(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、タンパク質キナーゼ活性を有するタンパク質と、
（ｃ）特異的結合タグペプチドが前記（ａ）又は（ｂ）のいずれかのポリペプチドに連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を用意するステップと、
（２）前記ステップ（１）で用意されたタンパク質と、試験化合物とを含む反応混合液のキナーゼ活性を測定するステップと、
（３）前記試験化合物の非存在下で、前記ステップ（１）で用意されたタンパク質を含む反応混合液のキナーゼ活性を測定するステップと、
（４）前記ステップ（２）のキナーゼ活性と、前記ステップ（３）のキナーゼ活性とを比較するステップとを含むことを特徴とする、トリパノソーマ・ブルース原虫の増殖阻害剤を検出する方法。
【請求項２】
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と、
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、タンパク質キナーゼ活性を有するタンパク質と、
（ｃ）特異的結合タグペプチドが前記（ａ）又は（ｂ）のいずれかのポリペプチドに連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、トリパノソーマ・ブルース原虫における前記タンパク質の発現を抑制する配列特異的発現抑制剤。
【請求項３】
配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列のカルボキシル末端から２番目のセリン残基がリン酸化され、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と、トリパノソーマ・ブルース原虫の１４−３−３−Ｉ及び１４−３−３−ＩＩのヘテロ２量体との会合を阻害することを特徴とする、ホスホペプチド。
【請求項４】
請求項３に記載のホスホペプチドと、細胞膜透過性ペプチドとの融合ペプチド。
【請求項５】
請求項２に記載の配列特異的発現抑制剤を含むことを特徴とする、トリパノソーマ・ブルース原虫感染症の治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、原虫の増殖阻害剤を検出する方法と、ＡＫＢ１４−３−３−１タンパク質等の配列特異的発現抑制剤と、ＡＫＢ１４−３−３−１タンパク質と、トリパノソーマ１４−３−３−ＩＩのヘテロ２量体との会合を阻害するホスホペプチド等と、これらを含む原虫感染症の治療用組成物とに関する。
【背景技術】
【０００２】
アフリカ睡眠病は、ヒトのみならず家畜にも感染する人畜共通感染症である。現在は、患者数は減少傾向（ＷＨＯによる推定５万人−７万人）にあるが、アンゴラ、コンゴ、スーダン、中央アフリカ共和国、チャド、コートジボワール、ギニア、マラウィ、ウガンダ及びタンザニアなどでは、２００５年にアウトブレイクが見られた。治療しなければ死亡する疾患で、特に脳血液関門を通過した原虫が引き起こす脳神経性症状は重篤である。
【０００３】
感染初期では、ペンタミジン及びスラミンが使われる。ペンタミジンには副作用があるが、患者が耐えうる程度である。スラミンは色素化合物であり、アレルギー、尿路系の副作用がある。中枢神経期には、メラルソプロル及びエフロルニチンが使われる。メラルソプロルにはさまざまな副作用があり、特に３−１０％が副作用の反応性脳症にて死亡する。さらに耐性が報告されている。エフロルニチンは、メラルソプロルより毒性がすくないが、トリパノソーマ・ブルース・ガンビエンセ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ  ｇａｍｂｉｅｎｓｅ）には有効であるが、トリパノソーマ・ブルース・ローデシイ（Tｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ  ｒｈｏｄｅｓｉｅ）のように週ないし月単位で急激に中枢神経に移行する原虫には効かない。そして、現在この中枢神経症状をきたす患者に有効かつ安全な薬は存在しない。
【０００４】
発明者らは、トリパノソーマ症の予防・治療薬の開発に携わってきた（特許文献１）が、近年、多機能分子１４−３−３の研究から、トリパノソーマ・ブルースの１４−３−３ホモログ（以下、「Ｔｂ１４−３−３」という。）としてＩ型及びＩＩ型アイソフォームを単離し、これらが、細胞周期及び細胞骨格の調節に関与し、Ｉ型及びＩＩ型がともに細胞分裂に必須であることを証明した（非特許文献１）。
【０００５】
これまでの本発明の発明者らの研究から、１４−３−３分子は、モード１あるいはモード２のモチーフには、ほとんど結合を示さず、モード３には、ヒト１４−３−３よりも弱いながらも結合を示すことを明らかにし、さらにアフィニティの高い新規モード３ペプチドを世界に先駆けて同定した。しかしながら（１）普遍的なモチーフへの結合が弱いこと、（２）ペプチドタグによる１４−３−３タンパクのヘテロ２量体形成不全、（３）Ｔｂ１４−３−３の標的タンパクへの結合が弱いこと、（４）従来のほ乳類の阻害剤の組成だとトリパノソーマ・ブルースの脱リン酸化酵素の活性を抑えられないこと等の理由により、Ｔｂ１４−３−３と結合するタンパク質の同定は、困難をきわめた。さらに、弱い結合が細胞内で果たす機能の意義を評価することも困難である。
【０００６】
このような状況の中で、本発明の発明者らは、Ｔｂ１４−３−３のヘテロ２量体と特異的に結合するタンパク質の網羅的解析を行って、ＡＫＢ１４−３−３−１と命名された１種類のタンパク質の発現抑制及び過剰発現が、Ｔｂ１４−３−３の発現抑制と同様に細胞分裂異常を伴う細胞増殖停止をもたらすことを発見した。本発明は、かかる新発見にもとづいて想到された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−２９７２８０
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｉｎｏｕｅ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８０：１４０８５、（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、トリパノソーマ・ブルースの中枢神経症状をきたす患者に有効かつ安全な薬を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、原虫の増殖阻害剤を検出する方法を提供する。本発明の方法は、（１）（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と、（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、タンパク質キナーゼ活性を有するタンパク質と、（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、タンパク質キナーゼ活性を有するタンパク質と、（ｄ）特異的結合タグペプチドが前記（ａ）ないし（ｃ）のいずれかのポリペプチドに連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を用意するステップと、（２）前記ステップ（１）で用意されたタンパク質と、試験化合物とを含む反応混合液のキナーゼ活性を測定するステップと、（３）前記試験化合物の非存在下で、前記ステップ（１）で用意されたタンパク質を含む反応混合液のキナーゼ活性を測定するステップと、（４）前記ステップ（２）のキナーゼ活性と、前記ステップ（３）のキナーゼ活性とを比較するステップとを含む。
【００１１】
本明細書において、特異的結合タグとは、所望の機能を有するポリペプチドを遺伝子組み換えによって調製する際に、前記所望の機能を有するポリペプチドとペプチド結合で連結した融合タンパク質として発現させることにより、形質転換体からの発現タンパク質の分離、精製又は検出をより容易に行うことを可能にするために、他のタンパク質、多糖類、糖脂質、核酸及びこれらの誘導体、樹脂、シリコン等と特異的に結合するポリペプチドをいう。前記特異的結合タグは、水溶液中に溶解した物質又は固体支持体と結合する場合がある。前記特異的結合タグには、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、インテインタグ、ＭＢＰ、ＧＳＴその他これらに類するポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。前記特異的結合タグは、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、インテインタグ、ＭＢＰ又はＧＳＴからなるグループから選択される場合がある。
【００１２】
本明細書において、原虫とは、トリパノソーマ・ブルース、トリパノソーマ・クルーズ及びリーシュマニアを含むが、これらに限定されないキネトプラスト科原虫をいう。
【００１３】
本発明の原虫の増殖阻害剤において、前記ステップ（１）で用意されたタンパク質には、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＡＫＢ１４−３−３−１タンパク質のトリパノソーマ・クルーズ又はリーシュマニアにおけるホモログの場合がある。
【００１４】
本発明は、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と、（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、タンパク質キナーゼ活性を有するタンパク質と、（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、タンパク質キナーゼ活性を有するタンパク質と、（ｄ）特異的結合タグペプチドが前記（ａ）ないし（ｃ）のいずれかのポリペプチドに連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質の血流型トリパノソーマ・ブルース原虫における発現を抑制する配列特異的発現抑制剤を提供する。
【００１５】
本明細書において、あるタンパク質の血流型トリパノソーマ・ブルース原虫における発現を抑制する配列特異的発現抑制剤とは、当該タンパク質のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、当該タンパク質の発現を一過性に抑制するものをいう。本明細書における配列特異的遺伝子発現抑制剤には、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸及びＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。本明細書のｓｉＲＮＡとは、標的とする遺伝子のヌクレオチド配列に相補的な配列を有する２１−２３塩基対程度の２本鎖ＲＮＡであって、該標的とする遺伝子のｍＲＮＡの分解を引き起こすことにより前記標的とする遺伝子の発現を特異的に抑制する、２本鎖ＲＮＡをいう。本明細書のｍｉＲＮＡとは、標的とする遺伝子のヌクレオチド配列に相補的な配列を有する１本鎖ＲＮＡであって、該標的とする遺伝子のｍＲＮＡの分解又は翻訳阻害を引き起こすことにより前記標的とする遺伝子の発現を特異的に抑制し、長い（数百塩基以上の）転写産物として精製された後、切断、プロセシングを受けて短い（２０−２５塩基程度の）オリゴリボヌクレオチドとなり機能する、１本鎖ＲＮＡをいう。本明細書のリボザイムとは、標的とする遺伝子のヌクレオチド配列に相補的な配列を有するＲＮＡであって、該標的とする遺伝子のｍＲＮＡの分解する触媒として働くことにより前記標的とする遺伝子の発現を特異的に抑制するＲＮＡをいう。本明細書のアンチセンス核酸とは、標的とする遺伝子のヌクレオチド配列に相補的な配列を有する２０塩基程度の１本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡであって、該標的とする遺伝子のｍＲＮＡと２本鎖を形成することで分解又は翻訳阻害を引き起こすことにより、前記標的とする遺伝子の発現を特異的に抑制する、１本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡをいう。これらの配列特異的遺伝子発現抑制剤は、標的とする遺伝子のヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドであって、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとが混在するように重合された、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドの場合がある。前記ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドは、核酸分子の安定性を高める目的等で使用される。
【００１６】
本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列のカルボキシル末端から２番目のセリン残基がリン酸化され、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と、トリパノソーマ・ブルースの１４−３−３−Ｉ及び１４−３−３−ＩＩのヘテロ２量体との会合を阻害する、ホスホペプチドを提供する。
【００１７】
前記ホスホペプチドは、細胞膜透過ペプチド、特異的結合タグを含むが、これらに限定されない、他の機能を有するポリペプチド鎖が、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのアミノ末端及び／又はカルボキシル末端に連結された融合タンパク質の場合がある。
【００１８】
本発明は、本発明のホスホペプチドと、細胞膜透過性ペプチドとの融合ペプチドを提供する。
【００１９】
本明細書において、細胞膜透過ペプチドとは、他のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質との融合タンパク質を細胞外に添加すると、細胞膜を透過して前記融合タンパク質を細胞内に移行させることができるペプチドをいい、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）のＴａｔタンパク質ＲＮＡ  結合領域（４８−６０位）由来のアルギニンに富む塩基性ペプチド（ＴＡＴペプチド）や、アルギニン残基が６ないし１２個連続したオリゴホモペプチドや、ショウジョウバエ由来の転写因子Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質のＤＮＡ  結合領域由来の塩基性両親媒性ヘリックス構造を有するペプチド（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２０】
本発明は、本発明の配列特異的発現抑制剤か、あるいは、本発明のホスホペプチドかを含む、原虫感染症の治療用組成物を提供する。
【００２１】
本明細書において、原虫感染症とは、アフリカ睡眠病、Ｃｈａｇａｓ病及びリーシュマニア症を含むが、これらに限定されない、キネトプラスト科原虫を病原体とする感染症をいう。
【００２２】
本発明の原虫感染症の治療用組成物は、原虫の増殖阻害効果を損なわないことを条件として、さらに、他の疾患の治療に有効な成分及び／又は薬学的に許容される添加物を１種類又は２種類以上含む場合がある。前記添加物は、希釈剤及び膨張剤と、結合剤及び接着剤と、滑剤と、流動促進剤と、可塑剤と、崩壊剤と、担体溶媒と、緩衝剤と、着色料と、香料と、甘味料と、防腐剤及び安定化剤と、吸着剤と、当業者に知られたその他の医薬品添加剤とを含むが、これらに限られない。
【００２３】
本発明は、原虫感染症治療薬候補を選択するスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、（１）試験化合物を用意するステップと、（２）（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と、（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、タンパク質キナーゼ活性を有するタンパク質と、（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、タンパク質キナーゼ活性を有するタンパク質と、（ｄ）特異的結合タグペプチドが前記（ａ）ないし（ｃ）のいずれかのポリペプチドに連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を用意するステップと、（３）前記試験化合物の存在下で、前記ステップ（２）で用意されたタンパク質のキナーゼ活性を測定するステップと、（４）前記試験化合物の非存在下で前記ポリペプチドのキナーゼ活性とを測定するステップと、（５）前記ステップ（３）のキナーゼ活性が、前記ステップ（４）のキナーゼ活性より低いとき、前記試験化合物をトリパノソーマ・ブルース感染症治療薬候補として選択するステップとを含む。
【００２４】
本発明のスクリーニング方法において、前記試験化合物は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＡＫＢ１４−３−３−１タンパク質が、原虫、特に、血流型トリパノソーマ・ブルース原虫において発現することを抑制する場合がある。
【００２５】
本発明のスクリーニング方法において、前記試験化合物は、ＡＫＢ１４−３−３−１タンパク質と、１４−３−３のヘテロ２量体との会合を阻害する場合がある。
【００２６】
本発明において、ある特定のアミノ酸配列を含むペプチド、ポリペプチド又はタンパク質とは、当該ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の機能を損なわないことを条件として、当該ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端に、細胞膜透過ペプチドと、特異的結合タグとを含むが、これらに限定されない、他の機能を有するペプチド、ポリペプチド又はタンパク質が融合したものをいう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＡＫＢ１４−３−３−１と１４−３−３ヘテロ２量体との結合の特異性を検討した結果を示すウェスタンブロット図。
【図２】ＡＫＢ１４−３−３−１の野生型と、突然変異型（とのＶ５タグ付きのタンパク質との精製収量を示すブロット図。
【図３】原虫細胞内で発現され、精製された、ＡＫＢ１４−３−３−１の野生型及び突然変異型タンパク質を用いたキナーゼアッセイの結果を示す、蛍光染色された電気泳動図。
【図４】ＡＫＢ１４−３−３−１タンパク質のキナーゼアッセイの結果を示す、蛍光標識ペプチド基質の電気泳動図。
【図５】ＡＫＢ１４−３−３−１タンパク質のキナーゼアッセイの結果を示す、蛍光標識ペプチド基質の電気泳動図。
【図６】ＰＣＦ細胞Ｂ５クローンを、テトラサイクリン存在下で１日間培養した後、ＡＫＢ１４−３−３−１及びα−チューブリンの遺伝子発現がそれぞれのｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ法によって分析された結果の電気泳動図。
【図７】ＰＣＦ細胞Ｂ５クローンのテトラサイクリンの存在下又は非存在下での増殖曲線を示す片対数直線グラフ。
【図８】ＰＣＦ細胞Ｂ５クローンのテトラサイクリンの存在下又は非存在下での形態を示す蛍光顕微鏡写真。
【図９】図８で観察された細胞１００個について、細胞ごとの核及びキネトプラストの個数をプロットしたヒストグラム。
【図１０】ＢＳＦ細胞Ａ５クローンを、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）存在下又は非存在下で１日間培養した後、ＡＫＢ１４−３−３−１及びα−チューブリンの遺伝子発現がそれぞれのｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ法によって分析された結果の電気泳動図。
【図１１】ＢＳＦ細胞Ａ５クローンのテトラサイクリンの存在下又は非存在下での増殖曲線を示す片対数直線グラフ。
【図１２】ＢＳＦ細胞Ａ５クローンのテトラサイクリンの存在下又は非存在下での形態を示す蛍光顕微鏡写真。
【図１３】図１２で観察された細胞１００個について、細胞ごとの核及びキネトプラストの個数をプロットしたヒストグラム。
【図１４】ＰＣＦ細胞Ａ１１クローンを、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）存在下又は非存在下で１日間培養した後、ＡＫＢ１４−３−３−１の発現が抗ＡＫＢ１４−３−３−１抗体を用いたウェスタンブロッティング法で解析された結果のブロット図。
【図１５】テトラサイクリン存在下（＋）又は非存在下（−）で培養された、ＰＣＦ細胞Ａ１１クローンの典型的なＤＡＰＩ染色蛍光顕微鏡写真。
【図１６】ＰＣＦ細胞のＡ１１クローンのテトラサイクリンの存在下又は非存在下での増殖曲線を示す片対数直線グラフ。
【図１７】図１５で観察された細胞１００個について、細胞ごとの核及びキネトプラストの個数をプロットしたヒストグラム。
【図１８】ＰＣＦ細胞Ｂ１０クローンを、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）存在下又は非存在下で１日間培養した後、ＡＫＢ１４−３−３−１ＮＦＧの発現が抗ＡＫＢ１４−３−３−１抗体を用いたウェスタンブロッティング法で解析された結果のブロット図。
【図１９】テトラサイクリン存在下（＋）又は非存在下（−）で培養された、ＰＣＦ細胞Ｂ１０クローンの典型的なＤＡＰＩ染色蛍光顕微鏡写真。
【図２０】ＰＣＦ細胞のＢ１０クローンのテトラサイクリンの存在下又は非存在下での増殖曲線を示す片対数直線グラフ。
【図２１】図１９で観察された細胞１００個について、細胞ごとの核及びキネトプラストの個数をプロットしたヒストグラム。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【実施例１】
【００２９】
トリパノソーマ１４−３−３タンパク質ヘテロ２量体と結合する可能性のあるタンパク質の同定
１．トリパノソーマ１４−３−３タンパク質の発現ベクターの構築
トリパノソーマにおいて外来遺伝子を構成的に発現できるｐＬｅｗ８２ベクターは、Ｇ．Ｃｒｏｓｓ博士より恵与され、発明者らの研究室で、Ｔ７プロモーターが追加され、ｐＬｅｗ８２Ｔ７ｐｈｌｅｏと命名された。ｐＬｅｗ８２Ｔ７は、さらに、Ｖ−５タグ配列、３Ｃプロテアーゼ切断配列及び制限酵素Ｈｐａ  Ｉ切断部位が追加され、フレオマイシン耐性遺伝子がピューロマイシン耐性遺伝子に置換され、ｐＬｅｗ８２Ｔ７ｐｕｒｏＮ−Ｖ５−３Ｃと命名された。トリパノソーマ・ブルース１４−３−３のＩ型アイソフォーム（Ｉｎｏｕｅ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８０：１４０８５、（２００５）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０５９８２７）は、ｍｙｃタグ配列が追加され、それぞれ、ｐＬｅｗ８２Ｔ７ｐｕｒｏＮ−Ｖ５−３Ｃにサブクローニングされ、ｐＬｅｗ８２Ｔ７ｐｕｒｏＮ−Ｖ５−３Ｃ−Ｍｙｃ−１４−３−３Ｉと命名された。トリパノソーマ・ブルース１４−３−３のＩＩ型アイソフォーム（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０６６５６５）は、ｐＬｅｗ８２Ｔ７ｐｈｌｅｏにサブクローニングされ、ｐＬｅｗ８２Ｔ７ｐｈｌｅｏ−１４−３−３ＩＩと命名された。
【００３０】
２．トリパノソーマ１４−３−３タンパク質を発現するトリパノソーマ細胞の調製
２９−１３細胞は、ハイグロマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、Ｇ４１８（２５μｇ／ｍＬ）及び１０％ウシ胎仔血清が添加されたＳＤＭ−７９培地で維持される。以下では、ＳＤＭ−７９培地にはハイグロマイシン及びＧ４１８が含まれる。２９−１３細胞は、ｐＬｅｗ８２Ｔ７ｐｈｌｅｏ−１４−３−３ＩＩが２９−１３細胞に常法に従ってトランスフェクションされ、フレオマイシン（２．５μｇ／ｍＬ）が添加されたＳＤＭ−７９培地で選択された。得られたフレオマイシン耐性クローンに、ｐＬｅｗ８２Ｔ７ｐｕｒｏＮ−Ｖ５−３Ｃ−Ｍｙｃ−１４−３−３Ｉがさらにトランスフェクションされ、二重にトランスフェクションされたクローンが、フレオマイシン（２．５μｇ／ｍＬ）及びピューロマイシン（１μｇ／ｍＬ）、が添加されたＳＤＭ−７９培地で選択され、維持された。前記二重にトランスフェクションされたクローンについて、トリパノソーマ・ブルース１４−３−３のＩ型及びＩＩ型アイソフォームのヘテロ２量体の存在量が、抗Ｖ５タグ抗体を不動化したアガロースビーズを各クローンの細胞の溶解液に懸濁して、前記アガロースビーズに吸着したタンパク質を抗トリパノソーマ・ブルース１４−３−３Ｉ抗体及び抗トリパノソーマ・ブルース１４−３−３ＩＩ抗体（Ｉｎｏｕｅ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８０：１４０８５、（２００５））を用いるウェスタンブロッティング法で分析されたその結果、前記二重にトランスフェクションされた細胞のクローンのうち、Ｉ型及びＩＩ型アイソフォームのヘテロ２量体を最も大量に産生するものとして、Ａ６クローンの細胞が選ばれた。
【００３１】
３．トリパノソーマ１４−３−３ヘテロ２量体と結合するタンパク質の回収
２×１０６個／ｍＬの前記Ａ６クローンの細胞懸濁液２５０ｍＬはテトラサイクリン（１μｇ／ｍＬ）が添加されたＳＤＭ−７９培地で２６時間培養された。Ａ６細胞のペレットはＰＢＳ（−）で２回洗浄された後、１ｍＬのＰＭＥＭ細胞溶解バッファー（０．１Ｍ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．９、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２００μＭ  ジギトニン、プロテアーゼ阻害剤混合液（シグマ、カタログ番号Ｐ８３４０）、１０ｍＭ  Ｅ６４、５０ｍＭ  ＮａＦ及び２．５ｍＭ  ＮａＶＯ４）とともに氷上で３０分間インキュベーションされて溶解された。細胞溶解液は、５０００ｒｐｍ、４°Ｃで２分間遠心され、上清はさらに１００，０００ｇ、４°Ｃで１時間遠心され、その上清が回収された。前記上清は、抗Ｖ５タグ抗体を不動化したアガロースビーズ（シグマ、カタログ番号Ａ７３４５）１００μＬとともに４°Ｃで３．５時間回転しながらインキュベーションされた。前記アガロースビーズは、５０ｍＭ  ＮａＦ及び２．５ｍＭ  ＮａＶＯ４が添加された前記ＰＭＥＭ細胞溶解バッファーの２倍希釈液で３回洗浄され、前記ＰＭＥＭ細胞溶解バッファーの１倍液で１回洗浄された後、スピン−Ｘカラム（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号８１６０）に移された。前記アガロースビーズに結合したタンパク質は、ＨＶＳＧＬＫＲＲＲＳＶ（配列番号２）からなり、カルボキシル末端から２番目のセリン残基がリン酸化されたホスホペプチド１００μｇ／ｍＬを含む前記ＰＭＥＭ細胞溶解バッファーの１倍液２１０μＬで溶出された。溶出されたタンパク質は、氷冷されたメタノール、クロロホルム及び脱イオン水で沈殿され、１５，０００ｒｐｍ、４°Ｃで１時間遠心され、ペレットは、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５中の８Ｍ尿素溶液１０μＬに再懸濁された。
【００３２】
４．質量分析によるトリパノソーマ１４−３−３ヘテロ２量体と結合するタンパク質の解析
前記８Ｍ尿素溶液に０．５μＬの０．１Ｍ  ＤＴＴが添加されて、６０°Ｃ、２０分間インキュベーションされ、その後、０．５μＬの０．２Ｍ  ヨウ化アセトアミドが添加されて、室温、１時間インキュベーションによりチオール基がカルボキシメチル化された。そして反応混合液に１μＬの０．５ｍｇ／ｍＬリシル・エンドペプチダーゼ（和光純薬株式会社、カタログ番号１２５−０５０６１）が添加され、３７°Ｃで３時間インキュベーションされた。その後、前記反応混合液は４０μＬの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５で希釈され、１２５ｎｇのトリプシン（ＭＳグレード、和光純薬株式会社、カタログ番号２０２−１５９１）が添加され、３７°Ｃ、終夜インキュベーションされた。前記反応混合液は減圧乾燥の後、０．３％  ギ酸（和光純薬株式会社、カタログ番号０６７−０４５３１）に再懸濁され、日立液体クロマトグラフ質量分析計（日立ハイテク株式会社、ＮａｎｏＦｒｏｎｔｉｅｒＬＤ）によるナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に供された。
【００３３】
５．結果
トリパノソーマ１４−３−３ヘテロ２量体と結合するタンパク質のトリプシン消化断片ペプチドの質量分析ピーク値から、トリパノソーマ・ブルースのゲノムにエンコードされるタンパク質が７５個同定された。
【実施例２】
【００３４】
トリパノソーマ１４−３−３タンパク質ヘテロ２量体と結合する可能性のあるタンパク質の予備的な特徴付け
１．全長ｃＤＮＡのクローニング
実施例１で同定されたトリパノソーマ・ブルースのタンパク質７５個のうち、１４−３−３のＩ型及びＩＩ型アイソフォームと、アミノ酸の相同性から機能が推測できないものと、熱ショックタンパク質、リボソームタンパク質、カルモジュリン等の１４−３−３ヘテロ２量体との特異的結合が考えにくいタンパク質を除いて、ＭＡＳＣＯＴ検索（マトリックスサイエンス株式会社）のスコアの高いタンパク質４個（Ｔｂ１０．６１．１９００、Ｔｂ９２７．１０．７７８０、Ｔｂ９２７．５．４３００及びＴｂ１１．４７．００３５）について、全長ｃＤＮＡクローンがＴｂ４２７プロサイクリック型（昆虫感染型）細胞由来ｃＤＮＡライブラリからＰＣＲ法で単離された。Ｔｂ１０．６１．１９００と、Ｔｂ９２７．１０．７７８０と、Ｔｂ９２７．５．４３００と、Ｔｂ１１．４７．００３５とは、それぞれ、推定キナーゼと、マイトジェン活性化キナーゼと、プロリリルオリゴペプチダーゼ、推定、セリンペプチダーゼと、カルパイン様システインペプチダーゼとしてアノテーションがされている。
【００３５】
２．誘導可能なノックダウンベクターの構築と、トリパノソーマ細胞への導入
前記全長ｃＤＮＡ４個は、それぞれ、ｐＱｕａｄｒａ３ｂｓｒテトラサイクリン依存性ノックダウンベクター（Ｉｎｏｕｅ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８０：１４０８５（２００５））にサブクローニングされ、常法に従って２９−１３プロサイクリック型（以下、「ＰＣＦ」ともいう。）細胞株及び９０−１３血流型（以下、「ＢＳＦ」ともいう。）細胞株にトランスフェクションされた。ＰＣＦ細胞は、ブラストサイジン（１０μｇ／ｍＬ）が添加されたＳＤＭ−７９培地で選択された。ＢＳＦ細胞は、ブラストサイジン（５μｇ／ｍＬ）、２０％ウシ胎仔血清、ハイグロマイシ（５０μｇ／ｍＬ）及びＧ４１８（２５μｇ／ｍＬ）を含むＨＭＩ−９培地で選択された。
【００３６】
３．原虫細胞のキネトプラスト、核及び鞭毛の形態学的解析
トリパノソーマ・ブルース細胞のＤＮＡ及びα−チューブリンの検出は常法にしたがって行われた。簡潔には、トリパノソーマ・ブルース細胞は、室温で、４％  パラメータホルムアルデヒドにより固定され、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘでパーメアライズ処理された。さらに、１Ｍ  グリシンで自家蛍光を消光する処理を行った後、ＢｌｏｃｋＡｃｅ（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社、カタログ番号ＵＫ１３８０）でブロッキングされた。それから、前記細胞は、ＦＩＴＣ抗α−チューブリン抗体（Ｓｉｇｍａ、ＤＭ−１Ａ、カタログ番号Ｆ２１６８−２ＭＬ）と反応され、さらに、ＤＡＰＩで染色された。
【００３７】
４．結果
前記ノックダウンベクター４種類がトランスフェクションされた細胞のうち、Ｔｂ１０．６１．１９００の２本鎖ＲＮＡがテトラサイクリン存在下で誘導される細胞では、キネトプラスト、核及び鞭毛が過剰形成されたり、あるいは、全くなかったり、というように細胞分裂およびサイトキネシスに異常をきたしたモンスター様細胞（ｍｏｎｓｔｅｒ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｋｉｎｅｔｏｐｌａｓｔｓ、Ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅｕｓ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｆｌａｇｅｌｌａ）が観察された。かかるモンスター様細胞は、トリパノソーマ・ブルースの１４−３−３のＩ型及びＩＩ型アイソフォームを両方とも過剰発現させるか、あるいは、両方とも発現抑制させることによっても観察された。そこで、Ｔｂ１０．６１．１９００の遺伝子座タグ（ｌｏｃｕｓ  ｔａｇ）にエンコードされるタンパク質はトリパノソーマ・ブルースの１４−３−３の下流で機能することが示唆された。
【００３８】
なお、残りのノックダウンベクター３種類がトランスフェクションされた細胞については、テトラサイクリン存在下で２本鎖ＲＮＡを発現させたとき、キネトプラスト、核及び鞭毛のいずれにも影響が見られなかった。そこで以下では、Ｔｂ１０．６１．１９００の遺伝子座タグ（ｌｏｃｕｓ  ｔａｇ）にエンコードされるタンパク質は、ＡＫＢ１４−３−３−１（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｋｉｎａｓｅ  ｏｆ  Ｔｒｙｐａｂｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ  １４−３−３  Ｔｙｐｅ  Ｉ）という。
【実施例３】
【００３９】
ＡＫＢ１４−３−３−１の特徴付け（１）
１．ＡＫＢ１４−３−３−１のトリパノソーマ発現ベクターの構築
ＡＫＢ１４−３−３−１、すなわち、Ｔｂ１０．６１．１９００の遺伝子座タグにエンコードされるタンパク質の配列は配列番号１に示される。前記全長アミノ酸配列をエンコードするポリヌクレオチドが、前記ｐＬｅｗ８２Ｔ７ｐｕｒｏＮ−Ｖ５ベクターにサブクローニングされて、Ｖ５タグが連結されたＡＫＢ１４−３−３−１の融合タンパク質を原虫細胞内で過剰に発現するベクターが構築された。
【００４０】
２．ＡＫＢ１４−３−３−１の大腸菌発現ベクターの構築
ＡＫＢ１４−３−３−１、すなわち、Ｔｂ１０．６１．１９００の遺伝子座タグにエンコードされるタンパク質の配列は配列番号１に示される。前記全長アミノ酸配列をエンコードするポリヌクレオチドが、ｐＥＴ４７ｂ及びｐＧＥＸ４Ｔ２にサブクローニングされて、それぞれＨｉｓタグ及びＧＳＴと連結した融合タンパク質（Ｈｉｓ−ＡＫＢ−１４−３−３−１及びＧＳＴ−ＡＫＢ−１４−３−３−１）を大腸菌で発現するベクターｐＥＴ４７ｂ−Ｈｉｓ−ＡＫＢ−１４−３−３−１及びｐＧＥＸ４Ｔ２−ＡＫＢ１４−３−３−１が構築された。
【００４１】
２．ＡＫＢ１４−３−３−１に対する特異抗体の作成
ＧＳＴ−ＡＫＢ−１４−３−３−１は、常法に従って、ｐＧＥＸ４Ｔ２−ＡＫＢ１４−３−３−１ベクターで形質転換された大腸菌Ｔ７Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｌｙｓＹ／Ｉｑ株（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社、カタログ番号＃Ｃ３０１３Ｈ）を０．４ｍＭ  ＩＰＴＧ存在下で終夜培養した後リゾチームで溶菌させて得られた溶菌液からグルタチオン−セファロース・カラム（ＧＥヘルスサイエンス株式会社、カタログ番号１７−０７５６−０１）を用いて精製された。得られた精製ＧＳＴ−ＡＫＢ−１４−３−３−１は１回に１５０μｇずつフロイントアジュバントに添加してウィスター系ラットに感作された。４回の免疫感作後の前記ラットの血清が抗ＡＫＢ１４−３−３−１抗体として用いられた。
【００４２】
３．抗ＡＫＢ１４−３−３−１抗体を用いるウェスタンブロッティング法による原虫細胞でのＡＫＢ１４−３−３−１の検出
トリパノソーマ・ブルースのＰＣＦ細胞２×１０６個又はＢＳＦ細胞５×１０６個は、５％のβ−メルカプトエタノールが添加された２×ＳＤＳローディングバッファー（バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社）に溶解され、常法にしたがって、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離され、電気泳動後のゲルからＰＶＤＦメンブレンに電気的に転写された。抗ＡＫＢ１４−３−３−１抗体として、前記抗ＡＫＢ１４−３−３−１ラット血清が２０００倍に希釈して用いられた。トリパノソーマ・ブルース１４−３−３Ｉ及びＩＩを検出するためには、抗トリパノソーマ・ブルース１４−３−３Ｉ及びＩＩ血清が２：１の割合で混合された血清混合液（以下、「抗Ｔｂ１４−３−３混合血清」という。）が１０００倍に希釈して用いられた。
【００４３】
４．ＡＫＢ１４−３−３−１と１４−３−３ヘテロ２量体との結合の特異性の検討
実施例１で説明されたのと同様に、テトラサイクリン（１μｇ／ｍＬ）が添加されたＳＤＭ−７９培地で終夜培養された約７．５ｘ１０６個／ｍＬの前記Ａ６クローンの細胞懸濁液２５０ｍＬに由来する細胞溶解液の上清（以下、「Ｉｎｐｕｔ」という。）が抗Ｖ５タグ抗体を不動化したアガロースビーズと反応され、スピン−Ｘカラムに移された。前記上清との反応の後、前記アガロースビーズから分離された溶液（以下、「Ｕｎｂｏｕｎｄ」という。）が除去され、その後前記スピン−Ｘカラム中のアガロースビーズに、ＨＶＳＧＬＫＲＲＲＳＶ（配列番号２）からなるペプチド（１００μｇ／ｍＬ）が添加されて得られた溶出液（以下、「Ｐｅｐｔｉｄｅ」という。）と、該ペプチドのカルボキシル末端から２番目のセリン残基がリン酸化されたホスホペプチド（１００μｇ／ｍＬ）が添加されて得られた溶出液（以下、「Ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｔｉｄｅ」という。）とが回収された。さらに、それぞれのペプチドによる処理後の前記アガロースビーズに、８Ｍ尿素が添加され、溶出液が回収された。Ｉｎｐｕｔの細胞溶解液上清と、Ｕｎｂｏｕｎｄの溶液と、Ｐｅｐｔｉｄｅ又はＰｈｏｓｐｈｏｐｅｔｉｄｅの溶出液と、前記Ｐｅｐｔｉｄｅ又はＰｈｏｓｐｈｏｐｅｔｉｄｅによる溶出後の前記アガロースビーズから８Ｍ尿素で溶出された溶出液とが、抗Ｔｂ１４−３−３混合血清又は抗ＡＫＢ１４−３−３−１抗体を用いるウェスタンブロッティング法によって解析された。
【００４４】
５．結果
ＡＫＢ１４−３−３−１、すなわち、Ｔｂ１０．６１．１９００の遺伝子座タグにエンコードされるタンパク質の配列（配列番号１）には、全長６４０個のアミノ酸からなり、そのうち４０−３３３番目には、推定セリン／スレオニン  タンパク質キナーゼの触媒ドメインが含まれ、また、５７１−６３８番目には、細胞骨格との会合に関与するＣａｐ−Ｇｌｙドメインが含まれる。
【００４５】
図１は、ＡＫＢ１４−３−３−１と１４−３−３ヘテロ２量体との結合の特異性を検討した結果を示すウェスタンブロット図である。図１の上半分は抗ＡＫＢ１４−３−３−１抗体を用いるウェスタンブロッティングの結果であり、矢印はＡＫＢ１４−３−３−１のバンドの位置を示す。図１の下半分は抗Ｔｂ１４−３−３混合血清を用いるウェスタンブロッティングの結果である。図１から明らかなとおり、ＡＫＢ１４−３−３−１はリン酸化ペプチドによる溶出液（Ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅ）のレーンでは検出されたが、リン酸化されないペプチドによる溶出液（Ｐｅｐｔｉｄｅ）のレーンではほとんど検出されなかった。また、８Ｍ  Ｕｒｅａの左側のレーンは、リン酸化されないペプチドで溶離後、８Ｍ  尿素によって溶離された溶出液のレーンであり、大量のＡＫＢ１４−３−３−１が、Ｖ５−３Ｃ−Ｍｙｃ−１４−３−３Ｉ（図１では「１４−３−３Ｖ５−Ｍｙｃ−Ｉ」と表される。）と、タグが連結しない１４−３−３Ｉ及び１４−３−３ＩＩとともに検出された。これに対し、８Ｍ  Ｕｒｅａの右側のレーンは、リン酸化されたペプチドで溶離後、８Ｍ  尿素によって溶離された溶出液のレーンであり、Ｖ５−Ｍｙｃ−１４−３−３Ｉと、タグが連結しない１４−３−３Ｉ及び１４−３−３ＩＩとは、８Ｍ  Ｕｒｅａの左側のレーンとほぼ同じ量が出てされたが、ＡＫＢ１４−３−３−１はわずかしか検出されなかった。
【００４６】
図１の結果から、ＡＫＢ１４−３−３−１タンパク質と、トリパノソーマ・ブルース１４−３−３ヘテロ２量体との結合は、ＨＶＳＧＬＫＲＲＲＳＶ（配列番号２）からなるペプチドでは競合阻害されないが、該ペプチドのカルボキシル末端から２番目のセリン残基がリン酸化されたホスホペプチドでは競合阻害されることが示された。したがって、本発明のＡＫＢ１４−３−３−１タンパク質は原虫細胞内でリン酸化され、１４−３−３ヘテロ２量体と、特異的に結合していることが示唆された。
【実施例４】
【００４７】
ＡＫＢ１４−３−３−１の特徴付け（２）
１．ＡＫＢ１４−３−３−１タンパク質のキナーゼ活性突然変異体の作成
ＡＫＢ−１４−３−３−１の推定ＡＴＰ結合部位の１つである第１８６番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換された突然変異体タンパク質はＡＫＢ−１４−３−３−１ＮＦＧと命名され、そのＨｉｓタグ又はＧＳＴとの融合タンパク質を大腸菌で発現するベクターが構築された。
【００４８】
２．ＡＫＢ１４−３−３のキナーゼ活性のアッセイ
大腸菌で発現され、精製された、Ｈｉｓ−ＡＫＢ−１４−３−３−１及びＧＳＴ−ＡＫＢ−１４−３−３−１と、これらの突然変異体タンパク質（ＮＦＧ）のキナーゼ活性は、ＰｅｐＴａｇ（登録商標）非放射性ＰＫＣアッセイ（プロメガ株式会社、カタログ番号Ｖ５３３０）を用いて確認された。すなわち、１回の反応あたり０．１又は０．５μｇのＨｉｓ−ＡＫＢ−１４−３−３−１又はＧＳＴ−ＡＫＢ−１４−３−３−１が、０．０８ｍｇ／ｍＬのＰｅｐＴａｇ  Ｃ１ペプチド（ＰＬＳＲＴＬＳＶＡＡＫ（配列番号３）のアミノ酸配列からなる蛍光標識されたＣキナーゼ基質ペプチド）と、１ｍＭのＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ又はＡＴＰ−γＳか、１ｍＭのＡＴＰ及び１ｍＭのＤＴＴかとが、反応混合液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４及び１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に添加され、３０°Ｃで、ＧＳＴ−Ｔａｇが０．１μｇのとき３０分間、Ｈｉｓ−Ｔａｇ又はＧＳＴ−Ｔａｇが０．５μｇのとき１時間インキュベーションされた後、製造者の指示に従って、アガロース電気泳動法により、リン酸化された基質が未反応の基質から分離され、蛍光により検出された。
【００４９】
２．結果
図２は、ＡＫＢ１４−３−３−１の野生型（図２及び３では「Ｗｉｌｄ」と表される。）と、推定ＡＴＰ結合部位の１つである第１８６番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換された突然変異型（図２及び３では「ＮＦＧ」と表される。）とのＶ５タグ付きのタンパク質とが、原虫細胞内で発現され、抗Ｖ５タグ抗体を固定化したアガロースビーズにより精製され、遊離のＶ５タグペプチドにより溶離された溶出液が抗ＡＫＢ１４−３−３−１抗体を用いるウェスタンブロッティング法で解析された結果を示すブロット図である。図２から明らかなとおり、突然変異型、原虫細胞から精製された量には違いが見られなかった。
【００５０】
図３は、原虫細胞内で発現され、精製された、ＡＫＢ１４−３−３−１の野生型及び突然変異型タンパク質を用いたキナーゼアッセイの結果を示す、蛍光染色された電気泳動図である。図３から明らかなとおり、野生型タンパク質にはキナーゼ活性が認められたが、突然変異タンパク質にはキナーゼ活性は認められなかった。したがって、ＡＫＢ１４−３−３−１タンパク質のキナーゼ活性は、精製が不十分なために他の酵素が混入したためではないことが示された。
【００５１】
図４及び５は、ＡＫＢ１４−３−３−１タンパク質のキナーゼアッセイの結果を示す、蛍光標識ペプチド基質の電気泳動図である。図４では、Ｈｉｓ−ＡＫＢ−１４−３−３−１（図４では「Ｈｉｓ−ｔａｇ」と表される。）と、ＧＳＴ−ＡＫＢ−１４−３−３−１（図４では「ＧＳＴ−ｔａｇ」と表される。）とが、さまざまなリボモノヌクレオチド存在下で、基質のＰｅｐＴａｇ  Ｃ１ペプチドをリン酸化するかどうかが調べられた。その結果、Ｈｉｓタグとの融合タンパク質でも、ＧＳＴとの融合タンパク質でも、ＡＫＢ１４−３−３−１は、ＡＴＰの他、ＧＴＰ、及びＡＴＰ−γＳは利用可能であるが、ＵＴＰ及びＣＴＰは利用できないことが示された。さらに図５では、ＧＳＴ−ＡＫＢ−１４−３−３−１について、さまざまなリボモノヌクレオチドだけでなく、さまざまなデオキシリボモノヌクレオチドの存在下で、基質のＰｅｐＴａｇ  Ｃ１ペプチドとのキナーゼ反応に供された。図４及び５から、ＡＫＢ１４−３−３−１タンパク質は、リン酸基の供与体として、ＡＴＰの他、ＧＴＰ、ＡＴＰ−γＳ及びｄＡＴＰは利用可能であるが、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰは利用できないことが示された。
【実施例５】
【００５２】
ＡＫＢ１４−３−３−１の特徴付け（３）
【００５３】
１．原虫細胞におけるＡＫＢ１４−３−３−１遺伝子発現量の解析
トリパノソーマ・ブルース細胞の全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（株式会社キアゲン、カタログ番号７４１３４）を用いて抽出された。１００ｎｇの全ＲＮＡがスーパースクリプトＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ合成キット（ライフテクノロジーズジャパン株式会社、インビトロジェン、カタログ番号１１７５４０５０）を用いて逆転写された。全ＲＮＡ１０ｎｇから合成されたｃＤＮＡが１回のＰＣＲ反応に供された。ＡＫＢ１４−３−３−１をエンコードするｃＤＮＡを増幅するためのＰＣＲプライマーは、配列番号４及び配列番号５が用いられ、α−チューブリンをエンコードするｃＤＮＡを増幅するためのＰＣＲプライマーは、配列番号６及び配列番号７が用いられた。ＡＫＢ１４−３−３−１をエンコードするｃＤＮＡを増幅するためには、９５°Ｃ１分間の後、９５°Ｃ１５秒間、５５°Ｃ１５秒間、７２°Ｃ１５秒間を２２ないし２３回繰り返して、最後に７２°Ｃ５分間という反応条件が用いられた。α−チューブリンをエンコードするｃＤＮＡを増幅するためには、９５°Ｃ１分間の後、９５°Ｃ１５秒間、５５°Ｃ１５秒間、７２°Ｃ１５秒間を２０回繰り返して、最後に７２°Ｃ５分間という反応条件が用いられた。ＰＣＲ産物は、２％ＴＡＥ−アガロースゲル電気泳動による分離され、ＧｅｌＲｅｄ（Ｂｉｏｔｉｕｍ、ナカライテスク株式会社）により染色された。
【００５４】
２．原虫細胞の増殖の解析
細胞数は、血球計算盤により測定された。細胞密度を一定範囲内に保つために、ＰＣＦ細胞の培養では毎日５倍に希釈して播種され、ＢＳＦ細胞の培養では毎日１０倍に希釈して播種された。ｐＱｕａｄｒａ３ｂｓｒＡＫＢ１４−３−３−１ベクターでｄｓＲＮＡｉによるＡＫＢ１４−３−３−１の発現抑制を行う場合には、テトラサイクリン（１μｇ／ｍＬ）が添加されたＳＤＭ−７９培地が用いられた。なお、ｐＱｕａｄｒａ３ｂｓｒＡＫＢ１４−３−３−１がトランスフェクションされたＢＳＦ細胞をテトラサイクリン存在下で培養する場合には、細胞密度が低下するため、希釈して播種する作業は第４日で中止された。
【００５５】
３．ＰＣＦでの結果
ＰＣＦ細胞（２９−１３株）にｐＱｕａｄｒａ３ｂｓｒＡＫＢ１４−３−３−１ベクターがトランスフェクションされ、ブラストサイジン（１０μｇ／ｍＬ）が添加されたＳＤＭ−７９培地で、安定的にｐＱｕａｄｒａ３ｂｓｒＡＫＢ１４−３−３−１ベクターがインテグレーションされたＰＣＦ細胞のクローンＢ５が選択された。図６は、かかるＰＣＦ細胞Ｂ５クローンを、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）存在下又は非存在下で１日間培養した後、ＡＫＢ１４−３−３−１及びα−チューブリンの遺伝子発現がそれぞれのｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ法によって分析された結果の電気泳動図である。図６から明らかなとおり、ＰＣＦ細胞Ｂ５クローンは、テトラサイクリン存在下で培養された細胞（Ｔｅｔ＋）では、テトラサイクリン非存在下で培養された細胞（Ｔｅｔ−）と比較すると、ＡＫＢ１４−３−３−１のｍＲＮＡ量が顕著に少なかった。これに対して、対照実験のα−チューブリンのｍＲＮＡ量は、テトラサイクリンの有無によって違いは認められなかった。したがって、ＰＣＦ細胞Ｂ５クローンでは、テトラサイクリンによりＡＫＢ１４−３−３−１遺伝子の発現が抑制されることが示された。
【００５６】
図７は、図６に用いられた、ＰＣＦ細胞Ｂ５クローンのテトラサイクリンの存在下又は非存在下での増殖曲線を示す片対数直線グラフである。「□」が結ばれたグラフは、テトラサイクリン存在下での前記ＰＣＦ細胞のクローンの増殖曲線である。「×」が結ばれたグラフはテトラサイクリン非存在下での前記ＰＣＦ細胞のクローンの増殖曲線である。図７から明らかなとおり、テトラサイクリンによってＡＫＢ１４−３−３−１の遺伝子発現が抑制されたＰＣＦ細胞では、遺伝子発現抑制が起こらないときと比較して、細胞の増殖が１０分の１程度に低下した。したがって、ＡＫＢ１４−３−３−１遺伝子の発現抑制は細胞増殖の低減をもたらすことが示された。
【００５７】
図８は、図６及び７に用いられた、ＰＣＦ細胞Ｂ５クローンのテトラサイクリンの存在下又は非存在下での形態を示す蛍光顕微鏡写真である。テトラサイクリン非存在下（Ｔｅｔ−）及び存在下（＋）で３日間培養された細胞を、それぞれ、抗α−チューブリン抗体又はＤＡＰＩで染色後、蛍光顕微鏡で観察したところ、テトラサイクリン存在下で培養されたＰＣＦ細胞ではサイトキネシスの異常が観察された。
【００５８】
図９は、図８で観察された細胞１００個について、細胞ごとの核及びキネトプラストの個数をプロットしたヒストグラムである。黒及び白の棒グラフは、それぞれ、テトラサイクリン存在下（＋）及び非存在下（−）での核の個数が、０個、１個、２個、３個又はそれ以上（「０Ｎ」、「１Ｎ」、「２Ｎ」又は「＞２Ｎ」）で、キネトプラストの個数が０個、１個、２個、３個又はそれ以上（「０Ｋ」、「１Ｋ」、「２Ｋ」又は「＞２Ｋ」）の細胞の百分率を表す。図８及び９から明らかなとおり、ＰＣＦ細胞におけるＡＫＢ１４−３−３−１遺伝子の発現抑制は、細胞分裂及びサイトキネシスの異常をもたらした。
【００５９】
４．ＢＳＦでの結果
ＢＳＦ細胞（９０−１３株）にｐＱｕａｄｒａ３ｂｓｒＡＫＢ１４−３−３−１ベクターがトランスフェクションされ、ブラストサイジン（１０μｇ／ｍＬ）が添加されたＨＭＩ−９培地で、安定的にｐＱｕａｄｒａ３ｂｓｒＡＫＢ１４−３−３−１ベクターがインテグレーションされたＢＳＦ細胞のＡ５クローンが選択された。図１０は、ＢＳＦ細胞Ａ５クローンを、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）存在下又は非存在下で１日間培養した後、ＡＫＢ１４−３−３−１及びα−チューブリンの遺伝子発現がそれぞれのｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ法によって分析された結果の電気泳動図である。図１０から明らかなとおり、ＢＳＦ細胞Ａ５クローンは、テトラサイクリン存在下で培養された細胞（Ｔｅｔ＋）では、テトラサイクリン非存在下で培養された細胞（Ｔｅｔ−）と比較すると、ＡＫＢ１４−３−３−１のｍＲＮＡ量が顕著に少なかった。これに対して、対照実験のα−チューブリンのｍＲＮＡ量は、テトラサイクリンの有無によって違いは認められなかった。したがって、このｐＱｕａｄｒａ３ｂｓｒＡＫＢ１４−３−３−１ベクターがトランスフェクションされたＢＳＦ細胞のクローンでは、テトラサイクリンによりＡＫＢ１４−３−３−１遺伝子の発現が抑制されることが示された。なお、図６と図１０とを比較すると、ＢＳＦ細胞での遺伝子発現の抑制は、ＰＣＦ細胞よりはやや弱かった。
【００６０】
図１１は、図１０に用いられた、ＢＳＦ細胞Ａ５クローンのテトラサイクリンの存在下又は非存在下での増殖曲線を示す片対数直線グラフである。「□」が結ばれたグラフは、テトラサイクリン存在下での前記ＰＣＦ細胞のクローンの増殖曲線である。「×」が結ばれたグラフはテトラサイクリン非存在下での前記ＢＳＦ細胞のクローンの増殖曲線である。図１１から明らかなとおり、テトラサイクリンによってＡＫＢ１４−３−３−１の遺伝子発現が抑制されたＢＳＦ細胞では、遺伝子発現抑制が起こらないときと比較して、細胞の増殖が１００分の１程度に低下した。また、培養４日目以降は細胞増殖がほぼ完全に停止した。したがって、ＡＫＢ１４−３−３−１遺伝子の発現抑制はＢＳＦ細胞の細胞増殖の阻害をもたらすことが示された。
【００６１】
図１２は、図１０及び１１に用いられた、ＢＳＦ細胞Ａ５クローンのテトラサイクリンの存在下又は非存在下での形態を示す蛍光顕微鏡写真である。テトラサイクリン非存在下（Ｔｅｔ−）及び存在下（＋）で３日間培養された細胞を、それぞれ、抗α−チューブリン抗体又はＤＡＰＩで染色後、蛍光顕微鏡で観察したところ、テトラサイクリン存在下で培養されたＰＣＦ細胞ではサイトキネシスの異常が観察された。
【００６２】
図１３は、図１２で観察された細胞について、細胞ごとの核及びキネトプラストの個数をプロットしたヒストグラムである。黒及び白の棒グラフは、それぞれ、テトラサイクリン存在下（＋）及び非存在下（−）での核の個数が、０個、１個、２個、３個又はそれ以上（「０Ｎ」、「１Ｎ」、「２Ｎ」又は「＞２Ｎ」）で、キネトプラストの個数が０個、１個、２個、３個又はそれ以上（「０Ｋ」、「１Ｋ」、「２Ｋ」又は「＞２Ｋ」）の細胞の百分率を表す。図１２及び１３から明らかなとおり、ＢＳＦ細胞におけるＡＫＢ１４−３−３−１遺伝子の発現抑制は、細胞分裂及びサイトキネシスをもたらした。
【００６３】
以上詳しく説明したとおり、ＡＫＢ１４−３−３−１タンパク質には、正常な細胞分裂及びサイトキネシスに必須の機能があることが証明された。
【実施例６】
【００６４】
ＡＫＢ１４−３−３−１の特徴付け（３）
１．ＡＫＢ１４−３−３−１タンパク質の野生型及び突然変異体の原虫細胞内での過剰発現
ＡＫＢ−１４−３−３−１と、ＡＫＢ−１４−３−３−１の推定ＡＴＰ結合部位の１つである第１８６番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換された突然変異体タンパク質（ＡＫＢ−１４−３−３−１ＮＦＧ）とが、テトラサイクリン依存性発現ベクターのｐＬｅｗ８２Ｔ７ｂｓｒにサブクローニングされ、それぞれ、ｐＬｅｗ８２Ｔ７ｂｓｒ  ＡＫＢ−１４−３−３−１及びｐＬｅｗ８２Ｔ７ｂｓｒ  ＡＫＢ−１４−３−３−１ＮＦＧと命名された。ｐＬｅｗ８２Ｔ７ｂｓｒ  ＡＫＢ−１４−３−３−１及びｐＬｅｗ８２Ｔ７ｂｓｒ  ＡＫＢ−１４−３−３−１ＮＦＧが、ＰＣＦ細胞（２９−１３株）にトランスフェクションされ、ブラストサイジン（１０μｇ／ｍＬ）が添加されたＳＤＭ−７９培地で、安定的に過剰発現ベクターがインテグレーションされたＰＣＦ細胞のクローンが選択された。
【００６５】
２．結果
図１４は、かかるｐＬｅｗ８２Ｔ７ｂｓｒＡＫＢ１４−３−３−１ベクターがトランスフェクションされたＰＣＦ細胞Ａ１１クローンを、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）存在下又は非存在下で１日間培養した後、ＡＫＢ１４−３−３−１の発現が抗ＡＫＢ１４−３−３−１抗体を用いたウェスタンブロッティング法で解析された結果のブロット図である。図１４の上半分に示されるとおり、ＰＣＦ細胞Ａ１１クローンは、テトラサイクリン存在下で培養された細胞（Ｔｅｔ＋）では、テトラサイクリン非存在下で培養された細胞（Ｔｅｔ−）と比較すると、ＡＫＢ１４−３−３−１タンパク質の量が顕著に多かった。図１４の下半分は、前記ウェスタンブロッティング法のサンプルの電気泳動ゲルのクーマジーブルー染色写真のうち、ＡＫＢ１４−３−３−１タンパク質のバンドに相当する移動度の部分を示したものである。図１４の下半分に示されるとおり、ＡＫＢ１４−３−３−１タンパク質以外の原虫細胞のタンパク質の量は、テトラサイクリンの有無によって違いは認められなかった。したがって、ＰＣＦ細胞のＡ１１クローンでは、テトラサイクリンによりＡＫＢ１４−３−３−１タンパク質の発現が特異的に誘導されることが示された。
【００６６】
図１５は、テトラサイクリン存在下（＋）又は非存在下（−）で培養された、ＰＣＦ細胞Ａ１１クローンの典型的なＤＡＰＩ染色蛍光顕微鏡写真である。図１５の左側に示すとおり、テトラサイクリン非存在下では、ＰＣＦ細胞は１個の核と１個のキネトプラストを有する。これに対し、図１５の右側に示すとおり、テトラサイクリン存在下では、ＰＣＦ細胞は２個以上の核と２個以上のキネトプラストを有する。
【００６７】
図１６は、ＰＣＦ細胞のＡ１１クローンのテトラサイクリンの存在下又は非存在下での増殖曲線を示す片対数直線グラフである。「□」が結ばれたグラフは、テトラサイクリン存在下での前記ＰＣＦ細胞のクローンの増殖曲線である。「×」が結ばれたグラフはテトラサイクリン非存在下での前記ＰＣＦ細胞のクローンの増殖曲線である。図１６から明らかなとおり、ＰＣＦ細胞Ａ１１クローンでは、過剰発現が起こらないときと比較して、７日間で細胞の増殖が１０分の１程度に低下した。したがって、ＡＫＢ１４−３−３−１の過剰発現はＰＣＦ細胞の細胞増殖の低下をもたらすことが示された。
【００６８】
図１７は、図１５で観察された細胞１００個について、細胞ごとの核及びキネトプラストの個数をプロットしたヒストグラムである。黒及び白の棒グラフは、それぞれ、テトラサイクリン存在下（＋）及び非存在下（−）での核の個数が、０個、１個、２個、３個又はそれ以上（「０Ｎ」、「１Ｎ」、「２Ｎ」又は「＞２Ｎ」）で、キネトプラストの個数が０個、１個、２個、３個又はそれ以上（「０Ｋ」、「１Ｋ」、「２Ｋ」又は「＞２Ｋ」）の細胞の百分率を表す。図１７から明らかなとおり、ＰＣＦ細胞におけるＡＫＢ１４−３−３−１の過剰発現は、細胞分裂及びサイトキネシスの異常をもたらした。
【００６９】
図１８は、ｐＬｅｗ８２Ｔ７ｂｓｒ  ＡＫＢ−１４−３−３−１ＮＦＧがトランスフェクションされたＰＣＦ細胞Ｂ１０クローンを、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）存在下又は非存在下で１日間培養した後、ＡＫＢ１４−３−３−１ＮＦＧの発現が抗ＡＫＢ１４−３−３−１抗体を用いたウェスタンブロッティング法で解析された結果のブロット図である。図１８の上半分に示されるとおり、ＰＣＦ細胞Ｂ１０クローンは、テトラサイクリン存在下で培養された細胞（Ｔｅｔ＋）では、テトラサイクリン非存在下で培養された細胞（Ｔｅｔ−）と比較すると、ＡＫＢ１４−３−３−１ＮＦＧタンパク質の量が顕著に多かった。図１８の下半分は、前記ウェスタンブロッティング法のサンプルの電気泳動ゲルのクーマジーブルー染色写真のうち、ＡＫＢ１４−３−３−１ＮＦＧタンパク質のバンドに相当する移動度の部分を示したものである。図１８の下半分に示されるとおり、ＡＫＢ１４−３−３−１ＮＦＧタンパク質以外の原虫細胞のタンパク質の量は、テトラサイクリンの有無によって違いは認められなかった。したがって、ＰＣＦ細胞のＢ１０クローンでは、テトラサイクリンによりＡＫＢ１４−３−３−１ＮＦＧタンパク質の発現が特異的に誘導されることが示された。
【００７０】
図１９は、テトラサイクリン存在下（＋）又は非存在下（−）で培養された、ＰＣＦ細胞Ｂ１０クローンの典型的なＤＡＰＩ染色蛍光顕微鏡写真である。図１９に示すとおり、テトラサイクリン存在下でも非存在下でも、ＰＣＦ細胞は１個の核と１個のキネトプラストを有する。ただし、核及びキネトプラストの位置関係が正常なＰＣＦ細胞と異なる細胞が８．５％認められた。これらは、エピマスチゴート型というトリパノソーマ・ブルースの生活史でＰＣＦとは異なるステージの細胞に変化したことを示唆する。
【００７１】
図２０は、ＰＣＦ細胞のＢ１０クローンのテトラサイクリンの存在下又は非存在下での増殖曲線を示す片対数直線グラフである。「□」が結ばれたグラフは、テトラサイクリン存在下での前記ＰＣＦ細胞のクローンの増殖曲線である。「×」が結ばれたグラフはテトラサイクリン非存在下での前記ＰＣＦ細胞のクローンの増殖曲線である。図２０から明らかなとおり、テトラサイクリンによってＡＫＢ１４−３−３−１ＮＦＧが過剰に発現されたＰＣＦ細胞では、過剰発現が起こらないときと比較して、７日間の細胞の増殖はほとんど違いが認められなかった。したがって、ＡＫＢ１４−３−３−１ＮＦＧの過剰発現はＰＣＦ細胞の細胞増殖には影響を与えないことが示された。
【００７２】
図２１は、図１９で観察された細胞１００個について、細胞ごとの核及びキネトプラストの個数をプロットしたヒストグラムである。黒及び白の棒グラフは、それぞれ、テトラサイクリン存在下（＋）及び非存在下（−）での核の個数が、０個、１個、２個、３個又はそれ以上（「０Ｎ」、「１Ｎ」、「２Ｎ」又は「＞２Ｎ」）で、キネトプラストの個数が０個、１個、２個、３個又はそれ以上（「０Ｋ」、「１Ｋ」、「２Ｋ」又は「＞２Ｋ」）の細胞の百分率を表す。図２１から明らかなとおり、ＰＣＦ細胞におけるＡＫＢ１４−３−３−１ＮＦＧの過剰発現は、サイトキネシスの異常をもたらさなかった。よって、ＡＫＢ１４−３−３−１が細胞分裂、サイトキネシスを調節する機能を発揮するためには、キナーゼ活性が必要であることが示唆された。
【００７３】
これらの実施例から、本発明のＡＫＢ１４−３−３−１タンパク質は、トリパノソーマ・ブルースの１４−３−３ヘテロ２量体と結合するタンパク質キナーゼであって、１４−３−３と同様に、細胞増殖及びサイトキネシスに関与することが示された。とくに、図１１に示されるとおり、本発明のＡＫＢ１４−３−３−１遺伝子発現を抑制すると、ＢＳＦ細胞の増殖が完全に阻害される。ＢＳＦすなわち血流型はヒトや家畜に感染した状態を反映するため、本発明のＡＫＢ１４−３−３−１タンパク質の機能を阻害することによって、ヒトや家畜に感染したトリパノソーマ・ブルースの増殖を阻害できると考えられる。つまり、本発明のＡＫＢ１４−３−３−１タンパク質の機能を阻害する物質は、アフリカ睡眠病の有効な治療薬となることが期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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