(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体物質検出用素子を用いるバイオ物質の統合分析方法であって、
前記生体物質検出用素子は反応器、ヘッド、前記ヘッドの下部に突出形成された反応器の結合部、前記反応器の結合部の下部から延長形成されたロッド、及び前記ロッドの下部に形成されたバイオチップ、を含み、
前記バイオチップには標的遺伝子のプローブが固定化され、
前記反応器の結合部の少なくとも一部分が前記反応器内部に挿入され、
前記反応器内で、 リアルタイム重合酵素連鎖反応（real−time PCR）を用いて増幅された反応産物の定量分析とバイオチップ（chip）からの前記反応産物の定性分析と、が同時に行われることを特徴とするバイオ物質の統合分析方法。
【請求項２】
前記標的遺伝子のプローブは、ペプチド、タンパク質、核酸、PNA（Peptide Nucleic Acid）、アプタマー（Aptamer）及び抗体から選択される一つ以上の物質であることを特徴とする請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記反応器の結合部の外周面の一部に突出部が形成されていて、前記反応器の結合部は前記反応器の上部に前記突出部が接触するまで反応器内に挿入され前記反応器と結合し、
これにより前記反応器の結合部の一部分が前記反応器内部に挿入され、
前記ヘッドの下部は前記反応器の上端と一定の高さほど離れて位置するようになることを特徴とする請求項１に記載の分析方法。
【請求項４】
前記ロッドは前記反応器の結合部に脱着可能に形成されていることを特徴とする請求項1に記載の分析方法。
【請求項５】
前記分析方法は、結核菌またはＢ型肝炎ウイルスの標的核酸を検出することを特徴とする請求項１に記載の分析方法。
【請求項６】
前記結核菌またはＢ型肝炎ウイルスの標的核酸は、配列番号１〜４６の塩基配列からなる一つ以上の標的遺伝子のプライマー及びプローブを用いて検出されることを特徴とする請求項１に記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リアルタイム重合酵素連鎖反応及びＤＮＡチップが統合された検査システム、並びにこれを用いた統合分析方法に関し、より詳細には、リアルタイム重合酵素連鎖反応及びＤＮＡチップが統合された装置、並びにこれを用いた統合分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、分子診断において広く実施されている分析物質の標的遺伝子の検査方法は、標的遺伝子の発現程度及び遺伝子のコピー数（copy number）を測定する相対あるいは絶対定量法（quantitative method）と、標的遺伝子の存在有無及び遺伝子型を解析する（genotyping）定性的方法（qualitative method）との二つに大別することができる。
【０００３】
分析物質の標的遺伝子の検査方法のうち、標的遺伝子の発現程度及び遺伝子のコピー数を分析するために使用している定量的検査の代表的な方法としてはリアルタイム重合酵素連鎖反応（Real−time PCR）が挙げられる。
【０００４】
リアルタイム重合酵素連鎖反応方法は、重合酵素連鎖反応装置（thermal cycler）と分光蛍光光度計（spectrophotometer）が一体化した装置を用いることにより、ＰＣＲ過程後にＰＣＲ産物を確認するための別の電気泳動過程を行わず、増幅過程中にリアルタイムで標的遺伝子の増幅産物の生成過程をモニタリングして初期に投入したり存在するＤＮＡまたはＲＮＡの量を分析する方法である。より具体的に、リアルタイム重合酵素連鎖反応（Real−time PCR）は、蛍光物質（fluorescent material）をＰＣＲ技法に応用したものであって、反応中に検体内に存在する標的遺伝子の増幅に比例して増加する蛍光物質の発光（emission）程度をリアルタイムで検出し、定量分析して標的遺伝子の発現パターン及びその遺伝子のコピー数を迅速かつ正確に分析することができる方法である。リアルタイム重合酵素連鎖反応において蛍光信号を得る方法は非特異検出と特異検出とに大別されるが、非特異検出はＤＮＡ二本鎖の間に挿入された時に蛍光物質信号が出力される蛍光体（例えば、SYBR Green Ι、BEBO、BOXTO、EvaGreen、など）を用いる方法により遺伝子増幅中に二本鎖が形成された全体の蛍光信号を測定するものであり、特異検出は標的遺伝子と相補的結合が可能な特異的配列を有する短いオリゴヌクレオチド鎖に蛍光体を接合してプローブ（例えば、TaqMan probe、Molecular Beacon、Light−Up probe、Hybridization probe、など）を製造し、標的遺伝子とともに増幅される際に遺伝子増幅に比例して前記短いオリゴヌクレオチドプローブから発生する蛍光信号を測定する方法である。
【０００５】
前記特異検出方法のうち、ＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイム重合酵素連鎖反応について詳細に説明すると、一般的なＰＣＲのように２個のプライマーを用いる原理は同一であるが、蛍光物質が化学的に結合されているオリゴヌクレオチドプローブを使用しなければならない。ＴａｑＭａｎプローブは、５´末端にはレポーター（reporter）蛍光物質としてＦＡＭなどを付着し、３´末端にはレポーター（reporter）蛍光物質の蛍光を相殺させる消光物質（quencher）として蛍光物質であるＴＡＭＲＡなどを付着したものである。ＴａｑＭａｎプローブをＰＣＲ反応液に添加すると、ＴａｑＭａｎプローブはＰＣＲ過程中に鋳型とのアニーリング（annealing）により鋳型ＤＮＡに結合されるが、レポーター及び消光物質の相殺作用によって蛍光が検知されず、ＰＣＲ過程中にTaq DNAポリメラーゼ（Taq DNA Polymerase）による伸長反応（extension）時に、Taq DNAポリメラーゼの５´→３´エキソヌクレアーゼ（exonuclease）活性により鋳型に混成化されたＴａｑＭａｎプローブが分解されると、蛍光物質ＦＡＭなどが遊離されることにより消光物質（quencher）による相殺が解除され蛍光を発するようになり、検出される蛍光の量を分析して増幅産物の生成量を測定することができる。
【０００６】
また、前記非特異検出方法のうち、ＳＹＢＲグリーンＩ（SYBR Green I）を用いたリアルタイム重合酵素連鎖反応（Real−time PCR）について詳細に説明すると、全体蛍光をモニターする方法である。これは二本鎖（double strand）ＤＮＡ鎖に挿入（intercalating）する原理を用いるものであり、ＰＰＣＲ反応時に蛍光物質ＳＹＢＲグリーンＩ（SYBR Green I）を添加してＰＣＲ産物の増幅に比例して発光する蛍光の量を検出することにより増幅産物の生成量を測定することができ、また、増幅ＤＮＡの融解温度を測定することができる。
【０００７】
また、分析物質の標的遺伝子の検査方法のうち標的遺伝子の有無及び遺伝子型を解析する（genotyping）ために使用している定性的（qualitative）検査方法として、最近、分子生物学的技術及び電子工学的技術を適用して一枚のスライドに数十〜数万種類の遺伝子を同時に検査することができるＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）方法とが挙げられる。
【０００８】
より詳細には、標的遺伝子を検出することができるオリゴヌクレオチド、ＰＮＡあるいはｃＤＮＡをプローブにしてマイクロアレイ固定したチップを用いる方法として、マイクロアレイチップ（Microarray Chip）方法が挙げられる。これは主にＰＣＲ反応後の増幅産物を標的マイクロアレイチップと混成化して、チップ固体の表面に（ガラス、プラスチック、メンブレン、シリコン、など）固定された各種のプローブ（オリゴヌクレオチド、ＰＮＡあるいはｃＤＮＡ）と結合し、結合有無を増幅産物に標識された蛍光物質信号を確認する方法により判断することができるため、各種の遺伝子型分析において有用であるが、試験過程が複雑で多少時間がかかるという欠点を有しており、結果を目で確認することができず、別の蛍光分析装置を必要とする。
【０００９】
近年、前記のような分子診断領域のうち、感染体疾患の場合、診断と治療の概念が適用されるにつれて、分析物質の標的遺伝子の検査方法がリアルタイム重合酵素連鎖反応による感染程度を確認するための遺伝子のコピー数（copy number）の定量的情報、あるいは感染体の種類を確認して適した治療剤を処方するためのマイクロアレイチップ活用遺伝子型解析（genotyping）の定性的情報がリアルタイムで複合的に要求されている。前記目的に応じてリアルタイム重合酵素連鎖反応とマイクロアレイチップそれぞれの独立した検査を併行して用いている。
【００１０】
しかし、前記検査方法の適用は単純にそれぞれの方法を互いに異なる反応器で順に実験を行い、これを分析するものであり、依然として多い手間と時間がかかり、複雑である。また、前記検査方法を一つのデバイスで自動化することが困難な上に単純に適用されたものを自動化するための装備を製作しても装備を備えるために広い空間が要求され、装備もまた相当高価であるため、病院で行われる分子診断検査に一般的に使用することは容易でなく、そのため発達した技術開発が切実に要求される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＫＲ１０−１０６８９３９Ｂ１（２０１１年０９月２３日）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者は分析物質の標的遺伝子の検査方法において、定量的検査方法及び定量的検査方法を単一の反応器で一段階（one−stop）で行うことにより、誰でも簡単に利用できるだけでなく、正確かつ効率的に標的遺伝子を検出することができるバイオ物質の統合分析方法を見つけて本発明を完成した。
【００１３】
本発明は、多数の遺伝子に対して、重合酵素連鎖反応またはリアルタイム重合酵素連鎖反応を用いた定量分析または定性分析と、ＤＮＡチップを用いた定性分析と、が同時に行われるバイオ物質の統合分析方法を提供することを目的とする。
【００１４】
より詳細には、本発明は、単一の反応器内で、重合酵素連鎖反応またはリアルタイム重合酵素連鎖反応を用いた定量分析または定性分析と、ＤＮＡチップを用いた定性分析と、を同時に統合して行うことができる統合分析のための装置及びこれを用いたバイオ物質の統合分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、前記目的を達成するために、重合酵素連鎖反応またはリアルタイム重合酵素連鎖反応を用いた定量分析または定性分析と、ＤＮＡチップを用いた定性分析と、が同時に行われるバイオ物質の統合分析方法及び統合分析のための装置を提供する。
【００１６】
本発明によるバイオ物質の統合分析方法は、重合酵素連鎖反応またはリアルタイム重合酵素連鎖反応を用いた定量分析または定性分析と、ＤＮＡチップを用いた定性分析と、が単一の反応器内で同時に行われて分析されることを特徴とする。
【００１７】
前記統合分析のためには、反応器内部の下部、側面部、または反応器の結合部の下部から延長形成されるロッドにバイオチップが形成されている単一の反応器を用いることを特徴とする。
【００１８】
本発明において、前記「反応器」は、反応容器と、反応容器の上部に結合されるキャップとを全て含み、前記キャップは本発明の反応器の結合部を含むことができる。
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
図１及び図２を参照すると、本発明は、一つの単一の反応器内で重合酵素連鎖反応またはリアルタイム重合酵素連鎖反応（real−time PCR）を用いて増幅された反応産物の定量分析または定性分析と、標的遺伝子のプローブが固定化されたバイオチップ（chip）からの前記反応産物の定性分析と、が同時に行われることを特徴とする分析方法であって、前記単一の反応器は、反応器内部の下部、側面部、または反応器の結合部の下部から延長形成されるロッドにバイオチップが形成されていることを特徴とするバイオ物質の統合分析方法を提供する。
【００２１】
本発明において、前記標的遺伝子のプローブは、ペプチド、タンパク質、核酸、ＰＮＡ（Peptide Nucleic Acid）、アプタマー（Aptamer）及び抗体から選択される一つ以上の物質を含むことができる。
【００２２】
本発明によるプローブは、標的遺伝子の任意の塩基配列の少なくとも一つの位置をＤＮＡ挿入（intercalating）蛍光、燐光または放射性物質で標識して得ることができる。
【００２３】
前記プローブの蛍光物質は、ピレン（Pyrene）、シアニン２（Cyanine２）、ＧＦＰ、カルセイン（Calcein）、ＦＩＴＣ、アレキサ（Alexa４８８）、ＦＡＭ、フルオレセインクロロトリアジニル（Fluorescein Chlorotriazinyl）、フルオレセイン（Fluorescein）、ローダミン（Rhodamine１１０）、オレゴングリーン（Oregon Green）、マグネシウムグリーン（Magnesium Green）、カルシウムグリーン（Calcium Green）、ＪＯＥ、シアニン３（Cyanine３）、テトラメチルローダミン（Tetramethylrhodamine）、ＴＲＩＴＣ、ＴＡＭＲＡ、ローダミンファロイジン（Rhodamine Phalloidin）、ピロニンＹ（Pyronin Y）、リサミン（Lissamine）、ＲＯＸ、カルシウムクリムソン（Calcium Crimson）、テキサスレッド（Texas Red）、ナイルレッド（Nile Red）、シアニン５（Cyanine５）、及びチアジカルボシアニン（Thiadicarbocyanine）で構成された群から選択される１種以上を使用することができる。
【００２４】
本発明において、前記単一の反応器は、複数個のウェルを有するプレート、試験管、チューブ、及び反応器の結合部の下部から延長形成されるロッドを含む生体物質検出用素子から選択される一つ以上を使用することができ、ＰＣＲを行うことができる反応器であれば何れも使用することができる。
【００２５】
本発明において、前記単一の反応器は、より好ましくは、複数個のウェルを有するプレート、または反応器の結合部の下部から延長形成されるロッドを含む生体物質検出用素子であることを特徴とする。
【００２６】
本発明による前記複数個のウェルを有するプレートは、２段以上のウェル構造を有することを特徴とし、複数個のウェルを有するプレートは所望の個数のウェルを有するように分離して使用することができる。
【００２７】
本発明において、図３を参照すると、前記複数個のウェルを有するプレートは、プレートの一面に凹状に形成される複数個のウェルを含んでなり、前記ウェルは上部ウェル２１０及びその下部に前記上部ウェルより小さい直径を有する下部ウェル２２０を含み、前記下部ウェルの底面にバイオチップが形成されていることを特徴とする。
【００２８】
より詳細には、図３のように、前記複数個のウェルを有するプレート１０００は、前記上部ウェル２１０及び下部ウェル２２０が様々な直径及び深さで形成されることができ、本発明では生体物質を反応させるための試料及びその上層に前記試料を保護するためのオイルが収容されることができるようにマイクロ単位でウェルが形成される。
【００２９】
前記複数個のウェルを有するプレート１０００は下記の方法で製造することができる。
【００３０】
即ち、前記上部ウェル２１０と下部ウェル２２０を形成する方法としては、先ず、前記プレート１００の上面に上部ウェル２１０の直径に該当する部分が空の状態でレジストなどのマスクパターンを形成して食刻することにより特定の深さの上部ウェル２１０が形成されるようにすることができる。また、前記上部ウェル２１０が形成された後、また前記上部ウェル２１０の底面に下部ウェル２２０の直径に該当する部分が空になるようにドーナツ状のマスクパターンを形成し、また食刻して特定の深さの下部ウェル２２０が形成されるようにすることができる。それから前記マスクパターンらを除去して洗浄し、所望の形状（２段）のウェル構造を形成することができる。
【００３１】
他の方法としては、物理的な加工を施してウェル２００が形成されることができ、切削加工、レーザ加工または放電加工など前記プレート１００の材質に応じて様々な方法を用いて前記のように２段にウェル２００が形成されることができる。
【００３２】
また、前記のように構成される本発明の複数個のウェルを有するプレート１０００は、遺伝子増幅反応などに使用され、その使用方法としては、図３のＢのように前記下部ウェル２２０に試験しようとする試料４００を注入し、その上層である上部ウェル２１０に前記試料４００を保護するためのオイル５００などを注入する。これは前記上部ウェル２１０に注入されたオイル５００層が前記下部ウェル２２０に収容された試料４００を覆っている状態になる。この際、１段でウェルが形成される場合には試料を一定の高さに注入し、その上にオイルを注入して前記試料の上面にオイル層が覆われているようにすることもできるが、これは前記オイルと試料が一方に傾いて混合される可能性があり、注入時に混合されなくても試料を反応させるために加熱する時にオイルと試料が一方に傾いて混合されることで、生体物質反応の信頼性が低下する可能性がある。
【００３３】
従って、本発明による複数個のウェルを有するプレート１０００は、２段にウェルが形成されて試料の上部にオイルが覆われるが、物理的構造によって試料とオイルが混合されないようになっており、試料の加熱による蒸発を防止することができる。また、ウェルが２段に形成されるため、試料の注入量とオイルの注入量が一定にすることができ、試料の上部にオイルが覆われるようにすることができ、外部から試料に不純物が流入されることを防止することができるため、検査の信頼性を向上させることができる。
【００３４】
本発明において、図４を参照すると、前記生物物質検出用素子は、反応器及び反応器の結合部の下部から延長形成されるロッドを含んでなり、前記ロッドは下部にバイオチップが形成されているものであり、前記反応器の結合部に脱着可能に形成されていることを特徴とする。
【００３５】
より詳細には、図４のように、前記生物物質検出用素子２０００はヘッド２１００が平板状またはブロック状などに形成されることができ、使用者が手でつかんで移動させたり試料で満たされた反応器２７００に脱着時に力を加えたり自動化装置に結合されて移動可能に構成される部分である。
【００３６】
前記反応器の結合部２２００は、前記ヘッド２１００の下部に突出するように形成され、前記反応器２７００が外側に挿入されて結合されることができるように形成される。この際、前記反応器の結合部２２００の外周面には円周方向に沿って溝を形成し、その溝にＯリング（O−ring）のような弾性シーリング部材を結合して前記反応器の結合部２２００に反応器を挿入することにより結合時に反応容器の内部が密閉されるようにすることができる。
【００３７】
前記ロッド２３００は前記反応器の結合部２２００の下部から延長形成され、下部方向に長く棒状に形成されることができる。この際、前記ロッド２３００は、前記反応器の結合部２２００より小さい直径を有することが好ましく、生体物質溶液のような試料と接する部分であるため、試料との反応性がないガラスで形成されることが好ましい。
【００３８】
また、前記ロッド２３００は前記反応器の結合部２２００に脱着可能に形成されることができる。即ち、前記反応器の結合部２２００の下部にホールを形成して前記ロッド２３００が前記ホールに挿入され、前記反応器の結合部と結合し、必要に反応して前記ロッド２３００を交替して使用できるように形成されることができる。
【００３９】
また、前記バイオチップ２４００は、前記ロッド２３００の下部に形成され、前記試料に浸漬されて試料と反応を起こし、標的物質を検出することができる部分である。
【００４０】
前記の生体物質検出用素子２０００は、ヘッド２１００、反応器の結合部２２００、ロッド２３００及びバイオチップ２４００を含んでなり、図４のＢのように試料で満たされた反応器２７００に前記反応器の結合部２２００が挿入されるように結合されることができ、この際、前記ロッド２３００の下部に形成されたバイオチップ２４００が反応器２７００内の試料２８００に浸漬されるように形成される。これにより、反応器２７００内で遺伝子増幅及び混成化が行われると共に、増幅された遺伝子は混成化過程中にバイオチップ２４００の標的遺伝子プローブと反応して接合及び反応することができる。
【００４１】
即ち、反応器２７００内でReal−time PCR（Polymerase Chain Reaction；遺伝子増幅）を行い、反応器２７００で発生する蛍光信号をモニタリング装置を用いてリアルタイムで信号を取得することにより値を得ることができ、その後、バイオチップに固定されたプローブと混成化を行い、反応器２７００と分離してロッド２３００とバイオチップ２４００を洗浄した後、専用の蛍光検出器でプローブと反応した蛍光信号を得てバイオチップの分析を行うことができる。従って、Real−time PCRとバイオチップ分析を単一の反応器内で統合して行うことができるという利点がある。
【００４２】
本発明によるバイオ物質の統合分析方法は、結核菌またはＢ型肝炎ウイルスの標的核酸を検出することができ、より詳細には、結核菌の有無による診断及び抗生剤の耐性を有する結核菌の診断、またはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の有無による診断及び薬剤耐性変異型のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を検出することを特徴とする。
【００４３】
より詳細には、結核菌と非結核菌を区分するための標的遺伝子のプライマー及びプローブは結核菌のみが有する標的遺伝子に特異的に結合反応することができる塩基配列またはこれに相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含むことができ、より好ましくは、配列番号１〜３の塩基配列やこれの相補的な塩基配列を含む一つ以上のプライマー及びプローブを含むことができる。
【００４４】
また、抗生剤耐性を検出するための標的遺伝子のプライマー及びプローブは、抗生剤耐性を誘発する標的遺伝子に特異的に結合反応することができる塩基配列、例えば、リファンピン（rifampin；ＲＭＰ）、イソニアジド（isoniazid；ＩＮＨ）に対する耐性を誘発する塩基配列に特異的に反応が可能な、即ち、相補的な塩基配列のあるオリゴヌクレオチドも含むが、好ましくはリファンピン耐性を誘発するｒｐｏＢ遺伝子の点突然変異塩基配列またはこれに相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、イソニアジド耐性を誘発するｋａｔＧ遺伝子とｉｎｈＡ遺伝子の点突然変異塩基配列またはこれに相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含むことができ、より好ましくは、配列番号４〜３５の塩基配列またはこれの相補的な塩基配列を含む一つ以上のプライマー及びプローブを含むことができる。
【００４５】
薬剤耐性ＨＢＶを検出するための標的遺伝子のプライマー及びプローブは、ラミブジン（lamivudine）に対する耐性を誘導する標的遺伝子に特異的に結合することができる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、好ましくはラミブジン耐性を誘導するHBV DNA polymerase遺伝子のＢ領域のコドン５２８、５２９と５１４部位とＣ領域のコドン５５２、５４８と５５５部位の点突然変異塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含むことができ、より好ましくは、配列番号３６〜４６の塩基配列またはこれの相補的な塩基配列を含む一つ以上のプライマー及びプローブを含むことができる。
【００４６】
本発明において、前記提示した標的遺伝子の他にも新たに開発される抗生剤または薬剤に対しても耐性を同時に検出するために新しく開示される抗生剤に係わる塩基配列または薬剤耐性に係わる突然変異塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをさらに含むこともできる。
【００４７】
本発明によるプローブにおいて、リアルタイム重合酵素連鎖反応（real−time PCR）を用いて増幅された反応産物を定量分析するためのプローブの蛍光物質と前記増幅された反応産物と混成化を行った後、定性分析のためのプローブの蛍光物質は相違する波長を有することができる。
【００４８】
より詳細には、本発明によるプローブは、リアルタイム重合酵素連鎖反応（real−time PCR）を用いて増幅された反応産物の定量分析のためにＦＡＭ蛍光物質を使用し、前記増幅された反応産物と混成化を行った後、定性分析のためにＣｙ３蛍光物質を使用した。
【００４９】
具体的な一例として、本発明による複数個のウェルを有するプレート１０００または生物物質検出用素子２０００を用いて統合分析されることができる。
【００５０】
図１のように、(1)と(2)の表面に多数個の標的遺伝子プローブをアレイした後、(3)のように標的遺伝子プローブがある反応器にリアルタイムＰＣＲ試薬及び標的遺伝子のプライマーを注入して遺伝子増幅を行う。遺伝子増幅が行われるうちに(5)のような反応が起こり、(5)のように反応器内で発生する蛍光物質（例えば、ＦＡＭ）信号をカメラがリアルタイムで信号を取得することにより定量分析された値を得て、遺伝子が増幅された反応産物は別の処理を行わず温度変化のみにより、(6)のようにＤＮＡマイクロアレイ反応が行われる。前記結果は、洗浄後、リアルタイムＰＣＲで検出した蛍光体とは異なる種類の(7)のような蛍光物質（例えば、Ｃｙ３）信号を蛍光検出器を活用して読み取り、(8)のように遺伝子型信号を得て定性分析することができる。
【発明の効果】
【００５１】
本発明によるバイオ物質の統合分析方法は、単一の反応器内で遺伝子の増幅が行われ、その状態で続けて混成化が行われることにより、反応のために移動させる過程中に発生し得る外部要因による汚染を防止することができ、試料の注入、生体物質の反応、結果検出及び結果分析のような一連の過程が自動化されるという利点がある。
【００５２】
本発明によるバイオ物質の統合分析方法は、従来の商品化された方法より各種疾患の原因となる人体有害微生物を検出するために必要な時間をはるかに短縮されるだけでなく、コストの面においても非常に経済的であり、正確かつ効率的に標的遺伝子を検出することができるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明によるバイオ物質の統合分析方法の概略を示す図面である。
【図２】本発明によるバイオ物質の統合分析方法の作動原理を示す図面である。
【図３】Ａは本発明による複数個のウェルを有するプレートの斜視図であり、Ｂは前記複数個のウェルを有するプレートのウェル内の試料とオイルが収容された状態を示す断面図である。
【図４】Ａは本発明による生体物質検出用素子の斜視図であり、Ｂは前記生体物質検出用素子と試料が収容された反応器の結合断面図である。
【図５】本発明の実施例４による結核菌の抗生剤耐性検出結果を示す図面である。
【図６】本発明の実施例４による結核菌と非結核性抗酸菌の区分と結核菌の多重薬剤耐性の検出結果を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本発明について下記実施例を参照してより具体的に説明する。しかし、下記実施例は本発明を容易に理解するためのものであり、どのような意味でも本発明の範囲はこのような実施例によって限定されるものではない。
【００５５】
ここで使用される技術用語及び科学用語において他の定義がない限り、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者が一般的に理解している意味を有し、下記の説明及び図面において本発明の要旨を不明確にする可能性のある公知機能及び構成に対する説明は省略する。
【００５６】
［実施例１］プライマー及びプローブの製作
（１）結核菌／非結核性抗酸菌区分プライマー及びreal−time PCR用プローブ、抗生剤耐性診断ＤＮＡチップ用プライマー及びプローブ製作
本発明に使用されたマイコバクテリウム−ツベルクローシスの区分及びリファンピン（Rifampin、rpoB）、イソニアジド（Isoniazid、inhA、katG）薬剤耐性診断を行うためのオリゴヌクレオチドプライマー、real−time PCR用プローブ及びＤＮＡチップ用プローブを下記表１（結核菌区分プライマー）、表２（結核菌区分 real−time PCR用プローブ）、表３（抗生剤耐性診断用プライマー）及び表４（抗生剤耐性診断用ＤＮＡチップ固定プローブ）に示す。
【００５７】
下記プローブのうち、表１と表２は、リアルタイム重合酵素連鎖反応（real−time PCR）を用いて増幅された結核菌の反応産物を定量分析するためのものであり、蛍光物質としてＦＡＭを、消光物質としてＴＡＭＲＡを使用した。前記増幅された反応産物は、混成化を進めた後、抗生剤耐性診断用の遺伝子型の定性分析をＤＮＡチップ（DNA chip）で確認するために、下記表３の抗生剤耐性診断用プライマーにＣｙ３蛍光物質を付着し、これは遺伝子増幅過程中に増幅反応産物にＣｙ３蛍光が付着され、既にＤＮＡチップの表面に固定された抗生剤耐性診断用プローブと反応して信号を出力するように製作した。
【００５８】
【表１】
0005689446.tif 000002
【００５９】
【表２】
0005689446.tif 000003
【００６０】
【表３】
0005689446.tif 000004
【００６１】
【表４】
0005689446.tif 000005
【００６２】
（２）薬剤耐性Ｂ型肝炎ウイルス検出のためのプライマー及びプローブ製作
薬剤耐性ＨＢＶを検出するためのプライマーと標的プローブは、ラミブジン（lamivudine）耐性を誘導するHBV DNA polymerase 遺伝子のＣ領域内のYMDD motifのコドン５５２、５４８と５５５部位とＢ領域のコドン５２８、５２９と５１４部位の点突然変異塩基配列を含むように製作し、下記表５、表６及び表７に示す。
【００６３】
下記プローブはリアルタイム重合酵素連鎖反応（real−time PCR）を用いて増幅された反応産物を定量分析するために蛍光物質としてＦＡＭを使用し、前記増幅された反応産物と混成化を進めた後、定性分析のためにＣｙ３蛍光物質を選択してプローブを製作した。
【００６４】
下記プローブのうち表５（Ｂ型肝炎ウイルス検出のためのプライマー）と表６（Ｂ型肝炎ウイルス検出のためのreal−time PCR用プローブ）は、リアルタイム重合酵素連鎖反応（real−time PCR）を用いて増幅されたＢ型肝炎ウイルスの反応産物を定量分析するためのものであり、蛍光物質としてＦＡＭを、消光物質としてＴＡＭＲＡを使用した。前記増幅された反応産物は混成化を進めた後、抗生剤耐性診断用遺伝子型定性分析をＤＮＡチップで確認するために、下記表５の抗生剤耐性診断用プライマーにＣｙ３蛍光物質を付着し、これは遺伝子増幅過程中に増幅反応産物にＣｙ３蛍光が付着され、既にＤＮＡチップ表面に固定された表７の抗生剤耐性診断用プローブと反応して信号を出力するように製作した。
【００６５】
【表５】
0005689446.tif 000006
【００６６】
【表６】
0005689446.tif 000007
【００６７】
【表７】
0005689446.tif 000008
【００６８】
［実施例２］支持体にプローブ付着
前記実施例１で製作された定量分析及び定性分析のためのプローブそれぞれを１００ｐｍｏｌで希釈し、９６ウェル（well）マイクロプレートに移してスポッティング（spotting）溶液を添加して５０ｐｍｏｌで均一に混合した。スライドガラスまたはメンブレン（membrane）などの支持体にプローブをマイクロアレイヤー（Cartesian Technologies、PLXSYS ７５００ SQXL Microarryer、USA）を用いて付着した。
【００６９】
支持体の表面に付着していないプローブを除去するために室温で０．２％ＳＤＳ（Sodiuｍdodecyl sulfate）溶液に洗浄した後、蒸溜水で洗浄した。Sodiuｍborohydride溶液で洗浄してまた沸騰する蒸溜水で洗浄した。室温で０．２％ＳＤＳと蒸溜水を用いて洗浄した後、遠心分離機を用いて支持体の表面を完全に乾燥させてマイクロアレイ製作（バイオチップ）を完了した。
【００７０】
［実施例３］生体物質検出用素子の製造
前記実施例２で製造したバイオチップをロッドの底面に固定して生体物質検出用素子の製造した。
【００７１】
［実施例４］菌株からのゲノムＤＮＡ分離
（１）結核菌からのゲノムＤＮＡ分離
本実験に使用された結核菌は、「大韓結核協会」から菌株を得て、「国立馬山結核病院」から検体を確保した。これらのＤＮＡを抽出するために、インスタジーンマトリックス（InstaGene matrix、Bio−Rad Co.,USA）を使用した。１．５ｍｌのチューブにインスタジーンマトリックス１００μlを加えた。そして、本実験に使用する菌株を固体培地（Ogawa培地）で培養した後、１白金耳を採りインスタジーンマトリックスが入っているチューブに注入して浮遊させた。これを恒温水槽の５６℃にて３０分間反応させた後、１０秒間よく混合するように攪拌して均質化させ、また１００℃にて８分間熱処理した後、１０秒間よく攪拌した。混合物を１２,０００ｒｐｍで３分間遠心分離して分離した上層液を新しいチューブに移した。これをリアルタイムＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとして使用した。
【００７２】
（２）Ｂ型肝炎ウイルスからのゲノムＤＮＡ分離
Ｂ型肝炎患者から採血した血液は直ちに冷蔵保管して一時間血液凝固後、３０００ｒｐｍで５分間血清を遠心分離した。確保された血清は−７０℃にて保管し、これらのＤＮＡを抽出するためにQIAamp DNA Blood Mini Kit（QIAGEN Inc.,CA、USA）を使用した。キットを用いて血清から最終的に２００μlのHBV DNAを確保した。これをリアルタイムＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとして使用した。
【００７３】
［実施例５］結果分析
（１）結核菌有無及び抗生剤耐性検出
前記実施例３で製造した生体物質検出用素子を試料で満たされたチューブ内に装着した後、Real−time PCRを進めた。
【００７４】
遺伝子増幅過程中にチューブで発生するＦＡＭ蛍光信号をカメラがリアルタイムで信号を取得することにより値を得てから混成化を進めた後、ふたを開けてキャップに付着されたガラス棒を洗浄した後、専用の蛍光検出器でプローブと反応したＣｙ３蛍光信号を得てＤＮＡチップ分析を行った。その結果を図６に示した。
【００７５】
（２）薬剤耐性Ｂ型肝炎ウイルス検出
前記実施例３で製造した生体物質検出用素子を試料で満たされたチューブ内に装着した後、Real−time PCRを進めた。
【００７６】
遺伝子増幅過程中にチューブで発生するＦＡＭ蛍光信号をカメラがリアルタイムで信号を取得することにより値を得てから混成化を進めた後、ふたを開けてキャップに付着されたガラス棒を洗浄した後、専用の蛍光検出器でプローブに応じたＣｙ３蛍光信号を得てＤＮＡチップ分析を行った。
【００７７】
前記結果から確認したところ、本発明によるバイオ物質の統合分析方法は単一の反応器内で遺伝子の増幅が行われ、その状態で続けて混成化が行われることにより、反応のために移す過程中に発生し得る外部要因による汚染を防止することができ、試料の注入、生体物質の反応、結果検出及び結果分析のような一連の過程が自動化されるという利点がある。
【００７８】
また、本発明によるバイオ物質の統合分析方法は、従来の商品化された方法より各種疾患の原因となる人体有害微生物を検出するために必要な時間をはるかに短縮させるだけでなく、コストの面においても非常に経済的であり、正確かつ効率的に標的遺伝子を検出することができるという利点がある。
【符号の説明】
【００７９】
１０００  （本発明の）複数個のウェルを有するプレート
１００  プレート
２００  ウェル
２１０  上部ウェル
２２０  下部ウェル
３００  バイオチップ
４００  試料
５００  オイル
２０００  （本発明の）生体物質検出用素子
２１００  ヘッド
２２００  反応器の結合部
２２１０  突出部
２３００  ロッド
２４００  バイオチップ
２５００  方向表示部
２６００  アダプダ
２７００  反応器
２８００  試料
【図１】
0005689446.tif 000009
【図２】
0005689446.tif 000010
【図３】
0005689446.tif 000011
【図４】
0005689446.tif 000012
【図５】
0005689446.tif 000013
【図６】
0005689446.tif 000014