(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
８〜３６個の炭素のアルキル鎖からなる骨格を含む、アジュバント又は免疫調節剤を調製するための合成モノミコリルグリセロール（ＭＭＧ）の使用。
【請求項２】
前記合成ＭＭＧが：
0005689314.tif 000003
で表される、請求項１に記載の合成ＭＭＧの使用。
【請求項３】
請求項１又は２の記載に従って調製されたアジュバント又は免疫調節剤。
【請求項４】
界面活性剤をさらに含む、請求項３に記載のアジュバント又は免疫調節剤。
【請求項５】
前記界面活性剤が、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ−Ｂ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド（ＤＤＡ−Ｃ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムスルフェート、ジメチルジオクタデシルアンモニウムホスフェート、ジメチルジオクタデシルアンモニウムアセテート、ジメチルジオクタデセニルアンモニウムブロミド（ＤＯＤＡ−Ｂ）、ジメチルジオクタデセニルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡ−Ｃ）、ジメチルジオクタデセニルアンモニウムスルフェート、ジメチルジオクタデセニルアンモニウムホスフェート、ジメチルジオクタデセニルアンモニウムアセテート、１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジアラキドイルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジアラキドイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＡＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、又はジアラキドイルホスファチジルグリセロール（ＤＡＰＧ）を含む、請求項４に記載のアジュバント又は免疫調節剤。
【請求項６】
α，α’−トレハロース６，６’−ジベヘネート（ＴＤＢ）及びムラミルジペプチド（ＭＤＰ）からなる群から選択される非ＴＬＲリガンド、又はポリイノシンポリシチジン酸（Ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ）を含むＴＬＲリガンドである追加の免疫調節剤を含む、請求項３ないし５のいずれか１項に記載のアジュバント又は免疫調節剤。
【請求項７】
８〜３６個の炭素のアルキル鎖からなる骨格を含む、合成ＭＭＧ。
【請求項８】
８〜１６個の炭素又は最大で３６個の炭素を有する、請求項７に記載の合成ＭＭＧ。
【請求項９】
前記合成ＭＭＧが：
0005689314.tif 000004
で表される、請求項８に記載の合成ＭＭＧ。
【請求項１０】
非経口、経口、粘膜投与、舌下、経皮、局所、吸入、鼻腔内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内のための、又は遺伝子銃、皮膚パッチによる、又は点眼剤若しくはうがい薬の形態における、請求項３ないし６のいずれか１項に記載のアジュバント又は免疫調節剤を含むワクチン。
【請求項１１】
抗原性成分を更に含む、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
前記抗原性成分が細胞内病原体由来の抗原性エピトープを含む、請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記抗原性成分が、有毒のマイコバクテリウム、結核菌、ウシ型結核菌又はマイコバクテリウム・アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）由来の抗原性エピトープを含む、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記抗原性成分が、融合生成物Ａｇ８５ｂ＿ＴＢ１０．４、Ａｇ８５ｂ＿ＥＳＡＴ−６＿Ｒｖ２６６０、Ａｇ８５ｂ＿ＴＢ１０．４＿Ｒｖ２６６０、及びＡｇ８５ａ＿ＴＢ１０．４＿Ｒｖ２６６０の中から選択される、請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１５】
前記抗原性成分が、Ｍｓｐ１、Ｍｓｐ２、Ｍｓｐ３、Ａｍａ１、ＧＬＵＲＰ、ＬＳＡ１、ＬＳＡ３、及びＣＳＰからなる群から選択される熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、ＣＴ１８４、ＣＴ５２１、ＣＴ４４３、ＣＴ５２０、ＣＴ５２１、ＣＴ３７５、ＣＴ５８３、ＣＴ６０３、ＣＴ６１０、及びＣＴ６８１からなる群から選択されるトラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、ＨＩＶ、インフルエンザ又は肝炎Ｂ若しくはＣ由来の抗原性エピトープを含む、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１６】
癌、自己免疫障害、アルツハイマー病を含む神経障害、気道炎症、炎症性障害、感染性疾患、皮膚障害、アレルギー、喘息、又は病原体により惹起される疾患を治療するための、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１７】
癌、自己免疫障害、アルツハイマー病を含む神経疾患、気道炎症、炎症性障害、感染性疾患、皮膚障害、アレルギー、喘息又は病原体により惹起される疾患を治療するための、請求項３ないし６のいずれか１項に記載のアジュバント又は免疫調節剤を含む送達ビヒクル。
【請求項１８】
前記合成ＭＭＧが、１つまたは複数のワクチン、抗原、抗体、細胞傷害性因子、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＬＲ及び非ＴＬＲアゴニスト、ＴＬＲ及び非ＴＬＲアンタゴニスト、ペプチド、タンパク質、遺伝子療法ベクター、ＤＮＡワクチン、免疫調節剤、又は共刺激性分子との組合せで投与される、請求項１７に記載の送達ビヒクル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫調節剤、アジュバント及びワクチン又はこのアジュバントを含む送達系を調製するための、モノミコリルグリセロール（ＭＭＧ）又はその合成同族体、類似体及び改変体の使用を開示する。
【背景技術】
【０００２】
最初のワクチンは、生きた弱毒化された病原体からなるものであった。弱毒化形態は、天然に生ずる密接に関係する生物であるか又は培養で連続継代により得られるかのいずれかであった。例えば、ヒトにおける結核（ＴＢ）は、多年にわたり、８０年を超える以前に開発されたウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ）の弱毒株ＢＣＧワクチンによるワクチン接種により対処されてきた。しかしながら、３０億を超える用量のＢＣＧが投与されたにも拘わらず（他のいかなるワクチンも超える）、それは、どの集団においてもヒトＴＢに対する満足な抵抗性を必ずしも提供しない。
【０００３】
現在、最新の手法は、高度に精製された物質、例えば精製された組み替えタンパク質又はペプチドを使用することである。これらのワクチンは、十分解明されており、副作用は最小化されている。残念ながら、多くの高度に精製された物質は、免疫原性が強くなくて、防御を与えるのに十分な免疫応答を誘発しない。これを行うために、抗原は、アジュバントと呼ばれる免疫応答強化剤から幾らかの助力を必要とする。病原体に応じて、防御は、液性の又は細胞媒介の応答のいずれが支配的であるかを要求することができる。免疫血清により移入され得る免疫応答は液性免疫と称され、感染性因子に関連する抗原性物質と結合して、それにより抗原性物質に対する免疫応答を始動させる抗体により媒介される抵抗性を意味する。細胞媒介免疫（ＣＭＩ）は、免疫応答を担う免疫系細胞に依存する。ＣＭＩ、又はＴヘルパー（Ｔｈ）１の免疫応答は、一般的には、リーシュマニア及び結核を含む細胞内病原体との闘いに関連しているが、他のタイプの感染例えば酵母感染カンジダとの闘いにも役割を有する。液性、又はＴｈ２免疫応答は、細胞外病原体、例えば蠕虫感染に対する防御のために必要とされる。
【０００４】
多くの場合、例えばインフルエンザ、肝炎Ｃ（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、クラミジア及びマラリアの場合に、感染のステージに依存して、混合したＴｈ１／Ｔｈ２応答が必要になり得る（Ｍｏｓｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｓａｄ  １９９６）。これら場合、それらの生活環の一部は細胞内であるが、それらは細胞外の相を通っても移動、例えば細胞間伝播するので、Ｔｈ１及びＴｈ２の両方が必要になる。
【０００５】
特定の種類の免疫応答（液性又は細胞媒介）の開発は、アジュバントの選択により決定され得る。例えば、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のような細胞内病原体に対する防御免疫は、細胞媒介免疫応答を必要とし、ＴＢを目的とするサブユニットワクチン用の適当なアジュバントは、Ｔｈ１応答を増強すべきである（Ｌｉｎｄｂｌａｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９７）。
【０００６】
多数のアジュバントが存在するが、それらの大部分は、それらのヒトにおける使用を妨げる数多くの問題に悩まされている。少数のアジュバントだけ、例えばアルミニウム系アジュバント（ＡｌＯＨ塩）及びＭＦ−５９が、ヒトへの使用を許容されているが、しかし、それらは両方ともＴｈ２に偏った応答を誘発し、そのことがそれらを、Ｔｈ１応答を必要とするＴＢワクチンおよび他のワクチンとして不適当にしている（Ｌｉｎｄｂｌａｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９７）。
【０００７】
過去２０〜３０年の間、多数の新しいアジュバント系が確認されて、それらの幾つかは現在開発中である。それにも拘わらず、新アジュバント系に対する必要性は、臨床用途に利用可能な選択が不足している中で、未だなお認識されており（Ｍｏｉｎｇｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、明らかである。
【０００８】
アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ：ラテン語のａｄｊｕｖａｒｅに由来し、助けるという意味）は、ワクチン中で投与されたときに、特異的な免疫応答を指示、促進、延長、及び／又は増強するのに役立つ任意の物質と定義することができる。アジュバントは、送達系又は免疫調節剤／免疫刺激剤のいずれか二つの主なカテゴリーに分けられている。送達系は、例えば、エマルション、ポリスチレン粒子、ニオソーム（ｎｉｏｓｏｍｅ）、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）、ビロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ）、ミクロスフェア、又は脂質二重層で構成される小胞である界面活性剤様リポソームにすることがでる。リポソームは、抗原（小胞内か又は表面に付着しているかのいずれか）の担体として作用し、接種部位でデポを形成することができて、抗原の緩やかな連続的放出を可能にする。注射及び食作用後の短時間中に、リポソームの提示により、特定量の抗原が単一抗原提示細胞に行き渡ることが確実になる（Ｇｌｕｃｋ，１９９５）。免疫調節剤は、独特の細胞又は受容体、例えばＡＰＣの表面上のＴｏｌｌ様受容体を標的とする。送達系と免疫調節剤とは、一緒に、例えばＧｌａｘｏの一連のアジュバントにおけるように使用することができる。したがって、送達系は、ワクチン抗原の送達に加えて、免疫調節剤を送達するために使用することもできる。
【０００９】
ワクチン中の成分であることに加えて、免疫調節剤は、抗原（単数又は複数）なしで投与することもできる。この手法により、免疫系を局所的に活性化することが可能であり、例えば、抗腫瘍及び抗ウイルス活性にとって重要な、抗原提示細胞の成熟、サイトカイン産生として見られる。したがって、免疫調節剤の投与は、例えば癌及び皮膚疾患の根絶における支援になり得る。局所投与できる免疫調節剤の例は、タキサン類、例えばタキソール、Ｔｏｌｌ様受容体７／８リガンドのレシキモッド（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）、イミキモッド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）、ガルジキモッド（Ｇａｒｄｉｑｕｉｍｏｄ）である。
【００１０】
ジメチルジオクタデシルアンモニウム−ブロミド、−クロリド、−ホスフェート、−アセテート又は他の有機若しくは無機塩（ＤＤＡ）は、親油性第四級アンモニウム化合物であり、水溶液中において４０℃を超える温度でカチオン性リポソームを形成する。ＤＤＡは、ＡＰＣ中へのワクチン抗原の取り込みを増大させる非常に効率的な送達系である。ＤＤＡと免疫調節剤との組合せは記載がある。ＤＤＡを含むＡｒｑｕａｄ  ２ＨＴのヒトにおける投与は有望であり、明確な副作用を誘発しなかった（Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ，１９７３）。ＤＤＡとＴＤＢとの又はＤＤＡとＭＰＬとの組合せは、送達ビヒクル（ＤＤＡ）と免疫調節剤（ＴＤＢ又はＭＰＬ）との間の非常に明瞭な相乗効果を示し、どちらかの成分単独で得られる応答に比較して、高度に上昇したレベルのＣＭＩ応答があった。したがって、ＤＤＡは、例えば、ＴＢ及び他の細胞内病原体に対するワクチンのためのアジュバント系の開発において、ワクチン抗原及び免疫調節剤のための有望な送達ビヒクルである。
【００１１】
マイコバクテリア由来の種々の化合物が、免疫調節性であると報告されている。ウシ型結核菌ＢＣＧから抽出された脂質がアジュバントとして使用されたとき、卵白アルブミンに対する皮膚試験応答が、モルモットで得られた（Ｈｉｕ  １９７５）。ウシ型結核菌ＢＣＧの全極性脂質から温度を上げて形成されたリポソームは、卵白アルブミンに対する液性応答を生じさせることができて、これらの極性脂質から調製されたワクチンは、マウスにおいて腫瘍細胞でチャレンジしたとき、防御を与えた（ＷＯ０３／０１１３３６）。モルモットに対する実験的ＴＢワクチンにおける結核菌Ｈ３７Ｒｖ由来の全脂質の抗原としての効果が、Ｄａｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００３）により研究された。この研究においては、コレステロールと１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスドコリン（ＤＳＰＣ）とに基づくリポソームが、結核菌Ｈ３７Ｒ．Ｖの全脂質抽出物と混合された。溶媒を除去した後、脂質は、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）をアジュバントとして、ＰＢＳ緩衝液中で再構成された。このワクチンで免疫されたモルモットは、細菌の有意の減少を示さず、ＤＤＡと混合されたリポソームのこの製剤は、強力な抗原を欠くこと、又はマイコバクテリアの脂質とコレステロール／ＤＳＰＣとの製剤は、ＤＤＡのアジュバント効果を妨げることを示唆した。また、種々の脂質の混合物が投与されたとき、有効な脂質が、全脂質の構成要素となり得る比率はあまりに限られている。
【００１２】
マイコバクテリア由来の種々の精製された成分は、それらのアジュバント活性についても研究されている。精製されたタンパク質誘導体（ＰＰＤ）は、それ自体では遅延型過敏性反応を誘発しなかったが、ワックスＤ（マイコバクテリアの細胞壁のペプチドグリカンフラグメント−アラビノガラクタン−ミコール酸複合体）がアジュバントとして添加されたとき、強い反応が観察された（Ｙａｍａｚａｋｉ  Ｓ，１９６９）。免疫調節剤ＳＳＭ又はＺ−１００、結核菌から抽出された脂質アラビノマンナンは、抗腫瘍活性を有する（Ｓｕｚｕｋｉ  Ｆ，１９８６）。他のマイコバクテリア細胞由来の化合物は、トレハロース６，６’−ジミコレート（ＴＤＭ）（コード因子；ミコール酸含有糖脂質）である（Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ，１９７６）。ＴＤＭ（又は合成類似体）も免疫刺激効果を有し、種々のアジュバント製剤中に含まれてきた（ＭｃＢｒｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９８）（Ｋｏｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９８）。
【００１３】
Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ（１９８５）による論文においては、ウシ型結核菌ＢＣＧから精製された５つの成分が、脂質で被覆されたチャーコール粒子として静脈内に注射されて、マウスの肺内に炎症性反応を生じさせた。５つの成分には、ＴＤＭ、トレハロースモノミコレート（ＭＭＴ）、グルコースモノミコレート（ＭＭＧｌｃ）、アラビノースモノミコレート（ＭＭＡｒ）、及びグリセロールモノミコレート（ＭＭＧｌｙｃ）が含まれた。この論文は、モノグリコリルグリセロール頭部基を記載しているが、ミコール酸の組成物の定義が不十分で、構造データも提供されていない。それに加えて、脂質を投与したときの反応だけは、肺における炎症性活性として記載されているが、アジュバント効果として知られている特異的免疫応答を増強する性能は記載されていない。
【００１４】
マイコバクテリア由来の脂質の免疫刺激性及び炎症性活性は、動物（マウス）モデルにおいて免疫応答を刺激し得る脂質についての増加し続ける文献で何十年間も認められてきたが、今日まで、ヒト樹状細胞（ＤＣ）を刺激する能力を有する個々の脂質（単数又は複数）は同定されていない。例として、ＴＤＭは、炎症誘発性応答に関して最も活性なマイコバクテリア脂質であることが示されているにも拘わらず、ＴＤＭで刺激したとき樹状細胞の活性化は観察されていない（Ｕｅｈｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ，２００３）。このように、ＴＤＭは、数編の論文において炎症性活性を示しているが、この脂質は、免疫応答を開始するために不可欠な樹状細胞を活性化する能力を明らかに欠いている。ヒト樹状細胞を活性化する能力を有するような脂質の同定は、それがヒトにおける使用に適した新規アジュバント系の一部として使用することができることを示唆するであろう。さらに、ヒト使用に適したＴｈ１誘発アジュバントの欠如により、Ｔｈ１助長能力を有する単独のマイコバクテリア由来の脂質の同定は大いなる発見になる。
【００１５】
ＤＣは、結核菌などの病原体に感染したときに免疫応答を指示する必須の役割を演ずる専門の抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。したがって、活性化されたＤＣによるＩＬ−１２の産生は、それが、マクロファージの活性化を促進する、Ｔｈ−１細胞によるＩＦＮ−γの産生の推進にこの上なく重要なサイトカインなので、結核菌感染の制御に不可欠なステップである（Ｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８３）。さらに、近年、免疫応答を調節する試みの中で、マイコバクテリアはＤＣも標的とすることを示す証拠が見出されて、この過程におけるマイコバクテリアの脂質にとって極めて重要な役割が確立された。
【００１６】
マイコバクテリアの細胞エンベロープの乾燥重量の４０％までが、脂質からなる（Ｍｉｎｎｉｋｉｎ  １９８２）。これらの脂質は、この科の生物の独特の病原性と長らく関連づけられており、宿主のマイコバクテリア感染に対する応答において実質的役割を演ずることが知られている（Ｂｒｅｎｎａｎ  ａｎｄ  Ｇｏｒｅｎ  １９７９）。これらの脂質の中で重要なのは、フチオセロールジミコセロセート（ＰＤＩＭ：ｐｈｔｈｉｏｃｅｒｏｌ  ｄｉｍｙｃｏｃｅｒｏｓａｔｅ）ワックスであり（Ｍｉｎｎｉｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２００２）、その存在は病原性と相関することが示されている。ＰＤＩＭ欠損結核菌変異体は、マウス中で減弱した増殖を示す（Ｓｉｒａｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。ＰＤＩＭに密接に関係するのは、いわゆる「フェノール性糖脂質」（ＰＧＬ）であり、適当な例は、ウシ型結核菌中で見出された２−メチルラムノシルフェノール−フチオセロールジミコセロセート（「マイコサイド（ｍｙｃｏｓｉｄｅ）Ｂ」）である。このモノグリコシルＰＧＬと結核菌のある種の分離菌の高毒性との間の関連が、最近、明らかにされた（Ｒｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。
【００１７】
特に興味ある他の種類の脂質は、トレハロース−６，６−ジミコレート（ＴＤＭ）、いわゆる「コード因子」である。ＴＤＭは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１２などの炎症誘発性サイトカイン、及びＴｈ−１促進サイトカインであるＩＦＮ−γ（Ｌｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．２００１）の放出を刺激することにより肉芽腫性病変の維持を助長し、ファゴソーム−リソソーム融合を阻害することにより、マクロファージ内の結核菌の生存を長引かせる役割を有する（Ｉｎｄｒｉｇｏ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。ＴＤＭのミコレート成分の微細構造は、初期感染期におけるマクロファージの炎症誘発性活性化において重要である（Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。
【００１８】
マイコバクテリアの生存の増加におけるそれらの役割にも拘わらず、マイコバクテリア脂質の免疫調節力は、新世代のＴｈ１誘発アジュバントを創出することに利用することもできる。強力な免疫刺激活性を有する個々の脂質の同定において、強力なアジュバント活性をなお維持しながら、油分と混合された加熱殺菌結核菌の全細胞（フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ））の使用に伴う毒性ゆえの問題を回避することは可能であるかもしれない。実際、ウシ型結核菌バチルス・カルメット・ゲラン（ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ）の極性脂質から形成されたリポソームは、マウスの骨髄由来の樹状細胞（ＢＭ−ＤＣ）を活性化することが最近示された。この活性の大部分は、糖リン脂質であるホスファチジルイノシトールジマンノシドという脂質に起因し得ることが見出された（Ｓｐｒｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。
【００１９】
本発明者らの研究室における最近の研究は、強力な液性及び細胞媒介成分で複雑な遅延免疫応答を促進することができる、ウシ型結核菌ＢＣＧからのマイコバクテリア脂質抽出物とジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）との新規なアジュバントの組合せの特性を明らかにした（Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。全ＢＣＧ脂質のアジュバント活性の大部分は、無極性脂質に起因することが見出された。
【００２０】
これらの研究はマイコバクテリア脂質がアジュバントとして作用する可能性をさらに確かなものにするが、最善の解決は、単独で強力な活性を有する、単独の最も免疫刺激性の脂質を同定することであろう。このことは、さらに単純で廉価なアジュバントを提示し、世界中で投与されるワクチンで使用するためのアジュバントに要求される大量に産生され得る脂質の合成類似体を作製して、より無害な系を可能にする可能性も浮揚させるであろう。
【発明の概要】
【００２１】
本発明は、ヒトＤＣを活性化し得る免疫刺激性脂質、モノミコリルグリセロール（ＭＭＧ）及びそれらの合成同族体、類似体及び改変体を開示する。ＭＭＧは全ＢＣＧ脂質の無極性分画に由来し、これらの脂質に関連する、アジュバントの及び防御の効果を誘発する原因である。小さめの炭素主鎖を有する合成ＭＭＧは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて天然ＭＭＧのヒトＤＣに対する刺激性を増強することができ、マウスモデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで、ＴＢに対する長く継続する防御免疫応答につながる強いＴｈ１応答も誘発する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ウシ型結核菌ＢＣＧの無極性及び極性脂質の単離及び免疫刺激活性のアセスメント。ウシ型結核菌ＢＣＧコペンハーゲン株から抽出された極性及び無極性脂質抽出物を２次元ＴＬＣにより分析した。極性脂質分画中において、１〜４はホスファチジルイノシトールマンノシドであり、ＰＩはホスファチジルイノシトールであり、ＰＥはホスファチジルエタノールアミンであり、及びＤＰＧはジホスファチジルグリセロール（カルジオリピド（ｃａｒｄｉｏｌｉｐｉｄ））である。ＰＧは、Ｌ−α−ホスファチジル−ＤＬ−グリセロールであるが、５及び６は、未知のリン脂質である。無極性分画において、ＴＡＧはトリアシルグリセロールであり、ＰＤＩＭはフチオセロールジミコセロセートＡ、Ｂ及びＣであり、ＭＭＧはモノミコリルグリセロールであり、ＰＧＬはフェノール性糖脂質であり、ＦＦＡは遊離脂肪酸である（パネルＡ）。ｉＤＣは、培地単独、ＬＰＳ（０．１μｇ／ｍｌ）、ＭＰＬ（１００μｇ／ｍｌ）、コード因子（ＣＦ）（１００μｇ／ｍｌ）、無極性脂質（０．１−１００μｇ／ｍｌ）又は極性脂質（０．１−１００μｇ／ｍｌ）の存在下に、２４時間インキュベートした。処理後のＤＣ上の表面マーカーの幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）のレベルを示す。３名の異なる提供者を使用した３つの実験のうち１つの代表的実験から得られたデータ（パネルＢ）。１００μｇ／ｍｌの無極性又は極性脂質による処理後に得られた培養上清を、サイトカインＩＬ−６、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１２の存在についてＥＬＩＳＡにより分析した。３名の異なる提供者を使用して３重で実施された３つのうち１つの代表的実験から得られたデータ（±ｓ．ｅ．ｍ）を示す（パネルＣ）。ＰＰＤ陰性の提供者からの、１００μｇ／ｍｌの無極性又は極性脂質で２４時間処理されたＤＣとインキュベーション後の、ＭＬＲアッセイにおける、Ｔ細胞の増殖（パネルＤ）及びＩＦＮ−γ放出（パネルＥ）。３名の異なる提供者を使用して３重で実施された３つのうち１つの代表的実験から得られたデータ（±ｓ．ｅ．ｍ）を示す。
【図２】ＭＭＧ、ＴＡＧ、ＰＤＩＭ及びＰＧＬの構造。個々の脂質ＰＤＩＭ、ＴＡＧ、ＰＧＬ及びＭＭＧの２次元ＴＬＣ分析（パネルＡ）並びにＭＭＧ、ＰＧＬ、ＰＤＩＭ及びＴＡＧの代表的構造（パネルＢ）。
【図３】ＭＭＧによるヒト樹状細胞の活性化。ｉＤＣを、培地単独で（点線）又はＭＭＧ、ＰＤＩＭ、ＰＧＬ若しくはＴＡＧ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下に２４時間インキュベートした。脂質の調製物は、エンドドキシン汚染のないことが認められた（＜０．００１ｎｇＬＰＳ／μｇ脂質）。６名中１名の代表的提供者について、処理後のＤＣ上の表面マーカーのレベルのＭＦＩを示す（パネルＡ）。ＭＭＧ、ＰＤＩＭＡ、ＰＧＬ又はＴＡＧ（１０μｇ／ｍｌ）で処理後に得られた培養上清を、サイトカインＩＬ−６、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１２の存在について、ＥＬＩＳＡにより分析した（パネルＢ）。異なる提供者を使用して３重で実施した３つ又は４つの実験から得られたデータの平均（±ｓ．ｅ．ｍ．）を示す。データはチューキー検定を使用して分析した。
【図４】ＭＭＧのα及びケトミコレートは免疫刺激性である。ｉＤＣは、培地単独及びＭＭＧのα−又はケトミコレート（１０μｇ／ｍｌ）の存在下に２４時間インキュベートした。処理後のＤＣ上の表面マーカーのＭＦＩを示す。
【図５】ウシ型結核菌ＢＣＧコペンハーゲン株から単離されたＭＭＧにより誘発されたＩＦＮ−γ放出。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＢＣＧコペンハーゲン株から単離された脂質に基づくアジュバントとの組合せでＤＤＡリポソームに組み込まれたＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６で免疫した。ワクチン接種７日後に排出するリンパ節から単離されたＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ放出を測定した。
【図６】有毒ＴＢ感染に対するＭＭＧアジュバントを用いる防御。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＤＤＡと１０μｇ又は５０μｇのＭＭＧとに基づくアジュバントとを組み合せて、Ａｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６で３回免疫した。最終ワクチン接種の６週間後に、マウスは結核菌を用いるエアロゾルのチャレンジを受けた。６週間後に細菌の数を肺及び脾臓で測定した。標準的ＢＣＧワクチン接種を受けるマウスは陽性対照として、及び抗原なしでＤＤＡ／ＭＭＧ（１０μｇ）により免疫されるマウスは陰性対照として含まれた。実験的ワクチンの防御の有効性は、免疫されないマウスと比較して、肺における細菌負荷の減少のＬｏｇ１０として表す。結果は、各群中の６匹のマウスについての平均値±ＳＥＭである。免疫されていない対照と有意に異なる値には、＊印を付けてある。Ｐ＜０．０５。
【図７】ＩＦＮ−γ放出は、ＭＭＧとＤＤＡとを組み合わせることにより増大する。２通りの実験において、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＤＤＡ若しくはＤＤＡ／ＭＭＧ中（パネルＡ）又はＭＭＧ若しくはＤＤＡ／ＭＭＧ中（パネルＢ）のＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６で免疫した。最終ワクチン接種の３週間後に、血液から単離された（パネルＡ）又は脾臓中の（パネルＢ）ＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ放出を測定した。
【図８】ＩＦＮ−γ放出は、ＭＭＧ／ＤＤＡの組合せにＴＤＢを添加することにより増大する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＭＭＧが組み込まれたＤＤＡリポソーム中、又はＴＤＢを含有し、ＭＭＧが組み込まれたＤＤＡリポソーム中で投与されたＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６により免疫した。ワクチン接種の５ヵ月後に血液から単離されたＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ放出を測定した。
【図９】合成ＭＭＧ類似体の構造の例。
【図１０】免疫応答は、天然及び合成ＭＭＧ類似体で同等である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＤＤＡ、ＤＤＡ／ＭＭＧ中（１０μｇ）、ＤＤＡ／ＭＭＧ  Ｃ３６中（１０μｇ）又はＤＤＡ／ＭＭＧ  Ｃ１６中（１０μｇ）中のＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６を用いて免疫した。最終免疫の１週間後に血液から単離されたＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ放出を測定した。
【図１１】鎖長が短いほど免疫応答は高い。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＤＤＡ中、又は８から３６の範囲の鎖長の種々のＭＭＧ類似体を含むＤＤＡ中のＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６で免疫した（１μｇ／用量）。最終免疫の３週間後に血液から単離されたＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ放出を測定した。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、免疫調節剤、アジュバント及びワクチン、又はヒト樹状細胞を刺激する特有の能力を有するこのアジュバントを含む送達系を調製するための、モノミコリルグリセロール（ＭＭＧ）又はそれらの合成同族体、類似体及び改変体の使用を開示する。
【００２４】
免疫調節剤として、ＭＭＧ又はそれらの合成同族体，類似体及び改変体は、抗原（単数又は複数）なしでも投与される。この手法により、免疫系を局所的に活性化することが可能であり、例えば、抗腫瘍及び抗ウイルス活性にとって重要な、抗原提示細胞の成熟、サイトカイン産生として見られる。
【００２５】
アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ：ラテン語のａｄｊｕｖａｒｅに由来し、助けるという意味）は、ワクチン中で投与されたときに、特定の免疫応答を指示、促進、延長、及び／又は増強するのに役立つ任意の物質と定義することができる。アジュバントの性質に依存して、それは、細胞媒介免疫応答、液性免疫応答又はその２つの混合した応答を促進することができる。ワクチンアジュバントとして使用されるとき、抗原性成分がアジュバントに添加される。アジュバントにより媒介される免疫応答の増強は非特異的であるから、同じアジュバントが異なる抗原とともに使用されて、異なる標的に対する応答を助長すること、例えば、結核菌由来の抗原とともに結核菌に対する免疫を助長すること、又は腫瘍由来の抗原とともにその特定の種類の腫瘍に対する免疫を助長することができることは、当分野においてよく理解されている。
【００２６】
本発明により開示された好ましいアジュバントは、ＭＭＧ又はそれらの合成同族体、類似体又は改変体を含むアジュバントであり、それらには、送達ビヒクル、例えばエマルション、ポリスチレン粒子、ニオソーム、ＩＳ−ＣＯＭＳ、ビロソーム、ミクロスフェア、又は界面活性剤様リポソームがさらに含まれる。好ましい界面活性剤は、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド又はこのクロリド（ＤＤＡ−Ｂ又はＤＤＡ−Ｃ）又はスルフェート、ホスフェート又はアセテート塩（ＤＤＡ−Ｘ）、又はジメチルジオクタデセニルアンモニウムブロミド又はこのクロリド（ＤＯＤＡ−Ｂ又はＤＯＤＡ−Ｃ）又はスルフェート、ホスフェート又はアセテート化合物（ＤＯＤＡ−Ｘ）に基づくカチオン性脂質であることが最も好ましい。この発明において使用される他のタイプの好ましいカチオン性脂質には、１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン，１，２−ジパルミトイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン及びジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）及びＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）が含まれるが、これらに限定はされない。他の界面活性剤は、ＤＸＰＣ、ＤＸＰＥ、ＤＸＰＧ又はこれらの組合せの中から選択され、ここで、Ｘは、鎖長記載についての置き換え、例えばＰ＝パルミトイル（１６Ｃ）、Ｓ＝ステアロイル（１８Ｃ）、Ａ＝アラキドイル（２０Ｃ）である。
【００２７】
送達ビヒクルは、ＴＬＲ及び非ＴＬＲリガンド様ＭＰＬ（モノホスホリル脂質Ａ）、ポリイノシンポリシチジン酸（ポリ−ＩＣ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、ザイモサン、二重螺旋ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、カチオン性ペプチド、ＴＤＭ、ＴＤＢ、タモキシフェン又はこれらの分子の任意の類似体など他の免疫調節剤のためにも使用することができる。したがって、好ましいアジュバントには、送達ビヒクル中のＭＭＧ又はそれらの同族体、類似体、又は改変体が含まれ、さらにＴＬＲ−又は非ＴＬＲリガンドが含まれる。
【００２８】
ＭＭＧ又はそれらの合成同族体、類似体及び改変体を含む送達系は、癌、自己免疫障害、神経障害例えばアルツハイマー病、気道炎、炎症性疾患、感染性疾患、皮膚疾患、アレルギー、喘息、又は病原体により惹起される疾患を治療するために使用することができる。ＭＭＧ又はそれらの合成同族体、類似体及び改変体は、１つまたは複数ワクチン、抗原、抗体、細胞傷害性因子、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＬＲ−及び非ＴＬＲアゴニスト、ＴＬＲ−及び非ＴＬＲアンタゴニスト、ペプチド、タンパク質、遺伝子療法ベクター、ＤＮＡワクチン、又は共刺激分子との組合せで投与される。
【００２９】
抗原性成分又は抗原性物質は、予め形成された抗体及び／又はＴ細胞及びＢ細胞上の特異的受容体と反応する分子である。ワクチン接種との関係においては、特定のＴ細胞又はＢ細胞の発生を刺激する分子が、抗原が免疫細胞と２度目に遭遇した場合に、より速い「記憶」応答を促進する免疫細胞の記憶集団の形成をもたらすことができる。記憶集団がクローン性であることは稀なので、実際には、このことは、抗原は、以前それに曝されたことがある個体の免疫細胞に再度遭遇したときに、免疫応答における増強を刺激することができる任意の分子又は分子の集合であることを意味する。
【００３０】
本発明は、非経口、経口若しくは粘膜投与又は送達系のための、アジュバントを含むワクチンをさらに開示する。好ましいワクチンには、細胞内病原体に由来する抗原性エピトープ、例えば有毒マイコバクテリウム（例えば、融合生成物Ａｇ８５ｂ＿ＴＢ１０．４、Ａｇ８５ｂ＿ＥＳＡＴ−６＿Ｒｖ２６６０、Ａｇ８５ｂ＿ＴＢ１０．４＿Ｒｖ２６６０及びＡｇ８５ａ＿ＴＢ１０．４＿Ｒｖ２６６０）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）（Ｍｓｐ１、Ｍｓｐ２、Ｍｓｐ３、Ａｍａ１、ＧＬＵＲＰ、ＬＳＡ１、ＬＳＡ３又はＣＳＰ）、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（例えばＣＴ１８４、ＣＴ５２１、ＣＴ４４３、ＣＴ５２０、ＣＴ５２１、ＣＴ３７５、ＣＴ５８３、ＣＴ６０３、ＣＴ６１０又はＣＴ６８１）、ＨＩＶ、インフルエンザ又はＢ型若しくはＣ型肝炎ウイルスに由来する抗原性エピトープが含まれる。アジュバント又は送達系は、癌、アレルギー又は自己免疫疾患を治療するためのワクチンにおいて使用することもできる。
【００３１】
全マイコバクテリア脂質抽出物は、マイコバクテリア、例えばＢＣＧ、Ｍ．ミクロティ（Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）、結核菌及びＭ．バッカエ（Ｍ．ｖａｃｃａｅ）から、化学的又は物理的方法により得られる脂質の混合物である。本研究において、抽出に使用した方法は、有機溶媒の作用であるが（以下に記載する）、当業者に知られた他の可能性も可能である。
【００３２】
無極性脂質の分画は、極性のない脂質と定義される。無極性脂質の分画は、マイコバクテリアをメタノール／食塩水と石油エーテルとの二相混合物で処理することにより得られる。石油エーテル抽出物は、無極性（非極性）脂質を含む。その後、マイコバクテリア及び残留水相にクロロホルムを添加することにより、極性脂質の分画が得られる。クロロホルム抽出物は、残留する極性脂質を含有する。無極性脂質の分画中の主成分は、フチオセロールジミコセロセート、トリアシルグリセロール、トレハロースミコリペネート（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ  ｍｙｃｏｌｉｐｅｎａｔｅ）及びメナキノンである。極性脂質分画の主成分は、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジルイノシトールなどのリン脂質である。中間的極性の脂質は、スルホリピド、トレハロースミコレート、グリコシル化フェノールフチオセロール（フェノール性糖脂質、ＰＧＬを含む）及びアシル化トレハロースである（Ｄｏｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８５）。
【００３３】
ＭＭＧは、無極性脂質の分画から得られる脂質モノミコリルグリセロール、及びそれらの誘導体、例えばα−ＭＭＧ及びケトＭＭＧ並びに天然及び合成類似体を指す。ＭＭＧは、トルエン／アセトン（９５：５）でＴＬＣ処理により単離することができる。ＰＧＬ及びＭＭＧは、この方法により一緒に抽出されるが、クロロホルム：メタノール：０．８８０アンモニア（９７：３：０．５）での１次元ＴＬＣにより分離することができる。ＭＭＧの誘導体、α−ＭＭＧ及びケト−ＭＭＧは、１６×１００ｍｍの試験管中で５％ＴＢＡＨ水溶液（２．５ｍｌ）とともに、１００℃で終夜加熱することにより得ることができる（Ｍｉｎｎｉｋｉｎ  １９８８）。
【００３４】
ＭＭＧの合成同族体、類似体又は改変体は、化学合成の任意の従来法により製造することができる。類似体とは、構造は類似しているが、基本的組成に関して異なる一群の化合物の一つを指し、同族体とは、同族列の化合物の任意の構成要素を指す。これらの化合物は、炭素鎖の長さを変えることができる。特にサイズを小さくすることは毒性の減少を伴い、したがって、類似体のいかなる顕性毒性も減少させることに役立ち得る。したがって、合成体は、例えば、８〜３６個の炭素を有し、且つ各脂質尾部に０〜３個の二重結合を有するアルキル鎖に基づくことができる。あるいは、脂質尾部の一つを除去することにより、単純化された形態を得ることができる。合成ＭＭＧの炭素主鎖サイズは、好ましくはＣ８〜Ｃ３６、例えば３−ヒドロキシ−２−エチル−ヘキサン酸−２，３−ジヒドロキシプロピルエステル（Ｃ８）、３−ヒドロキシ−２−ブチル−オクタン酸−２，３−ジヒドロキシプロピルエステル（Ｃ１２）、３−ヒドロキシ−２−ヘキシル−デカン酸−２，３−ジヒドロキシプロピルエステル（Ｃ１６）、３−ヒドロキシ−２−ヘプチル−ウンデカン酸−２，３−ジヒドロキシプロピルエステル（Ｃ１８）、３−ヒドロキシ−２−テトラデシル−オクタデカン酸−２，３−ジヒドロキシプロピルエステル（Ｃ３２）又は３−ヒドロキシ−２−ヘキサデシル−アイコサン酸−２，３−ジヒドロキシプロピルエステル（Ｃ３６）、及び最も好ましくはＣ８又はＣ１６である。改変体は、グリセロール部分を他のポリオール頭部群、例えば、ポリプロピレングリコール及びポリエチレングリセロールで置き換えることにより調製することができる。合成モノミコレートのＣ２及びＣ３の周囲の立体化学は、グリセロールにおけると同様に変更することができる。以下において、単にＭＭＧと書かれたものは、ＭＭＧの上記の合成同族体、類似体又は改変体も意味する。
【００３５】
抗原性成分又は物質は、ポリペプチド又はポリペプチドの部分であってよく、それは、動物又は人類において、及び／又は生物学的試料において、本明細書中に記載する生物学的アッセイのいずれかにより測定される免疫応答を生じさせる。ポリペプチドの免疫原性部分は、Ｔ細胞エピトープ又はＢ細胞エピトープであってよい。免疫応答の間に認識される関連のあるＴ細胞エピトープを同定するために、「力づく」の方法を使用することが可能である。即ち、Ｔ細胞エピトープは線状であるから、ポリペプチドの欠失変異体が体系的に構成されれば、例えば、これらの欠失変異体を、例えば本明細書中に記載したＩＦＮ−γアッセイにかけることにより、ポリペプチドのどの領域が免疫認識において必須であるかが明らかになるであろう。他の方法は、ポリペプチド由来の重複オリゴペプチド（好ましくは、例えば２０アミノ酸の長さの残基を有する合成体）を利用する。これらのペプチドは、生物学的アッセイ（例えば本明細書中に記載したＩＦＮ−γアッセイ）で試験することができ、これらの一部はペプチド中のＴ細胞エピトープの存在に対する確証として、陽性の応答（したがって免疫原性である）を与えるであろう。線状のＢ細胞エピトープは、例えばＨａｒｂｏｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９８に記載されたように、関心のあるポリペプチドを包含する重複ペプチドに対するＢ細胞の認識を分析することにより、決定することができる。
【００３６】
Ｔ細胞エピトープの最小長さは、少なくとも６アミノ酸であることが示されているが、そのようなエピトープがそれより長いアミノ酸のつながりで構成されていることは普通である。したがって、本発明のポリペプチドフラグメントは、少なくとも７アミノ酸残基、例えば、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２４、及び少なくとも３０アミノ酸残基などの長さを有することが好ましい。したがって、本発明の方法の重要な実施形態において、ポリペプチドフラグメントは、最大で５０アミノ酸残基、例えば、最大で、４０、３５、３０、２５、及び２０アミノ酸残基などの長さを有することが好ましい。１０と２０との間のアミノ酸残基の長さを有するペプチドは、診断の手段として最も有効であると証明されることが予想され、したがって、本発明の方法で使用されるポリペプチドフラグメントの特に好ましい長さは、１８、例えば、１５、１４、１３、１２さらに１１アミノ酸などである。
【００３７】
具体的に、抗原性物質は、代謝する結核菌、ウシ型結核菌及び他の環境マイコバクテリア、例えばトリ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）などの培養液から取り出すことができる。そのようなマイコバクテリアの濾液からの特に興味ある物質は、ＥＳＡＴ−６遺伝子ファミリーのタンパク質（ＥＳＡＴ６及びＴＢ１０．４など）、並びにＴＢ患者及び種々の動物モデルにおける結核の初期相において、細胞媒介免疫にとって主要な標的であるＡｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂ、ＯＲＦ２ｃ、Ｒｖ１０３６及びＲｖ０２８５などの他の初期抗原である。ＴＢ感染の後期段階の期間中、主要な標的であるＲｖ２６５３、Ｒｖ２６５５、Ｒｖ２６５６、Ｒｖ２６５７、Ｒｖ２６５８、Ｒｖ２６５９、Ｒｖ２６６０など他の抗原も関連する。それらの免疫原性は、それ自体では低いが、この明細書の以下の詳細な部分で示すように、本発明のアジュバントの組合せとの組合せで、結核に対する高く且つ持続する免疫を誘発するための有力な候補であることが判明した。ＥＳＡＴ−６遺伝子ファミリーのタンパク質並びに本発明のアジュバントの組合せとの組合せに適用可能な他の抗原は、現在、人工的に、例えば、合成的に又は遺伝子組み替え技法により製造することができる。
【００３８】
融合タンパク質は、ワクチンにおける抗原性物質として特に十分に適していることが証明されており、例えば、融合生成物Ａｇ８５ｂ＿ＴＢ１０．４、Ａｇ８５ｂ＿ＥＳＡＴ−６＿Ｒｖ２６６０、Ａｇ８５ｂ＿ＴＢ１０．４＿Ｒｖ２６６０及びＡｇ８５ａ＿ＴＢ１０．４＿Ｒｖ２６６０は、ＴＢに対して非常に有効であることが証明されている。
【００３９】
ワクチンは、疾患に対する免疫を生じさせる接種のための、死滅したか弱毒化されたか若しくは他の方法で改変された微生物（細菌、ウイルス、又はリケッチャ）又はそれらの部分の懸濁液と定義される。ワクチンは、疾患を防止するための予防用ワクチン又は癌若しくは潜在性の感染性疾患など既存の疾患に対処するための治療用ワクチンのいずれかとしてだけでなく、アレルギー及び自己免疫疾患と関連して投与することができる。ワクチンは、免疫応答を強化するために、適当なアジュバント中に乳化することができる。
【００４０】
ワクチンは、投与製剤と適合した様式で、且つ治療的に有効で免疫原性であるような量で投与される。投与されるべき量は、例えば、個体の免疫系の免疫応答を開始する能力、及び所望の防御の程度を含めて治療される対象に依存する。適当な用量範囲は、ワクチン接種当たり数百マイクログラムの桁の有効成分であり、好ましい範囲は約０．１μｇから１０００μｇ、例えば約１μｇから３００μｇの範囲など、特に約１μｇから５０μｇの範囲内である。初期投与及びブースター投与に適当な投与計画も調節可能であるが、初期投与に類型化され、その後の接種又は他の投与が続く。
【００４１】
適用の様式は広範に変えることができる。ワクチン投与の任意の従来法が適用可能である。これらの方法は、生理学的に許容される固体基剤による経口若しくは粘膜適用、又は生理学的に許容される分散剤での、非経口的な、注射による等の適用を含むと考えられる。ワクチンの用量は、投与経路に依存し、また、ワクチン接種されるヒトの年齢、及び程度は低いが、ワクチン接種されるヒトの体格によって変わる。
【００４２】
ワクチンは、非経口的に、注射により、例えば皮下又は筋肉内のいずれかに投与するのが便利である。他の様式の投与に適したさらなる製剤には、坐剤及び、ある場合には、経口又は粘膜用製剤が含まれる。坐剤に対して、在来の結合剤及び担体は、例えば、ポリアルキレングリコール又はトリグリセリドが含むことができ、そのような坐剤は、０．５％から１０％、好ましくは１〜２％の範囲内の有効成分を含有する混合物から形成することができる。経口製剤には、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等のような普通に使用される賦形剤が含まれる。これらの組成物は、溶液剤、懸濁液剤、錠剤、丸薬、カプセル剤、徐放性製剤又は散剤の形態をとり、１０〜９５％、好ましくは２５〜７０％の有効成分を含有することが有利である。
【００４３】
選択のワクチンには、例えば、次のものがなり得る。
タンパク質ワクチン：ポリペプチド（又はそれらの少なくとも１つ免疫原性部分）、ペプチド混合物又は融合ポリペプチドを含むワクチン組成物；
組み替え生ワクチン：非病原性微生物又はウイルス中におけるワクチンに関連ある抗原の発現。そのような微生物の周知の例は、ウシ型結核菌ＢＣＧ、サルモネラ及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）であり、ウイルスの例は、ワクシニアウイルス及びアデノウイルスである。
【００４４】
これらのワクチン構築物の全てに対して、適当なアジュバントの添加は、結果として、ワクチンの有効性を増強した（Ｂｒａｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．２０００）、（ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊ  ｅｔ  ａｌ．２００２）、（Ｂｅｎｎｅｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。
【００４５】
リポソーム（即ち、脂質小胞）は、脂質二重層により封入された水性区画である。脂質成分は、コレステロール及び他の荷電脂質でしばしば補完された、通常リン脂質又は界面活性剤など他の両親媒性物質である。リポソームは、水に及び脂質に可溶性の化合物を捕捉することができ、その結果、リポソームは担体として作用することが可能になる。リポソームは、免疫アジュバント、感染性疾患及び炎症の治療、癌療法、及び遺伝子療法など薬理学及び医学における送達系として使用されてきた（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９５）。リポソームのアジュバント効果に対して影響を有し得る要因は、リポソームのサイズ、脂質組成物、及び表面電荷である。さらに、抗原の所在も（例えば、それが、リポソーム表面に吸着されているか若しくは共有結合で結合しているか、又はリポソームの水性区画中に封入されているかどうか）重要であり得る。樹状細胞は、抗原送達ビヒクルとして使用することができる。抗原を樹状細胞などの抗原提示細胞に負荷することは、抗腫瘍免疫において役割を有する活性Ｔ細胞を発生させるのに有効な方法であることを示した。
【００４６】
第四級アンモニウム化合物、例えばジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、クロリド若しくはこれらの他の有機若しくは無機塩（ＤＤＡ−Ｂ、ＤＤＡ−Ｃ又はＤＤＡ−Ｘ）、ジメチルオクタデセニルアンモニウムクロリド、ブロミド若しくはこれらの他の有機若しくは無機塩（ＤＯＤＡ−Ｃ、ＤＯＤＡ−Ｂ又はＤＯＤＡ−Ｘ）、又は１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジパルミトイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン、１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン及びジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）及びＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）は、水性媒体に分散されたときに、脂質二重層、単層及び多層両方の全てのタイプのリポソーム、ミセルなどの脂質集合体を形成することができる。これらの構造の脂質膜は、糖脂質、例えば、小胞の分散を安定化することが示されているＭＭＧ又はα，α’−トレハロース６，６’−ジベヘネート（ＴＤＢ）（Ｄａｖｉｄｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，ＰＣＴ／ＤＫ２００５／０００４６７）など他の両親媒性化合物の封入体のための優れた基質を提供する。
【００４７】
ＭＭＧと送達系との組合せは相乗的に作用して、例えば、ＤＤＡが単独で投与されたときの免疫応答を増強することができる。その結果、ＤＤＡは、低レベルのＩＦＮ−γ産生を促進するが、しかしながらＭＭＧとの組合せで、ＩＦＮ−γ産生は劇的に増大する。
【００４８】
本発明のリポソームは、当技術分野において周知の種々の方法（Ｄａｖｉｄｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，ＰＣＴ／ＤＫ２００５／０００４６７）により作製することができる。ＭＭＧのリポソーム／送達系中への組み込みは、リポソームとＭＭＧとの単なる混合を含む、当技術分野において周知の種々の方法により行うことができる。特に、ＭＭＧのリポソーム中への組み込みは、Ｄａｖｉｄｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，ＰＣＴ／ＤＫ２００５／０００４６７に記載されたようにして行うことができる。
【００４９】
疾患に対する免疫を提供するのに加えて、本発明のアジュバントの組合せは、それ自体では免疫原性の不十分な物質である化合物に対する抗体を産生するために使用することもでき、そのような抗体は、例えば医学及び分析化学において問題の化合物の検出及び定量のために使用することができる。
【実施例】
【００５０】
材料及び方法：
ウシ型結核菌ＢＣＧからの無極性及び極性の脂質の抽出
ウシ型結核菌ＢＣＧ（コペンハーゲン株）をＳａｕｔｏｎ変法培地中で培養した。マイコバクテリアを２〜３週間後に収集してＰＢＳ中に懸濁させ、６０℃で１．５時間インキュベートすることにより殺菌した。無極性及び極性の脂質を、標準的手順（Ｄｏｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８５）（Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ．２００５）に従って抽出した。
【００５１】
無極性脂質を抽出するために、０．３％ＮａＣｌ：メタノール（４４０ｍｌ）及び４４０ｍｌの石油エーテルを２０ｇのマイコバクテリア（湿重量）に加えて、混合物を２時間攪拌した。遠心分離後、上層を除去して下層を４４０ｍｌの石油エーテルで再抽出した。両方の抽出で得た上清相を合わせて蒸発させ、無極性脂質を得た。
【００５２】
極性脂質を抽出するために、生物由来資源を含むメタノール性食塩水溶液を、沸騰水浴中１００℃で１０分間加熱し、続いて３７℃で１０分間冷却した。体積５２０ｍｌのクロロホルム：０．３％ＮａＣｌ：メタノール（９：１０：３）を加えて、混合物を終夜攪拌した。全混合物を焼結ガラス漏斗を通して濾過し、濾過ケーキを捕集して１７０ｍｌのクロロホルム：メタノール：０．３％ＮａＣｌ（５：１０：４）で２回再抽出した。３つの水性メタノール性クロロホルム相全てを合わせて、５８０ｍｌのクロロホルム：０．３％ＮａＣｌ水溶液（１：１）を加え、１０分間攪拌した。放置して相を分離させた後、上の水層を除去して廃棄した。下の有機層を蒸発乾固すると極性脂質が得られた。
【００５３】
個々の無極性脂質の精製
ＰＤＩＭ及びＴＡＧを石油エーテル／アセトン（９８：２）におけるＴＬＣ処理を使用して単離した。フチオセロールＡに基づくＰＤＩＭの主成分のみ回収された。ＰＧＬ及びＭＭＧは、トルエン／アセトン（９５：５）におけるＴＬＣ処理により一緒に分離された。ＰＧＬとＭＭＧとは、クロロホルム：メタノール：０．８８０アンモニア（９７：３：０．５）で１次元ＴＬＣにより分離された。ＰＤＩＭ、ＴＡＧ、ＰＧＬ及びＭＭＧを、５００ＭＨｚ  １Ｈ及び１３Ｃ核磁気共鳴（ＮＭＲ）（Ｂｒｕｋｅｒ  ｄｒｘ５００）及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（ＭＳ）（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｆｌｅｘ  ＩＶ）にかけた。再水和した脂質抽出物（１ｍｇ／ｍｌ）の試料（１０μｌ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ  ｅｔ  ａｌ，１９７０）及び銀染色（Ｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ，１９８７）により分析し、残留タンパク質含有量を求めた。脂質調製物は、エンドドキシン汚染のないことが認められた（＜０．００１ｎｇＬＰＳ／μｇ脂質）。  
【００５４】
モノミコリルグリセロールの加水分解
モノミコリルグリセロールを１６×１００ｍｍの試験管中で５％ＴＢＡＨ水溶液（２．５ｍｌ）とともに１００℃で終夜加熱した（Ｍｉｎｎｉｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８８）。冷却後、混合物を水（２ｍｌ）で希釈し、ジクロロメタン中ヨードメタンの１０％溶液（３ｍｌ）を加えて、試験管を回転装置上に１時間置いた。上の水層を廃棄して、下層を等量の１ＭのＨＣｌ及び水で洗浄し、蒸発乾固すると残渣が生じて、ＴＬＣ（石油エーテル：アセトン９５：５）により、α−及びケトミコレートメチルエステルを含有することが示された。分取ＴＬＣ（上記の）により、αメチルミコレート及びケトメチルミコレートが得られた。
【００５５】
α−ＭＭＧ及びケト−ＭＭＧを分離するために、トリメチルシリル誘導体化を使用した。ＭＭＧ混合物と６００ｍｌのＴＲＩ−ＳＩＬ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）とを７５℃で２０分間加熱した。次に、冷却した溶液を窒素気流下で乾燥し、分取ＴＬＣプレート上に負荷して石油エーテル：トルエン（５０：５０）で展開し、０．０１％ローダミンを使用してα−ＭＭＧ及びケト−ＭＭＧのバンドを可視化し、長波長の蛍光で検査した。対応するバンドをＴＬＣプレートから掻き落とし、ジエチルエーテルを使用してα−ＭＭＧ及びケト−ＭＭＧを、シリカゲルから３回抽出した（３×５ｍＬ）。合わせた抽出物を乾燥し、ヘプタン：メタノール（１：１）及びパラ−トルエンスルホン酸の少量の結晶を添加して、１時間攪拌することによりトリメチルシリル基を除去した。ヘプタン層を回収して蒸発乾固すると、精製されたα−ＭＭＧ及びケト−ＭＭＧが得られた。
【００５６】
Ｃ３６の生成を示すＭＭＧの合成
３−ヒドロキシ−２−テトラデシル−オクタデカン酸（Ｄａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ，１９９１に従って合成された合成Ｃ３２コリノミコール酸）（１００ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、１ｅｑ）及び４−ピロリジノピリジン（１００ｍｇ、３ｅｑ）を５０ｍｌの丸底フラスコ中に入れて、モレキュラーシーブ４Aと一緒にジクロロメタン（５００μｌ）中５０μｌの２，２−ジメチル−４−ヒドロキシメチル−１，３−ジオキソラン（ｓｎ−イソプロピリデングリセロール）溶液を加えた。その混合物を、高真空下に室温で完全に乾固させ、Ｎ’，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミダゾール（ＤＣＣ）（１５ｍｌ、ＤＣＭ中０．１ＭのＤＣＣ、５ｅｑ）を加えて、反応混合物を室温で終夜攪拌するままにした。モレキュラーシーブを濾過により除去し、反応混合物を真空で濃縮して乾固し、残渣を、フラッシュカラムクロマトグラフィ（Ｆｌｕｋａ  ６０７４１シリカゲル６０）を使用して、ヘキサンからヘキサン：酢酸エチル（８：２）を使用して５％増分で溶出させて精製し、純粋なイソプロピリデン保護化合物（３−ヒドロキシ−２−テトラデシル−オクタデカン酸−２，２−ジメチル−［１，３］−ジオキソラン−４−イルメチルエステル）を収率５６％で得た（６８ｍｇ）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）δＨ０．９０（ｔ、６Ｈ、ＣＨ３）、１．２０（ｓ、５４Ｈ、ＣＨ２）、１．４０（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、１．４５（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、２．５０（ｍ、１Ｈ、ＣＨ）、４．０５〜４．４０（ｍ、５Ｈ、ＣＨ２、ＣＨ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、７５ＭＨｚ）δＣ１５．０（ＣＨ３）、２２．１、２８．８、２８．９、２９．０、３１．４（ＣＨ２）、２９．１（ＣＨ３）、５２．１（ＣＨ（ＣＨ２）１３ＣＨ３）、６３．２（ＣＨ２ＯＣＯ）、６９．３（ＣＨ２Ｏ）、７３．４（ＣＨ（ＣＨ２）１４ＣＨ３）、１７４．３（Ｃ＝Ｏ）；ｍ／ｚ（ＥＩ）６３３．５５［Ｍ＋Ｎａ＋］（１００％）；ＨＲＭＳ  Ｃ３８Ｈ７４Ｏ５Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ＋］に対する計算値６３３．５５３６、実測値６３３．５５２７。
【００５７】
３−ヒドロキシ−２−テトラデシル−オクタデカン酸−２，２−ジメチル−［１，３］−ジオキソラン−４−イルメチルエステル（６８ｍｇ、１ｅｑ）を６ｍｌのトリフルオロ酢酸：テトラヒドロフラン：水（体積で８：１７：３）溶液中に溶解して、室温で終夜攪拌した。その溶液を飽和重炭酸ナトリウム水溶液で中和して、混合物をクロロホルムで２回抽出した。有機抽出物を水及び塩水で洗浄して乾燥し、真空中で濃縮して粗生成物を白色固体として得、それを、１０ｇのシリカゲルＶａｒｉａｎ  Ｂｏｎｄ  Ｅｌｕｔ  １２２５６０２６カートリッジでフラッシュカラムクロマトグラフィにより、ヘキサンからヘキサン：酢酸エチル（７：３）を使用して、５％増分で溶出させることにより精製し、表題化合物を白色固体として収率４９％で得た（３２ｍｇ）。融点７２〜７４℃。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）δＨ０．９０（ｔ、６Ｈ、ＣＨ３）、１．２５（ｓ、５４Ｈ、ＣＨ２）、２．５０（ｍ、１Ｈ、ＣＨ）、３．４５〜３．８５（ｍ、３Ｈ、ＣＨ、ＣＨ２）、４．２５（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２）；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、７５ＭＨｚ）δＣ１５．０（ＣＨ３）、２６．３、３０．９、３１．３、３３．５（ＣＨ２）、４７．５（ＣＨ（ＣＨ２）１３ＣＨ３）、６８．４（ＣＨ２）、６９．５（ＣＨ（ＣＨ２）１４ＣＨ３）、７２．５（ＣＨ２Ｏ）、７６．４（ＣＨ）、１７５．４（Ｃ−１）；ｍ／ｚ（ＥＩ）５９３．５０［Ｍ＋Ｎａ＋］（１００％）；ＨＲＭＳ  Ｃ３５Ｈ７０Ｏ５Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ＋］に対する計算値５９３．５１２１、実測値５９３．５１４３。
【００５８】
樹状細胞アッセイ
ヒトＰＢＭＣ由来のＤＣを、Ｒｏｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４から改良した方法に従って得た。末梢血はバフィーコートから得た。簡単に述べると、単球は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ遠心分離により単離し（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ  １０７７密度媒質、Ｎｙｃｏｍｅｄ、オスロー、ノルウエイ）、続いて抗ＣＤ１４標識磁性ビーズ（ＭＡＣＳ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｅｓｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を使用してＣＤ１４陽性細胞を分離した。単球は、１０％ＦＣＳ、５０μＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン（全てＧｉｂｃｏ）（ＣＭ）で補完した完全ＲＰＭＩ  １６４０中で、１００ｎｇ／ｍｌのヒト組み替えＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｒｅｐｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ、ＵＳＡ）及び５０ｎｇ／ｍｌのヒト組み替えＩＬ−４（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ））を存在させて、３７℃、５％ＣＯ２で７日間培養した。
【００５９】
７日目に、ｉＤＣ（１×１０５細胞／ｍｌ）を、リポ多糖（ＬＰＳ）（大腸菌Ｏ１２７：Ｂ８）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｒｏｎｄｂｙ、デンマーク）又はウシ型結核菌ＢＣＧ由来の脂質とともに、さらに２４時間培養した。脂質抽出物は、乾燥ウシ型結核菌脂質材料をクロロホルム：メタノール（２：１）で再溶解し、続いて溶媒を蒸発させ、ＣＭ中にプローブ超音波処理することにより調製した。脂質を、未成熟ＤＣに０．１ないし１００μｇ／ｍｌで加えた。
【００６０】
フローサイトメトリー分析
ＤＣを先ず関連するｍＡｂ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と（３０分、４℃）、続いて１／２０希釈ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）と（３０分、４℃）インキュベートすることにより、表面マーカーを染色した。非特異的Ａｂの結合は、関連する１次ヒトｍＡｂの添加前に、１０％ウシ胎児血清溶液で阻止した（１５分、４℃）。染色された細胞は、直ちにＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトーター（ＢＤ）を使用して、フローサイトメトリーにより検査し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアで分析した。
【００６１】
サイトカイン測定
ＤＣ培養上清を収集して、−２０℃で貯蔵した。分泌されたＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αを、ＥＬＩＳＡ（ＢＤ）によりメーカーの説明書に従って測定した。
【００６２】
混合白血球反応（ＭＬＲ）アッセイ
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイのためのｉＤＣは、上で概説したようにして、単球から発生させた。生成した細胞（ｉＤＣ）は、同じ培地中で、又は脂質（１０μｇ又は１００μｇ／ｍｌ）を含有する培地中で２４時間培養した。０．１２５×１０５から２×１０５まで漸増させたＤＣを、３７℃／５％ＣＯ２でＰＰＤ陰性の提供者からの同種異系のＴ細胞（１０５細胞／ウェル）と平底９６ウェルのマイクロタイタープレート中でインキュベートした。Ｔ細胞は、Ｐａｎ−Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用し、メーカーの説明書に従って単離した。ＤＣと同種異系Ｔ細胞との共培養は、６日間インキュベートした。上清を収集して、分泌されたＩＦＮ−γがＥＬＩＳＡ（ＢＤ）によりメーカーの説明書に従って測定されるまで、−２０℃で貯蔵した。次に、両方のアッセイには、１８時間の最終培養の間、１μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］チミジンを含む培地をパルスで適用した。細胞を収集して、Ｔ細胞の増殖を液体シンチレーション計数（Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により測定した。全てのアッセイは、少なくとも３名の異なる提供者を使用して３重で実施した。
【００６３】
抗原
Ａｇ８５ＢとＥＳＡＴ−６との融合タンパク質（以下、Ａｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６と称する）は、前に記載したように（Ｏｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２００１）組み替えタンパク質として産生された。
【００６４】
動物
８ないし１２週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ又はＣ５７ＢＬ／６マウスを、Ｂｏｍｈｏｌｔｇａａｒｄ（Ｒｙ、デンマーク）又はＨａｒｌａｎ  Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａ（デンマーク）から入手した。感染させたマウスは、ＢＬ−３層流安全密閉箱内のケージ中で飼育した。
【００６５】
免疫
マウスは、尾部の底部で皮下に（ｓ．ｃ．）、各免疫化間２週間の間隔で最高３回免疫した。ワクチン（０．２ｍｌ／マウス）は、特に断らない限り、２５０μｇのＤＤＡと１０μｇの再水和脂質抽出物との中で乳化された２μｇの融合タンパク質Ａｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６からなるものであった。幾つかの場合には、１１ｍｏｌ％のＴＤＢがＤＤＡリポソーム中に組み込まれた（Ｄａｖｉｄｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ、ＰＣＴ／ＤＫ２００５／０００４６７）。結核菌感染を含む実験における陽性対照として、１群のマウスが、尾部の底部皮下に、１用量のＢＣＧデンマーク株１３３１の注射を受けた。全ての又は個々の脂質抽出物は、乾燥ウシ型結核菌脂質材料を１ｍｇ／ｍｌ又は５ｍｇ／ｍｌのＭｉｌｌｉ  Ｑ水で再水和し、続いてプローブ超音波処理することにより調製した。標準的脂質ワクチンは、抗原を食塩水と混合し、続いて再水和した脂質抽出物及びＤＤＡを添加して、ボルテックスで混合することにより調製した。ワクチンを終夜放置して、抗原を吸着させた。
【００６６】
リンパ球培養
血液試料又は鼠径部リンパ節を、最終免疫の７〜１５０日後のマウスから採取し、前に記載したようにして（Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ，２００５）調製した。細胞培養は、２−メルカプトエタノール、グルタミン、ペニシリン−ストレプトマイシン、Ｈｅｐｅｓ、及び１０％ウシ胎児血清で補完された、体積２００μｌのＲＰＭＩ中に２×１０５の細胞を入れた丸底マイクロタイターウェル中で、３重で実施した。再刺激のための抗原は、５μｇ／ｍｌの濃度で使用した。培地のみ又は５μｇ／ｍｌのＣｏｎＡを入れたウェルが、全ての実験でそれぞれ陰性及び陽性対照として含まれた。培養上清は、並行する培養液から、抗原を存在させて７２時間インキュベートした後収集して、IＦＮ−γの量を酵素結合免疫吸着測定法（Ｂｒａｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ，２０００）により測定した。
【００６７】
実験的感染
ワクチンの有効性を評価するために、マウスに、最初の免疫の２．５ヵ月後に、約２５ＣＦＵの有毒結核菌Ｅｒｄｍａｎ株を投入するように較正されたＧｌａｓ−Ｃｏｌの吸入曝露系で、エアロゾル経路により肺にチャレンジした。脾臓及び肺における細菌負荷は、ＢＣＧの増殖を選択的に阻害するために１ｍｌ当たり２μｌの２−チオフェン−カルボン酸ヒドラジドで補完したＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１１アガー上に、段階希釈液を蒔くことにより、６週間後に測定した。３７℃で２〜３週間インキュベーション後に、コロニーを計数した。
【００６８】
統計分析
感染マウスと対照マウスとの間のコロニー数の差を、変動分析により検定した。有意の効果が示されたときは、平均間の差をダネット検定により評価した。ヒトＤＣアッセイについては、異なる脂質に対する応答におけるサイトカイン放出の差を、変動分析により検定し、有意の効果が示されたときは、平均間の差をチューキー検定により評価した。
【実施例１】
【００６９】
ウシ型結核菌ＢＣＧ由来の無極性脂質の単離及び免疫刺激活性
ウシ型結核菌ＢＣＧの全脂質を、極性及び無極性分画に分離した。極性分画中で同定することができた脂質は、ホスファチジルイノシトールマンノシド（１〜４）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ジホスファチジルジグリセロール（ＤＰＧ）及びＬ−α−ホスファチジル−ＤＬ−グリセロール（ＰＧ）であった。多数の未知のリン脂質も同定された（７及び８）（図１Ａ）。無極性分画中で同定された主な脂質は、フチオセロールジミコセロセート（ＰＤＩＭ）、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）、フェノール性糖脂質（ＰＧＬ）及びモノミコリルグリセロール（ＭＭＧ）（図１）であった。ＦＦＡは遊離脂肪酸である。
【００７０】
無極性及び極性脂質の比較のための免疫刺激性活性は、ヒト末梢血単球由来の未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）を使用して検査した（図１）。無極性脂質で処理した結果、活性化マーカーＣＤ８６、ＣＤ４０及びＨＬＡ−ＤＲのレベルは、処理しなかった対照と比較して、用量に依存して上昇した（図１Ｂ）。１００μｇ／ｍｌの無極性脂質の用量は、強力な免疫刺激性分子ＬＰＳ（０．１μｇ／ｍｌ）で観察されるのと同等の、並びにマイコバクテリアのコード因子（ＴＤＭ）及びＭＰＬと比較して優れたＤＣ活性化を生じた。これらの分子の上方制御は、炎症誘発性メディエーターの腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン（ＩＬ）−６及びＩＬ−１２の分泌を伴った（図１Ｃ）。極性脂質で処理されたｉＤＣの上清中のこれらの炎症誘発性サイトカインのレベルは、このアッセイを使用する検出の限界未満であった。最後に、本発明者らは、ＤＣ活性化の他の表示として、ＰＰＤ陰性の提供者からの同族異系Ｔ細胞を使用する混合白血球反応（ＭＬＲ）を使用した（図１ＤおよびＥ）。無極性脂質で処理したＤＣの高い活性化状態をさらに支持することとして、本発明者らは、高レベルの増殖及びＩＦＮ−γ放出を認めたが、ＭＬＲは極性分画によっては誘発されなかった。
【実施例２】
【００７１】
ウシ型結核菌ＢＣＧの無極性脂質抽出物からの個々の脂質の単離及びＭＭＧの特徴づけ
免疫刺激性の無極性分画の脂質は、分取ＴＬＣを使用して単離され、フチオセロールジミコセロセートＡ（ＰＤＩＭＡ）、ＴＡＧ、ＰＧＬ及びＭＭＧの純粋な試料を与えた。少量のフチオセロールＢ及びフチオジオロンＡも検出されたが、利用した分取方法では回収されなかった（図２Ａ）。脂質の構造及び同一性は、１Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）及び質量分析法（ＭＳ）により確認された（図２Ｂ及び不掲載データ）。ＭＭＧ成分は、１−モノアシルグリセロールに特徴的な１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示した（Ｇｕｎｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９１）。全ＭＭＧ分画のＮＭＲデータと結びつけたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（表１）は、α−ミコレート並びにｃｉｓ及びｔｒａｎｓ型のケト−ミコレートの存在を明らかにした。主成分のおよその比は、それぞれ１．００：０．２９：０．２４であった。
【００７２】
表１：精製されたＭＭＧのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析。シグナルはＭ＋Ｎａ＋イオンに対するｍ／ｚである。系列の多量成分は太字で示し、その主成分には下線を引いた。
0005689314.tif 000002
【実施例３】
【００７３】
ＭＭＧによるヒト樹状細胞の活性化
精製されたＭＭＧ、ＰＤＩＭＡ、ＰＧＬ及びＴＡＧを、ヒトｉＤＣを活性化するそれらの能力について評価した。これらのアッセイにおいて、ＭＭＧは、ＣＤ８６、ＣＤ４０及びＨＬＡ−ＤＲの顕著な上方制御に通ずる、ＤＣ活性化の最も強力な誘発因子であることが一貫して認められた（図３Ａ）。ＭＭＧは、マイコバクテリアの病原性と長らく関連づけられてきた脂質であるＰＤＩＭＡよりさらに大きくＤＣを活性化し（Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）、ＰＤＩＭＡは２番目に活性な脂質となったが、一方、ＰＧＬ及びＴＡＧが誘発する活性化はそれより小さかった。６名の個々の提供者における活性化の順は、ＭＭＧ＞ＰＤＩＭＡ＞ＰＧＬ＞ＴＡＧと認められ、ＣＤ８６レベルにおいて、未処理ｉＤＣに関するレベルを超える平均の上昇倍率は、それぞれ１．９１±０．２９、１．８２±０．４３、１．５２±０．２６及び１．３２±０．１４であった。サイトカイン誘発も全体的に同じ傾向をたどり（図３Ｂ）、ＭＭＧは最も強力な免疫刺激剤脂質として卓越している。ＩＬ−６は、ＭＭＧに曝されたＤＣにより、ＰＧＬ又はＴＡＧにより誘発されるレベルを有意に超えるレベルで（Ｐ＜０．０５）放出された。他の脂質によるサイトカイン誘発の間で、有意の差は記録されなかった。したがって、ＭＭＧは、ウシ型結核菌ＢＣＧの無極性脂質分画中で最も強力な免疫刺激性脂質として分類することができる。
【実施例４】
【００７４】
α−及びケト−ＭＭＧの免疫刺激活性
この実施例において、本発明者らは、ＭＭＧの免疫刺激特性を精査し、その強力な免疫刺激性能の原因となる有効成分を同定することをさらに求めた。α−ＭＭＧとケト−ＭＭＧとを、ＭＭＧのトリメチルシリルエーテルの調製、分取ＴＬＣ処理及びそれに続くトリメチルシリルエーテル保護基の加水分解によって分離し、α−ＭＭＧ及びケト−ＭＭＧを得た。α及びケト−ミコレートの構造を図２Ｂに示す。ヒトｉＤＣを活性化するそれらの能力を評価したとき、α−及びケト−ＭＭＧは、活性化マーカーのレベルにおいて２〜３倍の程度で刺激した（図４）。したがって、ＭＭＧの２つの下位成分も、ヒトＤＣを刺激する顕著な能力を示す。
【実施例５】
【００７５】
ウシ型結核菌ＢＣＧから単離されたＭＭＧによるＴｈ１免疫応答の誘発
ＭＭＧのアジュバント活性を研究するために、単離された脂質を、マウスにおいてＩＦＮ−γ産生を誘発するそれらの能力について試験した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１０μｇの全脂質又は個々の脂質を投与した。Ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＤＤＡは、脂質を入れて送達するビヒクルとして役立つ。それゆえ、２５０μｇのＤＤＡ中で乳化された２μｇの融合タンパク質Ａｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６及び１０μｇの再水和脂質抽出物を、皮下経路により投与した。ＤＤＡリポソーム中に組み込まれた１０μｇのＭＭＧの用量は、排出するリンパ節から単離されたＰＢＭＣの再刺激で、１０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γレベルを生じた。このレベルは、ＤＤＡ中の全脂質に対して記録されたレベルと、等用量で同等である（図５）。ＰＤＩＭ−Ａも、より低いレベルとはいえ、ＩＦＮ−γ産生を誘発したが、ＴＡＧ又はＰＧＬの組み込まれたＤＤＡリポソームは、ＩＦＮ−γ放出を殆ど助長しなかった（図５及び不記載データ）。これらの個々の脂質は、全脂質抽出物又は個々の脂質のいずれで再刺激しても記憶応答は観察されなかったので、アジュバントとして作用しているように思われることは注目すべきである（不記載データ）。したがって、ＭＭＧは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて最も活性な無極性脂質でもあるとして確認されて、ＢＣＧ由来の全脂質のアジュバント活性の大部分を単独で説明することができた。
【実施例６】
【００７６】
ＭＭＧに基づくアジュバントの防御有効性
ＭＭＧに基づくアジュバントのＴＢ感染に対する防御提供能力を評価するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＭＭＧ（２つの異なる用量）及びＤＤＡに送達されたＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６により免疫した。ＢＣＧワクチン接種及びアジュバント単独を受けるマウスの群は、それぞれ陽性及び陰性対照として含まれた。最後のワクチン接種の６週間後に、マウスに、生結核菌をエアロゾル経路によりチャレンジした。ワクチンが細菌負荷を減少させる能力を、その６週間後に肺及び脾臓で測定した。これらのデータは、ＭＭＧ／ＤＤＡをアジュバントとして有意の防御レベル、及びＢＣＧのレベルと同等の防御レベルを示した（図６）。予想されたように、抗原なしでアジュバントを接種されたマウスは、細菌の増殖を阻止することができなかったので、この効果は特異的である。
【実施例７】
【００７７】
ＭＭＧとＤＤＡとを組み合わせることによるさらに優れた効果
免疫調節剤（ＭＭＧ）と送達系（ＤＤＡ）とを組み合わせる効果を評価するために、ＤＤＡ単独若しくはＤＤＡ／ＭＭＧの組合せで（実験１、図７Ａ）、又は実験２（図７Ｂ）においてはＭＭＧ単独若しくはＤＤＡ／ＭＭＧの組合せで、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにワクチンを接種した。これらの実験から、免疫応答は、ＤＤＡとＭＭＧとを組み合わせることにより、劇的に増強されることが明らかである。
【実施例８】
【００７８】
ＴＤＢ／第３成分のＭＭＧとＤＤＡとのリポソーム中への組み込みによる免疫応答の増強
他の免疫刺激性成分と組み合わせたときの、ＭＭＧのアジュバント活性に対する効果を研究するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける免疫応答を、ＤＤＡリポソーム中に組み込まれたＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６及び１０μｇのＭＭＧ、又は免疫調節剤ＴＤＢの組み込まれたＤＤＡリポソーム（Ｄａｖｉｄｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，ＰＣＴ／ＤＫ２００５／０００４６７）を使用して皮下で免疫した後、最初のワクチン接種の５ヵ月後に評価した。ＤＤＡリポソーム中に組み込まれたＭＭＧという組合せは、血液から単離されたＰＢＭＣの再刺激で、約２５ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γレベルを生じたが、ＩＦＮ−γの放出は、ＴＤＢの組み込まれたＤＤＡリポソームが使用されたとき、劇的に上昇した（図８）。したがって、ＭＭＧ、ＤＤＡ及びＴＤＢの間で相乗的効果が観察され、ＭＭＧとＤＤＡとの組合せに対する第３成分の添加は、アジュバント活性をさらに増強させ得ることを示した。
【実施例９】
【００７９】
ＭＭＧ類似体のアジュバント活性は、天然ＭＭＧの活性と同等である
合成ＭＭＧ類似体の免疫学的効果を評価するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、天然ＭＭＧ、１６個の炭素を有する合成ＭＭＧ類似体（図９に示した）及び３６個の炭素を有する合成ＭＭＧ類似体（図９に示した）（全て１０μｇ／ＤＤＡ／ＭＭＧ）を加えたＤＤＡ中のＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６で免疫した。免疫応答は、最後のワクチン接種の１週間後に血液で測定され、３種のＭＭＧに基づくアジュバントで同等のレベルの応答を示したが、ＤＤＡは、それだけではより低い効果を再び示した。
【実施例１０】
【００８０】
鎖長が短いほど免疫応答は高い
鎖長がより短い合成ＭＭＧ類似体の免疫学的効果を評価するために、単独のＤＤＡ中、天然ＭＭＧを加えたＤＤＡ中、Ｃ８ないしＣ３６の範囲の異なる合成類似体を加えたＤＤＡ中のＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６で（全て１μｇ／用量）、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを免疫した。免疫応答は、最後のワクチン接種の３週間後に血液で測定され、合成ＭＭＧ類似体は１μｇの用量レベルでも活性であることを示した。さらに、これらの結果は、より短い合成ＭＭＧ類似体（１６Ｃ以下）は、天然ＭＭＧと比較してより有効であることも示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１（図１１）
【００８１】
［参考文献］
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Ｂｌｕｍ，  Ｈ．，  Ｈ．  Ｂｅｉｅｒ，  ａｎｄ  Ｈ．  Ｊ．  Ｇｒｏｓｓ．  １９８７．  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｉｌｖｅｒ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  ＲＮＡ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌｓ．  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ８：  ９３−９９．
Ｂｒａｎｄｔ．  Ｌ．，  Ｍ．  Ｅｌｈａｙ，  Ｉ．  Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｄｓ，  Ｅ．  Ｂ．  Ｌｉｎｄｂｌａｄ，  ａｎｄ  Ｐ．  Ａｎｄｅｒｓｅｎ．  ２０００．  ＥＳＡＴ−６  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６８：  ７９１−７９５．
Ｂｒｅｎｎａｎ，  Ｐ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｍ．  Ｂ．  Ｇｏｒｅｎ．  １９７９．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  ｌｉｐｉｄｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ．Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ．Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ  ｓｅｒｏｃｏｍｐｌｅｘ．  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ  ｓｅｒｏｔｖｐｅ  ９．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５４（１０）：  ４２０５−４２１１．
Ｃｏｘ，  Ｊ．  Ｓ．，  Ｂ．  Ｃｈｅｎ，  Ｍ．  ＭｃＮｅｉｌ，  ａｎｄ  Ｗ．Ｒ．  Ｊａｃｏｂｓ，  Ｊｒ．  １９９９．  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｌｉｐｉｄ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４０２：  ７９−８３．
Ｄａｓｃｈｅｒ，  Ｃ．  Ｃ，  Ｋ．  Ｈｉｒｏｍａｔｓｕ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００３．  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｌｉｐｉｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５（８）：  ９１５−９２５．
Ｄａｖｉｄｓｅｎ，  Ｊ．，  Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｄｓ，  Ｌ，  ａｎｄ  Ｐ．  Ａｎｄｅｒｓｅｎ．  （ＰＣＴ／ＤＫ２００５／０００４６７）  
Ｄｏｂｓｏｎ，  Ｇ．，  Ｄ．  Ｅ．  Ｍｉｎｎｉｋｉｎ，  Ｓ．  Ｍ．  Ｍｉｎｎｉｋｉｎ，  Ｊ．  Ｈ．  Ｐａｒｌｅｔｔ，  Ｍ．  Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｒｉｄｅｌｌ，  ａ．  Ｍ．  Ｍ．  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｌｉｐｉｄｓ  （ｅｄ．  Ｍｉｎｎｉｋｉｎ，  Ｍ．  Ｇ．  ａ．  Ｄ．  Ｅ．）  ２３７−２６５  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  １９８５）．
Ｇｌｕｃｋ，  Ｒ．  １９９５．  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ６：  ３２５−３４５．
Ｇｕｎｓｔｏｎｅ，  Ｆ．  Ｄ．  １９９１．  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄｓ  ５８：  ２１９−２２４．  
Ｈａｒｂｏｅ，  Ｍ．，  Ａ．Ｓ．  Ｍａｌｉｎ，  Ｈ．Ｓ．  Ｄｏｃｋｒｅｌｌ，  Ｈ．Ｇ．  Ｗｉｋｅｒ，  Ｇ．  Ｕｌｖｓｕｎｄ，  Ａ．  Ｈｏｌｍ，  Ｍ．Ｃ．  Ｊβｒｇｅｎｓｅｎ，  Ａｎｄｅｒｓｅｎ  Ｐ．  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥＳＡＴ−６  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．  Ｉｎｆｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６６（２）：７１７−２３．
Ｈｉｕ，  Ｉ．  Ｊ．  １９７５．  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃａｒｒｉｅｒ．  Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ．  ３１（８）：  ９８３−５．
Ｉｎｄｒｉｇｏ，  Ｊ．，  Ｒ．  Ｌ．  Ｈｕｎｔｅｒ，  Ｊｒ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００２．  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｒｅｈａｌｏｓｅ  ６，６’−ｄｉｍｙｃｏｌａｔｅ  （ＴＤＭ）  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４８（７）：  １９９１−１９９８．
Ｋｏｉｋｅ，  Ｙ．，  Ｙ．  Ｃ．  Ｙｏｏ，  ｅｔ  ａｌ．  １９９８．  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  １６（２０）：  １９８２−１９８９．
Ｌａｅｍｍｌｉ，  Ｕ．  Ｋ．  １９７０．  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４．  Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：  ６８０−６８５．
Ｌｉｍａ，  Ｖ．  Ｍ．  Ｆ．，  Ｖ．  Ｌ．  Ｄ．  Ｂｏｎａｔｏ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００１．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ  Ｄｉｍｙｃｏｌａｔｅ  ｉｎ  Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ＮＯ  ｉｎ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６９（９）：  ５３０５−５３１２．
Ｌｉｎｄｂｌａｄ，  Ｅ．，  Ｍ．  Ｅｌｈａｙ，  ｅｔ  ａｌ．  １９９７．  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６５（２）：  ６２３−６２９．  
ＭｃＢｒｉｄｅ，  Ｂ．  Ｗ．，  Ａ．  Ｍｏｇｇ，  ｅｔ  ａｌ．  １９９８．  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ａｎｄ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍａｒｋｅｒｓ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  １６（８）：  ８１０−８１７．
Ｍｉｎｎｉｋｉｎ，  Ｄ．  Ｅ．  １９８２．  Ｌｉｐｉｄｓ：  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｌｉｐｉｄｓ，  ｔｈｅｉｒ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｒｏｌｅｓ．  Ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ．  Ｃ．  Ｒ．  ａ．  Ｊ．  Ｌ．  Ｓｔａｎｆｏｒｄ．  Ｌｏｎｄｏｎ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．
Ｍｉｎｎｉｋｉｎ，  Ｄ．  Ｅ．  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  （ｅｄ．  Ｈａｎｃｏｃｋ，  Ｉ．  Ｃ，  Ｐｏｘｔｏｎ，  Ｉ．  Ｒ．）  １２５−１３５  （Ｗｉｌｅｙ，  Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，  １９８８）．
Ｍｉｎｎｉｋｉｎ，  Ｄ．  Ｅ．  １９８８．  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｗａｌｌ  ｌｉｐｉｄｓ．  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．  Ｉ．  Ｃ．  Ｈａｎｃｏｃｋ，  Ｐｏｘｔｏｎ，  Ｉ．  Ｒ．  Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，  Ｗｉｌｅｙ：  １２５−１３５．
Ｍｉｎｎｉｋｉｎ，  Ｄ．  Ｅ．，  Ｌ．  Ｋｒｅｍｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００２．  ”Ｔｈｅ  Ｍｅｔｈｙｌ−Ｂｒａｎｃｈｅｄ  Ｆｏｒｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９（５）：  ５４５−５５３．
Ｍｏｉｎｇｅｏｎ，  Ｐ．，  Ｊ．  Ｈａｅｎｓｌｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００１．  Ｔｏｗａｒｄｓ  ｔｈｅ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ＴｈＩ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  １９（３１）：  ４３６３−４３７２．
Ｍｏｓｍａｎｎ，  Ｔ．  Ｒ．  ａｎｄ  Ｓ．  Ｓａｄ  １９９６．  Ｔｈｅ  ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｕｎｉｖｅｒｓｅ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ：  ＴｈＩ，  Ｔｈ２  ａｎｄ  ｍｏｒｅ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １７（３）：  １３８−１４６．
Ｎａｔｈａｎ，  Ｃ，  Ｈ．  Ｍｕｒｒａｙ，  ｅｔ  ａｌ．  １９８３．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ  ａｓ  ｔｈｅ  ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  ｔｈａｔ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １５８（３）：  ６７０−６８９．
Ｏｌｓｅｎ，  Ａ．  Ｗ．，  Ｌ．  Ａ．  Ｈ．  ｖａｎ  Ｐｉｎｘｔｅｒｅｎ，  Ｌ．  Ｍ．  Ｏｋｋｅｌｓ，  Ｐ．  Ｂ．  Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，  ａｎｄ  Ｐ．  Ａｎｄｅｒｓｅｎ．  ２００１．  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ８５Ｂ  ａｎｄ  ＥＳＡＴ−６．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６９：２７７３−２７７８．  
Ｒａｏ  Ｖ，  Ｆ．  Ｎ．，  Ｐｏｒｃｅｌｌｉ  ＳＡ，  Ｇｌｉｃｋｍａｎ  ＭＳ  ２００５．  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｈｏｓｔ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０１：  ５３５−５４３．
Ｒｅｅｄ，  Ｍ．  Ｂ．，  Ｐ．  Ｄｏｍｅｎｅｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００４．  Ａ  ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ  ｏｆ  ｈｙｐｅｒｖｉｒｕｌｅｎｔ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４３１（７００４）：  ８４−８７．
Ｒｏｍａｎｉ，  Ｎ．，  Ｓ．  Ｇｒｕｎｅｒ，  Ｄ．  Ｂｒａｎｇ，  Ｅ．  Ｋａｍｐｇｅｎ，  Ａ．  Ｌｅｎｚ，  Ｂ．  Ｔｒｏｃｋｅｎｂａｃｈｅｒ，  Ｇ．  Ｋｏｎｗａｌｉｎｋｅｒ，  Ｐ．Ｏ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｒ．Ｍ．  Ｓｔｅｉｎｍａｎ，  ａｎｄ  Ｇ．  Ｓｃｈｕｌｅｒ．  １９９４．  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｌｏｏｄ．  Ｊ．Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８０：  ８３−９３．
Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｄｓ，  Ｌ，  Ｅ．Ｍ．  Ａｇｇｅｒ，  Ａ．Ｗ．  Ｏｌｓｅｎ，  Ｋ．Ｓ．  Ｋｏｒｓｈｏｌｍ，  ＣＳ．  Ａｎｄｅｒｓｅｎ，  Ｋ．Ｔ．  Ｊｅｎｓｅｎ，  ａｎｄ  Ｐ．  Ａｎｄｅｒｓｅｎ．  ２００５．  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｙｃｏｂａｃ−  ｔｅｒｉａｌ  Ｌｉｐｉｄｓ：  ａ  Ｎｅｗ  Ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ＴｈＩ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ７３：  ５８１７−  ５８２６．
Ｓａｉｔｏ，  Ｒ．，  Ｔａｎａｋａ，  Ａ．，  Ｓｕｇｉｙａｍａ，  Ｋ．，  Ａｚｕｍａ，  Ｉ．  ａｎｄ  Ｙａｍａｍｕｒａ，  Ｙ．  １９７６．  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｏｒｄ  ｆａｃｔｏｒ，  ａ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｌｉｐｉｄ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  １３（３）：  ７７６−７８１．
Ｓｉｌｖａ，  ＣＬ．  １９８５．  Ｉｎｆｌａｍａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｍｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  （ＢＣＧ）．  Ｂｒａｚｉｌｉａｎ  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．  １８：  ３２７−３３５．
Ｓｉｒａｋｏｖａ，  Ｔ．  Ｄ．，  Ｖ．  Ｓ．  Ｄｕｂｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００３．  Ｔｈｅ  Ｌａｒｇｅｓｔ  Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ  （ｐｋｓｌ２）  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｓ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｄｉｍｙｃｏｃｅｒｏｓｙｌ  Ｐｈｔｈｉｏｃｅｒｏｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ７１（７）：  ３７９４−３８０１．
Ｓｐｒｏｔｔ，  Ｇ．  Ｄ．，  Ｃ  Ｊ．  Ｄｉｃａｉｒｅ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００４．  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  Ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  Ｍａｎｎｏｓｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏ−  ｖｉｓ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ７２（９）：  ５２３５−５２４６．  
Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ，  Ｊ．Ｐ．，  Ｄ．  Ｇａｌｌ，  Ｂｒａｃｋｅｎ  Ｐ．Ｍ．  １９７３．  Ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｓｅ  ａｎｔｅｎａｔａｌ  ｔｅｔａｎｕｓ  ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ．  Ｌａｎｃｅｔ  ｌ（７７９７）：２１５−９．
Ｓｕｚｕｋｉ  Ｆ，  Ｂ．  Ｒ．，  Ｐｏｌｌａｒｄ  ＲＢ．  １９８６．  Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  Ｌｙｔ  １＋  Ｔ−ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ，  ＳＳＭ，  ｅｘｔｒａｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ−ｔｙｐｅ  Ｔｕｂｅｒｃｌｅ  ｂａｃｉｌｌｉ．１９８６  ７７（２）：  ４４１−７．
Ｕｅｈｏｒｉ，  Ｊ．，  Ｍ．  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  Ｓ．  Ｔｓｕｊｉ，  Ｔ．  Ａｋａｚａｗａ，  Ｏ．  Ｔａｋｅｕｃｈｉ，  Ｓ．  Ａｋｉｒａ，  Ｔ．  Ｋａｗａｔａ，  Ｉ．  Ａｚｕｍａ，  Ｋ．  Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ，  ａｎｄ  Ｔ．  Ｓｅｙａ．  ２００３．  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ２  ａｎｄ  ４  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ７１：４２３８−４２４９．
ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊ，  Ｅ．  Ｍ．  Ａ．，  Ｈ．  Ｌ．  Ｇｌａｎｓｂｅｅｋ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００２．  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｄｉ−  ｍｅｔｈｙｌｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ  ａｓ  ａｎ  Ａｄｊｕｖａｎｔ．”  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７６（２０）：  １０５４０−  １０５４５．
Ｙａｍａｚａｋｉ  Ｓ，  Ｋ．  Ｋ．，  Ｓｏｍｅｙａ  Ｓ，  Ａｚｕｍａ  Ｉ，  Ｙａｍａｍｕｒａ  Ｙ．  １９６９．  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｌｌｅｒｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｗａｘ  Ｄ  ｆｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．  Ａｍ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｐｉｓ．  １００（５）：  ６９１−８．  
【図１】
0005689314.tif 000005
【図２】
0005689314.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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