(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドを細胞にインビボで送達するための結合体送達システムであって、式：
0005735573.tif 000034
（式中、
Ｐは、膜作用性両親媒性ポリアミンであり、
−Ｌ２−Ｍ１は、-CO-C(R)=C(M1)-COOH、または-CO-C(M1)=C(R)-COOHにより表される構造を有し、ここで、M1はターゲティング基を含み、Rはアルキル基であり、
−Ｌ２−Ｍ２は、-CO-C(R)=C(M2)-COOH、または-CO-C(M2)=C(R)-COOHにより表される構造を有し、ここで、M2はポリエチレングリコールを含み、Rはアルキル基であり、
Ｎは、ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドであり、
Ｌ１は、Ｌ２に対して直交する生理学的に不安定な共有結合であり、
ｙは、０より大きい整数であり、
ｚは、０より大きいか０に等しい整数であり、
ここでｙおよびｚを合わせた値は、Ｐのアミンの数の５０％より大きく、
Ｐの膜活性は、マレアマート結合Ｌ２を介するＭ１およびＭ２の結合によりＰのアミンの数の５０％を超える修飾により可逆的に阻害され、
Ｌ２の開裂がＰの膜活性を回復させる）
を有する結合体を含む、結合体送達システム。
【請求項２】
前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドが、siRNA、またはmiRNAを含む、請求項１記載の結合体送達システム。
【請求項３】
前記膜ポリアミンが５ｋＤａより大きい、請求項１記載の結合体送達システム。
【請求項４】
前記ターゲティング基がガラクトース誘導体である、請求項１記載の結合体送達システム。
【請求項５】
Ｐ−Ｌ２−Ｍ１が、構造：
0005735573.tif 000035
（式中、ｎは１〜５００の整数である）
を有する、請求項１記載の結合体送達システム。
【請求項６】
Ｐ−Ｌ２−Ｍ２が、構造：
0005735573.tif 000036
（式中、ｎは１〜５００の整数である）
を有する、請求項１記載の結合体送達システム。
【請求項７】
膜作用性両親媒性ポリアミンが、３つまたはそれより多い異なるモノマーを含む、請求項１記載の結合体送達システム。
【請求項８】
前記モノマーが、アミン含有モノマー、低分子アルキルモノマー、ブチルモノマー、高分子アルキルモノマー、ドデシルモノマー、およびオクタデシルモノマーからなる群から選択される、請求項７記載の結合体送達システム。
【請求項９】
ｙ＋ｚの値が、ポリアミン上のアミンの数の７０％より大きいかそれに等しい、請求項１記載の結合体送達システム。
【請求項１０】
前記膜作用性両親媒性ポリアミンが、２つまたはそれより多い異なるモノマーを含む、請求項１記載の結合体送達システム。
【請求項１１】
前記結合体が、薬学的に許容される担体または希釈剤中に供される、請求項１記載の結合体送達システム。
【請求項１２】
前記ターゲティング基が、細胞表面分子に対するアフィニティーを持つ化合物、細胞受容体リガンド、細胞表面分子に対するアフィニティーを持つ抗体、細胞受容体リガンド、サッカリド、ガラクトース、N-アセチルガラクトサミン、マンノース、マンノース誘導体、ビタミン、フォレート、ビオチン、ペプチド、RGD含有ペプチド、インスリン、およびEGFからなる群から選択される、請求項１記載の結合体送達システム。
【請求項１３】
生理学的に不安定な結合を介して複数のマスキング剤に可逆的に共有結合した過剰な膜作用性ポリアミンをさらに含み、ここで、その過剰なポリマーが、前記ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドに共有結合していない、請求項１記載の結合体送達システム。
【請求項１４】
前記結合体が、ｐＨ９で０ｍＶ〜―２０ｍＶのゼータ電位を有する、請求項１記載の結合体送達システム。
【請求項１５】
前記結合体が直径２０ｎｍより小さい、請求項１記載の結合体送達システム。
【請求項１６】
ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドを細胞にインビボで送達するための結合体送達システムであって、
ａ）膜作用性両親媒性ポリアミンを形成するステップと、
ｂ）ターゲティング基を含む二置換無水マレイン酸結合を含む第１のマスキング剤を形成するステップと、
ｃ）ポリエチレングリコールを含む二置換無水マレイン酸結合を含む第２のマスキング剤を形成するステップと、
ｄ）ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドを、前記ポリアミンに、マレアマート結合に対して直交する生理学的に不安定な共有結合を介して結合させるステップと、
ｅ）前記膜作用性両親媒性ポリアミンの膜活性を可逆的に阻害するステップであって、該阻害が、前記ポリアミンを前記第１および第２のマスキング剤と反応させることによりポリアミン上のアミンの数の５０％またはそれより多くを修飾することからなるステップと、
を含む方法により形成される、結合体送達システム。
【請求項１７】
前記ターゲティング基がガラクトース誘導体である、請求項１６記載の結合体送達システム。
【請求項１８】
前記ガラクトース誘導体がＮ−アセチル−ガラクトサミンである、請求項１７記載の結合体送達システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2006年8月18日に出願された米国特許仮出願第60/822,833号、および2007年5月3日に出願された米国特許仮出願第60/915,868号に優先権を請求する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ポリヌクレオチドおよび他の膜不浸透性化合物の生存細胞内への送達は、細胞の複雑な膜系によって非常に制限される。アンチセンスおよび遺伝子治療で用いられる薬物は、比較的大きな親水性ポリマーであり、かつ、しばしば非常に負にもまた荷電されている。これらの物理的特性の両方により、それらが細胞膜を横断して直接拡散することは不可能である。したがって、ポリヌクレオチド送達に対する主要な障壁は、細胞内部へのポリヌクレオチドの送達である。インビトロで細胞にポリヌクレオチドを送達するため、多くのトランスフェクション試薬が開発されてきている。しかし、ポリヌクレオチドのインビボ送達は、毒性、血清相互作用、およびインビトロで有効なトランスフェクション試薬の乏しいターゲティングによって、困難になる。インビトロでよく働くトランスフェクション試薬、陽イオン性ポリマーおよび脂質は、典型的には細胞膜を不安定化し、かつ巨大粒子を形成する。トランスフェクション試薬が陽イオンに荷電しているにより、核酸結合ならびに細胞結合が促進される。膜の不安定化は、細胞膜を渡る膜不浸透性ポリヌクレオチドの送達を促進する。これらの特性によって、トランスフェクション試薬は、インビボで無効となるかまたは毒性となる。陽イオン性荷電は、血清構成要素との相互作用を生じ、これによって、ポリヌクレオチド-トランスフェクション試薬の相互作用が不安定化され、かつ生物学的利用能およびターゲティングが乏しくなる。陽イオン性荷電はまた、インビボ毒性も導き得る。インビトロで有効であり得るトランスフェクション試薬の膜作用は、しばしば、インビボで毒性を導く。
【０００３】
インビボ送達のため、トランスフェクション複合体 (送達しようとする核酸と会合したトランスフェクション試薬)は、小さくなければならず、直径100 nm未満であり、かつ好ましくは50 nm未満である。20 nm未満または10 nm未満の、さらにより小さい複合体が、さらにより有用であろう。100 nmより大きいトランスフェクション複合体は、インビボで、血管細胞以外の細胞にはほとんどアクセスできない。インビトロ複合体はまた、正に荷電している。この正電荷は、複合体が細胞に付着するために、かつ膜融合、不安定化または破壊のために、必要である。インビボ・トランスフェクション複合体の陽イオン電荷は、不都合な血清相互作用を導き、したがって乏しい生物学的利用能を引き起こす。ほぼ中性のまたは負に荷電した複合体は、より優れたインビボ分布およびターゲティング能を有するであろう。しかし、インビトロ・トランスフェクション複合体は、電荷-電荷 (静電)相互作用を介して、核酸と会合する。負に荷電したポリマーおよび脂質は、負に荷電した核酸と相互作用しない。さらに、これらの静電複合体は、生理学的塩濃度または血清構成要素に曝露される場合に、凝集するかまたは崩壊する。最後に、インビトロで有効であるトランスフェクション複合体は、しばしば、インビボで毒性である。トランスフェクションに用いられるポリマーおよび脂質は、細胞膜を破壊するかまたは不安定化する。この活性と核酸送達の平衡化は、インビボよりもインビトロでより容易に達成される。
【０００４】
いくつかのグループがインビボでの細胞への遺伝子送達改善に向けて、漸進的な改善を行ってきているが、トランスフェクション試薬のインビボ投与に通常関連する毒性を伴わずに、送達剤と一緒にポリヌクレオチドをターゲット細胞に有効に送達する配合物に関する必要性が依然としてある。本発明は、生物学的に不安定な結合体送達系を用いて、ポリヌクレオチドを細胞に送達し、かつ放出するための組成物および方法を提供する。
【発明の概要】
【０００５】
好ましい態様において、本発明は、ポリヌクレオチドに可逆的に結合体化され、可逆的にマスキングされた膜作用性（membrane active）ポリマーを含む、インビボで細胞にポリヌクレオチドを送達するための組成物を特徴とする。該ポリマーは、1つまたは複数の第一の可逆的共有結合を介して、1つまたは複数のマスキング剤に付着し、かつ1つまたは複数の第二の可逆的共有結合を介して、1つまたは複数のポリヌクレオチドにさらに付着する。第一および第二の可逆的共有結合は、同じもしくは類似の条件下で開裂される可逆的結合を含んでもよいし、または別個の条件下で開裂されてもよく、すなわちこれらは直交性の可逆的結合を含んでもよい。ポリヌクレオチド-ポリマー結合体は、薬学的に許容される担体または希釈剤中で、哺乳動物に投与される。
【０００６】
好ましい態様において、ポリビニルエーテルランダムコポリマーを含む膜作用性ポリマーが開示される。このポリビニルエーテルコポリマーは、2つ、3つ、またはそれより多い異なるモノマーから合成可能である。モノマーは、保護アミノビニルエーテル、例えばフタルイミド含有ビニルエーテル、ブチルビニルエーテル、ドデシルビニルエーテル、オクタデシルビニルエーテルを含むリストより選択可能である。好ましいポリビニルエーテルランダムコポリマーは、アミン含有モノマー、ブチルビニルエーテル、およびオクタデシルビニルエーテルの3つのモノマーを含む。
【０００７】
好ましい態様において、膜作用性ポリマーの1つまたは複数の生物物理学的特性は、マスキング剤によって可逆的に遮蔽されるかまたは修飾される。マスキング剤は、立体安定化剤、ターゲティング基および電荷修飾剤を含む群より選択可能である。マスキング剤は、血清構成要素または非ターゲット細胞とポリマーの非特異的相互作用を阻害することによって、ポリマー-ポリヌクレオチド結合体の生体内分布またはターゲティングを改善し得る。マスキング剤はまた、ポリマーまたはポリマー-ポリヌクレオチド結合体の凝集を減少させ得る。ターゲティング基を含有するマスキング剤は、結合体系を細胞表面受容体にターゲティングすることによって、細胞特異的ターゲティングまたは細胞内在化を増進させ得る。ポリヌクレオチドへのポリマーの結合体化前にまたはその後に、マスキング剤を膜作用性ポリマーに結合体化してもよい。
【０００８】
好ましい態様において、記載する結合体系を用いて、細胞に送達可能なポリヌクレオチドは、DNA、RNA、ブロッキングポリヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、プラスミド、発現ベクター、オリゴヌクレオチド、siRNA、マイクロRNA、mRNA、shRNAおよびリボザイムを含む群より選択可能である。
【０００９】
好ましい態様において、マスキング剤およびポリヌクレオチドは、可逆的連結を介して、膜作用性ポリマーに共有結合される。ポリマーのマスキング、およびポリマーへのポリヌクレオチドの付着は重要であるが、これらの付着は、ポリマーのトランスフェクション活性またはポリヌクレオチドの活性に干渉し得る。適切な時点で開裂される可逆的連結を介して、マスキング剤およびポリヌクレオチドをポリマーに付着させることによって、ポリマーに対して活性が回復され、かつポリヌクレオチドが放出される。可逆的共有結合は、可逆的または不安定な結合を含有し、これは、生理学的に不安定な結合、細胞生理学的に不安定な結合、pH不安定な結合、非常にpH不安定な結合、極端にpH不安定な結合、酵素により開裂可能な結合、およびジスルフィド結合を含む群より選択可能である。ポリマーをポリヌクレオチドおよびマスキング剤に連結する2つの可逆的連結の存在によって、送達ポリマーとポリヌクレオチドの同時送達、ならびにマスキング剤による送達ポリマーの選択的ターゲティングおよび不活性化が提供される。連結の可逆性は、膜作用性ポリマーからのポリヌクレオチドの放出および膜作用性ポリマーの選択的活性化を提供する。
【００１０】
好ましい態様において、本発明者らは、a) 1つまたは複数の可逆的連結を介して、1つまたは複数のターゲティング基、立体安定化剤または電荷修飾剤に、かつb) 1つまたは複数の可逆的連結を介して、1つまたは複数のポリヌクレオチドに共有結合した送達ポリマーを含む組成物を記載する。1つの態様において、ターゲティング剤、立体安定化剤、または電荷修飾剤の可逆的共有結合は、ポリヌクレオチドの可逆的共有結合に対して直交性である。
【００１１】
好ましい態様において、本発明者らは、それ自体がマスキング剤に可逆的に結合体化された膜作用性ポリマーに可逆的に結合体化されたポリヌクレオチドを含む、細胞にポリヌクレオチドを送達し、かつ細胞内でポリヌクレオチドを放出するためのポリマー結合体系を記載する。結合体化結合は、同じであってもよいし、またはこれらは異なってもよい。さらに、結合体化結合は、同じまたは異なる条件下で開裂されてもよい。
【００１２】
好ましい態様において、本発明者らは、細胞に膜不浸透性分子を送達し、かつ細胞中でその分子を放出するためのポリマー結合体系を記載する。ポリマー結合体系は、膜作用性ポリマーに可逆的に連結された膜不浸透性分子を含み、ここで、可逆的共有結合を介して、複数のマスキング剤が、膜作用性ポリマーに連結されている。膜作用性ポリマーは、毒性であってもよいし、またはインビボで適用された場合にターゲティングされなくてもよい。マスキング剤の可逆的付着は、ポリマーの膜相互作用、血清相互作用、細胞相互作用、毒性、または電荷を可逆的に阻害するかまたは改変する。好ましい可逆的共有結合は、不安定な結合、生理学的に不安定な結合、または哺乳動物細胞内条件下で開裂可能な結合を含む。好ましい不安定な結合は、pH不安定な結合を含む。好ましいpH不安定な結合は、マレアマート結合を含む。別の好ましい不安定な結合は、ジスルフィド結合を含む。膜不浸透性分子には、限定されるわけではないが、ポリヌクレオチド、タンパク質、抗体、および膜不浸透性薬物が含まれる。
【００１３】
好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、過剰なポリマーの存在下でポリマーに付着する。過剰なポリマーは、ポリヌクレオチド-ポリマー結合体の配合の助けとなり得る。過剰なポリマーは、結合体形成中、結合体の凝集を減少させ得る。細胞または生物への結合体投与前に、ポリヌクレオチド-ポリマー結合体を、過剰なポリマーから分離させてもよい。あるいは、ポリヌクレオチド-ポリマー結合体を、過剰なポリマーとともに、細胞または生物に同時投与してもよい。過剰なポリマーは、ポリマーと同じであってもよいし、または異なってもよい。
【００１４】
好ましい態様において、ポリヌクレオチドまたは他の膜不浸透性分子のインビトロ送達に、本発明のポリマー結合体を用いてもよい。インビトロ送達に関して、ポリマーの可逆的マスキングは、ポリリジンのようないくつかの他の無効なポリアミンのトランスフェクション活性を増進させる。可逆的マスキングはまた、他の膜作用性ポリマーの毒性を減少させるか、またはそれらの膜破壊特性をエンドソームに限定させることによって、それらのポリマーの有用性を増進させ得る。
【００１５】
好ましい態様において、本発明者らは、ポリヌクレオチドにターゲティング基を共有結合させる工程、膜作用性ポリマーに第二のターゲティング基を共有結合させる工程、ならびに生物内にポリヌクレオチドおよび膜作用性ポリマーを注入する工程を含む、インビボで細胞にポリヌクレオチドを送達する系を記載する。
【００１６】
本発明のさらなる目的、特徴、および利点は、付随する図と合わせて理解すると以下の詳細な説明から明らかであろう。
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
［１］
下記の式の結合体を含む、細胞に分子を送達するための組成物：
N-L1-P-(L2-M)y
式中、
Nが膜不浸透性分子または低い膜浸透性を持つ分子であり、
L1が生理学的に不安定な結合を含有する第一の可逆的連結であり、
Pがポリマーであり、
L2が生理学的に不安定な結合を含有する第二の可逆的連結であり、
Mがマスキング剤であり、かつ
yが0より大きい整数である。
［２］
ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、抗体、および膜不浸透性薬物からなる群より選択される、［1］記載の組成物。
［３］
ポリヌクレオチドが、修飾ポリヌクレオチド、DNA、RNA、siRNA、miRNA、および発現カセットからなる群より選択される、［2］記載の組成物。
［４］
ポリマーが10 kDaより大きい、［1］記載の組成物。
［５］
ポリマーが膜作用性ポリマーである、［4］記載の組成物。
［６］
膜作用性ポリマーがポリアミンである、［5］記載の組成物。
［７］
膜作用性ポリアミンがポリビニルエーテルランダムコポリマーからなる、［6］記載の組成物。
［８］
ポリビニルエーテルランダムコポリマーが3つまたはそれより多い異なるモノマーを含有する、［7］記載の組成物。
［９］
3つまたはそれより多い異なるモノマーが、アミン含有ビニルエーテルモノマー、より低次のアルキルビニルエーテルモノマー、およびより高次のアルキルビニルエーテルモノマーからなる、［8］記載の組成物。
［１０］
より低次のアルキルビニルエーテルモノマーが、ブチルビニルエーテルモノマーからなり、かつより高次のアルキルビニルエーテルモノマーがオクタデシルビニルエーテルモノマーまたはドデシルビニルエーテルモノマーからなる、［9］記載の組成物。
［１１］
ポリマーが生物分解性ポリマーである、［1］記載の組成物。
［１２］
第一の可逆的連結の生理学的に不安定な結合が、第二の可逆的連結の生理学的に不安定な結合に対して直交性である、［1］記載の組成物。
［１３］
第一の可逆的連結および第二の可逆的連結が、生理学的に不安定な結合、細胞生理学的に不安定な結合、pH不安定な結合、非常にpH不安定な結合、極端にpH不安定な結合、マレアマート結合、酵素により開裂可能な結合、およびジスルフィド結合からなる群より独立に選択される生理学的に不安定な結合を含有する、［12］記載の組成物。
［１４］
yが2またはそれより大きい、［1］記載の組成物。
［１５］
マスキング剤が同じかまたは異なる、［14］記載の組成物。
［１６］
マスキング剤が、立体安定化剤、ターゲティング基および電荷修飾剤からなる群より選択される、［15］記載の組成物。
［１７］
マスキング剤の少なくとも1つが、細胞表面分子に対するアフィニティーを持つ化合物、細胞受容体リガンド、細胞表面分子に対するアフィニティーを持つ抗体、細胞受容体リガンド、サッカリド、ガラクトース、ガラクトース誘導体、N-アセチルガラクトサミン、マンノース、マンノース誘導体、ビタミン、フォレート、ビオチン、アプタマー、ペプチド、RGD含有ペプチド、インスリン、およびEGFからなる群より選択されるターゲティング基からなる、［16］記載の組成物。
［１８］
マスキング剤が、無水ジメチルマレイン酸、無水カルボキシジメチルマレイン酸(CDM)、CDM-チオエステル、CDM誘導体、CDM-立体安定化剤、CDM-PEG、CDM-PEG、CDM-リガンド、CDM-ガラクトース、CDM-ラクトビオン酸(LBA)、CDM-Pip-LBA、およびCDM-NAGからなる群より独立に選択される、［14］記載の組成物。
［１９］
過剰なポリマーをさらに含む、［1］記載の組成物。
［２０］
結合体が、pH 7で+30 mV〜-30 mVの間のゼータ電位を有する、［1］記載の組成物。
［２１］
結合体が直径20 nmより小さい、［1］記載の組成物。
［２２］
以下の工程を含む、インビボで哺乳動物の細胞にオリゴヌクレオチドを送達するための方法：
a) 生理学的に不安定な結合を介してオリゴヌクレオチドを可逆的にマスキングされたポリマーに共有結合させて、結合体を形成する工程；および
b) 該結合体を哺乳動物に投与する工程。
［２３］
下記の式の結合体を含む、細胞に分子を送達するための組成物：
N-L1-P-(L2-M)y
式中、
Nが膜不浸透性分子または低い膜浸透性を持つ分子であり、
L1が生理学的に不安定な結合を含有する第一の可逆的連結であり、
Pがポリマーであり、
L2が直交性の生理学的に不安定な結合を含有する第二の可逆的連結であり、
Mがマスキング剤であり、かつ
yが0より大きい整数である。
［２４］
生理学的に不安定な結合を介して分子に可逆的に連結され、かつ生理学的に不安定な結合を介して2つまたはそれより多いマスキング剤にさらに連結された、膜作用性ポリマーであって、2つまたはそれより多いマスキング剤が少なくとも1つのターゲティング基および少なくとも1つの立体安定化剤または電荷修飾剤からなる膜作用性ポリマーを含む、
細胞に分子を送達するための結合体。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ポリビニルエーテルポリマーの重合のための反応スキーム。
【図２】本発明のマスキング剤のいくつかの態様を図示する図。
【図３】ポリヌクレオチド-ポリマー可逆的結合体およびマレアマート（maleamate）による結合体の可逆的マスキングを図示する略図。
【図４】A) CDM-PEG (左)またはB) CDM-PEGに加えてCDM-Pip-LBAでマスキングしたPBAVEポリマーの肝細胞へのターゲティング化送達を示す顕微鏡写真。
【図５】インビボでの肝細胞へのマスキングされたポリヌクレオチド-ポリマー結合体の送達を示す顕微鏡写真。
【図６】ポリ結合体が仲介するppara siRNAの送達後のインビボのターゲット遺伝子ノックダウンを図示するグラフ。
【図７Ａ】DNA-DW1360-CDM-PEG/NAGを用いた、インビボでの肝臓へのds DNAの送達を示す顕微鏡写真。Cy3標識DNA = 各パネルの上部左部分、ALEXA (登録商標)-488ファロイジン染色アクチン = 上部右部分、核 = 下部左部分、および合成写真 = 下部右部分。
【図７Ｂ】DNA + DW1360-CDM-PEG/NAG (ポリマーに結合体化されていないポリヌクレオチド)を用いた、インビボでの肝臓へのds DNAの送達を示す顕微鏡写真。Cy3標識DNA = 各パネルの上部左部分、ALEXA (登録商標)-488ファロイジン染色アクチン = 上部右部分、核 = 下部左部分、および合成写真 = 下部右部分。
【図７Ｃ】DNA-DW1360-CDM-PEG/グルコースを用いた、インビボでの肝臓へのds DNAの送達を示す顕微鏡写真。Cy3標識DNA = 各パネルの上部左部分、ALEXA (登録商標)-488ファロイジン染色アクチン = 上部右部分、核 = 下部左部分、および合成写真 = 下部右部分。
【図７Ｄ】DNA-DW1360-CDM-PEG/マンノースを用いた、インビボでの肝臓へのds DNAの送達を示す顕微鏡写真。Cy3標識DNA = 各パネルの上部左部分、ALEXA (登録商標)-488ファロイジン染色アクチン = 上部右部分、核 = 下部左部分、および合成写真 = 下部右部分。
【図８】siRNAポリ結合体の静脈内注射後、マウス肝臓におけるターゲット遺伝子発現のノックダウンを図示するグラフおよびブロット。(A) apoB siRNAポリ結合体での処置後の肝臓におけるapoB mRNAレベルの減少。(B) apoB siRNAポリ結合体処置マウスにおけるapoB-100タンパク質の血清レベル。(C) ppara siRNAポリ結合体の静脈内注射後の肝臓におけるppara mRNAレベルの減少。
【図９】apoB-1 siRNAポリ結合体用量反応を図示するグラフ。(A) apoB-1 siRNAポリ結合体の連続希釈注射後のapoB mRNAのノックダウン。(B) 多様な量のsiRNAの注射後のapoB mRNAのノックダウン。
【図１０】apoB-1 siRNAポリ結合体処置マウスにおけるコレステロールレベルを図示するグラフ。
【図１１】(A) ApoB siRNAまたは(B) GL3陰性対照siRNA、または(C)生理食塩水のみのポリ結合体送達後のマウス肝臓における脂質集積を示す顕微鏡写真。
【図１２】第0日のマウスにおけるapoB-1 siRNA結合体の投与後、第2〜15日の遺伝子発現の阻害(A)、およびその結果の血清コレステロール減少(B)を図示するグラフ。
【図１３】DW1360に可逆的に結合体化され、かつCDM-PEGおよびCDM-NAGでマスキングされた抗体の投与を介した、肝細胞への抗体のインビボ送達を示す顕微鏡写真。上部左部分は標識抗体を示し、上部右部分はアクチンを示し、下部左部分は核を示し、かつ下部右部分は合成画像を示す。
【図１４】市販のインビトロ・トランスフェクション試薬または多様な量のApoB siRNAポリ結合体を用いて送達されるApoB siRNAでトランスフェクションされた初代肝細胞における遺伝子ノックダウンを図示するグラフ。
【図１５】インビトロでのHepa-1c1c7細胞へのsiRNA結合体のトランスフェクションを図示するグラフ：結合体のみ = マスキングされたsiRNA-PLL。
【図１６】PBAVEの存在下でのDPHの蛍光を図示するグラフ。
【図１７Ａ】Shodex SB-803カラム上のPEG標準の溶出プロファイルを図示するグラフ。
【図１７Ｂ】Shodex SB-803カラムに関する較正プロットを図示するグラフ。
【図１７Ｃ】PBAVEポリマーに関する分子量計算を図示するグラフ。
【図１８Ａ】Cy3標識核酸標準およびマスキングされたポリヌクレオチド-ポリマー結合体の溶出プロファイルを図示するグラフ。
【図１８Ｂ】Sephacryl S-500サイズ排除クロマトグラフィーに関する較正プロットを図示するグラフ。
【図１８Ｃ】マスキングされたポリヌクレオチド-ポリマー結合体に関する分子量計算を図示するグラフ。
【図１９】オリゴヌクレオチド-ポリマー-CDM/PEG/NAG結合体 (A、C) またはオリゴヌクレオチド-ポリマー-CDM/PEG/グルコース結合体 (B、D) を用いた、マウス・ガラクトース受容体陽性腫瘍 (A-B) またはガラクトース受容体陰性腫瘍 (C-D) へのインビボ・ポリヌクレオチド送達を示す顕微鏡写真。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、哺乳動物細胞にポリヌクレオチドまたは他の細胞不浸透性分子を送達するために有用な化合物、組成物、および方法に関する。インビボで、細胞にポリヌクレオチドまたは他の膜不浸透性分子を送達するためのポリ結合体系を、本明細書に記載する。ポリ結合体系は、50ナノメートル未満の小さい送達ビヒクル内に、ターゲティング、抗オプソニン化、抗凝集、およびトランスフェクション活性を取り込む。系の重要な構成要素は、構成要素部分を連結する結合の可逆性である。
【００１９】
記載するインビボ・ポリヌクレオチド送達結合体の第一の構成要素は、膜作用性ポリマーへのポリヌクレオチドの生理学的に可逆的な共有結合を含む。膜作用性ポリマーへのポリヌクレオチドの共有結合は、インビボ、またはエクスビボで、血清の存在下で投与された場合に、ポリヌクレオチドが、ポリマーから容易に解離せず、したがって、ターゲット細胞への膜作用性ポリマーとポリヌクレオチドの同時送達を提供することを確実にする。しかし、ポリマーへのポリヌクレオチドの共有結合は、ポリヌクレオチドを不活性にし得る。したがって、膜作用性ポリマーへのポリヌクレオチドの付着は、生理学的に可逆的な連結または結合を通じて達成される。生理学的に可逆的な連結を用いることによって、ポリヌクレオチドをポリマーから開裂し、ポリヌクレオチドを放出して、細胞構成要素との機能的相互作用に関与させることも可能である。適切な可逆的連結を選択することによって、所望の位置、例えば細胞質に送達された後にのみ、ポリヌクレオチドを放出する結合体を形成することが可能である。
【００２０】
記載するインビボ・ポリヌクレオチド送達結合体の第二の構成要素は、膜作用性ポリマーの可逆的修飾を含む。膜作用性ポリマーの可逆的修飾は、非生産的な血清および非ターゲット細胞の相互作用を減少させ、かつ毒性を減少させる。マスキング剤はまた、ターゲット細胞相互作用を増進させるかまたは結合体のエンドサイトーシスを増進させるなど、結合体に所望の機能を付加することも可能である。ポリマーは、生理学的に可逆的な共有結合を介して、ポリマーにマスキング剤を共有結合させることによって、マスキングされる。マスキング剤は、立体安定化剤、ターゲティング基、または電荷修飾剤であってもよい。マスキング剤は、非特異的相互作用からポリマーを遮蔽するか、循環時間を増加させるか、特異的相互作用を増進させるか、毒性を阻害するか、またはポリマーの電荷を改変することも可能である。これらの修飾は各々、ポリマーの膜作用を改変し、修飾ポリマーがポリヌクレオチドの送達を促進するのを不可能にする可能性もある。したがって、膜作用性ポリマーへのマスキング剤の付着は、生理学的に可逆的な結合を通じて達成される。生理学的に可逆的な連結を用いることによって、マスキング剤は、ポリマーから開裂され、それによってポリマーをアンマスキングし、かつアンマスキングされたポリマーの活性を回復することも可能である。適切な可逆的連結を選択することによって、所望の細胞種または細胞位置に送達されたかまたはターゲティングされた後、膜作用性ポリマーの活性を回復する結合体を形成することが可能である。
【００２１】
本発明には、下記の一般構造の結合体送達系が含まれる。
N-L1-P-(L2-M)y
式中、Nは、ポリヌクレオチドまたは他の細胞膜不浸透性分子であり、L1は可逆的連結であり、Pはポリマーであり、L2は第二の可逆的連結であり、かつMはマスキング剤である。マスキング剤Mは、Pの特性または相互作用を遮蔽するかまたは修飾する。yは0より大きい整数である。好ましいポリマーは、膜作用性ポリマーである。別の好ましいポリマーは、トランスフェクションポリマーである。複数のマスキング剤を単一のポリマーに連結してもよい。複数のマスキング剤を、複数の可逆的連結を介してポリマーに連結してもよい。可逆的連結L2を開裂すると、マスキングされた特性または相互作用がポリマーPに回復される。マスキング剤Mは、細胞受容体結合などの活性をポリマーPに付加し得る。L1の可逆的結合は、L2の可逆的結合と同じでもまたは異なっても (直交性であっても)よい。可逆的連結L1またはL2の可逆的結合は、所望の生理学的条件下、例えば所望の組織、臓器、および細胞下の位置に存在する生理学的条件下で、または薬学的に許容される外因性の薬剤の添加に反応して、開裂が起こるように選択される。ポリヌクレオチドNおよびマスキング剤Mは、ポリマーPの全長に渡って、どこでポリマーPに付着してもよい。
【００２２】
ポリマー
ポリマーは、モノマーと呼ばれるより小さい単位がともに反復して結合することによって構築される分子である。ポリマーは、直鎖、分枝ネットワーク、星、櫛、またはラダー型であってもよい。ポリマーの主鎖は、その結合がポリマー長の伸長(propagation)に必要である原子で構成される。例えば、ポリ-L-リジンでは、カルボニル炭素、α-炭素、およびα-アミン基がポリマー長に必要であり、したがって主鎖原子である。ポリマーの側鎖は、その結合がポリマー長の伸長に必要ではない原子で構成される。
【００２３】
ポリマーは、単一のモノマーが用いられるホモポリマーであってもよいし、またはポリマーは、2つもしくはそれより多い異なるモノマーが用いられるコポリマーであってもよい。コポリマーは、交互、ランダム(統計的)、ブロックおよびグラフト(櫛)であってもよい。
【００２４】
交互ポリマーは、-[A-B]n-などの、定義される反復順序でモノマーを含有する。交互ポリマーのモノマーは、典型的にはホモ重合せず、その代わり一緒に反応して、交互コポリマーを生じる。
【００２５】
ランダムコポリマー中のモノマーは、任意の所定の鎖に沿って、明確な順序または配置を持たず、例えば、-An-Bm-である。このようなポリマーの一般的な組成は、インプットモノマーの比を反映する。しかし、別のモノマーに対する1つのモノマーの正確な比は、鎖間で異なる可能性もある。モノマーの分布もまた、単一のポリマーの長さに沿って、異なる可能性もある。また、モノマーの化学的特性は、ランダムコポリマーへの取り込み速度、およびポリマー内のその分布に影響を及ぼし得る。したがって、ランダムポリマー中のモノマーの比は、モノマーのインプット比に依存するが、インプット比は、取り込まれるモノマーの比と正確にはマッチしない可能性もある。
【００２６】
ブロックポリマーは、1つのポリマーのセグメントまたはブロック(ポリA)の後に、第二のポリマーのセグメントまたはブロック(ポリB)を有する。すなわち、-ポリA-ポリB-である。その結果、異なるポリマー鎖が、ヘッド-テール配置で連結される。したがって、ブロックポリマーは、異なるモノマー組成のブロックの直鎖配置である。必要とされるわけではないが、一般的に、ポリマーブロックは、ポリマーBとは異なるモノマーで構成されるポリマーAを含むホモポリマーである。2ブロックコポリマーは、ポリA-ポリBであり、かつ3ブロックコポリマーは、ポリA-ポリB-ポリAである。Aが親水性基であり、かつBが疎水性基である場合、生じるブロックコポリマーは、ポリマー性界面活性剤と見なされ得る。グラフトポリマーは、以下の式におけるように(式中、n、m、x、y、およびzは整数である)、1つのモノマーの鎖が他方のモノマーの側鎖上に移植されるブロックコポリマーのタイプである。
0005735573.tif 000002
【００２７】
モノマー
重合プロセスにおいて、非常に多様なモノマーが使用可能である。モノマーは、陽イオン性、陰イオン性、双性イオン性、親水性、疎水性、親油性、両親媒性、または両性であってもよい。モノマーはそれ自体、ポリマーであってもよい。モノマーは、重合前または重合後に修飾可能な化学基を含有してもよい。このようなモノマーは、アミン(一級、二級、および三級)、アミド、カルボン酸、エステル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、アルキルハロゲン化物、アルデヒド、およびケトンを含む群より選択される反応基を有してもよい。好ましくは、反応基は、ポリヌクレオチドの結合体化後に、または水性溶液中で、修飾されてもよい。
【００２８】
重合の当業者にとっては、重合プロセスのいくつかのカテゴリーがある。例えば、重合は、連鎖または段階重合であってもよい。
【００２９】
段階重合
段階重合において、重合は、段階的様式で起こる。ポリマー成長は、モノマー、オリゴマーおよびポリマーの間の反応によって起こる。同じ反応が全体で起こるため、開始剤は必要なく、かつ終結工程がなく、したがって末端基はなお反応性である。官能基が消費されるにつれて、重合速度が減少する。
【００３０】
同じモノマー中に2つの反応基(AおよびB)を有するモノマー (ヘテロ二官能性)を用いることによって、段階重合を用いてポリマーを生成してもよく、ここで、Aは反応基を含み、かつBはA反応基 (Aと共有結合を形成する反応基)を含む。A-Bの重合は、-[A-B]n-を生じる。反応基AおよびBは、1つの共有結合または複数の共有結合によって連結されて、それによってポリマーモノマーを形成してもよい。ポリマーはまた、A-A + B-Bが-[A-A-B-B]n-を生じるように、ホモ二官能性モノマーを用いることによる、段階重合を用いても生成可能である。一般的に、これらの反応は、アシル化またはアルキル化を伴ってもよい。モノマーの2つの反応基を、単一の共有結合または複数の共有結合によって連結してもよい。
【００３１】
反応基Aがアミンである場合には、Bはアミン反応基であり、これは、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、N-ヒドロキシ-スクシンイミド、塩化スルホニル、アルデヒド(ホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドを含む)、ケトン、エポキシド、カーボネート、イミドエステル、カルボジイミドで活性化されたカルボキシレート、アルキルホスフェート、アリールハロゲン化物 (ジフルオロ-ジニトロベンゼン)、無水物、酸ハロゲン化物、p-ニトロフェニルエステル、o-ニトロフェニルエステル、ペンタクロロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、カルボニルイミダゾール、カルボニルピリジニウム、およびカルボニルジメチルアミノピリジニウムを含む群より選択可能である。反応基Aがアミンである他の場合、Bは、アシル化もしくはアルキル化剤またはアミン化剤であってもよい。
【００３２】
反応基Aがスルフィドリル (チオール)である場合、Bはチオール反応基であり、これは、ヨードアセチル誘導体、マレイミド、アジリジン誘導体、アクリロイル誘導体、フルオロベンゼン誘導体、およびジスルフィド誘導体 (ピリジルジスルフィドまたは5-チオ-2-ニトロ安息香酸(TNB)誘導体など)を含む群より選択可能である。
【００３３】
反応基Aがカルボキシレートである場合、反応基Bはカルボキシレート反応基であり、これは、ジアゾアセテート、およびカルボジイミドが用いられるアミンを含む群より選択可能である。カルボニルジイミダゾール、ジメチルアミノピリジン(DMAP)、N-ヒドロキシスクシンイミド、またはカルボジイミドおよびDMAPを用いるアルコールなどの他の添加剤を利用してもよい。
【００３４】
反応基Aがヒドロキシルである場合、反応基Bはヒドロキシル反応基であり、これは、エポキシド、オキシラン、活性化カルバメート、活性化エステル、およびアルキルハロゲン化物を含む群より選択可能である。
【００３５】
反応基Aがアルデヒドまたはケトンである場合、反応基Bはアルデヒドまたはケトン反応基であり、これは、ヒドラジン、ヒドラジド誘導体、アミン (NaCNBH3などの還元剤によって還元されてもまたは還元されなくてもよいシッフ塩基を形成する)、およびヒドロキシル化合物を含む群より選択可能である。
【００３６】
別の薬剤を加えたA-Aが-[A-A]n-を生じるように、二官能性モノマーおよび別の薬剤を用いることによって、段階重合を用いて、ポリマーを生成してもよい。
【００３７】
反応基Aがスルフィドリル (チオール)基である場合には、ヨウ素 (I2)、過ヨウ素酸ナトリウム (NaIO4)、または酸素 (O2)などの酸化剤によって、これをジスルフィド結合に変換してもよい。反応基Aがアミンである場合には、2-イミノチオレート (トラウト（Traut）試薬)との反応によって、これをチオールに変換して、これを次いで、酸化およびジスルフィド形成に供してもよい。ジスルフィド誘導体 (ピリジルジスルフィドまたはTNB誘導体など)を用いて、ジスルフィド結合形成を触媒してもよい。
【００３８】
任意の上記例の反応基AまたはBはまた、アリールアジド (ハロゲン化アリールアジドを含む)、ジアゾ、ベンゾフェノン、アルキン、またはジアリジン誘導体などの光反応基であってもよい。
【００３９】
アミン、ヒドロキシル、スルフィドリル、またはカルボキシレート基の反応は、アミド、アミジン、ジスルフィド、エーテル、エステル、エナミン、イミン、尿素、イソチオ尿素、イソ尿素、スルホンアミド、カルバメート、アルキルアミン結合 (二級アミン)、および炭素がヒドロキシル基、チオエステル、ジオール、ヒドラゾン、ジアゾ、またはスルホンを含有する炭素-窒素単結合と記載される化学結合を生じる。
【００４０】
連鎖重合
連鎖反応重合において、ポリマーの成長は、限定された数の成長中の鎖に、モノマー単位を連続して添加することによって起こる。開始および伸長機構は異なり、かつ典型的には鎖終結工程がある。連鎖重合反応は、ラジカル性、陰イオン性または陽イオン性であってもよい。連鎖重合のためのモノマーは、ビニル、ビニルエーテル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、およびメタクリルアミド基を含む群より選択可能である。連鎖重合はまた、サイクルまたは開環重合によっても達成可能である。いくつかの異なるタイプのフリーラジカル開始剤を用いてもよく、これには限定されるわけではないが、過酸化物、ヒドロキシ過酸化物、およびアゾ化合物、例えば2,2’-アゾビス(-アミジノプロパン) ジヒドロクロリド (AAP) が含まれる。
【００４１】
トランスフェクション活性
トランスフェクションという用語は、ポリヌクレオチドまたは生物学的活性化合物が機能するような、細胞外部から細胞内部へのポリヌクレオチドまたは他の生物学的活性化合物の転移を指す。ポリヌクレオチドの細胞への送達のためのトランスフェクション試薬の例には、限定されるわけではないが、リポソーム、脂質、ポリアミン、リン酸カルシウム沈殿物、ヒストンタンパク質、ポリエチレンイミン、およびポリ両性電解質複合体、ならびにこれらの組み合わせが含まれる。多くのインビトロ・トランスフェクション試薬は陽イオン性であり、これによって、静電相互作用を介して、試薬が、負に荷電した核酸と会合するかまたは複合体を形成することが可能になる。
【００４２】
膜作用性ポリマー
膜作用性ポリマーは、生物学的膜に対する以下の効果の1つまたは複数を誘導できる両親媒性ポリマーである：膜非浸透性分子が細胞に進入するかもしくは膜を横断することを可能にする膜の改変もしくは破壊、膜中の孔形成、膜融合、または膜の破壊もしくは溶解。本明細書において用いられるように、膜、または細胞膜は、脂質二重層を含む。本発明の膜作用性ポリマーには、細胞外部から細胞内部への、かつ好ましくは細胞質への、ポリヌクレオチドまたは他の膜不浸透性分子の送達を促進するポリマーが含まれる。少なくとも1つの以下のアッセイ法におけるポリマーまたは化合物の活性によって、膜の改変または破壊を機能的に定義してもよい：赤血球溶解 (溶血)、リポソーム漏出、リポソーム融合、細胞融合、細胞溶解、およびエンドソーム放出。細胞膜の溶解を引き起こし得る膜作用性ポリマーはまた、膜溶解性ポリマーとも称される。エンドソームまたはリソソームの破壊を引き起こし得る膜作用性ポリマーは、エンドソーム溶解性と見なされる。細胞膜に対する膜作用性ポリマーの効果は、一過性であってもよい。ポリマーの膜作用は、膜に対するそのアフィニティーに由来し、これが二重層構造の変性または変形を引き起こす。膜作用性ポリマーは、合成または非天然両親媒性ポリマーであってもよい。膜作用性ポリマーは、インビトロ・トランスフェクション活性を有してもよい。膜作用性ポリマーは、陽イオン性、陰イオン性、両親媒性、両性、表面活性、またはこれらの組み合わせであってもよい。
【００４３】
ポリヌクレオチドまたは他の膜不浸透性分子の細胞への送達は、膜における孔の形成、またはエンドソームもしくはリソソーム機能の破壊を含めた、形質膜または内部小胞膜 (エンドソームまたはリソソームなど)を破壊するかまたは不安定化する、膜作用性ポリマーによって仲介される。
【００４４】
本明細書において用いられるように、膜作用性ポリマーは、HIV TATタンパク質由来のアルギニンリッチ・ペプチド、アンテナペディア・ペプチド、VP22ペプチド、トランスポータン、アルギニンリッチ人工ペプチド、低分子グアニジンリッチ人工ポリマー等の化合物に代表される、細胞浸透ペプチドまたはポリマーと称されるポリマーの種類とは別である。細胞浸透化合物は、外見上、エンドサイトーシスを要することなく、かつ膜の完全性を妨げることなく、いくつかの分子を、膜を渡って、脂質二重層の一方の側から脂質二重層のもう一方の側に輸送するようであるが、その機構は理解されておらず、かつ活性自体が疑われている。
【００４５】
エンドソーム溶解性ポリマー
エンドソーム溶解性ポリマーは、pHの変化に反応して、エンドソームの破壊もしくは溶解を引き起こすか、またはポリヌクレオチドもしくはタンパク質などの通常は膜不浸透性の化合物の、エンドソームもしくはリソソームなどの細胞内部膜封入小胞からの脱出を提供することが可能なポリマーである。エンドソーム放出は、エンドサイトーシスされたが、細胞膜を渡って拡散不能な非常に多様な分子の送達に重要である。エンドソーム溶解性ポリマーは、生理学的に適切なpH範囲 (通常pH 5.5〜8)に渡って、物理化学的特性におけるシフトを受ける。このシフトは、ポリマーの可溶性、他の化合物と相互作用する能力の変化、および疎水性または親水性におけるシフトであってもよい。例示的なエンドソーム溶解性ポリマーは、pH滴定可能基またはpH不安定な基もしくは結合を有してもよい。本明細書において用いられるように、pH滴定可能基は、生理学的条件下、すなわち4〜8のpH範囲で、pHに応じて水中でプロトンを可逆的に受容するかまたは供与する。pH滴定可能基は、4〜8の範囲のpKaを有し、かつこのpH範囲内で緩衝剤として作用する。したがって、pH滴定可能基は、エンドソームのより低いpH環境において、電荷を獲得するかまたは失う。酸-塩基滴定を行い、かつ基が4〜8のpH範囲内で緩衝するかどうかを実験的に決定することによって、生理学的pHで滴定可能な基を実験的に決定してもよい。このpH範囲内で緩衝を示し得る基の例には、限定されるわけではないが、カルボン酸、イミダゾール、N-置換イミダゾール、ピリジン、フェノール、およびポリアミンが含まれる。pH滴定可能基を持つポリマーは、いわゆるプロトンスポンジ効果によって、内部小胞を破壊し得る。したがって、マスキング剤がpH不安定な結合を介してポリマーに付着している、可逆的にマスキングされた膜作用性ポリマーは、エンドソーム溶解性ポリマーと見なしてもよい。
【００４６】
エンドソーム溶解性化合物のサブセットは、膜融合性ペプチドを含む膜融合性化合物である。膜融合性ペプチドは、細胞質へのオリゴマー性化合物などの薬剤のエンドソーム放出を促進し得る。膜融合性ペプチドは、酸性のpHにおいてコンホメーションを変化させ、エンドソーム膜を有効に不安定化し、それによってエンドソーム内容物の細胞質送達を増進すると考えられる。膜融合性ペプチドの例には、ポリミキシンB、インフルエンザHA2、GALA、KALA、EALA、メリチンおよびメリチン由来ペプチド、アルツハイマーβ-アミロイドペプチド等が含まれる。
【００４７】
ポリ両性電解質
ポリ両性電解質は、陰イオン性および陽イオン性の両モノマー単位を含有するポリマーである。より具体的には、本明細書において用いられるように、ポリ両性電解質は、複数の陰イオン性モノマーおよび複数の陽イオン性単位を含有する。ポリ両性電解質ポリマーは、任意で、非イオン性モノマー単位を含有してもよい。水性溶液において、ポリ両性電解質は、等電点付近で沈殿する。ポリ両性電解質は、ポリマー性モノマーを含む、陰イオン性および陽イオン性のモノマーを重合させることによって形成可能である。あるいは、ポリ両性電解質は、ポリマー上の荷電基のすべてではないが複数を修飾することによっても形成可能である。荷電基が可逆的に修飾される場合、可逆的ポリ両性電解質が形成される。
【００４８】
両親媒性
両親媒性またはアンフィフィリック（amphiphilic）ポリマーは、周知でありかつ当技術分野で認識され、かつ親水性 (極性、水溶性)および疎水性 (非極性、親油性、水不溶性)基または部分の両方を有する。親水性基は、定性的な用語で化学的部分が水を好むことを示す。典型的には、このような化学基は、水溶性であり、かつ水による水素結合供与体または受容体である。親水性基は荷電していてもまたは非荷電であってもよい。荷電基は、正に荷電しているか (陰イオン性)または負に荷電している (陽イオン性)かまたは両方であってもよい。両親媒性化合物は、ポリアニオン、ポリカチオン、双性イオン、またはポリ両性電解質であってもよい。親水性基の例には、以下の化学部分を持つ化合物が含まれる；炭水化物、ポリオキシエチレン、特定のペプチド、オリゴヌクレオチド、およびアミン、アミド、アルコキシアミド、カルボン酸、イオウ、またはヒドロキシルを含有する基。疎水性基は、定性的な用語で化学部分が水回避性であることを示す。典型的には、このような化学基は、水溶性でなく、かつ水素結合を形成しない傾向にある。親油性基は、脂肪、油、脂質、および非極性溶媒中に溶解し、かつ水素結合を形成する能力をほとんどまたはまったくない。炭化水素 (2つまたはそれより多い炭素原子を含有する)、特定の置換炭化水素、コレステロール、コレステロール誘導体、および特定のペプチドが、疎水性基の例である。本明細書において用いられるように、両親媒性ポリマーに関して、部分は、1つの共有結合が破壊され、かつ水素によって置換された場合に得られる分子と定義される。例えば、ブチルアミンにおいて、炭素と窒素結合の間の分解に水素での置換により、アンモニア (親水性)およびブタン (疎水性)が生じる。しかし、1,4-ジアミノブタンが窒素-炭素結合で開裂され、かつ水素で置換される場合には、生じる分子は再び、アンモニア (2x)およびブタンである。しかし、疎水性部分の形成は、2つの結合の切断を必要とするため、1,4-ジアミノブタンは、両親媒性とは見なされない。
【００４９】
天然存在ポリマーは、天然に見られ得るポリマーである。例には、ポリヌクレオチド、タンパク質、コラーゲン、および多糖 (デンプン、セルロース、グリコサミノグリカン、キチン、寒天、アガロース)が含まれる。天然ポリマーは、生物学的供給源から単離可能であるか、または合成であることができる。合成ポリマーは、「人による」化学プロセスによって配合されるかまたは製造され、かつ天然存在生物学的プロセスによって生成されない。非天然ポリマーは、天然存在 (動物または植物)物質またはモノマー (アミノ酸、ヌクレオチド、およびサッカリドなど)からは作られない合成ポリマーである。ポリマーは、完全にまたは部分的に天然、合成、または非天然であってもよい。
【００５０】
ポリマーは、1つまたは複数の不安定なまたは開裂可能な結合を有してもよい。不安定な結合が、生理学的条件下でまたは細胞生理学的条件下で開裂可能である場合、ポリマーは生体分解性である。開裂可能結合は、主鎖中または側鎖中のいずれにあってもよい。開裂可能結合が主鎖に存在する場合、結合の開裂は、ポリマー長の減少および2つまたはそれより多い分子の形成を生じる。例えば、不安定な結合を介して、より低分子のポリビニルエーテルポリマーを連結して、大きなポリビニルエーテルポリマーを形成してもよい。開裂可能結合が側鎖中に存在する場合、結合の開裂は、ポリマーからの側鎖原子の喪失を生じる。
【００５１】
ある種類の両親媒性ポリビニルランダムコポリマーが本明細書に開示される。ポリビニルコポリマーは、2つ、3つ、またはそれより多い異なるモノマーから合成されてもよい。好ましいモノマーは、荷電ビニルエーテル、保護されたイオン性基を含有するビニルエーテル、フタルイミドで保護されたアミンビニルエーテル、アシルビニルエーテル、アルキルビニルエーテル、より低次のアルキルビニルエーテル、より高次のアルキルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル、ドデシルビニルエーテル、オクタデシルビニルエーテル、コレステロールビニルエーテル、および他の炭化水素含有疎水性ビニルエーテルを含むリストより選択可能である。
【００５２】
特に有用なポリマーの種類は、フタルイミドモノマー、低分子疎水性モノマー、および高分子疎水性モノマーの3つのモノマーを用いて重合させた、アミン含有ポリビニルエーテルランダムコポリマーを含む。フタルイミドモノマーの脱保護は、アミンモノマーを生じる。低分子疎水性モノマーは、2〜6の炭素原子を含む炭素-水素鎖を含む。高分子疎水性モノマーは、約10〜約22の炭素原子、または約12〜約18の炭素原子を含む炭素-水素鎖を含む。中鎖疎水性モノマーは、約6〜約10の炭素原子を含む炭素-水素鎖を含む。好ましいアミノポリビニルエーテルポリマーは、アミノ/ブチル/オクタデシルポリビニルエーテルまたはアミノ/ブチル/ドデシルポリビニルエーテルを含む。
【００５３】
ポリ(ビニルエーテル)ランダムコポリマーの生物物理的特性は、選択した特定のモノマー、ポリマー内に取り込まれる比、およびポリマーのサイズによって決定される。重合反応において、モノマーの供給比を改変することによって、異なるポリマーを作製可能である。ポリマー中に取り込まれるモノマーの比はモノマーの供給比と同じであることができるが、比は異なることができる。モノマーが供給比でまたは異なる比で取り込まれるかいずれであっても、モノマーの供給比を改変して、所望のモノマー取り込み比を達成することが可能である。好ましいアミノポリビニルエーテルは、水溶性膜作用性アミン/ブチル/オクタデシルまたはアミン/ブチル/ドデシルランダムトリポリマーである。類似のアミンおよびポリアミン由来の疎水性モノマー内容物、例えば、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリビニルアミン、およびポリアリルアミン、またはポリビニルアルコールなどの他のポリマーを用いて、これらのポリマーの側鎖の修飾を通じて、ポリマーを合成することが可能である。
【００５４】
本発明の好ましい膜作用性ポリマーは、1 mg/mlまたはそれより高い濃度で水溶性である。本発明の好ましい膜作用性ポリマーは、表面活性である。本発明の膜作用性ポリマーは、好ましくは約5 kDa〜約100 kDaであり、より好ましくは約7.5 kDa〜約50 kDaであり、かつより好ましくは約10 kDa〜約30 kDaである。
【００５５】
マスキング剤
細胞外部から細胞質にポリヌクレオチドを送達可能なポリマーは、しばしば毒性であるか、またはインビボで乏しい生体内分布を有する。したがって、毒性または乏しい生体内分布を引き起こすポリマーの特性をマスキングすることが必要である。これらの特性をマスキングするためにポリマーを修飾することはまた、ポリマーのトランスフェクション活性または膜作用を不活性化し得るため、生理学的に可逆的な連結を介して、マスキング剤をポリマーに連結する。連結の開裂は、遮蔽されたかまたはマスキングされたポリマーの特性を回復する。
【００５６】
本明細書において用いられるように、マスキング剤は、ポリマーに連結された場合に、ポリマーの1つまたは複数の特性 (生物物理的または生化学的特性)を遮蔽するか、阻害するかまたは不活性化する分子を含む。マスキング剤はまた、ポリマーがマスキング剤の非存在下で持たない活性または機能をポリマーに付加し得る。マスキングされてもよいポリマー特性には、膜作用、エンドソーム溶解活性、電荷、有効電荷、トランスフェクション活性、血清相互作用、細胞相互作用、および毒性が含まれる。マスキング剤はまた、生理学的条件下で、ポリヌクレオチド-ポリマー結合体の凝集を阻害するかまたは防止し得る。本発明のマスキング剤は、立体安定化剤、ターゲティング基、および電荷修飾剤からなる群より選択可能である。多数のマスキング剤を単一のポリマーに可逆的に連結してもよい。ポリマーの特性を不活性化するため、複数のマスキング剤をポリマーに連結することが必要である可能性もある。十分な数のマスキング剤をポリマーに連結して、不活性化の所望のレベルを達成する。マスキング剤の付着によるポリマー修飾の所望のレベルは、適切なポリマー活性アッセイ法を用いて、容易に決定される。例えば、ポリマーが所定のアッセイ法において膜作用を所持する場合、十分なレベルのマスキング剤をポリマーに連結して、そのアッセイ法において膜作用の阻害の所望のレベルを達成する。十分な数のマスキング剤をポリマーに可逆的に連結して、生理学的条件下で、ポリマーの凝集を阻害してもよい。複数種のマスキング剤を用いてもよい。例えば、立体安定化剤およびターゲティング基の両方をポリマーに連結してもよい。立体安定化剤およびターゲティング基はまた、電荷修飾剤としても機能してもよいしまたはしなくてもよい。本発明のマスキング剤は、ポリマーに可逆的に連結される。本明細書において用いられるように、連結の逆転がマスキングされたポリマーの活性の回復を生じる場合、マスキング剤は、ポリマーに可逆的に連結されている。マスキング剤は、ポリマー上の反応基との可逆的共有結合の形成を通じて、ポリマーに連結される。反応基は、アミン、アルコール、チオール、ヒドラジド、アルデヒド、カルボキシルなどを含む群より選択可能である。ポリマー上の反応基または荷電基の1つからすべてまでを可逆的に修飾してもよい。1つの態様において、少なくとも2つのマスキング剤がポリマーに可逆的に連結される。別の態様において、マスキング剤は、ポリマー上の反応基の約20%、30%、40%、50%、60%、70%、または80%に可逆的に連結される。別の態様において、マスキング剤は、ポリマー上の荷電基の約20%、30%、40%、50%、60%、70%、または80%に可逆的に連結される。別の態様において、ポリマー上の荷電基に対する、ポリマーに可逆的に連結されたマスキング剤の割合は、約20%、30%、40%、50%、60%、70%、または80%である。
【００５７】
本明細書において用いられるように、ポリマーの1つまたは複数の特性が1つまたは複数のマスキング剤の付着によって阻害されるかまたは不活性化される場合には、ポリマーはマスキングされている。ポリマーにマスキング剤を連結している結合の開裂が、マスキングされたポリマーの特性の回復を生じる場合には、ポリマーは、可逆的にマスキングされている。
【００５８】
本発明の好ましいマスキング剤は、水溶液中で、ポリマーを修飾 (ポリマーと可逆的結合を形成)可能である。特に有用なのは、R1がメチル (-CH3) であり、かつR2がプロピオン酸基 (-(CH2)2CO2H) またはその酸に由来するエステル/アミドである、無水マレイン酸誘導体である。
【００５９】
本明細書において用いられるように、立体安定化剤は、天然、合成、または非天然非イオン性親水性ポリマーであり、このポリマーが、立体安定化剤を含有しないポリマーと比べて、それが付着されるポリマーの分子内または分子間相互作用を防止する。立体安定化剤は、ポリマーが静電相互作用に関与するのを妨げる。静電相互作用は、正および負電荷間の引力による、2つまたはそれより多い物質の非共有結合である。立体安定化剤は、血液構成要素との相互作用、したがって、オプソニン化、食作用および細網内皮系による取り込みを阻害し得る。したがって、立体安定化剤は、付着した分子の循環時間を増加させ得る。立体安定化剤はまた、ポリマーの凝集も阻害し得る。好ましい立体安定化剤は、ポリエチレングリコール (PEG) およびPEG誘導体である。本明細書において用いられるように、好ましいPEGは、約1〜500のエチレングリコールモノマー、2〜20のエチレングリコールモノマー、5〜15のエチレングリコールモノマー、または約10のエチレングリコールモノマーを有してもよい。本明細書において用いられるように、好ましいPEGはまた、約85〜20,000ダルトン (Da)、約200〜1000 Da、約200〜750 Da、または約550 Daの分子量平均を有してもよい。他の適切な立体安定化剤は、多糖、デキストラン、シクロデキストリン、ポリ(ビニルアルコール)、ポリビニルピロリドン、2-ヒドロキシプロピルメタクリレート (HPMA)、および水溶性セルロースエーテルを含む群より選択可能である。
【００６０】
ターゲット細胞もしくは組織、または特定の細胞種に、ポリマーをターゲティングするかまたは送達するために、ターゲティング基またはリガンドを用いる。ターゲティング基は、ターゲット細胞と分子の会合を増進する。したがって、ターゲティング基は、付着している結合体の薬物動態学的または生体内分布特性を増進して、結合体の細胞分布および細胞取り込みを改善することも可能である。1つまたは複数のターゲティング基を、直接またはスペーサーを用いた連結を介してのいずれかで、膜作用性ポリマーに連結してもよい。リガンドなどのターゲティング基の細胞または細胞受容体への結合は、エンドサイトーシスを開始し得る。ターゲティング基は、一価、二価、三価、四価またはより高次の価であってもよい。ターゲティング基は、細胞表面分子に対するアフィニティーを持つ化合物、細胞受容体リガンド、ならびに細胞表面分子に対するアフィニティーを持つ抗体、抗体断片、および抗体模倣体を含む群より選択可能である。好ましいターゲティング基は、細胞受容体リガンドを含む。薬物および遺伝子を、細胞におよび特定の細胞受容体にターゲティングするため、多様なリガンドが用いられてきている。細胞受容体リガンドは、炭水化物、グリカン、サッカリド (限定されるわけではないが、ガラクトース、ガラクトース誘導体、マンノース、およびマンノース誘導体を含む)、ビタミン、フォレート、ビオチン、アプタマー、およびペプチド (限定されるわけではないが、RGD含有ペプチド、インスリン、EGF、およびトランスフェリンを含む)を含む群より選択可能である。ターゲティング基の例には、アシアロ糖タンパク質またはガラクトース残基を用いることによってアシアロ糖タンパク質受容体をターゲティングするものが含まれる。例えば、肝細胞は、ASGP受容体を含有する。したがって、ガラクトース含有ターゲティング基を用いて、肝細胞をターゲティングしてもよい。ガラクトース含有ターゲティング基には、限定されるわけではないが、ガラクトース、N-アセチルガラクトサミン、オリゴ糖、およびサッカリドクラスター (Tyr-Glu-Glu-(アミノヘキシルGalNAc)3、リジンに基づくガラクトースクラスター、およびコランに基づくガラクトースクラスターなど)が含まれる。さらに適切な結合体には、アシアロ糖タンパク質受容体 (ASGP-R)上に見られる炭水化物認識ドメイン(CRD)に結合可能なオリゴ糖が含まれ得る。オリゴ糖および/または炭水化物複合体を含有する結合体部分の例は、米国特許第6,525,031号に提供される。
【００６１】
本明細書において用いられるように、電荷修飾剤は、ポリマー上のイオン性基の電荷を改変する基である。電荷修飾剤は、ポリマー上の荷電基を中和するか、またはポリマーイオンの電荷を正から負にもしくは負から正に逆転させることができる。ポリイオンの電荷修飾は、ポリイオンの電荷を減少させるか、反対の電荷のポリイオンを形成するか、またはポリ両性電解質を形成することができる。電荷修飾はまた、所望の正味電荷またはゼータ電位を持つポリマーを形成するのにも使用可能である。ポリヌクレオチドのインビボ送達には、ほぼ中性の正味電荷またはゼータ電位を持つ結合体が好ましい。好ましい電荷修飾剤は、荷電されたまたはイオン性の基を可逆的に修飾する。可逆的電荷修飾剤は、CDM、DM、CDM-チオエステル、CDM-マスキング剤、CDM-立体安定化剤、CDM-リガンド、CDM-PEG、およびCDM-ガラクトースを含む群より選択可能である。
【００６２】
ゼータ電位は、懸濁中にある任意の粒子によって示される物理的特性であり、かつ表面電荷に緊密に関連する。水性媒体中、試料のpHは、ゼータ電位に影響を及ぼす最も重要な要因の1つである。電荷が塩基/酸のプロトン化/脱プロトン化に基づく場合、電荷はpHに依存する。したがって、意味があるものであるためには、ゼータ電位価には、溶液状態、特にpHが含まれなければならない。典型的な粒子に関して、ゼータ電位の大きさは、コロイド系の潜在的安定性の指標を提供する。懸濁中のすべての粒子が大きな負のまたは正のゼータ電位を有する場合、これらは互いに反発する傾向があり、かつ粒子が一緒に集まる傾向がないであろう。しかし、粒子が低いゼータ電位価を有する場合、粒子が一緒に集まり、かつ凝集するのを妨げる力はまったくないであろう。典型的な粒子に関する安定および不安定懸濁物の間の一般的な境界線は、一般的に、+30または-30 mVのいずれかに取られる。+30 mVより正であるかまたは-30 mVより負であるゼータ電位を持つ粒子は、通常、安定と見なされる。本発明者らは、本明細書において、CDMでマスキングされたポリヌクレオチド-ポリマー結合体が、生理学的塩およびpH 9では+30〜-30 mVの間のゼータ電位を有するにもかかわらず安定である< 20 nmまたは< 10 nmの小さい粒子 (動的光散乱、分析的超遠心、または原子間力顕微鏡によって測定した場合)を形成できることを示す。
【００６３】
マスキング剤または電荷修飾剤の付着によって、本発明のポリヌクレオチド-ポリマー結合体の正味電荷またはゼータ電位を調節してもよい。ポリマー電荷、特に正電荷は、血清構成要素または非ターゲット細胞との望ましくない相互作用を生じ得る。立体安定化剤で電荷を遮蔽するかまたは電荷を修飾することによって、結合体は、中性近傍の見かけの表面電荷を持つように容易に作製可能である。ポリマー上の荷電基を修飾することによって、pH 9で測定したゼータ電位が、+30〜-30 mVの間、+20〜-20 mVの間、+10〜-10 mVの間、または+5〜-5 mVの間である、血清安定性粒子を作製可能である。pH 7では、結合体の正味電荷は、pH 9でよりも、より正であると予期される。正味電荷または表面電荷は、インビボでのポリヌクレオチド複合体の送達において、重要な要因である。
【００６４】
不安定連結
連結またはリンカーは、1つまたは複数の共有結合を介して、関心対象の1つの化学基またはセグメントを、関心対象の別の化学基またはセグメントに連結する、2つの原子間の連結である。例えば、連結は、ポリヌクレオチドまたはマスキング剤をポリマーに連結することも可能である。連結の形成は、2つの別個の分子を連結して単一の分子にすることも可能であるか、または同じ分子中の2つの原子を連結可能である。連結は、電荷が中性であってもよいし、または正もしくは負電荷を所持してもよい。可逆的または不安定な連結は、可逆的または不安定な結合を含有する。連結には、2つの連結された原子間の距離を増加させるスペーサーが任意で含まれてもよい。スペーサーは、連結に柔軟性および/または長さをさらに付加し得る。スペーサーには、限定されるわけではないが、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、アラルキニル基が含まれてもよく、これらの各々は、1つまたは複数のヘテロ原子、および複素環を含有してもよい。スペーサー基は、当技術分野に周知であり、かつ先行するリストは、本発明の範囲を限定することを意味しない。
【００６５】
可逆的または不安定な結合は、同じ分子中の他の共有結合を切断するかまたは開裂しないであろう条件下で、選択的に切断されるかまたは開裂されることが可能である水素原子への共有結合以外の共有結合である。より具体的には、可逆的または不安定な結合は、適切な条件下で、同じ分子中の他の不安定でない共有結合よりも、より安定でない (熱力学的に)またはより迅速に切断される (力学的に)共有結合である。分子内の不安定な結合の開裂は、2つまたはそれより多い分子の形成を生じ得る。当業者には、結合の開裂または不安定性は、一般的に、結合開裂の半減期 (t1/2)、または結合の半分が開裂されるのに必要な時間に関して論じられる。直交性結合は、一方を開裂し、かつ他方を開裂しない条件下で開裂される結合である。定義される環境における開裂の半減期が、互いに10倍またはそれより多く異なる場合、2つの結合は直交性であると見なされる。したがって、可逆的または不安定な結合は、分子中の他の結合よりも、より迅速に、選択的に開裂可能な結合を含む。
【００６６】
電子供与基または求引基の存在は、電子供与基または求引基の電子的影響が、結合開裂の速度に影響を及ぼすように、分子中、開裂可能結合の十分に近傍に位置していてもよい。電子求引基 (EWG)は、別の原子、結合、または分子の部分から電子密度を求引する原子または分子の部分であり、ここで、関心対象の結合 (供与体)に対する電子密度の減少がある。電子供与基 (EDG)は、別の原子、結合、または分子の部分に電子を供与する原子または分子の部分であり、ここで、関心対象の結合 (受容体)に対する電子密度の増加がある。電子求引/供与基は、影響を達成するために十分に近接している必要があり、これは典型的には、破壊される結合の約3結合以内である。
【００６７】
結合開裂速度を増加させる別の戦略は、不安定な結合と同じ分子内に官能基を取り込むことである。分子内での官能基の互いの近接性は、分子間反応に比べて、分子内反応が好ましいようなものであってもよい。分子内での官能基の互いの近接性は、事実上、官能基の局所的により高い濃度を生じ得る。一般的に、分子内反応は、分子間反応よりはるかに迅速である。5および6原子離れた反応基は、5および6員環遷移状態を形成するため、特に不安定な結合を形成し得る。この例には、エステル、カルボン酸および炭酸エステル、リン酸エステル、チオールエステル、酸無水物、またはアミドを作製するために、一緒に反応する同じ分子中にカルボン酸誘導体 (酸、エステル、アミド)およびアルコール、チオール、カルボン酸またはアミンを有するものが含まれる。立体相互作用もまた、結合の開裂速度を変化させ得る。
【００６８】
適切な条件は、不安定な結合のタイプによって決定され、かつ有機化学において周知である。不安定な結合は、pH、酸化もしくは還元条件もしくは剤、温度、塩濃度、酵素の存在、または添加される剤の存在に感受性であってもよい。例えば、特定のペプチド、エステル、またはサッカリドリンカーは、適切な酵素の存在下で開裂可能である。別の例において、pHの増加または減少が、pH不安定な結合に適切な条件であり得る。さらに別の例において、酸化条件は、酸化的に不安定な結合に適切な条件であり得る。さらに別の例において、還元条件は、還元的に不安定な結合に適切な条件であり得る。例えば、2つのアルキルチオールから構築されたジスルフィドは、炭素-炭素結合の開裂を伴わずに、チオールの存在下での還元によって切断されることが可能である。この例において、炭素-炭素結合は、還元条件に対して不安定性でない。
【００６９】
不安定基を含有する分子の化学的構成要素を改変することによって、不安定基が転換を受ける速度を調節可能である。例えば、不安定基近傍に特定の化学部分 (例えば電子受容体または供与体)を付加することは、化学転換が起こる特定の条件 (例えばpH)に影響を及ぼし得る。
【００７０】
分子は、1つまたは複数の可逆的または不安定な結合を含有し得る。複数の可逆的または不安定な結合が分子中に存在し、かつ可逆的または不安定な結合のすべてが同じタイプである (同じ条件下で、ほぼ同じ速度で開裂される)場合、分子は多数の可逆的または不安定な結合を含有する。複数の可逆的または不安定な結合が分子に存在する場合、かつ可逆的または不安定な結合が異なるタイプである (不安定性に適した条件、または不安定な結合の化学的官能基に基づいて)場合、分子は、直交性の可逆的または不安定な結合を含有する。直交性の可逆的または不安定な結合は、1つのタイプの可逆的または不安定な結合が開裂される一方、第二のタイプの可逆的結合が開裂されないかまたは切断されないままにしておく能力を提供する。言い換えると、他方が無傷の (intact)ままである条件下で、一方が開裂され得る場合、2つの不安定な結合は、互いに直交性である。直交性の保護基は、有機化学において周知であり、かつ直交性結合を含む。
【００７１】
本明細書において用いられるように、生理学的に不安定な結合は、哺乳動物体内で通常出会う条件または出会うものに類似の条件の下で開裂可能である不安定な結合である。生理学的に不安定な連結基は、これらが特定の生理学的条件中に存在する場合、化学転換 (例えば開裂)を受けるように選択される。
【００７２】
本明細書において用いられるように、細胞生理学的に不安定な結合は、哺乳動物細胞内条件下で開裂可能な不安定な結合である。哺乳動物細胞内条件には、哺乳動物細胞中で見られるまたは出会うものに類似の、pH、温度、酸化または還元条件または剤、および塩濃度などの化学的条件が含まれる。哺乳動物細胞内条件にはまた、タンパク質分解または加水分解酵素由来などの哺乳動物細胞中に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。細胞生理学的に不安定な結合はまた、薬学的に許容される外因性の薬剤の投与に反応して開裂されることも可能である。45分間未満の半減期で開裂される生理学的に不安定な結合は、非常に不安定と見なされる。15分間未満の半減期で開裂される生理学的に不安定な結合は、極端に不安定と見なされる。
【００７３】
化学転換 (不安定な結合の開裂)は、細胞への薬学的に許容される薬剤の添加によって開始可能であるか、または不安定な結合を含有する分子が適切な細胞内および/または細胞外環境に到達した場合に、自発的に起こることが可能である。例えば、pH不安定な結合は、分子が酸性化されたエンドソーム中に進入した場合に開裂され得る。したがって、pH不安定な結合は、エンドソーム開裂可能結合と見なされ得る。酵素開裂可能結合は、エンドソームもしくはリソソーム中、または細胞質中に存在するものなどの酵素に曝露された場合に開裂され得る。ジスルフィド結合は、分子が細胞質のより還元性の環境に進入した場合に開裂され得る。したがって、ジスルフィドは、細胞質開裂可能結合と見なされ得る。
【００７４】
pH不安定な結合：
本明細書において用いられるように、pH不安定な結合は、酸性条件下 (pH<7)で選択的に切断される不安定な結合である。細胞エンドソームおよびリソソームが7未満のpHを有するため、このような結合はまた、エンドソーム的に不安定な結合とも称され得る。pH不安定という用語には、pH不安定な結合、非常にpH不安定な結合、および極端にpH不安定な結合が含まれる。pH不安定な結合は、以下を含む群より選択可能である。
a) 酸性環境中 (7未満で4より大きいpH)で不安定であり、ジオールおよびケトンを形成する、ケタール、
b) 酸性環境中 (7未満で4より大きいpH)で不安定であり、ジオールおよびアルデヒドを形成する、アセタール、
c) 酸性環境中 (7未満で4より大きいpH)で不安定であり、アミンおよびアルデヒドまたはケトンを形成する、イミンまたはイミニウム、
d) 酸性条件下で不安定なケイ素-酸素-炭素連結、
e) ケイ素-窒素 (シラザン)連結、および
f) ケイ素-炭素連結 (アリールシラン、ビニルシラン、およびアリルシラン)。
g) 無水マレイン酸誘導体およびアミンから合成されるマレアマートアミド結合
h) オルトエステル
i) ヒドラゾン
j) 酸触媒加水分解を受けるように設計された活性化カルボン酸誘導体 (エステル、アミド)。
k) ビニルエーテル
【００７５】
有機シランは、(ケイ素-酸素-炭素連結の)調製が容易であり、かつ酸性条件下で保護基の除去が容易であることの両方から、有機合成において、酸素保護基として長く利用されてきている。例えば、シリルエーテルおよびシリルエノールエーテルはどちらもこのような連結を所持する。ケイ素-酸素-炭素連結は、酸性条件下で加水分解されて、シラノールおよびアルコール (またはエノール)を形成しやすい。ケイ素原子およびアルコール炭素上の置換はどちらも、立体および電子的影響によって、加水分解速度に影響を及ぼし得る。これによって、有機シラン、アルコール、または有機シランおよびアルコールの両方のいずれかに対する置換を変化させて、所望の影響を促進することにより、ケイ素-酸素-炭素連結の加水分解速度を調整することが可能になる。さらに、アミンまたはカルボキシレートなどの荷電または反応基をケイ素原子に連結して、これが、不安定な化合物に電荷および／または反応性を与えることも可能である。
【００７６】
シラザンの加水分解は、シラノールおよびアミンの形成を導く。シラザンは、本質的に、ケイ素-酸素-炭素連結よりも加水分解により感受性であるが、加水分解速度は、酸性条件下で増加する。ケイ素原子およびアミン上の置換はどちらも、立体および電子的影響によって、加水分解速度に影響を及ぼし得る。これによって、ケイ素またはアミンのいずれかに対する置換を変化させて、所望の影響を促進することにより、シラザンの加水分解速度を調整することが可能になる。
【００７７】
pH不安定な結合の別の例は、酸不安定性エノールエーテル結合の使用である。この不安定な結合が開裂される速度は、形成されるカルボニル化合物の構造および放出されるアルコールに応じる。例えば、β-ハロエーテルから合成可能なエチルイソプロペニルエーテルの類似体は、pH 5でおよそ2分間の半減期を有する。フェノールエーテルから合成可能なエチルシクロヘキセニルエーテルの類似体は、pH 5でおよそ14分間の半減期を有する。
【００７８】
無水物とアミンの反応は、アミドおよび酸を形成する。典型的には、逆反応 (無水物およびアミンの形成)は、非常に緩慢であり、かつエネルギー的に好ましくない。しかし、無水物が環状無水物である場合、アミンとの反応は、アミドおよび酸が同じ分子中にある、アミド酸である分子を生じる。同じ分子中の両反応基 (アミドおよびカルボン酸)の存在は、逆反応を加速する。特に、一級アミンの、無水マレイン酸および無水マレイン酸誘導体、マレアミド酸との産物は、非環状類似体よりも1 x 109〜1 x 1013倍迅速に、アミンおよび無水物に戻る (Kirby 1980)。
【００７９】
アミドおよび酸を形成するためのアミンと無水物の反応
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【００８０】
アミド酸を形成するためのアミンと環状無水物の反応
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【００８１】
アミンおよび無水物を形成するアミド酸の開裂は、pH依存性であり、かつ酸性pHで非常に加速される。このpH依存性反応性を利用して、可逆的pH感受性結合およびリンカーを形成することも可能である。シス-アコニット酸がこのようなpH可逆的リンカー分子として用いられてきている。γ-カルボキシレートが、分子に最初にカップリングする。第二の工程において、αまたはβカルボキシレートのいずれかが第二の分子にカップリングして、2つの分子のpH感受性カップリングを形成する。このリンカーのpH 5での開裂の半減期は、8〜24時間の間である。
【００８２】
無水シス-アコニット酸および無水マレイン酸の構造
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【００８３】
開裂が起こるpHは、不安定な部分に化学構成要素を付加することによって調節される。マレアミン酸からアミンおよび無水マレイン酸への変換速度は、無水マレイン酸系の置換 (R2およびR3)に強く依存する。R2がメチルである場合、R2およびR3が水素である場合よりも、変換速度は50倍高い。R2およびR3の両方にアルキル置換がある場合 (例えば、2,3-ジメチルマレイン酸無水物)、速度は劇的に増加して、非置換無水マレイン酸より10,000倍速い。2,3-ジメチルマレイン酸無水物でのアミンの修飾によって形成されるマレアマート結合は、pH 5で4〜10分間の間の半減期で開裂されて、無水物およびアミンを回復する。R2およびR3が水素より大きい基であれば、アミンおよび無水物へのアミド-酸変換速度は、R2および/またはR3が水素である場合よりも速いであろう。
【００８４】
非常にpH不安定な結合：
非常にpH不安定な結合は、pH 5で45分間未満の開裂半減期を有する。非常にpH不安定な結合の構築は、化学分野で周知である。
【００８５】
極端にpH不安定な結合：
極端にpH不安定な結合は、pH 5で15分間未満の開裂半減期を有する。極端にpH不安定な結合の構築は、化学分野で周知である。
【００８６】
ポリヌクレオチドのポリマーへの連結
細胞にポリヌクレオチドを送達するための先の方法の大部分は、陽イオン性ポリマーまたは陽イオン性脂質などの陽イオン性送達剤と陰イオン性核酸の複合体化に依存している。より大きいポリヌクレオチド、例えばプラスミドとの静電複合体は、生理学的溶液中で凝集して、かつ大きくなる、すなわち>500 nmになる傾向がある。より小さいポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドは、サイズが小さいため、潜在的な送達剤と不安定な静電複合体を形成する。ポリヌクレオチドをパッケージングするためのより有効な方法は、ポリヌクレオチドを送達ビヒクルに共有結合させることである。しかし、ポリマーへの付着は、細胞におけるポリヌクレオチドの活性を阻害し得る。本発明者らは、ポリヌクレオチドが細胞に送達された後に切断される可逆的リンカーを介して、ポリマーにポリヌクレオチドを付着させることによって、インビボで、機能的に活性であるポリヌクレオチドを細胞に送達することが可能であることを見出した。可逆的リンカーは、特定の生理学的条件 (例えば細胞質の還元性環境)に存在する場合に、化学転換 (例えば開裂)を受けるように、選択される。送達または膜作用性ポリマーへのポリヌクレオチドの付着は、インビボで細胞へのポリヌクレオチドの送達を増進する。可逆的結合の開裂によるポリマーからポリヌクレオチドの放出は、活性のための適切な細胞構成要素とポリヌクレオチドとの相互作用を促進する。
【００８７】
ポリヌクレオチドに加えて、他の膜不浸透性分子または低い膜浸透性を持つ分子の他の送達が、記載するポリ結合体送達ビヒクルを用いて、インビボで細胞に送達可能である。膜作用性ポリマーへの可逆的付着に適した分子には、タンパク質、抗体、抗体断片、転写因子、小分子薬物、抗癌薬、および転写に影響を及ぼすものを含めた他の合成分子が含まれる。
【００８８】
膜作用性ポリマーへの膜不浸透性分子の付着は、適切なサイズのインビボ送達ビヒクルの形成を可能にする。記載する分子結合体は、本質的にポリマー性であり、かつ他のポリマーで観察されるものと類似のサイズおよびターゲティング特性を有する。管内 (intravascular) (全身)送達に関して、ビヒクルは、関心対象の実質細胞に到達するために内皮バリアを横断可能である必要がある。最大の内皮窓 (内皮バリア中の穴)は、肝臓に存在し、かつ約100 nmの平均直径を有する。他の臓器中の経上皮孔は、はるかにより小さい。例えば、筋内皮は、半径4 nmの多数の小さい孔を有し、かつ半径20〜30 nmの少数の大きい孔を有する。ポリヌクレオチド送達ビヒクルのサイズもまた、細胞取り込みプロセスに重要である。エンドサイトーシスを通じた細胞内在化は、細胞内小胞のサイズである直径約100 nmの複合体に限定されると考えられる。記載する結合体は、100 nm未満、より好ましくは50 nM未満、かつより好ましくは20 nM未満または10 nm未満である。
【００８９】
腎限外ろ過は、血液から親水性タンパク質、ポリマーおよびポリマー-タンパク質結合体を排除する主要な経路の1つである。このプロセスに影響を及ぼすパラメーターの中に、化学組成、サイズ、電荷がある。約70 kDaより大きい球状タンパク質は、腎限外ろ過によるクリアランスから大部分除外される。PEGなどの立体安定化剤の結合体化は、したがって、付着するポリマーの有効分子サイズを増加させることによって、腎クリアランスを減少させる。8 kDaより小さい分子量のPEGの限外ろ過は制限されない一方、8〜30 kDaの範囲のPEGの限外ろ過は、分子サイズに支配される。30 kDaを超える分子量では、PEG排除は劇的に減少する。このため、全体のサイズが約10 kDaより大きい、約20 kDaより大きい、または約30 kDaより大きい、マスキングされたポリマー-ポリヌクレオチド結合体が好ましい。ポリマー分子量の増加は、腎限外ろ過の減少に加えて、受動的浸透増進および滞留機構によって、浸透可能組織、例えば腫瘍への集積を促進し得る。
【００９０】
ポリヌクレオチド
ポリヌクレオチド、または核酸もしくはポリ核酸という用語は、少なくとも2つのヌクレオチドを含有するポリマーを指す技術用語である。ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドポリマーのモノマー単位である。120未満のモノマー単位を持つポリヌクレオチドは、しばしば、オリゴヌクレオチドと呼ばれる。天然核酸は、デオキシリボース-またはリボース-リン酸主鎖を有する。非天然または合成ポリヌクレオチドは、インビトロまたは細胞不含系において重合し、かつ同じまたは類似の塩基を含有するが、天然のリボースまたはデオキシリボース-リン酸主鎖以外のタイプの主鎖を含有してもよい。当技術分野に公知の任意の技術を用いて、ポリヌクレオチドを合成してもよい。当技術分野に公知のポリヌクレオチド主鎖には、PNA (ペプチド核酸)、ホスホロチオエート、ホスホロジアミデート、モルホリノ、および天然核酸のリン酸主鎖の他の変異体が含まれる。塩基には、プリンおよびピリミジンが含まれ、これには、天然化合物、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、および天然類似体がさらに含まれる。プリンおよびピリミジンの合成誘導体には、限定されるわけではないが、ヌクレオチド上に新規反応基、例えば、限定されるわけではないが、アミン、アルコール、チオール、カルボキシレートおよびアルキルハロゲン化物を配置する修飾が含まれる。塩基という用語は、DNAおよびRNAの公知の塩基類似体の任意のものを含む。ポリヌクレオチドという用語には、デオキシリボ核酸 (DNA)およびリボ核酸 (RNA)、ならびにDNA、RNAおよび他の天然および合成ヌクレオチドの組み合わせが含まれる。
【００９１】
DNAは、cDNA、インビトロ重合DNA、プラスミドDNA、プラスミドDNAの一部、ウイルス由来の遺伝物質、直鎖DNA、ベクター (P1、PAC、BAC、YAC、および人工染色体)、発現ベクター、発現カセット、キメラ配列、組換えDNA、染色体DNA、オリゴヌクレオチド、アンチセンスDNA、またはこれらの群の誘導体の形であってもよい。RNAは、メッセンジャーRNA (mRNA)、インビトロ重合RNA、組換えRNA、オリゴヌクレオチドRNA、転移RNA (tRNA)、低分子核内RNA (snRNA)、リボソームRNA (rRNA)、キメラ配列、アンチセンスRNA、干渉RNA、低分子干渉RNA (siRNA)、マイクロRNA (miRNA)、リボザイム、外部ガイド配列、低分子非メッセンジャーRNA (snmRNA)、非翻訳RNA (utRNA)、snoRNA (24量体、アンチセンス機構によって作用する修飾snmRNA)、極小非コードRNA (tncRNA)、低分子ヘアピンRNA (shRNA)、またはこれらの群の誘導体の形であってもよい。さらに、DNAおよびRNAは、一本鎖、二重鎖、三重鎖、または四重鎖であってもよい。二重鎖、三重鎖、および四重鎖ポリヌクレオチドは、RNAおよびDNA両方、または天然および/または合成核酸の他の組み合わせを含有してもよい。
【００９２】
ブロッキングポリヌクレオチドは、DNAまたはRNAの機能または発現に干渉するポリヌクレオチドである。ブロッキングポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されないが、細胞におけるその存在または発現は、細胞遺伝子またはRNAの発現または機能を改変する。ブロッキングポリヌクレオチドは、配列特異的な様式で、特定の細胞RNA、通常はmRNAの分解を引き起こすか、またはその機能もしくは翻訳を阻害する。したがって、RNAの阻害は、RNAが転写される遺伝子の発現を有効に阻害可能である。本明細書において用いられるように、ブロッキングポリヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、RNA干渉ポリヌクレオチド、dsRNA、siRNA、miRNA、hRNA、リボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、外部ガイド配列 (US 5,962,426)、snoRNA、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、ブロッキングポリヌクレオチドをコードするRNAポリメラーゼIIに転写されるDNA、ブロッキングポリヌクレオチドをコードするRNAポリメラーゼIIIに転写されるDNAを含むリストより選択可能である。ブロッキングポリヌクレオチドは、DNA、RNA、RNAおよびDNAの組み合わせであってもよく、または非天然もしくは合成ヌクレオチドを含有してもよい。
【００９３】
ブロッキングポリヌクレオチドをインビトロで重合してもよく、これらは、組換えであってもよいし、キメラ配列を含有してもよいし、またはこれらの群の誘導体であってもよい。ブロッキングポリヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、合成ヌクレオチド、またはターゲットRNAもしくは遺伝子が阻害されるような任意の適切な組み合わせであってもよい。
【００９４】
RNA干渉 (RNAi)ポリヌクレオチドは、配列特異的な様式で、導入遺伝子のメッセンジャーRNA (mRNA)転写物を分解するか、またはその翻訳を阻害する、哺乳動物細胞のRNA干渉経路機構との相互作用を通じたRNA干渉を誘導可能な分子である。2つの主なRNAiポリヌクレオチドは、低分子 (または短分子)干渉RNA (siRNA)およびマイクロRNA (miRNA)である。しかし、他のポリヌクレオチドがRNA干渉を仲介することが示されている。RNAiポリヌクレオチドは、siRNA、マイクロRNA、二重鎖RNA (dsRNA)、短分子ヘアピンRNA (shRNA)、およびRNA干渉を誘導可能なRNAをコードする発現カセットを含む群より選択可能である。siRNAは、典型的には15〜50塩基対を、かつ好ましくは21〜25塩基対を含有し、かつ細胞内で発現されるターゲット遺伝子またはRNAのコード配列に同一の (完全に相補的な)またはほぼ同一の (部分的に相補的な)ヌクレオチド配列を有する、二重鎖構造を含む。siRNAは、二ヌクレオチド3’オーバーハングを有してもよい。siRNAは、ヘアピン構造を形成する、2つのアニーリングしたポリヌクレオチドまたは単一のポリヌクレオチドで構成されてもよい。本発明のsiRNA分子は、センス領域およびアンチセンス領域を含む。1つの態様において、結合体のsiRNAは、2つのオリゴヌクレオチド断片から組み立てられ、ここで、1つの断片は、siRNA分子のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を含み、かつ第二の断片は、siRNA分子のセンス領域のヌクレオチド配列を含む。別の態様において、センス鎖は、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーなどのリンカー分子を介して、アンチセンス鎖に連結される。マイクロRNA (miRNA)は、mRNAターゲットの破壊または翻訳抑制を導く、長さ約22 ntの低分子非コードRNA遺伝子産物である。miRNAおよびターゲットmRNAの間の相補性が部分的である場合には、ターゲットmRNAの翻訳が抑制され、一方、相補性が大規模である場合には、ターゲットmRNAは開裂される。miRNAに関しては、複合体は、典型的にはmiRNAと部分的相同性しか共有しないmRNAの3’UTRに通常位置するターゲット部位に結合する。ターゲットと完全な塩基対を形成するmiRNAの5’端上の約7の連続ヌクレオチドのストレッチである「シード（seed）領域」が、miRNAの特異性において重要な役割を果たす。mRNAへのRISC/miRNA複合体の結合は、タンパク質翻訳の抑制またはmRNAの開裂および分解のいずれかを導き得る。最近のデータは、シード領域にのみ完全な塩基対形成を示すのではなく、miRNAおよびそのターゲットの長さ全体にわたって完全な相同性がある場合に、mRNA開裂が優先的に起こることを示す (Pillaiら2007)。
【００９５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ターゲットmRNAに存在する配列に相補的な配列を含有するポリヌクレオチドを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列特異的な様式でmRNAに結合する (mRNAと塩基対を形成する)。この結合は、他の細胞酵素がmRNAに結合するのを防止し、それによってmRNAの翻訳の阻害またはmRNAの分解を導く。
【００９６】
外部ガイド配列は、前駆体tRNA様複合体を形成することによって、RNアーゼPが仲介するターゲットRNAの開裂を誘導する短分子アンチセンスオリゴリボヌクレオチドである (US 5,624,824)。
【００９７】
リボザイムは、典型的にはRNAオリゴヌクレオチドであり、ターゲットメッセンジャーRNAに相補的な配列およびメッセンジャーRNAを開裂する酵素として作用するRNA配列を含有する。mRNAの開裂は翻訳を防止する。
【００９８】
ブロッキングポリヌクレオチドを形成するオリゴヌクレオチドには、5’端、3’端、または5’および3’端の両方に、末端キャップ部分が含まれてもよい。キャップ部分は、限定されるわけではないが、反転デオキシ無塩基性部分、反転デオキシチミジン部分、チミジン部分、または3’グリセリル修飾であってもよい。
【００９９】
RNAポリメラーゼIIおよびIIIが転写するDNAは、細胞中で転写されて、siRNAとして機能可能な低分子ヘアピンRNA、別個のセンスおよびアンチセンス鎖直鎖siRNA、リボザイム、またはアンチセンスRNAとして機能可能な直鎖RNAを産生可能である。RNAポリメラーゼIIIが転写するDNAは、U6プロモーター、H1プロモーター、およびtRNAプロモーターを含むリストより選択されるプロモーターを含有する。RNAポリメラーゼIIプロモーターには、U1、U2、U4、およびU5プロモーター、snRNAプロモーター、マイクロRNAプロモーター、およびmRNAプロモーターが含まれる。
【０１００】
公知のmiRNA配列のリストは、とりわけ、Wellcome Trust Sanger Institute、Penn Center for Bioinformatics、Memorial Sloan Kettering Cancer Center、およびEuropean Molecule Biology Laboratoryなどの研究機関によって維持されるデータベース中に見いだされ得る。公知の有効なsiRNA配列および同族結合部位もまた、関連のある文献によく示されている。RNAi分子は、当技術分野に公知の技術によって、容易に設計され、かつ産生される。さらに、有効および特異的な配列モチーフを発見する機会を増加させる計算ツールがある (Peiら2006、Reynoldsら2004、Khvorovaら2003、Schwarzら2003、Ui-Teiら2004、Healeら2005、Chalkら2004、Amarzguiouiら2004)。
【０１０１】
本発明のポリヌクレオチドは、化学的に修飾されていてもよい。化学的に修飾されたポリヌクレオチドの使用は、限定されるわけではないが、インビボでのヌクレアーゼ分解に対する耐性、細胞取り込み、活性、および配列特異的ハイブリダイゼーションを含む、ポリヌクレオチドの多様な特性を改善し得る。このような化学的修飾の限定されない例には、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、2’-O-メチルリボヌクレオチド、2’-デオキシ-2’-フルオロリボヌクレオチド、2’-デオキシリボヌクレオチド、「普遍的塩基」ヌクレオチド、5-C-メチルヌクレオチド、および反転デオキシ無塩基性残基取り込みが含まれる。これらの化学的修飾は、多様なポリヌクレオチド構築物で用いた場合、細胞におけるポリヌクレオチド活性を保持する一方、同時に、これらの化合物の血清安定性を劇的に増加させることが示されている。化学的に修飾されたsiRNAはまた、ヒトにおいてインターフェロン活性を活性化する可能性を最小限にし得る。
【０１０２】
1つの態様において、本発明の化学的に修飾されたRNAiポリヌクレオチドは、2つの鎖を有する二重鎖を含み、この一方または両方が、化学的に修飾され、各鎖は約19〜約29 (例えば約19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、または29)ヌクレオチドである。1つの態様において、本発明のRNAiポリヌクレオチドは、1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む一方、細胞または再構成インビトロ系内部でRNAiを仲介する能力を維持する。RNAiポリヌクレオチドを修飾することができ、ここで化学的修飾は、ヌクレオチドの1つまたは複数 (例えば約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれより多く)を含む。本発明のRNAiポリヌクレオチドは、RNAiポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチドの総数の割合として、修飾ヌクレオチドを含んでもよい。こうしたものとして、本発明のRNAiポリヌクレオチドは、一般的に、ヌクレオチド位（nucleotide position）の約5〜約100% (例えばヌクレオチド位の5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または100%)の修飾ヌクレオチドを含んでもよい。所定のRNAiポリヌクレオチド中に存在する修飾ヌクレオチドの実際の割合は、RNAiポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチドの総数に依存する。RNAiポリヌクレオチドが一本鎖である場合、修飾パーセントは、一本鎖RNAiポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチド総数に基づいていてもよい。同様に、RNAiポリヌクレオチドが二重鎖である場合、修飾パーセントは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはセンスおよびアンチセンス鎖の両方に存在するヌクレオチド総数に基づいていてもよい。さらに、所定のRNAiポリヌクレオチド中に存在する修飾ヌクレオチドの実際の割合はまた、RNAiポリヌクレオチド中に存在するプリンおよびピリミジンヌクレオチドの総数に応じ得る。例えば、RNAiポリヌクレオチド中に存在するすべてのピリミジンヌクレオチドおよび/またはすべてのプリンヌクレオチドが修飾される。
【０１０３】
RNAiポリヌクレオチドは、遺伝子にコードされるRNAの発現を調節する。多数の遺伝子が、互いにある程度の配列相同性を共有し得るため、十分な配列相同性を持つある種類の遺伝子をターゲティングするように、RNAiポリヌクレオチドを設計することも可能である。したがって、RNAiポリヌクレオチドは、異なる遺伝子ターゲットの間で共有される配列に相補性を有するか、または特定の遺伝子ターゲットに対して特有である配列を含有してもよい。したがって、RNAiポリヌクレオチドは、いくつかの遺伝子間で相同性を有するRNA配列の保存領域をターゲティングするよう設計され、それによって遺伝子ファミリー中のいくつかの遺伝子 (例えば異なる遺伝子アイソフォーム、スプライス変異体、突然変異体遺伝子など)をターゲティングしてもよい。別の態様において、単一の遺伝子の特定のRNA配列に対して特有な配列をターゲティングするように、RNAiポリヌクレオチドを設計してもよい。
【０１０４】
相補性という用語は、ポリヌクレオチドが伝統的Watson-Crickまたは他の非伝統的タイプのいずれかによって、別のポリヌクレオチド配列と水素結合を形成する能力を指す。本発明のポリヌクレオチド分子に関連して、ポリヌクレオチド分子とそのターゲット (エフェクター結合部位)または相補配列に関する結合自由エネルギーは、ポリヌクレオチドの適切な機能、例えば酵素のmRNA開裂または翻訳阻害が進行するのを可能にするのに十分である。核酸分子に関する結合自由エネルギーの決定は、当技術分野に周知である (Frierら1986、Turnerら1987)。相補性パーセントは、第二のポリヌクレオチド配列と水素結合 (例えばWatson-Crick塩基対形成)を形成可能な第一のポリヌクレオチド分子中の、連続鎖における塩基の割合を示す (例えば10のうちの5、6、7、8、9、10は、50%、60%、70%、80%、90%、および100%相補的である)。完全に相補的とは、ポリヌクレオチド配列の連続鎖中のすべての塩基が、第二のポリヌクレオチド配列において、同じ数の連続塩基と水素結合することを意味する。
【０１０５】
遺伝子発現の阻害、下方制御、またはノックダウンによって、遺伝子から転写されるRNAのレベル、またはRNAから翻訳されるポリペプチド、タンパク質もしくはタンパク質サブユニットのレベルによって測定した場合、遺伝子の発現が、本発明のブロッキングポリヌクレオチド結合体の非存在下で観察されるものより下に、減少することを意味する。本発明の組成物によって送達されるポリヌクレオチドを用いた、遺伝子発現の阻害、下方制御、またはノックダウンは、好ましくは、対照不活性核酸、スクランブル化配列もしくは不活性化ミスマッチを持つ核酸の存在下で、またはマスキングされたポリマーへのポリヌクレオチド結合体化の非存在下で観察されるレベルより下である。
【０１０６】
送達されるポリヌクレオチドは、内因性遺伝物質とは離れて、細胞質内または核内に留まっていてもよい。あるいは、DNAは内因性遺伝物質と組換えを生じて (その一部になって)もよい。組換えは、相同的または非相同的組換えのいずれかによって、DNAを染色体DNAに挿入させ得る。
【０１０７】
ポリヌクレオチドを細胞に送達して、外因性ヌクレオチド配列を発現させるか、内因性ヌクレオチド配列の発現を阻害するか、排除するか、増大させるか、もしくは改変するか、または天然には細胞と関連しない特定の生理学的特性に影響を及ぼしてもよい。
【０１０８】
ポリヌクレオチドは、全もしくは部分的タンパク質またはRNAを発現するようにコードされた発現カセットを含有してもよい。発現カセットは、配列を発現可能な、天然のまたは組換えにより産生されたポリヌクレオチドを指す。組換えという用語は、本明細書において用いられるように、分子生物学的技術によって、ともに連結されたポリヌクレオチドのセグメントで構成されるポリヌクレオチド分子を指す。カセットは、関心対照の配列の発現に影響を及ぼす任意の他の配列とともに、関心対照の遺伝子のコード領域を含有する。発現カセットには、典型的には、プロモーター (転写開始を可能にする)、および転写される配列が含まれる。任意で、発現カセットには、限定されるわけではないが、転写エンハンサー、非コード配列、スプライシングシグナル、転写終結シグナル、およびポリアデニル化シグナルが含まれていてもよい。RNA発現カセットには、典型的には、翻訳開始コドン (翻訳開始を可能にする)、および1つまたは複数のタンパク質をコードする配列が含まれる。任意で、発現カセットには、限定されるわけではないが、翻訳終結シグナル、ポリアデノシン配列、内部リボソーム進入部位 (IRES)、および非コード配列が含まれていてもよい。
【０１０９】
ポリヌクレオチドは、ターゲット細胞中で特定の機能を果たさないが、ポリヌクレオチドの生成に使用される配列を含有してもよい。このような配列には、限定されるわけではないが、宿主生物において、ポリヌクレオチドの複製または選択に必要な配列が含まれる。
【０１１０】
遺伝子という用語は、治療的ポリヌクレオチド (例えばリボザイム)もしくはポリペプチドまたは前駆体の産生に必要なコード配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。全長ポリペプチドまたは断片の所望の活性または機能特性 (例えば酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達)が保持されている限り、ポリペプチドは、全長コード配列にコードされていてもよいし、またはコード配列の任意の部分によってコードされていてもよい。この用語はまた、遺伝子のコード領域、ならびに遺伝子が全長mRNAの長さに対応するように、いずれの側も約1 kbまたはそれより長い距離に渡って、コード領域に隣接して5’および3’端両方に位置する包含配列 (including sequences)も含む。コード領域の5’に位置し、かつmRNA上に存在する配列は、5’非翻訳配列と称される。コード領域の3’または下流に位置し、かつmRNA上に存在する配列は、3’非翻訳配列と称される。遺伝子という用語は、遺伝子のcDNAおよびゲノム型両方を含む。遺伝子のゲノム型またはクローンは、イントロン、介在領域または介在配列と称される非コード配列で中断されるコード領域を含有する。イントロンは、核内RNAに転写される遺伝子のセグメントである。イントロンは、エンハンサーなどの制御要素を含有してもよい。イントロンは、核内または一次転写物から除去されるかまたはスプライシングされ；したがって、イントロンは、成熟RNA転写物には存在しない。メッセンジャーRNA (mRNA)は、翻訳中に機能して、新生ポリペプチド中のアミノ酸の配列または順序を特定する。遺伝子にはまた、限定されるわけではないが、プロモーター、エンハンサー、転写因子結合部位、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム進入部位、サイレンサー、遮蔽配列、マトリックス付着領域を含む、他の領域または配列も含まれてもよい。これらの配列は、遺伝子のコード領域近傍 (10,000ヌクレオチド以内)または離れた部位 (10,000ヌクレオチドより遠い)に存在してもよい。これらの非コード配列は、遺伝子の転写および/または翻訳のレベルまたは速度に影響を及ぼす。遺伝子の共有修飾は、転写速度 (例えばゲノムDNAのメチル化)、mRNAの安定性 (例えば3’ポリアデノシンテールの長さ)、翻訳速度 (例えば5’キャップ)、核酸修復、核輸送、および免疫原性に影響を及ぼし得る。核酸の共有修飾の一例は、LABELIT (登録商標)試薬 (Mirus Corporation, Madison, WI)の作用を伴う。
【０１１１】
本明細書において用いられるように、遺伝子発現という用語は、デオキシリボ核酸遺伝子の転写を通じて (例えばRNAポリメラーゼの酵素作用を介して)、遺伝子にコードされる遺伝情報をRNA (例えば低分子RNA、siRNA、mRNA、rRNA、tRNA、またはsnRNA)に変換し、かつタンパク質コード遺伝子に関しては、mRNAの翻訳を通じてタンパク質に変換するプロセスを指す。遺伝子発現は、プロセスの多くの段階で制御可能である。上方制御または活性化は、遺伝子発現産物 (すなわちRNAまたはタンパク質)の産生を増加させる制御を指し、一方、下方制御または抑制は、産生を減少させる制御を指す。上方制御または下方制御に関与する分子 (例えば転写因子)は、しばしば、それぞれ、アクチベーターおよびリプレッサーと呼ばれる。
【０１１２】
ポリヌクレオチドを研究目的に用いるか、または細胞において治療に役立ち得る変化を生じるために用いてもよい。治療目的のためのポリヌクレオチドの送達は、通常、遺伝子治療と呼ばれる。ポリヌクレオチドの送達は、ターゲット細胞中に存在する遺伝物質の修飾を導き得る。安定トランスフェクションまたは安定にトランスフェクションされたという用語は、一般的に、トランスフェクションされた細胞のゲノム内への外因性ポリヌクレオチドの導入および組込みを指す。安定トランスフェクタントという用語は、ゲノムDNA内に安定して組み込まれたポリヌクレオチドを有する細胞を指す。安定トランスフェクションはまた、真核細胞分裂中に複製されるエピソームベクター (例えば、パピローマウイルス複製起点を含有するプラスミドDNAベクター、人工染色体)を用いることによっても得られ得る。一過性トランスフェクションまたは一過性にトランスフェクションされたという用語は、ポリヌクレオチドが、トランスフェクションされた細胞のゲノム内に組み入れられていない、細胞内へのポリヌクレオチドの導入を指す。ポリヌクレオチドが発現可能遺伝子を含有する場合、発現カセットは、染色体中の内因性遺伝子の発現を支配する、制御調節に供される。一過性トランスフェクタントという用語は、ポリヌクレオチドを取り込んだが、ポリヌクレオチドをゲノムDNA内に組み込んでいない細胞を指す。
【０１１３】
配合物
ポリヌクレオチド-ポリマー結合体は、ポリヌクレオチドをポリマーに共有結合させることによって形成される。ポリマーは、反応基Aを含有するように重合されるかまたは修飾される。ポリヌクレオチドもまた、反応基Bを含有するように重合されるかまたは修飾される。反応基AおよびBは、当技術分野に公知の方法を用いて、可逆的共有結合を介して連結可能であるように、選択される。
【０１１４】
ポリマーへのポリヌクレオチドの結合体化は、過剰なポリマーの存在下で実行可能である。ポリヌクレオチドおよびポリマーは、結合体化中、反対の電荷である場合があるため、過剰なポリマーの存在は、結合体の凝集を減少させるかまたは排除し得る。あるいは、ポリカチオンなどの担体ポリマーを過剰に用いてもよい。動物または細胞培養への結合体の投与前に、過剰なポリマーを結合体化ポリマーから除去してもよい。あるいは、過剰なポリマーを結合体と一緒に、動物または細胞培養に同時投与してもよい。
【０１１５】
同様に、過剰なポリマーまたはマスキング剤の存在下で、ポリマーをマスキング剤に結合体化してもよい。ポリヌクレオチドおよびポリマーは、結合体化中、反対の電荷である場合があるため、過剰なポリマーの存在は、結合体の凝集を減少させるかまたは排除することも可能である。あるいは、過剰な担体ポリマーを用いてもよい。動物または細胞培養への結合体の投与前に、過剰なポリマーを結合体化ポリマーから除去してもよい。あるいは、過剰なポリマーを結合体と一緒に、動物または細胞培養に同時投与してもよい。ポリヌクレオチドのポリマーへの結合体化前にまたは結合体化に続いて、ポリマーを修飾してもよい。
【０１１６】
トランスフェクション試薬
細胞にポリヌクレオチドを送達するプロセスは、通常、トランスフェクションまたはトランスフェクティングプロセスと呼ばれている。トランスフェクティングという用語は、本明細書において用いられるように、ポリヌクレオチドが生物学的活性を有するような、細胞外部から細胞内部への、ポリヌクレオチドまたは他の生物学的活性化合物の導入を指す。ポリヌクレオチドを研究目的に用いるか、または細胞において治療に役立ち得る変化を生じるために用いてもよい。ポリヌクレオチドの送達は、ターゲット細胞に存在する遺伝物質の修飾を導き得る。トランスフェクション試薬または送達ビヒクルは、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドに結合するかまたはこれらと複合体を形成し、かつ細胞内へのその進入を仲介する化合物である。
【０１１７】
インビトロ・トランスフェクション試薬または送達ビヒクルは、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドに結合するかまたはこれらと複合体を形成し、かつ細胞内へのその進入を仲介する化合物または化合物の組成物である。トランスフェクション試薬の例には、限定されるわけではないが、タンパク質およびポリマー複合体 (ポリプレックス)、脂質およびリポソーム (リポプレックス)、ポリマーおよび脂質の組み合わせ (リポポリプレックス)、リン酸カルシウム沈殿物、およびデンドリマーが含まれる。典型的には、トランスフェクション試薬は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの負電荷に結合する正味正電荷を持つ構成要素を有する。陽イオン性トランスフェクション剤はまた、巨大核酸を凝集させることも可能である。トランスフェクション剤はまた、機能する基とポリヌクレオチドを会合させるのにも使用可能である。機能する基には、細胞ターゲティングシグナル、核局在化シグナル、エンドソームまたは他の細胞内小胞からの内容物の放出を増進する化合物 (膜作用性化合物など)、および付着した化合物または複合体の振る舞いまたは相互作用を改変する他の化合物 (相互作用修飾剤)が含まれる。
【０１１８】
本発明の結合体化ポリヌクレオチドは、多様な治療的、診断的、ターゲット検証、ゲノム発見、遺伝子操作および薬理遺伝学適用のための有用な試薬および方法を提供する。結合体化ポリヌクレオチドは、結合体化されていない同じポリヌクレオチドと比較して、改善された細胞取り込み特性を有する。
【０１１９】
非経口投与経路には、シリンジおよび針またはカテーテルを用いる、管内 (静脈内、動脈内)、筋内、実質内、皮内、真皮下、皮下、腫瘍内、腹腔内、クモ膜下腔内、硬膜下、硬膜外、およびリンパ内注射が含まれる。管内は、本明細書において、体内の組織または臓器に連結されている管と呼ばれる管状構造内を意味する。管状構造腔内で、体液が体の部分にまたは体の部分から流動する。体液の例には、血液、脳脊髄液 (CSF)、リンパ液、または胆汁が含まれる。管の例には、動脈、細動脈、毛細血管、細静脈、類洞、静脈、リンパ管、胆管、および唾液または他の外分泌腺の管が含まれる。管内経路には、動脈または静脈などの血管を通じた送達が含まれる。血液循環系は、薬物の全身伝播を提供する。粘膜に関与する投与経路は、鼻、気管支、肺への吸入、または目を介したものが含まれると意味される。実質内には、肝臓、肺、心臓、筋肉 (骨格筋または横隔膜)、脾臓、膵臓、脳 (脳室内を含む)、脊髄、神経節、リンパ節、脂肪組織、甲状腺組織、副腎、腎臓、前立腺、および腫瘍などの組織内への直接注入が含まれる。経皮投与経路は、パッチおよびイオン導入によって達成されている。他の上皮経路には、経口、鼻、呼吸器、直腸、および膣投与経路が含まれる。
【０１２０】
結合体は、薬学的に許容される担体溶液中に注入可能である。薬学的に許容されるとは、薬理学的/毒性学的観点から、哺乳動物に許容される特性および/または物質を指す。薬学的に許容されるという語句は、生理学的に許容可能であり、かつ哺乳動物に投与した場合、アレルギー性または他の有害なもしくは毒性の反応を典型的には生じない、分子実体、組成物、および特性を指す。好ましくは、本明細書において用いられるように、薬学的に許容されるという用語は、動物における、かつより詳細にはヒトにおける使用のために、連邦もしくは州政府の監督官庁によって認可されたか、または米国薬局方もしくは他の一般的に認識される薬局方に列挙されていることを意味する。
【０１２１】
治療効果
本発明者らは、特定の組織において、レポーター遺伝子および内因性遺伝子の遺伝子発現を生じるかまたは遺伝子発現の阻害を生じる、ポリヌクレオチド送達を開示した。ポリヌクレオチドの送達後に測定されるレポーター (マーカー)遺伝子発現レベルは、他のポリヌクレオチドの送達後の遺伝子発現と類似のレベルの合理的な予期を示す。一般の技術を有する当業者によって有益であると見なされる治療レベルは、疾患ごとに異なり、例えば、血友病AおよびBは、それぞれ、X染色体連鎖凝固因子VIIIおよびIXの欠損によって引き起こされる。臨床的経過は、因子VIIIまたはIXの通常血清レベルの割合によって大きく影響される：<2%、重症；2〜5%、中程度；および5〜30%、軽度。したがって、重症患者における循環因子の通常レベルが1%から2%への増加は、有益であると見なされ得る。6%より高いレベルは、手術または傷害に続く出血以外の自発的な出血が防止される。同様に、治療上の利点を提供するには、遺伝子の阻害が100%である必要はない。遺伝子治療業において一般的な当業者は、マーカー遺伝子結果の十分なレベルに基づいて、疾患に特異的な遺伝子発現の有益なレベルを合理的に予想するであろう。血友病の例では、マーカー遺伝子が発現されて、体積において因子VIIIの通常レベルの2%に匹敵するレベルのタンパク質を生じた場合、因子VIIIをコードする遺伝子もまた、類似のレベルで発現されたと合理的に予期され得る。したがって、ルシフェラーゼおよびβ-ガラクトシダーゼの遺伝子などのレポーターまたはマーカー遺伝子は、一般的に、細胞内タンパク質の発現の有用な規範として働く。同様に、分泌アルカリホスファターゼ (SEAP)のレポーターまたはマーカー遺伝子は、一般的に、分泌されるタンパク質の有用な規範として働く。
【０１２２】
疾患、状態、もしくは症状を減弱するかまたは防止する場合の送達されたポリヌクレオチドから発現されたタンパク質の治療効果は、細胞内に留まるか、膜中で細胞に付着したままであるか、またはそれが全身循環および血液に進入可能で細胞から分泌されかつ解離する、タンパク質によって達成可能である。治療に役立ち得る分泌タンパク質には、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、凝固因子、抗プロテアーゼタンパク質 (例えばアルファ-アンチトリプシン)および血中に存在する他のタンパク質が含まれる。膜上のタンパク質は、タンパク質またはリポタンパク質を取り込むために、細胞に受容体を提供することによって、治療効果を有することも可能である。例えば、低密度リポタンパク質 (LDL)受容体は、肝細胞中で発現されて、かつ血中コレステロールレベルを低下させ、かつそれによって、脳卒中または心筋梗塞を引き起こし得るアテローム性動脈硬化性病変を防止することも可能である。細胞内に留まる治療タンパク質は、フェニルケトン尿症におけるように、循環毒性代謝産物を一掃する酵素であってもよい。これらはまた、癌細胞を、より増殖性でなくするかまたは癌性でなくする (例えばより転移性でなくする)ことも可能である。細胞内タンパク質はまた、ウイルス複製と干渉してもよい。
【０１２３】
肝臓は、代謝 (例えば多様な高コレステロール血症におけるリポタンパク質代謝)および循環タンパク質 (例えば血友病における凝固因子)分泌における中枢の役割を鑑みると、遺伝子治療の最も重要なターゲット組織の1つである。肝臓に向けられる遺伝子治療によって、少なくとも100の異なる遺伝子障害が、潜在的に修正可能である。さらに、慢性肝炎および肝硬変などの後天性障害が一般的であり、かつこれらもまた、ポリヌクレオチドに基づく肝臓治療によって治療可能であり得る。異所性遺伝子発現を伴う遺伝子治療は、肝臓に向けられる遺伝子導入によって治療可能な障害の数をさらに増大させ得る。例えば、糖尿病は、肝細胞生理が、グルコースが制御するインスリン分泌を可能にし得る肝細胞内でインスリン遺伝子を発現させることによって、治療可能である。
【０１２４】
代謝または疾患に関与する遺伝子の増加または減少に加えて、インビボでの細胞へのポリヌクレオチドの送達はまた、免疫系を刺激するか、免疫系を刺激して癌細胞を破壊するか、癌原遺伝子を不活性化するか、または腫瘍抑制遺伝子を活性化するかもしくは送達するのにも使用可能である。また、ポリヌクレオチドを送達して、病原体に対する免疫を誘導するか、または病原性遺伝子の発現をブロッキングしてもよい。
【０１２５】
諸定義
本明細書において用いられるように、インビボは、生物内部で起こること、かつより具体的には、一部のものまたは死んだものとは対立するものとして、哺乳動物などの完全な生存している多細胞生物 (動物)の生存組織中でまたはこの組織に対して行われるプロセスを意味する。
【０１２６】
本明細書において用いられるように、インビトロは、疾患またはプロセスを研究するための実験的研究で用いられる、生存多細胞生物の外に生成される人工的環境 (例えば試験管または培養プレート)において行われるプロセスを指す。本明細書において用いられるように、インビトロには、培養中で増殖する無傷の細胞で行われるプロセスが含まれる。
【０１２７】
本明細書において用いられるように、インサイチューは、無傷の組織で実行されるプロセスを指す。しかし、組織は、生存生物中であってもよいし、または生物から除去されていてもよい。
【０１２８】
本明細書において用いられるように、エクスビボは、生物から除去され、かつ続いて生物に戻される生存細胞または組織に対して、生物外の人工的環境において行われるプロセスを指す。
【０１２９】
架橋剤は、2つの分子を一緒に連結する、すなわち2つの分子間に連結を形成するのに用いられる二官能性分子である。二官能性分子は、ホモまたはヘテロ二官能性を含有してもよい。
【０１３０】
本明細書において用いられるように、表面活性ポリマーは、水の表面張力および/または他の相との界面張力を低下させ、したがって液体/蒸気界面で正に吸着される。
【０１３１】
抗体は、特定のエピトープに結合する、抗体およびその断片を含む、任意の免疫グロブリンである。この用語は、ポリクローナル、モノクローナル、およびキメラ抗体を含む。抗体組み合わせ部位は、抗原に特異的に結合する重鎖および軽鎖可変および超可変領域で構成される、抗体分子のその構造部分である。抗体分子という語句は、多様な文法的形式において、本明細書において用いられるように、無傷の免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分の両方を意図する。例示的な抗体分子は、無傷の免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン分子、ならびに本明細書に記載する治療法で使用するのに好ましい、Fab、Fab'、F(ab')2およびF(v)として当技術分野に公知である部分を含む、パラトープを含有する免疫グロブリン分子部分である。抗体分子のFabおよびF(ab')2部分は、それぞれ、周知の方法による実質的に無傷の抗体分子に対するパパインおよびペプシンのタンパク質分解反応によって調製される。モノクローナル抗体という語句は、多様な文法的形式において、特定の抗原と免疫反応可能な抗体組み合わせ部位の1つの種のみを有する抗体を指す。したがって、モノクローナル抗体は、免疫反応する任意の抗原に対する単一の結合アフィニティーを示す。したがって、モノクローナル抗体は、各々、異なる抗原に対して免疫特異的である、複数の抗体組み合わせ部位を有する抗体分子、例えば二重官能性 (キメラ)モノクローナル抗体を含有してもよい。
【実施例】
【０１３２】
実施例
実施例1. ポリヌクレオチド合成および組み立て
以下の合成RNAオリゴヌクレオチド (Dharmacon, Lafayette CO)を用いた。センス鎖RNAは、送達ビヒクルへの結合体化を可能にする6つの炭素スペーサーを含む一級アミンを5’に含有した。製造者の指示にしたがって、アニーリング工程前に、2’ACEで保護されたRNAオリゴヌクレオチドを脱保護した。siRNAは以下の配列を有した。
apoB (Ensembl#ENSMUST00000037520)；
apoB-1 siRNA
センス
0005735573.tif 000006
、アンチセンス
0005735573.tif 000007
；
apoB-2 siRNA
センス
0005735573.tif 000008
、アンチセンス
0005735573.tif 000009
；
ppara (GenBank# NM_011144)；
ppara-1 siRNA、
センス
0005735573.tif 000010
、アンチセンス
0005735573.tif 000011
；
ppara-2 siRNA
センス
0005735573.tif 000012
、アンチセンス
0005735573.tif 000013
；
対照siRNA (GL-3ルシフェラーゼレポーター遺伝子)、
センス
0005735573.tif 000014
、アンチセンス
0005735573.tif 000015
。
m = 2’-O-CH3置換、
* = ホスホロチオエート連結、および
P = PO4
各々、等モル量を混合し、かつ94℃で5分間加熱し、90℃に3分間冷却し、次いで温度を0.3℃ずつ250回減少させ、各工程で3秒間維持することによって、各ターゲット配列に対するセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドをアニーリングさせた。
【０１３３】
実施例2. ポリビニルエーテルランダムコポリマー
A. ビニルエーテルモノマーの合成
相間移動触媒として、テトラn-ブチルアンモニウムブロミド (0.5 g)を用い、100℃ DMF (75 ml)中で2-クロロエチルビニルエーテル (25 g、0.24 mol)およびフタルイミドカリウム(25 g、0.135 mol)を反応させることによって、2-ビニルオキシエチルフタルイミドを調製した。この溶液を6時間加熱し、次いで、水中で砕き、かつろ過した。この固体を次いで、メタノールから2回再結晶させて、白色結晶を得た。
【０１３４】
B. アミン + より低次のアルキルポリビニルエーテルポリマー
多様なアルキル対アミン基比および1〜4の炭素を有するアルキル基を用いて、ビニルエーテルモノマーから、一連のコポリマーを合成した(図1、RおよびR'は同じであってもまたは異なってもよい)。膜作用は、サイズ (アルキル鎖長)および疎水性モノマーの比に依存した (Wakefield 2005)。プロピルおよびブチル由来ポリマーは、モデルリポソームを用いて、膜溶解性であることが見出され、一方、メチルおよびエチル含有ポリマーは膜溶解性でなかった。本発明者らは、これらのポリマーを、メチル、エチル、プロピル、またはブチル-アミノビニルエーテル (またはそれぞれ、PMAVE、PEAVE、PPAVE、もしくはPBAVE)と名付けた。これらのポリマーは、塩の生理学的濃度で、DNAと複合体形成するのに十分な電荷を所持する。対照的に、メリチンなどの低分子膜溶解性陽イオン性ペプチドは、弱すぎであり、かつ等張生理食塩水溶液中でDNAを凝集不能である。合成両親媒性ポリマーがより大きいサイズであることから、DNA結合能が増進するだけでなく、モルに基づいてメリチンよりもより溶解性になる。より少数のポリマー分子で膜を溶解可能であれば、インビボ核酸送達が促進されるであろう。フルオロフォア標識DNAを用いて、本発明者らは、合成ポリマーの電荷密度を決定し、かつ生理食塩水中の安定性を確認した。
【０１３５】
C. 水溶性、両親媒性、膜作用性ポリビニルエーテルポリアミン・ターポリマーの合成
Xモル%のアミンで保護されたビニルエーテル (例えば2-ビニルオキシエチルフタルイミド)を、無水ジクロロメタン中の窒素ブランケット下で、オーブンで乾燥させた丸底フラスコに添加した。この溶液に、Yモル%のアルキル (例えばエチル、プロピル、またはブチル)ビニルエーテルを添加し、その後、Zモル%のアルキル (ドデシル、オクタデシル)ビニルエーテルを添加した (図1)。詳述したポリマーは、2〜3の異なるモノマーに由来するが、本発明はビニルエーテルモノマーの特定の組成には限定されない。より多くのモノマーまたは異なるモノマーを含むポリマーが容易に想定された。乾燥氷冷アセトン槽中で、溶液を-78℃にした。この溶液に、10モル%のBF3EtOEtを添加し、かつ反応を-78℃で2〜3時間進行させ、次いでメタノール・水酸化アンモニウム溶液で反応停止した。ポリマーを減圧下で乾燥させ、次いで、30 mlの1,4-ジオキサン/メタノール (2/1)中に取り込んだ。フタルイミドあたり20モル当量のヒドラジンを添加して、アミンから保護基を除去した。溶液を3時間還流し、次いで減圧下で乾燥させた。固体を20 mlの0.5 M HCl中に取り込み、15分間還流し、20 mlの再蒸留水で希釈し、かつさらに1時間還流した。次いで、溶液をNaOHで中和し、室温に冷却し、3,500分子セルロース管に移し、再蒸留水に対して、24時間 (2 x 20 L)透析し、かつ凍結乾燥した。標準法にしたがって、分析的サイズ排除カラムを用いて、ポリマーの分子量を概算した。示されるビニルエーテルモノマーを含有するポリマーをこれらの例で記載するが、本発明はこれらの特定のモノマーに限定されない。
【０１３６】
ヒドラジンおよびHClでの連続処理によってフタルイミド基を除去した後、ポリマーを3,500分子セルロース管に移し、かつ再蒸留水に対して、24時間 (2 x 20 L)透析し、かつ凍結乾燥した。次いで、ポリマーを水に溶解し、かつsephadex G-15カラム上に置いた。sephadex G-15から排出されたポリマーを単離し、かつ凍結乾燥によって濃縮した。次いで、Eprogen Inc. CATSEC100、CATSEC300、およびCATSEC1000カラムを連続して用いて、GPCにより、ポリマーの分子量を決定した。流動緩衝液は、50 mM NaCl、0.1% TFA、および10% MeOHであった。ポリビニルピリジン標準を、検量線として用いた。ポリマーの分子量は、10,000〜100,000 Daの範囲であり、ポリマー調製物の大部分は20,000 Daを超えた。
【０１３７】
D. DW1360の合成
アミン/ブチル/オクタデシルポリビニルエーテル・ターポリマーを、2-ビニルオキシエチルフタルイミド (3.27 g、15 mmol)、ブチルビニルエーテル (0.40 g、4 mmol)、およびオクタデシルビニルエーテル (0.29 g、1 mmol)モノマーから合成した。モノマーを30 mlの無水ジクロロメタン中に溶解した。次いで、これらの溶液を-78℃のドライアイス/アセトン槽に添加した。2分後、BF3・OEt2 (0.042 g、0.3 mmol)を添加し、かつ反応を-78℃で3時間進行させた。次いで、メタノール中の水酸化アンモニウムの50/50混合物または水素化ホウ素リチウムの溶液の添加によって停止させた。次いで、回転蒸発によって溶媒を除去した。次いで、30 mlの1,4-ジオキサン/メタノール (2/1)中にポリマーを溶解した。この溶液に、ヒドラジン (0.44 g、138 mmol)を添加し、かつ混合物を加熱して3時間還流した。次いで、回転蒸発によって溶媒を除去して、次いで、生じた固体を20 mlの0.5 M HCl中に取り込んで、かつ15分間還流し、20 mlの再蒸留水で希釈し、かつさらに1時間還流した。次いで、この溶液をNaOHで中和し、RTに冷却し、3,500分子セルロース管に移し、かつ再蒸留水に対して、24時間 (2 x 20 L)透析し、かつ凍結乾燥した。
【０１３８】
同様に、多様な比でアミン、ブチルおよびオクタデシル基を含有する他のポリマーを合成してもよい。他のモノマーもやはり取り込まれてもよい。特に、t-ブチルビニルエーテル、ドデシルビニルエーテル、およびオレイン酸ビニルエーテルが、ポリマー内に取り込まれている。
【０１３９】
1つの態様において、アミン/より低次のアルキル/より高次のアルキルポリビニルエーテル・ターポリマーは、15のアミンモノマー： 4のより低次のアルキル： 1のより高次のアルキルモノマーの供給比でモノマーを用いて、合成可能である。上述の条件下で、取り込み比は、約5.4〜7.5のアミンモノマー： 3〜3.5のより低次のアルキルモノマー： 1のより高次のアルキルモノマーであると決定された。別の態様において、4〜8のアミンモノマー： 3〜5のより低次のアルキルモノマー： 1のより高次のアルキルモノマーの供給比で、モノマーを用いて、アミン/より低次のアルキル/より高次のアルキルポリビニルエーテル・ターポリマーを合成する。好ましい態様において、ポリマーは水溶性 (25℃で約1 mg/mlまたはそれより濃い)であり、かつ表面活性である。
【０１４０】
1つの態様において、ポリマーを分画して、約5 kDa〜約50 kDa、かつより好ましくは約10 kDa〜約30 kDaの分子量のポリマーを得る。
【０１４１】
E. 他のターポリマー
限定されるわけではないが、ポリ-L-リジン (PLL)、ポリビニルアミン (PVA)、およびポリアリルアミン (PAA)を含む異なる塩基ポリマーを修飾して、類似のポリマーを合成してもよい。アルキル基を、これらのポリマーの異なる主鎖に付着させることによって、アミン：より低次のアルキル：より高次のアルキルの比が約6:3:1であるターポリマーを作製してもよい。
【０１４２】
F. リポソーム溶解
10 mgの卵ホスファチジルコリンを、100 mMカルボキシフルオレセイン (CF)、および10 mM HEPES pH7.5を含有する緩衝液1 mlで水和させた。次いで、100 nm孔のポリカーボネートフィルター (Nucleopore, Pleasanton, CA)を通じてリポソームを押し出した。Sepharose 4B-200を用い、10 mM HEPES pH 8、0.1 M NaClで溶出させるサイズ排除クロマトグラフィーによって、捕捉されていないCFを除去した。CF装填リポソームの200μLのアリコットを、1.8 mlの等張緩衝液に添加した。0.25μgのポリマーまたはメリチンを小胞懸濁物に添加した30分後に、蛍光 (λex = 488、λem = 540)を測定した。各実験終了時、40μlの1% Triton X-100溶液を添加することによって小胞を破壊して、最大溶解を決定した。
【０１４３】
実施例3. マスキング剤
A. 2-プロピオン酸-3-メチルマレイン酸無水物 (カルボキシジメチルマレイン酸無水物またはCDM) の合成
50 mlの無水テトラヒドロフラン中の水素化ナトリウム (0.58 g、25 mmol)の懸濁物に、トリエチル-2-ホスホノプロピオネート (7.1 g、30 mmol)を添加した。水素ガスの発生が停止した後、10 mlの無水テトラヒドロフラン中のジメチル-2-オキソグルタレート (3.5 g、20 mmol)を添加し、かつ30分間攪拌した。次いで、水10 mlを添加し、かつ回転蒸発によってテトラヒドロフランを除去した。生じた固体および水混合物を3 x 50 mlのエチルエーテルで抽出した。エーテル抽出物を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥させ、かつ濃縮して淡黄色油を得た。2:1 エーテル：ヘキサンでのシリカゲルクロマトグラフィー溶出によって油を精製して、4 g (82%収量)の純粋なトリエステルを得た。次いで、4.5 g (5当量)の水酸化カリウムを含有する水およびエタノールの50/50混合物50 ml内で、このトリエステルを溶解することによって、2-プロピオン酸-3-メチルマレイン酸無水物を形成した。この溶液を加熱して1時間還流した。次いで、回転蒸発によってエタノールを除去し、かつ溶液を塩酸でpH 2に酸性化した。次いで、200 ml酢酸エチルでこの水性溶液を抽出し、これを単離し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、かつ濃縮して白色固体を得た。次いで、この固体をジクロロメタンおよびヘキサンから再結晶化させて、2 g (80%収量)の2-プロピオン酸-3-メチルマレイン酸無水物を得た。
【０１４４】
塩化オキサリルでCDMをその酸塩化物に変換した後、チオール、エステルまたはアミンおよびピリジンを添加して、CDMからチオエステル、エステルおよびアミドを合成した。CDMおよびその誘導体は、ターゲティングリガンド、立体安定化剤、荷電基、および他の反応基を付加する、当技術分野で標準的な方法によって容易に修飾される。生じた分子を用いて、アミンを可逆的に修飾してもよい。
【０１４５】
B. ガラクトース含有ターゲティング基
最も広く研究されている肝細胞ターゲティングリガンドは、ガラクトースに基づき、これは肝細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体 (ASGPr)に結合される。ガラクトースの付着は、オリゴ糖キトサン、ポリスチレン誘導体、およびポリアクリルアミドHPMAを含む、いくつかの非常に水溶性の非荷電ポリマーの肝細胞ターゲティングを促進することが示されている。ガラクトースターゲティング基は、グルコース残基の修飾を介して、ガラクトース-ラクトース二糖であるラクトースを用い、容易に生成される。ラクトビオン酸 (LBA、グルコースがグルコン酸に酸化されているラクトース誘導体)は、標準的アミドカップリング技術を用いて、無水マレイン酸誘導体内に容易に取り込まれる。図2は、無水マレイン酸CDMにガラクトースをカップリングする2つのLBA誘導体の構造を示す。
【０１４６】
マレアマート修飾は、正に荷電したアミン基を負に荷電したものに変換する。この電荷修飾は、ポリマーと負に荷電した細胞および血清構成要素の非特異的相互作用を減少させ得る。しかし、あまりにも多い負電荷は、スカベンジャー受容体との相互作用を増進させ得る。正に荷電した三級アミン基をマスキング剤内に挿入して、双性イオンを生成することによって、純中性ガラクトース含有無水マレイン酸誘導体を生成してもよい。このような化合物、CDM-Pip-LBAは、構成要素のCDM、プロピルアミノピペラジン、およびラクトビオン酸から生成された (図2)。
【０１４７】
C. 立体安定化剤CDM-PEGおよびターゲティング基CDM-NAG (N-アセチルガラクトサミン) 合成 (図2) 
50 ml塩化メチレン中のCDM (Rozema 2003) (300 mg、0.16 mmol)の溶液に、塩化オキサリル (2g、10重量当量)およびジメチルホルムアミド (5μl)を添加した。反応を一晩進行させて、この時点で過剰な塩化オキサリルおよび塩化メチレンを回転蒸発によって除去して、CDM酸塩化物を得た。酸塩化物を1 mlの塩化メチレン中に溶解した。この溶液に、CDM-PEGの場合は1.1モル当量のポリエチレングリコールモノメチルエーテル (MW平均450)、またはCDM-NAGの場合は (アミノエトキシ)エトキシ-2-(アセチルアミノ)-2-デオキシ-β-D-グルコピラノシド (すなわちアミノビスエトキシルエチルNAG)、および10mlの塩化メチレン中のピリジン (200μl、1.5当量)を添加した。次いで、溶液を1.5時間攪拌した。次いで、溶媒を除去し、かつ生じた固体を5 mlの水中に溶解し、かつ0.1% TFA水/アセトニトリル勾配を用いた逆相HPLCを用いて精製した (図2)。
【０１４８】
実施例4. ポリマーへのポリヌクレオチドの可逆的付着
S-アセチル基でのアミノsiRNAオリゴの修飾は、アミン含有ポリカチオンの存在下、塩基性溶液 (pH≧9)中で放出され得る、安定に保護されたチオールを生じた。チオエステル基の除去のための標準的脱保護条件は、ヒドロキシルアミンとのインキュベーションを要する。しかし、これらの脱保護条件は、有意なsiRNAジスルフィド二量体形成を生じる。典型的には、アルキルアミンおよびチオエステル間の反応は比較的緩慢であるが、ポリアニオン性siRNAおよびポリカチオン性アミン間の複合体において、官能基間の反応は、本質的に分子内になり、かつ非常に加速された (図3中の工程2aを参照されたい)。脱保護の加速に加えて、放出されたチオールの、ポリカチオン上の活性化ジスルフィド基との反応が、非常に増進された (工程2b)。活性化ジスルフィドピリジルジチオール (PD)は、選択的ジスルフィド形成を確実にし、かつ市販の試薬を用いて、ポリカチオンに容易に付着された。これらの粒子内反応の結果は、ポリカチオンへのジスルフィドの>90%結合体化であった。
【０１４９】
実施例5. ポリマーへのポリヌクレオチドの可逆的結合体化
A. SATA修飾ポリヌクレオチド
5’アミン修飾siRNAを、水中で、1重量当量 (wt.eq.)のSATA試薬 (Pierce)および0.36 wt.eq.のNaHCO3と4℃で16時間反応させることによって、N-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセテート (SATA)修飾ポリヌクレオチドを合成した。9体積のエタノールを添加し、かつ-78℃で2時間インキュベーションすることによって、保護されたチオール修飾siRNAを沈殿させた。沈殿物を単離し、1 x siRNA緩衝液 (Dharmacon)中に溶解し、かつ260 nm波長で吸光度を測定することによって定量化した。
【０１５０】
1.5重量%の4-スクシンイミジルオキシカルボニル-α-メチル-α-[2-ピリジルジチオ]-トルエン (SMPT、Pierce)を添加することによって、本実施例ではPBAVEまたはDW1360 (5 mM TAPS pH 9中の30 mg/ml)であるポリマーを修飾した。SMPTを添加した1時間後、5 mM TAPS pH 9を含有する400μlの等張グルコース溶液に0.8 mgのSMPT-ポリマーを添加した。この溶液に、50μgのSATA修飾siRNAを添加した。PBAVE濃度が一定である用量反応実験のため、異なる量のsiRNAを添加した。次いで、混合物を16時間インキュベーションした。このような方法で、可逆的ジスルフィド結合を介して、ポリヌクレオチドをポリマーに結合体化した。ポリマーおよびsiRNA間の結合体化のためのジスルフィド結合は、細胞質の還元性環境において可逆性を提供する。溶液に、5.6 mgのHEPES遊離塩基を添加し、その後、3.7 mg CDM-NAGおよび1.9 mg CDM-PEGの混合物を添加することによって、siRNA-ポリマー結合体をマスキングした。次いで、注射前に、溶液を1時間室温 (RT)でインキュベーションした。
【０１５１】
B. 結合体化ポリヌクレオチドの定量化
結合体化siRNAの量を定量化するため、1μg siRNAを含有する、10μlアリコットのsiRNA-ポリマー結合体を、2μlの1 M DTTでまたは添加剤なしで、RTで16時間処理した。100μgポリアクリル酸および300μg NaClを試料に添加して、静電相互作用を中和した。2時間インキュベーションした後、試料を2%アガロースゲル上で電気泳動し、かつエチジウムブロミドでの染色によって、siRNAを視覚化した。Kodak Molecular Imaging Software v4.0を用いて、siRNAバンドを定量化した。結合体化されていないsiRNAの量を、DTT処理すると放出される量に対して基準化して、結合体化された割合を決定した。結合体化siRNAの量は、典型的には70〜90%であった。
【０１５２】
チオールがジスルフィドとして保護されるかまたはまったく保護されない、他のジスルフィド結合体化化学を用いてもよい。さらに、他の活性化ジスルフィド基、チオール基、または保護チオール基を用いて、ポリマーを修飾してもよい。
【０１５３】
実施例6. ポリヌクレオチド-ポリマー結合体に対するCDM-マスキング剤の可逆的付着
ポリヌクレオチド-ポリマー結合体をマレイン酸誘導体などで修飾して、ポリマーを可逆的に修飾してもよい (図3、工程4)。溶液に、5.6 mgのHEPES遊離塩基を添加し、その後、3.7 mg CDM-NAGおよび1.9 mg CDM-PEGの混合物を添加することによって、siRNA-ポリマー結合体をマスキングした。次いで、インビボ注射前に、溶液を室温 (RT)で1時間インキュベーションした。
【０１５４】
実施例7. マスキングされた結合体のターゲティング活性
CDM-PIP-LBA (ガラクトース含有)剤が、両親媒性ポリビニルエーテル25/75 (25:75 ブチル：アミン)PBAVEを肝臓にターゲティング可能である能力を立証するため、ポリマーをフルオロフォアCy3で標識し、その後、CDM-PEGで、かつCDM-Pip-LBAでまたはp-LBAなしで修飾した。400μl等張グルコース中の100μgのマスキングされたポリマーを、マウスの尾静脈内に注射した。注射1時間後に肝臓標本を取り除き、かつ凍結させた肝切片を調製し、かつ免疫組織化学のために加工処理した (図4)。図4に示すように、CDM-Pip-LBAターゲティング化ポリマーは、肝細胞内に広範囲に位置する (B)一方、ターゲティング化されていないポリマーは、主に、肝臓のマクロファージとともに局在した (A)。
【０１５５】
CDM-LBA修飾PBAVEは、非常に陰イオン性であり、かつ主に、マクロファージとともに見られた (未提示)。CDM-Pip-LBA (双性イオン性マスキング剤)で修飾されたポリマーは、ほぼ中性であり、かつ全体として、肝臓に、かつより重要なことに、特に肝細胞に、ターゲティングされたポリマー量の増加を示した (図4B)。CDM-PEGマスキング剤を含む立体安定化剤で、電荷、例えば負電荷を遮蔽することもまた可能である。
【０１５６】
実施例8. 肝細胞へのポリヌクレオチドのターゲティング
上述のようにオリゴヌクレオチド-ポリマー結合体を作製し、かつCDM-Pip-LBAでマスキングした。20μgのSATA/Cy3修飾siRNAを1.8 mgのPD修飾PLLに結合体化し、かつCDM-Pip-LBAで修飾した。マスキングされた結合体を、400μLの生理食塩水中、マウス尾静脈に注射した。同じ注射溶液中には、オレゴングリーンで標識された100μgのCDM-Pip-LBA修飾25/75-PBAVEがあった。結合体は可溶性であり、かつ生理学的条件下で非凝集性であった。注入1時間後、肝臓を採取して、かつ凍結肝切片を調製し、かつ免疫組織化学のために加工処理した。TO-PRO-3 (登録商標)を用いて、細胞核を染色した。マウス尾静脈内に注射した後、肝細胞において、標識オリゴヌクレオチドおよびPBAVEを観察した (図5の上部左パネル)。
【０１５７】
実施例9. 結合体のインビボ活性
マスキングされたポリヌクレオチド-ポリマー結合体が、マウス肝臓における内因性遺伝子、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アルファ (PPARa)を阻害するためのsiRNAを送達する能力を評価した。尾静脈を介して、400μLの等張グルコース中で、CDM-Pip-LBA修飾PPARa siRNA-PLL結合体 (20μg siRNA、1.8 mg PD-PLL)および25/75-PBAVE (100μg)を、C57Bマウス (n=4)に注射した。注射48時間後、肝臓からRNAを調製した。定量的リアルタイムPCR (qRT-PCR)を用いて、PPARa mRNAレベルを決定した。抗ルシフェラーゼsiRNAを注射した動物に対して、mRNAレベルを基準化した。mRNAレベルに対する変化を、内因性GAPDHに対して基準化した。3つの独立な実験を行った。図6に示すように、PPARa mRNAレベルの20%阻害が得られた。
【０１５８】
実施例10. 結合体のインビボ送達/活性
6〜8週齢の雄マウス (C57BL/6系統、20〜25 g)をHarlan Sprague Dawley (Indianapolis, IN)より得た。注射前にマウスを少なくとも10日間飼育した。給餌は、Harlan Teklad Rodent Diet (Harlan, Madison WI)を随意に与えて行った。0.4 ml注射の総体積で、HEPES緩衝 (5 mM pH 7.5)等張グルコースを、マウス尾静脈内に注入した。DNAまたはsiRNA結合体のいずれかをマウスに注射した。
【０１５９】
後眼窩出血による血清収集および肝臓採取前に、マウスを4時間絶食させた。ウェスタンアッセイ法で使用する血清を収集し、かつ等体積のEDTA含有完全プロテアーゼ阻害カクテル (Roche, Indianapolis IN)に添加し、かつ-20℃で保存した。製造者のプロトコルにしたがって、TRI-REAGENT (登録商標) (Molecular Research Center, Cincinnati OH)を用いて、採取直後に肝臓から総RNAを単離した。
【０１６０】
肝細胞ターゲティングを分析するため、総体積0.2 ml中、10μgのCy3標識した21量体dsDNAを上述のように配合し、かつ雄ICRマウス (20〜25 g、Harlan Sprague Dawley)に静脈内注射によって送達した。注射1時間後、マウスを屠殺し、かつ肝臓標本を切り出した。いくつかの実験において、肺、腎臓、脾臓、脳および膵臓由来の組織標本もまた切り出した。組織標本を、4%パラホルムアルデヒド/PBS中で6時間固定し、次いで、30%スクロース/PBS溶液中に4℃で一晩入れた。次いで、固定された組織標本を、OCT凍結培地 (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)を含有するブロックホルダー内に入れ、かつ液体窒素中でスナップ凍結した。Microm HM 505Nクリオスタット (Carl Zeiss, Thornwood, NY)を用いて、凍結組織切片 (8〜10μm)を調製し、かつSuperfrost-Plus顕微鏡スライド (Fisher Scientific)に乗せた。組織切片を、PBS中、ALEXA (登録商標)-488ファロイジン (13 nM、Invitrogen, Carlsbad CA)およびTO-PRO-3 (登録商標) (40 nM、Invitrogen)で20分間対比染色した。スライドをVectashield (Vector Laboratories, Burlingame CA)中でマウントし、かつLSM510共焦点顕微鏡 (Carl Zeiss)によって分析した。
【０１６１】
Cy3で標識した21量体の二重鎖DNAを含有するポリヌクレオチド-ポリマー結合体を注射した1時間後、マウスから採取した肝切片の共焦点顕微鏡写真を図7に示す (各パネルの上部左部分)。上部右部分にアクチンを示して、細胞の輪郭を示す。核を下部左部分に示す。融合図を下部右部分に示す。ポリマーがNAGターゲティング部分を含有する場合、肝細胞におけるCy3標識dsDNAの集積が観察され、クッパー細胞によって最低限にしか取り込まれないか、または肝類洞に最小限にしか集積しなかった (図7A)。分布は、肝臓の異なる葉全体でほぼ均一であった。他の臓器の観察により、肝臓より少なくとも20倍低いと概算されるレベルで、脾臓および腎臓に少量のCy3蛍光が見られた。非結合体化ポリヌクレオチド + ポリマー、または送達ビヒクル上のCDM-NAGをCDM-グルコースで置換したものの注射は、肝細胞取り込みの顕著な減少、ならびに脾臓および腎臓による取り込みの増加を生じ (それぞれ、図7Bおよび7C)、これはアシアロ糖タンパク質受容体に対してグルコースのアフィニティーが低いことと一致する。送達ビヒクル上のCDM-NAGをCDM-マンノースで置換することにより、マクロファージおよび肝内皮細胞ターゲティングの増加が生じた (図7D)。
【０１６２】
定量的PCRおよびインベーダー（Invader）アッセイ法
定量的PCRの調製において、製造者のプロトコルにしたがって、SUPERSCRIPT III (登録商標) (Invitrogen)およびオリゴ-dTプライマーを用いて、総RNA (500 ng)を逆転写した。Model 7500 Fast Real-Time PCR系 (Applied Biosystems, Foster City CA)を用いることによって、定量的PCRを行った。TAQMAN (登録商標) Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)を用いて、GAPDH mRNAプライマーおよびプローブを用いた3通りでの二重 (biplex)反応において、apoBおよびpparaに関するTAQMAN (登録商標)遺伝子発現アッセイ法を用いた。GAPDHプライマーおよびプローブ (IDT, Coralville IA)の配列は、以下の通りであった：
GAPDH-順方向
0005735573.tif 000016
；
GAPDH-逆方向
0005735573.tif 000017
；
GAPDH-プローブ
0005735573.tif 000018
。
【０１６３】
製造者の指示にしたがって、カスタム設計されたINVADER (登録商標) mRNAアッセイ法 (Third Wave Technologies, Madison WI)を用いて、ppara mRNAレベルの直接測定を行った。製造者の指示にしたがって、ユビキチンのためのプローブセットを用いて、二重反応を3通りで行った。
【０１６４】
ApoBウェスタン、サイトカインアッセイ法、ならびに肝臓毒性および代謝パネル
3〜8%ポリアクリルアミド/SDSゲルの電気泳動によって、血清タンパク質(0.1μl)の分離を達成した。分離されたタンパク質を、電気泳動によりPVDF膜に転写して、その後、1:5000希釈のウサギポリクローナル抗ApoB抗体 (Biodesign International, Saco ME)とインキュベーションした。次いで、ブロットを西洋ワサビ (horseradish)ペルオキシダーゼ (Sigma)に結合体化された1:80,000希釈のヤギ抗ウサギ抗体とインキュベーションし、かつ増進化学発光検出キット (Amersham Biosciences, Piscataway NJ)を用いて抗体結合を検出した。製造者の指示にしたがって、試薬を用いて、サンドイッチELISAによって (R&D Systems, Minneapolis MN)、マウスサイトカインTNF-αおよびIL-6の血清レベルを測定した。製造者の指示にしたがって、サンドイッチELISAキットを用いて (PBL Biomedical, Piscataway NJ)、マウスIFN-αの血清レベルを測定した。Marshfield Clinic Laboratories Veterinary Diagnostic Division (Marshfield WI)で、自動化系を用いて、ALT、AST、コレステロール、およびトリグリセリドの血清レベルを測定した。
【０１６５】
siRNA結合体処置マウスにおけるサイトカインおよび肝酵素の血清レベル
0005735573.tif 000019
n=5、データは平均±s.d.として示される。
【０１６６】
実施例11. マウス肝臓におけるターゲット遺伝子のノックダウン
インビボで、系がsiRNAを送達し、かつターゲット遺伝子発現をノックダウンする能力を立証するため、apoB-1 siRNA (800μgポリマー、50μg siRNA)を含有する結合体を、C57Bl/6マウス内に注射した。インビボ・ターゲティング研究におけるように、尾静脈注入によって、siRNA結合体を投与した。注射2日後に、注射したマウスから肝臓を採取し、かつ逆転写酵素定量的PCR (RT-qPCR)を用いて、apoB mRNAレベルに関してアッセイした。相対的apoB mRNAレベルにおける何らかの相違がハウスキーピング遺伝子発現に対する非特異的影響のためである可能性を減少させるため、GAPDH mRNAレベルおよびμg総インプットRNAに対して、apoB mRNAレベルを測定した。図8Aに示すように、apoB-1 siRNA結合体で処置されたマウスは、非apoB対照siRNAを投与されたマウスまたは生理食塩水のみを注射されたマウスに比較して、注射2日後に測定した場合に、有意に減少したapoB mRNAレベルを有した (n=5、p<0.00001)。特に、apoB-1 siRNA結合体を投与されたマウスにおける、GAPDH mRNAレベルに対する平均apoB mRNAレベルは、生理食塩水処置された群に比較して、76±14%減少し、一方、対照siRNAを注射されたマウスでは、apoB mRNAレベルは影響を受けなかった。apoB mRNAレベルを総RNAに対して測定した場合も、類似の結果を得た。血清中のapoB-100タンパク質レベルのウェスタンブロット分析は、肝臓apoB mRNAレベルの減少を反映した (図8)。
【０１６７】
apoBノックダウンの特異性を確認するため、別個の群のマウスを、apoB mRNAの異なる領域をターゲティングするsiRNAで処置した。apoB-2 siRNA結合体を投与されたマウスもまた、apoB mRNAレベルの有意な減少を示した (60±6%減少、n=5、p<0.00001、図8A)。血清中のapoB-100タンパク質レベルのウェスタンブロット分析は、肝臓apoB mRNAレベルの減少を反映した (図8B)。ApoB mRNA発現は、apoB遺伝子を発現する別の組織である十二指腸では減少せず、結合体がこの組織をターゲティングしないことが示唆された。この組織特異的活性は、肝細胞ターゲティングと一致する。
【０１６８】
本発明者らはまた、肝臓の脂肪酸代謝を制御する場合に重要な遺伝子である、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アルファ (ppara) (Kersten 1999、Schoonjans 1996)をターゲティングするsiRNAを含有する結合体も調製した。pparaをターゲティングする2つの異なるsiRNAの送達は、mRNAレベルを定量化するための2つの独立の方法によってアッセイした場合、ppara mRNAレベルの有意なノックダウンを生じた (図8C)。対照siRNAを投与されたマウスに対して、ppara-1 siRNAを投与されたマウスでは、それぞれ、IINVADER (登録商標)またはRT-qPCRによってアッセイした場合、ppara mRNAレベルが、40±9%〜64±9%の間で減少した。ppara mRNA配列の別の領域をターゲティングする、ppara-2 siRNAを含有する送達ビヒクルを注射されたマウスでは、ppara mRNAレベルの類似の減少が観察された。
【０１６９】
肝臓酵素およびサイトカインの血清レベルを測定することによって、送達系の潜在的毒性を評価した。注射48時間後、生理食塩水で処置されたマウスに比較した場合、対照siRNAまたはapoB-1 siRNA結合体を投与されたマウスでは、ALTおよびASTレベルのわずかな上昇が検出された。しかし、増加レベルは有意ではなく (p<0.05)、かつ肝切片の組織学的検査は、肝毒性の徴候を明らかにしなかった。同様に、ELISAを用いた血清中のTNF-αおよびIL-6レベルの分析によって、どちらも、siRNA-ポリマー結合体の注射6時間後にわずかに上昇したが、48時間後までにはベースラインに回復することが明らかになった。6時間の時点で観察された増加は、有意な免疫刺激を引き起こすとは予期されず、かつリポ多糖で刺激すると観察されるもの (Matsumoto 1998、Matsuzaki 2001)より少なくとも4桁低く、かつアデノウイルス注射後に観察されるもの (Lieber 1997、Benihoud 2007)より1〜3桁低かった。apoB-1 siRNA結合体の注射6時間後、わずかな増加があったほかは、INF-αの血清レベルには、どの時点でも、有意な相違が検出されなかった。これらの結果は、ターゲティング化送達系がよく許容されることを示す。
【０１７０】
実施例12. 用量反応および表現型分析
本発明者らは、マウスに送達されるsiRNA結合体の量を減少させることによるか、またはポリマーの量を一定に維持するが、結合体化siRNAの量を減少させることによる、2つの方法で、用量反応研究を行った。これらの実験結果を比較することによって、本発明者らは、送達ビヒクルの2つの構成要素のエンドソーム溶解性ポリマーまたはsiRNA自体のどちらが、送達を限定するのかを決定することを期待した。
【０１７１】
マウスに、apoB-1 siRNA結合体の単純な連続希釈を注射することにより、肝臓apoB mRNAのノックダウン量の漸進性の減少が導かれた (図9A)。最高注射用量 (800 μgポリマー、50μg siRNA、すなわち2.5 mg/kg)で、GAPDH mRNAに対する肝臓中のapoB mRNAレベルは、生理食塩水のみを注射されたマウスに比較して、注射後、第2日、84±5%減少した。apoB mRNAレベルを総RNAに対して測定した場合も、類似の結果を得た。2倍少ないsiRNA結合体 (400μgポリマー、25μg siRNA)を注射することにより、相対的apoB mRNAレベルにおいて、50±8%の減少が生じた。4倍少ない量を注射することにより、生理食塩水対照群と比較した場合、apoBノックダウンはまったく生じなかった。ポリマーの量を一定に維持するが、送達ビヒクルに結合体化させるapoB-1 siRNAの量を減少させることにより、連続希釈から得られるものと定量的に類似の結果が導かれた (図9B)。この知見は、送達ビヒクル中に存在するエンドソーム溶解性ポリマー量は、観察されるノックダウンの限定要因ではなく、むしろ、結合体化されるsiRNAの量または強度が限定要因であることを示唆する。
【０１７２】
apoB欠損の特徴は、VLDL組み立ておよび肝臓からのコレステロール輸送が損なわれることによる、血清コレステロールレベルの減少である (Burnett Zimmermann 200602)。図10に示すapoBのノックダウンレベルが、これらのマウスにおいて、生理学的反応を誘発するのに十分であるかどうかを決定するため、総血清コレステロールレベルを測定した。最高の送達siRNA用量 (50μg)で、本発明者らは、対照siRNAまたは生理食塩水のみを投与されたマウスに対する平均血清コレステロールレベルの有意な減少 (30±7%、n=5、p<0.001)を観察した (図10)。apoB-2 siRNA結合体で処置した動物において、類似の結果を得た。送達するsiRNA量の減少は、観察されるコレステロール低下量の漸進性減少のつながり、これは、これらの動物で測定されるapoB mRNAノックダウンの減少と一致した。
【０１７３】
肝臓でVLDL組み立てが損なわれ、かつその結果、VLDL搬出が減少することにより、トリグリセリドもまたVLDL粒子内に取り込まれるため、肝臓トリグリセリドレベルも改変されると予期され得る (Gibbons 2004)。実際、家族性低ベータリポタンパク質血症患者に見られる型と類似のapoBの一部切除型を発現しているトランスジェニックマウスもまた、肝臓トリグリセリドを輸送する能力の減少を示す (Chen 2000)。トリグリセリド輸送に対するapoBノックダウンの影響を評価するため、本発明者らは、apoB-1 siRNA結合体を注射したマウスから得た肝切片のオイルレッド染色を行った。肝切片を調べることにより、対照マウスに比較して、肝臓脂質含量の劇的な増加が明らかになった (図11)。パネルAは、ApoB siRNAで処置したマウスを示す。パネルBは、陰性対照GL3 siRNAで処置したマウスを示す。パネルCは、生理食塩水のみを注射したマウスを示す。血清トリグリセリドレベルの減少もまた、これらのマウスで観察され、肝臓トリグリセリド搬出能の減少のさらなる証拠が提供された。総合すると、これらの結果は、apoB-1 siRNA結合体の単純な静脈内注射によって、肝細胞に対するポリヌクレオチドの機能性送達が生じ、したがって、肝臓におけるapoB発現のノックダウンが生じ、予期される表現型上の影響が伴うことを示す。
【０１７４】
肝臓脂肪集積を分析するため、siRNA結合体処置マウスおよび対照マウス由来の肝臓標本を、OCT凍結培地中で凍結させ、かつ上述のように凍結組織切片 (8〜10μm)を調製した。風乾組織切片を4%ホルムアルデヒド/PBS中で20分間固定し、再蒸留水を数回変えてリンスし、次いで、60%イソプロパノールで簡単にリンスした。100 mlのイソプロパノール中、0.5 gのオイルレッドOを一晩混合することによって、オイルレッドOストック溶液を調製し、かつWhatman #1ろ紙を用いてろ過した。30 mlのオイルレッドOストック溶液と20 mlの水を混合することによって、オイルレッドO作業溶液を調製し、かつ0.2μm Nalgeneろ過装置 (Fisher Scientific)を用いてろ過した。固定切片を、新鮮に調製したオイルレッドO作業溶液で15分間染色し、60%イソプロパノールで簡単にリンスした。スライドをHarris修飾ヘマトキシリン溶液 (Sigma, St. Louis MO)内に7回浸すことによって、核の対比染色を行い、かつ再蒸留水でリンスした。次いで、リンスしたスライドをGel Mount (Biomedia Corp., Foster City CA)でマウントした。デジタルカメラ (Axiocam, Carl Zeiss)を備えたZeiss Axioplan 2顕微鏡を用いて、染色したスライドを分析した。AxioVisionソフトウェア (Carl Zeiss)を用いて、デジタル画像を捕捉した。
【０１７５】
実施例13. CDMまたはジスルフィド不安定連結による、膜作用性ポリマーへの結合体化によるsiRNAの送達
ジスルフィド結合体：
センス鎖上に5’-アミノ基を有する、ルシフェラーゼに対してターゲティングされた50 ngのsiRNAを、HEPES塩基pH 7.5の存在下で、1μgのN-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセテートと反応させた。これとは別に、アミン保護およびブチルビニルエーテルモノマーの50/50混合物から合成された50μgのポリビニルエーテルを、HEPES pH 7.5の存在下で、5μgの3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させた。次いで、修飾siRNAおよび修飾ポリマーを合わせて、ポリマーへのsiRNAの共有結合を可能にした。6〜24時間後、ポリマー-siRNA結合体を、HEPES塩基の存在下で、200μgの2-プロピオン酸-3-メチルマレイン酸無水物と反応させた。ルシフェラーゼ遺伝子を安定して発現するマウス肝細胞HEPA細胞株に粒子を添加した。対照として、CDM修飾ポリマーを含有する試料(siRNAを含まない)を細胞に添加した。ポリマー-ポリヌクレオチド結合体に曝露された細胞では、ポリマーのみに曝露された細胞に対するルシフェラーゼ発現が75%抑制され、細胞に機能性siRNAが送達されたことが示された。
【０１７６】
CDM結合体：
センス鎖上に5’-アミノ基を有する、ルシフェラーゼにターゲティングされた50 ngのsiRNAを、HEPES pH7.9の存在下で、2μgのCDMチオエステルと反応させた。siRNAに、アミン保護およびブチルビニルエーテルモノマーの50/50混合物から合成した50μgのポリビニルエーテルを添加した。6〜24時間後、ポリマー-siRNA結合体を、HEPES塩基の存在下で、200μgの2-プロピオン酸-3-メチルマレイン酸無水物と反応させた。ルシフェラーゼ遺伝子を安定して発現するマウス肝細胞HEPA細胞株に粒子を添加した。対照として、CDM修飾ポリマーを含有する(siRNAを含まない)試料を細胞に添加した。ポリマー-ポリヌクレオチド結合体に曝露された細胞では、ポリマーのみに曝露された細胞に対するルシフェラーゼ発現が86%抑制され、細胞に機能性siRNAが送達されたことが示された。
【０１７７】
膜作用性ポリマーsiRNA結合体を用いたHEPA-Luc細胞のトランスフェクション後のルシフェラーゼ活性の阻害パーセント
0005735573.tif 000020
【０１７８】
実施例14. apoBノックダウンおよびその表現型上の影響の長さ
本発明者らは、apoB-1 siRNA結合体の単回用量注射後のマウスにおけるapoBノックダウンおよびコレステロール低下の期間を決定する経時的実験を行った。先のセクションに記載した本発明者らの結果と一致して、apoB-1 siRNA結合体 (800μgポリマー、50μg siRNA)を注射した結果、第2日に、対照マウスに対する平均apoB mRNAレベルが87±8%減少した (図12A)。apoB発現の減少には、総血清コレステロールレベルの42±5%の減少が付随した (図12B)。apoB mRNA発現減少は、第10日まで有意なままであり、かつ第15日までに、対照レベル近くまで戻った。血清コレステロールの減少は、第4日まで有意なままであり (n=5、p<0.01)、かつ第10日まで、対照レベルに完全に回復しなかった。これらの結果は、apoBノックダウンの維持および表現型の生成が、siRNA結合体の単回注射後に達成可能であり、かつapoB発現が、長期的に正常レベルに戻るにつれて、表現型が逆転可能であることを示す。
【０１７９】
実施例15. ポリマー-PMO結合体を用いた、細胞へのホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド (PMO)の送達
siRNAおよびポリマーを連結するのに用いたCDM-チオエステルに基づく架橋を用いて、他の種類のオリゴヌクレオチドをポリマーに可逆的に結合体化することもまた可能である。特に、本発明者らは、細胞へのPMOの送達を研究した。裸であるかまたはDNAの相補鎖にハイブリダイズしたか、いずれかの5 nmolのアミノ-PMO (突然変異体ルシフェラーゼ転写物中の突然変異体スプライス部位をブロッキングする)を、HEPES pH 7.9の存在下、何とも反応させないか、または2μgのCDMチオエステルと反応させた。これに、50%アミノビニルエーテル、45%ブチルビニルエーテルおよび5%ドデシルビニルエーテル (DW550)から合成した200μgのポリビニルエーテルを添加した。3時間またはそれより長時間経った後、ポリマー + PMOまたはポリマー-PMO結合体を、pH>7.5を維持するためHEPESの存在下で、500μgのCDMと反応させた。CDMに加えて、CDMの酸塩化物および多様な分子量のPEGモノメチルエーテルから得られる、CDMのPEGエステルと、結合体を反応させた。次いで、HeLa細胞に用いる条件下で増殖させたHeLa Luc/705細胞 (Gene Tools, Philomath OR)に、結合体を添加した。3 x 106細胞/ウェルの密度で24ウェル培養プレート中に細胞をプレーティングし、かつ24時間インキュベーションした。2.5 nmolアミノ-PMO複合体を含有する1.0 ml DMEMで培地を交換した。細胞を加湿5%CO2インキュベーター中、37℃で4時間インキュベーションした。次いで、10%ウシ胎児血清を含有するDMEMで培地を交換した。次いで、細胞をさらに48時間インキュベーションした。次いで、細胞を採取し、次いで、ルシフェラーゼ発現に関して、溶解物をアッセイした。結果から、トランスフェクション剤がDW550ポリビニルエーテルポリマー-PMO結合体である場合、非荷電ポリヌクレオチドの送達が増進されることが立証される。
【０１８０】
細胞への非荷電ポリヌクレオチドの送達
0005735573.tif 000021
【０１８１】
実施例16. 筋肉に対するsiRNAの結合体送達
40μg PPARa siRNAまたは対照 (GL3) siRNAをPBAVEポリマーに結合体化し、かつ上述のようにマスキングした。250μlの結合体を、マウスにおいて、腓腹筋内に注射した (n=3)。注射速度は、約25μl/秒であった。PPARa発現レベルを上記のように決定した。
【０１８２】
マスキングされた結合体の直接注射後の筋肉におけるPPARa阻害
0005735573.tif 000022
【０１８３】
実施例17. siRNA発現カセットのインビボ送達
U6プロモーターの制御下で、SEAP siRNAを発現する20μgのPCR生成直鎖SEAP siRNA発現カセットを、400μgの膜作用性ポリマーDW1453 (75 mol%のアミノ、21 mol%のより低次のアルキル (ブチル)および4 mol%のより高次のアルキル (C18、オクタデシル)基の重合で構成され、かつラクトビオン酸 (LBA)とガラクトースで修飾されている)と複合体化した。43 mg LBAを60 mgポリマーに添加し、その後、34 mg EDCおよび24 mg NHSを添加することによって、ラクトビオン化を行った。対照として、ルシフェラーゼsiRNA (GL3)を発現するカセットもまた配合した。0.65重量当量のグルタルアルデヒドを添加することによって、DNAをポリマーに結合体化した。一晩、結合体化した後、40モル% NHS-アセテートで複合体を修飾して、ポリマー上の電荷を還元した。
【０１８４】
500μgのラクトビオン化DW1453を、14重量当量のHEPES塩基の存在下で、7重量当量のマスキング剤CDM-PEG (平均10単位)で修飾し、かつ分泌アルカリホスファターゼ (SEAP)を発現するマウス尾静脈内に注射した。マスキングされたポリマーを注射した10分後、同時ターゲティング化DNA-DW1453ポリマー結合体を注射した。第1日および第14日、血液を抜き取って、かつSEAPレベルに関してアッセイした。
0005735573.tif 000023
活性は、4匹の動物の平均±標準偏差であった。
【０１８５】
実施例18. 抗体の送達
35μgのウサギIGG (Sigma)抗体を2重量% SPDP (Pierce)で修飾した。2重量%イミノチオランを添加することによって、DW1360 (5 mM TAPS pH 9中、30 mg/ml)を修飾した。5mM TAPS pH 9を含有する400μlの等張グルコース溶液に、530μgのイミノチオラン-PBAVEを添加した。この溶液に35μgのSPDP-修飾抗体を添加した。16時間後、抗体-ポリマー結合体を7重量当量のCDM-NAGおよびCDM-PEGの2:1混合物で修飾した。結合体を、マウス尾静脈内に注射した。注射20分後、マウスを屠殺し、かつ肝臓を採取して、かつ顕微鏡分析のため、加工処理した。肝臓組織の検査により、肝細胞中に抗体が有意に集積していることが示された (図13)。上部左部分は、標識抗体を示し、上部右部分はアクチンを示し、下部左部分は核を示し、かつ下部右部分は、合成画像を示す。
【０１８６】
実施例19. インビトロ・トランスフェクション試薬としての、マスキングされたポリヌクレオチド-ポリマー結合体
先に記載されたような2工程コラゲナーゼ灌流法 (Klaunig 1981)を用いて、成体マウス (C57BL/6系統)から初代肝細胞を採取した。トリパンブルー排除によって決定した場合、肝細胞生存度は、85〜90%であった。10%ウシ胎児血清を含有する1 mlの培地中、コラーゲンをコーティングした12ウェルプレート中、ウェルあたり、1.5 x 105細胞の密度で、肝細胞をプレーティングした。プレーティングした24時間後、3通りのウェル中の細胞を、培地を交換せずに、製造者のプロトコルにしたがって、TRANSIT-SIQUEST (登録商標) (Mirus Bio, Madison WI)を用い、siRNAで、または異なる量のsiRNA結合体で、トランスフェクションした。トランスフェクション24時間後に肝細胞を採取し、かつTRIREAGENT (登録商標)試薬 (Molecular Research Center, Cincinnati OH)を用いて、総RNAを単離した。
【０１８７】
記載したマスキングされたポリヌクレオチド-ポリマー結合体のインビトロ・トランスフェクション特性を立証するため、市販のsiRNAトランスフェクション試薬または記載するポリヌクレオチド結合体を用いて、アポリポタンパク質B (apoB)特異的siRNAを初代肝細胞に送達した。結合体での初代肝細胞のトランスフェクションは非常に有効であり、apoB mRNAのほぼ80%のノックダウンを生じた (図14)。siRNA送達レベルは、ターゲット遺伝子ノックダウンによって測定した場合、市販の試薬SIQUEST (登録商標)で達成されたものに匹敵した。予測されるように、細胞に添加された結合体の量の減少は、apoBノックダウンの漸進性の減少を導いた。
【０１８８】
実施例20. インビトロ・トランスフェクション試薬としての、マスキングされたポリヌクレオチド-ポリマー結合体
TRANSIT LT1 (登録商標) (Mirus Bio)を用いて、ホタル (firefly)およびウミシイタケ (renilla)ルシフェラーゼをコードするプラスミドで、Hepa-1c1c7細胞をトランスフェクションした。プラスミドトランスフェクションの4時間後、9μg PD-PLLと結合体化し、その後、CDM-Pip-LBA (45 g)で修飾した、100 ngのルシフェラーゼsiRNAを、細胞に添加した。いくつかの試料に関して、CDM-Pip-LBAで修飾した25/75-PBAVE (5μg)を細胞に添加した。siRNAを添加した48時間後、細胞を採取し、かつホタルおよびウミシイタケ・ルシフェラーゼに関してアッセイした。各試料に関してはウミシイタケに対して、かつ各グループに関してはsiRNAに曝露されていない細胞に対して、ホタル発現量を基準化した。単独では、PLL-siRNA結合体は、インビトロで、細胞にsiRNAを送達することは不可能である (白色バー、図15)。マレアマートでマスキングされた、膜溶解性ポリマーPBAVEの添加は、市販のトランスフェクション試薬 (黒色バー)と等しい活性を生じる。一般的に、siRNAおよびDNAトランスフェクションは、過剰な試薬を必要とするようである。siRNAと相互作用するのに必要なものより多い過剰な放出ポリマーは、インビトロおよびインビボ機能的送達 (エンドソームからの放出)を増進可能である。siRNA-ポリマー結合体およびポリマー間では、サイズおよび荷電が類似であるため、これらは、インビボで肝細胞を同時にターゲティング可能である。この予測を裏付けて、本発明者らは、オレゴングリーンで標識した25/75-PBAVEでPLLに結合体化したCy3標識siRNAの同時注射が、実際に肝細胞に同時局在することを観察した (上記を参照されたい)。
【０１８９】
送達ポリマーを含むsiRNA結合体のインビトロ活性は、市販試薬TRANSIT TKO (登録商標)でトランスフェクションした非結合体化siRNAに等しい(図15)。ヨードアセトアミドアルキル化化学反応に基づく、siRNAおよびポリマーの不可逆的連結を用いた平行実験 (IA-結合体、図15の点を打ったバー)は、結合体化が可逆的でない場合には、siRNA-ポリマー結合体が活性でないことを立証し、siRNAの機能的送達のためには、ジスルフィド結合を還元しなければならないことを示唆した (観察される20%ノックダウンは、ゲル分析によって決定されるように、結合体化されていないおよそ10%のオリゴのためである)。マレアマート化結合体に関して観察された活性は、ポリマーがもはや正荷電でなく、かつ静電力によってオリゴヌクレオチドと相互作用している場合であっても、siRNA結合体が血清中のヌクレアーゼによる分解に対して耐性であることを示唆する。ヌクレアーゼ耐性である修飾siRNA類似体もまた使用可能である。
【０１９０】
実施例21. 膜作用性ポリマーへのマスキング剤およびポリヌクレオチドの付着のための不安定な連結
A. PEGスペーサーを含む、pH不安定な結合
ASGP-Rリガンドターゲット基の1つの態様は、以下のように調製可能である。
0005735573.tif 000024
化合物I
2-アセトアミド-3,4,6-トリ-O-アセチル-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシドの(アミノエトキシ)エチル誘導体
0005735573.tif 000025
化合物II
N-アセチル-ガラクトサミン-PEG-メチルマレイン酸無水物
【０１９１】
PBAVEポリマーなどのアミン含有性膜作用性ポリマーを可逆的に修飾することが可能なガラクトースターゲティング基マスキング剤である化合物IIを生成する前駆体として、化合物Iを用いた。無水マレイン酸をポリマー上のアミン基と反応させた結果、ガラクトースおよびポリマーの間にpH不安定連結が形成される。PBAVEポリマーを化合物IIで修飾すると以下の化合物が生じる。
0005735573.tif 000026
化合物III
【０１９２】
PBAVEアミノ基の化合物III (0.75:1の化合物III対ポリマーアミンモル比) およびCDM-PEG500 (0.25 CDM-PEG対ポリマーアミンモル比)での修飾は、インビボで肝細胞へのターゲティングを示す結合体を生じた。エチレン基の多様なスペーサー長 (n = 1、2、3、または7)はすべて、ターゲット遺伝子発現のノックダウンによって立証されるように、インビボで肝細胞にsiRNAを送達する場合に有効であった。
【０１９３】
B. アルキルスペーサーを含むpH不安定な結合
化合物Vに例示するようなアルキルスペーサー基もまた、使用可能である。しかし、アルキルスペーサーは、マスキング剤の疎水性を増加させて、マスキング剤および結合体のより低い可溶性を生じる可能性もある。
0005735573.tif 000027
化合物V
N-アセチル-ガラクトサミン-C6-メチル無水マレイン酸マスキング剤
【０１９４】
C. 多価ターゲティング基
より高い価のターゲティング基もまた利用可能である。多価ガラクトースターゲティング基の例示的な態様を以下に例示する。二価 (VI)および三価 (VII)ガラクトースリガンドが、ASGP-Rに対するより高いアフィニティーを有することも可能である。
0005735573.tif 000028
化合物VI
0005735573.tif 000029
化合物VII
【０１９５】
D. 陰性対照ターゲティングリガンド
ターゲット細胞に対して有意により低いアフィニティーを有する関連ターゲティング基を、陰性対照として用いて、好ましいターゲティング基の有効性を決定してもよい。例えば、肝細胞のASGP-Rはガラクトースに結合するが、グルコースに結合しない。したがって、グルコースターゲティング基 (VIII)は、細胞ターゲティングアッセイ法において、陰性対照として働き得る。
0005735573.tif 000030
Glcβ-異性体
VIII
【０１９６】
E. マンノースターゲティング基
マクロファージおよび肝臓クッパー細胞は、マンノース糖に結合する受容体を有することが公知である。したがって、マンノース残基を含むターゲティング基(IX)を用いて、これらの細胞をターゲティングしてもよい。
0005735573.tif 000031
Manα-異性体
IX
【０１９７】
F. 多様な不安定性を持つ連結
多様な不安定性 (開裂力学)の連結を用いて、マスキング剤またはポリヌクレオチドを膜作用性ポリマーに連結してもよい。
【０１９８】
アンチセンスポリヌクレオチドを送達するため、結合体からのポリヌクレオチドの放出速度を減少させることによって、ノックダウンの期間を増加させることも可能であり得る。典型的な哺乳動物細胞中の還元性環境において、多様な開裂動力学で、ジスルフィド結合を作製してもよい。ポリマーからのマスキング剤の緩慢な放出は、インビボで結合体の循環時間を増加させ得る。例えば、5-メチル-2-イミノチオラン (M2IT、連結X)は、SMTP連結 (化合物XI)よりも4x遅い開裂速度を示す。
0005735573.tif 000032
【０１９９】
化合物XIIの開裂速度は、二置換無水マレイン酸連結よりも約30x緩慢であると予期される。
0005735573.tif 000033
【０２００】
実施例22. PBAVEおよびポリヌクレオチド-PBAVE結合体の特徴付け
A. 両親媒性分析
1,6-ジフェニル-1,3,5-ヘキサトリエン (DPH、Invitrogen)蛍光 (λex = 350 nm；λem = 452 nm)は、疎水性環境で増進される。このフルオロフォアを用いて、PBAVE (DW 1360)ポリマーを分析した。0.5 mlの50 mM HEPES緩衝液、pH 8.0中の40μgプラスミドDNAの存在下または非存在下で、0.5μM (最終濃度)DPHを10μg PBAVEに添加した。次いで、DPHの蛍光を測定することによって、疎水性環境中のDPH集積に関して、溶液を試験した。結合体存在下でのDPH蛍光の増加は、ポリマーによる疎水性環境の形成を示す。過剰なDNAの添加は、DPH蛍光を有意には改変しなかった (図16)。
【０２０１】
B. 分子量
HPLCサイズ排除クロマトグラフィーおよび標準としての一組のポリエチレングリコール (American Polymer Standard Corp.)を用いて、DW 1360の分子量を決定した。メタノール中の0.2 M LiClO4、5%AcOHとともに、Shodec SB-803 HQカラムを用いたGPC HPLC上で、ポリマーを分離した。カラムからのPBAVEポリマーの溶出は、約12.8 kDaの平均サイズを示した (図17)。
【０２０２】
C. ポリヌクレオチド-ポリマー結合体の分子量
FPLCサイズ排除クロマトグラフィーおよび標準としてのCy3標識核酸を用いて、マスキングされたポリヌクレオチド-ポリマー結合体の分子量を決定した。1 x 22 cm Sephacryl S-500カラムを用いて結合体および標準をShimadzu FPLC上で分離し、かつ1 ml/分の50 mM HEPES、pH 8.0で溶出させた。カラムからの結合体の溶出は、約77 kDaの平均サイズを示した (図18)。
【０２０３】
D. 結合体化学量論
PBAVEポリマーの平均分子量は、約13 kDaであると実験的に決定された。マスキングされたポリヌクレオチド-ポリマー結合体の平均分子量は、約77 kDaであると実験的に決定された。PBAVEポリマーの電荷 (アミン)あたりの平均分子量は、約200 Daであると実験的に決定された。CDMマスキング剤の平均分子量は、約550 Daであると計算された。PBAVEポリマーの平均の修飾度合いは、利用可能なアミンの約75%であると実験的に決定された。結合体siRNAの平均分子量は、約14 kDaであると計算された。これらの値を用いて、CDMでマスキングされたPBAVEポリマーマスキング剤の平均分子量は、約30 kDaであると計算された。したがって、マスキングされたポリマーに対するsiRNAのあり得る化学量論は、約1:2であると概算された。
【０２０４】
E. 粒子サイズ決定およびゼータ電位
インビボで注射する結合体のサイズは、Brookhaven Instruments Corporation, ZetaPlus Particle Sizer, 190を用いて、532 nmの光散乱によって測定された。ピークの単一モードの分析は、100〜30 nmの間で多様であった。多モード分析を用いた場合、粒子の最大数 (>95%)を含むピークは、50 nmより小さく、かつより典型的には20 nmより小さかった。ポリ結合体サイズはまた、分析的超遠心または原子間力顕微鏡を用いても測定可能である。同じ方法で、Brookhaven Instruments Corporation ZetaPALSを用いて、結合体のゼータ電位を測定した。CDM-マスキングされた結合体のゼータ電位は、0〜-30 mVの間で多様であり、かつより大部分0〜-20 mVの間で多様であった。ゼータ電位は、5 mM TAPSでpH 9に緩衝された等張グルコース中で測定された。安定な非凝集結合体もまた、同じ条件下で、0〜-10 mVの間、および0〜-5 mVの間のゼータ電位を伴って形成された。pH 7では、結合体は、アミンのいくつかのプロトン化のため、ある程度の正電荷を獲得すると予期されるであろう。
【０２０５】
実施例23. ヌードマウスにおけるヒト肝細胞腫異種移植片への結合体のインビボ送達
記載した結合体が腫瘍細胞をターゲティングするのに利用可能であることを立証するため、側腹部にヒト肝癌HepG2細胞を皮下 (SC)移植したマウスに、CDM-NAG修飾したオリゴヌクレオチド-DW1360結合体を注射した。6週齢の雌無胸腺ヌードマウスをHarlan Spraque Dawley (Indianapolis, IN)から得た。マウスの左側腹部に、300μl PBS中の200万のHepG2細胞を皮下接種した。2週間後、対照結腸癌腫HT-29細胞 (PBS 300μl中200万)を右側腹部にSC接種した。注射を後にするのは、増殖速度がより迅速であるのを補償するためであった。SC腫瘍が、幅および長さおよそ8 mmまで増殖した場合に、200μlの送達緩衝液中10μg Cy3標識21量体dsDNAを含有するCDM-NAGおよびCDM-PEG修飾した結合体を、尾静脈を介して注射した。
【０２０６】
NAGターゲティング化結合体の集積が、SC肝細胞腫塊のかなりの割合で観察された (30〜60%、n = 4、図19A)。取り込みを示す腫瘍細胞の代表的な領域を図19Aに示す。グルコースターゲティング化結合体を投与されたマウスでは、非常に低レベルの腫瘍ターゲティングしか観察されなかった (図19B、腫瘍塊の<5%、n = 3)。ガラクトース受容体を含まない対照結腸癌腫瘍において、NAGまたはグルコース修飾結合体のいずれでも、腫瘍細胞シグナルは観察されなかった (図19 C〜D、n = 2)。異種移植片を確立するのにHuH-7肝癌細胞を用いてもまた、類似の結果が観察された。
【０２０７】
実施例24. 結合体化前の可逆的PEG修飾でのポリマーの修飾
400μgのポリマーDW1360 (75:20:5のアミン：ブチル：オクタデシルビニルエーテルの供給比から形成されるもの)を1.5重量% SMPTで修飾した。1時間後、CDM-NAG (N-アセチルガラクトースアミン)およびCDM-PEG (平均11単位)の2:1 重量：重量混合物の2重量当量を、5.6 mgのHEPES塩基の存在下で、ポリマーに添加した。この溶液に、20μgのSATA/Cy3修飾22量体DNAオリゴヌクレオチドを添加した。一晩インキュベーションした後、CDM-NAGおよびCDM-PEGの2:1 重量：重量混合物の5重量当量を結合体に添加した。マスキングされた結合体を、400μlの生理食塩水中で、マウスの尾静脈内に注射した。結合体化前のCDM-NAGおよびCDM-PEGでのポリマーの修飾は、結合体有効性を減少させないことが決定された。注射1時間後、肝臓を採取して、かつ凍結肝切片を調製し、かつ免疫組織化学のために加工処理した。TO-PRO-3 (登録商標)を用いて、細胞核を染色した。マウス尾静脈内に注射した後、肝細胞における標識オリゴヌクレオチドを観察した。
【０２０８】
実施例25. CDM試薬修飾後の結合体中のアミン基の定量化
オリゴヌクレオチド-DW1360結合体ポリマーを先に記載するように合成し、その後、14重量当量HEPES塩基、ならびにCDM-NAGおよびCDM-PEG (平均11単位)の2:1 重量：重量混合物の7重量当量で処理した。1時間後、無水マレイン酸誘導体で処理した結合体のアミン含量を、100 mM NaHCO3中のトリニトロベンゼンスルホン酸 (TNBS)での処理によって測定した。マレアマート修飾されていない結合体に対して基準化する場合、修飾アミンの量は、総量の約75%であると決定された。この修飾の度合いは、添加する無水マレイン酸の量を変化させることによって、変化させ得る。
【０２０９】
実施例26. オリゴヌクレオチド-ポリマー結合体およびその無水マレイン酸誘導体の電気泳動
オリゴヌクレオチド-ポリマーDW 1360結合体を、先に記載するように作製した。次いで、1μgのオリゴヌクレオチドを含有する結合体を、多様な量のCDM-PEG (平均11単位)およびCDM-NAGで修飾した。次いで、結合体をアガロースゲル (2重量%)に入れ、かつ電気泳動した。エチジウムブロミドで染色すると、無水マレイン酸誘導体の当量に応じて、正から中性に、負に、結合体の電位が改変されることが注目された。
【０２１０】
前述のものは、本発明の原理の例示のみとして見なされる。さらに、多くの修飾および変化が当業者には容易に思い浮かぶであろうため、示し、かつ記載する、正確な構築物および操作に本発明を限定することは望ましくない。したがって、すべての適切な修飾および同等物が、本発明の範囲内に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
0005735573.tif 000043
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0005735573.tif 000049
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【配列表】
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