(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞のＦａｓシグナルの活性を制御することを含む、幹細胞の分化制御方法であって、幹細胞にＦａｓシグナル阻害剤を投与して該幹細胞のＦａｓシグナルを抑制し、これにより該幹細胞の未分化性を維持する、幹細胞の分化制御方法。
【請求項２】
前記Ｆａｓシグナル阻害剤が、配列番号３９のアミノ酸配列を有するペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記幹細胞が哺乳類に由来する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記幹細胞がＥＳ細胞である、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｆａｓシグナルを介して幹細胞の分化を制御する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）をはじめとする幹細胞は、生体に存在する様々な細胞に分化する能力を有し、細胞移植が有効な治療方法として期待される疾病、例えば、白血病、パーキンソン病等の治療に用いることが期待されている。
幹細胞を適切に維持・管理するためには、幹細胞の未分化性を維持した状態を保ちながら継代培養することが必要になる。したがって、幹細胞の未分化性を、確実にしかも簡便に維持するための手法の開発が望まれている。
一方、幹細胞を分化させる際には、より迅速に目的の分化状態へと方向付けすることが要求される。したがって、幹細胞の未分化性をより迅速に解除するための手法の開発も望まれている。
【０００３】
糖鎖は、細胞の生存に必須であるばかりでなく、がん、免疫、発生・分化や感染症などにおいて特に重要な役割を果たしていることが報告されている。発生分化の過程においては、その分化程度や状態に応じて糖鎖を合成する糖転移酵素遺伝子の発現パターンが変化し、合成される糖鎖構造も変化することが知られている。しかし、糖鎖に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素の活性が幹細胞の分化に与える影響についてはこれまで知られていない。
【０００４】
Ｆａｓシグナルはアポトーシスを引き起こすシグナル経路として知られており、アポトーシスは細胞の分化に関与することが知られている。
しかし、幹細胞におけるＦａｓシグナルと分化状態との関係についてこれまで報告はなく、また、幹細胞におけるＦａｓシグナルと硫酸基転移酵素との関係についても知られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、幹細胞の分化状態を制御する方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題の解決のために鋭意検討を行った。その結果、Ｆａｓシグナルの活性を制御することにより、幹細胞の分化状態を制御できることを見い出した。また、本発明者らは、硫酸基転移酵素の活性を制御することでＦａｓシグナルの活性を制御することができ、これにより幹細胞の分化状態をも制御できることを見い出した。本発明はこれらの知見に基づき完成するに至ったものである。
【０００７】
本発明の課題は下記の手段により達成された。
［１］幹細胞のＦａｓシグナルの活性を制御することを含む、幹細胞の分化制御方法であって、幹細胞にＦａｓシグナル阻害剤を投与して該幹細胞のＦａｓシグナルを抑制し、これにより該幹細胞の未分化性を維持する、幹細胞の分化制御方法。
［２］前記Ｆａｓシグナル阻害剤が、配列番号３９のアミノ酸配列を有するペプチドを含む、［１］に記載の方法。
［３］前記幹細胞が哺乳類に由来する、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記幹細胞がＥＳ細胞である、［３］に記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、幹細胞を所望の分化状態に制御することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞において、グルコサミン残基の３位に硫酸基が転移したＨＳの細胞表面における存在量をＦＡＣＳ分析により測定した結果を示す図である。図１中、ａはコントロール細胞の結果を示し、ｂはｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞の結果を示す。
【図２】ｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞において、細胞表面に存在するＦａｓの量をＦＡＣＳ分析により測定した結果を示す図である。図２中、ａはコントロール細胞の結果を示し、ｂはｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞の結果を示す。
【図３】ｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞における脂質ラフト中のＦａｓの存在量をイムノブロットにより調べた結果を示す写真である。図３中、ａはコントロール細胞の結果を示し、ｂはｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞の結果を示す。各画分の番号は実施例で使用した遠心管の最上層から数えた層の順番を示す。
【図４】ｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞における不活性型カスパーゼ−８の量をイムノブロットにより調べた結果を示す図である。図４中、ａはコントロール細胞の結果を示し、ｂはｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞の結果を示す。
【図５】ｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞における切断カスパーゼ−３及びＮａｎｏｇの量をイムノブロットにより調べた結果を示す図である。図５中、ａはコントロール細胞の結果を示し、ｂはｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞の結果を示す。
【図６】ｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞における未分化マーカー（Ｏｃｔ３／４及びＮａｎｏｇ）のｍＲＮＡ量をリアルタイムＰＣＲにより調べた結果を示す図である。図６中、ａはコントロール細胞の結果を示し、ｂはＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞の結果を示す。
【図７】ｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞における分化マーカー（Ｉｓｌ１、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｆｇｆ５、Ｇａｔａ４、Ｇａｔａ６、ＬａｍｉｎｉｎＢ１、Ｂｍｐ２及びＣｄｘ２）のｍＲＮＡ量をリアルタイムＰＣＲにより調べた結果を示す図である。図７中、ａはコントロール細胞の結果を示し、ｂはｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞の結果を示す。
【図８】ｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞におけるＨＳとＦａｓとの結合機序をオーバーレイアッセイにより調べた結果を示す写真である。図７中、ＡはＨＳ４Ｃ３（抗へパラン硫酸抗体：グルコサミン残基の３位が硫酸化された硫酸化構造を特異的に認識する抗体）を反応させた後にＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を用いて発色させた結果を示し、ＢはＧＳＴ融合Ｆａｓを反応させた後にＨＲＰ標識抗ＧＳＴ抗体を用いて発色させた結果を示し、ＣはＧＳＴ融合ＦａｓとＨＳ４Ｃ３との混合物を反応させた後にＨＲＰ標識抗ＧＳＴ抗体を用いて発色させた結果を示し、ＤはＧＳＴ融合変異導入Ｆａｓを反応させた後にＨＲＰ標識抗ＧＳＴ抗体を用いて発色させた結果を示す。Ｅはβ−アクチンの量をイムノブロットにより調べた結果を示す。また、図７中、ａはコントロール細胞の結果を示し、ｂはｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞の結果を示す。
【図９】ｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞において、ＩＥＴＤの添加によりＦａｓシグナルを阻害したときの分化状態の変化をマーカー発現量を指標に調べた結果を示す図である。図８中、ａはコントロール細胞の結果を示し、ｂはｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞の結果を示す。
【図１０】Ｒ１細胞の分化に対するＦａｓシグナル阻害剤（ＩＥＴＤ）の影響を調べた結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明について、その好ましい実施態様に基づき詳細に説明する。
【００１１】
本発明は、幹細胞中においてＦａｓシグナルの活性を制御することにより該幹細胞の分化状態を制御する方法である。上記Ｆａｓシグナルの活性制御手段に特に制限はないが、幹細胞中の硫酸基転移酵素活性の制御や、幹細胞へのＦａｓシグナル阻害剤の投与により行うことが好ましい。本発明において「分化状態を制御する」とは、未分化性を維持することを含む概念である。また、本発明において「Ｆａｓ」とはＦａｓ受容体を意味する。
【００１２】
本発明に用いる幹細胞に特に制限はなく、分化万能性、分化多能性、分化単一性のいずれの分化能を有する幹細胞であってもよいが、分化万能性を有する幹細胞であることが好ましい。本発明に用いる幹細胞の具体例として、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖幹細胞、核移植ＥＳ細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、皮膚幹細胞、筋幹細胞等が挙げられるが、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞であることが好ましく、ＥＳ細胞であることがより好ましい。上記幹細胞の由来に特に制限はなく、哺乳類、鳥類等に由来するものを用いることができるが、哺乳類に由来する幹細胞を好適に用いることができる。前記哺乳類としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウサギ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられる。
上記幹細胞は通常の方法で調製することができる。また、寄託機関等に寄託されているセルライン等の分譲により得ることもできる。
【００１３】
続いて、幹細胞のＦａｓシグナルの活性を制御する手段について説明する。
【００１４】
本発明において、幹細胞のＦａｓシグナルは、幹細胞中で硫酸基転移酵素活性の制御することで行うことができる。
本発明における硫酸基転移酵素活性の制御とは、硫酸基転移酵素の活性を高めること及び抑制することの両概念を含む。
本発明において活性が制御されうる硫酸基転移酵素は、硫酸基供与体から糖鎖に硫酸基を転移する酵素である。上記硫酸基転移酵素は、その活性を高めることでＦａｓシグナルを所望のレベルまで活性化させることができ、また、その活性を低下させるとＦａｓシグナルを所望のレベルまで不活性化できる酵素である。上記硫酸基転移酵素は硫酸基供与体からヘパラン硫酸（ＨＳ）に硫酸基を転移する硫酸基転移酵素であることが好ましく、硫酸基供与体からヘパラン硫酸のグルコサミン残基の３位のヒドロキシル基に硫酸基を転移する活性を有する硫酸基転移酵素（ヘパラン硫酸３位硫酸基転移酵素（ＨＳ  ３−Ｏ−ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、以下、ＨＳ３ＯＳＴと呼ぶことがある。）であることがより好ましい。
【００１５】
上記ＨＳ３ＯＳＴは、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有することが好ましい。上記「アミノ酸配列の同一性（％）」とは、比較する２つのアミノ酸配列を必要に応じて間隙を導入して整列（アラインメント）させ、得られる最大のアミノ酸配列の同一性（％）をいう。アミノ酸配列の同一性を決定する目的のためのアラインメントは、通常の方法を用いて行うことができ、例えばＢＬＡＳＴのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアや、ＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏ（日立ソフトウェアエンジニアリング社製）並びにＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス社製）等の市販のソフトウェアを使用することもできる。
【００１６】
また、上記ＨＳ３ＯＳＴは、配列番号２のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。上記「１もしくは数個」とは、１〜５０個の整数であることが好ましく、１〜３０個の整数であることが好ましく、１〜２０個の整数であることがより好ましく、１〜１５個の整数であることがさらに好ましく、１〜１０個の整数であることがさらに好ましい。
【００１７】
上記ＨＳ３ＯＳＴは、配列番号１の塩基配列又は配列番号１の塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上の同一性を有するＤＮＡにコードされるものであることが好ましい。上記「塩基配列の同一性（％）」とは、比較する２つの塩基配列を必要に応じて間隙を導入して整列（アラインメント）させ、得られる最大の塩基配列の同一性（％）をいう。塩基配列の同一性を決定する目的のためのアラインメントは、通常の方法を用いて行うことができ、例えばＢＬＡＳＴのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアや、ＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏ（日立ソフトウェアエンジニアリング社製）並びにＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス社製）等の市販のソフトウェアを使用することもできる。
【００１８】
また、上記ＨＳ３ＯＳＴは、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるものであってもよい。本発明において「ストリンジェントな条件」とは、塩基配列の同一性が高いＤＮＡ同士、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の同一性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより同一性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より好ましくは、６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましくは６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する温度及び塩濃度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。上記ハイブリダイゼーションは、Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法等、公知の方法で行うことができる。
【００１９】
本発明において活性が制御される硫酸基転移酵素は１種類であっても２種以上であってもよい。
本発明において活性が制御される硫酸基転移酵素は、使用する幹細胞の由来と同一の由来であることが好ましいが、異なっていてもいてよい。例えば、使用する幹細胞がヒト由来のＥＳ細胞を用いる場合には、該幹細胞中でヒト由来の硫酸基転移酵素の活性を制御することが好ましいが、該幹細胞中で硫酸基転移酵素の活性を高める際には、ヒト以外に由来する硫酸基転移酵素を導入することで、該幹細胞とは由来の異なる硫酸基転移酵素の活性を高めてもよい。
硫酸基転移反応における上記硫酸基供与体は、通常、３’ホスホアデノシン５’ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）が利用される。
【００２０】
幹細胞中における硫酸基転移酵素活性の制御は通常の方法により行うことができる。硫酸基転移酵素活性を抑制する場合には、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、以下ＲＮＡｉと記す）を用いる方法、アンチセンス核酸を用いる方法、所望の硫酸基転移酵素遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸を用いる方法、又は幹細胞のゲノムＤＮＡに存在する硫酸基転移酵素遺伝子を変性・破壊する方法のような通常の遺伝子発現抑制手法を用いることが好ましい。より確実に、しかも簡便に硫酸基転移酵素活性を抑制する観点から、ＲＮＡｉを用いる方法で制御することがより好ましい。
【００２１】
ＲＮＡｉに用いる核酸は、硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の少なくとも一部と完全な相同性を有することが好ましいが、必ずしも完全同一である必要はない。
【００２２】
上記ＲＮＡｉに用いる核酸としてｓｉＲＮＡ（短鎖二本鎖ＲＮＡ）を好適に用いることができる。ｓｉＲＮＡの設計は、制御対象である硫酸基転移酵素の任意の塩基配列領域を標的として通常の方法で行うことができる。すなわち、所望の硫酸基転移酵素の一部の領域を標的とし、該領域と同一の塩基配列を有するｓｉＲＮＡを通常の方法により作製することができる。
【００２３】
また、ｓｉＲＮＡは、標的配列に対して１又は数個の塩基の置換、欠失、挿入又は付加を有するものであっても、上述の糖鎖関連遺伝子の発現を抑制する機能を有する限り使用することができる。上記「１又は数個」とは、１〜１０個の整数、好ましくは１〜５個の整数を表わす。
【００２４】
さらに、これらのｓｉＲＮＡの相補鎖とストリンジェントな条件下においてハイブリダイズしうる核酸も、本発明の核酸に包含される。この場合の「ストリンジェントな条件」として好ましくは６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より好ましくは６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する温度及び塩濃度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００２５】
ここで、ｓｉＲＮＡには、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ：ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）のような、分子内において二本鎖ＲＮＡ構造を形成し得る分子も含む。
【００２６】
また、ｓｉＲＮＡは、必ずしも標的配列に対する一組の二本鎖ＲＮＡである必要はなく、標的配列を含んだ領域に対する複数組の二本鎖ＲＮＡの混合物であってもよい。例えば、標的となる糖鎖関連遺伝子のｍＲＮＡ全長又は全長に近い領域に対応する長鎖二本鎖ＲＮＡを予めＤＩＣＥＲ酵素で分解し、その分解産物を本発明の核酸として用いることができる。
【００２７】
上述したＲＮＡを発現し得る発現ベクターを幹細胞に導入することで、所望のＲＮＡｉの効果を得ることができる。かかる発現ベクターは、当業者であれば、一般的な遺伝子工学技術により適宜作製することができる。発現ベクターとして、ｐＢＡｓｉやｐｉＧＥＮＥといったＮａｋｅｄプラスミドベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター等を好適に用いることができる。
【００２８】
一方、幹細胞中で硫酸基転移酵素活性を高める場合には、硫酸基転移酵素の発現を促進させる機能を有する核酸や、所望の硫酸基転移酵素をコードする遺伝子を所望のプロモーターの下流に連結した発現ベクターを幹細胞に導入することにより該幹細胞中で硫酸基転移酵素を発現させることができ、これにより該幹細胞中で硫酸基転移酵素の活性を高めることができる。
また、硫酸基転移酵素を含有する培地中で幹細胞を培養することで、該幹細胞中で硫酸基転移酵素の活性を高めることもできる。
【００２９】
上述した硫酸基転移酵素活性の制御は、幹細胞におけるＦａｓシグナルの活性を制御するための手段である。Ｆａｓシグナルは、アポトーシスを誘起するシグナル経路として知られている。リボソームで翻訳されたＦａｓはゴルジ体に移行し、ゴルジ体に移行したＦａｓはゴルジ体において所定の糖鎖と結合する。適切に糖鎖が結合したＦａｓは脂質ラフト（膜マイクロドメインの一種であり、スフィンゴ脂質とコレステロールとに富む細胞膜領域を意味する。）にリクルートされ、これが引き金となってＦａｓシグナルが活性化されると考えられている。
ＥＳ細胞等の幹細胞では、通常、Ｆａｓシグナルは活性化されていない。このような幹細胞において、硫酸基転移酵素の活性を高めると、Ｆａｓシグナルが活性化し、未分化性の解除が引き起こされる。そのメカニズムとして以下のことが考えられる。
【００３０】
特定の硫酸基転移酵素の活性が高まると、該硫酸基転移酵素が硫酸基供与体から硫酸基を特定の糖鎖に転移する速度が上昇し、該硫酸基転移酵素により硫酸基が転移された糖鎖の数が増大する。この硫酸基が転移された糖鎖はＦａｓとの結合能が増大し、Ｆａｓに結合しやすくなる。これによりゴルジ体で糖鎖がＦａｓに結合するようになると、糖鎖が結合したＦａｓがゴルジ体から細胞膜の脂質ラフトに移行してＦａｓシグナルカスケードが活性化される。
Ｆａｓシグナルが活性化すると、その下流に位置するカスパーゼ−８やカスパーゼ−３が活性化され、これにより幹細胞中でＮａｎｏｇ等の未分化性維持因子が分解され、幹細胞の未分化性を解除する。また、同時に、Ｆａｓシグナルが活性化すると、未分化性維持因子のｍＲＮＡレベルが低下すると同時に特定の分化因子のｍＲＮＡレベルが上昇し、幹細胞の未分化性の解除を促進する。
逆に、幹細胞中において特定の硫酸基転移酵素の活性を抑制しておけばＦａｓの脂質ラフトへの移行が抑制される。その結果、Ｆａｓシグナルの活性化を防ぐことができるため、幹細胞の未分化性を維持することが可能になる。
【００３１】
また、本発明において、Ｆａｓシグナルの活性は、Ｆａｓシグナル阻害剤によっても制御することができる。Ｆａｓシグナル阻害剤によるＦａｓシグナルの活性制御は、Ｆａｓシグナルの活性抑制である。
Ｆａｓシグナル阻害剤は、幹細胞中でＦａｓシグナルを阻害しうるものであれば特に制限はないが、配列番号３９のアミノ酸配列（ＩＥＴＤ）を有するペプチド又は該ペプチドの誘導体を含む分子を好適に用いることができる。配列番号３９のアミノ酸配列は、カスパーゼ−８に認識される配列であるため、上記ペプチド又はその誘導体が存在すると、カスパーゼ−８が本来の働きができなくなる。カスパーゼ−８はＦａｓシグナルの下流で働く酵素であるため、カスパーゼ−８の働きが抑制されると、結果としてＦａｓシグナルの活性も抑制される。
【００３２】
Ｆａｓシグナル阻害剤の幹細胞への投与は、例えば、Ｆａｓシグナル阻害剤を幹細胞の培養液中に含有させておくことで行うことができる。
【００３３】
本発明の方法は、幹細胞の分化を制御するために用いることができる。本発明の方法によれば、簡便に幹細胞の分化を制御・管理することができ、再生医療の実現に貢献することができる。
【００３４】
本発明の細胞は、上記本発明の分化制御方法により分化が制御された細胞である。ここで、「分化が制御された」とは、未分化性が維持された状態を含む概念である。該細胞には、未分化性が維持されている細胞、分化開始前の細胞、分化過程の細胞、分化した細胞のいずれもが含まれる。本発明の細胞には、本発明の分化制御方法によって幹細胞から分化した組織や器官に含まれる細胞をも含む。
【００３５】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００３６】
調製例１  硫酸基転移酵素の活性が高められた幹細胞の調製
マウス由来ヘパラン硫酸３位硫酸基転移酵素−５（ｍＨＳ３ＯＳＴ−５）の発現ベクターは、ｐＣＡＧＩＰｕｒｏベクター（東京大学大学院理学系研究科、程久美子准教授より供与）を用いて、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２００６；２８１：１０９４５〜１０９５３に記載の方法に基づき調製した。調製した発現ベクターは、ｍＨＳ３ＯＳＴ−５の全長をコードする配列番号１の塩基配列を含み、配列番号２のアミノ酸配列からなる蛋白質を発現するように設計された。
【００３７】
１０００Ｕ／ｍＬのｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）を含むＥＳＣ培地（１５質量％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社製）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ社製）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ社製）を含有するＤＭＥＭ培地）を用いて、１０μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣで不活化したマウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦｓ）上で、マウスＥＳ細胞であるＲ１セルライン（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（１９９３）８４２４−８４２８に記載、自然科学研究機構  生理学研究所  分子神経生理研究部門  より供与）を維持した。
上記Ｒ１細胞を回収し、１×１０６個の細胞をゼラチンコートしたフィーダーフリーの６０ｍｍ培養皿（Ｉｗａｋｉ社製）に移し、ＬＩＦを含むＥＳＣ培地で１６時間培養した。培養後の細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、上記で調製したＨＳ３ＯＳＴ−５を含むＣＡＧＩＰｕｒｏベクター２μｇを導入した。その後１日間培養し、２μｇ／ｍＬのピューロマイシン（シグマ社製）の存在下で２４時間セレクションを行った。セレクションされた細胞を、ｍＨＳ３ＯＳＴ−５の活性が高められたマウスＥＳ細胞（以下、ｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞ということがある。）として後述する実験に用いた。
なお、以下で使用されるコントロール細胞は、ＨＳ３ＯＳＴ−５を含まない空のｐＣＡＧＩＰｕｒｏベクターを上記と同様の方法によりＲ１細胞に導入したものである。
【００３８】
試験例１  ＦＡＣＳ分析
ｍＨＳ３ＯＳＴ−５は、ヘパラン硫酸のグルコサミン残基の３位のヒドロキシル基に硫酸基を転移する。したがって、ヘパラン硫酸のグルコサミン残基の３位の硫酸化を含む硫酸化構造に特異的に結合する抗体（ＨＳ４Ｃ３）が認識するエピトープを増加させると考えられる。そこで、ｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞について、細胞表面に存在するＨＳ４Ｃ３認識エピトープの量をＦＡＣＳ分析により調べた。
具体的には、遺伝子導入後２日目のＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞をＦＡＣＳ緩衝液（０．５質量％ＢＳＡ、０．１質量％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）中でＶｅｓｉｃｕｌａｒ  Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ（ＶＳＶ）標識したＨＳ４Ｃ３（Department  of  Biochemistry, Nijmegen  Center  for  Molecular  Life  Sciences,  Radboud  University  Nijmegen  Medical  Centre,  Nijmegen,  The  Netherlands  Toin  H.  Van  Kuppevelt教授より供与  （J  Biol  Chem
2006; 281:4654-4662））と共にインキュベートし、洗浄後、細胞懸濁液をマウス由来抗ＶＳＶグリコプロテイン抗体（ＩｇＧ、シグマ社製）と共にＦＡＣＳ緩衝液中でインキュベートした。続いてＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（シグマ社製）を用いて標識した。その後、細胞をＦＡＣＳｒｉａ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（ベクトンディッキンソン社製）に通してＦＡＣＳ分析を行った。
結果を図１に示す。
【００３９】
図１の結果から、ｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞において細胞の蛍光強度が高く、細胞表面のＨＳ４Ｃ３認識エピトープが増加していることがわかる。
【００４０】
続いて、ｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞において細胞表面へとリクルートされたＦａｓの量をＦＡＣＳ分析により調べた。使用する抗体をＦＩＴＣ標識抗Ｆａｓ抗体（商品名：Ｊｏ２、ベクトンディッキンソン社製）としたこと以外は上記と同様にＦＡＣＳ分析を行った。
結果を図２に示す。
【００４１】
図２に示すように、ｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞において蛍光強度が高く、細胞表面に存在するＦａｓの量が増加していることがわかった。
【００４２】
上述した図１及び図２の結果は、幹細胞においてＨＳ３ＯＳＴの活性を高めることで、ヘパラン硫酸のグルコサミン酸基の３位の硫酸化が促進され、これによりＦａｓにヘパラン硫酸が結合しやすくなり、その結果Ｆａｓが細胞表面へと移動したことを示す。
【００４３】
試験例２  脂質ラフト中のＦａｓの存在量
細胞表面の存在するＦａｓは、脂質ラフトに組み込まれることで、Ｆａｓシグナルを活性化する。そこで、ｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞において細胞表面に存在するＦａｓが脂質ラフトに存在しているか否かをイムノブロッットにより調べた。
【００４４】
脂質ラフトは、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９；１６２：７２１７−７２２３及びＣｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ  ２００２；９：３２９−３３９の記載に基づき調製した。
具体的には、遺伝子導入後２日目の細胞を０．６ｍＬの細胞溶解液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、プロテアーゼインヒビター）を用いて氷上でホモジナイズし（ｔｉｇｈｔ  Ｄｏｕｎｃｅ  ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒを用いて５０回）、抽出物をタンパク質１ｍｇ当たり６０質量％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（シグマ社製）１．４ｍＬと混合して４２．５質量％のＯｐｔｉｐｒｅｐ溶液を調製した。これを遠心管（ベックマンコールター社製）に移して、５ｍＬの３０質量％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ溶液と、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４及び１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する３ｍＬの５％Ｏｐｔｉｐｒｅｐを積層した。これをＳＷ４１Ｔｉローター（ベックマンコールター社製）を用いて４℃で１６時間、３０，０００ｒｐｍで遠心することで溶液を９層に分断した。遠心管の上から３〜５層目が脂質ラフトを含みうる画分であり、上から７〜９層目は脂質ラフトを含まない画分である。
【００４５】
上記各画分を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社製）に転写した。この転写後のメンブレンをブロッキングした後、マウス由来抗Ｆａｓ抗体（ＩｇＧ、BD  biosciences  社製）を反応させた。洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を２次抗体として反応させ、さらに洗浄後、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ試薬（ＧＥヘルスケア社製）によりＨＲＰを発色させた。
結果を図３に示す。
【００４６】
図３の結果から、ｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞において脂質ラフトに存在するＦａｓの量が増加していることがわかる。この結果は、ｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞においてＦａｓシグナルが活性化していることを強く示唆するものである。
【００４７】
試験例３  不活性化カスパーゼ−８の存在量
カスパーゼ−８はＦａｓシグナルの下流で働く。そこで、ｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞におけるカスパーゼ−８の状態を調べるために、不活性化カスパーゼ−８の量をイムノブロットにより調べた。
具体的には、遺伝子導入後２日目のｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞を細胞溶解液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１質量％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１０ｍＭ  ＮａＦ、プロテアーゼインヒビター）で溶解し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、上記と同様にＰＶＤＦメンブレンに転写し、プライマリー抗体としてラビット由来抗不活性化カスパーゼ−８抗体（ＩｇＧ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を、２次抗体としてＨＲＰ標識抗ラビットＩｇＧ抗体を用いて不活性化カスパーゼ８の量を調べた。
得られたバンド強度をＮＩＨｉｍａｇｅで測定した結果を図４に示す。なお、図４の値はβ−アクチンのバンド強度により補正した値である。
【００４８】
図４に示すように、ｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞では不活性化カスパーゼ−８の量が減少していることから、活性化カスパーゼ−８が増加していることを示す。すなわち、ｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞では、Ｆａｓシグナルが活性化されていることが示された。
【００４９】
試験例４  切断カスパーゼ−３及びＮａｎｏｇの存在量
カスパーゼ−３はＦａｓシグナルの下流で機能するタンパク質であり、カスパーゼ−８の下流で働くことが知られている。また、カスパーゼ−３は切断されることで活性化されることが知られている。そこで、切断カスパーゼ−３及びさらにその下流で機能する未分化性維持因子であるＮａｎｏｇについて、遺伝子導入後２日目のｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞における存在量をイムノブロットにより調べた。
プライマリー抗体として上記のラビット由来抗不活性化カスパーゼ−８抗体に代えてラビット由来抗切断カスパーゼ−３抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）又はラビット由来抗Ｎａｎｏｇ抗体（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ社製）を用いた以外は上記と同様の方法により、ｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞における切断カスパーゼ−３及びＮａｎｏｇの存在量を調べた。
結果を図５に示す。
【００５０】
図５に示すように、ＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞において切断カスパーゼ−３の量が増加しており、カスパーゼ−３の活性が増加していることがわかる。また、これに伴いＮａｎｏｇの量が減少しており、切断カスパーゼ−３によりＮａｎｏｇが分解されたことが示唆された。Ｎａｎｏｇは幹細胞の未分化性維持因子である。したがって、この結果は、ｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞において未分化性が解除されたことを示す。
【００５１】
試験例５  Ｏｃｔ３／４とＮａｎｏｇのｍＲＮＡレベル
遺伝子導入後４日目のｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞において、未分化性マーカーとして知られるＯｃｔ３／４及びＮａｎｏｇのｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲにより調べた。各ｍＲＮＡの発現量は、下記表１に示す配列番号の塩基配列からなるプライマーセット及びプローブを用い、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて調べた。
【００５２】
【表１】
0005815953.tif 000002
【００５３】
結果を図６に示す。
図６の結果から、ｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞においていずれの未分化性マーカーのｍＲＮＡレベルも顕著に低下していることがわかる。これにより、ｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞において、タンパク質レベルでの分解のみならず、転写レベルにおいても未分化性維持に必要な因子の発現が抑制されていることが示された。
【００５４】
試験例６  分化マーカーのｍＲＮＡレベル
遺伝子導入後４日目のｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞において、各種分化マーカーについて、ｍＲＮＡの発現量を調べた。各ｍＲＮＡの発現量は、下記表２に示す配列番号の塩基配列からなるプライマー及びプローブを用い、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。
【００５５】
【表２】
0005815953.tif 000003
【００５６】
結果を図７に示す。
図７に示すように、各種分化マーカーにおいてもその発現量の変化が認められ、特に、神経外胚葉マーカーであるＩｓｌ１、遠位内胚葉マーカーであるＬａｍｉｎｉｎＢ１、及び栄養膜マーカーであるＣｄｘ２におけるｍＲＮＡレベルの低下、並びに原始外胚葉マーカーであるＦｇｆ５及び原始内胚葉マーカーであるＧａｔａ６のｍＲＮＡレベルの上昇がコントロール細胞に比べて有意であった。
これらの結果もまた、ｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞において未分化性が解除されていること示す。
【００５７】
試験例７  ＨＳ中のｍＨＳ４Ｃ３認識エピトープの増加とＦａｓとの結合能
ｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞においてＨＳとＦａｓとの結合能が高まっていることをバインディングアッセイにより調べた。
具体的には、遺伝子導入後２日目のｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞の細胞溶解液を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、ＰＶＤＦメンブレンに転写し、これをブロッキング液（５％ｎｏｎ−ｆａｔドライミルクを含むＰＢＳ  ｐＨ６．５）でブロッキングし、さらにＧＳＴ（グルタチオンセファローストランスフェラーゼ）融合Ｆａｓ、ＧＳＴ融合変異導入Ｆａｓ、又はＧＳＴ融合ＦａｓとＨＳ４Ｃ３との混合物を１０ｎＭの濃度で反応させた。その後、メンブレンを洗浄液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ  ｐＨ６．５）で洗浄し、ＨＲＰ標識抗ＧＳＴ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）を室温で１時間反応させ後、ＨＲＰをＥＣＬ  Ｐｌｕｓ試薬を用いて発色させた。
ＧＳＴ融合Ｆａｓ、ＧＳＴ融合変異導入Ｆａｓは、Ｆａｓ又は変異導入ＦａｓをＧＳＴとの融合タンパク質として大腸菌ＢＬ２１株で常法により発現させ、これらをグルタチオンセファロース４Ｂ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）を用いて精製することで得た。
上記変異導入Ｆａｓは、ＨＳとの結合に寄与することが予測された正電荷アミノ酸領域（配列番号３６;KLRRRVH）を配列番号３７（ALAAAVA）のアミノ酸配列に置き換えた構造をもつ。
結果を図８に示す。
【００５８】
図８Ａは、転写後のＰＶＤＦにＨＳ４Ｃ３を反応させ、さらにＨＲＰ標識２次抗体を用いて発色させた結果を示す。ｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞において強いバンド強度が認められることから、ｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞においてグルコサミン残基の３位が硫酸化されたＨＳが増加していることがわかる。
図８Ｂは、転写後のＰＶＤＦにＧＳＴ標識Ｆａｓを反応させ、ＨＲＰ標識抗ＧＳＴ抗体で検出たものである。ｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞においてＦａｓの結合量が高いことから、ｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞においてＦａｓ結合物質が増加していることがわかる。
図８Ｃは、転写後のＰＶＤＦにＧＳＴ標識ＦａｓとＨＳ４Ｃ３の混合物を反応させ、ＨＲＰ標識抗ＧＳＴ抗体で検出したものである。この場合にはバンドが確認できないことから、ＦａｓのＨＳとの結合部位がＨＳ４Ｃ３と競合していることがわかる。すなわち、ＦａｓがＨＳのグルコサミン残基の３位が硫酸化された部分を特異的に認識して結合していることがわかる。
図８Ｄは、転写後のＰＶＤＦにＧＳＴ標識変異導入Ｆａｓを反応させたものである。変異導入Ｆａｓでは未変異Ｆａｓに比べてバンド強度が弱いことから、Ｆａｓの配列番号３６のアミノ酸配列領域がＨＳとの結合に主要な役割を果たしていることがわかる。
なお、図８Ｅは、コントロールとしてβアクチンの量を調べた結果である。
【００５９】
試験例８  Ｆａｓシグナル阻害による未分化性の回復
ＩＥＴＤ（Ac-IETD-CHO）はカスパーゼ−８の働きを抑制する薬剤であり、Ｆａｓシグナルカスケードを遮断する薬剤である。そこで、ＩＥＴＤによりｍＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞において引き起こされている未分化性の解除を脱することができるか、すなわち、再び未分化状態に戻りうるか調べた。
具体的には、ＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞を１０μＭ濃度のＩＥＴＤ（PEPTIDE  INSTITUTE,  INC社製）の存在下で２４時間培養し、細胞を回収して溶解し、イムノブロットにより切断カスパーゼ−３とＮａｎｏｇのタンパク質量を、リアルタイムＰＣＲによりＯｃｔ３／とＮａｎｏｇのｍＲＮＡ量をそれぞれ上述した方法により調べた。
結果を図９に示す。
【００６０】
図９の結果から、ＩＥＴＤ存在下で培養したＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞において、切断カスパーゼ−３のタンパク質量が低下し、これに伴いＮａｎｏｇのタンパク質量が増加していることがわかった。これらはいずれもコントロール細胞と同等のレベルまで回復していることもわかる。
また、ＩＥＴＤの存在下で培養したＨＳ３ＯＳＴ−５過剰発現細胞では、Ｏｃｔ３／４及びＮａｎｏｇのｍＲＮＡの発現量もコントロール細胞と同レベルにまで回復していることがわかる。
これらの結果は、一度未分化性が解除された細胞においてさえ、Ｆａｓシグナルを阻害すれば、再び未分化性を回復しうることを示す。また、このことから、幹細胞においてＦａｓシグナルを活性化しうる硫酸基転移酵素の活性を抑制しておけば、Ｆａｓシグナルの抑制状態が維持され、その結果幹細胞の未分化性を維持できることもわかる。
【００６１】
試験例９  Ｆａｓシグナル阻害による未分化性の維持
ＥＳ細胞ではアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）が活性化している。したがって、ＥＳ細胞をＡＬＰ染色し、陽性コロニー数を評価することにより、未分化性を維持したＥＳ細胞の評価を行うことができる。本試験では、ＥＳ細胞をＦａｓシグナル阻害ペプチドである上記ＩＥＴＤで処理した場合のＥＳ細胞の分化状態をＡＬＰ活性を指標として評価した。
【００６２】
具体的には、６ｃｍディッシュに１×１０４のＥＳ細胞（Ｒ１細胞）をまき、ＬＩＦ及び１０μＭ  Ac-IETD-CHOの存在下又は非存在下で、５日間培養した。培養後、ホルマリン／メタノールで細胞を固定し、洗浄後、5-bromo-4-chloro-3-indolyl  phosphate-nitroblue  tetrazolium  (Nacalai  Tesque)で染色を行った。染色された（陽性）コロニーは顕微鏡下でカウントした。結果を図１０に示す。
上記ＥＳ細胞の未分化性の維持に必要なＬＩＦを除いて分化させた細胞では、ＡＬＰ陽性コロニー率が低下していた。しかし、Ac-IETD-CHOを加え、Ｆａｓシグナルをブロックした細胞では、ＡＬＰ陽性コロニー率が顕著に増加した。このことから、Ｆａｓシグナル阻害剤には、ＥＳ細胞の未分化性を維持する作用があることがわかった。
【００６３】
調製例２  硫酸基転移酵素の活性が抑制された幹細胞の調製
ｍＨＳ３ＯＳＴ−５を標的としたショートヘアピンＲＮＡを発現するための発現プラスミドをｐＳＵＰＥＲ．ｒｅｔｒｏ．ｐｕｒｏ（ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ社製）を用いて構築した。具体的には、配列番号３８の塩基配列を有するＤＮＡをｐＳＵＰＥＲ．ｒｅｔｒｏ．ｐｕｒｏのＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩサイトの間に挿入した。レトロウィルスを産生するために、上記のコンストラクトをウィルスパッケージング細胞（ＰＬＡＴ−Ｅ）に感染させ、このウィルスを含むＰＬＡＴ−Ｅ培養液を８μｇ／ｍＬＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（シグマ社製）と混合した後、Ｒ１細胞と共に２４時間インキュベートした。こうしてＲ１細胞にウィルスを感染させた後、Ｒ１細胞をＬＩＦを含むＥＳＣ培地に移し、２μｇ／ｍＬのピューロマイシンの存在下で５〜７日間培養することで、ｍＨＳ３ＯＳＴ−５の活性が抑制されたマウスＥＳ細胞（以下、ｍＨＳ３ＯＳＴ−５抑制細胞という。）を得た。
【００６４】
ｍＨＳ３ＯＳＴ−５抑制細胞はヘパラン硫酸のグルコサミン残基の３位のＯＨ基に対する硫酸基の転移反応が抑制されているため、ゴルジ体においてＦａｓが糖鎖と適切に結合することができない。したがって、Ｆａｓが脂質ラフトに移動することができず、Ｆａｓシグナルの活性が抑制されている。
【００６５】
ｍＨＳ３ＯＳＴ−５以外の硫酸基転移酵素であっても、糖鎖のＦａｓに対する親和性を制御することができるものであれば、幹細胞中で該硫酸基転移酵素の活性を制御することでＦａｓシグナルの活性を制御することができ、ｍＨＳ３ＯＳＴ−５と同様のメカニズムにより幹細胞の分化を制御することができる。
【００６６】
以上の結果、幹細胞中でＦａｓシグナルの活性を制御することにより、該幹細胞の分化を制御できることが示された。より具体的には、Ｆａｓシグナルの活性を抑制することにより、幹細胞の未分化性を維持することができ、逆にＦａｓシグナルを活性化すれば、幹細胞の未分化性が解除できることが示された。
【図４】
0005815953.tif 000004
【図５】
0005815953.tif 000005
【図６】
0005815953.tif 000006
【図７】
0005815953.tif 000007
【図９】
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【図１０】
0005815953.tif 000009
【図１】
0005815953.tif 000010
【図２】
0005815953.tif 000011
【図３】
0005815953.tif 000012
【図８】
0005815953.tif 000013
【配列表】
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