(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号４のポリペプチド、ここで、（ｉ）位置９８におけるロイシンがアルギニンに置換され、（ｉｉ）位置１７１におけるプロリンがグリシンに置換され、（ｉｉｉ）位置１８０におけるアラニンがグルタミン酸に置換されている、
（ｂ）配列番号３１を含むリンカー配列、及び
（ｃ）配列番号１１を含むＦｃドメイン
を含むポリペプチド。
【請求項２】
配列番号４７の配列を含むポリペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の単離ポリペプチド及び製薬上許容可能な製剤を含む医薬組成物。
【請求項４】
前記製薬上許容可能な製剤がヒドロゲルである請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
配列番号４のポリペプチドが、
（ａ）８個以下のアミノ酸残基のアミノ末端切頭化、ここで、前記ポリペプチドは哺乳類において血糖を低下し得る、
（ｂ）１２個以下のアミノ酸残基のカルボキシル末端切頭化、ここで、前記ポリペプチドは哺乳類において血糖を低下し得る、又は、
（ｃ）８個以下のアミノ酸残基のアミノ末端切頭化及び１２個以下のアミノ酸残基のカルボキシル末端切頭化、ここで、前記ポリペプチドは哺乳類において血糖を低下し得る、
を含む請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項６】
１以上のポリマーに共有結合している請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ポリマーがＰＥＧである請求項６のポリペプチド。
【請求項８】
配列番号４６の核酸配列によりコードされるポリペプチド。
【請求項９】
（ａ）配列番号４のポリペプチド、ここで、（ｉ）位置９８におけるロイシンがアルギニンに置換され、（ｉｉ）位置１７１におけるプロリンがグリシンに置換され、（ｉｉｉ）位置１８０におけるアラニンがグルタミン酸に置換されている、
（ｂ）配列番号３１を含むリンカー配列、及び
（ｃ）配列番号１１を含むＦｃドメイン
をコードする核酸。
【請求項１０】
配列番号４６を含む請求項９に記載の核酸。
【請求項１１】
請求項１０の核酸分子を含むベクター。
【請求項１２】
請求項１１のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
配列番号４７のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１４】
配列番号４６のヌクレオチド１〜１２７２を含む核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００９年５月５日に出願された米国仮出願第６１／１７５，７３６号及び２００９年１２月９日に出願された米国仮出願第６１／２８５，１１８号の利益を請求するものであり、前記仮出願のすべては本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ＦＧＦ２１変異ポリペプチドをコードする核酸分子、ＦＧＦ２１変異ポリペプチド、ＦＧＦ２１変異ポリペプチドを含む医薬組成物、及びこのような核酸、ポリペプチド、又は医薬組成物を用いて代謝性疾患を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＦＧＦ２１は、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１、及びＦＧＦ２３を含む繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）のサブファミリーに属する分泌性ポリペプチドである（Ｉｔｏｈら、２００４、Ｔｒｅｎｄ  Ｇｅｎｅｔ．２０：５６３−６９）。ＦＧＦ２１は、ヘパリン非依存性であり、グルコース、脂質、及びエネルギー代謝の制御におけるホルモンとして機能するという点で、非定型のＦＧＦである。
【０００４】
ＦＧＦ２１は、肝臓分泌因子として肝臓ｃＤＮＡライブラリから単離された。これは、肝臓及び膵臓で非常に多く発現され、肝臓で主に発現される唯一のＦＧＦファミリーのメンバーである。ＦＧＦ２１を過剰発現するトランスジェニックマウスは、成長速度が遅く、血漿グルコース及びトリグリセリド値が低く、加齢に伴う２型糖尿病、膵島過形成及び肥満が無いという代謝表現型を示す。げっ歯類及び霊長類モデルにおいて組み換えＦＧＦ２１タンパク質の医薬投与により、血漿グルコース値が正常となり、トリグリセリド及びコレステロール値が低下し、耐糖能、インスリン感受性が改善するという結果をもたらす。更に、ＦＧＦ２１は、エネルギー消費、身体活動度、及び新陳代謝率の向上により、体重及び体脂肪を減少させる。実験的研究から、ヒトにおける２型糖尿病、肥満、脂質異常症、及び他の代謝状態又は代謝疾患の治療のためのＦＧＦ２１の医薬投与が支持される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｉｔｏｈら、２００４、Ｔｒｅｎｄ  Ｇｅｎｅｔ．２０：５６３−６９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ヒトＦＧＦ２１のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期は短い。マウスにおいて、ヒトＦＧＦ２１の半減期は１時間から２時間であり、カニクイザルにおいては、半減期は２．５時間から３時間である。２型糖尿病を治療する際に治療薬として使用するＦＧＦ２１タンパク質を開発する場合には、半減期を延長させることが望ましいであろう。半減期が延長されたＦＧＦ２１タンパク質により、タンパク質を投与されている患者の投与頻度を少なくすることができるであろう。
そのようなタンパク質を本明細書で説明する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
配列番号４のアミノ酸配列を含み、そして更に：（ａ）位置１８０における少なくとも１つのアミノ酸置換；及び（ｂ）（ｉ）位置１７１における置換；及び（ｉｉ）位置９８における置換から成る群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換；及び（ｃ）それらの組み合わせを含む単離ポリペプチドを開示する。
【０００８】
一つの実施態様では、単離ポリペプチドは、位置９８に置換及び位置１８０に置換を含み、そしてその場合：（ａ）位置９８における置換は、アルギニン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、リジン、及びスレオニンから成る群より選択され；そして（ｂ）位置１８０における置換は、グリシン、プロリン、セリン、又はグルタミン酸から成る群より選択され；そして（ｃ）それらの組み合わせから選択される。一つの実施態様では、位置９８の残基はアルギニンであり、位置１８０の残基はグルタミン酸である。また、異種アミノ酸配列に融合される単離ポリペプチドを含む融合ポリペプチドも提供する。一つの実施態様では、異種アミノ酸配列は、Ｆｃドメイン又はその断片であって、配列番号１１のアミノ酸配列を含むことができる。別の実施態様では、ポリペプチドは、リンカーを介してＦｃドメインに融合され、また、もう一つ別の実施態様では、前記リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３１）を含む。一つの特定の実施態様では、ポリペプチドは、配列番号４７を含む。また、融合ポリペプチドのうちの２種以上を含む多量体も開示する。単離ポリペプチドと、薬学的に許容可能な処方剤、例えばヒドロゲルとを含む医薬組成物も開示する。別の態様では、代謝性疾患を治療する方法を提供し、そして、一つの実施態様では、前記方法は、本発明で提供される医薬組成物を、それを必要とするヒト患者に投与することを含む。一つの実施態様では、代謝性疾患は糖尿病であり、別の実施態様では、代謝性疾患は肥満である。単離ポリペプチドをコードする核酸も提供し、そして一つの実施態様では、核酸は配列番号４６を含む。核酸は  ベクター中に存在することができ、そして、ベクターそれ自体は、宿主細胞中に存在できる。更に別の実施態様では、ポリペプチドは：（ａ）８個を超えないアミノ酸残基のアミノ末端短縮（ポリペプチドは哺乳動物において血糖を低下させることができる。）；（ｂ）１２個を超えないアミノ酸残基のカルボキシル末端短縮（ポリペプチドは哺乳動物において血糖を低下させることができる。）；又は（ｃ）８個を超えないアミノ酸残基のアミノ末端短縮及び１２個を超えないカルボキシル末端短縮（ポリペプチドは哺乳動物において血糖を低下させることができる。）を含む。更に別の実施態様では、前記ポリペプチドは、ＰＥＧなどの１以上のポリマーに共有結合される。
【０００９】
別の実施態様では、単離ポリペプチドは、位置１７１に置換及び位置１８０に置換を含み、そしてその場合：（ａ）位置１８０における置換は、グリシン、プロリン、セリン、及びグルタミン酸から成る群より選択され；（ｂ）位置１７１における置換は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、セリン、スレオニン、トリプトファン、及びチロシンから成る群より選択され；そして（ｃ）それらの組み合わせから選択される。一つの実施態様では、位置１７１の残基はグリシンであり、位置１８０の残基はグルタミン酸である。また、異種アミノ酸配列に融合される単離ポリペプチドを含む融合ポリペプチドも提供する。一つの実施態様では、異種アミノ酸配列は、Ｆｃドメイン又はその断片であって、配列番号１１のアミノ酸配列を含むことができる。別の実施態様では、前記ポリペプチドは、リンカーを介してＦｃドメインに融合され、また、もう一つ別の実施態様では、前記リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３１）を含む。一つの特定の実施態様では、ポリペプチドは、配列番号４７を含む。また、融合ポリペプチドのうちの２種以上を含む多量体も開示する。単離ポリペプチドと、薬学的に許容可能な処方剤、例えばヒドロゲルとを含む医薬組成物も開示する。別の態様では、代謝性疾患を治療する方法を提供し、そして、一つの実施態様では、前記方法は、本発明で提供される医薬組成物を、それを必要とするヒト患者に投与することを含む。一つの実施態様では、代謝性疾患は糖尿病であり、別の実施態様では、代謝性疾患は肥満である。単離ポリペプチドをコードする核酸も提供し、そして一つの実施態様では、核酸は配列番号４６を含む。核酸は  ベクター中に存在することができ、そして、ベクターそれ自体は、宿主細胞中に存在できる。更に別の実施態様では、前記ポリペプチドは：（ａ）８個を超えないアミノ酸残基のアミノ末端短縮（ポリペプチドは哺乳動物において血糖を低下させることができる。）；（ｂ）１２個を超えないアミノ酸残基のカルボキシル末端短縮（ポリペプチドは哺乳動物において血糖を低下させることができる。）；又は（ｃ）８個を超えないアミノ酸残基のアミノ末端短縮及び１２個を超えないアミノ酸残基のカルボキシル末端短縮（ポリペプチドは哺乳動物において血糖を低下させることができる。）を含む。更に別の実施態様では、ポリペプチドは、ＰＥＧなどの１以上のポリマーに共有結合される。
【００１０】
更に別の実施態様では、前記ポリペプチドは、配列番号４の、位置９８に置換、位置１７１に置換、そして位置１８０に置換を含み、そしてその場合：（ａ）位置１７１における置換は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、セリン、スレオニン、トリプトファン、又はチロシンから成る群より選択され；（ｂ）位置９８における置換は、アルギニン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、リジン、又はスレオニンから成る群より選択され；そして（ｃ）位置１８０における置換は、グリシン、プロリン、セリン、又はグルタミン酸から成る群より選択され；そしてそれらの組み合わせから選択される。更なる実施態様では、位置９８の残基はアルギニンであり、位置１７１の残基はグリシンであり、そして位置１８０の残基はグルタミン酸である。また、異種アミノ酸配列に融合される単離ポリペプチドを含む融合ポリペプチドも提供する。一つの実施態様では、異種アミノ酸配列は、Ｆｃドメイン又はその断片であって、配列番号１１のアミノ酸配列を含むことができる。別の実施態様では、ポリペプチドは、リンカーを介してＦｃドメインに融合され、また、もう一つ別の実施態様では、前記リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：３１）を含む。一つの特定の実施態様では、前記ポリペプチドは、配列番号４７を含む。また、融合ポリペプチドのうちの２種以上を含む多量体も開示する。単離ポリペプチド及び薬学的に許容可能な処方剤、例えばヒドロゲルを含む医薬組成物も開示する。別の態様では、代謝性疾患を治療する方法を提供し、そして、一つの実施態様では、前記方法は、本発明で提供される医薬組成物を、それを必要とするヒト患者に投与することを含む。一つの実施態様では、代謝性疾患は糖尿病であり、別の実施態様では、代謝性疾患は肥満である。単離ポリペプチドをコードする核酸も提供し、そして一つの実施態様では、核酸は配列番号４６を含む。核酸は  ベクター中に存在することができ、そして、ベクターそれ自体は、宿主細胞中に存在できる。更に別の実施態様では、前記ポリペプチドは：（ａ）８個を超えないアミノ酸残基のアミノ末端短縮（ポリペプチドは哺乳動物において血糖を低下させることができる。）；（ｂ）１２個を超えないアミノ酸残基のカルボキシル末端短縮（ポリペプチドは哺乳動物において血糖を低下させることができる。）；又は（ｃ）８個を超えないアミノ酸残基のアミノ末端短縮及び１２個を超えないアミノ酸残基のカルボキシル末端短縮（ポリペプチドは哺乳動物において血糖を低下させることができる。）を含む。更に別の実施態様では、ポリペプチドは、ＰＥＧなどの１以上のポリマーに共有結合される。
【００１１】
以下の特定の実施態様及び特許請求の範囲に関するより詳細な説明から、本発明の具体的な実施態様が明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】ＦＧＦ２１短縮変異体７−１８１及び８−１８１（図１Ａ）及びＦＧＦ２１短縮変異体１−１７２、１−１７１、１−１６９及び１−１６４（図１Ｂ）に対して行われたＥＬＫ−ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示す図であり；各パネルは、ヒトＦＧＦ２１対照に対して得られた結果を示す。
【図１Ｂ】ＦＧＦ２１短縮変異体７−１８１及び８−１８１（図１Ａ）及びＦＧＦ２１短縮変異体１−１７２、１−１７１、１−１６９及び１−１６４（図１Ｂ）に対して行われたＥＬＫ−ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示す図であり；各パネルは、ヒトＦＧＦ２１対照に対して得られた結果を示す。
【図２】ヒトＦＧＦ２１対照及びＦＧＦ２１短縮変異体３−１８１、４−１８１、５−１８１、７−１８１、８−１８１、１−１８０、１−１７８、１−１７７、１−１７６、１−１７５、１−１７４、１−１７３、１−１７２、９−１８１、及び１−１４９において行われたＥＬＫ−ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示す図である。
【図３】ＰＢＳ（黒いバー）、ヒトＦＧＦ２１対照（白いバー）又はＦＧＦ２１短縮変異体８−１８１（右下がり斜線のバー）及び９−１８１（左下がり斜線のバー）を注射したマウスで測定された血糖値を示す図である。
【図４】ＰＢＳ（黒丸）、Ｆｃ−ＦＧＦ２１対照（野生）（白丸）又はアミノ酸残基５−１８１（黒三角）もしくは７−１８１（白三角）を含む切頭化Ｆｃ−ＦＧＦ２１融合タンパク質を注射したマウスにおいて測定された血糖値の変化％を示す図である。
【図５】ＰＢＳ（黒丸）、ＦＧＦ２１−Ｆｃ対照（野生）（白丸）、残基１−１７５を含む切頭化ＦＧＦ２１−Ｆｃ融合タンパク質（黒三角）、又はアミノ酸残基１−１７１を含む切頭化Ｆｃ−ＦＧＦ２１タンパク質（白三角）を注射したマウスで測定された血糖値の変化％を示す図である。
【図６Ａ】ヒトＦｃ−（Ｇ５）−ＦＧＦ２１（配列番号１０７）対照試料（図６Ａ）に関する、そして、注射から６時間後（試料Ｄ６；図６Ｂ）、２４時間後（試料Ｄ２４；図６Ｃ）及び４８時間後（試料Ｄ４８；図６Ｄ）にマウスから採取したＦｃ−（Ｇ５）−ＦＧＦ２１の試料に関する液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）の結果を示す図である。
【図６Ｂ】ヒトＦｃ−（Ｇ５）−ＦＧＦ２１（配列番号１０７）対照試料（図６Ａ）に関する、そして、注射から６時間後（試料Ｄ６；図６Ｂ）、２４時間後（試料Ｄ２４；図６Ｃ）及び４８時間後（試料Ｄ４８；図６Ｄ）にマウスから採取したＦｃ−（Ｇ５）−ＦＧＦ２１の試料に関する液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）の結果を示す図である。
【図６Ｃ】ヒトＦｃ−（Ｇ５）−ＦＧＦ２１（配列番号１０７）対照試料（図６Ａ）に関する、そして、注射から６時間後（試料Ｄ６；図６Ｂ）、２４時間後（試料Ｄ２４；図６Ｃ）及び４８時間後（試料Ｄ４８；図６Ｄ）にマウスから採取したＦｃ−（Ｇ５）−ＦＧＦ２１の試料に関する液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）の結果を示す図である。
【図６Ｄ】ヒトＦｃ−（Ｇ５）−ＦＧＦ２１（配列番号１０７）対照試料（図６Ａ）に関する、そして、注射から６時間後（試料Ｄ６；図６Ｂ）、２４時間後（試料Ｄ２４；図６Ｃ）及び４８時間後（試料Ｄ４８；図６Ｄ）にマウスから採取したＦｃ−（Ｇ５）−ＦＧＦ２１の試料に関する液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）の結果を示す図である。
【図７Ａ】哺乳動物由来ヒトＦＧＦ２１−（Ｇ３）−Ｆｃ（配列番号１０５）対照試料（図７Ａ）に関する、そして、注射から６時間後（試料Ｅ６；図７Ｂ）、２４時間後（試料Ｅ２４；図７Ｃ）、及び４８時間後（試料Ｅ４８；図７Ｄ）にマウスから採取したＦＧＦ２１−（Ｇ３）−Ｆｃの試料に関するＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図７Ｂ】哺乳動物由来ヒトＦＧＦ２１−（Ｇ３）−Ｆｃ（配列番号１０５）対照試料（図７Ａ）に関する、そして、注射から６時間後（試料Ｅ６；図７Ｂ）、２４時間後（試料Ｅ２４；図７Ｃ）、及び４８時間後（試料Ｅ４８；図７Ｄ）にマウスから採取したＦＧＦ２１−（Ｇ３）−Ｆｃの試料に関するＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図７Ｃ】哺乳動物由来ヒトＦＧＦ２１−（Ｇ３）−Ｆｃ（配列番号１０５）対照試料（図７Ａ）に関する、そして、注射から６時間後（試料Ｅ６；図７Ｂ）、２４時間後（試料Ｅ２４；図７Ｃ）、及び４８時間後（試料Ｅ４８；図７Ｄ）にマウスから採取したＦＧＦ２１−（Ｇ３）−Ｆｃの試料に関するＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図７Ｄ】哺乳動物由来ヒトＦＧＦ２１−（Ｇ３）−Ｆｃ（配列番号１０５）対照試料（図７Ａ）に関する、そして、注射から６時間後（試料Ｅ６；図７Ｂ）、２４時間後（試料Ｅ２４；図７Ｃ）、及び４８時間後（試料Ｅ４８；図７Ｄ）にマウスから採取したＦＧＦ２１−（Ｇ３）−Ｆｃの試料に関するＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図８Ａ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（配列番号４９）対照試料（図８Ａ）に関する、そして、注射から６時間後（図８Ｂ）、２４時間後（図８Ｃ）、及び４８時間後（図８Ｄ）にマウスから採取したＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１の試料に関するＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図８Ｂ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（配列番号４９）対照試料（図８Ａ）に関する、そして、注射から６時間後（図８Ｂ）、２４時間後（図８Ｃ）、及び４８時間後（図８Ｄ）にマウスから採取したＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１の試料に関するＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図８Ｃ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（配列番号４９）対照試料（図８Ａ）に関する、そして、注射から６時間後（図８Ｂ）、２４時間後（図８Ｃ）、及び４８時間後（図８Ｄ）にマウスから採取したＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１の試料に関するＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図８Ｄ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（配列番号４９）対照試料（図８Ａ）に関する、そして、注射から６時間後（図８Ｂ）、２４時間後（図８Ｃ）、及び４８時間後（図８Ｄ）にマウスから採取したＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１の試料に関するＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図９Ａ】ＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃ（配列番号４１）対照試料（図９Ａ）に関する、そして、注射から６時間後（図９Ｂ）、２４時間後（図９Ｃ）及び４８時間後（図９Ｄ）にマウスから採取したＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃの試料のＬＣ−ＭＳ分析に関する結果を示す図である。
【図９Ｂ】ＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃ（配列番号４１）対照試料（図９Ａ）に関する、そして、注射から６時間後（図９Ｂ）、２４時間後（図９Ｃ）及び４８時間後（図９Ｄ）にマウスから採取したＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃの試料のＬＣ−ＭＳ分析に関する結果を示す図である。
【図９Ｃ】ＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃ（配列番号４１）対照試料（図９Ａ）に関する、そして、注射から６時間後（図９Ｂ）、２４時間後（図９Ｃ）及び４８時間後（図９Ｄ）にマウスから採取したＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃの試料のＬＣ−ＭＳ分析に関する結果を示す図である。
【図９Ｄ】ＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃ（配列番号４１）対照試料（図９Ａ）に関する、そして、注射から６時間後（図９Ｂ）、２４時間後（図９Ｃ）及び４８時間後（図９Ｄ）にマウスから採取したＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃの試料のＬＣ−ＭＳ分析に関する結果を示す図である。
【図１０Ａ】マウスに注射した、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（図１０Ａ、配列番号４９）及びＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃ（図１０Ｂ、配列番号４１）融合タンパク質のＬＣ−ＭＳ分析によって特定された切断部位を示す図である。
【図１０Ｂ】マウスに注射した、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（図１０Ａ、配列番号４９）及びＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃ（図１０Ｂ、配列番号４１）融合タンパク質のＬＣ−ＭＳ分析によって特定された切断部位を示す図である。
【図１１】ＰＢＳ（黒いバー）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（配列番号：４９）（白いバー）又はＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１変異体であるＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（配列番号５１）（左下がり斜線のバー）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ（配列番号５３）（右下がり斜線のバー）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ（配列番号５５）（斜め網目状のバー）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｇ１７０Ｅ、Ｐ１７１Ａ、Ｓ１７２Ｌ）（配列番号５９）（水平線模様のバー）、又はＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｇ１５１Ａ（配列番号６１）（階段状斜線のバー）を注射したマウスで測定された血糖値を示す図である。
【図１２】ＰＢＳ（黒丸）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（配列番号４９）（白丸）、又はＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１変異体であるＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（配列番号５１）（黒三角）（Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ（配列番号５３）（白三角）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ（配列番号５５）（黒菱形）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｇ１７０Ｅ、Ｐ１７１Ａ、Ｓ１７２Ｌ）（配列番号５９）（白菱形）、又はＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｇ１５１Ａ（配列番号６１）（黒四角）を注射したマウスで測定された血糖値の変化％を示す図である。
【図１３】ＰＢＳ（黒いバー）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（配列番号４９）（白いバー）、又はＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１変異体であるＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｐ１５０Ａ、Ｇ１５１Ａ、Ｉ１５２Ｖ）（左下がり斜線のバー）、（Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（配列番号５１）（右下がり斜線のバー）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｇ１７０Ｅ、Ｐ１７１Ａ）（配列番号６３）（斜め網目状のバー）、又はＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｇ１７０Ｅ、Ｓ１７２Ｌ）（配列番号６７）（水平線模様のバー）を注射したマウスで測定された血糖値を示す図である。
【図１４】ＰＢＳ（黒四角）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（配列番号４９）（白四角）、又はＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１変異体であるＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｐ１５０Ａ、Ｇ１５１Ａ、Ｉ１５２Ｖ）（配列番号６５）（黒逆三角形）（Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（配列番号５１）（白逆三角形）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｇ１７０Ｅ（Ｐ１７１Ａ））（配列番号６３）（黒い円）、又はＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｇ１７０Ｅ、Ｓ１７２Ｌ）（配列番号６７）（白い円）を注射したマウスにおいて測定された血糖値の変化％を示す図である。
【図１５】ＰＢＳ（黒いバー）又はＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１変異体であるＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（配列番号５１）（白いバー）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ａ（配列番号６９）（左下がり斜線のバー）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｃ（配列番号７１）（右下がり斜線のバー）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｄ（配列番号７３）（斜め網目状のバー）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｎ（配列番号７５）（水平線模様のバー）、又はＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｓ（配列番号７７）（階段状斜線のバー）を注射したマウスで測定された血糖値を示す図である。
【図１６】ＰＢＳ（黒丸）又はＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１変異体であるＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（配列番号５１）（白丸）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ａ（配列番号６９）（黒三角）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｃ（配列番号７１）（白三角）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｄ（配列番号７３）（黒菱形）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｎ（配列番号７５）（白三角）、又はＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｓ（配列番号７７）（逆黒三角）を注射したマウスで測定された血糖値の変化％を示す図である。
【図１７】ＰＢＳ（黒いバー）又はＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１変異体であるＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（配列番号５１）（白いバー）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｅ（配列番号７９）（左下がり斜線のバー）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｈ（配列番号８１）（右下がり斜線のバー）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｑ（配列番号８３）（斜め網目状のバー）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｔ（配列番号８５）（水平線模様のバー）、又はＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｙ（配列番号８７）（階段状斜線のバー）を注射したマウスで測定された血糖値を示す図である。
【図１８】ＰＢＳ（黒丸）又はＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１変異体であるＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（配列番号５１）（白丸）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｅ（配列番号７９）（黒三角）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｈ（配列番号８１）（白三角）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｑ（配列番号８３）（黒菱形）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｔ（配列番号８５）（白菱形）、又はＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｙ（配列番号８７）（黒四角）を注射したマウスで測定された血糖値の変化％を示す図である。
【図１９Ａ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１対照試料（図１９Ａ、配列番号４９）に関する、そして、注射から６時間後（図１９Ｂ）、２４時間後（図１９Ｃ）、及び４８時間後（図１９Ｄ）にマウスから採取された試料に関するＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図１９Ｂ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１対照試料（図１９Ａ、配列番号４９）に関する、そして、注射から６時間後（図１９Ｂ）、２４時間後（図１９Ｃ）、及び４８時間後（図１９Ｄ）にマウスから採取された試料に関するＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図１９Ｃ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１対照試料（図１９Ａ、配列番号４９）に関する、そして、注射から６時間後（図１９Ｂ）、２４時間後（図１９Ｃ）、及び４８時間後（図１９Ｄ）にマウスから採取された試料に関するＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図１９Ｄ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１対照試料（図１９Ａ、配列番号４９）に関する、そして、注射から６時間後（図１９Ｂ）、２４時間後（図１９Ｃ）、及び４８時間後（図１９Ｄ）にマウスから採取された試料に関するＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図２０Ａ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ対照試料（図２０Ａ、配列番号５１）に関する、そして、注射から６時間後（図２０Ｂ）、２４時間後（図２０Ｃ）、及び４８時間後（図２０Ｄ）にマウスから採取された、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅの試料に関するＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図２０Ｂ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ対照試料（図２０Ａ、配列番号５１）に関する、そして、注射から６時間後（図２０Ｂ）、２４時間後（図２０Ｃ）、及び４８時間後（図２０Ｄ）にマウスから採取された、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅの試料に関するＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図２０Ｃ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ対照試料（図２０Ａ、配列番号５１）に関する、そして、注射から６時間後（図２０Ｂ）、２４時間後（図２０Ｃ）、及び４８時間後（図２０Ｄ）にマウスから採取された、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅの試料に関するＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図２０Ｄ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ対照試料（図２０Ａ、配列番号５１）に関する、そして、注射から６時間後（図２０Ｂ）、２４時間後（図２０Ｃ）、及び４８時間後（図２０Ｄ）にマウスから採取された、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅの試料に関するＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図２１Ａ】Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ対照試料（図２１Ａ、配列番号５３）に関する、そして、注射から６時間後（図２１Ｂ）、２４時間後（図２１Ｃ）、及び４８時間後（図２１Ｄ）にマウスから採取されたＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａの試料に関するＬＣ―ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図２１Ｂ】Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ対照試料（図２１Ａ、配列番号５３）に関する、そして、注射から６時間後（図２１Ｂ）、２４時間後（図２１Ｃ）、及び４８時間後（図２１Ｄ）にマウスから採取されたＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａの試料に関するＬＣ―ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図２１Ｃ】Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ対照試料（図２１Ａ、配列番号５３）に関する、そして、注射から６時間後（図２１Ｂ）、２４時間後（図２１Ｃ）、及び４８時間後（図２１Ｄ）にマウスから採取されたＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａの試料に関するＬＣ―ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図２１Ｄ】Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ対照試料（図２１Ａ、配列番号５３）に関する、そして、注射から６時間後（図２１Ｂ）、２４時間後（図２１Ｃ）、及び４８時間後（図２１Ｄ）にマウスから採取されたＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａの試料に関するＬＣ―ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図２２Ａ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ対照試料（図２２Ａ、配列番号５５）に関する、そして、注射から６時間後（図２２Ｂ）、２４時間後（図２２Ｃ）及び４８時間後（図２２Ｄ）にマウスから採取されたＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌの試料に関するＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図２２Ｂ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ対照試料（図２２Ａ、配列番号５５）に関する、そして、注射から６時間後（図２２Ｂ）、２４時間後（図２２Ｃ）及び４８時間後（図２２Ｄ）にマウスから採取されたＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌの試料に関するＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図２２Ｃ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ対照試料（図２２Ａ、配列番号５５）に関する、そして、注射から６時間後（図２２Ｂ）、２４時間後（図２２Ｃ）及び４８時間後（図２２Ｄ）にマウスから採取されたＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌの試料に関するＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図２２Ｄ】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ対照試料（図２２Ａ、配列番号５５）に関する、そして、注射から６時間後（図２２Ｂ）、２４時間後（図２２Ｃ）及び４８時間後（図２２Ｄ）にマウスから採取されたＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌの試料に関するＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図２３Ａ】マウスに注射した、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（図２３Ａ、配列番号４９）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（図２３Ｂ、配列番号５１）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ（図２３Ｃ、配列番号５３）、及びＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ（図２３Ｄ、配列番号５５）融合タンパク質のＬＣ−ＭＳ分析により特定された切断部位を示す図である。
【図２３Ｂ】マウスに注射した、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（図２３Ａ、配列番号４９）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（図２３Ｂ、配列番号５１）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ（図２３Ｃ、配列番号５３）、及びＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ（図２３Ｄ、配列番号５５）融合タンパク質のＬＣ−ＭＳ分析により特定された切断部位を示す図である。
【図２３Ｃ】マウスに注射した、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（図２３Ａ、配列番号４９）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（図２３Ｂ、配列番号５１）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ（図２３Ｃ、配列番号５３）、及びＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ（図２３Ｄ、配列番号５５）融合タンパク質のＬＣ−ＭＳ分析により特定された切断部位を示す図である。
【図２３Ｄ】マウスに注射した、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（図２３Ａ、配列番号４９）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（図２３Ｂ、配列番号５１）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ（図２３Ｃ、配列番号５３）、及びＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ（図２３Ｄ、配列番号５５）融合タンパク質のＬＣ−ＭＳ分析により特定された切断部位を示す図である。
【図２４Ａ】ＦＧＦ２１変異体であるＦＧＦ２１  Ｌ９９Ｒ（配列番号１０９）、ＦＧＦ２１  Ｌ９９Ｄ（配列番号１１１）、及びＦＧＦ２１  Ａ１１１Ｔ（配列番号１１３）（図２４Ａ）；ＦＧＦ２１変異体ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｄ（配列番号１１５）、ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｑ（配列番号１１７）、及びＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｋ（配列番号１１９）（図２４Ｂ）；及び、ＦＧＦ２１変異体ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｙ（配列番号１２１）、ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｅ（配列番号１２３）、及びＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｋ（配列番号１２５）（図２４Ｃ）に関して行ったＥＬＫ−ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示す図である；各パネルは、ヒトＦＧＦ２１対照に関して得られた結果を示す。
【図２４Ｂ】ＦＧＦ２１変異体であるＦＧＦ２１  Ｌ９９Ｒ（配列番号１０９）、ＦＧＦ２１  Ｌ９９Ｄ（配列番号１１１）、及びＦＧＦ２１  Ａ１１１Ｔ（配列番号１１３）（図２４Ａ）；ＦＧＦ２１変異体ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｄ（配列番号１１５）、ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｑ（配列番号１１７）、及びＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｋ（配列番号１１９）（図２４Ｂ）；及び、ＦＧＦ２１変異体ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｙ（配列番号１２１）、ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｅ（配列番号１２３）、及びＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｋ（配列番号１２５）（図２４Ｃ）に関して行ったＥＬＫ−ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示す図である；各パネルは、ヒトＦＧＦ２１対照に関して得られた結果を示す。
【図２４Ｃ】ＦＧＦ２１変異体であるＦＧＦ２１  Ｌ９９Ｒ（配列番号１０９）、ＦＧＦ２１  Ｌ９９Ｄ（配列番号１１１）、及びＦＧＦ２１  Ａ１１１Ｔ（配列番号１１３）（図２４Ａ）；ＦＧＦ２１変異体ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｄ（配列番号１１５）、ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｑ（配列番号１１７）、及びＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｋ（配列番号１１９）（図２４Ｂ）；及び、ＦＧＦ２１変異体ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｙ（配列番号１２１）、ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｅ（配列番号１２３）、及びＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｋ（配列番号１２５）（図２４Ｃ）に関して行ったＥＬＫ−ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示す図である；各パネルは、ヒトＦＧＦ２１対照に関して得られた結果を示す。
【図２５Ａ】Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１変異体であるＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｇ（配列番号８９）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｓ（配列番号９１）、及びＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｔ（配列番号８５）（図２５Ａ）；Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１変異体Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｙ（配列番号８７）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｗ（配列番号９３）及びＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｃ（配列番号９５）（図２５Ｂ）；Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（配列番号４９）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｇ１７０Ｅ）（配列番号９７）及びＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ（配列番号９９）（図２５Ｃ）；そして、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（配列番号４９）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｅ（配列番号７９）及びＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｇ１７０Ｅ）（配列番号９７）（図２５Ｄ）に関して行われたＥＬＫ−ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示す図である；各パネルは、ヒトＦＧＦ２１対照に関して得られた結果を示す。
【図２５Ｂ】Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１変異体であるＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｇ（配列番号８９）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｓ（配列番号９１）、及びＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｔ（配列番号８５）（図２５Ａ）；Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１変異体Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｙ（配列番号８７）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｗ（配列番号９３）及びＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｃ（配列番号９５）（図２５Ｂ）；Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（配列番号４９）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｇ１７０Ｅ）（配列番号９７）及びＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ（配列番号９９）（図２５Ｃ）；そして、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（配列番号４９）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｅ（配列番号７９）及びＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｇ１７０Ｅ）（配列番号９７）（図２５Ｄ）に関して行われたＥＬＫ−ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示す図である；各パネルは、ヒトＦＧＦ２１対照に関して得られた結果を示す。
【図２５Ｃ】Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１変異体であるＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｇ（配列番号８９）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｓ（配列番号９１）、及びＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｔ（配列番号８５）（図２５Ａ）；Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１変異体Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｙ（配列番号８７）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｗ（配列番号９３）及びＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｃ（配列番号９５）（図２５Ｂ）；Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（配列番号４９）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｇ１７０Ｅ）（配列番号９７）及びＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ（配列番号９９）（図２５Ｃ）；そして、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（配列番号４９）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｅ（配列番号７９）及びＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｇ１７０Ｅ）（配列番号９７）（図２５Ｄ）に関して行われたＥＬＫ−ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示す図である；各パネルは、ヒトＦＧＦ２１対照に関して得られた結果を示す。
【図２５Ｄ】Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１変異体であるＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｇ（配列番号８９）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｓ（配列番号９１）、及びＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｔ（配列番号８５）（図２５Ａ）；Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１変異体Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｙ（配列番号８７）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｗ（配列番号９３）及びＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｃ（配列番号９５）（図２５Ｂ）；Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（配列番号４９）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｇ１７０Ｅ）（配列番号９７）及びＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ（配列番号９９）（図２５Ｃ）；そして、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（配列番号４９）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｅ（配列番号７９）及びＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｇ１７０Ｅ）（配列番号９７）（図２５Ｄ）に関して行われたＥＬＫ−ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示す図である；各パネルは、ヒトＦＧＦ２１対照に関して得られた結果を示す。
【図２６Ａ】野生型成熟ＦＧＦ２１及び様々なＦＧＦ２１変異体に関する、時間の関数としての凝集を示す図である；図２６Ａは、１、２及び４日間にわたり４℃で６５ｍｇ／ｍＬタンパク質をインキュベートした後の、ＦＧＦ２１対照（野生型、黒菱形）及びＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ（黒丸）に関する凝集％の変化を示す図であり、図２６Ｂは、１、６及び１０日間にわたり４℃で６５ｍｇ／ｍＬタンパク質をインキュベートした後の、ＦＧＦ２１対照（野生）（配列番号４）及びＦＧＦ２１  Ｐ７８Ｃ（配列番号１２７）、ＦＧＦ２１  Ｐ７８Ｒ（配列番号１２９）、ＦＧＦ２１  Ｌ８６Ｔ（配列番号１３１）、ＦＧＦ２１  Ｌ８６Ｃ（配列番号１３３）、ＦＧＦ２１  Ｌ９８Ｃ（配列番号１３５）、ＦＧＦ２１  Ｌ９８Ｒ（配列番号１３７）、ＦＧＦ２１  Ａ１１１Ｔ（配列番号１１３）、ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｄ（配列番号１１５）、ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｑ（配列番号１１７）、ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｋ（配列番号１２５）、ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｋ（配列番号１１９）、ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｙ（配列番号１２１）、及びＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｅ（配列番号１２３）（すべてプロット上で標識）に関する凝集％の変化を示す図である。
【図２６Ｂ】野生型成熟ＦＧＦ２１及び様々なＦＧＦ２１変異体に関する、時間の関数としての凝集を示す図である；図２６Ａは、１、２及び４日間にわたり４℃で６５ｍｇ／ｍＬタンパク質をインキュベートした後の、ＦＧＦ２１対照（野生型、黒菱形）及びＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ（黒丸）に関する凝集％の変化を示す図であり、図２６Ｂは、１、６及び１０日間にわたり４℃で６５ｍｇ／ｍＬタンパク質をインキュベートした後の、ＦＧＦ２１対照（野生）（配列番号４）及びＦＧＦ２１  Ｐ７８Ｃ（配列番号１２７）、ＦＧＦ２１  Ｐ７８Ｒ（配列番号１２９）、ＦＧＦ２１  Ｌ８６Ｔ（配列番号１３１）、ＦＧＦ２１  Ｌ８６Ｃ（配列番号１３３）、ＦＧＦ２１  Ｌ９８Ｃ（配列番号１３５）、ＦＧＦ２１  Ｌ９８Ｒ（配列番号１３７）、ＦＧＦ２１  Ａ１１１Ｔ（配列番号１１３）、ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｄ（配列番号１１５）、ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｑ（配列番号１１７）、ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｋ（配列番号１２５）、ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｋ（配列番号１１９）、ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｙ（配列番号１２１）、及びＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｅ（配列番号１２３）（すべてプロット上で標識）に関する凝集％の変化を示す図である。
【図２７】ヒトＦＧＦ２１対照及びＦＧＦ２１変異体であるＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ（配列番号９９）、ＦＧＦ２１  Ｌ５２Ｔ（配列番号１３９）、及びＦＧＦ２１  Ｌ５８Ｅ（配列番号１４１）に関して行ったＥＬＫ−ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示す図である。
【図２８Ａ】１、４及び８日間にわたり４℃でインキュベートした後の、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１変異体であるＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（６―１８１、Ｇ１７０Ｅ）（配列番号１０１）（黒菱形）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｇ１７０Ｅ）（配列番号９７）（白四角）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｅ（配列番号７９）（黒三角）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ（配列番号５３）（十字）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（配列番号５１）（白三角）、及びＦＧＦ２１対照（黒丸）に関する凝集レベルの変化を示す図である。
【図２８Ｂ】これもまた培養の結果を示す棒グラフである。
【図２９】ＰＢＳ（ビヒクル）（黒丸）又はＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体であるＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｇ１７０Ｅ）（配列番号９７）（白丸）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号１０３）（黒三角）、又はＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）（白三角）を注射したマウスで測定された血糖値を示す図である。
【図３０】ヒトＦＧＦ２１（黒丸、実線）、Ｆｃ―（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（配列番号４９）（白丸、実線）及びＦｃ―（Ｌ１５）ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）（黒三角、点線）に関して行ったＥＬＫ―ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示すプロットである。
【図３１Ａ】ＦＧＦ２１（配列番号４）（黒丸、実線）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（配列番号４９）（白丸、実線）及びＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）（黒三角、点線）に関して、室温（図３１Ａ）及び４℃（図３１Ｂ）で９日後に観察された高分子量凝集体の％を示すプロットである。
【図３１Ｂ】ＦＧＦ２１（配列番号４）（黒丸、実線）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（配列番号４９）（白丸、実線）及びＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）（黒三角、点線）に関して、室温（図３１Ａ）及び４℃（図３１Ｂ）で９日後に観察された高分子量凝集体の％を示すプロットである。
【図３２】１６８時間にわたる様々な時点でのＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）において、観察された変化を示す一連のＭＡＬＤＩ質量分析トレースである。
【図３３】ＰＢＳビヒクル対照（白丸）、野生型成熟ＦＧＦ２１（黒四角）、及びＦＧＦ２１変異体であるＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）（黒逆三角）；Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ，１８２Ｐ）（配列番号１４３）（白菱形）、及びＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ，１８２Ｇ）（配列番号１４５）（黒丸）のそれぞれに関する、ｏｂ／ｏｂマウスでの血糖値の変化％を示すプロットである。
【図３４】ＰＢＳビヒクル対照（黒丸）、及びＦＧＦ２１変異体であるＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）（黒三角）；Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ、１８３Ｇ）（配列番号１４７）（白三角）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ）（配列番号１４５）（黒菱形）及びＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｐ）（配列番号１４３）（白菱形）のそれぞれに関する、ｏｂ／ｏｂマウスでの血糖値の変化％を示すプロットである。
【図３５】ＰＢＳビヒクル対照（白丸）、及びＦＧＦ２１変異体であるＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）（黒四角）；Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ｙ１７９Ｓ）（配列番号１４９）（白三角）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ｙ１７９Ａ）（配列番号１５３）（黒逆三角）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｓ）（配列番号１５５）（白菱形）及びＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｇ）（配列番号１５７）（黒丸）のそれぞれに関する、ｏｂ／ｏｂマウスでの血糖値の変化％を示すプロットである。
【図３６】ＰＢＳビヒクル対照（黒丸）、及びＦＧＦ２１変異体であるＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）（白四角）；Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ｙ１７９Ｆ）（配列番号１５１）（黒三角）及びＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号５７）（白菱形）のそれぞれに関する、ｏｂ／ｏｂマウスでの血糖値の変化％を示すプロットである。
【図３７】アカゲザルで行われた６週間の用量漸増実験に関する研究計画を図示するダイアグラムである。この図面において、左下がり斜線の印は、絶食状態での採血を示し、白ぬきは給餌状態での採血を示す。
【図３８Ａ】アカゲザルがＯＧＴＴプロファイル、ＯＧＴＴ  ＡＵＣ及び体重においてどのように無作為化されたかを示す一連のプロットである；図３８Ａは、化合物又はビヒクルが各群に割り当てられる前の、ＯＧＴＴ１におけるベースライングルコース値を示し、黒四角は群Ａに対応し、黒丸、黒線は、群Ｂに対応し、白丸、点線は群Ｃに対応する；図３８Ｂは、化合物又はビヒクルが各群に割り当てられる前の、ＯＧＴＴ２におけるベースライングルコース値を示し、黒四角は群Ａに対応し、黒丸、黒線は、群Ｂに対応し、白丸、黒線は群Ｃに対応する；図３８Ｃは、ＡＵＣに関して示されるＯＧＴＴ１及び２に対するベースライングルコース値を示し、左下がり斜線のバーは群Ａに対応し、右下がり斜線のバーは群Ｂに対応し、白色のバーは群Ｃに対応する；そして図３８Ｄは、ベースライン体重を示し、左下がり斜線のバーは群Ａに対応し、右下がり斜線のバーは群Ｂに対応し、白色のバーは群Ｃに対応する。
【図３８Ｂ】アカゲザルがＯＧＴＴプロファイル、ＯＧＴＴ  ＡＵＣ及び体重においてどのように無作為化されたかを示す一連のプロットである；図３８Ａは、化合物又はビヒクルが各群に割り当てられる前の、ＯＧＴＴ１におけるベースライングルコース値を示し、黒四角は群Ａに対応し、黒丸、黒線は、群Ｂに対応し、白丸、点線は群Ｃに対応する；図３８Ｂは、化合物又はビヒクルが各群に割り当てられる前の、ＯＧＴＴ２におけるベースライングルコース値を示し、黒四角は群Ａに対応し、黒丸、黒線は、群Ｂに対応し、白丸、黒線は群Ｃに対応する；図３８Ｃは、ＡＵＣに関して示されるＯＧＴＴ１及び２に対するベースライングルコース値を示し、左下がり斜線のバーは群Ａに対応し、右下がり斜線のバーは群Ｂに対応し、白色のバーは群Ｃに対応する；そして図３８Ｄは、ベースライン体重を示し、左下がり斜線のバーは群Ａに対応し、右下がり斜線のバーは群Ｂに対応し、白色のバーは群Ｃに対応する。
【図３８Ｃ】アカゲザルがＯＧＴＴプロファイル、ＯＧＴＴ  ＡＵＣ及び体重においてどのように無作為化されたかを示す一連のプロットである；図３８Ａは、化合物又はビヒクルが各群に割り当てられる前の、ＯＧＴＴ１におけるベースライングルコース値を示し、黒四角は群Ａに対応し、黒丸、黒線は、群Ｂに対応し、白丸、点線は群Ｃに対応する；図３８Ｂは、化合物又はビヒクルが各群に割り当てられる前の、ＯＧＴＴ２におけるベースライングルコース値を示し、黒四角は群Ａに対応し、黒丸、黒線は、群Ｂに対応し、白丸、黒線は群Ｃに対応する；図３８Ｃは、ＡＵＣに関して示されるＯＧＴＴ１及び２に対するベースライングルコース値を示し、左下がり斜線のバーは群Ａに対応し、右下がり斜線のバーは群Ｂに対応し、白色のバーは群Ｃに対応する；そして図３８Ｄは、ベースライン体重を示し、左下がり斜線のバーは群Ａに対応し、右下がり斜線のバーは群Ｂに対応し、白色のバーは群Ｃに対応する。
【図３８Ｄ】アカゲザルがＯＧＴＴプロファイル、ＯＧＴＴ  ＡＵＣ及び体重においてどのように無作為化されたかを示す一連のプロットである；図３８Ａは、化合物又はビヒクルが各群に割り当てられる前の、ＯＧＴＴ１におけるベースライングルコース値を示し、黒四角は群Ａに対応し、黒丸、黒線は、群Ｂに対応し、白丸、点線は群Ｃに対応する；図３８Ｂは、化合物又はビヒクルが各群に割り当てられる前の、ＯＧＴＴ２におけるベースライングルコース値を示し、黒四角は群Ａに対応し、黒丸、黒線は、群Ｂに対応し、白丸、黒線は群Ｃに対応する；図３８Ｃは、ＡＵＣに関して示されるＯＧＴＴ１及び２に対するベースライングルコース値を示し、左下がり斜線のバーは群Ａに対応し、右下がり斜線のバーは群Ｂに対応し、白色のバーは群Ｃに対応する；そして図３８Ｄは、ベースライン体重を示し、左下がり斜線のバーは群Ａに対応し、右下がり斜線のバーは群Ｂに対応し、白色のバーは群Ｃに対応する。
【図３９】アカゲザルにおける、ビヒクル、ＦＧＦ２１（配列番号４）及びＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）のベースラインに対する体重の変化％を示すプロットである；左下がり斜線のバー１及び２は、低用量での第１及び２週に対応し、白色のバー３及び４は、中程度の用量での第３及び４週に対応し、黒色のバー５及び６は、高用量での第５及び６週に対応し、右下がり斜線のバー７、８及び９は、休薬期間中の第７〜９週に対応している。
【図４０】アカゲザルでの空腹時インスリン値に関する、ビヒクル、ＦＧＦ２１（配列番号４）及びＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）のベースラインに対する空腹時インスリンの変化％を示すプロットである；左下がり斜線のバー１及び２は低用量での第１及び２週に対応し、白色のバー３及び４は、中程度の用量での第３及び４週に対応し、黒色のバー５及び６は高用量での第５及び６週に対応し、右下がり斜線のバー７及び８は薬期間中の第７及び８週に対応する。
【図４１】この試験の第５及び６週の間に得られたアカゲザルの給餌状態でのインスリン値に対する、高用量で投与したビヒクル、ＦＧＦ２１（配列番号４）及びＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）の影響を示すプロットである；右下がり斜線のバーは第５週に対応し、白色バーは第６週に対応する。
【図４２】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）での２週間の高用量処置の終了時に行ったＯＧＴＴ５のグルコースプロファイルを示すプロットである；黒丸、黒線は、ビヒクルに対応し、白四角、点線は、ＦＧＦ２１に対応し、黒三角、黒線は、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）に対応する。
【図４３】Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）での２週間の高用量処置の終了時に行ったＯＧＴＴ５のインシュリンプロファイルを示すプロットである；黒丸、黒線は、ビヒクルに対応し、白四角、点線は、ＦＧＦ２１に対応し、黒三角、黒線は、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）に対応する。
【図４４】アカゲザルの各投与期間（低、中及び高用量）の終了時に測定された、グルコースＯＧＴＴ  ＡＵＣ３−５のベースラインからの変化％を示す図である；白色のバーは、ＯＧＴＴ３中のグルコース測定値から計算されたＡＵＣ３に対応し、右下がり斜線のバーは、ＯＧＴＴ４中のグルコース測定値から計算されたＡＵＣ４に対応し、左下がり斜線のバーは、ＯＧＴＴ５中のグルコース測定値から計算されたＡＵＣ５に対応する。
【図４５】アカゲザルの各群からの空腹時血漿トリグリセリド値のベースラインからの変化％に対するビヒクル、ＦＧＦ２１及びＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）の影響を示すグラフである；左下がり斜線のバー１及び２は、低用量での第１及び２週に対応し、白色のバー３及び４は、中程度の用量での第３及び４週に対応し、黒色のバー５及び６は、高用量での第５及び６週に対応し、右下がり斜線のバー７、８及び９は、休薬期間中の第７〜９週に対応する。
【図４６】ビヒクル、高用量のＦＧＦ２１又はＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）による処置の第５及び６週の間に測定した、アカゲザルの各群からの給餌状態での血漿トリグリセリド値を示すグラフである；左下がり斜線のバーは第５週に対応し、黒色バーは第６週に対応する。
【図４７】各注射からおよそ２１時間後に得た試料による、投与前及び５、１２、１９及び２６日に測定された、個々のサルのＦＧＦ２１レベルを示すプロットである。
【図４８】各注射からおよそ５日後に得た試料による、投与前及び５、１２、１９及び２６日に測定された、個々のサルのＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）レベルを示すプロットである。
【図４９】低、中及び高用量のそれぞれの投与後に行われた３回のＯＧＴＴから測定されたＦＧＦ２１及びＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）レベルの平均濃度を示すプロットである；左下がり斜線のバーは低用量でのＯＧＴＴ３に対応し、黒のバーは中程度の用量でのＯＧＴＴ４に対応し、そして白いバーは高用量でのＯＧＴＴ５に対応する。
【図５０】Ｆｃ―（Ｇ４Ｓ）３―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）融合タンパク質（配列番号４７）のアミノ酸配列の図面である；ＩｇＧ１  Ｆｃ残基（配列番号１１）は太字体であり、（Ｇ４Ｓ）３のリンカー（配列番号３１）は斜体活字であり、そして、ＦＧＦ２１配列（配列番号３９）における点変異は太字体である。
【図５１】Ｅｒｋ―ルシフェラーゼ分析において試験された化合物の用量反応を示す図である；Ｆｃ―（Ｇ４Ｓ）３―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号５７）、野生型ＦＧＦ２１、及び野生型ＦＧＦ２１を試験した。
【図５２】ヒト（右）及びｃｙｎｏ−Ｋｌｏｔｈｏ（左）に対する、Ｆｃ―（Ｇ４Ｓ）３―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）及びＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）のＢｉａｃｏｒｅ溶解平衡結合アッセイからの結果を示すプロットである。
【図５３Ａ】単回投与後のｄｂ／ｄｂマウスにおけるＦｃ―（Ｇ４Ｓ）３―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）の用量反応を示す一対のプロットである；図５３Ａは、ビヒクル又はＦｃ―（Ｇ４Ｓ）３―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）注射後の様々な時点におけるｄｂ／ｄｂマウスの血糖値を示しており、一方、図５３Ｂは、ｄｂ／ｄｂマウスへの単回注射後の体重に対するＦｃ―（Ｇ４Ｓ）３―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）の効果を示す。
【図５３Ｂ】単回投与後のｄｂ／ｄｂマウスにおけるＦｃ―（Ｇ４Ｓ）３―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）の用量反応を示す一対のプロットである；図５３Ａは、ビヒクル又はＦｃ―（Ｇ４Ｓ）３―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）注射後の様々な時点におけるｄｂ／ｄｂマウスの血糖値を示しており、一方、図５３Ｂは、ｄｂ／ｄｂマウスへの単回注射後の体重に対するＦｃ―（Ｇ４Ｓ）３―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）の効果を示す。
【図５４】糖尿病モデルマウス（ＤＩＯマウス）におけるＦｃ―（Ｇ４Ｓ）３―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）及びＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）の投与頻度試験を図示する概略図である。
【図５５】異なる投与頻度で、ビヒクル、Ｆｃ―（Ｇ４Ｓ）３―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）又はＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）で処置したマウスのＧＴＴプロファイルを示すプロットである。
【図５６】ビヒクル、Ｆｃ―（Ｇ４Ｓ）３―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）又はＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）で処置したマウスにおけるベースライン（０日目）からの体重の変化を示すプロットである。
【図５７】ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号３７）ＦＧＦ２１変異体を含むヒドロゲルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験の結果を示すプロットである。
【図５８】様々なヒドロゲル製剤の投与による８週齢のｄｂ／ｄｂマウスの血糖値に関する効果を示すプロットである。
【図５９】様々なヒドロゲル製剤の投与による８週齢のｄｂ／ｄｂマウスの血糖値に関する効果を示すプロットである。
【図６０】様々なヒドロゲル製剤の投与による８週齢のｄｂ／Ｂ６マウスの血糖値に対する効果を示すプロットである；黒丸はヒドロゲル対照を投与したマウスを示しており、黒四角は１０ｍｇ／ｋｇでヒドロゲル中ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号３７）を投与したマウスを示しており、黒三角は３０ｍｇ／ｋｇでヒドロゲル中ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）を投与したマウスを表しており、そして、逆三角形はＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号５７）だけを投与したマウスを示す。
【図６１】様々なヒドロゲル製剤の投与による８週齢のｄｂ／Ｂ６マウスの血糖値の変化％を示すプロットである；黒丸はヒドロゲル対照を投与したマウスを示しており、黒四角は１０ｍｇ／ｋｇでヒドロゲル中ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号３７）を投与したマウスを示しており、黒三角は３０ｍｇ／ｋｇでヒドロゲル中ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）を投与したマウスを表しており、そして、逆三角形はＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号５７）だけを投与したマウスを示す。
【図６２】様々なヒドロゲル製剤の投与による８週齢のｄｂ／Ｂ６マウスの体重に対する効果を示すプロットである。黒丸はヒドロゲル対照を投与したマウスを示しており、黒四角は１０ｍｇ／ｋｇでヒドロゲル中ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号３７）を投与したマウスを示しており、黒三角は３０ｍｇ／ｋｇでヒドロゲル中ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）を投与したマウスを表しており、そして、逆三角形はＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号５７）だけを投与したマウスを示す。
【図６３】様々なヒドロゲル製剤の投与による８週齢のｄｂ／Ｂ６マウスの体重の変化％を示すプロットである。黒丸はヒドロゲル対照を投与したマウスを示しており、黒四角は１０ｍｇ／ｋｇでヒドロゲル中ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号３７）を投与したマウスを示しており、黒三角は３０ｍｇ／ｋｇでヒドロゲル中ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）を投与したマウスを表しており、そして、逆三角形はＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号５７）だけを投与したマウスを示す。
【図６４】耐糖能異常（ＩＧＴ）のカニクイザルで行った９週間の用量漸増実験に関する研究計画を図示するダイアグラムである。
【図６５】試験したＩＧＴカニクイザルの午前食餌食物摂取に対する、ビヒクル、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）及びＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ，Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）の効果を示すプロットである。
【図６６】試験したＩＧＴカニクイザルの果物摂取に対する、ビヒクル、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）及びＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ，Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）の効果を示すプロットである。
【図６７】試験したＩＧＴカニクイザルの午後食餌食物摂取に関する、ビヒクル、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）及びＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ，Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）の効果を示すプロットである。
【図６８】試験したＩＧＴカニクイザルの体重に対する、ビヒクル、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）及びＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ，Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）の効果を示すプロットである。
【図６９】試験したＩＧＴカニクイザルの肥満度指数に対する、ビヒクル、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）及びＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ，Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）の効果を示すプロットである。
【図７０】試験したＩＧＴカニクイザルの皮下脂肪厚に対する、ビヒクル、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）及びＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ，Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）の効果を示すプロットである。
【図７１】試験したＩＧＴカニクイザルの腹囲に対する、ビヒクル、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）及びＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ，Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）の効果を示すプロットである。
【図７２】試験したＩＧＴカニクイザルの血漿グルコース値に対する、ビヒクル、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）及びＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ，Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）の効果を示すプロットである。
【図７３】試験したＩＧＴカニクイザルの耐糖能に対する、ビヒクル、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）及びＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ，Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）の効果を示すプロットである。
【図７４】試験したＩＧＴカニクイザルの血漿トリグリセリド値に対する、ビヒクル、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）及びＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ，Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）の効果を示すプロットである。
【図７５】試験したＩＧＴカニクイザルの血漿総コレステロール値に対する、ビヒクル、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）及びＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ，Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）の効果を示すプロットである。
【図７６】試験したＩＧＴカニクイザルの血漿ＨＤＬコレステロール値に対する、ビヒクル、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）及びＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ，Ａ１８０Ｅ）（配列番号４７）の効果を示すプロットである。
【図７７】１６８時間にわたる様々な時点でのＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（左のパネル、配列番号４３）及びＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ，Ａ１８０Ｅ）（右のパネル、配列番号５７）における、観察された変化を示す一連のＭＡＬＤＩ質量分析トレースである。
【図７８】Ａｓｐ―Ｎ消化後にＭＲＭ  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析した、Ｆｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）及びＦｃ―（Ｌ１５）―ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）の両方から誘導された総Ｃ末端ペプチド断片における全長Ｃ末端ペプチドの相対存在量（％）を示すプロットである。
【図７９】マウスに静脈注射した後２４０時間にわたって、無傷全長のＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）及びＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ，Ｐ１７１Ｇ，Ａ１８０Ｅ）（配列番号５７）の血漿濃度に関してＥＬＩＳＡアッセイした結果を示すプロットである。
【図８０】陰性対照であるヒトＦＧＦ２１（配列番号４）、及びＦＧＦ２１グリコシル化変異体ＦＧＦ２１（Ｙ１７９Ｎ，Ｓ１８１Ｔ）（配列番号１６１）、ＦＧＦ２１  Ｙ１７９Ｎ（配列番号１６３）及びＦＧＦ２１  Ｐ１２４Ｓ（配列番号１６５）に関して行ったＥＬＫ−ルシフェラーゼ活性アッセイの結果を示すプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書で開示される方法及び標準的な分子生物学的方法を用いて、半減期延長及び／又は凝集低下などの特性が強化されているヒトＦＧＦ２１タンパク質を調製することができる。任意には、野生型ＦＧＦ２１配列のＮ末端又はＣ末端に抗体又はその一部を融合させることにより、半減期を更に延長させることができる。タンパク質にアミノ酸置換を導入することにより、野生型ＦＧＦ２１タンパク質の半減期を更に延長させるか又は凝集を低下させることも可能である。このような修飾タンパク質は、本明細書で、変異体又はＦＧＦ２１変異体と呼ばれ、本発明の実施態様を形成する。
【００１４】
実施例におけるものを含む、本明細書で使用される組み換え核酸法は、一般的に、ＳａｍｂｒｏｏｋらによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）又はＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．及びＷｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  １９９４）（両方ともあらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。）に記載されているものである。
【００１５】
１．一般的定義
「単離核酸分子」という用語は、（１）全体的な核酸が起源細胞から単離される際に、一緒に天然に見出される、タンパク質、脂質、炭水化物又は他の物質の少なくとも約５０％から分離されているか、（２）「単離核酸分子」が天然で連結されるポリヌクレオチドのすべて又は一部に連結されていないか、（３）それが天然では連結されないポリヌクレオチドに操作可能に連結されているか、又は（４）より大きいポリヌクレオチド配列の一部としては天然に生じない、核酸分子を指す。好ましくは、単離核酸分子は、あらゆる他の夾雑核酸分子、又は、ポリペプチド産生若しくはその治療、診断、予防若しくは研究用途でのその使用を妨害する、その天然の環境で見出される他の夾雑物を実質的に含まない。
【００１６】
「ベクター」という用語は、宿主細胞にコード情報を移すために使用される何らかの分子（例えば、核酸、プラスミド又はウイルス）を指すために使用される。
【００１７】
「発現ベクター」という用語は、宿主細胞の形質転換に適切であり、挿入された異種核酸配列の発現を指図及び／又は制御する核酸配列を含むベクターを指す。発現としては、遺伝子移入、翻訳、及びＲＮＡスプライシング（イントロンが存在する場合）などのプロセスが挙げられるが、それらに限定されない。
【００１８】
「操作可能に連結される」という用語は、フランキング配列の配置であって、そのように記載されるフランキング配列がそれらの通常の機能を発揮するように構成されるか又は組み立てられるを指すために本明細書で使用される。従って、コード配列に操作可能に連結されるフランキング配列は、コード配列の、複製、遺伝子移入及び／又は翻訳をもたらすことが可能であり得る。例えば、コード配列は、プロモーターがコード配列の遺伝子移入を指図できる場合、プロモーターに操作可能に連結される。フランキング配列は、それが正確に機能する限り、コード配列に隣接している必要はない。従って、例えば、介在する、非翻訳であるが転写される配列がプロモーター配列とコード配列との間に存在することができ、それでもなお、プロモーター配列は、コード配列に「操作可能に連結される」とみなすことができる。
【００１９】
「宿主細胞」という用語は、核酸配列で形質転換されているか又は核酸配列（例えば、本明細で提供される核酸）で形質転換することができ、次いで、対象とする選択された遺伝子を発現させることができる、細胞を指すために使用される。この用語には、その子孫が形態的に又は遺伝子構成について元の親と同一であるにしてもないにしても、選択された遺伝子が存在する限り、親細胞の子孫が含まれる。
【００２０】
「単離ポリペプチド」という用語は、（１）起源細胞から単離される際に、それが天然に一緒に見出される、ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物又は他の物質の少なくとも約５０％から分離されているか、（２）「単離ポリペプチド」が天然で連結されるポリペプチドのすべて又は一部に（共有又は非共有結合により）連結されていないか、（３）天然では連結されないポリペプチドに（共有又は非共有結合により）操作可能に連結されているか又は（４）天然では生じない、ポリペプチドを指す。好ましくは、本単離ポリペプチドは、実質的に、あらゆる他の夾雑ポリペプチド又は、その治療、診断、予防又は研究での使用を妨害する、その天然の環境で見出される他の夾雑物を含まない。
【００２１】
「天然の」という用語は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などの生体物質と関連して使用される場合、天然で見出され、人により操作されていない物質を指す。同様に、「非天然の」とは、本明細書中で使用される場合、天然で見出されないか又は人により構造的に修飾若しくは合成された物質を指す。ヌクレオチドと関連して使用される場合、「天然の」という用語は、塩基アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ）を指す。アミノ酸と関連して使用される場合、「天然の」という用語は、２０個のアミノ酸、すなわちアラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、及びチロシン（Ｙ）を指す。
【００２２】
「ＦＧＦ２１ポリペプチド」という用語は、ヒトにおいて発現される天然の野生型ポリペプチドを指す。この開示の目的のために、「ＦＧＦ２１ポリペプチド」という用語は、何らかの全長ＦＧＦ２１ポリペプチド、例えば、配列番号２（２０９個のアミノ酸残基からなり、配列番号１及び５それぞれのヌクレオチド配列によりコードされる）；ポリペプチドの何らかの成熟型、例えば、配列番号４及び８（１８１個のアミノ酸残基から成り、配列番号３及び７のヌクレオチド配列によりコードされ、全長ＦＧＦ２１ポリペプチドのアミノ末端（即ち、シグナルペプチドを構成する）の２８個のアミノ酸残基が除去されている）を指すために交換可能に使用できる。全長及び成熟型ＦＧＦ２１ポリペプチドは、アミノ末端メチオニン残基を含むことができるが、含む必要はなく、前記アミノ末端メチオニン残基は、操作によって、又は、細菌発現プロセスの結果として導入し得る。
【００２３】
「ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体」及び「ＦＧＦ２１変異体」という用語は、同義で使用することができ、そして、天然のＦＧＦ２１アミノ酸配列（例えば、配列番号２、４、６、又は８）が修飾されている、ＦＧＦ２１ポリペプチドを指す。このような修飾としては、非天然アミノ酸及び非天然アミノ酸類似体による置換を含む１以上のアミノ酸置換、そして短縮が挙げられるが、それらに限定されない。従って、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体には、限定されないが、本明細書に記載のような、部位特異的ＦＧＦ２１変異体、切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチド、タンパク質分解耐性ＦＧＦ２１変異体、凝集性低下ＦＧＦ２１変異体、ＦＧＦ２１組み合わせ変異体及びＦＧＦ２１融合タンパク質が含まれる。本発明のＦＧＦ２１変異体の具体的な短縮及びアミノ酸置換を識別するために、短縮されるか又は変異されたアミノ酸残基の付番は、成熟型１８１残基ＦＧＦ２１ポリペプチドのものに対応する。ＦＧＦ２１変異体は、アミノ末端メチオニンを含むことができるが、含む必要はなく、前記アミノ末端メチオニンは、操作によって、又は、細菌発現プロセスの結果として導入し得る。本発明の他の実施態様において、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体は、変異体ＦＧＦ２１のアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を含むが、この場合、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体に対して所望の特性、例えば、タンパク質分解耐性、半減期延長又は凝集性低下特性及びそれらの組み合わせを付与する特異的な残基は更に修飾されていない。言い換えると、タンパク質分解耐性、凝集性低下又は他の特性もたらすために修飾されたＦＧＦ２１変異配列における残基を除き、ＦＧＦ２１変異配列中のすべての他のアミノ酸残基の約１５％が修飾され得る。例えば、ＦＧＦ２１変異体であるＱ１７３Ｅにおいて、位置１７３のグルタミンに対して置換されたグルタミン酸残基を除き、全アミノ酸残基の最大で１５％が修飾され得る。更に他の実施態様では、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体は、変異体ＦＧＦ２１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％又は約９５、９６、９７、９８又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むが、この場合、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体のタンパク質分解耐性又は凝集性低下特性をもたらす特異的な残基は更に修飾されていない。このようなＦＧＦ２１ポリペプチド変異体は、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの少なくとも１つの活性を保持する。
【００２４】
本発明はまた、変異体ＦＧＦ２１のアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であるアミノ酸配列を含むＦＧＦ２１ポリペプチド変異体をコードするが、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体に対して所望の特性、例えば、タンパク質分解耐性、半減期延長又は凝集性低下特性及びそれらの組み合わせを付与する特異的な残基は、更に修飾されていない核酸分子も包含する。
【００２５】
言い換えると、タンパク質分解耐性、凝集性低下又は他の特性もたらすために修飾されたＦＧＦ２１変異体配列における残基を除き、ＦＧＦ２１変異体配列中のすべての他のアミノ酸残基の約１５％が修飾され得る。例えば、ＦＧＦ２１変異体であるＱ１７３Ｅにおいて、位置１７３のグルタミンに対して置換されたグルタミン酸残基を除き、全アミノ酸残基の最大で１５％が修飾され得る。本発明は、更に、ＦＧＦ２１変異体をコードするヌクレオチド配列と少なくとも約９０％又は約９５、９６、９７、９８又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含むが、コードされるＦＧＦ２１ポリペプチド変異体のタンパク質分解耐性又は凝集性低下特性をもたらすアミノ酸残基をコードするヌクレオチドは更に修飾されていない、核酸分子を包含する。前記核酸分子は、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの少なくとも１つの活性を保持するＦＧＦ２１変異ポリペプチドをコードする。
【００２６】
「生物学的活性のあるＦＧＦ２１ポリペプチド変異体」という用語は、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体に導入された修飾のタイプ又は数に関係なく、血糖、インスリン、トリグリセリド、又はコレステロールを低下させる能力；体重を減少させる能力；及び耐糖能、エネルギー消費、又はインスリン感受性を向上させる能力などのような野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの活性を保持する本明細書記載のあらゆるＦＧＦ２１ポリペプチド変異体を指す。野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドと比較して、ＦＧＦ２１活性のレベルがある程度低下したＦＧＦ２１ポリペプチド変異体は、それでもなお、生物学的活性のあるＦＧＦ２１ポリペプチド変異体とみなすことができる。
【００２７】
「有効量」及び「治療的有効量」という用語はそれぞれ、血糖、インスリン、トリグリセリド又はコレステロールを低下させる能力；体重を減少させる能力；及び耐糖能、エネルギー消費又はインスリン感受性を向上させる能力などのような野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの１つ以上の生物学的活性の観察可能なレベルを維持するために使用されるＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の量を指す。
【００２８】
「医薬的に許容可能な担体」又は「生理学的に許容可能な担体」とは、本明細書で使用される場合、ヒト被験者又は非ヒト被験者の身体中へのＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の送達を遂行又は促進するのに適する１種以上の製剤用薬剤を指す。前記用語は、生理学的に適合性である、任意の及びすべての溶媒、分散媒、剤皮、抗バクテリア剤及び抗菌剤を包む。薬学的に許容可能な担体としては、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ブドウ糖、グリセリン、及びエタノールなど、ならびにそれらの組み合わせのうちの１つ以上が挙げられる。場合によっては、医薬組成物中に、等張剤、例えば糖質、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の貯蔵寿命又は効果を向上させる、薬学的に許容可能な物質、例えば湿潤剤又は補助剤、例えば湿潤剤又は乳化剤、防腐剤又は緩衝剤は、担体として作用することもでき、又は担体の成分を形成することもできる。
【００２９】
「抗原」という用語は、抗体により結合可能であり、更に、抗原のエピトープに結合可能である抗体を作製するために動物において使用可能である、分子又は分子の一部を指す。抗原は、１つ以上のエピトープを有し得る。
【００３０】
「ネイティブＦｃ」という用語は、単量体であれ、マルチマー形態であれ、全抗体の消化の結果得られるか又は他の手段により作製される非抗原結合断片の配列を含む、分子又は配列を指し、ヒンジ領域を含むことができる。ネイティブＦｃの元の免疫グロブリン源は、好ましくは、ヒト起源のものであり、何らかの免疫グロブリンであり得るが、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２が好ましい。ＩｇＧ４を使用することもできる。ネイティブＦｃ分子は、共有（即ちジスルフィド結合）及び非共有結合により二量体又はマルチマー形態に連結できる単量体ポリペプチドから構成される。ネイティブＦｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ）又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＧＡ２）に依存して、１から４の範囲である。ネイティブＦｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化の結果得られるジスルフィド結合二量体である（Ｅｌｌｉｓｏｎら、１９８２、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：４０７１−９）。「ネイティブＦｃ」という用語は、本明細書中で使用される場合、単量体、二量体及びマルチマー形態に関する総称である。Ｆｃポリペプチド配列の例は、配列番号１１で提示され、そしてそれは、ヒトＩｇＧ１分子から誘導される。ネイティブＦｃは、アミノ末端メチオニンを含むことができるが、含む必要はなく、アミノ末端メチオニンは、操作によって、又は、細菌発現プロセスの結果として導入し得る；そのようなＦｃ分子は、なお「ネイティブＦｃ」分子であると考えられる。
【００３１】
「Ｆｃ変異体」という用語は、ネイティブＦｃから修飾されるが、依然としてサルベージ受容体、ＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）に対する結合部位を含む分子又は配列を指す。国際公開第ＷＯ９７／３４６３１号及び第ＷＯ９６／３２４７８号は、代表的なＦｃ変異体ならびにサルベージ受容体との相互作用を記載しており、参照により本明細書によって組み込まれる。従って、「Ｆｃ変異体」という用語は、非ヒトネイティブＦｃからヒト化された分子又は配列を含むことができる。更に、ネイティブＦｃは、本発明のＦＧＦ２１変異体の融合分子に必要ではない構造的特性又は生物学的活性をもたらす故に除去され得る領域を含む。従って、「Ｆｃ変異体」という用語は、１以上のネイティブＦｃ部位又は残基を欠くか又は１以上のＦｃ部位又は残基が修飾されており、（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択される宿主細胞との不適合性、（３）選択される宿主細胞での発現時のＮ末端の不均一性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合又は（７）抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）に影響を与えるか又はこれらに関与する、分子又は配列を含む。Ｆｃ変異体を、以下で更に説明する。Ｆｃ変異体は、アミノ末端メチオニンを含むことができるが、含む必要はなく、アミノ末端メチオニンは、操作によって、又は、細菌発現プロセスの結果として導入し得る；前記Ｆｃ分子は、なお「Ｆｃ変異体」分子であると考えられる。
【００３２】
「Ｆｃドメイン」という用語は、上で定義したネイティブＦｃ及びＦｃ変異体及び配列を包含する。Ｆｃ変異体及びネイティブＦｃ分子と同様に、「Ｆｃドメイン」という用語は、全抗体から消化されたものであれ又は他の手段により作製されたものであれ、単量体又はマルチマー形態の分子を含む。本発明のいくつかの実施態様では、Ｆｃドメインは、例えばＦｃドメインとＦＧＦ２１配列との間の共有結合を介して、ＦＧＦ２１又はＦＧＦ２１変異体（ＦＧＦ２１の切頭化又はＦＧＦ２１変異体を含む。）に融合され得る。このような融合タンパク質は、Ｆｃドメインの結合を介してマルチマーを形成することができ、これらの融合タンパク質及びそれらのマルチマーの両者とも本発明の態様である。Ｆｃドメインは、アミノ末端メチオニンを含むことができるが、含む必要はなく、アミノ末端メチオニンは、操作によって、又は、細菌発現プロセスの結果として導入し得る。
【００３３】
２．  ＦＧＦ２１変異体
【００３４】
「ＦＧＦ２１変異体」という用語は、天然のＦＧＦ２１ポリペプチド配列のアミノ酸配列（例えば、配列番号２、４、６または８）と1つ以上のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有するＦＧＦ２１変異ポリペプチドを指す。ＦＧＦ２１変異体は、ＦＧＦ２１ポリペプチドの特定の位置に、保存的または非保存的な１つ以上のアミノ酸置換を導入することにより、ならびに天然または非天然アミノ酸を用いて、生成され得る。
【００３５】
「保存アミノ酸置換」は、その位置のアミノ酸残基の極性または電荷にほとんどまたは全く影響を及ぼさないような、非ネイティブ残基（即ち、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド配列の所定の位置で見出されない残基）でのネイティブアミノ酸残基（即ち、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド配列の所定の位置で見出される残基）の置換を含み得る。保存的アミノ酸置換は、生体系での合成によるものではなくむしろ化学的ペプチド合成により典型的には組み入れられる非天然アミノ酸残基も包含する。これらは、ペプチド模倣物およびアミノ酸部分のその他の反転型（ｒｅｖｅｒｓｅｄ  ｆｏｒｍ）または逆転型（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｆｏｒｍ）を含む。
【００３６】
天然の残基は、共通の側鎖の特性に基づきクラスに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００３７】
保存的置換には、これらのクラスのうち１つのメンバーを、同じクラスの別のメンバーに交換することが含まれ得る。非保存置換には、これらのクラスのうち１つのメンバーを、別のクラスからのメンバーに交換することが含まれ得る。
【００３８】
所望のアミノ酸置換（保存的であるかまたは非保存的であるか）は、そのような置換が所望される時に当業者により決定され得る。アミノ酸置換の代表的（であるが限定的でない）一覧を表１で示す。
【表１】
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【００３９】
３．切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチド
【００４０】
本発明のある実施形態は、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドの切頭化型に関する。本発明のこの実施形態は、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドの非切頭化型に対して同様であり、いくつかの例においてはそれを上回る、活性を提供することが可能である切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドを特定するための取り組みから得られた。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、「切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチド」という用語は、アミノ酸残基がＦＧＦ２１ポリペプチドのアミノ末端（またはＮ末端）から除去されているか、アミノ酸残基がＦＧＦ２１ポリペプチドのカルボキシル末端（またはＣ末端）から除去されているか、あるいはアミノ酸残基がＦＧＦ２１ポリペプチドのアミノ末端およびカルボキシル末端の両方から除去されている、ＦＧＦ２１ポリペプチドを指す。本明細書中の実施例３および６に記載のように、本明細書中で開示される種々の切頭化を調製した。
【００４２】
実施例４に記載のようなin  vitroＥＬＫ−ルシフェラーゼアッセイを用いて、Ｎ末端切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＣ末端切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドの活性を検定することができる。切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドの活性を調べるために使用することができるin  vitroアッセイの具体的な詳細は実施例４で見出すことができる。
【００４３】
本発明の切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドの活性は、実施例５および７で示されるようなin  vivoアッセイ（例えば、ｄｂ／ｄｂマウスまたはｏｂ／ｏｂマウス）で評価することもできる。一般に、切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドのin  vivo活性を評価するために、試験動物にその切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドを腹腔内投与し得る。所望のインキュベーション時間（例えば１時間以上）後、血液試料を採取し、血糖値を測定することができる。切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドの活性を調べるために使用することができるin  vivoアッセイの具体的な詳細は、実施例５および７で見出すことができる。
【００４４】
ａ．  Ｎ末端切頭化
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態では、Ｎ末端切頭化は、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドのＮ末端からの１、２、３、４、５、６、７または８個のアミノ酸残基を含む。例えば、実施例５および図３で示されるように、９アミノ酸残基未満のＮ末端切頭化を有する切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドは、個体における血糖を低下する成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドの能力を保持する。したがって、特定の実施形態において、本発明は、１、２、３、４、５、６、７または８個のアミノ酸残基のＮ末端切頭化を有する成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の切頭化型を包含する。
【００４６】
ｂ．  Ｃ末端切頭化
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態では、Ｃ末端切頭化は、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドのＣ末端からの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のアミノ酸残基を含む。例えば、実施例４および図１Ｂで示されるように、１３アミノ酸残基未満のＣ末端切頭化を有する切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドは、in  vitroＥＬＫ−ルシフェラーゼアッセイにおいて、野生型ＦＧＦ２１の効力の少なくとも５０％の効力を示し、このことから、これらのＦＧＦ２１変異体が、個体における血糖を低下する成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドの能力を保持することが分かる。したがって、特定の実施形態において、本発明は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のアミノ酸残基のＣ末端切頭化を有する成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の切頭化型を包含する。
【００４８】
ｃ．Ｎ末端およびＣ末端切頭化
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態では、切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドは、Ｎ末端およびＣ末端切頭化の組み合わせを有し得る。Ｎ末端およびＣ末端切頭化の組み合わせを有する切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端切頭化の何れかのみを有する対応する切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドの活性を共有する。言い換えると、９アミノ酸残基未満のＮ末端切頭化および１３アミノ酸残基未満のＣ末端切頭化の両方を有する切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドは、９アミノ酸残基未満のＮ末端切頭化を有する切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドまたは１３アミノ酸残基未満のＣ末端切頭化を有する切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドと同様であるかまたはより高い生物学的活性、例えば血糖降下活性を保有する。したがって、特定の実施形態において、本発明は、１、２、３、４、５、６、７または８個のアミノ酸残基のＮ末端切頭化および１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のアミノ酸残基のＣ末端切頭化の両方を有する、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の切頭化型を包含する。
【００５０】
本発明の全てのＦＧＦ２１変異体と同様に、切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体は、任意に、アミノ末端メチオニン残基を含み得るが、これは、定方向変異によりまたは細菌発現プロセスの結果として導入され得る。
【００５１】
本発明の切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドは、実施例３および６に記載のように調製され得る。標準的な分子生物学的技術に精通している当業者は、その知識を本開示と組み合わせて用いて、本発明の切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドを作製し、使用することができる。標準的技術は、組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のために使用することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、上記（これは、あらゆる目的のために参照により本明細書中に組み込まれる）を参照。酵素反応および精製技術は、製造者の説明書に従い、当技術分野で一般的に遂行されるようにまたは本明細書中に記載のように行われ得る。別段の定義がない限り、本明細書中に記載の、分析化学、合成有機化学ならびに医学および薬学化学に関連して利用される命名法およびこれらの実験室での手順および技術は、周知のものであり、当技術分野で一般的に使用される。化学合成；化学分析；医薬調製、製剤および送達；ならびに患者の治療に対して標準的技術を使用することができる。
【００５２】
本発明の切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドはまた、別の物質に融合させることができ、これは切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドにさらなる特性を付与し得る。本発明の一実施形態において、切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドをＦｃ配列に融合させることができる。このような融合は、既知の分子生物学的方法および／または本明細書中で提供される指針を用いて遂行され得る。このような融合ポリペプチドの利点、ならびにこのような融合ポリペプチドを作製するための方法を本明細書中でさらに詳しく考察する。
【００５３】
４．  タンパク質分解耐性ＦＧＦ２１変異体
【００５４】
実施例８に記載のように、成熟ＦＧＦ２１は、in  vivo分解を受けることが分かり、これは、最終的には、タンパク質分解性攻撃から生じることが突き止められた。成熟ＦＧＦ２１のin  vivo分解により、有効半減期が短縮されることが分かり、これは、分子の治療可能性に悪影響を与え得る。したがって、タンパク質分解に耐性を示すＦＧＦ２１変異体を特定するために指向性実験を実施した。この実験の結果として、特にタンパク質分解を受けやすいと判定された成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドにおける部位には、位置４−５、２０−２１、１５１−１５２、１７１−１７２および１７８−１８１のアミノ酸残基間のペプチド結合が含まれる。
【００５５】
タンパク質の活性に許容できない程度まで影響を及ぼすことなく、観察されるタンパク質分解効果を消去する特定の置換を特定するために、幅広いが集中的であり指向性実験を実施した。表８および１１は、調製し、試験した変異体のいくつかに脚光を当てる。例えば実施例１３および１４に記載のように、全てのＦＧＦ２１変異体が、理想的プロファイルを示した訳ではなく；いくつかの変異体は、タンパク質分解耐性をもたらしたが、しかしＦＧＦ２１活性を損減した。その他の変異はＦＧＦ２１活性を保持したが、タンパク質分解耐性を付与しなかった。例えば、ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｇを含むいくつかの変異体は、野生型ＦＧＦ２１と同レベルの活性を保持する一方で、タンパク質分解性分解に対する耐性も示した。
【００５６】
所望のタンパク質分解耐性ＦＧＦ２１変異体を特定するための一選択基準は、ＦＧＦ２１変異の活性が、基本的に野生型ＦＧＦ２１の活性と同じであるかまたはそれより大きいということであった。したがって、本発明の別の実施形態は、タンパク質分解に耐性があり、基本的に野生型ＦＧＦ２１と同じであるかまたはそれより大きい活性を依然として保持する、ＦＧＦ２１変異体に関する。場合によってはあまり所望されないが、タンパク質分解に耐性があるが、ある程度の活性低下を示すＦＧＦ２１変異体は、本発明の別の実施形態を形成する。場合により、タンパク質分解の程度を維持することが所望され得て、結果として、ある程度のタンパク質分解が起こるＦＧＦ２１変異体も、本発明の別の実施形態を形成する。
【００５７】
本明細書中で提供される全てのＦＧＦ２１変異体と同様に、本発明のタンパク質分解耐性のあるＦＧＦ２１変異体は、本明細書中に記載のように調製することができる。当業者、例えば、標準的分子生物学技術に精通している者は、本開示と組み合わせて、本発明のタンパク質分解耐性のあるＦＧＦ２１変異体を作製し、使用するためにその知識を使用することができる。標準的技術を、組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のために使用することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、上記を参照（これは、あらゆる目的に対して参照により本明細書中に組み込まれる）。酵素反応および精製技術は、当技術分野で一般に遂行されるようにまたは本明細書中に記載のように、製造者の説明書に従い行われ得る。具体的な定義がない限り、本明細書中に記載の、分析化学、合成有機化学および医薬化学と関連して利用される命名法およびこれらの実験室での手順および技術は、周知であり、当技術分野で一般的に使用されるものである。化学合成；化学分析；医薬調製、製剤および送達；および患者の治療に対して標準的技術を使用することができる。
【００５８】
本発明のタンパク質分解耐性のＦＧＦ２１変異体は、別の物質と融合され得る、それはタンパク質分解耐性のあるＦＧＦ２１変異体にさらなる特性をもたらし得る。本発明の一実施形態において、タンパク質分解耐性のあるＦＧＦ２１変異体は、ＩｇＧ  Ｆｃ配列、例えば、配列番号１１と融合され得る。このような融合は、既知の分子生物学的方法および／または本明細書中で提供される指針を用いて遂行され得る。このような融合ポリペプチドの利点、ならびにこのような融合ポリペプチドを作製するための方法は既知であり、本明細書中でさらに詳しく考察する。
【００５９】
５．  凝集性低減ＦＧＦ２１変異体
【００６０】
実施例１５に記載のように、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドの１つの特性は、その凝集傾向である。約５ｍｇ／ｍＬを超える濃度では、凝集速度は室温において高い。本明細書中で示され、記載されるように、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドに関する凝集速度は、濃度および温度の両方に依存する。
【００６１】
治療製剤に関連してなど、これらの濃度で野生型ＦＧＦ２１を用いて作業する場合、凝集が課題であることが見られ得る。したがって、ＦＧＦ２１凝集の低下を示すＦＧＦ２１変異体を特定するために、指向性試験を実施した。次に、結果として得られたＦＧＦ２１変異体を、種々の濃度での凝集傾向について試験した。
【００６２】
野生型ＦＧＦ２１の観察される凝集的影響をなくすかまたは軽減する一方、許容できない程度までタンパク質の活性に影響を与えない特定の置換を特定するために、幅広いが集中的で指向性試験を実施した。適切な凝集性低減変異体を特定するためのアプローチを実施例１５に記載する。表１６は、調製し、試験した変異体のいくつかに脚光を当てる。例えば、実施例１７で記載されるように、ＦＧＦ２１変異体の全てが理想的プロファイルを示した訳ではなかった。ＦＧＦ２１  Ｌ５８Ｅなどのいくつかの変異体は、ＦＧＦ２１活性を低下させ、さらに試験しなかった。ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｅなどのその他の変異体は、ＦＧＦ２１活性を保持したが、凝集特性低下は示さなかった。ＦＧＦ２１  Ｌ９８Ｒなどのいくつかの変異体は、ＦＧＦ２１活性を保持し、また凝集性低減も示した。１つの変異体、ＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋは、驚くべきことに、ＦＧＦ２１活性が向上し、一方で凝集特性低下も示した。
【００６３】
所望の凝集性低減ＦＧＦ２１変異体を特定するためのある選択基準は、ＦＧＦ２１変異体の活性が、基本的に野生型ＦＧＦ２１の活性と同じであるかまたはそれより大きいということであった。したがって、本発明の別の実施形態は、野生型ＦＧＦ２１と同等であるかまたはそれより大きいＦＧＦ２１活性を依然として保持しながら、凝集特性低下を示すＦＧＦ２１変異体に関する。場合によってはあまり所望されないが、凝集特性が低下しているが、ある程度のＦＧＦ２１活性低下を示すＦＧＦ２１変異体は、本発明の別の実施形態を形成する。場合により、凝集度を維持することが所望され得るが、結果として、ある程度の凝集が起こるＦＧＦ２１変異体も、本発明の別の実施形態を形成する。
【００６４】
本明細書中で提供される全てのＦＧＦ２１変異体と同様に、本発明の凝集性低減ＦＧＦ２１変異体は、本明細書中に記載のように調製され得る。標準的分子生物学的技術に精通している当業者は、その知識を本開示と組み合わせて使用して、本発明の凝集性低減ＦＧＦ２１変異体を作製することができる。標準的技術は、組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）に対して使用することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、上記を参照（これは、あらゆる目的に対して参照により本明細書中に組み込まれる）。酵素反応および精製技術は、当技術分野で一般に遂行されるようにまたは本明細書中に記載のように、製造者の説明書に従い行われ得る。具体的な定義がない限り、本明細書中に記載の、分析化学、合成有機化学および医薬化学と関連して利用される命名法およびこれらの実験室での手順および技術は、周知であり、当技術分野で一般的に使用されるものである。標準的技術は、化学合成；化学分析；医薬調製、製剤および送達；および患者の治療に対して使用され得る。
【００６５】
本発明の凝集性低減ＦＧＦ２１変異体は、別の物質に融合され得、それは凝集性低減ＦＧＦ２１変異体にさらなる特性をもたらし得る。本発明のある実施形態において、凝集性低減ＦＧＦ２１変異体は、ＩｇＧ  Ｆｃ配列、例えば、配列番号１１に融合され得る。このような融合は、既知の分子生物学的方法および／または本明細書中で提供される指針を用いて遂行され得る。このような融合ポリペプチドの利点、ならびにこのような融合ポリペプチドを作製するための方法を本明細書中でさらに詳しく考察する。
【００６６】
６．  ＦＧＦ２１組み合わせ変異体
【００６７】
本明細書中に記載のように、野生型ＦＧＦ２１配列は、ＦＧＦ２１が治療用分子として使用される場合、重大な課題をもたらし得るいくつかの特性を有する。これらの課題の中でも、タンパク質の分解に対する感受性および高濃度でのその凝集傾向が挙げられる。これらの各課題を克服するＦＧＦ２１ポリペプチドを特定するための多大な努力の後、野生型ＦＧＦ２１の活性と同等であるかまたはそれより大きい活性レベルを維持しながら、タンパク質分解耐性をもたらすアミノ酸置換および凝集性低減特性をもたらすアミノ酸置換が、単一のポリペプチド配列で付加的または相乗的に組み合わせられ得るか否かを調べるために、指向性試験を実施した。所定のポリペプチドにおける複数の変異の導入は、ときにタンパク質の発現、活性およびその後の製造に悪影響を及ぼし得ることが当技術分野で知られているので、これは相当に困難な課題であった。
【００６８】
驚くべきことに、例えば、実施例１９および２０で示されるように、製薬学的特性が向上したＦＧＦ２１変異体を作製するために、いくつかのＦＧＦ２１変異体の所望の特性が実際に相加的または相乗的に組み合わせられ得ることが分かった。タンパク質分解に対する耐性があるＦＧＦ変異体は、凝集速度が低下しており、これは、本明細書中で開示される野生型ＦＧＦ２１と同等であるかまたはそれより大きい活性を依然として保持する。
【００６９】
所望のＦＧＦ２１組み合わせ変異体を特定するためのある選択基準は、ＦＧＦ２１変異の活性が、野生型ＦＧＦ２１の活性と同等であるかまたはそれより大きいことであった。したがって、本発明の別の実施形態は、タンパク質分解耐性があり、野生型ＦＧＦ２１と同等であるかまたはそれより大きいＦＧＦ２１活性を依然として保持しながら、凝集特性が低下しているＦＧＦ２１変異体に関する。場合によってはあまり所望されないが、タンパク質分解耐性があり、凝集性が低下しているが、ある程度のＦＧＦ２１活性低下を示すＦＧＦ２１変異体は、本発明の別の実施形態を形成する。場合により、タンパク質分解度および／または凝集度を維持することが所望され得るが、結果として、ある程度のタンパク質分解および／または凝集が起こるＦＧＦ２１変異体も、本発明の別の実施形態を形成する。
【００７０】
本発明の全てのＦＧＦ２１変異体と同様に、本発明のＦＧＦ２１組み合わせ変異体は、本明細書中に記載のように調製することができる。標準的分子生物学的技術に精通している当業者は、その知識を本開示と組み合わせて使用して、本発明のＦＧＦ２１組み合わせ変異体を作製し、使用することができる。標準的技術は、組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）に対して使用することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、上記を参照（これは、あらゆる目的に対して参照により本明細書中に組み込まれる。）。酵素反応および精製技術は、当技術分野で一般に遂行されるようにまたは本明細書中に記載のように、製造者の説明書に従い行われ得る。具体的な定義がない限り、本明細書中に記載の、分析化学、合成有機化学および医薬化学と関連して利用される命名法およびこれらの実験室での手順および技術は、周知であり、当技術分野で一般的に使用されるものである。化学合成；化学分析；医薬調製、製剤および送達；および患者の治療に対して標準的技術を使用することができる。
【００７１】
本発明のＦＧＦ２１組み合わせ変異体は、別のものと融合することができ、それはＦＧＦ２１組み合わせ変異体にさらなる特性をもたらし得る。本発明のある実施形態において、ＦＧＦ２１組み合わせ変異体は、ＩｇＧ  Ｆｃ配列、例えば、配列番号１１に融合され得る。このような融合は、既知の分子生物学的方法および／または本明細書中で提供される指針を用いて遂行され得る。このような融合ポリペプチドの利点、ならびにこのような融合ポリペプチドを作製するための方法を本明細書中でさらに詳しく考察する。
【００７２】
７．  ＦＧＦ２１融合タンパク質
【００７３】
本明細書中で使用される場合、「ＦＧＦ２１融合ポリペプチド」または「ＦＧＦ２１融合タンパク質」という用語は、本明細書中に記載の任意のＦＧＦ２１ポリペプチド変異体のＮ末端またはＣ末端での１つ以上のアミノ酸残基（異種タンパク質またはペプチドなど）の融合を指す。
【００７４】
異種ペプチドおよびポリペプチドとしては、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の検出および／または単離を可能にするエピトープ；膜貫通受容体タンパク質またはその一部、例えば、細胞外ドメインまたは膜貫通および細胞内ドメインなど；膜貫通受容体タンパク質に結合するリガンドまたはその一部；触媒的に活性のある酵素またはその一部；オリゴマー化を促進するポリペプチドまたはペプチド、例えばロイシンジッパードメイン；安定性を向上させる、ポリペプチドまたはペプチド、例えば免疫グロブリン定常領域（例えば、Ｆｃドメイン）；ＦＧＦ２１変異体に関して、主に親水性のまたは主に疎水性の融合相手を形成するよう意図される２つ以上（例えば２、５、１０、１５、２０、２５等）の天然または非天然荷電および／または非荷電アミノ酸（例えばセリン、グリシン、グルタミン酸またはアスパラギン酸）の組合せを含む半減期延長配列；機能的または非機能的抗体、あるいはその重鎖または軽鎖；ならびに本発明のＦＧＦ２１ポリペプチド変異体とは異なる、治療活性などの活性を有するポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に融合されたＦＧＦ２１変異体も本発明に包含される。
【００７５】
ＦＧＦ２１融合タンパク質は、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体のＮ末端またはＣ末端の何れかに異種配列を融合することにより作製され得る。本明細書中に記載のように、異種配列は、アミノ酸配列または非アミノ酸含有ポリマーであり得る。異種配列は、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体に直接的に、あるいはリンカーまたはアダプター分子を介して融合され得る。リンカーまたはアダプター分子は、１つ以上のアミノ酸残基（または−ｍｅｒ）、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９残基（または−ｍｅｒ）、好ましくは１０〜５０アミノ酸残基（または−ｍｅｒ）、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０残基（または−ｍｅｒ）、さらに好ましくは１５〜３５アミノ酸残基（または−ｍｅｒ）であり得る。リンカーまたはアダプター分子は、融合部分の分離を可能にするために、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼに対するかまたはプロテアーゼに対する切断部位とともに設計することもできる。
【００７６】
ａ．  Ｆｃ融合物
【００７７】
本発明の一実施形態では、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体は、例えばヒトＩｇＧのＦｃ領域の１つ以上のドメインのようなＦｃドメインと融合される。抗体は、２つの機能的に独立した部分、すなわち抗原を結合する、「Ｆａｂ」として知られる可変ドメイン、ならびに補体活性化および食細胞による攻撃などのエフェクター機能に関与する「Ｆｃ」として知られる定常ドメインを含む。Ｆｃは、血清半減期が長いが、Ｆａｂは短命である（Ｃａｐｏｎら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５２５−３１）。治療用タンパク質と一緒に連結される場合、Ｆｃドメインは、半減期を延長させ得るか、あるいはＦｃ受容体結合、プロテインＡ結合、補体結合およびおそらくは胎盤移行などの機能を組み入れ得る（Ｃａｐｏｎら、１９８９）。
【００７８】
in  vivoでの薬理学的分析から、ヒトＦＧＦ２１の半減期は、急速なクリアランスおよびin  vivoでの分解のためにマウスにおいて約１時間と短いことが示された。したがって、ＦＧＦ２１の半減期を延長させるために、ネイティブＦｃ配列をＦＧＦ２１ポリペプチドのＮまたはＣ末端に融合させた。野生型ＦＧＦ２１へのＦｃ領域の融合、特に野生型ＦＧＦ２１のＮ末端へ融合されるＦｃによって、予想通りに半減期は延長されなかったが、しかし、この観察より、in  vivoでのＦＧＦ２１のタンパク質分解性分解の研究およびこのような分解に耐性があったＦＧＦ２１変異体の特定につながった。このような変異体は、例えば実施例９および１１に記載されており、この半減期は野生型ＦＧＦ２１よりも長い。これらおよびその他のＦＧＦ２１融合タンパク質は、本発明の実施形態を形成する。
【００７９】
本開示全体を通して、Ｆｃ−ＦＧＦ２１は、Ｆｃ配列がＦＧＦ２１のＮ末端に融合されている融合タンパク質を指す。同様に、本開示全体を通して、ＦＧＦ２１−Ｆｃは、Ｆｃ配列がＦＧＦ２１のＣ末端に融合されている融合タンパク質を指す。
【００８０】
結果的に得られるＦＧＦ２１融合タンパク質は、例えば、プロテインＡアフィニティーカラムの使用により、精製することができる。Ｆｃ領域に融合されたペプチドおよびタンパク質は、非融合のものよりもin  vivoでの半減期が実質的に長くなることが分かった。また、Ｆｃ領域への融合により、融合ポリペプチドの二量体化／多量体化が可能となる。Ｆｃ領域は、天然のＦｃ領域であり得るか、あるいは治療的な質、循環時間または凝集低減など、ある種の質を向上させるために変更され得る。
【００８１】
抗体の「Ｆｃ」ドメインとの融合によるタンパク質治療薬の有用な修飾は、国際公開ＷＯ００／０２４７８２（その記載内容は参照により本明細書に組み込まれる）で詳細に考察されている。
【００８２】
ｂ．  融合タンパク質リンカー
【００８３】
本発明の融合タンパク質を形成させる場合、必要ではないが、リンカーを使用することができる。存在する場合、リンカーは主にスペーサーとして使用されるので、リンカーの化学構造は重要ではないことがある。このリンカーは、ペプチド結合により一緒に連結されるアミノ酸から構成され得る。本発明のいくつかの実施形態において、リンカーは、ペプチド結合により連結される１から２０個のアミノ酸から構成され、この場合、このアミノ酸は、２０種類の天然アミノ酸から選択される。種々の実施形態において、１〜２０個のアミノ酸は、グリシン、セリン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミンおよびリシンのアミノ酸から選択される。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシンおよびアラニンのような非立体障害アミノ酸から主に構成される。いくつかの実施形態では、リンカーは、ポリグリシン（例えば（Ｇｌｙ）４（配列番号２９）および（Ｇｌｙ）５（配列番号３０））、ポリアラニン、グリシンおよびアラニンの組み合わせ（例えばポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ））、またはグリシンおよびセリンの組み合わせ（例えばポリ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ））である。その他の適切なリンカーとしては、（Ｇｌｙ）５−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）３−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ（配列番号２８）、（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ（配列番号３１）、（Ｇｌｙ）３−Ｌｙｓ−（Ｇｌｙ）４（配列番号３２）、（Ｇｌｙ）３−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）２（配列番号３３）、（Ｇｌｙ）３−Ｃｙｓ−（Ｇｌｙ）４（配列番号３４）およびＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号３５）が挙げられる。１５個のアミノ酸残基のリンカーが、ＦＧＦ２１融合タンパク質に関して特に良好に役立つことが分かってはいるが、本発明は、あらゆる長さまたは組成のリンカーを意図する。リンカーが、異種配列、例えばＦｃドメインと、ＦＧＦ２１ポリペプチドまたはＦＧＦ２１を連結するために用いられる場合、リンカーは括弧に入れて表される。
【００８４】
本明細書中に記載されるリンカーは典型例であり、それよりかなり長い、およびその他の残基を含むリンカーが本発明により意図される。非ペプチドリンカーもまた、本発明により意図される。例えば、−ＮＨ−（ＣＨ２）Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ここで、ｓ＝２〜２０である）のようなアルキルリンカーが使用され得る。これらのアルキルリンカーは、例えば、低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ６）、低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２またはフェニル（これらに限定されない）を含めた任意の非立体障害基によりさらに置換され得る。典型的な非ペプチドリンカーはポリエチレングリコールリンカーであり、このリンカーの分子量は、１００〜５０００ｋＤ、例えば１００から５００ｋＤである。
【００８５】
８．化学的に修飾されたＦＧＦ２１変異体
【００８６】
本明細書中に記載のＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の化学的修飾形態、例えば本明細書中に記載のＦＧＦ２１の切頭化型は、本明細書中に記載の開示を前提として、当業者により調製され得る。このような化学的修飾ＦＧＦ２１変異体は、ＦＧＦ２１変異体に天然に結合される分子のタイプまたは場所の何れかにおいて化学的修飾ＦＧＦ２１変異体が非修飾ＦＧＦ２１変異体とは異なるように、変更される。化学的修飾ＦＧＦ２１変異体は、１つ以上の天然に結合される化学基の欠失により形成される分子を含み得る。
【００８７】
一実施形態では、本発明のＦＧＦ２１ポリペプチド変異体は、１つ以上のポリマーの共有結合により修飾され得る。例えば、選択されるポリマーは、典型的には、それが結合されるタンパク質が生理的環境のような水性環境中で沈殿しないように、水溶性である。ポリマーの混合物は、適切なポリマーの範囲内に含まれる。好ましくは、最終生成調製物の治療的使用のために、ポリマーは薬学的に許容可能である。本発明のＦＧＦ２１ポリペプチド変異体に結合された非水溶性ポリマーも本発明の態様を形成する。
【００８８】
典型的なポリマーは各々、任意の分子量のものであり得るし、分枝鎖または非分枝鎖型であり得る。ポリマーは各々、典型的には約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａの平均分子量を有する（「約」という用語は、水溶性ポリマーの調製物中で、いくつかの分子が言及された分子量よりも大きく、いくつかの分子はそれより小さいことを示す）。各ポリマーの平均分子量は、好ましくは、約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、さらに好ましくは約１２ｋＤａ〜約４０ｋＤａ、最も好ましくは約２０ｋＤａ〜約３５ｋＤａである。
【００８９】
適切な水溶性ポリマーまたはそれらの混合物としては、Ｎ−結合型またはＯ結合型炭水化物、糖、リン酸塩、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、タンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの形態、例えばモノ−（Ｃ１−Ｃ１０）、アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコール）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン（例えば約６ｋＤの低分子量のデキストラン）、セルロースまたはその他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）およびポリビニルアルコールが挙げられるが、これらに限定されない。共有結合したＦＧＦ２１ポリペプチド変異体マルチマーを調製するために使用することができる二官能性架橋分子も本発明に包含される。ポリシアル酸と共有結合したＦＧＦ２１変異体も本発明に包含される。
【００９０】
本発明のいくつかの実施形態では、ＦＧＦ２１変異体は、１つ以上の水溶性ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリオキシエチレングリコールまたはポリプロピレングリコール（これらに限定されない）を含むように共有結合的にまたは化学的に修飾される。例えば、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号；および第４，１７９，３３７号参照。本発明のいくつかの実施形態では、ＦＧＦ２１変異体は、１つ以上のポリマー、例えばモノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、別の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコールまたはこのようなポリマーの混合物（これらに限定されない）を含む。
【００９１】
本発明のいくつかの実施形態では、ＦＧＦ２１変異体は、ＰＥＧサブユニットによって共有結合により修飾される。いくつかの実施形態では、１つ以上の水溶性ポリマーが、ＦＧＦ２１変異体の１つ以上の特定の位置（例えばＮ末端）に結合される。いくつかの実施形態では、１つ以上の水溶性ポリマーが、ＦＧＦ２１変異体の１つ以上の側鎖に無作為に結合される。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ２１変異体の治療能を改善するために、ＰＥＧが使用される。ある種のこのような方法は、例えば米国特許第６，１３３，４２６号（任意の目的のために参照により本明細書によって組み込まれる）で考察されている。
【００９２】
本発明の実施形態において、ポリマーがＰＥＧである場合、このＰＥＧ基は、任意の好都合の分子量のものであり得るし、線状または分枝鎖であり得る。ＰＥＧ基の平均分子量は、好ましくは約２ｋＤ〜約１００ｋＤａ、さらに好ましくは約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａの範囲、例えば、１０、２０、３０、４０または５０ｋＤａである。ＰＥＧ基は、一般的に、ＦＧＦ２１変異体上の反応基（例えば、アルデヒド、アミノまたはエステル基）に対する、ＰＥＧ部分上の反応基（例えば、アルデヒド、アミノ、チオールまたはエステル基）を介したアシル化または還元的アルキル化により、ＦＧＦ２１変異体と結合される。
【００９３】
本発明のＦＧＦ２１変異体を含めたポリペプチドのＰＥＧ付加は、具体的には、当技術分野で既知のＰＥＧ化反応の何れかを用いて実行され得る。このような反応は、例えば、以下の文献に記載されている：Ｆｒａｎｃｉｓら、１９９２、Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３：４−１０；欧州特許第０  １５４  ３１６号および同第０  ４０１  ３８４号；および米国特許第４，１７９，３３７号。例えば、ＰＥＧ付加は、本明細書中に記載のような反応性ポリエチレングリコール分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）を用いて、アシル化反応またはアルキル化反応により実行され得る。アシル化反応に関しては、選択されるポリマーは、１個の反応性エステル基を有するべきである。還元的アルキル化に関しては、選択ポリマーは、１個の反応性アルデヒド基を有するべきである。反応性アルデヒドは、例えば、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（これは耐水性である）、あるいはモノＣ１−Ｃ１０アルコキシまたはそのアリールオキシ誘導体である（例えば、米国特許第５，２５２，７１４号参照）。
【００９４】
本発明のいくつかの実施形態では、ポリペプチドへのＰＥＧ基の結合のための有用な方策は、溶液中での共役結合の形成を通して、他方のＰＥＧに対して互いに反応性である特別な官能性を各々が有する、ペプチドおよびＰＥＧ部分を組み合わせることを含む。ペプチドは、慣用的固相合成により容易に調製することができる。ペプチドは、特定の部位で適切な官能基で「予め活性化」される。ＰＥＧ部分と反応させる前に、前駆体を精製し、十分に特性評価する。ＰＥＧとのペプチドの結紮は、通常は、水相で行われ、逆相分析的ＨＰＬＣにより容易に監視することができる。ＰＥＧ付加ペプチドは、分取ＨＰＬＣにより容易に精製し、分析的ＨＰＬＣ、アミノ酸分析およびレーザー脱離質量分析により特性評価することができる。
【００９５】
多糖ポリマーは、タンパク質修飾のために使用することができる水溶性ポリマーの別のタイプである。したがって、多糖ポリマーに融合された本発明のＦＧＦ２１変異体は、本発明の実施形態を形成する。デキストランは、α１−６結合により主に連結されるグルコースの個々のサブユニットから構成される多糖ポリマーである。デキストランそれ自体は、多くの分子量範囲で利用可能であり、約１ｋＤ〜約７０ｋＤの分子量で容易に利用可能である。デキストランは、単独で、または別のビヒクル（例えばＦＣ）と組み合わせて、ビヒクルとして用いるのに適した水溶性ポリマーである。例えば、国際公開ＷＯ９６／１１９５３参照。治療用または診断用免疫グロブリンに結合されたデキストランの使用が報告されている。例えば、欧州特許公開第０  ３１５  ４５６（参照により本明細書によって組み込まれる。）参照。本発明は、約１ｋＤ〜約２０ｋＤのデキストランの使用も包含する。
【００９６】
一般に、化学修飾は、活性化ポリマー分子とタンパク質を反応させるために用いられる任意の適切な条件下で行うことができる。化学的修飾ポリペプチドを調製するための方法は、一般的に、（ａ）ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体が１つ以上のポリマー分子に結合されるようになる条件下で、活性化ポリマー分子（例えば、ポリマー分子の反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）とポリペプチドを反応させ、（ｂ）反応産物を得る、段階を含む。最適反応条件は、既知のパラメーターおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、ポリマー分子のタンパク質に対する比が大きいほど、結合されるポリマー分子の割合が高くなる。本発明の一実施形態では、化学的修飾ＦＧＦ２１変異体は、アミノ末端に１個のポリマー分子部分を有し得る（例えば、米国特許第５，２３４，７８４号参照）。
【００９７】
本発明の別の実施形態において、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体をビオチンに化学的にカップリングすることができる。次に、ビオチン／ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体をアビジンに結合させ、その結果として、アビジン、四価アビジン／ビオチン／ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体が得られる。ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体をジニトロフェノール（ＤＮＰ）またはトリニトロフェノール（ＴＮＰ）に共有結合によりカップリングすることもでき、得られた複合体を抗−ＤＮＰまたは抗−ＴＮＰ−ＩｇＭで沈降させ、１０価の１０量体複合体を形成させる。
【００９８】
一般に、本化学的修飾ＦＧＦ２１変異体の投与により改善させるかまたは調整することができる条件には、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体に対して本明細書中に記載される条件が含まれる。しかしながら、本明細書中で開示される化学的修飾ＦＧＦ２１変異体は、非修飾ＦＧＦ２１変異体と比較した場合、さらなる活性を有し得るし、生物活性の増強または低減、あるいはその他の特質（例えば、半減期の短縮または延長）を示し得る。
【００９９】
９．  ＦＧＦ２１変異体の医薬組成物およびその投与
【０１００】
ＦＧＦ２１変異体を含む医薬組成物は本発明の範囲内であり、特性増強を示すいくつかの変異ＦＧＦ２１配列の特定を考慮して、具体的に意図される。このようなＦＧＦ２１変異体医薬組成物は、投与方式との適合性のために選択された薬学的にまたは生理学的に許容可能な製剤用物質と合わせて、治療的有効量のＦＧＦ２１ポリペプチド変異体を含み得る。
【０１０１】
許容可能な製剤用物質は、好ましくは、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して無毒性である。
【０１０２】
本医薬組成物は、例えば、本組成物のｐＨ、浸透圧、粘性、透明度、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解もしくは放出速度、吸着または浸透度を、改変し、維持し、または保存するための製剤用物質を含有し得る。適切な製剤用物質としては、アミノ酸（例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシン）、抗菌剤、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム）、緩衝剤（例えばホウ酸、重炭酸、トリス−ＨＣｌ、クエン酸、リン酸またはその他の有機酸）、増量剤（例えばマンニトールまたはグリシン）、キレート剤（例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、錯化剤（例えばカフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）、充填剤、単糖、二糖およびその他の炭水化物（例えばグルコース、マンノースまたはデキストリン）、タンパク質（例えば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）、着色剤、香味剤および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（例えばポリビニルピロリドン）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（例えばナトリウム）、防腐剤（例えば塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）、溶媒（例えばグリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）、糖アルコール（例えばマンニトールまたはソルビトール）、縣濁剤、界面活性剤または湿潤剤（例えばプルロニック；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート、例えばポリソルベート２０またはポリソルベート８０；トリトン；トロメタミン；レシチン；コレステロールまたはチロキサパル）、安定性強化剤（例えばスクロースまたはソルビトール）、等張性強化剤（例えばハロゲン化アルカリ金属−好ましくは塩化ナトリウムまたはカリウム−あるいはマンニトールソルビトール）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または医薬アジュバント（これらに限定されない）が挙げられる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）およびその改訂版（任意の目的に関して参照により本明細書中に組み込まれる。）参照）。
【０１０３】
最適な医薬組成物は、例えば、意図する投与経路、送達方式および所望の投与量に依って、熟練者により決定される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上記参照）。このような組成物は、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の、物理学的状態、安定性、in  vivo放出速度およびin  vivoクリアランス速度に影響を与え得る。
【０１０４】
医薬組成物中の主要なビヒクルまたは担体は、水性または非水性の性質であり得る。例えば、注射用の適切なビヒクルまたは担体は、水、生理的食塩水または人工脳脊髄液であり得るし、非経口投与用の組成物中で一般的なその他の材料が追加され得る。中性緩衝食塩水または血清アルブミンと混合された食塩水は、さらなる典型的ビヒクルである。その他の典型的医薬組成物は、ｐＨ約７．０−８．５のトリス緩衝液またはｐＨ約４．０−５．５の酢酸緩衝液を含み、これはさらに、ソルビトールまたは適切な代替物を含み得る。本発明の一実施形態では、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体組成物は、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で、最適な製剤用物質（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上記）と所望の純度を有する選択された組成物を混合することによって保存用に調製され得る。さらに、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体産物は、適切な賦形剤、例えばスクロースを用いて、凍結乾燥物として処方され得る。
【０１０５】
非経口送達のために、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体医薬組成物を選択することができる。あるいは、本組成物を吸入のためにまたは消化管を通じた送達（例えば、経口）のために選択することができる。このような医薬的に許容可能な組成物の調製は当技術分野の技術の範囲内である。
【０１０６】
製剤成分は、投与部位に対して許容可能である濃度で存在する。例えば、生理的ｐＨにまたは僅かに低いｐＨ、典型的には約５〜約８のｐＨ範囲内に組成物を維持するために、緩衝液を使用する。
【０１０７】
非経口投与が意図される場合、本発明での使用のための治療用組成物は、医薬的に許容可能なビヒクル中で所望のＦＧＦ２１ポリペプチド変異体を含む、発熱物質不含の非経口投与的に許容可能な水溶液の形態であり得る。非経口注射のための特に適切なビヒクルは、滅菌蒸留水であり、この中で、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体は、適正に保存された滅菌等張溶液として処方される。さらに別の調製は、デポー注射を介して送達され得る産物の制御または持続性放出を可能とする、注射用マイクロスフェア、生体内崩壊性粒子、ポリマー性化合物（例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソームといったような物質とともに所望の分子を処方することを含み得る。ヒアルロン酸を使用することもでき、これは、循環中の持続時間を延長させる効果を有し得る。所望の分子の導入のためのその他の適切な手段には、移植可能な薬物送達装置が含まれる。
【０１０８】
一実施形態では、医薬組成物は、吸入用に処方され得る。例えば、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体は、吸入用の乾燥粉末として処方することができる。エアロゾル送達用の噴射剤とともにＦＧＦ２１ポリペプチド変異体吸入溶液を処方することもできる。また別の実施形態において、溶液を霧状化し得る。肺投与は、化学修飾タンパク質の肺送達について記載する国際公開ＷＯ９４／２００６９にさらに記載されている。
【０１０９】
ある製剤を経口投与することができることも企図される。本発明の一実施形態では、この方式で投与されるＦＧＦ２１ポリペプチド変異体は、錠剤およびカプセルのような固体投与形態の調合において通常使用される担体とともにまたはこれらを使用せずに、処方することができる。例えば、生物学的利用能が最大となり、前全身性分解が最小となる胃腸管中の時点で、製剤の活性部分を放出するように、カプセルを設計することができる。ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の吸収を促進するために、さらなる物質が含まれ得る。希釈剤、香味料、低融点蝋、植物油、滑剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤および結合剤も使用できる。
【０１１０】
別の医薬組成物は、錠剤の製造に適切である無毒性賦形剤との混合物中に、有効量のＦＧＦ２１ポリペプチド変異体を含み得る。滅菌水または別の適切なビヒクル中に錠剤を溶解することにより、単位剤形で、溶液を調製することができる。適切な賦形剤としては、不活性希釈剤（例えば炭酸カルシウム、炭酸または重炭酸ナトリウム、ラクトースまたはリン酸カルシウム）；あるいは結合剤（例えばデンプン、ゼラチンまたはアラビアゴム）；あるいは滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１１】
さらなるＦＧＦ２１ポリペプチド変異体医薬組成物は、持続性または制御送達製剤中にＦＧＦ２１ポリペプチド変異体を含む製剤を含め、当業者にとって明らかである。リポソーム担体、生体内崩壊性微粒子または多孔性ビーズおよびデポー注射といったような種々の他の持続性または制御送達手段を処方するための技術も当業者にとって既知である（例えば、国際公開ＷＯ９３／１５７２２（これは、医薬組成物の送達のための多孔性ポリマー性微粒子の制御放出を記載）およびＷｉｓｃｈｋｅ＆Ｓｃｈｗｅｎｄｅｍａｎ、２００８、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．３６４：２９８−３２７およびＦｒｅｉｂｅｒｇ  ＆  Ｚｈｕ、２００４、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２８２：１−１８（これらは、ミクロスフェア／微粒子調製および使用について考察）参照）。本明細書中に記載されるように、ヒドロゲルは持続性または制御送達製剤の一例である。
【０１１２】
徐放性調製物のさらなる例としては、造形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態の半透性ポリマーマトリクスが挙げられる。徐放性マトリクスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許第０  ０５８  ４８１号）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、１９８３、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、１９８１、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ、１９８２、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、上記）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第０  １３３  ９８８）が挙げられる。徐放性組成物は、リポソームも含み得る（これは、当技術分野で既知のいくつかの方法の何れかにより調製され得る。）。例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３６８８−９２；および欧州特許第０  ０３６  ６７６号、同第０  ０８８  ０４６号および同第０  １４３  ９４９号参照。
【０１１３】
in  vivo投与のために用いられるべきＦＧＦ２１ポリペプチド変異体医薬組成物は、典型的には、無菌であるべきである。これは、滅菌濾過膜を通じた濾過により成し遂げられ得る。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を用いた滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後に行い得る。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥形態でまたは溶液中で保存され得る。さらに、非経口組成物は、一般的に、無菌のアクセスポートがある容器（例えば、皮下注射用注射針により穿孔可能なストッパーがある、静脈溶液バッグまたはバイアル）に入れられる。
【０１１４】
医薬組成物を処方したら、溶液、縣濁液、ゲル、エマルジョン、固形物として、あるいは無水または凍結乾燥粉末として、これを無菌バイアル中で保存することができる。このような製剤は、即時使用形態でまたは投与前に再構成を必要とする形態（例えば凍結乾燥）で保存することができる。
【０１１５】
具体的な実施形態において、本発明は、単回投与単位を調製するためのキットに関する。本キットは、各々、乾燥タンパク質を有する第一の容器および水性の製剤を有する第二の容器の両方を含有し得る。単腔型および多室型の充填済み注射器（例えば液体シリンジおよび分散シリンジ）を含有するキットも本発明の範囲内に含まれる。
【０１１６】
治療的に用いられるべきＦＧＦ２１ポリペプチド変異体医薬組成物の有効量は、例えば治療内容および目的に依って決まる。したがって、当業者にとって当然のことながら、治療のための適切な投与量レベルは、一部は、送達される分子、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体が使用される適応症、投与経路、ならびに患者の体格（体重、身体表面または器官の大きさ）および状態（年齢および全身的健康）によって変動する。したがって、臨床医は、最適な治療効果を得るために、投与量を滴定し、投与経路を変更することができる。典型的投与量は、上述の要因に依って、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。他の実施形態では、投与量は、０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ；または１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ；または５μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、３５μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、４５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、５５μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、６５μｇ／ｋｇ、７０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲であり得る。さらに他の実施形態では、投与量は、５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、４５０μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、５５０μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、６５０μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、８５０μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、９５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、１０００μｇ／ｋｇ、２０００μｇ／ｋｇ、３０００μｇ／ｋｇ、４０００μｇ／ｋｇ、５０００μｇ／ｋｇ、６０００μｇ／ｋｇ、７０００μｇ／ｋｇ、８０００μｇ／ｋｇ、９０００μｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇであり得る。
【０１１７】
投与頻度は、使用される製剤中のＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の薬物動態学的パラメーターに依って決まる。典型的には、臨床医は、投与量が所望の効果を達成するまで、組成物を投与する。したがって、単回投与として、長期にわたる２回以上の投与（同量の所望分子を含有することもまたはしないこともある）として、あるいは移植デバイスまたはカテーテルを介した連続的点滴として、本組成物を投与することができる。適切な投与量のさらなる改善は、当業者により日常的になされ、当業者により日常的に行われる業務の領域の範囲内である。適切な投与量は、適切な用量−反応データの使用を通じて確定され得る。
【０１１８】
医薬組成物の投与経路は、例えば、経口による；静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内または病巣内経路による注射による；徐放系による（注射もされ得る）；または移植装置による、既知の方法に従う。必要に応じて、ボーラス注射により、または点滴により連続的に、または移植装置により、組成物を投与することができる。
【０１１９】
代替的にまたは付加的に、本組成物は、所望の分子が吸収されているかまたは封入されている、膜、スポンジまたはその他の適切な材料の移植を介して局所的に投与することができる。移植装置を使用する場合、任意の適切な組織または器官にこの装置を移植することができ、所望の分子の送達は、拡散、時限放出ボーラスまたは連続的投与を介したものであり得る。
【０１２０】
長期間にわたって薬剤濃度が所望の治療的有効量に保持され得るよう、予定速度で、薬剤、例えば本明細書中に開示されるＦＧＦ２１変異体を送達するために、種々の異なるアプローチが用いられ得る。一例では、ゼラチン（例えば、ウシゼラチン、ヒトゼラチンまたは別の供給源からのゼラチン）、あるいは天然または合成的に製造されたポリマーのようなポリマーを含むヒドロゲルが用いられ得る。任意のパーセンテージのポリマー（例えばゼラチン）、例えば５、１０、１５または２０％のポリマーが、ヒドロゲル中に用いられ得る。適切な濃度の選択は、種々の要因、例えば、所望される治療プロフィール、ならびに治療用分子の薬物動態プロフィールによって決まる。
【０１２１】
ヒドロゲル中に組入れられ得るポリマーの例としては、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド−コ−ポリプロピレンオキシド、コ−ポリエチレンオキシドブロックまたはランダムコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（アミノ酸）、デキストラン、ヘパリン、多糖、ポリエーテル等が挙げられる。
【０１２２】
ヒドロゲル製剤を生成する場合に考慮され得る別の要因は、ヒドロゲル中の架橋の程度、ならびに架橋剤である。一実施形態では、架橋は、無水メタクリル酸を包含するメタクリル化反応を介して達成され得る。いくつかの状況では、高度の架橋が望ましいが、一方、他の状況では、低度の架橋が好ましい。いくつかの場合、高度の架橋はより長い徐放性を提供する。高度の架橋は、より堅いヒドロゲル、ならびに薬剤が送達されるより長い期間を提供し得る。
【０１２３】
所望の特性を有するヒドロゲルを生成するために、任意の割合のポリマー対架橋剤（例えば無水メタクリル酸）が用いられ得る。例えば、ポリマー対架橋剤の比は、例えば８：１、１６：１、２４：１または３２：１であり得る。例えば、ヒドロゲルポリマーがゼラチンであり、架橋剤がメタクリレートである場合、８：１、１６：１、２４：１または３２：１の無水メタクリレート：ゼラチン比が用いられ得る。
【０１２４】
１０．  ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体の治療的使用
【０１２５】
多くの疾患、障害または症状、例えば代謝障害（これに限定されない）を、治療し、診断し、改善し、または防止するために、ＦＧＦ２１ポリペプチド変異体が用いられ得る。一実施形態では、治療されるべき代謝障害は、糖尿病、例えば２型糖尿病である。別の実施形態では、代謝障害は肥満症である。他の実施形態は、脂質異常症；高血圧症；脂肪肝、例えば非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）；心臓血管性疾患、例えばアテローム性動脈硬化症；および加齢のような症状または障害を包含する。
【０１２６】
適用に際して、糖尿病または肥満症のような障害または症状は、治療的有効用量の量で、それを必要とする患者に本明細書中に記載されるようなＦＧＦ２１ポリペプチド変異体を投与することにより治療され得る。投与は、本明細書中に記載されているように、例えば、静脈注射、腹腔内注射、筋肉内注射により、あるいは錠剤もしくは液体製剤の形態で経口的に、実施され得る。ほとんどの状況において、所望の投与量は、本明細書中に記載されているように臨床医により決定され得るし、これはＦＧＦ２１変異ポリペプチドの治療的有効量を表し得る。当業者にとって当然のことながら、ＦＧＦ２１変異ポリペプチドの治療的有効量は、とりわけ、投与スケジュール、投与される作用物質の単位用量、核酸分子またはポリペプチドがその他の治療薬と組み合わせて投与されるか否か、免疫状態およびレシピエントの健康に依って決まる。「治療的有効量」という用語は、本明細書中で用いられる場合、研究者、医師またはその他の臨床医により求められている、組織系、動物またはヒトにおける、生物学的または医学的応答（治療されている疾患または障害の症候の改善を含む）を引き出すＦＧＦ２１変異ポリペプチドの量を意味する。
【０１２７】
１１．  抗体
【０１２８】
本発明のＦＧＦ２１変異ポリペプチドと特異的に結合するが、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチドとは特異的に結合しない抗体および抗体断片が企図され、これは本発明の範囲内である。抗体は、ポリクローナル、例えば単一特異的ポリクローナル；モノクローナル（ＭＡｂ）；組み換え；キメラ；ヒト化、例えば相補性決定領域（ＣＤＲ）移植；ヒト；１本鎖；および／または二特異性；ならびにその断片；その変異体；またはその化学的修飾分子であり得る。抗体断片は、ＦＧＦ２１変異ポリペプチド上のエピトープと特異的に結合する抗体の一部を包含する。このような断片の例としては、全長抗体の酵素切断により生成されるＦａｂおよびＦ（ａｂ’）断片が挙げられる。その他の結合断片としては、組み換えＤＮＡ技術により、例えば抗体可変領域をコードする核酸配列を含有する組み換えプラスミドの発現により作製されるものが挙げられる。
【０１２９】
「特異的に結合する」という用語は、抗体の状況で用いられる場合、タンパク質および／またはその他の生物学的物質の異種集団の存在下で抗体がその標的を結合する、ということを意味する。さらに特定的には、抗体がその標的を特異的に結合する場合、これは、既定のイムノアッセイ条件下で、抗体がその標的と結合し、試料中に存在する他のタンパク質と有意量で結合しない、ということを意味する。その標的を特異的に結合する抗体を特定するために、任意の便利なイムノアッセイフォーマット、例えば固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイが用いられ得る（例えばHarlow  and  Lane  (1988)  Antibodies,  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harbor  Publications,  New  York参照）。ＦＧＦ２１変異ポリペプチドに対するポリクローナル抗体は、一般に、ＦＧＦ２１変異ポリペプチドおよびアジュバントの複数回の皮下または腹腔内注射によって、動物（例えば、ウサギまたはマウス）において産生される。カギアナカサガイへモシアニン、血清、アルブミン、ウシサイログロブリンまたはダイズトリプシン阻害剤のような、免疫化されるべき種において免疫原性である担体タンパク質とＦＧＦ２１変異ポリペプチドを結合させることは有用であり得る。さらにまた、免疫応答を増強するために、ミョウバンのような凝集剤も使用される。免疫化後、動物から採血し、抗ＦＧＦ２１変異体抗体力価に関して血清を検定する。
【０１３０】
培養において継続的細胞株による抗体分子の作製をもたらす任意の方法を用いて、ＦＧＦ２１変異ポリペプチドに対するモノクローナル抗体が産生され得る。モノクローナル抗体を調製するための適切な方法の例としては、Ｋｏｈｌｅｒら、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−９７のハイブリドーマ法およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ、１９８４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、１９８７）が挙げられる。ＦＧＦ２１変異ポリペプチドとの反応性があるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株も本発明により提供される。
【０１３１】
本発明のモノクローナル抗体は、治療薬として用いるために修飾され得る。一実施形態では、モノクローナル抗体は、重（Ｈ）鎖および／または軽（Ｌ）鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるかまたは相同であり、一方で、鎖（単数または複数）の残りの部分が、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるかまたは相同である、「キメラ」抗体である。このような抗体の断片も、これらが所望の生物学的活性を示す限り、含まれる。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１−５５参照。
【０１３２】
別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法は当技術分野で周知である。例えば、米国特許第５，５８５，０８９号および同第５，６９３，７６２号参照。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれに導入される１以上のアミノ酸残基を有する。例えば、ヒト抗体の対応領域に対してげっ歯類相補性決定領域の少なくとも一部を置換することにより、当技術分野に記載の方法を用いてヒト化を行うことができる（例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−３６参照）。
【０１３３】
本発明のＦＧＦ２１変異ポリペプチドを結合するヒト抗体も、本発明に包含される。内因性の免疫グロブリンを産生せずにヒト抗体のレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えばマウス）を用いて、任意に担体に結合されるＦＧＦ２１変異体由来の抗原（即ち少なくとも６連続アミノ酸を有する）で免疫化することにより、このような抗体が産生される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：２５５１−５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−５８；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、１９９３、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．７：３３参照。一方法では、このようなトランスジェニック動物は、その中で重および軽免疫グロブリン鎖をコードする内在性の遺伝子座を不能にし、ヒト重および軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座をそのゲノムに挿入することにより作製される。所望の免疫系の改変全てを有する動物を得るために、次に、一部改変動物、即ち完全に改変されていない動物を、異種交配する。免疫原を投与される場合、これらのトランスジェニック動物は、これらの抗原に対して免疫特異的である可変領域を含む、（例えばマウスではなく）ヒトアミノ酸配列のある抗体を産生する。例えば、国際公開ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９４／０２６０２参照。さらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号、国際公開ＷＯ９１／１０７４１およびＷＯ９０／０４０３６および欧州特許第０  ５４６  ０７３に記載されている。ヒト抗体は、本明細書中に記載のように、宿主細胞での組み換えＤＮＡの発現によるかまたはハイブリドーマ細胞における発現によっても産生され得る。
【０１３４】
代替的実施形態において、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリからも産生され得る（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１参照）。これらのプロセスは、糸状バクテリオファージの表面上で抗体レパートリーを表示し、その後、最適の抗原とのそれらの結合によりファージを選択することにより、免疫選択を模倣する。
【０１３５】
キメラ、ＣＤＲグラフトおよびヒト化抗体は、典型的には、組み換え法により産生される。抗体をコードする核酸を宿主細胞に導入し、本明細書中に記載の材料および手順を用いて発現させる。一実施形態において、抗体は、哺乳動物宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞において産生される。モノクローナル（例えばヒト）抗体は、宿主細胞における組み換えＤＮＡの発現により、または本明細書中に記載のようなハイブリドーマ細胞における発現により産生され得る。
【０１３６】
ＦＧＦ２１変異ポリペプチドの検出および定量のために、任意の既知の方法、例えば競合的結合検定、直接的および間接的サンドイッチ検定および免疫沈降検定（例えば、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる、Ｓｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８７）参照）において、本発明の抗ＦＧＦ２１変異抗体を使用することができる。本抗体は、使用されている検定方法に適切である親和性で、ＦＧＦ２１変異ポリペプチドを結合する。
【０１３７】
診断的適用に関しては、ある実施形態において、検出可能部分で抗ＦＧＦ２１変異体抗体を標識することができる。検出可能部分は、直接または間接的に、検出可能シグナルを生成させることが可能である何れかのものであり得る。例えば、検出可能部分は、放射性同位体、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎまたは６７Ｇａ；蛍光または化学発光化合物、例えばフルオレセインイソチオシアネート、ローダミンまたはルシフェリン；あるいは酵素、例えばアルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｂａｙｅｒら、１９９０、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１８４：１３８−６３）であり得る。
【０１３８】
競合的結合検定は、限定量の抗ＦＧＦ２１変異体抗体との結合に関して試験試料分析物（例えばＦＧＦ２１変異ポリペプチド）と競合する標識化標準物質（例えば、ＦＧＦ２１変異ポリペプチドまたは免疫学的反応性があるその一部）の能力に頼っている。試験試料中のＦＧＦ２１変異ポリペプチドの量は、抗体と結合されるようになる標準物質の量と反比例する。結合されるようになる標準物質の量を決定することを促進するために、抗体と結合される標準物質および分析物が、都合よく、未結合のままである標準物質および分析物から分離され得るように、抗体は、典型的には、競合前または後に不溶化される。
【０１３９】
サンドイッチ検定は、典型的には、各々が検出および／または定量されるべきタンパク質の、異なる免疫原部分またはエピトープと結合可能である、２つの抗体の使用を含む。サンドイッチ検定において、試験試料分析物は、典型的には、固体支持体上に固定化される第一の抗体により結合され、その後、第二の抗体が分析物と結合し、したがって不溶性の３部構成の複合体を形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号参照。二次抗体は、それ自体、検出可能部分で標識され得るか（直接サンドイッチ検定）、または検出可能部分で標識される抗免疫グロブリン抗体を用いて測定され得る（間接的サンドイッチ検定）。例えば、サンドイッチ検定の１つのタイプは、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）であり、この場合、検出可能部分は酵素である。
【０１４０】
本発明の抗ＦＧＦ２１変異体抗体はまた、in  vivo画像解析に関しても有用である。検出可能部分で標識される抗体は、動物に、好ましくは血流中に投与され、そして寄主中の標識化抗体の存在および位置が検定され得る。抗体は、核磁気共鳴、放射線または当技術分野で既知のその他の検出手段の何れによるものであれ、動物において検出可能である任意の部分で標識され得る。
【０１４１】
本発明のＦＧＦ２１変異体抗体は、治療薬として使用され得る。これらの治療薬は、一般に、それらが、それぞれ、ＦＧＦ２１変異ポリペプチドの生物学的活性の少なくとも１つを増強するかまたは低減するという点において、アゴニストまたはアンタゴニストである。一実施形態では、本発明のアンタゴニスト抗体は、ＦＧＦ２１変異ポリペプチドと特異的に結合し得る、そしてin  vivoまたはin  vitroでＦＧＦ２１変異ポリペプチドの機能的活性を抑制するかまたは排除し得る、抗体またはその結合断片である。いくつかの実施形態では、アンタゴニスト抗体は、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約８０％、ＦＧＦ２１変異ポリペプチドの機能的活性を抑制する。別の実施形態において、抗ＦＧＦ２１変異抗体は、ＦＧＦ２１変異ポリペプチドとＦＧＦ受容体との間の相互作用を妨害可能であり、それにより、in  vitroまたはin  vivoでＦＧＦ２１変異ポリペプチド活性を抑制または排除し得る。アゴニストおよびアンタゴニスト抗ＦＧＦ２１変異抗体は、当技術分野で周知のスクリーニング検定により特定される。
【０１４２】
本発明は、ＦＧＦ２１変異体抗体と、生体試料中でＦＧＦ２１変異ポリペプチドレベルを検出するために有用なその他の試薬とを含むキットに関する。このような試薬は、検出可能標識、ブロッキング血清、陽性および陰性対照試料、ならびに検出試薬を含み得る。
【０１４３】
（実施例）
【０１４４】
以下の実施例は、本発明の具体的な実施形態およびその種々の使用の例証である。それらは、単に説明を目的として記されるものであり、如何なる点でも本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０１４５】
ＦＧＦ２１発現構築物の調製
【０１４６】
成熟ＦＧＦ２１配列の５’および３’末端に対応するヌクレオチド配列を有するプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により、成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドをコードする核酸配列を得た。表２は、成熟ＦＧＦ２１配列を増幅するために使用したプライマーを列挙する。
【表２】
0005823954.tif 000003
【０１４７】
成熟ＦＧＦ２１発現構築物を調製するために用いたプライマーは、適切な発現ベクター（例えば、ｐＥＴ３０（Ｎｏｖａｇｅｎ／ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）またはｐＡＭＧ３３（Ａｍｇｅｎ；Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、ＣＡ））への配列の指向性クローニングのための制限エンドヌクレアーゼ部位を組入れた。発現ベクターｐＡＭＧ３３は、低複製数Ｒ−１００複製起点、修飾ｌａｃプロモーターおよびカナマイシン耐性遺伝子を含有する。発現ベクターｐＥＴ３０は、ｐＢＲ３２２由来複製起点、誘導性Ｔ７プロモーターおよびカナマイシン耐性遺伝子を含有する。ｐＡＭＧ３３からの発現がより高いことが分かった一方で、ｐＥＴ３０はより信頼性の高いクローニングベクターであることが分かった。したがって、本発明の開示中に記載される構築物の大多数は、先ずｐＥＴ３０において作製し、次いで、効力についてスクリーニングした。さらなる増幅のために、次に、選択配列をｐＡＭＧ３３に移入した。
【０１４８】
４０．６５μＬ  ｄＨ２Ｏ、５μＬ  ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ反応緩衝液（１０ｘ）、１．２５μＬ  ｄＮＴＰミックス（４０ｍＭ〜４ｘ１０ｍＭ）、０．１μＬ鋳型（１００ｎｇ／ｍＬ）、１μＬプライマー１（１０μＭ）、１μＬプライマー２（１０μＭ）および１μＬ  ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ融合ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を含有する反応混合物中で、ＦＧＦ２１配列を増幅させた。９５℃で２分間加熱し；その後、９５℃で２０秒間、６０℃で２０秒間（１サイクルごとに追加的に１℃ずつ低下させる）および７２℃で１５秒間／キロベース（所望の産物）を１０回繰り返し；その後、９４℃で２０秒間、５５℃で２０秒間および７２℃で１５秒間／キロベース（所望の産物）を２０サイクル繰り返し；その後、７２℃で３分間加熱することによって、増幅反応を実施した。増幅産物を制限エンドヌクレアーゼ、ＮｄｅＩ、ＤｐｎＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、適切なベクターに結紮し、次いでコンピーテント細胞中で形質転換した。
【実施例２】
【０１４９】
細菌からのＦＧＦ２１タンパク質の精製
【０１５０】
以下の実施例において、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド、切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチド、ＦＧＦ２１変異体およびＦＧＦ２１融合タンパク質を含めた種々のＦＧＦ２１タンパク質を細菌発現系で発現させた。下記で述べる発現後、別記しない限り、この実施例に記載のとおりにＦＧＦ２１タンパク質を精製した。
【０１５１】
細菌の封入体からの野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド、切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドおよびＦＧＦ２１変異体を精製するために、ｐＨ８．５のトリス緩衝液中の塩酸グアニジンおよびＤＴＴを含有する可溶化緩衝液中で、二重洗浄封入体（ＤＷＩＢ）を溶解した。次いで、それらを室温で１時間混合し、ｐＨ９．５の、尿素、アルギニン、システインおよび塩酸シスタミンを含有するリフォールディング緩衝液に可溶化混合液を付加し、次いで、５℃で２４時間混合した（例えば、Ｃｌａｒｋｅ、１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：１５７−６３；Ｍａｎｎａｌｌら、２００７、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９７：１５２３−３４；Ｒｕｄｏｌｐｈら、１９９７、「Ｆｏｌｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）５７−９９；およびＩｓｈｉｂａｓｈｉら、２００５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．４２：１−６参照）。
【０１５２】
可溶化およびリフォールディング後、０．４５ミクロンフィルターを通して混合液を濾過した。次に、２０ｐｓｉの膜間圧差（ＴＭＰ）で１０ｋＤ分子量カットオフＰａｌｌ  Ｏｍｅｇａカセットを用いて、リフォールディングプールをおよそ１０倍濃縮し、２０ｐｓｉのＴＭＰで、２０ｍＭ  トリス、ｐＨ８．０の３カラム体積を用いてダイアフィルトレーション処理した。
【０１５３】
次に、清澄化試料に、ＱセファロースＨＰ樹脂を用いた陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー処理を施した。２０ｍＭ  トリス中の０〜２５０ｍＭ  ＮａＣｌの線状塩濃度勾配を、ｐＨ８．０で５℃で作動させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりピーク分画を分析し、プールした。
【０１５４】
次に、ＡＥＸ溶出プールに、フェニルセファロースＨＰ樹脂を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）処理を施した。ｐＨ８．０および周囲温度で、０．７Ｍ〜０Ｍ硫酸アンモニウムの漸減線状勾配を用いて、タンパク質を溶出させた。ピーク分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０、Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：６８０−８５）により分析し、プールした。
【０１５５】
２０ｐｓｉのＴＭＰで７ｍｇ／ｍＬになるまで、１０ｋＤ分子量カットオフＰａｌｌ  Ｏｍｅｇａ  ０．２ｍ２カセットでＨＩＣプールを濃縮した。２０ｐｓｉのＴＭＰで、５カラム体積の処方緩衝液で濃縮液を透析ろ過し、回収した濃縮液を５ｍｇ／ｍＬに希釈した。最終的に、Ｐａｌｌ  ｍｉｎｉ−Ｋｌｅｅｎｐａｃ  ０．２μＭ  Ｐｏｓｉｄｙｎｅ膜を通して溶液を濾過した。
【０１５６】
細菌封入体からＦＧＦ２１融合タンパク質およびＦＧＦ２１融合変異タンパク質を精製するために、ｐＨ８．５のトリス緩衝液中で塩酸グアニジンおよびＤＴＴを含有する可溶化緩衝液中で、二重洗浄封入体（ＤＷＩＢ）を溶解し、次いで、室温で１時間混合した。次に、ｐＨ９．５の、尿素、アルギニン、システインおよび塩酸シスタミンを含有するリフォールディング緩衝液に可溶化混合液を付加し、次いで５℃で２４時間混合した（例えば、Ｃｌａｒｋｅ、１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：１５７−６３；Ｍａｎｎａｌｌら、２００７、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９７：１５２３−３４；Ｒｕｄｏｌｐｈら、１９９７、「Ｆｏｌｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）５７−９９；およびＩｓｈｉｂａｓｈｉら、２００５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．４２：１−６参照）。
【０１５７】
溶解およびリフォールディング後、１０ｋＤ透析チューブを用いて、２０ｍＭ  トリス、ｐＨ８．０の５体積に対して、混合液を透析した。５０％酢酸を用いて、透析したリフォールディング液のｐＨを５．０に調整し、次いで、４Ｋで３０分間の遠心分離により清澄化した。
【０１５８】
次に、清澄化試料に、ＱセファロースＨＰ樹脂を用いた陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー処理を施した。ｐＨ８．０で５℃で、２０ｍＭ  トリス中の０〜２５０ｍＭ  ＮａＣｌの線状塩濃度勾配を作動させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０、Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：６８０−８５）によりピーク分画を分析し、プールした。
【０１５９】
次に、ＡＥＸ溶出プールに、フェニルセファロースＨＰ樹脂を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）処理を施した。ｐＨ８．０および周囲温度で、０．６Ｍ〜０Ｍ硫酸アンモニウムの漸減線状勾配を用いて、タンパク質を溶出させた。ピーク分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０、Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：６８０−８５）により分析し、プールした。
【０１６０】
ＨＩＣ段階後、次に、６０体積の処方緩衝液でプールを透析した。Ｐａｌｌ  ｊｕｍｂｏｓｅｐを用いて、透析プールを５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。最後に、溶液を、Ｐａｌｌ  ｍｉｎｉ−Ｋｌｅｅｎｐａｃ  ０．２μＭ  Ｐｏｓｉｄｙｎｅ膜を通して濾過した。
【実施例３】
【０１６１】
切頭化ＦＧＦ２１タンパク質の調製および発現
【０１６２】
下記のような野生型ＦＧＦ２１発現ベクターのＰＣＲ増幅により、表３で列挙される切頭化ＦＧＦ２１タンパク質をコードする構築物を調製した（野生型ＦＧＦ２１発現ベクターの構築は実施例１で記載する。）。
【表３】
0005823954.tif 000004
0005823954.tif 000005
【０１６３】
欠失されるべき（切頭化を生じる）コドン（単数または複数）の上流および下流の領域と相同である配列を有するプライマーを用いて、切頭化ＦＧＦ２１タンパク質構築物を調製した。このような増幅反応で使用されるプライマーは、増幅産物の再環状化を可能とするために約１５ヌクレオチドの重複配列も提供した（即ち、ここで、ベクター全体は所望の変異体または切頭化を有する）。
【０１６４】
表４で示されるプライマーを用いて、成熟ＦＧＦ２１配列の位置１のヒスチジン残基を欠くＦＧＦ２１タンパク質をコードする代表的な切頭化ＦＧＦ２１構築物（即ち、２−１８１切頭化変異体）を調製した。
【表４】
0005823954.tif 000006
【０１６５】
表４で示されるプライマーは、下記で示されるようにヒスチジン残基を欠失させるが、ここで、上の配列（配列番号９）は、Ｎ末端メチオニンを含む成熟ＦＧＦ２１ポリペプチドの一部であり、第２の配列はセンスプライマー（配列番号１４）であり、第３および第４の配列（配列番号１７および１８）はＦＧＦ２１発現構築物の一部であり、第５の配列はアンチセンスプライマー（配列番号１６）である：
ＭｅｔＨｉｓＰｒｏＩｌｅＰｒｏＡｓｐＳｅｒＳｅｒＰｒｏＬｅｕ
５’−ＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧ−−−ＣＣＡＡＴＴＣＣＡＧＡＴＴＣＴＴＣＴＣＣＡＴＴＡＴＴ
ＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＣＡＴＣＣＡＡＴＴＣＣＡＧＡＴＴＣＴＴＣＴＣＣＡＴＴＡＴＴ
ＡＡＡＡＣＡＡＡＴＴＧＡＡＡＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＴＡＴＧＴＡＴＡＣＧＴＡＧＧＴＴＡＡＧＧＴＣＴＡＡＧＡＡＧＡＧＧＴＡＡＴＡＡ
ＡＡＡＡＣＡＡＡＴＴＧＡＡＡＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＴＡＴＧＴＡＴＡＣ−５’
【０１６６】
切頭化ＦＧＦ２１タンパク質構築物を、本質的に実施例１に記載のＰＣＲ条件を用いて調製した。制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩで増幅産物を消化し、次いで、コンピーテント細胞に形質転換した。その結果生じたクローンを配列決定して、ポリメラーゼ生成性エラーがないことを確認した。
【０１６７】
特定の切頭化ＦＧＦ２１タンパク質をコードする構築物でコンピーテントＢＬ２１（ＤＥ３）またはＢＬ２１  Ｓｔａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）細胞を形質転換することにより、切頭化ＦＧＦ２１タンパク質を発現させた。通気を制限して、４０μｇ／ｍＬカナマイシンを補足したＴＢ培地中で形質転換体を一晩増殖させ、翌朝、空気を供給し、短い回復時間の後、０．４ｍＭ  ＩＰＴＧ中で誘導した。誘導から１８〜２０時間後、遠心分離によりＦＧＦ２１変異体を収穫した。
【実施例４】
【０１６８】
切頭化ＦＧＦ２１タンパク質のin  vitro活性
【０１６９】
ＥＬＫ−ルシフェラーゼin  vitro検定において、野生型ＦＧＦ２１活性を保持する切頭化ＦＧＦ２１タンパク質を特定するために実験を実施した。表５は、Ｎ末端、Ｃ末端またはＮ末端およびＣ末端の両方に切頭化があるＦＧＦ２１タンパク質に関して得られた結果を要約する。組み換えヒト２９３Ｔ腎臓細胞系を用いてＥＬＫ−ルシフェラーゼ検定を実施した（ここで、２９３Ｔ細胞はβ−ｋｌｏｔｈｏおよびルシフェラーゼレポーター構築物を過剰発現する）。これらの構築物は、ＧＡＬ４−ＥＬＫ１および５ｘＵＡＳ−Ｌｕｃ（Ｇａｌ４結合部位の５個のタンデムコピーを含有するプロモーターにより駆動されるルシフェラーゼレポーター）をコードする配列も含有する。β−Ｋｌｏｔｈｏは、そのＦＧＦ受容体の活性化および細胞内シグナル伝達の誘導（これは、次いで、ＥｒｋおよびＥＬＫリン酸化をもたらす）のためにＦＧＦ２１により必要とされる共受容体である。ルシフェラーゼ活性は、リン酸化Ｅｒｋ／ＥＬＫ１のレベルにより調節され、ＦＧＦ２１活性を間接的に監視し定量するために使用される。
【０１７０】
異なる濃度の野生型ＦＧＦ２１またはＦＧＦ２１変異ポリペプチドの存在下で２９３Ｔ細胞を６時間培養し、次いでルシフェラーゼ活性に関して細胞溶解物を検定することにより、ＥＬＫ−ルシフェラーゼ検定を実施した。図１Ａ〜１Ｂは、ＦＧＦ２１切頭化変異体７−１８１および８−１８１（図１Ａ）ならびにＦＧＦ２１切頭化変異体１−１７２、１−１７１、１−１６９および１−１６４（図１Ｂ）に関して実施したＥＬＫ−ルシフェラーゼ活性検定の結果を示す。ＦＧＦ２１切頭化変異体３−１８１、４−１８１、５−１８１、７−１８１、８−１８１、１−１８０、１−１７８、１−１７７、１−１７６、１−１７５、１−１７４、１−１７３、１−１７２、９−１８１および１−１４９の各々に関するＥＬＫ−ルシフェラーゼ検定において得られた発光を図２に示す。
【０１７１】
ＦＧＦ２１変異ポリペプチドを野生型ＦＧＦ２１標準と比較し、野生型ＦＧＦ２１の効力の少なくとも５０％の効力を示す変異体を、ＦＧＦ２１活性を喪失しなかったものとみなし、表５で「＋」とした。
【表５】
0005823954.tif 000007
【０１７２】
まとめると、表５で提示された結果は、１４以上のアミノ酸残基のＣ末端欠失（即ち、アミノ酸残基１−１６７からなるＣ末端切頭化ＦＧＦ２１タンパク質およびより短いタンパク質）がＦＧＦ２１の活性を除去する、ということを示す。さらに、表５は、７以上のアミノ酸残基のＮ末端欠失（即ち、アミノ酸残基８−１８１からなるＮ末端切頭化ＦＧＦ２１タンパク質およびより短いタンパク質）は、ＦＧＦ２１の活性を除去することを示す。意外ではないが、８〜１４残基のＮ末端切頭化ならびに１２または３２残基のＣ末端切頭化の両方を保有する切頭化ＦＧＦ２１タンパク質は、ＥＬＫ−ルシフェラーゼ検定において活性を欠くことが判明した。
【０１７３】
表５で提示されたデータと一致して、７アミノ酸残基未満のＮ末端切頭化を有する切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドは、本発明の実施形態を構成する。同様に、１３アミノ酸残基未満のＣ末端切頭化を有する切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドは、本発明の実施形態を構成する。
【実施例５】
【０１７４】
切頭化ＦＧＦ２１タンパク質のin  vivo活性
【０１７５】
ＦＧＦ２１は、多数の生物学的活性、例えば、血糖、インスリン、トリグリセリドまたはコレステロール値を下げる能力；体重を減少させる能力；あるいはグルコース耐性、エネルギー消費またはインスリン感受性を改善する能力を有する。切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドをインスリン抵抗性ｏｂ／ｏｂマウスに導入し、特定の切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドの血糖低下能を測定することによって、in  vivoのＦＧＦ２１活性に関して切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドをさらに分析した。試験されるべき切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドを８週齢ｏｂ／ｏｂマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に腹腔内注射し、１回の注射後、種々の時点で（例えば、注射後、０、６、２４、７２、１２０および１６８時間で）血液試料を得た。ＯｎｅＴｏｕｃｈ  Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（ＬｉｆｅＳｃａｎ、Ｉｎｃ．Ｍｉｌｐｉｔａｓ、ＣＡ）で血糖値を測定し、血糖の基線値（即ち、時間０のもの）に比した血糖の変化％としてその結果を表した。
【０１７６】
一実験の結果を図３に提示するが、これは、ＦＧＦ２１切頭化変異体８−１８１および９−１８１を注射したマウスにおいて検出された血糖の量を示す。この実験から、アミノ酸残基８−１８１を含む切頭化ＦＧＦ２１融合タンパク質はin  vivoで血糖低下活性を示すが、しかしながら、注射後３および６時間では、その活性は野生型ＦＧＦ２１の活性よりわずかに低いが、アミノ酸残基９−１８１を含む切頭化ＦＧＦ２１融合タンパク質はこのような活性を示さないことが明らかとなった。したがって、切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドのin  vivo分析は、成熟ＦＧＦ２１のＮ末端からの７個までのアミノ酸の欠失によって分子の生物学的活性は破壊されないことを示した（成熟ＦＧＦ２１のＮ末端から７アミノ酸の欠失により活性が破壊されることを示唆するin  vitro分析と対比）。
【０１７７】
In  vitroおよびin  vivo検定において特定のＮ末端切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチド（例えばＦＧＦ２１  ８−１８１）により得られた異なる結果は、シグナル伝達を実行するに際してのＦＧＦ２１とβ−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦ受容体との相互作用により説明することができる。特に、ＦＧＦ２１は、共受容体β−ＫｌｏｔｈｏおよびＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）を含む二重受容体複合体を活性化し、これが、チロシンキナーゼを含むシグナル伝達カスケードを開始する。ＦＧＦ２１のＮ末端は、ＦＧＦＲの結合および活性化に関与することが示されており、一方、ＦＧＦ２１のＣ末端はβ−Ｋｌｏｔｈｏ相互作用に必要とされる（Ｙｉｅら、２００９  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５８３：１９−２４）。共受容体β−Ｋｌｏｔｈｏが過剰発現され、ＦＧＦＲが正常レベルで発現される２９３腎臓細胞において、ＥＬＫ−ルシフェラーゼin  vitro検定を実施する。ＦＧＦＲの量は、β−Ｋｌｏｔｈｏの量に比して低く、したがって、２９３細胞でのβ−Ｋｌｏｔｈｏ対ＦＧＦＲの比は非生理学的であり、これは、受容体複合体形成、最終的にはリガンド結合およびＦＧＦＲの活性化に影響を与え得る。２９３in  vitro系は、Ｎ末端切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドをより受け易いと思われ、したがって、ＦＧＦ２１  ８−１８１のような試験されるＮ末端切頭化変異体の一部に対して活性損失という結果を引き起こしている可能性がある。したがって、特定のＮ末端切頭化ＦＧＦ２１変異体が野生型ＦＧＦ２１活性を保持したか否かを確定するに際して、in  vivo検定におけるそのＦＧＦ２１変異体の活性が解決の手がかりとなると考えられた。したがって、８個未満のアミノ酸残基のＮ末端切頭化を有する切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドは本発明により包含される。
【実施例６】
【０１７８】
切頭化ＦＧＦ２１融合タンパク質の調製および発現
【０１７９】
タンパク質の半減期はタンパク質をＦｃ配列と融合することにより増大し得るため、切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドを含む融合タンパク質を調製し、分析した。ＳＯＥｉｎｇ（重複伸長による遺伝子スプライシング）ＰＣＲにより増幅されたＦＧＦ２１配列から、表６で列挙する切頭化ＦＧＦ２１融合タンパク質を調製した。ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１遺伝子のＦｃ部分（配列番号１１）がＦＧＦ２１タンパク質のＮ末端またはＣ末端の何れかと融合されるように、ＦＧＦ２１融合タンパク質を調製した。
【表６】
0005823954.tif 000008
【０１８０】
特に、ＦＧＦ２１融合タンパク質構築物（切頭化ＦＧＦ２１融合タンパク質をコードするものを含む）を、本質的に実施例１に記載の反応条件を用いて、一連の３回の増幅反応で調製した。第一の反応において、ＮｄｅＩクローニング部位（細菌発現に関するＮ末端メチオニンを含む）、Ｆｃ領域およびリンカー配列を含有する配列を生成するよう、一対のプライマーを設計した。第二の反応において、リンカーの重複部分、ＦＧＦ２１コード配列の一部およびＥｃｏＲＩクローニング部位を含有する配列を生成するよう、一対のプライマーを設計した。最後に、第三の反応において、最初の２つの反応の生成物を連結する目的で、一対のプライマーを設計した。Ｆｃ−ＦＧＦ２１  １−１８１の構築のためのプライマーの一例示組を、表７に列挙する。
【表７】
0005823954.tif 000009
【０１８１】
最終反応生成物を制限エンドヌクレアーゼ、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ｐＥＴ３０ベクターに結紮して、次に、コンピーテント細胞に形質転換した。その結果生じたクローンを配列決定して、ポリメラーゼにより生じたエラーがないことを確認した。
【実施例７】
【０１８２】
切頭化ＦＧＦ２１融合タンパク質のin  vivo活性
【０１８３】
Ｆｃ配列に融合された切頭化ＦＧＦ２１配列を含む融合タンパク質を作製し、in  vivo活性に関して検定した。単一連続配列を形成するために、ＩｇＧ１  Ｆｃ分子を切頭化ＦＧＦ２１タンパク質のＮ末端またはＣ末端の何れかに融合させることにより、切頭化ＦＧＦ２１融合タンパク質を調製した。Ｎ末端融合物とＣ末端融合物とを区別するために、Ｆｃ分子がＦＧＦ２１タンパク質のＮ末端に融合されたＦＧＦ２１融合タンパク質をＦｃ−ＦＧＦ２１と呼び、Ｆｃ分子がＦＧＦ２１タンパク質のＣ末端に融合されたＦＧＦ２１融合タンパク質をＦＧＦ２１−Ｆｃと呼ぶ。
【０１８４】
ＦＧＦ２１は、血糖、インスリン、トリグリセリドまたはコレステロール値を低下させる能力；体重を低減する能力；あるいはグルコース耐性、エネルギー消費またはインスリン感受性を改善する能力を含めた多数の生物学的活性を有する。In  vivoでのＦＧＦ２１活性を査定するために、ＦＧＦ２１ポリペプチド、ＦＧＦ２１変異ポリペプチドおよびＦＧＦ２１融合ポリペプチドをインスリン抵抗性ｏｂ／ｏｂマウスに導入し、特定のＦＧＦ２１タンパク質の血糖値を低下させる能力を測定した。試験されるべきＦＧＦ２１ポリペプチド、ＦＧＦ２１変異ポリペプチドまたはＦＧＦ２１融合ポリペプチドを８週齢ｏｂ／ｏｂマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に腹腔内注射し、１回の注射後、種々の時点で（例えば、注射から、０、６、２４、７２、１２０および１６８時間後）血液試料を得た。ＯｎｅＴｏｕｃｈ  Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（ＬｉｆｅＳｃａｎ、Ｉｎｃ．Ｍｉｌｐｉｔａｓ、ＣＡ）で血糖値を測定し、血糖の基線値（即ち時間０のもの）に対する血糖の変化％としてその結果を表した。
【０１８５】
一実験の結果を図４で提供するが、これは、ＰＢＳ対照、アミノ酸残基１−１８１を含む野生型Ｆｃ−ＦＧＦ２１対照、あるいはアミノ酸残基５−１８１または７−１８１を含む切頭化Ｆｃ−ＦＧＦ２１融合タンパク質を注射したマウスにおいて観察された血糖値の変化％を示す。この実験は、アミノ酸残基５−１８１または７−１８１を含む切頭化Ｆｃ−ＦＧＦ２１融合タンパク質が、注射の６時間後に、野生型Ｆｃ−ＦＧＦ２１の活性と同様の血糖低下活性を示すことを実証した。このようにして、切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドのin  vivo分析は、成熟ＦＧＦ２１のＮ末端からの６個までのアミノ酸の欠失が分子の生物学的活性に影響を与えないことを示した。しかしながら、in  vivo分析は、血糖低下する切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチドの能力が低減され、注射の２４時間後に血糖値が基線に戻される、ということも示した（野生型ＦＧＦ２１で同様の結果が得られた）。短いin  vivo活性は、実施例８に記載のように、ＦＧＦ２１のタンパク質分解性分解の結果であることが分かった。
【０１８６】
別の実験の結果を図５で提供するが、これは、ＰＢＳ対照、アミノ酸残基１−１８１を含む野生型ＦＧＦ２１−Ｆｃ対照、残基１−１７５を含む切頭化ＦＧＦ２１−Ｆｃ融合タンパク質、またはアミノ酸残基１−１７１を含む切頭化Ｆｃ−ＦＧＦ２１タンパク質を注射したマウスにおいて観察される血糖値の変化％を示す。この実験は、アミノ酸残基１−１８１を含む野生型ＦＧＦ２１−Ｆｃが、持続的なグルコース低下活性（その結果、注射後２４時間〜１２０時間の期間に亘って、およそ３０％、血糖値が低下する）を有することを実証した。アミノ酸残基１−１７１を含む切頭化Ｆｃ−ＦＧＦ２１タンパク質は、注射後７２時間目にだけ、遅発性の血糖低下活性事象を示す。しかしながら、観察される活性は野生型ＦＧＦ２１−Ｆｃの活性と同じである。残基１−１７５を含む切頭化ＦＧＦ２１−Ｆｃ融合タンパク質は、血糖を低下させることにおいてin  vivoで活性ではない。
【０１８７】
まとめると、本明細書中に記載の切頭化実験は、Ｎ末端切頭化を有する切頭化ＦＧＦ２１融合タンパク質が、野生型ＦＧＦ２１融合タンパク質と同様の血糖低下活性を示し、さらに、Ｆｃ分子が切頭化ＦＧＦ２１タンパク質のＮ末端に融合されている切頭化ＦＧＦ２１融合タンパク質が、Ｆｃ分子が切頭化ＦＧＦ２１タンパク質のＣ末端に融合されている融合タンパク質よりも高い活性を示すことを実証している。
【実施例８】
【０１８８】
ＦＧＦ２１の観察されたin  vivo分解
【０１８９】
ＦＧＦ２１分解を、実施例７に記載のように、ＦＧＦ２１  Ｆｃ融合タンパク質構築物で最初に観察した。in  vivo薬物動態学的分析は、ヒトＦＧＦ２１が、急速なクリアランスおよびin  vivo分解のために、マウスにおいて約１時間という短い半減期を有することを示した。したがって、ＦＧＦ２１の半減期を延長するために、Ｆｃ配列をＦＧＦ２１ポリペプチドのＮ−またはＣ末端に融合させた。しかしながら、Ｆｃ配列がＦＧＦ２１ポリペプチドのＮ−またはＣ末端に融合された融合タンパク質（特にＦｃ−ＦＧＦ２１融合物、即ち、Ｆｃ配列が成熟ＦＧＦ２１のＮ末端に融合されているもの）は、予想されたin  vivo効力を示さず、それどころか、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて２４時間以上、血糖低下活性を維持することが判明したため、Ｆｃ領域の融合は、半減期の問題を完全には解決しなかった。図４に記載のように、Ｆｃ−ＦＧＦ２１融合タンパク質は、注射の６時間後に約３０〜４０％、血糖値を低減し、一方、血糖値は、２４時間で基線値に戻った。
【０１９０】
その後、野生型ＦＧＦ２１のタンパク質分解性分解を調べて、Ｆｃ−ＦＧＦ２１融合タンパク質でのin  vivo活性の急速な損失は、ＦＧＦ２１のin  vivo分解の結果であることが分かった。タンパク質分解性分解により、in  vivoで分子の生物学的活性が低下し、したがって有効半減期がより短くなるが、このような分解はその分子の治療での使用に悪影響を与える。したがって、ＦＧＦ２１Ｆｃ融合タンパク質の分解が見られたことから、in  vivoでのＦＧＦ２１のタンパク質分解性分解の研究およびこのような分解に対して耐性があるＦＧＦ２１変異体の特定に至った。
【０１９１】
分解の部位を確定するために、雄Ｃ５７Ｂ６マウスに注射後、種々の時点で得られた野生型ヒトＦＧＦ２１およびＦＧＦ２１  Ｆｃ融合タンパク質に関して、ＬＣ−ＭＳ分析およびエドマン配列解析を実施した。エドマン配列解析は、タンパク質のＮ末端またはＣ末端が分解を受けたか否かの確認に役立った。Ｆｃ配列がヒトＦＧＦ２１のＮ末端に融合されている場合、分解は、融合分子のヒトＦＧＦ２１部分の、アミノ酸残基１５１と１５２との間およびアミノ酸残基１７１と１７２との間のペプチド結合で起こることが分かった（上記の残基の付番は、成熟ＦＧＦ２１配列に基づいており、融合タンパク質のＦｃ部分を含まない）。１７１−１７２での分解が最初に起こり、その後、１５１−１５２での分解が起こることが分かった。１７１−１７２での分解は、律速段階であると思われ、分子の半減期に関与する。Ｆｃ配列がＦＧＦ２１のＣ末端に融合された場合、分解は、アミノ酸残基４と５との間およびアミノ酸残基２０と２１との間のペプチド結合で起こることが分かった。これらの実験の結果、Ｆｃ配列が、Ｆｃ配列に隣接するＦＧＦ２１配列の部分を分解から保護すると思われることが確定された。野生型ＦＧＦ２１およびＦｃ−ＦＧＦ２１融合タンパク質のin  vivo分解の分析を、カニクイザルにおいてさらに実行した。これらの研究から、アミノ酸残基１７１−１７２でのＦＧＦ２１の切断部位がサルにおいて分解の主要な部位であり、この分解部位がマウスと霊長類との間で保存されていることが確認された。
【実施例９】
【０１９２】
ＦＧＦ２１タンパク質分解耐性変異体の特定
【０１９３】
主要なタンパク質分解活性の部位である野生型ＦＧＦ２１配列の位置を実験的に確定することにより、適切なＦＧＦ２１変異体を特定し、特異的なアミノ酸置換をこれらの部位に導入した。アミノ酸置換は、（実施例８に記載のような）その他の種とのＦＧＦ２１配列保存およびその他のアミノ酸残基との生化学的保存に基づいた。野生型ＦＧＦ２１タンパク質に導入されたかまたは導入することができるアミノ酸置換の一覧を表８に提示するが、表８は単なる例示であり、その他の置換を行うことができる。表８で示される位置の番号は、１８１アミノ酸残基からなる成熟ＦＧＦ２１タンパク質での残基の位置に対応する。
【表８】
0005823954.tif 000010
【実施例１０】
【０１９４】
Ｆｃ−ＦＧＦ２１およびＦＧＦ２１−Ｆｃ分解のin  vivo分析
【０１９５】
融合タンパク質をマウスに注射し、種々の時点でマウスから採血し、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により血清を分析することにより、in  vivoでのＦＧＦ２１Ｆｃ融合タンパク質の安定性を確定した。特に、（実施例２に記載のように大腸菌中で発現させ、精製した）Ｆｃ−（Ｇ５）−ＦＧＦ２１（配列番号１０７）または（標準手順に従って哺乳動物細胞中で発現させ、精製した）ＦＧＦ２１（Ｇ３）Ｆｃ（配列番号１０５）  １０ｍｇ／ｋｇをマウスに腹腔内注射した。注射の６、２４および４８時間後にマウスから採血し（表９）、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で前処理したＥＤＴＡ試験管中に収集した。１２，０００ｇで１０分間、試料を遠心分離することにより血漿を分離した。抗ヒト−Ｆｃアガロース樹脂を用いて、血液からＦＧＦ２１タンパク質をアフィニティー精製した。
【表９】
0005823954.tif 000011
【０１９６】
ＬＣ−ＭＳによりアフィニティー精製試料を分析する前に、参照としてＦｃ−（Ｇ５）−ＦＧＦ２１およびＦＧＦ２１−（Ｇ３）−Ｆｃタンパク質標準を分析した。タンパク質標準は、トリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン（ＴＣＥＰ）で還元されるかまたは還元されなかった。ＬＣＱ  Ｃｌａｓｓｉｃイオントラップ質量分析装置にカラム流出液を噴霧し、ＡＣＥシアノ０．３ｍｍｘ３０ｃｍカラムを用いて、ＬＣ−ＭＳにより、還元および非還元標準物質を分析した。還元試料のノイズ除去スペクトルはより明瞭であったので、ＬＣ−ＭＳ分析前にアフィニティー精製試料を還元した。
【０１９７】
還元Ｆｃ（５）ＦＧＦ２１標準物質および試料Ｄ６、Ｄ２４およびＤ４８に関する実測質量を、図６Ａ−６Ｄに示す。還元ＦＧＦ２１−（Ｇ３）−Ｆｃ標準、ならびに試料Ｅ６、Ｅ２４およびＥ４８に関する実測質量を、図７Ａ−７Ｄに示す。ＬＣ−ＭＳにより測定されたようなタンパク質および断片のＮ末端を確認するために、標準および試料溶出物のうちいくつかをエドマン配列解析にかけた。標準物質および試料のＬＣ−ＭＳ分析の結果を、表１０に示す。
【表１０】
0005823954.tif 000012
【０１９８】
表１０で示されるように、アフィニティー精製試料の全てが、循環のわずか６時間後に、ある程度の分解を示した。循環２４時間後、Ｆｃ−（Ｇ５）−ＦＧＦ２１の主要な産物は、アミノ酸残基１−４０４からなる断片であり、これはＤおよびＥ試料の両方で観察された。しかしながら、Ｅ試料において、ＦＧＦ２１−（Ｇ３）−Ｆｃの主要産物は、アミノ酸残基５−４１０からなる断片であった。試験した両方の融合タンパク質に関して、融合タンパク質のＦＧＦ２１部分は、タンパク質のＦｃ部分よりも分解され易かった。
【実施例１１】
【０１９９】
タンパク質分解耐性ＦＧＦ２１変異体および融合タンパク質の調製および発現
【０２００】
下記のような野生型ＦＧＦ２１発現ベクターのＰＣＲ増幅により、表１１で列挙されるＦＧＦ２１変異体をコードする構築物を調製した（野生型ＦＧＦ２１発現ベクターの構築は実施例１に記載されている）。リンカーが構築物中に含まれた場合、用いられるリンカーはＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（「Ｌ１５」、配列番号２８）であり、これらの実験の目標は、タンパク質分解に耐性であり、半減期がより長いＦＧＦ２１変異体を作製することであった。
【表１１】
0005823954.tif 000013
0005823954.tif 000014
0005823954.tif 000015
0005823954.tif 000016
【０２０１】
変異化されるべきコドン（単数または複数）の上流および下流の領域と相同である配列を有するプライマーを用いて、ＦＧＦ２１変異体構築物を調製した。このような増幅反応で使用したプライマーは、増幅産物の再環化を可能とするために約１５ヌクレオチドの重複配列も提供した（即ち、ここでベクター全体は、所望の変異体を有する）。
【０２０２】
表１２で示されるプライマーを用いて、ネイティブグリシン残基の代わりに位置１７０にグルタミン酸残基を有するＦＧＦ２１変異体をコードする典型的なＦＧＦ２１変異構築物（即ちＧ１７０Ｅ変異体）を調製した。
【表１２】
0005823954.tif 000017
【０２０３】
表１２で示されるプライマーにより、下記で示されるような、グルタミン酸残基でのグリシン残基の置換が可能になる（この場合、上の配列は、センスプライマー（配列番号２３）であり、第二および第三の配列（配列番号２５および２７）は、ＦＧＦ２１発現構築物の一部であり、第四の配列はアンチセンスプライマー（配列番号２６）：
５’−ＡＴＧＧＴＧＧＡＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＧＣＣＧＡＡＧＣ
ＣＴＣＣＴＣＧＧＡＣＣＣＴＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＴＧＧＧＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＧＣＣＧＡＡＧＣＣＣＣＡ
ＧＡＧＧＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＡＣＴＣＧＴＡＣＣＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＧＧＴＣＣＣＧＧＣＴＴＣＧＧＧＧＴ
ＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＡＣＴＣＧＴＡＣＣＡＣＣＴＴＧＧＡＡＧＧ−５’
である。
【０２０４】
ＦＧＦ２１変異体構築物を、本質的に実施例１に記載のＰＣＲ条件を用いて調製した。制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩで増幅産物を消化し、次いで、コンピーテント細胞に形質転換した。ポリメラーゼにより生じたエラーがないことを確認するために、結果として得られるクローンをシーケンシングした。本明細書中、例えば実施例６に記載のように、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１およびＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃ融合タンパク質を作製した。
【０２０５】
特定の変異体をコードする構築物を用いてコンピーテントＢＬ２１（ＤＥ３）またはＢＬ２１Ｓｔａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）細胞を形質転換することにより、ＦＧＦ２１変異体を発現させた。４０μｇ／ｍＬカナマイシンを補足したＴＢ培地中で通気を制限して、形質転換体を一晩増殖させ、翌朝通気し、短時間の回復時間の後、０．４ｍＭ  ＩＰＴＧ中で誘導した。誘導から１８〜２０時間後に、遠心分離によりＦＧＦ２１変異ポリペプチドを収穫した。
【０２０６】
ＦＧＦ２１変異体を、予測される免疫原性に関しても分析した。タンパク質に対する免疫応答は、抗原プロセシングおよび主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ結合部位での提示により増強される。この相互作用は、タンパク質を認識する抗体の成熟におけるＴ細胞ヘルプに必要とされる。ＭＨＣクラスＩＩ分子の結合部位の特徴が分かっているので、タンパク質が、一連の共通のヒト対立遺伝子に結合し得る特異的配列を有するか否かを予測することが可能である。線状アミノ酸ペプチド配列が免疫寛容性を破壊する可能性があるか否かを確定するために、参考文献およびＭＨＣクラスＩＩ結晶構造に基づき、コンピュータアルゴリズムを作成した。特定のＦＧＦ２１変異体における点変異が大多数のヒトにおいて抗原特異的Ｔ細胞を増加するか否かを確定するために、ＴＥＰＩＴＯＰＥコンピュータプログラムを使用した。各ＦＧＦ２１変異体の線状タンパク質配列の分析に基づき、免疫原性を増強することが予想される変異体はなかった。
【実施例１２】
【０２０７】
ＦＧＦ２１分解に及ぼすリンカー配列の影響
【０２０８】
Ｆｃ配列とＦＧＦ２１配列との間のより長いアミノ酸リンカーの存在がＦＧＦ２１分解に影響を与えるか否かを確定するために、Ｆｃ領域が、配列ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（「Ｌ１５」と呼ばれる、配列番号２８）を有する１５アミノ酸のリンカーによりＦＧＦ２１配列から分離されたＦＧＦ２１融合タンパク質をマウスに注射し、種々の時点でそのマウスから採血し、ＬＣ−ＭＳにより血清を分析した。特に、２３ｍｇ／ｋｇでＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１またはＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃ（大腸菌から得た）をマウスに注射し、６、２４および４８時間目に採血し、抗ヒト−Ｆｃアガロース樹脂を用いて採取血液をアフィニティー精製した。
【０２０９】
ＬＣ−ＭＳにより精製試料を分析する前に、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１およびＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃタンパク質標準を参照物質として分析した。タンパク質標準物質をＴＣＥＰで還元し、あるいは還元しなかった。ＬＣＱ  Ｃｌａｓｓｉｃイオントラップ質量分析装置にカラム流出液を噴霧して、ＡＣＥシアノ０．３ｍｍｘ３０ｃｍカラムを用いて、ＬＣ−ＭＳにより、還元および非還元標準物質の両方を分析した。還元試料のノイズ除去スペクトルがより明瞭であったので、ＬＣ−ＭＳ分析前にアフィニティー精製試料を還元した。
【０２１０】
還元Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１標準および種々の時点で採取した対応するアフィニティー精製試料に関する実測質量を図８Ａ−８Ｄで示す。還元ＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃ標準および種々の時点で採取された対応するアフィニティー精製試料に関する実測質量を図９Ａ−９Ｄに示す。タンパク質のＮ末端を確認し、ＬＣ−ＭＳにより観察された断片が何であるか予測することを促すために、標準物質および試料溶出物のうちいくつかをエドマン配列解析にかけた。標準物質および試料のＬＣ−ＭＳ分析の結果および予測される断片の指標を表１３に示す。
【表１３】
0005823954.tif 000018
【０２１１】
表１３で示されるように、アフィニティー精製試料の全てが、循環のわずか６時間後にある程度の分解を示した。循環の２４時間後、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１の主要な産物は、アミノ酸残基１−４１４（試料の８５％）および１−３９４（試料の１５％）からなる断片であり、ＦＧＦ２１（１５）Ｆｃの主要な産物は、アミノ酸残基１−４２３（試料の４０％）、６−４２３（試料の３５％）および２２−４２３（試料の２５％）からなる断片であった。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１およびＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃタンパク質に関して特定された切断点をそれぞれ図１０Ａおよび１０Ｂで示す。
【実施例１３】
【０２１２】
注射後１−７日日目のタンパク質分解耐性Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体のin  vivo活性
【０２１３】
本明細書中に記載のように、ＦＧＦ２１Ｆｃ融合タンパク質のタンパク質分解性切断は、Ｆｃ配列の配向に依って決まり、融合タンパク質のＦｃ末端は、融合タンパク質のＦＧＦ２１末端よりも安定であった（即ち、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１融合タンパク質のＮ末端部分およびＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃ融合タンパク質のＣ末端部分がより安定であることが判明した）。例えば、ＦＧＦ２１−（Ｌ１５）−Ｆｃの位置５および２１ならびにＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１の位置１５１および１７１で切断が特定された。
【０２１４】
これらの観察の結果、タンパク質分解耐性ＦＧＦ２１変異体を特定するために、試験を実施した。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１のＬＣ−ＭＳ分析は、in  vivoタンパク質分解性分解が、先ず、アミノ酸残基１７１−１７２の間で起こり、その後、アミノ酸残基１５１−１５２の間で分解が起こることを実証する。位置１７１でタンパク質分解性分解を遮断することにより、位置１５１での切断が防止され、効果的にその分子の半減期を延長し得る。しかしながら、位置１５１での切断が妨げられたタンパク質分解耐性変異体は、プロテアーゼ攻撃を受けやすい位置１７１の残基を依然として保有し、それにより、結果として、共受容体β−Ｋｌｏｔｈｏ（これは、リガンド受容体親和性ならびにin  vitroおよびin  vivo能力の決定因子である）の結合に関与することが知られている、最後の１０アミノ酸がない分子を生じ得る。したがって、成熟ＦＧＦ２１の位置１７１の周囲のアミノ酸残基の変異誘発が、分子の、in  vivo安定性、効能および効力を改良するためにより重要であると思われる。
【０２１５】
ＦＧＦ２１変異体をｏｂ／ｏｂマウスに腹腔内注射し、注射後０、０．２５、１、３、５および７日目に、注射したマウスから採血し、次いで試料中の血糖値を測定することにより、特定のタンパク質分解耐性Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体のin  vivo活性を検定した。一実験の結果を図１１で示すが、これは、ＰＢＳ対照、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（配列番号４９）対照、あるいはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（配列番号５１）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ（配列番号５３）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ（配列番号５５）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  （Ｇ１７０Ｅ、Ｐ１７１Ａ、Ｓ１７２Ｌ）（配列番号５９）またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１５１Ａ（配列番号６１）を注射したマウスで測定した血糖値を示す。図１２は、この実験で測定した場合の血糖値の変化％を示す。この実験は、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２ＬおよびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｇ１７０Ｅ、Ｐ１７１Ａ、Ｓ１７２Ｌ）変異体が、５日までの間、持続的な血糖低下活性を示すことを実証するが、これは、野生型Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１の活性を上回る。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１５１Ａ変異体は、野生型Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１融合タンパク質と比較した場合、血糖低下活性の持続時間を部分的に改善しただけであった。意外にも、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ変異体は、タンパク質分解耐性変異体ではなく、したがって、野生型Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１ポリペプチドと同様の分解プロファイルを有するが、しかし、この変異体は、野生型Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１ポリペプチドと比較した場合、in  vivoで改善を示すことが判明した。
【０２１６】
別の実験の結果を図１３に示すが、これは、ＰＢＳ対照、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１対照、あるいはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｐ１５０Ａ、Ｇ１５１Ａ、Ｉ１５２Ｖ）（配列番号６５）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（配列番号５１）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｇ１７０Ｅ、Ｐ１７１Ａ）（配列番号６３）またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｇ１７０Ｅ、Ｓ１７２Ｌ）（配列番号６７）を注射したマウスにおいて測定した血糖値を示す。図１４は、この実験において測定した場合の、血糖値の変化％を示す。上述の実験と同様に、野生型Ｆｃ−ＦＧＦ２１融合タンパク質およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｐ１５０Ａ、Ｇ１５１Ａ、Ｉ１５２Ｖ）変異体は、持続性の血糖低下活性を示さないが、おそらくこれは、１７１部位での分解が依然として生じ得るからであり、これらのタンパク質を注射した動物における血糖値は注射後２４時間で基線に戻った。しかしながら、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｇ１７０Ｅ、Ｐ１７１Ａ）またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｇ１７０Ｅ、Ｓ１７２Ｌ）は、注射後５日まで最大血糖低下活性を示し、これは、野生型Ｆｃ−ＦＧＦ２１融合タンパク質およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｐ１５０Ａ、Ｇ１５１Ａ、Ｉ１５２Ｖ）変異体を上回る。
【０２１７】
別の実験の結果を図１５に示すが、これは、ＰＢＳ対照、あるいはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（配列番号５１）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ａ（配列番号６９）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｃ（配列番号７１）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｄ（配列番号７３）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｎ（配列番号７５）またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｓ（配列番号７７）を注射したマウスにおいて測定した血糖値を示す。図１６は、この実験で測定した場合の、血糖値の変化％を示す。この実験で試験したＦＧＦ２１変異体は全て、注射後５日まで、持続性の血糖低下活性を示した。
【０２１８】
別の実験の結果を図１７に示すが、これは、ＰＢＳ、あるいはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ（配列番号５１）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｅ（配列番号７９）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｈ（配列番号８１）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｑ（配列番号８３）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｔ（配列番号８５）またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｙ（配列番号８７）を注射したマウスにおいて測定した血糖値を示す。図１８は、この実験で測定した場合の、血糖値の変化％を示す。この実験で試験したＦＧＦ２１変異体は全て、野生型Ｆｃ−ＦＧＦ２１と比較した場合、血糖低下活性を改善した。
【実施例１４】
【０２１９】
注射後６〜１２０時間目のタンパク質分解耐性Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体のin  vivo分解
【０２２０】
ＦＧＦ２１変異体をマウスに注射し、種々の時点でマウスから採血し、ＬＣ−ＭＳにより血清を分析することにより、選択したＦＧＦ２１変異体のin  vivo安定性を分析した。特に、注射前に約１８０μＬの１０ｍＭ  ＨＣｌ中で各々を希釈したＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１ＡまたはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌ変異体（実施例２に記載のように大腸菌から得た）の何れかをマウスに注射し、６、２４、４８、７２および１２０時間で採血した。抗ヒト−Ｆｃアガロース樹脂カラムを用いて、採取血液から、ＦＧＦ２１タンパク質をアフィニティー精製した。１０ｍＭ  ＨＣｌを用いて、カラムから試料を溶出させた。ＦＧＦ２１構築物は全て、ＦＧＦ２１タンパク質のアミノ末端にＦｃ領域および１５アミノ酸のリンカーを含む。野生型ＦＧＦ２１対照もマウスに注射した。
【０２２１】
ＬＣ−ＭＳによりアフィニティー精製試料を分析する前に、未処理野生型ＦＧＦ２１および未処理ＦＧＦ２１変異体を参照として分析した。全ての標準物質および時点試料をＴＣＥＰで還元し、次いで、ＬＣＱ  Ｃｌａｓｓｉｃイオントラップ質量分析装置にカラム流出液を噴霧して、ＡＣＥシアノ０．３ｍｍ  ｘ３０ｃｍカラムを用いて、ＬＣ−ＭＳにより分析した。酢酸アンモニウムでアフィニティー精製試料を希釈し、ＴＣＥＰで還元し、次いで上記のようにＬＣ−ＭＳにより分析した。
【０２２２】
注射の０、６、２４および４８時間後の野生型Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１の実測質量をそれぞれ図１９Ａ−１９Ｄに示す。注射の０、６、２４および４８時間後のＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅに関する実測質量をそれぞれ図２０Ａ−２０Ｄに示す。注射の０、６、２４および４８時間後のＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａに関する実測質量をそれぞれ図２１Ａ−２１Ｄに示す。注射の０、６、２４および４８時間後のＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌに関する実測質量をそれぞれ図２２Ａ−２２Ｄに示す。
【０２２３】
７２および１２０時間に採取した試料は全て、残りのＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１融合タンパク質よりもはるかに多いフィブリノーゲンの高分子量（非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、２００ｋＤ超）の成分を含有することが判明した。その他の標準物質および試料のＬＣ−ＭＳ分析の結果を表１４に示す。
【表１４】
0005823954.tif 000019
【０２２４】
表１４で示されるように、野生型Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１およびＳ１７２Ｌ変異体の分解は循環２４時間後の時点で同様であると思われ、融合タンパク質の主要な産物は、アミノ酸残基１−４１４からなる断片であった。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０ＥおよびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ変異体の分解産物もまた、循環２４時間後に採取された試料が、７０−８０％の無傷のタンパク質（アミノ酸１−４２４）およびアミノ酸残基１−４２１からなる断片２０−３０％を含有するという点で同様であると思われる。４８時間後でさえも、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０ＥおよびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ変異体は一方で、アミノ酸残基１−４２１からなる断片量の増加を示しつつ、依然として無傷のタンパク質を保持した。Ｆｃ−ＦＧＦ２１構築物の以前の分析で観察されたように、融合タンパク質のＦＧＦ２１部分の分解が検出され、Ｆｃ部分は安定なままであることが分かった。野生型、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１ＡおよびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｓ１７２Ｌに対して特定された切断部位をそれぞれ図２３Ａ−２３Ｄで示す。
【実施例１５】
【０２２５】
凝集性低減ＦＧＦ２１変異体の特定
【０２２６】
野生型ＦＧＦ２１の一つの特性は、その凝集傾向である。この特性にかんがみて、凝集性低減ＦＧＦ２１変異体を生成することが所望された。２つの仮説に基づき、凝集性低減ＦＧＦ２１変異体を特定した。第１の仮説は、ＦＧＦ２１に関して、凝集（または二量体化）が、親水性の水ベースの溶媒環境に曝露される疎水性残基により引き起こされる、疎水性相互作用およびＦＧＦ２１分子間のファンデルワールス相互作用により誘発される、というものである。第２の仮説は、ＦＧＦ２１活性を損なうことなく、これらの曝露された疎水性残基が置換し、ＦＧＦ２１アミノ酸配列中に凝集性を低下させる点変異を作製することができるというものである。
【０２２７】
ＦＧＦ２１における曝露疎水性残基を特定するために、系統的理論的タンパク質工学処理法を用いた。曝露疎水性残基を特定するために用いられ得るＦＧＦ２１の既知のＸ線またはＮＭＲ構造がなかったので、ＭＯＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ；Chemical  Computing  Group;Montreal、Quebec、Canada）モデリングソフトウェアを用いてＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋ（ＰＤＢ）から得たＦＧＦ１９（ＩＰＷＡ）の高解像度（１．３Å）Ｘ線結晶構造を使用して、ＦＧＦ２１の３Ｄホモロジーモデルを作成した。ＰＤＢに寄託されたタンパク質の中でも、ＦＧＦ１９はアミノ酸配列相同性に関してＦＧＦ２１と最も近縁のタンパク質であるので、鋳型としてＦＧＦ１９を選択した。
【０２２８】
ＭＯＥを用いた以下の方法により、溶媒接触度を算定した。表面積の第１の尺度（ＳＡ１）を、Å２単位での残基の接触可能表面積と定義する。特定のアミノ酸残基はタンパク質の一次配列で複数回出現するが、残基の各出現は、とりわけ、タンパク質表面に対する残基の近接性、残基の側鎖の配向および隣接アミノ酸残基の空間的位置の相違ゆえに、異なる表面積を有し得る。したがって、表面積の第２の尺度（ＳＡ２）がもたらされ、この場合、当該残基は、その残基に隣接するかまたは近接する残基と一緒に、タンパク質構造から抽出される。これらの空間的に近接する残基を、その側鎖を除去するために、コンピュータ内でグリシンに変異させ、次いで、当該残基に関するＳＡ２を算定して、その特定の立体配座におけるその残基に関する考え得る総表面積の測定値を得る。次に、ＳＡ２に対するＳＡ１の比（ＳＡ１／ＳＡ２）から、実際に曝露されるその残基に関して考え得る表面積のパーセンテージの測定値を得る。
【０２２９】
さらなる分析のために溶媒に高度に曝露されるいくつかの疎水性残基を選択し、選択した残基をその他の天然のアミノ酸残基で置換するために、これらの残基に対してコンピュータ上で点変異を作成した。ＦＧＦ２１モデル、ならびにＣＵＰＳＡＴウェブサイトで提供される説明書に従い、相互交流型ウェブ利用プログラムＣＵＰＳＡＴ（Ｃｏｌｏｇｎｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｏｌｓ）を用いて、種々の置換の結果起こるタンパク質温度安定性の変化を算定した。Ｐａｒｔｈｉｂａｎら、２００６、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３４：Ｗ２３９−４２；Ｐａｒｔｈｉｂａｎら、２００７、ＢＭＣ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：５４参照。凝集性低減する点変異体の設計において、著しく不安定化するかまたは疎水性である変異を除外した。親水性および／またはイオン性の特性改良を導入する置換の安定化（または、まれに、わずかに不安定化）を、凝集性低減ＦＧＦ２１変異体の候補とみなした。
【０２３０】
この合理的タンパク質工学処理法を通して得られたデータの要約を表１５に示すが、これは、タンパク質凝集性低減および安定性改善を示すことが予期されるＦＧＦ２１変異体の例も列挙する。
【表１５】
0005823954.tif 000020
0005823954.tif 000021
【実施例１６】
【０２３１】
凝集性低減ＦＧＦ２１変異体および融合タンパク質の調製および発現
【０２３２】
実施例１１に記載のような野生型ＦＧＦ２１発現ベクターのＰＣＲ増幅により、表１６で列挙されるＦＧＦ２１変異体をコードする構築物を調製した（野生型ＦＧＦ２１発現ベクターの構築は実施例１に記載）。本明細書中、例えば実施例６に記載のように、融合タンパク質を作製した。リンカーを用いた場合、それは、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（「Ｌ１５」、配列番号２８）であった。
【表１６】
0005823954.tif 000022
0005823954.tif 000023
【０２３３】
野生型ＦＧＦ２１、切頭化ＦＧＦ２１ポリペプチド、ＦＧＦ２１変異体およびＦＧＦ２１融合タンパク質を含めた種々のＦＧＦ２１タンパク質の凝集を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって検定した。種々の時点に関して、分析されるべき試料を４℃、室温または３７℃でインキュベートし、次いでＳＥＣ分析に付した。ＳＥＣカラムを備えたＢｅｃｋｍａｎ  ＨＰＬＣシステムにおいて実験を実施した。野生型ＦＧＦ２１に関して、移動相として２％イソプロピルアルコールを含有する２ｘＰＢＳとともに、ＴＯＳＯＨＡＡＳ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ２０００  ＳＥＣカラムを使用した。ＦＧＦ２１  Ｆｃ融合タンパク質およびＦＧＦ２１変異ポリペプチドに関して、移動相として２ｘＰＢＳとともに、ＴＯＳＯＨＡＡＳ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＥＣカラムを使用した。
【実施例１７】
【０２３４】
凝集性低減ＦＧＦ２１変異体のin  vitro活性
【０２３５】
ＥＬＫ−ルシフェラーゼin  vitro検定において野生型ＦＧＦ２１活性を保持する凝集性低減変異体を特定するために、実験を実施した。実施例４に記載のように、ＥＬＫ−ルシフェラーゼ検定を実施した。図２４Ａ−２４Ｃは、ＦＧＦ２１変異体ＦＧＦ２１  Ｌ９９Ｒ（配列番号１０９）、ＦＧＦ２１  Ｌ９９Ｄ（配列番号１１１）およびＦＧＦ２１  Ａ１１１Ｔ（配列番号１１３）（図２４Ａ）；ＦＧＦ２１変異体ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｄ（配列番号１１５）、ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｑ（配列番号１１７）およびＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｋ（配列番号１１９）（図２４Ｂ）；ならびにＦＧＦ２１変異体ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｙ（配列番号１２１）、ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｅ（配列番号１２３）およびＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｋ（配列番号１２５）（図２４Ｃ）において実施したＥＬＫ−ルシフェラーゼ活性検定の結果を示す。これらの実験の結果は、凝集性低減変異体のうち一部が、ＥＬＫ−ルシフェラーゼ検定で検定した場合にＦＧＦ２１活性に悪影響を与えなかったことを実証する。
【実施例１８】
【０２３６】
より長い半減期およびより低い凝集レベルを示すＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１組み合わせ変異体の調製および発現
【０２３７】
凝集性を低減し、ならびにタンパク質分解性分解を中断することによって半減期を増大することが示される変異を含有する、多数のＦＧＦ２１組み合わせ変異体を調製し、ＩｇＧ１  Ｆｃ分子（配列番号１１）と接合させた。これらのＦＧＦ２１変異体を、本質的に実施例１１に記載したように調製した。
【実施例１９】
【０２３８】
より長い半減期およびより低い凝集レベルを示すＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体のin  vitro試験
【０２３９】
野生型ＦＧＦ２１活性を保持するＦＧＦ２１組み合わせ変異体を特定するために、ＥＬＫ−ルシフェラーゼin  vitro検定において実験を実施した。ＥＬＫ−ルシフェラーゼ検定は、実施例４に記載したように実施した。
【０２４０】
図２５Ａ−２５Ｄは、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｇ、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１ＳおよびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｔ（図２５Ａ）；Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｙ、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１ＷおよびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｃ（図２５Ｂ）；Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｇ１７０Ｅ）およびＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ（図２５Ｃ）；ならびにＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１ＥおよびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｇ１７０Ｅ）（図２５Ｄ）において実施したＥＬＫ−ルシフェラーゼ活性検定の結果を示す。これらの実験の結果は、安定性、または安定性および溶解性の両方の改善を目指す変異が、野生型Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１と比較した場合に、in  vitro活性を損なわなかったことを実証する。興味深いことに、ＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ変異体は、野生型Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１に比して改善された効力を示した。
【０２４１】
図２６Ａは、４℃で１、２および４日間、６５ｍｇ／ｍＬタンパク質のインキュベーション後の、ＦＧＦ２１対照（野生）およびＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋに関する凝集％の変化を示す。このデータは、Ａ４５Ｋ変異が、野生型タンパク質と比較して、タンパク質の凝集性の低減をもたらすことを示した。
【０２４２】
図２６Ｂは、４℃で１、６および１０日間、６５ｍｇ／ｍＬタンパク質のインキュベーション後の、ＦＧＦ２１対照（野生）、ならびにＦＧＦ２１  Ｐ７８Ｃ、ＦＧＦ２１  Ｐ７８Ｒ、ＦＧＦ２１  Ｌ８６Ｔ、ＦＧＦ２１  Ｌ８６Ｒ、ＦＧＦ２１  Ｌ９８Ｃ、ＦＧＦ２１  Ｌ９８Ｒ、ＦＧＦ２１  Ａ１１１Ｔ、ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｄ、ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｑ、ＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｋ、ＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｋ、ＦＧＦ２１  Ａ１３４ＹおよびＦＧＦ２１  Ａ１３４Ｅに関する凝集％の変化を示す。このデータは、ＦＧＦ２１  Ｌ８６Ｒ、ＦＧＦ２１  Ｌ９８Ｃ、ＦＧＦ２１  Ｌ９８Ｒ、ＦＧＦ２１  Ａ１１１Ｔ、ＦＧＦ２１  Ａ１２９ＱおよびＦＧＦ２１  Ａ１２９Ｋが、野生型タンパク質と比較して、タンパク質の凝集の低減をもたらす、ということを示した。
【０２４３】
図２７は、ヒトＦＧＦ２１対照、ならびにＦＧＦ２１変異体ＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ、ＦＧＦ２１  Ｌ５２ＴおよびＦＧＦ２１  Ｌ５８Ｅにおいて実施されたＥＬＫ−ルシフェラーゼ活性検定の結果を示す。この実験は、ＦＧＦ２１  Ａ４５Ｋ変異体が、野生型ＦＧＦ２１の全効力を保持し、野生型ＦＧＦ２１よりもさらに大きい効能を示すことを実証する。しかしながら、ＦＧＦ２１  Ｌ５２ＴおよびＦＧＦ２１  Ｌ５８Ｅ変異体は、野生型ＦＧＦ２１と比較した場合、潜在能および効力の低減を示す。
【０２４４】
図２８Ａ−２８Ｂは、４℃で１、４および８日間インキュベーション後の、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１変異体Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（６−１８１、Ｇ１７０Ｅ）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｇ１７０Ｅ）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｅ、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ａ、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０Ｅ、ならびにＦＧＦ２１対照に関する凝集レベルの変化を示す。この実験は、８日間に亘って、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｇ１７０）Ｅ変異体が、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｇ１７０ＥまたはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１  Ｐ１７１Ｅ変異体よりも低い凝集性を示したが、３つの変異体全てが、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１対照よりも低い凝集性を示したことを実証する。表１７は、４℃または室温で０、２、３、４または７日間インキュベーション後の、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１対照およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｇ１７０Ｅ）変異体に関して得られた凝集％を示す。
【表１７】
0005823954.tif 000024
【実施例２０】
【０２４５】
Ｆｃ−ＦＧＦ２１融合組み合わせ変異体の調製および発現
【０２４６】
上記のように、特定の切頭化およびアミノ酸置換の導入を通して、ＦＧＦ２１の安定性および溶解性を調整し得る。さらに、このような修飾ＦＧＦ２１タンパク質をヒト免疫グロブリンＩｇＧ１遺伝子のＦｃ部分と融合させることによって、ＦＧＦ２１安定性をさらに増強し得る。さらに、上記修飾の組み合わせを導入することにより、安定性および溶解性の両方の増強を有するＦＧＦ２１分子を作製し得る。上記の技術を用いて、表１８で列挙されるＦＧＦ２１組み合わせ変異体をコードする核酸配列を調製した。用いたリンカーは、Ｌ１５リンカー  ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２８）であった。
【表１８】
0005823954.tif 000025
【０２４７】
図２９は、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１組み合わせ変異体Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｇ１７０Ｅ）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ａ４５Ｋ、Ｐ１７１Ｇ）またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）を注射したマウスにおいて測定した血糖値を示す。
【０２４８】
別の実験において、ＦＧＦ２１変異体Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）を野生型成熟ＦＧＦ２１およびＦｃ−ＦＧＦ２１と並行して試験した。一実験において、６時間に亘り、異なる濃度のＦＧＦ２１、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の存在下で、組み換え２９３Ｔ細胞株を培養した。次に、ルシフェラーゼ活性に関して、細胞溶解物を検定した。図３０で示されるように、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）は、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１と同様の活性を有し、このことは、２つの点変異の導入が、分子のin  vitro活性を変更しなかったことを示す。
【０２４９】
さらに別の実験において、ＦＧＦ２１およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１と並行して、２種類の異なる温度、即ち室温および４℃で、９日間、６５ｍｇ／ｍＬでＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の安定性を評価した。インキュベーション期間後、次に、種々の温度での時間プロファイルに対する凝集性を確定するために、ＳＥＣ−ＨＰＬＣで細胞溶解物を分析した。図３１Ａおよび３１Ｂで示されるデータは、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）において、室温（図３１Ａの、黒三角、点線）および４℃（図３１Ｂの、黒三角、点線）で、凝集形成速度が顕著に低減されたことを示す。
【実施例２１】
【０２５０】
Ｃ末端変異を含むタンパク質分解耐性ＦＧＦ２１変異体
【０２５１】
組み合わせ変異体のin  vivo安定性も試験した。具体的には、ネズミおよびカニクイザルモデルにおいて、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）のin  vivo安定性をＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１の安定性と比較した。結果は、両種において同様であることが判明した。カニクイザル試験において、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１を２３．５ｍｇ／ｋｇで静脈注射し、用量投与後８４０時間までの時点で血清および血漿のアリコートを収集した。１６８時間までの時点を分析した。抗Ｆｃ試薬を用いて時点試料をアフィニティー精製し、次いでＭＡＬＤＩ質量分析を用いて分析した。この結果は、この２つの分析間で良好に相関した。
【０２５２】
免疫親和性ＭＡＬＤＩを用いて生成されたデータを分析して、Ｐ１７１部位での切取りは、Ｐ１７１からＰ１７１Ｇの変異の結果として、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）分子においては排除たと思われた。しかしながら、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）に関して、３個までのＣ末端残基の損失を生じる小さく且つゆっくりとした分解が観察された（図３２）。アミノ酸残基１７１と１７２との間のより切断が起こりやすい部位を図２０および２１で示されるように遮断した後、他のＦＧＦ２１変異体によっても、３個のＣ末端残基での小切断が観察された。３個のＣ末端残基切断は、連続した残基ごとのカルボキシペプチダーゼによるかまたはアミノ酸残基１７９−１８０および１８０−１８１での非特異的切取りを伴うアミノ酸残基１７８および１７９での特異的プロテアーゼ攻撃による分子のＣ末端からの切断の停止を表し得る。Ｃ末端での２−３個のアミノ酸の損失は、β−Ｋｌｏｔｈｏ結合の低減、最終的にはその分子の効能およびin  vivo活性の低下を引き起こし得る。例えば、Ｙｉｅら、２００９、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５８３：１９−２４参照。Ｃ末端の見掛けのカルボキシペプチダーゼ分解に対処するために、種々のＦＧＦ２１変異ポリペプチドにアミノ酸残基「キャップ」を付加する影響を試験した。表１９で提示されるものを含めて種々の構築物を作製し、本明細書中に記載の技術を用いて検定した。表１９は、in  vitroＥＬＫルシフェラーゼ検定の結果を要約する。
【０２５３】
適切なアミノ酸キャップは、１〜１５アミノ酸長、例えば１、２、３、４、５、１０または１５アミノ酸長であり得る。任意の数および種類のアミノ酸（単数または複数）、例えば、単一プロリン残基および単一グリシン残基、２個のグリシン残基、５個のグリシン残基ならびにその他の組み合わせを、キャップとして用い得る。キャップのさらなる例が、本実施例および表１９に提示されている。
【０２５４】
さらに、アミノ酸残基１７８および１７９での見掛けのプロテアーゼ攻撃に対処するために、位置１７９、１８０および１８１のアミノ酸残基の変異を試験した。再び、表１９で提示されるものを含めて種々の構築物を作製し、本明細書中に記載の技術を用いて検定した。これらの部位でのキャップおよび変異の組み合わせの影響も調べた。表１９は、作製し、in  vitroＥＬＫ−ルシフェラーゼ検定で試験した（本明細書中に記載のように実施）、代表的な構築物を要約する。本明細書中で用いられる用語と一致して、ｈＦｃはヒトＦｃ配列（即ち、配列番号１１）を意味し、Ｌ１５は、Ｌ１５リンカー（即ち、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、配列番号２８）を指す。
【表１９】
0005823954.tif 000026
【０２５５】
図３３は、ＰＢＳ対照、野生型ネイティブＦＧＦ２１、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）、ならびに、プロリンまたはグリシン残基の何れかがＣ末端に付加された２種類のキャップ付き分子、即ちＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｐ）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ）を注射した糖尿病ｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７Ｂ６バックグラウンド）で観察された血糖値の変化％を示す。野生型または変異ＦＧＦ２１ポリペプチドのＣ末端に残基を付加した場合、この残基は、結果的に生じるタンパク質におけるその位置によって言及される。したがって、「１８２Ｇ」は、成熟１８１残基野生型または変異体タンパク質のＣ末端にグリシン残基が付加されたことを示す。図３３は、ネイティブＦＧＦ２１が６時間にわたり血糖値を低下させたが、一方、試験した３種類のＦｃ−ＦＧＦ２１変異体全てが、少なくとも１２０時間、持続性の血糖低下活性を示した、ということを示す。融合分子のＦＧＦ２１成分のＣ末端へのプロリン残基の付加を含む分子であるＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｐ）は、最も強力であると思われたし、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ）と比較して、最低血糖値を生じた。
【０２５６】
その後の実験において、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｐ）のin  vivo活性を試験し、Ｃ末端に２個のグリシン付加を含むキャップ付き分子、即ちＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ、１８３Ｇ）のin  vivo活性と比較した。図３４は、ＰＢＳ対照、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ、１８３Ｇ）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｐ）を注射したｏｂ／ｏｂマウスで観察された血糖値の変化％を示す。
【０２５７】
図３４で示されるように、試験した分子は全て、ＰＢＳ対照と比較して、持続性のグルコース低下活性を示した。この実験は、Ｃ末端にプロリン付加を有するＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｐ）が、プロリンキャップなしの分子、例えばＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）と比較して、グルコース低下効力のわずかな増強を示したという以前の結果（図３３）を確証した。しかしながら、Ｃ末端での２個のグリシン残基の付加、例えばＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、１８２Ｇ  １８３Ｇ）は、分子のin  vivo効能を低減すると思われ、in  vivoグルコース低下作用の持続時間を短縮した。
【０２５８】
図３５は、ＰＢＳ対照またはＦＧＦ２１変異ポリペプチドＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ｙ１７９Ｓ）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ｙ１７９Ａ）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｓ）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｇ）を注射した糖尿病ｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７Ｂ６バックグラウンド）で観察された血糖値の変化％を示す。全ての変異体が、同様の作用持続時間で同様のグルコース低下活性を示した。
【０２５９】
図３６は、ビヒクル対照、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ｙ１７９Ｆ）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）を注射した糖尿病ｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７Ｂ６バックグラウンド）で観察された血糖値の変化％を示す。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）と比較して、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ｙ１７９Ｆ）は、血糖低下に際して効力が低かった。しかしながら、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（アミノ酸位置１８０のアラニンがグルタミン酸に変異）は、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）よりも効力が高く、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）と比較して、血糖値をさらに２０％低下させた。これらのデータは、Ａ１８０Ｅ変異が、in  vivoでＣ末端分解を低減し、それにより、その分子のin  vivo効能および効力を改善し得た、ということを示唆する。
【実施例２２】
【０２６０】
アカゲザル試験
【０２６１】
本明細書中に記載の方法を用いて、Ｆｃ−リンカー−ＦＧＦ２１構築物を作製した。構築物は、Ｌ１５  （Ｇｌｙ）５−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）３−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒリンカー配列（配列番号２８）にＣ末端で融合されたＩｇＧ１  Ｆｃ配列（配列番号１１）を含み、これは次に、成熟ＦＧＦ２１配列（配列番号４）のＮ末端にＣ末端で融合され、これに２つの変異Ｌ９８ＲおよびＰ１７１Ｇが導入された。次に、本明細書中に記載のとおり、この構築物を発現させ、精製した。二量体形態のタンパク質を単離し、これは、各単量体のＦｃ領域間の分子間ジスルフィド結合を介して連結された。この分子は、本実施例２２で「Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）」と呼ばれ、配列番号４３のアミノ酸配列を有し、配列番号４２によりコードされる。この実施例において、ＦＧＦ２１は、ＦＧＦ２１の成熟型、即ち配列番号４を指す。
【０２６２】
２２．１  試験計画
【０２６３】
ＢＭＩが３５を超える非糖尿病雄アカゲザルに、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）構築物を長期にわたり皮下（「ＳＣ」）投与した。成熟ＦＧＦ２１（即ち配列番号４）またはビヒクル対照の何れかでサルの他の２つの群（１群あたりｎ＝１０）を処置した。
【０２６４】
任意の試験化合物の投与前に４２日間、動物を順化させ、次いで１０の群に分けて、図３７のグラフに示すように、盲検で試験化合物または対照物質の複数回皮下注射を施した。要するに、各動物に化合物またはビヒクルを１日１回注射した。ＦＧＦ２１を毎日投与し、一方で、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）を毎週投与した。図３７で示されるように、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）およびＦＧＦ２１用量を２週間毎に漸増した。この実験全体を通して、体重および摂餌を監視した。開発業務受託機関に対して処置が分からないようにした。
【０２６５】
処置開始前に、２回の経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）を実施した。曲線下面積（ＡＵＣ）および体重に基づく動物の分布が同様である３つの等価の群に動物を振り分けるために、ＯＧＴＴ１を用いた。第一のＯＧＴＴ（ＯＧＴＴ１）の群の振り分けを確認するために、第二のＯＧＴＴ（ＯＧＴＴ２）の結果を用いた。１回の試験（ＯＧＴＴ１）と次の試験（ＯＧＴＴ２）のＯＧＴＴプロファイルが一致しなかったサルは除外した。ＯＧＴＴ１および２の結果を図３８Ａおよび３８Ｂで示し、ＡＵＣ測定値は図３８Ｃに示す。基線体重は図３８Ｄおよび表２０に示す。
【０２６６】
低、中および高用量の各用量処置の終了時に２週間毎にＯＧＴＴ３、４および５を実施した。絶食動物から毎週血液試料を収集し、グルコース、インスリン、トリグリセリド値ならびに試験化合物レベルを測定するために使用した。３週間の洗い出し期間中も、血液試料を毎週収集した。
【０２６７】
基線ＯＧＴＴ１およびＯＧＴＴ２は、正常動物で見られるような予測グルコースプロファイルを示し、３０分で血漿グルコースが最大となり、３つの異なる群に関する安定ＡＵＣを実証した。
【０２６８】
血漿化学に関する空腹時基線値を表２０に示す。治療開始前に収集した血液試料において、血漿化学測定を実施した。
【表２０】
0005823954.tif 000027
【０２６９】
３つの異なる用量レベルを選択し、ＦＧＦ２１およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）に関して、それぞれ、低用量は０．１および０．３ｍｇ／ｋｇであり、中用量は０．３および１ｍｇ／ｋｇであり、高用量は、１および５ｍｇ／ｋｇであった。マウスにおいて観察された用量応答に基づいて用量レベルを選択し、用量投与レジメンは、ヒトにおける予測注射頻度に基づいた。低および中用量に関してはＦＧＦ２１の等モル用量を用い、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）高用量は５ｍｇ／ｋｇに上げた（即ち、３ｍｇ／ｋｇの代わりで、これは、１ｍｇ／ｋｇ  ＦＧＦ２１用量と等モルであった）。
【０２７０】
２２．２  体重に及ぼす試験化合物の作用
【０２７１】
この実験では、毎週測定される体重に及ぼす試験化合物の作用を測定するために、アカゲザルの３つの異なる群において、基線からの％体重変化を毎週算定した。３週間の洗い出し期間中も、体重を測定した。表２０には、各群に関する基線体重値が含まれる。
【０２７２】
試験全体を通して、試験化合物の投与前および投与後に、体重を追跡調査した。ビヒクル動物の基線からの体重変化％は経時的に増大し、一方、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）およびＦＧＦ２１で処置した動物の体重は、図３９で示されるように、６週間の処置期間の経過中、用量依存的に減少した。以前にげっ歯類で観察されたように（Ｘｕら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５８（１）：２５０−９（２００９））、ＦＧＦ２１での処置は、体重を統計学的に有意に低減した。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）は、ＦＧＦ２１よりも高い曝露を示し（それぞれ図４８および図４７）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）がＦＧＦ２１よりも顕著な体重減少を示したという所見に対する考え得る説明を提供した。
【０２７３】
２２．３．インスリン値に及ぼす試験化合物の作用
【０２７４】
一晩絶食させた後または午後の食餌の後に収集した血液試料中で、インスリン値を測定した。
【０２７５】
ビヒクル、ＦＧＦ２１またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の何れかで処置したアカゲザルにおいて、ならびに３週間の洗い出し期間中に、毎週、アカゲザルの空腹時血漿インスリン値を測定した。最終Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）注射の約５日後、および最終ＦＧＦ２１注射の約２１時間後に、空腹時血液試料を採取した。
【０２７６】
高用量処置中、ビヒクルまたはＦＧＦ２１の何れかでの処置の第５および第６週の間、給餌状態での血漿インスリン値をアカゲザルで測定した。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）注射の約３日後および最終ＦＧＦ２１注射の約２時間後に、給餌状態での血液試料を採取した。図４０は、全９週間試験中の空腹時インスリン値に及ぼすビヒクル、ＦＧＦ２１およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の作用を示し、一方、図４１は、第５および６週の間に採取した試料から確定された給餌状態でのインスリン値を示す。
【０２７７】
要約すると、２種類の最大用量で、ＦＧＦ２１およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の両方が、空腹時および給餌状態での血漿インスリン値を統計学的に有意に低減した。グルコース値増大が観察されることなく、ＦＧＦ２１およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）で処置した動物のインスリン値が低減されたという観察は、インスリン感受性増大を示す。
【０２７８】
２２．４  ＯＧＴＴ（グルコースおよびインスリン）に及ぼす試験化合物の作用
【０２７９】
処置開始後、３回のＯＧＴＴ（ＯＧＴＴ３、４および５）を実施した。ビヒクル、ＦＧＦ２１またはＦｃ−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）で６週間処置した動物において（高用量漸増レジメンの最後の２週に対応）、ＯＧＴＴ５グルコースおよびインスリン値プロファイルを測定した。最終Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）注射の約７日後および最終ＦＧＦ２１注射の約２１時間後に、ＯＧＴＴ５を実行した。ＯＧＴＴ５グルコースおよびインスリンプロファイルを、それぞれ図４２および図４３に示す。図４２で示されるように、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）で処置した動物は、最大用量でのみ、そして最終測定時点で、ビヒクル処置動物と比較して、グルコースクリアランス改善を示した。最終用量投与の終了時に、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）は、グルコースクリアランスの最強の改善を示した。ＦＧＦ２１は、グルコースクリアランスの改善を示さなかった。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）は、ＦＧＦ２１よりも大きな曝露を示し（それぞれ図４８および図４７）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）がＦＧＦ２１よりもグルコースクリアランスにおいて顕著な作用を示したという観察に関して考え得る説明を提供した。ＯＧＴＴ５中のインスリン値は、ビヒクルで処置した動物と比較して、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）で処置した動物において最終測定時点で統計学的に有意に低下した。
【０２８０】
図４４で示されるように、アカゲザルの３つの異なる群における、低、中および高用量の各々の終了時に実施した３回のＯＧＴＴ（ＯＧＴＴ３、４および５）に関して、基線からのグルコースＡＵＣ変化％を算定した。最終Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）注射の約７日後および最終ＦＧＦ２１注射の２１時間後にＯＧＴＴ５を実行し、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）が、統計学的に有意にＡＵＣ５を低減することが示された。各群に関する基線ＯＧＴＴ値を、図３８Ｃに示す。
【０２８１】
ＯＧＴＴを実施しない日に、空腹時血漿グルコース値を測定した。３つの動物群中で測定した空腹時血漿グルコース値において、統計学的有意差は認められなかった。
【０２８２】
２２．５  トリグリセリド値に及ぼす試験化合物の作用
【０２８３】
ビヒクル、ＦＧＦ２１またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の何れかで処置したアカゲザルで毎週、ならびに３週間の洗い出し期間中に、アカゲザルにおいて、空腹時血漿トリグリセリド値の変化％を算定した。最終Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）注射の約５日後および最終ＦＧＦ２１注射の約２１時間後に、空腹時血液試料を採取した。処置開始後、毎週、トリグリセリド値を測定し、基線からの変化％を図４５で示し、空腹時基線値を表２０に示す。
【０２８４】
図４５示されるように、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）またはＦＧＦ２１の何れかで処置した動物は、トリグリセリド値の用量依存的低下を示し、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）は、ＦＧＦ２１と比較して、最大の低下作用を有した。
【０２８５】
図４６は、ビヒクルまたはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）またはＦＧＦ２１での治療の第５および６週の間の、給餌状態でのアカゲザルから得た試料中の血漿トリグリセリド値を示す。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）注射の約３日後および最終ＦＧＦ２１注射の約２時間後に、給餌状態での血液試料を採取した。ＦＧＦ２１およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）で処置した動物における給餌状態での血漿トリグリセリド値は、ビヒクルで処置した動物のトリグリセリド値と比較して、統計学的に有意に低下した（図４６）。
【０２８６】
２２．６  試験化合物の濃度
【０２８７】
試験期間全体を通して、ほぼ等モル用量レベルで投与した試験化合物の曝露を査定した。投与前および最終注射の約５日後に、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の濃度を測定した。投与前ならびに５、１２、１９および２６日目に、ＦＧＦ２１レベルを測定した。最終注射の約２１時間後に、血液試料を採取した。
【０２８８】
各サルにおける試験化合物の個々の濃度を、図４７および４８に示す。図４７で示されるように、ＦＧＦ２１処置群の動物の大多数は、定量限界より低い濃度を有した。図４８は、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）処置群の動物が、各用量投与相中（同じ用量強度で毎週２回の用量投与）、検出可能レベルのＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）を有した、ということを示す。各用量投与相からの平均濃度は、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）に関して０．３から５ｍｇ／ｋｇに、ほぼ用量と比例して増大した。両化合物に関して、各用量漸増相内での第一および第二の毎週用量投与後に一定濃度であることにより実証されるようなわずかな蓄積が認められる。無処置相（洗い出し期間）の間、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）レベルは、ほぼ４７日目（最終投与の１２日後）まで検出可能であり、その後は、定量（ＬＬＯＱ）の下限より低かった。
【０２８９】
各ＯＧＴＴ中、試験化合物の曝露も監視した。低および中用量のＦＧＦ２１処置後、ＯＧＴＴ３および４中は、ＦＧＦ２１は検出可能ではなかった。しかしながら、高用量処置後、ＯＧＴＴ５中に、測定可能なレベルが観察された。図４９で示されるように、漸増レベルでの第三から第五のＯＧＴＴにわたり、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）レベルの用量比例的増大が観察された。
【０２９０】
化合物レベルデータは、用量漸増方式で、各化合物、即ちＦＧＦ２１およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の予測量に動物が曝露されたことを確証する。測定されたＦＧＦ２１の量の大幅な変動が観察されたが、これは、最終用量投与の約２１時間後に試料採取を実施し、ＦＧＦ２１の半減期が約１時間であることを考慮すると、予期される結果であった。
【０２９１】
２２．７  結論
【０２９２】
ＦＧＦ２１は、最高用量で、空腹時および給餌状態での血漿トリグリセリドおよびインスリン値を低下させ、体重を減少させた。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）は、最高用量で、ＯＧＴＴを改善し、インスリン値を低下させ、用量依存的に空腹時および給餌状態での血漿トリグリセリド値ならびに体重を低減した。ＦＧＦ２１およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）はともに、非糖尿病アカゲザルにおいて多数の代謝パラメーターを低下させた。インスリンおよびトリグリセリド値の低下は、給餌状態において、循環化合物レベルが同様の範囲である場合、ＦＧＦ２１とＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）との間で同一であった。その改善された特性のため、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）は、測定したパラメーターのほとんどにおいてＦＧＦ２１を上回り、週に１回投与して、代謝パラメーターにおける効力を観察し得た。
【実施例２３】
【０２９３】
Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）Ｆｃ融合分子
【０２９４】
リンカーによりＩｇＧ１  Ｆｃに連結されたＦＧＦ２１変異体を含むＦｃ融合物を生成した。Ｆｃ融合物のＦＧＦ２１構成成分は、ＦＧＦ２１のポリペプチド配列中に工学処理された３つの点変異、すなわち、Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ（配列番号４として提供されるＦＧＦ２１の成熟形態に基づいて番号付けした）を含んだ。この分子を、ヒトＦｃ（配列番号１１）を、ＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３１）の配列を含む１５アミノ酸リンカーを介してＬ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ変異体ＦＧＦ２１（配列番号３９）のＮ末端に接合することにより構築した。この分子を、「Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）」と名づけ、その全長アミノ酸配列を、図５０に、そして配列番号４７で示す。それは、配列番号４６の核酸によりコードされる。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）のin  vitro試験は、それが、β−Ｋｌｏｔｈｏを過剰発現する組換え細胞株におけるＥｒｋリン酸化の強力な刺激剤であることを示した。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、野生型ＦＧＦ２１のＦｃ融合物またはＦＧＦ２１−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４５）のＦｃ融合物と比較して、β−Ｋｌｏｔｈｏ結合親和性増強も示した。糖尿病動物モデルに注射した場合、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、血糖値を低減し、体重を減少し、週２回注射に適していた。
【０２９５】
２３．１  Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）のin  vitro活性
【０２９６】
ＥＬＫ−ルシフェラーゼin  vitro検定において、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）が野生型ＦＧＦ２１または野生型ネイティブＦＧＦ２１のＦｃ融合物と類似の活性を保持するか否かを調べるために、実験を実施した。
【０２９７】
組換えヒト２９３Ｔ腎臓細胞系を用いてＥＬＫ−ルシフェラーゼ検定を実施したが、この場合、２９３Ｔ細胞はβ−Ｋｌｏｔｈｏおよびルシフェラーゼレポーター構築物を過剰発現する。β−ｋｌｏｔｈｏは、ＦＧＦ２１がＦＧＦ受容体を活性化し、細胞内シグナル伝達（例えば、Ｅｒｋリン酸化）を誘導するために必要とされる共受容体である。Ｅｒｋ−ルシフェラーゼ受容体構築物は、ＧＡＬ４−ＥＬＫ１および５ｘＵＡＳ−ルシフェラーゼ受容体をコードする配列を含有する。５ｘＵＡＳ−ルシフェラーゼ受容体は、Ｇａｌ４結合部位の５個のタンデムコピーを含有するプロモーターにより駆動される。受容体活性は、リン酸化Ｅｒｋのレベルにより調節され、ＦＧＦ２１活性を間接的に監視し定量するために用いられる。
【０２９８】
異なる濃度の野生型ＦＧＦ２１、野生型ＦＧＦ２１のＦｃ融合物、Ｆｃ−Ｌ１５−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）の存在下で２９３Ｔ細胞を６時間培養し、次いでルシフェラーゼ活性に関して細胞溶解物を検定することにより、ＥＬＫ−ルシフェラーゼ検定を実施した。ＦＧＦ２１構築物の各々に関するＥＬＫ−ルシフェラーゼ検定で得られた発光をｙ軸で表し、化合物濃度をｘ軸で表す。
【０２９９】
図５１は、Ｅｒｋ−ルシフェラーゼ検定における試験化合物の用量応答を示す。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、ＦＧＦ２１野生型のＦｃ融合物と比較して同様に活性を保持したが、これは、Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅによる変異の組合せがＦＧＦ２１の生体活性を変えなかった、ということを示唆する。野生型ＦＧＦ２１と比較して、Ｆｃ融合構築物は、過剰発現された共受容体β−Ｋｌｏｔｈｏを用いたこの細胞ベースの検定においてわずかに低減された効力と最大活性を示した。
【０３００】
２３．２  異なるリンカー配列を含むＦｃ−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）融合物のin  vitro活性
【０３０１】
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃを、異なるリンカー配列ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２８）を介してＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）に融合することにより、同様のＦｃ融合類似体を生成した。このリンカーをＬ１５と命名し、その結果生じた融合分子を、Ｆｃ−Ｌ１５−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号５７）と名づけた。この実験において、Ｆｃ−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）融合物の活性に及ぼす異なるリンカー配列の作用を試験した。
【０３０２】
異なる濃度のＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）およびＦｃ−Ｌ１５−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）の存在下で２９３Ｔ細胞を６時間培養し、次いでルシフェラーゼ活性に関して細胞溶解物を検定することにより、ＥＬＫ−ルシフェラーゼ検定を実施した。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）はＦｃ−Ｌ１５−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）と同様の活性を示したが、これは、異なるリンカー配列、例えば（Ｇ４Ｓ）３またはＬ１５リンカーがＦｃ−ＦＧＦ２１融合物の生体活性に有意の影響を及ぼさなかった、ということを示す。
【０３０３】
２３．３  結合検定におけるβ−Ｋｌｏｔｈｏに関するＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）のin  vitro結合親和性
【０３０４】
Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）とヒトおよびアカゲザルβ−Ｋｌｏｔｈｏとの結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ溶液平衡結合検定で試験した。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）の親和性は、Ｌ９８ＲおよびＰ１７１Ｇ変異のみを有するＦｃ融合ＦＧＦ２１、すなわちＦｃ−Ｌ１５−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）とも比較された。
【０３０５】
アミンカップリングを用いて、ニュートラアビジンをＣＭ５チップ上に固定した。ビオチン−ＦＧＦ２１を、第二のフローセル上に捕捉して、約１５００ＲＵとした。第一フローセルを、バックグラウンド対照として用いた。５倍希釈（０．０３〜２０００ｎＭ）でのＦＧＦ２１変異体を、ＰＢＳ＋０．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、０．００５％Ｐ２０中の１０ｎＭヒトまたは２５ｎＭカニクイザルβ−Ｋｌｏｔｈｏとともに、室温で１時間、インキュベートした。ビオチン−ＦＧＦ２１表面上に注射することにより、混合溶液中の遊離β−Ｋｌｏｔｈｏの結合を測定した。溶液中のＦＧＦ２１変異体の非存在下で、１００％β−Ｋｌｏｔｈｏ結合シグナルを確定した。ＦＧＦ２１変異体の濃度増大に伴うβ−Ｋｌｏｔｈｏ結合応答低減は、β−Ｋｌｏｔｈｏが溶液中のＦＧＦ２１変異体と結合しつつあったことを示し、これが、固定化ビオチン−ＦＧＦ２１表面にβ−Ｋｌｏｔｈｏが結合するのを遮断した。ＦＧＦ２１のモル濃度に対する混合物の相対結合を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｚｍ５を用いてプロットした。同一ソフトウェアで一部位競合非線状適合を用いて、ＥＣ５０を算定した。
【０３０６】
図５２は、ヒト（右）およびアカゲザルβ−Ｋｌｏｔｈｏ（左）とのＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）およびＦｃ−Ｌ１５−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）のＢｉａｃｏｒｅ溶液平衡結合検定からの結果を示した。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、Ｆｃ−Ｌ１５−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）と比較して、ヒトおよびアカゲザルβ−Ｋｌｏｔｈｏとの結合活性の少なくとも２倍の改善を示した。
【０３０７】
２３．４  糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスにおけるＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）のin  vivo効力
【０３０８】
Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）が代謝的有益作用、例えば血糖降下および体重低減を発揮し得るか否かという疑問を、ｄｂ／ｄｂマウスで試験した。試験は、１回注射後のＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）の持続時間および用量応答を検査するようにも意図された。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）を、０．１、０．３、１および３ｍｇ／ｋｇの用量で、糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスに腹腔内注射した。ビヒクル（１０ｍＭトリス、２．２％スクロース、３．３％ソルビトール、ｐＨ８．５）処置群も、試験に含まれた。基線（注射前）、ならびに注射後６、２４、７２、１２０および１６８時間に、各動物（ｎ＝１０匹／群）から血液試料を得た。ＯｎｅＴｏｕｃｈ  Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（LifeScan,  Inc.  Militas,  CA）で血糖値を測定した。基線（０時間目）、ならびに注射後２４、７２、１２０および１６８時間に、体重を測定した。
【０３０９】
図５３Ａは、ビヒクルまたはＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）注射後の種々の時点でのｄｂ／ｄｂマウスにおける血糖値を示す。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、ｄｂ／ｄｂマウスにおける血糖値の用量依存的低下を生じた。最大グルコース低減は、基線から、またはビヒクル処置群と比較して、約５０％であった。最大作用は、注射後６時間以内に到達され、注射後１２０時間持続した。血糖値は、約１６８時間で基線に戻り始めた。半最大作用を達成するのに必要とされる用量である概算ＥＤ５０は、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）に関しては、ｄｂ／ｄｂマウスで約１ｍｇ／ｋｇであった。
【０３１０】
図５３Ｂは、ｄｂ／ｄｂマウスへの１回注射後の体重に及ぼすＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）の作用を示す。結果は、０時間目（注射前）からの体重の変化として表される。ビヒクル処置マウスは、７日試験期間中、漸増性の且つ安定した体重増を示した。しかしながら、体重増加速度は、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）処置マウスでは、用量依存的に抑制された。用量が高いほど、体重増加抑制は長くなった。一例では、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、３ｍｇ／ｋｇでは５日間、１ｍｇ／ｋｇでは３日間、または０．３ｍｇ／ｋｇでは１日間、体重増を鈍らせた。体重増加速度は、その後回復した。体重低減に関するＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）の概算ＥＤ５０は、この実験では約１ｍｇ／ｋｇであった。
【０３１１】
２３．５  異なる注射頻度でのＤＩＯマウスにおけるＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の効力比較
【０３１２】
本試験は、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）がＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）より低頻度で注射されるが、しかし同様の効力を達成し得るか否かを確定することであった。週１回（Ｑ７Ｄ）または２週毎に１回（Ｑ１４Ｄ）投与されるＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）、あるいは週２回（ＢＩＷ）、Ｑ７ＤまたはＱ１４Ｄで投与されるＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）を用いて、ＤＩＯマウスで本試験を実行した。
【０３１３】
飽和脂肪酸を濃化した脂肪からのエネルギー６０％を含有する高脂肪餌（Ｄ１２４９２、Research  Diets,  Inc.,  New  Brunswick,  NJ）を、４週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに給餌することにより、ＤＩＯマウスを調製した。高脂肪餌給餌の１２時間後、体重および血糖値を測定した。以下の合計７群で試験した：ビヒクル（Ｑ７Ｄで投与）；Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（Ｑ７ＤまたはＱ１４Ｄで投与）；あるいはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（ＢＩＷ、Ｑ７ＤまたはＱ１４Ｄで投与）。注射は腹腔内であり、試験を３１日間実行した。体重は毎週測定した。試験２８日目にＧＴＴを実施し、３１日目に試験を終了した。
【０３１４】
図５５は、異なる用量投与頻度で、ビヒクル、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）で処置したマウスにおけるＧＴＴプロファイルを示す。グルコース耐性は、ビヒクルと比較した場合、Ｑ７ＤまたはＱ１４Ｄ用量投与でＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）で処置したマウスにおいて、統計学的に有意に改善されたが、これは、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）がＤＩＯマウスにおけるＱ１４Ｄ投与に関して有効であり且つ適している、ということを示唆する。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）は、ＢＩＷまたはＱ７Ｄで投与された場合はグルコース耐性を改善したが、しかしＱ１４Ｄでは改善せず、これは、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）がマウスにおけるＱ１４Ｄ注射に関して余り適していないかもしれない、ということを示唆する。Ｑ７ＤまたはＱ１４ＤでのＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）の効力は、それぞれ、ＢＩＷまたはＱ７ＤでのＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の効力に匹敵したが、これは、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）を、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の２分の１の投与頻度で投与し得ることを示唆する。
【０３１５】
図５６は、異なる用量投与頻度で、ビヒクル、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）で処置したマウスにおける基線（０日目）からの体重の変化を示す。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）でＱ７Ｄ処置したマウスは、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）でＢＩＷ処置したマウスと同様に、有意の体重損失を示した。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）でＱ１４Ｄで、またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）でＱ７Ｄで処置したマウスでは、体重は中等度に低減された。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）でＱ１４Ｄ処置したマウスでは、有意の体重作用は観察されなかった。体重に及ぼす作用は、上記のようにＧＴＴに及ぼす作用と一致したが、これは、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）がＱ１４Ｄ用量投与で有効であり、同一作用を達成するために要する注射頻度はＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の約２分の１である、ということを示唆する。
【実施例２４】
【０３１６】
ＦＧＦ２１変異体を含むヒドロゲル製剤
【０３１７】
タンパク質ベースの治療薬のための製剤として、ヒドロゲルは、多数の所望の特性を提供する。例えば、ヒドロゲルは、ヒドロゲル中に組入れられるタンパク質のネイティブ構造および機能を保存する。さらに、それらは良好に耐容され、ポリマーおよび架橋の型によって、それらは生分解性であり得る。さらにヒドロゲルは、従来、タンパク質の持続性放出のために、首尾よく用いられてきた。したがって、本明細書中に開示されるＦＧＦ２１変異体のための考え得る送達方法として、ヒドロゲルを調べた。
【０３１８】
この実施例に記載される実験全てに関して、ヒドロゲルを以下のように調製した。ＰＢＳ中の１．２５％ウシゼラチン（Sigma）溶液を調製した。架橋剤無水メタクリル酸を、１６：１、２４：１または３２：１のモル比（ＭＡ対ゼラチン）に付加した。その結果生じた溶液を水に対して透析して、任意の非重合化メタクリルアミドを除去して、ヒドロゲルビヒクルを作製した。最後に、ヒドロゲルビヒクルを凍結乾燥し、ＦＧＦ２１変異体を含むヒドロゲルを作製する準備ができるまで、４℃で保存した。この調製物を用いて、本明細書中に開示されるＦＧＦ２１変異体のいずれかを含むよう、その後、適合され得るゼラチンベースのヒドロゲルビヒクルを調製し得る。
【０３１９】
次に、特定のＦＧＦ２１変異体を有するヒドロゲルを調製した。１０％凍結乾燥化メタクリル酸ゼラチンヒドロゲルビヒクルから始めて、溶液を調製した。ヒドロゲルビヒクルを温め、次いで、遠心分離して、凍結乾燥ＭＡゼラチンヒドロゲルビヒクルを溶解し、液化した。選択ＦＧＦ２１タンパク質（当該実施例では、ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）、（配列番号３７））を、次に、液化ゼラチン溶液に付加して、既定濃度にした。次いで、ＴＥＭＥＤストック溶液を付加した。ＫＰＳストック溶液を次に付加し、溶液を静かに混合した。１ｍｌ注射器に充填して２００μｌとして、室温で１．５〜２時間固化させた。注射器を−２０℃で保存して、４℃で一晩解凍した後、使用した。１０ｍＭトリス、９％スクロース、ｐＨ８．５を含み、ＦＧＦ２１変異体を付加しないヒドロゲルビヒクルを、対照として用いた。
【０３２０】
in  vivo実験のために、注射器を、３７℃で約１０分間、加熱パッド上に置いた後、動物に注射した。
【０３２１】
２４．１  種々の架橋比での１０％ヒドロゲルから放出されるＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）のin  vitro活性
【０３２２】
この実験の目的は、ＥＬＫ−ルシフェラーゼin  vitro検定において、ヒドロゲルから放出されるＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）が、ネイティブ型のＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）と比較して、生物学的に活性であるか、否かを試験することであった。
【０３２３】
ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）を調製し、上記のように１６：１、２４：１および３２：１でのメタクリル酸ゼラチン架橋比を有する１０％メタクリル酸ゼラチンヒドロゲル中に混入した。次いで、ヒドロゲルをin  vitro緩衝溶液中に分散して、ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の放出を可能にした。１００または１５０時間後に媒質を収集し、ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）活性に関してin  vitro検定に付した。分析的検定（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除ＨＰＬＣおよび逆相ＨＰＬＣ）は、放出されたＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）が全ての時点で無傷であったことを示す。
【０３２４】
組換えヒト２９３Ｔ腎臓細胞系を用いてＥＬＫ−ルシフェラーゼ検定を実施したが、この場合、２９３Ｔ細胞はβ−Ｋｌｏｔｈｏおよびルシフェラーゼレポーター構築物を過剰発現する。β−Ｋｌｏｔｈｏは、そのＦＧＦ受容体の活性化のためにＦＧＦ２１により必要とされる共受容体である。この検定に用いられるＦＧＦ受容体は、２９３Ｔ腎臓細胞中で発現される内因性ＦＧＦ受容体である。ルシフェラーゼ受容体構築物は、ＧＡＬ４−ＥＬＫ１、ならびにＧａｌ４結合部位の５個のタンデムコピーを含有するプロモーターにより駆動されるルシフェラーゼ受容体（５×ＵＡＳ−Ｌｕｃ）を含有する。ルシフェラーゼ活性は、リン酸化Ｅｒｋ／ＥＬＫ１のレベルにより調節され、ＦＧＦ２１活性を間接的に監視し定量するために用いられる。
【０３２５】
異なる濃度のネイティブ型のＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）またはヒドロゲル放出ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の存在下で、２９３Ｔ細胞を６時間培養し、次いでルシフェラーゼ活性に関して細胞溶解物を検定することにより、ＥＬＫ−ルシフェラーゼ検定を実施した。図５７は、ＥＬＫ−ルシフェラーゼ検定からのin  vitroの結果を示す。１６：１、２４：１および３２：１でのメタクリル酸ゼラチン架橋比を有するヒドロゲルから放出されるＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）は生物学的に活性であり、ネイティブ形態のＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）と等価の活性を有した。データは、ヒドロゲルが組込まれたタンパク質の構造および機能を保存し、放出ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）は、培地中で１０〜１５時間後でさえ、活性かつ安定である、ということを実証した。
【０３２６】
２４．２  ｏｂ／ｏｂマウスにおける異なる架橋比でのヒドロゲルＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）のin  vivo効力
【０３２７】
この実験の目的は、２４：１および３２：１のメタクリル酸ゼラチン架橋比で調製されたＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）ヒドロゲルが、in  vivoで生物学的に活性なＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の持続性放出を提供し、最終的に、ネイティブ型のＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）と比較してより長いin  vivo効力を生じるか否かを確定することであった。さらに、in  vitro放出速度の査定に基づいて、メタクリル酸ゼラチンの架橋比が高いほど、組入れられたＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の持続性放出は良好である、ということが確定された。したがって、この実験の別の目的は、２４：１および３２：１のメタクリル酸ゼラチン架橋比で調製された２つのＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）ヒドロゲルを比較することであった。
【０３２８】
ＦＧＦ２１は、多数の生物学的活性、例えば、血糖、インスリン、トリグリセリドまたはコレステロール値を下げる能力；体重を減少させる能力；あるいはグルコース耐性、エネルギー消費またはインスリン感受性を改善する能力を有する。ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）ヒドロゲルをインスリン抵抗性ｏｂ／ｏｂマウスに導入し、そして、血糖を低下し、体重を低減するＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）ヒドロゲルの能力を測定した。in  vivo作業のための手順を、以下に示す。
【０３２９】
上記の手法を用いて、ヒドロゲルを調製した。８週齢ｏｂ／ｏｂマウス（Jackson  Laboratory）を、注射部位で剃毛し、注射直前にイソフルランおよびＯ２で麻酔した。ヒドロゲル（０．２ｍｌ）を皮下にゆっくり注射し、注射後、注射部位にベトボンドを適用した。ビヒクル（１０ｍＭ  トリス、９％スクロース、ｐＨ８．５）またはネイティブＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）も実験に含み、ヒドロゲルと同様に注射した。麻酔から覚醒後、動物をそれらのケージに戻した。注射前ならびに注射後の種々の時点で、例えば注射後０、３、６、２４、７２、１２０、１９２および２６４時間目に、血液試料を採取した。ＯｎｅＴｏｕｃｈ  Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（LifeScan,  Inc.  Milpitas,  CA）を用いて、血糖値を測定した。体重もモニタリングした。
【０３３０】
図５８および５９は、実験の結果を要約する。ビヒクルまたは対照ヒドロゲルと比較して、ネイティブ型のＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）は、注射後３および６時間で血糖値を急速に低減した。しかしながら、ネイティブ型のＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）のin  vivo活性は減衰し、血糖値は注射後２４時間で基線に戻った。ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）ヒドロゲルは、注射後３時間という早期に血糖低減を生じ、活性は、８日まで持続した。２４：１または３２：１の架橋比間に、有意差は認められなかった。ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）ヒドロゲル群は、ビヒクルまたはヒドロゲル単独で処置したマウスより遅い体重増も示した。これらの結果は、２４：１および３２：１のメタクリル酸ゼラチン架橋比で調製されたＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）ヒドロゲルが、in  vivoで生物学的に活性なＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の持続性放出を提供し、最終的には、ネイティブ型のＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）と比較してより長いin  vivo効力を生じ得る、ということを実証した。
【０３３１】
２４．３  ｄｂ／Ｂ６マウスにおける異なる架橋比でのヒドロゲルＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）およびＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）のin  vivo効力
【０３３２】
ウシゼラチン（Sigma）およびいくつかのＦＧＦ２１変異体ならびに構築物、すなわちＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）を用いて、ヒドロゲル製剤を調製した。ヒドロゲル対照も調製した。０．２ｍＬのヒドロゲルを、２１Ｇ針を有する１ｍｌ注射器中に入れた。
【０３３３】
ヒドロゲル対照およびＦＧＦ２１変異体を含むヒドロゲルを、上記のように調製した。８週齢ｄｂ／Ｂ６マウス（Jackson  Laboratory）を、注射部位で剃毛し、注射直前にイソフルランおよびＯ２で麻酔した。ヒドロゲル（０．２ｍｌ）を皮下にゆっくり注射し、注射後、注射部位にベトボンドを適用した。ビヒクル（１０ｍＭ  トリス、９％スクロース、ｐＨ８．５）またはネイティブＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）も実験に含み、ヒドロゲルと同様に注射した。麻酔から覚醒後、動物をそれらのケージに戻した。注射前、ならびに注射後の種々の時点で、例えば注射後０、２４、９６、１６８、２４０、３１２時間目に、血液試料を採取した。ＯｎｅＴｏｕｃｈ  Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（LifeScan,  Inc.  Milpitas,  CA）を用いて、血糖値を測定した。体重もモニタリングした。
【０３３４】
実験計画を以下に示す：
動物群（ｎ＝９匹／群）
Ａ．  対照ヒドロゲル３２：１（１０％）ＭＡ：ＨＵ４              ２００μｌ
Ｂ．  ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）ヒドロゲル３２：１（１０％）ＭＡ：ＨＵ４          ０．５ｍｇ／マウス
（２００μｌ、〜１０ｍｇ／ｋｇ）
Ｃ．  ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）ヒドロゲル３２：１（１０％）ＭＡ：ＨＵ４          １．５ｍｇ／マウス
（２００μｌ、〜３０ｍｇ／ｋｇ）
Ｄ．  Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）
（無ヒドロゲル）、  ３ｍｇ／ｋｇ
【０３３５】
種々のパラメーターを測定した。実験結果を図６０〜６３に示す。図６０は、１４日実験の経過中の血糖の変化を示し、一方、図６１は、同一期間中の血糖の変化％を示す。図６２は、１４日実験の経過中の体重の変化を示し、一方、図６３は、同一期間中の体重の変化％を示す。
【０３３６】
図６０〜６３にグラフで示した実験結果は、以下のように要約される：
【０３３７】
ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）３２：１（１０％）ＭＡ：ＨＵ４は、１０ｍｇ／ｋｇでは、注射後２４時間で血糖を低減するのに有効であり、血糖値は４〜７日で基線に戻った。
【０３３８】
ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）３２：１（１０％）ＭＡ：ＨＵ４は、３０ｍｇ／ｋｇでは、血糖の低減において１０ｍｇ／ｋｇ投与量より有効であり、血糖値は７〜１０日で基線に戻ることが認められた。
【０３３９】
Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、３ｍｇ／ｋｇでは、それ自体、注射後２４時間で血糖を、ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（３０ｍｇ／ｋｇ、ヒドロゲルから）と同程度に低減した。
【０３４０】
ヒドロゲル対照（ＦＧＦ２１変異体を含まなかった）は、血糖の低減において如何なる作用も有さなかった。
【０３４１】
ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）ヒドロゲル群およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（ヒドロゲル中で提供されなかった）は、ヒドロゲル対照で処置したマウスと比較して、体重増の低減を示した。
【実施例２５】
【０３４２】
アカゲザル試験
【０３４３】
本明細書中に記載される方法を用いて、２つのＦｃ−リンカー−ＦＧＦ２１構築物を作製した。１つの構築物は、Ｃ末端で（Ｇｌｙ）５−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）３−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒリンカー配列（配列番号２８）と融合されたＩｇＧ１  Ｆｃ配列（配列番号１１）を含み、これは次に、成熟ＦＧＦ２１配列（配列番号４）のＮ末端と融合されたが、ここで、２つの変異Ｌ９８ＲおよびＰ１７１Ｇを導入した。この分子は、本実施例では、「Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）」（配列番号４３）として言及される。第二の構築物は、Ｃ末端で（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒリンカー配列（配列番号３１）と融合されたＩｇＧ１  Ｆｃ配列（配列番号１１）を含み、これは次に、成熟ＦＧＦ２１配列（配列番号４）のＮ末端と融合されたが、ここで、３つの変異Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１ＧおよびＡ１８０Ｅが導入された。この分子は、本実施例では、「Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）」（配列番号４７）として言及される。これらの構築物を、次に、本明細書中に記載されるように発現し、精製して、そして二量体形態のタンパク質として単離し、この各単量体を、分子間ジスルフィド結合を介して、各単量体のＦｃ領域間に連結した。
【０３４４】
２５．１  試験計画
【０３４５】
グルコース耐性減損（ＩＧＴ）の特質を有するカニクイザルで、試験を実行した。サルは、８〜１８歳であった。それらの体重は５〜１５ｋｇの範囲であり、ＢＭＩは３２〜７０ｋｇ／ｍ２の範囲であった。４４匹のサルを６週間馴化させた後、化合物投与を開始した。馴化期間中、椅子拘束、皮下注射（ＰＢＳ、０．１ｍｌ／ｋｇ）、強制飼養（水、１０ｍｌ／ｋｇ）、非ＯＧＴおよびＯＧＴＴ試料用の採血を含めた手順に慣れるよう、４週間、週４回、サルを訓練した。４週間の訓練後、基線ＯＧＴＴおよび血漿代謝パラメーターを測定した。４４匹のサルから４０匹を選択し、３つの処置群に無作為化して、体重、ＯＧＴＴ  ＡＵＣ応答、ならびに血漿グルコースおよびトリグリセリドレベルの同様の基線レベルを達成した。
【０３４６】
盲検で、試験を実行した。ビヒクル（ｎ＝１４）、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（ｎ＝１３）およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（ｎ＝１３）を、化合物Ａ、ＢおよびＣとして標識して、皮下注射により週１回投与した。低（０．３ｍｇ／ｋｇ）、中（１ｍｇ／ｋｇ）レベルから高（３ｍｇ／ｋｇ）レベルまで、用量漸増方式で化合物を投与し、用量を３週間毎に漸増した。９週間の化合物処置後、化合物洗い出しおよび処置からの回復のために、さらに３週間、動物をモニタリングした。食餌摂取量、体重、臨床化学およびＯＧＴＴを、試験全体を通してモニタリングした。食餌摂取量を、毎食測定した。体重を毎週測定した。血液試料を、各注射後５日に毎週収集して、グルコース、トリグリセリド、総コレステロール、ＨＤＬ−およびＬＤＬ−コレステロールレベルを測定した。処置開始後３週間毎に（各用量レベルの終了時）、ＯＧＴＴを実行した。処置開始日を０と称し、詳細な試験計画を図６４に示す。
【０３４７】
この実施例に示される結果は、９週間処置の終了時に収集したデータである。
【０３４８】
２５．２  摂餌量に及ぼす試験化合物の作用
【０３４９】
動物に１日２回給餌し、各動物は、馴化期間中に確立された１２０ｇの処方餌を摂取した。各食餌時間後に、残っている餌を取り出し、計量して、摂餌量を算定した。給餌時間は午前８時から８時３０分まで（±３０分）、次に、午後４時３０分から午後５時まで（±３０分）であった。おやつを出すために、毎日午後１１時３０分から１２時３０分（±３０分）に、リンゴ（１５０ｇ）を各動物に与えた。
【０３５０】
ビヒクルと比較して、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、サルにおける摂餌量を低減した（図６５、６６および６７）。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、０．３ｍｇ／ｋｇ用量で、午前の食餌、果物の食餌、および午後の食餌を含めた全ての食餌における摂餌量を抑制した。しかしながら、その作用は減少し、用量を１ｍｇ／ｋｇに漸増した場合、処置の約３０日後に、摂餌量は基線または対照レベルに戻った。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）は、用量を１および３ｍｇ／ｋｇに漸増した場合、午前の摂餌量に有意の作用を及ぼさず、午後の食餌時間における摂餌量を控えめに低減しただけであった。しかしながら、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）は、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）と同様に果物摂取量を低減した。全体として、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）より強い摂餌量を抑制する作用を示した。摂餌量に及ぼす作用は短期であると思われ、摂餌量は処置の約３０日後に回復した。
【０３５１】
２５．３  体重に及ぼす試験化合物の作用
【０３５２】
試験全体を通して、体重を毎週モニタリングした。９週間処置の経過中、ビヒクルで処置した動物の体重は一定のままであったが、一方、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）で処置した動物の体重は漸次減少した。図６８に示すように、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）より顕著な体重減少を生じた。
【０３５３】
２５．４  体格指数（ＢＭＩ）、皮下脂肪厚（ＳＦＴ）および腹囲（ＡＣ）に及ぼす試験化合物の作用
【０３５４】
試験全体を通して毎週、体重を測定する場合には試験化合物の投与の前および後の両方で、ＢＭＩ、ＳＦＴおよびＡＣをモニタリングした。ＢＭＩは、個体の体重をその身長の二乗で割った値と定義される。ＳＦＴは、その部位で一定の張力を発揮する特定の内径での皮膚の二重層とその下の脂肪の厚みである。ＢＭＩ、ＳＦＴおよびＡＣは、特に皮下脂肪を示す身体組成の比較的正確、簡単且つ安価な測定値である。ビヒクルで処置した動物は、試験全体を通して、相対的に安定したＢＭＩ、ＳＦＴおよびＡＣを示した。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）およびＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）で処置した動物は、９週間試験の経過中、ＢＭＩ、ＳＦＴおよびＡＣのレベル低下を示したが、これは、両化合物が脂肪量の低減を生じた、ということを示唆する。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、ＢＭＩ、ＳＦＴおよびＡＣに関して、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）より有効で、且つ顕著な減少を生じた。結果を、それぞれ、図６９、７０および７１に示す。
【０３５５】
２５．５  空腹時血糖値に及ぼす試験化合物の作用
【０３５６】
血液を、一晩絶食させた動物から採取した。毎週、各注射後５日目に、採血を実行した。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）はともに、空腹時血糖値を低減した。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、０．３ｍｇ／ｋｇの用量で空腹時血糖値を低減し、最大糖低減は、用量を１ｍｇ／ｋｇに漸増した場合に達成された。しかしながら、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）は、試験した最高用量（３ｍｇ／ｋｇ）で血糖値のわずかな低減を生じただけであった。したがって、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）より有効であり、より顕著な血糖低減を生じた。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）で処置したサルのいずれにおいても、低血糖症は観察されなかった。図７２は、試験経過中の空腹時血漿グルコースのレベルを示す。
【０３５７】
２５．６  経口グルコース耐性試験（ＯＧＴＴ）に及ぼす試験化合物の作用
【０３５８】
処置開始の前および後に、ＯＧＴＴを実行した。用量投与後ＯＧＴＴを３週間毎に実施して、各用量レベルでの化合物作用を試験した。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、０．３から３ｍｇ／ｋｇまでの試験した用量全てで、グルコース耐性を改善した。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）処置に応答して、グルコースレベルが低減し、ボーラスグルコース負荷試験後のグルコース変動が増大した。用量応答は観察されなかったが、これは、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）が０．３ｍｇ／ｋｇの用量でその最大作用を達成したことを示唆する。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）は、１ｍｇ／ｋｇ用量でグルコース耐性の改善を生じただけであり、用量を３ｍｇ／ｋｇに漸増した場合に作用が減少した理由は明らかでなかった。図７３は、ＯＧＴＴ前および後曲線プロファイルならびにＯＧＴＴ曲線下面積を示す。
【０３５９】
２５．７  トリグリセリドレベルに及ぼす試験化合物の作用
【０３６０】
血液を、一晩絶食させた動物から採取した。毎週、各注射後５日目に、採血を実行した。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）で処置した動物において、トリグリセリドレベルは有意に低減された。しかしながら、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）より有効であった。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は０．３ｍｇ／ｋｇで血漿トリグリセリドレベルの最大低減を生じたが、一方、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）は、最高試験用量（３ｍｇ／ｋｇ）でトリグリセリドレベルの中等度の低減を生じただけであった。図７４は、試験経過中の空腹時血漿トリグリセリドのレベルを示す。
【０３６１】
２５．８  総コレステロールおよびＨＤＬ−コレステロールレベルに及ぼす試験化合物の作用
【０３６２】
血液を、一晩絶食させた動物から採取した。毎週、各注射後５日目に、採血を実行した。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）処置後、血漿総コレステロールおよびＨＤＬ−コレステロールレベルは増大傾向を示した。図７５および７６は、試験経過中の総コレステロールおよびＨＤＬ−コレステロールのレベルを示す。
【０３６３】
２５．９  結論
【０３６４】
雄ＩＧＴカニクイザルで実行した用量漸増試験において、Ｆｃ接合ＦＧＦ２１変異体、すなわちＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）で処置した動物は、代謝パラメーター改善を示した。体重は低減され、身体組成は改善された。摂餌量の短期低減が観察されたが、摂餌量は、試験半ばに、基線または対照レベルに回復した。空腹時血糖値およびトリグリセリド値も、両化合物、すなわちＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）またはＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）により低減された。ＯＧＴＴは改善され、ＨＤＬ−コレステロールレベルはわずかに増大した。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）と比較して、Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は任意の試験用量で測定された全てのパラメーターにおいて、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）より優れていると思われた。Ｆｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、０．３ｍｇ／ｋｇで投与した場合、測定されたパラメーターのほとんどに関してその最大作用を達成した。したがって、高等動物種におけるＦｃ−（Ｇ４Ｓ）３−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）の治療的有効用量は、０．３ｍｇ／ｋｇより低いこともあり得る。
【実施例２６】
【０３６５】
カニクイザルにおける安定性試験
【０３６６】
Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号５７）がＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）よりプロテアーゼ耐性であるか否かを確定するために、この試験を計画した。実施例２１に示したようなマウスまたはサルへのＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）注射後に、カルボキシ末端プロセシングを観察した。分解は、Ｃ末端からの１〜３アミノ酸残基の連続損失を生じた。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）のＣ末端をキャッピングし、またはＣ末端に付加的変異を導入するといった努力により、優れた分子であるＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）を産生した。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）が、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）と比較してin  vivo安定性を改善したか否かを査定するために、この試験を計画した。
【０３６７】
Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）構築物を生成した。これらの構築物は、Ｃ末端で（Ｇｌｙ）５−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）３−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒリンカー配列（配列番号２８）と融合されたＩｇＧ１  Ｆｃ配列（配列番号１１）を含み、これは次に、成熟ＦＧＦ２１配列（配列番号４）のＮ末端と融合されたが、ここで、２つの変異Ｌ９８ＲおよびＰ１７１Ｇ、または３つの変異Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１ＧおよびＡ１８０Ｅを導入した。これらの構築物を、次に、本明細書中に記載されるように発現し、精製して、そして二量体形態のタンパク質として単離し、この各単量体を、分子間ジスルフィド結合を介して、各単量体のＦｃ領域間に連結した。
【０３６８】
Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）のin  vivo安定性を、雄カニクイザルで比較した。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）を、２３．５ｍｇ／ｋｇでカニクイザルに静脈内注射した。１回の静脈内注射後、種々の時点で血液試料を採取した。イムノアフィニティーＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を用いて、注射後の各時点で代謝産物をモニタリングした。結果を、図７７に示す。
【０３６９】
Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）と比較して、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、無傷分子の親ピークに隣接した少数の検出可能な質量ピークを有するＣ末端分解の有意の低減を示したが、これは、Ａ１８０Ｅ変異がＣ末端ペプチダーゼ分解を遅くしたことを示唆する。［１−３７６］、［１−３９４］および［１−４０１］で概算された質量損失に伴うより大きな切頭化も観察されたが、その部位は、ＦＧＦ２１ポリペプチド配列中の１３３−１３４、１５３−１５４および１５８−１５９に対応した。内部エンドペプチダーゼ切取りは、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）の両方の全体的代謝に関与し、Ａ１８０Ｅ変異は、内部エンドペプチダーゼ分解の速度に有意の影響を及ぼすとは思われなかった。
【０３７０】
解像度を増大し、分解混合物の詳細を提供するために、ＭＲＭ（多重反応モニタリング）ＬＣ−ＭＳ質量分析も実施して、種々の形態のＣ末端分解断片をモニタリングした。サル試料をアフィニティー精製して、次に、Ａｓｐ−Ｎ消化に付した。次いで、ＭＲＭにより、Ｃ末端消化ペプチドをモニタリングした。種々の形態のＣ末端分解断片に関する結果は、図７８に示すように、全長ペプチド種に対する相対量（％）として表される。ＭＡＬＤスペクトルと一致して、Ｃ末端断片のＭＲＭ半定量分析も、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）を投与したサルにおいて、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）と比較して、Ｃ末端から１〜３アミノ酸を失っているペプチド断片の相対的存在量の低減、ならびに無傷分子の相対的存在量の増大を示した。
【０３７１】
要するに、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、カニクイザルにおいて、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）と比較して、Ｃ末端分解低減ならびにin  vivo安定性増強を示した。
【実施例２７】
【０３７２】
マウスにおけるＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の薬物動態
【０３７３】
雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスへの１回静脈内用量投与後のＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）（配列番号５７）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）（配列番号４３）の薬物動態を査定するために、この試験を計画した。
【０３７４】
静脈内注射により２０ｍｇ／ｋｇで、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）を投与した。用量投与後、０．００８３（５分）、１、４、８、１６、２４、４８、７２、９６、１６８および２４０時間目に、血液試料を採取した。無傷全長分子の血漿濃度を測定するために、Ｎ末端およびＣ末端ＦＧＦ２１に向けられる免疫反応性を有するＥＬＩＳＡ検定を開発した。検定は、全長無傷分子を追跡測定したが、他の分解産物からの夾雑物はごくわずかであった。マウスにおける静脈内注射後２４０時間の期間中の無傷Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）およびＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の血漿濃度を、図７９に示す。
【０３７５】
Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）の血漿濃度は、注射後２４から１６８時間までに同一用量レベルで投与されたＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の濃度より有意に高かった。マウスにおいて、注射後１６８時間目に、有意量のＦｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）が測定可能であった。その結果、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）は、マウスにおいて、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）と比較して、ＡＵＣ適用範囲および血漿循環半減期の増大が２倍であることが示された。Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ、Ａ１８０Ｅ）の半減期は１６．６時間、Ｆｃ−（Ｌ１５）−ＦＧＦ２１（Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１Ｇ）の半減期は９．４時間であった。両化合物が、用量投与後２４０時間で、検出可能レベルを下回った。
【実施例２８】
【０３７６】
溶解性を改善し、あるいはＣ末端切取りを低減して半減期を増大するためのＮ連結グリコシル化変異体の生成
【０３７７】
ネイティブアミノ酸配列に対する最小度の破壊を伴う哺乳動物発現のための潜在的Ｎ連結グリコシル化部位を作製するために、ＦＧＦ２１変異体を設計し、生成した。構築された変異体は、ＦＧＦ２１（Ｙ１７９Ｎ、Ｓ１８１Ｔ）（配列番号１６１）、ＦＧＦ２１  Ｙ１７９Ｎ（配列番号１６３）およびＦＧＦ２１  Ｐ１２４Ｓ（配列番号１６５）を含む。
【０３７８】
変異体の発現を２９３−６Ｅ細胞で一時的に実施して、状態調節培地を、ＥＬＫ−ルシフェラーゼin  vitro検定において活性に関して試験した。ＥＬＫ−ルシフェラーゼ検定は、実施例４に記載されたとおりに実施したが、但し、異なる濃度の精製タンパク質ではなくて、状態調節培地の連続希釈を用いた。
【０３７９】
状態調節培地の分析は、野生型と比較した場合のグリコシル化の増大が一過性発現系においては達成されなかった、ということを明示した。図８０は、ＥＬＫ−ルシフェラーゼ活性検定の結果を示す。ＦＧＦ２１  Ｐ１２４Ｓ変異体はＦＧＦ２１活性に悪影響を及ぼさなかったが、しかしＦＧＦ２１  Ｙ１７９ＮおよびＦＧＦ２１（Ｙ１７９Ｎ、Ｓ１８１Ｔ）変異体は、グリコシル化の非存在下で、ＥＬＫ−ルシフェラーゼ検定において検定されたように活性低減を生じた、ということを図８０に示した結果は実証する。
【０３８０】
種々の実施形態に関して本発明を記載してきたが、変更および修正がなされ得ることが当業者には理解される。したがって、添付の特許請求の範囲は、特許請求されるような本発明の範囲内にあるこのような等価の変更を全て網羅するよう意図される。さらに、本明細書中で用いられる節の見出しは、構成上のために過ぎず、記載された対象物を限定するものではない。
【０３８１】
本出願中で引用された参考文献は全て、あらゆる目的のために参照により本明細書中で援用される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
0005823954.tif 000037
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３８Ｄ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【配列表】
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