(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のインフルエンザウイルスサブタイプによる感染を治療または予防するための医薬を調製するためのγ線を照射したインフルエンザウイルスの使用であって、前記γ線を照射したインフルエンザウイルスは、ニワトリ赤血球（ｃＲＢＣ）に吸着されておらず、前記医薬は、鼻腔内投与用に処方され、前記複数のインフルエンザウイルスサブタイプに対する被験体における交差反応免疫を誘発する、使用。
【請求項２】
前記γ線を照射したインフルエンザウイルスは、前記ウイルスを、６．５×１０４ｒａｄ〜２×１０７ｒａｄのγ線の総線量に曝露することによって生成される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記γ線を照射したインフルエンザウイルスは、Ａ／ＷＳＮ［Ｈ１Ｎ１］、Ａ／ＰＲ８［Ｈ１Ｎ１］、Ａ／ＪＡＰ［Ｈ２Ｎ２］およびＡ／ＰＣ［Ｈ３／Ｎ２］からなる群より選択される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記交差反応免疫は、交差反応細胞性免疫および交差反応体液性免疫を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記交差反応細胞性免疫は、
（ｉ）交差反応ヘルパーＴ細胞応答
（ｉｉ）交差反応細胞障害性Ｔ細胞応答
のうちのいずれかまたは両方を含む、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記複数のインフルエンザウイルスサブタイプは、ヒト、トリ、ブタ、イヌまたはウマインフルエンザウイルスサブタイプのうちの１つ以上を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記複数のインフルエンザウイルスサブタイプはインフルエンザＡサブタイプＨＰＡＩ  Ａ（Ｈ５Ｎ１）またはＨ１Ｎ１  ０９ブタインフルエンザを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記γ線を照射したインフルエンザウイルスは、接線／クロスフロー濾過によって精製されたウイルスストックから調製される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記γ線を照射したインフルエンザウイルスは、凍結ウイルス調製物にγ線を照射することによって生成される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記γ線を照射したインフルエンザウイルスは、凍結乾燥形態で調製される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザウイルスによる感染を予防および治療するための組成物および方法に関する。より具体的には、本発明は、インフルエンザウイルスに対する交差反応免疫を誘発するためのワクチン組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは、インフルエンザウイルスでの気道の感染によって引き起こされる高度に感染性の疾患である。それは、特に幼児および老人において潜在的に命の危険性のある合併症を引き起こす可能性がある。
【０００３】
同種ウイルスでの再感染に対する防御は、中和抗体によって主に媒介されるが、インフルエンザウイルス感染からの回復は、細胞障害性ＣＤ８＋Ｔ（Ｔｃ）細胞応答を必要とする。インフルエンザウイルスに対する現在のワクチンは、主に不活性化された全ウイルスまたはサブユニット調製物であり、ウイルスの感染が化学的処理によって不活性化される。これらのワクチンは、ほぼ例外なく、頻繁に起こる抗原性変異（例えばＨＡおよびＮＡ）を受けるウイルス表面糖タンパク質を標的とする中和抗体を誘発することによって機能する。ウイルス表面糖タンパク質によって提示される頻繁に起こる抗原性変異は、それらに対するワクチンが概して交差反応免疫応答を誘発せず、従って、複数のインフルエンザウイルスサブタイプおよび種に対する防御ができないことを意味する。従って、抗体ベースのワクチンの防御価値は制限される。つまり、インフルエンザウイルスの頻繁に起こる抗原連続変異および／または抗原不連続変異から生じる新規のサブタイプ／種に対してほとんどまたは全く防御免疫を与えない。さらに、このようなワクチンによってウイルス表面糖タンパク質に与えられる選択圧は、ワクチンを無効にする抗原性変異を高めるのを促進する。
【０００４】
現在のインフルエンザワクチンの生成は、現在蔓延しているヒトインフルエンザ種と既知の単離種とを比較することによってなされる「経験に基づいた推測」に基づく。しかしながら、特定のインフルエンザの季節において感染を引き起こし得るインフルエンザ種の予測は、ウイルス変異に起因して生じる可能性のある抗原性変異のために当てることができない。さらに、継続しているウイルス変異および関連する抗原性変異は、ワクチンの効力を減少させ、間違った予測はワクチンを無効にさせる。２００７年−２００８年の季節に関する北半球のインフルエンザワクチン生成（Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）様ウイルス；Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）様ウイルス；およびＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４様ウイルス）が、このようなシナリオを示している。米国における疾病予防管理センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）によれば、Ａ型Ｈ３Ｎ２ブリズベン株およびＢ型フロリダ株が、インフルエンザの季節の疾患の多くの原因となった。しかしながら、これらの株はワクチンに導入されていなかったため、ワクチンは効果がなかった。
【０００５】
深刻なインフルエンザを軽減する際のワクチン接種によって誘発されるＴ細胞媒介性免疫の有益な効果は、ほとんど効き目がない。Ｔ細胞応答は、インフルエンザでの一次感染からの回復を成功させるのに重要であり、感染後初期のウイルス負荷を低下させることによって疾患の重症度を減少させる。Ｔ細胞免疫はまた、長く続き、Ｔ細胞応答を誘発するのに関与する抗原決定基は、概して、通常、ウイルスによる免疫回避を受けない保存タンパク質（例えばウイルス核タンパク質およびマトリクスタンパク質）から誘導される。従って、Ｔ細胞媒介性免疫を誘発できるワクチンが望まれ、この必要性は、現在利用可能な不活性化インフルエンザワクチン調製物によって満たされない。
【０００６】
さらに、現在利用可能なインフルエンザワクチンの製造に使用される方法は、ウイルス抗原の完全性をこわす粗い処置を含む。例えば、超遠心分離法はウイルス抗原に対して損傷効果を有するが、一般に、弱毒化する前にウイルスを精製するために使用されている。さらに、化学的に不活性化されたインフルエンザワクチン調製物は、物理的および化学的因子が抗原タンパク質を損傷させる未凍結ウイルスの使用を必要とする。従って、凍結ウイルス調製物に対するウイルス不活性化法の効果は、免疫原性を高める限定した抗原分解の利点を与える。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
Ｔリンパ球応答を誘発できるインフルエンザワクチンについての必要性が存在する。特に、抗原連続変異および／または抗原不連続変異から頻繁に生じる表面抗原性変異に関わらず、インフルエンザウイルスに対して交差防御免疫を誘発できるインフルエンザワクチンについての必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の態様において、本発明は、被験体におけるインフルエンザウイルス感染を治療または予防するための方法を提供し、その方法は、治療有効量のガンマ線を照射したウイルスを被験体に投与する工程を含む。
【０００９】
第２の態様において、本発明は、被験体におけるインフルエンザウイルス感染を治療または予防するための方法を提供し、その方法は、治療有効量のガンマ線を照射したインフルエンザウイルスを被験体に鼻腔内投与する工程を含む。
【００１０】
第１または第２の態様の一実施形態において、インフルエンザウイルス感染はインフルエンザＡサブタイプＨ５Ｎ１感染である。
【００１１】
第１または第２の態様の一実施形態において、インフルエンザウイルス感染はインフルエンザＡサブタイプＨＰＡＩ  Ａ（Ｈ５Ｎ１）感染である。
【００１２】
第１または第２の態様の一実施形態において、インフルエンザウイルス感染はインフルエンザＡサブタイプＨ１Ｎ１  ０９ブタインフルエンザ感染である。
【００１３】
第３の態様において、本発明は、被験体において複数のインフルエンザウイルスサブタイプに対する交差反応免疫を誘発するための方法を提供し、その方法は、治療有効量のガンマ線を照射したインフルエンザウイルスを被験体に投与する工程を含む。
【００１４】
第４の態様において、本発明は、被験体において複数のインフルエンザウイルスサブタイプに対する交差反応免疫を誘発または高めるための方法を提供し、その方法は、治療有効量のガンマ線を照射したインフルエンザウイルスを被験体に鼻腔内投与する工程を含む。
【００１５】
第３または第４の態様の一実施形態において、交差反応免疫は、交差反応細胞性免疫を含む。交差反応細胞性免疫は、
（ｉ）交差反応ヘルパーＴ細胞応答
（ｉｉ）交差反応細胞障害性Ｔ細胞応答
のいずれかまたは両方を含み得る。
【００１６】
第３または第４の態様の一実施形態において、交差反応免疫は、交差反応体液性免疫を含み得る。
【００１７】
第３または第４の態様の一実施形態において、複数のインフルエンザウイルスサブタイプは、ヒト、トリ、ブタ、イヌまたはウマインフルエンザウイルスのうちの１つ以上を含む。トリインフルエンザウイルスサブタイプは、インフルエンザウイルスサブタイプＨ５Ｎ１を含み得る。
【００１８】
第３または第４の態様の一実施形態において、複数のインフルエンザウイルスサブタイプは、インフルエンザＡサブタイプＨＰＡＩ  Ａ（Ｈ５Ｎ１）を含む。
【００１９】
第３または第４の態様の一実施形態において、複数のインフルエンザウイルスサブタイプは、インフルエンザＡサブタイプＨ１Ｎ１  ０９ブタインフルエンザを含む。
【００２０】
第５の態様において、本発明は、被験体においてインフルエンザウイルスに対するＴ細胞免疫応答を誘発または高める方法を提供し、その方法は、治療有効量のガンマ線を照射したインフルエンザウイルスを被験体に投与する工程を含む。Ｔ細胞免疫応答は、インフルエンザサブタイプＨ５Ｎ１に対して誘発され得るか、または高められ得る。Ｔ細胞免疫応答は、（ｉ）ヘルパーＴ細胞免疫応答、（ｉｉ）細胞障害性Ｔ細胞免疫のいずれかまたは両方を含み得る。
【００２１】
第５の態様の一実施形態において、Ｔ細胞免疫応答は、インフルエンザＡサブタイプＨＰＡＩ  Ａ（Ｈ５Ｎ１）に対して誘発され得るか、または高められ得る。
【００２２】
第５の態様の一実施形態において、Ｔ細胞免疫反応は、インフルエンザＡサブタイプＨ１Ｎ１  ０９ブタインフルエンザに対して誘発されるか、または高められる。
【００２３】
第１、第２、第３、第４または第５の態様の一実施形態において、ガンマ線を照射したインフルエンザウイルスはインフルエンザＡウイルスである。インフルエンザＡウイルスは、Ａ／ＷＳＮ［Ｈ１Ｎ１］、Ａ／ＰＲ８［Ｈ１Ｎ１］、Ａ／ＪＡＰ［Ｈ２Ｎ２］およびＡ／ＰＣ［Ｈ３／Ｎ２］からなる群より選択され得る。
【００２４】
第１、第２、第３、第４または第５の態様の一実施形態において、ガンマ線を照射したインフルエンザウイルスは人畜共通インフルエンザウイルスである。人畜共通インフルエンザウイルスは人畜共通インフルエンザＡウイルスであってもよい。
【００２５】
第１、第２、第３、第４または第５の態様の一実施形態において、ガンマ線を照射したインフルエンザウイルスは凍結乾燥形態で調製される。
【００２６】
第１、第２、第３、第４または第５の態様の一実施形態において、ガンマ線を照射したインフルエンザウイルスは、接線／クロスフロー濾過によって精製されたウイルスストックから調製される。
【００２７】
第１、第２、第３、第４または第５の態様の一実施形態において、ガンマ線を照射したインフルエンザウイルスは、ガンマ線を照射した凍結ウイルス調製物によって生成される。
【００２８】
第１、第２、第３、第４または第５の態様の一実施形態において、ガンマ線を照射したインフルエンザウイルスは、前記ウイルスを、約６．５×１０４ｒａｄ〜約２×１０７ｒａｄの間のガンマ線の総線量に曝露することによって生成される。
【００２９】
第１、第２、第３、第４または第５の態様の別の実施形態において、ガンマ線を照射したインフルエンザウイルスは、前記ウイルスを、約１×１０６ｒａｄのガンマ線の総線量に曝露することによって生成される。
【００３０】
第１、第２、第３、第４または第５の態様のさらなる実施形態において、ガンマ線を照射したインフルエンザウイルスは、複数の別個の用量で投与される。複数の別個の用量のうちの１つ以上は、再接種のための追加免疫として投与されてもよい。
【００３１】
第１、第２、第３、第４または第５の態様の別の実施形態において、治療有効量のガンマ線を照射したインフルエンザウイルスは、薬理学的に許容可能な担体、補助剤または賦形剤と一緒に投与される。
【００３２】
第６の態様において、本発明は、インフルエンザワクチンを産生する方法を提供し、その方法は、ガンマ線によってインフルエンザウイルスの調製物を不活性化する工程を含む。
【００３３】
第６の態様の一実施形態において、インフルエンザウイルスの調製物は、前記ガンマ線によって不活性化する工程の前に接線／クロスフロー濾過によって精製される。
【００３４】
第６の態様の一実施形態において、インフルエンザウイルスの調製物は、凍結の間にガンマ線を照射される。
【００３５】
第６の態様の一実施形態において、この方法は、前記ガンマ線によって不活性化する工程の後に前記ウイルスを凍結乾燥するさらなる工程を含む。
【００３６】
第６の態様の一実施形態において、ワクチンは鼻腔内への注入のために処方される。
【００３７】
第６の態様の一実施形態において、インフルエンザワクチンは、複数のインフルエンザウイルスサブタイプに対する交差反応免疫を誘発する。
【００３８】
第６の態様の一実施形態において、複数のインフルエンザウイルスサブタイプは、インフルエンザウイルスＡサブタイプＨＰＡＩ  Ａ（Ｈ５Ｎ１）を含む。
【００３９】
第６の態様の一実施形態において、複数のインフルエンザウイルスサブタイプは、インフルエンザＡサブタイプＨ１Ｎ１  ０９ブタインフルエンザを含む。
【００４０】
第６の態様の一実施形態において、不活性化する工程は、前記ウイルスを、約６．５×１０４ｒａｄ〜約２×１０７ｒａｄの間のガンマ線の総線量に曝露する工程を含む。
【００４１】
第６の態様の一実施形態において、不活性化する工程は、前記ウイルスを、約１×１０６ｒａｄのガンマ線の総線量に曝露する工程を含む。
【００４２】
第６の態様の別の実施形態において、インフルエンザワクチンは、複数のインフルエンザウイルスサブタイプに対する交差反応免疫を誘発する。インフルエンザウイルスサブタイプは、インフルエンザウイルスサブタイプＨ５Ｎ１を含んでもよい。
【００４３】
第６の態様の別の実施形態において、インフルエンザウイルスの調製物は、インフルエンザＡウイルスを含む。
【００４４】
第７の態様において、本発明は、インフルエンザウイルス感染を治療または予防するための医薬を製造するためのガンマ線を照射したインフルエンザウイルスの使用を提供する。
【００４５】
第７の態様の一実施形態において、医薬は、鼻腔内への注入のために処方される。
【００４６】
第７の態様の別の実施形態において、インフルエンザウイルス感染の治療または予防は、インフルエンザウイルスサブタイプＨ５Ｎ１感染である。
【００４７】
第７の態様の一実施形態において、医薬は、複数のインフルエンザウイルスサブタイプに対する交差反応免疫を誘発する。複数のインフルエンザウイルスサブタイプは、インフルエンザＡサブタイプＨＰＡＩ  Ａ（Ｈ５Ｎ１）を含む。複数のインフルエンザウイルスサブタイプは、インフルエンザウイルスサブタイプＨ１Ｎ１  ０９ブタインフルエンザを含む。
【００４８】
第７の態様の一実施形態において、医薬はワクチンである。ワクチンは、複数のインフルエンザウイルスサブタイプに対する交差反応免疫を誘発することができる。
【００４９】
第７の態様の一実施形態において、ガンマ線を照射したインフルエンザウイルスは、インフルエンザＡウイルスである。
【００５０】
第８の態様において、本発明は、インフルエンザ感染の治療または予防に使用するためのガンマ線を照射したインフルエンザウイルスを提供する。
【００５１】
第９の態様において、本発明は、第６の態様に従って産生されたワクチンを提供する。
【００５２】
ここで、本発明の好ましい実施形態は添付の図面を参照して例示のみとして記載される。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、Ａ／ＪＡＰ（５０ＨＡＵ／マウス）での鼻腔内感染後、静脈内にワクチンを接種された動物の体重減少を示す棒グラフである。表５に示した群からのマウスは、感染後６日に体重を測定した。
【図２】図２は、未処置のマウスおよびγ−ｆｌｕのワクチンを接種されたマウス由来の免疫組織化学的に染色された肺組織の代表的な顕微鏡写真を示す。（Ａ）未処置のマウス、（Ｂ）Ａ／ＷＳＮ後６日の未処置のマウス、（Ｃ）γ−ｆｌｕでワクチンを接種され、同種のＡ／ＷＳＮ株で抗原投与されたマウス、および（Ｄ）γ−ｆｌｕでワクチンを接種され、異種のＡ／ＰＣ株で抗原投与されたマウスにおける、肺炎症に対するγ−ｆｌｕ（ガンマ線を照射したインフルエンザウイルス）ワクチン接種の効果を示す。
【図３】図３は、ＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤に対するγ−ｆｌｕワクチン接種の効果を示す棒グラフである。模擬またはガンマ線を照射したインフルエンザウイルス（γ−Ａ／ＷＳＮ、γ−Ａ／ＪＡＰ、γ−Ａ／Ｐｃ）を、動物に静脈内にワクチンを接種するために用いた。４週間後、マウスをＡ／ＷＳＮで鼻腔内に抗原投与した。Ａ／ＷＳＮ抗原投与後、６日に、各群から３匹のマウスを屠殺し、全肺浸潤物内のＣＤ８＋細胞の割合をＦＡＣＳによって測定した。
【図４】図４は、γ−ｆｌｕによって誘発された交差反応細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を示す一連の棒グラフを提供する。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ａ／ＷＳＮ、γ−Ａ／ＷＳＮ、Ａ／ＰＣまたはγ−Ａ／Ｐｃを用いて感染させるか、またはワクチンを接種し、それらの脾細胞を、（Ａ）模擬処置した標的物、（Ｂ）Ａ／ＷＳＮで感染させた標的物、（Ｃ）Ａ／ＰＣで感染させた標的物、および（Ｄ）ＮＰＰで標識したＰ８１５標的物に対する殺活性について試験した。
【図５】図５は、γ−ｆｌｕによって誘発された交差反応細胞障害性Ｔ細胞応答を示す一連の棒グラフを与える。Ａ／ＰＲ８、γ−Ａ／ＰＲ８、Ａ／ＰＣ、またはγ−Ａ／ＰＣを用いて感染させるか、またはワクチンを接種したＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾細胞を、模擬処置した標的物（データは示さず）、（Ａ）Ａ／ＰＣ［Ｈ３Ｎ２］で感染させた標的物、（Ｂ）Ａ／ＰＲ８［Ｈ１Ｎ１］で感染させた標的物、（Ｃ）Ａ／ＪＡＰ［Ｈ２Ｎ２］で感染させた標的物、およびＮＰＰで標識したＰ８１５標的物に対するそれらの殺活性について試験した。
【図６】図６は、致死量のＡ／ＰＲ８での抗原投与後のマウスの致死率を示す一連のグラフを示す。以下の群：（Ａ）未処置（ワクチンを接種されていない）マウス、（Ｂ）Ａ／ＰＲ８γ−ｆｌｕで鼻腔内にワクチンを接種されたマウス（ｎ＝１０）、（Ｃ）Ａ／ＰＣγ−ｆｌｕで鼻腔内にワクチンを接種されたマウス（ｎ＝１０）、および（Ｄ）ホルマリンで不活性化されたＡ／ＰＣで鼻腔内にワクチンを接種された（ｎ＝８）マウスを、鼻腔内に３×１０２ＨＡＵ（２×１０５ｐｆｕ／マウス）のＡ／ＰＲ８を鼻腔内に抗原投与した。体重減少および致死率（Ｅ）を免疫化後２１日間モニターした。個々のマウスの体重の追跡の終わりは動物の死を示す。
【図７】図７は、γ−ｆｌｕでの鼻腔内ワクチン接種が、異種ウイルス抗原投与に対する優れた防御を示す一連のグラフを示す。１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群は、模擬処置したマウス（Ａ）、あるいはγ−Ａ／ＰＣ（３．２×１０６ＰＦＵ当量）で静脈内（Ｂ）または鼻腔内（Ｃ）にワクチン接種したマウスのいずれかであった。３週間後、マウスに、鼻腔内に致死量（６×１０２ＰＦＵ）のＡ／ＰＲ８を抗原投与し、２１日間、毎日体重を記録した。模倣処置、あるいは鼻腔内、静脈内、腹腔内、または皮下にワクチン接種し、（Ａ〜Ｃ）に関して抗原投与したマウスの３０％体重減少によって定義される生存率を２１日間モニターした（Ｄ）。
【図８】図８は、Ｈ５Ｎ１（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４）での鼻腔内感染後の体重減少を示す一連のグラフを示す。感染したマウスを、体重減少および致死率についてモニターした。個々のマウスの体重追跡の終わりは、約２５％体重減少による屠殺を示す。
【図９】図９は、Ｈ５Ｎ１での抗原投与後のＢＡＬＢ／ｃマウスの体重および致死率を示す２つのグラフを示す。１０匹のマウスの群は、（Ａ）模擬処置したマウス、または（Ｂ）γ−Ａ／ＰＲ８［Ｈ１Ｎ１］で鼻腔内にワクチン接種したマウスのいずれかであった。体重を２１日間毎日記録した。
【図１０】図１０は、受動血清伝達が、γ線を照射したＡ／ＰＣによって誘発された異種サブタイプ（ｈｅｔｅｒｏｓｕｂｔｙｐｉｃ）免疫を、ワクチンを接種していないマウスに移すことができないことを示す一連のグラフを与える。（Ａ、ＢおよびＣ）＝体重減少；（Ｄ）＝致死率；エンドポイント：２５％体重減少；＊Ｐ＜０．０５対コントロール免疫前血清群；フィッシャーの正確確率検定。
【図１１】図１１は、Ｂ細胞欠失マウスにおける異種サブタイプ防御の欠失を示す一連のグラフを与える。（Ａ）＝未処置のマウスの体重減少；（Ｂ）＝免疫化マウスの体重減少；（Ｃ）＝未処置のマウス／免疫化マウスの致死率。
【図１２】図１２は、ＭＨＣ  ＩＩ欠失マウスにおける異種サブタイプ防御の欠失を示す一連のグラフを提供する。（Ａ）＝未処置のマウスの体重減少；（Ｂ）＝免疫化マウスの体重減少；（Ｃ）＝未処置のマウス／免疫化マウスの致死率。
【図１３】図１３は、β２Ｍ欠失マウスにおける異種サブタイプ防御の欠失を示す一連のグラフを提供する。（Ａ）＝未処置のマウスの体重減少；（Ｂ）＝免疫化マウスの体重減少；（Ｃ）＝未処置のマウス／免疫化マウスの致死率。
【図１４】図１４は、Ｂ細胞ではなく、適合移植されたＴ細胞が異種サブタイプ抗原投与に対してマウスを防御することを示す一連のグラフを提供する。（Ａ、ＢおよびＣ）＝体重減少；（Ｄ）＝致死率；＊Ｐ＜０．０５対コントロールゼロ群；フィッシャーの正確確率検定。
【図１５】図１５は、パーフォリン欠失マウスにおける異種サブタイプ防御の欠失を示す一連のグラフを提供する。（ＡおよびＢ）＝体重減少；（Ｃ）＝致死率。
【図１６】図１６は、ＩＩ型ＩＦＮ受容体ノックアウトマウスにおける異種サブタイプ防御を示す一連のグラフを提供する。（Ａ、Ｂ）＝体重減少；（Ｃ）＝致死率；＊Ｐ＜０．０５対コントロールゼロ群；フィッシャーの正確確率検定。
【図１７】図１７は、免疫化マウスの血清における交差中和活性の欠失を示す２つのグラフを提供する。（Ａ）＝Ａ／ＰＣ（Ｈ３Ｎ２）に対するウイルス中和活性；（Ｂ）＝Ａ／ＰＲ８（Ｈ１Ｎ１）に対するウイルス中和活性。
【図１８】図１８は、γ線を照射したＡ／ＰＣによって誘発される一次Ｔｃ細胞反応の用量依存性を示す２つのグラフを提供する。（Ａ、Ｂ）＝免疫化後６日に収集した脾細胞。エラーバーは平均±Ｓ．Ｄのパーセントを表す。特定の溶解値を６０：１のエフェクター：標的物の比における回帰曲線から補間した。
【図１９】図１９は、生体外での二次Ｔｃ細胞反応を示すグラフである。特定の溶解値を４０：１のエフェクター：標的物の比における回帰曲線から補間した。
【図２０−１】図２０−１は、ガンマ線を照射したインフルエンザウイルスＡ／ＰＣが、同種および異種サブタイプの抗原投与の両方に対してマウスを防御することを示す一連のグラフを提供する。（Ａ）＝模擬処置されたマウス；（Ｂ）＝ホルマリンにより不活性化されたＡ／ＰＣで鼻腔内に免疫化されたマウス；（Ｃ）＝紫外線により不活性化されたＡ／ＰＣで鼻腔内に免疫化されたマウス；（Ｄ）＝γ線により不活性化されたＡ／ＰＣで鼻腔内に免疫化されたマウス；（Ｅ）＝２０日後の生存率；＊Ｐ＜０．０５対コントロールの未処置の群；フィッシャーの正確確率検定。
【図２０−２】図２０−２は、ガンマ線を照射したインフルエンザウイルスＡ／ＰＣが、同種および異種サブタイプの抗原投与の両方に対してマウスを防御することを示す一連のグラフを提供する。（Ｆ）＝模擬処置されたマウス；（Ｇ）＝ホルマリンにより不活性化されたＡ／ＰＣで鼻腔内に免疫化されたマウス；（Ｈ）＝紫外線により不活性化されたＡ／ＰＣで鼻腔内に免疫化されたマウス；（Ｉ）＝γ線により不活性化されたＡ／ＰＣで鼻腔内に免疫化されたマウス；（Ｊ）＝２０日後の生存率；＊Ｐ＜０．０５対コントロールのワクチンを接種されていない群；フィッシャーの正確確率検定。
【図２１−１】図２１−１は、ホルマリンにより不活性化されたインフルエンザウイルスＡ／ＰＣの複数の免疫化が、同種の防御を誘発するために必要とされることを示す一連のグラフを提供する。（Ａ）＝模擬処置されたマウス；（Ｂ）＝ホルマリンにより不活性化されたＡ／ＰＣで１回免疫化されたマウス；（Ｃ）＝ホルマリンにより不活性化されたＡ／ＰＣで２回免疫化されたマウス；（Ｄ）＝ホルマリンにより不活性化されたＡ／ＰＣで３回免疫化されたマウス；＊Ｐ＜０．０５対コントロールの未処置の群；フィッシャーの正確確率検定。
【図２１−２】図２１−２は、ホルマリンにより不活性化されたインフルエンザウイルスＡ／ＰＣの複数の免疫化が、同種の防御を誘発するために必要とされることを示す一連のグラフを提供する。（Ｆ）＝模擬処置されたマウス；（Ｇ）＝ホルマリンにより不活性化されたＡ／ＰＣで３回免疫化されたマウス；（Ｅ、Ｈ）＝２０日後の生存率；＊Ｐ＜０．０５対コントロールの未処置の群；フィッシャーの正確確率検定。
【図２２−１】図２２−１は、三価インフルエンザワクチンが連続変異した株に対して防御を与えることができないことを示す一連のグラフを提供する。（Ａ、Ｄ）＝未処置；（Ｂ、Ｅ）＝免疫化された；（Ｃ）＝２０日後の生存率。
【図２２−２】図２２−２は、三価インフルエンザワクチンが連続変異した株に対して防御を与えることができないことを示す一連のグラフを提供する。（Ｆ）＝２０日後の生存率。
【図２３】図２３は、同種の抗原投与後の免疫組織化学的に染色された肺組織の代表的な顕微鏡写真を提供する。（Ａ）＝未処置の肺；（Ｂ）＝ワクチンを接種されていない（感染された）；（Ｃ）＝ガンマ−Ａ／ＰＣによるワクチンを接種された（抗原投与された）；（Ｄ）＝ホルマリン−Ａ／ＰＣによるワクチンを接種された（抗原投与された）；Ｅ＝紫外線−Ａ／ＰＣによるワクチンを接種された（抗原投与された）。
【図２４】図２４は、異種サブタイプの抗原投与後の免疫組織化学的に染色された肺組織の代表的な顕微鏡写真を提供する。（Ａ）＝未処置の肺；（Ｂ）＝ワクチンを接種されていない（感染された）；（Ｃ）＝ガンマ−Ａ／ＰＣによるワクチンを接種された（抗原投与された）；（Ｄ）＝ホルマリン−Ａ／ＰＣによるワクチンを接種された（抗原投与された）；Ｅ＝紫外線−Ａ／ＰＣによるワクチンを接種された（抗原投与された）。
【図２５】図２５は、種々の不活性化されたウイルス調製物がインフルエンザ感染を防御しないが、γ線により不活性化されたＡ／ＰＣでの免疫化が初期のウイルスクリアランスを導くことを示すグラフである。
【図２６】図２６は、生きているＡ／ＰＣおよび不活性化されたＡ／ＰＣによって誘発されるＴｃ細胞応答の比較を示すグラフである。１群あたり２匹のマウスの平均値±ＳＤを示す。特定の溶解値を５０：１のエフェクター：標的物の比における回帰曲線から補間した。Ｎ．Ｄ．：未検出。
【図２７−１】図２７−１は、γ線を照射したＡ／ＰＣでの鼻腔内免疫化が、高用量のＡ／ＰＲ８の致死量の抗原投与に対する防御を与えることを示す一連のグラフを提供する。（Ａ、Ｃ）＝ＬＤ５０  Ａ／ＰＲ８で抗原投与されたマウス；（Ｂ、Ｄ）＝５×ＬＤ５０  Ａ／ＰＲ８で抗原投与されたマウス。＊Ｐ＜０．０５対コントロールの未処置群；フィッシャーの正確確率検定。
【図２７−２】図２７−２は、γ線を照射したＡ／ＰＣでの鼻腔内免疫化が、高用量のＡ／ＰＲ８の致死量の抗原投与に対する防御を与えることを示す一連のグラフを提供する。（Ｅ）＝５０×ＬＤ５０  Ａ／ＰＲで抗原投与されたマウス；（Ｆ）＝２０日後の生存率および体重減少。＊Ｐ＜０．０５対コントロールの未処置群；フィッシャーの正確確率検定。
【図２８】図２８は、γ線を照射したＡ／ＰＣの異種サブタイプの防御特性が凍結乾燥プロセス後に維持されることを示す一連のグラフを提供する。（Ａ）＝模擬処置；（Ｂ）＝異種サブタイプ株Ａ／ＰＲ８で抗原投与した；（Ｃ）＝２０日後の生存率および体重減少。＊Ｐ＜０．０５対コントロールの未処置の群；フィッシャーの正確確率検定。
【図２９】図２９は、γ線を照射したＡ／ＰＣの異種サブタイプの防御特性が凍結乾燥プロセス後に維持されることを示す一連のグラフを提供する。（Ａ）＝模擬処置；（Ｂ）＝凍結乾燥したγ線により不活性化されたＡ／ＰＲ８で抗原投与した；（Ｃ）＝２０日後の生存率および体重減少。＊Ｐ＜０．０５対コントロールの未処置の群；フィッシャーの正確確率検定。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本出願で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他に明確に示さない限り、複数形の言及も含む。例えば、用語「植物細胞」は複数の植物細胞も含む。
【００５５】
本明細書で使用される場合、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」など、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の様々な形は、対応して変化させた意味を有する。従って、例えば、タンパク質をコードする配列を「含んでいる」ポリヌクレオチドは、その配列のみからなり得るか、または１つ以上のさらなる配列を含み得る。
【００５６】
用語「交差反応免疫」および「交差防御免疫」は、本明細書で交換可能に使用され、同様の意図される意味を有する。
【００５７】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」および「抗体（複数も含む）」としては、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭおよびＩｇＹ、一本鎖の全抗体を含む全抗体、ならびにそれらの抗原結合フラグメントが挙げられる。抗原結合抗体フラグメントとしては、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド−５結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）およびＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメントが挙げられる。抗体は任意の動物由来であってもよい。一本鎖抗体を含む、抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を単独、またはヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの全部もしくは一部と組み合わせて含み得る。また、可変領域ならびにヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの任意の組み合わせも含まれる。抗体は、生体分子と特異的に結合するモノクローナル、ポリクローナル、キメラ、多特異的、ヒト化、およびヒトモノクローナルおよびポリクローナル抗体であり得る。
【００５８】
本明細書中の先行技術文献のあらゆる詳細、またはそれらの文献に由来するか、もしくは基づく本明細書中の記載は、それらの文献またはそれに由来する記載が、オーストラリアまたはその他の場所における関連技術の一般的知見の一部であることを認めるものではない。
【００５９】
記述の目的のために、本明細書中で参照される全ての文献は他に指定されない限り参照により援用される。
【００６０】
（詳細な説明）
現在利用可能なインフルエンザワクチンは、主に体液性反応（Ｂ細胞由来の抗体反応）を含む。これらの反応は、主に、突然変異に起因する頻繁な抗原性変異を受ける、ウイルス表面糖タンパク質血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）に対して向けられる。従って、現在のインフルエンザワクチンの目だった不利点は、頻繁な抗原連続変異および／または抗原不連続変異に由来する新規のインフルエンザサブタイプ／株に対して、少ししか、または全く防御を与えないことである。
【００６１】
対照的に、インフルエンザウイルスに対するＴ細胞反応は、主に、内部ウイルスタンパク質に対して向けられる。それらのタンパク質は、全てのインフルエンザウイルスサブタイプの中で高度に保存され、変異の影響をほとんど受けない。従って、Ｔ細胞反応を誘発するワクチンは、交差防御免疫を与える可能性が高い。Ｔ細胞反応はまた、長く続き、インフルエンザ感染からの効果的な回復に重要である。従って、Ｔ細胞性免疫を誘発する能力は、不活性化されたインフルエンザウイルスワクチンの非常に望ましい特性である。これにも関わらず、現在利用可能なインフルエンザワクチンは、Ｔ細胞性免疫を誘発できず、従って、それらの有効性が実質的に制限される。
【００６２】
本発明は、インフルエンザウイルスの保存されたタンパク質に向けられたＴ細胞性免疫を誘発できるインフルエンザワクチンを提供することによってこれらの不利益を克服する手段を提供する。本発明のガンマ線を照射した（γ線を照射した）インフルエンザワクチンはまた、異なるインフルエンザウイルスサブタイプおよび株に対する交差反応／交差防御免疫を誘発することが実証されている。
【００６３】
特定の機構によって制限されないが、抗原構造に対するγ線の照射の減少した影響およびインフルエンザウイルス表面タンパク質の生物学的健全性は、それらの機能的ドメインをインタクトなままにするので、宿主免疫細胞によるウイルス粒子の効果的な取り込みおよび脱殻を可能にすると考えられる。次いで、これにより、十分なウイルス抗原（マトリクスおよび核タンパク質）を、Ｔ細胞性免疫の効果的な誘発のために抗原が存在する細胞の細胞質に提供できる。さらに、断片化したゲノムインフルエンザウイルスＲＮＡの不成功の複製／翻訳は、ウイルス特異的Ｔ細胞性免疫のプライミングを可能にする。なぜなら、不完全なリボソーム産物（例えば時期を早めて終端された、および／またはミスフォールドされた）は、ＭＨＣクラスＩ抗原提示のウイルス抗原の主要源であるとみなされるからである。ウイルス粒子の抗原構造に対するγ線照射の減少した影響はまた、現在使用されているワクチン調製物によって誘発される体液性免疫と比較してワクチン接種者における体液性免疫の程度および／または質を改善すると考えられる。
【００６４】
タンパク質の架橋と相互作用し、誘発する不活性化されたインフルエンザウイルスワクチン（例えばホルマリンまたはβ−プロピオラクトン）の生成において現在使用されている化学的処理と対照的に、γ線照射は、遺伝物質において鎖切断を生じることによって感染的にウイルスを不活性化すると考えられている。γ線照射は、生物学的物質内への、および生物学的物質を通る高侵入の化学的因子と比較してさらなる利点を有する。さらに、γ線照射は、ワクチン製造の間のウイルス抗原の保存を容易にするインフルエンザウイルスの凍結された調製物を不活性化するのに使用され得る。
【００６５】
（組成物およびワクチン）
本発明は、γ線を照射したインフルエンザウイルスを含む組成物およびワクチンを提供する。その組成物およびワクチンは、γ線を照射したインフルエンザウイルスの任意のサブタイプまたは株を含んでもよい。γ線を照射したインフルエンザウイルスの２つ以上の株の混合物もまた意図される。混合物に使用される株は、同じまたは異なるインフルエンザウイルスサブタイプ由来であってもよい。
【００６６】
本発明の組成物およびワクチンは、単一のγ線を照射したインフルエンザ株、または異なるγ線を照射したインフルエンザ株の混合物を含んでもよい。インフルエンザ株は、オルソミクソウイルスファミリーの任意の属由来であってもよい。例えば、インフルエンザ株は、インフルエンザＡ（Ａ型）、インフルエンザＢ（Ｂ型）、またはインフルエンザＣ（Ｃ型）の属のサブタイプ由来であってもよい。
【００６７】
インフルエンザＡの好ましいサブタイプとしては、限定されないが、Ｈ１Ｎ１（例えばＨ１Ｎ１  ０９ブタインフルエンザ）、Ｈ１Ｎ２、Ｈ１Ｎ７、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ８、Ｈ４Ｎ８、Ｈ５Ｎ１（例えばＨＰＡＩ  Ａ（Ｈ５Ｎ１））、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ６Ｎ５、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ７、Ｈ８Ｎ４、Ｈ９Ｎ２、Ｈ１０Ｎ７、Ｈ１１Ｎ６、Ｈ１２Ｎ５、Ｈ１３Ｎ６、Ｈ１４Ｎ５、およびインフルエンザＡウイルスの間の再分類から生じる任意の他のサブタイプが挙げられる。
【００６８】
本明細書で意図される「Ｈ１Ｎ１  ０９ブタインフルエンザウイルス」はまた、世界保健機構によって「汎発性インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）」ともいわれる。
【００６９】
特定の実施形態において、本発明の組成物および／またはワクチンはγ線を照射した人畜共通インフルエンザウイルス株を含む。
【００７０】
本発明に従って使用するためのインフルエンザウイルスは、当該分野で公知の方法を用いて生成され得る。例えば、インフルエンザウイルスは、例えば、Ｃｏｉｃｏら，（Ｅｄｓ）「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」，（２００７），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（特に、「Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ：Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ，Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｓｔｏｒａｇｅ」という標題のＵｎｉｔ  １５Ｇ．１を参照のこと）に記載されるように、孵化卵中の連続継代によって誘導され得る。この技術の簡単な説明を以下に提示する。
【００７１】
孵化卵は、受精後９〜１２日で得られ得、気嚢を見つけるために光を当てた。次いで、無菌条件下で卵に穴を開け、シリンジを用いて空隙内に種ウイルスを接種した。この処置は、手動で、または機械によって自動的に行うことができる。次いで、接種した卵を、約２〜３日間、湿気のある環境中でインキュベートした。この期間の終わりに、胚を停止させ、尿膜腔液の清澄化に役立つように、所望の場合、卵を約４℃に維持してもよい。次いで、卵の上部を取り除き、膜に穴を開け、尿膜腔液を収集した。再び、これは手動で、または自動化された機械によりなされてもよい。尿膜腔液は、例えば、細胞残屑を除去するために遠心分離によって清澄化され、および／またはγ照射によるインフルエンザウイルスの不活性化前または後にさらなる精製を受けてもよい。尿膜腔液の精製は、例えば、ニワトリ赤血球（ＣＲＢＣ）に対する温度依存性の吸着、ショ糖密度勾配、または透析によってなされてもよい。
【００７２】
インフルエンザウイルスの生成に適切な上記のプロセスの改変はまた、米国特許出願第７２７０９９０号、ＰＣＴ国際公開第０２／０６７９８３号およびＰＣＴ国際公開第２００５／１１３７５６号に記載されている。
【００７３】
さらに、または代替として、本発明の組成物およびワクチンに使用するためのインフルエンザウイルスは、細胞培養物中で生成されてもよい（例えば、Ｆｕｒｍｉｎｇｅｒ，「Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」，Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら，（ｅｄｓ．），Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，Ｃｈａｐｔｅｒ２４，ｐｐ．３２４−３３２およびＭｅｒｔｅｎら，１９９６，「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ」，Ｃｏｈｅｎ  ＆  Ｓｈａｆｆｅｒｍａｎ（ｅｄｓ．），Ｎｏｖｅｌ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ｐｐ．１４１  １５１，米国特許第５８２４５３６号および米国特許第６３４４３５４号を参照のこと）。
【００７４】
インフルエンザウイルスを増殖させるための基質として使用され得る適切な細胞株の非限定的な例としては、ベロ細胞、Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞、ＰＥＲＣ６細胞（例えば、米国特許第７１９２７５９号を参照のこと）、ニワトリ胚細胞（例えば、ニワトリ胚線維芽細胞）および鳥類胚細胞株（例えば、ＰＣＴ国際公開第２００６／１０８８４６号を参照のこと）が挙げられる。非限定的であるが、米国特許第６８２５０３６、米国特許第６４５５２９８号、およびＰＣＴ国際公開第２００６／１０８８４６号に記載されるものを含む、これらの細胞株の変異体が使用されてもよい。
【００７５】
細胞株を用いるインフルエンザウイルスの増殖は、一般に、既知組成培地中で所望の量まで細胞を増幅することを含む。好ましくは、培地は無血清培地である。ウイルスの増殖は、培地へのプロテアーゼの添加によって支援され得る。一般に、細胞は、インフルエンザウイルスで感染され、必要な数のウイルスを生成するのに十分な時間（例えば数日間）、インキュベートされる。感染の多様性、インキュベーション時間および温度などのパラメーターは、一般に、使用される特定の細胞株および／または増殖される特定のインフルエンザ株に最適化される必要がある。上記に参照したものを含む増殖パラメーターの最適化は、必要以上の実験をせずに当業者によって容易に決定され得る。インキュベーション時間の後、所望の場合、ウイルスを収集し、精製してもよい。
【００７６】
細胞培養物中のインフルエンザウイルスの生成に適切なプロセスの非限定的な例としては、米国特許第５６９８４３３号、米国特許第５７５３４８９号、米国特許第６１４６８７３号、米国特許第６４５５２９８号および米国特許第６９５１７５２号に記載されるものが挙げられる。
【００７７】
細胞培養物中のインフルエンザウイルスの収率は、例えば、タンパク質キナーゼＰＫＲをコードする細胞遺伝子または（２’−５’）オリゴアデニル酸（２−５Ａ）シンセターゼ遺伝子を修飾すること（例えば、米国特許第６６７３５９１号および米国特許第６６８６１９０号を参照のこと）、あるいはウイルス骨格を代替的な非構造タンパク質１（ＮＳ１）遺伝子で修飾すること（例えば、ＰＣＴ国際公開第２００５／０２４０３９号を参照のこと）によって向上できる。さらに、または代替的に、インフルエンザウイルスの増殖に利用される細胞株は、シアリルトランスフェラーゼを過剰発現してもよい（例えば、米国特許第７１３２２７１号を参照のこと）。
【００７８】
上記の方法（または任意の他の手段）を用いて増殖されるインフルエンザウイルスは、γ線を照射する前に精製および／または濃縮されてもよい。当該分野において公知の任意の適切な方法がこの目的のために使用されてもよい。例えば、インフルエンザウイルスは、Ｌａｖｅｒ（１９６９）「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ」，ＨＫａＳ  ＮＰ，（ｅｄ）Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｎｄ  Ｌｏｎｄｏｎ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．ｐｐ．８２−８６に記載される方法を用いてニワトリの赤血球に対する温度依存性吸着により精製されてもよい。あるいは、インフルエンザウイルスは、密度勾配遠心分離法により精製されてもよい（例えば、Ｓｏｋｏｌｏｖら，（１９７１），「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ」，Ａｒｃｈｉｖ  ｆｉｉｒ  ｄｉｅ  ｇｅｓａｒａｔｅ  Ｖｉｒｕｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇ，３５，３５６−３６３を参照のこと）。
【００７９】
好ましくは、インフルエンザウイルスは、接線／クロスフロー濾過を用いて、γ線を照射する前に精製および／または濃縮される。例えば、ウイルスを含有する流体は、適切な細孔径（例えば約８０ｎｍ未満）を有する膜などの濾過装置に付与され得る。流体は膜の表面に沿って（すなわち表面にわたって）接線方向にくみ上げられ、圧力が、膜を通して濾液側まで流体の一部に力を加える。加えられる圧力は、通常、ビリオン構造および／またはウイルス抗原の完全性に悪影響を与えない程度である。ウイルス粒子を含有する濾液は膜を通過するが、流体中の微粒子および高分子は非常に大きいので、反対側に保持される膜孔を通過できない。一般に、保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）（すなわち保持される成分）は膜の表面に構築せず、代わりに接線流によって流される。保持液は、適切な培地（例えばデキストランおよび／またはスクロースを含有するＰＢＳ）で再希釈され得、必要な場合、濾過プロセスが繰り返される。
【００８０】
γ線照射に使用されるインフルエンザウイルスを精製するための接線／クロスフロー濾過の使用は、ウイルス抗原の完全性が保存されるため、インフルエンザワクチン調製物に従来使用される精製技術（例えば超遠心分離法）よりも利点を与える。次いで、これにより、γ線を照射したウイルス調製物の免疫原性、特に複数のインフルエンザサブタイプおよび株に対する交差反応／交差防御免疫を誘発するそれらの能力が向上する。
【００８１】
本発明の組成物およびワクチンに使用するためのインフルエンザウイルスはγ線を照射されている。任意の適切なγ線照射源が使用され得る。簡便なγ線放出体としては、限定されないが、Ｂａ１３７、Ｃｏ６０、Ｃｓ１３７、Ｉｒ１９２、Ｕ２３５、Ｓｅ７５およびＹｂ１６９が挙げられる。
【００８２】
インフルエンザウイルスのγ線照射は、市販の装置、例えば、Ａｔｏｍｉｃ  Ｅｎｅｒｇｙ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａ  Ｌｔｄ．，カナダにより製造されたガンマセル（Ｇａｍｍａｃｅｌｌ）照射器（例えばガンマセル４０照射器、ガンマセル２２０照射器、ガンマセル１０００照射器、ガンマセル３０００照射器）、Ｊ．Ｌ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（サンフェルナンド、カリフォルニア州、米国）により製造されたガンマ線照射器、またはＮｏｒｄｉｏｎ  Ｉｎｃ．（カナタ、オンタリオ州、カナダ）により製造されたＮｏｒｄｉｏｎガンマセル１０００照射器を用いて実施され得る。他の適切な装置は、例えば、米国特許第３５５７３７０号および米国特許第３５６７９３８号に記載されている。
【００８３】
好ましくは、インフルエンザウイルスは、それを不活性化するのに十分なγ線照射の線量に曝露される。より好ましくは、γ線照射の線量は、ウイルス抗原の構造を実質的に分解せず、特にウイルス表面抗原の構造を実質的に分解せずにウイルスを不活性化するのに十分である。従って、抗原決定基の免疫原性はγ線を照射したウイルスにより保持され得る。
【００８４】
従って、本発明の好ましい実施形態において、インフルエンザウイルスは、ウイルスの抗原構造を保持しながら、そのウイルスを不活性化できるγ線照射の線量で処理される。好ましくは、γ線照射の線量が、処理下の全てのウイルスが、ウイルス抗原決定基の構造的完全性に悪影響を与えずに曝露されるのを保証するのに一定の時間かつ十分なレベルでウイルスに照射される。
【００８５】
例えば、インフルエンザウイルスは、約１×１０３ｒａｄおよび約２×１０９ｒａｄ（または約１０Ｇｙ〜約２×１０４ｋＧｙ）の範囲のγ線照射の総線量で曝露され得る。本発明の特定の実施形態において、インフルエンザウイルスは、約１×１０３ｒａｄ〜約２×１０９ｒａｄ、約１×１０３ｒａｄ〜約１×１０９ｒａｄ、約１×１０３ｒａｄ〜約１×１０８ｒａｄ、約１×１０３ｒａｄ〜約１×１０７ｒａｄ、約１×１０３ｒａｄ〜約１×１０６ｒａｄ、約１×１０３ｒａｄ〜約１×１０５ｒａｄ、約１×１０３ｒａｄ〜約１×１０４ｒａｄ、約１×１０３ｒａｄ〜約２×１０９ｒａｄ、約１×１０４ｒａｄ〜約２×１０９ｒａｄ、約１×１０５ｒａｄ〜約２×１０９ｒａｄ、約１×１０６ｒａｄ〜約２×１０９ｒａｄ、約１×１０７ｒａｄ〜約２×１０９ｒａｄ、約１×１０８ｒａｄ〜約２×１０９ｒａｄ、または約１×１０９ｒａｄ〜約２×１０９ｒａｄのγ線照射の総線量で曝露される。本発明の一実施形態において、インフルエンザウイルスは、約６．５×１０４ｒａｄ〜約２×１０７ｒａｄ（約０．６５ＫＧｙ〜約２００ｋＧｙ）のγ線の総線量で曝露される。本発明の好ましい実施形態において、インフルエンザウイルスは、約１．２６×１０６ｒａｄ（１２．６ＫＧｙ）のγ線照射の総線量、約１×１０６ｒａｄ（約１０ｋＧｙ）のγ線照射の総線量、または約１×１０５ｒａｄ（１ＫＧｙ）のγ線照射の総線量で曝露される。
【００８６】
γ線照射の最適な線量は、ウイルスが存在する培地、処理されるウイルスの量、存在するウイルスの温度、および／または処理下のウイルスのサブタイプもしくは株などの要因によって影響され得る。従って、γ線照射の総線量、γ線照射の曝露時間および／または曝露時間にわたって付与されるγ線照射のレベルは、処理の効果を高めるために最適化され得る。
【００８７】
γ線照射の総線量は、一定の時間、最適化してウイルスに照射され得る。例えば、γ線照射は、必要とされるγ線照射の総線量を達成するのに十分な時間にわたって総線量より低いレベルでウイルスに照射され得る。
【００８８】
一実施形態において、インフルエンザウイルス調製物は、γ線に曝露されている間、凍結状態で維持される。これにより、生物学的完全性の保存が容易にでき、ウイルス抗原の不必要な損傷を回避でき、それによって、γ線を照射されたウイルス調製物の免疫原性、特に複数のインフルエンザサブタイプおよび株に対する交差反応／交差防御免疫を誘発する能力を高める。一般に、１０〜２０ｋＧｙのγ線照射線量は、凍結されたウイルス調製物を処理するのに有効であり得る。
【００８９】
上記のように、γ線照射での処理は、ウイルス抗原の構造を実質的に分解せずにインフルエンザウイルスを不活性化するのに十分であることが好ましい。ウイルスの不活性化は、一般に当該分野において公知の方法を用いて評価され得る。例えば、ウイルス感染性は、上記のように孵化卵および／または細胞株にワクチンを接種して、ウイルスが増殖できるか否かを決定することによって、γ線照射後に測定され得る。
【００９０】
抗原決定基の完全性は、例えば、γ線照射後の凝集活性についてウイルスをアッセイすることによって評価され得る。凝集アッセイを実施する方法は当該分野において公知であり、例えば、Ｃｏｉｃｏら，（Ｅｄｓ）「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」，（２００７），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（特に、「Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ：Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ，Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｓｔｏｒａｇｅ」という標題のＵｎｉｔ  １５Ｇ．１を参照のこと）およびＳａｔｏら，（１９８３），「Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ」，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，４１，３１３−３２０に記載されている。さらに、または代替として、ノイラミニダーゼアッセイが、ウイルス抗原決定基の完全性を評価するために使用されてもよい（例えば、Ｋｈｏｒｌｉｎら，（１９７０），「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅｓ  ｏｆ  ｓｏｍｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｓｔｒａｉｎｓ」，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，８：１７−１９およびＶａｎ  Ｄｅｕｓｅｎら，（１９８３），「Ｍｉｃｒｏ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅｓ」Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．，２７：７４５−５０を参照のこと）。さらに、γ線を照射された調製物によって誘導される内在性タンパク質に対する細胞障害性Ｔ細胞反応が、タンパク質完全性についての指標として使用されてもよい。
【００９１】
γ線を照射したインフルエンザウイルスを含む適切な組成物およびワクチンは、当業者に公知の方法に従って調製され得、それに応じて、薬学的に許容可能な担体、希釈剤および／または補助剤を含んでもよい。
【００９２】
担体、希釈剤および補助剤は、組成物の他の成分との適合性に関して「許容可能」でなければならず、その受容者に対して有害であってはならない。
【００９３】
補助剤は、γ線を照射したインフルエンザウイルスを含む本発明の組成物およびワクチンと組み合わされてもよいが、本明細書に提供される実験データは、同様のレベルの免疫原性が、補助剤の非存在下でγ線により不活性化されたインフルエンザ調製物を用いて得られ得ることを実証する。従って、補助剤が本発明の組成物およびワクチンに含まれてもよいが、それらは通常必要とされなくてもよいことは理解されるだろう。従って、補助剤の使用から生じる反応原性は回避され得る。
【００９４】
好ましくは、補助剤は、γ線を照射したインフルエンザウイルスにより誘発および／または高められた免疫反応を向上させ、それによって、防御効果を改善する。好ましくは、補助剤は、低い線量のγ線を照射したインフルエンザウイルスを利用する防御免疫の誘発を可能にする。
【００９５】
任意の適切な補助剤が本発明の組成物およびワクチンに含まれてもよい。例えば、アルミニウムベースの補助剤が利用されてもよい。適切なアルミニウムベースの補助剤としては、限定されないが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびそれらの組み合わせが挙げられる。利用され得るアルミニウムベースの補助剤の他の特定の例は、欧州特許第１２１６０５３号および米国特許第６３７２２２３号に記載されている。
【００９６】
水中油エマルションが、本発明の組成物およびワクチン中の補助剤として利用されてもよい。水中油エマルションは当該分野において周知である。一般に、水中油組成物は、代謝可能な油、例えば、魚油、植物油または合成油を含む。適切な水中油エマルションの例としては、欧州特許第０３９９８４３号、米国特許第７０２９６７８号およびＰＣＴ国際公開第２００７／００６９３９号に記載されるものが挙げられる。水中油エマルションは、他の補助剤および／または免疫刺激剤とともに利用されてもよい。
【００９７】
他の適切な補助剤の非限定的な例としては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、コレラ毒素（ＣＴ）またはその構成サブユニット、易熱性毒素（ＬＴ）またはその構成サブユニットなどの免疫刺激剤、リポ多糖（ＬＰＳ）およびその誘導体（例えばモノホスホリルリピドＡおよび３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ）、ムラミールジペプチド（ＭＤＰ）および呼吸器合胞体ウイルスのＦタンパク質などのトール様受容体リガンド補助剤が挙げられる。
【００９８】
薬学的に許容可能な担体または希釈剤としては、脱塩水または蒸留水；食塩水；ピーナッツ油、サフラワー油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、ラッカセイ油またはココナッツ油などの植物ベースの油；メチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサンおよびメチルフェニルポリシロキサン（ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ  ｐｏｌｙｓｏｌｐｏｘａｎｅ）などのポリシロキサンを含むシリコーン油；揮発性シリコーン；流動パラフィン、軟パラフィンまたはスクアランなどの鉱油；メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体；低級アルカノール、例えばエタノールまたはイソプロパノール；低級アラルカノール（ａｒａｌｋａｎｏｌ）；低級ポリアルキレングリコールまたは低級アルキレングリコール、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールまたはグリセリン；パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピルまたはオレイン酸エチルなどの脂肪酸エステル；ポリビニルピリドン；寒天；カラギーナン；トラガカントガムまたはアカシアガム、およびワセリンが挙げられる。典型的に、担体（複数も含む）は組成物の１０重量％〜９９．９重量％を形成する。
【００９９】
本発明の組成物およびワクチンは、限定されないが、非経口（例えば、静脈内、髄腔内、皮下または筋肉内）、経口、粘膜（例えば、鼻腔内）または局所経路を含む、標準的な経路によって投与され得る。
【０１００】
本発明の組成物およびワクチンは、注射による投与に適切な形態、経口摂取に適切な製剤の形態（例えばカプセル剤、錠剤、カプレット、エリキシル剤）、局所投与に適切な軟膏、クリームまたはローションの形態、点眼剤としての送達に適切な形態、鼻腔内吸入または経口吸入などの吸入による投与に適切なエアロゾル形態、非経口投与、すなわち皮下、筋肉内または静脈内注射に適切な形態であり得る。
【０１０１】
組成物およびワクチンの鼻腔内への注入は、例えば、点鼻剤、スプレー、または吸入に適切な液体形態、粉末、クリームあるいはエマルションとして処方され得る。
【０１０２】
投与に関して、注射可能な溶液または懸濁液、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または担体としては、リンガー溶液、等張食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、エタノールおよび１，２プロピレングリコールが挙げられ得る。
【０１０３】
経口使用のための適切な担体、希釈剤、賦形剤および補助剤のいくつかの例としては、ピーナッツ油、流動パラフィン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、アカシアガム、トラガカントガム、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、ゼラチンおよびレシチンが挙げられる。さらに、それらの経口処方物は、適切な矯味矯臭剤および着色剤を含んでもよい。カプセル形態で使用される場合、そのカプセルは、分解を遅延させるモノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリルなどの化合物でコーティングされてもよい。
【０１０４】
典型的に、補助剤としては、皮膚軟化剤、乳化剤、増粘剤、防腐剤、殺菌剤および緩衝剤が挙げられる。別の種類の「自己補助剤」は、水溶性リポペプチドＰａｍ３Ｃｙｓまたはそのジパルミトイル誘導体Ｐａｍ２Ｃｙｓなどの脂質に対する免疫原性ペプチドのコンジュゲーションによって提供される。そのような補助剤は、免疫原性ペプチドを抗原提示細胞（樹枝状細胞）に付随させ、それによって、増加した抗原提示および同時に細胞の活性化を生じるという利点を有する。それらの薬剤は少なくとも部分的にＴＯＬＬ様受容体２により作用する（Ｂｒｏｗｎ  ＬＥおよびＪａｃｋｓｏｎ  ＤＣ，Ｌｉｐｉｄ  ｂａｓｅｄ  ｓｅｌｆ  ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２３：８３，２００５を参照のこと）。
【０１０５】
本発明の組成物およびワクチンは、適切な補助剤などの薬学的に許容可能な賦形剤を含んでもよい。適切な補助剤は、例えば、不完全フロイントアジュバントおよび完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，デトロイト，ミシガン州）；Ｍｅｒｃｋアジュバント６５（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）；ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ，フィラデルフィア，ペンシルベニア州）；水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；カルシウム、鉄または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖；アニオンまたはカチオンにより誘導体化された多糖；ポリホスファゼン；生分解性ミクロスフェア；モノホスホリルリピドＡおよびキル（ｑｕｉｌ）Ａなどで商業的に利用可能である。ＧＭ−ＣＳＦまたはインターロイキン−２、−７、もしくは−１２などのサイトカインもまた、補助剤として使用されてもよい。
【０１０６】
本発明の一実施態様において、補助剤組成物はＴＨ１タイプの免疫反応を優先的に誘発できる。ＴＨ１タイプの反応を優先的に誘発するのに使用するための適切な補助剤としては、例えば、モノホスホリルリピドＡ、好ましくは３−Ｏ−脱アシル化（３−ｄｅ−Ｏ−ａｃｙｌａｔｅｄ）モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）とアルミニウム塩との組み合わせが挙げられる。例えば、組成物またはワクチンは、Ｔｈｏｅｌｅｎ，Ｓ．ら，「Ａ  ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ」，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００１）１９：２４００−２４０３に記載されるような水酸化アルミニウム（ミョウバン）および３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル化リピドＡ（ＭＰＬ）を含有するアジュバントＡＳ０４とともに処方されてもよい。ＴＨ１タイプの免疫反応を優先的に誘発する他の公知の補助剤としては、ＣｐＧを含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。このオリゴヌクレオチドはＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されないという特徴を有する。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、例えばＰＣＴ国際公開第１９９６／０２５５５号に記載されている。免疫活性化ＤＮＡ配列もまた、例えば、Ｓａｔｏら，１９９６，「Ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ  ｇｅｎｅ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３：３５２−３５４に記載されている。別の好ましい補助剤は、サポニン、好ましくはＱＳ２１（Ａｑｕｉｌａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，Ｍａｓｓ．）であり、他の補助剤と単独または組み合わせて使用されてもよい。例えば、強化された系は、ＰＣＴ国際公開第１９９４／００１５３号に記載されるようにＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬとの組み合わせなどのモノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体との組み合わせ、またはＰＣＴ国際公開第１９９６／３３７３９号に記載されるようにＱＳ２１がコレステロールでクエンチされる低い反応原性組成物を含む。他の好ましい製剤は水中油エマルションおよびトコフェロールを含む。水中油エマルション中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを含むアジュバント製剤は、ＰＣＴ国際公開第１９９５／１７２１０号に記載されている。アジュバント組成物は、ＰＣＴ国際公開第１９９５／１７２１０号に記載されるように、水中油エマルション中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを含む製剤を含んでもよい。一実施形態において、組成物は、モンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）ＩＳＡ７２０アジュバント（Ｍ−ＩＳＡ−７２０；Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ，Ｎ．Ｊ．）、天然の代謝可能な油に基づいたアジュバントを含む。
【０１０７】
本発明のワクチンおよび組成物は、例えば、一般的に、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎによって編集されたＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６１「Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ−ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ」，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５，ならびにＶｏｌｌｅｒらによって編集された「Ｎｅｗ  Ｔｒｅｎｄｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐａｒｋ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．１９７８に記載されるような標準的な方法に従って調製され得る。
【０１０８】
経口投与用の固形物は、ヒトおよび獣医学の薬務において許容可能な結合剤、甘味料、崩壊剤、希釈剤、矯味矯臭剤、コーティング剤、防腐剤、滑剤および／または時間遅延剤を含み得る。適切な結合剤としては、アカシアガム、ゼラチン、コーンスターチ、トラガカントガム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルソースまたはポリエチレングリコールが挙げられる。適切な甘味料としては、スクロース、ラクトース、グルコース、アスパルテームまたはサッカリンが挙げられる。適切な崩壊剤としては、コーンスターチ、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、グアーガム、キサンタンガム、ベントナイト、アルギン酸または寒天が挙げられる。適切な希釈剤としては、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、デキストロース、カオリン、セルロース、炭酸カルシウム、ケイ酸カルシウムまたは第二リン酸カルシウムが挙げられる。適切な矯味矯臭剤としては、ペパーミント油、ウィンターグリーン油、チェリー、オレンジまたはラズベリー矯味矯臭剤が挙げられる。適切なコーティング剤としては、アクリル酸および／またはメタクリル酸および／またはそれらのエステルのポリマーまたはコポリマー、ワックス、脂肪アルコール、ゼイン、シェラックまたはグルテンが挙げられる。適切な防腐剤としては、安息香酸ナトリウム、ビタミンＥ、α−トコフェロール、アスコルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベンまたは亜硫酸水素ナトリウムが挙げられる。適切な滑剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、オレイン酸ナトリウム、塩化ナトリウムまたはタルクが挙げられる。適切な時間遅延剤としては、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルが挙げられる。
【０１０９】
経口投与用の液状形態は、上記の薬剤に加えて液体担体を含み得る。適切な液体担体としては、水、オリーブ油などの油、ピーナッツ油、ゴマ油、ヒマワリ油、サフラワー油、ラッカセイ油、ココナッツ油、流動パラフィン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、グリセロール、脂肪アルコール、トリグリセリドまたはそれらの混合物が挙げられる。
【０１１０】
経口投与用の懸濁液はさらに、分散剤および／または懸濁化剤を含み得る。適切な懸濁化剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウムまたはアセチルアルコールが挙げられる。適切な分散剤としては、レシチン、ステアリン酸などの脂肪酸のポリオキシエチレンエステル、ポリオキシエチレンソルビトールモノ−またはジ−オレエート、−ステアレートまたは−ラウレートなどが挙げられる。
【０１１１】
経口投与用のエマルションはさらに、１つ以上の乳化剤を含み得る。適切な乳化剤としては、上記に示した分散剤またはグアーガム、アカシアガムまたはトラガカントガムなどの天然ガムが挙げられる。
【０１１２】
非経口投与可能な組成物を調製する方法は、当業者に自明であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａにより詳細に記載されている。
【０１１３】
本発明の局所製剤は、１つ以上の許容可能な担体とともに活性成分、および必要に応じて任意の他の治療成分を含む。局所投与に適切な製剤は、皮膚を通して治療が必要とされる部位への侵入に適切な液体または半液体調製物、例えば塗布薬、ローション、クリーム、軟膏またはペースト、および眼、耳または鼻への投与に適切な点眼剤を含む。
【０１１４】
本発明による点眼剤は、滅菌水溶液または油性溶液または懸濁液を含み得る。それらは、殺菌剤および／または抗菌剤ならびに／あるいは任意の他の適切な防腐剤の水溶液中の活性成分を溶解することにより調製され得、必要に応じて表面活性剤を含む。次いで、得られた溶液は、濾過により清澄化され、適切な容器に移され、滅菌され得る。滅菌は、３０分間、９０℃〜１００℃にてオートクレーブまたは維持することにより達成され得るか、あるいは濾過し、続いて無菌技術により容器に移すことにより達成され得る。点眼剤への封入に適切な殺菌剤および抗菌剤の例は、硝酸フェニル水銀または酢酸フェニル水銀（０．００２％）、塩化ベンザルコニウム（０．０１％）および酢酸クロルヘキシジン（０．０１％）である。油性溶液の調製に適切な溶媒としては、グリセロール、希釈アルコールおよびプロピレングリコールが挙げられる。
【０１１５】
本発明によるローションとしては、皮膚または眼への適用に適切なものが挙げられる。点眼用ローションは、必要に応じて殺菌剤を含有する滅菌水溶液を含み得、点眼剤の調製に関して上に記載されるものと同様の方法によって調製され得る。また、皮膚の適用のためのローションまたは塗布薬としては、皮膚の乾燥を早め、冷却する薬剤、例えばアルコールまたはアセトン、および／またはグリセロールなどの保湿剤、またはヒマシ油もしくはラッカセイ油などの油が挙げられる。
【０１１６】
本発明によるクリーム、軟膏またはペーストは、外用のための活性成分の半固体製剤である。それらは、脂肪性または非脂肪性基剤とともに、単独または水性もしくは非水性流体の溶液もしくは懸濁液中で、微粉化または粉末化形態において活性成分を混合することによって作製され得る。基剤は、固形、軟または流動パラフィン、グリセロール、密ろう、金属せっけん、粘液などの炭化水素；アーモンド油、トウモロコシ油、ラッカセイ油、ヒマシ油またはオリーブ油などの天然起源の油；羊毛脂もしくはその誘導体、またはプロピレングリコールもしくはマクロゴールなどのアルコールと一緒のステアリン酸もしくはオレイン酸などの脂肪酸を含み得る。
【０１１７】
本発明の組成物およびワクチンは、ソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体などのアニオン性、カチオン性または非イオン性界面活性剤などの任意の適切な界面活性剤を組み込んでもよい。天然ガムなどの懸濁化剤、セルロース誘導体、またはシリカ（ｓｉｌｉｃａｃｅｏｕｓ  ｓｉｌｉｃａ）などの無機物質、およびラノリンなどの他の成分も含まれてもよい。
【０１１８】
本発明の組成物およびワクチンはまた、リポソームの形態で投与されてもよい。リポソームは、通常、リン脂質または他の脂質物質から誘導され、水媒体に分散される単層または多層状の水和液晶によって形成される。任意の非毒性で、生理学的に許容可能でリポソームを形成できる代謝可能な脂質が形成され得る。リポソーム形態の組成物は、安定剤、防腐剤、賦形剤などを含んでもよい。好ましい脂質は、天然および合成の両方のリン脂質およびホスファチジルコリン（レシチン）である。リポソームを形成する方法は、当該分野において公知であり、この特定の参照に関しては、Ｐｒｅｓｃｏｔｔ，Ｅｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ＸＩＶ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９７６），ｐ．３３（以下参照）になされている。
【０１１９】
（医薬およびワクチン）
また、本発明に意図されるものは、インフルエンザ感染を予防するためのワクチンを生成する方法である。その方法は、γ線を照射することによってインフルエンザウイルスの調製物を不活性化する工程を含む。ワクチン生成方法に使用するためのインフルエンザウイルス調製物は、上記のセクション（すなわち「組成物およびワクチン」）に記載されるように生成されて、γ線を照射され得る。
【０１２０】
インフルエンザウイルス調製物は、インフルエンザＡウイルスを含み得る。インフルエンザＡウイルス調製物は、通常ヒトに感染するインフルエンザＡの１つ以上のサブタイプ由来の株を含み得る。インフルエンザＡ株は、ヒトの集団において現在蔓延している場合がある。
【０１２１】
好ましくは、本発明のインフルエンザワクチンは、被験体において複数のインフルエンザウイルスサブタイプに対する交差反応免疫を誘発および／または向上させる。最も好ましくは、複数のインフルエンザウイルスサブタイプは、インフルエンザウイルスサブタイプＨ５Ｎ１（例えばＨＰＡＩＡ（Ｈ５Ｎ１））および／またはＨ１Ｎ１（例えばＨ１Ｎ１  ０９ブタインフルエンザ）を含む。ワクチンは鼻腔内投与用に処方され得る。
【０１２２】
一実施形態において、インフルエンザウイルス調製物は、人畜共通のインフルエンザＡウイルスの１つ以上の株を含む。
【０１２３】
別の実施形態において、インフルエンザワクチンは、鼻腔内投与用に処方される。
【０１２４】
一実施形態において、ワクチン生成方法は、γ線を照射することによってインフルエンザウイルスの調製物を不活性化する工程を含む（上記の「組成物およびワクチン」という標題のセクションを参照のこと）。
【０１２５】
一実施形態において、ワクチン生成方法は、γ線の照射によって不活性化する前に、接線／クロスフロー濾過によってインフルエンザウイルスを精製する工程を含む（上記の「組成物およびワクチン」という標題のセクションを参照のこと）。
【０１２６】
別の実施形態において、ワクチン生成方法は、インフルエンザウイルスの凍結調製物にγ線を照射する工程を含む（上記の「組成物およびワクチン」という標題のセクションを参照のこと）。
【０１２７】
別の実施形態において、ワクチン生成方法は、γ線照射によって不活性化する工程の後にウイルスを凍結乾燥する工程を含む（下記の「投与経路」という標題のセクションを参照のこと）。
【０１２８】
別の実施形態において、ワクチン生成方法は、ウイルス調製物を、約６．５×１０４ｒａｄ〜約２×１０７ｒａｄのγ線の総線量に曝露する工程を含む。
【０１２９】
別の実施形態において、本明細書に記載される生成方法に従って生成されるワクチンは、ワクチン接種に使用され得るか、または再ワクチン接種の目的のために使用され得る。
【０１３０】
別の実施形態において、ワクチン生成方法は、ウイルス調製物を、約１×１０６ｒａｄのγ線の総線量に曝露する工程を含む。
【０１３１】
本発明の一実施形態において、ワクチンは再ワクチン接種のために使用され得る。典型的に、再ワクチン接種は、第１のワクチン接種の後、少なくとも６ヶ月、適切には第１のワクチン接種の後、８〜１４ヶ月、適切には第１のワクチン接種の後、約１０〜１２ヶ月で行われる。再ワクチン接種（または「追加免疫」）は、薬理学的に許容可能な担体、補助剤または賦形剤と一緒に投与され得る。
【０１３２】
一態様において、本発明は、本明細書に記載されるワクチン生成方法に従って生成されたワクチンを提供する。
【０１３３】
本発明はまた、インフルエンザウイルス感染の治療および／または予防のための医薬を調製するためのγ線を照射されたインフルエンザウイルスの使用を提供する。γ線を照射されたインフルエンザウイルスは、限定されないが、インフルエンザＡウイルスを含む、任意のインフルエンザウイルスであり得る。好ましくは、医薬は、複数のインフルエンザウイルスサブタイプに対する交差反応免疫を誘発する。一実施形態において、医薬は、インフルエンザウイルスサブタイプＨ５Ｎ１（例えばＨＰＡＩ  Ａ（Ｈ５Ｎ１））および／またはＨ１Ｎ１（例えばＨ１Ｎ１  ０９ブタインフルエンザ）感染の治療および／または予防のためである。別の実施形態において、医薬はワクチンである。好ましい実施形態において、医薬は鼻腔内投与のために処方される。
【０１３４】
また、本発明によって提供されるのは、インフルエンザ感染の治療または予防に使用するためのγ線を照射されたインフルエンザウイルスである。
【０１３５】
（治療方法）
本発明は、被験体におけるインフルエンザウイルス感染を治療または予防する方法を提供する。その方法は、治療有効量のγ線を照射したインフルエンザウイルスを被験体に投与する工程を含む。
【０１３６】
γ線を照射したインフルエンザウイルスは、本発明の組成物またはワクチンの形態で被験体に投与され得る（上記の「組成物およびワクチン」という標題のセクションを参照のこと）。通常、γ線を照射したインフルエンザウイルスは免疫原性である。典型的に、その方法は、インフルエンザウイルス感染に対して被験体を免疫化する工程を含む。
【０１３７】
「被験体」は、哺乳動物、例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、霊長類および齧歯動物を含む、経済的、社会的または研究上重要な任意の哺乳動物である。典型的に、被験体はヒトである。被験体は、インフルエンザに感染し、インフルエンザウイルスに感染する疑いがあり、インフルエンザウイルスに以前に感染し、および／またはインフルエンザウイルスに感染する危険性があり得る。インフルエンザウイルスに感染する危険性のある被験体は、例えば、インフルエンザウイルスに感染した個体とともに作業するか、またはその個体をケアする被験体であり得る。
【０１３８】
本明細書で使用する場合、用語「治療有効量」は、非毒性であるが、望まれる治療効果を与えるために本発明において使用するのに十分な量の組成物またはワクチンを意味する。必要とされる正確な量は、治療されるウイルスサブタイプ／株、被験体の年齢および健康状態、治療される状態の重症度、投与される特定の年齢、および投与経路などの要因に応じて被験体ごとに変化する。従って、正確な「有効量」を特定することはできない。しかしながら、いずれかの所定の場合において、適切な「有効量」は、慣例の実験のみを用いて当業者により決定され得る。
【０１３９】
本発明の方法によるγ線を照射したインフルエンザウイルス（またはγ線を照射したインフルエンザウイルスを含む組成物）の治療有効量は、単回投与で被験体に投与され得るか、または複数回投与で被験体に投与され得る。
【０１４０】
一般に、用語「治療有効量」とは、インフルエンザウイルスの１つ以上の株に対する免疫反応を誘発および／または向上させることができる前記γ線を照射したインフルエンザウイルス（またはγ線を照射したインフルエンザウイルスを含む組成物）の量を意味する。好ましくは、免疫反応は、インフルエンザの１つ以上の異なるサブタイプ由来の株に対して誘発および／または向上される。典型的に、被験体に投与される場合、治療有効量は、被験体のインフルエンザウイルスの曝露後の感染の重症度を減少させるか、またはインフルエンザウイルスに感染された被験体に投与される場合、インフルエンザウイルスの１つ以上の症状を減少させるのに十分、被験体において免疫反応を誘発する。典型的に、インフルエンザ感染に見られる任意の１つ以上の症状の減少は、例えば、感染の持続期間の減少、熱、頭痛、咳、のどの痛み、全身の痛み、筋肉痛、鼻づまり、咳嗽、くしゃみ、赤くなった目、皮膚、口、喉および鼻、下痢、嘔吐ならびに疲れなどの１つ以上の症状の持続期間の減少を意味することを含むことが理解されるだろう。
【０１４１】
従って、本発明は、治療有効量のγ線を照射したインフルエンザウイルス（またはγ線を照射したインフルエンザウイルスを含む組成物）を投与することによって、そのような状態（この状態はインフルエンザウイルス感染に関連する）を治療する方法を提供する。γ線を照射したインフルエンザウイルスは、γ線を照射したインフルエンザウイルスの任意の適切なサブタイプまたは株であり得る。γ線を照射したインフルエンザウイルスの２種以上の株の混合物の投与もまた、意図される。株は、異なるインフルエンザウイルスサブタイプ由来であり得る。
【０１４２】
インフルエンザ株は、オルソミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）科の任意の属由来であり得る。例えば、インフルエンザ株は、インフルエンザＡ（Ａ型）、インフルエンザＢ（Ｂ型）、またはインフルエンザＣ（Ｃ型）の属のサブタイプ由来であり得る。
【０１４３】
インフルエンザＡの好ましいサブタイプとしては、限定されないが、Ｈ１Ｎ１（例えばＨ１Ｎ１  ０９ブタインフルエンザ）、Ｈ１Ｎ２、Ｈ１Ｎ７、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ８、Ｈ４Ｎ８、Ｈ５Ｎ１（例えばＨＰＡＩ  Ａ（Ｈ５Ｎ１））、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ６Ｎ５、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ７、Ｈ８Ｎ４、Ｈ９Ｎ２、Ｈ１０Ｎ７、Ｈ１１Ｎ６、Ｈ１２Ｎ５、Ｈ１３Ｎ６、Ｈ１４Ｎ５、およびインフルエンザＡウイルス間の再分類から生じる任意の他のサブタイプが挙げられる。
【０１４４】
特定の実施形態において、本発明の方法に使用されるγ線を照射したインフルエンザウイルス株は、γ線を照射した人畜共通のインフルエンザウイルス株を含む。
【０１４５】
本発明の方法に従って使用するためのインフルエンザウイルスは当該分野において公知の方法を用いて生成される。例えば、インフルエンザウイルスは、孵化卵において連続継代によって生成され得るか、および／または細胞培地において生成され得、その技術は上記の「組成物およびワクチン」という標題のセクションに記載される。
【０１４６】
本発明の方法に従う使用のためのインフルエンザウイルスのγ線照射は、当該分野において公知の方法によって実施され得る。インフルエンザウイルスのγ線照射のための適切な方法の例は、上記の「組成物およびワクチン」という標題のセクションに提供される。
【０１４７】
好ましくは、被験体はヒトであり、投与されるγ線を照射したインフルエンザはヒトに感染することが知られているインフルエンザサブタイプを含む。あるいは、投与されるγ線を照射したインフルエンザウイルスは、ヒトに感染することが知られていないインフルエンザサブタイプを含んでもよい。投与は鼻腔内投与であり得る。γ線を照射したインフルエンザウイルスは凍結乾燥形態で調製され得る（以下の「投与経路」という標題の段落を参照のこと）。被験体に投与されるγ線を照射したインフルエンザウイルスは、上記の「組成物およびワクチン」という標題のセクションに記載される接線／クロスフロー濾過によって精製されたウイルスストックから調製されてもよい。被験体に投与されるγ線を照射したインフルエンザウイルスを調製するために使用されるウイルスストックは、γ線を照射している間、凍結されていてもよい（上記の「組成物およびワクチン」という標題のセクションを参照のこと）。
【０１４８】
本発明の方法によれば、γ線を照射したインフルエンザウイルスの被験体への投与は、通常、被験体におけるインフルエンザウイルスに対する免疫反応を誘発および／または向上させる。本発明の一実施形態において、免疫反応は、インフルエンザウイルスに以前に曝露されていない、免疫学的に感作されていない患者において誘発されてもよい。
【０１４９】
本発明の別の実施形態において、免疫反応は、特定のγ線を照射したインフルエンザウイルスサブタイプに以前に曝露されていない（または特定のγ線を照射したインフルエンザウイルスサブタイプに反応しなかった）、免疫学的に感作されていない患者において誘発されてもよい。その免疫反応は投与された株から生じる。さらに、または代替的に、免疫反応は、投与される特定のγ線を照射したインフルエンザウイルスに以前に曝露されていない（または投与される特定のγ線を照射したインフルエンザウイルスに反応しなかった）、免疫学的に感作されていない患者において誘発されてもよい。
【０１５０】
本発明の別の実施形態において、免疫反応は、投与される特定のγ線を照射したインフルエンザウイルス株に以前に曝露され、かつ、免疫反応を生じている被験体において向上され得る。さらに、または代替的に、免疫反応は、特定のγ線を照射したインフルエンザウイルスサブタイプ（投与される株はそのγ線を照射したインフルエンザウイルスサブタイプ由来である）に以前に曝露され、かつ、免疫反応を生じている被験体において向上され得る。
【０１５１】
好ましくは、被験体において誘発および／または向上される免疫反応は、交差反応免疫反応である。従って、本発明の好ましい実施形態において、γ線を照射したインフルエンザウイルスの特定のサブタイプの投与は、他のさらなるインフルエンザウイルスサブタイプに対する免疫反応を誘発および／または向上させる。好ましい実施形態において、現在蔓延しているヒトインフルエンザＡサブタイプ由来の１つ以上のγ線を照射した株の調製物の投与は、トリインフルエンザサブタイプＨ５Ｎ１（例えばＨＰＡＩ  Ａ（Ｈ５Ｎ１））および／またはＨ１Ｎ１（例えばＨ１Ｎ１  ０９ブタインフルエンザ）に対する免疫反応を誘発および／または向上させる。
【０１５２】
本発明の方法は、複数のインフルエンザウイルス株に特異的な被験体におけるＴ細胞反応を誘発および／または向上させるために使用されてもよい。好ましくは、株は、インフルエンザウイルスの複数の異なるサブタイプ由来である。通常、Ｔ細胞免疫反応の誘発および／または向上は、ＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の活性の向上に関与し得る。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（例えばヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞）または細胞障害性Ｔ細胞（例えば細胞障害性ＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞障害性ＣＤ８＋Ｔ細胞）であり得る。
【０１５３】
被験体におけるＴ細胞免疫反応の誘発および／または向上は、当該分野において公知の方法を用いて検出され得る。例えば、多数のインフルエンザウイルスに特異的なＴ細胞は、Ｔ細胞免疫反応が向上されているか、または誘発されているという指標を与えるように測定できる。ウイルス特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の計数および特徴付けの方法ならびに技術は、当該分野において公知である。インフルエンザ特異的Ｔ細胞は、例えば、Ｖｏｇｔら，２００８，「Ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｂｏｔｈ  ＣＤ４  ａｎｄ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８０：１４８２−１４８９に概して記載される方法を用いて、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって検出され得る。さらに、または代替的に、インフルエンザウイルス特異的Ｔ細胞は、インフルエンザウイルスおよび／またはそのインフルエンザウイルス由来のタンパク質抗原での抗原投与に対するＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞反応の割合を測定することによって検出され得る。典型的に、反応Ｔ細胞は、例えば、細胞内サイトカイン染色アッセイ（例えば、Ｖｏｇｔら，前出およびＬｏｎｇｈｉら，２００８，「Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  Ｉｓ  Ｃｒｕｃｉａｌ  ｆｏｒ  Ｒｅｃａｌｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｅｍｏｒｙ  ＣＤ４＋  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ」，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．，４（２）：ｅ１０００００６を参照のこと）を用いて検出され得るインフルエンザウイルス抗原（例えばＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦαおよび／またはＣＤ４０Ｌ）に対する曝露に対して１つ以上の特異的サイトカインを分泌する。インフルエンザ特異的Ｔ細胞の検出に関する他の適切なアッセイの例としては、四量体ベースのアッセイ（例えば、Ｌｏｎｇｈｉら，前出およびＦｌｙｎｎら，１９９９，「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｉｖｅ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ」ＰＮＡＳ，９６（１５）：８５９７−８６０２）が挙げられる。
【０１５４】
さらに、または代替として、本発明の方法は、インフルエンザウイルスの複数の株に特異的な被験体における体液性免疫反応を誘発および／または向上させることができる。好ましくは、株は、インフルエンザウイルスの複数の異なるサブタイプ由来である。通常、体液性免疫反応の誘発および／または向上は、Ｂ細胞の活性の向上に関する。これは、インフルエンザウイルス抗原と遭遇する際に、抗体を分泌するプラズマ細胞に分化し得る高頻度の末梢血リンパ球によって反映され得る。従って、体液性免疫反応の誘発または向上は、循環しているインフルエンザウイルス特異的抗体（例えばＩｇＡおよびＩｇＧ）の量の増加に関与し得る。インフルエンザ特異的抗体を検出するための方法は当該分野において公知である（例えば、Ｓａｓａｋｉら，２００７，「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔｓ  ｗｉｔｈ  ｌｉｖｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｏｒ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ」，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２００７；８１：２１５−２８およびＣｏｘら，１９９４，「Ａｎ  ｅａｒｌｙ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ」，Ｖａｃｃｉｎｅ，１２：９９３−９９９を参照のこと）。
【０１５５】
好ましい実施形態において、本明細書に記載される方法によるγ線を照射したインフルエンザウイルスの投与は、被験体におけるインフルエンザウイルスに対するＴ細胞免疫反応および／または体液性免疫反応を誘発ならびに／あるいは向上させる。特定の好ましい実施形態において、γ線を照射したヒトインフルエンザＡウイルスの１つ以上の株の投与は、被験体におけるインフルエンザＨ５Ｎ１（例えばＨＰＡＩ  Ａ（Ｈ５Ｎ１））および／またはＨ１Ｎ１（例えばＨ１Ｎ１  ０９ブタインフルエンザ）に対するＴ細胞免疫反応および／または体液性免疫反応を誘発ならびに／あるいは向上させる。γ線を照射したヒトインフルエンザＡウイルスは鼻腔内に投与され得る。
【０１５６】
（交差反応／交差防御免疫）
現在のインフルエンザワクチンは、変異に起因して頻繁な抗原性変異を受ける高度に可変のウイルス表面糖タンパク質を標的とする。従って、他のインフルエンザウイルスサブタイプおよび／または新規に生じるサブタイプに対して防御がほとんどまたは全く与えられないため、それらの防御価値は著しく制限される。
【０１５７】
本発明は、内在性インフルエンザウイルスタンパク質に対する免疫反応を誘発および／または向上させることによって上記の不都合を克服する。これらのタンパク質は、全てのインフルエンザウイルスサブタイプの中で高度に保存され、変異に左右されない。従って、本発明は、被験体における複数のインフルエンザウイルスサブタイプに対する交差反応免疫を誘発および／または向上させる方法を提供する。その方法は、治療有効量のγ線を照射したインフルエンザウイルスを被験体に投与する工程を含む。交差反応免疫は、交差反応Ｔ細胞免疫の誘発および／または向上を生じ得る。さらに、または代替として、交差反応免疫は、被験体における交差反応体液性免疫の誘発および／または向上を生じ得る。
【０１５８】
好ましくは、被験体はヒトであり、投与されるγ線を照射したインフルエンザウイルスは、ヒトに感染することが知られているインフルエンザサブタイプを含む。代替的に、投与されるγ線を照射したインフルエンザウイルスは、ヒトに感染することが知られていないインフルエンザサブタイプを含んでもよい。
【０１５９】
一実施形態において、投与されるγ線を照射したインフルエンザウイルスは人畜共通のインフルエンザウイルス株を含む。
【０１６０】
投与は鼻腔内投与であり得る。好ましくは、交差防御免疫は、保存されたインフルエンザウイルス抗原に対して誘発および／または向上される。最も好ましくは、交差防御免疫は、抗原不連続変異および／または抗原連続変異を受けていない保存されたインフルエンザウイルス抗原、あるいは抗原不連続変異および／または抗原連続変異をごくわずかな程度受けているインフルエンザウイルス抗原に対して誘発および／または向上される。抗原不連続変異および／または抗原連続変異のごくわずかな程度は、通常、抗原を認識し、その抗原に反応する宿主免疫細胞の能力を変化させない抗原不連続変異および／または抗原連続変異の程度である。
【０１６１】
本発明の好ましい実施形態において、インフルエンザウイルスに対する免疫を含む交差反応免疫は、γ線を照射したインフルエンザウイルスの被験体への鼻腔内投与によって誘発または高められる。γ線を照射したインフルエンザウイルスは、凍結乾燥形態で調製され得る（下記の「投与経路」という標題のセクションを参照のこと）。被験体に投与されるγ線を照射したインフルエンザウイルスは、上記の「組成物およびワクチン」という標題のセクションに記載される接線／クロスフロー濾過によって精製されたウイルスストックから調製され得る。被験体に投与されるγ線を照射したインフルエンザウイルスを調製するために使用されるウイルスストックは、γ線を照射する間、凍結されていてもよい（上記の「組成物およびワクチン」という標題の段落を参照のこと）。
【０１６２】
本発明の好ましい実施形態において、交差反応免疫は、複数のインフルエンザウイルスサブタイプに特異的な交差反応ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘発（および／または活性の向上）を生じる。
【０１６３】
通常、交差反応免疫反応は、１つ以上の異なるインフルエンザウイルスサブタイプと同一または実質的に類似している１つ以上のインフルエンザウイルス抗原に関する。従って、交差反応免疫細胞は、複数のウイルスサブタイプによって共有される実質的に類似または同一のウイルス抗原を認識し、かつそれらに反応する。
【０１６４】
本明細書に記載される方法による、γ線を照射したインフルエンザウイルスの被験体への投与により、交差反応免疫細胞を生成することができる。交差反応免疫細胞は、被験体に投与されるインフルエンザウイルスサブタイプの株を認識し、かつそれらに反応できる。さらに、交差反応免疫細胞は、被験体に投与されなかった少なくとも１つの他のさらなるインフルエンザウイルスサブタイプの株を認識し、かつそれらに反応できる。
【０１６５】
本発明の方法による、被験体において誘発および／または向上させる交差反応免疫は交差反応細胞免疫を含んでもよい。交差反応細胞免疫は、例えば、交差反応ヘルパーＴ細胞反応および／または交差反応細胞障害性Ｔ細胞反応を含んでもよい。好ましくは、相互反応細胞免疫は、相互反応細胞障害性ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を含む。特定の機構によって束縛されずに、本発明の方法によって誘発および／または向上される相互反応Ｔ細胞免疫は、γ線照射を与えられたウイルス表面タンパク質の機能的ドメイン（例えば機能的受容体および融合ドメイン）の保存された完全性に起因して、γ線を照射したインフルエンザウイルスの抗原提示細胞への効果的な取り込みを生じ得ると考えられる。次いで、これは、十分なウイルス抗原を与えるウイルス粒子（例えば基質および核タンパク質）の、抗原提示細胞の細胞質へのより効果的な取り込みおよび脱殻、ならびに主要組織適合性（ＭＨＣ）タンパク質に対するウイルス抗原の効果的な提示を可能にする。さらに、または代替として、断片化したゲノムインフルエンザウイルスＲＮＡの不成功の複製／翻訳は、ＭＨＣ提示に対して主要源のウイルス抗原（すなわち時期尚早に終結および／またはミスフォールドした遺伝子産物を含む不完全なリボソーム産物）を提供することを生じ得るので、ウイルス特異的Ｔ細胞免疫を刺激する。
【０１６６】
交差反応細胞免疫の誘発および／または向上は、当該分野において公知の方法を用いて検出できる。例えば、交差反応Ｔ細胞（例えばヘルパーＴ細胞および細胞障害性Ｔ細胞）は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ、細胞内サイトカイン染色アッセイおよび四量体ベースのアッセイ（上記）を含む、ウイルス特異的Ｔ細胞を検出するのに利用される一般的な方法を用いて検出または定量化され得る。
【０１６７】
被験体において誘発および／または向上される交差反応免疫は、交差反応体液性免疫を含み得る。交差反応体液性免疫は、通常、交差反応Ｂ細胞応答に関与する。次いで、これにより、被験体の循環において多数の交差反応インフルエンザウイルス特異的抗体（例えばＩｇＡおよびＩｇＧ）が生じ得る。通常、交差反応抗体は、その抗体の産生を刺激しなかったインフルエンザウイルス抗原と反応および／または結合する能力を有する。交差反応Ｂ細胞およびそれら由来の抗体は、当該分野において公知の方法を用いて（例えばマイクロ中和アッセイ、フローサイトメトリーまたは免疫組織化学によって）検出できる。交差反応インフルエンザウイルス特異的抗体を検出するための適切な技術の特定の例は、例えば、Ｒｏｔａら，１９８７「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｖａｒｉａｎｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｔｙｐｅ  Ｂ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ」，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１６１：２６９−７５，およびＨａｒｍｏｎら，１９８８，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ  ｔｏ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｔｙｐｅ  Ｂ  Ｈｏｓｔ−Ｃｅｌｌ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｖａｒｉａｎｔｓ  ａｆｔｅｒ  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｅｇｇ−Ｄｅｒｉｖｅｄ）Ｖａｃｃｉｎｅ  ｏｒ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２６：３３３−３３７に記載されている。
【０１６８】
本発明の方法によれば、所定のインフルエンザウイルスサブタイプ由来のγ線を照射した株の投与によって誘発および／または向上される交差反応免疫は、投与されたサブタイプの株に対して交差防御を与える。好ましくは、所定のインフルエンザウイルスサブタイプ由来のγ線を照射した株の投与はまた、少なくとも１つのさらなるインフルエンザウイルスサブタイプ由来の株に対して交差防御を与える。
【０１６９】
従って、ヒトに感染することが知られている１つのインフルエンザＡウイルスサブタイプ由来の治療有効量の所定のγ線を照射した株のヒト被験体への投与は、そのサブタイプ由来の株ならびに少なくとも１つの他のさらなるインフルエンザウイルスサブタイプ由来の株に対する免疫反応を誘発および／または向上させる。さらなるウイルスサブタイプは、インフルエンザＡウイルスサブタイプ、インフルエンザＢウイルスサブタイプおよび／またはインフルエンザＣウイルスサブタイプであってもよい。さらなるインフルエンザウイルスサブタイプは、例えば、ヒト集団に見出される別個のインフルエンザＡサブタイプ（例えば、Ｈ１Ｎ１（Ｈ１Ｎ１  ０９ブタインフルエンザを含む））であってもよい。さらに、または代替的に、さらなるインフルエンザウイルスサブタイプは、他の種において一般に見出され得る。例えば、さらなるインフルエンザウイルスサブタイプは、一般に、トリ（例えばＡサブタイプＨ５Ｎ１（例えばＨＰＡＩ  Ａ（Ｈ５Ｎ１））、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ７およびＨ９Ｎ２）、ブタ（例えばＡサブタイプＨ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２）、イヌ（例えばＡサブタイプＨ３Ｎ８）またはウマ（例えばＡサブタイプＨ３Ｎ８、Ｈ７Ｎ７）集団に見出され得る。さらなるインフルエンザウイルスサブタイプはまた、サブタイプ間の遺伝子組み換え型由来の組み換えウイルス株であり得る。サブタイプは、（すなわち感染している）異なる種由来であり得る。
【０１７０】
インフルエンザイウイルスにおける抗原不連続変異および／または抗原連続変異は、インフルエンザ大流行の知られている原因である。本明細書に記載される方法に従って、γ線を照射したインフルエンザウイルスの投与によって誘発および／または向上された交差反応免疫は、ワクチン接種によってそのような大流行を予防する有効な手段を提供する。さらに、または代替的に、大流行の間にインフルエンザに感染した個体が、本明細書に記載される方法に従って、γ線を照射したインフルエンザウイルスで治療されてもよい。
【０１７１】
特定の実施形態において、γ線を照射したインフルエンザウイルスの投与によって誘発または向上される交差反応免疫は、人畜共通のインフルエンザウイルス株に対する免疫を含む。
【０１７２】
本発明の好ましい実施形態において、γ線を照射したインフルエンザウイルスの投与によって誘発または向上される交差反応免疫は、（トリ）インフルエンザＡウイルスサブタイプＨ５Ｎ１（例えばＨＰＡＩ  Ａ（Ｈ５Ｎ１））に対する免疫を含む。現在のヒトインフルエンザＡウイルスは、主に、上気道で発現されるα２，６結合型シアル酸受容体に結合する。α２，６結合型受容体に対する結合は、通常、低い毒性の高い感染性インフルエンザウイルス感染に関連する。対照的に、トリインフルエンザＨ５Ｎ１は、下気道において発現されるα２，３結合型受容体に結合する。α２，３結合型受容体に対する結合は、通常、低い感染性であるが、高い毒性および致死性のインフルエンザウイルス感染に関連する。従って、トリＨ５Ｎ１インフルエンザパンデミックは、ウイルスがα２，６結合型受容体に結合できるＨ５Ｎ１の血球凝集素（ＨＡ）タンパク質における変異に関連すると予想される。現在流行しているＨ５Ｎ１サブタイプタンパク質（すなわちα２，３結合型受容体）に対して向けられるワクチンは、α２，６結合型受容体に結合できるＨ５Ｎ１ウイルス変異に対する免疫を誘発できない。従って、そのようなワクチンによる抗体媒介性防御は、起こり得るトリインフルエンザパンデミックに対して本質的に効果がない。
【０１７３】
ヒトインフルエンザＡウイルスに対して向けられるＴ細胞集団によるトリＨ５Ｎ１インフルエンザウイルス（例えばＨＰＡＩ  Ａ（Ｈ５Ｎ１））の交差認識は、上記の問題を克服する手段を表す。本発明の方法によれば、γ線を照射したインフルエンザウイルスの被験体への投与は、トリＨ５Ｎ１インフルエンザウイルス（例えばＨＰＡＩ  Ａ（Ｈ５Ｎ１））に対して、被験体における交差防御免疫を誘発および／または向上させる。被験体に投与されるγ線を照射したインフルエンザウイルスは、γ線を照射したトリＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスを含んでもよいか、または含まなくてもよい。好ましくは、被験体はヒトであり、投与されるγ線を照射したインフルエンザウイルスは、ヒトに感染することが知られているインフルエンザＡサブタイプを含む。投与は鼻腔内投与であり得る。好ましくは、交差防御免疫は、限定されないが、ＨＰＡＩ  Ａ（Ｈ５Ｎ１）ウイルス抗原を含む、保存されたトリＨ５Ｎ１インフルエンザウイルス抗原に対して誘発および／または向上される。最も好ましくは、交差防御免疫は、抗原不連続変異および／または抗原連続変異を受けない保存されたトリＨ５Ｎ１  インフルエンザウイルス抗原、あるいはわずかな程度の抗原不連続変異および／または抗原連続変異を受けるトリＨ５Ｎ１インフルエンザウイルス抗原に対して誘発および／または向上される。わずかな程度の抗原不連続変異および／または抗原連続変異は、通常、抗原を認識し、その抗原に反応する宿主免疫細胞の能力を変化させない程度の抗原不連続変異および／または抗原連続変異である。
【０１７４】
本発明の好ましい実施形態において、（トリ）インフルエンザウイルスサブタイプＨ５Ｎ１（例えばＨＰＡＩ  Ａ（Ｈ５Ｎ１））に対する免疫を含む交差反応免疫は、γ線を照射したインフルエンザウイルスの被験体への鼻腔内投与によって誘発または向上される。γ線を照射したインフルエンザウイルスは、凍結乾燥形態で調製され得る（下記の「投与経路」という標題のセクションを参照のこと）。投与されるγ線を照射したインフルエンザウイルスは、ヒト集団由来のインフルエンザＡウイルスサブタイプを含んでもよい。代替的に、投与されるγ線を照射したインフルエンザウイルスは、ヒトに感染することが知られていないインフルエンザサブタイプを含んでもよい。被験体に投与されるγ線を照射したインフルエンザウイルスは、上記の「組成物およびワクチン」という標題のセクションに記載される接線／クロスフロー濾過によって精製されたウイルスストックから調製され得る。被験体に投与されるγ線を照射したインフルエンザウイルスを調製するために使用されるウイルスストックは、γ線照射の間に凍結されていてもよい（上記の「組成物およびワクチン」という標題の段落に記載される）。
【０１７５】
本発明の別の好ましい実施形態において、γ線を照射したインフルエンザウイルスの投与によって誘発または向上される交差反応免疫は、Ｈ１Ｎ１  ０９ブタインフルエンザウイルス（その他に、世界保健機構によって「パンデミックインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）」と称される）に対する免疫を含む。被験体に投与されるγ線を照射したインフルエンザウイルスは、γ線を照射したＨ１Ｎ１  ０９ブタインフルエンザウイルスを含んでもよいか、または含まなくてもよい。投与されるγ線を照射したインフルエンザウイルスは、ヒトに感染することが知られているインフルエンザＡサブタイプを含んでもよい。代替的に、投与されるγ線を照射したインフルエンザウイルスは、ヒトに感染することが知られていないインフルエンザサブタイプを含んでもよい。投与は鼻腔内投与であり得る。好ましくは、交差防御免疫は、保存されたＨ１Ｎ１  ０９ブタインフルエンザウイルス抗原に対して誘発および／または向上される。最も好ましくは、交差防御免疫は、抗原不連続変異および／または抗原連続変異を受けていない保存されたＨ１Ｎ１  ０９ブタインフルエンザウイルス抗原、あるいはわずかな程度の抗原不連続変異および／または抗原連続変異を受けているＨ１Ｎ１  ０９ブタインフルエンザウイルス抗原に対して誘発および／または向上される。わずかな程度の抗原不連続変異および／または抗原連続変異は、通常、抗原を認識、その抗原に反応する宿主免疫細胞の能力を変化させない程度の抗原不連続変異および／または抗原連続変異である。
【０１７６】
本発明の好ましい実施形態において、Ｈ１Ｎ１  ０９ブタインフルエンザウイルスに対する免疫を含む交差反応免疫は、γ線を照射したインフルエンザウイルスの被験体への鼻腔内投与によって誘発または向上される。γ線を照射したインフルエンザウイルスは、凍結乾燥形態で調製され得る（下記の「投与経路」という標題のセクションを参照のこと）。投与されるγ線を照射したインフルエンザウイルスは、ヒト集団由来のインフルエンザＡウイルスサブタイプであってもよい。被験体に投与されるγ線を照射したインフルエンザウイルスは、上記の「組成物およびワクチン」という標題のセクションに記載される接線／クロスフロー濾過によって精製されたウイルスストックから調製され得る。被験体に投与されるγ線を照射したインフルエンザウイルスを調製するために使用されるウイルスストックは、γ線照射の間に凍結されていてもよい（上記の「組成物およびワクチン」という標題のセクションを参照のこと）。
【０１７７】
（用量）
本発明の方法に従って使用するためのγ線を照射したインフルエンザウイルス（またはγ線を照射したインフルエンザウイルスを含む組成物／ワクチン）の適切な用量は、種々の要因に依存する。そのような要因としては、限定されないが、被験体の身体的特徴（例えば年齢、体重、性別）、化合物が単一の薬剤または補助的治療として使用されるかどうか、患者のＭＨＣ制限のタイプ、インフルエンザ感染の進行（すなわち病理学的状態）、および当業者によって認識され得る他の要因が挙げられる。一般に、γ線を照射したインフルエンザウイルス調製物（またはγ線を照射したインフルエンザウイルス調製物を含む組成物／ワクチン）は、約５０マイクログラム〜約５ｍｇの量で患者に投与され得；約５０マイクログラム〜約５００マイクログラムの用量が特に好ましい。
【０１７８】
当業者は、慣例の実験によって、適用可能なインフルエンザウイルス感染を治療するのに必要とされるγ線を照射したインフルエンザウイルス（またはγ線を照射したインフルエンザウイルスを含む組成物／ワクチン）の有効な非毒性の量を決定できる。
【０１７９】
一般に、有効な用量は、２４時間につき体重１ｋｇ当たり約０．０００１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、典型的には、２４時間につき体重１ｋｇ当たり約０．００１ｍｇ〜約７５０ｍｇ；２４時間につき体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇ；２４時間につき体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇ；２４時間につき体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜約２５０ｍｇ；２４時間につき体重１ｋｇ当たり約１．０ｍｇ〜約２５０ｍｇの範囲であると予想される。より典型的には、有効な用量範囲は、２４時間につき体重１ｋｇ当たり約１．０ｍｇ〜約２００ｍｇ；２４時間につき体重１ｋｇ当たり約１．０ｍｇ〜約１００ｍｇ；２４時間につき体重１ｋｇ当たり約１．０ｍｇ〜約５０ｍｇ；２４時間につき体重１ｋｇ当たり約１．０ｍｇ〜約２５ｍｇ；２４時間につき体重１ｋｇ当たり約５．０ｍｇ〜約５０ｍｇ；２４時間につき体重１ｋｇ当たり約５．０ｍｇ〜約２０ｍｇ；２４時間につき体重１ｋｇ当たり約５．０ｍｇ〜約１５ｍｇの範囲であると予想される。
【０１８０】
代替的に、有効な用量は約５００ｍｇ／ｍ２までであり得る。一般に、有効な用量は、約２５〜約５００ｍｇ／ｍ２、好ましくは約２５〜約３５０ｍｇ／ｍ２、より好ましくは約２５〜約３００ｍｇ／ｍ２、さらにより好ましくは約２５〜約２５０ｍｇ／ｍ２、なおより好ましくは約５０〜約２５０ｍｇ／ｍ２、さらになおより好ましくは約７５〜約１５０ｍｇ／ｍ２の範囲であると予想される。
【０１８１】
典型的に、治療用途において、治療は疾患状態または症状の間、持続される。さらに、個々の用量の最適量および間隔は、治療される疾患状態または症状の性質および程度、投与の形態、経路および部位、ならびに治療される特定の個体の性質によって決定される。また、そのような最適条件は従来技術によって決定され得ることは当業者に明らかであろう。
【０１８２】
治療の最適過程は、治療決定試験の従来の過程を用いて確定され得ることは当業者に明らかであろう。
【０１８３】
２つ以上の治療的実体物が被験体に「併せて」投与され、それらは、同じ部位に単一の組成物で、または同じ時間に別個の組成物で、または間隔を置いた時間に別個の組成物で投与されてもよい。
【０１８４】
特定の実施形態において、本発明の方法は、複数回の別個の用量におけるγ線を照射したインフルエンザウイルス（またはγ線を照射したインフルエンザウイルスを含む組成物／ワクチン）の投与に関する。従って、本明細書に記載されるインフルエンザウイルス感染を予防（すなわちワクチン接種）および治療するための方法は、規定された期間にわたる、被験体に対する複数回の別個の用量の投与を含む。従って、本明細書に開示されるインフルエンザウイルス感染を予防（すなわちワクチン接種）および治療するための方法は、本発明のγ線を照射したインフルエンザウイルス（またはγ線を照射したインフルエンザウイルスを含む組成物／ワクチン）の一次用量を投与する工程を含む。一次投与の後に、追加投与が行われてもよい。追加投与は再ワクチン接種の目的であり得る。種々の実施形態において、組成物またはワクチンは、少なくとも１回、２回、３回またはそれ以上投与される。
【０１８５】
本発明のγ線を照射したインフルエンザウイルス（またはγ線を照射したインフルエンザウイルスを含む組成物／ワクチン）は、単一の薬剤治療として、または生ウイルス、弱毒化ウイルスもしくは殺傷ウイルスの接種などの規定された治療あるいはインフルエンザウイルスを治療するために当該分野において公知の任意の他の治療に加えて投与されてもよい。例えば、それらは、サブユニットワクチン、分裂したインフルエンザウイルスまたは分裂したインフルエンザウイルス抗原調製物、不活性化された完全ウイルスまたは生きて弱毒化されたインフルエンザ調製物とともに投与されてもよい。
【０１８６】
（投与経路）
本発明は、治療有効量のγ線を照射したインフルエンザウイルス（またはγ線を照射したインフルエンザウイルスを含む組成物／ワクチン）の被験体への投与を意図する。γ線を照射したインフルエンザウイルス（または組成物／ワクチン）は、薬理学的に許容可能な担体、補助剤または賦形剤とともに投与されてもよい。
【０１８７】
投与は、限定されないが、非経口（例えば静脈内、皮内、皮下または筋肉内）、粘膜（例えば経口または鼻腔内）あるいは局所経路（上記の「組成物およびワクチン」という標題のセクションを参照のこと）を含む、任意の適切な経路によって実施され得る。
【０１８８】
従って、γ線を照射したインフルエンザウイルス（またはそれらを含む組成物／ワクチン）は、処方物の形態において、注射による投与に適切な形態において、経口接種（例えば、カプセル剤、錠剤、カプレットエリキシル剤など）に適切な処方物の形態において、局所投与に適切な軟膏、クリームまたはローションの形態において、点眼剤としての送達に適切な形態において、鼻腔内吸入または経口吸入などの吸入による投与に適切なエアロゾル形態において、非経口投与（つまり皮下、筋肉内または静脈内注射）に適切な形態において、投与されてもよい。
【０１８９】
好ましい実施形態において、γ線を照射したインフルエンザウイルス（またはγ線を照射したインフルエンザウイルスを含む組成物／ワクチン）は、鼻腔内経路によって被験体に投与される。γ線を照射したインフルエンザウイルス（またはそれらを含む組成物／ワクチン）の被験体への鼻腔内投与は、他の投与経路より利点を提供する。例えば、鼻腔内投与は、血清ＩｇＧより効果的に交差防御を導く、粘膜上皮において分泌性のＩｇＡ産物を誘発する。特定の機構に束縛されずに、γ線照射によるインフルエンザウイルスの不活性化は、ウイルス粒子の抗原構造に影響を与えずに、ウイルスゲノムの鎖切断を引き起こすことによってウイルスを不活性化させると考えられる。従って、γ線を照射したインフルエンザウイルスと鼻腔内投与との組み合わせは、限定されないが、以下を含むいくつかの利点を提供すると考えられる：１）組織特異的受容体に対する不活性化されたウイルスの結合を促進すること、２）組織特異的免疫反応の誘発を可能にすること、３）完全ウイルス抗原に対する全身曝露を減少させること、および４）完全ウイルスワクチンに関連する副作用を制限すること。
【０１９０】
一実施形態において、鼻腔内投与のためのγ線を照射したインフルエンザウイルスは、使用直前に再構成できる凍結乾燥された粉末形態で提供される。本発明のワクチンおよび組成物の粉末ワクチン製剤は、液体ベースのワクチンの安定性および送達に関連する冷蔵保存および分配の要求を克服する手段を提供する。乾燥粉末製剤は、より安定であり、また微生物の増殖を支持しないという利点を提供する。
【０１９１】
本明細書で実証されるように、γ線を照射して不活性化されたインフルエンザウイルスの凍結乾燥製剤は、凍結乾燥していない製剤と同様のレベルの異種サブタイプ免疫を誘発する。γ線を照射したインフルエンザウイルスは、当該分野において公知の任意の適切な技術を用いて凍結乾燥されてもよい。例えば、γ線を照射して不活性化されたインフルエンザウイルスの液体調製物は、ドライアイス−イソプロパノールスラリーで凍結されてもよく、適切な時間（例えば２４時間）、フリーズドライヤー（例えばＶｉｔｒｉｓ  Ｍｏｄｅｌ  １０−３２４  Ｂｅｎｃｈ，Ｇａｒｄｉｎｅｒ，ＮＹ）で凍結乾燥されてもよい。
【０１９２】
一実施形態において、γ線を照射したインフルエンザウイルスの乾燥粉末経鼻ワクチン処方物は、噴霧凍結乾燥（ＳＦＤ）粒子を生成することによって産生される（例えば、Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏら，（２００２），「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｒａｙ  ｆｒｅｅｚｅ  ｄｒｙｉｎｇ．２．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｖａｒｉａｂｌｅｓ  ｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ」，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．，９１：３８８−３９５；Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏら，（２０００），「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｒａｙ−ｆｒｅｅｚｅ  ｄｒｙｉｎｇ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｔｏｍｉｚａｔｉｏｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｉｔｙ」，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．，１７：１３７４−１３８３；Ｍａａら，（１９９９），「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  ｐｏｗｄｅｒｓ：ｓｐｒａｙ  ｄｒｙｉｎｇ  ｖｓ  ｓｐｒａｙ  ｆｒｅｅｚｅ  ｄｒｙｉｎｇ」，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ，１６：２４９−２５４；Ｃａｒｒａｓｑｕｉｌｌｏら，（２００１）；「Ｎｏｎ−ａｑｕｅｏｕｓ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｓｐｒａｙ−ｆｒｅｅｚｅ  ｄｒｉｅｄ  ＢＳＡ  ｉｎｔｏ  ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｎａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ」，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，７６：１９９−２０８；Ｃａｒｒａｓｑｕｉｌｌｏら，（２００１），「Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｂｙ  ｎｏｎ−ａｑｕｅｏｕｓ  ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ」，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５３：１１５−１２０；および米国特許第６，５６９，４５８号を参照のこと）。例えば、γ線を照射したインフルエンザウイルスおよび１０％の固形物（例えばトレハロース）を含有する水溶液は、液体窒素を含有するトレイに回収される窒素ガスおよび液滴を噴霧しながらスプレーを通過でき、次いでマニホルドフリーズドライヤーで凍結乾燥される。凍結乾燥された製剤は使用直前に再構成され得る。
【０１９３】
本発明の方法に従って使用するための経鼻投与は、例えば、点鼻剤、スプレーとしての液体形態、または粉末、クリームまたはエマルションとしての吸入に適切な形態で処方され得る。
【０１９４】
典型的に、γ線を照射したインフルエンザウイルス（またはそれを含む組成物／ワクチン）は、好ましくは肺に吸入されずに、鼻粘膜によって吸収するために鼻咽頭領域に投与される。本発明の方法による経鼻投与のための適切な装置としては噴霧装置が挙げられる。適切な市販の噴霧装置が使用されてもよい。γ線を照射したインフルエンザウイルス（またはそれを含む組成物／ワクチン）の少用量を含有する複数回投与送達装置が利用されてもよい。
【０１９５】
多くの変更および／または改変が、広範囲に記載される本発明の精神または範囲から逸脱せずに特定の実施形態において示される本発明に対してなされ得ることは当業者によって理解されるだろう。従って、本発明の実施形態はあらゆる点で例示とみなされ、限定とみなされるべきではない。
【実施例】
【０１９６】
本発明は、ここで、特定の実施例に対して参照とともに記載され、それらは、決して限定とみなされるべきではない。
【０１９７】
（実施例１：γ線を照射したインフルエンザＡウイルスでのＢＡＬＢ／ｃマウスの静脈内ワクチン接種）
（ｉ）材料および方法
同じ性別、かつ同様の年齢群（８〜１２週齢）のＢＡＬＢ／ｃマウスを各実験に使用した。
【０１９８】
（ウイルスおよび免疫化）
インフルエンザウイルス株Ａ／ＷＳＮ（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＪＡＰ（Ｈ２Ｎ２）およびＡ／ＰＣ（Ｈ３Ｎ２）を、Ｙａｐら，１９７７，「Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌｓ」，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３２：１５１に記載されるように増殖させ、滴定した。ウイルス力価を血球凝集ユニット（ＨＡＵ）として表した。Ａ／ＪＡＰインフルエンザウイルスを、粗尿膜腔液をＣｏ６０線源（３５０ｒａｄ／分にて６０時間）からの１．２６×１０６ｒａｄ（１２．６ＫＧｙ）に曝露することによって、または透析された、感染性尿膜腔液を１０分間紫外線（３２０μＷ／ｃｍ２）に曝露することのいずれかによって不活性化させた。これらの時間のγ線または紫外線への曝露により、孵化卵において試験した場合、完全に感染性が破壊された。動物を１０３ＨＡＵの単一の静脈内注射によって免疫化した。
【０１９９】
（標的細胞）
Ｐ８１５チオグルコール酸誘導腹腔マクロファージ（ＴＧＭ）、コンカナバリンＡ（ｃｏｎ−Ａ）およびリポ多糖（ＬＰＳ）誘導リンパ芽球を、Ｙａｐら，１９７７，「Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌｓ」，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３２：１５１，ならびにＰａｒｉｓｈおよびＭｕｅｌｌｂａｃｈｅｒ，１９８３，「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ．，５８：２２５−２３７に記載されるように、獲得し、調製し、感染させた。
【０２００】
（エフェクター細胞の生成）
インビボにおいてインフルエンザ免疫Ｔｃ細胞を二次的に生成するためのメモリー培養物を、Ｍｕｅｌｌｂａｃｈｅｒ，１９８４，「Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ−ｉｍｍｕｎｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５２，９２８−９１３に記載される方法を用いて生成した。つまり、３ヶ月前にインフルエンザウイルスで免疫化したマウス由来の８×１０７の脾臓細胞を、インビトロにおいて５日間、１×１０７のウイルス感染性刺激細胞とともに共培養した。刺激細胞を、１０６細胞あたり約１０３ＨＡＵの感染の多重度にて感染性ウイルスまたは不活性化されたウイルスで感染させた。
【０２０１】
（細胞障害性アッセイ）
腫瘍細胞およびマクロファージ標的物に関して使用される方法は、Ｙａｐら，１９７７，「Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌｓ」，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３２：１５１，Ｐａｒｉｓｈ  ａｎｄ  Ｍｕｅｌｌｂａｃｈｅｒ，１９８３，「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ．，５８：２２５−２３７，およびＭｕｅｌｌｂａｃｈｅｒ，１９８４，「Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ  ａｎｔ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ−ｉｍｍｕｎｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５２，９２８−９３１に詳細に記載されている。アッセイの時間は６時間であった。特異的溶解の割合を以下の式を用いて算出した。
【数１】
0005689796.tif 000002
【０２０２】
（ｉｉ）結果
（メモリーＴｃ細胞についての感染性インフルエンザウイルスまたは不活性化されたインフルエンザウイルスでのＢＡＬＢ／ｃマウスの初回抗原刺激）
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、１０３ＨＡＵの感染性の、γ線または紫外線で不活性化されたＡ／ＪＡＰウイルスのいずれかを注入した。３ヶ月後、脾臓を除去し、細胞を、インビトロにおいて感染性のＡ／ＪＡＰにより感染させた刺激脾臓細胞で追加免疫し、Ｔｃ細胞応答を、３つのエフェクター：標的細胞の割合にて５日後に測定した。表１は、感染したＰ８１５標的細胞の特異的溶解の割合の代表的なデータを示す。明らかに、ＴＣ細胞について抗原刺激した感染ウイルスは、γ線または紫外線を照射したウイルスより効果的に反応するが、γ線を照射したウイルスは、紫外線を照射したウイルスによる非常に弱い反応と比較して、全ての３つの感染した標的細胞（Ａ／ＷＳＮ、Ａ／ＪＡＰおよびＡ／ＰＣ）を用いて実質的な溶解を与えた。限界希釈条件下で、前駆体頻度解析から、感染性ウイルスで抗原刺激した動物は、γ線を照射したウイルスで抗原刺激した動物より、脾臓において約３倍高い測定値のＴｃ細胞前駆体頻度を与えた。これは、バルク培養で得た溶解の値と一致している（表１）。
【０２０３】
表１．感染性の、γ線または紫外線を照射したＡ／ＪＡＰウイルスで以前に免疫化したマウス由来の脾臓細胞の感染性Ａ／ＪＡＰウイルスでのインビトロにおける二次刺激
【０２０４】
【表１】
0005689796.tif 000003
【０２０５】
＊示される特異的溶解の割合についての値は、感染されていないＰ８１５細胞上のエフェクター細胞による溶解の値を減ずることによって得た。３連のサンプルの標準誤差は常に、８％未満であり、通常４％未満であった。自然の５１Ｃｒ放出は１６〜１９％の範囲であった。
【０２０６】
（メモリーインフルエンザ免疫Ｔｃ細胞を追加免疫する不活性化されたウイルスの能力）
３ヶ月前に感染性Ａ／ＪＡＰウイルス（１０３ＨＡＵ）で抗原刺激したマウスの脾臓細胞を、感染性ウイルスのγ線または紫外線を照射したウイルスのいずれかを用いて、Ａ／ＪＡＰ処置した刺激細胞でインビトロにおいて追加免疫し、Ｔｃ細胞活性アッセイ実施した。表２に示す結果は、全ての３つのウイルスが、交差反応Ｔｃメモリー細胞を再刺激できるが、γ線を照射したウイルスは紫外線を照射したウイルスより優れていることを実証する。紫外線を照射したウイルスで追加免疫した細胞は、同種ウイルスで感染した標的細胞でのみ有意な溶解を与えた。
【０２０７】
表２．感染性Ａ／ＪＡＰウイルスで以前に免疫化したマウス由来の脾臓細胞の感染性または不活性化されたＡ／ＪＡＰウイルスでのインビトロにおける二次刺激
【０２０８】
【表２】
0005689796.tif 000004
【０２０９】
＊示される特異的溶解の割合についての値は、感染されていないＰ８１５細胞上のエフェクター細胞による溶解の値を減ずることによって得た。３連のサンプルの標準誤差は常に、８％未満であり、通常４％未満であった。自然の５１Ｃｒ放出は８〜１０％の範囲であった。
【０２１０】
（感染性および不活性化されたＡ／ＪＡＰウイルスでの標的細胞の感作）
不活性化されたインフルエンザウイルスが標的細胞を感作できるか否かを決定するために、Ｐ８１５腫瘍細胞、ＴＧＭ、およびＬＰＳならびにｃｏｎ−Ａリンパ芽球を、２時間、１０６細胞あたり１０３ＨＡＵ（２×１０６細胞／ｍｌ）にて感染性、γ線または紫外線を照射したウイルスのいずれかで処理した。次いで、これらの標的物を、インビトロにおける二次的インフルエンザ免疫Ｔｃ細胞による特異的溶解について試験した（表３）。感染ウイルスのみが、標的物（特にＰ８１５およびＴＧＭ）を感作して、感染されていないコントロール標的物より有用な溶解を示した。
【０２１１】
表３．二次インフルエンザ免疫Ｔｃ細胞によって試験した場合の感染性Ａ／ＪＡＰウイルスおよび不活性化されたＡ／ＪＡＰウイルスによる標的細胞の感作
【０２１２】
【表３】
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【０２１３】
＊示される特異的溶解の割合についての値は、感染されていないＰ８１５細胞上のエフェクター細胞による溶解の値を減ずることによって得た。３連のサンプルの標準誤差は常に、８％未満であり、通常４％未満であった。自然の５１Ｃｒ放出は：Ｐ８１５について１０〜１２％、ＴＧＭについて１３〜１７％、ＬＰＳについて３７〜４０％およびｃｏｎ−Ａ芽球について２２〜２５％の範囲であった。
【０２１４】
（不活性化されたウイルスでの致死性インフルエンザウイルスからの防御）
このような不活性化されたウイルス調製物で免疫化されたマウスが、致死性インフルエンザウイルス感染に対して防御されるか否かを調べるために、マウスを、同じまたは異なるサブタイプの生インフルエンザウイルスの致死用量を抗原投与する４〜５週間前に、感染性、γ線または紫外線を照射したＡ／ＪＡＰウイルスで抗原刺激した。２つの実験のうちの１つからの結果を表４に示す。３つのウイルスのいずれかで抗原刺激したマウスは、同種Ａ／ＪＡＰおよび異種Ａ／ＷＳＮウイルスによる抗原投与で生存したが、紫外線照射したウイルスで抗原刺激し、Ａ／ＷＳＮで抗原投与したマウスは病気になり、１匹が死んだ。観察された主な相違はＡ／ＰＣウイルスであった。紫外線を照射したウイルスで抗原刺激したマウスは、抗原刺激していない動物と同じほど感染しやすいが、γ線を照射したウイルスで抗原刺激したマウスは、感染ウイルスで抗原刺激したマウスと少なくとも同じくらい、抗原投与で生存した。感染性ウイルスまたはγ線を照射したウイルスのいずれかで抗原刺激した動物由来の免疫血清の移入が、Ａ／ＷＳＮで感染された動物でなく、同種Ａ／ＪＡＰウイルスで感染された動物の肺におけるウイルス力価を著しく減少させたので、抗体は、観察された交差防御に関与しないように見える。
【０２１５】
表４．致死用量の感染性Ａ／ＷＳＮ（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＪＡＰ（Ｈ２Ｎ２）またはＡ／ＰＣ（Ｈ３Ｎ２）での後の抗原投与後の生存に対する、感染性、γ線または紫外線を照射したＡ／ＪＡＰでのマウスの予備免疫の効果
【０２１６】
【表４】
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【０２１７】
＊以前の実験は、抗原刺激したマウスが常に、同種ウイルスによる抗原投与に耐性を示した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、１０３ＨＡＵの感染性Ａ／ＪＡＰウイルス、紫外線照射したＡ／ＪＡＰウイルスまたはγ線照射したＡ／ＪＡＰウイルスを静脈内（ｉ．ｖ．）注射したか、あるいは何も注射しなかった。８週間後、マウスの群（１群あたり８匹のマウス）に、致死用量のＡ／ＷＳＮ（１０４のＥＩＤ５０）、Ａ／ＪＡＰ（３×１０５のＥＩＤ５０）またはＡ／ＰＣ（１．５×１０８のＥＩＤ５０）を鼻腔内接種した。マウスの死を、上記の得られた結果を用いて、２０日間記録した。
【０２１８】
これらの結果は、γ線で不活性化されたウイルスが、感染性ウイルスと少なくとも同じくらい異種Ａ株のウイルスによる感染に対して動物を防御することを示す。他方で、紫外線で不活性化されたウイルスは、より離れた関係にあるウイルスＡ／ＰＣ（Ｈ３Ｎ２）に対してこの防御を与えなかった。γ線照射が、ウイルス感染を破壊する際に交差反応Ｔｃ細胞について抗原刺激をする能力を保有するという点で、紫外線照射より効果的であるという発見は、γ線照射が、紫外線照射より少なくとも一部の内在性タンパク質の抗原構造にほとんど損傷を与えないことを示唆する。驚くべきことに、以前に、ウイルスまたはタンパク質に対するγ線照射の効果について公開された研究はほとんどない。感染性ウイルスと対照的に、γ線を照射したウイルスまたは紫外線を照射したウイルスのいずれも、ウイルス特異的Ｔｃ細胞による溶解を促進する標的細胞（活性化されたマクロファージ、リンパ芽球またはＰ８１５細胞）を感作できなかった。しかしながら、主に、静脈内注射後の照射ウイルスの抗原提示に関与する細胞が、活性化されたマクロファージまたはリンパ球のものと異なる特性を有し得ることは可能である。
【０２１９】
（実施例２：γ線を照射したインフルエンザＡ株、Ａ／ＷＳＮ［Ｈ１Ｎ１］、Ａ／ＰＲ８［Ｈ１Ｎ１］、Ａ／ＪＡＰ［Ｈ２Ｎ２］およびＡ／ＰＣ［Ｈ３Ｎ２］での静脈内ワクチン接種）
（ｉ）材料および方法
（動物およびウイルス）
インフルエンザＡウイルス（株、Ａ／ＷＳＮ、Ａ／Ｐｒ８［Ｈ１Ｎ１］；Ａ／ＪＡＰ［Ｈ２Ｎ２］；Ａ／ＰＣ［Ｈ３Ｎ２］）を、１０日の孵化卵中で調製した。ウイルスストックを尿膜腔液から調製し、−７０℃にてアリコート中に保存した。最初に、ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７Ｂ１／６マウスを鼻腔内で感染させ、インフルエンザ感染の重症度を、致死率、体重損失、肺組織構造および肺浸潤の点で評価した。
【０２２０】
（インフルエンザ株のγ線照射）
凍結し、室温に維持したウイルスストックのγ線量反応研究を、最適免疫原性を有する滅菌ウイルス調製物を与える条件を規定するためにＡＮＳＴＯ／Ｌｕｃａｓ  Ｈｅｉｇｈｔｓ／ＮＳＷで行った。５×１０５ｒａｄ（５ＫＧｙ）の線量が、孵化卵中に残っている感染性ウイルスの増幅後に血球凝集（ＨＡ）アッセイによって決定された無菌を誘発するのに十分であった。完全なウイルス粒子の不活性化を守るために、１×１０６ｒａｄ（１０ＫＧｙ）の線量のγ線を、γ−ｆｌｕ（γ線を照射したインフルエンザ）調製物について選択し、その調製物を、感染性インフルエンザで抗原投与する前に、マウスにワクチン接種するために使用した。ウイルスストックを、照射プロセスの間にわたってドライアイス上に維持した。
【０２２１】
（静脈内ワクチン接種および鼻腔内抗原投与）
８匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、致死量のＡ／ＪＡＰで鼻腔内に抗原投与する前に、４週間離して２回、静脈内にγ−ｆｌｕでワクチン接種した。γ−Ａ／ＷＳＮ（６×１０３血球凝集ユニット（ＨＡＵ）／マウス）、γ−Ａ／ＰＣ（６×１０３  ＨＡＵ／マウス）、およびγ−Ａ／ＪＡＰ（３×１０３  ＨＡＵ／マウス）を静脈内に注射した。γ−ｆｌｕの第２回の投与の４週間後に、マウスをＡ／ＪＡＰ（５０ＨＡＵ／マウス）で抗原投与し、それらを２０日間モニターした。
【０２２２】
（免疫組織化学）
肺を、１週間、１０％の中性緩衝化ホルマリンに固定し、パラフィンに包埋した。組織形態の実験のために、４ミクロンの断片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【０２２３】
（肺からのリンパ球単離およびＦＡＣＳ解析）
ＣＤ８＋Ｔ細胞の組織浸潤に対するγ−ｆｌｕでのワクチン接種の効果を評価するために、模擬およびワクチン接種したマウスからの肺を、インフルエンザウイルスでの抗原投与後６日に５％ＦＣＳを含有する氷冷ＭＥＭに収集した。振盪しながら３７℃にて３０分間、ＭＥＭ／５％ＦＣＳ中の１型コラゲナーゼ（Ｇｉｂｃｏ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で消化し、１００μｍのメッシュ組織篩を通して穏やかに押下することによってホモジナイズした。次いで、ホモジネートを、１０分間、４００×ｇにて遠心分離し、ペレットを、ＭＥＭ／５％ＦＣＳ中の２ｍＬの９０％Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に再懸濁した。懸濁液を１５ｍＬのチューブに移し、ＭＥＭ中の６０、４０および１０％のＰｅｒｃｏｌｌで穏やかに覆った。勾配を、８００×ｇにて４５分間、遠心分離した。リンパ球を４０〜６０％の界面から回収し、ＭＥＭ／５％ＦＣＳで２回洗浄した。Ａ／ＥＳＮで感染（模擬およびワクチン接種の両方）したマウスの肺から新たなに単離されたリンパ球上の細胞表面マーカーの発現を、ＣＤ８（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）に特異的なＡｂで染色することによって測定した。単一のマウス由来の細胞を、１００μＬの氷冷ＭＥＭ／５％ＦＣＳに懸濁し、４℃にて１５分間、Ｆｃ  Ｂｌｏｃｋ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）とともにインキュベートした。細胞を洗浄し、暗所で４℃にて３０分間、関連Ａｂとともにインキュベートし、次いで２回洗浄し、２％ｗ／ｖパラホルムアルデヒドで固定し、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて解析するまで暗所で４℃にて保存した。
【０２２４】
（γ−ｆｌｕによって誘発される交差反応ＣＴＬ応答）
γ−ｆｌｕが交差反応Ｔｃ細胞応答を誘発するか否かを試験するために、Ａ／ＷＳＮおよびＡ／ＰＣならびにそれらの対応するγ−ｆｌｕ調製物を、マウスを静脈内で感染またはワクチン接種するために使用した。１０週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ａ／ＷＳＮ、γ−Ａ／ＷＳＮ、Ａ／ＰＣおよびγ−Ａ／Ｐｃで感染またはワクチン接種のいずれかを行った。５日後、感染した動物、ワクチン接種した動物、模擬免疫化した動物由来の脾細胞を、模擬標的細胞、Ａ／ＷＳＮ感染標的細胞、Ａ／ＰＣ感染標的細胞、および適切なＫｄを限定した核タンパク質由来のペプチドで修飾した標的細胞（ＮＰＰで標識したＰ８１５標的）に対するそれらの殺傷活性について試験した。ＣＴＬ反応を、Ｍｕｅｌｌｂａｃｈｅｒら，１９９３，「Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｔ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  １１４  ｉｎ  Ｈ−２Ｋｄ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９，１２２８−１２３４に記載されるＣｒ５１放出アッセイを用いて測定した。
【０２２５】
（統計）
全ての統計的解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＩｎＳｔａｔソフトウェアを用いて実施した。Ｏｎｅ−Ｗａｙ−ＡＮＯＶＡ検定を、体重損失の点で、ワクチン接種した群およびワクチン接種していない群の間の有意差についてＭＥＡＮおよびＳＥＭを比較するために使用した。
【０２２６】
（ｉｉ）結果
（静脈内γ−ｆｌｕワクチン接種は、インフルエンザＡ／ＪＡＰでの致死量の抗原投与に対して防御する）
防御免疫を誘発するγ−ｆｌｕ調製物の能力を、γ−ｆｌｕで抗原刺激したマウスに同種および異種のインフルエンザウイルスを抗原投与することによって試験した。マウスにおけるインフルエンザＡ／ＪＡＰ（Ｈ２Ｎ２）での呼吸器感染は致死率と関連があり、ＬＤ５０は、１０週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて鼻腔内（ｉ．ｎ．）で５０ＨＡＵ／マウスである（表５）。
【０２２７】
表５．同種または異種インフルエンザＡ感染に対するγ−ｆｌｕ調製物の防御効果
【０２２８】
【表５】
0005689796.tif 000007
【０２２９】
＊８匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、致死量のＡ／ＪＡＰでの抗原投与前に、４週間離して２回、γ−ｆｌｕでワクチン接種した。γ−Ａ／ＷＳＮ（６×１０３  ＨＡＵ／マウス）、γ−Ａ／ＰＣ（６×１０３  ＨＡＵ／マウス）、およびγ−Ａ／ＪＡＰ（３×１０３  ＨＡＵ／マウス）を、第２回のγ−ｆｌｕの投与後、４週間で静脈内注射し、マウスを、Ａ／ＪＡＰ（５０ＨＡＵ／マウス）で鼻腔内に抗原投与し、マウスを２０日間、モニターした。
【０２３０】
γ線により不活性化した同種または異種インフルエンザＡ株の事前の静脈内（ｉ．ｖ．）注射は、ＬＤ５０  Ａ／ＪＡＰで抗原投与したマウスの生存率を高めた（表５）。ワクチン接種していないマウスと比較した場合、全てのワクチン接種した群（Ａ、ＢおよびＣ）は、Ａ／ＪＡＰでの静脈内感染後、体重損失の有意な減少を示した（ＡＮＯＶＡ検定を用いて０．０１より小さいＰ値）（図１）。未処置のワクチン接種を受けていない動物は、Ａ／ＪＡＰ抗原投与後６日で３０％より大きい体重損失を示した。相対的に、全てのワクチン接種した動物のみが、１０％より小さい緩やかな体重損失を示した（図１）。
【０２３１】
（γ−ｆｌｕワクチン接種は、インフルエンザＡ／ＷＳＮでの抗原投与後の肺の炎症を減少させる）
Ａ／ＪＡＰ感染後の致死率および体重減少に加えて、Ａ／ＷＳＮ感染後の肺の炎症および浸潤を評価した。Ａ／ＷＳＮでの鼻腔内感染は、重度の炎症反応によって特徴付けられ、未処置（図２Ａ）と感染した（図２Ｂ）肺の組織構造の比較から明白である。炎症は、同種（図２Ｃ）または異種（図２Ｄ）インフルエンザウイルスで抗原投与したγ−ｆｌｕでワクチン接種した動物において有意に減少している。低い全体の炎症にもかかわらず、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、優先的に、γ−ｆｌｕでワクチン接種した動物の肺に浸潤した（図３）。
【０２３２】
（γ−ｆｌｕは、交差反応細胞障害性（Ｔｃ）細胞応答を誘発する）
同種ウイルスでの感染に対するγ−ｆｌｕの防御効果は、体液性免疫および細胞性免疫の両方に関与すると考えられる。観察された交差防御免疫（異種感染からの防御）に関与する機構は、少なくとも部分的に細胞障害性Ｔ（Ｔｃ）細胞媒介性であり得る。γ−ｆｌｕが交差反応Ｔｃ細胞応答を誘発するか否かを試験するために、Ａ／ＷＳＮおよびＡ／ＰＣならびにそれらの対応するγ−ｆｌｕ調製物を、マウスを感染またはワクチン接種するために使用し、次いで、脾臓エフェクターを、模擬標的細胞、Ａ／ＷＳＮ感染標的細胞、Ａ／ＪＡＰ感染標的細胞、および適切なＫｄを限定した核タンパク質由来のペプチド（ＮＰＰ）で修飾した標的細胞に対するそれらの殺傷能力について試験した。図４に示すように、感染した動物およびワクチン接種した動物由来のエフェクター脾細胞は、同種および異種のウイルス感染Ｐ８１５標的物を溶解した。さらに、模擬感染したマウス由来のものを除く、全ての脾細胞は、核タンパク質ペプチドで標識した標的物に対する殺傷活性を示した。
【０２３３】
（実施例３：γ線を照射したインフルエンザＡウイルスでの鼻腔内ワクチン接種はＨ５Ｎ１（トリインフルエンザ）に対して防御する）
（ｉ）材料および方法
（動物）
１０週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスをこの実験に使用した。
【０２３４】
（ウイルス）
インフルエンザウイルスの２つのＡ株（Ａ／ＰＲ８［Ｈ１Ｎ１］およびＡ／ＰＣ［Ｈ３Ｎ２］）のウイルスストックを、孵化したニワトリ卵で増殖させて、ニワトリ赤血球に対する温度依存性吸着により精製して、ウイルス力価を、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）での標準的なプラークアッセイによって評価し、力価をｐｆｕ／ｍｌと表した。
【０２３５】
（インフルエンザ株のγ線照射）
精製したストックを、上記の実施例２に記載したように１×１０６ｒａｄ（１０ｋＧｙ）のγ線（ＡＮＳＴＯ，Ｌｕｃａｓ  Ｈｅｉｇｈｔ，オーストラリア）に曝露した。照射したストックに残っているウイルス感染性を、孵化したニワトリ卵を用いて試験した。ウイルスストックは滅菌したが、照射後に血球凝集能を保有した。
【０２３６】
（統計）
全ての統計的解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＩｎＳｔａｔソフトウェアを用いて実施した。フィッシャーの正確確率検定およびカイ二乗検定を、有意差について生存率を比較するために使用した。
【０２３７】
（ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける交差反応細胞障害性Ｔ細胞応答）
１０週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ａ／ＰＲ８、γ−Ａ／ＰＲ８、Ａ／ＰＣ、またはγ−Ａ／ＰＣで感染またはワクチン接種のいずれかをした。６日後、これらのマウス由来の脾細胞を、上記の実施例１および２に記載したようにＣｒ５１放出アッセイを用いて模擬標的物、Ａ／ＰＣ−標的物、Ａ／ＰＲ８−標的物、Ａ／ＪＡＰ感染標的物、およびＮＰＰ−標識Ｐ８１５標的物に対するそれらの殺傷能力について試験した。
【０２３８】
（異種および同種防御についてのγ−ｆｌｕでの鼻腔内ワクチン接種）
マウスの群を、γ−Ａ／ＰＲ８（ｎ＝１０）、γ−Ａ／ＰＣ（ｎ＝１０）、ホルマリン不活性化Ａ／ＰＣ（Ｎ＝８）の３．２×１０６ｐｆｕ／マウスでワクチン接種したか、または模擬処置した（ｎ＝１０）。ワクチン接種の４週間後、マウスを、２×１０５ｐｆｕ／マウスのＡ／ＰＲ８で鼻腔内に抗原投与し、２１日間、体重減少および致死率をモニターした。
【０２３９】
（鼻腔内γ−ｆｌｕワクチン接種対他の投与経路）
異なる経路（鼻腔内（ｉ．ｎ）、静脈内（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）および皮下（ｓ．ｃ．））の接種を、３．２×１０６ｐｆｕ当量のγ−Ａ／ＰＣでＢＡＬＢ／ｃマウス（１０匹のマウス／群）にワクチン接種するために使用した。ワクチン接種の３週間後、マウスを、致死量の生Ａ／ＰＲ８（６×１０２ｐｆｕ）で鼻腔内に抗原投与し、エンドポイントとして３０％体重減少を用いて致死率および臨床症状をモニターした。
【０２４０】
（ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける致死量Ｈ５Ｎ１感染の基礎パラメーター）
１０週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、１０倍滅菌希釈のＨ５Ｎ１ウイルスストックで鼻腔内に感染させた。マウスを体重減少および致死率についてモニターした。個々のマウスの体重追跡の終わりは、約２５％体重減少による屠殺を示す。
【０２４１】
（γ−ｆｌｕ（γ−Ａ／ＰＲ８［Ｈ１Ｎ１］）での鼻腔内ワクチン接種を用いるＨ５Ｎ１に対する防御）
致死量のＨ５Ｎ１の抗原投与に対するγ−ｆｌｕの防御効果を試験した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１０匹のマウス／群）を、模擬処置したか、または単一用量のγ−Ａ／ＰＲ８［Ｈ１Ｎ１］（３．２×１０６ｐｆｕ当量／マウス）で鼻腔内にワクチン接種した。ワクチン接種の４週間後、マウスを、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４［Ｈ５Ｎ１］の３倍のマウス感染用量５０（３×ＭＩＤ５０）で鼻腔内に抗原投与し、エンドポイントとして２０％体重減少を用いて、２１日間毎日、致死率および臨床症状をモニターした。
【０２４２】
（Ｈ５Ｎ１遺伝的荷重に対するγ−ｆｌｕワクチンの効果を評価するためのリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ））
６００μｌのＲＬＴ緩衝液中への１００μｌの肺または脳のホモジネートの添加後、ＲＮＡを、製造業者の指示書に従ってＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。各サンプルの全ＲＮＡ濃度を分光光度法により測定し、ヌクレアーゼを含まない水で４０ｎｇ  μｌ−１に調整した。続いて、標準化量（２００ｎｇ）のテンプレートを、製造業者の推奨に従って、２０μｌの反応物中でＴａｑＭａｎ逆転写試薬キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて逆転写した。ウイルスｃＤＮＡの定量のために、ウイルスマトリクス遺伝子内由来の産物を増幅し、検出する、一般的なＡ型インフルエンザ特異的プライマーおよびＴａｑＭａｎプローブを、以前に記載されるように使用した（Ｈｅｉｎｅ，Ｈ．Ｇ．ら，２００７「Ｒａｐｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｈ５Ｎ１  ｖｉｒｕｓ  ｂｙ  ＴａｑＭａｎ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ」Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．５１：３７０−３７２を参照のこと）。
【０２４３】
反応を３連で実施し、反応物は、１２．５μｌのＴａｑＭａｎ  ２Ｘ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、９００ｎＭの各プライマー、２５０ｎＭのプローブ、２μｌのｃＤＮＡテンプレートおよび６．８μｌの水を含有した。１８Ｓ  ｒＲＮＡ（ＴａｑＭａｎリボソームコントロール試薬、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を定量化するための別の３連の反応もまた、試験した全てのサンプル中のＰＣＲインヒビターの存在を排除するために実施した。反応は、７５００高速リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および以下のサイクルパラメーター：５０℃、２分間；９５℃、１０分間；９５℃、１５秒間および６０℃、１分間の４５サイクルを用いて９６ウェルプレートで実施した。ウイルス遺伝的荷重の相対定量のために、標準曲線を、テンプレートとして、感染していないマウスの肺から調製した４０ｎｇ  μｌ−１のＲＮＡ中の１０倍滅菌希釈の抽出ストックウイルスＲＮＡを用いて生成した。データの解釈を容易にするために、１ユニット（１Ｕ）のウイルスＲＮＡを、ＲＮＡ分子の数と任意に定義し、逆転写され、リアルタイムＰＣＲを受けた場合、３８のＣＴ値を生じた。
【０２４４】
（ｉｉ）結果
（Ａ／ＰＲ８γ−ｆｌｕおよびＡ／ＰＣγ−ｆｌｕ調製物はＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて交差反応細胞障害性Ｔ細胞応答を誘発する）
交差反応細胞障害性Ｔ（Ｔｃ）細胞応答の誘発を、γ−ｆｌｕでワクチン接種したマウスにおいて試験した。Ａ／ＰＲ８およびＡ／ＰＣならびにそれらの対応するγ−ｆｌｕ調製物を、マウスを感染またはワクチン接種するために使用した。６日後、感染動物、ワクチン接種動物、および模擬免疫化動物由来の脾細胞を、Ｃｒ５１放出アッセイ（上記の実施例２および３に記載した）を用いて、模擬標的細胞、Ａ／ＰＣ−標的細胞、Ａ／ＰＲ８−感染標的細胞またはＡ／ＪＡＰ感染標的細胞および適切なＫｄを制限した核タンパク質由来のペプチド（ＮＰＰ）で修飾した標的細胞に対するそれらの殺傷能力について試験した。図５に示すように、インフルエンザ感染動物およびγ−ｆｌｕワクチン接種動物由来のエフェクター脾細胞は、使用されるウイルス株に関わらず、全てのインフルエンザ感染Ｐ８１５標的物に対して殺傷活性を誘発した。さらに、模擬感染マウス由来のものを除く、全ての脾細胞集団は、インフルエンザウイルス核タンパク質ペプチド標識した標的物に対して殺傷活性を示した。これらのデータは、マウスにおいて交差反応Ｔｃ細胞応答を誘発するγ−ｆｌｕ調製物の能力を示す。
【０２４５】
（鼻腔内γ−ｆｌｕワクチン接種は致死量のインフルエンザＡ／ＰＲ８に対して防御する）
完全なウイルスワクチンが高い反応原性に起因する合併症を引き起こすこと、およびγ線照射がウイルス免疫原性に対してほとんど影響を与えない（上記に示した）ことを考慮して、γ−ｆｌｕの鼻腔内投与を試験した。鼻腔内γ−ｆｌｕワクチン製剤の有効性を、現在ヒトインフルエンザウイルス調製物に使用されている化学的に不活性化されたワクチン調製物のものと比較した。マウスを、鼻腔内にワクチン接種した。これらの実験において、マウスを単一の用量のみでワクチン接種し、致死量（＞３００×致死量５０）のＡ／ＰＲ８で４週間後に抗原投与した。抗原投与後３週間、マウスの体重を測定し、致死率をモニターした（図６）。γ−Ａ／ＰＲ８ワクチン接種した動物は、同種ウイルスでの抗原投与後、少しの体重減少で完全に回復した（図６Ｂ）。γ−Ａ／ＰＣワクチン接種した動物のＡ／ＰＲ８（すなわち異種ウイルス）での抗原投与により、メモリーＴｃ細胞応答のピークと一致する４日で動物の体重減少の割合がほとんど最初まで回復した（図６Ｃ）（ＭｕｅｌｌｂａｃｈｅｒおよびＴｈａ  Ｈｌａ，１９９３，「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｌａｓｓ  Ｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｕｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｈｙｐｏｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ」，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３，２５２６−２５３１）。γ−Ａ／ＰＣワクチン接種した動物の生存率を、ワクチン接種していない群と有意に比較する（カイ二乗検定を用いてＰ＜０．０５）。ホルマリン不活性化ワクチン調製物でワクチン接種した全てのマウスは急速に体重が減少した（図６Ｄ）。致死率データ（図６Ｅ）は、γ−ｆｌｕでの鼻腔内ワクチン接種が同種および異種インフルエンザＡ抗原投与から防御することを示し、確認した。
【０２４６】
（鼻腔内γ−ｆｌｕワクチン接種対他の投与経路）
異なる経路（鼻腔内（ｉ．ｎ）、静脈内（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）および皮下（ｓ．ｃ．））の接種を、３．２×１０６プラーク形成単位（ＰＦＵ）当量のγ−Ａ／ＰＣでＢＡＬＢ／ｃマウス（１０匹のマウス／群）にワクチン接種するために使用した。ワクチン接種の３週間後、マウスを、致死量の生Ａ／ＰＲ８（６×１０２ＰＦＵ）で鼻腔内に抗原投与し、エンドポイントとして３０％体重減少を用いて致死率および臨床症状をモニターした（図７）。全ての鼻腔内ワクチン接種した動物は、異種サブタイプウイルスでの抗原投与後に体重減少があれば、少しで完全に回復した（図７Ｃ）。対照的に、ほとんどのワクチン接種していないマウス（図７Ａ）、ｉ．ｖ．ワクチン接種したマウス（図７Ｂ）、ｉ．ｐ．ワクチン接種したマウス（データは示さず）およびｓ．ｃ．ワクチン接種したマウス（データは示さず）は、感染後７日および８日で３０％体重減少に達した。生存率データ（図７Ｄ）により、Ａ／ＰＲ８の異常な高い抗原投与量の使用にもかかわらず、ｉ．ｎ．ワクチン接種したマウスが、生存したこと（フィッシャーの正確確率検定を用いてＰ＜０．０５）が示される。
【０２４７】
（ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける致死量のＨ５Ｎ１感染の基礎パラメーター）
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける体重損失を、Ｈ５Ｎ１（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４）での鼻腔内感染後に評価した。図８に示すように、５匹のマウスの群を、希釈剤のみ（群１）またはストックウイルスの１０倍連続希釈（群２〜６、接種濃度を増加させるため）のいずれかで抗原投与した。マウスの体重を測定し、致死率を観察し、２５％より大きい体重損失に到達する前に屠殺した。１１１  ＥＩＤ５０で感染させたマウス（群３）および１１１００  ＥＩＤ５０で感染させたマウス（群５）は、それぞれ、感染後６日および２日で体重減少を示し始めた。
【０２４８】
（Ｈ５Ｎ１トリインフルエンザウイルスに対する防御）
致死量のＨ５Ｎ１抗原投与に対するγ−ｆｌｕの防御効果を試験した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１０匹のマウス／群）を、単一用量のγ−Ａ／ＰＲ８［Ｈ１Ｎ１］（３．２×１０６ＰＦＵ当量／マウス）で鼻腔内にワクチン接種した。ワクチン接種の４週間後、マウスを、３×マウス感染用量５０（３×ＭＩＤ５０）のＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４［Ｈ５Ｎ１］で鼻腔内に抗原投与し、エンドポイントとして２０％体重減少を用いて致死率および臨床症状をモニターした（図９）。コントロール群（模擬ワクチン接種）における１０匹全てのマウスは、Ｈ５Ｎ１感染と一致する臨床症状を示し、感染後、ＡＥＣによって承認されている実験的エンドポイント（２０％以上の体重減少が観察された場合、いずれかの神経学的兆候が検出された場合、または感染により食物／飲料を得ることができない場合（例えば重度の猫背、重度の脱水症、無気力））に従って、ＤＰＩ７日と１４日の間で安楽死させた（図９Ａ）。通常、ワクチンを接種していないマウスは、感染後４日から脂っこく／しわのよった毛になり、２匹のマウスは、異常な後肢の歩き方および後肢の弱さによって分類される神経学的兆候を示し、その時点で、それらを安楽死させ、そして他の全てのマウスは、約２０％体重減少（様々な程度の抑鬱症、無気力および脱水症）時に安楽死させた。
【０２４９】
対照的に、ワクチン接種した全てのマウス（γ−Ａ／ＰＲ８［Ｈ１Ｎ１］）は、研究の間にわたって元気があり、活発であり、感染後２１日の試験の終わりに安楽死させた（図９Ｂ）。一匹の動物のみが感染後４日で１１％の体重減少を示したが、元気で活発であり、試験の終わりまでに抗原投与前の体重に回復した。通常、全てのマウスが致死量のＨ５Ｎ１での抗原投与で生存し、何匹かの動物がそれらの抗原投与前の体重を超えて体重を取り戻した。
【０２５０】
（鼻腔内γ−ｆｌｕワクチン接種は肺からＨ５Ｎ１の迅速なクリアランスを生じる）
上に示したように、全てのワクチン接種したマウスは致死量のＨ５Ｎ１で生存した。従って、そのデータは、鼻腔内に投与される単一用量のγ−ｆｌｕ調製物が、致死量のＨ５Ｎ１ウイルスでの抗原投与に対してマウスにおいて交差防御免疫を誘発することを実証する。ウイルス感染性およびウイルス遺伝的荷重の定量により、トリインフルエンザに対するγ−Ａ／ＰＲ８［Ｈ１Ｎ１］の防御効果が確認され、抗原投与後６日で肺組織からのＨ５Ｎ１ウイルスのクリアランスが示された（表６）。抗原投与後３日で１匹のワクチン接種した動物の肺におけるウイルス感染性およびウイルスＲＮＡの検出により、観察された交差防御免疫が、以前に記載される（Ｂｅｎｎｉｎｋら，１９７８，「Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｌ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ：ｅａｒｌｙ  ａｐｐｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｌｕｎｇｓ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｐｒｉｍｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｙｐｅ  Ａ  ｖｉｒｕｓｅｓ」，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３５：５０３−５０９）ように、未処置のＴｃ細胞のものより加速された活性化速度を表す、メモリーＴｃ細胞によって媒介される可能性が高いことが示されたが、６日ではどれも示されなかった。
【０２５１】
表６．肺および脳におけるＨ５Ｎ１感染性およびウイルス遺伝的荷重
【０２５２】
【表６】
0005689796.tif 000008
【０２５３】
ウイルス感染性および相対的ウイルス遺伝的荷重を、ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０ｇ−１およびｌｏｇ１０  Ｕ／２０ｎｇの抽出ＲＮＡ（３連の反応の幾何学的平均±ｓ．ｄ．）としてそれぞれ表し、逆転写され、リアルタイムＰＣＲを受けた場合、１ユニット（１Ｕ）のウイルスＲＮＡを、任意にＲＮＡ分子の数と定義し、３８のＣＴ値を生じる。
＊感染後の日数。
†検出不能（１０３．２ＴＣＩＤ５０ｇ−１（感染性）より小さいか、または１Ｕ／２０ｎｇの抽出ＲＮＡ（遺伝的荷重）より小さい）。
【０２５４】
（実施例４：γ線不活性化インフルエンザＡウイルスは細胞障害性Ｔ細胞によって最初に媒介されるマウスにおいて交差防御免疫を誘発する）
（ｉ）材料および方法
（細胞およびウイルス）
Ｐ８１５肥満細胞腫およびＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を、３７℃にて５％ＣＯ２を含む加湿空気雰囲気下でＥＭＥＭプラス５％ＦＣＳ中に維持した。Ａ型インフルエンザウイルスＡ、Ａ／ＰＲ／８［Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）］およびＡ／ＰＣ［Ａ／Ｐｏｒｔ  Ｃｈａｌｍｅｒｓ／１／７３（Ｈ３Ｎ２）］を、１０日齢の孵化ニワトリ卵中で増殖させた。各卵に、３７℃にて４８時間インキュベートし、次いで４℃にて一晩保持した、１血球凝集ユニット（ＨＡＵ）のウイルスを含有する０．１ｍｌの正常な生理食塩水を注入した。羊水／尿膜腔液を収集し、プールし、−８０℃にて保存した。力価は、ＭＤＣＬ細胞でプラークアッセイを用いて１０７ＰＦＵ／ｍｌ（Ａ／ＰＣ）および２×１０８ＰＦＵ／ｍｌ（Ａ／ＰＲ８）であった。ウイルスを、記載される（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄら，（１９５４），「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｂｙ  ｒｅｄ−ｃｅｌｌ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｌｕｔｉｏｎ」，Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３５；２１４−２２２）ようにワクチン調製物のためにニワトリ赤血球を用いて精製した。つまり、感染性尿膜腔液を、４℃にて４５分間、赤血球とともにインキュベートし、ウイルス血球凝集素を赤血球に結合させ、次いで遠心分離して、尿膜腔液上清を除去した。ペレットを正常な生理食塩水に再懸濁し、ウイルスから赤血球を遊離するために３７℃にて１時間インキュベートし、次いで遠心分離して、赤血球を除去して、上清中のウイルスを回収した。Ａ／ＰＣストックを精製し、力価は５×１０８ＰＦＵ／ｍｌであった。
【０２５５】
（ウイルス不活性化）
ホルマリン不活性化のために、ウイルスを、４℃にて１週間、０．２％ホルマリンとともにインキュベートした。次いで、ホルマリンを、４℃にて２４時間、正常な生理食塩水を用いて圧力透析によって除去した。透析方法は免疫学における現在のプロトコル（Ａｎｄｒｅｗら，（２００１），「Ｄｉａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」，ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎら，（ｅｄｓ），Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ３：Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ３Ｈを参照のこと）を採用した。紫外線不活性化のために、ウイルスを、１０ｍｍの流体深さを有する６０ｍｍのペトリ皿に入れた。ウイルスを、４℃にて４５分間、１ｃｍ２あたり４０００ｅｒｇに曝露した。γ線不活性化のために、インフルエンザウイルスに、６０Ｃｏ源（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔａｉｏｎ−ＡＮＳＴＯ）から１０ｋＧｙの線量を与えた。ウイルスストックを、γ線照射の間、ドライアイスで凍結し続けた。ウイルス感染の損失を、卵中の不活性化されたウイルス調製物の滴定により確認した。不活性化されたウイルスストックのＨＡＵ力価を、γ線不活性化Ａ／ＰＣについて７．３×１０４ＨＡＵ／ｍｌ、ホルマリンおよび紫外線不活性化Ａ／ＰＣについて２．４×１０４ＨＡＵ／ｍｌになるように決定した。
【０２５６】
（防御実験）
ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６、１２９Ｓｖ／Ｅｖ、β２−ミクログロブリン（β２ｍ−／−）、Ｉｇ  μ−鎖（μＭＴ−／−）、パーフォリン（Ｐｒｆ−／−）、ＩＦＮ−γ受容体（ＩＦＮ−ＩＩＲ−／−）およびＭＨＣ−ＩＩ−／−マウスを、特定の病原体を含まない条件下で飼育した。１０〜１４週齢の雌を使用した。マウスを、不活性化ウイルス調製物（３．２×１０６ＰＦＵ当量）で鼻腔内に免疫化した。致死量の抗原投与のために、免疫化後３週間で、マウスを、Ａ／ＰＲ８（７×１０２ＰＦＵ）で鼻腔内に感染させた。抗原投与後２０日まで、マウスの体重を測定し、致死率をモニターした。
【０２５７】
（養子免疫リンパ球転移実験）
１０週齢のドナーＢＡＬＢ／ｃマウスを、γ線を照射したＡ／ＰＣ（１×１０８ＰＦＵ当量）で静脈内に免疫化した。脾細胞を免疫後３週間で収集した。単一細胞の懸濁液を調製し、赤血球を溶解させた。脾臓リンパ細胞を、ナイロンウールカラムに細胞を通過させることによってＢ細胞およびＴ細胞集団に分離した。２ｍｌの５×１０７細胞／ｍｌをカラムに負荷し、３７℃にて２時間インキュベートした。カラムを温かい（３７℃）ハンクス平衡塩類溶液＋５％ＦＣＳで洗浄し、最初の流出物中の非接着Ｔ細胞を収集した。次に、ナイロンウールに結合したＢ細胞を、冷たい（４℃）ハンクス平衡塩類溶液でカラムを洗浄することによって収集した。Ｔ細胞（８２．８％＋７．９４％Ｂ細胞）およびＢ細胞（８４．２％＋８．３％Ｔ細胞）集団の純度を、フローサイトメトリー解析によって確認した。精製した脾細胞の小集団を２％ＦＣＳを含むＰＢＳ中で洗浄した。Ｆｃ受容体を、４℃にて２０分間、マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（ＦＣγＩＩＩ／ＩＩ受容体）Ａｂ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）とのインキュベーションによってブロックした。細胞を洗浄し、蛍光結合抗ＣＤ３、抗ＣＤ８、抗ＣＤ１９（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）Ａｂｓの混合物とともにさらにインキュベートした。死細胞を７−アミノアクチノマイシンＤ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で標識した。染色した細胞を、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて定量した。精製したＴ細胞またはＢ細胞（０．２ｍｌの体積中に１．１×１０７細胞）を、レシピエントマウスに静脈内注射し、次いで養子細胞転移後３時間でＡ／ＰＲ８（７×１０１ＰＦＵ）で鼻腔内に抗原投与した。抗原投与後２０日まで、マウスの体重減少および致死率を測定した。
【０２５８】
（受動的血清転移実験）
γ線を照射したＡ／ＰＣで鼻腔内免疫化したマウス由来の血清を免疫化後３週間で収集した。プールした免疫血清を５６℃にて３０分間加熱して、補体を不活性化した。レシピエントマウスに、２００μＬの免疫血清を静脈内に与えた。２時間後、レシピエントマウスをＡ／ＰＲ８（７×１０２ＰＦＵ）で抗原投与した。抗原投与後２０日まで、マウスの体重減少および致死率をモニターした。
【０２５９】
（プラーク減少アッセイ）
免疫血清を、生きている、γ線、ホルマリンまたは紫外線により不活性化されたＡ／ＰＣでワクチン接種したマウスから、免疫後３週間で収集した。５６℃にて３０分間、血清サンプルを熱により不活性化した後、１９０μＬの連続希釈した（×１０、×３０、×９０、×２７０）血清を、ほぼ１００ＰＦＵ含有する１０μＬのウイルス（Ａ／ＰＣまたはＡ／ＰＲ８株）懸濁液と混合した。
【０２６０】
（細胞障害性Ｔリンパ球（Ｔｃ細胞）アッセイ）
インフルエンザ特異的Ｔｃ細胞を、生Ａ／ＰＣ（約２×１０６ＰＦＵ）または不活性化されたＡ／ＰＣ（γ線、ホルマリン、紫外線により不活性化された、約１×１０８ＰＦＵ当量）のいずれかをＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈内注射することによって生成した。脾臓を免疫後７日で収集し、赤血球を含まない細胞懸濁液をエフェクター細胞として使用するために調製した。標的細胞を、１の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ）にて生Ａ／ＰＣでＰ８１５細胞を感染させることによって調製し、続いて１００〜２００μＣｉの５１Ｃｒを含有する培地で１時間インキュベートした。洗浄後、標的細胞を、８時間のクロム遊離アッセイにおいて異なる割合でエフェクター細胞と混合した。上清中の放射線のレベルをγ線カウンターで測定した。特異的溶解を、３連のウェルの平均溶解パーセントとして得て、式：（実験のｃｐｍ−自然発生のｃｐｍ）／（最大放出のｃｐｍ−自然発生のｃｐｍ）×１００を用いて値を算出した。エキソビボでの二次的なＴｃ細胞応答に関して、抗原刺激したマウスに、一次免疫後３ヶ月で静脈内の二次免疫化を与え、脾細胞を、クロム遊離アッセイのために免疫後７日で収集した。
【０２６１】
（ｉｉ）結果
（γ線を照射したインフルエンザウイルスによって誘発される異種サブタイプ免疫における免疫血清ならびにＢリンパ球およびＴリンパ球の役割）
交差防御免疫における抗体の役割を決定するために、マウスを、生Ａ／ＰＲ８（７×１０１ＰＦＵ）またはγ線を照射したＡ／ＰＣ（３．２×１０６ＰＦＵ当量）で静脈内に免疫化し、３週間後血液を収集した。未処置のマウスの群に、２００μｌのγ線を照射したＡ／ＰＣ免疫血清、過免疫血清（３週間の間隔で２回用量の生Ａ／ＰＲ８を受容したマウス由来）または免疫前血清のいずれかで静脈内注射し、血清転移後２時間で、致死量のＡ／ＰＲ８ウイルス（７×１０２ＰＦＵ）で抗原投与した。
【０２６２】
図１０は、受動的血清転移は、γ線を照射したＡ／ＰＣによって誘発される異種サブタイプの免疫を未処置のマウスに転移できないことを示す。血清サンプルを、単回用量のγ線を照射したＡ／ＰＣ（３．２×１０６ＰＦＵ当量）または２回用量の生Ａ／ＰＲ８（７×１０２ＰＦＵ）（過免疫）のいずれかで免疫化したドナーマウスからプールした。レシピエントマウス（１群あたり９〜１０匹のマウス）に、０．２ｍｌの免疫血清またはコントロールとして免疫前血清を静脈内に与えた。血清転移後２時間で、マウスを、Ａ／ＰＲ８（７×１０２ＰＦＵ）で鼻腔内に抗原投与した。マウスを、体重減少（図１０Ａ、ＢおよびＣ）および致死率（図１０Ｄ）に関して毎日モニターした。γ線を照射したＡ／ＰＣ免疫血清を受容した未処置のマウスは、免疫前血清を受容したものと同様の臨床的症状および体重減少を示した（図１０Ａ、ＣおよびＤ）。それらのマウスは、急速に体重減少し、２５％のエンドポイントに到達したので、異種サブタイプ抗原投与から防御されなかった。対照的に、過免疫血清を受容したマウスは、同種Ａ／ＰＲ８（７×１０１ＰＦＵ）で抗原投与した場合、実質的に体重減少がなく、完全に防御された（図１０ＢおよびＤ）。これらのデータは、γ線を照射したＡ／ＰＣにより誘発された抗体が交差防御しないことを示す。
【０２６３】
第２に、Ｂ細胞欠損μＭＴ−／−マウスを、交差防御免疫におけるＢ細胞の役割を評価するために使用した。１０週齢のμＭＴ−／−マウスを、γ線を照射したＡ／ＰＣ（３．２×１０６ＰＦＵ当量）で鼻腔内に免疫化し、免疫後３週間で、異種サブタイプ株Ａ／ＰＲ８（７×１０２ＰＦＵ）で抗原投与した。マウスを、２０日間毎日、体重減少および致死率についてモニターした。ワクチン接種したμＭＴ−／−マウスは、未処置のマウス（図１１Ａ、ＢおよびＣ）のものと同様の生存率を示し、これは、Ｂ細胞用量の欠失が交差防御免疫の発達を損なうことを意味する。さらに、γ線を照射したＡ／ＰＣ（３．２×１０６ＰＦＵ当量）での鼻腔内ワクチン接種は、Ａ／ＰＲ８での異種サブタイプ抗原投与に対してＭＨＣ−ＩＩ−／−マウスを防御できなかった（図１２Ａ、ＢおよびＣ）。ＭＨＣＩＩ−／−マウスを、γ線を照射したＡ／ＰＣ（３．２×１０６ＰＦＵ当量）で鼻腔内に免疫化した。免疫化後３週間で、未処置および免疫化したマウス（１群あたり９〜１０匹）を、異種サブタイプ株Ａ／ＰＲ８（７×１０２ＰＦＵ）で抗原投与した。マウスを、２０日間毎日、体重減少および致死率についてモニターした。γ線を照射したＡ／ＰＣでのワクチン接種は、Ａ／ＰＲ８での異種サブタイプ抗原投与に対してＭＨＣ−ＩＩ−／−マウスを防御できなかった。これは、Ｂ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞が、γ線を照射したインフルエンザウイルスによる交差防御免疫の誘発に関与するという証拠を与える。
【０２６４】
ＣＤ８＋  Ｔｃ細胞応答を欠失しているβ２Ｍ−／−マウスを、γ線を照射したＡ／ＰＣ（３．２×１０６ＰＦＵ当量）での鼻腔内免疫化によって誘発される交差防御免疫におけるＣＤ８＋  Ｔ（Ｔｃ）細胞の寄与を評価するために使用した。Ａ／ＰＲ８（７×１０２ＰＦＵ）での異種サブタイプ抗原投与により、６０％の致死率が生じ、生存しているマウスは回復する前に１０％以上の体重を減少した（図１３ＢおよびＣ）。コントロールの同じウイルス株で感染させたワクチン接種していないマウスは、１００％の致死率を被った（図１３ＡおよびＣ）。これは、γ線を照射したインフルエンザウイルスによって誘発される交差防御免疫におけるＣＤ８＋Ｔ細胞についての臨床的役割を示す。
【０２６５】
これらの結果は、インフルエンザに対する交差防御免疫におけるＢ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞についての役割を示すが、ノックアウトマウスにおける不完全な一次免疫反応は、体液性および細胞性メモリー応答の両方の交差防御の可能性を妨げ得る。エフェクター細胞の性質を評価するための代替的アプローチとして、本出願人らは、ドナー細胞として３週間早い静脈内にγ線を照射したＡ／ＰＣ（１×１０８ＰＦＵ当量）で免疫化したマウス由来の脾細胞を有する養子転移モデルを使用した。脾細胞はナイロンウールで増加させたＴ細胞（８２．８％Ｔ細胞、７．９％Ｂ細胞）またはＢ細胞（８４．２％Ｂ細胞、８．３％Ｔ細胞）であり、未処置のマウスに静脈内に転移した。転移後３時間で、マウスを、０．１×ＬＤ５０  Ａ／ＰＲ８（７×１０ＰＦＵ）で抗原投与した。マウスを、２０日間毎日、体重減少および致死率についてモニターした。Ｔ細胞レシピエントは、Ａ／ＰＲ８抗原投与に対して部分的に防御した（図１４Ａ、ＢおよびＤ）。対照的に、防御はＢ細胞レシピエントマウスにおいて観察されず、Ａ／ＰＲ８抗原投与後にコントロール（リンパ球転移のないワクチン接種していない）マウスと同様の疾患症状が進行した（図１４Ａ、ＣおよびＤ）。これらの養子転移研究は、Ａ／ＰＲ８抗原投与に対する交差防御免疫において、Ｂ細胞ではなく、Ｔ細胞についての臨床的役割をさらに支持する。
【０２６６】
ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞を直接殺傷すること、またはＩＦＮ−γおよびＴＮＦなどのサイトカインを分泌することによって抗ウイルス効果を与える。Ｔ細胞のエフェクター機能が異種サブタイプ免疫を与えることを説明するために、ｐｒｆ−／−マウス（プロフェリン媒介性溶解機能を欠く）およびＩＦＮ−ＩＩＲ−／−マウス（その免疫細胞はＩＦＮ−γに反応しない）を利用した。ｐｒｆ−／−マウスを、γ線を照射したＡ／ＰＣ（３．２×１０６ＰＦＵ当量）で鼻腔内に免疫化した。免疫後３週間で、未処置および免疫化したマウス（１群あたり９〜１０匹のマウス）を、異種サブタイプ株Ａ／ＰＲ８（７×１０２ＰＦＵ）で抗原投与した。マウスを、２０日間毎日、体重減少および致死率についてモニターした。γ線を照射したＡ／ＰＣでワクチン接種したマウスは、ｐｒｆ−／−マウスの有意な交差防御を与えることができなかった（図１５Ａ、ＢおよびＣ）。これは、γ線を照射したＡ／ＰＣによって誘発される交差防御が、ＣＤ８＋ＴおよびＮＫ細胞に関連する、パーフォリン媒介性溶解機能を必要することを強く示唆する。
【０２６７】
対照的に、γ線を照射したＡ／ＰＣ（同じ条件）で免疫化したＩＦＮ−ＩＩＲ−／−マウスは、致死量のＡ／ＰＲ８での抗原投与に対して完全に防御された（図１６Ａ、ＢおよびＣ）。従って、ＩＦＮ−γの機能は、交差防御免疫の誘発に必要ではない。
【０２６８】
（γ線を照射したＡ／ＰＣ免疫化マウスの血清中の交差中和活性の欠失）
上記の実施例３に示したように、γ線を照射した（ホルマリンまたは紫外線で不活性化していない）インフルエンザウイルスでの免疫化は、交差防御免疫を誘発する。従って、同種および異種のインフルエンザＡウイルスの株に対して種々に不活性化されたインフルエンザ製剤によって誘発される免疫血清の交差中和活性を試験した。Ａ／ＰＣ（Ｈ３Ｎ２）またはＡ／ＰＲ８（Ｈ１Ｎ１）に対するウイルス中和活性を、生Ａ／ＰＣ、γ線を照射したＡ／ＰＣ、ホルマリンで不活性化したＡ／ＰＣ、または紫外線で不活性化したＡ／ＰＣでの免疫後３週間で収集した血清についてプラーク減少アッセイによって測定した。５６℃にて３０分間、血清サンプルの熱不活性化後、１９０μｌの連続希釈した（×１０、×３０、×９０、×２７０）血清を、約１×１０２ＰＦＵを含有する１０μｌのウイルス懸濁液と混合した。６０分のインキュベーション後、ウイルス／血清混合物をプラークアッセイのために６つのウェルプレートに加えた。ワクチン接種した動物全てから収集した免疫血清は、同種株Ａ／ＰＣ（Ｈ３Ｎ２）に対して高レベルの中和活性を含有した（図１７Ａ）。異種株Ａ／ＰＲ８（Ｈ１Ｎ１）に対して試験した場合、同じ免疫血清は、未処置の血清のものと同様の中和活性のレベルを示した（図１７Ｂ）。これらのデータは、γ線を照射したインフルエンザウイルスを含む、不活性化されたインフルエンザウイルス調製物での免疫化が、もしあれば、限定された交差中和活性を有する高い株特異的の中和抗体を誘発することを示す。
【０２６９】
（γ線を照射したＡ／ＰＣによる交差反応Ｔｃ細胞応答の誘発および程度は用量依存性である）
Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルスとＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスとの間の血清交差中和活性の欠失は、規定されたノックアウトマウスにおいて交差防御免疫を欠く、養子転移実験からの結果は、細胞性免疫が、異種サブタイプ抗原投与に対してマウスを防御することにおいて極めて重要な役割を果たすことを示す。ワクチン接種したマウスにおけるＴ細胞の細胞障害性機能を特徴付けるために、マウスを、生Ａ／ＰＣまたはγ線を照射したＡ／ＰＣのいずれかの種々の用量で静脈内に免疫化し、それらの脾細胞を、免疫後６日で殺傷する特異的標的細胞に関して試験した。２匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、生Ａ／ＰＣまたはγ線を照射したＡ／ＰＣのいずれかの種々の用量で静脈内に免疫化し、脾細胞を免疫後６日で収集した。脾細胞を、模擬処置標的細胞またはＡ／ＰＣ感染標的細胞またはＡ／ＰＲ８感染標的細胞に対するエフェクター細胞として使用した。生Ａ／ＰＣは、広範囲の免疫化用量より強いＴｃ細胞応答を誘発した（図１８Ａ）。高用量（１０８ＰＦＵ当量）のγ線を照射したＡ／ＰＣでの免疫化は、Ａ／ＰＣおよびＡ／ＰＲ８で感染させた標的物に対して強いＴｃ細胞応答を誘発した（図１８Ｂ）。しかしながら、低用量（１．６×１０５ＰＦＵ当量未満）での免疫化は、統計的に有意な交差反応Ｔｃ細胞応答を誘発しなかった。従って、γ線を照射したＡ／ＰＣによるＴｃ細胞応答の程度は免疫化用量と相関する。
【０２７０】
（γ線を照射したＡ／ＰＣによるメモリーＴｃ細胞の誘発）
上記の実施例３に記載したように、γ線を照射したＡ／ＰＣでの免疫化は、少なくとも３ヶ月間、交差防御を与える。従って、長期間継続する防御の役割を担うメモリーＴ細胞の寿命を調べた。２匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、生Ａ／ＰＣ（２×１０６ＰＦＵ）、Ａ／ＰＲ８（１×１０７ＰＦＵ）またはγ線を照射したＡ／ＰＣ（１×１０８ＰＦＵ当量）のいずれかで１回または２回、静脈内に免疫化した。二次免疫を抗原刺激後３週間に与えた。脾細胞を二次免疫後７日に収集し、模擬処置標的細胞、Ａ／ＰＣ感染標的細胞、またはＡ／ＰＲ８感染標的細胞あるいは、Ｋｄを制限した核タンパク質由来のペプチド（ＮＰＰ）で標識したＰ８１５細胞に対するエフェクター細胞として使用した。生きている異種サブタイプ株Ａ／ＰＲ８での二次免疫は、強い二次Ｔｃ細胞応答を誘発した（図１９）。対照的に、二次免疫として生きている同種株Ａ／ＰＣを受容したマウスは、Ｔｃ細胞有効性の増大を示さなかった（図１９）。
【０２７１】
（ｉｉｉ）考察
上記の実施例に記載したように、特に鼻腔内に投与される場合、γ線を照射したインフルエンザＡウイルスは、感染力の強いトリＨ５Ｎ１株を含む、致死量の同種および異種サブタイプのウイルス抗原投与に対して強力な防御を与える。これらのデータは、交差反応体液性免疫ではなく、交差反応細胞性免疫が、Ｔｃ細胞によって主に媒介され、γ線を照射したインフルエンザウイルスによって誘発される交差防御免疫に関与する必須要素であることを示す。この結論は、以下の証拠のいくつかの独立した系統に基づく：１）β２Ｍ−／−マウスは交差防御免疫反応を生成しなかった；２）γ線を照射したインフルエンザ免疫ドナーマウス由来の、Ｂ細胞でも免疫血清でもなく、増加したＴ細胞の転移が未処置のレシピエントに対して交差反応免疫を与えた；３）調製物によって誘発される交差防御免疫は、必須の細胞障害性エフェクター分子パーフォリンに依存した。
【０２７２】
ＩＦＮ  ＩＩＲ−／−マウスにおいて誘発される交差防御免疫の誘発とともに、後者の観測は、細胞障害性Ｔｃ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞ＩＦＮ−γ媒介性ウイルスコントロールによってではなく、細胞毒性の顆粒エキソサイトーシスを介してウイルス感染細胞を殺傷することによって防御を与えることを強く示唆する。上記と一致して、γ線を照射したインフルエンザウイルスでの免疫化は、生きているウイルスによって誘発されるものに対して同様のＴ細胞応答を誘発できる。この交差反応Ｔ細胞の効果は、少なくとも３ヶ月間持続し、インビボでの再免疫化に際してより強い二次的Ｔｃ反応を導く。これは、γ線を照射したインフルエンザウイルスで免疫化したマウスが、少なくとも３ヶ月間、異種サブタイプの抗原投与に対して十分に防御されるという観測と相関する。しかしながら、同種株での免疫化は、二次的Ｔｃ反応を増加させなかった。この観測は、一次免疫が、同種ウイルスでの二次抗原投与を中和する高い株特異的抗体反応を誘発するので、メモリーＴｃ細胞活性化を抑制することを示唆する。
【０２７３】
交差反応Ｔｃ細胞応答の誘発は、複製の生きているウイルスとは対照的にγ線を照射したウイルスで高い用量依存性であった。異種サブタイプの防御を与える際の支配的要因と識別されたＴｃ細胞とともに、この防御反応に対するＢ細胞による寄与のさらにいくつかの証拠が存在した。なぜなら、μＭＴ−／−マウスもまた、異種サブタイプ抗原投与に対して高い感受性を示したからである。血清中の交差中和抗体反応の欠失および転移された血清の防御効果の欠失は、Ｂ細胞の寄与が、それらの可溶性産物の抗体と独立していることを示唆する。特定の状況において、未処置のＢ細胞は、抗体依存性形態で二次感染に対してμＭＴ−／−マウスにおける免疫を回復できると考えられる。さらに、Ｂ細胞はエフェクターＴｃ細胞機能を促進する役割を有し得る。従って、交差防御抗体の可能性のある役割は少しだけではなく、粘膜交差中和抗体もまた、異種サブタイプ免疫に寄与し得る。統計的に有意ではないが、β２Ｍ−／−およびｐｒｆ−／−マウスにおいて観測される部分的交差防御がこの考えを支持する。さらに、養子Ｔ細胞転移によって得られる受動免疫は、致死下用量の感染性の強いＡ／ＰＲ８に対する防御の際に部分的に成功するだけであった。従って、抗体およびＴｃ細胞の両方は、最終的に、最適な交差防御に寄与し得る。
【０２７４】
（実施例５：紫外線で不活性化されたインフルエンザワクチンおよびホルマリンで不活性化されたインフルエンザワクチンと比較してγ線で不活性化されたインフルエンザワクチンの優位性）
（ｉ）材料および方法
（マウス）
９〜１０週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスをこれらの研究において慣例的に使用した。
（ウイルスおよび細胞）
Ｐ８１５肥満細胞腫、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）およびベビーハムスター（ＢＨＫ）細胞を増殖させ、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下中で３７℃にてＥＭＥＭおよび５％ＦＣＳに維持した。Ａ型インフルエンザウイルス、Ａ／ＰＲ／８［Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）］およびＡ／ＰＣ［Ａ／Ｐｏｒｔ  Ｃｈａｌｍｅｒｓ１／７３（Ｈ３Ｎ２）］を、１０日齢の孵化ニワトリ卵中で増殖させた。各卵に、１血球凝集素ユニット（ＨＡＵ）のウイルスを含有する０．１ｍｌの生理食塩水を注入し、３７℃にて４８時間インキュベートし、４℃にて一晩保持した。次いで、尿膜腔液を収集し、プールし、−８０℃にて保存した。力価は、ＭＤＣＫ細胞でプラークアッセイを用いて１０７ＰＦＵ／ｍｌ（Ａ／ＰＣ）および２×１０８ＰＦＵ／ｍｌ（Ａ／ＰＲ８）であった。ウイルスを、記載される（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄら，（１９５４），「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｂｙ  ｒｅｄ−ｃｅｌｌ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｌｕｒｉｏｎ」，Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３５：２１４−２２２）ようにワクチン製剤のためにニワトリの赤血球を用いて精製した。つまり、感染性尿膜腔液を、４℃にて４５分間、赤血球細胞とともにインキュベートし、血球凝集素を赤血球に結合させ、次いで遠心分離して、尿膜腔液上清を除去した。ペレットを生理食塩水に懸濁し、３７℃にて１時間インキュベートして、ウイルスから赤血球を遊離し、次いで遠心分離して、赤血球を除去し、上清中のウイルスを収集した。精製したＡ／ＰＣ力価は５×１０８ＰＦＵ／ｍｌであった。
【０２７５】
（ウイルス不活性化）
ホルマリン不活性化のために、ウイルスを、４℃にて１週間、０．２％ホルマリンとともにインキュベートした。次いで、ホルマリンを、４℃にて２４時間、生理食塩水を用いて圧力透析により除去した。透析方法は、免疫学における現在のプロトコル（Ａｎｄｒｅｗら，（２００１），「Ｄｉａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」，Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎら（ｅｄｓ），Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ３：Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ３Ｈを参照のこと）から適合した。紫外線不活性化のために、ウイルスを、１０ｍｍの流体深さを有する６０ｍｍのペトリ皿に入れた。ウイルスを４℃にて４５分間、４０００ｅｒｇ／ｃｍ２に曝露した。γ線不活性化のために、インフルエンザウイルスに、６０ＣＯ線源（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ−ＡＮＳＴＯ）から１０ｋＧｙの線量を与えた。ウイルスストックを、γ線照射の間にドライアイス上で凍結し続けた。ウイルス感染性の損失を、卵中の不活性化されたウイルス調製物の滴定により確認した。不活性化されたウイルスストックのＨＡＵ力価は、γ−Ａ／ＰＣについて７．２９×１０４ＨＡＵ／ｍｌ、ホルマリン−Ａ／ＰＣおよび紫外線−Ａ／ＰＣについて２．４３×１０４ＨＡＵ／ｍｌになるように測定した。
【０２７６】
（γ線により不活性化されたインフルエンザの凍結乾燥）
凍結乾燥のために、０．５ｍｌのγ線により不活性化されたＡ／ＰＣを含有する１つのバイアルを、マニホルドフリーズドライヤー（ＦＴＳ  ＳＹＳＴＥＭＳ，Ｄｕｒａ−ＤｒｙＴＭ  ＭＰ）に入れた。
【０２７７】
（血球凝集アッセイ）
生きているウイルス調製物および不活性化されたウイルス調製物を、９６ウェルＵ底マイクロタイタープレート上で１００μ容積中で連続希釈した。０．５％のニワトリ赤血球懸濁液を全てのウェルに加え、プレートを氷上で３０分間インキュベートした。この方法は、微生物学における現在のプロトコル（Ｓｚｒｅｔｔｅｒら，（２００６），「Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ：ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ，ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｓｔｏｒａｇｅ」，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｉｃｏら（ｅｄｓ），Ｃｈａｐｔｅｒ  １５：Ｕｎｉｔ  １５Ｇ  １１を参照のこと）から適合した。
【０２７８】
（防御実験）
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、特定の病原体を含まない条件下で飼育した。１０〜１４週齢の雌を使用した。マウスを、不活性化されたウイルス調製物（３．２×１０６ＰＦＵ当量）または三価の不活性化されたサブユニットインフルエンザワクチン（ＣＳＬ  ｆｌｕｖａｘワクチン；Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６  Ｈ１Ｎ１，Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７  Ｈ３Ｎ２，Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６；３ｍｇの血球凝集素）で静脈内に免疫化した。ホルマリンにより不活性化されたＡ／ＰＣでワクチン接種したマウスを、２および３週間後に１回または２回、再免疫化した。致死量の抗原投与のために、免疫後１〜３週間で、マウスを、５０％のマウス致死用量（ＭＬＤ５０）で鼻腔内に感染させた。ＭＬＤ５０は、予備実験において、Ａ／ＰＲ８およびＡ／ＰＣに関して、それぞれ７×１０２ＰＦＵおよび３．２×１０５ＰＦＵになるように測定した。肺ウイルス力価の解析のために、３匹のマウスを、抗原投与後３日および６日に安楽死させた。残っている動物を、抗原投与後２０日まで、体重減少および致死率についてモニターした。
【０２７９】
（プラークアッセイ）
肺組織サンプルを、鼻腔内抗原投与後、３日および６日で収集した。除去後、全肺を生理食塩水中でホモジナイズした。ホモジネートを、１５００ｒｐｍにて５分間、遠心分離した。上清を収集し、−２０℃で保存した。サンプルの連続希釈物を、６ウェル組織培養プレートで培養したＭＤＣＫ細胞に接種した。１時間吸着後、細胞を、１．８％のＢａｃｔｏ−Ａｇａｒを含有するＥＭＥＭ培地で覆った。２〜３日間のインキュベーション後、細胞単層を、２．５％のクリスタルバイオレット溶液で染色し、プラークを数えた。
【０２８０】
（肺組織構造）
肺組織サンプルを、１０％の中性緩衝ホルムアルデヒド中で最大２４時間、固定した。１０μｍの断片をヘマトキシリン−エオシンで染色し、光学顕微鏡検査により評価した。
【０２８１】
（細胞障害性Ｔリンパ球（Ｔｃ細胞）アッセイ）
インフルエンザ特異的Ｔｃ細胞を、生Ａ／ＰＣまたは不活性化された、１０８ＰＦＵ当量のＡ／ＰＣ（γ線、ホルマリン、または紫外線で不活性化された）のいずれかをＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈内注射することにより生成した。脾臓を、免疫後７日で収集し、赤血球を含まない細胞懸濁液を、エフェクター細胞として使用するために調製した。標的細胞を、生Ａ／ＰＣについて１および不活性化されたＡ／ＰＣについて１０の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ）にてＰ８１５細胞を感染させることによって調製し、続いて、１００〜２００μＣｉの５１Ｃｒを含有する培地中で１時間インキュベートした。洗浄後、標的細胞を、８時間のクロム遊離アッセイにおいて異なる割合でエフェクター細胞と混合した。上清中の放射線のレベルを、γ線カウンターで測定した。特定の溶解を、３連のウェルの平均溶解パーセントとして得て、式：（実験のｃｐｍ−自然発生のｃｐｍ）／（最大放出のｃｐｍ−自然発生のｃｐｍ）×１００を用いて算出した。
【０２８２】
（ｉｉ）結果
（血球凝集活性に対するウイルス不活性化の効果）
ウイルス不活性化後の血球凝集アッセイは、滅菌処理の効果を変性させるような１つの指標を与える。精製したインフルエンザストックを、バッチ中にアリコートし、ホルマリン、紫外線またはγ線のいずれかで処理した。孵化卵中にウイルス増殖が存在しないことにより検証した感染性の完全な不活性化後、生きているウイルスと不活性化されたウイルスとの血球凝集活性を比較した（表７）。
【０２８３】
表７．不活性化されたインフルエンザウイルスＡ／ＰＣ調製物の血球凝集活性
【０２８４】
【表７】
0005689796.tif 000009
【０２８５】
血球凝集活性は、γ線を照射したウイルスに関して３倍減少しが、ホルマリンおよび紫外線による不活性化は血球凝集価を９倍減少させた。これらの結果は、これらの３つのウイルス滅菌法のうち、γ線照射がウイルスタンパク質構造を最も少なく変性させるという証拠を与える。
【０２８６】
（ホルマリンまたは紫外線による不活性化ではなく、γ線を照射したウイルス調製物は異種サブタイプ免疫を誘発する）
同種および異種サブタイプの生きているウイルス抗原投与に対する、γ線を照射して不活性化されたインフルエンザウイルス調製物、ホルマリンで不活性化されたインフルエンザウイルス調製物または紫外線で不活性化されたウイルス調製物の防御効果を比較した。９〜１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、模擬処置するか、またはホルマリンで不活性化されたＡ／ＰＣ、紫外線で不活性化されたＡ／ＰＣ、もしくはγ線で不活性化されたＡ／ＰＣ（３．２×１０６ＰＦＵ当量）のいずれかで静脈内に免疫化し、免疫後３週間で、未処置のマウスおよび免疫化したマウス（１群あたり９〜１０匹）を、Ａ／ＰＣ（ＭＬＤ５０；３．２×１０５ＰＦＵ）またはＡ／ＰＲ８（ＭＬＤ５０；７．０×１０２ＰＦＵ）で静脈内に感染させた。感染させたマウスの生存を、２０日間毎日モニターした。図２０Ａ、Ｅ、ＦおよびＪに示すように、Ａ／ＰＣまたはＡ／ＰＲ８での未処置のマウスの鼻腔内感染は、９０〜１００％の致死率を有する急速な体重減少を生じた（エンドポイントとして２５％の体重減少に基づく）。ホルマリンで不活性化されたＡ／ＰＣ（図２０ＢおよびＥ）または紫外線で不活性化されたＡ／ＰＣ（図２０ＣおよびＥ）のいずれかで免疫化したマウスもまた、生きている同種のウイルスで抗原投与した場合、顕著な体重減少を生じ、約７０％の致死率を生じた。同様に、ワクチン接種したマウスを、異種サブタイプ株Ａ／ＰＲ８で抗原投与し、動物は９０〜１００％の致死率で相当の体重を減少させた（図２０Ｇ、ＨおよびＪ）。同種および異種サブタイプの抗原投与の両方の場合において、誘発される防御は、ワクチンとして使用するのに不十分であるとみなした（Ｐ値＞０．０５、フィッシャーの正確確率検定）。対照的に、単一の用量のγ線で不活性化されたＡ／ＰＣで免疫化したマウスは、同種のウイルス抗原投与に対して防御されなかっただけではなく、異種サブタイプの抗原投与に対しても防御されず、マウスは平均で５％のみの体重を減少した（図２０Ｄ、Ｅ、ＩおよびＪ）。従って、γ線を照射したインフルエンザウイルスは、同種および異種サブタイプインフルエンザウイルス抗原投与に対する防御免疫を誘発するための非常に最も効果的なワクチン調製物であることが判明した（Ｐ＜０．０５）。
【０２８７】
（複数回投与のホルマリンで不活性化されたインフルエンザウイルス調製物は防御効果を高めることができるか）
γ線で不活性化されたＡ／ＰＣは、ホルマリンで不活性化された調製物の複数回の鼻腔内投与より、１回のみの鼻腔内投与の後、明らかにより効果的であった。次いで、ホルマリンで不活性化されたＡ／ＰＣの弱い防御効果が、異なる免疫化スケジュールを試験することによって改良され得るか否かを測定した。９〜１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、模擬処置するか、またはホルマリンで不活性化されたＡ／ＰＣ（９．６×１０６ＰＦＵ当量またはγ線で不活性化されたＡ／ＰＣのものと等しいＨＡＵ用量；２３００ＨＡＵ）で１回、２回もしくは３回のいずれかで免疫化した。模擬処置したマウスまたは単一用量で免疫化したマウスを、免疫後３週間にＡ／ＰＣ（ＭＬＤ５０；３．２×１０５ＰＦＵ）で抗原投与した。２倍または３倍用量の免疫化したマウスを、最終免疫後１週間にＡ／ＰＣ（ＭＬＤ５０；３．２×１０５ＰＦＵ）またはＡ／ＰＲ８（ＭＬＤ５０；７×１０２ＰＦＵ）で静脈内に感染させた。感染させたマウスの生存を２０日間毎日モニターした。単一の免疫化を受けたマウスの群は、ワクチン接種していないマウスと比較して生存率が改良されなかった（図２１Ａ、ＢおよびＥ）。対照的に、２倍の免疫化は６０％（Ｐ＜０．０５）まで生存率が改良されたが、ほとんどのマウスはさらに、体重の顕著な減少を示し、それらのマウスが重症疾患を受けたことを示す（図２１ＣおよびＥ）。ホルマリンで不活性化されたＡ／ＰＣで３倍の免疫化を受けたマウスは、致死せず、ほとんど体重を減少しない完全な防御を示した（図２１ＤおよびＥ）。３倍の免疫化は、異種サブタイプの抗原投与からの部分的な防御を与えた（Ｐ＜０．０５）（図２１Ｆ、ＧおよびＨ）。このように、ホルマリンで不活性化されたＡ／ＰＣは、より多くの用量を必要とし、交差防御を誘発できず、誘発された免疫が、定量的だけでなく、定性的にも、γ線により不活性化されたＡ／ＰＣによって誘発されたものより実質的に劣ることを示唆する。
【０２８８】
（三価インフルエンザワクチンは連続変異株に対して無効である）
直接比較のために、市販の三価インフルエンザワクチンの防御効果を、本明細書に記載した実験的アプローチにおいて試験した。マウスを、三価インフルエンザワクチン（ＣＳＬ  ｆｌｕｖａｘワクチン；Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６  Ｈ１Ｎ１，Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７  Ｈ３Ｎ２，Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６；３μｇ血球凝集素）で、免疫後３週間に静脈内に１回免疫化し、未処置のマウスおよび免疫化したマウスを、Ａ／ＰＣ（３．２×１０５ＰＦＵ／マウス）またはＡ／ＰＲ８（７×１０２ＰＦＵ）のいずれかで静脈内に抗原投与した。感染したマウスの生存率を、２０日間、毎日モニターした。図２２に示すように、マウスの単一の鼻腔内免疫化は、Ａ／ＰＣ（３．２×１０５ＰＦＵ）（図２２Ａ、ＢおよびＣ）ならびにＡ／ＰＲ８（７×１０２ＰＦＵ）（図２２Ｄ、ＥおよびＦ）の両方に対して統計的に有意な防御を与えなかった（Ｐ＞０．０５）。これは明らかに、現在のインフルエンザワクチン用量が、同じサブタイプ内の株に対してさえ、単一の用量後に感知できる交差防御を与えないことを示す。
【０２８９】
（γ線により不活性化されたＡ／ＰＣでのワクチン接種後の最小のインフルエンザ感染により誘発された肺炎症）
γ線を照射したＡ／ＰＣ、ホルマリンで不活性化されたＡ／ＰＣおよび紫外線で不活性化されたＡ／ＰＣでのワクチン接種（３．２×１０６ＰＦＵ当量）の３週間後、マウスを、生ウイルスのＡ／ＰＣ株（同種）またはＡ／ＰＲ８株（異種サブタイプ）のいずれかで抗原投与した。生存しているマウスの肺を抗原投与の２１日後に収集し、組織構造のために肺を処理した。肺のサンプルは、与えられた免疫化のタイプに対応する、注目すべき組織構造の相違を示した。図２３に示すように、ワクチン接種したマウスを同種ウイルスＡ／ＰＣで抗原投与した場合、限定された炎症反応が見られた。全ての３種類のワクチン接種した群（γ線を照射したＡ／ＰＣ、ホルマリンで不活性化されたＡ／ＰＣまたは紫外線で不活性化されたＡ／ＰＣ）からの肺断片を未処置の組織のものの外観と比較した（図２３Ａ、Ｃ、ＤおよびＥ）。対照的に、ワクチン接種されていないマウス、Ａ／ＰＣ抗原投与したマウス由来の肺組織は、広範囲の炎症反応を示した（図２３Ｂ）。異種サブタイプの抗原投与は、種々のワクチン接種した群の間で明白な相違を生じた。
【０２９０】
ホルマリン−Ａ／ＰＣおよび紫外線−Ａ／ＰＣでワクチン接種した動物における炎症反応は強く、ワクチン接種後２１日にＡ／ＰＲ８を抗原投与した後のワクチン接種していない動物のものと同様であった（図２４Ｂ、ＤおよびＥ）。対照的に、γ線を照射したＡ／ＰＣでワクチン接種した動物における肺炎症は、Ａ／ＰＲ８での異種サブタイプの抗原投与後に限られた（図２４Ｃ）。それらの肺は、弱いリンパ球浸潤を有する局所性炎症を示したが、全身状態は未処置の肺のものと同様であった（図２４Ａ）。
【０２９１】
（γ線により不活性化されたＡ／ＰＣワクチンは感染を防御しないが、ウイルスクリアランスを促進する）
Ａ／ＰＲ８での異種サブタイプの抗原投与後の３日および６日での肺のウイルス負荷に対するワクチン接種の効果を評価した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、γ線を照射して不活性化されたＡ／ＰＣ、ホルマリンで不活性化されたＡ／ＰＣまたは紫外線で不活性化されたＡ／ＰＣ（３．２×１０６ＰＦＵ当量）のいずれかで、免疫後３週間に、鼻腔内に免疫化し、未処置のマウスおよび免疫化したマウスをＡ／ＰＲ８ウイルス（ＭＬＤ５０）で鼻腔内に抗原投与した。感染後３日および６日に、１群あたり３匹のマウスを屠殺し、肺におけるウイルス力価を、上記のＭＤＣＫ細胞を用いてプラークアッセイによって測定した。感染後、３日および６日間で、それぞれ１０７および１０６ＰＦＵ／肺に達する高ウイルス力価を、ワクチン接種していないマウスにおいて検出した（図２５）。ホルマリンで不活性化されたＡ／ＰＣおよび紫外線で不活性化されたＡ／ＰＣで免疫化したマウスの肺におけるウイルス力価は、ワクチン接種していないコントロールマウスにおいて検出されたものに匹敵した。対照的に、γ線を照射したＡ／ＰＣでワクチン接種した群は、抗原投与後３日および６日の両方において、ワクチン接種していないコントロールマウスにおいて見られるものと比べてＡ／ＰＲ８肺ウイルス力価の１００倍より大きい減少を示した（スチューデントのＴ検定を用いてＰ＜０．０５）。
【０２９２】
（ホルマリンで不活性化されたウイルスまたは紫外線で不活性化されたウイルスではなく、γ線で不活性化されたウイルスはＴｃ細胞免疫原性を保持する）
生Ａ／ＰＣおよび不活性化されたＡ／ＰＣ（γ線、ホルマリン、紫外線）によってインフルエンザ免疫細胞障害性Ｔ（Ｔｃ）細胞応答を生じる能力を比較した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、生Ａ／ＰＣ、γ線を照射して不活性化されたＡ／ＰＣ、ホルマリンで不活性化されたＡ／ＰＣ、または紫外線で不活性化されたＡ／ＰＣで静脈内に免疫化した。脾細胞を、免疫後７日に収集し、Ａ／ＰＣで感染させたＰ８１５標的細胞に対するエフェクター細胞として使用した。生きているウイルスでの感染後のＴｃ細胞応答のピークを、免疫後７日に検出した（データは示さず）。静脈内免疫後の７日に、各群由来の２匹のマウスを評価した。生きているＡ／ＰＣ（１０７ＰＦＵ）またはγ線で不活性化されたＡ／ＰＣ（１０８ＰＦＵ当量）で免疫化したマウスから収集したエフェクター脾細胞は、Ａ／ＰＣで感染させた標的細胞を溶解させたが、ホルマリンで不活性化されたＡ／ＰＣまたは紫外線で不活性化されたＡ／ＰＣで免疫化したマウス由来のエフェクター細胞は溶解させなかった（図２６）。
【０２９３】
（γ線で不活性化されたＡ／ＰＣでの鼻腔内免疫化は高用量の異種サブタイプの抗原投与に対する防御を与える）
異種サブタイプの抗原投与からマウスを防御するγ線を照射したＡ／ＰＣの優れた防御能力を考慮して、防御の限界を、増大させたインフルエンザウイルス用量で抗原投与することによって調べた（図２７）。９〜１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群を模擬処置するか、またはγ線で不活性化されたＡ／ＰＣ（３．２×１０６ＰＦＵ／ｍｌ当量）で鼻腔内に免疫化し、免疫後３週間にて、ＬＤ５０  Ａ／ＰＲ８、５×ＬＤ５０  Ａ／ＰＲ８、または５０×ＬＤ５０Ａ／ＰＲ８のいずれかで鼻腔内に抗原投与した。感染させたマウスの生存および体重減少を２０日間モニターした。１×ＬＤ５０の異種サブタイプ抗原投与を受けた免疫化マウスは全て生存し、ほとんどまたは全く体重減少しなかった（図２７ＣおよびＦ）。５×ＬＤ５０の抗原投与用量を与えた免疫化マウスは、抗原投与後の最初の７日間で、初めに体重減少したが、顕著ではなく、全て完全に回復した（図２７ＤおよびＦ）。５０×ＬＤ５０を受けたマウスは平均８％の体重を減少させたが、ここでも全てのマウスは完全に回復した（図２７ＥおよびＦ）。１×ＬＤ５０または５×ＬＤ５０を受けた未処置のマウスは徐々に体重減少し、抗原投与で生存できなかった（図２７Ａ、ＢおよびＦ）。
【０２９４】
（γ線により不活性化された調製物によって与えられる長期間継続する異種サブタイプ防御）
有効なインフルエンザワクチンについての重要な要件は、持続する異種サブタイプ免疫の誘発である。９〜１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、模擬処置するか、またはγ線により不活性化されたＡ／ＰＣ（３．２×１０６ＰＦＵ当量）で静脈内に免疫化し、免疫後３ヶ月にて、マウスを、ＭＬＤ５０  Ａ／ＰＲ８（７×１０２ＰＦＵ）で静脈内に抗原投与した。感染させたマウスの生存および体重減少を２０日間モニターした。１×ＬＤ５０  Ａ／ＰＲ８で抗原投与したワクチン接種したマウスは、平均で１０％までのみの体重を減少させ、完全に回復した（図２８ＢおよびＣ）。対照的に、ほとんどの抗原投与した未処置のマウスはかなりの体重を減少させ、抗原投与後約７日で体重損失の合計２５％のエンドポイントに達した（図２８ＡおよびＣ）。
【０２９５】
（凍結乾燥用量はγ線により不活性化されたＡ／ＰＣの免疫原性を破壊しない）
現在の液体ベースのインフルエンザワクチンの既知の欠点は、特に発展途上国においてワクチン分配に関する問題を課す冷蔵保存の必要性である。現在のインフルエンザワクチンの厳しい保存の必要性を克服する試みにおいて、凍結乾燥しているγ線により不活性化されたインフルエンザウイルスを、冷蔵保存の必要性を省略する手段として評価した。γ線により不活性化されたＡ／ＰＣストックを凍結乾燥し、鼻腔内投与（３．２×１０６ＰＦＵ当量）の直前に希釈した水に再懸濁した。９〜１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、模擬処置するか、または凍結乾燥したγ線により不活性化されたＡ／ＰＣで免疫化し、免疫後３週間に異種サブタイプ株Ａ／ＰＲ８（７×１０２ＰＦＵ）で抗原投与した。マウスの生存および体重減少を、２０日間毎日モニターした。ほとんどのマウスは、１０％未満の全体重減少であったが、２／１０のマウスのみが１０％以上の全体重を減少させ、軽度の症状を示した。全てのワクチン接種したマウスは、未処置のマウスにおける１０％生存とは対照的に、Ａ／ＰＲ８（７×１０２ＰＦＵ）での異種サブタイプの抗原投与で生存した（図２９Ａ、ＢおよびＣ）。これらのデータは、凍結乾燥プロセスが、異種サブタイプ免疫を誘発する、γ線により不活性化されたＡ／ＰＣの能力を著しく減少させないことを示唆する。
【０２９６】
（スプリットワクチン（ｓｐｌｉｔ  ｖａｃｃｉｎｅ）と比較したγ線により不活性化されたインフルエンザの優位性）
以下に明らかにしたマウスにおける鼻腔内ワクチン接種後の商業的に利用可能なインフルエンザワクチン、Ｆｌｕ−ｖａｘと、γ線を照射した精製したインフルエンザウイルスとの交差防御効果の比較。
【０２９７】
【表８】
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【０２９８】
従って、γ線を照射したインフルエンザウイルスは、当量ウイルス用量に基づいて、商業的に利用可能なインフルエンザワクチンより少なくとも３０〜１００倍有効であり、品質において、存在する商業的に利用可能なインフルエンザワクチンより優れている。
【０２９９】
（ｉｉｉ）考察
本研究は、相対的設定において、１９４５年から現在使用されている化学的不活性化法が、インフルエンザワクチン調製物について最も適切な選択であるか否かを評価するために、３種類の不活性化療法、γ線、およびホルマリン、または紫外線による不活性化の防御効果を評価した。γ線により不活性化されたＡ／ＰＣ（３．２×１０６ＰＦＵ当量、２３００ＨＡＵ）は、他の滅菌法と比較して優れた免疫原性を有し、同種抗原投与および異種抗原投与の両方に対して高レベルの防御を与える。この優れた防御は、１００％の生存およびより少ない体重減少で反映され、感染後の肺組織の組織学的評価と相関し、未処置のマウス、およびホルマリンまたは紫外線で不活性化されたウイルスでワクチン接種したマウスと比べて肺のウイルス負荷を減少させた。同様に、単一用量の現在使用されている三価インフルエンザワクチンは、Ａ／ＰＣまたはＡ／ＰＲ８抗原投与に対して防御を与えなかった。
【０３００】
３倍高い用量のホルマリンで不活性化されたＡ／ＰＣ（９．６×１０６ＰＦＵ当量、２３００ＨＡＵ）および多重免疫化が、γ線により不活性化されたＡ／ＰＣによって与えられる防御レベルを得るのに必要とされた。さらに、ホルマリンにより不活性化されたＡ／ＰＣは、同種（異種サブタイプではなく）ウイルス抗原投与に対してのみ防御を与えた。従って、免疫化の用量および頻度の増加のみが、ホルマリンで不活性化されたウイルスの株特異的免疫を向上させる。不活性化されるウイルス粒子１つあたりに関して、γ線により不活性化されたウイルスは、ホルマリンで不活性化されたウイルスより免疫原性であると留意することは重要である。なぜなら、株特異的免疫を得るために、ホルマリンにより不活性化されたウイルス調製物は、γ線を照射したＡ／ＰＣについての単一の抗原刺激とは対照的に、匹敵するＨＡＵに関して３倍多いＰＦＵおよび３倍の免疫化を必要としたからである。これらの知見は、γ線による不活性化が、他の処置と比べて優れた抗原性および免疫原性を維持することを実証する。従って、γ線により不活性化されたウイルスは、ホルマリン処置または紫外線照射によって不活性化されたウイルス調製物より定量的だけでなく、定性的にも優れた免疫を誘発できる。
【０３０１】
パンデミック現象において、γ線を照射したウイルスによって見込まれている単一用量の投薬計画は、複数回用量、高用量、補助剤も必要とするホルマリンで不活性化されたインフルエンザワクチンでの免疫化の投薬計画より比較にならないほど好ましい。さらに、γ線により不活性化されたインフルエンザに関して、補助剤を必要としないという事実は、副作用を引き起こす反応原性の問題に出くわす可能性が少ないことを示唆する。ミョウバンは、ヒトワクチンについて最も一般に使用される補助剤であるが、インフルエンザワクチン抗原の免疫原性を高めることに効果的でないことが証明されている。さらに、ミョウバンは、γ線により不活性化されたウイルスの有効性を減少させ得る２型ヘルパーＴ（Ｔｈ）により支援される体液性免疫反応に対する免疫反応を歪める。なぜなら、γ線により不活性化されたウイルスは、異種サブタイプ防御と相関するＴｃ細胞応答を含む、Ｔｈ１型の細胞性免疫反応を誘発することが知られているからである。さらに、γ線を照射したインフルエンザウイルスの効果は、単一用量の鼻腔内抗原刺激後に、免疫化マウスが、誘発される強力な免疫を受けている３ヶ月までの期間、５０×ＬＤ５０用量までの異種サブタイプの抗原投与に抵抗性があり得るという事実によって強調される。
【０３０２】
γ線を照射したウイルスによって誘発される交差防御は、粘膜Ｔｃ細胞応答によって媒介されると推測される。代替の仮説は、鼻腔内ウイルスタンパク質に対する交差反応分泌型ＩｇＡ抗体の誘発である。一部の分泌型ＩｇＡ抗体は、感染させた上皮細胞へのトランサイトーシスの間、インフルエンザウイルスを細胞内中和でき、このデータは、不活性化されたインフルエンザウイルスの他の形態が、インフルエンザ免疫Ｔｃ細胞応答を抗原刺激できないため、交差反応Ｔｃ細胞が、本明細書において観測される交差防御に関与し得ることを示唆する。さらに、γ線不活性化は、ホルマリンまたは紫外線不活性化より血球凝集活性に対してほとんど影響を与えない。未処置の形態と同様の抗原を保有する、γ線を照射したウイルスは、少なくとも部分的に、その優れた免疫原性に関与するように見える。鼻腔内投与は、気道内の免疫を誘発するためのリンパ器官に関連する肺粘膜を標的とする。しかしながら、以前に市販されている鼻腔内投与されるインフルエンザワクチンは、ベル麻痺の症例−顔面麻痺（Ｍｕｔｓｃｈら，（２００４），「Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  Ｂｅｌｌ’ｓ  ｐａｌｓｙ  ｉｎ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ」，Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３５０：８９６−９０３を参照のこと）の数の増加と関連し、その結果、このワクチン調製物の市場からの撤退を生じた。この有害事象は、使用される粘膜補助剤；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ易熱性毒素によるものである。関連するこのような安全性は、γ線により不活性化されたインフルエンザワクチンに関する問題ではない。なぜなら、そのワクチン製剤において健康を害する可能性がある補助剤の含有を必要としないからである。
【０３０３】
観察される強力な防御効果とは別に、いくつかのさらなる要因は、インフルエンザワクチンについてのγ線照射の魅力による。第１に、凍結乾燥したγ線により不活性化されたＡ／ＰＣは、その交差防御特性を維持した。乾燥粉末製剤は、パンデミック事象のワクチン分配において顕著な利点を与える種々の保存条件下で液体製剤と比較して安定性を向上する。第２に、ほとんど訓練を必要とせず、または医師を必要としない送達の鼻腔内経路は、発展途上国についてさらなる利点を与える。第３に、γ線により不活性化されたインフルエンザワクチンは比較的容易であり、他のワクチン製剤プロセスと比べて製造に対して費用がかからない。最も重要には、製造の考慮および利用可能性に関して、γ線により不活性化されたインフルエンザによって誘発される強力な異種サブタイプ防御は、廃れたインフルエンザワクチンの毎年の改質を与えることができる。
【０３０４】
（実施例６：γ線照射のためのインフルエンザウイルスの調製）
現在インフルエンザワクチンに使用されているウイルスは、一般に、ウイルス抗原の損失および／またはビリオン構造の破壊に関連している超遠心分離法を用いて減弱の前に精製される。γ線を照射したインフルエンザワクチンによる細胞障害性Ｔ細胞応答の誘発は、ビリオン構造の完全性を保存するγ線照射の前に、ウイルス精製（分別／接線濾過）の代替的方法からの利点を受ける。
【０３０５】
ウイルスストックは、低速度（約３０００ｒｐｍ）にて遠心分離を用いて浄化され、サイズ排除ベースの遠心分離に使用されると予想される。浄化したストックは、５０〜８０ｎｍの細孔径を有する濾過装置により回転される。一般に、インフルエンザウイルスのサイズは８０〜１２０ｎｍである。従って、可変の細孔径（例えば８０ｎｍ未満）が、濾過によって液体を得るのに必要とされる限り、４℃にて低い遠心分離速度（４０００〜１００００ｒｐｍ）（可変速度が使用され得る）でインフルエンザウイルスを精製するために使用される。フィルターの上流側の初期のウイルスストック液体流路は、フィルター面を接線方向に通るか、または横断する。遠心分離時に、ほとんどの液体は、フィルターを通過（浸透）するが、少しの部分が、残余分（全てのウイルスを含む）として中心のリザーバーに保持される。
【０３０６】
残余分は、浸透圧を維持し、結果としてウイルス完全性を維持するために糖（デキストラン、スクロース）を含有し得るＰＢＳ（生理食塩水または任意の他の培地）で再希釈される。必要な場合、これらの希釈した調製物を再度濾過してもよい。最後の遠心分離工程から濃縮したウイルスは、上記の実施例に記載するようにγ線照射により処理される。アスコルビン酸塩などのフリーラジカル捕捉剤は、ウイルスタンパク質に対する起こり得る損傷を減少させるために、照射する前に精製したウイルスストックに加えられてもよいが、γ線照射の間にウイルスゲノムを不活性化させる。
【０３０７】
例えば、以下のプロトコルが、γ線照射に使用されるインタクトなインフルエンザウイルスの精製のために利用され得る。
１．インフルエンザウイルスストックは、孵化卵またはインビトロでの組織培養から収集され得る。
２．３００Ｋｄのカットオフを有する濾過装置を用いて、ウイルスストックは、４℃にて３０分間、３００ｇで遠心分離することによって浄化され得、インフルエンザウイルスおよび尿膜腔液のタンパク質（または組織培養培地）の両方がフィルターを通過することができる。
３．１００Ｋｄのカットオフを有する濾過装置を用いて、浄化したウイルスストックが、４℃にて３０分間、３００ｇにて精製され得る。この工程において、インフルエンザウイルスは、フィルターの片側でフィルターを通過しない（従ってウイルスを濃縮する）。
４．濃縮したウイルスは、残っているいずれかの卵タンパク質を除去するために、生理食塩水（または任意の緩衝化した培地）で洗浄され得る（洗浄は、濃縮したウイルスを生理食塩水で希釈し、上記の工程３に記載したように遠心分離することによって実施され得る）。
５．最終ウイルス濃度はインタクトなビリオンを含む。
【０３０８】
一般に、上記の技術に使用される濾過装置についての細孔のカットオフレベルは、８０〜１２０ｎｍのビリオンサイズに適合するように設計され得る。全ての手順は４℃にて実施され得、超遠心分離法は必要とされない。ウイルス感染価は、オリジナルのストックおよび最終産物について試験され得る。ウイルス力価および体積を事前に知ることで、濃度のレベルの推定を容易にすることができる。最終産物の純度は、標準的な生化学分析を用いて測定され得る。
【０３０９】
（参照による援用）
本出願は、２００８年８月１日に出願された米国仮特許出願第６１／０８５，８０２号からの優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に援用される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８】
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【図２９】
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