(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における結腸直腸がん（ＣＲＣ）再発の可能性を決定する方法であって、
前記被験者から得られたＣＲＣ腫瘍細胞を含む生体試料におけるｈｓａ−ｍｉＲ−３６３＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０ａ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ｂ−５ｐ、およびｈｓａ−ｍｉＲ−１２２４−５ｐからなる群より選ばれる２個以上のマイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）の発現量を測定するステップ、
ＣＲＣ再発への寄与度により、前記ｍｉＲＮＡの発現量を重み付けすることを含む方法により再発スコアを計算するステップ、
再発スコア＝ｅｘｐ（ｙ）／（１＋ｅｘｐ（ｙ））であり、
ここでｙは多重の予測因子を組み合わせた再発スコアの式であり、ならびに、
前記再発スコアを用いて前記被験者の結腸直腸がん再発の可能性を決定するステップ、
を含む方法。
【請求項２】
前記被験者がヒトである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｍｉＲＮＡの発現量が、（ａ）ｍｉＲＮＡの逆転写および定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）または（ｂ）マイクロアレイ分析を含む方法によって測定される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記測定された発現量が、（ａ）１個以上の非コードリボ核酸（ｎｃＲＮＡ）の発現量、（ｂ）ＲＮＡの総量、（ｃ）１個以上のｍｉＲＮＡの発現量、または（ｄ）１個以上の１８Ｓ ｒＲＮＡの発現量に対して正規化される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記測定された発現量が正規化されず、未処理のｑＰＣＲ  Ｃｔ結果が前記再発スコアを計算するのに用いられる請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記測定された発現量が、１個以上の非コードリボ核酸（ｎｃＲＮＡ）の発現量に対して正規化され、かつ前記非コードリボ核酸（ｎｃＲＮＡ）がＲＮＵ６Ｂ、ＲＮＵ４４、およびＲＮＵ４８の転写産物から選ばれる請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記測定された発現量が、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６および／またはｈｓａ−ｍｉＲ−９２の発現量に対して正規化される請求項４に記載の方法。
【請求項８】
測定された各ｍｉＲＮＡの発現量の個々の寄与度が、前記計算ステップにおいて別々に重み付けされる請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記生体試料が、ＣＲＣ腫瘍の新鮮試料、ＣＲＣ腫瘍の凍結試料またはペアの非腫瘍組織である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記生体試料がスモールＲＮＡを含む試料である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記再発スコアおよび／または前記再発スコアを用いてなされるＣＲＣ再発の可能性の決定を含むレポートを作成するステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
被験者における結腸直腸がんの再発を予測するためのキットであって、
ｈｓａ−ｍｉＲ−３６３＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０ａ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ｂ−５ｐ、およびｈｓａ−ｍｉＲ−１２２４−５ｐからなる群より選ばれる少なくとも２個のｍｉＲＮＡをｃＤＮＡに特異的に逆転写するための少なくとも２個の逆転写プライマー
ならびに、
前記再発スコアおよび／または前記再発スコアを用いて作成されるＣＲＣ再発の可能性の決定を含むレポートを含み、
前記再発スコアが前記逆転写プライマーを用いて測定される前記ｍｉＲＮＡの発現量と、下記式により計算され、
再発スコア＝ｅｘｐ（ｙ）／（１＋ｅｘｐ（ｙ））であり、
ここでｙは多重の予測因子を組み合わせた再発スコアの式である、キット。
【請求項１３】
被験者における結腸直腸がんの再発を予測するためのキットであって、
ｈｓａ−ｍｉＲ−３６３＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０ａ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ｂ−５ｐ、およびｈｓａ−ｍｉＲ−１２２４−５ｐからなる群より選ばれる少なくとも２個のｍｉＲＮＡをｃＤＮＡに特異的に逆転写するための少なくとも２個の逆転写プライマー、
前記ｍｉＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡに特異的に結合する少なくとも２個のプローブであって、存在している前記ｍｉＲＮＡを定量化するためのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）への使用に適するプローブ、
少なくとも１個の非コードＲＮＡを特異的に逆転写するための逆転写プライマー、および前記少なくとも１個の非コードＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡに特異的に結合するプローブであって、存在している前記非コードＲＮＡを定量化するためのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）への使用に適するプローブ、ならびに
再発スコアおよび／または再発スコアを用いて作成されるＣＲＣ再発の可能性の決定を含むレポートを含み、
前記再発スコアが前記逆転写プライマー及びプローブを用いて測定される前記ｍｉＲＮＡの発現量と、下記式により計算され、
再発スコア＝ｅｘｐ（ｙ）／（１＋ｅｘｐ（ｙ））であり、
ここでｙは多重の予測因子を組み合わせた再発スコアの式である、キット。
【請求項１４】
被験者における結腸直腸がん再発の可能性を決定する方法であって、
スモールＲＮＡを含む試料において、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０、およびｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ｂ−５ｐの各ｍｉＲＮＡの発現を検出するステップ、ならびに、
再発スコアにしたがって前記被験者が結腸直腸がんを再発する確率を計算するステップ、
再発スコア＝ｅｘｐ（ｙ）／（１＋ｅｘｐ（ｙ））であり、
ここでｙは多重の予測因子を組み合わせた再発スコアの式である、方法。
【請求項１５】
被験者における結腸直腸がん再発の可能性を決定する方法であって、
スモールＲＮＡを含む試料において、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９−３ｐ、およびｈｓａ−ｍｉＲ−２２３＊の各ｍｉＲＮＡの発現を検出するステップ、ならびに、
再発スコアにしたがって前記被験者が結腸直腸がんを再発する確率を計算するステップ、
を含み、
再発スコア＝ｅｘｐ（ｙ）／（１＋ｅｘｐ（ｙ））であり、
ここでｙは多重の予測因子を組み合わせた再発スコアの式である、
方法。
【請求項１６】
前記再発スコアが図４〜６０に示される式のうちの１つによって決定される請求項１、１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記再発スコアが図４〜６０に示される式のうちの１つによって決定される請求項１２又は１３に記載のキット。
【請求項１８】
被験者における結腸直腸がん再発の可能性を決定する方法であって、
前記被験者の（ａ）結腸直腸腫瘍の試料、および（ｂ）前記腫瘍が形成された組織と同じタイプの組織である非腫瘍組織のペアの試料において、
試料（ａ）および（ｂ）の各々から全リボ核酸（ＲＮＡ）を抽出するステップ、
試料（ａ）および（ｂ）の各々について前記抽出したＲＮＡを用い逆転写および定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行って、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９−３ｐ、およびｈｓａ−ｍｉＲ−２２３＊の各ｍｉＲＮＡの正規化された発現量を決定するステップであって、前記発現量が、前記試料における非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）のＲＮＵ６ＢおよびＲＮＵ４４の発現量に対して正規化される、ステップ、ならびに、
再発スコアにしたがって前記被験者が結腸直腸がんを再発する確率を計算するステップ、
を含み、
再発スコア＝ｅｘｐ（ｙ）／（１＋ｅｘｐ（ｙ））であり、
ここでｙは、図４〜６０の式のうちの１つによって決定され、
ここで（腫瘍）は試料（ａ）における特定のｍｉＲＮＡの発現を示し、（正常）は前記腫瘍が形成された組織と同じタイプの組織である非腫瘍組織から採取された試料（ｂ）における特定のｍｉＲＮＡの発現を示す、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.§１１９（ｅ）に基づいて２０１１年１月１３日に出願された米国仮出願第６１／４３２，４６８号の優先権を主張し、その全体の内容が参照することにより本明細書に明示的に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、被験者における結腸直腸がんの再発を予測するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
結腸直腸がん（ＣＲＣ）は、大腸（結腸）あるいは直腸のいずれかで発生するがんである。ＣＲＣは世界的に見て、男性で３番目に多いがんであり、女性では２番目に多いがんである。２００８年には、世界中で年間約６０８，０００人の死亡がＣＲＣに起因し得たと推測されており、これは全てのがん死亡の８％を占め、ＣＲＣは全世界におけるがんによる死亡の４番目に多い原因となっている。ＣＲＣはアメリカ合衆国および欧州連合におけるがんに関連する死亡の原因の第２位であり、米国および欧州連合における全てのがんに関連する死亡の１０％を占めている。米国がん協会（ＡＣＳ）は、２０１１年に米国において結腸がんの新患者は約１００，０００人、直腸がんの新患者は４０，０００人近くになると推定している。ＡＣＳはさらに、２０１１年における米国のＣＲＣに関連する死亡は５０，０００人近くになると推定している。
【０００４】
結腸がんおよび直腸がんは、分子レベルでは同一の疾病または類似の疾病を示し得るが、解剖学的構造の問題により、直腸がんの手術は結腸がんの手術に比べてより複雑である。恐らくはこの理由のために、がん組織の外科的切除後の局所再発率は、結腸がんに比べて直腸ではるかに高く、よってこれら２つのがんの治療へのアプローチはかなり異なっている。
【０００５】
がん専門医が十分に妥当な治療を決定するのに役立つ臨床試験は、非常に重要なものである。がん専門医は、患者を化学療法剤で治療するか治療しないかの決定に繰り返し直面する。現在のがん治療薬は通常、かなりの毒性を伴うある程度の効果しか持たない。故に、原発腫瘍の切除を受けた患者の転移性再発の可能性を知ることは、がん専門医にとって治療法の決定に有用である。このような情報を以って、高リスク患者が化学療法の対象とされ、がんを再発する可能性が低い患者が化学療法に関連する有害事象への不必要な暴露を免れ得る。
【０００６】
結腸直腸がんの進行を追跡するのに用いられる２つの分類システム、つまり、修正されたデュークスの（またはアストラ・コラー）病期分類システム（ステージＡ〜Ｄ）（非特許文献１）、および最近の米国がん合同委員会により開発されたＴＮＭ病期分類（ステージＩ〜ＩＶ）（非特許文献２)がある。両システムは、原発腫瘍の結腸または直腸壁の層から隣接した臓器、リンパ節および遠隔部位への広がりを測定することによって腫瘍の進行を評価するものである。現在、結腸がんの再発リスクの評価および治療法の決定は、主として腫瘍のステージに基づいている。
【０００７】
補助化学療法を施すかどうかの判断は単純なものではない。米国で毎年、およそ３３，０００人がステージIIの結腸直腸がんと新たに診断される。これら患者のほとんど全員が、腫瘍の外科的切除を行うことによって治療されており、そして切除後、それら外科患者の約４０％が５-フルオロウラシル（５−ＦＵ）ベースの化学療法で治療されている。外科手術だけで治療されたステージIIの結腸がん患者の５年生存率はおよそ８０％である。５−ＦＵ＋ロイコボリン（ロイコボリン媒介のフルオロウラシル（ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）)を用いる標準的補助療法は、わずか２〜４％の５年生存率の確かな改善をもたらすにすぎず、このような化学療法はかなりの毒性を伴うものである。
【０００８】
ステージIIIの結腸がんの治療における化学療法の利点は、ステージIIの結腸がんの治療の利点よりもはるかに明白である。ステージIIIの結腸がんと診断された患者の大部分が、５−ＦＵベースの補助化学療法を受ける。ステージIIIの結腸がんにおける化学療法について報告された明らかな利点は、治療計画により異なる。５−ＦＵ＋ロイコボリンで治療した患者の生存率の上昇は約１８％であり、５−ＦＵ＋ロイコボリン＋オキサリプラチンで治療した患者の生存率の上昇は約２４％であると報告されている。ステージIIIの結腸がん患者に対する現在の標準治療の化学療法治療はある程度有効なものであり、約５０％（外科手術のみ）から約６５％（５−ＦＵ＋ロイコボリン）または７０％（５−ＦＵ＋ロイコボリン＋オキサリプラチン）の５年生存率の改善を達成している。５−ＦＵ＋ロイコボリン単独でまたはオキサリプラチンとの併用による治療は、様々な副作用、例えば治療されたおよそ１％の患者の中毒死を伴う。ステージIIIの患者（全体で未治療の５年生存率約５０％）の一部が、ステージIIの患者（全体で未治療の５年生存率約８０％）で観察される再発リスクと似ているために生存するかどうかは、証明されていない。
【０００９】
直腸腫瘍の病期分類は、結腸腫瘍の病期分類に使用されるのと類似の基準を用いて行われる。ステージII／IIIの直腸腫瘍は、それらの状態の進行に関し、ステージII／IIIの結腸腫瘍とかなり相関している。上述したように、局所再発率およびその他の予後の側面は直腸がんと結腸がんとで異なり、これらの違いは、直腸腫瘍の全切除を成し遂げることの難しさから生じ得るものである。
【００１０】
よって、外科的切除後のＣＲＣ再発の可能性について毒性が既存の化学療法の情報に関連するのであれば、そのような化学療法が患者にとって期待できる効果となり得るかどうかをがん専門医が判断するのに有益である。
【００１１】
がんの臨床試験は通常、単一の検体の試験である。単一の検体の試験は、特定のがんと関連する多数の異なるマーカーの間で生じ得る複雑な関係をとらえることはできない。さらに、多くの既存のがん臨床試験は定量的ではなく、免疫組織化学に依存している。免疫組織化学の結果は、１つには試薬が標準化されていないため、また１つには解釈が主観的で容易に定量化できないために、研究室間で異なることがある。
【００１２】
リボ核酸（ＲＮＡ）ベースの試験は、組織試料中のＲＮＡが容易に分解される傾向があるために、臨床試験にはあまり用いられていない。しかしながら、ＲＮＡベースの方法は、がん患者から採取した少量の材料（つまり、組織または細胞）に由来する多数のがんマーカーの発現の同時に観察できる可能性がある。
【００１３】
マイクロＲＮＡ(ｍｉＲＮＡと省略)は、菌類（fungi）、藻類（algae）、および海藻類（marine plants）を除き、全ての真核細胞に見られる短いリボ核酸（ＲＮＡ）分子である。ｍｉＲＮＡ分子は、他のＲＮＡに比べてごく少ないヌクレオチド（平均で２２)しか有さない。ｍｉＲＮＡは標的メッセンジャーＲＮＡ転写産物(ｍＲＮＡ)上の相補配列に結合する転写後調節因子であり、通常、翻訳抑制または標的の分解および遺伝子サイレンシングをもたらす。ヒトゲノムは１０００個をこえるｍｉＲＮＡをコードでき、それは哺乳動物遺伝子の約６０％を標的とすることができ、かつ多くのヒトの細胞型に豊富に含まれている。
【００１４】
２０００年代初頭まで、ｍｉＲＮＡは、保存された機能を有する生体調節因子の１つの明確な分類として認められていなかった。その後、ｍｉＲＮＡの研究によって、負の調節(転写産物の分解および隔離（sequestration）、翻訳抑制)における多数の役割、ならびに正の調節(転写および翻訳活性化)への関与の可能性が明らかとなった。遺伝子調節に影響を及ぼすことにより、ｍｉＲＮＡは、大部分の生物学的過程に係わっていると思われる。異なる細胞型および組織に、異なる組のｍｉＲＮＡ発現が見られる。ｍｉＲＮＡの異常な発現は、多くの病状と関係がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ａｓｔｌｅｒ  Ｖ  Ｂ，  Ｃｏｌｌｅｒ  Ｆ  Ａ．，  Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  １９５４；  １３９：８４６−５２
【非特許文献２】ＡＪＣＣ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｇｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ，６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、被験者における結腸直腸がんの再発を予測するための方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明のいくつかの態様は、被験者における結腸直腸がん（ＣＲＣ）再発の可能性を決定するための方法に関する。かかる方法は、前記被験者から得られたＣＲＣ腫瘍細胞を含む生体試料におけるｈｓａ−ｍｉＲ−３６３＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０ａ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ｂ−５ｐ、およびｈｓａ−ｍｉＲ−１２２４−５ｐからなる群より選ばれる２個以上のマイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）の発現量を測定するステップを含み得る。測定された発現量は、ＣＲＣ再発へのそれらの寄与度によりｍｉＲＮＡの発現量を重み付けすることを含む方法により再発スコアを計算するのに用いることができる。本発明のいくつかの実施形態では、次いで、再発スコアを用い被験者の結腸直腸がん再発の可能性が決定され得る。クレームに係る方法のいくつかは、再発スコアおよび／または再発スコアを用いてなされるＣＲＣ再発の可能性の決定を含むレポートを作成するステップをさらに含み得る。
【００１８】
本発明の特定の実施形態は、被験者における結腸直腸がん（ＣＲＣ）再発の可能性を決定するための方法に関する。かかる方法は、被験者から得られたＣＲＣ腫瘍細胞を含む生体試料におけるｈｓａ−ｍｉＲ−３６３＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０ａ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ｂ−５ｐ、およびｈｓａ−ｍｉＲ−１２２４−５ｐからなる群より選ばれる２個以上のマイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）の発現量を測定するステップを含み得る。測定された発現量は、正規化され、かつＣＲＣ再発へのそれらの寄与度によりｍｉＲＮＡの正規化された発現量を重み付けすることを含む方法により再発スコアを計算するのに用いることができる。本発明のいくつかの実施形態では、次いで、再発スコアを用い被験者の結腸直腸がん再発の可能性が決定され得る。クレームに係る方法のいくつかは、再発スコアおよび／または再発スコアを用いてなされるＣＲＣ再発の可能性の決定を含むレポートを作成するステップをさらに含み得る。
【００１９】
本発明の特定の実施形態は、被験者におけるＣＲＣの再発を予測するためのキットに関する。いくつかの実施形態において、キットは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６３＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０ａ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ｂ−５ｐ、およびｈｓａ−ｍｉＲ−１２２４−５ｐからなる群より選ばれる少なくとも２個のｍｉＲＮＡをｃＤＮＡに特異的に逆転写するための少なくとも２個の逆転写プライマーからなる。
【００２０】
特定の実施形態において、キットは、（ａ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３６３＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０ａ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ｂ−５ｐ、およびｈｓａ−ｍｉＲ−１２２４−５ｐからなる群より選ばれる少なくとも２個のｍｉＲＮＡをｃＤＮＡに特異的に逆転写するための少なくとも２個の逆転写プライマー、（ｂ）前記ｍｉＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡに特異的に結合する少なくとも２個のプローブであって、存在しているｍｉＲＮＡを定量化するためのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、例えば定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲまたはＱ−ＰＣＲ）への使用に適するプローブ、ならびに（ｃ）少なくとも１個の非コードＲＮＡを特異的に逆転写するための逆転写プライマー、および少なくとも１個の非コードＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡに特異的に結合するプローブであって、存在している非コードＲＮＡを定量化するためのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、例えば定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲまたはＱ−ＰＣＲ）への使用に適するプローブ、を含み得る。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態は、被験者における結腸直腸がん再発の可能性を決定するための方法であって、結腸直腸がん腫瘍の除去手術時に被験者から（ａ）結腸直腸腫瘍の試料、および（ｂ）腫瘍が形成された組織と同じタイプの組織である非腫瘍組織のペアの試料を採取するステップ、を含む方法に関する。次いで、試料（ａ）および（ｂ）の各々から全リボ核酸（ＲＮＡ）が抽出され得る。抽出した全ＲＮＡを用い逆転写および定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲまたはＱ−ＰＣＲ）を試料（ａ）および（ｂ）の各々について行って、ｈｓａ−ｍｉｒ−１２２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−５１８ｂ、ｈｓａ−ｍｉｒ−６２９、ｈｓａ−ｍｉｒ−８８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１３９−３ｐ、およびｈｓａ−ｍｉｒ−２２３＊の各ｍｉＲＮＡの正規化された発現量を決定することができる。ｍｉＲＮＡの発現量は、試料における非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）のＲＮＵ６ＢおよびＲＮＵ４４の発現量に対して正規化され得る。本発明の特定の態様では、正規化された発現量が与えられると、被験者が結腸直腸がんを再発する確率をロジスティック回帰分析にしたがって計算することができる。
【００２２】
本発明の特定の実施形態は、被験者における結腸直腸がん再発の可能性を決定するための方法であって、（ａ）スモールＲＮＡを含む被験者由来の試料を準備するステップ、（ｂ）ｈｓａ−ｍｉｒ−１２２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−５１８ｂ、ｈｓａ−ｍｉｒ−６２９、ｈｓａ−ｍｉｒ−８８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２２３＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０、およびｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ｂ−５ｐの各ｍｉＲＮＡの発現を検出するステップ、ならびに（ｃ）ロジスティック回帰分析にしたがって被験者が結腸直腸がんを再発する確率を計算するステップ、を含む方法に関する。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態は、被験者における結腸直腸がん再発の可能性を決定するための方法であって、（ａ）スモールＲＮＡを含む被験者由来の試料を準備するステップ、（ｂ）ｈｓａ−ｍｉｒ−１２２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−５１８ｂ、ｈｓａ−ｍｉｒ−６２９、ｈｓａ−ｍｉｒ−８８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１３９−３ｐ、およびｈｓａ−ｍｉｒ−２２３＊の各ｍｉＲＮＡの発現を検出するステップ、ならびに（ｃ）ロジスティック回帰分析にしたがって被験者が結腸直腸がんを再発する確率を計算するステップ、を含む方法に関する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、結腸直腸がんの再発を予測するための方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は本発明の１実施形態の概略図である。
【図２】図２−１は、ＣＲＣ再発予測モデルの受信者動作特性曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）曲線および無病生存分析を示す図である。陰性的中率（ＮＰＶ）＝１および感度＝１．００を達成するため、ロジスティック回帰法を用い１９個の候補から６個を選んで予測モデルを作った。図２−１ａは、訓練データセットにおける６５人の患者から得られた結果であり、再発スコアセットのカットオフ値は０．１８３０である。図２−１ｂは、試験データセットにおける１５人の患者から得られた結果を示しており、再発スコアセットのカットオフ値は０．１８３０である。
【図３】図３−１は、ＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病生存分析を示す図である。陽性的中率（ＮＰＶ）＝１および特異度＝１．００を達成するため、ロジスティック回帰法を用い１９個の候補から６個を選んで予測モデルを作った。図３−１ａは、訓練データセットにおける６５人の患者から得られた結果を示しており、再発スコアセットのカットオフ値は０．２３３１である。図３−１ｂは、試験データセットにおける１５人の患者から得られた結果を示しており、再発スコアセットのカットオフ値は０．２３３１である。
【図４】図４は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。図４〜４９は、ＲＮＵ６ＢおよびＲＮＵ４４を用いて正規化された、ｑＰＣＲから得られたデータを示す（“腫瘍”：腫瘍組織から得られた正規化されたｑＰＣＲ  Ｃｔ、“正常”：ペアの非腫瘍組織から得られた正規化されたｑＰＣＲ  Ｃｔ）。
【図５】図５は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図６】図６は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図７】図７は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図８】図８は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図９】図９は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図１０】図１０は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図１１】図１１は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図１２】図１２は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図１３】図１３は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図１４】図１４は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図１５】図１５は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図１６】図１６は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図１７】図１７は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図１８】図１８は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図１９】図１９は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図２０】図２０は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図２１】図２１は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図２２】図２２は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図２３】図２３は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図２４】図２４は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図２５】図２５は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図２６】図２６は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図２７】図２７は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図２８】図２８は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図２９】図２９は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図３０】図３０は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図３１】図３１は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図３２】図３２は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図３３】図３３は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図３４】図３４は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図３５】図３５は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図３６】図３６は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図３７】図３７は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図３８】図３８は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図３９】図３９は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図４０】図４０は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図４１】図４１は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図４２】図４２は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図４３】図４３は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図４４】図４４は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図４５】図４５は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図４６】図４６は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図４７】図４７は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図４８】図４８は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図４９】図４９は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図５０】図５０は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。図５０〜５４は、正規化されていないｑＰＣＲから得られたデータを示す（“腫瘍”：腫瘍組織から得られた未処理のｑＰＣＲ  Ｃｔ、“正常”：ペアの非腫瘍組織から得られた未処理ｑＰＣＲ  Ｃｔ）。
【図５１】図５１は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図５２】図５２は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図５３】図５３は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図５４】図５４は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図５５】図５５は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。図５５〜６０はマイクロアレイ実験から得られたデータを示し、各候補は、腫瘍組織アレイの強度／正常組織アレイの強度を表す。
【図５６】図５６は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図５７】図５７は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図５８】図５８は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図５９】図５９は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【図６０】図６０は、本発明の１実施形態のＣＲＣ再発予測モデルのＡＵＲＯＣ曲線および無病分析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下の詳細な説明において、説明の目的で、開示される実施形態が十分に理解されるよう、多数の具体的詳細を示す。しかしながら、これら具体的詳細がなくとも１つまたはそれ以上の実施形態が実施され得ることは明らかである。別の場合では、説明を簡潔とするため、周知の構造および装置は概略的に示される。
【００２７】
当業者は、本明細書に記載されたものに類似するまたは均等であり、本発明の実施において用いられ得る多くの方法および材料を理解する。実際、本発明は決して、記載された方法および材料に限定はされない。本発明の目的のために、次の用語を以下に定義する。
【００２８】
本明細書で用いられる“マイクロＲＮＡ”および“ｍｉＲＮＡ”は、ｍｉＲＢａｓｅ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）に登録されているマイクロＲＮＡを含む。ｍｉＲＢａｓｅは、全てのマイクロＲＮＡの配列およびアノテーションの主要オンラインレジストリである。現行のリリース（ｍｉＲＢａｓｅ  １７）は、１５０以上の種における１６０００以上のマイクロＲＮＡ遺伝子座および１９０００以上の異なる成熟マイクロＲＮＡ配列を含んでいる。本明細書で用いられる“マイクロＲＮＡ”および“ｍｉＲＮＡ”は、前駆体ｍｉＲＮＡおよび成熟ｍｉＲＮＡ産物の両方を含む。
【００２９】
本明細書で用いられる“腫瘍”という用語は、悪性か良性かを問わず、全ての腫瘍細胞（neoplastic cell）の成長および増殖、ならびに前がんおよびがんの細胞および組織の全てを指す。
【００３０】
“がん”および“がん性”という用語は、一般的に無秩序な細胞成長によって特徴付けられる哺乳動物の生理的状態のことを指すまたは表す。結腸直腸がんは、がんの１種である。“結腸直腸がん”という用語は、最も広義に用いられ、(１)大腸および／もしくは直腸の上皮細胞から生じるがんの全てのステージおよび全ての形態、ならびに／または（２）大腸および／もしくは直腸の内層（lining）に影響を及ぼすがんの全てのステージおよび全ての形態のことを指す。結腸直腸がん(ＣＲＣ)は大腸（結腸）または直腸のいずれかに発生するがんである。結腸がんおよび直腸がんは、分子レベルにおいて同一の疾患または類似する疾患を意味し得る。
【００３１】
結腸直腸がんの分類に用いられる病期分類システムにおいて、結腸および直腸は１つの器官として扱われる。米国がん合同委員会(ＡＪＣＣ)の腫瘍、リンパ節、および転移(ＴＮＭ)病期分類システム（Ｇｒｅｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  ＡＪＣＣ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｇｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ．  ６ｔｈ  Ｅｄ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．：  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；  ２００２）によると、結腸直腸がんの各ステージは次のように定義される。
【００３２】
腫瘍：Ｔ１：腫瘍が粘膜下組織に浸潤する、Ｔ２：腫瘍が固有筋層（ｍｕｓｃｕｌａｒｉｓ  ｐｒｏｐｒｉａ）に浸潤する、Ｔ３：腫瘍が固有筋層から漿膜下組織に、または結腸周囲もしくは直腸周囲組織に浸潤する、Ｔ４:腫瘍が他の器官もしくは構造に直接浸潤する、および／または穿通する。
【００３３】
リンパ節：Ｎ０：限局部リンパ節転移がない、Ｎ１：１〜３の限局部リンパ節の転移、Ｎ２：４以上の限局部リンパ節の転移。
【００３４】
転移：Ｍ０：遠隔転移なし、Ｍ１：遠隔転移あり。
【００３５】
病期グループ分け：ステージＩ：Ｔ１  Ｎ０  Ｍ０、Ｔ２  Ｎ０  Ｍ０、ステージII：Ｔ３  Ｎ０  Ｍ０、Ｔ４  Ｎ０  Ｍ０、ステージIII：Ｔのいずれか、Ｎ１〜２、Ｍ０、ステージＩＶ：Ｔのいずれか、Ｎのいずれか、Ｍ１。
【００３６】
修正されたデューク病期分類システムによれば、結腸直腸がんの各ステージは次のように定義される。
【００３７】
ステージＡ：腫瘍が腸壁の粘膜に浸潤するがさらには進まない。ステージＢ：腫瘍が腸壁の固有筋層に浸潤し貫通している。ステージＣ：腫瘍が腸壁の固有筋層に浸潤するが貫通せず、リンパ節に結腸直腸がんの病理学的証拠がある、または腫瘍が腸壁の固有筋層に浸潤し貫通しており、リンパ節にがんの病理学的証拠がある、ステージＤ：腫瘍がリンパ節の境界をこえて肝臓、肺または骨のような他の器官へ広がっている。
【００３８】
予後因子は、結腸直腸がんの自然発達に関する変数であって、以前に結腸直腸がんを発症した患者の再発率と結果に影響を与える変数である。予後不良に関係した臨床的特性（clinical parameter）には、例えば、リンパ節の関与、および高悪性度の腫瘍が含まれる。予後因子は、異なる指標再発リスクを有するサブグループに患者を分類するのによく用いられる。
【００３９】
本明細書において“予測”という用語は、患者がＣＲＣを再発する可能性のことを指すために使用される。本発明の予測方法は、任意の特定の患者に対し最適な治療法を選ぶことによって臨床的に治療法を決定するのに用いることができる。
【００４０】
“被験者”または“患者”という用語は、治療を受けている哺乳動物のことを指す。本発明の１実施形態において哺乳動物はヒトである。
【００４１】
“発現に差があるバイオマーカー（differentially  expressed  biomarker）”という用語は、疾病、具体的にはＣＲＣのようながんを患う被験者において、発現が、正常なもしくは対照被験者における発現に比べて、あるいは当該被験者から採取した非がん性組織の発現に比べて、より高いまたはより低いレベルに活性化されるバイオマーカー（つまり、ｍｉＲＮＡなど）のことを指す。この用語には、同じ疾病の異なるステージにおいて発現がより高いまたはより低いレベルに活性化されるバイオマーカーも含まれる。このような差は、前駆体ｍｉＲＮＡまたは成熟ｍｉＲＮＡの変化によって証明され得る。
【００４２】
本発明の特定の実施形態は、被験者における結腸直腸がん（ＣＲＣ）再発の可能性を決定するための方法であって、前記被験者から得たＣＲＣ腫瘍細胞を含む生体試料中のｈｓａ−ｍｉＲ−３６３＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０ａ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ｂ−５ｐ、およびｈｓａ−ｍｉＲ−１２２４−５ｐからなる群より選ばれる２個以上のマイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）の発現量を測定するステップを含む方法に関する。測定された発現量は正規化することができ、かつ、正規化されたｍｉＲＮＡの発現量をＣＲＣ再発への寄与度により重み付けすることを含む方法により再発スコアが計算され得る。被験者におけるＣＲＣ再発の可能性は、再発スコアを用いて決定することができる。本発明のいくつかの実施形態において、生体試料は、被験者由来の新鮮もしくは凍結腫瘍組織、またはかかる組織試料から採取した細胞であり得る。生体試料は、いくつかの実施形態では、ペアの非腫瘍組織（paired non-tumoral tissue）であってもよい。生体試料は、本発明の特定の実施形態において、スモールＲＮＡ（small RNA）を含む。
【００４３】
本発明の特定の実施形態は、被験者における結腸直腸がん再発の可能性を決定する方法であって、結腸直腸腫瘍の除去手術時に被験者から（ａ）結腸直腸腫瘍の試料、および（ｂ）腫瘍が形成された組織と同じタイプの組織である非腫瘍組織のペアの試料を採取するステップを含む方法に関する。全ＲＮＡが、試料（ａ）および（ｂ）の各々の全リボ核酸（ＲＮＡ）から抽出され、かつ試料（ａ）および（ｂ）の各々について抽出したＲＮＡを用い逆転写および定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）が行われる。ｈｓａ−ｍｉｒ−１２２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−５１８ｂ、ｈｓａ−ｍｉｒ−６２９、ｈｓａ−ｍｉｒ−８８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１３９−３ｐ、およびｈｓａ−ｍｉｒ−２２３＊の各ｍｉＲＮＡの正規化された発現量が決定され、かつ前記ｍｉＲＮＡの発現量が、試料中の非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、ＲＮＵ６ＢおよびＲＮＵ４４の発現量に対して正規化され得る。被験者が結腸直腸がんを再発する可能性は、次の式により計算することができる。
【００４４】
再発スコア＝ｅｘｐ（ｙ）／（１＋ｅｘｐ（ｙ））
【００４５】
再発スコアは、以下に記載される統計分析から導かれる式によって決定され得る。
【００４６】
本発明の特定の実施形態において、ｍｉＲＮＡの発現量は、（ａ）ｍｉＲＮＡの逆転写および定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲもしくはＱ−ＰＣＲ）または（ｂ）マイクロアレイ分析を含む方法によって測定され得る。さらに、いくつかの実施形態では、測定されたｍｉＲＮＡの発現量は、１個以上の非コードリボ核酸（ｎｃＲＮＡ）の発現量またはＲＮＡの全入力量に対して正規化されてもよい。本発明の特定の実施形態では、測定された各ｍｉＲＮＡ発現量の個々の寄与度は、被験者の再発スコアおよび／またはＣＲＣ再発の可能性の計算において別々に重み付けされ得る。クレームに係る方法の特定の態様において、特定のｍｉＲＮＡの正規化された発現量は、カプラン・マイヤー（Kaplan-Meier）生存曲線を用いて分析することができる。
【００４７】
“被験者”または“患者”という用語は、治療を受けている哺乳動物のことを指す。被験者はクレームに係る方法において哺乳動物であり得、かつ哺乳動物は、あるクレームに係る方法において、ヒトであり得る。クレームに係る方法のいくつかの態様において、ｍｉＲＮＡの発現量の決定に用いられる生体試料は、新鮮腫瘍組織、例えば、新鮮ＣＲＣ腫瘍組織であってよい。本発明のいくつかの実施形態では、新鮮腫瘍組織は、被験者に行われる外科的切除時に、または生検から得ることができる。
【００４８】
結腸直腸がん組織および任意にペアの非腫瘍組織の新鮮または凍結試料は、本発明での使用に適した被験者から得ることができる。ペアの非腫瘍組織は、がん性ＣＲＣ腫瘍が形成された組織と同じタイプのものであり得る。本発明のいくつかの態様において、用いられる試料は、ＣＲＣ腫瘍およびＣＲＣ腫瘍が形成された組織からのペアの非腫瘍組織の凍結試料である。
【００４９】
組織試料は、被験者におけるＣＲＣの外科手術／切除時に採取することができる。あるいは、試料は、吸引生検のような生検により得ることができる。
【００５０】
クレームに係る方法の発明は、被験者由来の（がん性または非がん性）組織試料からの抽出ＲＮＡを含み得る。ｍｉＲＮＡの発現量を決定するための第１のステップは、目的の試料からのＲＮＡの単離である。ＲＮＡは、当該技術分野で公知の方法によって抽出することができる。全ＲＮＡは組織試料または細胞から抽出され得る。
【００５１】
出発材料は通常、ヒト腫瘍または腫瘍細胞株、および対応する正常組織または細胞株からそれぞれ単離された全ＲＮＡである。よって、ＲＮＡは、結腸もしくは直腸の原発腫瘍、または腫瘍細胞株から単離され得る。ＲＮＡの供給源が原発腫瘍である場合、ＲＮＡは、例えば、凍結または新鮮組織試料から抽出することができる。
【００５２】
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）などを含む）抽出の一般的な方法は当該技術分野において周知であり、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９７）などの分子生物学の標準的なテキストブックに開示されている。具体的には、ＲＮＡ単離は、Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡのような商業的メーカーが提供する精製キット、バッファーセットおよびプロテアーゼを、メーカーの使用説明書にしたがって用いて行うことができる。例えば、培養細胞由来の全ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ｍｉＲＮｅａｓｙミニカラムもしくはＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ（登録商標）ＲＮＡ精製キット（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．)を用いて単離することができる、またはＲＮＡは、グアニジニウムチオシアネート−フェノール−クロロホルムを用いて抽出することもできる（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉ，  “Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｃｉｄ  ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，”  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ａｐｒｉｌ  １９８７，Ｖｏｌ．１６２，ＮＯ．１，ｐａｇｅｓ１５６−１５９）。例えばＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）に基づく方法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）またはＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）に基づく方法（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を用いて抽出することができる。あるいは、ＲＮＡは、フェノール：クロロホルムを使用しない方法、ｍｉｒＶａｎａ（登録商標）ｍｉＲＮＡ単離法（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）を用いて組織から抽出することができる。これらの方法は、グアニジニウムチオシアネートを用いる細胞または組織の破壊と、エタノール溶液での処理と、ＲＮＡ結合ガラス繊維フィルターへの適用を含むものである。結合したＲＮＡは、洗浄してタンパク質、ＤＮＡおよびその他の不純物を除去した後に、フィルターから溶出される。
【００５３】
マイクロＲＮＡ(ｍｉＲＮＡ)は、長いヘアピンを含むｍｉＲＮＡ前駆体(ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ)から解けて２０〜２４ヌクレオチドの一本鎖成熟ｍｉＲＮＡとなり、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に入ると共にこれをガイドして、直接のｍＲＮＡ切断または翻訳抑制によるサイレンシングのための標的メッセージを特定する（Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．，  “ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ：  ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｅｌｌ，２００４，Ｖｏｌ．１１６，ｐａｇｅｓ２８１−２９７；  Ａｍｂｒｏｓ，Ｖ．，“Ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ，”  ２００４，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．４３１，  ｐａｇｅｓ３５０−３５５)。かかるｍｉＲＮＡ介在遺伝子サイレンシングは、様々な発生、代謝、および細胞の過程を調節すると予測されている。
【００５４】
本発明の方法では、特定のｍｉＲＮＡの発現量が決定され、被験者における結腸直腸がんの再発の可能性が予測される。本発明のいくつかの態様において、前記被験者から得られた生体試料（つまり、腫瘍試料、がん細胞、ペアの組織試料など）中のｈｓａ−ｍｉＲ−３６３＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０ａ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ｂ−５ｐ、およびｈｓａ−ｍｉＲ−１２２４−５ｐからなる群より選ばれる２個以上のマイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）について発現量が測定される。
【００５５】
本発明のいくつかの態様において、ｈｓａ−ｍｉｒ−１２２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−５１８ｂ、ｈｓａ−ｍｉｒ−６２９、ｈｓａ−ｍｉｒ−８８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２２３＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０、およびｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ｂ−５ｐからなる群より選ばれる２個以上のマイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）について発現量が測定される。
【００５６】
本発明の特定の態様において、ｈｓａ−ｍｉｒ−１２２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−５１８ｂ、ｈｓａ−ｍｉｒ−６２９、ｈｓａ−ｍｉｒ−８８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１３９−３ｐ、およびｈｓａ−ｍｉｒ−２２３＊からなる群より選ばれる２個以上のマイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）について発現量が測定される。
【００５７】
本発明に用いられ得る発現プロファイリングの方法には、当該分野で知られているポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション分析に基づいた方法およびプロテオミクスに基づいた方法が含まれる。試料中のｍｉＲＮＡ発現の定量化に用いる当該分野で知られた方法には、ノーザンブロッティング、ならびにＰＣＲに基づいた方法（ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ）、例えば逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ)（Ｗｅｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８：２６３−２６４（１９９２））および定量的リアルタイムポリメラーゼ(Ｑ−ＰＣＲ／ｑＲＴ−ＰＣＲ)が含まれる。
【００５８】
近年、多くのｍｉＲＮＡ検出システム、例えばｍｉｒＶａｎａ（登録商標）ｍｉＲＮＡ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）、インベーダーアッセイに基づく検出（ｉｎｖａｄｅｒ  ａｓｓａｙ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）（Ａｌｌａｗｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｉｎｖａｄｅｒ  ａｓｓａｙ，２００４，ＲＮＡ，Ｖｏｌ．１０，ｐａｇｅｓ１３０９−１３２２）、ｍｉｒＭＡＳＡ（登録商標）ｍｉＲＮＡプロファイリング（Ｇｅｎａｃｏ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，ＵＳＡ）（Ｂａｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，“ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：  ｓｙｓｔｅｍ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅｓ，”２００４，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．１４，ｐａｇｅｓ２４８６−２４９４）、および修正されたマイクロアレイ（Ｍｉｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｂｒａｉｎ，”２００４，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ，Ｖｏｌ．５，ｐａｇｅ  Ｒ６８；Ｂａｂａｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｗｉｔｈ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：  ｔｉｓｓｕｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，”２００４，ＲＮＡ，  Ｖｏｌ．  １０，  ｐａｇｅｓ  １８１３−１８１９）が開発されている。高感度リアルタイムＰＣＲ法がｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの発現を定量化するため、開発されている（Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｍｏｎｉｔｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ，”２００４  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．３２，ｐａｇｅ  ｅ４３）。
【００５９】
本発明の様々な実施形態において、開示されるバイオマーカーの発現量の決定には、各種の技術的アプローチ、例えば逆転写、ｑＲＴ−ＰＣＲ、およびマイクロアレイが利用できるが、これらに限定されることはない。本発明のいくつかの態様において、ｍｉＲＮＡの発現量は、ｍｉＲＮＡの逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）および定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を含む方法によって測定される。
【００６０】
逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、各種試料におけるＲＮＡ（つまり、ｍｉＲＮＡ、ｎｃＲＮＡなど)の量（level）の決定に用いることができる。その結果は、試料の組、例えば、正常および腫瘍組織間における遺伝子発現パターンを比較するのに用いることができる。
【００６１】
ＲＮＡはＰＣＲの鋳型になり得ないため、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングにおける第１のステップは、ＲＮＡ鋳型のｃＤＮＡへの逆転写、それに続くＰＣＲ反応におけるその指数関数的増幅である。最もよく用いられる２つの逆転写酵素は、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ａｖｉｌｏ  ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，ＡＭＶ−ＲＴ)およびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，ＭＭＬＶ−ＲＴ)である。逆転写のステップは通常、状況および発現プロファイリングの目標に応じて、特定のプライマー、ランダムヘキサマーまたはオリゴ-ｄＴプライマーを用いて開始される。例えば、抽出ＲＮＡは、ＧｅｎｅＡｍｐ ＲＮＡ ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）をメーカーの使用説明書にしたがって用い、逆転写することができる。得られたｃＤＮＡは、後続のＰＣＲ反応における鋳型として用いることができる。
【００６２】
ＰＣＲステップは、様々な熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いることができるが、通常は５’−３’ヌクレアーゼ活性を有する一方で３’−５’プルーフリディングエンドヌクレアーゼ活性は持たないＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを採用する。よって、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲは通常、ＴａｑまたはＴｔｈポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性を利用して、その標的アンプリコンに結合するハイブリダイゼーションプローブを加水分解するが、同等の５’ヌクレアーゼ活性を持ついずれの酵素も使用することができる。２つのオリゴヌクレオチドプライマー（つまり、特定のｍｉＲＮＡまたはｎｃＲＮＡなどに対するプライマー）を用いて、ＰＣＲ反応に特有なアンプリコンが生成される。
【００６３】
特定の実施形態では、３番目のオリゴヌクレオチドまたはプローブが、２つのＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を特異的に検出するように設計される。プローブはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素により伸長ができず、レポーター蛍光色素およびクエンチャー蛍光色素で標識される。これら２種の色素がプローブ上にてすぐ近くにあるときに、レポーター色素からのレーザー誘起発光（laser-induced emission）はいずれも、クエンチャー色素により消光される。増幅反応時において、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素は鋳型依存的にプローブを切断する。結果として得られたプローブ断片は溶液中にて切り離され、かつ放出されたレポーター色素からの信号は、第２のフルオロフォアの消光効果によりなくなる。レポーター色素の１つの分子は、新しい分子が合成されるごとに放出され、そして消光されないレポーター色素の検出が、データの定量的説明の根拠を与える。
【００６４】
本発明のいくつかの態様では、マイクロＲＮＡの発現量の決定に用いる既知の手法、例えばＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  Ａｒｒａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）および／またはＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）が用いられ得る。ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓは、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓリアルタイムＰＣＲ機器を用いて成熟マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、スモール干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、およびその他のスモールＲＮＡを検出しかつ定量化するように設計された、予め作製されたプライマーおよびブローブのセットである。このアッセイは、６ｌｏｇより大きいダイナミックレンジを持つ１〜１０ｎｇの全ＲＮＡにおけるスモールＲＮＡを検出および定量化することができる。マイクロＲＮＡの分析に用いられるとき、このアッセイは成熟ｍｉＲＮＡ配列とそれらの前駆体とを区別することができる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓは、ｍｉＲＢａｓｅのｍｉＲＮＡ配列リポジトリ中にある大部分のコンテンツが使用可能な、予め設計されたアッセイである。これらのアッセイは、標的を絞った定量化、スクリーニング、およびｍｉＲＮＡプロファイリング結果の検証に用いることができる。
【００６５】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲは、例えばＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７５００（登録商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）、またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のような市販の装置を使用して行うことができる。
【００６６】
ｑＲＴ−ＰＣＲに用いられ得るシステムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ)、カメラおよびコンピュータからなるものであってよい。このシステムは、サーモサイクラー上の９６ウェル形式で試料を増幅することができる。増幅時において、９６ウェル全てについて光学ファイバーケーブルによりリアルタイムでレーザー誘起蛍光信号が収集されると共に、ＣＣＤで検出される。このシステムは、機器を動作させるため、およびデータを分析するためのソフトウェアを含む。
【００６７】
５’−ヌクレアーゼアッセイデータは、最初はＣｔ、または閾値サイクル（threshold cycle）として表され得る。上述したように、蛍光値はサイクルごとに記録され、増幅反応においてその点まで増幅した産物の量を表す。蛍光信号が統計的に有意なものとして最初に記録されるときの点が、閾値サイクル(Ｃｔ)である。
【００６８】
別の種類のＲＴ−ＰＣＲ技術は、リアルタイム定量的ＰＣＲ(Ｑ−ＰＣＲまたはｑＲＴ−ＰＣＲ)であって、これは二重標識化蛍光発生プローブ (つまり、ＴａｑＭａｎ（登録商標)プローブ）によりＰＣＲ産物の蓄積を測定するものである。リアルタイムＰＣＲは、各標的配列に対する内部競合物質（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）が正規化のために用いられる定量的競合ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＰＣＲ）、および試料中に含まれる正規化遺伝子またはＲＴ−ＰＣＲ用のハウスキーピング遺伝子を用いる定量的比較ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ，ＰＣＲ）の両方に適合し得る。さらなる詳細は、例えばＨｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９８６−９９４  （１９９６）を参照されたい。
【００６９】
誤差および試料間変動の影響を最小限に抑えるため、ＲＴ−ＰＣＲは通常、内部標準を用いて行われる。理想的な内部標準は、異なる組織において一定の量で発現し、かつ試験処理による影響を受けないものである。
【００７０】
マイクロＲＮＡの発現量を決定するとき、出発材料の量、試料の収集、ＲＮＡの調製および質、ならびに逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）効率のばらつきは、定量化エラーの一因となり得る。内在性コントロール遺伝子に対する正規化は、潜在的なＲＮＡインプットまたはＲＴ−ＰＣＲ効率のバイアスを補正するのに用いられ得る。よって、ｍｉＲＮＡの発現量は、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、特定のｍｉＲＮＡまたはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の発現量に対して正規化され得る。正規化の目的で用いることのできる非コードＲＮＡは、ＲＮＵ２４、ＲＮＵ６６、ＲＮＵ１９、ＲＮＵ３８Ｂ、ＲＮＵ４９、Ｚ３０、ＲＮＵ４８、ＲＮＵ４３、Ｕ１８、ＲＮＵ５８Ｂ、ＲＮＵ５８Ａ、ＲＰＬ２１、Ｕ５４、ＨＹ３、Ｕ７５、ＲＮＵ６８、ＲＮＵ４４、Ｕ４７およびＲＮＵ６Ｂなどを含む。正規化の目的で用いることのできるｍｉＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２Ｎ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４およびｈｓａ−ｍｉＲ−１６などを含む。あるいは、本発明のいくつかの態様では、１８Ｓ  ｒＲＮＡが正規化のために用いられ得る。ｎｃＲＮＡ発現量および全インプットＲＮＡが正規化のために用いられると好ましい。あるいは、正規化は、アッセイされた遺伝子全てまたはその大きなサブセットの平均値または中央値信号（Ｃｔ）に基づくものであってもよい（グローバル正規化アプローチ）。
【００７１】
本発明の特定の実施形態において、目的のｍｉＲＮＡの測定された発現量は、１個以上の非コードリボ核酸（ｎｃＲＮＡ）の発現量に対して正規化される。本発明のいくつかの態様では、ＲＮＵ６Ｂ、ＲＮＵ４４、および／またはＲＮＵ４８の発現量が、目的のｍｉＲＮＡの正規化された発現量を決定するのに用いられる。本発明の特定の態様において、ＲＮＵ６Ｂ、および／またはＲＮＵ４４の発現量が、目的のｍｉＲＮＡの正規化された発現量を決定するのに用いられる。
【００７２】
本発明のいくつかの実施形態において、目的のｍｉＲＮＡの測定された発現量は、ＲＮＡの総量、１個以上のｍｉＲＮＡの発現量、または１個以上の１８Ｓ  ｒＲＮＡの発現量に対して正規化される。本発明のいくつかの態様では、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６および／またはｈｓａ−ｍｉＲ−９２の発現量が、目的のｍｉＲＮＡの正規化された発現量を決定するのに用いられ得る。本発明の別の実施形態において、ｍｉＲＮＡの測定された量は正規化されず、未処理のｑＰＣＲ  Ｃｔ結果が再発スコアを計算するのに用いられ得る。
【００７３】
バイオマーカー／ＲＮＡの発現の差異も、マイクロアレイ技術を用いて同定または確認することができる。よって、マイクロアレイ技術を利用して、組織／細胞における結腸直腸がん関連バイオマーカーの発現プロファイルが測定され得る。この方法においては、目的のポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む）が、マイクロチップ基板上に覆われるまたは配置される。次いで、配置された配列が、目的の細胞または組織由来の特定のＤＮＡプローブにハイブリダイズする。ＲＴ−ＰＣＲ法と同じように、ｍＲＮＡの供給源は通常、ヒト腫瘍または腫瘍細胞株、および対応する正常組織または細胞株から単離された全ＲＮＡである。よって、ＲＮＡは、様々な原発腫瘍または腫瘍細胞株から単離され得る。ｍＲＮＡの供給源が原発腫瘍である場合、ｍＲＮＡは組織試料または細胞から抽出することができる。
【００７４】
マイクロアレイ技術の特定の実施形態では、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅インサートが、高密度の配置で基板に適用される。少なくとも１００００個のヌクレオチド配列が基板に適用されることが好ましい。マイクロチップ上に１００００個の要素それぞれに固定化され、マイクロアレイされた遺伝子は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションに適している。蛍光標識されたｃＤＮＡプローブは、目的の組織から抽出されたＲＮＡの逆転写による蛍光ヌクレオチドの取り込みによって生成され得る。チップに適用される標識ｃＤＮＡプローブは、アレイ上のＤＮＡの各スポットと特異的にハイリダイズする。ストリンジェントな洗浄で非特異的に結合したプローブを除去した後、そのチップは、共焦点レーザー顕微鏡またはＣＣＤカメラのようなその他の検出手段により走査される。配置された各要素のハイブリダイゼーションの定量によって、対応するｍＲＮＡの存在量の評価が可能となる。二色蛍光により、２つの供給源のＲＮＡから生成された別々に標識されたｃＤＮＡプローブは、アレイに対して対になって（pair wise）ハイブリダイズする。よって、特定の各遺伝子に対応する２つの供給源からの転写物の相対的存在量が同時に決定される。ハイブリダイゼーションの規模の小型化により、多数の遺伝子の発現パターンの簡便かつ迅速な評価が可能となる。かかる方法は、細胞当たり数コピーでしか発現されない稀な転写物を検出し、かつ発現量における少なくともほぼ２倍の差異を再現可能に検出するのに必要な感度を有することが示されている（Ｓｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３（２）：１０６−１４９（１９９６））。マイクロアレイ分析は、市販の装置により製造業者のプロトコールにしたがって、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎＣｈｉｐ技術、またはＩｎｃｙｔｅのマイクロアレイ技術を用いることにより、行うことができる。
【００７５】
本発明の方法で用いる材料は、周知の手順にしたがって作製されるキットの調製に適している。よって、本発明は、被験者におけるＣＲＣ再発の可能性の予測のため開示されるバイオマーカー（つまりｍｉＲＮＡ)の発現を定量化するためのバイオマーカー特異的なもしくはバイオマーカー選択的なプローブおよび／またはプライマーを含み得る試薬を含むキットを提供する。かかるキットは任意で、腫瘍試料または細胞からのＲＮＡの抽出のための試薬を含み得る。さらに、キットは、本発明の方法におけるそれらの使用に関しての識別の表示または標識または使用説明書を伴う試薬を任意で含み得る。キットは、容器(本方法の自動化実施における使用に適するマイクロタイタープレートを含む）を含んでいてもよく、各々が本方法で用いられる１つ以上の各種試薬（通常は濃縮された形で）、例えば、あらかじめ作製されたマイクロアレイ、バッファー、適したヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、またはｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰおよびＵＴＰ）、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ならびに本発明の１つ以上のプローブおよびプライマー（例えば、ＲＮＡポリメラーゼと反応するプロモーターへの結合に適した長さのポリ（Ｔ）またはランダムプライマー)を含むものである。予後または予測情報を評価または定量化するために用いられる数学アルゴリズムもまた、適正に、キットの潜在的要素である。
【００７６】
よって、本発明のキットは、（ａ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３６３＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０ａ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ｂ−５ｐ、およびｈｓａ−ｍｉＲ−１２２４−５ｐからなる群より選ばれる少なくとも２個のｍｉＲＮＡをｃＤＮＡに特異的に逆転写するための少なくとも２個の逆転写プライマー、（ｂ）前記ｍｉＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡに特異的に結合する少なくとも２個のプローブであって、存在しているｍｉＲＮＡを定量化するための定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）に用いるのに適するプローブ、ならびに少なくとも１個の非コードＲＮＡを特異的に逆転写するため逆転写プライマー、および少なくとも１個の非コードＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡに特異的に結合するプローブであって、存在している非コードＲＮＡを定量化するための定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）に用いるのに適するプローブ、を含み得る。
【００７７】
ＣＲＣ再発の可能性を計算するための予測モデルは、外科的切除を受けた結腸直腸患者を募集すること、ならびに患者由来のがん組織／細胞およびペアの非がん性組織／細胞における様々な既知のｍｉＲＮＡの正規化された発現量の統計分析（つまり、Ｔ−検定、ウィルコクソンの符号順位検定、ロジスティック回帰、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析、コックス比例ハザードモデル、ピアソン相関分析およびカプラン・マイヤー推定量、など)を行うこと、同時に特定期間における患者のＣＲＣ再発率を考慮に入れること、を含む方法により得ることができる。
【００７８】
本発明のいくつかの態様において、募集した外科的切除を受けたＣＲＣ患者は、訓練データセット（training dataset）および試験データセット（testing dataset）に無作為に割り当てられ得る。各データセットは２つのリスク群に分類され得る。“低リスク”は手術後３年より長い無病と定義され、“高リスク”は手術後３年未満での再発と定義されるものである。結腸直腸がん組織とペアの非腫瘍組織の試料は、全ての被験者から得ることができ、かつ正規化された発現量を決定するためのｍｉＲＮＡおよびその他のバイオマーカーの群の発現量が決定され得る。測定されるｍｉＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、またはｒＲＮＡ（ｎｃＲＮＡおよびｒＲＮＡは正規化のために測定される）は、当該分野で知られているいずれのものであってもよい。少なくとも７５４個のヒトｍｉＲＮＡが当該分野において知られている。
【００７９】
本発明の特定の実施形態では、以下のｍｉＲＮＡのうちの少なくとも２個の正規化された発現量が、患者におけるＣＲＣ再発の可能性の予測モデルを得るために用いられる統計分析において考慮される：ｈｓａ−ｍｉＲ−３６３＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０ａ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ｂ−５ｐ、およびｈｓａ−ｍｉＲ−１２２４−５ｐ。
【００８０】
いくつかの実施形態において、以下のｍｉＲＮＡの正規化された発現量が、患者におけるＣＲＣ再発の可能性の予測モデルを得るために用いられる統計分析において考慮される：ｈｓａ−ｍｉｒ−１２２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１３９−３ｐ、およびｈｓａ−ｍｉＲ−２２３＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０、およびｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ｂ−５ｐ。
【００８１】
続いて、発現量が統計分析に供され、患者におけるＣＲＣ再発の可能性を予測するための予測モデル／方程式が得られ得る。よって、本発明のいくつかの態様では、Ｔ−検定およびウィルコクソンの符号順位検定が、２つの定義された患者群（低リスク、高リスク）についての発現量データに適用されて、遺伝子発現データ中の有意なバイオマーカー（例えばｍｉＲＮＡ）の候補（Ｐ値＜０．０５）が決定され得る。ピアソン相関分析は、再発の時間と遺伝子発現との間の相関関係を計算するのに用いることができる。
【００８２】
被験者が高リスクか低リスクかをよりよく見分けるため、ロジスティック回帰分析およびＲＯＣ曲線分析が、ＲＴ−ＰＣＲデータからのＣｔ値の分析に用いられ得る。また、カプラン・マイヤー法およびコックス比例ハザード回帰モデルも用いることができる。
【００８３】
候補遺伝子(ｑＰＣＲデータ)および臨床学的因子を組み合わせ、ロジスティック回帰分析を用いて反応変数および多重の予測因子のモデルを作ることができる。感度対１−特異度をプロットすることにより基準のそれぞれについてＲＯＣ曲線が作成され得る。このプロセスは、ロジスティック回帰分析によって、推定の感度および特異度の各情報（observation）を計算し、かつ各ケースについての予測確率をも算出するものである。曲線下面積(AUC)がモデルの性能を示すために算出されてもよい。
【００８４】
事象は、研究期間における再発または死亡の時として定義され得る。全てのケースは、追跡不能または研究期間(５年)の終了の時点で打ち切られ得る。カプラン・マイヤー法が、無病生存(ＤＦＳ)率を計算し、かつ定義された２つの群（高および低リスク）間の生存曲線をプロットするのに用いられ得る。ログランク検定（log-rank test）は、２つの群の２つの生存分布を比較するために用いることができる。このような分析を考慮して、モデルを作成するために候補および臨床学的因子が選択され得る。候補遺伝子は、コックス比例ハザード回帰モデルを用いて同定し、低リスクの被験者を高リスクの被験者と比べたときの遺伝子発現量間の相互作用を検討することができる。またハザード比（ＨＲ)も、コックス比例ハザード回帰モデルによって算出され得る。
【００８５】
Ｔ−検定は当該分野において知られており、帰無仮説が支持される場合に、検定統計量がスチューデントのｔ分布（Student's t distribution）にしたがう統計学的仮説検定である。これは、検定統計量におけるスケーリング項（scaling term）の値が既知である場合に検定統計量が正規分布にしたがうときに適用できる。スケーリング項が未知であり、かつデータに基づいた推定量（estimate）に置き換えられるとき、検定統計量は(特定の条件下)スチューデントのｔ分布にしたがう。Ｔ−検定は、２つの群の平均値が互いに統計的に異なるかどうかを評価するのに用いることができる。
【００８６】
ウィルコクソンの符号順位検定（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ，“Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｂｙ  ｒａｎｋｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ，”１９４５，Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，Ｖｏｌ．１，ＮＯ．６,  ｐａｇｅｓ８０−８３；  Ｓｉｅｇｅｌ，“Ｎｏｎ−ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”１９５６，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ７５−８３）は、２つの関連する試料または単一の試料への反復測定を比較する場合それらの母平均が異なるかどうかを評価するために用いられ得るノンパラメトリック統計学的仮説検定である(つまり二群間の差の検定（paired difference test）)。
【００８７】
ピアソンの積率相関係数(ピアソン相関分析)は、２つの変数ＸとＹの間の相関関係（一次従属）を測定するのに用いることができ、＋１から−１までの値をとる。それは、２つの変数の間の一次従属の強度の目安として用いられ得る。
【００８８】
候補遺伝子および臨床学的因子を組み合わせ、ロジスティック回帰法を用いて予測モデルを作ることができる。モデルの効果は、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析によって確認することができる。カプラン・マイヤー法は、二群間における患者の生存率を比較するために実行され得る。候補バイオマーカー／遺伝子（つまり、ｍｉＲＮＡなど）は、コックス比例ハザード回帰モデルを用いて同定することができ、これにより低リスクの患者を高リスクの患者と比べたときの遺伝子発現量間の相互作用効果を検討する。高リスク患者対低リスク患者で測定したときに、候補のハザード比(危険率)は異なるものになり得る。
【００８９】
信号検出理論において、受信者動作特性（ＲＯＣ）、即ち単にＲＯＣ曲線は、その識別閾値（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）が変化するときのバイナリ分類子システムのための、感度、即ち真陽性率ｖｓ偽陽性率（１−特異度、即ち１−真陰性率）のグラフ上のプロットである。ＲＯＣはまた、陽性中の真陽性の割合（ＴＰＲ＝真陽性率）ｖｓ陰性中の偽陽性の割合（ＦＰＲ＝偽陽性率）をプロットすることによっても、同じように表され得る。それは、基準が変化するときの２つの動作特性（ＴＰＲ＆ＦＰＲ）の比較であることから、相対動作特性曲線としても知られる。ＲＯＣ分析は、コストコンテクスト（ｃｏｓｔ  ｃｏｎｔｅｘｔ）またはクラス分布からは独立して（かつそれらを特定するのに先立って）、最適と思われるモデルを選択し、かつ次善のモデルを棄却するためのツールを提供する。
【００９０】
積極限推定量としても知られるカプラン・マイヤー推定量(Ｋａｐｌａｎ  ａｎｄ  Ｍｅｉｅｒ，“Ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ，”１９５８，Ｊ．Ａｍｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔ  Ａｓｓｎ，Ｖｏｌ．５３，ｐａｇｅｓ４５７−４８１)は、寿命データから生存時間関数を推定するための推定量である。これは、治療後一定期間生存している患者の割合を測定するのに用いることができるものである。生存時間関数のカプラン・マイヤー推定値のプロットは、十分な量の試料が採取されるときに、その母集団の真の生存時間関数に近づく、水平方向に大きさが減少する一連の階段である。連続する別個のサンプリングされた情報間の生存時間関数の値は一定であると推定される。本発明のいくつかの実施形態は、カプラン・マイヤー生存曲線を用いてＣＲＣ再発と相関性のある特定のｍｉＲＮＡの正規化された発現量を分析することを含み得る。
【００９１】
ログランク検定を伴うカプラン・マイヤー法が２つ以上の群で生存曲線を比較するのに有用であるのに対し、コックス比例ハザード回帰は、数個の危険因子の生存への影響を分析できるようにするものである（Ｃｏｘ，“Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｏｄｅｌｓ  ａｎｄ  Ｌｉｆｅ−Ｔａｂｌｅｓ，”１９７２，Ｊ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｔａｔ  Ｓｏｃ，  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ  （Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ），Ｖｏｌ．３４，ＮＯ．２，ｐａｇｅｓ１８７−２２０．）。エンドポイント(死亡、またはその他任意の対象のイベント、例えばＣＲＣの再発)の確率がハザードとして指定される。
【００９２】
上述の統計学的手法は、既知の統計分析用のコンピュータプログラムを用いて実行することができる。
【００９３】
患者におけるＣＲＣ再発の可能性を予測するための本発明の２つの例示的再発予測モデルは次の通りである。
【００９４】
再発予測モデル１
【００９５】
再発スコア＝ｅｘｐ（ｙ）／（１＋ｅｘｐ（ｙ））
ここでｙは次の通りである。
【００９６】
【数１】
0005836397.tif 000002
【００９７】
再発予測モデル２
【００９８】
再発スコア＝ｅｘｐ（ｙ）／（１＋ｅｘｐ（ｙ））
ここでｙは次の通りである。
【００９９】
【数２】
0005836397.tif 000003
【０１００】
上記の予測モデルにおいて、（腫瘍）は、腫瘍試料またはがん細胞の試料における特定のｍｉＲＮＡの発現を示し、（正常）は、腫瘍が形成された組織と同じタイプの組織である非がん性組織由来の試料における特定のｍｉＲＮＡの発現を示す。
【０１０１】
これらは本発明による２つの例示的な予測モデルにすぎない。本明細書に開示された方法を用いて他の予測モデルを開発することができる。他の予測モデルは、より多くのまたはより少ないマイクロＲＮＡを用いて、患者におけるＣＲＣ再発の可能性を予測することができる。
【０１０２】
よって、ＲＮＡは、ＣＲＣ患者由来の腫瘍試料またはがん細胞から抽出することができる。予測モデルに用いられる特定のｍｉＲＮＡの正規化された発現量が決定され、かつこれら発現量を利用してＣＲＣ再発の可能性が計算され得る。
【０１０３】
本発明により提供される方法は、全体または一部において自動化され得る。
【０１０４】
本発明の方法は、本発明の方法によって生じる予測をまとめたレポートの作成に適している。したがって、本発明は、レポートを作成する方法、およびその結果としてのレポートを提供する。レポートは、患者の腫瘍組織から得られる細胞中の特定のバイオマーカー（つまり、ｍｉＲＮＡなど）のＲＮＡ転写産物の発現量についての概要を含み得る。本発明のいくつかの実施形態では、レポートは、再発スコアおよび／または再発スコアを用いてなされるＣＲＣ再発の可能性の決定により作成される。レポートは、上述の被験者がＣＲＣ再発の可能性が高いという予測を含み得る。レポートは、手術のみまたは手術と化学療法との併用などの治療法についての推奨を含み得る。レポートは、電子形式で、または紙面上に示され得る。
【０１０５】
本発明の全ての態様は、例えば高いピアソン相関係数から明らかとなるように、開示された遺伝子と共発現し、限られた数のさらなる遺伝子が、開示されたバイオマーカーに加えておよび／またはその代わりに予測試験に用いられるように、実施されてもよい。
【０１０６】
本発明を説明したが、以下の実施例を参照することによって一層容易に本発明が理解でき、これら実施例は例示として提供されるものであって、決して本発明を限定することを意図したものではない。本開示における全ての引用は、参照することにより本明細書に明示的に組み込まれる。
【実施例】
【０１０７】
実施例１
患者および組織試料
結腸直腸がん患者８０人は、外科的切除を受け、台湾台南の国立成功大学病院（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｎｇ−Ｋｕｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，  Ｔａｉｎａｎ，  Ｔａｉｗａｎ）で募集された。これらの患者を訓練データセット（ｎ＝６５）および試験データセット（ｎ＝１５）に無作為に割り当てた。患者の特徴を表１にまとめる。各データセットは２つのリスク群からなった。“低リスク”は手術後無病として定義し、“高リスク”は手術後３年未満での再発と定義した。結腸直腸がん組織とペアの非腫瘍組織の凍結試料を全ての被験者から得た。
【０１０８】
【表１】
0005836397.tif 000004
【０１０９】
本研究における患者に関するより詳細な情報を以下の表２〜４に提示する。
【０１１０】
【表２】
0005836397.tif 000005
【０１１１】
【表３】
0005836397.tif 000006
【０１１２】
【表４】
0005836397.tif 000007
【０１１３】
マイクロＲＮＡプロファイリング
ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）に基づく方法を用い、全ての研究被験者から全ＲＮＡを抽出した。創製段階（discovery phase）では、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  Ａｒｒａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｈｕｍａｎ  ＭＩ＿Ｖ２（ヒトマイクロアレイバージョン２、１１４６個のプローブを含む)（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて３０個の潜在的な候補を同定した。その後、カスタムＴａｑＭａｎ（登録商標）ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を、検証およびアルゴリズム開発（algorithm development）のために用いた。マイクロアレイを用いて、約３０個のスモールＲＮＡ候補が含まれる有意な差異のあるスモールＲＮＡ候補を選んだ。ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓを用いて、選ばれた３０個の候補をさらに検証した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓを用いて、１９個のｍｉＲＮＡ候補が高／低リスク群間で発現の差異を示した。全体的な創製プロセスを図１に要約する。各ｍｉＲＮＡの発現量は閾値サイクル（Ｃｔ）値で表した。次いで、各ｍｉＲＮＡのＣｔ値を、ｍｉＲＮＡ定量化アッセイの内部標準（internal controls）としてよく用いられるＲＮＵ６ＢおよびＲＮＵ４４の発現量により正規化した。最後に、正規化されたｍｉＲＮＡ発現量をｄＣｔとして表した。
【０１１４】
統計分析
２つの定義された群（低リスク、高リスク）にしたがい、Ｔ−検定およびウィルコクソンの符号順位検定を利用して、遺伝子発現データにおける有意な候補を決定した（Ｐ−値＜０．０５）。ピアソン相関分析を用い、再発時間および遺伝子発現間の相関関係を計算した。
【０１１５】
候補遺伝子および臨床学的因子を組み合わせ、ロジスティック回帰法を用いて予測モデルを作った。モデルの効果は、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析によって確認した。カプラン・マイヤー法を実行し、二群間における患者の生存率を比較した。候補遺伝子をコックス比例ハザード回帰モデルを用いて同定し、低リスクの患者を高リスクの患者と比べたときの遺伝子発現量間の相互作用効果を検討した。高リスク患者対低リスク患者で測定したときに、候補のハザード比(危険率)は変化した。
【０１１６】
高リスクまたは低リスクの被験者をよりはっきりと区別するため、ロジスティック回帰分析およびＲＯＣ曲線分析を考慮して、ＲＴ−ＰＣＲデータからのＣｔ値を分析した。加えて、その目的は、がんの再発の進行をよりよく理解するためであった。カプラン・マイヤー法およびコックス比例ハザード回帰モデルも用いた。
【０１１７】
候補遺伝子(ｑＰＣＲデータ)および臨床学的因子を組み合わせ、ロジスティック回帰分析を用いて反応変数および多重の予測因子のモデルを作った。感度対１−特異度をプロットすることにより基準（criteria）のそれぞれについてＲＯＣ曲線を作成した。このプロセスは、ロジスティック回帰分析によって、推定の感度および特異度の各情報（observation）を計算し、かつ各ケースについての予測確率をも算出するものである。曲線下面積（ＡＵＣ）を算出して、モデルの性能を示した。
【０１１８】
研究期間における再発または死亡の時として事象を定義した。全てのケースは、追跡不能または研究期間(５年)の終了の時点で打ち切られた。カプラン・マイヤー法を実行し、２つの定義された群（高リスク、低リスク）間で、無病生存（ＤＦＳ）率を計算すると共に、生存曲線をプロットした。ログランク検定を、２つの群の２つの生存分布の比較のために用いた。先に考慮した候補および臨床学的因子をモデルに用いるべく選択した。候補遺伝子はコックス比例ハザード回帰モデルを用いて同定でき、低リスクの被験者を高リスクの被験者と比べたときの遺伝子発現量間の相互作用効果を検討した。またハザード比（ＨＲ)もコックス比例ハザードモデルで算出した。
【０１１９】
結果
１８個のｍｉＲＮＡ：ｈｓａ−ｍｉＲ−３６３＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０ａ＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ｂ−５ｐ、およびｈｓａ−ｍｉＲ−１２２４−５ｐを含む、結腸直腸がん（ＣＲＣ）再発バイオマーカーの発現量を測定した。ＣＲＣ再発バイオマーカーについて測定された発現量を正規化するために、２つの参照非コードＲＮＡ、ＲＮＵ６ＢおよびＲＮＵ４４の発現量も測定した。測定されたＣＲＣバイオマーカー（マイクロＲＮＡ）の配列情報を表５に要約する。
【０１２０】
【表５−１】
0005836397.tif 000008
【０１２１】
【表５−２】
0005836397.tif 000009
【０１２２】
実行された統計分析から作成された２つの再発予測モデルを以下に詳述する。以下の予測モデルにおいて、（腫瘍）は、腫瘍試料またはがん細胞の試料における特定のｍｉＲＮＡの発現を示し、（正常）は、腫瘍が形成された組織と同じタイプの組織である非がん組織由来の試料における特定のｍｉＲＮＡの発現を示す。
【０１２３】
再発予測モデル１
本研究の患者集団の腫瘍組織および適合組織における発現量の統計分析に基づき、次の予測モデルを作成した。
【０１２４】
再発スコア＝ｅｘｐ（ｙ）／（１＋ｅｘｐ（ｙ））
ここでｙは次の通りである。
【０１２５】
【数３】
0005836397.tif 000010
【０１２６】
再発予測モデル２
本研究の患者集団の腫瘍組織および適合組織における発現量の統計分析に基づき、次の第２の予測モデルを作成した。
【０１２７】
再発スコアｓｃｏｒｅ＝ｅｘｐ（ｙ）／（１＋ｅｘｐ（ｙ））
ここでｙは次の通りである。
【０１２８】
【数４】
0005836397.tif 000011
【０１２９】
再発モデルの作成において実行され、かつ信頼される統計分析の結果を図２〜６０に示す。図２〜６０は、特定のマイクロＲＮＡ候補の組み合わせを示しており、これらはＡＵＲＯＣ＞０．８５（臨床上有用である）に達することができた。これらは本発明の実施例であって、全ての可能な実施形態を包含することは意図されていない。
【０１３０】
本発明を、特定の実施形態と見なされるものに関して説明したが、本発明はかかる実施形態に限定はされないと理解されるべきである。それとは反対に、本発明は、添付の特許請求の範囲の精神および範囲に含まれる様々な変更および均等物を含むことが意図されている。本開示において引用された全ての参考文献は、参照することにより本明細書に明示的に組み込まれる。
【０１３１】
開示された実施形態に対し様々な変更および変化を加え得ることは、当業者には明らかであろう。発明の詳細および実施例は単に例示として見なされることが意図され、本開示の真の範囲は以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物によって示される。
【図１】
0005836397.tif 000012
【図２】
0005836397.tif 000013
【図３】
0005836397.tif 000014
【図４】
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【図５】
0005836397.tif 000016
【図６】
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【図７】
0005836397.tif 000018
【図８】
0005836397.tif 000019
【図９】
0005836397.tif 000020
【図１０】
0005836397.tif 000021
【図１１】
0005836397.tif 000022
【図１２】
0005836397.tif 000023
【図１３】
0005836397.tif 000024
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
0005836397.tif 000027
【図１７】
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【図１８】
0005836397.tif 000029
【図１９】
0005836397.tif 000030
【図２０】
0005836397.tif 000031
【図２１】
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【図２２】
0005836397.tif 000033
【図２３】
0005836397.tif 000034
【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
0005836397.tif 000037
【図２７】
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【図２８】
0005836397.tif 000039
【図２９】
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【図３０】
0005836397.tif 000041
【図３１】
0005836397.tif 000042
【図３２】
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【図３３】
0005836397.tif 000044
【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
0005836397.tif 000047
【図３７】
0005836397.tif 000048
【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
0005836397.tif 000051
【図４１】
0005836397.tif 000052
【図４２】
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【図４３】
0005836397.tif 000054
【図４４】
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【図４５】
0005836397.tif 000056
【図４６】
0005836397.tif 000057
【図４７】
0005836397.tif 000058
【図４８】
0005836397.tif 000059
【図４９】
0005836397.tif 000060
【図５０】
0005836397.tif 000061
【図５１】
0005836397.tif 000062
【図５２】
0005836397.tif 000063
【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
0005836397.tif 000070
【図６０】
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【配列表】
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