(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列における７０３位のアスパラギン酸がグリシンまたはセリンに置換されているアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列（ただし、配列番号２で表されるアミノ酸配列における７０３位のアスパラギン酸のグリシンまたはセリンへの置換は維持されている）からなり、かつＧａｌ−Ｇｌｃまたはその誘導体にフコシル基を導入する活性を有する、タンパク質であって、
Ｇａｌ−Ｇｌｃまたはその誘導体にフコシル基を導入する活性が以下（ａ）および（ｂ）からなる群より選ばれる活性である、タンパク質：
（ａ）ラクト−Ｎ−ビオースＩ〔Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ〕、またはラクト−Ｎ−ビオースＩ〔Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ〕を非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ルイスａ抗原〔Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ〕、またはルイスａ抗原〔Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ〕を非還元末端に有する糖鎖を生成する活性；および
（ｂ）Ｎ−アセチルラクトサミン〔Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ〕、またはＮ−アセチルラクトサミン〔Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ〕を非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ルイスｘ抗原〔Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ〕、またはルイスｘ抗原〔Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ〕を非還元末端に有する糖鎖を生成する活性。
【請求項２】
前記糖鎖が、二糖、三糖または四糖である、請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
請求項１または２記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項５】
請求項４記載の発現ベクターが導入された形質転換体。
【請求項６】
請求項５記載の形質転換体を培地中で培養して、請求項１または２記載のタンパク質を生成することを含む、タンパク質の製造方法。
【請求項７】
請求項１または２記載のタンパク質の存在下における、フコシル化されたＧａｌ−Ｇｌｃまたはその誘導体の製造方法であって、
当該製造方法が以下（ａ）および（ｂ）からなる群より選ばれる方法である、製造方法：
（ａ）ラクト−Ｎ−ビオースＩ〔Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ〕、またはラクト−Ｎ−ビオースＩ〔Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ〕を非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ルイスａ抗原〔Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ〕、またはルイスａ抗原〔Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ〕を非還元末端に有する糖鎖を生成する方法；および
（ｂ）Ｎ−アセチルラクトサミン〔Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ〕、またはＮ−アセチルラクトサミン〔Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ〕を非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ルイスｘ抗原〔Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ〕、またはルイスｘ抗原〔Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ〕を非還元末端に有する糖鎖を生成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フコシル化されたＧａｌ−Ｇｌｃまたはその誘導体の製造方法などに関する
。
【背景技術】
【０００２】
ルイス（Ｌｅ）式血液型抗原決定基は、複合糖質糖鎖の非還元末端に頻繁に見られ、ヒ
トなどの高等動物で様々な役割を果たしている。マウス胚の発生過程では、段階特異的に
Ｌｅｘ［Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ］抗原の発現が観察され、この
一過的発現は胚細胞緊密化に関与していると考えられている。Ｌｅｘ抗原の発現は脳にお
いても制御されていることが見出され、中枢神経系の発達に重要であると推定されている
。通常の発生過程のみならず、Ｌｅａ［Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ
］およびＬｅｂ［Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ］抗原
の発現量の増加は、癌の進行および悪性度と相関していることがよく知られている。さら
に、シアリルＬｅｘ抗原は、炎症部位での白血球ローリングを制御するセレクチンリガン
ドとして作用している。
【０００３】
Ｌｅ抗原は、動物における細胞間情報伝達に限らず、宿主と病原体との相互作用にも関
わっている。Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉではリポ多糖（ＬＰＳ）にＬｅ抗
原が発現しており、このＬｅ抗原はＨ．ｐｙｌｏｒｉが宿主の上皮細胞に接着する際の足
場として働くことが知られている。さらに、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉのＬＰＳ上のＬｅｘ抗原は
、宿主のＤＣ−ＳＩＧＮ（樹状細胞特異的細胞間接着分子−３−グラビング非インテグリ
ン）を介して免疫応答を抑制する働きがあることが知られている。ＤＣ−ＳＩＧＮは、マ
ンノースを含む複合糖質を認識するＣ型レクチンであり、通常は様々な病原菌を捕らえて
Ｔ細胞に病原菌の抗原を提示する役割を有するが、近年の研究によって、ＤＣ−ＳＩＧＮ
はＬｅ抗原により高い親和性を示すことが示され、例えば、Ｌｅｘ抗原を有する糖タンパ
ク質やミルクオリゴ糖はヒト免疫不全ウイルスＩ型がＤＣ−ＳＩＧＮに結合するのを阻害
することが知られている。
【０００４】
以上のことは、Ｌｅ抗原を含むオリゴ糖が、糖鎖機能研究や医薬品応用に不可欠である
ことを示している。オリゴ糖を精密合成するには、グリコシド結合の位置および立体の正
確な制御が要求される。酵素合成法はアノマー（立体化学的）配置を完璧に制御する点で
、また、面倒な保護・脱保護を行わずに比較的高い位置特異性を有する点で、化学合成法
より優れていると考えられる。酵素合成では一般的にグリコシルトランスフェラーゼとグ
リコシダーゼを利用する（非特許文献１、２）。グリコシルトランスフェラーゼは、一般
に厳密な位置特異性および受容体特異性を示し、オリゴ糖の精密合成には優れた触媒であ
る。近年、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ由来α−１，３−フコシルトランスフェラーゼを利用してＬ
ｅｘトリサッカライドを効率的に合成可能であることが報告された（非特許文献３）。し
かしながら、文献中にも記述されているように、グリコシルトランスフェラーゼの利用に
は高価な糖ヌクレオチドもしくは糖ヌクレオチド再生システムが必要であるため、大規模
オリゴ糖生産（高濃度オリゴ糖生産）への利用が難しい。一方で、グリコシダーゼの糖転
移活性を利用した合成は、反応の簡便性および多様性のため、現在まで効率的に利用され
てきている（非特許文献１、２）。特に１０年ほど前に開発されたグリコシンターゼと呼
ばれる新しいタイプの酵素を利用した合成法は特筆すべきである（非特許文献４〜６）。
グリコシンターゼは、グリコシダーゼの加水分解活性を欠損させた変異体であるが、基質
として適切な糖供与体（フッ素のような脱離基を有する糖）を用いると糖転移反応を触媒
する。このように、グリコシダーゼおよびその変異体は、オリゴ糖を合成する際の有効な
手段となってきた（非特許文献２、７〜９）。しかしながら、グリコシダーゼが触媒する
糖転移反応は、一般的に位置選択性および受容体特異性がそれほど高くなく、反応産物は
様々な長さや様々な結合を持つオリゴ糖の混合物として得られてしまうため、精密合成と
いう点では克服すべき課題が残されていた。これらのことを考えると、グリコシド結合を
精密（立体・位置特異的）に合成するためには、グリコシド結合および脱離基（転移反応
の際に受容体となる）の両方に対して厳密な特異性を有するグリコシダーゼを見つけるこ
とが極めて重要であることとなる。
【０００５】
以前の研究において、我々は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ由来
の２種類のα−Ｌ−フコシダーゼを単離し、それらが厳密な基質特異性を有していること
を明らかにした。その１つは１，２−α−Ｌ−フコシダーゼ（ＢｂＡｆｃＡ）であり、複
合糖質糖鎖の非還元末端に存在するＦｕｃα１−２Ｇａｌ結合を特異的に分解する（非特
許文献１０〜１２）。もう１つは、１，３−１，４−α−Ｌ−フコシダーゼ（ＢｂＡｆｃ
Ｂ）で、ＬｅａおよびＬｅｘ抗原を含む様々な複合糖質糖鎖に存在するα−１，３／４−
フコシル結合に特異的に作用する（非特許文献１３）。我々は、これら２種のα−Ｌ−フ
コシダーゼをオリゴ糖の精密酵素合成に利用することを試み、まず１，２−α−Ｌ−フコ
シダーゼ（ＢｂＡｆｃＡ）を１，２−α−Ｌ−フコシンターゼに変換することに成功し報
告した（非特許文献１４）。この酵素は、供与体にβ−Ｌ−フコピラノシルフルオリド（
ＦｕｃＦ）、受容体にラクトース（Ｌａｃ）を用いて反応させると、２’−フコシルラク
トース（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ，２’−ＦＬ）のみを特異的に合成し、副
産物は全く生じなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｈａｎｃｏｃｋ  ＳＭ，Ｖａｕｇｈａｎ  ＭＤ，Ｗｉｔｈｅｒｓ  ＳＧ．２００６．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅｓ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．１０：５０９−５１９．
【非特許文献２】Ｗａｎｇ  ＬＸ，Ｈｕａｎｇ  Ｗ．２００９．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．１３：５９２−６００．
【非特許文献３】Ｗａｎｇ  Ｗ，Ｈｕ  Ｔ，Ｆｒａｎｔｏｍ  ＰＡ，Ｚｈｅｎｇ  Ｔ，Ｇｅｒｗｅ  Ｂ，Ｄｅｌ  Ａｍｏ  ＤＳ，Ｇａｒｒｅｔ  Ｓ，Ｓｅｉｄｅｌ  ＲＤ  ＩＩＩ，Ｗｕ  Ｐ．２００９．Ｃｈｅｍｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｌｅｗｉｓ  Ｘ  ｇｌｙｃａｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０６：１６０９６−１６１０１．
【非特許文献４】Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ  ＬＦ，Ｗａｎｇ  Ｑ，Ｗａｒｒｅｎ  ＲＡＪ，Ｗｉｔｈｅｒｓ  ＳＧ．１９９８．Ｇｌｙｃｏｓｙｎｔｈａｓｅｓ：ｍｕｔａｎｔ  ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．１２０：５５８３−５５８４．
【非特許文献５】Ｍａｌｅｔ  Ｃ，Ｐｌａｎａｓ  Ａ．１９９８．Ｆｒｏｍ  β−ｇｌｕｃａｎａｓｅ  ｔｏ  β−ｇｌｕｃａｎｓｙｎｔｈａｓｅ：ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  α−ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅｓ  ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ａ  ｍｕｔａｎｔ  ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｉｔｓ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４４０：２０８−２１２．
【非特許文献６】Ｈｏｎｄａ  Ｙ，Ｋｉｔａｏｋａ  Ｍ．２００６．Ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｇｌｙｃｏｓｙｎｔｈａｓｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｎ  ｉｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８１：１４２６−１４３１．
【非特許文献７】Ｕｍｅｋａｗａ  Ｍ，Ｈｕａｎｇ  Ｗ，Ｌｉ  Ｂ，Ｆｕｊｉｔａ  Ｋ，Ａｓｈｉｄａ  Ｈ，Ｗａｎｇ  ＬＸ，Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｋ．２００８．Ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｍｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ  ｅｎｄｏ−β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ  ｓｈｏｗ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｎｔｈａｓｅ−ｌｉｋｅ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８３：４４６９−４４７９．
【非特許文献８】Ｓｈａｉｋｈ  ＦＡ，Ｗｉｔｈｅｒｓ  ＳＧ．２００８．Ｔｅａｃｈｉｎｇ  ｏｌｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｎｅｗ  ｔｒｉｃｋｓ：ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅｓ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８６：１６９−１７７．
【非特許文献９】Ｋｉｔａｏｋａ  Ｍ，Ｈｏｎｄａ  Ｙ，Ｆｕｓｈｉｎｏｂｕ  Ｓ，Ｈｉｄａｋａ  Ｍ，Ｋａｔａｙａｍａ  Ｔ，Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｋ．２００９．ＣＯｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ  ｉｎｔｏ  ｃａｔａｌｙｓｔｓ  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  ａ  ｇｌｙｃｏｓｙｎｔｈａｓｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉ  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：２３−３９．
【非特許文献１０】Ｋａｔａｙａｍａ  Ｔ，Ｓａｋｕｍａ  Ａ，Ｋｉｍｕｒａ  Ｔ，Ｍａｋｉｍｕｒａ  Ｙ，  Ｈｉｒａｔａｋｅ  Ｊ，Ｓａｋａｔａ  Ｋ，Ｙａｍａｎｏｉ  Ｔ，Ｋｕｍａｇａｉ  Ｈ，Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｋ．２００４．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  １，２−α−Ｌ−ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ（ＡｆｃＡ），ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ（ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ９５）．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：４８８５−４８９３．
【非特許文献１１】Ｋａｔａｙａｍａ  Ｔ，Ｆｕｊｉｔａ  Ｋ，Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｋ．２００５．Ｎｏｖｅｌ  ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅｓ  ａｃｔｉｎｇ  ｏｎ  ｓｕｇａｒ  ｃｈａｉｎｓ  ｏｆ  ｍｕｃｉｎ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｅｎｇ．９９：４５７−４６５．
【非特許文献１２】Ｎａｇａｅ  Ｍ，  Ｔｓｕｃｈｉｙａ  Ａ，Ｋａｔａｙａｍａ  Ｔ，Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｋ，Ｗａｋａｔｓｕｋｉ  Ｓ，Ｋａｔｏ  Ｒ．２００７．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  １，２−α−Ｌ−ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８２：１８４９７−１８５０９．
【非特許文献１３】Ａｓｈｉｄａ  Ｈ，Ｍｉｙａｋｅ  Ａ，Ｋｉｙｏｈａｒａ  Ｍ，Ｗａｄａ  Ｊ，Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｅ，Ｋｕｍａｇａｉ  Ｈ，Ｋａｔａｙａｍａ  Ｔ，Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｋ．２００９．Ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  α−Ｌ−ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ａｒｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｍｉｌｋ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．１９：１０１０−１０１７．
【非特許文献１４】Ｗａｄａ  Ｊ，Ｈｏｎｄａ  Ｙ，Ｎａｇａｅ  Ｍ，Ｋａｔｏ  Ｒ，Ｗａｋａｔｓｕｋｉ  Ｓ，Ｋａｔａｙａｍａ  Ｔ，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  Ｈ，Ｋｕｍａｇａｉ  Ｈ，Ｋｉｔａｏｋａ  Ｍ，Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｋ．２００８．１，２−α−Ｌ−Ｆｕｃｏｓｙｎｔｈａｓｅ：ａ  ｇｌｙｃｏｓｙｎｔｈａｓｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｎ  ｉｎｖｅｒｔｉｎｇ  α−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５８２：３７３９−３７４３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＬｅａおよびＬｅｘ抗原を含む様々な糖鎖を特異的に製造可能な方法を開発
することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、オリゴ糖精密合成を目的としたグリコシンターゼ技術の可能性を広げる
ために、ＢｂＡｆｃＢを１，３−１，４−α−Ｌ−フコシンターゼ化し、次に、その位置
特異性および受容体特異性について検討した。その結果、本酵素が、Ｉ型糖鎖（Ｇａｌβ
１−３ＧｌｃＮＡｃ，ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｂｉｏｓｅ  Ｉ，ＬＮＢ）にＬｅａ抗原決定基を
、またＩＩ型糖鎖（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ，Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉ
ｎｅ，ＬａｃＮＡｃ）にＬｅｘ抗原決定基を導入するのに有効な手段となることなどを見
出し、本願発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕配列番号２で表されるアミノ酸配列における７０３位のアスパラギン酸がグリシンまたはセリンに置換されているアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列（ただし、配列番号２で表されるアミノ酸配列における７０３位のアスパラギン酸のグリシンまたはセリンへの置換は維持されている）からなり、かつＧａｌ−Ｇｌｃまたはその誘導体にフコシル基を導入する活性を有する、タンパク質。
〔２〕Ｇａｌ−Ｇｌｃまたはその誘導体が、下記式（１ａ）または（１ｂ）：
【化１】
0005834484.tif 000002
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、各々独立して、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６炭化水素基、置換されていてもよいＣ３〜Ｃ１１芳香族基、アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジ（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジ（Ｃ３〜Ｃ１１芳香族）アミノ基、置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）（Ｃ３〜Ｃ１１芳香族）アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジ（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素−カルボニル）アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジ（Ｃ３〜Ｃ１１芳香族−カルボニル）アミノ基、ヒドロキシ基、置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）オキシ基、置換されていてもよい（Ｃ３〜Ｃ１１芳香族）オキシ基、またはハロゲン原子を示し、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、各々独立して、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６炭化水素基、置換されていてもよいＣ３〜Ｃ１１芳香族基、アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジ（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジ（Ｃ３〜Ｃ１１芳香族）アミノ基、置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）（Ｃ３〜Ｃ１１芳香族）アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジ（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素−カルボニル）アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジ（Ｃ３〜Ｃ１１芳香族−カルボニル）アミノ基、ヒドロキシ基、置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）オキシ基、置換されていてもよい（Ｃ３〜Ｃ１１芳香族）オキシ基、またはハロゲン原子、あるいは１以上の糖残基を示す。）で表される糖化合物である、〔１〕のタンパク質。
〔３〕Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が、各々独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、（ヒドロキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、アミノ基、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ基、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル−カルボニル）アミノ基、ヒドロキシ基、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）オキシ基を示し、  Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７が、各々独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、（ヒドロキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、アミノ基、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ基、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル−カルボニル）アミノ基、ヒドロキシ基、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）オキシ基、または１以上の糖残基を示す、〔１〕または〔２〕のタンパク質。
〔４〕Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７から選ばれる３つの基が、各々独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、（ヒドロキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、アミノ基、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ基、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル−カルボニル）アミノ基、ヒドロキシ基、または（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）オキシ基を示し、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７から選ばれる残りの１つの基が、１以上の糖残基を示す、〔３〕のタンパク質。
〔５〕前記活性が、Ｇａｌ−Ｇｌｃまたはその誘導体にフコシル基を導入して、下記式（２ａ）または（２ｂ）：
【化２】
0005834484.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、前記と同じである。Ｆｕｃは、フコシル基を示す。）
で表される糖化合物を生成する活性である、〔２〕〜〔４〕のいずれかのタンパク質。
〔６〕前記活性が、ラクト−Ｎ−ビオースＩ〔Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ〕、またはラクト−Ｎ−ビオースＩ〔Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ〕を非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ルイスａ抗原〔Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ〕、またはルイスａ抗原〔Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ〕を非還元末端に有する糖鎖を生成する活性である、〔１〕のタンパク質。
〔７〕前記活性が、Ｎ−アセチルラクトサミン〔Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ〕、またはＮ−アセチルラクトサミン〔Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ〕を非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ルイスｘ抗原〔Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ〕、またはルイスｘ抗原〔Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ〕を非還元末端に有する糖鎖を生成する活性である、〔１〕のタンパク質。
〔８〕前記糖鎖が、二糖、三糖または四糖である、〔１〕〜〔７〕のいずれかのタンパク質。
〔９〕〔１〕〜〔８〕のいずれかのタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔１０〕〔９〕のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
〔１１〕〔１０〕の発現ベクターが導入された形質転換体。
〔１２〕〔１１〕の形質転換体を培地中で培養して、〔１〕〜〔８〕のいずれかのタンパク質を生成することを含む、タンパク質の製造方法。
〔１３〕〔１〕〜〔８〕のいずれかのタンパク質の存在下において、Ｇａｌ−Ｇｌｃまたはその誘導体にフコシル基を導入して、フコシル化されたＧａｌ−Ｇｌｃまたはその誘導体を得ることを含む、フコシル化されたＧａｌ−Ｇｌｃまたはその誘導体の製造方法。
〔１４〕ラクト−Ｎ−ビオースＩ〔Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ〕、またはラクト−Ｎ−ビオースＩ〔Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ〕を非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ルイスａ抗原〔Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ〕、またはルイスａ抗原〔Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ〕を非還元末端に有する糖鎖を生成する方法である、〔１３〕の方法。
〔１５〕Ｎ−アセチルラクトサミン〔Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ〕、またはＮ−アセチルラクトサミン〔Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ〕を非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ルイスｘ抗原〔Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ〕、またはルイスｘ抗原〔Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ〕を非還元末端に有する糖鎖を生成する方法である、〔１３〕の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ＬｅａおよびＬｅｘ抗原を含む様々な糖鎖を特異的に製造することが
できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＢｂＡｆｃＢの触媒性求核基としてＡｓｐ−７０３を示す図〔ＢｂＡｆｃＢおよび他の１，３−１，４−α−Ｌ−フコシダーゼ（ＧＨ２９−Ｂ）の配列アライメント〕を示す図である。アライメントは、ＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｔｏｐ−ｊ．ｈｔｍｌ）およびＢｏｘＳｈａｄｅ  ３．２１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＢＯＸ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）により作成した。Ｆｕｃ認識に関与すると推測されるＢｉＡｆｃＢの残基について、アステリスクで印を付す。ＢｉＡｆｃＢのＡｓｐ−１７２に対応するＢｂＡｆｃＢのＡｓｐ−７０３を、ボックスで囲む。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来の１，３−１，４−α−Ｌ−フコシダーゼ（Ｚｅｌｅｎｙ  ｅｔ  ａｌ．２００６）；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．１４２由来の１，３−１，４−α−Ｌ−フコシダーゼ（Ｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９２）。
【図２】図２は、ＢｂＡｆｃＢ  Ｄ７０３変異体によるＬｅａ三糖の合成を示す図である。野生型酵素およびＤ７０３変異体（１７μＭ）を、１００ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ  ＦｕｃＦ（供与体）および１００ｍＭ  ＬＮＢ（受容体）からなる反応混合液（５０μｌ）中において、３０℃で１０分間インキュベートした。標品の糖（Ｓｔｄ．）は、ラクト−Ｎ−ビオースＩ（ＬＮＢ）およびルイスａ（Ｌｅａ）である。
【図３】図３は、ＢｂＡｆｃＢ  Ｄ７０３変異体によるＬｅｘ三糖の合成を示す図である。１００ｍＭ  ＬａｃＮＡｃを受容体として用いたことを除いて、Ｌｅｘ合成のために、図２と同様の反応を行った。反応生成物は、ＨＰＬＣ−ＵＶ検出によって解析した。標品の糖（Ｓｔｄ．）は、Ｎ−アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）、ルイスｘ（Ｌｅｘ）である。
【図４】図４は、ＢｂＡｆｃＢ  Ｄ７０３Ｓ変異体により触媒される合成反応のｐＨプロフィールを示す図である。反応を、２０ｍＭ  ＦｕｃＦおよび２００ｍＭ  ＬＮＢを含有する以下の緩衝液中において、３０℃で５分間行った。用いた緩衝液は、１００ｍＭ  クエン酸−ＮａＯＨ（ｐＨ４．０−５．０，白丸）、１００ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．０−６．５，白三角）および１００ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５−８．０，白四角）であった。ｐＨ５．０（ＭＥＳ緩衝液）での活性を、１００％とした。
【図５】図５は、ＢｂＡｆｃＢ  Ｄ７０３Ｓ変異体によるＬｅａ三糖の合成を示す図である。反応は、４０ｍＭ  ＦｕｃＦ（供与体）、２００ｍＭ  ＬＮＢ（受容体）および１７μＭ  Ｄ７０３Ｓ変異体を含有する１００ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）中において、３０℃で４０分間行った。コントロール実験については、基質または酵素のいずれかを、反応から省略した。反応生成物は、ＨＰＬＣ−ＣＡＤによって解析した。Ｌ−フコース（Ｆｕｃ）、ラクト−Ｎ−ビオースＩ（ＬＮＢ）およびルイスａ（Ｌｅａ）のピークを示す。
【図６】図６は、ＢｂＡｆｃＢ  Ｄ７０３Ｓ変異体によるＬｅｘ三糖の合成を示す図である。１００ｍＭ  ＬａｃＮＡｃを受容体として用いたことを除いて、図５と同様のセットの反応を、Ｌｅｘの合成について行った。反応生成物は、ＨＰＬＣ−ＣＡＤによって解析した。Ｌ−フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ−アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）、およびルイスｘ（Ｌｅｘ）のピークを示す。
【図７】図７は、Ｌｅａ三糖についての合成反応の飽和曲線を示す図である。反応を、１７μＭ  Ｄ７０３Ｓの存在下で、ＦｕｃＦ（２０ｍＭ，白丸；６０ｍＭ，白三角）およびＬＮＢ（０−３００ｍＭ）を含有する１００ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）中において、３０℃で５分間行った。反応生成物は、ＨＰＬＣ−ＵＶ検出によって解析した。速度論的パラメータを、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ  ４．０（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、実験データをＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ方程式にカーブフィッティングすることにより算出した。
【図８】図８は、Ｌｅｘ三糖についての合成反応の飽和曲線を示す図である。ＬａｃＮＡｃ（０−３００ｍＭ）を受容体として用いたことを除いて、図７と同様の反応を、Ｌｅｘの合成のために行った。反応生成物は、ＨＰＬＣ−ＵＶ検出によって解析した。速度論的パラメータを、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ  ４．０（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、実験データをＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ方程式にカーブフィッティングすることにより算出した。
【図９】図９は、ＢｂＡｆｃＢ  Ｄ７０３Ｓ変異体により触媒されたＬｅａ合成のタイムコースを示す図である。反応は、Ｄ７０３Ｓ変異体（１７μＭ）の存在下で、４０ｍＭ  ＦｕｃＦおよび２００ｍＭ  ＬＮＢを含有する１００ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）中において、３０℃で１２０分間行った。反応液の一部を、示された時間に採取し、ＨＰＬＣ−ＣＡＤによって解析した。
【図１０】図１０は、ＢｂＡｆｃＢ  Ｄ７０３Ｓ変異体により触媒されたＬｅｘ合成のタイムコースを示す図である。１００ｍＭ  ＬａｃＮＡｃを用いたことを除いて、図９と同様の反応を、Ｌｅｘの合成のために行った。反応液の一部を、示された時間に採取し、ＨＰＬＣ−ＣＡＤによって解析した。
【図１１】図１１は、受容体の構造の好ましい例、および１，３−１，４−α−Ｌ−フコシンターゼのフコシル化部位を示す図である。酵素により認識されるコア構造を、破線ボックスで示し、ラクト−Ｎ−ビオースＩ（ＬＮＢ）、Ｎ−アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）およびラクトース（Ｌａｃ）の構造を、示す。グループＲ１（−ＮＨＣＯＣＨ３、−ＣＨ２ＯＨまたは−ＯＨ）のサイズは、生成物の収率に影響し得る（表３を参照）。ＢｂＡｆｃＢは、ＧａｌおよびＧｌｃＮＡｃ／Ｇｌｃ残基についてのサブサイトを有し得る。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、Ｇａｌ−Ｇｌｃまたはその誘導体にフコシル基を導入する活性を有するタン
パク質を提供する。
【００１３】
本発明のタンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列における７０３位のアスパラギン酸がグリシンまたはセリンに置換されているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなる（ただし、配列番号２で表されるアミノ酸配列における７０３位のアスパラギン酸のグリシンまたはセリンへの置換は維持されている）。アミノ酸配列の同一性パーセントは、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。
【００１４】
一実施形態では、本発明のタンパク質は、配列番号２で表されるアミノ酸配列における７０３位のアスパラギン酸がグリシンまたはセリンに置換されているアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基の変異（例、欠失、置換、付加および挿入）を含むアミノ酸配列からなるものであってもよい（ただし、配列番号２で表されるアミノ酸配列における７０３位のアスパラギン酸のグリシンまたはセリンへの置換は維持されている）。１または数個のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。アミノ酸残基の変異に関する用語「１または数個」が示す数は、例えば、１〜２９０個、好ましくは１〜２５０個、より好ましくは１〜２００個、１〜１５０個または１〜１００個、さらにより好ましくは１〜５０個、１〜３０個、１〜２０個または１〜１０個、特に好ましくは１、２、３、４または５個である。
【００１５】
アミノ酸配列において変異を導入されてもよいアミノ酸残基の位置は、当業者に明らか
であるが、配列アライメントを参考にして、変異体を作製してもよい。具体的には、当業
者は、１）複数のホモログのアミノ酸配列（例、配列番号２で表されるアミノ酸配列、お
よび他のホモログのアミノ酸配列）を比較し、２）相対的に保存されている領域、および
相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域
および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領
域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を
認識できる（図１）。
【００１６】
アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であっ
てもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基
を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ
酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては
、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有
するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ
酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非
極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン
、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有する
アミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例
、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、
アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チ
ロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げ
られる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間で
の置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルア
ラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイ
シンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよ
い。
【００１７】
別の実施形態では、本発明のタンパク質は、配列番号１で表されるヌクレオチド配列に
対して相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドによりコードされるものであってもよい（ただし、配列番号１で表されるヌ
クレオチド配列における２１０７〜２１０９位のヌクレオチド残基は、グリシンまたはセ
リンをコードするように置換されている）。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる
特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。
このような条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、同一性が高いポ
リヌクレオチド同士、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％
以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９６％以上、９７％以上、９８
％以上または９９％以上の同一性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、そ
れより低い同一性を示すポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件である。具体
的には、このような条件としては、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）
中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中
、５０〜６５℃での１または２回以上の洗浄が挙げられる。
【００１８】
アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の相同性（例、同一性または類似性）は、例えば
ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））、ＰｅａｒｓｏｎによるＦ
ＡＳＴＡ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定
することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴ
Ｎとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌ
ｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、アミノ酸配
列およびヌクレオチド配列の相同性を計算してもよい。また、アミノ酸配列の相同性とし
ては、例えば、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用している株式会社ゼネティックス
のソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリ
ペプチド部分全長を用いて、Ｕｎｉｔ  Ｓｉｚｅ  ｔｏ  Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＳ
ｉｍｉｌａｒｉｔｙをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値を用いてもよい。アミノ
酸配列およびヌクレオチド配列の相同性として、これらの計算で導き出される値のうち、
最も低い値を採用してもよい。
【００１９】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質が由来し得る微生物としては、
特に限定されないが、例えば、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）等のビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ）属に属する細菌が挙げられる。
【００２０】
本発明のタンパク質は、Ｇａｌ−Ｇｌｃまたはその誘導体にフコシル基を導入する活性
を有し、それにより、フコシル化されたＧａｌ−Ｇｌｃまたはその誘導体を生成する。Ｇ
ａｌは、ガラクトースを示し、Ｇｌｃはグルコースを示し、Ｇａｌ−Ｇｌｃは、ガラクト
ースおよびグルコースからなる二糖を示す。Ｇａｌ−Ｇｌｃまたはその誘導体の糖間の結
合としては、Ｇａｌ−Ｇｌｃまたはその誘導体に対してフコシル基を導入する活性を保持
し得るものである限り特に限定されないが、例えば、β−１，３−結合、およびβ−１，
４−結合が挙げられる。好ましくは、上記活性は、Ｇａｌ−Ｇｌｃまたはその誘導体にフ
コシル基を導入して、Ｇａｌ−ＧｌｃにおけるＧｌｃ部分またはＧａｌ−Ｇｌｃの誘導体
におけるＧｌｃ対応部分と、α−１，３−フコシル結合またはα−１，４−フコシル結合
を生成する活性である。
【００２１】
Ｇａｌ−Ｇｌｃの誘導体としては、Ｇａｌ−Ｇｌｃ中のＧａｌ部分および／またはＧｌ
ｃ部分が修飾された誘導体、ならびにＧａｌ−Ｇｌｃまたはその誘導体を、糖鎖の非還元
末端に有する糖化合物が挙げられる。糖化合物を構成する糖残基の個数は、Ｇａｌ−Ｇｌ
ｃに起因する糖残基の個数（２個）を、後述する糖残基の個数に加算した数である。
【００２２】
より具体的には、Ｇａｌ−Ｇｌｃの誘導体としては、以下が挙げられる：
（１）Ｇａｌ−ＧｌｃにおけるＧｌｃ部分の１以上のヒドロキシ基が、置換されていても
よいＣ１〜Ｃ６炭化水素基、置換されていてもよいＣ３〜Ｃ１１芳香族基、アミノ基（−
ＮＨ３）、置換されていてもよいモノまたはジ（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）アミノ基、置換さ
れていてもよいモノまたはジ（Ｃ３〜Ｃ１１芳香族）アミノ基、置換されていてもよい（
Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）（Ｃ３〜Ｃ１１芳香族）アミノ基、置換されていてもよいモノまた
はジ（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素−カルボニル）アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジ
（Ｃ３〜Ｃ１１芳香族−カルボニル）アミノ基、ヒドロキシ基（−ＯＨ）、置換されてい
てもよい（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）オキシ基、置換されていてもよい（Ｃ３〜Ｃ１１芳香族
）オキシ基、またはハロゲン原子で置換された化合物；
（２）Ｇａｌ−ＧｌｃにおけるＧａｌ部分のヒドロキシ基が、置換されていてもよいＣ１
〜Ｃ６炭化水素基、置換されていてもよいＣ３〜Ｃ１１芳香族基、アミノ基、置換されて
いてもよいモノまたはジ（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）アミノ基、置換されていてもよいモノま
たはジ（Ｃ３〜Ｃ１１芳香族）アミノ基、置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）
（Ｃ３〜Ｃ１１芳香族）アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジ（Ｃ１〜Ｃ６炭化
水素−カルボニル）アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジ（Ｃ３〜Ｃ１１芳香族
−カルボニル）アミノ基、ヒドロキシ基、置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）
オキシ基、置換されていてもよい（Ｃ３〜Ｃ１１芳香族）オキシ基、またはハロゲン原子
、あるいは１以上の糖残基で置換された化合物；ならびに
（３）上記（１）および（２）で示された置換が組み合わされた化合物。
【００２３】
好ましい実施形態では、Ｇａｌ−Ｇｌｃまたはその誘導体は、下記式（１ａ）または（
１ｂ）：
【化３】
0005834484.tif 000004
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、各々独立して、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６炭化
水素基、置換されていてもよいＣ３〜Ｃ１１芳香族基、アミノ基、置換されていてもよい
モノまたはジ（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジ（Ｃ
３〜Ｃ１１芳香族）アミノ基、置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）（Ｃ３〜Ｃ
１１芳香族）アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジ（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素−カル
ボニル）アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジ（Ｃ３〜Ｃ１１芳香族−カルボニ
ル）アミノ基、ヒドロキシ基、置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）オキシ基、
置換されていてもよい（Ｃ３〜Ｃ１１芳香族）オキシ基、またはハロゲン原子を示し、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、各々独立して、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６炭化
水素基、置換されていてもよいＣ３〜Ｃ１１芳香族基、アミノ基、置換されていてもよい
モノまたはジ（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジ（Ｃ
３〜Ｃ１１芳香族）アミノ基、置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）（Ｃ３〜Ｃ
１１芳香族）アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジ（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素−カル
ボニル）アミノ基、置換されていてもよいモノまたはジ（Ｃ３〜Ｃ１１芳香族−カルボニ
ル）アミノ基、ヒドロキシ基、置換されていてもよい（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）オキシ基、
置換されていてもよい（Ｃ３〜Ｃ１１芳香族）オキシ基、またはハロゲン原子、あるいは
１以上の糖残基を示す。）で表される糖化合物であってもよい。
【００２４】
したがって、Ｇａｌ−Ｇｌｃまたはその誘導体にフコシル基を導入する活性は、上記の
Ｇａｌ−Ｇｌｃまたはその誘導体にフコシル基を導入して、下記式（２ａ）または（２ｂ
）：
【化４】
0005834484.tif 000005
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、前記と同じである。Ｆｕｃ
は、フコシル基を示す。）
で表される糖化合物を生成する活性であってもよい。
【００２５】
Ｃ１〜Ｃ６炭化水素基は、直鎖または分岐鎖、あるいは環状の炭素原子数１〜６個の炭
化水素基を示す。Ｃ１−６炭化水素基としては、例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基（例、メ
チル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒ
ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル）、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル基（例、ビニル、アリル）、
Ｃ２〜Ｃ６アルキニル基（例、エチニル、プロパルギル）、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル基
（例、シクロプロピル、シクロブチル）が挙げられる。Ｃ１〜Ｃ６炭化水素基は、好まし
くは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基である。また、Ｃ１〜Ｃ６炭化水素基は、上述したように置
換されていてもよいが、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６炭化水素基としては、ヒドロキ
シ基で置換されたＣ１〜Ｃ６炭化水素基が好ましく、ヒドロキシ基で置換されたＣ１〜Ｃ
６アルキル基である（ヒドロキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル基がより好ましい。
【００２６】
Ｃ３〜Ｃ１１芳香族基は、炭素原子数３〜１１個の芳香族基を示す。Ｃ３〜Ｃ１１芳香
族基としては、例えば、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基（例、フェニル、１−ナフチル、２−ナ
フチル）またはＣ３〜Ｃ１１芳香族複素環基が挙げられる。Ｃ３〜Ｃ１１芳香族基は、好
ましくは、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基である。
【００２７】
Ｃ３〜Ｃ１１芳香族複素環基は、３〜１１個の炭素原子および少なくとも１個のヘテロ
原子を含む単環式芳香族複素環基または縮合芳香族複素環基であり得る。このような単環
式芳香族複素環基は、環構成原子として炭素原子以外に酸素原子、硫黄原子および窒素原
子（好ましくは、窒素原子）から選ばれるヘテロ原子を１ないし４個含有する４ないし７
員（好ましくは、５または６員）の基であり得る。このような縮合芳香族複素環基は、上
記の単環式芳香族複素環基（好ましくは、環構成原子として窒素原子を含有する基）に対
応する環と、１または２個の窒素原子を含む５または６員の芳香族複素環（例、ピロール
、イミダゾール、ピラゾール、ピラジン、ピリジン、ピリミジン）、１個の硫黄原子を含
む５員の芳香族複素環（例、チオフェン）およびベンゼン環から選ばれる１または２個の
環とが縮合した環から誘導される基であり得る。
【００２８】
上記の単環式芳香族複素環基としては、例えば、フリル、チエニル、ピリジル、ピリミ
ジニル、ピリダジニル、ピラジニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル
、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリ
ル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニルが挙げられる。
【００２９】
上記の縮合芳香族複素環基としては、例えば、キノリル、イソキノリル、キナゾリル、
キノキサリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンズオキサゾリル、ベンズイソオキサ
ゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾトリアゾリル、インドリル（例
、インドール−１−イル、インドール−２−イル、インドール−３−イル、インドール−
５−イル）、インダゾリル、ピロロピラジニル、イミダゾピリジニル、イミダゾピラジニ
ル、ピラゾロピリジニル、ピラゾロチエニル、ピラゾロトリアジニルが挙げられる。
【００３０】
モノまたはジ（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）アミノ基は、上記のＣ１〜Ｃ６炭化水素基でモノ
置換またはジ置換されたアミノ基を示す。モノまたはジ（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）アミノ基
は、好ましくは、モノまたはジ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ基であり、より好ましくは
、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ基である。
【００３１】
モノまたはジ（Ｃ３〜Ｃ１１芳香族）アミノ基は、上記のＣ３〜Ｃ１１芳香族基でモノ
置換またはジ置換されたアミノ基を示す。モノまたはジ（Ｃ３〜Ｃ１１芳香族）アミノ基
は、好ましくは、モノまたはジ（Ｃ３〜Ｃ１１芳香族）アミノ基であり、より好ましくは
、（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）アミノ基である。
【００３２】
（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）（Ｃ３〜Ｃ１１芳香族）アミノ基は、上記のＣ１〜Ｃ６炭化水
素基および上記のＣ３〜Ｃ１１芳香族基で置換されたアミノ基を示す。
【００３３】
モノまたはジ（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素−カルボニル）アミノ基は、Ｃ１〜Ｃ６炭化水素−
カルボニルでモノ置換またはジ置換されたアミノ基を示す。Ｃ１〜Ｃ６炭化水素−カルボ
ニルにおけるＣ１〜Ｃ６炭化水素部分は、上記のＣ１〜Ｃ６炭化水素基と同様である。モ
ノまたはジ（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素−カルボニル）アミノ基は、好ましくは、モノまたはジ
（Ｃ１〜Ｃ６アルキル−カルボニル）アミノ基であり、より好ましくは、（Ｃ１〜Ｃ６ア
ルキル−カルボニル）アミノ基である。Ｃ１〜Ｃ６アルキル−カルボニルにおけるＣ１〜
Ｃ６アルキル部分は、上記のＣ１〜Ｃ６アルキル基と同様である。
【００３４】
モノまたはジ（Ｃ３〜Ｃ１１芳香族−カルボニル）アミノ基は、Ｃ３〜Ｃ１１芳香族−
カルボニルでモノ置換またはジ置換されたアミノ基を示す。Ｃ３〜Ｃ１１芳香族−カルボ
ニルにおけるＣ３〜Ｃ１１芳香族部分は、上記のＣ３〜Ｃ１１芳香族基と同様である。モ
ノまたはジ（Ｃ３〜Ｃ１１芳香族−カルボニル）アミノ基は、好ましくは、モノまたはジ
（Ｃ６〜Ｃ１０アリール−カルボニル）アミノ基であり、より好ましくは、（Ｃ６〜Ｃ１
０アリール−カルボニル）アミノ基である。Ｃ６〜Ｃ１０アリール−カルボニルにおける
Ｃ６〜Ｃ１０アリール部分は、上記のＣ６〜Ｃ１０アリール基と同様である。
【００３５】
（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）オキシ基は、上記のＣ１〜Ｃ６炭化水素基で置換されたヒドロ
キシ基（−Ｏ−Ｒ）を示す。（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）オキシ基は、好ましくは、（Ｃ１〜
Ｃ６アルキル）オキシ基である。（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）オキシ基におけるＣ１〜Ｃ６ア
ルキル部分は、上記のＣ１〜Ｃ６アルキル基と同様である。
【００３６】
（Ｃ３〜Ｃ１１芳香族）オキシ基は、上記のＣ３〜Ｃ１１芳香族で置換されたヒドロキ
シ基（−Ｏ−Ｒ’）を示す。（Ｃ３〜Ｃ１１芳香族）オキシ基は、好ましくは、（Ｃ６〜
Ｃ１０アリール）オキシ基である。（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）オキシ基におけるＣ６〜Ｃ
１０アリール部分は、上記のＣ６〜Ｃ１０アリール基と同様である。
【００３７】
ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子が挙げられ
る。
【００３８】
置換されていてもよい上記の基における「置換基」としては、例えば、ヒドロキシ基、
ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、スルホニル基、ホルミル基、アミノ基およびカルボ
キシル基、ならびに上述したようなＣ１〜Ｃ６炭化水素基、Ｃ３〜Ｃ１１芳香族基、Ｃ３
〜Ｃ１１芳香族複素環基、モノまたはジ（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）アミノ基、モノまたはジ
（Ｃ３〜Ｃ１１芳香族）アミノ基、（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）（Ｃ３〜Ｃ１１芳香族）アミ
ノ基、モノまたはジ（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素−カルボニル）アミノ基、モノまたはジ（Ｃ３
〜Ｃ１１芳香族−カルボニル）アミノ基、（Ｃ１〜Ｃ６炭化水素）オキシ基、および（Ｃ
３〜Ｃ１１芳香族）オキシ基が挙げられる。置換基の個数は、１〜３個であり、好ましく
は、１個または２個である。置換基が２個または３個である場合、各置換基は同一でも異
なっていてもよい。
【００３９】
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６についての糖残基としては、ペントース、ヘキソース、ヘ
プトースが挙げられる。糖残基は、アルドースまたはケトースであり得る。具体的には、
糖残基としては、グルコース、マンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチル−グルコサミン
、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、フコース、キシロース、シアル酸が挙げられる。糖残
基は、α体またはβ体であり得る。糖残基はまた、Ｄ体またはＬ体であり得る。糖残基の
個数が２個以上である場合、糖残基の種類は同じでも異なっていてもよい。
【００４０】
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６についての糖残基の個数は、１以上であれば特に限定され
ないが、例えば、１〜１５個、好ましくは、１〜１０個、より好ましくは、１〜５個、さ
らにより好ましくは１〜３個、特に好ましくは、１個または２個である。例えば、糖残基
の個数が１個である場合、式（１）で表される糖鎖は三糖であり、糖残基の個数が２個で
ある場合、式（１）で表される糖鎖は四糖である。
【００４１】
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６についての糖残基は、通常の糖間結合を介して、Ｇａｌ−
ＧｌｃにおけるＧａｌに結合し得る。また、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６についての糖残
基の個数が２個以上である場合、２個以上の糖残基は、通常の糖間結合を介して、隣接す
る糖残基に各々結合し得る。このような糖間結合としては、Ｇａｌ−Ｇｌｃまたはその誘
導体（糖鎖の非還元末端に存在し得る）に対してフコシル基を導入する活性を保持し得る
ものである限り特に限定されないが、例えば、α−１，２−結合、α−１，３−結合、α
−１，４−結合、β−１，２−結合、β−１，３−結合、およびβ−１，４−結合が挙げ
られる。
【００４２】
好ましくは、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、各々独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、（ヒド
ロキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、アミノ基、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ基、（Ｃ１〜
Ｃ６アルキル−カルボニル）アミノ基、ヒドロキシ基、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）オキシ基
を示してもよい。
【００４３】
好ましくは、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、各々独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、
（ヒドロキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、アミノ基、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ基、（
Ｃ１〜Ｃ６アルキル−カルボニル）アミノ基、ヒドロキシ基、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）オ
キシ基、または１以上の糖残基を示してもよい。より好ましくは、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およ
びＲ７から選ばれる３つの基は、各々独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、（ヒドロキシ）
Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、アミノ基、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ基、（Ｃ１〜Ｃ６アル
キル−カルボニル）アミノ基、ヒドロキシ基、または（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）オキシ基を
示してもよく、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７から選ばれる残りの１つの基が、１以上の糖
残基を示してもよい。
【００４４】
さらにより好ましくは、Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、（
ヒドロキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、アミノ基、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ基、（Ｃ
１〜Ｃ６アルキル−カルボニル）アミノ基、ヒドロキシ基、または（Ｃ１〜Ｃ６アルキル
）オキシ基を示してもよい。Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、ヒドロキシ基、または（Ｃ
１〜Ｃ６アルキル）オキシ基を示してもよい。Ｒ７は、ヒドロキシメチル基等の（ヒドロ
キシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル基を示してもよい。
【００４５】
フコシル基の導入のために用いられるフコシル基供給化合物は、フコース中のヒドロキ
シ基（例、１位のヒドロキシル基）が脱離基で置換されているフコース誘導体であり得る
。フコシル基供給化合物におけるフコシル基は、α体またはβ体であり得る。フコシル基
はまた、Ｌ体であり得る。脱離基としては、例えば、フッ素原子、リン酸基が挙げられる
。好ましくは、フコシル基供給化合物は、フッ化フコースである。
【００４６】
より好ましい実施形態では、本発明のタンパク質は、以下の活性を有し得る：
（ｉ）ラクト−Ｎ−ビオースＩ（Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）、またはラクト−Ｎ−ビ
オースＩ（Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）を非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導
入して、ルイスａ抗原〔Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ〕、またはルイ
スａ抗原〔Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ〕を非還元末端に有する糖鎖
を生成する活性（ＧｌｃＮＡｃは、グルコサミンを示す。以下、同様。）；
（ｉｉ）Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、またはＮ−アセチ
ルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）を非還元末端に有する糖鎖に、フコシル
基を導入して、ルイスｘ抗原〔Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ〕、また
はルイスｘ抗原〔Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ〕を非還元末端に有す
る糖鎖を生成する活性；
（ｉｉｉ）ラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、またはラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇ
ｌｃ）を非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、３−フコシルラクトース［
Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）Ｇｌｃ］、または３−フコシルラクトース［Ｇａｌβ
１−４（Ｆｕｃα１−３）Ｇｌｃ］を非還元末端に有する糖鎖を生成する活性；
（ｉｖ）２’−フコシルラクトース（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、または２
’−フコシルラクトース（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）を非還元末端に有する
糖鎖に、フコシル基を導入して、ジフコシルラクトース［Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ（Ｆｕ
ｃα１−３）１−４Ｇｌｃ］、またはジフコシルラクトース［Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ（
Ｆｕｃα１−３）１−４Ｇｌｃ］を非還元末端に有する糖鎖を生成する活性；ならびに
（ｖ）ラクト−Ｎ−テトラオース（Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４
Ｇｌｃ）、またはラクト−Ｎ−テトラオース（Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａ
ｌβ１−４Ｇｌｃ）を非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ラクト−Ｎ−
フコペンタオースＩＩ［Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌ
β１−４Ｇｌｃ］、またはラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ［Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃ
α１−４）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ］を非還元末端に有する糖鎖を生
成する活性。
【００４７】
上記糖鎖を構成する糖残基の総数は、Ｇａｌ−Ｇｌｃに起因する糖残基の個数（２個）
を、上述した糖残基の個数に加算した数である。したがって、糖鎖を構成する糖残基の総
数は、例えば、１〜１７個、好ましくは、１〜１２個、より好ましくは、１〜７個、さら
により好ましくは３、４または５個である。
【００４８】
本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質を発現する形質転換体から得ることができ
る。この形質転換体は、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、本発
明のタンパク質の発現ベクターを作製し、次いで、この発現ベクターを宿主に導入するこ
とにより作製することができる。本発明のタンパク質を発現させるための宿主としては、
例えば、エスケリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエスケリシア属
細菌、コリネバクテリウム属細菌、およびバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ）をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピヒア・スティピティス（Ｐｉｃｈ
ｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙ
ｚａｅ）をはじめとする種々の真核細胞が挙げられる。
【００４９】
形質転換される宿主としてＥ．ｃｏｌｉについて詳述すると、Ｅ．ｃｏｌｉとしては、
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株亜種のＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＨＢ
１０１株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株が挙げられる。形質転換方法、および形質転換体を選別
する方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａ
ｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒ
ｅｓｓ  （２００１／０１／１５）などにも記載されている。以下、形質転換されたＥ．
ｃｏｌｉを作製し、これを用いて本発明のタンパク質を製造する方法を、一例としてより
具体的に説明する。
【００５０】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを発現させるプロモータとしては、通常Ｅ．ｃ
ｏｌｉにおける異種タンパク質生産に用いられるプロモータを使用することができ、例え
ば、Ｔ７プロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｔａｃ
プロモータ、ラムダファージのＰＲプロモータ、ＰＬプロモータ、Ｔ５プロモータ等の強
力なプロモータが挙げられる。ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐ
ＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳ
Ｆ１０１０、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭ
Ｗ２１９、ｐＭＷ２１８、ｐＱＥ３０およびその誘導体が挙げられる。
【００５１】
また、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の下流に、転写終結配列であるターミネ
ータを連結してもよい。このようなターミネータとしては、例えば、Ｔ７ターミネータ、
ｆｄファージターミネータ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネ
ータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータが挙げられる。
【００５２】
本発明のタンパク質をコードする遺伝子をＥ．ｃｏｌｉに導入するためのベクターとし
ては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有する
プラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘
導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加および／ま
たは逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう「改
変」とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも
含む。
【００５３】
ベクターは、形質転換体の選別のため、アンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有する
ことが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモータを持つ発現ベクターが
市販されている（例、ｐＵＣ系（タカラバイオ社製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製
）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製））。
【００５４】
得られた発現ベクターを用いてＥ．ｃｏｌｉを形質転換し、得られたＥ．ｃｏｌｉを培
養すると、本発明のタンパク質が発現される。
【００５５】
培地としては、例えば、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するため
に通常用いる培地が挙げられる。培養および生産誘導等の条件は、用いたベクターのマー
カー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択することができる。
【００５６】
本発明のタンパク質を回収するには、以下の方法などがある。本発明のタンパク質は、
本発明のタンパク質を産生する形質転換体を回収した後、形質転換体を破砕（例、ソニケ
ーション、ホモジナイゼーション）あるいは溶解（例、リゾチーム処理）することにより
、破砕物および溶解物として得ることができる。このような破砕物および溶解物を、抽出
、沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法に供することにより、精製タンパク質
、粗タンパク質、または本発明のタンパク質含有画分を得ることができる。
【００５７】
本発明はまた、本発明のタンパク質の作製に用いることができる、上述したような、本
発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドを含む発
現ベクター、ならびに当該発現ベクターを含む形質転換体を提供する。
【００５８】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質をコードするので、本発明のタンパ
ク質に関する上述した説明に基づいて、種々の観点から特定することができる。
【００５９】
本発明はまた、フコシル化されたＧａｌ−Ｇｌｃまたはその誘導体の製造方法を提供す
る。本方法は、本発明のタンパク質の存在下において、Ｇａｌ−Ｇｌｃまたはその誘導体
にフコシル基を導入して、フコシル化されたＧａｌ−Ｇｌｃまたはその誘導体を生成する
ことを含む。本発明のタンパク質、Ｇａｌ−Ｇｌｃまたはその誘導体、フコシル基を導入
するためのフコシル基供給化合物等の詳細は、上述したとおりである。
【００６０】
好ましい実施形態では、Ｇａｌ−Ｇｌｃまたはその誘導体は、上記式（１）で表される
多糖であってもよい。
【００６１】
より好ましい実施形態では、本発明の製造方法は、以下のとおりである：
（ｉ’）ラクト−Ｎ−ビオースＩ（Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）、またはラクト−Ｎ−
ビオースＩ（Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）を非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を
導入して、ルイスａ抗原〔Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ〕、またはル
イスａ抗原〔Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ〕を非還元末端に有する糖
鎖を生成する方法
（ｉｉ’）Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、またはＮ−アセ
チルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）を非還元末端に有する糖鎖に、フコシ
ル基を導入して、ルイスｘ抗原〔Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ〕、ま
たはルイスｘ抗原〔Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ〕を非還元末端に有
する糖鎖を生成する製造方法；
（ｉｉｉ’）ラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、またはラクトース（Ｇａｌβ１−４
Ｇｌｃ）を非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、３−フコシルラクトース
［Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）Ｇｌｃ］、または３−フコシルラクトース［Ｇａｌ
β１−４（Ｆｕｃα１−３）Ｇｌｃ］を非還元末端に有する糖鎖を生成する製造方法；
（ｉｖ’）２’−フコシルラクトース（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、または
２’−フコシルラクトース（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）を非還元末端に有す
る糖鎖に、フコシル基を導入して、ジフコシルラクトース［Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ（Ｆ
ｕｃα１−３）１−４Ｇｌｃ］、またはジフコシルラクトース［Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ
（Ｆｕｃα１−３）１−４Ｇｌｃ］を非還元末端に有する糖鎖を生成する製造方法；なら
びに
（ｖ’）ラクト−Ｎ−テトラオース（Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−
４Ｇｌｃ）、またはラクト−Ｎ−テトラオース（Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇ
ａｌβ１−４Ｇｌｃ）を非還元末端に有する糖鎖に、フコシル基を導入して、ラクト−Ｎ
−フコペンタオースＩＩ［Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａ
ｌβ１−４Ｇｌｃ］、またはラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ［Ｇａｌβ１−３（Ｆｕ
ｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ］を非還元末端に有する糖鎖を
生成する製造方法。
【００６２】
上記糖鎖を構成する糖残基の総数は、上述したとおりである。
【００６３】
本発明のタンパク質の存在下におけるＧａｌ−Ｇｌｃまたはその誘導体へのフコシル基
の導入は、反応系中に、本発明のタンパク質、ならびにＧａｌ−Ｇｌｃまたはその誘導体
およびフコシル基供給化合物が共存する条件下で行なわれる。このような条件は、例えば
、（Ｉ）本発明のタンパク質（例、精製タンパク質、粗タンパク質）、ならびにＧａｌ−
Ｇｌｃまたはその誘導体およびフコシル基供給化合物を含有する反応液、または（ＩＩ）
本発明のタンパク質を発現する本発明の形質転換体、ならびにＧａｌ−Ｇｌｃまたはその
誘導体およびフコシル基供給化合物を含有する培養液を用いることにより達成することが
できる。
【００６４】
反応系中の基質（Ｇａｌ−Ｇｌｃまたはその誘導体およびフコシル基供給化合物）の濃
度は、特に制限されず、適宜設定できる。基質はまた、反応中に適宜補充されてもよい。
さらに、基質は、遊離の塩基および塩のいずれの形態でも用いることができる。反応系中
には、フッ化フコース等の基質の自発分解を抑制し得る成分を補充してもよい。このよう
な成分としては、例えば、ＤＭＳＯが挙げられる。
【００６５】
本発明の製造方法におけるｐＨは、目的の反応が進行する限り特に限定されない。本発
明の製造方法は、目的化合物の収率の観点から、例えば、ｐＨ約４．０〜約７．５、好ま
しくは、ｐＨ約４．０〜約６．５、より好ましくはｐＨ約４．５〜約５．５で行なわれて
もよい。
【００６６】
本発明の製造方法における温度は、目的の反応が進行する限り特に限定されない。本発
明の製造方法は、例えば、約２０〜４５℃、好ましくは、約２５〜４０℃で行なわれても
よい。
【００６７】
本発明の製造方法において、反応時間は、製造されるべき目的化合物の量に応じて適宜
設定できる。反応は、静置または攪拌状態で行われ得る。
【００６８】
本発明の製造方法において得られる目的化合物は、公知の分離精製手段、例えば、濃縮
、減圧濃縮、溶媒抽出、晶出、再結晶、転溶、活性炭処理、イオン交換クロマトグラフィ
ー等のクロマトグラフィーなどの処理を必要に応じて組み合せることにより単離精製する
ことができる。本発明の製造方法において原料として用いられる化合物、および本発明の
製造方法において得られる目的化合物は、特に断らない限り、塩の形態であってもよい。
このような塩は、それ自体公知の手段に従い、例えば、原料または目的化合物に無機酸ま
たは有機酸を加えることによって製造することができる。また、原料または目的化合物の
塩は、水和物であってもよく、水和物および非水和物のいずれも本発明の範囲に包含され
るものである。塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等の各種塩が挙
げられる。
【００６９】
（略語）
ＣＡＤ：荷電エアロゾル検出器〔ｃｈａｒｇｅｄ  ａｅｒｏｓｏｌ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ〕
ＤＣ−ＳＩＧＮ：樹状細胞特異的細胞間接着分子−３−グラビング非インテグリン〔ｄｅ
ｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅ
ｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−３−ｇｒａｂｂｉｎｇ  ｎｏｎ−ｉｎｔｅｇｒｉｎ〕
ＤＦＬ：ジフコシルラクトース〔ｄｉｆｕｃｏｓｙｌｌａｃｔｏｓｅ〕
ＥＳＩ−ＭＳ：電気スプレーイオン化−質量分析〔ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉ
ｚａｔｉｏｎ−ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ〕
２’−ＦＬ：２’−フコシルラクトース〔２’−ｆｕｃｏｓｙｌｌａｃｔｏｓｅ〕
３−ＦＬ：３−フコシルラクトース〔３−ｆｕｃｏｓｙｌｌａｃｔｏｓｅ〕
ＦｕｃＦ：β−Ｌ−フコピラノシルフルオリド〔β−Ｌ−ｆｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ  
ｆｌｕｏｒｉｄｅ〕
ＦｕｃＮ３：β−Ｌ−フコピラノシルアジド〔β−Ｌ−ｆｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ  ａ
ｚｉｄｅ〕
ＧＨ：グリコシドヒドロラーゼ〔ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ〕
ＨＥＰＥＳ：４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸〔４−（
２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ  ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏ
ｎｉｃ  ａｃｉｄ〕
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー〔ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕ
ｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ〕
Ｌａｃ：ラクトース〔ｌａｃｔｏｓｅ〕
ＬａｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルラクトサミン〔Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ〕
ＬＮＢ：ラクト−Ｎ−ビオースＩ〔ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｂｉｏｓｅ  Ｉ〕
ＬＮＤＦＨ：ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオース〔ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｄｉｆｕｃｏｈｅｘａ
ｏｓｅ〕
ＬＮＦＰ：ラクト−Ｎ−フコメンタオース〔ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｆｕｃｏｐｅｎｔａｏｓｅ
〕
ＬＮＴ：ラクト−Ｎ−テトラオース〔ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｔｅｔｒａｏｓｅ〕
ＬＰＳ：リポ多糖〔ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ〕
ＭＥＳ：２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸〔２−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）
ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ〕
ＭＯＰＳ：３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸〔３−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎ
ｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ〕
ＮＭＲ：核磁気共鳴〔ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ〕
ｐＮＰ−α−Ｆｕｃ：４−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピラノシド〔４−ｎｉｒｔｏｐ
ｈｅｎｙｌ−α−Ｌ−ｆｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ〕
ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー〔ｔｈｉｎ−ｌａｙｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ
ｙ〕
【実施例】
【００７０】
以下の実施例により、本発明を詳細に説明するが、これらの実施例により本発明が限定
されるものではない。
【００７１】
（材料および方法）
材料
ＬａｃＮＡｃ、Ｌｅａ、Ｌｅｘ、および、ＬＮＦＰ  ＩＩは、Ｄｅｘｔｒａ  Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｅａｄｉｎｇ，ＵＫ）より購入した。Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビ
オースは生化学工業（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から、ＤＦＬはＩｓｏｓｅｐ（Ｔｕｌｌ
ｉｎｇｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）から購入した。ＬＮＢ（Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．２
００７）、Ｇｌｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（Ｈｏｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．２００４）、および
、ＦｕｃＦ（Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．２００８）は既報通りに合成した。３−ＦＬはＤｅ
ｘｔｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓで購入し、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ２カラム（Ｂｉｏ−
Ｒａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）で更に精製した。他の試薬は、分析グレードの市販品である。
【００７２】
変異体の構築
ＢｂＡｆｃＢのＤ７０３変異体（Ｄ７０３Ａ，Ｄ７０３Ｃ，Ｄ７０３Ｇ，Ｄ７０３Ｓ）
は、鋳型にプラスミドｐＥＴ２３ｂ−ａｆｃＢ（Ａｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．２００９）
を使って、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉ
ｓ  ｍｅｔｈｏｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により構築した。使用したプライマーは、以
下の表１に記載した。設計した部分以外に余分な変異が入っていないことはシークエンス
により確認した。作製したプラスミドは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１
ΔｌａｃＺ（ＤＥ３）に導入した（Ａｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。
【００７３】
【表１】
0005834484.tif 000006
【００７４】
タンパク質発現と精製
組換え体は、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地に
て、吸光度（６００ｎｍ）が０．５に達するまで１８℃で培養し、その後、ｉｓｏｐｒｏ
ｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅを終濃度０．１ｍＭにな
るように加えた。さらに１５時間培養した後に集菌し、超音波処理により破砕した。超音
波破砕することで、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅ
ａｇｅｎｔ（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した以前の方法
（Ａｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．２００９）よりも高収率で活性酵素を得ることが出来た。
遠心後、上清をＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ）にアプライし、マニュア
ルに従って蛋白質を溶出させた。活性フラクションを収集し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ
５０  Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）にて濃縮した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  
２００  １０／３００  ＧＬゲルろ過カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に供した。溶出は１５０ｍＭ  ＮａＣ
ｌを含む２０ｍＭ  ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ
−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）にて行った。精製した酵素は５０ｍＭ  ４−（２
−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉ
ｃ  ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）に透析した。タンパク質濃度は
、ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎを標準に用い、ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  
ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ，ＩＬ，ＵＳＡ）にて測定した。
【００７５】
酵素測定
ＢｂＡｆｃＢ変異体の加水分解活性は、基質に３−ＦＬを用いて決定した。反応液の組
成は、１００ｍＭ  ３−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ
ａｃｉｄ（ＭＯＰＳ）ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．５）、１ｍＭ基質、および、酵素（野生
型１４ｎＭ、および、Ｄ７０３変異体１２μＭ）とした。反応は３０℃で行い、熱処理で
反応を止めた後、遊離したＬ−ｆｕｃｏｓｅ（Ｆｕｃ）の量をフコースデヒドロゲナーゼ
カップリング法で決定した（Ｃｏｈｅｎｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．１９８９；Ｋａｔａｙａ
ｍａ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのＦｕｃを生じさせるのに
必要な酵素量とした。
Ｄ７０３変異体のグリコシンターゼ活性は、１００ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐ
Ｈ７．０）、２０ｍＭ  ＦｕｃＦ（供与体）、１００ｍＭ  ＬＮＢ／ＬａｃＮＡｃ（受容
体）、および、酵素（１７μＭ）の存在下で測定した。反応は５０μｌで行い、３０℃に
て１０分保温後に、３０％トリクロロ酢酸５μｌを加えて反応を止めた。反応産物はＳｕ
ｇａｒ−Ｄカラム（４．６×２５０ｍｍ、Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）を用いた高速
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析した。溶出には７５％もしくは７８％アセ
トニトリルを用い、４０℃および流速１．０ｍＬ／ｍｉｎとした。検出は２１４ｎｍもし
くはコロナ荷電化粒子検出器（Ｃｏｒｏｎａ  ＣＡＤ，Ｅｓａ，ＵＳＡ）にて行った。反
応産物の濃度は、ＬｅａおよびＬｅｘトリサッカライド標品を使用して作成した検量線を
用いて決定した。
【００７６】
グリコシンターゼ反応の至適ｐＨは、Ｄ７０３Ｓ変異体を用いて決定した。緩衝液（１
００ｍＭ）は、クエン酸−ＮａＯＨ（ｐＨ４．０−５．０）、ＭＥＳ（ｐＨ５．０−６．
５）、およびＭＯＰＳ（ｐＨ６．５−８．０）を使用した。反応初速度は、１００ｍＭ  
ＭＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．０）、ＦｕｃＦ（２０および６０ｍＭ）、ＬＮＢ／Ｌａ
ｃＮＡｃ（０−３００ｍＭ）、および、酵素（１７μＭ  Ｄ７０３Ｓ）の存在下、反応産
物が直線的に増加する条件下（３０℃，５分）で決定した。Ｄ７０３Ｓ変異体の受容体特
異性は、１３種類の基質を用いて検討した。４０ｍＭ  ＦｕｃＦおよび１００ｍＭ各受容
体を含む１００ｍＭ  ＭＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．０）を、１７μＭ  Ｄ７０３Ｓ存
在下もしくは非存在下で３０℃４０分間保温し、その後、反応産物をＨＰＬＣ−ＣＡＤに
て分析した。
【００７７】
Ｄ７０３Ｓ変異体を使用した最適条件下でのＬｅａおよびＬｅｘトリサッカライドの合成
Ｌｅａトリサッカライド合成は、１００ｍＭ  ＭＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．０）、
４０ｍＭ  ＦｕｃＦ（供与体）、２００ｍＭ  ＬＮＢ（受容体）、および、Ｄ７０３変異
体（１７μＭ）の存在下で行った。反応液は３００μｌとし３０℃で行った。Ｌｅｘトリ
サッカライド合成では、受容体に１００ｍＭ  ＬａｃＮＡｃを用い、同様の条件で行った
。
【００７８】
反応産物の精製と構造解析
反応産物はＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＭＢ−３にて脱塩し、凍結乾燥させた後に、Ｓｕｇａ
ｒ−Ｄカラムを使ってＨＰＬＣにより精製した。溶出条件は上記の通りである。得られた
画分は、凍結乾燥後、さらにＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０ＴＳカラム（４．６×２５０ｍ
ｍ，Ｔｏｓｏｈ，Ｊａｐａｎ）を用いて精製し、残存するＬＮＢ／ＬａｃＮＡｃを完全に
取り除いた。溶出には水を用い、流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎとした。また、検出には示差
屈折率検出器（ＲＩＤ−１０Ａ，Ｓｈｉｍａｚｕ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を用いた。
１Ｈ−および１３Ｃ  ＮＭＲ解析には、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ５００  ｓｐｅｃ
ｔｒｏｍｅｔｅｒを用いた。ＥＳＩ−ＭＳ測定にはＢｒｕｋｅｒ  ＡＰＥＸ  ＩＩ  ７０
ｅフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計を用い、ポジティブモードで行った
。
【００７９】
求核残基としてのＡｓｐ−７０３
Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ由来１，３−１，４−α−Ｌ−フコシダーゼ（ＢｂＡｆｃＢ）は、
糖質加水分解酵素（ＧＨ）ファミリー２９に属している（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚ
ｙ．ｏｒｇ）（Ｃａｎｔａｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ，２００９）。このファミリーに属する酵
素は、立体保持型の反応機構でα−Ｌ−フコシル結合を加水分解する（ＭｃＣａｒｔｅｒ
ａｎｄ  Ｗｉｔｈｅｒｓ  １９９４；Ｓｕｌｚｅｎｂａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００
４）。ＢｂＡｆｃＢのα−Ｌ−フコシンターゼ化の第一段階として、まず求核残基の同定
を試みた（立体保持型グリコシダーゼをグリコシンターゼ化するためには、求核残基に変
異を導入して加水分解活性を消失させることが必須である）。既知の数種類のＧＨ２９酵
素の立体構造やアミノ酸配列を比較した結果、Ａｓｐ−７０３が求核残基である可能性が
示唆された（後に詳しく考察する）。
【００８０】
Ａｓｐ−７０３をアラニン、システイン、グリシン、および、セリンに置換し、これら
変異体の加水分解活性を調べた［これらのアミノ酸残基はグリコシンターゼ化に適してい
ると言われている（Ｊａｋｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｉｔｈｅｒｓ  ２００２）］。なお、活
性は比活性のみで表している。というのも、反応初速度が２０ｍＭの基質濃度まで直線的
に増加し、速度論的パラメータを算出できなかったためである。野生型酵素の比活性と比
較して、Ｄ７０３Ａ、Ｄ７０３Ｃ、Ｄ７０３Ｇ、およびＤ７０３Ｓの比活性はそれぞれ１
６０，０００倍、４６，０００倍、１７，０００倍、および７６，０００倍低下した（表
２）。これらの結果から、Ａｓｐ−７０３がＢｂＡｆｃＢの求核残基であることが強く示
唆された（考察および図１）。
【表２】
0005834484.tif 000007
【００８１】
１，３−１，４−α−Ｌ−フコシンターゼへの変換
上記で得られたＢｂＡｆｃＢ  Ｄ７０３変異体のグリコシンターゼ活性を調べた。２０
ｍＭ  ＦｕｃＦ（β−Ｌ−フコピラノシルフルオリド）を供与体、１００ｍＭ  ＬＮＢ（
Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）を受容体として反応させたところ、Ｄ７０３ＧとＤ７０３
Ｓ変異体において、保持時間１５．４分にＬｅａトリサッカライドに相当するピークが検
出された（図２）。しかしながら、野生型およびＤ７０３Ａ／Ｃ変異体においては検出さ
れなかった。Ｄ７０３ＧとＤ７０３Ｓ変異体では、受容体にＬａｃＮＡｃ（Ｇａｌβ１−
４ＧｌｃＮＡｃ）を用いた際にも、保持時間１４．９分にＬｅｘトリサッカライドに相当
するピークが観察された（図３）。どちらの受容体を用いた場合でも、Ｄ７０３Ｓのピー
クの方がＤ７０３Ｇのピークよりわずかに大きかった。以上の結果、および、Ｄ７０３Ｓ
の加水分解活性の方がＤ７０３Ｇより低いことから（表２）、以降の実験にはＤ７０３Ｓ
を使用することとした。
【００８２】
合成反応の至適ｐＨは５．０（２−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌ
ｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＭＥＳ）ｂｕｆｆｅｒ）であり、その時の収量はｐＨ７．０のと
きより２倍高かった（図４）。反応液をコロナ荷電化粒子検出器を用いた高速液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ−ＣＡＤ）によって分析した結果、ＦｕｃＦ、ＬＮＢ／ＬａｃＮ
Ａｃ、および、酵素が存在した時にのみ合成活性が検出され、どれか１つでも反応系から
除くと、基質以外のピークは検出されないことが明らかとなった（図５、６）［１２０分
以降の保持時間においてもピークは検出されなかった（データ示さず）］。反応産物の薄
層クロマトグラフィー分析においても、ＬｅａおよびＬｅｘトリサッカライドの特異的合
成が示唆された（データ示さず）。反応産物の同定については後述する。
【００８３】
次に、ＦｕｃＦ濃度を２０ｍＭおよび６０ｍＭに固定し、ＬＮＢ／ＬａｃＮＡｃ濃度を
変化させる（０−３００ｍＭ）ことによって、速度論的パラメータを決定しようと試みた
（図７、８）。その結果、ＬＮＢ／ＬａｃＮＡｃに対する見かけのＫｍ値はＦｕｃＦ依存
的に増加し、また、これらの値は２基質反応の式（Ｃｌｅｌａｎｄ  １９６３）に回帰す
ることが出来なかった。以上の結果から、本酵素のＦｕｃＦに対する親和性が低いことが
示唆された。
【００８４】
最適化した条件下［４０ｍＭ  ＦｕｃＦ（供与体），２００ｍＭ  ＬＮＢもしくは１０
０ｍＭ  ＬａｃＮＡｃ（受容体），１７μＭ酵素］において反応の時間依存性を検討した
ところ、Ｌｅａトリサッカライドの濃度は約４０分、Ｌｅｘトリサッカライドの濃度は約
６０分で最大に達した。両者とも、その反応効率は添加したＦｕｃＦに対して５６％であ
った（図９、１０）。
【００８５】
受容体特異性
様々な単糖およびオリゴ糖（１００ｍＭ）を使用して、ＢｂＡｆｃＢ  Ｄ７０３Ｓの受
容体特異性を調べた（表３）。本酵素は、ＬＮＢおよびＬａｃＮＡｃに加えてラクトース
（Ｌａｃ）（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、２’−フコシルラクトース（２’−ＦＬ）（Ｆｕ
ｃα１−２Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、およびラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）（Ｇａ
ｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）を認識し、それぞれ３−ＦＬ［
Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）Ｇｌｃ］、ジフコシルラクトース（ＤＦＬ）［Ｆｕｃ
α１−２Ｇａｌβ（Ｆｕｃα１−３）１−４Ｇｌｃ］、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ
Ｉ（ＬＮＦＰＩＩ）［Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ
１−４Ｇｌｃ］を生成した。収率は、添加したＦｕｃＦに対して１３％、５．５％、およ
び、４１％であった。しかしながら本酵素は、単糖（Ｇａｌ，ＧａｌＮＡｃ，Ｇｌｃ，Ｇ
ｌｃＮＡｃ）、セロビオース（Ｇｌｃβ１−４Ｇｌｃ）、２−アセトアミド−２−デオキ
シ−４−Ｏ−（β−グルコシル）−グルコース（Ｇｌｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ，Ｎ
’−ジアセチルキトビオース  （ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、および、ガラク
ト−Ｎ−ビオース（Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ）には全く作用しなかった。以上の結果
から、本酵素は、非還元末端のＬＮＢ、ＬａｃＮＡｃ、Ｌａｃ二糖構造［Ｇａｌβ１−３
／４Ｇｌｃ（ＮＡｃ）］を認識して、ＧｌｃＮＡｃ／Ｇｌｃ残基にα−（１→３／４）−
フコシル結合を導入することが明らかになった（図１１）。
【００８６】
【表３】
0005834484.tif 000008
【００８７】
反応産物の分析
１，３−１，４−α−Ｌ−フコシンターゼの位置特異性および立体特異性を証明するた
め、反応産物を精製してエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）、および
、１Ｈ−，１３Ｃ−核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）を用いて分析した。ＭＳスペクトルの結
果は、ＬＮＢおよびＬａｃＮＡｃにフコシル基が一カ所導入されたことを示していた（ナ
トリウム付加物［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値は５５２．１９、実測値は５５２．１８）。１Ｈ
および１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、ＬｅａおよびＬｅｘトリサッカライド標準品のスペ
クトルと一致した（データ示さず）。受容体にＬＮＴを用いた場合では、ＬＮＦＰ  ＩＩ
［Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ］のみ
が合成され、ラクト−Ｎ−フコペンタオース  Ｖ［Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３
Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）Ｇｌｃ］やラクト−Ｎ−ジフコヘキサオース  ＩＩ［
Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−
３）Ｇｌｃ、ＬＮＤＦＨ  ＩＩ］は合成されなかった（データ示さず）。以上の結果によ
り、本シンターゼの特異性が証明された。
【００８８】
（考察）
ＢｂＡｆｃＢの求核残基Ｄ７０３
ＧＨ２９は、そのアミノ酸配列の系統樹解析により２つのサブファミリーに分類されて
おり、この分類は明らかに両グループの基質特異性の差異と相関している（Ａｓｈｉｄａ
ｅｔ  ａｌ．２００９）。一つ目のサブファミリー（ＧＨ２９−Ａ）は、ヒトやＴｈｅ
ｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来の酵素によって代表されるように、比較的広い基
質特異性を示し、４−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコピラノシド（ｐＮＰ−α−Ｆｕｃ）
にも作用する酵素群から構成される（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．２００９ａ；Ｓｕｌｚｅｎｂ
ａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。これとは対照的に、もう一つのサブファミリー（
ＧＨ２９−Ｂ）に属する酵素は、非還元末端に存在するα−（１→３）−およびα−（１
→４）−フコシル結合のみを特異的に切断し、ｐＮＰ−α−Ｆｕｃには作用しない。Ｂｂ
ＡｆｃＢはＧＨ２９−Ｂサブファミリーに分類される（Ａｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．２０
０９）。最近、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｉｎｆａｎｔｉｓ  ＡＴＣＣ１５６９７
由来の１，３−１，４−α−Ｌ−フコシダーゼホモログ（ＢｉＡｆｃＢ，ＧＨ２９−Ｂ）
の結晶構造が決定された（ＰＤＢ  ｃｏｄｅ：３ＭＯ４）。その立体構造はＴ．ｍａｒｉ
ｔｉｍａ（ＴｍＦｕｃ）（ＧＨ２９−Ａ）のα−Ｌ−フコシダーゼ（ＰＤＢ  ｃｏｄｅ：
１ＯＤＵ）と類似性を示し［ｔｈｅ  ｒｏｏｔ  ｍｅａｎ  ｓｑｕａｒｅ  ｄｅｖｉａ
ｔｉｏｎ＝３．５オングストローム（２８９  Ｃα原子に対して）；Ｚスコア＝２８．５
；配列一致性＝２４％］（Ｈｏｌｍ  ａｎｄ  Ｐａｒｋ  ２０００）、特に、−１サブサ
イトの構造が極似していた。ＴｍＦｕｃの求核残基Ａｓｐ−２２４（Ｓｕｌｚｅｎｂａｃ
ｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００４）は、立体構造上でＢｉＡｆｃＢのＡｓｐ−１７２とよく
重なり、ＢｉＡｆｃＢのＡｓｐ−１７２は、アミノ酸配列のアライメントにおいてＢｂＡ
ｆｃＢのＡｓｐ−７０３に対応していた（図１）。これらの知見、および、変異体解析の
結果から、ＢｂＡｆｃＢの求核残基はＡｓｐ−７０３であると結論づけた。
【００８９】
１，３−１，４−α−Ｌ−フコシンターゼ
Ｄ７０３ＧおよびＤ７０３ＳはＬｅａとＬｅｘトリサッカライド合成活性を示したのに
対し、Ｄ７０３ＡおよびＤ７０３Ｃは示さなかった。この結果は、ＢｂＡｆｃＢのグリコ
シンターゼ化には、変異体の残存加水分解活性や置換残基の側鎖の大きさが関係しないこ
とを示唆している（表２）。それゆえ、グリコシンターゼ化を行う上で求核残基をどのア
ミノ酸残基に置換するのが適当であるかという疑問に対する答えは、Ｃｏｂｕｃｃｉ−Ｐ
ｏｎｚａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）が示唆しているように、目的の酵素に依存して
いるのであろう。
【００９０】
合成反応において、２基質反応の式に適合する速度論的パラメータは、今回の実験条件
下では得られなかった。このことは、本シンターゼの基質に対する親和性の低さを示唆し
ている。変異体は、添加したＦｕｃＦ量に対して約６０％の収率でＬｅａおよびＬｅｘト
リサッカライドを合成した。この反応効率は典型的なグリコシンターゼ（８０％以上）よ
りわずかに低いと思われるが、これは、反応中にＦｕｃＦが自然分解したためと考えられ
る（Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。
【００９１】
近年、Ｃｏｂｕｃｃｉ−Ｐｏｎｚａｎｏら（２００９）はＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏ
ｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来（ＳｓＦｕｃ  Ｄ２４２Ｓ）およびＴ．ｍａｒｉｔｉｍａ由来
（ＴｍＦｕｃ  Ｄ２２４Ｇ）の２種のα−Ｌ−フコシンターゼを作製した（両酵素ともＧ
Ｈ２９−Ａサブファミリーに属している）。これら２種のフコシンターゼは、β−Ｌ−フ
コピラノシルアザイド（ＦｕｃＮ３）（水溶液中ではＦｕｃＦに比べてかなり安定）を糖
供与体に利用することが可能であり、その反応効率は、受容体の種類により変動するもの
の（３０−９０％）、最大でＦｕｃＮ３に対して９０％まで到達した。ＢｂＡｆｃＢ  Ｄ
７０３変異体は、検討した条件下においてはＦｕｃＮ３を供与体として利用できず、また
、アザイドによってその活性はレスキューされなかった（データ示さず）。
【００９２】
基質特異性
位置特異性および受容体特異性の高さは、オリゴ糖を精密合成する際に、特に重要な決
定因子であり、その点で、酵素合成法は化学合成法よりも有効である場合が多い。これま
でに、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｐｅｎ
ｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ、および、Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ由来の立体保
持型α−Ｌ−フコシダーゼにおいて、糖供与体にｐＮＰ−Ｆｕｃを利用した糖転移反応に
よるフコシルオリゴ糖の合成が行われてきた（Ａｊｉｓａｋａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８；
Ｍｕｒａｔａ  ｅｔ  ａｌ．１９９９；Ｆａｒｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．２０００；Ｏｓａ
ｎｊｏ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。また、上述したように、近年、ＴｍＦｕとＳｓＦｕｃ
がグリコシンターゼ化された（Ｃｏｂｕｃｃｉ−Ｐｏｎｚａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．２００９
）。これらの酵素もしくは変異体は、様々な受容体に効率的にα−Ｌ−フコシル結合を導
入することが出来るが、ＧＨ２９−Ａに属しているため（いくつかの酵素についての遺伝
子情報は得られていないが、ｐＮＰ−Ｆｕｃに対して活性があることから推察できる）、
本質的に、位置および受容体の選択的制御が出来ない。例えば、ＴｍＦｕｃをｐＮＰ−α
−Ｆｕｃ（供与体）およびｐＮＰ−β−Ｇａｌ（受容体）と反応さて糖転移反応を行うと
、Ｆｕｃα１−３Ｆｕｃα−ｐＮＰ  およびＦｕｃα１−２Ｇａｌβ−ｐＮＰの混合物が
得られることが知られている（Ｏｓａｎｊｏ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。また、ＳｓＦｕ
ｃのグリコシンターゼ変異体は、供与体にＦｕｃＮ３、および、受容体にＧａｌβ−ｐＮ
Ｐを用いると、Ｆｕｃα１−６Ｇａｌβ−ｐＮＰ、Ｆｕｃα１−３Ｇａｌβ−ｐＮＰ、Ｆ
ｕｃα１−４Ｇａｌβ−ｐＮＰ、および、Ｆｕｃα１−２（Ｆｕｃα１−３）Ｇａｌβ−
ｐＮＰを生じることが報告されている（Ｃｏｂｕｃｃｉ−Ｐｏｎｚａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．
２００９）。
【００９３】
本研究では、ＢｂＡｆｃＢのグリコシンターゼ化により、特異的かつ効率的にＬｅａお
よびＬｅｘトリサッカライドを合成することに成功した。特筆すべきはその厳密な受容体
特異性である。本酵素は、非還元末端に存在するＬＮＢ、ＬａｃＮＡｃ、Ｌａｃの二糖構
造［Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ（Ｇｌｃ）］のみを受容体として認識し、単糖はＧ
ｌｃＮＡｃでさえ認識しない。現在、ＢｂＡｆｃＢの立体構造情報がないので（類縁酵素
ＢｉＡｆｃＢにおいても、（＋）サブサイトを形成するループ構造が決定できていない）
、本酵素の受容体特異性について説明することが出来ないが、以前の報告にあるように（
Ｓｕｇｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．２００６）、様々な基質を利用して受容体特異性を調べ
ることで、（＋）サブサイトの特性についての有用な情報を得ることが出来た。つまり、
ＢｂＡｆｃＢはＧｌｃ／ＧｌｃＮＡｃ残基のサブサイト（ＧａｌＮＡｃ残基は認識しない
）の隣に、枝分かれしたＧａｌ残基を収容できるサブサイト（ＧｌｃＮＡｃ／Ｇｌｃ残基
は認識しない）があると推察された（表３、図１１）。ここで、ＬＮＢとＬａｃＮＡｃ（
Ｌａｃ）では、ＧｌｃＮＡｃ環の面が反転しており、そのためにそれぞれのＧｌｃＮＡｃ
残基のＯ４およびＯ３の水酸基の立体位置が同一となることに注目すべきである（図１１
）。非還元末端Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ（Ｇｌｃ）二糖を認識することによって
、本酵素は特異的にＧｌｃＮＡｃ（Ｇｌｃ）のＯ３／Ｏ４位にα−Ｌ−フコシル基を導入
する。ＧｌｃＮＡｃ／Ｇｌｃ残基のフコシル化部位の隣の位置する環外官能基の大きさ（
−ＮＨＣＯＣＨ３，−ＣＨ２ＯＨ，−ＯＨ）が反応効率に影響すると考えられた（表３、
図１１）。このような位置特異性および受容体特異性は、本酵素ＢｂＡｆｃＢ  Ｄ７０３
Ｓのユニークの特性であり、ＧＨ２９−Ａサブファミリーに属する他のα−Ｌ−フコシダ
ーゼを利用することでは確立できなかったであろうと思われる。
【００９４】
本酵素は受容体に２’−ＦＬ（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）を利用し、効率
は良くないがＤＦＬ［Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ（Ｆｕｃα１−３）１−４Ｇｌｃ］を特異
的に合成した。また、本酵素はＬＮＴ（Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１
−４Ｇｌｃ）を受容体とした場合に、ＬＮＦＰ  ＩＩ［Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４
）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ］を合成した。ＬＮＴにはフコシル化可能
な部位が２つ存在するが、単離した産物を分析したところ、ＬＮＦＰ  ＩＩしか検出され
なかった。このことは、野生型のＢｂＡｆｃＢをＬＮＤＦＨ  ＩＩ［Ｇａｌβ１−３（Ｆ
ｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）Ｇｌｃ］に作用
させた場合、Ｆｕｃα１−３Ｇｌｃ結合よりもＦｕｃα１−４ＧｌｃＮＡｃ結合を約１０
０倍早く切断するという事実と良く一致していた（データ示さず）。
【００９５】
ＢｂＡｆｃＢ  Ｄ７０３Ｓ変異体を利用すれば、様々な複合糖質糖鎖の非還元末端のＩ
型およびＩＩ型構造に、極めて特異的に、意図しないフコシル基を導入することなく、Ｌ
ｅａおよびＬｅｘ抗原を形成することが可能となる。また、１，３−１，４−α−Ｌ−フ
コシンターゼ、および、我々がすでに開発している１，２−α−Ｌ−フコシンターゼ（Ｗ
ａｄａ  ｅｔ  ａｌ．２００８）を組み合わせることで、すべてのタイプのルイス糖を合
成することが可能となるかも知れない。
【００９６】
（まとめ）
ルイスａ（Ｌｅａ）［Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ］およびルイス
ｘ（Ｌｅｘ）［Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ］血液型抗原決定基は、
複合糖質糖鎖の非還元末端に存在し、様々な生命現象に関わっている．それゆえ、これら
抗原の効率的な合成方法を確立することは、糖鎖の機能研究において極めて重要である。
我々は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ由来１，３−１，４−α−Ｌ
−フコシダーゼの求核残基変異体Ｄ７０３Ｓが、供与体にβ−Ｌ−フッ化フコース（Ｆｕ
ｃＦ）および受容体にラクト−Ｎ−ビオースＩ（Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）あるいは
Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）を用いた場合に、添加したＦ
ｕｃＦ濃度に対して５６％の効率でＬｅａとＬｅｘトリサッカライドを合成することを見
出した。また、本酵素は受容体としてラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、２’−フコ
シルラクトース（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、ラクト−Ｎ−テトラオース（
Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）を認識し、それぞれ３−フ
コシルラクトース［Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）Ｇｌｃ］、ジフコシルラクトース
［Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ（Ｆｕｃα１−３）１−４Ｇｌｃ］、ラクト−Ｎ−フコペンタ
オースＩＩ  ［Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４
Ｇｌｃ］を特異的に合成した。しかしながら、単糖、セロビオース（Ｇｌｃβ１−４Ｇｌ
ｃ）、Ｇｌｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオース（ＧｌｃＮＡｃ
β１−４ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクト−Ｎ−ビオース（Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ）は受
容体にはならなかった。すなわち、本酵素は、非還元末端に存在する二糖構造［Ｇａｌβ
１−３／４ＧｌｃＮＡｃ（Ｇｌｃ）］を特異的に認識し、ＧｌｃＮＡｃ／Ｇｌｃ残基の３
位もしくは４位にフコシル基を特異的に導入することを明らかとした。本酵素（１，３−
１，４−α−Ｌ−フコシンターゼ）の高い位置特異性および受容体特異性は極めてユニー
クであり、Ｉ型およびＩＩ型糖鎖構造にそれぞれＬｅａおよびＬｅｘ抗原決定基を導入す
るための極めて有用なツールとなることが示唆された。
【００９７】
（参考文献）
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【０１００】
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【０１０１】
Ｃｌｅｌａｎｄ  ＷＷ．１９６３．Ｔｈｅ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ−ｃ
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ｔｒａｔｅｓ  ｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｉ．Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｒａ
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【０１０２】
Ｃｏｂｕｃｃｉ−Ｐｏｎｚａｎｏ  Ｂ，Ｃｏｎｔｅ  Ｆ，Ｂｅｄｉｎｉ  Ｅ，Ｃｏｒｓａ
ｒｏ  ＭＭ，Ｐａｒｒｉｌｌｉ  Ｍ，Ｓｕｌｚｅｎｂａｃｈｅｒ  Ｇ，Ｌｉｐｓｋｉ  Ａ
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００９．β−Ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ａｚｉｄｅｓ  ａｓ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  
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【０１０３】
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【０１０４】
Ｆａｒｋａｓ  Ｅ，Ｔｈｉｅｍ  Ｊ，Ａｊｉｓａｋａ  Ｋ．２０００．Ｅｎｚｙｍａｔｉ
ｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｆｕｃｏｓｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｄｉｓａｃｃｈ
ａｒｉｄｅｓ  ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  
α−Ｌ−ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｃｏｌ
ｏｒ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ．３２８：２９３−２９９．
【０１０５】
Ｈａｎｃｏｃｋ  ＳＭ，Ｖａｕｇｈａｎ  ＭＤ，Ｗｉｔｈｅｒｓ  ＳＧ．２００６．Ｅｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅｓ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒ
ａｎｓｆｅｒａｓｅｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．１０：５０９−５１
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【０１０６】
Ｈｏｌｍ  Ｌ，Ｐａｒｋ  Ｊ．２０００．ＤａｌｉＬｉｔｅ  ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  ｆｏ
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【０１０７】
Ｈｏｎｄａ  Ｙ，Ｋｉｔａｏｋａ  Ｍ，  Ｈａｙａｓｈｉ  Ｋ．２００４．Ｒｅａｃｔｉ
ｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｃｈｉｔｏｂｉｏｓｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ
ｆｒｏｍ  Ｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ  ｏｆ  ｆａｍｉｌｙ  ３６  ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎ  Ｖｉ
ｂｒｉｏ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３７７：２２５−２３２．
【０１０８】
Ｈｏｎｄａ  Ｙ，Ｋｉｔａｏｋａ  Ｍ．２００６．Ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｇｌｙｃｏｓｙ
ｎｔｈａｓｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｎ  ｉｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｓｉ
ｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８１：１４２６−１４３１．
【０１０９】
Ｊａｋｅｍａｎ  ＤＬ，Ｗｉｔｈｅｒｓ  ＳＧ．２００２．Ｇｌｙｃｏｓｙｎｔｈａｓｅ
ｓ：Ｎｅｗ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉ  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１３−２５．
【０１１０】
Ｋａｔａｙａｍａ  Ｔ，Ｓａｋｕｍａ  Ａ，Ｋｉｍｕｒａ  Ｔ，Ｍａｋｉｍｕｒａ  Ｙ，
Ｈｉｒａｔａｋｅ  Ｊ，Ｓａｋａｔａ  Ｋ，Ｙａｍａｎｏｉ  Ｔ，Ｋｕｍａｇａｉ  Ｈ
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ｒｔｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ（ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａ
ｍｉｌｙ  ９５）．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：４８８５−４８９３．
【０１１１】
Ｋａｔａｙａｍａ  Ｔ，Ｆｕｊｉｔａ  Ｋ，Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｋ．２００５．Ｎｏｖｅ
ｌ  ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅｓ  ａｃｔｉｎｇ  ｏｎ
ｓｕｇａｒ  ｃｈａｉｎｓ  ｏｆ  ｍｕｃｉｎ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ  Ｂ
ｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｅｎｇ．９９：４５７−４６５．
【０１１２】
Ｋｉｔａｏｋａ  Ｍ，Ｈｏｎｄａ  Ｙ，Ｆｕｓｈｉｎｏｂｕ  Ｓ，Ｈｉｄａｋａ  Ｍ，Ｋ
ａｔａｙａｍａ  Ｔ，Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｋ．２００９．ＣＯｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  
ｉｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ  ｉｎｔｏ  ｃａｔａ
ｌｙｓｔｓ  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  ｅｍｐｌｏｙ
ｉｎｇ  ａ  ｇｌｙｃｏｓｙｎｔｈａｓｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｌｙｃ
ｏｓｃｉ  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：２３−３９．
【０１１３】
Ｌｉｕ  ＳＷ，Ｃｈｅｎ  ＣＳ，Ｃｈａｎｇ  ＳＳ，Ｍｏｎｇ  ＫＫ，Ｌｉｎ  ＣＨ，Ｃ
ｈａｎｇ  ＣＷ，Ｔａｎｇ  ＣＹ，Ｌｉ  ＹＫ．２００９．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ  ｏｆ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  α−Ｌ−ｆｕｃ
ｏｓｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ｔｅｓｔｓ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ．４８：１１０−１２０．
【０１１４】
Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ  ＬＦ，Ｗａｎｇ  Ｑ，Ｗａｒｒｅｎ  ＲＡＪ，Ｗｉｔｈｅｒｓ  Ｓ
Ｇ．１９９８．Ｇｌｙｃｏｓｙｎｔｈａｓｅｓ：ｍｕｔａｎｔ  ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ
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【０１１５】
Ｍａｌｅｔ  Ｃ，Ｐｌａｎａｓ  Ａ．１９９８．Ｆｒｏｍ  β−ｇｌｕｃａｎａｓｅ  ｔ
ｏ  β−ｇｌｕｃａｎｓｙｎｔｈａｓｅ：ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  
α−ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅｓ  ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ａ  ｍｕｔａ
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【０１１６】
ＭｃＣａｒｔｅｒ  ＪＤ，Ｗｉｔｈｅｒｓ  ＳＧ．１９９４．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏ
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【０１１７】
Ｍｕｒａｔａ  Ｔ，Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  Ｓ，Ｚｅｎｇ  Ｘ，Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｓ，Ｕｓ
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ｎｚｙｍｅｓ  ｎｅｗ  ｔｒｉｃｋｓ：ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔ
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ｒａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８６：１６９−１７７．
【０１２２】
Ｓａｎｏ  Ｍ，Ｈａｙａｋａｗａ  Ｋ，ｋａｔｏ  Ｉ．１９９２．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  α−Ｌ−ｆｕｃｏｓｉｄａｓ
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ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  
１０  ｘｙｌａｎａｓｅｓ．Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．７
０：１２１０−１２１７．
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ｉｎｇ  ＣＡ，Ｗｉｔｈｅｒｓ  ＳＧ，Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ  Ｂ，Ｂｏｕｒｎｅ  Ｙ．２
００４．Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉ
ｔｉｍａ  α−Ｌ−ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ．Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｃａ
ｔａｌｙｔｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉ
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【０１２６】
Ｗａｄａ  Ｊ，Ｈｏｎｄａ  Ｙ，Ｎａｇａｅ  Ｍ，Ｋａｔｏ  Ｒ，Ｗａｋａｔｓｕｋｉ  
Ｓ，Ｋａｔａｙａｍａ  Ｔ，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  Ｈ，Ｋｕｍａｇａｉ  Ｈ，Ｋｉｔａｏ
ｋａ  Ｍ，Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｋ．２００８．１，２−α−Ｌ−Ｆｕｃｏｓｙｎｔｈａｓ
ｅ：ａ  ｇｌｙｃｏｓｙｎｔｈａｓｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｎ  ｉｎｖｅｒｔ
ｉｎｇ  α−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｒｅａｃｔｉ
ｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５８２：３７３９−３７４３．
【０１２７】
Ｗａｎｇ  ＬＸ，Ｈｕａｎｇ  Ｗ．２００９．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｔｒａｎｓｇｌｙｃ
ｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｃ
ｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．１３：５９２−６００．
【０１２８】
Ｗａｎｇ  Ｗ，Ｈｕ  Ｔ，Ｆｒａｎｔｏｍ  ＰＡ，Ｚｈｅｎｇ  Ｔ，Ｇｅｒｗｅ  Ｂ，Ｄ
ｅｌ  Ａｍｏ  ＤＳ，Ｇａｒｒｅｔ  Ｓ，Ｓｅｉｄｅｌ  ＲＤ  ＩＩＩ，Ｗｕ  Ｐ．２０
０９．Ｃｈｅｍｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃ
ｏｓｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｌｅｗｉｓ  Ｘ  ｇｌｙｃａｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｐ
ｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０６：１６０９６−１６１０１．
【０１２９】
Ｚｅｌｅｎｙ  Ｒ，Ｌｅｏｎａｒｄ  Ｒ，Ｄｏｒｆｎｅｒ  Ｇ，Ｄａｌｉｋ  Ｔ，Ｋｏｌ
ａｒｉｃｈ  Ｄ，Ａｌｔｍａｎｎ  Ｆ．２００６．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ
ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｌａｎｔ  α１，３／４−
ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇｓ  ｆｒｏｍ  ａ
ｌｍｏｎｄ  ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ  Ｉ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．６７：６４１
−６４８．
【産業上の利用可能性】
【０１３０】
本発明は、ＬｅａおよびＬｅｘ抗原を含む様々な糖鎖の特異的な製造に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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