(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム遺伝子座を増幅する方法であって、
（ａ）必須酵素の阻害剤に、構造
Ａ１−Ｐ−Ｍ−Ａ２
のゲノム遺伝子座を含む細菌性宿主細胞の集団を接触させる工程であって、ここで、Ａ１とＡ２が繰り返し配列であり、Ｐは目的タンパク質のコーディング配列を含み、Ｍは、必須酵素のコーディング配列を含む前記工程、及び
（ｂ）前記阻害剤に耐性のある細胞を選択する工程であって、
前記阻害剤に耐性のある細胞が増幅単位の複数のコピーを有する前記工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記細菌性宿主細胞が、バチルス種細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記必須酵素が、前記細胞に内因性の野生型酵素である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細菌性宿主細胞が、前記必須酵素をコードする不活性化された遺伝子をさらに含み、前記不活性化された遺伝子が、前記細胞に内因性であって、構造Ａ１−Ｐ−Ｍ−Ａ２の前記ゲノム遺伝子座と異なるゲノム遺伝子座にある、請求項１−３のいずれかの方法。
【請求項５】
Ｐが発現カセットを含む、請求項１−４のいずれかの方法。
【請求項６】
Ａ１がＰのコーディング配列と操作可能に連結されたプロモーターを含む、請求項１−５のいずれかの方法。
【請求項７】
前記必須酵素の前記コーディング配列が、前記コーディング配列に内因性のプロモーターに連結される、請求項１−６のいずれかの方法。
【請求項８】
前記目的タンパク質がズブチリシンである、請求項１−７のいずれかの方法。
【請求項９】
前記必須酵素がＤ−アラニンラセマーゼである、請求項１の方法。
【請求項１０】
前記必須酵素がＤ−アラニンラセマーゼであり、前記阻害剤がβ−クロロ−Ｄ−アラニンである、請求項１−８のいずれかの方法。
【請求項１１】
構造
Ａ１−Ｐ−Ｍ−Ａ２
の増幅単位を含むゲノム遺伝子座を含む細菌性宿主細胞であり、
Ａ１とＡ２は繰り返し配列であり、Ｐは目的タンパク質のコーディング配列を含み、Ｍは
必須酵素のコーディング配列を含む、前記細菌性宿主細胞。
【請求項１２】
構造
Ａ１−Ｐ−Ｍ−Ａ２
の増幅単位の複数のコピーを含むゲノム遺伝子座を含む細菌性宿主細胞であって、
Ａ１とＡ２は繰り返し配列であり、Ｐは目的タンパク質の第１コーディング配列を含み、
Ｍは必須酵素の第２コーディング配列を含み、前記第１コーディング配列が、繰り返し配
列Ａ１に存在するプロモーターと操作可能に連結される、前記細菌性宿主細胞。
【請求項１３】
前記目的タンパク質がズブチリシンであり、前記必須酵素がアラニンラセマーゼである、
請求項１１または１２の細菌性宿主細胞。
【請求項１４】
前記増幅単位が配列番号７で示す配列を有する、請求項１１−１３のいずれかの細菌性宿主細胞。
【請求項１５】
増殖培地、及び
請求項１１−１４のいずれかの細菌性細胞の集団
を含む細菌性細胞培地。
【請求項１６】
前記目的タンパク質の生産に適した条件下で、請求項１５の細胞の培地を維持する工程
を含む方法。
【請求項１７】
前記培地から前記目的タンパク質を回収する工程をさらに含む、請求項１６の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００８年３月２８日に出願された米国仮出願６１／０４０，４５６について優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、抗生物質を使用せずにゲノム遺伝子座を増幅する方法を提供する。本発明は、特に目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を生体内で増幅する方法、前記増幅されたＤＮＡ配列の複数のコピーを包括する細胞及び前記方法で使用されるＤＮＡ構築物を包括するベクターに関する。さらに、本発明は、上述のような細胞の培養により、目的ポリペプチド、例えば、酵素等を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
外因性のポリペプチドの発現及び組み換え体生産は広く用いられている技術である。大量の所望ポリペプチドの発現及び生産のための外因性の目的ポリペプチドをコードする核酸により、細胞を形質転換可能なことはよく知られている。いくつかの適用において、前記方法は、基となる生物により自然に生産されるポリペプチド以上の莫大な量のポリペプチドを生産するために使用される。実際は、内因性の配列の過剰発現と同様に外因性の核酸配列の発現も、現代のバイオテクノロジーにおいて広範囲に用いられている。
【０００４】
分子生物学及びタンパク質工学の進歩にもかかわらず、宿主細胞内でのポリペプチドの発現レベルを増加させる新しい方法及び組成物の必要性が残る。
【発明の概要】
【０００５】
ゲノム遺伝子座を増幅する方法が本明細書で提供される。所定の実施態様において、前記方法は、以下の工程を含むことが出来る。すなわち、ａ）必須酵素の阻害剤に細菌性宿主細胞の集団を接触させる工程であって、前記細菌性宿主細胞が構造Ａ１−Ｐ−Ｍ−Ａ２のゲノム遺伝子座を含み、ここで、Ａ１とＡ２が繰り返し配列であり、Ｐは目的ポリペプチドのコーディング配列を含み、Ｍは必須酵素のコーディング配列を含む、前記工程、及びｂ）前記阻害剤に耐性のある細胞を選択する工程であって、前記阻害剤に耐性のある細胞が前記増幅単位の複数のコピーを有する、前記工程である。前記細菌性宿主細胞は、バチルス種細胞とすることが出来る。もっとも、他の細菌性細胞型、例えば、ストレプトミセス種等も想定される。いくつかの実施態様において、目的ポリペプチドは、ズブチリシン、例えば、配列番号８のズブチリシンまたは配列番号１２で示すその成熟形等である。所定の場合において、前記方法は、抗生物質マーカー及び抗生物質の使用を回避し、抗生物質に基づく増幅システムに対し代替案を提供する。所定の実施態様において、前記必須酵素は、酵素、例えば、細胞に内因性の野生型酵素等のアミノ酸配列を有する。所定の実施態様において、前記方法で用いられる細菌性宿主細胞は、前記必須酵素をコードする、不活性化された内因性遺伝子を含むか、または含まない。ここで、前記不活性化された遺伝子は、異なるゲノム遺伝子座から構造Ａ１−Ｐ−Ｍ−Ａ２のゲノム遺伝子座にあることが出来る。所定の場合において、前記必須酵素は、アラニンラセマーゼ、例えば、配列番号１１等とすることが出来る。また、前記阻害剤は、β−クロロ−Ｄ−アラニンまたはシクロセリンとすることが出来る。もっとも、他の酵素／阻害剤の組み合わせとしても使用されることが出来る。いくつかの実施態様において、前記増幅単位は、配列番号７で示す配列を含む。
【０００６】
増幅単位は、領域Ｍによりコードされた必須酵素の発現を提供する。所定の実施態様において、Ｍは、必須酵素のコーディング配列及び前記コーディング配列と操作可能に連結するプロモーターを含むことが出来る。ここで、前記プロモーターは、必須酵素のコーディング配列に天然である。所定の実施態様において、前記コーディング配列及びプロモーターは、宿主細胞に内因性であることが出来る。前記増幅単位は、さらに領域Ｐによりコードされた目的タンパク質の発現を供給する。所定の実施態様において、Ｐのコーディング配列は、隣接した繰り返し配列（Ａ１）に存在する、内因性か、または非内因性のプロモーターと操作可能に連結されることが出来る。他の実施態様において、Ｐのプロモーターは、隣接した繰り返し配列に存在しないことが出来る。むしろ、前記プロモーターは、領域Ｐに存在することが出来る。
【０００７】
いくつかの実施態様において、本発明は、構造Ａ１−Ｐ−Ｍ−Ａ２の増幅単位を含むゲノムの遺伝子座を含む細菌性宿主細胞も提供する。ここで、Ａ１とＡ２は繰り返し配列であり、Ｐは目的ポリペプチドのコーディング配列を含み、Ｍは必須酵素のコーディング配列を含む。この実施態様において、前記増幅単位は、必須酵素の有意な発現を提供する。前記細菌性宿主細胞は、バチルス種細胞とすることが出来る。もっとも、他の細菌性細胞型、例えば、ストレプトミセス種等も想定される。いくつかの実施態様において、目的ポリペプチドは、ズブチリシン、例えば、配列番号８のズブチリシンまたは配列番号１２で示すその成熟形等である。所定の場合において、前記方法は、抗生物質マーカー及び抗生物質の使用を回避し、抗生物質に基づく増幅システムに対し代替案を提供する。所定の実施態様において、前記必須酵素は、酵素、例えば、細胞に内因性の野生型酵素等のアミノ酸配列を有する。所定の実施態様において、前記細菌性宿主細胞は、前記必須酵素をコードする、不活性化された内因性遺伝子を含むか、または含まない。ここで、前記不活性化された遺伝子は、異なるゲノム遺伝子座から構造Ａ１−Ｐ−Ｍ−Ａ２のゲノム遺伝子座にあることが出来る。所定の場合において、前記必須酵素は、アラニンラセマーゼ、例えば、配列番号１１等とすることが出来る。また、前記阻害剤はβ−クロロ−Ｄ−アラニンまたはシクロセリンとすることが出来る。もっとも、他の酵素／阻害剤の組み合わせとしても使用されることが出来る。いくつかの実施態様において、前記増幅単位は、配列番号７で示す配列を含む。
【０００８】
他の実施態様において、本発明に係る細菌性宿主細胞は、構造Ａ１−Ｐ−Ｍ−Ａ２の増幅単位の複数のコピーを含むゲノム遺伝子座を含む。ここで、Ａ１とＡ２は繰り返し配列であり、Ｐは目的ポリペプチドの第１コーディング配列を含み、Ｍは必須酵素の第２コーディング配列を含む。いくつかの実施態様において、前記増幅単位は、配列番号７で示すポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施態様において、前記第１コーディング配列は、繰り返し配列Ａ１に存在するプロモーターと操作可能に連結される。所定の実施態様において、前記細菌性宿主細胞は、式（Ａ１−Ｐ−Ｍ）ｎ−Ａ２により示される増幅単位の複数のコピーを含むゲノム遺伝子座を含む。ここで、ｎは少なくとも２であり、Ａ１とＡ２は繰り返し配列であり、Ｐは目的ポリペプチドのコーディング配列を含み、Ｍは必須酵素をコードする。また、Ｍのコーディング配列が内因性か、または非内因性のプロモーターと操作可能に連結される。一の実施態様において、前記Ｍのコーディング配列及び前記プロモーターは、宿主細胞に内因性であることが出来る。いくつかの実施態様において、細菌性宿主細胞は、配列番号７の増幅単位の複数のコピー、例えば、少なくとも２コピーを含むゲノム遺伝子座を含む。前記増幅単位は、目的ポリペプチド、例えば、ズブチリシン及び必須酵素の両方の発現を提供する。いくつかの実施態様において、前記発現された目的ポリペプチドは、配列番号８で示すズブチリシンＦＮＡか、または配列番号１２で示すその成熟形であり、前記必須酵素は、配列番号１１で示すアラニンラセマーゼである。所定の実施態様において、Ｐのコーディング配列と操作可能に連結する前記プロモーターは、隣接する繰り返し配列（Ａ１）の一部とすることが出来る。別の実施態様において、領域Ｐのコーディング配列と操作可能に連結する前記プロモーターは、隣接する繰り返し配列ではなく領域Ｐに存在する。
【０００９】
別の実施態様において、本発明は、増殖培地を含む細菌性細胞培養及び構造Ａ１−Ｐ−Ｍ−Ａ２の増幅単位の少なくとも１、少なくとも２またはそれ以上のコピーを含む細菌性宿主細胞の集団を包含する。ここで、Ａ１とＡ２は繰り返し配列であり、Ｐは目的ポリペプチドの第１コーディング配列を含み、Ｍは必須酵素の第２コーディング配列を含む。上述のように、増幅単位は、目的ポリペプチド、例えば、ズブチリシン等及び必須酵素の両方の発現を提供する。いくつかの実施態様において、前記発現された目的ポリペプチドは、配列番号８で示すズブチリシンＦＮＡまたは配列番号１２で示すその成熟形であり、前記必須酵素は、配列番号１１で示すアラニンラセマーゼである。さらに別の実施態様において、前記細菌性細胞培養は、前記コーディング配列によりコードされた目的ポリペプチドの生産に適切な条件下で対象細胞の培養を維持する工程を含むタンパク質生産方法で使用されることが出来る。所定の実施態様において、この方法は、培養地から目的ポリペプチドを回収する工程をさらに含むことが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本明細書で記載する実施態様のいくつかの特徴を概略的に示す。
【図２】図２は、ｐＢＳＦＮＡａｌｒプラスミド（配列番号２）の遺伝子地図を示す。
【図３】図３は、ｑＰＣＲ検量線を示す。
【図４】図４は、様々な宿主株からのズブチリシンＦＮＡの発現レベルを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
定義
別途記載のない限り、本明細書で用いられる全ての技術及び科学上の用語は、本発明が属する分野の当業者により通常理解されるものと同様の意味を持つ。本明細書に記載の方法及び材料と同様のまたは同等の方法及び材料が本発明の実施または試験のために使用されるが、好ましい方法及び材料が本明細書に記載される。
【００１２】
本明細書で参照される全ての特許及び公開刊行物は、そこに開示される全ての配列を含み、参照により明確に組み込まれる。
【００１３】
数値範囲は、範囲を規定する数値も含むものとする。別途記載のない限り、核酸は左から右ヘ、５’末端から３’末端方向に、アミノ酸配列は左から右ヘ、アミノ基からカルボキシ基方向へ各々記載される。
【００１４】
本明細書に提供される見出しは、多様な本発明の側面または実施態様を制限するものではない。従って、以下に定義される用語は明細書を全体として参照することによってより完全に規定される。
【００１５】
別途記載のない限り、本明細書で用いられる全ての技術及び科学上の用語は、本発明が属する分野の当業者により通常理解されるものと同様の意味を持つ。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ他、「微生物学及び分子生物学辞典（ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ）」、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ出版、ニューヨーク州（１９９４年）及びＨａｌｅ及びＭａｒｋｈａｍ、「ハーパー・コリンズ生物学辞典（ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ）」、Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ出版、ニューヨーク州（１９９１年）は、本明細書で使用される多数の用語の意味を当業者に示す一般的な辞書である。また、所定の用語は、明確化の目的及び参照の容易さのために以下に定義される。
【００１６】
「組み換え体」の語は、宿主細胞では自然に発生しないポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。組み換え体分子は、自然に生じない方法で互いに連結する２以上の自然発生の配列を含む。組み換え体細胞は、組み換えポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む。
【００１７】
「異種」の語は、通常互いに関連しない要素をいう。例えば、宿主細胞が異種のタンパク質を生産する場合、そのタンパク質はその宿主細胞で通常生産されない。同様に、異種コーディング配列と操作可能に連結するプロモーターは、野生型の宿主細胞内では通常操作可能に連結しないコーディング配列と操作可能に連結するプロモーターである。ポリヌクレオチドまたはタンパク質に関連した「同種」の語は、宿主細胞で自然に生じるポリヌクレオチドまたはタンパク質をいう。
【００１８】
「タンパク質」及び「ポリペプチド」の語は、本明細書で相互置換可能に用いられる。
【００１９】
「シグナル配列」は、細胞からのタンパク質の成熟形の分泌を促進し、タンパク質のＮ末端部分に存在するアミノ酸配列である。シグナル配列における定義は、機能的なものである。前記シグナル配列は分泌過程で開裂され、細胞外タンパク質の成熟形では、シグナル配列を欠く。
【００２０】
「核酸」の語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖あるいは二本鎖及びそれらの化学修飾を包含する。「核酸」及び「ポリヌクレオチド」の語は、本明細書で相互置換可能に用いられる。
【００２１】
「ベクター」は、１以上の宿主細胞へ核酸を導入するように設計されたポリヌクレオチドをいう。所定の実施態様において、ベクターは、異なる宿主細胞内で自律的に複製し、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセット等を含む。他の実施態様において、ベクターは、宿主細胞ゲノム中に統合されることが出来る。
【００２２】
「プロモーター」は、下流にある核酸の転写を開始する調節配列である。
【００２３】
「操作可能に連結する」の語は、機能的な関連付けを可能にする要素の配置をいう。例えば、プロモーターが配列の転写をコントロールする場合、そのプロモーターはコーディング配列と操作可能に連結する。
【００２４】
「選択マーカー」の語は、導入された核酸またはベクターを含む宿主の選択を容易にする、宿主中での発現が可能なタンパク質をいう。選択マーカーの例は、抗生物質（例えば、ヒグロマイシン、ブレオマイシンまたはクロラムフェニコール）及び／または宿主細胞上の栄養学的優位性のような代謝の優位を与える遺伝子を含むが、それらに限られない。
【００２５】
本明細書で用いられる「回収された」、「単離された」及び「精製された」の語は、自然に関連する少なくとも一成分から取り出されたタンパク質、細胞、核酸またはアミノ酸をいう。
【００２６】
細胞に関連して本明細書で用いられる「形質転換された」、「安定に形質転換された」及び「遺伝子組み換え」の語は、前記細胞が、ゲノム中または複数世代において維持される、エピソームプラスミドに統合された非天然の（例えば、異種の）核酸配列を有することを意味する。
【００２７】
本明細書で用いられる「発現」の語は、ポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて生産される過程をいう。前記過程は、転写と翻訳の両方を含む。
【００２８】
核酸配列を細胞に挿入することに関連して本明細書で用いられる「導入される」の語は、「トランスフェクション」または「形質転換」あるいは「形質導入」を意味し、核酸配列が細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、色素体あるいはミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれるか、自律レプリコンに変換されるか、または一時的に発現される（例えば、トランスフェクトｍＲＮＡ）、真核生物または原核細胞への核酸配列の組み込みについての言及を含む。
【００２９】
「ハイブリダイゼーション」の語は、核酸の鎖が当該技術分野で知られる塩基対合を通じて相補鎖と連結する過程をいう。２つの配列が中度から高度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件下で互いに特異的にハイブリダイズする場合、核酸は対象核酸配列と「選択的にハイブリダイズすることが出来る」と考えられる。中度から高度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、既に知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ他、分子生物学における簡易プロトコール（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第３版、Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ出版、１９９５、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、分子クローニング：ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第３版、２００１年、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州を参照されたい）。高度なストリンジェンシー条件の一例は、５０％フォルムアミド、５ＸＳＳＣ、５Ｘデンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ及び１００ｕｇ／ｍｌ変性キャリアーＤＮＡの約４２℃でのハイブリダイゼーション及びそれに続く２ＸＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳの室温での２度の洗浄及び０．１ＸＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳの４２℃での２度の洗浄を含む。
【００３０】
「コーディング配列」は、ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントである。
【００３１】
本明細書で用いられる「発現カセット」は、適切な宿主細胞中のタンパク質の発現をもたらすことが出来る適切な制御配列と操作可能に連結されるタンパク質コーディング領域を含むＤＮＡ構築物を意味する。前記制御配列は、転写をもたらすプロモーター、ｍＲＮＡの生成のための転写を制御する任意のオペレータ配列、ｍＲＮＡ上の適したリボソーム結合部位をコードする配列及びエンハンサー及び転写や翻訳の終了を制御するその他の配列を含むことが出来る。
【００３２】
「宿主細胞に天然の」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、改変されていない宿主細胞に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドのものと等しいアミノ酸またはヌクレオチド配列を有する。所定の場合において、細胞は、前記細胞に天然のポリヌクレオチド（例えば、コーディング配列）を含む組み換え核酸を含むことが出来る。これらの場合において、前記細胞は、宿主細胞の改変されていない型（すなわち、いかなる遺伝子ノックアウトも含まない宿主細胞）にも存在するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを包含する組み換え核酸を異なる遺伝子座に含む。所定の場合において、細胞は、前記細胞に天然のポリペプチドをコードする組み換え核酸を含むことが出来る。これらの場合において、前記細胞は、宿主細胞の改変されていない型（すなわち、いかなる遺伝子ノックアウトも含まない宿主細胞）で見られるポリペプチドのものと等しいアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする組み換え核酸を含む。「内因性の（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）」の語は、「天然の（ｎａｔｉｖｅ）」の語と同義である。
【００３３】
天然のプロモーターと操作可能に連結するコーディング配列に関連する「天然のプロモーター」は、細胞内のコーディング配列と操作可能に連結する野生型宿主細胞のプロモーターをいう。
【００３４】
「繰り返し配列」の語は、等しい配向で存在し、細胞内で相同組み換えを受けることが出来る少なくとも２の配列要素をいう。繰り返し配列は、少なくとも５０のヌクレオチド、例えば、少なくとも１００、少なくとも２００または少なくとも５００またはそれ以上のヌクレオチドと同一か、ほとんど同一のヌクレオチド配列（例えば、少なくとも９８％または９９％の配列同一性）を有する。
【００３５】
「阻害剤」の語は、競合的阻害または非競争的阻害（例えば、アロステリック的）のいずれかにより、可逆的に酵素を阻害する化合物をいう。
【００３６】
「必須酵素」の語は、細胞の増殖に必須な酵素である。
【００３７】
内因性の必須酵素の遺伝子が細胞中で野生型の（すなわち、不活性化されていない）場合、「必須酵素の有意な発現を提供する発現カセット」の語は、内因性の必須酵素のレベルの５０％以上（例えば、少なくとも７０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％、最高で１０００％）のレベルに必須酵素の発現を提供する発現カセットをいう。
【００３８】
「アラニンラセマーゼ」の語は、Ｌ−アラニン及びＤ−アラニンの転換を触媒する酵素をいう。アラニンラセマーゼは、ＩＵＢＭＢ酵素命名法に従って、ＥＣ５．１．１．１と評される活性を有する。アラニンラセマーゼをコードする遺伝子は、「ａｌｒ」、「ａｌｒＡ」または「ｄａｌ」遺伝子として表記されることが出来る。
【００３９】
用語の他の定義が、明細書の全体にわたり見られることが出来る。
【００４０】
例示的な実施態様の詳細な記載
上述のように、ゲノム遺伝子座を増幅する方法が提供される。本発明に係る方法のいくつかの一般的な特徴が、図１で示される。図１に関して、前記方法で使用される細菌性宿主細胞は、構造Ａ１−Ｐ−Ｍ−Ａ２の増幅単位を含むゲノム遺伝子座を含むことが出来る。ここで、Ａ１とＡ２は繰り返し配列であり、Ｐは目的ポリペプチドのコーディング配列を含み、Ｍは細胞に必須である酵素のコーディング配列を含む。式Ａ１−Ｐ−Ｍ−Ａ２は、Ｐ及びＭに関する一方の方向に配向する繰り返し配列を含むゲノム遺伝子座を包含することが意図される。
【００４１】
増幅単位は、細胞内の目的ポリペプチド及び必須酵素の発現を提供する。所定の場合において、領域Ｐ及び領域Ｍは、独立して目的ポリペプチド及び必須酵素に用いられる発現カセット（すなわち、プロモーターと操作可能に連結するコーディング配列）をそれぞれ含むことが出来る。いくつかの実施態様において、前記増幅単位は、前記目的ポリペプチドを発現するための第１発現カセット及び前記必須酵素を発現するための第２発現カセットを含む。他の実施態様において、前記領域Ｐのコーディング配列は、前記隣接した繰り返し配列に存在するプロモーターと操作可能に連結されることが出来る。この実施態様において、また以下でより詳しく議論するように、前記繰り返し配列及び前記必須酵素のコーディング配列が組み合わされたヌクレオチド配列は、前記細胞に内因性である、すなわち、前記宿主細胞のゲノムに見られることが出来る。所定の実施態様において、前記領域Ｍのコーディング配列と操作可能に連結するプロモーターは、そのコーディング配列に内因性または非内因性とすることが出来る。所定の実施態様において、前記領域Ｍのコーディング配列は、前記Ｐのコーディング配列と操作可能に連結するプロモーターにより誘導されることが出来る。
【００４２】
容易に明らかなように、本明細書で記載される核酸のいずれかにおける前記Ｐ及びＭの配向は、逆の配向（すなわち、Ａ１−Ｍ−Ｐ−Ａ２）とすることも出来る。この逆の配向及び所定の実施態様において、領域Ｍのコーディング配列は、繰り返し配列Ａ１でプロモーターと操作可能に連結されることが出来る。あるいは、領域Ｍのコーディング配列は、領域Ｍに存在するプロモーターと操作可能に連結されることが出来る。
【００４３】
前記細胞の集団は、必須酵素の阻害剤と接触される。また、阻害剤に耐性のある細胞（すなわち、阻害剤が存在する状態で、増殖及び分裂し、コロニーを形成することが出来る細胞）が選択される。図１に示すように、選択された細胞は、増幅単位の複数のコピーを含むゲノム遺伝子座を有する。前記ゲノム遺伝子座は、式（Ａ１−Ｐ−Ｍ）ｎ−Ａ２により記載されることが出来る。ここで、Ａ１及びＡ２は繰り返し配列であり、ｎは少なくとも２である。ｎは、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または少なくとも１０、例えば、１０〜５０または５０〜１００、またはそれ以上の範囲等とすることが出来る。選択されていない細胞に比べて、前記選択された細胞は、必須酵素のコーディング配列（例えば、阻害剤の結合部位に）または前記コーディング配列と連結するプロモーターに変異を有さない。むしろ、選択された細胞は、阻害剤がある状態での細胞の増殖を可能にする、増幅単位のコピー数の増加が見られる。所定の場合において、細胞の集団は、各回で連続的に増加する阻害剤の濃度（例えば、連続倍加の阻害剤の濃度）を用いた、数回の選択を受けることが出来る。いくつかの実施態様において、前記Ａ１−Ｐ−Ｍ−Ａ２増幅単位は、配列番号７で示すポリヌクレオチド配列を含む。
【００４４】
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ここで、反復単位Ａ１及びＡ２は下線で示し、目的タンパク質、すなわち、ズブチリシンＦＮＡをコードするポリヌクレオチド配列は太字で示す。また、必須酵素、例えば、アラニンラセマーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、イタリック体で示す。プロモーター配列は、太字の大文字で示す。
【００４５】
前記方法により作られた宿主細胞は、第１発現カセットのより多くのコピーを含むため、Ａ１−Ｐ−Ｍ−Ａ２増幅単位の単一コピーを有する宿主細胞より前記細胞は、第１発現カセットでコードされたより多くの目的ポリペプチドを生産することが出来る。所定の実施態様において、結果として生じる宿主細胞は、Ａ１−Ｐ−Ｍ−Ａ２増幅単位の単一のコピーを有する他の同一宿主細胞と比べ、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍または少なくとも１０倍、最高で約１００倍多くのタンパク質を生成することが出来る。
【００４６】
本発明の方法で使用される阻害剤の濃度は、用いられる必須酵素及び阻害剤の性能に応じて変化することが出来る。所定の実施態様において、前記阻害剤は、１μＭから１００ｍＭ、例えば、５μＭから１０ｍＭ、２０μＭから１ｍＭの範囲の濃度とすることが出来る。もっとも、それらの範囲外での阻害剤濃度も想定される。前記阻害剤は、液体培養に加えられるか、または細菌が増殖する固形培地（例えば、寒天培地）に存在することも出来る。上述のように、前記細胞の集団は、各回で連続的に増加する阻害剤の濃度（例えば、連続倍加の阻害剤の濃度）を用いた、数回の選択を受けることが出来る。
【００４７】
所定の実施態様において、前記増幅単位は、抗生物質耐性マーカーを含まず、また細胞選択は、抗生物質のない培地で行われることが出来る。
【００４８】
前記第１及び第２発現カセット及び宿主細胞については、以下でより詳しく記載する。
【００４９】
発現カセット
上述のように、前記増幅単位は、目的ポリペプチドの発現及び必須酵素の発現を提供する。そのため、前記増幅単位は一般に、少なくとも２個の発現カセットを含む。すなわち、目的ポリペプチドの発現に用いられる第１発現カセット及び必須酵素の発現に用いられる第２発現カセットである。各発現カセットは、操作可能な連結でプロモーター、コーディング配列及びターミネーターを含む。所定の場合において、前記増幅単位の領域Ｐは第１発現カセットを含むことができ、また前記増幅単位の領域Ｍは第２発現カセットを含むことが出来る。他の場合において、また上述のように、領域Ｐに隣接する繰り返し配列は、領域Ｐのコーディング配列と操作可能に連結するプロモーターを含むことが出来る。所定の場合において、前記領域Ｐの隣接ヌクレオチド配列及び前記領域Ｐに隣接する繰り返し配列は、宿主細胞に内因性である（すなわち、宿主細胞のゲノムに存在する）ことが出来る。特定の実施態様において、領域Ｍのコーディング配列は、領域Ｐのプロモーターと操作可能に連結することが出来る。
【００５０】
本明細書で説明する各発現カセットは、操作可能な連結でプロモーター、コーディング配列及びターミネーター配列を含むことが出来る。ここで、前記発現カセットは、宿主細胞内のタンパク質生産に十分な量である。以下でより詳しく説明するように、第１発現カセットのコーディング配列は、組み換えタンパク質、例えば、治療用タンパク質またはいわゆる「産業酵素」をコードすることが出来る。特定の実施態様において、このコーディング配列は、前記細胞からのタンパク質の分泌を提供するシグナル配列を有するタンパク質をコードすることが出来る。上述のように、また以下でより詳しく記載するように、第２発現カセットは、必須酵素の発現を提供する。
【００５１】
前記プロモーター、ターミネーター及びシグナル配列の選択は、使用される場合、大部分が用いられる宿主細胞に依存する。宿主細胞は、バチルス種宿主細胞、ストレプトミセス種宿主細胞、大腸菌及びその他の細菌性宿主細胞を含む。上述のように、模範的な実施態様において、ストレプトミセス宿主細胞が使用されることが出来る。その場合においてシグナル配列は、使用される場合、ｃｅｌＡシグナル配列とすることが出来る。所定の場合において、前記ｃｅｌＡシグナル配列は、Ｋｌｕｅｐｆｅｌ他（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９６年、第１４巻、７５６−７５９頁）で説明されるように、Ｓ．リビダンス・セルラーゼＡ遺伝子、ＣｅｌＡでコードされるシグナル配列とすることが出来る。バチルス宿主細胞が使用されるその他の模範的な実施態様において、前記シグナル配列は、バチルス宿主細胞の分泌経路に融合タンパク質を導くことが出来る、アミノ酸の任意の配列とすることが出来る。所定の場合において、使用され得るシグナル配列は、野生型バチルス細胞から分泌されるタンパク質のシグナル配列を含む。前記シグナル配列は、α−アミラーゼ、プロテアーゼ、例えば、ａｐｒＥまたはズブチリシンＥ、またはβ−ラクタマーゼ遺伝子でコードされたシグナル配列を含む。模範的なシグナル配列は、α−アミラーゼ遺伝子、ズブチリシン遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、中性プロテアーゼ遺伝子（例えば、ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）またはＢ．ステロサーモフィラス、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．クラウジイ、Ｂ．ズブチリス及びＢ．アミロリケファシエンスを非限定的に含む、任意の適切なバチルス種由来のｐｒｓＡ遺伝子でコードされたシグナル配列を含むが、これらに限られない。一の実施態様において、前記シグナル配列は、（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００３年、第６２巻、３６９−７３頁で説明されるように）Ｂ．ズブチリスのａｐｒＥ遺伝子でコードされる。別のシグナルペプチドが、Ｓｉｍｏｎｅｎ及びＰａｌｖａ（微生物学概論（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ）、１９９３年、第５７巻、１０９−１３７頁）及びその他の参考文献で説明される。
【００５２】
バチルス及びストレプトミセス宿主細胞で使用される、適切なプロモーター及びターミネーターは既に知られ、ａｐｒ（アルカリプロテアーゼ）、ｎｐｒ（中性プロテアーゼ）、ａｍｙ（α−アミラーゼ）及びβ−ラクタマーゼ遺伝子のプロモーター及びターミネーターや、Ｂ．ズブチリス・レバンスクラーゼ（ｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ）遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂ．リケニフォルミス・アルファ・アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂ．ステロサーモフィラス・マルトジェニック（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ）・アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂ．アミロリケファシエンス・アルファ・アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂ．リケニフォルミス・ペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂ．ズブチリスｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子、国際公開番号ＷＯ９３／１０２４９、ＷＯ９８／０７８４６及びＷＯ９９／４３８３５で説明されるプロモーター及びターミネーターを含む。ストレプトミセス宿主細胞で使用される発現カセットは、Ｈｏｐｗｏｏｄ他（ストレプトミセスの遺伝子操作：ラボラトリーマニュアル（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバー研究室、１９８５年、Ｈｏｐｗｏｏｄ他（Ｂｏｏｔｈ，Ｉ．及びＨｉｇｇｉｎｓ，Ｃ．編集、一般微生物学、遺伝子発現調節学会シンポジウム（Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、ケンブリッジ大学出版、１９８６年、２５１−２７６頁内の抗生物質生産ストレプトミセスにおける遺伝子発現の調節（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ））、Ｆｏｒｎｗａｌｄ他（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９８７年、第８４巻、２１３０−２１３４頁）、Ｐｕｌｉｄｏ他（Ｇｅｎｅ、１９８７年、第５６巻、２７７−８２頁）、Ｄｅｈｏｔｔａｙ他（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８７年、第１６６巻、３４５−５０頁）、田口（Ｇｅｎｅ、１９８９年、第８４巻、２７９−８６頁）、Ｓｃｈｍｉｔｔ−Ｊｏｈｎ他（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９２年、第３６巻、４９３−８頁）、Ｍｏｔａｍｅｄｉ（Ｇｅｎｅ、１９９５年、第１６０巻、２５−３１頁）及びＢｉｎｎｉｅ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．、１９９７年、第１１巻、２７１−８頁）等で説明されるプロモーター及びターミネーターを用いて構築することが出来る。一の実施態様において、参照により本明細書に組み込まれる国際公開番号ＷＯ０６／０５４９９７で説明される、Ａ４プロモーターを使用することが出来る。
【００５３】
所定の実施態様において、コーディング配列のいずれかは、使用される宿主細胞内の目的ポリペプチドの発現のためにコドン最適化されることが出来る。多くの細胞内での各コドンの使用頻度を列挙したコドン使用頻度表が当該技術分野（例えば、中村他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第２８巻、２９２頁、２０００年を参照されたい）で知られるか、または容易に導き出せることから、このような核酸は、前記タンパク質のアミノ酸配列を発現させるように容易に設計されることが出来る。
【００５４】
ストレプトミセス及びバチルス宿主細胞内の組換え型タンパク質の発現に用いられるシステムは、当該技術分野でよく知られ、上述されるものよりも詳細な説明は必要とされない。
【００５５】
第１発現カセット
第１発現カセットは、プロモーター及び目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド（すなわち、コーディング配列）を含むことが出来る。ここで、前記単離された核酸がポリヌクレオチドの転写及び目的タンパク質の生産を引き起こすように、前記プロモーター及びポリヌクレオチドは操作可能に連結される。
【００５６】
前記コードされた目的タンパク質は、いわゆる「産業酵素」、治療用タンパク質、リポータータンパク質、食品添加物または食料等とすることが出来る。
【００５７】
一の実施態様において、目的タンパク質は、液化及び糖化α−アミラーゼ、アルカリα−アミラーゼ、β−アミラーゼ、セルラーゼ、デキストラナーゼ、α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペントサナーゼ（ｐｅｎｔｏｓａｎａｓｅ）、キシラナーゼ、インベルターゼ、ラクターゼ、ナリンガナーゼ（ｎａｒｉｎｇａｎａｓｅ）、ペクチナーゼあるいはプルラナーゼ等のカルボヒドラーゼ、酸性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、ブロメライン、フィシン、中性プロテアーゼ、パパイン、ペプシン、ペプチダーゼ、レンネット、レンニン、キモシン、ズブチリシン、サーモリシン、アスパラギン酸プロテイナーゼあるいはトリプシン等のプロテアーゼ、トリグリセリダーゼ、ホスホリパーゼ、前胃（ｐｒｅｇａｓｔｒｉｃ）エステラーゼ、ホスファターゼ、フィターゼ、アミダーゼ、イミノアシラーゼ（ｉｍｉｎｏａｃｙｌａｓｅ）、グルタミナーゼ、リゾチームまたはペニシリンアシラーゼ等のリパーゼまたはエステラーゼ、グルコースイソメラーゼ等のイソメラーゼ、例えば、アミノ酸オキシダーゼ、カタラーゼ、クロロペルオキシダーゼ（ｃｈｌｏｒｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、グルコースオキシダーゼ、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼあるいはペルオキシダーゼ等のオキシドレダクターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、アスパラギン酸β−デカルボキシラーゼ、フマラーゼあるいはヒスタダーゼ（ｈｉｓｔａｄａｓｅ）等のリアーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ等のトランスフェラーゼまたはリガーゼ等の酵素とすることが出来る。
【００５８】
特定の実施態様において、前記タンパク質は、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ラッカーゼ、マンノシダーゼ、ミュータナーゼ、ペクチン分解酵素、ポリフェノールオキシダーゼ、リボヌクレアーゼまたはトランスグルタミナーゼ等とすることが出来る。
【００５９】
特定の実施態様において、第１発現カセットでコードされた目的タンパク質は、洗剤添加物タンパク質、すなわち、ａ）前記細胞から分泌され、ｂ）洗濯用洗剤に加えられる、タンパク質（例えば、酵素）である。模範的な洗剤添加物タンパク質は、プロテアーゼ、例えば、ズブチリシン、α−アミラーゼ及びリパーゼを含む。ズブチリシン、すなわち、細胞外アルカリセリンプロテアーゼが特に対象となる。ズブチリシンは、野生型ゲノムで見られるアミノ酸配列を有することが出来る（すなわち、前記ズブチリシンは自然発生のズブチリシンとすることが出来る）か、自然発生のズブチリシンの変異体とすることができ、従って、野生型ゲノムでコードされるズブチリシンと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むことが出来る。模範的なズブチリシンは、Ａｌｃａｎａｓｅ（登録商標）（ノボザイムズ）、ＦＮＡ（商標）（ジェネンコー）、Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）（ノボザイムズ）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（商標）（ジェネンコー）、ＫＡＰ（商標）（花王）、Ｅｖｅｒｌａｓｅ（商標）（ノボザイムズ）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ  ＯｘＰ（商標）（ジェネンコー）、ＦＮ４（商標）（ジェネンコー）、ＢＬＡＰ  Ｓ（商標）（ヘンケル）、ＢＬＡＰ  Ｘ（商標）（ヘンケル）、Ｅｓｐｅｒａｓｅ（登録商標）（ノボザイムズ）、Ｋａｎｎａｓｅ（商標）（ノボザイムズ）及びＰｒｏｓｐｅｒａｓｅ（商標）（ジェネンコー）を含む。他の実施態様において、ズブチリシンは、ズブチリシン１６８、ズブチリシンＢＰＮ’、ズブチリシン・カールスバーグ、ズブチリシンＤＹ、ズブチリシン１４７またはズブチリシン３０９とすることが出来る（例えば、ＥＰ４１４２７９Ｂ、ＷＯ８９／０６２７９及びＳｔａｈｌ他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９８４年、第１５９巻、８１１ー８１８頁を参照されたい）。いくつかの実施態様において、前記第１発現カセットでコードされるズブチリシンは、ＦＮＡ
ＶＲＳＫＫＬＷＩＳＬＬＦＡＬＡＬＩＦＴＭＡＦＧＳＴＳＳＡＱＡＡＧＫＳＮＧＥＫＫＹＩＶＧＦＫＱＴＭＳＴＭＳＡＡＫＫＫＤＶＩＳＥＫＧＧＫＶＱＫＱＦＫＹＶＤＡＡＳＡＴＬＮＥＫＡＶＫＥＬＫＫＤＰＳＶＡＹＶＥＥＤＨＶＡＨＡＹＡＱＳＶＰＹＧＶＳＱＩＫＡＰＡＬＨＳＱＧＹＴＧＳＮＶＫＶＡＶＩＤＳＧＩＤＳＳＨＰＤＬＫＶＡＧＧＡＳＭＶＰＳＥＴＮＰＦＱＤＮＮＳＨＧＴＨＶＡＧＴＶＡＡＬＮＮＳＩＧＶＬＧＶＡＰＳＡＳＬＹＡＶＫＶＬＧＡＤＧＳＧＱＹＳＷＩＩＮＧＩＥＷＡＩＡＮＮＭＤＶＩＮＭＳＬＧＧＰＳＧＳＡＡＬＫＡＡＶＤＫＡＶＡＳＧＶＶＶＶＡＡＡＧＮＥＧＴＳＧＳＳＳＴＶＧＹＰＧＫＹＰＳＶＩＡＶＧＡＶＤＳＳＮＱＲＡＳＦＳＳＶＧＰＥＬＤＶＭＡＰＧＶＳＩＱＳＴＬＰＧＮＫＹＧＡＬＮＧＴＳＭＡＳＰＨＶＡＧＡＡＡＬＩＬＳＫＨＰＮＷＴＮＴＱＶＲＳＳＬＥＮＴＴＴＫＬＧＤＳＦＹＹＧＫＧＬＩＮＶＱＡＡＡＱ  （配列番号８）である。ズブチリシンのプレ・プロ（ｐｒｅ−ｐｒｏ）領域はイタリック体で示され、成熟領域は太字で示される（配列番号１２）。ＦＮＡをコードするポリヌクレオチドの一例は、
ｇｔｇａｇａａｇｃａａａａａａｔｔｇｔｇｇａｔｃａｇｔｔｔｇｃｔｇｔｔｔｇｃｔｔｔａｇｃｇｔｔａａｔｃｔｔｔａｃｇａｔｇｇｃｇｔｔｃｇｇｃａｇｃａｃａｔｃｃｔｃｔｇｃｃｃａｇｇｃｇｇｃａｇｇｇａａａｔｃａａａｃｇｇｇｇａａａａｇａａａｔａｔａｔｔｇｔｃｇｇｇｔｔｔａａａｃａｇａｃａａｔｇａｇｃａｃｇａｔｇａｇｃｇｃｃｇｃｔａａｇａｇａａａｇａｔｇｔｃａｔｔｔｃｔｇａａａａａｇｇｃｇｇｇａａａｇｔｇｃａａａａｇｃａａｔｔｃａａａｔａｔｇｔａｇａｃｇｃａｇｃｔｔｃａｇｃｔａｃａｔｔａａａｃｇａａａａａｇｃｔｇｔａａａａｇａａｔｔｇａａａａａａｇａｃｃｃｇａｇｃｇｔｃｇｃｔｔａｃｇｔｔｇａａｇａａｇａｔｃａｃｇｔａｇｃａｃａｔｇｃｇｔａｃｇｃｇｃａｇｔｃｃｇｔｇｃｃｔｔａｃｇｇｃｇｔａｔｃａｃａａａｔｔａａａｇｃｃｃｃｔｇｃｔｃｔｇｃａｃｔｃｔｃａａｇｇｃｔａｃａｃｔｇｇａｔｃａａａｔｇｔｔａａａｇｔａｇｃｇｇｔｔａｔｃｇａｃａｇｃｇｇｔａｔｃｇａｔｔｃｔｔｃｔｃｔｃｃｔｇａｔｔｔａａａｇｇｔａｇｃａｇｇｃｇｇａｇｃｃａｇｃａｔｇｇｔｔｃｃｔｔｃｔｇａａａｃａａａｔｃｃｔｔｔｃｃａａｇａｃａａｃａａｃｔｃｔｃａｃｇｇａａｃｔｃａｃｇｔｔｇｃｃｇｇｃａｃａｇｔｔｇｃｇｇｃｔｃｔｔａａｔａａｃｔｃａａｔｃｇｇｔｇｔａｔｔａｇｇｃｇｔｔｇｃｇｃｃａａｇｃｇｃａｔｃａｃｔｔｔａｃｇｃｔｇｔａａａａｇｔｔｃｔｃｇｇｔｇｃｔｇａｃｇｇｔｔｃｃｇｇｃｃａａｔａｃａｇｃｔｇｇａｔｃａｔｔａａｃｇｇａａｔｃｇａｇｔｇｇｇｃｇａｔｃｇｃａａａｃａａｔａｔｇｇａｃｇｔｔａｔｔａａｃａｔｇａｇｃｃｔｃｇｇｃｇｇａｃｃｔｔｃｔｇｇｔｔｃｔｇｃｔｇｃｔｔｔａａａａｇｃｇｇｃａｇｔｔｇａｔａａａｇｃｃｇｔｔｇｃａｔｃｃｇｇｃｇｔｃｇｔａｇｔｃｇｔｔｇｃｇｇｃａｇｃｃｇｇｔａａｃｇａａｇｇｃａｃｔｔｃｃｇｇｃａｇｃｔｃａａｇｃａｃａｇｔｇｇｇｃｔａｃｃｃｔｇｇｔａａａｔａｃｃｃｔｔｃｔｇｔｃａｔｔｇｃａｇｔａｇｇｃｇｃｔｇｔｔｇａｃａｇｃａｇｃａａｃｃａａａｇａｇｃａｔｃｔｔｔｃｔｃａａｇｃｇｔａｇｇａｃｃｔｇａｇｃｔｔｇａｔｇｔｃａｔｇｇｃａｃｃｔｇｇｃｇｔａｔｃｔａｔｃｃａａａｇｃａｃｇｃｔｔｃｃｔｇｇａａａｃａａａｔａｃｇｇｃｇｃｇｔｔｇａａｃｇｇｔａｃａｔｃａａｔｇｇｃａｔｃｔｃｃｇｃａｃｇｔｔ
ｇｃｃｇｇａｇｃｇｇｃｔｇｃｔｔｔｇａｔｔｃｔｔｔｃｔａａｇｃａｃｃｃｇａａｃｔｇｇａｃａａａｃａｃｔｃａａｇｔｃｃｇｃａｇｃａｇｔｔｔａｇａａａａｃａｃｃａｃｔａｃａａａａｃｔｔｇｇｔｇａｔｔｃｔｔｔｃｔａｃｔａｔｇｇａａａａｇｇｇｃｔｇａｔｃａａｃｇｔａｃａｇｇｃｇｇｃａｇｃｔｃａｇｔａａ  （配列番号９）である。
【００６０】
本明細書で使用され得る模範的なズブチリシン及びその他のプロテアーゼは、ＷＯ９９／２０７７０、ＷＯ９９／２０７２６、ＷＯ９９／２０７６９、ＷＯ８９／０６２７９、ＲＥ３４，６０６、米国特許第４，９１４，０３１号、米国特許第４，９８０，２８８号、米国特許第５，２０８，１５８号、米国特許第５，３１０，６７５号、米国特許第５，３３６，６１１号、米国特許第５，３９９，２８３号、米国特許第５，４４１，８８２号、米国特許第５，４８２，８４９号、米国特許第５，６３１，２１７号、米国特許第５，６６５，５８７号、米国特許第５，７００，６７６号、米国特許第５，７４１，６９４号、米国特許第５，８５８，７５７号、米国特許第５，８８０，０８０号、米国特許第６，１９７，５６７号及び米国特許第６，２１８，１６５号で説明されるものを含む。ズブチリシン一般は、Ｓｉｅｚｅｎ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．、１９９７年、第６巻、５０１−５２３頁）でより詳しく論評され、洗剤添加物のズブチリシンは、Ｂｒｙａｎ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、２０００年、第１５４３巻、２０３−２２２頁）、Ｍａｕｒｅｒ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００４年、第１５巻、３３０−３３４頁）及びＧｕｐｔａ（Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００２年、第５９巻、１５−３２頁）で論評される。所定の目的のズブチリシンは、ＩＵＢＭＢ酵素命名法に従って、ＥＣ３．４．４．１６として示される活性を有する。
【００６１】
他の実施態様において、目的タンパク質は、治療用タンパク質（すなわち、治療効果のある生物活性を有するタンパク質）とすることが出来る。適した治療用タンパク質の例は、エリトロポイエチン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−ο及び顆粒球−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ等のサイトカイン、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子及びヒトプロテインＣ等の凝固因子、抗トロンビンIII、トロンビン、可溶性ＩｇＥレセプターα−鎖、ＩｇＧ、ＩｇＧ断片、ＩｇＧ融合体、ＩｇＭ、ＩｇＡ、インターロイキン、ウロキナーゼ、キマーゼ及び尿素トリプシン・インヒビター、ＩＧＦ結合蛋白質、上皮成長因子、成長ホルモン放出因子、アネキシン（ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ融合タンパク質、血液造成阻害剤、血管内皮成長因子−２、骨髄性前駆体抑制因子−１、オステオプロテゲリン、α−１−抗トリプシン及びα−胎児タンパク質、デオキシリボヌクレアーゼII、ヒトプラスミノゲンのクリングル３、グルコセレブロシダーゼ、ＴＮＦ結合蛋白質１、卵胞刺激ホルモン、抗原４−Ｉｇに関連した細胞毒性Ｔリンパ球、膜貫通活性剤及びカルシウム・モジュレーター及びシクロフィリン・リガンド、可溶性ＴＮＦ受容体Ｆｃ融合体、グルカゴン様タンパク質１及びＩＬ−２受容体アゴニストを含む。抗体タンパク質、例えば、ヒト化され得るモノクローナル抗体が、特に対象となる。
【００６２】
別の実施態様において、目的タンパク質は、リポータータンパク質とすることが出来る。例えば、このようなレポータータンパク質は、光学的に検知可能かまたは発色性（ｃｏｌｏｒｉｇｅｎｉｃ）であることが出来る。この実施態様において、前記タンパク質は、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ、ノパリン・シンターゼ（ＮＯＳ）、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）または蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはそれらの派生物とすることが出来る。
【００６３】
上述のように、コーディング配列は融合タンパク質をコードすることが出来る。これらの実施態様のいくつかにおいて、融合タンパク質は、宿主細胞からの目的タンパク質の分泌を提供することが出来る。前記宿主細胞において、前記融合タンパク質は発現され、目的タンパク質のＮ末端と操作可能に連結されるシグナル配列を含むことが出来る。ここで、前記シグナル配列は、宿主細胞の分泌システムにタンパク質を導き、結果として宿主細胞が増殖する培地中へ宿主細胞からのタンパク質の分泌をもたらす、アミノ酸の配列を含む。シグナル配列は、目的タンパク質の分泌の前に融合タンパク質から開裂される。
【００６４】
第２発現カセット
第２発現カセットは、必須酵素の発現を提供する。ここで、上述のように、必須酵素は細胞増殖に用いられる細胞で必要とされる。特定の実施態様において、前記必須酵素は、所定の条件下（例えば、必須酵素のいかなる損失も取消す外因性化合物が欠失する等）でのみ細胞増殖に必要とされる、条件付きで必須とされることが出来る。所定の場合において、条件的に必須な酵素（それは酵素をコードする遺伝子の不活性化によるか、または細胞を酵素の阻害剤と接触させることにより作られてもよい）の活性を欠く細胞は、外因性化合物を加えることにより培養中で増殖することが出来る。前記外因性化合物は、所定の場合において酵素または代替炭素源の生産物であることが出来る。従って、所定の場合において、第２発現カセット内で使用される前記必須酵素は、細胞内で不在の場合に、細胞を特定の化合物に対して栄養要求的にするか、１以上の特定の炭素源を利用できなくする酵素であることが出来る。
【００６５】
このような必須酵素／阻害剤の組み合わせの例は既に知られ、例えば、アミノ酸合成に関与する酵素及びその各々の阻害剤、及び特定の炭素源の利用に関与する酵素及びその各々の阻害剤を含む。このような酵素／阻害剤の組み合わせの例については、以下に示す。アミノ酸の合成に関与する酵素をコードする遺伝子の不活化により、そのアミノ酸に対しての栄養要求性がもたらされる。同様に、特定の炭素源の利用に関与する酵素をコードする遺伝子の不活性化は、別の炭素源に対しての栄養要求性をもたらす。前記酵素は、阻害剤を開裂しない。むしろ、前記阻害剤は、可逆的かつ特異的に前記酵素の触媒作用を競争的にまたは非競争的に阻害する。
【００６６】
一の実施態様において、前記酵素は、（ｍｅｔＥ、ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）アクセス番号Ｕ５２８１２でコードされた）Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素とすることが出来る（Ｙｏｃｕｍ他、バチルス・ズブチリスに由来するＳ‐アデノシルメチオニン合成酵素をコードするｍｅｔＥ遺伝子のクローニング及び評価（Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｔＥ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ．）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９９６年、第１７８巻、４６０４頁を参照されたい）。前記合成酵素は、メチオニン類似物、プリン類似物、８−アザグアニン及びアザチオプリン（Ｂｅｒｇｅｒ他、マイコバクテリウム・スメグマティス及びＭ．チュバルクロシスに由来するメチオニンアデノシルトランスフェラーゼの評価（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ａｄｅｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ  ａｎｄ  Ｍ．  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．）、ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２００３年、第３巻、１２頁）と同様にシクロルイシン（ｃｙｃｌｏｌｅｕｃｉｎｅ）（Ｃｈｉａｎｇ  他、熱帯熱マラリア原虫Ｓ‐アデノシルメチオニン合成酵素の分子評価（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．、１９９９年、第３４４巻、５７１−６頁）により阻害されることが出来る。Ｓ−アデノシルメチオニン合成酵素遺伝子の不活性化は、メチオニン栄養要求性をもたらす。
【００６７】
別の実施態様において、前記酵素は、３−カルボキシ−２−ヒドロキシ−４−メチルペンタノアートから３−カルボキシ−４−メチル−２−オキソペンタノアートへの転換を触媒する、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼとすることが出来る。この酵素は、ｌｅｕＢによりコードされる。また、ｌｅｕＢ−欠損株は、ロイシン栄養要求性である。３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼは、例えば、Ｏ−イソブテニルオキサリルヒドロキサネート（Ｏ−ｉｓｏｂｕｔｅｎｙｌ＿ｏｘａｌｙｌｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅ）により阻害されることが出来る（Ｓｉｎｇｈ他、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００５年、第３４６巻、１−１１頁からのＬｅｕＢ（Ｒｖ２９９５ｃ）の高分解能構造（Ｔｈｅ  Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ＬｅｕＢ  （Ｒｖ２９９５ｃ）））。
【００６８】
別の実施態様において、前記酵素は、メソ−２，６−ジアミノヘプタンジオアートからＬ−リシンへの転換を触媒し、ｌｙｓＡによりコードされる、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼとすることが出来る。ｌｙｓＡ−欠損株は、リシン栄養要求性になる。ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの阻害剤は、ランチオニン・スルフォキシド、ランチオニン・スルホンのメソ及びＬＬ異性体、ランチオニン、Ｎ−ヒドロキシジアミノピメリン酸４及びＮ−アミノジアミノピメリン酸５を含むＮ−修飾類似物（Ｋｅｌｌａｎｄ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８６年、バシラス・スフェリカス及びコムギ麦芽由来のメソ−ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼの阻害剤としてのジアミノピメリン酸の類似物（Ａｎａｌｏｇｓ  ｏｆ  ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｍｅｓｏ−ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｅｌａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  ａｎｄ  ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ．）、第２６１巻、１３２１６−１３２２３頁を参照されたい）を含むが、これらに限られないジアミノピメリン酸の類似物を含む。
【００６９】
別の実施態様において、前記酵素は、５−アミノ・レブリン酸の合成を触媒し、ｈｅｍＡによりコードされる、グルタミルｔＲＮＡ還元酵素とすることが出来る。ｈｅｍＡ−欠損株は、５−アミノ・レブリン酸またはヘミンに対して栄養要求性である。この酵素は、グルタマイシン（ｇｌｕｔａｍｙｃｉｎ）により阻害されることが出来る（Ｓｃｈａｕｅｒ他、大腸菌グルタミルｔＲＮＡ還元酵素（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｇｌｕｔａｍｙｌ−ｔＲＮＡ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００２年、第２７７巻、４８６５７−４８６６３頁）。
【００７０】
別の実施態様において、前記酵素は、Ｌ−アラニン及びＤ−アラニンの相互転換を触媒し、ａｌｒ（ｄａｌとしても知られる）によりコードされる、Ｄ−アラニンラセマーゼとすることが出来る。ａｌｒ欠損株は、細胞膜生合成に必要とされる、Ｄ−アラニンに対して栄養要求性である。Ｄ−アラニンラセマーゼの阻害剤は、Ｄ‐シクロセリン、β−クロロ−Ｄ−アラニン及びＯ−カルバミル−Ｄ−セリンを含むが、それらに限られない（例えば、Ｍａｎｎｉｎｇ他、β−クロロ−Ｄ−アラニンによる細菌増殖の阻害（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｂｙ  β−ｃｈｌｏｒｏ−Ｄ−ａｌａｎｉｎｅ）、ＰＮＡＳ、１９７４年、第７１巻、４１７−４２１頁を参照されたい）。いくつかの実施態様において、前記第２発現カセットは、例えば、以下のポリヌクレオチドを含む。すなわち、ａｔｇａｇｃａｃ  ａａａａｃｃｔｔｔｔ  ｔａｃａｇａｇａｔａ  ｃｇｔｇｇｇｃｇｇａ  ａａｔｔｇａｃｔｔｇ  ｔｃｃｇｃｇａｔａａ  ａｇｇａａａａｔｇｔ  ｃａｇｃａａｔａｔｇ  ａａａａａａｃａｔａ  ｔｃｇｇｔｇａａｃａ  ｔｇｔｃｃａｃｔｔｇ  ａｔｇｇｃａｇｔｔｇ  ｔｇａａａｇｃａａａ  ｃｇｃｃｔａｃｇｇｇ  ｃａｔｇｇｔｇａｔｇ  ｃａｇａａａｃａｇｃ  ａａａｇｇｃｔｇｃｔ  ｃｔｔｇａｃｇｃａｇ  ｇｔｇｃｔｔｃａｔｇ  ｃｔｔｇｇｃｃｇｔｇ  ｇｃｃａｔｔｔｔｇｇ  ａｔｇａａｇｃｇａｔ  ｔｔｃａｃｔｇｃｇｃ  ａａａａａｇｇｇａｔ  ｔｇａａｇｇｃｇｃｃ  ｔａｔａｔｔｇｇｔｇ  ｃｔｔｇｇｃｇｃｇｇ  ｔｔｃｃｃｃｃｇｇａ  ｇｔａｔｇｔｇｇｃａ  ａｔｃｇｃｔｇｃｔｇ  ａｇｔａｔｇａｃｇｔ  ｇａｃｃｔｔａａｃａ  ｇｇｔｔａｔｔｃｔｇ  ｔｔｇａａｔｇｇｃｔ  ｔｃａｇｇａｇｇｃａ  ｇｃｃｃｇｃｃａｃａ  ｃｇａａａａａａｇｇ  ｔｔｃｔｃｔｔｃａｔ  ｔｔｔｃａｔｃｔｇａ  ａｇｇｔｃｇａｔａｃ  ｇｇｇｇａｔｇａａｃ  ａｇａｃｔｔｇｇｔｇ  ｔａａａａａｃａｇａ  ｇｇａａｇａａｇｔｔ  ｃａｇａａｃｇｔｇａ  ｔｇｇｃａａｔｔｃｔ  ｔｇａｃｃｇｃａａｃ  ｃｃｔｃｇｔｔｔａａ  ａｇｔｇｃａａａｇｇ  ｇｇｔａｔｔｔａｃｃ  ｃａｔｔｔｔｇｃｇａ  ｃａｇｃｇｇａｔｇａ  ａａａａｇａａａｇａ  ｇｇｃｔａｔｔｔｃｔ  ｔａａｔｇｃａｇｔｔ  ｔｇａｇｃｇｃｔｔｔ  ａａａｇａｇｃｔｇａ  ｔｔｇｃｔ
ｃｃｇｃｔ  ｇｃｃｇｔｔａａａｇ  ａａｔｃｔａａｔｇｇ  ｔｃｃａｃｔｇｃｇｃ  ｇａａｃａｇｃｇｃｃ  ｇｃｔｇｇａｃｔｃｃ  ｇｇｃｔｇａａａａａ  ａｇｇｃｔｔｔｔｔｔ  ａａｔｇｃａｇｔｃａ  ｇａｔｔｃｇｇｃａｔ  ｃｇｇｃａｔｇｔａｔ  ｇｇｃｃｔｔｃｇｃｃ  ｃｇｔｃｔｇｃｔｇａ  ｃａｔｇｔｃｇｇａｃ  ｇａｇａｔａｃｃｇｔ  ｔｔｃａｇｃｔｇｃｇ  ｔｃｃｇｇｃａｔｔｔ  ａｃｃｃｔｇｃａｔｔ  ｃｇａｃａｃｔｇｔｃ  ａｃａｔｇｔｃａａａ  ｃｔｇａｔｃａｇａａ  ａａｇｇｃｇａｇａｇ  ｃｇｔｃａｇｃｔａｃ  ｇｇａｇｃｃｇａｇｔ  ａｃａｃａｇｃｇｇａ  ａａａａｇａｃａｃａ  ｔｇｇａｔｃｇｇｇａ  ｃｇｇｔｇｃｃｔｇｔ  ａｇｇｃｔａｔｇｃｇ  ｇａｃｇｇｃｔｇｇｃ  ｔｃｃｇａａａａｔｔ  ｇａａａｇｇｇａｃｃ  ｇａｃａｔｃｃｔｔｇ  ｔｇａａｇｇｇａａａ  ａｃｇｃｃｔｇａａａ  ａｔｔｇｃｃｇｇｃｃ  ｇａａｔｔｔｇｃａｔ  ｇｇａｃｃａａｔｔｔ  ａｔｇｇｔｇｇａｇｃ  ｔｇｇａｔｃａｇｇａ  ａｔａｔｃｃｇｃｃｇ  ｇｇｃａｃａａａａｇ  ｔｃａｃａｔｔａａｔ  ａｇｇｃｃｇｇｃａｇ  ｇｇｇｇａｔｇａａｔ  ａｔａｔｔｔｃｃａｔ  ｇｇａｔｇａｇａｔｔ  ｇｃａｇｇａａｇｇｃ  ｔｃｇａａａｃｃａｔ  ｔａａｃｔａｔｇａｇ  ｇｔｇｇｃｃｔｇｔａ  ｃａａｔａａｇｔｔｃ  ｃｃｇｔｇｔｔｃｃｃ  ｃｇｔａｔｇｔｔｔｔ  ｔｇｇａａａａｔｇｇ  ｇａｇｔａｔａａｔｇ  ｇａａｇｔａａｇａａ  ａｔｃｃｔｔｔａｔｔ  ｇｃａｇｇｔａａａｔ  ａｔａａｇｃａａｔｔ  ａａ  （配列番号１０）である。前記ポリヌクレオチドは、Ｄ−アラニンラセマーゼ
ＭＳＴＫＰＦＹＲＤＴＷＡＥＩＤＬＳＡＩＫＥＮＶＳＮＭＫＫＨＩＧＥＨＶＨＬＭＡＶＶＫＡＮＡＹＧＨＧＤＡＥＴＡＫＡＡＬＤＡＧＡＳＣＬＡＶＡＩＬＤＥＡＩＳＬＲＫＫＧＬＫＡＰＩＬＶＬＧＡＶＰＰＥＹＶＡＩＡＡＥＹＤＶＴＬＴＧＹＳＶＥＷＬＱＥＡＡＲＨＴＫＫＧＳＬＨＦＨＬＫＶＤＴＧＭＮＲＬＧＶＫＴＥＥＥＶＱＮＶＭＡＩＬＤＲＮＰＲＬＫＣＫＧＶＦＴＨＦＡＴＡＤＥＫＥＲＧＹＦＬＭＱＦＥＲＦＫＥＬＩＡＰＬＰＬＫＮＬＭＶＨＣＡＮＳＡＡＧＬＲＬＫＫＧＦＦＮＡＶＲＦＧＩＧＭＹＧＬＲＰＳＡＤＭＳＤＥＩＰＦＱＬＲＰＡＦＴＬＨＳＴＬＳＨＶＫＬＩＲＫＧＥＳＶＳＹＧＡＥＹＴＡＥＫＤＴＷＩＧＴＶＰＶＧＹＡＤＧＷＬＲＫＬＫＧＴＤＩＬＶＫＧＫＲＬＫＩＡＧＲＩＣＭＤＱＦＭＶＥＬＤＱＥＹＰＰＧＴＫＶＴＬＩＧＲＱＧＤＥＹＩＳＭＤＥＩＡＧＲＬＥＴＩＮＹＥＶＡＣＴＩＳＳＲＶＰＲＭＦＬＥＮＧＳＩＭＥＶＲＮＰＬＬＱＶＮＩＳＮ  （配列番号１１）をコードする。
【００７１】
阻害剤が用いられることが出来るその他の必須酵素は、キシロースイソメラーゼ（ｘｙｌＡ）、グルコン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．１．１２）、グルコン酸塩透過酵素（ｇｎｔＫまたはｇｎｔＰ）、グリセロール・キナーゼ、グリセロール脱水素酵素、例えば、ｇｌｐＰ、ｇｌｐＦ、ｇｌｐＫあるいはｇｌｐＤまたは、例えば、アラビノース・イソメラーゼ（ａｒａＡ）を含む。
【００７２】
特定の実施態様において、前記第２発現カセットは、内因性の必須酵素の遺伝子が細胞内で野生型（すなわち、不活性化されない場合）内因性の必須酵素のレベルの５０％以上（例えば、少なくとも約７０％、少なくとも約９０％または少なくとも約１００％、最高で少なくとも約１０００％）のレベルに必須酵素が生産される、必須酵素の有意な発現を提供する。
【００７３】
所定の実施態様において、前記領域Ｍによりコードされた必須酵素は、野生型の必須酵素のアミノ酸配列を有するという点で自然発生のものであることが出来る。他の実施態様において、領域Ｍによりコードされた必須酵素は、自然発生の酵素の変異体になり得、例えば、自然発生の必須酵素と少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一または少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列を有することが出来る。
【００７４】
特定の実施態様において、前記必須酵素は、自然発生のアミノ酸配列を有することができ、所定の実施態様において、前記必須酵素は、任意の不活性化変異前において宿主細胞のゲノムによりコードされるアミノ酸配列を有するという点で宿主細胞に内因性であることが出来る。
【００７５】
特定の実施態様において、発現カセットのヌクレオチド配列（すなわち、プロモーター、コーディング配列及びターミネーター）は、任意の不活性化変異前において宿主細胞の内因性遺伝子とすることが出来る。このような遺伝子は、発現カセットの遺伝子座と異なるゲノム遺伝子座にあることが出来る。
【００７６】
本発明に係る方法の実施に必ずしも必要とされないが、前記必須酵素の内因性遺伝子（すなわち、Ａ１−Ｐ−Ｍ−Ａ２遺伝子座を未含有の宿主細胞に存在する遺伝子）は、変異により不活性化されることが出来る。特異的に細菌遺伝子を不活性化する方法、例えば、欠失、置換または挿入による方法等は、当該技術分野でよく知られている。
【００７７】
宿主細胞
本明細書で用いられる細菌性宿主細胞は、グラム陽性菌またはグラム陰性菌になり得、バチルス種細菌、例えば、バチルス・クラウジイ、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・シルクランス、バチルス・コアグランス、バチルス・ラウタス、バチルス・レンタス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ステロサーモフィラス、バチルス・ズブチリスまたはバチルス・チューリンゲンシス細菌等、ストレプトミセス種細菌、例えば、Ｓ．リビダンス、Ｓ．カルボフィラス、Ｓ．ヘルバチカス、Ｓ．ルビギノサスまたはＳ．ムリナス細菌等、シュードモナス種細菌及び大腸菌を含むが、それらに限られない。特定の場合において、前記細菌性宿主細胞は、、ＧＲＡＳ状態、すなわち、通常ＦＤＡにより安全であると認識される状態にある、タンパク質の生産に利用される使用歴のある株の細胞とすることが出来る。
【００７８】
Ｂ．ズブチリス宿主細胞は、米国特許５，２６４，３６６及び４，７６０，０２５（ＲＥ  ３４，６０６）で説明されるものと同様に、１Ａ６（ＡＴＣＣ  ３９０８５）、１６８（１Ａ０１）、ＳＢ１９、Ｗ２３、Ｔｓ８５、Ｂ６３７、ＰＢ１７５３からＰＢ１７５８、ＰＢ３３６０、ＪＨ６４２、１Ａ２４３（ＡＴＣＣ  ３９，０８７）、ＡＴＣＣ  ２１３３２、ＡＴＣＣ  ６０５１、ＭＩ１１３、ＤＥ１００（ＡＴＣＣ  ３９，０９４）、ＧＸ４９３１、ＰＢＴ  １１０及びＰＥＰ  ２１１株（例えば、Ｈｏｃｈ他、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９７３年、第７３巻、２１５−２２８頁、米国特許第４，４５０，２３５号、米国特許第４，３０２，５４４号及びＥＰ０１３４０４８等を参照されたい）を含むが、それらに限られない。発現宿主としてのＢ．ズブチリスの使用は、例えば、Ｐａｌｖａ他等にも説明される（Ｐａｌｖａ他、Ｇｅｎｅ、１９８２年、第１９巻、８１−８７頁を参照されたい。さらに、Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ及びＦｉｓｃｈｅｒ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９８６年、第１６５巻、７９６−８０４頁及びＷａｎｇ  他、Ｇｅｎｅ、１９８８年、第６９巻、３９−４７頁も参照されたい）。
【００７９】
特定の実施態様において、前記バチルス宿主細胞はタンパク質発現を最大限にするために設計されることができ、そのため、次の遺伝子、ｄｅｇＵ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＲ及びｄｅｇＱの少なくとも１において不活性化する改変を含むことが出来る。Ｍｓａｄｅｋ他（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９９０年、第１７２巻、８２４−８３４頁）及びＯｌｍｏｓ他（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９７年、第２５３巻、５６２−５６７頁）を参照されたい。一の株は、バチルス・ズブチリス種であり、ｄｅｇＵ３２（Ｈｙ）変異を有する。別の実施態様において、前記バチルス宿主細胞は、ｓｃｏＣ４（Ｃａｌｄｗｅｌｌ他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、２００１年、第１８３巻、７３２９−７３４０頁を参照されたい）、ｓｐｏＩＩＥ（Ａｒｉｇｏｎｉ他、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９９年、第３１巻、１４０７−１４１５頁を参照されたい）、ｏｐｐオペロン内のｏｐｐＡまたは別の遺伝子（Ｐｅｒｅｇｏ  他、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９１年、第５巻、１７３−１８５頁を参照されたい）での変異または欠失を含むことが出来る。
【００８０】
本発明に係る方法で用いられる前記細菌性細胞は、細菌性宿主細胞のゲノムに組み換え核酸を挿入することにより作成されることが出来る。特定の実施態様において、前記細胞は、Ｊｕｎｇ他（Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９８年、第４４巻、１０７−１１１頁）、Ｔａｎｇｎｅｙ他（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．Ｌｅｔｔ．、１９９５年、第１２５巻、１０７−１１４頁）、Ｐｅｔｉｔ他（ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９９２年、第１１巻、１３１７−１３２６頁）、米国特許第５，７３３，７５３号及び公開米国特許出願第２００７０１３４７６０号の方法のような、確立している方法と類似の方法を用いた相同または非相同の組み換えにより作成されることが出来る。
【００８１】
前記宿主細胞は、必須酵素をコードする不活性化された内因性遺伝子を有するか、または有さない。
【００８２】
タンパク質生産方法
上記の細胞を用いた方法も提供される。所定の実施態様において、本発明に係る方法は、細胞の集団を培養し、第１発現カセットによりコードされる目的タンパク質を生産する工程を含む。所定の実施態様において、また上述するように、前記目的タンパク質は培養地へ分泌されることが出来る。前記方法の特定の実施態様は、培養地から目的タンパク質を回収する工程を含む。
【００８３】
目的タンパク質は、任意の好都合な方法、例えば、当該技術分野で知られる沈殿、遠心分離、親和性、濾過または任意の他の方法等により、培養基から回収されることが出来る。例えば、親和性クロマトグラフィー（Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈ他、１９８４年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、第１６巻、２１５頁）、イオン交換クロマトグラフ法（Ｇｏｙａｌ他、１９９１年、Ｂｉｏｒｅｓ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、第３６巻、３７頁、Ｆｌｉｅｓｓ他、１９８３年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第１７巻、３１４頁、Ｂｈｉｋｈａｂｈａｉ他、１９８４年、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第６巻、３３６頁及びＥｌｌｏｕｚ他、１９８７年、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、第３９６巻、３０７頁）等の他、高解像度パワーを有する材料を用いたイオン交換（Ｍｅｄｖｅ他、１９９８年、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ、第８０８巻、１５３頁）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｔｏｍａｚ及びＱｕｅｉｒｏｚ、１９９９年、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ、第８６５巻、１２３頁）、二相分配（Ｂｒｕｍｂａｕｅｒ他、１９９９年、Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ、第７巻、２８７頁）、エタノール沈澱、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のまたはＤＥＡＥのようなカチオン交換樹脂上のクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫安沈澱及び例えば、セファデックスＧ−７５等を用いたゲル濾過等が使用されることが出来る。特定の実施態様において、前記洗剤添加物タンパク質は、培養地中の他の成分からの精製を伴わないで使用されることが出来る。所定の実施態様において、前記培養地の成分は、例えば、単に濃縮され、その後増殖培地の他の成分からの更なるタンパク質の精製を伴わないで使用されることが出来る。
【００８４】
いくつかの実施態様において、細胞は、バッチまたは連続発酵条件下で培養される。伝統的なバッチ発酵法は閉鎖系で使用され、ここで、前記培養地は発酵運転開始前に作成され、前記培地は所望の有機体と共に保温され、さらにいずれの化合物も培地に連続して添加されることなく発酵は起こる。所定の場合において、炭素源含有量ではなく、増殖培地のｐＨ及び酸素含有量がバッチ法の最中に変更される。バッチ系の代謝産物及び細胞バイオマスは、発酵が停止される時間に至るまで常時変化する。バッチ系において、細胞は通常静的誘導期から対数高度増殖期を通り、最終的に増殖が減少または停止する静止期まで発育する。非処理の場合、静止期の細胞は最終的に死滅する。一般に、対数期の細胞が大部分のタンパク質を生産する。
【００８５】
標準的バッチ系の一の変形は、「流加バッチ発酵」系である。この系において、栄養（例えば、炭素源、窒素源、塩、Ｏ２または他の栄養）は、培養内のそれらの濃度が閾値以下に低下した場合にのみ添加される。異化代謝産物抑制により細胞の代謝が抑制される傾向がある場合及び培地において栄養の制限量を有することが望ましい場合に、流加バッチ系は有用である。流加バッチ系における実際の栄養濃度の測定は、ｐＨ、溶解酸素及びＣＯ２のような排ガスの分圧等の測定可能な因子の変化に基づいて評価される。バッチ及び流加バッチ発酵は一般的であり、当該技術分野で周知である。
【００８６】
連続発酵は開放系であり、指定された発酵培地が連続的にバイオリアクターへ添加され、同時に等量の調製培地が過程において回収される。連続発酵は一般に、一定高密度での培養で維持され、細胞は主に対数増殖期にある。
【００８７】
連続発酵は、細胞増殖及び／または最終生成物濃度に影響する一因子または任意数の因子の調節を可能にする。例えば、一の実施態様において、炭素源または窒素源等の制限栄養素は、定率で維持され、他の全てのパラメーターは、調製可能である。他の系において、増殖に影響する多くの因子は、連続的に変化され得る一方、培地濁度により測定される前記細胞の濃度は一定に保たれる。連続系は、定常状態の増殖の条件維持を目指す。従って、培地の排出による細胞の損失により、発酵における細胞増殖率との均衡が保たれることが出来る。連続発酵過程に用いる栄養素及び増殖因子の調節方法並びに生成物の形成率を最大にする技術は、既に知られている。
【実施例】
【００８８】
実験
以下の実施例は、本発明の所定の好ましい実施態様及び側面を実証及びさらに例証するために提供され、それらの範囲を限定するように解釈されない。
【００８９】
材料及び方法
ＤＮＡの操作に使用した実験技術は、分子生物学の分野では標準的技術であった（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、分子クローニング：ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ））。プラスミドを調製し、挿入断片をキアゲン・キット（キアゲン社）を用いて精製した。制限エンドヌクレアーゼ及び他の酵素を、ロッシュ・アプライド・サイエンス（インディアナポリス、インディアナ州）から購入し、メーカーが推奨するように用いた。Ｆｅｒｒａｒｉ  Ｅ．及びＢ．Ｍｉｌｌｅｒ（バチルスの発現：遺伝子発現系におけるグラム陽性型：発現分野の性質の利用（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ａ  Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｍｏｄｅｌ．Ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｕｓｉｎｇ  Ｎａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｒｔ  ｏｆ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．）、１９９９年、アカデミックプレス、ニューヨーク州）で説明されるように、コンピテントＢ．ズブチリス細胞を調製した。
【００９０】
ＰＣＲ反応をメーカーの指示に従って、ヘルクラーゼ（Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ）酵素（ストラタジェン社）を用いて行った。前記反応に、２００ｎＭの各プライマー、１単位のヘルクラーゼ及び２００μＭの各ｄＮＴＰを入れた。Ｈｙｂａｉｄ（サーモ社）のＰｘＥサーマルサイクラーを以下のサイクルで用いた。すなわち、３分間９４℃の変性、続けて３０サイクルの３０秒間９４℃の変性、３０秒間５５℃のアニーリング及び１分／１ｋｂｐで増幅させるための７２℃での伸張である。その後、前記ＰＣＲ反応を、インビトロジェンの０．８％アガロースｅ−ゲル上で分析した。
【００９１】
ゲノムＤＮＡを、エッペンドルフ・フェーズ・ロック・ゲル・チューブ（エッペンドルフ社）及びそれらのプロトコールを用いて調製した。
【００９２】
Ｄ−アラニン、Ｄ‐シクロセリン及びβ−クロロ−Ｄ−アラニンを、シグマ社から得た。
【００９３】
ズブチリシンの定量
ズブチリシンの定量を、従前に説明されるように（Ｅｓｔｅｌｌ，Ｄ．Ｖ．、Ｇｒａｙｃａｒ，Ｔ．Ｐ．、Ｗｅｌｌｓ，  Ｊ．Ａ．、１９８５年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２６０巻、６５１８−６５２１頁）、１．６ｍＭ  Ｎ−スクシニル−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリド（ベガ・バイオケミカルズ）を含む０．１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８．６中で行った。前記定量では、ｐ−ニトロアニリンの放出による４１０ｎｍ／分での吸収の増加を測定した。定量を、初速度条件下で行った。プロテアーゼ単位は、４１０ｎｍでの吸光度を増加させるプロテアーゼ酵素の量として定義される。前記量は、２５℃で、１ｃｍのビーム路程があるキュベット内の上述する標準液の分当たりの１吸光度単位（ＡＵ）により、定義される。
【００９４】
細菌株
大腸菌ＭＭ２９４：ｅｎｄＡ  ｔｈｉＡ  ｈｓｄＲ１７  ｓｕｐＥ４４
バチルス・ズブチリス株ＢＧ２１９０（ａｌｒ−）及びＢＧ２１８９（ａｌｒ−ＣｍＲ）は、Ｆｅｒｒａｒｉ及びＹａｎｇ（バチルス・ズブチリス由来のアラニンラセマーゼ遺伝子の単離及びＢ．ズブチリス内のプラスミド維持のためのその用途（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｌａｎｉｎｅ  ｒａｃｅｍａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｕｓｅ  ｆｏｒ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｉｎ  Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ．）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第３巻、１００３−１００７頁、１９８５年）で説明されている。
【００９５】
Ｂ．ズブチリス株ＢＧ３５９４：ｎｐｒＥ  ａｐｒＥ  ｓｐｏＩＩＥ  ｄｅｇＵ３２  ｏｐｐＡ
Ｂ．ズブチリス株ＢＧ３５９４ｃｏｍＫ：この株は、ＷＯ０２／１４４９０で説明されるようなｘｙｌＲ−ＰｘｙｌＡ−ｃｏｍＫ構成を含むＢ．ズブチリスＢＧ３５９４である。前記構成は、この株がスーパーコンピテント（すなわち、細胞集団の１％以上は染色体バチルスＤＮＡと形質転換可能である）に作成されることを可能にする。
【００９６】
Ｂ．ズブチリス株ＣＰ３４９０：この株は、ａｌｒがノックダウンされている（ＢＧ２１９０での変異と等しい）Ｂ．ズブチリス株ＢＧ３５９４ｃｏｍＫである。
【００９７】
Ｂ．ズブチリス株ＣＰ３５４９１：この株は、ａｌｒがノックダウンされている（ＢＧ２１９０での変異と等しい）Ｂ．ズブチリス株ＢＧ３５９４である。
【００９８】
Ｂ．ズブチリスＭＤＴ０１−１３８：この株は、以下の構造の増幅可能なカセットを有するＢ．ズブチリス株ＢＧ３５９４である。すなわち、前記構造は、ａｐｒＥ  ５’−ズブチリシンＦＮＡ−クロラムフェニコール−ａｐｒＥ  ５’であり、Ｃｍ２５に増幅されている。
【００９９】
Ｂ．ズブチリス株ＣＰ４０１０：この株は、以下の構造の増幅可能なカセットを有するＢ．ズブチリス株ＢＧ３５９４  ｃｏｍＫである。すなわち、前記構造は、ａｐｒＥ  ５’−ズブチリシンＦＮＡ−ａｌｒ−ａｐｒＥ  ５’であり、β−クロロ−Ｄ−アラニンを用いて増幅されている。
【０１００】
Ｂ．ズブチリス株ＣＰ４０２０：この株は、以下の構造の増幅可能なカセットを有するＢ．ズブチリス株ＢＧ３５９４である。すなわち、前記構造は、ａｐｒＥ  ５’−ズブチリシンＦＮＡ−ａｌｒ−ａｐｒＥ  ５’であり、β−クロロ−Ｄ−アラニンを用いて増幅されている。
【０１０１】
Ｂ．ズブチリス株Ｈｙｐｅｒ１：この株は、ズブチリシンＦＮＡをコードし、クロラムフェニコール・マーカーを含む、増幅されたカセットを有する。
【０１０２】
ＣＰ３５９１：この株は、ｏｐｐＡ遺伝子座内のａｐｒＥプロモーターの後にズブチリシンＦＮＡの一のコピー（すなわち、ズブチリシン全体で１コピー）を有するＢＧ３５９４である。
【０１０３】
ＣＰ３５９２：この株は、ｙｂｄＬ及びｙｂｄＭ遺伝子の間、ａｐｒＥプロモーターの後にズブチリシンＦＮＡの一の追加的なコピー（すなわち、ズブチリシン全体で２コピー）を有するＣＰ３５９１である。
【０１０４】
ＣＰ３５９３：この株は、ｐｐｓ遺伝子座内のａｐｒＥプロモーターの後にズブチリシンＦＮＡの一の追加的なコピー（すなわち、ズブチリシン全体で３コピー）を有するＣＰ３５９２である。
【０１０５】
ＣＰ３５９４：この株は、ｎｐｒＥ遺伝子座内のａｐｒＥプロモーターの後にズブチリシンＦＮＡの一の追加的なコピー（すなわち、ズブチリシン全体で４コピー）を有するＣＰ３５９３である。
【０１０６】
プラスミド
ｐＤＡＬｓｕｂ１は、Ｆｅｒｒａｒｉ他、１９８５年で説明されている。このプラスミドは、ａｌｒを発現する（Ｆｅｒｒａｒｉ及びＹａｎｇ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第３巻、１００３−１００７頁、１９８５年）。
【０１０７】
ｐＢＳＦＮＡＣｍ（配列番号１）：このプラスミドは、ｆ１（ＩＧ）−ファージｆ１の遺伝子間領域、ｒｅｐ（ｐＭＢ１）−ファージミドの複製に関与するｐＭＢ１レプリコン、ｂｌａ（ＡｐＲ）−アンピシリンに対する抵抗を与えるβ‐ラクタマーゼをコードする遺伝子、ｌａｃＺ−ベータ−ガラクトシダーゼのＮ末端断片をコードするｌａｃＺ遺伝子の５’末端部分、ａｐｒＥ  ５’領域、ズブチリシン（ＦＮＡ）をコードする遺伝子、プロモーターを有するｐＣ１９４由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子、ａｐｒＥ  ５’領域の反復を含むポリペプチド発現カセットを含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ派生物（Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ，Ｍ．Ａ．及びＳｈｏｒｔ，Ｊ．Ｍ．、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ：遺伝子地図作製ベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ：ｇｅｎｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第１７巻（２２）、９４９４頁、１９８９年）である。このプラスミドは、５’ａｐｒＥ領域内の発現カセットを統合するために用いられる。
【０１０８】
ｐＢＳＦＮＡａｌｒ（配列番号２）：このプラスミドは、上述のｐＢＳＦＮＡＣｍの派生物である。このプラスミドにおいて、特有のプロモーターを有するＢ．ズブチリスａｌｒ遺伝子は、クロラムフェニコール耐性遺伝子と置き換わる。このプラスミドは、５’ａｐｒＥ領域内の発現カセットを統合するために用いられる。
【０１０９】
培地
ＬＢ及びＬＢ寒天（ＬＡ）を、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．他編集、「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ出版、１９９５年で説明されるように調製した。ＬＢＧ１％は、１０ｇ／ｌグルコースが補給されたＬＢである。ＬＢＳＭは、１．６％スキムミルクが補給されたＬＢ寒天である。プロテアーゼ生産の研究のために用いられるＦＮＩＩ培地は、ＷＯ０５０５２１４６Ａ２で説明される。Ａｌｒ−株は、ＬＢ寒天＋１００ｍｇ／Ｌ  Ｄ−アラニン上で増殖される。
【０１１０】
適切な場合、クロラムフェニコール、アンピシリン、シクロセリンまたはβ−クロロ−Ｄ−アラニンを、プレートまたは培養液に加えた。
【０１１１】
定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
生産される目的ポリペプチド（例えば、ズブチリシン）をコードする遺伝子のコピー数を定量するｑＰＣＲを、ＡＢＩプリズム７０００シークエンス・ディテクション・システム（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）（アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア州）で行った。ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現マスター・ミックス・キット（ＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｋｉｔ）を、メーカー（アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア州）が指示するように用いた。
【０１１２】
発酵
試験する株を、３７℃及び２５０ｒｐｍで、１０ｍｌチューブ中の５ｍｌのＬＢＧ１％で増殖した。約１以下のＯＤ６００において、２．５ｍｌの培養地を、２５０ｍｌエルレンマイアー振盪フラスコ内の２５ｍｌのＦＮＩＩ培地に植菌するために用いた。３７℃及び２５０ｒｐｍで、前記振盪フラスコを保温し、培養液サンプルを、ズブチリシン活性の測定のために規則的に採取した。
【０１１３】
実施例１
バチルス・ズブチリスＢＧ３５９４及びＢＧ３５９４，ｐＤＡＬｓｕｂ１のβ−クロロ−Ｄ−アラニン（ＣＤＡ）への感受閾値の測定
第１段階において、Ｂ．ズブチリスの増殖の阻害に必要なβ−クロロ−Ｄ−アラニン（ＣＤＡ）の濃度を、異なる濃度のＣＤＡを含むＬＢ寒天プレート上にＬＢ増殖株ＢＧ３５９４の稀釈液をプレートすることにより測定した。表１で示すように、ＢＧ３５９４は、２０ｍｇ／Ｌの濃度でも増殖可能であるが、５０ｍｇ／Ｌの濃度では完全に増殖は阻害される。第２段階において、ｐＤａｌｓｕｂ１をＢＧ３５９４に転換し、ａｌｒの過剰発現が阻害濃度のＣＤＡでの細胞の増殖を回復出来るか判定した。表１で示すように、ａｌｒ表現プラスミドの存在は、試験する全てのＣＤＡ濃度での増殖を可能にする。この結果は、増幅が起こる場合のみ、染色体にコードされた発現カセット「目的ポリペプチド−ａｌｒ」を含む株が、２０ｍｇ／Ｌを超えるＣＤＡ濃度で増殖することが出来ることを示す。ＣＤＡの代わりに、シクロセリンのような他のアラニンラセマーゼ阻害剤を用いることも出来る。
【表１】
0005659143.tif 000002
【０１１４】
実施例２
染色体にコードされた発現カセット「目的ポリペプチド・マーカー」を含む株の構築（株ＢＧ４０１０（ｃｏｍＫ）及びＢＧ４０２０）
プラスミドｐＢＳＦＮＡａｌｒ（配列番号２）を、ｐＢＳＦＮＡＣｍ（配列番号１）から以下のように構築した。特有のプロモーターを有するＢ．ズブチリスａｌｒ遺伝子を、鋳型としての染色体ＤＮＡを用いて、ＰＣＲ増幅した。使用したプライマーは、ＥｃｏＲＩＤｒｄＩａｌｒＦ（ＤｒｄＩ部位を有する、ｇａａｇａａｔｔｃｇ  ａｃｔａｇｇｔｔｇｔ  ｃｔｔｔｔｃｇｔｔａ  ｇａｃａｔｃｇｔｔｔ  ｃｃｃｔｔｔａｇｃ、配列番号３）及びＳｍａＩ−ａｌｒＲ（ＳｍａＩ部位を有する、ｇｇｔｔｃｃｃｇｇｇ  ｔｔａａｔｔｇｃｔｔ  ａｔａｔｔｔａｃｃｔ  ｇｃａａｔａａａｇｇ、配列番号４）であった。ＰＣＲ生産物を、ＤｒｄＩ／ＳｍａＩで消化し、ＢｓｍＩ／ＳｔｕＩ−消化ｐＢＳＦＮＡＣｍのより大きな断片と再連結した。連結体を、大腸菌株ＭＭ２９４内に形質転換し、カルベニシリン５０ｐｐｍ上にプレートした。この形質転換体からの４個のコロニーを、プラスミド精製のために５ｍｌ  ＬＢ＋カルベニシリン５０ｐｐｍに植菌した。得られた構成物を、ｐＢＳＦＮＡａｌｒ（配列番号２）とした。
【０１１５】
ｐＢＳＦＮＡＣｍ（配列番号１）
ｃｔａａａｔｔｇｔａ  ａｇｃｇｔｔａａｔａ  ｔｔｔｔｇｔｔａａａ  ａｔｔｃｇｃｇｔｔａ  ａａｔｔｔｔｔｇｔｔ  ａａａｔｃａｇｃｔｃ  ６０
ａｔｔｔｔｔｔａａｃ  ｃａａｔａｇｇｃｃｇ  ａａａｔｃｇｇｃａａ  ａａｔｃｃｃｔｔａｔ  ａａａｔｃａａａａｇ  ａａｔａｇａｃｃｇａ  １２０
ｇａｔａｇｇｇｔｔｇ  ａｇｔｇｔｔｇｔｔｃ  ｃａｇｔｔｔｇｇａａ  ｃａａｇａｇｔｃｃａ  ｃｔａｔｔａａａｇａ  ａｃｇｔｇｇａｃｔｃ  １８０
ｃａａｃｇｔｃａａａ  ｇｇｇｃｇａａａａａ  ｃｃｇｔｃｔａｔｃａ  ｇｇｇｃｇａｔｇｇｃ  ｃｃａｃｔａｃｇｔｇ  ａａｃｃａｔｃａｃｃ  ２４０
ｃｔａａｔｃａａｇｔ  ｔｔｔｔｔｇｇｇｇｔ  ｃｇａｇｇｔｇｃｃｇ  ｔａａａｇｃａｃｔａ  ａａｔｃｇｇａａｃｃ  ｃｔａａａｇｇｇａｇ  ３００
ｃｃｃｃｃｇａｔｔｔ  ａｇａｇｃｔｔｇａｃ  ｇｇｇｇａａａｇｃｃ  ｇｇｃｇａａｃｇｔｇ  ｇｃｇａｇａａａｇｇ  ａａｇｇｇａａｇａａ  ３６０
ａｇｃｇａａａｇｇａ  ｇｃｇｇｇｃｇｃｔａ  ｇｇｇｃｇｃｔｇｇｃ  ａａｇｔｇｔａｇｃｇ  ｇｔｃａｃｇｃｔｇｃ  ｇｃｇｔａａｃｃａｃ  ４２０
ｃａｃａｃｃｃｇｃｃ  ｇｃｇｃｔｔａａｔｇ  ｃｇｃｃｇｃｔａｃａ  ｇｇｇｃｇｃｇｔｃｃ  ｃａｔｔｃｇｃｃａｔ  ｔｃａｇｇｃｔｇｃｇ  ４８０
ｃａａｃｔｇｔｔｇｇ  ｇａａｇｇｇｃｇａｔ  ｃｇｇｔｇｃｇｇｇｃ  ｃｔｃｔｔｃｇｃｔａ  ｔｔａｃｇｃｃａｇｃ  ｔｇｇｃｇａａａｇｇ  ５４０
ｇｇｇａｔｇｔｇｃｔ  ｇｃａａｇｇｃｇａｔ  ｔａａｇｔｔｇｇｇｔ  ａａｃｇｃｃａｇｇｇ  ｔｔｔｔｃｃｃａｇｔ  ｃａｃｇａｃｇｔｔｇ  ６００
ｔａａａａｃｇａｃｇ  ｇｃｃａｇｔｇａｇｃ  ｇｃｇｃｇｔａａｔａ  ｃｇａｃｔｃａｃｔａ  ｔａｇｇｇｃｇａａｔ  ｔｇｇａｇｃｔｃｃａ  ６６０
ｃｃｇｃｇｇｔｇｇｃ  ｇｇｃｃｇｃｔｃｔａ  ｇａａｃｔａｇｔｇｇ  ａｔｃｃｃｃｃｇｇｇ  ｃｔｇｃａｇｇａａｔ  ｔｃｔｃｃａｔｔｔｔ  ７２０
ｃｔｔｃｔｇｃｔａｔ  ｃａａａａｔａａｃａ  ｇａｃｔｃｇｔｇａｔ  ｔｔｔｃｃａａａｃｇ  ａｇｃｔｔｔｃａａａ  ａａａｇｃｃｔｃｔｇ  ７８０
ｃｃｃｃｔｔｇｃａａ  ａｔｃｇｇａｔｇｃｃ  ｔｇｔｃｔａｔａａａ  ａｔｔｃｃｃｇａｔａ  ｔｔｇｇｔｔａａａｃ  ａｇｃｇｇｃｇｃａａ  ８４０
ｔｇｇｃｇｇｃｃｇｃ  ａｔｃｔｇａｔｇｔｃ  ｔｔｔｇｃｔｔｇｇｃ  ｇａａｔｇｔｔｃａｔ  ｃｔｔａｔｔｔｃｔｔ  ｃｃｔｃｃｃｔｃｔｃ  ９００
ａａｔａａｔｔｔｔｔ  ｔｃａｔｔｃｔａｔｃ  ｃｃｔｔｔｔｃｔｇｔ  ａａａｇｔｔｔａｔｔ  ｔｔｔｃａｇａａｔａ  ｃｔｔｔｔａｔｃａｔ  ９６０
ｃａｔｇｃｔｔｔｇａ  ａａａａａｔａｔｃａ  ｃｇａｔａａｔａｔｃ  ｃａｔｔｇｔｔｃｔｃ  ａｃｇｇａａｇｃａｃ  ａｃｇｃａｇｇｔｃａ  １０２０
ｔｔｔｇａａｃｇａａ  ｔｔｔｔｔｔｃｇａｃ  ａｇｇａａｔｔｔｇｃ  ｃｇｇｇａｃｔｃａｇ  ｇａｇｃａｔｔｔａａ  ｃｃｔａａａａａａｇ  １０８０
ｃａｔｇａｃａｔｔｔ  ｃａｇｃａｔａａｔｇ  ａａｃａｔｔｔａｃｔ  ｃａｔｇｔｃｔａｔｔ  ｔｔｃｇｔｔｃｔｔｔ  ｔｃｔｇｔａｔｇａａ  １１４０
ａａｔａｇｔｔａｔｔ  ｔｃｇａｇｔｃｔｃｔ  ａｃｇｇａａａｔａｇ  ｃｇａｇａｇａｔｇａ  ｔａｔａｃｃｔａａａ  ｔａｇａｇａｔａａａ  １２００
ａｔｃａｔｃｔｃａａ  ａａａａａｔｇｇｇｔ  ｃｔａｃｔａａａａｔ  ａｔｔａｔｔｃｃａｔ  ｃｔａｔｔａｃａａｔ  ａａａｔｔｃａｃａｇ  １２６０
ａａｔａｇｔｃｔｔｔ  ｔａａｇｔａａｇｔｃ  ｔａｃｔｃｔｇａａｔ  ｔｔｔｔｔｔａａａａ  ｇｇａｇａｇｇｇｔａ  ａａｇａｇｔｇａｇａ  １３２０
ａｇｃａａａａａａｔ  ｔｇｔｇｇａｔｃａｇ  ｔｔｔｇｃｔｇｔｔｔ  ｇｃｔｔｔａｇｃｇｔ  ｔａａｔｃｔｔｔａｃ  ｇａｔｇｇｃｇｔｔｃ  １３８０
ｇｇｃａｇｃａｃａｔ  ｃｃｔｃｔｇｃｃｃａ  ｇｇｃｇｇｃａｇｇｇ  ａａａｔｃａａａｃｇ  ｇｇｇａａａａｇａａ  ａｔａｔａｔｔｇｔｃ  １４４０
ｇｇｇｔｔｔａａａｃ  ａｇａｃａａｔｇａｇ  ｃａｃｇａｔｇａｇｃ  ｇｃｃｇｃｔａａｇａ  ａｇａａａｇａｔｇｔ  ｃａｔｔｔｃｔｇａａ  １５００
ａａａｇｇｃｇｇｇａ  ａａｇｔｇｃａａａａ  ｇｃａａｔｔｃａａａ  ｔａｔｇｔａｇａｃｇ  ｃａｇｃｔｔｃａｇｃ  ｔａｃａｔｔａａａｃ  １５６０
ｇａａａａａｇｃｔｇ  ｔａａａａｇａａｔｔ  ｇａａａａａａｇａｃ  ｃｃｇａｇｃｇｔｃｇ  ｃｔｔａｃｇｔｔｇａ  ａｇａａｇａｔｃａｃ  １６２０
ｇｔａｇｃａｃａｔｇ  ｃｇｔａｃｇｃｇｃａ  ｇｔｃｃｇｔｇｃｃｔ  ｔａｃｇｇｃｇｔａｔ  ｃａｃａａａｔｔａａ  ａｇｃｃｃｃｔｇｃｔ  １６８０
ｃｔｇｃａｃｔｃｔｃ  ａａｇｇｃｔａｃａｃ  ｔｇｇａｔｃａａａｔ  ｇｔｔａａａｇｔａｇ  ｃｇｇｔｔａｔｃｇａ  ｃａｇｃｇｇｔａｔｃ  １７４０
ｇａｔｔｃｔｔｃｔｃ  ａｔｃｃｔｇａｔｔｔ  ａａａｇｇｔａｇｃａ  ｇｇｃｇｇａｇｃｃａ  ｇｃａｔｇｇｔｔｃｃ  ｔｔｃｔｇａａａｃａ  １８００
ａａｔｃｃｔｔｔｃｃ  ａａｇａｃａａｃａａ  ｃｔｃｔｃａｃｇｇａ  ａｃｔｃａｃｇｔｔｇ  ｃｃｇｇｃａｃａｇｔ  ｔｇｃｇｇｃｔｃｔｔ  １８６０
ａａｔａａｃｔｃａａ  ｔｃｇｇｔｇｔａｔｔ  ａｇｇｃｇｔｔｇｃｇ  ｃｃａａｇｃｇｃａｔ  ｃａｃｔｔｔａｃｇｃ  ｔｇｔａａａａｇｔｔ  １９２０
ｃｔｃｇｇｔｇｃｔｇ  ａｃｇｇｔｔｃｃｇｇ  ｃｃａａｔａｃａｇｃ  ｔｇｇａｔｃａｔｔａ  ａｃｇｇａａｔｃｇａ  ｇｔｇｇｇｃｇａｔｃ  １９８０
ｇｃａａａｃａａｔａ  ｔｇｇａｃｇｔｔａｔ  ｔａａｃａｔｇａｇｃ  ｃｔｃｇｇｃｇｇａｃ  ｃｔｔｃｔｇｇｔｔｃ  ｔｇｃｔｇｃｔｔｔａ  ２０４０
ａａａｇｃｇｇｃａｇ  ｔｔｇａｔａａａｇｃ  ｃｇｔｔｇｃａｔｃｃ  ｇｇｃｇｔｃｇｔａｇ  ｔｃｇｔｔｇｃｇｇｃ  ａｇｃｃｇｇｔａａｃ  ２１００
ｇａａｇｇｃａｃｔｔ  ｃｃｇｇｃａｇｃｔｃ  ａａｇｃａｃａｇｔｇ  ｇｇｃｔａｃｃｃｔｇ  ｇｔａａａｔａｃｃｃ  ｔｔｃｔｇｔｃａｔｔ  ２１６０
ｇｃａｇｔａｇｇｃｇ  ｃｔｇｔｔｇａｃａｇ  ｃａｇｃａａｃｃａａ  ａｇａｇｃａｔｃｔｔ  ｔｃｔｃａａｇｃｇｔ  ａｇｇａｃｃｔｇａｇ  ２２２０
ｃｔｔｇａｔｇｔｃａ  ｔｇｇｃａｃｃｔｇｇ  ｃｇｔａｔｃｔａｔｃ  ｃａａａｇｃａｃｇｃ  ｔｔｃｃｔｇｇａａａ  ｃａａａｔａｃｇｇｃ  ２２８０
ｇｃｇｔｔｇａａｃｇ  ｇｔａｃａｔｃａａｔ  ｇｇｃａｔｃｔｃｃｇ  ｃａｃｇｔｔｇｃｃｇ  ｇａｇｃｇｇｃｔｇｃ  ｔｔｔｇａｔｔｃｔｔ  ２３４０
ｔｃｔａａｇｃａｃｃ  ｃｇａａｃｔｇｇａｃ  ａａａｃａｃｔｃａａ  ｇｔｃｃｇｃａｇｃａ  ｇｔｔｔａｇａａａａ  ｃａｃｃａｃｔａｃａ  ２４００
ａａａｃｔｔｇｇｔｇ  ａｔｔｃｔｔｔｃｔａ  ｃｔａｔｇｇａａａａ  ｇｇｇｃｔｇａｔｃａ  ａｃｇｔａｃａｇｇｃ  ｇｇｃａｇｃｔｃａｇ  ２４６０
ｔａａａａｃａｔａａ  ａａａａｃｃｇｇｃｃ  ｔｔｇｇｃｃｃｃｇｃ  ｃｇｇｔｔｔｔｔｔａ  ｔｔａｔｔｔｔｔｃｔ  ｔｃｃｔｃｃｇｃａｔ  ２５２０
ｇｔｔｃａａｔｃｃｇ  ｃｔｃｃａｔａａｔｃ  ｇａｃｇｇａｔｇｇｃ  ｔｃｃｃｔｃｔｇａａ  ａａｔｔｔｔａａｃｇ  ａｇａａａｃｇｇｃｇ  ２５８０
ｇｇｔｔｇａｃｃｃｇ  ｇｃｔｃａｇｔｃｃｃ  ｇｔａａｃｇｇｃｃａ  ａｇｔｃｃｔｇａａａ  ｃｇｔｃｔｃａａｔｃ  ｇｃｃｇｃｔｔｃｃｃ  ２６４０
ｇｇｔｔｔｃｃｇｇｔ  ｃａｇｃｔｃａａｔｇ  ｃｃｇｔａａｃｇｇｔ  ｃｇｇｃｇｇｃｇｔｔ  ｔｔｃｃｔｇａｔａｃ  ｃｇｇｇａｇａｃｇｇ  ２７００
ｃａｔｔｃｇｔａａｔ  ｃｇｇａｔｃｃｔｃｔ  ａｇａｇｔｃｇａｔｔ  ｔｔｔａｃａａｇａａ  ｔｔａｇｃｔｔｔａｔ  ａｔａａｔｔｔｃｔｇ  ２７６０
ｔｔｔｔｔｃｔａａａ  ｇｔｔｔｔａｔｃａｇ  ｃｔａｃａａａａｇａ  ｃａｇａａａｔｇｔａ  ｔｔｇｃａａｔｃｔｔ  ｃａａｃｔａａａｔｃ  ２８２０
ｃａｔｔｔｇａｔｔｃ  ｔｃｔｃｃａａｔａｔ  ｇａｃｇｔｔｔａａｔ  ａａａｔｔｔｃｔｇａ  ａａｔａｃｔｔｇａｔ  ｔｔｃｔｔｔｇｔｔｔ  ２８８０
ｔｔｔｃｔｃａｇｔａ  ｔａｃｔｔｔｔｃｃａ  ｔｇｔｔａｔａａｃａ  ｃａｔａａａａａｃａ  ａｃｔｔａｇｔｔｔｔ  ｃａｃａａａｃｔａｔ  ２９４０
ｇａｃａａｔａａａａ  ａａａｇｔｔｇｃｔｔ  ｔｔｔｃｃｃｃｔｔｔ  ｃｔａｔｇｔａｔｇｔ  ｔｔｔｔｔａｃｔａｇ  ｔｃａｔｔｔａａａａ  ３０００
ｃｇａｔａｃａｔｔａ  ａｔａｇｇｔａｃｇａ  ａａａａｇｃａａｃｔ  ｔｔｔｔｔｔｇｃｇｃ  ｔｔａａａａｃｃａｇ  ｔｃａｔａｃｃａａｔ  ３０６０
ａａｃｔｔａａｇｇｇ  ｔａａｃｔａｇｃｃｔ  ｃｇｃｃｇｇｃａａｔ  ａｇｔｔａｃｃｃｔｔ  ａｔｔａｔｃａａｇａ  ｔａａｇａａａｇａａ  ３１２０
ａａｇｇａｔｔｔｔｔ  ｃｇｃｔａｃｇｃｔｃ  ａａａｔｃｃｔｔｔａ  ａａａａａａｃａｃａ  ａａａｇａｃｃａｃａ  ｔｔｔｔｔｔａａｔｇ  ３１８０
ｔｇｇｔｃｔｔｔａｔ  ｔｃｔｔｃａａｃｔａ  ａａｇｃａｃｃｃａｔ  ｔａｇｔｔｃａａｃａ  ａａｃｇａａａａｔｔ  ｇｇａｔａａａｇｔｇ  ３２４０
ｇｇａｔａｔｔｔｔｔ  ａａａａｔａｔａｔａ  ｔｔｔａｔｇｔｔａｃ  ａｇｔａａｔａｔｔｇ  ａｃｔｔｔｔａａａａ  ａａｇｇａｔｔｇａｔ  ３３００
ｔｃｔａａｔｇａａｇ  ａａａｇｃａｇａｃａ  ａｇｔａａｇｃｃｔｃ  ｃｔａａａｔｔｃａｃ  ｔｔｔａｇａｔａａａ  ａａｔｔｔａｇｇａｇ  ３３６０
ｇｃａｔａｔｃａａａ  ｔｇａａｃｔｔｔａａ  ｔａａａａｔｔｇａｔ  ｔｔａｇａｃａａｔｔ  ｇｇａａｇａｇａａａ  ａｇａｇａｔａｔｔｔ  ３４２０
ａａｔｃａｔｔａｔｔ  ｔｇａａｃｃａａｃａ  ａａｃｇａｃｔｔｔｔ  ａｇｔａｔａａｃｃａ  ｃａｇａａａｔｔｇａ  ｔａｔｔａｇｔｇｔｔ  ３４８０
ｔｔａｔａｃｃｇａａ  ａｃａｔａａａａｃａ  ａｇａａｇｇａｔａｔ  ａａａｔｔｔｔａｃｃ  ｃｔｇｃａｔｔｔａｔ  ｔｔｔｃｔｔａｇｔｇ  ３５４０
ａｃａａｇｇｇｔｇａ  ｔａａａｃｔｃａａａ  ｔａｃａｇｃｔｔｔｔ  ａｇａａｃｔｇｇｔｔ  ａｃａａｔａｇｃｇａ  ｃｇｇａｇａｇｔｔａ  ３６００
ｇｇｔｔａｔｔｇｇｇ  ａｔａａｇｔｔａｇａ  ｇｃｃａｃｔｔｔａｔ  ａｃａａｔｔｔｔｔｇ  ａｔｇｇｔｇｔａｔｃ  ｔａａａａｃａｔｔｃ  ３６６０
ｔｃｔｇｇｔａｔｔｔ  ｇｇａｃｔｃｃｔｇｔ  ａａａｇａａｔｇａｃ  ｔｔｃａａａｇａｇｔ  ｔｔｔａｔｇａｔｔｔ  ａｔａｃｃｔｔｔｃｔ  ３７２０
ｇａｔｇｔａｇａｇａ  ａａｔａｔａａｔｇｇ  ｔｔｃｇｇｇｇａａａ  ｔｔｇｔｔｔｃｃｃａ  ａａａｃａｃｃｔａｔ  ａｃｃｔｇａａａａｔ  ３７８０
ｇｃｔｔｔｔｔｃｔｃ  ｔｔｔｃｔａｔｔａｔ  ｔｃｃａｔｇｇａｃｔ  ｔｃａｔｔｔａｃｔｇ  ｇｇｔｔｔａａｃｔｔ  ａａａｔａｔｃａａｔ  ３８４０
ａａｔａａｔａｇｔａ  ａｔｔａｃｃｔｔｃｔ  ａｃｃｃａｔｔａｔｔ  ａｃａｇｃａｇｇａａ  ａａｔｔｃａｔｔａａ  ｔａａａｇｇｔａａｔ  ３９００
ｔｃａａｔａｔａｔｔ  ｔａｃｃｇｃｔａｔｃ  ｔｔｔａｃａｇｇｔａ  ｃａｔｃａｔｔｃｔｇ  ｔｔｔｇｔｇａｔｇｇ  ｔｔａｔｃａｔｇｃａ  ３９６０
ｇｇａｔｔｇｔｔｔａ  ｔｇａａｃｔｃｔａｔ  ｔｃａｇｇａａｔｔｇ  ｔｃａｇａｔａｇｇｃ  ｃｔａａｔｇａｃｔｇ  ｇｃｔｔｔｔａｔａａ  ４０２０
ｔａｔｇａｇａｔａａ  ｔｇｃｃｇａｃｔｇｔ  ａｃｔｔｔｔｔａｃａ  ｇｔｃｇｇｔｔｔｔｃ  ｔａａｔｇｔｃａｃｔ  ａａｃｃｔｇｃｃｃｃ  ４０８０
ｇｔｔａｇｔｔｇａａ  ｇａａｇｇｔｔｔｔｔ  ａｔａｔｔａｃａｇｃ  ｔｃｃａｇａｔｃｃａ  ｔａｔｃｃｔｔｃｔｔ  ｔｔｔｃｔｇａａｃｃ  ４１４０
ｇａｃｔｔｃｔｃｃｔ  ｔｔｔｔｃｇｃｔｔｃ  ｔｔｔａｔｔｃｃａａ  ｔｔｇｃｔｔｔａｔｔ  ｇａｃｇｔｔｇａｇｃ  ｃｔｃｇｇａａｃｃｃ  ４２００
ｔｔａａｃａａｔｃｃ  ｃａａａａｃｔｔｇｔ  ｃｇａａｔｇｇｔｃｇ  ｇｃｔｔａａｔａｇｃ  ｔｃａｃｇｃｔａｔｇ  ｃｃｇａｃａｔｔｃｇ  ４２６０
ｔｃｔｇｃａａｇｔｔ  ｔａｇｔｔａａｇｇｇ  ｔｔｃｔｔｃｔｃａａ  ｃｇｃａｃａａｔａａ  ａｔｔｔｔｃｔｃｇｇ  ｃａｔａａａｔｇｃｇ  ４３２０
ｔｇｇｔｃｔａａｔｔ  ｔｔｔａｔｔｔｔｔａ  ａｔａａｃｃｔｔｇａ  ｔａｇｃａａａａａａ  ｔｇｃｃａｔｔｃｃａ  ａｔａｃａａａａｃｃ  ４３８０
ａｃａｔａｃｃｔａｔ  ａａｔｃｇａｃｃｇｇ  ａａｔｔａａｔｔｃｔ  ｃｃａｔｔｔｔｃｔｔ  ｃｔｇｃｔａｔｃａａ  ａａｔａａｃａｇａｃ  ４４４０
ｔｃｇｔｇａｔｔｔｔ  ｃｃａａａｃｇａｇｃ  ｔｔｔｃａａａａａａ  ｇｃｃｔｃｔｇｃｃｃ  ｃｔｔｇｃａａａｔｃ  ｇｇａｔｇｃｃｔｇｔ  ４５００
ｃｔａｔａａａａｔｔ  ｃｃｃｇａｔａｔｔｇ  ｇｔｔａａａｃａｇｃ  ｇｇｃｇｃａａｔｇｇ  ｃｇｇｃｃｇｃａｔｃ  ｔｇａｔｇｔｃｔｔｔ  ４５６０
ｇｃｔｔｇｇｃｇａａ  ｔｇｔｔｃａｔｃｔｔ  ａｔｔｔｃｔｔｃｃｔ  ｃｃｃｔｃｔｃａａｔ  ａａｔｔｔｔｔｔｃａ  ｔｔｃｔａｔｃｃｃｔ  ４６２０
ｔｔｔｃｔｇｔａａａ  ｇｔｔｔａｔｔｔｔｔ  ｃａｇａａｔａｃｔｔ  ｔｔａｔｃａｔｃａｔ  ｇｃｔｔｔｇａａａａ  ａａｔａｔｃａｃｇａ  ４６８０
ｔａａｔａｔｃｃａｔ  ｔｇｔｔｃｔｃａｃｇ  ｇａａｇｃａｃａｃｇ  ｃａｇｇｔｃａｔｔｔ  ｇａａｃｇａａｔｔｔ  ｔｔｔｃｇａｃａｇｇ  ４７４０
ａａｔｔｔｇｃｃｇｇ  ｇａｃｔｃａｇｇａｇ  ｃａｔｔｔａａｃｃｔ  ａａａａａａｇｃａｔ  ｇａｃａｔｔｔｃａｇ  ｃａｔａａｔｇａａｃ  ４８００
ａｔｔｔａｃｔｃａｔ  ｇｔｃｔａｔｔｔｔｃ  ｇｔｔｃｔｔｔｔｃｔ  ｇｔａｔｇａａａａｔ  ａｇｔｔａｔｔｔｃｇ  ａｇｔｃｔｃｔａｃｇ  ４８６０
ｇａａａｔａｇｃｇａ  ｇａｇａｔｇａｔａｔ  ａｃｃｔａａａｔａｇ  ａｇａｔａａａａｔｃ  ａｔｃｔｃａａａａａ  ａａｔｇｇｇｔｃｔａ  ４９２０
ｃｔａａａａｔａｔｔ  ａｔｔｃｃａｔｃｔａ  ｔｔａｃａａｔａａａ  ｔｔｃａｃａｇａａｔ  ａｇｔｃｔｔｔｔａａ  ｇｔａａｇｔｃｔａｃ  ４９８０
ｔｃｔｇａａｔｔｔｔ  ｔｔｔａｔｃａａｇｃ  ｔｔａｔｃｇａｔａｃ  ｃｇｔｃｇａｃｃｔｃ  ｇａｇｇｇｇｇｇｇｃ  ｃｃｇｇｔａｃｃｃａ  ５０４０
ｇｃｔｔｔｔｇｔｔｃ  ｃｃｔｔｔａｇｔｇａ  ｇｇｇｔｔａａｔｔｇ  ｃｇｃｇｃｔｔｇｇｃ  ｇｔａａｔｃａｔｇｇ  ｔｃａｔａｇｃｔｇｔ  ５１００
ｔｔｃｃｔｇｔｇｔｇ  ａａａｔｔｇｔｔａｔ  ｃｃｇｃｔｃａｃａａ  ｔｔｃｃａｃａｃａａ  ｃａｔａｃｇａｇｃｃ  ｇｇａａｇｃａｔａａ  ５１６０
ａｇｔｇｔａａａｇｃ  ｃｔｇｇｇｇｔｇｃｃ  ｔａａｔｇａｇｔｇａ  ｇｃｔａａｃｔｃａｃ  ａｔｔａａｔｔｇｃｇ  ｔｔｇｃｇｃｔｃａｃ  ５２２０
ｔｇｃｃｃｇｃｔｔｔ  ｃｃａｇｔｃｇｇｇａ  ａａｃｃｔｇｔｃｇｔ  ｇｃｃａｇｃｔｇｃａ  ｔｔａａｔｇａａｔｃ  ｇｇｃｃａａｃｇｃｇ  ５２８０
ｃｇｇｇｇａｇａｇｇ  ｃｇｇｔｔｔｇｃｇｔ  ａｔｔｇｇｇｃｇｃｔ  ｃｔｔｃｃｇｃｔｔｃ  ｃｔｃｇｃｔｃａｃｔ  ｇａｃｔｃｇｃｔｇｃ  ５３４０
ｇｃｔｃｇｇｔｃｇｔ  ｔｃｇｇｃｔｇｃｇｇ  ｃｇａｇｃｇｇｔａｔ  ｃａｇｃｔｃａｃｔｃ  ａａａｇｇｃｇｇｔａ  ａｔａｃｇｇｔｔａｔ  ５４００
ｃｃａｃａｇａａｔｃ  ａｇｇｇｇａｔａａｃ  ｇｃａｇｇａａａｇａ  ａｃａｔｇｔｇａｇｃ  ａａａａｇｇｃｃａｇ  ｃａａａａｇｇｃｃａ  ５４６０
ｇｇａａｃｃｇｔａａ  ａａａｇｇｃｃｇｃｇ  ｔｔｇｃｔｇｇｃｇｔ  ｔｔｔｔｃｃａｔａｇ  ｇｃｔｃｃｇｃｃｃｃ  ｃｃｔｇａｃｇａｇｃ  ５５２０
ａｔｃａｃａａａａａ  ｔｃｇａｃｇｃｔｃａ  ａｇｔｃａｇａｇｇｔ  ｇｇｃｇａａａｃｃｃ  ｇａｃａｇｇａｃｔａ  ｔａａａｇａｔａｃｃ  ５５８０
ａｇｇｃｇｔｔｔｃｃ  ｃｃｃｔｇｇａａｇｃ  ｔｃｃｃｔｃｇｔｇｃ  ｇｃｔｃｔｃｃｔｇｔ  ｔｃｃｇａｃｃｃｔｇ  ｃｃｇｃｔｔａｃｃｇ  ５６４０
ｇａｔａｃｃｔｇｔｃ  ｃｇｃｃｔｔｔｃｔｃ  ｃｃｔｔｃｇｇｇａａ  ｇｃｇｔｇｇｃｇｃｔ  ｔｔｃｔｃａｔａｇｃ  ｔｃａｃｇｃｔｇｔａ  ５７００
ｇｇｔａｔｃｔｃａｇ  ｔｔｃｇｇｔｇｔａｇ  ｇｔｃｇｔｔｃｇｃｔ  ｃｃａａｇｃｔｇｇｇ  ｃｔｇｔｇｔｇｃａｃ  ｇａａｃｃｃｃｃｃｇ  ５７６０
ｔｔｃａｇｃｃｃｇａ  ｃｃｇｃｔｇｃｇｃｃ  ｔｔａｔｃｃｇｇｔａ  ａｃｔａｔｃｇｔｃｔ  ｔｇａｇｔｃｃａａｃ  ｃｃｇｇｔａａｇａｃ  ５８２０
ａｃｇａｃｔｔａｔｃ  ｇｃｃａｃｔｇｇｃａ  ｇｃａｇｃｃａｃｔｇ  ｇｔａａｃａｇｇａｔ  ｔａｇｃａｇａｇｃｇ  ａｇｇｔａｔｇｔａｇ  ５８８０
ｇｃｇｇｔｇｃｔａｃ  ａｇａｇｔｔｃｔｔｇ  ａａｇｔｇｇｔｇｇｃ  ｃｔａａｃｔａｃｇｇ  ｃｔａｃａｃｔａｇａ  ａｇｇａｃａｇｔａｔ  ５９４０
ｔｔｇｇｔａｔｃｔｇ  ｃｇｃｔｃｔｇｃｔｇ  ａａｇｃｃａｇｔｔａ  ｃｃｔｔｃｇｇａａａ  ａａｇａｇｔｔｇｇｔ  ａｇｃｔｃｔｔｇａｔ  ６０００
ｃｃｇｇｃａａａｃａ  ａａｃｃａｃｃｇｃｔ  ｇｇｔａｇｃｇｇｔｇ  ｇｔｔｔｔｔｔｔｇｔ  ｔｔｇｃａａｇｃａｇ  ｃａｇａｔｔａｃｇｃ  ６０６０
ｇｃａｇａａａａａａ  ａｇｇａｔｃｔｃａａ  ｇａａｇａｔｃｃｔｔ  ｔｇａｔｃｔｔｔｔｃ  ｔａｃｇｇｇｇｔｃｔ  ｇａｃｇｃｔｃａｇｔ  ６１２０
ｇｇａａｃｇａａａａ  ｃｔｃａｃｇｔｔａａ  ｇｇｇａｔｔｔｔｇｇ  ｔｃａｔｇａｇａｔｔ  ａｔｃａａａａａｇｇ  ａｔｃｔｔｃａｃｃｔ  ６１８０
ａｇａｔｃｃｔｔｔｔ  ａａａｔｔａａａａａ  ｔｇａａｇｔｔｔｔａ  ａａｔｃａａｔｃｔａ  ａａｇｔａｔａｔａｔ  ｇａｇｔａａａｃｔｔ  ６２４０
ｇｇｔｃｔｇａｃａｇ  ｔｔａｃｃａａｔｇｃ  ｔｔａａｔｃａｇｔｇ  ａｇｇｃａｃｃｔａｔ  ｃｔｃａｇｃｇａｔｃ  ｔｇｔｃｔａｔｔｔｃ  ６３００
ｇｔｔｃａｔｃｃａｔ  ａｇｔｔｇｃｃｔｇａ  ｃｔｃｃｃｃｇｔｃｇ  ｔｇｔａｇａｔａａｃ  ｔａｃｇａｔａｃｇｇ  ｇａｇｇｇｃｔｔａｃ  ６３６０
ｃａｔｃｔｇｇｃｃｃ  ｃａｇｔｇｃｔｇｃａ  ａｔｇａｔａｃｃｇｃ  ｇａｇａｃｃｃａｃｇ  ｃｔｃａｃｃｇｇｃｔ  ｃｃａｇａｔｔｔａｔ  ６４２０
ｃａｇｃａａｔａａａ  ｃｃａｇｃｃａｇｃｃ  ｇｇａａｇｇｇｃｃｇ  ａｇｃｇｃａｇａａｇ  ｔｇｇｔｃｃｔｇｃａ  ａｃｔｔｔａｔｃｃｇ  ６４８０
ｃｃｔｃｃａｔｃｃａ  ｇｔｃｔａｔｔａａｔ  ｔｇｔｔｇｃｃｇｇｇ  ａａｇｃｔａｇａｇｔ  ａａｇｔａｇｔｔｃｇ  ｃｃａｇｔｔａａｔａ  ６５４０
ｇｔｔｔｇｃｇｃａａ  ｃｇｔｔｇｔｔｇｃｃ  ａｔｔｇｃｔａｃａｇ  ｇｃａｔｃｇｔｇｇｔ  ｇｔｃａｃｇｃｔｃｇ  ｔｃｇｔｔｔｇｇｔａ  ６６００
ｔｇｇｃｔｔｃａｔｔ  ｃａｇｃｔｃｃｇｇｔ  ｔｃｃｃａａｃｇａｔ  ｃａａｇｇｃｇａｇｔ  ｔａｃａｔｇａｔｃｃ  ｃｃｃａｔｇｔｔｇｔ  ６６６０
ｇｃａａａａａａｇｃ  ｇｇｔｔａｇｃｔｃｃ  ｔｔｃｇｇｔｃｃｔｃ  ｃｇａｔｃｇｔｔｇｔ  ｃａｇａａｇｔａａｇ  ｔｔｇｇｃｃｇｃａｇ  ６７２０
ｔｇｔｔａｔｃａｃｔ  ｃａｔｇｇｔｔａｔｇ  ｇｃａｇｃａｃｔｇｃ  ａｔａａｔｔｃｔｃｔ  ｔａｃｔｇｔｃａｔｇ  ｃｃａｔｃｃｇｔａａ  ６７８０
ｇａｔｇｃｔｔｔｔｃ  ｔｇｔｇａｃｔｇｇｔ  ｇａｇｔａｃｔｃａａ  ｃｃａａｇｔｃａｔｔ  ｃｔｇａｇａａｔａｇ  ｔｇｔａｔｇｃｇｇｃ  ６８４０
ｇａｃｃｇａｇｔｔｇ  ｃｔｃｔｔｇｃｃｃｇ  ｇｃｇｔｃａａｔａｃ  ｇｇｇａｔａａｔａｃ  ｃｇｃｇｃｃａｃａｔ  ａｇｃａｇａａｃｔｔ  ６９００
ｔａａａａｇｔｇｃｔ  ｃａｔｃａｔｔｇｇａ  ａａａｃｇｔｔｃｔｔ  ｃｇｇｇｇｃｇａａａ  ａｃｔｃｔｃａａｇｇ  ａｔｃｔｔａｃｃｇｃ  ６９６０
ｔｇｔｔｇａｇａｔｃ  ｃａｇｔｔｃｇａｔｇ  ｔａａｃｃｃａｃｔｃ  ｇｔｇｃａｃｃｃａａ  ｃｔｇａｔｃｔｔｃａ  ｇｃａｔｃｔｔｔｔａ  ７０２０
ｃｔｔｔｃａｃｃａｇ  ｃｇｔｔｔｃｔｇｇｇ  ｔｇａｇｃａａａａａ  ｃａｇｇａａｇｇｃａ  ａａａｔｇｃｃｇｃａ  ａａａａａｇｇｇａａ  ７０８０
ｔａａｇｇｇｃｇａｃ  ａｃｇｇａａａｔｇｔ  ｔｇａａｔａｃｔｃａ  ｔａｃｔｃｔｔｃｃｔ  ｔｔｔｔｃａａｔａｔ  ｔａｔｔｇａａｇｃａ  ７１４０
ｔｔｔａｔｃａｇｇｇ  ｔｔａｔｔｇｔｃｔｃ  ａｔｇａｇｃｇｇａｔ  ａｃａｔａｔｔｔｇａ  ａｔｇｔａｔｔｔａｇ  ａａａａａｔａａａｃ  ７２００
ａａａｔａｇｇｇｇｔ  ｔｃｃｇｃｇｃａｃａ  ｔｔｔｃｃｃｃｇａａ  ａａｇｔｇｃｃａｃ（配列番号１）                                      ７２３９
ｐＢＳＦＮＡａｌｒ（配列番号２）
ｃｔａａａｔｔｇｔａ  ａｇｃｇｔｔａａｔａ  ｔｔｔｔｇｔｔａａａ  ａｔｔｃｇｃｇｔｔａ  ａａｔｔｔｔｔｇｔｔ  ａａａｔｃａｇｃｔｃ  ６０
ａｔｔｔｔｔｔａａｃ  ｃａａｔａｇｇｃｃｇ  ａａａｔｃｇｇｃａａ  ａａｔｃｃｃｔｔａｔ  ａａａｔｃａａａａｇ  ａａｔａｇａｃｃｇａ  １２０
ｇａｔａｇｇｇｔｔｇ  ａｇｔｇｔｔｇｔｔｃ  ｃａｇｔｔｔｇｇａａ  ｃａａｇａｇｔｃｃａ  ｃｔａｔｔａａａｇａ  ａｃｇｔｇｇａｃｔｃ  １８０
ｃａａｃｇｔｃａａａ  ｇｇｇｃｇａａａａａ  ｃｃｇｔｃｔａｔｃａ  ｇｇｇｃｇａｔｇｇｃ  ｃｃａｃｔａｃｇｔｇ  ａａｃｃａｔｃａｃｃ  ２４０
ｃｔａａｔｃａａｇｔ  ｔｔｔｔｔｇｇｇｇｔ  ｃｇａｇｇｔｇｃｃｇ  ｔａａａｇｃａｃｔａ  ａａｔｃｇｇａａｃｃ  ｃｔａａａｇｇｇａｇ  ３００
ｃｃｃｃｃｇａｔｔｔ  ａｇａｇｃｔｔｇａｃ  ｇｇｇｇａａａｇｃｃ  ｇｇｃｇａａｃｇｔｇ  ｇｃｇａｇａａａｇｇ  ａａｇｇｇａａｇａａ  ３６０
ａｇｃｇａａａｇｇａ  ｇｃｇｇｇｃｇｃｔａ  ｇｇｇｃｇｃｔｇｇｃ  ａａｇｔｇｔａｇｃｇ  ｇｔｃａｃｇｃｔｇｃ  ｇｃｇｔａａｃｃａｃ  ４２０
ｃａｃａｃｃｃｇｃｃ  ｇｃｇｃｔｔａａｔｇ  ｃｇｃｃｇｃｔａｃａ  ｇｇｇｃｇｃｇｔｃｃ  ｃａｔｔｃｇｃｃａｔ  ｔｃａｇｇｃｔｇｃｇ  ４８０
ｃａａｃｔｇｔｔｇｇ  ｇａａｇｇｇｃｇａｔ  ｃｇｇｔｇｃｇｇｇｃ  ｃｔｃｔｔｃｇｃｔａ  ｔｔａｃｇｃｃａｇｃ  ｔｇｇｃｇａａａｇｇ  ５４０
ｇｇｇａｔｇｔｇｃｔ  ｇｃａａｇｇｃｇａｔ  ｔａａｇｔｔｇｇｇｔ  ａａｃｇｃｃａｇｇｇ  ｔｔｔｔｃｃｃａｇｔ  ｃａｃｇａｃｇｔｔｇ  ６００
ｔａａａａｃｇａｃｇ  ｇｃｃａｇｔｇａｇｃ  ｇｃｇｃｇｔａａｔａ  ｃｇａｃｔｃａｃｔａ  ｔａｇｇｇｃｇａａｔ  ｔｇｇａｇｃｔｃｃａ  ６６０
ｃｃｇｃｇｇｔｇｇｃ  ｇｇｃｃｇｃｔｃｔａ  ｇａａｃｔａｇｔｇｇ  ａｔｃｃｃｃｃｇｇｇ  ｃｔｇｃａｇｇａａｔ  ｔｃｔｃｃａｔｔｔｔ  ７２０
ｃｔｔｃｔｇｃｔａｔ  ｃａａａａｔａａｃａ  ｇａｃｔｃｇｔｇａｔ  ｔｔｔｃｃａａａｃｇ  ａｇｃｔｔｔｃａａａ  ａａａｇｃｃｔｃｔｇ  ７８０
ｃｃｃｃｔｔｇｃａａ  ａｔｃｇｇａｔｇｃｃ  ｔｇｔｃｔａｔａａａ  ａｔｔｃｃｃｇａｔａ  ｔｔｇｇｔｔａａａｃ  ａｇｃｇｇｃｇｃａａ  ８４０
ｔｇｇｃｇｇｃｃｇｃ  ａｔｃｔｇａｔｇｔｃ  ｔｔｔｇｃｔｔｇｇｃ  ｇａａｔｇｔｔｃａｔ  ｃｔｔａｔｔｔｃｔｔ  ｃｃｔｃｃｃｔｃｔｃ  ９００
ａａｔａａｔｔｔｔｔ  ｔｃａｔｔｃｔａｔｃ  ｃｃｔｔｔｔｃｔｇｔ  ａａａｇｔｔｔａｔｔ  ｔｔｔｃａｇａａｔａ  ｃｔｔｔｔａｔｃａｔ  ９６０
ｃａｔｇｃｔｔｔｇａ  ａａａａａｔａｔｃａ  ｃｇａｔａａｔａｔｃ  ｃａｔｔｇｔｔｃｔｃ  ａｃｇｇａａｇｃａｃ  ａｃｇｃａｇｇｔｃａ  １０２０
ｔｔｔｇａａｃｇａａ  ｔｔｔｔｔｔｃｇａｃ  ａｇｇａａｔｔｔｇｃ  ｃｇｇｇａｃｔｃａｇ  ｇａｇｃａｔｔｔａａ  ｃｃｔａａａａａａｇ  １０８０
ｃａｔｇａｃａｔｔｔ  ｃａｇｃａｔａａｔｇ  ａａｃａｔｔｔａｃｔ  ｃａｔｇｔｃｔａｔｔ  ｔｔｃｇｔｔｃｔｔｔ  ｔｃｔｇｔａｔｇａａ  １１４０
ａａｔａｇｔｔａｔｔ  ｔｃｇａｇｔｃｔｃｔ  ａｃｇｇａａａｔａｇ  ｃｇａｇａｇａｔｇａ  ｔａｔａｃｃｔａａａ  ｔａｇａｇａｔａａａ  １２００
ａｔｃａｔｃｔｃａａ  ａａａａａｔｇｇｇｔ  ｃｔａｃｔａａａａｔ  ａｔｔａｔｔｃｃａｔ  ｃｔａｔｔａｃａａｔ  ａａａｔｔｃａｃａｇ  １２６０
ａａｔａｇｔｃｔｔｔ  ｔａａｇｔａａｇｔｃ  ｔａｃｔｃｔｇａａｔ  ｔｔｔｔｔｔａａａａ  ｇｇａｇａｇｇｇｔａ  ａａｇａｇｔｇａｇａ  １３２０
ａｇｃａａａａａａｔ  ｔｇｔｇｇａｔｃａｇ  ｔｔｔｇｃｔｇｔｔｔ  ｇｃｔｔｔａｇｃｇｔ  ｔａａｔｃｔｔｔａｃ  ｇａｔｇｇｃｇｔｔｃ  １３８０
ｇｇｃａｇｃａｃａｔ  ｃｃｔｃｔｇｃｃｃａ  ｇｇｃｇｇｃａｇｇｇ  ａａａｔｃａａａｃｇ  ｇｇｇａａａａｇａａ  ａｔａｔａｔｔｇｔｃ  １４４０
ｇｇｇｔｔｔａａａｃ  ａｇａｃａａｔｇａｇ  ｃａｃｇａｔｇａｇｃ  ｇｃｃｇｃｔａａｇａ  ａｇａａａｇａｔｇｔ  ｃａｔｔｔｃｔｇａａ  １５００
ａａａｇｇｃｇｇｇａ  ａａｇｔｇｃａａａａ  ｇｃａａｔｔｃａａａ  ｔａｔｇｔａｇａｃｇ  ｃａｇｃｔｔｃａｇｃ  ｔａｃａｔｔａａａｃ  １５６０
ｇａａａａａｇｃｔｇ  ｔａａａａｇａａｔｔ  ｇａａａａａａｇａｃ  ｃｃｇａｇｃｇｔｃｇ  ｃｔｔａｃｇｔｔｇａ  ａｇａａｇａｔｃａｃ  １６２０
ｇｔａｇｃａｃａｔｇ  ｃｇｔａｃｇｃｇｃａ  ｇｔｃｃｇｔｇｃｃｔ  ｔａｃｇｇｃｇｔａｔ  ｃａｃａａａｔｔａａ  ａｇｃｃｃｃｔｇｃｔ  １６８０
ｃｔｇｃａｃｔｃｔｃ  ａａｇｇｃｔａｃａｃ  ｔｇｇａｔｃａａａｔ  ｇｔｔａａａｇｔａｇ  ｃｇｇｔｔａｔｃｇａ  ｃａｇｃｇｇｔａｔｃ  １７４０
ｇａｔｔｃｔｔｃｔｃ  ａｔｃｃｔｇａｔｔｔ  ａａａｇｇｔａｇｃａ  ｇｇｃｇｇａｇｃｃａ  ｇｃａｔｇｇｔｔｃｃ  ｔｔｃｔｇａａａｃａ  １８００
ａａｔｃｃｔｔｔｃｃ  ａａｇａｃａａｃａａ  ｃｔｃｔｃａｃｇｇａ  ａｃｔｃａｃｇｔｔｇ  ｃｃｇｇｃａｃａｇｔ  ｔｇｃｇｇｃｔｃｔｔ  １８６０
ａａｔａａｃｔｃａａ  ｔｃｇｇｔｇｔａｔｔ  ａｇｇｃｇｔｔｇｃｇ  ｃｃａａｇｃｇｃａｔ  ｃａｃｔｔｔａｃｇｃ  ｔｇｔａａａａｇｔｔ  １９２０
ｃｔｃｇｇｔｇｃｔｇ  ａｃｇｇｔｔｃｃｇｇ  ｃｃａａｔａｃａｇｃ  ｔｇｇａｔｃａｔｔａ  ａｃｇｇａａｔｃｇａ  ｇｔｇｇｇｃｇａｔｃ  １９８０
ｇｃａａａｃａａｔａ  ｔｇｇａｃｇｔｔａｔ  ｔａａｃａｔｇａｇｃ  ｃｔｃｇｇｃｇｇａｃ  ｃｔｔｃｔｇｇｔｔｃ  ｔｇｃｔｇｃｔｔｔａ  ２０４０
ａａａｇｃｇｇｃａｇ  ｔｔｇａｔａａａｇｃ  ｃｇｔｔｇｃａｔｃｃ  ｇｇｃｇｔｃｇｔａｇ  ｔｃｇｔｔｇｃｇｇｃ  ａｇｃｃｇｇｔａａｃ  ２１００
ｇａａｇｇｃａｃｔｔ  ｃｃｇｇｃａｇｃｔｃ  ａａｇｃａｃａｇｔｇ  ｇｇｃｔａｃｃｃｔｇ  ｇｔａａａｔａｃｃｃ  ｔｔｃｔｇｔｃａｔｔ  ２１６０
ｇｃａｇｔａｇｇｃｇ  ｃｔｇｔｔｇａｃａｇ  ｃａｇｃａａｃｃａａ  ａｇａｇｃａｔｃｔｔ  ｔｃｔｃａａｇｃｇｔ  ａｇｇａｃｃｔｇａｇ  ２２２０
ｃｔｔｇａｔｇｔｃａ  ｔｇｇｃａｃｃｔｇｇ  ｃｇｔａｔｃｔａｔｃ  ｃａａａｇｃａｃｇｃ  ｔｔｃｃｔｇｇａａａ  ｃａａａｔａｃｇｇｃ  ２２８０
ｇｃｇｔｔｇａａｃｇ  ｇｔａｃａｔｃａａｔ  ｇｇｃａｔｃｔｃｃｇ  ｃａｃｇｔｔｇｃｃｇ  ｇａｇｃｇｇｃｔｇｃ  ｔｔｔｇａｔｔｃｔｔ  ２３４０
ｔｃｔａａｇｃａｃｃ  ｃｇａａｃｔｇｇａｃ  ａａａｃａｃｔｃａａ  ｇｔｃｃｇｃａｇｃａ  ｇｔｔｔａｇａａａａ  ｃａｃｃａｃｔａｃａ  ２４００
ａａａｃｔｔｇｇｔｇ  ａｔｔｃｔｔｔｃｔａ  ｃｔａｔｇｇａａａａ  ｇｇｇｃｔｇａｔｃａ  ａｃｇｔａｃａｇｇｃ  ｇｇｃａｇｃｔｃａｇ  ２４６０
ｔａａａａｃａｔａａ  ａａａａｃｃｇｇｃｃ  ｔｔｇｇｃｃｃｃｇｃ  ｃｇｇｔｔｔｔｔｔａ  ｔｔａｔｔｔｔｔｃｔ  ｔｃｃｔｃｃｇｃａｔ  ２５２０
ｇｔｔｃａａｔｃｃｇ  ｃｔｃｃａｔａａｔｃ  ｇａｃｇｇａｔｇｇｃ  ｔｃｃｃｔｃｔｇａａ  ａａｔｔｔｔａａｃｇ  ａｇａａａｃｇｇｃｇ  ２５８０
ｇｇｔｔｇａｃｃｃｇ  ｇｃｔｃａｇｔｃｃｃ  ｇｔａａｃｇｇｃｃａ  ａｇｔｃｃｔｇａａａ  ｃｇｔｃｔｃａａｔｃ  ｇｃｃｇｃｔｔｃｃｃ  ２６４０
ｇｇｔｔｔｃｃｇｇｔ  ｃａｇｃｔｃａａｔｇ  ｃｃｇｔａａｃｇｇｔ  ｃｇｇｃｇｇｃｇｔｔ  ｔｔｃｃｔｇａｔａｃ  ｃｇｇｇａｇａｃｔｔ  ２７００
ｔｔｃｇｔｔａｇａｃ  ａｔｃｇｔｔｔｃｃｃ  ｔｔｔａｇｃｃｔｔｔ  ａａｔｔｔｔａｇｔａ  ｔｇａｔａｔｇｔａａ  ａｔｇａｔａｔｔｇａ  ２７６０
ａｔａａａａｇｃｔａ  ｇｇａａｇｔｇｔｃｇ  ｔａａｔｇａｇｃａｃ  ａａａａｃｃｔｔｔｔ  ｔａｃａｇａｇａｔａ  ｃｇｔｇｇｇｃｇｇａ  ２８２０
ａａｔｔｇａｃｔｔｇ  ｔｃｃｇｃｇａｔａａ  ａｇｇａａａａｔｇｔ  ｃａｇｃａａｔａｔｇ  ａａａａａａｃａｔａ  ｔｃｇｇｔｇａａｃａ  ２８８０
ｔｇｔｃｃａｃｔｔｇ  ａｔｇｇｃａｇｔｔｇ  ｔｇａａａｇｃａａａ  ｃｇｃｃｔａｃｇｇｇ  ｃａｔｇｇｔｇａｔｇ  ｃａｇａａａｃａｇｃ  ２９４０
ａａａｇｇｃｔｇｃｔ  ｃｔｔｇａｃｇｃａｇ  ｇｔｇｃｔｔｃａｔｇ  ｃｔｔｇｇｃｃｇｔｇ  ｇｃｃａｔｔｔｔｇｇ  ａｔｇａａｇｃｇａｔ  ３０００
ｔｔｃａｃｔｇｃｇｃ  ａａａａａｇｇｇａｔ  ｔｇａａｇｇｃｇｃｃ  ｔａｔａｔｔｇｇｔｇ  ｃｔｔｇｇｃｇｃｇｇ  ｔｔｃｃｃｃｃｇｇａ  ３０６０
ｇｔａｔｇｔｇｇｃａ  ａｔｃｇｃｔｇｃｔｇ  ａｇｔａｔｇａｃｇｔ  ｇａｃｃｔｔａａｃａ  ｇｇｔｔａｔｔｃｔｇ  ｔｔｇａａｔｇｇｃｔ  ３１２０
ｔｃａｇｇａｇｇｃａ  ｇｃｃｃｇｃｃａｃａ  ｃｇａａａａａａｇｇ  ｔｔｃｔｃｔｔｃａｔ  ｔｔｔｃａｔｃｔｇａ  ａｇｇｔｃｇａｔａｃ  ３１８０
ｇｇｇｇａｔｇａａｃ  ａｇａｃｔｔｇｇｔｇ  ｔａａａａａｃａｇａ  ｇｇａａｇａａｇｔｔ  ｃａｇａａｃｇｔｇａ  ｔｇｇｃａａｔｔｃｔ  ３２４０
ｔｇａｃｃｇｃａａｃ  ｃｃｔｃｇｔｔｔａａ  ａｇｔｇｃａａａｇｇ  ｇｇｔａｔｔｔａｃｃ  ｃａｔｔｔｔｇｃｇａ  ｃａｇｃｇｇａｔｇａ  ３３００
ａａａａｇａａａｇａ  ｇｇｃｔａｔｔｔｃｔ  ｔａａｔｇｃａｇｔｔ  ｔｇａｇｃｇｃｔｔｔ  ａａａｇａｇｃｔｇａ  ｔｔｇｃｔｃｃｇｃｔ  ３３６０
ｇｃｃｇｔｔａａａｇ  ａａｔｃｔａａｔｇｇ  ｔｃｃａｃｔｇｃｇｃ  ｇａａｃａｇｃｇｃｃ  ｇｃｔｇｇａｃｔｃｃ  ｇｇｃｔｇａａａａａ  ３４２０
ａｇｇｃｔｔｔｔｔｔ  ａａｔｇｃａｇｔｃａ  ｇａｔｔｃｇｇｃａｔ  ｃｇｇｃａｔｇｔａｔ  ｇｇｃｃｔｔｃｇｃｃ  ｃｇｔｃｔｇｃｔｇａ  ３４８０
ｃａｔｇｔｃｇｇａｃ  ｇａｇａｔａｃｃｇｔ  ｔｔｃａｇｃｔｇｃｇ  ｔｃｃｇｇｃａｔｔｔ  ａｃｃｃｔｇｃａｔｔ  ｃｇａｃａｃｔｇｔｃ  ３５４０
ａｃａｔｇｔｃａａａ  ｃｔｇａｔｃａｇａａ  ａａｇｇｃｇａｇａｇ  ｃｇｔｃａｇｃｔａｃ  ｇｇａｇｃｃｇａｇｔ  ａｃａｃａｇｃｇｇａ  ３６００
ａａａａｇａｃａｃａ  ｔｇｇａｔｃｇｇｇａ  ｃｇｇｔｇｃｃｔｇｔ  ａｇｇｃｔａｔｇｃｇ  ｇａｃｇｇｃｔｇｇｃ  ｔｃｃｇａａａａｔｔ  ３６６０
ｇａａａｇｇｇａｃｃ  ｇａｃａｔｃｃｔｔｇ  ｔｇａａｇｇｇａａａ  ａｃｇｃｃｔｇａａａ  ａｔｔｇｃｃｇｇｃｃ  ｇａａｔｔｔｇｃａｔ  ３７２０
ｇｇａｃｃａａｔｔｔ  ａｔｇｇｔｇｇａｇｃ  ｔｇｇａｔｃａｇｇａ  ａｔａｔｃｃｇｃｃｇ  ｇｇｃａｃａａａａｇ  ｔｃａｃａｔｔａａｔ  ３７８０
ａｇｇｃｃｇｇｃａｇ  ｇｇｇｇａｔｇａａｔ  ａｔａｔｔｔｃｃａｔ  ｇｇａｔｇａｇａｔｔ  ｇｃａｇｇａａｇｇｃ  ｔｃｇａａａｃｃａｔ  ３８４０
ｔａａｃｔａｔｇａｇ  ｇｔｇｇｃｃｔｇｔａ  ｃａａｔａａｇｔｔｃ  ｃｃｇｔｇｔｔｃｃｃ  ｃｇｔａｔｇｔｔｔｔ  ｔｇｇａａａａｔｇｇ  ３９００
ｇａｇｔａｔａａｔｇ  ｇａａｇｔａａｇａａ  ａｔｃｃｔｔｔａｔｔ  ｇｃａｇｇｔａａａｔ  ａｔａａｇｃａａｔｔ  ａａｃｃｔａａｔｇａ  ３９６０
ｃｔｇｇｃｔｔｔｔａ  ｔａａｔａｔｇａｇａ  ｔａａｔｇｃｃｇａｃ  ｔｇｔａｃｔｔｔｔｔ  ａｃａｇｔｃｇｇｔｔ  ｔｔｃｔａａｔｇｔｃ  ４０２０
ａｃｔａａｃｃｔｇｃ  ｃｃｃｇｔｔａｇｔｔ  ｇａａｇａａｇｇｔｔ  ｔｔｔａｔａｔｔａｃ  ａｇｃｔｃｃａｇａｔ  ｃｃａｔａｔｃｃｔｔ  ４０８０
ｃｔｔｔｔｔｃｔｇａ  ａｃｃｇａｃｔｔｃｔ  ｃｃｔｔｔｔｔｃｇｃ  ｔｔｃｔｔｔａｔｔｃ  ｃａａｔｔｇｃｔｔｔ  ａｔｔｇａｃｇｔｔｇ  ４１４０
ａｇｃｃｔｃｇｇａａ  ｃｃｃｔｔａａｃａａ  ｔｃｃｃａａａａｃｔ  ｔｇｔｃｇａａｔｇｇ  ｔｃｇｇｃｔｔａａｔ  ａｇｃｔｃａｃｇｃｔ  ４２００
ａｔｇｃｃｇａｃａｔ  ｔｃｇｔｃｔｇｃａａ  ｇｔｔｔａｇｔｔａａ  ｇｇｇｔｔｃｔｔｃｔ  ｃａａｃｇｃａｃａａ  ｔａａａｔｔｔｔｃｔ  ４２６０
ｃｇｇｃａｔａａａｔ  ｇｃｇｔｇｇｔｃｔａ  ａｔｔｔｔｔａｔｔｔ  ｔｔａａｔａａｃｃｔ  ｔｇａｔａｇｃａａａ  ａａａｔｇｃｃａｔｔ  ４３２０
ｃｃａａｔａｃａａａ  ａｃｃａｃａｔａｃｃ  ｔａｔａａｔｃｇａｃ  ｃｔｇｃａｇｇａａｔ  ｔａａｔｔｃｃｔｃｃ  ａｔｔｔｔｃｔｔｃｔ  ４３８０
ｇｃｔａｔｃａａａａ  ｔａａｃａｇａｃｔｃ  ｇｔｇａｔｔｔｔｃｃ  ａａａｃｇａｇｃｔｔ  ｔｃａａａａａａｇｃ  ｃｔｃｔｇｃｃｃｃｔ  ４４４０
ｔｇｃａａａｔｃｇｇ  ａｔｇｃｃｔｇｔｃｔ  ａｔａａａａｔｔｃｃ  ｃｇａｔａｔｔｇｇｃ  ｔｔａａａｃａｇｃｇ  ｇｃｇｃａａｔｇｇｃ  ４５００
ｇｇｃｃｇｃａｔｃｔ  ｇａｔｇｔｃｔｔｔｇ  ｃｔｔｇｇｃｇａａｔ  ｇｔｔｃａｔｃｔｔａ  ｔｔｔｃｔｔｃｃｔｃ  ｃｃｔｃｔｃａａｔａ  ４５６０
ａｔｔｔｔｔｔｃａｔ  ｔｃｔａｔｃｃｃｔｔ  ｔｔｃｔｇｔａａａｇ  ｔｔｔａｔｔｔｔｔｃ  ａｇａａｔａｃｔｔｔ  ｔａｔｃａｔｃａｔｇ  ４６２０
ｃｔｔｔｇａａａａａ  ａｔａｔｃａｃｇａｔ  ａａｔａｔｃｃａｔｔ  ｇｔｔｃｔｃａｃｇｇ  ａａｇｃａｃａｃｇｃ  ａｇｇｔｃａｔｔｔｇ  ４６８０
ａａｃｇａａｔｔｔｔ  ｔｔｃｇａｃａｇｇａ  ａｔｔｔｇｃｃｇｇｇ  ａｃｔｃａｇｇａｇｃ  ａｔｔｔａａｃｃｔａ  ａａａａａｇｃａｔｇ  ４７４０
ａｃａｔｔｔｃａｇｃ  ａｔａａｔｇａａｃａ  ｔｔｔａｃｔｃａｔｇ  ｔｃｔａｔｔｔｔｃｇ  ｔｔｃｔｔｔｔｃｔｇ  ｔａｔｇａａａａｔａ  ４８００
ｇｔｔａｔｔｔｃｇａ  ｇｔｃｔｃｔａｃｇｇ  ａａａｔａｇｃｇａｇ  ａｇａｔｇａｔａｔａ  ｃｃｔａａａｔａｇａ  ｇａｔａａａａｔｃａ  ４８６０
ｔｃｔｃａａａａａａ  ａｔｇｇｇｔｃｔａｃ  ｔａａａａｔａｔｔａ  ｔｔｃｃａｔｃｔａｔ  ｔａｃａａｔａａａｔ  ｔｃａｃａｇａａｔａ  ４９２０
ｇｔｃｔｔｔｔａａｇ  ｔａａｇｔｃｔａｃｔ  ｃｔｇａａｔｔｔｔｔ  ｔｔａｔｃａａｇｃｔ  ｔａｔｃｇａｔａｃｃ  ｇｔｃｇａｃｃｔｃｇ  ４９８０
ａｇｇｇｇｇｇｇｃｃ  ｃｇｇｔａｃｃｃａｇ  ｃｔｔｔｔｇｔｔｃｃ  ｃｔｔｔａｇｔｇａｇ  ｇｇｔｔａａｔｔｇｃ  ｇｃｇｃｔｔｇｇｃｇ  ５０４０
ｔａａｔｃａｔｇｇｔ  ｃａｔａｇｃｔｇｔｔ  ｔｃｃｔｇｔｇｔｇａ  ａａｔｔｇｔｔａｔｃ  ｃｇｃｔｃａｃａａｔ  ｔｃｃａｃａｃａａｃ  ５１００
ａｔａｃｇａｇｃｃｇ  ｇａａｇｃａｔａａａ  ｇｔｇｔａａａｇｃｃ  ｔｇｇｇｇｔｇｃｃｔ  ａａｔｇａｇｔｇａｇ  ｃｔａａｃｔｃａｃａ  ５１６０
ｔｔａａｔｔｇｃｇｔ  ｔｇｃｇｃｔｃａｃｔ  ｇｃｃｃｇｃｔｔｔｃ  ｃａｇｔｃｇｇｇａａ  ａｃｃｔｇｔｃｇｔｇ  ｃｃａｇｃｔｇｃａｔ  ５２２０
ｔａａｔｇａａｔｃｇ  ｇｃｃａａｃｇｃｇｃ  ｇｇｇｇａｇａｇｇｃ  ｇｇｔｔｔｇｃｇｔａ  ｔｔｇｇｇｃｇｃｔｃ  ｔｔｃｃｇｃｔｔｃｃ  ５２８０
ｔｃｇｃｔｃａｃｔｇ  ａｃｔｃｇｃｔｇｃｇ  ｃｔｃｇｇｔｃｇｔｔ  ｃｇｇｃｔｇｃｇｇｃ  ｇａｇｃｇｇｔａｔｃ  ａｇｃｔｃａｃｔｃａ  ５３４０
ａａｇｇｃｇｇｔａａ  ｔａｃｇｇｔｔａｔｃ  ｃａｃａｇａａｔｃａ  ｇｇｇｇａｔａａｃｇ  ｃａｇｇａａａｇａａ  ｃａｔｇｔｇａｇｃａ  ５４００
ａａａｇｇｃｃａｇｃ  ａａａａｇｇｃｃａｇ  ｇａａｃｃｇｔａａａ  ａａｇｇｃｃｇｃｇｔ  ｔｇｃｔｇｇｃｇｔｔ  ｔｔｔｃｃａｔａｇｇ  ５４６０
ｃｔｃｃｇｃｃｃｃｃ  ｃｔｇａｃｇａｇｃａ  ｔｃａｃａａａａａｔ  ｃｇａｃｇｃｔｃａａ  ｇｔｃａｇａｇｇｔｇ  ｇｃｇａａａｃｃｃｇ  ５５２０
ａｃａｇｇａｃｔａｔ  ａａａｇａｔａｃｃａ  ｇｇｃｇｔｔｔｃｃｃ  ｃｃｔｇｇａａｇｃｔ  ｃｃｃｔｃｇｔｇｃｇ  ｃｔｃｔｃｃｔｇｔｔ  ５５８０
ｃｃｇａｃｃｃｔｇｃ  ｃｇｃｔｔａｃｃｇｇ  ａｔａｃｃｔｇｔｃｃ  ｇｃｃｔｔｔｃｔｃｃ  ｃｔｔｃｇｇｇａａｇ  ｃｇｔｇｇｃｇｃｔｔ  ５６４０
ｔｃｔｃａｔａｇｃｔ  ｃａｃｇｃｔｇｔａｇ  ｇｔａｔｃｔｃａｇｔ  ｔｃｇｇｔｇｔａｇｇ  ｔｃｇｔｔｃｇｃｔｃ  ｃａａｇｃｔｇｇｇｃ  ５７００
ｔｇｔｇｔｇｃａｃｇ  ａａｃｃｃｃｃｃｇｔ  ｔｃａｇｃｃｃｇａｃ  ｃｇｃｔｇｃｇｃｃｔ  ｔａｔｃｃｇｇｔａａ  ｃｔａｔｃｇｔｃｔｔ  ５７６０
ｇａｇｔｃｃａａｃｃ  ｃｇｇｔａａｇａｃａ  ｃｇａｃｔｔａｔｃｇ  ｃｃａｃｔｇｇｃａｇ  ｃａｇｃｃａｃｔｇｇ  ｔａａｃａｇｇａｔｔ  ５８２０
ａｇｃａｇａｇｃｇａ  ｇｇｔａｔｇｔａｇｇ  ｃｇｇｔｇｃｔａｃａ  ｇａｇｔｔｃｔｔｇａ  ａｇｔｇｇｔｇｇｃｃ  ｔａａｃｔａｃｇｇｃ  ５８８０
ｔａｃａｃｔａｇａａ  ｇｇａｃａｇｔａｔｔ  ｔｇｇｔａｔｃｔｇｃ  ｇｃｔｃｔｇｃｔｇａ  ａｇｃｃａｇｔｔａｃ  ｃｔｔｃｇｇａａａａ  ５９４０
ａｇａｇｔｔｇｇｔａ  ｇｃｔｃｔｔｇａｔｃ  ｃｇｇｃａａａｃａａ  ａｃｃａｃｃｇｃｔｇ  ｇｔａｇｃｇｇｔｇｇ  ｔｔｔｔｔｔｔｇｔｔ  ６０００
ｔｇｃａａｇｃａｇｃ  ａｇａｔｔａｃｇｃｇ  ｃａｇａａａａａａａ  ｇｇａｔｃｔｃａａｇ  ａａｇａｔｃｃｔｔｔ  ｇａｔｃｔｔｔｔｃｔ  ６０６０
ａｃｇｇｇｇｔｃｔｇ  ａｃｇｃｔｃａｇｔｇ  ｇａａｃｇａａａａｃ  ｔｃａｃｇｔｔａａｇ  ｇｇａｔｔｔｔｇｇｔ  ｃａｔｇａｇａｔｔａ  ６１２０
ｔｃａａａａａｇｇａ  ｔｃｔｔｃａｃｃｔａ  ｇａｔｃｃｔｔｔｔａ  ａａｔｔａａａａａｔ  ｇａａｇｔｔｔｔａａ  ａｔｃａａｔｃｔａａ  ６１８０
ａｇｔａｔａｔａｔｇ  ａｇｔａａａｃｔｔｇ  ｇｔｃｔｇａｃａｇｔ  ｔａｃｃａａｔｇｃｔ  ｔａａｔｃａｇｔｇａ  ｇｇｃａｃｃｔａｔｃ  ６２４０
ｔｃａｇｃｇａｔｃｔ  ｇｔｃｔａｔｔｔｃｇ  ｔｔｃａｔｃｃａｔａ  ｇｔｔｇｃｃｔｇａｃ  ｔｃｃｃｃｇｔｃｇｔ  ｇｔａｇａｔａａｃｔ  ６３００
ａｃｇａｔａｃｇｇｇ  ａｇｇｇｃｔｔａｃｃ  ａｔｃｔｇｇｃｃｃｃ  ａｇｔｇｃｔｇｃａａ  ｔｇａｔａｃｃｇｃｇ  ａｇａｃｃｃａｃｇｃ  ６３６０
ｔｃａｃｃｇｇｃｔｃ  ｃａｇａｔｔｔａｔｃ  ａｇｃａａｔａａａｃ  ｃａｇｃｃａｇｃｃｇ  ｇａａｇｇｇｃｃｇａ  ｇｃｇｃａｇａａｇｔ  ６４２０
ｇｇｔｃｃｔｇｃａａ  ｃｔｔｔａｔｃｃｇｃ  ｃｔｃｃａｔｃｃａｇ  ｔｃｔａｔｔａａｔｔ  ｇｔｔｇｃｃｇｇｇａ  ａｇｃｔａｇａｇｔａ  ６４８０
ａｇｔａｇｔｔｃｇｃ  ｃａｇｔｔａａｔａｇ  ｔｔｔｇｃｇｃａａｃ  ｇｔｔｇｔｔｇｃｃａ  ｔｔｇｃｔａｃａｇｇ  ｃａｔｃｇｔｇｇｔｇ  ６５４０
ｔｃａｃｇｃｔｃｇｔ  ｃｇｔｔｔｇｇｔａｔ  ｇｇｃｔｔｃａｔｔｃ  ａｇｃｔｃｃｇｇｔｔ  ｃｃｃａａｃｇａｔｃ  ａａｇｇｃｇａｇｔｔ  ６６００
ａｃａｔｇａｔｃｃｃ  ｃｃａｔｇｔｔｇｔｇ  ｃａａａａａａｇｃｇ  ｇｔｔａｇｃｔｃｃｔ  ｔｃｇｇｔｃｃｔｃｃ  ｇａｔｃｇｔｔｇｔｃ  ６６６０
ａｇａａｇｔａａｇｔ  ｔｇｇｃｃｇｃａｇｔ  ｇｔｔａｔｃａｃｔｃ  ａｔｇｇｔｔａｔｇｇ  ｃａｇｃａｃｔｇｃａ  ｔａａｔｔｃｔｃｔｔ  ６７２０
ａｃｔｇｔｃａｔｇｃ  ｃａｔｃｃｇｔａａｇ  ａｔｇｃｔｔｔｔｃｔ  ｇｔｇａｃｔｇｇｔｇ  ａｇｔａｃｔｃａａｃ  ｃａａｇｔｃａｔｔｃ  ６７８０
ｔｇａｇａａｔａｇｔ  ｇｔａｔｇｃｇｇｃｇ  ａｃｃｇａｇｔｔｇｃ  ｔｃｔｔｇｃｃｃｇｇ  ｃｇｔｃａａｔａｃｇ  ｇｇａｔａａｔａｃｃ  ６８４０
ｇｃｇｃｃａｃａｔａ  ｇｃａｇａａｃｔｔｔ  ａａａａｇｔｇｃｔｃ  ａｔｃａｔｔｇｇａａ  ａａｃｇｔｔｃｔｔｃ  ｇｇｇｇｃｇａａａａ  ６９００
ｃｔｃｔｃａａｇｇａ  ｔｃｔｔａｃｃｇｃｔ  ｇｔｔｇａｇａｔｃｃ  ａｇｔｔｃｇａｔｇｔ  ａａｃｃｃａｃｔｃｇ  ｔｇｃａｃｃｃａａｃ  ６９６０
ｔｇａｔｃｔｔｃａｇ  ｃａｔｃｔｔｔｔａｃ  ｔｔｔｃａｃｃａｇｃ  ｇｔｔｔｃｔｇｇｇｔ  ｇａｇｃａａａａａｃ  ａｇｇａａｇｇｃａａ  ７０２０
ａａｔｇｃｃｇｃａａ  ａａａａｇｇｇａａｔ  ａａｇｇｇｃｇａｃａ  ｃｇｇａａａｔｇｔｔ  ｇａａｔａｃｔｃａｔ  ａｃｔｃｔｔｃｃｔｔ  ７０８０
ｔｔｔｃａａｔａｔｔ  ａｔｔｇａａｇｃａｔ  ｔｔａｔｃａｇｇｇｔ  ｔａｔｔｇｔｃｔｃａ  ｔｇａｇｃｇｇａｔａ  ｃａｔａｔｔｔｇａａ  ７１４０
ｔｇｔａｔｔｔａｇａ  ａａａａｔａａａｃａ  ａａｔａｇｇｇｇｔｔ  ｃｃｇｃｇｃａｃａｔ  ｔｔｃｃｃｃｇａａａ  ａｇｔｇｃｃａｃ      ７１９８
（配列番号２）
ｐＢＳＦＮＡａｌｒを、ゲル上に流す際にＮｏｔＩ／ＳｃａＩ（バッファーＨ）で消化し、４つの断片を作成した。断片のサイズは、３６６０−２２６３−１１０５−１７４であった。カセット５’−ＦＮＡ−ａｌｒ−５’を含む最も大きな断片を、ゲル精製し、それ自身に連結させた。前記連結は、「ラピッド・ライゲーション（ｒａｐｉｄ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）」キット（ロッシュ）を用いて行った。得られたＤＮＡの環状断片を、ローリングサークル反応（アマシャム・キット）に用い、ＣＰ３５９０またはＣＰ３５９１のいずれかのコンピテント細胞に形質転換し、ＬＡ＋１．６％スキムミルク上にプレートした。また、ＢＧ３５９４またはＢＧ３５９４ｃｏｍＫのいずれかのコンピテント細胞に形質転換し、ＬＡ＋１．６％スキムミルク＋５０ｐｐｍ  ＣＤＡ上にプレートした。適正な構成を有する株は、それらのプレート上で増殖し、発現されたプロテアーゼがスキムミルクを透明化することにより輪形を示す。
【０１１６】
前記カセットは、上項で述べた株の染色体ＤＮＡを伴う形質転換及びＣＤＡ  ５０における選択により任意の株に移すことが出来る。前記カセットの増幅は、増加量のＣＤＡ（最大で２００ｐｐｍ）上に前記株を線状に付けることにより行った。１．６％スキムミルク上にプレートされた場合、増幅された株にはより大きな輪形が見られる。これは、増加量のＣＤＡ上に前記株を植え付けることで、前記カセットの増幅に至ることを実証する。
【０１１７】
実施例３
ｑＰＣＲを用いた、株ＢＧ４０２０におけるズブチリシン遺伝子のコピー数の測定
染色体ＤＮＡを、株ＣＰ３５９１、ＣＰ３５９２、ＣＰ３５９３、ＢＧ４０２０、増幅されたＢＧ４０２０及びＨｙｐｅｒ１から抽出した。ＤＮＡ濃度を測定し、各サンプルで均一の濃度に希釈した。次に、ズブチリシン遺伝子にアニールするプライマー（ＦＮＡ−Ｒ２、ｃｃａｇｔｇｔａｇｃ  ｃｔｔｇａｇａｇ、配列番号５及びＦＮＡ−Ｆ２、ａｃａａｔｇａｇｃａ  ｃｇａｔｇａｇｃ、配列番号６）を用いて、各株の均一量のＤＮＡをｑＰＣＲ反応に使用した。
【０１１８】
それぞれ１、２及び３コピーの遺伝子を用いて、株ＣＰ３５９１、ＣＰ３５９２及びＣＰ３５９３を、検量線（図３）の作成に用いた。この検量線を、ＢＧ４０２０、増幅されたＢＧ４０２０及びＭＤＴ０１−１３８におけるズブチリシンのコピー数を測定するために用いた。
【０１１９】
表２は、ＢＧ４０２０、増幅されたＢＧ４０２０及びＨｙｐｅｒ１株におけるｑＰＣＲ反応から得られたカウント数を提供する。対応するズブチリシン遺伝子のコピー数を、図３で示す検量線から導き出した。その結果は、ａｌｒマーカーを用いた増幅（増幅されたＢＧ４０２０）が、クロラムフェニコール・マーカーを用いた増幅（Ｈｙｐｅｒ１）と同等に効率的であることを示す。増幅されたＢＧ４０２０及びＨｙｐｅｒ１株の両方は、同等のコピー数、すなわち、４を含むと判定された。４０２０におけるコピー数の非整数は、増幅された遺伝子を均一の等しいコピー数で含まない細胞の集団に起因され得、２．４の値は平均を表わす。
【表２】
0005659143.tif 000003
【０１２０】
実施例４
Ｃｍまたはａｌｒ−含有カセットを用いて増幅された株からの目的ポリペプチドの生産
試験する株を、３７℃及び２５０ｒｐｍで、１０ｍｌチューブ内の５ｍｌのＬＢＧ１％で増殖した。１以下のＯＤ６００において、２．５ｍｌの培養地を、２５０ｍｌエルレンマイアー振盪フラスコ内の２５ｍｌのＦＮＩＩ培地に植菌するために用いた。３７℃及び２５０ｒｐｍで、前記振盪フラスコを保温し、培養液サンプルを、ズブチリシン活性の測定のために規則的に採取した。４株をこの方法で試験した。すなわち、前記４株は、ＢＧ３５９１（ズブチリシン遺伝子の１コピーを含む株、増幅不可）、ＭＤＴ０１−１３８（クロラムフェニコールを用いて増幅された株）、ＢＧ４０２０（カセット５’−ズブチリシンａｌｒ−５’が導入された株）、増幅されたＢＧ４０２０（増加濃度のＣＤＡに再度線状に付けられたＢＧ４０２０株）である。ＭＤＴ０１−１３８は、Ｈｙｐｅｒ１と同質遺伝子型の株であって、クロラムフェニコール・マーカー遺伝子を含む。
【０１２１】
前記株の各々により振盪フラスコ内で生産されたズブチリシン・プロテアーゼの量は、図４に示す。このグラフから、前記ズブチリシン遺伝子の増幅（増幅されたＢＧ４０２０）は、１コピーの株（ＢＧ３５９１）または増幅されていない株（ＢＧ４０２０）より高いプロテアーゼ生産性をもたらす。さらに、ａｌｒマーカーを用いた増幅により得られた株（増幅されたＢＧ４０２０）は、クロラムフェニコール・マーカーを用いて増幅された株（ＭＤＴ０１−１３８）より多くのプロテアーゼを生産した。
【０１２２】
これらの結果は、目的ポリペプチドをコードする発現カセットの増幅及び目的ポリペプチドを高レベルで連続して生産するための非抗菌的及び非外因性のマーカーとして、効率的にａｌｒ遺伝子を使用出来ることを示す。
【図１】
0005659143.tif 000004
【図２】
0005659143.tif 000005
【図３】
0005659143.tif 000006
【図４】
0005659143.tif 000007