(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１００個の異なる配列の単鎖アルファボディーポリペプチドを含有してなる単鎖アルファボディーライブラリーであって、
前記単鎖アルファボディーポリペプチドは、それぞれ、一般式：
ＨＲＳ１−Ｌ１−ＨＲＳ２−Ｌ２−ＨＲＳ３
（式中、
・ＨＲＳ１、ＨＲＳ２およびＨＲＳ３は、それぞれ独立して、２〜７個の連続するヘプタッド反復単位からなるヘプタッド反復配列（ＨＲＳ）であり、すべてのヘプタッドのａ位およびｄ位の少なくとも５０％は、イソロイシン残基によって占められており、各ＨＲＳは、ヘプタッドのａ位またはｄ位のいずれかに位置する脂肪族アミノ酸残基または芳香族アミノ酸残基で開始および終了しており、ＨＲＳ１、ＨＲＳ２およびＨＲＳ３は、ともに三本鎖のα−ヘリックスコイルドコイル構造を形成しており；かつ
・Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、ＨＲＳ１とＨＲＳ２とを共有結合的に連結し、ＨＲＳ２とＨＲＳ３とを共有結合的に連結するリンカー断片であり、少なくとも４個のアミノ酸残基からなるリンカー断片である）
を有しており、
前記アルファボディーポリペプチドが、５〜２０個の多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットの少なくとも１つにおいて互いに異なり、前記多様化されるアミノ酸残基位置のすべてではなく、少なくとも７０％の多様化されるアミノ酸残基位置が、
（ｉ）前記アルファボディーポリペプチドの第１のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｅ位および第２のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｇ位、
または
（ｉｉ）前記アルファボディーポリペプチドの１個のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｂ位、ｃ位およびｆ位、
または
（ｉｉｉ）アルファボディーポリペプチドの２個の連続するα−ヘリックスを連結するリンカー断片における位置
のいずれかに位置する、単鎖アルファボディーライブラリー。
【請求項２】
前記リンカー断片の前記少なくとも４個のアミノ酸残基の少なくとも５０％が、プロリン、グリシンおよびセリンからなる群より選択される、請求項１に記載の単鎖アルファボディーライブラリー。
【請求項３】
前記多様化されるアミノ酸残基位置のすべてではなく、少なくとも７０％の多様化されるアミノ酸残基位置が、請求項１の（ｉ）に加え、前記アルファボディーポリペプチドの前記第１のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｂ位および／または前記アルファボディーポリペプチドの前記第２のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｃ位に位置する、請求項１または２に記載の単鎖アルファボディーライブラリー。
【請求項４】
前記少なくとも１００個の異なる配列の単鎖アルファボディーポリペプチドそれぞれの定常の非多様化部分が、非天然物由来である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単鎖アルファボディーライブラリー。
【請求項５】
前記多様化されるアミノ酸残基位置が、天然アミノ酸型によって独占的に占められている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単鎖アルファボディーライブラリー。
【請求項６】
２〜６個の異なる構成ライブラリーを含有してなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアルファボディーライブラリーの混合物。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の単鎖アルファボディーライブラリーをコードするか、もしくは請求項６に記載の単鎖アルファボディーライブラリーの混合物をコードする、核酸またはベクターのライブラリー。
【請求項８】
宿主細胞のライブラリーであって、各宿主細胞が、請求項７に記載の前記核酸またはベクターのライブラリーのメンバーを含有してなる、ライブラリー。
【請求項９】
イン・ビトロタンパク質ディスプレイのための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単鎖アルファボディーライブラリーまたは請求項６に記載の単鎖アルファボディーライブラリーの混合物の使用。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の単鎖アルファボディーライブラリーを製造する製造方法であって、
ａ）請求項１〜５のいずれか１項に記載の単鎖アルファボディーライブラリーをコードするか、もしくは請求項６に記載の単鎖アルファボディーライブラリーの混合物をコードする核酸またはベクターのライブラリーを製造するステップ、および
ｂ）前記単鎖アルファボディーライブラリーの製造に適した条件下で、前記核酸またはベクターのライブラリーによってコードされるアルファボディーポリペプチドを発現させるステップ
を少なくとも含む、製造方法。
【請求項１１】
前記核酸またはベクターのライブラリーによってコードされる前記アルファボディーポリペプチドを発現させるステップｂ）が、前記核酸またはベクターのライブラリーのメンバーを宿主細胞に導入し、当該宿主細胞を、前記単鎖アルファボディーライブラリーの製造に適した条件下の培地中で培養するステップを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記宿主細胞および／または前記培地から、ステップｂ）において製造された単鎖アルファボディーライブラリーを単離するステップをさらに含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性または目的の標的分子もしくは標的細胞に対する検出可能なイン・ビトロ活性を有する１つ以上の単鎖アルファボディーポリペプチドの製造方法であって、
前記単鎖アルファボディーポリペプチドが、一般式：
ＨＲＳ１−Ｌ１−ＨＲＳ２−Ｌ２−ＨＲＳ３
（式中、
・ＨＲＳ１、ＨＲＳ２およびＨＲＳ３は、それぞれ独立して、２〜７個の連続するヘプタッド反復単位からなるヘプタッド反復配列（ＨＲＳ）であり、すべてのヘプタッドのａ位およびｄ位の少なくとも５０％は、イソロイシン残基によって占められており、各ＨＲＳは、ヘプタッドのａ位またはｄ位のいずれかに位置する脂肪族アミノ酸残基または芳香族アミノ酸残基で開始および終了しており、ＨＲＳ１、ＨＲＳ２およびＨＲＳ３は、ともに三本鎖のα−ヘリックスコイルドコイル構造を形成しており；かつ
・Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、ＨＲＳ１とＨＲＳ２とを共有結合的に連結し、ＨＲＳ２とＨＲＳ３とを共有結合的に連結するリンカー断片であり、少なくとも４個のアミノ酸残基からなるリンカー断片である）
を有するものであり、
当該方法が、
ａ）請求項１〜５のいずれか１項に記載の単鎖アルファボディーライブラリーまたは請求項６に記載の単鎖アルファボディーライブラリーの混合物を製造するステップ、
ｂ）目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性または目的の標的分子もしくは標的細胞に対する検出可能なイン・ビトロ活性を有する１つ以上の単鎖アルファボディーポリペプチドを選択するステップ、および
ｃ）前記１つ以上の単鎖アルファボディーポリペプチドを単離するステップ
を少なくとも含む、製造方法。
【請求項１４】
前記リンカー断片の前記少なくとも４個のアミノ酸残基の少なくとも５０％が、プロリン、グリシンおよびセリンからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ｄ）目的の標的タンパク質もしくは標的細胞に対する検出可能な結合親和性または検出可能なイン・ビトロ活性を有する１つ以上の単鎖アルファボディーを増幅するステップ
をさらに含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性を有する１つ以上の単鎖アルファボディーポリペプチドを選択する前記ステップが、
ａ）前記目的の標的分子を、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単鎖アルファボディーライブラリーまたは請求項６に記載の単鎖アルファボディーライブラリーの混合物に接触させるステップ、
ｂ）前記目的の標的分子に接触させた前記単鎖アルファボディーライブラリーまたは単鎖アルファボディーライブラリーの混合物から、前記目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性を有する１つ以上の単鎖アルファボディーポリペプチドを同定するステップ
を含む、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ｃ）前記目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性を有する前記１つ以上の単鎖アルファボディーポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を決定するステップ
をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ステップａ）およびｂ）を繰り返し行なうことによって、前記目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性を有する単鎖アルファボディーポリペプチドについて、前記アルファボディーライブラリーまたはアルファボディーライブラリーの混合物をさらに濃縮する、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
目的の標的分子もしくは標的細胞に対する検出可能なイン・ビトロ活性を有する１つ以上の単鎖アルファボディーポリペプチドを選択する前記ステップが、
ａ１）前記目的の標的細胞中で、請求項１〜５のいずれかに記載の単鎖アルファボディーライブラリーまたは請求項６に記載の単鎖アルファボディーライブラリーの混合物を発現させるステップ
または
ａ２）請求項１〜５のいずれか１項に記載の単鎖アルファボディーライブラリーまたは請求項６に記載の単鎖アルファボディーライブラリーの混合物を前記目的の標的細胞に接触させるステップ、
ｂ）前記発現された単鎖アルファボディーライブラリーまたは単鎖アルファボディーライブラリーの混合物から、前記目的の標的分子もしくは標的細胞に対する検出可能なイン・ビトロ活性を有する１つ以上の単鎖アルファボディーを同定するステップ
を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
ｃ）前記目的の標的分子もしくは標的細胞に対する検出可能なイン・ビトロ活性を有する前記１つ以上の単鎖アルファボディーポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を決定するステップ
をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ポリペプチドライブラリーおよびその製造方法の分野、ならびに予防目的用、治療目的用または診断目的用のアルファボディーを開発するためのかかるポリペプチドライブラリーの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
抗体（系）ライブラリーは、１つ以上の目的の標的化合物に特異的に結合するタンパク質の選択および同定のために、これまで広く使用されている。
【０００３】
様々な種類の抗体ライブラリーの適用性は多様である。例えば、免疫ライブラリーでは、イン・ビボ抗体親和性増強が、免疫された動物またはヒト患者で起こるので、免疫ライブラリーは、限られた量の標的抗原（免疫原）に対する高親和性抗体の割合が高いことを特徴とする。したがって、複雑性が比較的小さな免疫ライブラリーは、特定の抗原に対する高親和性の結合剤を生成することができる。しかしながら、通常、研究される各抗原または患者群について、別々の免疫ライブラリーを構築しなければならない。加えて、明らかな倫理的理由により、ヒトの能動免疫化は不可能なので、ほとんどの標的に対するヒト抗体を生成することは、この方法では実行不可能である。
【０００４】
一方、無感作の（ｎａｉｖｅ）および合成の抗体（系）ライブラリーでは、抗体のレパートリー提示は、抗原により引き起こされる抗体増強を介して進化しなかった。その結果として、これらのライブラリーの多様性は、ライブラリー中の抗体のいくつかが、合理的なまたは高い親和性で任意の所定の標的に結合することができる十分な統計的機会を確保するために、非常に高度でなければならない。
【０００５】
抗体は、かなり大きなタンパク質であり、加熱、凍結融解によるタンパク質分解および硫酸アンモニウム沈殿のような処理に対して感受性である。また、抗体の大きさは、それらの投与方法を限定している。
【０００６】
したがって、抗体骨格の不利な点を考慮すると、様々な目的の標的タンパク質に対する高い親和性および活性を有する良質なタンパク質を確実に生産する代替的な改善されたタンパク質ライブラリー（およびその製造方法）に対する必要性が依然としてある。
【０００７】
国際公開第２０１０／０６６７４０号および欧州特許出願公開第２１６１２７８号明細書には、単鎖三重α−ヘリックスコイルドコイル骨格としてアルファボディー構造が記載されている。しかしながら、これまでに、アルファボディー骨格を操作して、十分な親和性で目的の標的分子に特異的に結合できる多数の結合パートナーを生産するアルファボディーライブラリーを得ることができる方法は、開示も示唆もされていない。
【発明の概要】
【０００８】
発明の概要
本発明者らは、アルファボディーライブラリー（本明細書において、「（本）発明の（単鎖）アルファボディーライブラリー」と称される）の作製を可能にする新たな方法を開発した。加えて、本発明者らは、本発明のアルファボディーライブラリーが、目的の標的分子に特異的に結合する１つ以上のアルファボディーのスクリーニングおよび／または選択に使用され得ることを見出した。したがって、本発明者らは、異なる配列のアルファボディーポリペプチドを含有し、高い親和性および特異性で目的の標的分子に結合し、従来技術の結合剤の不利な点の１つ以上を克服する結合剤が単離され得る新規の改善されたライブラリーを開発した。さらに、単離されたアルファボディー結合剤は、当該技術分野において公知の従来の（免疫グロブリンおよび非免疫グロブリン）結合剤試薬に優るいくつかの利点を有することを見出した。このような利点としては、限定されないが、それらのサイズがコンパクトかつ小型（１０〜１４ｋＤａ。これは、抗体よりも１０倍小さい）であり、それらが（１００℃超の融点を有する）非常に（熱）安定性であり、ｐＨの変化およびタンパク質分解に対して比較的非感受性であるという事実が挙げられる。加えて、本発明のライブラリーから単離されたアルファボディー結合剤および本発明の方法によって単離されたアルファボディー結合剤は高溶解性であり、天然のモチーフに基づいているがタンパク質工学技術により設計されている構造を有する。
【０００９】
本発明の重要な態様は、本発明のアルファボディーライブラリーにおいてアミノ酸配列変異を導入するために選択されるアルファボディー領域（すなわち、多様化されるアルファボディー領域）である。本明細書において詳細に記載されるように、折り畳まれたアルファボディー骨格構造について定義された異なる領域、すなわち「ヘリックス表面」領域、「溝」領域および「ループ」領域があり、それぞれがそれ自体に本質的な三次元（３−Ｄ）形状を有している。例えば、アルファボディーの溝は（細長い）凹形状を本質的に有し、ヘリックス表面は（細長い）凸形状を本質的に有し、リンカー断片は、柔軟性のある（変化する）形状を本質的に有するであろう。アルファボディーは、１個の同じ骨格構造において、溝、ヘリックス表面および柔軟性のあるリンカー断片（またはループ）を結合する唯一の骨格分子であるので、この点において独特である。
【００１０】
しかしながら、本発明者らは、導入された配列変異が特定の一領域のみに限定されないアルファボディーライブラリーの構築を検討した。
【００１１】
したがって、一態様において、本発明は、少なくとも１００個の異なる配列の単鎖アルファボディーポリペプチドを含有する単鎖アルファボディーライブラリーであって、前記アルファボディーポリペプチドが、５〜２０個の多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットの少なくとも１つにおいて互いに相違し、少なくとも７０％であるがすべてではない多様化されるアミノ酸残基位置が、
（ｉ）アルファボディーポリペプチドの第１のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｅ位および第１のα−ヘリックスに平行の第２のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｇ位、任意に、アルファボディーポリペプチドの第１のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｂ位および／またはアルファボディーポリペプチドの第２のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｃ位、
または
（ｉｉ）アルファボディーポリペプチドの１個のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｂ位、ｃ位およびｆ位、
または
（ｉｉｉ）アルファボディーポリペプチドの２個の連続するα−ヘリックスを連結するリンカー断片における位置
のいずれかに位置する単鎖アルファボディーライブラリーを提供する。
【００１２】
したがって、本発明によれば、少なくとも７０％であるが、すべてではない多様化されるアミノ酸残基位置は、本明細書において記載される「ループ」、「ヘリックス表面」または「リンカー」領域から選択される領域のうちの１つに位置する。
【００１３】
ある特定の実施形態において、本発明の単鎖アルファボディーライブラリーは、少なくとも２個の異なる構成ライブラリーを含有するアルファボディーライブラリーの混合物であり得る。
【００１４】
さらなる態様において、本発明は、本発明の単鎖アルファボディー（ポリペプチド）ライブラリーまたは本発明の単鎖アルファボディーライブラリーの混合物をコードする核酸およびベクターのライブラリーをも提供する。
【００１５】
さらにさらなる態様において、本発明は、宿主細胞のライブラリーであって、各宿主細胞が、本発明の単鎖アルファボディー（ポリペプチド）ライブラリーもしくは本発明の単鎖アルファボディーライブラリーの混合物をコードする核酸またはベクターのライブラリーの最大１個のメンバーを含有するライブラリーを提供する。
【００１６】
さらに別の態様において、本発明は、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイもしくはｍＲＮＡディスプレイなどのイン・ビトロタンパク質進化のための、本発明の単鎖アルファボディーライブラリーの使用または本発明の単鎖アルファボディーライブラリーの混合物の使用を提供する。
【００１７】
さらにさらなる態様において、本発明は、本発明の単鎖アルファボディーライブラリーの製造方法であって、
ａ）本発明の単鎖アルファボディーライブラリーをコードするか、もしくは本発明の単鎖アルファボディーライブラリーの混合物をコードする核酸またはベクターのライブラリーを製造するステップ、および
ｂ）単鎖アルファボディーライブラリーの製造に適した条件下で、核酸またはベクターのライブラリーを発現させるステップ
を少なくとも含む製造方法を提供する。
【００１８】
これらの製造方法のある実施形態において、核酸またはベクターのライブラリーを発現させるステップｂ）は、核酸またはベクターのライブラリーの個々のメンバーを宿主細胞に導入し、当該宿主細胞を、単鎖アルファボディーライブラリーの製造に適した条件下の培地中で培養するステップを含む。
【００１９】
さらに特定の実施形態において、本発明の単鎖アルファボディーライブラリーの製造方法は、宿主細胞および／または培地から、ステップｂ）において製造された単鎖アルファボディーライブラリーを単離するステップをさらに含む。
【００２０】
さらにさらなる態様において、本発明は、目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性を有する単鎖アルファボディーポリペプチドの製造における、本発明の単鎖アルファボディーライブラリーの使用を提供する。より具体的には、本発明は、目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性または目的の標的タンパク質もしくは標的細胞に対する検出可能なイン・ビトロ活性を有する１つ以上の単鎖アルファボディーポリペプチドの製造方法であって、
ａ）本発明の単鎖アルファボディーライブラリーまたは本発明の単鎖アルファボディーライブラリーの混合物を製造するステップ、
ｂ）目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性または目的の標的タンパク質もしくは標的細胞に対する検出可能なイン・ビトロ活性を有する１つ以上の単鎖アルファボディーポリペプチドを選択するステップ、および任意に、
ｃ）１つ以上の単鎖アルファボディーポリペプチドを単離するステップ
を少なくとも含む製造方法を提供する。
【００２１】
ある特定の実施形態において、目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性を有する１つ以上の単鎖アルファボディーポリペプチドを選択するステップは、
ｂ１）目的の標的分子を、本発明の単鎖アルファボディーライブラリーまたは本発明の単鎖アルファボディーライブラリーの混合物に接触させるステップ、
ｂ２）目的の標的分子に接触している単鎖アルファボディーライブラリーまたは単鎖アルファボディーライブラリーの混合物から、目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性を有する１つ以上の単鎖アルファボディーポリペプチドを同定するステップ、および任意に、
ｂ３）目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性を有する１つ以上の単鎖アルファボディーポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を決定するステップ
を含む。
【００２２】
目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性を有する１つ以上の単鎖アルファボディーポリペプチドの製造方法のある特定の実施形態において、アルファボディーライブラリーまたはアルファボディーライブラリーの混合物は、選択の接触ステップｂ１）および同定ステップｂ２）を繰り返し行なうことによって、目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性を有する単鎖アルファボディーポリペプチドについてさらに濃縮される。
【００２３】
さらなる態様において、本発明は、目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性または目的の標的タンパク質もしくは標的細胞に対する検出可能なイン・ビトロ活性を有し、本発明の方法によって得られ得る単鎖アルファボディーポリペプチドも提供する。
【００２４】
さらにさらなる態様において、本発明は、本発明の方法によって製造された単鎖アルファボディーポリペプチドをコードする核酸を提供する。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は、本発明の方法によって製造された単鎖アルファボディーポリペプチドをコードする核酸を含有するベクター、および本発明の方法によって製造された単鎖アルファボディーポリペプチドをコードする核酸またはベクターを含有する宿主細胞を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
本明細書において、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、特に明記されない限り、単数形および複数形の両方の指示対象を含む。
【００２７】
本明細書において、「含有している（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ）」という用語は、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「含有している（含んでいる）（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（含む）（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同じ意味であり、包括的または非限定的であり、追加の、記載されていないメンバー、要素または方法のステップを排除するものではない。
【００２８】
端点による数値範囲の記載は、各範囲内に包含されたすべての数および有理数、ならびに記載されている端点を含む。
【００２９】
本明細書において、「約」という用語は、測定可能な値、例えば、パラメータ、量、時間の持続期間などについて言及する場合、特定の値の、および特定の値から＋／−１０％以下、好ましくは＋／−５％以下、より好ましくは＋／−１％以下、さらにより好ましくは＋／−０．１％以下の変動を、このような変動が開示の発明を実施するうえで適切である限り、包含することを意味する。就職語句「約」が言及する値は、それ自体も明確に好ましく開示されていることは理解されるべきである。
【００３０】
本明細書において、「（本発明の）アルファボディー（Ａｌｐｈａｂｏｄｙ）」または「（本発明の）アルファボディー（Ａｌｐｈａｂｏｄｉｅｓ）」は、一般に、自己フォールディングしており、単鎖の三本鎖の、α−ヘリックスコイルドコイルを主に有するアミノ酸配列と定義され得る。
【００３１】
したがって、「単鎖アルファボディー」における「単鎖」という用語は、重複しているが、多くの公知のオリゴマー（例えば、トリマー）のペプチド性コイルドコイルの存在とは対照的に、単一のポリペプチド鎖としてのアルファボディーの組成を強調するために通常は含まれている。より具体的には、本発明との関係において使用する場合、アルファボディーは、一般式
ＨＲＳ１−Ｌ１−ＨＲＳ２−Ｌ２−ＨＲＳ３
（式中、
・ＨＲＳ１、ＨＲＳ２およびＨＲＳ３は、それぞれ独立して、２〜７個の連続するヘプタッド反復単位からなるヘプタッド反復配列（ＨＲＳ）であり、すべてのヘプタッドのａ位およびｄ位の少なくとも５０％は、イソロイシン残基によって占められており、各ＨＲＳは、ヘプタッドのａ位またはｄ位のいずれかに位置する脂肪族アミノ酸残基または芳香族アミノ酸残基で開始および終了しており、ＨＲＳ１、ＨＲＳ２およびＨＲＳ３は、ともに三本鎖のα−ヘリックスコイルドコイル構造を形成しており；かつ
・Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、ＨＲＳ１とＨＲＳ２とを共有結合的に連結し、ＨＲＳ２とＨＲＳ３とを共有結合的に連結するリンカー断片であり、少なくとも４個のアミノ酸残基からなり、好ましくは当該アミノ酸残基の少なくとも５０％がプロリン、グリシンおよびセリンからなる群より選択されるリンカー断片である）
を有するアミノ酸配列、ポリペプチドまたはタンパク質と定義され得る。
【００３２】
本明細書において、「平行アルファボディー」は、三本鎖のα−ヘリックスコイルドコイル構造のα−ヘリックスが、平行コイルドコイル構造、すなわち、３個のα−ヘリックスのすべてが平行であるコイルドコイルをともに形成する（本発明の）アルファボディーの意味を有するものとする。
【００３３】
本明細書において、「逆平行アルファボディー」は、三本鎖のα−ヘリックスコイルドコイル構造のα−ヘリックスが、逆平行コイルドコイル構造、すなわち、２個のα−ヘリックスが平行であり、かつ第３のα−ヘリックスがこれらの２個のヘリックスに対して逆平行であるコイルドコイルをともに形成する（本発明の）アルファボディーの意味を有するものとする。
【００３４】
本明細書におけるさらなる説明から明らかになるように、本発明は、一般式ＨＲＳ１−Ｌ１−ＨＲＳ２−Ｌ２−ＨＲＳ３を有する配列を含有する複数のポリペプチドも想定するが、ある特定の実施形態において、これらのポリペプチドは、さらなる基、部分および／または残基を含有し、これらは式ＨＲＳ１−Ｌ１−ＨＲＳ２−Ｌ２−ＨＲＳ３を有する基本アルファボディー構造に共有結合的に連結され、より具体的には、Ｎ末端および／またはＣ末端が共有結合的に連結される。これらは、本明細書において「本発明のアルファボディーポリペプチド」と称される。
【００３５】
「ヘプタッド」、「ヘプタッド単位」または「ヘプタッド反復単位」という用語は、本明細書において互換的に使用され、本明細書においては、アルファボディーの各ヘプタッド反復配列内で２回以上反復され、「ａｂｃｄｅｆｇ」または「ｄｅｆｇａｂｃ」で表わされる７残基の（ポリ）ペプチド断片という意味を有するものとし、「ａ」〜「ｇ」という記号は、通常のヘプタッドの位置を意味する。通常のヘプタッドの位置は、例えば、ルパス（Ｌｕｐａｓ）ら〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９１、２５２：１１６２−１１６４；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｕｓｓｅｌｌ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃｏｉｌｓ−ｓｙｒ．ｐｌ〕のＣＯＩＬＳ法などの専門のソフトウェアを使用することによって、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物中に存在するヘプタッド、ヘプタッド単位またはヘプタッド反復単位内の特定のアミノ酸残基に割り当てられる。しかしながら、本明細書におけるさらなる説明から明らかになるように、アルファボディー中に存在するヘプタッドまたはヘプタッド単位は、厳密には、上記表記（すなわち、「ａｂｃｄｅｆｇ」または「ｄｅｆｇａｂｃ」）に限定されるものではなく、それらの最も広い意味において、少なくとも割り当て可能なヘプタッドのａ位およびｄ位を含有する７残基の（ポリ）ペプチド断片それ自体を構成することに留意するべきである。
【００３６】
「ヘプタッドのａ位」、「ヘプタッドのｂ位」、「ヘプタッドのｃ位」、「ヘプタッドのｄ位」、「ヘプタッドのｅ位」、「ヘプタッドのｆ位」および「ヘプタッドのｇ位」という用語は、それぞれ、アルファボディーのヘプタッド、ヘプタッド反復またはヘプタッド反復単位における通常の「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、「ｄ」、「ｅ」、「ｆ」および「ｇ」のアミノ酸位置を指す。
【００３７】
本明細書において、「ヘプタッドモチーフ」は、７残基の（ポリ）ペプチドパターンという意味を有するものとする。「ａｂｃｄｅｆｇ」型の「ヘプタッドモチーフ」は、通常、「ＨＰＰＨＰＰＰ」と表わされ得るが、「ｄｅｆｇａｂｃ」型の「ヘプタッドモチーフ」は、通常、「ＨＰＰＰＨＰＰ」と表わされ得、式中、記号「Ｈ」は、非極性アミノ酸残基または疎水性アミノ酸残基を意味し、記号「Ｐ」は、極性アミノ酸残基または親水性アミノ酸残基を意味する。しかしながら、本明細書におけるさらなる説明から明らかになるように、アルファボディー中に存在するヘプタッドモチーフは、厳密には、上記表記（すなわち、「ａｂｃｄｅｆｇ」、「ＨＰＰＨＰＰＰ」、「ｄｅｆｇａｂｃ」および「ＨＰＰＰＨＰＰ」）に限定されるものではないことに留意するべきである。
【００３８】
本明細書において、「ヘプタッド反復配列」（「ＨＲＳ」）は、ｎ個の連続するヘプタッドからなるアミノ酸配列または配列断片の意味を有するものであり、ｎは、２以上の数である。
【００３９】
アルファボディー（本明細書において定義される）の単鎖構造との関連において、「リンカー」、「リンカー断片」または「リンカー配列」という用語は、本明細書において互換的に使用され、単鎖（モノマー）アルファボディーの近接するアミノ酸配列の一部であり、そのアルファボディーのＨＲＳ配列を相互に共有結合的に連結するアミノ酸配列断片を指す。
【００４０】
本発明との関連において、「コイルドコイル」または「コイルドコイル構造」は、本明細書において互換的に使用され、当業者であれば、共通の一般常識および本明細書において引用されるさらなる参考文献に基づいて明らかであろう。これに関する具体的な参考文献は、コイルドコイル構造に関する総説、例えば、コーヘン（Ｃｏｈｅｎ）およびパリー（Ｐａｒｒｙ）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １９９０，７：１−１５；コーン（Ｋｏｈｎ）およびホッジ（Ｈｏｄｇｅｓ）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９８，１６：３７９−３８９；シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）ら、Ｆｏｌｄ  Ｄｅｓ  １９９８，３：Ｒ２９−Ｒ４０；ハーブリー（Ｈａｒｂｕｒｙ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９８，２８２：１４６２−１４６７；メーソン（Ｍａｓｏｎ）およびアーント（Ａｒｎｄｔ）  ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２００４，５：１７０−１７６；ルパス（Ｌｕｐａｓ）およびグリューバー（Ｇｒｕｂｅｒ）、Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００５，７０：３７−７８；ウールフソン（Ｗｏｏｌｆｓｏｎ）、Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００５，７０：７９−１１２；パリー（Ｐａｒｒｙ）ら、Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ２００８，１６３：２５８−２６９；マクファーレン（ＭｃＦａｒｌａｎｅ）ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２００９，６２５：１０１−１０７などを特に参照のこと。
【００４１】
「アルファボディーのα−ヘリックス部分」は、本明細書において、α−ヘリックス二次構造を有するアルファボディーの一部という意味を有するものとする。さらに、α−ヘリックス二次構造を有するアルファボディー全体の任意の部分も、アルファボディーのα−ヘリックス部分とみなされる。より具体的には、結合部位との関連において、アルファボディーのα−ヘリックス部分に位置する１つ以上のアミノ酸が結合部位に寄与している場合、当該結合部位は、アルファボディーのα−ヘリックス部分によって形成されているとみなされる。
【００４２】
アルファボディーのα−ヘリックスの「溶媒配向（ｓｏｌｖｅｎｔ−ｏｒｉｅｎｔｅｄ）」領域または「溶媒曝露」領域は、本明細書において、それが存在する溶媒、環境、周囲または周辺（ｍｉｌｉｅｕ）に直接曝露されるか、または直接接触するアルファボディーの部分の意味を有するものである。さらに、溶媒に直接曝露されるか、または直接接触するアルファボディー全体のうちの任意の一部も、アルファボディーの溶媒配向領域または溶媒曝露領域とみなされる。より具体的には、結合部位との関連において、アルファボディーの溶媒配向部分に位置する１つ以上のアミノ酸が結合部位に寄与している場合、結合部位は、アルファボディーの溶媒配向部分によって形成されているとみなされる。
【００４３】
「アルファボディーの溝」という用語は、本明細書において、アルファボディー内の空間的に隣接したα−ヘリックスの任意の対によって形成される、くぼんだ溝様の局所的形状に対応するアルファボディーの部分の意味を有するものとする。
【００４４】
本明細書において、アミノ酸残基は、それらの正式名称によって示されるか、または標準的な３文字もしくは１文字のアミノ酸コードにしたがって示されるであろう。
【００４５】
本明細書において、「相同性」という用語は、同じ分類群または異なる分類群に由来する２つの高分子間、具体的には、２つのポリペプチド間または２つのポリヌクレオチド間の少なくとも一次構造の類似性を表わし、前記類似性は、共通の祖先に起因する。好ましくは、相同ポリペプチドは、二次構造または三次構造の類似性も示すであろう。したがって、「ホモログ」という用語は、前記一次構造の類似性、および任意に、タンパク質高分子については二次構造または三次構造の類似性を有する非常に関連する高分子を表わす。２つ以上のヌクレオチド配列を比較するために、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間の「配列同一性（のパーセンテージ）」は、当業者に公知の方法を使用することによって、例えば、第１のヌクレオチド中のヌクレオチドであって、第２のヌクレオチド配列における対応する位置のヌクレオチドと同一のヌクレオチドの数を、第１のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの総数で割り、１００％を乗じることによって、またはシーケンスアライメントのための公知のコンピューターアルゴリズム、例えば、ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔなどを使用することによって計算され得る。２つのアルファボディー間の配列同一性の程度を決定する際、当業者であれば、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮することができ、保存的アミノ酸置換は、一般に、あるアミノ酸残基が類似の化学構造の別のアミノ酸残基で置換されるアミノ酸置換であって、ポリペプチドの機能、活性またはその他の生物学的特性に対してほとんど影響を及ぼさないか、あるいは本質的にはまったく影響を及ぼさないアミノ酸置換として説明され得る。可能な保存的アミノ酸置換は、当業者に明らかであると思われる。２つ以上のアルファボディーまたは２つ以上の核酸配列は、それらがそれらの全長にわたって１００％の配列同一性を有する場合、「まったく同じもの」であると言われる。
【００４６】
本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物は、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物が特定の標的に対し、（または、少なくとも１つのその部分または断片に対し）、親和性を有するか、特異性を有するか、および／またはそれに対して特異的なものである場合、その標的「に特異的に結合する」と言われる。
【００４７】
本明細書において、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物の「特異性」は、親和性および／またはアビディティに基づいて決定され得る。本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物の「親和性」は、アルファボディー、ポリペプチドまたは組成物と、それが結合する対象となる標的タンパク質との解離平衡定数によって表わされる。ＫＤ値が低いほど、アルファボディー、ポリペプチドまたは組成物と、それが結合する対象となる標的タンパク質との間の結合力がより強くなる。代替的には、親和性は、１／ＫＤに対応する親和定数（ＫＡ）としても表わされ得る。本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物の結合親和性は、具体的な目的の標的タンパク質に応じて、当業者に公知の方法で決定され得る。
【００４８】
ＫＤは、ｋＯｆｆ（秒−１またはｓ−１で表わされる）で示される複合体の解離速度定数の、ｋＯｎ（モル−１秒−１またはＭ−１ｓ−１で表わされる）で示されるその結合速度定数に対する比として表わされ得ることが、当該技術分野において一般に公知である。約１ミリモルよりも大きいＫＤ値は、一般に、非結合または非特異的結合を示すとみなされる。
【００４９】
本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物の「アビディティ」は、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物と、目的の関連標的タンパク質との間の結合力の大きさの尺度である。アビディティは、目的の標的タンパク質の結合部位と、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物の結合部位との間の親和性、および本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物に存在する関連結合部位の数の両方に関係するものである。結合親和性、すなわち、ｋＯｆｆとｋＯｎとの比は、当業者に公知の方法によって決定され得る。これらの方法としては、限定されないが、ＲＩＡ（放射免疫測定法）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫放射定量測定法、ゲル内拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイなど）、補体結合アッセイ、免疫蛍光測定法、免疫電気泳動アッセイ、等温滴定熱量測定法、表面プラズモン共鳴、蛍光活性化細胞分類分析などが挙げられる。
【００５０】
本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物は、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物が目的の第２の標的タンパク質に結合する親和性に対し、少なくとも５倍、例えば、少なくとも１０倍、例えば、少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１０００倍高い親和性で目的の第１の標的タンパク質に結合する場合、「目的の第２の標的タンパク質にではなく目的の第１の標的タンパク質に対して特異的」であると言われる。したがって、ある実施形態において、アルファボディー、ポリペプチドまたは組成物が目的の第２の標的タンパク質ではなく目的の第１の標的タンパク質「に対して特異的」であると言われる場合、当該アルファボディー、ポリペプチドまたは組成物は、目的の第１の標的タンパク質に（本明細書において定義されるように）特異的に結合するが、目的の第２の標的タンパク質とは結合しないであろう。
【００５１】
本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物は、限定されないが、ＲＩＡ（放射免疫測定法）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫放射定量測定法、ゲル内拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイなど）、補体結合アッセイ、免疫蛍光測定法、免疫電気泳動アッセイ、等温滴定熱量測定法、表面プラズモン共鳴、蛍光活性化細胞分類分析などの方法のいずれかの検出限界よりも高い親和性で目的のタンパク質に結合する場合、目的のタンパク質「に対する検出可能な結合親和性を有する」と言われる。
【００５２】
本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは化合物の「半減期」は、一般に、アルファボディー、ポリペプチドまたは化合物のイン・ビボの血清濃度または血漿濃度が５０％減少するまでに必要な時間と定義することができる。本発明のアルファボディー、化合物またはポリペプチドのイン・ビボ半減期は、当業者に公知の任意の方法、例えば、薬物動態分析などによって決定され得る。当業者に明らかであるように、半減期は、ｔ１／２−α、ｔ１／２−βおよび曲線下面積（ＡＵＣ）などのパラメータを使用して表わされ得る。イン・ビボ半減期の増加は、一般に、ｔ１／２−α、ｔ１／２−βおよび曲線下面積（ＡＵＣ）の１つ以上のパラメータの増加、好ましくは３つすべてのパラメータの増加によって特徴付けられる。
【００５３】
本明細書において、「阻害」、「減少」および／または「抑制」という用語は、目的の標的タンパク質に特異的に結合し、当該目的の標的タンパク質とその天然の結合パートナーとの間の相互作用を阻害、減少および／または抑制する、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物（の使用）を指し得る。「阻害」、「減少」および／または「抑制」という用語は、目的の標的タンパク質に特異的に結合し、適切なイン・ビトロアッセイ、細胞アッセイまたはイン・ビボアッセイを使用して測定した場合、当該目的の標的タンパク質の生物学的活性を阻害、減少および／または抑制する、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物（の使用）も指し得る。したがって、「阻害」、「減少」および／または「抑制」は、目的の標的タンパク質に特異的に結合し、目的の標的タンパク質が関与する１つ以上の生物学的または生理学的な機序、効果、応答、機能経路または活性を阻害、減少および／または抑制する、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物（の使用）も指し得る。アンタゴニストとしての本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物のこのような作用は、目的の標的タンパク質に応じて、任意の適切な方法で、および／または当該技術分野において公知の任意の適切な（イン・ビトロおよび通常は細胞またはイン・ビボ）アッセイを使用して決定され得る。これに関連して、任意の適切な方法で、および／または当該技術分野において公知の任意の適切なイン・ビトロアッセイを使用して決定される、アンタゴニストとしてのアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物のイン・ビトロ作用は、本明細書において、目的の標的タンパク質「に対する検出可能なイン・ビトロ（アンタゴニスト）活性」とも称される。
【００５４】
本明細書において使用される「増強」、「増加」および／または「活性化」という用語は、目的の標的タンパク質に特異的に結合し、その目的の標的タンパク質と、その天然の結合パートナーとの間の相互作用を増強、増加および／または活性化する本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物（の使用）を指し得る。「増強」、「増加」および／または「活性化」という用語は、目的の標的タンパク質に特異的に結合し、適切なイン・ビトロアッセイ、細胞アッセイまたはイン・ビボアッセイを使用して測定した場合にその目的の標的タンパク質の生物学的活性を増強、増加および／または活性化する本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物（の使用）も指し得る。したがって、「増強」、「増加」および／または「活性化」は、目的の標的タンパク質に特異的に結合し、目的の標的タンパク質が関与する１つ以上の生物学的もしくは生理学的な機序、効果、応答、機能経路または活性を増強、増加および／または活性化する本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物（の使用）も指し得る。アゴニストとしての本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物のこのような作用は、目的の標的タンパク質に応じて、任意の適切な方法で、および／または当該技術分野において公知の任意の適切な（イン・ビトロおよび通常は細胞またはイン・ビボ）アッセイを使用して決定され得る。
【００５５】
本発明のアルファボディー、ポリペプチドもしくは組成物の阻害活性もしくはアンタゴニスト活性または増強活性もしくはアゴニスト活性は、可逆的であってもよく、不可逆的であってもよいが、医薬的用途および薬理学的用途においては、通常、可逆的に起こるであろう。
【００５６】
本発明のアルファボディー、ポリペプチド、組成物または核酸配列は、それが産生される宿主細胞および／または培地から抽出または精製されている場合、本明細書においては、アルファボディーに対応する「本質的に単離された（形態）」であるとみなされる。
【００５７】
アルファボディー、ポリペプチドおよび（医薬）組成物については、アルファボディー、ポリペプチドまたは医薬組成物に存在する「結合領域」、「結合部位」または「相互作用部位」という用語は、本明細書において、アルファボディー、ポリペプチドまたは医薬組成物に存在するアミノ酸残基の特定の部位、部分、ドメインまたはストレッチであって、標的分子との結合に関与する特定の部位、部分、ドメインまたはストレッチの意味を有するものとする。このような結合領域は、標的分子と接触するアルファボディーの特定のアミノ酸残基から本質的に構成される。
【００５８】
本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物は、それが２つの異なる目的の標的タンパク質の両方に対して特異的（本明細書において定義される）である場合、これらの異なる目的の標的タンパク質に対する「交差反応性」を示すと言われる。
【００５９】
本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物は、アルファボディーが、目的の標的のアミノ酸残基の部位、決定基、部分、ドメインまたはストレッチに対する１個の結合部位またはそれらに特異的に結合する１個の結合部位を含有する場合、「一価」であると言われる。アルファボディーの２個以上の結合部位が、目的の標的のアミノ酸残基の同じ部位、決定基、部分、ドメインもしくはストレッチに対するものであるか、またはそれらに特異的に結合する場合、アルファボディーは、「二価」（アルファボディー上に２個の結合部位がある場合）または「多価」（アルファボディー上に３個以上の結合部位がある場合）、例えば、三価などであると言われる。
【００６０】
アルファボディーについて言及する場合、「二重特異性」という用語は、ａ）アルファボディーの２個以上の結合部位が、同じ目的の標的に対するものであるか、または当該標的に特異的に結合するが、その標的のアミノ酸残基の同じ部位、決定基、部分、ドメインもしくはストレッチに対するものではなく（すなわち、異なる部位、決定基、部分、ドメインもしくはストレッチに対するもの）、またはそれらに特異的に結合しないこと、またはｂ）アルファボディーの２個以上の結合部位が目的の異なる標的分子に対するものであるか、またはそれらに特異的に結合することのいずれかを意味する。「多重特異性」という用語は、３個以上の結合部位がアルファボディーに存在する場合に使用される。
【００６１】
したがって、本明細書において、「二重特異性アルファボディー」または「多重特異性アルファボディー」は、それぞれ、２個または少なくとも２個の結合部位を含む式（Ｎ−）ＨＲＳ１−Ｌ１−ＨＲＳ２−Ｌ２−ＨＲＳ３（−Ｃ）の単鎖アルファボディーであって、これらの２個以上の結合部位が異なる結合特異性を有する単鎖アルファボディーの意味を有するものとする。したがって、本明細書において、それぞれ２個または３個以上の異なる結合領域が同じモノマーの単一ドメインアルファボディー中に存在する場合、アルファボディーは、「二重特異性」または「多重特異性」とみなされる。
【００６２】
本明細書において、「予防および／または治療」という用語は、特定の疾患および／または障害を予防および／または治療すること、特定の疾患および／または障害の発症を予防すること、特定の疾患および／または障害の進行を遅延または回復させること、特定の疾患および／または障害に伴う１つ以上の症状の発症を予防または遅延させること、特定の疾患および／または障害に伴う１つ以上の症状を軽減および／または緩和すること、特定の疾患および／または障害の重症度および／または持続期間を軽減すること、ならびに一般には、治療されている被験体または患者にとって有益な本発明のアルファボディーまたはポリペプチドの任意の予防効果または治療効果を含む。
【００６３】
本明細書に引用されるすべての文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。特に定義されない限り、専門用語および科学用語などの本発明を開示するのに使用されるすべての用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般に理解されている意味を有する。さらなるガイダンスによって、用語の定義は、本発明の教示をより理解するために包含される。
【００６４】
本発明者らは、異なる配列のアルファボディーポリペプチドを含有する単鎖アルファボディーライブラリー［本明細書において、「（本）発明の（単鎖）アルファボディーライブラリー」または「（本）発明のライブラリー」と称される］を作製（すなわち、構築、製造、生成）するための方法を特定した。より具体的には、本発明のアルファボディーライブラリーは、本質的にはランダムなアミノ酸残基が配置される多様化位置を含有するという点において、本質的にはランダムライブラリーである。本発明のライブラリーは、異なる目的の標的タンパク質に結合する良質なアルファボディーまたはアルファボディーポリペプチドをもたらす本質的な可能性を有する。
【００６５】
本発明者らは、アミノ酸配列変異がアルファボディーの定義された特定領域内に導入されているランダム化アルファボディーライブラリーの使用をさらに検討した。このようなアルファボディーの定義された特定領域は、本質的には、アルファボディー（本明細書において定義される）内の溝、ヘリックス表面またはリンカー断片のいずれかに対応する。対応するアルファボディーライブラリーは、本明細書において、それぞれ「溝」ライブラリー、「ヘリックス」（または「ヘリックス表面」）ライブラリーまたは「リンカー」（または任意に「ループ」）ライブラリーと称される。
【００６６】
本発明の重要な態様は、アミノ酸配列変異を導入するために選択されるアルファボディー領域（すなわち、多様化されるアルファボディー領域）がそれぞれ、折り畳みアルファボディー骨格構造中にそれぞれ本質的な三次元（３−Ｄ）形状を有するという事実である。例えば、アルファボディーの溝は（細長い）凹形状を本質的に有し、ヘリックス表面は（細長い）凸形状を本質的に有し、リンカー断片は柔軟性のある（変化する）形状を本質的に有するであろう。アルファボディーは、１個の同じ骨格構造において溝、ヘリックス表面および柔軟性のあるリンカー断片（またはループ）が一体化（ｕｎｉｔｅ）する唯一の骨格分子であるので、この点において独特である。
【００６７】
この独特の特徴を考慮して、本発明者らは、導入された配列変異が特定の一領域のみに限定されないアルファボディーライブラリーの構築を検討している。例えば、リンカーまたはループのライブラリーを構築する場合、限定的な配列変異は、ヘリックス表面に導入され得る。あるいは、限定的な配列変異は、溝ライブラリーにおける多様化される位置に隣接する完全に曝露されたヘリックス残基の位置に導入され得る。あるいは、限定的な配列変異は、溝ライブラリーまたはヘリックス表面ライブラリーにおける多様化されるα−ヘリックスに隣接するリンカー断片内に導入され得る。多様化される残基位置の大部分が位置する（典型的には、すべての多様化される位置の少なくとも７０％が溝、ヘリックス表面またはリンカー断片内に位置するであろう）特徴的な領域の（凹形状、凸形状または変化する形状）形状特性を維持するために、定義された特徴的な領域の外側の前記限定的な配列変異は、（溝、ヘリックス表面またはリンカー断片などの定義された特徴的な領域内の配列変異と組み合わせて）典型的には、すべての多様化されるアミノ酸残基位置の３０％未満に制限されるであろう。
【００６８】
また、本発明者らは、本発明のアルファボディーライブラリーが、目的の標的分子に特異的に結合する１つ以上のアルファボディーもしくはアルファボディーポリペプチドのスクリーニングおよび／または選択に使用され得ることも見出している。
【００６９】
同定および／または単離された標的結合アルファボディーおよびアルファボディーポリペプチドであって、本発明のアルファボディーライブラリーを使用して得られたアルファボディーおよびアルファボディーポリペプチドが、従来技術の標的結合分子の不利な点の１つ以上を克服することがさらに実証されている。実際、本発明のライブラリーから単離された標的結合アルファボディーは、従来の結合剤に少なくとも匹敵する親和性、多くの場合はそれよりも優れた親和性で標的に結合できることが見出されている。また、本発明のライブラリーから選択および単離され得る標的結合アルファボディーは、例えば、国際公開第２０１０／０６６７４０号および欧州特許公開第２１６１２７８号明細書で提供されているアルファボディー骨格などの基本的なアルファボディー骨格構造について最初に同定された利点、限定されないが、小さいサイズ（１０〜１４ｋＤａ）、極めて高い耐熱性、高いプロテアーゼ耐性、（それらの正確かつ安定な折り畳みは、一般に、複数の置換によっても消失しないという意味において）高いエンジニアアビリティ（ｅｎｇｉｎｅｅｒａｂｉｌｉｔｙ）、および天然のモチーフに基づいており、タンパク質工学技術により再設計された構造などを維持している。最後に、異なる本質的な形状を有するアルファボディー骨格ライブラリーの利用可能性は、骨格ライブラリー（これから、良い結合剤を取り出す必要がある）と一般的な標的分子（これは、非常に多様な形状であり得る）との間の本質的な形状相補性（の欠如）についての技術的問題を解決する。また、異なる本質的な形状のアルファボディーライブラリーの組み合わせまたは混合物を任意に使用することは、目的の標的分子との本質的な形状相補性（の欠如）についての技術的問題を解決する助けになり得る。
【００７０】
主な目的として、本発明は、単鎖アルファボディーライブラリーを提供する。本発明のこれらの単鎖アルファボディーライブラリーは、それらが異なる配列の単鎖アルファボディーポリペプチドの集合体を含有することを特徴とする。
【００７１】
本発明のライブラリーに含まれる異なる配列のアルファボディーポリペプチドは、これらのポリペプチドが、多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットにおいて互いに相違することを特徴とする。したがって、「異なる配列」という用語は、本発明のライブラリーの２つ以上のアルファボディーポリペプチドの間で、アミノ酸残基位置の所定のセットに配列変異または配列差異が存在することを指す。
【００７２】
アルファボディー配列のライブラリーまたは集合体は、任意の適切な数の異なるアルファボディー配列、例えば、少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも１０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも１０５個、少なくとも１０６個、少なくとも１０７個、少なくとも１０８個、少なくとも１０９個またはそれ以上の異なる配列の（単鎖）アルファボディーを含むことができる。
【００７３】
より具体的には、本発明の異なるアルファボディー配列のライブラリーまたは集合体は、少なくとも１００個の異なる配列のアルファボディーポリペプチド、例えば、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、例えば、少なくとも１０００個、少なくとも１００００個、少なくとも１０５個、少なくとも１０６個、少なくとも１０７個、少なくとも１０８個、少なくとも１０９個またはそれ以上の配列を含有する。
【００７４】
特定の実施形態において、本発明のアルファボディー配列のセット、集合体またはライブラリー（本明細書において互換的に使用される）は、少なくとも１００個の異なる配列のアルファボディーポリペプチドを含有する。
【００７５】
加えて、本発明の単鎖アルファボディーライブラリーは、そのライブラリーに含まれる異なる配列の単鎖アルファボディーポリペプチドが、多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットの少なくとも１つにおいて互いに相違することを特徴とする。
【００７６】
したがって、特定の実施形態において、本発明のライブラリーに含まれる異なるアルファボディー配列（本明細書において、異なる配列の（単鎖）アルファボディーとも称される）は、アミノ酸残基位置の規定の、すなわち、一定のまたは所定のセットにおいてのみ互いに相違する。
【００７７】
製造されたライブラリー内の異なる配列の（単鎖）アルファボディーを互いに比較すると、多様化されるアミノ酸残基位置のこのような所定のセットは、アミノ酸残基の種類の多種性または多様性を特徴とする多数の特定アミノ酸残基位置からなるものである。
【００７８】
「多様化されるアミノ酸残基位置」という概念は、異なる配列のアルファボディーのライブラリーについて言及する場合、前記アルファボディーのライブラリーに由来する異なる配列のアルファボディーのアミノ酸配列の少なくとも２つを互いに比較した場合、少なくとも２つの異なる種類のアミノ酸残基（定義された種類のアミノ酸残基、例えば、天然型のアミノ酸残基など）が位置するアミノ酸残基位置（これらの位置は、ライブラリーの任意の２個の異なる配列のアルファボディーについては相違しないが、ライブラリーは、このアミノ酸残基位置が相違する少なくとも２個の異なる配列のアルファボディーを含有することに留意するべきである）を指す。「多様化されるアミノ酸残基位置のセット」は、異なる配列のアルファボディーのライブラリーについて言及する場合、前記アルファボディーのライブラリーに由来する異なる配列のアルファボディーのアミノ酸配列の少なくとも２つを互いに比較すると、少なくとも２つの異なる種類のアミノ酸残基が位置するアミノ酸残基位置のセット（これらの位置は、ライブラリーの任意の２個の異なる配列のアルファボディーについては相違しないことに留意するべきである）を指す。「多様化されるアミノ酸残基位置の規定のセット（ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｅｔ）」は、異なる配列のアルファボディーのライブラリーについて言及する場合、前記異なる配列のアルファボディーのライブラリーに由来するすべてのアミノ酸配列を互いに同時比較すると、少なくとも２つの異なる種類のアミノ酸残基が位置するアミノ酸残基位置の特定のセットを指す。したがって、前記異なる配列のアルファボディーのライブラリーに由来するすべてのアミノ酸配列を同時比較すること、およびこのような同時比較において、少なくとも２つの異なる種類のアミノ酸残基が位置するアミノ酸残基位置を同定することにより、アルファボディーライブラリーにおける前記多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットを同定することが可能になる。本明細書では、当業者であれば、単鎖アルファボディーライブラリーなどの配列ライブラリー中の配列を決定する方法を知っているものと考える。さらに、本明細書では、アルファボディー配列は、アミノ酸配列レベル、またはこれらのアミノ酸配列を表わす（コードする）ヌクレオチド配列レベルの両方で比較され得ると理解される。
【００７９】
２個以上の異なる配列のアルファボディーを比較するのに好ましい方法は、自動化シーケンスアライメントのための公知のコンピューターアルゴリズム、例えば、ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔによって生成されるペアワイズシーケンスアライメントまたはマルチプルシーケンスアライメントに基づくものである。あるいは、２個以上の異なる配列のアルファボディーは、熟練ユーザーによって生成されるペアワイズシーケンスアライメントまたはマルチプルシーケンスアライメントに基づいて比較され得るが、このようなアライメント方法は、マニュアルシーケンスアライメントとしても公知である。異なる配列のアルファボディーに適用される自動化シーケンスアライメントおよびマニュアルシーケンスアライメントの技術は両方とも、全般的な配列同一性もしくは全般的な配列類似性（または相同性もしくは一致性）を最大化すること、または異なる配列のアルファボディーのコアアミノ酸位置（すなわち、本明細書において定義されるヘプタッドのａ位およびｄ位）の配列同一性もしくは配列類似性を最大化することに基づくものであり得る。
【００８０】
したがって、多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットは、アルファボディーライブラリーにおけるすべての異なる配列のアルファボディーのすべてもしくは少なくとも代表的なサブセットのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の比較から推定され得る。アルファボディーライブラリーを生成する際に、いわゆる意図されたものでない突然変異、挿入または欠失が起こり得ることも一般に認められている。このような意図されたものでない突然変異、挿入または欠失は、前記アルファボディーライブラリーを設計または生成する際に多様化することを意図していなかった位置に起こるヌクレオチドもしくはアミノ酸の突然変異、挿入または欠失である。当業者によって一般に認められているように、前記アルファボディーライブラリーを最先端の技術で生成した条件では、このような意図されたものでない突然変異、挿入または欠失は、アルファボディーライブラリー配列内において、散在的な形式で（すなわち、異なる位置で）散発的にしか起こらないであろう。好ましくは、このような意図されたものでない突然変異、挿入または欠失は、１０％未満、より好ましくは５％未満、より好ましくは２％未満、１％または１％よりもさらに少ない頻度で、任意の所定位置において起こるであろう。したがって、アルファボディーライブラリー内の意図されたものでない突然変異、挿入または欠失は、意図的な配列変異を示す位置で観察される変動性と比較してそれらが低頻度であることに基づいて同定され得る。したがって、前記ライブラリーの設計または製造についての知識を持たずに、本発明のアルファボディーライブラリー内の多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットを決定するのに好ましい方法は、このライブラリー内に含まれる配列の少なくとも代表的なサブセットのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を決定し、その後、すべての決定した配列を（好ましくはマルチプル）アライメントで比較し、その後、配列変異が観察される位置を特定し、その後、各可変位置で観察されるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の種類の頻度を特定し、その後、所定のカットオフパーセンテージよりも高頻度で突然変異、挿入または欠失を有する位置を特定することであり、このカットオフパーセンテージは、１０％、５％、２％、１％またはさらに１％未満、例えば、０．５％、０．１％または０％（この場合、観察される変異はすべて、多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットに含まれる）に設定する。あるいは、単鎖アルファボディーライブラリーの元の設計または製造についての知識が利用可能である場合、このライブラリーの多様化されるアミノ酸残基位置のセットは、好ましくは、ライブラリーそれ自体の分析ではなく前記知識に基づくものである。多様化される位置の選択を含む単鎖アルファボディーライブラリーの設計方法は、以下に記載される。
【００８１】
本発明のライブラリーにおいて、このような所定のセットにおける多様化されるアミノ酸残基位置の数は、５〜２０個のアミノ酸残基位置の範囲であり得る。したがって、本発明のライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットは、５〜２０個、例えば、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個の定義された多様化されるアミノ酸残基位置を含有し得る。
【００８２】
本発明のライブラリーに含まれる異なる配列のアルファボディーポリペプチドは、このような所定のセットの５〜２０個の位置のうちの少なくとも１個のアミノ酸残基位置において互いに相違し得る。したがって、例えば、ライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットが、１３個の多様化されるアミノ酸残基位置のセットを含有する場合、本発明のライブラリーにおける異なる配列のアルファボディーポリペプチドは、これらのアミノ酸残基位置の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個または１３個すべてにおいて互いに相違し得る。したがって、好ましくは散発的かつ意図されたものでない突然変異、挿入または欠失が、多様化される位置の所定のセットの位置以外の位置においてさらに起こり得るという条件下で、本発明のライブラリーに含まれる異なる配列のアルファボディーポリペプチド配列は、５〜２０個の多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットに存在する配列の差異によって互いに区別され得ることが明らかである。
【００８３】
本発明のライブラリーの構築のための基盤として（すなわち、参照または鋳型構造として）使用されるアルファボディー骨格は、ＨＲＳ１−Ｌ１−ＨＲＳ２−Ｌ２−ＨＲＳ３で表わされる単鎖三重α−ヘリックスコイルドコイル構造を形成する。ヘプタッド反復配列（ＨＲＳ）１、２および３はそれぞれ、α−ヘリックスコンフォメーションをとり、アルファボディーの（α−）ヘリックスと称される。（アルファボディー中に存在する）これらの３つのヘリックスは、典型的には、それぞれヘリックスＡ、ＢおよびＣと称される。
【００８４】
異なる種類のアルファボディーライブラリーは、アルファボディー単鎖コイルドコイル骨格を使用して、多様化されるアミノ酸残基位置のセットが位置するアルファボディー構造内の場所に応じて生成され得る。多様化されるアミノ酸のセットの位置は、本発明の方法を適用することによってアルファボディー上に生成される結合部位の種類および位置を決定する。これに関し、「溝ライブラリー」（結合部位は、アルファボディーの３個のヘリックスのうちの２個のヘリックスの間の溝に位置するアミノ酸残基によって主に形成される）、「ヘリックスライブラリー」（結合部位は、アルファボディーの３個のα−ヘリックスのうちの１個のヘリックスの溶媒配向側面に位置するアミノ酸残基によって主に形成される）、または「ループライブラリー」（結合部位は、ループの役割を果たすアルファボディーリンカー配列の１つ以上の中に位置するアミノ酸残基によって主に形成される）を参照し得る。
【００８５】
多様化されるアミノ酸残基位置がアルファボディーの溝、表面またはリンカーのいずれかに、独占的に（すなわち、１００％）位置するライブラリーは、本明細書において、「純粋な溝」、「純粋な表面」または「純粋なループ」のライブラリーと称される。しかしながら、本明細書において以下に詳細に記載されるように、本方法は、「純粋な」溝、表面またはループのライブラリーである必要がないアルファボディーライブラリーの使用を想定する。
【００８６】
本発明の特定の実施形態において、多様化されるアミノ酸残基位置が、アルファボディーの３個のヘリックスのうちの２個のヘリックスの間の溝に主に位置するアルファボディーライブラリーが提供される。これらの実施形態では、本発明のライブラリーに含まれるアルファボディーにおいて、標的タンパク質に結合するための結合部位は、アルファボディーの３個のα−ヘリックスのうちの２個のヘリックスの間の溝に位置するアミノ酸残基位置によって主に形成される。
【００８７】
アルファボディーにおける２個の隣接するα−ヘリックスの間の溝（の表面）の形成に関与する残基は、一般に、ヘプタッドのｅ位およびｇ位に位置するが、より曝露されているｂ位およびｃ位のいくつかならびに大部分が埋まっているコアａ位およびｄ位も、溝表面に寄与する可能性がある；このようなことは、本質的には、これらの位置に配置されるアミノ酸側鎖の大きさに依存するであろう。
【００８８】
平行または逆平行の単鎖コイルドコイルのいずれかに折り畳まれるという生成されるアルファボディーの性質に応じて、溝ライブラリーを得るために多様化する必要があるアルファボディー配列内の位置は、変化するであろう。
【００８９】
平行アルファボディーにおけるすべてのヘリックスペアの場合ならびに逆平行アルファボディーにおけるヘリックスＡおよびＣの場合のように、アルファボディーの２個の空間的に隣接するα−ヘリックス（すなわち、結合のための溝がその間に位置するα−ヘリックス）は平行に走っているため、溝に位置する結合部位は、第１のヘリックスのｅ残基の少なくとも数個かおよび平行な第２のヘリックスのｇ残基の少なくとも数個を多様化することによって形成され得る。これらの残基に加えて、結合部位は、任意に、第１のヘリックスにおけるｂ位の残基および／または平行な第２のヘリックスにおけるｃ位の残基を多様化することによってさらに形成され得る。したがって、これらの実施形態において、結合部位がｅ／ｇ−溝に位置するアルファボディーを得るために、標的特異的なアルファボディーの生成に使用されるアルファボディーライブラリーの多様化されるアミノ酸残基位置は、アルファボディーポリペプチドの第１のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｅ位および第１のα−ヘリックスに平行の第２のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｇ位、任意に、さらに、第１のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｂ位および／またはアルファボディーポリペプチドの第２のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｃ位に位置する。特定の実施形態において、多様化されるアミノ酸残基位置が、主に（すなわち、少なくとも７０％）、アルファボディーポリペプチドの第１のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｅ位（および任意に、さらにｂ位）および第１のα−ヘリックスに平行の第２のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｇ位（および任意に、さらにｃ位）に位置するアルファボディーライブラリーが提供されることが想定される。
【００９０】
代わりにまたは加えて、逆平行に位置する２個の空間的に隣接するα−ヘリックスを含有するアルファボディー骨格が使用され得る（これらの逆平行ヘリックスの間の溝に位置する結合部位が想定される場合）。これは、典型的には、逆平行アルファボディーにおけるヘリックスＡおよびＢまたはヘリックスＢおよびＣの場合である。これらの実施形態において、典型的には、結合部位が逆平行ヘリックスの間の溝によって形成されることを保証するために多様化する必要がある多様化されるアミノ酸残基位置の種類について、２つの可能性がある。
【００９１】
第１の可能性において、２個の逆平行ヘリックスの間の溝は、第１のヘリックスのｅ残基の少なくとも数個および逆平行な第２のヘリックスのｅ残基の少なくとも数個によって形成される。したがって、このようなｅ／ｅ−溝内に形成される結合部位を得るために、少なくともこれらのアミノ酸残基位置が多様化される。これらの残基に加えて、このような結合部位は、任意に、第１のヘリックスにおけるｂ位の残基および／または逆平行な第２のヘリックスにおけるｂ位の残基によってさらに形成され得る。したがって、これらの実施形態において、目的の標的タンパク質に対するアルファボディーであって、結合部位がｅ／ｇ−溝に位置するアルファボディーを得るために、多様化されるアミノ酸残基位置は、アルファボディーポリペプチドの第１のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｅ位および第１のα−ヘリックスに逆平行の第２のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｅ位、任意に、さらに、第１のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｂ位および／またはアルファボディーポリペプチドの第２のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｂ位に位置する。本発明の特定の実施形態において、多様化されるアミノ酸残基位置が、主に（すなわち、少なくとも７０％）、アルファボディーポリペプチドの第１のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｅ位（および任意に、さらにｂ位）および第１のα−ヘリックスに逆平行の第２のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｅ位（および任意に、さらにｂ位）に位置するアルファボディーライブラリーが提供されることが想定される。
【００９２】
第２の可能性において、２個の逆平行ヘリックスの間の溝は、第１のヘリックスのｇ残基の少なくとも数個および逆平行な第２のヘリックスのｇ残基の少なくとも数個によって形成される。したがって、このようなｇ／ｇ−溝内に形成される結合部位を得るために、少なくともこれらのアミノ酸残基位置が多様化される。これらの残基に加えて、このような結合部位は、任意に、第１のヘリックスにおけるｃ位の残基および／または逆平行な第２のヘリックスにおけるｃ位の残基によってさらに形成され得る。したがって、これらの実施形態において、結合部位がｇ／ｇ−溝に位置するアルファボディーを得るために、多様化されるアミノ酸残基位置は、アルファボディーポリペプチドの第１のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｇ位および第１のα−ヘリックスに逆平行の第２のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｇ位、任意に、さらに、第１のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｃ位および／またはアルファボディーポリペプチドの第２のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｃ位に位置する。本発明の特定の実施形態において、多様化されるアミノ酸残基位置が、主に（すなわち、少なくとも７０％）、アルファボディーポリペプチドの第１のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｇ位（および任意に、さらにｃ位）および第１のα−ヘリックスに逆平行の第２のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｇ位（および任意に、さらにｃ位）に位置するアルファボディーライブラリーが提供されることが想定される。
【００９３】
したがって、それぞれが互いに平行な３個のα−ヘリックスを有する平行アルファボディーは、３個のｅ／ｇ−溝を含むことが明らかであろう。一方、互いに平行な２個のα−ヘリックスと、逆平行に伸びる１個のα−ヘリックスとを含む逆平行アルファボディーは、１個のｅ／ｇ−溝、１個のｅ／ｅ−溝および１個のｇ／ｇ−溝を含む。アルファボディーの溝の任意の部分も、溝領域とみなされる。
【００９４】
原則として、「純粋な」溝ライブラリーは、このようなライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置がすべて、アルファボディーポリペプチドの第１のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｅ位およびｂ位またはｇ位およびｃ位ならびにアルファボディーポリペプチドの第２のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｅ位およびｂ位またはｇ位およびｃ位に位置することを特徴とするアルファボディーライブラリーである。このようなライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置が独占的ではなく単に大部分、アルファボディーポリペプチドの第１のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｅ位およびｂ位またはｇ位およびｃ位ならびにアルファボディーポリペプチドの第２のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｅ位およびｂ位またはｇ位およびｃ位に位置することを特徴とするアルファボディーライブラリーは、より多くのより優れた標的特異的なアルファボディーを生成することが、本発明者らによって見出された。したがって、本発明の方法は、具体的には、このようなライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置が独占的ではなく大部分（すなわち、少なくとも７０％）、アルファボディーポリペプチドの第１のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｅ位およびｂ位またはｇ位およびｃ位ならびにアルファボディーポリペプチドの第２のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｅ位およびｂ位またはｇ位およびｃ位に位置するアルファボディーライブラリーを想定する。特定の実施形態において、使用されるアルファボディーライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置は、少なくとも７０％が溝を形成する指定位置に位置する。さらに特定の実施形態において、ライブラリーにおける少なくとも１個の多様化されるアミノ酸残基位置は、アルファボディーポリペプチドの第１のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｅ位およびｂ位またはｇ位およびｃ位に対応する位置ならびにアルファボディーポリペプチドの第２のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｅ位およびｂ位またはｇ位およびｃ位に対応する位置の外側に位置する。
【００９５】
加えてまたは代わりに、結合部位が、主に、アルファボディーの３個のヘリックスのうちの１個の表面によって形成されるアルファボディーライブラリーが提供される。したがって、これらの実施形態において、多様化されるアミノ酸残基位置が、主に、アルファボディーポリペプチドの３個のヘリックスのうちの１個のヘリックスの溶媒配向側に位置するアルファボディーライブラリーが提供される。このようなアルファボディーライブラリーは、本明細書において、「ヘリックス表面ライブラリー」または「ヘリックスライブラリー」と称される。
【００９６】
アルファボディーの表面にあると考えられるアミノ酸残基位置は、ヘリックスＡ、ＢまたはＣのいずれかに位置し得る。特定の実施形態において、アルファボディーライブラリーは、多様化されるアミノ酸残基が、ヘリックスＣの完全に溶媒に曝露されているアミノ酸残基に対応するアルファボディーを含む。最も突出しており、したがって溶媒配向性である残基は、アルファボディーの各α−ヘリックスにおけるｂ位、ｃ位およびｆ位に位置する。したがって、特定の実施形態において、本発明のアルファボディーライブラリーは、アルファボディーポリペプチドの１個のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｂ位、ｃ位およびｆ位に位置する多様化されるアミノ酸残基位置を含有する。
【００９７】
原則として、「純粋な」ヘリックス表面のライブラリーは、このようなライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置がすべて、アルファボディーポリペプチドの１個のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｂ位、ｃ位およびｆ位に位置することを特徴とするアルファボディーライブラリーである。多様化されるアミノ酸残基位置が独占的ではなく、単に、アルファボディーポリペプチドのα−ヘリックスのヘプタッドのｂ位、ｃ位およびｆ位に主に位置することを特徴とするアルファボディーライブラリーは、より多くのより優れた標的特異的なアルファボディーを生み出すことが、本発明者らによって見出された。したがって、本発明は、具体的には、このようなライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置が独占的ではなく、主に（すなわち、少なくとも７０％）、アルファボディーポリペプチドのα−ヘリックスのヘプタッドのｂ位、ｃ位およびｆ位に位置するアルファボディーライブラリーを想定する。特定の実施形態において、使用されるアルファボディーライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置は、少なくとも７０％が溶媒に曝露している指定位置に位置する。さらに特定の実施形態において、ライブラリーにおける少なくとも１個の多様化されるアミノ酸残基位置は、アルファボディーポリペプチドのα−ヘリックスのヘプタッドのｂ位、ｃ位およびｆ位に対応する位置の外側に位置する。
【００９８】
加えてまたは代わりに、アルファボディー上の結合部位が、主に、α−ヘリックスを相互に結合するアルファボディーリンカー配列のうちの１個の中に位置するアミノ酸残基位置によって形成されるアルファボディーライブラリーが提供される。平行アルファボディーにおいて、２個のリンカーは、コイルドコイル構造の末端部を相互に連結する（すなわち、それらは、ヘリックスＣ末端と、反対側に位置するヘリックスＮ末端との間の結合を形成する）。逆平行アルファボディーにおいて、２個のリンカーは、コイルドコイル構造の近接端部を相互に結合する（すなわち、それらは、ヘリックスＣ末端と、同じ側に位置するヘリックスＮ末端との間の結合を形成する）。両方の種類のアルファボディーにおいても、リンカーは、立体構造的に柔軟であると考えられる。加えて、両方の種類のアルファボディーにおけるリンカーも、それらのアミノ酸配列に関して柔軟であると考えられる。したがって、いずれの種類のアルファボディーにおけるリンカーも、アルファボディーのコイルドコイル骨格の折り畳みおよび安定性に対する重大な影響を伴わずに、アミノ酸配列変異に供され得る。その結果として、配列多様性が、平行型アルファボディーまたは逆平行型アルファボディーのいずれかにおけるリンカー断片のいずれかのアミノ酸位置内に導入されるアルファボディーの「ループ」または「リンカーライブラリー」が提供される。特定の実施形態において、１個のリンカー断片のアミノ酸残基位置のすべてが多様化されるライブラリーが提供される。さらに特定の実施形態において、リンカー断片の中央付近に位置する残基位置の選択が多様化される（α−ヘリックス末端の障害とならないために）。さらに特定の実施形態において、リンカー断片の末端のうちの１個の付近にある選択残基位置が変化し得る；これは、α−ヘリックス末端の障害となるリスクを増加させるが、アルファボディーは、一般に、このような潜在的障害を許容するのに十分安定であろう。さらにさらなる特定の実施形態において、部分長または全長のループ配列に対して残基位置の変化が多様化され得る。
【００９９】
「純粋な」リンカーまたはループのライブラリーは、このようなライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置が、すべて、アルファボディーポリペプチドのリンカー断片内に位置することを特徴とするアルファボディーライブラリーである。多様化されるアミノ酸残基位置が独占的ではなく単に大部分、アルファボディーポリペプチドにおけるリンカーの位置に位置することを特徴とするアルファボディーライブラリーは、より多くのより優れた標的特異的なアルファボディーを生み出すことが、本発明者らによって見出された。したがって、本発明は、具体的には、このようなライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置が独占的ではなく大部分（すなわち、少なくとも７０％）、アルファボディーポリペプチドのリンカーのうちの１個の中に位置するアルファボディーライブラリーを想定する。特定の実施形態において、提供されるアルファボディーライブラリーにおける多様化されるアミノ酸残基位置は、少なくとも７０％がアルファボディーリンカー断片のうちの１個の中に位置する。さらに特定の実施形態において、ライブラリーにおける少なくとも１個の多様化されるアミノ酸残基位置は、アルファボディーポリペプチドのリンカー断片のアミノ酸残基位置の外側に位置する。
【０１００】
上記のように、本発明の方法の特定の実施形態において、結合部位が、主に、アルファボディーの溝、ヘリックス表面またはリンカー断片によってそれぞれ形成されるように、多様化されるアミノ酸のセットが、アルファボディーの溝、ヘリックス表面またはリンカー断片の外側にそれぞれ位置する少なくとも１個、より具体的には２個以上のアミノ酸残基位置を含有することを特徴とするアルファボディーライブラリーが提供される。これらの実施形態において、その溝、ヘリックス表面またはリンカー断片によって、主に形成される結合部位を有するアルファボディーの溝、ヘリックス表面またはリンカー断片内の多様化されるアミノ酸位置のパーセンテージは、１００％未満である。しかしながら、溝、ヘリックス表面またはリンカー断片内に位置する多様化されるアミノ酸位置のパーセンテージは、典型的には、少なくとも７０％である。
【０１０１】
したがって、本発明の特定の実施形態において、アルファボディーライブラリーは、純粋な溝、純粋な表面または純粋なループのライブラリーではない。より具体的には、少なくとも７０％であるが、すべてではない多様化されるアミノ酸位置、例えば、多様化されるアミノ酸位置の９５％未満、例えば、９０％未満または８５％未満が、アルファボディーの溝、ヘリックス表面またはリンカー断片内に位置する。
【０１０２】
多様化されるアミノ酸残基位置の数に応じて、上記パーセンテージは、様々な数の実際のアミノ酸残基位置に対応するであろう。したがって、上記から明らかであるように、本発明の方法の特定の実施形態において、例えば、これらの５〜２０個の位置の少なくとも５％（すなわち、５〜２０個の多様化される位置の少なくとも１個の位置）、または特に少なくとも１０％（すなわち、少なくとも１個または少なくとも２個の位置）、または特に少なくとも１５％（すなわち、少なくとも１個〜少なくとも３個の位置）、または特に少なくとも２０％（すなわち、少なくとも１個〜少なくとも４個の位置）、または特に少なくとも２５％（すなわち、少なくとも２個〜少なくとも５個の位置）、または特に３０％（すなわち、２〜６個の位置）の位置が、
（ｉ）アルファボディーポリペプチドの第１のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｅ位またはｇ位および第２のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｅ位またはｇ位、任意に、アルファボディーポリペプチドの第１のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｂ位もしくはｃ位および／またはアルファボディーポリペプチドの第２のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｂ位もしくはｃ位、例えば、
（ｉ１）アルファボディーポリペプチドの第１のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｅ位および第１のα−ヘリックスに平行の第２のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｇ位、任意に、アルファボディーポリペプチドの第１のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｂ位および／またはアルファボディーポリペプチドの第２のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｃ位、
または
（ｉ２）アルファボディーポリペプチドの第１のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｅ位および第１のα−ヘリックスに逆平行の第２のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｅ位、任意に、アルファボディーポリペプチドの第１のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｂ位および／またはアルファボディーポリペプチドの第２のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｂ位、
または
（ｉ３）アルファボディーポリペプチドの第１のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｇ位および第１のα−ヘリックスに逆平行の第２のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｇ位、任意に、アルファボディーポリペプチドの第１のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｃ位および／またはアルファボディーポリペプチドの第２のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｃ位
または
（ｉｉ）アルファボディーポリペプチドの１個のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｂ位、ｃ位およびｆ位、
または
（ｉｉｉ）アルファボディーポリペプチドの２個の連続するα−ヘリックスを連結するリンカー断片における位置
以外の位置に位置するアルファボディーライブラリーが提供される。
【０１０３】
したがって、ライブラリーにおける異なる配列の（単鎖）アルファボディーは、５〜２０個のアミノ酸残基位置の所定のセットにおいて相違し、各ライブラリーについて、これらの５〜２０個の位置の少なくとも７０％（すなわち、少なくとも４個〜少なくとも１４個の位置）、例えば、少なくとも７５％（すなわち、少なくとも４個〜少なくとも１５個の位置）、少なくとも８０％（すなわち、少なくとも４個〜少なくとも１６個の位置）、少なくとも８５％（すなわち、少なくとも４個〜少なくとも１７個の位置）、例えば、少なくとも９０％（すなわち、少なくとも５個〜少なくとも１８個の位置）、例えば、少なくとも９５％（すなわち、少なくとも５個〜少なくとも１９個の位置）またはそれ以上、例えば、１００％（すなわち、５個〜２０個の位置すべて）が、ライブラリーにおける各アルファボディーポリペプチドの
（ｉ）２個の隣接するα−ヘリックスによって形成されるか、もしくはそれらの間の溝、または
（ｉｉ）１個のα−ヘリックスの溶媒配向表面、または
（ｉｉｉ）２個のα−ヘリックスを相互に連結するリンカー断片のうちの１個の中
のいずれかに位置する；より具体的には、これらの多様化される位置は、上記各選択肢について記載した位置に位置する。
【０１０４】
多様化されるアミノ酸残基位置が、主に（すなわち、少なくとも７０％）溝に位置するアルファボディーライブラリーについて、前記ヘプタッドのｅ、ｇ、ｂまたはｃ位以外の場所に位置する残りの多様化される位置は、例えば、ヘプタッドのａ位、ヘプタッドのｄ位、ヘプタッドのｆ位またはアルファボディーのリンカーにおけるアミノ酸残基位置に位置し得ることに留意するべきである。本発明のアルファボディーの各ヘプタッド反復配列におけるａ位およびｄ位（コア残基とも称される）は、アルファボディーの溶媒遮蔽（すなわち、埋まっている）部分を本質的に形成するコイルドコイル構造のアミノ酸残基位置である。ほとんどの本発明のアルファボディー溝ライブラリーにおいて、アルファボディーの安定性を維持するために、これらのコア残基のすべてまたは数個は保存されることが想定される。これらの実施形態において、残りの多様化される位置は、例えば、リンカー残基位置またはヘプタッドのｆ位に位置し得る。
【０１０５】
同様に、多様化されるアミノ酸残基位置が、主に（すなわち、少なくとも７０％）アルファボディーヘリックスの溶媒配向表面に位置するアルファボディーライブラリーについて、前記ヘプタッドのｂ位、ｃ位またはｆ位に位置しない残りの多様化される位置は、例えば、ヘプタッドのｅ位、ｇ位、ａ位もしくはｄ位またはアルファボディーのリンカーにおけるアミノ酸残基位置に位置し得る。上に詳細に記載されるように、ほとんどの本発明のアルファボディーヘリックス表面ライブラリーにおいて、アルファボディーの安定性を維持するために、コア残基（ａ位およびｄ位）のすべてまたは数個は保存されることが想定される。これらの実施形態において、残りの多様化される位置は、例えば、ヘプタッドのｅ位もしくはｇ位またはリンカー残基位置に位置し得る。
【０１０６】
最後に、多様化されるアミノ酸残基位置が、主に（すなわち、少なくとも７０％）アルファボディーのリンカー断片内に位置するアルファボディーライブラリーについて、リンカー断片内に位置しない残りの多様化される位置は、例えば、ヘプタッドのｅ位、ｇ位、ｆ位、ｂ位、ｃ位、ａ位もしくはｄ位またはアルファボディーの２個のリンカー断片とは別の部分のアミノ酸残基位置に位置し得る。先と同様に、いくつかの実施形態において、安定性を確保するために、アルファボディーの各ヘプタッド単位におけるａ位およびｄ位は、変化されないであろう。これらの実施形態において、残りの多様化されるアミノ酸残基位置は、ヘプタッドのｅ位、ｇ位、ｆ位、ｂ位もしくはｃ位またはアルファボディーの２個のリンカー断片とは別の部分のアミノ酸残基位置に位置し得る。
【０１０７】
各アルファボディーポリペプチドの２個の隣接するα−ヘリックスによって形成されるかまたはそれらの間の溝内に位置する多様化されるアミノ酸残基位置について言及する場合、それは、これらの多様化されるアミノ酸残基位置が、ライブラリーに含まれる各アルファボディーポリペプチドにおいて、１個の同じ溝、すなわち、２個の同じ隣接するα−ヘリックスによって形成される溝内に位置することを意味する。同様に、アルファボディーポリペプチドの１個のα−ヘリックス内に位置する多様化されるアミノ酸残基位置について言及する場合、それは、これらの多様化されるアミノ酸残基位置が、ライブラリーに含まれる各アルファボディーポリペプチドにおいて、１個の同じα−ヘリックス内に位置することを意味する。また、２個の連続するα−ヘリックスを相互に連結するリンカー断片内の位置に位置する多様化されるアミノ酸残基位置について言及する場合、それは、これらの多様化されるアミノ酸残基位置が、ライブラリーに含まれる各アルファボディーポリペプチドにおいて、２個の連続するα−ヘリックスを相互に連結する１個の同じリンカー断片内に位置することを意味する。
【０１０８】
しかしながら、例えば、特定の標的に対するアルファボディーの開発に使用するために、異なる溝、表面またはループのライブラリーが組み合わせられることが想定され得る。より具体的には、ヘリックスＣの表面上に主に位置する多様化されるアミノ酸位置を含有するヘリックス表面ライブラリーは、ヘリックスＡの表面上に主に位置する多様化されるアミノ酸位置を含有するヘリックス表面ライブラリーおよび／またはヘリックスＢの表面上に主に位置する多様化されるアミノ酸位置を含有するヘリックス表面ライブラリーと組み合わせられることが想定され得る。同様に、ｅ／ｇ−溝内に主に位置する多様化されるアミノ酸位置を含有する溝ライブラリーは、ｅ／ｅ−溝内に主に位置する多様化されるアミノ酸位置を含有する溝ライブラリー、および／またはｇ／ｇ−溝内に主に位置する多様化されるアミノ酸位置を含有する溝ライブラリーと組み合わせられることが想定され得る。同様に、第１のリンカー断片内に主に位置する多様化されるアミノ酸位置を含有するリンカーライブラリーは、第２のリンカー断片内に主に位置する多様化されるアミノ酸位置を含有するリンカーライブラリーと組み合わせられることが想定され得る。最後に、１つ以上のヘリックス表面ライブラリーは、１つ以上の溝ライブラリー、および／または１つ以上のリンカーライブラリーと組み合わせられることが想定され得る。単鎖アルファボディーライブラリーを組み合わせる実用的な方法は、例えば、異なるライブラリーをほぼ等量で混合することによって達成され得る。
【０１０９】
本発明のアルファボディーライブラリーは、様々な形態で提供され得、以下に限定されないが、タンパク質のライブラリー、核酸のライブラリー、ベクターのライブラリーまたは宿主細胞のライブラリーであり得る。
【０１１０】
特定の実施形態において、本発明のライブラリーは、宿主細胞のライブラリーであって、各宿主細胞が核酸またはベクターのライブラリーの最大１個のメンバーを含有し、このような核酸またはベクターのライブラリーの各メンバーが本発明の単鎖アルファボディー（ポリペプチド）をコードするライブラリーである。より具体的には、ライブラリーは、アルファボディーが発現される宿主細胞のライブラリーである。
【０１１１】
特定の実施形態において、目的の標的タンパク質もしくは標的細胞に対する検出可能な結合親和性または検出可能なイン・ビトロ活性を有する所望のアルファボディー配列を単離するためのスクリーニングまたは選択を容易にするために、ライブラリーのアルファボディーは、ファージ粒子、リボソーム、細菌、酵母細胞、哺乳類細胞または任意のその他の適切な（微）生物の表面上に提示される。
【０１１２】
したがって、特定の実施形態において、本発明のライブラリーは、タンパク質配列のセットまたは集合体を表わすので、アルファボディータンパク質のライブラリーである。ライブラリーのアルファボディーメンバーは、ライブラリーにおいて別々のアルファボディー配列として提示され得るか、または異なるアルファボディー配列の混合物として提供され得る。
【０１１３】
さらなる態様において、本発明は、本発明の単鎖アルファボディー（ポリペプチドまたはタンパク質）ライブラリーもしくは単鎖アルファボディーライブラリーの混合物をコードする核酸およびベクターのライブラリーを提供する。
【０１１４】
さらなる態様において、本発明は、本発明の単鎖アルファボディーライブラリーの製造方法を提供する。したがって、これらの方法は、ポリペプチド、核酸またはベクターのライブラリーを製造するステップを含む。
【０１１５】
当業者であれば、本発明のアルファボディーライブラリーは、典型的には、組換えＤＮＡ技術によって生成されることを理解するであろう。より具体的には、特定のアミノ酸位置がそれぞれ相違するアルファボディーをコードする核酸配列のライブラリーは、鋳型配列の部位特異的変異導入またはランダム変異導入によって得られる。当業者によって一般に認められているように、ランダムなアミノ酸残基は、例えば、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列における対応する位置の「ＮＮＫ」または「ＮＮＳ」コドンを選択（導入）することによって、前記アミノ酸配列における特定の位置に導入され得る。
【０１１６】
したがって、（部分的に）ランダム化された単鎖アルファボディーライブラリーの生成は、鋳型または基準または参照のアルファボディー骨格配列内の特定の位置の（部分的な）ランダム化を必要とする。このようなライブラリーの製造方法は当業者に公知であり、このようなライブラリーを生成するために商業的なサービスを利用できる。目的の位置の関連するアミノ酸残基を決定するヌクレオチドは、例えば、異なるアルファボディーをコードするヌクレオチド配列のライブラリーを得るための様々な方法で突然変異される。
【０１１７】
本発明の特定の実施形態において、単鎖アルファボディーライブラリーに存在する単鎖アルファボディーポリペプチドの定常の非多様化部分（the constant, non-varigated part）は、天然に存在するタンパク質配列に対応していないので、骨格の非多様化部分を表わす配列は、非天然物由来である。実際、典型的には、本発明のライブラリーにおけるアルファボディーポリペプチドの定常の非多様化部分は、人工的な配列である。
【０１１８】
鋳型アルファボディー骨格の配列は、その（ほぼ）最適な物理化学的特性に基づいて選択された参照アルファボディーの配列である。国際公開第２０１０／０６６７４０号の実施例で実証されているように、単鎖アルファボディーは、一般に、高温（すなわち、熱力学的）安定性、高溶解度、ｐＨ変化に対する高い耐性、および重要なことにアミノ酸配列変異に対する高い許容性を有する。このような単鎖アルファボディー、または適切な物理化学的特性、例えば、アミノ酸配列変異に対する高い許容性を有するその他の単鎖アルファボディーは、本発明の単鎖アルファボディーライブラリーの生成のための参照または鋳型アルファボディー骨格（または骨格配列）として選択され得る。
【０１１９】
本発明のライブラリーにおいて想定される多様化は、天然に存在するアミノ酸残基および合成アミノ酸残基の両方を包含すると想定される。しかしながら、本発明の特定の実施形態において、多様化されるアミノ酸残基位置は、天然に存在する種類のアミノ酸、例えば、限定されないが、例えば、グリジン、アラニン、プロリン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、アルギニン、リジン、トレオニン、セリン、システイン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、バリンなどの天然型のアミノ酸によって独占的に占められている。
【０１２０】
特定の実施形態において、本発明のアルファボディーポリペプチドライブラリーの製造は、少なくとも１００個のメンバーの核酸またはベクターのライブラリーであって、各メンバーが単鎖アルファボディーを含有するポリペプチドをコードし、コードされる異なる配列のアルファボディーポリペプチドが、５〜２０個の多様化されるアミノ酸残基位置の所定のセットの少なくとも１つにおいて互いに相違するライブラリーを製造するステップを含む。特定の実施形態において、これらの少なくとも７０％であるが、すべてではない多様化されるアミノ酸残基位置は、
（ｉ）アルファボディーポリペプチドの第１のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｅ位またはｇ位および第２のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｅ位またはｇ位、任意に、アルファボディーポリペプチドの第１のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｂ位もしくはｃ位および／またはアルファボディーポリペプチドの第２のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｂ位もしくはｃ位、
または
（ｉｉ）アルファボディーポリペプチドの１個のα−ヘリックスにおけるヘプタッドのｂ位、ｃ位およびｆ位、または
（ｉｉｉ）アルファボディーポリペプチドの２個の連続するα−ヘリックスを連結するリンカー断片における位置
のいずれかに位置する。
【０１２１】
これらのアルファボディー配列が宿主細胞中で発現すると、アルファボディーポリペプチドライブラリーが得られる。当業者に公知であるように、ランダムライブラリーの製造は、様々な方法で達成され得る。一般に、本発明のアルファボディーライブラリーの製造方法は、典型的には、単鎖アルファボディーライブラリーをコードする核酸もしくはベクターのライブラリーまたは感染性粒子で、適切な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするステップを含む。さらに、アルファボディーライブラリーの製造方法は、典型的には、前記宿主細胞の増殖（増加、成長）に適した条件下で前記宿主細胞を培養するステップ、およびコードされる単鎖アルファボディーの製造（発現、合成）に適した条件下で培養するステップを含む。増殖または発現に適した条件下における宿主細胞の培養は、典型的には、細胞成長または発現誘導に適切な成分を含有する培地の存在下で達成される。特定の実施形態において、本発明のアルファボディーライブラリーの製造方法は、宿主細胞または培地から、製造された単鎖アルファボディーを単離するステップをさらに含む。発現されたアルファボディーライブラリーは、異なる配列のポリペプチドに加えて、同一のポリペプチドの複数コピーも含有することにさらに留意するべきである。
【０１２２】
さらにさらなる態様において、本発明は、目的の標的タンパク質に対するアルファボディーの製造のための、本発明の単鎖アルファボディーライブラリーの使用を提供する。より具体的には、本発明は、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイもしくはｍＲＮＡディスプレイなどのイン・ビトロディスプレイ法のための、本発明のアルファボディーライブラリーまたは単鎖アルファボディーライブラリーの混合物の使用を提供する。
【０１２３】
したがって、本発明は、目的の標的分子もしくは標的細胞に対する検出可能な結合親和性（本明細書において定義される）または検出可能なイン・ビトロ活性（本明細書において定義される）、例えば、検出可能なイン・ビトロアンタゴニストまたはアゴニスト活性を有する１つ以上の単鎖アルファボディーの生成方法をも提供する。これらの方法は、ランダムライブラリーの製造、および目的の標的分子に対する結合または活性についてのスクリーニングの概念に基づくものである。
【０１２４】
標的特異的なアルファボディーを得るために、標的特異的なアルファボディーの生成方法は、ａ）本発明の単鎖アルファボディーライブラリーを生成するステップ、およびｂ）このような本発明の単鎖アルファボディーライブラリーから、目的のタンパク質もしくは細胞に対する検出可能な結合親和性または検出可能なイン・ビトロ活性を有する少なくとも１つの単鎖アルファボディーを選択するステップを含む。
【０１２５】
したがって、目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性または目的の標的タンパク質もしくは標的細胞に対する検出可能なイン・ビトロ活性を有する１つ以上の単鎖アルファボディーの本発明の製造方法は、
ａ）本発明の単鎖アルファボディーライブラリーまたは本発明の単鎖アルファボディーライブラリーの混合物を製造するステップ、
ｂ）目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性または目的の標的タンパク質もしくは標的細胞に対する検出可能なイン・ビトロ活性を有する１つ以上の単鎖アルファボディーを選択するステップ、および任意に、
ｃ）１つ以上の単鎖アルファボディーを単離するステップ
を少なくとも含む。
【０１２６】
目的の標的分子もしくは標的タンパク質に特異的に結合するか、または目的の標的分子もしくは標的タンパク質に対するものであるか、または目的の標的分子もしくは標的タンパク質に対する検出可能な結合親和性を有する単鎖アルファボディーを選択するステップは、様々な方法で、例えば、選択方法として一般に公知の方法によって、またはスクリーニング方法として一般に公知の方法によって実施され得る。両方法は、所望の成分および所望ではない成分の両方を含む元の集合体（すなわち、アルファボディーライブラリー）から、所望の成分（すなわち、アルファボディーライブラリーメンバー）を同定し、続いて単離すること（すなわち、選択ステップ）を想定する。選択方法の場合、ライブラリーメンバーは、典型的には、所望の特性を適用して所望の目的を得るステップによって単離されるであろう；このような場合、所望の特性は、通常、目的の所定標的分子に対する高親和性の特性に限定され、所望の目的は、通常、その他のものからこのような高親和性のライブラリーメンバーを単離することに限定される。このような方法は、一般に、親和性選択方法として公知であり、本発明との関連において、このような親和性選択方法は、目的のタンパク質またはそのサブドメインもしくはサブ領域に対する高親和性を有するアルファボディーを選択する目的のために、単鎖アルファボディーライブラリーに適用されるであろう。あるいは、スクリーニング方法の場合、ライブラリーメンバーは、典型的には、すべてのライブラリーメンバー、またはライブラリーメンバーの少なくとも実質的な集合体が、所望の所定特性に関して個々に検査されて、このような所望の特性を有するメンバーは保持されるが、このような所望の特性を有しないメンバーは破棄されるステップによって単離されるであろう；このような場合、本発明との関連において、所望の特性は、目的のタンパク質またはそのサブドメインもしくはサブ領域に対する高親和性、または目的の標的タンパク質の活性の阻害、減少および／または抑制などの機能活性のいずれかに関するものであり得る。したがって、本発明の方法の選択ステップは、（親和性）選択技術によって、または親和性に基づくもしくは活性に基づく機能スクリーニング技術によって達成され得、いずれの技術によっても、本発明の単鎖アルファボディーライブラリーの選択されなかったアルファボディーと比較して有益な（有利な、所望の、優れた）親和性特性または活性特性を有する１つ以上の単鎖アルファボディーの選択をもたらすと考えられる。
【０１２７】
したがって、特定の実施形態において、選択ステップは、本発明の単鎖アルファボディーライブラリーまたは本発明の単鎖アルファボディーライブラリーの混合物を目的の標的分子に接触させるステップ、および標的分子と、ライブラリーに存在するアルファボディーとの間の結合を測定するステップを含む。目的の標的分子または標的タンパク質へのアルファボディーの特異的結合は、それ自体が公知の任意の適切な方法、例えば、バイオパニング、スキャチャード解析および／または競合結合アッセイ、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）およびサンドイッチ競合アッセイ、ならびに当該技術分野において公知のそれらの様々な変法などで測定され得る。
【０１２８】
アルファボディーライブラリーの選択またはスクリーニングが様々な方法で実施され得ること、およびこのような方法がアルファボディーライブラリーが提供される形態に調整されるであろうことを留意するべきである。多様化されるポリペプチド配列またはこのような多様化されるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列（のセット、集合体またはライブラリー）を提示および選択またはスクリーニングするのに適切であり、アルファボディーに適用され得る方法、技術ならびに宿主生物は、当業者に公知である。このような方法は、例えば、ジョルジョー（Ｇｅｏｒｇｉｏｕ）ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９７，１５：２９−３４；ウィットラップ（Ｗｉｔｔｒｕｐ）、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００１，１２：３９５−３９９；リポセック（Ｌｉｐｏｖｓｅｋ）およびプラックトゥーン（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ）、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００４，２９０：５１−６７；レイアセン（Ｒｅｉｅｒｓｅｎ）ら、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２００５，３３：ｅ１０；レビン（Ｌｅｖｉｎ）およびワイス（Ｗｅｉｓｓ）、Ｍｏｌ  ＢｉｏＳｙｓｔ  ２００６，２：４９−５７；ブラトコビッチ（Ｂｒａｔｋｏｖｉｃ）、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ２０１０，６７：７４９−７６７に記載されている。
【０１２９】
特定の実施形態において、本発明のアルファボディーライブラリーは、ファージライブラリーとして提供され、結合アルファボディーは、ファージを標識標的分子に接触させ、その後、標識結合標的の検出または選択的な回収により結合ファージを取り出すことによって同定される。
【０１３０】
特定の実施形態において、バイオパニング法が使用される。直接的バイオパニングのプロトコールにおいて、標的は、固体支持体上に固定化される。固体支持体の例は、マイクロタイタープレートもしくはチューブ（例えば、Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｐｌａｔｅｓ，Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｔｕｂｅｓ，Ｎｕｎｃ）または磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。標的は、プラスチックまたはビーズ（表面活性化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ２７０  Ｅｐｏｘｙ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に直接的にコーティングされ得るか、または標的がビオチン化される場合はストレプトアビジンを介してコーティングされ得る（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅストレプトアビジンＴ１，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。Ｈｉｓ−タグなどのその他のタグは、標的を捕捉するのに使用され得、あるいは標的に対する抗体も、支持体上の標的を捕捉するのに使用され得る。これらの代替的なタグは、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｈｉｓ−ｔａｇ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびプロテインＡまたはプロテインＧが結合したＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ−プロテインＡ／Ｇ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とも適合する。標的を磁気ビーズ上に固定化するために、具体的なビーズの各種類については製造業者の推奨に従う。
【０１３１】
加えて、可溶性バイオパニングのプロトコールが使用され得る。これは、ファージライブラリーとのインキュベーション後に、標的が固体支持体上に捕捉されることを意味する。標的−ファージの相互作用は、溶液中で行われる。未結合ファージを洗い流すために、標的は、固体支持体上に固定化される必要がある。可溶性バイオパニング法における標的の固定化は、直接的バイオパニングのプロトコールにおける固定化の方法と同じである。
【０１３２】
特定の実施形態において、ビオチン化標的が使用され、それにより、標的に結合するアルファボディーを提示するファージは、ストレプトアビジンでコーティングされた支持体（すなわち、磁気ビーズ）で捕捉される。ファージライブラリーディスプレイの技術、およびファージディスプレイ技術による選択は、最も強く、かつ多目的である利用可能な選択技術の中の１つなので、標的特異的な結合剤のハイスループット同定方法として選択され得る（スコット（Ｓｃｏｔｔ）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９０，２４９：３８６−３９０；バラトコビッチ（Ｂｒａｔｋｏｖｉｃ）、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ２０１０，６７：７４９−７６７）。この技術の主な利点は、遺伝子型（すなわち、提示されるタンパク質をコードするカプセル化されたＤＮＡ）と表現型（すなわち、提示されるタンパク質、例えば、本発明のアルファボディー）とのカップリングであり、比較的簡単なイン・ビトロアッセイにおいて、何百万から何兆個のポリペプチド変異体を有する大きなライブラリーから親和性に基づいて選択することが可能になる。
【０１３３】
アルファボディーポリペプチド配列のセット、集合体またはライブラリーに含まれるアルファボディーポリペプチド配列が、適切な細胞またはファージまたは粒子上に提示される場合、前記細胞またはファージまたは粒子から、そのアルファボディーポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を単離することも可能である。次いで、選択されたアルファボディーライブラリーメンバーのヌクレオチド配列は、通常の配列決定法によって決定され得る。最後に、実際の所望のアルファボディーポリペプチド配列は、当業者に公知であるように、適切な条件下の宿主生物中で前記ヌクレオチド配列を発現させることによって得られ得る。
【０１３４】
本発明の方法は、目的の標的タンパク質もしくは標的細胞に対する検出可能な結合親和性または検出可能なイン・ビトロ活性を有する少なくとも１つの単鎖アルファボディーを増幅するステップをさらに含み得る。例えば、本発明の方法の選択ステップから得られたファージクローンであって、特定の単鎖アルファボディーを提示するファージクローンは、宿主細菌の再感染および成長培地中でのインキュベーションによって増幅され得る。
【０１３５】
加えて、目的の標的タンパク質もしくは標的細胞に対する検出可能な結合親和性または検出可能なイン・ビトロ活性を有する得られたアルファボディー配列は、任意にそれらの配列が同定された後に、可溶性タンパク質構築物として合成され得る。
【０１３６】
例えば、本発明の方法によって得られたアルファボディー、得られ得るアルファボディーまたは選択されたアルファボディーは、当該技術分野において公知の組換え合成方法または化学合成方法を使用して合成され得る。また、本発明の方法によって得られたアルファボディー、得られ得るアルファボディーまたは選択されたアルファボディーは、遺伝子工学技術によって製造され得る。したがって、本発明の方法によって得られたアルファボディー、得られ得るアルファボディーまたは選択されたアルファボディーの合成方法は、目的の標的タンパク質もしくは標的細胞に対する検出可能な結合親和性または検出可能なイン・ビトロ活性を有するアルファボディー配列をコードする核酸またはベクターで、宿主細胞を形質転換または感染することを含み得る。したがって、目的の標的タンパク質もしくは標的細胞に対する検出可能な結合親和性または検出可能なイン・ビトロ活性を有するアルファボディー配列は、組換えＤＮＡ法によって作製され得る。アルファボディーをコードするＤＮＡは、従来の手法を使用して容易に合成され得る。ＤＮＡは、調製されるとすぐに発現ベクターに導入され得、次いで発現ベクターは、組換え宿主細胞および／またはこれらの組換え宿主細胞が存在する培地中でアルファボディーの発現を得るために、Ｅ．ｃｏｌｉなどの宿主細胞または任意の適切な発現系に形質転換またはトランスフェクションされ得る。
【０１３７】
宿主細胞への核酸もしくはベクターの形質転換またはトランスフェクションは、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、ポリブレン媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染および遺伝子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）法などの当業者に公知の様々な手段によって達成され得る。
【０１３８】
所望のアルファボディーの発現に適切な宿主細胞は、イン・ビトロに存在するかまたはイン・ビボに存在するかにかかわらず、任意の真核細胞または原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚類細胞および昆虫細胞）であり得る。例えば、宿主細胞は、トランスジェニック動物中に存在し得る。
【０１３９】
本発明の特定の実施形態において、目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性（本明細書において定義される）を有する１つ以上の単鎖アルファボディーの製造方法の選択ステップは、目的の標的分子を本発明の単鎖アルファボディーライブラリーまたは単鎖アルファボディーライブラリーの混合物に接触させるステップ、および続いて目的の標的分子に接触している単鎖アルファボディーライブラリーまたは単鎖アルファボディーライブラリーの混合物から、目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性を有する１つ以上の単鎖アルファボディーを同定するステップを繰り返し行なうことによって、目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性を有する単鎖アルファボディーについて、アルファボディーライブラリーまたはアルファボディーライブラリーの混合物を（さらに）濃縮することを含み得る。
【０１４０】
本発明は、本発明のアルファボディーライブラリーを使用して得られた標的特異的なアルファボディーの結合特異性および／または有効性を改善または最適化こととの関連で製造され得る専用アルファボディーライブラリーをさらに提供する。
【０１４１】
特定の実施形態において、本発明のアルファボディーライブラリーに基づいて１つ以上の標的結合アルファボディーを製造するための上記方法の後に、得られたアルファボディー配列もしくは製造されたアルファボディー配列の合理化を含むステップまたは方法がさらに行われ得る。このような配列合理化ステップは、目的の特定標的分子に対する（すなわち、結合する）異なるアルファボディーの間でもしくはアルファボディーの中で保存されている特定のアミノ酸残基、アミノ酸残基位置、ストレッチ、モチーフもしくはパターンの同定または決定を含み得る。したがって、この合理化ステップは、目的の標的タンパク質に結合すると同定された異なるアルファボディー配列を比較することによって、およびこれらの配列の間の配列保存を同定することによって行われ得る。このようなステップは、任意に、分子モデリングおよび相互リガンドドッキングの技術を使用することによって支援され得るか、または実施され得る。
【０１４２】
目的の特定標的分子に対する異なるアルファボディーの間でもしくはそれらの中で保存されていると同定される特定のアミノ酸残基、アミノ酸残基位置、ストレッチ、モチーフもしくはパターンは、標的特異的なアルファボディーの結合または活性に有意に寄与すると考えられ得る。
【０１４３】
特定の実施形態において、上記配列合理化ステップの後に、目的の標的分子に対して特異的であると同定され、本発明の方法を使用して製造された異なるアルファボディー配列のセットから、アルファボディー配列の新たなライブラリーがさらに作製され得る。このような実施形態において、アミノ酸残基、ストレッチ、モチーフまたはパターンが位置する位置であって、異なる標的結合アルファボディーの間でまたはそれらの中で保存されている位置が一定に維持されており、アルファボディー配列が多様化されるアミノ酸残基位置の新たな所定のセットにおいて変化する。この新たな所定のセットにおいて、多様化される位置は、アミノ酸残基、ストレッチ、モチーフまたはパターンが位置する位置であって、異なる標的結合アルファボディーの間でまたはそれらの中で保存されている位置の外側に位置する。このようにして得られたアルファボディーライブラリーは、アルファボディーの「専用ライブラリー」と称される。次いで、これらの専用ライブラリーを再度スクリーニングして、最良の標的結合アルファボディーが同定され得る。
【０１４４】
したがって、本発明は、目的の標的タンパク質の専用ライブラリーの製造方法であって、上記標的結合アルファボディーを生成するための方法ステップに加えて、ランダムライブラリーから２つ以上の標的結合アルファボディーを同定した後に、
−目的の標的タンパク質に結合する製造されたアルファボディー配列を比較するステップ、
−これらの異なるアルファボディー配列の間でまたはそれらの中で保存されているアミノ酸残基、アミノ酸残基位置、ストレッチ、モチーフまたはパターンを同定するステップ、および：
−比較された２つ以上のアルファボディー配列の少なくとも１つから開始し、異なる標的結合アルファボディー配列の間でまたはそれらの中で保存されているアミノ酸残基、アミノ酸残基位置、ストレッチ、モチーフまたはパターンではないアミノ酸位置のセットにおいて多様化される異なるアルファボディー配列を含む専用ライブラリーを製造するステップ
を含む製造方法をさらに提供する。
【０１４５】
これらの専用ライブラリーは、改善された特性を有するアルファボディーを得るのに使用され得る。より具体的には、これは、
−専用ライブラリーから、目的の標的分子もしくは標的細胞に対する改善もしくは最適化された結合特異性および／またはイン・ビトロ活性を有するアルファボディー配列を選択および／または同定するステップ、ならびに任意に、
−目的の標的分子もしくは標的細胞に対する改善もしくは最適化された結合特異性および／またはイン・ビトロ活性を有するこれらのアルファボディー配列を単離するステップ
を含む。
【０１４６】
専用ライブラリーを製造し、目的の標的分子もしくは標的細胞に対する改善もしくは最適化された結合特異性および／またはイン・ビトロ活性を有するアルファボディー配列を選択、同定および単離するための方法に含まれるステップは、本発明の標的結合アルファボディーの製造方法の対応するステップについて記載したのと同様の方法で実施され得ることが理解されるであろう。
【０１４７】
本明細書においてさらに記載されるように、本発明のアルファボディーにおけるアミノ酸残基の総数は、主に、ヘプタッド反復配列あたりのヘプタッドの数、およびヘプタッド反復配列を相互に連結する柔軟性のあるリンカーの長さに応じて、約５０〜約２１０個の範囲であり得る。本発明のアルファボディー、ポリペプチドもしくは組成物の部分、断片、類似体または誘導体は、このような部分、断片、類似体または誘導体が、それらが由来する本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物の生物学的機能を依然として有しており、想定される（薬理学的）目的に依然として使用され得る限り、それらの長さおよび／または大きさについては特に限定されない。
【０１４８】
さらなる態様において、本発明は、目的の標的分子に対する検出可能な結合親和性または目的の標的分子もしくは標的細胞に対する検出可能なイン・ビトロ活性を有する単鎖アルファボディーであって、本発明のアルファボディーライブラリーを伴う方法によって得られ得る単鎖アルファボディーをも提供する。これらの標的特異的なアルファボディー、ならびにこれらの標的特異的なアルファボディーを含有するむポリペプチドおよび組成物は、本明細書において、それぞれ「本発明のアルファボディー」および「本発明のポリペプチドおよび組成物」とも称される。
【０１４９】
したがって、本発明は、目的の標的分子および標的タンパク質に特異的に結合するアルファボディー、ならびに１つ以上のこのようなアルファボディーを含有するかまたは１つ以上のこのようなアルファボディーから本質的になるポリペプチドおよび医薬組成物、ならびに予防目的、治療目的もしくは診断目的のためのこのようなアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物の使用も提供する。
【０１５０】
したがって、本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物は、当該アルファボディー、ポリペプチドおよび／または組成物が対象とする目的の標的分子が関与する生物学的経路によって媒介される疾患および障害の予防ならびに治療に使用され得る。
【０１５１】
特定の実施形態によれば、本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび医薬組成物は、１つ以上の目的の特定標的分子に結合することによって、１つ以上の目的の標的分子と、それらの対応する受容体または天然の結合パートナーとの間の相互作用を抑制または阻害し、それにより、その目的の標的分子によって媒介されるシグナル伝達経路を抑制、阻害または減少するか、および／またはその目的の標的分子が関与する生物学的な経路および機序を調節するのに使用され得る。
【０１５２】
したがって、特定の実施形態において、本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物は、目的の標的分子、より具体的にはその目的の標的分子上の受容体結合部位に特異的に結合する。
【０１５３】
したがって、特定の実施形態において、本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物は、目的の標的分子に対するものである。目的の標的分子へのアルファボディーの結合の結果は、目的の標的分子に結合するとアルファボディーが、本発明のこのようなアルファボディー、ポリペプチドまたは医薬組成物の非存在下で目的の標的分子がその受容体に結合するのと比較して、目的の標的分子がその受容体もしくはその少なくとも１つのサブユニットに結合することを、当該技術分野において公知の適切なアッセイによって測定した場合に少なくとも２０％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上抑制、減少または阻害するようなものであり得る。
【０１５４】
あるいは、目的の標的分子へのアルファボディーの結合は、目的の標的分子がその受容体に結合することを依然として許容するが、本発明のこのようなアルファボディー、ポリペプチドまたは医薬組成物の非存在下で目的の標的分子がその受容体に結合する場合のシグナル伝達と比較して、目的の標的分子がその受容体またはその少なくとも１つのサブユニットに結合することによって引き起こされ得るシグナル伝達を、当該技術分野において公知の適切なアッセイによって測定した場合に少なくとも２０％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上抑制、減少または阻害するようなものである。さらに特定の実施形態において、目的の標的分子へのアルファボディーの結合は、すなわち、本発明のこのようなアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物が存在しない場合における目的の標的分子によって媒介される受容体の結合と比較して、受容体の活性化および／または結合、特に目的の標的分子によって媒介される受容体の結合を、当該技術分野において公知の適切なアッセイによって測定した場合に少なくとも２０％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上抑制、減少または阻害するようなものである。
【０１５５】
特定の実施形態において、本発明のライブラリーを使用して得られたアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物は、目的の標的タンパク質と、その天然の結合パートナーとの間の相互作用を阻害、減少および／または抑制する（ｐｒｅｖｅｎｔｉ）か、あるいは目的の標的タンパク質の活性を阻害、減少（ｒｅｄｕｃ）および／または抑制するか、あるいは目的の標的タンパク質が関与する１つ以上の生物学的もしくは生理学的な機序、効果、応答、機能経路もしくは活性を阻害、減少および／または抑制し、これらの阻害、減少および／または抑制は、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物を使用しない場合の同じ条件下の同じアッセイにおける目的の標的タンパク質の活性と比較して、適切なイン・ビトロアッセイ、細胞アッセイまたはイン・ビボアッセイを使用して測定した場合に例えば、少なくとも１０％、しかし好ましくは少なくとも２０％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上阻害、減少および／または抑制するものである。加えて、「阻害」、「減少」および／または「抑制」は、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物が存在しない場合の同じ条件と比較して、その天然の結合パートナーの１つ以上に対する目的の標的タンパク質の親和性、アビディティ、特異性および／または選択性の低下を誘導すること、および／または目的の標的タンパク質が存在する培地もしくは環境の１つ以上の条件（例えば、ｐＨ、イオン強度、補因子の存在など）に対する目的の標的タンパク質の感受性の低下を誘導することをも意味し得る。本発明との関連において、「阻害」、「減少」および／または「抑制」は、目的の標的タンパク質の活性のアロステリックな阻害、減少および／または抑制をも含み得る。
【０１５６】
当業者に公知であるように、本発明の上記アルファボディー、ポリペプチドおよび組成物は、一般に、目的の標的分子によって媒介されるシグナル伝達（すなわち、目的の標的分子がその受容体に結合することによって引き起こされるシグナル伝達）、ならびにこのようなシグナル伝達によって誘導される生物学的な機序および効果のアンタゴニストとして作用するであろう。
【０１５７】
ある非限定的な実施形態において、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物は目的の標的分子に特異的に結合し、それにより、目的の標的分子とその受容体との間の相互作用を増強、増加および／または活性化し得る。あるいは、本発明のアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物は、天然のリガンドを模倣して受容体に直接的に結合し、それにより、その受容体の生物学的機能をも増強、増加および／または活性化し得る。それにより、このような本発明の作動的なアルファボディー、ポリペプチドまたは組成物は、適切なイン・ビトロアッセイ、細胞アッセイまたはイン・ビボアッセイを使用して測定した場合に目的の標的分子の生物学的活性および／または１つ以上の生物学的もしくは生理学的な機序、効果、応答、機能もしくは経路を増強、増加および／または活性化し得る。
【０１５８】
したがって、特定の実施形態において、本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび医薬組成物は、本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物の１つ以上が結合する目的の標的分子が関与する被験体における１つ以上の特定の細胞応答を増加させるのに使用され得る。目的の特定標的分子に結合する本発明の作動的なアルファボディー、ポリペプチドまたは医薬組成物は、例えば、免疫系の障害を特徴とする疾患、または免疫系の障害を有する結果として起こり得る疾患の予防および／または治療のために、被験体における１つ以上の免疫応答を刺激または増強するのに使用され得る。
【０１５９】
さらなる態様において、本発明は、目的のタンパク質に特異的に結合する少なくとも１つの本発明のアルファボディーを含有するか、または当該アルファボディーから本質的になるポリペプチド（本明細書において、本発明のポリペプチドとも称される）を提供する。本発明のポリペプチドは、少なくとも１つの本発明のアルファボディーと、任意に、１つ以上のリンカーを介して任意に結合された１つ以上のさらなる基、部分、残基とを含有し得る。
【０１６０】
したがって、本発明のポリペプチドは、任意に、その他の目的の標的または標的タンパク質に結合するための１つ以上のさらなる基、部分または残基を含有し得る。このようなさらなる基、残基、部分および／または結合部位が、さらなる機能性を本発明のアルファボディーに（および／または、それが存在するポリペプチドまたは組成物に）提供してもしなくてもよく、本発明のアルファボディーの特性を改変してもよいし改変しなくてもよいことは明らかである。このような基、残基、部分または結合単位は、例えば、生物学的および／または薬理学的に活性であり得る化学基でもあり得る。
【０１６１】
特定の実施形態において、これらの基、部分または残基は、Ｎ末端またはＣ末端でアルファボディーに結合される。しかしながら、特定の実施形態において、１つ以上の基、部分または残基は、例えば、α−ヘリックス中のシステインへのカップリングによりアルファボディーの本体に結合される。
【０１６２】
特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、化学的に修飾されたアルファボディーを含有する。例えば、このような修飾は、１つ以上の官能基、残基または部分を本発明のアルファボディー上に導入または結合することを含み得る。これらの基、残基または部分は、１つ以上の所望の特性または機能性を本発明のアルファボディーに付与し得る。このような官能基の例は、当業者に明らかであり、限定されないが、精製タグ、検出タグ、蛍光タグ、グリカン部分、ＰＥＧ部分などが挙げられる。
【０１６３】
また、本発明のアルファボディーへの官能基の導入または結合は、本発明のアルファボディーの半減期、溶解度および／または安定性を増加させる効果を有し得るか、あるいは本発明のアルファボディーの毒性を減少させる効果を有し得るか、あるいは本発明のアルファボディーの任意の望ましくない副作用を排除または軽減する効果を有し得るか、および／またはその他の有利な特性の効果を有し得る。
【０１６４】
特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、例えば、ＰＥＧ化によって、血清タンパク質に結合する基または血清タンパク質（例えば、血清アルブミン）もしくは血清タンパク質ドメインを付加することによって、または一般には、本発明のアルファボディーの半減期を増加させる部分にアルファボディーを結合させることによって修飾されて、その半減期が明確に増加したアルファボディーを含有する。典型的には、半減期が増加した本発明のポリペプチドは、前記化学修飾を持たない対応する本発明のアルファボディーの半減期よりも少なくとも２倍、例えば、少なくとも３倍、例えば、少なくとも５倍、例えば、少なくとも１０倍またはそれ以上長い半減期を有する。
【０１６５】
本発明のアルファボディーの特定の修飾は、標識アルファボディーの使用目的に応じて、１つ以上の検出可能な標識またはその他のシグナルを生成する基もしくは部分を導入することを含み得る。さらにさらなる特定の修飾は、キレート基を導入して、例えば、１つ以上の金属または金属カチオンをキレートすることを含み得る。特定の修飾は、特定の結合ペア、例えば、ビオチン−（ストレプト）アビジン結合ペアの一方の部分である官能基を導入することを含み得る。その他の化学的および酵素的な修飾の候補は、当業者に明らかであろう。
【０１６６】
特定の実施形態において、１つ以上の基、残基、部分は、１つ以上の適切なリンカーまたはスペーサーによりアルファボディーに結合される。
【０１６７】
さらに特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、２つ以上の標的特異的なアルファボディーを含む。このような特定の実施形態において、２つ以上の標的特異的なアルファボディーは、直接的または間接的な方法のいずれかで互いに結合（カップリング、連結、相互に結合、融合）され得る。２つ以上のアルファボディーが互いに直接的に結合される実施形態において、それらは、スペーサーまたはリンカー断片または部分の補助なしで結合される。代替的には、２つ以上のアルファボディーが互いに間接的に結合される実施形態において、それらは、適切なスペーサーまたはリンカー断片またはリンカー部分により連結される。
【０１６８】
２つ以上のアルファボディーが直接的に連結される実施形態において、それらは、単鎖融合構築物として（すなわち、２つ以上のアルファボディー配列が、単一の近接するアミノ酸配列中で互いに直接的に続いている単鎖タンパク質構築物として）製造され得る。代替的には、アルファボディーの直接的な結合も、２つのアルファボディーの間にジスルフィド架橋を形成するシステインにより達成され得る（すなわち、酸化条件などの適切な条件下で、遊離システインをそれぞれ含有する２つのアルファボディーは互いに反応して、構成モノマーがジスルフィド架橋を介して共有結合的に結合されているダイマーを形成し得る）。
【０１６９】
あるいは、２つ以上のアルファボディーが間接的に連結される実施形態において、それらは、適切なスペーサーまたはリンカー断片またはリンカー部分を介して互いに連結され得る。このような実施形態において、それらも、単鎖融合構築物として（すなわち、２つ以上のアルファボディー配列が、単一の近接するアミノ酸配列中で互いに続いているが、アルファボディーは、スペーサー断片として作用する適切に選択されたアミノ酸配列断片の存在によって分離されたままである単鎖タンパク質構築物として）製造され得る。代替的には、アルファボディーの間接的な結合も、アミノ酸側基を介して、またはアルファボディーのＮ末端もしくはＣ末端を介して達成され得る。例えば、適切に選択された条件下で、遊離システインをそれぞれ含有する２つのアルファボディーは、ホモ二官能性化合物と反応し、構成アルファボディーが、前記ホモ二官能性化合物によって共有結合的に架橋されているアルファボディーダイマーを生成し得る。同様に、１つ以上のアルファボディーは、反応性の側基または末端と、タンパク質の架橋のために適切に選択されたホモ二官能性化合物またはヘテロ二官能性化合物との任意の組み合わせにより架橋され得る。
【０１７０】
結合されたアルファボディーの特定の実施形態において、２つ以上の結合されたアルファボディーは、同じアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を有し得る。２つ以上の結合されたアルファボディーも、同じ結合特異性または異なる結合特異性を有し得る。２つ以上の結合されたアルファボディーも、同じ結合親和性または異なる結合親和性を有し得る。
【０１７１】
本発明の異なるアルファボディーのカップリングに使用するのに適切なスペーサーまたはリンカーは当業者に明らかであり、一般に、ペプチドおよび／またはタンパク質を結合するのに当該技術分野において使用される任意のリンカーまたはスペーサーであり得る。特に、このようなリンカーまたはスペーサーは、医薬用途を目的とするタンパク質またはポリペプチドを構築するのに適切である。
【０１７２】
単鎖アミノ酸配列におけるアルファボディーのカップリングに特に適切ないくつかのリンカーまたはスペーサーとしては、例えば、限定されないが、ポリペプチドリンカー、例えば、グリシンリンカー、セリンリンカー、混合グリシン／セリンリンカー、グリシン−およびセリン−リッチなリンカー、または大部分が極性ポリペプチド断片から構成されるリンカーなどが挙げられる。化学架橋によるアルファボディーのカップリングに特に適切ないくつかのリンカーまたはスペーサーとしては、例えば、限定されないが、ホモ二官能性化学架橋化合物、例えば、グルタルアルデヒド、イミドエステル、例えば、アジプイミド酸ジメチル（ＤＭＡ）、スベルイミド酸ジメチル（ＤＭＳ）およびピメルイミド酸ジメチル（ＤＭＰ）、またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、例えば、ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）（ＤＳＰ）およびジチオビス（プロピオン酸スルホスクシンイミジル）（ＤＴＳＳＰ）が挙げられる。架橋のためのヘテロ二官能性試薬の例としては、限定されないが、一方がアミン反応性末端であり、他方の末端にスルフヒドリル反応性部分を有する架橋剤、または一方の末端にＮＨＳエステルを有し、他方の末端にＳＨ反応性基（例えば、マレイミドまたはピリジルジスルフィド）を有する架橋剤が挙げられる。
【０１７３】
単鎖連結アルファボディー構築物に使用するためのポリペプチドリンカーまたはスペーサーは、１〜５０個のアミノ酸の長さ、例えば、１〜３０個、特に１〜１０個のアミノ酸残基を有する任意の適切な（例えば、グリシンリッチな）アミノ酸配列であり得る。スペーサーの長さ、柔軟性の程度および／またはその他の特性は、最終的な本発明のポリペプチドの特性、限定されないが、目的の標的タンパク質に対する親和性、特異性またはアビディティなどに対していくらかの影響を与え得ることが明らかである。２個以上のスペーサーが本発明のポリペプチドに使用される場合、これらのスペーサーは同じものでもよいし異なるものでもよいことが明らかである。本発明の文脈および開示において、当業者であれば、いかなる過度の実験的な負担も伴わずに、本発明のアルファボディーをカップリングする目的のために最適なスペーサーを決定できるであろう。
【０１７４】
本発明の結合されたアルファボディーポリペプチドは、一般に、任意に１つ以上の適切なリンカーを介して、１つ以上の本発明のアルファボディーを１つ以上のさらなる基、残基、部分および／またはその他の本発明のアルファボディーに適切に結合して、本発明のポリペプチドを提供する少なくとも１つのステップを含む方法によって調製され得る。
【０１７５】
また、本発明のポリペプチドは、（ｉ）適切な宿主細胞または発現系において、本発明のポリペプチドを発現させるステップ、および（ｉｉ）本発明のポリペプチドを単離および／または精製するステップを少なくとも含む方法によって製造され得る。上記ステップを実施するための技術は、当業者に公知である。
【０１７６】
また、本発明は、本発明のアルファボディーおよびポリペプチドの一部、断片、類似体、突然変異体、変異体および／または誘導体、および／またはこのような一部、断片、類似体、変異体、バリアントおよび／または誘導体の１つ以上を含むかまたはそれらから本質的になるポリペプチドをも包含する。
【０１７７】
このような本発明の一部、断片、類似体、変異体、バリアントおよび／または誘導体は、依然として、目的の標的分子に特異的に結合できるものであり得る。特定の実施形態において、本発明は、本発明のアルファボディーの標的結合断片、バリアントまたは誘導体を提供する。
【０１７８】
本発明のライブラリー、アルファボディー、ポリペプチドまたは組成物（または、それらを発現させるのに使用される本発明のヌクレオチド配列）は、天然に存在するタンパク質（またはヌクレオチド配列）ではないことに留意するべきである。典型的には、本発明のアルファボディーは、組換え、合成もしくは半合成のアミノ酸配列、ポリペプチドまたはタンパク質（またはヌクレオチド配列）である。
【０１７９】
本発明によって提供されるアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物は、本質的に単離された形態（本明細書において定義される）であり得るか、あるいは少なくとも１つの本発明のアルファボディーを含有し得るかまたは当該アルファボディーから本質的になり得、任意に、１つ以上のその他の基、部分または残基（これらはすべて、任意に、１つ以上の適切なリンカーにより連結される）をさらに含有し得る本発明のポリペプチドまたは組成物の一部を形成し得る。
【０１８０】
予防用途、治療用途および／または診断用途のために、本発明のライブラリーを使用して得られ得るアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物は、原則として、目的のヒト標的分子に対するものであるか、またはそれに特異的に結合することが、本明細書における開示に基づいて理解されるであろう。しかしながら、本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物が獣医用途を目的とするものである場合、それらは、治療しようとする種に由来する目的の標的分子に対するものであるか、あるいは当該標的分子に特異的に結合するか、あるいは当該標的分子が治療されるべき種に由来する目的の標的分子と少なくとも交差反応性であろう。したがって、１つの被験種に由来する目的の標的分子に特異的に結合するアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物は、１つ以上のその他の被験種に由来する目的の標的分子と交差反応性を示してもよいし、示さなくてもよい。当然のことながら、ヒトまたは動物において使用するためのアルファボディーの開発の文脈では、研究および実験室試験で使用するために取り扱われるものとは別の種に由来する目的の標的分子に結合するアルファボディーが開発され得ることが想定される。
【０１８１】
本発明のアルファボディーおよびポリペプチドは、目的の標的分子のいくつかの天然または合成の類似体、バリアント、変異体、アレル、一部および断片に結合し得ることも予想される。より具体的には、本発明のアルファボディーおよびポリペプチドは、（天然／野生型の）目的の標的分子、および／またはそのアルファボディーおよびポリペプチドが結合する目的の標的分子の結合部位、一部またはドメインを（依然として）含有する目的の標的分子の類似体、変異体、突然変異体、アレル、一部および断片に少なくとも結合することが予想される。特定の実施形態において、目的の標的分子に特異的に結合するアルファボディー、ポリペプチドおよび組成物は、目的の標的タンパク質以外の天然に存在するタンパク質と交差反応性を示さない。
【０１８２】
さらにさらなる態様において、本発明は、本発明の方法によって選択および／または製造された単鎖アルファボディーをコードする核酸を提供する。
【０１８３】
さらなる態様において、本発明は、本発明の方法によって得られ得る単鎖アルファボディーをコードする核酸（本明細書において、「本発明の核酸または核酸配列」とも称される）、ならびにこのような核酸配列を含有するベクターおよび宿主細胞を提供する。
【０１８４】
核酸配列は、ベクターまたは遺伝子構築物またはポリヌクレオチドの形態でもあり得る。本発明の核酸配列は、合成または半合成の配列、ライブラリー（特に、発現ライブラリー）から単離されたヌクレオチド配列、オーバーラッピングプライマーを使用してＰＣＲによって調製されたヌクレオチド配列、またはそれ自体が公知のＤＮＡ合成技術を使用して調製されたヌクレオチド配列であり得る。
【０１８５】
本発明の遺伝子構築物は、ＤＮＡでもよいしＲＮＡでもよく、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。本発明の遺伝子構築物は、目的の宿主細胞または宿主生物の形質転換に適切な形態、目的の宿主細胞のゲノムＤＮＡへの組み込みに適切な形態、または目的の宿主生物における自律複製、保持および／または継代に適切な形態でもあり得る。例えば、本発明の遺伝子構築物は、ベクターの形態、例えば、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ウイルスベクターまたはトランスポゾンなどであり得る。特に、ベクターは、発現ベクター、すなわち、イン・ビトロおよび／またはイン・ビボ（例えば、適切な宿主細胞、宿主生物および／または発現系）における発現を提供できるベクターであり得る。本発明の遺伝子構築物は、発現されたアルファボディーを目的の細胞内分画または細胞外分画に導くのに適切なリーダー配列を含み得る。例えば、本発明の遺伝子構築物は、適切なベクターのｐｅｌＢリーダー配列部位に挿入されて、発現されたアルファボディーを細菌のペリプラズム空間に導き得る。また、ベクターは、例えば、アルファボディーの産生を最適化するのに適切なプロモーター系を備え得る。
【０１８６】
さらなる態様において、本発明は、本発明の方法によって得られ得る単鎖アルファボディーをコードする核酸を含むベクターを提供する。
【０１８７】
さらにさらなる態様において、本発明は、本発明の方法によって得られ得る単鎖アルファボディーをコードする核酸またはこれらの核酸を含有するベクターを含有する宿主細胞を提供する。したがって、本発明の特定の実施形態は、本発明の方法によって得られ得るアルファボディーをコードする核酸配列を含むベクターでトランスフェクションまたは形質転換され、アルファボディーを発現できる宿主細胞である。本発明のアルファボディーまたはポリペプチドの発現に適切な宿主または宿主細胞の例は当業者に明らかであり、イン・ビトロに存在するかまたはイン・ビボに存在するかにかかわらず、任意の適切な真核細胞または原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚類細胞および昆虫細胞）が挙げられる。
【０１８８】
さらにさらなる態様において、本発明は、本発明の方法によって得られ得る１つ以上のアルファボディー、ポリペプチドおよび／または核酸配列と、任意に少なくとも１つの薬学的に許容され得る担体とを含有する医薬組成物（本明細書において、本発明の医薬組成物とも称される）を提供する。ある特定の実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、任意に、少なくとも１つのその他の薬学的に活性な化合物をさらに含有し得る。
【０１８９】
本発明の医薬組成物は、目的の標的分子に関連する疾患および障害の診断、予防および／または治療に使用され得る。
【０１９０】
特に、本発明は、本発明のアルファボディーおよびポリペプチドを含有し、温血動物、特に哺乳動物、より具体的にはヒトにおける予防用途、治療用途および／または診断用途に適切な医薬組成物を提供する。
【０１９１】
また、本発明は、本発明のアルファボディーおよびポリペプチドを含有し、目的の標的分子に関連するか、および／またはそれによって媒介される１つ以上の疾患、障害もしくは病態の予防および／または治療における獣医用途に使用され得る医薬組成物を提供する。
【０１９２】
一般に、医薬用途のために、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つの本発明のアルファボディーまたはポリペプチドと、少なくとも１つの薬学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤および／またはアジュバントと、任意に１つ以上のさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物とを含有する医薬調製物または医薬組成物として製剤化され得る。このような製剤は、経口投与、非経口投与、局所投与または吸入投与に適切であり得る。したがって、本発明のアルファボディーもしくはポリペプチド、および／またはそれらを含む組成物は、例えば、先と同様に使用されるべき特定の医薬製剤または医薬組成物に応じて、経口投与、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、経皮投与、局所投与、坐剤投与、吸入投与され得る。臨床医であれば、適切な投与経路、およびこのような投与に使用されるのに適切な医薬製剤または医薬組成物を選択できるであろう。
【０１９３】
また、医薬組成物は、適切な結合剤、崩壊剤、甘味剤または香味剤を含有し得る。錠剤、丸剤またはカプセル剤は、例えば、ゼラチン、ワックスまたは糖などでコーティングされ得る。加えて、本発明のアルファボディーおよびポリペプチドは、持続放出調製物または持続放出装置に組み込まれ得る。
【０１９４】
注射または点滴に適切な医薬剤形としては、滅菌注射液もしくは滅菌点滴液または滅菌分散液の即時調製に適合されている有効成分であって、任意にリポソーム中にカプセル化される有効成分を含有する滅菌水溶液もしくは滅菌分散液または滅菌粉末を挙げることができる。すべての場合において、最終的な剤形は、製造および保存の条件下で安定な滅菌液でなければならない。液体担体またはビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、非毒性グリセリルエステルおよびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または液体分散媒であり得る。抗菌剤または抗真菌剤なども、任意に追加され得る。
【０１９５】
本発明のアルファボディーおよびポリペプチドの有用な投与量は、動物モデルでそれらのイン・ビトロ活性およびイン・ビボ活性を測定することによって決定され得る。マウスおよびその他の動物における有効投与量からヒトのものを推定するための方法は、当業者に公知である。
【０１９６】
予防および／または治療に使用するのに必要な本発明のアルファボディーおよびポリペプチドの量は、選択された特定のアルファボディーまたはポリペプチドだけではなく投与経路、治療されている病態の性質ならびに患者の年齢および状態により変化し得、最終的には担当の医師または臨床医の判断であろう。また、本発明のアルファボディーおよびポリペプチドの投与量は、標的とする細胞、腫瘍、組織、移植片もしくは器官、または標的分子の血漿濃度に応じて変化し得る。
【０１９７】
本発明のアルファボディーもしくはポリペプチドおよび／またはそれらを含む組成物は、予防もしくは治療されるべき疾患または障害を予防および／または治療するのに適切な治療計画にしたがって投与される。臨床医は、一般に、適切な治療計画を決定できるであろう。一般に、治療計画は、１つ以上の薬学的に有効な量または用量で、１つ以上の本発明のアルファボディーおよび／またはポリペプチド、またはそれらを含有する１つ以上の組成物を投与することを含むであろう。
【０１９８】
所望用量は、便宜上、単回用量、または適切な間隔で投与される分割用量（これは、さらにサブ用量化され得る）で提示され得る。投与計画としては、長期（すなわち、少なくとも２週間、例えば、数カ月間または数年間）または１日の治療が挙げられ得る。
【０１９９】
本発明のアルファボディーおよびポリペプチドは、とりわけ病態の重症度および治療されるべき患者に基づいて医師によって決定される量で投与されるであろう。典型的には、各疾患の兆候について、最適用量（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｏｓａｇｅ）は、単回１日用量として、または１日の間の複数回分割用量として連続的に（例えば、点滴によって）ｋｇ体重／日あたりに投与されるべき量を特定して決定されるであろう。臨床医であれば、一般に、本明細書において記載されるファクターに応じて適切な１日用量を決定できるであろう。特定の場合、臨床医であれば、例えば、上記要因および専門家としての判断に基づいてこれらの量から逸脱することを選択し得ることも明らかであろう。
【０２００】
特に、本発明のアルファボディーおよびポリペプチドは、目的の標的分子が関与する疾患および障害の予防および／または治療に使用されるか、あるいは使用され得るその他の薬学的に活性な化合物または成分と併用してもよく、その結果として、相乗効果が得られてもよいし、得られなくてもよい。このような化合物および成分、ならびにそれらを投与するための経路、方法および医薬製剤または医薬組成物の例は、臨床医に明らかであろう。
【０２０１】
さらなる態様によれば、本発明は、目的の標的分子が関与し、目的の標的分子によって媒介される少なくとも１つの疾患および／または障害の予防および／または治療のための薬剤の調製のための、目的の標的分子に特異的に結合する本発明のアルファボディーまたはポリペプチドの使用を提供する。したがって、本発明は、前記目的の標的分子が関与し、目的の標的分子によって媒介される少なくとも１つの疾患および／または障害の予防および／または治療に使用するための、目的の標的分子に特異的に結合するアルファボディー、ポリペプチドおよび医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、本発明は、目的の標的分子によって媒介される少なくとも１つの疾患および／または障害を予防および／または治療するための方法であって、１つ以上の本発明のアルファボディー、ポリペプチドおよび／または医薬組成物の薬学的に有効な量を、それを必要とする被験体に投与するステップを含む方法をも提供する。特に、薬学的に有効な量は、目的の標的分子が関与する生物学的活性および／または生物学的な経路もしくはシグナル伝達を阻害、抑制または低下させる（ためのアルファボディーまたはポリペプチドの循環レベルを作り出す）のに十分な量であり得る。
【０２０２】
本発明のアルファボディーまたはポリペプチドを用いて治療されるべき被験体または患者は任意の温血動物であり得るが、特に、本発明のアルファボディーまたはポリペプチドが特異的に結合する目的の標的分子が関与する疾患および障害に罹患しているか、またはそれらのリスクがある哺乳動物、より具体的にはヒトである。
【０２０３】
本発明のアルファボディーおよびポリペプチド、ならびにそれらを含む組成物の有効性は、関与する特定の疾患または障害に応じて、それ自体が公知の任意の適切なイン・ビトロアッセイ、細胞系アッセイ、イン・ビボアッセイおよび／または動物モデル、またはそれらの任意の組み合わせを使用して試験され得る。適切なアッセイおよび動物モデルは、当業者に明らかであろう。関与する目的の標的分子に応じて、当業者であれば、一般に、適切なイン・ビトロアッセイ、細胞アッセイまたは動物モデルを選択して、これらの目的の標的分子の活性、および／またはこれらが関与する生物学的機序に影響を与える能力について；ならびに目的の標的分子に関連する１つ以上の疾患および障害に関する治療効果および／または予防効果について、本発明のアルファボディーおよびポリペプチドを試験できるであろう。
次に、以下の非限定的な実施例および図面によって、本発明をさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【０２０４】
【図１】図１は、アルファボディーの溝の説明図を示す。当該図面は、本明細書において記載される「ｓｃＡＢ０１３＿Ｌ１６」アルファボディーと同じ寸法（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）の単鎖アルファボディーを簡略に表示したものを示す。すべてのアミノ酸残基は、アラニン（Ｃ−β原子のみ）として示される。骨格トレースは、リボン表示で示される。主要な、副次的なおよびコアの溝の位置（本明細書において定義される）は、溝の位置および形状を説明するために表面レンダリングしている。それに応じて、第１のα−ヘリックス（ライブラリーｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１１におけるＡ−ヘリックス）のｃ残基およびｇ残基および第２のα−ヘリックス（ライブラリーｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１１におけるＣ−ヘリックス）のｂ残基およびｅ残基を表示している。
【図２】図２は、単鎖アルファボディーｓｃＡＢ０１３＿Ｌ１６のアミノ酸配列の説明図を示す。１文字表記の全アミノ酸配列は、下部の「全」と表示した右側に記載する。さらに、同じ配列内の特定のセグメントが最先部に示され、Ｎ末端およびＣ末端フランキングセグメント（それぞれ「Ｎ」および「Ｃ」と表示する）、リンカーセグメント（それぞれ「Ｌ１」および「Ｌ２」と表示する）ならびに実際のヘプタッド反復配列（「ＨＲＳ１」、「ＨＲＳ２」および「ＨＲＳ３」と表示する）を識別するのを容易にしている。ヘプタッドのａ位およびｄ位を最上段に示して、ヘプタッド反復配列内でそれらを識別するのを容易にしている。
【図３−１】図３−１は、単鎖アルファボディーライブラリーの説明図を示す。それぞれがファージコートタンパク質ｐＩＩＩのＮ末端とＣ末端で結合している３個のアルファボディーライブラリーを示す。各ライブラリーの名称は、３個の各パネルの最上段に示す（「ｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１１」、「ｓｃＬｉｂ＿Ｃ９」および「ｓｃＬｉｂ＿Ｃ７」）。それらの全アミノ酸配列は、各表パネルの下部の「全」と表示した右側に（１文字表記で）記載する。「ｘ」という記号は、ランダム化される位置に使用する。「ＰＩＩＩ」は、ファージｐＩＩＩコートタンパク質を意味する。さらに、同じ配列内の特定のセグメントが最先部に示され、Ｎ末端およびＣ末端フランキングセグメント（それぞれ「Ｎ」および「Ｃ」と表示する）、リンカーセグメント（それぞれ「Ｌ１」および「Ｌ２」と表示する）ならびに実際のヘプタッド反復配列（「ＨＲＳ１」、「ＨＲＳ２」および「ＨＲＳ３」と表示する）を識別するのを容易にしている。ヘプタッドのａ位およびｄ位を最上段に示して、ヘプタッド反復配列内でそれらを識別するのを容易にしている。
【図３−２】図３（続き）は、単鎖アルファボディーライブラリーの説明図を示す。
【図３−３】図３（続き）は、単鎖アルファボディーライブラリーの説明図を示す。
【図４−１】図４は、さらなる単鎖アルファボディーライブラリーの説明図を示す。各ライブラリーの名称は、３個の各パネルの最上段に示す（「ｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１１ｂ」、「ｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１２」および「ｓｃＬｉｂ＿Ｂ１０」）。表記、記号および形式は、図３と同じである。いくつかのアミノ酸残基位置が灰色の背景で示され、それらが由来するライブラリーに関する多様化される位置の差異を強調する（ｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１２はｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１１と比較され、ｓｃＬｉｂ＿Ｂ１０はｓｃＬｉｂ＿Ｃ９と比較された）。
【図４−２】図４（続き）は、さらなる単鎖アルファボディーライブラリーの説明図を示す。
【図４−３】図４（続き）は、さらなる単鎖アルファボディーライブラリーの説明図を示す。
【図５】図５は、アルファボディーライブラリーファージのウエスタンブロット分析を示す。各レーンにおいて、２×１０１１個のファージをアプライした。各ライブラリーに由来するファージについて、数バッチを試験した。還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に、サンプルをニトロセルロース膜上にブロットした。マウス−抗ｇｐＩＩＩ抗体を使用した後にＡＰ−抗マウスコンジュゲートを使用することによって融合産物の存在を実証し、ＮＢＴ−ＢＣＩＰ基質を添加することによってブロットを発色させた。
【図６】図６は、さらなるアルファボディーライブラリーファージのウエスタンブロット分析を示す。１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でファージを泳動させ、ウエスタンブロット分析用のＰＶＤＦ膜上に転写した。抗ｐＩＩＩ抗体でｐＩＩＩタンパク質を可視化した。パネルＡ：最初の２個のレーンは、それぞれサイズラダー（ＣｏｌｏｒＰｌｕｓ  Ｐｒｅ−ｓｔａｉｎｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ  ｂｒｏａｄ  ｒａｎｇｅ  １０−２３０ｋＤａ，ＮＥＢ）および空ファージである。空ファージは、野生型ｐＩＩＩタンパク質のみを提示した。次の３個のレーンは、それぞれ参照アルファボディーライブラリー、ｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１２およびｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１１ｂライブラリーである。パネルＢ：最初の２個のレーンは、それぞれサイズラダー（ＣｏｌｏｒＰｌｕｓ  Ｐｒｅ−ｓｔａｉｎｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ  ｂｒｏａｄ  ｒａｎｇｅ  １０−２３０ｋＤＡ，ＮＥＢ）およびファージである。次の２個のレーンは、それぞれ参照アルファボディーライブラリーおよびｓｃＬｉｂ＿Ｂ１０ライブラリーである。矢印は、野生型ｐＩＩＩタンパク質よりも高分子量を示すアルファボディー融合ｐＩＩＩタンパク質を示す。
【図７】図７は、ライブラリーｓｃＬｉｂ＿Ｂ１０（Ｂ１０と表記）およびｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１２（ＡＣ１２と表記）を連続してバイオパニングしたラウンドにおける陽性クローンのパーセンテージを示す。
【図８−１】図８は、表３：ＩＬ−２３に対するＡＣ１２ライブラリーから得られる７７個のアルファボディー配列のマルチプルアライメントを示す。
【図８−２】図８（続き）は、表３：ＩＬ−２３に対するＡＣ１２ライブラリーから得られる７７個のアルファボディー配列のマルチプルアライメントを示す。
【図８−３】図８（続き）は、表３：ＩＬ−２３に対するＡＣ１２ライブラリーから得られる７７個のアルファボディー配列のマルチプルアライメントを示す。
【図８−４】図８（続き）は、表３：ＩＬ−２３に対するＡＣ１２ライブラリーから得られる７７個のアルファボディー配列のマルチプルアライメントを示す。
【図８−５】図８（続き）は、表３：ＩＬ−２３に対するＡＣ１２ライブラリーから得られる７７個のアルファボディー配列のマルチプルアライメントを示す。
【図８−６】図８（続き）は、表３：ＩＬ−２３に対するＡＣ１２ライブラリーから得られる７７個のアルファボディー配列のマルチプルアライメントを示す。
【図８−７】図８（続き）は、表３：ＩＬ−２３に対するＡＣ１２ライブラリーから得られる７７個のアルファボディー配列のマルチプルアライメントを示す。
【実施例】
【０２０５】
実施例１．単鎖アルファボディーライブラリーの生成
本実施例は、ファージ上に十分に提示されており、目的の標的タンパク質に結合する単鎖アルファボディー配列を得るのに潜在的に有用な単鎖アルファボディーライブラリーを取得できることを実証する。
【０２０６】
アノテーションされたアミノ酸配列と「ｓｃＡＢ０１３＿Ｌ１６」という名称の参照アルファボディーの３−Ｄモデルとから、単鎖アルファボディーランダムライブラリーを設計した。この参照アルファボディーの簡略な３−Ｄモデルを図１に示す。さらに、ｓｃＡＢ０１３＿Ｌ１６のアミノ酸配列は、本明細書において配列番号：１として提供される。当該配列は、図２にさらに示され、通常のヘプタッドのコア位置も示される。
【０２０７】
アルファボディーの溝は、折り畳まれたアルファボディータンパク質の２個の空間的に隣接するα−ヘリックスによって形成される（図１）。このような溝は、（細長い）凹形状を特徴とする。アルファボディー１つあたり３個のα−ヘリックスがあるので、原則として、ランダム化し得る３個の溝の候補がある。前記３−Ｄモデルを調べて、ランダム化に最も適切な溝を最初に選択した。３−Ｄモデルで平行する第１のα−ヘリックス（「Ａ−ヘリックス」）と第３のα−ヘリックス（「Ｃ−ヘリックス」）との間の溝を選択することを決定した。次いで、このモデルをさらに調べて、各α−ヘリックスにおいてランダム化する（多様化する、変化させる）のに最も適切なアミノ酸残基位置を同定した。前記溝は、Ａ−ヘリックスにおけるヘプタッドのｃ位およびｇ位ならびにＣ−ヘリックスにおけるヘプタッドのｂ位およびｅ位に位置する残基によって実際に形成されることが観察された。ｇ位およびｅ位がこの溝に最も（すなわち、最も直接的に）寄与することが見出されたので、「主要な溝の位置」と表示される。ｃ位およびｂ位は溝の中央から少し離れて位置するので、「副次的な溝の位置」と示す。これらの主要なおよび副次的な溝の位置に加えて、溝の底は、数個のコア（ａおよびｄ）位によって形成される；具体的に、前記モデルは、特に、主要な溝の位置が小さいアミノ酸残基、例えば、グリシン、アラニンまたはセリンなどによって占められる場合、Ａ−ヘリックスのコアｄ位およびＣ−ヘリックスのコアａ位は、溝の形状にも寄与する可能性があることを示した。溝の形状に条件付きで寄与し得るこのようなコアａ位およびｄ位は、本明細書において、「溝のコア位置」と表示される。
【０２０８】
図１は、ｓｃＡＢ０１３＿Ｌ１６アルファボディーモデルのコイルドコイル部分内に、３個の主要なｅ位、およびさらに３個の主要なｇ位があることを示す。副次的な溝の位置に、４個のｂ位および４個のｃ位があることがさらにわかる。さらに、溝に潜在的に寄与し得る４個のコアｄ位および４個のコアｅ位がある。したがって、多様化されると溝の形状に影響を与え得る位置が合計２２個ある。２２個すべてを２０個の天然アミノ酸残基に完全にランダム化する場合、これは、２０２２個または約４×１０２８個の異なる配列の配列スペース（すなわち、可能な組み合わせの総数）に対応する。明らかに、すべての異なる配列が物理的に存在する形態で、このような巨大なライブラリーを作製することはできない（すなわち、このようなライブラリーは「完全」であることはできない）。その結果として、想定されるライブラリーを完全（またはほぼ完全）にするのを目的とする場合、可変位置の数を大幅に減らすべきである。
【０２０９】
したがって、溝のコア位置はいずれも変化させないことを決定した。この決定は、コイルドコイルにおける突然変異コア位置に関連するリスク（の回避）によって動機づけられた：このような置換の多くは、各アルファボディー構築物の安定性および／または正確な折り畳みに有害であろう。さらに、２個の副次的な溝の位置も変化させないことを決定した。具体的には、Ａ−ヘリックスにおける第１のｃ位およびＣ−ヘリックスにおける第１のｂ位は、一定に維持した。最後に、Ｃ−ヘリックスにおける第１の主要な溝のｅ位も同様に固定した。この結果、参照アルファボディーｓｃＡＢ０１３＿Ｌ１６のなかで、多様化する位置を１１個選択した。したがって、このようなライブラリーの理論上の配列スペースは、完全にランダム化する場合、２０１１個または約２×１０１４個の異なる配列である。
【０２１０】
多様化する位置に加えて、参照アルファボディーｓｃＡＢ０１３＿Ｌ１６に対して、その他の２種類の改変を行なった。第１に、リジンからグルタミン酸への２個の変異、すなわち、ヘリックスＡおよびＣそれぞれにおける第２のヘプタッドのｆ位における１個の変異を導入した。第２に、アルギニンからアラニンへの２個の変異、すなわち、ヘリックスＢおよびＣそれぞれにおける第４のヘプタッドのｃ位における１個の変異を導入した。多様化対象の位置が「ｘ」という記号によって示されるこの改変単鎖アルファボディーの配列を図３に示す。また、この配列は、配列番号：２として提供される。この設計に基づいて構築された単鎖アルファボディーライブラリーを以下「ｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１１」と称する。すべての多様化する位置は、アルファボディーの溝に位置するので、このライブラリーは、「純粋な溝ライブラリー」とも称する。
【０２１１】
第２の単鎖アルファボディーの純粋な溝ライブラリーは、「ｓｃＡＢ１４０＿Ｌ１４」という名称のより小さなアルファボディー参照構築物の３−Ｄモデルから設計された。後者は、各α−ヘリックスにおける第３のヘプタッドが削除されており、グリシン／セリンリンカー配列が１６残基から１４残基に減らされており、Ｎ末端α−ヘリックスキャッピング残基が弱い負電荷の別のモチーフで置換されたｓｃＡＢ０１３＿Ｌ１６構築物に本質的に対応している。ライブラリーを設計する際に、これらの差異以外は、多様化対象の主要な、副次的なおよびコアの溝の位置に関してまったく同じものを選択した。ヘリックスそれぞれにおける１個のヘプタッド単位の欠失を考慮すると、このライブラリーは、７個の可変残基位置のみを含有する。したがって、完全なランダム化のための理論上の配列スペースは２０７個または約１０９個であり、これにより、実際に製造されるライブラリーがほぼ完全であることが保証されるはずである。「ｓｃＬｉｂ＿ＡＣ７」という名称のこの単鎖アルファボディーの溝ライブラリーの配列を図３に示す。また、この配列は、配列番号：３として提供される。
【０２１２】
実際のところ、ｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１１ライブラリーの改変である第３の単鎖アルファボディーの純粋な溝ライブラリーを設計した。「ｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１１ｂ」という名称のこのライブラリーは、同じ（１１個の）多様化される溝の残基位置を含有するが、Ｎ末端ヘリックスキャッピング領域内およびリンカー領域内において、いくつかの改変がなされた。第１に、α−ヘリックスのヘプタッド反復配列の前のメチオニンをグリシンに変異させた。これらの変異は、これらのメチオニンがヘリックスをキャッピングする役割を果たすこと、およびｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１１ライブラリーの構築に使用した３−Ｄモデルがメチオニンが溝に位置すると示していることが理由である；溝におけるこのような位置は、溝を占有するリガンドに対する立体的な障害を形成し得るので、可能な限り最小でかつ構造的により柔軟性のある種類のアミノ酸残基、すなわち、グリシンでそれらを置換した。加えて、各ヘリックスのＮ末端部の負電荷を減少させ、それにより、このような負電荷から生じる潜在的な静電気的偏りを減少させるために、各α−ヘリックスの第１のヘプタッドにおけるｃ位のグルタミン酸をグルタミンに置換した。第３に、反復特性を低下させるために、リンカー断片におけるグリシンおよびセリンの配分を変化させた。ｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１１ｂライブラリーの配列を図４に示し、配列番号：４としても提供する。
【０２１３】
第４の単鎖アルファボディーライブラリーを設計して、単一のα−ヘリックス上の溶媒曝露領域を介して標的に結合するアルファボディーを生成する可能性を調査した。このような溶媒曝露α−ヘリックス領域は、（細長い）凸形状を特徴とする。換言すれば、この設計の目的は、配列多様性が単一のアルファボディーヘリックスの凸状の溶媒配向領域内に導入される（溝ライブラリーであるｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１１ライブラリーおよびｓｃＬｉｂ＿ＡＣ７ライブラリーとは対照的に）アルファボディーの「ヘリックスライブラリー」を生成することであった。多様化対象の位置の選択を導くための鋳型構造として、ｓｃＡＢ０１３＿Ｌ１６の３−Ｄモデルを再度使用した。多様化対象のものとして、この構造のＣ−ヘリックスを選択することを決定した。このモデルをさらに調べたところ、ｂ位、ｃ位およびｆ位は、（細長い）凸形状の近接するリムをともに形成することが示されている。このα−ヘリックスにおいて、識別可能な１１個のこのような表面位置がある。原則として、いくつかの隣接するｅ位およびｇ位は近接する結合表面の形成を潜在的に支援し得ることが観察されたが、アルファボディーを不安定化させるリスクを考慮して、および可変位置の数が過度に急増するという理由で、このオプションを放棄した。したがって、当初は、Ｃ−ヘリックスにおける１１個のｂ位、ｃ位およびｆ位すべてについて多様化を検討したが、キャッピング機能を無効化しないため、および妥当な範囲内でライブラリーの完全性を維持するために、最終的には、２個のＮ末端グルタミン酸は変化させなかった。この結果、最終的には、ライブラリーにおける多様化対象の９個のｂ位、ｃ位およびｆ位をもたらした。したがって、このライブラリーを「ｓｃＬｉｂ＿Ｃ９」と命名した。すべての多様化する残基位置は、単一のα−ヘリックスにおける完全に溶媒に曝露されている残基位置に位置するので、このライブラリーは、「純粋なヘリックス（表面）ライブラリー」の一例である。このライブラリーの配列を図３に示す。また、この配列は、配列番号：５として提供される。
【０２１４】
第５の単鎖アルファボディーライブラリーを設計して、溝のみに限定されない配列多様性を含有するアルファボディーライブラリーの可能性を調査した。このような「純粋ではない溝ライブラリー」を設計して、溝の外側にあるがこの溝領域のすぐ隣の多様化される残基位置も、特定の標的に結合するアルファボディーの発見に良い意味で寄与するか否かを調べた。この戦略は、多様化を溝の外側にこのように拡大することにより、細長い溝の形状とは異なる本質的な立体構造的形状を有する多様化される表面領域が生じるという事実によって動機づけられた。拡大された多様化される表面を含有するライブラリーに含まれるアルファボディーは、純粋な溝と最適に適合するエピトープとは異なる目的の標的分子上の形状相補的なエピトープ（表面領域）に潜在的に結合し得る。したがって、このような拡大されたライブラリーを設計して、それらが、様々な形状の標的分子（およびその上の表面領域）に対処する（すなわち、それに対する結合剤を生成する）のに本質的により適しているか否かを調べた。このようなライブラリーの具体的な設計は、ｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１１ライブラリーから、前記ｓｃＡＢ０１３＿Ｌ１６アルファボディーモデルを再度使用して行なった。第１の改変は、リンカー断片の長さの減少を含む（両リンカーとも８残基短くした）。可変位置に関して、１個の副次的な溝の位置（ヘリックスＡの第４のヘプタッドにおけるｃ位）はもはや多様化せずに、アラニンに固定した。ヘリックスＣでは、ｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１１ライブラリーで多様化している溝の位置に加えて、溝ではない２個のｆ位を選択して多様化した（これらの溝ではない位置は、ヘリックスＣの第２および第３の両ヘプタッドのｆ位にある）。前記モデルは、１２個の多様化する残基位置の新たな選択が、より凝縮された「パッチ様の」可変表面をもたらすことが示された；この表面の本質的な形状は、純粋な溝ライブラリーの形状と比較して、あまり細長くも幅広でもなく、凹状の領域には、新たに選択されたｆ位によって主に形成された小さな凸状のサブ領域が付加されている。したがって、このライブラリーを「ｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１２」と命名した。このライブラリーの配列を図４に示し、配列番号：６としても提供する。
【０２１５】
第６の単鎖アルファボディーライブラリーを設計して、単一のヘリックス表面のみに限定されない配列多様性を含有するアルファボディーライブラリーの可能性を調査した。このような「純粋ではないヘリックスライブラリー」を設計して、ヘリックス表面の外側にあるがこのヘリックス表面領域のすぐ隣の多様化される残基位置も、特定の標的に結合するアルファボディーの発見に良い意味で寄与するか否かを調べた。先と同様に、この戦略は、多様化をヘリックス表面の外側にこのように拡大することにより、ヘリックス表面残基の細長いリムとは異なる本質的な立体構造的形状を有する多様化される表面領域が生じるという事実によって動機づけられた。このようなライブラリーに含まれるアルファボディーは、単一のヘリックスと最適に適合するエピトープとは異なる目的の標的分子上の形状相補的なエピトープに潜在的に結合し得る。したがって、このような拡大されたライブラリーを設計して、それらが、様々な形状の標的分子（およびその上の表面領域）に対処するのに本質的により適しているか否かを調べた。このようなライブラリーの具体的な設計は、ｓｃＬｉｂ＿Ｃ９ライブラリーから、前記ｓｃＡＢ０１３＿Ｌ１６アルファボディーモデルを再度使用して行なった。第１の改変は、リンカー断片の選択を含み、ｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１１ｂライブラリーにおけるリンカー断片と同じように選択した。第２の改変は、ランダム化対象のヘリックスの選択を含んだ：ここでは、配列変異をｓｃＬｉｂ＿Ｃ９のようにＣ−ヘリックスではなくＢ−ヘリックスに導入することを選択した。可変位置の実際の選択に関して、先に改変された位相的に同等の２個のヘリックス表面位置は一定に維持された（ヘリックスＢの第１および第２のヘプタッドにおけるｆ位およびｂ位は、それぞれリジンおよびアラニンに固定された）。次いで、ｓｃＬｉｂ＿Ｃ９のＣ−ヘリックスで多様化しているヘリックス表面の位置に加えて、Ｂ−ヘリックスにおける溝のｇ位を２個選択して多様化した（これらの溝の位置は、ヘリックスＢの第２および第３のヘプタッドの両方のｇ位にある）。最終的には、前記モデルは、Ｃ−ヘリックスの位置（Ｃ−ヘリックスの第１のヘプタッドにおけるｇ位）が、その他の多様化される位置に直接的に隣接することを示唆したので、この位置も可変のままにした。つまり、前記モデルは、１０個の多様化する残基位置の新たに選択が、より凝縮された「パッチ様の」可変表面をもたらすことが示された；この表面の本質的な形状は、純粋なヘリックス表面ライブラリーの形状と比較して、あまり細長くも幅広でもなく、凸状の領域には、新たに選択した溝のｇ位によって主に形成された小さな凹状のサブ領域が付加されている。したがって、このライブラリーを「ｓｃＬｉｂ＿Ｂ１０」と命名した。このライブラリーの配列を図４に示し、配列番号：７としても提供する。
【０２１６】
実際の単鎖アルファボディーライブラリーは、Ｇｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に発注した。ｐＨＥＮ由来ファージミドであるｐＣｘｌベクターを使用して、「３＋３」一価ディスプレイ形式（Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ  １２８：１−２（１９９３））を採用した。ライブラリーｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１１、ｓｃＬｉｂ＿ＡＣ７およびｓｃＬｉｂ＿Ｃ９は、１０８個の独自のクローンが最低保証された形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞として供給された。ライブラリーｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１１ｂ、ｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１２およびｓｃＬｉｂ＿Ｂ１０は、１０９個の独自のクローンの最低保証付きで供給された。アルファボディー配列は、Ｍ１３ファージのｐＩＩＩコートタンパク質と融合されていた。それらは、それらのＣ末端により、アンバーコドン（遺伝子レベルで）およびＨｉｓ６タグを含むリンカー配列を介してｐＩＩＩコートタンパク質に結合されていた。ペリプラズムへの融合アルファボディーの輸送は、Ｎ末端のＰｅｌＢリーダー配列の存在によって保証された。ウェスタンブロッティングを使用してファージ上の提示レベルが調べられ、適切な高さであることが分かった。分析により、一般に、ファージの３分の１がアルファボディーを提示することが示された（図５）。
【０２１７】
実施例２．標的特異的なアルファボディーを生成するための本発明のアルファボディーライブラリーの使用
上記アルファボディーライブラリーなどのアルファボディーライブラリーを使用して、ヒトＩＬ−２３用の結合剤を生成した。インターロイキン−２３（ＩＬ−２３）は、２個のサブユニット、すなわちそれぞれがβ鎖によって形成される３個のドメインからなるｐ４０と、４個のヘリックスの束状組織を有する別のｐ１９とからなるヘテロ二量体サイトカインである。ｐ４０サブユニットは、ＩＬ−１２にも見られる。したがって、ＩＬ−２３に対して特異的なアルファボディーを得るために、バイオパニングのプロトコールをわずかに調整して、Ｐ１９サブユニットに結合するアルファボディーをさらに選択した。
【０２１８】
ライブラリー
実施例１に記載したように入手したファージライブラリーｓｃＬｉｂ＿ＡＣ１２およびｓｃＬｉｂ＿Ｂ１０を使用した。これらのファージライブラリーは、ウイルスのｐＩＩＩタンパク質を有する融合タンパク質としてランダム化アルファボディー配列を提示した。
【０２１９】
ｓｃＬｉｂＢ１０は、ヘリックスライブラリーであるが、ｓｃＬｉｂＡＣ１２は溝ライブラリーである。
【０２２０】
ライブラリーの定義を図７に示す。
【０２２１】
ファージライブラリーのレスキュー
ライブラリーストックの接種材料（それぞれ０．６０８ｍｌおよび１．１５７ｍｌ）を、０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンと２％のグルコースとを補充した２×ＴＹ（２×ＴＹ−ＡＧ）からなる計算容量（それぞれ９３３ｍｌおよび１４６６ｍｌ）の成長培地に移した。ＯＤ６００ｎｍが０．５（対数増殖期中期（ｍｉｄ−ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ））に達するまで細菌培養液を、バッフルフラスコ中で振盪（３００ｒｐｍ）させながら３７℃で生育させた。細菌培養液を、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で重複感染させるのに使用して、ファージ粒子を製造した。重複感染に適用したヘルパーファージ／細菌の比は、２０：１であった。
【０２２２】
感染培養液を、振盪せずに３７℃で３０分間インキュベーションして、細菌を感染させた。インキュベーション後、感染培養液のサンプルを２×ＴＹ−ＡＧ寒天プレートおよび２×ＴＹ−ＡＧＫ（Ｋは、カナマイシン（２５マイクログラム／ｍｌ）を意味する。ヘルパーファージは、カナマイシン耐性であるため）寒天プレートで力価測定して、生菌数および感染細菌数をそれぞれ測定した。次いで、感染培養液を、振盪しながら３７℃でさらに３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、培養液を室温、４０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって、細菌細胞ペレットを得た。細菌ペレットを、最初の開始容量と同容量の予め加温した２×ＴＹ−ＡＫ培地に再懸濁した。培養液を、振盪（３００ｒｍｐ）しながら３０℃で一晩生育させた。
【０２２３】
一晩のインキュベーション後、培養液のサンプルを、２×ＴＹ−ＡＧＫ寒天プレートで力価測定して、生細胞を測定した。培養液を氷上で５分間冷却し、細菌を７０００ｒｐｍで２０分間ペレット化した。５分の１の容量の２０％ＰＥＧ４０００／２．５ＭのＮａＣｌの溶液を添加することによって上清を回収して、ファージを沈殿させ、氷上で１〜２時間インキュベーションした。インキュベーション後、４℃、７０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によって、ファージを回収した。ファージペレットを３５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／９００ｍｌの細菌培養液に溶解させ、１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって、細菌のデブリスを除去した。２回目のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿を１時間実施し、その後に細菌のデブリスを除去した。最終的に、ライブラリーに対応する精製ファージを得た（１０ｍｌ／最初の細菌培養液９００ｍｌ）。１５％のグリセロールをファージに添加して、−８０℃で保存した。
【０２２４】
ライブラリーに対応するファージ調製物の力価は、精製ファージの段階希釈物で細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１株）を感染させ、これらの希釈物を２×ＴＹ−ＡＧ寒天プレート上にプレートすることによって測定した。この力価測定により、感染ファージ粒子（コロニー形成単位（ｃｆｕ）または形質導入単位（ＴＵ））の数を測定できた。ライブラリーは、形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２７３８細菌として提供されたが、さらなるファージの繁殖はすべて、ファージディスプレイ技術に使用される一般的な株であるＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して実施した。
【０２２５】
アルファボディーの発現は、野生型ｐＩＩＩタンパク質およびアルファボディー融合ｐＩＩＩタンパク質の存在を決定するための抗ｐＩＩＩ抗体を使用して、ウエスタンブロット分析で評価した。融合ｐＩＩＩタンパク質の分子量は、野生型ｐＩＩＩタンパク質よりも大きいので、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中ではより遅く移動するであろう。融合タンパク質が存在する場合、抗ｐＩＩＩ抗体を使用して、２個のバンドが可視化されるはずである。
【０２２６】
この特定の実施例の回収したライブラリーの力価を表１に示す。ライブラリーｓｃＬｉｂ０１３ＡＰＬ８＿ＡＣ１２、ｓｃＬｉｂ０１３ＡＰＬ１６＿Ｂ１０の場合、ライブラリーのサイズの１４倍および８倍の力価がそれぞれ得られた。ウエスタンブロット分析により、すべてのライブラリーについて、アルファボディー−融合ｐＩＩＩタンパク質が存在することが示された（図６）。２個のバンドが可視化された。下方のバンドは、野生型ｐＩＩＩに対応し、より高分子量の上方のバンドは融合ｐＩＩＩタンパク質に対応する（図６）。結論としては、ライブラリーの回収は成功した。開始ライブラリーのサイズの１０倍超の力価が得られ、ウエスタンブロットによれば、すべてのライブラリーが融合ｐＩＩＩタンパク質を提示した。
【０２２７】
【表１】
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【０２２８】
バイオパニングのプロトコール
可溶性バイオパニングのプロトコールを使用した。サイトカインＩＬ−２３のサブユニットｐ４０を認識するビオチン化抗ｐ４０ＩＬ−２３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，５０８８０２，ｃｌｏｎｅ  Ｃ８．６）を使用して、ファージライブラリーと相互作用させた後に、標的ＩＬ−２３の捕捉を実施した。
【０２２９】
ライブラリーとともにインキュベーションする前に、サイトカインＩＬ−２３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，３４−８２３９−８５，ｌｏｔ  Ｅ０３４０４９）を抗ｐ４０抗体とともにインキュベーションした。この戦略は、ｐ４０ユニットを抗体でブロッキングすることによって、ＩＬ−２３のｐ１９サブユニットの結合剤に対する選択を促進するために開発した。次いで、この特定の抗体をまた使用して、洗浄目的のためにＩＬ−２３を固体支持体上に固定化した。
【０２３０】
具体的には、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２）緩衝液に溶解させた０．１％ＢＳＡ中で、可変濃度のＩＬ−２３を、２倍濃度のビオチン化抗ＩＬ−２３ｐ４０抗体で１時間インキュベーションした。選択ストリンジェンシーを調節して、より標的特異的なファージを得るために、ＩＬ−２３の濃度を、選択ラウンドの関数として変化させた。それぞれ２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭおよび１２．５ｎＭのＩＬ−２３を使用して、５ラウンドを実施した。対照的に、インプットファージ、すなわち、各選択ラウンドで標的に添加するファージの濃度を一定に保った。
【０２３１】
ＩＬ−２３に結合するために抗ｐ４０抗体を使用したので、ＩｇＧ−Ｆｃ結合剤の選択を防ぐために、２回目のラウンドから、２０マイクロモルの全ＩｇＧ（Ｓａｎｇｕｉｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）をＩＬ−２３／抗ｐ４０抗体／ファージ混合物に添加した。前記ファージを標的（抗ｐ４０＋ＩＬ−２３）とともに室温で１時間インキュベーションし、その後、０．１ｍｌのストレプトアビジンをコーティングした磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に３０分間捕捉した。使用前に、製造業者が推奨するように磁気ビーズを洗浄し、回転ホイール上で、ＰＢＳに溶解させた０．１％ＢＳＡを用いて室温で１時間ブロッキングした。
【０２３２】
捕捉後、次いで、磁気ビーズを、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含む１ｍｌのＰＢＳで１０回洗浄して、非特異的なファージを排除した。バイオパニングの分野の当業者に公知であるように、磁気ビーズは、磁石を使用して容易に洗浄できる。
【０２３３】
０．２ｍｌのグリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２）を使用して、標的特異的なファージをビーズから５分間かけて溶出し、その後に０．０５ｍｌのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８）で中性にした。対数増殖期中期の細菌を磁気ビーズに直接的に添加することによって、追加の画分を回収した。
【０２３４】
対数増殖期中期（ＯＤ６００ｎｍ＝０．５）まで生育させたＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細菌の感染による力価測定のために、溶出させたファージのサンプルを使用して、溶出したファージの１０倍希釈物（１Ｅ−１〜１Ｅ−４）を２×ＴＹで調製した。また、各選択ラウンドでインプットとして使用したファージの小サンプルから、同じ希釈物（１Ｅ−７〜１Ｅ−９）を調製した。これらの力価測定結果により、上記式を使用して選択ラウンドの収量を計算できるであろう。
【０２３５】
本実施例では、０．９ｍｌの細菌を０．１ｍｌのファージ希釈物に添加して、３７℃で３０分間インキュベーションした。コロニー計算および力価測定のために、０．１ｍｌの感染培養液を２×ＴＹ−ＡＧ寒天プレート上にプレートする。
【０２３６】
溶出したファージを使用して、２０ｍｌの対数増殖期中期（ｍｉｄ−ｌｏｇ  ｐｈａｇｅ）のＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１細菌に３７℃で３０分間感染させた。インキュベーション後、４０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって、細菌ペレットを得た。ペレットを２ｍｌの２×ＴＹに再懸濁し、２個の大きな２×ＴＹ−ＡＧ寒天プレート（２５Ｘ２５ｃｍ）上にプレートした。
【０２３７】
０．２５ｍｌ容量の対数増殖期中期の細菌を磁気ビーズ上に直接的に添加し、３７℃で３０分間インキュベーションした。前述のように、サンプルを力価測定した。感染培養液を２個の大きな２×ＴＹ−ＡＧ寒天プレート上にプレートした。
【０２３８】
翌日、各プレート上のコロニーを計算し、収量計算のために、インプットファージおよびアウトプットファージの力価を測定した。大量の感染培養液に対応する大きな寒天プレート上の細菌を、ＬＢを使用してプレートから擦り取り、ＯＤ６００ｎｍで測定することによって細菌数を測定し、１５％グリセロールを添加して、−８０℃で保存した。前述のように、これらのグリセロールストックからファージを回収して、連続選択ラウンドのための精製ファージを得た。１Ｅ１２ファージを次の選択ラウンドに用いた。
【０２３９】
ＩＬ−２３に対するプールした個々のライブラリーを用いて５回の選択ラウンドで得られた力価を表２に示す。ＡＣ１２ライブラリーを用いるバイオパニングの場合、４回の選択ラウンドの後に、最高収量が得られた（表２）。Ｂ１０ライブラリーを用いるバイオパニングでは、５回のラウンドの後に、最高収量が得られた（表２）。バイオパニングキャンペーンにより、アウトプット力価が４８〜１００倍増加したので、濃縮が観察された。
【０２４０】
【表２】
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【０２４１】
異なる選択ラウンドから標的陽性クローンを単離するために、およびバイオパニングの有効性をさらに決定するために、ＥＬＩＳＡアッセイによるスクリーニングを実施した。このアッセイでは、小容量の細菌培養液からの上清を試験した。これらの細菌培養液は、異なる選択ラウンドの力価測定プレートからランダムに選択された個々のクローン（＝個々のファージ）に対応する。これらの細菌クローンは、０．１２ｍｌの２×ＴＹ−ＡＧ入りの９６ディープウェルプレートにおいて、振盪（１８０ｒｐｍ）しながら３０℃で一晩生育させた（マスタープレート）。翌日、０．００２ｍｌのこのプレートを使用して、グルコースを含まない０．１ｍｌ／ウェルの２×ＴＹ−Ａを接種し、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージをすぐに添加した（２×１０9（２ｘ１０９）プラーク形成単位／０．０２μｌ／ウェル）。振盪（１８０ｒｐｍ）しながら３７℃で２．５時間インキュベーションした後、０．０３０ｍｌの２×ＴＹ−ＡＫ（アンピシリン（Ａｍｐ）：０．１ｍｇ／ｍｌおよびカナマイシン（Ｋａｎ）：０．０５ｍｇ／ｍｌ）を培養液に添加し、ファージを繁殖させるために、振盪（１８０ｒｐｍ）しながら３０℃でさらに一晩インキュベーションした。
【０２４２】
マスタープレートについて、−８０℃での保存のために、０．０２０ｍｌの８０％グリセロールを添加した。個々の陽性クローンの標的相互作用をさらに特性決定するために、マスタープレートは、個々の陽性クローンを生育させ、続いてファージを精製するのに役立つ。
【０２４３】
本実施例では、４回のバイオパニングキャンペーンの選択ラウンドあたり４４個のクローンをスクリーニングした。１回目の選択ラウンドから標的特異的なクローンを単離する期待は低いので、１回目の選択ラウンドからはクローンをスクリーニングしなかった。
【０２４４】
ＥＬＩＳＡの準備は以下のようにした。ニュートラアビジンを室温（ＲＴ）、０．０１０ｍｇ／ｍｌ（ＰＢＳ（０．１００ｍｌ）中）の濃度でプレート上に１時間固定化した。プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で５分間かけて５回洗浄した。続いて、０．１ｍｌのビオチン化抗ｐ４０抗体（１００ｎＭ）を、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ入りのプレートに添加し、４℃で一晩または室温で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、０．１％ＢＳＡおよび０．５％ゼラチン（０．１２０ｍｌ／ウェル）含有ＰＢＳを用いて、室温で少なくとも１時間または４℃で一晩ブロッキングした。ＰＢＳＴで５回洗浄した後、１００ｎＭのＩＬ−２３を０．１ｍｌのＰＢＳ、０．１％ＢＳＡに添加した（＝標的）。個々の陰性対照については、ＩＬ−２３を添加しなかった（＝バックグラウンド）。
【０２４５】
一方、細菌プレートを１７００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、細菌をペレット化した。ＩＬ−２３を固定化したプレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、ファージを含有する０．０５０ｍｌの細菌培養上清とともに、０．０５０ｍｌの０．２％ＢＳＡ含有ＰＢＳをプレートに添加した。プレートを、振盪しながら室温で１〜１．５時間インキュベーションした。プレートを振盪することにより、ＥＬＩＳＡのシグナルを増幅した。
【０２４６】
インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、０．１％ＢＳＡ（０．１ｍｌ／ウェル）含有２％ＰＢＳで１：５０００に希釈したＨＲＰ標識抗Ｍ１３抗体とともに、振盪しながら室温で４０分間インキュベーションした。プレートを５回洗浄し、ＴＭＢ（ＨＲＰの基質）溶液（０．１ｍｌ／ウェル）を添加し、プレートを暗所で５〜３０分間インキュベーションした。０．０５ｍｌの２Ｎ硫酸（Ｈ２ＳＯ４）を各ウェルに添加することによって反応を停止させ、プレートを４５０ｎｍで読み取った。
【０２４７】
陽性クローンの同定
標的上のシグナルがバックグラウンドの少なくとも３倍超であった場合、クローンを陽性であるとみなした。
【０２４８】
ＡＣ１２のバイオパニングキャンペーンは、ＥＬＩＳＡにより測定した陽性クローンのパーセンテージと、選択ラウンドの増加との間に正の相関関係をもたらした。
【０２４９】
ライブラリーＢ１０のパフォーマンスはあまり十分ではなく、このライブラリーからは、少数の陽性クローンしか回収されなかった。ＡＣ１２ライブラリーの場合、陽性クローンの９０％超が４回の選択ラウンド後に得られた。
【０２５０】
また、ＥＬＩＳＡは、ファージ上に提示されたアルファボディーの代わりに可溶性アルファボディーを使用して実施することができる。可溶性アルファボディーの製造は、グルコースを含まない条件を使用することによるｌａｃＺプロモーターの異化抑制、および細菌ゲノム上のｌａｃｌｑリプレッサーを不活性化することによるイソプロピルチオ−β−ガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ）の転写誘導に基づくものである。アルファボディーをコードする遺伝子が転写され、可溶性アルファボディーが製造される。
【０２５１】
選択ラウンドの滴定プレートから細菌コロニーをランダムに選択して、０．１２ｍｌの２×ＴＹ−ＡＧ入りの９６ウェルプレートにおいて、振盪（１８０ｒｐｍ）しながら３０℃で一晩生育させる。翌日、０．００２ｍｌのこのプレートを使用して、０．１ｍｌ／ウェルの０．１％グルコース含有２×ＴＹ−Ａを接種し、ＯＤ６００ｎｍが０．９になるまで（約２〜３時間）、３７℃でさらに生育させる。次いで、０．０３ｍｌの３．３ｍＭ  ＩＰＴＧ含有２×ＴＹ−Ａを培養液に添加し、振盪（１８０ｒｐｍ）しながら３０℃でさらに１６〜１８時間インキュベーションする。ＩＰＴＧで発現を誘導した後、新たに調製した０．０１４ｍｌのＢ−ｐｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ）をウェルごとに添加し、混合しながら室温で１５分間インキュベーションする。次いで、上清をＥＬＩＳＡアッセイに使用する。
【０２５２】
配列決定
ＡＣ１２バイオパニングからのＩＬ−２３に結合するすべての陽性クローン（異なるバイオパニングラウンドから選択されたもの）について、アルファボディーの配列を決定した。これらの配列は、サンガー配列決定法およびＭ１３ＲＳシークエンシングプライマーを使用して、ＶＩＢ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｎｔｗｅｒｐ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）の標準的なＤＮＡ配列決定サービスによって決定された。表３（図８）は、ＩＬ−２３に対するＡＣ１２ライブラリーから得られた７７個のアルファボディー配列のマルチプルアライメントを示す。また、これらのアルファボディーは、上記のように可溶性アルファボディー（すなわち、ファージフォーマットの外側）で容易に製造され、続いて、タンパク質精製の分野の当業者に公知の標準的なＮｉ−ＮＴＡ／ＳＥＣ法によって精製され得る。通常、可溶性アルファボディーは、アルファボディーのＣ末端部（アルファボディーライブラリーフォーマットＡＣ１２、Ｂ１０の場合）に、または所定のアルファボディー遺伝子がそのファージコンテクストから（標準的な分子生物学技術によって）切り出され、適切な発現ベクター（例えば、ｈｉｓタグおよびプロテアーゼ切断部位がアルファボディー遺伝子の前にあるｐＥＴ１６など）に挿入される再クローニングステップの結果としてＮ末端にＨｉｓタグを含むので、Ｎｉ−ＮＴＡ精製は、簡単な最初の精製ステップである。ＩＬ−２３への結合のＫｄ（解離定数）を決定するために、可溶性アルファボディーを（動態）Ｂｉａｃｏｒｅ分析もしくはＦｒｉｇｕｅｔ（間接ＥＬＩＳＡ）分析（Ｆｒｉｇｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）、または結合力測定の分野の当業者に公知の別の適切な方法に供する。
【０２５３】
マウスＩＬ−２３との交差反応性
マウスＩＬ−２３との交差反応性は、ヒトＩＬ−２３戦略と同様に、マウス抗ｐ４０抗体によってマウスＩＬ−２３を捕捉するＥＬＩＳＡ分析を使用して研究した。ＥＬＩＳＡ分析は前述のように実施し、標的上のシグナルがバックグラウンドのシグナルの少なくとも２．５倍超であった場合、クローンを陽性であるとみなした。ＡＣ１２ライブラリーから得られたＩＬ−２３陽性クローンについて、分析されたクローンの２６％は、マウスＩＬ−２３と交差反応性であることが観察された（Ｔ／Ｂ＞２．５）。
【０２５４】
ＩＬ−１２との交差反応性
また、１２７個の異なるクローンのドメイン特異性も、ヒトＩＬ−１２で試験された。ＩＬ−２３について記載されたように、ＥＬＩＳＡを実施した。ヒトＩＬ−１２を抗ヒトｐ４０抗体によってプレート上に捕捉し、前述のようにＥＬＩＳＡを実施した。ＥＬＩＳＡの結果により、クローンは、それぞれＡＣ１２ライブラリーからは５個／７６個およびＢ１０ライブラリーからは０個がヒトＩＬ−１２と交差反応性であることが示された。ＡＣ１２ライブラリーについては、５個のヒトＩＬ−１２陽性クローンのうちの４個は、マウスＩＬ−２３とも交差反応した。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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