(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳低酸素症(hypoxia)による新生児脳損傷を含む新生児脳損傷を予防または治療するための医薬の製造でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用であって、
上記ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質が配列番号１〜３のポリペプチドから成る群の中から選択されるポリペプチドと少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有し、上記ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質誘導体がＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質およびＨＩＰ／ＰＡＰキメラまたは融合蛋白質の生物学的活性部分から成る群の中から選択されることを特徴とする使用。
【請求項２】
新生児脳損傷が胎児虚血、周産期虚血、胎児低酸素血症、周産期低酸素血症および興奮性神経伝達物質の過剰放出から成る群の中から選択される病理学的状態を含む請求項１に記載の使用。
【請求項３】
新生児の脳損傷が脳卒中を含む脳血管障害から成る請求項１に記載の使用。
【請求項４】
新生児の脳損傷が虚血性脳卒中および出血性脳卒中から成る群の中から選択される請求項１に記載の使用。
【請求項５】
ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体が神経細胞アポトーシスまたは神経細胞死に対する予防効果を発揮する請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新生児、小児および成人の神経学を含む、神経学（neurology）の分野に関するものである。
本発明は特に、新生児脳損傷 (neonatal brain injury) の分野に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
新生児神経損傷に関与するプロセスは成人患者の神経損傷に至るプロセスとは異なるので、新生児脳損傷は医学研究の特定分野を構成する。
【０００３】
産科および新生児のケアは改善されてきているが、２つのグループの新生児すなわち主として白質損傷を伴う早産児と低酸素虚血性脳損傷を伴う満期仮死産児には恒久的神経学的障害を伴う周産期脳損傷を発症する危険性が依然としてある。これら２つのグループでは低酸素虚血性の他に興奮毒性細胞死および活性酸素種生成（ＲＯＳ）に至るグルタメートの放出増加が脳損傷プロセスで重要である。
【０００４】
低酸素虚血性（ＨＩ）としても知られる新生児仮死は早産時、陣痛時、分娩時または出生直後の乳児の酸素摂取不足から生じる症状である。新生児仮死は依然として新生児の慢性神経罹患率および急性死亡率の主要な原因であり、低酸素虚血性脳症に至る。６分という短時間の新生児低酸素症でも恒久的神経損傷に至ることがあることが従来の研究でわかっている。全出生時死亡の約１４．６％は新生児低酸素症に起因する。欧米諸国では新生児の約０．９％が新生児低酸素症になる。約１５〜２０％が死亡し、生存者の２５％が重症身障児であり、これは長期合併症、例えば精神遅滞、脳性まひ、痙性、学習困難またはてんかんに起因する。さらに、初期には合併症を克服したように見えるやや軽い低酸素症の小児は、この新生児発作に遡ることができる行動障害を小児期に有することが次第に認識されてきている。
【０００５】
一般に、新生児脳損傷の開始および発達は複雑なプロセスであり、早発性、遅発性損傷の両方を発生する複数の寄与メカニズムおよび経路を有する。研究ではこれらのプロセスの種々の特徴、例えば酸化的ストレス、炎症および興奮毒性に焦点が当てられてきた。これらは成熟脳または未成熟脳で大きく異なる（非特許文献１）。
【０００６】
現在、新生児ＨＩに関連する脳損傷に対して承認された治療方法は集中治療の一部として施される支持療法および医療介入以外にない。しかし、医療介入を改善し且つ臨床応用のために試験して失敗した治療の結果として新規な方法を発見するために、多くの有望な研究手段がある。失敗した治療の例には、救急甦生時のグルコース補充、換気亢進、ミダゾラム、バルビツレート、デキサメタゾンおよびその他のグルココルチコイド、カルシウムチャネル阻害剤、硫酸マグネシウム、インドメタシン、ポリエチレングリコールに共役したスーパーオキシドジスムターゼ／カタラーゼ、ＭＫ−８０１、デトロメトルファンおよびカスパーゼ阻害剤が含まれる。新生児脳ＨＩの管理には、適切な換気、体液の細心の管理、低血圧および低血糖の回避および発作の治療を施す支持療法が含まれる。実際には、乳児をＨＩ後に蘇生する方法を改善することは、転帰を改善し且つ身体障害を減らすのに極めて重要な第１段階になりうると仮定されている。蘇生中に用いられる酸素の濃度はＨＩ後の脳損傷に影響しうる。ＨＩを有する新生児および局所的虚血性脳卒中のげっ歯類モデルにおいて、高圧酸素を試みて成功した例がある。発作を有する新生児（さらに酸素フリーラジカル疾患の危険性もある）における酸素の役割を明らかにするためにさらに研究を行う必要がある。
【０００７】
集中治療を改善する他にも、新規な治療方法の選択肢および潜在的な医療介入を同定して、進行中の脳損傷のプロセスを改善するために、たくさんの研究がなされている。簡単に言うと、種々の方法、例えば抗酸化物、抗炎症薬、細胞死阻害剤、成長因子の試験、幹細胞治療または低体温法が研究されている。種々の抗炎症化合物が研究されている。複数の医療介入、例えばアロプリノール／オキシプリノール、デスフェロキサミンおよびメラトニン、フリーラジカルによって生じるＨＩ誘発脳損傷を減らそうとする試みは、その副作用プロフィールおよび試験の失敗例のために、臨床的関心を高められなかった。最近の有望な治療には、エリスロポエチンおよびＮ−アセチルシステインがある。エリスロポエチンは抗アポトーシス性、抗ニトロソ化および抗血管新生作用を有する抗酸化物である。エリスロポエチンはさらに、神経保護作用および神経新生を細胞運命決定の変更によって促進し、且つ、未成熟ラットにおける発作後の機能転帰を改善することが報告されている。周知な抗酸化およびフリーラジカル除去薬であるＮ−アセチルシステインは、胎盤と血液脳関門（ＢＢＢ）とを交差させ、妊娠中の安全性プロフィールが良い。Ｎ−アセチルシステインは酸化的ストレスを軽減し、細胞内グルタチオンレベルを回復し、酸素フリーラジカルを除去し、細胞酸化還元電位を改善し、新生児脳のアポトーシスおよび炎症を減らし、さらに、仮死後に認められる心臓−腎臓の回復が改善することがわかっている。水素治療も研究すべき治療方法である可能性がある。さらに、低酸素虚血新生ラットの脳損傷を、コンドロイチナーゼＡＢＣと一緒に神経幹／前駆細胞を脳室内注入することによって減らす試みがなされている（非特許文献２）。
【０００８】
大きな懸念を引き起こす脳外傷の中では、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）は外からの力で脳が損傷したときに起こる。ＴＢＩは世界的に死亡および身体障害、特に小児および若年成人において主要な原因である。ＴＢＩは、外部からの機械的力、例えば急速加速または減速、衝撃、爆風または発射物の貫通で生じる脳への損傷で定義される。脳外傷は二次的脳損傷、例えば脳血流および頭蓋内圧力の変化を引き起こす。ＴＢＩは多くの物理的、認知的、感情的および行動的影響をもたらす可能性がある。ＴＢＩ転帰は完全な回復から恒久的身体障害または死亡までの範囲にわたりうる。２０世紀には、死亡率を低下させ且つ転帰を改善させる診断および治療において大きな進歩があった。これらの例としては、画像化技術、例えばコンピュータ断層撮影法および磁気共鳴映像法が挙げられる。ＴＢＩ患者は緊急に、損傷後のいわゆる「ゴールデンアワー」内に救命処置を施さなければならない。中等度から重度の損傷を有する患者はおそらく集中治療室で治療を受けた後、脳神経外科病棟で治療を受ける。治療は患者の回復期に依存する。急性期の主要目的は患者を安定させ、さらなる脳損傷を防ぐことである。なぜなら、外傷によって引き起こされた初期損傷を回復させるためにできることはほとんどないからである。主要な医学的懸念は適切な酸素供給の確保と、十分な脳血流の維持と、頭蓋内圧亢進のコントロールである。現在、患者の神経保護作用の助けとなり得る潜在的な医療を計画するための研究がなされている。しかし、脳細胞損傷を食い止めうる薬剤の臨床試験はほとんどが失敗している。
【０００９】
例えば、低体温症において損傷脳を冷やしてＴＢＩ損傷を抑制することに関心が向けられたが、ＴＢＩの治療には有用ではないことが臨床試験によって示された。これらの失敗は、臨床試験計画の欠陥または二次的損傷に関与する一連の損傷プロセスを予防するには不十分な単剤を含む要因による可能性がある。
【００１０】
高圧酸素療法（ＨＢＯ）はＴＢＩ後の補助療法として評価されており、「その使用はＴＢＩにとって正当なＨＢＯになり得なかった」とするコクランレビューはまだ議論の余地があると推論される。すなわち、改善されたメカニズムが探し出されており、それが治療として有望である証拠が研究によって分かっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Gonzalez et al., 2008, Pharmacology and Therapeutics, Vol. 120: 43-53
【非特許文献２】Sato et al., 2008, Reprod Sci., Vol. 15(nー6) : 613-620
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
こうした現状から、外傷性脳損傷を有する患者の治療に対する医学の進歩が強く求められている。
この分野では新生児脳損傷を効果的に治療できる化合物を同定するというニーズがある。
この分野ではさらに、現在利用可能な治療法がほとんどない新生児細胞死を引き起こす外傷性脳損傷（ＴＢＩ）の治療に有用な化合物を同定するというニーズがある。
さらに、この分野では小脳遺伝的疾患および環境性小脳疾患を含む小脳疾患の治療に有用な化合物を同定するというニーズもある。
さらに、アルツハイマー病およびアルツハイマー病の特異的な症状に先行する軽度認識障害の治療に有用な化合物を同定するというニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、種々のタイプの脳損傷を予防または治療する化合物を提供する。
本発明は、脳低酸素症による新生児脳損傷を含む新生児脳損傷の予防または治療でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用に関するものである。
本発明はさらに、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）の予防または治療でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用にも関する。
本発明はさらに、脳低酸素症による脳損傷の予防または治療でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用にも関する。
本発明は特に、脳低酸素症によって引き起こされる新生児脳損傷から成る脳損傷の予防または治療でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用に関する。
本発明はさらに、脳低酸素症によって引き起こされる小児脳損傷から成る脳損傷の予防または治療でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用に関する。
本発明はさらに、脳低酸素症によって引き起こされる成人脳損傷から成る脳損傷の予防または治療でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用に関する。
【００１４】
本発明はさらに、脳卒中を含む脳血管障害または外傷性脳損傷から成る脳損傷の予防または治療でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用に関する。上記脳卒中は特に虚血性脳卒中および出血性脳卒中から成る群の中から選択される。
本発明は特に、小脳性運動失調症を含む、小脳疾患または小脳障害の予防または治療でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用に関する。
本発明はさらに、神経細胞または可塑性のインビトロまたはインビボ変調、促進または改善でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用に関する。
【００１５】
本発明はさらに、神経細胞の構造再構築または可塑性の変調でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用に関する。
本発明はさらに、神経細胞アポトーシスまたは神経細胞死からの神経細胞の保護でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用に関する。
本発明はさらに、Ｇａｐ−４３の産生の調節不良または欠陥、または、Ｇａｐ−４３のホスホリル化の調節不良または欠陥を含む障害または疾患の予防または治療でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用に関する。
本発明のさらに他の対象は、神経細胞のインビトロ培養でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用にある。
本発明のさらに他の対象は、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体を含む神経細胞用の培地にある。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】GAP 43 +/+マウスからの皮質神経細胞の細胞アポトーシスに対するHIP/PAPの予防効果を示す図。縦軸はTUNEL陽性細胞のパーセンテージを表し、横軸は左から右へ(1) 対照培地、(2) NMDA, (3) NMDAおよびHIP/PAP,および(4) NMDA単独でインキュベートした細胞を表す。'#"は:対照と比べて有意であることを表し、"*"はNMDAと比べて有意であることを表す。
【００１７】
【図２】GAP 43 +/+マウスからの皮質神経細胞の一次神経突起の数に対するHIP/PAPの予防効果を示す図。縦軸は特定数の一次神経突起を有する細胞のパーセンテージを表し、横軸の４セットの棒は左から右へそれぞれ(1)０の一次神経突起を有する細胞、(2) １つの一次神経突起を有する細胞、(3)２つの一次神経突起を有する細胞、 (4) ３つ以上の一次神経突起を有する細胞を表し、各棒セットは左から右へ(a) 対照培地, (b) NMDA, (c) NMDA およびHIP/PAP および (d) HIP/PAP単独で得られた結果を示す。'#"は対照と比べて有意であることを表し、"*"は NMDAと比べて有意であることを表す。
【００１８】
【図３】マウス皮質神経細胞の二次神経突起の数に対するHIP/PAPの効果を示す図。縦軸は二次神経突起を有する細胞のパーセンテージを表し、横軸の４セットの棒は左から右へそれぞれ(1) 対照培地、(2) NMDA, (3) NMDAおよびHIP/PAPおよび(4) HIP/PAP単独を表す。各棒セットは左から右へ(a) GAP 43 +/+マウス，(b) GAP 43 +/-マウス, (c) GAP 43 -/-マウスから得られるマウス皮質細胞で得られた結果を示す。'#"は対照と比べて有意であることを表し、"*"はNMDAと比べて有意であることを表す。
【００１９】
【図４】マウス皮質神経細胞の三次神経突起の数に対するHIP/PAPの効果を示す図。縦軸は三次神経突起を有する細胞のパーセンテージを表し、横軸の４セットの棒は左から右へそれぞれ(1) 対照培地、(2) NMDA, (3) NMDAおよびHIP/PAP,および(4) HIP/PAP単独を表し、各棒セットは左から右へ(a) GAP 43 +/+マウス，(b) GAP 43 +/-マウス, (c) GAP 43 -/-マウスから得られるマウス皮質細胞で得られた結果を示す。'#"は対照と比べて有意であることを表し、"*"はNMDAと比べて有意であることを表す。
【００２０】
【図５】GAP 43 +/+マウスからの皮質神経細胞の枝分かれ部位の数に対するHIP/PAPの効果を示す図。縦軸は特定数の枝分かれ部位を有する細胞のパーセンテージを表し、横軸の３セットの棒は左から右へそれぞれ (1)１の枝分かれ部位を有する細胞、(2) ２つの枝分かれ部位を有する細胞、(3)３つ以上の枝分かれ部位を有する細胞を表し、各棒セットは左から右へ(a) 対照培地, (b) NMDA, (c) NMDA およびHIP/PAP, および (d) HIP/PAP単独で得られた結果を示す。 '#"は対照と比べて有意であることを表し、"*"はNMDAと比べて有意であることを表す。
【００２１】
【図６】GAP 43 +/+マウスからの皮質神経細胞の神経突起の長さに対するHIP/PAPの効果を示す図。縦軸は特定の神経突起の長さ範囲を有する細胞のパーセンテージを表し、横軸の４セットの棒は左から右へそれぞれ(1) 神経突起の長さ範囲が０〜１０μｍの細胞、(2) 神経突起の長さ範囲が１１〜２５μｍの細胞、(3) 神経突起の長さ範囲が２５〜４０μｍの細胞、(4) 神経突起の長さ範囲が４０μｍ以上の細胞を表し、各棒セットは左から右へ(a) 対照培地, (b) NMDA, (c) NMDA およびHIP/PAP, および (d) HIP/PAP単独で得られた結果を示す。 '#"は対照と比べて有意であることを表し、"*"はNMDAと比べて有意であることを表す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明者は、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体が、神経細胞死、特に脳損傷、例えば新生児脳損傷、小児脳損傷および成人脳損傷で生じる神経細胞死を予防できるということを見出した。
【００２３】
ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質はこれまで肝細胞のマイトジェン因子として知られていた。またＨＩＰ／ＰＡＰ (Reg IIIa) 遺伝子は炎症脳疾患のマウス実験モデルすなわち実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）でアップレギュレート（上方制御）されることが知られている。さらに、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質はマウスＥＡＥに対する予防効果を潜在的に有することも知られていた。これらの予備データから他の著者達は成人患者の多くの炎症または神経疾患、例えば多発性硬化症、視神経炎、視神経脊髄炎、副腎白質萎縮症、副腎脊髄神経障害、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症、炎症性腸疾患または敗血症下記の治療におけるReg III蛋白質の有益な効果を記載している(特許文献１参照)。
【特許文献１】米国特許出願第US 2005/0277593号明細書
【００２４】
ここで、ＥＡＥは多発性硬化症および急性散在性脳脊髄炎(ADEM)のような中枢神経系の炎症性脱髄性疾患に似た症状を呈する脳炎の動物モデルから成るということを思い出されたい。一般にＥＡＥはT-細胞性自己免疫疾患のプロトタイプでもある。さらに、ミエリンはグリア細胞の増殖から成り、Scwann細胞は末梢ニューロンにミエリンを供給する一方で、オリゴデンドロサイト、特に維管束内の型のものは中枢神経系の軸策を有髄化するということも思い出されたい。脱髄性疾患には基本的に多発性硬化症、急性散在性脳脊髄炎、横断性脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、ギラン・バレー症候群、橋中央ミエリン溶解、テイ・サックス病および遺伝性脱髄疾患、例えば、ロイコジストロフィーおよびシャルコー・マリー・ツース病が含まれる。しかし、敗血症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄損傷、炎症性腸疾患、アルツハイマー病、認知症、血管炎または虚血性傷害のような疾患は最初に脱髄によって引き起こされる疾患ではないことは言うに及ばない。従って、ＥＡＥ症状を阻害する物質によるこれら後者の疾患の予防または治療は当業者にとっては技術的信頼性がない。
【００２５】
さらに、ＨＩＰ／ＰＡＰ遺伝子のゲノム配列中の対立遺伝子多型と多発性硬化症の発生との間に相関があることが示されている(特許文献２参照)。
【特許文献２】国際特許出願第WO 2007/071437号公報
【００２６】
さらに、Regファミリーは、損傷ニューロンおよびグリア細胞の間のメディエータであろうこと、および、これらは神経再生中に潜在的に役割を果たすことが示されている（非特許文献３参照)
【非特許文献３】Namikawa et al., 2005, Biochem Biophys Res Commun, Vol. 332 (nー 1) : 126-134
【００２７】
本発明者は、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体が脳損傷時に神経保護作用を有するということ、そして、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体は初期の発達段階に生じた新生児脳損傷（従って、成人の発達した脳で起こる脳損傷とは全く異なる脳損傷）時に神経保護作用を有するということを見出した。
特に、ＨＩＰ／ＰＡＰは脳損傷の実験モデル、特に新生児脳損傷の実験モデルにおいてインビトロおよびインビボで神経保護作用を有するということがわかった。
【００２８】
本発明の対象は、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の、アポトーシスまたは細胞死からの神経細胞の保護での使用にある。
本発明の別の対象は、新生児、小児および成人の脳損傷の予防または治療でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用にある。
一般的には、本発明は胎児、新生児、小児および成人の外傷性脳損傷（ＴＢＩ）の予防または治療でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用に関するものである。
【００２９】
一般に、本明細書で、外傷、疾患および障害を含む病理学的状態の予防または治療でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用を明記した場合、それはＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の、その病理学的状態の予防または治療で使用に関連する本発明の観点も意味する。
一般に、本明細書で、外傷、疾患および障害を含む病理学的状態の予防または治療でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用を明記した場合、それはＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の、その病理学的状態の予防薬または治療剤の製造での使用に関連する本発明の観点も意味する。
【００３０】
一般に、本明細書で、外傷、疾患および障害を含む病理学的状態の予防または治療でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用を明記した場合、それはＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体を治療を必要とする患者に投与する段階を含む、その病理学的状態の予防または治療方法に関連する本発明の観点も意味する。
本明細書で外傷性脳損傷（traumatic brain injury）はグラスゴー・コーマ・スケール(GCS)に従って医学的に決定され、分類される。このスケールでは患者の意識レベルを話し方、運動および刺激に対する開眼反応に基づいて３〜１５の段階に類別する(非特許文献４参照)
【非特許文献４】Marion DW (1999). "introduction" in Marion DW. Traumatic Brain Injury. Stuttgart: Thieme
【００３１】
本発明の別の対象は、新生児脳損傷および成人または小児の脳損傷から成る群の中から選択される疾患、例えば脳低酸素症による成人または小児の脳損傷の予防または治療でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用にある。
従って、本発明は、新生児脳損傷および成人または小児の脳損傷から成る群の中から選択される疾患、例えば脳低酸素症による成人または小児脳損傷を予防または治療する薬剤の製造でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用に関係する。
【００３２】
本発明のさらに別の対象は、脳損傷、特に新生児脳の実験モデルにおける脳損傷の予防または治療方法にある。この方法は、治療を必要とする患者に適量のＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体を投与する段階を含む。
本発明はさらに、治療を必要とする患者に適量のＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体を投与する段階を含む、胎児、新生児、小児および成人の外傷性脳損傷（ＴＢＩ）の予防または治療方法を提供する。
【００３３】
本発明のさらに別の対象は、治療を必要とする患者に適量のＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体を投与する段階を含む、新生児脳損傷および成人または小児の脳損傷から成る群の中から選択される疾患、例えば脳低酸素症による成人または小児脳損傷の予防または治療方法にある。
【００３４】
本発明のさらに別の対象は、胎児、新生児、小児および成人の外傷性脳損傷（ＴＢＩ）の予防または治療でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用にある。
本発明はさらに、新生児脳損傷の予防または治療でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用にある。
本発明のさらに別の対象は、胎児、新生児、小児および成人の外傷性脳損傷（ＴＢＩ）の予防または治療薬の製造でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用にある。
【００３５】
従って、本発明は、新生児脳損傷の予防または治療薬の製造でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用にも関するものである。
本発明はさらに、治療を必要とする患者に適量のＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体を投与する段階を含む、新生児脳損傷の予防または治療方法にも関するものである。
【００３６】
本発明はさらに、新生児、小児および成人患者を含む小脳疾患または障害の予防または治療でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用に関する。
本発明はさらに、Ｇａｐ−４３の産生またはホスホリル化の欠陥を含む疾患の予防または治療でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用に関する。
【００３７】
本明細書に記載の予防または治療方法の大部分の実施例では、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体を一種以上の医薬上許容可能な賦形剤と組み合わせて医薬組成物が形成される。
医薬上許容可能な賦形剤は米国薬局方または欧州薬局方で合意またはこれに記載されたものから成るのが好ましい。
本発明は、新規な保護組成物を提供することによって、任意の脳損傷／外傷／変性からの神経を保護する新規な手掛かりを提供する。
【００３８】
「ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質(タンパク)」とは、配列番号１のアミノ酸配列を含む蛋白質を意味する。ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質の特定の実施例には、配列番号２および配列番号３から成る群の中から選択されるアミノ酸配列を含む蛋白質が含まれる。配列番号３のＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質は本発明の実施例で特に説明されるＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質から成る。これは「ＡＬＦ５７５５」ともよばれる。実施例で説明するように、配列番号３のＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質はE. coli中で組換えして産生できる。配列番号３のＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質は１２のアミノ酸のＮ−末端プロペプチド部分を含む。この部分はＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質の生物活性部分を放出するためにインビボで切断される。このＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質の生物活性部分は１３位置にあるイソロイシン残基から、配列番号３の１５０位置にあるアスパラギン酸残基に位置する。同様に、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質の生物活性部分は１２位置にあるトリプトファン残基から、配列番号２の１４９位置にあるアスパラギン酸残基に位置する。
【００３９】
ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質の任意の実施例およびその誘導体の任意の実施例は、組換え蛋白質、例えば細菌または動物細胞、例えば昆虫細胞および哺乳類細胞中で組換え産生した蛋白質から成るのが好ましい。
本発明者は、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質が興奮毒性脳病変を有する新生マウスモデルのニューロン死またはアポトーシスを有意に減らすことを示した。
【００４０】
本発明はさらに、以下で詳細に説明するように、ＨＩＰ／ＰＡＰの抗酸化力によってニューロンの異常の腫瘍因子である酸化ストレスに対する治療ツールを提供する。さらに、興味深いことに、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質の効果は、ＣＮＳに直接送達させるのではなく、末梢に投与したときでも認められる。さらに、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質の保護作用にはニューロン死の予防および神経可塑性の誘発が含まれる。
【００４１】
本発明はさらに、神経細胞の構造再構築または可塑性のモジュレーションでのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用に関する。
本発明の実施例で示すように、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質は、マウス神経一次培養でN-メチル-D-アスパラギン酸 (NMDA)-誘発神経細胞死をインビトロで予防する。さらに、本発明では、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質は一次マウス神経培養でN-メチル-D-アスパラギン酸 (NMDA)-誘発神経細胞死をインビトロで救出することがわかる。
さらに、本発明では、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質は、発育中のマウス脳におけるグルタミン酸作動性類似体イボテン酸によって引き起こされる興奮毒性病変をインビボで予防することがわかる。
【００４２】
さらに、実施例で示された結果から、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質は、発育中のマウス脳におけるグルタミン酸作動性類似体イボテン酸によって引き起こされる興奮毒性病変に対してインビボ救出効果を有することが明らかになった。さらに、本発明では、新生児脳損傷に対するＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質の予防および治療インビボ効果は、ＨＩＰ／ＰＡＰの多面的 (pleiotropic) 活性の結果、すなわち複数の神経救出病理学的経路におけるＨＩＰ／ＰＡＰの関与の結果であることがわかった。
【００４３】
新生児脳損傷の予防または治療におけるＨＩＰ／ＰＡＰの多面的活性の説明として、本発明では、ＨＩＰ／ＰＡＰは過酸化水素（H2O2）等の反応性酸素種によって誘発される新生児神経細胞死に対する神経保護作用があることもわかった。
新生児脳損傷の予防または治療におけるＨＩＰ／ＰＡＰの多面的活性のさらなる説明として、新生児脳障害のインビトロおよびインビボモデルにおいて、ＨＩＰ／ＰＡＰはGAP-43の産生、ホスホリル化および分布を変化させることもわかった。GAP-43は当技術分野で軸索成長および神経可塑性に関与するとして知られる蛋白質である。
【００４４】
特に、ＨＩＰ／ＰＡＰはGAP-43標識の神経突起の神経束分布を誘発する。
さらに、ＨＩＰ／ＰＡＰは、GAP-43アミノ酸配列の４１位置（Ｓ４１）にあるセリン残基でのGAP-43蛋白質のホスホリル化型の発現増加、すなわち、ホスホリル化GAP-43型の発現増加を誘発する。ＨＩＰ／ＰＡＰはGAP-43の全細胞量を減少させと同時にホスホ(S41)-GAP-43の増加を誘発する。
【００４５】
特定の理論に拘束されるものではないが、本発明者はGAP-43に対するＨＩＰ／ＰＡＰ生物学的効果は、脳低酸素症によって引き起こされる脳損傷の予防または治療、特に新生児脳損傷の予防または治療にとって重要であると考える。これに関連して、本発明者はGAP-43産生および代謝に対するＨＩＰ／ＰＡＰの効果はある種の神経細胞死またはアポトーシスの影響を緩和すると考える。
【００４６】
本発明の実施例では、ＨＩＰ／ＰＡＰの保護効果は、GAP43蛋白質を産生しない(GAP43 -/-)哺乳類において保持されるので、神経細胞死または神経細胞アポトーシスに対するＨＩＰ／ＰＡＰの保護効果は、ＧＡＰ４３に対するＨＩＰ／ＰＡＰの作用によって強制的には媒介されないことがわかった。
【００４７】
さらに、本発明の実施例では、GAP43を産生しない(GAP43 -/-)哺乳類においても、ＨＩＰ／ＰＡＰは神経可塑性を誘発または増加させることがわかる。
本発明の実施例で示すように、この神経可塑性増加はＨＩＰ／ＰＡＰによって引き起こされ、ＨＩＰ／ＰＡＰが神経突起の数の増加を発生させ、且つ、高複雑度を有する神経突起を発生させる（一次、二次および三次神経突起の存在および枝分かれ部位の数の増加を有する神経突起の存在）。本発明の実施例では、ＨＩＰ／ＰＡＰによる神経可塑性の増加はさらに、ＨＩＰ／ＰＡＰが神経突起成長に対するＮＭＤＡのような毒物の有害効果を逆転する能力によっても説明される。
【００４８】
本明細書では、「脳の可塑性」とほぼ同じ意味で使われる「神経可塑性(neuoplasticity)」とは、成熟期に脳の構造および機能を変化させる脳の能力を意味し、学習障害、環境性障害または病理、例えば外傷性事象、例えば頭蓋内損傷ともよばれる外傷性脳損傷（ＴＢＩ）がある。
【００４９】
ＨＩＰ／ＰＡＰによる神経可塑性の増加は、脳への血液供給の遮断を引き起こす有害事象、例えば外傷性脳損傷および脳卒中を受けた患者の治療で特に有用である。実際には、虚血性傷害後に大脳皮質においておよび皮質下構造において生じる可塑性現象はシナプス、細胞およびネットワークレベルで十分に立証されている。先行研究から、神経可塑性が脳卒中生存者において虚血脳後の神経リハビリテーション中に、重要な役割を果たすことがわかっている。
【００５０】
上記実験結果は、神経成長または神経可塑性のモジュレーション、促進または改善でのインビトロとインビボの両方でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質の有用性を支持している。神経成長または神経可塑性の上記のモジュレーションまたは改善はGap-43によって媒介され場合とGap-43によって媒介されない場合かある。
【００５１】
さらに、本発明の実施例では、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質は、マウス小脳顆粒細胞の一次培地中でインビトロ興奮毒性誘発細胞死と酸化的再防止の両方を防止する。これらの結果は、小脳症状、例えば脊髄小脳失調の予防および治療でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質の有用性を支持する。
【００５２】
これらの実験結果はさらに、複数の神経細胞タイプ、特に皮質および小脳に存在するものに対する、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質の神経保護的活性を支持する。
本発明で「脳低酸素症」は脳損傷が脳、特に神経細胞への酸素供給の減少によって引き起こされる状況および脳低酸素症が神経細胞死またはアポトーシスを引き起こす状況を含む。脳低酸素症は、脳組織内で血管が閉塞した時および／または酸素欠乏、特に仮死の任意のその他の原因が起きたときに発生すると考えられる。
【００５３】
本発明で「新生児脳損傷」は、胎児の脳に生じる任意の損傷（胎児脳損傷ともよばれる）、早産新生児、満期および過期新生児を含む。小児は１歳以下である。従って、新生児脳損傷は、分娩の直前および直後に発生する慣習的に「周産期」脳損傷とよばれるもの、および、周産期中から生後４週に至るまでに発生する慣習的に新生児脳損傷とよばれるものを含む。新生児脳損傷は、脳卒中、出産時外傷、代謝異常または遺伝性疾患、てんかん重積症および、低酸素症および虚血（ＨＩ）を生じる種々の仮死事象を含む。
【００５４】
ＨＩは早産児において脳室周囲白質損傷に至ることが多い一方で、満期産児は皮質／皮質下病変を発症する。一般に、当技術分野では、新生児脳損傷は生後３日間の間に昏睡から過剰興奮性に、昏迷に、進化する特異型の脳障害に基づいて認識されることが認められている。新生児脳損傷の利用可能な診断方法のレビューはFerrieroの非特許文献５に記載されている。当業者は下記文献を参照されたい。この特許の内容は全て本明細書に含まれる。
【非特許文献５】Ferriero, 204, New England Journal of Medicine, Vol. 351 (nー 19) : 1985-1995
【００５５】
胎児期の新生児脳損傷は（ｉ）動脈低酸素分圧によって誘発された低循環による低酸素虚血性障害または（ｉｉ）神経虚血に至る後続の脳低かん流を有する心筋機能障害に至る重症低酸素血症によって引き起こされる。
【００５６】
新生児脳損傷は、通常胎盤機能不全の結果である胎児低酸素血症を含む。
新生児脳損傷はさらに、周産期低酸素血症を含む。これは、一般に呼吸不全または心不全のいずれかによって単独でまたは併発して生じる出生後低酸素血症である。
新生児脳損傷は胎児虚血を含む。
新生児脳損傷は周産期虚血を含み、これは出生後虚血であり、この出生後虚血は重症心収縮機能障害に起因しうる。この障害は脳低かん流および脳血管調節の低下に至る。循環不全は重症出生前または出生後の出血または新生児敗血症から生じうる。
新生児脳損傷はさらに、脳循環の自己調節が損なわれて低酸素血症が誘発される受動圧脳循環に起因する損傷を含む。
【００５７】
新生児脳損傷はさらに、溝深度に影響し且つ降圧発作に対する感受性増加を発生させる低かん流による新生児低酸素症を含む。
実際には、新生児損傷は、新生児脳低酸素症時の興奮性神経伝達物質の過剰放出を含む。
本発明では、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体は、新生児脳損傷の予防または治療に使用できる。この際、低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）の分類に用いられる従来のSarnatの評点式に従って１〜３の段階で類別する。
【００５８】
Sarnat評点式のステージ１は、過剰覚醒および交感神経活性化、刺激に対する過剰反応、正常な緊張性を有する弱い吸引、および、脳電図(EEG)所見を特徴とする早期症候群の所見に依存する。このステージが続くのは２４時間以下で、ステージ１にとどまる患者は正常な神経学的転帰を有する。
【００５９】
Sarnat評点式のステージ２に進行する患者は、軽度低血圧を有し、昏睡状態または鈍麻状態であり（例えば、感覚刺激に対する遅延反応および不完全応答）、臨床的発作、縮瞳（薄暗い所でも）を有する副交感神経活性化、心拍数の減少( <120 拍／分)、蠕動増加、および、大量の分泌物を有する。早い時期に、EEGは比較的低電位振幅(遅いシータおよびデルタ範囲では<25 μV）を示す。
【００６０】
二日目に、ＥＥＧは覚醒時または鈍麻（睡眠中に悪化する）時のバーストパターン、中枢優位または側頭優位を有する多発性、低周波(1-〜1.5-Hz)ＥＥＧ発作を示す。ＥＥＧが５日以内に回復する場合は、再び完全に正常に戻る。回復に５日以上かかる場合は、低振幅緩徐化が認められる。ステージ２は２〜１４日間続く。５日以内の臨床的およびＥＥＧの回復は良好な予後と関連している。周期的ＥＥＧは、インターバースト間隔が完全に平坦な場合、または、バースト周波数が６秒おき以下で、バーストパターン（３〜６秒おき）が７日以上続いた場合に、不良な予後を示しうる。
【００６１】
Sarnat評点式のステージ３は、強い刺激のみへの応答、離脱または除脳姿勢を有する昏迷、重症低血圧（例えば弛緩）および深部腱反射、原始（例えばモロー、緊張性頸、吸引）反射、および、脳幹（例えば角膜、眼球頭、咽頭）反射の抑制を特徴とする。ステージ３の臨床的発作はステージ２よりも頻度が減る。患者は全身性交感神経または副交感神経自律神経機能障害を有し、この際、異常呼吸および光に対してあまり反応しない瞳孔縮小または中間位瞳孔を有する。ＥＥＧは、振幅の増加およびバースト周波数の減少（６〜１２秒おき）を有する周期パターンの深刻化を示す。事態がさらに悪化すると、超低電位または平坦ＥＥＧに至る。
【００６２】
本発明で「小児」脳損傷、特に小児外傷性脳損傷は、１才〜１２才未満のヒトに生じる脳損傷、特に外傷性脳損傷を含むまたはこれらから成る。
本発明で「成人」脳損傷、特に成人外傷性脳損傷は、１２才以上の年齢から死亡年齢までのヒトに生じる脳損傷、特に外傷性脳損傷を含むまたはこれらから成る。
本発明でＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質の「誘導体」は配列番号１〜３から成る群の中から選択されるポリペプチドと少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００６３】
本明細書で用いる「含む／含んでいる」およびその文法的類似表現は明示された特徴、整数、ステップまたは成分またはこれらの群の存在を特定するものであるが、一つ以上の他の特徴、整数、ステップまたは成分またはその群の存在または追加を除外するものではない。
ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質誘導体は、配列番号１〜３のポリペプチドから成る群の中から選択されるポリペプチドと少なくとも９０％、好ましくは91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質を含む。
【００６４】
本発明の一つの実施例では、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質誘導体は、配列番号１〜３から成る群の中から選択されるＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質と強いアミノ酸同一性を有し且つ対照のＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質と比べてアミノ酸残基の一つ以上の付加、置換または欠失を有する蛋白質を含む。この実施例では、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質誘導体は対照のＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質のアミノ酸配列と比べてアミノ酸残基の1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20以上の付加、置換または欠失を含むことができる。これらの実施例ではＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質は対照のＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質のアミノ酸配列と比べて、アミノ酸残基の２５以下の付加、置換または欠失を有することができる。
本発明ではＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質誘導体は生物学的に活性である。本発明ではＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質誘導体はＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質の生物学的活性部分を含む。
【００６５】
ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質の「生物学的活性」誘導体は下記の生物学的活性を一つ以上の有するＨＩＰ／ＰＡＰ由来ペプチドを含む：
(i) マウス神経一次培養物、特にマウス皮質神経細胞一次培養物およびマウス小脳顆粒細胞一次培養物でN-メチル-D-アスパラギン酸 (NMDA)-誘発神経細胞死をインビトロで予防する、
(ii)発育中の脳、例えば、発育中のマウス脳でグルタミン酸作動性類似体イボテン酸によって引き起こされる興奮毒性病変をインビボで予防する。
(iii)発育中の脳、例えば、発育中のマウス脳でグルタミン酸作動性類似体イボテン酸によって引き起こされる興奮毒性病変に対してインビボ救出効果を有する。
(iv) 過酸化水素（H2O2）のような反応性酸素種によって誘発される新生児神経細胞死に対する神経保護作用がある。
(v) 一次マウス小脳顆粒細胞に対するH2O2-誘発損傷をインビトロで予防する。 
(vi) GAP-43の産生、ホスホリル化および分布の変化を誘発する。
【００６６】
上記の(i)〜(v)の中から選択される生物学的活性を有するＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質の「生物学的活性」誘導体は、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質誘導体が上記の(i)〜(v)の一つまたは複数の生物学的活性を、本発明実施例で開示されるアッセイで用いた検出可能レベルで有する限り、必ずしも同じ桁(スケール)の生物学的活性を有する必要はない。
本発明の実施例では、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその誘導体、例えば、上述のＨＩＰ／ＰＡＰの生物学的活性部分は、標準的な蛋白質精製技術を用いた適切な精製スキームによって、細胞または組織起源から単離できる。
本発明の他の実施例では、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその誘導体、例えば、上述のＨＩＰ／ＰＡＰの生物学的活性部分は、当業者に周知な組換えDNA技術によって産生できる。
【００６７】
本発明のさらなる実施例では、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその誘導体、例えば、上述のＨＩＰ／ＰＡＰの生物学的活性部分は、標準的なペプチド合成技術を用いて化学的に合成できる。
単離または精製ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその誘導体、例えば、上述のＨＩＰ／ＰＡＰの生物学的活性部分は、蛋白質が由来する細胞または組織起源からの細胞物質またはその他の汚染蛋白質を実質的に含まないか、あるいは、化学合成時に化学的前駆体を実質的に含まない。
ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質誘導体はＨＩＰ／ＰＡＰキメラ蛋白質または融合蛋白質をさらに含む。本発明では、キメラ蛋白質または融合蛋白質は、上述のポリペプチドを含み、このポリペプチドは非ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質に融合される。融合蛋白質内では、ＨＩＰ／ＰＡＰポリペプチドおよび非ＨＩＰ／ＰＡＰポリペプチドが互いに対して融合する。非ＨＩＰ／ＰＡＰポリペプチドはＨＩＰ／ＰＡＰポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合できる。
例えば、本発明の一つの実施例では、融合蛋白質は、ＨＩＰ／ＰＡＰ配列がGST配列のＣ末端に融合されたGST-HIP/PAP 融合蛋白質である。このような融合蛋白質は組換えＨＩＰ／ＰＡＰの精製を促進できる。
【００６８】
いずれの場合も、本発明の融合蛋白質は、本明細書のこの表現の先の定義に従って「生物学的活性」である。これは、融合蛋白質が、配列番号３のＨＩＰ／ＰＡＰと同じ生物学的活性を有することを意味する。
２つのアミノ酸配列の同一性のパーセントを決定する時には配列を整列させ、最適比較する。例えば、最適整列に対して第１および第２アミノ酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較では非相同配列を無視できる。
【００６９】
最適比較ではCLUSTAL W (バージョン 1.82)で下記パラメータを用いて２つのアミノ酸配列の同一性のパーセントを決定できる:(1) CPU MODE = ClustalW mp; (2) ALIGNMENT = ≪full≫; (3) OUTPUT FORMAT = ≪aln w/numbers≫; (4) OUTPUT ORDER = ≪aligned≫; (5) COLOR ALIGNMENT = ≪no≫; (6) KTUP (word size) = ≪default≫; (7) WINDOW LENGTH = ≪default≫; (8) SCORE TYPE = ≪percent≫; (9) TOPDIAG = ≪default≫; (10) PAIRGAP = ≪default≫； (11) PHYLOGENETIC TREE/TREE  TYPE = ≪none≫; (12) MATRIX = ≪default≫; (13) GAP OPEN = ≪default≫;  (14) END GAPS = ≪default≫;  (15) GAP EXTENSION = ≪default≫;  (16) GAP DISTANCES = ≪default≫; (17) TREE TYPE = ≪cladogram≫ et (18) TREE GRAP DISTANCES = ≪hide≫
【００７０】
ＨＩＰ／ＰＡＰの生物学的活性部分は、配列番号１〜３のいずれか一つのＨＩＰ／ＰＡＰの完全長アミノ酸配列に十分に相同のアミノ酸配列を含むペプチドを含む。これは対応する完全長ＨＩＰ／ＰＡＰと同じ数のアミノ酸を含み、ＨＩＰ／ＰＡＰと少なくとも同じ生物学的活性を示す。
ＨＩＰ／ＰＡＰの生物学的活性部分はさらに、配列番号１〜３のいずれか一つのＨＩＰ／ＰＡＰの完全長アミノ酸配列に十分に相同のアミノ酸配列を含むペプチドを含む。これは対応する完全長ＨＩＰ／ＰＡＰより多い数のアミノ酸を含み、ＨＩＰ／ＰＡＰと少なくとも同じ生物学的活性を示す。
哺乳類中に存在するＨＩＰ／ＰＡＰ配列の生物学的活性部分の自然発生対立遺伝子多型に加えて、当業者はさらに、配列番号１〜３のいずれか一つのヌクレオチド配列への突然変異によって変化を導入でき、それによって、ＨＩＰ／ＰＡＰの生物学的活性を変更せずに、ＨＩＰ／ＰＡＰのアミノ酸配列を変化させることができるということは理解できよう。
【００７１】
非必須アミノ酸の置換をＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質に対応する配列中で行うこともできる。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を変更せずに、ＨＩＰ／ＰＡＰの野生型配列から変更できるアミノ酸残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は生物学的活性に必要なアミノ酸残基である。
一般に、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質誘導体は、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはそのＨＩＰ／ＰＡＰ生物学的活性部分を含む物質を含む。
これらのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質誘導体の所定の実施例では、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはそのＨＩＰ／ＰＡＰ生物学的活性部分を組合せ、または、これらをその非ＨＩＰ／ＰＡＰ部分と非共有結合によって結合させることができる。本発明の具体例は、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはそのＨＩＰ／ＰＡＰ生物学的活性部分を含むリポソームを含み、ここで、その非ＨＩＰ／ＰＡＰ部分はリポソーム粒子自体から成る。
【００７２】
所定リポソームの種類に応じて、あるいは、このリポソームの製造に用いる方法に応じて、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその生物学的活性部分はリポソーム表面（例えばリポソーム外部環境に曝される）に位置付けでき、あるいは、その中に封入できる。
これらのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質誘導体の実施例では、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはそのＨＩＰ／ＰＡＰ生物学的活性部分を組合せ、または、これらをその非ＨＩＰ／ＰＡＰ部分と非共有結合によって結合させることができる。具体的には、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはそのＨＩＰ／ＰＡＰ生物学的活性部分を、蛋白質から選択される非ＨＩＰ／ＰＡＰ部分または非蛋白質化合物、例えばポリエチレングリコール分子と共有結合できる。最終ＨＩＰ／ＰＡＰ誘導体はペグＨＩＰ／ＰＡＰまたはそのペグ生物学的活性部分から成る。
【００７３】
ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質がこれを患者に投与したときに生物学的活性になる限り、治療を必要とする患者に投与する前の状態で、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質誘導体の蛋白質誘導体は「生物学的活性」でなくてもよい。さらに、治療を必要とする患者に投与する前の状態で、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質誘導体の蛋白質誘導体が予め「生物学的活性」であってもよい。
一般に、脳損傷の予防または治療、その他のＨＩＰ／ＰＡＰ用途に用いる場合、本発明に開示された任意のＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の有効量を一種以上の生理学的に許容可能な賦形剤と組み合わせて医薬組成物中に入れる。
【００７４】
特定の理論に拘束されるものではないが、本発明者は配列番号２の配列の完全ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質、すなわち、ＣＲＤ配列を含むポリペプチドおよびプロペプチドは、この蛋白質を最もよく折りたたむと考えられる。特に、この蛋白質をコードする発現カセットでトランスフェクトされた真核生物細胞におけるＤＮＡ組換え技術によってこの蛋白質を産生した時にそうである。治療的活性ＨＩＰ／ＰＡＰが正確に折りたたむことで、低酸素症に起因する脳損傷の予防または治療での上記蛋白質を含む医薬組成物の生物学的効率を蛋白質の一部のみを含む組成物に比べて改善できる。
【００７５】
しかし、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質の他の型、例えば配列番号１および２のポリペプチド型や本明細書に記載のＨＩＰ／ＰＡＰ誘導体のいずれか一つは、これらのポリペプチドが必ずしも本発明の最も好ましい実施例から成るとは限らない場合でも、インビトロおよびインビボで使用できる。
既に述べたように、本発明は特に、成人または小児脳損傷、例えば脳低酸素症に起因するものの予防または治療での、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用に関する。従って、本発明の一つの対象は、脳低酸素症に起因する成人脳損傷の予防または治療でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用にある。
【００７６】
より一般的な観点から、本発明は脳低酸素症に起因する脳損傷の治療方法におけるＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質の使用に関する。特定の理論に拘束されるものではないが、本明細書に開示されたインビトロおよびインビボ新生児脳損傷に対するＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質の種々の効果は、脳卒中から成る群から選択される成人または小児脳の極めて特異的な病理学的−生理学的状況にも有用であると本発明者は考える。
【００７７】
本発明の所定の実施例では、上記成人または小児の脳損傷は、脳卒中 (strole)ともよばれる脳血管障害から成る。脳血管障害または脳卒中は、脳へ血液を供給する血管の障害による脳機能の急速な低下から成る。脳血管障害は下記(i)および(ii)を含む：(i)血栓症または塞栓症に起因する虚血, これは「虚血性脳卒中」ともよばれる、(ii)出血による虚血、これは「出血性脳卒中」ともよばれる。新生児脳損傷のように、脳血管障害または脳卒中は恒久的神経学的障害を引き起こすことがあり、且つ、死に至ることがある。世界保健機関によれば、脳血管障害または脳卒中は脳血管原因の神経学的欠損から成る。この欠損は２４時間を超えて持続するか、あるいは、２４時間以内に死によって中断される。
【００７８】
脳血管障害または脳卒中は、血栓性脳卒中または塞栓性脳卒中、心機能障害に起因する虚血、全身性低かん流、静脈血栓症および脳内出血を含む。
外傷性脳損傷は一般に、脳出血、血腫または浮腫で生じる脳酸素流の障害を引き起こす。
本発明の別の対象は、成人または小児の外傷性脳損傷の予防または治療での、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用にある。
成人または小児の脳外傷性損傷が低酸素症に起因する脳損傷に属する場合もある。
【００７９】
外傷性脳損傷（ＴＢＩ）は、身体的外傷が脳を損傷したときに生じ、一般に、損傷に伴う意識消失、記憶喪失と、神経学的スケールのスコアの程度に応じて軽度、中程度または重症に分類される。外傷性脳損傷の診断およびスケーリングは慣習的に、グラスゴー・コーマ・スケール(GCS) (非特許文献６)、外傷後健忘(PTA)の持続時間測定法および意識消失スケーリング法(LOC)、(非特許文献７)から成る群から選択される方法で行われる。
【非特許文献６】Arlinghaus et al., 2005, Textbook of Traumatic Brain Injury, Washington, DC : American Psychiatric Association, pp; 59-62
【非特許文献７】Rao et al., 2000, Psychosomatics, Vol. 41 (nー2) : 95-103
【００８０】
GCSが13またはそれ以上のＴＢＩは軽度で、9〜12のGCSは中程度で、８またはそれ以下のGCSは重症であることは、一般に認められている。具体的には、13〜15のGCSスコアは、外傷後記憶喪失（ＰＴＡ）の持続時間が２４時間以下であり且つ意識消失（ＬＯＣ）の持続時間が０〜３０分である患者で測定される。さらに具体的には、９〜１２のＧＣＳスコアは、外傷後記憶喪失（ＰＴＡ）の持続時間が１〜７日であり且つ意識消失（ＬＯＣ）の持続時間が３０分〜２４時間である患者で測定される。さらに具体的には、３〜８のＧＣＳスコアは、外傷後記憶喪失（ＰＴＡ）の持続時間が７日を超え且つ意識消失（ＬＯＣ）の持続時間が２４時間を超える患者で測定される。
【００８１】
外傷性脳損傷と新生児脳損傷との間の生理学的類似性の中で、ＴＢＩは血管破裂による出血を伴い、低酸素症を引き起こす。
本発明では、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体は、３〜１５のＧＣＳ分類スコアを有する外傷性脳損傷の予防または治療で使用できる。
従って、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体は、"軽度"ＴＢＩ(GSCスコア13〜15),中程度ＴＢＩ (GCSスコア9〜12) および重症ＴＢＩ (GSCスコア3〜8)から成る群の中から選択される外傷性脳損傷の予防または治療で使用できる。典型的に、軽度ＴＢＩのＧＣＳスコアは１３〜１５であり、ＰＴＡスコアは１時間以下、ＬＯＣスコアは３０分以下である。典型的に、中程度のＴＢＩのＧＣＳスコアは９〜１２、ＰＴＡスコアは３０分〜２４時間で、ＬＯＣスコアは１〜２４時間である。典型的には、重症ＴＢＩはＧＣＳスコアが３〜８で、ＰＴＡスコアが一日以上で、ＬＯＣスコアが一日以上である。
【００８２】
本発明では、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質は、治療される患者で測定されたＧＣＳスコアにかかわりなく、通常のＴＢＩの治療方法において、治療上有用となると考える。
直接外傷性小脳損傷の治療を含む、ＴＢＩ治療でのＨＩＰ／ＰＡＰの治療上有用性は、前頭または側頭ＴＢＩに比べてはるかに知られていない。しかし、小脳は、初期損傷がこの構造に直接関与しないときでも、影響を受けていることが多い。このような間接的損傷は複数の神経学的障害、例えば、姿勢の不安定、振戦、平衡、微細運動技能における障害および認知障害を誘発しうる。たとえ、テント上外傷で生じる間接的小脳損傷の原因が完全にはわかっていなくても、複数の研究によって、小脳への損傷の伝達における興奮毒性の関与（神経伝達物質グルタミン酸の過剰放出）が示唆されている(非特許文献８)。
【非特許文献８】Potts et al., Cerebellum, 2009, (8), 211-221
【００８３】
特定の理論に拘束されるものではないが、本発明者は、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその誘導体は、小脳細胞を興奮毒性から保護することによって、小児または成人患者のＴＢＩで生じる間接的小脳損傷から小脳ニューロンを保護できると考える。
従って、本発明の別の対象は、ＴＢＩで生じる間接的外傷性小脳損傷の予防または治療でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその誘導体の使用にある。
本発明では、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質をＴＢＩ患者に、慢性期に投与することもできるが、急性期に投与すべきであると考える。
本発明では、ＴＢＩは局所性 (focal) またはびまん性 (diffuse) ＴＢＩを含む。びまん性ＴＢＩは浮腫およびびまん性軸索損傷を含み、これは、白質路を含む軸索および皮質への突出までの広範囲にわたる損傷である。びまん性ＴＢＩはさらに、震盪およびびまん性軸策損傷、白質路および大脳半球を含む領域における軸策までの広範囲損傷を含む。
【００８４】
局所性ＴＢＩの場合、オンペネトタリング(on-penetrating) ＴＢＩにおける局所性病変を有する最も一般的な領域は、眼窩前頭皮質および前側頭葉であり、これらは社会的行動、情動表出の制御、嗅覚および意思決定に関与する領域から成る。局所性損傷の一つの型である大脳の裂傷は脳組織が切断または断裂したときに起こる。
外傷性脳損傷は、前頭ＴＢＩ、側頭ＴＢＩは、直接小脳ＴＢＩおよび間接小脳ＴＢＩを含むが、これらに限定されるものではない。
既に述べたように、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその誘導体は、興奮毒性および酸化的死からインビトロ小脳ニューロンを保護できる。
特定の理論に拘束されるものではないが、本発明者は、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその誘導体は、種々の小脳障害、例えば小脳性運動失調において起こる死から小脳ニューロンを保護できると考える。
このような疾患では、小脳運動失調も認められる。
従って、本発明の別の対象は、小脳運動失調の治療または予防でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその誘導体の使用にある。
【００８５】
本発明では、小脳運動失調とは小脳の機能障害を意味する。小脳運動失調は種々の基本神経学的欠損、例えばアンタゴニスト低圧、アシナジー、測定障害、時間測定障害および拮抗運動反復不全を引き起こしうる。
小脳運動失調は、遺伝性脊髄小脳失調および後天性小脳運動失調を含む。
本発明の他の対象は、遺伝性脊髄小脳失調の治療でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその誘導体の使用にある。
遺伝性脊髄小脳失調は、常染色優性脊髄小脳失調(SCA)および常染色体劣性脊髄小脳失調を含むが、これらに限定されるものではない。
常染色優性脊髄小脳失調の例は下記を含む： SCA1 (常染色優性型1), SCA2, SCA3, SCA4, SCA6, SCA7, SCA8, SCA9, SCA10, SCA11, SCA12, SCA13, 一過性運動失調型1 (EA-1) および一過性運動失調型2 (EA-2)。
常染色体劣性脊髄小脳失調はフリードライヒ失調症、毛細血管拡張性運動失調症、および、乳児発症型脊髄小脳失調を含むが、これらに限定されるものではない。
【００８６】
本発明の他の対象は、後天性脊髄小脳失調の治療および予防でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその誘導体の使用にある。
後天性脊髄小脳失調は、腫瘍随伴症候群、中毒誘発小脳運動失調、感染性運動失調および血管性小脳運動失調を含むが、これらに限定されるものではない。
中毒誘発小脳運動失調は、毒物、例えば溶剤、ガソリンおよび重金属への暴露、生成物、例えばアルコール、バルビツール酸塩またはリチウムおよび細胞傷害性化学療法薬の摂取によって引き起こされることがある。
感染性運動失調は、ウイルス、細菌またはプリオン感染に起因する運動失調を含む。
ウイルス感染性小脳運動失調は例えばウイルス脳症およびウイルス感染後脳症で生じることがある。
細菌感染性小脳運動失調は、髄膜血管性梅毒またはライム病で生じる運動失調を含むが、これらに限定されるものではない。
【００８７】
血管性運動失調は、虚血性脳卒中に起因する運動失調、例えば小脳梗塞、出血または硬膜下血腫を含むが、これらに限定されるものではない。
「脳損傷 (brain injury)」とは、脳損傷が新生児脳損傷、小児脳損傷または成人脳損傷から成るかどうかにかかわらず、初期原因が神経細胞の脱髄である脳損傷は含まない。
換言すれば、「脳損傷」は、脱髄疾患の種類にかかわらず、脱髄疾患、例えば自己免疫疾患または遺伝性疾患によって脳に生じる損傷を含まない。従って、本発明で意図されるように、「脳損傷」は、下記から成る群の中から選択される疾患に起因する脳損傷を含まない：多発性硬化症、急性散在性脳脊髄炎、横断性脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、ギラン・バレー症候群、橋中央ミエリン溶解、テイ・サックス病、および、遺伝性脱髄疾患、例えば、ロイコジストロフィーおよびシャルコー・マリー・ツース病。
「大脳白質萎縮症」は下記を含む：副腎白質萎縮症(WHO分類番号E71.3), 副腎脊髄ニューロパシー(WHO分類番号E71.3), 異染性白質ジストロフィー(WHO分類番号E75.2), クラッベ病(WHO 分類番号E75.2), ペリツェウス・メルツバッハー病(WHO分類番号E75.2), カナバン病、中枢性低髄鞘形成を有する小児期運動失調 (CACH), 白質の消失を伴う白質脳症、アレキサンダー病, レフサム病 (WHO分類番号G60.1), ツェルヴェーガー病, エカルディ‐グティエール症候群, 巨大脳白質ジストロフィーおよび脳腱黄色腫症。
【００８８】
既に述べたように、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその誘導体は、本発明で証明したGap-43産生またはホスホリル化に対してＨＩＰ／ＰＡＰ活性を有するので、神経細胞成長関連タンパク質であるGap-43によって媒介される神経細胞成長または可塑性のモジュレーション、促進または改善にも使用できる。
従って、本発明はさらに、Ｇａｐ−４３の産生の欠陥または失調またはＧａｐ−４３のホスホリル化の欠陥または失調を含む障害または疾患、例えばアルツハイマー病の予防または治療でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用にも関する。
【００８９】
ＨＩＰ／ＰＡＰ関連蛋白質がアルツハイマー病に作用するのに有用であろうということは当業者間で言われていたが、その主張を技術的に支持する出発点となる実験結果は全くされていなかった。
それに対して、Gap-43蛋白質の産生またはホスホリル化に対するＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質の生物学的活性はアルツハイマー病の予防または治療での上記ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質の有用性を初めて支持した。
アルツハイマー病において、Gap-43蛋白質の産生またはホスホリル化の欠陥が生じることは当業者には周知である。特に、当技術分野では、不活性Gap-43蛋白質の産生はアルツハイマー病患者に関与することがわかっている。さらに、Gap-43のホスホリル化変化はアルツハイマー病患者において当技術分野で既に示されている。
従って、本発明はさらに、アルツハイマー病の予防または治療でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその誘導体の使用に関する。
【００９０】
本発明はさらに、治療を必要とする患者への、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその誘導体の投与ステップを含むアルツハイマー病の予防または治療方法に関する。本発明はさらに、アルツハイマー病自体の発生に先行する病理学的状態、例えば軽度認識障害の予防または治療でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用に関する。
従って、本発明はさらに、アルツハイマー病自体の前に発生する軽度認識障害の予防または治療でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の使用に関する。
本発明実施例では、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質がインビトロで神経細胞を救出する能力を有することが示されているので、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその誘導体はさらに、培養神経細胞の生存度または成長を維持または改善する薬剤として有用であることがわかった。そして、本発明実施例の結果は、神経細胞培地において加えることができる神経細胞培養剤としてのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその誘導体の有用性を支持する。
本発明はさらに、神経細胞のインビトロ培養、例えば神経細胞の初代培養および神経細胞株の培養でのＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質の使用を含む。
【００９１】
本発明はさらに、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその誘導体を含む神経細胞用培地に関する。ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその誘導体の存在以外にも、適切な培地の定性的および定量的構成は当業者によって容易に測定される。具体的には、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその誘導体を、神経細胞に適した周知な培地、例えばRPMI 199培地に単純に付加できる。
この培地は、有効量のＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその誘導体を含む。上記培地中のＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその誘導体の最終濃度は好ましくは1 ng/mL 〜10 mg/mlである。
本発明では、インビボ用途に関して、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体は好ましくは医薬組成物中の活性成分として含まれる。
【００９２】
この医薬組成物はＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその誘導体と、一種以上の医薬上許容可能な賦形剤とを含む。
医薬組成物は有効量のＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体を含む。
一般に、本発明で使用可能な医薬組成物は、医薬組成物の全重量に対して０．１重量％〜９９．９重量％のＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体を含む。従って、本発明の医薬組成物は医薬組成物の全重量に対して少なくとも0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%（重量％）以上のＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体を含むことができる。さらに、本発明の医薬組成物は医薬組成物の全重量に対して最大で10% 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%（重量％）以下の医薬上許容可能な賦形剤を含むことができる。
【００９３】
ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の治療上有効量は、治療すべき病理学的状態（予防を含む）、投与方法、治療に用いる化合物の型、任意の併用療法、患者の年齢、体重、全身状態、病歴等のような要因に応じて変わり、その決定は開業医の技術の範囲内で十分であることは理解できよう。従って、医師は投与量をタイターし、最大治療効果が得られるように投与経路を変更する必要がある。臨床医はＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体を、問題となる症状の治療に所望の効果が得られる投与量に達するまで投与する。
治療すべき症状とは、本出願に記載の病理学的状態、例えば、低酸素症による新生児脳損傷、低酸素症による成人または小児の脳損傷、例えば脳卒中、ＴＢＩおよび小脳疾患の一つを意味する。
【００９４】
「患者」とは、新生児患者、小児患者または成人患者を意味し、後者は妊娠中の患者を含む。
本発明では特に、有効量のＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体は、新生児脳損傷時に脳に生じる物理的損傷を少なくとも部分的に逆転できるＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその誘導体の量から成る。特に、有効量のＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体は、新生児脳損傷時に発生する神経細胞死を減らすまたはブロックするＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその誘導体の量から成る。
本発明実施例で示された結果から始めると、有効量のＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体は、体重1kg当たり約0.1 μg〜約100 mgの範囲にすることができる。従って、本発明の有効量のＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体は、患者の体重1kg当たりで少なくとも1 μg/kg, 2 μg/kg, 3 μg/kg, 4 μg/kg, 5 μg/kg, 6 μg/kg, 7 μg/kg, 8 μg/kg, 9 μg/kg, 10 μg/kg, 15 μg/kg, 20 μg/kg, 20, μg/kg, 30 μg/kg, 40 μg/kg, 50 μg/kg, 60 μg/kg, 70 μg/kg, 80 μg/kg, 90 μg/kg, 100 μg/kg, 200 μg/kg, 300 μg/kg, 400 μg/kg, 500 μg/kg, 600 μg/kg, 700 μg/kg, 800 μg/kg, 900 μg/kg, 1 mg/kg以上の量を含む。
【００９５】
新生児損傷の場合の「患者」とは、胎児を含む新生児患者および妊娠患者を意味する。
胎児の体に対する新生児脳損傷を予防または治療するために、本発明の医薬組成物は好ましくは妊娠中の成人の体に投与する。しかし、ある実施例では、医薬組成物を、特殊な内視鏡検査医療機器を用いて、胎児の体に直接投与することもできる。
【００９６】
分娩時または分娩後の新生児の新生児脳損傷の予防または治療、および、成人の脳損傷の予防または治療には、本発明の医薬組成物をそれぞれ新生児の体または成人の体に投与する。
本発明の医薬組成物を全身投与することもできる。
本発明の医薬組成物を、頭蓋内経路を介して、特に頭蓋骨の形成が終了していない胎児の体または新生児の体に局所投与することもできる。
ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の投与経路は、例えば静脈内、筋肉内、大脳内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、経口、局所、吸入経路による注射または点滴による、あるいは、以下で説明する徐放性製剤による周知な方法に従う。
ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体あるいはこれを含む医薬組成物を単一回で投与することもできる。
【００９７】
他の実施例では、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体あるいはこれを含む医薬組成物を、例えば、脳損傷診断時からまたは脳損傷見込み診断時から、投与された体が危険な状態を脱する時間まで、決定された時間間隔で複数の用量として投与する。
本発明の医薬組成物の実施例では、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体は、脳低酸素症に起因する脳損傷の予防または治療に有用な一種以上のその他の活性成分、例えば、新生児脳損傷の予防または治療に有用であると当技術分野で知られている一種以上の活性成分と組み合わせることができる。
【００９８】
本発明の治療組成物は、適切な純度を有する所望の分子と、任意成分の医薬上許容可能なキャリヤ、賦形剤または安定剤(非特許文献９)とを混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形で貯蔵用に調製できる。
【非特許文献９】Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. (1980)
【００９９】
許容可能なキャリヤ、賦形剤または安定剤は、用いられる用量および濃度では、レシピエントに対して非毒性であり、下記のものを含む：緩衝液、例えば燐酸、クエン酸、およびその他の有機酸；抗酸化物、例えば、アスコルビン酸およびメチオニン；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０以下の残基）ポリペプチド；蛋白質；例えば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン；単糖類、二糖類、および、その他の炭水化物、例えばグルコース、マンノース、または、デキストリン；キレート化剤、例えばEDTA；糖類、例えばショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩類形成対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ蛋白質複合体）；および／または非イオン性界面活性剤、例えばTWEEN（商標） PLURONICS（商標）またはポリエチレングリコール(PEG)。
【０１００】
キャリヤの追加の例は下記を含む：イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清蛋白質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えば燐酸、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、または、電解質、例えば硫酸プロタミン、燐酸1水素2ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、および、ポリエチレングリコール。局所またはゲルベースの形の本発明のＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその誘導体の物質のためのキャリヤは下記を含む：多糖類、例えばカルボキシメチルセルロースまたはメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよびウッドワックスアルコール。いずれの投与においても、通常のデポー型を用いるのが適している。このような型には、例えば、マイクロカプセル、ナノカプセル、リポソーム、プラスター、吸入型、鼻用スプレー、舌下錠および徐放性製剤がある。ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体は、一般に、このようなビヒクル中に、約0.1 mg/ml〜100 mg/mlの濃度で、配合される。
【０１０１】
インビボ投与で用いられるＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体は無菌でなければならない。これは、凍結乾燥および再構成の前または後の無菌濾過膜による濾過によって容易に達成される。ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体は、全身投与の場合、通常、凍結乾燥の形または溶液状態で貯蔵される。凍結乾燥の形では、HPI/PAP蛋白質またはその蛋白質誘導体は、通常、使用の瞬間に適切な希釈剤で再構成するためのその他の成分と組み合わせて配合される。ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の液剤の一例は、皮下注射用一回投与バイアルに充填された無菌で、清澄で、無色新鮮な溶液である。反復使用に適した保存医薬組成物は例えば、主としてポリペプチドの指標および型に応じて、下記(a)〜(f)を含むことができる：
(a) ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体、
(b) ｐＨを溶液中のポリペプチドまたはその他の分子の最大安定性の範囲、好ましくは約４〜８に維持できる緩衝液、
(c) 撹拌誘発凝集に対してポリペプチドまたは分子を主に安定化する洗浄剤／界面活性剤、
(d) 等張剤、
(e) フェノール、ベンジルアルコール、および、ハロゲン化、例えば塩化ベンゼトニウムの群の中から選択される防腐剤、
(f) 水。
【０１０２】
非イオン性面活性剤の場合には例えばポリソルベート（例えばPolysorbate(登録商標), Tween(登録商標) 20,80等）またはポロキサマ（例えばPoloxamer(登録商標) 188）にすることができる。非イオン性界面活性剤の使用によって、ポリペプチドの変性を引き起こさずに、製剤を剪断面ストレスに暴露できる。さらに、このような界面活性剤を含む製剤は、エアロゾル装置、例えば肺投薬で使用される装置および無針噴射注射銃において使用できる（特許文献３）。
【特許文献３】欧州特許第２５７，９５６号公報
【０１０３】
等張剤は、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の液体組成物の等張性を保証するために存在させることができ、多価糖アルコール、好ましくは多価または高級糖アルコール、例えばグリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールを含む。これらの糖アルコールは単独でまたは組み合わせて使用できる。または、塩化ナトリウムまたはその他の適切な無機塩は溶液を等張にするのに使用できる。緩衝液は、所望のｐＨに応じて、例えば酢酸、クエン酸、コハク酸または燐酸緩衝液にすることができる。本発明の液剤の一つの型のｐＨは約４〜８、好ましくはほぼ生理的ｐＨの範囲内で緩衝される。
防腐剤フェノール、ベンジルアルコールおよびハロゲン化例えば塩化ベンゼトニウムは使用可能な周知な抗菌剤である。
ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の組成物は一般に、無菌点検口を有する容器、例えば静脈注射用溶液袋または皮下注射用注射針で穿孔可能な栓を有するバイアルに入れられる。製剤は、反復静脈内(i.v.)、皮下(s.c.)または筋肉内(i.m.)注射としてまたは、鼻腔内または肺内送達（肺内送達に関しては上記特許文献３参照）に適したエアロゾル製剤として投与するのが好ましい。
【０１０４】
ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体はさらに、徐放性製剤の形で投与できる。徐放性製剤の適切な例は、蛋白質を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、このマトリックスは造形品、例えばフィルム、またはマイクロカプセルの形にできる。徐放性マトリックスの例は下記を含む：ポリエステル、ヒドロゲル〔例えば2-ヒドロキシエチル-メタクリレート（非特許文献１０および非特許文献１１) またはポリ（ビニルアルコール）〕、ポリラクチド（特許文献4、特許文献5）、L-グルタミン酸およびガンマエチル-L-グルタメートのコポリマー（非特許文献１２）、非分解性エチレン酢酸ビニル(上記非特許文献１０)、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばLupron Depot（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドとから成る注射可能な小球体）およびポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸 (特許文献６)。
【非特許文献１０】Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981)
【非特許文献１１】Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)
【特許文献４】米国特許第３，７７３，９１９号明細書
【特許文献５】欧州特許第５８，４８１号公報
【非特許文献１２】Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556 (1983)
【特許文献６】欧州特許第１３３，９８８号公報
【０１０５】
ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸が１００日以上にわたって分子を放出でき、ある種のヒドロゲルはより短い時間の間に蛋白質を放出する。封入蛋白質が体内に長時間残存するとき、これらは３７℃で水分に暴露された結果として変性または凝集し、生物学的活性を失い、場合によっては、免疫原性が変化することもある。関与するメカニズムに応じて蛋白質を安定化するために、合理的な戦術を考案できる。例えば、凝集メカニズムはチオ−ジスルフィド交換によって分子間Ｓ−Ｓ結合を形成することが発見されれば、スルフヒドリル残基の変更、酸性溶液からの凍結乾燥、含水率の調節、適切な添加剤の使用、および、特異的ポリマーマトリックス組成物の開発によって安定化することができる。
【０１０６】
徐放性ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体はさらに、リポソーム封入ポリペプチドを含む。問題となっているポリペプチドを含むリポソームはそれ自体周知な方法、すなわち下記文献によって調製される。
【特許文献７】ドイツ国第DE 3,218,121号公報
【非特許文献１３】Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985)
【非特許文献１４】Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034 (1980)
【特許文献８】欧州特許第EP 52,322号公報
【特許文献９】欧州特許第EP 36,676号公報
【特許文献１０】欧州特許第EP 88,046号公報
【特許文献１１】欧州特許第EP 143,949号公報
【特許文献１２】欧州特許第EP 142,641号公報
【特許文献１３】日本国特許出願第83-118008号公報
【特許文献１４】米国特許第4,485,045号明細書
【特許文献１５】米国特許第4,544,545号明細書
【特許文献１６】欧州特許第102,324号公報
【０１０７】
通常、リポソームは小さい（約２００〜８００オングストローム）単層型であり、脂質含量は約３０モル％コレステロール以上であり、選択された比率は最適な治療に応じて調整される。
【０１０８】
ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体の治療上有効量は、治療すべき病理学的状態（予防を含む）、投与方法、治療に用いる化合物の型、任意の併用療法、患者の年齢、体重、全身状態、病歴等のような要因に応じて変わり、その決定は医師の技術範囲内で十分であることは理解できよう。従って、医師は投与量をタイターし、最大治療効果が得られるように投与経路を変更する必要がある。臨床医はＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体を、問題となっている症状の治療に所望の効果が得られる投与量に達するまで投与する。
【０１０９】
投与経路は、例えば静脈内、筋肉内、大脳内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、眼球内、関節内、滑液嚢内、くも膜下腔内、経口、局所、吸入経路による注射または点滴による、あるいは、以下で説明する徐放性製剤による周知な方法に従う。ＨＩＰ／ＰＡＰまたはその蛋白質誘導体はさらに、病巣内または病変部近傍経路によって適切に投与され、局所および全身治療効果を発揮する。塩類を形成し且つ本明細書で有用な薬理学的に許容可能な塩類の例としては、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えばカルシウム塩、カリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えばカルシウム塩、マグネシウム塩）、アンモニウム塩、有機塩基塩（例えばピリジン塩、トリエチルアミン塩）、無機酸塩（例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩）および有機酸の塩類（例えば酢酸塩、シュウ酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩）がある。
【０１１０】
ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体はさらに、調製されたマイクロカプセルに、例えば下記の方法：コアセルベーション法または界面重合、例えばヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルによって、それぞれ、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルションにおいて封入できる。このような技術は上記非特許文献９に開示されている。
【０１１１】
徐放性製剤を調製できる。徐放性製剤の適切な例は、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質またはその蛋白質誘導体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、このマトリックスは造形品、例えばフィルム、またはマイクロカプセルの形をしている。徐放性マトリックスの例は下記を含む：ポリエステル、ヒドロゲル〔例えばポリ（2-ヒドロキシエチル-メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール）〕、ポリラクチド（上記特許文献４）、L-グルタミン酸およびｙエチル-L-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばLupron Depot（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドとから成る注射可能な小球体）およびポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸。
ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸が１００日以上にわたって分子を放出できる一方で、ある種のヒドロゲルはより短い時間の間に蛋白質を放出する。封入蛋白質が体内に長時間残存するとき、これらは３７℃で水分に暴露された結果として変性または凝集し、生物学的活性ｙを失い、場合によっては、免疫原性が変化することもある。関与するメカニズムに応じて蛋白質を安定化するために、合理的な戦術を考案できる。これらの戦術はスルフヒドリル残基の変更、酸性溶液からの凍結乾燥、含水率の調節、適切な添加剤の使用、および、特異的ポリマーマトリックス組成物の開発によって達成できる。
以下、実施例を参照して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明が下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１１２】
組換えヒトＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質をE. coli細菌系中で産生し、精製した。得られた産物をALF-5755とよぶ。配列番号３のALF-5755はＨＩＰ／ＰＡＰ配列番号２と比べて一つだけ多いアミノ酸、メチオニンをNH2末端基に有する。
【０１１３】
実施例１
新生児脳損傷のモデルにおけるＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質のインビトロ効果
Ａ．材料および方法
皮質ニューロン培養
一次皮質ニューロン培養をE14.5 胎児マウスから調製した。簡潔に言えば、子宮から胎児を取り出し、滅菌ペトリ皿に入れた。脳を切断し、１Ｍ HEPESのHBSS 1x (インビトロゲン社)に入れた。解剖顕微鏡を用いて、脳、髄膜、基底核および海馬をばらばらにし、新皮質をB27サプリメントを含むNeurobasal培地（インビトロゲン社）に入れた。次いで、新皮質を０．２５％トリプシン−０．０２％EDTAで解離し、DNase 1 (Sigma St-Quentin Fallavier, France)でインキュベートした。細胞を、ポリ−DL−オルニチン(Sigma St-Quentin Fallavier, France)で被覆された９６ウェルプレートで８００００細胞／ウェルの密度でMEM1Xおよび１０％ウマ血清を用いてプレーティングした。プレーティングしてから２〜４時間後に、培地を除去してNeurobasal ＋ B27で置換した。３日後、グリア増殖を抑えるために、細胞を5 μM のAraC (シトシンアラビノシド)で処理した。DIV10 とDIV12との間で、その他の産物のいずれかを用いてニューロンを８時間処理した。
(i): PBS;
(ii): 3μg/mlまたは5 μg/mlのALF-5755;
(iii): 300 μMのNMDA;
(iv): 300 μMのNMDA ＋10 μMのMK801または
(v): 300 μMのNMDAおよび3μg/mlまたは5 μg/ml of ALF-5755。
【０１１４】
細胞生存度の測定
細胞生存度はMTS/Formazanアッセイ(CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay; Promega, Charbonnieres, France)を用いてモニターした。
【０１１５】
ウェスタンブロット分析
処理した神経細胞培養（以下参照）およびP5実質器官注射でPBS、10 μgのイボテン酸塩、0.3 μgのALF-5755 (ALF-5755の最も効果的な濃度として決定された) または0.3 μgのALF-5755を有する10 μgのイボテン酸塩のいずれかを投与した仔マウスの右新皮質から全蛋白質を抽出した。投薬から4, 24, 48または120時間後に、仔マウスを犠牲にした。市販のキット(Cell Signaling Technology)の手順に従って蛋白質を抽出した。
Anti-Total-Gap43およびanti-Ser41-Phospho-Gap43を1/1000の濃度で用いた。サンプル間の蛋白質発現を標準化するために、anti -b-チューブリン（anti-b-tubulin） ヤギ抗体 (Santa Cruz Biotechnology)を1/10000の濃度で用いた。ウェスタンブロット実験を繰り返した。サンプル間の蛋白質濃度の差をイメージJ（Image J）を用いて推定した。
【０１１６】
免疫細胞化学
Total Gap-43、Phospho Gap-43および成長円錐(2G13)を検出するために、処理細胞培養を4% PFA中に固定し、ニワトリanti-Total-Gap-43抗体（Interchim; 1/200）、ウサギanti-Ser41- Phospho Gap43抗体 (Novus Biologicals 1/200), マウスanti-成長円錐2G13抗体(Novus Biologicals 1/200)と反応させた。ラベル化抗原の検出を、Cy3共役 ロバ抗ニワトリ抗体、AMCA-共役ロバ抗ウサギ抗体およびAlexa 488-共役ロバ抗マウス抗体 (Jackson Immunoresearch)で行った。
統計分析
各処理の効果を調べるために、データをクラスカル・ワリス検定で分析した。
【０１１７】
Ｂ．結果
組換えヒトＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質をE. coli細菌系中で産生し、精製した。得られた産物をALF-5755とよぶ。配列番号３のALF-5755はＨＩＰ／ＰＡＰ配列番号２と比べて一つだけ多いアミノ酸、メチオニンをNH2末端基に有する。
ALF-5755の生化学的、生物学的および機能的研究を行った。これらの研究によって、ALF-5755は、複数の種々の動物モデルにおいてＨＩＰ／ＰＡＰに関連することが既に証明されているものと同じ生物学的活性、特に分裂促進活性および抗アポトーシス活性を示すことが確証された。
N-メチル-D-アスパラギン酸 (NMDA)-誘発神経細胞死に対するインビトロでのALF-5755の神経保護効果は、一次マウス皮質神経培養において研究された。
ALF-5755インビトロ神経保護特性は、一次神経細胞培養（ＮＭＤＡに暴露されたE14スイスマウスの大脳半球からのニューロン）の良く確立されたモデルを用いて評価された。実験は、培養の開始から８日目〜１２日目に実施した。300 μMのNMDAまたは10, 30, 100 μM のH2O2による８時間中毒開始の直後または３時間後に、ＨＩＰ／ＰＡＰの用量(150 ng/ml〜10 μg/ml)を培地に添加した。次いで、細胞生存度をMTTアッセイで測定した。
【０１１８】
ＮＭＤＡ単独に暴露した後の神経細胞死（ALF-5755で処理していない）はニューロンの６０％であった。ALF-5755を用いた処理によって、神経細胞死の比率の有意な、用量依存的減少が引き起こされた。神経細胞死の減少は、損傷開始直後に添加されたときに、5 μg/mLのALF-5755で最大（ALF-5755で処理しない場合は45%であるのに対して35%の神経細胞死）であった。ALF-5755の神経保護効果は、損傷開始の３時間後に添加したときにも認められた。
【０１１９】
H2O2単独に対する暴露は、酸化的損傷による細胞生存の用量依存的減少を誘発する。これは100μM暴露で最大(64%の神経細胞死)である。ALF-5755による完全または部分的処理はH2O2の毒性を逆転する。この保護効果は3μg/mlのALF-5755で最大である。ALF-5755の保護効果はカタラーゼで認められる効果に匹敵する。ALF-5755の保護効果は、薬剤をH202の直後に添加しても、損傷の３時間後に添加しても認められる。ALF-5755は抗酸化特性を示す。軸策成長および神経可塑性に関与する蛋白質であるGAP-43の産生、セリン41 (S41)でのホスホリル化状態および分布に対するALF-5755の効果を測定するために、神経細胞培養の免疫細胞化学(ICC)研究およびウェスタンブロット(WB)分析を実施した。
【０１２０】
ＮＭＤＡ直後に添加したとき、ＩＣＣは、ALF-5755がGAP-43-ラベル化神経突起の神経束分布を誘発することを証明する。この効果は5μg/mlで最適であり、対照培養、ＮＭＤＡまたはH202処理培養、または、H202およびALF-5755処理培養では認められない。さらに、ＩＣＣはALF-5755が、対照培養またはNMDAまたはH2O2単独で処理した培養と比べて、神経突起中のホスホ-GAP-43の発現の増加を誘発することを示す。
【０１２１】
培養ニューロンからの抽出物のウェスタンブロット分析は、total GAP-43レベルおよびphospho-GAP-43レベルの変化を定量化できる。NMDAはGAP-43の量の有意な変化を全く誘発しない。対照的に、ALF-5755単独ではtotal GAP-43の用量依存的減少を誘発したが、ホスホリル化GAP-43の比率（phospho GAP-43 / total Gap-43）の有意な増加を誘発した。GAP-43に対するALF-5755の効果はＮＭＤＡに暴露される培養においてさらに顕著である。ALF-5755によって誘発されるGAP-43のホスホリル化状態のこれらの変化は、ALF-5755に暴露される培養に認められる束状化を説明する。要するに、これらのデータは、ALF-5755が興奮毒性および酸化的神経細胞死をインビトロで予防するという仮説を支持する。さらに、ALF-5755はGAP-43 ホスホリル化および束状化を含む可塑性様変化を誘発する。
【０１２２】
実施例２
新生児脳損傷のモデルにおけるＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質のインビボ効果
Ａ．材料および方法
動物
この試験では雌雄のスイスマウスを用いた。実験手順は施設内審査委員会に承認されており、'Institut National de la Sant饅och et de la Recherche Medicale'のガイドラインを満たしている。
薬剤
イボテン酸塩(Sigma, St-Quentin Fallavier, France)、ALF-5755, NMDA (Tocris, Bristol, UK)およびMK801 (Sigma, St-Quentin Fallavier, France)を燐酸緩衝生理食塩水(PBS)に希釈した。
興奮毒性剤の投与
既に述べたように発育中マウス脳にイボテン酸塩を投与して興奮毒性脳病変を誘発した(非特許文献１５〜２１)。
【非特許文献１５】Marret et al., 1995
【非特許文献１６】Gressens et al., 1997, 1998
【非特許文献１７】Bac et al., 1998
【非特許文献１８】Dommergues et al., 2000
【非特許文献１９】Tahraoui et al., 2001
【非特許文献２０】Laudenbach et al., 2001, 2002
【非特許文献２１】Husson et al., 2002
【０１２３】
簡潔に言えば、P5日に仔マウスに脳内（新外套実質中）投与した。実質器官内投与は目盛付きのマイクロディスペンサー上に装着された50 μlのハミルトン注射器で２５ゲージ針を用いて行った。右半球の前頭頭頂領域の頭皮の外側表面の２ｍｍ下と、外側−内側面の正中線から２ｍｍの所と、体軸方向面のブレグマの前方３ｍｍの所に針を挿入した。２つの1 μl用量のイボテン酸塩またはイボテン酸塩＋ALF-5755またはPBSを２０秒間隔で投与した。最初のボーラスは白質への局所投与に対応し、第２ボーラスは皮質投与である。10 μgのイボテン酸塩または10 μg イボテン酸塩＋ALF-5755 (範囲: 0.0015 μg-0.15 μg) またはPBSを各仔マウスに投与した。
一部の仔マウスには、イボテン酸塩投与の直後または３時間後に、種々の濃度（0.0015 μg〜1.5 μg）でALF-5755を腹腔内投与した。
【０１２４】
実験群
少なくとも２種類の同腹仔の仔マウスを各実験群で用い、２つ以上の連続した実験からデータを得た。
ALF-5755の投与方法（イボテン酸塩との同時実質内投与、イボテン酸塩投与直後の腹腔内投与またはイボテン酸塩投与の１〜５時間後）に応じて、３種類の群を構成した。
最初のP5仔マウス群に、イボテン酸塩およびPBS（ビヒクル対照）または0.003, 0.015, 0.03または0.3 μgのALF-5755を実質内投与した。
ALF-5755の実質内投与と腹腔内投与との比較を計画した実験の第２群では、P5仔マウスにイボテン酸塩をPBSと一緒に実質内投与し、次いで、複数の濃度(0.0015, 0.0075, 0.015, 0.075, 0.15, 0.75または1.5 μgのALF-5755)でALF-5755を腹腔内投与した。
【０１２５】
ALF-5755がイボテン酸病変を予防ではなく、修復できるかどうかを知るために、第３P5仔マウス群に、イボテン酸塩の実質内投与の３時間後に、0.75 or 1.5 μgのALF-5755を遅延腹腔内投与した。イボテン酸塩投与の１時間後または５時間後に、単一ALF-5755濃度を腹腔内で試験した(1.5 μg)。
【０１２６】
病変寸法の決定
各実験群で12匹の仔マウスを用いた。興奮毒性投与の１２０時間後に断頭によって仔マウスを犠牲にした。すぐに脳を４％ホルマリン中で少なくとも４日間固定した。パラフィンに包埋した後、２０μm厚さの冠状切片に切断した。切片を２つおきにクレシル・バイオレットで染色した。上記の研究（非特許文献１５; 非特許文献１６; 非特許文献２１）から、外側−内側における病変の最大寸法と、興奮毒性病変の前頭−後頭軸との優れた相関がわかっている。これによって、病変の最大前頭−後頭直径の正確で再現性のある決定が可能になり、この直径は病変が存在する切片の数に20 μmを乗じたものに等しい。
【０１２７】
Ｂ  結果
ALF-5755インビボの神経保護可能性を、脳性麻痺に関連した脳損傷に似た症状を有する新生児興奮毒性病変のマウスモデルによって評価した。
脳損傷はイボテン酸塩、ＮＭＤＡに作用するグルタミン酸作動性アゴニストおよび代謝型グルタミン酸受容体によって誘発した。生後(P)５日のマウス新皮質に投与したときに、イボテン酸塩は、新皮質層および大きい脳室周囲白質嚢腫において劇的な神経細胞損失を生じた。これは、多くのヒト早産新生児に現れる病変である、脳室周囲白質軟化症で見られるものに似ている。
ALF-5755はP5にイボテン酸塩と脳内同時投与するか、あるいは、イボテン酸塩直後または３時間後にALF-5755を腹腔内投与した。P10で脳病変の分析を行った。
【０１２８】
ALF-5755とイボテン酸塩の同時投与によって、150 ng ALF-5755の用量で、白質および皮質灰白質病変が(イボテン酸塩単独で処置した仔マウスに比べて)それぞれ37%および67%減少した。良い（大脳病変の寸法の５０％減少）神経保護は、ALF-5755の投与を、損傷の直後または３時間後に腹腔内で行ったときにも認められた。これによって、全身経路を介したALF-5755の単回投与の有効性が、たとえ遅延投与でも、確立される。これはさらに、脳内投与または末梢投与されたALF5755が、上記の神経学的疾患および関連疾患における治療効果を有することができることを示す。
インビトロデータをさらに確認すると、ウェスタンブロット分析から、ALF-5755は単独でまたはイボテン酸塩と組み合わせることによって、対照またはイボテン酸塩を単独で投与した動物と比べて、total GAP-43の有意な減少を誘発するが、ホスホリル化GAP-43の比率の有意で大きな増加を誘発することがわかった。
【０１２９】
実施例３
仔マウスの発育中小脳におけるＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質のインビボ発現および小脳損傷のモデルにおけるALF-5755蛋白質のインビトロ効果
Ａ．材料および方法
定量ＲＴ  ＰＣＲ
P0, P5-7およびP60スイスマウス小脳、P5 皮質、および成体子宮からのRNAをRNeasyミニキット(Quiagen)を用いて抽出した。６００ｎｇの全ＲＮＡを用いて逆転写を行い、ＨＩＰ／ＰＡＰおよびＨＰＲＴ cDNAを得た。次いで、HIP/PAPおよびHPRT 転写物の定量的ＰＣＲ（適切なプライマーを用いた９４℃での３０’’変性、５８℃での３０’’ハイブリッド形成、７２℃での３０’’重合の４５サイクル）をバイオラドシステムを用いて誘発した。
様々な年齢の仔マウス小脳におけるＨＩＰ／ＰＡＰ発現の定量化を、HPRT転写物に対するＨＩＰ／ＰＡＰを合理化して（関連バイオラドソフトウェア）行い、ＲＴ ＰＣＲをキャリブレートし、時間の間で、ＨＩＰ／ＰＡＰ発現のレベルを比較した。
【０１３０】
小脳顆粒ニューロン培養
顆粒細胞は小脳ニューロンの大部分を占める。一次顆粒ニューロン培養をP7仔マウスから調製した。簡潔に言えば、脳を解剖してHHGN (HBSS 1x および1 M HEPESおよび4.45%グルコール; Invitrogen)に入れた。アストロサイトによる広範な汚染を避けるために髄膜を除去した。単離後、小脳をHHGNで洗浄して小片にし、細胞を０．２５％のトリプシン−０．０２％EDTAで解離し、DNase 1 (Sigma St-Quentin Fallavier, France)でインキュベートした。細胞を、ポリ−L−オルニチン(Sigma)で被覆された２４ウェルプレートにおいて2200万細胞／ウェルの密度でMEM1Xおよび１０％ウマ血清を用いてプレーティングした。プレーティングしてから２４時間後に、グリア増殖を抑えるために、10 μMのAraC (シトシンアラビノシド)を培地に添加した。インビトロで７日後（DIV7）、１時間細胞を処理し、以下の誘発物質を用いて8, 16または24時間の次の回復期を可能にすることによって、神経死滅を誘発した：
(i): H2O2 0.01〜1 mM、酸化的ストレスを誘発し、次に細胞死を６０％にする。
(ii): 0.3〜3 mM NMDA、興奮毒性を誘発し、次に細胞死を約４０％にする。
いずれの症状においても、ALF-5755神経保護効果は、０．３ｍMのH2O2濃度の存在下でまたは1mMのNMDAの存在下で、5および10μg/mLで評価した。
【０１３１】
免疫細胞化学
GFAP (アストロサイト検出), NeuN (ニューロン検出), Zic1 (成熟顆粒細胞検出), MAP2 (ニューロン検出),および切断カスパーゼ3 (活性カスパーゼ3検出)染色では、処理細胞培養を4% PFA中に固定し、anti-GFAP (Dako, 1/500), anti-NeuN (Millipore, 1/100), anti-Zic1 (Abcam 1/100), anti-MAP2 (Abcam, 1/2000),およびanti-切断カスパーゼ 3 (Cell Signaling Technology, 1/100)抗体と反応させた。ラベル化抗原の検出を、実験に依存する種々の波長で蛍光を発する二次抗体、それぞれ、Cy3共役 ロバ抗マウス抗体(1/1000, Jackson Immunoresearch)、および、488-共役ロバ抗ウサギ抗体 (1/1000, Molecular Probes)で行った。次いで、核をDapi (1/1000)で対比染色した。
統計分析
統計分析はGraphpadソフトウェアで行った。
【０１３２】
Ｂ．結果
生後発育中のＨＩＰ／ＰＡＰ小脳発現：
今までに、生後発育中マウスの皮質および小脳におけるＨＩＰ／ＰＡＰ発現が使用明されたことは無い。ここではＨＩＰ／ＰＡＰが両領域において、P5で低いが匹敵するレベルで発現することを報告する。ＨＩＰ／ＰＡＰレベルは小脳内で時間の中で増加し、P5マウスと比較したときに成体では20倍の大きさに達する。その他の構造における発現は研究中である。
【０１３３】
H2O2 誘発細胞死に対するALF-5755保護効果の評価:
0.3mMの濃度でH2O2に１時間暴露し、続いて１６Hの回復時間を示し、約６１％の細胞死を誘発した。細胞H2O2暴露はカスパーゼ３の切断を誘発しなかったことが認められた。従って、H2O2誘発細胞は同様にカスパーゼ３経路から独立していた。
5または10 μg/mL μMのALF-5755を用いた処理は、切断カスパーゼ３レベルにも、AIF局所化にも影響しなかった。しかし、5または10 μg/mlのALF-5755に暴露された細胞は、対照細胞と比べて改善された形態を示す。ALF-5755によって処理された細胞は、進行した濃縮面が対照細胞よりも少ない。なぜなら、クロマチンの凝縮が対照細胞より大きくないからである。従って、この結果から、ALF5755蛋白質はH2O2-誘発細胞死から小脳顆粒細胞を保護できることがわかる。
【０１３４】
NMDA誘発細胞死に対するALF-5755保護効果の評価:
1mMの濃度のNMDAを1時間および１６時間の回復時間によって、約３４％の細胞死を誘発した。細胞NMDA暴露はカスパーゼ３の切断を誘発したことが認められた。従って、ＮＭＤＡ誘発細胞死はカスパーゼ経路の活性化によってシグナル伝達された。
5または10 μMのALF-5755を用いた処理によって、濃縮細胞の発生が有意に減少した。すなわち、対照サンプルでは、約８０％の細胞が濃縮面を示したのに対し、5μMまたは10 μMのALF-5755の存在下では濃縮細胞のパーセンテージは４０％を超えなかった。従って、ALF-5755はＮＭＤＡ誘発細胞死から顆粒細胞ニューロンを保護することが示された。
総合すれば、これらの結果は、ALF-5755は興奮毒性および酸化的死滅から小脳顆粒細胞を保護できることを強く示唆する。
【０１３５】
実施例４
皮質神経細胞のアポトーシスに対するＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質の保護効果
Ａ．材料および方法
Ａ．１．皮質培養
P0仔マウスを低体温によって犠牲にした。仔マウスの皮質をCMFタイロード液中で無菌的に解剖した。髄膜を除去し、組織を小片に細かく切り刻み、CMF-タイロード液中に回収した。これらをトリプシン-DNAseで処理し、次いで、同じ溶液中で粉砕して解離し、単細胞浮遊液を作り、顆粒化し、そして、15mM HEPES, L-グルタミン, ピロキシジン 塩酸塩 (Invitrogen, Carlsbad, CA), N2 サプリメント(Invitrogen), 10%ウシ胎児血清, 25mM KCl,およびペニシリン−ストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地-F-12 (DMEM-F-12)中で再懸濁した。
細胞を、ポリ−D-リジンで被覆されたLabtek容器(Nunc, Roskilde, DK)上に2ラ104 細胞/cm2の密度でプレーティングした。5% CO2中に37℃で24時間インキュベートした後、血清含有培地を除去した。次いで、細胞を無血清培地中で１２時間培養し、その後、NMDA (最終濃度0.3 mM) およびHIP (最終濃度18.3 ng)を用いた処理を開始した。処理はさらに24時間続け、その後、細胞を1X PBSで洗浄し、次いで、4% PFA中で固定した。
【０１３６】
Ａ．２．TUNELアッセイ
ロシュ社からTUNELキットを購入し、メーカの指示に従ってアッセイを行った。簡潔に言えば、細胞を０．０２％のトリトン−X中に３０分間透過化処理し、次いで、ターミナルヌクレオチジルトランスフェラーゼから成るラベリング混合物中およびラベル化ヌクレオチド混合物中に、加湿容器内で３７℃で１時間インキュベートした。培養中にTUNEL-陽性細胞の定量化を、２つのウェルそれぞれからの計１０のランダム野から、TUNEL-陽性細胞を数えることによって行った。
【０１３７】
Ｂ．結果
結果は［図１］にまとめてある。ここでは、皮質細胞アポトーシスのレベルを、TUNEL陽性細胞のパーセントを測定して評価する。
［図１］に示すように、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質は、単独で用いたときでも、皮質神経細胞の保護効果を発揮する（［図１］の一番右端の「ＨＩＰ」棒を参照）。これらの結果は、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質単独で、細胞のインビトロ培養のベースライン作用に対する保護効果を誘発することを意味する。
最も重要なことには、［図１］はＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質が、ＮＭＤＡによって誘発される皮質神経細胞アポトーシスに対して強い保護効果を発揮することを示すことである（「ＮＭＤＡ」棒を「ＮＭＤＡ＋ＨＩＰ」棒と比較）。
［図１］に示す結果は、野生型GAP 43遺伝子(GAP43 +/+)に対してホモ接合性であるマウスに由来する皮質細胞のインビトロ培養から得られた。
図示されていないが、(i) GAP43 +/- マウスまたは(ii) GAP43 -/- マウスに由来する皮質細胞のインビトロ培養を用いて、同じ結果が得られた。
後者の結果は、上記ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質の保護効果はGAP43蛋白質の存在を必要としなかったことを示唆する。
【０１３８】
実施例５
神経細胞の可塑性に対するＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質の効果
Ａ．材料および方法
Ａ．１．皮質培養
P0仔マウスを低体温化によって犠牲にした。仔マウスの皮質をCMFタイロード液中で無菌的に解剖した。髄膜を除去し、組織を小片に細かく切り刻み、CMF-タイロード液中に回収した。これらをトリプシン-DNAseで処理し、次いで、同じ溶液中で粉砕によって解離し、単細胞浮遊液を作り、顆粒化し、15mM HEPES, L-グルタミン, ピロキシジン 塩酸塩 (Invitrogen, Carlsbad, CA), N2 サプリメント(Invitrogen), 10%ウシ胎児血清, 25mM KCl,およびペニシリン−ストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地-F-12 (DMEM-F-12)中で再懸濁した。
細胞を、ポリ−D-リジンで被覆されたLabtek容器(Nunc, Roskilde, DK)上に2×104 細胞/cm2の密度でプレーティングした。5% CO2中に37℃で24時間インキュベートした後、血清含有培地を除去した。次いで、細胞を無血清培地中で１２時間培養し、その後、NMDA (最終濃度0.3 mM) およびHIP (最終濃度18.3 ng)を用いた処理を開始した。処理はさらに24時間続け、その後、細胞を1X PBSで洗浄し、次いで、4% PFA中で固定した。
【０１３９】
Ａ．２．顕微鏡観察
Axio Cam HRC CCDカメラを用いて、Zeiss Axioplan 2顕微鏡で画像を撮影し、Zeiss KS 400 3.0ソフトウェアを用いて分析した。画像は対比および輝度の微調整を必要とした。その他の画像変更は必要なかった。
Ａ．３．神経突起長さ分析
枝分かれ部位の数を調べる他に、一次、二次および三次神経突起の数を調べた。マーカーとしてベータIIIチューブリンを用いた（データは実施例には示していない）。画像をZeiss Axioplan IIで撮影した。神経突起長さはIM50ソフトウェアを用いて得た。
【０１４０】
Ｂ．結果
結果はそれぞれ［図２］〜［図６］に示してある。
［図２］〜［図５］の結果から、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質は単独で用いたときでも、神経可塑性の増加を発揮することがわかる。すなわち、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質は（ｉ）一次神経突起の数を増やし（［図２］）且つ二次および三次神経突起を有する細胞の数を増やす（それぞれ［図３］および［図４］参照）。
［図６］に示す結果から、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質は、ＮＭＤＡによって神経突起成長上に引き起こされる有害作用から神経細胞を保護する能力を有することがわかる。より具体的には、［図６］に示す結果から、ＨＩＰ／ＰＡＰは、ＮＭＤＡでインキュベートされた神経細胞に加えたときに、培地単独でインキュベートした対照神経細胞培養において測定される神経突起成長のレベルを回復することがわかる。
さらに、ＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質は、細胞毒性量のＮＭＤＡでインキュベートされた皮質神経細胞の神経可塑性を回復する能力を有することもわかる。
［図２］、［図５］および［図６］に示す結果は、野生型GAP 43遺伝子(GAP43 +/+)に対してホモ接合性であるマウスに由来する皮質細胞のインビトロ培養から得られた。
図示していないが、(i) GAP43 +/- マウスまたは(ii) GAP43 -/- マウスに由来する皮質細胞のインビトロ培養を用いて、同じ結果が得られた。
後者の結果は、上記神経可塑性に対するＨＩＰ／ＰＡＰ蛋白質の陽性作用はGAP43蛋白質の存在を必要としなかったことを示唆する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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