(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）感染に対してウシを保護するためのワクチンであって、ワクチンがペスチウイルスの変異体と薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とし、ペスチウイルスが、細胞変性系統のＢＶＤＶであり、Ｎｐｒｏタンパク質のＮ末端の１２個のアミノ酸を除き、Ｎｐｒｏ領域をコードする遺伝子配列の全てが欠損しており、ＢＶＤＶの全構造タンパク質が発現される、ワクチン。
【請求項２】
ペスチウイルスの変異体がＣＰ７  ＢＶＤＶ系統に基づく、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
野生型ＢＶＤＶ感染に対して家畜を保護するワクチンの製造における、ペスチウイルスの変異体の使用であって、ペスチウイルスは細胞変性系統のＢＶＤＶであり、Ｎｐｒｏタンパク質のＮ末端の１２個のアミノ酸を除き、Ｎｐｒｏ領域をコードする遺伝子配列の全てが欠損しており、ＢＶＤＶの全構造タンパク質が発現される、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペスチウイルスの全構造タンパク質を発現するペスチウイルス変異体、家畜（ｌｉｆｅ  ｓｔｏｃｋ）をペスチウイルス感染から保護するワクチンへのその使用、及び前記変異体を含むワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
動物は、ワクチン接種によってペスチウイルスから保護することができるが、従来の不活性化又は改変された生ワクチンは、安全性及び効力に関して欠点を有する。したがって、新しいタイプのワクチンを開発すべきである。
【０００３】
ペスチウイルスは、２種類の生物型、すなわち、それぞれ細胞変性（ｃｐ）と非細胞変性（ｎｃｐ）ウイルスに分類することができる。ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）は、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）ペスチウイルス属の１メンバーであり、世界中のウシの経済的に重要な疾患であるウシウイルス性下痢症の病原体である。遺伝的及び構造的に密接に関連したウイルス種は、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）及びヒツジボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）である。ペスチウイルスは、世界的な著しい経済的損失を伴う重度の疾患を誘発し得る。ＢＶＤＶ感染によって引き起こされる主要な経済的損失は、繁殖性の低下、流産、及び致命的な「粘膜病」を発症し得る持続感染した子ウシの発生である。ペスチウイルスゲノムは、陽性配向（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）の一本鎖ＲＮＡからなる。このＲＮＡは、長さが約１２．３ｋｂであり、両方のゲノム末端において非翻訳領域（ＮＴＲ）が側面にある１個の大きいオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。ペスチウイルスのＯＲＦは、１個のポリタンパク質に翻訳され、このポリタンパク質は、ウイルス及び細胞のプロテアーゼによって、翻訳時及び翻訳後に１２種類の成熟タンパク質に加工される。ｃｐ  ＢＶＤＶにおいては、ＮＳ３は、例えば、非構造タンパク質ＮＳ２及びＮＳ３をより効率的に切断することができる挿入物（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ）のために、より効率的に発現される。したがって、ｃｐ  ＢＶＤＶは、感染細胞培養物中の著しいより多量の検出可能なＮＳ３を特徴とする。ペスチウイルスＯＲＦの第１のタンパク質はＮｐｒｏ（Ｎ末端プロテアーゼ）である。Ｎｐｒｏは、ＯＲＦによってコードされたポリタンパク質の残りの部分からそれ自体を切断し、それによってそれ自体のＣ末端、及びＯＲＦ中の第１の構造タンパク質であるＣ（コア）タンパク質の正確なＮ末端を生成する、非構造自己プロテアーゼである。Ｎｐｒｏは、他のフラビウイルスに対応物を持たない。
【０００４】
ＯＲＦ中のＣタンパク質には、別の構造タンパク質ＥＲＮＳ、Ｅ１、Ｅ２が（この順で）続く。一緒に、キャプシド（Ｃ）タンパク質及び３種類のグリコシル化エンベロープタンパク質（ＥＲＮＳ、Ｅ１、Ｅ２）は、ペスチウイルスビリオンを構成する。構造タンパク質には、非構造タンパク質（ｐ７、ＮＳ２−ＮＳ３及びＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ並びにＮＳ５Ｂ）が続く。ＮＳ３（セリンプロテアーゼ）及びＮＳ５（ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性）は、ウイルス複製に直接関与する。
【０００５】
ペスチウイルスは、様々に分類することができる。ＢＶＤＶの場合、異なる遺伝子型（ＢＶＤＶ−１とＢＶＤＶ−２）を区別することができる。また、培養細胞の感染後には、細胞変性系統（ｃｐ）及び非細胞変性（ｎｃｐ）系統と称する２種類の生物型を区別することができる。
【０００６】
遺伝子型は、ウイルスゲノム配列の相違に基づく。培養細胞がｃｐ系統に感染すると、細胞が溶解するのに対して、ｎｃｐ系統による感染は細胞損傷を起こさないと考えられる。
【０００７】
ｃｐＢＶＤＶ系統は、ｎｃｐＢＶＤＶ系統からウイルスゲノムの再配列によって発生すると一般に考えられる。ＢＶＤＶの場合、ｎｃｐ分離物では、大部分は未加工のＮＳ２−ＮＳ３が認められ、少量のＮＳ３が検出可能である。対照的に、ｃｐ分離物では、ＮＳ２−３のＣ末端部分がより多量に出現する（ＮＳ３タンパク質）。ＢＶＤＶ分離物ＣＰ７では、ＮＳ２コード領域への２７ヌクレオチドの挿入が、効率的ＮＳ２−３切断を媒介し、細胞変性を与えるのに十分であることが示された（Ｔａｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７３（１１），  ９４２２−９４３２，  １９９９）。
【０００８】
異なるＢＶＤＶ生物型は、異なる疾患形態に関連する。ＢＶＤＶ感染は、発育中の胎児において持続感染（ＰＩ）も引き起こし得る。感染しやすい妊娠中のウシが非細胞変性ＢＶＤＶに曝されると（妊娠４２から１１０日）、持続感染（ＰＩ）した子ウシが生まれるおそれがある。持続感染した子ウシは、胎児に感染するＢＶＤＶ系統に対して免疫寛容である。したがって、ＰＩ子ウシは、生涯の効率的ウイルス発散源（ｓｈｅｄｄｅｒ）であり、世界中の感染しやすいウシにおけるウイルス拡散の最も重要な原因である。したがって、このＰＩ症候群によって、これらの感染を予防するワクチンに由来する高レベルのＢＶＤＶ免疫に対する要求が生じている。
【０００９】
ＢＶＤＶでは、ＢＶＤＶ−１系統及びＢＶＤＶ−２系統を細分化することができる。ＢＶＤＶ−１と−２は、ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ＰＣＲ法又は核酸配列決定によって互いに識別することができる。最近、２つの遺伝子型がＢＶＤＶ１ａ、ＢＶＤＶ１ｂ、ＢＶＤＶ２ａ及びＢＶＤＶ２ｂのようなサブゲノタイプに更に細分された。ＢＶＤＶ１の１１を超えるサブタイプが知られている。
【００１０】
ペスチウイルスの複製の研究は、逆遺伝学系、及び自己複製サブゲノムＲＮＡ（レプリコン）の発見によってかなり促進された。（Ｂｅｈｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，  ７２，  ２３６４−２７２，  １９９８；  Ｍｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，  ７０，  ８６０６−８６１３，  １９９６）。
【００１１】
ＣＳＦＶ複製の最低要件は、例えば、構造タンパク質の遺伝子配列を欠く欠陥ＣＳＦＶゲノムを作製することによって検討された。欠陥ＣＳＦＶゲノムは、ヘルパーＡ１８７−ＣＡＴ  ＲＮＡと一緒にＳＫ−６細胞に導入すると、依然として複製され、ウイルス粒子に入れることができることが見いだされた（Ｍｏｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，  ７７８７−７７９４，  １９９９）。
【００１２】
Ｎｐｒｏ遺伝子配列並びにＣ、Ｅｒｎｓ、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７及びＮＳ２をコードする遺伝子の一部を欠く、自己複製欠陥のあるＢＶＤＶゲノムが記述された（Ｂｅｈｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，  ７２，  ２３６４−２３７２，  １９９８）。
【００１３】
Ｋｕｐｆｅｒｍａｎｎ等は、Ｎｐｒｏの第１の１２個のアミノ酸が保持されたが、構造タンパク質（Ｅ１タンパク質のＡＡ  ５５１−５６０以外）と一緒に、残りの部分が欠損した、ＢＶＤＶ系統ＳＤ−１及びＣＰ  １３由来のＢＶＤＶ変異体を作製した。
【００１４】
Ｎｐｒｏ遺伝子の５’コード領域は、ＢＶＤＶ  ＩＲＥＳの一部であり（Ｔａｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ，  上掲；  Ｂｅｈｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  上掲；  Ｍｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，  ７５（９），  ４２２６−４２３８，  ２００１）、複製に必須であることが示唆された。
【００１５】
本発明は、新しいワクチン用ペスチウイルス変異体の提供を目的とする。ワクチンは、主に、免疫応答を引き起こすことを目的とする。ワクチンは、一方では、防御免疫応答を誘発することができるべきであるが、他方で、接種動物又は接触動物において（ウイルス性）疾患を引き起こしてはならないことは言うまでもない。誘発される免疫応答は、通常、主にウイルスのエンベロープタンパク質に対するものである。しかし、全構造、特に、全エンベロープタンパク質コード配列が欠損したレプリコンを使用する場合、かかるタンパク質はレプリコンから産生されず、これらのタンパク質に対する免疫応答は得られない。ＢＶＤＶ抗体は、ＥＲＮＳ、Ｅ２及びＮＳ３に対して作られる。中和活性は、Ｅ２特異抗体で主に実証された。
【００１６】
ワクチンは、不活性化された野生型ウイルス全体に基づき得る（弱毒ワクチン）。ワクチンは、組換えＤＮＡ技術によってインビトロで生成され得る、ウイルスの特別なタンパク質にも基づき得る。通常、かかるタンパク質は、ウイルスのエンベロープタンパク質である（サブユニットワクチン）。本発明は、そのゲノムの変異のために、宿主動物において防御免疫応答を誘発しないが、ウイルス性疾患を引き起こさないウイルス変異体に基づく、ワクチンの第３のカテゴリーである弱毒生ワクチンに関する。
【００１７】
構造遺伝子（の一部）が欠損したペスチウイルス変異体は、当分野で公知である。例えば、欧州特許第１１６１５３７号では、Ｅｒｎｓタンパク質が欠損した（及びトランスにおいて補完された）ＣＳＦＶ変異体が記述される。Ｍａｕｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３，  ３３１８−３３２８，  ２００５は、Ｅ２タンパク質を部分的又は完全に欠損したＣＳＦＶを記述した。
【００１８】
ワクチン候補としてのＣＳＦＶ及びＢＶＤＶのＮｐｒｏ欠損変異体の使用が示唆された。
【００１９】
ＣＳＦＶ  Ｎｐｒｏ変異体は、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７２（９），  ｐ７６８１−７６８４，  Ｓｅｐｔ．  １９９８に既に開示された。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ等は、Ｎｐｒｏ遺伝子をネズミユビキチン配列で置換し（変異体はｖＡ１８７−Ｕｂｉと呼ばれた。）、Ｎｐｒｏのタンパク質分解活性（Ｃタンパク質の正確なＮ末端の生成）がウイルス複製に必須であるが、この活性は、ユビキチンのタンパク質分解活性で置換され得ると結論した。変異体はブタでは完全に無毒であることが見いだされた。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ等は、Ｎｐｒｏ遺伝子が欠損し、別のプロテアーゼで置換されないときには、生存可能なウイルスが得られないことを見いだした。Ｎｐｒｏがネズミユビキチンで置換されたこれらの変異体は、生弱毒ワクチンとしての使用についても試験された（Ｍａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２２，  ３１７−３２８，  ２００４）。しかし、高毒性ＣＳＦＶ系統に基づく変異体は、接種したブタにおいてワクチン接種７日後にウイルス血症を引き起こすことが判明した。したがって、無毒ＣＳＦＶ系統に基づく変異体の使用が推奨された。
【００２０】
更なる研究プロジェクトにおいては、完全ＢＶＤＶ−Ｎｐｒｏコード配列が除去され、生成した変異体がワクチン候補として提案された。欧州特許第１０１３７５７号では、細胞変性系統ＮＡＤＬに基づき、完全Ｎｐｒｏ配列を欠く、ＢＶＤＶ  Ｎｐｒｏ欠損変異体が記述された。生成した変異体は、その野生型対応物に比較して、細胞培養における感染性がはるかに低く、複製が遅いことが記述された。この低増殖速度は弱毒化表現型を与えることが示唆された。また、Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ，  ７４（１４），  ６３３９−６３４７，  ２０００は、ＮＡＤＬ系統に基づくＢＶＤＶ  Ｎｐｒｏヌル変異体を記述した。このＢＶＤＶ  Ｎｐｒｏヌル変異体は、複製が極めて不完全であり、産生レベルが野生型ウイルスよりも少なくとも１０倍低かった。この変異体は、その複製能力が限られているため、ワクチン候補であり得ることが示唆された。
【００２１】
しかし、このタイプの変異体は、その複製が欠如しているため、十分な量を生成することが困難であり得る。さらに、変異体が、標的動物において、防御免疫応答を誘発し得る程度に複製するかどうかは疑問である。
【００２２】
国際公開第２００５１１１２０１号では、Ｎｐｒｏ遺伝子とＥｒｎｓ遺伝子の両方が欠損したＢＶＤＶ変異体が開示された。Ｎｐｒｏ変異又はＥｒｎｓ変異のみでは、妊娠中の幼雌ウシにおける胎児の感染予防には不十分であると結論された。ＢＶＤＶ２型系統ＮＹ９３に基づく二重変異体においてのみ、妊娠中の幼雌ウシにおける胎児の感染を予防することができた（しかし、二重変異体は、２型攻撃に対してのみ試験され、それが別の２型系統であっても、ＢＶＤＶ１型攻撃に対しては試験されなかった。）。
【００２３】
試験変異体は、Ｎｐｒｏ配列のＮ末端の４個のアミノ酸以外の全部を欠いた。
【００２４】
変異体の増殖は野生型ウイルスよりもかなり低いことが注目された。増殖を改善するために、ウシユビキチン遺伝子断片又はウシＬＣ３−ｃｏｃｉｄｎｇ配列断片がＮｐｒｏ遺伝子の主要部分を置換した、ウイルス変異体が構築された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２５】
【特許文献１】欧州特許第１１６１５３７号明細書
【特許文献２】欧州特許第１０１３７５７号明細書
【特許文献３】国際公開第２００５１１１２０１号パンフレット
【非特許文献】
【００２６】
【非特許文献１】Ｔａｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７３（１１），  ９４２２−９４３２，  １９９９
【非特許文献２】Ｂｅｈｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，  ７２，  ２３６４−２７２，  １９９８
【非特許文献３】Ｍｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，  ７０，  ８６０６−８６１３，  １９９６
【非特許文献４】Ｍｏｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，  ７７８７−７７９４，  １９９９
【非特許文献５】Ｂｅｈｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，  ７２，  ２３６４−２３７２，  １９９８
【非特許文献６】Ｍｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，  ７５（９），  ４２２６−４２３８，  ２００１
【非特許文献７】Ｍａｕｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３，  ３３１８−３３２８，  ２００５
【非特許文献８】Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７２（９），  ｐ７６８１−７６８４，  Ｓｅｐｔ．  １９９８
【非特許文献９】Ｍａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２２，  ３１７−３２８，  ２００４
【非特許文献１０】Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ，  ７４（１４），  ６３３９−６３４７，  ２０００
【非特許文献１１】Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ｂ，  Ｄｅｐｎｅｒ  Ｋ，  Ｓｃｈｉｒｒｍｅｉｅｒ  Ｈ，  Ｂｅｅｒ  Ｍ．  Ａ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｄｕｐｌｅｘ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  ａｓｓａｙｓ  ｕｓｅｄ  ｉｎ  ａ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓｅｓ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２００６；１３６（１−２）：２００−２０９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２７】
本発明者らは、ワクチンに使用することができるが、そのゲノムがペスチウイルスの全構造タンパク質、したがって全エンベロープタンパク質を依然としてコードし、発現する、ペスチウイルス変異体を提供することを目的とした。
【００２８】
本発明者らは、ウイルスのＮｐｒｏタンパク質のコード領域に変異を含むペスチウイルス変異体を用いて研究した。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明による変異体は、変異体が、Ｎｐｒｏ領域をコードする遺伝子配列の一部が欠損したウイルスのｃｐ系統に基づき、前記欠損部分は、Ｎｐｒｏタンパク質のＮ末端の１２個のアミノ酸のコード配列を含まないことを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ＢＶＤＶ  Ｎｐｒｏ欠損変異体の構築を示す図である。
【図２】未処置の子ウシにＣＰ７  Ｎｐｒｏ欠損変異体を含むワクチンを接種する動物試験（試験Ｉ）の設定を示す図である。
【図３】ワクチン接種及び攻撃感染（試験Ｉ）後の平均白血球数を示すグラフである。
【図４】ＢＶＤＶ  ＮＳ３ブロッキングＥＬＩＳＡ、試験Ｉの結果を示すグラフである。
【図５】ＢＶＤＶ中和アッセイ、試験Ｉの結果を示すグラフである。
【図６】妊娠中のＢＶＤＶ未感染（ｎａｉｖｅ）の幼雌ウシにＢＶＤＶのＣＰ７  Ｎｐｒｏ欠損変異体を接種する動物試験ＩＩの設計を示す図である。
【図７】ＢＶＤＶ  ＮＳ３ブロッキングＥＬＩＳＡで測定した、動物試験ＩＩにおけるＢＶＤＶ特異抗体の発生を示すグラフである。
【図８】ワクチン接種（試験ＩＩ）後の平均白血球数を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
好ましくは、このペスチウイルスはウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）である。
【００３２】
特にＢＶＤＶの場合、本発明による変異体は安全で効率的なワクチン候補であることが見いだされた。
【００３３】
この変異体は、野生型ウイルス感染に対して適切な保護を提供し、持続感染した子ウシを生じない。
【００３４】
Ｎｐｒｏの残りの１２個の末端アミノ酸のコード配列の存在は、ウイルスの複製に十分であることが判明した。増殖の動力学はわずかに損なわれるにすぎず、最終力価は０．５−１．０  ｌｏｇ１０だけ低下した。従来の細胞上でのウイルス増殖は、約１−５．６×１０６  ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価−収率（ｔｉｔｅｒ−ｙｉｅｌｄｓ）で可能であった。
【００３５】
本発明の変異体は、そのゲノム配列内、コード領域内又は非コード領域内に更なる変異を含み得る。前記変異は、ウイルスを更に弱毒化する。
【００３６】
しかし、本発明による変異体は、好ましくは、ウイルスの全構造タンパク質を発現する。
【００３７】
本発明による変異体は、好ましくは、ウイルスのｃｐ系統に基づく。
【００３８】
ＮＡＤＬ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｃ２４Ｖ、Ｏｓｌｏｓｓ、ＣＰ７など、ＢＶＤＶの種々のｃｐ系統が当分野で公知であり、本発明に使用することができる。好ましくは、ｃｐ  ７系統を使用する。多数のｃｐ  ＢＶＤＶ系統の細胞変性効果の強度は異なる。幾つかの系統は、２４から４８時間後の極めて初期にアポトーシスを誘発するが、別の系統は、検出可能な細胞損傷を誘発するのに７２時間を超える時間を必要とする。これは、免疫原性と相関すると仮定される。すなわち、ｃｐの誘発が遅いほど、良好な免疫応答が惹起される。その結果、高いワクチン接種効力を保証するために、極めて遅いｃｐ効果を誘発するｃｐ  ７系統が選択された。
【００３９】
Ｎ末端の１２個のアミノ酸の配列は、ＢＶＤＶの異なる分離物ごとに変化する。例えば、この配列はＭＥＬＩＴＮＥＬＬＹＫＴであり得、これは系統ｃｐ７のＮ  ｐｒｏタンパク質のＮ末端の１２個のアミノ酸の配列でもある。
【００４０】
Ｎｐｒｏの１２個のアミノ酸は、Ｃタンパク質のＣ末端アミノ酸と直接結合し得る。あるいは、別のアミノ酸鎖を導入することもできる。例えば、変異体又は結合配列の構築に用いられる制限酵素断片に由来するアミノ酸。
【００４１】
本発明による変異体は、野生型ペスチウイルス感染に対して家畜を保護するワクチンの製造に使用できるということが見いだされた。
【００４２】
したがって、本発明は、本発明による変異体と薬学的に許容される担体とを含む、ＢＶＤＶ感染に対してウシを保護するワクチンに更に関係する。
【００４３】
適切な担体は当分野で公知である。例えば、本発明による変異体ウイルスは、凍結乾燥させ、生理的に許容される適切な塩溶液に戻すことができ、又はワクチンは、安定剤などの公知の担体添加剤を更に含む、既製液体無菌溶液に変異体を含むことができる。
【００４４】
好ましくは、変異体はＣＰ７  ＢＶＤＶ系統に基づき、Ｎｐｒｏタンパク質のＮ末端の１２個のアミノ酸のコード配列以外のＮｐｒｏ遺伝子の全部が欠損している。
【実施例１】
【００４５】
ＢＶＤＶ  Ｎｐｒｏ欠損変異体の構築
ＢＶＤＶ  ｃＤＮＡクローンＣＰ７ΔＮｐｒｏを、完全長感染性クローンｐＡ／ＢＶＤＶ（Ｍｅｙｅｒｓ  ｅｔ．  ａｌ．，  １９９６）に基づいて、２段階手順で構築した。第一段階では、プラスミドｐＡ／ＢＶＤＶ／ＣＰ７のＰＣＲ断片を、プライマー対ｃｐ７＿２０８＿ＸｈｏＩとｃｐ７＿４０６Ｒ＿ＰａｃＩ（表１）を用いて増幅し、ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩで消化し、続いてＫｐｎＩ２４４７／３７９７及びＸｈｏＩ２０８で消化されたプラスミドｐＡ／ＢＶＤＶ／ＣＰ７に連結した。第２の段階では、生成したプラスミドｐＡ／ＢＶＤＶ／ＣＰ７ΔＮｐｒｏ−ｐ７、及びプライマーｃｐ７＿８７３＿ＰａｃＩとｃｐ７＿４９１３Ｒを用いてｐＡ／ＢＶＤＶ／ＣＰ７から増幅されたＰＣＲ断片を、ＰａｃＩ及びＮｏｔＩを用いて切断し、連結した。欠損はＮｐｒｏの大部分（ｎｔ  ４０７−８７２、ＮＣＰ７配列）を含むのに対して、ＢＶＤＶ−ＩＲＥＳと重複する第１の３６ヌクレオチドは除去されなかった（図１Ａ及びＢ）。
【００４６】
【表１】
0005775665.tif 000002
ａ  制限酵素部位を下線で示す。インフレーム連結用の追加のヌクレオチドを太字で示す。
ｂ  ＢＶＤＶ−ＣＰ７配列中のヌクレオチド位置
【実施例２】
【００４７】
子ウシにおける生ワクチンとしてのＣＰ７  Ｎｐｒｏ欠損変異体
第１のワクチン接種−攻撃試験において、子ウシは、ＣＰ７  ΔＮｐｒｏを１回筋肉内接種した後に、異種ＢＶＤＶ  Ｉ型攻撃感染から完全に保護されることが示された。経鼻ワクチンウイルス排出は、細胞培養におけるウイルス分離によって検出されなかった。４匹の動物のうち１匹がウイルス血症を１日示した。
【００４８】
免疫化は、殺菌免疫（ｓｔｅｒｉｌｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を誘発した。ＢＶＤＶ  Ｉ型攻撃感染後は、経鼻ウイルス排出もウイルス血症も認められなかった。
【００４９】
試験設定：
試験設定を図２に示す。
【００５０】
ＢＶＤＶ未感染の子ウシ（ｎ＝４／群）にワクチン接種し、又は偽ワクチン接種し、５２日後、毒性ＢＶＤＶ  Ｉｂ型系統ＳＥ５５０８（Ｗｏｌｆｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）による攻撃感染を実施した。子ウシに単一用量の６．７  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０  ＢＶＤＶ  ＣＰ７ΔＮｐｒｏをｉ．ｍ．接種した（５ｍｌ）。偽ワクチン接種には非感染性細胞培養上清ｉ．ｍ．（５ｍｌ）を使用した。攻撃感染の場合、子ウシに、ネブライザーを用いて６．５  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０  ＢＶＤＶ  ＳＥ５５０８（Ｉｂ）２ｍｌをｉ．ｎ．投与した。
−  子ウシの臨床症状を毎日監視し、体温を毎日監視した。
−  １４日間、ワクチン接種後及び攻撃感染後に、ウイルス血症及び経鼻ウイルス排出について子ウシを毎日検査した。
−  血清反応を毎週監視した。
【００５１】
結果
赤血球のアルカリ溶解後、白血球をＥＤＴＡ−血液から精製した。拭き取り体液（ｓｗａｂ  ｆｌｕｉｄ）１００μｌ又は白血球３×１０６個を４組のウシの細胞に接種した。５−６日間同時培養後、ウイルス複製を間接蛍光抗体試験（ＩＩＦＴ）によって確認した。上清の更なる１盲目継代を実施した（６日→ＩＩＦＴ）。
【００５２】
ワクチン接種した４匹の子ウシのうち１匹において、細胞結合（ｃｅｌｌ  ｂｏｕｎｄ）ウイルス血症を検出した。第１の細胞培養継代後のワクチン接種後４日目に少量のＣＰ７ΔＮｐｒｏを再分離することができた。
【００５３】
経鼻ワクチンウイルス排出は記録されなかった。
【００５４】
攻撃感染後、経鼻ＢＶＤＶ  ＳＥ５５０８排出は、ワクチン接種動物では検出されなかった。ワクチン接種動物はすべてウイルス血症に対して完全に保護され、攻撃ウイルスは精製白血球から再分離されなかった（「殺菌免疫」）。
【００５５】
対照的に、対照の子ウシはすべて、経鼻ＢＶＤＶ排出を６−８日間示し、細胞結合ウイルス血症を６−８日間示した。
【００５６】
ワクチン接種後、ＣＰ７ΔＮｐｒｏで免疫された動物はすべて、極めて穏やかな白血球数低下を示し、接種後７日までにワクチン接種前の値に回復した（図３Ａ）。
【００５７】
攻撃感染後、免疫された子ウシでは白血球の大きな減少は認められなかった。平均血球数は、生理学的範囲内のままであった。対照動物では、著しい白血球減少が攻撃から３日後に開始するのが認められた。平均白血球数は、２週間以上低下したままであった（図３Ｂ）。
【００５８】
ワクチン接種前の温度に比較して、直腸体温のわずかな上昇のみがワクチン接種後に記録された。
【００５９】
攻撃感染（ｃ）後、免疫動物は温度曲線の変化を示さなかった。温度応答に関しては、動物は、臨床のＢＶＤから明らかに保護された。
【００６０】
すべての対照子ウシにおいて、中程度の温度上昇が接種から３日後に生じた。１週間を超えた後、体温は攻撃前のレベルに戻った。
【００６１】
すべての動物の全身状態の変化、及びＢＶＤＶに典型的な呼吸器又は胃腸症状を監視した。
【００６２】
観察期間全体（免疫化前４週間から免疫化後１２週間まで）にわたって、主にワクチン接種動物において、鼻汁、散発的咳そうなどの交互の軽度の呼吸器症状が認められた。ワクチン接種後、有害な臨床反応は生じなかった。ワクチンにおいては、ワクチン接種前のスコアの悪化は認められなかった。攻撃感染後、免疫動物は臨床症状を示さなかった。対照子ウシでは、軽度の呼吸器症状が記録され、餌の摂取量が１−２日間減少した。動物は、胃腸疾患も粘膜の病変も示さなかった。
【００６３】
動物の血清反応をＢＶＤＶ  ＥＬＩＳＡ（ＮＳ３ブロッキング、図４）並びにＢＶＤＶ  １型及び２型特異的中和アッセイ（図５）によって監視した。
【００６４】
ＣＰ７ΔＮｐｒｏを接種した動物はすべて、Ｃｅｄｉｔｅｓｔ  ＢＶＤＶ  ＥＬＩＳＡ（Ｃｅｄｉ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）によって試験して、ワクチン接種後３週間までにＢＶＤＶ  ＮＳ３特異抗体に対して陽性となった。対照子ウシは、攻撃感染後２−３週間まで陰性のままであった（図４）。
【００６５】
ワクチン接種後、すべての動物がＢＶＤＶ  １型中和抗体を中程度の力価で生じた（図５）。攻撃感染（ｃ）後、免疫動物は、中和抗体力価の顕著な上昇（ｂｏｏｓｔｅｒ）を示さなかった。偽ワクチン接種動物は、ＢＶＤＶ  １型系統ＳＥ５５０８による攻撃感染後２週間まで陰性であった。より低力価のＢＶＤＶ  ２型（ＵＳ９８０系統）特異的中和抗体も、ワクチン接種後に誘導された。中和抗体力価は、ＢＶＤＶ  Ｉ型野外（ｆｉｅｌｄ）系統ＳＥ５５０８による接種後３週間、対照動物の値と同等であった。
【実施例３】
【００６６】
妊娠中の幼雌ウシにおける生ワクチンとしてのＣＰ７  Ｎｐｒｏ欠損変異体
ＢＶＤＶ  Ｎｐｒｏ欠損変異体系統ＣＰ７ΔＮｐｒｏを用いた動物試験スケジュールを図６に示す。
【００６７】
ＢＶＤＶ未感染の幼雌ウシ（ｎ＝４／群）にＢＶＤＶ変異体系統ＣＰ７ΔＮｐｒｏを、妊娠６８日と８８日の間（第一期）に筋肉内又は静脈内及び鼻腔内接種した。
【００６８】
体積４ｍｌの６．０２  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０  ＢＶＤＶ  ＣＰ７ΔＮｐｒｏの適用
３ｍｌ  ｉ．ｖ．＋１ｍｌ  ｉ．ｎ．：（「最悪のシナリオ」）
４ｍｌ  ｉ．ｍ．：（「生ワクチン接種の模倣」）
【００６９】
試験中、以下のパラメータを監視した。
毎日：
−臨床調査
−直腸体温の監視
感染後１０−１２日間毎日：
−ウイルス血症、経鼻ウイルス排出
毎週：
−血清反応
−臨床的流産
−胎児病原性（ｆｅｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）
−胎児器官（持続感染胎児を除外）における接種後４か月のウイルス検出
また、約４か月齢の３匹のＨｏｌｓｔｅｉｎ−Ｆｒｉｓｅａｎ子ウシを接触動物として含め、ＢＶＤＶ特異抗体を毎週監視した。
【００７０】
結果
ウイルス接種後１０から１２日間、幼雌ウシのウイルス血症及び経鼻ウイルス排出を監視した。
【００７１】
拭き取り体液１００μｌ又は精製白血球３×１０６個を４組のウシの細胞に接種した。５から６日間同時培養後、ウイルス複製を接種培養物の間接蛍光抗体試験（ＩＩＦＴ）によって確認した。また、すべての上清の追加の１盲目継代を実施し、６日間温置後ＩＩＦＴによって試験した。
【００７２】
接種経路には無関係に、経鼻ウイルス排出は認められなかった。ＣＰ７ΔＮｐｒｏの静脈内と鼻腔内の同時適用後に４匹の動物のうち２匹において、また、筋肉内感染後に１匹の動物において、極めて低いウイルス力価のウイルス血症を１日目に検出することができた。
【００７３】
ＢＶＤＶ特異抗体の発生を市販ＮＳ３特異的ブロッキングＥＬＩＳＡ（Ｃｅｄｉｔｅｓｔ  ＢＶＤＶ  ＥＬＩＳＡ、Ｃｅｄｉ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって監視した。すべての接種動物は、ワクチン接種後２から３週間までにＮＳ３特異抗体に対して陽性となった（図７）。すべての接触動物は、観察期間全体にわたって血清陰性であった。これは、血清中和試験によっても確認された。
【００７４】
両方の群において、白血球数の著しい減少は、接種後に認められなかった。平均相対白血球数の減少は２０％未満であり、８日以内に感染前の値に戻った（図８）。白血球値が増加する反跳効果は、すべての動物で認められ、４週間後の観察期間の終わりまで値がわずかに上昇した。筋肉内感染後、ＢＶＤＶ  ＣＰ７  Ｎｐｒｏ欠損変異体を用いると、白血球減少の更なる遅延は明白であり、ｐ．ｉ．４日目に始まり、ｐ．ｉ．８日目に復帰した。２群間の減少値は同等であった（図８）。
【００７５】
攻撃前体温に比較して、直腸体温の上昇は、Ｎｐｒｏ欠損変異体の適用後には記録されなかった。
【００７６】
すべての動物の全身状態及びＢＶＤＶ特有の臨床症状を監視した。すべての動物（接種動物及び接触対照）において、不特定の眼脂（ｏｃｕｌａｒ  ｄｉｓｃｈａｒｇｅ）が期間全体にわたって観察された。感染後、有害反応は生じず、疾患の臨床徴候は認められなかった。
【００７７】
幼雌ウシは、３つの異なる会社（ｈｏｌｄｉｎｇｓ）から購入した。同じ農場で生まれた５匹の動物のうち４匹は筋骨格系に問題があったが、これはワクチンウイルスの適用とは無関係であった。したがって、動物を予定試験終了日前の異なる時点で安楽死させた。
【００７８】
動物の１匹は、感染後５４日で流産した。流産した胎児を含めて、すべての胎児は、体重及び発育が正常であった。病理所見は剖検で記録されなかった。
【００７９】
細胞培養におけるウイルス分離を（衝撃凍結（ｓｈｏｃｋ  ｆｒｏｚｅｎ）させ、海砂を用いて粉砕した）器官材料０．３ｇから実施し、第１の陰性結果の場合には、続いて上清の１連続継代を実施した。
【００８０】
ＭＤＢＫ細胞及びインターフェロン無能ＭＤＢＫ細胞に対してウイルス分離を実施した。培養物の免疫蛍光分析は、ＢＶＤＶに対して染色を示さなかった。疑わしい骨髄洗浄試料１ｍｌも７ｃｍ２組織培養プレート上で接種した。更なる３継代後でも、培養物はウイルス複製に対して陰性であった。
【００８１】
市販抗原ＥＬＩＳＡ（ＢＶＤＶ  Ａｇ／Ｓｅｒｕｍ  ｐｌｕｓ、Ｉｄｅｘｘ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｂ．Ｖ．）を用いて、胎児組織をＢＶＤＶタンパク質の存在についてスクリーニングした。皮膚、腎臓、へん桃、血清及び白血球は、ＢＶＤＶ抗原に対して明らかに陰性であった。胎児の器官及び組織を実時間ＲＴ−ＰＣＲ分析にも供した。ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ（登録商標）を用いて試料を破壊し、均質化した後、ＲＮＡを腎臓、小脳、白血球及び胸腺からＲＮｅａｓｙ（登録商標）ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造者の指示に従って抽出した。それに続く高感度実時間ＲＴ−ＰＣＲ［Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ｂ，  Ｄｅｐｎｅｒ  Ｋ，  Ｓｃｈｉｒｒｍｅｉｅｒ  Ｈ，  Ｂｅｅｒ  Ｍ．  Ａ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｄｕｐｌｅｘ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  ａｓｓａｙｓ  ｕｓｅｄ  ｉｎ  ａ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓｅｓ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２００６；１３６（１−２）：２００−２０９］では、ウイルスゲノム等価物は検出されなかった。
【００８２】
結論：
結論として、ＢＶＤＶ変異体ＣＰ７ΔＮｐｒｏの高力価の静脈内／鼻腔内又は筋肉内適用は、妊娠初期中でもウシに無害であることを明確に実証することができた。幼雌ウシの臨床徴候も、胎児の持続感染も認められなかった。ＣＰ７  Ｎｐｒｏ欠損変異体が胎盤関門を実際に通過することができたかどうか、又は胎児がＣＰ７ΔＮｐｒｏ感染を乗り越えることができたかどうかは不明なままであるが、感染ウイルスは胎児器官の大きいパネルから再分離されなかった。また、ウイルスゲノムは、胎児の精製白血球及び多数の器官で検出されなかった。妊娠中の幼雌ウシが妊娠第一期に改変生ウイルスＣＰ７  ΔＮｐｒｏに感染しても胎児病原性効果は認められなかった。要約すると、妊娠中の幼雌ウシの実験感染は、ＣＰ７ΔＮｐｒｏが高度に弱毒化された安全なＢＶＤＶワクチン候補である良好な証拠を与える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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