(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トルコギキョウの複対立遺伝子ＨＺ、ＨＤ又はその両方の塩基配列の第１エクソン部分に、配列番号４の塩基配列又はその配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列であって、かつ、レトロトランスポゾン活性をコードするレトロトランスポゾンを挿入することを含む、ただし複対立遺伝子ＨＤ又はＨＺが、フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の水酸化に関して３’，５’位の水酸化を制御し、デルフィニジン（Ｄｐｎ）の生合成に関与する遺伝子であり、複対立遺伝子ＨＺ又はＨＤの塩基配列が、配列番号２の塩基配列又はその配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列である、トルコギキョウの花色を改変する方法。
【請求項２】
花色の改変が、複対立遺伝子ＨＤ又はＨＺの機能を失い、新たに複対立遺伝子ＨＴ又はＨＦの機能を獲得することによって生じる、ただし複対立遺伝子ＨＴが、フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の水酸化に関して３’位の水酸化を制御し、ペラルゴニジン（Ｐｇｎ）とシアニジン（Ｃｙｎ）の生合成に関与する遺伝子であり、複対立遺伝子ＨＦがフラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の水酸化に関して、ペラルゴニジン（Ｐｇｎ）の生合成に関与する遺伝子であり、複対立遺伝子ＨＴ又はＨＦが、配列番号１の塩基配列又はその配列と９８％以上の同一性を有する塩基配列からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
複対立遺伝子ＨＺ、ＨＤ又はその両方の塩基配列の第１エクソン部分が、第１エクソンの４９１ｂｐと５００ｂｐとの間である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、花卉の花色発現に重要な役割を演じているフラボノイド３’、５’−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３’、５’Ｈ）の遺伝子、並びに、この遺伝子を利用する花色の予測及び改変方法に関する。より詳しくは、本発明は、フラボノイド生合成に関与し、遺伝する花色遺伝型交配法の育種法に用いることができるＦ３’、５’Ｈ遺伝子構造が含まれる複対立遺伝子、及び／又は、複対立遺伝子にレトロトランスポゾン遺伝子が挿入されたＦ３’、５’Ｈ遺伝子を利用して、開花前の花卉の花色を予測する方法、或いは、花色を改変する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
花色発現の発現遺伝子に関する研究は、１９８０年代の前半より１９９０年代の後半の約２０年間で大きな飛躍を遂げている。花色発現に関わる植物の生合成経路として、フラボノイド生合成がよく知られている。本経路の代謝産物であるフラボノイド中、特に、黄色い色を発現するフラボノール配糖体の色素や、赤から紫、青などの花色発現に重要なアントシアニンの色素は、他の色素と比べると普遍的に存在する。
【０００３】
トウモロコシ、キンギョソウ、ペチュニアの花色発現遺伝子の研究に関して、アントシアニン生合成の酵素をコードする構造遺伝子、例えば、カルコン合成酵素（ＣＨＳ）、カルコン異性化酵素（ＣＨＩ）、フラボン３−水酸化酵素（Ｆ３Ｈ）、フラボノイド３’−水酸化酵素（Ｆ３’Ｈ）、フラボノイド３’、５’−水酸化酵素（Ｆ３’、５’Ｈ）などの報告がある。また、アントシアニン生合成を調節する遺伝子、例えば、ＣＨＳ、ＤＦＲ、３ＧＴ、ＡＮＳなどを調節する遺伝子座の報告もある（非特許文献１）。
【０００４】
トルコギキョウの花色発現遺伝子に関して、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＮＡ）からコードされるＦ３’５’Ｈ遺伝子（Ｆ３’５’−Ｈ  ｃＤＮＡ）をリンドウ、ペチュニア、ナスの類似遺伝子と比較した報告がある（非特許文献２）。この遺伝子は、紫色の花色を発現するデルフィニジンの生合成に関与することが示されている。
【０００５】
ペチュニアから単離したＦ３’５’−Ｈ  ｃＤＮＡ、ＡＫ１４をプローブとして利用し、トルコギキョウ（Ｅｕｓｔｏｍａ  ｒｕｓｓｅｌｉａｎｕｍ）よりＦ３’５’−Ｈ  ｃＤＮＡ、ＴＧ１を単離したという報告がある。さらに、ＴＧ１とＡＫ１４をペチュニアとタバコに挿入し、形質転換体植物の花色発現を調査した報告がある（非特許文献３）。さらにまた、フウリンソウ（Ｃａｍｐａｎｕｌａ  ｍｅｄｉｕｍ）より単離したＦ３’５’−Ｈ  ｃＤＮＡ、Ｋａ１をタバコに挿入し、形質転換体植物の花色発現を調査し、本遺伝子が遺伝子工学を用いて花色を青色へ改変することのできる最も良好な遺伝子資源であるとの報告がある（非特許文献４）。
【０００６】
ニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）より得られたチトクロームＰ４５０依存型フラボノイド水酸化酵素に関する報告がある。また、ペチュニアより得られたＣＹＰ７５  Ｈｆ１  ｃＤＮＡをプローブにして、ニチニチソウでＦ３’５’−Ｈ  ｃＤＮＡについてスクリーニング（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）を行った結果、両者より得られたフラボノイド水酸化酵素は６８〜７８％の相同性のあることが報告されている（非特許文献５）。
【０００７】
アサガオの花色多形に関して、アサガオの遺伝的表現型の変異は、通常遺伝子にトランスポゾンが挿入され、そのほとんどが改変された結果であるとの記載がある。また、アサガオの花色表現型を決定する遺伝子型が４つの遺伝子座で制御されるというメンデルの法則に従い、それらのなかでもＡ／ａ遺伝子座が上位優性（ｅｐｉｓｔａｓｉｓ）であるとの記載がある（非特許文献６）。
【０００８】
トルコギキョウの花色発現に関わる遺伝子群の研究について、カルコン合成酵素（ＣＨＳ）、カルコン異性化酵素（ＣＨＩ）、フラボン３−水酸化酵素（Ｆ３Ｈ）、フラボノイド３’、５’−水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）、ジヒドロフラボノール還元酵素（ＤＦＲ）、アントシアニン合成酵素（ＡＮＳ）について、ｍＲＮＡよりｃＤＮＡを合成し、それらの構造を解析したとの報告がある（非特許文献７）。これによると、トルコギキョウのＦ３’５’Ｈ  ｃＤＮＡは、１８９２ｂｐの長さを持ち、これにより合成可能なフラボノイド３’、５’−水酸化酵素タンパクは５１０個のアミノ酸配列から成ることの記載がある。
【０００９】
ツルニチニチソウ（Ｖｉｎｃａ  ｍａｊｏｒ）の花色発現に関わるフラボノイド３’、５’−水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）の研究に関して、ツルニチニチソウからＰＣＲ法により遺伝子クローンされたＦ３’５’Ｈ遺伝子を単離し、ＶｍＦＨ１と命名された。この遺伝子は、翻訳領域又は推定遺伝子領域（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ）の塩基配列は１５１８ｂｐであり、８８５ｂｐと６３３ｂｐの２つのエクソン（ｅｘｏｎ）から成る。また、この遺伝子は５０６個のアミノ酸をコードし、デルフィニジンを生合成できることから、将来、ユリ科植物の青色花改変植物を得るための第一段階の研究であることの記載がある（非特許文献８）。
【００１０】
ブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）の果色発現に関わるアントシアニン生合成酵素遺伝子とその調節遺伝子の研究に関して、ブドウの果皮色は、ｍｙｂ−関連遺伝子であるＶｖｍｙｂＡ１遺伝子で発現し、品種「イタリア」と「ルビーオクヤマ」のクローン遺伝子の構造を解析した結果、ＶｖｍｙｂＡ１遺伝子にはＧｒｅｔ１（Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ  ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  １）と称するレトロトランスポゾンが含まれていることが分かり、これがＶｖｍｙｂＡ１遺伝子をコードする上流部分に挿入されている理由から、変異を生じ、野生型の紫色の果皮色から自然に白色様の果皮色が出現したとの記載がある（非特許文献９）。また、ブドウの品種「キャビネットサウヴィニオン（Ｃａｂｅｒｎｅｔ  Ｓａｕｖｉｇｎｏｎ）」より４つのフラボノイド３’−水酸化酵素（Ｆ３’Ｈ）のＤＮＡの遺伝子配列を明らかにしたとの記載がある（非特許文献１０）。４つの遺伝子は、それぞれＦ３’ｈ１、Ｆ３’ｈ２、Ｆ３’ｈ３、Ｆ３’ｈ４と称し、同様の位置に二つのイントロン（ｉｎｔｒｏｎ）が挿入され、アサガオ、ダイズ、アラビドプシスと同様であったとの記載がある（非特許文献１０）。
【００１１】
ペチュニア園芸品種のアントシアニジン３−グルコシド−ラムノシル変換酵素（ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ  ３−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ−ｒｈａｍｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＲＴ）の遺伝子に、トランソポゾン様因子が挿入されたとの記載がある。トランソポゾン様因子はｄＴｐｈ３ｓと称し、これがＲＴ遺伝子の１１８１ｂｐの位置に挿入されることによって、赤色の花色を発現することができるとの記載がある。さらに、このトランスポゾンの挿入は不安定であり、挿入ＲＴ遺伝子から容易に抜け出すことができ、抜け出した後にはＲＴ遺伝子にフットプリントを残し、フットプリントのあるＲＴ遺伝子の方が、トランスポゾン様因子ｄＴｐｈ３ｓが挿入されたＲＴ遺伝子に比べて、赤色花を育種するためにはより利用価値があるとの記載がある（非特許文献１１）。
【００１２】
また、ペチュニアのＦ３’５’Ｈをコードしている優性型遺伝子Ｈｆ１遺伝子と劣性型遺伝子ｈｆ１に関して、Ｈｆ１遺伝子の第３エクソン（ｅｘｏｎ）に、突然変異を起こすことのできる２つのトランスポゾン様因子ｄＴｐｈ９とｒＴｐｈ１がそれぞれ挿入された遺伝子が、結果として劣性遺伝子であるｈｆ１であることの報告がある（非特許文献１２）。
【００１３】
特許文献１に、遺伝子型判定方法に関して、遺伝子にトランスポゾンが挿入された状態の長いＤＮＡ断片、遺伝子にトランスポゾンが挿入されたものの抜けた状態又は正常な中くらいの長さのＤＮＡ断片及びトランスポゾンのフットプリントに対応する短いＤＮＡ断片の長さを電気泳動法によって分析し、その組み合わせにより、これらを区別して、遺伝子型を判定することができることが記載されている。
【００１４】
特許文献２に、ライムギなどのムギ類の新規なトランスポゾン様因子に関して、トランスポゾン様因子は、有用資源植物の分子育種に資するプローブ又はプライマー、更には染色体マーカーを開発するためのツールとして有用であるという記載がある。
【００１５】
特許文献３に、イネのトランスポゾン様ＤＮＡ及びその利用方法が記載されている。このトランスポゾン様ＤＮＡは、イネのフィトクロームＡ遺伝子のプロモーター領域に存在する（ＴＡ／ＡＴ）の繰り返し配列からなるマイクロサテライトの解析をする過程で、マイクロサテライト内に３９１ｂｐから成るＤＮＡ断片として見出された。
【００１６】
特許文献４には、レトロトランスポゾン、プロモーター活性を有するＤＮＡ断片、及びその利用の記載がある。
【００１７】
特許文献５には、タバコのレトロトランスポゾンを利用した遺伝子破壊法に関して、レトロトランスポゾンを該植物に導入する工程、及び該レトロトランスポゾンが導入された植物を培養することにより再分化させ、形質転換植物を作出する工程を包含する方法が記載されている。
【００１８】
特許文献６には、フラボノイド３’、５’−ヒドロキシラーゼ活性を有する蛋白質及びそれをコードする核酸に関する記載がある。
【００１９】
特許文献７には、フラボノイド生合成をコードする遺伝子配列とその利用に関して、フラボノイド３’−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３’Ｈ）、又はその関連蛋白、これらを利用することによって植物や植物器官の色素発現を制御することが記載されている。
【００２０】
特許文献８には、花色遺伝型交配法が記載されている。特に、フラボノイド生合成のＢ環の水酸化に関するフラボノイド３’−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３’Ｈ）やフラボノイド３’、５’−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３’、５’Ｈ）、などの遺伝に着目し、その遺伝の分離を調べた結果、ペラルゴニジン（Ｐｇｎ）、シアニジン（Ｃｙｎ）、デルフィニジン（Ｄｐｎ）の生合成に関与するジヒドロフラボノールリダクターゼ（ＤＦＲ）及びアントシアニジンシンターゼ（ＡＳ）の酵素系の遺伝が、それぞれＰｇ／ｐｇ、Ｃｙ／ｃｙ、Ｄｐ／ｄｐの遺伝子によって制御されていることと併せて、フラボノイド３’−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３’Ｈ）やフラボノイド３’、５’−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３’、５’Ｈ）の遺伝が４つの複対立遺伝子（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｌｌｅｌｅ）によって制御されているという法則を見出し、結果として、遺伝子組み替え、放射線等照射などによる突然変異を起こさせる方法を用いなくても、花卉の色素遺伝子型（ｐｉｇｍｅｎｔ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ）からその花色を自由に創成できること、また、色素前駆体のＢ環の水酸化に関与するフラボノイド３’−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３’Ｈ）とフラボノイド３’、５’−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３’、５’Ｈ）の酵素反応系には、ＨＴ、ＨＦ、ＨＤ、ＨＯの４つの複対立遺伝子が存在し、これらが３’位の水酸化、５’位の水酸化、３’、５’位の水酸化、及び３’位と３’、５’位の水酸化を制御し、これらの組合せによって色素表現型と花色表現型が決定されることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】特開２００４−２０１５８２
【特許文献２】特開２００５−７３５６１
【特許文献３】特開平１１−２０６３７４号公報
【特許文献４】特開２００２−２９１４７３
【特許文献５】国際公開ＷＯ００／７１６９９号パンフレット
【特許文献６】特開２０００−２３６８６
【特許文献７】米国特許出願公開２００５０８１２６４号明細書
【特許文献８】国際公開ＷＯ２００４／１０３０６５号パンフレット
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Ｈｏｌｔｏｎ、Ｔ．Ａ．とＣｏｒｎｉｓｈ、Ｅ．Ｃ．、「Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１９９５年、第７巻、第１０７１−１０８３頁
【非特許文献２】Ｎｉｅｌｓｏｎ、Ｋ．Ｍ．とＰｏｄｉｖｉｎｓｋｙ、Ｅ．、「ｃＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｆｌａｖｏｎｏｉｄ  ３’５’−Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｅｔａｌｓ  ｏｆ  Ｌｉｓｉａｎｔｈｕｓ  （Ｅｕｓｔｏｍａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）」、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９７年、第１２９巻、第１６７−１７４頁
【非特許文献３】Ｓｈｉｍａｄａ、Ｙ．、他５名、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｐ４５０  Ｇｅｎｅｓ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｆｌａｖｏｎｏｉｄ−３’、５’−Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｔｏｂａｃｃｏ  ａｎｄ  Ｐｅｔｕｎｉａ  Ｐｌａｎｔｓ」、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９９年、第４６１巻、第２４１−２４５頁
【非特許文献４】Ｏｋｉｎａｋａ、Ｙ．ら、「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｐｕｔａｔｉｖｅ  Ｆｌａｖｏｎｏｉｄ  ３’、５’−Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ｃＤＮＡ  ｆｒｏｍ  Ｃａｍｐａｎｕｌａ  ｍｅｄｉｕｍ」、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３年、第６７巻、第１６１−１６５頁
【非特許文献５】Ｋａｌｔｅｎｂａｃｈ、Ｍ．ら「Ｆｌａｖｏｎｏｉｄ  Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ：  ｃＤＮＡ、Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ−Ｔｙｐｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔｓ」、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１９９９年、第１９巻、第１８３−１９３頁
【非特許文献６】Ｃｌｅｇｇ、Ｍ．Ｔ．とＤｕｒｂｉｎ、Ｍ．Ｌ．、「Ｆｌｏｗｅｒ  Ｃｏｌｏｒ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ：  Ａ  Ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｌｌｏｑｕｉｕｍ、２０００年、第９７巻、第７０１６−７０２３頁
【非特許文献７】Ｎｏｄａら、「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｆｌａｖｏｎｏｌ  ａｎｄ  Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｐｅｔａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｌｉｓｉａｎｔｈｕｓ  （Ｅｕｓｔｏｍａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）」、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ、２００４年、第１２２巻、第３０５−３１３頁
【非特許文献８】Ｍｏｒｉ、Ｓ．ら、「Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｌａｖｏｎｏｉｄ  ３’、５’−Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  Ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｖｉｎｃａ  ｍａｊｏｒ  Ａｌｔｅｒｓ  Ｆｌｏｗｅｒ  Ｃｏｌｏｒ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ」、  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔ、２００４年、第２２巻、第４１５−４２１頁
【非特許文献９】Ｋｏｂａｙａｓｈｉ、Ｓ．ら、「Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＶｖｍｙｂＡ１  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｒａｐｅ  （Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）  Ｓｋｉｎ−Ｃｏｌｏｒ  Ｍｕｔａｎｔｓ」、  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｒｔｉｃｕｔｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００５年、第７４巻、第１９６−２０３頁
【非特許文献１０】Ｊｅｏｎｇ、Ｓ．Ｔ．ら、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｌａｖｏｎｏｉｄ  ３’−Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ａｎｄ  Ｆｌａｖｏｎｏｉｄ  ３’、５’−Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｆｌａｖｏｎｏｉｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｒａｐｅｓ  （Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）」、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００６年、第１７０巻、第６１−６９頁
【非特許文献１１】Ｎａｋａｊｉｍａ、Ｔ．ら、「Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｇｏｖｅｒｎｓ  ｔｈｅ  Ｒｅｄ  Ｆｌｏｒａｌ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｐｅｔｕｎｉａｓ」、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００５年、第１１０巻、第１０３８−１０４３頁
【非特許文献１２】Ｍａｔｓｕｂａｒａ、Ｋ．ら、「Ｔｗｏ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ａ  Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  Ｇｅｎｅ  Ｇｏｖｅｒｎ  Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  Ｐｅｔｕｎｉａｓ」、Ｇｅｎｅ、２００５年、第３５８巻、第１２１−１２６頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
上記の特許文献の中で、遺伝子にトランスポゾン及び／又はレトロトランスポゾンが挿入された遺伝子、並びに遺伝子にトランスポゾンが挿入されたものの抜けた状態でフットプリントを残した遺伝子が明らかにされ、さらに、遺伝子にトランスポゾン及び／又はレトロトランスポゾンを挿入することによって植物の様々な発現を人為的に制御できることが明らかにされたが、花色発現に関わる複対立遺伝子とトランスポゾン及び／又はレトロトランスポゾンとの関係については、記載はなかったし、また、これらのＤＮＡ断片の長さを電気泳動法によって分析し、その組み合わせにより、これらを区別して、遺伝子型を判定することは知られていたが、それらの遺伝子型を有する個体及び／又は系統がどのような花色／果色を有するか判定することができなかった。
【００２４】
さらに、これに関連して、トランスポゾン及び／又はレトロトランスポゾンが挿入された遺伝子を保有する遺伝子型が花色に関する遺伝子型育種法で後代にどのように遺伝するか曖昧であり、実用化する場合問題がある。また、非特許文献１２に記載されるＨｆ１／ｈｆ１で表されたペチュニアの花色素の遺伝について、基本的にメンデルの遺伝の法則に従うはずであるが、ｈｆ１遺伝子型には２種類以上存在することの記載があることから、後代の分離に曖昧な点があるため実用化には至っていない。さらに、トランスポゾン及び／又はレトロトランスポゾンが挿入された遺伝子を保有する遺伝子型である個体がどのような花色を有するか、ＣＩＥＬａｂ表色系（ＣＩＥＬａｂ  ｃｏｌｏｒ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ）などを用いて花色を正確に測色・数値化し、遺伝させることが十分ではなかったという問題点もある。
【００２５】
もし花卉の花色発現に関係する複対立遺伝子の遺伝子型を構造的に解明し、これらの遺伝子型と花色との相関が明らかになれば、それらの遺伝子型を判定した上で遺伝する個体がどのような花色を当代及び／又は後代へ発現するか容易に予測することができ、そのような遺伝子型は、花色を予測又は検定するための遺伝子指標（マーカー）として利用できるかもしれない。これによって、複対立遺伝子型について開花を迎えずに早期に判定するだけで、遺伝する当代及び／又は後代の花色をＣＩＥＬａｂ表色系などの座標軸上の値として容易に予測することができ、開花を迎えずに早期に花色を正確に知ることができると考えられる。
【００２６】
また、もし新規トランスポゾン及び／又はレトロトランスポゾンが挿入された遺伝子を保有する遺伝子型と、花色との関係が明確になれば、ＣＩＥＬａｂ表色系などの座標軸上の値としてより正確に花色を育種する技術として使用できるかもしれない。
【００２７】
本発明者らは、花色発現に関連する５つの複対立遺伝子型の遺伝子構造を明らかにし、それらの構造と当代及び／又は後代に遺伝される花色遺伝を明らかにし、また、ＣＩＥＬａｂ表色系などを用いて花色を正確に測色・数値化した上で、その色素遺伝子型と花色遺伝との関係を明らかにし、花卉の新花色作出について実用的な花色改変法と、及び／又は、花卉の開花を迎えずに早期に遺伝子を検定した上で、複対立遺伝子型を帰属し、遺伝する花色を知ることができる実用的な花色予測法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明者らは、上記の課題を解決するため、花色発現に関連する５つの複対立遺伝子型、すなわちＨＴ、ＨＦ、ＨＤ、ＨＺ、ＨＯのいずれか又はその組み合わせからなる遺伝子型を有する花卉品種を用いて、ＣＩＥＬａｂ表色系（ＣＩＥＬａｂ  ｃｏｌｏｒ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ）による花色を測定・数値化し、また、それらの色素表現型を分析し、それらの遺伝子型を帰属した。さらに、帰属された５つの複対立遺伝子型、ＨＴ、ＨＦ、ＨＤ、ＨＺ、ＨＯのそれぞれについて、フラボノイド３’、５’−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３’、５’−Ｈ）遺伝子の構造を明らかにし、その結果、５つの複対立遺伝子型ＨＴ、ＨＦ、ＨＤ、ＨＺ、ＨＯは３つのフラボノイド３’、５’−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３’、５’−Ｈ）遺伝子群に分類できることを今回見出した。
【００２９】
発明の概要
本発明は、要約すると、以下の特徴を有する。
（１）図４に示す経路式のフラボノイド生合成の色素前駆物質のＢ環の水酸化に関わるフラボノイド３'，５’-水酸化酵素を含む花卉の酵素反応系の花粉親配偶子及び種子親配偶子由来の複対立遺伝子ＨＴ、ＨＦ、ＨＺ、ＨＤ及びＨＯの組み合わせを、該複対立遺伝子に対応するフラボノイド３’、５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子に基づいて開花前の花卉組織から決定し、遺伝子型ＨＸＨＸ・Ｐｇ／ｐｇ・Ｃｙ／ｃｙ・Ｄｐ／ｄｐについて花粉親配偶子及び種子親配偶子間の複対立遺伝子の組み合わせと花色との相関に基づいて開花前の花卉の花色を予測する方法であって、ここで、複対立遺伝子ＨＴが、該フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の水酸化に関して３’位の水酸化を制御し、ペラルゴニジン（Ｐｇｎ）とシアニジン（Ｃｙｎ）の生合成に関与する遺伝子であり、複対立遺伝子ＨＦが該フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の水酸化に関して５’位の水酸化を制御し、ペラルゴニジン（Ｐｇｎ）の生合成に関与する遺伝子であり、複対立遺伝子ＨＤ又はＨＺが、該フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の水酸化に関して３’，５’位の水酸化を制御し、デルフィニジン（Ｄｐｎ）の生合成に関与する遺伝子であり、並びに、複対立遺伝子ＨＯが該フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の水酸化に関して３’、５’位の水酸化を制御し、デルフィニジン（Ｄｐｎ）の生合成に関与する遺伝子である、前記方法。
【００３０】
（２）複対立遺伝子の組み合わせが、電気泳動により決定される、（１）に記載の方法。
【００３１】
（３）複対立遺伝子ＨＴ又はＨＦが、配列番号１の塩基配列、その相補的配列、又はそれらの配列と８０％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡである、（１）又は（２）に記載の方法。
【００３２】
（４）複対立遺伝子ＨＺ又はＨＤが、配列番号２の塩基配列、その相補的配列、又はそれらの配列と８０％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡである、（１）又は（２）に記載の方法。
【００３３】
（５）複対立遺伝子ＨＯが、配列番号３の塩基配列、その相補的配列、又はそれらの配列と８０％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡである、（１）又は（２）に記載の方法。
【００３４】
（６）花卉が、双子葉植物又は単子葉植物から選択される、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
【００３５】
（７）花卉がトルコギキョウである、（６）に記載の方法。
【００３６】
（８）複対立遺伝子ＨＴ又はＨＦ由来の配列番号１の塩基配列、その相補的配列、又はそれらの配列と８０％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ又はその１５塩基以上の断片。
【００３７】
（９）複対立遺伝子ＨＺ又はＨＤ由来の配列番号２の塩基配列又はそれらの配列と８０％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡの第１エクソン配列中に、配列番号４のレトロトランスポゾンの塩基配列又はそれらの配列と６０％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列が挿入されている、（８）に記載のＤＮＡ又はその１５塩基以上の断片。
【００３８】
（１０）配列番号４の塩基配列又はそれらの配列と６０％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むレトロトランスポゾン又はその１５塩基以上の断片。
【００３９】
（１１）複対立遺伝子ＨＯ由来の配列番号３の塩基配列、その相補的配列、又はそれらの配列と８０％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ又はその１５塩基以上の断片。
【００４０】
（１２）開花前の花卉の花色を予測するためのキットであって、下記の（ａ）〜（ｃ）のＤＮＡ又はその断片：
（ａ）複対立遺伝子ＨＴ又はＨＦ由来の配列番号１の塩基配列、その相補的配列、又はそれらの配列と８０％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ、或いは該ＤＮＡの１５塩基以上の断片、
（ｂ）複対立遺伝子ＨＺ又はＨＤ由来の配列番号２の塩基配列、その相補的配列、又はそれらの配列と８０％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ、或いは該ＤＮＡの１５塩基以上の断片、並びに、
（ｃ）複対立遺伝子ＨＯ由来の配列番号３の塩基配列、その相補的配列、又はそれらの配列と８０％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ、或いは該ＤＮＡの１５塩基以上の断片、
の少なくとも１つをプローブ又はプライマーとして含む、前記キット。
【００４１】
（１３）プローブが標識されている、（１２）に記載のキット。
（１４）前記複対立遺伝子の組み合わせと花色との相関を示す早見表をさらに含む、（１２）又は（１３）に記載のキット。
【００４２】
（１５）花卉の複対立遺伝子ＨＺ、ＨＤ又はその両方のエクソン部分に、配列番号４の塩基配列又はそれらの配列と６０％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むレトロトランスポゾンを挿入することを含む、ただし複対立遺伝子ＨＤ又はＨＺが、フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の水酸化に関して３’，５’位の水酸化を制御し、デルフィニジン（Ｄｐｎ）の生合成に関与する遺伝子である、花卉の花色を改変する方法。
【００４３】
（１６）エクソンが第１エクソンである、（１５）に記載の方法。
（１７）花色の改変が、複対立遺伝子ＨＤ又はＨＺの機能を失い、新たに複対立遺伝子ＨＴ又はＨＦの機能を獲得することによって生じる、ただし複対立遺伝子ＨＴが、フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の水酸化に関して３’位の水酸化を制御し、ペラルゴニジン（Ｐｇｎ）とシアニジン（Ｃｙｎ）の生合成に関与する遺伝子であり、複対立遺伝子ＨＦがフラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の水酸化に関して、ペラルゴニジン（Ｐｇｎ）の生合成に関与する遺伝子である、（１５）又は（１６）に記載の方法。
【００４４】
（１８）花卉が、双子葉植物又は単子葉植物から選択される、（１５）〜（１７）のいずれかに記載の方法。
【００４５】
（１９）図４に示す経路式のフラボノイド生合成の色素前駆物質のＢ環の水酸化に関わるフラボノイド３'，５’-水酸化酵素を含む花卉の酵素反応系の花粉親配偶子及び種子親配偶子由来の複対立遺伝子ＨＴ、ＨＦ、ＨＺ、ＨＤ及びＨＯの組み合わせと花色との相関を示す早見表であって、ここで、複対立遺伝子ＨＴが、該フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の水酸化に関して３’位の水酸化を制御し、ペラルゴニジン（Ｐｇｎ）とシアニジン（Ｃｙｎ）の生合成に関与する遺伝子であり、複対立遺伝子ＨＦが該フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の水酸化に関して５’位の水酸化を制御し、ペラルゴニジン（Ｐｇｎ）の生合成に関与する遺伝子であり、複対立遺伝子ＨＤ又はＨＺが、該フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の水酸化に関して３’，５’位の水酸化を制御し、デルフィニジン（Ｄｐｎ）の生合成に関与する遺伝子であり、並びに、複対立遺伝子ＨＯが該フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の水酸化に関して３’、５’位の水酸化を制御し、デルフィニジン（Ｄｐｎ）の生合成に関与する遺伝子である、前記早見表。
【００４６】
（２０）下記のいずれかである、（１９）に記載の早見表。
0005648215.tif 000002
【００４７】
0005648215.tif 000003
【００４８】
定義
本明細書中で使用される用語は、以下の定義を有する。
【００４９】
「複対立遺伝子に対応するフラボノイド３’、５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子」とは、花卉のフラボノイド３'、５’水酸化に関与し、複対立遺伝子遺伝子座に存在する複数の遺伝的な因子の一部を構成する要素を意味する。
【００５０】
「花卉」とは、フラボノイドを含む花を有する被子植物、特に双子葉植物及び単子葉植物、をいう。
【００５１】
「花色遺伝型交配法」とは、フラボノイドのアントシアニジン色素、すなわちペラルゴニジン（Ｐｇｎ）、シアニジン（Ｃｙｎ）及びデルフィニジン（Ｄｐｎ）、に関する遺伝型育種法において、フラボノイド生合成における前駆物質のＢ環の水酸化に関わる５つの複対立遺伝子を任意に組み合わせることによって自由に花色を作製するための方法をいう。
【００５２】
「花粉親配偶子」とは、雄性配偶子をいう。一方、「種子親配偶子」とは、雌性配偶子をいう。
【００５３】
「％同一性」とは、対象の複対立遺伝子のＤＮＡ配列との配列比較（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を、ギャップを導入して又はギャップを導入しないで行い、対象のＤＮＡ配列の全塩基数に対する同一塩基数の百分率（％）をいう。配列比較は、通常、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのアルゴリズムを利用して行うことができる（例えば、Ｓ．Ｆ．  Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０（１９９０）；Ｗ．Ｒ．  Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｄ．Ｓ．  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８（１９８８））。
【００５４】
「ストリンジェントな条件」とは、対象の複対立遺伝子のＤＮＡ配列に対してハイブリダイズすることができる条件であって、例えば３０〜５０℃で、３〜５×ＳＳＣ、０．１〜１％ＳＤＳ中で１〜１５時間のハイブリダイゼーション、その後の、例えば０．１〜２×ＳＳＣ、０．１〜１％ＳＤＳ中、室温〜７０℃での洗浄からなる条件をいう。このような条件下で対象の複対立遺伝子のＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができるＤＮＡは、例えば該複対立遺伝子の変異体又はホモログである。ここで、ホモログは、対象植物とは異なる植物又は植物品種の同族の複対立遺伝子を指す。
【発明の効果】
【００５５】
本発明により、花色発現に関連する５つの複対立遺伝子の構造が解明された結果、それらの遺伝子型を判定した上で遺伝する個体がどのような花色を当代及び／又は後代へ発現するか容易に予測することができるし、また、開花を迎えずに早期に花色を予測することができる。これによって、花粉親配偶子及び種子親配偶子間の複対立遺伝子の組み合わせと花色との関係を示す早見表の作成が可能となり、これは花色の予測のために便利に利用できる。
【００５６】
さらにまた、本発明により、新規レトロトランスポゾンが見出され、これが挿入された遺伝子を保有する遺伝子型が解明された結果、５つの複対立遺伝子と花色との関係が明確となり、複対立遺伝子へのレトロトランスポゾン挿入を介して花色の改変、特に赤色への改変が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】各複対立遺伝子ＨＴ、ＨＦ、ＨＺ、ＨＤ、ＨＯのＦ３’、５’−Ｈ  ＤＮＡバンドの特徴を示す電気泳動図を示す。
【図２】複対立遺伝子ＨＴ、ＨＦ、ＨＺ、ＨＤ、ＨＯより得られたＦ３’、５’−Ｈ  ＤＮＡ遺伝子の構造を模式化した図を示す。
【図３】ヘテロ型の複対立遺伝子の組み合わせ、ＨＴとＨＤ、及び、ＨＴとＨＯのＦ３’、５’−Ｈ  ＤＮＡバンドを示す電気泳動図を示す。
【図４】花卉のフラボノイド生合成の経路図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
複対立遺伝子
特許文献８に一部記載されるように、本発明者らは、花色遺伝型が、図４に示す経路式（Ｉ）のフラボノイド生合成に関係することを見出した。
図４中、ＨＴ、ＨＦ、ＨＺ、ＨＤ及びＨＯは、フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の水酸化に関与する複対立遺伝子を表わし、ここで、複対立遺伝子ＨＴが、該前駆物質でのＢ環の水酸化に関して３’位の水酸化を制御し、ペラルゴニジン（Ｐｇｎ）とシアニジン（Ｃｙｎ）の生合成に関与する遺伝子であり、複対立遺伝子ＨＦが該前駆物質でのＢ環の水酸化に関して５’位の水酸化を制御し、ペラルゴニジン（Ｐｇｎ）の生合成に関与する遺伝子であり、複対立遺伝子ＨＤ又はＨＺが、該前駆物質でのＢ環の水酸化に関して３’，５’位の水酸化を制御し、デルフィニジン（Ｄｐｎ）の生合成に関与する遺伝子であり、並びに、複対立遺伝子ＨＯが該前駆物質でのＢ環の水酸化に関して３’、５’位の水酸化を制御し、デルフィニジン（Ｄｐｎ）の生合成に関与する遺伝子である。
【００５９】
さらにまた、図４中、花卉の花色発現に関わる主要アントシアニジン色素のペラルゴニジン（Ｐｇｎ）、シアニジン（Ｃｙｎ）、デルフィニジン（Ｄｐｎ）の遺伝について、Ｐｇｎ、Ｃｙｎ、Ｄｐｎ色素の遺伝子座をそれぞれＰｇ／ｐｇ、Ｃｙ／ｃｙ、Ｄｐ／ｄｐとして示した。Ｐｇｎ、Ｃｙｎ、Ｄｐｎの生合成に関与するジヒドロフラボノールリダクターゼ（ＤＦＲ）およびアントシアニジンシンターゼ（ＡＳ）の酵素系の遺伝が、それぞれＰｇ／ｐｇ、Ｃｙ／ｃｙ、Ｄｐ／ｄｐの遺伝子によって制御されている(特許文献８)。
【００６０】
本発明によれば、上記５つの複対立遺伝子ＨＴ、ＨＦ、ＨＺ、ＨＤ及びＨＯは、該複対立遺伝子によって制御される３つのフラボノイド３'、５’-ヒドロキシラーゼ（Ｆ３’、５’-Ｈ）遺伝子群に基づいて、ＨＴとＨＦ、ＨＺとＨＤ及びＨＯに分類できる。
【００６１】
フラボノイド色素前駆体のＢ環の水酸化に関与するフラボノイド３'−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３'Ｈ）とフラボノイド３'、５'−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３'、５'Ｈ）の酵素反応系の遺伝子型を、上記のとおり、ＨＴ、ＨＦ、ＨＤ、ＨＺ、ＨＯの５つの複対立遺伝子で示し、Ｐｇ／ｐｇの記号のうち２つを選択し（すなわち、ＰｇＰｇ、Ｐｇｐｇ、ｐｇｐｇの組合せ記号のうち１つを選択し）、Ｃｙ／ｃｙの記号のうち２つを選択し（すなわち、Ｃｙｃｙ、Ｃｙｃｙ、ｃｙｃｙの組合せ記号のうち１つを選択し）、Ｄｐ／ｄｐの記号のうち２つを選択し（すなわち、ＤｐＤｐ、Ｄｐｄｐ、ｄｐｄｐの組合せ記号のうち１つを選択し）、また、ＨＴ、ＨＦ、ＨＤ、ＨＺ、ＨＯの記号のうち２つを選択し（すなわち、ＨＴＨＴ、ＨＴＨＦ、ＨＴＨＤ、ＨＴＨＺ、ＨＴＨＯ、ＨＦＨＦ、ＨＤＨＦ、ＨＺＨＦ、ＨＯＨＦ、ＨＤＨＤ、ＨＤＨＺ、ＨＤＨＯ、ＨＺＨＯ、ＨＯＨＯの組合せ記号のうち１つを選択し）、花色を決める遺伝子型(色素遺伝子型)をＤ／ｄ・Ｅ／ｅ・ＨＸＨＸ・Ｐｇ／ｐｇ・Ｃｙ／ｃｙ・Ｄｐ／ｄｐとして表わすことができる。
【００６２】
本発明の３種の遺伝子は、花卉の組織、例えば根、葉、茎、種子などの植物体のあらゆる部分からＤＮＡを抽出し、プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、増幅産物を単離し、その後、配列決定によって得ることができる。すなわち、３種の遺伝子の翻訳領域を夾み、互いに向かい合う１５〜３０ｂｐのオリゴヌクレオチドをプライマーとし、花卉の組織より抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う。このＰＣＲによって、プライマーにはさまれる領域のＤＮＡ断片が増幅される。
【００６３】
このようにして、複対立遺伝子ＨＤとＨＺが３１１５ｂｐの塩基配列（配列番号２）を含むこと、複対立遺伝子ＨＯが２４９８ｂｐの塩基配列（配列番号３）を含むこと、複対立遺伝子ＨＴ又はＨＦが８５２５ｂｐの塩基配列（配列番号１）を含み、この配列中に配列番号４の塩基配列を含むレトロトランスポゾン様因子ｒＴｅｇ１（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｅｕｓｔｏｍａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ  １）が含まれることが判明した（図２参照）。
【００６４】
具体的には、複対立遺伝子型ＨＤ又はＨＺのフラボノイド３’、５’−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３’、５’−Ｈ）遺伝子の構造は、配列番号２に示す３１１５ｂｐの塩基配列であり、９８６ｂｐと１０００ｂｐからなる２つのエクソンの間に、１１２９ｂｐのイントロンを保有した構造である。
【００６５】
また、複対立遺伝子型ＨＯのＦ３’、５’−Ｈ遺伝子の構造は、配列番号３に示す２４９８ｂｐの塩基配列であり、９８６ｂｐと１０００ｂｐからなる２つのエクソンの間に、５１２ｂｐのイントロンを保有した構造である。
【００６６】
さらにまた、複対立遺伝子型ＨＴ又はＨＦのＦ３’、５’−Ｈ遺伝子の構造は、配列番号１に示す８５２５ｂｐの塩基配列であり、９９１ｂｐと１０００ｂｐからなる２つのエクソンの間に１１２９ｂｐのイントロンを保有し、さらに９９１ｂｐの第１エクソンの４９１ｂｐと５００ｂｐとの間に５４０５ｂｐのレトロトランスポゾンが挿入された構造である。
【００６７】
花色の予測法
本発明によれば、開花前の花卉の花色を予測する方法が提供される。この方法は、花粉親及び種子親配偶子間の上記複対立遺伝子ＨＴ、ＨＦ、ＨＺ、ＨＤ及びＨＯの組み合わせを、該複対立遺伝子のフラボノイド３’、５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子に基づいて開花前の花卉組織から決定し、遺伝子型ＨＸＨＸ・Ｐｇ／ｐｇ・Ｃｙ／ｃｙ・Ｄｐ／ｄｐについて花粉親及び種子親配偶子間の複対立遺伝子の組み合わせと花色との相関に基づいて、開花前の花卉の花色を予測することを含む。
【００６８】
本発明において、花卉とは、フラボノイド（ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ）を含む花、果実、種子、葉、すなわち、フラボノイドを含む花弁、萼片、苞、花被、果皮、種皮、葉柄などを有する顕花植物門（Ａｎｔｈｏｐｈｙｔａ）の被子植物門（Ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍａｅ）であり、被子植物門には双子葉植物綱（Ｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｅａｅ）及び単子葉植物綱（Ｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎｅａｅ）が含まれる。
【００６９】
双子葉植物綱の合弁花亜網（Ｓｙｍｐｅｔａｌａｅ）の花卉として、限定されるものではないが、例えば、キキョウ目（Ｃａｍｐａｎｕｌａｔａｅ）（キク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）、スティリディウム科（Ｓｔｙｌｉｄｉａｃｅａｅ）、クサトベラ科（Ｇｏｏｄｅｎｉａｃｅａｅ）、キキョウ科（Ｃａｍｐａｎｕｌａｃａｅ））、ウリ目（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｌｅｓ）（ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ））、アカネ目（Ｒｕｂｉａｌｅｓ）（マツムシソウ科（Ｄｉｐｓａｃａｃｅａｅ）、オミナエシ科（Ｖａｌｅｒｉａｎａｃｅａｅ）、スイカズラ科（Ｃａｐｒｉｆｏｌｉａｃｅａｅ）、アカネ科（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ））、シソ目（Ｔｕｂｉｆｌｏｒａｅ）（キツネノマゴ科（Ａｃａｎｔｈａｃｅａｅ）、タヌキモ科（Ｌｅｎｔｉｂｕｌａｒｉａｃｅａｅ）、イワタバコ科（Ｇｅｓｎｅｒｉａｃｅａｅ）、ツノゴマ科（Ｍａｒｔｙｎｉａｃｅａｅ）、ゴマ科（Ｐｅｄａｌｉａｃｅａｅ）、ノウゼンカズラ科（Ｂｉｇｎｏｎｉａｃｅａｅ）、ゴマノハグサ科（Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｃｅａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、シソ科（Ｌａｂｉａｔａｅ）、クマツヅラ科（Ｖｅｒｂｅｎａｃｅａｅ）、ムラサキ科（Ｂｏｒａｇｉｎａｃｅａｅ）、ハゼリソウ科（Ｈｙｄｒｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）、ハナシノブ科（Ｐｏｌｅｍｏｎｉａｃｅａｅ）、ヒルガオ科（Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌａｃｅａｅ））、モクセイ目（Ｃｏｎｔｏｒｔａｅ）（ガガイモ科（Ａｓｃｌｅｐｉａｄａｃｅａｅ）、キョウチクトウ科（Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ）、リンドウ科（Ｇｅｎｔｉａｎａｃｅａｅ）、フジウツギ科（Ｌｏｇａｎｉａｃｅａｅ）、モクセイ科（Ｏｌｅａｃｅａｅ））、イソマツ目（Ｐｌｕｍｂａｇｉｎａｌｅｓ）（イソマツ科（Ｐｌｕｍｂａｇｉｎａｃｅａｅ））、サクラソウ目（Ｐｒｉｍｕｌａｌｅｓ）（サクラソウ科（Ｐｒｉｍｕｌａｃｅａｅ）、ヤブコウジ科（Ｍｙｒｓｉｎａｃｅａｅ））、ツツジ目（Ｅｒｉｃａｌｅｓ）（ツツジ科（Ｅｒｉｃａｃｅａｅ）、イチヤクソウ科（Ｐｙｒｏｌａｃｅａｅ））、イワウメ目（Ｄｉａｐｅｎｓｉａｌｅｓ）（イワウメ科（Ｄｉａｐｅｎｓｉａｃｅａｅ））が挙げられる。
【００７０】
双子葉植物綱の離弁花亜網（Ａｒｃｈｉｃｈｌａｍｙｄｅａｅ）の花卉として、例えば、限定されるものではないが、テンニンカ目（Ｍｙｒｔｉｆｌｏｒａｅ）（アカバナ科（Ｏｎａｇｒａｃｅａｅ）、ノボタン科（Ｍｅｌａｓｔｏｍａｔａｃｅａｅ）、フトモモ科（Ｍｙｒｔａｃｅａｒ）、シクンシ科（Ｃｏｍｂｒｅｔａｃｅａｅ）、ザクロ科（Ｐｕｎｉｃａｃｅａｅ）、ミソハギ科（Ｌｙｔｈｒａｃｅａｅ）、グミ科（Ｅｌａｅｇｎａｃｅａｅ）、ジンチョウゲ科（Ｔｈｙｍｅｌａｅａｃｅａｅ））、ツバキ目（Ｐａｒｉｅｔａｌｅｓ）（シュウカイドウ科（Ｂｅｇｏｎｉａｃｅａｅ）、トケイソウ科（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａｃｅａｅ）、ハンニチバナ科（Ｃｉｓｔａｃｅａｅ）、スミレ科（Ｖｉｏｌａｃｅａｅ）、ツバキ科（Ｃａｍｅｌｌｉａｃｅａｅ））、アオイ目（Ｍａｌｖａｌｅｓ）（アオイ科（Ｍａｌｖａｃａｅａｅ）、ホルトノキ科（Ｅｌａｅｏｃａｒｐａｃｅａｅ））、クロウメモドキ目（Ｒｈａｍｎａｌｅｓ）（ブドウ科（Ｖｉｔａｃｅａｅ）、クロウメモドキ科（Ｒｈａｍｎａｃｅａｅ））、ムクロジ目（Ｓａｐｉｎｄａｌｅｓ）（ツリフネソウ科（Ｂａｌｓａｍｉｎａｃｅａｅ）、トチノキ科（Ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎａｃｅａｅ）、カエデ科（Ａｃｅｒａｃｅａｅ）、ニシキギ科（Ｃｅｌａｓｔｒａｃｅａｅ）、モチノキ科（Ａｑｕｉｆｏｌｉａｃｅａｅ）、ウルシ科（Ａｎａｃａｒｄｉａｃｅａｅ））、フウロソウ目（Ｇｅｒａｎｉａｌｅｓ）（トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）、ヒメハギ科（Ｐｏｌｙｇａｌａｃｅａｅ）、ミカン科（Ｒｕｔａｃｅａｅ）、アマ科（Ｌｉｎａｃｅａｅ）、フウロソウ科（Ｇｅｒａｎｉａｃｅａｅ）、カタバミ科（Ｏｘａｌｉｄａｃｅａｅ））、バラ目（Ｒｏｓａｌｅｓ）（マメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、マンサク科（Ｈａｍａｍｅｌｉｄａｃｅａｅ）、トベラ科（Ｐｉｔｔｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）、ユキノシタ科（Ｓａｘｉｆｒａｇａｃｅａｅ）、ベンケイソウ科（Ｃｒａｓｓｕｌａｃｅａｅ））、サラセニア目（Ｓａｒｒａｃｅｎｉａｌｅｓ）（サラセニア科（Ｓａｒｒａｃｅｎｉａｃｅａｅ）、ウツボカズラ科（Ｎｅｐｅｎｔｈａｃｅａｅ）、モウセンゴケ科（Ｄｒｏｓｅｒａｃｅａｅ））、ケシ目（Ｐａｐａｖｅｒａｌｅｓ）（アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｓｅａｅ）、フウチョウソウ科（Ｃａｐｐａｒｉｄａｃｅａｅ）、ケシ科（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ））、キンポウゲ目（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｌｅｓ）（クスノキ科（Ｌａｕｒａｃｅａｅ）、メギ科（Ｂｅｒｂｅｒｉｄａｃｅａｅ）、キンポウゲ科（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ）、アケビ科（Ｌａｒｄｉｚａｂａｌａｃｅａｅ）、スイレン科（Ｎｙｍｐｈａｅａｃｅａｅ）、バンレイシ科（Ａｎｎｏｎａｃｅａｅ）、モクレン科（Ｍａｇｎｏｌｉａｃｅａｅ））、アカザ目（Ｃｅｎｔｒｏｓｐｅｒｍａｅ）（ナデシコ科（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）、オシロイバナ科（Ｎｙｃｔａｇｉｎａｃｅａｅ））、タデ目（Ｐｏｌｙｇｏｎａｌｅｓ）（タデ科（Ｐｏｌｙｇｏｎａｃｅａｅ））、イラクサ目（Ｕｒｔｉｃａｌｅｓ）（クワ科（Ｍｏｒａｃｅａｅ））、ヤマモモ目（Ｍｙｒｉｃａｌｅｓ）（ヤマモモ科（Ｍｙｒｉｃａｃｅａｅ））が挙げられる。
【００７１】
単子葉植物網の花卉として、限定されるものではないが、例えば、ラン目（Ｏｒｃｈｉｄａｌｅｓ）（ラン科（Ｏｒｃｈｉｄａｃｅａｅ））、ショウガ目（Ｓｃｉｔａｍｉｎｅａ）（カンナ科（Ｃａｎｎａｃｅａｅ）、ショウガ科（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｃｅａｅ）、バショウ科（Ｍｕｓａｃｅａｅ））、ユリ目（Ｌｉｌｉｉｆｌｏｒａｅ）（アヤメ科（Ｉｒｉｄａｃｅａｅ）、ヒガンバナ科（Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）、ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ））、ツユクサ目（Ｃｏｍｍｅｌｉｎａｌｅｓ）（ミズアオイ科（Ｐｏｎｔｅｄｅｒｉａｃｅａｅ）、ツユクサ科（Ｃｏｍｍｅｌｉｎａｃｅａｅ）、パイナップル科（Ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｅ）、サトイモ目（Ａｒａｌｅｓ）（サトイモ科（Ａｒａｃｅａｅ））が挙げられる。
【００７２】
本発明において、上記５つの複対立遺伝子型の組み合わせは、３種類のフラボノイド３’、５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子に基づいて開花前の花卉組織から決定される。
【００７３】
上記３種類のフラボノイド３’、５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子を得るために、レトロトランスポゾン様因子ｒＴｅｇ１の挿入部位を挟み込む、５’→３’向きの塩基配列に対応した第１のプライマーと、３’→５’向きの塩基配列に対応した第２のプライマーを用いてＰＣＲを行うことができる。そのためのプライマーは、例えば以下のものである。
第１のプライマー：
５’−ＣＴＣＡＧＡＣＣＴＣＴＧＴＴＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＧ−３’（配列番号５）
第２のプライマー：
３’−ＡＧＡＡＡＣＴＧＡＡＣＴＣＴＣＡＴＣＣ−５’（配列番号６）
【００７４】
増幅されたＤＮＡは、電気泳動で分離することができ、電気泳動ゲル上のバンドとして検出される。ゲル上のバンドは、ゲルから単離可能で、単離されたＤＮＡ断片はサイクルシークエンシング法によるプライマーウォーキングなど、通常行われている塩基配列決定の方法に従って、全塩基配列を決定できる。ＤＮＡ断片の塩基配列が決定されたとき、その断片にトランスポゾン様ＤＮＡが挿入されていれば、そのトランスポゾンの配列と挿入位置も決定される。
【００７５】
例えば、トルコギキョウの品種あすかの紅から抽出したＤＮＡを鋳型として用い、上記に示されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ＰＣＲを行って、ＰＣＲ産物をアガロースゲルによる電気泳動を行った場合には、約８ｋｂｐのＤＮＡ断片が得られる。このＤＮＡ断片をアガロースゲルから抽出して、サイクルシークエンシング法によるプライマーウォーキングによって全塩基配列を決定すると、配列番号１に示す８５２５ｂｐの塩基配列からなるトランスポゾン様ＤＮＡが含まれることが判明した。
【００７６】
例えばトルコギキョウの品種ロイヤルバイオレットから抽出したＤＮＡを用い、上記に示されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ＰＣＲを行って、ＰＣＲ産物をアガロースゲルによる電気泳動を行った場合には約２．５ｋｂｐのＤＮＡ断片が得られる。このＤＮＡ断片をアガロースゲルから抽出して、サイクルシークエンシング法によるプライマーウォーキングによって全塩基配列を決定すると、配列番号３に示す２４９８ｂｐの塩基配列からなるＤＮＡが含まれることが判明した。
【００７７】
例えば、トルコギキョウの品種メロウラベンダーから抽出した抽出したＤＮＡを用い、上記に示されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ＰＣＲを行って、ＰＣＲ産物をアガロースゲルによる電気泳動を行った場合には約３ｋｂｐのＤＮＡ断片が得られる。このＤＮＡ断片をアガロースゲルから抽出して、サイクルシークエンシング法によるプライマーウォーキングによって全塩基配列を決定すると、配列番号２に示す３１１５ｂｐの塩基配列からなるＤＮＡが含まれることが判明した。
【００７８】
したがって、本発明によれば、上記複対立遺伝子型を決める３種類のフラボノイド３’、５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子は、以下のものである。
【００７９】
（１）複対立遺伝子型ＨＴを表わす、該フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の水酸化に関して３’位の水酸化を制御しペラルゴニジン（Ｐｇｎ）とシアニジン（Ｃｙｎ）の生合成に関与するＤＮＡであって、配列番号１の塩基配列、その相補的配列、又はそれらの配列と８０％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ、或いは、
複対立遺伝子型ＨＦを表わす、該フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の水酸化に関して５’位の水酸化を制御し、ペラルゴニジン（Ｐｇｎ）の生合成に関与するＤＮＡであって、配列番号１の塩基配列、その相補的配列、又はそれらの配列と８０％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ。
【００８０】
（２）複対立遺伝子ＨＤ又はＨＺを表わす、該フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の水酸化に関して３’，５’位の水酸化を制御し、デルフィニジン（Ｄｐｎ）の生合成に関与するＤＮＡであって、配列番号２の塩基配列、その相補的配列、又はそれらの配列と８０％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ。
【００８１】
（３）複対立遺伝子型ＨＯを表わす、該フラボノイド生合成の前駆物質でのＢ環の水酸化に関して３’、５’位の水酸化を制御し、デルフィニジン（Ｄｐｎ）の生合成に関与するＤＮＡであって、配列番号３の塩基配列、その相補的配列、又はそれらの配列と８０％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ。
【００８２】
上記（１）〜（３）のＤＮＡにおいて、該ＤＮＡには、上記のフラボノイド生合成に関与する活性を有するという条件で、配列番号１、配列番号２又は配列番号３の塩基配列或いはその相補的配列と通常６０％以上、好ましくは７０％以上、７５％以上、より好ましくは８０％以上、８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、９５％以上又は９８％以上の同一性を有するＤＮＡも包含される。
【００８３】
また、そのようなＤＮＡには、配列番号１、配列番号２又は配列番号３の塩基配列或いはその相補的配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡも包含される。ストリンジェントな条件は、上記定義のとおりであり、すなわち、以下のものに特に限定されないが、例えば３０〜５０℃で、３〜５×ＳＳＣ、０．１〜１％ＳＤＳ中で１〜１５時間のハイブリダイゼーション、その後の、例えば０．１〜２×ＳＳＣ、０．１〜１％ＳＤＳ中、室温〜７０℃での洗浄からなる条件をいう。ここで、１×ＳＳＣとは、１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む水溶液（ｐＨ７．２）である。ストリンジェントな条件の他の例は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載されており、その開示を本発明でも利用しうるものとする。
【００８４】
上記の８０％以上の同一性を有するＤＮＡ、或いは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡは、配列番号１、配列番号２又は配列番号３の塩基配列或いはその相補的配列の突然変異体、それとは異なる植物又は植物品種のホモログなどを含む。
【００８５】
本発明の方法では、開花前の花卉の組織、例えば葉、根、茎などの任意の部位からＤＮＡを抽出し、必要であればＰＣＲ法により該ＤＮＡを増幅し、ＤＮＡをサイズ分離する。ＤＮＡのサイズは、例えばトルコギキョウの場合８５２５ｂｐ（配列番号１）、３１１５ｂｐ（配列番号２）、２４９８ｂｐ（配列番号３）であり、これらは、後述の実施例６又は図３ではそれぞれＥｆ３、Ｅｆ２、Ｅｆ１と称される。これらの特定のＤＮＡサイズは、あくまでも例示であり、もし植物の種類が異なれば、それらのサイズも相違するかもしれないが、本発明では、配列番号１、配列番号２又は配列番号３の塩基配列或いはその相補的配列と一次構造及び活性の点で類似する限り、いかなるＤＮＡサイズも許容しうる。
【００８６】
ＤＮＡの抽出は、花卉の組織を微塵切りにし、これを適当なバッファー中でホジナイズしたのち、フェノール法などの公知のＤＮＡ抽出法にて、全ＤＮＡを抽出する。このためには、市販のＤＮＡ抽出キットを使用してもよく、そのようなキットの例は、Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉキット（バイオジーン社）などである。
【００８７】
全ＤＮＡから対象のＤＮＡをサイズ分離するために、例えば電気泳動、サザンハイブリダイゼーションなどを利用することができる。電気泳動の場合、ゲルは、通常、アガロースゲルが好ましい。
【００８８】
対象ＤＮＡを電気泳動で検出する場合、対象ＤＮＡを予めＰＣＲ法で増幅することが好ましい。ＰＣＲのためのプライマーは、配列番号１、２及び３の５’末端側配列及び３’末端側配列はいずれも同じ配列を有するため、同一の正方向プライマーと逆方向プライマーを設計、作製し、使用することができる。植物種によっては、配列番号１、２及び３の塩基配列から設計されたプライマー配列が、例えば５’末端又は３’末端の配列の相違のために、使用できない場合もあるかもしれないが、そのような場合には、植物種の組織からＤＮＡを抽出し、配列番号１、２及び３の塩基配列との同一性を考慮して作製したランダムなプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、増幅されたＤＮＡについて塩基配列を決定することを通して、適切なプライマー配列を決めることができる。或いは、ＧｅｎＢａｎｋなどの配列データバンクを介して、対象ＤＮＡ配列に関して種々の植物種の関連配列を検索し、得られた配列に基づいてプライマー配列を決めることができる。プライマーのサイズは、例えば１５〜５０塩基、好ましくは１７〜２５塩基である。
【００８９】
ＰＣＲ条件は、目的の対象ＤＮＡが増幅可能な限り限定されないが、例えば９４〜９５℃で１０秒〜１分間の変性、５０〜６５℃で１０秒〜1分間のアニーリング、７２℃で３０秒〜１０分の伸長反応を１サイクルとし、２０〜５０サイクル反応を行うことを含む。ＰＣＲに際しては、耐熱性逆転写酵素（例えばＴａｑポリメラーゼなど）、ｄＮＴＰ（ここで、ＮはＡ，Ｔ，Ｇ及びＣである）、Ｍｇ２＋を含有するバッファーなどが用いられる。
【００９０】
対象ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーションで検出する場合、植物の組織から抽出された全ＤＮＡを、上記のように電気泳動にかけてサイズ分離したのち、アルカリ処理し、ナイロンなどのメンブランに転写し、標識プローブを用いて対象ＤＮＡを検出する。プローブは、下記の（１）〜（３）のＤＮＡ又はその断片の少なくとも１つである。
【００９１】
（１）複対立遺伝子ＨＴ又はＨＦ由来の配列番号１の塩基配列、その相補的配列、又はそれらの配列と８０％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ、或いは該ＤＮＡの１５塩基以上の断片。
【００９２】
（２）複対立遺伝子ＨＺ又はＨＤ由来の配列番号２の塩基配列、その相補的配列、又はそれらの配列と８０％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ、或いは該ＤＮＡの１５塩基以上の断片。
【００９３】
（３）複対立遺伝子ＨＯ由来の配列番号３の塩基配列、その相補的配列、又はそれらの配列と８０％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ、或いは該ＤＮＡの１５塩基以上の断片。
【００９４】
プローブのサイズは、１５塩基以上であり、例えば２０〜２００塩基、２５〜１００塩基、５０〜８０塩基などである。また、プローブの標識は、例えば蛍光ラベル化剤、放射性同位元素によって行われる。
【００９５】
本発明においては、上記の手法によって、該アントシアニジン類のフラボノイド生合成の前駆化合物のＢ環の水酸化に関与する５つの複対立遺伝子型のフラボノイド３’、５’−ヒドロキシラーゼ遺伝子を知ることが可能である。
【００９６】
複対立遺伝子型がＨＴＨＴの場合、Ｂ環の水酸基が１個と２個を有する４種の前駆物質（ナリンゲニン（ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）、エリオディクチオール（ｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ）、ジヒドロケンフェロール（ｄｉｈｙｄｒｏｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ）、ジヒドロクエルセチン（ｄｉｈｙｄｒｏｑｕｅｒｃｅｔｉｎ））を生成し、ＨＦＨＦの場合、Ｂ環の水酸基を１個有する２種の前駆物質（ナリンゲニン（ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）、ジヒドロケンフェロール（ｄｉｈｙｄｒｏｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ））を生成し、ＨＴＨＦの場合、Ｂ環（Ｂ−ｒｉｎｇ）の水酸基が１〜３個有する６種の前駆物質（ナリンゲニン（ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）、エリオディクチオール（ｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ）、ペンタヒドロキシフラバノン（ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙｆｌａｖａｎｏｎｅ）、ジヒドロケンフェロール（ｄｉｈｙｄｒｏｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ）、ジヒドロクエルセチン（ｄｉｈｙｄｒｏｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）、ジヒドロミリセチン（ｄｉｈｙｄｒｏｍｙｒｉｃｅｔｉｎ））を生成するが、これらのフラボノイド３’、５’−水酸化酵素（Ｆ３’、５’−Ｈ）遺伝子として、配列番号１に示す８５２５ｂｐの塩基配列の遺伝子が検出される。
【００９７】
複対立遺伝子型がＨＤＨＤの場合、Ｂ環の水酸基を３個有する２種の前駆物質（ペンタヒドロキシフラバノン（ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙｆｌａｖａｎｏｎｅ）、ジヒドロミリセチン（ｄｉｈｙｄｒｏｍｙｒｉｃｅｔｉｎ））を生成し、ＨＤＨＺ、ＨＺＨＺの場合、Ｂ環の水酸基が３個有する２種の前駆物質（ペンタヒドロキシフラバノン（ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙｆｌａｖａｎｏｎｅ）、ジヒドロミリセチン（ｄｉｈｙｄｒｏｍｙｒｉｃｅｔｉｎ））を生成するが、これらのフラボノイド３’、５’−水酸化酵素（Ｆ３’、５’−Ｈ）遺伝子として、配列番号２に示す３１１５ｂｐの塩基配列の遺伝子が検出される。
【００９８】
複対立遺伝子型がＨＯＨＯの場合、Ｂ環（Ｂ−ｒｉｎｇ）の水酸基が１〜３個有する６種の前駆物質（ナリンゲニン（ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）、エリオディクチオール（ｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ）、ペンタヒドロキシフラバノン（ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙｆｌａｖａｎｏｎｅ）、ジヒドロケンフェロール（ｄｉｈｙｄｒｏｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ）、ジヒドロクエルセチン（ｄｉｈｙｄｒｏｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）、ジヒドロミリセチン（ｄｉｈｙｄｒｏｍｙｒｉｃｅｔｉｎ））を生成するが、このフラボノイド３’、５’−水酸化酵素（Ｆ３’、５’−Ｈ）遺伝子として、配列番号３に示す２４９８ｂｐの塩基配列の遺伝子が検出される。
【００９９】
すなわち、配列番号１に示す８５２５ｂｐの塩基配列の遺伝子は、ＨＴの対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）の制御に関係し、従って、ナリンゲニン（ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）からエリオディクティオール（ｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ）並びにジヒドロケンフェロール（ｄｉｈｙｄｒｏｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ）からジヒドロクエルセチン（ｄｉｈｙｄｒｏｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）への生化学的変換（ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の制御に関係する。また、８５２５ｂｐの塩基配列の遺伝子は、ＨＦの対立遺伝子の制御にも関係し、従って、エリオディクティオール（ｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ）からペンタヒドロキシフラバノン（ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙｆｌａｖａｎｏｎｅ）並びにジヒドロクエルセチン（ｄｉｈｙｄｒｏｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）からジヒドロミリセチン（ｄｉｈｙｄｒｏｍｙｒｉｃｅｔｉｎ）への生化学的変換の制御に関係する。
【０１００】
また、配列番号２に示す３１１５ｂｐの塩基配列の遺伝子は、ＨＤ及び／又はＨＺの対立遺伝子の制御に関係し、従って、ナリンゲニン（ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）からペンタヒドロキシフラバノン（ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙｆｌａｖａｎｏｎｅ）並びにジヒドロケンフェロール（ｄｉｈｙｄｒｏｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ）からジヒドロミリセチン（ｄｉｈｙｄｒｏｍｙｒｉｃｅｔｉｎ）への生化学的変換の制御に関係する。
【０１０１】
さらにまた、配列番号３に示す２４９８ｂｐの塩基配列の遺伝子は、ＨＯの対立遺伝子の制御に関係し、従って、ナリンゲニン（ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）からエリオディクティオール（ｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ）とペンタヒドロキシフラバノン（ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙｆｌａｖａｎｏｎｅ）並びにジヒドロケンフェロール（ｄｉｈｙｄｒｏｋａｅｍｐｈｅｒｏｌ）からジヒドロクエルセチン（ｄｉｈｙｄｒｏｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）とジヒドロミリセチン（ｄｉｈｙｄｒｏｍｙｒｉｃｅｔｉｎ）への全ての生化学的変換の制御に関係する。
【０１０２】
なお、上記の前駆物質の構造を含むＰｇｎ、Ｃｙｎ及びＤｐｎの生合成経路に関しては、村上孝夫、天然物の構造と化学、１５５〜１８５頁、廣川書店、１９８４年に記載されている。
【０１０３】
本発明において、例えば、トルコギキョウ花弁の色素遺伝子型（ｐｉｇｍｅｎｔ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ）について、ＨＴＨＴＰｇ−ＣｙＣｙＤｐＤｐの色素遺伝子型でＰｇｎＣｙｎ型の色素表現型（ＰｇｎＣｙｎ−ｐｉｇｍｅｎｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）の場合、ＨＴＨＦＰｇ−ＣｙＣｙＤｐＤｐの遺伝子型でＰｇｎＣｙｎＤｐｎ型の表現型の場合、及びＨＦＨＦＰｇ−ＣｙＣｙＤｐＤｐの遺伝子型でＰｇｎ型の表現型の場合、いずれのフラボノイド３’、５’−水酸化酵素（Ｆ３’、５’−Ｈ）遺伝子も、配列番号１に示す８５２５ｂｐの塩基配列の遺伝子である。色素遺伝子型の表記において、「−」は、その一つ前に表記された遺伝子（遺伝子及び／又は遺伝子型）に優性的に支配されていることを示し、いずれの遺伝子でも用いることができることを意味する。
【０１０４】
例えば、ＨＺＨＺ−−ＣｙＣｙＤｐＤｐ、ＨＤＨＺ−−ＣｙＣｙＤｐＤｐ、ＨＤＨＤ−−ＣｙＣｙＤｐＤｐの色素遺伝子型でＤｐｎ型の色素表現型の場合、いずれのフラボノイド３’、５’−水酸化酵素（Ｆ３’、５’−Ｈ）遺伝子も、配列番号２に示す３１１５ｂｐの塩基配列の遺伝子である。色素遺伝子型の表記において、「−−」は、いずれの遺伝子（遺伝子及び／又は遺伝子型）も用いることができることを意味する。
【０１０５】
例えば、ＨＯＨＯｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐの色素遺伝子型でＣｙｎＤｐｎ型の色素表現型、及び、ＨＯＨＯＰｇ−ＣｙＣｙＤｐＤｐの色素遺伝子型でＰｇｎＣｙｎＤｐｎ型の色素表現型の場合、いずれのフラボノイド３’、５’−水酸化酵素（Ｆ３’、５’−Ｈ）遺伝子も、配列番号３に示す２４９８ｂｐの塩基配列の遺伝子である。
【０１０６】
本発明では、ヘテロ型の遺伝子型をフラボノイド３’、５’−水酸化酵素（Ｆ３’、５’−Ｈ）遺伝子より同定できる。例えば、ＨＴＨＯＰｇ−ＣｙＣｙＤｐＤｐの色素遺伝子型でＰｇｎＣｙｎＤｐｎ型の色素表現型の場合、フラボノイド３’、５’−水酸化酵素（Ｆ３’、５’−Ｈ）遺伝子は、配列番号１に示す８５２５ｂｐの塩基配列の遺伝子と配列番号３に示す２４９８ｂｐの塩基配列の遺伝子とが検出される。例えば、ＨＴＨＤＰｇ−ＣｙＣｙＤｐＤｐの色素遺伝子型でＰｇｎＣｙｎＤｐｎ型の色素表現型の場合、フラボノイド３’、５’−水酸化酵素（Ｆ３’、５’−Ｈ）遺伝子は、配列番号１に示す８５２５ｂｐの塩基配列の遺伝子と配列番号２に示す３１１５ｂｐの塩基配列の遺伝子が検出される。
【０１０７】
アントシアニジン類では、その構造中のＢ環の水酸化が異なることでその呈色が決定される。すなわち、Ｂ環の４’位に水酸基が１個有するペラルゴニジン（Ｐｇｎ）はオレンジ色〜朱赤色を呈し、Ｂ環の３’、４’位に水酸基が２個有するシアニジン（Ｃｙｎ）は赤色〜深紅色を呈し、Ｂ環の３’、４’、５’位に水酸基が３個有するデルフィニジン（Ｄｐｎ）は赤紫〜紫色を呈し、これらが共存することによって様々な花色を発現する（本多利雄ら、現代化学、２５〜３２頁、東京化学同人、１９９８年）。
【０１０８】
本発明において、例えば、トルコギキョウのフラボノイド３’、５’−水酸化酵素（Ｆ３’、５’−Ｈ）遺伝子が、配列番号１に示す８５２５ｂｐの塩基配列の遺伝子であれば、赤紫色、赤色、深赤色、紫赤色、淡赤色、ピンク色、白赤色、白色の花を得ることができる。ここで、白色はアントシアニジンを全く含まないことに起因する。トルコギキョウのフラボノイド３’、５’−水酸化酵素（Ｆ３’、５’−Ｈ）遺伝子が、配列番号２に示す３１１５ｂｐの塩基配列の遺伝子であれば、淡紫色、紫赤色、紫色、青紫色の花を得ることができる。トルコギキョウのフラボノイド３’、５’−水酸化酵素（Ｆ３’、５’−Ｈ）遺伝子が、配列番号３に示す２４９８ｂｐの塩基配列の遺伝子であれば、赤紫色、赤色、紫赤色の花を得ることができる。
【０１０９】
トルコギキョウ以外の花卉として、例えば、スイートピー（ｓｗｅｅｔ  ｐｅａ、Ｌａｔｈｙｒｕｓ  ｏｄｏｒａｔｕｓ）花弁の色素遺伝子型について、ＨＴＨＴＰｇ−ＣｙＣｙＤｐＤｐでＰｇｎＣｙｎ型（ＰｇｎＣｙｎ表現型）を得ることができる。ＨＴＨＦｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐ、ＨＴＨＤｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐとＨＯ−ｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐでＣｙｎＤｐｎ型（ＣｙｎＤｐｎ表現型）を得ることができる。ＨＴＨＴｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐでＣｙｎ型（Ｃｙｎ表現型）を得ることができる。ＨＤＨＦ−−ＣｙＣｙＤｐＤｐとＨＤＨＤ−−ＣｙＣｙＤｐＤｐでＤｐｎ型（Ｄｐｎ表現型）を得ることができる。ＨＦＨＦｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐで白色の花を得ることができる。色素遺伝子型において、「−」及び「−−」は、上記と同義である。また、Ｄｐｎ型（Ｄｐｎ表現型）の色素表現型にはメチル化アントシアニジン（ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ）であるマルヴィジン（ｍａｌｖｉｄｉｎ、Ｍｖ）とペチュニジン（ｐｅｔｕｎｉｄｉｎ、Ｐｔ）を含むが、これらは、いずれもＤｐｎ型（Ｄｐｎ表現型）の色素表現型に包含される。さらに、Ｃｙｎ型（Ｃｙｎ表現型）の色素表現型にはメチル化アントシアニジンであるペオニジン（ｐｅｏｎｉｄｉｎ、Ｐｎ）を含むが、これはＣｙｎ型（Ｃｙｎ表現型）の色素表現型に包含される。
【０１１０】
さらにまた、例えば、ツツジおよびシャクナゲ花弁の色素遺伝子型について、ＨＴＨＴｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐでＣｙｎ型（Ｃｙｎ表現型）を得ることができる。ＨＴＨＦｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐ、ＨＴＨＯｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐ、ＨＯＨＯｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐでＣｙｎＤｐｎ型（ＣｙｎＤｐｎ表現型）を得ることができる。ＨＦＨＦｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐで白色の花を得ることができる。なお、ＰｇｎＤｐｎ型（ＰｇｎＤｐｎ表現型）は得られない。ツツジ花弁の色素遺伝子型の特徴として、Ｐｇｎ色素（Ｐｇｎ表現型）の生合成に関与するジヒドロフラボノールリダクターゼ（ＤＦＲ）又はアントシアニジンシンターゼ（ＡＳ）の発現に関する遺伝子座が劣性のホモ型（ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  ｈｏｍｏｚｙｇｏｔｅ）（ｐｇｐｇ）になっているために、Ｐｇｎ色素が生成されない。Ｄｐｎ型（Ｄｐｎ表現型）の色素表現型にはメチル化アントシアニジンであるマルヴィジン（Ｍｖ）とペチュニジン（Ｐｔ）を含むが、これらは、いずれもＤｐｎ型（Ｄｐｎ表現型）の色素表現型に包含される。さらに、Ｃｙｎ型（Ｃｙｎ表現型）の色素表現型にはメチル化アントシアニジンであるペオニジン（Ｐｎ）を含むが、これらはＣｙｎ型（Ｃｙｎ表現型）の色素表現型に包含される。
【０１１１】
花卉の花色は、花弁又は萼片、花被、苞、果皮などの有色部分から、５０％（ｖ/ｖ）酢酸水溶液又は５０％（ｖ/ｖ）酢酸メタノール（ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃ−ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）を用いてアントシアニン（ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ）を抽出し［酢酸の濃度は１０〜５０％でも可能であり、酢酸の代わりに０．５〜２規定塩酸を用いてもよい］、これを塩酸加水分解して、アントシアニジン（ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ）を含む加水分解物を得て、これを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などを用いて各種アントシアニジンを分析することによって測定できる（例えばＵｄｄｉｎら，  Ｊａｐａｎ  Ｓｏｃ．  Ｈｏｒｔ．  Ｓｃｉ．，  ７１：４０−４７，  ２００２）。
【０１１２】
さらに、自殖（ｓｅｌｆ−ｐｏｌｌｉｎａｔｉｏｎ）や交雑を繰り返して得られた後代の遺伝子型について、優性ホモ型（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｈｏｍｏｚｙｇｏｔｅ）、優性ヘテロ型（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ）、劣性ホモ型（ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  ｈｏｍｏｚｙｇｏｔｅ）などを決定し、花色と色素遺伝子型と３種のフラボノイド３’、５’−水酸化酵素（Ｆ３’、５’−Ｈ）遺伝子を同定する。これに基づいて、花粉親配偶子及び種子親配偶子間の複対立遺伝子型の組み合わせと花色との相関を示す早見表を作成することができる（例えば、後述実施例７（６）参照）。早見表の例として、例えばトルコギギョウの花色を予測するための早見表(後述の表６及び表７)が挙げられる。
【０１１３】
花色については、ＣＩＥＬａｂ表色系（ＣＩＥＬａｂ  ｃｏｌｏｒ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ）などを用いて花色を正確に測色・数値化することができる。
【０１１４】
したがって、花卉の３種のフラボノイド３’、５’−水酸化酵素（Ｆ３’、５’−Ｈ）遺伝子を測定し、上記配偶子間で５つの複対立遺伝子型ＨＴ、ＨＦ、ＨＺ、ＨＤ及びＨＯの組み合わせを決定することによって、上記のような早見表を用いて、開花前の花卉の花色を予測することができる。
【０１１５】
キットとＤＮＡ
本発明はさらに、開花前の花卉の花色を予測するためのキットも提供する。
キットには、下記の（１）〜（３）のＤＮＡ又はその断片：
（１）複対立遺伝子ＨＴ又はＨＦ由来の配列番号１の塩基配列、その相補的配列、又はそれらの配列と８０％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ、或いは該ＤＮＡの１５塩基以上の断片、
（２）複対立遺伝子ＨＺ又はＨＤ由来の配列番号２の塩基配列、その相補的配列、又はそれらの配列と８０％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ、或いは該ＤＮＡの１５塩基以上の断片、並びに、
（３）複対立遺伝子ＨＯ由来の配列番号３の塩基配列、その相補的配列、又はそれらの配列と８０％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ、或いは該ＤＮＡの１５塩基以上の断片、
の少なくとも１つをプローブ又はプライマーとして含む。
プライマーのサイズは、例えば１５〜５０塩基、好ましくは１７〜２５塩基である。
【０１１６】
プローブのサイズは、１５塩基以上であり、例えば２０〜２００塩基、２５〜１００塩基、５０〜８０塩基などである。
プローブは、好ましくは、例えば蛍光ラベル化剤、放射性同位元素などのラベル化剤によって標識されている。蛍光ラベル化剤には、例えばローダミン、フルオレサミン、ダンシル、それらの誘導体、Ｃｙダイなどが含まれ、一方、放射性同位元素には、例えば３２Ｐ、３５Ｓなどが含まれる。
【０１１７】
本発明のキットには、上記複対立遺伝子型の組み合わせと花色との相関を示す早見表をさらに含むことができる。また、キットには、ＰＣＲ用の酵素やバッファー、ハイブリダイゼーション用の試薬やバッファーなどをさらに含むことができる。
【０１１８】
本発明のキットは、プローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行い、複対立遺伝子型の検定や花色の予測が可能である。
本発明はさらに、以下のＤＮＡ又はその断片を提供する。
【０１１９】
（４）複対立遺伝子ＨＴ又はＨＦ由来の配列番号１の塩基配列、その相補的配列、又はそれらの配列と８０％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ、或いは１５塩基以上のその断片。
【０１２０】
このＤＮＡは、複対立遺伝子ＨＺ又はＨＤ由来の配列番号２の塩基配列又はそれらの配列と８０％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡの第１エクソン配列中に、配列番号４のレトロトランスポゾンの塩基配列又はそれらの配列と６０％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列が挿入されたＤＮＡである。
【０１２１】
（５）配列番号４の塩基配列又はそれらの配列と６０％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むレトロトランスポゾン、或いは１５塩基以上のその断片。
【０１２２】
（６）複対立遺伝子ＨＺ又はＨＤ由来の配列番号２の塩基配列、その相補的配列、又はそれらの配列と８０％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ、或いは１５塩基以上のその断片。
【０１２３】
（７）複対立遺伝子ＨＯ由来の配列番号３の塩基配列、その相補的配列、又はそれらの配列と８０％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡ、或いは１５塩基以上のその断片。
【０１２４】
本発明の上記（４）〜（７）のＤＮＡ又はその断片は、プローブとして用いて蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を行うことにより、トルコギキョウなどの花卉の染色体の検出を行うこともまた可能である。また、プローブ及び／又はプライマーとして用いて、種々の植物種から本発明の配列番号１、２又は３の塩基配列を有するＤＮＡに相当するホモログを得ることが可能であるし、また染色体マッピングなどに応用することも可能である。さらにまた、プライマーとして用いてＰＣＲを行うと、ゲノム中より種々のＤＮＡ断片が増幅されるが、このような断片は、染色体と同様に扱うことができるので、ＤＮＡ多型から染色体マッピングが可能であり、従って、そのようなプライマーを用いることで、新たな染色体マーカーや遺伝子マーカーを開発することも可能となる。さらにまた、上記ＤＮＡを遺伝子組換えなどの技術に用いることで、人為的な形質改変も可能となる。
【０１２５】
レトロトランスポゾン
本発明者らは、上述したように、配列番号１に示す複対立遺伝子ＨＴ又はＨＦの塩基配列において、その第１エクソン中にレトロトランスポゾン（ｒＴｅｇ１；配列番号４）を含むことを見出した（図２）。また、このレトロトランスポゾン配列が挿入される前の配列は複対立遺伝子ＨＤ又はＨＺであることも判明した。
【０１２６】
本発明のレトロトランスポゾンは、配列番号４の塩基配列と通常６０％以上、好ましくは７０％以上、７５％以上、より好ましくは８０％以上、８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、９５％以上又は９８％以上の同一性を有する、レトロトランスポゾン活性を有するＤＮＡも包含する。このようなＤＮＡは、トルコギキョウの品種間の突然変異体、リンドウ科の近縁種のホモログなどを包含する。
【０１２７】
ここで、「レトロトランスポゾン活性」とは、他の遺伝子に挿入されたとき、その遺伝子の機能を改変する或いは不活性化する活性をいう。
【０１２８】
本発明のレトロトランスポゾンを他の遺伝子、特に複対立遺伝子ＨＤ又はＨＺに挿入させることによって、その遺伝子の機能を改変することも可能である。例えばフラボノイド３’、５’−水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）遺伝子にレトロトランスポゾンを挿入することで、紫の花色を赤に改変させることも可能である。
【０１２９】
すなわち、本発明はさらに、花卉の複対立遺伝子ＨＺ、ＨＤ又はその両方のエクソン部分に、配列番号４の塩基配列又はそれらの配列と６０％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むレトロトランスポゾンを挿入することを含む、花卉の花色を改変する方法を提供する。
【０１３０】
本発明では、上記エクソンは、第１エクソンであることが好ましい。
花色の改変は、レトロトランスポゾンの挿入のために、複対立遺伝子ＨＤ又はＨＺの機能が失われ、その代わりに新たに複対立遺伝子ＨＴ又はＨＦの機能が獲得されることによって生じる。
【０１３１】
本発明で使用可能な花卉には、上に例示したような双子葉植物及び単子葉植物が含まれる。
【０１３２】
本発明のトランスポゾンによる形質転換は、双子葉植物及び単子葉植物の一般的な形質転換法を用いて行うことができる。ベクターとしては、好ましくは、バイナリーベクター（例えば、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１など）が使用される。このベクターには、Ｔ-ＤＮＡ領域の左側ボーダー（ＬＢ）と右側ボーダー（ＲＢ）の間に、上記の配列番号４の塩基配列又はそれらの配列と６０％以上の同一性を有する若しくはそれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むレトロトランスポゾン配列が挿入される。ベクターには、さらに細菌での選択用のカナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子などの選択マーカー、植物での選択用のネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼなどの選択マーカー、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）プロモーターなどのプロモーターなどを含むことができる。形質転換は、アグロバクテリウム法（アセトシリンゴンの使用を含む）、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法などによって行うことができる。アグロバクテリウムの例は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（例えば、ＥＨＡ１０５、ＥＨＡ１０１など）を含む。これによって、レトロトランスポゾン配列は、相同組換えによって植物ゲノムに組み込まれる。形質転換は、カルスや多芽体などに対して実施され、通常の植物培養法を介して植物体にまで再生される。植物の遺伝子工学に関しては、例えば松橋通生ら監訳、ワトソン・組換えＤＮＡの分子生物学、第２版、丸善、１９９４年；島本功ら監修、植物細胞工学シリーズ１５、モデル植物の実験プロトコール、遺伝学的手法からゲノム解析まで、秀潤社などの記載を利用することができる。
【実施例】
【０１３３】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されないものとする。
【０１３４】
［実施例１］トルコギキョウの葉から複対立遺伝子ＨＴ、ＨＦ、ＨＺ、ＨＤ、ＨＯのＦ３’、５’−Ｈ  ＤＮＡの確認
トルコギキョウの５系統の成葉から、Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉキット（バイオジーン社）を使用し、ＤＮＡを抽出した。レトロトランスポゾン挿入部位を挟み込む形で下記の２種類のプライマー組を設計した。
プライマー組Ｒ：
ＧＴＡＣＴＴＡＡＡＧＧＴＡＧＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧＡＴＡＣＣＴＣＣＣＴＡＴＡＧＡＣＧＡＧＡＡＧＣＣ（配列番号７）
プライマー組Ｌ：
ＧＴＡＣＴＴＡＡＡＧＧＴＡＧＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧＣＣＴＣＴＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＧＴＣＡＣＴＣ（配列番号８）
【０１３５】
ＰＣＲはＧｅｎｅＡｍｐ９７００システム（ＡＢＩ社）を使用して行った。反応液２０μｌ中には１０ｎｇ  ＤＮＡ、０．５ｕｎｉｔｓ  ＴＡＫＡＲＡ  ＥＸＴａｑ  ＨＳ（タカラバイオ社）、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、２μｌ１０×ＥＸＴａｑバッファー、０．４μＭプライマーが含まれる。ＰＣＲ条件は、９５℃で１０秒間の変性、６２℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３分の伸長反応を１サイクルとし、４５サイクル反応させた。反応後、１％アガロースゲルＳ（ニッポンジーン社）上の電気泳動によりバンドの確認を行った。その結果を図１に示す。ＨＴとＨＦは約８ｋｂの同様のバンド、ＨＺとＨＤは約３ｋｂの同様のバンド、ＨＯは２．５ｋｂのバンドを示すことが分かる（図１）。図１中、プライマー組Ｒを用いて検出したバンドが右（Ｒ）、プライマー組Ｌを用いて検出したバンドが左のバンド（Ｌ）である。
【０１３６】
［実施例２］トルコギキョウの葉から複対立遺伝子ＨＴ及びＨＦに関わるＦ３’、５’−Ｈ  ＤＮＡの構造の確認
実施例１の結果、花弁にデルフィニジンが存在しない系統では、全ての系統で、レトロトランスポゾンの挿入を示す約８ｋｂのバンドが観察された。これに対して、デルフィニジンが存在する系統では、２〜２．５ｋｂのバンドのみが存在する場合と、２〜２．５ｋｂのバンドと８ｋｂのバンドの両方が存在する場合があった。これらのバンドの配列はダイレクトシークエンス法によって決定した。具体的には、得られたバンドからＱＩＡＥＸIIｇｅｌ−ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡを抽出した。抽出された断片ＤＮＡはプライマーウォーキング法による塩基配列の決定に供された。シークエンス反応はＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｖｅｒ．３によるサイクルシークエンスを採用した。反応液２０μｌ中には１０〜１００ｎｇ  ＤＮＡ、２μｌＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｖｅｒ．３プレミックス、１．５μｌ  １０×Ｔａｑバッファー（ニッポンジーン社）、１００ｎｇＤＮＡ、３．２ｐｍプライマーが含まれる。サイクルシークエンス反応の条件は、９６℃で１０秒間の変性、５０℃で５秒間のアニーリング、６０℃で４分間の伸長反応を１サイクルとし、２５サイクル反応させた。反応後、反応産物をエタノール／酢酸ナトリウム沈殿により精製し、鹿児島大学フロンティアサイエンス研究推進センター(鹿児島)のＤＮＡシークエンス解析サービスに依頼し、末端から約５００ｂｐ程度の配列を決定した。決定された配列をもとにプライマーを設計し、再び、サイクルシークエンシングによる配列決定を進め、最終的に全長の配列を決定した。
【０１３７】
この結果を図２に示す。複対立遺伝子ＨＴ及びＨＦに関わるＦ３’、５’−Ｈ  ＤＮＡの構造は配列番号１に示す８５２５ｂｐの塩基配列の遺伝子であることが分かる。また、レトロトランスポゾンの構造は、配列番号４に示す５４０５ｂｐの塩基配列の遺伝子であることが分かる（図２）。
【０１３８】
［実施例３］トルコギキョウの葉から複対立遺伝子ＨＺ及びＨＤに関わるＦ３’、５’−Ｈ  ＤＮＡの構造の確認
実施例１と同じ方法で、ＨＤをホモで持つ系統からＤＮＡを抽出し、トルコギキョウのフラボノイド３’、５’−水酸化酵素（Ｆ３’、５’−Ｈ）遺伝子の翻訳領域全てを挟み込む形でプライマー（５’−ＧＧＣＣＧＣＡＴＴＣＴＴＡＣＣＡＡＧＡＴ−３’（配列番号９）及び５’−ＴＡＧＡＡＡＣＡＴＧＧＡＣＧＡＡＣＴＣＣ−３’（配列番号１０）のＤＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチド）を設計した。実施例１及び２と同じ方法でＰＣＲを行い、電気泳動のバンドからＤＮＡを抽出し、塩基配列を決定した。
【０１３９】
この結果を図２に示す。複対立遺伝子ＨＺ及びＨＤに関わるＦ３’、５’−Ｈ  ＤＮＡの構造は、配列番号２に示す３１１５ｂｐの塩基配列の遺伝子であることが分かる（図２）。
【０１４０】
［実施例４］トルコギキョウの葉から複対立遺伝子ＨＯに関わるＦ３’、５’−Ｈ  ＤＮＡの構造の確認
実施例３と同じ方法で、ＨＯ約をホモで持つ系統からＤＮＡを抽出しＰＣＲを行い、電気泳動のバンドからＤＮＡを抽出し、塩基配列を決定した。この結果を図２に示す。複対立遺伝子ＨＯに関わるＦ３’、５’−Ｈ  ＤＮＡの構造は、配列番号３に示す２４９８ｂｐの塩基配列の遺伝子であることが分かる（図２）。
【０１４１】
［実施例５］複対立遺伝子ＨＴ、ＨＦ、ＨＺ、ＨＤ、ＨＯのＦ３’、５’−Ｈ  ＤＮＡが翻訳する蛋白質の構造
（１）複対立遺伝子ＨＴ、ＨＦに関わる、配列番号１に示す８５２５ｂｐの塩基配列のＦ３’、５’−Ｈ  ＤＮＡが翻訳する蛋白質の構造
複対立遺伝子ＨＴ、ＨＦに関わる、配列番号１に示す８５２５ｂｐの塩基配列から予測されるアミノ酸配列の検討を行った結果、下記の２つの蛋白質、一つは１３６個のアミノ酸配列を有する蛋白質と、もう一つは３８６個のアミノ酸配列を有する蛋白質の、２種類を翻訳することが分かった。
ＭＡＶＧＮＧＶＬＬＨＩＡＡＳＬＭＬＦＦＨＶＱＫＬＶＱＹＬＷＭＮＳＲＲＨＲＬＰＰＧＰＩＧＷＰＶＬＧＡＬＲＬＬＧＴＭＰＨＶＡＬＡＮＭＡＫＫＹＧＰＶＭＹＬＫＶＧＳＣＧＬＡＶＡＳＴＰＥＡＡＫＡＦＬＫＴＬＤＭＮＦＳＮＲＰＰＮＡＧＡＴＨＬＡＹＮＡＱＤＭＶＦＡＤＹＧＰＲＷＫＬＬＲＫＬＣ（配列番号１１）；
ＭＫＮＶＭＦＰＳＮＫＬＳＮＩＨＩＬＧＧＫＡＬＱＧＷＥＥＶＲＫＫＥＬＧＹＭＬＹＡＭＡＥＳＧＲＨＧＱＰＶＶＶＳＥＭＬＴＹＡＭＡＮＭＬＧＱＶＭＬＳＫＲＶＦＧＳＱＧＳＥＳＮＥＦＫＤＭＶＶＥＬＭＴＶＡＧＹＦＮＩＧＤＦＩＰＳＩＡＷＭＤＬＱＧＩＱＧＧＭＫＲＬＨＫＫＦＤＡＬＬＴＲＬＬＥＥＨＴＡＳＡＨＥＲＫＧＳＰＤＦＬＤＦＶＶＡＮＧＤＮＳＥＧＥＲＬＱＴＶＮＩＫＡＬＬＬＮＭＦＴＡＧＴＤＴＳＳＳＶＩＥＷＡＬＡＥＬＬＫＮＰＩＩＬＲＲＡＱＥＥＭＤＧＶＩＧＲＤＲＲＦＬＥＡＤＩＳＫＬＰＹＬＱＡＩＣＫＥＡＦＲＫＨＰＳＴＰＬＮＬＰＲＩＡＳＱＡＣＥＶＮＧＨＹＩＰＫＧＴＲＬＳＶＮＩＷＡＩＧＲＤＰＳＶＷＥＮＰＮＥＦＮＰＤＲＦＬＥＲＫＮＡＫＩＤＰＲＧＮＤＦＥＬＩＰＦＧＡＧＲＲＩＣＡＧＴＲＬＧＩＬＬＶＥＹＩＬＧＴＬＶＨＳＦＶＷＥＬＰＳＳＶＩＥＬＮＭＤＥＳＦＧＬＡＬＱＫＡＶＰＬＡＡＭＶＴＰＲＬＰＬＨＩＹＳＰ（配列番号１２）
【０１４２】
（２）複対立遺伝子ＨＺ、ＨＤに関わる、配列番号２に示す３１１５ｂｐの塩基配列のＦ３’、５’−Ｈ  ＤＮＡが翻訳する蛋白質の構造
複対立遺伝子ＨＺ、ＨＤに関わる、配列番号２に示す３１１５ｂｐの塩基配列から予測されるアミノ酸配列の検討を行った結果、下記の５１０個のアミノ酸配列を有する蛋白質を翻訳することが分かった。この蛋白質のアミノ酸配列構造は、非特許文献７のそれと一致した。
ＭＡＶＧＮＧＶＬＬＨＩＡＡＳＬＭＬＦＦＨＶＱＫＬＶＱＹＬＷＭＮＳＲＲＨＲＬＰＰＧＰＩＧＷＰＶＬＧＡＬＲＬＬＧＴＭＰＨＶＡＬＡＮＭＡＫＫＹＧＰＶＭＹＬＫＶＧＳＣＧＬＡＶＡＳＴＰＥＡＡＫＡＦＬＫＴＬＤＭＮＦＳＮＲＰＰＮＡＧＡＴＨＬＡＹＮＡＱＤＭＶＦＡＤＹＧＰＲＷＫＬＬＲＫＬＳＮＩＨＩＬＧＧＫＡＬＱＧＷＥＥＶＲＫＫＥＬＧＹＭＬＹＡＭＡＥＳＧＲＨＧＱＰＶＶＶＳＥＭＬＴＹＡＭＡＮＭＬＧＱＶＭＬＳＫＲＶＦＧＳＱＧＳＥＳＮＥＦＫＤＭＶＶＥＬＭＴＶＡＧＹＦＮＩＧＤＦＩＰＳＩＡＷＭＤＬＱＧＩＱＧＧＭＫＲＬＨＫＫＦＤＡＬＬＴＲＬＬＥＥＨＴＡＳＡＨＥＲＫＧＳＰＤＦＬＤＦＶＶＡＮＧＤＮＳＥＧＥＲＬＱＴＶＮＩＫＡＬＬＬＮＭＦＴＡＧＴＤＴＳＳＳＶＩＥＷＡＬＡＥＬＬＫＮＰＩＩＬＲＲＡＱＥＥＭＤＧＶＩＧＲＤＲＲＦＬＥＡＤＩＳＫＬＰＹＬＱＡＩＣＫＥＡＦＲＫＨＰＳＴＰＬＮＬＰＲＩＡＳＱＡＣＥＶＮＧＨＹＩＰＫＧＴＲＬＳＶＮＩＷＡＩＧＲＤＰＳＶＷＥＮＰＮＥＦＮＰＤＲＦＬＥＲＫＮＡＫＩＤＰＲＧＮＤＦＥＬＩＰＦＧＡＧＲＲＩＣＡＧＴＲＬＧＩＬＬＶＥＹＩＬＧＴＬＶＨＳＦＶＷＥＬＰＳＳＶＩＥＬＮＭＤＥＳＦＧＬＡＬＱＫＡＶＰＬＡＡＭＶＴＰＲＬＰＬＨＩＹＳＰ（配列番号１３）
【０１４３】
（３）複対立遺伝子ＨＯに関わる、配列番号３に示す２４９８ｂｐの塩基配列のＦ３’、５’−Ｈ  ＤＮＡが翻訳する蛋白質の構造
複対立遺伝子ＨＯに関わる、配列番号３に示す２４９８ｂｐの塩基配列から予測されるアミノ酸配列の検討を行った結果、下記の５１０個のアミノ酸配列を有する蛋白質を翻訳することが分かった。
ＭＡＶＧＮＧＶＬＬＨＩＡＡＳＬＭＬＦＦＨＶＱＫＬＶＱＹＬＷＭＮＳＲＲＨＲＬＰＰＧＰＩＧＷＰＶＬＧＡＬＰＬＬＧＴＭＰＨＶＡＬＡＮＭＡＫＫＹＧＰＶＭＹＬＫＶＧＳＣＧＬＡＶＡＳＴＰＥＡＡＫＡＦＬＫＴＬＤＭＮＦＳＮＲＰＰＮＡＧＡＴＨＬＡＹＮＡＱＤＭＶＦＡＤＹＧＰＲＷＫＬＬＲＫＬＳＮＩＨＩＬＧＧＫＡＬＱＧＷＥＥＶＲＫＫＥＬＧＹＭＬＹＡＭＡＥＳＧＲＨＧＱＰＶＶＶＳＥＭＬＴＹＡＭＡＮＭＬＧＱＶＭＬＳＫＲＶＦＧＳＱＧＳＥＳＮＥＦＫＤＭＶＶＥＬＭＴＶＡＧＹＦＮＩＧＤＦＩＰＳＩＡＷＭＤＬＱＧＩＱＧＧＭＫＲＬＨＫＫＦＤＡＬＬＴＲＬＬＥＥＨＴＡＳＡＨＥＲＫＧＳＰＤＦＬＤＦＶＶＡＮＲＤＮＳＥＧＥＲＬＨＴＶＮＩＫＡＬＬＬＮＭＦＴＡＧＴＤＴＳＳＳＶＩＥＷＡＬＡＥＬＬＫＮＰＩＩＬＫＲＡＱＥＥＭＤＧＶＩＧＲＤＲＲＦＬＥＡＤＩＳＫＬＰＹＬＱＡＩＣＫＥＡＦＲＫＨＰＳＴＰＬＮＬＰＲＩＡＳＱＡＣＥＶＮＧＨＹＩＰＫＧＴＲＬＳＶＮＩＷＡＩＧＲＤＰＳＬＷＥＮＰＮＥＦＮＰＤＲＦＬＥＲＫＮＡＫＩＤＰＲＧＮＤＦＥＬＩＰＦＧＡＧＲＲＩＣＡＧＴＲＬＧＩＬＬＶＥＹＩＬＧＴＬＶＨＳＦＤＷＥＬＰＳＳＶＩＥＬＮＭＤＥＰＦＧＬＡＬＱＫＡＶＰＬＡＡＭＶＴＰＲＬＰＬＨＩＹＣＰ（配列番号１４）
【０１４４】
（４）配列番号４に示す５４０５ｂｐの塩基配列のレトロトランスポゾンＤＮＡ（ｒＴｅｇ１）が翻訳する蛋白質の構造
配列番号４に示す５４０５ｂｐの塩基配列から予測されるアミノ酸配列の検討を行った結果、下記の１５９１個のアミノ酸配列を有する蛋白質を翻訳することが分かった。
ＭＳＥＴＳＰＮＰＱＥＰＫＴＥＳＳＶＨＴＴＰＧＤＬＡＬＱＶＡＱＩＬＫＤＳＬＧＳＴＰＳＱＳＩＴＬＰＥＮＬＮＶＡＶＫＬＴＧＮＮＹＳＬＷＳＲＩＩＹＲＡＩＬＧＲＧＲＱＹＨＬＴＧＴＰＰＰＰＬＰＴＤＰＲＦＳＲＷＥＱＤＤＮＳＶＦＴＷＩＬＱＮＶＤＡＳＭＩＮＮＶＳＲＹＰＴＡＫＡＬＷＤＧＬＡＬＴＹＧＳＲＧＤＳＬＱＶＦＤＬＨＲＫＡＮＮＩＲＱＧＤＤＴＬＥＡＣＷＮＮＬＱＤＩＷＶＳＩＤＴＬＤＴＮＰＭＫＣＰＥＤＩＳＬＹＮＱＫＭＱＥＦＲＬＹＱＦＬＴＡＶＳＤＲＦＥＴＥＫＫＥＬＬＫＲＴＰＬＰＮＶＥＡＡＦＦＥＦＫＲＡＥＳＱＡＧＬＩＫＨＧＰＳＥＱＩＳＳＬＧＩＧＱＧＬＴＶＫＰＡＴＧＫＧＲＧＫＧＴＤＲＳＭＮＴＩＲＳＮＮＡＳＳＲＭＤＫＳＮＬＬＣＥＨＣＧＫＫＧＨＳＲＥＫＣＦＱＩＨＧＹＰＥＷＷＥＧＫＲＩＴＴＧＱＧＫＴＡＡＡＲＴＰＧＥＧＶＳＳＮＥＡＱＭＴＧＥＳＲＥＥＥＥＱＮＲＥＮＰＲＡＱＧＮＳＡＡＡＧＭＧＬＧＥＮＰＳＰＮＰＰＦＫＳＩＦＴＰＨＡＰＨＦＳＶＬＳＰＤＰＬＳＳＳＤＩＩＦＰＳＰＳＳＬＮＦＳＰＰＳＰＱＳＳＨＲＡＮＭＶＱＨＴＳＥＦＴＤＱＰＨＴＦＰＩＳＲＬＤＴＨＴＳＰＫＹＰＦＳＰＱＰＰＰＧＬＳＨＨＩＲＶＴＰＳＱＷＩＦＤＣＧＡＴＤＴＭＴＦＤＰＴＤＬＬＴＱＳＰＰＬＫＳＨＶＥＴＡＳＧＤＴＩＰＶＱＡＳＧＰＩＴＩＴＰＤＩＴＬＱＮＣＬＬＶＰＳＬＳＴＫＬＬＳＩＳＱＬＴＫＡＬＤＣＶＶＬＭＹＰＳＦＣＬＬＱＤＩＲＴＱＡＩＩＧＲＧＴＥＮＧＧＬＹＹＶＤＡＶＶＱＨＧＳＳＮＬＡＴＧＴＶＴＲＱＩＷＬＷＨＲＲＬＧＨＰＳＦＳＹＬＱＫＬＦＰＴＬＦＳＲＴＬＰＰＬＴＣＤＴＣＬＲＡＫＱＰＲＡＴＹＲＳＮＮＴＲＶＮＫＶＦＳＬＩＨＳＤＶＷＧＰＳＰＨＳＴＰＣＧＦＫＹＦＶＩＦＶＤＤＣＳＲＭＴＷＬＹＩＬＲＨＫＳＥＶＡＴＫＦＶＥＦＹＨＭＩＨＴＱＹＳＳＴＩＱＩＬＲＴＤＮＧＧＥＹＦＡＧＡＬＱＱＦＦＲＤＮＧＩＩＨＱＴＴＣＰＤＴＰＥＱＮＧＶＡＥＲＫＮＲＴＬＬＥＭＴＲＡＬＭＬＥＳＳＶＰＲＦＬＷＰＥＡＶＳＴＡＴＹＬＳＮＲＬＰＴＶＴＬＮＨＱＴＰＬＤＶＬＡＳＱＴＬＩＰＳＬＬＴＬＰＰＫＶＦＧＣＴＶＦＩＨＩＳＫＴＨＲＤＫＬＤＰＣＡＥＫＣＶＦＶＧＹＡＳＴＱＫＧＹＲＣＹＮＰＲＴＲＱＩＨＶＴＬＮＣＶＦＬＥＴＥＦＦＦＧＴＨＰＲＳＱＧＥＩＡＴＤＧＹＬＤＷＬＰＮＬＳＷＳＶＡＤＰＴＲＱＶＶＥＰＡＣＴＩＡＰＳＤＮＭＤＳＩＰＶＰＴＮＤＩＰＲＥＮＶＬＱＱＶＮＥＳＩＨＤＤＴＧＳＰＶＰＦＳＳＰＰＦＶＰＮＴＴＬＤＤＳＬＴＴＳＩＡＩＰＤＰＳＳＥＬＤＨＴＮＰＣＶＫＥＱＧＲＴＬＰＰＲＫＴＲＧＶＰＰＤＲＹＳＰＴＫＩＡＲＡＴＬＹＰＶＳＴＳＲＫＮＬＧＨＡＡＫＡＦＦＴＱＩＣＳＥＫＩＰＲＴＶＤＥＡＣＳＱＳＮＷＲＤＡＭＩＭＥＭＤＡＬＮＫＮＮＴＷＥＲＣＱＬＰＰＧＫＲＴＶＧＣＲＷＶＦＴＶＫＹＫＡＤＧＴＩＥＲＨＫＡＲＬＶＡＫＧＹＴＱＴＹＧＶＤＹＳＥＴＦＳＰＶＡＲＩＤＴＩＲＶＬＦＡＩＡＡＴＥＮＷＰＬＨＱＦＤＶＫＮＡＦＬＨＧＴＬＫＥＥＶＦＭＤＰＰＰＧＦＳＫＥＦＬＰＧＱＶＣＫＬＮＲＡＬＹＧＬＫＱＳＰＲＡＷＦＧＲＦＴＱＡＭＫＫＤＧＹＲＱＳＮＡＤＨＴＬＦＩＫＲＱＧＳＬＶＴＣＬＩＩＹＶＤＤＭＩＩＴＧＮＤＡＮＥＩＳＲＬＲＤＹＬＦＴＱＦＥＭＫＤＬＧＧＬＫＹＦＬＧＩＥＶＬＲＳＡＥＧＩＹＩＳＱＲＫＹＩＬＤＬＬＴＥＶＧＬＬＤＡＫＰＡＤＴＰＭＶＱＮＨＫＬＤＩＶＱＧＡＡＳＡＤＲＥＱＹＱＲＬＶＧＫＬＩＹＬＳＨＴＲＰＤＩＡＹＡＶＧＶＶＳＱＦＭＨＳＰＱＫＨＨＬＥＡＶＦＲＩＭＲＹＬＫＧＴＰＧＲＧＬＬＦＫＮＮＧＨＬＮＩＥＡＹＴＤＡＤＷＡＧＳＱＩＤＲＲＳＴＳＧＹＦＴＬＶＧＧＮＶＶＴＷＲＳＫＫＱＫＶＶＡＬＳＳＡＥＡＥＹＲＧＩＶＫＧＶＳＥＶＬＷＩＲＫＬＬＱＥＬＧＦＰＶＴＤＰＴＣＬＭＣＤＮＫＡＳＩＳＩＳＥＮＰＶＱＨＤＲＴＫＨＶＥＩＤＲＨＦＶＫＥＫＩＥＤＧＩＩＡＬＰＨＶＲＳＥＤＱＬＡＤＩＬＴＫＡＶＮＧＲＩＦＥＦＩＬＲＫＬＮＩＶＤＰＴＩＱＬＥＧＥＣ（配列番号１５）
【０１４５】
［実施例６］トルコギキョウの葉からヘテロ型複対立遺伝子のＦ３’、５’−Ｈ  ＤＮＡの確認
紫とピンク色の花色を有する４系統のトルコギキョウの葉からＦ３’、５’−Ｈ  ＤＮＡの遺伝子を抽出した。ＤＮＡの抽出、ＰＣＲ、電気泳動は実施例１の方法に従った。ＰＣＲのプライマーは実施例１の図１の（Ｒ）のプライマーを用いた。
【０１４６】
その結果を図３に示す。ＨＴ、ＨＤ、ＨＯをホモで有する個体ではそれぞれ、ＨＴホモでは配列番号１に示す８５２５ｂｐの塩基配列、ＨＤホモでは配列番号２に示す３１１５ｂｐの塩基配列、ＨＯホモでは配列番号３に示す２４９８ｂｐの塩基配列に対応するそれぞれのバンドＥｆ３、Ｅｆ２、Ｅｆ１が現れた。ＨＴとＨＤの複対立遺伝子をヘテロ型で有する系統の電気泳動のバンドは、配列番号１に示す８５２５ｂｐの塩基配列と、配列番号２に示す３１１５ｂｐの塩基配列に対応する各バンドＥｆ３とＥｆ２を示し、一方、ＨＴとＨＯの複対立遺伝子をヘテロ型で有する系統の電気泳動のバンドは、配列番号１に示す８５２５ｂｐの塩基配列と、配列番号３に示す２４９８ｂｐの塩基配列に対応する各バンドＥｆ３とＥｆ１を示すことが分かる（図３）。Ｍと１Ｋはマーカーを示す。
【０１４７】
［実施例７］トルコギキョウの色素表現型、色素遺伝子型の帰属、花色測色とＦ３’、５’−Ｈ  ＤＮＡバンドの検出
（１）トルコギキョウ市販品種の調査
園芸品種‘あすかの舞姫’、‘あずまの粧’、‘キングオブスノー’の品種について、特許文献８に記載の花色遺伝型交配法を用いて、ＣＩＥＬａｂ表色系を用いて花色を測定し、高速液体クロマトグラフィーを用いてアントシアニジンの色素表現型を分析した。また、前記した実施例と同様にフラボノイド３’、５’−水酸化酵素（Ｆ３’、５’−Ｈ）  ＤＮＡバンドを測定した。その結果を表１に示す。
【０１４８】
【表１】
0005648215.tif 000004
【０１４９】
覆輪系の‘あすかの舞姫’と‘あずまの粧’は、共に色素表現型がＰｇｎＣｙｎ型であったこと、及び、共に配列番号１に示す８５２５ｂｐの塩基配列に対応するバンドＥｆ３を検出したことから、色素遺伝子型がｄｄＥｅＨＴＨＴＰｇ−ＣｙＣｙＤｐＤｐであることが分かる。‘あすかの舞姫’と‘あずまの粧’は、共に赤色の花色を示した。
【０１５０】
また、覆輪系の‘あすかの舞姫'は、明度が３５．１と比較的暗く、彩度は６３．１と大変鮮やかな花色を有する。また、色素角は１．５度と赤色方向の色であった。‘あずまの粧'は、明度が６５．３と明るく、彩度は３５．３と鮮やかな花色である。また、色素角は−１．０度と赤色方向の色であった。
【０１５１】
八重系の‘キングオブスノー’の品種２について、色素表現型がＰｇｎ型であったこと、及び、配列番号１に示す８５２５ｂｐの塩基配列に対応するバンドＥｆ３を検出したことから、色素遺伝子型がＤｄｅｅＨＦＨＦＰｇ−ＣｙＣｙＤｐＤｐであることが分かる。
【０１５２】
一方、八重系の‘キングオブスノー’の品種９及び１１については、色素表現型がＤｐｎ型であったこと、及び、配列番号２に示す３１１５ｂｐの塩基配列に対応するバンドＥｆ２を検出したことから、色素遺伝子型がＤｄｅｅＨＤＨＤＰｇ−ＣｙＣｙＤｐＤｐであることが分かる。
【０１５３】
また、八重系の‘キングオブスノー’の品種１０については、色素表現型がＤｐｎ型であったこと、及び、配列番号２に示す３１１５ｂｐの塩基配列と配列番号１に示す８５２５ｂｐの塩基配列に対応するバンドＥｆ２とＥｆ３を同時に検出したことから、色素遺伝子型がＤｄｅｅＨＤＨＦＰｇ−ＣｙＣｙＤｐＤｐであることが分かる。
【０１５４】
‘キングオブスノー'は、明度が８８〜９２の範囲であって大変明るく、彩度は４〜１０の範囲でありほぼ白色の花色を有する。また、色素角は９３〜１０６度の範囲であって、黄色方向の色であった、肉眼では大変薄いクリーム色の花色であった。
【０１５５】
このように、従来では、八重系の‘キングオブスノー’の品種９〜１１の品種群で、花色遺伝型交配法により、ヘテロ型かホモ型か見分けることができなかったが、ＤＮＡバンドを検出することによって、複対立遺伝子型について、品種９及び１１はＨＤＨＤのホモ型、品種１０はＨＤＨＦのヘテロ型であることを見分けることが可能である。これら４種の‘キングオブスノー’の品種は、色素の蓄積が少なかったことからほとんどの品種がクリーム色の「白色」を示した。
【０１５６】
（２）トルコギキョウ市販品種の自殖後代Ｓ１の調査
園芸品種‘あすかのそよ風（ＡＳＹ１７系統）’、‘アクロポリスホワイト（ＡＷ３系統）’、‘キャンディーオーキッド（ＣＡＯ２４系統）’、‘パピオンローズピンク（ＰＲＰ５系統）’の品種を自殖し、後代Ｓ１について、特許文献８に記載の花色遺伝型交配法を用いて、ＣＩＥＬａｂ表色系を用いて花色を測定し、高速液体クロマトグラフィーを用いてアントシアニジンの色素表現型を分析した。また、前記の実施例と同様にフラボノイド３’、５’−水酸化酵素（Ｆ３’、５’−Ｈ）  ＤＮＡバンドを測定した。その結果を表２に示す。
【０１５７】
【表２】
0005648215.tif 000005
【０１５８】
‘あすかのそよ風’の自殖後代Ｓ１のＡＳＹ１７−１３系統はＥｆ２とＥｆ３の二つのバンドを検出し（赤紫色を示し）、ＡＳＹ１７−２２系統はＥｆ３のバンド（赤色）を検出した。この結果、‘あすかのそよ風’の色素遺伝子型はｄｄｅｅＨＴＨＤＰｇ−ＣｙＣｙＤｐＤｐであることが分かる。‘あすかのそよ風’の自殖後代Ｓ１のＡＳＹ１７−１３系統は、大変鮮やかで（８５．２）、赤紫色の花色（−２１．７）であった。一方、ＡＳＹ１７−２２系統は、やや鮮やかで（４０．３）、赤色の花色（−１．３）であった。
【０１５９】
‘アクロポリスホワイト’の自殖後代Ｓ１は、花色の分離がＡＷ３−８系統と同様であり、Ｅｆ２のバンドを検出したことから、‘アクロポリスホワイト’の色素遺伝子型はｄｄＥ−ＨＤＨＤ−−ＣｙＣｙＤｐＤｐであることが分かる。‘アクロポリスホワイト’の品種は色素蓄積が少ないことから、クリーム色の「白色」を示した。‘アクロポリスホワイト’の自殖後代Ｓ１のＡＷ３−８系統は、ＣＩＥＬａｂ測定の結果、大変明るく（９２．５）、黄色方向の花色（１０７．０）を示した。
【０１６０】
‘キャンディーオーキッド’の自殖後代Ｓ１は花色が分離したことから、その３種のＣＡＯ２４系統を分析した。その結果、ＣＡＯ２４−５（クリーム色の「白色」を示した）とＣＡＯ２４−６（赤色花）はＥｆ３のバンドを検出し、一方ＣＡＯ２４−２０（紫赤色花）はＥｆ１のバンドを検出したことから、‘キャンディーオーキッド’の色素遺伝子型はｄｄｅｅＨＴＨＯＰｇ−ＣｙＣｙＤｐＤｐであることが分かる。‘キャンディーオーキッド’の自殖後代Ｓ１は花色が分離したことから、その３種のＣＡＯ２４系統を分析した。ＣＩＥＬａｂ測定の結果、ＣＡＯ２４−５は黄色方向の色（１０４．０）で、大変明るい色（９０．６）を有し、ＣＡＯ２４−６は赤色方向の色（−３．５）で、やや鮮やかな色（２３．１）を有し、ＣＡＯ２４−２０はやや鮮やかな色（３０．１）であり、赤紫色方向の色（−２７．１）であった。
【０１６１】
‘パピオンローズピンク’の自殖後代Ｓ１のは花色が分離したことからその３種のＰＲＰ５系統を分析した。その結果、ＰＲＰ５−２（赤色花）とＰＲＰ５−１５（赤色花）はＥｆ３のバンドを検出し、一方ＰＲＰ５−１（赤紫色花）はＥｆ１のバンドを検出したことから、‘キャンディーオーキッド’の色素遺伝子型はｄｄｅｅＨＴＨＴＰｇ−ＣｙＣｙＤｐＤｐであることが分かる。 ‘パピオンローズピンク’のＰＲＰ５−２とＰＲＰ５−１５は、明るさは明るく（６１．３，５５．６）、鮮やかさはやや鮮やか（３９．７，４９．０）であり、両者赤色方向の花色（−３．２，−５．６）であった。、一方、ＰＲＰ５−１の明るさと鮮やかさ（５８．４、４４．６）は、前２者と同様であったが、色相は赤紫色方向の色（−１４．７）を示した。
【０１６２】
（３）トルコギキョウ野生型交雑種の調査
トルコギキョウ野生型交雑種：Ｅｕｓｔｏｍａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ  アリゾナ系統（ＡＺ３（Ｄｐ）７）、Ｅｕｓｔｏｍａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ  テキサス系統（ＴＸ３４）の自殖後代Ｓ２〜Ｓ３について、特許文献８に記載の花色遺伝型交配法を用いて、ＣＩＥＬａｂ表色系を用いて花色を測定し、高速液体クロマトグラフィーを用いてアントシアニジンの色素表現型を分析した。また、前記した実施例と同様にフラボノイド３’、５’−水酸化酵素（Ｆ３’、５’−Ｈ）  ＤＮＡバンドを測定した。その結果を表３に示す。
【０１６３】
【表３】
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【０１６４】
Ｅｕｓｔｏｍａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍアリゾナ系統ＡＺ３（Ｄｐ）７−６の花色は紫赤色であり、Ｅｆ２のバンドを検出した。色素表現型がＤｐｎ型であったことから、Ｅｕｓｔｏｍａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ  アリゾナ系統ＡＺ３（Ｄｐ）７−６の色素遺伝子型はｄｄｅｅＨＤＨＤ−−ＣｙＣｙＤｐＤｐであることが分かる。アリゾナ系統ＡＺ３（Ｄｐ）７−６の花色は非常に暗く（２６．７）、鮮やかさはとても鮮やか（８２．７）で、色相は赤紫色方向の花色（−２３．１）であった。
【０１６５】
Ｅｕｓｔｏｍａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ  テキサス系統ＴＸ３４の５系統は、すべて赤色の花であり、Ｅｆ３のバンドであった。色素表現型がＰｇｎＣｙｎ型であったことから、Ｅｕｓｔｏｍａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ  テキサス系統ＴＸ３４の５系統の色素遺伝子型はすべてｄｄｅｅＨＴＨＴＰｇＰｇＣｙＣｙＤｐＤｐであることが分かる。テキサス系統ＴＸ３４の５系統は、明るさは概ね６７〜８５の値の範囲で明るく、鮮やかさは１４〜３８の値の範囲であまり鮮やかではないかやや鮮やかな範囲であり、色相は−７〜４度の範囲であり、従って、５系統の色相は概ね赤色方向の色であった。
【０１６６】
（４）トルコギキョウ野生型交雑種の自殖後代Ｓ１の調査
トルコギキョウ野生型交雑種：Ｅｕｓｔｏｍａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ  テキサス系統（ＴＸ６１）の自殖後代Ｓ２について、特許文献８に記載の花色遺伝型交配法を用いて、ＣＩＥＬａｂ表色系を用いて花色を測定し、高速液体クロマトグラフィーを用いてアントシアニジンの色素表現型を分析した。また、前記した実施例と同様にフラボノイド３’、５’−水酸化酵素（Ｆ３’、５’−Ｈ）  ＤＮＡバンドを測定した。その結果を表４に示す。
【０１６７】
【表４】
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【０１６８】
ＴＸ６１−２は、紫赤色の花色であり、Ｅｆ１のバンドであった。色素表現型がＣｙｎＤｐｎ型であったことから、ＴＸ６１−２の色素遺伝子型はｄｄｅｅＨＯＨＯｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐであることが分かる。
【０１６９】
ＴＸ６１−１は、紫赤色の花色であり、Ｅｆ１とＥｆ３の２つのバンドを検出した。色素表現型がＣｙｎＤｐｎ型であったことから、ＴＸ６１−１の色素遺伝子型はｄｄｅｅＨＯＨＴｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐであることが分かる。
【０１７０】
ＴＸ６１−８及びＴＸ６１−１１は、赤紫色の花色であり、Ｅｆ１とＥｆ３の２つのバンドを検出した。色素表現型がＰｇｎＣｙｎＤｐｎ型であったことから、ＴＸ６１−８及びＴＸ６１−１１の色素遺伝子型はｄｄｅｅＨＯＨＴＰｇ−ＣｙＣｙＤｐＤｐであることが分かる。
【０１７１】
ＴＸ６１−３、ＴＸ６１−５、ＴＸ６１−６、ＴＸ６１−９、ＴＸ６１−１５の５系統は、いずれも赤色の花色であり、Ｅｆ３のバンドであった。色素表現型がＣｙｎＤｐｎ型であったことから、ＴＸ６１−２の色素遺伝子型はｄｄｅｅＨＯＨＯｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐであることが分かる。ＴＸ６１の系統では、複対立遺伝子型がＨＯを保有するものは概ね紫色から紫赤色の色相角（ｈ）を示し（−２３度〜−３４度の値）、複対立遺伝子型がＨＴのホモ型になっているものは、概ね赤色の色相角（−１度〜４度の値）を示した。
【０１７２】
（５）トルコギキョウ市販品種の自殖後代Ｓ３の調査
園芸品種‘ロイヤルバイオレット（ＲＶ１０ＣＲ４１系統）’、‘あすかの舞姫（ＡＭ１Ａ系統）’、‘あずまの粧（ＡＹ２Ａ９系統）’を自殖し、後代Ｓ３について、特許文献８に記載の花色遺伝型交配法を用いて、ＣＩＥＬａｂ表色系を用いて花色を測定し、高速液体クロマトグラフィーを用いてアントシアニジンの色素表現型を分析した。また、前記した実施例と同様にフラボノイド３’、５’−水酸化酵素（Ｆ３’、５’−Ｈ）  ＤＮＡバンドを測定した。その結果を表５に示す。
【０１７３】
【表５】
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【０１７４】
‘ロイヤルバイオレット’のＲＶ１０ＣＲ４１の２系統は、赤紫（ｈが−２３．５度）〜紫赤色（ｈが−２９．７度）の花色であり、いずれもＥｆ２のバンドであった。色素表現型がＤｐｎ型であったことから、ＲＶ１０ＣＲ４１の２系統の色素遺伝子型はｄｄｅｅＨＤＨＤ−−ＣｙＣｙＤｐＤｐであることが分かる。
【０１７５】
‘あすかの舞姫’のＡＭ１Ａの３系統は、いずれも赤色（ｈが−２．２〜２．８度の範囲）の花色であり、Ｅｆ３のバンドであった。色素表現型がＰｇｎＣｙｎ型であったことから、ＡＭ１Ａの３系統の色素遺伝子型はｄｄＥ−ＨＴＨＴＰｇ−ＣｙＣｙＤｐＤｐであることが分かる。
【０１７６】
‘あずまの粧’のＡＹ２Ａ９の２系統は、いずれも赤色（ｈが−１．３と−４．３度）の花色であり、Ｅｆ３のバンドであった。色素表現型がＰｇｎＣｙｎ型であったことから、ＡＹ２Ａ９−１２及びＡＹ２Ａ９−１９の２系統の色素遺伝子型はそれぞれ、ｄｄｅｅＨＴＨＴＰｇ−ＣｙＣｙＤｐＤｐ及びｄｄＥ−ＨＴＨＴＰｇ−ＣｙＣｙＤｐＤｐであることが分かる。
【０１７７】
（６）早見表の作成
トルコギキョウを例にとりながら、各複対立遺伝子の組み合わせから花色とフラボノイド３’、５’−水酸化酵素（Ｆ３’、５’−Ｈ）遺伝子に対応する３つのバンド、Ｅｆ１、Ｅｆ２、Ｅｆ３を知ることのできる早見表を、表６及び表７に示す。行には花粉親の配偶子を示し、列には種子親の配偶子を示す。表６は、Ｐｇ／ｐｇ、Ｃｙ／ｃｙ及びＤｐ／ｄｐで示される遺伝子座がＰｇＰｇＣｙＣｙＤｐＤｐ又はＰｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐで表される場合の組み合わせ表であり、表７は、Ｐｇ／ｐｇ、Ｃｙ／ｃｙ及びＤｐ／ｄｐで示される遺伝子座がｐｇｐｇＣｙＣｙＤｐＤｐで表される場合の組み合わせ表である。
【０１７８】
例えば、一つの複対立遺伝子ＨＴともう一つの複対立遺伝子ＨＤが受精し、その組み合わせがＨＴＨＤとなった場合は、表６からその色素表現型はＰｇｎＣｙｎＤｐｎであり、その花色は紫赤色であり、したがって、フラボノイド３’、５’−水酸化酵素（Ｆ３’、５’−Ｈ）遺伝子に対応するバンドは、Ｅｆ２とＥｆ３の２つであることをこの早見表より速やかに知ることができる。
【０１７９】
一方、フラボノイド３’、５’−水酸化酵素（Ｆ３’、５’−Ｈ）遺伝子に対応するバンドがＥｆ２とＥｆ３の２つで、花色が紫色で、その色素表現型がＤｐｎ型である場合、複対立遺伝子型の組み合わせが、ＨＦＨＤ又はＨＤＨＦのいずれかであることをこの早見表より速やかに知ることができる。
【０１８０】
【表６】
0005648215.tif 000009
【０１８１】
【表７】
0005648215.tif 000010
【産業上の利用可能性】
【０１８２】
今回、花色遺伝子型交配法に記載の５つの複対立遺伝子型の遺伝子の構造を明らかにできた。また、それらの構造と当代及び／又は後代に遺伝される花色遺伝を明らかにできた。さらに、ＣＩＥＬａｂ表色系などを用いて花色を正確に測色・数値化した上で、その色素遺伝子型と花色遺伝と遺伝子との関係を明らかにできた。これらの知見によって、本発明は、花卉の新花色作出のための実用的花色改変法と、及び／又は、花卉の開花を迎えずに早期に遺伝子を検定した上で、複対立遺伝子型を帰属し、遺伝する花色を知ることのできる、優れた実用的花色予測法を提供する。
【配列表フリーテキスト】
【０１８３】
配列番号５    人工配列の説明：プライマー
配列番号６    人工配列の説明：プライマー
配列番号７    人工配列の説明：プライマー
配列番号８    人工配列の説明：プライマー
配列番号９    人工配列の説明：プライマー
配列番号１０  人工配列の説明：プライマー
【図１】
0005648215.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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