(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
可逆的に結合した水溶性ポリマーで修飾されたタンパク質から該水溶性ポリマーを遊離させる、または可逆的に結合した水溶性ポリマーで修飾されたタンパク質の活性を増加させるインビトロの方法であって、該方法は、該タンパク質を、該水溶性ポリマーを遊離させるために有効な条件下でインキュベートする工程を含み、該水溶性ポリマーを遊離させるために有効な条件が、該タンパク質を含む緩衝液の遊離アミン濃度を、該緩衝液に遊離リシンもしくはヒスチジンまたはこれらの組合せを添加することによって増加させて、該水溶性ポリマーを遊離させるのに有効な濃度にすることを含む、方法。
【請求項２】
前記条件が、前記タンパク質を含む緩衝液のｐＨを増加させること、該タンパク質を含む緩衝液の温度を上昇させること、または前記遊離アミンとのインキュベーション時間を増加させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記緩衝液のｐＨが８．１まで上昇させられる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記緩衝液のｐＨが９．８まで上昇させられる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記緩衝液の温度が４℃から３７℃へ上昇させられる、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質が前記遊離アミンと共に１６８時間インキュベートされる、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質が前記遊離アミンと共に４８時間インキュベートされる、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質が、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質が、フォンビルブランド因子（ＶＷＦ）である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記水溶性ポリマーが、９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル（ｆｍｏｃ）、ジベンゾフルベン、またはその誘導体を有する前記タンパク質に可逆的に結合する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記水溶性ポリマーが、９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル（ｆｍｏｃ）、またはその誘導体に結合する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコールである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記水溶性ポリマーが、ポリシアル酸である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記緩衝液のアミン濃度は１００ｍＭである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記緩衝液のアミン濃度は２００ｍＭである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００８年１０月２１日に出願された米国仮特許出願番号６１／１０７，２５７、および２００９年９月１５日に出願された米国仮特許出願番号６１／２４２，６３４の利益を主張し、上記米国仮特許出願の各々は、その全容が参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は一般的に、可逆的に結合した水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリシアル酸（ＰＳＡ））で修飾されたタンパク質からの、水溶性ポリマーの遊離を強制するインビトロアッセイシステムの開発に関連する。本発明は、水溶性ポリマーの遊離を分析する方法、および回復したタンパク質活性を測定する方法を含む。本発明はさらに、ＰＥＧおよびＰＳＡのようなポリマーを含む、遊離可能水溶性ポリマーで修飾されたタンパク質の品質管理に適当な方法を含む。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
血液凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の欠損または機能不全は、出血性障害血友病Ａに関連する。血友病Ａの管理のための処置の選択は、血漿由来または組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）濃縮物による置換療法である。重症の血友病Ａ、すなわちＦＶＩＩＩレベルが１％より少ない患者は、ＦＶＩＩＩレベルを１％より上の中間的な量に維持する目的の予防的治療によって最もよく処置されることが、一般的に受け入れられている。循環中における様々なＦＶＩＩＩ製品の平均半減期を考慮して、この循環濃度を、通常、ＦＶＩＩＩを１週間に２から３回投与することによって達成し得る。現在の予防治療の利便性を増すために、全ての他の製品の特徴を維持しながら、増強された薬力学的および薬物動態学的性質を有する次世代の製品の開発は、週１回ベースの投与を可能にすることが予想される。
【０００４】
治療的ポリペプチド薬は、タンパク質分解酵素および中和化抗体にさらされるだけではなく、受容体媒介性細胞取り込みによって循環から除去されやすい。これらのイベントは、適用されたタンパク質の半減期および循環時間の抑制と関連し、それによってその治療的効果を制限する。ＰＥＧのようなポリマーによるポリペプチド薬の修飾は、それらを有意な程度まで酵素的分解およびクリアランスから保護し、それによってその薬力学的および薬物動態学的プロファイルを改善することが示された。それに加えて、ペグ化は、免疫原性の減少、物理的および熱的安定性の増加、溶解性の増加、液体安定性の増加、および凝集の抑制を引き起こし得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ペグ化は通常、ポリペプチド薬への、１モノマーあたり１つまたはそれ以上のＰＥＧ鎖の共有結合によって達成される。ＰＥＧのタンパク質への安定な結合は、不可逆的な方式でそのタンパク質の生物学的機能を減少させる不利益を有する。タンパク質を、時間につれてタンパク質から解離する可能性を有する、可逆的に結合したＰＥＧで修飾することによって、これを回避し得る。この型の遊離可能ＰＥＧは、天然タンパク質の活性の完全な回復を伴って、天然タンパク質の遊離を可能にするはずである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、可逆的に結合した水溶性ポリマーで修飾されたタンパク質からの、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリシアル酸（ＰＳＡ）のような水溶性ポリマーの遊離を強制する、インビトロアッセイシステムの開発に関連する分野における１つまたはそれ以上のニーズに取り組む。本発明は、水溶性ポリマーの遊離を分析する方法、および回復したタンパク質活性を測定する方法を含む。本発明はさらに、遊離可能水溶性ポリマーで修飾されたタンパク質の品質管理に適当な方法を含む。
【０００７】
１つの実施態様において、本発明は、水溶性ポリマーで修飾されたタンパク質から、可逆的に結合した水溶性ポリマーを遊離させる方法を含む。別の実施態様において、本発明は、可逆的に結合した水溶性ポリマーによって修飾されたタンパク質の活性を増加させる方法を含む。どちらの方法も、タンパク質を、水溶性ポリマーを遊離させるために有効な１つまたはそれ以上の条件下でインキュベートする工程を含む。従って、本発明は、水溶性ポリマーを遊離させるために有効な条件の組み合わせを含む。１つの局面において、水溶性ポリマーを遊離させるために有効な条件は、タンパク質を含む緩衝液のｐＨを、約ｐＨ６から約ｐＨ１０まで上昇させることを含む。別の局面において、その条件は、その緩衝液のｐＨを、約ｐＨ６．１から約ｐＨ９．８まで上昇させることを含む。さらなる局面において、その条件は、その緩衝液のｐＨを、約ｐＨ７．３から約ｐＨ９．８まで上昇させることを含む。さらに別の局面において、その条件は、その緩衝液のｐＨを、約ｐＨ６．５から約ｐＨ８．１まで上昇させることを含む。
【０００８】
別の局面において、ポリマー（すなわちポリエチレングリコール）によって修飾されたタンパク質から、可逆的に結合した水溶性ポリマーを遊離させるために有効な条件は、ポリマー−タンパク質結合体を含む緩衝液の遊離アミン濃度を増加させることを含む。１つの局面において、緩衝液の遊離アミン濃度の増加は、リシンの濃度の増加の結果である。別の局面において、緩衝液の遊離アミン濃度の増加は、ヒスチジンの濃度の増加の結果である。さらなる局面において、緩衝液の遊離アミン濃度の増加は、アミンの組み合わせの増加の結果である。さらに別の局面において、そのアミンの組み合わせは、リシンおよびヒスチジンである。
【０００９】
さらなる局面において、ポリマー（すなわちポリエチレングリコール）によって修飾されたタンパク質から、可逆的に結合した水溶性ポリマーを遊離させるために有効な条件は、ポリマー−タンパク質結合体を含む緩衝液の温度を、室温付近から約３７℃へ上昇させることを含む。さらなる局面において、タンパク質から可逆的に結合した水溶性ポリマーを遊離させるために有効な条件は、緩衝液の温度を、約４℃から約３７℃へ上昇させることを含む。
【００１０】
またさらなる局面において、ポリエチレングリコールのような、可逆的に結合した水溶性ポリマーを遊離させるために有効な条件は、ポリマー−タンパク質結合体をインキュベートする時間を、約５分から約１６８時間へ延長することを含む。様々な局面において、インキュベーション時間を、数分から数時間、数日、さらに１週間、またはそれ以上まで延長する。別の局面において、インキュベーション時間は、約５分から約４８時間の範囲である。
【００１１】
別の実施態様において、本発明は、タンパク質を約０時間から約６時間まで３７℃で、約１００ｍＭのヒスチジンおよび約１００ｍＭのリシンを含む、約ｐＨ７．３の緩衝液中でインキュベートし、そして最初の６時間以内にタンパク質活性を分析する工程を含む、可逆的に結合した遊離可能水溶性ポリマーで修飾されたタンパク質の品質管理をアッセイする方法を含む。これらの方法は、例えば、バッチ間での一貫性または保存する際の安定性を示すための手段を提供する。
【００１２】
さらに別の実施態様において、本発明は、可逆的に結合した水溶性ポリマーによって修飾されたタンパク質の活性の増加または回復をモニターする方法を含む。そのような方法は、タンパク質から可逆的に結合した水溶性ポリマーを除去する前および後に、タンパク質の活性を測定することを含む。
【００１３】
さらに別の実施態様において、本発明は、可逆的に結合した水溶性ポリマーによって修飾されたタンパク質からのポリマー遊離の動態を測定する方法を含む。そのような方法は反応混合物においてある期間にわたって、遊離の水溶性ポリマーの量およびタンパク質に結合体化している可逆的に結合した水溶性ポリマーの量を同時に測定することを含み、ここで遊離の水溶性ポリマーの量の変化およびタンパク質に結合体化しているポリマーの量の変化から動態を決定する。１つの局面において、その測定は、蛍光発光スペクトルに基づき、そしてポリエチレングリコール−９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル結合体に関しては約３５０−３５５ｎｍの発光ピーク、およびポリエチレングリコール−ジベンゾフルベンに関しては約４６０−５６０ｎｍの発光ピークにおける蛍光を用いて、同時の測定を行う。別の局面において、測定は遊離のポリエチレングリコール−９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルおよびポリエチレングリコール−ジベンゾフルベンに関する高速液体クロマトグラフィーに基づく。さらなる局面において、測定は、免疫化学的に、ポリマー結合タンパク質、すなわちペグ化タンパク質、および遊離タンパク質に関する酵素結合イムノソルベント検定法に基づく。
【００１４】
様々な局面において、その水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレングリコール）、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）、エチレングリコールおよびプロピレングリコールのコポリマー等、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリフォスファゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｓｐｈａｚｅｎｅ）、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、ポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、ポリ（マレイン酸）、ポリ（ＤＬ−アラニン）、多糖、例えば、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ヒアルロン酸、およびキチン、ポリ（メタ）クリレート、およびポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシエチルデンプン、および前述のいずれかの組み合わせを含むがこれに限らない。１つの局面において、その水溶性ポリマーはＰＥＧである。別の局面において、その水溶性ポリマーはポリシアル酸（ＰＳＡ）である。
【００１５】
様々な局面において、そのタンパク質は第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）またはフォンビルブランド因子（ＶＷＦ）である。本発明のさらなる局面において、その水溶性ポリマーは、タンパク質Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）またはアルデヒドに基づく化学、水溶性ポリマー鎖と結合部位との間に異なる化学的結合を有する改変体、および長さが異なる改変体に結合する。１つの局面において、その水溶性ポリマーは、９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル、ジベンゾフルベン、またはその誘導体に結合する。
【００１６】
本発明の他の特徴および利点が、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし、本発明の意図および範囲内の様々な変化および修飾が、この詳細な説明から当業者に明らかになるので、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の特定の実施態様を示すが、説明のためのみに提供されることが理解されるべきである。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
可逆的に結合した水溶性ポリマーで修飾されたタンパク質から該水溶性ポリマーを遊離させる方法であって、該方法は、該タンパク質を、該水溶性ポリマーを遊離させるために有効な１つまたはそれ以上の条件下でインキュベートする工程を含む、方法。
（項目２）
可逆的に結合した水溶性ポリマーで修飾されたタンパク質の活性を増加させる方法であって、該方法は、該タンパク質を、該水溶性ポリマーを遊離させるために有効な１つまたはそれ以上の条件下でインキュベートする工程を含む、方法。
（項目３）
上記水溶性ポリマーを遊離させるために有効な条件が、上記タンパク質を含む緩衝液のｐＨを、約ｐＨ６から約ｐＨ１０まで上昇させることを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
上記条件が、上記緩衝液のｐＨを、約６．１から約９．８まで上昇させることを含む、項目３に記載の方法。
（項目５）
上記条件が、上記緩衝液のｐＨを、約７．３から約９．８まで上昇させることを含む、項目３に記載の方法。
（項目６）
上記条件が、上記緩衝液のｐＨを、約６．５から約８．１まで上昇させることを含む、項目３に記載の方法。
（項目７）
上記水溶性ポリマーを遊離させるために有効な条件が、上記タンパク質を含む緩衝液の遊離アミン濃度を増加させることを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目８）
上記緩衝液の遊離アミン濃度の増加が、リシンの濃度の増加の結果である、項目７に記載の方法。
（項目９）
上記緩衝液の遊離アミン濃度の増加が、ヒスチジンの濃度の増加の結果である、項目７に記載の方法。
（項目１０）
上記緩衝液の遊離アミン濃度の増加が、アミンの組み合わせの増加の結果である、項目７に記載の方法。
（項目１１）
上記アミンの組み合わせが、リシンおよびヒスチジンである、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
上記水溶性ポリマーを遊離させるために有効な条件が、上記緩衝液の温度を、室温付近から約３７℃へ上昇させることを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目１３）
上記水溶性ポリマーを遊離させるために有効な条件が、上記緩衝液の温度を、約４℃から約３７℃へ上昇させることを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目１４）
上記水溶性ポリマーを遊離させるために有効な条件が、上記タンパク質をインキュベートする時間を、約５分から約１６８時間へ延長することを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目１５）
上記時間が、約５分から約４８時間の範囲である、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
遊離可能水溶性ポリマーで修飾されたタンパク質の品質管理をアッセイする方法であって、該方法は、該タンパク質を０時間から約６時間まで３７℃で、約１００ｍＭのヒスチジンおよび約１００ｍＭのリシンを含む、約ｐＨ７．３の緩衝液中でインキュベートする工程、ならびに最初の６時間以内にタンパク質活性を分析する工程を含む、方法。
（項目１７）
可逆的に結合した水溶性ポリマーによって修飾されたタンパク質の活性の増加または回復をモニターする方法であって、該方法は、該タンパク質から該可逆的に結合した水溶性ポリマーを除去する前および後に、タンパク質の活性を測定する工程を含む、方法。
（項目１８）
可逆的に結合した水溶性ポリマーによって修飾されたタンパク質からの水溶性ポリマー遊離の動態を測定する方法であって、該方法は、反応混合物においてある期間にわたって、遊離の水溶性ポリマーの量およびタンパク質に結合体化した水溶性ポリマーの量を同時に測定する工程を含み、ここで該遊離の水溶性ポリマーの量の変化および該タンパク質に結合体化した水溶性ポリマーの量の変化から動態を決定する、方法。
（項目１９）
上記測定する工程が、蛍光発光スペクトルに基づき、ここで、該同時に測定する工程が、水溶性ポリマー−９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル（ｆｍｏｃ）結合体に関しては約３５０−３５５ｎｍの発光ピーク、そして水溶性ポリマー−ジベンゾフルベンに関しては約４６０−５６０ｎｍの発光ピークにおける蛍光を用いて実行される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
上記測定する工程が、遊離の水溶性ポリマー−９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル（ｆｍｏｃ）および水溶性ポリマー−ジベンゾフルベンに関する高速液体クロマトグラフィーに基づく、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
上記測定する工程が、免疫化学的に、水溶性ポリマー結合体化タンパク質および遊離の該タンパク質に関する酵素結合イムノソルベント検定法に基づく、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
上記タンパク質が、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）である、項目１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
上記タンパク質が、フォンビルブランド因子（ＶＷＦ）である、項目１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
上記水溶性ポリマーが、９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル（ｆｍｏｃ）、ジベンゾフルベン、またはその誘導体を有する上記タンパク質に可逆的に結合する、項目１、２、１６、１７または１８に記載の方法。
（項目２５）
上記水溶性ポリマーが、９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル（ｆｍｏｃ）、またはその誘導体に結合する、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
上記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコールである、項目１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
上記水溶性ポリマーが、ポリシアル酸である、項目１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
本発明のさらなる説明を、下記の図１−１１で述べる付随する図面を参照して提供する。
【図１】図１は、ペグ化ｒＶＷＦのマルチマー構造に対する、ｐＨ依存性ＰＥＧ遊離の影響を示す。
【図２】図２は、抗ＶＷＦ抗体を用いて、ペグ化ｒＶＷＦのマルチマー構造に対する、ｐＨおよびアミン依存性ＰＥＧ遊離の影響を示す。
【図３】図３は、抗ＶＷＦ抗体を用いて、ペグ化ｒＶＷＦのマルチマー構造に対する、ｐＨおよびアミン依存性ＰＥＧ遊離の影響を示す。
【図４】図４は、ＦＶＩＩＩ×ＶＷＦ欠損マウスモデルにおける、天然および脱ペグ化ｒＶＷＦのインビボｒＦＶＩＩＩ安定化効果の比較を示す。
【図５】図５は、異なる濃度でヒスチジンおよび／またはリシンを含む緩衝液における、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩのインキュベーションに際した、ＦＶＩＩＩ色素形成活性の増加の比較を示す。
【図６】図６は、ｐＨ９．８またはヒスチジンおよびリシンを含む中性ｐＨの緩衝液における、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩのインキュベーションに際した、ＦＶＩＩＩ色素形成活性の増加の比較を示す。
【図７】図７は、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩのＦＶＩＩＩ色素形成活性およびＶＷＦ結合能力に対する、アミンに基づく緩衝液依存性のＰＥＧ遊離の影響を示す。
【図８】図８は、インビトロ遊離アッセイの再現性およびバッチによる一貫性を調節するための試験を示す。
【図９】図９は、ｐＨ＝８．５におけるＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩのインキュベーションに際した、ＰＥＧ−ジベンゾフルベン（４６０−５６０ｎｍ）の産生および対応するＰＥＧ−ＦＭＯＣ結合体の蛍光シグナル（３５０−３５５ｎｍ）の減少を示す蛍光スペクトルを示す。
【図１０】図１０は、還元グルタチオン存在下における、ｐＨ＝８．５での遊離可能ペグ化ＦＶＩＩＩのインキュベーションに際した、ＰＥＧ−ジベンゾフルベン蛍光の形成を伴わない、ＰＥＧ−ＦＭＯＣ結合体蛍光シグナル（３５０−３５５ｎｍ）のわずかな減少を示す蛍光スペクトルを示す。
【図１１】図１１は、ｐＨ＝６．０における遊離可能ＰＥＧ化ＦＶＩＩＩのインキュベーションに際した、ＰＥＧ−ＦＭＯＣ結合体蛍光シグナル（３５０−３５５ｎｍ）の安定性を示す蛍光スペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、可逆的な結合でタンパク質に共有結合した水溶性ポリマーの遊離に関連する、タンパク質の活性の回復率を調査するための、インビトロアッセイシステムの開発に関連する。タンパク質の「活性の回復」という用語は、水溶性ポリマーが遊離した後の、生物学的機能、受容体結合、および酵素活性のような活性を含むがこれに限らないタンパク質活性の増加を指す。タンパク質のこの型の水溶性ポリマー修飾は、遊離可能水溶性ポリマー、すなわちＰＥＧ−ＦＭＯＣ−ＮＨＳ試薬の、関心のあるタンパク質の露出したリシン残基への結合によって達成される。「ＦＭＯＣ」という用語は、９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルを表し、それはペプチドまたはポリペプチド鎖の保護基を説明する。
【００１９】
「タンパク質」という用語は、組換えタンパク質、タンパク質複合体、およびペプチド結合によって連結したアミノ酸残基から成るポリペプチドを含む、任意のタンパク質、タンパク質複合体、またはポリペプチドを指す。タンパク質を、インビボ供給源からの単離によって（すなわち天然に存在する）、合成方法によって、または組換えＤＮＡ技術によって得る。合成ポリペプチドを、例えば自動化ポリペプチド合成機を用いて合成する。本発明によって使用する組換えタンパク質を、下記の本明細書中で説明するような、当該分野で公知の任意の方法によって産生する。１つの実施態様において、そのタンパク質は、治療的タンパク質またはその生物学的に活性な誘導体を含む、生理学的に活性なタンパク質である。「タンパク質」という用語は典型的には、大きいポリペプチドを指す。「ペプチド」という用語は典型的には、短いポリペプチドを指す。その区別に関わらず、本明細書中で使用される場合、ポリペプチド、タンパク質、およびペプチドは、交換可能に使用される。
【００２０】
ポリペプチドの「断片」は、全長ポリペプチドまたはタンパク質発現産物よりも小さい、ポリペプチドの任意の部分を指す。１つの局面において、断片は、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が、全長ポリペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシ末端から除去された、全長ポリペプチドの欠失アナログである。よって、「断片」は、下記で説明する欠失アナログのサブセットである。
【００２１】
「アナログ（ａｎａｌｏｇｕｅ）」、「アナログ（ａｎａｌｏｇ）」、または「誘導体」は、ある場合においては様々な程度ではあるが、天然に存在する分子と、構造において実質的に同様であり、そして同じ生物学的活性を有する化合物である。例えば、ポリペプチドアナログは、参照ポリペプチドと実質的に同様の構造を共有し、そして同じ生物学的活性を有するポリペプチドを指す。アナログは、以下のものを含む１つまたはそれ以上の変異に基づいて、そのアナログが得られた天然に存在するポリペプチドと比較して、そのアミノ酸配列の組成において異なる：（ｉ）天然に存在するポリペプチド配列の、１つまたはそれ以上のポリペプチドの末端および／または１つまたはそれ以上の内部領域における、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の欠失、（ｉｉ）天然に存在するポリペプチド配列の、１つまたはそれ以上のポリペプチドの末端（典型的には「付加」アナログ）および／または１つまたはそれ以上の内部領域（典型的には「挿入」アナログ）における、１つまたはそれ以上のアミノ酸の挿入または付加、または（ｉｉｉ）天然に存在するポリペプチド配列における、１つまたはそれ以上のアミノ酸の、他のアミノ酸との置換。
【００２２】
１つの実施態様において、本発明は、本発明の化合物または結合体および薬学的に許容可能な担体を混合することによって産生した、組成物または薬学的組成物を含む。「薬学的組成物」という用語は、ヒトおよび哺乳動物を含む被験体動物における薬学的使用に適当な組成物を指す。薬学的組成物は、薬理学的に有効な量のポリマー−ポリペプチド結合体を含み、そして薬学的に許容可能な担体も含む。薬学的組成物は、活性成分、および薬学的に許容可能な担体を構成する不活性成分、および直接的または間接的に、任意の２つまたはそれ以上の成分での組み合わせ、錯体形成、または凝集からできる任意の産物を含む組成物を含む。
【００２３】
「薬学的に許容可能な担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩水溶液、デキストロースの５％水性溶液、および水中油型または油中水型エマルジョンのようなエマルジョン、および様々な型の湿潤剤および／またはアジュバントのような、任意および全ての臨床的に有用な溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝液、および賦形剤を含む。適当な薬学的担体および処方が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、１９９５）において記載される。組成物のために有用な薬学的担体は、活性薬剤の意図される投与方式に依存する。典型的な投与方式は、経腸（例えば経口）または非経口（例えば皮下、筋肉内、静脈内、または腹腔内注射；または局所、経皮、または経粘膜投与）を含むがこれに限らない。「薬学的に許容可能な塩」は、薬学的な使用のために化合物または結合体に処方され得る塩であり、例えば金属塩（ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等）およびアンモニアまたは有機アミンの塩を含む。
【００２４】
「薬学的に許容可能な」または「薬理学的に許容可能な」という用語は、生物学的にまたは他の面で望ましくないことがない物質を意味する。すなわち、その物質は、下記で説明するような当該分野で周知の経路を用いて投与されるときに、任意の望ましくない生物学的効果を引き起こさず、またはそれが含まれる組成物の任意の成分と有害な方式で相互作用せずに、個体へ投与され得る。
【００２５】
１つの実施態様において、本発明は、そのタンパク質またはポリペプチドの産生、バイアビリティーに有利な影響を与える化学的部分へ結合した、化学的に修飾されたタンパク質またはポリペプチドを含む。例えば、水溶性ポリマーのポリペプチドへの非特異的または部位特異的（例えばＮ末端）結合は、当該分野において、潜在的に免疫原性、腎クリアランスを抑制すること、および／またはプロテアーゼ抵抗性を改善することによって、半減期を改善することが公知である。いくつかの実施態様において、本発明で使用するためのポリペプチドは、分子の半減期および／または安定性を増加させるために、ペプチドに可逆的に結合した水溶性ポリマーを含む。様々な局面において、その水溶性ポリマーは、水溶性ポリマーを収容し得る任意の部位において、ペプチドまたはポリペプチドと結合する。１つの局面において、その水溶性ポリマーは、Ｎ末端に結合する。別の局面において、その水溶性ポリマーは、Ｃ末端に結合する。
【００２６】
「水溶性ポリマー」という用語は、実質的に水性溶液中で可溶性であるかまたは懸濁物の形式で存在し、そして薬学的に有効な量での当該ポリマーに結合体化したタンパク質の投与に際し、実質的に哺乳動物に負の影響を与えず、そして生体適合性であると考えられ得るポリマー分子を指す。１つの実施態様において、生理学的に許容可能な分子は、約２から約３００の反復ユニットを含む。様々な局面において、水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレングリコール）、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）、エチレングリコールおよびプロピレングリコールのコポリマー等、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリフォスファゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｓｐｈａｚｅｎｅ）、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、ポリ（アルキレンオキシド）ポリマー、ポリ（マレイン酸）、ポリ（ＤＬ−アラニン）、多糖、例えば、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ヒアルロン酸、およびキチン、ポリ（メタ）クリレート、およびポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシエチルデンプン、および前述のいずれかの組み合わせを含むがこれに限らない。
【００２７】
１つの実施態様において、本発明は、型、結合、連結、配置および長さにおいて異なる、水溶性ポリマーの使用を含む。その水溶性ポリマー分子は、特定の構造に制限されず、ある局面において、直線状、分岐または多肢、樹状であるか、または分解性の連結を有する。さらに、そのポリマー分子の内部構造は、さらに他の局面において、任意の数の異なるパターンに組織化され、そして制限無しに、ホモポリマー、交互のコポリマー、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー、交互のトリポリマー、ランダムトリポリマー、およびブロックトリポリマーからなる群より選択される。
【００２８】
ある実施態様において、ポリマー−タンパク質結合体は、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）またはアルデヒドに基づく化学によって結合したポリマー−タンパク質結合体、水溶性ポリマー鎖と結合部位との間の異なる化学結合を有する改変体、および長さが異なる改変体を含むがこれに限らない。
【００２９】
１つの局面において、その水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）である。ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）またはポリオキシエチレン（ＰＯＥ）としても公知であるＰＥＧは、ポリエーテルの１つの型である。ＰＥＧ、ＰＥＯ、またはＰＯＥは、エチレンオキシドのオリゴマーまたはポリマーを指す。３つの名前は、化学的には同義であるが、歴史的にはＰＥＧは２０，０００ｇ／ｍｏｌより少ない分子量を有するオリゴマーおよびポリマー、ＰＥＯは２０，０００ｇ／ｍｏｌより大きい分子量を有すポリマー、ＰＯＥはあらゆる分子量のポリマーを指す傾向があった。しかし、本明細書中において、その用語を交換可能に使用する。
【００３０】
ＰＥＧおよびＰＥＯは、分子量の分布を有する分子を含む（すなわち多分散）。そのサイズ分布を、その重量平均分子量（Ｍｗ）およびその数平均分子量（Ｍｎ）によって統計学的に特徴づけることができ、その比は多分散指数と呼ばれる（Ｍｗ／Ｍｎ）。ＭｗおよびＭｎを、質量分析によって測定し得る。ほとんどのＰＥＧ−タンパク質結合体、特に１ＫＤａより大きなＰＥＧに結合体化したものは、親ＰＥＧ分子の多分散性質による分子量の範囲を示す。例えば、ｍＰＥＧ２Ｋ（Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ  ＭＥ−０２０ＨＳ、ＮＯＦ）の場合、実際の分子量は、１．０３６の多分散指数で１．５〜３．０ＫＤａの範囲にわたって分布する。例外は、ＭＳ（ＰＥＧ）ｎ（Ｎ＝４、８、１２または２４、例えばＰＥＯ４、ＰＥＯ１２）に基づく試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）に結合体化したタンパク質であり、それらは別々の鎖長および規定された分子量を有する単分散混合物として特別に調製される。
【００３１】
１つの実施態様において、水溶性ポリマーがＰＥＧである場合、ＰＥＧの平均分子量は約３から２００キロダルトン（「ｋＤａ」）、約５ｋＤａから約１２０ｋＤａ、約１０ｋＤａから約１００ｋＤａ、約２０ｋＤａから約５０ｋＤａ、約１０ｋＤａから約２５ｋＤａ、約５ｋＤａから約５０ｋＤａ、または約５ｋＤａから約１０ｋＤａの範囲である。
【００３２】
「ＰＥＧ」という用語は、本明細書中で議論されるか、または当該分野においてタンパク質を誘導体化するために使用されてきた、ＰＥＧの任意の形式を含むことを意味する。本発明は、１−１００の反復ユニット（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）を含むがこれに限らない、いくつかの異なる直線状ＰＥＧポリマーの長さ、または２アームの分岐ＰＥＧポリマーの結合体を含む。いくつかの局面において、ＰＥＧポリマーの長さは、１０−２０００の反復ユニット（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）または２アームの分岐ＰＥＧポリマーの結合体を含む。１２から５０ユニットを有する、ＮＨＳまたはアルデヒドに基づくＰＥＧ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎも、さらに本発明に含まれる。一般的に、本明細書中に含まれるペグ化反応に関して、加わるＰＥＧ部分の平均分子量は、約１ｋＤａから約５０ｋＤａ（「約」という用語は＋／−１ｋＤａを示す）である。他の局面において、ＰＥＧ部分の平均分子量は、約６０ｋＤａの大きさであり得る。ある局面において、平均分子量は約０．５−５ｋＤａである。
【００３３】
「ペグ化」という用語は、１つまたはそれ以上のＰＥＧ部分に結合したタンパク質、タンパク質複合体、またはポリペプチドを指す。本明細書中で使用される「ペグ化」という用語は、１つまたはそれ以上のＰＥＧをタンパク質へ結合する過程を指す。
【００３４】
別の実施態様において、本発明は、ＮＨＳ−結合であり、そして長さが−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ、ここでｎ＝１から１００、の範囲である直線状ＰＥＧ−タンパク質結合体、アルデヒド結合であり、そして長さが−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ、ここでｎ＝１から１００、の範囲である直線状ＰＥＧ−タンパク質結合体、ＮＨＳ−結合であり、そして長さが変動する２アームの分岐ＰＥＧ−タンパク質結合体、およびＮＨＳ結合である３アーム分岐ＰＥＧ−タンパク質結合体からなる群より選択されるＰＥＧ−タンパク質結合体を含む。他の局面において、ｎ＝１０から１０００である。本発明はまた、その結合部位とＰＥＧ鎖との間に、異なる化学的結合（−ＣＯ（ＣＨ２）ｎ−、および−（ＣＨ２）ｎ−、ここでｎ＝１から５）を含む、ＰＥＧ−タンパク質結合体を含む。本発明はさらに、腎クリアランスを抑制するために、カルボキシル化、硫酸化、およびリン酸化化合物（陰イオン性）を含むがこれに限らない、荷電した、陰イオン性ＰＥＧ−タンパク質結合体を含む（Ｃａｌｉｃｅｔｉ、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２００３  ５５（１０）：１２６１−７７；Ｐｅｒｌｍａｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏ．Ｍｅｔａｂ．２００３  ８８（７）：３２２７−３５；Ｐｉｔｋｉｎ、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇ．Ｃｈｅｍｏ．１９８６  ２９（３）：４４０−４４；Ｖｅｈａｓｋａｒｉ、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｌ．１９８２  ２２  １２７−１３５）。さらなる実施態様において、そのペプチドを任意でビスホスホネート、炭水化物、脂肪酸、またはさらなるアミノ酸を含む部分へ結合体化する。
【００３５】
１つの実施態様において、本発明は、タンパク質へ結合体化した水溶性ポリマーを低い程度で有する血液因子のような、修飾タンパク質を提供する。本発明の様々な局面において、タンパク質の低ペグ化形式を、結合反応において、タンパク質に対して低いモル過剰の水溶性ポリマーを用いて産生する。例えば、タンパク質をペグ化する典型的な方法は、関心のあるタンパク質に対して６１．８Ｍ過剰のＰＥＧを使用する。いくつかの局面において、タンパク質をペグ化する方法は、タンパク質に対して５０−１００Ｍ過剰のＰＥＧを使用する。様々な局面において、本明細書中で記載したような低ペグ化タンパク質を、標準的な技術で使用するより少ない、反応中のモル過剰を用いて産生する。
【００３６】
さらに、本明細書中で記載された低ペグ化タンパク質は、血液因子分子あたり、または血液凝固タンパク質分子あたり少なくとも約１および約１０以下の水溶性ポリマー部分を含むことが企図される。１つの実施態様において、その修飾タンパク質は、タンパク質分子あたり、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、または９個の水溶性ポリマー部分を含む。別の実施態様において、その修飾タンパク質は、タンパク質分子あたり、約４〜８の間の水溶性ポリマー部分を含む。いくつかの実施態様において、その修飾タンパク質は、血液因子である。他の局面において、その修飾タンパク質は、血液凝固タンパク質である。関連する実施態様において、本発明は、第ＩＩ因子、第ＩＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、フォンビルブランド因子およびフィブリノーゲンのような、任意の血液因子を含むがこれに限らない。１つの局面において、その血液因子分子は、第ＶＩＩＩ因子である。別の局面において、その血液因子分子はＶＷＦである。またさらなる局面において、その血液因子分子はヒトである。１つの実施態様において、その修飾血液因子または血液凝固タンパク質分子は、分子あたり少なくとも１つおよび２０より少ないＰＥＧ部分を含む。関連する実施態様において、その修飾血液因子は、血液因子分子あたり、少なくとも４および１０より少ないＰＥＧ部分を含む。さらなる実施態様において、その修飾血液因子は、血液因子分子あたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の水溶性ポリマー部分を含む。関連する実施態様において、その修飾血液因子分子は、血液因子分子あたり、１〜２０の間、２〜１０の間、または４〜８の間のＰＥＧ部分を含む。１つの局面において、５個のＰＥＧ部分が、組換えＶＷＦに結合する。別の局面において、１２個のＰＥＧ部分が、組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）に結合する。
【００３７】
ペプチド、ポリペプチド（タンパク質）のインビボ治療的半減期が、ペグ化から利益を得るかどうかを決定するために、様々な異なるＰＥＧ−タンパク質結合体を合成し、インビトロおよびインビボ（薬物動態に関して）で特徴付ける。
【００３８】
本発明のペグ化タンパク質を調製する方法は一般的に、ＰＥＧがタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または任意の他のアミノ酸に可逆的に結合する条件下で、関心のあるタンパク質をＰＥＧと反応させる工程、そして反応産物を得る工程を含む。タンパク質のペグ化は、そのタンパク質の内因性活性を有意に変え得るので、異なる型のＰＥＧを探索する。タンパク質のペグ化に使用し得る化学は、メトキシ−ＰＥＧ（Ｏ−［（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル）−メチル］−Ｏ’−メチルポリエチレングリコール）のＮＨＳエステルを用いた、タンパク質の１級アミンのアシル化を含む。メトキシ−ＰＥＧ−ＮＨＳまたはメトキシ−ＰＥＧ−ＳＰＡによるアシル化は、オリジナルの１級アミンから荷電を排除するアミド結合を生じる（また、Ｃ末端に関してはＢｏｃ−ＰＥＧ）。リボソームタンパク質合成と異なり、合成ペプチドの合成は、Ｃ末端からＮ末端へ進行する。従って、Ｂｏｃ−ＰＥＧは、ペプチドのＣ末端へＰＥＧを結合する１つの方法である（すなわちｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ、ｔ−Ｂｏｃ）合成を用いる）（Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉ．Ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  Ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５（１４）：２１４９−２１５４）。あるいは、側鎖保護基を除去するために、有害なフッ化水素酸の使用を必要としないので、フルオレニル−メトキシ−カルボニル（ＦＭＯＣ）化学（Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅ．；Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．（１９８９）Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ：ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）を使用する。ＰＥＧ部分を含むペプチドを産生する方法は、当該分野で周知である。例えば、米国特許第５，８２４，７８４号を参照のこと。
【００３９】
「リンカー」という用語は、水溶性ポリマーを、生物学的に活性な分子と連結する分子の断片を指す。その断片は典型的には、別のリンカーと、または直接的に生物学的に活性な求核剤と結合され得るか、またはそれらと反応するように活性化され得る、２つの官能基を有する。例として、リシンのようなω−アミノアルカン酸を通常使用する。本発明は、水溶性ポリマーのポリペプチドへの結合に使用される、遊離可能、分解性、または加水分解性リンカーを含む。
【００４０】
１つの局面において、本発明は、タンパク質に遊離可能に連結したＰＥＧを含む。この型のＰＥＧ修飾を、遊離可能ＰＥＧ−ＦＭＯＣ−ＮＨＳ試薬を、関心のあるタンパク質の露出したリシン残基へ結合することによって達成する。形成された結合体を、そのβ脱離メカニズムによってＰＥＧを遊離させる能力によって特徴付ける。β脱離速度は、塩基（例えばアミン基）によって触媒され、そして塩基性ｐＨおよび高い温度によって促進される。従って、高い濃度の遊離アミンによって、およびｐＨおよび温度の上昇によって、ＰＥＧの遊離をインビトロにおいて強制し得る。
【００４１】
様々な他の局面において、本発明は、水溶性ポリマーの、関心のあるポリペプチドへの結合を促進し得る、安定かつ加水分解性のリンカーを含む。安定なリンカーは、アミド、アミン、エーテル、カルバメート、チオ尿素、尿素、チオカルバメート、チオカルボネート、チオエーテル、チオエステル、およびジチオカルバメート結合、例えば、ω，ω−アミノアルカン、Ｎ−カルボキシアルキルマレイミド、またはアミノアルカン酸、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル、グルタルアルデヒド、または無水コハク酸、Ｎ−カルボキシメチルマレイミドＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルオキサレートおよび１，１’−ビス［６−（トリフルオロメチル）ベンゾ−トリアゾリル］オキサレートを含むがこれに限らない。他の局面において、水溶性ポリマーを、加水分解性リンカーを用いてポリペプチドへ結合する。加水分解性リンカーは、水溶性ポリマーをポリペプチドに加水分解性または分解性結合で連結し、それは生理学的条件下で水と反応する（すなわち加水分解する）比較的弱い結合である。結合の水中で加水分解する傾向は、２つの中央の原子をつなぐ結合の一般的な型だけでなく、これらの中央の原子に結合した置換基にも依存する。特定の局面において、加水分解性リンカーシステムを使用する。他の局面において、他の分解性または遊離可能システムを、特別な条件下で、例えば塩基触媒によって切断し得る。加水分解性、分解性、または遊離可能リンカーを含む水溶性ポリマーを作成する方法、およびこれらのリンカーを含む場合に加水分解性の水溶性ポリマーを含む結合体を作成する方法が、米国特許第７，２５９，２２４号（Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）および米国特許第７，２６７，９４１号（Ｎｅｋｔａｒ  ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓおよびＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）、米国特許第６，５１５，１００号（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＷＯ２００６／１３８５７２（Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、米国２００８／０２３４１９３（Ｎｅｋｔａｒ  ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓおよびＢａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＷＯ２００４／０８９２８０（Ｙｅｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏ．ＬＴＤ）、米国特許第７，１２２，１８９号（Ｅｎｚｏｎ  Ｉｎｃ．）において記載され、そしてリンカーシステムはさらにＧｒｅｅｎｗａｌｄら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２：３６５７−３６６７、１９９９）によって記載される。例えば、加水分解に供されるポリマーバックボーンにおけるエステル結合を有するＰＥＧを調製し得る。この加水分解は、ポリマーのより小さい分子量の断片への切断を引き起こす。適当な、加水分解に不安定、または弱い結合は、カルボン酸エステル、リン酸エステル、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、オルトエステル、ペプチドおよびオリゴヌクレオチド、チオエステル、チオールエステル、およびカルボネートを含むがこれに限らない。ポリマーバックボーンに含まれ得る加水分解的に分解性の結合は、カルバメート、カルボネート、サルフェート、およびアシルオキシアルキルエーテル結合、例えば���ミンおよびアルデヒドの反応から生じるイミン結合（例えばＯｕｃｈｉら、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ、３８（１）：５８２−３（１９９７）を参照のこと）；カルバメート、リン酸エステル、ヒドラゾン、アセタール、ケタール、またはオルトエステル結合（アセトン−ビス−（Ｎ−マレイミドエチル）ケタールリンカー（ＭＫ）を含む）を含む。本発明に含まれる他の分解性および遊離可能システムは、ＦＭＯＣ化学に基づくか、またはＢｉｃｉｎ誘導体に基づく遊離可能リンカーシステムである。他の局面において、他の遊離可能システムは、１，４−または１，６−ベンジル脱離反応を採用する。いくつかの局面において、本発明の方法は、ポリマー−タンパク質結合体の実質的に均一な混合物を提供する。本明細書中で使用される「実質的に均一な」は、ポリマー−タンパク質結合体分子のみが観察されることを意味する。ポリマー−タンパク質結合体は、生物学的活性を有し、そして「実質的に均一な」ペグ化タンパク質調製物は、均一な調製物の利点、例えば臨床的適用におけるロットごとの薬物動態の予測の容易さを示すために十分均一であるものである。
【００４２】
形成された結合体を、そのβ脱離メカニズムによってＰＥＧを遊離させる能力によって特徴付ける。β脱離速度は、塩基（例えばアミン基）によって触媒され、そして塩基性ｐＨおよび高い温度によって促進される。従って、ＰＥＧの遊離は、インビトロにおいて、高い濃度の遊離アミンおよび高いｐＨおよび温度によって強制され得る。
【００４３】
本発明は、可逆的に結合したＰＥＧによって修飾されたタンパク質から、インビトロにおいてＰＥＧの遊離を強制するための様々な戦略、およびその脱ペグ化をモニターするための適当なインビトロアッセイシステムの開発を記載する。例えば、タンパク質結合体、ペグ化組換えフォンビルブランド因子（ｒＶＷＦ）および組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）を使用する。
【００４４】
様々な実施態様において、本発明の方法において、ペグ化ｒＶＷＦまたはペグ化ｒＦＶＩＩＩを使用する。様々な血液凝固障害または出血性障害の処置において、ペグ化ｒＶＷＦおよびペグ化ｒＦＶＩＩＩを使用する。用語「血液凝固障害」または「出血性障害」は、任意の、血液が効率的に血餅を形成できないことを引き起こす血液凝固因子におけるいくつかの遺伝的または発病した（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）欠損、および続く被験体における異常な出血を指す。血液凝固障害は、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォンビルブランド症候群、第Ｘ因子欠損症、第ＶＩＩ因子欠損症、アレキサンダー病、ローゼンタール症候群（第ＸＩ因子欠損症または血友病Ｃ）、および第ＸＩＩＩ因子欠損症を含むがこれに限らない。血液凝固障害の処置は、予防的処置または治療的処置を指す。
【００４５】
さらに、ＶＷＦは機能的なＦＶＩＩＩの必須の成分であるので、ＶＷＦ欠損症は、表現型血友病Ａを引き起こし得る。それに加えて、フォンビルブランド病（ＶＷＤ）またはＶＷＦ症候群に罹患した患者は、多くの場合ＦＶＩＩＩ欠損症を示す。これらの患者において、抑制されたＦＶＩＩＩの活性は、第Ｘ染色体遺伝子の欠損の結果ではなく、血漿中のＶＷＦの定量的および定性的変化の間接的な結果である。血友病ＡとＶＷＤとの間の区別は、通常ＶＷＦ抗原の測定によって、またはリストセチンコファクターの活性を決定することによって行い得る。リストセチンコファクター活性を、リストセチンおよび血小板基質を患者の血漿へ加えることによって測定する。リストセチンは、ＶＷＦの血小板糖タンパク質Ｉｂ受容体への結合を増強し、凝集を引き起こす。光透過の変化によって測定されるように、患者のＶＷＦは、リストセチンによって誘発された血小板凝集を支援する。従って、これは患者のＶＷＦの機能的活性のインビトロにおける測定であり、そしてＶＷＤを診断するための最も鋭敏なアッセイである。ＶＷＦ抗原含有量およびリストセチンコファクター活性の両方が、ほとんどのＶＷＤ患者において低下するが、それらは血友病Ａ患者においては正常である。本発明は、可逆的にペグ化されたＶＷＦおよびＦＶＩＩＩを含む方法を議論するが、可逆的な結合によってＰＥＧへ共有結合し得る全ての他のタンパク質を含む。様々な局面において、本発明は、第ＩＩ因子（トロンビン）、第ＩＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子（プロコンベルチン）、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子（ＦＩＸ、クリスマス因子）、第ＸＩ因子、および第ＸＩＩＩ因子サブユニットＡおよびサブユニットＢを含むがこれに限らない、他の血液凝固因子タンパク質からＰＥＧを遊離させる方法を含む。
【００４６】
ＰＥＧのタンパク質からの遊離を、遊離ＰＥＧの増加、タンパク質活性の回復、およびｒＶＷＦの場合、例えばまた薬物動態学的パラメーターのインビボにおける回復を測定することによって、決定する。分離の必要無しに別個のＰＥＧ種の可能性をモニタリングすることが、異なるＵＶ吸収および蛍光発光スペクトルを有する、置換フルオレン（ＰＥＧ結合体に存在するような）、およびジベンゾフルベン（遊離ＰＥＧ）発色団の縮合した環構造のスペクトルの性質に基づいて提供される。
【００４７】
本発明の１つの実施態様は、修飾タンパク質の生物学的活性のインビトロにおける回復のモニタリングを可能にするアッセイシステムの開発である。ＰＥＧのような、遊離可能水溶性ポリマーを、ｐＨを上昇させることによってタンパク質から分離し得る（ｐＨを約８．１、約９．５、および約９．８の値まで上昇させることを含むがこれに限らない）。天然のタンパク質を回復するためのこの型のアッセイは、高いｐＨにおいて安定であるタンパク質に関して適当である。提供される方法の様々な局面において、ｐＨを約６．０から約８．５、約６．５から約８．１、約６．５から約９．５、約７．３から約９．８、および約６．５から約９．８へ上昇させる。さらなる局面において、本発明は、約１０までｐＨを上昇させることを含む。またさらなる局面において、提供される方法は、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、約９．０、約９．１、約９．２、約９．３、約９．４、約９．５、約９．６、約９．７、約９．８、約９．９、約１０．０、約１０．１、約１０．２、約１０．３、約１０．４、約１０．５、約１０．６、約１０．７、約１０．８、約１０．９、約１１．０、約１１．５、および約１２．０より高くまでｐＨ値を上昇させて試験することを含む。
【００４８】
別の実施態様において、遊離アミンの添加を、中性ｐＨにおいて水溶性ポリマーの遊離を強制する代替の方法として使用する。いくつかの局面において、その遊離アミンは、ヒスチジンおよびリシンを含むがこれに限らない。他の局面において、環状アミン、１級、２級、３級生体アミン、および芳香族アミンを使用する。従ってこの方法は、ｐＨ感受性タンパク質に適当である。これら２つのアプローチの組み合わせも、本発明の一部である。これらのアプローチを、ペグ化ｒＶＷＦおよびペグ化ｒＦＶＩＩＩで説明する（実施例１から５を参照のこと）。
【００４９】
別の実施態様において、タンパク質からの水溶性ポリマーの遊離を強制する、１つまたはそれ以上のさらなる手段として、緩衝液の温度の上昇を使用する。様々な局面において、その温度を、約４℃から室温付近、約３７℃へ上昇させる。またさらなる局面において、提供される方法は、緩衝液の温度を約４℃から約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃、約９０℃、約９５℃、および約１００℃まで上昇させることを含む。
【００５０】
従って、その水溶性ポリマーを、ポリペプチドへ可逆的に結合させ得、そして緩衝液の遊離アミン濃度を増加させることによって、緩衝液のｐＨを上昇させることによって、緩衝液の温度を上昇させることによって、または上記のいずれかの組み合わせによって、ポリペプチドから遊離させ得る。さらに、またさらなる実施態様において、本発明の方法は、タンパク質から水溶性ポリマーを遊離させるための１つまたはそれ以上の手段として、緩衝液中でタンパク質をインキュベートする時間を延長することを含む。様々な局面において、そのインキュベーション時間を、約５分（ｍｉｎ）から約１０分、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、約１時間（ｈｒ）、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約６０時間、約７２時間、約８４時間、約９６時間、約１０８時間、約１２０時間、約１３２時間、約１４４時間、約１４６時間、約１６８時間、約１８０時間、約１９２時間、約２０４時間、約２２８時間、約２５２時間、約２７６時間、および約３００時間まで増加させる。従って、その水溶性ポリマーを、様々な局面において、インキュベーション時間を増加させることによって、緩衝液のアミン濃度またはｐＨを増加させることによって、緩衝液の温度を上昇させることによって、または１つまたはそれ以上のこれらの列挙した手段のいずれかの組み合わせによって、ポリペプチドから遊離させる。
【００５１】
別の実施態様において、本発明は、遊離可能ＰＥＧまたは他の遊離可能水溶性ポリマーで修飾されたタンパク質の品質管理のために使用可能なアッセイシステムの開発である（実施例６を参照のこと）。
【００５２】
本発明はまた、サイズ排除クロマトグラフィーおよび遊離の水溶性ポリマー、すなわちＰＥＧの検出／測定による、遊離した水溶性ポリマーの測定の参照方法として使用される、分離に基づく方法の例を提供する（実施例７、８、および９を参照のこと）。使用される水溶性ポリマーリンカーの型に基づいて、水溶性ポリマーの分画および定量を、カラムの流出液の屈折率、光学濃度、および／または蛍光を測定することによって達成し得る。
【００５３】
本発明のさらなる実施態様は、反応混合物中において、すなわち産生された種を分離する必要性無しに、遊離した水溶性ポリマーおよび水溶性ポリマー−タンパク質結合体の量を測定することによる、水溶性ポリマー遊離の動態の特徴付けである（実施例７、８および９を参照のこと）。
【００５４】
１つの局面において、使用される蛍光分子の種が、そのスペクトルの性質において十分異なるなら、蛍光測定を使用する。フッ素−またはジベンゾフルベン−ポリマーおよびフッ素−（ＦＭＯＣ）−ポリマー結合種または遊離の水溶性ポリマー（すなわちＰＥＧ）およびＰＥＧ結合種の同時測定が、置換フルオレンの３５０−３５５ｎｍの発光ピークおよびジベンゾフルベンの４６０−５６０ｎｍの発光領域のような、別々の発光スペクトルを有する異なる縮合環システムのために、適当な励起波長における蛍光の測定によって可能である。さらに、励起波長の注意深い選択はまた、約２８０ｎｍで最大の感受性を有するタンパク質トリプトファンおよびチロシンの蛍光の励起を回避する。そのような測定に関して、約２０ｎｍのＳｔｏｋｅｓシフトを有する励起および発光シグナルを分離するために、狭い分光計のスリットが好ましい。
【００５５】
別の局面において、結合体結合水溶性ポリマー（すなわちＰＥＧ）の測定を可能にする、比イムノアッセイを使用する。この方法は、ＵＳＳＮ６１／００９，３２７において開示されるように、ＰＥＧおよび非結合タンパク質に特異的に結合する、対になった抗体の組み合わせの使用による測定を可能にする。次いでＰＥＧ結合体の脱ペグ化を、脱ペグ化の前に結合体に関して測定した反応と比較して表す、ＰＥＧタンパク質ＥＬＩＳＡにおける反応性の相対的減少によって検出する（実施例７、８、および９を参照のこと）。この型のＥＬＩＳＡは、遊離のＰＥＧは検出せず、結合体に結合したＰＥＧのみを特異的に検出する。
【００５６】
これらのインビトロアッセイシステムの開発によって、実質的な方式で、可逆的ペグ化タンパク質からのＰＥＧ遊離のβ脱離による速度を増加させること、および非修飾タンパク質の活性を回復させることが可能である。
【実施例】
【００５７】
（実施例）
本発明のさらなる局面および詳細が、以下の実施例から明らかであり、それは制限ではなく説明であることを意図する。実施例１は、上昇したｐＨにおける遊離可能ＰＥＧ−ｒＶＷＦのインビトロ脱ペグ化を説明する；実施例２は、１級アミンの存在下および高いｐＨにおける遊離可能ＰＥＧ−ｒＶＷＦのインビトロ脱ペグ化を説明する；実施例３は、選択された遊離アミンの存在下における、遊離可能ＰＥＧ−ＲＦＶＩＩＩのタンパク質活性のインビトロにおける回復を説明する；実施例４は、遊離アミンの組み合わせの存在下における、遊離可能ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩのインビトロ脱ペグ化を説明する；実施例５は、Ｈｅｐｅｓ／Ｔｒｉｓの存在下における、遊離可能ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩのインビトロ脱ペグ化を説明する；実施例６は、選択された遊離アミンの存在下における、遊離可能ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩのタンパク質活性のインビトロにおける回復を説明する；実施例７は、種の分離を伴わない、蛍光測定によるＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩからのＰＥＧ遊離の検出を説明する；実施例８は、グルタチオンによるＰＥＧ−ジベンゾフルベンの除去を説明する；実施例９は、ＰＥＧ−ジベンゾフルベン産生に対するｐＨの影響を示す；実施例１０は、上昇したｐＨにおける遊離可能ＰＳＡ−ｒＶＷＦのインビトロ解重合を議論する；実施例１１は、１級アミンの存在下および高いｐＨにおける遊離可能ＰＳＡ−ｒＶＷＦのインビトロ解重合を説明する；実施例１２は、選択された遊離アミンの存在下における、遊離可能ＰＳＡ−ＲＦＶＩＩＩのタンパク質活性のインビトロにおける回復を説明する；実施例１３は、遊離アミンの組み合わせの存在下における、遊離可能ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩのインビトロ解重合を説明する；および実施例１４は、Ｈｅｐｅｓ／Ｔｒｉｓの存在下における、遊離可能ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩのインビトロ解重合を説明する。
【００５８】
（実施例１）
（上昇したｐＨにおける遊離可能ＰＥＧ−ｒＶＷＦのインビトロ脱ペグ化）
遊離可能ｒＶＷＦ結合体（２０Ｋの分岐ＰＥＧと結合）の脱ペグ化を、タンパク質を２つの異なるｐＨ値、ｐＨ６．５およびｐＨ８．１でインキュベートすることによって行った。精製ＰＥＧ−ｒＶＷＦを、６．５のｐＨ値を有する０．０２Ｍのクエン酸ナトリウム、０．１５ＭのＮａＣｌに溶解した。アルカリ性サンプルのために、同じ緩衝液を、０．１ＭのＮａＯＨを加えることによってｐＨ８．１に調整した。規定された時点でサブサンプルを取り、そしてそのＶＷＦ抗原（ＶＷＦ：Ａｇ）の含有量、遊離ＰＥＧ、全ＰＥＧ、およびマルチマーのＶＷＦ組成に関して分析した。
【００５９】
ＶＷＦ：Ａｇの含有量を、市販で入手可能な抗体（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡによって決定した。遊離ＰＥＧおよび全ＰＥＧを、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）によって提供された高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法によって決定した。「高速液体クロマトグラフィー」、「高圧液体クロマトグラフィー」、およびＨＰＬＣという用語は、本明細書中で交換可能に使用される。高密度水平ＳＤＳアガロースゲル電気泳動およびポリクローナル抗ヒトＶＷＦ抗体（Ｄａｋｏ）を用いた免疫染色によって、ＶＷＦマルチマー分析を行った。これらの実験の結果を、表１および図１にまとめる。
【００６０】
表１のデータはそれぞれ、ｐＨ６．５およびｐＨ８．１におけるインキュベーション中の、ＶＷＦ：Ａｇ対タンパク質の決定された比（ＩＵ／ｍｇ）および全ＰＥＧ含有量に対する遊離した遊離ＰＥＧのパーセンテージの結果を示す。基礎の値は、結合体の最初の性質、すなわち強制されたＰＥＧ遊離が開始される前を反映する。ＶＷＦ：Ａｇ対タンパク質の比は、天然の非修飾ｒＶＷＦの１００−１６０ＩＵ／ｍｇと比較して、ＰＥＧ−ｒＶＷＦ（３９ＩＵ／ｍｇ）に関して著しく減少した。遊離ＰＥＧのパーセンテージは、５％と低かった。３７℃におけるインキュベーションに際し、ＶＷＦ：Ａｇ対タンパク質比は、両方の条件下で時間につれて徐々に増加したが、ｐＨ８．１における値がわずかに高かった。ＰＥＧ−ｒＶＷＦ結合体から遊離したＰＥＧの量は、より高いｐＨにおいて有意に促進された。ｐＨ８．１における１時間後、遊離した遊離ＰＥＧのパーセンテージは５３％であった；一方より低いｐＨ６．５において、２３％の遊離ＰＥＧが遊離した。遊離ＰＥＧのパーセンテージにおいて見られた差異は、より長いインキュベーション時間で減少し、そして２９日後、ｐＨ６．５において６０％のＰＥＧが遊離し、そしてｐＨ８．１において全ＰＥＧの６８％が遊離した。
【００６１】
【表１】
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これらのサンプルのマルチマー分析（図１）は、ペグ化後の各ＶＷＦマルチマーの典型的なシフトを示す（「天然ｒＶＷＦ」および「オリジナル」と命名されたレーンと比較した場合）。ｐＨ６．５および８．１の両方におけるインキュベーション中、より低い分子量へのシフトバックによって識別可能であるように、ペグ化ｒＶＷＦマルチマーの分子量は徐々に減少し、時間につれたＰＥＧの遊離を示した。しかし、非修飾ｒＶＷＦのオリジナルの構造の完全な回復は、両方のｐＨ条件下で達成されなかった。それでも、そのデータは、３７℃における、ｐＨ６．５およびｐＨ８．１の両方におけるインキュベーションは、ペグ化ｒＶＷＦからのＰＥＧの実質的な遊離を引き起こしたことを示す。
【００６２】
（実施例２）
（１級アミンの存在下および高いｐＨにおける遊離可能ＰＥＧ−ｒＶＷＦのインビトロ脱ペグ化）
遊離可能ＰＥＧ−ｒＶＷＦ（２０ｋの分岐ＰＥＧ）結合体を、１００ｍＭのリシンを含む、ｐＨ９．８の０．０２Ｍのクエン酸ナトリウム、０．１５ＭのＮａＣｌ緩衝液で希釈し、そして３７℃でインキュベートした。規定された時点でサブサンプルを取り、そしてそのＶＷＦ抗原の含有量（ＶＷＦ：Ａｇ）、遊離ＰＥＧ、全ＰＥＧ、およびマルチマー組成に関して分析した。高密度水平ＳＤＳアガロースゲル電気泳動、およびヒトＶＷＦ（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）またはＰＥＧ（研究室内で開発したポリクローナルウサギ抗ＰＥＧ抗体）のいずれかに対する抗体を用いた免疫染色によって、マルチマー分析を行った。その結果を表２、図２、および図３にまとめる。
【００６３】
【表２】
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表２のデータは、ｐＨ９．８における、アミンリシンの存在下におけるＰＥＧ−ｒＶＷＦのインキュベーションに際し、ＶＷＦ：Ａｇ対タンパク質の比の明らかな増加が時間につれて起こったことを示す。さらに、述べた緩衝液中における４８時間のインキュベーション後、全ＰＥＧの８１％が遊離した。図２のマルチマーゲルは、１０−２０時間のインキュベーション後、ＶＷＦマルチマーはより低い分子量へシフトバックし、そしてその構造は非修飾ｒＶＷＦのものと同様になったことを示す。より長いインキュベーション時間（４８時間）は、ｒＶＷＦタンパク質構造の分解を引き起こした。図３において、マルチマーゲルの染色のためにポリクローナル抗ＰＥＧ抗体を用いることによって、ｒＶＷＦの脱ペグ化を直接示した。２０時間のインキュベーション後、少量のＰＥＧのみが、単一のＶＷＦマルチマーに結合したままであった。そのデータは、ｐＨ９．８における、リシンの存在下におけるインキュベーションは、実施例１と比較してより短い時間に明らかなＰＥＧの遊離を引き起こし、そしてｒＶＷＦの構造を回復させたことを示す。従って実施例２によって説明した方法は、高いｐＨにおいて安定なタンパク質のために適当である。
【００６４】
脱ペグ化ＰＥＧ−ｒＶＷＦの薬物動態を、ＶＷＦ×ＦＶＩＩＩダブルノックアウトマウスモデルにおいて決定した。マウスに、ＦＶＩＩＩ（２００ＩＵ／ｋｇ）を単独で、または１．６ｍｇ／ｋｇの天然ｒＶＷＦ、遊離可能ＰＥＧ−ｒＶＷＦ（２０Ｋ分岐）、または脱ペグ化ｒＶＷＦ（ｐＨ９．８においてリシン溶液中で、＋３７℃で１０時間インキュベートした）のいずれかと共に、尾静脈によるボーラス注射（１０ｍｌ／ｋｇ）で与えた。
【００６５】
血液サンプル（クエン酸ナトリウムで抗凝固）を、注射の５分後、および３時間後、６時間後、９時間後、および２４時間後に、それぞれのグループから麻酔後に心臓穿刺によって採取した。遠心分離によって血漿を調製し、そして色素形成アッセイによってＦＶＩＩＩ活性を測定することによって、ＶＷＦのインビボにおけるＦＶＩＩＩ安定化機能を決定した。この実験の結果を、図４にまとめ、ペグ化ｒＶＷＦは、非修飾ｒＶＷＦよりも高い程度、ＦＶＩＩＩを保護したことを示す。脱ペグ化ｒＶＷＦは、非修飾ｒＶＷＦと同じＦＶＩＩＩ安定化能力を保持し、強制的なインビトロ遊離中に活性なｒＶＷＦが遊離したことを示す。
【００６６】
（実施例３）
（選択された遊離アミンの存在下における、遊離可能ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩのタンパク質活性のインビトロにおける回復）
遊離可能ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ結合体（２０Ｋ分岐ＰＥＧ）を、７．３のｐＨを有する緩衝液（１０ｍＭのヒスチジン、９０ｍＭのＮａＣｌ、１．７ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのＴｒｉｓ、０．２６ｍＭのグルタチオン、１７６ｍＭのマンニトール、２３．５ｍＭのトレハロース、および０．１ｇ／ｌのＴｗｅｅｎ８０）中で、５ＩＵ／ｍｌのＦＶＩＩＩ色素形成活性まで希釈した；その緩衝液はさらに、リシン、ヒスチジン、または両方のアミノ酸の組み合わせを含んでおり、そしてその緩衝液を３７℃でインキュベートして、タンパク質結合体からのＰＥＧのインビトロ遊離を強制した。規定された時点（２４時間、４８時間、および７２時間）においてサブサンプルを取り、そしてＦＶＩＩＩ色素形成アッセイを使用することによって、ＦＶＩＩＩ色素形成活性をオンライン（ｏｎｌｉｎｅ）で決定した。その結果を図５にまとめる。
【００６７】
アミンを欠く緩衝液において、７２時間後に５．０から１１．５ＩＵ／ｍｌのＦＶＩＩＩ：Ｃまで活性が増加した。７２時間の時点で、１００ｍＭのヒスチジンの存在は、ＦＶＩＩＩ活性を１７．８ＩＵ／ｍｌまで、１００ｍＭのリシンは２０．４ＩＵ／ｍｌまで、２００ｍＭのヒスチジンは２４．９ＩＵ／ｍｌまで、そして１００ｍＭのヒスチジンおよび１００ｍＭのリシンの組み合わせは３４．７ＩＵ／ｍｌまで増加させた。従って、強制的なＰＥＧ遊離は明らかに、アミン濃度およびおそらくアミンの組成に依存していた。この実施例によって本明細書中で説明された方法は、ｐＨ環境に感受性である可逆的ペグ化タンパク質のタンパク質活性のインビトロにおける回復に適当である。
【００６８】
（実施例４）
（遊離アミンの組み合わせの存在下における、遊離可能ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩのインビトロ脱ペグ化）
遊離可能ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ結合体（２０Ｋ分岐ＰＥＧ）を、７．３のｐＨを有する緩衝液（２０ｍＭのクエン酸Ｎａ３、１．７ｍＭのＣａＣｌ２、１７６ｍＭのマンニトール、３６ｍＭのショ糖、および０．１ｇ／ｌのＴｗｅｅｎ８０）中でインキュベートした；その緩衝液はさらに、１００ｍＭのヒスチジンおよび１００ｍＭのリシンを含み、そして＋３７℃でインキュベートした。１６８時間までの規定された時点でサブサンプルを取り、そしてＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩの機能的活性を、ＦＶＩＩＩ色素形成アッセイの使用によってオンラインで決定した。それに加えて、ＰＥＧの遊離を、凍結サブサンプルから、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）によって提供されるＨＰＬＣ法によって、遊離ＰＥＧおよび全ＰＥＧを測定することによって確認した。その結果を、図６および表３にまとめる。
【００６９】
図６は、インキュベーション段階中の、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩのＦＶＩＩＩ色素形成活性の増加を示す。タンパク質活性の増加は、２段階の過程をたどった：ＦＶＩＩＩ活性の迅速な増加が、最初の６時間以内に観察され、インキュベーションの２４時間後に最大に達する遅い活性の増加の段階が続き、６．０ＩＵ／ｍｌの開始活性と比較して、２１．９ＩＵ／ｍｌまでＦＶＩＩＩ色素形成活性が増加し、それは３６６％の活性の増加に相当する。１４４時間までのさらなるインキュベーションは、ＦＶＩＩＩ活性の遅い、漸進的減少を引き起こした。実施例１および２において概略を述べたように、高いｐＨ（例えば９．８）におけるペグ化タンパク質のインキュベーションは、インビトロでＰＥＧの遊離を誘発する別の選択肢である。従って、同じＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ結合体をｐＨ９．８において３７℃でインキュベートし、そして活性の増加を、ｐＨ７．３でヒスチジン／リシンの存在下で達成されたものと比較した。図６は、ｐＨ９．８において、ＦＶＩＩＩ色素形成活性の回復はより低く、ＦＶＩＩＩ色素形成活性は、４．４ＩＵ／ｍｌの開始活性と比較して、２４時間の時点で１４．８ＩＵ／ｍｌまで増加したことを示す。これはおそらく、この高いｐＨ値におけるＦＶＩＩＩ不活性化の増強のためであった。この結論は、両方の条件下におけるＰＥＧ遊離の同様の速度によって支持された（表３）。遊離したＰＥＧの量を、ＰＥＧの全量に関して遊離ＰＥＧのパーセンテージとして表した。遊離ＰＥＧの最初の低い含有量（８から１３％＝基礎値）は、両方の緩衝液におけるインキュベーションに際し、時間依存的な方式で増加し、ヒスチジン／リシン緩衝液の場合は１４４時間後に全ＰＥＧの６４％、そしてアルカリ性緩衝液（ｐＨ９．８）に関しては１６８時間後に７４％の最大に達した。これらのデータは、どちらの条件もＰＥＧの遊離を誘発するために適当であることを確認する。
【００７０】
【表３】
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実施例６のデータはまた、ｐＨ感受性タンパク質に関して、中性ｐＨにおける組み合わせた遊離アミンは、タンパク質活性の回復が、アルカリ性による遊離と比較して、そのような条件下でより高いので、強制インビトロＰＥＧ遊離に有利であることを示唆する。
【００７１】
（実施例５）
（ＨＥＰＥＳ／ＴＲＩＳの存在下における、遊離可能ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩのインビトロ脱ペグ化）
遊離可能ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩ（２０Ｋ分岐ＰＥＧ）を、ｐＨ７．４において典型的なアミンを含む緩衝物質の組み合わせ、すなわち２００ｍＭのＨＥＰＥＳおよび２００ｍＭのＴｒｉｓ中において、３７℃でインキュベートした。規定された時点においてサブサンプルを取り、ＦＶＩＩＩ活性の回復を色素形成アッセイによってモニターし、そしてそのＶＷＦと相互作用する能力を決定した。循環中におけるＦＶＩＩＩの生存を決定的に決定するＶＷＦ結合を、表面プラズモン共鳴技術を用いることによってモニターした。Ｂｉａｃｏｒｅ装置を用いて、様々なＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩサンプルを移動相に注入し、そして固定化ＶＷＦとの相互作用に関して試験した。ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩはほんの低レベルでしかｒＶＷＦに結合しなかったが、サンプルの結合はＰＥＧ遊離と共に増加した。図７は、ｒＦＶＩＩＩのＶＷＦへの結合の増加を伴う、経時的な色素形成性ＦＶＩＩＩ活性の増加を示し、これは、脱ペグ化のシグナルである。実施例５のデータは、広いスペクトルのアミンを、そのような結合体からＰＥＧの遊離を強制するために使用し得ることを示す。色素形成活性およびＶＷＦへの結合の両方の回復はさらに、機能的タンパク質が時間につれて産生されることを示す。
【００７２】
（実施例６）
（遊離アミンの存在下におけるＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩのインキュベーションに際した、ＦＶＩＩＩ活性増加の初速度）
実施例４において、３７℃におけるインキュベーションの０から６時間の時間間隔として定義された、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩからのＰＥＧ遊離の最初の急速期を、バッチごとの一貫性を調査するためのパラメーターとしての適合性に関して分析した。図８は、最初の６時間の、３７℃におけるｐＨ７．３の１００ｍＭのヒスチジン／１００ｍＭのリシン緩衝液中でのインキュベーションに際したＦＶＩＩＩ活性の増加を示す。
【００７３】
左のパネルにおいて、同じＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩのバッチの６回反復した測定を示し、一方右のパネルにおいて、結合体の２つの別のバッチの平均活性値を示す。１時間あたりのＦＶＩＩＩ活性（ＩＵ／ｍｌ）の増加を、直線回帰によって曲線をフィッティングすることによって計算し、そして傾き（ｋ’）として表す。６回のテスト単位および２つのバッチの傾きの数値を表４にまとめる。両方の場合において、同様の傾きが得られ、それによってそのアッセイシステムは再現性のある結果を生じることを示した。さらに、ＦＶＩＩＩ活性増加の初速度を決定することは、遊離可能ＰＥＧ結合体の異なるバッチの比較を可能にする。
【００７４】
【表４】
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（実施例７）
（種の分離を伴わない蛍光測定による、ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩＩからのＰＥＧ遊離の検出）
６．０ＩＵ／ｍｌの開始活性ｒＦＶＩＩＩ（２０ｋ分岐ＰＥＧ）と比較して、ＦＶＩＩＩ色素形成活性が２１．９ＩＵ／ｍｌに増加し、１リットルあたり３２ｍｇのマンニトール、１２ｇのショ糖、２．５ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、および１００ｍｇポリソルベート８０を含む２０ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ＝６．０に処方され、そして凍結乾燥された遊離可能ＰＥＧを、３６０ｍｇのタンパク質（ビチンコン酸（ｂｉｃｈｉｎｃｈｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）アッセイ）および３４５ｍｇの全ＰＥＧを含む溶液へ再構成した。この溶液を、１リットルあたり３２ｇのマンニトール、１２ｇのショ糖、２．５ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、および１００ｍｇのポリソルベート８０を含む（９９％オレイン酸、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｏｉｌｓ  ａｎｄ  Ｆａｔｓ）、１００ｍＭの炭酸水素ナトリウム溶液、ｐＨ８．５中に１：５に希釈し、そして２０−２５℃におけるインキュベーションに際し、規定された時間間隔で、３５０−３５５ｎｍの間の狭いピークでＰＥＧ−ＦＭＯＣ化合物、および４６０−５６０ｎｍの間の広いピークで遊離ＰＥＧ−ジベンゾフルベン（ＰＥＧ−ＤＢＦ）を示す蛍光スペクトルを、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ５０Ｂ分光蛍光計（０．４（励起）×１（発光）ｃｍのＰＴＦＥ−ストッパー付き石英キュベット中１．２５ｍＬ、３３０ｎｍ励起／３４０−６００ｎｍ発光波長、５／５ｎｍスリット幅、１８０ｎｍ／分スキャニングスピード、８００Ｖ光電子増倍電圧（ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  ｖｏｌｔａｇｅ））で測定した（図９）。
【００７５】
【表５】
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別個のリザーバーからこれらの指定された間隔で取ったサンプルを、遊離ＦＭＯＣ−ＰＥＧおよびジベンゾフルベン−ＰＥＧに関して、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５０ｍＭの硫酸ナトリウム、ｐＨ６．１で操作した、Ｓｈｏｄｅｘタンパク質５μカラム（ＫＷ−８０３  ３００Ａ、３００×８ｍｍ（Ｓｈｏｗａ  Ｄｅｎｋｏ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）））においてＨＰＬＣによって分析し、そしてＰＥＧ−ＦＶＩＩＩおよび遊離ＦＶＩＩＩ抗原に関してＥＬＩＳＡによって免疫化学的に分析した。ＰＥＧ−ＦＶＩＩＩ  ＥＬＩＳＡの結果は、新しく溶解した標準調製物のものと比較した、アッセイにおいて測定した結合として与えられる。蛍光シグナルを、ＰＥＧ−ＦＭＯＣ結合体およびＰＥＧ−ジベンゾフルベンに関して、それぞれ３５０−３５５ｎｍおよび４６０−５６０ｎｍ（０．５ｎｍステップで）から統合した。そのデータを表５にまとめる。
【００７６】
最初に測定された濃度のパーセントとして示された、表５で示したデータは、４６０−５６０ｎｍにおける蛍光シグナルの増加によって示される遊離ベンゾフルベン−ＰＥＧの遊離、ならびに、ＥＬＩＳＡによって、およびＰＥＧ−ＦＭＯＣタンパク質結合体の対応する減少によって測定される（３５０−３５５ｎｍ蛍光シグナルおよびＰＥＧ−ＦＶＩＩＩ  ＥＬＩＳＡによって測定されるＦＶＩＩＩ結合ＰＥＧのレベルの減少によって示される）、遊離ＦＶＩＩＩ抗原の遊離を示す。
【００７７】
（実施例８）
（グルタチオンによるＰＥＧ−ジベンゾフルベンの除去）
実施例７の炭酸水素溶液に、１０ｍＭの還元グルタチオン（ＧＳＨ）を加え、そして希釈、インキュベーション、測定、サンプリング、および分析を、実施例８で述べたように行った。スペクトルを図１０に示す。約２４時間後、蛍光キュベットの中ではなく、サンプリングリザーバー中のグルタチオンが、酸化によって消耗したようであった（表６）。
【００７８】
【表６】
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最初に測定された濃度のパーセントとして示された、表６のデータは、４６０−５６０ｎｍにおける比蛍光シグナルの中程度の増加（実施例５と比較して）、および３５０−３５５ｎｍ蛍光シグナルによって示されるような、結合ＰＥＧ−ＦＭＯＣ化合物の対応する中程度の減少によって示されるように、還元グルタチオンによる遊離のジベンゾフルベン−ＰＥＧの除去を示す。遊離のＦＶＩＩＩ抗原が産生され、そしてＦＶＩＩＩ−結合ＰＥＧレベルは実施例５と同様の速度で減少する。
【００７９】
（実施例９）
（ＰＥＧ−ジベンゾフルベンの産生に対するｐＨの効果の実証）
実施例８のＦＶＩＩＩ溶液を、１リットルあたり３２ｇのマンニトール、１２ｇのショ糖、２．５ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、および１００ｍｇのポリソルベート８０（９９％オレイン酸）を含む、２０ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ６．０で１：５に希釈した。インキュベーション、測定、サンプリング、および分析を、実施例７で述べたように行った。スペクトルを図１１に示す。ｐＨ６．０において、ＰＥＧ−ジベンゾフルベンの遊離は、ｐＨ＝８．５のときよりも低かった（表７を表５と比較する）。そのデータは、β脱離のメカニズムが、水酸化物陰イオンのような、塩基性求核剤の攻撃によって行われることを示唆する。
【００８０】
【表７】
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（実施例１０）
（上昇したｐＨにおける遊離可能ＰＳＡ−ｒＶＷＦのインビトロ解重合）
ポリシアル酸（ＰＳＡ）−ｒＶＷＦ結合体のような、遊離可能水溶性ポリマー結合体の解重合を、そのタンパク質結合体のｐＨを上昇させることによって行う。異なるｐＨ値において、例えば約６のｐＨ、および約８または約１０のｐＨにおいて、タンパク質結合体をインキュベートすることによって、解重合を測定する。精製ＰＳＡ−ｒＶＷＦを、約６のｐＨ値を有する、０．０２Ｍのクエン酸Ｎａ、０．１５ＭのＮａＣｌに溶解する。アルカリ性のサンプルに関して、同じ緩衝液を、０．１ＭのＮａＯＨの添加によって、約８または約１０の上昇したｐＨへ調整する。規定された時点においてサブサンプルを取り、そしてそのＶＷＦ抗原（ＶＷＦ：Ａｇ）の含有量、遊離ＰＳＡ、全ＰＳＡ、およびマルチマーのＶＷＦ組成に関して分析する。
【００８１】
ＶＷＦ：Ａｇの含有量を、市販で入手可能な抗体（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡによって決定する。遊離ＰＳＡおよび全ＰＳＡを、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定する。ＶＷＦマルチマー分析を、高密度水平ＳＤＳアガロースゲル電気泳動およびポリクローナル抗ヒトＶＷＦ抗体（Ｄａｋｏ）を用いた免疫染色によって行う。ＰＳＡ−ｒＶＷＦの解重合が、ｐＨの上昇と共に増加することが予期される。
【００８２】
（実施例１１）
（１級アミンの存在下および高いｐＨにおける遊離可能ＰＳＡ−ｒＶＷＦのインビトロ解重合）
ポリシアル酸（ＰＳＡ）−ｒＶＷＦ結合体のような、遊離可能水溶性ポリマー結合体の解重合を、別の局面において、タンパク質結合体緩衝液のアミン濃度を増加させることによって行う。遊離可能ＰＳＡ−ｒＶＷＦ結合体を、１００ｍＭのリシンを含む、約９．８のｐＨの０．０２Ｍのクエン酸ナトリウム、０．１５ＭのＮａＣｌ緩衝液中で希釈し、そして３７℃でインキュベートする。規定された時点でサブサンプルを取り、そしてそのＶＷＦ抗原（ＶＷＦ：Ａｇ）の含有量、遊離ＰＳＡ、全ＰＳＡ、およびマルチマー組成に関して分析する。マルチマー分析を、高密度水平ＳＤＳアガロースゲル電気泳動、およびヒトＶＷＦ（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）またはＰＳＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）のいずれかに対する抗体を用いた免疫染色によって行う。
【００８３】
ｐＨ９．８における、アミンリシンの存在下でのＰＳＡ−ｒＶＷＦのインキュベーションに際し、経時的なＶＷＦ：Ａｇ対タンパク質の比の増加が予期される。それに加えて、全ＰＳＡの大部分は、述べた緩衝液中でのインキュベーション後に遊離されることが予期される。インキュベーション後、少量のＰＳＡのみが、単一のＶＷＦマルチマーに結合したままであることが予期される。
【００８４】
（実施例１２）
（選択された遊離アミンの存在下における、遊離可能ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩのタンパク質活性のインビトロにおける回復）
水溶性ポリマー結合体化タンパク質のタンパク質活性は、遊離アミンの存在下で増加することが予期され、アミン濃度が上昇するときにポリマーの遊離を示す。この実験において、遊離可能ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ結合体を、約７．３のｐＨを有する緩衝液（１０ｍＭのヒスチジン、９０ｍＭのＮａＣｌ、１．７ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのＴｒｉｓ、０．２６ｍＭのグルタチオン、１７６ｍＭのマンニトール、２３．５ｍＭのトレハロース、および０．１ｇ／ｌのＴｗｅｅｎ８０）において、５ＩＵ／ｍｌのＦＶＩＩＩ色素形成活性へ希釈する；その緩衝液はさらにリシン、ヒスチジン、または両方のアミノ酸の組み合わせを含み、そしてその緩衝液を３７℃でインキュベートして、タンパク質結合体からのＰＳＡのインビトロにおける遊離を強制する。規定された時点（２４時間、４８時間、および７２時間）においてサブサンプルを取り、そしてＦＶＩＩＩ色素形成活性を、ＦＶＩＩＩ色素形成性アッセイの使用によって、オンラインで決定する。ＦＶＩＩＩ活性は、濃度漸増のリシン、ヒスチジン、または両方のアミンの組み合わせを有する緩衝液において、時間につれて増加することが予期される。
【００８５】
（実施例１３）
（遊離アミンの組み合わせの存在下における、遊離可能ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩのインビトロ解重合）
遊離可能ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩ結合体を、ｐＨ７．３の緩衝液（２０ｍＭのクエン酸Ｎａ３、１．７ｍＭのＣａＣｌ２、１７６ｍＭのマンニトール、３６ｍＭのショ糖、および０．１ｇ／ｌのＴｗｅｅｎ８０）中でインキュベートする；その緩衝液はさらに１００ｍＭのヒスチジンおよび１００ｍＭのリシンを含み、そして＋３７℃でインキュベートする。あるいは、その緩衝液を、ヒスチジンおよびリシンを加えずに、ｐＨを高いｐＨ（例えば９．８）まで増加させる。１６８時間までの規定された時点でサブサンプルを取り、そしてＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩの機能的活性を、ＦＶＩＩＩ色素形成性アッセイを用いることによって決定する（前に記載したように）。それに加えて、ＰＳＡの遊離を、凍結サブサンプルからＨＰＬＣによって遊離ＰＳＡおよび全ＰＳＡを測定することによって確認する。そのような条件は、インビトロでｒＦＶＩＩＩタンパク質からのＰＳＡの遊離を引き起こすことが予期される。
【００８６】
（実施例１４）
（ＨＥＰＥＳ−Ｔｒｉｓの存在下における、遊離可能ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩのインビトロ解重合）
以前の実験は、緩衝液のアミン濃度の増加は、遊離可能水溶性ポリマーのタンパク質結合体からの遊離を強制することを示す。この実験において、遊離可能ＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩを、約７．４のｐＨにおいて、典型的なアミンを含む緩衝物質の組み合わせ、すなわち２００ｍＭのＨＥＰＥＳおよび２００ｍＭのＴｒｉｓ中で、３７℃でインキュベートする。規定された時点でサブサンプルを取る。ＦＶＩＩＩ活性の回復を色素形成性アッセイによってモニターし、そしてそのＶＷＦと相互作用する能力を決定する。循環中のＦＶＩＩＩの生存を決定的に決定するＶＷＦ結合を、表面プラズモン共鳴技術を用いることによってモニターする。Ｂｉａｃｏｒｅシステムを用いて、様々なＰＳＡ−ｒＦＶＩＩＩサンプルを移動相に注入し、そして固定化ＶＷＦとの相互作用に関して試験する。ＶＷＦの結合は、ＰＳＡの遊離と共に増加することが予期される。従って、経時的な色素形成性ＦＶＩＩＩ活性の増加は、ｒＦＶＩＩＩのＶＷＦへの結合の増加を伴うはずであり、それは解重合のシグナルである（ＰＳＡの除去）。以前の実施例において述べたように、広いスペクトルのアミンを、そのような結合体からのＰＳＡの遊離を強制するために使用し得ることが予期される。色素形成活性およびＶＷＦへの結合の増加は、時間につれて機能的タンパク質が産生されることを示す。
【００８７】
本発明は、本発明の実施のために好ましい方式を含むと発見されたか、または提案された特定の実施態様に関して記載された。本開示を考えて、本発明の意図された範囲から離れることなく、多くの修飾および変化を、例示された特定の実施態様において行い得ることが、当業者によって認識される。従って、添付の請求が、請求されたような本発明の範囲内に入る、全てのそのような同等のバリエーションを含むことが意図される。
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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