(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号７または１８７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および配列番号８または１８８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
配列番号９または１８９のアミノ酸配列を含む重鎖；および配列番号１０または１９０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項３】
前記単離モノクローナル抗体が、ヒトＣ５タンパク質に結合する、請求項１又は２に記載の単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項４】
１００ｐＭヒトＣ５で再構成されるヒトＣ５枯渇血清を用いるとき、インビトロ溶血検定法によって測定して、２０−２００ｐＭのＩＣ50で副補体経路を阻害する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントであって、ここで、前記抗体は、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体である、単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントであって、前記抗体は、ＩｇＧアイソタイプである、単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメント、および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸。
【請求項９】
重鎖可変領域を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、配列番号１１の配列を含み、および軽鎖可変領域を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、配列番号１２の配列を含む、請求項８に記載の単離核酸。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の単離核酸を含むベクター。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントの重鎖および軽鎖をコードする組換えＤＮＡセグメントを含む単離宿主細胞であって；ここで、前記ＤＮＡセグメントは、機能し得るようにプロモーターに結合され、そして、前記宿主細胞において発現され得る、単離宿主細胞。
【請求項１２】
薬として使用するための、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントを含む、超急性同種移植片拒絶、加齢性黄斑変性、喘息、関節炎、自己免疫心疾患、多発性硬化症、炎症性腸疾患、虚血−再灌流損傷、バラクワ−サイモン（Ｂａｒｒａｑｕｅｒ−Ｓｉｍｏｎｓ）症候群、全身性エリテマトーデス、紅斑性狼瘡、乾癬、多発性硬化症、アルツハイマー病、糸球体腎炎、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、またはＭＰＧＮＩＩの処置における使用のための医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントを含む、体外循環と関連した免疫および血液凝固系の機能不全を縮小させる方法における使用のための医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントを含む、血液透析および移植における使用のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．緒論
本発明は、補体タンパク質Ｃ５を標的とする抗体ならびにその組成物および使用方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
２．発明の背景
自然免疫系の一部である補体の通常の役割は、宿主防御に存する。補体は、細菌感染を防御し、適応免疫および自然免疫を連動させ、免疫複合体および炎症性損傷産物を処理する。
【０００３】
防御機能は、補体活性化の過程で生成される生物活性産物により遂行され、感染源をオプソニン化し、炎症を促進するかまたは感受性標的を溶解する（Marzari et al., Eur J Immunol 32:2773-2782 (2002)）。補体系は、免疫系においてある一定の役割を演じる約２５〜３０の血漿タンパク質により構成される。補体カスケードは、少なくとも３つの主要経路により活性化される。古典的経路は、典型的には免疫複合体により活性化され、副経路は、非保護細胞表面により活性化され得、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）経路は、細胞表面炭水化物へのＭＢＬの結合により開始される（Trendelenburg, Swiss Med Wkly 137:413-417 (2007)）。
【０００４】
３経路は全て、最終的にＣ５転換酵素によるＣ５の開裂に至る。この開裂の結果は、強力な炎症性分子、Ｃ５ａフラグメントおよび膜侵襲複合体（ＭＡＣ）を誘導するＣ５ｂの放出である。補体生成物は、一旦放出されると、外来および自己標的間の区別をしなくなり、厳重に統制されていない場合、制限のない補体活性化に随伴する臨床的状態においてバイスタンダー細胞および組織の広範な損傷を誘発することが多い（Marzari et al., 2002）。
【０００５】
Ｃ５は、１８残基シグナル配列および成熟Ｎ−末端β鎖およびＣ−末端α鎖の間に位置する高Ａｒｇリンカー配列（ＲＰＲＲ）から成る１６７６アミノ酸の単一プロ−Ｃ５ペプチドとして細胞内で発現される。成熟Ｃ５は、約１９０ｋＤａの分子量を有し、ジスルフィド結合により連結された２本のポリペプチド鎖（α、１１５ｋＤａおよびβ、７５ｋＤａ）により構成される。Ｃ５転換酵素は、アルファ鎖の残基７４および７５間でＣ５を開裂することにより、７４アミノ酸Ｃ５ａペプチドおよびＣ５ｂフラグメントを放出させ、それに続いてＣ５ｂフラグメントは膜侵襲複合体（ＭＡＣ）に組み込まれる。
【０００６】
黄斑変性は、網膜の黄斑領域として知られる目の内層の中心が、薄弱化、萎縮、場合によっては出血を呈する主に高齢者で見出される医学的状態である。この結果、中心視覚が失われ得るため、必然的に細かい事物を見たり、読んだり、顔を認識することができなくなる。脈絡膜の新生血管形成の病因についてはあまり解明されていないが、炎症、虚血および血管新生因子の局所産生などの因子が重要であると考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
古典的または副成分経路に関連した疾患および障害、特にＡＭＤの処置について現行治療法の選択肢があるにもかかわらず、依然として有効かつ寛容性の優れた治療法をもたらす特異的標的の発見が要望されている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
３．発明の要旨
本発明は、単離補体Ｃ５結合分子（例、Ｃ５−結合抗体またはその抗原結合フラグメント）、上記分子を含む医薬組成物、上記分子および組成物の製造方法、およびその使用方法を提供する。
【０００９】
一部の実施態様において、本発明は、Ｃ５タンパク質と特異的に結合する単離抗体または抗原結合フラグメントを提供するが、この抗体は、少なくとも１×１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０10Ｍ−１または１０11Ｍ−１の親和定数（ＫＡ）を有するものとする。
【００１０】
一部の実施態様において、本発明は、Ｃ５タンパク質と特異的に結合し、約２０ｐＭ〜約２００ｐＭのＩＣ５０範囲でインビトロ溶血検定法により測定されたとおり、副完全経路を阻害する単離抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１１】
一部の実施態様において、本発明は、Ｃ５タンパク質と特異的に結合し、下表１記載の抗体と交差競合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一部の実施態様において、本発明は、下表１記載の抗体と同一のＣ５タンパク質のエピトープと結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１２】
一部の実施態様において、本発明抗体は、Ｃ５タンパク質と特異的に結合する単離モノクローナル抗体である。一部の実施態様において、本発明抗体は、Ｃ５タンパク質と特異的に結合する単離ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である。一部の実施態様において、本発明抗体は、Ｃ５タンパク質と特異的に結合する単離キメラ抗体である。一部の実施態様において、本発明抗体は、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域を含む。
【００１３】
一部の実施態様において、本発明は、Ｃ５タンパク質と特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントを提供するが、この抗体は単鎖抗体であるものとする。一部の実施態様において、本発明抗体はＦａｂフラグメントである。若干の実施態様において、本発明抗体はｓｃＦｖである。
【００１４】
一部の実施態様において、本発明は、ヒトＣ５およびカニクイザルＣ５の両方と特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。若干の実施態様において、本発明抗体はＩｇＧアイソタイプである。
【００１５】
一部の実施態様において、本発明は、アミノ酸が、各ヒトＶＨまたはＶＬ生殖系列化配列から抗体フレームワーク中へ置換されたフレームワークを含む単離抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１６】
一部の実施態様において、本発明は、Ｃ５タンパク質と特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供するが、それらの抗体は、配列番号１、２、３、４、５、６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４９、５０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、７７、７８、８９、９５、１０１、１０７、１１３、１１９、１２０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０９、２２６、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９または２４０と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する少なくとも１つの相補性決定（ＣＤＲ）配列を含むものとする。
【００１７】
一部の実施態様において、本発明は、Ｃ５タンパク質と特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供するが、それらの抗体は、配列番号１、２、３、１７、１８、１９、３３、３４、３５、４９、６１、６２、６３、７７、７７、９５、１０７、１１３、１１９、１３２、１３１、１３３、１４５、１４６、１４７、１５９、１６０、１６１、１７３、１７４、１７５、１９５、１９６、１９７、２２６、２３５、２３６または２３７と同一である少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ配列を含むものとする。
【００１８】
一部の実施態様において、本発明は、Ｃ５タンパク質と特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供するが、それらの抗体は、配列番号４、５、６、２０、２１、２２、３６、３７、３８、５０、６４、６５、６６、７８、８９、１０１、１２０、１３４、１３５、１３６、１４８、１４９、１５０、１６２、１６３、１６４、１７６、１７７、１７８、１９８、１９９、２００、２０９、２３８、２３９または２４０と同一である少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ配列を含むものとする。
【００１９】
一部の実施態様において、本発明は、Ｃ５タンパク質と特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供するが、それらの抗体は、配列番号１、１７、３３、６１、１３１、１４５、１５９、１７３、１９５および２３５から成る群から選択される重鎖ＣＤＲ１；配列番号２、１８、３４、４９、６２、７７、９５、１０７、１１３、１１９、１３２、１４６、１６０、１７４、１９６、２２６および２３６から成る群から選択される重鎖ＣＤＲ２；および配列番号３、１９、３５、６３、１３３、１４７、１６１、１７５、１９７および２３７から成る群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含むものとする。一部の実施態様において、上記抗体またはその抗原結合フラグメントは、さらに配列番号４、２０、３６、６４、１３４、１４８、１６２、１７６、１９８および２３８から成る群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５、２１、３７、６５、１３５、１４９、１６３、１７７、１９９および２３９から成る群から選択される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号６、２２、３８、５０、６６、７８、８９、１０１、１２０、１３６、１５０、１６４、１７８、２００、２０９および２４０から成る群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【００２０】
一部の実施態様において、本発明は、Ｃ５タンパク質と特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供するが、それらの抗体は、配列番号４、２０、３６、６４、１３４、１４８、１６２、１７６、１９８および２３８から成る群から選択される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５、２１、３７、６５、１３５、１４９、１６３、１７７、１９９および２３９から成る群から選択される軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号６、２２、３８、５０、６６、７８、８９、１０１、１２０、１３６、１５０、１６４、１７８、２００、２０９および２４０から成る群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含むものとする。
【００２１】
一部の実施態様において、本発明は、Ｃ５タンパク質と特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供するが、それらの抗体は、配列番号７、２３、３９、５１、６７、７９、９６、１０８、１１４、１２１、１３７、１５１、１６５、１７９、１８７、２０１、２１０、２１８、２２７、２４１、２５３、２５７、２７３、２７７または２８１と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含むものとする。一部の実施態様において、上記抗体またはその抗原結合フラグメントは、さらに、配列番号８、２４、４０、５２、６８、８０、９０、１０２、１２２、１３８、１５２、１６６、１８０、１８８、２０２、２１１、２１９、２２８、２４２、２６１、２６５、２６９、２８５および２８９と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。
【００２２】
一部の実施態様において、本発明は、Ｃ５タンパク質と特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供するが、それらの抗体は、配列番号８、２４、４０、５２、６８、８０、９０、１０２、１２２、１３８、１５２、１６６、１８０、１８８、２０２、２１１、２１９、２２８、２４２、２６１、２６５、２６９、２８５および２８９と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含むものとする。
【００２３】
一部の実施態様において、本発明は、Ｃ５タンパク質と特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供するが、それらの抗体は、配列番号９、２５、４１、５３、６９、８１、９７、１０９、１１５、１２３、１３９、１５３、１６７、１８１、１８９、２０３、２１２、２２０、２２９、２４３、２４９、２５４、２５８、２７４、２７８または２８２と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する重鎖を含むものとする。一部の実施態様において、上記抗体は、さらに、配列番号１０、２６、４２、５４、７０、８２、９１、１０３、１２４、１４０、１５４、１６８、１８２、１９０、２０４、２１３、２２１、２３０、２４４、２５１、２６２、２６６、２７０、２８６または２９０と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する軽鎖を含む。
【００２４】
一部の実施態様において、本発明は、Ｃ５タンパク質と特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供するが、それらの抗体は、配列番号１０、２６、４２、５４、７０、８２、９１、１０３、１２４、１４０、１５４、１６８、１８２、１９０、２０４、２１３、２２１、２３０、２４４、２５１、２６２、２６６、２７０、２８６または２９０と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する軽鎖を含むものとする。
【００２５】
本発明はまた、１個またはそれ以上の本発明Ｃ５結合分子（例、Ｃ５結合抗体またはその抗原結合フラグメント）および医薬上許容される担体を含む医薬組成物を包含する。
【００２６】
一部の実施態様において、本発明は、配列番号７、２３、３９、５１、６７、７９、９６、１０８、１１４、１２１、１３７、１５１、１６５、１７９、１８７、２０１、２１０、２１８、２２７、２４１、２５３、２５７、２７３、２７７または２８１と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含むポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００２７】
一部の実施態様において、本発明は、配列番号８、２４、４０、５２、６８、８０、９０、１０２、１２２、１３８、１５２、１６６、１８０、１８８、２０２、２１１、２１９、２２８、２４２、２６１、２６５、２６９、２８５および２８９と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含むポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００２８】
本発明はまた、上記核酸を含むベクターおよび宿主細胞を提供する。一実施態様において、本発明は、（１）本発明抗体の重鎖をコード化する組換えＤＮＡセグメントおよび（２）本発明抗体の軽鎖をコード化する第２組換えＤＮＡセグメントを含む単離宿主細胞を提供する。ここで、上記ＤＮＡセグメントは、それぞれ第１および第２プロモーターに機能し得るように結合されており、上記宿主細胞において発現され得るものとする。別の実施態様において、本発明は、本発明抗体の重鎖および軽鎖をそれぞれコード化する組換えＤＮＡセグメントを含む単離宿主細胞を提供するが、ここで上記ＤＮＡセグメントは、プロモーターに機能し得るように結合されており、上記宿主細胞で発現され得るものとする。一部の実施態様において、宿主細胞はヒト以外の哺乳類セルラインである。若干の実施態様において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【００２９】
さらに本発明は、本発明のＣ５結合分子（例、Ｃ５結合抗体またはその抗原結合フラグメント）を用いた診断的処置方法を提供する。一実施態様において、本発明は、処置を必要とする対象に、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物の有効量を投与することを含む、加齢性黄斑変性の処置方法を提供する。
【００３０】
別の実施態様において、本発明は、処置を必要とする対象に、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物の有効量を投与することを含む、疾患の処置方法を提供する。この場合、疾患とは、喘息、関節炎、自己免疫心疾患、多発性硬化症、炎症性腸疾患、虚血−再灌流損傷、バラクワ−サイモン(Barraquer-Simons)症候群、血液透析、全身性エリテマトーデス、紅斑性狼瘡、乾癬、多発性硬化症、移植、アルツハイマー病、糸球体腎炎またはＭＰＧＮIIである。
【００３１】
本発明はまた、処置を必要とする対象に、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物の有効量を投与することを含む、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）の処置方法を提供する。
【００３２】
さらに本発明は、処置を必要とする対象に、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物の有効量を投与することを含む、体外循環に随伴する症状の改善方法を提供する。
【００３３】
３.１．定義
特に断らなければ、本明細書で使用している技術および科学用語は全て、当業者が一般的に理解しているのと同じ意味を有する。
【００３４】
本明細書で使用している「抗体」の語は、抗体全体およびその抗原結合フラグメント（すなわち、「抗原結合部分」）または単鎖を包含する。天然に存する「抗体」は、ジスルフィド結合により相互に連結された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）および重鎖定常領域により構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３により構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）および軽鎖定常領域により構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬにより構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、さらにフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存性の高い領域およびそれと相互散在した相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域とに分けられ得る。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端まで次の順序で配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲにより構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、様々な免疫系細胞（例、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織または因子へ免疫グロブリンを結合させ得る。
【００３５】
本明細書で使用している抗体の「抗原結合部分」なる語は、所与の抗原（例、Ｃ５）への特異的結合能を保持している無傷抗体の１または複数フラグメントをいう。抗体の抗原結合機能は、無傷抗体のフラグメントにより遂行され得る。抗体の「抗原結合部分」なる語に包含される結合フラグメントの例としては、Ｆａｂフラグメント、すなわちＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから成る一価フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、すなわちヒンジ領域でジスルフィド結合により結合された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント、ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄフラグメント、抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖフラグメント、ＶＨドメインから成る単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント（Ward et al., 1989 Nature 341:544-546）および単離相補性決定領域（ＣＤＲ）がある。
【００３６】
さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によりコードされるが、それらは、組換え方法を用いて、人工ペプチドリンカーにより連結され得、そのリンカーは、ＶＬおよびＶＨ領域が対合して一価分子を形成している単一タンパク質鎖としてそれらを構成させ得る（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）としても知られている；例、Bird et al., 1988 Science 242:423-426; および Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883 参照）。上記単鎖抗体は、抗体の１個またはそれ以上の「抗原結合部分」を含む。これらの抗体フラグメントは、当業者に周知の慣用的技術を用いて得られ、フラグメントは、無傷抗体の場合と同様にして有用性についてスクリーニングされる。
【００３７】
抗原結合部分はまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、細胞内発現抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ｖ−ＮＡＲおよびｂｉｓ−ｓｃＦｖに組み込まれ得る（例、Hollinger および Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136 参照）。抗体の抗原結合部分は、ポリペプチドに基づいたスカホールド、例えばフィブロネクチンIII型（Ｆｎ３）へ移植され得る（フィブロネクチンポリペプチドモノボディを記載している米国特許第６７０３１９９号参照）。
【００３８】
抗原結合部分は、一対のタンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む単鎖分子に組み込まれ得、相補性軽鎖ポリペプチドと一緒になって、一対の抗原結合領域を形成する（Zapata et al., 1995  Protein Eng. 8(10):1057-1062; および米国特許第５６４１８７０号）。
【００３９】
本明細書で使用している「親和力」の語は、単一抗原性部位での抗体および抗原間における相互作用の強度をいう。各抗原性部位内では、抗体「アーム」の可変領域が、弱い非共有結合力を通じて多くの部位で抗原と相互作用する。相互作用が多いとき、親和力は強くなる。
【００４０】
本明細書で使用している「結合力」の語は、抗体−抗原複合体の全体的安定性または強度の情報を与える尺度をいう。それは、３つの主要な因子：抗体エピトープ親和力、抗原および抗体の両方の価および相互作用部分の構造的配置により制御される。最終的に、これらの因子は、抗体の特異性、すなわち特定抗体が正確な抗原エピトープにと結合している尤度を特定する。
【００４１】
「アミノ酸」の語は、天然および合成アミノ酸、並びに天然アミノ酸と類似した形で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物質をいう。天然アミノ酸は、遺伝コードによりコード化されたもの、および後で修飾が加えられるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメートおよびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基に結合しているアルファ炭素を有する化合物をいい、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムがある。上記類似体は、修飾Ｒ基（例、ノルロイシン）または修飾ペプチドバックボーンを有するが、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造を保持している。アミノ酸模倣物質は、アミノ酸の一般化学構造とは異なるが、天然アミノ酸と類似した形で機能する構造を有する化学的化合物をいう。
【００４２】
本明細書で使用している「結合特異性」の語は、唯一の抗原決定基と反応する個々の抗体結合部位の能力をいう。抗体結合部位は、分子のＦａｂ部分に位置し、重および軽鎖の超可変領域から構築される。抗体の結合親和力は、単一抗原決定基および単一抗体結合部位間における反応強度である。それは、抗原決定基と抗体結合部位間ではたらく引力と斥力の和である。
【００４３】
２物質間の特異的結合とは、平衡定数（ＫＡ）が少なくとも１×１０７Ｍ-1、１０８Ｍ-1、１０９Ｍ-1、１０10Ｍ-1または１０11Ｍ-1である結合を意味する。抗体（例、Ｃ５−結合抗体）と「特異的（または選択的）に結合する」という表現は、タンパク質および他の生物製剤の異種集団におけるコグネイト抗原（例、ヒトＣ５またはカニクイザルＣ５）の存在を決定する結合反応をいう。上記で示した平衡定数（ＫＡ）に加えて、本発明のＣ５結合抗体はまた、典型的には、約１×１０-2ｓ-1、１×１０-３ｓ-1、１×１０-４ｓ-1、１×１０-４ｓ-1またはそれ未満の解離速度定数（Ｋｄ）を有し、その非特異的抗原（例、Ｃ３、Ｃ４、ＢＳＡ）との結合親和力の少なくとも２倍の親和力でＣ５と結合する。「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」という表現については、本明細書では「抗原と特異的に結合する抗体」なる語とほとんど同じ意味として使用する。
【００４４】
「キメラ抗体」なる語は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が、異なるかまたは改変されたクラス、エフェクター機能および／または種の定常領域、または新たな特性をキメラ抗体に付与する全く異なる分子、例えば酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬剤などに結合されるように、定常領域またはその一部分が改変、置換または交換されているか、または（ｂ）可変領域またはその一部分が、異なるかまたは改変された抗原特異性を有する可変領域により改変、置換または交換されている抗体分子である。例えば、マウス抗体は、その定常領域をヒト免疫グロブリンからの定常領域と置き換えることにより修飾され得る。ヒト定常領域による置換故に、キメラ抗体は、元のマウス抗体と比べてヒトでの抗原性が低いながらも抗原認識の際にはその特異性を保持し得る。
【００４５】
「補体Ｃ５タンパク質」または「Ｃ５」なる語については、ほとんど同じ意味で使用しており、異なる種におけるＣ５タンパク質をいう。例えば、ヒトＣ５は、配列番号２９６に示した配列を有し、カニクイザルＣ５は、配列番号２９７に示した配列を有する（マカカ・ファスシクラリス(Macaca fascicularis）)（表１参照）。ヒトＣ５は、Quidelから入手され得る（カタログ番号Ａ４０３）。カニクイザルＣ５は、下記実施例の項で説明している要領で製造され得る。
【００４６】
「保存的修飾変異型」の語は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関する場合、保存的修飾変異型は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコード化する核酸、または核酸がアミノ酸配列をコード化しない場合には、本質的に同一の配列をいう。遺伝コードの縮重故に、多数の機能的に同一の核酸が所与のタンパク質をコード化する。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全てアミノ酸アラニンをコード化する。すなわち、アラニンがコドンにより特定されているどの位置でも、コドンは、コード化されるポリペプチドを改変することなく、特定された対応するコドンのいずれかに改変され得る。上記核酸変異型は「サイレント変異」であり、一種の保存的修飾変異である。また、ポリペプチドをコード化する本明細書の核酸配列は、いずれも核酸のあらゆる可能なサイレント変異を特定している。当業者であれば、核酸中の各コドン（ただし、通常メチオニンについての唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンについての唯一のコドンであるＴＧＧは例外とする）に修飾を加えることにより、機能的に同一の分子が得られることを認めるはずである。したがって、ポリペプチドをコード化する核酸の各サイレント変異は、特定された各配列に暗に含まれている。
【００４７】
ポリペプチド配列の場合、「保存的修飾変異型」は、ポリペプチド配列に対する個々の置換、欠失または付加を含み、結果的にアミノ酸は化学的に類似したアミノ酸と置き換えられる。機能的に類似したアミノ酸を提示する同類置換表は、当業界では周知である。上記の保存的修飾変異型は、それに加えて本発明の多形変異型、種間相同体および対立遺伝子を包含する。以下の８群は、互いに同類置換体であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例、Creighton, Proteins（1984）参照）。一部の実施態様において、「同類配列修飾」の語は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性にあまり影響しないかまたはそれらを改変することのないアミノ酸修飾を指すのに使用される。
【００４８】
「交差ブロック」、「交差ブロックされた」および「交差ブロックする」の語は、本明細書ではほとんど同じ意味で用いられており、標準競合的結合検定法において抗体または他の結合剤が呈するＣ５への他の抗体または結合剤の結合に対する妨害能力を意味する。
【００４９】
抗体または他の結合剤が、Ｃ５への別の抗体または結合分子の結合を妨害し得る能力または範囲、従って、それが本発明に従って交差ブロックすると言えるか否かは、標準競合結合検定法を用いて決定され得る。適切な一検定法には、Biacore 技術を使用するものがあり（例、BIAcore 3000 器具（Biacore、ウプサラ、スウェーデン国）を用いることによる）、表面プラズモン共鳴技術を用いて相互作用の範囲を測定し得る。交差ブロックを測定するための別の検定法は、ＥＬＩＳＡに基づく方法を使用する。
【００５０】
「エピトープ」の語は、抗体と特異的に結合することができるタンパク質決定基を意味する。エピトープは、通常、分子の化学的活性表面群、例えばアミノ酸または糖側鎖により構成され、通常、特異的な三次元構造特性および特異的な電荷特性を有する。立体配座的および非立体配座的エピトープは、変性溶媒の存在下では、後者ではなく前者への結合が失われるという点で区別される。
【００５１】
本明細書で使用しているＩｇＧ抗体についての「高親和性」の語は、標的抗原に関して１０-８Ｍまたはそれ未満、１０-９Ｍまたはそれ未満、または１０-10Ｍまたは１０-11Ｍまたはそれ未満のＫＤを有する抗体を指す。しかしながら、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプについては変化し得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプについての「高親和性」結合は、１０-７Ｍまたはそれ未満、または１０-８Ｍまたはそれ未満のＫＤを有する抗体を指す。
【００５２】
本明細書で使用している「ヒト抗体」の語は、フレームワークおよびＣＤＲの両領域がヒト起源の配列に由来する可変領域を有する抗体を含むものとする。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域はまた、上記ヒト配列、例えばヒト生殖系列化配列、またはヒト生殖系列化配列の突然変異バージョンから誘導される。本発明のヒト抗体は、ヒト配列によってコード化されないアミノ酸残基を含み得る（例、インビトロでのランダムまたは位置指定突然変異導入またはインビボでの体細胞突然変異により導入された突然変異）。
【００５３】
「ヒトモノクローナル抗体」の語は、フレームワークおよびＣＤＲの両領域がヒト配列に由来する可変領域を有する単一結合特異性を示す抗体を指す。一実施態様において、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合されたヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するヒト以外のトランスジェニック動物、例えばトランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマにより産生される。
【００５４】
「ヒト化」抗体は、ヒトでの免疫原性は低いながらも非ヒト抗体の反応性を保持している抗体である。これは、例えば、非ヒトＣＤＲ領域を維持し、抗体の残りの部分をそれらのヒト対応物質（すなわち、定常領域および可変領域のフレームワーク部分）と置き換えることにより達成され得る。例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984; Morrison および Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991; および Padlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994 参照。ヒト遺伝子工学技術の他の例には、限定されるわけではないが、米国特許第５７６６８８６号に開示されたＸｏｍａ技術がある。
【００５５】
２またはそれ以上の核酸またはポリペプチドという文脈における「同一の」または「同一性」パーセントの語は、同一である２またはそれ以上の配列または部分配列を指す。２つの配列が、下記の配列比較アルゴリズムの一つを用いて、または手動アラインメントおよび目視検査により測定されるある一定の比較ウインドウまたは指定領域における最大の一致を得るために比較および整列させたときに、特定パーセンテージで同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する場合（すなわち、特定領域にわたって、または特定されていない場合には配列全体にわたって６０％の同一性、所望により６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性）、２つの配列は「実質的に同一」である。所望により、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）長である領域にわたって、またはさらに好ましくは１００〜５００または１０００またはそれ以上のヌクレオチド（または２０、５０、２００またはそれ以上のアミノ酸）長である領域にわたって存在してもよい。
【００５６】
配列比較をするため、典型的には、一つの配列が、試験配列と比較されるリファレンス配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを用いるとき、試験およびリファレンス配列をコンピューターに入力し、部分配列座標を指定し、必要ならば、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。デフォルトプログラムパラメーターが使用され得るか、または選択的パラメーターが指定され得る。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて、リファレンス配列に対する試験配列についての配列同一性パーセントを計算する。
【００５７】
本明細書で使用している「比較ウインドウ」は、２０〜６００、通常約５０〜約２００、さらに一般的には約１００〜約１５０から成る群から選択される連続位置数のいずれか１つの区分への照合を含み、その場合、ある配列とリファレンス配列を最適な形で整列させた後、その配列は同じ連続位置数のリファレンス配列と比較され得る。比較用配列アラインメント方法は、当業界では公知である。比較するための最適な配列アラインメントは、例えば、Smith および Waterman（1970）Adv. Appl. Math. 2:482c の局所相同性アルゴリズムにより、Needleman および Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970 の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson および Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988 の類似性検索方法により、これらのアルゴリズムのコンピューター実装（Wisconsin Genetics Software Package における ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Genetics Computer Group、５７５ サイエンスドライブ、マディソン、ウィスコンシン）により、または手動アラインメントおよび目視検査（例、Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed.,、2003)参照）により実施され得る。
【００５８】
配列同一性および配列類似性パーセントの測定に適切なアルゴリズムの２例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２.０アルゴリズムであり、これらは、それぞれAltschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977; および Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990 に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析実施用ソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information を通して公的に入手可能である。このアルゴリズムでは、まず、データベース配列中で同じ長さのワードと整列させたとき、正と評価される閾値スコアＴに適合するか、またはそれを満たす、検索配列中の長さＷの短いワードを同定することにより高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定する。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と称される（Altschul et al.、前出）。これらの最初の近傍ワードヒットは、それらを含むさらに長いＨＳＰを発見するべく検索を開始する際のシードとして機能する。累積アライメントスコアが増加し得る限り、ワードヒットを各配列に沿って両方向に伸長させる。ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（マッチ残基対に関するリウォードスコア；常時＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常時＜０）を用いて累積スコアを計算する。アミノ酸配列については、スコアマトリックスを用いて累積スコアを計算する。各方向におけるワードヒットの伸長は、次のときには停止する：累積アライメントスコアが、その最大到達値からＸ量低下したとき；１またはそれ以上の負のスコア残基アライメントの蓄積により、累積スコアがゼロまたはそれ未満になったとき；または、いずれかの配列の末端に達したとき。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長、および１０の期待値（Ｅ）を使用し、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff および Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989 参照）アライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を用いる。
【００５９】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２配列間における類似性の統計分析を行う（例、Karlin および Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873−5787, 1993、参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムが提供する類似性の一尺度は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、２個のヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチが偶然起こる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸とリファレンス核酸の比較における最小和確率が、約０.２未満、より好ましくは約０.０１未満、最も好ましくは約０.００１未満であるとき、その核酸はリファレンス配列と類似していると見なされる。
【００６０】
また、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、PAM120 重量残余表(weight residue table)、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を用いる、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２.０）に組み込まれた E. Meyers および W. Miller （Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988）のアルゴリズムを用いて決定され得る。さらに、２つのアミノ酸配列間における同一性パーセントは、Blossom 62 マトリックスまたは PAM250 マトリックス、およびギャップ重量１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さ重量１、２、３、４、５または６を用いる、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（www.gcg.comで利用可能）におけるＧＡＰプログラムに組み込まれた Needleman および Wunsch（J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970）アルゴリズムを用いて決定され得る。
【００６１】
上記の配列同一性パーセンテージ以外に、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一である場合の別の指標は、第一の核酸によりコード化されたポリペプチドが、下記のように、第二の核酸によりコード化されたポリペプチドに対して産生した抗体と免疫学的に交差反応することである。すなわち、ポリペプチドは、典型的には、例えば２個のペプチドが同類置換によってのみ異なる場合、第二のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一である場合の別の指標は、２個の分子またはその相補体が、下記のように、ストリンジェント条件下で互いにハイブリダイゼーションすることである。２つの核酸配列が実質的に同一である場合のさらに別の指標は、同じプライマーが配列の増幅に使用され得ることである。
【００６２】
「単離抗体」の語は、抗原特異性が異なる他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例、Ｃ５と特異的に結合する単離抗体は、Ｃ５以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、Ｃ５と特異的に結合する単離抗体は、他の抗原との交差反応性を有し得る。さらに、単離抗体は、他の細胞材料および／または化学物質については実質的に不含有であり得る。
【００６３】
「アイソタイプ」の語は、重鎖定常領域遺伝子がもたらす抗体クラス（例、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４）を指す。アイソタイプはまた、Ｆｃ機能を改変するように、例えばエフェクター機能またはＦｃ受容体への結合を向上または低下させるように修飾が加えられた、これらのクラスの一つの修飾バージョンを含む。
【００６４】
本明細書で使用している「Kassoc」または「Ｋａ」の語は、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度をいうものとし、本明細書で使用している「Ｋｄｉｓ」または「Ｋｄ」の語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度をいうものとする。本明細書で使用している「ＫＤ」の語は解離定数をいうものとし、それはＫａに対するＫｄの割合（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体に関するＫＤ価は、当業界で十分に確立された方法を用いて決定され得る。抗体のＫＤの決定方法は、表面プラズモン共鳴を用いるか、またはバイオセンサーシステム、例えば Biacore（登録商標）システムを用いて行われる。
【００６５】
本明細書で使用している「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」の語は、単一分子組成物の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定エピトープについての単一結合特異性および親和性を示す。
【００６６】
本明細書で使用している「核酸」の語は、本明細書では「ポリヌクレオチド」の語とほとんど同じ意味で用いられ、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびその重合体の１本または２本鎖形態をいう。この語は、合成的、天然および非天然的なものであり、リファレンス核酸と類似した結合特性を有し、リファレンスヌクレオチドと類似した形で代謝される公知ヌクレオチド類似体または修飾バックボーン残基または結合を含む核酸を包含する。上記類似体の例には、限定するわけではないが、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）がある。
【００６７】
特に断らなければ、特定の核酸配列はまた、その保存的修飾変異型（例、縮重コドン置換）および相補的配列並びに明示された配列も暗黙的に包含する。具体的には、下記で詳述するとおり、縮重コドン置換は、１個以上の選択された（または全ての）コドンの第３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基により置換されている配列を作製することにより達成され得る（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; および Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994）。
【００６８】
「機能し得るように結合された」という表現は、２個またはそれ以上のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指す。典型的には、それは、転写された配列に対する転写調節配列の機能的関係をいう。例えば、プロモーターまたはエンハンサー配列は、それが適切な宿主細胞または他の発現系におけるコーディング配列の転写を刺激または調節する場合、コーディング配列と機能し得るように結合されている。一般的に、転写配列に機能し得るように結合されたプロモーター転写調節配列は、転写配列と物理的に近接している、すなわちそれらはシス作用性である。しかしながら、例えばエンハンサーなどの転写調節配列の中には、それらが転写を促すコーディング配列と物理的に近接するかまたは極めて近位に位置することを必要としないものもある。
【００６９】
本明細書で使用している「最適化された」の語は、生産細胞または生物体、一般的には真核生物細胞、例えばピキア（Pichia）の細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはヒト細胞で好まれるコドンを用いてアミノ酸配列をコード化するようにヌクレオチド配列が改変されたことを意味する。最適化ヌクレオチド配列には、「親」配列としても知られている出発ヌクレオチド配列により最初にコード化されたアミノ酸配列を完全に、または可能な限り多く保持するように遺伝子操作が加えられる。本発明での最適化配列は、哺乳類細胞で好まれるコドンを有するように遺伝子操作が加えられている。しかしながら、他の真核生物細胞または原核生物細胞におけるこれらの配列の最適化発現もまた想到される。最適化ヌクレオチド配列によりコード化されたアミノ酸配列もまた最適化されていると称される。
【００７０】
「ポリペプチド」および「タンパク質」の語は、アミノ酸残基の重合体を指すものとして、本明細書ではほとんど同じ意味で使用している。これらの語は、１個以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的化学模倣体であるアミノ酸重合体、並びに天然アミノ酸重合体および非天然アミノ酸重合体に適用される。特に断らなければ、特定のポリペプチド配列は、その保存的修飾変異型についても暗黙的に含むものとする。
【００７１】
本明細書で使用している「組換えヒト抗体」の語は、組換え手段により調製、発現、作製または単離されたヒト抗体、例えばヒト免疫グロブリン遺伝子に関して導入遺伝子または導入染色体により形質転換された動物（例、マウス）またはそこから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えばトランスフェクトーマから単離された抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、および他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子の全部または一部分の配列のスプライシングを含む他の手段により調製、発現、作製または単離された抗体を全て包含する。上記組換えヒト抗体は、フレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖系列化免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかしながら、ある種の実施態様では、上記組換えヒト抗体に対し、インビトロ突然変異（またはヒトＩｇ配列についてのトランスジェニック動物を使用するときには、インビボ体細胞突然変異）が導入され得るため、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列化ＶＨおよびＶＬ配列から誘導され、関連したものでありながら、インビボでのヒト抗体生殖系列化レパートリー内に天然には存在し得ない配列である。
【００７２】
「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）の語は、組換え発現ベクターが導入されている細胞を指す。言うまでもなく、上記の語は、特定の対象細胞とその細胞の子孫の両方を指すものとする。ある種の修飾は、突然変異または環境の影響故に後続世代で起こり得るため、上記子孫は、事実、親細胞と同一でない場合もあり得るが、依然として本明細書で使用している「宿主細胞」の語の範囲内に含まれるものとする。
【００７３】
「対象」の語は、ヒトおよびヒト以外の動物を包含する。ヒト以外の動物としては、あらゆる脊椎動物、例えば哺乳類および非哺乳類、例えばヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類および爬虫類がある。特記していない場合、「患者」または「対象」の語は、本明細書ではほとんど同じ意味で使用している。
【００７４】
「処置する」の語は、組成物または抗体の投与による、病気（例、ＡＭＤ）の症状、合併症または生化学的徴候の開始の阻止または遅延、症状の軽減または疾患、状態または障害のさらなる進展の停止または阻止を含む。処置は、予防的（病気の開始を阻止または遅延させるか、またはその臨床的または潜在的症状の発現を阻止するため）または病気の症状発現後における症状の治療的抑制または軽減であり得る。
【００７５】
「ベクター」の語は、それが結合されている別のポリヌクレオチドを輸送することができるポリヌクレオチド分子を指すものとする。ベクターの一タイプは「プラスミド」であり、追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状２本鎖ＤＮＡループをいう。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲーションされ得る。ある種のベクターは、それらが導入されている宿主細胞において自律複製することができる（例、細菌性の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳類ベクター）。他のベクター（例、非エピソーム性哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、そこで宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが機能し得るように結合されている遺伝子の発現を指令することができる。上記ベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と称す。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミド形態をとることが多い。本明細書では、プラスミドが最も慣用的な形態のベクターであるため、「プラスミド」および「ベクター」は、ほとんど同じ意味で使用され得る。しかしながら、本発明は、均等内容の機能を果たす上記の他の形態の発現ベクター、例えばウイルスベクター（例、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）なども包含するものとする。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
４．図面の簡単な説明
【図１】図１は、選択された抗体とそれらの最も密接に関連したヒト生殖系列化配列の可変領域アラインメントを示す。
【図２】図２は、ヒトＣ５をヒトＣ５枯渇血清中へ滴定することにより、Ｃ５活性を測定する溶血検定法を示す。
【図３】図３は、ヒトＣ５枯渇血清中へカニクイザル血清を滴定することによる、副経路溶血検定法についての最適カニクイザルＣ５濃度の測定を示す。
【図４】図４は、２０％ヒト血清による古典的経路溶血検定法の例を示す。
【図５】図５は、１００ｐＭ精製ヒトＣ５をヒトＣ５枯渇血清に添加する副経路溶血検定法の例を示す。
【図６】図６は、０.０２５％カニクイザル血清をヒトＣ５枯渇血清に添加する副経路溶血検定法の例を示す。
【図７】図７は、成熟Ｆａｂをそれらの各親物質と比較した古典的経路溶血検定法（２０％ヒト血清）の例を示す。
【図８】図８は、成熟Ｆａｂによる古典的経路溶血検定法（５％カニクイザル血清）の例を示す。
【図９】図９は、２０％ヒトＣ５−枯渇血清に添加した１００ｐＭヒトＣ５を用いる副経路溶血検定法における親和性成熟Ｆａｂ特性評価を示す。
【図１０】図１０は、２０％ヒト血清を用いる副経路溶血検定法における親和性成熟Ｆａｂ特性評価を示す。
【図１１】図１１は、２０％ヒトＣ５−枯渇血清に添加した１００ｐＭカニクイザルＣ５を用いる副経路溶血検定法における親和性成熟Ｆａｂ特性評価を示す。
【図１２】図１２は、２０％ヒト血清を用いる古典的経路溶血検定法における生殖系列化ＩｇＧの特性評価を示す。
【図１３】図１３は、５％カニクイザル血清を用いる古典的経路溶血検定法における生殖系列化ＩｇＧの特性評価を示す。
【図１４】図１４は、副経路溶血検定法、１００ｐＭヒトＣ５における生殖系列化ＩｇＧの特性評価を示す。
【図１５】図１５は、２０％ヒト血清を用いる副経路溶血検定法およびＣ５ａ生成ＥＬＩＳＡにおける最終生殖系列化ＩｇＧの特性評価を示す。
【図１６】図１６は、２０％ヒト血清溶血検定法からの上清を用いたＣ５ａ ＥＬＩＳＡにおける親和性成熟Ｆａｂ特性評価を示す。
【図１７】図１７は、抗体７０９１およびその誘導体を試験するヒトＣ３、Ｃ４、Ｃ５およびカニクイザルＣ５での特異性液中ＥＬＩＳＡを示す。
【図１８】図１８は、Ｆａｂによる血清安定性検定法（５０％血清の存在下におけるヒトＣ５への結合）を示す。
【図１９】図１９は、親和性改良Ｆａｂのエピトープ結合(binning)を示す。
【図２０】図２０は、マウス−ヒトキメラＣ５またはヒトＣ５への抗体結合に関するＥＬＩＳＡによる、アルファ鎖対ベータ鎖結合剤の測定を示す。Ｃ５は５Ｇ１.１により提示され、５Ｇ１.１との競合が測定される。
【図２１】図２１は、５Ｇ１.１捕捉でアルファ鎖対ベータ鎖結合剤を試験するＥＬＩＳＡを示す。
【図２２】図２２は、アルファ鎖対ベータ鎖結合剤を試験する溶血検定法の結果を示す。
【図２３】図２３は、３７℃での親Ｆａｂのサーモリシンタンパク質加水分解を示す（０、３０、６０および９０分）。
【図２４】図２４は、５５℃での親Ｆａｂのサーモリシンタンパク質加水分解を示す（０、３０、６０および９０分）。
【図２５】図２５は、３７℃での成熟Ｆａｂのサーモリシン感受性を示す。
【図２６】図２６は、５５℃での成熟Ｆａｂのサーモリシン感受性を示す。
【図２７】図２７は、ＭＡＣ沈着検定法における副経路のＦａｂ阻害の例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
５．発明の詳細な説明
本発明は、補体Ｃ５タンパク質（例、ヒトＣ５、カニクイザルＣ５）と特異的に結合する抗体、医薬組成物、上記抗体および組成物の製造方法および使用方法を提供する。
【００７８】
５.１．Ｃ５抗体
本発明は、Ｃ５（例、ヒトＣ５、カニクイザルＣ５）と特異的に結合する抗体を提供する。一部の実施態様において、本発明は、ヒトおよびカニクイザルの両Ｃ５と特異的に結合する抗体を提供する。本発明抗体には、実施例記載の要領で単離されたヒトモノクローナル抗体が含まれるが、これらに限定されるわけではない（下記６項参照）。
【００７９】
本発明は、Ｃ５タンパク質（例、ヒトおよび／またはカニクイザルＣ５）と特異的に結合する抗体を提供するもので、上記抗体は、配列番号７、２３、３９、５１、６７、７９、９６、１０８、１１４、１２１、１３７、１５１、１６５、１７９、１８７、２０１、２１０、２１８、２２７、２４１、２５３、２５７、２７３、２７７または２８１のアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む。本発明はまた、Ｃ５タンパク質（例、ヒトおよび／またはカニクイザルＣ５）と特異的に結合する抗体を提供するもので、上記抗体は、下記表１に列挙したＶＨ ＣＤＲのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲを含む。特に、本発明は、Ｃ５タンパク質（例、ヒトおよび／またはカニクイザルＣ５）と特異的に結合する抗体を提供するもので、上記抗体は、下記表１に列挙したＶＨ ＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を有する１、２、３、４、５またはそれ以上のＶＨ ＣＤＲを含む（または別法としてそれらにより構成される）。
【００８０】
本発明は、Ｃ５タンパク質（例、ヒトおよび／またはカニクイザルＣ５）と特異的に結合する抗体を提供するもので、上記抗体は、配列番号８、２４、４０、５２、６８、８０、９０、１０２、１２２、１３８、１５２、１６６、１８０、１８８、２０２、２１１、２１９、２２８、２４２、２６１、２６５、２６９、２８５または２８９のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む。本発明はまた、Ｃ５タンパク質（例、ヒトおよび／またはカニクイザルＣ５）と特異的に結合する抗体を提供するもので、上記抗体は、下記表１に列挙したＶＬ ＣＤＲのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲを含む。特に、本発明は、Ｃ５タンパク質（例、ヒトおよび／またはカニクイザルＣ５）と特異的に結合する抗体を提供するもので、上記抗体は、下記表１に列挙したＶＬ ＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を有する１、２、３またはそれ以上のＶＬ ＣＤＲを含む（または別法としてそれらにより構成される）。
【００８１】
本発明の他の抗体は、突然変異が誘発されてはいるが、表１記載の配列に描かれたＣＤＲ領域と、ＣＤＲ領域において少なくとも６０、７０、８０、９０または９５パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。実施態様によっては、表１記載の配列に描かれたＣＤＲ領域と比べたとき、１、２、３、４または５個以下のアミノ酸がＣＤＲ領域において突然変異している突然変異体アミノ酸配列を含む場合もある。
【００８２】
本発明はまた、Ｃ５タンパク質（例、ヒトおよび／またはカニクイザルＣ５）と特異的に結合する抗体のＶＨ、ＶＬ、完全長重鎖および完全長軽鎖をコード化する核酸配列を提供する。上記の核酸配列は、哺乳類細胞での発現用に最適化され得る（例えば、表１は、抗体８１０９、８１１０、８１１１、８１１３、８１１４、８１１２、８１２５、８１２６、８１２７、８１２８、８１２９、８１３０、８１３１、８１３２および８０９１の重鎖および軽鎖についての最適化核酸配列を示す）。
【００８３】
【表１−１】
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【００８４】
【表１−２】
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【００８５】
【表１−３】
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【００８６】
【表１−４】
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【００８７】
【表１−５】
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【００８８】
【表１−６】
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【００８９】
【表１−７】
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【００９０】
【表１−８】
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【００９１】
【表１−９】
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【００９２】
【表１−１０】
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【００９３】
【表１−１１】
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【００９４】
【表１−１２】
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【００９５】
【表１−１３】
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【００９６】
【表１−１４】
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【００９７】
【表１−１５】
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【００９８】
【表１−１６】
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【００９９】
【表１−１７】
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【０１００】
【表１−１８】
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【０１０１】
【表１−１９】
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【０１０２】
【表１−２０】
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【０１０３】
【表１−２１】
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【表１−２２】
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【０１０４】
【表１−２３】
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【０１０５】
【表１−２４】
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【０１０６】
【表１−２５】
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【０１０７】
【表１−２６】
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【０１０８】
【表１−２７】
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【０１０９】
【表１−２８】
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【０１１０】
【表１−２９】
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【０１１１】
【表１−３０】
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【０１１２】
【表１−３１】
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【０１１３】
【表１−３２】
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【０１１４】
【表１−３３】
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【０１１５】
【表１−３４】
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【０１１６】
【表１−３５】
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【０１１７】
【表１−３６】
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【０１１８】
【表１−３７】
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【０１１９】
【表１−３８】
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【０１２０】
【表１−３９】
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【０１２１】
【表１−４０】
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【０１２２】
【表１−４１】
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【０１２３】
【表１−４２】
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【０１２４】
【表１−４３】
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【０１２５】
【表１−４４】
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【０１２６】
【表１−４５】
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【０１２７】
【表１−４６】
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【０１２８】
【表１−４７】
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【０１２９】
【表１−４８】
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【０１３０】
【表１−４９】
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【０１３１】
【表１−５０】
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【０１３２】
【表１−５１】
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【０１３３】
【表１−５２】
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【０１３４】
【表１−５３】
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【０１３５】
【表１−５４】
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【０１３６】
【表１−５５】
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【０１３７】
【表１−５６】
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【０１３８】
【表１−５７】
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【０１３９】
【表１−５８】
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【０１４０】
【表１−５９】
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【０１４１】
【表１−６０】
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【０１４２】
【表１−６１】
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【０１４３】
【表１−６２】
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【０１４４】
【表１−６３】
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【０１４５】
【表１−６４】
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【０１４６】
【表１−６５】
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【０１４７】
【表１−６６】
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【０１４８】
【表１−６７】
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【０１４９】
【表１−６８】
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【０１５０】
【表１−６９】
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【０１５１】
【表１−７０】
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【表１−７１】
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【０１５２】
【表１−７２】
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【０１５３】
【表１−７３】
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【０１５４】
【表１−７４】
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【０１５５】
【表１−７５】
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【０１５６】
【表１−７６】
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【０１５７】
【表１−７７】
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【０１５８】
【表１−７８】
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【０１５９】
【表１−７９】
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【０１６０】
【表１−８０】
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【０１６１】
【表１−８１】
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【０１６２】
【表１−８２】
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【０１６３】
【表１−８３】
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【０１６４】
【表１−８４】
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【０１６５】
【表１−８５】
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【０１６６】
【表１−８６】
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【０１６７】
【表１−８７】
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【０１６８】
【表１−８８】
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【０１６９】
【表１−８９】
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【０１７０】
【表１−９０】
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【０１７１】
【表１−９１】
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【０１７２】
【表１−９２】
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【０１７３】
本発明の他の抗体は、アミノ酸またはアミノ酸をコード化する核酸に突然変異が導入されてはいるが、表１記載の配列との少なくとも６０、７０、８０、９０または９５パーセントの同一性を有するものを含む。実施態様によっては、実質的に同じ治療活性を保持しながらも、表１記載の配列に描かれた可変領域と比べたとき、１、２、３、４または５個以下のアミノ酸が可変領域において突然変異している突然変異体アミノ酸配列を含む場合もある。
【０１７４】
これらの抗体はそれぞれＣ５と結合し得るため、ＶＨ、ＶＬ、完全長軽鎖および完全長重鎖配列（アミノ酸配列およびアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列）を、「混合およびマッチさせる」ことにより、本発明の他のＣ５結合性抗体を作製することができる。上記の「混合およびマッチ」によるＣ５結合性抗体は、当業界で公知の結合検定法（例、ＥＬＩＳＡ類、および実施例の項記載の他の検定法）を用いて試験され得る。これらの鎖を混合およびマッチさせるとき、特定ＶＨ／ＶＬ対合からのＶＨ配列を、構造的に類似したＶＨ配列と置換するべきである。同様に、特定完全長重鎖／完全長軽鎖対合からの完全長重鎖配列を、構造的に類似した完全長重鎖配列と置き換えるべきである。同様に、特定ＶＨ／ＶＬ対合からのＶＬ配列を、構造的に類似したＶＬ配列と置き換えるべきである。同様に、特定完全長重鎖／完全長軽鎖対合からの完全長軽鎖配列を、構造的に類似した完全長軽鎖配列と置き換えるべきである。従って、一態様において、本発明は、配列番号７、２３、３９、５１、６７、７９、９６、１０８、１１４、１２１、１３７、１５１、１６５、１７９、１８７、２０１、２１０、２１８、２２７、２４１、２５３、２５７、２７３、２７７および２８１から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号８、２４、４０、５２、６８、８０、９０、１０２、１２２、１３８、１５２、１６６、１８０、１８８、２０２、２１１、２１９、２２８、２４２、２６１、２６５、２６９、２８５および２８９から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合領域を提供し、この抗体はＣ５（例、ヒトおよび／またはカニクイザルＣ５）と特異的に結合するものとする。
【０１７５】
別の態様において、本発明は、（ｉ）配列番号９、２５、４１、５３、６９、８１、９７、１０９、１１５、１２３、１３９、１５３、１６７、１８１、１８９、２０３、２１２、２２０、２２９、２４３、２４９、２５４、２５８、２７４、２７８および２８２から成る群から選択された哺乳類細胞での発現用に最適化されたアミノ酸配列を含む完全長重鎖、および配列番号１０、２６、４２、５４、７０、８２、９１、１０３、１２４、１４０、１５４、１６８、１８２、１９０、２０４、２１３、２２１、２３０、２４４、２５１、２６２、２６６、２７０、２８６および２９０から成る群から選択された哺乳類細胞での発現用に最適化されたアミノ酸配列を含む完全長軽鎖を有する単離モノクローナル抗体、または（ii）その抗原結合部分を含む機能性タンパク質を提供する。
【０１７６】
別の態様において、本発明は、表１記載の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３またはその組み合わせを含むＣ５結合性抗体を提供する。抗体のＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸配列を、配列番号１、１７、３３、６１、１３１、１４５、１５９、１７３、１９５および２３５に示す。抗体のＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列を、配列番号２、１８、３４、４９、６２、７７、９５、１０７、１１３、１１９、１３２、１４６、１６０、１７４、１９６、２２６および２３６に示す。抗体のＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列を、配列番号３、１９、３５、６３、１３３、１４７、１６１、１７５、１９７および２３７に示す。抗体のＶＬ ＣＤＲ１のアミノ酸配列を、配列番号４、２０、３６、６４、１３４、１４８、１６２、１７６、１９８および２３８に示す。抗体のＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列を、配列番号５、２１、３７、６５、１３５、１４９、１６３、１７７、１９９および２３９に示す。抗体のＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列を、配列番号６、２２、３８、５０、６６、７８、８９、１０１、１２０、１３６、１５０、１６４、１７８、２００、２０９および２４０に示す。Kabat システムを用いて、ＣＤＲ領域を図に示す（Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版、米国保健福祉省、NIH Publication No. 91-3242）。
【０１７７】
これらの抗体がそれぞれＣ５と結合し得、抗原結合特異性が主にＣＤＲ１、２および３領域によりもたらされるとすれば、ＶＨ ＣＤＲ１、２および３配列およびＶＬ ＣＤＲ１、２および３配列は「混合およびマッチ」され得る（すなわち、本発明の他のＣ５結合性分子を作製するためには、各抗体はＶＨ ＣＤＲ１、２および３およびＶＬ ＣＤＲ１、２および３を含まなければならないが、異なる抗体からのＣＤＲを混合およびマッチさせることはできる）。上記の「混合およびマッチされた」Ｃ５結合性抗体は、当業界で公知の結合検定法および実施例記載の方法（例、ＥＬＩＳＡ類）を用いて試験され得る。ＶＨ ＣＤＲ配列を混合およびマッチさせるとき、特定ＶＨ配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似したＣＤＲ配列（複数も可）と置き換えるべきである。同様に、ＶＬ ＣＤＲ配列を混合およびマッチさせるとき、特定ＶＬ配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似したＣＤＲ配列（複数も可）と置き換えるべきである。１つまたはそれ以上のＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ領域配列を、本発明のモノクローナル抗体について本明細書で示したＣＤＲ配列からの構造的に類似した配列と置換することにより、新規ＶＨおよびＶＬ配列が作製され得ることは、当業者には容易に理解できるはずである。
【０１７８】
したがって、本発明は、配列番号１、１７、３３、６１、１３１、１４５、１５９、１７３、１９５および２３５から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２、１８、３４、４９、６２、７７、９５、１０７、１１３、１１９、１３２、１４６、１６０、１７４、１９６、２２６および２３６から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３、１９、３５、６３、１３３、１４７、１６１、１７５、１９７および２３７から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号４、２０、３６、６４、１３４、１４８、１６２、１７６、１９８および２３８から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５、２１、３７、６５、１３５、１４９、１６３、１７７、１９９および２３９から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号６、２２、３８、５０、６６、７８、８９、１０１、１２０、１３６、１５０、１６４、１７８、２００、２０９および２４０から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含み、Ｃ５と特異的に結合する抗体である、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【０１７９】
一実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、配列番号１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号６の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。別の実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、配列番号１７の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１８の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１９の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２０の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２１の軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号２２の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０１８０】
別の実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、配列番号３３の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３４の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３５の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号３６の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３７の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号３８の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。別の実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、配列番号１７の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号４９の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１９の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２０の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２１の軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号５０の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０１８１】
別の実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、配列番号６１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号６２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号６３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号６４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号６５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号６６の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。別の実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、配列番号６１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号７７の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号６３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号６４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号６５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号７８の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０１８２】
別の実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、配列番号６１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号７７の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号６３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号６４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号６５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号８９の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。別の実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、配列番号６１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号６２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号６３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号６４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号６５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号８９の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０１８３】
別の実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、配列番号６１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号９５の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号６３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号６４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号６５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号８９の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。別の実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、配列番号１７の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号４９の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１９の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２０の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２１の軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号１０１の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０１８４】
別の実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、配列番号１７の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１０７の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１９の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２０の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２１の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号２２の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。別の実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、配列番号１７の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１０７の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１９の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２０の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２１の軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号１０１の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０１８５】
別の実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、配列番号１７の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１１３の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１９の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２０の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２１の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号２２の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。別の実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、配列番号１７の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１１３の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１９の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２０の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２１の軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号１０１の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０１８６】
別の実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、配列番号１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１１９の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号１２０の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。別の実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、配列番号１３１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１３２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１３３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１３４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１３５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号１３６の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０１８７】
別の実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、配列番号１４５の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１４６の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１４７の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１４８の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１４９の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号１５０の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。別の実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、配列番号１５９の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１６０の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１６１の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１６２の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１６３の軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号１６４の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０１８８】
別の実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、配列番号１７３の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１７４の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１７５の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１７６の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１７７の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号１７８の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。別の実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、配列番号１９５の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１９６の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１９７の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号１９８の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１９９の軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号２００の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０１８９】
別の実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、配列番号６１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号７７の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号６３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号６４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号６５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号２０９の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。別の実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、配列番号１７の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号４９の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１９の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２０の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２１の軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号２２の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０１９０】
別の実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、配列番号３３の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２２６の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３５の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号３６の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号３７の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号３８の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。別の実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、配列番号２３５の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２３６の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号２３７の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２３８の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２３９の軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号２４０の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０１９１】
別の実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、配列番号１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１１９の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号６の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。別の実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、配列番号１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号１２０の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０１９２】
別の実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、配列番号６１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号６２の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号６３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号６４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号６５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号２０９の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。別の実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、配列番号６１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号９５の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号６３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号６４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号６５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号２０９の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０１９３】
別の実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、配列番号６１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号７７の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号６３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号６４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号６５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号６６の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。別の実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、配列番号６１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号７７の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号６３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号６４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号６５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号７８の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０１９４】
別の実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、配列番号６１の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号７７の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号６３の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号６４の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号６５の軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号８９の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。別の実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、配列番号１７の重鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号１０７の重鎖可変領域ＣＤＲ２；配列番号１９の重鎖可変領域ＣＤＲ３；配列番号２０の軽鎖可変領域ＣＤＲ１；配列番号２１の軽鎖可変領域ＣＤＲ２および配列番号２２の軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０１９５】
ある種の実施態様において、Ｃ５と特異的に結合する抗体は、表１に記載されている抗体である。
【０１９６】
本明細書で使用しているヒト抗体は、抗体の可変領域または完全長鎖がヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子を用いる系から得られる場合、特定生殖細胞系配列「の産物」であるかまたは「そこから誘導された」重または軽鎖可変領域または完全長重または軽鎖を含む。上記の系では、ヒト免疫グロブリン遺伝子をもつトランスジェニックマウスを興味の対象である抗原で免疫化するか、またはファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーを興味の対象である抗原でスクリーニングする。ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたは「そこから誘導された」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、ヒト抗体の配列と配列が最も近似した（すなわち、最大の同一性％である）ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列を選択することによりそれ自体同定され得る。特定のヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたは「そこから誘導された」ヒト抗体は、例えば自然発生的体細胞突然変異または内在的な位置指定突然変異導入故に、生殖細胞系配列と比べた場合にアミノ酸の差異を含み得る。しかしながら、ＶＨまたはＶＬフレームワーク領域において、選択されたヒト抗体は、典型的にはヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によりコード化されたアミノ酸配列とのアミノ酸配列同一性が少なくとも９０％であり、他の種の生殖細胞系免疫グロブリンアミノ酸配列（例、ネズミ生殖細胞系配列）と比較したときにヒトに由来するものであるとしてヒト抗体を同定するアミノ酸残基を含む。ある種の場合、ヒト抗体は、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によりコード化されたアミノ酸配列とのアミノ酸配列同一性が少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または少なくとも９５％、さらには少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％であり得る。典型的には、組換えヒト抗体は、ＶＨまたはＶＬフレームワーク領域においてヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によりコード化されたアミノ酸配列に対して１０個以下のアミノ酸差異を示す。ある種の場合、ヒト抗体は、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によりコード化されるアミノ酸配列に対して５以下または４、３、２または１以下のアミノ酸差異を示し得る。
【０１９７】
相同性抗体
別の実施態様において、本発明は、表１記載の配列と相同性であるアミノ酸配列を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、上記抗体は、Ｃ５タンパク質（例、ヒトおよび／またはカニクイザルＣ５）と結合し、表１記載の抗体の所望の機能的特性を保持しているものとする。
【０１９８】
例えば、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体（またはその機能性抗原結合フラグメント）を提供する。ここで、重鎖可変領域は、配列番号７、２３、３９、５１、６７、７９、９６、１０８、１１４、１２１、１３７、１５１、１６５、１７９、１８７、２０１、２１０、２１８、２２７、２４１、２５３、２５７、２７３、２７７または２８１から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、配列番号８、２４、４０、５２、６８、８０、９０、１０２、１２２、１３８、１５２、１６６、１８０、１８８、２０２、２１１、２１９、２２８、２４２、２６１、２６５、２６９、２８５または２８９から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、抗体は、Ｃ５（例、ヒトおよび／またはカニクイザルＣ５）と特異的に結合し、抗体は溶血検定法において赤血球細胞溶解を阻害し得る。一具体例において、上記抗体は、１００ｐＭのヒトＣ５により再構成されるヒトＣ５枯渇血清を用いたとき、２０〜２００ｐＭの溶血検定法におけるＩＣ５０値を有する。
【０１９９】
他の実施態様において、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、表１に示した配列と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。他の実施態様において、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、１、２、３、４または５以下のアミノ酸位置でのアミノ酸置換を除いて同一であり得る。表１記載の配列のＶＨおよびＶＬ領域との高い（すなわち、８０％またはそれより大）同一性を有するＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体は、配列番号７、２３、３９、５１、６７、７９、９６、１０８、１１４、１２１、１３７、１５１、１６５、１７９、１８７、２０１、２１０、２１８、２２７、２４１、２５３、２５７、２７３、２７７または２８１、および８、２４、４０、５２、６８、８０、９０、１０２、１２２、１３８、１５２、１６６、１８０、１８８、２０２、２１１、２１９、２２８、２４２、２６１、２６５、２６９、２８５または２８９をそれぞれコード化する核酸分子に対する突然変異誘発（例、位置指定またはＰＣＲ介在性突然変異導入）により得られ、次いで本明細書記載の機能性検定法を用いることにより、保持された機能についてコード化された改変抗体は試験に付され得る。
【０２００】
他の実施態様において、完全長重鎖および／または完全長軽鎖アミノ酸配列は、表１に示した配列と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。配列番号９、２５、４１、５３、６９、８１、９７、１０９、１１５、１２３、１３９、１５３、１６７、１８１、１８９、２０３、２１２、２２０、２２９、２４３、２４９、２５４、２５８、２７４、２７８および２８２のいずれかの完全長重鎖および配列番号１０、２６、４２、５４、７０、８２、９１、１０３、１２４、１４０、１５４、１６８、１８２、１９０、２０４、２１３、２２１、２３０、２４４、２５１、２６２、２６６、２７０、２８６および２９０のいずれかの完全長軽鎖とそれぞれ高い（すなわち、８０％またはそれより大）同一性を有する完全長重鎖および完全長軽鎖を有する抗体は、上記ポリペプチドをそれぞれコード化する核酸分子に対する突然変異誘発（例、位置指定またはＰＣＲ介在性突然変異導入）により得られ、次いで本明細書記載の機能性検定法を用いることにより、保持された機能についてコード化された改変抗体は試験に付され得る。
【０２０１】
他の実施態様において、完全長重鎖および／または完全長軽鎖ヌクレオチド配列は、上記配列と６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。
【０２０２】
他の実施態様において、重鎖および／または軽鎖ヌクレオチド配列の可変領域は、上記配列と６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。
【０２０３】
本明細書で使用している２配列間の同一性パーセントは、２配列の最適アラインメントのために導入される必要がある、ギャップの数およぎ各ギャップの長さを考慮したうえでの配列により共有された同一位置の数の関数（すなわち、同一性％は、同一位置数／位置総数×１００に等しい）である。配列比較および２配列間における同一性パーセントの測定は、下記の非限定的実施例に記載している数学的アルゴリズムを用いて遂行され得る。
【０２０４】
さらに、または別法として、本発明のタンパク質配列は、さらに例えば関連配列を同定するため公開データベースに対する検索を遂行する際の「クエリ配列」として使用され得る。例えば、上記検索は、Altschul, et al., 1990 J.Mol. Biol. 215:403-10 のＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２.０）を用いて実施され得る。
【０２０５】
保存的修飾を伴う抗体
ある種の実施態様において、本発明抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を有するもので、これらのＣＤＲ配列の１つ以上は、本明細書記載の抗体に基づいた特定アミノ酸配列またはその保存的修飾体を有し、抗体は本発明のＣ５結合性抗体の所望の機能的特性を保持している。したがって、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域から成る単離モノクローナル抗体またはその機能性抗原結合フラグメントを提供する。ここで、重鎖可変領域ＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号１、１７、３３、６１、１３１、１４５、１５９、１７３、１９５および２３５から成る群から選択され、またその保存的修飾体も含まれるものとし、重鎖可変領域ＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号２、１８、３４、４９、６２、７７、９５、１０７、１１３、１１９、１３２、１４６、１６０、１７４、１９６、２２６および２３６から成る群から選択され、またその保存的修飾体も含まれるものとし、重鎖可変領域ＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号３、１９、３５、６３、１３３、１４７、１６１、１７５、１９７および２３７から成る群から選択され、またその保存的修飾体も含まれるものとし、軽鎖可変領域ＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号４、２０、３６、６４、１３４、１４８、１６２、１７６、１９８および２３８から成る群から選択され、またその保存的修飾体も含まれるものとし、軽鎖可変領域ＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号５、２１、３７、６５、１３５、１４９、１６３、１７７、１９９および２３９から成る群から選択され、またその保存的修飾体も含まれるものとし、軽鎖可変領域ＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号６、２２、３８、５０、６６、７８、８９、１０１、１２０、１３６、１５０、１６４、１７８、２００、２０９および２４０から成る群から選択され、またその保存的修飾体も含まれるものとし、抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｃ５と特異的に結合し、本明細書記載の溶血検定法で赤血球溶解を阻害する。
【０２０６】
他の実施態様において、哺乳類細胞での発現用に最適化された本発明抗体は、完全長重鎖配列および完全長軽鎖配列を有するもので、これらの配列の１つ以上は、本明細書記載の抗体に基づいた特定のアミノ酸配列またはその保存的修飾体を有し、抗体は、本発明のＣ５結合性抗体の所望の機能的特性を保持しているものとする。したがって、本発明は、完全長重鎖および完全長軽鎖から成る哺乳類細胞での発現用に最適化された単離モノクローナル抗体を提供する。ここで、完全長重鎖は、配列番号９、２５、４１、５３、６９、８１、９７、１０９、１１５、１２３、１３９、１５３、１６７、１８１、１８９、２０３、２１２、２２０、２２９、２４３、２４９、２５４、２５８、２７４、２７８および２８２から成る群から選択されたアミノ酸配列またはその保存的修飾体を有し、完全長軽鎖は、配列番号１０、２６、４２、５４、７０、８２、９１、１０３、１２４、１４０、１５４、１６８、１８２、１９０、２０４、２１３、２２１、２３０、２４４、２５１、２６２、２６６、２７０、２８６および２９０から成る群から選択されたアミノ酸配列またはその保存的修飾体を有し、抗体はＣ５（例、ヒトおよび／またはカニクイザルＣ５）と特異的に結合し、抗体は、本明細書記載の溶血検定法で赤血球溶解を阻害する。一実施態様において、上記抗体は、１００ｐＭのヒトＣ５により再構成されるヒトＣ５枯渇血清を用いたとき、２０〜２００ｐＭの溶血検定法におけるＩＣ５０値を有する。
【０２０７】
同じエピトープに結合する抗体
本発明は、表１記載のＣ５結合性抗体の場合と同じエピトープと結合する抗体を提供する。したがって、Ｃ５結合性検定法において本発明の他の抗体と交差競合する（例、統計的に有意な形で他抗体の結合を競合的に阻害する）能力に基づいて、さらなる抗体が同定され得る。Ｃ５タンパク質（例、ヒトおよび／またはカニクイザルＣ５）への本発明抗体の結合に対する試験抗体の阻害能力は、試験抗体が、Ｃ５への結合についてその抗体と競合し得ることを立証する。非限定的な理論によると、かかる抗体は、それが競合する抗体とＣ５タンパク質上の同じかまたは関連した（例、構造的に類似しているか空間的に近位の）エピトープに結合する。ある種の実施態様では、本発明抗体と同じＣ５上のエピトープに結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。上記のヒトモノクローナル抗体は、本明細書記載の要領で調製および単離され得る。
【０２０８】
遺伝子操作および修飾された抗体
さらに本発明抗体は、出発材料として本明細書で示したＶＨおよび／またはＶＬ配列の１つ以上を有する抗体を用いて修飾抗体に遺伝子操作を加えることにより製造され得、その修飾抗体は出発抗体から改変された特性を有し得る。一方または両方の可変領域（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）内、例えば１つ以上のＣＤＲ領域内および／または１つ以上のフレームワーク領域内において１個以上の残基を修飾することにより、抗体は遺伝子操作され得る。さらに、または別法として、例えば抗体のエフェクター機能（複数も可）を改変するように定常領域（複数も可）内における残基を修飾することにより、抗体は遺伝子操作され得る。
【０２０９】
遂行され得る可変領域遺伝子操作の一タイプは、ＣＤＲ移植である。抗体は、主として６つの重および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を通して標的抗原と相互作用する。この理由のため、ＣＤＲ内におけるアミノ酸配列は、ＣＤＲの外側配列よりも個々の抗体間での方が多様性に富んでいる。ＣＤＲ配列はほとんどの抗体抗原相互作用に関与するため、異なる特性を有する異なる抗体からフレームワーク配列へ移植された特異的天然抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特異的な天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることは可能である（例、Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86:10029-10033; 米国特許第5,225,539号、Winter および米国特許第5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 および 6,180,370号、Queen et al.参照）。
【０２１０】
したがって、本発明の別の実施態様は、配列番号１、１７、３３、６１、１３１、１４５、１５９、１７３、１９５および２３５から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列、配列番号２、１８、３４、４９、６２、７７、９５、１０７、１１３、１１９、１３２、１４６、１６０、１７４、１９６、２２６および２３６から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列、配列番号３、１９、３５、６３、１３３、１４７、１６１、１７５、１９７および２３７から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３配列をそれぞれ含む重鎖可変領域、および配列番号４、２０、３６、６４、１３４、１４８、１６２、１７６、１９８および２３８から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列、配列番号５、２１、３７、６５、１３５、１４９、１６３、１７７、１９９および２３９から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列、および配列番号６、２２、３８、５０、６６、７８、８９、１０１、１２０、１３６、１５０、１６４、１７８、２００、２０９および２４０から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３配列をそれぞれ含む軽鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントに関するものである。すなわち、上記抗体は、モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ ＣＤＲ配列を含むが、これらの抗体とは異なるフレームワーク配列を含み得る。
【０２１１】
上記フレームワーク配列は、生殖細胞系抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベースまたは公開リファレンスから入手され得る。例えば、ヒト重および軽鎖可変領域遺伝子に関する生殖細胞系ＤＮＡ配列は、「ＶＢase」ヒト生殖細胞系配列データベース（インターネットwww.mrc- cpe.cam.ac.uk/vbaseで利用可能）、並びに Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版、米国保健福祉省、NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al., 1992  J. fol. Biol. 227:776-798; および Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836 から入手され得、これらの内容については、出典明示で援用する。
【０２１２】
本発明抗体で使用されるフレームワーク配列の一例は、選択された本発明抗体により使用されるフレームワーク配列、例えば本発明モノクローナル抗体により使用される共通配列および／またはフレームワーク配列と構造的に類似したものである。ＶＨ ＣＤＲ１、２および３配列、およびＶＬ ＣＤＲ１、２および３配列は、フレームワーク配列が誘導される生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子で見出される配列と同一の配列を有するフレームワーク領域へ移植され得るか、またはＣＤＲ配列は、生殖細胞系配列との比較において１つ以上の突然変異を含むフレームワーク領域へ移植され得る。例えば、場合によっては、抗体の抗原結合能を維持するか高めるために、フレームワーク領域内での残基に突然変異を誘発することが有益であると判明している（例、米国特許第5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 および 6,180,370号、Queen et al.参照）。
【０２１３】
可変領域修飾の別のタイプは、ＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内においてアミノ酸残基に突然変異を誘導することにより、興味の対象である抗体の１つ以上の結合特性（例、親和性）を改善することであり、これは「親和性成熟」として知られている。位置指定突然変異導入またはＰＣＲ介在性突然変異誘発を遂行することにより、突然変異（複数も可）を導入することができ、また、抗体結合または興味の対象である他の機能的特性に対する効果を、本明細書に記載し、実施例で説明しているインビトロまたはインビボ検定法で評価することができる。保存的修飾（上記で検討）が導入され得る。突然変異は、アミノ酸置換、付加または欠失であり得る。さらに、典型的には、ＣＤＲ領域内における１、２、３、４または５個以下の残基が改変される。
【０２１４】
したがって、別の実施態様において、本発明は、配列番号１、１７、３３、６１、１３１、１４５、１５９、１７３、１９５および２３５を有する群から選択されるアミノ酸配列または配列番号１、１７、３３、６１、１３１、１４５、１５９、１７３、１９５および２３５との比較において１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列から成るＶＨ ＣＤＲ１領域、配列番号２、１８、３４、４９、６２、７７、９５、１０７、１１３、１１９、１３２、１４６、１６０、１７４、１９６、２２６および２３６から成る群から選択されるアミノ酸配列または配列番号２、１８、３４、４９、６２、７７、９５、１０７、１１３、１１９、１３２、１４６、１６０、１７４、１９６、２２６および２３６との比較において１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２領域、配列番号３、１９、３５、６３、１３３、１４７、１６１、１７５、１９７および２３７から成る群から選択されるアミノ酸配列または配列番号３、１９、３５、６３、１３３、１４７、１６１、１７５、１９７および２３７との比較において１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域、配列番号４、２０、３６、６４、１３４、１４８、１６２、１７６、１９８および２３８から成る群から選択されるアミノ酸配列または配列番号４、２０、３６、６４、１３４、１４８、１６２、１７６、１９８および２３８との比較において１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１領域、配列番号５、２１、３７、６５、１３５、１４９、１６３、１７７、１９９および２３９から成る群から選択されるアミノ酸配列または配列番号５、２１、３７、６５、１３５、１４９、１６３、１７７、１９９および２３９との比較において１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２領域、および配列番号６、２２、３８、５０、６６、７８、８９、１０１、１２０、１３６、１５０、１６４、１７８、２００、２０９および２４０から成る群から選択されるアミノ酸配列または配列番号６、２２、３８、５０、６６、７８、８９、１０１、１２０、１３６、１５０、１６４、１７８、２００、２０９および２４０との比較において１、２、３、４または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３領域（を有する軽鎖可変領域）により構成される、単離Ｃ５結合性モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【０２１５】
代替的フレームワークまたはスカホールドへの抗原結合ドメインの移植
生成するポリペプチドが、Ｃ５と特異的に結合する少なくとも１つの結合領域を含むものである限り、広く多様な抗体／免疫グロブリンフレームワークまたはスカホールドが使用され得る。上記フレームワークまたはスカホールドは、５つの主要イディオタイプのヒト免疫グロブリンまたはそのフラグメントを含み、好ましくはヒト化局面を有する他の動物種の免疫グロブリンを含む。ラクダ科で同定されたものなどの単重鎖抗体は、この点に関し特に興味深いものである。新たなフレームワーク、スカホールドおよびフラグメントが、当業者により発見および開発され続けている。
【０２１６】
一態様において、本発明は、本発明ＣＤＲが移植され得る非免疫グロブリンスカホールドを用いた非免疫グロブリン性抗体の生成に関するものである。標的Ｃ５タンパク質（例、ヒトおよび／またはカニクイザルＣ５）に特異的な結合領域を含むものである限り、既知または将来的に有望な非免疫グロブリンフレームワークおよびスカホールドが使用され得る。公知非免疫グロブリンフレームワークまたはスカホールドには、限定されるわけではないが、フィブロネクチン（Compound Therapeutics, Inc.、ワルサム、マサチューセッツ）、アンキリン（Molecular Partners AG、チューリッヒ、スイス国）、ドメイン抗体（Domantis, Ltd.、ケンブリッジ、マサチューセッツ、および Ablynx nv、ツヴィナールデ、ベルギー国）、リポカリン（Pieris Proteolab AG、フライシング、ドイツ国）、小モジュール免疫医薬（Trubion Pharmaceuticals Inc.、シアトル、ワシントン）、マキシボディ（Avidia, Inc.、マウンテンビュー、カリフォルニア）、プロテインＡ（Affibody AG、スウェーデン国）およびアフィリン（ガンマ−クリスタリンまたはユビキチン）（Scil Proteins GmbH、ハーレ、ドイツ国）がある。
【０２１７】
フィブロネクチンスカホールドは、フィブロネクチンIII型ドメイン（例、フィブロネクチンIII型の第１０モジュール（１０Ｆｎ３ドメイン））に基づいている。フィブロネクチンIII型ドメインには、２つのベータシート間に分布する７または８本のベータ鎖があり、それら自体互いに間詰めしてタンパク質のコアを形成し、さらにベータ鎖を互いに繋ぎ、溶媒に曝されるループ（ＣＤＲと類似）が含まれる。ベータシートサンドイッチの各縁に少なくとも３つの上記ループがあり、その縁は、ベータ鎖方向と垂直をなすタンパク質の境界となっている（米国特許第６８１８４１８号参照）。全体的折りたたみは、ラクダおよびリャマＩｇＧにおける抗原認識単位全体を含む重鎖の可変領域である、最小の機能性抗体フラグメントの折りたたみと密接に関連しているが、これらのフィブロネクチンに基づくスカホールドは免疫グロブリンではない。この構造故に、非免疫グロブリン抗体は、抗体の場合と性質および親和性が類似した抗原結合特性を模倣する。これらのスカホールドは、インビボでの抗体の親和性成熟過程と類似したインビトロでのループランダム化およびシャッフリング戦略で使用され得る。これらのフィブロネクチンに基づく分子は、標準クローニング技術を用いて分子のループ領域が本発明ＣＤＲと置き換えられ得るスカホールドとして使用され得る。
【０２１８】
アンキリン技術は、異なる標的への結合に使用され得る可変領域を担うためのスカホールドとしてのアンキリン誘導反復モジュールをもつタンパク質の使用に基づいている。アンキリン反復モジュールは、２個の逆平行α−ヘリックスおよび１個のβ−ターンから成る３３個のアミノ酸ポリペプチドである。可変領域の結合は、主としてリボソームディスプレイを用いることにより最適化され得る。
【０２１９】
アビマー(avimer)は、ＬＲＰ−１などの天然Ａ−ドメイン含有タンパク質から誘導される。これらのドメインは、本来タンパク質−タンパク質相互作用に使用され、ヒトでは、２５０を超えるタンパク質が構造的にＡ−ドメインに基づいている。アビマーは、アミノ酸リンカーにより結合された若干の異なる「Ａ−ドメイン」単量体（２〜１０）により構成される。例えば、米国特許出願公開第20040175756; 20050053973; 20050048512; および 20060008844号記載の方法を用いて、標的抗原に結合し得るアビマーが作製され得る。
【０２２０】
アフィボディ(Affibody)親和性リガンドは、プロテインＡのＩｇＧ結合性ドメインの一つのスカホールドに基づいた３ヘリックスバンドルにより構成される単純な小タンパク質である。プロテインＡは、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）菌由来の表面タンパク質である。このスカホールドドメインは、５８個のアミノ酸により構成され、そのうち１３個は、多数のリガンド変異型をもつアフィボディライブラリーを作製するためにランダム化されている（米国特許第５８３１０１２号参照）。アフィボディ分子は抗体を模倣するが、それらは、１５０ｋＤａである抗体の分子量と比べて、６ｋＤａの分子量を有する。サイズが小さいにもかかわらずアフィボディ分子の結合部位は抗体のそれと類似している。
【０２２１】
アンチカリン(Anticalin)類は、Pieris ProteoLab AG 社により開発された製品である。それらは、通常化学的に感受性が高いか、または不溶性の化合物の生理学的輸送または貯蔵に関与する強固な小タンパク質の広範な一群である、リポカリン類から誘導される。幾つかの天然リポカリン類は、ヒト組織または体液で生じる。タンパク質構造は、堅固なフレームワークの上部に超可変ループをもつ、免疫グロブリンを連想させるものである。しかしながら、抗体またはそれらの組換えフラグメントとは対照的に、リポカリンは、１６０〜１８０個のアミノ酸残基を有する単一ポリペプチド鎖により構成され、免疫グロブリンドメインより僅かに大きい。結合ポケットを構成する４ループのセットは、著しい構造的可塑性を示し、様々な側鎖を許容する。したがって、結合部位は、高い親和性および特異性で形状の異なる所定の標的分子を認識できるように独自開発工程で再成形され得る。リポカリンファミリーの一タンパク質、ピエリス・ブラシカエ（Pieris Brassicae）のビリン結合性タンパク質（ＢＢＰ）は、４ループのセットに突然変異を誘発することによりアンチカリンの開発に使用されてきた。アンチカリンについて記載している親出願の一例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ１９９９１６８７３号である。
【０２２２】
アフィリン分子は、タンパク質および小分子に対する特異的親和性について設計された小さな非免疫グロブリンタンパク質である。新たなアフィリン分子は、２つのライブラリーから非常に迅速に選択され得、それぞれ異なるヒト由来のスカホールドタンパク質に基づいたものである。アフィリン分子は、免疫グロブリンタンパク質との構造相同性を全く示さない。現時点では、２つのアフィリンスカホールドを使用しており、その一方はガンマクリスタリン、すなわちヒト構造的眼水晶体タンパク質であり、他方は「ユビキチン」スーパーファミリータンパク質である。ヒトスカホールドは両方とも非常に小さく、高温安定性を示し、ｐＨ変化および変性剤に対する耐性を示す。この高温安定性は、主としてタンパク質の拡張されたベータシート構造に起因する。ガンマクリスタリン由来タンパク質の例は国際公開第２００１０４１４４号に記載されており、「ユビキチン様」タンパク質の例は国際公開第２００４１０６３６８号に記載されている。
【０２２３】
タンパク質エピトープ模倣分子（ＰＥＭ）は、タンパク質−タンパク質相互作用に関与する主要２次構造である、タンパク質のベータ−ヘアピン２次構造を模倣する中程度のサイズの環状ペプチド様分子（分子量１〜２ｋＤａ）である。
【０２２４】
一部の実施態様では、Ｆｃ領域を変えることにより、ＦａｂをサイレントＩｇＧ１形に変換する。例えば、表１における抗体６５２５−７９１０は、重鎖についてのアミノ酸配列における「Ｘ」を、次の配列：
CDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号２９３）
により置換し、軽鎖についてのアミノ酸配列における「Ｘ」を、軽鎖がラムダである場合ＣＳまたは軽鎖がカッパである場合Ｃで置換することにより、サイレントＩｇＧ１形に変換され得る。本明細書で使用している「サイレントＩｇＧ１」は、Ｆｃ伝達エフェクター機能が低下するようにアミノ酸配列が改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ配列である（例えばＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ）。かかる抗体は、典型的にはＦｃ受容体および／またはＣ１ｑへの結合性の低下を呈する。
【０２２５】
若干の他の実施態様において、Ｆａｂは、ＩｇＧ２形に変換される。例えば、表１における抗体６５２５−７９１０は、定常配列
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSX（配列番号２９４）
を、ＩｇＧ２の重鎖についての定常配列：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号２９５）
で置換し、軽鎖についてのアミノ酸配列における「Ｘ」を軽鎖がラムダである場合ＣＳ、または軽鎖がカッパである場合Ｃで置換することにより、ＩｇＧ２形に変換され得る。
【０２２６】
ヒトまたはヒト化抗体
本発明は、Ｃ５タンパク質（例、ヒトおよび／またはカニクイザルＣ５）と特異的に結合する完全ヒト抗体を提供する。キメラまたはヒト化抗体と比べて、本発明のヒトＣ５結合性抗体は、さらにヒト対象への投与時に低い抗原性を呈する。
【０２２７】
ヒトＣ５結合性抗体は、当業界で公知の方法を用いて作製され得る。例えば、非ヒト抗体を遺伝子組換えヒト抗体に変換するのに使用されるヒューマニアリング技術がある。米国特許出願第２００５０００８６２５号は、非ヒト抗体の場合との比較において同じかまたは優れた結合特性を維持しながら、抗体の非ヒト抗体可変領域をヒト可変領域に置き換えるインビボ方法を記載している。この方法は、完全ヒト抗体による非ヒトリファレンス抗体の可変領域のエピトープ誘導置換に依存するものである。生成したヒト抗体は、一般的にリファレンス非ヒト抗体とは構造的に関連していないが、リファレンス抗体と同じ抗原上の同じエピトープに結合する。簡単に述べると、連続エピトープ誘導相補性置換方法は、抗原への試験抗体の結合に応答するリポーター系の存在下、限定量の抗原への結合をめぐって「競合相手」とリファレンス抗体の多様なハイブリッド（「試験抗体」）のライブラリーの間に細胞での競合を設定することにより可能となる。競合相手は、リファレンス抗体またはその誘導体、例えば１本鎖Ｆｖフラグメントであり得る。競合相手はまた、リファレンス抗体と同じエピトープに結合する抗原の天然または人工リガンドであり得る。競合相手の必要条件は、それがリファレンス抗体と同じエピトープに結合すること、およびそれが抗原結合をめぐってリファレンス抗体と競合することのみである。試験抗体は、非ヒトリファレンス抗体からの共通した１個の抗原結合Ｖ領域、およびヒト抗体のレパートリーライブラリーなどの多様な供給源から無作為に選択された他のＶ領域を有する。リファレンス抗体由来の共通Ｖ−領域は、選択をリファレンス抗体への最高の抗原結合忠実度に偏向させるように、抗原上の同じエピトープに同じ配向で試験抗体を配置させる指針としての役割を果たす。
【０２２８】
試験抗体と抗原間における所望の相互作用の検出に、多くのタイプのリポーター系が使用され得る。例えば、相補的リポーターフラグメントは抗原および試験抗体にそれぞれ結合され得、その結果、試験抗体が抗原に結合したときにフラグメント相補性によってのみリポーター活性化が起こる。試験抗体−および抗原−リポーターフラグメント融合体が、競合相手と共に発現されるとき、リポーター活性化は、抗原に対する試験抗体の親和性に比例する、試験抗体が呈する競合相手との競合能力に左右される。使用され得る他のリポーター系には、米国特許出願第１０／２０８７３０号（公開番号第２００３０１９８９７１号）に開示された自己阻害型リポーター再活性化システム（ＰＡＩＲ）、または米国特許出願第１０／０７６８４５号（公開番号第２００３０１５７５７９号）に開示された競合的活性化システムがある。
【０２２９】
連続エピトープ誘導相補性置換システムにより、競合相手、抗原およびリポーター構成成分と一緒に単一試験抗体を発現する細胞を同定するべく選択を行う。これらの細胞において、各試験抗体は、限定量の抗原への結合をめぐって競合相手と１対１で競争する。リポーター活性は、試験抗体に結合した抗原の量に比例しており、また抗原に対する試験抗体の親和性および試験抗体の安定性に比例している。試験抗体は、まず、試験抗体としての発現時にリファレンス抗体の活性に対するそれらの相対活性に基づいて選択される。第１回目の選択の結果は、それぞれ、リファレンス抗体からの同一非ヒトＶ領域およびライブラリーからのヒトＶ領域により構成され、またそれぞれリファレンス抗体と同じ抗原上のエピトープに結合する一連の「ハイブリッド」抗体である。第１回目に選択された複数のハイブリッド抗体の中には、リファレンス抗体の親和性と同等またはそれより高い抗原に対する親和性を有するものがある。
【０２３０】
第２のＶ領域置換段階では、第１段階で選択されたヒトＶ領域を、同種のヒトＶ領域の多様なライブラリーで残りの非ヒトリファレンス抗体Ｖ領域に関するヒト置換体を選択するための指針として使用する。第１回目に選択されたハイブリッド抗体はまた、第２回目の選択用の競合相手として使用され得る。第２回目の選択の結果は、リファレンス抗体とは構造的に異なるが、同一抗原への結合をめぐってリファレンス抗体と競合する一連の完全ヒト抗体である。選択されたヒト抗体の中には、リファレンス抗体と同じ抗原上の同じエピトープに結合するものもある。これらの選択されたヒト抗体の中では、１つ以上がリファレンス抗体の場合と同等またはそれより高い親和性でもって同じエピトープに結合する。
【０２３１】
リファレンス抗体として上記のマウスまたはキメラＣ５結合性抗体の１つを用いることにより、この方法は、同じ結合特異性および同じかまたは優れた結合親和性でヒトＣ５と結合するヒト抗体を作製するのに容易に使用され得る。さらに、上記ヒトＣ５結合性抗体はまた、通例ヒト抗体を生産している会社、例えば KaloBios, Inc.（マウンテンビュー、カリフォルニア）から市販されている。
【０２３２】
ラクダ科抗体
リャマ種（ラマ・パコス（Lama paccos）、ラマ・グラマ（Lama glama）およびラマ・ビクーニャ（Lama vicugna））などの南米大陸の構成員を含む一般的なラクダおよびヒトコブラクダ（カメルス・バクトリアヌス（Camelus bactrianus）およびカレルス・ドロマデリウス（Calelus dromaderius））ファミリーの構成員から得られる抗体タンパク質は、サイズ、構造複雑度およびヒト対象に対する抗原性に関して特性確認されてきた。天然に見出されるこの哺乳類ファミリーからのある種のＩｇＧ抗体は、軽鎖を欠くため、他の動物からの抗体についての２本の重鎖および２本の軽鎖を有する典型的な４鎖４次構造とは構造的に区別される。ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４号（１９９４年３月３日公開の国際公開第９４／０４６７８号）参照。
【０２３３】
ＶＨＨとして同定された小さな単一可変ドメインであるラクダ科抗体の一領域は、遺伝子工学技術により得られ、標的に対する高い親和性を有する小タンパク質を生じることにより、「ラクダ科ナノボディ」として知られる低分子量抗体誘導タンパク質をもたらす。１９９８年６月２日付、米国特許第５７５９８０８号参照、また、Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62; および Lauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520 も参照。ラクダ科抗体および抗体フラグメントの遺伝子工学により作製されたライブラリーは、例えば、ベルギー国ゲントの Ablynx から市販されている。ヒト以外に由来する他の抗体の場合と同様、ラクダ科抗体のアミノ酸配列を遺伝子組換え技術で改変することにより、ヒト配列とより密接に近似した配列が得られる、すなわち、ナノボディが「ヒト化」され得る。したがって、ヒトに対するラクダ科抗体の天然の低抗原性をさらに低下させることができる。
【０２３４】
ラクダ科ナノボディの分子量は、ヒトＩｇＧ分子の約１０分の１であり、タンパク質の物理的直径は、僅か数ナノメートルである。サイズが小さいことによる一つの結果は、大きな抗体タンパク質にとっては機能上目に見えないほど小さい抗原部位でもラクダ科ナノボディであれば結合できることであり、従って、ラクダ科ナノボディは、古典的な免疫学的技術を用いた場合普通なら潜在的なものである抗原を検出する試薬として、また可能な治療剤として有用である。すなわち、サイズが小さいことによる別の結果は、ラクダ科ナノボディが、標的タンパク質の溝または狭いクレフトにおける特異的部位への結合の結果として阻害し得るため、古典的抗体の場合よりも古典的低分子量薬剤の機能とさらに密接に類似する受容力で役割を果たし得ることである。
【０２３５】
さらに、低分子量で小型サイズであることから、ラクダ科ナノボディは、非常に熱安定性が高く、極端なｐＨおよびタンパク質加水分解的消化に対して安定しており、抗原性は乏しいものとなっている。別の結果は、ラクダ科ナノボディが循環系から組織へ容易に移動し、血液脳関門でさえ通過するため、神経組織を侵す疾患を処置し得ることである。ナノボディは、さらに薬剤輸送を促進し、血液脳関門を通過させ得る。２００４年８月１９日付米国特許出願第２００４０１６１７３８号参照。これらの特徴とヒトに対する低抗原性とを考え合わせると、多大な治療可能性が示唆される。さらに、これらの分子は、原核生物細胞、例えばエシェリキア・コリ（E.coli）で完全に発現され得、バクテリオファージとの融合タンパク質として発現され、機能的である。
【０２３６】
したがって、本発明の一つの特徴は、Ｃ５に対する高い親和性を有するラクダ科抗体またはナノボディである。本明細書におけるある種の実施態様では、ラクダ科抗体またはナノボディは、ラクダ科動物で天然に産生される、すなわち、他の抗体に関する本明細書記載の技術を用いることにより、Ｃ５またはそのペプチドフラグメントでの免疫化後にラクダ科動物により産生される。別法として、Ｃ５結合性ラクダ科ナノボディは、遺伝子工学により作製される、すなわち、本明細書の実施例記載の要領で標的としてＣ５を用いるパンニング手順を用いることにより、例えば適切に突然変異が誘導されたラクダ科ナノボディタンパク質をディスプレイするファージライブラリーからの選択により生産される。さらに、遺伝子工学により作製されたナノボディは、受容対象において４５分から２週間の半減期を有するように遺伝子操作されることによりカスタマイズされ得る。一実施態様において、ラクダ科抗体またはナノボディは、例えばＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４記載の要領で、本発明ヒト抗体の重または軽鎖のＣＤＲ配列をナノボディまたは単一ドメイン抗体フレームワーク配列へ移植することにより得られる。
【０２３７】
二重特異性分子および多価抗体
別の態様において、本発明は、本発明のＣ５結合性抗体またはそのフラグメントを含む二重特異性または多重特異性分子を特徴とする。本発明の抗体またはその抗原結合領域を、別の機能性分子、例えば別のペプチドまたはタンパク質（例、受容体に対する別の抗体またはリガンド）に誘導体化または結合させることにより、少なくとも２個の異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を生成し得る。事実、本発明抗体を複数の他の機能性分子に誘導体化または結合させることにより、２個より多い異なる結合部位および／または標的分子に結合する多重特異性分子を生成することが可能である。上記多重特異性分子もまた、本明細書で使用している「二重特異性分子」の語に包含されるものとする。本発明の二重特異性分子を作製するため、本発明抗体は、１個以上の他の結合分子、例えば別の抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは結合模倣物質に（例えば化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合またはその他の方法により）結合され得、その結果二重特異性分子が生成される。
【０２３８】
したがって、本発明は、Ｃ５に関する少なくとも１つの第１結合特異性および第２標的エピトープに関する第２結合特異性を含む二重特異性分子を含む。例えば、第２標的エピトープは、第１標的エピトープとは異なるＣ５の別のエピトープである。
【０２３９】
さらに、二重特異性分子が多重特異性である本発明の場合、分子は、第１および第２標的エピトープに加えて、さらに第３の結合特異性を含み得る。
【０２４０】
一実施態様において、本発明の二重特異性分子は、結合特異性として少なくとも１個の抗体またはその抗体フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または１本鎖Ｆｖを含む。抗体はまた、Ladner et al. 米国特許第４９４６７７８号に記載されたように軽鎖または重鎖二量体、またはその最小フラグメント、例えばＦｖまたは１本鎖構築物であり得る。
【０２４１】
二重特異性抗体（diabody）は、同一鎖上の２ドメイン間で対合させるには短すぎるリンカーで結合したＶＨおよびＶＬドメインを、単一ポリペプチド鎖で発現させた２価の二重特異性分子である。ＶＨおよびＶＬドメインは、別の鎖の相補性ドメインと対合することにより、２個の抗原結合部位を作製する（例、Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al., 1994 Structure 2:1121-1123 参照）。二重特異性抗体は、同一細胞内にＶＨＡ−ＶＬＢおよびＶＨＢ−ＶＬＡ（ＶＨ−ＶＬ立体配置）またはＶＬＡ−ＶＨＢおよびＶＬＢ−ＶＨＡ（ＶＬ−ＶＨ立体配置）構造をもつ２本のポリペプチド鎖を発現させることにより製造され得る。それらの大部分は、細菌において可溶性形態で発現され得る。１本鎖二重特異性抗体（ｓｃＤｂ）は、２本の二重特異性抗体形成ポリペプチド鎖を約１５個のアミノ酸残基のリンカーで連結することにより製造される（Holliger および Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4):128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36 参照）。ｓｃＤｂは、可溶性活性単量体形態で細菌において発現され得る（Holliger および Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36; Pluckthun および Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2): 83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7):617-21 参照）。二重特異性抗体をＦｃと融合させることにより、「二重−二重特異性抗体（di-diabody）」が生成され得る（Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65 参照）。
【０２４２】
本発明の二重特異性分子で使用され得る他の抗体は、ネズミ、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体である。
【０２４３】
本発明の二重特異性分子は、当業界で公知の方法を用いて、構成成分結合特異性を結合することにより調製され得る。例えば、二重特異性分子の各結合特異性は、別々に製造され、次いで互いに結合され得る。結合特異性がタンパク質またはペプチドであるとき、様々なカップリング剤または架橋剤が共有結合に使用され得る。架橋剤の例としては、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５,５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）ｏ−フェニレン次マレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、およびスルホスクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）がある（例、Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648 参照）。他の方法には、Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83 および Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375 記載のものがある。結合剤は、ＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、両方ともPierce Chemical Co.（ロックフォード、イリノイ）から入手できる。
【０２４４】
結合特異性が抗体であるとき、それらは、２本の重鎖のＣ−末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合により結合され得る。一特定実施態様では、ヒンジ領域は、複合体形成前に、奇数個、例えば１個のスルフヒドリル残基を含むように修飾される。
【０２４５】
別法として、両結合特異性は、同じベクターでコード化され、同じ宿主細胞で発現および構築され得る。二重特異性分子が、ｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質であるとき、この方法は特に有用である。本発明の二重特異性分子は、１個の１本鎖抗体および結合決定基を含む１本鎖分子、または２個の結合決定基を含む１本鎖二重特異性分子であり得る。二重特異性分子は、少なくとも２個の１本鎖分子を含み得る。二重特異性分子の製造方法は、例えば米国特許第5,260,203号; 米国特許第5,455,030号; 米国特許第4,881,175号; 米国特許第5,132,405号; 米国特許第5,091,513号; 米国特許第5,476,786号; 米国特許第5,013,653号; 米国特許第5,258,498号; および米国特許第5,482,858号に記載されている。
【０２４６】
二重特異性分子のそれらの特異的標的への結合は、例えば、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例、成長阻害）またはウエスタンブロット検定法により確認され得る。これらの検定法はそれぞれ、一般的に興味の対象である複合体に特異的な標識試薬（例、抗体）を用いることにより特に興味の対象であるタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。
【０２４７】
別の態様において、本発明は、Ｃ５に結合する本発明抗体の少なくとも２個の同一または異なる抗原結合部分を含む多価化合物を提供する。抗原結合部分は、タンパク質融合または共有結合または非共有結合を介して結合され得る。別法として、二重特異性分子についての結合方法が報告されている。四価化合物は、例えば本発明抗体の定常領域、例えばＦｃまたはヒンジ領域と結合する抗体と本発明抗体との抗体間架橋により生成され得る。
【０２４８】
トリマー化ドメインは、例えば Borean の欧州特許第１０１２２８０Ｂ１号で報告されている。ペンタマー化モジュールは、例えばＰＣＴ／ＥＰ９７／０５８９７号に記載されている。
【０２４９】
半減期が延長された抗体
本発明は、インビボでの半減期が延長されたＣ５タンパク質と特異的に結合する抗体を提供する。
【０２５０】
多くの因子がタンパク質のインビボ半減期に影響を及ぼし得る。例えば、腎臓ろ過、肝臓での代謝、タンパク質加水分解酵素（プロテアーゼ類）による分解、および免疫原性応答（例、抗体によるタンパク質中和およびマクロファージおよび樹状細胞による取込み）など。本発明抗体の半減期の延長には、様々な戦略が使用され得る。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ｒｅＣＯＤＥ ＰＥＧ、抗体スカホールド、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ）、アルブミン結合リガンドおよび炭水化物シールドへの化学的結合、例えばアルブミン、ＩｇＧ、ＦｃＲｎなどの血清タンパク質に結合するタンパク質との遺伝子融合および導入、血清タンパク質と結合する他の結合部分、例えばナノボディ、Ｆａｂ、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、アフィボディおよびアンチカリンへのカップリング（遺伝子的または化学的）、ｒＰＥＧ、アルブミン、アルブミンのドメイン、アルブミン結合タンパク質およびＦｃとの遺伝子融合、またはナノキャリア(nancarrier)、遅延放出型製剤または医療装置への組み込みによる方法がある。
【０２５１】
抗体のインビボ血清循環を長くするため、高分子量ＰＥＧなどの不活性ポリマー分子が、多機能性リンカーを用いて、または用いずに、抗体のＮ−またはＣ−末端へのＰＥＧの部位特異的コンジュゲーションを通して、またはリシン残基に存在するイプシロン−アミノ基を介して抗体またはそのフラグメントに結合され得る。抗体をペグ化するため、抗体またはそのフラグメントを、典型的には１個以上のＰＥＧ基が抗体または抗体フラグメントに結合される条件下、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えばＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と反応させる。ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似した反応性水様性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応により実施され得る。本明細書で使用している「ポリエチレングリコール」の語は、例えばモノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなど、他のタンパク質の誘導体化に使用されているあらゆる形態のＰＥＧを包含するものとする。ある種の実施態様では、ペグ化される抗体は、アグリコシル化抗体である。生物活性の喪失を最小限に抑える線状または分枝状ポリマー誘導体化が使用される。コンジュゲーションの度合いを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析法で緊密にモニターすることにより、抗体へのＰＥＧ分子の適切なコンジュゲーションが確実なものとなり得る。未反応ＰＥＧは、サイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーにより抗体−ＰＥＧコンジュゲートから分離され得る。ＰＥＧ誘導体化抗体は、当業者によく知られた方法を用いて、例えば本明細書記載のイムノアッセイにより結合活性およびインビボ効力について試験され得る。タンパク質のペグ化方法は、当業界では公知であり、本発明の抗体に適用され得る。例えば、Nishimura et al.、欧州特許第０１５４３１６号およびIshikawa et al.、欧州特許第０４０１３８４号参照。
【０２５２】
他の修飾ペグ化技術としては、ｔＲＮＡシンテターゼおよびｔＲＮＡを含む再構成システムにより化学的に特定された側鎖を生合成タンパク質に組み込む、再構成式化学的オルトゴナル指向型工学技術（ＲｅＣＯＤＥ ＰＥＧ）がある。この技術により、エシェリキア・コリ（E.coli）、酵母および哺乳類細胞において３０を超える新たなアミノ酸を生合成タンパク質に組み込むことが可能となった。ｔＲＮＡは、アンバーコドンが位置する場所に非天然アミノ酸を組み込み、アンバーを停止コドンから化学的に特定されたアミノ酸の組み込みを表示するものに変換する。
【０２５３】
組換えペグ化技術（ｒＰＥＧ）はまた、血清半減期延長に使用され得る。この技術では、３００〜６００アミノ酸の構造不定タンパク質尾部を既存の医薬タンパク質に遺伝子融合させる。かかる構造不定タンパク質鎖の見かけ上の分子量は、その実際の分子量の約１５倍であるため、タンパク質の血清半減期を大きく増加させる。化学的コンジュゲーションおよび再精製を必要とする伝統的ＰＥＧ化とは対照的に、製造工程は非常に簡略化されており、製品は均一である。
【０２５４】
ポリシアル化はまた別の技術であり、天然重合体ポリシアル酸（ＰＳＡ）を使用することにより、治療用ペプチドおよびタンパク質の活性寿命を延長し、安定性を改善する。ＰＳＡは、シアル酸の重合体（糖）である。タンパク質および治療用ペプチド薬剤送達に使用した場合、ポリシアル酸は、コンジュゲーションに対する保護的な微小環境を提供する。この結果、循環系における治療タンパク質の活性寿命は増加し、それを免疫系が認識するのが阻止される。ＰＳＡ重合体は、人体で天然に見出される。何百万年にもわたって進化したある種の細菌は、それらの壁を被覆するのにこの物質を採用していた。従って、これらの天然ポリシアル化細菌は、分子擬態により身体防御系を未然に防ぐことができた。天然の究極的ステルス技術であるＰＳＡは、上記細菌から予め定められた物理特性を伴って容易に大量生産され得る。細菌性ＰＳＡは、人体におけるＰＳＡと化学的に同一であるため、タンパク質にカップリングされたときでも、完全に非免疫原性である。
【０２５５】
別の技術では、抗体に結合させたヒドロキシエチル澱粉（「ＨＥＳ」）誘導体を使用する。ＨＥＳは、ろう質トウモロコシ澱粉から誘導された修飾天然重合体であり、体内酵素により代謝され得る。ＨＥＳ溶液は、通常、不足した血液量の代用として、また血液の流動特性を改善するのに投与される。抗体をＨＥＳ化すると、分子の安定性の増加および腎臓クリアランスの低下により循環半減期が延長され得、生物活性が増加し得る。例えばＨＥＳの分子量などの種々のパラメーターを変えることにより、広い範囲のＨＥＳ抗体コンジュゲートがカスタマイズされ得る。
【０２５６】
また、インビボでの半減期が増加した抗体は、１個以上のアミノ酸修飾（すなわち、置換、挿入または欠失）をＩｇＧ定常ドメインまたはそのＦｃＲｎ結合フラグメント（好ましくはＦｃまたはヒンジＦｃドメインフラグメント）へ導入する形で作製され得る。例えば、国際公開第ＷＯ９８／２３２８９号、国際公開第ＷＯ９７／３４６３１号および米国特許第６２７７３７５号参照。
【０２５７】
さらに、抗体をアルブミンにコンジュゲーションすることにより、インビボでより安定しているか、または長いインビボ半減期を有する抗体または抗体フラグメントを作製し得る。これらの技術は当業界では公知であり、例えば国際公開第ＷＯ９３／１５１９９、ＷＯ９３／１５２００およびＷＯ０１／７７１３７号および欧州特許第ＥＰ４１３６２２号参照。
【０２５８】
半減期を延長する戦略は、ナノボディ、フィブロネクチンに基づく結合剤およびインビボ半減期の増加が望まれる他の抗体またはタンパク質において特に有用である。
【０２５９】
抗体コンジュゲート
本発明は、異種タンパク質またはポリペプチド（またはそのフラグメント、好ましくは少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０または少なくとも１００個のアミノ酸のポリペプチド）と遺伝子組換え的融合または化学的にコンジュゲーション（共有結合および非共有結合の両方を含む）されることにより融合タンパク質を形成する、Ｃ５タンパク質と特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを提供する。特に、本発明は、本明細書記載の抗体の抗原結合フラグメント（例、Ｆａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、ＶＨドメイン、ＶＨ ＣＤＲ、ＶＬドメインまたはＶＬ ＣＤＲ）および異種タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含む融合タンパク質を提供する。抗体または抗体フラグメントへのタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの融合またはコンジュゲーション方法は、当業界では公知である。例えば、米国特許第5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851, および 5,112,946号、欧州特許第EP 307,434 および EP 367,166号、国際公開第WO 96/04388 および WO 91/06570号、Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539; Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600; および Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337- 11341参照。
【０２６０】
さらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフリングおよび／またはコドンシャッフリング（ひとまとめにして「ＤＮＡシャッフリング」と称される）技術を通して作製され得る。ＤＮＡシャッフリングを用いることにより、本発明抗体またはそのフラグメントの活性が改変され得る（例、親和性が高く、解離速度が低い抗体またはそのフラグメント）。概括的には、米国特許第5,605,793, 5,811,238, 5,830,721, 5,834,252 および 5,837,458号、Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76; および Lorenzo および Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308- 313 参照（これらの特許および刊行物のそれぞれについては、出典明示により援用する）。抗体またはそのフラグメント、またはコード化された抗体またはそのフラグメントは、組換え操作前にエラープローンＰＣＲによるランダム突然変異導入、ランダムヌクレオチド挿入または他の方法にかけられることにより改変され得る。Ｃ５タンパク質と特異的に結合する抗体またはそのフラグメントをコード化するポリヌクレオチドは、１個以上の異種分子の１個以上の構成成分、モチーフ、区分、部分、ドメイン、フラグメントなどにより組換えられ得る。
【０２６１】
さらに、抗体またはそのフラグメントを、一ペプチドなどのマーカー配列に融合することにより、精製が簡易化され得る。好ましい実施態様では、マーカーアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド、中でも、例えばｐＱＥベクター（QIAGEN, Inc.、９２５９イートン・アベニュー、チャッツワース、カリフォルニア、９１３１１）で与えられた標識であり、多くは市販されている。例えば、Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 で報告されているように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の好都合な精製を可能にする。精製に有用な他のペプチド標識には、限定されるわけではないが、インフルエンザ血球凝集素タンパク質から誘導されたエピトープに対応する血球凝集素（「ＨＡ」）標識（Wilson et al., 1984, Cell 37:767）、および「フラッグ」標識がある。
【０２６２】
他の実施態様では、本発明の抗体またはそのフラグメントを、診断または検出可能な薬剤にコンジュゲーションする。上記抗体は、例えば特定治療の効力を測定するなど、臨床検査手順の一部として疾患または障害の開始、発達、進行および／または重症度を監視または予知するのに有用であり得る。上記診断および検出は、限定されるわけではないが、様々な酵素、例えば、限定されるわけではないが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼ、補欠分子族、例えば、限定されるわけではないが、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン、蛍光性物質、例えば、限定されるわけではないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリン、発光性物質、例えば、限定されるわけではないが、ルミノール、生物発光性物質、例えば、限定されるわけではないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリン、放射性物質、例えば、限定されるわけではないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉおよび１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎおよび１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎおよび１１７Ｔｉｎ、および様々な陽電子放射断層撮影法を用いる陽電子放射性金属および非放射性常磁性金属イオンを含む検出可能な物質に抗体をカップリングすることにより達成され得る。
【０２６３】
さらに本発明は、治療部分にコンジュゲーションさせた抗体またはそのフラグメントの使用を包含する。抗体またはそのフラグメントは、治療部分、例えば細胞毒素、例えば静細胞剤または細胞致死剤、治療剤または放射性金属イオン、例えばアルファ−エミッターにコンジュゲーションされ得る。細胞毒素または細胞傷害剤は、細胞に有害な薬剤を全て包含する。
【０２６４】
さらに、抗体またはそのフラグメントは、所与の生物応答を修飾する治療部分または薬剤部分にコンジュゲーションされ得る。治療部分または薬剤部分は、古典的な化学療法剤に限定されるものとみなすべきではない。例えば、薬剤部分は、所望の生物活性を有するタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドであり得る。上記タンパク質は、例えば、毒素、例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、コレラ毒素またはジフテリア毒素、タンパク質、例えば腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス剤、抗血管新生剤、または生物応答修飾剤、例えばリンホカインを含み得る。
【０２６５】
さらに、抗体は、治療部分、例えば放射性金属イオン、例えばアルファ−エミッター、例えば２１３Ｂｉなど、または限定されるわけではないが、１３１Ｉｎ、１３１ＬＵ、１３１Ｙ、１３１Ｈｏ、１３１Ｓｍを含む放射性イオンのポリペプチドへのコンジュゲーションに有用な大環状キレート剤にコンジュゲーションされ得る。ある種の実施態様において、大環状キレート剤は、リンカー分子を介して抗体に結合され得る１,４,７,１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ,Ｎ’,Ｎ’’,Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）である。上記リンカー分子は当業界では公知であり、Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; および Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50 で報告されており、これらについては出典明示により援用する。
【０２６６】
抗体への治療部分のコンジュゲーション技術は公知である、例えば、Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (編), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (第２版), Robinson et al. (編), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (編), pp. 475-506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), および Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58 を参照。
【０２６７】
また、抗体は、イムノアッセイまたは標的抗原の精製に特に有用な固体支持体に結合され得る。上記固体支持体には、限定されるわけではないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリビニルクロリドまたはポリプロピレンがある。
【０２６８】
５．２．本発明抗体の製造方法
５．２．１．抗体をコード化する核酸
本発明は、上記Ｃ５結合性抗体鎖のセグメントまたはドメインを含むポリペプチドをコード化する実質的に精製された核酸分子を提供する。本発明核酸の中には、配列番号７、２３、３９、５１、６７、７９、９６、１０８、１１４、１２１、１３７、１５１、１６５、１７９、１８７、２０１、２１０、２１８、２２７、２４１、２５３、２５７、２７３、２７７または２８１に示された重鎖可変領域をコード化するヌクレオチド配列、および／または配列番号８、２４、４０、５２、６８、８０、９０、１０２、１２２、１３８、１５２、１６６、１８０、１８８、２０２、２１１、２１９、２２８、２４２、２６１、２６５、２６９、２８５または２８９に示された軽鎖可変領域をコード化するヌクレオチド配列を含むものがある。一実施態様において、核酸分子は、表１に示されたものである。本発明の他の核酸分子の中には、表１に示されたもののヌクレオチド配列と実質的に同一（例、少なくとも６５、８０％、９５％または９９％）であるヌクレオチド配列を含むものもある。適切な発現ベクターから発現されると、これらのポリヌクレオチドによりコード化されたポリペプチドは、Ｃ５抗原結合能力を呈することができる。
【０２６９】
また、本発明は、上記で示したＣ５結合性抗体の重または軽鎖からの少なくとも１つのＣＤＲ領域および通常は３つのＣＤＲ領域全部をコード化するポリヌクレオチドを提供する。他のポリヌクレオチドの中には、上記で示したＣ５結合性抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域配列の全部または実質的に全部をコード化するものもある。コードの縮重故に、様々な核酸配列が、免疫グロブリンアミノ酸配列をそれぞれコード化する。
【０２７０】
本発明の核酸分子は、抗体の可変領域および定常領域の両方をコード化し得る。本発明の核酸配列の中には、配列番号７、２３、３９、５１、６７、７９、９６、１０８、１１４、１２１、１３７、１５１、１６５、１７９、１８７、２０１、２１０、２１８、２２７、２４１、２５３、２５７、２７３、２７７または２８１に示された成熟重鎖可変領域配列と実質的に同一（例、少なくとも８０％、９０％または９９％）である成熟重鎖可変領域をコード化するヌクレオチド配列を含むものもある。他の核酸配列の中には、配列番号８、２４、４０、５２、６８、８０、９０、１０２、１２２、１３８、１５２、１６６、１８０、１８８、２０２、２１１、２１９、２２８、２４２、２６１、２６５、２６９、２８５または２８９に示された成熟軽鎖可変領域配列と実質的に同一（例、少なくとも８０％、９０％または９９％）である成熟軽鎖可変領域配列をコード化するヌクレオチドを含むものもある。
【０２７１】
ポリヌクレオチド配列は、新規固相ＤＮＡ合成またはＣ５結合性抗体またはその結合性フラグメントをコード化する既存配列（例、下記実施例記載の配列）のＰＣＲ突然変異導入により製造され得る。核酸の直接的化学合成は、当業界で公知の方法、例えば Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90 のホスホトリエステル方法、Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979 のホスホジエステル方法、Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981 のジエチルホスホルアミダイト方法および米国特許第４４５８０６６号の固体支持体方法により達成され得る。ＰＣＲによるポリヌクレオチド配列への突然変異導入は、例えば、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (編), Freeman Press, ニューヨーク、ニューヨーク、1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (編), Academic Press, サンディエゴ、カリフォルニア、1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; および Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991 に記載の要領で実施され得る。
【０２７２】
また本発明は、上記Ｃ５結合性抗体を製造するための発現ベクターおよび宿主細胞を提供する。Ｃ５結合性抗体鎖または結合性フラグメントをコード化するポリヌクレオチドを発現させるのに、様々な発現ベクターが使用され得る。ウイルス性および非ウイルス性発現ベクターは両方とも、哺乳類宿主細胞における抗体の製造に使用され得る。非ウイルス性ベクターおよび系には、プラスミド、エピソーム性ベクター、典型的にはタンパク質またはＲＮＡ発現用の発現カセットを伴うもの、およびヒト人工染色体がある（例、Harrington et al., Nat Genet  15:345, 1997 参照）。例えば、哺乳類（例、ヒト）細胞におけるＣ５結合性ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に有用な非ウイルス性ベクターには、ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ａ、ＢおよびＣ、ｐｃＤＮＡ３.１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ Ａ、ＢおよびＣ、(Invitrogen, サンディエゴ、カリフォルニア)、ＭＰＳＶベクター、および他のタンパク質発現用の当業界で公知の多数の他のベクターがある。有用なウイルス性ベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルスに基づくベクター、ＳＶ４０、乳頭腫ウイルス、ＨＢＰエプスタインバールウイルスに基づくベクター、ワクシニアウイルスベクターおよびセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）ベクターがある。Brent et al., 前出; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; および Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992 参照。
【０２７３】
発現ベクターの選択は、ベクターを発現させる予定の宿主細胞に左右される。典型的には、発現ベクターは、Ｃ５結合性抗体鎖またはフラグメントをコード化するポリヌクレオチドに機能し得るように結合されたプロモーターおよび他の調節配列（例、エンハンサー）を含む。一部の実施態様では、誘導性プロモーターを用いることにより、誘導条件下以外での挿入配列の発現を阻止する。誘導性プロモーターには、例えばアラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーターまたは熱ショックプロモーターがある。形質転換された生物体の培養物は、発現産物が宿主細胞による耐容性の高いものであるコーディング配列について集団を偏向させることなく非誘導的条件下で拡大され得る。プロモーターに加えて、他の調節エレメントも、Ｃ５結合性抗体鎖またはフラグメントの有効な発現に要求または所望され得る。これらのエレメントには、典型的にはＡＴＧ開始コドンおよび隣接リボソーム結合部位または他の配列がある。さらに、使用する細胞系に適切なエンハンサーを含ませることにより、発現効率を高めることができる（例、Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994; および Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987 参照）。例えば、ＳＶ４０エンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーを用いることにより、哺乳類宿主細胞での発現を増加させることができる。
【０２７４】
発現ベクターはまた、分泌シグナル配列位置を提供することにより、挿入されたＣ５結合性抗体配列によりコード化されるポリペプチドとの融合タンパク質を形成させ得る。さらに多くの場合、ベクターに封入する前に、挿入されたＣ５結合性抗体配列をシグナル配列に結合する。また、Ｃ５結合性抗体軽および重鎖可変ドメインをコード化する配列を受容するのに使用されるベクターが、定常領域またはその一部をコード化することもある。上記ベクターにより、定常領域との融合タンパク質として可変領域が発現され得るため、無傷の抗体またはそのフラグメントの産生が誘導される。典型的には、上記定常領域はヒトである。
【０２７５】
Ｃ５結合性抗体鎖を内部に含み、発現させる宿主細胞は、原核生物性または真核生物性であり得る。エシェリキア・コリ（E.coli）は、本発明のポリヌクレオチドのクローニングおよび発現に有用な一原核生物宿主である。使用に適した他の微生物宿主には、バシラス（桿菌）、例えばバシラス・サチラス（Bacillus subtilis）、および他の腸内細菌科、例えばサルモネラ（Salmonella）、セラチア（Serratia）および様々なシュードモナス（Pseudomonas）種がある。これらの原核生物宿主では、典型的には宿主細胞と適合し得る発現制御配列（例、複製起点）を含む発現ベクターを作製することができる。さらに、かなり多数の様々な公知プロモーター、例えばラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ベータ−ラクタマーゼプロモーター系、またはファージラムダからのプロモーター系が存在する。典型的には、プロモーターは、所望によりオペレーター配列と共に発現を制御し、転写および翻訳を開始および完了させるため、リボソーム結合部位配列などを有する。また、酵母などの他の微生物も、本発明のＣ５結合性ポリペプチドの発現に使用され得る。バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞もまた使用され得る。
【０２７６】
若干の好ましい実施態様では、哺乳類宿主細胞を用いて本発明のＣ５結合性ポリペプチドを発現および生産させる。例えば、それらは、内因性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマセルライン（例、実施例に記載された１Ｄ６.Ｃ９骨髄腫ハイブリドーマクローン）または外因性発現ベクターを内部に含む哺乳類セルライン（例、下記で例示したＳＰ２／０骨髄腫細胞）であり得る。これらは、正常な致死または正常または異常な不死動物またはヒト細胞を含む。例えば、無傷の免疫グロブリンを分泌し得る若干の適切な宿主細胞系が、ＣＨＯセルライン、様々なＣｏｓセルライン、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫セルライン、形質転換Ｂ細胞およびハイブリドーマを含め、開発されている。哺乳類組織細胞培養物の使用によるポリペプチドの発現は、例えば Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, ニューヨーク、ニューヨーク、1987 で全般的に検討されている。哺乳類宿主細胞用の発現ベクターは、発現制御配列、例えば複製起点、プロモーターおよびエンハンサー（Queen, et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986）、および必要なプロセッシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写ターミネーター配列を含み得る。これらの発現ベクターは、通常哺乳類遺伝子または哺乳類ウイルス由来のプロモーターを含む。適切なプロモーターは、構成的、細胞型特異的、段階特異的および／またはモジュレーション可能または調節可能なものであり得る。有用なプロモーターには、限定されるわけではないが、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰｐｏIIIIプロモーター、構成的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（例えばヒト極初期ＣＭＶプロモーター）、構成的ＣＭＶプロモーター、および当業界で公知のプロモーター−エンハンサーの組み合わせがある。
【０２７７】
興味の対象であるポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターの導入方法は、細胞性宿主のタイプにより異なる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは、原核生物細胞に通常使用され、リン酸カルシウム処理または電気穿孔は、他の細胞性宿主に使用され得る。（全般的には、Sambrook, et al.、前出参照）。他の方法には、例えば電気穿孔、リン酸カルシウム処理、リポソーム介在形質転換、注射および顕微注入、弾丸導入法、ウイロソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２との融合（Elliot および O'Hare, Cell 88:223, 1997）、ＤＮＡの薬剤促進による取込み、およびエクスビボ形質導入がある。長期間高収率で組換えタンパク質を製造するためには、多くの場合安定した発現が所望される。例えば、Ｃ５結合性抗体鎖または結合フラグメントを安定して発現するセルラインは、ウイルス性複製起点または内因性発現エレメントおよび選択可能なマーカー遺伝子を含む本発明の発現ベクターを用いて製造され得る。ベクター導入後、細胞を１〜２日間強化培地で成長させ得、その後それらを選択培地に切り替える。選択可能マーカーの目的は、選択に対する抵抗性の付与であり、その存在により、選択培地で導入された配列を有効に発現する細胞を成長させ得る。抵抗性のある安定したトランスフェクション細胞は、細胞型に適切な組織培養技術を用いて増殖され得る。
【０２７８】
５．２．２．本発明のモノクローナル抗体の生成
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、慣用的モノクローナル抗体方法、例えば Kohler および Milstein, 1975 Nature 256: 495 の標準体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む様々な技術により製造され得る。モノクローナル抗体の多くの生産技術、例えばＢリンパ球のウイルスまたは発癌遺伝子による形質転換が使用され得る。
【０２７９】
ハイブリドーマを調製するための動物系はネズミ系である。マウスにおけるハイブリドーマ生産は、十分に確立された手順である。融合用免疫化脾臓細胞の単離に関する免疫化プロトコルおよび技術は、当業界では公知である。融合パートナー（例、ネズミ骨髄腫細胞）および融合手順も公知である。
【０２８０】
本発明のキメラまたはヒト化抗体は、上記要領で調製されたネズミモノクローナル抗体の配列に基づいて調製され得る。重および軽鎖免疫グロブリンをコード化するＤＮＡは、興味の対象であるネズミハイブリドーマから入手され、標準分子生物学技術を用いて非ネズミ（例、ヒト）免疫グロブリン配列を含むように遺伝子操作にかけられ得る。例えば、キメラ抗体を作製するため、ネズミ可変領域は、当業界で公知の方法を用いてヒト定常領域に結合され得る（例、Cabilly et al.による、米国特許第４８１６５６７号参照）。ヒト化抗体を作製するため、ネズミＣＤＲ領域は、当業界で公知の方法を用いてヒトフレームワークへ挿入され得る。例えば、Winter、米国特許第５２２５５３９号、および Queen et al.、米国特許第５５３０１０１;５５８５０８９;５６９３７６２および６１８０３７０号参照。
【０２８１】
ある種の実施態様において、本発明抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。Ｃ５に指向した上記ヒトモノクローナル抗体は、マウス免疫系ではなくヒト免疫系の部分を担持する遺伝子または染色体導入による形質転換マウスを用いて作製され得る。これらの遺伝子または染色体導入による形質転換マウスは、本明細書においてそれぞれＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと称するマウスを含み、本明細書ではひとまとめにして「ヒトＩｇマウス」と称する。
【０２８２】
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（Medarex, Inc.）は、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活化する標的化突然変異と一緒に、非転位ヒト重（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコード化するヒト免疫グロブリン遺伝子小遺伝子座を含む（例、Lonberg, et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859 参照）。したがって、マウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現低下を呈し、免疫化に応答して、導入されたヒト重および軽鎖導入遺伝子に対し、クラス転換および体細胞突然変異が誘発され、高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナルが生成され得る（Lonberg, N. et al., 1994 前出; Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101 で検討; Lonberg, N. および Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93, および Harding, F. および Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546）。ＨｕＭＡｂマウスの製造および使用、および上記マウスがもつゲノム修飾については、さらに Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et at., 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591; および Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851 に記載されており、これら全ての内容については出典明示で援用する。さらに、全て Lonberg および Kay による、米国特許第5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; および 5,770,429号、Surani et al.による、米国特許第5,545,807号、全て Lonberg および Kay による、ＰＣＴ公開第WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 および WO 99/45962号、および Korman et al.による、ＰＣＴ公開第WO 01/14424号参照。
【０２８３】
別の実施態様において、導入遺伝子および導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列をもつマウス、例えばヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体をもつマウスを用いることにより、本発明のヒト抗体を産生させることができる。本明細書において「ＫＭマウス」と称する上記マウスは、Ishida et al.による、ＰＣＴ公開第WO 02/43478号に詳述されている。
【０２８４】
さらにまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替的トランスジェニック動物系が当業界では利用可能であり、本発明Ｃ５結合性抗体の産生に使用され得る。例えば、Xenomouse（Abgenix, Inc.）と称される代替的トランスジェニック系が使用され得る。上記マウスは、例えば Kucherlapati et al.による、米国特許第5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6, 150,584 および 6,162,963号に記載されている。
【０２８５】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替的導入染色体形質転換動物系が当業界では利用可能であり、本発明Ｃ５結合性抗体の産生に使用され得る。例えば、「ＴＣマウス」と称される、ヒト重鎖導入染色体およびヒト軽鎖導入染色体の両方をもつマウスが使用され得る。上記マウスは、Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727 に記載されている。さらに、ヒト重および軽鎖導入染色体をもつウシが当業界では報告されており（Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894）、本発明Ｃ５結合性抗体の産生に使用され得る。
【０２８６】
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ方法を用いて製造され得る。ヒト抗体を単離するための上記ファージディスプレイ方法は、当業界では確立されているか、または下記実施例に記載されている。例えば、Ladner et al.による、米国特許第5,223,409; 5,403,484; および 5,571,698号、Dower et al.による、米国特許第5,427,908 および 5,580,717号、McCafferty et al.による、米国特許第5,969,108 および 6,172,197号、および Griffiths et al.による、米国特許第5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 および 6,593,081号参照。
【０２８７】
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト抗体応答が免疫化時に誘発され得るようにヒト免疫細胞が再構成されたＳＣＩＤマウスを用いて製造され得る。上記マウスは、例えば、Wilson et al.による、米国特許第5,476,996 および 5,698,767号に記載されている。
【０２８８】
５．２．３．フレームワークまたはＦｃ遺伝子操作
遺伝子工学による本発明抗体には、例えば抗体の特性を改善するためにＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に修飾が加えられたものが含まれる。典型的には、上記フレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を減らすために加えられる。例えば、一つの方法は、１個以上のフレームワーク残基を対応する生殖系細胞配列へ「復帰突然変異させる」ことである。さらに具体的には、体細胞突然変異が導入された抗体は、抗体が由来する生殖系細胞配列とは異なるフレームワーク残基を含み得る。上記残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖系細胞配列と比較することにより同定され得る。フレームワーク領域配列をそれらの生殖系細胞立体配置に戻すため、例えば位置指定突然変異導入により、体細胞突然変異を生殖系細胞配列に「復帰突然変異導入」させ得る。上記「復帰突然変異」抗体もまた本発明に包含される。
【０２８９】
別のタイプのフレームワーク修飾では、フレームワーク領域内または１つ以上のＣＤＲ領域内における１個以上の残基に突然変異を誘発してＴ細胞エピトープを除去することにより、抗体の潜在的免疫原性を低下させる。この方法は、「脱免疫化」とも称され、Carr et al.による米国特許公開第20030153043号でさらに詳述されている。
【０２９０】
フレームワークまたはＣＤＲ領域内で行われる修飾に加えて、またはそれらに代わるものとして、本発明抗体には、Ｆｃ領域内に修飾を含むように、典型的には抗体の１つ以上の機能的特性、例えば血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合性、および／または抗原依存的（細胞性）細胞傷害性を改変するように遺伝子操作が加えられ得る。さらに、本発明抗体は、化学的に修飾されるか（例、１個以上の化学的部分が抗体に結合され得る）、またはそのグリコシル化を改変するように、同じく抗体の１つ以上の機能的特性を改変するように修飾され得る。これらの実施態様についてはそれぞれ下記で詳述している。Ｆｃ領域における残基の番号付は、Kabat のＥＵインデックスの番号付である。
【０２９１】
一実施態様において、ＣＨ１のヒンジ領域には、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数が改変されるように、例えば増加または減少するように修飾が加えられる。この方法は、さらに Bodmer et al.による、米国特許第5,677,425号に記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域におけるシステイン残基の数は、例えば軽および重鎖が会合し易くなるように、または抗体の安定性を増加または減少させるように改変される。
【０２９２】
別の実施態様では、抗体のＦｃヒンジ領域に突然変異を導入することにより、抗体の生物学的半減期を減少させる。さらに具体的には、抗体の有するスタフィロコッカス（Staphylococcyl）プロテインＡ（ＳｐＡ）結合性が天然ＦｃヒンジドメインＳｐＡ結合性よりも低くなるように、１個以上のアミノ酸突然変異をＦｃヒンジフラグメントのＣＨ２−ＣＨ３ドメイン中間領域に導入する。この方法は、さらにWard et al.による、米国特許第6,165,745号に詳述されている。
【０２９３】
別の実施態様では、抗体に対し、その生物学的半減期を増加させるように修飾を加える。様々な方法が可能である。Ward による米国特許第6,277,375号で記載されているように、例えば、以下の突然変異の１つ以上が導入され得る：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。別法として、生物学的半減期を増加させるため、Presta et al.による米国特許第5,869,046 および 6,121,022号で記載されているように、抗体は、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２個のループから取られたサルベージ受容体結合エピトープを含むようにＣＨ１またはＣＬ領域内で改変され得る。
【０２９４】
さらに他の実施態様では、抗体のエフェクター機能を改変するため、少なくとも１個のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することにより、Ｆｃ領域を改変する。例えば、抗体がエフェクターリガンドについて改変された親和性を有するが、親抗体の抗原結合能については保持しているように、１個以上のアミノ酸が異なるアミノ酸残基により置換され得る。親和性が改変されるエフェクターリガンドは、例えばＦｃ受容体または補体のＣ１成分であり得る。この方法は、Winter et al.による、両米国特許第5,624,821 および 5,648,260号でさらに詳述されている。
【０２９５】
別の実施態様では、抗体の呈するＣ１ｑ結合性が改変され、および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）が縮小または破壊されるように、アミノ酸残基から選択された１個以上のアミノ酸が異なるアミノ酸残基により置換され得る。この方法は、Idusogie et al.による、米国特許第6,194,551号でさらに詳述されている。
【０２９６】
別の実施態様では、１個以上のアミノ酸残基を改変することにより、抗体の補体固定能力を改変する。この方法は、さらに Bodmer et al.によるＰＣＴ公開第ＷＯ９４／２９３５１号で報告されている。
【０２９７】
さらに別の実施態様では、Ｆｃ領域を修飾することにより、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）についての抗体の伝達能を高め、および／または１個以上のアミノ酸を修飾することによりＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増加させる。この方法は、さらに Presta によるＰＣＴ公開第ＷＯ００／４２０７２号に記載されている。さらに、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲII、ＦｃγＲIIIおよびＦｃＲｎに関するヒトＩｇＧ１での結合部位がマッピングされ、結合性が改善された変異型が報告されている（Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604参照）。
【０２９８】
さらに別の実施態様では、抗体のグリコシル化に修飾を加える。例えば、アグリコシル化抗体が作製され得る（すなわち、抗体はグリコシル化を欠く）。グリコシル化を改変することにより、例えば「抗原」に対する抗体の親和性を高めることができる。上記炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内における１個以上のグリコシル化部位を改変することにより達成され得る。例えば、１個以上のアミノ酸が置換され得、その結果、１個以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位が排除されることにより、その部位でのグリコシル化が排除される。上記アグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を高め得る。上記方法は、Co et al.による、米国特許第5,714,350 および 6,350,861号に詳述されている。
【０２９９】
さらに、または別法として、改変されたタイプのグリコシル化を有する抗体、例えばフコシル残基の量が減少した低フコシル化抗体またはバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を増加させた抗体が作製され得る。上記の改変されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を高めることが立証されている。上記炭水化物修飾は、例えば、グリコシル化機構が改変された宿主細胞で抗体を発現させることにより達成され得る。グリコシル化機構が改変された細胞について、当業界では既に報告されており、本発明の組換え抗体を発現させることにより、グリコシル化が改変された抗体を産生させる宿主細胞として使用され得る。例えば、Hang et al.による欧州特許第EP 1,176,195号は、フコシルトランスフェラーゼをコード化する、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子をもつセルラインについて記載しており、かかるセルラインで発現された抗体は、低フコシル化を呈する。Presta によるＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０３５８３５号は、宿主細胞で発現される抗体の低フコシル化をもたらす、Ａｓｎ（２９７）結合炭水化物にフコースを結合させる能力が低下した変異型ＣＨＯセルライン、Ｌｅｃｌ３細胞について記載している（また、Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740 も参照）。Umana et al.によるＰＣＴ公開第ＷＯ９９／５４３４２号は、糖タンパク質修飾性グリコシルトランスフェラーゼ（例、ベータ（１,４）−Ｎ アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII（ＧｎＴIII））を発現するように遺伝子操作が加えられたセルラインについて報告しており、かかる遺伝子操作が加えられたセルラインで発現される抗体は、抗体のＡＤＣＣ活性の増加をもたらすバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造の増加を呈する（また、Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180 参照）。
【０３００】
５．２．４．遺伝子工学により改変された抗体の作製方法
上記で検討したところによると、本明細書で示したＶＨおよびＶＬ配列または完全長重および軽鎖配列を有するＣ５結合性抗体を用いて、完全長重鎖および／または軽鎖配列、ＶＨおよび／またはＶＬ配列またはそこに結合した定常領域（複数も可）を修飾することにより新たなＣ５結合性抗体を作製することができる。すなわち、本発明の別の態様では、本発明Ｃ５結合性抗体の構造的特徴を利用することにより、本発明抗体の少なくとも１つの機能的特性、例えばヒトＣ５への結合性およびＣ５の１つ以上の機能的特性の阻害性（例、溶血検定法で赤血球溶解を抑制する）を保持する構造的に関連したＣ５結合性抗体を作製する。
【０３０１】
例えば、上記で検討しているように、本発明抗体の１個以上のＣＤＲ領域またはその突然変異体を、既知フレームワーク領域および／または他のＣＤＲと遺伝子組換え的に組み合わせることにより、本発明のさらなる遺伝子組換えＣ５結合性抗体を作製することが可能である。他のタイプの修飾には、前項で記載したものが含まれる。遺伝子操作方法の出発材料は、本明細書で提供したＶＨおよび／またはＶＬ配列の１個以上、またはその１個以上のＣＤＲ領域である。遺伝子組換え抗体を作製するために、本明細書で提供したＶＨおよび／またはＶＬ配列の１個以上、またはその１個以上のＣＤＲ領域を有する抗体を実際に調製する（すなわち、タンパク質として発現させる）必要は無い。むしろ、配列（複数も可）に含まれる情報を出発材料として使用することにより、元の配列（複数も可）から誘導された「第２世代」配列（複数も可）を作製し、次いで「第２世代」配列（複数も可）を調製し、タンパク質として発現させる。
【０３０２】
したがって、別の実施態様において、本発明は、配列番号１、１７、３３、６１、１３１、１４５、１５９、１７３、１９５および２３５から成る群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２、１８、３４、４９、６２、７７、９５、１０７、１１３、１１９、１３２、１４６、１６０、１７４、１９６、２２６および２３６から成る群から選択されるＣＤＲ２配列、および／または配列番号３、１９、３５、６３、１３３、１４７、１６１、１７５、１９７および２３７から成る群から選択されるＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域抗体配列、および配列番号４、２０、３６、６４、１３４、１４８、１６２、１７６、１９８および２３８から成る群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号５、２１、３７、６５、１３５、１４９、１６３、１７７、１９９および２３９から成る群から選択されるＣＤＲ２配列、および／または配列番号６、２２、３８、５０、６６、７８、８９、１０１、１２０、１３６、１５０、１６４、１７８、２００、２０９および２４０から成る群から選択されるＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域抗体配列から成るＣ５結合性抗体を調製し、重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配列内における少なくとも１個のアミノ酸残基を改変することにより少なくとも１つの改変された抗体配列を作製し、改変された抗体配列をタンパク質として発現させる方法を提供する。
【０３０３】
したがって、別の実施態様において、本発明は、配列番号９、２５、４１、５３、６９、８１、９７、１０９、１１５、１２３、１３９、１５３、１６７、１８１、１８９、２０３、２１２、２２０、２２９、２４３、２４９、２５４、２５８、２７４、２７８および２８２から成る群から選択される配列を有する完全長重鎖抗体配列、および配列番号１０、２６、４２、５４、７０、８２、９１、１０３、１２４、１４０、１５４、１６８、１８２、１９０、２０４、２１３、２２１、２３０、２４４、２５１、２６２、２６６、２７０、２８６および２９０から成る群から選択される配列を含む完全長軽鎖抗体配列により構成される、哺乳類細胞での発現用に最適化されたＣ５結合性抗体を調製し、完全長重鎖抗体配列および／または完全長軽鎖抗体配列内における少なくとも１個のアミノ酸残基を改変することにより少なくとも１つの改変された抗体配列を作製し、改変された抗体配列をタンパク質として発現させる方法を提供する。
【０３０４】
改変された抗体配列はまた、固定したＣＤＲ３配列またはＵＳ２００５０２５５５５２号記載の最小必須結合決定基およびＣＤＲ１およびＣＤＲ２での多様性を有する抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより調製され得る。スクリーニングは、抗体ライブラリーから抗体をスクリーニングするのに適切なスクリーニング技術、例えばファージディスプレイ技術にしたがって実施され得る。
【０３０５】
標準分子生物学的技術を用いることにより、改変された抗体分子を調製および発現させることができる。改変された抗体配列（複数も可）によりコード化された抗体は、本明細書記載のＣ５結合性抗体の機能的特性の１つ、一部または全部を保持しているものであり、その機能的特性としては、限定されるわけではないが、ヒトおよび／またはカニクイザルＣ５への特異的結合性が挙げられ、抗体は溶血検定法において赤血球溶解を抑制する。
【０３０６】
改変された抗体の機能的特性は、当業界で利用可能および／または本明細書記載の標準検定法、例えば実施例で示した方法（例、ＥＬＩＳＡ）を用いて評価され得る。
【０３０７】
本発明抗体の遺伝子操作方法のある種の実施態様では、Ｃ５結合性抗体コーディング配列の全部または一部に沿って突然変異を無作為的または選択的に導入し得、生成した修飾Ｃ５結合性抗体を、結合活性および／または本明細書記載の他の機能的特性についてスクリーニングにかけ得る。突然変異誘発方法は、当業界では既に報告されている。例えば、Short によるＰＣＴ公開第ＷＯ０２／０９２７８０号は、飽和突然変異導入、合成ライゲーションによる組立またはその組み合わせを用いる抗体突然変異の作製およびスクリーニング方法について記載している。別法として、Lazar et al. によるＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０７４６７９号は、抗体の物理化学特性を最適化するためのコンピュータースクリーニング方法の使用方法について記載している。
【０３０８】
５．３．本発明抗体の特性確認
本発明抗体は、様々な機能性検定法により特性確認され得る。例えば、それらは、溶血検定法における赤血球溶解の抑制能力、Ｃ５タンパク質（例、ヒトおよび／またはカニクイザルＣ５）への親和性、エピトープ結合性（binning）、タンパク質加水分解に対する抵抗性および補体カスケードを遮断する能力、例えばＭＡＣ形成を阻害する能力により特性確認され得る。
【０３０９】
様々な方法を用いることにより、補体経路分子の存在および補体系の活性化を測定することができる（例、米国特許第6,087,120号; および Newell et al., J Lab Clin Med, 100:437-44, 1982 参照）。例えば、補体活性は、（ｉ）赤血球の補体介在溶解現象（溶血）の抑制の測定、（ii）Ｃ３またはＣ５の開裂を阻害する能力の測定、および（iii）副経路介在溶血現象の阻害によりモニターされ得る。
【０３１０】
２つの最も常用的な技術は、溶血検定法（例、Baatrup et al., Ann Rheum Dis, 51:892-7, 1992 参照）および免疫学的検定法（例、Auda et al., Rheumatol Int, 10:185-9, 1990 参照）である。溶血技術では、古典的経路にせよ、副経路にせよ、配列全体の機能的受容力を測定する。免疫学的技術では、特異的補体成分またはスプリット生成物のタンパク質濃度を測定する。本発明方法における補体活性化の検出および補体成分の活性の測定に使用され得る他の検定法には、例えばＴ細胞増殖検定法（Chain et al., J Immunol Methods, 99:221-8, 1987）および遅延型高感受性（ＤＴＨ）検定法（Forstrom et al., 1983, Nature 303:627-629; Hallidayet al., 1982, in Assessment of Immune Status by the Leukocyte Adherence Inhibition Test, Academic, ニューヨーク、pp. 1-26; Koppi et al., 1982, Cell. Immunol. 66:394-406、および米国特許第5,843,449号）がある。
【０３１１】
溶血技術では、補体成分の全てが存在し、かつ機能性でなくてはならない。従って、溶血技術では、補体系の機能的完全性および欠損の両方がスクリーニングされ得る（例、Dijk et al., J Immunol Methods 36: 29-39, 1980; Minh et al., Clin Lab Haematol. 5:23-34 1983; および Tanaka et al., J Immunol 86: 161-170, 1986 参照）。古典的経路の機能的受容力を測定するため、溶血素（ヒツジ赤血球に対するウサギＩｇＧ）でコートしたヒツジ赤血球またはウサギ抗ニワトリ抗体によるニワトリ感作赤血球を、標的細胞（感作細胞）として使用する。これらのＡｇ−Ａｂ複合体は、古典的経路を活性化することにより、構成要素が機能的であり、適切な濃度で存在するときに標的細胞の溶解をもたらす。副経路の機能的受容力を測定するため、ウサギ赤血球を標的細胞として使用する（例、米国特許第6,087,120号参照）。
【０３１２】
抗体のＭＡＣ（膜侵襲複合体）形成阻害能力を試験するため、ＭＡＣ沈着検定法が実施され得る。簡単に述べると、ザイモサンが副経路の活性化に使用され得、ＩｇＭは古典的経路を活性化するのに使用され得る。Ｆａｂをヒト血清とプレインキュベーションし、ザイモサンまたはＩｇＭでコートしたプレートに添加する。ＭＡＣ沈着の阻害パーセンテージが、ベースライン（ＥＤＴＡ処理ヒト血清）および陽性対照（ヒト血清）に対して各試料について計算され得る。
【０３１３】
抗体のＣ５への結合能は、直接興味の対象である抗体を標識することにより検出され得るか、または抗体は非標識であり、結合は当業界で公知の様々なサンドイッチ検定方式を用いて間接的に検出される。
【０３１４】
一部の実施態様において、本発明のＣ５結合性抗体は、Ｃ５ポリペプチドへのリファレンスＣ５結合性抗体の結合を遮断するかまたはそれと競合する。これらは、上記の完全ヒトＣ５結合性抗体であり得る。それらはまた、リファレンス抗体と同じエピトープに結合する他のマウス、キメラまたはヒト化Ｃ５結合性抗体であり得る。リファレンス抗体結合を遮断またはそれと競合する能力は、試験下のＣ５結合性抗体が、リファレンス抗体により特定されるエピトープと同じかまたは類似したエピトープ、またはリファレンスＣ５結合性抗体が結合するエピトープと十分に近位にあるエピトープに結合することを示す。上記抗体は、特にリファレンス抗体について確認された有利な特性を共有していると思われる。リファレンス抗体を遮断またはそれと競合する能力は、例えば競合結合検定法により測定され得る。競合結合検定法では、共通抗原、例えばＣ５ポリペプチドへのリファレンス抗体の特異的結合を阻害する能力について試験下の抗体を検査する。過剰の試験抗体が実質的にリファレンス抗体の結合を阻害する場合、試験抗体は、抗原への特異的結合をめぐってリファレンス抗体と競合している。実質的阻害とは、試験抗体がリファレンス抗体の特異的結合を通常少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％または９０％低下させることを意味する。
【０３１５】
Ｃ５タンパク質への結合をめぐるＣ５結合性抗体とリファレンスＣ５結合性抗体の競合を評価するのに使用され得る若干の公知競合結合検定法がある。これらの例としては、固相直接または間接放射線免疫検定法（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素免疫検定法（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合検定法（Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253, 1983 参照）、固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619, 1986 参照）、固相直接標識検定法、固相直接標識サンドイッチ検定法（Harlow および Lane、前出参照）、Ｉ−１２５標識を用いる固相直接標識ＲＩＡ（Morel et al., Molec. Immunol. 25:7-15, 1988 参照）、固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Cheung et al., Virology 176:546-552, 1990 参照）、および直接標識ＲＩＡ（Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82, 1990）がある。典型的には、かかる検定法では、これら非標識試験Ｃ５結合性抗体および標識リファレンス抗体のいずれかをもつ固体表面または細胞に結合した精製抗原を使用する。競合的阻害は、試験抗体の存在下で固体表面または細胞に結合した標識の量を測定することにより測定される。通常、試験抗体は過剰に存在する。競合検定法により同定される抗体（競合抗体）には、リファレンス抗体と同じエピトープに結合する抗体および立体障害が生じるほどリファレンス抗体が結合するエピトープと十分近位にある隣接エピトープに結合する抗体が含まれる。
【０３１６】
選択されたＣ５結合性モノクローナル抗体が特有のエピトープに結合するか否かを測定するため、各抗体は、市販の試薬（例、Pierce による試薬、ロックフォード、イリノイ）を用いてビオチニル化され得る。非標識モノクローナル抗体およびビオチニル化モノクローナル抗体を用いる競合試験は、Ｃ５ポリペプチドコートＥＬＩＳＡプレートを用いて実施され得る。ビオチニル化ＭＡｂ結合は、ストレプトアビジン（strep-avidin）−アルカリ性ホスファターゼプローブで検出され得る。精製Ｃ５結合性抗体のアイソタイプを決定するため、アイソタイプＥＬＩＳＡが実施され得る。例えば、マイクロタイタープレートのウェルを、４℃で一晩１μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧでコートし得る。１％ＢＳＡで遮断後、プレートを、周囲温度で１〜２時間、１μｇ／ｍｌまたはそれ未満のモノクローナルＣ５結合性抗体または精製アイソタイプ対照と反応させる。次いで、ウェルをヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭ−特異的アルカリ性ホスファターゼ−コンジュゲートプローブと反応させ得る。次いで、プレートを展開し、精製抗体のアイソタイプが決定され得るように分析する。
【０３１７】
Ｃ５ポリペプチドを発現する生細胞へのモノクローナルＣ５結合性抗体の結合を立証するために、フローサイトメトリーが使用され得る。簡単に述べると、Ｃ５を発現するセルライン（標準成長条件下で成長）を、０.１％ＢＳＡおよび１０％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ中の様々な濃度のＣ５結合性抗体と混合し、３７℃で１時間インキュベーションし得る。洗浄後、１次抗体染色と同じ条件下で、細胞をフルオレセイン標識抗ヒトＩｇＧ抗体と反応させる。光および側方散乱特性を用いて単細胞でゲートを設けるＦＡＣＳｃａｎ装置により試料を分析し得る。蛍光顕微鏡を用いる別の検定法を、フローサイトメトリー検定法に加えて、またはその代わりに使用してもよい。細胞を、上記要領で正確に染色し、蛍光顕微鏡で検査することが可能である。この方法により、個々の細胞の視覚化は可能となるが、抗原の密度によっては感度が低下することもあり得る。
【０３１８】
さらに本発明のＣ５結合性抗体は、ウエスタン・ブロッティングによりＣ５ポリペプチドまたは抗原性フラグメントとの反応性について試験され得る。簡単に述べると、精製Ｃ５ポリペプチドまたは融合タンパク質、またはＣ５を発現する細胞からの細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動にかけ得る。電気泳動後、分離した抗原をニトロセルロース膜に移し、１０％ウシ胎児血清で遮断し、供試モノクローナル抗体で探査する。ヒトＩｇＧ結合は、抗ヒトＩｇＧアルカリ性ホスファターゼを用いて検出され、BCIP/NBT基質錠（Sigma Chem. Co.、セントルイス、ミズーリ）で展開され得る。
【０３１９】
また、機能性検定法の例については、下記実施例の項でも記載している。
５．４．予防的および治療的使用
本発明は、処置を必要とする対象に本発明抗体の有効量を投与することによる、補体活性の増大に随伴する疾患または障害の処置方法を提供する。一実施態様において、本発明は、処置を必要とする対象に本発明の有効量を投与することによる、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の処置方法を提供する。
【０３２０】
本発明抗体は、特に、萎縮型ＡＭＤから滲出型ＡＭＤへの進行の阻止、地図状萎縮の進行の遅延および／または阻止、および萎縮型ＡＭＤの進行による視力低下の改善に使用され得る。また、これは、滲出型ＡＭＤ患者を処置するための抗ＶＥＧＦ療法と併用され得る。
【０３２１】
一部の実施態様において、本発明は、処置を必要とする対象に本発明抗体の有効量を投与することによる補体関連疾患または障害の処置方法を提供する。公知補体関連疾患または障害の例としては、神経障害、多発性硬化症、卒中、ギラン−バレー症候群、外傷性脳損傷、パーキンソン病、不適切または望ましくない補体活性化の障害、血液透析合併症、超急性同種移植片拒絶、異種移植片拒絶、インターロイキン−２療法中のＩＬ−２誘発毒性、炎症性障害、自己免疫疾患の炎症、クローン病、成人呼吸窮迫症候群、火傷または凍傷を含む熱損傷、虚血後再灌流状態、心筋梗塞、バルーン血管形成術、心肺バイパスまたは腎臓バイパスにおけるポストポンプ症候群、血液透析、腎虚血、無脈再構築後の腸間膜動脈再灌流、感染性疾患または敗血症、免疫複合体障害および自己免疫疾患、慢性関節リウマチ、全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ＳＬＥ腎炎、増殖性腎炎、溶血性貧血、および重症筋無力症がある。さらに、他の公知補体関連疾患は、肺疾患および障害、例えば呼吸困難、喀血、ＡＲＤＳ、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺浮腫、肺塞栓症および梗塞、肺炎、線維形成性塵肺、不活性粉塵および鉱物（例、珪素、炭粉、ベリリウムおよび石綿）、肺線維症、有機塵肺、化学的損傷（刺激性ガスおよび化学物質、例えば塩素、ホスゲン、二酸化硫黄、硫化水素、二酸化窒素、アンモニアおよび塩酸に起因）、喫煙損傷、熱損傷（例、火傷、凍傷）、喘息、アレルギー、気管支収縮、過敏性肺炎、寄生虫病、グッドパスチャー症候群、肺血管炎および免疫複合体関連炎症である。
【０３２２】
一実施態様において、本発明は、処置を必要とする対象に本発明抗体の有効量を投与することによる補体関連疾患または障害の処置方法を提供する。上記疾患または障害は、喘息、関節炎（例、慢性関節リウマチ）、自己免疫心疾患、多発性硬化症、炎症性腸疾患、虚血−再灌流損傷、バラクワ−サイモン症候群、血液透析、全身性エリテマトーデス、紅斑性狼瘡、乾癬、多発性硬化症、移植、中枢神経系の疾患、例えばアルツハイマー病および他の神経変性状態、ａＨＵＳ、糸球体腎炎、類天疱瘡またはＭＰＧＮIIである。
【０３２３】
一実施態様において、本発明は、処置を必要とする対象に本発明抗体を含む組成物の有効量を投与することによる糸球体腎炎の処置方法を提供する。糸球体腎炎の症状としては、限定されるわけではないが、タンパク尿、糸球体ろ過率（ＧＦＲ）の低下、高血圧および浮腫をもたらす水分貯留に至る、高窒素血症（尿毒症、過剰な血液尿素窒素--ＢＵＮ）および塩類貯留を含む血清電解質変化、血尿および赤血球円柱を含む異常な尿沈渣、低アルブミン血症、高脂血症および脂肪尿がある。一実施態様において、本発明は、処置を必要とする対象に本発明抗体を含む組成物の有効量を投与することによる発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）の処置方法を提供する。
【０３２４】
一実施態様において、本発明は、処置を必要とする対象に本発明抗体を含む組成物の有効量を投与することによる、体外循環と関連した免疫および血液凝固系の機能不全を縮小させる方法を提供する。本発明抗体は、患者の血液を、患者の血管から、導管を通して、患者の血管に戻して循環させるあらゆる手順で使用され得、かかる導管は、補体活性化、血小板活性化、白血球活性化または血小板−白血球接着の少なくとも１つを誘発し得る物質を含む管腔表面を有している。上記手順には、限定されるわけではないが、ＥＣＣの全形態、および患者の血液回路中への人工または外来臓器、組織または脈管の導入を伴う手順が含まれる。
【０３２５】
本発明の治療剤で処置される対象はまた、黄斑変性に関連した状態の公知処置方法、例えば米国特許第6,218,368号記載の抗生物質処置により他の治療剤も投与され得る。他の処置では、シクロスポリンなどの免疫抑制剤が、免疫応答を抑制し得る薬剤である。これらの薬剤には、細胞傷害剤、コルチコステロイド類、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、特異的Ｔリンパ球免疫抑制剤、および抗体またはそのフラグメントがある（Physicians' Desk Reference, 第５３版、Medical Economics Company Inc., モントベイル、ニュージャージー(1999) 参照）。免疫抑制処置は、典型的には間隔をおいて１週間、１か月、３か月、６か月または１年の期間続行される。患者によっては、終生処置を続ける場合もある。
【０３２６】
本発明の治療剤を別の薬剤と一緒に投与するとき、２薬剤は、いずれかの順序で逐次的に、または同時に投与され得る。局面によっては、第２の薬剤（例、ベルテポルフィン）での治療も受けている対象に本発明抗体を投与する場合もある。他の局面において、外科的処置と連係して結合性分子を投与する場合もある。
【０３２７】
Ｃ５結合性抗体との組み合わせ処置に適切な作用物質には、補体構成要素の活性をモジュレーションできる当業界で公知の作用物質がある（例、米国特許第５８０８１０９号参照）。他の作用物質も、補体介在活性を減少させることが報告されている。上記作用物質には、アミノ酸（Takada, Y. et al. Immunology 1978, 34, 509）、ホスホン酸エステル類（Becker, L. Biochem. Biophy. Acta 1967, 147, 289）、ポリアニオン性物質（Conrow, R. B. et al. J. Med. Chem. 1980, 23, 242）、スルホニルフルオリド類（(Hansch, C.; Yoshimoto, M. J. Med. Chem. 1974, 17, 1160、およびそこに引用されている参考文献）、ポリヌクレオチド類（DeClercq, P. F. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975, 67, 255）、ピマル酸（Glovsky, M. M. et al. J. Immunol. 1969, 102, 1）、ポルフィン類（Lapidus, M. および Tomasco, J. Immunopharmacol. 1981, 3, 137）、幾つかの抗炎症剤（Burge, J. J. et al. J. Immunol. 1978, 120, 1625）、フェノール類（Muller-Eberhard, H. J. 1978, in Molecular Basis of Biological Degradative Processes, Berlin, R. D. et al.編、Academic Press, ニューヨーク、p. 65）およびベンゾアミジン類（Vogt, W. et al Immunology 1979, 36, 138）がある。これらの作用物質の中には、プロテアーゼおよびエステラーゼの全般的阻害により機能するものもある。その他は、補体経路における特定中間段階にとって特異的ではないが、補体活性化の複数段階を阻害する。後者の化合物の例としては、Ｃ１、Ｃ４およびＣ５使用を遮断するベンゾアミジン類がある（例、Vogt et al. Immunol. 1979, 36, 138参照）。
【０３２８】
補体構成要素の活性を阻害し得る当業界で公知のさらなる作用物質には、スタキボトリス（Stachybotrys）からの菌類代謝産物、Ｋ−７６がある（Corey et al., J. Amer. Chem. Soc. 104: 5551, 1982）。Ｋ−７６およびＫ−７６ ＣＯＯＨは両方とも、主としてＣ５段階で補体を阻害し（Hong et al., J. Immunol. 122: 2418, 1979; Miyazaki et al., Microbiol. Immunol. 24: 1091, 1980）、正常ヒト補体からの走化性因子の生成を阻止することが示された（Bumpers et al., Lab. Clinc. Med. 102: 421, 1983）。高濃度のＫ−７６またはＫ−７６ ＣＯＯＨでは、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ６、Ｃ７およびＣ９とそれらの個々の上記中間体との反応の阻害が示される。Ｋ−７６またはＫ−７６ ＣＯＯＨはまた、補体のＣ３ｂ不活性化因子系を阻害することが報告されている（Hong et al., J. Immunol. 127: 104-108, 1981）。本発明方法の実践に適切な他の作用物質には、グリセオフルビン（Weinberg, in Principles of Medicinal Chemistry, 第２版、Foye, W. O.編、Lea & Febiger, フィラデルフィア、ペンシルベニア、p. 813, 1981）、イソパンナリン（Djura et al., Aust. J. Chem.36: 1057, 1983）およびシホノジクチオン・コラリ−ファグム（Siphonodictyon coralli-phagum）の代謝産物（Sullivan et al., Tetrahedron 37: 979, 1981）がある。
【０３２９】
併用療法は付加的なものであり得るか、または相乗効果をもたらし得る（例、２作用物質の併用に関して予測されたよりも補体経路活性が縮小する）。一部の実施態様において、本発明は、本発明のＣ５結合性抗体と抗血管新生剤、例えば抗ＶＥＧＦ剤による上記ＡＭＤまたは別の補体関連疾患を予防および／または処置するための併用療法を提供する。
【０３３０】
５．５．診断的利用法
一態様において、本発明は、生物試料（例、血液、血清、細胞、組織）の状態で、または病気または障害を患っているか、またはＡＭＤに関連した障害を発症する危険のある個体からＣ５タンパク質および／または核酸の発現並びにＣ５タンパク質機能を測定するための診断的検定法を包含する。
【０３３１】
診断的検定法、例えば競合検定法は、共通の結合パートナー上の限られた数の結合部位をめぐって被検体試料と競う際の標識類似体（「トレーサー」）の競合能力に信頼を置くものである。一般的には、競合の前または後に結合パートナーを不溶化し、次いで結合パートナーに結合したトレーサーおよび被検体を、未結合のトレーサーおよび被検体から分離する。この分離は、傾瀉（結合パートナーが不溶化前の場合）により、または遠心分離（競合的反応後に結合パートナーが沈殿した場合）により達成される。被検体試料の量は、マーカー物質の量により測定される結合したトレーサーの量に反比例している。既知量の被検体による用量応答曲線を作成し、試験結果と比較することにより、試料中に存在する被検体の量を定量的に測定する。これらの検定法は、酵素を検出可能マーカーとして使用する場合ＥＬＩＳＡシステムと呼ばれる。この形態の検定法では、抗体とＣ５結合性抗体間の競合的結合の結果、血清試料中の抗体、さらに特定すれば血清試料中の中和抗体の尺度である、結合Ｃ５タンパク質、好ましくは本発明のＣ５エピトープが生じる。
【０３３２】
上記検定法の顕著な利点は、測定が直接中和抗体（すなわち、Ｃ５タンパク質、具体的にはエピトープの結合を妨害する抗体）により構成されることである。特にＥＬＩＳＡ試験形態である上記検定法は、臨床環境および常用的血液スクリーニングにおいて多大な適用性を有する。
【０３３３】
免疫学的技術は、検出すべき様々な補体構成要素（例、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５）の異なるエピトープ、例えば補体構成要素のスプリット生成物に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いる（例、Hugli et al., Immunoassays Clinical Laboratory Techniques 443-460, 1980; Gorski et al., J Immunol Meth 47: 61-73, 1981; Linder et al., J Immunol Meth 47: 49-59, 1981; および Burger et al., J Immunol 141: 553-558, 1988 参照）。次いで、既知濃度の標識スプリット生成物との競合におけるスプリット生成物と抗体の結合が測定され得る。様々な検定法、例えば放射線免疫検定法、ＥＬＩＳＡおよび放射拡散検定法が補体スプリット生成物の検出に利用可能である。
【０３３４】
免疫学的技術では、黄斑変性に罹患または非罹患の被検対象および対照対象からの血液中におけるスプリット生成物形成が測定され得るため、補体活性化が高感度で検出される。したがって、本発明方法の中には、被検対象からの血漿中における補体構成要素の可溶性スプリット生成物の定量化による異常な補体活性化の測定により、視覚障害に随伴した障害の診断結果が得られる場合もある。測定は、例えば、Chenoweth et al., N Engl J Med 304: 497-502, 1981; および Bhakdi et al., Biochim Biophys Acta 737: 343-372, 1983 に記載の要領で実施され得る。好ましくは、インビボで形成された補体活性化のみを測定する。これは、補体系の阻害剤を含む媒質中に対象から生物試料（例、血清）を集め、それに続いて試料中の補体活性化を測定（例、スプリット生成物の定量化）することにより達成され得る。
【０３３５】
眼科疾患または障害に随伴した障害をもつ患者の臨床的診断またはモニタリングにおいては、正常対象からの対応する生物試料でのレベルとの比較における補体タンパク質の検出が、黄斑変性に関連した障害をもつ患者の指標である。
【０３３６】
インビボ診断またはイメージングは、ＵＳ２００６／００６７９３５に記載されている。簡単に述べると、これらの方法では、一般的に非侵襲的方法により検出され得るマーカーまたは標識に機能し得るように結合させたＣ５結合分子の診断有効量を患者に投与または導入する。抗体−マーカーコンジュゲートを十分な時間おいて局在させ、眼内の補体タンパク質と結合させる。次いで、患者を検出装置に適用することにより、検出可能なマーカーを識別、すなわち患者の目におけるＣ５結合分子の位置を画像化する。Ｃ５結合性抗体またはその抗原結合フラグメントの存在は、抗体−マーカーが眼の構成要素に結合するか否かを測定することにより検出される。ＡＭＤ疾患に罹患していない正常個体との比較における選択された補体タンパク質またはタンパク質の組み合わせの高レベルの検出が、黄斑変性に随伴した障害の疾病素因および／または兆候の指標となる。本発明のこれらの態様は、眼科イメージング方法および併用の抗原性診断および処置方法での使用にも好ましい。
【０３３７】
本発明はまた、診断的検定法、予知的検定法、薬理ゲノム学および臨床試験モニタリングを予知（予測）目的に使用することにより、個体を予防的に処置する予測医学分野に関するものである。
【０３３８】
本発明はまた、個体が補体経路活性の調節障害に随伴する障害を発症する危険に瀕しているか否かを測定するための予知的（または予測的）検定法を提供する。例えば、Ｃ５遺伝子における突然変異は、生物試料で検定され得る。上記検定法を予知または予測目的に使用することにより、Ｃ５タンパク質、核酸発現または活性を特徴とするか、またはそれに関連した障害の始まる前に個体を予防的に処置することができる。
【０３３９】
本発明の別の態様は、個体においてＣ５核酸発現またはＣ５タンパク質活性を測定することにより、その個体に適切な治療または予防剤を選択する方法を提供する（本明細書では「薬理ゲノム学」と称す）。薬理ゲノム学により、個体の遺伝子型（例、特定作用物質に対する個体の応答能を測定するために検査される個体の遺伝子型）に基づいて個体の治療または予防処置用の作用物質（例、薬剤）を選択することができる。
【０３４０】
本発明のさらに別の態様は、臨床試験におけるＣ５タンパク質の発現または活性に対する作用物質（例、薬剤）の影響のモニタリングに関するものである。
【０３４１】
５．６．医薬組成物
本発明は、医薬上許容される担体と一緒に製剤化されたＣ５結合性抗体（無傷または結合性フラグメント）を含む医薬組成物を提供する。さらに、上記組成物は、補体関連疾患（例、ＡＭＤ）の処置または予防に適した１つ以上の他の治療剤を含み得る。医薬用担体は、組成物を向上または安定化させるか、または組成物の製造を容易にする。医薬上許容される担体には、生理学的に適合性のある溶媒、分散媒質、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などがある。
【０３４２】
本発明の医薬組成物は、当業界で公知の様々な方法により投与され得る。投与経路および／または方式は、所望の結果により異なる。静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下投与または標的部位の近位への投与が好ましい。一実施態様では、本発明抗体が眼の硝子体内へ投与され得るようにそれらを製剤化する。医薬上許容される担体は、当然、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例、注射または注入による）に適切なものである。投与経路によっては、活性化合物、すなわち、抗体、二重特異性および多重特異性分子を、化合物を不活化し得る酸または他の自然条件の作用から化合物を保護する材料でコーティングする場合もあり得る。
【０３４３】
上記組成物は、無菌および流動状態とすべきである。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合に必要とされる粒子サイズの維持および界面活性剤の使用により維持され得る。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば糖類、ポリアルコール類、例えばマンニトールまたはソルビトール、および塩化ナトリウムを含ませるのが好ましい。注射可能組成物の長期吸収は、吸収を遅らせる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを組成物に含ませることにより達成され得る。
【０３４４】
本発明医薬組成物は、当業界で公知であり、常用的に実践されている方法に従って製造され得る。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 第２０版、2000; および Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson 編、Marcel Dekker, Inc., ニューヨーク、1978 参照。医薬組成物は、好ましくはＧＭＰ条件下で製造される。典型的には、治療実効用量または有効用量のＣ５結合性抗体を、本発明医薬組成物中で使用する。当業者に公知の慣用的方法により、Ｃ５結合性抗体を医薬上許容される投薬形態に製剤化する。投薬レジメンを調節することにより、最適な所望の応答（例、治療応答）を提供させる。例えば、単一ボーラスを投与する場合もあれば、時間をかけて数回の分割用量を投与する場合もあり得るか、または用量は治療状況の緊急性による指示に応じて減量または増量され得る。投与し易く、また用量を均一にするために用量単位形態で非経口組成物を処方することが特に有利である。本明細書で使用する用量単位形態は、処置される対象にとって単位投薬量として適切な物理的に分離された単位をいう。各単位は、必要とされる医薬用担体と共に所望の治療効果をもたらすように計算された活性化合物の予め定められた量を含む。
【０３４５】
本発明医薬組成物における有効成分の実際の用量レベルを変えることにより、患者に有毒な作用をもたらすことなく、特定の患者、組成物および投与方式にとって望ましい治療応答を達成するのに効果的である有効成分の量を達成することができる。選択される用量レベルは、使用される本発明の特定組成物またはそのエステル、塩またはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用されている特定化合物の排泄速度、使用特定組成物と併用される処置、他薬剤、化合物および／または材料の持続性、処置されている患者の年齢、性別、体重、状態、全般的健康および病歴などの因子を含む様々な薬物動態因子に左右される。
【０３４６】
医師または獣医は、医薬組成物中で使用する本発明抗体の用量を、所望の治療効果の達成に必要とされるレベルより低レベルから出発し、所望の効果が達成されるまで徐々に投薬量を増加させ得る。一般に、本明細書記載のアレルギー性炎症障害の処置に関する本発明組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるかという点、投与されている他の医薬および処置が予防的であるか治療的であるかという点を含む多くの異なる因子により変動する。安全性および効力を最適化するためには、処置用量を滴定する必要がある。抗体による全身投与の場合、投薬量は、対象体重の約０.０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、さらに通常は０.０１〜１５ｍｇ／ｋｇの範囲である。具体例としての処置レジメンは、２週間に１回または１か月に１回または３〜６か月に１回の全身投与を必要とする。抗体を用いた硝子体内投与の場合、投薬量は、約０.０００１〜約１０ｍｇの範囲である。具体例としての処置レジメンは、２週間に１回または１か月に１回または３〜６か月に１回の全身投与を必要とする。
【０３４７】
抗体は、通常多数回投与される。投薬間隔は、週ごと、月ごとまたは年ごとであり得る。また、間隔は、患者におけるＣ５結合性抗体の血液レベルの測定結果による指示に応じて不定期の場合もあり得る。全身投与方法の場合、１〜１０００μｇ／ｍｌおよび方法によっては２５〜５００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を達成するように投薬量を調節することもある。別法として、抗体は、持続放出型製剤として投与され得、その場合投与頻度は少なくて済む。投薬量および頻度は、患者における抗体の半減期により変動する。一般に、ヒト化抗体は、キメラ抗体および非ヒト抗体の場合よりも長い半減期を示す。投薬量および投与頻度は、処置が予防的であるのか、治療的であるのかにより異なり得る。予防的適用では、比較的低用量を長期間にわたって比較的低頻度の間隔で投与する。患者によっては、終生治療を受け続ける場合もある。治療適用では、病気の進行を縮小するかまたは終結させるまで、好ましくは患者が病気の症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高用量が要求されることもある。その後、患者には、予防的レジメンが実施され得る。
【実施例】
【０３４８】
６．実施例
以下の実施例では、本発明をさらに説明するが、ただし、その範囲を限定するものではない。本発明の他の変形は、当業者には容易に想到できるはずであり、後記請求の範囲に包含されるものとする。
【実施例１】
【０３４９】
実施例１：カニクイザルＣ５およびヒトＣ５の作製
１．カニクイザルＣ５の作製
MOR07086 hu ＩｇＧ１を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより、カニクイザルＣ５をカニクイザル血清から効果的に精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、質量分析法および溶血検定法により、カニクイザルＣ５を定性分析した。精製カニクイザルＣ５の品質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより高いことが示された。Ｃ３汚染物質の欠如は、ＳＤＳおよびウエスタンブロットにより確認された。さらに、カニクイザルＣ５配列の同一性を質量分光計分析により測定し、精製カニクイザルＣ５の活性を溶血検定法で試験した。溶血検定法では、新しい調製物が、ヒトＣ５と等しい能力を示した（例、試料６、親和性成熟パニングで使用、精製ヒトＣ５と類似した活性をもつ２０％ヒトＣ５枯渇血清の再構成された補体活性）。
【０３５０】
２．ヒトおよびカニクイザルビオチニル化および非ビオチニル化Ｃ５タンパク質の品質管理
精製ヒトＣ５の生物活性を、副経路溶血活性により特性検定および確認した。Ｃ５を様々な濃度でＣ５枯渇ヒト血清中へスパイクすることにより、ＥＣ５０を得た。０.０２〜０.１ｎＭの範囲におけるＥＣ５０値は許容できるとみなされた。
【０３５１】
使用前、あらゆる精製ヒトＣ５タンパク質ロットの対生物活性を溶血検定法で試験した。カニクイザル血清からの精製後のカニクイザルＣ５についても同じ品質管理を行った。ヒトおよびカニクイザルＣ５のビオチニル化後、上記材料の対生物活性も溶血検定法で試験することにより、ビオチニル化により誘発された活性の喪失があるか否かを分析した。
【実施例２】
【０３５２】
実施例２：HuCAL GOLD（登録商標）ライブラリーからのＣ５特異的抗体の作製
抗体変異型タンパク質の供給源として、市販のファージディスプレイライブラリー、HuCAL GOLD（登録商標）ライブラリーを使用することによる、高い結合親和性をもつクローンの選択によりＣ５抗体を作製した。
【０３５３】
HuCAL GOLD（登録商標）ライブラリーは、６個のＣＤＲが全て適切な突然変異により多様化され、Ｆａｂをファージ表面へ結合させるのに CysDisplayTM 技術を使用しているＦａｂライブラリー（Knappik et al., 2000）である（国際公開第ＷＯ０１／０５９５０号、Loehning et al., 2001）。
【０３５４】
１．ライブラリーからのＣ５特異抗体のパニングによる選択
Ｃ５に対する抗体を選択するため、２種の異なるパニング戦略を適用した。６つの異なるプールを、３回の（ａ）抗原（ヒトおよびカニクイザルＣ５）で直接 Maxisorp ９６ウェルマイクロタイタープレート（Nunc、ビースバーデン、ドイツ国）をコートする固相パニング、または（ｂ）ファージ−抗原複合体を各パニングプールについてストレプトアビジン磁気ビーズ（Dynabeads M-280; Dynal）により捕捉させるビオチニル化ヒトおよびカニクイザルＣ５での液中パニングに個々に適用した。
３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび１％グルコースを含む２×ＹＴ培地（２×ＹＴ−ＣＧ）中で、HuCAL GOLD（登録商標）ライブラリーを増幅した。０.５のＯＤ６００ｎｍでＶＣＳＭ１３ヘルパーファージにより感染させた後（振とうせずに３７℃で３０分、２５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で３０分）、細胞をスピンダウンし（４１２０ｇ、５分、４℃）、２×ＹＴ／３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール／５０μｇ／ｍｌカナマイシン／０.２５ｍＭのＩＰＴＧに再懸濁し、２２℃で一晩成長させた。ファージを上清からＰＥＧ沈殿させ、ＰＢＳ／２０％グリセリンに再懸濁し、−８０℃で貯蔵した。２回のパニング間でのファージ増幅を次の要領で実施した：対数増殖中期エシェリキア・コリ（E.coli）ＴＧ１細胞を、溶離ファージにより感染させ、１％のグルコースおよび３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補ったＬＢ−寒天（ＬＢ−ＣＧプレート）へ平板培養した。一晩３０℃でインキュベーション後、ＴＧ１コロニーを寒天プレートからはがし取り、０.５のＯＤ６００ｎｍに達するまで２×ＹＴ−ＣＧへ接種するのに使用した。上記要領で、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージを添加して感染させた。
【０３５５】
全パニング戦略から誘導された３５４のクローンを一まとめにして、配列決定すると、所望のプロフィール：ヒトおよびカニクイザルＣ５への結合性およびカウンター標的Ｃ３およびＣ４への非結合性をもつ６４の特有クローンが得られた。
【０３５６】
固相パニングから誘導された４５のクローンおよび液中パニングから誘導された１９のクローンを、タンパク質発現および精製用に選択した。固相パニングからの４つのＦａｂ（ＭＯＲ０６５２５、ＭＯＲ０６７５６、ＭＯＲ０６７５７およびＭＯＲ０６７６３）および液中パニングからの６つのＦａｂ（ＭＯＲ０７０８６、ＭＯＲ０７０８７、ＭＯＲ０７０９１、ＭＯＲ０７０９２、ＭＯＲ０７０９３およびＭＯＲ０７０９４）は、親和性成熟過程にはいった。
【０３５７】
直接コートタンパク質におけるＣ５に対する固相パニング
初回パニングの変形は、ヒトＣ５（１回目および３回目の選択）およびカニクイザルＣ５（２回目の選択）を交替させる固相パニングであった。
【０３５８】
Maxisorp プレート（F96 Nunc-Immunoplate）の３つのウェルを、４℃でｏ／ｎ、２００μｌの５０ｎＭのそれぞれのＣ５によりコートした。コートしたウェルを、４００μｌのＰＢＳで２回洗浄し、マイクロタイタープレート振とう器において２時間ＲＴで３５０μｌの５％ＭＰＢＳにより遮断した。各パニングについては、約１０１３のHuCAL GOLD（登録商標）ファージ−抗体を、室温で２時間、等量のＰＢＳＴ／５％粉乳により遮断した。コートしたウェルを、遮断手順後４００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。遮断前のHuCAL GOLD（登録商標）ファージ−抗体２００μｌを、各コートウェルに添加し、振とう器においてＲＴで２時間インキュベーションした。５回３５０μｌのＰＢＳ／０.０５％Tween を加えることにより、洗浄を実施し、次いでさらに５回ＰＢＳで洗浄した。パニング条件によっては、さらにストリンジェントな洗浄手順を適用した。
【０３５９】
１０分間１ウェル当たり１０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８）中２０ｍＭのＤＴＴ２００μｌにより、プレートからファージを溶離した。ＤＴＴファージ溶離液を、１５ｍｌのエシェリキア・コリ（E.coli）ＴＧ１に加え、２ＹＴ培地中３７℃で０.６〜０.８のＯＤ６００まで成長させ、３７℃で４５分間、ファージ感染のために振とうすることなく５０ｍｌプラスチック管中でインキュベーションした。５分間４１２０×ｇで遠心分離後、細菌ペレットをそれぞれ６００μｌの２×ＹＴ培地に再懸濁し、３×ＹＴ−ＣＧ寒天プレートで平板培養し、３７℃で一晩インキュベーションした。上記要領で、コロニーをプレートからはがし取り、ファージをレスキューし、増幅した。
【０３６０】
２回目および３回目の固相パニングを初回のプロトコルにしたがって実施した。パニング条件によっては、２回目の選択において、初回生産物をカニクイザルＣ５に関する選択に使用することにより、カニクイザル交差反応性抗体について強化する場合もあった。
【０３６１】
パニング条件によっては、洗浄ストリンジェンシーを高め、３回目の選択内で抗原濃度を減らすことにより、高親和性抗体を作製する場合もあった。
【０３６２】
HuCAL GOLD（登録商標）ファージミドライブラリーを用いることにより、ヒトＣ５に対する特異的Ｆａｂ抗体フラグメントを選択した。初回戦略は、直接コートヒトＣ５タンパク質に対する固相パニングであった（上記パニング手順）。
【０３６３】
３回目のパニング後、強化ファージプールを、pMORPH（登録商標）２３ライブラリーベクター（ファージ表面での有効な抗体ディスプレーを可能にする）から、可溶性Ｆａｂのペリプラズム発現を媒介する pMORPH（登録商標）×9_Fab_MH 発現ベクターへサブクローニングした。単クローンを採取し、可溶性Ｆａｂをこれらの単クローンから発現させた。
【０３６４】
全部で６６２４のクローンを、Maxisorp マイクロタイタープレートに固定されたヒトＣ５への、溶菌液から直接得たＦａｂの結合により実施される１次スクリーニングで分析した。ヒトＣ５に対する１次スクリーニングから、１６６０のヒットを得、シグナルはバックグラウンドの５倍を超えていた。さらに、３８４のヒットを２次スクリーニングで分析することにより、ヒトＣ５での結合を確認し、カウンター標的ヒトＣ３およびＣ４への結合についてスクリーニングした。
【０３６５】
多くの主要なヒットが、ヒトＣ５で確認され得、ヒトＣ３およびＣ４との交差反応性は示さなかったが、６個のＦａｂのみカニクイザルＣ５との弱い交差反応性を示した。
【０３６６】
第１の結果として、ヒトおよびカニクイザルＣ５で交互に行いながら新たな固相パニングを実施した。平行して、精製カニクイザルＣ５バッチの品質管理により、カニクイザルＣ５バッチ内における高量のカニクイザルＣ３が明らかにされた。この結果を考慮して、カニクイザル交差反応性抗体についての新たなスクリーニング方法を適用した。Ｃ５結合性ポリクローナル抗体（実施例３、３項を参照）を用いて、カニクイザルＣ５を、カニクイザル血清から捕捉させた。この方法を用いて、初回１次ヒットをカニクイザルＣ５に対して再びスクリーニングし、５６のクローンをカニクイザルＣ５への結合について確認した。
【０３６７】
交替型固相パニングについては、最も有効な１２のヒト固相パニングの初回産物を、カニクイザルＣ５に対する選択に使用した（タンパク質バッチはカニクイザル３で汚染されていた；パニング中は判明せず）。ヒトＣ５への結合に関する２次スクリーニングにおいて３７６のクローンを確認し、カニクイザル血清から捕捉されたカニクイザルＣ５への結合について３６１のクローンを確認した。
【０３６８】
ビオチニル化Ｃ５タンパク質に対する液中パニング
第２パニングの変形は、生物活性（溶血検定法で）ビオチニル化ヒトＣ５およびビオチニル化カニクイザルＣ５に対する液中パニングであった。
【０３６９】
このパニングについては、ストレプトアビジン磁気ビーズ（Dynabeads M-280; Dynal）２００μｌを、ＰＢＳで１回洗浄し、ＲＴで２時間、Chemiblockerにより遮断した。ＰＢＳ希釈ファージ３００μｌを、回転装置においてＲＴで１〜２時間同じく Chemiblockerにより遮断した。遮断されたファージを、３０分間５０μｌの遮断ストレプトアビジン磁気ビーズに対して２回前吸着させた。ファージ上清を新たな遮断２ｍｌ反応管に移し、ヒトビオチニル化Ｃ５を添加し、回転装置においてＲＴで１時間インキュベーションした。遮断されたストレプトアビジン磁気ビーズ１００μｌを各パニングプールに添加し、回転装置において１０分間インキュベーションした。ビーズを約２.５分間粒子分離器（Dynal MPC-E）で集め、溶液を注意深く除去した。
【０３７０】
次いで、回転装置を用いて７×ＰＢＳ／０.０５％Tweenによりビーズを洗浄した後、ＰＢＳでさらに３回洗浄した。１０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８）中の２０ｍＭのＤＴＴ２００μｌを各管に加え、１０分間インキュベーションすることにより、Dynabeads からファージを溶離させた。磁気粒子分離器によりDynabeadsを除去し、０.６〜０.８のＯＤ６００ｎｍに成長させたエシェリキア・コリ（E.coli）ＴＧ−１培養物１５ｍｌへ上清を加えた。次いで、ビーズを２００μｌのＰＢＳで１回洗浄し、追加除去されたファージと一緒にＰＢＳを１５ｍｌのエシェリキア・コリ（E.coli）ＴＧ−１培養物へ加えた。ファージ感染のため、培養物を３７℃で４５分間、振とうせずに５０ｍｌのプラスチック管中でインキュベーションした。４１２０×ｇで５分間遠心分離した後、細菌ペレットをそれぞれ６００μｌの２×ＹＴ培地に再懸濁し、３×ＹＴ−ＣＧ寒天プレートで平板培養し、３７℃で一晩インキュベーションした。上記と同様に、コロニーをプレートからはがし取り、ファージをレスキューし、増幅させた。初回選択と同一方法で、２回目および３回目の選択を実施した。
【０３７１】
さらなるパニング戦略は、ヒトＣ５および交互のヒトおよびカニクイザルＣ５を用いる液中パニングであった（タンパク質バッチは、カニクイザルＣ３で汚染されていた、パニング中には判明せず）。従って、タンパク質をビオチニル化し、ビオチニル化手順後に保持されていた生物機能性を溶血バイオアッセイで確認した。
【０３７２】
ファージ−抗原複合体を、抗原のビオチン部分によりストレプトアビジン磁気ビーズ上で捕捉させた。洗浄後、特異的結合ファージのみが溶離された（上記パニング手順）。
【０３７３】
初回スクリーニングを直接コートタンパク質（実施例３、１項参照）で実施し、ヒトＣ５については８０クローンのみが確認され得た。パニング中、抗原は溶解状態で保たれているという事実故に、新たなスクリーニング方法が開発された。液中ＥＬＩＳＡでは、Ｆａｂを、NeutrAvidin プレートにおいてビオチニル化抗原とインキュベーションした。この液中スクリーニング手順を用いると、著しく高量のヒトおよびカニクイザルＣ５特異的クローンが選択され得た。これらの結果は、液中パニングから誘導された多くのＦａｂが、溶解状態でのみ、または（例、ポリクローナルＣ５結合性抗体により）捕捉されたときにＣ５を認識するということを確認するものであった。
【０３７４】
２．選択されたＦａｂフラグメントのサブクローニングおよび発現
可溶性Ｆａｂの迅速な発現を促すため、選択された HuCAL GOLD（登録商標）ファージのＦａｂエンコーディング挿入体を、ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩによりエシェリキア・コリ（E.coli）発現ベクターpMORPH（登録商標）×９＿ＭＨへサブクローニングした。Ｆａｂフラグメントは、Ｃ−末端Ｍｙｃ標識および第２Ｃ−末端標識として６×Ｈｉｓ標識をもつ（Chen et al., Gene 139:73-75 (1994)）。エシェリキア・コリ（E.coli）ＴＧ１Ｆ−細胞への発現プラスミドの形質転換後、クロラムフェニコール耐性単クローンを採取し、６０μｌの２×ＹＴ−ＣＧ培地で予め満たしておいた滅菌３８４ウェルマイクロタイタープレートのウェル中へ入れ、３０℃でｏ／ｎ成長させた。各エシェリキア・コリ（E.coli）ＴＧ−１ｏ／ｎ培養物５μｌを、１ウェル当たり３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補った４０μｌの２×ＹＴ培地で予め満たしておいた新しい滅菌９６ウェルマイクロタイタープレートへ移した。マイクロタイタープレートを、培養物が〜０.５のＯＤ６００ｎｍで僅かに濁るまで（〜２〜４時間）、マイクロプレート振とう器において４００ｒｐｍで振とうしながら３０℃でインキュベーションした。これらの発現プレートに、１ウェル当たり３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび３ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を補った１０μｌの２×ＹＴ培地を添加した（最終濃度０.５ｍＭのＩＰＴＧ）。マイクロタイタープレートを、気体透過性テープで密閉し、４００ｒｐｍで振とうしながら３０℃でｏ／ｎインキュベーションした。発現プレートの各ウェルに、２.５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、４ｍＭのＥＤＴＡおよび１０Ｕ／μｌのベンゾナーゼを含む１５μｌのＢＥＬ緩衝液を加え、マイクロタイタープレート振とう器（４００ｒｐｍ）において２２℃で１時間インキュベーションし、次いで−８０℃で少なくとも２時間所望による冷凍工程にかけた。ＢＥＬ抽出物を、親和性成熟後ＥＬＩＳＡまたはＦａｂ ＳＥＴスクリーニングによる結合分析に使用した。
【０３７５】
ＴＧ−１細胞における pMORPH（登録商標）×９_Ｆａｂ_ＭＨによりコード化されたＦａｂフラグメントの発現は、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補った７５０ｍｌの２×ＹＴ培地を用いて振とうフラスコ培養物において実施された。ＯＤ６００ｎｍが０.５に達するまで培養物を３０℃で振とうした。３０℃で２０時間０.７５ｍＭのＩＰＴＧの添加により発現を誘導した。リゾチームを用いて細胞を破壊し、ＦａｂフラグメントをＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー（Qiagen、ヒルデン、ドイツ国）により単離した。ＰＤ１０カラムを用いて、１×ダルベッコＰＢＳ（ｐＨ７.２）への緩衝液交換を実施した。試料を滅菌濾過した（０.２μｍ、Millipore）。試料の純度を、変性還元状態ではＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％ Criterion Gels, BioRad）により、および天然状態ではサイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）により測定した。タンパク質濃度をＵＶ−分光測光法により測定した（Krebs et al., J. Immunol. Methods 254:67-84 (2001)）。
【０３７６】
Ｆａｂレベルでは、全体的発現率およびＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）におけるモノマーフラクションのパーセンテージは、同定された抗体フラグメントの大部分にとって許容限度〜良好な範囲であった。６４の親Ｆａｂが発現され、６１のＦａｂが精製され得た。６０の親和性成熟Ｆａｂをｍｇ規模で精製した。Ｆａｂのほとんどは良好な発現体であり、凝集傾向は無かった。
【実施例３】
【０３７７】
実施例３：HuCAL GOLD（登録商標）ライブラリーからのＣ５特異抗体の同定
以下、４種の異なる酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）方法は、特異およびカウンター抗原に対するＣ５結合性抗体（細菌性ＢＥＬ溶菌液または精製Ｆａｂとして）のスクリーニングを説明するものである。
【０３７８】
１．直接コートタンパク質に対するスクリーニング
Maxisorp（Nunc、ロチェスター、ニューヨーク、米国）３８４ウェルプレートを、４℃でｏ／ｎ、１ウェル当たりＰＢＳ（ｐＨ７.４）中２.５μｇ／ｍｌの抗原（ヒトＣ５およびカウンタータンパク質ヒトＣ３およびＣ４）２０μｌでコートした。平行して、１ウェル当たり、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）中で希釈した、Ｆｄフラグメント特異的な５μｇ／ｍｌのヒツジ抗ヒトＩｇＧ（The Binding Site、バーミンガム、英国）２０μｌでプレートをコートし、Ｆａｂ発現レベルについてチェックした。
【０３７９】
５％粉乳を含むＰＢＳ／０.０５％ Tween 20（ＰＢＳＴ）により、プレートをＲＴで１〜２時間遮断した。ＰＢＳＴでウェルを洗浄した後、ＰＢＳ中で希釈したＢＥＬ抽出物、精製 HuCAL GOLD（登録商標）Ｆａｂまたは対照Ｆａｂを加え、ＲＴで１時間インキュベーションした。Ｆａｂ結合を検出するため、ペルオキシダーゼにカップリングした抗ＨＩＳ６抗体を適用した（Roche）。
【０３８０】
ＰＯＤ−コンジュゲートを検出するため、蛍光性基質 QuantaBlu（Pierce）を、製造業者の使用説明書に従って使用した。全インキュベーション段階の間、マイクロタイタープレートのウェルをＰＢＳＴで３回および５回２次抗体との最終インキュベーション後に洗浄した。Tecan GENios Pro プレート読取装置で蛍光を測定した。
【０３８１】
２．ビオチニル化タンパク質での液中スクリーニング
下記ＥＬＩＳＡ方法を、ビオチニル化補体タンパク質の使用による液中パニング後HuCAL GOLD（登録商標）Ｆａｂのスクリーニングに使用した。
【０３８２】
NeutrAvidin プレートを、４℃でｏ／ｎ、ＰＢＳ中で希釈した１×Chemiblocker（Chemicon）により遮断した。これらのプレートを用いて、ヒトＣ５およびカウンター標的Ｃ３およびＣ４への結合についてスクリーニングした。平行して、Maxisorp３８４ウェルプレート（Nunc、ロチェスター、ニューヨーク、米国）を、１ウェル当たり、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）中で希釈した、Ｆｄフラグメント特異的な５μｇ／ｍｌのヒツジ抗ヒトＩｇＧ（The Binding Site、バーミンガム、英国）２０μｌでコートした。これらのプレートを用いて、Ｆａｂ発現レベルおよび非特異的ビオチン結合についてチェックした。翌日、コートした Maxisorp プレートを、ＰＢＳＴで２回洗浄し、ＲＴで１〜２時間ＴＢＳ中３％のＢＳＡにより遮断した。Ｆａｂまたは精製 HuCAL GOLD（登録商標）Ｆａｂを含むペリプラズムＢＥＬ抽出物を加えることにより、NeutrAvidin および Maxisorp の両プレートを遮断した。
【０３８３】
それに続いて、１ウェル当たり２０μｌのビオチニル化ヒトＣ５（特異的結合を検出するため）および平行してビオチニル化ヒトＣ３およびＣ４（望ましくない結合を検出するため）を、NeutrAvidin プレートのウェルに加えた。ビオチニル化抗原をＲＴで１〜２時間、HuCAL GOLD（登録商標）Ｆａｂとインキュベーションした。次いで、ビオチニル化非関連抗原トランスフェリンを Maxisorp プレートに加えて、ビオチン結合Ｆａｂについてチェックした（この場合、HuCAL GOLD（登録商標）Ｆａｂフラグメントを予め抗Ｆｄ抗体により捕捉させておいた）。
【０３８４】
２次抗体を検出に適用した後、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲートストレプトアビジン−ＡＰ AffiniPure Ｆ（ａｂ'）２フラグメント（ヤギ抗ヒト）を、Maxisorp 発現プレートに加えた。抗ＨＩＳ６ペルオキシダーゼコンジュゲートマウス抗体（Roche）を、NeutrAvidin プレートに加え、ストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ、ＺＹＭＥＤを、ビオチニル化トランスフェリンと共に Maxisorp プレートに加えた。
【０３８５】
ＡＰ−コンジュゲートの検出用として蛍光性基質 AttoPhos（Roche Diagnostics、マンハイム、ドイツ国）およびＰＯＤ−コンジュゲートの検出用として蛍光性基質 QuantaBlu（Pierce）を製造業者の使用説明書に従って使用した。Tecan GENios Pro プレート読取装置で蛍光を測定した。
【０３８６】
この方法を用いることにより、溶解状態のヒトＣ５を認識する抗ヒトＣ５Ｆａｂについてのスクリーニングおよび標的抗原のビオチン部分に結合する抗体の排除が可能となった。
【０３８７】
３．カニクイザルＣ５への交差反応性の測定
ポリクローナルＣ５結合性抗体（US Biological カタログ番号C7850-24）を用いて、カニクイザル血清からカニクイザルＣ５を捕捉した。
【０３８８】
３８４ウェルの Maxisorp プレートを、ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌのポリクローナルＣ５結合抗体２０μｌ／ウェルによりコートし、４℃でｏ／ｎインキュベーションした。翌日、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ＲＴで２時間、１００μｌ／ウェルの希釈剤（４％ＢＳＡ／０.１％Tween20／０.１％Triton-X 100／ＰＢＳ）で遮断した。カニクイザル血清を、希釈液（４％ＢＳＡ／０.１％Tween20／０.１％Triton-X100／ＰＢＳ）で１：２０に希釈し（〜カニクイザルＣ５のおよその濃度４μｇ／ｍｌ）、２０μｌ／ウェルを、２×ＰＢＳＴで洗浄した Maxisorp プレートに加えた。ＲＴで１時間インキュベーション後、プレートを３×ＰＢＳＴで洗浄し、Ｆａｂフラグメントまたは精製Ｆａｂを含むＢＥＬ溶菌液を加え、ＲＴで１時間インキュベーションした。プレートを再び洗浄し、検出抗体抗ＨＩＳ６−ＰＯＤ（Roche #1965085）を加えた。ＰＯＤ基質、可溶性のＢＭブルー（Roche Applied Science）を加え、１ＭのＨ２ＳＯ４で反応を停止させた。BMG Reader 装置を用いて、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。
【実施例４】
【０３８９】
実施例４：親和性成熟
１．選択されたＣ５結合性Ｆａｂの親和性成熟ライブラリーの構築
選択された抗体フラグメントの親和性および生物活性を高めるため、Ｌ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ２領域を、トリヌクレオチド指定突然変異誘発を用いるカセット突然変異導入により平行して最適化し（例、Virnekas et al., Nucleic Acids Res. 22:5600-5607 (1994)参照）、フレームワーク領域の方は定常に保った。親和性成熟のためのクローニング前、全親Ｆａｂフラグメントを、ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩにより対応する発現ベクター（pMORPH（登録商標）x9_MH）から CysDisplayTM ベクター pMORPH（登録商標）２５へ移入した。pMORPH（登録商標）２５を、Ｈ−ＣＤＲ２最適化のためのライブラリークローニングを妨害する１個のＢｓｓＨII部位の除去により、HuCAL GOLD（登録商標）ディスプレイベクター pMORPH（登録商標）２３から作製した。親ＦａｂのＬ−ＣＤＲ３を最適化するため、Ｌ−ＣＤＲ３、フレームワーク４および結合剤の軽鎖（４０５ｂｐ）の定常領域を、ＢｐｉＩ／ＳｐｈＩにより除去し、フレームワーク４および定常ドメインと一緒に多様化Ｌ−ＣＤＲ３のレパートリーにより置き換えた。
【０３９０】
１０個の親Ｃ５結合性Ｆａｂを、異なる選択基準に従って７プールに分け、同じフレームワークをもつＦａｂのみ寄せ集めた：（１）ＭＯＲ０７０８６; （２）ＭＯＲ０６５２５＋６７５６(同じフレームワーク);（３）ＭＯＲ０６７５７;（４）ＭＯＲ０６７６３;（５）ＭＯＲ０７０８７;（６）ＭＯＲ０７０９１＋７０９２（同じフレームワーク）;（７）ＭＯＲ０７０９３＋７０９４（同じフレームワーク）。
【０３９１】
約１.５μｇの単一ＦａｂベクターフラグメントおよびＦａｂプールを、多様化Ｌ−ＣＤＲ３をもつ３〜５倍モル過剰の挿入フラグメントとライゲーションした。第２のライブラリーでは、Ｈ−ＣＤＲ２（ＸｈｏＩ／ＢｓｓＨII）を多様化し、連結しているフレームワーク領域については定常に保った。クローニング効率をモニターするため、親Ｈ−ＣＤＲ２をダミーにより置き換えた後、多様化Ｈ−ＣＤＲ２カセットをそこにクローン化した。
【０３９２】
異なるライブラリーのライゲーション混合物を、エシェリキア・コリ（E.coli）ＴＯＰ１０Ｆ'細胞（Invitrogen）へ電気穿孔することにより、２×１０７〜２×１０８の独立コロニーを得た。ライブラリーを増幅した。品質管理のため、１ライブラリー当たり幾つかの単クローンを、無作為に採取し、プライマーＣＦＲ８４（ＶＬ）およびＯＣＡＬ＿Ｓｅｑ＿Ｈｐ（ＶＨ）を用いて配列決定した。
上記と同様、７個の突然変異サブプールを作製し、後続の選択工程中は別々に保った。
【０３９３】
標準クローニング手順およびエレクトロコンピテントなエシェリキア・コリ（E.coli）ＴＯＰ１０Ｆ'細胞（Invitrogen）への多様化クローンの形質転換により、１４の異なる親和性成熟ライブラリー（各リードまたはプールについて１つのＬＣＤＲ３および１つのＨＣＤＲ３ライブラリー）を作製した。ライブラリーサイズは良好であり、２×１０７〜５×１０８の範囲であった。無作為に採取したクローンの配列決定は、１００％の多様性を示した。親結合剤ではなく、全ての各親インプット結合剤の誘導体が見出された。最後に、１４の全ライブラリーのファージを別々に調製した。
表２．成熟ライブラリーの概観
【０３９４】
【表２】
0005815403.tif 000094
【０３９５】
２．親和性成熟用抗体−ファージの調製
HuCAL（登録商標）成熟ライブラリーを、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび１％グルコース含有の２×ＹＴ培地（２×ＹＴ−ＣＧ）中で増幅した。０.５のＯＤ６００ｎｍでのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージによる感染後（振とうせずに３７℃で３０分、２５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で３０分）、細胞をスピンダウン（４１２０×ｇ、５分、４℃）し、２×ＹＴ／３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール／５０μｇ／ｍｌカナマイシン／０.２５ｍＭのＩＰＴＧに再懸濁し、２２℃でｏ／ｎ成長させた。ファージを２回上清からＰＥＧ沈殿させ、ＰＢＳに再懸濁し、下記の成熟パニングに使用した。
【０３９６】
３．ビオチニル化Ｃ５タンパク質に対する標準液中成熟パニング
上記要領で、作製された親和性成熟ライブラリーからレスキューされた約１０１２個のファージを、非常にストリンジェントな条件下で実施されるパニングにかけることにより、親和性改良Ｃ５特異的Ｆａｂを選択した。
【０３９７】
ビオチニル化ヒトＣ５または交互のビオチニル化ヒトおよびカニクイザルＣ５タンパク質を用いて、それぞれのファージプールを用いる液中パニングを実施した。パニングストリンジェンシーを高め、改善された解離速度（off-rate）について選択するため、抗原濃度を減らし、延長された洗浄期間を適用した（洗浄条件を表３に列挙する）。
【０３９８】
【表３】
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【０３９９】
予め遮断されたファージ（ＲＴで１時間インキュベーションした２× Chemiblocker との１：２混合物）を、ＲＴで１〜２時間、低濃度のビオチニル化ヒトＣ５タンパク質とインキュベーションした。パニング戦略は、上記標準液中パニングと同様である。ファージ抗原複合体を、ＲＴで３０分間、予め遮断したストレプトアビジン磁気ビーズにＣ５のビオチン部分を介して捕捉させた。次いで、ビーズを通常のパニングと比べて高いストリンジェンシーで洗浄した。ファージの溶離および増幅を上記と同様にして実施した。
【０４００】
１回目と同一の方法ではあるが、高いストリンジェンシー洗浄条件および低い抗原濃度で２回目および３回目の選択を実施した。各抗体リードまたはプールについて、幾つかの異なるパニングを実施した。各パニング戦略については、異なるストリンジェンシー条件を適用した。パニング戦略を表４に要約する。
【０４０１】
【表４】
0005815403.tif 000096
【０４０２】
成熟パニング後、濃化ファージミドプールを、pMORPH（登録商標）×９＿ＭＨ発現ベクターへサブクローニングした。
【０４０３】
４．最適化ＶＬ（Ｌ−ＣＤＲ３）と最適化ＶＨ（Ｈ−ＣＤＲ２）の交差組み合わせ
親和性および効力をさらに改善するため、同じ親クローンに由来する、成熟抗体から独立して最適化された重および軽鎖を組み合わせた（例、Rauchenberger et al., J. Biol. Chem. 278:38194-38205 (2003); Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999); および Schier et al., J. Mol. Biol. 263:551-567 (1996)参照）。交差クローニングと呼ばれるこの手順を、同じ親クローンに由来する結合剤に適用した。
【０４０４】
５．親和性スクリーニングおよび成熟パニングの結果
全パニングから誘導された合計２６４０のクローンを、ヒトＣ５に対する改善された親和性について細菌溶菌液としてスクリーニングした。予備的親和性を、液中平衡滴定（ＳＥＴ）により評価した。評価された親和性に基づいて、各親ＦａｂまたはＦａｂプールから誘導されたクローンを配列決定した。表５は、各パニング条件に関する配列決定されたクローンの数および得られた特有配列の数を示す。
表５．配列分析用に選択された親和性改良クローンの概観
【０４０５】
【表５】
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【０４０６】
６．タンパク質製造用の親和性最適化Ｆａｂの配列分析および選択
１０個の全親Ｆａｂの誘導体を回収することにより、非常に良好な多様性を維持した。１８８のＨＣＤＲ２改良クローンについての重鎖（ＶＨ）および１５０の改良ＬＣＤＲ３クローンについての軽鎖（ＶＬ）可変領域のヌクレオチド配列を決定した。８７の特有ＨＣＤＲ２および５２の特有ＬＣＤＲ３配列を、成熟ＣＤＲ内における詳細な配列多様性解析用に選択した。ＣＤＲに可能なグリコシル化部位を含むＦａｂについては、さらなる特性検定から除外した。
【０４０７】
ＶＨおよびＶＬ配列解析および親和性データは、１０個の全親Ｆａｂから親和性の改善された後継クローンが得られることを示していた。親Ｆａｂ ＭＯＲ０６５２５、ＭＯＲ０６７５７、ＭＯＲ０６７６３、ＭＯＲ０７０８７およびＭＯＲ０７０９４からは、ＨＣＤＲ２改良クローンのみが得られ、親Ｆａｂ ＭＯＲ０６７５６およびＭＯＲ０７０９３からは、ＬＣＤＲ３改良クローンのみが得られた。ＭＯＲ０７０８６、ＭＯＲ０７０９１およびＭＯＲ０７０９２は、ＶＨおよびＶＬの両方についての成熟クローンを有していた。この後者は、ＶＨおよびＶＬ成熟鎖の交差クローニングを可能にする。全データから、成熟ＣＤＲにおいて最良の親和性および最高の多様性をもつ６０のクローンが、Ｆａｂ発現用に選択された。選択されたＶＨおよびＶＬアミノ酸並びにヌクレオチド配列は、表１に列挙されている。
【実施例５】
【０４０８】
実施例５：ＩｇＧ変換
１．ヒトＩｇＧ２形式への変換
完全長免疫グロブリン（Ｉｇ）を発現させるため、重（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインフラグメントを、pMORPH（登録商標）ｘ９_ＭＨ Ｆａｂ発現ベクターからヒトＩｇＧ２用の pMORPH（登録商標）２_ｈ_Ｉｇベクターシリーズへサブクローニングした。pMORPH（登録商標）2_h_ＩｇＧ２へのＶＨドメインフラグメントのサブクローニングには、制限酵素ＭｆｅＩおよびＢｌｐＩを使用した。pMORPH（登録商標）2_h_IgκへのＶＬドメインフラグメントのサブクローニングには、ＥｃｏＲＶおよびＢｓｉＷＩ部位を使用し、pMORPH（登録商標）2_h_Ｉｇλ２へのサブクローニングには、ＥｃｏＲＶおよびＨｐａＩ部位を用いた。
【０４０９】
１０個の全親Ｆａｂ（ＭＯＲ０６５２５、６７５６、６７５７、６７６３、７０８６、７０８７、ＭＯＲ０７０９１、７０９２、７０９３および７０９４）が、ヒトＩｇＧ２に変換しされ。またＩｇＧも発現された。
【０４１０】
２．ヒトＩｇＧ１ＡＡ形式への変換
完全長免疫グロブリンを発現させるため、Ｆａｂ重（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインフラグメントを、Ｆａｂ発現ベクターからＩｇＧ１発現ベクターへサブクローニングした。制限酵素ＭｆｅＩおよびＢｌｐＩを用いることにより、pMORPH（登録商標）2_h_ＩｇＧ１ＡＡへＶＨドメインフラグメントをサブクローニングし、その際２３４および２３５位のロイシンをアラニンに突然変異させることにより、ＦｃＲγ結合を排除し、エフェクター機能を弱めた。制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＨｐａＩを用いて、ＶＬドメインフラグメントを pMORPH（登録商標）2_h_Ｉｇλ２へサブクローニングした。
【０４１１】
所望のプロフィールをもつ以下の成熟ＦａｂをヒトＩｇＧ１ＡＡ形式へサブクローニングした：ＭＯＲ０７８３２、７８３４、７８７２、７８７６、７８２９、７８７１、７８６５、７８７３、７８３０、７８７８、７９１０。軽および重鎖構築物の組み合わせで細胞をトランスフェクションすることにより、ＩｇＧレベルでの交差クローニングを達成した。例えば、ＭＯＲ０８１１４は、ＭＯＲ０７８２９からの生殖系列化重鎖およびＭＯＲ０７８７１からの生殖系列化軽鎖の生成物であった。表６は、最も関連性のある交差クローン化生殖系列化ＩｇＧを要約している。
表６．最も関連性のある交差クローン化生殖系列化ＩｇＧの概観
【０４１２】
【表６】
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【０４１３】
３．ヒトＩｇＧの一時的発現および精製
真核生物ＨＫＢ１１およびＨＥＫ２９３細胞を、当モル比のＩｇＧ重および軽鎖発現ベクターＤＮＡによりトランスフェクションした。トランスフェクションの３または７日後に細胞培養上清を採取し、標準プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（rProteinA FF または MabSelect SURE, GE Healthcare）にかけた。特に指定されなかったため、１×ダルベッコのＰＢＳ（ｐＨ７.２、Invitrogen）への緩衝液交換を実施し、試料を滅菌濾過（０.２μｍ）した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中変性還元的および非還元的条件下、または Agilent BioAnalyzer の使用により、天然状態ではＨＰ−ＳＥＣによりＩｇＧの純度を分析した。
【実施例６】
【０４１４】
実施例６：生殖系列化
QuickChange（登録商標）位置指定突然変異導入キット（Stratagene）を用いる位置指定突然変異導入法により、ＩｇＧ構築物を生殖系列化した。ＭＯＲ０８１１１ Ｖλ２のＮ−末端ＤＩをＥＳに変えることにより、ヒト生殖系列配列とマッチさせ、末端Ｑ（Ｎ−末端Ｑはピログルタミンを形成し得る）を回避した。ＭＯＲ０８１１０ Ｖλ３、ＭＯＲ０８１１３ Ｖλ３およびＭＯＲ０８１１４ Ｖλ３のＮ−末端ＤＩを、ヒトλ遺伝子で最もよく見出される配列、ＳＹに生殖系列化した。ＭＯＲ０８１１１ ＶＨ２のＮ−末端ＱＶＱを、ＥＶＴに生殖系列化することにより、λ２遺伝子とマッチさせ、末端Ｑを回避した。ＭＯＲ０８１０９ ＶＨ５、ＭＯＲ０８１１０ ＶＨ５、ＭＯＲ０８１１３ ＶＨ５およびＭＯＲ０８１１４ ＶＨ５におけるＮ−末端ＱについてもＥに突然変異させた。
【０４１５】
ＭＯＲ０８１０９ Ｖλ３に関するフレームワーク配列を合成することにより、ヒトλ３ｉ遺伝子とマッチさせ、ＮｈｅＩおよびＨｐａＩ制限部位を用いて発現ベクターへクローン化した。抗体可変ドメインとそれらの最も関連性の密な各ヒト生殖系列配列との配列アラインメントを図１に示す。
【実施例７】
【０４１６】
実施例７：親和性測定
１．表面プラズモン共鳴（Biacore）を用いる抗ヒトＣ５抗体のＫon／Ｋoff およびＫＤ測定
Biacore チップへのＦａｂの固定化に使用される抗Ｆａｂ抗体が、ヒトＣ５に関する各Ｆａｂの結合親和性に異なる形で影響することにより、Ｆａｂ間の比較を困難にしていることが測定された。Biacore 分析をＩｇＧ抗体に対して実施した。
【０４１７】
標準ＥＤＣ−ＮＨＳアミンカップリング化学を用いて、ＣＭ４チップを、１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４.５）中５０μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＦｃ抗体（５００〜２０００ＲＵ）でコートした。各抗ヒトＣ５ＩｇＧを、２０ＲＵ前後のリガンド密度に至るまでの接触時間一定の流速１０μｌ／分でＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中のチップに捕捉させた。抗ヒトＣ５ＩｇＧを捕捉後、０.１５６ｎＭ〜２.５ｎＭの範囲で異なる濃度のヒトまたはカニクイザルＣ５を注射した。各サイクルを、リン酸での２回の再生段階により完了させた。全流動条件を１×ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中２５℃で実施した。生じるシグナルを、リファレンスフロ−セルおよび被検体の無い結合段階から屈折率値を控除する、ダブルリファレンスにより調節した。データを１０Ｈｚで集め、Biacore T100 Evaluation ソフトウェアバージョン１.１（ＧＥ）を用いて解析した。このプログラムは、各相互作用に関する速度および親和定数測定用のグローバルフィッティング解析方法を使用する。
【０４１８】
抗体の特異性を測定した。好ましくは、ヒトおよびカニクイザルＣ５への結合に関するＫonおよびＫoff値は次のとおりである：Ｋon ＞１ｘ１０５、Ｋoff ＜１ｘ１０-４。これらの測定を、生殖系列化ＩｇＧについて Biacore で実施し、得られたデータを表７に列挙する。
表７．Biacore で測定された生殖系列化ＩｇＧのＫＤ、ＫｏｎおよびＫｏｆｆ値
【０４１９】
【表７】
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【０４２０】
２．精製ＦａｂまたはＦａｂ細菌溶菌液（Meso Scale Discovery（MSD））に関する液中平衡滴定（ＳＥＴ）を用いたピコモル親和性の測定
液中平衡滴定（ＳＥＴ）によりＫＤを測定するため、Ｆａｂタンパク質のモノマーフラクション（少なくとも９０％のモノマー含有率、分析用ＳＥＣにより分析、Superdex75, Amersham Pharmacia）を使用した。液中での親和性測定を、基本的には文献に記載された要領で実施した（Friguet et al., J. Immunol Methods 77:305-319 (1985)）。ＳＥＴ方法の感度および精度を改良するため、古典的ＥＬＩＳＡからＥＣＬに基づく技術に移行した（Haenel et al., Anal Biochem 339:182-184 (2005）。
【０４２１】
１ｍｇ／ｍｌのヤギ抗ヒト（Ｆａｂ）２フラグメント特異抗体（Dianova）を、製造業者の使用説明書に従ってECL Sulfo−TAGTM NHS-Ester（Meso Scale Discovery、ガイザーズバーグ、メリーランド、米国）で標識した。ポリプロピレンマイクロタイタープレートにおいて検定緩衝液として０.５％ＢＳＡおよび０.０２％Tween 20 含有ＰＢＳ（ｐＨ７.４）を用いて実験を実施した。非標識抗原を２ｎ系列で、ＫＤより少なくとも１０倍高濃度から出発して希釈した。抗原不含有ウェルを用いることにより、Ｂmax値を決定した。抗原もＦａｂも含まないウェルを用いることにより、バックグラウンドを測定した。例えば１０ｐＭのＦａｂ（６０μｌ最終量中の最終濃度）を加えた後、混合物をＲＴで一晩インキュベーションした。適用されたＦａｂ濃度は、予測ＫＤと近似またはそれ未満であった。
【０４２２】
ストレプトアビジンＭＳＤプレートを、０.２μｇ／ｍｌのビオチニル化ヒトＣ５（３０μｌ／ウェル）でコートし、ＰＢＳ中５％のＢＳＡで遮断した。それに続いて、平衡させた試料をそれらのプレートに移し入れ（１ウェル当たり３０μｌ）、２０分間インキュベーションした。洗浄後、３０μｌ／ウェルの ECL Sulfo−タグ標識検出抗体（ヤギ抗ヒト（Ｆａｂ）２）を、１：１５００の最終希釈率で、ＭＳＤプレートに加え、エッペンドルフ振とう器（７００ｒｐｍ）で３０分間インキュベーションした。
【０４２３】
洗浄し、３０μｌ／ウェルの MSD Read Buffer T を界面活性剤と共に添加した後、Sector Imager 6000（Meso Scale Discovery、ガイザーズバーグ、メリーランド、米国）を用いることにより、電気化学発光シグナルが検出された。
【０４２４】
カスタマイズされたフィッティングモデルを適用する XLfit（IDBS）ソフトウェアでデータを評価した。データ評価、すなわちＦａｂ分子のＫＤ測定を行うため、以下のフィットモデルを使用した（モデル：Abraham et al16, et al., 200515、準拠して改変）：y=Bmax-(Bmax/(2*cFab)*(x +cFab+KD-sqrt((x+cFab+ KD)*(x+cFab+ KD)-4*x*cFab)))；ｃＦａｂ：適用されたＦａｂ濃度；ｘ：適用された総可溶性抗原濃度（結合部位）；ｓｑｒｔ：平方根。上記検定条件を用いることにより、親和性最適化Ｃ５結合性Ｆａｂについての（モノマー）親和性を液中で測定した。
【０４２５】
親Ｆａｂ
Ｃ５結合性抗体をさらに特性確認するために、ヒトＣ５に対する親Ｆａｂの親和性を測定した。特性確認の焦点は溶血検定法における効力であったため、最も関連性の高いＦａｂについてのみ親和性測定を行った。１価親和性の信頼できる測定を達成するため、Ｆａｂバッチのみを測定に使用したところ、定性的サイズ排除クロマトグラフィーにおいて≧９０％のモノマーフラクションを示した。
【０４２６】
親和性成熟過程にはいった１０個の親Ｆａｂの親和性を表８に要約する。親和性は、７２ｐＭ〜３.７ｎＭの範囲であった。
表８．ＳＥＴで測定された１０個の親Ｆａｂの親和性
【０４２７】
【表８】
0005815403.tif 000100
【０４２８】
成熟Ｆａｂ
ヒトＣ５に対する精製Ｆａｂの１価親和性をＳＥＴで測定した。親和性は、低ｐＭ範囲であり、最良の親和性は、ＭＯＲ０７０８６、７０９１、７０９２および７０９３の誘導体について得られた。それに続いて、カニクイザルＣ５に対するこれらの誘導体の親和性を測定した結果は、中〜低ｐＭ範囲での親和性を示していた。
【０４２９】
親和性成熟過程は非常に有効であったため、親和性が著しく改良された結合剤のレパートリーをもたらした。表９は、最も改良された結合剤のヒトおよびカニクイザルＣ５への親和性を要約している。ある種のＦａｂは、≦３０ｐＭのヒトＣ５に対するＫＤおよび≦１５０ｐＭのカニクイザルＣ５に対するＫＤを有する。
表９．最も親和性が改良されたＦａｂについてのヒトおよびカニクイザルＣ５に対する親和性の概観
【０４３０】
【表９】
0005815403.tif 000101
【０４３１】
３．液中平衡滴定（ＳＥＴ）を用いたＩｇＧ分子のＫＤ測定
ヒトおよびカニクイザルＣ５に対する生殖系列ＩｇＧ（ヒトＩｇＧ１ＡＡ形式）の親和性を、下記要領によりＳＥＴで測定した。独立した測定間における類似したデータセットは、リファレンスＩｇＧ５Ｇ１.１よりもヒトＣ５に対するリードＩｇＧの高い親和性を示していた（米国特許第6,355,245号参照）。最終ＩｇＧは、１〜１４ｐＭの範囲のヒトＣ５に対する親和性および３〜２９ｐＭの範囲のカニクイザルＣ５に対する親和性を有していた。
表１０．ＳＥＴにおける最終リードＩｇＧ（ヒトＩｇＧ１ＡＡ形式）に関するＫＤ値測定
【０４３２】
【表１０】
0005815403.tif 000102
【０４３３】
液中平衡滴定（ＳＥＴ）によりＫＤを測定するため、ＩｇＧタンパク質のモノマーフラクションを使用した（少なくとも９０％のモノマー含有率。分析用ＳＥＣ ＭＡＬＳにより分析；Tosoh TSKgel G3000SWXL, Wyatt Treos miniDAWN）。液中での親和性測定を基本的には文献に記載の要領で実施した（Friguet et al., J. Immunol Methods 77:305-319 (1985)）。ＳＥＴ方法の感度および精度を改良するため、古典的ＥＬＩＳＡからＥＣＬに基づく技術に移行した（Haenel et al., Anal Biochem 339:182-184 (2005）。
【０４３４】
１ｍｇ／ｍｌのヤギ抗ヒト（Ｆａｂ）２フラグメント特異抗体（Dianova）を、製造業者の使用説明書に従ってECL Sulfo−TAGTM NHS-Ester（Meso Scale Discovery、ガイザーズバーグ、メリーランド、米国）で標識した。ポリプロピレンマイクロタイタープレートにおいて検定緩衝液として０.５％ＢＳＡおよび０.０２％Tween 20 含有ＰＢＳ（ｐＨ７.４）を用いて実験を実施した。非標識抗原を２ｎまたは１.７５ｎ系列で、ＫＤより少なくとも１０倍高濃度から出発してそれぞれ希釈した。抗原不含有ウェルを用いることにより、Ｂmax値を決定した。抗原もＩｇＧも含まないウェルを用いることにより、バックグラウンドを測定した。例えば１０ｐＭのＩｇＧ（６０μｌ最終量中の最終濃度）を加えた後、混合物をＲＴで一晩インキュベーションした。適用されたＩｇＧ濃度は、予測ＫＤと近似またはそれ未満であった。
【０４３５】
ストレプトアビジンＭＳＤプレートを、０.２μｇ／ｍｌのビオチニル化ヒトＣ５（３０μｌ／ウェル）でコートし、ＰＢＳ中５％のＢＳＡで遮断した。それに続いて、平衡させた試料をそれらのプレートに移し入れ（１ウェル当たり３０μｌ）、２０分間インキュベーションした。洗浄後、３０μｌ／ウェルの ECL Sulfo−タグ標識検出抗体（ヤギ抗ヒト（Ｆａｂ）２）を、１：１５００の最終希釈率で、ＭＳＤプレートに加え、エッペンドルフ振とう器（７００ｒｐｍ）で３０分間インキュベーションした。
【０４３６】
洗浄し、３０μｌ／ウェルの MSD Read Buffer T を界面活性剤と共に添加した後、Sector Imager 6000（Meso Scale Discovery、ガイザーズバーグ、メリーランド、米国）を用いることにより、電気化学発光シグナルが検出された。
【０４３７】
カスタマイズされたフィッティングモデルを適用する XLfit（IDBS）ソフトウェアでデータを評価した。データ評価、すなわちＩｇＧ分子のＫＤ測定を行うため、ＩｇＧについての以下のフィットモデルを使用した（Piehler et al., 199717 に従って改変）：y=Bmax/(cIgG/2)*(cIgG/2-((x+cIgG+KD)/2-((x+cIgG+KD)^2/4-x*cIgG^0.5)^2/(2*IgG)); cIgG ＝適用されたＩｇＧ濃度、完全分子（結合部位無し）；ｘ＝適用された総可溶性抗原濃度（結合部位）；ｓｑｒｔ：平方根。
【実施例８】
【０４３８】
実施例８：溶血検定法による特性確認
溶血検定法は、補体活性化について試験する基本的な機能性検定法であり、補体経路による赤血球（ＲＢＣ）の溶解を遮断する抗ヒトＣ５ｍＡｂおよびＦａｂ分子の能力を評価するのに使用されてきた（例、Evans et al., Mol. Immunol 32: 1183-1195 (1995); Thomas et al., Mol Immunol 33:1389-1401 (1996); Rinder et al., J Clin Invest 96:1564-1572 (1995)参照）。簡単に述べると、古典的経路検定法の場合、感作赤血球を、血清中に存在する補体タンパク質による溶解についての標的として使用する。この検定法は、高親和性抗ヒトＣ５ ｍＡｂの特性確認およびスクリーニングにとって興味深いものである。
【０４３９】
１．古典的経路
所望の数のニワトリ赤血球を、冷ゼラチンベロナール緩衝液（ＧＶＢ＋＋）で４回洗浄し、５×１０７細胞／ｍｌに再懸濁した。細胞を感作するため、ウサギ抗ｃｈＲＢＣ ＩｇＧをＲＢＣ細胞懸濁液に加え、１μｇ／ｍｌＩｇＧの最終濃度とした。氷上で１５分インキュベーションした後、感作ｃｈＲＢＣを遠心分離にかけ、ＧＶＢ＋＋で２回洗浄し、８.３３×１０７細胞／ｍｌに希釈した。
【０４４０】
丸底９６ウェルプレートを溶血検定法に使用した。抗体をＧＶＢ＋＋緩衝液で希釈し、ウェルに加えた（Ｃ５結合性Ａｂの必要濃度を計算するとき、血清を加えると、試料は２倍希釈となることを考慮に入れた）。５０μｌの４０％ヒト血清（ＧＶＢ＋＋で希釈）を、５０μｌの抗体希釈液に加えることにより、最終血清検定濃度は２０％となった。
【０４４１】
対照およびブランクウェルを次に記載の要領で調製した：対照ウェル：ｉ）０％溶解対照→１００μｌのＧＶＢ＋＋、ii）１００％溶解対照→１００μｌの０.１％ＮＰ−４０、iii）２０％血清対照→１００μｌの２０％血清（０％Ａｂ対照）。ブランクウェル：ｉ）２０％血清ブランク→１００μｌの２０％血清、ii）ＧＶＢ＋＋ブランク→１００μｌのＧＶＢ＋＋、iii）ＮＰ−４０ブランク→１００μｌの０.１％ＮＰ−４０。
【０４４２】
２.５×１０６（３０μｌ）の感作ｃｈＲＢＣ／ウェルを、全ての試料および対照ウェルに加えた。ブランクウェルには、細胞の代わりにＰＢＳを加えた。検定プレートを、３７℃で３０分間インキュベーションし、遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分）し、８５μｌの上清を、新しい平底９６ウェルプレートに移し入れた。新しいプレートを遠心分離（２０００ｒｐｍ、３分）にかけて、泡沫を除去した。４１５ｎｍで吸光度を読み取ることにより、ヘモグロビン放出を測定した。下記の計算アルゴリズムを用いることにより、対照およびブランクウェルに関して溶血のパーセンテージを計算した：
溶血％＝１００×（ＯＤ試料−ＯＤ陰性対照）／（ＯＤ陽性対照−ＯＤ陰性対照）
（式中、
ＯＤ試料＝［平均ＯＤ試料］−［平均ＯＤ２０％血清ブランク］
ＯＤ陰性対照＝［平均ＯＤ溶血０％］−［平均ＯＤＧＶＢ＋ブランク］
ＯＤ陽性対照＝［平均ＯＤ溶血１００％］−［平均ＯＤＮＰ−４０ブランク］）
【０４４３】
この手順を用いることにより、赤血球溶解を阻害し得る抗ヒトＣ５抗体が同定され得た。カニクイザルＣ５との交差反応性についてスクリーニングするため、５％カニクイザル血清を用いて古典的経路を実施した。
【０４４４】
２．副経路
古典的経路溶血検定法と同様にして、副経路を再現する溶血検定法を実施した。副経路では、ウサギからのＰＢＣ細胞を使用し、細胞を感作する必要は無かった。ウサギＲＢＣは、補体副経路により誘発される溶解に感受性がある点でニワトリＲＢＣとは異なる。
【０４４５】
副経路のＣ５変換酵素は、Ｍｇ＋＋依存的であり、古典的経路のＣ５変換酵素はＣａ＋＋依存的であるため、使用緩衝液は、１０ｍＭのＥＧＴＡおよび５ｍＭのＭｇ＋＋を補ったＧＶＢ＋＋であった。
【０４４６】
副経路の溶血検定法を、ｉ）２０％ヒト血清、ii）２０％ヒトＣ５枯渇血清に加えた１００ｐＭヒトＣ５、iii）２０％ヒトＣ５枯渇血清に加えた０.０２５％カニクイザル血清、iv）２０％ヒトＣ５枯渇血清に加えた１００ｐＭカニクイザルＣ５、ｖ）１０％カニクイザル血清により実施した。これらの設定を使用することにより、補体副経路により誘導される赤血球溶解を非常に効果的に阻害し得るヒトおよびカニクイザルＣ５タンパク質に対し高い親和性を有する抗体についてスクリーニングした。
【０４４７】
３．親Ｆａｂによる溶血検定法
溶血検定法を基本的生物機能性検定法として用いることにより、抗ヒトＣ５ｍＡｂが赤血球の補体介在溶解を遮断する能力を評価した。Ｃ５変換酵素は、Ｃ５をＣ５ａペプチドおよびＣ５ｂフラグメントに開裂するもので、それに続いて、細胞溶解をまねく膜侵襲複合体（ＭＡＣ）へ組み込まれる。Ｃ３ｂＣ４ｂＣ２ａ複合体により形成される古典的経路のＣ５変換酵素は、Ｃ３ｂＣ３ｂＢｂ複合体により形成される副経路のＣ５変換酵素とは異なる構造を有する。HuCAL GOLD（登録商標）作製抗体は、当然古典的経路および副経路の両方において阻害性を示すが、主として副経路（Ｈ因子、Ｂ因子およびＨ因子関連遺伝子）の方がＡＭＤに関与しているため副経路に焦点を合わせている。
【０４４８】
古典的および副経路検定法を２０％ヒト血清（〜８０ｎｍのＣ５）により実施した。副経路検定法の感度を高めるため、新しい検定方式が開発された。１０〜１００ｐＭの精製ヒトＣ５または０.０２５％のカニクイザル血清（〜１００ｐＭカニクイザルＣ５）を、ヒトＣ５枯渇血清（ただし、全ての他の血清および補体構成成分を含む）に加えた。
【０４４９】
図２は、かなりの溶血現象が、ヒトＣ５枯渇血清に加えられた１０〜１００ｐＭのヒトＣ５について観察され得たことを示す。カニクイザル血清をヒトＣ５枯渇血清に加えることにより、交差反応性を試験した。図３は、ヒトＣ５枯渇血清に加えられた０.０２５％のカニクイザル血清（〜１００ｐＭのＣ５）について、溶血活性を回復していることを示す。
【０４５０】
古典的経路
初回Ｆａｂ選択を古典的経路で行った（２０％ヒト血清）。６１の精製親Ｆａｂの約半分は、古典的経路の弱〜強阻害剤であった。最高の阻害性ＦａｂのＩＣ５０は、３５〜９００ｎＭであった。
【０４５１】
検定を行ったところ、合致する結果（図４に示されている）が示された。溶血％を対照およびブランクウェルについて計算した。細胞溶解のＦａｂ阻害を、２０％ヒト血清により誘発される最大溶解（＝１００％）と比較した。関連性のないヒトＦａｂ（鶏卵白由来リゾチーム結合剤ＭＯＲ０３２０７）を、陰性対照として、抗ヒトＣ５ ＩｇＧモノクローナル抗体（Quidel）を陽性対照として使用した。図４は、最良の阻害性Ｆａｂによる例を示す。
【０４５２】
副経路
古典的経路で阻害活性を示すＦａｂを、副経路でさらに評価した。ヒトＣ５枯渇血清に加えた１００ｐＭの精製ヒトＣ５または０.０２５％のカニクイザル血清について、溶血検定法を実施した。ヒト副経路に関するＩＣ５０は、０.１〜９０ｎＭであった（最も関連性の高いＦａｂによる検定の例を図５に示す）。
【０４５３】
古典的経路の陽性対照（抗ヒトＣ５抗体、Quidel）は、副経路では阻害性を示さなかった。従って、抗補体因子Ｐ抗体（Quidel）を陽性対照として使用した。図５に示す通り、ＭＯＲ０７０８６は、最高の阻害活性を有し、ＮＶＳデータは、リファレンス抗体５Ｇ１.１の場合よりもすぐれた効力があることを明らかにした。
【０４５４】
カニクイザル交差反応性を試験するため、副経路の溶血検定法を、ヒトＣ５枯渇血清に加えた０.０２５％のカニクイザル血清により実施した。５Ｇ１.１はカニクイザルＣ５を認識しないため、５Ｇ１.１との比較は不可能であった。抗因子Ｐ抗体を陽性対照として使用した。検定結果は、最良の阻害性Ｆａｂについて０.１〜４００ｎＭのＩＣ５０値を示していた。また、ＭＯＲ０７０８６は、最高の効力を示した（図６に示す）。
【０４５５】
Ｆａｂの一貫した阻害活性は、古典的経路および副経路の両方で認められた。下表１１は、最も関連性の高い２２のＦａｂに関する溶血検定法の結果を要約している。異なる実験間の比較を信頼できるものにするため、２０％ヒト血清により誘発される溶解を１００％に正規化した。
表１１．最も関連性の高いＦａｂによる溶血検定法の要約
【０４５６】
【表１１】
0005815403.tif 000103
【０４５７】
４．成熟Ｆａｂによる溶血検定法
古典的経路
（１）２０％ヒト血清を用いる古典的経路
成熟Ｆａｂを、２０％ヒト血清により古典的経路で試験した。ＭＯＲ０７０８６、７０９１、７０９２および７０９３の誘導体は、非常に高い効力を示した（低ｎＭ範囲でのＩＣ５０値）。ＭＯＲ０７０９１、７０９２および７０９３の子孫は、強く改良された効力を示した。図７は、ＭＯＲ０７０８６、７０９１、７０９２および７０９３の誘導体による溶血検定法の例を示す。
【０４５８】
（２）５％カニクイザル血清を用いる古典的経路
また、５％カニクイザル血清の存在下で補体経路の検定法を実施することにより、交差反応性について試験した。ＭＯＲ０７０８６、７０９１、７０９２および７０９３の誘導体は、非常に有効に赤血球溶解を阻害し得た。陰性対照、ＭＯＲ０３２０７（抗リゾチームＦａｂ）は、補体経路に何ら影響を及ぼさなかった。これらの検定法の結果を図８に示す。
【０４５９】
副経路
（１）１００ｐＭのヒトＣ５を用いる副経路
成熟Ｆａｂを、１００ｐＭのヒトＣ５による副経路溶血検定法で試験した。ＭＯＲ０６５２５、６７５７、６７６３および７０８７の誘導体の中には、それらの親Ｆａｂと比べて効力の改善を示すものもあった。ＭＯＲ０７０８６−、７０９１−、７０９２−、７０９３−および７０９４−誘導Ｆａｂは、非常に高い効力を示した（低ｎＭ範囲でのＩＣ５０値）。ＭＯＲ０７０９１、７０９２、７０９３および７０９４の子孫は、非常に改善された効力を示し、その多くはリファレンス抗体５Ｇ１.１よりも強力である。図９は、親和性成熟Ｆａｂおよび５Ｇ１.１に関する溶血検定結果の例を示す。
【０４６０】
（２）２０％ヒト血清を用いる副経路
成熟Ｆａｂを、２０％ヒト血清による副経路溶血検定法で試験した。ＭＯＲ０７０８６−、７０９１−、７０９２−および７０９３−誘導Ｆａｂは、非常に高い阻害活性を示した。これらのＦａｂの多くは、５Ｇ１.１よりも高い阻害活性を有していた。図１０は、親和性成熟Ｆａｂおよびリファレンス抗体５Ｇ１.１に関する溶血検定結果の例を示す。
【０４６１】
（３）１００ｐＭのカニクイザルＣ５を用いる副経路
成熟Ｆａｂを、２０％ヒトＣ５枯渇血清に加えた１００ｐＭのカニクイザルＣ５を用いる副経路溶血検定法で試験した。ＭＯＲ０７０９１−、７０９２−および７０９３−誘導Ｆａｂは、非常に高い阻害活性を示した。５Ｇ１.１は、カニクイザルＣ５とは交差反応しない。図１１は、親和性成熟Ｆａｂに関する溶血検定結果の例を示す。
【０４６２】
５．生殖系列化ＩｇＧ（ヒトＩｇＧ１ＡＡ形式）による溶血検定法
古典的経路
（１）２０％ヒト血清を用いる古典的経路
２０％ヒト血清を用いる古典的経路検定法をＭＯＲで実施した。最終生殖系列化ヒトＩｇＧＡＡ−ＭＯＲ０８１０９、８１１０、８１１３、８１１４のＩＣ５０値は、リファレンスＩｇＧ ５Ｇ１.１より良好または近似していた（図１２参照）。
【０４６３】
（２）５％カニクイザル血清を用いる古典的経路
リファレンス抗体５Ｇ１.１はカニクイザルＣ５を認識しないため、５％カニクイザル血清を用いる古典的経路における５Ｇ１.１との比較は適用できなかった。最終生殖系列化ＩｇＧは、ＭＯＲ０８１１１を除き、カニクイザル血清により誘導される赤血球溶解を完全に阻害し得た。データを図１３に示す。
【０４６４】
副経路
（１）１００ｐＭのヒトＣ５を用いる副経路
生殖系列化ＩｇＧを、１００ｐＭのヒトＣ５を用いる副経路溶血検定法で試験した。抗体は全て、ＩＣ５０値２８〜１２８ｐＭでの強力な阻害活性を示し（ただしＭＯＲ０８１１１を除外、図１４参照）、全て５Ｇ１.１と同等またはさらに良好であった。図１４は、ＩｇＧに関する溶血検定結果の例を示す。
【０４６５】
（２）２０％ヒト血清を用いる副経路およびＣ５ａ生成ＥＬＩＳＡ
生殖系列化ＩｇＧについても、２０％ヒト血清による副経路溶血検定法で試験した。試験した抗体の大多数は、８０ｎＭ未満のＩＣ５０値で完全な阻害を達成する。リファレンス抗体５Ｇ１.１は、この検定法において溶血現象を十分には阻害しない。図１５は、ＩｇＧに関する溶血検定結果の例を示す。最終ＩｇＧによるＣ５ａ生成の阻害は、５Ｇ１.１の場合と類似していた（低ｎＭ範囲でのＩＣ５０値）。
【０４６６】
（３）１００ｐＭのカニクイザルＣ５を用いる副経路
２０％ヒトＣ５枯渇血清における副経路の溶血検定法を、１００ｐＭのカニクイザルＣ５で再構成した。カニクイザルＣ５に対する生殖系列化最終候補の効力は、ヒトＣ５に関する場合の５倍以内であった（低ｎＭ範囲でのＩＣ５０値）。
【０４６７】
（４）１０％カニクイザル血清を用いる副経路
１０％カニクイザル血清（［Ｃ５］〜４０ｎＭ）を用いる副経路の溶血検定法では、生殖系列化候補の効力は、ヒト血清での効力と類似していた（成功基準は、ヒトＣ５を用いる機能性検定法の場合の最低５分の１の強さの効力を有することであった）。
【実施例９】
【０４６８】
実施例９：Ｃ５ａ生成ＥＬＩＳＡ
Ｃ５ａ−ｄｅｓ−Ａｒｇ ＥＬＩＳＡを開発することにより、溶血現象中におけるＣ５ａ生成を測定し、溶血検定法で阻害性を示す抗体が、Ｃ５からＣ５ａおよびＣ５ｂへの開裂についても阻害することを確認した。
【０４６９】
Maxisorp プレートを、コーティング緩衝液（重炭酸ｐＨ９.５〜９.８）中１μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトＣ５ａ−ｄｅｓ−Ａｒｇ（US Biologics）１００μｌ／ウェルによりコートし、４℃で一晩インキュベーションした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、プレートを、室温で２時間３００μｌ／ウェルの希釈剤（Synblock, AbD Serotec）により遮断した。遮断溶液を吸引した後、希釈剤で希釈した１００μｌの試料または標準物質を、室温で１時間インキュベーションした。標準物質を次の要領で調製した：出発濃度は標準物質（ｒＣ５ａ−ｄｅｓ−Ａｒｇ）１ｍｌ当たり２０ｎｇであり、７ポイント曲線用に１：４系列希釈液を調製した。溶血検定法の試料を、希釈剤で１：５に希釈した（Ｃ５ａＥＬＩＳＡで使用するまで溶血検定上清を−８０℃で貯蔵するべきである）。プレート間において、ＰＢＳＴによる洗浄を３回実施した。希釈剤で希釈した０.４μｇ／ｍｌの検出抗体（ビオチン−ヤギ抗ヒトｃ５ａ、R&D Systems）１００μｌ／ウェルを加え、室温で１時間インキュベーション後、ＨＲＰ希釈剤（ポリ−ＨＲＰ希釈剤）で１：５０００に希釈した Strep-HRP（ポリ−ＨＲＰストレプトアビジン）１００μｌ／ウェルを３０分間にわたって加えた。ＰＢＳＴで４回洗浄後、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ultra TMB 基質溶液）を５〜１０分間にわたって加えた。５０μｌ／ウェルの停止液（２Ｎ Ｈ２ＳＯ４）で反応を停止させた。吸光度（Ａ４５０〜Ａ５７０）を読み取り、SoftMax Pro を用いて、データを解析した。
【０４７０】
成熟Ｆａｂを、溶血現象中におけるＣ５ａ生成について試験することにより、阻害活性が、Ｃ５ａおよびＣ５ｂへのＣ５開裂の遮断によるものであることを確認した。２０％ヒト血清中の溶血検定法からの上清を、Ｃ５ａ形成の定量化に使用した。
【０４７１】
試験したＦａｂは全て、Ｃ５ａレベルをベースラインまで低下させた。図１６は、Ｃ５ａ ＥＬＩＳＡ結果の例を示す。
【実施例１０】
【０４７２】
実施例１０：ヒトＣ３、Ｃ４、Ｃ５およびカニクイザルＣ５に対する特異性ＥＬＩＳＡ
全精製Ｆａｂを、ヒトＣ３、Ｃ４およびＣ５への結合について液中ＥＬＩＳＡ（上記方法）で分析した。Ｆａｂを、Neutravidin プレートにおいてビオチニル化抗原とインキュベーションし、ヒスチジン標識により検出した。
【０４７３】
それぞれの親Ｆａｂと比べると、ほとんど全ての成熟Ｆａｂについて結合性の改善が見られた。カウンター標的ヒトＣ４およびＣ３への結合は、１００ｎＭ以下のＦａｂでは検出されなかった。これらの結果は、特異性に関する成功基準に達している：ヒトおよびカニクイザルＣ５への結合およびヒト補体タンパク質Ｃ３およびＣ４への結合無し。親Ｆａｂ ＭＯＲ０７０９１の誘導体に関する例を図１７に示す。
【実施例１１】
【０４７４】
実施例１１：血清安定性検定法
Ｃ５結合性抗体の５０％ヒト血清での結合検定法におけるヒトＣ５への保持された結合活性を、下記要領で測定した。
【０４７５】
抗体（Ｆａｂ形）を、１００％ヒトＣ５枯渇血清またはＰＢＳＴ／０.５％ＢＳＡ（陽性対照）と３７℃で８時間までインキュベーションした。遮断されたポリプロピレンプレートのウェルをインキュベーションに使用することにより、長いインキュベーション時間にわたって確実に表面への抗体の結合が起こらないようにした。試料を異なる時点で集め、−２０℃で貯蔵した。
【０４７６】
NeutrAvidin プレートにおける液中ＥＬＩＳＡで試料を試験することにより、ヒトＣ５への結合能をチェックした。１×ChemiBlocker-PBST でｏ／ｎ遮断しておいた NeutrAvidin プレートに、異なる時点で採取した試料の系列希釈液２０μｌを加えた。試料の１回目の希釈率は１：２であり（最終血清濃度５０％）、次なる希釈段階は１：３であった。１時間インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、２０μｌのビオチニル化ヒトＣ５を２.５μｇ／ｍｌの濃度に適用した。１時間後、プレートを再び５×ＰＢＳＴ（０.０５％Tween）で洗浄し、Ｆａｂに関する抗ＨＩＳ６−ＰＯＤ検出抗体を加えた。
【０４７７】
基質（Quanta Blue または AttoPhos）の蛍光を５〜１０分後に測定し、保持されている結合活性を、それぞれの最大シグナル（ＰＢＳＴ／０.５％ＢＳＡとインキュベーションした抗体）との比較により計算した。
【０４７８】
Ｃ５結合性抗体に関する「絶対必要」基準の一つは、ｉ）１０％血清での機能性検定法およびii）５０％血清での結合検定法においてヒト血清での結合活性の７５〜８０％を保持していることである。溶血検定法は、２０％血清の存在下で実施されるため、５０％血清での結合検定法で保持された結合性を示すだけでよかった。
【０４７９】
従って、成熟最終Ｆａｂを、３７℃で８時間１００％ヒトＣ５枯渇血清とインキュベーションした。試料を異なる時点で集め、液中ＥＬＩＳＡにおいてヒトＣ５への結合について試験した。ＥＬＩＳＡに使用するＦａｂ＋血清試料を、５０％血清＋１０ｎＭ Ｆａｂの濃度に希釈した。
【０４８０】
図１８は、Ｆａｂ形式での最終Ｃ５結合性最終抗体の結果を説明している。結合活性の７０〜９３％は、ＰＢＳ中でのインキュベーションの場合と異なり５０％血清中３７℃で８時間のインキュベーション後に保持されていた。
【実施例１２】
【０４８１】
実施例１２：エピトープ結合（binning）による特性確認
この手順を用いて、抗ヒトＣ５Ｆａｂを、Ｃ５タンパク質の同じかまたは部分重複エピトープへ結合する種々のエピトープビン（bin）に分類した。
【０４８２】
１００倍過剰の各非標識抗ヒトＣ５抗体と各ビオチニル化抗ヒトＣ５抗体との競合を、ＥＬＩＳＡ（捕捉方式）で試験した。それを、各抗体の最高シグナル（非競合のビオチニル化Ｆａｂ）と比較した。
【０４８３】
ヒトＣ５を、３８４ウェル黒色 Maxisorp プレートにおいて予め４℃でｏ／ｎコートしておいたポリクローナル抗ヒトＣ５ ＩｇＧ（US Biological）により捕捉させた。翌日、プレートをＰＢＳＴで２回洗浄し、３％ＢＳＡ−ＰＢＳＴで２時間遮断した。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、２０μｌのヒトＣ５を加え、ＲＴで２時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後、Ｆａｂを加えた。
【０４８４】
２０μｌの非標識Ｆａｂ（２００μｇ／ｍｌまたは４００μｇ／ｍｌ）（１００倍過剰）を、Maxisorp プレートのウェルに加え、それに続いて２０ｎｇ／ｍｌまたは４０ｎｇ／ｍｌのビオチニル化Ｆａｂを加えた。ビオチニル化および非標識Ｆａｂを、ＲＴで１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、Strep-AP Zymax Streptavidin-Alkaline Phosphatase, ZYMED, コード: 43-8322, ロット: 50799648 を、プレートにＣ５を介して結合しているビオチニル化Ｆａｂの検出用に加えた。AttoPhos 基質（Roche）をプレートに加え、５〜１０分後蛍光を読み取った。
【０４８５】
親Ｆａｂ
Ｃ５を捕捉させ（ポリクローナル抗体により）、非標識ＦａｂＹをビオチニル化ＦａｂＸに対し過剰に適用した。ヒトＣ５へのビオチニル化ＦａｂＸの結合が検出された。６群のＦａｂが特定され得た：第１群:ＭＯＲ０６９５２、６９６１; 第２群:ＭＯＲ０６５２５、６７５６、６７５７、６７６３; 第３群: ＭＯＲ０７０８７; 第４群: ＭＯＲ０６７６４、６７７６、７０８１; 第５群: ＭＯＲ０７０８９; 第６群: ＭＯＲ０７０８２、７０８３、７０８４、７０８６、７０８８、７０９０、７０９１、７０９２、７０９３、７０９５。
【０４８６】
また、異なる方法を用いて、Ｆａｂを異なるエピトープ結合群に分類した：ＦａｂＸを固定し、次いでビオチニル化Ｃ５と予めインキュベーションしておいたＦａｂＹを加えた。Ｆａｂの次の群が特定され得た：第１群:ＭＯＲ０６９５２、６９６１; 第２群: ＭＯＲ０６５２５，６７５７、７０８３; 第３群: ＭＯＲ０７０８７ ; 第４群: ＭＯＲ０６７６３; 第５群: ＭＯＲ０７０８１; 第６群: ＭＯＲ０７０８２、７０８３、７０８４、７０８６、７０８８、７０９１、７０９２、７０９３（７０８９は７０８４と競合する）。２種の異なる方法を用いても、同様の結果が得られるという結論が導かれた。
【０４８７】
成熟したＦａｂ
Ｆａｂの特性確認を完成させるため、非標識Ｆａｂ（１００倍過剰で適用）とビオチニル化Ｆａｂの競合を、液中ＥＬＩＳＡで測定した。結果を最高のシグナル（非競合のビオチニル化Ｆａｂ）と比較した。
【０４８８】
図１９に示す通り、ビオチニル化Ｆａｂは、同一の非標識Ｆａｂと競合し、全Ｆａｂは、同じかまたは部分重複エピトープへの結合をめぐって競合する。これらの結果は、親Ｆａｂに関するエピトープ結合（binning）データと相関関係をなす。
【実施例１３】
【０４８９】
実施例１３：Ｃ５アルファ対ベータ鎖結合剤のスクリーニングおよび競合検定法
下記要領でＥＬＩＳＡ実験および溶血検定法を実施することにより、Ｆａｂがアルファまたはベータ鎖結合剤のいずれであるかを試験した。
【０４９０】
第１実験では、Ｆａｂをプレート上でコートし、精製Ｃ５またはキメラＣ５調製物（ヒトアルファ、マウスベータ鎖）からの上清を加えた。次なる段階として、５Ｇ１.１を適用し、抗ヒトＩｇＧにより検出を実施した。
【０４９１】
第２実験では、５Ｇ１.１をプレート上でコートし、精製Ｃ５またはキメラＣ５調製物（ヒトアルファ、マウスベータ鎖）からの上清を加え、次いでＦａｂを適用し、抗Ｍｙｃ抗体により検出した。
【０４９２】
リファレンスＩｇＧ ５Ｇ１.１はアルファ鎖を認識するため、これを用いることにより、MorhpSys 生成Ｆａｂが結合をめぐって５Ｇ１.１と競合するか否かを測定した。溶血検定法では、キメラＣ５調製物からの上清をヒトＣ５枯渇血清に加え、Ｆａｂを溶血現象の阻害について試験した。
【０４９３】
親Ｆａｂ
図２０は、Ｆａｂをプレート上でコートし、Ｃ５またはキメラＣ５調製物（ヒトアルファ鎖およびマウスベータ鎖）の上清、次いで５Ｇ１.１を加えたＥＬＩＳＡ実験の結果を示す。図２１は、精製Ｃ５およびキメラＣ５からの上清を５Ｇ１.１により捕捉させたＥＬＩＳＡ実験の結果を示す。
【０４９４】
ＭＯＲ０６５２５、６７５６、６７６３は、ベータ鎖結合剤であった（Ｃ５に結合するが、キメラＣ５には結合しない）。ほとんどのＭＯＲ０７０ＸＸ Ｆａｂ（液中パニングから誘導）は、アルファ鎖結合剤である（Ｃ５およびキメラＣ５に結合する）。ＭＯＲ０６９５２および６９６１は、５Ｇ１.１と競合するため、それらはＣ５およびキメラＣ５の両方について陰性であり、従って、５Ｇ１.１と同様アルファ鎖結合剤である可能性が高い。ＭＯＲ０６７５７は、ＭＯＲ０６９５２および６９６１と同様の動きを見せることから、アルファ鎖結合剤であると思われる。しかしながら、ＭＯＲ０６７５７は、Ｃ５枯渇血清へスパイクされたキメラＣ５上清の溶血現象を阻害しないが、他のアルファ鎖結合剤は全てそれを阻害する（図２２参照）。
【０４９５】
溶血検定法では、キメラＣ５調製物からの上清を、ヒトＣ５枯渇血清に加え、溶血現象の阻害についてＦａｂを試験した。ＭＯＲ０６５２５、６７５６、６７５７および６７６３は、キメラＣ５による溶血現象を阻害しなかったことから、ベータ鎖結合剤であり得た。ＭＯＲ０６９５２、６９６１、７０８１、７０８２、７０８３、７０８４、７０８６、７０８７、７０８８、７０８９、７０９０、７０９１、７０９２、７０９３、７０９４、７０９５は、溶血現象を阻害したため、アルファ鎖結合剤であり得た。
【実施例１４】
【０４９６】
実施例１４：タンパク質加水分解に対する抵抗性
Ｆａｂの構造的堅固さを調べるため、サーモリシンによるタンパク質加水分解に対するＦａｂの抵抗を実現させた（サーモリシン細菌性プロテアーゼ、Calbiochem）。Ｆａｂをサーモリシンと、３７℃または５５℃（サーモリシン活性は５５℃が最適である）でインキュベーション（Ｆａｂ：サーモリシン＝３：１（ｗ／ｗ）、反応量８μＬ）した。４μＬの０.５ＭのＥＤＴＡおよび４μＬの４×ＬＤＳ試料緩衝液（Invitrogen）を加えることにより、反応を停止させ、停止した試料を非還元的条件で４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。Coomassie 染色により視覚化されるＦａｂバンドの消失をモニターすることにより、Ｆａｂのタンパク質加水分解を分析した。
【０４９７】
親Ｆａｂ
３７℃および５５℃でのサーモリシンタンパク質加水分解に対する抵抗性について親Ｆａｂを試験した。ヒト化ＩＬ−１β抗体からのＦａｂを対照として使用した。試験されたほとんどのＦａｂは、９０分まで３７℃での熱分解に抵抗を示した。Ｆａｂの構造的堅固さをさらに差別化するため、タンパク質加水分解をさらに高温の５５℃で実施した。試験されたＦａｂの多くは５５℃で迅速に分解されたが（９０％を超えるＦａｂが３０分以内に分解された）、Ｆａｂの中には９０分後でもまだタンパク質加水分解に対して抵抗を示すものもあった（例、７０９４）。抵抗性Ｆａｂは、さらに堅固な構造を有すると考えられ、そのため、それらはさらに良好なインビボ薬物動態特性を示すと思われた。これらの実験の結果を図２３および図２４に示す。
【０４９８】
成熟したＦａｂ
溶血検定法において最高の効力を呈するＦａｂを、３７℃および５５℃でのサーモリシンに対する感受性について試験した。図２５および図２６では、ＭＯＲ０７０８６、７０９１、７０９２および７０９３の誘導体による実験を示す。
【０４９９】
これらの試験の結果は、親ＭＯＲ０７０９１、７０９２および７０９３の誘導体はタンパク質加水分解に対する感受性が低く、ＭＯＲ０７０８６誘導体は、タンパク質加水分解に対する感受性が高いことを明らかにしていた。
【０５００】
実施例１５：ＭＡＣ沈着検定法
末端補体カスケードはＭＡＣの形成で終結するため、ＭＡＣ形成の阻害は、補体カスケードを遮断する抗体能力についてのさらなるヒントであった。合理的な形は、細胞および細胞行動とは独立した追加の構成を有することであった。
【０５０１】
ＭＡＣ（膜侵襲複合体）沈着を測定するため、特に副経路の免疫検定法で使用される、酵母の細胞壁由来の不溶性炭水化物である Zymosan（Sigma）をコートして、副経路を活性化し、ＩｇＭ（Sigma）をコートして古典的経路を活性化した。Ｆａｂをヒト血清（ＡＰ用には６％、ＣＰ用には２％）と予めインキュベーションし、プレートに加えた。ＭＡＣ沈着の阻害パーセンテージ（％）を、ベースライン（ＥＤＴＡ処理ヒト血清）および陽性対照（ヒト血清）に対し各試料について計算し、それを用いて XLFit でＩＣ５０曲線を作成した。
【０５０２】
親Ｆａｂ
親Ｆａｂを異なる濃度で使用し、最大阻害（適用可能であれば、ＩＣ５０値も）を測定した（例を図２７に示す）。ほとんどのＦａｂは、ＭＡＣ沈着を完全に阻害したことから、Ｃ５開裂の遮断が示唆された。Ｆａｂの効力およびランク付けは、溶血検定法からのデータと類似していた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図９ｅ】
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【図９ｆ】
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【図９ｇ】
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【図９ｈ】
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【図９ｉ】
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【図９ｊ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１０ｅ】
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【図１０ｆ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１１ｅ】
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【図１１ｆ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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【図１５ｄ】
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【図１５ｅ】
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【図１５ｆ】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１６ｃ】
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【図１６ｄ】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
0005815403.tif 000164
【図２２−３】
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【図２３】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
0005815403.tif 000168
【図２５−３】
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【図２５−４】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２６−３】
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【図２６−４】
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【図２７】
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【図２４】
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【配列表】
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