(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
剪断力を適用することによりアイメリアオーシストから生存可能なスポロシストを放出させこれを回収する方法であって、その方法が：
（ａ）懸濁したオーシストを含有する溶液を調製すること；
（ｂ）オーシストの直径に等しいか又はそれよりも大きい直径を有するチャンバーを有する細胞破壊装置を提供すること；
（ｃ）剪断力が１分当り３．００×１０5ｓｅｃ-1から１分当り３．００×１０6ｓｅｃ-1の間の１分当りの剪断速度を生じるよう、連続する溶液の流れを細胞破壊装置のチャンバーに通し、オーシストから無傷の生存可能なスポロシストを放出させること；
（ｄ）無傷の生存可能なスポロシストを溶液から回収すること；
を含み、チャンバーの直径が、７５μｍから４００μｍの間であり、（ｃ）が２０００から４０００ｐｓｉの間で行われる、方法。
【請求項２】
オーシストが装置のチャンバー内の非直線的な流路に沿って移動し、非直線的な流路の直径がオーシストの直径に等しい又はそれよりも大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
非直線的な流路が、Ｙ形またはＺ形のいずれかである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
オーシストが、連続する流れを細胞破壊装置に供する前に、それらの壁を脆弱化するための前処理に供され、前処理が：（ａ）化学的にオーシストを処理してその壁を脆弱化すること、（ｂ）熱的にオーシストを処理してその壁を脆弱化すること、（ｃ）酵素的にオーシストを処理してその壁を脆弱化すること、及び（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の任意の組み合わせ、から成るグループから選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
オーシストが、アイメリアマキシマ、アイメリアミティス、アイメリアテネラ、アイメリアアセルブリナ、アイメリアブルネッティ、アイメリアネカトリックス、アイメリアプレコックス、アイメリアミバティ、アイメリアメレアグリミティス、アイメリアアデノイデス、アイメリアガロパボニス、アイメリアディスパーサ、アイメリアイノキュア、アイメリアスブロツンダ、アイメリアアーサーター、アイメリアバクエンシス、アイメリアクランダリス、アイメリアファウレイ、アイメリアグラヌロサ、アイメリアイントリカータ、アイメリアマルシカ、アイメリアオビノイダリス、アイメリアパリダ、アイメリアパルバ、アイメリアウェイブリッジエンシス、アイメリアインテスティナリス、アイメリアベイドフスキィ、アイメリアピリフォルミス、アイメリアコエキコラ、アイメリアイレシデュア、アイメリアフラベセンス、アイメリアエキシグア、アイメリアマグナ、アイメリアパーフォランス、アイメリアメディア、アイメリアスティダイ、及びその任意の組み合わせから成るグループから選択されるアイメリアオーシストである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
連続するオーシスト溶液の流れを細胞破壊装置内で剪断力に供することが、生存可能なスポロゾイトも放出させる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２００７年２月８日に提出された米国仮出願第６０／９００２３３号の利益及び優先権を請求するものであって、その開示内容は、参照により、その全体が記述されているかのように本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は一般的にオーシストに関係し、更に詳しくは、スポロシストをオーシストから放出させる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
家禽鶏のコクシジウム症は、アイメリア（Eimeria）属の寄生原虫によって引き起こされる疾患である。アイメリア（Eimeria）種のオーシストは環境の至るところに存在し、家禽敷料中に何ケ月間も生き残る。オーシストを摂取すると、種特異的な様式で腸管の様々な部位への感染をもたらす。その生物は、数日間かけて腸管内で増殖し、次世代のオーシストが糞便排泄されることになる。複数サイクルの感染で免疫が誘導され、そして感染が群に対して早期に、かつ群間で一様な用量で提示される場合には、数サイクルの曝露で発達した免疫は、極めて強固になる可能性がある。
【０００４】
対照的に、感染がトリに一様な様式で提示されないと、未感染のトリが突然大量感染し、飼料転換及び体重増加に関する成績不振につながり、併せて二次感染のリスクが高まるという状況が生じる可能性がある。現在、家禽産業においてコクシジウム症の抑制に用いられる最も一般的な方法は、予防接種ではなく、むしろ飼料に入れた抗コクシジウム薬の投与である。ワクチンの使用割合の低さは、しばしば従来の投与経路及び投与時期である飼育施設での飼料若しくは水を経由した投与、又は孵化場でのスプレーキャビネットワクチン接種による投与が、投与の一様性において不確実であることに因る。孵化場での投与中のワクチン送達の一様性を改善し、それによって群内により一様防御を提供することに関心が高まっている。
【０００５】
近年、卵内ワクチン接種技術が、生きたオーシストに基づくコクシジウム症ワクチンの投与に適用できることが見出されている（例えば、特許文献１、特許文献２及び特許文献３を参照）。卵内投与経路は、胚がまだ卵内にあるうちに、ワクチンの均一な投与量をそれぞれの胚に送達する便利な方法を提供する。鳥類ワクチンの卵内送達は、現在、米国で毎年生産される９０億羽のブロイラーの約８５％に実施されており、米国外で毎年生産される２１０億羽中でのパーセントも増加している（特許文献４を参照）。従って、生きた卵内送達コクシジウム症ワクチンの潜在的な市場は、孵化後送達コクシジウム症ワクチンの市場よりもかなり大きい。
【０００６】
アイメリア（Eimeria）属のオーシストは、オーシストの保護壁内に４個のスポロシストを含む。スポロシストは、ワクチン、生死判別試験、スポロゾイト生産など、様々な目的に使うことができる。従来のオーシスト破壊及びスポロシスト放出の方法には、ガラスビーズを使用する。オーシストをガラスビーズと共に振盪すると、オーシスト壁にひび割れを起こし、その中に保持されたスポロシストを放出する。しかし、オーシストを高いパーセントで破壊するためには一般にかなりの振盪が必要であり、継続的な振盪作用は先に放出されたスポロシストを劣化させる可能性がある。同様の問題は、スポロシスト放出のための組織粉砕器の使用のような、従来の他のスポロシスト放出の方法にも存在する。処理の早期に放出されたスポロシストは、粉砕処理を継続することによって壊される可能性がある。
【０００７】
スポロシストをオーシストから放出させる従来の他の方法は、スポロシストをオーシストから化学的に放出させることを含む。典型的には、オーシストを、例えば炭酸ガスを含む緩衝液に懸濁する。またシステイン塩酸塩も含有させる。この方法は、オーシストの卵門領域におけるジスルフィド結合を還元する。最終的に、スポロシストは、緩められた卵門キャップを通って放出され得る。残念ながら、化学的放出単独では、必ずしもスポロシスト放出のための効率的な方法とは限らない。
【０００８】
斯くの如く、スポロシストを胞子形成オーシストから放出させる従来の方法は非効率的であり、生存能力のある一部の利用可能なスポロシストしか産生するに過ぎない。従って、スポロシストをオーシストから放出させる方法で、従来の方法に関連する問題を克服する改善された方法の必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第６，５００，４３８号（Pfizer, Inc.）
【特許文献２】米国特許第６，４９５，１４６号（Pfizer, Inc.）
【特許文献３】米国特許第６，６２７，２０５号（Pfizer, Inc.）
【特許文献４】米国特許第４，４５８，６３０号（米国政府)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の議論に鑑み、オーシストの溶液に、オーシスト壁を破壊して生存可能なスポロシストを放出させるのに十分な制御された剪断力を加え、そこから生存可能なスポロシストを放出させる、オーシストからスポロシストを放出させる方法が提供される。本発明の幾つかの実施態様によれば、オーシストの水溶液は、１つ又はそれ以上のMicrofluidizer（登録商標）プロセッサチャンバーユニットを、所定のチャンバー径、チャンバー形状及び圧力の条件下で通される。オーシストはチャンバー壁に衝突して制御された高い剪断力を受け、オーシスト壁が開裂して無傷の（intact）スポロシストを放出する。この方法は、オーシスト壁を高いパーセントで割ることができ、高い割合でスポロシストの回収を可能にするため、特にスポロシストの放出に有効である。更に、放出されたスポロシストへのダメージは殆んど無く、回収されたスポロシストを高いパーセントで生存したまま残すことを可能にする。
【００１１】
いくつかの実施態様では、オーシストは、制御された剪断力が溶液に加えられる前に、その壁を脆弱化するために処理される。例えば、オーシストを熱的処理、化学的処理、酵素的処理してもよく、又は熱的、化学的及び酵素的処理の様々な組み合わせで処理してもよい。
【００１２】
幾つかの実施態様では、回収されたスポロシストは、保存のために凍結保存される。幾つかの実施態様において、回収されたスポロシストは、ワクチン及び／又は診断アッセイに使用される。
【００１３】
幾つかの実施態様において、スポロゾイトを回収されたスポロシストから脱嚢させる。これらのスポロゾイトは、ワクチン及び／又は診断アッセイの製造に使用される。
【００１４】
本発明の実施態様に従って、スポロシストを回収できる例示的なオーシストは、アイメリアマキシマ（Eimeria.maxima）オーシスト、アイメリアミティス（E.mitis）オーシスト、アイメリアテネラ（E.tenella）オーシスト、アイメリアアセルブリナ（E.acervulina）オーシスト、アイメリアブルネッティ（E.brunetti）オーシスト、アイメリアネカトリックス（E.necatrix）オーシスト、アイメリアプレコックス（E.praecox）オーシスト、アイメリアミバティ（E.mivati）オーシスト、及びそれらの任意の組合せを含むグループから選択されるアイメリア（Eimeria）属オーシスト； アイメリアメレアグリミティス（E.meleagrimitis）オーシスト、アイメリアアデノイデス（E.adenoeides）オーシスト、アイメリアガロパボニス（E.gallopavonis）オーシスト、アイメリアディスパーサ（E.dispersa）オーシスト、アイメリアイノキュア（E.innocua）オーシスト、及びアイメリアスブロツンダ（E.subrotunda）オーシスト、並びにそれらの任意の組合せを含むグループから選択されるアイメリア（Eimeria）属オーシスト；アイメリアツェルニィ（E.zuernii）オーシスト、アイメリアボビス（E.bovis）オーシスト、及びそれらの任意の組合せを含むグループから選択されるアイメリア（Eimeria）属オーシスト；アイメリアアーサーター（E.ahsata）オーシスト、アイメリアバクエンシス（E.bakuensis）オーシスト、アイメリアクランダリス（E.crandallis）オーシスト、アイメリアファウレイ（E.faurei）オーシスト、アイメリアグラヌロサ（E.granulosa）オーシスト、アイメリアイントカタ（E.inthcata）オーシスト、アイメリアマルシカ（E.marsica）オーシスト、アイメリアオビノイダリス（E.ovinoidalis）オーシスト、アイメリアパリダ（E.pallida）オーシスト、アイメリアパルバ（E.parva）オーシスト、アイメリアウェイブリッジエンシス（E.weybridgensis）オーシスト、及びそれらの任意の組合せを含むグループから選択されるアイメリア（Eimeria）属オーシスト；そして、アイメリアインテスティナリス（E.intestinalis）オーシスト、アイメリアベイドフスキイ（E.vejdovskyi）オーシスト、アイメリアピリフォルミス（E.piriformis）オーシスト、アイメリアコエキコラ（E.coecicola）オーシスト、アイメリアイレシデュア（E.irresidua）オーシスト、アイメリアフラベセンス（E.flavescens）オーシスト、アイメリアエキシグア（E.exigua）オーシスト、アイメリアマグナ（E.magna）オーシスト、アイメリアパーフォランス（E.perforans）オーシスト、アイメリアメディア（E.media）オーシスト、アイメリアスティダイ（E.stiedai）オーシスト、及びそれらの任意の組合せを含むグループから選択されるアイメリア（Eimeria）属オーシストである。
【００１５】
幾つかの実施態様において、オーシストの溶液に、オーシスト壁を破壊してオーシストからスポロゾイトを放出させるのに十分な制御された剪断力を加え、オーシストからスポロゾイトを放出させる方法が提供される。本発明の幾つかの実施態様によれば、オーシストの水溶液は、１つ又はそれ以上のMicrofluidizer（登録商標）プロセッサチャンバーユニットを、所定のチャンバー径、チャンバー形状及び圧力の条件下で通過させる。オーシストはチャンバー壁に衝突しそして制御された高い剪断力を受け、オーシスト壁が開裂して無傷のスポロゾイトを放出する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の実施態様は、従来の方法よりも有利である。例えば、本発明の実施態様は再現性があり、一定した収率でスポロシストを産生する。対照的に、従来のガラスビーズ及び組織粉砕の方法は、それらを作業者が実施するという点で変動し易く、一貫性のないスポロシスト収率になる可能性がある。また、本発明の実施態様は、規模拡大が可能であり、ラージスケールでのスポロシストの経済的生産を可能にする。対照的に、従来のガラスビーズ及び組織粉砕の方法は、大量生産に適応させることは容易ではない。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の幾つかの実施態様に従って、スポロシストをオーシストから放出させる操作のフローチャートである。
【図２】本発明の幾つかの実施態様に従って、スポロシストをオーシストから放出させる操作のフローチャートである。
【図３】Microfluidizer（登録商標）プロセッサのブロック図である。
【図４】本発明の幾つかの実施態様に従って、放出されたスポロシストを処理する操作のフローチャートである。
【図５】本発明の幾つかの実施態様に従って、放出されたスポロシストを処理し、放出されたスポロシストからスポロゾイトを脱嚢させる操作のフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下に、本発明の好ましい実施態様を示した添付の図面を参照して、本発明をさらに十分に説明する。しかし、本発明は、多くの異なる形態で具体化される可能性があり、本明細書で説明した実施態様に限定されると解釈すべきではない；むしろ、これらの実施態様は本開示を徹底的に完全なものにし、そして本発明の範囲を当業者に十分に伝えるものとなるように提供される。
【００１９】
類似の数字は、本明細書の全体を通じて類似の要素を指す。図面において、明瞭化のために特定のライン、層、成分、要素、又は外観の太さを、強調する場合がある。本明細書で言及する全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２０】
本明細書で用いる用語は、特定の実施態様を説明することだけの目的のためであり、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書で用いるように、文脈がそれ以外を明確に指示しない限り、単数形の「１つの（a, an）」及び「その（the）」には、複数形も同様に含まれるものとする。更に、当然のことながら、用語の「含む（comprises）」及び／又は「含んでいる（comprising）」は、本明細書で使われる場合、記載された特徴、工程、操作、要素、及び／又は成分の存在を特定するが、１つ又はそれ以上の他の特徴、工程、操作、要素、成分、及び／又はそれらのグループの存在又は付加を除外しない。本明細書で用いるように、用語の「及び／又は」は、関連して挙げられた項目の１つ又はそれ以上のいずれかおよびあらゆる組み合わせを含む。本明細書で用いるように、「ＸとＹの間」及び「約ＸとＹの間」のような語句は、Ｘ及びＹを含むと解釈されるべきである。本明細書で用いるように、「約ＸとＹの間」のような語句は、「約Ｘと約Ｙの間」を意味する。本明細書で用いるように、「約ＸからＹまで」のような語句は、「約Ｘから約Ｙまで」を意味する。
【００２１】
他のことを定義していない限り、本明細書で用いるすべての用語（技術用語および科学用語を含む）は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じような意味を有する。更に、当然のことながら、一般に使用される辞書に定義されているような用語は、本明細書及び関連技術の文脈における意味に合致する意味を有すると解釈すべきであり、本明細書に明示的に定義していない限り、理想的な又は過度に形式的な意味で解釈すべきではない。よく知られた機能又は構造については、簡潔及び／又は明瞭にするために、詳細に説明しない場合がある。特に具体的に指示しない限り、操作（又は工程）の順序は、請求項又は図面に示される順序に限定されない。
【００２２】
本発明の実施態様は、医学的及び獣医学的使用のため、並びに診断及び／又は研究目的のため、スポロシストをオーシストから放出させることに適している。オーシストは、哺乳類及び鳥類の対象（subject）を含んで、任意の動物対象に感染する原生動物由来のものであればよい。用語の「動物」及び「動物対象」は哺乳類及び／又は鳥類の対象を含むが、これらに限定されない。好適な哺乳類の対象としては、霊長類の対象（例えば、ヒト対象及びサルの様なヒト以外の霊長類対象)、ブタ、ウシ（例えば、畜牛）、ヤギ、ウマ
、ネコ、ヒツジ、イヌ、ネズミ（例えば、マウス、ラット）及びウサギ目動物の対象が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
本明細書に用いられる用語の「鳥類」及び「鳥類対象」（即ち、「トリ」及び「トリ対象」）には任意の鳥類の種の雄及び雌が含まれるが、主として卵、食肉又は愛玩動物として商業的に飼育される家禽を包含することを意図している。従って、用語の「鳥類」及び「鳥類対象」は、特に、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、インコ、オウム、コッカトゥー（cockatoo）、オカメインコ、ダチョウ、エミューなどを包含するものとするが、これらに限定されない。特定の実施態様では、鳥類対象は、ニワトリ又はシチメンチョウの対象である。本明細書で用いるように、「鳥類」及び「鳥類対象」は、卵内の鳥類胚又は孵化後の鳥類を指してもよい。
【００２４】
用語の「凍結保存する」及び「凍結保存（すること）」とは、本発明の当業者にはよく理解されており、細胞及び他の材料を凍結し非常に定温で保存することを言う。
【００２５】
本発明は、一般的にスポロシストを原生動物のオーシストから放出させる方法に関する。そのような方法の用途としては、例えば、ワクチンの製造方法がある。原生動物の多くは、「オーシスト」として呼ばれるライフステージを形成する。本発明を実施して、アイメリア属、シクロスポラ（Cyclospora）属、トキソプラズマ（Toxoplasma）属、ネオスポラ（Neospora）属及びイソスポラ（Isospora）属を含むがこれらに限定されない、原生動物の任意の種のスポロシストを含有するオーシストから、スポロシストを放出させることができる。
【００２６】
本発明は、また、原生動物のオーシストからスポロゾイトを放出させる方法に関する。幾つかの原生動物は、「オーシスト」と呼ばれるが、オーシストの中にスポロゾイトを含有し、スポロシストを産生しない、ライフステージを形成する。そのような方法の用途としては、例えば細胞株感染、感染性アッセイ、ワクチン製造、又は診断アッセイを含むがこれらに限定されない、オーシストからスポロゾイトを放出させる方法がある。本発明を実施して、オーシスト内にスポロゾイトを含有する、クリプトスポリジウム（Cryptosporidium）属及びプラスモジウム（Plasmodium）属を含むがこれらに限定されない任意の種の寄生虫のオーシストからスポロゾイトを放出させることができる。
【００２７】
用語の「原生動物」、「オーシスト」、「スポロシスト」、「スポロゾイト」及び「メロゾイト」は、業界で認められた意味を有する。当業者には当然ながら、殺処理した原生動物、オーシスト、スポロシスト、スポロゾイト及びメロゾイトを使ってワクチンを製剤化できるが、特に指示がない限り、これらの用語は、弱毒化した形態を含んで、生きた（即ち、生存可能な）原生動物、オーシスト、スポロシスト、スポロゾイト及びメロゾイトを呼ぶものとする。当業者には当然ながら、通常死菌ワクチンは、最初に生存可能な生物を精製することによって製造される。同様に、遺伝子的に改変した原生動物、オーシスト、スポロシスト、スポロゾイト及びメロゾイトも本発明に包含される。
【００２８】
「アイメリア属」という用語は、アイメリア属の１つ又はそれ以上の種を指す。「アイメリア属」と言う用語は、鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ）又は哺乳類（例えば、ウシ、ヒツジ又はウサギ）の種に感染するアイメリア属の株又は種を含むが、これらに限定されない。そのようなアイメリア属の種としては、ニワトリに見出される、アイメリアテネラ、アイメリアアセルブリナ、アイメリアマキシマ、アイメリアネカトリックス、アイメリアミティス、アイメリアプレコックス、アイメリアミバティ及びアイメリアブルネッティを含むがこれらに限定されないアイメリア属；シチメンチョウに見出される、アイメリアメレアグリミティス、アイメリアアデノイデス、アイメリアガロパボニス、アイメリアディスパーサ、アイメリアイノキュア及びアイメリアスブロツンダを含むがこれに限定されないアイメリア属；及びウシに感染する、アイメリアボビス及びアイメリアツェルニィを含むがこれに限定されないアイメリア属；アイメリアアーサーター、アイメリアバクエンシス、アイメリアクランダリス、アイメリアファウレイ、アイメリアグラヌロサ、アイメリアイントリカータ（E.intricata）、アイメリアマルシカ、アイメリアオビノイダリス、アイメリアパリダ、アイメリアパルバ、アイメリアウェイブリッジエンシスなどの、しかしこれらに限定されないヒツジに感染するアイメリア属の種；及び、アイメリアインテスティナリス、アイメリアベイドフスキィ、アイメリアピリフォルミス、アイメリアコエキコラ、アイメリアイレシデュア、アイメリアフラベセンス、アイメリアエキシグア、アイメリアマグナ、アイメリアパーフォランス、アイメリアメディア及びアイメリアスティダイを含むがこれらに限定されないウサギに感染するアイメリア属の種が挙げられる。また、「アイメリア属」という用語には、野生型株、早熟で又は別の方法で選択された株、弱毒化株、及び例えば照射、化学処理などによって弱毒化されているオーシストを含むがこれらに限定されない上記のすべてのアイメリア属の種が含まれる。更に、用語の「アイメリア属」は、また、新たに発見されるアイメリア属の株又は種を含む。最後に、用語の「アイメリア属」は、特に断らない限り生存可能なアイメリア属を対象とするが、生存可能な及び殺処理されたアイメリア属を包含する。
【００２９】
アイメリアのオーシストを含む組成物の用途としては、コクシジウム症に対してトリを免疫にする方法がある。コクシジウム症に対してトリを免疫にする方法は業界に公知であり、卵内ワクチン接種法（例えば、Pfizer Inc.の米国特許第６，５００，４３８号；米国特許第６，４９５，１４６号；及び米国特許第６，６２７，２０５号；）及び孵化後ワクチン接種法（例えば、Auburn Research Foundation の 米国特許第３，１４７，１８６号；National Research Development Corporation の米国特許第５，０５５，２９２号及び米国特許第４，４３８，０９７号）が挙げられる。
【００３０】
「原生動物」という用語には、野生型株、早熟で又は別の方法で選択された株、弱毒化株、及び例えば照射、化学処理などによって弱毒化されたオーシストが含まれる。更に、「原生動物」という用語はまた、新たに発見される原生動物の株又は種を含む。最後に、用語の「原生動物」は、他に断らない限り生存可能な原生動物を対象とするが、生存可能な及び殺処理された原生動物を包含する。オーシストなどの「生産する」、「生産すること」又は「生産」という用語は、一般的に、動物からオーシストを採取する過程及び糞便物質からオーシストを精製する過程を指す。
【００３１】
アイメリア（Eimeria）属オーシストのようなオーシストを生産する方法は、業界で周知されている（例えば、Auburn Research Foundation の 米国特許第３，１４７，１８６号；Internationale Octrooi Maatschappij“Octropa”B.V. の米国特許第４，５４４，５４８号；Unilever Patent Holdingsの米国特許第４，８６３，７３１号；Pfizer, Inc.
の国際公開第００／５００７２号；Embrex, Inc.の国際公開第０３／０２０９１７号；及びNovus International, Inc.の国際公開第０２／３７９６１号；Hammond et al., (1944) Amer. J. Vet. Res. 5:70；Hill et al., (1961) J. Parasit. 47:357；Jackson, (1964) Parasitology 54:87；Lotze et al., (1961) J. Parasit. 47:588；Schmatz et al., (1984) J. Protozool. 31:181；Whitlock, (1959) Aust. Vet. J. 35:310；Kowalik et al., (1999) Parasitol. Res. 85:496-499 を参照）。
【００３２】
本発明の幾つかの実施態様に従って胞子形成オーシストからスポロシストを放出させる方法を、図１〜２を参照して今から説明する。最初に、胞子形成オーシストを熱的に、及び／又は化学的に、及び／又は酵素的に前処理してオーシストの壁を脆弱化する（ブロック１００）。熱的、化学的及び／又は酵素的処理によって引き起こされる脆弱化は、オーシスト壁をその後に加えられる剪断力による破壊を受け易くする。典型的な熱処理は、オーシストを３７℃と４１℃の間で０．５時間から２時間の加熱が含まれるが、これに限定されない。典型的な化学的処理は、次亜塩素酸塩溶液、又は溶存二酸化炭素及びシステイン塩酸塩、同様にタウロデオキシコール酸を含有する水溶液が含まれるが、これに限定されない。典型的な酵素的処理は、例えばペプシン及び種々のホスホリパーゼを含むが、これに限定されない。胞子形成オーシストの熱的、化学的及び／又は酵素的な前処理は任意であり、本発明の実施態様において必須ではない。更に、特定のタイプの胞子形成オーシストは、その壁を脆弱化する前処理を必要としない場合がある。熱、化学、及び／又は酵素処理の様々な組み合わせを使用することができる。
【００３３】
懸濁した胞子形成オーシストを含む水溶液を調製する（ブロック１１０）。典型的な水溶液としては、ハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、ＲＰＭＩ培地、ＤＭＥＭ培地、又はカゼインなどのタンパク質、若しくはカゼイン加水分解物若しくは大豆タンパク質加水分解物のようなタンパク質の加水分解物と組み合わせた上記の溶液が挙げられるが、これらに限定されない。次いで、水溶液には、オーシストの壁を破り、スポロシストをそれから放出させるのに十分な剪断力が加えられる（ブロック１２０）。放出されたスポロシストは、水溶液から回収される（ブロック１３０）。回収されたスポロシストは、次の処理に進めてもよく（ブロック１４０）、及び／又は凍結保存してもよい (ブロック１５０)。
【００３４】
図２を参照するに、本発明の幾つかの実施態様によれば、オーシストの水溶液に、オーシスト壁を破りそこからスポロシストを放出させるのに十分な剪断力を加える（ブロック１２０）ことは、その水溶液を加圧下（例えば、約２０００ｐｓｉと約６０００ｐｓｉの間）でMicrofluidizer（登録商標）プロセスチャンバーを通過させること（ブロック１２２）によって行われる。Microfluidizer（登録商標）プロセッサは、Microfluidics Corporation, 30 Ossipee Road, Newton, MA から入手可能である。Microfluidizer（登録商標）プロセッサは、精密に規定されたマイクロチャネル又はチャンバー中、溶液の高圧液流を超高速で衝突させることを可能にする［Constant Systems Ltd., Daventry, Northants, NN114SD、England, UKによって製造されたConstant Cell Disruption System を含め（しかしこれに限定されない）、その他の細胞破壊装置を使用することができる］。本発明の実施態様は、Microfluidizer（登録商標）プロセスチャンバーの使用に限定されない。
【００３５】
Microfluidizer（登録商標）プロセスチャンバーは、そこを通って流れる溶液に剪断と衝突を併せた力を加える。各チャンバーは固定形状で設計され、生成物の流れを高速度に加速するように構成される。固定した形状の構造によって、加えられる剪断力を精密に制御し、そしてモニターすることができる。
【００３６】
剪断力の制御は、チャンバー形状、チャンバー直径及び加える圧力の規定された組み合わせを使って達成される。制御されるプロセスの他の側面としては、粘性、比重、化学組成、浸透圧、ｐＨ及び温度などのパラメータを含み、使用する溶液の特性及び処方を挙げることができる。最適化された条件は、当業者の日常的な手法によって決定することができる。方法のコンシステンシーは、規定した条件下で緩衝液単独を用いて試験走行を行い、流速を測定することによって確保できる。そのような試験によって経時的に流量を追跡することにより、機器の磨耗又はシステム上の他の不良の兆候が得られ、システムを標準動作条件に戻すために、是正措置をとることができる。
【００３７】
本発明の幾つかの実施態様に従って使用される典型的なMicrofluidizer（登録商標）プロセッサチャンバーは、「Ｙ形」及び「Ｚ形」の構造を備えたチャンバーを含む。Ｙ形チャンバーは、１点に集まる２つの流入経路及び単一流路としての出口を含む。Ｚ形チャンバーは、Ｚ形の進路を備えた単一流路を有する。スポロシストの最適回収のためのチャンバー構造は、種によって変動する可能性がある。従って、種々の種類のオーシスト用に、種々のチャンバー構造が選択される。また、Microfluidizer（登録商標）プロセッサチャンバーを直列に配置してもよい。
【００３８】
また、Microfluidizer（登録商標）プロセッサチャンバーは、種々の直径を有してもよい。例えば、約７５μｍと約５００μｍの間の直径を使うことができる。また、異なる直径のMicrofluidizer（登録商標）プロセッサチャンバーを、直列に配置してもよい。
【００３９】
本発明者らは、溶液中のオーシストの直径と実質的に等しいか又はそれより大きい直径を有するチャンバーが、特に効果的であることを見出した。例えば、一般的に直径が約２０μｍから４０μｍであるアイメリアマキシマオーシストに対しては、直径が約３００μｍの反応チャンバーが好ましい。しかし、約７５μｍから約４００μｍの範囲の直径もまた使用できる。典型的には、使用される流路はＺ形構造であるが、Ｙ形構造又は他の構造を使用することもできる。流量は、通常、圧力が１０００〜５０００ｐｓｉの範囲では、１分当たり約５００ｍＬから約２０００ｍＬの範囲である。典型的に、アイメリアマキシマオーシストからスポロシストを放出させるために必要な剪断力の量（amount）は、１分当り約３．００×１０5ｓｅｃ-1から１分当り約１．５０×１０6ｓｅｃ-1の範囲である。
【００４０】
一般的に直径が約１５μｍから２５μｍであるアイメリアテネラオーシスト及び一般的に直径が約１０μｍから１５μｍであるアイメリアアセルブリナオーシストに対しては、直径が１００μｍのMicrofluidizer（登録商標）プロセッサ反応チャンバーが好ましい。しかし、約７５μｍから約４００μｍの範囲の直径も、また、使用することができる。使用される流路は、一般的にＺ形構造であるが、Ｙ形構造又は他の構造を使用してもよい。流量は、通常、圧力が１０００〜４０００ｐｓｉの範囲では、１分当たり約１００ｍＬから約２５０ｍＬの範囲である。典型的に、アイメリアテネラ又はアイメリアアセルブリナオーシストからスポロシストを放出させるために必要な剪断力の量は、１分当り約１．００×１０6ｓｅｃ-1から１分当り約３．００×１０6ｓｅｃ-1の範囲である。
【００４１】
何れの種のアイメリア属オーシストに対しても、特に、オーシストが熱的に、化学的に又は酵素的に前処理されている場合、スポロシストをオーシストから放出させるのにより低い剪断力を生じる条件を使うことができる。チャンバーの複数回通過を用いてもよいが、１回通過が好ましい。
【００４２】
本発明の実施態様は、特定のオーシストに対する特定のチャンバー直径に限定されない。本発明の実施態様は、すべてのタイプの構造及び直径を有するチャンバーを利用することができる。
【００４３】
図３を参照すると、Microfluidizer（登録商標）プロセッサ（２００）が図解されている。図解されたMicrofluidizer（登録商標）プロセッサ（２００）には、胞子形成オーシストの水溶液が入った注入口リザーバ（２０２）が含まれる。水溶液はポンプ（例えば、定圧増圧ポンプなど）（２０４）を介して加圧され、くみ上げられ、チャンバー（例えば、Ｙ形、Ｚ形チャンバーなど、）（２０６）に通される。加圧水溶液中のオーシストは、チャンバー（２０６）内で剪断及び衝突力が加えられ、オーシスト壁からスポロシストを放出させる。放出されたスポロシストを含む水溶液は、排出口リザーバ（２０８）に集められる。
【００４４】
図１に戻って参照するに、本発明の幾つかの実施態様によれば、オーシストから放出され回収されるスポロシストのパーセント（即ち、スポロシスト収率）を測定することができる（ブロック１６０）。スポロシスト収率は、例えば顕微鏡検査を介して評価してもよい。顕微鏡検査で回収されたとされるスポロシストは、その生存、非生存又はその混合のいずれかである可能性がある。しかし、生存可能な状態は、顕微鏡検査単独では判定できない可能性がある。従って、放出された生存可能なスポロシストのパーセント（即ち、生存能収率）の測定も行われる。生存能収率の測定には、インビボ手法を必要とする場合がある。適切なインビボ手法には、スポロシスト製剤を強制経口投与で鳥類対象に投与し、生じるオーシストの排出量を、同数の無傷のオーシストの投与で得られる排出量と比較することが含まれる。
【００４５】
図４を参照すると、回収されたスポロシストは、様々な方法で、そして様々な目的のために処理することができる。例えば、ワクチンは、回収されたスポロシストから製造され（ブロック１４１）、保管のために凍結保存することができる（ブロック１４２）。図５を参照すると、本発明の幾つかの実施態様によれば、回収されたスポロシストを処理して、そこからスポロゾイトを放出させる（即ち、脱嚢させる）ことができる（ブロック１４３）。放出されたスポロゾイトは、ワクチンの製造のために（ブロック１４４）、又は何か他の目的のために使用することができる。脱嚢したスポロゾイトから製造されたワクチンは、保管のために凍結保存できる（ブロック１４５）。
【００４６】
いかなる種類のオーシストでも、本発明の実施態様に従って処理することができる。特に好適なオーシストは、アイメリアマキシマオーシスト、アイメリアミティスオーシスト、アイメリアテネラオーシスト、アイメリアアセルブリナオーシスト、アイメリアブルネッティオーシスト、アイメリアネカトリックスオーシスト、アイメリアプレコックスオーシスト、アイメリアミバティオーシスト、及びそれらの任意の組合せ；アイメリアメレアグリミティスオーシスト、アイメリアアデノイデスオーシスト、アイメリアガロパボニスオーシスト、アイメリアディスパーサオーシスト、アイメリアイノキュアオーシスト、アイメリアスブロツンダオーシスト、及びにそれらの任意の組合せ；アイメリアツェルニィオーシスト、アイメリアボビスオーシスト、及びそれらの任意の組合せ；アイメリアアーサーターオーシスト、アイメリアバクエンシスオーシスト、アイメリアクランダリスオーシスト、アイメリアファウレイオーシスト、アイメリアグラヌロサオーシスト、アイメリアイントカタオーシスト、アイメリアマルシカオーシスト、アイメリアオビノイダリスオーシスト、アイメリアパリダオーシスト、アイメリアパルバオーシスト、アイメリアウェイブリッジエンシスオーシスト、及びそれらの任意の組合せ；アイメリアインテスティナリスオーシスト、アイメリアベイドフスキイオーシスト、アイメリアピリフォルミスオーシスト、アイメリアコエキコラオーシスト、アイメリアイレシデュアオーシスト、アイメリアフラベセンスオーシスト、アイメリアエキシグアオーシスト、アイメリアマグナオーシスト、アイメリアパーフォランスオーシスト、アイメリアメディアオーシスト、アイメリアスティダイオーシスト、及びそれらの任意の組合せを含むが、これらに限定されないアイメリア属オーシストである。
【００４７】
本発明を説明してきたが、単に例示目的でのみ本明細書に含められ、且つ本発明を制限することを意図しない以下の実施例により、本発明をより詳細に説明する。
【００４８】
〔実施例１〕
広範囲のパラメータ値にわたって、スポロシスト回収及びオーシスト破壊を描くために一連の実験を行った。各実験は、５００ｍＬのＨＢＳＳ中合計約２×１０8個の胞子形成オーシスト（ｍＬ当たり４×１０5胞子形成オーシスト）を使用した。サブサンプルを、Microfluidizer（登録商標）プロセッサ処理前に、計数のために取った。試験しようとするチャンバーの直径は、種によって、１）アイメリアマキシマ：２００、３００、４００μｍ直径のチャンバー；２）アイメリアテネラ：２００、３００μｍ直径のチャンバー；３）アイメリアアセルブリナ：１２５μｍ直径のチャンバー、に変えた。単回通過様式を使用した。圧力は、試験によって、２０００ｐｓｉｇから６０００ｐｓｉｇの範囲の圧力を使用した。Microfluidizer（登録商標）プロセッサを通過させた後、全量をＨＢＳＳで１Ｌに調整し、サンプルを混合し、そして計数用のサブサンプルを取った。典型的には、３つの複製の操作を各設定条件を使用して作った。
【００４９】
回収されたスポロシストの割合及び破壊されたオーシストの割合は、実験ごとに血球計カウントを使って測定した。理想的には、回収されたスポロシストの割合及び破壊されたオーシストの両割合は、１００％の筈である。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
アイメリアアセルブリナ１のMicrofluidizer（登録商標）実験の結論：
１） アイメリアアセルブリナのオーシストが破壊される割合は、１２５μｍチャンバーを使って、圧力が高まるに従って増加することが観察された。
２）スポロシスト回収の最も良い結果は、１２５μｍチャンバーを使って５０００ｐｓｉｇで得られた（５４％回収）。
【００５２】
【表２】
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【００５３】
アイメリアマキシマ１のMicrofluidizer（登録商標）実験の結論：
１）スポロシスト放出方法は、チャンバー直径及び試験圧力の試験したほぼ全ての組み合わせにおいて、かなり良く稼動した。
２）３００μｍチャンバーと３０００ｐｓｉｇの圧力の組み合わせは、Microfluidizer（登録商標）プロセッサを使用したアイメリアマキシマ１スポロシスト生産にとって適切な初期標準条件を与えた。
【００５４】
【表３】
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【００５５】
アイメリアマキシマ２のMicrofluidizer（登録商標）プロセッサ実験の結論：
１）スポロシストの放出方法は、チャンバー直径及び試験圧力のほぼ全ての組み合わせにおいて、かなり良く稼動した。
２）３００μｍチャンバーと３０００ｐｓｉｇの圧力の組み合わせが、最適であると考えられた。
【００５６】
【表４】
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【００５７】
アイメリアテネラ１のMicrofluidizer（登録商標）プロセッサ実験の結論：
１）アイメリアテネラスポロシストの回収及びオーシストの破壊の割合は、予想通り、試験した両チャンバー共に、圧力の上昇に従って増加することが観察された。
２）最良の結果は、１２５μｍチャンバーを用いた４０００ｐｓｉｇで得られた。
【００５８】
本発明の実施態様は、スポロシストの回収について、組織粉砕機、ガラスビーズ及び薬剤によって放出させる従来の方法よりも再現性があり、規模拡大可能な代替法を提供する。アイメリアマキシマ１及びアイメリアマキシマ２からのスポロシストの本質的に定量的な回収が提供される。ほぼ定量的なアイメリアテネラスポロシストの回収が観察される。アイメリアアセルブリナオーシストの回収率は、約４０〜５０％である。
【００５９】
〔実施例２〕
スポロシストを放出させるために細胞破壊装置を使用する場合、放出されたスポロシストの生存率を確保するため、放出条件の最適化が必要である。生存能力は、スポロシストの用量をトリに投与し、感染から生じる関連のオーシストの排出量を計数することによって評価することができる。細胞破砕装置のチャンバー形状及び圧力が変わる条件下では、生存可能でない条件でスポロシストをオーシストから効率的に放出させ得る。即ち、そのスポロシストの投与でトリに起こさせる感染は、ガラスビーズのような従来の方法によって放出されたスポロシストを使用して行った場合と比較して、減少する可能性がある。生存能力のあるスポロシストの生産を確実にするためには、チャンバーの形状及び圧力の条件は、慎重に評価されなければならない。
【００６０】
スポロシストを、ガラスビーズ又は２０００ｐｓｉ若しくは５０００ｐｓｉでの１００Ｚチャンバーで構成されたMicrofluidizer（登録商標）プロセッサのいずれかを用いて、アイメリアアセルブリナオーシストから放出させた。次にそれぞれの方法によって放出されたスポロシストを、１用量当たり１０００、３０００及び５０００個のスポロシストを用いる用量反応モデルでニワトリに投与した。それぞれの処理につき３つの複製の檻（pens）を１複製当り９羽のトリで使った。スポロシスト５０００個に相当する、１用量当たり１２５０個の胞子形成オーシストのオーシストコントロールも、試験に含めた。オーシストは、強制投与後４日から７日まで、クエン酸（１０％）、過酸化水素（０．７５％）及びプロピオン酸（０．２５％）の水溶液に集めた。オーシストを含む糞便は、水を使って一様な容量にし、混合し、サブサンプルを取った。オーシストは、McMasterの方法を使って計数した。結果を下表に示す。
【表５】
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【００６１】
結果は、Microfluidizer（登録商標）プロセッサを用いて２０００ｐｓｉで生産されたスポロシストは、それぞれの用量で、従来のガラスビーズを使って生産されたスポロシストと同様の生存能力であったが、一方Microfluidizer（登録商標）プロセッサを用いて５０００ｐｓｉで生産されたスポロシストは、それぞれの用量で、ガラスビーズを使って生産されたスポロシストよりも著しく低い生存能であったことを示す。生存可能なスポロシストを与える圧力の範囲は、それ故、実験的に決定されなければならない。
【００６２】
〔実施例３〕
アイメリアアセルブリナ（長さ：約１２μｍ）及びアイメリアテネラ（長さ約２０μｍ）を含む、より小さいアイメリア属は、より大きいアイメリアマキシマ種（長さ：約４０μｍ）より、剪断を受けにくいことが観察される。Microfluidizer（登録商標）システムにおいて圧力を高めることによってより高いレベルの剪断を生じさせると、どの種についてもオーシストからのスポロシストの顕微鏡的収率の改善が可能であるが、特により小さい種の効率的な放出に必要である；しかし、圧力の上昇は、また、生存率を低下させる可能性がある。生存率を改善するために圧力を下げることは、本質的に収率を犠牲にする。顕微鏡的収率と生存率の両者の改善を提供するために、オーシストの壁のコンディションを調整する前処理が開発されている。
【００６３】
胆汁塩(タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）)、嫌気性環境（炭酸ガス気泡）及び温かい温度（３７℃で１時間）の組み合わせを使用して、オーシストの前処理の効果を調べるための検討を行った。本検討の目的は、放出されたスポロシストのインビトロ回収率（顕微鏡検査を介した）及びインビボ生存能力（オーシストの排出を介した）を測定することである。
【００６４】
以下の処理群を確立した：（１） アイメリアアセルブリナ胞子形成オーシストコントロール；用量当たり１０００個の胞子形成オーシスト；（２）ガラスビーズで生産のスポロシストコントロール；用量当たり４０００個のスポロシスト；（３）前処理無しで、Microfluidizer（登録商標）で生産のスポロシストコントロール；１００μｍチャンバー；２０００ｐｓｉ；用量当たり４０００個のスポロシスト；（４）タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）（０．７５％)及び炭酸ガス気泡を含む３７℃で１時間の前処理をして、Microfluidizer（登録商標）で生産したスポロシスト；１００μｍチャンバー；２０００ｐｓｉ；用量当たり４０００個のスポロシスト；（５）ＴＤＣＡ（０．７５％)及び炭酸ガス気泡を含む３７℃で１時間の前処理をして、Microfluidizer（登録商標）で生産したスポロシスト；１００μｍチャンバー；３０００ｐｓｉ；用量当たり４０００個のスポロシスト；（６）ＴＤＣＡ（０．７５％)及び炭酸ガス気泡を含む３７℃で１時間の前処理をして、Microfluidizer（登録商標）で生産したスポロシスト；１００μｍチャンバー；４０００ｐｓｉ；用量当たり４０００個のスポロシスト。残留する無傷のオーシスト及びオーシスト殻体は、パーコール（Percoll）を用いてスポロシスト調製物から除去した。用量コントロール当り１０００個のオーシストに相当する用量にするために、各オーシストは４個のスポロシストを含むものとして、用量当り４０００個のスポロシストでスポロシスト用量をトリに送達した。
【００６５】
オーシストからのスポロシストの解放は顕微鏡的に評価した。Microfluidizer（登録商標）で生産した材料を、下表に要約する。
【表６】
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【００６６】
前処理は、２０００ｐｓｉでのスポロシストの回収を約６倍改善し、高い圧力では、顕微鏡的回収の更なる改善が観察された。
【００６７】
インビボ評価のため、それぞれの処理に、檻当り９羽の鳥の入った５つの複製檻を使用した。処理物は強制経口投与により素嚢（crop）に投与した。糞便は、強制投与後４日から７日まで、クエン酸（１０％）、過酸化水素（０．７５％）及びプロピオン酸（０．２５％）の水溶液に集めた。オーシストを含む糞便は、水を使って一様な容量にし、混合し、サブサンプルを取った。オーシストは、McMasterの方法を使用して計数した。
【００６８】
前述の放出方法を用いて生産されたスポロシストの生存能力は、１羽当たりのオーシストの排出量を、ガラスビーズで生産したスポロシストコントロールと比較することによって評価した。結果を下表に要約する。
【表７】
0005690488.tif 000008
【００６９】
トリ１羽当りの平均オーシスト排出では、処理間に有意差は無かった（ｐ＞０．０５）。前処理は、広範囲の圧力にわたって、放出されたスポロシストの生存能力を改善した。いくつかのケースでは、Microfluidizer（登録商標）法によって前処理されたオーシストから放出されたスポロシストの生存能力は、ガラスビーズ放出スポロシストのそれより数値的に高かった。全般的な前処理の効果は、放出工程におけるオーシストからの回収及び生存能力の両者を改善し、従って２重の効果があった。
【００７０】
前記は、本発明を例証するためのものであり、それを限定するものと解釈すべきではない。本発明の２、３の典型的な実施態様を開示しているが、当業者は、本発明の新しい教示及び利点から実質的に逸脱することなく、典型的な実施態様に多くの改変が可能であることを当然ながら容易に理解する。従って、その様なすべての改変は、請求項に定義される通り、本発明の範囲内に含まれるものとする。本発明は、その中に含むべき請求項の均等物を伴う添付の特許請求の範囲によって定義される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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