(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンカーによって固体担体に結合した保護された、以下の式Ｉ：
【化１】
0005689054.tif 000029
（式中、
Ｘ1はＨ、又はジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基及びピキシル基から選択されるヒドロキシル保護基であり、
Ｘ2はＨ、又はリン酸基の保護基であって、β脱離により除去可能な基であり、
Ｘ3は、以下の式Ａ：
【化２】
0005689054.tif 000030
（式中、ＸはＯ又はＳであり、Ｒ'はＨ又はＣＨ3であり、Ｒは直鎖又は分岐Ｃ1〜Ｃ4アルキル基及び基Ｒ1−Ｏ−Ｒ2（ここで、Ｒ1はＣ1〜Ｃ2アルキル基であり、Ｒ2はＣＨ3又はＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ3又はアリール基である）から選択される）のリボースの２'位のヒドロキシルを保護する塩基不安定の基であり、
Ｘ4はリンカー−担体アセンブリを表し、
Ｘ6はＨ、又は基ＯＸ3若しくはＯＡｃであり、
Ｂｐは、Ｘ6がＨである場合に天然若しくは修飾チミン核酸塩基であり、又はＸ6がＯＸ3若しくはＯＡｃである場合に天然若しくは修飾ウラシルであり、又はＸ6にかかわらず保護された天然若しくは修飾アデニン、又は保護された天然若しくは修飾シトシン、又は保護された天然若しくは修飾グアニンであり、
ｎは０以上の整数である）の一本鎖ＲＮＡから出発して、一本鎖ＲＮＡを放出させる方法であって、
ａ）Ｘ2がＨと異なる場合、担体に結合した、保護された前記式Ｉの一本鎖ＲＮＡを、ピペリジン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）、リエチルアミンから選択される塩基を用いて室温で処理して、３'−５'ヌクレオシド間リンカーのリン酸を脱保護する工程、
続いて、ｂ）Ｘ2がＨである前記式Ｉの一本鎖ＲＮＡ、又は、工程ａ）において得られる部分的に脱保護された前記ＲＮＡを、濃縮アンモニア、メチルアミン、炭酸カリウムから選択される塩基を用いて室温で処理する工程を含むことを特徴とし、
前記式Ｉにおいて、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、及びＸ4がＨであり、Ｘ6がＨ又はＯＨであり、Ｂｐが前記定義されるようなものである一本鎖ＲＮＡが得られる、方法。
【請求項２】
式Ｉにおいて、Ｘ1がジメトキシトリチル基である、及び／又は、Ｘ2がシアノエチル基である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
式Ｉにおいて、Ｘ3がピバロイルオキシメチル基、又はイソブチリルオキシメチル基、
又はブチリルオキシメチル基、又はプロピオニルオキシメチル基、又はアセチルオキシメ
チル基であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
式Ｉにおいて、前記Ｂｐが天然又は修飾ウラシルであることを特徴とする、請
求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
式Ｉにおいて、前記４つの天然又は修飾核酸塩基ウラシル、アデニン、シトシン及びグアニンが存在し、工程ｂ）において、前記保護基Ｘ3の除去を、アンモニアで処理した後、総容量に対してアンモニアの１５容量％のイソプロピルアミンを添加し、次いで減圧下で脱保護媒体を蒸発させることによって行うことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
式Ｉにおいて、Ｘ4が塩基不安定のリンカーと固体担体とのアセンブリであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
一本鎖ＲＮＡを合成する方法であって、
ａ）固体担体に、以下の式ＩＩ：
【化３】
0005689054.tif 000031
（式中、
Ｘ1はジメトキシトリチル基であり、
Ｘ6はＨ、又は基ＯＡｃ若しくはＯＸ3（ここで、Ｘ3は以下の式Ａ：
【化４】
0005689054.tif 000032
（式中、ＸはＯ又はＳであり、Ｒ'はＨ又はＣＨ3であり、Ｒは直鎖又は分岐Ｃ1〜Ｃ4アルキル基及び基Ｒ1−Ｏ−Ｒ2（ここで、Ｒ1はＣ1〜Ｃ2アルキル基であり、Ｒ2はＣＨ3又はＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ3又はアリール基である）から選択される）の基である）であり、
Ｂｐは、Ｘ6がＨである場合に天然若しくは修飾チミン核酸塩基であり、又はＸ6がＯＡｃ若しくはＯＸ3である場合に天然若しくは修飾ウラシル核酸塩基であり、又はＸ6にかかわらず保護された天然若しくは修飾アデニン核酸塩基、又は保護された天然若しくは修飾シトシン核酸塩基、又は保護された天然若しくは修飾グアニン核酸塩基である）のモノマーを結合させる工程であって、式ＩＩのモノマーにおいてリボース糖の３'位のＯをリンカーによって固体担体に結合させる工程、
ｂ）工程ａ）において得られる、その担体に結合した前記式ＩＩのモノマーと、少なくとも１つの以下の式ＩＩＩ：
【化５】
0005689054.tif 000033
（式中、Ｘ1、Ｂｐ、Ｘ3は式ＩＩについて定義されるようなものであり、Ｘ5は２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト基である）のモノマーとを結合させ、それにより担体に結合した、保護された以下の式Ｉ：
【化６】
0005689054.tif 000034
（式中、
Ｘ1はＨ、又はジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基及びピキシル基から選択されるヒドロキシル保護基であり、
Ｘ2はシアノエチル基であり、
Ｘ3は、以下の式Ａ：
【化７】
0005689054.tif 000035
（式中、ＸはＯ又はＳであり、Ｒ'はＨ又はＣＨ3であり、Ｒは直鎖又は分岐Ｃ1〜Ｃ4アルキル基及び基Ｒ1−Ｏ−Ｒ2（ここで、Ｒ1はＣ1〜Ｃ2アルキル基であり、Ｒ2はＣＨ3又はＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ3又はアリール基である）から選択される）のリボースの２'位のヒドロキシルを保護する塩基不安定の基であり、
Ｘ4はリンカー−担体アセンブリを表し、
Ｘ6はＨ、又は基ＯＸ3若しくはＯＡｃであり、
Ｂｐは、Ｘ6がＨである場合に天然若しくは修飾チミン核酸塩基であり、又はＸ6がＯＸ3若しくはＯＡｃである場合に天然若しくは修飾ウラシルであり、又はＸ6にかかわらず保護された天然若しくは修飾アデニン、又は保護された天然若しくは修飾シトシン、又は保護された天然若しくは修飾グアニンであり、
ｎは０以上の整数である）の一本鎖ＲＮＡを得る工程であって、
式ＩＩのモノマーと式ＩＩＩのモノマーとの間に、式ＩＩのモノマーのリボース糖の５’位と式ＩＩＩのモノマーのリボース糖の３’位との間、及び、２以上の式ＩＩＩのモノマーが存在する場合は、２つの式ＩＩＩのモノマーの間に、１の式ＩＩＩのモノマーのリボース糖の５’位と別の式ＩＩＩのモノマーのリボース糖の３’位との間の３’−５’ヌクレオシド間リンカーを形成する工程、及び
ｃ）前工程において得られる担体に結合した、保護された前記一本鎖ＲＮＡを、下記工程c-1）及びc-2）を含む放出させる方法によって放出させる工程：
c-1）担体に結合した、保護された前記式Ｉの一本鎖ＲＮＡを、ピペリジン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）、リエチルアミンから選択される塩基を用いて室温で処理して、３'−５'ヌクレオシド間リンカーのリン酸を脱保護し、式Ｉにおいて、Ｘ1及びＸ2がＨであり、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ6及びＢｐが前記定義されるようなものである一本鎖ＲＮＡを得る工程、及び
c-2）工程c-1）において得られる部分的に脱保護された前記ＲＮＡを、濃縮アンモニア、メチルアミン、炭酸カリウムから選択される塩基を用いて室温で処理し、式Ｉにおいて、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、及びＸ4がＨであり、Ｘ6がＨ又はＯＨであり、Ｂｐが前記定義されるようなものである一本鎖ＲＮＡを得る工程、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項８】
下記の工程ｂ’）をさらに含む、請求項７に記載の方法：
ｂ’）工程ｂ）の後、かつ、工程ｃ）の前に、工程ｂ）において得られるアセンブリを酸性媒体で処理し、式Ｉにおいて、Ｘ1がＨであり、Ｘ2がシアノエチル基であり、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ6及びＢｐが前記定義されるようなものである一本鎖ＲＮＡを得る工程、
【請求項９】
工程ｂ）の前に、下記工程a'-1）〜a'-4）を含む、ａ'）式ＩＩＩのモノマーを合成する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項７又は８に記載の一本鎖ＲＮＡを合成する方法：
a'-1）前記核酸塩基Ｂｐが天然若しくは修飾ウラシルと異なる場合、該核酸塩基Ｂｐの環外アミンを保護する工程、
a'-2）リボース糖の５'位のヒドロキシルを保護する工程、
a'-3）リボース糖の２'位のヒドロキシルを式Ａの基で保護する工程、及び
a'-4）リボース糖の３'位のヒドロキシルを２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト基で官能基化する工程。
【請求項１０】
二本鎖ＲＮＡを合成する方法であって、
ａ）固体担体に、以下の式ＩＩ：
【化８】
0005689054.tif 000036
（式中、
Ｘ1はジメトキシトリチル基であり、
Ｘ6はＨ、又は基ＯＡｃ若しくはＯＸ3（ここで、Ｘ3は以下の式Ａ：
【化９】
0005689054.tif 000037
（式中、ＸはＯ又はＳであり、Ｒ'はＨ又はＣＨ3であり、Ｒは直鎖又は分岐Ｃ1〜Ｃ4アルキル基及び基Ｒ1−Ｏ−Ｒ2（ここで、Ｒ1はＣ1〜Ｃ2アルキル基であり、Ｒ2はＣＨ3又はＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ3又はアリール基である）から選択される）の基である）であり、
Ｂｐは、Ｘ6がＨである場合に天然若しくは修飾チミン核酸塩基であり、又はＸ6がＯＡｃ若しくはＯＸ3である場合に天然若しくは修飾ウラシル核酸塩基であり、又はＸ6にかかわらず保護された天然若しくは修飾アデニン核酸塩基、又は保護された天然若しくは修飾シトシン核酸塩基、又は保護された天然若しくは修飾グアニン核酸塩基である）のモノマーを結合させる工程であって、式ＩＩのモノマーにおいてリボース糖の３'位のＯをリンカーによって固体担体に結合させる工程、
ｂ）工程ａ）において得られる、その担体に結合した前記式ＩＩのモノマーと、少なく
とも１つの以下の式ＩＩＩ：
【化１０】
0005689054.tif 000038
（式中、Ｘ1、Ｂｐ、Ｘ3は式ＩＩについて定義されるようなものであり、Ｘ5は２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト基である）のモノマーとを結合させ、それにより担体に結合した、保護された以下の式Ｉ：
【化１１】
0005689054.tif 000039
（式中、
Ｘ1はＨ、又はジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基及びピキシル基から選択されるヒドロキシル保護基であり、
Ｘ2はシアノエチル基であり、
Ｘ3は、以下の式Ａ：
【化１２】
0005689054.tif 000040
（式中、ＸはＯ又はＳであり、Ｒ'はＨ又はＣＨ3であり、Ｒは直鎖又は分岐Ｃ1〜Ｃ4アルキル基及び基Ｒ1−Ｏ−Ｒ2（ここで、Ｒ1はＣ1〜Ｃ2アルキル基であり、Ｒ2はＣＨ3又はＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ3又はアリール基である）から選択される）のリボースの２'位のヒドロキシルを保護する塩基不安定の基であり、
Ｘ4はリンカー−担体アセンブリを表し、
Ｘ6はＨ、又は基ＯＸ3若しくはＯＡｃであり、
Ｂｐは、Ｘ6がＨである場合に天然若しくは修飾チミン核酸塩基であり、又はＸ6がＯＸ3若しくはＯＡｃである場合に天然若しくは修飾ウラシルであり、又はＸ6にかかわらず保護された天然若しくは修飾アデニン、又は保護された天然若しくは修飾シトシン、又は保護された天然若しくは修飾グアニンであり、
ｎは０以上の整数である）の一本鎖ＲＮＡを得る工程であって、
式ＩＩのモノマーと式ＩＩＩのモノマーとの間に、式ＩＩのモノマーのリボース糖の５’位と式ＩＩＩのモノマーのリボース糖の３’位との間、及び、２以上の式ＩＩＩのモノマーが存在する場合は、２つの式ＩＩＩのモノマーの間に、１の式ＩＩＩのモノマーのリボース糖の５’位と別の式ＩＩＩのモノマーのリボース糖の３’位との間の３’−５’ヌクレオシド間リンカーを形成する工程、及び
ｃ）前工程において得られる、担体に結合した、保護された一本鎖ＲＮＡを、下記工程c-1）及びc-2）を含む放出させる方法によって放出させる工程：
c-1）担体に結合した、保護された式Ｉの一本鎖ＲＮＡを、ピペリジン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）、リエチルアミンから選択される塩基を用いて室温で処理して、３'−５'ヌクレオシド間リンカーのリン酸を脱保護し、式Ｉにおいて、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、及びＸ4がＨであり、Ｘ6がＨ又はＯＨであり、Ｂｐが前記定義されるようなものである一本鎖ＲＮＡを得る工程、及び
c-2）工程c-1）において得られる部分的に脱保護された前記ＲＮＡを、濃縮アンモニア、メチルアミン、炭酸カリウムから選択される塩基を用いて室温で処理し、前記式Ｉにおいて、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、及びＸ4がＨであり、Ｘ6がＨ又はＯＨであり、Ｂｐが前記定義されるようなものである一本鎖ＲＮＡを得る工程、及び
ｄ）工程ａ）〜ｃ）により合成される一本鎖ＲＮＡを、相補配列を有する一本鎖ＲＮＡとハイブリダイズさせる工程
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１１】
工程ｂ）の後、かつ、工程ｃ）の前に、工程ｂ）において得られるアセンブリを酸性媒体で処理する工程ｂ’）をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程ｂ）の前に、下記工程a'-1）〜a'-4）を含む、ａ'）式ＩＩＩのモノマーを合成する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１０又は１１に記載の方法：
a'-1）前記核酸塩基Ｂｐが天然若しくは修飾ウラシルと異なる場合、該核酸塩基Ｂｐの環外アミンを保護する工程、
a'-2）リボース糖の５'位のヒドロキシルを保護する工程、
a'-3）リボース糖の２'位のヒドロキシルを式Ａの基で保護する工程、及び
a'-4）リボース糖の３'位のヒドロキシルを２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト基で官能基化する工程。
【請求項１３】
前記二本鎖ＲＮＡがｓｉＲＮＡであることを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の合成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＲＮＡ合成方法、保護されたＲＮＡを放出させる方法、及び保護されたリボヌクレオチドモノマーを合成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の発見以来、生物学的研究及び治療的用途に対する低分子合成ＲＮＡ、特に２１ヌクレオチド長の低分子オリゴリボヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）の極めて重要な必要性が生じている。
【０００３】
これらのＲＮＡを構成するリボヌクレオチド単位は、当該技術分野で知られるように、特に非特許文献１、非特許文献２及び非特許文献３に記載されるように、天然のリボヌクレオチド単位であるか、又は核酸塩基の修飾若しくはリボース環の修飾を問わず、修飾されたリボヌクレオチド単位であり得る。
【０００４】
ＤＮＡ合成と比較すると、合成ＲＮＡの製造は、保護する必要のあるリボース糖の２’位のヒドロキシル官能基（function）の存在のためにより複雑である。ＲＮＡ合成を成功させるためには、理想的な保護基を見つけ出すことが極めて重要なポイントである。鎖の結合におけるカップリング収率がＤＮＡ合成と比べて低いことに加え、ＲＮＡ化学における主な難点は塩基性媒体におけるＲＮＡの不安定性から生じる。
【０００５】
このため、当該技術分野では、オリゴデオキシリボヌクレオチド（低分子ＤＮＡ）の製造に用いられる標準的な合成戦略（ＤＮＡの全ての反応性官能基が、塩基不安定の保護基、すなわち化学的伸長プロセスの終了時に塩基による単回処理によって除去される保護基で保護される）が、オリゴリボヌクレオチド（低分子ＲＮＡ）の製造には適用可能でないことが一般に推測されている。
【０００６】
ＤＮＡ合成と同様に、ＲＮＡを化学的経路によって合成するために現在最も一般的に用いられている２つの経路の一方は、ホスホロアミダイトによる経路であり、他方は水素ホスホネート（Ｈ−ホスホネート）による経路である。
【０００７】
ホスホロアミダイトによる経路においては、ホスホロアミダイト基によって３’位で官能基化されたモノマーを結合させるが、結合したＲＮＡはこの場合、好ましくはシアノエチル基によって保護された３’−５’ヌクレオチド間リン酸リンカーを有する。
【０００８】
例えば非特許文献４において教示されるように、トリメチルシリルエチル（ＴＳＥ）基もリン酸（phosphate）の保護基として使用することができる。しかしながら、この文献では、ＴＳＥ基はシアノエチル基とは対照的に塩基性条件では除去されないが、フッ化物イオンによって除去されるため、ＴＳＥ基を選択したと述べられている。また、この文献では、実際には、３’−５’ホスホジエステルリンカーを得るために行われる酸化に用いられたヨウ素溶液によってＴＳＥ基が除去されたとも述べられている。
【０００９】
水素ホスホネートによる経路においては、水素ホスホネートモノエステル基によって３’位で官能基化されたモノマーを結合させるが、結合したＲＮＡはこの場合、水素ホスホネートジエステルリンカーである３’−５’ヌクレオチド間リンカーを有し、これを次いでリン酸へと酸化する。この経路では、伸長の終了時及び酸化後に得られるＲＮＡは、保護されていない３’−５’リン酸ヌクレオシド間リンカーを有する。
【００１０】
ホスホロアミダイトによる経路においては、リボース糖の２’位のヒドロキシルの保護は、リン酸の保護基と同時に除去され得る（ヌクレオチド間リンカー中のリン原子の２’位のヒドロキシルによる求核攻撃をもたらし、それにより塩基性脱保護条件での天然３’−５’リンカーの２’−５’異性化又は３’−５’リンカーの破壊が生じ得る）、塩基不安定の保護基を用いて行うべきではないことが当該技術分野で一般に推測されている。
【００１１】
このため、非特許文献５は、リボースの２’位のヒドロキシル基を、アセチル基又はベンゾイル基等のアシル基で保護することによるオリゴリボヌクレオチド合成において、収率が非常に低いことを報告している。
【００１２】
ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基は、リボースの２’位のヒドロキシルを保護するために最もよく使用されているのは確かである。それを代替するために、トリイソプロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）基、ビス（２−アセトキシエチルオキシ）メチル（ＡＣＥ）基、ｔｅｒｔ−ブチルジチオメチル（ＤＴＭ）基、１−（２−シアノエトキシ）エチル（ＣＥＥ）基、２−シアノエトキシメチル（ＣＥＭ）基、２−（４−トルイルスルホニル）エトキシメチル（ＴＥＭ）基、レブリニル（levulinyl）基及び２−シアノエチル基といった幾つかの保護基が提案されているが、これらの基の大部分はＴＢＤＭＳのように、フッ化物イオンによって除去される。しかしながら、フッ化物イオンによる脱保護は、その塩の混入のために、純粋なオリゴリボヌクレオチドを得る上で重大な障害となり、結果として長い追加の精製手順につながる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Watts, J. K. et al., Drug Discovery Today, Vol. 13, 19/20, October 2008
【非特許文献２】Schram K. H. et al., Mass Spectrometry Reviews, 1998, 17, 131-251
【非特許文献３】Porcher et al., Helvetica Chimica Acta, Vol. 88, 2005, pages 2683-2704
【非特許文献４】Parey et al., "First Evaluation of Acyloxymethyl or Acylthiomethyl Groups as Biolabile 2'-O-Protections of RNA", Organic Letters, 2006, Vol. 8, No. 17, 3869-3872
【非特許文献５】T. KEMPE et al., "Nucleic Acids Research", 1982, 10, 6695-6714
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、リン原子の求核攻撃及びＲＮＡの３’−５’リンカーの破壊をもたらすことなく塩基によって除去され得る、リボースの２’位のヒドロキシルの保護基を用いるＲＮＡ合成方法を提案することによって、ｓｉＲＮＡ及びより長いＲＮＡの両方、天然核酸塩基及び修飾核酸塩基を含むＲＮＡ又は天然若しくは修飾リボース環を含むＲＮＡの両方についての従来技術のＲＮＡ化学合成方法の欠点を克服することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
この目的で、本発明は、リンカーによって固体担体(solid substrate)に結合した保護された、以下の式Ｉ：
【００１６】
【化１】
0005689054.tif 000002
【００１７】
（式中、
Ｘ１はＨ、又はジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基及びピキシル基から選択されるヒドロキシル保護基、好ましくはジメトキシトリチル基であり、
Ｘ２はＨ、又はβ−脱離可能なリン酸を保護する基、好ましくはシアノエチル基であり、
Ｘ３は、以下の式Ａ：
【００１８】
【化２】
0005689054.tif 000003
【００１９】
（式中、ＸはＯ又はＳであり、Ｒ'はＨ又はＣＨ3であり、Ｒは直鎖又は分岐Ｃ1〜Ｃ4アルキル基及び基Ｒ1−Ｏ−Ｒ2（ここで、Ｒ1はＣ1〜Ｃ2アルキル基であり、Ｒ2はＣＨ3又はＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ3又はアリール基である）から選択される）のリボースの２'位のヒドロキシルを保護する、塩基不安定の基であり、
Ｘ4はリンカー−固体担体アセンブリを表し、
Ｘ6はＨ又はＯＸ3又はＯＡｃであり、
Ｂｐは核酸塩基：Ｘ6がＨである場合に天然若しくは修飾チミン、又はＸ6がＯＸ3若しくはＯＡｃである場合に天然若しくは修飾ウラシル、又はＸ6にかかわらず保護された天然若しくは修飾アデニン、又は保護された天然若しくは修飾シトシン、又は保護された天然若しくは修飾グアニンであり、
ｎは０以上の整数である）の一本鎖ＲＮＡから、一本鎖ＲＮＡを放出させる方法であって、ａ）Ｘ2がＨと異なる場合、３'−５'ヌクレオチド間リンカーのリン酸を放出させるために、担体に結合した、保護された式Ｉの一本鎖ＲＮＡを、ピペリジン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）及びトリエチルアミンから選択される塩基を用いて室温で処理する工程、続いて、ｂ）工程ａ）において得られる部分的に遊離したＲＮＡを、濃縮アンモニア、メチルアミン、炭酸カリウムから選択される塩基を用いて室温で処理する工程を含むことを特徴とする、方法を提案する。
【００２０】
好ましくは、式Ｉにおいて、Ｘ３は式Ａの基である。
【００２１】
より好ましくは、式Ｉにおいて、Ｘ３はピバロイルオキシメチル基、イソブチリルオキシメチル基、ｎ−ブチリルオキシメチル基、プロピオニルオキシメチル基及びアセチルオキシメチル基から選択される。
【００２２】
本発明の放出させる方法の第１の好ましい実施の形態では、式Ｉにおいて、核酸塩基Ｂｐは天然又は修飾ウラシルである。
【００２３】
本発明の放出させる方法の第２の好ましい実施の形態では、式Ｉにおいて、天然又は任意で互いに独立して修飾された４つの核酸塩基ウラシル、アデニン、シトシン及びグアニンが存在し、工程ｂ）において、Ｘ３基の除去を好ましくは、２８％アンモニア水溶液で処理した後、アンモニアの容量に対して１５容量％のイソプロピルアミンを添加し、次いで減圧下で蒸発させることによって行う。
【００２４】
本発明の放出させる方法の第３の好ましい実施の形態では、担体に結合した、保護された式ＩのＲＮＡは、塩基不安定のリンカーによって固体担体に結合されている。
【００２５】
本発明の放出させる方法の第４の好ましい実施の形態では、式Ｉにおいて、Ｘ６がＨである場合、天然又は任意で互いに独立して修飾された４つの核酸塩基チミン、アデニン、シトシン及びグアニンが存在する。
【００２６】
本発明は、一本鎖ＲＮＡを合成する方法であって、
ａ）担体に、以下の式ＩＩ：
【００２７】
【化３】
0005689054.tif 000004
【００２８】
（式中、
Ｂｐは天然若しくは修飾核酸塩基であり、該核酸塩基は、Ｘ６がＯＸ３若しくはＯＡｃである場合にウラシル核酸塩基であり、又はＸ６がＨである場合にチミン核酸塩基であり、又はＸ６にかかわらず保護されたアデニン核酸塩基、若しくは保護されたシトシン核酸塩基、若しくは保護されたグアニン核酸塩基であり、
Ｘ１はジメトキシトリチル基であり、
Ｘ６はＨ、又は基ＯＡｃ若しくはＯＸ３（ここで、Ｘ３は以下の式Ａ：
【００２９】
【化４】
0005689054.tif 000005
【００３０】
（式中、ＸはＯ又はＳであり、Ｒ’はＨ又はＣＨ３であり、Ｒは直鎖又は分岐Ｃ１〜Ｃ４アルキル基及び基Ｒ１−Ｏ−Ｒ２（ここで、Ｒ１はＣ１〜Ｃ２アルキル基であり、Ｒ２はＣＨ３又はＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３又はアリール基である）から選択される）の基である）である）のモノマーをリンカーによって結合させる工程、
ｂ）工程ａ）において得られる、その担体に結合した式ＩＩのモノマーと、少なくとも１つの以下の式ＩＩＩ：
【００３１】
【化５】
0005689054.tif 000006
【００３２】
（式中、Ｘ１、Ｂｐ、Ｘ３は式ＩＩについて定義されるようなものであり、Ｘ５は水素ホスホネートモノエステル基又はホスホロアミダイト、好ましくは２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト基である）のモノマーとを結合させ、それにより担体に結合した、保護された式Ｉの一本鎖ＲＮＡを得る工程、
ｃ）任意で、工程ｂ）において得られるアセンブリを酸性媒体で処理する工程、及び
ｄ）工程ｂ）又は工程ｃ）において得られる担体に結合した、保護された一本鎖ＲＮＡを、本発明の放出させる方法によって放出させる工程を含むことを特徴とする、方法も提案する。
【００３３】
本発明は、二本鎖ＲＮＡを合成する方法であって、本発明の一本鎖ＲＮＡを合成する方法に従って一本鎖ＲＮＡを合成すること、及びそれにより合成されるこの一本鎖ＲＮＡを、相補配列を有する一本鎖ＲＮＡとハイブリダイズさせることを含むことを特徴とする、方法も提案する。
【００３４】
好ましくは、二本鎖ＲＮＡはｓｉＲＮＡである。
【００３５】
しかしながら、本発明は、以下の式ＩＩＩ：
【００３６】
【化６】
0005689054.tif 000007
【００３７】
（式中、Ｘ１、Ｂｐ、Ｘ３は式ＩＩについて定義されるようなものであり、Ｘ５は水素ホスホネート基又はホスホロアミダイト基、好ましくは２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト基である）のモノマーを、それにより担体上に保護された式Ｉの一本鎖ＲＮＡが得られる、
以下の式ＩＶ：
【００３８】
【化７】
0005689054.tif 000008
【００３９】
（式中、Ｂｐは式ＩＩについて定義されるようなものである）のリボヌクレオシドモノマーから合成する方法であって、
ａ）核酸塩基Ｂｐが任意で修飾されたウラシルと異なる場合、核酸塩基Ｂｐの環外アミンを保護する工程、
ｂ）リボース糖の５’位のヒドロキシルを保護する工程、
ｃ）リボース糖の２’位のヒドロキシルを以下の式Ａ：
【００４０】
【化８】
0005689054.tif 000009
【００４１】
（式中、ＸはＯ又はＳであり、Ｒ’はＨ又はＣＨ３であり、Ｒは直鎖又は分岐Ｃ１〜Ｃ４アルキル基及び基Ｒ１−Ｏ−Ｒ２（ここで、Ｒ１はＣ１〜Ｃ２アルキル基であり、Ｒ２はＣＨ３又はＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３又はアリール基である）から選択される）の基で保護する工程、及び
ｄ）リボース糖の３’位のヒドロキシルを、水素ホスホネートモノエステル基又はホスホロアミダイト、好ましくは２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト基で官能基化する工程から成ることを特徴とする、方法をさらに提案する。
【００４２】
より好ましくは、工程ｃ）において、式Ａの基はピバロイルオキシメチル基、又はイソブチリルオキシメチル基、又はｎ−ブチリルオキシメチル基、又はプロピオニルオキシメチル基、又はアセチルオキシメチル基である。
【００４３】
工程ｂ）において、保護基がジメトキシトリチル基であるのも好ましい。
【００４４】
本発明による式ＩＩＩのモノマーを合成する方法の第１の好ましい実施の形態では、核酸塩基は天然又は修飾シトシンであり、工程ａ）における保護基はアセチル基である。
【００４５】
本発明による式ＩＩＩのモノマーを合成する方法の第２の好ましい実施の形態では、核酸塩基は天然又は修飾アデニンであり、工程ａ）における保護基はフェノキシアセチル基である。
【００４６】
本発明による式ＩＩＩのモノマーを合成する方法の第３の好ましい実施の形態では、核酸塩基は天然又は修飾グアニンであり、工程ａ）における保護基はｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル基又はイソプロピルフェノキシアセチル基である。
【００４７】
以下の説明的な記載を読むことによって、本発明はより良く理解され、本発明の他の利点及び特徴はより明確となる。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本発明において、「核酸塩基（複数可）Ｂｐ」又は「Ｂｐ」という用語は、当業者に明らかなように、任意で修飾されたか、保護されたか又は保護されていないウラシル、アデニン、シトシン又はグアニン核酸塩基を表す。
【００４９】
本発明は、ＲＮＡを構成するリボヌクレオチド単位の数にも、これらのリボヌクレオチド単位が天然の単位であるか又は修飾された単位であるかにもかかわらず、ＲＮＡ伸長の終了時に塩基性条件で除去される、リボヌクレオチド上の様々な反応性官能基を保護する基（特にホスホロアミダイトによる合成経路を用いる場合の３’−５ヌクレオチド間リンカーのリン酸を保護する基、及びリボース環の２’位のヒドロキシルを保護する基を含む）を用いる化学経路によって、以前のＲＮＡ合成戦略からの脱却を示す。これにより、核酸塩基を保護する基（存在する場合）と、保護された合成ＲＮＡを担体に結合させるリンカーとが塩基不安定である場合、完全に塩基不安定のＲＮＡ合成戦略を用いることが可能となる。本発明はしたがって、「ＲＮＡ合成は完全に塩基不安定の戦略とは相容れない」という定説から脱却するものである。
【００５０】
このような完全に塩基不安定の戦略を用いることを可能にする主要な特徴は、リボース糖の２’位のヒドロキシルを保護するために、以下の式Ａ：
【００５１】
【化９】
0005689054.tif 000010
【００５２】
（式中、ＸはＯ又はＳであり、Ｒ’はＨ又はＣＨ３であり、Ｒは直鎖又は分岐Ｃ１〜Ｃ４アルキル基及び基Ｒ１−Ｏ−Ｒ２（ここで、Ｒ１はＣ１〜Ｃ２アルキル基であり、Ｒ２はＣＨ３又はＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３又はアリール基である）から選択される）の保護基を使用することである。
【００５３】
より好ましくは、これらの式Ａの保護基はピバロイルオキシメチル基、又はイソブチリルオキシメチル基、又はブチリルオキシメチル基、又はプロピオニルオキシメチル基、又はアセチルオキシメチル基である。
【００５４】
実際に、上記保護基を使用することによって、ＲＮＡが破壊されることも、当該技術分野で用いられるフッ化物塩が混入することもなく、所望のＲＮＡのリボースの２’位のヒドロキシルを、塩基を用いた処理によって遊離させることが可能となる。
【００５５】
ピバロイルオキシメチル保護基、アセチルオキシメチル保護基、ピバロイルチオメチル保護基及びアセチルチオメチル保護基は既に、非特許文献４に記載されているように、保護されたＲＮＡの或る特定の特性、特にその細胞膜透過性及びそのヌクレアーゼ耐性を向上させる目的で、リボース環の２’位に導入されている（それぞれリボース環の２’位のＯＨと共に、Ｏ−ピバロイルオキシメチル基、Ｏ−アセチルオキシメチル基、Ｏ−ピバロイルチオメチル基又はＯ−アセチルチオメチル基を形成する）。
【００５６】
この論文では、アセタールエステル基、特にピバロイルオキシメチル基、アセチルオキシメチル基、ピバロイルチオメチル基及びアセチルチオメチル基は、このようにしてリボース環の２’位で官能基化されたＲＮＡが、細胞膜を通過し、次いで細胞自身によって、その中にある酵素を用いて脱保護されることを可能にすることができる基として記載されている。したがって、これらの保護基は生体不安定（biolabile）基として記載されており、かかる保護基の使用が、塩基性条件で脱保護される塩基不安定の保護を用いたＲＮＡ合成戦略を用いることを可能にし得ることを示唆する記載はこの文献にはない。
【００５７】
さらに、この文献では、リボヌクレオシドモノマーの２’位におけるアセタールエステル基の選択的導入が、Ｍａｒｋｉｅｗｉｃｚ試薬（ＴＩＰＳｉＣｌ２）によってリボースの５’位及び３’位のヒドロキシルを同時にブロックし、リボースの２’位のヒドロキシルを遊離させ、選択される基に応じて、ピバロイルオキシメチル基、アセチルオキシメチル基、ピバロイルチオメチル基又はアセチルチオメチル基を受容する合成によって行われる。この方法によって、２’位及び３’位で保護された種々の異性体の製造及び分離を回避することが可能となるが、保護されたＲＮＡの合成には少なくとも７つの工程が必要とされる。
【００５８】
これらの７つの工程は高い収率で行われるが、時間がかかるものであり、ＴＩＰＳｉＣｌ２は高価な試薬である。
【００５９】
本発明は、対照的に、核酸塩基、並びにリボースの３’位及び５’位のヒドロキシルが従来通り完全に保護され、リボース糖の２’位のヒドロキシルがアシルオキシアルキル基又はアシルチオアルキル基、好ましくはアシルオキシメチルによって保護されたリボヌクレオシドモノマーを合成する方法であって、４つの工程で行われ、最終収率が２７％〜３７％である、方法を提案する。
【００６０】
この方法は、従来技術と同様に、以下の式ＩＶ：
【００６１】
【化１０】
0005689054.tif 000011
【００６２】
（式中、Ｂｐは天然又は修飾核酸塩基ウラシル、アデニン、シトシン又はグアニンである）の化合物から出発する。
【００６３】
この方法の第１の工程は、核酸塩基がウラシルと異なる場合に核酸塩基を保護することから成る。
【００６４】
第２の工程は、リボース環の５’位のヒドロキシルを、この目的で当業者によって典型的に使用される保護基によって保護することから成る。リボース環の５’位のヒドロキシルを保護するために従来使用されるこれらの保護基は、中でもジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基及びピキシル基である。
【００６５】
本発明では、使用される好ましい保護基は、オリゴヌクレオチド合成において広く使用される酸不安定ジメトキシトリチル基である。
【００６６】
鎖を構築するための構成要素となり、一本鎖ＲＮＡの生成をもたらすリボヌクレオチドモノマーを合成する方法の第３の工程は、リボースの２’位のヒドロキシルを、以下の式Ａ：
【００６７】
【化１１】
0005689054.tif 000012
【００６８】
（式中、ＸはＯ又はＳであり、Ｒ’はＨ又はＣＨ３であり、Ｒは直鎖又は分岐Ｃ１〜Ｃ４アルキル基及び基Ｒ１−Ｏ−Ｒ２（ここで、Ｒ１はＣ１〜Ｃ２アルキル基であり、Ｒ２はＣＨ３又はＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３又はアリール基である）から選択される）の基によって保護することである。
【００６９】
より好ましくは、リボースの２’位のヒドロキシルを保護する基は、ピバロイルオキシメチル基、又はイソブチリルオキシメチル基、又はｎ−ブチリルオキシメチル基、又はプロピオニルオキシメチル基、又はアセチルオキシメチル基である。
【００７０】
最も好ましくは、リボースの２’位のヒドロキシルを保護する基はピバロイルオキシメチル基である。
【００７１】
この工程では、２つの異性体が得られる：一方は天然又は修飾リボースの３’位のヒドロキシル基が式Ａの基によって保護され、他方は天然又は修飾リボースの２’位のヒドロキシル基が式Ａの基によって保護されている。
【００７２】
リボース環の２’位のヒドロキシルが保護された異性体を分離するが、本発明による保護されたリボヌクレオチドモノマーを合成する方法の第４の工程は次に、リボースの３’位のヒドロキシルを当業者に既知のリン酸化基によって官能基化することから成る。好ましくは、第１の実施形態では、ホスホロアミダイト基、より好ましくは２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト基を本発明の方法に使用する。
【００７３】
次いで、以下の式ＩＩＩ：
【００７４】
【化１２】
0005689054.tif 000013
【００７５】
（式中、Ｂｐは天然若しくは修飾ウラシル核酸塩基、又は保護されたアデニン核酸塩基、又は保護されたシトシン核酸塩基、又は保護されたグアニン核酸塩基であり、
Ｘ１は酸不安定基から選択されるヒドロキシル保護基、好ましくはジメトキシトリチル基であり、
Ｘ５はホスホロアミダイト基、好ましくは２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト基であり、
Ｘ３は先に定義した式Ａの基である）の化合物が得られる。
【００７６】
しかしながら、第２の実施形態では、本発明の方法において３’位のヒドロキシルの官能基化のために水素ホスホネートモノエステル基が使用される。
【００７７】
次いで得られる式ＩＩＩの化合物は、Ｂｐ、Ｘ１及びＸ３は先に定義したようなものであるが、Ｘ５が水素ホスホネートモノエステル基である式ＩＩＩの化合物である。
【００７８】
式ＩＩＩのリボヌクレオチドモノマー、及びＸ６がＯＸ３若しくはＯＡｃである式ＩＩのリボヌクレオチドモノマー、又はＸ６がＨである式ＩＩのデオキシリボヌクレオチドから出発して、保護された一本鎖ＲＮＡが固体担体上に合成される。
【００７９】
この保護された一本鎖ＲＮＡを合成する方法も本発明の一目的である。
【００８０】
この保護された一本鎖ＲＮＡは、以下の式Ｉ：
【００８１】
【化１３】
0005689054.tif 000014
【００８２】
（式中、
Ｘ１はＨ、又は酸不安定基から選択されるヒドロキシル保護基、好ましくはジメトキシトリチル基であり、
Ｘ２はＨ、又はリン酸を保護する基、好ましくは２−シアノエチル基であり、
Ｘ３は以下の式Ａ：
【００８３】
【化１４】
0005689054.tif 000015
【００８４】
（式中、ＸはＯ又はＳであり、Ｒ’はＨ又はＣＨ３であり、Ｒは直鎖又は分岐Ｃ１〜Ｃ４アルキル基及び基Ｒ１−Ｏ−Ｒ２（ここで、Ｒ１はＣ１〜Ｃ２アルキル基であり、Ｒ２はＣＨ３又はＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３又はアリール基である）から選択される）の基であり、
Ｘ４は固体担体と、オリゴヌクレオチドを担体に連結するリンカーとの複合体（assemblage）を表し（担体は、ガラスビーズ（ＬＣＡ−ＣＰＧ：長鎖アルキルアミン調整多孔質ガラス（long chain alkylamine-controlled pore glass））又はポリスチレン樹脂ビーズ（ＨＣＰ：高度に架橋したポリスチレン）であり得る。リンカーは、伸長の終了時に塩基によって分解されるリンカー、例えばオキサリル、スクシニル、グリオキサール、ヒドロキノン−Ｏ，Ｏ−二酢酸（Ｑリンカー）等から選択され、好ましくはスクシニルリンカー又はＱリンカーである）、
Ｘ６はＨ、又は基ＯＸ３若しくはＯＡｃであり、
Ｂｐは天然若しくは修飾核酸塩基：Ｘ６がＨである場合にチミン、又はＸ６がＯＸ３若しくはＯＡｃである場合にウラシル、又はＸ６にかかわらず保護されたアデニン、又は保護されたシトシン、又は保護されたグアニンであり、
ｎは０以上の整数である）を有する。
【００８５】
Ｘ６がＯＡｃである場合、Ｘ４及びＸ６の位置は交換可能である。
【００８６】
本発明によるこの一本鎖ＲＮＡを合成する方法は、式ＩＩのリボヌクレオシドモノマー又はデオキシリボヌクレオシドモノマーを、それ自体が好ましくは同様に塩基不安定であるリンカーを用いて、先に定義したような担体に結合させる工程、続いて上記式ＩＩのモノマーを、少なくとも１つの式ＩＩＩのモノマーと結合させる工程、及び必要に応じて、得られるモノマーのアセンブリを酸処理して、保護基Ｘ１を除去する工程、及び最後にそれにより得られる保護されたＲＮＡを放出させる工程を含む。
【００８７】
したがって、放出させる工程を適用するＲＮＡは、酸処理する工程を行う場合、Ｘ１がＨである式ＩのＲＮＡであり、又は酸処理する工程を行わない場合、Ｘ１がヒドロキシル保護基である式ＩのＲＮＡである。
【００８８】
式ＩＩＩのリボヌクレオチドモノマーの結合は一般に、固体担体上での自動合成によって行われる。
【００８９】
この場合、合成された、保護されたＲＮＡはリンカーによって、その３’位の末端Ｘ４で固体担体へと結合される。
【００９０】
このリンカーが同様に塩基不安定である場合、ＲＮＡのその担体からの放出は、本発明の方法では、リボースの２’位のＯＨの脱保護と同時に、追加の工程なしに達成される。
【００９１】
これはいかなる塩基不安定のリンカーについても当てはまる。
【００９２】
一本鎖ＲＮＡを放出させた後、放出された一本鎖ＲＮＡと相補配列を有する一本鎖ＲＮＡとのハイブリダイゼーションによって二本鎖ＲＮＡを形成することができる。相補配列を有する一本鎖ＲＮＡはそれ自体が本発明の方法によって合成されたものであっても、又は他の方法によって合成されたものであってもよい。
【００９３】
これによって、特にｓｉＲＮＡを作製することが可能となる。
【００９４】
保護された式Ｉの一本鎖ＲＮＡを放出させる方法は本発明の一目的である。この方法は、この放出させる方法が塩基処理によってリボースの２’位のヒドロキシルの保護基を除去することから成るという従来技術の偏見を克服する。
【００９５】
より正確には、この塩基処理は、ａ）３’−５’ヌクレオチド間リンカーからリン酸を放出させるために、保護された式ＩのＲＮＡをピペリジン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）、トリエチルアミンから選択される強塩基を用いて室温で処理する工程を含む。
【００９６】
この工程ａ）は、ホスホロアミダイトによる合成経路を用いる場合にのみ行われる。
【００９７】
実際には、水素ホスホネートによる合成経路を用いる場合、モノマーの結合によって、水素ホスホネートジエステル３’−５’ヌクレオシド間リンカーが得られ、これを次いでリン酸へと酸化して、Ｘ２がＨである式ＩのＲＮＡを得る（これを次いで本発明の方法によって放出させる必要がある）。
【００９８】
この任意の工程ａ）の後に、ｂ）このようにして部分的に放出された、工程ａ）において得られるＲＮＡを、濃縮アンモニア、メチルアミン、炭酸カリウムから選択される強塩基を用いて室温で処理する工程が続く。
【００９９】
どのようなＲＮＡ合成経路を用いる場合であっても、工程ｂ）はＲＮＡの放出に一般的なものである。
【０１００】
ピペリジン又はＤＢＵを用いた室温での処理は、当業者に既知の任意の好適な溶媒、より好ましくはＴＨＦ又は乾燥アセトニトリル中で、１５分間（ピペリジン）、又は４５分間（０．４５Ｍ  ＤＢＵ）、又は１分間（１Ｍ  ＤＢＵ）行われる。
【０１０１】
３’−５’ヌクレオチド間リンカーのリン酸のこの脱保護の後、使用される基に応じてピバロイルオキシメチル保護基、イソブチリルオキシメチル保護基、ｎ−ブチリルオキシメチル保護基、プロピオニルオキシメチル保護基、アセチルオキシメチル保護基はその場に残る。
【０１０２】
次いで、２’位のヒドロキシル基を、濃アンモニア水を用いて室温で３時間処理することによって放出させる。この工程ではＲＮＡの破壊は起こらない。最初にＤＢＵ又はピペリジンを用い、次にアンモニア水を用いた、この二段階の逐次脱保護では、放出された２’位のヒドロキシルによる、隣接するホスホトリエステル又はホスホジエステルの攻撃（鎖切断を引き起こす可能性がある）を回避する必要がある。
【０１０３】
しかしながら、保護された式ＩのＲＮＡが複数の天然又は修飾核酸塩基：チミン又はウラシル、アデニン、シトシン及びグアニンを含有する、すなわち核酸塩基が全て異なる少なくとも４つの式ＩＩＩのモノマーを含有する場合、本発明の放出させる方法は、アンモニアによる処理の後、１５％のイソプロピルアミンを添加する工程をさらに含む。
【０１０４】
いずれの場合においても、脱保護媒体を減圧下で蒸発させて、純粋な放出されたＲＮＡが得られる。
【０１０５】
本発明をより良く理解するために、純粋に例示を目的とする、非限定的な例として幾つかの実施形態をここに記載する。
【実施例】
【０１０６】
下記の実施例においては、Ｘ５がホスホロアミダイト基、好ましくは２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト基である式ＩＩＩのリボヌクレオチドモノマーを、以下の一般スキームに従って合成した：
【０１０７】
【化１５】
0005689054.tif 000016
【０１０８】
塩基グアニン、シトシン及びアデノシンの保護の第１の工程は、このスキームには示されていない。
【０１０９】
このスキームでは、ＢｐはＧｉＰｒＰＡＣであってもよく、その場合、化合物２ａ〜２ｄの２’位にピバロイルオキシメチル基を導入する工程は、下記で説明されるようにマイクロ波処理なしで行われる。
実施例１：モノマー２’−Ｏ−ピバロイルオキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト５ａの合成
ここで合成されたモノマーは式ＩＩＩを有するが、ここで核酸塩基はウラシル核酸塩基であり、リボースの５’位のヒドロキシルを保護する基はジメトキシトリチルであり、リボースの３’位のヒドロキシルにグラフトされる基は２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイトであり、リボースの２’位のヒドロキシルを保護する基はピバロイルオキシメチルである。
【０１１０】
この合成に関しては、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン２ａから出発する。したがって、すべきことは、第１の工程において、リボースの２’位にピバロイルオキシメチル基を、及びモノマーの３’位に２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト基を導入することだけである。
【０１１１】
そのために、初めにピバロイルオキシメチル基をリボースの２’位に導入する。
【０１１２】
より正確には、テトラブチルアンモニウムブロミド（１．９３ｇ、５．９８ｍｍｏｌ、１．３当量）、酸化ジブチルスズ（１．５ｇ、５．９８ｍｍｏｌ、１．３当量）及びクロロメチルピバレート（１．６７ｍＬ、１１．５ｍｍｏｌ、２．５当量）を、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン２ａ（２．５ｇ、４．６ｍｍｏｌ、１当量）のジクロロエタン（ＤＣＥ）溶液（１５ｍＬ）に添加する。
【０１１３】
反応混合物をマイクロ波照射下（出力３００Ｗ）で、７５℃で２．５時間加熱し、冷却して、溶媒を蒸発させる。
【０１１４】
次いで、反応混合物を、ジクロロメタン中のアセトンの勾配（０％→４０％）によるシリカゲルクロマトグラフィーにかける。最初に溶出する異性体が所望の化合物４ａである。これは溶媒を蒸発させた後に白色の発泡体の形態で得られる。
【０１１５】
４ａの収率：１．１ｇ、３６％。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＨＨ−ＣＯＳＹ、ＣＤＣｌ３）：δ９．５７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）；７．９４（ｄ，ＪＨ−６／Ｈ−５＝８．１Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６）；７．３７〜７．０９（ｍ，９Ｈ，Ｈ  ａｒ，ＤＭＴｒ）；６．８３〜６．６９（ｍ，４Ｈ，Ｈ  ａｒ，ＤＭＴｒ）；５．８７（ｄ，３ＪＨ１’／Ｈ２’＝１．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１’）；５．５２、５．３７（２ｄＡＢ，ＪＡＢ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ＋１Ｈ，ＯＣＨ２Ｏ）；５．２３（ｄ，ＪＨ−５／Ｈ−６＝８．１Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５）；４．３９（ｄｄｄ，３ＪＨ３’／ＯＨ３’＝８．８Ｈｚ；３ＪＨ３’／Ｈ４’＝７．７Ｈｚ；３ＪＨ３’／Ｈ２’＝５．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−３’）；４．２４（ｄｄ，３ＪＨ２’／Ｈ３’＝５．２Ｈｚ；３ＪＨ２’／Ｈ１’＝１．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−２’）；３．９５（ｄｔ，３ＪＨ４’／Ｈ３’＝７．７Ｈｚ；３ＪＨ４’／Ｈ５’．Ｈ５’’＝２．１Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４’）；３．７１（ｓ，６Ｈ，２  ＯＣＨ３）；３．４８（ｄｄ，２ＪＨ５’／Ｈ５’’＝１１．２Ｈｚ；３ＪＨ５’／Ｈ４’＝２．１Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５’）；３．４２（ｄｄ，２ＪＨ５’’／Ｈ５’＝１１．２Ｈｚ；３ＪＨ５’’／Ｈ４’＝２．１Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５’’）；２．４８（ｄ，ＪＯＨ−３’／Ｈ−３’＝８．８Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ３’）；１．１５（ｓ，９Ｈ，ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１７７．１（ＯＣ＝Ｏ）；１６２．５（Ｃ＝Ｏ）；１５７．７；１５７．６；１４３．３；１３４．２；１３３．９（Ｃｑ，Ｃａｒ）；１４９．２（Ｃ＝Ｏ）；１３８．８（Ｃ６）；１２９．２；１２９．１；１２７．１；１２７．０；１２６．２；１１２．３（ＣＨ，Ｃａｒ）；１０１．２（Ｃ５）；８７．２（Ｃ１’）；８６．９（ＯＣＨ２Ｏ）；８６．１（ＯＣｑ，ＤＭＴｒ）；８２．２（Ｃ４’）；８１．１（Ｃ２’）；６７．５（Ｃ３’）；６０．１（Ｃ５’）；５４．２（ＯＣＨ３，ＤＭＴｒ）；３７．８（Ｃｑ，ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３）；２５．９（ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３）。ＨＲＭＳ（ＦＡＢ）  Ｃ３６Ｈ４０Ｎ２Ｏ１０［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値：６６０．２７０９；実測値：６６０．２６８３。
【０１１６】
このようにして得られる２’−Ｏ−ピバロイルオキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン４ａから出発して、２’−Ｏ−ピバロイルオキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト５ａを以下のようにして得た：
先の工程で得られる２’−Ｏ−ピバロイルオキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン４ａ（１ｇ、１．５１ｍｍｏｌ、１当量）を、無水ＣＨ３ＣＮと共に３回同時蒸発させることによって乾燥させる。次いで、残渣を無水ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中に溶解させて、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４７４μＬ、２．７２ｍｍｏｌ、１．８当量）、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（５０６μＬ、２．２７ｍｍｏｌ、１．５当量）及びＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）の混合物を滴下する。この混合物をアルゴン下、室温で３時間攪拌する。
【０１１７】
次に、酢酸エチルを添加し、反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液中に注ぎ入れ、ＥｔＯＡｃによる抽出を行う。抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させて溶媒を除去した後に得られる混合物を、１％のピリジンを含むシクロヘキサン中のＣＨ２Ｃｌ２の勾配（６０％→１００％）によるシリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。所望の式ＩＩＩのモノマー５ａが得られる。これは溶媒を蒸発させた後に白色の発泡体の形態である。
【０１１８】
５ａの収率：１．０５ｇ、８１％。
３１Ｐ  ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＮ）：δ１５０．３５；１４９．２０。
【０１１９】
実施例２：Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−ピバロキシオキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シチジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト５ｂの合成
この式ＩＩＩのリボヌクレオチドモノマーは、核酸塩基がシトシンであり、リボースの５’位のヒドロキシルを保護する基がジメトキシトリチルであり、リボースの３’位のヒドロキシルにグラフトされる基が２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイトであり、リボースの２’位のヒドロキシルを保護する基がピバロイルオキシメチルであるモノマーである。
【０１２０】
この合成では、Ｎ４−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シチジン２ｂから出発するが、これは本実施例がリボースの２’位及び３’位のＯＨ基の保護を説明するものであることを示している。
【０１２１】
これらの保護は以下のようにして行った：
テトラブチルアンモニウムブロミド（１．７８ｇ、５．５４ｍｍｏｌ、１．３当量）、酸化ジブチルスズ（１．３９ｇ、５．５４ｍｍｏｌ、１．３当量）及びクロロメチルピバレート（１．５５ｍＬ、１０．６５ｍｍｏｌ、２．５当量）を、Ｎ４−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シチジン２ｂ（２．５ｇ、４．２６ｍｍｏｌ、１当量）のＤＣＥ溶液（１５ｍＬ）に添加する。反応混合物をマイクロ波照射下（出力３００Ｗ）で、７５℃で２．５時間加熱し、冷却して、溶媒を蒸発させる。
【０１２２】
この反応混合物を、ジクロロメタン中のアセトンの勾配（４０％→１００％）によるシリカゲルクロマトグラフィーにかける。
【０１２３】
最初に溶出する異性体が所望の化合物４ｂであり、これは溶媒を蒸発させた後に白色の発泡体の形態で得られる。
【０１２４】
４ｂの収率：１．１４ｇ、３８％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＨＨ−ＣＯＳＹ、ＣＤＣｌ３）：δ９．８４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）；８．４２（ｄ，ＪＨ−６／Ｈ−５＝７．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６）；７．３４〜７．１４（ｍ，９Ｈ，Ｈ  ａｒ，ＤＭＴｒ）；７．０６（ｄ，ＪＨ−５／Ｈ−６＝７．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５）；６．８０〜６．７６（ｍ，４Ｈ，Ｈ  ａｒ，ＤＭＴｒ）；５．８６（ｓ，１Ｈ，Ｈ−１’）；５．６０；５．５０（２ｄＡＢ，ＪＡＢ＝６．１Ｈｚ，１Ｈ＋１Ｈ，ＯＣＨ２Ｏ）；４．３４（ｄｔ，３ＪＨ３’／ＯＨ３’＝１０．６Ｈｚ；３ＪＨ３’／Ｈ４’．Ｈ２’＝５．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−３’）；４．２１（ｄ，３ＪＨ２’／Ｈ３’＝５．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−２’）；３．９８（ｄｔ，３ＪＨ４’／Ｈ３’＝５．２Ｈｚ；３ＪＨ４’／Ｈ５’．Ｈ５’’＝１．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４’）；３．７１（ｓ，６Ｈ，２  ＯＣＨ３）；３．５２（ｄｄ，２ＪＨ５’／Ｈ５’’＝１１．１Ｈｚ；３ＪＨ５’／Ｈ４’＝１．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５’）；３．４８（ｄｄ，２ＪＨ５’’／Ｈ５’＝１１．１Ｈｚ；３ＪＨ５’’／Ｈ４’＝１．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５’’）；２．５０（ｄ，ＪＯＨ−３’／Ｈ−３’＝１０．６Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ３’）；２．１９（ｓ，３Ｈ，ＮＨＣＯＣＨ３）；１．１３（ｓ，９Ｈ，ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１７８．２（ＯＣ＝Ｏ）；１７０．６（ＮＨＣＯ）；１６３．１（Ｃ４）；１５８．７（Ｃｑ，Ｃａｒ）；１４７．４（Ｃ２）；１４６．６（Ｃ６）；１４６．３；１３５．２（Ｃｑ，Ｃａｒ）；１３０．１；１２９．２；１２８．２；１２８；１２７．９；１２７．８；１２７．２；１２７；１１３．３；１１３．１（ＣＨ，Ｃａｒ）；９６．８（Ｃ５）；９１．５（Ｃ１’）；８８．０（ＯＣＨ２Ｏ）；８７．６（ＯＣｑ，ＤＭＴｒ）；８３．１（Ｃ４’）；８１．７（Ｃ２’）；６７．８（Ｃ３’）；６０．７（Ｃ５’）；５５．３（ＯＣＨ３，ＤＭＴｒ）；３８．９（Ｃｑ，ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３）；２７．０（ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３）；１８．１（ＣＯＣＨ３）。ＨＲＭＳ（ＦＡＢ）  Ｃ３８Ｈ４４Ｎ３Ｏ１０［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値：７０２．３０４２；実測値：７０２．３０２７。
【０１２５】
次いで、このようにして得られる化合物４ｂ（１．３ｇ、１．８５ｍｍｏｌ、１当量）を、無水ＣＨ３ＣＮと共に３回同時蒸発させることによって乾燥させる。得られる残渣を無水ＣＨ２Ｃｌ２（１３ｍＬ）中に溶解させて、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５８０μＬ、３．３３ｍｍｏｌ、１．８当量）、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（６２０μＬ、２．７８ｍｍｏｌ、１．５当量）及びＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）の混合物を滴下する。この混合物をアルゴン下、室温で３時間攪拌する。次に、酢酸エチルを添加し、反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液中に注ぎ入れ、ＥｔＯＡｃによる抽出を行う。抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させて溶媒を除去した後に得られる混合物を、１％のピリジンを含むヘキサン中のＥｔＯＡｃの勾配（１０％→８０％）によるシリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。
【０１２６】
所望の式ＩＩＩのリボヌクレオチドモノマー５ｂが、溶媒を蒸発させた後に白色の発泡体の形態で得られる。
【０１２７】
５ｂの収率：１．３７ｇ、８２％。
３１Ｐ  ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＮ）：δ１５０．１５；１４８．３５。
実施例３：Ｎ６−フェノキシアセチル−２’−Ｏ−ピバロイルオキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）アデノシン３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）５ｃの合成
この化合物は、核酸塩基がアデニンであり、アミンがフェノキシアセチル基によって保護されており、リボースの５’位のヒドロキシルを保護する基がジメトキシトリチルであり、３’位のヒドロキシルにグラフトされる基が２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイトであり、リボースの２’位のヒドロキシルを保護する基がピバロイルオキシメチルである式ＩＩＩのモノマーに相当する。
【０１２８】
この合成については、核酸塩基及び５’位のヒドロキシルが保護されたリボヌクレオシド２ｃから出発する。
【０１２９】
テトラブチルアンモニウムブロミド（５９６ｍｇ、１．８５ｍｍｏｌ、１．３当量）、酸化ジブチルスズ（４６２ｍｇ、１．８５ｍｍｏｌ、１．３当量）及びピバル酸クロロメチル（５１５μＬ、３．５５ｍｍｏｌ、２．５当量）を、Ｎ６−フェノキシアセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）アデノシン２ｃ（１ｇ、１．４２ｍｍｏｌ、１当量）のＤＣＥ溶液（５ｍＬ）に添加する。反応混合物をマイクロ波照射下（出力３００Ｗ）で、７５℃で２．５時間加熱し、冷却して、溶媒を蒸発させる。反応混合物を、ジクロロメタン中のアセトンの勾配（０％→３０％）によるシリカゲルクロマトグラフィーにかける。最初に溶出する異性体が、溶媒を蒸発させた後、白色の発泡体の形態である所望の化合物４ｃである。
【０１３０】
４ｃの収率：３９５ｍｇ、３４％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＨＨ−ＣＯＳＹ、ＣＤＣｌ３）：δ９．５０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）；８．７２（ｓ，１Ｈ，Ｈ−２）；８．２５（ｓ，１Ｈ，Ｈ−８）；７．４４〜６．８１（ｍ，１８Ｈ，Ｈ  ａｒ，ＤＭＴｒ−Ｐａｃ）；６．２２（ｄ，３ＪＨ１’／Ｈ２’＝４．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１’）；５．５１；５．４０（２ｄＡＢ，ＪＡＢ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ＋１Ｈ，ＯＣＨ２Ｏ）；５．０８（ｔ，３ＪＨ２’／Ｈ３’．Ｈ１’＝４．７Ｈｚ；１Ｈ，Ｈ−２’）；４．８８（ｓ，２Ｈ，ＮＨＣＯＣＨ２Ｐｈ）；４．５５（ｑ，３ＪＨ３’／Ｈ２’．ＯＨ３’．Ｈ４’＝４．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−３’）；４．２８（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４’）；３．７９（ｓ，６Ｈ，２  ＯＣＨ３）；３．５４（ｄｄ，２ＪＨ５’／Ｈ５’’＝１０．７Ｈｚ；３ＪＨ５’／Ｈ４’＝３．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５’）；３．４３（ｄｄ，２ＪＨ５’’／Ｈ５’＝１０．７Ｈｚ；３ＪＨ５’’／Ｈ４’＝４Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５’’）；２．７５（ｄ，ＪＯＨ−３’／Ｈ−３’＝４．７Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ３’）；１．１７（ｓ，９Ｈ，ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１７７．９（ＯＣ＝Ｏ）；１６６．７（ＮＨＣＯ）；１５８．６（Ｃｑ，Ｃａｒ）；１５７．２（Ｃｑ，Ｐａｃ）；１５２．６（Ｃ２）；１５１．５（Ｃ６）；１４８．４（Ｃ４）；１４４．４；１３５．５（Ｃｑ，Ｃａｒ）；１４２．２（Ｃ８）；１３０．１；１２９．９；１２８．１；１２７．９；１２２．４；１１５；１１４．９；１１３．２（ＣＨ，Ｃａｒ）；１２３．２（Ｃ５）；８９．０（ＯＣＨ２Ｏ）；８７．３（Ｃ１’）；８６．７（ＯＣｑ，ＤＭＴｒ）；８４．２（Ｃ４’）；８１．７（Ｃ２’）；７０．５（Ｃ３’）；６８．１（ＮＨＣＯＣＨ２Ｐｈ）；６２．９（Ｃ５’）；５５．３（ＯＣＨ３，ＤＭＴｒ）；３８．９（Ｃｑ，ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３）；２７．０（ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３）。ＨＲＭＳ（ＦＡＢ）  Ｃ４５Ｈ４８Ｎ５Ｏ１０［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値：８１８．３４０１；実測値：８１８．３３９７。
【０１３１】
得られる化合物４ｃ（５５０ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ、１当量）を、無水ＣＨ３ＣＮと共に３回同時蒸発させることによって乾燥させる。次いで、残渣を無水ＣＨ２Ｃｌ２（７ｍＬ）中に溶解させて、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２１１μＬ、１．２１ｍｍｏｌ、１．８当量）、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（２２３μＬ、１ｍｍｏｌ、１．５当量）及びＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）の混合物を滴下する。この混合物をアルゴン下、室温で２時間攪拌する。次に、酢酸エチルを添加し、反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液中に注ぎ入れ、ＥｔＯＡｃによる抽出を行う。
【０１３２】
抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させて溶媒を除去した後に得られる混合物を、１％のピリジンを含むシクロヘキサン中のＣＨ２Ｃｌ２の勾配（４０％→１００％）によるシリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。所望のリボヌクレオチドモノマー５ｃが、溶媒を蒸発させた後に白色の発泡体の形態で得られる。
【０１３３】
５ｃの収率：５４０ｍｇ、７９％。
３１Ｐ  ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１５０．８５；１５０．８０。
実施例４：Ｎ２−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル−２’−Ｏ−ピバロイルオキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）５ｄの合成
本実施例で合成される化合物は、核酸塩基がｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチルによって保護されたグアニンであり、５’位のヒドロキシルがジメトキシトリチルであり、３’位のヒドロキシルにグラフトされる基が２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイトであり、リボースの２’位のヒドロキシルを保護する基がピバロイルオキシメチルである式ＩＩＩのモノマー５ｄである。
【０１３４】
この場合、核酸塩基及びリボースの５’位のヒドロキシル基が保護されたリボヌクレオシド２ｄから出発する。
【０１３５】
テトラブチルアンモニウムブロミド（１．４ｇ、４．３６ｍｍｏｌ、１．３当量）、酸化ジブチルスズ（１．１ｇ、４．３６ｍｍｏｌ、１．３当量）及びクロロメチルピバレート（１．２２ｍＬ、８．３８ｍｍｏｌ、２．５当量）を、Ｎ２−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン２ｄ（２．６ｇ、３．３５ｍｍｏｌ、１当量）のＤＣＥ溶液（１５ｍＬ）に添加する。反応混合物をマイクロ波照射下（出力３００Ｗ）で、７５℃で２時間加熱し、冷却して、溶媒を蒸発させる。反応混合物を、ジクロロメタン中のアセトンの勾配（０％→１５％）によるシリカゲルクロマトグラフィーにかける。最初に溶出する異性体が所望の化合物４ｄであり、これは溶媒を蒸発させた後に白色の発泡体の形態で得られる。
【０１３６】
４ｄの収率：１．４６ｇ、４９％。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＨＨ−ＣＯＳＹ、ＣＤＣｌ３）：δ１１．７８（ｓ，１Ｈ，ＮＨ−１）；９．０９（ｓ，１Ｈ，ＮＨＰａｃ）；７．７９（ｓ，１Ｈ，Ｈ−８）；７．３６〜６．７３（ｍ，１８Ｈ，Ｈ  ａｒ，ＤＭＴｒ−ｔｂｕＰａｃ）；５．９９（ｄ，３ＪＨ１’／Ｈ２’＝４．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１’）；５．４６；５．３６（２ｄＡＢ，ＪＡＢ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ＋１Ｈ，ＯＣＨ２Ｏ）；）；５．２３（ｓ，２Ｈ，ＮＨＣＯＣＨ２Ｐｈ）；４．６５（ｔ，３ＪＨ２’／Ｈ３’．Ｈ１’＝４．７Ｈｚ；１Ｈ，Ｈ−２’）；４．３４（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３’）；４．１７（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４’）；３．７０（ｓ，６Ｈ，２  ＯＣＨ３）；３．３８（ｄｄ，２ＪＨ５’／Ｈ５’’＝１０．７Ｈｚ；３ＪＨ５’／Ｈ４’＝２．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５’）；３．３５（ｄｄ，２ＪＨ５’’／Ｈ５’＝１０．７Ｈｚ；３ＪＨ５’’／Ｈ４’＝２．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５’’）；２．４９（ｄ，ＪＯＨ−３’／Ｈ−３’＝４．３Ｈｚ。１Ｈ，ＯＨ３’）；１．２４（ｓ，９Ｈ，ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３）；１．１０（ｓ，９Ｈ，ｔｂｕＰａｃ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ１７７．９（ＯＣ＝Ｏ）；１６９．９（ＮＨＣＯ）；１５８．６（Ｃｑ，Ｃａｒ）；１５５．２（Ｃ６）；１５４．２（Ｃｑ，ｔｂｕＰａｃ）；１４７．７（Ｃ２）；１４６．５（Ｃ４）；１４５．９（Ｃｑ，ｔｂｕＰａｃ）；１４４．３；１３５．５（Ｃｑ，Ｃａｒ）；１３７．０（Ｃ８）；１３０．１；１２８．１；１２７．１；１２６．９；１２６．８；１１４．４；１１３．３（ＣＨ，Ｃａｒ）；１２２．３（Ｃ５）；８９．３（ＯＣＨ２Ｏ）；８６．８（ＯＣｑ，ＤＭＴｒ）；８６．１（Ｃ１’）；８４．０（Ｃ２’）；８２．７（Ｃ４’）；７０．４（Ｃ３’）；６７．１（ＮＨＣＯＣＨ２Ｐｈ）；６３．１（Ｃ５’）；５５．３（ＯＣＨ３，ＤＭＴｒ）；３８．９（Ｃｑ，ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３）；３４．３（Ｃｑ，ＰｈＣ（ＣＨ３）３）；３１．４（ＰｈＣ（ＣＨ３）３）；２７（ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ４９Ｈ５６Ｎ５Ｏ１１［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値：８９０．３９７６；実測値：８９０．３９３４。
【０１３７】
得られる化合物４ｄ（７００ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ、１当量）を、無水ＣＨ３ＣＮと共に３回同時蒸発させることによって乾燥させる。次いで、残渣を無水ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中に溶解させて、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２４７μＬ、１．４２ｍｍｏｌ、１．８当量）、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（２６５μＬ、１．１９ｍｍｏｌ、１．５当量）及びＣＨ２Ｃｌ２（０．５ｍＬ）の混合物を滴下する。この混合物をアルゴン下、室温で３時間攪拌する。次に、酢酸エチルを添加し、反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液中に注ぎ入れ、ＥｔＯＡｃによる抽出を行う。
【０１３８】
抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させて溶媒を除去した後に得られる混合物を、１％のピリジンを含むシクロヘキサン中のＣＨ２Ｃｌ２の勾配（４０％→１００％）によるシリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。所望のリボヌクレオチドモノマー５ｄが、溶媒を蒸発させた後に白色の発泡体の形態で得られる。
【０１３９】
５ｄの収率：６４６ｍｇ、７５％。
３１Ｐ  ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＮ）：δ１５０．４３、１４９．６７。
【０１４０】
化合物４ａ〜４ｄを得るための先の実施例に記載の方法（ピバロイルオキシメチル基を導入する反応に相当する）は、マイクロ波装置の使用を伴う。この使用は、本発明の方法によるリボヌクレオチドの製造及びＲＮＡ合成手法の開発のスケールアップの妨げとなり得る。この理由から、本発明はマイクロ波の使用を含まない上述の化合物５を合成する方法も提案する。この方法では、一方で核酸塩基Ｂｐを基ｉＰｒＰＡＣによって保護し、他方で化合物４を得るためにピバロイルオキシメチル基を導入する工程を、以下の一般的な手順に置き換えた：
ヌクレオシド２ａ〜２ｄをＤＣＥ又は無水アセトニトリル中に溶解させた後、ヌクレオシドの性質に応じて、酸化ジブチルスズ（ＤＢＴＯ）、次いでテトラブチルアンモニウムブロミド（ＴＢＡＢ）、次いでクロロメチルピバレート又はヨードメチルピバレートを室温及びアルゴン下で攪拌しながら添加する。反応混合物を次いで加熱し、アルゴン下、７０℃又は７５℃に１．５時間から６時間までの様々な時間で維持する。
【０１４１】
例えば、ＢｐがＧである化合物に関しては、手順は以下の通りである：
モノマー２’−Ｏ−ピバロイルオキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン４ａの合成：
ヌクレオシド（１当量）、ＤＢＴＯ（１．３当量）、ＴＢＡＢ（１．３当量）、ピバル酸クロロメチル（２．５当量）；アセトニトリル中、７０℃で３時間。
Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−ピバロキシオキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シチジン４ｂの合成：
ヌクレオシド（１当量）、ＤＢＴＯ（１．５当量）、ＴＢＡＢ（１．５当量）、クロロメチルピバレート（３当量）；ＤＣＥ中、７５℃で６時間。
Ｎ６−フェノキシアセチル−２’−Ｏ−ピバロイルオキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）アデノシン４ｃの合成：
ヌクレオシド（１当量）、ＤＢＴＯ（１．３当量）、ＴＢＡＢ（１．３当量）、ヨードメチルピバレート（２．５当量）；ＤＣＥ中、７０℃で１．５時間。
Ｎ２−イソプロピルフェノキシアセチル−２’−Ｏ−ピバロイルオキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン４ｅの合成：
化合物４ｅは、一般スキームに記載される化合物４ｄに相当するが、そのＢｐは基ｉＰｒＰＡＣによって保護されている。
ヌクレオシド（１当量）、ＤＢＴＯ（１．３当量）、ＴＢＡＢ（１．３当量）、クロロメチルピバレート（３当量）；ＤＣＥ中、７５℃で３時間。
実施例５：ピバロイルオキシメチル基であるＸ３を有する式Ｉの一本鎖ＲＮＡのホスホロアミダイト化学による合成
一本鎖ＲＮＡを、実施例１〜実施例４において得られるモノマー５ａ〜５ｄから出発して合成した。
【０１４２】
これらの保護された式ＩのＲＮＡは、ＤＮＡ合成装置（ABIのモデル３８１Ａ）において、実施例１〜実施例４において得られる式ＩＩＩのモノマー５ａ〜５ｄを用いて、下記表１に示す条件で、１μｍｏｌの規模で調製した。
【０１４３】
【表１】
0005689054.tif 000017
【０１４４】
保護されたＲＮＡ  ＯＮ１〜ＯＮ５（配列番号１〜配列番号５）を、活性化剤として５−ベンジルメルカプトテトラゾール（ＢＭＴ）、酸化剤としてヨウ素溶液、マスキング溶液としてＴＨＦ／ピリジン混合物中のフェノキシ酢酸無水物（Ｐａｃ）２ＯとＴＨＦ中のＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）との混合物を用いて合成した。
【０１４５】
上記の条件で脱保護した後、脱保護されたＲＮＡに相当するオリゴヌクレオチドを、
ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  １００−５  Ｃ１８カラム（１５０×４．６ｍｍ；Macherey-Nagel）を用いたＲＰ−ＨＰＬＣ（DionexのＤＸ  ６００）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（Voyager Perspective Biosystems）によって分析し、最後にＤｅｌｔａ−Ｐａｋカラム（７．８×３００ｍｍ  １５μ  Ｃ１８  １００Å；Waters）でＨＰＬＣにより精製した。
【０１４６】
ＯＮ１〜ＯＮ５に指定したＲＮＡが得られ、下記表２に示す式を有していた：
【０１４７】
【表２】
0005689054.tif 000018
【０１４８】
実施例６：２’−Ｏ−アシルオキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイトモノマー１２ａ〜１２ｄの合成
本実施例では、核酸塩基がウラシルであり、リボースの５’位のヒドロキシルを保護する基がジメトキシトリチル基であり、リボースの２’位のヒドロキシルを保護する基が、イソブチリルオキシメチル基（化合物１２ａ：２’−Ｏ−イソブチリルオキシメチル−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン）））、又はブチリルオキシメチル基（化合物１２ｂ：２’−Ｏ−ブチリルオキシメチル−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン、又はプロピオニルオキシメチル基（化合物１２ｃ：２’−Ｏ−プロピオニルオキシメチル−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン）））、又はアセチルオキシメチル基（化合物１２ｄ：２’−Ｏ−アセチルオキシメチル−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジンのいずれかである式ＩＩＩのリボヌクレオチドモノマーを、以下の一般スキームに従って合成した：
【０１４９】
【化１６】
0005689054.tif 000019
【０１５０】
この合成の第１の工程は、以下の化合物９ａ〜９ｄをそれぞれ調製することから成る：
２’−Ｏ−イソブチリルオキシメチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）ウリジン（９ａ）、
２’−Ｏ−ブチリルオキシメチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）ウリジン（９ｂ）、
２’−Ｏ−プロピオニルオキシメチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）ウリジン（９ｃ）、
２’−Ｏ−アセチルオキシメチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）ウリジン（９ｄ）。
【０１５１】
手順は以下の通りである：
１．０Ｍの塩化スルフリルのＣＨ２Ｃｌ２溶液（７．０ｍＬ、７．０ｍｍｏｌ、１．２５当量）を、アルゴン下で２’−Ｏ−メチルチオメチル−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）ウリジン８（３．０７ｇ、５．６１ｍｍｏｌ、１当量）のＣＨ２Ｃｌ２溶液（２５ｍＬ）に滴下した。反応混合物を室温で２時間攪拌した。反応の終了後、クロロメチルエーテル誘導体が、溶媒を蒸発させた後に褐色の発泡体の形態で得られ、これを直接次の工程に使用した。
【０１５２】
陽イオンに応じて、イソ酪酸カリウム（１．２２ｇ、９．６０ｍｍｏｌ、１．７２当量）、又は酪酸ナトリウム（１．０６ｇ、９．６０ｍｍｏｌ、１．７２当量）、又はプロピオン酸ナトリウム（９２２ｍｇ、９．６０ｍｍｏｌ、１．７２当量）、又は酢酸カリウム（９２６ｍｇ、９．６０ｍｍｏｌ、１．７２当量）、及びジベンゾクラウンエーテル−１８−６（１．４８ｇ、４．１７ｍｍｏｌ、０．７５当量）又はクラウンエーテル１５−５（９２０ｍｇ、４．１７ｍｍｏｌ、０．７５当量）のＣＨ２Ｃｌ２溶液（１０ｍＬ）を、クロロメチルエーテル誘導体のＣＨ２Ｃｌ２溶液（２０ｍＬ）に滴下した。室温で３時間攪拌した後、混合物を酢酸エチルで希釈し、水で洗った。ＥｔＯＡｃによる抽出を行い、抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を濃縮した後、クラウンエーテル沈殿物（ジベンゾクラウンエーテル１８−６のみ）を濾過によって除去し、濾液を蒸発させた。反応混合物をシクロヘキサン中のＥｔＯＡｃの勾配（０％→５０％）によるシリカゲルクロマトグラフィーにかけた。所望の化合物９ａ、９ｂ、９ｃ及び９ｄが、溶媒を蒸発させた後に白色の発泡体の形態で得られた。
【０１５３】
９ａ。（２．３０ｇ、７０％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＨＨ−ＣＯＳＹ、ＣＤＣｌ３）：８．８１（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）；７．８０（ｄ，ＪＨ−６／Ｈ−５＝８．１Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６）；５．７０（ｓ，１Ｈ，Ｈ−１’）；５．６２（ｄ，ＪＨ−５／Ｈ−６＝８．１Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５）；５．４５（２ｄＡＢ，ＪＡＢ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ，ＯＣＨ２Ｏ）；４．２５〜４．１４（ｍ，３Ｈ，Ｈ−２’，Ｈ−３’，Ｈ−５ａ’）；４．０６（ｄｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４’）；３．９０（ｄｄ，ＪＨ５’ｂ／Ｈ４’＝２．４Ｈｚ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５’ｂ）；２．５４（ｈｅｐｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ）；１．１８〜０．８３（ｍ，２２Ｈ，ｉＰｒ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１７６．６（ＯＣ＝Ｏ）；１６３．６（Ｃ＝Ｏ）；１４９．６（Ｃ＝Ｏ）；１３９．４（Ｃ−６）；１０１．６（Ｃ−５）；８９．１（Ｃ−１’）；８７．６（ＯＣＨ２Ｏ）；８１．７（Ｃ−４’）；８１．３（Ｃ−２’）；６７．８（Ｃ−３’）；５９．３（Ｃ−５’）；３３．９（Ｃ（Ｏ）ＣＨ）１８．８−１８．７−１７．５−１７．６−１７．４−１７．３−１７．２−１７．１−１６．９−１６．８（ＣＨ３、ｉＰｒ）；１３．４−１３．２−１３．１−１２．９−１２．５（ＣＨ，ｉＰｒ）。
【０１５４】
９ｂ。（２．９０ｇ、８９％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＨＨ−ＣＯＳＹ、ＣＤＣｌ３）：８．８０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）；７．７９（ｄ，ＪＨ−６／Ｈ−５＝８．１Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６）；５．６６（ｓ，１Ｈ，Ｈ−１’）；５．６１（ｄｄ，ＪＨ−５／Ｈ−６＝８．１Ｈｚ，ＪＨ−５／ＮＨ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５）；５．４６（ｓ，２Ｈ，ＯＣＨ２Ｏ）；４．１９〜４．１３（ｍ，３Ｈ，Ｈ−２’，Ｈ−３’，Ｈ−５ａ’）；４．０６（ｄｄ，ＪＨ−４’／Ｈ−５’ｂ＝１．８Ｈｚ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４’）；３．９０（ｄｄ，ＪＨ−５’ｂ／Ｈ−４’＝２．３Ｈｚ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５’ｂ）；２．２８（ｔｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，２Ｈ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ２）；１．６０（ｓｅｘｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２β）；１．０３〜０．９２（ｍ，２８Ｈ，ｉＰｒ）；０．８９（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３γ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１７３．２（ＯＣ＝Ｏ）；１６３．３（Ｃ＝Ｏ）；１４９．７（Ｃ＝Ｏ）；１３９．４（Ｃ−６）；１０１．６（Ｃ−５）；８９．２（Ｃ−１’）；８７．５（ＯＣＨ２Ｏ）；８１．７（Ｃ−４’）；８１．３（Ｃ−２’）；６７．８（Ｃ−３’）；５９．３（Ｃ−５’）；３６．１（Ｃ（Ｏ）ＣＨ２）；１８．１（ＣＨ２β）；１７．５−１７．４−１７．３−１７．２−１７．１−１７．０−１６．９−１３．６−１３．４−１３．０−１２．９−１２．５（ｉＰｒ、ＴＩＰＳ及びＣＨ３γ）。
【０１５５】
９ｃ。（２．３７ｇ、７７％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＨＨ−ＣＯＳＹ、ＣＤＣｌ３）：９．１８（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）；７．８０（ｄ，ＪＨ−６／Ｈ−５＝８．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６）；５．６７（ｓ，１Ｈ，Ｈ−１’）；５．６１（ｄｄ，ＪＨ−５／Ｈ−６＝８．１Ｈｚ，ＪＨ−５／ＮＨ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５）；５．４５（ｓ，２Ｈ，ＯＣＨ２Ｏ）；４．２０〜４．１３（ｍ，３Ｈ，Ｈ−２’，Ｈ−３’，Ｈ−５ａ’）；４．０６（ｄｄ，ＪＨ−４’／Ｈ−５’ｂ＝１．７Ｈｚ，Ｊ＝９，Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４’）；３．９０（ｄｄ，ＪＨ−５’ｂ／Ｈ−４’＝２．１Ｈｚ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５’ｂ）；２．３４（ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ２）；１．０８（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３β）；１．３〜０．８８（ｍ，２８Ｈ，ｉＰｒ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１７４．０（ＯＣ＝Ｏ）；１６３．６（Ｃ＝Ｏ）；１４９．８（Ｃ＝Ｏ）；１３９．３（Ｃ−６）；１０１．６（Ｃ−５）；８９．２（Ｃ−１’）；８７．５（ＯＣＨ２Ｏ）；８１．７（Ｃ−４’）；８１．３（Ｃ−２’）；６７．７（Ｃ−３’）；５９．３（Ｃ−５’）；２７．５（Ｃ（Ｏ）Ｃα）；１７．５−１７．４−１７．３−１７．２−１７．１−１７．０−１６．８−１３．４−１３．０−１２．９−１２．５（ｉＰｒ、ＴＩＰＳ）；８．８（ＣＨ３β）。
【０１５６】
９ｄ。この化合物の同定は非特許文献４において同化合物に関して記載されるものと同一である。
【０１５７】
次いで、化合物２’−Ｏ−イソブチリルオキシメチル−ウリジン１０ａ、２’−Ｏ−ブチリルオキシメチル−ウリジン１０ｂ、２’−Ｏ−プロピオニルオキシメチル−ウリジン１０ｃ及び２’−Ｏ−アセチルオキシメチル−ウリジン１０ｄを以下のようにして合成した：
Ｅｔ３Ｎ・３ＨＦ溶液（９ａについては７６７μＬ、１５．６８ｍｍｏｌ、４当量；９ｂについては９７０μＬ、１９．８０ｍｍｏｌ、４当量；９ｃについては８６５μＬ、１７．６４ｍｍｏｌ、４当量；９ｄについては１０１７μＬ、２０．７６ｍｍｏｌ、４当量）を、９ａ（２．３０ｇ、３．９２ｍｍｏｌ、１当量）、又は９ｂ（２．９０ｇ、４．９４ｍｍｏｌ、１当量）、又は９ｃ（２．３７ｇ、４．４１ｍｍｏｌ、１当量）、又は９ｄ（２．９０ｇ、５．１９ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に添加した。室温で１．５時間〜５時間攪拌した後、脱保護を完了し、反応混合物を酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（２Ｍ、ｐＨ７）で処理した後、蒸発させた。この原料混合物を、ＣＨ２Ｃｌ２中のＭｅＯＨの勾配（０％→４．５％）によるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。所望の化合物１０ａ〜１０ｄが、ジオキサンを用いた凍結乾燥の後に白色の粉末の形態で得られた。
【０１５８】
１０ａ。（１．２５ｇ、９３％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＨＨ−ＣＯＳＹ、ＤＭＳＯ）：１１．３８（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）；７．２（ｄ，ＪＨ−６／Ｈ−５＝８．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６）；５．８９（ｄ，ＪＨ−１’／Ｈ−２’＝５．４Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１’）；５．６８（ｄ，ＪＨ−５／Ｈ−６＝８．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５）；５．３７、５．３（２ｄＡＢ，ＪＡＢ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ，ＯＣＨ２Ｏ）；５．３２（ｓ，１Ｈ，ＯＨ−３’）；５．２０（ｓ，１Ｈ，ＯＨ−５’）；４．２６（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−２’）；４．１４（ｓ，１Ｈ，Ｈ−３’）；３．８８（ｄｄ，ＪＨ−４’／Ｈ−５’ｂ＝３．０Ｈｚ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４’）；３．６５（ｄｄ，ＪＨ−５’ａ／Ｈ−４’＝２．３Ｈｚ，ＪＨ−５’ａ／Ｈ−５’ｂ＝１１．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５’ａ）；３．５７（ｄｄ，ＪＨ−５’ｂ／Ｈ−４’＝２．５Ｈｚ，ＪＨ−５’ｂ／Ｈ−５’ａ＝１１．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５’ｂ）；２．５０（ｈｅｐｔ，ＪＣＨ／ＣＨ３＝７．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ）；１．０７（ｄ，ＪＣＨ３／ＣＨ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３）、１．０６（ｄ，ＪＣＨ３／ＣＨ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）：１７６．０（ＯＣ＝Ｏ）；１６３．５（Ｃ＝Ｏ）；１５１．０（Ｃ＝Ｏ）；１４０．９（Ｃ−６）；１０２．４（Ｃ−５）；８８．０（ＯＣＨ２Ｏ）；８６．４（Ｃ−１’）；８５．６（Ｃ−４’）；８１．１（Ｃ−２’）；６９．１（Ｃ−３’）；６１．１（Ｃ−５’）；３３．７（Ｃ（Ｏ）ＣＨ）；１８．９（ＣＨ３、２Ｃ）。
【０１５９】
１０ｂ。（１．５６ｇ、９２％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＨＨ−ＣＯＳＹ、ＤＭＳＯ）：１１．４２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）；７．９２（ｄ，ＪＨ−６／Ｈ−５＝８．１Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６）；５．９４（ｄ，ＪＨ−１’／Ｈ−２’＝５．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１’）；５．７３（ｄ，ＪＨ−５／Ｈ−６＝８．１Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５）；５．４２、５．２５（２ｄＡＢ，ＪＡＢ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ，ＯＣＨ２Ｏ）；５．３５（ｓ，１Ｈ，ＯＨ−３’）；５．２２（ｓ，１Ｈ，ＯＨ−５’）；４．３０（ｔ，ＪＨ−２’／Ｈ−３’＝５．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−２’）；４．１９（ｄｄ，ＪＨ−３’／Ｈ−２’＝５．２Ｈｚ，ＪＨ−３’／Ｈ−４’＝９．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−３’）；３．９３（ｄｄ，ＪＨ−４’／Ｈ−５’ｂ＝３．１Ｈｚ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４’）；３．７０（ｄ，ＪＨ−５’ａ／Ｈ−５’ｂ＝１２．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５’ａ）；３．６２（ｄ，ＪＨ−５’ｂ／Ｈ−５’ａ＝１２．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５’ｂ）；２．３０（ｔ，ＪＣＨ２a／ＣＨ２β＝７．３Ｈｚ，２Ｈ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ２a）；１．５６（ｓｅｘｔ，ＪＣＨ２β／ＣＨ２a＝ＪＣＨ２β／ＣＨ３γ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２β）、０．９１（ｔ，ＪＣＨ３γ／ＣＨ２β＝７．４Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）：１７２．２（ＯＣ＝Ｏ）；１６３．０（Ｃ＝Ｏ）；１５１．０（Ｃ＝Ｏ）；１４０．４（Ｃ−６）；１０１．９（Ｃ−５）；８７．５（ＯＣＨ２Ｏ）；８６．０（Ｃ−１’）；８５．１（Ｃ−４’）；８０．７（Ｃ−２’）；６８．７（Ｃ−３’）；６０．６（Ｃ−５’）；３５．３（Ｃ（Ｏ）ＣＨ２a）；１７．６（ＣＨ２β）；１３．３（ＣＨ３γ）。
【０１６０】
１０ｃ。（１．２５ｇ、８６％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＨＨ−ＣＯＳＹ、ＤＭＳＯ）：１１．３９（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）；７．９３（ｄ，ＪＨ−６／Ｈ−５＝８．１Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６）；５．８９（ｄ，ＪＨ−１’／Ｈ−２’＝３．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１’）；５．６９（ｄ，ＪＨ−５／Ｈ−６＝８．１Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５）；５．３６、５．２３（２ｄＡＢ，ＪＡＢ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ，ＯＣＨ２Ｏ）；４．２５（ｔ，ＪＨ−２’／Ｈ−３’＝５．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−２’）；４．１４（ｔ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−３’）；３．８８（ｄｄ，ＪＨ−４’／Ｈ−５’ｂ＝３．０Ｈｚ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４’）；３．６８〜３．５６（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５’ａ；Ｈ−５’ｂ）；２．３０（ｑ，ＪＣＨ２α／ＣＨ３β＝７．５Ｈｚ，２Ｈ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ２a）；１．０１（ｔ，ＪＣＨ３β／ＣＨ２＝７．５Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３β）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）：１７３．０（ＯＣ＝Ｏ）；１６３．０（Ｃ＝Ｏ）；１５１．５（Ｃ＝Ｏ）；１４０．４（Ｃ−６）；１０１．９（Ｃ−５）；８７．７（ＯＣＨ２Ｏ）；８６．１（Ｃ−１’）；８５．０（Ｃ−４’）；８０．８（Ｃ−２’）；６８．６（Ｃ−３’）；６０．５（Ｃ−５’）；２６．８（Ｃ（Ｏ）ＣＨ２a）；８．６（ＣＨ３β）。
【０１６１】
１０ｄ。この化合物の同定は非特許文献４において同化合物に関して記載されるものと同一である。
【０１６２】
次に、以下の化合物１１ａ〜１１ｄを合成した：
２’−Ｏ−イソブチリルオキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン１１ａ、
２’−Ｏ−ブチリルオキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン１１ｂ、
２’−Ｏ−プロピオニルオキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン１１ｃ、及び
２’−Ｏ−アセチルオキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン１１ｄ。
【０１６３】
これに関しては、化合物１０ａ（１．２５ｇ、３．６４ｍｍｏｌ、１当量）、１０ｂ（１．４６ｇ、４．２５ｍｍｏｌ、１当量）、１０ｃ（１．１５ｇ、３．４９ｍｍｏｌ、１当量）及び１０ｄ（１．５１ｇ、４．７７ｍｍｏｌ、１当量）を、無水ピリジンと共に３回同時蒸発させることによって乾燥させた。次いで、１０ａ〜１０ｄの無水ピリジン溶液（２０ｍＬ）を、ジメトキシトリチルクロリド（１．２当量）を１５分で少量ずつ添加して処理した。反応混合物をアルゴン下、室温で２時間〜４時間攪拌した。反応の終了時に、混合物を濃縮し、ＣＨ２Ｃｌ２を添加した。この溶液を飽和ＮａＨＣＯ３溶液中に注ぎ入れた。ＣＨ２Ｃｌ２による抽出を行い、抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を除去した後に得られる混合物を、１％のピリジンを含むシクロヘキサン中のＣＨ２Ｃｌ２（８０％→１００％）、次いで１％のピリジンを含むＣＨ２Ｃｌ２中のＭｅＯＨの勾配（０％→１％）によるシリカゲルクロマトグラフィーにかけた。所望の化合物１１ａ〜１１ｄが、溶媒を蒸発させた後に白色の発泡体の形態で得られた。
【０１６４】
１１ａ。（１．８９ｇ、７９％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＨＨ−ＣＯＳＹ、ＣＤＣｌ３）：９．４０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）；７．９３（ｄ，ＪＨ−６／Ｈ−５＝８．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６）；７．３２〜７．０８（ｍ，１０Ｈ，Ｈａｒ）；６．７９〜６．７５（ｍ，３Ｈ，Ｈａｒ）；５．８８（ｄ，ＪＨ−１’／Ｈ−２’＝１．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１’）；５．５０、５．３８（２ｄＡＢ，ＪＡＢ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ，ＯＣＨ２Ｏ）；５．２３（ｄ，ＪＨ−５／Ｈ−６＝８．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５）；４．３９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３’）；４．２５（ｄｄ，ＪＨ−２’／Ｈ−１’＝１．８Ｈｚ，ＪＨ−２’／Ｈ−３’＝５．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−２’）；３．９５（ｔｄ，ＪＨ−４’／Ｈ−５’ａ＝ＪＨ−４’／Ｈ−５’ｂ＝２．１Ｈｚ，ＪＨ−４’／Ｈ−３’＝７．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４’）；３．７２、３．７１（２ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）；３．４６（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５’ａ，Ｈ−５’ｂ）；２．５２（ｈｅｐｔ，ＪＣＨ／（ＣＨ３）２＝７．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ）；１．１１（２ｄ，ＪＣＨ３／ＣＨ＝７．０Ｈｚ，６Ｈ，ＣＨ３）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１７６．６（ＯＣ＝Ｏ）；１６３．４、１５０．３（Ｃ＝Ｏ）；１５８．８−１５８．７−１４４．３−１３５．２−１３５．０（Ｃｑ  ａｒｏｍ．）；１３９．７（Ｃ−６）；１３０．２−１３０．１−１２９．２−１２９．０−１２８．２−１２８．１−１２８．０−１２７．２−１２５．３−１２３．８−１１３．３−１１３．１（ＣＨ  ａｒｏｍ．）；１０２．２（Ｃ−５）；８８．２（Ｃ−１’）；８７．７（ＯＣＨ２Ｏ）；８７．１（ＯＣｑ，ＤＭＴｒ）；８３．２（Ｃ−４’）；８２．１（Ｃ−２’）；６８．５（Ｃ−３’）；６１．２（Ｃ−５’）；５５．３（ＯＣＨ３，ＤＭＴｒ）；３４．０（Ｃ（Ｏ）ＣＨ）；１７．８（ＣＨ３、ｉＰｒ）。
【０１６５】
１１ｂ。（２．２６ｇ、７９％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＨＨ−ＣＯＳＹ、ＣＤＣｌ３）：９．２０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）；７．９１（ｄ，ＪＨ−６／Ｈ−５＝８．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６）；７．３３〜７．１４（ｍ，１０Ｈ，Ｈａｒ）；６．７９〜６．７５（ｍ，３Ｈ，Ｈａｒ）；５．８８（ｄ，ＪＨ−１’／Ｈ−２’＝１．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１’）；５．４８、５．３８（２ｄＡＢ，ＪＡＢ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ，ＯＣＨ２Ｏ）；５．２３（ｄｄ，ＪＨ−５／ＮＨ＝１．９Ｈｚ，ＪＨ−５／Ｈ−６＝８．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５）；４．４３〜４．３７（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３’）；４．２６〜４．２４（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２’）；３．７２、３．７１（２ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）；３．９６〜３．９４（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４’）；３．５０〜３．４２（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５’ａ，Ｈ−５’ｂ）；２．４７（ｄ，ＪＯＨ−３’／Ｈ−３’＝８．９Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ−３’）；２．２７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ２a）；１．５８（ｓｅｘｔ，ＪＣＨ２β／ＣＨ２a＝ＪＣＨ２β／ＣＨ３γ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２β）；０．８８（ｔ，ＪＣＨ３γ／ＣＨ２β＝７．５Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３γ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１７３．１（ＯＣ＝Ｏ）；１６３．２、１５０．２（Ｃ＝Ｏ）；１５８．８−１５８．７−１４４．３−１３５．２−１３５．０（Ｃｑ  ａｒｏｍ．）；１３９．８（Ｃ−６）；１３０．２−１３０．１−１２９．１−１２９．０−１２８．１−１２８．０−１２７．８−１２７．２−１１３．３−１１３．２−１１３．１（ＣＨ  ａｒｏｍ．）；１０２．２（Ｃ−５）；８８．１（Ｃ−１’）；８７．７（ＯＣＨ２Ｏ）；８７．１（ＯＣｑ，ＤＭＴｒ）；８３．２（Ｃ−４’）；８２．０（Ｃ−２’）；６８．６（Ｃ−３’）；６１．２（Ｃ−５’）；５５．３（ＯＣＨ３，ＤＭＴｒ）；３６．１（Ｃ（Ｏ）ＣＨ２）；１８．１（ＣＨ２β）；１３．６（ＣＨ３γ）。
【０１６６】
１１ｃ。（１．８１ｇ、８２％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＨＨ−ＣＯＳＹ、ＣＤＣｌ３）：９．２７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）；７．９１（ｄ，ＪＨ−６／Ｈ−５＝８．１Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６）；７．３１〜７．０８（ｍ，１０Ｈ，Ｈａｒ）；６．７８〜６．７４（ｍ，３Ｈ，Ｈａｒ）；５．８８（ｄ，ＪＨ−１’／Ｈ−２’＝１．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１’）；５．４７、５．３９（２ｄＡＢ，ＪＡＢ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ，ＯＣＨ２Ｏ）；５．２２（ｄｄ，ＪＨ−５／ＮＨ＝１．０Ｈｚ，ＪＨ−５／Ｈ−６＝８．１Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５）；４．４３〜４．３７（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３’）；４．２５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２’）；３．９５（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４’）；３．７２、３．７１（２ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）；３．４７〜３．４２（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５’ａ，Ｈ−５’ｂ）；２．４８（ｄ，ＪＯＨ−３’／Ｈ−３’＝８．５Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ−３’）；２．３１（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ２a）；１．０７（ｔ，ＪＣＨ３β／ＣＨ２a＝７．５Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３β）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：１７４．０（ＯＣ＝Ｏ）；１６３．４、１５０．２（Ｃ＝Ｏ）；１５８．７−１４４．３−１４１．５−１３５．３−１３５．０（Ｃｑ  ａｒｏｍ．）；１３９．９（Ｃ−６）；１３０．２−１３０．１−１２９．１−１２８．１−１２８．０−１２７．８−１２７．７−１２７．２−１２７．１−１１３．３−１１３．２（ＣＨ  ａｒｏｍ．）；１０２．２（Ｃ−５）；８８．１（Ｃ−１’）；８７．８（ＯＣＨ２Ｏ）；８７．１（ＯＣｑ，ＤＭＴｒ）；８３．２（Ｃ−４’）；８２．０（Ｃ−２’）；６８．６（Ｃ−３’）；６１．２（Ｃ−５’）；５５．３（２Ｃ，ＯＣＨ３，ＤＭＴｒ）；２７．５（Ｃ（Ｏ）ＣＨ２）；８．８（ＣＨ３ｂβ）。
１１ｄ。この化合物の同定は非特許文献４において同化合物に関して記載されるものと同一である。
【０１６７】
最後に、式ＩＩＩのモノマーを合成した。
【０１６８】
２’−Ｏ−イソブチリルオキシメチル−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン１２ａ、２’−Ｏ−ブチリルオキシメチル−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン１２ｂ、２’−Ｏ−プロピオニルオキシメチル−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン１２ｃ及び２’−Ｏ−アセチルオキシメチル−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン１２ｄ。
【０１６９】
これに関しては、化合物１１ａ（１．７７ｇ、２．７４ｍｍｏｌ、１当量）、１１ｂ（２．１７ｇ、３．３６ｍｍｏｌ）、１１ｃ（１．８０ｇ、２．８５ｍｍｏｌ）及び１１ｄ（１．６５ｇ、２．６７ｍｍｏｌ）を、無水ＣＨ３ＣＮと共に３回同時蒸発させることによって乾燥させた。次いで、残渣を無水ＣＨ２Ｃｌ２（１４ｍＬ）中に溶解させ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１ａについては８５９μＬ、４．９３ｍｍｏｌ、１．８当量；１１ｂについては１０５０μＬ、６．０６ｍｍｏｌ、１．８当量；１１ｃについては８９４μＬ、５．１３ｍｍｏｌ、１．８当量；１１ｄについては８３８μＬ、４．８１ｍｍｏｌ、１．８当量）、及び２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（１１ａについては９１７μＬ、４．１１ｍｍｏｌ、１．５当量；１１ｂについては１１２０μＬ、５．０４ｍｍｏｌ、１．５当量；１１ｃについては９５４μＬ、４．２８ｍｍｏｌ、１．５当量；１１ｄについては８９５μＬ、４．０１ｍｍｏｌ、１．５当量）、及びＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）の混合物を滴下した。この混合物をアルゴン下、室温で３時間攪拌した。反応の終了後、酢酸エチルを添加し、反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液中に注ぎ入れ、ＥｔＯＡｃによる抽出を適用した。抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させて溶媒を除去した後に得られる混合物を、１％のピリジンを含むシクロヘキサン中のＣＨ２Ｃｌ２の勾配（５０％→１００％）によるシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。所望のホスホロアミダイト１２ａ〜１２ｄが、溶媒を蒸発させた後に白色の発泡体の形態で得られた。
【０１７０】
１２ａ。（１．６３ｇ、７０％）。３１Ｐ  ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＮ）：δ（ｐｐｍ）：１５０．３５、１４９．１５。
【０１７１】
１２ｂ。（１．８５ｇ、６６％）。３１Ｐ  ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＮ）：δ（ｐｐｍ）：１５０．３１、１４９．０９。
【０１７２】
１２ｃ。（１．９３ｇ、８１％）。３１Ｐ  ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＮ）：δ（ｐｐｍ）：１５０．３０、１４９．０１。
【０１７３】
１２ｄ。（１．１４ｇ、５２％）。３１Ｐ  ＮＭＲ（１２１ＭＨｚ、ＣＤ３ＣＮ）：δ（ｐｐｍ）：１５０．３１、１４８．９６。
実施例７：イソブチリルオキシメチル基、又はブチリルオキシメチル基、又はプロピオニルオキシメチル基、又はアセチルオキシメチル基であるＸ３を有する式Ｉの一本鎖ＲＮＡのホスホロアミダイト化学による合成
一本鎖ＲＮＡを、実施例６において得られるモノマー１２ａ〜１２ｄから出発して合成した。
【０１７４】
これらの保護された式ＩのＲＮＡは、ＯＮ４〜ＯＮ５を得ることに関して実施例５において記載されるものと同一の方法に従って調製した。
【０１７５】
同一配列Ｕ１９ＴＴを有するＯＮ６〜ＯＮ９に指定したＲＮＡを得て、結果を下記表３に示した：
【０１７６】
【表３】
0005689054.tif 000020
【０１７７】
基Ｘ３であるイソブチリルオキシメチル及びブチリルオキシメチルが、濃縮アンモニアを用いた処理によって１５分で式ＩのＲＮＡから除去され、基Ｘ３であるプロピオニルオキシメチル及びアセチルオキシメチルが、濃縮アンモニアを用いた処理によって５分未満で（固体担体に付いたスクシニルリンカーを完全に破壊して、ＲＮＡを放出させるためにこの処理を１．５時間に延長しても）除去されたことを指摘すべきである。
実施例８：ＲＮＡの酵素消化
実施例５において得られるＲＮＡ  ＯＮ４及びＯＮ５（２ＯＤ単位（２６０ｎｍ））を、ヌクレアーゼＰ１（０．２５単位）（３’−５’ヌクレオシド間リンカーの切断に特異的）と共に３７℃で４８時間インキュベートした。
【０１７８】
次いで、アルカリホスファターゼ（２．５単位）及び緩衝液（５０ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ９．３、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＺｎＣｌ２及び１ｍＭのスペルミジンを含有（最終濃度））を添加して、総容量を１１５μｌとし、混合物を３７℃でさらに２４時間インキュベートした。反応混合物をＨＰＬＣによって分析した。
【０１７９】
ＲＮＡは完全に分解されて、４つの天然リボヌクレオシドが得られ、３’−５’ヌクレオチド間リンカーの完全性が証明された。非天然２’−５’リンカーは検出されなかった。
実施例９：本発明の方法によって得られるｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験
ハイブリダイズした一本鎖ＲＮＡ  ＯＮ４及びＯＮ５から得られるｓｉＲＮＡ二本鎖の活性を、甲状腺乳頭癌に関与する癌遺伝子Ｒｅｔ／ＰＴＣ１のメッセンジャーＲＮＡを標的とするＲＮＡ干渉試験において評価した。
【０１８０】
この本発明の方法によって得られるｓｉＲＮＡ  ＯＮ４／ＯＮ５二本鎖の活性を、Eurogentecによって供給され、別の合成経路（２’−ＴＢＤＭＳ法）によって合成された同じｓｉＲＮＡ  ＡＳ二本鎖の活性と比較した。
【０１８１】
得られるｓｉＲＮＡを試験するのに使用される細胞は、ヒト癌遺伝子Ｒｅｔ／ＰＴＣ１を発現するベクターｐＢＡＢを安定にトランスフェクトしたマウス線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３であった。細胞培養を、１０％の熱不活化新生仔牛血清（１０％、gibco）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ、GIBCO）及びピューロマイシン（２．５μｇ／ｍｌ、Sigma）を含有するＤＭＥＭ培地（GIBCO）において、３７℃、５％ＣＯ２で多湿雰囲気下で行った。
【０１８２】
次いで、この細胞培養物を、一本鎖ＲＮＡ  ＯＮ４及びＯＮ５から得られるｓｉＲＮＡ、並びに市販のｓｉＲＮＡ  ＡＳで処理した。
【０１８３】
処理の前日に、３×１０５個の細胞を６ウェルプレート上に播種した。トランスフェクションを、５０μｌのＨｅｐｅｓ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．２）、１００ｍＭのＮａＣｌ中の０．０５ｎｍｏｌのｓｉＲＮＡと、５０μｌの同じ緩衝液中の２μｇのｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ（GTS）とを混合することによって行った。室温で１０分間のインキュベーションの後、この混合物（complexes）を、血清を含有する９００μｌの新たな培養培地中の細胞に２４時間添加した。実験は三連で（in triplicate）行った。ｓｉＲＮＡの対照配列は、配列番号６：５’−ＧＣＣＡＧＵＧＵＣＡＣＣＧＵＣＡＡＧＧｄＡｄＧ−３’及び配列番号７：５’−ＣＣＵＵＧＡＣＧＧＵＧＡＣＡＣＵＧＧＣｄＴｄＴ−３’であり、Eurogentecによって供給された。これらは所要のｍＲＮＡの非特異的ランダム配列である。
【０１８４】
次いで、ｍＲＮＡ  Ｒｅｔ／ＰＴＣ１の発現の検出をＲＴ−ＰＣＲによって行った。ｍＲＮＡを試薬ＴＲＩｚｏｌ（Invitrogen）を用いて製造業者の指示通りに抽出した。ＵＶ分光測定によって濃度を決定した後、対照細胞又は処理細胞に由来する１μｇの総ＲＮＡを、Ｍｏ−ＭｕＬＶ  ＲＴ（Promega）と共に２０μｌの最終容量で４２℃で１時間、製造業者の指示通りにインキュベートした。次いで、ｍＲＮＡ  Ｒｅｔ／ＰＴＣ１の発現を、Ｔａｑポリメラーゼ（Ozyme）を含む５０μｌの反応混合物中の２μｌの逆転写産物に対してＰＣＲによって決定した。
【０１８５】
以下のプライマーを、Ｒｅｔ／ＰＴＣ１（２９０ｐｂ）の増幅に使用した：アンチセンスプライマー：配列番号８：５’−ＣＴＧＣＴＴＣＡＧＧＡＣＧＴＴＧＡＡ−３’及びセンスプライマー：配列番号９：５’−ＡＧＡＴＡＧＡＧＣＴＧＧＡＧＡＣＣＴＡＣ−３’。
【０１８６】
酵素グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であるＧＡＰＤＨ（５３１ｐｂ）を、プライマー配列：配列番号１０：５’−ＧＡＣＡＡＣＴＣＡＣＴＣＡＡＧＡＴＴＧＴＣＡＧ−３’及び配列番号１１：５’−ＣＡＴＴＧＴＣＡＴＡＣＣＡＧＧＡＡＡＴＧ−３’による逆転写（ＲＴ）の機能に関する対照として使用した。
【０１８７】
ＰＣＲ産物がそれぞれ２１サイクル又は３２サイクル後に得られ、トリス酢酸ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＡＥ）［０．５×］を用いた２％アガロースゲルでの電気泳動によって分析した。ＤＮＡ断片をエチジウムブロマイドで染色した後、ＵＶ照明下で検出し、次いでカメラと接続したコンピュータ分析システム（Syngene）を用いて定量を行った。実験は三連で行った。
【０１８８】
これらの様々な実験（三連で行った）により、ＲＮＡ  ＯＮ４及びＯＮ５から得られる二本鎖ｓｉＲＮＡ（それ自体が本発明の方法によって得られる）の遺伝子サイレンシング活性（６０％阻害）が、購入した同じ配列の二本鎖ｓｉＲＮＡ  ＡＳ（ＴＢＤＭＳを用いた化学的保護方法によって製造される）の遺伝子サイレンシング活性（４０％阻害）よりも良好であることが示された。このより良好な活性は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した本発明の二本鎖ＲＮＡの純度が、ＰＡＧＥによって精製したｓｉＲＮＡ  ＡＳの純度と比較して高いことにより説明することができた。
【０１８９】
いずれの場合にも、この結果により、本発明の方法によって合成されたＲＮＡの完全性及び純粋性が確認される。
【０１９０】
核酸塩基、及びリボースの３’位及び５’位のヒドロキシルを保護する任意の他の既知の基を、３’位のヒドロキシルを保護する基が、アシルオキシアルキル又はアシルチオアルキルタイプの塩基不安定基であれば使用することができることは当業者に明らかである。
【０１９１】
さらに、２’位のヒドロキシル及び合成されたＲＮＡの核酸塩基の環外アミン官能基を脱保護するために用いられるアンモニア処理によって、ＲＮＡがスクシニルリンカー又はＱリンカー等の塩基不安定のリンカーによって固体担体に結合している場合に、その固体担体からＲＮＡを遊離させることも同時に可能となることは当業者に明らかである。
【０１９２】
さらに、上述の記載及び添付の特許請求の範囲において、保護基Ｘ１が酸不安定基から
選択されると記載されているが、当業者に既知の好適なフッ素不安定又は塩基不安定の基
を同様にリボースの５’位のヒドロキシルを保護するために使用してもよいことは当業者
に明らかである。
［本発明の態様］
本発明は、下記の態様を包含する。
項１、リンカーによって固体担体に結合した保護された、以下の式Ｉ：
【化１７】
0005689054.tif 000021
（式中、
Ｘ1はＨ、又はジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基及びピキシル基から選択されるヒドロキシル保護基、好ましくはジメトキシトリチル基であり、
Ｘ2はＨ、又はβ−脱離可能なリン酸を保護する基、好ましくはシアノエチル基であり、
Ｘ3は、以下の式Ａ：
【化１８】
0005689054.tif 000022
（式中、ＸはＯ又はＳであり、Ｒ'はＨ又はＣＨ3であり、Ｒは直鎖又は分岐Ｃ1〜Ｃ4アルキル基及び基Ｒ1−Ｏ−Ｒ2（ここで、Ｒ1はＣ1〜Ｃ2アルキル基であり、Ｒ2はＣＨ3又はＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ3又はアリール基である）から選択される）のリボースの２'位のヒドロキシルを保護する塩基不安定の基であり、
Ｘ4はリンカー−担体アセンブリを表し、
Ｘ6はＨ、又は基ＯＸ3若しくはＯＡｃであり、
Ｂｐは、Ｘ6がＨである場合に天然若しくは修飾チミン核酸塩基であり、又はＸ6がＯＸ3若しくはＯＡｃである場合に天然若しくは修飾ウラシルであり、又はＸ6にかかわらず保護された天然若しくは修飾アデニン、又は保護された天然若しくは修飾シトシン、又は保護された天然若しくは修飾グアニンであり、
ｎは０以上の整数である）の一本鎖ＲＮＡから出発して、一本鎖ＲＮＡを放出させる方法であって、
ａ）Ｘ2がＨと異なる場合、担体に結合した、保護された前記式Ｉの一本鎖ＲＮＡを、ピペリジン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）、トリエチルアミンから選択される塩基を用いて室温で処理して、３'−５'ヌクレオシド間リンカーのリン酸を放出させる工程、
続いて、ｂ）工程ａ）において得られる部分的に放出された前記ＲＮＡを、濃縮アンモニア、メチルアミン、炭酸カリウムから選択される塩基を用いて室温で処理する工程を含むことを特徴とする、方法。
項２、式Ｉにおいて、Ｘ3が式Ａの基であることを特徴とする、項１に記載の方法。
項３、式Ｉにおいて、Ｘ3がピバロイルオキシメチル基、又はイソブチリルオキシメチル基、又はブチリルオキシメチル基、又はプロピオニルオキシメチル基、又はアセチルオキシメチル基であることを特徴とする、項１又は２に記載の方法。
項４、式Ｉにおいて、前記核酸塩基Ｂｐが天然又は修飾ウラシルであることを特徴とする、項１〜３のいずれ１項に記載の方法。
項５、式Ｉにおいて、前記４つの天然又は修飾核酸塩基ウラシル、アデニン、シトシン及びグアニンが存在し、工程ｂ）において、前記保護基Ｘ3の除去を、アンモニアで処理した後、総容量に対してアンモニアの１５容量％のイソプロピルアミンを添加し、次いで減圧下で脱保護媒体を蒸発させることによって行うことを特徴とする、項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
項６、担体に結合した、保護された前記式ＩのＲＮＡが、塩基不安定のリンカーによって固体担体に結合されていることを特徴とする、項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
項７、一本鎖ＲＮＡを合成する方法であって、
ａ）固体担体に、以下の式ＩＩ：
【化１９】
0005689054.tif 000023
（式中、
Ｘ1はジメトキシトリチル基であり、
Ｘ6はＨ、又は基ＯＡｃ若しくはＯＸ3（ここで、Ｘ3は以下の式Ａ：
【化２０】
0005689054.tif 000024
（式中、ＸはＯ又はＳであり、Ｒ'はＨ又はＣＨ3であり、Ｒは直鎖又は分岐Ｃ1〜Ｃ4アルキル基及び基Ｒ1−Ｏ−Ｒ2（ここで、Ｒ1はＣ1〜Ｃ2アルキル基であり、Ｒ2はＣＨ3又はＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ3又はアリール基である）から選択される）の基である）であり、
Ｂｐは、Ｘ6がＨである場合に天然若しくは修飾チミン核酸塩基であり、又はＸ6がＯＡｃ若しくはＯＸ3である場合に天然若しくは修飾ウラシル核酸塩基であり、又はＸ6にかかわらず保護された天然若しくは修飾アデニン核酸塩基、又は保護された天然若しくは修飾シトシン核酸塩基、又は保護された天然若しくは修飾グアニン核酸塩基である）のモノマーを結合させる工程、
ｂ）工程ａ）において得られる、その担体に結合した前記式ＩＩのモノマーと、少なくとも１つの以下の式ＩＩＩ：
【化２１】
0005689054.tif 000025
（式中、Ｘ1、Ｂｐ、Ｘ3は式ＩＩについて定義されるようなものであり、Ｘ5は水素ホスホネートモノエステル基又はホスホロアミダイト、好ましくは２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト基である）のモノマーとを結合させ、それにより担体に結合した、保護された式Ｉの一本鎖ＲＮＡを得る工程、
ｃ）必要に応じて、工程ｂ）において得られるアセンブリを酸性媒体で処理する工程、
及び
ｄ）工程ｂ）又は工程ｃ）において得られる担体に結合した、保護された前記一本鎖ＲＮＡを、項１〜６のいずれか１項に記載の放出させる方法によって放出させる工程を含むことを特徴とする、方法。
項８、工程ｂ）の前に、
ａ）前記核酸塩基Ｂｐが天然若しくは修飾ウラシルと異なる場合、該核酸塩基Ｂｐの環外アミンを保護する工程、
ｂ）リボース糖の５'位のヒドロキシルを保護する工程、
ｃ）リボース糖の２'位のヒドロキシルを式Ａの基で保護する工程、及び
ｄ）リボース糖の３'位のヒドロキシルを、水素ホスホネートモノエステル基又はホスホロアミダイト、好ましくは２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト基で官能基化する工程を含む、ａ'）式ＩＩＩのモノマーを合成する工程をさらに含むことを特徴とする、項７に記載の一本鎖ＲＮＡを合成する方法。
項９、二本鎖ＲＮＡを合成する方法であって、項７に記載の方法に従って一本鎖ＲＮＡを合成すること、及びそれにより合成される一本鎖ＲＮＡを、相補配列を有する一本鎖ＲＮＡとハイブリダイズさせることを含むことを特徴とする、方法。
項１０、前記二本鎖ＲＮＡがｓｉＲＮＡであることを特徴とする、項８又は９に記載の合成する方法。
項１１、以下の式ＩＩＩ：
【化２２】
0005689054.tif 000026
（式中、
Ｂｐは天然若しくは修飾ウラシル核酸塩基、又は保護された天然若しくは修飾アデニン核酸塩基、又は保護された天然若しくは修飾シトシン核酸塩基、又は保護された天然若しくは修飾グアニン核酸塩基であり、
Ｘ1はジメトキシトリチル基であり、
Ｘ3は以下の式Ａ：
【化２３】
0005689054.tif 000027
（式中、ＸはＯ又はＳであり、Ｒ'はＨ又はＣＨ3であり、Ｒは直鎖又は分岐Ｃ1〜Ｃ4アルキル基及び基Ｒ1−Ｏ−Ｒ2（ここで、Ｒ1はＣ1〜Ｃ2アルキル基であり、Ｒ2はＣＨ3又はＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ3又はアリール基である）から選択される）の塩基不安定の基であり、
Ｘ5は水素ホスホネート基又はホスホロアミダイト基、好ましくは２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト基である）のモノマーを、以下の式ＩＶ：
【化２４】
0005689054.tif 000028
（式中、Ｂｐは天然又は修飾ウラシル、アデニン、シトシン又はグアニン核酸塩基である）のリボヌクレオシドモノマーから合成する方法であって、
ａ）前記核酸塩基Ｂｐが天然又は修飾ウラシルと異なる場合、該核酸塩基Ｂｐの環外アミンを保護する工程、
ｂ）リボース糖の５'位のヒドロキシルを保護する工程、
ｃ）リボース糖の２'位のヒドロキシルを式Ａの保護基で保護する工程、及び
ｄ）リボース糖の３'位のヒドロキシルを、水素ホスホネートモノエステル基又はホスホロアミダイト、好ましくは２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト基で官能基化する工程から成ることを特徴とする、方法。
項１２、工程ｃ）において、前記保護基がピバロイルオキシメチル基、イソブチリルオキシメチル基、ブチリルオキシメチル基、プロピオニルオキシメチル基及びアセチルオキシメチル基から選択される式Ａの基であることを特徴とする、項１１に記載の方法。
項１３、工程ｃ）において、前記式Ａの基がピバロイルオキシメチル基であることを特徴とする、項１１又は１２に記載の方法。
項１４、工程ｂ）において、前記保護基がジメトキシトリチル基であることを特徴とする、項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
項１５、工程ｄ）において、前記基Ｘ5が２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト基であることを特徴とする、項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
項１６、前記核酸塩基が天然又は修飾シトシンであり、工程ａ）における前記保護基がアセチル基であることを特徴とする、項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
項１７、前記核酸塩基が天然又は修飾アデニンであり、工程ａ）における前記保護基がフェノキシアセチル基であることを特徴とする、項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
項１８、前記核酸塩基が天然又は修飾グアニンであり、工程ａ）における前記保護基がｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル基又はイソプロピルフェノキシアセチル基であることを特徴とする、項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【配列表】
0005689054000001.app