(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体から得られた試料における細胞の腫瘍形成状態を検出する方法であって、前記細胞中に存在する式
【化５】
0005765587.tif 000015
で示されるＯＣＤＯ化合物の量を決定する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
個体の癌を診断する方法であって、前記個体から得られた試料における細胞中のＯＣＤＯ化合物の量を決定する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
癌を発症している個体の治療への反応をモニタリングする方法であって、請求項１に記載したように前記個体から得られた試料における細胞の腫瘍形成状態を、又は請求項２に記載したように個体の診断を、治療前及び治療中に決定する工程を含み、ここで治療中の腫瘍形成状態における又は個体の診断における変化が、その個体による前記治療への反応の指標となる、方法。
【請求項４】
個体から得られた試料における細胞の腫瘍形成状態のマーカーとしてのＯＣＤＯ化合物の使用。
【請求項５】
癌を発症した個体の前記癌の治療における医薬の有効性を評価する方法であって、
（ａ）前記個体から得られた試料における細胞の液体抽出物中のＯＣＤＯの濃度Ｄ１をアッセイし；
（ｂ）治療的処置期間の後に、工程（ａ）と同様の方法で、前記個体から得られた試料における細胞の液体抽出物中のＯＣＤＯの濃度Ｄ２をアッセイし；
（ｃ）Ｄ１とＤ２を比較し；そして
（ｄ）Ｄ２＜Ｄ１である場合に、それから、前記医薬が前記癌の治療に有効であると推論する
ことを特徴とする方法。
【請求項６】
癌を発症した個体における前記癌治療の有効性を評価する方法であって、請求項１に記載したように前記個体から得られた試料における細胞の腫瘍形成状態を、又は請求項２に記載したように個体の診断を、治療前及び治療中に決定する工程を含み、ここで治療中の腫瘍形成状態における又は個体の診断における変化が、癌治療における前記治療の有効性の指標となる、方法。
【請求項７】
Ｒｏ  ４８−８０７１及びイボゲインから選択されることを特徴とする、ヒト又は動物の癌の治療方法において使用するためのＯＣＤＯ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の腫瘍形成状態の決定方法、及びその使用に関する。本発明はまた、癌の治療方法で使用するためのＯＣＤＯ阻害剤にも関する。
【０００２】
癌の診断は様々な基準、具体的には、聴診及び健康診断（内視鏡検査、マイクロファイバー、放射線透視法など）のような目に見える又は触診しうる、症状の徴候を医師に示すことができる基準、並びに赤血球細胞、白血球細胞及び血小板の数、ヘモグロビンレベル、及びクレアチニンレベルを決定することが可能な血液及び尿検査、あるいは患者から採取した試料中の特定の癌マーカーの存在を検出すること、に基づいている。多くの癌マーカーが文献に記載されてきた。一般的にそれらは、とりわけ特定の型の癌に特異的なものであり、さらには、患者の亜集団に特異的なものである。さらに、文献に記載されたマーカーは通常、癌を明確に診断することはできず、さらに、偽陰性又は偽陽性の率がいまだに高い。最終的に、癌発生の後期においてのみ、いくつかのマーカーを検出することができるが、このことは、少なくとも部分的には治療の成功を損なうものである。
【０００３】
そのため、初期のいずれの型の癌をも、確実性及び再現性をもって診断することが可能な、新しい癌マーカーが必要とされている。
【０００４】
発明の概要
本発明は、個体から得られた試料における細胞の腫瘍形成状態を検出する方法に関し、この方法は、得られた細胞中に存在する式
【化１】
0005765587.tif 000002
で示される化合物ＯＣＤＯの量を決定する工程を含むことを特徴とする。
【０００５】
本発明はまた、個体における癌の診断方法にも関し、この方法は、前記個体から得られた試料における細胞中の化合物ＯＣＤＯ、すなわち、６−オキソ−コレスタン−３β，５α−ジオールの量を決定する工程を含むことを特徴とする。
【０００６】
本発明はまた、個体から得られた試料の腫瘍形成状態のマーカーとしての化合物ＯＣＤＯの使用に関する。
【０００７】
本発明はまた、癌を発症している個体の治療への反応をモニタリングする方法に関し、前記方法は、本発明による方法を用いて、前記個体から得られた試料における細胞の腫瘍形成状態を、又は個体の診断を、治療前及び治療中に決定する工程を含み、ここで、治療中の腫瘍形成状態における又は個体の診断における変化が、その個体による前記治療への反応の指標となる方法。
【０００８】
本発明はまた、癌を発症した個体の前記癌の治療における医薬の有効性を評価する方法であって、
（ａ）前記個体から得られた試料における細胞の液体抽出物中のＯＣＤＯの濃度Ｄ１をアッセイし；
（ｂ）治療的処置期間の後に、工程（ａ）と同様の方法で、前記個体から得られた試料における細胞の液体抽出物中のＯＣＤＯの濃度Ｄ２をアッセイし；
（ｃ）Ｄ１とＤ２を比較し；そして
（ｄ）Ｄ２＜Ｄ１である場合に、それから、前記医薬が前記癌の治療に有効であると推論する
ことを特徴とする方法にも関する。
【０００９】
本発明の目的はまた、癌を発症した個体における前記癌治療の有効性を評価する方法であって、本発明による方法を用いて、前記個体から得られた試料における細胞の腫瘍形成状態を、又は個体の診断を、治療前及び治療中に決定する工程を含み、ここで、治療中の腫瘍形成状態における又は個体の診断における変化が、癌治療における前記治療の有効性の指標となる方法である。
【００１０】
本発明はまた、ヒト又は動物の癌の治療方法において使用するためのＯＣＤＯ阻害剤に関する。
【００１１】
定義
本発明の目的において、「生体材料」又は「試料」という用語は、生物の組織、標本、又は液体若しくは固体である、生物組織に由来する抽出物を意味することを目的とし、この材料はまた、上記で定義した少なくとも２つの材料の混合物であってもよい。そのため、そのような試料又は生体材料は、具体的には、組織、器官、糞便、又はヒト若しくは哺乳類の体液から調製したもの、又は「インビトロ」細胞培養物から得られたものであってもよく、そのような試料又は生体材料はまた、血液、血清、血漿、尿、髄液、骨液、腹膜水、胸膜液、精液又は腹水であってもよい。一般的には、本発明の試料又は生体材料は、癌組織又は癌であることが予測される組織の生検である。
【００１２】
本発明の目的において、「個体」という用語は、ヒト又が哺乳類動物を意味することを目的とする。
【００１３】
細胞の「腫瘍形成状態」という用語は、細胞が制御されずに増殖するように、前記細胞の増殖プログラムが変化し、侵襲性及び／又は転移性の悪性腫瘍形成を引き起こす可能性のある、脱分化した状態を意味することを目的とする。
【００１４】
「治療」及び「治療する」という用語は、個体の健康状態を改善することを目的とした任意の行為、例えば疾患の治療、防止、予防又は疾患を遅らせることを指す。特定の実施形態においてこれらの用語は、疾患又はこの疾患に関連する症状の改善又は根絶を指す。その他の実施形態においてこれらの用語は、疾患の進行又は悪性度を低減させることを指す。
【００１５】
「治療上有効量」という用語は、個体を治療するために十分な量を意味することを目的とする。
【００１６】
「癌」という用語は、ヒト又は動物の体の特定の細胞が制御されずに分裂する、いずれの疾患をも意味することを目的とする。癌は一般的には、癌腫、肉腫、及び血液癌から選択される。より具体的には、本発明の癌は、乳癌、肺癌、黒色腫、結腸癌、直腸癌、膵癌、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、カポジ肉腫、精巣癌、前立腺癌、子宮癌、神経膠腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、胚性癌腫又は甲状腺髄様癌である。
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、腫瘍細胞において初期に表れ、そして細胞分裂特性及び腫瘍の侵襲刺激特性を示すマーカーである、ＯＣＤＯの同定に関する。本発明は、癌を発症していると疑われる若しくは癌を発症している個体から得られた試料中のこのマーカーの検出、及びそのマーカーをアッセイすることに基づくものである。本発明はまた、癌の治療法において用いるためのＯＣＤＯ阻害分子にも関する。
【００１８】
長い間、コレステロール及びコレステロールの酸化産物がヒトにおいて発癌特性を有することが疑われてきた（Fritz Bischof, Advances in Lipid Research, vol. 7, p. 165-244, 1969）。最初はこれらの効果は限られた数の齧歯類の種において観察され、それは、この対象について研究していた科学者からは無視されるような、矛盾する観察結果であった（Leland L Smith et al., Free Radical Biology and Medicine, vol. 7, p. 285-332, 1989）。特定のコレステロール酸化産物がコレステロールの異化及びステロイドホルモンの生産の途中で生じることが分かっている。特定の数のオキシステロールが、免疫系、神経系及び心血管系における重要な生理学的な機能を担っている。オキシステロールの既知の標的には、リガンド依存性転写因子があり、その中でも最もよく知られているものがＬＸＲ受容体（肝臓Ｘ受容体）である。オキシステロールは、コレステロールの細胞間輸送、脂質ミクロドメインの形成、胚発生での形態形成に関わるＨｅｄｇｅＨｏｇ経路の活性化を調節し、また、それらは芳香族炭化水素受容体に対する拮抗特性を有する。
【００１９】
特定のオキシステロールがコレステロール代謝、具体的には、メバロン酸の生合成（ＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼ）、コレステロールのエステル化及びコレステロールエポキシドの加水分解に関与する酵素の活性を調節することが示されてきた（Schoepfer G. Jr.: Physiological Reviews, vol. 80, No. 1, p. 361-554, 2000を参照のこと）。また、酸素含有基（アルコール、カルボニル、ヒドロペルオキシド、ペルオキシド又はエポキシド）の性質、コレステロールの炭化水素骨格におけるその位置、その空間的な方向及び前記炭化水素骨格上の酸素含有基の数により、コレステロール酸化産物が様々な生体標的（膜、酵素、受容体）に対する特異的な認識特性を有する可能性があることも示されてきた。
【００２０】
本発明から、コレスタン−３β，５α−ジオール−６−オン（ＯＣＤＯ）が、組織由来の様々な腫瘍株に存在することが示された。腫瘍の細胞分裂におけるこの分子の特性、及びインビトロでは、移植を受けた齧歯類での細胞及び腫瘍への侵襲性おけるこの分子の特性について解析されてきた。この分子が腫瘍細胞においては免疫抑制性サイトカインの発現の刺激を誘導するが、免疫刺激性サイトカインの発現を低下させることもまた示されており、このことは、腫瘍周辺での免疫抑制、その発生の促進、及び侵襲性と一致するものである。
【００２１】
コレステロールエポキシドヒドロラーゼ（ＣｈＥＨ）が、以下に示す反応である、コレステロールエポキシド（ＣＥ）からコレスタントリオール（ＣＴ）を生じる加水分解に関与する酵素であることが知られている（Medina et al., Faseb J. 19(4): A285-A285, Part I Suppl. S, 4 March 2005を参照のこと）。
【化２】
0005765587.tif 000003
【００２２】
出願人らは最初の工程において、正常組織の細胞及び腫瘍細胞から得られた細胞抽出物における、ＣｈＥＨの活性を比較した。ＣｈＥＨの活性は、ＣｈＥＨのＣＴ生成に関与するＣＥ基質を、薄層クロマトグラフィーを用いて分離することにより観察することができる。ＣＥ及びＣＴ化合物に相当するスポットを１４Ｃ放射性標識により可視化した。実験の詳細は、この後に詳細に記載したアッセイ１において示し、結果を図１に示す。
【００２３】
出願人らは、正常な細胞からはＣＥ及びＣＴ化合物に相当する２つのスポットを可視化することができたが、一方、驚くべきことに、腫瘍細胞からは３つのスポットが現れたことを示した。すなわち、１つはコレスタントリオール（ＣＴ）に相当し、２番目のものはコレステロールエポキシド（ＣＥ）に相当し（正常な細胞の、相当するスポットと比較して弱い）、そして第３のスポットはＣＥ化合物のスポットに近かったが、それにも関わらず、はっきりと区別できるものであった。
【００２４】
乳癌の治療及び予防において、腫瘍抑制性の抗癌剤として既知の方法で用いられるタモキシフェン（ｔａｍ）がＣｈＥＨの阻害剤であり、また、既知の抗増殖剤であるＰＢＰＥ（Ｎ，Ｎ−ピロリジノ−［（４−ベンジル）フェノキシ］エタンアミン）もまたＣｈＥＨの阻害剤であることが知られている（これに関しては、本願のアッセイ２で示した参考文献公刊物を参照のこと）。腫瘍細胞をタモキシフェンを用いて処理した場合、出願人らが代謝産物Ｍとしたこの「第３のスポット」もＣＴのスポットもいずれも現れなかった。タモキシフェンがＣｈＥＨを阻害することから、２番目の工程においては、処理した腫瘍細胞のクロマトグラフィープレートにおける「第３のスポット」の出現にＣｈＥＨの阻害が関与するかどうかを調査した。この実験の詳細は後に記載するアッセイ２において示し、結果を図３Ａ及び３Ｂに示す。この調査を行うために、タモキシフェン又はＰＢＰＥそれぞれで処理した腫瘍細胞の抽出物においてＣｈＥＨ活性を阻害した。細胞と阻害剤とのインキュベーションを３日間維持し、増加用量の阻害剤を用いて逐次アッセイを行った。さらに、阻害剤の用量を増やして行った薄層クロマトグラフィーでは、ＣＥ化合物のスポットに近い位置にある「第３のスポット」と同じ時点で、ＣＴ化合物が消失することが示された。このことから、本発明により出願人は、「第３のスポット」に関与する代謝産物ＭがＣＴ化合物の誘導体であるだろうと予測した。
【００２５】
３番目の工程において出願人らは、「第３のスポット」に相当する代謝産物Ｍの形成が、ＣｈＥＨ阻害剤であるタモキシフェンとの２４時間を超えるインキュベーションの後に、ＣＥ化合物の形成が失われるまで、徐々に生じること；及びこの現象がＣＥ化合物のα及びβ２種類の異性体を用いた場合にも起こることを確認するにより、この実験を完成させた。この、さらなる結果についてはアッセイ３、並びに図２Ａ及び２Ｂにおいて詳細に示した。その結果、出願人らは、これらのことから、本発明により、「第３のスポット」に関する産物が、クロマトグラフィーにおいてはＣＥ化合物と似た挙動を示すが、クロマトグラフィー支持体への保持の程度がより高い、ＣＴ化合物の変換産物であると結論づけた。この結果は、「第３のスポット」に関連する代謝産物Ｍが、ＣＴ及びＣＥ化合物の極性の中間的な極性を有し、かつ、ＣＥ及びＣＴ分子２つと類似した構造をもつ化合物であることを示すものである。
【００２６】
以下に詳述するアッセイ４では、「第３のスポット」の代謝産物Ｍが、ＣＴ化合物の変換に由来するものであることを確認するために行った研究の全ての情報を示す；このアッセイの結果を図４に示す。
【００２７】
最後にアッセイ５では、この「第３のスポット」に相当する産物の、化学構造の同定を可能にする方法を記載する。出願人らはその結果、本発明により、この「第３のスポット」が、腫瘍細胞のみをアッセイした場合に表れる、以下の式に相当する、６−オキソ−コレスタン−３β，５α−ジオール（ＯＣＤＯ）によるものであることを確認した。
【化３】
0005765587.tif 000004
【００２８】
ＯＣＤＯ産物は新規の産物ではなく、コレスタン−３β，５α，６β−トリオール（ＣＴ）のＮ−ブロモスクシンイミドによる酸化の産物としての記載がある（Fieser L.F. et al.; Rajagopalan S.: Selective oxidation with N-bromosuccinimide. II. Cholestane-3β,5α,6β-triol, J Am Chem Soc, 71, p. 3938-41, 1949）。さらに、ＯＣＤＯの化学合成についても１９０８年に、既に記載がある（Robert Howson Pickard et al., J. Chem. Soc. Trans. vol. 93, p. 1678-1687, 1908）。
【００２９】
コレスタン−３β，５α，６β−トリオールの変換の結果生じる代謝産物として、この分子の存在が１９７１年に報告され、ＯＣＤＯはコレスタン−３β，５α，６β−トリオールを強制給餌したラットの糞便中に見られる場合があることが示された（Roscoe HG, Fahrenbach MJ, J Lipid Res, vol. 12, p. 17-23, 1971）。また、ＯＣＤＯは、ウシ血清及びヒトの血液中でも、１０〜１００nmの範囲の濃度で見いだされる場合があることが示された（Yamaguchi M. et al., Biol. Pharm. Bull. 20(9), p. 1044-46, 1997）。
【００３０】
ＯＣＤＯマーカーの同定を可能にする、アッセイ１〜５で行った実験方法の詳細を以下に示す。
【００３１】
アッセイ１〜５及び本特許出願で後述するいくつかの実施例においては、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）由来のＭＣＦ７腫瘍細胞を用いた。これらの細胞を、２ｇ／リットルの炭酸ナトリウム水溶液、１．２mMのグルタミン（２３℃でpH７．４）及び５％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地中、培地１リットル当たりに２．５mlの抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン）を加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。マウス細胞におけるＣｈＥＨの活性をシリカ薄層クロマトグラフィーにより解析することが望ましい。可視化することが所望される化合物は、上記に定義した、ＣＥ及びＣＴ化合物である。クロマトグラフィープレート上のＣＥ及びＣＴに相当するスポットを可視化するために、１４Ｃで標識したＣＥ及びＣＴ化合物を合成した。
【００３２】
ａ）［１４Ｃ］５，６−β−エポキシコレスタン−３β−オール及び［１４Ｃ］５，６−α−エポキシコレスタン−３β−オールの合成
０．３５μmolの［１４Ｃ］コレステロール（５８mCi／mmol）を、０．５６μmolのメタ−クロロ過安息香酸存在下で２００μlのジクロロメタンに溶解する。この溶液を周囲温度で５時間撹拌する。反応混合物を１mlのジクロロメタンに溶解し、そして亜硫酸ナトリウム水溶液（１０重量％）、炭酸水素ナトリウム（５重量％水溶液）及び飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄する。有機層を蒸発除去し、そして残渣をＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｕｌｔｒａｓｅｐ  ＥＳ  Ｃ１８  ６μm疎水性カラム）により、ＣＨ３ＯＨ／Ｈ２Ｏ（容量で９５／５）イソクラティック条件下、０．７ml／分で精製する。α及びβ異性体をこれら条件下において速やかに分離し、放射能検出器（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）で検出する。
【００３３】
この反応からの全収率は８０％であり、得られた産物は、７５％のα異性体（ＣＥα）と２５％  ５のβ異性体を（ＣＥβ）含む。
【００３４】
ｂ）［１４Ｃ］コレスタン−３β，５α，６β−トリオールの合成
この化合物を、文献に記載されているように（Pulfer MK and Murphy RC, Formation of biologically active oxysterols during ozonolysis of cholesterol present in lung surfactant, J Biol Chem, vol. 279(25), p. 26331-26338, 2004）、［１４Ｃ］５，６−β−エポキシコレスタン−３β−オールから合成した。上記（ａ）で調製した［１４Ｃ］ＣＥβ（５８mCi／mmol）を１mlのテトラヒドロフラン／Ｈ２Ｏ／アセトン混合物（ｖ／ｖ／ｖ、４：１：０．５）に溶解する。１２５μlの過塩素酸を反応媒体に加え、これを周囲温度で４時間撹拌する。
【００３５】
この反応混合物を１mlのジクロロメタンで希釈し、炭酸水素ナトリウム（５重量％の水溶液）、次いで水で洗浄する。残渣を疎水性カラム（Ｕｌｔｒａｓｅｐ  ＥＳ  Ｃ１８  ６μm）を用いたＨＰＬＣにより、ＣＨ３ＯＨ／Ｈ２Ｏ（容量で９５／５）イソクラティック条件下、流速０．７ml／分で精製する。収率６２％で［１４Ｃ］ＣＴが得られる。
【００３６】
以下のアッセイ１〜５で使用するために、細胞を６−ウェルプレート中に、２ml当たり８００００個の密度になるように播種する。播種の３６時間後に細胞を、溶媒（ＰＢＳ緩衝液に溶解した１‰エタノール）又は試験することを所望する化合物で１５分間処理する；そのため、アッセイに応じて、このインキュベーションは［１４Ｃ］ＣＥα（０．６μM、１５μCi／μmol）及び［１４Ｃ］ＣＥβ（０．６μM、１５μCi／μmol）又は［１４Ｃ］ＣＴ（１μM、１５μCi／μmol）化合物を用いて行う；溶媒の割合は培地の容量に対して２‰を超えないものである。アッセイで必要とされたインキュベーション時間の後、培地を回収し、細胞を冷ＰＢＳ（リン酸塩緩衝液）（１ウェル当たり２ml）で洗浄し、これを培地と共にプールする。この細胞を次に冷ＰＢＳ（３ウェルにつき１ml）中にかき集め；ウェルを再度冷ＰＢＳ（３ウェルにつき１ml）でリンスした。得られた細胞懸濁液を１０００rpmで５分間、４℃で遠心分離する。細胞沈殿物と培地を改変Ｆｏｌｃｈ法（Ways P. et al., J Lipid Res, 5(3): 318 (1964)により公開された）により抽出する。本明細書の他の部分にわたり、用いられた溶媒は上記で定義したものと同じである。
【００３７】
水層及び有機層の放射活性を測定する。有機層はアルゴン下で乾燥させる。残渣を６０μlのエタノールに再懸濁し、その後１レーン当たり２０μlの割合で、背面がガラス製のシリカプレート（ＷｈａｔｍａｎＬＫ−６−ＤＦ、２０×２０）にのせ、これを様々なアッセイに用いる（これらのプレートは、１００℃で１時間予め加熱しておいた）。移動相としては酢酸エチルを用いる。カセット中でクロマトグラフィープレートを「フォスファスクリーン」プレートに接触させ、一晩置いた。「フォスファスクリーン」をＳｔｏｒｍ型の「Ｐｈｏｓｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ」を用いて可視化する。プレート上に現れたスポットの濃さの特性がより濃いか又はより薄いかを評価するために、「Ｉｍａｇｅｑｕａｎｔ」（商標）コンピュータープログラムを用いた濃度計により、放射活性を定量する。
【００３８】
アッセイ１
このアッセイ１においては、健康なマウス細胞及びＭＣＦ７マウス腫瘍細胞におけるＣｈＥＨの活性を示した。この過程は、直前に記載した方法に従って薄層クロマトグラフィーにより行う。結果を図１に示す。
【００３９】
この図では、レーンの下段に１点鎖線で示したように、全ての沈着物が同じレベルで調製されたことが分かる。
【００４０】
上述した方法により、予め調製しておいた［１４Ｃ］ＣＥ化合物（０．６μM、１５μCi／μmol）を左側のレーンにのせた。中央及び右側のレーンは、上述した方法に従って、［１４Ｃ］ＣＥと共に予めインキュベートしておいた細胞の抽出物に対応する。
【００４１】
右側のレーンの下側にのせた細胞抽出物は、体重が２０〜２５ｇの、成体Ｃ５７／Ｂｌ６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから供給された）から採取した正常な肝細胞の抽出物に対応する。肝細胞を、Ｄａｖｉｓ（Davis RA et al., J. Biol Chem, 1979, vol. 254, No. 6, p. 2010-2016）のプロトコールに従い、コラゲナーゼを用いた潅流により単離し、そしてコラーゲンでコーティングされた直径６cmのシャーレ中で、１シャーレ当たり２００万個の細胞密度で培養した。培地としては、１０％のウシ胎仔血清、インスリン（０．５Ｕ／ml）及び抗生物質（５０ユニット／ml）（ペニシリンとストレプトマイシンの混合物）を含む、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。シャーレを３７℃の恒湿インキュベーター中、５％ＣＯ２に維持する。細胞が接着した後、細胞くずを除去するために細胞をＰＢＳ緩衝液で洗浄し、そして栄養培地を新しい培地と交換する。細胞を翌日のできるだけ早くにアッセイに用いる。
【００４２】
図１の右側のレーンから、ＣＴ化合物が最初に現れること、そしてＣＥ化合物のレベルは直接左側のレーンにのせたものと実質的に同じであることが分かる。クロマトグラフィーには両方が現れているが、生成するＣＴ化合物は必ずＣｈＥＨヒドロラーゼによって変換されたＣＥ化合物から生じるため、最初に標識したＣＥ化合物のみをのせて、スポットの出現を可能にした。
【００４３】
一方、中央のレーンにはＭＣＦ７マウス腫瘍細胞の抽出物をのせた。この細胞抽出物は、Ｃ５７／Ｂｌ６マウス細胞の肝細胞抽出物と同じ方法で培養した、ＭＣＦ７細胞から調製した。ＣＴ化合物に相当するスポットが示され、その次に互いの位置が近い２つのスポットが現れた。１つは右側のレーンのＣＥ化合物に相当するものであり、もう１つが未確認の代謝産物Ｍに相当するものである。さらに、この「第３のスポット」はＣＥ化合物の相当するスポットよりも濃い。
【００４４】
従って、腫瘍細胞においてはＣＥ化合物の一部が、ＣＥ化合物に近いクロマトグラフィーでの挙動を示し、かつ、ＣＥ及びＣＴ化合物の間の中間的な極性を示す、代謝産物Ｍに変換されたと推測した。
【００４５】
アッセイ２
アッセイ１のクロマトグラフィープレート上の「第３のスポット」の出現が、細胞中ではＣＥ化合物からＣＴ化合物を生じるＣｈＥＨの阻害に影響されるかどうかについて解析した。タモキシフェン（Ｔａｍ）及びＰＢＰＥによりＣｈＥＨが阻害されることが知られている（FASEB Journal, vol. 19, Issue 4, p. A285-A285, Part 1 Suppl. S）。そこで、このアッセイにおいてはこれら２種類の阻害剤を用いた。
【００４６】
この実験を行うために、ＭＣＦ７腫瘍細胞の細胞抽出物をアッセイ１で示したように［１４Ｃ］ＣＥ（−α又は−β）の溶液中でインキュベートし、続いてその後ＣｈＥＨ阻害剤、すなわちタモキシフェン又はＰＢＰＥの水溶液中で３日間インキュベートして、これをアッセイ１で使用したものと同じ型のクロマトグラフィープレート上にのせた。［１４Ｃ］ＣＥ−αと共にインキュベートする場合には、１×１０−２、１×１０−１、５×１０−１、１、２．５及び５μM濃度のタモキシフェン溶液を用いる（図３Ａ）；［１４Ｃ］ＣＥβと共にインキュベートする場合には、１×１０−２、１×１０−１、１、５及び１０μM濃度のＰＢＰＥ溶液を用いる（図３Ｂ）。図３Ａ及び３Ｂは、２つの例で得られたクロマトグラフィープレートを示す。インキュベートするときに多量の阻害剤を用いると、ＣＴ化合物及び代謝産物Ｍによる「第３のスポット」が同時に消失することが示される。逆に、少量の阻害剤では、ＣＴ化合物及び代謝産物Ｍによる両方のスポットは十分であるが、ＣＥによるスポットは弱く、ＣＥが（ＣＴ＋代謝産物）に変換されたことを示す。このことから、ＣｈＥＨヒドロラーゼは、相対的に阻害されていない場合には、ＣＴを生じさせることができ、続いて代謝産物Ｍのスポットもまた現れると結論づけられる。
【００４７】
アッセイ３
［１４Ｃ］で標識したＣＥ（−α又は-β）化合物を用いて、ＭＣＦ７細胞におけるＣｈＥＨ活性の動力学を解析した。アッセイ２と同様に、細胞を［１４Ｃ］ＣＥ（−α又は−β）とインキュベートする。４、８、１６、２４、４８及び７２時間インキュベートした後、抽出物をクロマトグラフィープレート上にのせた。得られたプレートを図２Ａ（ＣＥα）及び２Ｂ（ＣＥβ）に示す。図１並びに図３Ａ及び３Ｂと同様に、レーンの下側に１点鎖線で示したように、沈着物は同じレベルで調製された。インキュベートする時間が短いと、多量のＣＥ化合物をＣＴ化合物に変換する時間がないことが分かる。しかしながら、インキュベートの時間を長くすると、ＣＴスポットがより濃くなる一方でＣＥスポットがより淡くなることから分かるように、ＣｈＥＨは次第にＣＥ化合物をＣＴ化合物に変換する。そして同時に、ＣＴ化合物が現れると、代謝産物Ｍに相当する「第３のスポット」が生じるようになる。
【００４８】
その結果、出願人は、「第３のスポット」である代謝産物ＭがＣＴ化合物の誘導体である可能性が高いと考えた。
【００４９】
アッセイ４
実施例１〜３で出した結論を確認するために、上記で定義した方法を用いて、ＭＣＦ７細胞を２４、４８及び１５  ７２時間の間、［１４Ｃ］ＣＴ化合物とインキュベートした。その後、アッセイ１に示したように細胞抽出物を得て、そしてクロマトグラフィープレートにのせた（図４を参照のこと）。プレートの左端のレーンは［１４Ｃ］ＣＥ沈着物を示し、その隣のレーンに移動対照となる［１４Ｃ］ＣＴ沈着物を示す。その他３つのレーンはインキュベート後のアッセイした細胞抽出物に相当する。２４時間インキュベートすると、細胞抽出物のレーン上の［１４Ｃ］ＣＥ化合物のスポットの近くに代謝産物に相当するスポットが見られることが示される。より長い期間インキュベートして、このスポットの濃さがより濃くなるほど、つまり代謝産物Ｍのスポットが濃くなるほど、ＣＴ化合物のスポットが淡くなる。
【００５０】
このことは、この代謝産物が真にＣＴ−化合物の変換産物であることを確認するものである。
【００５１】
アッセイ５
アッセイ１〜４で出現した代謝産物の化学構造を同定するために、多段階技術を用いた。ＭＣＦ７細胞を、アッセイ１で定義した１０mlの培地中、１シャーレ（直径１００mm）当たり０．４×１０６細胞播種した。播種の３６時間後、いくつかの細胞を１０μM濃度のＣＥα中でインキュベートし、残りの細胞を１０μM濃度の上述したように得た［１４Ｃ］ＣＥα中でインキュベートした。７２時間後、細胞を冷ＰＢＳ（リン酸塩緩衝液）で洗浄し、その後冷ＰＢＳ中にかき集め、そして１０００rpmで４分間、４℃で遠心分離する。細胞沈殿物と培地を改変Ｆｏｌｃｈ法（本明細書の９ページに既に示した参考文献を参照のこと）により、抽出する。
【００５２】
有機層を蒸発させ、メタノール中に再懸濁し、その後ＲＰ  Ｃ１８カートリッジに通す（Ｗａｔｅｒｓ社のＳｅｐ−Ｐａｃｋ）。その後カートリッジをメタノールで洗浄する。蒸発させた後、残渣を２０μlのエタノール中に溶解し、その後、イソクラティック条件（ＣＨ３ＯＨ／Ｈ２Ｏ（容量で９５／５）、流速０．７ml／分）を用いた逆相ＨＰＬＣ（「Ｕｌｔｒａｓｅｐ」疎水性カラム）により精製する。カラムの出口の１mn画分を回収し、標識した化合物、具体的には［１４Ｃ］ＣＥαから生じる代謝産物、の保持時間を決定するために放射活性を測定する。移動溶媒として酢酸エチルを用いた薄層クロマトグラフィーにより、放射性画分を解析する。放射性標識していないＣＥαで処理したＭＣＦ７細胞由来の目的のＨＰＬＣ画分を電子衝撃（７０ev）及び化学イオン化質量分析で解析する（図５のスペクトルを参照のこと）。
【００５３】
このように、ＭＣＦ７細胞によって生産されたＣＴの質量が４２０であり、そのクロマトグラフィーでの挙動が市販されているＣＴのものと同様であることが確認された。ＭＣＦ７細胞抽出物中に存在し、上述したように精製した代謝産物の質量分析からは、質量が４１８であること、すなわちＣＴ化合物に対して２質量単位の喪失が生じたことが示される。アッセイ１〜４において示されたように、代謝産物はＣＴ化合物の生物変換から生じる。そのため、質量の差は、２つの水素原子の喪失に相当する。このことは、ＣＴ化合物におけるケトン官能基の出現又は二重結合の出現を示唆するものである。赤外線解析により、ケトン官能基の帯域特性が示され、これは、６−オキソ−コレスタン−３β，５α−ジオール（ＯＣＤＯ）の形成を示す。ＯＣＤＯ化合物の構造は、核の第６炭素が有する、ヒドロキシル基におけるＣＴ化合物の脱水素から生じる産物に対応する。代謝産物のクロマトグラフィーにおける特性及び質量分析における崩壊プロファイルは、Ｓｔｅｒａｌｏｉｄｓ社から供給されている、市販のＯＣＤＯ化合物の標準物質のものと同一であり、これら２つの分子が同一であることが示された。
【００５４】
癌の診断方法
そのため、本発明は、個体から採取した試料から得られた細胞の腫瘍形成状態を検出する方法に関し、この方法は、得られた細胞中の、式のＯＣＤＯ化合物の量を決定する工程を含むことを特徴とする。
【化４】
0005765587.tif 000005
【００５５】
本発明はまた、ヒト個体又は哺乳動物由来の生体材料から得られた細胞の腫瘍形成状態を検出するための診断方法に関し、この方法は、得られた細胞が相当量のＯＣＤＯ化合物を含んでいるかどうかを可視化手段によって決定し、この検出の結果が陽性であった場合には、このことから、前記細胞が腫瘍形成状態にあると推測することを特徴とする。
【００５６】
本発明はまた、個体における癌の診断方法に関し、この方法は、前記個体から得られた試料中の細胞におけるＯＣＤＯ化合物の量を決定する工程を含むことを特徴とする。
【００５７】
本発明に従って、試験した個体由来の試料中の細胞におけるＯＣＤＯの量を、試験した個体由来に試料中の細胞におけるＯＣＤＯの量を測定したものと同じ実験条件下で、健常人由来の試料中の細胞において測定された値である基準値と比較する。基準値に対して有意に高いＯＣＤＯの量は、その後、前記試料中の細胞の腫瘍形成状態の指標となる。用語「有意に高い」とは、基準値よりも統計的に大きい値を意味することを目的とする（ｐ＜０．０５）。
【００５８】
本発明の方法は、一般的に、疾患の進行の初期に、個体における腫瘍の進行の予後を示すことを可能にする。個体からの試料中の細胞が、基準値未満又は基準値と同様のＯＣＤＯ量を示した場合には、これは予後が良いこと及び良性腫瘍を示すものである。逆に、個体からの試料中の細胞が基準値より高いＯＣＤＯ量を示す場合には、これは予後不良及び悪性腫瘍の指標となる。
【００５９】
一般的に、ＯＣＤＯの量は可視化手段により決定する。
【００６０】
本発明の一実施形態においては、前記細胞の液体抽出物中のＯＣＤＯ化合物の量を決定（測定）する。一般的に、この液体抽出物は、細胞を溶解し、その後固体及び液体画分を例えば遠心分離によって分離することから得られる。この液体画分が前記細胞の「液体抽出物」となる。
【００６１】
液体抽出物中でのＯＣＤＯの有無は、薄層クロマトグラフィーによって見いだすことができ、その後、適切な可視化手段を介してクロマトグラフィープレート上のＯＣＤＯの有無を検出する。可視化手段を用いるために、ＯＣＤＯを輸送タンパク質上に固定化するようにできる、ＯＣＤＯの化学修飾を含めることが可能であり、これをその後モノクローナル抗体を用いて検出する。変形形態では、可視化手段は、クロマトグラフィーの前に行われる、得られた細胞の放射性標識であり、可視化は、プレート上の放射能の定量により行われる。
【００６２】
細胞の液体抽出物のＯＣＤＯ濃度が１μMより高い場合に、前記細胞が腫瘍形成状態にあることが示された。抽出物中のＯＣＤＯ濃度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってアッセイすることができる。この濃度はまた、ガスクロマトグラフィーとそれに続く質量分析によってもアッセイすることができる。
【００６３】
特定の一実施形態においては、液体抽出物中のＯＣＤＯの量を薄層クロマトグラフィーによって決定し、クロマトグラフィープレート上のＯＣＤＯ化合物を適切な可視化手段により検出する。
【００６４】
本発明の目的は、個体から得られた試料における腫瘍形成状態のマーカーとしてのＯＣＤＯ化合物の使用でもまたある。
【００６５】
本発明はまた、ヒト個体又は哺乳動物由来の生体材料の腫瘍形成状態のマーカーとしてのＯＣＤＯ化合物の使用に関する。
【００６６】
本発明はまた、個体から得られた試料中の細胞における腫瘍形成状態のマーカーとしてのＯＣＤＯ化合物の使用に関する。
【００６７】
本発明はまた、ヒト又は動物生体に対して実施される、癌を診断する方法のために使用するＯＣＤＯ化合物に関する。
【００６８】
癌を発症している個体の治療をモニタリングする方法
本発明はまた、癌を発症している個体の治療への反応をモニタリングする方法に関し、前記方法は、治療中の個体の診断の変化が前記治療に対する個体の反応の指標となる本発明の診断方法を用いて、治療の前及び治療中に個体の診断を確定する工程を含む。
【００６９】
本発明はまた、癌を発症している個体の治療への反応をモニタリングする方法に関し、前記方法は、治療中の個体から得られた試料中の細胞の腫瘍形成状態の変化が、個体の前記治療に対する反応の指標となる本発明の細胞の腫瘍形成状態を検出する方法を用いて、治療の前及び治療中に前記個体から得られた試料における細胞の腫瘍形成状態を決定する工程を含む。
【００７０】
本発明では、治療の前及び治療中に採取される試料は、同じ実験条件下で採取される。
【００７１】
抗癌剤のスクリーニング方法
本発明の目的は、癌を発症している個体における、前記癌を治療するための薬剤の有効性を評価する方法でもまたあり、この方法は、
（ａ）前記個体から得られた試料中の細胞の液体抽出物におけるＯＣＤＯのＤ１濃度をアッセイし；
（ｂ）治療期間の後に、工程（ａ）と同じ方法で、前記個体から得られた試料中の細胞の液体抽出物におけるＯＣＤＯのＤ２濃度をアッセイし；
（ｃ）Ｄ１とＤ２を比較し；そして
（ｄ）Ｄ２＜Ｄ１である場合、この結果から、この薬物が前記癌の治療に有効であると推測すること、を特徴とする。
【００７２】
本発明はまた、癌を発症している個体における、前記癌治療の有効性を評価する方法に関し、前記方法は、治療中の個体の診断の変化が、癌を治療するための前記治療の有効性の指標となる本発明の診断方法を用いて、治療の前及び治療中に個体の診断を確定する工程を含む。
【００７３】
本発明はまた、癌を発症している個体における前記癌治療の有効性を評価する方法に関し、前記方法は、治療中の個体から得られた試料中の細胞の腫瘍形成状態の変化が癌を治療するための前記治療の有効性の指標となる本発明の細胞の腫瘍形成状態を検出する方法を用いて、治療の前及び治療中に、前記個体から得られた試料中の細胞の腫瘍形成状態を決定する工程を含む。
【００７４】
本発明では、治療の前及び治療中に採取される試料は、同じ実験条件下で採取される。
【００７５】
癌の治療方法
本発明の目的はまた、ヒト又は動物の癌治療において使用するためのＯＣＤＯ阻害剤でもある。
【００７６】
本発明はまた、癌を発症している個体の治療方法に関し、前記方法は、前記個体に治療上有効量のＯＣＤＯ阻害剤を投与する工程を含む。
【００７７】
一実施形態では、ＯＣＤＯをエタノール中に溶解し、得られた溶液を次に緩衝液、具体的にはリン酸塩緩衝液で希釈し（通常は１／１０００）、そして生じた希釈溶液を個体に、一般的には腫瘍内に注入する。用いる阻害剤に応じて、１μg／kg〜５００μg／kgまでの範囲の１日用量を、１〜１０週間の間の期間、注入することができる。しかしながら、当業者は、阻害剤を投与する形態ならびに治療用量及び治療期間の両方を、個体及び治療する疾患によって調節することができる。
【００７８】
ＯＣＤＯ阻害剤は通常、以下の製品、
ロバスタチン、Ｒｏ  ４８−８０７１阻害剤、Ｕ１８６６６Ａ、ＡＹ−９９４４、トリパラノール、テルビナフィン及びＳＫＦ−５２５Ａのような、コレステロール生合成に関与する酵素の阻害剤；
ケトコナゾール及びビタミンＥのような、コレステロールのエポキシ化において活性なシトクロムＰ４５０阻害剤、リポキシゲナーゼ及び酸化防止剤；
ＰＢＰＥ、ＰＣＰＥ、テスミリフェン、デンドロゲニンＡ（ＤＤＡ）、タモキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、ラロキシフェン、ニトロミフェン、クロミフェン、ＲＵ  ３９４１１、ＢＤ−１００８、ハロペリドール、ＳＲ  ３１７４７Ａ、イボゲイン、ＡＣ−９１５、リムカゾール、アミオダロン、トリフルオロペラジン、Ｕ１８６６６Ａ、ＡＹ−９９４４、トリパラノール、テルビナフィン及びＳＫＦ−５２５Ａのようなコレステロールエポキシドヒドロラーゼ（ＣｈＥＨ）活性の阻害剤；並びに
エストロゲン受容体アンタゴニスト、抗エストロゲン膜結合部位（ＡＥＢＳ）リガンド、σ−１及び−２受容体及び特定のアミノアルキルステロールのリガンド、細胞間コレステロール輸送阻害剤、並びに、プロゲステロン及びＡｈｒ受容体アンタゴニストからなる群より選択される酵素阻害剤、からなる群より選択される阻害剤；
から選択される。
【００７９】
本発明のその他の態様及び利点を以下の図及び実施例に記載するが、これらは本発明を例示するものと見なされるべきであり、本発明の範囲を限定しない。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】ＭＣＦ７細胞及びマウス肝細胞におけるＣｈＥＨ活性の測定。［１４Ｃ］ＣＥ存在下で細胞をインキュベートし、次に脂質を抽出し、そしてステロールをシリカプレート薄層クロマトグラフィーにより解析及び分離する。クロマトグラフィープレートをオートラジオグラフィーにより可視化する。ＣＥ：５，６−エポキシコレスタノール、ＣＴ：コレスタン−３β，５α，６β−トリオール、Ｍ：代謝産物Ｍ。
【図２】ＭＣＦ７細胞におけるＣｈＥＨ活性の動力学。ＭＣＦ７細胞を［１４Ｃ］ＣＥα（Ａ）又は［１４Ｃ］ＣＥβ（Ｂ）存在下で、４〜７２時間に時間を長くしながらインキュベートする。脂質を細胞から抽出し、そしてステロールをシリカプレート薄層クロマトグラフィーにより解析及び分離する。クロマトグラフィープレートをオートラジオグラフィーにより可視化する。ＣＥ：５，６−エポキシコレスタノール、ＣＴ：コレスタン−３β，５α，６β−トリオール、Ｍ：代謝産物Ｍ。
【図３】ＭＣＦ７細胞における、タモキシフェン及びＰＢＰＥによるＣｈＥＨ活性の用量依存的阻害（３日間）。ＭＣＦ７細胞を［１４Ｃ］ＣＥα（Ａ）又は［１４Ｃ］ＣＥβ（Ｂ）存在下で３日間、タモキシフェン（Ａ）又はＰＢＰＥ（Ｂ）の濃度を上げながらインキュベートする。脂質を細胞から抽出し、そしてステロールをシリカプレート薄層クロマトグラフィーにより解析及び分離する。クロマトグラフィープレートをオートラジオグラフィーにより可視化する。ＣＥ：５，６−エポキシコレスタノール、ＣＴ：コレスタン−３β，５α，６β−トリオール、Ｍ：代謝産物Ｍ。
【図４】ＣＴの代謝産物Ｍへの変換。ＭＣＦ７細胞を［１４Ｃ］ＣＴ（Ａ）存在下で２４、４８及び７２ 時間インキュベートする。脂質を細胞から抽出し、そしてステロールをシリカプレート薄層クロマトグラフィーにより解析及び分離する。クロマトグラフィープレートをオートラジオグラフィーにより可視化する。ＣＥ：５，６−エポキシコレスタノール、ＣＴ：コレスタン−３β，５α，６β−トリオール．Ｍ：代謝産物Ｍ。
【図５】代謝産物Ｃのマススペクトル。ＭＣＦ７細胞をＣＥ存在下でインキュベートし、次に脂質を抽出し、そしてＨＰＬＣにより精製し、ＯＣＤＯに相当する画分を質量分析により解析する。
【図６】健康な組織におけるＯＣＤＯ生産の解析。様々なマウス器官由来の細胞を、［１４Ｃ］ＣＴ（Ａ）存在下で４８時間、タモキシフェンを加えて又は加えないでインキュベートする。脂質を細胞から抽出し、そしてステロールをシリカプレート薄層クロマトグラフィーにより解析及び分離する。クロマトグラフィープレートをオートラジオグラフィーにより可視化する。ＣＴ：コレスタン−３β，５α，６β−トリオール、Ｍ：代謝産物Ｍ。
【図７】ＯＣＤＯがインビトロでの細胞増殖に及ぼす効果。ヒト甲状腺髄様癌細胞（ＴＴ細胞）を、ＯＣＤＯの濃度を０．１〜５μMの範囲で上げながら、４日間培養する。このインキュベート期間の後に細胞の量を測定し、そして増殖因子を決定する。
【図８】ＯＣＤＯがインビボでの腫瘍進行に及ぼす効果。ＴＴ細胞をヌードマウスに移植する。このマウスを溶媒（溶媒）又は５０μg／kgのＯＣＤＯを７日間のうちの５日間、１日１回注入しながら、数週間処理した。腫瘍体積を測定し、時間の関数としてグラフにする。
【図９】リンパ節の解析。リンパ節における腫瘍細胞の有無を解析し、溶媒（溶媒）又はＯＣＤＯで処理した動物間で比較する。
【図１０】腫瘍の組織形態学的解析。溶媒（溶媒）又はＯＣＤＯで処理した動物の腫瘍を固定し、そしてサイトケラチン、カルシトニン及び上皮膜抗原（ＥＭＡ）に対する抗体の存在下でインキュベートする。ストレプトアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体とインキュベートし、次にジアミノベンジジン溶液中でインキュベートし、そしてヘマトキシリンでの染色を行う方法により、可視化する。茶色の染色が、抗体で標識したタンパク質の発現を表す。
【図１１】ＯＣＤＯがサイトカインの発現に及ぼす効果。ＴＨＰ１細胞をインビトロにおいて、１０μMのＯＣＤＯで４時間処理する。細胞のトータルＲＮＡを抽出し、ＩＬ１２及びＩＬ１０をコードしている遺伝子の発現を決定し、図に表す。
【図１２】ＯＣＤＯの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による解析。ＯＣＤＯを、５，６−エポキシコレスタノール（ＣＥ）、コレスタン−３β，５αａ，６β−トリオール（ＣＴ）及び７−ケトコレステロール（７−ケト−Ｃｈ）などのその他のオキシステロールから分離する。２１０nmでのＵＶ検出を用いる。
【図１３】ＨＰＬＣによるＯＣＤＯの検量線。ＯＣＤＯを０．１〜５μgまで用量を上げながら注入し、ＨＰＬＣにより解析する。ＯＣＤＯに相当するピークの面積を注入した物質の質量の関数として表す。このグラフから、直線的な相関が確認される。
【図１４】ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によるＯＣＤＯの解析。５α−コレスタンとＯＣＤＯの混合物をトリメチルシリル化し、その後質量分析装置を備えたガスクロマトグラフィー（ＧＣ／ＭＳ）により解析する。３つのピークが得られる。第１のピーク（１０．６２分）は５α−コレスタンに相当し、二番目のピーク（３２．４３分）はＨ２Ｏを１分子失ったＯＣＤＯ（ＯＣＤＯ−Ｈ２Ｏ）に相当し、３番目のピーク（３６．６８分）がＯＣＤＯに相当する。
【図１５】ＧＣで３２．４３分に現れたピークの質量分析。質量崩壊プロファイルにより、これがＯＣＤＯの脱水産物であることが明らかとなる（Ｍ＋４７２．３）。得られた産物の構造を示す。
【図１６】ＧＣで３６．６８に現れたピークの質量分析。質量崩壊プロファイルにより、これがＯＣＤＯの脱水産物であることが明らかとなる（Ｍ＋（−ＣＨ３）５４６）。得られた産物の構造を示す。
【図１７】ＧＣ／ＭＳによるＯＣＤＯの検量線。ＯＣＤＯを６．２５ng〜１００ngまで、用量を上げながら注入し、ＧＣ／ＭＳにより解析する。ＯＣＤＯに相当するピークの面積を注入した物質の質量の関数として表す。このグラフから、直線的な相関が確認される。
【図１８】タモキシフェンによるインビボでの腫瘍成長の阻害。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＴＳ／Ａ型の乳房細胞を移植する。このマウスをタモキシフェン（タモキシフェン）又は溶媒（溶媒）で処理する。時間経過と共に、腫瘍の体積を測定する。
【図１９】腫瘍におけるＯＣＤＯ含量のＧＣ解析。タモキシフェンで処理した又は処理しなかった動物の腫瘍を抽出する。この抽出物をＧＣ／ＭＳにより解析する。溶媒（Ａ）で処理した動物からの抽出物のＧＣプロファイルから、ＯＣＤＯとその脱水産物（ＯＣＤＯ−Ｈ２Ｏ）に相当するピークの存在が明らかとなる。
【図２０】ＯＣＤＯ及びＯＣＤＯ−Ｈ２Ｏに相当するＧＣピークのＭＳ解析。質量分析を用いて、ＧＣにより得られたピーク中に存在する化合物の構造を同定する。
【図２１】ＭＣＦ７細胞における、ＣｈＥＨ阻害剤によるＯＣＤＯ産生の阻害。ＭＣＦ７細胞を［１４Ｃ］ＣＥα存在下で３日間、溶媒（Ｔ）、コレステロールエポキシド（ＣＥ）、タモキシフェン（Ｔａｍ）、ＰＢＰＥ（ＰＢＰＥ）、ラロキシフェン（Ｒａｌ）、及びテスミリフェン（ＤＰＰＥ）と共にインキュベートする。ＣＥαと示したレーンは、移動の標準物質としてのせた［１４Ｃ］ＣＥαに相当する。細胞から脂質を抽出し、ステロールをシリカプレート薄層クロマトグラフィーにより解析し、分離する。クロマトグラフィープレートをオートラジオグラフィーにより可視化する。ＣＥ：５，６−エポキシコレスタノール、ＣＴ：コレスタン−３β，５α，６β−トリオール。
【図２２】ＭＣＦ７細胞における、一般的なシトクロムＰ４５０阻害剤であるケトコナゾールによるＯＣＤＯ産生の阻害。ＭＣＦ７細胞を［１４Ｃ］ＣＥα存在下で３日間、溶媒（対照）又は１０μMのケトコナゾールと共にインキュベートする。細胞から脂質を抽出し、ステロールをシリカプレート薄層クロマトグラフィーにより解析し、分離する。クロマトグラフィープレートをオートラジオグラフィーにより可視化し、ＣＥ及びＯＣＤＯの量を定量する。
【図２３】ＭＣＦ７細胞における、アミノアルキルステロール（ＤＤＡ）によるＯＣＤＯ産生の阻害。レーン１は移動の標準物質としてのせた［１４Ｃ］ＣＥαに相当する。レーン２は移動の標準物質としてのせた［１４Ｃ］ＣＴαに相当する。ＭＣＦ７細胞を［１４Ｃ］ＣＥα存在下で４８時間、溶媒（レーン３）、０．１μMのＤＤＡ（レーン４）及び１μMのＤＤＡと共にインキュベートする。細胞から脂質を抽出し、ステロールをシリカプレート薄層クロマトグラフィーにより解析し、分離する。クロマトグラフィープレートをオートラジオグラフィーにより可視化する。ＣＥ：５，６−エポキシコレスタノール、ＣＴ：コレスタン−３β，５α，６β−トリオール。
【図２４】ＭＣＦ７細胞における、細胞間コレステロール輸送調節物質及びＡｈＲ受容体調節物質によるＯＣＤＯ産生の阻害。ＭＣＦ７細胞を［１４Ｃ］ＣＴα存在下で２４時間、溶媒（レーン１）、プロゲステロン（レーン２）、Ｕ１８６６６Ａ（レーン３）、ＴＣＤＤ（レーン４）、ベンゾ（Ａ）ピレン（レーン５）、レスベラトロール（レーン６）及びＰＤＭ２（レーン７）と共にインキュベートする。細胞から脂質を抽出し、ステロールをシリカプレート薄層クロマトグラフィーにより解析し、分離する。クロマトグラフィープレートをオートラジオグラフィーにより可視化する。ＣＴ：コレスタン−３β，５α，６β−トリオール。
【００８１】
実施例１：ＯＣＤＯは、細胞の腫瘍状態のマーカーである
ヒト、ラット又はマウスの様々な細胞型中でこのマーカーを観察できるかどうかを確認するために、本明細書の以下実施例４に記載した方法を用いて、数多くの腫瘍細胞株におけるＯＣＤＯの有無について試験した。試験した各腫瘍細胞株におけるＯＣＤＯ産生は、以下の表に示したように検出された：
【００８２】
【表１】
0005765587.tif 000006
【００８３】
試験した全ての腫瘍細胞でＯＣＤＯが認められたことから、出願人らは、ＯＣＤＯが細胞における腫瘍状態のマーカーとなると結論づけた。
【００８４】
しかしながら、予備的な研究として、そして上述したアッセイ１〜５で行った方法と類似の方法により、ＯＣＤＯを検出することが可能な条件下において様々な健康なマウス組織由来の細胞におけるＣＥ化合物の変換を評価した（図６に示す結果を参照のこと）。前記細胞を［１４Ｃ］ＣＥα化合物と共にインキュベートし、そしてタモキシフェンを加えた（＋）又は加えてない（−）場合に現れる放射性のスポットを、シリカ薄層クロマトグラフィーにより観察した。タモキシフェンがある場合には、ＣＴ化合物はもう現れず、このことはＣｈＥＨの阻害とよく対応することが示され；タモキシフェンを加えずにインキュベートすると、ＣＴ化合物は現れるが、ＣＥ化合物の近くにＯＣＤＯの存在に相当するスポットは現れないことが示される。
【００８５】
その結果、ＯＣＤＯは正常な組織では産生されず、そのためＯＣＤＯの検出は細胞の腫瘍状態を予測するための要素を明かに構成し、ＯＣＤＯが細胞の腫瘍形成状態のマーカーであることが明らかとなる。
【００８６】
実施例２：ＯＣＤＯは発癌性である
上述したアッセイ及び実施例１に基づいて、出願人らは本発明により、腫瘍段階にある細胞においてＯＣＤＯが存在することが、この分子それ自体が発癌性ポテンシャルを有する可能性と関連しているのではないかと考えた。
【００８７】
文献では、そのような可能性はこれまで報告されていない。
【００８８】
コレステロールは変異原性をもたない。ＯＣＤＯ前駆体及びコレステロールエポキシドエピマーが哺乳類細胞において弱い変異原性を有することが述べられている（Peterson AR, Peterson H, Spears CP, Trosko JE and Sevanian, Mutation Research, vol. 203, p. 355-366, 1988）。細菌を用いて行ったＡｍｅｓ試験において、ステロールエポキシドは全く変異原性を示さなかった（Smith LL et al., Mutation Research, vol. 68, p. 23-30, 5 1979; Ansari GAS et al., vol. 20, p. 35-41, 1982）。近年、これらの所見が確認された（Cheng YW et al., Food and Chemical Toxicology, vol. 43, p. 617-622, 2005）。ＴＰＡ（１２−テトラデカノイルホルボール１３−アセテート）のような腫瘍プロモーターを有する、ＯＣＤＯの構造的ホモログが確かに見いだされた（Endo Y. et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo), vol. 42 (3), p. 462-469, 1994）。しかしながら、ＯＣＤＯが実験動物においてＰＫＣ活性化特性又は腫瘍促進特性を有する可能性を、誰も記述若しくは示唆してさえもいない。この分子がホルボールエステル結合タンパク質に結合することが示されているだけである（Endo Y., Biochem. Biophys. Res. Comm., vol. 194, p. 1529-1535, 1993）。
【００８９】
細胞の観点から、ＯＣＤＯが、
１）ヒト血清由来のＴリンパ球によるロゼット形成を阻害する（Streuli R.A. et al., J. Immunol., vol. 123 (6)n, p. 2897-2902）；
２）白血球の移動を阻害する（Gordon L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 77(7), p. 4313-4316, 1980）；
３）マウスにおいて、ＮＫ細胞の毒性を誘導する（Kucuk O. et al., Cell. Immunol., 139, p. 541-549, 1992）；
４）マウスにおいて、Ｔリンパ球によって生じる細胞融解活性を阻害する（Kucuk O et al., Lipids, vol. 29(9), p. 657-660, 1994）、と考えられることが示されているのみであり、これらの効果は１〜２０μMの範囲の濃度で認められた。
【００９０】
本実施例２を通して、出願人らは、本発明の状況において、ＯＣＤＯが腫瘍発生に効果を及ぼすことを確認した。このことは、先行技術からは当業者に全く示唆されていなかったものである。
【００９１】
ａ）この実施例２においては、ヒト甲状腺髄様癌細胞株ＴＴ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を用いた。この株を、１０重量％のウシ胎仔血清と５０IU／ｇの抗生物質溶液（ペニシリン／ストレプトマイシン）２．５mlを含む、Ｋａｉｇｈｎにより改変されたＦ１２Ｋ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から販売されている）中で培養する。試験に用いたＯＣＤＯはＳｔｅｒａｌｏｉｄｓ社のものである。細胞成長に及ぼすＯＣＤＯの効果をインビトロで解析するために、ＴＴ細胞を、上に定義したＦ１２Ｋ培地を入れた６ウェルプレートに播種する（１ウェル当たり２００，０００細胞個）。ＴＴ細胞を２日ごとに溶媒（ＰＢＳリン酸塩緩衝液に溶解した０．１％エタノール）又はその溶媒中に０．１、１、２．５又は５μMの濃度になるような量のＯＣＤＯを加えたもののいずれかで処理する。播種して４日後に細胞を計測する。図７に示すように、溶媒で処理した細胞の増殖を基準として比較すると、ＯＣＤＯでの処理により、ＴＴ細胞の増殖は濃度依存的に増加する。処理４日後に測定した、ＯＣＤＯ濃度５μMでの増殖誘導係数は１．５であり；その結果、１００nM〜５μMの範囲の濃度のＯＣＤＯによる増殖の誘導がインビトロで確認された。この増殖刺激係数は、乳房腫瘍細胞において細胞分裂特性を有する分子である、エストロゲンのものと同等である（Medina et al., J Pharmacol Exp Ther, vol. 319, 2006: p. 139-149を参照のこと）。
【００９２】
ｂ）出願人らは、腫瘍発生に及ぼすＯＣＤＯの効果をインビボでもまた解析する。動物への注入には、この実施例の（ａ）において上で定義したＴＴ細胞をトリプシンを用いて回収し、ＰＢＳリン酸塩緩衝液で２回洗浄し、そして懸濁する。次に、ＴＴ細胞（およそ４×１０６細胞／０．１ml）を６週齢のメスの「Ｓｗｉｓｓヌードｎｕ／ｎｕ」マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒより供給）の側腹部に皮下注射する。５０μg／kgのＯＣＤＯ（処理群）又は溶媒（対照群）のいずれかで、７日のうちの５日間、１日１回、１１０日間にわたって、動物を皮下的に処理する（用いた溶媒は、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）中に溶解した０．１％エタノールである）。腫瘍の発生を測定するために、この動物（１群当たり５又は１０マウス）を定期的にモニタリングする。腫瘍の体積を、式Ｌ×ｌ２×０．５により算出する。式中、Ｌは腫瘍の長さ、ｌは幅である。図８に腫瘍の体積Ｖを処理期間ｔの関数として示す。ＯＣＤＯ処理は有意に腫瘍成長を促進し、ＯＣＤＯで処理した動物の腫瘍体積は、溶媒で処理した対照動物のおよそ３倍大きい。
【００９３】
処理７５日後に動物を安楽死させ、腫瘍及び様々な器官を組織学的に解析するために切除する。ＯＣＤＯで処理した動物では、溶媒で処理した動物に比較して、２倍多いリンパ節（ＬＮ）の浸潤が認められた（図９を参照のこと）。
【００９４】
組織形態学的解析を行った。この解析を行うために、ＯＣＤＯ又は溶媒で処理したマウスの腫瘍及び様々な器官（リンパ節、肺及び肝臓）を切除し、１０％の中性緩衝ホルマリン中で固定し、そしてパラフィンブロック中に包埋する。これらの解析用に、切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色する。甲状腺髄様癌に関連する様々なヒト抗原に対する抗体を用いて免疫標識を行う。抗体としては、抗カルシトニンポリクローナル抗体（Ｄａｋｏ  ＳＡＳ、Ｔｒａｐｐｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ、１：１０００）、抗サイトケラチンモノクローナル抗体（Ｄａｋｏ  ｃｌｏｎｅ  ＡＥ１／ＡＥ３、１：５０）及び抗上皮膜抗原（ＥＭＡ）モノクローナル抗体（Ｄａｋｏ  ｃｌｏｎｅ  Ｅ２９、１：５０）を用いる。パラフィン切片の免疫標識は、抗ＣＥＡ抗体についてはクエン酸塩緩衝液（１０mM、pH６）中、マイクロ波で１０分（７５０Ｗ）を２回、又は抗カルシトニン及び抗ＥＭＡ抗体についてはクエン酸塩緩衝液（１０mM、pH６）中、９５℃の恒温水槽で４０分加熱することのいずれかによる抗原回復技術の後に行う。
【００９５】
上記で定義した抗体とインキュベートした後、切片をストレプトアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体（ＳｔｒｅｐｔＡＢＣｏｍｐｌｅｘ／ＨＲＰ、Ｄａｋｏ）で、次いでジアミノベンジジン（ＤＡＢ）の発色溶液を用いて免疫標識し、その後ヘマトキシリンで染色する。
【００９６】
一次抗体を含まない緩衝液中でインキュベートしたものをネガティブコントロールとする。用いた３種類の抗体それぞれについて、この組織学的解析手段により得られた結果を図１０に示す。ＯＣＤＯで処理した動物由来の腫瘍が確かにヒト甲状腺髄様癌であることが示され、これにより、腫瘍由来の細胞によるリンパ節の浸潤が確認される。
【００９７】
その結果、実験動物において移植した腫瘍の成長を刺激することにより、出願人らはＯＣＤＯがインビボで細胞分裂活性を有することを確認した。
【００９８】
実施例３：ＯＣＤＯはＩＬ１０を刺激し、そしてＩＬ１２を低下させる。このことはＯＣＤＯの発癌活性を説明するものである。
本発明により、ＯＣＤＯがインビボでの癌細胞の浸潤能を刺激することを確認した出願人らは、ＯＣＤＯを用いてインビトロで処理したＴＨＰ１細胞におけるサイトカインの発現を、インビトロで解析することにより、ＯＣＤＯのこの効果を確認する。
【００９９】
１０％のウシ胎仔血清及び抗生物質の混合物を添加したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ）型の培地中で、ＴＨＰ１細胞（ＡＴＣＣから入手したヒト骨髄細胞株）を培養する。ＴＨＰ１細胞を１０μMのＯＣＤＯで４時間処理する。標準的な方法に従ってＲＮＡを抽出する。相補的なＤＮＡを生成し、その後目的の遺伝子の発現を測定するために用いる。インターロイキン１２（ＩＬ１２）及びインターロイキン１０（ＩＬ１０）をコードしている遺伝子の発現を解析した。これらのインターロイキンは、拮抗的な特性をもつ１対のサイトカインを代表するものである。ＩＬ１２は免疫刺激性のサイトカインであるが、一方ＩＬ１０は免疫抑制性のサイトカインである。これら２種類のサイトカインの発現の比率は、細胞の免疫抑制物質又は免疫刺激能を評価すること、及び腫瘍進行を促進する又は対照的にそれを遅らせるその能力を評価することを可能にする。
【０１００】
ヒトのＩＬ１０及びＩＬ１２配列に対応した以下のプライマーを用いる。
【０１０１】
ＩＬ１０センス：ＡＡＡ−ＣＣＡ−ＡＡＣ−ＣＡＣ−ＡＡＧ−ＡＣＡ−ＧＡＣ（配列番号１）、
ＩＬ１０アンチセンス：ＧＣＴ−ＧＡＡ−ＧＧＣ−ＡＴＣ−ＴＣＧ−ＧＡＧ（配列番号２）、
ＩＬ１２センス：ＣＴＡ−ＴＧＧ−ＴＧＡ−ＧＣＣ−ＧＴＧ−ＡＴＴ−ＧＴＧ（配列番号３）、
ＩＬ１２アンチセンス：ＴＣＴ−ＧＴＧ−ＴＣＡ−ＴＣＣ−ＴＣＣ−ＴＧＴ−ＧＴＣ（配列番号４）。
【０１０２】
結果を図１１に示す。ＯＣＤＯは免疫抑制性のサイトカインであるＩＬ１０の発現を刺激し、そしてサイトカインＩＬ１２の発現を低下させる。このメカニズムは、実施例２を通して示した腫瘍細胞の浸潤能の、ＯＣＤＯによる刺激を説明することを可能にするものである。
【０１０３】
実施例４：ＯＣＤＯのアッセイ
Ａ）ＨＰＬＣによるアッセイ
高速液体クロマトグラフィーＨＰＬＣ法により、ＯＣＤＯを分離及び解析した（９５  ＭｅＯＨ／５  Ｈ２Ｏ；０．７ｍｌ／分；カラムＵｌｔｒａｓｅｐＥＳ  ６μｍ、２５０×４、Ｃ１８（Ｂｉｓｈｏｆｆ、Ｌｅｏｎｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ））。クロマトグラフィーの装置はＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社の、２００シリーズのポンプ及び２００型のダイオードアレイ検出器を備えたものである。
【０１０４】
この装置は、装置を制御し、データを処理するためのＴｕｒｂｏｃｈｒｏｍｅ（商標）を用いる、「ＰＣ」コンピューターを備える。
【０１０５】
培養したＭＣＦ７腫瘍細胞の細胞抽出物をアッセイ１に記載したように準備する。およそ６０００万個の細胞を溶解し、１２００rpmで１０分間遠心分離した後に２５μlの液体抽出物を得る。この抽出物のうちの２０μlをクロマトグラフィーのカラムに通す。
【０１０６】
得られたクロマトグラフを図１２に示す：ＯＣＤＯが、ＣＴ、ＣＥ及びケト−コレステロール（７−ケト−Ｃｈ）から分離されたことが分かる。ＯＣＤＯの保持時間は１９分である。
【０１０７】
このようにして得られたＯＣＤＯのピークの表面積の測定と試料中に含まれたＯＣＤＯの重量を関連づけるために、較正を行う。
【０１０８】
この較正は、Ｓｔｅｒａｌｏｉｄｓ社から販売されているＯＣＤＯのエタノール溶液を、濃度を上げながら用いることにより行う。容量は、試料２０μlに固定して行う。８０ng、０．４μg、０．８μg、４μg及び８μgのＯＣＤＯ量をインジェクションした。Ｔｕｒｂｏｃｈｒｏｍｅ（商標）ソフトウェアを用いた積分により、ＯＣＤＯに相当するピークの面積を測定し、これらの値（ｙ）をＯＣＤＯに相当する質量（ｘ）の関数として図１３のグラフに示した。４０ng〜８０ngの範囲の質量のＯＣＤＯを定量することができる、好適な直線的な相関が得られる（ｙ＝６９４３０ｘ＋１３８１；ｒ２＝０．９９９；ｎ＝６×３；ｐ＜０．０００１；ｘはμg単位のＯＣＤＯ；ｙはμV.s）。この方法では、０．１〜５μgの範囲の量の分子のＯＣＤＯを定量することができる。
【０１０９】
Ｂ）質量分析装置を備えたガスクロマトグラフィー（ＧＣ／ＭＳ）によるアッセイ
Ｋｅｄｊｏｕａｒによって記載された方法に従って、５α−コレスタンとＯＣＤＯの混合物をトリメチルシリル化する（Kedjouar et al., J Biol Chem, 2004, vol. 279, No. 32, p. 34048-61を参照のこと）。試料を、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド／ピリジン（５０：５０、ｖ／ｖ）の混合物２０を用いて、３０分間、温度６０℃で処理する。試薬を窒素流の下で蒸発させ、そしてトリメチルシリル化（ＴＭＳ）誘導体をヘキサンに溶解する。ＲＴＸ−５０シリカキャピラリーカラム（内径３０ｍ×０．３２mm、フィルム厚０．１μm；Ｒｅｓｔｅｋ）を備えた、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄのシステム４８９０型装置により、これらのＧＣ／ＭＳ解析を行う。オーブンの温度は、２３０℃を１分、次に１分につき１℃の上昇率で２３０〜２４０℃を１０分、１分につき３℃の上昇率で２４０℃〜２５０℃、そして４５℃／分の上昇率で２９０℃まで、その後１分で３３０℃まで上がるようにプログラムする。
【０１１０】
インジェクター及び検出器はそれぞれ３１０℃及び３４０℃に設定する。得られたＧＣプロファイルを図１４に示す。３つのピークが得られた。１番目のピークは保持時間が１０．６２である５α−コレスタンに相当する。２番目は保持時間３２．４３分に相当し、電子衝撃崩壊を用いた質量分析による解析において、これがＯＣＤＯの脱水産物（Ｍ＋（４７２．３）、Ｍ＋から１つのＣＨ３基が失われたもの及びＭ＋から２つのＣＨ３基が失われたもの、に相当するという結果を示す（図１５を参照のこと）。最後に、３番目のピーク（保持時間３６．６８分）はＯＣＤＯに相当し、その質量崩壊プロファイルを図１６に示す。このプロファイルから、質量が５４６．２（Ｍ＋から１つのＣＨ３基が失われたもの）、５３１．２（Ｍ＋から２つのＣＨ３基が失われたもの）及び４７２．２（Ｍ＋からＨ２Ｏ及びＯＴＭＳ基が失われたもの）であることが決定される。
【０１１１】
方法の較正は、ＯＣＤＯのエタノール溶液を、濃度を上げながら用いることにより行う。６．２５ng、１２．５ng、５０ng及び１００ngのＯＣＤＯ量をインジェクションした。これらさまざまなＯＣＤＯ量について、ＯＣＤＯに相当するピークの面積を積分することにより、ＯＣＤＯを定量するための検量線を確立することができた。この方法では、５〜２００ngの範囲の量のＯＣＤＯをアッセイすることが可能である（図１７を参照のこと）。
【０１１２】
実施例５：タモキシフェンによるインビボでのＯＣＤＯ産生の阻害
アッセイ２において既に示したように（図３Ａ）、ＭＣＦ７腫瘍細胞培養にタモキシフェンを加えると、これら細胞中でのＯＣＤＯ産生が阻害される。以下に、タモキシフェンをインビボに投与することによってもまた、ＯＣＤＯ産生が阻害されることを示す。
【０１１３】
マウスに移植した腫瘍におけるＯＣＤＯの変化を測定するために、実施例４で用いたアッセイ法を用いた。
【０１１４】
最初に、ＴＳ／Ａ細胞の細胞培養を行った。これらＴＳ／Ａ細胞は、マウス乳房腺癌細胞である（Nanni P et al., Clin. Exp. Metastasis, 1983 Oct-Dec; 1(4): 373-80を参照のこと）。この細胞を、２ｇ／リットルの炭酸ナトリウム、１．２mMのグルタミン（２３℃でpH７．４）、５％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）及び培地１リットル当たり２．５mlの抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン）を添加したＤＭＥＭ培地中、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養する。
【０１１５】
トリプシンを用いてＴＳ／Ａ細胞を回収し、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、そして懸濁する。次に、ＴＳ／Ａ細胞（およそ４×１０６  １５細胞／０．１ml）を６週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒより供給）の側腹部に皮下注射する。腫瘍を移植してから２７日間、濃度１０μM、注入量１００μlのタモキシフェン（タモキシフェン処理群）又は溶媒（ＰＢＳリン酸塩緩衝液に溶解した０．１％エタノール）（対照群）のいずれかで、３７日間の期間にわたり、１日１回、腫瘍内投与で動物を処理する。腫瘍の発生について、動物（１群当たり１０マウス）を定期的にモニタリングする。腫瘍体積を、式Ｌ×ｌ２×０．５（Ｌは腫瘍の長さ、ｌは腫瘍の幅）により算出する。この実験を２度再現した。結果を図１８に示す（矢印は処理の開始時を示す）。
【０１１６】
ここから、タモキシフェンで処理したマウスにおける腫瘍成長の定性的な阻害が、図１８から認められる。
【０１１７】
ＯＣＤＯによる阻害に関する定性的な情報を得るために、同一の条件下で再度実験を行い、そして２８日目に腫瘍を切除した。５倍量（切除した容積に対して）の緩衝液（５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０mM  ＫＣｌ、pH＝７．４）を加える。腫瘍をすりつぶし、ホモジネートを２５００rpm、４℃で５分間遠心分離する。上清を回収し、次に１倍量のメタノール（上清の容積に対して）及び２倍量のクロロホルムを加える。遠心分離した後（相を分離するため）、有機相を回収する。有機相を乾燥するまで蒸発させ、その後残渣を０．５mlのクロロホルムに溶解する。有機抽出物を０．５mlのシリカカートリッジを用いてろ過する。極性ステロールを順次溶出する。
１）０．５ｍｌのヘキサン／クロロホルム（１／１）混合物、
２）０．５ｍｌのクロロホルム、
３）０．５ｍｌの酢酸エチル及びメタノール。
【０１１８】
抽出及び精製段階の最中に、１４Ｃ標識したＯＣＤＯの外部標準物質を加えることにより、回収率が８６±６％であったことを確認することができる。酢酸エチル画分を蒸発させ、シリル化し（５０μl  １／１  アセトニトリル／ＢＳＴＦＡ）、そして上述した条件によるＧＣ／ＭＳで解析する（２μl）。
【０１１９】
図１９は、実施例４に示したように行ったＧＣ／ＭＳ解析の、ガス相において生成された２つのクロマトグラムを示し、
Ａ）対照動物由来の腫瘍抽出物：腫瘍の重量は２ｇであった；
Ｂ）タモキシフェンで処理した動物由来の腫瘍抽出物：腫瘍の重量は１．４５ｇであった、
に対応する。
【０１２０】
図１９では、未処理マウス（Ａ）と比較して、処理したマウス（Ｂ）腫瘍のＯＣＤＯに由来するピークが有意に小さくなったことが観察される。質量分析により、この目的のピーク中の分子の構造を同定する（図２０を参照のこと）。
【０１２１】
従って、数字上では以下の表に示すような結果が得られた。対照群は上で定義され、そして対照群に関係する値を１００として、その係数をタモキシフェンに関する結果に適用した。
【０１２２】
【表２】
0005765587.tif 000007
【０１２３】
インビボでタモキシフェンが有意にＯＣＤＯを阻害することが分かる。
【０１２４】
タモキシフェンが抗腫瘍活性を有し、同時に、腫瘍を促進するオキシステロールの産生をインビボで阻害するという事実は、ＯＣＤＯがタモキシフェンの効果に関与することを示すものである。
【０１２５】
実施例６：ＰＢＰＥによるインビボでのＯＣＤＯ産生の阻害
ＰＢＰＥは、インビトロでの実験においてその抗増殖性効果が確認されている化合物である（アッセイ２で引用した参考文献、及びPayre B. et al., Mol. Cancer Ther., 7(12), 3707-3717による刊行物もまた参照のこと）。実施例５で示したタモキシフェンについての結果と同様の、ＰＢＰＥのインビボでの結果を確認した。毎日、濃度４０μMのＰＢＰＥを注入量１００μlで腫瘍内に投与した以外は、タモキシフェンでの処理について実施例５に詳述したプロトコールと厳密に同一のプロトコールを用いた。結果を並べて下記表５に示す。
【０１２６】
【表３】
0005765587.tif 000008
【０１２７】
従って、インビボではＰＢＰＥがＯＣＤＯの産生を阻害し、腫瘍の退行を生じることの両方の作用をもつことを確認した。
【０１２８】
実施例７：ＰＢＰＥによる、様々な腫瘍細胞でのＯＣＤＯ産生の阻害
上述したアッセイ２から、ＰＢＰＥ溶液中で３日間インキュベートしたＭＣＦ７腫瘍細胞の細胞抽出物においては、ＯＣＤＯと同定した代謝産物の阻害が観察されることが示された。
【０１２９】
異なる細胞株を用いて、同様の実験を行った。ここでは試験した細胞を４０μMのＰＢＰＥ溶液中で、４８時間インキュベートする。以下の表に示した試験した全ての株において、ＯＣＤＯは１００％阻害された。
【０１３０】
【表４】
0005765587.tif 000009
【０１３１】
通常、アッセイ２と同様に得た薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレートからＯＣＤＯ阻害のパーセンテージを確認するためには、放射性代謝産物を、ＧＰ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  ｓｃｒｅｅｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）型のユーロピウム感受性プレートとＳｔｏｒｍ  ８４０  ｐｈｏｓｐｈｏｒ  ｉｍａｇｏｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて前記プレートに基づいて同定し定量する。Ｉｍａｇｅ  ５  Ｑｕａｎｔ５．２ソフトウェアを用いてデンシトメトリーにより得られたオートラジオグラム上の、放射性標識したオキシステロールの割合を決定する。定量したオキシステロールの量をオキシステロールの総和（ＣＥＥ＋ＣＥ＋ＣＴ＋ＯＣＤＯ）で除算し、その間の割合に基づいてパーセンテージを算出する。ＣＥＥ（ＣＥエステル）の大部分がＣＥに由来することから、パーセンテージＣＥは、（ＣＥ＋ＣＥＥ）／（ＣＥ＋ＣＥＥ＋ＣＴ＋ＯＣＤＯ）の割合に基づいて算出する。
【０１３２】
実施例８：ＣｈＥＨが不活性の場合にＯＣＤＯは阻害される
本特許出願中でこれまでに確認したように、腫瘍細胞がＯＣＤＯを産生することが知られている。このことは、ＯＣＤＯの産生に必須の変化である、ＣＥからＣＴへの変換が可能であることからＣｈＥＨヒドロラーゼが活性であることもまた意味している。この実施例の後に示す表１で確認するように、タモキシフェン、ＰＢＰＥ、ラロキシフェン及びＤＰＰＥはＣｈＥＨ阻害剤である。そのため、上述したアッセイ２は、アッセイ２で詳述したようにＭＣＦ７腫瘍細胞をインキュベートした場合に生じる産物の量を測定することにより完成される。実施例７に記載したように、ＣＥ、ＣＴ及びＯＣＤＯのパーセンテージを算出する。結果を図２１に示す。この図は、薄層クロマトグラフィープレートを示し、レーンの下に示した符号で表すように各レーンは、細胞を溶媒Ｔ（ＰＢＳ緩衝液に溶解した０．１％エタノール）、ＣＥ−阻害剤及び４種類のＣｈＥＨ阻害剤と共にインキュベートしたものに対応する。得られた数値を下の表に並べて示す。
【０１３３】
【表５】
0005765587.tif 000010
【０１３４】
ＣｈＥＨを阻害することが実際にＯＣＤＯの阻害を引き起こし、ＣＴ産物の量も非常に低下することが示される。
【０１３５】
実際には、細胞中でのＯＣＤＯ形成は、
１．コレステロールの有無、
２．ＣＥの有無、
３．コレステロールエポキシドヒドロラーゼ（ＣｈＥＨ）の有無、
４．ＣＴの有無、
５．ＣＴがＯＣＤＯへと酸化される場所へのＣＴの輸送、
６．ＣＴのＯＣＤＯへの酸化に関わる酵素の有無及び活性、
の複数の指標に依存する。
【０１３６】
一方をＭＣＦ７腫瘍細胞中でＯＣＤＯを阻害するの様々な化合物の能力とし、他方をそれらのＣｈＥＨ阻害剤としての質として、両者の間の関係を根拠の確かなものとして確認するために、一定数の産物に関するＣｈＥＨの阻害係数であるＫｉを算出し、そしてその同じ産物と共にＭＣＦ７細胞をインキュベートした後に、その細胞が産生するＯＣＤＯの量を本特許出願のアッセイ２で定義したプロトコールに従って測定する。全ての結果を表１及び２に示す。これら２つの表から、コレステロール生合成に関わる酵素のいずれの阻害剤も、ＯＣＤＯの産生に使用される可能性のあるコレステロールを減少させると考えられる。具体的には、酵素、ヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡシンテターゼ（ＨＭＧ  ＣｏＡシンテターゼ）から７−デヒドロコレステロールレダクターゼ及び２４−デヒドロコレステロールレダクターゼの阻害剤について示す。
【０１３７】
ロバスタチンのようなＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤のカテゴリー内にある阻害剤についての実験を、１０μＭの濃度で行った。対照の値を１００とすると、アッセイ２で示したプロトコールに従ってＭＣＦ７細胞をインキュベートした後のＭＣＦ７細胞によるＯＣＤＯ産生の値は１未満であったことが示された。
【０１３８】
【表６】
0005765587.tif 000011
【０１３９】
【表７】
0005765587.tif 000012
【０１４０】
表１及び表２に示されており、かつ、本明細書中でこれまでに同定していない産物を、以下のリストにおいて、それらの化学名により定義する。
【０１４１】
ＰＣＰＥ：１−（２−（４−（２−フェニルプロパン−２−イル）フェノキシ）エチル）-ピロリジン；
テスミリフェン：２−（４−ベンジルフェノキシ）−Ｎ，Ｎ−ジエチルエタンアミン；
タモキシフェン：２−［４−［（Ｚ）−１，２−ジ（フェニル）ブタ−１−エニル］フェノキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン；
４ＯＨ−タモキシフェン：４−［（Ｚ）−１−［４−（２−ジメチルアミノエチルオキシ）-フェニル］−２−フェニルブタ−１−エニル］フェノール；
ラロキシフェン：［６−ヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシフェニル）−１−ベンゾチオフェン−３−イル］−［４−（２−ピペリジン−１−イルエトキシ）フェニル］メタノン；
ニトロミフェン：１−［２−［４−［（Ｚ）−１−（４−メトキシフェニル）−２−ニトロ−２−フェニルエテニル］フェノキシ］エチル］ピロリジン；
クロミフェン：２−［４−［（Ｚ）−２−クロロ−１，２−ジ（フェニル）エテニル］-フェノキシ］−Ｎ，Ｎ−ジエチルエタンアミン；
ＲＵ３９４１１：１１−［４−Ｎ，Ｎ−［ジエチルアミノエトキシ］フェニル］エストラ−１，３，５（１０）トリエン−３，１７−ジオール。
【０１４２】
ＢＤ−１００８：Ｎ−（３，４−ジクロロフェネチル）−Ｎ−メチル−２−（ピロリドン−１−イル）エタンアミン；
ハロペリドール：４−（４−（４−クロロフェニル）−４−ヒドロキシピペリジン−１−イル）−１−（４−フルオロフェニル）ブタン−１−オン；ＳＲ−３１７４７Ａ：（Ｅ）−Ｎ−（４−（３−クロロ−４−シクロヘキシルフェニル）ブタ−３−エニル）−Ｎ−エチルシクロヘキサンアミン；
ＡＣ９１５：Ｎ−（３，４−ジクロロフェネチル）−Ｎ−メチル−２−（ピロリドン−１−イル）エタンアミン；
リムカゾール：９−［３−［（３Ｓ，５Ｒ）−３，５−ジメチルピペラジン−１−イル］プロピル］カルバゾール；
アミオダロン：（２−ブチル−１−ベンゾフラン−３−イル）−［４−（２−ジエチルアミノエチルオキシ）−３，５−ジヨードフェニル］メタノン；
トリフルオロペラジン：１０−［３−（４−メチルピペラジン−１−イル）プロピル］−２−（トリフルオロメチル）フェノチアジン；
【０１４３】
ＲＯ４８−８０７１：（４−（６−（アリル（メチル）アミノ）ヘキシルオキシ）フェニル）（４−ブロモフェニル）メタノン；
Ｕ−１８６６６Ａ：３−β−（２−（ジエチルアミノ）エトキシ）アンドロスト−５−エン−１７−オン；
【０１４４】
ＡＹ−９９４４：トランス−１，４−ビス（２−クロロベンズアミノメチル）シクロヘキサン；
トリパラノール：２−（４−クロロフェニル）−１−（４−（２−ジエチルアミノ）エトキシ）フェニル）−１−ｐ−トリルエタノール；
テルビナフィン：（Ｅ）−Ｎ，３，６，６−テトラメチル−Ｎ−（ナフタレン−１−イルメチル）ヘプタ−２−エン−４−イン−１−アミン；
ＳＫＦ−５２５Ａ：２−ジエチルアミノエチル−２，２−ジフェニルペンタノエート。
【０１４５】
実験の対象とした、表１及び２の結果を示す阻害剤には、エストロゲン受容体モジュレーター、抗エストロゲン膜結合部位（ＡＥＢＳ）リガンド、シグマ−１及び−２受容体リガンド、及びスクワレンシンテターゼから７−及び２４−デヒドロコレステロールレダクターゼまでのコレステロール生合成阻害剤が含まれる。これらの全ての阻害剤における１つの共通点はすなわち、ＡＥＢＳリガンドであるということである。
【０１４６】
表１に示した阻害係数Ｋｉの測定に用いたプロトコールを以下に詳述する。
【０１４７】
ａ）ＡＥＢＳに対するＫｉ
Ｋｉは目的の分子の阻害定数に相当するものであり、以下の方法により測定する。ラット肝臓ミクロソームを、濃度２．５nMのトリチウム化タモキシフェン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より供給された）と増加濃度０．０１〜１０００μMの範囲の阻害剤とを、後述する刊行物に記載されている条件下でインキュベートする：Poirot M. et al., Bioorg Med Chem 2000, vol. 8(8), p. 2007-2016。ＩＣ５０値は、ＣｈＥＨ活性の５０％を阻害するのに必要とされる阻害剤の濃度に相当するものであり、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ４）データ処理プログラムを用いて決定する。Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｓｏｆの式（Cheng and Prussof, Biochem Pharmacol, 1973, vol. 22(23), pages 3099-3108）を用いてＫｉ値を算出する。Ｋｉを、Ｋｉ＝［ＩＣ５０］（１＋（トリチウム化タモキシフェン］）／Ｋｄ）の式により表す。トリチウム化タモキシフェンの濃度は２．５nMであり、及びＡＥＢＳに対するトリチウム化タモキシフェンの平衡での解離定数は２nMである。
【０１４８】
ｂ）ＣｈＥＨに対するＫｉの決定
１５０μgのラット肝臓ミクロソームタンパク質を、２種類の濃度の［１４Ｃ］ＣＥα存在下で、阻害剤の濃度を０．０１〜１０００μMまでの範囲で上昇させながら、ＣｈＥＨ活性の測定について上述した条件下でインキュベートする。Ｄｉｘｏｎ法（Dixon M, Biocheml Jl, 1953, vol. 55(1), p. 170-171）から決定されるように、１／Ｖの値をＣｈＥＨに対する１／Ｓの関数としてグラフ上にプロットすることにより得られる２本の線の、Ｘ軸上での交点をＫｉとして測定した。
【０１４９】
実施例９：シトクロムＰ４５０阻害剤によるＯＣＤＯの阻害
コレステロールのエポキシ化は、シトクロムＰ４５０又はリポキシゲナーゼなどの酵素作用が介在する、大気中の酸素によるコレステロールの自己酸化によって生じる場合がある（Schroepfer G.Jr, Physiological Reviews, vol. 80, No. 1, p. 361-554, 2000を参照のこと）。
【０１５０】
一般的なシトクロムＰ４５０阻害剤、すなわちケトコナゾール、を用いることにより、エポキシステロールＣＥ並びにその誘導体であるＣＴ及びＯＣＤＯの産生が阻害されることが示された（図２２を参照のこと）。
【０１５１】
この実験に用いたプロトコールは実施例７において記載したものと同じである。
【０１５２】
実施例１０：アミノアルキルステロールによるＣｈＥＨの阻害
この実験のために、仏国特許第２，８３８，７４１号に含まれ、式：６β−Ｎ−［２−（３Ｈ−イミダゾール−４−イル）エチルアミノ］コレスタン−３β、５α−ジオール（ＤＤＡ）を有するアミノアルキルステロールを選択した（de Medina et al., J Med Chem: 2009, vol. 52, No. 23, p. 7765-7777もまた参照のこと）。ＭＣＦ７腫瘍細胞を［１４Ｃ］ＣＥ（１０mCurie／mmol、０．６μM）と共に４８時間、上述したアミノアルキルステロール（０．１及び１μM濃度）を加えて又は加えずにインキュベートした。
【０１５３】
薄層クロマトグラフィーを行い、そのプレートを図２３に再現する。このプレートでは、レーン１については［１４Ｃ］ＣＥと、レーン２については［１４Ｃ］ＣＴと、レーン３についてはアッセイ１〜５で使用したものと同じ溶媒と、レーン４については［１４Ｃ］ＣＥ及び０．１μMのアミノアルキルステロールと、そしてレーン５については［１４Ｃ］ＣＥ及び濃度１μMのアミノアルキルステロールと共にインキュベートを行う。
【０１５４】
アミノアルキルステロールがあるとＣｈＥＨの阻害が引き起こされ、この阻害がアミノアルキルステロールの濃度に依存することが認められる。
【０１５５】
さらに、ホモジネートにおけるこの阻害についても研究を行った。プロトコールは以下の通りである：トリプシンを用いてＭＣＦ７細胞をばらばらにし、５％のＦＢＳを添加したＲＰＭＩ培地に懸濁する。得られた細胞懸濁液（６０００万細胞）を遠心分離し、冷ＰＢＳで洗浄し、そして１mlの２０  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（pH＝７．４；１５０mM  ＫＣｌ）に再懸濁する。凍結／融解（液体窒素／３７℃）を５サイクル繰り返すことにより細胞を溶解する。溶液を１２００rpm、４℃で１０分間遠心分離する。上清を回収し、ブラッドフォード法によりタンパク質を測定する。ＭＣＦ７細胞溶解物におけるＣｈＥＨ活性の測定は以下の通りに行う：１２５μlのＣｈＥＨ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH７．４、１５０mM  ＫＣｌ）と１５μlのＭＣＦ７タンパク質を含む、最終容量１５０μl中のタンパク質１５０μgについての酵素活性を測定する。ＩＣ５０値を比較し、（ＩＣ５０）細胞＝０．６μMであるが、（ＩＣ５０）ホモジネート＝１１．２μMであることが明らかになった。
【０１５６】
ＩＣ５０値におけるこの差は、試験したアミノアルキルステロールが癌発症に対する抑制特性を示すことを表すものである。
【０１５７】
加えて、ＤＤＡ化合物について、実施例６に示すＰＢＰＥについての結果と同様の結果が測定された。用いたプロトコールは、連日腫瘍内投与を１０μMの濃度で注入量１００μlで行った以外は、タモキシフェンを用いた処理について実施例５に詳述した方法と厳密に同一のものである。結果を以下の表に並べて示す。
【０１５８】
【表８】
0005765587.tif 000013
【０１５９】
その結果、この実施例から、ＤＤＡ産物が最初にＯＣＤＯを阻害し、２番目に、インビボで、腫瘍サイズを減少させることが確認される。
【０１６０】
実施例１１：細胞間コレステロール輸送モジュレーター及びアリール炭化水素受容体（Ａｈｒ受容体）モジュレーターによる、ＯＣＤＯの阻害
２種類の細胞間コレステロール輸送モジュレーター、すなわちプロゲステロン及びＵ１８６６６Ａ（３−β−（２，２０−（ジエチルアミノ）エトキシ）アンドロスト−５−エン−１７−オン）（Liscum L et al., J. Biol. Chem., vol. 270 (26) p. 15443-15446, 1995を参照のこと）（それぞれレーン２及び３）を試験する。
【０１６１】
２種類のＡｈｒ受容体（アリール炭化水素受容体）モジュレーター、すなわち２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（ＴＣＤＤ）及びベンゾ（Ａ）ピレンをもまた試験した（それぞれレーン４及び５を参照のこと）。最後に、２種類のＡｈｒ受容体アンタゴニスト、すなわちレスベラトール及び１，３−ジクロロ−５−［（１Ｅ）−２−（４−クロロフェニル）エテニル］−５−ベンゼン（ＰＤＭ２）を試験した（「Casper R.F. et al., Mol. Pharmacol., 1999 October; 56(4); 784-90」及び「de Medina et al., J. Med Chem., 2005 January 13; 48(1): 287-91」を参照のこと）。
【０１６２】
以下の実験を行った：０．５μMの［１４Ｃ］ＣＴ存在下にＭＣＦ７腫瘍細胞を置き、その後以下の産物のうちの１つを加えて２４時間インキュベートする。
１．対照の溶媒（ＰＢＳ緩衝液に溶解した０．１％エタノール）（レーン１）。
２．１０μMのプロゲステロン
３．１０μMのＵ１８６６６Ａ
４．１００nMのＴＣＤＤ
５．１０μMのベンゾ（Ａ）ピレン
６．１０μMのレスベラトール
７．１０μMのＰＤＭ２（Ａｎｔ．１）
【０１６３】
薄層クロマトグラフィーを行い、得られたプレートを図２４に示す。実施例７に詳述したプロトコールを用いることで、各レーンのスポットから、処理した細胞中でのＯＣＤＯ産生を定量した。この定量の結果を図２４のヒストグラムで示す。
【０１６４】
ＭＣＦ７細胞をその他のＡｈｒ受容体アンタゴニストと共に上で定義したものと同じプロトコールでインキュベートした場合に、細胞が産生するＯＣＤＯの量についてもまた測定し、対照試験を１００として、そのＯＣＤＯ産生を対照に対する割合（％）として表した（上記実験と同じ対照を用いた）。結果を以下の表に示す。
【０１６５】
【表９】
0005765587.tif 000014
【０１６６】
この結果から、細胞間コレステロール輸送モジュレーター及びＡｈｒ受容体アンタゴニストがＯＣＤＯの形成を阻害することが可能であり、従ってそれらの抗癌作用を用いることが可能であると考えられる。
【図３Ａ】
0005765587.tif 000016
【図３Ｂ】
0005765587.tif 000017
【図１３】
0005765587.tif 000018
【図２１】
0005765587.tif 000019
【図２３】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0005765587.tif 000029
【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２２】
0005765587.tif 000039
【図２４】
0005765587.tif 000040
【配列表】
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