(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リュウキュウバライチゴの抽出物を含有することを特徴とするメラニン生成抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性酸素消去、ＭＭＰ産生抑制、メラニン生成抑制及び細胞増殖促進作用に優れた新規な外用剤又は内用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は生体の最外層に位置し、紫外線等の影響により活性酸素が発生しやすい臓器であり、絶えずその酸素ストレスに曝されている。一方、皮膚細胞内には活性酸素消去酵素が存在しており、その能力を超える活性酸素が発生しないかぎり活性酸素の傷害から皮膚細胞を防衛している。ところが、皮膚細胞内の活性酸素消去酵素の活性は加齢とともに低下することが知られており、活性酸素による傷害がその防御反応を凌駕したとき、皮膚は酸化され、細胞機能が劣化して老化してゆくと考えられる。また、皮膚以外の臓器においても、その活性酸素消去能を越える活性酸素に曝されたとき、機能低下が起こり老化してゆくと考えられる。そこで、活性酸素による傷害からの防御を目的として活性酸素消去剤や抗酸化剤が検討され、ＳＯＤやカタラーゼ等の活性酸素消去酵素、ＳＯＤ様活性物質などの活性酸素消去剤や抗酸化剤を配合した食品、化粧品、医薬部外品及び医薬品等が開発されている（特許文献１，２参照）。
【０００３】
【特許文献１】特開平９−１１８６３０号公報
【特許文献２】特開平９−２０８４８４号公報
【０００４】
皮膚の老化に伴う変化を誘導する因子として、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ；Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ）の関与が指摘されている。このＭＭＰｓの中でも、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）は、皮膚の真皮細胞外マトリックスの主要構成成分であるコラーゲンを分解する酵素として知られているが、その発現は紫外線の照射により大きく増加し、コラーゲンの減少・変性の一因となり、皮膚のしわの形成、弾力性の低下等の大きな要因となると考えられている。このようなＭＭＰ−１活性阻害作用を有するものとしては、例えば、マツ科マツ属二葉松類の樹皮の抽出物等が知られている（特許文献３参照）。
【０００５】
【特許文献３】特開２００３−２７７２２３号公報
【０００６】
ゼラチナーゼ群に属する酵素であるマトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）は、基底膜の主要構成成分であるＩＶ型コラーゲンやラミニン５を分解する酵素として知られているが、その発現及び活性は紫外線の照射により大きく増加し、紫外線による基底膜成分の減少、基底膜の構造変化の原因となり、皮膚におけるシワやたるみの形成等の大きな要因となることが明らかとなっている（非特許文献１参照）。
【０００７】
【非特許文献１】Ｇａｒｙ  Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９６年，第３７９巻，第２５号，ｐ．３３５
【０００８】
さらに、ＭＭＰ−２は、血管内皮細胞下に存在する基底膜を構成するＩＶ型コラーゲン等を分解し、分解された血管内皮細胞は間質へ遊走していき、間質中で増殖し、管腔を形成し、新生血管を構築していく。そして、この新生された血管が腫瘍細胞に到達して、栄養源と酸素とを腫瘍細胞に供給し、腫瘍が大きくなっていくことが知られている（非特許文献２参照）。また、ＭＭＰ−２のノックアウトマウスにおいて、血管新生の未発達やガンの増殖抑制が認められるなど、ＭＭＰ−２は、ガンの増殖や血管新生において重要な役割を果たしている（非特許文献３参照）。
【０００９】
【非特許文献２】血管新生とマトリックスメタロプロテアーゼ，「第１２０回日本医学会シンポジウム記録集  血管新生の基礎と臨床」，２００１年１２月１３日，ｐ．４３−４９
【非特許文献３】Ｉｔｏｈ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１９９８，５８，１０４８−１０５１
【００１０】
一般に、シミ、ソバカス、日焼け等に見られる皮膚の色素沈着は、ホルモンの異常や紫外線の刺激により、皮膚内に存在するメラニン色素生成細胞がメラニン色素を過剰に生成し、これが皮膚内に沈着することが原因と考えられている。このような色素沈着を防ぐ方法の一つに、メラニンの過剰な生成を抑制する方法が知られている。従来、色素沈着の治療には、内用や外用などにおいて、アスコルビン酸（ビタミンＣ）等が用いられてきた。
【００１１】
加齢とともに表皮細胞の増殖・分裂能は低下し、表皮層自体は薄くなる（非特許文献４参照）。生体因子であるＥｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ／上皮細胞成長因子）や女性ホルモン（エストロゲン）は皮膚の表皮細胞増殖に働きかけるが、加齢と共にその分泌は低下する。このような加齢による表皮細胞代謝機能の低下は、皮膚のターンオーバー速度を遅らせ、肌荒れや皮膚の老化の原因となる。また、角層表面から剥がれ落ちる角層細胞が滞留することで、表皮内メラニンの排泄がスムーズに行われなくなり、色素沈着や肌のくすみの原因となる。さらに表皮の創傷治癒が遅くなることなども知られている。これらの現象の進行を防止あるいは改善するために、表皮細胞の増殖を促進させる成分の探索や、多くの皮膚外用剤の提案がなされてきた。
【００１２】
【非特許文献４】Ｖａｒａｎｉ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｓｙｍｐ  Ｐｒｏｃ，１９９８，３，５７６０
【００１３】
しかしながら、これらの活性酸素消去効果、ＭＭＰ産生抑制効果、メラニン生成抑制効果及び細胞増殖促進効果を有する植物由来の天然原料として、本発明に用いたリュウキュウバライチゴは検討されていなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
安全で安定性に優れ、活性酸素消去作用、ＭＭＰ産生抑制作用、メラニン生成抑制作用及び細胞増殖促進作用に優れた素材が望まれているが、未だ十分満足し得るものが提供されていないのが現状である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
このような事情により、本発明者らは鋭意検討した結果、リュウキュウバライチゴの抽出物が優れた活性酸素消去作用、ＭＭＰ産生抑制作用、メラニン生成抑制作用及び細胞増殖促進作用を持ち、安定性においても優れていることを見出した。さらに、その抽出物を含有する外用剤又は内用剤が、安全で安定であり、活性酸素消去作用、ＭＭＰ産生抑制作用、メラニン生成抑制作用及び細胞増殖促進作用に優れており、多機能性美容・健康用素材と成り得ることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１６】
本発明に用いるリュウキュウバライチゴの抽出物とは、バラ科キイチゴ属リュウキュウバライチゴ（学名：Ｒｕｂｕｓ  ｃｒｏｃｅａｃａｎｔｈｕｓ）（別名：オオバライチゴ）の花、茎、葉、枝、枝葉、根、種子等の植物体の一部又は全草から抽出したものである。その抽出方法は特に限定されず、例えば、加熱抽出したものであっても良いし、常温抽出したものであっても良い。
【００１７】
抽出する溶媒としては、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等）、液状多価アルコール（１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、流動パラフィン等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）が挙げられる。好ましくは、水、低級アルコール及び液状多価アルコール等の極性溶媒が良く、特に好ましくは、水、エタノール、１，３−ブチレングリコール及びプロピレングリコールが良い。これらの溶媒は一種でも二種以上を混合して用いても良い。
【００１８】
上記抽出物は、抽出した溶液のまま用いても良く、必要に応じて、濃縮、希釈及び濾過処理、活性炭等による脱色、脱臭処理等をして用いても良い。更には、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行い、乾燥物として用いても良い。
【００１９】
本発明の外用剤又は内用剤には、上記抽出物をそのまま使用しても良く、抽出物の効果を損なわない範囲内で、化粧品、医薬部外品、医薬品又は食品等に用いられる成分である油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、金属石鹸、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、美白剤、キレート剤、賦形剤、皮膜剤、甘味料、酸味料等の成分を配合することもできる。
【００２０】
本発明の剤型としては、例えば、化粧水、クリーム、マッサージクリーム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーション、打粉、口紅、軟膏、パップ剤、ペースト剤、プラスター剤、エッセンス、散剤、丸剤、錠剤、注射剤、坐剤、乳剤、カプセル剤、顆粒剤、液剤（チンキ剤、流エキス剤、酒精剤、懸濁剤、リモナーデ剤等を含む）、錠菓、飲料等が挙げられる。
【００２１】
本発明に用いる上記抽出物の配合量は、外用の場合、全量に対し、固形物に換算して０．０００１重量％以上が好ましく、０．００１〜１０重量％がより好ましい。さらに、０．０１〜５重量％が最も好ましい。０．０００１重量％未満では十分な効果は望みにくい。１０重量％を越えて配合した場合、効果の増強は認められにくく不経済である。一方、内用の場合、投与量は年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常、成人１人当たりの１日の量としては、５ｍｇ以上が好ましく、１０ｍｇ〜０．５ｇがより好ましい。さらに、２０ｍｇ〜０．２ｇが最も好ましい。
【００２２】
次に本発明を詳細に説明するため、実施例として本発明に用いる抽出物の製造例、処方例及び実験例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例に示す配合量の部とは重量部を、％とは重量％を示す。
【実施例１】
【００２３】
製造例１  リュウキュウバライチゴの熱水抽出物
リュウキュウバライチゴの全草の乾燥物２０ｇに精製水４００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してリュウキュウバライチゴの熱水抽出物を２．５ｇ得た。
【００２４】
製造例２  リュウキュウバライチゴの５０％エタノール抽出物
リュウキュウバライチゴの全草の乾燥物１００ｇに５０％エタノール水溶液１Ｌを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、リュウキュウバライチゴの５０％エタノール抽出物を３．８ｇ得た。
【００２５】
製造例３  リュウキュウバライチゴのエタノール抽出物
リュウキュウバライチゴの葉の乾燥物１００ｇにエタノール１Ｌを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、リュウキュウバライチゴのエタノール抽出物を４．１ｇ得た。
【００２６】
製造例４  リュウキュウバライチゴの５０％１，３−ブチレングリコール抽出物
リュウキュウバライチゴの地上部の乾燥物２０ｇに５０％１，３−ブチレングリコール水溶液４００ｍＬを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、リュウキュウバライチゴの５０％１，３−ブチレングリコール抽出物を３７０ｇ得た。
【実施例２】
【００２７】
処方例１  化粧水
処方                                                              配合量（部）
１．リュウキュウバライチゴの熱水抽出物（製造例１）                １．０
２．１，３−ブチレングリコール                                    ８．０
３．グリセリン                                                    ２．０
４．キサンタンガム                                                ０．０２
５．クエン酸                                                      ０．０１
６．クエン酸ナトリウム                                            ０．１
７．エタノール                                                    ５．０
８．パラオキシ安息香酸メチル                                      ０．１
９．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．）                ０．１
１０．香料                                                          適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜６及び１１と、成分７〜１０をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合し濾過して製品とする。
【００２８】
比較例１  従来の化粧水
処方例１において、リュウキュウバライチゴの熱水抽出物を精製水に置き換えたものを従来の化粧水とした。
【００２９】
処方例２  クリーム
処方                                                              配合量（部）
１．リュウキュウバライチゴの５０％エタノール抽出物（製造例２）    ０．５
２．スクワラン                                                    ５．５
３．オリーブ油                                                    ３．０
４．ステアリン酸                                                  ２．０
５．ミツロウ                                                      ２．０
６．ミリスチン酸オクチルドデシル                                  ３．５
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）              ３．０
８．ベヘニルアルコール                                            １．５
９．モノステアリン酸グリセリン                                    ２．５
１０．香料                                                          ０．１
１１．パラオキシ安息香酸メチル                                      ０．２
１２．パラオキシ安息香酸エチル                                      ０．０５
１３．１，３−ブチレングリコール                                    ８．５
１４．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１１〜１４を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。
【００３０】
処方例３  乳液
処方                                                            配合量（部）
１．リュウキュウバライチゴの熱水抽出物（製造例１）              ０．０１
２．スクワラン                                                  ５．０
３．オリーブ油                                                  ５．０
４．ホホバ油                                                    ５．０
５．セタノール                                                  １．５
６．モノステアリン酸グリセリン                                  ２．０
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）            ３．０
８．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（２０Ｅ．Ｏ．）  ２．０
９．香料                                                        ０．１
１０．プロピレングリコール                                        １．０
１１．グリセリン                                                  ２．０
１２．パラオキシ安息香酸メチル                                    ０．２
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜８を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１０〜１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分９を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。
【００３１】
処方例４  ゲル剤
処方                                                            配合量（部）
１．リュウキュウバライチゴのエタノール抽出物（製造例３）        １．０
２．エタノール                                                  ５．０
３．パラオキシ安息香酸メチル                                    ０．１
４．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．Ｏ．）              ０．１
５．香料                                                        適量
６．１，３−ブチレングリコール                                  ５．０
７．グリセリン                                                  ５．０
８．キサンタンガム                                              ０．１
９．カルボキシビニルポリマー                                    ０．２
１０．水酸化カリウム                                              ０．２
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜５と、成分１及び６〜１１をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合して製品とする。
【００３２】
処方例５  パック
処方                                                              配合量（部）
１．リュウキュウバライチゴの熱水抽出物（製造例１）              １．０
２．リュウキュウバライチゴの
５０％１，３−ブチレングリコール抽出物（製造例４）          ５．０
３．ポリビニルアルコール                                      １２．０
４．エタノール                                                  ５．０
５．１，３−ブチレングリコール                                  ８．０
６．パラオキシ安息香酸メチル                                    ０．２
７．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（２０Ｅ．Ｏ．）              ０．５
８．クエン酸                                                    ０．１
９．クエン酸ナトリウム                                          ０．３
１０．香料                                                        適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜１１を均一に溶解し製品とする。
【００３３】
処方例６  ファンデーション
処方                                                              配合量（部）
１．リュウキュウバライチゴの５０％エタノール抽出物（製造例２）    １．０
２．ステアリン酸                                                  ２．４
３．ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（２０Ｅ．Ｏ．）  １．０
４．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．）              ２．０
５．セタノール                                                    １．０
６．液状ラノリン                                                  ２．０
７．流動パラフィン                                                ３．０
８．ミリスチン酸イソプロピル                                      ６．５
９．カルボキシメチルセルロースナトリウム                          ０．１
１０．ベントナイト                                                  ０．５
１１．プロピレングリコール                                          ４．０
１２．トリエタノールアミン                                          １．１
１３．パラオキシ安息香酸メチル                                      ０．２
１４．二酸化チタン                                                  ８．０
１５．タルク                                                        ４．０
１６．ベンガラ                                                      １．０
１７．黄酸化鉄                                                      ２．０
１８．香料                                                          適量
１９．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜８を加熱溶解し、８０℃に保ち油相とする。成分１９に成分９をよく膨潤させ、続いて、成分１及び１０〜１３を加えて均一に混合する。これに粉砕機で粉砕混合した成分１４〜１７を加え、ホモミキサーで撹拌し７５℃に保ち水相とする。この水相に油相をかき混ぜながら加え、冷却し、４５℃で成分１８を加え、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。
【００３４】
処方例７  浴用剤
処方                                                              配合量（部）
１．リュウキュウバライチゴの熱水抽出物（製造例１）                １．０
２．炭酸水素ナトリウム                                          ５０．０
３．黄色２０２号（１）                                            適量
４．香料                                                          適量
５．硫酸ナトリウムにて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜５を均一に混合し製品とする。
【００３５】
処方例８  軟膏
処方                                                              配合量（部）
１．リュウキュウバライチゴの熱水抽出物（製造例１）                １．０
２．リュウキュウバライチゴの
５０％１，３−ブチレングリコール抽出物（製造例４）            ５．０
３．ポリオキシエチレンセチルエーテル（３０Ｅ．Ｏ．）              ２．０
４．モノステアリン酸グリセリン                                  １０．０
５．流動パラフィン                                                ５．０
６．セタノール                                                    ６．０
７．パラオキシ安息香酸メチル                                      ０．１
８．プロピレングリコール                                        １０．０
９．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分３〜６を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１、２及び７〜９を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。
【００３６】
処方例９  散剤１
処方                                                              配合量（部）
１．リュウキュウバライチゴの熱水抽出物（製造例１）                １．０
２．乾燥コーンスターチ                                          ３９．０
３．微結晶セルロース                                            ６０．０
［製造方法］成分１〜３を混合し、散剤とする。
【００３７】
処方例１０  散剤２
処方例９において、リュウキュウバライチゴの熱水抽出物をエタノール抽出物（製造例３）に置き換えたものを散剤２とした。
【００３８】
処方例１１  錠剤
処方                                                              配合量（部）
１．リュウキュウバライチゴのエタノール抽出物（製造例３）          ５．０
２．乾燥コーンスターチ                                          ２５．０
３．カルボキシメチルセルロースカルシウム                        ２０．０
４．微結晶セルロース                                            ４０．０
５．ポリビニルピロリドン                                          ７．０
６．タルク                                                        ３．０
［製造方法］成分１〜４を混合し、次いで成分５の水溶液を結合剤として加えて顆粒成型する。成型した顆粒に成分６を加えて打錠する。１錠０．５２ｇとする。
【００３９】
処方例１２  錠菓
処方                                                              配合量（部）
１．リュウキュウバライチゴのエタノール抽出物（製造例３）          ２．０
２．乾燥コーンスターチ                                          ４９．８
３．エリスリトール                                              ４０．０
４．クエン酸                                                      ５．０
５．ショ糖脂肪酸エステル                                          ３．０
６．香料                                                          ０．１
７．精製水                                                        ０．１
［製造方法］成分１〜４及び７を混合し、顆粒成型する。成型した顆粒に成分５及び６を加えて打錠する。１粒１．０ｇとする。
【００４０】
処方例１２  飲料
処方                                                              配合量（部）
１．リュウキュウバライチゴの熱水抽出物（製造例１）                ０．０５
２．ステビア                                                      ０．０５
３．リンゴ酸                                                      ５．０
４．香料                                                          ０．１
５．精製水                                                      ９４．８
［製造方法］成分２及び３を少量の水に溶解する。次いで、成分１、４及び５を加えて混合する。
【００４１】
次に、本発明の効果を詳細に説明するため、実験例を挙げる。
【実施例３】
【００４２】
実験例１  活性酸素消去作用
フリーラジカル捕捉除去作用の評価を行った。陽性対照としてはアスコルビン酸を用いた。フリーラジカルのモデルとしては、安定なフリーラジカルであるα，α−ジフェニル−β−ピクリルヒドラジル（以下ＤＰＰＨとする）を用い、試料と一定の割合で一定時間反応させ、減少するラジカルの量を波長５１７ｎｍの吸光度の減少量から測定した。
【００４３】
フリーラジカル捕捉除去作用の測定方法
各試料を、最終濃度０．０１ｍｇ／ｍＬ（アスコルビン酸は０．０１ｍｇ／ｍＬ）となるように加えた０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）２ｍＬに無水エタノール２ｍＬ及び０．５ｍＭ  ＤＰＰＨ無水エタノール溶液１ｍＬを加えて反応液とした。また、油溶性の試料の場合は無水エタノール２ｍＬに試料を加えて反応液とした。その後、３７℃で３０分間反応させ、水を対照として波長５１７ｎｍの吸光度（Ａ）を測定した。また、ブランクとして試料の代わりに精製水を用いて吸光度（Ｂ）を測定した。フリーラジカル捕捉除去率は、以下に示す式より算出した。
フリーラジカル捕捉除去率（％）＝（１−Ａ／Ｂ）×１００
【００４４】
これらの試験結果を表１に示した。本発明のリュウキュウバライチゴの熱水及び５０％エタノール抽出物は、安定で優れたフリーラジカル捕捉除去作用を有していることが認められた。また、その他の抽出物についても効果が認められた。なお、アスコルビン酸は、１００℃、１時間の熱処理で失活するが、本発明のリュウキュウバライチゴの抽出物は、活性に変化はなかった。
0005690150.tif 000002
【００４５】
実験例２  ＭＭＰ産生抑制作用
ＭＭＰ産生抑制作用をＭＭＰ−１及びＭＭＰ−２のｍＲＮＡ発現量を指標として評価した。
【００４６】
ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−２のｍＲＮＡ発現量の測定方法
正常ヒト皮膚線維芽細胞を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地にて３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養し、コンフルエントな状態になったところで試料（終濃度１０μｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭ培地にてさらに２４時間培養した後、総ＲＮＡの抽出を行った。総ＲＮＡの抽出にはＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いた。線維芽細胞から抽出した総ＲＮＡを基にリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によりＭＭＰ−１及びＭＭＰ−２ｍＲＮＡ発現量の測定を行った。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法にはＴａＫａＲａ  ＳＹＢＲ  ＥｘＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔを用い、ＭＭＰ−１用のｐｒｉｍｅｒとしては５’ＧＧＧＡＧＡＴＣＡＴＣＧＧＧＡＣＡＡＣＴＣ３’（配列番号１）及び５’ＴＧＡＧＣＡＴＣＣＣＣＴＣＣＡＡＴＡＣＣ３’（配列番号２）を用いた。ＭＭＰ−２用のｐｒｉｍｅｒとしては５’ＣＣＧＴＣＧＣＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡ３’（配列番号３）及び５’ＣＴＴＣＴＧＣＡＴＣＴＴＣＴＴＴＡＧＴＧＴＧＴＣＣＴＴ３’（配列番号４）を用いた。また、内部標準としてはＧＡＰＤＨを用い、ＧＡＰＤＨ用のｐｒｉｍｅｒとしては５’ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ３’（配列番号５）及び５’ＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧ３’（配列番号６）を用いた。その他の操作は定められた方法に従い、ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−２のｍＲＮＡ発現量を内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量に対する割合として求めた。
【００４７】
これらの試験結果を表２に示した。本発明のリュウキュウバライチゴの５０％エタノール抽出物は、優れたＭＭＰ産生抑制作用を有していることが認められた。また、その他の抽出物についても効果が認められた。
0005690150.tif 000003
【００４８】
実験例３  Ｂ１６マウスメラノーマを用いたメラニン生成抑制試験
対数増殖期にあるＢ１６マウスメラノーマをφ６０ｍｍｄｉｓｈに３×１０４個の細胞を播種し、各試料（最終濃度１μｇ／ｍＬ）を含むＥａｇｌｅｓ’ＭＥＭ（１０％牛胎児血清含有）培地を加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて培養した。培養５日後に細胞をｄｉｓｈから剥離し、細胞を超音波破砕した後、４ＮＮａＯＨを加え６０℃で２時間の処理を行い、分光光度計でＯ．Ｄ．４７５ｎｍを測定した。尚、超音波処理後の細胞破砕液をＬｏｗｒｙの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３，２６５−２７５，１９５１）でタンパク定量し、タンパク量当りのメラニン量を比較することによって、メラニン生成抑制効果の指標とした。
【００４９】
これらの試験結果を表３に示した。本発明のリュウキュウバライチゴの熱水抽出物は、優れたメラニン生成抑制作用を有していることが認められた。また、その他の抽出物についても効果が認められた。
0005690150.tif 000004
【００５０】
実験例４  細胞増殖促進試験
ＨａＣａＴ細胞を０．１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養液にて、９６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり５，０００個播種し、各試料を添加した後、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて３日間培養した。細胞数の測定は、ＭＴＴ法により行った。すなわち、培養終了後、培養液を除き、５００μｇ／ｍＬの濃度にて、ＭＴＴを溶解させたＤＭＥＭに培地を入れ替え、２時間培養した後、１５０μＬのＤＭＥＭに細胞を溶解させ、マイクロプレートリーダーをもちいて５９０及び６５０ｎｍにおける吸光度を測定した。細胞数は、５９０ｎｍの吸光度値から、６５０ｎｍの吸光度値を引いた値にて算出し、試料を添加しない細胞群（未添加細胞群）を１００％とした換算値として示した。
【００５１】
これらの実験結果を表４に示した。その結果、本発明のリュウキュウバライチゴの５０％エタノール抽出物は、優れた細胞増殖促進作用を示した。また、その他の抽出物についても効果が認められた。
0005690150.tif 000005
【００５２】
実験例５  使用試験１
処方例１の化粧水及び比較例１の従来の化粧水を用いて、シミ、ソバカスに悩む女性１０人（２３〜５０才）を対象に１ヶ月間の使用試験を行った。使用後、シミ、ソバカスの改善効果をアンケートにより判定した。
【００５３】
その結果、本発明の抽出物を含有する皮膚外用剤は、優れたシミ、ソバカスの改善作用を示した。なお、試験期間中、皮膚トラブルは一人もなく、安全性においても問題なかった。また、処方成分の劣化についても問題なかった。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
以上のことから、本発明のリュウキュウバライチゴの抽出物は、優れた活性酸素消去作用、ＭＭＰ産生抑制作用、メラニン生成抑制作用及び細胞増殖促進作用を有し、安定性にも優れていた。よって、本発明のリュウキュウバライチゴの抽出物は、皮膚の老化や美白といった美容分野だけでなく、老化による機能低下の抑制、ガンの予防、治療や創傷治癒などといった医療分野にも利用ででき、食品、化粧品、医薬部外品及び医薬品等への応用が期待される。
【配列表】
0005690150000001.app