(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エトキシジフェニルエタン誘導体であり、それ自体の構造が式（Ｉ）として示されることを特徴とするエトキシジフェニルエタン誘導体。
【化１】
0005735919.tif 000022
［式中、Ｒはヒドロキシ、アミノ、ホスフェート、サルフェート、コリンホスフェート、または‐ＮＨ（ＣＯＣＨＲ’ＮＨ）ｍ‐Ｈ［Ｒ’は水素、フェニルであり、ｍは１〜３の整数である］およびその水溶性アンモニウム塩、または‐ＮＨＣＯＣＨＮＨ２ＣＨ２ＯＨである。］
【請求項２】
前記Ｒはヒドロキシ、アミノ、ジナトリウムホスフェート塩、アンモニウムホスフェート塩、サルフェート塩、コリンホスフェート分子内塩、または‐ＮＨ（ＣＯＣＨＲ’ＮＨ）ｍ‐Ｈ［Ｒ’は水素、フェニルであり、ｍは１〜３の整数である］およびその水溶性アンモニウム塩であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記Ｒは‐ＯＨ、‐ＮＨ２、‐ＯＰＯ２Ｎａ２、‐ＮＨＣＯＣＨ２ＮＨ２または‐ＮＨＣＯＣＨＮＨ２ＣＨ２ＯＨであることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
下記式（Ｉ）で表されるエトキシジフェニルエタン誘導体の製造方法であって、
【化２】
0005735919.tif 000023
［式中、Ｒはヒドロキシ、ホスフェート、サルフェート、またはコリンホスフェートである。］
（１）相間移動触媒下で、
４‐ヒドロキシ‐３‐メトキシベンズアルデヒド（ＩＩ）をブロムエチルによってエトキシ化して４‐エトキシ‐３‐メトキシベンズアルデヒド（ＩＩＩ）を形成するステップと、
（２）メタ位のメチルをリチウムジフェニルホスフィドによって選択的に除去し、ヒドロキシに変換して４‐エトキシ‐３‐ヒドロキシベンズアルデヒド（ＩＶ）を得るステップと、
（３）前記４‐エトキシ‐３‐ヒドロキシベンズアルデヒド（ＩＶ）をベンジルクロライドによって４‐エトキシ‐３‐ベンジルオキシベンズアルデヒド（Ｖ）に調製するステップと、
（４）３，４，５‐トリメトキシトリフェニルベンジリデンブロミドホスホニウムブロミドテトラヒドロフラン溶液および４‐エトキシ‐３‐ベンジルオキシベンズアルデヒドにカリウムｔｅｒｔ‐ブトキシドを加えながらビニル基導入して、３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐ベンジルオキシ‐４’‐エトキシジフェニルエチレン（ＶＩ）を合成するステップと、
（５）前記３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐ベンジルオキシ‐４’‐エトキシジフェニルエチレン（ＶＩ）をパラジウム炭素下で水素化してオレフィン結合を水素化し、脱ベンジル化を実施して３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐ヒドロキシ‐４’‐エトキシジフェニルエタン（ＶＩＩ）を得るステップとを含むことを特徴とする製造方法。
【請求項５】
前記３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐ヒドロキシ‐４’‐エトキシジフェニルエタン（ＶＩＩ）は、リン酸化、リン酸エステル化および硫酸化を経てエトキシヒドロキシジフェニルエタン水溶性誘導体、すなわちジナトリウムホスフェート塩、サルフェート塩、アンモニウムホスフェート塩またはコリンホスフェート分子内塩を形成することを特徴とする、請求項４に記載の化合物の製造方法。
【請求項６】
前記３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐ヒドロキシ‐４’‐エトキシジフェニルエタン（ＶＩＩ）は、リン酸化剤オキシ塩化リンおよび２ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨの作用下で３，４，５‐トリメトキシ‐４’‐エトキシジフェニルエタン‐３’‐ｏ‐ジナトリウムホスフェート塩（ＶＩＩ）を形成することを特徴とする、請求項５に記載の化合物の製造方法。
【請求項７】
前記３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐ヒドロキシ‐４’‐エトキシジフェニルエタン（ＶＩＩ）は、ジベンジルホスフェートと反応してベンジルホスフェートを形成し、ナトリウムメトキシド／無水メタノールをトリメチルブロモシラン（ＴＭＢＳ）下で加えて３，４，５‐トリメトキシ‐４’‐エトキシジフェニルエタン‐３’‐ｏ‐ジナトリウムホスフェート塩を得ることを特徴とする、請求項５に記載の化合物の製造方法。
【請求項８】
下記式（Ｉ）で表されるエトキシジフェニルエタン誘導体の製造方法であって、
【化３】
0005735919.tif 000024
［式中、Ｒはアミノ、または‐ＮＨ（ＣＯＣＨＲ’ＮＨ）ｍ‐Ｈ［Ｒ’は水素、フェニルであり、ｍは１〜３の整数である］およびその水溶性アンモニウム塩、または‐ＮＨＣＯＣＨＮＨ２ＣＨ２ＯＨである。］
（１）相間移動触媒下で、４‐ヒドロキシ‐３‐ニトロベンズアルデヒド（ＩＸ）をブロムエチルによってエトキシ化して４‐エトキシ‐３‐ニトロベンズアルデヒド（Ｘ）を形成するステップと、
（２）トリメトキシフェニルブロミドトリフェニルホスホニウムメチリドおよび前記４‐エトキシ‐３‐ニトロベンズアルデヒド（Ｘ）をウィッティヒ反応させて３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐ニトリル‐４’‐エトキシジフェニルエチレン（ＸＩ）を生成するステップと、
（３）前記３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐ニトリル‐４’‐エトキシジフェニルエチレン（ＸＩ）をパラジウム炭素触媒／水素化ホウ素ナトリウム下で水素化還元して、ニトリルをアミノに還元し、オレフィン結合をエタン単結合に還元することにより３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐アミノ‐４’‐エトキシジフェニルエタン（ＸＩＩ）を得るステップとを更に含むことを特徴とする製造方法。
【請求項９】
前記３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐アミノ‐４’‐エトキシジフェニルエタン（ＸＩＩ）およびアミノ酸誘導体を反応させてアミノ酸アミド側鎖：‐ＮＨ（ＣＯＣＨＲ’ＮＨ）ｍ‐Ｈ［Ｒ’は水素、フェニルであり、ｍは１〜３の整数である］、または‐ＮＨＣＯＣＨＮＨ２ＣＨ２ＯＨ、を有するエトキシアミノジフェニルエタンアミノ酸アミド誘導体を形成することを特徴とする、請求項８に記載の化合物の製造方法。
【請求項１０】
ジシクロヘキシルカルボ‐ジイミド（ＤＣＣ）および１‐ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）またはベンゾトリアゾール‐１‐イル‐オキシ‐トリス（ジメチルアミノ）‐ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ剤）の触媒下で、前記３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐アミノ‐４’‐エトキシジフェニルエタン（ＸＩＩ）をＮａ‐９‐フルオレニルメトキシカルボニルアミノ酸誘導体（Ｆｍｏｃ ＡＡ）と反応させ、３’位のアミノをＦｍｏｃ‐アミノ酸アミドに変換し、Ｆｍｏｃを除去してエトキシジフェニルエタンアミノ酸アミド誘導体を生成し、前記エトキシジフェニルエタンアミノ酸アミド誘導体は、それぞれ３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐グリシルアミノ‐４’‐エトキシジフェニルエタン（ＸＩＩＩ）および３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐セリルアミノ‐４’‐エトキシジフェニルエタン（ＸＩＶ）であることを特徴とする、請求項９に記載の化合物の製造方法。
【請求項１１】
前記アミノ酸アミド誘導体をメタノール、エタノールまたはイソプロパノール中に溶解させ、当量の塩酸、硫酸もしくはリン酸および石油エーテルもしくはｎ‐へキサンを加えて前記誘導体を希釈して水溶性アンモニウム塩を形成することを特徴とする、請求項９に記載の化合物の製造方法。
【請求項１２】
前記アミノ酸アミド誘導体をメタノール、エタノールまたはイソプロパノール中に溶解させ、当量の塩酸、硫酸もしくはリン酸および石油エーテルもしくはｎ‐へキサンを加えて前記誘導体を希釈して水溶性アンモニウム塩を形成することを特徴とする、請求項１０に記載の化合物の製造方法。
【請求項１３】
前記化合物の製剤の形態は、静注投与される凍結乾燥粉体、粉体、注射、リポソーム、エマルション、マイクロカプセル、懸濁液もしくは溶液、または経口投与される顆粒、錠剤、カプセルもしくはシロップ、または坐剤からなる群から選択することができることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
チューブリン凝集阻害剤を製造する際の式（Ｉ）による前記化合物の使用を特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項１５】
抗腫瘍血管退化剤として様々な腫瘍に関する血管標的効果を有する医薬を製造する際の式（Ｉ）による前記化合物の使用を特徴とする、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
異常な血管新生に起因する疾患を治療するための医薬を製造する際の式（Ｉ）による前記化合物の使用を特徴とする、請求項１４に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は薬剤合成の分野に関するものであり、特にジフェニルエタン誘導体抗がん剤の合成に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近発見された新しいチューブリン解重合（脱重合）因子は、ＭＴＤよりも低い投与量で血管閉塞を引き起こす恐れがある（Expert Opin Investig Drugs. 2004 Sep; 13(9) 1171-82参照)。２００５年にロワンヴィンセントら(Loin Vincent et al.）は、血管標的薬剤（ＶＴＡ）としてチューブリン骨格に損傷を与える可能性がある同様の属性を有する新しいチューブリン解重合因子を発見した。文献上のデータによると、この血管標的薬剤はＶＥ‐カドヘリンシグナル経路を部分的に通って腫瘍血管の劣化を選択的に誘発する可能性がある。かかるチューブリン解重合因子は、腫瘍血管に選択的な損傷を引き起こす一方で、正常な血管系には影響を及ぼすことなく腫瘍の血管新生を防止する。一方、このチューブリン解重合因子は、腫瘍細胞に栄養および酸素が与えられない場合に腫瘍細胞を殺すまたは腫瘍転移を阻害する役割を果たすためにチューブリンの凝集を阻害し、腫瘍血管の機能不全および構造的損傷を選択的に引き起こし、血管内皮細胞のアポトーシスを誘発することができる。
【０００３】
２００５年にギリアンＭ．トーザーら（Gillian M.Tozer et al.）は有力雑誌Nature Rev Cancerにおいて、そのような化合物が血管内皮細胞の増殖だけでなく内皮細胞の移動にも影響を及ぼし、それにより管内皮細胞の形態を更に急速に変化させ、結果的に内皮細胞のアポトーシスをもたらすとともに血管内皮細胞間の接続を絶ち、それによって腫瘍血管の機能不全および構造的損傷を急速に引き起こすことを報告している。一般に、正常な血管はすべて平滑筋細胞によって支持されるので、平滑筋細胞によって支持されない血管にのみ作用する化合物は、腫瘍血管の機能不全および構造的損傷を急速且つ選択的に引き起こすにあたって平滑筋によって支持される血管には影響を及ぼさず、そのため腫瘍細胞に更に選択的に作用し、正常な細胞に対する毒性を大幅に低減する（Nat rve Canaer.2005 Jun; 5(6) 423-35, J. Clin. Invest., Novenber 1,2005; 115(11): 2992-3006参照）。かかる薬剤は現在最も有望な抗腫瘍剤の１つと考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００８／０３１３３３Ａ１号パンフレット
【特許文献２】米国特許第６０５４５９８号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Expert Opin Investig Drugs. 2004 Sep; 13(9) 1171-82
【非特許文献２】Nat rve Canaer.2005 Jun; 5(6) 423-35, J. Clin. Invest., Novenber 1,2005; 115(11): 2992-3006
【非特許文献３】Cushman, Mark et al., "Synthesis and evaluation of analogs of (Z)-1-(4-methoxyphenyl)-2-(3, 4, 5-trimethoxyphenyl)ethane as potential cytotoxic antimitotic agents", Journal of Medicinal Chemistry, 1992, Vol.35, No.12, 2293-306
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在、このような薬剤に関する国内外のすべての研究の中で臨床研究が進められているのはコンブレタスタチンＡ‐４ジフェニルエチレン化合物だけであり、国際公開第２００８／０３１３３３Ａ１号パンフレット（発明の名称：「ethoxycombretastatin and preparation and uses of prodrug thereof」）には、コンブレタスタチンＡ‐４のジフェニルエチレンＢ芳香環４’位のアルコキシを活性作用部位とし、ジフェニルエチレンＢ芳香環４’位の元のメチルをエチルに修飾して、３’位にヒドロキシ、アミノおよびその他の基を有する活性標的を形成することができ、したがってその腫瘍血管に関する標的活性を増強し得ることが開示されている。しかしながら、二重結合連結の故に、コンブレタスタチンのシス配列内のファミリーユニットは腫瘍血管に対して最も効果的な損傷を与える一方、トランス配列内のファミリー化合物は腫瘍に対して何ら阻害作用を及ぼさない。シス‐トランス異性化反応が存在するため、トランス配列はいくつかの毒作用および副作用を除いて何ら薬効をもたらさない。そのため、分離および精製技術の要件が高く、カラムクロマトグラフィが必要となり、原料の消費が大きく、技術的コストが高く、収率が低く、同時にジフェニルエチレン化合物は紫外照明に当たるとトランス配列に変換されるため、日光を避け低温で保管する必要がある。それ故、ジフェニルエチレン化合物の保管および実用は極めて困難である。
【０００７】
文献（Cushman, Mark et al., "Synthesis and evaluation of analogs of (Z)-1-(4-methoxyphenyl)-2-(3, 4, 5-trimethoxyphenyl)ethane as potential cytotoxic and antimitotic agents", Journal of Medicinal Chemistry, 1992, Vol.35, No.12, 2293-306）には化合物、すなわち（Ｚ）‐１‐（３，４，５‐トリメトキシ）フェニル‐２‐（４’‐エトキシ）フェニルエチレンが開示されているが、相乗作用的な活性標的を‐ＯＨのような置換基として形成することができず、‐ＮＨ２が３’位に存在せず、抗がん剤効果は４’位の４’‐メトキシ、エトキシ、プロポキシから漸減する。また、米国特許ＵＳ第６０５４５９８号には、２‐メトキシエストラジオールを２‐エトキシエストラジオールに修飾するための合成方法が開示されており、２‐エトキシエストラジオールは２‐メトキシエストラジオールの１０００倍程度のインビトロ抗がん活性を含む。更に、諸種の研究から、例えば、エトキシジフェニルエタン誘導体、４’位のエトキシ、および３’位のヒドロキシ、アミノは（ethoxydiphenylethane derivatives, 4’-ethoxy and 3’-hydroxy, amino）、同じ相乗効果を有し、抗がん効果を明白に高める可能性があるが、４’位をプロポキシで修飾するとその抗がん効果が著しく低下することが分かっている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の内容：
１．本発明は、式（Ｉ）として示される構造を有するエトキシジフェニルエタン誘導体を提供する。
【０００９】
【化１】
0005735919.tif 000002
【００１０】
式中、Ｒはヒドロキシ、アミノ、ホスフェート、サルフェート、コリンホスフェート、またはアミノ酸側鎖およびその水溶性アンモニウム塩である。
【００１１】
前記Ｒは、好ましくは、ヒドロキシ、アミノ、ジナトリウムホスフェート塩、アンモニウムホスフェート塩、サルフェート塩、コリンホスフェート分子内塩、天然アミノ酸側鎖およびその水溶性アンモニウム塩、または‐ＮＨ（ＣＯＣＨＲ’ＮＨ）ｍ‐Ｈ［Ｒ’は水素、フェニルであり、ｍは１〜３の整数である］およびその水溶性アンモニウム塩である。
【００１２】
好ましい実施形態において、前記Ｒは‐ＯＨ、‐ＮＨ２、‐ＯＰＯ２Ｎａ２、‐ＮＨＣＯＣＨ２ＮＨ２または‐ＮＨＣＯＣＨＮＨ２ＣＨ２ＯＨである。
【００１３】
２．本発明は、式（Ｉ）による前記化合物中のヒドロキシエトキシジフェニルエタン誘導体の製造方法であり、
（１）相間移動触媒下で、次式の４‐ヒドロキシ‐３‐メトキシベンズアルデヒドをブロムエチルによってエトキシ化して次式の４‐エトキシ‐３‐メトキシベンズアルデヒドＩＩＩを形成するステップと、
【００１４】
【化２】
0005735919.tif 000003
【００１５】
（２）メタ位のメチルをリチウムジフェニルホスフィドによって選択的に除去し、ヒドロキシに変換して次式の４‐エトキシ‐３‐ヒドロキシベンズアルデヒドＩＶを得るステップと、
【００１６】
【化３】
0005735919.tif 000004
【００１７】
（３）前記４‐エトキシ‐３‐ヒドロキシベンズアルデヒドＩＶをベンジルクロライドによって次式の４‐エトキシ‐３‐ベンジルオキシベンズアルデヒドＶに調製するステップと、
【００１８】
【化４】
0005735919.tif 000005
【００１９】
（４）３，４，５‐トリメトキシトリフェニルベンジリデンブロミドホスホニウムブロミドテトラヒドロフラン溶液および４‐エトキシ‐３‐ベンジルオキシベンズアルデヒドにカリウムｔｅｒｔ‐ブトキシドを加えながらビニル基導入（vinylation addition）して、次式の３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐ベンジルオキシ‐４’‐エトキシジフェニルエチレンＶＩを合成するステップと、
【００２０】
【化５】
0005735919.tif 000006
【００２１】
（５）前記３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐ベンジルオキシ‐４’‐エトキシジフェニルエチレンＶＩをパラジウム炭素下で水素化してオレフィン結合を水素化し、脱ベンジル化を実施して次式の３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐ヒドロキシ‐４’‐エトキシジフェニルエタンＶＩＩ（以下、コード：ＥＣＢ１と呼ぶ）を得るステップとを含み、
【００２２】
【化６】
0005735919.tif 000007
【００２３】
（６）前記３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐ヒドロキシ‐４’‐エトキシジフェニルエタン（ＶＩＩ）は、リン酸化、リン酸エステル化および硫酸化を経てエトキシヒドロキシジフェニルエタン水溶性誘導体、すなわちジナトリウムホスフェート塩、サルフェート塩、アンモニウムホスフェート塩またはコリンホスフェート分子内塩を形成し、
（７）ＥＣＢ１は、リン酸化剤オキシ塩化リンおよび２ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨの作用下で３，４，５‐トリメトキシ‐４’‐エトキシジフェニルエタン‐３’‐ｏ‐ジナトリウムホスフェート塩ＶＩＩ（以下、コード：ＥＣＢ１Ｐと呼ぶ）を形成し、
【００２４】
【化７】
0005735919.tif 000008
【００２５】
（８）別の好ましいリン酸エステル化は、ＥＣＢ１がジベンジルホスフェートと反応してベンジルホスフェートを形成し、ナトリウムメトキシド／無水メタノールをトリメチルブロモシラン（ＴＭＢＳ）下で加えて３，４，５‐トリメトキシ‐４’‐エトキシジフェニルエタン‐３’‐ｏ‐ジナトリウムホスフェート塩（以下、コード：ＥＣＢ１Ｐと呼ぶ）を得ることを特徴とする、方法を開示する。
【００２６】
本発明の別の好ましい実施形態は、式（Ｉ）による前記化合物中のアミノエトキシジフェニルエチレンの製造方法であり、
（１）相間移動触媒下で、次式のとおり４‐ヒドロキシ‐３‐ニトロベンズアルデヒドＩＸをブロムエチルによってエトキシ化して４‐エトキシ‐３‐ニトロベンズアルデヒドＸを形成するステップと、
【００２７】
【化８】
0005735919.tif 000009
【００２８】
（２）トリメトキシフェニルブロミドトリフェニルホスホニウムメチリドおよび前記４‐エトキシ‐３‐ニトロベンズアルデヒドＸをウィッティヒ反応させて次式の３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐ニトリル‐４’‐エトキシジフェニルエチレンＸＩを生成するステップと、
【００２９】
【化９】
0005735919.tif 000010
【００３０】
（３）前記３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐ニトリル‐４’‐エトキシジフェニルエチレンＸＩをパラジウム炭素触媒／水素化ホウ素ナトリウム下で水素化還元して、ニトリルをアミノに還元し、オレフィン結合をエタン単結合に還元することにより次式の３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐アミノ‐４’‐エトキシジフェニルエタンＸＩＩ（以下、コード：ＥＣＢ１Ｎと呼ぶ）を得るステップとを含み、
【００３１】
【化１０】
0005735919.tif 000011
【００３２】
（４）前記３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐アミノ‐４’‐エトキシジフェニルエタン（ＸＩＩ）およびアミノ酸誘導体を反応させて、下記のアミノ酸アミド側鎖：天然アミノ酸側鎖、または‐ＮＨ（ＣＯＣＨＲ’ＮＨ）ｍ‐Ｈ［Ｒ’は水素、フェニルであり、ｍは１〜３の整数である］を有するエトキシアミノジフェニルエタンアミノ酸アミド誘導体（ethoxyaminodiphenylethane amino acid amide derivative having the amino acid amide side chain as below: natural amino acid side chain, or -NH(COCHR’NH)m-H(wherein R’ is hydrogen, phenyl, and m represents an integer from 1 to 3) を形成し、
（５）ジシクロヘキシルカルボ‐ジイミド（ＤＣＣ）および１‐ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）またはベンゾトリアゾール‐１‐イル‐オキシ‐トリス（ジメチルアミノ）‐ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ剤）の触媒下で、前記３，４，５‐トリメトキシフェニル‐３’‐アミノ‐４’‐エトキシジフェニルエタンＸＩＩをＮａ‐９‐フルオレニルメトキシカルボニルアミノ酸誘導体（Ｆｍｏｃ  ＡＡ）と反応させ、３’位のアミノをＦｍｏｃ‐アミノ酸アミドに変換し、Ｆｍｏｃを除去してＥＣＢ１Ｎのアミノ酸アミドを生成し、前記ＥＣＢ１Ｎは、それぞれ３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐グリシルアミノ‐４’‐エトキシジフェニルエタンＸＩＩＩ（以下、コード：ＥＣＢ１ＧＮと呼ぶ）および３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐セリルアミノ‐４’‐エトキシジフェニルエタンＸＩＶ（以下、コード：ＥＣＢ１ＳＮと呼ぶ）であり、
【００３３】
【化１１】
0005735919.tif 000012
【００３４】
（６）前記アミノ酸アミド誘導体をメタノール、エタノールまたはイソプロパノール中に溶解させ、当量の塩酸、硫酸もしくはリン酸および石油エーテルもしくはｎ‐へキサンを加えて前記誘導体を希釈して水溶性アンモニウム塩を形成する、製造方法を提供する。
【００３５】
３．本発明の製剤の形態は、静注投与される凍結乾燥粉体、粉体、注射、リポソーム、エマルション、マイクロカプセル、懸濁液もしくは溶液、または経口投与される顆粒、錠剤、カプセルもしくはシロップ、または坐剤からなる群から選択される。
【００３６】
４．チューブリン凝集阻害剤を製造する際の式（Ｉ）による前記化合物の使用を提供する。
【００３７】
５．抗腫瘍血管退化剤（anti-tumor angiolysis agent）として様々な腫瘍に関する血管標的効果を有する医薬を製造する際の式（Ｉ）による化合物の使用を提供する。様々な腫瘍は主に、肺癌、非小細胞肺癌、肝癌、膵癌、胃癌、骨癌、食道癌、乳癌、前立腺癌、精巣癌、結腸直腸癌、卵巣癌、膀胱癌、子宮頸癌、黒色腫、扁平上皮癌腫、基底細胞癌腫、腺癌、汗腺癌腫、皮脂腺癌腫、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌腫(腺様嚢胞癌)（cystic adenoic carcinoma）、嚢胞癌（cystocarcinoma）、髄様癌、細気管支癌、骨細胞癌、上皮性癌腫、胆管癌、絨毛癌、胚性癌腫、精母細胞腫（spermatocytoma）、胎児性腺筋肉腫（embryonal adenomyosarcoma）、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血球母細胞腫、声帯神経腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、視神経芽細胞腫（opticneuroblastoma）、網膜芽細胞腫、神経線維腫、線維肉腫、線維芽細胞腫、線維腫、線維腺腫、線維軟骨腫、線維嚢腫、線維粘液腫、線維骨腫、線維粘液肉腫、線維乳頭腫、粘液肉腫、粘液嚢腫、粘液軟骨腫、粘液軟骨性肉腫、粘液軟骨線維肉腫、粘液腺腫、粘液芽細胞腫、脂肪肉腫、脂肪腫、脂肪腺腫、脂肪芽細胞腫、脂肪軟骨腫、脂肪線維腫、脂肪血管腫、粘液脂肪腫、軟骨性肉腫、軟骨腫、軟骨筋腫、脊索腫（notochordoma）、絨毛膜腺腫、絨毛上皮腫(chorionepithelioma)、絨毛上皮腫(chorionic epithelioma)、骨肉腫、骨芽細胞腫、骨軟骨線維腫、骨軟骨肉腫、骨軟骨腫、骨嚢腫、骨象牙質腫、線維骨腫、骨線維肉腫、血管肉腫、血管腫、血管脂肪腫、血管軟骨腫、血管芽腫、角化血管腫、血管神経膠腫、血管肉腫、血管線維腫、血管筋腫、血管脂肪腫、血管リンパ管腫、血管脂肪平滑筋腫、血管筋脂肪腫、血管筋神経腫、血管粘液腫、血管細網内皮腫（angioreticuloendothelioma）、リンパ管肉腫、リンパ肉芽腫、リンパ管腫、リンパ節腫、リンパ粘液腫、リンパ肉腫、リンパ管線維腫、リンパ細胞腫、リンパ上皮腫、リンパ芽細胞腫、内皮腫、内皮芽細胞腫（endoblastoma）、滑膜腫、滑膜肉腫、胎児性中皮腫、肥満細胞腫（mesocytoma）、ユーイング腫瘍、平滑筋腫、平滑筋肉腫、平滑筋芽細胞腫、平滑筋線維腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、横紋筋粘液腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性疾患による細胞増多および赤血球増加症（chronic disease cytosis and erythrocytosis）、リンパ腫ならびに多発性骨髄腫からなる。
【００３８】
６．異常な血管新生に起因する疾患を治療するための医薬を製造する際の式（Ｉ）による化合物の使用を提供する。これらの疾患は主に、リウマチ性関節炎、糖尿病性網膜症、未熟児性網膜症、網膜静脈閉塞症、乾癬、酒さ、カポージ肉腫、特異反応性（specific reaction）角膜炎、流行性角結膜炎、血管新生緑内障、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペスウイルス感染症、帯状疱疹ヘルペスウイルス感染症、原虫感染症、マイコバクテリウム感染症、多発動脈炎、肉芽腫性病変（類肉腫）、強膜炎、ルベオーシス、ドライマウスおよびドライアイの兆候を伴う関節炎症候群、全身紅はん性エリテマトーデス、後天性免疫不全症候群ならびに梅毒からなる。
【００３９】
７．式（Ｉ）による化合物の薬剤効果、安全性評価および陽性対照は下記のとおりである。
（Ｚ）‐３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐ヒドロキシ‐４’‐メトキシジフェニルエチレンＸＶ（以下、コード：ＣＡ４と呼ぶ）；
（Ｚ）‐３，４，５‐トリメトキシ‐４’‐メトキシジフェニルエチレン‐３’‐ｏ‐ジナトリウムホスフェート塩ＸＶＩ（以下、コード：ＣＡ４Ｐと呼ぶ）；
【００４０】
【化１２】
0005735919.tif 000013
【００４１】
（Ｚ）‐３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐アミノ‐４’‐メトキシジフェニルエチレンＸＶＩＩ（以下、コード：ＣＡ４Ｎと呼ぶ）；
【００４２】
【化１３】
0005735919.tif 000014
【００４３】
３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐ヒドロキシ‐４’‐メトキシジフェニルエタンＸＶＩＩＩ（以下、コード：ＣＢ１と呼ぶ）
３，４，５‐トリメトキシ‐４’‐メトキシジフェニルエタン３’‐ｏ‐ジナトリウムホスフェート塩ＸＩＶ（以下、コード：ＣＢ１Ｐと呼ぶ）；
【００４４】
【化１４】
0005735919.tif 000015
【００４５】
３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐アミノ‐４’‐メトキシジフェニルエタンＸＸ（以下、コード：ＣＢ１Ｎと呼ぶ）
３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐グリシルアミノ‐４’‐エトキシジフェニルエタンＸＸＩ（以下、コード：ＣＢ１ＧＮと呼ぶ）
【００４６】
【化１５】
0005735919.tif 000016
【００４７】
（Ｚ）‐３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐ヒドロキシ‐４’‐エトキシジフェニルエチレンＸＸＩＩ（以下、コード：ＥＣＡ４と呼ぶ）；
（Ｚ）‐３，４，５‐トリメトキシ‐４’‐エトキシジフェニルエチレン‐３’‐ｏ‐ジナトリウムホスフェート塩ＸＸＩＩＩ（以下、コード：ＥＣＡ４Ｐと呼ぶ）；
【００４８】
【化１６】
0005735919.tif 000017
【００４９】
（Ｚ）‐３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐アミノ‐４’‐エトキシジフェニルエチレンＸＸＩＶ（以下、コード：ＥＣＡ４Ｎと呼ぶ）；
（Ｚ）‐３、４、５‐トリメトキシ‐３’‐グリシルアミノ‐４’‐エトキシジフェニルエタンＸＸＶ（以下、コード：ＥＣＡ４ＧＮと呼ぶ）
【００５０】
【化１７】
0005735919.tif 000018
【００５１】
８．式（Ｉ）による化合物の薬剤効果および安全性評価結果は下記のように結論付けられる。
（１）インビトロ培養腫瘍細胞の抗腫瘍活性評価結果は、比較により、４’位のエトキシジフェニルエタン化合物ＥＣＢ１およびＥＣＢ１Ｎ、ならびに４’位のエトキシジフェニルエチレン陽性対照化合物ＥＣＡ４およびＥＣＡ４Ｎは、複数のインビトロ培養腫瘍細胞に対して明白且つ基本的に等価な抗腫瘍活性を有し、それらの抗腫瘍活性は４’位のメトキシ陽性対照化合物ＣＡ４、ＣＢ１およびＣＢ１Ｎのそれよりも顕著に（約１０〜２００倍）強力であり、結腸直腸癌ＨＴ‐２９について言えば、ＥＣＢ１Ｎは４’位のメトキシ陽性対照ＣＢ１よりも約２００倍強力となり、ＥＣＢ１は陽性対照ＣＢ１よりも約１００倍強力となる。
（２）固形腫瘍の成長は血管系に依存し、急速増殖下の腫瘍血管内皮細胞の一部は、完全な筋フィラメント構造の不足により完全な構造を維持する上で微小管への依存度が高く、増殖性のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の急速増殖は、完全な構造を維持する上で微小管への依存度が高い。したがって、通常は微小管が腫瘍血管内皮細胞のインビトロモデルとして使用され、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）がエトキシジフェニルエタン誘導体の抗腫瘍血管特性を評価するための作用対象として使用される。６．８×１０−４μｍｏｌ／ＬのＩＣ５０を有するエトキシジフェニルエタン誘導体ＥＣＢ１Ｎおよび７．５×１０−４μｍｏｌ／ＬのＩＣ５０を有するエトキシジフェニルエタン誘導体ＥＣＢ１は、ヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖阻害効果を有し、そのため４’位のメトキシ陽性対照化合物ＣＡ４、ＣＢ１およびＣＢ１Ｎ（４．８×１０−３〜７．７×１０−３のＩＣ５０を有する）よりも間違いなく強力なチューブリン凝集阻害剤を提供する。このことはエトキシジフェニルエタン誘導体が潜在的に非常に強力な腫瘍血管標的薬剤となることを示す。
（３）マウスのＳ１８０肉腫移植腫瘍に対するインビボ静注試験薬剤の腫瘍阻害率実験結果から、この投与提案によれば、すべての被検化合物がマウスのＳ１８０肉腫移植腫瘍の成長を明白に阻害することができ、薬剤投与後８日目前後に、比較により４’位のエトキシジフェニルエタン誘導体ＥＣＢ１Ｐ、ＥＣＢ１ＧＮ塩酸塩およびＥＣＢ１ＳＮ塩酸塩、ならびに４’位のエトキシジフェニルエチレン陽性対照化合物ＥＣＡ４ＰおよびＥＣＡ４ＧＮ塩酸塩は、どちらも薬剤投与群で腫瘍収縮の傾向を示し、５０ｍｇ／ｋｇの投与量では腫瘍阻害率が６０％超に達し、それぞれ基本的に等価な治療効果を有する。これらの治療効果はメトキシ陽性対照ＣＢ１ＧＮ塩酸塩、ＣＢ１ＰおよびＣＡ４Ｐの治療効果、すなわち１００ｍｇ／ｋｇの投与量で約４０％の腫瘍阻害率よりも明らかに優れている。
（４）単回のマウス腹腔内注射投与の急性毒性試験では、高用量注射投与により４０分後および１時間後にマウスが死ぬようにし、解剖後に明白な残留液体は確認されなかった。このことは薬剤の高速吸収を示す。他のマウスは主に投与後１〜２日目に死んだが、５日目以降はマウスの死は観察されなかった。死亡したマウスの心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓および他の器官の異常は解剖で発見されず、生存したマウスは重度でない下痢を起こした。このことは主に被検薬剤が明白な遅延毒性のない急性毒性反応をもたらすことを示す。したがって、この試験結果は、エトキシジフェニルエタン化合物ＥＣＢ１Ｐ、ＥＣＢ１ＧＮ塩酸塩およびＥＣＢ１ＳＮ塩酸塩の投与群の毒性がエトキシジフェニルエチレン陽性対照化合物ＥＣＡ４ＰおよびＥＣＡ４ＧＮ塩酸塩のそれよりも低いことを示している。
【００５２】
９．本発明の研究から、エトキシジフェニルエタン化合物、すなわち式（Ｉ）による化合物は、ジフェニルエタンＢ芳香環４’位の元のメトキシをエトキシに修飾することにより、３’位にヒドロキシおよびアミノを有する活性標的を形成することができ、その腫瘍血管標的活性を、Ｂ芳香環４’位に元のメトキシ基を、３’位にヒドロキシ基およびアミノ基を有するメトキシジフェニルエタン化合物と比較して大幅に増強させ得ることが分かった。この実験は、４’位のエトキシジフェニルエタン化合物ＥＣＢ１およびＥＣＢ１Ｎがどちらも複数のインビボ培養腫瘍細胞に関する明白な抗腫瘍活性を有し、４’位のメトキシ陽性対照化合物ＣＡ４、ＣＢ１およびＣＢ１Ｎよりも顕著に（１０〜２００倍）強力であり、結腸直腸癌ＨＴ‐２９について言えば、ＥＣＢ１Ｎは陽性対照ＣＢ１よりも約２００倍強力であり、ＥＣＢ１は陽性対照ＣＢ１よりも約１００倍強力であることを示している。
【００５３】
化合物がジフェニルエチレン化合物のコンブレタスタチンＡ‐４と異なる構造、配座、結合力および反転効果を有するように、且つシス‐トランス配列差が存在しないように２つのベンゼン環を単結合によって連結させる。また、毒性を低下させながら薬剤安定性を大幅に増加させることができ、製造技術をより良い形に簡略化することができる。また、カラムクロマトグラフィ分離が必要なくなり、技術収率が顕著に改善し、原料の消費が相当減少し、ユニット合成の技術的コストも大幅に削減され、薬剤安定性が増加し、光を避けた保管も必要なくなり、保管および実用の便宜性が大きく向上し、予想外の効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】ヒドロキシエトキシジフェニルエタン化合物およびその水溶性プロドラッグの合成経路を示す図である。
【図２】アミノエトキシジフェニルエタン化合物およびそのアミノ酸アミド誘導体の合成経路を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
［実施形態１］
４‐エトキシ‐３‐メトキシベンズアルデヒドの調製：
【００５６】
７６グラムの４‐ヒドロキシ‐３‐メトキシベンズアルデヒド（０．５ｍｏｌ）および５００ｍＬのイソプロパノールを４口フラスコに加え、次いで２０分間攪拌し、定圧滴下漏斗を使用して６．５グラムの１８‐クラウン‐６‐エーテルおよび１３３グラムの水酸化ナトリウムを含む１５０ミリリットルの水溶液をゆっくりと滴下し、攪拌を３０分間行い、反応系を６０℃まで加熱した。ここでは、ＴＬＣ追跡を実施しながら８５グラムのブロムエチルを反応のために５〜６時間滴下し、反応終了後に反応系を（１５℃まで）冷却し、これに５００ｍＬの水を加えて反応を停止させ、生成物をエーテル（３×３００ｍＬ）で抽出し、有機相を中性になるまで水で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、エーテルを部分蒸留し、大量の石油エーテルを加えて粗生成物を沈殿させ、この粗生成物をエーテル／石油エーテルで再結晶化させ、８３グラムの４‐エトキシ‐３‐メトキシベンズアルデヒドを得た。収率は９２％であった。
【００５７】
［実施形態２］
４‐エトキシ‐３‐ヒドロキシベンズアルデヒドの調製
【００５８】
ステップ１：アルゴン保護下で、５４グラムの４‐エトキシ‐３‐メトキシベンズアルデヒド（０．３ｍｏｌ）を３口フラスコに加え、次いでこのフラスコに１３０グラムのエチレングリコール（２．１ｍｏｌ）および１３３グラムのオルトギ酸ジエチル（０．９ｍｏｌ）を加えて約１００℃で還流させ、触媒として１ｍｌの三フッ化ホウ素エーテル溶液を加えた。反応はＴＬＣ追跡を実施しながら２４時間実施し、反応生成物を室温まで冷却し、２００ｍｌの１５％水酸化ナトリウム水溶液を加え、その後３００ｍｌのエーテルで抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、エチレングリコールおよびオルトギ酸トリエチルの減圧蒸留を利用して黄色の油状物を得た。
【００５９】
ステップ２：５６グラムのアセタール（０．２５ｍｏｌ）を２００ｍｌの１．２８Ｍリチウムジフェニルホスフィドテトラヒドロフラン溶液にバッチ単位で加え、ＴＬＣ追跡を実施しながら室温で３時間〜４時間攪拌を行い、水を加えて反応を停止させ、反応生成物に２００ｍｌの３０％水酸化ナトリウム溶液を加え、次いで３００ｍｌのエーテルで抽出し、塩酸によって酸性化し、約３〜４までｐＨ調整し、最後に５００ｍｌのエーテルで抽出し、エーテル抽出液を混合し、水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒の減圧除去を利用して黄色の固体を得た。その後この固体をベンゼン／石油エーテルで再結晶化させて３８．１グラムの黄色がかった結晶を得た。収率は７６％であった。
【００６０】
［実施形態３］
４‐エトキシ‐３‐ベンジルオキシベンズアルデヒドの調製：
【００６１】
１６．６グラムの４‐エトキシ‐３‐ヒドロキシベンズアルデヒド（１００ｍｍｏｌ）および２００ｍｌの無水エチルアルコールを３口フラスコに加え、次いで溶解させるために４０℃まで加熱し、９グラムの炭酸カリウム（６５．０７ｍｍｏｌ）を加え、１５ｍｌのベンジルクロライド（１３０．１３ｍｍｏｌ）を攪拌下で加え、加熱還流を１時間行い、ＴＬＣで完全反応が検出された後に反応生成物を５０℃まで冷却し、次いでそれが熱いうちに濾過し、濾液を一晩冷蔵庫に入れて冷却し、結晶を分離し、ポンプ濾過にかけ、瀘過ケーキを３０ｍＬの無水エチルアルコールによって洗浄し、その後真空乾燥して２１．５グラムの白色の針状結晶を得た。収率は８３．９％であった。
【００６２】
［実施形態４］
３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐ベンジルオキシ‐４’‐エトキシジフェニルエチレンの調製
【００６３】
３口瓶に２０グラムの３，４，５‐トリメトキシトリメトキシトリフェニルベンジリデンブロミドホスホニウムブロミド（３，４，５‐トリメトキシトリフェニルベンジリデンホスホニウムブロミド）および１５０ｍｌのテトラヒドロフランを加え、懸濁液を攪拌して１０．５グラムの４‐エトキシ‐３‐ベンジルオキシベンズアルデヒド（４１．０ｍｍｏｌ）を７０ｍｌのテトラヒドロフラン中に溶解させ、そのテトラヒドロフランを容量１００ｍｌの滴下漏斗に入れ、７．５グラムの固体カリウムｔｅｒｔ‐ブトキシド（６６．５ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加え、反応系を血紅色（sanguine）に変化させ、室温で５分間攪拌を行い、４‐エトキシ‐３‐ベンジルオキシベンズアルデヒドの溶液をゆっくり滴下し、再度室温で２０分間攪拌を行い、ＴＬＣで完全反応が検出された後に反応生成物を容量５００ｍｌの分離漏斗に注入し、溶液に１４０ｍｌの脱イオン水を加えて層化させ、その後抽出のために３００ｍｌ×２のエーテルを加え、エーテル層を併合し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、瀘過ケーキを５０ｍＬのエーテルで洗浄し、濾液を回転蒸発器の濃縮により乾燥させて２５グラムの油状物を得た。この油状物に２０ｍＬの無水エチルアルコールを加え、その後ポンプ濾過にかけて１４．１グラムの黄色がかった固体を得た。この黄色がかった固体を丸底フラスコに入れ、２５ｍｌの無水エチルアルコールを加え、その後加熱を利用して固体を部分的に溶解させ、室温で攪拌し、ポンプ濾過にかけ、瀘過ケーキを１０ｍｌの無水エチルアルコールで洗浄し、その後赤外線ランプで乾燥させて１０．６グラムの純粋な３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐ベンジルオキシ‐４’‐エトキシジフェニルエチレン、すなわち黄色がかった粉末状固体を得た。収率は６１．６％であった。
【００６４】
［実施形態５］
３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐ヒドロキシ‐４’‐エトキシジフェニルエタン（以下、コード：ＥＣＢ１と呼ぶ）の調製
【００６５】
ステップ１：１０．６グラムの純粋な３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐ベンジルオキシ‐４’‐エトキシジフェニルエチレン（２５．８ｍｍｏｌ）を３口フラスコに加え、２００ｍｌのエチルアセテートおよび１２０ｍｌの無水エチルアルコール中に溶解させ、結果として得られた黄色がかった溶液に１．０グラムの５％パラジウム炭素を加え、水素を攪拌下で供給し、溶液を室温で１時間撹拌し、その後濾過して無水溶液を得た。この無水溶液を回転蒸発器の濃縮により乾燥させて８．０６グラムの油状物、すなわち３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐ヒドロキシ‐４’‐エトキシジフェニルエタンの粗生成物を得た。収率は９６．８％であった。
【００６６】
ステップ２：８．０６グラムの３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐ヒドロキシ‐４’‐エトキシジフェニルエタンの粗生成物を丸底フラスコに加え、４０ｍｌの無水エチルアルコール中に溶解させ、不溶物があればそれらを濾過によって除去し、溶液を室温で静置しながら結晶を析出させ、一晩静置して溶媒を完全に揮発させると、大量の白色結晶が析出した。これらの白色結晶を濾過し、瀘過ケーキをエタノールで洗浄して６．７グラムの白色結晶を得た。収率は８３％であった。
【００６７】
［実施形態６］
３，４，５‐トリメトキシ‐４’‐エトキシジフェニルエタン‐３’‐ｏ‐ジナトリウムホスフェート塩（以下、コード：ＥＣＢ１Ｐと呼ぶ）の調製（リン酸エステル化１）
【００６８】
４．４ｍｌのオキシ塩化リン（４７．４ｍｍｏｌ）および２５ｍｌのジクロロメタンを丸底フラスコに加え、１０ｍｌのジクロロメタン中５グラムの３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐ヒドロキシ‐４’‐エトキシジフェニルエタン（１５．１ｍｍｏｌ）から得られた溶液を滴下し、次いで攪拌を５分間行い、５ｍｌのジクロロメタン中３．３ｍｌのトリエチルアミン（２３．８ｍｍｏｌ）から得られた溶液を滴下し、その後室温で３時間攪拌し、ＴＬＣ検出し、完全反応後に急冷のために１００ｍｌの冷水を加えた。十分な振動を利用して有機相を分離させ、５０ｍＬ×２の水で洗浄し、ジクロロメタンで水相を抽出した後に有機相を併合し、適当な量の無水硫酸ナトリウムで一晩乾燥させ、ポンプ濾過にかけ、濾液を減圧蒸留にかけて溶媒の濃い液体を除去し、氷浴の冷却下で混合溶液のｐＨが８〜１０に達するまで２ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ溶液を攪拌下で加え、攪拌を６５℃で８時間行い、不溶物を濾過によって除去し、溶液の大部分を減圧蒸留にかけ、冷却によって結晶を析出させて白色固体、すなわち３，４，５‐トリメトキシ‐４’‐エトキシジフェニルエタン‐３’‐ｏ‐ジナトリウムホスフェート塩の粗生成物を得た。この粗生成物を加熱によってエタノール中に溶解させ、生成物が溶解したエタノールを熱いうちに濾過して不溶性の固体を除去し、濾液を冷却して結晶を析出させ、約５．６グラムの白色結晶化生成物、すなわち純粋な生成物を得た。収率は８１．６％であった。
１Ｈ‐ＮＭＲ（ｐｐｍ）δ：７．３３（ｄ、１Ｈ、２’‐Ｈ）；６．８９（ｄ、１Ｈ、６’‐Ｈ）；６．６７（ｄ、１Ｈ、５’‐Ｈ）；６．５８（ｓ、２Ｈ、２、６Ｈ）；４．１８（２Ｈ、ｑ；‐ＯＣＨ２）；３．８０（ｓ、３Ｈ、４‐ＯＣＨ３）；３．７６（ｓ、６Ｈ、３、５‐ＯＣＨ３）；２．８２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１３．２Ｈｚ、ｌａ‐Ｈ）；２．７９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１３．３Ｈｚ、ｌａ’‐Ｈ）；１．５２（３Ｈ、ｔ；‐ＣＨ３）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（ｐｐｍ）δ：１４．９、３７．８、３８．２、５６．１、５６．３、６４．７、１０５．３、１１４．３、１１５．２、１３８．４、１２１．６、１３２．２、１３３．８、１４５．０、１５０．１、１３６．７。
【００６９】
［実施形態７］
３，４，５‐トリメトキシ‐４’‐エトキシジフェニルエタン‐３’‐ｏ‐ジナトリウムホスフェート塩（以下、コード：ＥＣＢ１Ｐと呼ぶ）の調製（リン酸エステル化２）
【００７０】
ステップ１：アルゴン雰囲気下で、４．２グラムの３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐ヒドロキシ‐４’‐エトキシジフェニルエタン（１２．６ｍｍｏｌ）を４口フラスコに加え、次いで４０ｍＬの乾燥アセトニトリルで溶解させ、−２．５℃まで冷却し、次いで６ｍｌの四塩化炭素を加え、攪拌を５分間続けた後、４．７ｍｌのジイソプロピルエチルアミンおよび０．１５グラムの４‐ジメチルアミノピリジンを加え、１分後に４ｍｌのジベンジルホスフェート（８０％）をゆっくりと加え、温度を−１０℃未満に保ち、ＴＬＣ追跡を実施しながら３．５時間連続で反応させ、完全反応時に１０ｍの１０．５Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４を加え、その後温度を室温まで自然に上昇させ、酢酸エチルで抽出し、有機層を併合し、蒸留水および飽和食塩水で逐次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧蒸留にかけて濁った油状物を得た。この油状物を酢酸エチル‐ｎ‐ヘキサンによって再結晶化させて６．６グラムの無色の針状結晶を得た。収率は８８％であった。
【００７１】
ステップ２：結果として得られた６．５グラムのベンジルホスフェート（１０．８ｍｍｏｌ）を４口フラスコに加え、２５ｍｌの乾燥無水アセトニトリルで溶解させ、１５℃のアルゴン雰囲気下で攪拌を行い、４．５ｍｌのトリメチルブロモシラン（ＴＭＢＳ）を急速に滴下し、５分後〜１０分後に１．８グラムのナトリウムメトキシドを含有した７ｍｌの無水メタノール溶液を加え、それにより反応系を乳白色の懸濁液に直ちに変化させ、３０分後に３．６ｍｌの無水メタノールおよび３．６ｍｌのアセトンを加え、懸濁液を攪拌下で一晩置き、その後ポンプ濾過して白色固体を得た。この白色固体を無水メタノールおよびアセトンで洗浄し、その後真空乾燥させた。水／メタノール／アセトンによる再結晶化を利用して４．１グラムの白色粉体を得た。収率は８３．６％であった。
【００７２】
１Ｈ‐ＮＭＲ（ｐｐｍ）δ：７．３４（ｄ、１Ｈ、２’‐Ｈ）；６．８８（ｄ、１Ｈ、６’‐Ｈ）；６．６８（ｄ、１Ｈ、５’‐Ｈ）；６．６０（ｓ、２Ｈ、２、６Ｈ）；４．２０（２Ｈ、ｑ；‐ＯＣＨ２）；３．７６（ｓ、３Ｈ、４‐ＯＣＨ３）；３．７５（ｓ、６Ｈ、３、５‐ＯＣＨ３）；２．８１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１３．６Ｈｚ、ｌａ‐Ｈ）；２．７９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１３．６Ｈｚ、ｌａ’‐Ｈ）；１．５４（３Ｈ、ｔ；‐ＣＨ３）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（ｐｐｍ）δ：１４．８、３７．８、３８．３、５６．１、５６．３、６４．６、１０５．５、１１４．６、１１５．３、１３８．３、１２１．７、１３２．４、１３３．８、１４５．１、１５０．１、１３６．７。
【００７３】
［実施形態８］
４‐エトキシ‐３‐ニトロベンズアルデヒドの調製
【００７４】
８３．５グラムの４‐ヒドロキシ‐３‐ニトロベンズアルデヒド（０．５ｍｏｌ）、６６８ｍＬのＮ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド、１６７グラムの炭酸カリウムおよび８．３５グラムの１８‐クラウン‐６‐エーテルを４口フラスコに加え、５５〜６５℃の温度で攪拌し、ＴＬＣ追跡を実施しながら約８０グラムのブロムエチルを反応のために５〜６時間加え、反応終了時に反応生成物を４０℃まで冷却し、反応を停止させるために６００ｍｌの純水を加え、反応生成物をエーテル（３×３００ｍＬ）で抽出し、有機相を中性になるまで水で洗浄し、その後無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、エーテルを部分蒸留し、大量の石油エーテルを加えて粗生成物を沈殿させ、この粗生成物をエーテル／石油エーテルで再結晶化させ、８０．９グラムの４‐エトキシ‐３‐ニトロベンズアルデヒドを得た。収率は８３％であった。
【００７５】
［実施形態９］
３，４，５‐トリメトキシフェニル‐３’‐ニトリル‐４’‐エトキシジフェニルエチレンの調製
【００７６】
アルゴン保護下で、１５グラムのトリメトキシフェニルトリフェニルホスホニウムブロミドメチリド（trimethoxyphenyl bromide triphenylphosphonium methylide）（２８．７ｍｍｏｌ）を約−１５℃の温度に冷却した３００ｍｌのＴＨＦ中で懸濁させ、２２ｍｌのｎ‐ブチルリチウムシクロヘキサン溶液（１．６ｍｏｌ／Ｌ）を反応のために１時間滴下した。ＴＬＣ追跡を実施しながら５．７グラムの４‐エトキシ‐３‐ニトロベンズアルデヒド（２９ｍｍｏｌ）を含有した２４ｍｌのＴＨＦ溶液を反応物中にゆっくりと滴下し、その後一晩攪拌し、反応温度を室温まで上昇させ、溶液の温度を−５℃まで下げ、反応を停止させるために飽和食塩水を加え、有機層を分離させ、溶媒の３／４を除去し、残りの母溶液の４倍程度の量の無水エチルアルコールを再結晶化のために０〜−５℃の温度で加え、濾過を利用して６．８グラムの黄色がかった物質を得た。収率は６５％であった。
【００７７】
［実施形態１０］
３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐アミノ‐４’‐エトキシジフェニルエタン（以下、コード：ＥＣＢ１Ｎと呼ぶ）の調製
【００７８】
１００ｍｌの水、０．５グラムの１０％パラジウム炭素触媒、および１５０ｍｌの水中に溶解させた８グラムの水素化ホウ素ナトリウムから得られた溶液を反応フラスコに加え、この反応フラスコに窒素を供給し、６．８グラムの３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐ニトリル‐４’‐エトキシジフェニルエチレン（１６．６ｍｍｏｌ）を攪拌下で滴下して２５０ｍｌのＮａＯＨから得た２ｍｏｌ／Ｌの溶液中に溶解させ、この滴下工程を約２０分間続け、その後溶液を濾過し、濾液を２ｍｏｌ／ＬのＨＣＬで酸性化して過剰な水素化ホウ素ナトリウムを分解し、次いで希釈ＮａＯＨで中和させ、最後にエーテル（１００ｍｌ×４）で抽出し、エーテル抽出液体を混合し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させてエーテルを蒸留し、ｎ‐ヘキサン：酢酸エチルの約９：１の比率による再結晶化を利用して４．８グラムの無色の結晶を得た。収率は８３％であった。
【００７９】
１Ｈ‐ＮＭＲ（ｐｐｍ）δ：７．１４（ｄ、１Ｈ、２’‐Ｈ）；６．８８（ｄ、１Ｈ、６’‐Ｈ）；６．６８（ｄ、１Ｈ、５’‐Ｈ）；６．６０（ｓ、２Ｈ、２、６−Ｈ）；４．４８（ｂｒｓ、２Ｈ、ＮＨ２）；４．０８（ｑ、２Ｈ、‐ＣＨ２）；３．７７（ｓ、３Ｈ、４‐ＯＣＨ３）；３．７５（ｓ、６Ｈ、３、５‐ＯＣＨ３）；２．８５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１２．５Ｈｚ、ｌａ‐Ｈ）；２．７８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１２．５Ｈｚ、ｌａ’‐Ｈ）；１．５６（３Ｈ、ｔ；‐ＣＨ３）。
ＭＳ（ｍ／Ｚ）：３３１（Ｍ＋）；高分解能質量分析法、計算値：３３１．１７８４、実測値：３３１．１７５３。
【００８０】
［実施形態１１］
３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐グリシルアミノ‐４’‐エトキシジフェニルエタンＸＩＩＩ（以下、コード：ＥＣＢ１ＧＮと呼ぶ）の調製
【００８１】
ステップ１：４．８グラムの３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐アミノ‐４’‐エトキシ‐ジフェニルエタン（１４．５ｍｍｏｌ）、５．２７グラムのＦｍｏｃ‐グリシン（１７．８ｍｍｏｌ）および２５グラムのＢＯＰ試薬を１００ｍｌのＤＭＦ中に溶解させ、反応混合物を攪拌下で６０℃まで加熱し、ＴＬＣ追跡を実施しながら２時間反応させ、反応終了時に反応生成物を冷却し、均一に混合されるように１００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加えた。この混合物を１２０ｍｌ×３のジクロロメタンで抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧濃縮を利用して６．６グラムの白色物質を得た。収率は７５％であった。
【００８２】
ステップ２：上記で得た６．６グラムの３，４，５‐トリメトキシフェニル‐３’‐アミノ‐４’‐エトキシジフェニルエタン‐Ｆｍｏｃ‐グリシンアミド（１０．８ｍｍｏｌ）を１２０ｍｌのメタノール中に溶解させ、次いでＴＬＣ追跡を実施しながらこのメタノールに６ｍｌの２Ｎ水酸化ナトリウム溶液を攪拌下で加え、これを３時間反応させ、反応終了時に反応生成物を冷却し、均一に混合されるように６０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加え、この混合物を１５０ｍｌ×３のジクロロメタンで抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、まず濾過を利用し次いで減圧濃縮を利用して３．２グラムの白色粉状物を得た。収率は７７％であった。
【００８３】
１Ｈ‐ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００Ｍ）δ：９．５４（ｂｒｓ、１Ｈ、‐ＮＨ）；７．０４（ｄ、１Ｈ、２’‐Ｈ）；６．９２（ｄ、１Ｈ、６’‐Ｈ）；６．７８（ｄ、１Ｈ、５’‐Ｈ）；６．６５（ｓ、２Ｈ、２、６Ｈ）；４．７７（ｂｒｓ、２Ｈ、Ｃｌｙ‐ＮＨ２）；４．２０（ｂｒｓ、２Ｈ、Ｇ１  ｙ‐ＣＨ２）；４．０２（ｑ、２Ｈ、‐ＣＨ２）；３．７６（ｓ、３Ｈ、４‐ＯＣＨ３）；３．７５（ｓ、６Ｈ、３、５‐ＯＣＨ３）；２．８８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１２．８Ｈｚ、ｌａ‐Ｈ）；２．７８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１２．８Ｈｚ、ｌａ’‐Ｈ）；１．５５（３Ｈ、ｔ；‐ＣＨ３）。
ＭＳ（ｍ／Ｚ）：３３８（Ｍ＋）；高分解能質量分析法、計算値：３３８．１９９８、実測値：３３８．１９４５。
【００８４】
［実施形態１２］
３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐セリルアミノ‐４’‐エトキシジフェニルエタン（以下、コード：ＥＣＢ１ＳＮと呼ぶ）の調製
【００８５】
ステップ１：４．８グラムの３，４，５‐トリメトキシ‐３’‐アミノ‐４’‐エトキシ‐ジフェニルエタン（１４．５ｍｍｏｌ）、６．５グラムのＦｍｏｃ‐セリン（１７．８ｍｍｏｌ）、３．７グラムのＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボ‐ジイミド）（１７．８ｍｍｏｌ）および２．７グラムのＨＯＢｔ（１‐ヒドロキシ‐ベンゾ‐トリアゾール）を９０ｍｌのＤＭＦ中に溶解させ、ＴＬＣ追跡を実施しながら反応混合物を室温で５時間攪拌下で反応させ、反応終了時に反応生成物を冷却し、均一に混合されるように６０ｍｌの酢酸エチルを加え、この混合物を濾過し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧濃縮を利用して６．５グラムの白色物質を得た。収率は７４％であった。
【００８６】
ステップ２：上記で得た６．５グラムの物質を７０ｍｌのメタノールおよび７０ｍｌのジクロロメタンの混合溶媒中に溶解させ、この混合溶媒に１２ｍｌの２Ｎ水酸化ナトリウム溶液を攪拌下で加え、ＴＬＣ追跡を実施しながら室温で２４時間反応させ、反応終了時に反応生成物を冷却し、均一に混合されるように６７０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加え、この混合物を１５０ｍｌ×３のジクロロメタンで抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、まず濾過を利用し次いで減圧濃縮を利用して３．３グラムの白色粉状物を得た。収率は７９％であった。
【００８７】
１Ｈ‐ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００Ｍ）δ：９．６５（ｂｒｓ、１Ｈ、‐ＮＨ）；７．０６（ｄ、１Ｈ、２’‐Ｈ）；６．９０（ｄ、１Ｈ、６’‐Ｈ）；６．７６（ｄ、１Ｈ、５’‐Ｈ）；６．６６（ｓ、２Ｈ、２、６Ｈ）；５．２７（ｂｒｓ、２Ｈ、Ｓｅｒ‐ＮＨ２）；４．５０（ｂｒｓ、２Ｈ、Ｓｅｒ‐ＯＨ）；４．１９（ｑ、２Ｈ、‐ＣＨ２）；３．９３（ｍ、１Ｈ、Ｓｅｒ‐ＣＨ）；３．８６（ｓ、３Ｈ、４‐ＯＣＨ３）；３．８０（ｓ、６Ｈ、３、５‐ＯＣＨ３）；２．９２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１３．２Ｈｚ、ｌａ‐Ｈ）；２．８５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１３．２Ｈｚ、ｌａ’‐Ｈ）；２．６７（ｍ、２Ｈ、Ｓｅｒ‐ＣＨ２）；１．５４（３Ｈ、ｔ；‐ＣＨ３）。
ＭＳ（ｍ／Ｚ）：４１８（Ｍ＋）；高分解能質量分析法、計算値：４１８．２１０４、実測値：４１８．２１１４。
【００８８】
［実施形態１３］（インビトロ培養腫瘍細胞に関する抗腫瘍活性評価）
【００８９】
１．試験方法
２００ｍＬ／Ｌのウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ  １６４０培養液で細胞を終始対数期となるように培養し、９６ウェルプレートに４〜８×１０４／ｍｌの密度（ＨＵＶＥＣ密度３×１０４／ｍＬ）で接種し、６つの濃度を有する薬剤の投与を３７℃で４８時間連続的に与え、薬剤毎に３つの二重ウェルがある場合は前培養後２４時間連続的に与え、培養液を分離させ、空気乾燥し、各ウェルに５００ｇ／Ｌの濃度（最終的な濃度は１００ｇ／Ｌ）で５０μＬの冷たいトリクロロ酢酸を加え、その後６０分間固定し、次いで脱イオン水で４〜５回洗浄し、最後に乾燥させ、各ウェルに４ｇ／Ｌの濃度のＳＲＢを１００μＬ加えて３０分間作用させ、その後１０ｍｌ／Ｌの酢酸で優しく４回洗浄し、乾燥させ、各ウェルを均一に振り混ぜるために各ウェルに２００μＬのＴｒｉｓベース（１０ｍｍｏｌ）を加え、平坦な振動子上で５分間振動させ、値ＡをＥＬＩＳＡ（enzyme linked immunosorbent assay：酵素結合免疫吸着法）リーダによって判定し、４９０ｎｍの波長でブランクコントロールによりゼロセットし、腫瘍阻害率（％）＝（薬剤なし細胞対照ウェル値Ａの平均値−薬剤塗布ウェル値Ａの平均値）／（薬剤なし細胞対照ウェル値Ａの平均値）×１００％、陽性対照をＣＡ４、ＣＢ１およびＣＢ１Ｎとし、ロジット法に基づいて、ＩＣ５０を様々な濃度下の薬剤の細胞成長阻害率に従って計算した。
【００９０】
２．試験結果：
比較により、４’位のエトキシジフェニルエタン化合物ＥＣＢ１およびＥＣＢ１Ｎ、ならびに４’位のエトキシジフェニルエチレン陽性対照化合物ＥＣＡ４およびＥＣＡ４Ｎは、複数のインビトロ培養腫瘍細胞に対して明白且つ基本的に等価な抗腫瘍活性を有し、それらの抗腫瘍活性は４’位のメトキシ陽性対照化合物ＣＡ４、ＣＢ１およびＣＢ１Ｎのそれよりも顕著に（約１０〜２００倍）強力であり、結腸直腸癌ＨＴ‐２９について言えば、ＥＣＢ１ＮはＣＢ１よりも約２００倍強力となり、ＥＣＢ１はＣＢ１よりも約１００倍強力となる。
【００９１】
固形腫瘍の成長は血管系に依存し、急速増殖下の腫瘍血管内皮細胞の一部は、完全な筋フィラメント構造の不足により完全な構造を維持する上で微小管への依存度が高く、増殖性のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の急速増殖は、完全な構造を維持する上で微小管への依存度が高い。したがって、通常は微小管が腫瘍血管内皮細胞のインビトロモデルとして使用され、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）がエトキシジフェニルエタン誘導体の抗腫瘍血管特性を評価するための作用対象として使用される。６．８×１０−４μｍｏｌ／ＬのＩＣ５０を有するエトキシジフェニルエタン誘導体ＥＣＢ１Ｎおよび７．５×１０−４μｍｏｌ／ＬのＩＣ５０を有するエトキシジフェニルエタン誘導体ＥＣＢ１は、４’位のメトキシ陽性対照化合物ＣＡ４、ＣＢ１およびＣＢ１Ｎ（４．８×１０−３〜７．７×１０−３のＩＣ５０を有する）よりも明白に強力なヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖阻害効果を有する。このことはエトキシジフェニルエタン誘導体が潜在的に非常に強力な腫瘍血管標的薬剤となることを示す。
【００９２】
【表１】
0005735919.tif 000019
【００９３】
［実施形態１４］（マウスのＳ１８０肉腫移植腫瘍に対するインビボ静注試験薬剤の腫瘍阻害率実験）
【００９４】
１．実験方法：
１週間の適応期間後、マウスにＳ１８０肉腫組織を皮下接種し、腫瘍が１００〜３００ｍｍ３程度の面積まで成長した後にマウスをランダムに分類し；すべての化合物を薬剤投与群では６匹のマウス、対照群では１２匹のマウスに使用し、投与量はＥＣＢ１Ｐ、ＥＣＢ１ＧＮ塩酸塩、ＥＣＢ１ＳＮ塩酸塩および陽性対照ＥＣＡ４Ｐ、ＥＣＡ４ＧＮ塩酸塩を２５、５０ｍｇ／ｋｇ、陽性対照ＣＢ１ＧＡ塩酸塩、ＣＢ１ＰおよびＣＡ４Ｐを５０、１００ｍｇ／ｋｇとし、ｄ０日目、ｄ２日目、ｄ４日目、ｄ６日目、ｄ８日目、ｄ１０日目およびｄ１２日目に合計７回静注投与を与え、腫瘍容積の測定、マウスの秤量およびデータの記録を週に３回実施し、マウスを接種後１４日目に屠殺し、腫瘍組織を秤量して腫瘍阻害率を下記のとおり計算した。
腫瘍阻害率％＝（１−治療群の平均腫瘍質量／対照群の平均腫瘍質量）×１００％
【００９５】
２．実験結果：
この投与提案によれば、上記のすべての化合物がマウスのＳ１８０肉腫移植腫瘍の成長を明白に阻害することができ、薬剤投与後８日目前後に、比較により４’位のエトキシジフェニルエタン誘導体ＥＣＢ１Ｐ、ＥＣＢ１ＧＮ塩酸塩およびＥＣＢ１ＳＮ塩酸塩、ならびに４’位のエトキシジフェニルエチレン陽性対照化合物ＥＣＡ４ＰおよびＥＣＡ４ＧＮ塩酸塩は、どちらも薬剤投与群で腫瘍収縮の傾向を示し、５０ｍｇ／ｋｇの投与量では腫瘍阻害率が６０％超に達し、それぞれ基本的に等価な治療効果を有する。これらの治療効果はメトキシ陽性対照ＣＢ１ＧＮ塩酸塩、ＣＢ１ＰおよびＣＡ４Ｐの治療効果、すなわち１００ｍｇ／ｋｇの投与量で約４０％の腫瘍阻害率よりも明らかに優れている。
【００９６】
【表２】
0005735919.tif 000020
【００９７】
［実施形態１５］（単回マウス腹腔内注射試験薬剤の急性毒性試験）
１．試験方法
昆明マウス（雌雄各半数、体重１７〜２２グラム）をそれぞれの体重に従ってランダムに分類し、試験ではマウスを０．９の比率に基づいて１０の投与群に分け、各群はそれぞれ１０匹のマウスを含み、最大投与量は１５００ｍｇ／ｋｇであり、１５００、１３５０、１２１５、１０９３、９８４、８８５、７９７、７１７、６４５および５８１ｍｇ／ｋｇの投与量をそれぞれ有する被検薬剤を単回腹腔内注射によって投与し、薬剤投与の０．２５時間後、０．５時間後、１時間後、２時間後、４時間後および２４時間後にマウス診察および死亡率記録をそれぞれ一度実施し、その後毎日のマウス診察および死亡率記録を１４日間続け、１５日目の時点で死亡していないマウスを屠殺し、病理解剖にかけた。
【００９８】
２．試験結果
単回の高用量腹腔内注射投与により４０分後および１時間後にマウスが死ぬようにし、解剖後に明白な残留液体は確認されなかった。このことは薬剤の高速吸収を示す。他のマウスは主に投与後１〜２日目に死んだが、５日目以降はマウスの死は観察されなかった。死亡したマウスの心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓および他の器官の異常は解剖で発見されず、生存したマウスは重度でない下痢を起こした。このことは主に被検薬剤が明白な遅延毒性のない急性毒性反応をもたらすことを示す。したがって、この試験結果は、エトキシジフェニルエタン化合物ＥＣＢ１Ｐ、ＥＣＢ１ＧＮ塩酸塩およびＥＣＢ１ＳＮ塩酸塩の投与群の毒性がエトキシジフェニルエチレン陽性対照化合物ＥＣＡ４ＰおよびＥＣＡ４ＧＮ塩酸塩のそれよりも低いことを示している。
【００９９】
【表３】
0005735919.tif 000021
【図１】
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【図２】
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