(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を収容する凹部が一面側に形成され、計測対象の環境因子の透過を阻害する材料で形成された第１層と、
前記第１層の他面側に配置され、前記第１層の材料と異なる材料で形成された第２層と、
前記凹部の内面に形成され、前記環境因子に応じて光学的反応を生じさせるプローブ部と、を備え、
前記プローブ部は、前記凹部の底面部分に形成され、
前記プローブ部の材料の軟化点は、前記第１層の材料の軟化点よりも高温であるマイクロリアクターデバイス。
【請求項２】
請求項１に記載のマイクロリアクターデバイスにおいて、
前記第２層の材料は、前記第１層の材料よりもヤング率が低いマイクロリアクターデバイス。
【請求項３】
請求項１に記載のマイクロリアクターデバイスにおいて、
前記第２層の材料の軟化点は、前記第１層の材料の軟化点よりも低温であるマイクロリアクターデバイス。
【請求項４】
請求項１から請求項３のいずれか１項に記載のマイクロリアクターデバイスにおいて、
前記第１層および前記第２層は、透光性を有する材料で形成されるマイクロリアクターデバイス。
【請求項５】
請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のマイクロリアクターデバイスにおいて、
前記第１層の他面側における前記凹部の対応領域が前記第２層の方向に突出しているマイクロリアクターデバイス。
【請求項６】
請求項１から請求項５のいずれか１項に記載のマイクロリアクターデバイスにおいて、
前記第１層および前記第２層がシート状であるマイクロリアクターデバイス。
【請求項７】
請求項６に記載のマイクロリアクターデバイスにおいて、
前記第１層および前記第２層が可撓性を有するマイクロリアクターデバイス。
【請求項８】
請求項６または請求項７に記載のマイクロリアクターデバイスにおいて、
シートの凹部形成面を除く部分に把手が形成されたマイクロリアクターデバイス。
【請求項９】
請求項１から請求項８のいずれか１項に記載のマイクロリアクターデバイスにおいて、
前記第１層の平面方向に前記凹部が複数配列されているマイクロリアクターデバイス。
【請求項１０】
請求項１から請求項９のいずれか１項に記載のマイクロリアクターデバイスにおいて、
前記第１層は、酸素の透過を阻害する材料で形成され、
前記プローブ部は、酸素の量に応じて光学的反応を生じさせるマイクロリアクターデバイス。
【請求項１１】
請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載のマイクロリアクターデバイスにおいて、
前記凹部の内面に、異なる種類の前記環境因子にそれぞれ反応する複数のプローブ部が形成されているマイクロリアクターデバイス。
【請求項１２】
請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載のマイクロリアクターデバイスにおいて、
前記凹部の内面に光分解性試薬が配置されたマイクロリアクターデバイス。
【請求項１３】
計測対象の環境因子の透過を阻害する材料で形成された第１シートと、前記第１シートと異なる材料で形成された第２シートとを貼り合わせる工程と、
前記第１シートに型材をプレスして、前記第１シートの表面に細胞を収容する凹部を形成するとともに、前記環境因子に応じて光学的反応を生じさせるプローブ層を前記凹部の内面に付着させる工程と、
前記第１シートの前記凹部以外の部分から前記プローブ層を除去する工程と、
を含むマイクロリアクターデバイスの製造方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載のマイクロリアクターデバイスの製造方法において、
前記プローブ層を、前記第１シートの表面に形成し、
前記第１シートおよび前記プローブ層に前記型材をプレスして、前記凹部の内面に前記プローブ層を付着させるマイクロリアクターデバイスの製造方法。
【請求項１５】
請求項１３または請求項１４に記載のマイクロリアクターデバイスの製造方法において、
前記凹部の形成がホットエンボス法によって行われるマイクロリアクターデバイスの製造方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載のマイクロリアクターデバイスの製造方法において、
前記プローブ層の軟化点は、前記第１シートの軟化点よりも高温であるマイクロリアクターデバイスの製造方法。
【請求項１７】
請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載のマイクロリアクターデバイスを細胞にかぶせて、前記マイクロリアクターデバイスの凹部に前記細胞を収容する工程と、
前記マイクロリアクターデバイスに形成されたプローブ部での光学的反応を観察する工程と、
を含む細胞の活性評価方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の細胞の活性評価方法において、
前記観察の後に前記マイクロリアクターデバイスを除去して、前記細胞の培養環境を復元する工程をさらに含む細胞の活性評価方法。
【請求項１９】
請求項１７または請求項１８に記載の細胞の活性評価方法において、
前記細胞は、幹細胞、卵細胞、薬剤に感作された細胞のいずれかである細胞の活性評価方法。
【請求項２０】
培養容器内に存在する細胞の位置を特定する位置検出部と、
請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載のマイクロリアクターデバイスを、前記培養容器内に配置する制御部と、
前記マイクロリアクターデバイスに形成されたプローブ部での光学的反応を観察する観察部と、
を備える細胞の活性評価装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロリアクターデバイス、マイクロリアクターデバイスの製造方法、細胞の活性評価方法および細胞の活性評価装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の生物学的活性を計測する技術は、再生医療などの先端医療分野や医薬品のスクリーニングをはじめとする幅広い分野における基盤技術となっている。一例として、本発明の発明者は、計測対象の細胞の活性を非侵襲で計測するためのマイクロチャンバ（マイクロリアクター）を提案している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００９／１５７２１１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記のマイクロリアクターの製造では、比較的困難な微細加工が必要となる一方、より容易に製造できることが求められる。
【０００５】
上記事情に鑑み、より容易に製造することができるマイクロリアクターデバイスを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一の態様であるマイクロリアクターデバイスは、第１層と、第２層と、プローブ部とを備える。第１層は、細胞を収容する凹部が一面側に形成され、計測対象の環境因子の透過を阻害する材料で形成される。第２層は、第１層の他面側に配置され、第１層の材料と異なる材料で形成される。プローブ部は、凹部の内面に形成され、環境因子に応じて光学的反応を生じさせる。プローブ部は、凹部の底面部分に形成され、プローブ部の材料の軟化点は、第１層の材料の軟化点よりも高温である。
【０００７】
本発明の他の態様であるマイクロリアクターデバイスの製造方法は、計測対象の環境因子の透過を阻害する材料で形成された第１シートと、第１シートと異なる材料で形成された第２シートとを貼り合わせる工程と、第１シートに型材をプレスして、第１シートの表面に細胞を収容する凹部を形成するとともに、環境因子に応じて光学的反応を生じさせるプローブ層を凹部の内面に付着させる工程と、第１シートの凹部以外の部分からプローブ層を除去する工程と、を含む。
【０００８】
本発明のさらに他の態様である細胞の活性評価方法は、一の態様のマイクロリアクターデバイスを細胞にかぶせて、マイクロリアクターデバイスの凹部に細胞を収容する工程と、マイクロリアクターデバイスに形成されたプローブ部での光学的反応を観察する工程と、を含む。
【０００９】
本発明のさらに他の態様である細胞の活性評価装置は、培養容器内に存在する細胞の位置を特定する位置検出部と、一の態様のマイクロリアクターデバイスを、培養容器内に配置する制御部と、マイクロリアクターデバイスに形成されたプローブ部での光学的反応を観察する観察部と、を備える。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、より製造が容易なマイクロリアクターデバイスが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】一実施形態のマイクロリアクターデバイスの構成例を示す断面図
【図２】一実施形態のマイクロリアクターデバイスの構成例を示す平面図
【図３】ＥＶＯＨの分子構造の例を示す図
【図４】各種材料の酸素透過係数を示す図
【図５】ＰｔＯＥＰの分子構造の例を示す図
【図６】ＰｔＯＥＰの吸収／発光スペクトルを示す図
【図７】細胞の活性評価方法を示す概要図
【図８】一実施形態のマイクロリアクターデバイスの製造方法を示す概要図
【図９】（ａ）：凹部を形成した積層シート（ＥＶＯＨ／ＰＤＭＳ）のＳＥＭ画像（平面方向）、（ｂ）：凹部を形成した積層シート（ＥＶＯＨ／ＰＤＭＳ）のＳＥＭ画像（断面方向）
【図１０】（ａ）：凹部を形成した積層シート（ＥＶＯＨ／ガラス）のＳＥＭ画像（平面方向）、（ｂ）：凹部を形成した積層シート（ＥＶＯＨ／ガラス）のＳＥＭ画像（断面方向）
【図１１】（ａ）：凹部を形成した積層シート（ＥＶＯＨ／ＥＶＯＨ）のＳＥＭ画像（平面方向）、（ｂ）：凹部を形成した積層シート（ＥＶＯＨ／ＥＶＯＨ）のＳＥＭ画像（断面方向）
【図１２】実験例２の実験概要を示す図
【図１３】実験例２での観察結果を示す図
【図１４】マイクロリアクターデバイスの断面方向のＳＥＭ画像
【図１５】（ａ）：平面方向からマイクロリアクターデバイスを透過観察した画像、（ｂ）：平面方向からマイクロリアクターデバイスを蛍光観察した画像
【図１６】実施例４でのリン光強度の計測結果を示すグラフ
【図１７】（ａ）：溶存酸素濃度０．８ｍｇ／Ｌの水溶液を凹部に封入したときのリン光の観察画像、（ｂ）：溶存酸素濃度７．３ｍｇ／Ｌの水溶液を凹部に封入したときのリン光の観察画像
【図１８】蛍光強度の逆数と溶存酸素濃度との関係を示すグラフ
【図１９】（ａ）：実験例５でのマイクロリアクターデバイスを透過観察した画像の一例を示す図、（ｂ）：実験例５でのマイクロリアクターデバイスを蛍光観察した画像の一例を示す図
【図２０】実施例５でのリン光強度の計測結果を示すグラフ
【図２１】実施例５でのリン光強度の逆数と細胞を凹部に封入した時間との関係を示すグラフ
【図２２】他の実施形態における活性評価装置の構成例を示す図
【図２３】他の実施形態における活性評価装置の動作例を示す流れ図
【図２４】複数のプローブ部を積層形成した例を示す図
【図２５】凹部の底面部分に２種類のプローブ部を領域別に形成した例を示す図
【図２６】プローブ部とケージド試薬の層とを積層して形成した例を示す図
【図２７】マイクロリアクターデバイスの製造方法の変形例を示す図
【図２８】マイクロリアクターデバイスの製造方法の変形例を示す図
【図２９】落射照明の顕微鏡でプローブ部の光学的変化を観察する状態を示す図
【図３０】マイクロリアクターデバイスの変形例の使用状態を示す図
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜一実施形態でのマイクロリアクターデバイスの構成例＞
図１は、一実施形態のマイクロリアクターデバイス１１の構成例を示す断面図である。図２は、一実施形態のマイクロリアクターデバイス１１の構成例を示す平面図である。
【００１３】
一実施形態のマイクロリアクターデバイス１１は、細胞にかぶせることで細胞の周囲に微少サイズの閉じた空間（被計測空間）を形成するとともに、被計測空間内での環境因子を光学的に計測するために用いられる。
【００１４】
ここで、本明細書での環境因子は、細胞の代謝で産生または消費される物質を意味する。例えば、環境因子には、グルコース、カルシウムイオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、水素イオン、酸素、活性酸素種、過酸化水素、二酸化炭素、細胞が産出するタンパクやヘプタイドなど（例えばサイトカイン、ホルモンなど）が含まれる。なお、一実施形態では、計測対象の環境因子が酸素である例を説明する。
【００１５】
一実施形態のマイクロリアクターデバイス１１は、全体形状が３ｃｍ平方の矩形の透明なシートである。図１に示すように、マイクロリアクターデバイス１１は、それぞれ材料の異なるシート（１２、１３）が積層された２層構造を有している。
【００１６】
マイクロリアクターデバイス１１の第１層１２は、図１の下側に位置する。第１層１２は、計測対象の環境因子の透過を阻害するとともに透光性を有する材料で形成される。
【００１７】
一例として、一実施形態での第１層１２は、生体適合性と高いガスバリア性とを有する親水性ポリマーであるエチレンビニルアルコール（ＥＶＯＨ）の透明フイルムで形成されている。ここで、図３にＥＶＯＨの分子構造の例を示す。また、図４は、各種材料の酸素透過係数を示す図である。図４に示すように、ＥＶＯＨの酸素透過係数は1E-17(cm3(STP)cm/(cm2・s・Pa))よりも小さく、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、シリコンゴムと比べて非常に低い値となる。よって、ＥＶＯＨで形成された第１層１２は、環境因子（酸素）をほとんど透過させないことが分かる。なお、一実施形態で用いたＥＶＯＨのフイルムの厚さは、例えば５０μｍである。
【００１８】
また、マイクロリアクターデバイス１１の第１層１２の一面側（図１における第１層１２の下面）には、細胞を収容して上記の被計測空間の一部を構築する凹部１２ａが形成されている。図２に示すように、一実施形態での第１層１２には、第１層１２の平面方向へ格子状をなすように、それぞれ複数の凹部１２ａが配列されている（図２では、簡単のため、２×２の配列とする）。各々の凹部１２ａは円筒形であって、いずれも同形状である。各々の凹部１２ａのサイズは、細胞の種類や数、環境因子の種類、計測の所要時間などに応じて適宜調整される。一例として、凹部１２ａの円筒形の直径は５０μｍから１００μｍ程度であり、凹部１２ａの深さは３０μｍから５０μｍ程度である。なお、上記の凹部１２ａの形状は、例えば、後述のようにホットエンボス法で形成される。
【００１９】
一方、マイクロリアクターデバイス１１の第２層１３は、第１層１２の他面側（図１における第１層１２の上面）と貼り合わされている。第２層１３は、透光性を有する弾性材料で形成されている。例えば、第２層１３の材料は第１層１２の材料よりも弾性が高い（ヤング率が低い）ものであってもよい。ここで、第１層１２に用いられるＥＶＯＨのヤング率は約２５００〜約２７００ＭＰａであり、第２層１３に用いられるＰＤＭＳのヤング率は４ＭＰａ以上（推定値）である。また、一例として、一実施形態での第２層１３は、厚さ０．３ｍｍの透明なシリコンゴム（ポリジメチルシロキサン：ＰＤＭＳ）で形成されている。なお、一実施形態において、第１層１２および第２層１３を積層したシートは、可撓性を有している。
【００２０】
また、一実施形態のマイクロリアクターデバイス１１では、ホットエンボス法で凹部１２ａを形成することに伴って、第１層１２の他面側における凹部１２ａの対応領域が第２層１３の方向に突出し、第１層１２と第２層１３との境界に凹凸が生じる（図１参照）。
【００２１】
さらに、一実施形態のマイクロリアクターデバイス１１では、環境因子に応じて光学的反応を生じさせるプローブ部１４が各々の凹部１２ａの内面に形成されている。一実施形態でのプローブ部１４は、凹部１２ａの底面部分（凹部１２ａ内で第１層１２の一面に対して略平行となる面）において円形の薄膜をなすように形成されている。一実施形態では、後述のようにホットエンボス法による加工時にプローブ部１４を凹部１２ａの底面部分に付着させるため、プローブ部１４の材料の軟化点（ガラス転移点Ｔｇ）は、第１層１２の材料の軟化点よりも高温である。ここで、第１層１２に用いられるＥＶＯＨのガラス転移点は約５５℃であり、プローブ部１４に用いられる後述のポリスチレンのガラス転移点は約１００℃である。なお、一実施形態において、プローブ部１４の厚さは、例えば１μｍである。
【００２２】
ここで、一実施形態のプローブ部１４は、計測する環境因子に応じてその材料が適宜選択される。一例として、亜鉛、白金、パラジウム等を中心金属とするポルフィリンやフタロシアニン、ルテニウム錯体を含む材料でプローブ部１４を形成してもよい。
【００２３】
例えば、被計測空間での酸素濃度を計測する場合、常温下で安定なリン光を発する白金オクタエチルポルフィリン（ＰｔＯＥＰ）を含む材料でプローブ部１４を形成してもよい。ＰｔＯＥＰを含むプローブ部１４は、溶存酸素の増加に対して蛍光強度が低下する特性を有する。なお、図５に、ＰｔＯＥＰの分子構造の例を示す。図６は、ＰｔＯＥＰの吸収／発光スペクトルを示す図である。なお、上記のＰｔＯＥＰを含むプローブ部１４を形成する場合、一例として、酸素透過性の高いポリスチレン（ＰＳ）を用いたＰｔＯＥＰ−ＰＳの薄膜を形成してもよい。
【００２４】
＜一実施形態におけるマイクロリアクターデバイス１１の使用方法＞
次に、一実施形態におけるマイクロリアクターデバイス１１の使用方法の一例として、上記のマイクロリアクターデバイス１１を用いた細胞の活性評価方法を説明する。図７は、細胞の活性評価方法を示す概要図である。
【００２５】
第１の工程として、液体培地とともに細胞１６を収容した培養容器１５（ディッシュなど）に対して、マイクロリアクターデバイス１１を細胞に上からかぶせる（図７（ａ）参照）。このとき、第１層１２の一面側を下に向けて、凹部１２ａに細胞１６が収容されるようにマイクロリアクターデバイス１１を培養容器１５に配置する。これにより、マイクロリアクターデバイス１１の凹部１２ａと培養容器１５の底面とによって、培養容器１５の容積と比べて微少な被計測空間が細胞１６の周囲に形成される。
【００２６】
なお、第１の工程において、熱の移動による培養環境への悪影響を抑制するために、マイクロリアクターデバイス１１を予め培地と同じ温度に保温しておいてもよい。また、被計測空間に収容する細胞１６の数は単数でも複数でもよい。
【００２７】
第２の工程として、被計測空間内に配置されているプローブ部１４の光学的反応を観察する（図７（ｂ）参照）。
【００２８】
一例として、プローブ部１４に向けて励起光を照射するとともに、プローブ部１４から生じるリン光の強度を顕微鏡で計測すればよい。プローブ部１４の光学的反応（リン光の強度）は被計測空間の環境因子（酸素）の量と相関があるため、被計測空間に含まれる環境因子はリン光の強度によって計測できる。そして、上記の計測結果に基づいて、例えば、被計測空間に存在する細胞の活性、アポトーシスや分化の度合い、細胞の性質などを評価できる。なお、マイクロリアクターデバイス１１の第１層１２および第２層１３はいずれも透光性を有するので、リン光の計測を妨げることはない。
【００２９】
ここで、マイクロリアクターデバイス１１の第１層１２は、環境因子（酸素）の透過を阻害する材料で形成されているので、被計測空間に含まれる環境因子は被計測空間に存在する細胞の代謝と密接に関連する。よって、一実施形態のマイクロリアクターデバイス１１を用いることで、培養環境下において個別の細胞に注目した局所的な環境因子の計測が可能となる。
【００３０】
また、一実施形態では、細胞の周囲の空間に含まれる環境因子を計測として細胞の活性を評価する。そのため、細胞自体を計測対象とする場合と比べてほぼ非侵襲で細胞の活性を計測できる。また、一実施形態では培養容器１５内で細胞をそのまま計測できるので、計測によって細胞や周囲の培養環境に与える影響を極めて少なくできる。このように、上記の方法によれば、計測による対象（細胞）の擾乱はほとんどない。
【００３１】
さらに、被計測空間は培養容器１５の容積に対して微小であるので、被計測空間内では外側の環境と比べて代謝物などの濃度変化がより大きくなる。そのため、非常に高い感度で環境因子を検出できる。また、被計測空間内では環境因子の濃度変化が高くなるため、比較的短時間で計測を行うことができる。
【００３２】
第３の工程として、第２の工程による観察の後にマイクロリアクターデバイス１１を除去する（図７（ｃ）参照）。これにより、細胞の培養環境を計測前とほぼ同様の状態に復元できる。
【００３３】
以上で、一実施形態での細胞の活性評価方法の説明を終了する。なお、上記の第１の工程から第３の工程を繰り返すことで、培養環境下で培養される細胞の活性をほぼ非侵襲で周期的に判断することも可能である。
【００３４】
ここで、上記の細胞の活性評価方法は、例えば以下の用途に利用することができる。
【００３５】
（用途例１：幹細胞の培養管理プロセスでの利用）
再生医療分野では、幹細胞（ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞）をインビトロで増殖、分化させて、所望の細胞組織を生成する培養管理プロセスが存在する。上記の培養管理プロセスでは、細胞の分化の成否、細胞の癌化や感染の有無を管理するために、培養細胞の生物学的活性を計測することが不可欠となる。
【００３６】
上記の培養管理プロセスでは、幹細胞から生成される細胞組織を人体に戻すことが前提となる。そのため、上記の培養管理プロセスでは、染色や遺伝子導入を必要とせず、かつ培養細胞に非侵襲である活性評価方法が要求されている。上記のマイクロリアクターデバイス１１を用いた細胞の活性評価方法は、かかる幹細胞の培養管理プロセスにおいて極めて有用である。
【００３７】
（用途例２：卵細胞の選別での利用）
体外受精では、成功率を高めるために、より活性の高い受精卵を選別して子宮内に戻すことが行われている。上記の体外受精においても、染色や遺伝子導入を必要とせず、かつ卵細胞に非侵襲である活性評価方法が要求されている。
【００３８】
かかる受精卵の活性計測の一例として、酸素センサを受精卵近傍に近づけて酸素濃度を求める手法が検討されている。しかし、細胞の代謝物は培地全体に拡散されることから、精度のよい活性計測はなお困難であった。
【００３９】
上記のマイクロリアクターデバイス１１を用いた細胞の活性評価方法は、かかる卵細胞の選別の工程で極めて有用である。
【００４０】
（用途例３：医薬品のスクリーニングでの利用）
医薬品のスクリーニングでは、医薬品が人体に及ぼす影響を確認するために、薬剤に感作された細胞の活性計測が行われる。一例として、新薬投与による心筋梗塞の有無を評価する場合、幹細胞から分化誘導した心筋細胞に薬剤を感作させて、その細胞の活性計測によって医薬品の安全性を評価することが想定される。
【００４１】
上記のマイクロリアクターデバイス１１を用いた細胞の活性評価方法は、かかる医薬品のスクリーニングの工程で極めて有用である。
【００４２】
＜一実施形態のマイクロリアクターデバイスの製造方法＞
次に、図８を参照しつつ、一実施形態のマイクロリアクターデバイス１１の製造方法を説明する。
【００４３】
第１の工程として、マイクロリアクターデバイス１１の第１層１２に対応する第１シート２１と、第２層１３に対応する第２シート２２とを貼り合わせる（図８（ａ）参照）。なお、図８では、第１シート２１が上側に位置し、第２シート２２が下側に位置する。
【００４４】
ここで、第１シート２１は、環境因子（一実施形態では酸素）の透過を阻害するとともに透光性を有する材料で形成される。第２シート２２は、透光性を有する弾性材料で形成される。一例として、第１シート２１は厚さ５０μｍのＥＶＯＨフイルムであり、第２シート２２はＰＤＭＳの基板である。また、第１シート２１および第２シート２２は接着によって貼り合わされる。
【００４５】
第２の工程として、環境因子に応じて光学的反応を生じさせるプローブ層２３を、第１シート２１の一面（図８における第１シート２１の上面）に形成する（図８（ｂ）参照）。このプローブ層２３の軟化点は、第１シート２１の軟化点よりも高温である。
【００４６】
ここで、一実施形態でのプローブ層２３は、厚さ１μｍ程度のＰｔＯＥＰ−ＰＳの薄膜である。例えば、７重量％ポリスチレンおよび１８０μＭＰｔ錯体が溶解したトルエンを、第１シート２１の上面側に滴下する。その後に１０００ｒｐｍでスピンコートすることで、第１シート２１の一面全体にＰｔＯＥＰ−ＰＳを塗布する。その後、スピンコートされたＰｔＯＥＰ−ＰＳを乾燥させることで上記のプローブ層２３を得ることができる。
【００４７】
第３の工程として、ホットエンボス法によって、第１シート２１の一面に細胞を収容するための円筒形の凹部１２ａを形成する。この第３の工程では、以下のようにして行われる。
【００４８】
まず、凹部１２ａの形状に対応した円柱体が格子状に配列された型材２４を用意する（図８（ｃ）参照）。上記の型材２４は、例えばリソグラフィおよび等の公知の微細加工手段を用いて製造できる。なお、一実施形態での型材２４はＳｉモールドである。
【００４９】
そして、第１シート２１のガラス転移点Ｔｇ以上に型材２４を加熱する。その後、第２の工程（図８（ｂ））で得られた積層シートに対して、プローブ層２３の形成されている一面側から加熱した型材２４をプレスする（図８（ｄ）参照）。例えば、一実施形態では、１３０℃に型材２４を加熱し、３０００Ｎの荷重で型材２４を３０分間プレスする。
【００５０】
ここで、第１シート２１と比べてプローブ層２３の軟化点の方が高温であるので、上記の積層シートに型材２４をプレスすると、硬さを保ったままのプローブ層２３は型材２４の円柱体によって円形に打ち抜かれる。そして、円形に打ち抜かれたプローブ層２３は、型材２４によって凹部１２ａの底面部分に押し込まれる。これにより、第１シート２１の凹部１２ａの内面（底面部分）にプローブ層２３が付着して、プローブ部１４が形成される。
【００５１】
また、一実施形態では、ホットエンボス加工で第１シート２１の一面側から型材２４を押し当てるので、凹部１２ａの部分の材料は第２シート２２の方向に押圧されて、第１シート２１の他面で凹部１２ａの対応領域が盛り上がる。これにより、第１シート２１の他面側における凹部１２ａの対応領域が第２シート２２の方向（図中下方向）に突出する。その一方で、弾性材料の第２シート２２は、第１シート２１における凹部１２ａの対応領域の突出に追従して変形する。これにより、ホットエンボス加工時に型材２４に押し出された材料で第１シート２１の加工面が歪むことを抑制できるので、第１シート２１の加工面の形状を良好に保つことができる。したがって、高い加工精度を確保できる。
【００５２】
その後、型材２４および積層シートを第１シート２１のガラス転移点Ｔｇ以下まで冷却してから、型材２４を離型する（図８（ｅ）参照）。
【００５３】
第４の工程として、第１シート２１の凹部１２ａ以外の部分からプローブ層２３を除去する（図８（ｆ）参照）。これにより、凹部１２ａの底面部分のみプローブ部１４が残る。
【００５４】
以上の工程で、一実施形態のマイクロリアクターデバイス１１を得ることができる。上記の製造方法によれば、第１シート２１（第１層１２）の凹部１２ａの加工と、凹部１２ａの底面部分へのプローブ層２３の付着とをホットエンボス加工で同時に行えるので、マイクロリアクターデバイス１１を容易に製造できる。
【００５５】
また、上記の製造方法によれば、弾性材料の第２シート２２（第２層１３）を設けることによって第１シート２１の加工面が歪むことを抑制できるので、マイクロリアクターデバイス１１を比較的高い加工精度で製造できる。特に、被計測空間の容積は環境因子の計測精度に影響を与えうる要素となるので、一実施形態のマイクロリアクターデバイス１１では、環境因子の計測をより高精度に行うことができる。
【００５６】
＜一実施形態に関する実験例＞
（実験例１）
発明者は、それぞれ第２層の弾性が相違する３種類の積層シートに、ホットエンボス法で凹部を加工した。そして、これらの加工面の形状を比較した。
【００５７】
具体的には、積層シートの第２層を、ＰＤＭＳ基板、ガラス基板、厚さ１００μｍのＥＶＯＨのフイルムとした。各々の積層シートの第１層は、いずれも同じく厚さ５０μｍのＥＶＯＨのフイルムである。なお、ＰＤＭＳ基板はＥＶＯＨよりも高い弾性を有し、ガラス基板はほとんど弾性を有していない。
【００５８】
図９は、第１層がＥＶＯＨ、第２層がＰＤＭＳの積層シート（ＥＶＯＨ／ＰＤＭＳ）に凹部を形成する場合のＳＥＭ画像である。図１０は、第１層がＥＶＯＨ、第２層がガラスの積層シート（ＥＶＯＨ／ガラス）に凹部を形成する場合のＳＥＭ画像である。図１１は、第１層および第２層がＥＶＯＨの積層シート（ＥＶＯＨ／ＥＶＯＨ）に凹部を形成する場合のＳＥＭ画像である。
【００５９】
図９に示すように、積層シート（ＥＶＯＨ／ＰＤＭＳ）にホットエンボス加工で凹部を形成する場合、第１層の凹部の断面形状はほぼコ字状となり、かつ第１層の一面側はほぼ均一となる（図９（ｂ）参照）。よって、積層シート（ＥＶＯＨ／ＰＤＭＳ）を用いた場合には、第２層の弾性変形によって、第１層の加工面の形状が良好に保たれることが分かる。
【００６０】
一方、図１０に示すように、積層シート（ＥＶＯＨ／ガラス）にホットエンボス加工で凹部を形成する場合、第２層が変形しないため第１層に凹部を形成することができない（図１０（ｂ）参照）。また、図１１に示すように、積層シート（ＥＶＯＨ／ＥＶＯＨ）にホットエンボス加工で凹部を形成する場合、図９の場合と比べて第１層の加工面が丸みを帯びてしまい、型材の形状を精度よく転写できないことが分かる（図１１（ｂ）参照）。
【００６１】
（実験例２）
発明者は、マイクロリアクターデバイスの液体封入性能を以下の手法で評価した。図１２は、実験例２の実験概要を示す図である。
【００６２】
まず、スライドガラス上に１ｍＭ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ溶液を滴下した。そして、ホットエンボス加工で凹部１２ａを形成した積層シート（ＥＶＯＨ／ＰＤＭＳ）をスライドガラスに上側からかぶせて、蛍光顕微鏡で観察を行った。
【００６３】
図１３に、実験例２での観察結果を示す。積層シートの平面方向からみた画像では、各凹部１２ａの対応位置（被計測空間）で円形の蛍光を観察でき、凹部１２ａ以外の部分では蛍光が生じていない。よって、上記のマイクロリアクターデバイスに関し、凹部１２ａでの液体の密閉性が良好であることが確認できた。
【００６４】
（実験例３）
上述した一実施形態のマイクロリアクターデバイスの製造方法（図８）に従って、マイクロリアクターデバイス１１を製造した。図１４は、マイクロリアクターデバイス１１の断面方向のＳＥＭ画像である。図１５は、平面方向からマイクロリアクターデバイス１１を透過観察した画像および蛍光観察した画像である。なお、実験例３の蛍光観察の条件として、励起光の波長は４８８ｎｍ、励起フィルタ（Ｅｘ）は４６５−４９５、ダイクロイックミラー（ＤＭ）は５６５、吸収フィルタ（ＢＡ）は６０５／５５である。
【００６５】
図１４から、製造されたマイクロリアクターデバイス１１には、第１層１２に円筒状の凹部１２ａが形成されていることと、凹部１２ａの底面部分に円形のプローブ部１４が形成されていることとが分かる。また、図１５から、蛍光観察時に凹部１２ａの底面部分のプローブ部１４が蛍光を生じさせていることも確認できる。
【００６６】
（実験例４）
上述した一実施形態のマイクロリアクターデバイス１１を用いて、プローブ部１４のリン光強度と溶存酸素濃度との相関を求めた。
【００６７】
具体的には、一実施形態のマイクロリアクターデバイス１１の凹部１２ａ（被計測空間）に溶存酸素濃度の異なる水溶液を封入し、その被計測空間内のプローブ部１４から生じるリン光の強度を計測した。なお、実験例４の蛍光観察の条件として、励起光の波長は４８８ｎｍ、励起フィルタ（Ｅｘ）は４６５−４９５、ダイクロイックミラー（ＤＭ）は５６５、吸収フィルタ（ＢＡ）は６０５／５５である。
【００６８】
図１６は、実施例４でのリン光強度の計測結果を示すグラフである。図１６の縦軸はリン光の強度を示し、図１６の横軸は凹部１２ａに封入した水溶液の溶存酸素濃度（ｍｇ／Ｌ）を示す。また、図１７（ａ）は、溶存酸素濃度０．８ｍｇ／Ｌの水溶液を凹部１２ａに封入したときのリン光の観察画像であり、図１７（ｂ）は、溶存酸素濃度７．３ｍｇ／Ｌの水溶液を凹部１２ａに封入したときのリン光の観察画像である。
【００６９】
図１６に示すように、水溶液の溶存酸素濃度が高くなるほど、酸素による消光が起こるため蛍光強度は低くなる。そして、図１７では、溶存酸素濃度０．８ｍｇ／Ｌの場合のリン光（図１７（ａ））は、溶存酸素濃度７．３ｍｇ／Ｌの場合のリン光（図１７（ｂ））よりも明るいことが確認できる。
【００７０】
また、実験例４での実験データをもとに酸素センサの検量線を作成した。検量線のパラメータは、下式（１）で示される。
Ｉ０／Ｉ＝１＋ＫＳＶ［Ｏ２］    …（１）
ここで、「Ｉ０」は、溶存酸素濃度が０ｍｇ／Ｌであるときの蛍光強度を示す。「Ｉ」は、各溶存酸素濃度での蛍光強度を示す。「ＫＳＶ」は、検量線の傾きを示す値である。「Ｏ２」は溶存酸素濃度を示す。なお、溶存酸素濃度が０ｍｇ／Ｌであるときの蛍光強度は実験から得ることができないため、蛍光強度の逆数を直線で近似し、近似曲線のｙ切片から求まるＩ”をＩ０とすればよい。
【００７１】
図１８は、蛍光強度の逆数と溶存酸素濃度との関係を示すグラフである。図１８の縦軸はリン光の強度の逆数（１／Ｉ）を示し、図１８の横軸は凹部１２ａに封入した水溶液の溶存酸素濃度（ｍｇ／Ｌ）を示す。また、図１８中の直線は上記の検量線である。
【００７２】
図１８に示すように、実験例４において溶存酸素濃度が少なくとも１ｍＬ−４ｍＬの範囲で、リン光の強度の逆数が検量線に沿って比例する。よって、一実施形態のマイクロリアクターデバイス１１を用いることで、被計測空間の溶存酸素濃度を計測できることが確認できる。
【００７３】
（実験例５）
上述した一実施形態のマイクロリアクターデバイス１１を、培養中のターゲットの細胞にかぶせて、プローブ部１４のリン光強度の変化を２時間にわたって計測した。なお、実験例５では、ターゲットの細胞として、ヒト乳ガン由来細胞（ＭＣＦ７）を用いた。
【００７４】
図１９（ａ）は、実験例５でのマイクロリアクターデバイス１１を位相差顕微鏡で観察した画像の一例であり、図１９（ｂ）は実験例５でのマイクロリアクターデバイス１１を蛍光顕微鏡で観察した画像の一例である。
【００７５】
図２０は、実施例５でのリン光強度の計測結果を示すグラフである。図２０の縦軸はリン光の強度を示し、図２０の横軸は細胞を凹部１２ａに封入した時間（分）を示す。また、図２１は、実施例５でのリン光強度の逆数と細胞を凹部１２ａに封入した時間との関係を示すグラフである。図２１の縦軸はリン光の強度（１／Ｉ）を示し、図２１の横軸は細胞を凹部１２ａに封入した時間（分）を示す。
【００７６】
図２０、図２１から、細胞を凹部１２ａに封入した時間が長くなるにつれて、プローブ部１４のリン光の強度が強くなることが分かる。よって、実験例５の計測では、細胞の酸素消費に伴って、被計測空間内の溶存酸素濃度が低下する現象を確認できた。
【００７７】
＜他の実施形態の説明＞
図２２は、上述した一実施形態の細胞の活性評価方法を実行するための活性評価装置の構成例を示す図である。
【００７８】
活性評価装置は、恒温室３１と、ロボットアーム３２と、光学観察ユニット３３と、モニタ３４と、記憶部３５と、ＣＰＵ３６と、ユーザから各種の操作を受け付ける操作部３７とを有している。ここで、ロボットアーム３２、光学観察ユニット３３、モニタ３４、記憶部３５および操作部３７は、それぞれＣＰＵ３６に接続されている。
【００７９】
恒温室３１には、ターゲットの細胞を培養する培養容器１５が収納される。この恒温室３１の内部は、細胞１６の培養に適した環境（例えば温度３７℃、湿度９０％の雰囲気）に維持されるとともに、コンタミネーションを防止するために高い清浄度に保たれている。
【００８０】
ロボットアーム３２は、一実施形態のマイクロリアクターデバイス１１を先端に保持しており、マイクロリアクターデバイス１１を三次元的に移動させる。そして、ロボットアーム３２は、ＣＰＵ３６の指示に応じて、培養容器１５の所定位置の細胞１６にマイクロリアクターデバイス１１を被せるとともに、計測終了後にマイクロリアクターデバイス１１を除去する。
【００８１】
光学観察ユニット３３は、培養細胞を照明する照明装置と、培養細胞を観察するための位相差顕微鏡および蛍光顕微鏡と、各顕微鏡を介して培養容器１５内の像を撮像する撮像装置とを有している。この光学観察ユニット３３は、ロボットアーム３２が培養容器１５内にマイクロリアクターデバイス１１を位置決めするときの位置情報の取得や、マイクロリアクターデバイス１１のプローブ部１４で生じる光学的反応を示す画像情報の取得に用いられる。なお、光学観察ユニット３３で撮像された画像は、ＣＰＵ３６の制御によってモニタ３４に表示されてもよい。
【００８２】
記憶部３５は、不揮発性の記憶媒体（ハードディスク、フラッシュメモリ等）である。この記憶部３５には、環境因子の計測情報や、環境因子の計測時に光学観察ユニット３３が生成した画像情報がそれぞれ記憶される。上記の画像情報や環境因子の計測情報は、ターゲットの細胞の識別情報および計測日時の情報とそれぞれ対応付けされた状態で記憶部３５に記憶される。なお、記憶部３５には、ＣＰＵ３６によって実行されるプログラムも記憶される。
【００８３】
ＣＰＵ３６は、活性評価装置の各部の動作を統括的に制御するプロセッサである。例えば、ＣＰＵ３６は、ロボットアーム３２を制御してマイクロリアクターデバイス１１を移動させる。また、ＣＰＵ３６は、光学観察ユニット３３の撮像装置を用いて、マイクロリアクターデバイス１１で形成される被計測空間内の環境因子の計測を行う。
【００８４】
以下、図２３の流れ図を参照しつつ、活性評価装置の動作例を説明する。
【００８５】
ステップＳ１０１：ＣＰＵ３６は、光学観察ユニット３３を駆動させて培養容器１５内の状態を位相差顕微鏡で撮像した観察画像を取得する。これにより、ＣＰＵ３６は、マイクロリアクターデバイス１１を位置決めするときの位置情報を取得する。一例として、ＣＰＵ３６は、画像の基準点（例えば画面の中心）と培養容器１５での位置とを予め対応付けておく。そして、ＣＰＵ３６は、光学観察ユニット３３での撮影倍率やレンズ位置などを考慮して、画像内における細胞１６と基準点との位置関係から、培養容器１５での実際の細胞１６の座標を幾何学的に求める。
【００８６】
その後、ＣＰＵ３６は、上記の観察画像をモニタ３４に表示する。これにより、ユーザは観察画像に基づいて、ターゲットの細胞１６を操作部３７から指定することができる。
【００８７】
ステップＳ１０２：ＣＰＵ３６は、ユーザから細胞１６の位置の指定を受け付けると、ロボットアーム３２を駆動させて、ターゲットの細胞１６の上に凹部１２ａが位置するように、マイクロリアクターデバイス１１を配置する。これにより、ターゲットの細胞１６の周囲に被計測空間が形成される。
【００８８】
ステップＳ１０３：ＣＰＵ３６は、光学観察ユニット３３による蛍光顕微鏡での画像の撮像によって、被計測空間内の環境因子の計測を実行する。そして、ＣＰＵ３６は、必要に応じて環境因子の計測結果を統計解析した後に、記憶部３５への計測結果の記録や、モニタ３４での計測結果の表示を行う。
【００８９】
ステップＳ１０４：ＣＰＵ３６は、計測終了後に、ロボットアーム３２を駆動させて培養容器１５からマイクロリアクターデバイス１１を除去し、培養容器１５内の培養環境を復元する。
【００９０】
以上で、図２３の流れ図の説明を終了する。他の実施形態での活性評価装置によれば、上述の一実施形態の活性評価方法を効率的に実行することが可能となる。
【００９１】
＜実施形態の補足事項＞
（補足事項１）上記した一実施形態では、各凹部１２ａに１種類の環境因子に反応を示すプローブ部１４を形成したマイクロリアクターデバイス１１の例を説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。
【００９２】
例えば、図２４に示すように、異なる種類の環境因子にそれぞれ反応する複数のプローブ部１４ａ，ｂを凹部１２ａに積層するように形成してもよい。この場合には、１つのマイクロリアクターデバイス１１において、複数の環境因子の計測を行うことが可能となる。なお、プローブ部１４ａ，ｂを積層する場合、図８に示す製造方法の第２の工程でプローブ層２３を形成した後に、さらにプローブ層２３を重ねて形成すればよい。
【００９３】
また、それぞれ異なる環境因子に光学的反応を示す複数種類のプローブ部１４ａ，ｂを、凹部１２ａの底面の領域別に形成してもよい。図２５は、２種類の半円形のプローブ部１４ａ，ｂを凹部１２ａの底面部分に形成した例を示す。この場合にも、１つのマイクロリアクターデバイス１１において、複数の環境因子の計測を行うことが可能となる。なお、凹部１２ａの底面部分の領域別に異なるプローブ部１４を形成する場合、図８に示す製造方法の第２の工程において、例えばインクジェットによるパターニングでプローブ層２３を形成すればよい。また、上記手法によれば、凹部１２ａごとにそれぞれ異なるプローブ部１４が１つずつ形成されたマイクロリアクターデバイス１１を得ることもできる。
【００９４】
また、各々が異なる環境因子に光学的反応を示す複数種類の分散質を含む材料を用いてプローブ部１４を形成してもよい（この場合の図示は省略する）。この場合には、１層で異なる種類の環境因子に反応するプローブ部１４を形成することができる。
【００９５】
（補足事項２）上記した一実施形態において、凹部１２ａの内面に光分解性試薬（ケージド試薬）を配置してもよい。図２６は、プローブ部１４とケージド試薬の層とを積層して形成した例を示している。ここで、ケージド試薬は、活性物質の活性部位をニトロベンジル基などでブロックすることで不活性化した物質であって、所定波長の開裂光が照射されると光分解によって活性を有するようになる。上記の構成によれば、培養容器１５に存在する細胞のうちで、被計測空間に存在するターゲットの細胞に限定して薬剤を感作させることができる。
【００９６】
（補足事項３）上記実施形態のマイクロリアクターデバイス１１は、使い捨て物品として設計されていてもよい。
【００９７】
（補足事項４）上記実施形態において、プローブ部１３は凹部１２ａの内面であれば底面部分以外に形成されてもよい。例えば、マイクロリアクターデバイス１１の凹部１２ａを釣鐘状に形成してもよい。
【００９８】
図２７は、マイクロリアクターデバイスの製造方法の変形例を示す図であって、図２７（ａ）〜（ｄ）は、図８（ｃ）〜（ｆ）にそれぞれ対応する。また、図２７の例では、釣鐘状の突起を有する型材２４ａを用いる以外は、図８の例とほぼ同じ工程でマイクロリアクターデバイス１１が製造される。上記の場合には、マイクロリアクターデバイス１１の凹部１２ａの側壁部分にプローブ部１４を形成することができる。
【００９９】
（補足事項５）上記実施形態でのマイクロリアクターデバイスの製造方法において、型材２４にプローブ層２３の材料（溶液など）を付着させた上で、第１シート２１にホットエンボスで凹部１２ａのパターニングを行うようにしてもよい。図２８は、マイクロリアクターデバイスの製造方法の変形例を示す図であって、図２８（ａ）〜（ｃ）は、図８（ｃ）〜（ｅ）にそれぞれ対応する。この場合には、第１シート２１の上にプローブ層２３を形成しなくとも、凹部１２ａの内面にプローブ部１４を形成することができる。
【０１００】
（補足事項６）上記実施形態の第２層１３の材料は、ホットエンボス加工時において第１層１２の材料よりも柔らかい材料であればよく、常温下では第１層１２よりも剛性の高い材料であってもよい。一例として、第２層１３の材料の軟化点が、第１層１２の材料の軟化点よりも低温となるように材料を選択すればよい。この場合には、第１層１２の材料にホットエンボス加工をするときには第２層１３の材料も加熱で塑性変形するので、型材の形状を精度よく転写することができる。例えば、第１層１２にＥＶＯＨ（ガラス転移点約５５℃）を用いる場合には、第２層１３にナイロン６、ナイロン６６を用いることができる。なお、ナイロン６のガラス転移点は約４８℃であり、ナイロン６６のガラス転移点は約５０℃である。なお、常温下で第１層１２よりも剛性が高く、５０度付近のガラス転移点を有する第２層１３の材料として、それぞれガラス転移点を下げるエチレンまたはアクリル酸エチルを含む共重合ポリマーを用いてもよい。
【０１０１】
（補足事項７）上記実施形態のマイクロリアクターデバイス１１は、第１層１２または第２層１３を透光性の低い材料で形成してもよい。上記の場合には、落射照明の顕微鏡を用いて、培養容器の下側からプローブ部１４の光学的反応を観察すればよい。なお、図７（ｂ）の変形例として、落射照明の顕微鏡でプローブ部１４の光学的反応を観察する例を図２９に示す。
【０１０２】
（補足事項８）上記実施形態のマイクロリアクターデバイス１１は可撓性を有するので、培養容器から除去するとき（細胞の活性評価方法の第３の工程：図７（ｃ））に、培養容器の底面から撓ませて容易に剥離できる（図３０参照）。なお、培養容器からの剥離をより容易にするために、シートの凹部形成面（下面）を除く部分に把手を形成してもよい。例えば、シートの側面部または上面部に把手１７を形成すればよい。
【０１０３】
以上の詳細な説明により、実施形態の特徴点および利点は明らかになるであろう。これは、特許請求の範囲が、その精神および権利範囲を逸脱しない範囲で前述のような実施形態の特徴点および利点にまで及ぶことを意図する。また、当該技術分野において通常の知識を有する者であれば、あらゆる改良および変更に容易に想到できるはずであり、発明性を有する実施形態の範囲を前述したものに限定する意図はなく、実施形態に開示された範囲に含まれる適当な改良物および均等物によることも可能である。
【符号の説明】
【０１０４】
１１…マイクロリアクターデバイス、１２…第１層、１２ａ…凹部、１３…第２層、１４，１４ａ，１４ｂ…プローブ部、１５…培養容器、１６…細胞、１７…把手、２１…第１シート、２２…第２シート、２３…プローブ層、２４…型材、３１…恒温室、３２…ロボットアーム、３３…光学観察ユニット、３４…モニタ、３５…記憶部、３６…ＣＰＵ、３７…操作部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１２】
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【図１６】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１９】
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