(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜コンタクターモジュールM1内の水性バイオマスから脂肪酸を抽出する方法であって、以下の工程:
a)水性バイオマスの脂質を加水分解して、遊離脂肪酸を放出させる工程と;
b)遊離脂肪酸を含有する加水分解された水性バイオマスを、バイオマスタンク(T1)から前記膜コンタクターモジュールM1の水性コンパートメント(1)へ送入して送流し、バイオマスタンク(T1)に還流する工程と;
c)脂肪酸を、疎水性膜(2)を介して、有機溶媒または溶媒混合物を含有する前記膜コンタクターモジュールM1の有機コンパートメント(3)へ抽出し、有機溶媒または溶媒混合物は生成物回収タンクT2へ送流され、有機コンパートメント(3)へ還流する工程と
によって特徴づけされる方法。
【請求項２】
脂質加水分解が、1または複数のリパーゼを適用する酵素的加水分解である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
脂肪酸が逐次的に放出され、中鎖〜長鎖の飽和脂肪酸およびモノ不飽和脂肪酸が第一段階で放出され、ポリ不飽和脂肪酸が最終段階で放出される、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
第一段階で放出される脂肪酸が、次の段階を開始する前に膜を介して抽出される、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
逐次的な放出が、より長時間にわたり第1のリパーゼを作用させておくこと、または異なるリパーゼを添加することにより達成される、請求項3または4に記載の方法。
【請求項６】
有機コンパートメントにおいて、脂肪酸をそれらのアルキルエステル誘導体へとエステル化させる工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
水性バイオマスが、脂質加水分解の前にプロテアーゼ処理にかけられる、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
水性バイオマスが、脂質加水分解の前にホスホリパーゼ処理にかけられる、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記有機溶媒または溶媒混合物が、非極性溶媒、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、ペンタン、トルエン、ジクロロエタン、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、アセトン、およびこれらの混合物の群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
前記有機溶媒または溶媒混合物が、低級アルキルアルコールの群から選択されるアルコールをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記有機溶媒または溶媒混合物が、酸、塩基、酵素、またはこれらの混合物の形態で触媒をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
バイオマスの脱水および/またはダイアフィルトレーションのためのクロスフロー濾過モジュールM2をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
以下の工程:
a)クロスフロー濾過モジュールM2内の前記水性バイオマスを脱水および/またはダイアフィルトレーションし、膜コンタクターモジュールM1におけるさらなる処理のための保持液(5)を生成させる工程と;
b)保持液(5)中の脂質を加水分解して、遊離脂肪酸を放出させる工程と;
c)遊離脂肪酸を含有する加水分解された保持液を、バイオマスタンク(T1)から前記膜コンタクターモジュールM1の水性コンパートメント(1)へ送入して送流し、バイオマスタンク(T1)に還流する工程と;
d)脂肪酸を、疎水性膜(2)を介して、有機溶媒または溶媒混合物を含有する前記膜コンタクターモジュールM1の有機コンパートメント(3)へ抽出し、有機溶媒または溶媒混合物は生成物回収タンクT2へ送流され、有機コンパートメント(3)へ還流する工程と
を含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
まず、水性バイオマスが、バイオマスタンクT1からクロスフロー膜モジュールM2を介して送流され、水および低分子化合物が膜(4)を透過して透過廃液(6)を生成させ、その後、保持液(5)が、膜コンタクターモジュールM1の水性コンパートメント(1)へ送流され、膜コンタクターの有機コンパートメント(3)内を流れる有機溶媒または溶媒混合物へ脂肪酸を抽出し、生成物回収タンクT2内に蓄積させる、請求項12に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜コンタクターモジュールにおいて水性バイオマスから脂肪酸を抽出する新規の方法に関する。本発明はまた、前記膜コンタクターモジュールにおいて、バイオマス濃縮および/またはダイアフィルトレーションと、脂肪酸抽出とを組み合わせる統合方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
長鎖オメガ-3ポリ不飽和脂肪酸は、人間にとって必須の脂肪酸であり、食事により供給しなければならない。これらのうち、ドコサヘキサエン酸、C22:6 Δ4,7,10,13, 16,19(DHA)は、健康にとって特に有益であり、栄養補助食品としてだけでなく、冠動脈疾患を治療するための医薬化合物としても用いられる(Wynnら、2005)。
【０００３】
DHAは、エイコサペンタエン酸(EPA)のような他の必須ポリエン脂肪酸に容易に転換されうるので、優れたポリエン酸である。ヒト体内で、EPAからDHAへの転換は不可能である。
【０００４】
機能食品において用いられる油を濃縮するため、および医薬に適用するため、脂肪酸またはそれらのアルキルエステル誘導体が必要とされている。現在のところ、ポリ不飽和脂肪酸を含有する組成物は、魚油から得られる。しかし、将来は、魚油が十分に入手できなくなることが懸念されている(Lewisら、1999)。さらに、重金属、ダイオキシン、およびポリ塩化ビフェニル(PCB)を含めた有毒汚染物質が、海洋環境から魚類脂質に蓄積される可能性についての報告により、ヒトの食用および動物飼料用の魚油の大規模な精製プロセスが必要とされている(Ratledgeら、2004)。
【０００５】
魚油に代わるものは、微生物供給源である。クリプテコディニウム・コニー(Crypthecodinium cohnii)(例えば、米国特許第5407957号)およびヤブレツボカビ(thraustochytrid)(例えば、WO特許第9408467号;米国特許第6509178号)など、一部の海洋性で従属栄養型の微小藻類は、大量のDHAを蓄積させる。これらの微生物はしばしば、それらの乾燥重量の50%超を脂質として蓄積させ、DHAは全脂質の25%超を占めることが多い(Lewisら、1999; Yokochiら、1998; Yaguchiら、1997)。魚油と比較した微生物によるDHA生成のさらなる利点は、DHAが、唯一の、または主要な、長鎖ポリ不飽和脂肪酸(PUFA:PolyUnsaturated Fatty Acid)であり、精製プロセスをより簡便にするということである。
【０００６】
従来、海産動物油および植物油は、熱機械的プロセスおよび/または溶媒による抽出を介して、バイオマスから単離される。脂肪酸アルキルエステルが所望の生成物である場合、抽出された油は、しばしば触媒の存在下でエステル交換される。一般に、微小藻類または魚類から脂肪酸を得る従来の方法は、脂肪酸、特に、不安定なポリ不飽和脂肪酸にとって有害でありうる複数の工程を包含する。脂肪酸は、長く過酷な操作、および高温にかけられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第5407957号
【特許文献２】WO特許第9408467号
【特許文献３】米国特許第6509178号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、高品質のポリ不飽和脂肪酸、とりわけ、DHAに対して増大しつつある市場および需要を満たすため、脂肪酸、特に、LC-PUFAを抽出する新規の方法が必要とされている。
【０００９】
本発明の1つの目的は、脂肪酸を抽出する新規の方法を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、脂肪酸を水性バイオマスから抽出する新規の方法を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに別の目的は、バイオマス脂質の加水分解を水性相中で実施する新規の方法を提供することである。
【００１２】
本発明のさらに別の目的は、特徴の異なる脂肪酸を逐次的に放出させる新規の方法を提供することである。
【００１３】
本発明のさらに別の目的は、ポリ不飽和脂肪酸、とりわけDHAを抽出する新規の方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
これらの目的およびさらなる目的が、本発明により達成される。
【００１５】
したがって、本発明の一態様は、膜コンタクターモジュールM1内の水性バイオマスから脂肪酸を抽出する方法であって、以下のステップ:
a)水性バイオマスの脂質を加水分解して、遊離脂肪酸を放出させるステップと;
b)遊離脂肪酸を含有する、加水分解された水性バイオマスを、前記膜コンタクターモジュールM1の水性コンパートメントへ送入するステップと;
c)脂肪酸を、疎水性膜を介して、有機溶媒/溶媒混合物を含有する前記膜コンタクターモジュールM1の有機コンパートメントへ抽出するステップと
を含む方法に関する。
【００１６】
新規な本発明の方法は、バイオマスから油性相を抽出することなく、水性バイオマスから脂肪酸、特に、DHAまたはそのアルキルエステル誘導体を得る簡便な方法である。脂質は、水性バイオマス中で加水分解される。有機相中のアルコール、触媒、および/またはエステル化酵素の存在によって、脂肪酸は、有機相中でそれらの脂肪酸エチルエステルへ転換することができる。
【００１７】
水性バイオマスという用語は、水性媒体中に懸濁している、分散している、ホモジナイズされている、または溶解している任意のバイオマスを意味する。水性バイオマスは、微生物の発酵培養液であることが好ましい。油糧微生物は、乾燥重量ベースで20%を超える脂質を含有するので、本発明によれば特に適切である。微生物は、光栄養型または従属栄養型微生物であってもよく、ヤブレツボカビが好ましいが、これらに限定されない。
【００１８】
しかし、脂質含量が十分である、例えば、10%を超える海産動物バイオマスおよびそれらの副産物、とりわけ魚類および魚類副産物が本発明に包含され、また、脂質含量が十分である、例えば、10%を超える植物バイオマスも本発明に包含される。水性バイオマスは、乾燥バイオマスから再構成することができる。水性バイオマスは、完全な細胞および破砕細胞を含有しうる。
【００１９】
水分含量および水性バイオマスの特性により、システム内の適正な送流が可能となるものとする。方法は、水分含量の高い、例えば、50%を超えるバイオマスに特に適用可能である。
【００２０】
脂質という用語は、モノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリド、ならびにリン脂質の両方を包含する。
【００２１】
膜コンタクターモジュールの概略表示を図1に示す。水性バイオマスは、膜コンタクターモジュールM1の、好ましくは撹拌装置を装備するバイオマスタンク(T1)から水性コンパートメント(1)へ送流され、バイオマスタンク(T1)へ還流する。有機溶媒または溶媒混合物は、膜コンタクターモジュールの生成物回収タンクT2から有機コンパートメント(3)へ送流され、一方、遊離脂肪酸は、疎水性膜(2)を介して有機コンパートメントへの拡散によって抽出され、そこに対象の生成物が蓄積する。
【００２２】
脂肪酸に富む水性バイオマスは、有機相の流速より高速の流速で流れる。脂肪酸は、疎水性膜を湿潤させる有機溶媒を介して、水性相から有機相のバルクへ抽出する(図1;膜モジュールの矢印は、溶質輸送の方向を示す)。疎水性膜は、水が膜を貫流することを回避し、その結果、溶質を受容する有機相の夾雑を回避する。
【００２３】
疎水性膜は、任意の疎水性ポリマー材料で作製することができる。それらの高度な疎水性特徴により、水が膜を貫流することを回避するため、ポリイミド膜が好ましい。Lenzing P84およびMatrimid 5218が好ましいがこれらに限定されない異なるポリマーを用いることができる。例えば、不織のポリエステル製ベーキングペーパーで作製した多孔性の支持層により、膜を強化することができる。
【００２４】
本発明で適用される膜は、多孔性膜(小径の限外濾過範囲またはナノ濾過範囲)の場合もあり、非多孔性膜の場合もある。疎水性膜はまた、加水分解された脂質と加水分解されていない脂質との間の障壁としても機能しうる。膜は、1または2個のDHA分子を含有するジグリセリド分子に対して、50%を超える、好ましくは70%を超える、なおより好ましくは95%を超える除去率を示しうる。
【００２５】
膜コンタクターモジュールの構成は、選択された膜のデザインに適応させる。本発明で用いられる膜は、プレートおよびフレーム、渦巻き螺旋、シェルおよびチューブ、ならびにこれらに由来するデザインなど、任意の既知のデザインにより構成することができる。管状膜、中空ファイバー膜、またはフラットシート膜を用いることもできる。
【００２６】
脂質の加水分解は、化学的または酵素的に実行し、水性バイオマスに対して直接実施する。酵素的加水分解は、1または複数のリパーゼを適用することにより実施することができる。モノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリド、ならびにリン脂質を加水分解すると、遊離脂肪酸が放出され、加水分解された水性のバイオマスが、膜コンタクターモジュールの水性コンパートメントへ送入される。膜コンタクターでは、遊離脂肪酸を、濃度勾配拡散によって疎水性膜から膜コンタクターモジュールの有機コンパートメントへ抽出する。脂肪酸のアルキルエステル誘導体が好ましい生成物であれば、有機コンパートメントは、場合によってアルコールおよび/または触媒と混合された、適切な有機溶媒または溶媒混合物を含む。
【００２７】
本発明により分離される脂肪酸は、対象の任意の脂肪酸である。これは、飽和またはモノ不飽和のいずれかの、14〜20個の炭素を含む、中鎖〜長鎖脂肪酸でありうる。例は、飽和ミリスチン酸(C14:0)、飽和パルミチン酸(C16:0)、飽和ステアリン酸(C18:0)、および飽和アラキドン酸(C20:0)、ならびにモノ不飽和オレイン酸(C18:1)およびモノ不飽和ガドレイン酸(C20:1)である。しかし、本発明により分離される好ましい脂肪酸は、炭素18個より長い炭素鎖および少なくとも3つの二重結合を有する、長鎖のポリ不飽和脂肪酸(LC-PUFA)、特に、EPAおよびDHAである。
【００２８】
本発明の一実施形態によれば、酵素的加水分解により、脂肪酸を逐次的に放出させる。第一段階では、第1のリパーゼにより、中鎖〜長鎖の、とりわけC16およびC18の飽和脂肪酸およびモノ不飽和酸を放出させる。最終段階では、中鎖〜長鎖のポリ不飽和脂肪酸、とりわけ、DHAを放出させるが、これは、第1のリパーゼをより長時間にわたり作用させておくこと、または異なるリパーゼを添加することにより達成することができる。対象の脂肪酸に応じて、第一段階と最終段階との間にさらなる段階が存在してもよい。実験の条件に応じて、脂肪酸放出の順序は変化しうる。第一段階で放出される脂肪酸は、次の段階を開始する前に膜を介して抽出される。
【００２９】
本発明により用いられるリパーゼは、固体支持体上に固定化させることもでき、水性バイオマス中に溶解させることもできる。
【００３０】
適用される酵素はリパーゼであり、例えば、カンジダ・ルゴーサ(Candida rugosa)、カンジダ・シリンドラセア(Candida cylindracea)、カンジダ・アンタルクティカ(Candida antarctica)、シュードモナス(Pseudomonas)属種、ムコール・ジャバニクス(Mucor javanicus)、ムコール・ミエイ(Mucor mihei)、テルモミセス・ラヌギノースス(Thermomyces lanuginosus)(Lipozyme TL 100L)、およびこれらの混合物に由来する、1位、3位特異的リパーゼおよび非特異的リパーゼなどであるがこれらに限定されない、微生物由来のリパーゼである。
【００３１】
加水分解プロセスの原理は、トリグリセリド分子中の望ましくない脂肪酸、すなわち、飽和化合物およびモノ不飽和化合物の除去である。このような脂肪酸とグリセロールとのエステル結合に対する攻撃は、それらの立体構造により促進される。飽和脂肪酸およびモノ不飽和脂肪酸は、酵素反応の初期において放出され、初めに除去される。その結果、残存するバイオマス加水分解物混合物が、LC-PUFA、特に、DHAで濃縮される。したがって、LC-PUFA、特に、DHAを放出させるために、異なる酵素を添加するか、または第1のリパーゼをより長時間にわたり作用させておく。
【００３２】
より具体的に述べると、好ましい実施形態では、段階的な酵素的加水分解の第一段階では、容易に攻撃される他の脂肪酸の中でも、パルミチン酸(C16:0)、ステアリン酸(C18:0)、および/またはオレイン酸(C18:1)を、それらの初期組成の好ましくは50%を超える、より好ましくは70%を超える、およびさらにより好ましくは90%を超える範囲で除去する。この段階で放出されるDHAは、10%を超えない、より好ましくは5%を超えないものとする。他の長鎖ポリ不飽和脂肪酸の中でも最大のDHA画分は、第1の酵素または第2の酵素の作用により、段階的な酵素的加水分解の最終段階で放出される。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態では、ポリ不飽和脂肪酸が、重量で、酵素的加水分解の最終段階で抽出される全脂肪酸の少なくとも50%、好ましくは60%、最も好ましくは80%を占める。
【００３４】
他の好ましい実施形態では、DHAが、酵素的加水分解の最終段階で抽出される全脂肪酸の約60%、好ましくは約70%、最も好ましくは約90%を占める。
【００３５】
膜コンタクターモジュールの生成物回収タンクT2から有機コンパートメントへ流れて、生成物回収タンクへ還流する有機相は、初めに、適切な有機溶媒または溶媒混合物で満たす。溶媒は、好ましくは、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、ペンタン、トルエン、ジクロロエタン、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、アセトン、およびこれらの混合物であるがこれらに限定されない非極性溶媒であることが好ましい。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態では、膜を介して有機コンパートメントへ抽出される脂肪酸が、エステル化によってそれらのアルキルエステル誘導体に転換される。したがって、生成物回収タンクから流れる溶媒または溶媒混合物は、低級アルキルアルコール、好ましくは、メタノールまたはエタノールの群から選択されるアルコールをさらに含みうる。したがって、T2に蓄積される対象の生成物は、脂肪酸のエステル誘導体である。エステル化を促進するため、膜コンタクターモジュールのT2から有機コンパートメントへ流れて、生成物回収タンクT2へ還流する有機相中に、酸、塩基、酵素(リパーゼ)、またはこれらの混合物の形態で触媒を存在させることができる。
【００３７】
脂肪酸が水性バイオマスから放出される初期速度をさらに高速化するために、バイオマスを、脂質の加水分解の前または同時に、前処理にかけてもよい。この前処理は、タンパク質および/またはリン脂質の加水分解を包含しうる。当業者に知られる任意のプロテアーゼまたはホスホリパーゼを用いることができる。供給元に推奨されているように、例えば、ストレプトミセス・グリセウス(Streptomyces griseus)に由来するプロテアーゼであるアルカラーゼ、およびそれらの混合物を用いることができる。ホスホリパーゼは、クラスA1、A2が好ましく、クラスBが最も好ましい。
【００３８】
水性バイオマスに夾雑する塩および他の低分子化合物は、ダイアフィルトレーションにより除去しうる。さらに、バイオマスが最適未満の濃度で供給される場合、細胞塊を脱水すべきである。したがって、本発明は、バイオマスの脱水および/またはダイアフィルトレーションを行うためのクロスフロー濾過モジュール(M2)をさらに含む方法に関する。
【００３９】
したがって、本発明の別の態様は、水性バイオマスから脂肪酸を抽出する統合方法であって、以下のステップ:
a)クロスフロー濾過モジュールM2内の前記水性バイオマスを脱水および/またはダイアフィルトレーションし、膜コンタクターモジュールM1におけるさらなる処理のための保持液を生成させるステップと;
b)保持液中の脂質を加水分解して、遊離脂肪酸を放出させるステップと;
c)遊離脂肪酸を含有する加水分解された保持液を、前記膜コンタクターモジュールM1の水性コンパートメントへ送入するステップと;
d)脂肪酸を、疎水性膜を介して、有機溶媒または溶媒混合物を含有する前記膜コンタクターモジュールM1の有機コンパートメントへ抽出するステップと
を含む統合方法に関する。
【００４０】
統合方法の概略表示を、図2に示す。脂肪酸に富む水性相は、クロスフロー膜モジュールM2へ送流され、バイオマスタンク(T1)へ還流する。水および低分子化合物は膜(4)を透過して透過廃液(6)を生成させる。本発明の第1の態様と同様に、所望の細胞濃度で、M2を介する送流は停止され、遊離脂肪酸を含有する水性の保持液(5)は膜コンタクターへ流れ始める。
【００４１】
クロスフロー濾過モジュールM2は、濃縮水性バイオマスを生成させて、膜コンタクターモジュールM1へ送入する。クロスフロー濾過により、例えば、発酵培養液から細胞塊を濃縮することは、M1における後続の処理に適応させることが容易であり、統合方法として配置することが好ましい。例えば、遠心分離により細胞塊を濃縮することは、M1における後続の処理に適応させることが容易ではない。
【００４２】
一実施形態では、まず、水性バイオマスは、バイオマスタンクT1からクロスフロー膜モジュールM2を介して送流され、その後、保持液(5)は、膜コンタクターモジュールM1の水性コンパートメント(1)へ送流され、膜コンタクターの有機コンパートメント(3)内を流れる有機溶媒/溶媒混合物へ脂肪酸を抽出し、これを生成物回収タンクT2内に蓄積させる。
【００４３】
クロスフロー膜を介して生成される透過液は、排出される水および低分子量化合物を含有する。
【００４４】
上記のステップd)はまた、エステル化して、これにより、脂肪酸エステル誘導体を得るさらなるステップを含んでもよい。
【００４５】
精密濾過(MF)法および限外濾過(UF)法の両方が、水性バイオマスの濃縮に適する。選択は通常、細胞培養液の特徴に応じてなされる。それらの化学的安定性および熱安定性が高いため、一部の産業的稼働では、有機膜よりセラミック膜の方が好ましいことが多い。本発明に適するクロスフロー濾過モジュールは、無機管状膜、例えば、チタンまたはジルコニウムで作製された膜を含有する。適切な無機管状膜のカットオフは、精密濾過(0.1〜10μm)または限外濾過の範囲(103〜106 Da)にある。
【００４６】
本発明による方法は通常、バッチプロセスまたは半連続プロセスとして稼働する。
【００４７】
本発明の方法または統合方法が終了した後、溶媒/溶媒混合物を回収する場合がある。溶媒の回収は、提案されているシステムにおける蒸留ではなく、有機溶媒ナノ濾過(OSN)により達成することが好ましい。ナノ濾過(既存のMET特許)により有機溶媒を回収する間に、有機相が濃縮される。しかし、溶媒混合物回収に適する任意のプロセスを用いることができる。
【００４８】
生成物回収タンクT2内で得られる遊離脂肪酸またはそれらのエステル誘導体は、分子蒸留またはクロマトグラフィーなど、当業者によく知られる方法によりさらに精製しうるが、特に、高速向流クロマトグラフィー(HPCCC)によりさらに精製することができる。
【００４９】
本発明による方法は、脂肪酸またはそれらのアルキルエステル誘導体を抽出するのに費用効果の高い方法である。本方法はまた、魚油に対する需要を低減する。本方法は、スケールアップが容易である。脂肪酸は、食品業界および製薬業界のいずれにも適する高品質である。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本発明による方法の概略表示を示す図である。脂肪酸に富む水性相は、膜コンタクターモジュールのバイオマスタンクT1から水性コンパートメント(1)へ送流され、バイオマスタンクT1へ還流する。溶媒または溶媒混合物は、膜コンタクターモジュールM1の生成物回収タンクT2から有機コンパートメント(3)へ送流され、生成物回収タンクT2へ還流する。遊離脂肪酸は、疎水性膜(2)を介して有機コンパートメントへの拡散により抽出され、そこに対象の生成物が蓄積する。
【図２】本発明による統合方法の概略表示を示す図である。脂肪酸に富む水性相は、クロスフロー膜モジュールM2へ送流され、バイオマスタンクT1へ還流する。水および低分子化合物は、膜(4)を透過して透過廃液(6)を生成させる。図1で説明した通り、所望の細胞濃度で、M2を介する送流は停止され、遊離脂肪酸を含有する水性の保持液(5)は膜コンタクターへ流れ始める。
【図３】実験全体の水性相および有機相におけるDHAおよびパルミチン酸の濃度を示す図である。プロットは、2つの区画に分かれる。第一段階は、第1のリパーゼを用いる際に達成される分離に対応する。予測される通り、有機相中におけるC16:0濃度は、この段階の終了時におけるDHA濃度より高濃度であった。第二段階は、残存するグリセリドを加水分解するために第2のリパーゼを添加したときに始まり、結果として、より多くのDHAが放出され、有機相中のDHA濃度が直線的に増大した。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
(実施例)
以下の実施例により、本発明を例示する。
【００５２】
(実施例1)
水性バイオマスの化学的加水分解対酵素的加水分解
本実施例は、
- 適用される反応時間および反応条件で、水性バイオマスの脂質を酵素的に加水分解することにより放出される脂肪酸量が、化学的に加水分解することにより放出される脂肪酸量の約70%であったこと(小節AおよびBに示す結果を比較されたい;表1(Table 1)および2(Table 2)の値を参照されたい);
- バイオマスをプロテアーゼで前処理してから脂質を酵素的に加水分解することにより、リパーゼと脂質との接触を促進しうること
を裏付ける。
【００５３】
A)水性バイオマスの化学的加水分解
乾燥重量150g/Lのバイオマス濃度をもたらすため、約200mgの乾燥バイオマスを含有する複数の試験管に、1.33mlの水を添加した。0.5MのKOH 5mlをエタノールに添加し、30秒間にわたり溶液をブレンドした(Ultraturrax (UT); 9500rpm)。水浴中60℃で2時間にわたり試験管をインキュベートした。インキュベーション時間後、2mlの水を添加し、結果として得られる溶液を、pH1まで酸性化した。加水分解した溶液を、各回ヘキサン2mlずつのアリコートにより3回にわたり洗浄して、遊離脂肪酸を抽出した。遊離脂肪酸を含有する正確な容量(2ml)のヘキサン相を、あらかじめ秤量した試験管へ引き入れ、窒素下でヘキサンをさらに蒸発させた。次いで、遊離脂肪酸をエタノール中に溶解させ、解析した。
【００５４】
B)水性バイオマスの酵素的加水分解
B1)プロテアーゼ処理を伴わない濃縮水性バイオマス(乾燥重量で150g/L)
300mgの凍結乾燥バイオマスを、2mlのリン酸緩衝液(37℃で0.1M、pH7.0)中に懸濁させ、150g/Lのバイオマス濃度へ再構成した。湿潤したバイオマスを煮沸し(98℃の水浴中10分間にわたり)、室温まで冷却した後で、バイオマス1グラム当たり3000UのリパーゼLPZ(Lipozyme TL 100L; Novozymes、Denmark)を添加した。
【００５５】
B2)プロテアーゼ処理を伴わない水性バイオマス(乾燥重量で50g/L)
2mlのリン酸緩衝液(37℃でpH7)を、100mgの凍結乾燥バイオマスに添加し、乾燥重量で50g/Lのバイオマス濃度をもたらした。次いで、10分間にわたり(98℃で)細胞塊懸濁液を煮沸し、その直後に室温まで冷却した。リパーゼLPZについて2つの酵素濃度、すなわち、バイオマス1グラム当たり1000単位および2000単位を調べた。
【００５６】
B3)プロテアーゼにより前処理した水性バイオマス(乾燥重量で50g/L)
100mgの凍結乾燥バイオマスを、2mlのリン酸緩衝液(37℃でpH7.0)中に懸濁させ、乾燥重量で50g/Lのバイオマス濃度をもたらした。次いで、10分間にわたり(98℃で)細胞塊懸濁液を煮沸し、その直後に室温まで冷却した。溶液1ml当たり20mgのアルカラーゼ(Novozymes、Denmark)を添加することにより、酵素的前処理を実施した。プロテアーゼによる反応を、60℃の水浴中で30分間にわたり続行した。この時間の後、試験管を30℃未満まで再度冷却してから、リパーゼを添加した。バイオマス1グラム当たり1000U等量のリパーゼLPZを添加した。
【００５７】
すべての試験管を窒素でフラッシュし、適正に密封してから、37℃のインキュベーター内のマルチポジション撹拌プレート上に置いた。B1およびB3を36時間にわたり、B2は12時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、2mlの脱イオン水をすべての試験管に添加した。次いで、結果として得られる水溶液/加水分解溶液にヘキサン2mlずつのアリコートを3回にわたり添加し、添加と添加の間に混合した。加水分解溶液およびヘキサンにより結果として形成されたエマルジョンを、遠心分離(10分間; 4000rpm)により分離した。遊離脂肪酸を含有する正確な容量のヘキサン相を、あらかじめ秤量した試験管へ引き入れ、窒素下で溶媒を蒸発させた。次いで、加水分解された油/遊離脂肪酸を、エタノール中に溶解させ、解析した。Table 1(表1)は、上記で説明した異なる条件で放出される主要な脂肪酸の量を示す。
【００５８】
【表１】
0005822825.tif 000002
【００５９】
B2およびB3を比較すると、プロテアーゼによる前処理は、放出される脂肪酸の最終収量に対して影響を及ぼさないが(データは示さない)、リパーゼと脂質との接触を促進し、初期速度を増大させ、これにより、全反応時間を短縮することを示す。酵素的加水分解から得られる結果は、とりわけ、濃縮水性バイオマス(B1)の場合、化学的加水分解と同等であった。全脂肪酸のうちの70%、すなわち、パルミチン酸(C16:0)のうちの81%、オレイン酸(C18:1)のうちの77%、およびDHA(C22:6)のうちの46%を回収した。
【００６０】
(実施例2)
酵素的加水分解による脂肪酸の逐次的放出
本実施例は、市販されている4つの微生物リガーゼ:すべてSigma Aldrich(ドイツ)製のカンジダ・ルゴーサ(CR)、ムコール・ジャバニクス(MJ)、シュードモナス属種(PS)、およびNovozymes(デンマーク)製のLipozyme (LPZ)の加水分解効率を裏付ける。
【００６１】
200mgの凍結乾燥バイオマスを、4mlのリン酸緩衝液(37℃で、0.1M、CR、PS、およびLPZにはpH7、ならびにMJにはpH8)中に懸濁させ、乾燥重量で50g/Lのバイオマス濃度とした。試験管を98℃の水浴中に入れ、10分間にわたり煮沸した。この時間の直後、試験管を水浴から取り出し、室温まで冷却した。バイオマス1グラム当たり2000U等量の酵素を試験管に添加した。窒素でフラッシュし、適正に密封した後、試験管を37℃のインキュベーター内のマルチポジション撹拌プレート(350rpm)上に置いた。24時間のインキュベーション後、4mlの脱イオン水をすべての試験管に添加した。次いで、結果として得られる水溶液/加水分解溶液にヘキサン2mlずつのアリコートを5回にわたり添加し、添加と添加との間に混合した。加水分解溶液およびヘキサンにより結果として形成されたエマルジョンを、遠心分離(10分間; 4000rpm)により分離した。遊離脂肪酸を含有する正確な容量のヘキサン相を、あらかじめ秤量した試験管へ引き入れ、窒素下で溶媒を蒸発させた。次いで、窒素下でヘキサンを蒸発させ、遊離脂肪酸をエタノール中に溶解させ、解析した。Table 2(表2)は、それぞれの場合に放出される主要な脂肪酸の総量を示す。
【００６２】
【表２】
0005822825.tif 000003
【００６３】
結果は、LPZが、反応時間中に最高量の脂肪酸を放出したことを示す。しかし、CRおよびMJはより選択的であった、すなわち、CRおよびMJは、C16:0およびC18:1を優先的に除去し、MJを用いたところ、C16:0が完全に回収された。したがって、本発明の所望の段階的加水分解の第一段階ではMJを用いることができ、第二段階ではPSを用いることができる。考えられる筋書では、リパーゼMJによりC16:0およびC18:1を除去した後に、リパーゼPSのDHA(C22:6)とグリセリド分子との間のエステル結合への接近が促進される。
【００６４】
(実施例3)
膜コンタクターモジュールを用いる脂肪酸の分離
以下で説明する実験は、有機溶媒を水性溶液と直接接触させずに脂肪酸を抽出するのに、膜コンタクターおよびポリイミド膜が有効であることを裏付ける目的で実施した。これらの予備的実験から、驚くべきことに、疎水性のポリイミド膜が、水性相(脂肪酸に富む相)と有機相(抽出溶媒相)との間の障壁として完全に機能することが見出された。水の貫流は観察されず、脂肪酸を水相から有機相へ抽出することに成功した。
【００６５】
膜コンタクターモジュール内で集塊を移動させる研究の準備試験として、微小藻類バイオマスを直接化学的に加水分解することにより、脂肪酸に富む溶液を調製した。10gの凍結乾燥バイオマスを、エタノール中0.5MのKOH 300ml中に懸濁させ、ホモジナイズ(9500rpm; Ultraturrax)し、室温で継続的に撹拌しながら一晩にわたり静置した。次いで、60℃の水浴中で30分間にわたりフラスコをインキュベートした。室温まで冷却した後、150mlの脱イオン水を添加した。次いで、遊離脂肪酸を得るため、6M HCl溶液を用いて、脂肪酸塩を含有する水溶液をpH1まで酸性化した。
【００６６】
用いた疎水性膜は、ポリイミド膜であった。このポリマーの疎水性特徴がよく知られているため、Matrimid 5218を選択した。N-メチルピロリドン(NMP)中で調製されたフラットシートのマトリミド膜は、濾過面積が41cm2であり、分子量カットオフ(MWCO)が約5kDaであった。
【００６７】
既に説明した通り、疎水性膜により分離される2つの液体流、すなわち、脂肪酸に富む相および有機相は、膜コンタクターの両側を1つずつ、連続的に流れた(ギアポンプによる)。水の貫流を回避し、また、溶媒により膜を湿潤させるため、脂肪酸に富む相の流速(90L/時間)を、有機相の流速(20L/時間)より高速で送流した。脂肪酸に富む相および有機相の初期容量は、それぞれ、500mlおよび100mlであった。室温および大気圧下で実験を実施した。実験で設定される限度容量に限界があるため、最長22時間にわたり試行実験を行った。22時間に及ぶまで定期的に試料を採取した。採取した試料をメチル化し、GCにより解析した。
【００６８】
【表３】
0005822825.tif 000004
【００６９】
この段階で到達した抽出容量は、約30〜32%であった、すなわち、微小藻類バイオマス中の主要な脂肪酸のうち、約30〜32%が、化学的加水分解後に形成されたエマルジョンから回収された。
【００７０】
22時間にわたる試行時における有機相中のDHA (C22:6)濃度の変化に基づき、全物質移動係数であるOMTC(Kaq)を計算した。Kaqの推定値は、7.0×10-7m・s-1であった。
【００７１】
(実施例4)
膜コンタクターモジュールを用いる脂肪酸の分離
本実施例で説明する実験は、実施例3と同じ根本原理に基づき実行した。しかし、分離能力を改善するため、両相の初期容量を変化させ、新規の膜を用いた。
【００７２】
5gの凍結乾燥バイオマスを、エタノール中0.5MのKOH 150ml中に懸濁させ、ホモジナイズ(9500rpm; Ultraturrax)し、室温で継続的に撹拌しながら一晩にわたり静置した。次いで、60℃の水浴中で30分間にわたりフラスコをインキュベートした。室温まで冷却した後、75mlの脱イオン水を添加した。次いで、遊離脂肪酸を得るため、6M HCl溶液を用いて、脂肪酸塩を含有する水溶液をpH1まで酸性化した。
【００７３】
用いた疎水性膜は、今回もフラットシートのポリイミド膜であり、濾過面積が41cm2であり、Matrimid5218およびN,N-ジメチルホルムアミド(DMF)により調製され、分子量カットオフ(MWCO)は約35kDaであった。
【００７４】
実験の設定および流速は、実施例3の場合と同じであった。脂肪酸に富む相および有機相の初期容量は、それぞれ、250mlおよび200mlであった。酸化を防止するため、有機相には、0.1%BHT(ブチル化ヒドロキシトルエン)を含有させた。室温および大気圧下で実験を実施した。採取した試料をメチル化し、GCにより解析した。送入相(脂肪酸に富む相)および生成物相(有機相)中の主要な脂肪酸の初期濃度および最終濃度を、Table 4(表4)に示す。
【００７５】
【表４】
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【００７６】
実施例3で示した結果と比較したところ、分離能力が、格段に改善された。到達した抽出収量率は約95〜98%であった、すなわち、微小藻類中の主要な脂肪酸のうち、約95〜98%が、化学的加水分解後に形成されたエマルジョンから回収された。
【００７７】
有機相中のDHA (C22:6)濃度の変化に基づき、全物質移動係数であるOMTC(Kaq)を計算した。Kaqの推定値は、17.0×10-7m・s-1であった。
【００７８】
(実施例5)
膜コンタクターモジュール内で酵素的加水分解と水性バイオマスからの分離とを同時的に行うことによる脂肪酸の分画
以下で説明する実験は、温和な条件下の膜コンタクターモジュール内で、脂肪酸の加水分解と水性バイオマスから有機相への脂肪酸の分離とを同時的に実施することにより、飽和脂肪酸とポリ不飽和脂肪酸との分画を達成しうることを示す目的で実施した。
【００７９】
微小藻類バイオマスを酵素的に加水分解することにより、脂肪酸に富む溶液を調製した。5gの凍結乾燥バイオマスを、0.1Mのリン酸カルシウム緩衝液(pH5)100ml中に懸濁させ、水浴中10分間にわたり98℃まで加熱した。前処理のため、1gのホスホリパーゼをバイオマス懸濁液に添加し、これをさらに連続的に撹拌しながら50℃で2時間にわたり水浴中に入れた。前処理の終了後、バイオマス懸濁液を約30℃まで冷却した。次いで、pHを7に調整し、100mlのエタノールをバイオマス懸濁液に添加し、37℃の水浴中でフラスコをインキュベートした。最適温度に達した時点で、第1のリパーゼを添加した。トリグリセリドの加水分解を開始して2時間後に、バイオマス懸濁液を膜コンタクターの水性コンパートメントへ再送流することを開始した。飽和脂肪酸の除去に成功し、有機相中の溶媒が清浄な溶媒で置換された時点で、第2のリパーゼをバイオマス懸濁液に添加した。
【００８０】
用いた疎水性膜および実験の設定、ならびに流速等の稼働条件は、実施例4の場合と同じであった。脂肪酸に富む相および有機相の初期容量は、それぞれ、250mlおよび200mlであった。酸化を防止するため、有機コンパートメント内を流れる溶媒には、0.1% BHT (ブチル化ヒドロキシトルエン)を含有させた。大気圧下で実験を実施した。試料を定期的に回収し、即座にメチル化し、GCによりさらに解析した。
【００８１】
図3に示す通り、第一段階では、飽和脂肪酸、すなわち、C16:0が、優先的に抽出される一方、ポリ不飽和酸は、水性相中に残存する。第2のリパーゼを添加することにより、残存するグリセリドを加水分解した。したがって、実験の第二段階では、ポリ不飽和脂肪酸、すなわち、DHAの物質移動速度の増大が観察された。この実験が終了するまで、DHA輸送が依然として直線的に増大する一方、C16:0は安定化した。第一段階において得られた全物質移動係数は、DHAの場合が0.36×10-7m・s-1であり、C16:0の場合が1.48×10-7m・s-1であった。
【００８２】
(実施例6)
クロスフロー精密濾過(CFMF)を用いる細胞の回収/ダイアフィルトレーション
クロスフロー精密濾過により、発酵培養液を、45〜50g/Lから180g/Lに濃縮した。
【００８３】
本試験で用いたCFMFシステムおよび管状膜は、Orelis (Novasep、Applexion、France)製であった。用いた精密濾過用Kerasep(商標)セラミック膜、すなわち、KERMBMM1およびKERMBMM2は、カットオフがそれぞれ、100nm〜200nmであり、濾過面積が0.008m2(供給元により与えられる)であった。
【００８４】
初期の細胞濃度が約45〜50g/L(乾燥重量ベース)である新鮮な発酵培養液を、5m/s(供給元により示される)の一定速度を有するモノスクリュー式ポンプにより、膜濾過モジュール(M2)内の管状膜を介して、容器(T1)からT1へ連続的に再還流させた。透過液重量に基づき濾過流量を計算し、元の発酵培養液の乾燥重量と実験終了時における保持液の乾燥重量との差に基づき濃縮倍率を計算した。
【００８５】
膜KERMBMM1を用いて、異なる膜透過圧(TMP)を比較した。各TMPで稼働した30分後に得られた濾過流量を、Table 5(表5)に示す。
【００８６】
【表５】
0005822825.tif 000006
【００８７】
0.7バール(Pin=0.8バール; Pout=0.6バール)のTMPが、このシステムに理想的であることが分かった。同じTMPで稼働する際に達成された透過流量および最終細胞濃度により、調べた2つの膜の性能を評価した。
【００８８】
【表６】
0005822825.tif 000007
【００８９】
培養液濃度および稼働条件が同じ場合は、膜KERMBMM2(200nm)の性能が最良であることが明らかであった。到達した最終的な細胞濃度は、180g/Lであった。
【符号の説明】
【００９０】
1  水性コンパートメント
2  疎水性膜
3  有機コンパートメント
4  膜
5  保持液
6  透過廃液
M1  膜コンタクターモジュール
M2  クロスフロー濾過モジュール
T1  バイオマスタンク
T2  生成物回収タンク
【図１】
0005822825.tif 000008
【図２】
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【図３】
0005822825.tif 000010