(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
胎児の遺伝的異常を決定するための、コンピュータにより実行される方法であって、前記遺伝的異常は染色体異数性であり、以下の工程a)〜e)を含む方法：
a) サンプルから複数のポリヌクレオチド断片の配列情報を得る工程であって、
前記サンプルは、妊娠女性に由来する末梢血サンプルであり母体DNAと胎児DNAとの両方を含有する工程、
b) 前記断片を各染色体における同じサイズの参照固有リードと比較することにより、前記断片を、前記配列情報に基づいて染色体に割り当てる工程であって、
前記参照固有リードは、参照ゲノム配列に基づいて単一の染色体上位置に明確に割り当てることができる、固有の配列を有する染色体断片である工程、
c) 工程b)において染色体の参照固有リードに割り当てられた断片の前記配列情報に基づいて、染色体のカバー深度およびGC含量を決定する工程であって、
前記カバー深度は、参照ヒトゲノム配列に基づいて、前記染色体に固有に割り当てられる断片の数と、前記染色体の同じ断片サイズの参照固有リードの数との間の比である工程、
d) 前記染色体の前記GC含量、および、異数性の不存在下における前記染色体のカバー深度とGC含量との間の確立された関係を使用して、前記染色体のあてはめられたカバー深度を決定する工程であって、
前記確立された関係は、次の工程(i)〜(iv)を含む方法により決定される工程：
(i) ゲノムDNAを含有する複数の正倍数体末梢血サンプルから、前記染色体をカバーする複数のポリヌクレオチド断片の配列情報を得る工程であって、その断片のサイズは、前記工程a)における複数のポリヌクレオチド断片の断片サイズと同じである工程、
(ii) 前記(i)の断片を、前記工程b)に従って、前記(i)の配列情報に基づいて染色体に割り当てる工程、
(iii) 各々の正倍数体サンプルについて、前記工程c)に従って、前記(i)の配列情報に基づいて前記染色体のカバー深度とGC含量とを決定すること、および、
(iv) 工程(iii)において各サンプルについて決定されたカバー深度とGC含量とを使用して、異数性の不存在下における前記染色体のカバー深度とGC含量との間の関係を決定する工程、
ならびに、
e) 前記あてはめられたカバー深度を、工程c)において決定された前記染色体の前記カバー深度と比較する工程であって、
それらの間の差異は胎児の染色体異数性を示す工程。
【請求項２】
前記工程a)は、複数の異なるサンプルから複数のポリヌクレオチド断片の配列情報を得ることをさらに含み、前記カバー深度は、異なるサンプルについて得られた配列リードの総数の違いについて調整するために正規化される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記正規化は、別の1つの染色体の平均カバー深度に対して行われる、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記正規化は、他のすべての常染色体の平均カバー深度、または他のすべての染色体の平均カバー深度に対して行われる、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
前記工程c)において、染色体のGC含量は、前記染色体に割り当てられるすべての断片の平均GC含量として決定される、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
胎児の性別を決定する工程をさらに含む、請求項2〜4のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
胎児の性別が以下の式に従って決定され、
【数６】
0005659319.tif 000081
式中、
【数７】
0005659319.tif 000082
および
【数８】
0005659319.tif 000083
は、それぞれ、サンプルiのX染色体およびY染色体の相対カバー深度である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
胎児分割合を推定する工程をさらに含み、
胎児分割合が、前記工程c)に従って決定されたX染色体および／またはY染色体のカバー深度に基づいて、
（イ）以下の式に従って計算され、
【数９】
0005659319.tif 000084
ここで、
Cri,Yは、サンプルiのY染色体のカバー深度であり、
【数１０】
0005659319.tif 000085
は、女性胎児を身ごもった妊娠女性からのサンプルのY染色体カバー深度と対応するGC含量との関係から計算される、あてはめられたカバー深度であり、
【数１１】
0005659319.tif 000086
は、男性被検者のY染色体カバー深度と対応するGC含量との関係から計算される、あてはめられたカバー深度を表し、または、
（ロ）以下の式に従って計算され、
【数１２】
0005659319.tif 000087
ここで、
Cri,Xは、サンプルiのX染色体のカバー深度であり、
【数１３】
0005659319.tif 000088
は、女性胎児を身ごもった妊娠女性からのサンプルのX染色体カバー深度と対応するGC含量との関係から計算される、あてはめられたカバー深度であり、
【数１４】
0005659319.tif 000089
は、男性被検者からのサンプルのX染色体カバー深度と対応するGC含量との関係から計算される、あてはめられたカバー深度を表し、または、
（ハ）以下の式に従って計算され、
【数１５】
0005659319.tif 000090
ここで、
【数１６】
0005659319.tif 000091
は、女性胎児を身ごもった妊娠女性からのサンプルのX染色体カバー深度と対応するGC含量との関係から計算される、あてはめられたカバー深度であり、
【数１７】
0005659319.tif 000092
は、女性胎児を身ごもった妊娠女性からのサンプルのY染色体カバー深度と対応するGC含量との関係から計算される、あてはめられたカバー深度を表し、
【数１８】
0005659319.tif 000093
は、男性被検者からのサンプルのX染色体カバー深度と対応するGC含量との関係から計算される、あてはめられたカバー深度を表し、
【数１９】
0005659319.tif 000094
は、男性被検者のY染色体カバー深度と対応するGC含量との関係から計算される、あてはめられたカバー深度を表す、
請求項2〜4のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記あてはめられたカバー深度と前記工程c)において決定された染色体のカバー深度との比較は、統計学的仮説検定により実行され、
1つの仮説は胎児が正倍数体であること（H0）であり、もう1つの仮説は胎児が前記染色体について異数性を示すこと（H1）である、請求項2〜4のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
両方の仮説についてスチューデントのt統計量が計算される、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
H0およびH1についてのスチューデントのt統計量が、それぞれ以下の式
【数２０】
0005659319.tif 000095
および
【数２１】
0005659319.tif 000096
に従って計算され、ここで
【数２２】
0005659319.tif 000097
は胎児分割合であり、
iはサンプル番号であり、
jは染色体番号であり、
以下の式
【数１】
0005659319.tif 000098
の関係が成立し、式中、
【数２】
0005659319.tif 000099
はサンプルi、染色体jの正規化されたカバー深度と対応するGC含量との間の関係についての関数を表し、εi,jはサンプルi、染色体jの残差を表し、
以下の式
【数３】
0005659319.tif 000100
の関係が成立し、この式はあてはめられたカバー深度を表し、
stdjは、以下の式
【数４】
0005659319.tif 000101
に従って計算される標準変動であり、ここでnsは参照サンプルの数を表す、
請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
t1およびt2の対数尤度比は以下の式に従って計算され、
【数２３】
0005659319.tif 000102
ここで、Li,jは対数尤度比であり、degreeはt分布の自由度を表し、Dは二倍性を表し、Tはトリソミーを表し、
【数２４】
0005659319.tif 000103
は、t分布自由度が与えられた場合の条件付き確率密度を表し、
前記比が1より大きい場合に、胎児が前記染色体についてトリソミーを示すと推量される、
請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
胎児の常染色体の異数性を決定することにおいて使用される、請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記胎児異数性が、13トリソミー、18トリソミー、および21トリソミーからなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
性染色体の異数性を決定することにおいて使用される、請求項6または7に記載の方法。
【請求項１６】
前記性染色体異数性が、XO、XXX、XXY、およびXYYからなる群から選択される、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
請求項1〜16のいずれかに記載の方法を実行するための複数の指示を含むコンピュータ可読媒体であって、前記指示には、前記工程a)に従って得られる配列情報が補足される、コンピュータ可読媒体。
【請求項１８】
請求項1〜16のいずれかに記載の方法を実行するためのシステムであって、
a) サンプルからの複数のポリヌクレオチド断片の配列情報を得るための手段、および
b) 請求項17に記載のコンピュータ可読媒体
を備えるシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、妊娠女性からのサンプルのDNA配列決定により胎児の遺伝的異常を検出するための非侵襲的方法に関する。より具体的には、本発明は、DNAサンプルの増幅および配列決定によって導入されたGCバイアスを除去するためのデータ解析に関する。本発明は、異数性を含む染色体異常のような胎児遺伝的異常を検出するための統計学的解析にもさらに関係する。
【背景技術】
【０００２】
絨毛採取や羊水穿刺のような侵襲的手順を伴う従来の出生前診断法は、胎児と母親の両方に対して潜在的な危険性をはらんでいる。母体の血清マーカーおよび超音波を用いた胎児異数性の非侵襲的スクリーニングが利用可能であるが、その感度および特異度は限定的である（Kaganら、Human Reproduction (2008) 23:1968-1975；Maloneら、N Engl J Med (2005) 353:2001-2011）。
【０００３】
妊娠女性の血漿中のDNA分子を大量並列配列決定することにより、胎児の異数性を非侵襲的に検出することが可能であることが、最近の研究により実証されている。胎児のDNAは、母体の血漿および血清中において検出され定量化されてきた（Loら、Lancet (1997) 350:485 487；Loら、Am. J. hum. Genet. (1998) 62:768-775）。母体の血液循環中には複数種の胎児細胞があり、そのような細胞としては胎児の顆粒球、リンパ球、有核赤血球、および栄養芽層細胞が含まれる（PertlとBianchi、Obstetrics and Gynecology (2001) 98:483-490）。胎児DNAは妊娠7週目に血清中に検出でき、妊娠期間とともに増加する。母体の血清および血漿中に存在する胎児DNAは、胎児細胞単離手順から得られるDNAの濃度に匹敵するものである。
【０００４】
循環する胎児DNAは胎児の性別を決定することに使用されてきた（Loら、Am. J. hum. Genet. (1998) 62:768-775）。また、胎児のRh D（rhesus D）遺伝子型も胎児DNAを使用して検出されてきた。しかしながら、循環する胎児DNAの診断的および臨床的応用は、胎児には存在するが母親には存在しない遺伝子に限定される（PertlとBianchi、Obstetrics and Gynecology (2001) 98:483-490）。従って、胎児DNAの配列を決定して胎児の染色体異常についての決定的な診断を提供することができる非侵襲的方法に対する必要性が、いまだに存在する。
【０００５】
母体血液中に胎児細胞および無細胞性の胎児核酸があるという過去二、三十年における発見、ならびに母体血漿の無細胞性DNAの高処理ショットガン配列決定の適用により、母体血漿サンプル中において異数体胎児により寄与される染色体提示のわずかな変化を検出することが可能となっている。13、18、および21トリソミー妊娠の非侵襲的検出が達成されてきた。
【０００６】
しかしながら、いくつかの研究が示しているように、増幅および配列決定により導入されるGCバイアスが、異数性検出の感度に対して実際的な制限を課していた。GCバイアスは、試薬の組成、クラスター密度、および温度のような異なる条件のもと、サンプル調製および配列決定過程の中で導入される可能性があり、これが異なるGC組成のDNA分子の差別的なサンプリングにつながり、GCに富んだ、またはGCに乏しい染色体の配列決定データにおける有意な変動につながる。
【０００７】
感度を改善するために、GCバイアスの影響を除去するための手順が開発されてきた。FanとQuakeは、局所的なゲノムGC含量に基づいて各々のGC密度に重みを適用することによりGCバイアスを計算上除去する方法を開発し、対応する重みを乗じることによって、各区分(bin)にマッピングされたリード(read)の数を改善させた（FanとQuake、PLoS ONE (2010) 5:e10439）。しかしながら、この過程は検出の精度を妨げるわずかなデータの歪みを引き起こし得るという理由により、性染色体障害、特にY染色体関連障害を扱う上でこの方法は困難を伴う。
【０００８】
本明細書では、発明者らは、GCバイアスを計算上除去して、胎児の遺伝的異常の検出においてより高い感度を得るとともにデータの歪みを回避する方法を記述する。この方法は、GC含量による統計学的検定のために使用されるパラメータを規定する。さらに、本発明者らは、2値仮説による診断に推定胎児分割合(estimated fetal fraction)を導入し、これは、より高い感度および特異度を示した。本発明者らの方法はまた、胎児DNAの割合が低い母体サンプルについて、より多くのポリヌクレオチド断片の配列決定をすることにより、胎児の遺伝的異常の非侵襲的検出の感度を所定の精度まで上昇させることが可能であるはずだということを示している。より後の妊娠週数において母体血漿を再採取することも診断の感度を上昇させ得る。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、母体の生体試料由来のヌクレオチドを大規模配列決定することにより胎児の遺伝的異常を非侵襲的に検出するための方法に関する。染色体のGC含量の違いに起因するGCバイアスを配列決定結果から除去する方法もさらに提供される。
【００１０】
従って、一側面において、本明細書では、染色体のカバー深度(coverage depth)とGC含量との関係を確立するための方法が提供され、この方法は、上記染色体および別の染色体をカバーする複数のポリヌクレオチド断片の配列情報を2つ以上のサンプルから得ること、上記断片を上記配列情報に基づいて染色体に割り当てること、各サンプルについて、上記配列情報に基づいて上記染色体のカバー深度とGC含量とを計算すること、ならびに、上記染色体のカバー深度とGC含量との関係を決定することを含む。
【００１１】
一実施態様では、上記ポリヌクレオチド断片は約10 bpから約1000 bpまでの範囲の長さである。別の実施態様では、上記ポリヌクレオチド断片は約15 bpから約500 bpまでの範囲の長さである。さらに別の実施態様では、上記ポリヌクレオチド断片は約20 bpから約200 bpまでの範囲の長さである。さらに別の実施態様では、上記ポリヌクレオチド断片は約25 bpから約100 bpまでの範囲の長さである。さらなる実施態様では、上記ポリヌクレオチド断片は約35 bpの長さである。
【００１２】
一実施態様では、上記配列情報は並列ゲノム配列決定により得られる。別の実施態様では、上記断片の染色体への割り当ては、それら断片の配列を参照ヒトゲノム配列と比較することにより行われる。この参照ヒトゲノム配列は、適切なおよび／または公表されているいずれのヒトゲノム構築物（例えばhg18もしくはhg19）であってもよい。2つ以上の染色体に割り当てられる断片や、いずれの染色体にも割り当てられない断片は、無視してよい。
【００１３】
一実施態様では、染色体のカバー深度は、その染色体に割り当てられる断片の数と、その染色体の参照固有リード（reference unique reads）の数との間の比である。別の実施態様では、カバー深度は正規化される。さらに別の実施態様では、上記正規化は、他のすべての常染色体のカバー度に対して計算される。さらに別の実施態様では、上記正規化は、他のすべての染色体のカバー度に対して計算される。
【００１４】
一実施態様では、次の式の関係が成立し、
【数１】
0005659319.tif 000002
ここで、
【数２】
0005659319.tif 000003
は、サンプルi、染色体jの正規化されたカバー深度と、対応するGC含量との間の関係の関数を表し、εi,jはサンプルi、染色体jの残差を表す。いくつかの実施態様では、カバー深度とGCとの間の関係は局所多項回帰により計算される。いくつかの実施態様では、その関係は強くない線形関係であり得る。いくつかの実施態様では、その関係はloessアルゴリズムにより決定される。
【００１５】
いくつかの実施態様では、上記方法は、次の式に従って、あてはめられたカバー深度を計算することをさらに含む。
【数３】
0005659319.tif 000004
【００１６】
いくつかの実施態様では、上記方法は、次の式に従って標準変動を計算することをさらに含み、
【数４】
0005659319.tif 000005
ここでnsは参照サンプルの数を表す。
【００１７】
いくつかの実施態様では、上記方法は、次の式に従ってスチューデントのt統計量を計算することをさらに含む。
【数５】
0005659319.tif 000006
【００１８】
一実施態様では、染色体のGC含量は、その染色体に割り当てられるすべての断片の平均GC含量である。断片のGC含量は、その断片中のG/Cヌクレオチドの数をその断片のヌクレオチド総数で割ることにより計算し得る。別の実施態様では、染色体のGC含量は、その染色体の参照固有リードの総計GC含量である。
【００１９】
いくつかの実施態様では、少なくとも2個、5個、10個、20個、50個、100個、200個、500個、または1000個のサンプルが使用される。いくつかの実施態様では、染色体は1番染色体、2番染色体、…、22番染色体、X染色体、またはY染色体である。
【００２０】
一実施態様では、サンプルは妊娠女性被検者からのものである。別の実施態様では、サンプルは男性被検者からのものである。さらに別の実施態様では、サンプルは妊娠女性被検者および男性被検者の両方からのものである。
【００２１】
いくつかの実施態様では、サンプルは生体試料である。いくつかの実施態様では、サンプルは末梢血サンプルである。
【００２２】
本明細書ではまた、胎児の遺伝的異常を決定する方法が提供され、この方法は、a) サンプルから複数のポリヌクレオチド断片の配列情報を得る工程、b) 上記断片を、上記配列情報に基づいて染色体に割り当てる工程、c) 上記配列情報に基づいて、染色体のカバー深度およびGC含量を計算する工程、d) 上記染色体の上記GC含量、および、上記染色体のカバー深度とGC含量との間の確立された関係を使用して、上記染色体のあてはめられたカバー深度を計算する工程、ならびに、e) 上記あてはめられたカバー深度を、上記染色体の上記カバー深度と比較する工程であって、それらの間の差異は胎児の遺伝的異常を示す工程、を含む。
【００２３】
いくつかの実施態様では、上記方法は、f) 胎児の性別を決定する工程をさらに含む。胎児の性別は次の式に従って決定することができ、
【数６】
0005659319.tif 000007
ここで、
【数７】
0005659319.tif 000008
および
【数８】
0005659319.tif 000009
は、それぞれ、XおよびY染色体の正規化された相対カバー度である。
【００２４】
いくつかの実施態様では、上記方法は、g) 胎児分割合を推定する工程をさらに含む。胎児分の割合は次の式に従って計算することができ、
【数９】
0005659319.tif 000010
ここで、
【数１０】
0005659319.tif 000011
は、女性胎児を身ごもった妊娠女性からのサンプルのY染色体カバー深度および対応するGC含量の関係から計算される、あてはめられたカバー深度であり、
【数１１】
0005659319.tif 000012
は、男性被検者のY染色体カバー深度および対応するGC含量の関係から計算される、あてはめられたカバー深度を表す。あるいは、胎児分の割合は次の式に従って計算することができ、
【数１２】
0005659319.tif 000013
ここで、
【数１３】
0005659319.tif 000014
は、女性胎児を身ごもった妊娠女性からのサンプルのX染色体カバー深度および対応するGC含量の関係から計算される、あてはめられたカバー深度であり、
【数１４】
0005659319.tif 000015
は、男性被検者からのサンプルのX染色体カバー深度および対応するGC含量の関係から計算される、あてはめられたカバー深度を表す。さらに、胎児分の割合は次の式に従って計算することができ、
【数１５】
0005659319.tif 000016
ここで、
【数１６】
0005659319.tif 000017
は、女性胎児を身ごもった妊娠女性からのサンプルのX染色体カバー深度および対応するGC含量の関係から計算される、あてはめられたカバー深度であり、
【数１７】
0005659319.tif 000018
は、女性胎児を身ごもった妊娠女性からのサンプルのY染色体カバー深度および対応するGC含量の関係から計算される、あてはめられたカバー深度を表し、
【数１８】
0005659319.tif 000019
は、男性被検者からのサンプルのX染色体カバー深度および対応するGC含量の関係から計算される、あてはめられたカバー深度を表し、
【数１９】
0005659319.tif 000020
は、男性被検者のY染色体カバー深度および対応するGC含量の関係から計算される、あてはめられたカバー深度を表す。
【００２５】
一実施態様では、遺伝的異常は染色体異常である。別の実施態様では、遺伝的異常は異数性である。さらに別の実施態様では、胎児の異数性は、13トリソミー、18トリソミー、および21トリソミーからなる群から選択される、常染色体についての障害である。さらに別の実施態様では、胎児の異数性は、XO、XXX、XXY、およびXYYからなる群から選択される、性染色体についての障害である。
【００２６】
いくつかの実施態様では、上記あてはめられたカバー深度と上記染色体のカバー深度との比較は、統計学的仮説検定により実行され、ここで、1つの仮説は胎児が正倍数体であること（H0）であり、もう1つの仮説は胎児が異数体であること（H1）である。統計量は両方の仮説について計算することができる。いくつかの実施態様では、スチューデントのt統計量を、H0およびH1について、それぞれ式
【数２０】
0005659319.tif 000021
および
【数２１】
0005659319.tif 000022
に従って計算し、ここで、
【数２２】
0005659319.tif 000023
は胎児分の割合である。いくつかの実施態様では、t1およびt2の対数尤度比は次の式に従って計算され、
【数２３】
0005659319.tif 000024
ここで、degreeはt分布の自由度を表し、Dは二倍性を表し、Tはトリソミーを表し、
【数２４】
0005659319.tif 000025
は、あるt分布自由度が与えられた場合の条件付き確率密度を表す。
【００２７】
一実施態様では、胎児の性別は女性であり、スチューデントのt統計量は次の式に従って計算され、
【数２５】
0005659319.tif 000026
ここで、
【数２６】
0005659319.tif 000027
は、女性胎児を身ごもった妊娠女性からのサンプルのX染色体カバー深度および対応するGC含量の関係から計算される、あてはめられたカバー深度である。いくつかの実施態様では、
【数２７】
0005659319.tif 000028
は胎児がXXXまたはXOであり得ることを示す。いくつかの実施態様では、
【数２８】
0005659319.tif 000029
は胎児がXXXまたはXOであることを示す。
【００２８】
別の実施態様では、胎児の性別は男性であり、スチューデントのt統計量は次の式に従って計算され、
【数２９】
0005659319.tif 000030
ここで、
【数３０】
0005659319.tif 000031
は、女性胎児を身ごもった妊娠女性からのサンプルのX染色体カバー深度および対応するGC含量の関係から計算される、あてはめられたカバー深度である。いくつかの実施態様では、
【数３１】
0005659319.tif 000032
は胎児がXXYまたはXYYであり得ることを示す。いくつかの実施態様では、
【数３２】
0005659319.tif 000033
は胎児がXXYまたはXYYであることを示す。
【００２９】
本明細書では、胎児の遺伝的異常を決定する方法がさらに提供され、この方法は、a) 2つ以上の正常サンプルから、1つの染色体ともう1つの染色体をカバーする複数のポリヌクレオチド断片の配列情報を得る工程、b) 上記断片を、上記配列情報に基づいて染色体に割り当てる工程、c) 上記正常サンプルからの上記配列情報に基づいて、上記染色体のカバー深度およびGC含量を計算する工程、d) 上記染色体のカバー深度とGC含量との間の関係を決定する工程、e) 生体試料から複数のポリヌクレオチド断片の配列情報を得る工程、f) 上記断片を、上記生体試料からの上記配列情報に基づいて染色体に割り当てる工程、g) 上記生体試料からの上記配列情報に基づいて、上記染色体のカバー深度とGC含量とを計算する工程、h) 上記染色体の上記GC含量、および、上記染色体のカバー深度とGC含量との間の上記関係を使用して、上記染色体のあてはめられたカバー深度を計算する工程、ならびに、i) 上記あてはめられたカバー深度を上記染色体の上記カバー深度と比較する工程であって、それらの間の差異は胎児の遺伝的異常を示す工程、を含み、ここで
【００３０】
別の側面では、胎児の遺伝的異常の出生前診断を実行するための複数の指示を含むコンピュータ可読媒体が本明細書において提供され、この複数の指示は、a) サンプルからの複数のポリヌクレオチド断片の配列情報を受け取る工程、b) 上記ポリヌクレオチド断片を、上記配列情報に基づいて染色体に割り当てる工程、c) 上記配列情報に基づいて、染色体のカバー深度およびGC含量を計算する工程、d) 上記染色体の上記GC含量、および、上記染色体のカバー深度とGC含量との間の確立された関係を使用して、上記染色体のあてはめられたカバー深度を計算する工程、ならびに、e) 上記あてはめられたカバー深度を、上記染色体の上記カバー深度と比較する工程であって、それらの間の差異は遺伝的異常を示す工程、を含む。
【００３１】
さらに別の側面では、胎児の遺伝的異常を決定するためのシステムが本明細書において提供され、その方法は、a) サンプルから複数のポリヌクレオチド断片の配列情報を得るための手段、およびb) 胎児の遺伝的異常の出生前診断を実行するための複数の指示を含むコンピュータ可読媒体を含む。いくつかの実施態様では、このシステムは、妊娠女性被検者から得られた生体試料をさらに含み、ここで、この生体試料は複数のポリヌクレオチド断片を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図1は、ポリヌクレオチド断片の配列情報を使用してカバー深度およびGC含量を計算する過程の概念図である。
【００３３】
【図２】図2は、300個の参照事例からのデータを使用して確立した、正規化カバー深度‐GC含量相関を図示する。各事例についての正規化カバー深度を、対応する配列決定済みGC含量に対してプロットした。十字記号は正倍数体の女性胎児の事例を示し、四角は正倍数体の男性胎児の事例を示す。実線は、カバー深度とGC含量のあてはめ線である。
【００３４】
【図３】図3は、染色体を固有昇順GC含量により並べることにより、正規化カバー深度と対応GC含量との間の傾向を図示する。ここでいう各染色体の固有昇順GC含量とは、300個の参照事例からのその染色体の配列決定済みタグの平均GC含量を表す。
【００３５】
【図４】図4は、各染色体についてのGC分類群の異なる組成を示す。各染色体について、参照固有リード中のすべての35 bp読み枠のGC含量を計算し、GC含量を36個の段階に分類し、各段階のパーセンテージを各染色体の組成GCとして計算した。それから染色体をヒートマップでグラフ化し、階層的にクラスタリングした。
【００３６】
【図５】図5は、シークエンサーの偏好性の過程の手動シミュレーションにより、配列決定のバイアスが図2に示す相関をもたらすことを実証している。
【００３７】
【図６】図6は、標準変動を、配列決定されたポリヌクレオチド断片の総数に対してプロットしている。150個のサンプルにおいて、すべての染色体の調整済み標準分散が、固有リード数の平方根の逆数と線形関係を示している。
【００３８】
【図７】図7は、式3により計算される全染色体の残差のQ-Qプロットを示す。正規分布と線形関係が示されている。
【００３９】
【図８】図8は、Y染色体カバー深度のヒストグラムを示す。2つのピークがあり、このことはY染色体のカバー深度により事例の性別を見分けることができることを示している。曲線は、ガウシアンカーネルを用いたカーネル密度推定により推定されたY染色体の相対カバー深度の分布である。
【００４０】
【図９】図9は、903個の試験サンプルを胎児染色体異常について診断する過程の図式を示す。
【００４１】
【図１０Ａ】図10は、異数性：13、18、21トリソミーおよびXO、XXY、XYYの事例、ならびに正常事例の結果を示す。図10Aは、13番、18番、および21番染色体について、正規化したカバー深度に対してGC含量をプロットしたものを示す。白丸は正常女性胎児の相対カバー深度とGC含量を表し、点は正常男性胎児を表す。実線は相対カバー度とGC含量とのあてはめ線であり、破線上ではt値の絶対値が1であり、点線上ではt値の絶対値が2であり、一点鎖線上ではt値の絶対値が3である。
【図１０Ｂ】図10BはX およびY染色体のプロットを示す。白丸は正常女性胎児の相対カバー深度とGCを表し、点は正常男性胎児を表す。実線は相対カバー度とGC含量とのあてはめ線であり、破線上ではt値の絶対値が1であり、点線上ではt値の絶対値が2であり、一点鎖線上ではt値の絶対値が3である。
【００４２】
【図１１】図11は、異なる診断アプローチの信頼値を比較する。
【００４３】
【図１２】図12は、胎児DNA割合と妊娠期間との間の関係を示す。母体血漿中の胎児DNAの割合は妊娠期間と相関する。胎児DNA割合はXとYの両方により推定した。平均胎児DNA割合と妊娠期間との間には統計学的に有意な相関がある（P<0.001）。R2値は相関係数の平方が小さいことを示していることに注意。最小の割合は3.49%である。
【００４４】
【図１３】図13は、標準分散と、検出に必要な事例数との関係を示す。式5によって計算された各染色体の標準分散は、サンプル数の違いに伴って変動する。サンプル数が100より大きくなると標準分散は安定する。
【００４５】
【図１４】図14は、無細胞血漿中で胎児異数性を検出するための固有リードの推定数を、胎児DNA割合の関数として示す。この推定は、それぞれ異なる長さを有する13番、18番、21番、およびX染色体、さらにはY染色体（XとYとの間の関係より）の異数性についての、信頼t値が3以上であるレベルに基づいたものである。胎児DNAの割合が低下すると、必要とされるショットガン配列の総数が増加する。フローセル上のチャンネルあたり400万の配列リードという配列決定処理量では、無細胞DNAの3.5%が胎児のものであれば21トリソミーを検出できる。X染色体の異数性は、この割合と固有リード数が小さい場合（例えば4%と500万リード）には容易に検出されなかった。異なる染色体は異なるレベルの胎児DNA割合および固有リード数を必要とするが、これは染色体のGC構造により引き起こされ得る。
【００４６】
【図１５】図15は、女性胎児の13番染色体トリソミーの検出について、データ量および妊娠期間（週）によって図表化した感度の等値線グラフを示しており、すべての妊娠週およびすべてのデータ量ポイントについて図表化している。
【００４７】
【図１６】図16は、女性胎児の18番染色体トリソミーの検出について、データ量および妊娠期間（週）によって図表化した感度の等値線グラフを示しており、すべての妊娠週およびすべてのデータ量ポイントについて図表化している。
【００４８】
【図１７】図17は、女性胎児の21番染色体トリソミーの検出について、データ量および妊娠期間（週）によって図表化した感度の等値線グラフを示しており、すべての妊娠週およびすべてのデータ量ポイントについて図表化している。
【００４９】
【図１８】図18は、女性胎児のX染色体トリソミーの検出について、データ量および妊娠期間（週）によって図表化した感度の等値線グラフを示しており、すべての妊娠週およびすべてのデータ量ポイントについて図表化している。
【００５０】
【図１９】図19は、男性の13番染色体トリソミーの検出について、データ量および妊娠期間（週）によって図表化した感度の等値線グラフを示す。すべての妊娠週およびすべてのデータ量ポイントについて、本発明者らはまず、胎児DNA割合の経験的分布および所与のデータ量についての標準分散を計算し、それから、XYまたはYにより推定された割合を比較しながら、すべての種類の異数性の感度を計算する。
【００５１】
【図２０】図20は、男性の18番染色体トリソミーの検出について、データ量および妊娠期間（週）によって図表化した感度の等値線グラフを示す。
【００５２】
【図２１】図21は、男性の21番染色体トリソミーの検出について、データ量および妊娠期間（週）によって図表化した感度の等値線グラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
本発明は、母体の生体試料由来のポリヌクレオチド断片を大規模配列決定することにより胎児の遺伝的異常を非侵襲的に検出するための方法に関する。さらに、染色体のカバー深度と対応するGC含量との間の関係に基づいて、染色体のGC含量の違いに起因するGCバイアスを配列決定結果から除去する方法も提供される。従って、各サンプルの染色体のカバー深度をそのポリヌクレオチド断片のGC含量に対してあてはめる局所重み付き多項回帰により、GC含量を用いたスチューデントのt計算において使用される参照パラメータを計算上調節する方法が、本明細書において提供される。
【００５４】
統計学的仮説検定を使用した統計学的解析により胎児の遺伝的異常を決定する方法も、本明細書において提供される。さらに、一定の統計学的有意水準のために必要とされる臨床サンプルの量を決定する上で有用なデータ品質管理（DQC）基準を計算するための方法も提供される。
【００５５】
［I. 定義］
他に定義が示されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本明細書で引用するすべての特許、出願、公開出願、およびその他の刊行物は、その全体が引用により組み入れられる。この節において提示される定義が、引用により本明細書に組み入れられる上記特許、出願、公開出願、およびその他の刊行物において提示される定義と相反する場合、あるいはそうでなくとも矛盾する場合は、この節において提示される定義が、引用により本明細書に組み入れられる定義よりも優先される。
【００５６】
本明細書において使用される場合、単数形の「a」、「an」、および「the」は、別段の表示が無い限り、複数への言及を含む。例えば、「ダイマー（“a” dimer）」は、1つ以上のダイマーを含む。
【００５７】
「染色体異常」という用語は、対象となる染色体の構造と正常な相同的染色体との間の偏差を表す。「正常」という用語は、特定の種の健康な個体において見出される主要な核型またはバンドパターンを表す。染色体異常は数または構造についてのものであり得、異数性、倍数性、逆位、トリソミー、モノソミー、重複、欠失、染色体の一部の欠失、追加、染色体の一部の追加、挿入、染色体の断片、染色体の領域、染色体再編成、および転座を含むがこれらに限定されない。染色体異常は、病理学的状態の存在、または病理学的状態を生じる素因と相関し得る。本明細書の定義では、一塩基多型（「SNP」）は染色体異常ではない。
【００５８】
Xモノソミー（XO、1つの完全なX染色体の欠如）はターナー症候群の最も一般的な種類であり、女性生産児の2500〜3000人に1人において起こる（SybertとMcCauley、N Engl J Med (2004) 351:1227-1238）。XXY症候群は、ヒトの男性が1つ余分なX染色体を有する状態であり、男性の約1000人に1人において存在する（Bock、Understanding Klinefelter Syndrome: A Guide for XXY Males and Their Families、NIH Pub. No. 93-3202 (1993)）。XYY症候群は性染色体の異数性であって、ヒトの男性が1つ余分にY染色体を受け取って、より一般的な46個ではなく全部で47個の染色体となるものであり、男児出生の1000件に1件に起こって、男性不妊につながる可能性も有する（Aksglaedeら、J Clin Endocrinol Metab (2008) 93:169-176）。
【００５９】
ターナー症候群はいくつの状態を包含するものであり、その中でもXモノソミー（XO、1つの完全な性染色体（バー小体）の欠如）が最も一般的である。通常の女性は2つのX染色体を有するが、ターナー症候群では、これら性染色体の内の1つが欠けている。表現型上女性である人の2000〜5000人に1人に生じるこの症候群は、多くの形で顕現する。クラインフェルター症候群は、ヒトの男性が1つ余分なX染色体を有する状態である。ヒトにおいてはクラインフェルター症候群は最も一般的な性染色体障害であり、余分な染色体の存在により引き起こされるものとしては2番目に一般的な状態である。この状態は男性約1,000人に1人に存在する。XYY症候群は性染色体の異数性であり、ヒトの男性が1つ余分にY染色体を受け取って、より一般的な46個ではなくて合計47個の染色体となっているものである。これは47、XYYという核型を生じる。この状態は通常は無症候性であり男児出生の1000件に1件に起こる一方で、男性不妊を引き起こし得る。
【００６０】
13トリソミー（パトー症候群）、18トリソミー（エドワーズ症候群）、および21トリソミー（ダウン症候群）は、臨床的に最も重要な常染色体トリソミーであり、これらをいかにして検出するかということは常に大きな関心事であった。上記胎児染色体異常の検出は出生前診断において大きな重要性を有する（Ostler、Diseases of the eye and skin: a color atlas、Lippincott Williams & Wilkins. pp. 72. ISBN 9780781749992 (2004)；DriscollとGross、N Engl J Med (2009) 360: 2556-2562；Kaganら、Human Reproduction (2008) 23:1968-1975）。
【００６１】
「参照固有リード」という用語は、固有の配列を有する染色体断片を表す。従って、そのような断片は単一の染色体上位置に明確に割り当てることができる。染色体の参照固有リードは、例えばhg18またはhg19のような、公表された参照ゲノム配列に基づいて構築することができる。
【００６２】
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、本明細書では互換的に使用されて、あらゆる長さのヌクレオチドの重合体形態を表し、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらの類似体、またはそれらの混合物を含み得る。この用語は分子の一次構造のみを表す。従ってこの用語は、三本鎖、二本鎖、および一本鎖デオキシリボ核酸（「DNA」）を含み、三本鎖、二本鎖、および一本鎖リボ核酸（「RNA」）も同様に含む。この用語はまた、例えばアルキル化および／またはキャッピングにより修飾された形態、ならびに非修飾形態のポリヌクレオチドも含む。より具体的には、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、tRNA、rRNA、hRNA、およびmRNA（スプライシングされているか否かを問わない）を含む、ポリデオキシリボヌクレオチド（2-デオキシ-D-リボースを含有する）、ポリリボヌクレオチド（D-リボースを含有する）、プリンもしくはピリミジン塩基のNもしくはCグリコシドである他の種類のポリヌクレオチドのいずれか、ならびに非ヌクレオチド骨格を含有するその他のポリマー、例えば、ポリアミド（例えばペプチド核酸（「PNA」））およびポリモルフォリノ（オレゴン州CorvallisのAnti-Virals社からNeuGene（登録商標）として市販されている）ポリマー、ならびにその他の合成配列特異的核酸ポリマー（DNAおよびRNAで見られるような塩基対形成および塩基スタッキングを許容する立体配置で核酸塩基を含有するポリマーであることを条件とする）を含む。従ってこれらの用語は、例えば、3’-デオキシ-2’,5’-DNA、オリゴデオキシリボヌクレオチドN3’−P5’ホスホロアミダート、2’-O-アルキル置換RNA、DNAとRNAとの間のハイブリッドまたはPNAとDNAもしくはRNAとの間のハイブリッドを含み、既知の種類の修飾、例えば、標識、アルキル化、「キャップ」、1つ以上のヌクレオチドを類似体で置換したもの、ヌクレオチド間修飾（例えば、無電荷の連結部（例えばメチルリン酸、リン酸トリエステル、ホスホロアミダート、カルバメート等）を有するもの、負に荷電した連結部（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を有するもの、および正に荷電した連結部（例えばアミノアルキルホスホロアミダート、アミノアルキルホスホトリエステル）を有するもの）、例えばタンパク質（酵素（例えばヌクレアーゼ）、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リシン等）のペンダント部分を含有するもの、インターカレーター（例えばアクリジン、ソラレン等）を有するもの、キレート（例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属等）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された連結部を有するもの（例えばアルファアノマー核酸等）、ならびにポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドの非修飾形態を含む。
【００６３】
「大量並列配列決定」とは、数百万個の核酸断片の配列決定を行う技術を意味し、例えば、無作為に断片化したゲノムDNAを平面状で光学的に透明な表面に結合させること、および、数百万個のクラスター（各々、平方センチメートル当たり約1,000コピーの鋳型を含む）を有する高密度配列決定フローセルを創出する固相増幅を用いる。これらの鋳型は、四色DNA合成による配列決定(four-color DNA sequencing-by-synthesis)テクノロジーを使用して配列決定される。カリフォルニア州San DiegoのIllumina社により提供される製品を参照のこと。本発明で使用される配列決定技術は、事前増幅またはクローニング工程を伴わずに実施されることが好ましいが、PCRと顕微鏡的な鋳型ベース配列決定の両方のための反応小室を有するマイクロ流体チップにおける増幅ベースの方法と組み合わせてもよい。ある配列を特定のヒト染色体に属する配列として同定するためには、約30 bpの無作為な配列情報が必要とされるだけである。より長い配列はより詳細な標的を特異的に同定できる。本事例では多数の35 bpリードが得られた。大量並列配列決定法のさらなる説明は、RogersとVentner、Nature (2005) 437:326-327に見出される。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「生体試料」とは、生きた採取源もしくはウイルス性採取源、または巨大分子および生体分子のその他の採取源から得られたあらゆるサンプルを表し、核酸もしくはタンパク質またはその他の巨大分子を得ることができる対象のあらゆる細胞種または組織を含む。生体試料は、生物学的供給源から直接得られたサンプルであっても処理されたサンプルであってもよい。例えば、増幅された単離核酸は生体試料を構成する。生体試料は、体液（例えば血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿、および汗）、動物および植物からの組織および臓器サンプル、ならびにこれらに由来する処理済みサンプルを含むが、これらに限定されない。
【００６５】
本明細書で記述される発明の側面および実施態様は、「からなる（“consisting”）」および／または「から実質的になる（“consisting essentially of”）」の側面および実施態様を含むものと理解される。
【００６６】
本発明の他の目的、利点、および特徴は、以下の明細書を添付の図面を参照しながら読むことによって明らかとなるであろう。
【００６７】
［II. カバー深度とGC含量との間の関係の確立］
本明細書では、染色体のカバー深度とGC含量との間の関係を確立するための方法が提供され、この方法は、上記染色体および別の染色体をカバーする複数のポリヌクレオチド断片の配列情報を2つ以上のサンプルから得ること、上記断片を上記配列情報に基づいて染色体に割り当てること、各々のサンプルについて、上記配列情報に基づいて上記染色体のカバー深度とGC含量とを計算すること、ならびに、上記染色体のカバー深度とGC含量との間の関係を決定することを含む。作業の工程が実施される順番は特に特定されない。いくつかの実施態様では、この方法は以下の順番で実施され得る：a)上記染色体および別の染色体をカバーする複数のポリヌクレオチド断片の配列情報を2つ以上のサンプルから得ること、b)上記断片を上記配列情報に基づいて染色体に割り当てること、c)各々のサンプルについて、上記配列情報に基づいて上記染色体のカバー深度とGC含量とを計算すること、ならびに、d)上記染色体のカバー深度とGC含量との間の関係を決定すること。
【００６８】
1つの染色体位置のカバー深度およびGC含量を計算するためには、サンプルから得られた鋳型DNAの配列決定をすることにより、ポリヌクレオチド断片の配列情報を得る。一実施態様では、鋳型DNAは母体DNAと胎児DNAの両方を含む。別の実施態様では、鋳型DNAは妊娠女性の血液から得られる。血液は、採血のためのいずれかの標準的な技術（静脈穿刺を含むがこれに限定されない）を使用して採集することができる。例えば、血液は肘の内側または手の裏の静脈から採取することができる。血液サンプルは、胎児妊娠のいずれの時期において妊娠女性から採取してもよい。例えば、血液サンプルは、胎児妊娠の第1〜4週、4〜8週、8〜12週、12〜16週、16〜20週、20〜24週、24〜28週、28〜32週、32〜36週、36〜40週、または40〜44週におけるヒト女性から採取することができ、胎児妊娠の第8〜28週の間に採取することが好ましい。
【００６９】
ポリヌクレオチド断片は、配列情報に基づいて染色体位置に割り当てられる。参照ゲノム配列を使用して参照固有リードを得る。本明細書において使用される場合、「参照固有リード」という用語は、参照ゲノム配列に基づいて特定のゲノム位置に割り当てられた、すべての固有ポリヌクレオチド断片を表す。いくつかの実施態様では、参照固有リードは同じ長さ（例えば約10、12、15、20、25、30、35、40、50、100、200、300、500、または1000 bp）を有する。いくつかの実施態様では、ヒトゲノム構築物hg18またはhg 19を参照ゲノム配列として使用し得る。染色体位置は、染色体上の互いに隣接したウィンドウであり得、このウィンドウは約10 KB、20 KB、30 KB、40 KB、50 KB、60 KB、70 KB、80 KB、90 KB、100 KB、200 KB、300 KB、400 KB、500 KB、600 KB、700 KB、800 KB、900 KB、1000 KB、2000 KB、3000 KB、4000 KB、5000 KB、6000 KB、7000 KB、8000 KB、9000 KB、10,000 KBまたはそれ以上の長さを有し得る。染色体位置は1つの染色体でもあり得る。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「カバー深度」という用語は、1つの染色体位置に割り当てられる断片の数と、その染色体位置の参照固有リードの数との間の比を表し、次の式を使用し、
【数３３】
0005659319.tif 000034
ここで、
【数３４】
0005659319.tif 000035
はサンプルiにおいて染色体jに位置付けられた固有配列リードの数であり、
【数３５】
0005659319.tif 000036
はサンプルiにおける染色体jのカバー深度であり、
【数３８】
0005659319.tif 000037
は染色体jにおける参照固有リードの数である。
【００７１】
いくつかの実施態様では、いずれの染色体位置にも割り当てられないポリヌクレオチド断片や、複数の染色体位置に割り当てられるポリヌクレオチド断片は廃棄される。いくつかの実施態様では、カバー深度は、別の染色体位置、別の染色体、他のすべての常染色体の平均、他のすべての染色体の平均、またはすべての染色体の平均のカバー深度に基づいて正規化される。いくつかの実施態様では、22個の常染色体の平均カバー深度を正規化定数として使用して、異なるサンプルについて得られる配列リードの総数の違いについて調整し、
【数３９】
0005659319.tif 000038
ここで、cri,jはサンプルiにおける染色体jの相対カバー深度を表す。ここから以降は、各染色体についての「相対カバー深度」は正規化された値を表し、異なるサンプルを比較するために使用され、後の解析のために使用される。
【００７２】
染色体位置のGC含量は、その染色体位置における固有参照リードに基づいて、またはその染色体位置に割り当てられる配列決定済みポリヌクレオチド断片に基づいて、染色体位置の平均GCパーセンテージにより計算することができる。染色体のGC含量は、次の式を使用して計算することができ、
【数４０】
0005659319.tif 000039
【数４０−２】
0005659319.tif 000040
ここで、iはサンプルiを表し、jは染色体jを表し、NGCi,jはGおよびCのDNA塩基の数を表し、BASEi.jはサンプルiにおける染色体jのDNA塩基の数を表す。
【００７３】
カバー深度およびGC含量は、単一のサンプル、または複数のサンプルから得られたポリヌクレオチド断片の配列情報に基づいたものであり得る。1つの染色体位置のカバー深度とGC含量との間の関係を確立するためには、少なくとも1個、2個、5個、10個、20個、50個、100個、200個、500個または1000個のサンプルから得られたポリヌクレオチド断片の配列情報に基づいた計算であり得る。
【００７４】
いくつかの実施態様では、カバー深度とGC含量との間の関係は、強くない線形関係である。Loessアルゴリズムあるいは局所重み付き多項回帰を使用して、数値対の間（例えばカバー深度とGC含量との間）の非線形関係（相関）を評価することができる。
【００７５】
［III. 胎児の遺伝的異常の決定］
本明細書では、胎児の遺伝的異常を決定する方法も提供され、この方法は、a)サンプルから複数のポリヌクレオチド断片の配列情報を得ること、b)上記断片を、上記配列情報に基づいて染色体に割り当てること、c) 上記配列情報に基づいて、染色体のカバー深度およびGC含量を計算すること、d)上記染色体の上記GC含量、および、上記染色体のカバー深度とGC含量との間の確立された関係を使用して、上記染色体のあてはめられたカバー深度を計算すること、ならびに、e)上記あてはめられたカバー深度を、上記染色体の上記カバー深度と比較することを含み、ここで、それらの間の差異は胎児の遺伝的異常を示す。
【００７６】
この方法は、胎児の染色体異常を検出するために使用することができ、異数性、倍数性、モノソミー、トリソミー、21トリソミー、13トリソミー、14トリソミー、15トリソミー、16トリソミー、18トリソミー、22トリソミー、三倍性、四倍性、ならびに、XO、XXY、XYY、およびXXXを含む性染色体異常の検出に特に有用である。本方法に従ってヒトゲノム中の特定の領域に焦点を合わせ、部分的モノソミーや部分的トリソミーを同定することもできる。例えば、本方法は、染色体上をスライドする規定の「ウィンドウ」（例えば、染色体を覆って分布する、互いに隣接する非重複50 Kb領域）における配列データを解析することを含み得る。13q、8p (8p23.1)、7q、遠位6p、5p、3q (3q25.1)、2q、1q (1q42.1および1q21-qter)の部分的トリソミー、部分的Xp、および4q35.1モノソミーが報告されているが、他にも報告例がある。例えば、18番染色体の長腕の部分的重複は、18q21.1-qterが重複される場合にはエドワーズ症候群を引き起こし得る（Mewarら、Am J Hum Genet. (1993) 53:1269-78）。
【００７７】
いくつかの実施態様では、胎児分の割合が、サンプルからのポリヌクレオチド断片について得られた配列情報に基づいて推定される。XおよびY染色体のカバー深度およびGC含量を、胎児分の割合を推定するために使用し得る。いくつかの実施態様では、サンプルからのポリヌクレオチド断片について得られた配列情報に基づいて胎児の性別が決定される。XおよびY染色体のカバー深度およびGC含量を、胎児の性別を決定するために使用し得る。
【００７８】
いくつかの実施態様では、上記あてはめられたカバー深度と上記染色体のカバー深度との比較は、統計学的仮説検定により実行され、ここで、1つの仮説は胎児が正倍数体であること（H0）であり、もう1つの仮説は胎児が異数体であること（H1）である。いくつかの実施態様では、双方の仮説についてスチューデントのt統計量をそれぞれt1およびt2として計算する。いくつかの実施態様では、t1およびt2の対数尤度比が計算される。いくつかの実施態様では、>1の対数尤度比が胎児のトリソミーを示す。
【００７９】
［IV. 胎児遺伝的異常の診断のためのコンピュータ可読媒体およびシステム］
別の側面において、本明細書では、胎児の遺伝的異常の出生前診断を実行するための複数の指示を含むコンピュータ可読媒体が提供され、この複数の指示は、a)上記配列情報を受け取る工程、b)上記ポリヌクレオチド断片を、上記配列情報に基づいて染色体に割り当てる工程、c)上記配列情報に基づいて、上記染色体のカバー深度およびGC含量を計算する工程、d)上記染色体の上記GC含量、および、上記染色体のカバー深度とGC含量との間の確立された関係を使用して、上記染色体のあてはめられたカバー深度を計算する工程、ならびに、e)上記あてはめられたカバー深度を、上記染色体の上記カバー深度と比較する工程であって、それらの間の差異は遺伝的異常を示す工程、を含む。
【００８０】
さらに別の側面において、本明細書では、胎児の異数性を決定するためのシステムが提供され、この方法は、a)上記ポリヌクレオチド断片から配列情報を得るための手段、およびb) 胎児の遺伝的異常の出生前診断を実行するための複数の指示を含むコンピュータ可読媒体を含む。いくつかの実施態様では、このシステムは、妊娠女性被検者から得られた生体試料をさらに含み、ここで、この生体試料は複数のポリヌクレオチド断片を含む。
【００８１】
多数の異なる配列決定法および変形を使用し得ることは当業者には明らかであろう。一実施態様では、配列決定は大量並列配列決定法を使用して行われる。例えば454プラットフォーム（Roche社）（Marguliesら、Nature (2005) 437:376-380）、Illuminaゲノムアナライザー（もしくはSolexa（登録商標）プラットフォーム）またはSOLiD（登録商標）システム（Applied Biosystems社）またはHelicos社のTrue Single Molecule DNA配列決定テクノロジー（Harrisら、Science (2008) 320:106-109）、Pacific Biosciences社の一分子リアルタイム（SMRT（登録商標））テクノロジー、およびナノポア配列決定法（SoniとMeller、Clin Chem (2007) 53:1996-2001）において達成されるような大量並列配列決定は、並列的な方式による高度な多重化の下、試料から単離された多数の核酸分子の配列決定を可能とする（Dear、Brief Funct Genomic Proteomic (2003) 1:397-416）。これらのプラットフォームの各々は、クローンとして増大されたか、あるいは増幅されてすらいない、核酸断片の単一分子群の配列決定をする。ポリヌクレオチド断片の配列情報を得るにあたっては市販の配列決定装置を使用することができる。
【実施例】
【００８２】
［V.実施例］
以下の実施例は本発明を説明するために提供されるのであって、本発明を限定するために提供されるのではない。
【００８３】
［実施例1  検出の感度に影響する因子の解析：GCバイアスおよび性別］
カバー深度およびGC含量を計算するための図式化された手順の枠組みを図1に示す。本発明者らは、ソフトウェアを使用してhg18参照配列をlマー(l-mer)に切り離すことにより参照固有リードを作成し（ここでいうlマーとは、サンプルの配列リードと同じ「l」の長さを有するようにヒト配列参照から人工的に分解されたリードである）、これらの「固有の」lマーを参照固有リードとして回収した。第2に、配列決定したサンプルのリードを、各染色体の参照固有リードにマッピングした。第3に、五分位数外れ値カットオフ法を適用することによって外れ値を削除し、明瞭なデータセットを得た。最後に、すべてのサンプルについて、各染色体のカバー深度をカウントし、すべてのサンプルについて、各染色体にマッピングされた配列決定済み固有リードのGC含量をカウントした。
【００８４】
GC含量がいかにデータに影響するかを調べるために、本発明者らは核型の検査結果を有する300個の正倍数体事例を選び、それらのカバー深度および関連する配列決定リードのGC含量をグラフ上に散布したところ、両者の間に強い相関が示され、そしてこの現象は過去に報告されていないものであった（図2）。図2において、カバー深度はGC含量と強く相関し、4番、13番等のようないくつかの染色体では明白に下向きな傾向を示した一方で、19番、22番等のような他の染色体では上向きの傾向を示した。図3に示すように、すべての染色体をそれらの固有GC含量に基づいて昇順に並べると、より低いGC含量の群の染色体においては下向き傾向が存在する一方で、より高いGC含量の群の染色体においては上向き傾向が存在する。あるサンプルについて配列決定されたポリヌクレオチド断片が他のサンプルより高いGC含量を有しているならば、より低いGC含量の群の染色体においては、このサンプルのカバー深度は上記他のサンプルのものと比較して低下することになり、より高いGC含量の群の染色体においては上昇することになる、と解釈することができる。
【００８５】
異なるGC含量の染色体間のこのような異なる変化傾向について考え得る説明としては、図4に示す異なる染色体におけるGC含量組成の違いと、配列決定過程において導入されるGCバイアスとの組合せがある。各染色体について、すべての35マー参照固有リードのGC含量を使用して、GC含量を36個のレベルに分類する。各染色体の組成GCとしての各レベルのパーセンテージを計算し、Heatmap2ソフトウェアを用いてヒートマップを描くために使用した。13番染色体を例にすると、その大部分はより低いGC含量の配列セグメントから構成されているが、その小部分はより高いGC含量の配列セグメントから構成されている。もし配列決定またはPCR処理の際の条件が、より高いGC含量のセグメントの配列を好むものであるならば、低GC含量である13番染色体の比較的大部分は配列決定されにくくなり、このサンプルの13番染色体におけるカバー深度が低下するという結果がもたらされたであろう。それと比較して、19番染色体のようなより高いGC含量の群では、このサンプルの19番染色体におけるカバー深度はより高くなっている。なぜなら19番染色体の大部分はシークエンサーが好む高GC含量であったからである。どの染色体であろうとGCに乏しいセグメントおよびGCに富んだセグメントは配列決定しにくいが、しかしGCバイアスによってもたらされる影響は、異なるGC含量組成を有する異なる染色体に応じて異なっていた。すべての参照染色体を1KBの区分に分割し、その区分における各々の固有参照リードのGC含量を計算した。適切な区間形式(interval form) [0.3, 0.6]内にある各区分のGC含量を0.001のステップサイズで分割し、すべての区間における相対カバー度を計算する。図5は、各染色体についての相対カバー度とGC含量とのプロットを示す。
【００８６】
独立2標本t検定を使用して、胎児の性別がデータに与える影響を解析した。ほぼ同じGC含量において、性染色体を除き常染色体間には有意差は見出されなかったが、女性と男性との間ではUR%の明白な差が存在し（Chiuら、(2008) Proc Natl Acad Sci USA 105:20458-20463）、常染色体の異数性を検出するときには胎児の性別を見分ける必要はないが、XO、XYY等のような性染色体の異数性を検出するときにはまず胎児の性別を見分ける必要があることが示唆される。
【００８７】
［実施例2  統計モデル］
上記で論じたこの現象を使用し、本発明者らは局所多項を用いてカバー深度と対応するGC含量との間の関係をあてはめることを試みた。カバー深度は、以下の式のように、GCの関数と正規分布の残差とからなり、
【数４１】
0005659319.tif 000041
ここで、
【数４２】
0005659319.tif 000042
はサンプルi、染色体jのカバー深度と対応するGC含量との間の関係についての関数を表し、εi,jはサンプルi、染色体jの残差を表す。
【００８８】
カバー深度と対応するGC含量との間には、強くない線形関係が存在することから、本発明者らは、loessアルゴリズムを適用してカバー深度を対応するGC含量とともにあてはめ、そこから、本発明者らのモデルにとって重要な値、すなわちあてはめられたカバー深度
【数４３】
0005659319.tif 000043
を計算した。このあてはめられたカバー深度を用いて、標準分散およびスチューデントのtを以下の式6および式7に従って計算した。
【数４４】
0005659319.tif 000044
【数４５】
0005659319.tif 000045
【００８９】
［実施例3  胎児分割合の推定］
胎児分割合は本発明者らが行う検出にとって非常に重要であるという理由から、本発明者らは、試験手順に先立って胎児分の割合を推定した。先述したように、本発明者らは19人の成人男性の配列決定を行い、そのカバー深度を女性胎児を身ごもった事例のものと比較したところ、男性のX染色体のカバー深度は女性のX染色体のカバー深度のほぼ1/2倍であり、男性のY染色体のカバー深度は女性のY染色体のカバー深度よりほぼ0.5も大きいことを見出した。従って、式8、式9および式10のように、GC相関も考慮しながら、X染色体およびY染色体のカバー深度に依存して胎児分の割合を推定でき、
【数４６】
0005659319.tif 000046
【数４７】
0005659319.tif 000047
【数４８】
0005659319.tif 000048
ここで、
【数４９】
0005659319.tif 000049
は、女性胎児を有する事例のX染色体カバー深度と対応するGC含量との回帰相関によるあてはめられたカバー深度であり、
【数５０】
0005659319.tif 000050
は、女性胎児を有する事例のY染色体カバー深度と対応するGC含量との回帰相関によるあてはめられたカバー深度を表し、
【数５１】
0005659319.tif 000051
は、成人男性のX染色体カバー深度と対応するGC含量との回帰相関によるあてはめられたカバー深度を表し、
【数５２】
0005659319.tif 000052
は、成人男性のY染色体カバー深度と対応するGC含量との回帰相関によるあてはめられたカバー深度を表す。単純に計算するために、所与の
【数５３】
0005659319.tif 000053
と
【数５４】
0005659319.tif 000054
は同等であり、
【数５５】
0005659319.tif 000055
と
【数５６】
0005659319.tif 000056
は同等である。
【００９０】
［実施例4  すべての染色体の残差の計算］
図6は、一定の固有リード総数のもとにおけるすべての染色体についての標準変動（式3を参照のこと）は、関与する参照事例数により影響されることを示す。各事例について170万の総固有リード数が配列決定されたという条件下で、選ばれた事例数が150より大きい場合は、標準変動はほとんど増加しなかった。しかしながら、標準変動は異なる染色体では異なっていた。GCバイアスを考慮に入れた後では、本発明者らの方法は、13番染色体（0.0063）、18番染色体（0.0066）、および21番染色体（0.0072）について中程度の標準変動を有していた。X染色体の標準変動は上述の染色体よりも高く、これは正確な異常検出を行うためにさらなる戦略を必要とするものである。
【００９１】
図7はQ-Qプロットを示しており、ここで残差は正規分布にコンパイルされ、スチューデントtの計算が合理的であることを示唆している。
【００９２】
［実施例5  胎児性別の識別］
性染色体の障害を発見するためには、胎児の性別を見分けることが最善である。本発明者らが300個の事例におけるY染色体のカバー深度の頻度分布を調べたところ、2つの明白なピークが存在しており、Y染色体のカバー深度によって性別を見分けるというヒントを発明者らは得た。図8のように、カバー深度が0.04未満である事例は女性胎児を身ごもっているとみなすことができ、0.051を超える事例は男性胎児を身ごもっているとみなすことができ、0.04と0.051の間ならば性別不明とみなされる。これらの性別不明瞭事例および異数性事例については、式11のようにしてロジスティック回帰を使用して性別を予測し（Fanら、Proc Natl Acad Sci USA (2008) 42:16266-16271）、
【数５７】
0005659319.tif 000057
ここで、
【数５８】
0005659319.tif 000058
および
【数５９】
0005659319.tif 000059
はそれぞれXおよびYの正規化された相対カバー度である。
【００９３】
核型の結果と比較すると、胎児性別を見分けるための本発明者らの方法は300個の参照事例において100%の精度で非常にうまく機能し、その一方で901個の事例セットにおいて実行した場合には1つの事例を誤認したが、誤認されたこの事例のY染色体カバー深度は0.04と0.051の間である。
【００９４】
［実施例6   GC相関t検定アプローチの診断的性能］
サンプル募集
事前に深セン市人民病院および深セン市母子ケアサービスセンターから903人の参加者を、その核型の検査結果とともに集めた。それぞれの募集場所の施設内審査委員会から承認を受け、すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。血液採取時における母体の年齢および妊娠週数を記録した。この903個の事例は、2個の13トリソミー事例、15個の18トリソミー事例、16個の21トリソミー事例、3個のXO事例、2個のXXY事例、および1個のXYY事例を含んでいた。参加者らの核型の結果の分布を図9に示す。
【００９５】
母体血漿DNAの配列決定
参加した各妊娠女性から末梢静脈血（5ミリリットル）を採取してEDTAチューブに入れ、4時間以内に、1,600gで10分間遠心分離した。血漿を微量遠心機用チューブに移し、16,000gで10分間、再び遠心分離して、残っていた細胞を除去した。細胞非含有血漿を、DNA抽出をする時まで80℃で保存した。各血漿試料は一度だけ凍結・解凍した。
【００９６】
大量並列ゲノム配列決定のために、母体血漿600μlからのすべての抽出DNAを使用して、Illumina社の修正プロトコールに従ってDNAライブラリー作製を行った。手短に述べると、T4 DNAポリメラーゼ、Klenow（登録商標）ポリメラーゼ、およびT4ポリヌクレオチドキナーゼを使用して、母体血漿DNA断片の末端修復を行った。末端A残基を付加した後、DNA断片に市販のアダプター（Illumina社）を連結した。それから、標準的なマルチプレックスプライマーを用いた17サイクルのPCRを使用して、アダプター連結DNAを追加的に増幅した。Agencourt AMPure（登録商標）60 mlキット（Beckman社）を使用してPCR産物を精製した。配列決定用ライブラリーのサイズ分布を、2100 Bioanalyzer（登録商標）（Agilent社）上でDNA 1000キットを用いて解析し、リアルタイムPCRで定量化した。Illumina GA II（登録商標）（単一末端配列決定法）上のクラスターステーションの前に、異なるインデックスを有する配列決定用ライブラリーを等量ずつプールして1つとした。
【００９７】
胎児DNAの割合を推定する後続の解析のために、19個の男性正倍数体サンプルを配列決定した。13トリソミー、18トリソミー、21トリソミー、および性染色体異常の診断のための1つの新しいGC相関t検定アプローチを本発明者らは開発した。本発明者らは、この新しい方法を、後述する他の2つの方法と、診断性能という点に関して比較した。
【００９８】
［実施例7  13、18、および21トリソミーのような胎児異数性の検出］
患者事例において染色体のコピー数が正常状態から逸脱しているか否かを決定するために、染色体のカバー深度を他のすべての参照事例のものと比較した。過去のすべての研究は1つの帰無仮説を有するのみであった。本発明者らは、2つの帰無仮説を使用することにより、2値仮説を初めて導入した。1つの帰無仮説（H0：胎児は正倍数性である）は、患者事例分布の平均カバー深度と、すべての正常参照分布の平均カバー深度とが同等であるという仮定であり、これは、もしこの帰無仮説が採択されるならばその患者事例は正倍数体であったことを意味する。スチューデントのt検定を使用して、式12のようにt1を計算することができる。
【数６０】
0005659319.tif 000060
別の帰無仮説（H1：胎児は異数性である）は、概算の(rough)胎児分割合を有する患者事例分布の平均カバー深度が、同じ胎児分割合を有する異数性事例の分布の平均カバー深度と同等であるというものであり、これは、もしこの帰無仮説が採択されるならばその患者事例は異数体であったことを意味する。スチューデントのt統計量t2を、式13
【数６１】
0005659319.tif 000061
のように計算した。
【数６２】
0005659319.tif 000062
および
【数６３】
0005659319.tif 000063
は、ほとんどの場合（特に、正倍数体事例と異数体事例との間の分布が完全に区別される場合）には異数体の事例を示す一方で、明確さが不十分であるとか胎児分割合が不十分である等のようなその他の条件では、|t1|が3より小さくても胎児は異常であり得る。t1とt2との組合せは、より正確な決定をする助けとなり得、そこで本発明者らは、式14のようにt1およびt2の対数尤度比を利用した（ここでLi,jは対数尤度比である）。
【数６４】
0005659319.tif 000064
もしこの比が1より大きいならば、胎児がトリソミーであり得ると推量できる。
【００９９】
しかし、女性胎児の事例では、胎児分割合を推定することが難しく、従って計算することが不可能である。しかしながら、胎児分割合の経験的分布に従って、割合7%の参照値（RV）を与えることができる。
【０１００】
903個の事例を調べ、それらのうち866事例は正倍数体胎児を身ごもっており、その中で300事例を無作為に選択して、GC相関スチューデントtアプローチを開発した。さらに、2個の13トリソミー事例、12個の18トリソミー事例、16個の21トリソミー事例、4個のXO事例（3つのXO事例、および1つの45, xo/46, xx（27:23）キメラ事例からなる）、2個のXXY事例、および1個のXYY事例が発明者ら調査に参加していた。アラインメントの後、本発明者らは、事例あたり平均170万のデータ（SD=306185）固有アラインメント済みリード（ミスマッチを含まない）を得た。本発明者らが新たに開発したGC相関スチューデントt検定を使用することにより、すべての13トリソミー事例（2件中2件）を同定することに成功する一方、901件の非13トリソミー事例のうち901件が正しく分類された（図10A）。このアプローチの感度および特異度は100%および100%であった（表1）。
【０１０１】
18トリソミーについては、12件の18トリソミー事例のうち12件、および891件の非18トリソミー事例のうち888件を正しく同定することができた（図10A）。このアプローチの感度および特異度はそれぞれ100%および99.66%であった。21トリソミーについては、16件の21トリソミー事例のうち16件、および16件の非21トリソミー事例のうち16件をやはり正しく同定することができた（図10A）。このアプローチの感度および特異度はそれぞれ100%および100%であった。
【０１０２】
［実施例8   XO、XXX、XXY、XYYの検出］
上記では、常染色体のトリソミーの検出を検討したが、XO、XXX、XXY、およびXYYのような性染色体の障害もまた、本発明者らの方法により検出することができる。
【０１０３】
第1に、性別識別により性別を確認した。もし試験事例が女性胎児を身ごもっていると確認されたならば、スチューデントのt値t1
【数６５】
0005659319.tif 000065
を計算することがXXXまたはXOの検出のために必要であり、ここで
【数６６】
0005659319.tif 000066
および
【数６７】
0005659319.tif 000067
は式10と同じである。もしt1が3.13より大きいかまたは-3.13より小さいならば、この事例はXXXまたはXOであり得る。しかし、X染色体についてのカバー深度の大きな偏差により精度が制限されていたことを考慮して、本発明者らは血漿を再び採取して実験を繰り返し、
【数６８】
0005659319.tif 000068
であっても
【数６９】
0005659319.tif 000069
である場合により信頼性のある決定を行った。この場合では
【数７０】
0005659319.tif 000070
が異数性であることが確認された。本発明者らのすべての検出プロセスは、データが標準的な品質管理を満たしていることを前提とするものであった。
【０１０４】
もし試験サンプルが男性胎児を身ごもっていることが確認されたら、胎児DNA割合はまずYおよびXによって推定した。その一方で、Y染色体のカバー深度のみによって推定された胎児DNA割合を用いてX染色体についてのあてはめられたカバー深度を外挿することができ、t2を計算することができる。
【数７１】
0005659319.tif 000071
もしt2が大きすぎたり（5より大きい）あるいは小さすぎたり（-5より小さい）すれば、その胎児はXXYまたはXYYであり得る。さらに、XとYによって独立に推定された胎児分割合の間の隔たりは、性染色体についての障害を検出するための情報を提供する。
【０１０５】
XOの検出においては、4件のXO事例のうち3件が検出され、同定できなかった事例はキメラ事例であった（図10B）。このアプローチの感度および特異度はそれぞれ75%（キメラ事例を無視するならば100%）および99.55%であった。XXY事例については、2つの事例の両方を同定することに成功する一方、901件の非XXY事例のうち901件が正しく分類され（図10B）、感度100%、特異度100%であった。XYY事例については正しく同定することができ（図10B）、感度および特異度はそれぞれ100%および100%であった。
【０１０６】
本発明者らの新規アプローチが、他の2つの報告されたアプローチ、すなわちzスコアおよびGC補正を伴うzスコアと比較して何らかの有利点を有するか否かを評価するために、本発明者らはこれらの3つのアプローチすべてを実施し、これらすべてのアプローチについて本発明者らの900事例および参照セットと同じ300事例を解析した。測定の精度は常に信頼値（CV）として具体化した。本発明者らの調査では、臨床的な関心事項である18番および21番染色体において、標準的なzスコアアプローチのCVは他のアプローチよりも高く（図11）、その結果、18トリソミーおよび21トリソミーについてより低い感度となっている（表1）。
【表１】
0005659319.tif 000072
【０１０７】
GC補正を伴うzスコアアプローチについては、13番染色体のCV値は0.0066であり、100%の感度および100%の特異度を伴っている。本明細書で記述した新規GC相関スチューデントtアプローチについては、13番染色体のCV値は0.0063であり、100%の感度および100%の特異度を伴っている。18番染色体では、これら2つのアプローチのCVはそれぞれ0.0062および0.0066であり、どちらも感度は100%であって、それらの特異度はそれぞれ99.89%および99.96%であった。21番染色体についてこれら2つのアプローチのCVを比較した場合には同様の成績であった（それぞれ0.0088および0.0072）。本発明者らの小さな事例セットの調査ではどちらも同じ100%の感度をもたらし、同じ100%の特異度を達成した。そして、これら2つの方法はいずれも標準的なzスコアアプローチよりも成績が良かった。本発明者らが新たに開発したGC相関のアプローチは、好成績を有してGC補正アプローチと比肩するだけでなく、XO、XXYおよびXYYのような性染色体異常の検出において別の有利点を有していた。本発明者らのデータは、GC補正アプローチを処理する場合には、重み因子を乗ずることにより配列タグの数を補正することで導入される、性染色体を表すデータの偏差によって、胎児の性別を見分けることが困難になることを示しており、従って性染色体障害の検出は難しいと見られた。
【０１０８】
［実施例9  データサイズ、妊娠週数、および胎児DNA割合を考慮した、GC相関t検定アプローチの理論的性能］
母体DNAの高いバックグラウンドのために、異数性を測定することは依然として難しいことであり（Fanら、Proc Natl Acad Sci USA (2008) 42:16266-16271）、今日に至るまで、大量並列ゲノム配列決定（MPGS）アプローチによる異数性の検出において、恣意的であってかつ小さい胎児DNA割合が最も重要な制約要因であった。しかしながら、MPGS検出の前に最小胎児DNA割合（特に女性胎児について）を臨床的に決定することについて大きな進展がなく、胎児DNAの割合を示すことに関連する唯一の臨床的手掛かりは妊娠週数であった。胎児DNA割合と妊娠期間との間には統計学的に有意な相関があることが以前に報告されている（Loら、Am. J. Human Genet. (1998) 62:768-775）。本発明者らの研究では、推定胎児DNA割合と妊娠期間との間の関係を調べるために、図12において、男性胎児を有するすべての本調査参加事例（全427事例）の胎児DNA割合をプロットし、推定式10を示した。各々のサンプルの推定胎児DNA割合は妊娠期間と相関している（Pは0.0001より小さい）。このデータはまた、妊娠期間20週においてでも、胎児DNA割合が5%未満であるものが65事例中4事例あることを示しており、これは検出精度に悪影響を与えるであろう。胎児分割合推定法を評価するために、本発明者らは、推定胎児分割合において階層的に分布しているいくつかの事例を選び、Q-PCRの補助によって、別個に相対胎児分割合を計算した。そこから、それらの間の強い相関を示す相関標準曲線が得られ、本発明者らの方法による胎児分割合の推定は信頼できるものであることが示された。
【０１０９】
一方で、配列決定深度（合計固有リード数）は、標準変動の値に具体化される異数性検出精度に影響する、もう1つの重要な因子である。参照事例数が150に達する場合には、本発明者らのGC相関アプローチにおいて利用される各染色体についての標準変動は一定レベルの配列決定深度のもとで固定され得る（図13）。配列決定深度がどのように各染色体についての標準変動に影響するかを調べるために、本発明者らは、170万のレベルにおいてだけではなく、合計固有リード数が500万（SD=170万）に達するもう1つの配列決定深度レベルにおいて、150事例の配列決定を行った。これら2つのセットによって、図6に示したように、標準分散は合計固有リード数の平方根の逆数と線形関係にあることを見出した。
【０１１０】
所与の胎児DNA割合について、染色体コピー数の正常状態からの偏差をt1=3にて検出するために発明者らの方法において必要とされる合計固有リード数を推定することができた（図14）。胎児DNA割合がより小さければ、より大きな配列決定深度が必要となることが示された。170万の固有リードのセットにおいては、本発明者らのアプローチは、4.5%を超える胎児DNA割合があれば13番染色体およびX染色体の異数性胎児を検出することができ、4%を超える胎児DNA割合があれば21番染色体および18番染色体の異数性胎児を検出することができる。一方で、500万の参照セットにおいては、発明者らのアプローチは、約3%の胎児DNA割合であっても18トリソミーおよび21トリソミーを検出する能力を有していた。約4%の胎児分割合においてXXXまたはXOのようなX染色体異常のある胎児を同定したいのであれば、これらの事例および対応する参照事例のために必要とされる合計固有数は500万に達するはずである。もし胎児DNAが3.5%に満たないのであれば、必要な配列決定深度は2000万を超えるであろう。DNA胎児分割合がより低いのであれば、検出は考えられないほど難しくなるので、本発明者らは別の戦略、すなわち、妊娠期間がより長くなった時にその妊娠女性の血漿を再採取し、上記実験を再実行し、データを再解析するべきことを発明者らは提案したが、これは妊娠期間の増加とともに胎児DNA割合が上昇するという可能性が高いことに基づく。この戦略は、胎児DNA割合が小さいことが疑われているサンプルにも適用できる。
【０１１１】
本発明者らのアプローチは高性能だとしても、大きなセットの異常事例を用いなければ説得力がない。本発明者らが適用するこのGC相関スチューデントtアプローチの感度を評価するために、異なる妊娠期間および異なる配列決定深度を考慮した理論的感度を公表した。
【０１１２】
発明者らは、以下の工程により異数性の理論的感度を計算した。第1に、回帰分析を適用して胎児DNA割合を妊娠期間にあてはめ、
【数７２】
0005659319.tif 000073
（ここで、
【数７３】
0005659319.tif 000074
は妊娠期間第i週
【数７４】
0005659319.tif 000075
における胎児DNA割合のあてはめ平均値である）、ガウシアンカーネル密度推定を利用することにより近似的な胎児DNA割合分布を推定した（Birke、(2008) Journal of Statistical Planning and Inference 139:2851-2862）（主に妊娠19週および20週に分布する推定胎児DNA割合を参照し、その後、胎児DNA割合と妊娠期間との間の関係
【数７５】
0005659319.tif 000076
に従って他の週数における胎児DNA割合分布を外挿した。ここで、
【数７６】
0005659319.tif 000077
は妊娠期間第i週における胎児DNA割合のあてはめ確率密度であり、Xは妊娠19週および20週のデータである）（図12）。第2に、前述したように合計固有リード数に従って標準分散を推定した
【数７７】
0005659319.tif 000078
（ここで、
【数７８】
0005659319.tif 000079
は合計固有リード数である）。最後に、各配列決定深度において推定された胎児DNA割合分布および標準分散に従って、一定の配列決定深度レベルにてすべての妊娠期間における感度を計算するために、すべての胎児DNA割合における偽陰性の確率密度を計算し（ここでは胎児DNA割合の変動は正規分布であることを仮定した）、それらをまとめて、すべてのレベルの胎児DNA割合からなる妊娠期間における偽陰性率（FNR）を得た
【数７９】
0005659319.tif 000080
（ここで、jは染色体j（第j番染色体）である）。この妊娠期間において一定の配列決定深度における理論的感度は1-FNRとして容易に計算される。図15〜21は、本発明者らの計算の結果のプロットを示す。3より大きいスチューデントtを女性胎児の異数性を同定するために設定する一方、男性胎児については、すべての割合の偽陰性の確率密度を計算する際に、2値仮説において言及した棄却限界値として1より大きい対数尤度を採用し、これが女性胎児と比べてより高い感度を達成する助けとなった。
【０１１３】
しかしながら、特に小規模のサンプリングで短い妊娠期間である場合には、妊娠期間に応じた胎児DNA割合の真の分布と限りなく近似した分布を得ることは難しいという理由から、本発明者らの推論は比較的控えめなものとなっている。
【０１１４】
［参考文献］
1.     Virginia P. Sybert, Elizabeth McCauley (2004). Turner’s Syndrome., N Engl J Med (2004) 351:1227-1238.
2.     Robert Bock (1993). Understanding Klinefelter Syndrome: A Guide for XXY Males and Their Families. NIH Pub. No. 93-3202 August 1993
3.     Aksglaede, Lise; Skakkebaek, Niels E.; Juul, Anders (January 2008). "Abnormal sex chromosome constitution and longitudinal growth: serum levels of insulin-like growth factor (IGF)-I, IGF binding protein-3, luteinizing hormone, and testosterone in 109 males with 47,XXY, 47,XYY, or sex-determining region of the Y chromosome (SRY)-positive 46,XX karyotypes". J Clin Endocrinol Metab 93 (1): 169-176. doi:10.1210/jc.2007-1426.PMID 17940117.
4.     H. Bruce Ostler (2004). Diseases of the eye and skin: a color atlas. Lippincott Williams & Wilkins. pp. 72. ISBN 9780781749992.
5.     Driscoll DA, Gross S (2009) Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy. N Engl J Med 360: 2556-2562.
6.      Karl O.Kagan, Dave Wright, Catalina Valencia etc (2008). Screening for trisomies 21, 18 and 13 by maternal age, fetal nuchal translucency, fetal heart rate, free b-hCG and pregnancy-associated plasma protein-A. Human Reproduction Vol.23, No.9 pp. 1968-1975, 2008 doi:10.1093/humrep/den224
7.     Malone FD, et al. (2005) First-trimester or second-trimester screening, or both, for Down's syndrome. N Engl J Med 353:2001-2011.
8.     Fan HC, Quake SR (2010) Sensitivity of Noninvasive Prenatal Detection of Fetal Aneuploidy from Maternal Plasma Using Shotgun Sequencing Is Limited Only by Counting Statistics. PLoS ONE 5(5): e10439. doi:10.1371/journal.pone.0010439.
9.     Chiu RW, Chan KC, Gao Y, Lau VY, Zheng W, et al. (2008) Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma. Proc Natl Acad Sci USA 105: 20458-20463.
10.    McCullagh, P. and Nelder, J.A. (1989), Generalized Linear Models, London, UK: Chapman & Hall/CRC.
11.    Fan HC, Blumenfeld YJ, et al. (2008) Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood. Proc Natl Acad Sci USA 42:16266-16271.
12.    Melanie Birke. (2008) Shape constrained kernel density estimation. Journal of Statistical Planning and Inference Volume 139, Issue 8, 1 August 2009, Pages 2851-2862.
13.     Lo et al., Lancet 350:485 487 (1997).
14.     Lo et al., Am. J. hum. Genet. 62:768-775 (1998).
15.     Pertl and Bianchi, Obstetrics and Gynecology 98:483-490 (2001).
16.     Rogers and Ventner, "Genomics: Massively parallel sequencing," Nature, 437, 326-327 (15 Sep. 2005).
17.     Mewar et al., "Clinical and molecular evaluation of four patients with partial duplications of the long arm of chromosome 18," Am J Hum Genet. 1993 December; 53(6):1269-78.
18.     Margulies et al., (2005) Nature 437:376-380.
19.     Harris et al., (2008) Science, 320:106-109.
20.     Soni and Meller, (2007) Clin Chem 53:1996-2001.
21.     Dear, (2003) Brief Funct Genomic Proteomic 1:397-416.
【図１】
0005659319.tif 000104
【図２−１】
0005659319.tif 000105
【図２−２】
0005659319.tif 000106
【図２−３】
0005659319.tif 000107
【図２−４】
0005659319.tif 000108
【図３】
0005659319.tif 000109
【図４】
0005659319.tif 000110
【図５−１】
0005659319.tif 000111
【図５−２】
0005659319.tif 000112
【図５−３】
0005659319.tif 000113
【図５−４】
0005659319.tif 000114
【図６−１】
0005659319.tif 000115
【図６−２】
0005659319.tif 000116
【図６−３】
0005659319.tif 000117
【図６−４】
0005659319.tif 000118
【図７−１】
0005659319.tif 000119
【図７−２】
0005659319.tif 000120
【図８】
0005659319.tif 000121
【図９】
0005659319.tif 000122
【図１０Ａ】
0005659319.tif 000123
【図１０Ｂ】
0005659319.tif 000124
【図１１】
0005659319.tif 000125
【図１２】
0005659319.tif 000126
【図１３】
0005659319.tif 000127
【図１４】
0005659319.tif 000128
【図１５】
0005659319.tif 000129
【図１６】
0005659319.tif 000130
【図１７】
0005659319.tif 000131
【図１８】
0005659319.tif 000132
【図１９】
0005659319.tif 000133
【図２０】
0005659319.tif 000134
【図２１】
0005659319.tif 000135