(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源から放射された照明光を走査する走査ユニットと、
前記照明光を試料に照射し、前記試料から出射する観察光を集光する対物レンズと、
前記走査ユニットと前記対物レンズとの間に配置され、前記照明光を対物レンズに導くとともに、前記観察光を検出部に導くダイクロイックミラーと、
前記照明光を遮断し前記観察光を透過することにより、前記照明光の光束径を成形する輪帯状のフィルタと、を備え、
前記対物レンズの射出瞳において、前記観察光の光束径は、成形された前記照明光の光束径よりも大きいことを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項２】
前記輪帯状のフィルタは、前記対物レンズ内に配置されることを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
【請求項３】
光源から放射された照明光を走査する走査ユニットと、
前記照明光を試料に照射し、前記試料から出射する観察光を集光する対物レンズと、
前記走査ユニットと前記対物レンズとの間に配置され、前記照明光を対物レンズに導くとともに、前記観察光を検出部に導くダイクロイックミラーと、を備え、
前記対物レンズは、
前記観察光が通過する第１レンズと、
前記第１レンズの外周に沿って配置された第２レンズと、を有し、
前記対物レンズの射出瞳において、前記観察光の光束径は、成形された前記照明光の光束径よりも大きいことを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項４】
前記光源は、多光子励起を生じさせる赤外短パルスレーザ光源であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
【請求項５】
前記観察光は、ピンホールを介さずに、前記検出部に導かれることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
【請求項６】
走査型顕微鏡に用いられ、光源から放射された第１の波長の照明光を試料に照射し、前記試料から出射する第２の波長の観察光を集光する対物レンズユニットであって、
対物レンズと、
前記第１の波長の照明光を遮断し、前記第２の波長の観察光を透過する輪帯状のフィルタであって、前記対物レンズの射出瞳を通過する前記照明光の光束径を、前記対物レンズの開口数の光束の径よりも小さくするフィルタと、を有することを特徴とする対物レンズユニット。
【請求項７】
前記フィルタは、前記対物レンズの射出瞳と略同一位置に配置されていることを特徴とする請求項６に記載の対物レンズユニット。
【請求項８】
前記フィルタは、前記射出瞳より標本側に配置される第１フィルタと、
前記射出瞳より前記光源側に配置される第２フィルタと、であることを特徴とする請求項６に記載の対物レンズユニット。
【請求項９】
走査型顕微鏡に用いられ、光源から放射された第１の波長の照明光を試料に照射し、前記試料から出射する第２の波長の観察光を集光する対物レンズユニットであって、
前記照明光が通過する第１レンズと、
前記第１レンズの外周に沿って配置された第２レンズと、を有する対物レンズを有し、
前記対物レンズの射出瞳において、前記観察光の光束径は、成形された前記照明光の光束径よりも大きいことを特徴とする対物レンズユニット。
【請求項１０】
前記光源から放射される第１の波長の照明光を走査する走査ユニットと、
請求項６〜９のいずれか一項に記載の対物レンズユニットと、
前記観察光を検出する検出部と、を有することを特徴とする走査型顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対物レンズユニット及びこの対物レンズユニットを有する走査型顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、生物顕微鏡の分野では、非線形効果を用いた顕微鏡が注目を集めている。その中でも、多光子励起を使用した顕微鏡は蛍光試料内の拡散に対して強く、試料の深部まで明るく観察をすることができる。したがって、今まで観察し難かった、脳などの光の拡散が大きい試料の深部をより明るく観察することができる。そのため、ユーザーからの需要がある。この需要に対応するため、多くの多光子励起顕微鏡が提案されている。
【０００３】
このような多光子励起顕微鏡は、対物レンズにより励起光がスポットを結ぶ位置のみが励起されるので、ピンホールを使用しなくともよいという特徴がある。そのため、わざわざ試料からの観察光を非走査光に変える（デスキャンする）必要がないので、走査手段と対物レンズとの間に光束分離手段を挿入配置し、その先にディテクターを配置することが可能である。このディテクターをＮＤＤ（Non Descanned Detector）と言う。ピンホールを使用する場合は、試料面のうち当該ピンホールと共役な位置から出射した観察光しか受光できないが、ＮＤＤであれば 集光位置の周りに拡散した観察光であっても受光することができるため、明るい画像を得ることができる。このＮＤＤの特徴を利用してさまざまな対物レンズが開発されている。例えば、より多くの散乱光を拾えるようにするため広視野・高開口数の対物レンズが開発されている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−００８９８９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような多光子励起顕微鏡の対物レンズにおいて、検出器をＮＤＤのみと考えた場合、良好に収差が補正されている必要があるのは励起側だけであり、蛍光は検出器に入りさえすればよい。しかし、従来の対物レンズでは、励起側と蛍光側とで開口数を変えることができないため、蛍光の取り込み側の開口数は励起側の良好に収差が補正できる範囲の開口数に限定されてしまうという課題があった。
【０００６】
本発明はこのような課題に鑑みてなされたものであり、良好に収差が補正されている必要がある励起側の開口数によらず蛍光側の取り込み開口数を大きくすることにより、より明るい画像を取得することが可能な対物レンズユニット及びこの対物レンズユニットを有する走査型顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するために、本発明に係る走査型顕微鏡は、光源から放射された照明光を走査する走査ユニットと、照明光を試料に照射し、試料から出射する観察光を集光する対物レンズと、走査ユニットと対物レンズとの間に配置され、照明光を対物レンズに導くとともに、観察光を検出部に導くダイクロイックミラーと、照明光を遮断し観察光を透過することにより、照明光の光束径を成形する輪帯状のフィルタと、を備え、対物レンズの射出瞳において、観察光の光束径は、成形された照明光の光束径よりも大きいことを特徴とする。
【０００８】
このような走査型顕微鏡において、輪帯状のフィルタは、対物レンズ内に配置されることが好ましい。
【０００９】
また、本発明に係る走査型顕微鏡は、光源から放射された照明光を走査する走査ユニットと、照明光を試料に照射し、試料から出射する観察光を集光する対物レンズと、走査ユニットと対物レンズとの間に配置され、照明光を対物レンズに導くとともに、観察光を検出部に導くダイクロイックミラーと、を備え、対物レンズは、観察光が通過する第１レンズと、この第１レンズの外周に沿って配置された第２レンズと、を有し、対物レンズの射出瞳において、観察光の光束径は、成形された照明光の光束径よりも大きいことを特徴とする。
【００１０】
このような走査型顕微鏡において、光源は、多光子励起を生じさせる赤外短パルスレーザ光源であることが好ましい。
【００１１】
また、このような走査型顕微鏡において、観察光は、ピンホールを介さずに、検出部に導かれることが好ましい。
【００１２】
また、本発明に係る対物レンズユニットは、走査型顕微鏡に用いられ、光源から放射された第１の波長の照明光を試料に照射し、試料から出射する第２の波長の観察光を集光する対物レンズユニットであって、対物レンズと、第１の波長の照明光を遮断し、第２の波長の観察光を透過する輪帯状のフィルタであって、対物レンズの射出瞳を通過する照明光の光束径を、対物レンズの開口数の光束の径よりも小さくするフィルタと、を有することを特徴とする。
このような本発明に係る対物レンズユニットにおいて、フィルタは、対物レンズの射出瞳と略同一位置に配置されていることが好ましい。
また、このような本発明に係る対物レンズユニットにおいて、フィルタは、射出瞳より標本側に配置される第１フィルタと、射出瞳より光源側に配置される第２フィルタと、であることが好ましい。
【００１３】
また、本発明に係る対物レンズユニットは、走査型顕微鏡に用いられ、光源から放射された第１の波長の照明光を試料に照射し、試料から出射する第２の波長の観察光を集光する対物レンズユニットであって、照明光が通過する第１レンズと、この第１レンズの外周に沿って配置された第２レンズと、を有する対物レンズを有し、対物レンズの射出瞳において、観察光の光束径は、成形された照明光の光束径よりも大きいことを特徴とする。
【００１４】
また、本発明に係る走査型顕微鏡は、光源から放射される第１の波長の照明光を走査する走査ユニットと、上述の対物レンズユニットのいずれかと、観察光を検出する検出部と、を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明を以上のように構成すると、良好に収差が補正されている必要がある励起側の開口数によらず蛍光側の取り込み開口数を大きくすることにより、より明るい画像を取得することが可能な対物レンズユニット及びこの対物レンズユニットを有する走査型顕微鏡を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】走査型顕微鏡の構成を示す説明図である。
【図２】走査光学系の主要部の構成を示す説明図である。
【図３】第１の実施形態に係る走査型顕微鏡における対物レンズユニットの構成を示す説明図であって、（ａ）はこの対物レンズユニットを示し、（ｂ）はフィルタを示し、（ｃ）はフィルタの特性を示す。
【図４】第１及び第２のフィルタで励起側の開口数を制限する構成を示す説明図であって、（ａ）は励起側の光線の状態を示し、（ｂ）は蛍光側の光線の状態を示す。
【図５】第２の実施形態に係る走査型顕微鏡の構成を示す説明図である。
【図６】第３の実施形態に係る走査型顕微鏡の構成を示す説明図である。
【図７】対物レンズの変形例を説明するための説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の好ましい実施形態について図面を参照して説明する。まず、図１を用いて走査型顕微鏡１０の構成について説明する。この走査型顕微鏡１０は、光源２０から放射されたレーザ光（照明光）をステージ１１上に載置された標本６０に照射して走査する走査光学系３０と、標本６０からの蛍光（観察光）を検出する第１検出部４０及び第２検出部５０と、を有して構成される。なお、以降の説明において、走査光学系３０の光軸方向をｚ軸とし、このｚ軸に直交する面内で互いに直交する方向をそれぞれｘ軸及びｙ軸とする。
【００１８】
この走査型顕微鏡１０において、光源２０は、波長が異なる複数のレーザ光を、同時または個別に射出することが可能に構成されている。なお、以降の説明においては、光源２０から赤外光および可視光の２種類のレーザ光が射出されるものとして説明する。また、この光源２０から射出される赤外光は、試料６０の多光子励起を誘発するための、所定の周期で射出される非常に短いパルス状の光（例えば、１００フェムト秒のパルス光であって、以下、「ＩＲパルス光」と称する）であるものとする。
【００１９】
走査光学系３０は、光源２０側から順に、第１集光レンズ３１、第１ダイクロイックミラー３２、走査ユニット３３、瞳投影レンズ３４、第２集光レンズ３５、第２ダイクロックミラー３６、及び、対物レンズ３７を有する。
【００２０】
また、第１検出部４０は、上述のＮＤＤであって、第２ダイクロイックミラー３６の側方に配置され、この第２ダイクロイックミラー３６側から順に、第３集光レンズ４１、第４集光レンズ４２、及び、第１光検出器４３から構成される。ここでは、第１光検出器４３の受光面は対物レンズ３７の射出瞳位置と略共役に配置されているが、第１光検出器４３は物体面との共役になっていてもよい。
【００２１】
さらに、第２検出部５０は、第１ダイクロイックミラー３２を挟んで試料６０と対向するように配置されており、この第１ダイクロイックミラー３２側から順に、第５集光レンズ５１、対物レンズ３７の試料側の焦点面と略共役な位置に配置された遮光板５２、及び、第２光検出器５３から構成される。ここで、遮光版５２にはピンホール５２ａが設けられており、このピンホール５２ａは走査光学系３０の光軸を含むように配置されている。
【００２２】
また、この走査型顕微鏡１０には、走査ユニット３３でレーザ光を走査する位置（試料６０上の走査面内の座標）及び第１及び第２光検出器４３，５３で検出された値を処理する図示しない処理部が設けられている。なお、第１及び第２光検出器４３，５３としては、例えば、ＰＭＴ（Photo Multiplier Tube:光電子倍増管）、ＧａＡｓＰ等が用いられる。
【００２３】
この走査型顕微鏡１０において、光源２０から放射されたレーザ光は、第１集光レンズ３１で略平行光束となり、第１ダイクロイックミラー３２に入射して対物レンズ３７側に反射され、走査ユニット３３に入射する。この走査ユニット３３は、光軸に直交する方向（上述のｘ軸方向及びｙ軸方向）にレーザ光を２次元的に走査するものであり、例えば、図２に示すようにレーザ光を反射することによりこのレーザ光を光軸に直交する面内で所定の方向（この方向をｘ軸方向とする）に偏向させる第１の偏向素子３３ｘ、及び、光軸に直交する面内で第１の偏向素子３３ｘの偏向方向と略直交する方向（この方向をｙ軸方向とする）に偏向させる第２の偏向素子３３ｙからなる２つの偏向素子で構成されている。そして、この走査ユニット３３を出射したレーザビーム（略平行光束）は瞳投影レンズ３４により一次像面に結像された後、第２集光レンズ３５を通過することにより再び略平行光束となり、第２ダイクロイックミラー３６を透過して対物レンズ３７によって試料６０上の対物レンズ３７の焦点面に集光される。なお、試料６０上に集光されたレーザ光は点像となっており、その点像の径は対物レンズ３７の開口数（ＮＡ）で決まる大きさである。
【００２４】
ここで、本実施形態に係る走査型顕微鏡１０において、試料６０の観察時には、光源２０から放射されるレーザー光のうち、ＩＲパルス光又は可視光の何れか一方が、試料６０の画像を得るためのイメージング用の光（励起光）として用いられる。
【００２５】
例えば、ＩＲパルス光を励起光（第１の波長の照明光）として用いる場合、可視光は全く使用されないか、又は、試料６０の光刺激用として使用される。この場合、ＩＲパルス光が試料６０に照射されると、試料６０からは多光子励起による蛍光が発生し、この蛍光は観察光（第２の波長の観察光）となって対物レンズ３７に入射し、この対物レンズ３７で略平行光束となり第２ダイクロイックミラー３６で反射されて第１検出部４０に入射する。そして、この観察光は第３集光レンズ４１及び第４集光レンズ４２で必要な径の略平行光束に変換されて第１光検出器４３に入射して検出される。なお、この第１検出部４０には、試料６０や対物レンズ３７等で反射され、観察光とともにこの第１検出部４０に入射するＩＲパルス光を除去するために、図示しないＩＲカットフィルタが配置されている。
【００２６】
一方、可視光を励起光として用いる場合、ＩＲパルス光は全く使用されないか、又は、試料６０の光刺激用として使用される。この場合、観察光が試料６０に照射されると、試料６０からは蛍光が発生し、この蛍光は観察光となって対物レンズ３７に入射し、この対物レンズ３７で略平行光束となり第２ダイクロイックミラー３６を透過する。そして、この観察光は、第２集光レンズ３５により一次像面に結像された後、さらに瞳投影レンズ３４で略平行光束にされて走査ユニット３３に入射し、この走査ユニット３３でデスキャンされて出射し、第１ダイクロイックミラー３２を透過して第２検出部５０内に入り、第５集光レンズ５１により遮光板５２のピンホール５２ａ上に集光される。この第２検出部５０において、遮光板５２のピンホール５２ａを通過した光のみが第２光検出器５３に到達し検出される。
【００２７】
上述のように、遮光板５２のピンホール５２ａは試料６０上の走査面に集光されたレーザ光の点像と共役であり、試料６０上の照射領域（対物レンズ３７の焦点面）から出た観察光（蛍光）はこのピンホール５２ａを通過することができる。一方、試料６０上の他の領域から出た光のほとんどはこのピンホール５２ａ上には集光されず、通過することができない。
【００２８】
以上より、図示しない処理部が走査ユニット３３の走査に同期されて第１及び第２光検出器４３，５３で検出された光信号を処理することにより、試料６０上のレーザ光が照射された座標と光信号から求められる輝度を用いて、試料６０の走査面における二次元的な画像を得ることができる。これによりこの走査型顕微鏡１０は、高い分解能で試料６０の像を得ることができる。このように、本実施形態に係る走査型顕微鏡１０は、走査型多光子顕微鏡及び走査型共焦点顕微鏡の両方として使用することができる。
【００２９】
［第１の実施形態］
それでは、このような構成の走査型顕微鏡１０の第１の実施形態として、励起光が放射されるとき（励起側）の開口数（ＮＡ）よりも、蛍光を取り込むとき（蛍光側）の開口数（ＮＡ）が大きくなるようにした構成について説明する。
【００３０】
図３に示すように、本第１の実施形態に係る走査型顕微鏡１０において、対物レンズ３７には、この対物レンズ３７の射出瞳の位置、若しくはその近傍に、輪帯状（リング状）のフィルタ３８が配置されて、対物レンズユニット３９を構成している。このフィルタ３８は、図３（ｃ）に示すように、光源２０から放射されたＩＲパルス光（第１の波長の照明光）を、例えば、吸収することにより遮断し、このＩＲパルス光により試料６０で励起された蛍光（第２の波長の観察光）を透過する光学部材で構成されており、その外径が、対物レンズ３７を通過する最大開口数の光束以上の大きさに形成され、また、開口部３８ａの内径は最大開口数の光束よりも小さく形成されている。そのため、図３（ａ）に示すように、ＩＲパルス光ＬＥはこのフィルタ３８の開口部３８ａのみを通過することができるので、このフィルタ３８により絞られ、対物レンズ３７から射出したときのＩＲパルス光ＬＥの開口数が対物レンズ３７の最大開口数よりも小さくなる。すなわち、ＩＲパルス光ＬＥは、対物レンズ３７の外周部は通過せず、収差が良好に補正された光軸付近を通過するため、このＩＲパルス光ＬＥを対物レンズ３７の焦点面上の一点に効率良く集光することができる。一方、このＩＲパルス光ＬＥにより励起された蛍光ＬＦはフィルタ３８を通過することができるので、対物レンズ３７の最大開口数で、散乱光も含めて効率良く取り込むことができる。
【００３１】
なお、図４に示すように射出瞳が対物レンズ３７の内部にある場合は、この対物レンズ３７を構成するレンズの適宜の面で光束を制限することで、励起側の開口数を対物レンズ３７の最大開口数（蛍光側の開口数）より小さくすることができる。具体的には、軸上物点から射出される最大開口数の光線及び、軸外物点から射出される光束の中、最も光軸から離れた方向に射出される光線を、軸上物点から射出される最大開口数の光線と対物レンズ３７内の適宜のレンズ面（例えば、図４における第Ａ面）との交点で制限するように第１フィルタ３８１を配置し、最も光軸に近い方向に射出される光線を、軸上物点から射出される最大開口数の光線と対物レンズ３７内の適宜のレンズ面（例えば、図４における第Ｂ面）との交点で制限するように第２フィルタ３８２を配置する。なお、第１及び第２フィルタ３８１，３８２の各々は、図３（ｂ）に示す形状を有するとともに、入射する光の波長に対して図３（ｃ）に示す特性を有している。
【００３２】
このような走査型顕微鏡１０において、第１検出部４０をＮＤＤと考えた場合、対物レンズ３７の蛍光側は厳密な収差の補正は必要がないため、液浸の対物レンズであれば蛍光側の取り込み開口数を１．３３、油浸の対物レンズであれば蛍光側の取り込み開口数を１．５まで上げて、より明るい画像を取得することができる。このとき、上述のように励起側の開口数はフィルタ３８（３８１，３８２）で制限されるため、対物レンズ３７において良好に収差が補正された光軸付近を使用することができるので、ＩＲパルス光を、試料６０上の所望の位置に効率良く集光して多光子励起を起こさせることができる。また、このように対物レンズ３７にフィルタ３８を設けた対物レンズユニット３９とすることにより、従来の走査型顕微鏡の対物レンズユニットの代わりにこの対物レンズユニット３９を取り付けることで上述の効果を得ることができる。
【００３３】
［第２の実施形態］
上述の第１の実施形態に係る走査型顕微鏡１０では、対物レンズ３７に励起側の開口数を制限するフィルタ３８（３８１，３８２）を設けた場合について説明したが、光源２０から走査光学系３０に入射するＩＲパルス光の光束を絞ることでも、同様の効果を得ることができる。例えば、図５に示すように、光源２０と走査ユニット３３との間の略平行光束の区間（図１に示す、第１集光レンズ３１と第１ダイクロイックミラー３２との間が望ましい）に、絞り２１を配置し、ＩＲパルス光の光束を絞ることで、対物レンズ３７の射出瞳を通過するＩＲパルス光の光束径も絞られる。そのため、ＩＲパルス光は、対物レンズ３７の外周部は通過せず、収差が良好に補正された光軸付近を通過するため、このＩＲパルス光を対物レンズ３７の焦点面上の一点に効率良く集光することができる。一方、このＩＲパルス光により励起された試料６０から発生した蛍光は、対物レンズ３７の最大開口数で、散乱光も含めて効率良く取り込むことができる。
【００３４】
［第３の実施形態］
あるいは、図６に示すように、光源２０と走査ユニット３３との間の略平行光束の区間（図１に示す、第１集光レンズ３１と第１ダイクロイックミラー３２との間が望ましい）に、ビームエキスパンダ２２を配置し、ＩＲパルス光の光束を細くすることで、対物レンズ３７の射出瞳を通過するＩＲパルス光の光束径も絞ることができ、第２の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【００３５】
なお、以上の第１〜第３の実施形態において、試料６０で発生する蛍光を取り込むために、対物レンズ３７の開口数を大きくすると、収差の補正が難しくなり、ＩＲパルス光を焦点面上の一点に集光することが難しくなる。そのため、図７に示すように、対物レンズ３７′を、走査光学系３０の光軸上に配置された第１レンズ３７ａと、その外周を囲むように配置された第２レンズ３７ｂとで構成し、光源２０から放射されたレーザ光（ＩＲパルス光）は第１レンズ３７ａで集光し、試料６０から出射した蛍光はこの第１レンズ３７ａ及び第２レンズ３７ｂで集光するように構成することができる。
【００３６】
対物レンズ３７′をこのような構成とすると、第１レンズ３７ａの開口数はＩＲパルス光を試料６０上に集光するために必要な開口数とすることができるので、収差を良好に補正することができる。一方、蛍光に対しては、上述のように第１検出部４０をＮＤＤであるとすると、対物レンズ３７′は、試料６０で発生する蛍光を集光してこの第１検出部４０に入射させれば良いので、第２レンズ３７ｂでも十分機能を発揮することができる。
【００３７】
なお、第２レンズ３７ｂは、中空でリング状のレンズでも良いし、複数のマイクロレンズを第１レンズ３７ａの外周に沿って輪帯状に並べた構成でも良い。また、この対物レンズ３７′を第１の実施形態の対物レンズユニット３９に適用する場合は、ＩＲパルス光が第１レンズ３７ａを通過するようにフィルタ３８を配置する。
【符号の説明】
【００３８】
１０  走査型顕微鏡    ２０  光源    ２１  絞り
２２  ビームエキスパンダ    ３３  走査ユニット
３７，３７′  対物レンズ    ３７ａ  第１レンズ    ３７ｂ  第２レンズ
３８  フィルタ    ３８１  第１フィルタ    ３８２  第２フィルタ
３９  対物レンズユニット    ６０  試料
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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