燥器の前冷却した棚上に置いて（−５０℃）、凍結ペレットを常にそれらの低温濃縮相のガラス転移点Ｔｇ'（Ｔｇ'値は、−１０℃〜−４５℃の範囲であり得る）以下に保持し、粒子の融解または凝集を回避する。凍結乾燥器にかけるとすぐに、最新技術によって知られているように凍結乾燥チャンバーを減圧吸引してペレットの慣用の凍結乾燥（氷の昇華）を開始させる。以下の凍結乾燥パラメーターは、Ｔｇ'が−３０℃〜−４５℃の範囲である製剤に用いることができるものの一例である：
一次乾燥：  −３５℃の棚温度、５０マイクロバールの圧力で１０時間。
二次乾燥：  ２０℃の棚温度、５０マイクロバールの圧力で３時間。
【００５４】
凍結乾燥サイクルは、残留水分が優先的に３％よりも低くなるように設計されなければならない。しかしながら、乾燥抗原の安定性が水分を必要とするならば、場合によっては、含水量は、高い値で最適化され得る。
【００５５】
ペレットを乾燥させるために、大気凍結乾燥法、流動床乾燥法、真空回転ドラム乾燥法、撹拌式凍結乾燥法、振動式凍結乾燥法および超音波式凍結乾燥法のような他の乾燥技術を用いることができる。
【００５６】
次いで、乾燥ペレットを分析しようとするバルク中に回収し、貯蔵する。貯蔵条件は、乾燥していて砕けやすい吸湿性粒子に適している。分析前に乾燥試料を、注射用蒸留水、バッファー、安定化賦形剤およびアジュバントを含有していてもよい希釈剤で再水和する。溶解は瞬時である。
【００５７】
次いで、現在市販されている乾燥粉末充填技術を用いてバルク乾燥ペレットをバイアルに充填する。
【００５８】
また、抗原の安定化乾燥バルクの貯蔵の観点から、該ペレットは、適した溶媒で再構成され、必要に応じて、バイアルまたは注射器に液体充填する前に処方される。このようなペレットの安定性のおかげで、ストックパイルの貯蔵は、＋５℃以上で行うことができ、冷凍液状物質の場合（−２０℃以下）よりも便利である。最後に、乾燥バルク物質の貯蔵は、それらの最終容器中において充填した乾燥製剤の貯蔵空間よりも消費空間のほうが非常に狭い。
【００５９】
アジュバント含有ワクチンの場合、＋５℃の温度またはそれ以上の温度およびそれ以下（凍結）の温度での貯蔵の間の安定性は、しばしば、抗原およびアジュバントが同一液体状態にある場合に問題がある。例えば、動的光散乱によって測定されたオキシヒドロキシルアルミニウムゲルに対する−２０℃での冷凍−解凍サイクルの影響を下記表に示す。
【００６０】
0005689687.tif 000005
【００６１】
マイクロペレット技術は、場合によっては、選択されるべき３種類のストラテジーをもって安定性の問題を克服することができる：
【００６２】
１．マイクロペレット形態下で抗原だけを乾燥させ、アジュバント（アルミニウムゲル、エマルションなど）と一緒に希釈剤に溶解させること。このストラテジーは、抗原安定性がマイクロペレット形態下で増大する場合およびアジュバントだけが非常に熱安定である場合に適している。
→  保存期間の間の相互作用はない。
→  独立して貯蔵した場合に各相の安定性が増大する。
→  液体アジュバントと一緒に乾燥抗原を即時溶解させることによって吸着行動が安定する。
【００６３】
２．抗原をアジュバントと一緒に乾燥させて、同一ペレット内で両者を安定化し、全ての分子運動および化学反応が非常に妨げられるガラス状マトリックス中にそれらを捕捉することによってそれらの相互作用を安定化させる。この固体状態は、貯蔵（高温であっても）の間じゅう、抗原の効力、アジュバントの物理的および免疫学的性質、ならびに抗原とアジュバントの相互作用の性質および力を維持することができる。
【００６４】
３．抗原を乾燥させ、別個にアジュバントを乾燥させ、次いで、抗原およびアジュバントをブレンドした後に充填するか、または連続充填する。場合によっては、アジュバント単独の安定性は、＋５℃以上の温度での長期貯蔵について液体状態での問題であり得る（エマルションの化学的安定性、アルミニウムゲル、リポソームおよびその他のものの物理的安定性）。マイクロペレット技術は、抗原およびアジュバントの個別のマイクロペレットを生じさせることよってアジュバント含有ワクチンの安定性の向上を可能にする。安定化製剤は、抗原およびアジュバントのそれぞれについて独立して最適化することができる。次いで、抗原およびアジュバントのマイクロペレットをバイアルに充填することができる。分離した固体状態により、貯蔵（高温であっても）の間じゅう、抗原とアジュバントの相互作用を回避することができ、抗原の効力ならびにアジュバントの物理的および免疫学的性質を維持することができる。このような形態において、バイアルの内容物は、抗原またはアジュバントのいずれか一方が液体状態である他の形態と比べて、または抗原およびアジュバントを同一ペレット内で乾燥させた場合と比べて、より安定であり得る。抗原とアジュバントの相互作用は、このように、注射用蒸留水、バッファーおよび安定化賦形剤を含み得る選択された希釈剤による乾燥コンビネーションの再水和後だけに生じるように標準化される。したがって、相互作用は、再水和とワクチン接種との間の短時間だけに存在する（早い相互作用および非常に短い熟成時間）。したがって、２つの生成物の全体的な安定性（各生成物についての製剤の最適化であって、合わせた２つの生成物の妥協ではない）およびワクチン自体の安定性を向上させることができ、貯蔵後および充填前に２つの生成物のうち１つの力価を調整して、乾燥している２つの生成物の分離によって製造過程を促進することができる。
【００６５】
マイクロペレット技術によって処理するために、抗原およびアジュバントのような生物学的物質を、プロセス全体を通して受けている物理的ストレスおよび化学的ストレスから保護するように処方することが必要である。
【００６６】
アジュバントの場合、安定化製剤は、処理（製剤化、ペレット化、乾燥、貯蔵、充填および再水和）の間、それらの質を維持しなければならない。
【００６７】
該ストラテジーが抗原およびアジュバントの両方を同一のマイクロペレット中で乾燥させることである場合、乾燥させようとする処方液体製剤は、得られた処方液体製剤が１ｍｌ当たりの目標量の安定化賦形剤および抗原を含有するように濃縮ワクチンバルク（抗原を含有する）、濃縮アジュバントバルク、ならびに少なくとも１種類の炭水化物および／または糖アルコールを含む安定化製剤を混合することによって得られる。安定化賦形剤の濃度は、処方液体製剤中２％（ｗ／ｖ）から溶解限界までの範囲である。
【００６８】
図３は、アジュバントを含む製剤化および乾燥方法を示すフローチャートである。
【００６９】
ストラテジーが抗原およびアジュバントを別々のマイクロペレット中で乾燥させることである場合、乾燥させようとする処方液体製剤（抗原を含有する）は、得られた処方液体製剤が１ｍｌ当たりの目標量の安定化賦形剤および抗原を含有するように濃縮ワクチンバルク（抗原を含有する）および安定化製剤を混合することによって得られる。炭水化物および安定化賦形剤の濃度は、処方液体製剤中２％（ｗ／ｖ）から溶解限界までの範囲である。
【００７０】
同様に、アジュバントについて、乾燥させようとする処方液体製剤は、得られた処方液体製剤が１ｍｌ当たりの目標量の安定化賦形剤およびアジュバントを含有するように濃縮アジュバントバルクおよび安定化賦形剤を混合することによって得られる。炭水化物および安定化賦形剤の濃度範囲は、処方液体製剤中２％（ｗ／ｖ）から溶解限界までの範囲である。
【００７１】
図４は、抗原含有マイクロペレットを生成するための製剤化および乾燥方法を示すフローチャートであり、図５は、アジュバント含有マイクロペレットを生成するための製剤化および乾燥方法を示すフローチャートである。図６は、乾燥ワクチンを完全にするための異なるマイクロペレットの組み合わせを示す。
【００７２】
一般的な乾燥マイクロペレットの生成方法は図２に示されている。アジュバント含有ワクチンについて選択されたストラテジーから独立して適用可能である。
【００７３】
マイクロペレット技術の高速凍結速度は、また、アジュバントを乾燥させるのに適している。例えば、図９のグラフは、炭水化物の存在下でマイクロペレット技術を用いるリン酸アルミニウムゲルの乾燥後の粒度分布結果を示す。乾燥および再水和がアジュバント粒子の粒度分布に対して有意な負の効果を及ぼさないことを示すことができる。
【００７４】
考えられ得る好適なアジュバントの例は、以下のとおりである：
【００７５】
１）微粒子状アジュバント：例えば、リポソームおよび特にカチオン性リポソーム（例えば、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、例えば、米国出願公開第２００６／０１６５７１７号を参照、ＤＯＴＡＰ、ＤＤＡＢおよび１,２−ジアルカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（エチルＰＣ）リポソーム、例えば、米国特許第７,３４４,７２０号を参照）、脂質または界面活性剤ミセルまたは他の脂質粒子（例えば、CSLからのＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ、またはIsconovaからのビロソームおよびプロテオコキレート）、ポリマーナノ粒子または微粒子（例えば、ＰＬＧＡおよびＰＬＡナノ粒子または微粒子、ＰＣＰＰ粒子、アルギネート／キトサン粒子）または可溶性ポリマー（例えば、ＰＣＰＰ、キトサン）、タンパク質粒子、例えば、髄膜炎菌プロテオソーム、鉱物ゲル（標準アルミニウムアジュバント：ＡｌＯＯＨ、ＡｌＰＯ4）、微粒子またはナノ粒子（例えば、Ｃａ3(ＰＯ4)2）、ポリマー／アルミニウム・ナノハイブリッド（例えば、ＰＭＡＡ−ＰＥＧ／ＡｌＯＯＨおよびＰＭＡＡ−ＰＥＧ／ＡｌＰＯ4・ナノ粒子）Ｏ／Ｗエマルション（例えば、NovartisからのＭＦ５９、GlaxoSmithKline BiologicalsからのＡＳ０３）およびＷ／Ｏエマルション（例えば、Seppicからの、または国際公開第２００８／００９３０９号に記載されている、ＩＳＡ５１およびＩＳＡ７２０）。例えば、本発明の方法に適しているアジュバントエマルションは、国際公開第２００７／００６９３９号に記載されているものである。
【００７６】
２）天然抽出物：例えば、サポニン抽出物ＱＳ２１およびその半合成誘導体、例えば、Avantogenによって開発されたもの、細菌細胞壁抽出物（例えば、Corixa／GSKによって開発されたミコバクテリア細胞壁骨格、ならびにミコバクテリア・コードファクターおよびその合成誘導体、トレハロースジミコレート）。
【００７７】
３）自然免疫受容体の刺激物質：例えば、天然または合成ＴＬＲアゴニスト（例えば、ＴＬＲ２／１またはＴＬＲ２／６ヘテロ二量体を刺激する合成リポペプチド、ＴＬＲ３を刺激する二本鎖ＲＮＡ、ＴＬＲ４を刺激するＬＰＳおよびその誘導体ＭＰＬ、ＴＬＲ４を刺激するＥ６０２０およびＲＣ−５２９、ＴＬＲ５を刺激するフラゲリン、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８を刺激する一本鎖ＲＮＡおよび３Ｍ合成イミダゾキノリン、ＴＬＲ９を刺激するＣｐＧ  ＤＮＡ、天然または合成ＮＯＤアゴニスト（例えば、ムラミルジペプチド）、天然または合成ＲＩＧアゴニスト（例えば、ウイルス核酸および特に３'リン酸ＲＮＡ）。
【００７８】
これらのアジュバントは、組み合わせて用いることもできる。好ましい組み合わせは、微粒子状アジュバントと天然抽出物との組み合わせ、および微粒子状アジュバントと自然免疫受容体の刺激物質との組み合わせである。
【００７９】
以下の実施例について、マイクロペレットを生成するために、Inotech（スイス）からのプリル化装置ＩＥ−５０Ｒ  Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈおよび３００μｍノズルヘッドを用いた。
【実施例】
【００８０】
実施例１：  Ｆｌｕ抗原を含有するマイクロペレット形態下の熱安定性乾燥ワクチンの製造
この研究では、現行の液体三価ｆｌｕワクチンの熱安定性を、マイクロペレット技術で処理したこの同ワクチンの乾燥製剤と比較した。三価ｆｌｕワクチンは、ワクチン用バッファー中に各々３０μｇ／ｍｌのＡ／Ｓａｌｏｍｏｎ、Ｂ／ＭａｌａｙｓｉａおよびＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ株を含有する。三価ｆｌｕワクチン１容量と、濃度が４％（ｗ／ｖ）から溶解限界までの範囲の少なくとも１種類の炭水化物を含む安定化製剤１容量を混合することによって、乾燥させるべき処方液体製剤を得た。これは、乾燥させるべき処方液体製剤中２％〜３２％（重量対容量）の濃度範囲に相当する。組成が表１および２に示されている２つの製剤ＳＧ１およびＳＧ２を評価した：
【００８１】
【表１】
0005689687.tif 000006
【００８２】
【表２】
0005689687.tif 000007
【００８３】
図７は、製剤化および乾燥方法のフローチャートを示す。
図２は、製剤ＳＧ１およびＳＧ２の乾燥マイクロペレットを生成するのに用いたプロセスを示す。
【００８４】
処方液体製剤ＳＧ１およびＳＧ２をプリル化して、調整液滴を得た。この製剤のプリル化パラメーターおよび３００μｍノズルヘッドは以下のとおりであった：
生成物の流速：  ８ｍｌ／分
ノズル振動数：  ９５４Ｈｚ
【００８５】
液体窒素の直接注入または非常に冷たいガス（ｔ°＜−１１０℃）の逆流によって温度を−１１０℃以下に維持した低温チャンバー中にこれらの液滴を落とした。液滴は落下の間に凍結し、調整凍結粒子を形成した。
【００８６】
次いで、これらの凍結粒子を−５０℃で前冷却したトレー上に移し、凍結乾燥器の前冷却した棚上に置いて（−５０℃）、冷凍ペレットを常にガラス転移（−３０℃〜−４０℃）以下に維持し、粒子の融解または凝集を回避した。凍結乾燥器にかけるとすぐに、最新技術によって知られているように凍結乾燥チャンバーを減圧吸引してペレットの慣用の凍結乾燥（氷の昇華）を開始させた。これらの製剤について、以下の凍結乾燥パラメーターを使用した：一次乾燥：−３５℃の棚温度、５０マイクロバールの圧力で１０時間。二次乾燥：２０℃の棚温度、５０マイクロバールの圧力で３時間。マイクロペレットの残存水分は、ＳＧ１製剤およびＳＧ２製剤ともに２％以下であった。
【００８７】
図８は、このペレット化および乾燥技術を用いて得られた非常に狭い粒度分布を提示する。
【００８８】
したがって、３つの製剤が熱安定性研究に利用可能であった：市販の三価ｆｌｕワクチン（ＶＡＸＩＧＲＩＰ（登録商標）、Sanofi Pasteur）、乾燥マイクロペレットＳＧ１製剤（三価ｆｌｕワクチン）および乾燥マイクロペレットＳＧ２製剤（三価ｆｌｕワクチン）。
【００８９】
これら３つの製剤の各試料を３７℃および４５℃で様々な時間暴露した。次いで、各試料の効力（１ｍｌ当たりの抗原のμｇ）をＳＲＤ（ＳＲＩＤ）法（M. S. Williams, Veterinary Microbiology, 37 (1993) 253-262）によって測定した。分析前に注射用蒸留水を用いて乾燥試料を再水和した。溶解は瞬時であった。得られた結果を表３、４および５にまとめて示す。結果は、１ｍｌ当たりの抗原の平均値μｇで表す。
【００９０】
【表３】
0005689687.tif 000008
【００９１】
【表４】
0005689687.tif 000009
【００９２】
【表５】
0005689687.tif 000010
【００９３】
これらの結果は、マイクロペレット形態の乾燥製剤ＳＧ１およびＳＧ２が現行の液体製剤よりも格段に安定であることを示している。３７℃で３ヶ月後まで、４５℃で１週間後までは有意な抗原性損失は測定されなかった。
【００９４】
実施例２：  オキシ水酸化アルミニウムゲルアジュバント含有Ｆｌｕ  Ｈ５Ｎ１（Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ）を含有するマイクロペレット形態下の熱安定性乾燥ワクチンの製造
この研究では、液体Ｈ５Ｎ１  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ  ｆｌｕワクチンの熱安定性を、本発明のマイクロペレット技術で処理されたこの同ワクチンの乾燥製剤と比較した。
【００９５】
ワクチンは、ワクチンバッファー中に６５.４μｇ／ｍｌのＨ５Ｎ１  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ株を含有しており、オキシ水酸化アルミニウムゲルアジュバントを含有している。
【００９６】
Ｈ５Ｎ１ワクチン１容量と安定化製剤ＳＧ１（ＳＧ１組成物については実施例１を参照）１容量とを混合することによって、乾燥させるべき処方液体製剤を得た。
【００９７】
図１０は、製剤化および乾燥方法のフローチャートを示す。
【００９８】
処方液体製剤ＳＧ１をプリル化して、調整液滴を得た。この製剤のプリル化パラメーターおよび３００μｍノズルヘッドは以下のとおりであった：
生成物の流速：  ８ｍｌ／分
ノズル振動数：  ９１６Ｈｚ
【００９９】
液体窒素の直接注入または非常に冷たいガス（ｔ°＜−１１０℃）の逆流によって温度を−１１０℃以下に維持した低温チャンバー中にこれらの液滴を落とした。液滴は落下の間に凍結し、調整凍結粒子を形成した。
【０１００】
次いで、これらの凍結粒子を−５０℃で前冷却したトレー上に移し、凍結乾燥器の前冷却した棚上に置いて（−５０℃）、冷凍ペレットを常にガラス転移（−３０℃〜−４０℃）以下に維持し、粒子の融解または凝集を回避した。凍結乾燥器にかけるとすぐに、最新技術によって知られているように凍結乾燥チャンバーを減圧吸引してペレットの慣用の凍結乾燥を開始させた。これらの製剤について、以下の凍結乾燥パラメーターを使用した：一次乾燥：−３５℃の棚温度、５０マイクロバールの圧力で１０時間。二次乾燥：２０℃の棚温度、５０マイクロバールの圧力で３時間。マイクロペレットの残存水分は、２％以下であった。
【０１０１】
マイクロペレット試料を３７℃および４５℃で７日間暴露した。次いで、各試料の効力（１ｍｌ当たりの抗原のμｇ）をＳＲＤ法によって測定した。分析前に注射用蒸留水を用いて乾燥試料を再水和した。溶解は瞬時であった。得られた結果を表６にまとめて示す。結果は、１ｍｌ当たりの抗原の平均値μｇで表す；N.D.は、「抗原性が検出不能である」ことを表す。
【０１０２】
【表６】
0005689687.tif 000011
【０１０３】
これらの結果は、マイクロペレット形態の乾燥製剤ＳＧ１が現行の液体製剤よりも格段に安定であることを示している。３７℃および４５℃で１週間後には有意な抗原性損失は測定されなかった。５５℃で１週間後には、アッセイ自体の精度に近い約１５％の損失が観察された。
【０１０４】
粒度分析器Ｍａｌｖｅｒｎ  ＭａｓｔｅｒＳｉｚｅｒ  ２０００を用いて、ペレットの乾燥前および溶解後に処方バルク中のオキシ水酸化アルミニウム粒度分布を測定することによって、アジュバント特性に対するこの乾燥方法およびペレットの再水和の影響を評価した。結果を図１１に示す。この方法はゲルの凝集を引き起こさなかったことが観察された。
【０１０５】
図１２はまた、３７℃、４５℃および５５℃で少なくとも７日間の熱安定性インキュベーションの後にゲルの粒度が維持されることを示しており、マイクロペレット形態でのアルミニウムゲルアジュバントの安定性を示している。
【０１０６】
この実施例によって、アルミニウムゲルアジュバント含有Ｆｌｕ抗原への本技術の適用性、および最も一般的には、マイクロペレット技術を用いてアルミニウムゲルアジュバント含有抗原を乾燥させることができる可能性が確認される。
【０１０７】
実施例３：  アジュバント不含Ｆｌｕ  Ｈ５Ｎ１（Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ）を含有するマイクロペレット形態下の熱安定性乾燥ワクチンの製造およびアジュバントエマルションによる再水和
この研究では、液体Ｈ５Ｎ１  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ  ｆｌｕワクチンの熱安定性を、マイクロペレット技術で処理したこの同ワクチンの乾燥製剤と比較した。
【０１０８】
ワクチンは、ワクチンバッファー中に１７６μｇ／ｍｌのＨ５Ｎ１  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ株を含有している。
【０１０９】
所望の抗原濃度および安定剤含有量を目標としてＨ５Ｎ１ワクチンと安定化製剤ＳＧ１とを混合することによって乾燥させるべき処方液体製剤を得た。製剤ＳＧ１（ＳＧ１組成物については実施例１を参照）を評価した。
【０１１０】
図１３は、製剤化および乾燥方法のフローチャートを示す。
【０１１１】
処方液体製剤をプリル化して、調整液滴を得た。この製剤のプリル化パラメーターおよび３００μｍノズルヘッドは以下のとおりであった：
生成物の流速：  ８ｍｌ／分
ノズル振動数：  ９９７Ｈｚ
【０１１２】
液体窒素の直接注入または非常に冷たいガス（ｔ°＜−１１０℃）の逆流によって温度を−１１０℃以下に維持した低温チャンバー中にこれらの液滴を落とした。液滴は落下の間に凍結し、調整凍結粒子を形成した。
【０１１３】
次いで、これらの凍結粒子を−５０℃で前冷却したトレー上に移し、凍結乾燥器の前冷却した棚上に置いて（−５０℃）、冷凍ペレットを常にガラス転移（−３０℃〜−４０℃）以下に維持し、粒子の融解または凝集を回避した。凍結乾燥器にかけるとすぐに、最新技術によって知られているように凍結乾燥チャンバーを減圧吸引してペレットの慣用の凍結乾燥を開始させた。これらの製剤について、以下の凍結乾燥パラメーターを使用した：一次乾燥：−３５℃の棚温度、５０マイクロバールの圧力で１０時間。二次乾燥：２０℃の棚温度、５０マイクロバールの圧力で３時間。マイクロペレットの残存水分は、２％以下であった。
【０１１４】
並行して、同処方製剤を得、バイアル中に充填し、標準的な凍結乾燥器中で凍結乾燥させた。充填したバイアルを５℃で前冷却した棚の上に置いた；次いで、該製剤を、１℃／分で−５０℃に冷凍し、減圧吸引して昇華を開始させた。一次乾燥パラメーターは、−１８℃の棚温度、５０マイクロバールの圧力で１６時間であった。二次乾燥パラメーターは、３７℃の棚温度、５０マイクロバールの圧力で２時間であった。
【０１１５】
凍結乾燥製剤の残存水分は、２％以下であった。
【０１１６】
マイクロペレットおよび液体試料を３７℃、４５℃および５５℃で様々な時間暴露した。凍結乾燥試料は、３７℃および５５℃で暴露した。次いで、各試料の効力（１ｍｌ当たりの抗原のμｇ）をＳＲＤ法によって測定した。分析前に注射用蒸留水（ＷＦＩ）を用いて乾燥試料を再水和した。溶解は瞬時であった。標準的な液体製剤、乾燥マイクロペレットおよび凍結乾燥製剤について得られた結果をそれぞれ表７、８および９にまとめて示す。結果は、１ｍｌ当たりの抗原の平均値μｇで表す。Ｔｏでの初期ＳＲＤ力価は、処理後のマイクロペレットの再構成後に測定した力価に相当する。
【０１１７】
【表７】
0005689687.tif 000012
【０１１８】
【表８】
0005689687.tif 000013
【０１１９】
【表９】
0005689687.tif 000014
【０１２０】
これらの結果は、マイクロペレット形態の乾燥製剤ＳＧ１が現行の液体製剤よりも格段に安定であることを示している。３７℃、４５℃および５５℃で３ヶ月後には有意な抗原性損失は測定されなかった。表９に示された結果から、標準的な凍結乾燥も良好な熱安定性を提供することが確認される。
【０１２１】
さらにまた、表１０に示されるデータは、＋５℃で９ヶ月後には抗原性損失が測定されなかったことを示している。これらの結果から、＋５℃および室温で数年間の長期安定性が期待できる。
【０１２２】
Ｈ５Ｎ１マイクロペレットをエマルションで再水和することができる可能性を研究した。この研究に使用したエマルションは、国際公開第２００７／００６９３９号に記載されているものである。表８と同様の実験計画を実行したが、試料は、注射用蒸留水ではなく該エマルションで再水和した。結果を表１０および１１に示す。
【０１２３】
【表１０】
0005689687.tif 000015
【０１２４】
【表１１】
0005689687.tif 000016
【０１２５】
表１０は、アジュバントとしてのエマルションによるマイクロペレットの溶解は、抗原の安定性に影響を及ぼさず、したがって、その復元に影響を及ぼさないことを立証している。表１１から、測定した全ての力価を注射用蒸留水により溶解した後に測定した力価と比較した場合、このことがマイクロペレットの熱安定性インキュベーション後にも証明されていることが確認される。
【０１２６】
図１４は、これらのマイクロペレットの再水和前および溶解後のエマルションの粒度の比較を示す。２つの粒度分布を重ね合わせることによって、エマルションの粒度、および、したがって、その完全性が凍結乾燥マトリックスの再水和によって有意に変わらないことが確認される。粒度分布は、単峰性のままであり、１００ｎｍを中心としていた。さらにまた、図１５から、マイクロペレットの溶解後および室温で１時間の貯蔵期間の間のエマルションの粒度の安定性が確認される。
【０１２７】
この研究によって、マイクロペレット技術のおかげで、溶解バッファーとしてアジュバントを使用することができ、製剤の保存期間の間のアジュバントと抗原の間の全ての相互作用を回避することができることが確認される。
【０１２８】
実施例４ａ：  安定剤として各種の糖を用いるアジュバント不含Ｆｌｕ  Ｈ５Ｎ１（Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ）を含有するマイクロペレット形態下の熱安定性乾燥ワクチンの製造
この研究は、それぞれ異なる二糖（トレハロース、ラクトースおよびマルトース）を含む３種類の安定化乾燥インフルエンザワクチン組成物の調製およびマイクロペレット技術で処理されたかかる乾燥組成物の熱安定性
ワクチンは、ワクチンバッファー中１３１μｇ／ｍｌのＨ５Ｎ１  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ株を含有する。
【０１２９】
所望の抗原濃度および安定剤含有量を目標としてＨ５Ｎ１ワクチンとそれぞれ安定化製剤ＳＧ５、ＳＧ６およびＳＧ７とを混合することによって乾燥させるべき処方液体製剤を得た（表１２ａ、１２ｂおよび１２ｃを参照）。
【０１３０】
【表１２−ａ】
0005689687.tif 000017
【０１３１】
【表１２−ｂ】
0005689687.tif 000018
【０１３２】
【表１２−ｃ】
0005689687.tif 000019
【０１３３】
図１３は、一例としてＳＧ１安定剤を用いる製剤化および乾燥方法のフローチャートを示す。ＳＧ５、ＳＧ６およびＳＧ７について同一のフローチャートを用いて、プリル化前の処方製剤中１５.４％（ｗ／ｖ）の二糖の濃度が得られた。
【０１３４】
３つの処方液体製剤の各々をプリル化して、調整液滴を得た。この製剤のプリル化パラメーターおよび３００μｍノズルヘッドは以下のとおりであった：
生成物の流速：  ８ｍｌ／分
ノズル振動数：  製剤に依存して９９４Ｈｚ〜１００１Ｈｚの範囲
【０１３５】
液体窒素の直接注入または非常に冷たいガス（ｔ°＜−１１０℃）の逆流によって温度を−１１０℃以下に維持した低温チャンバー中にこれらの液滴を落とした。液滴は落下の間に凍結し、調整凍結粒子を形成した。
【０１３６】
次いで、これらの凍結粒子を−５０℃で前冷却したトレー上に移し、凍結乾燥器の前冷却した棚上に置いて（−５０℃）、冷凍ペレットを常にガラス転移（−３０℃〜−４０℃）以下に維持し、粒子の融解または凝集を回避した。凍結乾燥器にかけるとすぐに、最新技術によって知られているように凍結乾燥チャンバーを減圧吸引してペレットの慣用の凍結乾燥を開始させた。これらの製剤について、以下の凍結乾燥パラメーターを使用した：一次乾燥：−３５℃の棚温度、５０マイクロバールの圧力で１０時間。二次乾燥：２０℃の棚温度、５０マイクロバールの圧力で３時間。マイクロペレットの残存水分は、２％以下であった。
【０１３７】
マイクロペレット試料を３７℃および５５℃で様々な時間暴露した。次いで、各試料の効力（１ｍｌ当たりの抗原のμｇ）をＳＲＤ法によって測定した。分析前に注射用蒸留水（ＷＦＩ）を用いて乾燥試料を再水和した。溶解は瞬時であった。乾燥マイクロペレットの形態の３つの組成物の各々について得られた熱安定性結果をそれぞれ表１２ｄ、１２ｅおよび１２ｆにまとめて示す。結果は、１ｍｌ当たりの抗原の平均値μｇで表す。Ｔｏでの初期ＳＲＤ力価は、処理後のマイクロペレットの再構成後に測定した力価に相当する。
【０１３８】
【表１２−ｄ】
0005689687.tif 000020
【０１３９】
【表１２−ｅ】
0005689687.tif 000021
【０１４０】
【表１２−ｆ】
0005689687.tif 000022
【０１４１】
これらの結果から、安定剤として使用した様々な糖賦形剤について同様の安定性プロファイルが確認される。
【０１４２】
実施例４ｂ：  処理しようとしている処方バルク中で２％（ｗ／ｖ）シュークロースと一緒にアジュバント不含Ｆｌｕ  Ｈ５Ｎ１（Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ）を含有するマイクロペレット形態下の熱安定性乾燥ワクチンの製造
ワクチンは、ワクチンバッファー中１７６μｇ／ｍｌのＨ５Ｎ１  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ株を含有する。
【０１４３】
所望の抗原濃度および２％（ｗ／ｖ）の安定剤含有量を目標としてＨ５Ｎ１ワクチンと安定化製剤ＳＧ８とを混合することによって乾燥させるべき処方液体製剤を得た。表１２ｇは、安定化製剤ＳＧ８の組成を示す。
【０１４４】
【表１２−ｇ】
0005689687.tif 000023
【０１４５】
実施例４ａの記載に従って、２％ｗ／ｖシュークロースを含有する処方液体バルク（ＳＧ８を用いて処方した液体バルク）から製造したマイクロペレットを得た。図１６は、製剤化および乾燥方法のフローチャートを示す。
【０１４６】
マイクロペレット試料を３７℃および５５℃で様々な時間暴露した。次いで、各試料の効力（１ｍｌ当たりの抗原のμｇ）をＳＲＤ法によって測定した。分析前に注射用蒸留水（ＷＦＩ）を用いて乾燥試料を再水和した。溶解は瞬時であった。表１２ｈは、乾燥マイクロペレットについて得られた結果を示す。結果は、１ｍｌ当たりの抗原の平均値μｇで表す。Ｔｏでの初期ＳＲＤ力価は、処理直後のマイクロペレットの再構成後に測定した力価に相当する。
【０１４７】
【表１２−ｈ】
0005689687.tif 000024
【０１４８】
実施例５：  アジュバント含有ジフテリアトキソイド（Ｄｔ）ワクチンおよび破傷風トキソイド（Ｔｔ）ワクチンについてのマイクロペレット処理の影響の研究
この研究の第一部では、アルミニウムゲルＡＬＯＯＨに前吸着しているかまたはしていないマイクロペレット形態で凍結乾燥した破傷風ＴｔおよびＤｔ抗原の安定性を評価した。以下に記載のとおり、５つの製剤を調製した。
【０１４９】
ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイド濃縮バルクの所定の容量をアルミニアムゲルおよび安定剤と混合することによって、アルミニウムゲルの存在下でジフテリアＤｔまたは破傷風Ｔｔを含有する乾燥させるべき処方液体製剤を得、以下の組成物を得た：
Ｄｔ（ジフテリアトキソイド）処方製剤：抗原２００Ｌｆ／ｍｌおよびアルミニウムゲル０.８ｍｇ／ｍｌ
Ｔｔ（破傷風トキソイド）処方製剤：抗原４０Ｌｆ／ｍｌおよびアルミニウムゲル０.８ｍｇ／ｍｌ
【０１５０】
図１７は、これら２つの製剤の製剤化および乾燥方法のフローチャートを示す。
【０１５１】
ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイド濃縮バルクの所定の容量を安定剤と混合することによって、ジフテリアＤｔまたは破傷風Ｔｔを含有するがアルミニウムゲルを含有しない乾燥させるべき処方液体製剤を得、以下の組成物を得た：
Ｄｔ（ジフテリアトキソイド）処方製剤：抗原５００Ｌｆ／ｍｌ
Ｔｔ（破傷風トキソイド）処方製剤：抗原１００Ｌｆ／ｍｌ
【０１５２】
図１８は、これら２つの製剤の製剤化および乾燥方法のフローチャートを示す。
【０１５３】
最新技術によって行われるように、ロケット免疫電気泳動試験を用いてジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドに関する抗原含有量を測定した。
【０１５４】
アルミニウムゲルの所定の容量を安定剤と混合することによってアルミニウムゲルだけを含有する乾燥させるべき処方液体製剤を得、以下の組成物を得た：
アルミニウムゲルＡＬＯＯＨ処方製剤：２.４ｍｇ／ｍｌ
【０１５５】
図１９は、この製剤の製剤化および乾燥方法のフローチャートを示す。
【０１５６】
この実験に使用した安定剤の組成物（ＳＤＴ−１と称する）を下記の表に示す：
【０１５７】
【表１３】
0005689687.tif 000025
【０１５８】
処方液体製剤をプリル化して、調整液滴を得た。これらの製剤のプリル化パラメーターおよび３００μｍノズルヘッドは以下のとおりであった：
【０１５９】
【表１４】
0005689687.tif 000026
【０１６０】
液体窒素の直接注入または非常に冷たいガス（ｔ°＜−１１０℃）の逆流によって温度を−１１０℃以下に維持した低温チャンバー中にこれらの液滴を落とした。液滴は落下の間に凍結し、調整凍結粒子を形成した。
【０１６１】
次いで、これらの凍結粒子を−５０℃で前冷却したトレー上に移し、凍結乾燥器の前冷却した棚上に置いて（−５０℃）、冷凍ペレットを常にガラス転移（−３０℃〜−４０℃）以下に維持し、粒子の融解または凝集を回避した。凍結乾燥器にかけるとすぐに、最新技術によって知られているように凍結乾燥チャンバーを減圧吸引してペレットの慣用の凍結乾燥を開始させた。これらの製剤について、以下の凍結乾燥パラメーターを使用した：一次乾燥：−３５℃の棚温度、５０マイクロバールの圧力で１０時間。二次乾燥：２０℃の棚温度、５０マイクロバールの圧力で３時間。マイクロペレットの残存水分は、２％以下であった。
【０１６２】
マイクロペレット試料を３７℃および５５℃で様々な時間暴露した。次いで、各試料の効力（Ｌｆ／ｍｌ）をロケット免疫電気泳動試験によって測定した。分析前に注射用蒸留水を用いて乾燥試料を再水和した。溶解は瞬時であった。
【０１６３】
ジフテリアトキソイド安定性結果：
【表１５】
0005689687.tif 000027
【０１６４】
これらの結果から、３７℃および５５℃で１ヶ月後まで有意な損失がないこと、および３ヶ月後に有意さの限界である約１３％だけ損失があることが確認される。さらにまた、ジフテリアトキソイドおよびアルミニウムゲルを含有するマイクロペレットのインキュベーションは、全ての時点および全ての試験温度で、抗原の１００％が溶解後もゲルに吸着したままであったことを示した。溶解および熱安定性研究後の観察されたゲル粒度分布安定性は、アルミニウムゲルアジュバント含有ｆｌｕ  Ｈ５Ｎ１と同様の結果を示した（実施例２を参照）。
【０１６５】
破傷風トキソイド安定性結果：
【表１６】
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【０１６６】
これらの結果から、３７℃および５５℃で３ヶ月後まで有意な損失がないことが確認される。さらにまた、破傷風トキソイドおよびアルミニウムゲルを含有するマイクロペレットのインキュベーションは、全ての時点および全ての試験温度で、抗原の１００％が溶解後もゲルに吸着したままであったことを示した。溶解および熱安定性研究後の観察されたゲル粒度分布安定性は、アルミニウムゲルアジュバント含有ｆｌｕ  Ｈ５Ｎ１と同様の結果を示した（実施例２を参照）。
【０１６７】
これらのデータから、適正に処方された場合、マイクロペレット処理によって、有意な分解を伴わずに５５℃で３ヶ月まで、効力、吸着状態およびアジュバントの質の観点から、熱安定性乾燥アジュバント含有または不含ジフテリアおよび破傷風トキソイドワクチンを得ることができることが確認される。さらにまた、アルミニウムゲルは、同等の粒度分布を維持しながら、かつ塊状の凝集を回避しながら、マイクロペレット技術を用いて凍結乾燥を成功させることができた。
【０１６８】
実施例６：  アルミニウムゲル特性に対するマイクロペレット処理の影響の研究：Ｔ（破傷風トキソイド）との相互作用
この実施例では、実施例５で得られたマイクロペレットを使用した。この研究の目的は、アルミニウムゲルＡｌＯＯＨ吸着能に対するマイクロペレット処理の影響を評価することである。
【０１６９】
３ｍｌのバイアル中で、初めは液体またはマイクロペレット形態である一定量のアルミニウムゲルＡｌＯＯＨ  ０.３ｍｇを、初めは液体またはマイクロペレット形態である様々な量の破傷風トキソイド（合計、０.０５、０.１、０.２、０.３、０.４、０.５および０.７５ｍｇ）と混合した。
【０１７０】
５つの実験を行った：
シリーズ１：  安定剤の不在下での、液体アルミニウムゲルＡｌＯＯＨおよびバルク破傷風トキソイド抗原の液体混合物
シリーズ２：  溶解したアルミニウムゲルＡｌＯＯＨマイクロペレットおよびバルク破傷風トキソイド抗原の液体混合物
シリーズ３：  液体アルミニウムゲルＡｌＯＯＨ、バルク破傷風トキソイド抗原および安定剤の液体混合物
シリーズ４：  液体アルミニウムゲルＡｌＯＯＨおよび溶解した破傷風トキソイドマイクロペレットの液体混合物
シリーズ５：  溶解したアルミニウムゲルＡｌＯＯＨマイクロペレットおよび溶解した破傷風トキソイドの液体混合物
【０１７１】
マイクロペレットの溶解前に水および安定剤含有量を調整して、全ての安定剤含有製剤（シリーズ２〜５）において厳密に同一の水和溶液を得た。
【０１７２】
液体製剤を混合した後、回転式撹拌器にて室温で２時間バイアルをインキュベートし、次いで、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。Ｍｉｃｒｏ  Ｂｒａｄｆｏｒｄ技術（Ｂｉｏ  Ｒａｄタンパク質アッセイ）によって上清中の非吸着破傷風トキソイドを定量化した。各シリーズの試料について破傷風トキソイドリファレンスを試験して、定量化アッセイを行った。得られた結果を下記の表にまとめて示す。
【０１７３】
【表１７】
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【０１７４】
これらの結果から、安定剤の存在がゲルの吸着能に対して有意に悪影響を及ぼさないことが確認される。さらにまた、マイクロペレット処理は、方法の多様性を考慮して、破傷風トキソイドおよび／またはアルミニウムゲルに適用した場合、アルミニウムゲルの吸着能に対して有意に影響を及ぼさない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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