(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ４受容体由来ペプチドを含んでなる複合分子であって、該ペプチドは、リンカーにより有機分子とカップリングされており、
該ＣＤ４受容体由来ペプチドは、以下の一般配列（Ｉ）：
Ｘａａｆ−Ｐ１−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐ２−Ｃｙｓ−Ｐ３−Ｃｙｓ−Ｘａａｇ−Ｘａａｈ−Ｘａａｉ−Ｘａａｊ−Ｃｙｓ−Ｘａａｋ−Ｃｙｓ−Ｘａａｌ−Ｘａａｍ、（Ｉ）を含んでなり、ここで、
Ｐ１は、３〜６個のアミノ酸残基を表し、
Ｐ２は、２〜４個のアミノ酸残基を表し、
Ｐ３は、６〜１０個のアミノ酸残基を表し、
Ｘａａｆは、Ｎ−アセチルシステイン（Ａｃ−Ｃｙｓ）またはチオプロピオン酸（ＴＰＡ）を表し、
Ｘａａｇは、ＡｌａまたはＧｌｎを表し、
Ｘａａｈは、Ｇｌｙまたは（Ｄ）ＡｓｐまたはＳｅｒを表し、
Ｘａａｉは、ＳｅｒまたはＨｉｓまたはＡｓｎを表し、
Ｘａａｊは、ビフェニルアラニン（Ｂｉｐ）、フェニルアラニンまたは［β］−ナフチルアラニンを表し、
Ｘａａｋは、ＴｈｒまたはＡｌａを表し、
Ｘａａｌは、Ｇｌｙ、ＶａｌまたはＬｅｕを表し、かつ、
Ｘａａｍは、−ＮＨ２または−ＯＨを表し、
Ｐ１、Ｐ２およびＰ３のアミノ酸残基は、天然または非天然型であり、同一または異なっており、Ｐ１、Ｐ２およびＰ３の該残基は、いずれもＬｙｓ残基とは異なり、Ｐ１、Ｐ２およびＰ３は、共通のまたは共通でない配列を有し、
一般配列（Ｉ）のＣＤ４受容体由来ペプチドの配列は、配列番号１および配列番号２の配列からなる群から選択され、
該有機分子は、以下の一般構造（ＩＩ）：
【化１】
0005775307.tif 000063
を有し、ここで、
ｎは、０〜１０の間の整数を表し、
Ｘは、無機対イオンまたは有機対イオンを表し、
ｍは、分子の負電荷の数を表し、
Ｒ１は、同一または異なる基であり、水素原子またはＧＰを表し、ＧＰはＯ−保護基を表し、
Ｒ２は、水素原子またはＧＰ’を表し、ＧＰ’はＯ−保護基を表し、ここで、ＧＰおよびＧＰ’は同一または異なり、
Ｒ３は、同一または異なる基であり、水素原子、硫酸基、リン酸基または任意のアニオン基を表し、
Ｒ４は、同一または異なる基であり、水素原子、硫酸基、アルキル基またはアシル基を表し、
Ｒ５は、同一または異なる基であり、水素原子、アルキル基またはアシル基を表し、  Ａは、式：−（ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｑ−、−（ＣＨ２−ＣＨ２）−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｑ−、−（ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−（ＣＨ２−ＣＨ２）−または−（ＣＨ２−ＣＨ２）−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−（ＣＨ２−ＣＨ２）−の中から選択される基を表し、ここで、ｐは、１〜１０の間の整数を表し、ｑは、１〜１０の間の整数を表し、
Ｚは、ハロゲン原子、チオール基またはマレイミド基を表し、
該リンカーは、ＣＤ４受容体由来ペプチドの一般配列（Ｉ）中に存在するアミノ酸残基Ｌｙｓの遊離アミノ基（−ＮＨ２）とその末端の一方で共有結合され、有機分子の官能基Ｚとその他方の末端で共有結合され、
リンカーは、
【化２】
0005775307.tif 000064
（ｋは２〜２４の間の整数を表す）、
【化３】
0005775307.tif 000065
（ｋ１は１、２、３、５および１０に相当する整数を表す）、
Ｚがチオール基を表す場合には、
【化４】
0005775307.tif 000066
並びに、Ｚがマレイミド基またはハロゲン原子を表す場合には、
【化５】
0005775307.tif 000067
からなる群から選択され、
Ｏ−保護基は、メトキシメチル、ベンジルオキシメチル、２−メトキシエトキシメチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル、ｔ−ブチル、メチル、ベンジル、トリフェニルメチル、ｐ−メトキシベンジル、テトラヒドロピラニル、２，２，２−トリクロロエチル、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）、ｔ−ブチルジフェニルシリル、アセチル、プロピオニル、ベンゾイル、およびアリルから選択された基である、複合分子。
【請求項２】
ｎが、０、１、２、３、４または５である、請求項１に記載の複合分子。
【請求項３】
Ｘが、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋、およびＭｇ２＋から選択される無機対イオン、または、Ｒ３ＮＨ＋およびＲ４Ｎ＋（ここで、Ｒは互いに独立にアルキル基を表す）から選択される有機対イオンを表す、請求項１または２に記載の複合分子。
【請求項４】
Ａが、式−（ＣＨ２）５−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−の基を表す、請求項１〜３のいずれか一項に記載の複合分子。
【請求項５】
Ｒ１基が、総て同一である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の複合分子。
【請求項６】
Ｒ１基が、水素原子、メチル基およびベンジル基からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の複合分子。
【請求項７】
Ｒ２が、水素原子およびｐ−メトキシベンジル基からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の複合分子。
【請求項８】
以下の分子：
【化６】
0005775307.tif 000068
【化７】
0005775307.tif 000069
および
【化８】
0005775307.tif 000070
から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の複合分子。
【請求項９】
ＣＤ４受容体由来ペプチドを含んでなる複合分子であって、該ペプチドは、リンカーにより有機分子とカップリングされており、
該ＣＤ４受容体由来ペプチドは、請求項１で定義された一般配列（Ｉ）を含んでなり、かつ、配列番号１および配列番号２の配列からなる群から選択され、
該有機分子は、ヘパリンおよびヘパラン硫酸から選択されるポリアニオンを表し、ここで、ウロン酸部分は、グルクロン酸またはイズロン酸であり、重合度ｄｐは２〜２４であり、ポリアニオンの遊離ヒドロキシ基の少なくとも７０％がＧＰ”で置換され、ここで、ＧＰ”はＯ−保護基を表し、これらのＧＰ”基は同一または異なり、このポリアニオンは、ハロゲン原子、チオール基またはマレイミド基から選択される官能基Ｚを有するように修飾され、
該リンカーは、ＣＤ４受容体由来ペプチドの一般配列（Ｉ）中に存在するアミノ酸残基Ｌｙｓの遊離アミノ基（−ＮＨ２）とその末端の一方で共有結合され、有機分子の官能基Ｚとその他方の末端で共有結合されており、
Ｏ−保護基は、メトキシメチル、ベンジルオキシメチル、２−メトキシエトキシメチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル、ｔ−ブチル、メチル、ベンジル、トリフェニルメチル、ｐ−メトキシベンジル、テトラヒドロピラニル、２，２，２−トリクロロエチル、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）、ｔ−ブチルジフェニルシリル、アセチル、プロピオニル、ベンゾイル、およびアリルから選択された基である、複合分子。
【請求項１０】
リンカーが、
【化９】
0005775307.tif 000071
（ｋは２〜２４の間の整数を表す）、
【化１０】
0005775307.tif 000072
（ｋ１は１、２、３、５および１０に相当する整数を表す）、
官能基Ｚがチオール基を表す場合には、
【化１１】
0005775307.tif 000073
並びに、官能基Ｚがマレイミド基またはハロゲン原子を表す場合には
【化１２】
0005775307.tif 000074
からなる群から選択される、請求項９に記載の複合分子。
【請求項１１】
ＧＰ”基が、同一である、請求項９または１０に記載の複合分子。
【請求項１２】
ＧＰ”基が、メチル基またはベンジル基である、請求項１１に記載の複合分子。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の複合分子の、医薬の製造のための使用。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の複合分子の、ＡＩＤＳの処置に用いるための医薬の製造のための使用。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の複合分子と薬学上許容されるビヒクルとを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１６】
ＡＩＤＳの処置に用いるための、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の複合分子の製造方法であって、下記工程：
ａ．請求項１で定義された一般配列（Ｉ）のＣＤ４受容体由来であり、かつ、配列番号１および配列番号２の配列からなる群から選択されるペプチドと、２つの活性基を有する二官能性化合物とを、２つの活性基の一方が一般配列（Ｉ）中に存在するアミノ酸Ｌｙｓの残基の遊離アミノ基（−ＮＨ２）と共有結合を形成するように接触させて、二官能性基の第二の活性基を有する活性化されたペプチドを得る工程、および
ｂ．工程（ａ）で得られた活性化されたペプチドと、官能基Ｚがハロゲン原子、チオール基、保護チオール基またはマレイミド基を表すことを除いて請求項１または９に記載の有機分子と同一の有機分子とを、活性化されたペプチドの活性基が有機分子の保護されたまたは保護されていない官能基Ｚと共有結合を形成するように接触させて複合分子を得る工程
を含んでなることを特徴とする、方法。
【請求項１８】
工程（ａ）において、一般配列（Ｉ）中に存在するアミノ酸Ｌｙｓの残基の遊離アミノ基（−ＮＨ２）と共有結合を形成する二官能性化合物の活性基が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはＮ−ヒドロキシ−４−スルホ−スクシンイミドエステルである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
二官能性化合物の２つの活性基が異なり、その２つの基の一方が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはＮ−ヒドロキシ−４−スルホ−スクシンイミドエステルである、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
二官能性化合物が、スクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）およびＮＨＳ−ＰＥＯｎ−マレイミド（ｎは２〜２４の間である）からなる群から選択される、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
以下の一般配列（ＩＩＩ）：
Ｐ１−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐ２−Ｃｙｓ−Ｐ３−Ｃｙｓ−Ｘａａｇ−Ｘａａｈ−Ｘａａｉ−Ｘａａｊ−Ｃｙｓ−Ｘａａｋ−Ｃｙｓ−Ｘａａｌ−Ｘａａｍ、（ＩＩＩ）（ここで、Ｐ１〜Ｐ３およびＸａａｇ〜Ｘａａｍは請求項１の一般配列（Ｉ）で定義された通りであり、
一般配列（ＩＩＩ）は、以下の２つの配列：
Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−ＮＨ２、および  Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ
から選択され、
Ｘａａは、ビフェニルアラニンを表す）
のＣＤ４受容体由来ペプチドと、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）とを接触させて、一般配列（ＩＩＩ）のＣＤ４受容体由来ペプチドのＮ末端にＴＰＡを組み込むことからなる予備工程を含んでなる、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＣＤ４受容体由来ペプチドとポリアニオン性多糖などの有機分子とを含んでなる複合分子(conjugated molecule)に関する。このような複合分子は抗ウイルス処置、特にＡＩＤＳの処置に使用することができる。本発明はさらに、その複合分子の製造方法に関する。
【０００２】
ヌクレオシド（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド（ＮＮＲＴＩ）および／またはプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）を組み合わせた三剤併用療法は、血清陽性ＨＩＶ患者の多くにおいて、ウイルス量を検出レベル以下に減少させる。この効果が、ＨＩＶ感染に起因する死亡数の実質的減少をもたらした。残念ながら、患者の８０％に抗ウイルス剤耐性を有する遺伝子型が認められ、さらに憂慮すべきことに、ウイルス集団の４５．５％がＮＲＴＩ／ＰＩ併用療法に耐性を示し、２６％が抗ＨＩＶ剤三剤併用療法に対して耐性を示している(Tamalet et al., AIDS. 2003 Nov 7;17(16):2383-8)。この知見は特に憂慮すべきものである。というのも、長期三剤併用処置を受けている患者の７０％に見られるこの処置の副作用（脂肪萎縮症、脂肪異栄養症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、神経障害など）がコンプライアンスの低下と、しばしば耐性につながる「突然の」処置中止という結果となるからである。従って、現在利用可能な薬剤が多く市販されているにもかかわらず、より副作用が少なく、かつ、交差耐性を伴わない、より穏やかな処置形態の開発が優先事項である。このことを考慮に入れると、逆転写やタンパク質分解以外のＨＩＶの複製過程を標的とすることが不可欠である。
【０００３】
ウイルスの細胞への侵入はウイルス感染サイクルの重要な段階である。このプロセスは二段階に分けられ、第一段階はウイルスと細胞表面との特定の宿主受容体のレベルでの相互作用であり、第二段階はウイルスの遺伝物質の標的細胞への浸透である。ＨＩＶでは、接着と侵入のメカニズムに関与する分子相手がよく確立されている。ウイルス側からは、ウイルス／細胞相互作用複合体を本質的に決定するのはｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質である。このタンパク質はまず宿主細胞のトランスメンブラン糖タンパク質ＣＤ４と結合する。この相互作用は、ＣＤ４誘導型（ＣＤ４ｉ）と呼ばれる特定のエピトープを露出し、従って、ケモカイン受容体（本質的にＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４）の結合部位を作出するｇｐ１２０におけるコンフォメーション変化をもたらす。従って、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４は、細胞表面においてｇｐ１２０共受容体として働く。この第二の相互作用はｇｐ１２０／ｇｐ４１タンパク質複合体の再構成と細胞／ウイルスの膜融合の誘発をもたらす。
【０００４】
ＨＩＶウイルスの細胞向性は、使用する共受容体のタイプによって定義される。いわゆるＸ４または「Ｔ向性」ウイルスは、より詳しくは、Ｔリンパ球など、それらの表面でＣＸＣＲ４を発現する細胞系統に感染する傾向がある。いわゆるＲ５または「Ｍ向性」ウイルスは共受容体ＣＣＲ５を用い、主にマクロファージおよび単球に感染する。タイプＲ５またはＸ４ウイルスの存在は一般にＡＩＤＳ発症の全く異なる段階に関与する（Ｒ５は無症候性段階、Ｘ４ウイルスの出現はしばしばこの疾病の好ましくない発達転帰に関連し、共受容体ＣＸＣＲ４の使用はＡＩＤＳ病理の重要な因子であることが示唆される）。ｇｐ１２０にはＣＣＲ５とＣＸＣＲ４の認識のための構造的決定基があることから、Ｒ５ウイルスとＸ４ウイルスは２つの別個の標的に相当する。
【０００５】
上記の受容体の他、ＨＩＶは細胞表面に見られる他の分子、特にヘパラン硫酸（ＨＳ）と結合し得る。ＨＳはグリコサミノグリカンファミリー（ＧＡＧ）に属す多糖である。それらは細胞表面および間質マトリックスに多量に見られ、特定の糖タンパク質の細胞外領域に固定されている。ヘパリン（その抗凝固特性に用いられる）と化学的に関連し、ＨＳは、他の生体高分子とは、それらの構造および機能の多様性によって異なる。それらの多くの異なるタンパク質と結合する能力の結果として、その構造、安定性および／または反応性はその相互作用により媒介され、極めて多くの現象に関与している。特に、それらは多くの病原体を認識し、その１つがＨＩＶであり、従って、結合受容体として働く。ＨＩＶでは、それはまたＨＳ認識部位を有するｇｐ１２０でもある。
【０００６】
本発明者らのこれまでの研究で、ヘパリン（またはＨＳ）に結合するＨＩＶの能力はＸ４型株に特異的であり、Ｒ５型ウイルスはこの多糖と極めてわずかに相互作用するに過ぎないことが見出されている(Moulard et al., J. Virol. 74, 1948-1960, 2000)。これらの結果は、ＨＳが、標的細胞の性質、Ｘ４株のより大きな病原性および感染の無症候性段階での潜伏Ｘ４ウイルスのリザーバーの構築など、細胞向性に関連する特定の特性のいくつかに関与している可能性があることを示唆する。
【０００７】
ＨＩＶ−ＨＳ相互作用は、本発明者らが見出したように、ウイルスの接着と侵入の全ての初期段階に関与するｇｐ１２０のレベルで起こる。この相互作用部位は、可変ループ３（Ｖ３）と呼ばれるｇｐ１２０の領域に存在する。Ｘ４のＶ３ループはＲ５単離物のＶ３ループに比べて塩基性アミノ酸が豊富であり、その結果、ヘパリン様オリゴ糖とより良い相互作用が生じる。
【０００８】
本明細書に記載されている本発明はｇｐ１２０−ヘパリンの相互作用がＣＤ４の存在下で極めて増強されるという知見に基づく。しかしながら、この効果は使用するウイルス単離物に依存し、ｇｐ１２０単独でＨＳと弱い相互作用しか示さない濃度で本質的に生じる。
【０００９】
本発明者らのこれまでの研究では、ＣＤ４により誘導される部位がヘパリンまたはＨＳとの補助的相互作用部位を構成することが示されている(Vives et al. J. Biol. Chem. 279, 54327-54333, 2005)。従って、阻害剤（ｍＣＤ４−ＨＳ）（その生体作用は後述する）は、ｇｐ１２０とＣＤ４認識部位で結合するペプチド（ｍＣＤ４）を含む。それは、ＣＤ４ｉエピトープの露出をもたらすｇｐ１２０のコンフォメーション変化を誘発することができる。次に、この共有結合したオリゴ糖（ＨＳ）が、図１に従い、ＣＤ４ｉ部位を認識することができる。
【００１０】
ヘパリン（ＨＰ）およびデキストラン硫酸（ＤＳ）などのある種のポリアニオンはＨＩＶによる細胞の感染を阻害することができるが、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）はそうではないことが長年知られていた。にもかかわらず、これらは、特にその抗凝固作用のため臨床的に使用されていない（Flexner C et al., Antimicrobial Agents Chemother. 1991 Dec; 35 (12): 2544-50）。近年、この阻害の分子機構がポリアニオンのＶ３ループとの相互作用と関連があることが示されている(Moulard M et al., J Virol. 2000 Feb; 74(4):1948-60)。
【００１１】
さらに、種々の研究が、ウイルスとＨＩＶ標的細胞の表面で発現されるＣＤ４との相互作用を阻害するための可溶性ＣＤ４の使用を検討してきた。この解決策は、可溶性ＣＤ４が、ウイルへの結合によりエピトープＣＤ４ｉを露出し、従って、場合により感染を増大させるウイルスとＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４共受容体との相互作用を助長することから、効果的でないことが判明した(Schenten D. et al., 1999. J Virol. 73:5373-80)。
【００１２】
国際特許ＷＯ０３／０８９０００から、ＣＤ４受容体由来ペプチドは、ポリアニオンと接触した場合に抗ＨＩＶ活性を有するが知られている。特に、該ペプチドとポリアニオンが結合される化合物、Najjam S. et al. (Cytokine 1997, 9(12):1013-1022)（実施例の節のポイントＩ．１を参照）による文献に示されている説明に従って製造することができるということが推奨される。
【００１３】
本発明において、本発明者らは、ポリアニオン性多糖などの有機分子と直接かつ共有結合的に結合する可能性のある活性化されたＣＤ４受容体由来ペプチドを得た。この活性化は、天然ペプチドへの特定のアミノ酸残基の挿入を必要とする。特に、本発明者らは、ＣＤ４受容体由来ペプチドの配列中のアミノ酸リシンの１つの残基、および１つだけの残基の存在が、本発明による活性化されたペプチドを得るために極めて重要であることを発見した。さらに、この単一のアミノ酸リシン残基は、ＣＤ４受容体由来ペプチドの配列の明確な位置になければならない。確定した位置に単一のアミノ酸リシン残基を含むミニＣＤ４ペプチドを考案すれば、所望の機能を選択的かつ直接的にミニＣＤ４に導入することができる。
【００１４】
ｍＣＤ４に基づく複合体の合成を簡略にするために、単一の誘導体化／カップリング部位を有するミニＣＤ４をデザインするアイデアが出された。本発明者らの戦略は、大パネルのリンカーと、ミニＣＤ４が適宜合成され、折りたたまれ、精製され、特性決定された後の化学を介して、多数の有機化合物のカップリングを可能とする。この戦略により我々は完全に確定された複合体を生成することができる。
【００１５】
当業者ならば、ペプチド配列内の選択されたアミノ酸を特異的に標識／誘導体化するための方法が存在することを論じることができよう。しかしながら、ミニＣＤ４配列内の複数のシステイン残基の存在は、選択されたアミノ酸を選択的に修飾／誘導体化するために固相ペプチド合成において一般に用いられる従来法のいくつかの使用を制限する（図１０参照）。
【００１６】
この線において、選択された側鎖へのマレイミド基の導入が可能でない。
【００１７】
実際、最終のＴＦＡ切断の際のチオール化されたスカベンジャーの使用ならびにミニＣＤ４ペプチドの適切な合成および折りたたみに必要とされるグルタチオンに基づく条件は、ペプチドを支持体に接着させたまま、選択されたリシンにマレイミド官能基（またはその他のチオール化された感受性誘導分子）を導入する機会を排除する。もっとはっきり言えば、これは例えば、ｍＣＤ４−ポリアニオン複合体化工程のロバストなマレイミド／ＳＨ戦略の使用を排除する。
【００１８】
さらに、本発明者らのｍＣＤ４合成後誘導体化戦略は、ペプチド樹脂上で何回もｍＣＤ４ペプチドの誘導体化、切断および折りたたみを行う必要なく、種々のリンカーの迅速なスクリーニングを可能にする。
【００１９】
より重要なことに、ミニＣＤ４配列内の誘導体化部位（リシン）の賢明な位置（例えば、５位）は、ＣＤ４ｉのＨＳＢＳおよび共受容体結合部位を標的とするポリアニオン性化合物の最適な配向を与える（図１１参照）。
【００２０】
よって、本発明は、多くの有効な抗ウイルス誘導体の作製を可能とする活性化されたペプチドを与える。これらの誘導体は、リンカーによる、ポリアニオン性多糖などの有機分子と特異的にカップリングされた(coupled to)ＣＤ４ペプチドを含んでなる複合分子からなる。
【００２１】
このアプローチは直接ウイルスを標的とし、細胞自体を標的としないので、ウイルスの細胞への接着を阻害するのに治療上有利である。よって、それは、一見して、共受容体と結合する薬剤を用いた場合に見られる細胞作用が全くない。加えて、様々なウイルス向性の機能として含まれる部位の保存という点で、本発明による化合物は種々のウイルス単離物のｇｐ１２０と相互作用する。また、耐性が生じないと思われると誤解される場合があるが、この新型の化合物は容易に耐性を出現させるべきではない。実際、ｇｐ１２０のＣＤ４部位は、共受容体との相互作用のためにポリアニオン性多糖との結合に関与する塩基性残基がそうであるように、ＣＤ４との結合を維持するために完全な状態を保たなければならない。これらの２つの部位の１つにおける突然変異の結果、感染性の低いウイルスが生じるはずである。最後に、本発明では、これらの化合物の完全合成型が開発可能であり、従って、多量に利用可能な調製物および均質で完全に定義されたものを保証する。このカップリング法は簡便、迅速かつ定量的である。
【００２２】
よって、第一の態様によれば、本発明は、ＣＤ４受容体由来ペプチドを含んでなる複合分子を包含し、該ペプチドはリンカーにより有機分子とカップリングされており、
該ＣＤ４受容体由来ペプチドは以下の一般配列（Ｉ）：
Ｘａａｆ−Ｐ１−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐ２−Ｃｙｓ−Ｐ３−Ｃｙｓ−Ｘａａｇ−Ｘａａｈ−Ｘａａｉ−Ｘａａｊ−Ｃｙｓ−Ｘａａｋ−Ｃｙｓ−Ｘａａｌ−Ｘａａｍ（Ｉ）
を含んでなり、ここで、
Ｐ１は３〜６個のアミノ酸残基を表し、
Ｐ２は２〜４個のアミノ酸残基を表し、
Ｐ３は６〜１０個のアミノ酸残基を表し、
ＸａａｆはＮ−アセチルシステイン（Ａｃ−Ｃｙｓ）またはチオプロピオン酸（ＴＰＡ）を表し、
ＸａａｇはＡｌａまたはＧｌｎを表し、
ＸａａｈはＧｌｙまたは（Ｄ）ＡｓｐまたはＳｅｒを表し、
ＸａａｌはＳｅｒまたはＨｉｓまたはＡｓｎを表し、
Ｘａａｊはビフェニルアラニン（Ｂｉｐ）、フェニルアラニンまたは［β］−ナフチルアラニンを表し、
ＸａａｋはＴｈｒまたはＡｌａを表し、
ＸａａｌはＧｌｙ、ＶａｌまたはＬｅｕを表し、かつ、
Ｘａａｍは−ＮＨ２または−ＯＨを表し、
Ｐ１、Ｐ２およびＰ３のアミノ酸残基は天然または非天然型であり、同一または異なっており、Ｐ１、Ｐ２およびＰ３の該残基は総てＬｙｓ残基とは異なり、Ｐ１、Ｐ２およびＰ３は共通のまたは共通でない配列であり、
有機分子は以下の構造（ＩＩ）：
【化１】
0005775307.tif 000002
を有し、ここで、
ｎは０〜１０の間の整数を表し、特に、ｎは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、有利には、ｎは０、１、２、３、４または５であり、
ＸはＮａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋もしくはＭｇ２＋などの無機対イオン、またはＲ３ＮＨ＋、Ｒ４Ｎ＋（ここで、Ｒは互いに独立にアルキル基を表す）などの有機対イオンを表し、有利にはＮａ＋であり、
ｍは分子の負電荷の数を表し、
Ｒ１は同一または異なる基であり、水素原子またはＯ−保護基ＧＰを表し、
Ｒ２は水素原子またはＯ−保護基ＧＰ’を表し、ここで、ＧＰおよびＧＰ’は同一または異なり、
Ｒ３は同一または異なる基であり、水素原子、硫酸基、リン酸基または任意のアニオン基を表し、
Ｒ４は同一または異なる基であり、水素原子、硫酸基、アルキル基またはアシル基を表し、
Ｒ５は同一または異なる基であり、水素原子、アルキル基またはアシル基を表し、
Ａは式：−（ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｑ−、−（ＣＨ２−ＣＨ２）−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｑ−、−（ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−（ＣＨ２−ＣＨ２）−または−（ＣＨ２−ＣＨ２）−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−（ＣＨ２−ＣＨ２）−の中から選択される基を表し、ここで、ｐは１〜１０の間の整数を表し、ｑは１〜１０の間の整数を表し、有利には、Ａは式−（ＣＨ２）５−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−の基を表し、
Ｚはハロゲン原子、チオール基またはマレイミド基を表し、
リンカーはＣＤ４受容体由来ペプチドの一般配列（Ｉ）中に存在するアミノ酸残基Ｌｙｓの遊離アミノ基（−ＮＨ２）とその末端の一方で共有結合され、有機分子のＺ基とその他方の末端で共有結合されている。
【００２３】
好ましくは、Ｐ３は少なくとも１つの塩基性アミノ酸を含んでなり、該塩基性アミノ酸はいっそうより好ましくはアルギニンである。ＣＤ４受容体フラグメントのこの部分における塩基性残基の存在は、そのｇｐ１２０タンパク質との結合に寄与する。よって、本発明者らは、少なくとも１つの塩基性アミノ酸、好ましくはアルギニンをＰ３に導入する方を選ぶ。よって、これは、ｐＨ７〜８における誘導では反応性がないが、ミニＣＤ４ペプチドとｇｐ１２０タンパク質の結合に有用であることが分かっている塩基性部分を維持する。
【００２４】
本願において「ミニ(mini)ＣＤ４ペプチド」、「ＣＤ４ペプチド」および「ミニＣＤ４」とは、上記で定義された一般配列（Ｉ）を含んでなるか、またはからなるＣＤ４受容体由来ペプチドを表すために互換的に用いられる。
【００２５】
本発明は、ＣＤ４受容体由来ペプチドが、その一般配列（Ｉ）中に、一般配列（Ｉ）の定義された位置にアミノ酸リシン（Ｌｙｓ）の残基を１つまたは１つだけ含むことを必要とする。
一般配列（Ｉ）中のＣｙｓ残基は、ミニＣＤ４の折りたたみ直しに必要とされる３つのジスルフィド橋の形成を可能とする。
チオプロピオン酸（ＴＰＡ）は、一般配列（Ｉ）のペプチドのＮ末端位にある場合、Ｎ末端における障害の軽減およびアミン基の存在の克服を可能とする。
【００２６】
よって、好ましい実施形態によれば、一般配列（Ｉ）中のＸａａｆはＴＰＡを表す。
一般配列（Ｉ）において、ＸａａｊはＢｉｐ、Ｐｈｅまたは［β］−ナフチルアラニンを表す。ビフェニルアラニンは、ＣＤ４受容体のＰｈｅ  ４３が収容されている空洞において糖タンパク質ｇｐ１２０との接触を増強する。しかしながらやはり、Ｐｈｅを有する、本発明によるミニＣＤ４ペプチドは、ミニＣＤ４／ｇｐ１２０複合体の構造が分析される場合、ＣＤ４をより良く模倣することができる(Huang CC et al., Structure. 2005 May;13 (5):755-68)。
【００２７】
よって、別の好ましい実施形態によれば、ＸａａｊはＰｈｅを表す。
【００２８】
ＣＤ４受容体に由来する一般配列（Ｉ）のペプチドは、αヘリックス構造とそれに続くβシートを有する。ｇｐ１２０との結合には主としてアミノ酸Ｘａａｇ−Ｘａａｈ−Ｘａａｉ−Ｘａａｊ−Ｃｙｓ−Ｘａａｋ−Ｃｙｓ−Ｘａａｌが関与する。これらのペプチドはｓＣＤ４（可溶性ＣＤ４）と同等のＩＣ５０（ｇｐ１２０に対する親和性）を有する。
【００２９】
ＣＤ４受容体に由来する一般配列（Ｉ）のペプチドは、例えばＦｍｏｃ固相ペプチド合成法("Fmoc solid phase peptide synthesis, a practical approach", W. C. Chan and P. D. White編, Oxford University Press, 2000)に従う慣例の固相化学合成技術および／または遺伝子組換えによって作製することができる。
【００３０】
好ましくは、一般配列（Ｉ）のＣＤ４受容体由来ペプチドの配列は配列番号１および配列番号２の配列からなる群から選択され、有利には配列番号１である。
【００３１】
本発明において「リンカー」とは、下記に定義される二官能性化合物とＣＤ４受容体由来ペプチドおよび有機分子とのカップリングにより得られるリンカーを表す。
【００３２】
よって、リンカーの長さは、用いる二官能性化合物の関数として変動する。
【００３３】
特に、リンカーは、有利には
【化２】
0005775307.tif 000003
（ここで、ｋは２〜２４の間の整数を表し、有利には２、４、８または１２である）、
【化３】
0005775307.tif 000004
（ここで、ｋ１は１〜１０の間の整数を表し、従って、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０に相当し、有利には１、２、３、５または１０に相当する）、
Ｚがチオール基を表す場合には、
【化４】
0005775307.tif 000005
Ｚがマレイミド基またはハロゲン基を表す場合には、
【化５】
0005775307.tif 000006
から選択される。
【００３４】
好ましい実施形態では、リンカーは、
【化６】
0005775307.tif 000007
（ここで、ｋは２〜２４の間の整数を表し、有利には２、４、８または１２である）
Ｚがチオール基を表す場合には、
【化７】
0005775307.tif 000008
Ｚがマレイミド基またはハロゲン基を表す場合には、
【化８】
0005775307.tif 000009
から選択される。
【００３５】
従って、このようなリンカーは、二官能性化合物としてのスクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、ＮＨＳ−ＰＥＯｎ−マレイミド（ここで、ｎは２〜２４の間の整数を表し、有利には２、４、８または１２である）、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート）およびＳＡＴＰ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオネート）の使用に相当する。
【００３６】
別の好ましい実施形態では、リンカーは、二官能性化合物ＮＨＳ−ＰＥＯ２−マレイミドに由来する
【化９】
0005775307.tif 000010
である。
【００３７】
式（ＩＩ）の有機分子は、重合度が低く、この分子に官能基Ｚを導入するために改変された特定の形態のヘパリンを表す。
【００３８】
本発明において用いる「Ｏ−保護基」とは、Greene, "Protective Groups In Organic synthesis", (John Wiley & Sons, New York (1981))に開示されているＯ−保護基など、合成手順中に望ましくない反応からヒドロキシル基を保護する置換基を表す。Ｏ−保護基は置換型または非置換型のメチルまたはアルキルエーテル、例えば、メトキシメチル（ＭＯＭ）、ベンジルオキシメチル、２−メトキシエトキシメチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル、ｔ−ブチル、ベンジルおよびトリフェニルメチル；置換型または非置換型ベンジルエーテル、例えば、ｐ−メトキシベンジル、テトラヒドロピラニルエーテル；置換エチルエーテル、例えば、２，２，２−トリクロロエチル；シリルエーテル、例えば、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）およびｔ−ブチルジフェニルシリル；ならびにヒドロキシル基を例えば、酢酸、プロピオン酸、安息香酸などのカルボン酸と反応させることにより製造されるエステルを含んでなる。特に、アリル基またはアセチル基は本発明による「Ｏ−保護基」である。有利には、それはメチル、ベンジルまたはｐ−メトキシベンジル基である。
【００３９】
本発明において用いる「アルキル」とは、１〜６個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖、置換または非置換アルキル基を表し、限定されるものではないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルなどが挙げられる。
【００４０】
本発明において用いる「アシル」とは、アルキル−ＣＯ基（ここで、アルキルは上記で定義された通り）を表す。
【００４１】
「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を表す。
【００４２】
好ましい実施形態では、Ｚはチオール基を表す。
【００４３】
特定の実施形態では、Ｒ１基は総て同一である。
【００４４】
別の特定の実施形態では、Ｒ１基は水素原子、メチル基およびベンジル基からなる群から選択される。
【００４５】
有利には、Ｒ２は水素原子、メチル基またはｐ−メトキシベンジル（ｐＭＢｎ）基である。
【００４６】
有利には、Ｒ３は硫酸部分またはリン酸部分である。
【００４７】
より有利には、Ｒ３は総て同一であり、特に、リン酸部分である。
【００４８】
有利には、Ｒ４は総て同一であり、特に、硫酸部分である。
【００４９】
有利には、Ｒ５は総て同一であり、特に、水素原子である。
【００５０】
好ましい実施形態では、有機分子は
【化１０】
0005775307.tif 000011
（ここで、ＡおよびＺは上記で定義された通り）
から選択される。
【００５１】
有利には、Ａは式−（ＣＨ２）５−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−の基を表す。
【００５２】
有利には、Ｚはチオール基を表す。
【００５３】
好ましい実施形態では、有機分子は
【化１１】
0005775307.tif 000012
（化合物２０）
【化１２】
0005775307.tif 000013
（化合物２１）
および
【化１３】
0005775307.tif 000014
（化合物２２）
から選択される。
【００５４】
特に、本発明による複合分子は以下の分子の１つであり得る。
【化１４】
0005775307.tif 000015
（化合物２３）
【化１５】
0005775307.tif 000016
（化合物２４）
および
【化１６】
0005775307.tif 000017
（化合物２５）
【００５５】
さらに、第二の態様によれば、本発明は、リンカーの手段により有機分子とカップリングされたＣＤ４受容体由来ペプチドを含んでなる複合分子を包含し、
ＣＤ４受容体由来ペプチドは上記で定義された一般配列（Ｉ）を含んでなり、
有機分子はヘパリンおよびヘパラン硫酸から選択されるポリアニオンを表し、ここで、ウロン酸部分はグルクロン酸またはイズロン酸である、重合度ｄｐは２〜２４であり、ポリアニオンの遊離ヒドロキシ基の本質的に総てがＯ−保護基ＧＰ”で置換され、これらのＧＰ”基は同一または異なり、このポリアニオンはハロゲン原子、チオール基またはマレイミド基から選択される官能基を有するように修飾され、
リンカーはＣＤ４受容体由来ペプチドの一般配列（Ｉ）中に存在するアミノ酸残基Ｌｙｓの遊離アミノ基（−ＮＨ２）とその末端の一方で共有結合され、有機分子の官能基とその他方の末端で共有結合されている。
【００５６】
本発明において「本質的に」とは、ポリアニオンの遊離ヒドロキシ基の総てまたはほとんど総てがＯ−保護基で置換されていること、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、いっそうより好ましくは９０％の遊離ヒドロキシ基が置換されていることを意味する。
【００５７】
ＣＤ４受容体由来ペプチドの特徴は上記で定義されたものと同じである。
【００５８】
特に、Ｐ３は好ましくは少なくとも１つの塩基性アミノ酸を含んでなり、この塩基性アミノ酸はいっそうより好ましくはアルギニンである。
【００５９】
好ましい実施形態によれば、一般配列（Ｉ）におけるＸａａｆはＴＰＡを表す。
【００６０】
別の好ましい実施形態によれば、ＸａａｊはＰｈｅを表す。
【００６１】
好ましくは、一般配列（Ｉ）のＣＤ４受容体由来ペプチドの配列は配列番号１および配列番号２の配列からなる群から選択され、有利には配列番号１である。
【００６２】
リンカーは上記で定義された通りであり、有利には、
【化１７】
0005775307.tif 000018
（ここで、ｋは２〜２４の間の整数を表し、有利には２、４、８または１２である）、
【化１８】
0005775307.tif 000019
（ここで、ｋ１は１〜１０の間の整数を表し、従って、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０に相当し、有利には１、２、３、５または１０に相当する）、
【化１９】
0005775307.tif 000020
から選択される。
【００６３】
好ましい実施形態では、リンカーは
【化２０】
0005775307.tif 000021
（ここで、ｋは２〜２４の間の整数を表し、有利には２、４、８または１２である）、
官能基がチオール基を表す場合には、
【化２１】
0005775307.tif 000022
官能基がマレイミド基またはハロゲン原子を表す場合には、
【化２２】
0005775307.tif 000023
から選択される。
別の好ましい実施形態では、リンカーは
【化２３】
0005775307.tif 000024
である。
【００６４】
「Ｏ−保護基」とは、上記で定義されたものと同じ意味を有する。有利には、それはメチル基、ベンジル基またはｐ−メトキシベンジル基である。
【００６５】
ポリアニオンは、本発明において望ましくない抗凝固活性を有し、種々のタンパク質、特にトロンビンおよび抗トロンビンＩＩＩと特異的結合を形成するので、長すぎず、ウロン酸部分に３−Ｏ−硫酸基を持たないことが好ましい。ポリアニオンは好ましくは２〜２４、有利には４〜１８、好ましくは４〜１４の重合度ｄｐを有する。ポリアニオンは好ましくは、二糖につき少なくとも２つのアニオン基を有する。
【００６６】
ヘパリン十二糖類（ＨＰ１２）および四糖類（ＨＰ４）が例として揚げられ、特にはＨＰ１２である。
【００６７】
有利には、官能基はチオール基である。
【００６８】
特定の実施形態では、ＧＰ”基は同一である。
【００６９】
有利には、これらのＧＰ”基はメチル基またはベンジル基である。
【００７０】
好ましい実施形態では、官能基を有するポリアニオンは、
【化２４】
0005775307.tif 000025
から選択され、ここで、
Ａは式：−（ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｑ−、−（ＣＨ２−ＣＨ２）−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｑ−、（ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−（ＣＨ２−ＣＨ２）−または−（ＣＨ２−ＣＨ２）−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｐ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｑ−（ＣＨ２−ＣＨ２）−の中から選択された基を表し、ｐは１〜１０の間の整数を表し、ｑは１〜１０の間の整数を表し、
Ｚはハロゲン原子、チオール基またはマレイミド基を表す。
【００７１】
有利には、Ａは式−（ＣＨ２）５−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−の基を表す。
【００７２】
有利には、Ｚはチオール基を表す。
【００７３】
好ましい実施形態では、有機分子は
【化２５】
0005775307.tif 000026
（化合物２０）
および
【化２６】
0005775307.tif 000027
（化合物２１）
から選択される。
【００７４】
別の特定の実施形態では、本発明の複合分子は以下の分子：
【化２７】
0005775307.tif 000028
（化合物２３）
および
【化２８】
0005775307.tif 000029
（化合物２４）
から選択される。
【００７５】
第三の態様によれば、本発明は、医薬としてのその使用のための、特にＡＩＤＳの処置のための上記で定義された複合分子を包含する。
【００７６】
抗ウイルス処置のための、特にＡＩＤＳの処置のための医薬の製造を目的とした上記で定義された複合分子の使用もまた本発明の目的である。
【００７７】
本発明はまた、必要とする患者に本発明による複合分子を投与することを含んでなる、抗ウイルス処置法、好ましくは抗ＡＩＤＳ処置法に関する。
【００７８】
第四の態様によれば、本発明は、上記で定義された複合分子と薬学上許容されるビヒクルとを含んでなる医薬組成物を包含する。
【００７９】
経口、鼻腔内、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所または直腸投与用の本発明の医薬組成物において、有効成分は慣例の医薬担体と混合した単位投与形で動物またはヒトに投与することができる。好適な単位投与形は、錠剤、ゼラチンカプセル剤、散剤、顆粒剤および経口溶液または懸濁液などの経口投与用剤形、舌下および口内投与用剤形、皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内または眼内投与用剤形ならびに直腸投与用剤形を含んでなる。
【００８０】
第五の態様によれば、本発明は、上記で定義された複合分子の製造方法であって、ａ．上記で定義された一般配列（Ｉ）のＣＤ４受容体由来ペプチドを２つの活性基を有する二官能性化合物と、２つの活性基の一方が一般配列（Ｉ）中に存在するアミノ酸Ｌｙｓの残基の遊離アミノ基（−ＮＨ２）と共有結合を形成するように接触させて、二官能性基の第二の活性基を有する活性化されたペプチドを得る工程、および
ｂ．工程（ａ）で得られた活性化されたペプチドを上記で定義された官能基を有する有機分子またはチオール基を有する上記で定義された有機分子に相当する有機分子（そのチオール基（ＳＨ）が保護チオール基により保護されている）と、活性化されたペプチドの活性基が有機分子の保護されたまたは保護されていない官能基と共有結合を形成するように接触させて複合分子を得る工程
を含んでなることを特徴とする方法を包含する。
【００８１】
よって、官能基はハロゲン原子、マレイミド基、チオール基または保護チオール基を表す。
【００８２】
工程（ａ）で得られた化合物は本願では同じように「活性化されたペプチド」、「活性化されたミニＣＤ４」、「活性化されたＣＤ４ペプチド」または「活性化されたミニＣＤ４ペプチド」と呼ばれる。
【００８３】
本発明において用いられる「保護チオール基」とは、合成手順中に望ましくない反応からチオール基を保護するためにＳ−保護基で置換された硫黄原子を表す。慣用のＳ−保護基はGreene, "Protective Groups In Organic Synthesis," (John Wiley & Sons, New York (1981))に開示されている。Ｓ−保護基は、ｐ−メトキシベンジルもしくはｐ−ニトロベンジルなどの置換または非置換ベンジルエーテル、トリチルエーテル、チオエーテル、チオアセテートまたはチオアセタールを含んでなる。有利には、保護されたチオール基はチオアセチルである。
【００８４】
有機化合物が保護チオール基を有する場合、この保護基は、遊離チオール基を回復させるため、また、このチオールと活性化されたペプチドの活性基とのカップリングを可能とするために工程（ｂ）の前または間に脱保護する。
【００８５】
ＣＤ４受容体由来ペプチドの特徴は上記で定義されたものと同様である。
【００８６】
特に、Ｐ３は好ましくは少なくとも１つの塩基性アミノ酸を含んでなり、該塩基性アミノ酸はいっそうより好ましくはアルギニンである。
【００８７】
好ましい実施形態によれば、一般配列（Ｉ）においてＸａａｆはＴＰＡを表す。
【００８８】
別の好ましい実施形態によれば、ＸａａｊはＰｈｅを表す。
【００８９】
好ましくは、一般配列（Ｉ）のＣＤ４受容体由来ペプチドの配列は配列番号１および配列番号２の配列からなる群から選択され、有利には配列番号１である。
【００９０】
本特許出願において「二官能性化合物」とは、２つの活性基を組み込み、その２つの活性基の一方が一般配列（Ｉ）中に存在するアミノ酸Ｌｙｓの残基の遊離アミノ基（−ＮＨ２）と共有結合を形成することができ、他方の活性基が有機分子と共有結合を形成することができる任意の化合物を表す。
【００９１】
当業者は、本発明で使用可能な二官能性化合物をよく知っている。特に、本発明による二官能性化合物は以下の非限定リストから選択することができる：ＮＨＳ−ＰＥＯｎ−マレイミド（ここで、ｎは２〜２４の間であり、有利には、ｎ＝２、４、８または１２である）、スルホ−ＫＭＵＳ（Ｎ−［ｋ−マレイミドウンデカノイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル）、ＬＣ−ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシ−［６−アミドカプロエート］）、ＫＭＵＡ（Ｎ−ｋ−マレイミドウンデカン酸）、ＳＭＰＢ（スクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート）、スルホ−ＳＭＰＢ（スルホスクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート）、スルホ−ＳＩＡＢ（Ｎ−スルホスクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート）、ＳＩＡＢ（Ｎ−スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート）、スルホ−ＥＭＣＳ（［Ｎ−ｅ−マレイミドカプロイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル）、ＥＭＣＡ（Ｎ−ｅ−マレイミドカプロン酸）、ＥＭＣＳ（［Ｎ−ｅ−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、スルホ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、スルホ−ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル）、ＧＭＢＳ（Ｎ−［ｇ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル）、スルホ−ＧＭＢＳ（Ｎ−［ｇ−マレイミドブチリルオキシ］スルホスクシンイミドエステル）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＢＡＰ（スクシンイミジル３−［ブロモアセトアミド］プロピオネート）、ＢＭＰＳ（Ｎ−［［β］−マレイミドプロピルオキシ］スクシンイミドエステル）、ＢＭＰＡ（Ｎ−［β］−マレイミドプロピオン酸）、ＡＭＡＳ  Ｎ−（ａ−マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル）、ＳＩＡ（Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート）、ＳＭＰＨ（スクシンイミジル−６−［βマレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート）、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート）およびＳＡＴＰ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオネート）。
【００９２】
本発明によれば、ＮＨＳ−ＰＥＯｎ−マレイミド（ここで、ｎ＝２）はスクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロプリオンアミド）−ジエチレングリコール］エステルとも呼ばれ、ＮＨＳ−ＰＥＯｎ−マレイミド（ここで、ｎ＝４）はスクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロプリオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステルとも呼ばれ、ＮＨＳ−ＰＥＯｎ−マレイミド（ここで、ｎ＝８）はスクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロプリオンアミド）−オクタエチレングリコール］エステルとも呼ばれ、ＮＨＳ−ＰＥＯｎ−マレイミド（ここで、ｎ＝１２）はスクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロプリオンアミド）−ドデカエチレングリコール］エステルとも呼ばれる。
【００９３】
一般配列（Ｉ）中に存在するアミノ酸Ｌｙｓの残基の遊離アミン基（−ＮＨ２）と共有結合を形成することができる活性基はいずれの活性エステル基であってもよい。
【００９４】
好ましくは、一般配列（Ｉ）中に存在するアミノ酸Ｌｙｓの残基の遊離アミン基（−ＮＨ２）と共有結合を形成することができる活性基は、活性基Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）またはＮ−ヒドロキシ−４−スルホ−スクシンイミドエステルであり、有利にはＮＨＳ活性基である。
【００９５】
いっそうより好ましくは、二官能性化合物の２つの活性基は異なり（ヘテロ二官能基）、その２つの基のうち１つはＮＨＳ活性基またはＮ−ヒドロキシ−４−スルホ−スクシンイミドエステルであり、有利にはＮＨＳ活性基である。
【００９６】
有利には、有機分子の官能基と共有結合基を形成することができる二官能性化合物の活性基は、有機分子の官能基がチオール基または保護チオール基である場合にはハロゲン原子またはマレイミド基であり、有機分子の官能基がハロゲン原子またはマレイミド基である場合には上記で定義されたようにチオール基または保護チオール基である。
【００９７】
好ましい実施形態によれば、有機分子の官能基はチオール基または保護チオール基である場合、二官能性化合物は、スクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）およびＮＨＳ−ＰＥＯｎ−マレイミド（ここで、ｎは２〜２４の間であり、有利には２、４、８または１２である）からなる群から選択される。
【００９８】
特に好ましい実施形態によれば、二官能性化合物はＳＭＰＨである。
【００９９】
ＳＭＰＨの分子構造は以下の通りである。
【化２９】
0005775307.tif 000030
【０１００】
さらに別の特に好ましい実施形態によれば、二官能性化合物はスクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−ジエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＯ２−マレイミドとも呼ばれる）、スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＯ４−マレイミドとも呼ばれる）、スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−オクタエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＯ８−マレイミドとも呼ばれる）、スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−ドデカエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＯ１２−マレイミドとも呼ばれる）であり、なおより好ましくは、二官能性化合物はＮＨＳ−ＰＥＯ２−マレイミドである。
【０１０１】
ＮＨＳ−ＰＥＯ２−マレイミドの分子構造は以下の通りである。
【化３０】
0005775307.tif 000031
【０１０２】
別の特に好ましい実施形態によれば、有機分子の官能基がハロゲン原子またはマレイミド基である場合、二官能性化合物はＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）およびＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオネート（ＳＡＴＰ）からなる群から選択される。
【０１０３】
ＳＡＴＡの分子構造は以下の通りである。
【化３１】
0005775307.tif 000032
【０１０４】
ＳＡＴＰの分子構造は以下の通りである。
【化３２】
0005775307.tif 000033
【０１０５】
二官能性化合物はPIERCE (Rockford, IL)から入手することができる。
【０１０６】
好ましくは、ここでも、本発明による方法は、ＸａａｆがＴＰＡを表す場合の一般配列（Ｉ）のＣＤ４受容体由来ペプチドを製造するための予備工程を含み、その方法は、ＣＤ４受容体由来ペプチドの配列（Ｉ）においてＸａａｆがＴＰＡを表す場合、以下の一般配列（ＩＩＩ）：
Ｐ１−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐ２−Ｃｙｓ−Ｐ３−Ｃｙｓ−Ｘａａｇ−Ｘａａｈ−Ｘａａｉ−Ｘａａｊ−Ｃｙｓ−Ｘａａｋ−Ｃｙｓ−Ｘａａｌ−Ｘａａｍ（ＩＩＩ）
（ここで、Ｐ１〜Ｐ３およびＸａａｇ〜Ｘａａｍは一般配列（Ｉ）で定義された通りである）
のＣＤ４受容体由来ペプチドをＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）と接触させて、一般配列（ＩＩＩ）の該ＣＤ４受容体由来ペプチドのＮ末端にＴＰＡを組み込むことからなる該ペプチドを製造するための予備工程を含んでなる。
【０１０７】
ＳＰＤＰの分子構造は以下の通りである。
【化３３】
0005775307.tif 000034
【０１０８】
さらに、共有結合により有機分子とカップリングすることができる活性基の例として、以下の基が挙げられる：マレイミドまたはブロモアセチル、Ｓ−Ｓ−ピリジニウムまたはチオアセチル。
【０１０９】
ミニＣＤ４が保護されたチオール基（例えば、チオアセチル）により活性化される場合、例えばマレイミド基を有する有機分子とのカップリングを行うことができる。これはチオール基または保護されたチオール基、例えばチオアセチルのよるポリアニオン性多糖の官能基化に問題がある場合に可能である。このようにこれは「逆カップリング」と呼ばれる。
【０１１０】
好ましくは、活性基はマレイミド基である。
【０１１１】
その活性基がマレイミドである本発明による活性化されたペプチドの分子構造は、用いる二官能性化合物がＳＭＰＨである場合、次のものである。
【化３４】
0005775307.tif 000035
【０１１２】
本願において「ＳＭＰＨで活性化されたミニＣＤ４ペプチド」とは、そのアミノ酸Ｌｙｓ残基が有利にはアミン結合により、ＳＭＰＨ由来リンカーを介してマレイミド活性基に共有結合されている本発明による活性化されたペプチドを表す。
【０１１３】
別の有利な実施形態によれば、その活性基がマレイミド基である本発明による活性化されたペプチドの分子構造は、用いる二官能性化合物がＮＨＳ−ＰＥＯ２−マレイミドである場合、次のものである。
【化３５】
0005775307.tif 000036
【０１１４】
本願において「ＰＥＯ２リンカーを介してマレイミドで活性化されたミニＣＤ４ペプチド」とは、そのアミノ酸Ｌｙｓ残基が有利にはアミン結合により、ＰＥＯ２リンカーを介してマレイミド活性基に共有結合されている本発明による活性化されたペプチドを表す。
【０１１５】
別の有利なものでは、活性基はチオアセチル基である。
【０１１６】
例えば、その活性基がチオアセチル基である本発明による活性化されたペプチドの分子構造は、用いる二官能性化合物がＳＡＴＡである場合、次のものである。
【化３６】
0005775307.tif 000037
【０１１７】
同様に、その活性基がチオアセチル基である本発明による活性化されたペプチドの分子構造は、用いる二官能性化合物がＳＡＴＰである場合、次のものである。
【化３７】
0005775307.tif 000038
【０１１８】
チオアセチル基はチオール基の保護された形態である。チオール基を脱保護するため、本発明者らは例えばヒドロキシルアミンを用いる。この工程は有機分子が有しているマレイミド基とのカップリングと同時に行われる。
【０１１９】
本願において「ＳＡＴＡで活性化されたミニＣＤ４ペプチド」および「ＳＡＴＰで活性化されたミニＣＤ４ペプチド」とは、そのアミノ酸Ｌｙｓ残基が有利にはアミン結合により、ＳＡＴＡまたはＳＡＴＰ由来リンカーを介して、保護されたチオール基（例えば、チオアセチル）に共有結合されている本発明による活性化されたペプチドを表す。
【０１２０】
よって、特定の実施形態によれば、活性化されたペプチドの活性基はマレイミド基であり、有機分子はチオール基またはチオアセチル基を有する。
【０１２１】
チオール基または保護されたチオール基、例えば、チオアセチル基を有する修飾ポリアニオンとカップリングされた一般配列（Ｉ）のＣＤ４受容体由来ペプチドを含む本発明による複合分子の分子構造は、カップリングのための二官能性化合物としてＳＭＰＨが用いられる場合、次のものである。
【化３８】
0005775307.tif 000039
【０１２２】
それはまた、用いる官能性化合物がＮＨＳ−ＰＥＯ２−マレイミドである場合、次の複合分子であり得る。
【化３９】
0005775307.tif 000040
【０１２３】
別の実施形態によれば、本発明による複合分子は、一般配列（Ｉ）、好ましくは、配列番号１の配列を含んでなる、またはからなるＣＤ４受容体由来ペプチドと、マレイミド基またはハロゲン基を有する有機分子とを含んでなる。
【０１２４】
別の特定の実施形態によれば、活性化されたペプチドの活性基はチオアセチル基であり、有機分子はマレイミド基またはハロゲン基を有する。
【０１２５】
例えば、マレイミド基を有する有機分子とカップリングされた一般配列（Ｉ）のＣＤ４受容体由来ペプチドを含むこのような複合分子の分子構造は、カップリングにＳＡＴＡが用いられる場合、次の通りである。
【化４０】
0005775307.tif 000041
【０１２６】
本発明によれば、ポリアニオン性糖類（本発明の有機分子）は、例えばへパリナーゼによる酵素法、または例えば亜硝酸による化学法を用いた、ヘパリン（ＨＰ）またはヘパラン硫酸の部分的脱重合により製造することができる。それらが化学的に得られる場合、ヘパランは、Ｎ硫酸化もしくはＮアセチル化グルコサミン、または硫酸基を可変割合で含む、ウロン酸（グルクロン酸またはイズロン酸）に結合されたＮ位が非置換のグルコサミンが存在することで定義することができる。これらのオリゴ糖の構造的類似体は化学合成により得ることができる。
【０１２７】
このような合成アプローチには、組換え化合物または天然源由来のものの複合化に比べて多くの利点がある。治療用途では、構造が完全に確定されることに加え、病原体の混入、特に、ＨＰフラグメントの場合にはプリオンタンパク質の混入が回避できるので、合成化合物が常に好ましい。さらに、合成ＨＰフラグメントは、それらの天然等価物よりもずっと均質である。例えば、合成ＨＰ１２は、ヘパリンの抗トロンビン活性の原因となる３−Ｏ−硫酸基を全く含まない。
【０１２８】
特に、式（ＩＩ）の有機分子は、Lubineau et al. (Chem. Eur. J. 2004, 10, 4265-4282)およびNoti et al. (Chem. Eur. J. 2006, 12, 8664-8686)に記載のものと同様の方法に従って合成することができる。
【０１２９】
活性化されたペプチドおよび複合分子の製造のための本発明による方法の操作条件は当業者に周知であり、必要であれば適合させることができる。
【０１３０】
以下、実施例および図面により本発明を説明するが、これらはその範囲を何ら限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】本発明の複合分子の生物作用を示す図である。
【図２】ミニＣＤ４とｇｐ１２０の相互作用  合成されたミニＣＤ４のｇｐ１２０に対する親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅにより評価した。これらの結果により、本発明者らにより「デザイン」された１個のリシンを有するミニＣＤ４がＣＤ４タンパク質の官能性類似体であることが確認される。  上：ｇｐ１２０とｍＣＤ４表面の結合；チップの作製のため、ビオチンをｍＣＤ４のＬｙｓ側鎖に結合させた。  中：ｇｐ１２０とｓＣＤ４表面の結合はｎＭ濃度のｍＣＤ４で阻害された。  下：ｍＣＤ４の不在下では、ｇｐ１２０はｍＡｂ  １７ｂ（ＣＤ４ｉエピトープと相互作用し、共受容体サロゲートとして用いられるｍＡｂ）と結合しない。この実験は、ｇｐ１２０との複合体中のｍＣＤ４がｇｐ１２０とｍＡｂ  １７ｂ表面の結合を促進することから、ｍＣＤ４がＣＤ４ｉエピトープの露出を誘導したことを示す。
【図３】ＰＥＯ２リンカーを介した、マレイミドで活性化されたミニＣＤ４ペプチドの合成に関する図。
【図４】ｇｐ１２０（ＹＵ２またはＭＮ）とＣＤ４の結合を示す図。ｇｐ１２０は単独で（細線）、またはｍＣＤ４（上のパネルの太線）もしくは共有結合ｍＣＤ４−ＨＳ１２Ｌｂ（２５）（下のパネルの太線）のいずれかと結合させてＣＤ４表面に注入した。
【図５】ｇｐ１２０（ＭＮ）とＨＳの結合を示す図。ｇｐ１２０は、単独（細線）で、またはｍＣＤ４（左上のパネルの太線）、ＨＳ１２Ｌｂ（１９）（右上のパネルの太線）、共有結合されていないｍＣＤ４およびＨＳ１２Ｌｂ（左下のパネルの太線）もしくは共有結合ｍＣＤ４−ＨＳ１２Ｌｂ（２５）（右下のパネルの太線）のいずれかと結合させてＨＳ表面に注入した。
【図６】ｇｐ１２０（ＹＵ２またはＭＮ）とｍＡｂ  １７ｂの結合を示す図。ｇｐ１２０は、単独（細線）で、またはｍＣＤ４（上のパネルの太線）もしくは共有結合ｍＣＤ４−ＨＳ１２Ｌｂ（２５）（下のパネルの太線）のいずれかと結合させてｍＡｂ  １７ｂ表面に注入した。
【図７】ｇｐ１２０ＭＮ（上）またはＹＵ２（下）とｍＡｂ  １７ｂの結合を示す図。ｇｐ１２０は、漸増濃度の共有結合されていないｍＣＤ４およびＨＳ１２Ｌｂ（１９）（黒）または共有結合ｍＣＤ４−ＨＳ１２Ｌｂ（２５）（白）のいずれかとともにｍＡｂ  １７ｂ表面に注入した。
【図８】ｇｐ１２０とｍＡｂ  １７ｂの結合を示す図。ｇｐ１２０は、ｍＣＤ４（Ｔ）、または共有結合されていない（黒）または共有結合されている（白）、ｍＣＤ４とＧＰＲ１、ＨＳ４Ｂｚ（１７）、ＨＳ１２Ｌｂ（１９）、ＨＳ１２Ｂｚ（１８）のいずれかとともにｍＡｂ  １７ｂ表面に注入した。
【図９】ｍＣＤ４−ＨＳ１２（３）はｇｐ１２０と結合し、ｇｐ１２０共受容体結合部位を暴露し、遮断する。センサーグラムを重ね合わせたものは、（上から下へ）７６、５１、３７、２２、１５および１０ｎＭのｍＣＤ４−ＨＳ１２（２５）と固定化されたＹＵ２（ａ）またはＭＮ（ｂ）ｇｐ１２０の結合を示す。ｍＣＤ４（黒）またはｍＣＤ４−ＨＳ１２（２５）（太）は５分間（１００〜４００秒）２００ｎＭで、ＹＵ２（ｃ、ｅ）またはＭＮ（ｄ、ｆ）で活性化されたセンサーチップ上に注入し、その後、ｍＡｂ  １７ｂ（ｃ、ｄ）またはｍＡｂ  Ｅ５１（ｅ、ｆ）をさらに５分間（４００〜７００秒）注入した。結合応答（ＲＵ）を時間（秒）の関数として記録した。
【図１０】複数を含むＬｙｓ配列（下）内で選択されたリシンの場合のリシンおよび１つしか含まないＬｙｓ配列（上）内のリシンのマレイミド標識のための先行技術の戦略。
【図１１】ｍＣＤ４（濃いグレー）との複合体におけるＹＵ２  ＧＰ１２０（薄いグレー）の構造。Ｌｙｓ５が、Ｒ４１９、Ｋ４２１およびＫ４３２により構成されるＨＳ結合部位の近傍に位置し、従って、ＨＳ由来オリゴ糖を製造するのにＬｙｓ１１よりも好適な結合点に相当する。
【実施例】
【０１３２】
実施例Ｉ  合成図
Ｉ．１  ミニＣＤ４ペプチドと出願ＷＯ０３／０８９０００(Najjam S. et al., Cytokine 1997, 9(12):1013-1022)に記載されているポリアニオンの間のカップリング法に関する合成図
アミン基と糖の還元末端とのカップリング
【化４１】
0005775307.tif 000042
【０１３３】
Ｉ．２．本発明のカップリング法に関する合成図
（二官能基としてのＳＭＰＨを用いた例）
【化４２】
0005775307.tif 000043
マレイミド基の組み込みによるミニＣＤ４活性化法は、任意の化合物と遊離チオール基（ＳＨ）またはマスクされたチオール基（例えば、チオアセチル）とのカップリングを可能とする。よって、この活性化されたミニＣＤ４は、ヘパリン（または他のいずれかの多糖）が予めチオール基により誘導体化されている限り、ミニＣＤ４−ヘパリン共有結合複合分子の取得を可能とする。
【０１３４】
実施例ＩＩ  ＳＭＰＨまたはＳＡＴＰを用いた活性化されたミニＣＤ４の化学合成
ＩＩ．１  ミニＣＤ４の合成
ミニ−ペプチドＣＤ４は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３３ペプチド合成装置を用い、Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成("Fmoc solid phase peptide synthesis, a practical approach", W. C. Chan and P. D. White編, Oxford University Press, 2000)の方法論に従って合成した。０．１ミリモルのアミド−Ｆｍｏｃ樹脂で始め、Ｆｍｏｃで保護され、ＨＡＴＵ／ＤＩＥＡ混合物で活性化された１０アミノ酸当量をカップリングすることによりペプチド鎖の段階的伸長を行った。Ｎ末端チオプロピオニル基は、ペプチド−樹脂上にＳＰＤＰ（ＤＭＦ中１．６当量）をカップリングすることにより導入した。
【０１３５】
ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＥＤＴ／ＴＩＳ（９４／２．５／２．５／１）による切断の後、冷ジエチルエーテル中での沈殿によりペプチドを回収した。凍結乾燥後、粗ペプチド（１５６ｍｇ）を２０％酢酸溶液中のＤＴＴ中で一晩還元し、流速２０ｍｌ／分で６０分間にわたってＢからＡ（Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ８０％／０．０８％ＴＦＡ水溶液２０％；Ａ＝０．０８％ＴＦＡ水溶液１００％）へ３０から９０％への直線勾配を用い、Ｎｕｃｌｅｏｐｒｅｐ  Ｃ１８カラム、２０μｍ、１００Å（２６×３１３ｍｍ）での逆相ＭＰＬＣにより精製した。純粋な画分を回収し、凍結乾燥した。次に、このペプチドを一晩ＧＳＨ／ＧＳＳＧ処理を用いて折りたたみ直した。折りたたみ直されたペプチドを６０分間にわたって２０から８０％への勾配を用いてＭＰＬＣにより精製し、８．７ｍｇのミニ−ＣＤ４を得た。純度（９３．５％）は、流速１ｍｌ／分で２０分間にわたって０．０８％ＴＦＡ水溶液中２５から３５％ＣＨ３ＣＮへの直線勾配を用い、ＮｕｃｌｅｏｓｉｌカラムＣ１８、５μｍ、３００Å（４．６×１５０ｍｍ）での分析的逆相ＨＰＬＣにより確認した（保持時間＝１５．４４分）。
ＥＳ＋ＭＳ：２８９６．３２±０．２３；予測値：２８９６．４９；収率：５．５％
【０１３６】
ＩＩ．２  ＳＭＰＨで活性化されたミニ−ＣＤ４
リン酸バッファーｐＨ＝８中、４ＳＭＰＨ当量を反応させることによりミニ−ＣＤ４の片側のＬｙｓ鎖にマレイミド基を導入した。反応はＨＰＬＣにより制御した。１５分後に１００％のカップリングが達成される。流速６ｍｌ／分で２０分間にわたって０．０８％ＴＦＡ水溶液中２５から４５％ＣＨ３ＣＮへの直線勾配を用い、逆相ＨＰＬＣ用半分取Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  Ｃ１８カラム、５μｍ、３００Å（１０×２５０ｍｍ）にて精製した後、ＳＭＰＨで活性化されたミニ−ＣＤ４の最終純度（９７．７％）は、２５から４５％への直線勾配を用いる分析的ＲＰ−ＨＰＬＣ（保持時間＝１３．２１分）により制御した。
ＥＳ＋ＭＳ：３１６０．８３±０．２９；予測値：３１６０．７８；収率：１．９ｍｇ（６７％）
【０１３７】
ＳＭＰＨで活性化されたミニＣＤ４ペプチドの最終的なＨＰＬＣのエルグラム
約２ｍｇ／ｍｌ
注入量  ５μｌ  ｄｓ  ２５−４５
サンプル名：ＦＢＸ１３０８２−１９０
表面積率％：
ソート手段：シグナル
濃縮率：１．００００
希釈率：１．００００
濃縮率および希釈率を内部標準とともに使用
シグナル１：ＤＡＤＩ  Ａ、Ｓｉｇ＝２３０．４  Ｒｅｆ＝ｏｆｆ
【０１３８】
【表１】
0005775307.tif 000044
改良型積算計を用いて結果を得た。
【０１３９】
ＳＭＰＨで活性化されたミニＣＤ４ペプチドの質量スペクトル
＋Ｑ１  ＭＣＭ（１０スキャン）の高質量算出のコピー：ＦＢＸ１３０８２−１９０／ＩｎｆＭＳｐｏ／ｃ／０３／０８／０５から
高質量算出に用いた基準
エージェント：質量：１．００７９、電荷：１、エージェント  ゲイン
電荷推定値の許容度：０．１０００
質量推定値間の許容度：２０．０００
【０１４０】
【表２】
0005775307.tif 000045
推定最終質量：３１６０．８３
標準偏差：０．２９
【０１４１】
ＩＩ．３  ＳＡＴＰで活性化されたミニ−ＣＤ４活性化された
リン酸バッファーｐＨ＝８中、１ＳＡＴＰ当量を反応させることにより、ミニ−ＣＤ４の片側のＬｙｓ鎖にチオアセチル基を導入した。反応はＨＰＬＣにより制御した。３分後に４６％のカップリングが達成される。流速６ｍｌ／分で２０分間にわたって０．０８％ＴＦＡ水溶液中２０から４０％ＣＨ３ＣＮへの直線勾配を用い、半分取逆相ＨＰＬＣ用Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  Ｃ１８カラム、５μｍ、３００Å（１０×２５０ｍｍ）にてＳＡＴＰで活性化されたミニ−ＣＤ４を単離した。ＳＡＴＰで活性化されたミニ−ＣＤ４の最終純度（１００％）は、２５から４５％への直線勾配を用いる分析的ＲＰ−ＨＰＬＣ（保持時間＝１３．８８分）により制御した。
ＥＳ＋ＭＳ：３０２７．３１±０．４１；予測値：３０２７．６６。このカップリング反応を１回行い、２当量のＳＡＴＰを直接加えることにより至適化することができた。
【０１４２】
ＳＡＴＰで活性化されたミニＣＤ４ペプチドの最終的なＨＰＬＣエルグラム
２０分で２５−４５
サンプル名：ＦＢＸ１３０８２−１６８−２
表面積率％：
ソート手段：シグナル
濃縮率：１．００００
希釈率：１．００００
濃縮率および希釈率を内部標準とともに使用
シグナル１：ＤＡＤＩ  Ａ、Ｓｉｇ＝２３０．４  Ｒｅｆ＝ｏｆｆ
【０１４３】
【表３】
0005775307.tif 000046
改良型積算計を用いて結果を得た。
【０１４４】
ＳＡＴＰで活性化されたミニＣＤ４ペプチドの質量スペクトル
＋Ｑ１  ＭＣＡ（１０スキャン）の高質量算出のコピー：ＦＢＸ１３０８２−１８６−２／Ｉｎｆｐｏ／ｃ／２９／０７／０５から
高質量算出に用いた基準
エージェント：、質量：１．００７９、電荷：１、エージェント  ゲイン
電荷推定値の許容度：０．１０００
質量推定値間の許容度：２０．０００
【０１４５】
【表４】
0005775307.tif 000047
推定最終質量：３１２７．３１
標準偏差：０．４１
【０１４６】
実施例ＩＩＩ  確定した位置にリシン残基を１つおよび１つだけ含む一般配列（Ｉ）の選択の妥当性
確定した位置にリシン残基を１つおよび１つだけ含む一般配列（Ｉ）の選択の妥当性を、ＥＺ−リンク−ＮＨＳ−（ＰＥＯ）４−ビオチンＰＩＥＲＣＥ試薬(Rockford, IL)を用い、（ＰＥＯ）４−ビオチンによりＬｙｓ上で誘導体化されたミニＣＤ４ペプチドの合成によりバリデートした。
【０１４７】
一般配列（Ｉ）の確定した位置にこのビオチン誘導体を導入してもｇｐ１２０とミニＣＤ４の結合は変わらない（図２のＢｉａｃｏｒｅ測定を参照）。
【０１４８】
これらの種々の合成方法は最適化しなかった。より良い収率を達成することができるはずである。
【０１４９】
実施例ＩＶ  ＰＥＯ２リンカーを介してマレイミドで活性化されたミニ−ＣＤ４（ミニＣＤ４−ＰＥＯ２−ｍａｌ）の化学合成（図３参照）
ｍＣＤ４−ＰＥＯ２−マレイミドは、化合物ｍＣＤ４−ＳＭＰＨと、リンカーのタイプという点で異なる。溶解度の理由で、親水性の高いポリエチレンオキシド（ＰＥＯ２）リンカーをミニＣＤ４とマレイミド基の間に組み込んだ。
【０１５０】
合成：１  ｍｌのＨ２Ｏ中、１０ｍｇのｍＣＤ４（ＭＷ：２８９７；３．４ミリモル）の溶液を１ｍｌのリン酸バッファー０．１Ｍ  ｐＨ８に希釈した。２０μｌのＤＭＳＯ中、この曇りのある溶液に、攪拌しながら４．５ｍｇのＮＨＳ−ＰＥＯ２−マレイミド（ＭＷ：３２５；１３．８ミリモル；４当量）を加えた。１０分後、８５％（ＨＰＬＣ）の出発材料がマレイミド誘導体に変換された。ｐＨ８でのマレイミド基の安定性が低いために、このカップリング反応物をそのまま、０．０８％ＴＦＡ水溶液中１０％のＣＨ３ＣＮで較正したＳｅｐａＫ  Ｃ１８カラムにロードした。マレイミド誘導体を５０％ＣＨ３ＣＮで溶出した。凍結乾燥後、次に、この化合物を半分取カラムで精製した。収量：５．２ｍｇ（４８％）、最終純度：７７％。
ＥＳ＋：３２０５．３９３８（予測モノアイソトピックＭ：３２０５．４２１１）、ＱＴＯＦ  Ｍｉｃｒｏ  Ｗａｔｅｒｓ  ＭａｘＥｎｔｌ。
【０１５１】
ＨＰＬＣ条件：
分析的：Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  ５Ｃ１８  ３００Å（４．６×１５０ｍｍ）；流速１ｍｌ／分で２０分間にわたって０．０８％ＴＦＡ水溶液中２５から４５％ＣＨ３ＣＮへの直線勾配。検出：２３０ｎｍ。ｍＣＤ４Ｒｔ＝１０．７分；ｍＣＤ４−ＰＥＯ２−Ｍａｌ  Ｒｔ＝１２．８分。
半分取：Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  ５Ｃ１８  ３００Å（１０×２５０ｍｍ）；流速６ｍｌ／分で２０分間にわたって０．０８％ＴＦＡ水溶液中２５から４５％ＣＨ３ＣＮへの直線勾配。
検出：２３０ｎｍ。ｍＣＤ４−ＰＥＯ２−Ｍａｌ  Ｒｔ＝１１．４。
【０１５２】
実施例Ｖ  本発明の複合分子の化学合成
Ｖ．１．合成図
【化４３】
0005775307.tif 000048
スキーム１：二糖構成ブロック１（ｍ＝５）への保護されたアミノリンカーの導入
ａ）ＴＭＳＯＴｆ、４Å、ＣＨ２Ｃｌ２、−４０〜−１０℃、７９％（α／β：２／８）
ｂ）ＴＦＡ、ＣＨ２Ｃｌ２、ＲＴ、９３％
【化４４】
0005775307.tif 000049
スキーム２：保護されたオリゴ糖５、８および１０の合成
ａ）ＴＭＳＯＴｆ、４Å、ＣＨ２Ｃｌ２、−４０〜−１０℃、８０％
ｂ）ＴＦＡ、ＣＨ２Ｃｌ２、ＲＴ、９３％の６、９１％の９
ｃ）７（１．３当量）、ＴＢＤＭＳＯＴｆ、４Å、ＣＨ２Ｃｌ２、−４０〜−１０℃、１０％の未反応６を伴う７８％の８、６％の未反応９を伴う８５％の１０
【化４５】
0005775307.tif 000050
スキーム３：硫酸化されたオリゴ糖１５、１８および１９の製造
ａ）Ｋ２ＣＯ３、ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２（１０／４）、０℃、１３％の１１ｂを伴う７１％の１１ａ、１７％の１２ｂを伴う８０％の１２
ｂ）１，３−プロパンジチオール、ＮＥｔ３、ＭｅＯＨ、７５％（１２）、８６％（１３）
ｃ）ピリジン・ＳＯ３、ピリジン、１６時間ＲＴ、２０時間５５℃、５１％（１５）、５２％（１６）
ｄ）ＬｉＯＨ、Ｈ２Ｏ２、２４時間ＲＴ、５０％（１７）；ＫＯＨ、Ｈ２Ｏ２、４８時間３７℃、５１％（１８）
ｅ）Ｐｄ（ＯＨ）２、リン酸バッファー水溶液０．１Ｍ  ｐＨ７．０／ｔＢｕＯＨ（６／２）、定量的（１９）
【０１５３】
Ｖ．２．有機分子（多糖）の化学合成
化合物１、２および７は、Lubineau et al. (Chem. Eur. J. 2004, 10, 4265-4282)およびＷＯ２００４／０００８８７に従って合成される。
化合物３：５−（アセトアミド−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）ペンチル（２−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−（４−メトキシベンジル）−α−Ｌ−ヨードピラノシルウロン酸メチル）−（１→４）−Ｏ−６−Ｏ−アセチル−２−アジド−３−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド
【化４６】
0005775307.tif 000051
アクセプター２（５０ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ、２当量）およびイミデート１（８３ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）をトルエンとともに共沸乾燥させ、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（４００μＬ）に溶解させた。粉末４Åモレキュラーシーブス（３００ｍｇ）を加え、この混合物をアルゴン下、室温で３０分間攪拌した。この溶液を−４０℃まで冷却し、ＴＭＳＯＴｆ（ＣＨ２Ｃｌ２中０．２Ｍ、９０μＬ、０．０１８ｍｍｏｌ、０．２当量）を加えた。この反応物をこの温度で１５分間攪拌した後、３０分かけて−１０℃まで昇温した。次に、この反応物をＮＥｔ３溶液（ＣＨ２Ｃｌ２中０．２Ｍ、１８０μＬ、０．０３６ｍｍｏｌ、０．４当量）で急冷した。この溶液を濾過した後、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（トルエン／ＡｃＯＥｔ  ６：１から１：１）により精製し、二糖３のαアノマーとβアノマー（７６ｍｇ、７９％）をα／β≒２／８の比率で別個に得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ = 7.43-7.23 (m, 15 H, Ph) , 7.13 (d, J = 8.5 Hz, 2H, Ph-OMe), 6.83 (d, J = 8.5 Hz, 2H, Ph-OMe) , 5.25 (d, J1, 2 = 4.5 Hz, IH, H-1B) , 5.23 (s, 2H, CH2Ph(CbZ)) , 4.87 (t, J1,2 = J2,3 = 4.5 Hz, 1 H, H-2B) , 4.82 (d, J = 11.0 Hz, 1 H, CH2Ph), 4.73 (d, J5,4 = 4.0 Hz, 1 H, H-5B) , 4.71 (d, J = 11.0 Hz, 1 H, CH2Ph) , 4.70 (d, J = 11.5 Hz, 1 H, CH2Ph) , 4.64 (d, J = 11.5 Hz, 1 H, CH2Ph) , 4.46 (d, J = 11.5 Hz, 1 H, CH2Ph), 4.42 (dd, J6a,6b = 11.5 Hz, J6a,5 = 2.0 Hz, 1.5 H, H-6aA) , 4.40 (d, J = 11.5 Hz, 1 H, CH2Ph) , 4.21 (d, J1, 2 = 7.5 Hz, 1 H, H-1A) , 4.18 (dd, J6a,6b = 11.5 Hz, J6b,5 = 4.0 Hz, 1 H, H-6bA) , 3.93 (t, J4,5 = J4,3 = 9.5 Hz, 1 H, H-4A) , 3.85 (dt, Ja,a’ = 9.5 Hz, Ja,b = 6.5 Hz, 1H, H-a) , 3.81 (t, J3, 4 = J4, 5 = 4.0 Hz, 1 H, H-4<B>) , 3.80 (s, IH, PhOMe), 3.76 (dd, J2, 3 = 4.5 Hz, J3,4 = 4.0 Hz, IH, H-3B) , 3.80-3.74 (m, 2H, H-e), 3.55 (s, 3H, COOMe), 3.52-3.38 (m, 2 H, H-a' および H- 5A) , 3.35 (dd, J2,3 = 10.0 Hz, J2,1 = 7.5 Hz, 1 H, H-2A) , 3.31 (t, J3, 2 = J3,4 = 9.5 Hz, 1 H, H-3A) , 2.50 (s, 3 H, CH3 NAc) , 2.06 (s, 3 H, CH3 OAc) , 2.03 (s, 3 H, CH3 OAc) , 1.68-1.48 (m, 4 H, H-b および H-d) , 1.43-1.28 (m, 2 H, H-c) ; 
13C NMR (100.6 MHz, CDCl3) δ = 172.8, 170.7, 170.0, 169.8 (C=O) , 159.4 (C-OMe, pMBn) , 138.1, 137.9, 135.1, 135.0 (C第４級芳香族) , 129.6, 129.4, 129.0, 128.9, 128.7, 128.6, 128.4, 128.3, 128.2, 128.1, 127.9, 127.8, 127.4 (C芳香族) , 113.7 (Cm PMBn) , 102.1 (C-1A) , 97.9 (C-1B) , 80.9 (C-3A) , 75.3 (C-4A) , 74.9 (CH2Ph) , 74.8 (C-4B) , 74.4 (C-3B) , 73.1 (C-5A) , 73.0 (CH2Ph) , 72.4 (CH2Ph) , 70.5 (C-5B) , 70.1 (C-2B) , 70.0 (CH2-a) , 68.4 (CH2Ph Cbz) , 66.2 (C-2A) , 62.2 (C-6A) , 55.2 (CH3, COOMe) , 51.8 (CH3, COOMe) , 44.0 (CH2-e) , 29.0 (CH2-b) , 28.2 (CH2-d) , 26.8 (CH3, NAc) , 23.1 (CH2-C) , 20.9, 20.8 (CH3, OAc) ;
Ｃ５４Ｈ６４Ｎ４Ｏ１７Ｎａに関するＥＳＩ  ＨＲ−ＭＳ  ｍ／ｚ計算値［Ｍ＋Ｎａ］＋：１０６３．４１５９、実測値：１０６３．４１７１。
【０１５４】
化合物４：５−（アセトアミド−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）ペンチル（２−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−ベンジル−α−Ｌ−ヨードピラノシルウロン酸メチル）−（１→４）−Ｏ−６−Ｏ−アセチル−２−アジド−３−Ｏ−ベンジル−１−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド
【化４７】
0005775307.tif 000052
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１．６ｍＬ）中、二糖３（１２５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（１６０μＬ、２．１６ｍｍｏｌ、１８当量）をゆっくり加え、得られた紫の溶液をアルゴン下で１時間攪拌した。次に、ＮＥｔ３（３５０μＬ）を加え、得られた溶液を濃縮した。残渣のフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、石油エーテル／ＡｃＯＥｔ８５：１５から３５：６５）により、所望の二糖４（１０３ｍｇ、９３％）を得た。
1H NMR (360 MHz, CDCl3) δ = 7.45-7.22 (m, 15 H, Ph) , 5.20 (s, 2H, CH2Ph(CbZ) ) , 5.03 (br.s, 1H, H-1B) , 4.92 (d, J5, 4 = 1.5 Hz, 1 H, H-5B) , 4.88 (br.s, 1 H, H-2B) , 4.72 (d, J = 11.5 Hz, 1 H, CH2Ph) , 4.71 (d, J = 11.5 Hz, 1 H, CH2Ph) , 4.66 (d, J = 11.5 Hz, 1 H, CH2Ph) , 4.60 (d, J = 11.5 Hz, 1 H, CH2Ph) , 4.42 (d, J6a,6b = 12.0 Hz, J6a,5 = 2.0 Hz, 1 H, H-6aA) , 4.20 (d, J1,2 = 8.0 Hz, 1 H, H-1A) , 4.15 (d, J6a,6b = 12.0 Hz, J6b,5 = 4.0 Hz, 1 H, H-6bA) , 3.95 (br. d, J4,OH = 10.5 Hz, 1 H, H-4B) , 3.90-3.84 (m, 1 H, H-a) , 3.82 (t, J4,5 = J4, 3 = 10.0 Hz, 1 H, H-4A) , 3.74-3.66 (m, 3 H, H- 3B および H-e) , 3.49-3.32 (m, 5 H, δ＝３．４７においてｓを含む, PhOMe, H-a' および H-5A) , 3.36 (dd, J2,3 = 10.0 Hz, J2,1 = 8.0 Hz, 1 H, H- 2A) , 3.23 (t, J3,2 = J3,4 = 10.0 Hz, 1 H, H-3A) , 2.59 (d, JOH,4 = 10.5 Hz, 1 H, OH) , 2.46 (s, 3 H, CH3 NAc) , 2.05 (s, 3 H, CH3 OAc) , 2.04 (s, 3 H, CH3 OAc) , 1.65-1.53 (m, 2 H, H-b) , 1.51 (q, Jc,d = Jc,d = Je,d = 7.5 Hz, 2 H, H-d) , 1.41-1.30 (m, 2 H, H-c) ; 
13C NMR (100.6 MHz, CDCl3) δ = 172.8, 170.5, 169.4, 169.1 (C=O) , 137.9, 137.2, 135.1 (C第４級芳香族) , 128.6, 128.4, 128.2, 128.1, 127.9, 127.4 (C芳香族) , 102.2 (C-1A) , 98.0 (C-1B) , 81.0 (C-3A) , 74.8 (C-4A) , 74.6 (CH2Ph) , 74.4 (C-3B) , 73.1 (C-5A) , 72.3 (CH2Ph) , 69.9 (CH2-a) , 68.5 (C-5B) , 68.4 (CH2Ph Cbz) , 67.7 (C-4B) , 67.2 (C-2B) , 66.4 (C-2A) , 62.2 (C-6A) , 52.0 (CH3, COOMe) , 43.9 (CH2-e) , 29.0 (CH2-b) , 28.2 (CH2-d) , 26.8 (CH3, NAc) , 23.1 (CH2-C) , 20.9, 20.8 (CH3, OAc) ; 
Ｃ４６Ｈ５６Ｎ４Ｏ１６Ｎａに関するＥＳＩ  ＨＲ−ＭＳ  ｍ／ｚ計算値［Ｍ＋Ｎａ］＋：９４３．３５８９０、実測値：９４３．３６０１８。
【０１５５】
化合物５：５−（アセトアミド−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）ペンチル［（２−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−（４−メトキシベンジル）−α−Ｌ−ヨードピラノシルウロン酸メチル）−（１→４）−Ｏ−（６−Ｏ−アセチル−２−アジド−３−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド）−（１→４）−Ｏ−（２−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−ベンジル−α−Ｌ−ヨードピラノシルウロン酸）メチル］−（１→４）−Ｏ−６−Ｏ−アセチル−２−アジド−３−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド
【化４８】
0005775307.tif 000053
アクセプター４（８０ｍｇ、０．０８７ｍｍｏｌ）およびイミデート１（１０７ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ、１．３当量）をトルエンとともに共沸乾燥させ、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（３６０μＬ）に溶解させた。粉末４Åモレキュラーシーブス（２８０ｍｇ）を加え、この混合物をアルゴン下、室温で３０分間攪拌した。この溶液を−４０℃まで冷却し、ＴＭＳＯＴｆ（ＣＨ２Ｃｌ２中０．２Ｍ、８９μＬ、０．０１７ｍｍｏｌ、０．２当量）を加えた。この反応物をこの温度で１５分間攪拌した後、３０分かけて−１０℃まで昇温した。次に、この反応物をＮＥｔ３溶液（ＣＨ２Ｃｌ２中０．２Ｍ、１８０μＬ、０．０３５ｍｍｏｌ、０．４当量）で急冷した。この溶液を濾過し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０クロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、１：１）の上に適用した。四糖５を含有する画分をプールし、濃縮し、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（トルエン／ＡｃＯＥｔ  ８５：１５から３５：６５）により精製し、四糖５（１１６ｍｇ、８０％）を得た。
1H NMR (360 MHz, CDCl3) δ = 7.37-7.14 (m, 25 H, Ph) , 7.06 (d, J = 8.5 Hz, 2 H, Ph-OMe), 6.76 (d, J = 8.5 Hz, 2 H, Ph-OMe) , 5.20 (d, J1, 2 = 5.5 Hz, 1H, H-1B) , 5.16 (s, 2H, CH2Ph(CbZ)) , 5.14 (d, J1,2 = 3.5 Hz, 1 H, H-1D) , 4.83 (d, J = 10.0 Hz, 1 H, CH2Ph) , 4.86-4.79 (m, 2 H, H-2D および H-1c ) , 4.79 (t, J2,3 = J2,1 = 5.5 Hz, 1 H, H-2B) , 4.69 (d, J = 10.5 Hz, 1 H, CH2Ph) , 4.71-4.62 (m, 4 H, H-5D, 2 CH2Ph) , 4.59 (s, 2H, CH2Ph) , 4.55 (d, J = 10.5 Hz, 1 H, CH2Ph) , 4.52 (d, J5,4 = 5.0 Hz, 1 H, H-5B) , 4.39 (d, J = 11.5 Hz, 1 H, CH2PhOMe) , 4.38-4.34 (m, 1 H, H-6aA) , 4.35 (d, J = 11.5 Hz, 1 H, CH2PhOMe) , 4.28 (d, J6a,6b = 12.0 Hz, 1 H, H-6ac) , 4.14 (d, J1,2 = 7.5 Hz, 1 H, H-1A) , 4.14-4.10 (m, 1 H, H-6bA) , 4.08 (dd, J6b,6a = 12.0, J6b,5 = 2.5 Hz, 1 H, H-6bc) , 3.92 (t, J4,3 = J4, s = 4.0 Hz, 1 H, H-4D) , 3.88 (t, J4,5 = J4,3 = 9.0 Hz, 1 H, H-4C) , 3.83 (t, J3,4 = J3,2 = 4.0 Hz, 1 H, H-3D) , 3.78 (t, J4,5 = J4,3 = 10.0 Hz, 1 H, H-4A) , 3.81-3.62 (m, 9 H, δ＝３．７３においてｓを含む, H-a, H-5C, H-4B, PhOMe, H-3B および H-e) , 3.58 (dd, J3,2 = 10.0, J3, 4 = 9.0 Hz, 1 H, H-3C) , 3.49 (s, 3 H, COOMe) , 3.42 (s, 3 H, COOMe) , 3.42-3.31 (m, 2 H, H-5A および H-a' ) , 3.29 (dd, J2,3 = 9.5, J2,1 = 7.5 Hz, 1 H, H-2A) , 3.22 (dd, J2,3 = 10.0, J2,1 = 3.5 Hz, 1 H, H-2C) , 3.21 (dd, J3,4 = 10.0, J3,2 = 9.5 Hz, 1 H, H-3A) , 2.42 (s, 3 H, CH3 NAc) , 2.03 (s, 3 H, CH3 OAc) , 1.98 (s, 3 H, CH3 OAc) , 1.96 (s, 3 H, CH3 OAc) , 1.95 (s, 3 H, CH3 OAc) , 1.61-1.48 (m, 2 H, H-b) , 1.47 (q, Jc,c = Jc,d = Je,d = 7.5 Hz, 2 H, H-d) , 1.28 (m, 2 H, H-c) . 
13C NMR (100.6 MHz, CDCl3) δ = 159.5 (C-OMe, pMBn) , 138.0, 137.8, 137.2 (C第４級芳香族) , 129.6, 128.7, 128.6, 128.5, 128.4, 128.3, 128.2, 128.0, 127.9, 127.8, 127.5 (C芳香族) , 113.8 (Cm pMBn) , 102.2 (C-1A) , 98.0 (C-1D) , 97.9 (C-1B) , 97.4 (C-1c) , 81.0 (C-3A) , 77.9 (C-3C , 75.6 (C-4C) , 75.5 (C-3B) , 75.3 (C-4B および C-4A) , 75.0 (CH2Ph) , 74.8 (CH2Ph) , 73.7 (C-3D) , 73.5 (CH2Ph) , 73.3 (CH2Ph) , 73.1 (C-5A) , 72.9 (C-4D) , 72.6 (CH2 pMBn) , 71.2 (C-5B) , 71.0 (C- 2B) , 70.0 (CH2-a) , 69.7 (C-5C) , 69.3 (C-5D) , 68.8 (C-2D) , 68.4 (CH2Ph Cbz ) , 66.2 (C-2A) , 62.8 (C-2C) , 62.2 (C-6A) , 61.7 (C-6C) , 55.3 (CH3, OMe pMBn) , 52.0 (CH3, COOMe) , 51.7 (CH3, COOMe) , 44.1 (CH2-e) , 29.1 (CH2-b) , 28.3 (CH2-d) , 26.8 (CH3, NAc) , 23.1 (CH2- c) , 20.9, 20.7 (CH3, OAc) ; 
IR (薄膜) : v = 3021 (Vc-H 芳香族) , 2948, 2933, 2833 (Vc-H 脂肪族) , 2110 (VN3) , 1741 (Vc-c) , 1618, 1550, 1509, 1452, 1369, 1227; 
[α]D28 = - 8.0833 (c = 1.2,  CH2Cl2において); 
Ｃ８５Ｈ９９Ｎ７Ｏ２９Ｎａに関するＥＳＩ  ＨＲ−ＭＳ  ｍ／ｚ計算値［Ｍ＋Ｎａ］＋：１７０４．６３８４９、実測値：１７０４．６３２５２。
【０１５６】
化合物８：５−（アセトアミド−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）ペンチル［（２−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−（４−メトキシベンジル）−α−Ｌ−ヨードピラノシルウロン酸メチル）−（１→４）−Ｏ−（６−Ｏ−アセチル−２−アジド−３−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド）−（１→４）−Ｏ−（２−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−ベンジル−α−Ｌ−ヨードピラノシルウロン酸メチル）−（１→４）−Ｏ−（６−Ｏ−アセチル−２−アジド−３−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド）−（１→４）−Ｏ−（２−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−ベンジル−α−Ｌ−ヨードピラノシルウロン酸メチル）−（１→４）−Ｏ−（６−Ｏ−アセチル−２−アジド−３−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド）−（１→４）−Ｏ−（２−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−ベンジル−α−Ｌ−ヨードピラノシルウロン酸メチル）］−（１→４）−Ｏ−６−Ｏ−アセチル−２−アジド−３−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド
【化４９】
0005775307.tif 000054
四糖５（１１０ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）を、二糖３に関して上記したように、ＣＨ２Ｃｌ２（８５０μＬ）中のＴＦＡ（８７μＬ、１．１８ｍｍｏｌ）で処理し、９５ｍｇの四糖６を得た（９３％）。アクセプター６（９５ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ）およびイミデート７（１２３．５ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ、１．３当量）をトルエンとともに共沸乾燥させ、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（９００μＬ）に溶解させた。粉末４Åモレキュラーシーブス（３２５ｍｇ）を加え、この混合物をアルゴン下、室温で３０分間攪拌した。この溶液を−４０℃まで冷却し、ＴＢＤＭＳＯＴｆ（ＣＨ２Ｃｌ２中０．２Ｍ、６０μＬ、０．０１２ｍｍｏｌ、０．２当量）を加えた。この反応物をこの温度で１５分間攪拌した後、３０分かけて−１０℃まで昇温した。次に、この反応物をＮＥｔ３溶液（ＣＨ２Ｃｌ２中０．２Ｍ、１２０μＬ、０．０２４ｍｍｏｌ、０．４当量）で急冷し、この温度で１５分間攪拌した。次に、この溶液をそのままＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０クロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、１：１）の上に適用し、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（トルエン／ＡｃＯＥｔ  ８５：１５から３５：６５）により精製し、八糖８（１４１ｍｇ、７８％）を１０ｍｇの未反応アクセプター６（１０％）とともに得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.45-7.10 (m, 47 H, Ph) , 6.75 (d, J = 8.5 Hz, 2 H, Ph-OMe) , 5.22 (d, J1,2 = 5.5 Hz, 1H, H-1B) , 5.21 (d, J1,2 = 5.5 Hz, 2 H, H-1D および H-1F) , 5.14 (s, 2H, CH2Ph (CbZ) ) , 5.13 (d, J1,2 = 3.5 Hz, 1 H, H-1H) , 4.89 (d, J1,2 = 3.0 Hz, 2 H, H-1c または H-1E または H-1G および H-1E または H-1G または H-1c) , 4.86-4.77 (m, 6 H, H-1G または H-1c または H-1E, H-2B, H-2D, H-2F, H-2H および CH2Ph) , 4.78 (d, J = 11.0 Hz, 2 H, CH2Ph) , 4.72-4.53 (m, 14 H, δ＝４．７９においてｓを含むH-5H, 13XCH2Ph) , 4.50 (d, J = 5.0 Hz, 2 H, H-5D および H-5F , 4.48 (d, J = 5.0 Hz, 1 H, H-5B) , 4.38 (d, J = 11.0 Hz, 1 H, CH2PhOMe) , 4.35 (d, J = 11.0 Hz, 1 H, CH2PhOMe) , 4.39-4.26 (m, 3 H, H-6aA H-6ac および H-6aE) , 4.26 (d, J6a,6b = 11.0 Hz, 1 H, H-6aG) , 4.13 (d, J1,2 = 8.0 Hz, 1H, H-1A) , 4.15-4.03 (m, 4 H, H-6bA, H- 6bc, H-6bE および H-6bG) , 3.96-3.88 (m, 3 H, H-4H, H-4F および H-4D) , 3.90-3.68 (m, 16 H, δ＝３．７１においてｓを含む, H-4G, H-3D, H-3F, H-3H, H-4E, H-4C, H-4A, H-a, H-5G, H-5C, H-5E, H-4B, PhOMe および H- 3B) , 3.65 (br t, Jd,e = 7.5 Hz, 2 H, H-e) , 3.61-3.50 (m, 3 H, H- 3G, H-3E および H-3C) , 3.50 (s, 3 H, COOMe) , 3.47 (s, 3 H, COOMe) , 3.45 (s, 3 H, COOMe) , 3.41 (s, 3 H, COOMe) , 3.41-3.31 (m, 2 H, H-a' および H-5A) , 3.28 (dd, J2,3 = 9.5, J2,1 = 8.0 Hz, 1 H, H-2A) , 3.24-3.15 (m, 4 H, δ＝３．２０においてｓを含むH-3A, H-2C, H-2E および H-2G) , 2.40 (s, 3 H, CH3 NAc) , 2.01 (s, 6 H, CH3 OAc) , 2.00 (s, 3 H, CH3 OAc) , 1.96 (s, 3 H, CH3 OAc) , 1.94 (2 s, 6 H, CH3 OAc) , 1.93 (s, 6 H, CH3 OAc) , 1.57-1.46 (m, 2 H, H-b) , 1.46 (q, Jc,d = Je,d = V.5 Hz, 2 H, H-d) , 1.33-1.22 (m, 2 H, H-c) ; 
13C NMR (100.6 MHz, CDCl3) δ = 170.7, 170.6, 169.9, 169.7, 169.5, 169.3 (C=O) , 159.5 (C-OMe, pMBn) , 137.9, 137.8, 137.7, 137.6, 137.4, 137.3 (C第４級芳香族) , 129.6, 129.3, 128.6, 128.5, 128.4, 128.2, 127.8, 127.6 (C芳香族) , 113.8 (Cm pMBn) , 102.1 (C-1A) , 98.0 (C-1H) , 97.9 (C-1B, C-1D および C-1F) , 97.7 (C-lC または E または G および C-1E または G またはC) , 97.1 (C-1G または C または E) , 80.9 (C-3A) , 77.9, 77.8, 77.7 (C-3C, C-3E および C-3G) , 75.7 (C-3B および C-4G) , 75.6 (C-4A および C-4B) , 75.5 (C-4C または E) , 75.4 (C-3D または F および C-4C または E) , 75.2 (C-3D または F) , 75.0 (2x CH2Ph) , 74.8 (4x CH2Ph) , 74.1 (CH2Ph) , 74.0 (CH2Ph) , 73.6 (C-3H および CH2Ph) , 73.5, 73.4 (C-4D and C-4F) , 73.2 (CH2Ph) , 73.1 (C-5A) , 72.6 (CH2 pMBn および C-4H) , 71.3 (C-5D または C-5F) , 71.2 (C-2D または C- 2F) , 70.6 (C-5B) , 70.4 (C-2B または C-5F) , 70.3 (C-5D または C-2B) , 70.1 (C-2F または C-2D) , 70.0 (CH2-a) , 69.7-60.6 (C-5C, C-5E および C-5G) , 69.1 (C-5H) , 68.7 (C-2H) , 68.4 (CH2Ph Cbz) , 66.2 (C-2A) , 63.0 (C- 2C または E) , 62.8 (C-2C または E および C-2G) , 62.2 (C-6A) , 61.6 (C-6C, C-6E および C-6G) , 55.2 (CH3, OMe pMBn) , 52.0 (3x CH3, COOMe) , 51.7 (CH3, COOMe) , 44.0 (CH2-e) , 29.0 (CH2-b) , 28.3 (CH2-d) , 26.8 (CH3, NAc) , 23.1 (CH2-C) , 20.8, 20.7 (CH3, OAc) ; 
Ｃ１４７Ｈ１６９Ｎ１３Ｏ５３Ｎａに関するＥＳＩ  ＨＲ−ＭＳ  ｍ／ｚ計算値［Ｍ＋Ｎａ］＋：２９８７．０８２１、実測値：２９８７．０８４５。
【０１５７】
化合物１０：５−（アセトアミド−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）ペンチル［（２−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−（４−メトキシベンジル）−α−Ｌ−ヨードピラノシルウロン酸メチル）−（１→４）−Ｏ−（６−Ｏ−アセチル−２−アジド−３−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド）−（１→４）−Ｏ−（２−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−ベンジル−α−Ｌ−ヨードピラノシルウロン酸メチル）−（１→４）−Ｏ−（６−Ｏ−アセチル−２−アジド−３−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド）−（１→４）−Ｏ−（２−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−ベンジル−α−Ｌ−ヨードピラノシルウロン酸メチル）−（１→４）−Ｏ−（６−Ｏ−アセチル−２−アジド−３−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド）−（１→４）−Ｏ−（２−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−ベンジル−α−Ｌ−ヨードピラノシルウロン酸メチル）］−（１→４）−Ｏ−（６−Ｏ−アセチル−２−アジド−３−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド）−（１→４）−Ｏ−（２−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−ベンジル−α−Ｌ−ヨードピラノシルウロン酸メチル）−（１→４）−Ｏ−（６−Ｏ−アセチル−２−アジド−３−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド）−（１→４）−Ｏ−（２−Ｏ−アセチル−３−Ｏ−ベンジル−α−Ｌ−ヨードピラノシルウロン酸メチル）］−（１→４）−Ｏ−６−Ｏ−アセチル−２−アジド−３−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド
【化５０】
0005775307.tif 000055
八糖８（１３６ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）を、３に関して上記したように、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１．２ｍＬ）中のＴＦＡ（６１μＬ、０．８２５ｍｍｏｌ）で処理し、１１９ｍｇの化合物９を得た（９１％、Ｃ１３９Ｈ１６１Ｎ１３Ｏ５２Ｎａに関するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＨＲ−ＭＳ  ｍ／ｚ計算値［Ｍ＋Ｎａ］＋：２８６７．０２４６、実測値：２８６７．０２２６）。アクセプター９（９５ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）およびイミデート７（６５ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ、１．３当量）をトルエンとともに共沸乾燥させ、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５００μＬ）に溶解させた。粉末４Åモレキュラーシーブス（１８０ｍｇ）を加え、この混合物をアルゴン下、室温で３０分間攪拌した。この溶液を−４０℃まで冷却し、ＴＢＤＭＳＯＴｆ（ＣＨ２Ｃｌ２中０．２Ｍ、３３μＬ、０．００６７ｍｍｏｌ、０．２当量）を加えた。この反応物をこの温度で１５分間攪拌した後、３０分かけて−１０℃まで昇温した。次に、この反応物をＮＥｔ３溶液（ＣＨ２Ｃｌ２中０．２Ｍ、６６μＬ、０．０１３ｍｍｏｌ、０．４当量）で急冷した。この溶液を濾過した後、そのままＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０クロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、１：１）の上に適用した。十二糖を含有する画分をプールし、濃縮し、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（トルエン／ＡｃＯＥｔ  ８０：２０から５０：５０）により精製し、十二糖１０（１２０ｍｇ、８５％）を６ｍｇの未反応アクセプター９（６％）とともに得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.36-7.03 (m, 67 H, Ph) , 6.76 (d, J = 8.5 Hz, 2 H, Ph-OMe) , 5.28-5.18 (m, 5H, H-1B, H-1D, H-1F, H-1H および H-1J) , 5.16 (s, 2H, CH2Ph(CbZ) ), 5.14 (d, J1,2 = 3.5 Hz, 1 H, H-1L) , 4.95-4.89 (m, 4 H, H-1C, H-1E, H-1G, H-1I, H-1kの４) , 4.88-4.75 (m, 10 H, H-1C, H-1E, H-1G, H-11, H-1K および H-2B, H- 2D, H-2F, H-2H, H-2J, H-2L and 4 x CH2Phの１) , 4.71 (d, J = 11.0 Hz, 2 H, CH2Ph) , 4.71 (br.s, 1 H, H-5L) , 4.71-4.58 (m, 19 H, 19 x CH2Ph) , 4.55-4.43 (m, 5 H, H-5B, H-5D, H-5F, H-5H および H-5J) , 4.41 (d, J = 11.0 Hz, 1 H, CH2PhOMe) , 4.37 (d, J = 11.0 Hz, 2 H, CH2PhOMe および H-6aA) , 4.35-4.24 (m, 5 H, H-6aC, H-6aE, H-6aG,H-6aK) , 4.14 (d, J1,2 = 8.0 Hz, 1H, H-1A) , 4.17-4.15 (m, 6 H, H- 6bA H-6bC, H-6bE, H-6bG, H-6bI and H-6bK) , 3.95-3.72 (m, 25 H, δ＝３．７３においてｓを含む, H-4A, H-4F, H-4H, H-4J, H-4L, H-4K, H- 4D, H-D, H-3F, H-3H, H-3J, H-3L, H-4C, H-4E, H-4G, H-4I, H-a, H-5C, H-5E, H-5G, H-5I, H-5K および PhOMe) , 3.72 (br.s, 2 H, H-3B および H- 4B) , 3.66 (br t, J1,e = 7.5 Hz, 2 H, H-e) , 3.63-3.52 (m, 5 H, H- 3C, H-3E, H-3G, H-3I および H-3K) , 3.51 (s, 3 H, COOMe) , 3.47 (s, 9 H, 3x COOMe) , 3.46 (s, 3 H, COOMe) , 3.41 (s, 3 H, COOMe) , 3.43- 3.32 (m, 2 H, H-a' および H-5A) , 3.30 (dd, J2,3 = 9.5, J2,1 = 8.0 Hz, 1 H, H-2A) , 3.26-3.17 (m, 6 H, H-3A, H-2C, H-2E, H-2G, H-2I および H-2K) , 2.42 (s, 3 H, CH3 NAc) , 2.03 (s, 6 H, CH3 OAc) , 2.03 (s, 9 H, CH3OAc) , 1.98 (s, 3 H, CH3 OAc) , 1.96 (s, 6 H, CH3 OAc) , 1.95 (s, 12 H, CH3 OAc) , 1.59-1.48 (m, 2 H, H-b) , 1.47 (q, Jc,d = Jc,d = Je,d = 7.5 Hz, 2 H, H-d) , 1.34-1.22 (m, 2 H, H-c) . 
13C NMR (100.6 MHz, CDCl3) δ = 170.6, 170.0, 169.7, 169.5 (C=O) , 137.9, 137.8, 137.6, 137.5, 137.4, 137.3 (C第４級芳香族) , 129.6, 129.0, 128.7, 128.6, 128.5, 128.4, 128.3, 128.2, 128.1, 128.0, 127.8, 127.6 (C芳香族) , 113.4 (Cm PMBn) , 102.1 (C-1A) , 98.0 (C-1L) , 97.8 (C-1B, C-1D, C-1F, C-1H, C-1J および C-1C 又は E または G または I または K, C-1E または G または I または K または C 、C-1C または I または K または C または E ,およびC-1 I または K または C または Eまたは C), 97.1(C-1K または C または E または G または I, 80.9 (C-3A) , 77.9, 77.8 (C-3C, C-3E, C-3G, C-3I および C- 3K) , 75.7, 75.6, 75.5, 75.3, 75.2 (C-3B, C-4B, C-4A, C-4C, C-4E, C-4G, C-41, C-3D, C-3F, C-3H, C-3J および C-4K) , 74.9, 74.8 ( 6x CH2Ph) , 74.1 (3x CH2Ph) , 74.0 (CH2Ph) , 73.7 (CH2Ph) , 73.4 (C-3L) , 73.1 (C-4D, C-4F, C-4H, C-4J および C-5A) , 72.7 (C-4L) , 72.6 (CH2 pMBn) , 71.3 (C-5J) , 71.2 (C-2B) , 70.6, 70.5, 70.4, 70.3, 70.1 (C- 5B, C-5D, C-5F, C-5H, C-2D, C-2F, C-2H および C-2J) , 70.0 (CH2-a) , 69.7 (C-5C, C-5E, C-5G, C-5I および C-5K) , 69.1 (C-5L) , 68.7 (C-2L) , 68.4 (CH2Ph Cbz) , 66.2 (C-2A) , 62.9, 62.8, 62.7 (C-2C, C-2E , C- 2G, C-2I および C-2K) , 62.2 (C-6A) , 61.6 (C-6C, C-6E, C-6G, C-6I および C-6K) , 55.3 (CH3, OMe pMBn) , 52.0 (4x CH3, COOMe) , 51.8 (2x CH3, COOMe) , 44.0 (CH2-e) , 29.0 (CH2-b) , 28.3 (CH2-d) , 26.9 (CH3, NAc) , 23.1 (CH2-C) , 20.9, 20.8, 20.7 (12x CH3, OAc) ;
Ｃ２０９Ｈ２３９Ｎ１９Ｏ７７Ｎａに関するＥＳＩ  ＨＲ−ＭＳ  ｍ／ｚ計算値［Ｍ＋Ｎａ］＋：４２６９．５２６２、実測値：４２６９．５２８０。
【０１５８】
化合物１７：５−アミノペンチル［（３−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−（４−メトキシベンジル）−２−Ｏ−スルホナト−α−Ｌ−ヨードピラノシルウロネート）−（１→４）−Ｏ−（３−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−２−スルホアミノ−６−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシド）−（１→４）−Ｏ−（３−Ｏ−ベンジル−２−Ｏ−スルホナト−α−Ｌ−ヨードピラノシルウロネート）］−（１→４）−Ｏ−３−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−２−スルホアミノ−６−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシド七ナトリウム塩（ＨＳ４Ｂｚ）
【化５１】
0005775307.tif 000056
四糖５（２９ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ／０．４ｍＬ）の混合物中、Ｋ２ＣＯ３（１．５ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ、０．６２５当量）とともに０℃で２時間攪拌した後、室温まで昇温した。この混合物をＢｉｏＲａｄ  ＡＧ  ５０Ｗ−Ｘ８  ２００（Ｈ＋）樹脂で中和し、濾過し、濃縮した。シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（トルエン／ＡｃＯＥｔ  ７０：３０から２０：８０）により脱アセチル化化合物１１ａ（１８ｍｇ、７１％）を３ｍｇの化合物１１ｂ（１３％、Ｃ７５Ｈ８９Ｎ７Ｏ２４Ｎａに関するＥＳＩ  ＨＲ−ＭＳ  ｍ／ｚ計算値［Ｍ＋Ｎａ］＋：１４９４．５８５６７、実測値：１４９４．５８４７４）とともに得た。
次に、化合物１１ａ（１８ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（３２４μＬ）に溶解させ、プロパン−１，３−ジチオール（２４μＬ、０．２４ｍｍｏｌ、２０当量）およびトリエチルアミン（３３μＬ、０．２４ｍｍｏｌ、２０当量）とともに１５時間攪拌した。得られた混合物をＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０クロマトグラフィー（０．１％のＮＥｔ３を含むＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、１：１）により２回精製し、１３ｍｇの１３（７５％、Ｃ７５Ｈ９３Ｎ３Ｏ２４Ｎａに関するＥＳＩ  ＨＲ−ＭＳ  ｍ／ｚ計算値［Ｍ＋Ｎａ］＋：１４４２．６０４６７、実測値：１４４２．６０２４８）を得た。
ピリジン（３２０μＬ）中、１３（１１ｍｇ、７．７５μｍｏｌ）の溶液に、三酸化硫黄ピリジン複合体（７４ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ、６０当量）を加えた。この混合物を光から保護し、室温で２４時間攪拌した後、５５℃で２０時間加熱した。次に、ＭｅＯＨ（１４０μＬ、０．１２４ｍｍｏｌ）およびＮＥｔ３（６３μＬ、０．０１４ｍｍｏｌ）を加えてこの反応物を急冷した。得られた混合物を室温で１時間攪拌し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０クロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、１：１）およびＲＰ−１８半分取ＨＰＬＣ（ＡｃＯＨＮＥｔ３  １００ｍＭ、ｐＨ７．０／ＣＨ３ＣＮ  ７０／３０から５８／４２）により順次精製し、次いで、凍結乾燥によりＡｃＯＨＮＥｔ３塩を除去した後（２×１ｍＬ  Ｈ２Ｏ）、ＢｉｏＲａｄ  ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８  ２００（Ｎａ＋、１ｍＬ）でイオン交換を行った。このようにして、六ナトリウム塩として化合物１５（８ｍｇ、５１％、Ｃ７５Ｈ８７Ｎ３Ｏ４２Ｓ６Ｎａ６のＥＳＩ  ＭＳ：ｍ／ｚ（％）６５４．１（１００）［Ｍ−３Ｎａ］３−／３、９９２．８（５０）［Ｍ−２Ｎａ］２ー／２）を得た。
四糖１５（６ｍｇ、２．９μｍｏｌ）をＬｉＯＨ（７ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ、５２当量）、水（４０μＬ）およびＨ２Ｏ２（水中３５％、４３μＬ、０．４９ｍｍｏｌ）の混合物に溶解させた。３７℃で２４時間後、ＡｃＯＨ（６Ｍ、３６μＬ、０．２２ｍｍｏｌ）を加え、この混合物をＲＰ−１８半分取ＨＰＬＣ（ＡｃＯＨＮＥｔ３  １００ｍＭ、ｐＨ７．０／ＣＨ３ＣＮ  ７５／２５から６０／４０）のより精製し、次いで、凍結乾燥によりＡｃＯＨＮＥｔ３塩を除去した後（２×１ｍＬ  Ｈ２Ｏ）、ＢｉｏＲａｄ  ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８  ２００（Ｎａ＋、１ｍＬ）でイオン交換を行った。このようにして、化合物１７（３ｍｇ、５０％）を八ナトリウム塩として得た。
1H NMR (400 MHz, D2O) δ = 7.60-7.24 (m, 22 H, Ph) , 6.93 (d, J = 8.5 Hz, 2 H, Ph-OMe), 5.37 (br. s, 1H, H-1B) , 5.29 (br. s, 1 H, H-1D) , 5.20 (d, J1, 2 = 3.0 Hz, 1 H, H-1C) , 4.77 (d, J = 12.0 Hz, 2 H, CH2Ph) , 4.75 (d, J1,2 = 6.5 Hz, 1 H, H-1A) , 4.68 (br. s, 1 H, H-5D) , 4.64 (d, J = 12.0 Hz, 2 H, CH2Ph) , 4.63 (d, J4,5 = 2.0 Hz, 1 H, H-5B) , 4.61 (d, J = 12.0 Hz, 2 H, CH2Ph) , 4.49 (d, J = 12.0 Hz, 2 H, CH2Ph) , 4.44 (d, J = 11.0 Hz, 1 H, CH2PhOMe) , 4.43 (br. s, 1 H, H-2D) , 4.41 (br. s, 1 H H-2B) , 4.40 (d, J = 11.0 Hz, 1 H, CH2PhOMe) , 4.36-4.24 (m, 4 H, H-6aA, H-6bA, H-6aC および H-6bC) , 4.19 (br. s, 1 H, H-3B) , 4.26 (br. s, 1 H, H-4B) , 4.22-4.13 (m, 1 H, H-5<C>) , 4.05 (t, J4, 5 = J4, 3 = 6.5 Hz, 1 H, H-4<A>) , 4.00 (m, 1 H, H-5A) , 3.97-3.75 (m, 9 H, δ＝３．８２においてｓを含む, H-3D, H-a, H- 4C, H-4D, H-3A, PhOMe および H-3C) , 3.79 (t, J3,2 = J3,4 = 9.0 Hz, 1 H, H-3C) , 3.64 (m, 1 H, H-a' ) , 3.41 (dd, J2,3 = 10.0, J2,1 = 3.0 Hz, 1 H, H-2C) , 3.34 (t, J2,1 = J2,3 = 6.5 Hz, 1 H, H-2A) , 2.95 (br. t, Jd,e = 7.0 Hz, 2 H, H-e) , 1.67 (q, Ja,b = Jb,c = 7.0 Hz, 2 H,H-b) , 1.65 (q, Jc,d = Je,d = 7.0 Hz, 2 H, H-d) , 1.47 (m, 2 H, H-C) ; 
13C NMR  1H-13C HSQC (100.6 MHz, D2O) δ = 101.7 (C-1A) , 98.5 (C-1C) , 97.8 (C-1B) , 97.6 (C-1D) , 79.4 (C-3A) , 77.5 (C-3C) , 75.5 (C-3B) , 75.2 (C-4B) , 74.2 (C-5A) , 73.9 (C-4C) , 73.7 (C-4D) , 73.6 (C-2B) , 73.5 (2ｘ CH2Ph) , 73.0 (C-4A) , 72.4 (C-2D) , 72.1 (CH2 pMBn, 2ｘ CH2Ph) , 71.4 (C-3D) , 70.2 (CH2-a) , 69.8 (C-5C) , 69.2 (C-5B) , 69.1 (C-5D) , 68.5 (C-6A) , 67.3 (C-6C) , 58.8 (C-2C) , 58.6 (C-2A) , 
Ｃ６５Ｈ７５Ｎ３Ｏ４０Ｓ６Ｎａ８のＬＣ−ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（１９１３，１４３２）：  ｍ／ｚ計算値［Ｍ＋Ｎａ］＋：１８３７．４１（１００）［Ｍ−８Ｎａ＋７Ｈ＋ＮＥｔ］−、１７３６．２９（９１）［Ｍ−８Ｎａ＋７Ｈ］−、１６５６．３３（８６）［Ｍ−８Ｎａ＋７Ｈ−ＳＯ３］２−、１５７６．３６（４９）［Ｍ−８Ｎａ＋７Ｈ−２ＳＯ３］３−
【０１５９】
化合物１８：５−アミノペンチル［（３−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−（４−メトキシベンジル）−２−Ｏ−スルホナト−α−Ｌ−ヨードピラノシルウロネート）−（１→４）−Ｏ−（３−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−２−スルホアミノ−６−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシド）−（１→４）−Ｏ−（３−Ｏ−ベンジル−２−Ｏ−スルホナト−α−Ｌ−ヨードピラノシルウロネート）−（３−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−２−スルホアミノ−６−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシド）−（１→４）−Ｏ−（３−Ｏ−ベンジル−２−Ｏ−スルホナト−α−Ｌ−ヨードピラノシルウロネート）−（３−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−２−スルホアミノ−６−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシド）−（１→４）−Ｏ−（３−Ｏ−ベンジル−２−Ｏ−スルホナト−α−Ｌ−ヨードピラノシルウロネート）−（３−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−２−スルホアミノ−６−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシド）−（１→４）−Ｏ−（３−Ｏ−ベンジル−２−Ｏ−スルホナト−α−Ｌ−ヨードピラノシルウロネート）−（３−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−２−スルホアミノ−６−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシド）−（１→４）−Ｏ−（３−Ｏ−ベンジル−２−Ｏ−スルホナト−α−Ｌ−ヨードピラノシルウロネート）］−（１→４）−Ｏ−３−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−２−スルホアミノ−６−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシド２４ナトリウム塩（ＨＳ１２Ｂｚ）
【化５２】
0005775307.tif 000057
十二糖(dodecasasaccharide)１１（９０ｍｇ、２１ｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２（６ｍＬ／３ｍＬ）の混合物中、Ｋ２ＣＯ３（４．６ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）とともに０℃で２時間攪拌した後、室温まで昇温した。この混合物をＢｉｏＲａｄ  ＡＧ  ５０Ｗ−Ｘ８  ２００（Ｈ＋）樹脂で中和し、濾過し、濃縮した。シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（トルエン／ＡｃＯＥｔ  ７０：３０から２０：８０）により、脱アセチル化化合物１２ａ（６３ｍｇ、８０％）を１３ｍｇの化合物１２ｂ（１７％）とともに得た。
次に、十二糖１２ａ（６３ｍｇ、１７μｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（８６０μＬ）中、プロパン−１，３−ジチオール（２１０μＬ、２．１ｍｍｏｌ、１２３当量）およびトリエチルアミン（２９０μＬ、２．１ｍｍｏｌ、１２３当量）で処理した。この混合物を室温で４２時間攪拌し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０クロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ  ０．１％ＮＥｔ３  ５０：５０）により精製し、十二糖１４（５２ｍｇ、８６％）を得た。
ピリジン（１．８ｍＬ）中、１４（５２ｍｇ、１４μｍｏｌ）の溶液に、三酸化硫黄ピリジン複合体（２０８ｍｇ、１．３１ｍｍｏｌ、８９当量）を加えた。この混合物を光から保護し、室温で１６時間、次いで５５℃で２０時間攪拌した。次に、ＭｅＯＨ（８００μＬ、２０ｍｍｏｌ）およびＮＥｔ３（３６０μＬ、２．６ｍｍｏｌ）を加えてこの反応物を急冷した。得られた混合物を室温で１時間攪拌した後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０クロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、１：１）により精製した。十二糖含有画分をプールし、濃縮した。ＨＰＬＣ分析は少量の脱−Ｎ−硫酸化化合物が生じたことを示したので、２ｍｌの水中で三酸化硫黄ピリジン複合体（２３ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）および塩基としてＫ２ＣＯ３（４１ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を用いて再−Ｎ−硫酸化を行った。次に、この混合物をそのまま、ＲＰ−１８フラッシュクロマトグラフィー（ＡｃＯＨＮＥｔ３  １００ｍＭ、ｐＨ７．０／ＣＨ３ＣＮ  １００：０から６０：４０）およびＲＰ−Ｃ１８半ｐｒｅｐ  ＨＰＬＣ（ＡｃＯＨＮＥｔ３  １００ｍＭ、ｐＨ７．０／ＣＨ３ＣＮ）を用いて精製し、次いで、凍結乾燥によりＡｃＯＨＮＥｔ３塩を除去した後（３×２ｍＬ  Ｈ２Ｏ）、ＢｉｏＲａｄ  ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８  ２００（Ｎａ＋、３ｍＬ）でイオン交換を行った。このようにして、化合物１６（４１ｍｇ、５２％、Ｃ１８３Ｈ２０７Ｎ７Ｏ１１８Ｓ１８Ｎａ１８のＬＣ−ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（正確な質量＝５３７９，３５４３）：ｍ／ｚ（％）：１８３０．０９（１３）［Ｍ−１８Ｎａ＋１５Ｈ＋５ＮＥｔ３］３ー／３、１７６８．７３（４０）［Ｍ−１８Ｎａ＋１５Ｈ＋４ＮＥｔ３−ＳＯ３］３ー／３、１７０８．３７（７３）［Ｍ−１８Ｎａ＋１５Ｈ＋３ＮＥｔ３−２ＳＯ３］３ー／３、１６８１．７１（９３）［Ｍ−１８Ｎａ＋１５Ｈ＋３ＮＥｔ３−３ＳＯ３］３ー／３、１６２１．３５（１００）［Ｍ−１８Ｎａ＋１５Ｈ＋２ＮＥｔ３−４ＳＯ３］３−／３）を１８ナトリウム塩として得た。
十二糖１６（２４ｍｇ、４．４μｍｏｌ）をＫＯＨ水溶液（６Ｍ、４８０μＬ、３ｍｍｏｌ）、水（１９２μＬ）およびＨ２Ｏ２（水中３５％、７６８μＬ、９ｍｍｏｌ）中、３７℃で２４時間攪拌した。その後、メチルエステルの完全な鹸化が見られたが、Ｃｂｚ基は部分的に加水分解されているに過ぎなかった。従って、ＫＯＨ水溶液（６Ｍ、４８０μＬ、３ｍｍｏｌ）およびＨ２Ｏ２（水中３５％、７６８μＬ、９ｍｍｏｌ）を加え、この反応物を３７℃でさらに２４時間攪拌し、その後、Ｃｂｚ基の加水分解が完了していた。ＡｃＯＨ水溶液（６Ｍ、７２０μＬ、４ｍｍｏｌ）を加え、この混合物をＲＰ−Ｃ１８半分取ＨＰＬＣ（ＡｃＯＨＮＥｔ３  １００ｍＭ、ｐＨ７．０／ＣＨ３ＣＮ）を用いて精製し、次いで、凍結乾燥によりＡｃＯＨＮＥｔ３塩を除去した後（３×２ｍＬ  Ｈ２Ｏ）、ＢｉｏＲａｄ  ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８  ２００（Ｎａ＋、１ｍＬ）でイオン交換を行った。このようにして化合物１８（１２ｍｇ、５１％）を２４ナトリウム塩として得た。
1H NMR (400 MHz, D2O, 50℃, ref CH3CN) これらのシグナルの一部だけが特定されたδ= 7.55-7.25 (m, 62 H, Ph), 7.93 (d, J = 8.0 Hz, 2 H, Ph-OMe), 6.94 (d, J = 8.5 Hz, 2 H, Ph-OMe), 5.60- 5.32 (m of br. s, 6H, H-1<B>, H-1<D>, H-1<F>, H-1<H>, H-1<J> and H-1<L>) , 5.32-5.18 (br. s, 5 H, H-C, H-1E, H-1G, H-IIおよび H-1Kのm) , 4.90-4.81 (m, CH2Ph), 4.81-4.71 (m, δ＝４．７７においてｓを含む(J = 6.0 Hz, H-1A) CH2Ph および H-5B または D または F または H または J または L) , 4.71-4.65 (m, CH2Ph および 5xH-5B または D または F または H または J または L) , 4.46-4.36 (m, 6 H, H-2B, H-2D, H-2F, H-2H, H-2J および H-2L) , 4.35-4.27 (m, 6 H, 6 x H-6) , 4.27- 4.16 (m, 12 H, H-3B, H-3D, H-3F, H-3H, H-3J, H-3L, H-4B, H-4D, H- 4F, H-4H, H-4J および H-4L) , 3.87 (dt, Jgem = 10.0 Hz, J = 6.0 Hz, Ha) , 3.82 (s, 3 H, PhOMe) , 3.61 (dt, Jgem = 10.0 Hz, J = 6.0 Hz, Ha') , 3.48-3.33 (m, 6 H, H-2A, H-2C>, H-2E, H-2G, H-2I, H-2K) , 3.94 (t, J = 7.5 Hz, 2 H, H-e) , 1.73-1.57 (m, 4 H, H-d および H-b) , 1.46 (q, J = 7.5 Hz, 2 H, H-c) .
13C NMR 1H-13C HSQC (100.6 MHz, D2O, 50℃, ref CH3CN) δ = 114.8 (Cm PMBn) , 101.6 (C-1A) , 99.2-98.1 (C-1B, C-1C, C-1D, C-1E, C-1F, C-1G, C-1H, C-1I, C-1J, C-1K, C-1L) , 73.9 (C-2イズロン部分) , 69.9 (C-a) , 68.7 (C-6) , 58.7 (C-2C, C-2E, C-2G, C-2I, C-2K) , 55.2 (CH3 OMe pMBn), 40.2 (C-e) , 28.5 (C-b) , 26.9 (C-d) , 23.0 (C-c) .
Ｃ１６９Ｈ１８３Ｎ７Ｏ１１６Ｓ１８Ｎａ２４のＥＳＩ  ＭＳ（正確な質量＝５２９３，１１５３）：  ｍ／ｚ  １７５６．０３（１４）［Ｍ−２４Ｎａ＋２１Ｈ＋５ＮＥｔ３］３−／３ 、１７２２．３２（３３）［Ｍ−２４Ｎａ＋２１Ｈ＋４ＮＥｔ３］３−／３、１７２２．３２（３３）［Ｍ−２４Ｎａ＋２１Ｈ＋４ＮＥｔ３］２３−／３、１６９５．６７（５１）［Ｍ−２４Ｎａ＋２１Ｈ＋３ＮＥｔ３−ＳＯ３］３−／３、１６３５．３（１００）［Ｍ−２４Ｎａ＋２１Ｈ＋３ＮＥｔ３−２ＳＯ３］３−／３
【０１６０】
化合物１９：５−アミノペンチル［（２−Ｏ−スルホナト−α−Ｌ−ヨードピラノシルウロネート）−（１→４）−Ｏ−（２−デオキシ−２−スルホアミノ−６−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシド）−（１→４）−Ｏ−（２−Ｏ−スルホナト−α−Ｌ−ヨードピラノシルウロネート）−（２−デオキシ−２−スルホアミノ−６−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシド）−（１→４）−Ｏ−（２−Ｏ−スルホナト−α−Ｌ−ヨードピラノシルウロネート）−（２−デオキシ−２−スルホアミノ−６−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシド）−（１→４）−Ｏ−（２−Ｏ−スルホナト−α−Ｌ−ヨードピラノシルウロネート）−（２−デオキシ−２−スルホアミノ−６−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシド）−（１→４）−Ｏ−（２−Ｏ−スルホナト−α−Ｌ−ヨードピラノシルウロネート）−（２−デオキシ−２−スルホアミノ−６−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシド）−（１→４）−Ｏ−（２−Ｏ−スルホナト−α−Ｌ−ヨードピラノシルウロネート）］−（１→４）−Ｏ−２−デオキシ−２−スルホアミノ−６−Ｏ−スルホナト−α−Ｄ−グルコピラノシド２４ナトリウム塩（ＨＳ１２Ｌｂ）
【化５３】
0005775307.tif 000058
リン酸バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ７．０、４００μＬ）およびｔｅｒｔ−ブタノール（２００μＬ）中、十二糖１８（５．５ｍｇ、９．４ｍｏｌ）の溶液に、Ｐｄ（ＯＨ）２（木炭上２０％、３０ｍｇ）を加えた。この混合物を脱気し、二水素（１気圧）下で２４時間攪拌した。室温で２４時間後、Ｐｄ（ＯＨ）２（木炭上２０％、２０ｍｇ）を追加し、この混合物を脱気し、水素（１気圧）下でさらに２４時間攪拌した。この懸濁液をウルトラフリー−ＭＣフィルター(Amicon)上で濾過し、触媒をリン酸バッファー（３３ｍＭ、ｐＨ７．０）／ｔｅｒｔ−ブタノール（３／１、４００μＬ）で２回、次いでＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（１／１、４００μＬ）で２回洗浄して木炭から化合物１９を脱着させた。凍結乾燥後、得られた溶液をＰＤ−１０カラム(Pharmacia)で脱塩し、凍結乾燥し、４ｍｇの１９（９８％）を得た。
1H NMR (400 MHz, D2O, 50℃ ref CH3CN) δ = 5.37 (br. s, 5 H, H- 1C, H-1E, H-1G, H-1I, H-1K) , 5.20 (br. s, 5 H, H-1B, H-1D, H-1F, H- 1H, H-1J) , 5.17 (br. s, 1 H, H-1L) , 4.80, 4.78 および4.72 (3 x br. s, H-5イズロン部分) , 4.55 (d, J1,2 = 8.0 Hz, H-1A) , 4.34-4.30 (m, H-2イズロン部分) , 4.30-4.28 (m, H-2イズロン部分) , 4.28-4.22 (m) , 4.22-4.14 (m, H-6b) , 4.14-3.94 (m, 11 H, H-4イズロン部分 ), R-5グルコサミン部分H-6b) , 3.90-3.82 (m, 1 H, H-a) , 3.80-3.59 (m, 13H, H-4グルコサミン部分, H-3グルコサミン部分, H-a’), 3.27(dd, J2,3 = 10.0 Hz, J2,1 = 3.0 Hz, 5 H, H-1C, H-1E, H-1G, H-1I, H-1K) , 3.05 (t, J2,1 = J2,3 = 8.0 Hz, H-2A) , 3.05 (t, J = 7.5 Hz, H-e) , 1.76- 1.56 (m, 4 H, H-d および H-b) , 1.53-1.43 (m, 2 H, H-c) . 
13C NMR 1H-13C HSQC (100.6 MHz, D2O, 50℃, ref CH3CN) δ = 114.8 (Cm PMBn) , 101.7 (C-1A) , 100.3-98.0 (C-1B, C-1D, C-1F, C-1H, C-1J, C-1L) , 98.0-95.5 (C-1C, C-1E, C-1G, C-1I, C-1K) , 77.5-75.4 (C-4グルコサミン部分), 77.5-75.0(C-3イズロン部分およびC-4イズロン部分), 73.0(C-3A), 70.9-68.5(C-2イズロン部分, C-5イズロン部分, C-5グルコサミン部分, C-3グルコサミン部分), 69.9(C-a), 67.8-65.3(C-6グルコサミン部分), 60.2(C-2A), 58.1(C-2C, C-2E, C-2G, C-2I, C-2K), 39.7 (C-e) , 28.1 (C-b) , 26.2 (C-d) .
Ｃ７７Ｈ１２７Ｎ７Ｏ１１５Ｓ１８に関するＥＳＩ  ＭＳ  ｍ／ｚ計算値［Ｍ−Ｈ］−：３５６３．９２０４、実測値：３５６３．７５６８；３４８３．９２８７（−１ＳＯ３）；３４０３．９８９７（−２ＳＯ３）；３３２４．０２９１（−３ＳＯ３）。
【０１６１】
Ｖ．３．本発明の複合分子の化学合成
ＨＰＬＣおよびＬＣＭＳ条件：
カップリング反応のモニタリングおよび純度の測定は、Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  ３．５μｍ  Ｃ１８  ３００Å（２．１×１００ｍｍ）カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣにて、流速１ｍｌ／分で２０分間にわたって１０ｍＭ酢酸アンモニウムバッファー水溶液中、ＣＨ３ＣＮの直線勾配を用いて行った。検出：２１５／２３０ｎｍ。
ＬＣＭＳ分析は、Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣと組み合わせたＷａｔｅｒｓ  Ｑ−ＴＯＦｍｉｃｒｏ質量分析計にて、同じカラムおよび溶媒を用いて行った。リン酸イオンの注入を避けるため、ＬＣＭＳ装置は、精製工程後に生成物の属性を評価するためだけに用いた。データはネガティブモード（ＥＳ−）を用いて取得した。硫酸の損失を最小にするために、コーン電圧を低い値（１０〜２０Ｖ）に設定した（ＳＯ３、８０質量単位）。オリゴ糖は、それらのｍＣＤ４複合体よりもＭＳ硫酸損失を受けやすかった。
化合物の定量
最初のオリゴ糖および最終のｍＣＤ４複合体の量をＨｉｔａｃｈｉＬ８８００にてアミノ酸分析（ＡＡＡ）により定量した。オリゴ糖の場合、ペプチド／タンパク質加水分解に用いる標準的な２０時間、１１０℃、６Ｎ  ＨＣｌ、２％フェノールの条件の代わりに、１６時間、９５℃、６Ｎ  ＨＣｌ、２％フェノール加水分解を用いた。加水分解の際に生じたグルコサミンはＰｈｅの後に溶出した。
【０１６２】
ＳＡＴＰ  Ｂｚｌ−四糖−ＳＡＴＰ  ２０を介したオリゴ糖へのチオール基の導入
６６０μｌの５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ８中、０．５ｍｇのＢｚｌ−四糖１７（ＭＷ：１９１４、８Ｎａ＋；０．２５μモル）に、１５分かけて４×６μｌのＳＡＴＰ／ＤＭＳＯ溶液（４０ｍｇ／ｍｌ；ＭＷ：２４５；４×０．５μモル）を加えた。２０分後、ＨＰＬＣで追跡すると定量的カップリングが見られた。Ｂｚｌ−四糖１７  Ｒｔ＝６．６分；Ｓ−アセチルチオプロピオネートＢｚｌ−四糖２０  Ｒｔ＝８．８（１２から３２％への勾配）。この混合物をＣ１８  Ｓｅｐａｋカートリッジにロードし、Ｓ−アセチルチオプロピオネートＢｚｌ−四糖２０を６ｍｌの２０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏにより溶出させた。凍結乾燥後、ＬＣＭＳ分析により生成物を制御した。Ｃ７０Ｈ８９Ｎ３Ｏ４２Ｓ７のモノアイソトピック質量計算値［Ｍ−Ｈ］−：１８６６．２８９２；実測値：１８６６．４６９２；１７８６．５１３１（−１ＳＯ３）；１７０６．５３００（−２ＳＯ３）。
【０１６３】
Ｂｚｌ−十二糖−ＳＡＴＰ  ２１
５３０μｌの５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ８中、１．５ｍｇのＢｚｌ−十二糖１８（ＭＷ：５２９３、２４Ｎａ＋；０．２９μモル）に、１５分かけて４×６μｌのＳＡＴＰ／ＤＭＳＯ溶液を加えた。２０分後、ＨＰＬＣで追跡すると定量的カップリングが見られた。Ｂｚｌ−十二糖１８  Ｒｔ＝１０．７分；Ｓ−アセチルチオプロピオネートＢｚｌ−十二糖２１  Ｒｔ＝１２．５（５から２５％への勾配）。生成物を、水溶出を用いたＰＤ１０ゲル濾過カラムにて精製した。Ｓ−アセチルチオプロピオネートＢｚｌ−十二糖２１（ＭＳ注入により確認）を含有する最初の溶出画分をプールし、凍結乾燥した。生成物をＬＣＭＳ分析により制御した。Ｃ１７４Ｈ２１３Ｎ７Ｏ１１８Ｓ１９のモノアイソトピック質量計算値［Ｍ−Ｈ］−：４８９４．５５０１；実測値：４８９４．６８３６；４８１５．６０８４（−１ＳＯ３）；４７３４．５６２５（−２ＳＯ３）；４６５４．６６６０（−３ＳＯ３）；４５７５．６２２６（−４ＳＯ３）。
【０１６４】
十二糖類−ＳＡＴＰ  ２２
６００μｌの１５ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ８中、０．５ｍｇの十二糖１９（ＭＷ：４０９２、２４Ｎａ＋；０．１２μモル）に、１５分かけて４×６μｌのＳＡＴＰ／ＤＭＳＯ溶液を加えた。２１５／２３０ＵＶ吸収が極めて低く、１９がＣ１８カラムに保持されないため、このカップリング反応はＨＰＬＣによりモニタリングされなかった。２０分後、この混合物をそのままＰＤ１０カラムにロードした。上記と同じ精製プロトコールを行った。生成物はＬＣＭＳ分析により制御した。完全な硫酸化（Ｃ８２Ｈ１３３Ｎ７Ｏ１７７Ｓ１９）は検出されなかった。−１ＳＯ３、−２ＳＯ３、−３ＳＯ３および−４ＳＯ３および−５ＳＯ３形態が検出された。Ｃ８２Ｈ１３３Ｎ７Ｏ１１４Ｓ１８のモノアイソトピック質量計算値［Ｍ−Ｈ−１ＳＯ３］ー：３６１３．９７２４。実測値：３６１３．９５３６；３５３３．９１７０（−２ＳＯ３）；３４５４．０１９０（−３ＳＯ３）；３３７４．０４７４（−４ＳＯ３）；３２９４．１５２８（−５ＳＯ３）。
【０１６５】
ｍＣＤ４−ＰＥＯ２−マレイミドとのカップリング
ｍＣＤ４−ＰＥＯ２−Ｂｚｌ−四糖２３（またはｍＣＤ４−ＨＳ４Ｂｚ）
ヒドロキシルアミンによる四糖−ＳＡＴＰ  ２０チオールの脱保護およびｍＣＤ４−ＰＥＯ２−マレイミドへのカップリングを追跡するため、１０ｍＭ酢酸アンモニウム中ＣＨ３ＣＮ１２−２２％（１０分）−８２％（１０分）の直線勾配を用いた。
５００μｌの５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．２、１００μｌの０．５Ｍ  ＮＨ２ＯＨ中Ｂｚｌ−四糖ＳＡＴＰ  ２０に、１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー中ＨＣｌ（ｐＨを４Ｎ  ＮａＯＨにより７．２に調整）を加えた。チオール官能基の脱保護をＨＰＬＣによりモニタリングした。
１０分後、１１％のＢｚｌ−四糖ＳＡＴＰ  ２０だけが残り（Ｒｔ＝８．７分）、ＳＨ四糖に相当する新たな収穫(pick)が７．４分に現れた。
１０分後に５０μｌのＨ２Ｏ中ｍＣＤ４−ＰＥＯ２−Ｍａｌ（ＭＷ：３２０７；０．１μモル）を加えた後、５分後にもう一度同じ添加を行った。
２０分後、遊離チオール四糖が全部消失した。ｍＣＤ４−ＰＥＯ２−Ｂｚｌ−四糖２３に相当する新たな化合物が１６分に現れた。この複合体を半分取ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ  ５μｍＣ１８３００Ａ、１０×２５０ｍｍ）にて、同じ勾配を用い、流速６ｍｌ／分で精製した。精製された生成物はＬＣＭＳ分析により制御した。Ｃ２０４Ｈ２９９Ｎ４３Ｏ７９Ｓ１３の計算平均質量：５０３４．７１８５。実測値：５０３４．７００２。
ｍＣＤ４−ＰＥＯ２−Ｂｚｌ−四糖２３の最終純度（８７％）はＳｙｍｍｅｔｒｙカラムにて２０から５０への直線勾配を用いて評価した（Ｒｔ＝１１．０６分）。
収量：ＡＡＡにより２７６μｇと定量（１７からすると２４％）。
【０１６６】
ｍＣＤ４−ＰＥＯ２−Ｂｚｌ−十二糖２４（またはｍＣＤ４−ＨＳ１２Ｂｚ）
５００μｌの５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．２中、Ｂｚｌ−十二糖類−ＳＡＴＰ  ２１に、１００μｌの同じヒドロキシルアミン溶液を加えた。５から２５％（２０分）から８５％（１０分）の勾配を用いて脱保護およびカップリング反応を追跡した。２０分後、Ｂｚｌ−十二糖類−ＳＡＴＰ  ２１（Ｒｔ＝１２．７分）が消失し、遊離チオールＢｚｌ−十二糖（Ｒｔ＝１１．９）が生じていた。ｍＣＤ４−ＰＥＯ２−Ｂｚｌ−十二糖２４複合体を定量的に得るためには（Ｒｔ＝２４．８）、ｍＣＤ４−ＰＥＯ−Ｍａｌ溶液（３×０．１ｍｍ）を３回連続して加えることが必要であった。この複合体を、５から２５％（１０分）から８５％（２０分）の勾配を用い、半分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。精製された生成物はＬＣＭＳ分析により制御した。Ｃ３０８Ｈ４２３Ｎ４７Ｏ１５５Ｓ２５の計算平均質量：８０６５．６２０４。実測値：８０６５．１００６；７９８５．６０００（−１ＳＯ３）；７９０５．２００２（−２ＳＯ３）。
ｍＣＤ４−ＰＥＯ２−Ｂｚｌ−十二糖２４複合体の最終純度（６３％）はＳｙｍｍｅｔｒｙカラムにて２０から５０への直線勾配を用いて評価した（Ｒｔ＝９．３７分）。
収量：ＡＡＡにより６４３μｇと定量（１８からすると２８％）。
【０１６７】
ｍＣＤ４−ＰＥＯ２−十二糖２５（またはｍＣＤ４−ＨＳ１２ＬｂまたはｍＣＤ４−ＨＳ１２）
ＵＶ吸収が極めて低く、十二糖類−ＳＡＴＰ  ２２がＣ１８カラムに保持されないため、この脱保護工程はＨＰＬＣによりモニタリングできなかった。５００μｌの５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．２中の十二糖類−ＳＡＴＰ  ２２に、１５０μｌの同じヒドロキシルアミン溶液を加えた。２０分後、この反応混合物に対して陽性エルマン試験を行ったところ、チオールの脱保護を示した。ｍＣＤ４−ＰＥＯ２−Ｍａｌ溶液を加えた（３×０．１μモル）。このカップリング反応のアリコートを注入したところ（１０分）、２０から５０％への勾配で、ｍＣＤ４−ＰＥＯ２−Ｍａｌ（Ｒｔ＝１１．８）がいくらか残留するとともに、新たな生成物（Ｒｔ＝８．４）が示された。この複合体を半分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより、ｍＣＤ４−ＰＥＯ２−Ｂｚｌ−十二糖２４複合体の場合と同様の条件を用いて精製した。
精製された生成物はＬＣＭＳ分析により制御した。Ｃ２１６Ｈ３４３Ｎ４７Ｏ１５４Ｓ２５の計算平均質量：６８６３．９７３８。実測値：６８６３．１００１；６７６３．２０００（−１ＳＯ３）；６７０３．５００５（−２ＳＯ３）。
ｍＣＤ４−ＰＥＯ２−十二糖２５複合体の最終純度（１００％）はＳｙｍｍｅｔｒｙカラムにて２０から５０への直線勾配を用いて評価した（Ｒｔ＝８．３７分）。
収量：ＡＡＡにより３２１μｇと定量（１９からすると３９％）。
【０１６８】
実施例ＶＩ：生物活性
この節では、ｍＣＤ４をミニＣＤ４と呼ぶ。
ＶＩ．１．方法
Ｘ４型単離物（ｇｐ１２０  ＭＮ）およびＲ５型単離物（ｇｐ１２０  ＹＵ２）に起源する２つの異なるｇｐ１２０を用いた。種々の分子の、ｇｐ１２０と種々の受容体または共受容体との相互作用を阻害する能力を、表面プラズモン共鳴(Biacore)により測定する。これを行うため、記載されている手順に従い(Vives et al. J. Biol. Chem. 279., 54327-54333, 2005)、バイオセンサー（センサーチップＣＭ  ４  Biacore）の表面に３種類の化合物を固定する。これらはＣＤ４、ＨＳ（またはヘパリン）およびモノクローナル抗体（ｍＡｂ  １７ｂ）である。この抗体はＣＤ４により誘導されるエピトープを認識し、共受容体ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４を模倣する。これら３種類の表面は、ｇｐ１２０により認識される細胞表面の３つの主要な分子（ＣＤ４、共受容体およびＨＳ）に相当する。
下記の実験セットにおいて、ｇｐ１２０（図４〜６の細線）単独で、または供試化合物とともにプレインキュベーションして（図４〜６の太線）これらの表面に注入し、相互作用シグナルを５分間、時間の関数として測定する。細線と太線の間の差は、ｇｐ１２０とバイオセンサーに固定化されている分子との間の相互作用に対する供試化合物の阻害能を示す。
【０１６９】
ＶＩ．２．結果
○ｍＣＤ４、ＨＳ１２Ｌｂ（分子１９）およびｍＣＤ４−ＨＳ１２Ｌｂ（分子２５）分子の分析
・ＣＤ４表面へ（ｇｐ１２０および阻害剤１００ｎＭ）：
化合物ＨＳ１２Ｌｂ単独ではｇｐ１２０／ＣＤ４相互作用に対して効果が無く、これらの結果はここでは示さない。
【０１７０】
化合物ｍＣＤ４−ＨＳ１２ＬｂがｍＣＤ４よりも強くｇｐ１２０／ＣＤ４相互作用を阻害することを注記しておくが、これはｇｐ１２０  Ｘ４およびＲ５に関してである（図４参照）。
・ＨＳ表面へ（ｇｐ１２０および阻害剤４０ｎＭ）
【０１７１】
ｇｐ１２０  ＹＵ２はＨＳに極めて弱くしか結合しない（Ｒ５型ｇｐ１２０のセットの場合と同様）。従って、この表面で得られた結果は示さない。
【０１７２】
ｍＣＤ４はｇｐ１２０／ＨＳ相互作用に対して効果が無い。化合物ＨＳ１２Ｌｂは、用いた濃度条件では、相互作用を部分的に阻害する。互いに結合していないｍＣＤ４およびＨＬ１２Ｌｂの混合物（ｍＣＤ４＋ＨＳ１２Ｌｂ）も同じ活性を有する。他方、ｍＣＤ４−ＨＳ１２Ｌｂ複合体はこの相互作用を全面的に阻害し、複合体化に結びついた強力な協働効果を実証する（図５参照）。
【０１７３】
・ｍＡｂ  １７ｂ表面へ（ｇｐ１２０および阻害剤４０ｎＭ）：
ｇｐ１２０は、ｍＣＤ４の不在下では、抗体１７ｂと極めてわずかしか結合しない（ＹＵ２）か、または全く結合しない（ＭＮ）（図６の細線）。ｍＣＤ４の存在はこの反応を増強する（図６の上の図の太線）。他方、ｍＣＤ４−ＨＳ１２Ｌｂ化合物はその相互作用を全面的に阻害し（図６の下の図の太線）、これにより、図１に記載されている機構（ｍＣＤ４によるＣＤ４ｉエピトープの露出およびＨＳ１２Ｌｂ分子によるこの遮断）が確認される。
【０１７４】
ｍＣＤ４とＨＳ１２Ｌｂの間の共有結合の増強効果を実証するために以下の実験を行った。
【０１７５】
４０ｎＭのｇｐ１２０（ＭＮまたはＹＵ２）を、漸増濃度（０〜８０ｎＭ）の共有結合ｍＣＤ４−ＨＳ１２Ｌｂ（図７の白）または結合していないｍＣＤ４＋ＨＳ１２Ｌｂ（図７の黒）とともにプレインキュベーションした後、１７ｂ表面に注入する。注入の終了時に、抗体と結合したｇｐ１２０の量を測定する。ｇｐ１２０は、ＣＤ４ｉがマスクされていない場合、すなわち、ｍＣＤ４またはｓＣＤ４の存在下でのみ１７ｂと結合することを思い出さなければならない。
【０１７６】
共有結合分子（ｍＣＤ４−ＨＳ１２Ｌｂ）はｇｐ１２０−１７ｂの相互作用を強く阻害するが、この２つの分子の混合物（ｍＣＤ４＋ＨＳ１２１Ｂ）は逆の効果を有する。すなわち、ｍＣＤ４の効果が優勢（ＣＤ４ｉ部位をマスクせず、従って、ｇｐ１２０が１７ｂに結合する）、ＨＳ１２ＬｂＢによる阻害は、ＭＮ型のｇｐ１２０に関して高濃度でのみ現れ始める。ＹＵ２型のｇｐ１２０では、ＹＵ２単独ではＨＳと全く結合しないか、または極めてわずかしか結合しないという所見（図７参照）と一致して、ＨＳ１２Ｌｂは阻害剤ではない。
【０１７７】
○ｍＣＤ４と混合したペプチドＧＰＲ１、ＨＳ４Ｂｚ（１７）、ＨＳ１２Ｂｚ（１８）、ＨＳ１２Ｌｂ（１９）分子と、ｍＣＤ４−ＧＰＲ１、ｍＣＤ４−ＨＳ４Ｂｚ（２３）、ｍＣＤ４−ＨＳ１２Ｂｚ（２４）およびｍＣＤ４−ＨＳ１２Ｌｂ（２５）複合体の分析
上記のような、ｍＣＤ４と結合している、または結合していない分子の阻害能の比較を、ＨＳ１２Ｌｂ以外の分子に関して行った。これを次の分子について行った。
ｍＣＤ４と混合した
１．ペプチドＧＰＲ１（配列番号４）、
２．オリゴ糖ＨＳ４Ｂｚ（１７）、
３．オリゴ糖ＨＳ１２Ｌｂ（１８）、
４．オリゴ糖ＨＳ１２Ｂｚ（１９）、または
複合体
Ａ．ｍＣＤ４−ＧＰＲ１、
Ｂ．ｍＣＤ４−ＨＳ４Ｂｚ（２３）、
Ｃ．ｍＣＤ４−ＨＳ１２Ｂｚ（２４）、
Ｄ．ｍＣＤ４−ＨＳ１２Ｌｂ（２５）。
【０１７８】
ペプチドＧＰＲ１は、Ｇタンパク質共役型受容体ＧＰＲ１の細胞外Ｎ末端領域に由来する合成ペプチド(Jinno-Oue et al., J Biol chem. 2005 Sep 2;280(35):30924-34. Epub 2005 may 26)。本発明によるポリアニオン性多糖に比べ、それは有機分子として用いられる。ペプチドＧＰＲ１は配列番号３または配列番号４の配列を持ち得る。
【０１７９】
次の実験では、４０ｎＭのｇｐ１２０を８０ｎＭのｍＣＤ４と８０ｎＭの上記の種々の分子、または８０ｎＭの対応する共有結合複合体とともに同時インキュベーションした。１７ｂとの相互作用を測定する。Ｔは、ｇｐ１２０とｍＣＤ４単独の結合の測定値を表す。
【０１８０】
供試分子は、ｍＣＤ４と結合していない場合には様々な程度の阻害能を有し（図８の黒）、一方、ｍＣＤ４と共有結合している場合には（図８の白）、これらの分子は全て、この相互作用を極めて強く阻害することを注記しておく。
【０１８１】
ＶＩ．３．結論
上記の研究は、共受容体認識部位を認識することができる分子と共有結合されたｍＣＤ４からなるハイブリッド分子（またはｇｐ１２０と結合し、その共受容体認識部位を露出させることができる他の分子）の阻害活性を実証する。
このハイブリッド分子の役割は、ｇｐ１２０と結合し、そのＣＤ４ｉ部位を露出させ（ｍＣＤ４を介する）、共受容体との相互作用部位を遮断する（複合体を介する）ことである。
特に重要な点は、
・ｇｐ１２０とＣＤ４、共受容体およびＨＳとの間の相互作用を、ｎＭ濃度範囲で同時に阻害すること、
・２つの分子の複合化により極めて高い協働作用が誘導されること、および
・Ｘ４およびＲ５型単離物に対する阻害活性
である。
【０１８２】
実施例ＶＩＩ．生物活性−補足実験
ＶＩＩ．１．親和性
本研究には次の文献に記載されている方法を用いた。
Vives R. R. et al. Journal of Biological Chemistry 2005, 280, 21353-21357 (Materials and methods - Surface Plasmon resonance-based binding assays参照)、および
Crublet E. et al. Journal of Biological Chemistry 2008, 283, 15193-15200 (Materials and methods - Surface Plasmon resonance-based binding assays参照)
【０１８３】
表５  ＭＮおよびＹＵ２  ｇｐ１２０に対するｍＣＤ４−ＨＳ１２の結合および解離速度定数
【表５】
0005775307.tif 000059
＊１：１ラングミュア結合モデルには利用不可
【０１８４】
ＭＮおよびＹＵ２  ｇｐ１２０に対するｍＣＤ４−ＨＳ１２（２５）の結合（ｋｏｎ）および解離（ｋｏｆｆ）速度定数（２回の独立した分析の平均）は、Ｂｉａｅｖａｌ  ３．１ソフトウエアを用い、図９ａ、ｂの一次データを当てはめることにより求めた。単純な「１：１ラングミュア」結合モデルを用いたセンサーグラムの評価は、それぞれＭＮおよびＹＵ２  ｇｐ１２０に対して３．７および２．７ｎＭの親和性値（Ｋｄ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を返した。しかしながら、χ２パラメーター（当てはめの近接性を表す）により評価したところ、このモデルからのデータにはいくらかの偏差が見られた。ｍＣＤ４−ＨＳ１２の二価特性と一致して、この当てはめは「二価結合」モデル（この場合のχ２パラメーターは、従前のモデルの２．７および１．６ではなく０．８および０．４であった）を用いて改良された。従って、このモデルによれば、初期結合工程は示された結合（ｋｏｎ１）および解離（ｋｏｆｆ１）速度定数を特徴とし、ＭＮでは１０ｎＭ、ＹＵ２  ｇｐ１２０では７．２ｎＭの解離平衡定数を生じた。これらの親和性は第二の結合工程によってさらに増強されるはずである。しかしながら、二価結合モデルでは、第二の結合部位に対する結合速度定数がＲＵ−１Ｓ−１であり（その反応が複合体（ＲＵ）とリガンド（これもまたＲＵ）の結合を含む）、Ｍ−１Ｓー１ではないために、ここではこれを定量することができない。しかしながらやはり、これらのデータは、ｍＣＤ４−ＨＳ１２がＸ４およびＲ５  ｇｐ１２０の双方と低ｎＭ範囲の親和性で結合することを示し、二価結合機構を示唆する（図９ｃ〜ｄ参照）。
【０１８５】
ＶＩＩ．２．抗ウイルス活性
ＶＩＩ．２．１．ＨＩＶ−Ｉ−ＬＡＩおよびＢａＬ株を用いた末梢血単核細胞の感染と阻害アッセイ
Ｘ４向性ＨＩＶ−Ｉ−ＬＡＩ(Barre-Sinoussi, Science 220, 868-71, 1983)またはＲ５向性ＨＩＶ−１／Ｂａ−Ｌ(Gartner et al, Science 233, 215-9, 1986)株を増幅し、in vitroにてフィトヘマグルチニン−Ｐ（ＰＨＡ−Ｐ）活性化末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対して滴定した。組織培養感染用量を、Ｋａｒｂｅｒの式(Karber, Arch. Exp. Path. Pharmak. 162, 480-483, 1931)を用いて算出した。抗ウイルスアッセイとしては、ＰＨＡ−Ｐ活性化ＰＢＭＣを各薬剤６種類の濃度（１μＭ〜３２０ｐＭの間で１：５希釈）で３０分間前処理し、１００  ５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）のＸ４向性ＬＡＩまたはＲ５向性Ｂａ−Ｌ株のいずれかで感染させた。培養中、薬剤を維持し、細胞上清を感染後７日目に回収し、−２０℃で保存した。これらの実験で、アジドチミジン（ＡＺＴ）を内部対照として用いた。ウイルス複製はＲｅｔｒｏＳｙｓ  ＨＩＶ  ＲＴキット(Innovagen)を用い、細胞培養上清において逆転写酵素（ＲＴ）活性を定量することにより測定した。
【０１８６】
並行して、サンプルの細胞傷害性を、７日目に感染していないＰＨＡ−Ｐ活性化ＰＢＭＣでメチルテトラゾリウム塩（ＭＴＴ）アッセイにより評価した。実験は３回行い、５０、７０および９０％有効量ならびに細胞傷害量を、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏソフトウエアを用いて算出した。
【０１８７】
表６．ｍＣＤ４、ＨＳ１２およびｍＣＤ４−ＨＳ１２の抗ウイルス活性
【表６】
0005775307.tif 000060
【０１８８】
ＰＨＡ−Ｐ活性化ＰＢＭＣを検討下の各薬剤で処理し（１μＭ〜３２０ｐＭの間で１：５希釈）、１００  ＴＣＩＤ５０のＨＩＶ−Ｉ−ＬＡＩ（Ｘ４向性）または／Ｂａ−Ｌ（Ｒ５向性）株で感染させた。培養中、分子およびウイルスを維持し、細胞上清を感染後７日目に回収し、それから逆転写酵素活性を定量した。実験は３回行い、５０、７０および９０％有効量（ＥＤ）（ｎＭ）（±Ｓ．Ｄ．）を、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏソフトウエアを用いて算出した。これらの分子に１μＭまでの細胞傷害性を示したものはなかった。
【０１８９】
表７．ｍＣＤ４−ＧＰＲ１、ｍＣＤ４−ＨＳ４Ｂｚｌ、ｍＣＤ４−ＨＳ１２Ｂｚｌの抗ウイルス活性
【表７】
0005775307.tif 000061
【０１９０】
ＶＩＩ．２．２．ＶＳＶに対する陰性対照−ＨＩＶ偽型リポーターウイルスによる末梢血単核細胞の感染
ＶＳＶ−Ｇ偽型ウイルス粒子を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において１回の感染サイクルにより作出し、プラスミドｐＮＬ４−３  ｅｎｖ−  Ｌｕｃと水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）由来エンベロープＧタンパク質の発現を可能とするプラスミドで同時トランスフェクトした。ｐＮＬ４−３  ｅｎｖ−  Ｌｕｃプラスミドは感染性プロウイルスクローンＨＩＶ−Ｉ  ＮＬ４−３に由来し、ｅｎｖ遺伝子にそれを非感染性とするフレームシフトを有する。ホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）リポーター遺伝子がＮＬ４−３  ｎｅｆ遺伝子に取って代わっている。感染性ＨＩＶ−ＩプロウイルスクローンｐＮＬ４−３  Ｌｕｃ（J. Alcami博士から譲渡、Madrid Spain）は、対応するＨＩＶ  ｎｅｆをＬｕｃ遺伝子に置き換えることで作出されたものである。感染性ウイルス調製物は、これらの構築物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトすることにより作出した。ＰＢＭＣは健常な血液提供者から単離し、フィトヘマグルチニンおよびＩＬ−２を４８時間、吹き付けた(blasted)。ウイルス調製物をＨｅＬａＣＤ４＋  ＣＸＣＲ４＋  ＣＣＲ５＋細胞で滴定し、ＰＢＭＣ感染に用いるウイルス量を、細胞溶解液で測定されたＬｕｃ酵素活性に対してノーマライズした。感染２時間後（ｍＣＤ４−ＨＳ１２の存在下または不在下）、細胞を徹底的に洗浄し、さらに４８時間マイクロプレートウェルに播種し（２×１０５細胞／ウェル）、その後、ＰＢＭＣ溶解液にて、ＬＢ  ９４０  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｍｉｔｈｒａｓ照度計装置(Berthold Technologies, Germany)を用いてＬｕｃ酵素活性を測定した。
【０１９１】
表８．ＮＬ４−３  ＨＩＶ−１およびΔｅｎｖ＋ＶＳＶｇ−ＨＩＶ−１に対するｍＣＤ４−ＨＳ１２の抗ウイルス活性
【表８】
0005775307.tif 000062
ＰＢＭＣを１０６  ＲＬＵのＮＬ４−３ウミシイタケ(Renilla)またはΔｅｎｖ＋ＶＳＶｇ−ｌｕｃウイルスで感染させ、示された濃度のｍＣＤ４−ＨＳ１２で処理して２日後にルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ×１０−５）を測定した。
【０１９２】
ＶＩＩ．３．結論
このように本発明者らの研究は、小ヘパリンフラグメントまたはより一般にはポリアニオン性化合物に結合された３ｋＤａ  ＣＤ４ミメティックを含んでなる比較的小さな合成分子は、ｍＡｂを認識するＣＤ４および共受容体結合部位を含む、いくつかの大きなｇｐ１２０リガンドを効果的に模倣する。このＣＤ４ミメティックの、共受容体結合部位をＨＳ介在遮断に利用可能とする能力に基づけば、これらの分子は、ｇｐ１２０上の２つの重要かつ保存性の高い構造を同時に標的とし、結果として、強い抗ウイルス活性を示す。顕著には、本発明に記載されている複合体はＲ５向性ＨＩＶ−１およびＸ４向性ＨＩＶ−１の双方を中和し、これは、ＣＣＲ５特異的アンタゴニストの有効性は、阻害剤がまだ得られていないＣＸＣＲ４を利用するウイルス株の出現により危うくなり得るので重要な利点である。
【０１９３】
ミニＣＤ４配列内に存在する誘導体化の単一部位を有するミニＣＤ４のデザインは、ｍＣＤ４に基づく複合体の合成および生物活性に大きな改善をもたらす。
【０１９４】
略号：
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＨＡＴＵ：Ｎ［（ジメチルアミノ）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−１−イルメチレン］−Ｎ−メチルメタンアミニウムのヘキサフルオロホスフェートＮ−オキシド
ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
ＳＰＤＰ：Ｎ−スクシンイミジル−３（２−ピリジルジチオ）プロピオネート
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＥＤＴ：エタンジチオール
ＴＩＳ：トリイソプロピルシラン
ＤＴＴ：１，４−ジチオトレイトール
ＭＰＬＣ：中速液体クロマトグラフィー
ＥＳ＋ＭＳ：エレクトロスプレー質量分析、ポジティブモード
ＧＳＨ：還元型グルタチオン
ＧＳＳＧ：参加型グルタチオン
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＲＰ−ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィー
ＳＭＰＨ：スクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエートＳＡＴＰ：Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロプリオネート
ＲＴ：室温
Ｒｔ：保持時間
ＴＭＳＯＴｆ：トリメチルシリルトリフレート
ＴＢＤＭＳＯＴｆ：ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シリルトリフレート
Ｃｂｚ：ベンジルオキシカルボニル
ｐＭＢｎ：ｐ−メトキシベンジル
Ｂｎ：ベンジル
Ａｃ：アセチル
Ｍｅ：メチル
Ｅｔ：エチル
ｅｑ：当量
ＮＭＲ：核磁気共鳴
ＩＲ：赤外線
ＨＳＱＣ：ヘテロ核単一量子コヒーレンス
ＨＲＭＳ：高分解質量スペクトル
ＥＳＩ：エレクトロスプレーイオン化
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：マトリックス支援レーザー脱離／イオン化タイム・オブ・フライト
ＬＣ−ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ：液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレーイオン化タイム・オブ・フライト質量分析
ＬＣＭＳ：液体クロマトグラフィー／質量分析
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
【図１】
0005775307.tif 000075
【図２】
0005775307.tif 000076
【図３】
0005775307.tif 000077
【図４】
0005775307.tif 000078
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図９ｅ】
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【図９ｆ】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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