(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−４、ＩＬ−１０、及びＴＧＦ−βからなる群から選ばれる１つもしくは複数のサイトカインをコードする１つもしくは複数の核酸と、
ＡｐｏＥ−２、神経成長因子（ＮＧＦ）、及び脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）をコードする核酸からなる群から選ばれる１つもしくは複数の核酸と、を含み、
βアミロイド及びβアミロイド1-42を含まない、
筋肉内注射によって投与される、
アルツハイマー病を治療または改善するための組成物。
【請求項２】
ＩＬ−４、ＩＬ−１０、及びＴＧＦ−βからなる群から選択される２つ以上のポリペプチドをコードする核酸を含み、
さらにＮＧＦ、およびＡｐｏＥ−２からなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸を含む、
筋肉内注射によって投与される、
アルツハイマー病を治療または改善するための組成物。
【請求項３】
哺乳動物に投与される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記核酸が、複製開始点（ＯＲＩ）、プロモーター、およびマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含む環状ＤＮＡを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記核酸が、細胞性免疫応答エレメント遺伝子をコードする配列に転写可能に連結されたプロモーター／エンハンサーを含むプラスミドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記プロモーターが、真核細胞中での発現に適したものである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
トランスフェクション促進物質と共に投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記核酸がベクターである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ベクターがｐＶＡＸ１、ｐＵＭＣＶ、ｐＧＣｙ、およびｐＬｅｎｔｉｌｏｘ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰからなる群より選ばれる一つもしくは複数のベクターを含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
炎症を増大させる遺伝子の発現を阻害するまたは減衰させる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
その投与によって哺乳動物の脳におけるアミロイド斑蓄積を減少させる結果となる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本発明は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、２００７年２月６日に出願された特許出願第６０／９００，１３８号の優先権を主張するものである。
【０００２】
アルツハイマー病などの神経変性疾患の治療および／または予防のための組成物および方法が本明細書で提供される。ある態様では、その組成物および方法は、養子細胞療法およびＤＮＡ免疫感作に関する。
【背景技術】
【０００３】
神経炎症は、アルツハイマー病（ＡＤ）の症状と関連する（非特許文献１および非特許文献２）。神経炎症には、多くの活性化されたミクログリアおよびアストロサイトならびに大部分は後毛細血管細静脈に付着している少数のＴ細胞の蓄積が関与する（非特許文献３、非特許文献４、および非特許文献５）。ミクログリアもアストロサイトも、ＡＤの主要な病理学的特徴のうちの１つであるβ−アミロイドタンパク質（Ａβ）を生成することが示された。Ａβ自体は、多くの炎症性構成成分の活性化を引き起こす炎症誘導作用物質として作用することが示された。付随する生化学的変化には、炎症およびフリーラジカル攻撃に特徴的な多数の分子の出現またはアップレギュレートがある。特に重要なのは、補体タンパク質、急性期反応物質、および炎症性サイトカインである可能性がある。非ステロイド系抗炎症薬を服用する患者は、服用していない患者よりもＡＤの危険性が低い。これらの結果により、ＡＤのための抗炎症療法の探究への関心が増大した（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｃｈｅｎ，Ｋ．ら、２８１  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３６５１〜５９頁（２００６年）
【非特許文献２】Ｆｒｅｎｋｅｌ，Ｄ．ら、１１５  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ．２４２３〜３３頁（２００５年）
【非特許文献３】Ａｇａｄｊａｎｙａｎ，Ｍ．Ｇ．ら、１７４  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８０〜８６頁（２００５年）
【非特許文献４】Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｄ．ら、７  Ｇｌｉａ  ７５〜８３頁（１９９３年）
【非特許文献５】Ｆｉｌｌｉｔ，Ｈ．ら、１２９  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．３１８〜２０頁（１９９１年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
アルツハイマー病などの神経変性疾患は、炎症または免疫系によって媒介されると古典的には考えられていないが、ある場合には、免疫系は、変性プロセスで重要な役割を果たす。ＡＤを治療するための、体液性免疫応答を誘導するように設計された免疫療法のアプローチが以前に開発されている。それらの研究は、有益なおよび有害な効果をもたらしたヒト治験をもたらした。動物モデルでは、Ｔ細胞は、誘導されるＴ細胞応答のタイプに応じて有益なまたは不利益な効果を有する可能性があるが、細胞性免疫応答を誘導するように設計された免疫療法は、中枢神経系損傷で有利である可能性があることが示された。これらの研究は、神経変性疾患の免疫系ベースの療法を探索するための新しい手段を提供する。
【０００６】
適応免疫系は、２つのタイプの応答、細胞性および体液性（抗体）タイプの応答に広く分類することができる。細胞性応答の中で、炎症性プロセスの調節のメカニズムを理解する際に重大な役割を果たす免疫応答の３つの主要なタイプまたはクラス、たとえば、Ｔｈ２応答またはＴｈ３応答（たとえばＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、およびＴＧＦ−βを含む）と対照的なＴｈ１応答（たとえばＩＦＮ−γを含む）が同定されている。異なるクラスのＴ細胞応答は、アルツハイマー病のためのワクチン接種戦略を開発するのに重要な意味を有する。
【０００７】
アルツハイマー病などの神経変性疾患の治療および／または予防のための組成物および方法が本明細書で提供される。ある態様では、組成物および方法は、神経変性疾患を治療または改善するためのＤＮＡワクチンおよび養子細胞遺伝子治療に関する。ある特定の態様では、組成物および方法は、Ｔｈ２サイトカインまたはＴｈ３サイトカインなどの細胞性免疫応答エレメントをコードするＤＮＡワクチンに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一態様では、方法は、神経変性疾患を治療または改善するための方法が提供され、その方法は、細胞性免疫応答を誘導する組成物を投与するステップを含む。他の態様では、細胞性免疫応答エレメントを含む組成物を投与することにより細胞性免疫応答を誘導する組成物を投与することにより、神経変性疾患を治療または改善する方法が提供され、好ましくは、細胞性免疫応答エレメントは、タンパク質、ペプチド、核酸、またはポリヌクレオチドである。関連する態様では、神経変性疾患を治療または改善する方法であって、２つ以上の、３つ以上の、４つ以上の、５つ以上の、または６つ以上の細胞性免疫応答エレメントを投与するステップを含む方法もまた提供される。他の態様では、神経変性疾患の治療または予防のための組成物を製造するための方法であって、細胞性免疫応答エレメント遺伝子またはその断片をコードする配列に転写可能に連結されたプロモーター／エンハンサーを有するポリヌクレオチドまたはその断片を調製するステップを含み得る方法もまた提供される。関連する態様では、対象における細胞性免疫応答エレメントポリヌクレオチドまたはその断片の発現のための組成物を調製するための方法であって、細胞性免疫応答エレメント遺伝子またはその断片をコードする配列に転写可能に連結されたプロモーター／エンハンサーを有するポリヌクレオチドを調製するステップと、トランスフェクション促進物質をポリヌクレオチドと組み合わせるステップとを含む方法が提供される。哺乳動物、好ましくはヒトへの投与のための組成物および方法もまた提供される。他の態様では、組成物は、薬学的に許容できる担体および細胞性免疫応答エレメントポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含んでもよい。ある態様では、対象、好ましくはヒトへの投与のための医薬品を保持するのに適した容器、細胞性免疫応答エレメントポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、薬学的に許容できる担体、および容器に添付されたラベルまたは添付文書を含み得るキットが提供される。他の態様では、細胞性免疫応答エレメントポリペプチドまたはその断片と相同なポリペプチドを投与するための方法が提供される。
【０００９】
ある実施形態では、細胞性免疫応答エレメントを誘導する組成物が提供される。方法および組成物は、タンパク質、核酸、もしくはポリヌクレオチドを含んでもよく、好ましくは、ポリヌクレオチドおよび／もしくは核酸はＤＮＡもしくはＲＮＡであり、好ましくは、ポリヌクレオチドは環状ＤＮＡであり、好ましくは、ポリヌクレオチドはプラスミドであり、好ましくは、ポリヌクレオチドは細胞性免疫応答エレメント遺伝子をコードする配列に転写可能に連結されたプロモーター／エンハンサーを含み、好ましくは、ポリヌクレオチドは複製開始点（ＯＲＩ）を含み、好ましくは、ポリヌクレオチドはマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含み、好ましくは、プロモーターは真核細胞中での発現に適しており、いくつかの好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、ベクター、好ましくはウイルスベクターであり、他の好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドはＲＮＡであり、好ましくは、ポリヌクレオチドは二本鎖ＲＮＡであり、好ましくは、ポリヌクレオチドは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であり、または好ましくは、炎症を低減する１つを超える組成物は、同時に投与することができる。いくつかの実施形態では、単一の細胞性免疫応答エレメントは、単一のポリヌクレオチドまたはプラスミド上にあり、他の実施形態では、１つを超える細胞性免疫応答エレメントは、単一のポリヌクレオチドまたはプラスミド上にあってもよい。他の実施形態では、単一のポリヌクレオチドまたはプラスミドは、１つまたは複数の細胞性免疫応答エレメントを含み、神経変性疾患の影響を治療または改善することが知られている１つまたは複数のポリペプチドまたはその断片をさらに含む（つまり、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、β−アミロイド、β−アミロイドペプチド１−４２（β−アミロイド１-４２）、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）、またはＡｐｏＥ−２。
【００１０】
他の実施形態は、細胞性免疫応答エレメントのタンパク質、ペプチド、および／またはポリペプチドの投与に関する。他の実施形態では、細胞性免疫応答エレメントポリペプチドをコードする核酸および／またはポリヌクレオチドの投与の方法が提供される。細胞性免疫応答エレメントポリペプチドが、組成物を投与する対象中で発現するように、組成物を調製し投与することができる。組成物は、抗炎症性サイトカイン、サイトカインアゴニスト、または抗ＴＮＦ抗体などの免疫調節性遺伝子の発現系、送達系、およびコード配列を含んでもよい。好ましくは、前記方法および組成物の細胞性免疫応答エレメントは、炎症を低下させる遺伝子を増大させ、好ましくは、遺伝子発現の増大は、発現をアップレギュレートすることによるものであり、好ましくは、炎症を低下させる遺伝子はＴｈ２サイトカインであり、好ましくは、Ｔｈ２サイトカインは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、またはＴＧＦ−βであり、他の好ましい実施形態では、細胞性免疫応答エレメントを含む組成物は、炎症を増大させる遺伝子を阻害しまたは減衰させ、好ましくは、炎症を増大させる遺伝子はＴｈ１サイトカインであり、好ましくは、遺伝子発現の減衰は、発現をダウンレギュレーションすることによるものであり、好ましくは、Ｔｈ１サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、またはＴＮＦαである。いくつかの実施形態では、組成物は、発現を刺激し、または炎症を低下させる遺伝子を産生することによって調節に影響を与えるのに対して、他の実施形態では、組成物は、Ｔｈ１アンタゴニストなどの、刺激を増大させる遺伝子の発現を阻害することによって調節に影響を与える。
【００１１】
驚いたことに、実施例３および４に記載されるように、ＩＦＮ−γをコードするポリヌクレオチドの投与は、動物モデルで、アルツハイマー病の影響を治療しかつ予防することができることが示された。ＩＦＮ−γはＴｈ１サイトカインであるが、遺伝子ワクチンとしてのその投与は、神経変性疾患の影響を最小限にすることが示された。したがって、ＩＦＮ−γをコードするまたはＩＦＮ−γと相同なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物および方法は、対象、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおける、アルツハイマー病などの神経変性疾患を治療および／または改善するための方法として本明細書で提供される。
【００１２】
ある実施形態では、細胞性免疫応答エレメントは、自己抗原をコードする遺伝子もしくはタンパク質、自己免疫性の炎症を低減するサイトカイン、自己免疫性の炎症を増大させるサイトカインに対するアンタゴニスト、もしくはアネルギーを誘導する遺伝子またはその断片を含み、好ましくは、細胞性免疫応答エレメントは、インターロイキン（ＩＬ）−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、形質転換成長因子−ベータ（ＴＧＦ−β）、もしくはインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）またはその断片でありまたはそれと相同である。
【００１３】
好ましい実施形態では、細胞性免疫応答エレメントを、神経変性疾患の影響をさらに治療および／もしくは改善するポリペプチドまたはその断片をコードする核酸またはタンパク質と共にさらに投与し、好ましくは、ポリペプチドをコードするさらなる遺伝子またはタンパク質は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、β−アミロイド、β−アミロイドペプチド１−４２（β−アミロイド１-４２）、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）、またはＡｐｏＥ−２であるまたはそれと相同である。
【００１４】
他の好ましい実施形態では、細胞性免疫応答を誘導する組成物および方法は、養子細胞遺伝子治療による送達を含む。好ましくは、養子細胞療法に使用される細胞のタイプは、自己または非自己のものであり、好ましくは、養子細胞遺伝子治療に使用される細胞のタイプは、Ｔ細胞、抗原提示細胞、線維芽細胞、または幹細胞であり、好ましくは、養子細胞遺伝子治療に使用される細胞のタイプは、樹状細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）の細胞などの非自己幹細胞、または自己幹細胞である。
【００１５】
ある実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを、薬学的に許容できる担体と共に患者に投与する。ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、真核生物のプロモーターを含み、好ましくは、真核生物のプロモーターは、ヒトでの発現をもたらす。ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞性免疫応答エレメントをコードする配列に転写可能に連結されたプロモーター／エンハンサーと複合体を形成したプラスミドである。ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、ウイルスベクターである。ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、リポフェクション試薬と共に投与される。ある実施形態では、方法は、静脈内、鼻腔内、皮下、注射によるもの、吸入によるもの、および遺伝子銃によるものからなる群から選択される、本明細書で提供される組成物を投与するための１つまたは複数の方法を含んでもよい。
【００１６】
本明細書で提供される方法のある好ましい実施形態では、細胞性免疫応答エレメントポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドもしくはその断片を哺乳動物に投与し、より好ましくは、哺乳動物はヒトであり、好ましくは、細胞性免疫応答エレメント遺伝子をコードする配列を含むポリヌクレオチドもしくはその断片を、トランスフェクション促進物質と共に投与し、好ましくは、トランスフェクション促進物質は脂質を含み、好ましくは、薬学的に許容できる担体に入れてポリヌクレオチドを投与し、ある好ましい実施形態では、ウイルス性形質導入によってポリヌクレオチドを投与し、好ましくは、遺伝子銃によってポリヌクレオチドを投与し、好ましくは、吸入によってポリヌクレオチドを投与し、または好ましくは、注射もしくは好ましくは皮下注射もしくは好ましくは筋肉内注射によってポリヌクレオチドを投与する。
【００１７】
ある実施形態では、組成物は、細胞性免疫応答エレメントポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片を含み、好ましくは、組成物は、薬学的に許容できる担体を含み、好ましくは、組成物はトランスフェクション促進物質を含み、好ましくは、トランスフェクション促進物質は脂質を含み、好ましくは、組成物をアジュバントと共に投与し、好ましくは、組成物は哺乳動物への注射に適しており、好ましくは、哺乳動物はヒトであり、好ましくは、組成物は、哺乳動物による吸入に適しており、好ましくは、哺乳動物は、ヒトであり、好ましくは、組成物は、薬学的に許容できる担体中に封入され、好ましくは、薬学的に許容できる担体は、その中の内容物を示すラベルおよびポリヌクレオチドの投与に関する説明を有し、好ましくは、組成物は、添付文書を含み、好ましくは、添付文書は、組成物の内容物に関する説明を含み、より好ましくは、添付文書は、投薬情報に関する説明を含む。
【００１８】
本明細書に使用されるように、用語「抗原」は、個体がそれに対して免疫応答を生成することができる任意の組成物を広く指す。本明細書に使用されるような「抗原」は、免疫応答がそれに対して誘導される可能性がある、少なくとも１つの抗原決定基を含有する分子を広く指す。免疫応答は、細胞媒介性のものまたは体液性のものまたはその両方であってもよい。当技術分野で十分に知られているように、抗原は、自然界のタンパク質、自然界の炭水化物、自然界の脂質、自然界の核酸、またはこれらの生体分子の組み合わせであってもよい。たとえば、抗原は、ポリマーなどの非天然分子を含んでもよい。抗原は、自己抗原および他の動物によって産生された抗原または病原体からの抗原などの外来抗原を含む。病原体抗原は、細菌性、ウイルス性、菌類、原生動物などのものであってもよい。
【００１９】
本明細書に使用されるように、用語「自己(autologous)」は、対象から細胞を取り出すこと、細胞を変化させる可能性、または細胞を保存すること、および細胞を対象に再注入して戻すことに関して使用される。
【００２０】
本明細書に使用されるように、用語「コード領域」または「コード配列」は、通常の塩基対形成およびコドン使用頻度の関連性に従って、発現が所望される特定の遺伝子産物またはその断片をコードする核酸配列、その相補体、またはその部分を指す。コード配列は、ゲノムＤＮＡ中のエキソンまたは未成熟の一次ＲＮＡ転写産物を含み、これらは、細胞の生化学的機構によって相互に連結されて、成熟ｍＲＮＡを提供する。アンチセンス鎖は、そのような核酸の相補体であり、コード配列はそこから推定することができる。コード配列は、適切な長さの転写物が産生され、適切なリーディングフレーム中での翻訳をもたらして、機能的な所望される産物を産生するように、転写コントロールエレメントおよび翻訳開始コドンおよび翻訳終止コドンに対して配置される。
【００２１】
用語「相補体」、「相補的」、または「相補性」は、標準的なＷａｔｓｏｎ／Ｃｒｉｃｋ対形成の規則に従って、ポリヌクレオチド（つまり、オリゴヌクレオチドまたは標的核酸などのヌクレオチドの配列）に関して本明細書に使用される。一方の配列の５’端末が他方の３’端末と対形成する核酸配列の相補体は「逆平行に対合」している。たとえば、配列「５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’」は、配列「３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’」に相補的である。天然の核酸に一般に見つけられないある種のヌクレオチドが、本明細書に記載される核酸には含まれていてもよく、これらには、たとえば、イノシン、７−デアザグアニン、ロックド核酸（ＬＮＡ）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。相補体配列はまた、ＤＮＡ配列に相補的なＲＮＡの配列またはその相補体配列とすることもでき、ｃＤＮＡとすることもできる。相補性は、完全である必要はなく、安定性の二重鎖は、不適性塩基対、縮重塩基、または不適合塩基を含有していてもよい。核酸技術の当業者らは、たとえば、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成および配列、イオン強度、ならびに不適性塩基対の発生率を含む多くの変数を経験的に考えて、二重鎖の安定性を決定することができる。
【００２２】
相補性は、２本の核酸鎖のヌクレオチド塩基のうちのいくつかのみが塩基対形成の規則に従って適合している「部分的な」ものであってもよい。相補性は、２本の核酸鎖のヌクレオチド塩基のすべてが塩基対形成の規則に従って適合している「完全な」または「全体的な」ものであってもよい。相補性は、２本の核酸鎖のヌクレオチド塩基のどれも塩基対形成の規則に従って適合していないといったように、存在していなくてもよい。核酸鎖の間の相補性の程度は、核酸鎖の間のハイブリダイゼーションの効率および強度に対して著しい効果を有する。これは、増幅反応および核酸の間の結合性に依存する検出方法で特に重要である。いずれの用語も、個々のヌクレオチドに関して、とりわけポリヌクレオチドに関する文脈内で使用されてもよい。たとえば、オリゴヌクレオチド内の特定のヌクレオチドは、他の核酸鎖内のヌクレオチドに対するその相補性またはその欠如について、残りのオリゴヌクレオチドおよび核酸鎖の間の相補性と対照的にまたはそれと比較して言及されてもよい。
【００２３】
本明細書に使用されるように、用語「実質的に相補的」は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする２つの配列を指す。当業者は、実質的に相補的な配列がそれらの全長にわたってハイブリダイズする必要はないことを理解するであろう。特に、実質的に相補的な配列は、標的配列に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする、塩基の近接する配列に対して３’または５’に位置する、標的配列にハイブリダイズしない、塩基の近接する配列を含む。
【００２４】
本明細書に使用されるように、用語「樹状細胞」（ＤＣ）は、造血幹細胞に由来し得る抗原提示細胞（ＡＰＣ）を指す。ＤＣは、多くのリンパ組織および非リンパ組織ならびに末梢血および骨髄から得ることができる。ヒトのＣＤ３４＋細胞などの造血幹細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＣに人工的に分化させることができる。樹状細胞は、いくつかの方向に樹状細胞体から伸びる薄いシート（葉状仮足）を有する特徴的な形態を有する。いくつかの表現型の基準もまた特有であるが、樹状細胞の供給源に応じて変わり得る。これらは、高レベルのＭＨＣ分子ならびに共刺激分子（たとえばＢ７−１およびＢ７−２）を含み、顆粒球、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、およびＴ細胞に特異的なマーカーが欠如している。マウスでは、いくつかの（しかしすべてではない）樹状細胞は、３３Ｄ１（皮膚または胸腺髄質ではなく脾臓およびパイエル板からのＤＣ）、ＮＬＤＣ１４５（皮膚およびいくつかのリンパ器官のＴ依存領域中のＤＣ、ならびにＣＤ１１Ｃ（Ｃｄ１１ｃはまたマクロファージとも反応する）を発現する。樹状細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで一次Ｔ細胞応答を開始することができる。これらの応答は抗原特異的である。樹状細胞は、末梢血白血球、脾細胞、Ｂ細胞および単球と比較して、強い混合白血球反応（ＭＬＲ）を誘導する。
【００２５】
本明細書に使用されるように、用語「発現」は、コード配列によってコードされる産物の生物学的産生を指す。ほとんどの場合では、コード配列を含むＤＮＡ配列は、転写されて、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を形成する。メッセンジャーＲＮＡは、翻訳されて、生物学的活性を有するポリペプチド産物を形成する。しかしながら、いくつかの場合では、ＲＮＡ産物は、関連性のある活性を有している可能性があり、したがって、遺伝子産物と見なされる。発現は、イントロンを除去するためのスプライシングなどの、転写ＲＮＡ産物のさらなるプロセシングステップおよび／またはポリペプチド産物の翻訳後プロセシングを含んでもよい。
【００２６】
本明細書に使用されるように、免疫寛容に関する用語は、自己抗原に対する不応答性の獲得を指す。自己抗原および非自己抗原を識別するための能力は宿主の維持にとって不可欠である。免疫寛容は、さらに、Ｓｅｒｏｏｇｙ，Ｃ．Ｍ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、第７巻、９〜１３頁（２０００年）；Ｃｏｓｔａ，Ｇ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１６４巻、３５８１〜９０頁（２０００年）；および（Ｗｅｉｎｅｒ，Ｈ．Ｌ．ら、ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第７７８巻、ｘｉｉｉ〜ｘｖｉｉｉ頁（１９９６年）に記載される。
【００２７】
本明細書に使用されるように、用語「細胞性免疫応答エレメント」は、細胞性免疫応答を誘導する任意の分子を指す。好ましくは、細胞性免疫応答は、Ｔｈ２またはＴｈ３の応答である。好ましくは、分子は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドである。いくつかの細胞性免疫応答エレメントは、当技術分野で十分に知られており、ポリペプチドＩＬ−４（つまりＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ１３９８２；配列番号１２）およびＩＬ−１０（つまりＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ５７６２７；配列番号１４）を含むが、これらに限定されない、自己免疫性の炎症を低下させるポリペプチドをアップレギュレートするまたは産生することができる分子ならびにＩＬ−４およびＩＬ−１０（つまり配列番号１および３）をコードする核酸を含むが、これらに限定されない。細胞性免疫応答エレメントはまた、ポリペプチドＴＧＦ−β（つまりＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ６０３１６；配列番号１６）を含むが、これらに限定されない自己免疫性の炎症を増大させるポリペプチドおよびＴＧＦ−β（つまり配列番号５）をコードする核酸をダウンレギュレートするまたは阻害することができる。しかしながら、他の細胞性免疫応答エレメントは当技術分野で知られているものおよびまだ同定されていないものを含むことが理解される。好ましくは、細胞性免疫応答エレメントポリペプチドまたはその断片は、本明細書で提供される、つまり、配列番号１２〜２２のような細胞性免疫応答エレメントのアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有する。ある好ましい実施形態では、細胞性免疫応答エレメントの断片は、本明細書で提供される、つまり配列番号１２〜２２のような細胞性免疫応答エレメントと相同である少なくとも２５個のアミノ酸、より好ましくは、少なくとも５０個のアミノ酸、より好ましくは、少なくとも１５０個のアミノ酸、より好ましくは、少なくとも２００個のアミノ酸、より好ましくは、少なくとも２５０個のアミノ酸、より好ましくは、少なくとも３００個のアミノ酸、より好ましくは、少なくとも４００個のアミノ酸、より好ましくは、少なくとも５００個のアミノ酸、より好ましくは、少なくとも６００個のアミノ酸、より好ましくは、少なくとも７００個のアミノ酸、より好ましくは、少なくとも８００個のアミノ酸を有する。用語「相同性」は、本明細書でアミノ酸配列について言及するとき、アミノ酸が、少なくとも７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、より好ましくは９８％、または最も好ましくは１００％、知られているアミノ酸配列（たとえば配列番号１２〜２２）に同一であることを意味する。
【００２８】
本明細書に使用されるように、用語「リポフェクション試薬」は、リポソームという手段によって細胞の中に遺伝物質を組み込むために使用される物質を指す。リポフェクション試薬の例として、リポフェクチン、リポフェクタミン、陽イオン性脂質、および中性共脂質（ｃｏ−ｌｉｐｉｄ）を含む。
【００２９】
本明細書に使用されるように、用語「プラスミド」は、遺伝物質（つまり核酸）から構成される構成物を指す。それは、挿入されたコード配列が真核細胞中で転写することができるように配列された遺伝エレメントを含む。プラスミドは、ウイルス性の核酸からの配列を含んでもよいが、そのようなウイルス性の配列は、ウイルス粒子の中へのプラスミドの組み込みを引き起こさず、したがって、プラスミドは、非ウイルスベクターとなる。好ましくは、プラスミドは、閉じた環状の核酸である。好ましくは、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。好ましくは、プラスミドは、形質転換によって細胞の中に導入されてもよく、細胞中で自律的に複製することができる。
【００３０】
本明細書に使用されるように、用語「薬学的に許容できる」は、ヒトへの投与に適した組成物を指す。当業者らは、ヒトへの投与に適するものとするために、組成物は、ある種の基準を満たさなければならず、たとえば、組成物は、好ましくは、Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＬＰ）に準拠し、好ましくは、組成物は、Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＭＰ）に準拠し、より好ましくは、組成物は、米国のＦｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎによって述べられるものなどの政府の規制に準拠し、好ましくは、組成物は、２１  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§３０１〜３９２に準拠するといったことを理解する。
【００３１】
本明細書に使用されるような用語「複製起点」または「複製開始点」は、核酸配列を複製する目的でＤＮＡ合成が始まるヌクレオチド配列を指す。これは一般にＯＲＩ部位と称される。環状の細菌は、一般に、単一のＯＲＩ部位を有するのに対して、それぞれの真核生物の染色体上に多くのＯＲＩ部位がある場合がある。この用語は、本明細書に使用されるようにＤＮＡ複製の間の自律性のユニットとして挙動する遺伝エレメントを指すレプリコンを含む。細菌では、染色体は、単一のレプリコンとして機能するが、真核生物の染色体は、連続した何百ものレプリコンを含有する。
【００３２】
用語「転写ユニット」または「発現カセット」は、転写の開始および終了を誘導する配列エレメントと共に少なくとも１つのコード配列を含有するヌクレオチド配列を指す。しかしながら、転写ユニットは、転写後プロセスまたは翻訳後プロセスに関与する配列を含み得るさらなる配列を含んでもよい。
【００３３】
本明細書に使用されるように、用語「転写コントロール配列」は、転写可能に連結されたコード領域の転写の速度をコントロールする配列を指す。用語は、プロモーター、オペレーター、およびエンハンサーなどのエレメントを含むことができる。好ましくは、転写コントロール配列は、少なくとも１つのプロモーター配列を含む。
【００３４】
本明細書に使用されるように、用語「転写可能に連結された」は、転写に適した系を指し、転写は、コントロール配列の誘導下で開始し、そのコントロール配列と転写可能に連結された配列を通して進行する。好ましくは、結果として生じる翻訳産物を変化させる突然変異は、結果として生じる転写物中で生じない。たとえば、「転写可能に連結された」は、一般に、連結されているＤＮＡ配列が近接していることを意味し、分泌リーダーの場合には、近接し、リーディングフェーズ（ｒｅａｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）中にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは近接する必要はない。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたは合成オリゴヌクレオチドリンカーを従来の方式に従って使用することができる。
【００３５】
本明細書に使用されるように、用語「５’非翻訳領域」または「５’ＵＴＲ」は、プロモーター領域に対して３’および下流のコード領域の５’に位置する配列を指す。したがって、そのような配列は、転写されるが、翻訳開始コドンの上流に（つまり５’）にあり、したがって、一般に、ポリペプチド産物の部分に翻訳されない。
【００３６】
本明細書に使用されるように、用語「３’非翻訳領域／ポリ（Ａ）シグナル」または「３’ＵＴＲポリ（Ａ）シグナル」は、重要なポリペプチドをコードする領域の下流（つまり３’）に位置する配列である。５’ＵＴＲでのように、この領域は一般に転写されるが、翻訳されない。真核細胞中での発現については、ポリＡテールの追加をシグナル伝達する配列を含むことは一般に好ましい。他の合成遺伝エレメントと同様に、合成３’ＵＴＲ／ポリ（Ａ）シグナルは、自然発生ＵＴＲエレメントと異なる配列を有する。
【００３７】
本明細書に使用されるように、用語「サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー配列」は、転写プロモーターおよび上流のエンハンサー配列として真核細胞中で機能的である、サイトメガロウイルスからの配列を指す。エンハンサー配列は、転写が、関連するプロモーターからより高い頻度で起こることを可能にする。
【００３８】
本明細書に記載されるプラスミドは、１つまたは複数の次のものを含んでもよく：プロモーター、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ／ポリ（Ａ）シグナル、イントロンは合成配列であってもよい。この文脈中で、用語「合成」は、そのタイプの自然発生遺伝エレメントの配列によって直接提供されず、むしろ人工的に生じさせた配列である（つまり、分子生物学的方法によって個体によって生じさせた）配列を指す。そのような合成配列の１つまたは複数の部分は、自然発生配列の部分と同じであってもよいが、特定の遺伝エレメント上の全配列は、そのタイプの自然発生遺伝エレメントと異なる。そのような合成遺伝エレメントの使用は、そのエレメントの機能的な特性が、所望される機能のために適切に設計されることを可能にする。
【００３９】
本明細書に使用されるように、細胞性免疫応答エレメントポリペプチドまたはその断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドは、本明細書に定義されるように、細胞性免疫応答を誘導することができるペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを指す。通常の塩基対形成およびコドン使用頻度の関連性に基づいて、単一のポリペプチド配列をコードすることができる多くの異なるヌクレオチド配列があることが理解される。そのため、その用語は、細胞性免疫応答エレメントまたはその断片をコードすると思われる任意の核酸配列を指す。ある好ましい実施形態では、細胞性免疫応答エレメントポリペプチドまたはその断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、もしくはＴＧＦ−βと相同なタンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその断片を含む。好ましくは、細胞性免疫応答エレメントポリペプチドまたはその断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドは、ポリペプチドＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＴＧＦ−β、またはＩＦＮ−γ（配列番号１〜６に示される）をコードする配列と相同である、少なくとも５０個のヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも１００個のヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも３００個のヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも６００個のヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも１，０００個のヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも１，５００個のヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも２，０００個のヌクレオチドの近接するセグメントを含む。用語「相同性」は、本明細書でヌクレオチド配列について言及するとき、ヌクレオチド配列が、少なくとも７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、より好ましくは９８％、または最も好ましくは１００％、知られているヌクレオチド配列（たとえば、配列番号１〜６に提供されるようなＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＴＧＦ−β、およびＩＦＮ−γをコードする配列）と同一であることを意味する。細胞性免疫応答エレメントポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドは、細胞性免疫応答エレメントをコードする配列を形成するヌクレオチド以外に、さらなるヌクレオチドを含有することができることが理解される。
【００４０】
本明細書に使用されるように、用語「サンプル」または「試験サンプル」は、対象とする核酸を含むと考えられる任意の液体物質または固体物質を指す。試験サンプルは、培養中の細胞もしくは組織サンプルなどの任意の生物学的供給源（つまり生物学的サンプル）から得られてもよく、または化学的に合成された鋳型を含めて合成的に産生されてもよい。
【００４１】
本明細書に使用されるように、用語「細胞性免疫応答遺伝子またはその断片をコードする配列」は、細胞性免疫応答エレメント遺伝子またはその断片をコードする任意の核酸配列を指す。細胞性免疫応答エレメント遺伝子は、炎症に影響を与える可能性があるポリペプチドに対応するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを指す。細胞性免疫応答エレメント遺伝子の例として、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＴＧＦ−β、およびＩＦＮ−γを含むが、これらに限定されない。好ましくは、本明細書に記載されるような細胞性免疫応答エレメント遺伝子は、通常の塩基対形成および翻訳コドン使用頻度の関連性に基づいて、細胞性免疫応答エレメントポリペプチドまたはその断片のいずれかのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するペプチドをコードする。好ましくは、コード配列は、天然の細胞性免疫応答エレメント遺伝子の正確な全アミノ酸配列をコードする。
【００４２】
本明細書に使用されるように、用語「形質導入された」は、細胞の中に移動させた、選択された核酸を有する細胞を指す。細胞は、選択された核酸が複製され、子孫細胞に伝えられる場合、選択された核酸を用いて「安定して形質導入される」。細胞は、選択された核酸が細胞のゲノムの中に統合される場合、選択された核酸を用いて「形質転換される」。
【００４３】
本明細書に使用されるように、用語「治療する」、「治療」、または「療法」は、治癒的療法、予防的療法、および予防性の療法を指す。「予防性の療法」または「予防的療法」の例は、予防または標的とされる病理学的状態もしくは障害の緩和である。治療を必要とする人々は、障害を既に有する人々および障害を有する傾向にある人々または障害が予防されなければならない人々を含む。投与は、長期間の間、初期の治療効果（活性）を維持するために、短期的なモードに対立するものとしての連続モードでの作用物質（複数可）の投与を指す、「長期的な」投与とすることができる。投与はまた、連続的に中断なしで行なわれず、むしろ事実上周期的である治療である「断続的な」投与とすることができる。投与はまた、さらなる１つまたは複数の治療薬「と組み合わせる」ことができ、同時（併用）投与および任意の順序での連続投与を含む。
【００４４】
本明細書に使用されるように、用語「アップレギュレートする」は、遺伝子の発現または１つもしくは複数のタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡもしくは等価なＲＮＡのレベルまたはＴｈ２サイトカインなどの１つもしくは複数のタンパク質サブユニットの活性が、本明細書に開示される組成物の非存在下で観察されるものよりも大きいことを指す。たとえば、ＩＬ−４などのタンパク質の発現は、遺伝子発現の不在または低レベル遺伝子発現によって引き起こされるまたは悪化する病理学的状態を治療する、予防する、改善する、または調整するために増大させることができる。
【００４５】
本明細書に使用されるように、用語「阻害する」または「ダウンレギュレートする」は、遺伝子の発現または１つもしくは複数のタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡまたは等価なＲＮＡのレベルまたはＴｈ１サイトカインなどの、１つもしくは複数のタンパク質サブユニットの活性が、核酸分子の非存在下で観察されるものを下回って低下することを指す。一実施形態では、酵素的な核酸分子による阻害またはダウンレギュレートは、好ましくは、標的ＲＮＡ上の同じ部位に結合することができるが、そのＲＮＡを切断することができない酵素的に不活性なまたは減衰した分子の存在下で観察されたそのレベルを下回る。他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる阻害またはダウンレギュレートは、好ましくは、たとえば、スクランブル配列またはミスマッチを有するオリゴヌクレオチドの存在下で観察されるそのレベルを下回る。他の実施形態では、本明細書に開示される組成物を用いる、Ｔｈ１サイトカインの阻害またはダウンレギュレートは、その組成物の存在下で、その非存在下よりも大きい。
【００４６】
本明細書に使用されるように、用語「約」は、量的な用語中では、示される値の１０％プラスまたはマイナスを意味する。
【００４７】
発明の他の特徴および利点は、好ましい実施形態についての以下の説明および特許請求の範囲から明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１ａ】２回の注射（６および８月齢時）の後の、ベクターコントロール（非治療グループ）ＡＰＰトランスジェニックアルツハイマー病マウスモデルの、９月齢時に処理した脳組織学的切片を示す図である。組織学的切片の矢印は、抗アミロイド−β抗体を用いる染色（免疫組織化学特異的染色）の後のアミロイド斑ラベリングを示す。
【図１ｂ】ＩＬ−１０遺伝子ワクチンでの２回の免疫感作（６および８月齢時）の後のＡＰＰトランスジェニックアルツハイマー病マウスモデルの、９月齢時に処理した脳組織学的切片を示す図である。組織像は、抗アミロイド−β抗体を用いる染色（免疫組織化学特異的染色）の後にいかなるアミロイド斑ラベリングをも示さない。
【図１ｃ】ＩＬ−４遺伝子ワクチンでの２回（６および８月齢時）の免疫感作の後のＡＰＰトランスジェニックアルツハイマー病マウスモデルの、９月齢時に処理した脳組織学的切片を示す図である。組織像は、抗アミロイド−β抗体を用いる染色（免疫組織化学特異的染色）の後にいかなるアミロイド斑ラベリングをも示さない。
【図１ｄ】ＴＧＦ−β遺伝子ワクチンでの２回の免疫感作（６および８月齢時）の後のＡＰＰトランスジェニックアルツハイマー病マウスモデルの、９月齢時に処理した脳組織学的切片を示す図である。組織像は、抗アミロイド−β抗体を用いる染色（免疫組織化学特異的染色）の後にいかなるアミロイド斑ラベリングをも示さない。
【図１ｅ】ＩＦＮ−γ遺伝子ワクチンでの２回の免疫感作（６および８月齢時）の後のＡＰＰトランスジェニックアルツハイマー病マウスモデルの、９月齢時に処理した脳組織学的切片を示す図である。組織学的切片の矢印は、抗アミロイド−β抗体を用いる染色（免疫組織化学特異的染色）の後のアミロイド斑ラベリングを示す。
【図２】ベクターのみ（図２ａ）またはＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＮＧＦ、およびＡｐｏ−Ｅ２遺伝子ワクチンの混合物（図２ｂ）での６回の免疫感作（６、８、１０、１２、１４、および１６月齢時）後のＡＰＰトランスジェニックアルツハイマー病マウスモデルの、１８月齢時に処理した海馬の脳組織学的切片を示す図である。混合ワクチン接種の組織像は、正常な、冒されていないマウスと一致して、抗アミロイド−β抗体を用いる染色（免疫組織化学特異的染色）の後にいかなるアミロイド斑ラベリングをも示さないのに対して、ベクターを投与したものはアミロイド斑をラベルした。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
アルツハイマー病などの神経変性疾患の治療および／または予防のための組成物および方法が本明細書で提供される。ある態様では、組成物および方法は、対象、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおける神経変性疾患を治療または改善するためのＤＮＡワクチンおよび養子細胞遺伝子治療に関する。ある態様では、組成物および方法は、Ｔｈ２サイトカインまたはＴｈ３サイトカインをコードするＤＮＡワクチンに関する。細胞性免疫応答エレメントコード配列が、組成物を投与する対象中で発現するように、組成物を調製し投与することができる。これらの組成物は、発現系、送達系、トランスフェクション促進物質、および１つまたは複数の細胞性免疫応答エレメントを含んでもよい。
【００５０】
アレルギー性疾患は、Ｔ−ヘルパータイプ１（Ｔｈ１）プロファイルから離れて、Ｔ−ヘルパータイプ２（Ｔｈ２）プロファイルに向かって偏向する免疫応答を有する。Ｔｈ１プロファイルは、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２などの、炎症応答を永続化させる分子のレベルの増大によって特徴づけられる。Ｔｈ２プロファイルは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３などの特定のインターロイキン（ＩＬ）のレベルの増大、ＣＤ４＋Ｔ細胞、および抗原特異的なＩｇＥの産生によって特徴づけられる。ＩＬ−４は、ＩｇＥ合成およびＴｈ２応答の発生において重要であり、ＩＬ−５は、好酸球生存において重要である。免疫療法は、Ｔｈ１サイトカイン、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−１２を増大させて、この不均衡の逆転をもたらし、これは、順番に、Ｔｈ２応答を阻害する。同時に、その遺伝的ワクチン接種の研究は、急成長しつつあり、占有された場合、肥満細胞および好塩基球上でＩｇＥ媒介性の応答を阻害する低親和性ＩｇＧレセプター、ＦＣγＲＩＩＢについての研究も急成長しつつある（Ｄａｅｒｏｎら、Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５（２）：５７７〜８５頁（１９９５年））。
【００５１】
驚いたことに、上記に記載され、実施例３および４に示されるように、ＩＦＮ−γをコードするポリヌクレオチドの投与は、動物モデルで、アルツハイマー病の影響を治療しかつ予防することができる。ＩＦＮ−γはＴｈ１サイトカインであるが、遺伝子ワクチンとしてのその投与は、神経変性疾患の影響を最小限にすることが示された。したがって、ＩＦＮ−γをコードするまたはＩＦＮ−γと相同なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物および方法は、対象、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおける、アルツハイマー病などの神経変性疾患を治療および／または改善するための方法として本明細書で提供される。
【００５２】
ある実施形態では、炎症を低減する組成物は、発現を刺激するまたは炎症を低下させる遺伝子を産生することができるのに対して、他の実施形態では、アンタゴニストなどの組成物は、炎症を増大させる遺伝子の発現を阻害することによって調節に影響を与えることができる。二本鎖ＲＮＡ、特にｓｉＲＮＡは、発現を阻害するために使用することができる。ＲＮＡは、生細胞の中に導入されて、その細胞中の標的の遺伝子発現を阻害することができる。そのプロセスは、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで行なってよい。そのようなＲＮＡ組成物および使用の方法は、たとえば、米国特許第６，５０６，５５９号にさらに記載される。
【００５３】
裸のＤＮＡ、リポソームと複合体を形成したＤＮＡ、および様々なウイルスベクターを投与することを含めて、宿主細胞中にＤＮＡを導入するのに様々なアプローチを使用することができる。米国特許第６，０４０，２９５号、第５，７６３，２７０号、および第５，５８０，８５９号に記載されるものなどの裸のポリヌクレオチド物質、方法、および送達系を使用してもよい。ポリヌクレオチドは、細胞の中に入るのを促進するように作用することができる任意の送達媒体もしくはリポソーム製剤などの、トランスフェクションを促進する任意の物質、リポフェクチンなどの荷電脂質、またはＣａＰＯ４などの沈殿剤が存在しないといった意味で裸である。
【００５４】
核酸を送達するためのベクターは、ウイルス性、非ウイルス性、または物的（physical）なものでよい。たとえば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：１５７５〜１５７８頁（１９８８年）およびＷｏｌｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：９０１１〜９０１４頁（１９８９年）を参照されたい。遺伝子治療に使用される方法および組成物の論述は、Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第９版のＥｃｋら、Ｈａｒｄｍａｎら編、ＭｃＧｒａｙ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９９６年）、第５章、７７〜１０１頁、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７（増補１）：３１〜３２頁（１９９７年）、Ｗｉｖｅｌら、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ／Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｓ．Ｌ．Ｅｃｋ編、１２（３）：４８３〜５０１頁（１９９８年）、Ｒｏｍａｎｏら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、１８：１９〜３９頁（２０００年）、およびそこに引用される参考文献を含む。米国特許第６，０８０，７２８号もまた、種々様々の遺伝子送達の方法および組成物の論述を提供する。送達の経路は、たとえば、全身投与およびインサイツでの投与を含む。十分に知られているウイルス性の送達技術は、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、フォーミーウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターの使用を含む。
【００５５】
ウイルスベクターはまた、哺乳動物細胞のトランスフェクションおよびゲノムの中へのポリヌクレオチドの導入に使用することができる。間接的な方法では、遺伝情報を運搬するウイルスベクターは、身体から除去された標的細胞を感染させるために使用され、次いで、これらの細胞は再移植される。出生後の動物の中への直接的なｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子移入が、リポソーム中にカプセル化されたＤＮＡおよびウイルスエンベロープレセプタータンパク質を含有するプロテオリポソーム中にカプセル化されたＤＮＡの製剤について報告されている（Ｎｉｃｏｌａｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：１０６８〜１０７２頁（１９８３年）、Ｋａｎｅｄａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：３７５〜３７８頁（１９８９年）、Ｍａｎｎｉｎｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６８２〜６９０頁（１９８８年）。ウイルスベクターは、Ｔ細胞（Ｎａｋａｊｉｍａ，Ａ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、第１７巻（２１）、１２９３〜１３１０頁（２００１年）およびＴｕｏｈｙ，Ｖ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、第１７巻（２）、２２６〜３２頁（２０００年））、線維芽細胞（Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ，Ｇ．Ａ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、第１９巻、３８５〜９８頁（１９９９年））、樹状細胞（ＤＣ）（Ｋｉｍ，Ｓ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１６６巻（２１）、３４９９〜３５５０頁（２００１年）およびＭｏｒｉｔａ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、第１７巻（２１）、１２７５〜８４頁（２００１年））、ならびに幹細胞（ＡＴＣＣまたは自己）などの宿主細胞中にｉｎ  ｖｉｔｒｏで注入または導入されたのち、養子移入され、送達媒体として貢献する。
【００５６】
ある実施形態では、ウイルスベクターは、好ましくは、レトロウイルスベクターである。レトロウイルスベクターは、遺伝子移入プラスミドであり、異種核酸が、２つのレトロウイルスＬＴＲの間に存在する。レトロウイルスベクターは、典型的に、レトロウイルスベクターまたは鋳型としてレトロウイルスベクターを使用して転写されたＲＮＡが、適切なパッケージング細胞系中でウイルスビリオンの中にパッケージされることを可能にする適切なパッケージングシグナルを含有する（たとえば、米国特許第４，６５０，７６４号を参照されたい）。
【００５７】
本明細書での使用に適したレトロウイルスベクターは、たとえば、米国特許第５，３９９，３４６号および第５，２５２，４７９号ならびにＷＩＰＯ国際公開第９２／０７５７３号、国際公開第９０／０６９９７号、国際公開第８９／０５３４５号、国際公開第９２／０５２６６、および国際公開第９２／１４８２９号に記載され、これらは、そのようなレトロウイルスベクターを使用してヒト細胞の中に核酸を効率的に導入するための方法の説明を提供する。他のレトロウイルスベクターは、たとえば、マウス乳癌ウイルスベクター（たとえば、Ｓｈａｃｋｌｅｆｏｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：９６５５〜９６５９頁（１９９８年））、レンチウイルスなどを含む。例示的なウイルスベクターは、ｐｌｅｎｔｉｌｏｘ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰである。
【００５８】
養子細胞遺伝子治療
細胞の中に核酸を導入するための技術は、核酸が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養細胞の中にまたは目的の宿主の細胞中にｉｎ  ｖｉｖｏで移入されるかどうかに応じて変わる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの哺乳動物細胞の中への核酸の移入に適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション（Ｌｕｘｅｍｂｏｕｒｇ  Ａ．ら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．７（１１）：１６４７〜１６６４頁（２００７年）、Ｋｅｓａｒａｊｕ  Ｐら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４（３）：４１６〜４２２頁（２００６年）、Ｌｕｘｅｍｂｏｕｒｇら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２４（２１）：４４９０〜４４９３頁（２００６年））、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などの使用を含む。好ましいｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子移入技術は、ウイルス（典型的にレトロウイルス）ベクターを用いるトランスフェクションおよびウイルスコートタンパク質−リポソーム媒介性のトランスフェクションを含む（Ｄｚａｕら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１（５）：２０５〜１０頁（１９９３年））。適したベクターは、当技術分野で十分に知られているいずれの方法によっても構築することができる。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）ならびにＡｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８７年および最新版）を参照されたい。ｐＶＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）などの、ＤＮＡワクチンのために設計されたベクターもまた、哺乳動物への核酸の送達に適している。ＣＤ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥリポソームなどの陽イオン性リポソームの使用は、ＤＮＡ／陽イオン性リポソーム複合体の静脈内注射を通して広範囲の組織にＤＮＡを送達するための適切な媒体として広く立証されてきた。Ｃａｐｌｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，１：３９〜４６頁（１９９５年）、Ｚｈｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１：２０９〜２１１頁（１９９３年）を参照されたい。形質膜と融合することによる標的細胞への遺伝子のリポソーム移入。リポソーム複合体の適用に成功した例は、Ｌｅｓｓｏｎ−Ｗｏｏｄら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、６：３９５〜４０５頁（１９９５年）およびＸｕら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、６３：１０３〜１０９頁（１９９８年）を含む。
【００５９】
個体での核酸の誘導送達は、当技術分野で知られているいずれの様々な手段によっても実現することができる。たとえば、核酸種は、細胞膜タンパク質または標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンドなどの、損傷を受けた組織の細胞を標的とする作用物質と組み合わせてもよい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスと関連する細胞膜タンパク質に結合するタンパク質は、ターゲティングのためにおよび／または取り込みを促進するために使用されてもよく、たとえば、特定の細胞型に栄養性のカプシドタンパク質またはその断片、サイクリングで内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内の局在化を標的とし、細胞内での半減期を増強するタンパク質がある。レセプター媒介性のエンドサイトーシスの技術は、たとえばＷｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（１０）：４４２９〜３２頁（１９８７年）およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７（９）：３４１０〜４頁（１９９０年）によって記載される。遺伝子マーキングおよび遺伝子治療のプロトコールの検討については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６（５０５８）：８０８〜１３頁（１９９２年）を参照されたい。
【００６０】
器官特異的自己免疫疾患の炎症部位へ移動するための能力を有する、初代のＴ細胞、樹状細胞、線維芽細胞、および幹細胞などの、遺伝子操作された免疫細胞を使用する養子細胞遺伝子治療で、本明細書で提供される方法および組成物を利用して、ｅｘ  ｖｉｖｏでのウイルス性の形質導入の後に免疫調節性産物および／または治療用遺伝子産物を発現させ、送達することもできる。これらの細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ形質導入は、導入遺伝子コードベクターへの宿主の全身性の曝露を回避し、したがって、このアプローチの安全性を付加する。ＩＬ−４などの抗炎症性サイトカイン、ＩＬ−１２レセプターアンタゴニストＩＬ−１２ｐ４０などのサイトカインアンタゴニスト、または抗ＴＮＦ抗体単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を発現する抗原特異的Ｔ細胞ハイブリドーマが使用された。これらの分子はすべて、疾患発症を阻害し、疾患重症度を低下させた。養子細胞遺伝子治療のＣＩＡモデルは、抗炎症遺伝子治療を媒介するための好都合な遺伝子シャトルの例である。さらなる研究により、形質導入するのがより困難である初代Ｔ細胞が、ＩＬ−１２ｐ４０を発現する場合、同等に有効であることが示され、成功した養子細胞遺伝子治療は、使用される細胞型と無関係に適用されてもよいことを示す。したがって、骨髄由来の樹状細胞（ＤＣ）などの細胞は、炎症部位へ移動するように使用することができる。
【００６１】
樹状細胞ファミリー（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｆａｍｉｌｙ）の細胞は、２つの別々の場所で２つの別個の機能を果たすのにとりわけ適合している。末梢組織では、樹状細胞（ＤＣ）は、「危険な」抗原の番人として働く。ＤＣは、移動し、リンパ器官に抗原を運び、そこで、ＤＣは、抗原に特異的なＴリンパ球の活性化を開始する。移動の間に、ＤＣは、抗原捕捉モードからＴ細胞感作モードに移行する。ＤＣはまた、Ｔ細胞分化の特質、つまりＴｈ１／Ｔｈ２の均衡に影響を及ぼす。ＤＣは、Ｔリンパ球の最適な活性化に必要とされる抗原シグナルおよび共刺激シグナルを提供する。ＤＣおよび使用の方法は、たとえば、米国特許第６，７３４，０１４号にさらに記載される。
【００６２】
幹細胞を、養子細胞遺伝子治療に使用することもできる。ヒト胚幹（ＥＳ）細胞を、本明細書で提供される組成物および方法に使用することができる。ＥＳ細胞は、未分化状態で無制限に増殖することができ、さらに、成人の体のすべての細胞に分化することもできる胚盤胞の内部細胞塊に由来する培養細胞系である。好ましくは、本明細書で提供される方法および組成物での使用に適切な幹細胞は、対象自身に由来するまたは胚性幹細胞ＤＮＡを対象のＤＮＡと交換することを伴う核移入または体細胞核移入などのように、免疫反応を避けるよう操作される。胚性幹細胞は、成人ヒトの体で見つけられる約２００個の異なる細胞型に分化する能力のために、最も用途の広い幹細胞であり、日常的な遺伝子工学プロトコールが開発されている唯一の幹細胞型である。ｅｘ  ｖｉｖｏで幹細胞を生成するための方法は、当技術分野で十分に知られており、米国特許第６，３２６，１９８号、第６，２６１，５４９号、第６，０９３，５３１号、第５，９３５，５６５号、第５，６７０，３５１号、第５，６７０，１４７号、第５，６４６，０４３号、第５，４３７，９９４号を含む。
【００６３】
ｃＤＮＡを用いるワクチン接種は、比較的わずかの注射を必要とし、より迅速な準備段階を有する。免疫療法への有害反応の危険性もまた低下する可能性がある。プラスミドＤＮＡおよびその遺伝子発現は長く持続することが知られ（Ｗｏｌｆｆら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３６３〜６９頁（１９９２年））、霊長動物およびげっ歯動物の免疫応答は、ＤＮＡワクチン接種の後に１年間以上持続することが立証されている（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ．１７６：１４５〜１５２頁（１９９４年）およびＲａｚら、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：９５１９−９５２３（１９９４年））。プラスミドＤＮＡは宿主ゲノムの中に組み込まれるのではなく、エピソームとしてとどまるようにみえる（Ｔａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ．３５６：１５２〜４頁（１９９２年））。裸のＤＮＡおよびＲＮＡが取り込まれ、ｉｎ  ｖｉｖｏで筋細胞によって一時的に発現するといった発見は、非ウイルス性媒体を遺伝子送達に使用することへの関心を増大させた。Ｗｏｌｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７、１４６５〜１４６８頁（１９９０年）、Ａｃｓａｄｉら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２、８１５〜８１８、（１９９１年）を参照されたい。裸のＤＮＡおよびＲＮＡは哺乳動物細胞によって取り込むことができるが、ＤＮＡまたはＲＮＡがリポソーム中で複合体を形成する場合、トランスフェクションの効率は大いに増大する可能性がある（Ｃｈｅｎら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７（１９）：１６９８〜７０５頁（２０００年））。
【００６４】
細胞性免疫応答エレメントまたはその断片が哺乳動物中で発現するように、ｉｎ  ｖｉｖｏで哺乳動物にポリヌクレオチドを投与することは、哺乳動物遺伝子発現について当技術分野で知られている多くの方法のいずれかを使用して実現することができる。たとえば、発現系および送達系を含む、哺乳動物に発現可能なポリヌクレオチドを投与するためのそのような方法は、米国特許第６，８７５，７４８号、第５，７６３，２７０号、第５，５８０，８５９号、第６，０４０，２９５号、および第６，０３４，０７２号に見つけることができる。
【００６５】
本明細書に記載されるポリヌクレオチド構築物は、細胞性免疫応答エレメントまたはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む。ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが細胞の中に組み込まれ、検出可能な量の予防的または治療的有効量の所望される細胞性免疫応答エレメントまたはその断片を発現するように投与される。本明細書で提供されるような使用に適した例示的な細胞性免疫応答エレメントは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＴＧＦ−β、およびＩＦＮ−γを含む。
【００６６】
発現系
ｉｎ  ｖｉｖｏでの核酸の非ウイルス性の投与は、様々な方法によって達成された。これらは、リポフェクチン／リポソーム融合を含む：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４、７４１３〜７４１７頁（１９９３年）、アデノウイルス増強を用いるおよび用いないポリリジン凝縮：Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３、１４７〜１５４頁（１９９２年）、および細胞への核酸のトランスフェリン：トランスフェリンレセプター送達：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７、３４１０〜３４１４頁（１９９０年）。ポリアクリル酸からなる特異的な組成物の使用は国際公開第９４／２４９８３号に開示されている。裸のＤＮＡは、国際公開第９０／１１０９２号に開示されるように投与された。
【００６７】
したがって、一態様では、プラスミドは、転写ユニットとも呼ぶことができる発現カセットを含む細胞性免疫応答エレメントまたはその断片の発現のために提供される。プラスミドが、遺伝子発現に適した環境に配置される場合、転写性ユニットは、したがって、細胞性免疫応答エレメントまたはその断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドを発現する。転写ユニットは、細胞性免疫応答エレメントコード配列と転写可能に連結された転写コントロール配列を含む。転写コントロール配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサー配列などのプロモーター／エンハンサー配列を含んでもよい。しかしながら、当業者らは、真核細胞中での発現に適した様々な他のプロモーター配列が知られており、本明細書に開示される構成物中で同様に使用することができることを認識するであろう。遺伝子産物の発現のレベルは、関連するプロモーターならびに関連するエンハンサーエレメントの存在および活性化に依存する。ある実施形態では、細胞性免疫応答エレメント遺伝子またはその断片をコードする配列は、転写、翻訳、ＲＮＡ安定性、および複製のための調節エレメントを含有する（つまり、転写コントロール配列を含む）発現プラスミドの中にクローニングすることができる。そのような発現プラスミドは当技術分野で十分に知られており、当業者は、細胞性免疫応答エレメントが発現可能なように、細胞性免疫応答エレメントまたはその断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドを有する適切な発現構成物を設計することができるはずである。ｐＣＩ−ｎｅｏ、ｐＵＭＶＣ、またはｐｃＤＮＡ３などの、細胞性免疫応答エレメント遺伝子またはその断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドがクローニングすることができる適した発現プラスミドの多数の例がある。
【００６８】
細胞性免疫応答エレメントまたはその断片の発現のためのプラスミドを収容する大量の細菌宿主は、発酵させてもよく、プラスミドは、後の使用のために精製してもよい。プラスミドを使用する現在のヒト臨床治験はこのアプローチを利用する。Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ａｄｖｉｓｏｒｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  Ｄａｔａ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：５３５〜５４８頁（１９９４年）。
【００６９】
プラスミドに関する目標は、哺乳動物の細胞または組織への核酸配列の効率的な送達および哺乳動物の細胞または組織中での治療遺伝子（つまり細胞性免疫応答エレメント）の発現のために、ヒト遺伝子治療で一般に使用することである。特に、プラスミドに関する目標は、高コピー数を実現すること、プラスミドの不安定性に関する潜在的な原因を回避すること、およびプラスミド選択のための手段を提供することである可能性がある。発現に関しては、核酸カセットは、カセット内に、核酸の発現のための必要なエレメントを含有する。発現は、プラスミドを用いる、挿入遺伝子、核酸配列、または核酸カセットの効率的な転写を含む。発現産物は、タンパク質、ポリペプチド、またはＲＮＡであってもよい。核酸配列は、核酸カセット中に含有することができる。核酸の発現は、連続的なものとすることができるまたは調節することができる。
【００７０】
核酸によってコードされる産物の発現を最終的に得るためのプロセスでの初期のステップは、細胞による核酸の取り込みを達成することである。細胞による核酸の取り込みは、多くの因子に依存する。それらのうちの１つは、核酸が細胞表面に接近する時間の長さである。たとえば、緩衝液中のプラスミドＤＮＡの筋肉内（ｉ．ｍ．）投与の後に、筋肉がマッサージされる場合、おそらく、直接のまたはリンパ管を介しての筋肉からのＤＮＡ漏出のために、遺伝子発現の顕著な低下が観察される（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：１５１〜１５９頁；１９９３年）。したがって、核酸が拡散する、または核酸の細胞内取込みが期待される部位から核酸の運び去られる速度を遅らせると思われる化合物とともに核酸を製剤化することが望ましいだろう。さらに、これらの化合物は、核酸の細胞内取込みを増大させるのに必要な物理的特性を維持しながらまたは取り戻しながら、注射などの手段によって生体に投与するのに適するだろう。
【００７１】
医薬組成物
本明細書で提供される組成物は、医薬組成物として投与することができ、化合物は、当技術分野で十分に知られている薬学的に許容できる担体を用いて製剤化される。医薬組成物の製剤および投与のための技術は、たとえば「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、（第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０年）に見つけることができる。したがって、化合物は、医薬の製造で使用することができる。化合物の医薬組成物は、非経口投与のための水剤または凍結乾燥散剤として製剤化することができる。そのような散剤は、使用に先立って、適切な希釈剤または他の薬学的に許容できる担体を添加して再構成される。そのような散剤はまた、乾燥形態でスプレーしてもよい。液体製剤は、緩衝等張水性水剤であってもよい。適切な希釈剤の例は、通常の等張生理食塩水、水中の標準的な５％デキストロース、または緩衝酢酸ナトリウム溶液もしくは緩衝酢酸アンモニウム溶液である。そのような製剤は、非経口投与にとりわけ適しているが、経口投与に使用してもよく、または吸入法のための定量吸入器または定量噴霧器中に入れてもよい。ポリビニルピロリドン、ゼラチン、ヒドロキシセルロース、アカシア、ポリエチレングリコール、マンニトール、塩化ナトリウム、またはクエン酸ナトリウムなどの添加剤を添加することは望ましい可能性がある。
【００７２】
その代わりに、細胞性免疫応答エレメントまたはその断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む組成物は、経口投与のために、カプセル化してもよく、錠剤にしてもよく、または乳剤もしくはシロップ剤で調製してもよい。薬学的に許容できる固体担体または液体担体を、組成物を増強するもしくは安定化するまたは組成物の調製を促進するために添加することができる。固体担体はデンプン、ラクトース、硫酸カルシウム二水塩、白土、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸、滑石、ペクチン、アカシア、寒天、またはゼラチンを含む。液体担体は、シロップ、ラッカセイ油、オリーブ油、食塩水、および水を含む。ｉｎ  ｖｉｖｏで使用される水性組成物については、パイロジェンフリー無菌水の使用は好ましい。そのような製剤は、哺乳動物、好ましくはヒトへの投与に適した薬学的に許容できる組成物を調製するために、適した量の水溶液と一緒に有効量のポリヌクレオチドを含有する。担体はまた、モノステアリン酸グリセリンまたはグリセリルジステアラートなどの徐放性物質を単独でまたはろうと共に含んでもよい。固体担体の量は様々であるが、好ましくは、投薬単位当たり約２０ｍｇ〜約１ｇの間となる。医薬調製物は、錠剤形態については、製粉、混合、造粒、および必要な場合、圧縮または硬ゼラチンカプセル形態については、製粉、混合、および充填を含む、製薬の従来の技術の後に作製する。液体担体が使用される場合、調製物は、シロップ剤、エリキシル剤、乳剤、または水性懸濁剤もしくは非水性懸濁剤の形態をしていてもよい。直腸投与については、化合物は、カカオバター、グリセリン、ゼラチン、またはポリエチレングリコールなどの添加剤と組み合わせ、坐剤に成形してもよい。
【００７３】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドの薬学的に許容できる塩の投与が含まれる。そのような塩は、有機塩基および無機塩基を含む薬学的に許容できる無毒性の塩基から調製されてもよい。無機塩基に由来する塩は、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウムなどを含む。薬学的に許容できる有機無毒性塩基に由来する塩は、第一級アミン、第二級アミン、および第三級アミン、塩基性アミノ酸などの塩を含む。医薬品の塩の有用な論述については、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ６６：１〜１９頁（１９７７年）。
【００７４】
哺乳動物に細胞性免疫応答エレメントポリペプチドを供給するのに使用される医薬組成物もまた、本明細書で提供され、これは、細胞性免疫応答エレメントまたはその断片をコードする配列を含む薬学的有効量のポリヌクレオチド、無菌様式で担体およびポリヌクレオチドを封入する容器（container）、ならびに容器から組織の間質空間へのポリヌクレオチドの移入を可能にするための容器と関連する手段を含み、それによって、組織の細胞は、ポリヌクレオチドを取り込み、発現させることができる。そのような移入を可能にするための手段は、たとえば針によって貫通可能な従来の隔壁を含んでいてもよい。あるいは、容器がシリンジである場合、手段は、シリンジのプランジャーまたはシリンジに付属された針を含むと考えることができる。容器は、１つまたは複数の単位投薬量を提供するために、少なくとも１、好ましくは少なくとも５、または１０およびより好ましくは少なくとも５０または１００マイクログラムのポリヌクレオチドを有してもよい。多くの適用について、容器は、少なくとも５００マイクログラムまたは１ミリグラムのポリヌクレオチドを有し、また、少なくとも５０または１００ミリグラムのポリヌクレオチドを含有することが多い。
【００７５】
容器中に、薬学的に許容できる投与可能な形態の、細胞性免疫応答エレメントまたはその断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドおよび医薬品の製造、使用、または販売を調節する政府機関によって規定された形態の容器と関連する通知を含み得る医薬組成物もまた提供され、この通知は、ヒトまたは獣医の投与のためのポリヌクレオチドの形態の機関による承認を反映する。そのような通知は、たとえば、処方薬について米国Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎによって承認されたラベリングまたは承認された製品添付文書であってもよい。
【００７６】
本明細書で提供される組成物は、医薬組成物として投与することができ、組成物は、当技術分野で十分に知られている薬学的に許容できる担体を用いて製剤化される。製剤および投与のための技術は、たとえば「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、（第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０年）に見つけることができる。したがって、組成物は、医薬の製造で使用することができる。薬学的に許容できる担体または医薬組成物または哺乳動物への投与に適した任意の物質は、地域の規制の基準に従って製造され、保管されるべきであることが理解される。たとえば、多くの政府は、衛生、プロセスバリデーション、設備および文書トレーサビリティー、ならびに人員の資格などの、哺乳動物および／またはヒトの中への投与のための組成物の製造および取り扱いの様々な側面を調節する指針または規則を有する。好ましくは、医薬組成物または薬学的に許容できる担体を含む本明細書で提供される組成物は、ヒトへの投与に適しており、そのような目的のために、米国Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎによって述べられるものなどの地域の規制、指針、および／またはＧＭＰ（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）規制に準拠する。
【００７７】
注射、送達の好ましい経路のための細胞性免疫応答エレメントまたはその断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドは、アンプルまたは多用量容器中で単位投薬量形態で調製することができる。ポリヌクレオチドは、油性媒体または好ましくは水性媒体中で、懸濁剤、水剤、または乳剤のような形態で存在していてもよい。あるいは、塩形態のポリヌクレオチドは、パイロジェンフリー無菌水などの適した媒体を用いて送達の時に元に戻すために、凍結乾燥形態としてもよい。液剤および元に戻すことになる凍結乾燥形態の両方は、注射する水剤のｐＨを適切に合わせるのに必要な量の作用物質、好ましくは緩衝液を含む。任意の非経口的な使用のために、特に、製剤が、静脈内に投与されることになる場合、溶質の総濃度は、調製物を等張性、低張性、または弱高張性にするようにコントロールされるべきである。糖などの非イオン性物質は、張性を合わせるのに好ましく、スクロースは特に好ましい。これらの形態のいずれも、デンプンもしくは糖、グリセロール、または食塩水などの適した製剤作用物質をさらに含んでもよい。単位投薬量当たりの組成物は、液体または固体に関わらず、０．１％〜９９％のポリヌクレオチド物質を含んでもよい。
【００７８】
ポリヌクレオチドが使用に先立ってパッケージされる単位投薬量アンプルまたは多用量容器は、その薬学的に有効な用量または有効な用量の倍量に適した、ある量のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含有する水剤を封入する密封容器を含んでもよい。ポリヌクレオチドは、無菌製剤としてパッケージされ、密封容器は、使用まで製剤の無菌状態を保つように設計される。
【００７９】
細胞性免疫応答エレメントまたはその断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドの容器は、ラベルされたパッケージを含んでもよく、ラベルは、政府機関、たとえばＦｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎによって規定される形態の注意書をつけていてもよく、この注意書は、ヒト投与のためのその中のポリヌクレオチド物質の製造、使用、または販売に関する、連邦法下の機関による承認を反映する。
【００８０】
連邦法は、ヒトの療法での医薬組成物の使用が連邦政府の機関によって承認されることを必要とする。米国では、執行は、Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎの責任であり、これは、２１  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§３０１〜３９２に詳述される、そのような承認を獲得するための適切な規制を公布する。動物の組織から作製された産物を含む生物学的物質についての規制は、４２  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§２６２下に提供される。同様の承認はほとんどの外国によって必要とされる。規制は、国によって変わるが、個々の手続きは、当業者らに十分に知られており、本明細書で提供される組成物および方法は、好ましくは、適宜準拠する。
【００８１】
投与すべき投薬量は、治療されている対象の状態および大きさならびに治療の頻度および投与の経路に大部分依存する。用量および頻度を含む、療法を継続するためのレジメンは、初期の応答および臨床的な判断によって管理されてもよい。エアロゾル製剤の吸入などの他の非経口経路が、たとえば鼻、咽喉、気管支組織、または肺の粘膜への特異的な投与で必要とされ得るが、組織の間質空間の中への注射の非経口経路は好ましい。
【００８２】
そのため、薬学的に許容できる注射可能な担体であって、組織内への間質性（interstitially）導入に適しており、組織の細胞が細胞性免疫応答エレメントまたはその断片を発現させる担体の水剤中にある細胞性免疫応答エレメントまたはその断片をコードする配列を含むポリヌクレオチド、水剤を封入する容器、ならびに医薬品の製造、使用、または販売を調節する政府機関によって規定される形態の容器と関連する注意書を含み得る（この注意書は、ヒト投与のためのポリヌクレオチドの水剤の製造、使用、または販売の機関による承認を反映する）医薬製品が本明細書で提供される。
【００８３】
投与
本明細書に開示される方法のいずれにおいても、細胞性免疫応答エレメントまたはその断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む組成物は、哺乳動物に送達することが好ましい。より好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。本明細書に開示される方法のいずれかに従う組成物の投与は、当技術分野で知られている様々な方法のいずれかに従って達成することができる。たとえば、米国特許第５，６７６，９５４号は、陽イオン性脂質担体と複合体を形成させた遺伝物質のマウスへの注射を開示する。さらに、米国特許第５，５８９，４６６号、第５，６９３，６２２号、第５，５８０，８５９号、第５，７０３，０５５号、およびＰＣＴ国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０６０６９（国際公開第９４／２９４６９号）は、裸のＤＮＡまたはＤＮＡ陽イオン性脂質複合体を含む組成物を脊椎動物に送達する方法を提供する。
【００８４】
ある実施形態では、細胞性免疫応答エレメントまたはその断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む化合物は、血管内、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下などのように非経口的に投与することができる。化合物は、筋肉組織、皮膚組織、脳組織、肺組織、肝臓組織、または脾臓組織の中に導入することができる。化合物はまた、血液の中にも導入することができる。投与はまた、エアロゾルを介しての、経口的な、経鼻的な、直腸性の、経皮的な、または吸入による投与でもよい。組成物はまた、ボーラスとして投与してもよく、または徐々に注入してもよい。
【００８５】
細胞性免疫応答エレメントまたはその断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドは、筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、目、腺、および結合組織の組織を含む、動物体の組織の間質空間に送達することができる。組織の間質空間は、細胞間の体液、器官組織の細網線維の間のムコ多糖マトリックス、管もしくは小室の壁の中の弾性線維、線維組織のコラーゲン線維、または筋細胞を鞘で覆う結合組織内のもしくは骨の小腔中のその同じマトリックスを含む。それは、同様に、血行路の血漿およびリンパ管のリンパ液によって占有される空間である。筋組織の間質空間への送達は、下記に論じられる理由のために好ましい。それらは、これらの細胞を含む組織の中への注射によって好都合に送達されてもよい。送達および発現は、たとえば血液の幹細胞または皮膚の線維芽細胞などの未分化細胞またはそれほど十分に分化していない細胞中で実現してもよいが、それらは、分化した消滅しない非分裂細胞に好ましくは送達され、その中で発現する。
【００８６】
ｉｎ  ｖｉｖｏで、筋細胞は、ポリヌクレオチドを取り込み、発現させるそれらの能力において特に優れている。この能力は、多核細胞、筋小胞体、および横行小管系を含む筋肉のまれな組織構造によるものである可能性がある。本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、細胞外液を含有し、筋細胞の中に深く伸びる横行小管系を通して筋肉に入る可能性がある。次いで回復する、損傷を受けた筋細胞にポリヌクレオチドが入る可能性もある。
【００８７】
動物は、皮膚を通しての直接的な注射によってうまく到達するバランスのとれた大きな筋肉のかたまりを有するので、筋肉もまた、多くの治療的適用で、ポリヌクレオチドの送達および発現のための部位としてに有利に使用され、この理由から、比較的多用量のポリヌクレオチドは、多数の注射によって筋肉中に蓄積させることができ、繰り返しの注射は、長期間にわたる療法を延長するために容易に行なわれ、特殊な技能または装置を用いないで安全に実行することができる。
【００８８】
筋肉の組織以外の組織もまた、細胞性免疫応答エレメントを産生するために注射部位として有利に使用してもよい。そのような１つの条件は、有効となるように、特異的タイプの細胞と結合して存在しなければならないポリペプチド、たとえば、コレステロールホメオスタシスと関連する肝細胞の細胞表面レセプターを提供するためのポリヌクレオチドの使用である（Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３４〜４７頁（１９８６年））。この適用および酵素またはホルモンが遺伝子産物である適用などの多くの他の適用で、有益な治療結果を達成するために、高レベルの発現を実現することは必要ではない可能性がある。
【００８９】
ある実施形態では、細胞性免疫応答エレメントまたはその断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドは、注射可能な担体を単独で使用して組織の中に導入される。担体は、好ましくは、等張性、低張性、または弱高張性であり、スクロース溶液によって提供されるイオン強度などのように、比較的低いイオン強度を有する。調製物は、さらにポリペプチドの形態でまたはポリヌクレオチドとしてリポソームの中に組み込まれた、サイトカインの供給源を有利に含んでもよい。
【００９０】
細胞性免疫応答エレメントまたはその断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む化合物は、他の医学的に有用な薬剤または生物学的作用物質を含むように製剤化される。化合物はまた、本明細書に記載される化合物が誘導される疾患または状態に有用な他の薬剤または生物学的作用物質の投与と共に投与してもよい（たとえば、骨粗鬆症に有用な有効成分についての米国特許第６，４１３，９５５号を参照されたい）。
【００９１】
細胞性免疫応答エレメントまたはその断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む化合物はまた、「遺伝子銃」によって組織または細胞の中に導入してもよい。ＤＮＡは、文献に記載されるように、金微小粒子上にコーティングされ、粒子衝撃装置または「遺伝子銃」によって皮内に送達してもよく（たとえばＴａｎｇら（１９９２年）、Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：１５２〜１５４頁を参照されたい）、金微粒子は、治療用ＤＮＡを用いてコーティングされ、次いで、皮膚細胞の中に衝撃される。
【００９２】
細胞性免疫応答エレメントまたはその断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む化合物はまた、経鼻投与および経口投与によって導入してもよい。低用量は、能動的抑制に好都合であり、より高い用量は、クローンアネルギー／消失に好都合である。経口抗原ならびに／または経鼻抗原は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節細胞および潜伏期関連性のペプチドＴ細胞に加えて、ＩＬ−４およびＩＬ−１０などのＴヘルパー２（Ｔｈ２）Ｔ細胞ならびにＴＧＦ−βなどのＴヘルパー３（Ｔｈ３）Ｔ細胞を誘導する。したがって、経口耐性の誘導は、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、抗ＩＬ−１２、ＴＧＦ−β、コレラ毒素Ｂサブユニット、Ｆｌｔ−３リガンド、および抗ＣＤ４０リガンドを投与することによって増強することができる。
【００９３】
経口抗原投与および経鼻抗原投与（たとえば粘膜耐性）は、喘息、アテローム性動脈硬化症、移植片拒絶、アレルギー（ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）への接触過敏症およびニッケルアレルギーなど）、大腸炎、発作などの非自己免疫疾患に加えて、実験的自己免疫性脳炎、ブドウ膜炎、甲状腺炎、筋無力症、関節炎、および非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスの糖尿病を含む自己免疫疾患の動物モデルならびにアルツハイマー病のモデルを抑制する（ＭｃＧｅｅｒ  Ｐ．ら、４２  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４４７〜４４９頁（１９９２年）、Ｏｋｕｒａｙ  Ｙ．、１０３（２５）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９６１９〜２４頁（Ｅｐｕｂ  ２００６年６月１２日）、Ｑｕ  Ｂ．ら、２４４（１−２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１５１〜１５８頁（２００６年））。粘膜耐性は、投与の容易性、毒性の欠如、および作用の抗原特異的なメカニズムのために、アルツハイマー病などの神経変性疾患の治療に有利である可能性がある。
【００９４】
粘膜耐性は、毒性がないこと、長い間にわたる投与の容易性、および作用の抗原特異的なメカニズムのために、神経変性疾患の治療のための魅力的なアプローチとなる。ヒト疾患の治療のための経口耐性の適用の成功は、用量、免疫効果を評価するための免疫マーカーの開発、経路（経鼻対経口）、製剤、粘膜アジュバント、併用療法、および早期療法に依存する。
【００９５】
本明細書に用いられるように、語句「有効量」は、そのレシピエントに有益な効果を与えるのに十分高い濃度を提供するのに十分な用量を指す。任意の特定の対象に特異的な治療的に有効な用量のレベルは、治療されている障害、障害の重症度、特異的な化合物の活性、投与の経路、化合物のクリアランスの速度、治療の期間、化合物と組み合わせてまたはそれと同時に使用される薬剤、年齢、体重、性別、対象の食事および健康状態、ならびに医学的技術および科学で十分に知られている類似の因子を含む様々な因子に依存する。「治療的有効量」を決定する際に考慮に入れられる様々な一般的な考察は、当業者らに知られており、たとえばＧｉｌｍａｎら編、Ｇｏｏｄｍａｎ  Ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第８版、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、１９９０年およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９９０年に記載される。
【００９６】
アジュバント
細胞性免疫応答エレメントまたはその断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドの哺乳動物系への送達については、送達系を利用することが普通、好ましい。そのような系は、多数の利点を提供することができ、特に、ＤＮＡの完全性を守るための安定性を提供し、細胞による取り込みを支援する。
【００９７】
加えて、本明細書に記載される例示的な送達系によって例証されるように（つまりトランスフェクション試薬）、製剤の非ＤＮＡ構成成分は、免疫系の増強または活性化に寄与し得る。その結果として、送達系の構成成分は、免疫刺激効果を増強するまたは最小限にするために特定の遺伝子産物と共に選択することができる。
【００９８】
免疫刺激効果はまた、ある種のヌクレオチド配列についても記載される。たとえば、Ｓａｔｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：３５２〜３５４頁（１９９６年）は、ある種のＣｐＧ含有配列を有する二本鎖ＤＮＡを用いるワクチン接種の、インターフェロン−γ、インターフェロン−β、およびインターロイキン−１２の産生に対する効果を記載する。
【００９９】
トランスフェクション試薬
本明細書で提供されるような細胞性免疫応答エレメントまたはその断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む組成物はまた、細胞の内部へのおよび／または細胞内の所望される場所へのポリヌクレオチドの送達を促進する１つまたは複数のトランスフェクション促進物質を含むこともできる。多くのそのようなトランスフェクション促進物質、たとえばリポフェクチン、リポフェクタミン、リポフェクタミン２０００、オプティフェクト（Ｏｐｔｉｆｅｃｔ）、スーパーフェクト（ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ）が市販で入手可能である。トランスフェクション促進物質の例として、脂質、好ましくは陽イオン性脂質、リン酸カルシウムなどの無機物質、および金属（たとえば金またはタングステン）粒子（たとえば「散剤」タイプの送達水剤）、陽イオン性ペプチド、ある種の細胞または核もしくは核小体などの細胞内小器官への選択的な送達のための標的ペプチド、および両親媒性ペプチド、つまりヘリックス形成またはポア形成ペプチドを含むペプチド、ヒストンなどの塩基性タンパク質、アシアロタンパク質（ａｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ウイルスタンパク質（たとえばセンダイウイルスコートタンパク質）、ポア形成タンパク質、ならびにデンドリマー、スターポリマー、「同種」ポリアミノ酸（たとえばポリリジン、ポリアルギニン）、「異種」ポリアミノ酸（たとえばリシン＆グリシンの混合物）、コポリマー、ポリビニルピロリジノン（ＰＶＰ）、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むポリマーを含むが、これらに限定されない。そのうえ、ｉｎ  ｖｉｖｏで、脊椎動物細胞の中にポリヌクレオチドが入るのを促進し、増強するそのような助剤もまた、「トランスフェクション促進物質」と考えられてもよい。
【０１００】
リポフェクションによって促進されるトランスフェクションは、たとえば米国特許第６，０３４，０７２号、第６，０４０，２９５号、および第６，７１０，０３５号に記載されるように、当技術分野で十分に知られている。ある実施形態では、本明細書で提供される組成物は、陽イオン性脂質（たとえばＤＯＴＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ）、塩基性脂質（たとえばステリルアミン）、中性脂質（たとえばコレステロール）、陰イオン性脂質（たとえばホスファチジルセリン）、および両性イオン性脂質（たとえばＤＯＰＥ、ＤＯＰＣ）を含む、トランスフェクション促進物質としての脂質を含んでもよい。好ましくは、陽イオン性脂質は、１つまたは複数の共脂質と混合される。定義の目的のために、用語「共脂質」は、陽イオン性脂質成分と組み合わせることができる任意の疎水性物質を指し、リン脂質などの両親媒性脂質およびコレステロールなどの中性脂質を含む。陽イオン性脂質および共脂質を、多くの方法で混合しまたは組み合わせて、たとえばリポソーム、多層状小胞、単層小胞、ミセル、および単純なフィルムを含む、様々な非共有結合的に結合した肉眼で見える構造体を産生してもよい。
【０１０１】
送達はまた、ＤＮＡ輸送体の使用を介するものでもよい。ＤＮＡ輸送体は、ＤＮＡベクターに結合し、表皮細胞によって取り込むことができる分子を指す。ＤＮＡ輸送体は、非共有結合的にＤＮＡに結合することができ、細胞膜を通してＤＮＡを効率的に運ぶ分子複合体を含有する。ＤＮＡ輸送体系は、独立して、非共有結合的にＤＮＡに結合するいくつかのエレメントを含有する粒子からなることができる。各エレメントは、ＤＮＡに結合する陽イオン性基と複合体を形成したタンパク質などの、特異的なレセプターまたは他の官能基を認識するリガンドからなる。使用できる陽イオンの例は、スペルミン、スペルミン誘導体、ヒストン、陽イオン性ペプチド、および／またはポリリジンである。第１のエレメントは、ＤＮＡベクターおよび標的細胞上の細胞表面レセプターの両方に結合することができる。そのようなエレメントの例は、アシアロ糖タンパク質レセプター、葉酸レセプター、マンノース−６−リン酸レセプター、またはカルニチンレセプターと相互作用する有機化合物である。第２のエレメントは、ＤＮＡベクターおよび核膜上のレセプターの両方に結合することができる。核リガンドは、輸送体系を認識し、核膜を通して運ぶことができる。そのようなリガンドの例は、ＳＶ４０ラージＴ抗原またはヒストンからの核標的配列である。第３のエレメントは、ＤＮＡベクターおよびエピソームの溶解を誘導するエレメントの両方に結合することができる。例として、アデノウイルスなどの不活性化ウイルス粒子、インフルエンザウイルス赤血球凝集素に関するペプチド、またはＧＡＬＡペプチドを含む。
【実施例１】
【０１０２】
ＤＮＡワクチン動物モデル研究
Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ  ＡＰＰ二重突然変異を含有するトランスジェニックマウス（Ｔｇ−２５７６）は、ＤＮＡワクチン接種の効果およびアルツハイマー病を研究するために使用した。マウスは、そのような研究についての施設内の指針により、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅの動物収容施設で維持した。これらの研究は、人道的配慮および実験動物の使用についてのＰｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  ｐｏｌｉｃｙに準拠して、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＴｅｎｎｅｓｓｅｅのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。動物モデル実験からの結果は、他の生体、特にヒトでの養子細胞遺伝子治療の原理証明を提供する。
【０１０３】
４〜５か月の間に、脳病変は、Ｔｇ−２５７６マウスに現われる。９〜１０か月後に、病変が完全に発症する。約４か月目に始まるワクチン接種は、アルツハイマー病に対する治療の予防的な効果を示すのに対して、５か月後に始まる（つまり６か月目に始まる）ワクチン接種は、既にアルツハイマー病を発症しているマウスの治療を示す。
【０１０４】
４月齢マウスは、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γをコードするＤＮＡワクチンを用いて治療し、またはコントロールベクターを投与した。１００μｇのワクチンを各マウスに与えた。マウスは、２か月の間隔で２回、追加免疫した。オスおよびメスのＴｇ−２５７６マウスの両方は、６０週齢まで使用し、維持した。次いで、マウスを屠殺し、それらの脳を摘出し、液体窒素中でスナップ凍結し、かつ−８０℃で保管した。
【実施例２】
【０１０５】
記憶の判定
空間学習および記憶は、Ｍｏｒｒｉｓ水迷路ナビゲーションタスク（水迷路）を使用して評価した。マウスは、水から逃れるために台の場所を学習するように不透明な水の円形プール中で訓練した。プールは、任意の別個の遠位にある空間的な手がかりを有する容器の中心に位置させた。試行はすべて、頭上のカメラを用いて録画した。水タンク（幅８０ｃｍ、深さ８０ｃｍ）を２３℃の水で満たした。隠された円形の台（幅１５ｃｍ）は、水面の１ｃｍ下に配置し、動物のための避難台とした。各試行についての最大水泳時間は、９０秒間とし、台の上での２０秒間の休息を後続させた。各マウスは、１日当たり４回の試行で５日間訓練した。４つの開始地点は、毎日の訓練で無作為化した。記銘試験（プローブ試行（ｐｒｏｂｅ  ｔｒｉａｌ））は、最後の試行の３０分後に台がない状態で行なった。各動物は、目標となる四分の一区分の反対の位置から放し、６０秒間泳がせた。７日目の再訓練の後に、避難台は、反対の四分の一区分に動かし、逆転訓練の手順を実験日８〜１０日目に行なった。逆転訓練についての記銘試験もまた、最後の習得試行の３０分後に行なった。各試験について、潜伏期（マウスが台に到達するのにかかった時間）を記録した。
【実施例３】
【０１０６】
アルツハイマー病の予防についての水迷路の結果
４月齢からワクチン接種した８月齢マウスの水迷路の結果。
【０１０７】
【表１】
0005829377.tif 000002
【０１０８】
４月齢からワクチン接種した９月齢マウスの水迷路の結果。
【０１０９】
【表２】
0005829377.tif 000003
【０１１０】
これらの結果は、アルツハイマー病の影響は、ＤＮＡワクチンを使用する早期治療で予防され、かつ／または大幅に減少し得ることを示す。
【実施例４】
【０１１１】
アルツハイマー病の治療についての水迷路の結果
６、８、１０、および１２月齢時にワクチン接種した７．５、９．５、および１１月齢マウスの水迷路の結果。
【０１１２】
【表３】
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【０１１３】
【表４】
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【０１１４】
【表５】
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【０１１５】
脳病変は、約４〜５月齢で形成されるので、これらのマウスは既にアルツハイマー病を発症しており、これらの結果は、アルツハイマー病を治療することができ、その影響は、細胞性免疫応答エレメントをコードするＤＮＡワクチンによって低下され得るまたは逆行され得ることを示す。
【実施例５】
【０１１６】
脳組織像
Ａｖｅｒｔｉｎを用いた麻酔の後に、マウスは、２分間、温かい０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢＳ）の溶液を用いて、その後、温かい緩衝１．５％パラホルムアルデヒド溶液を用いて耳を通して灌流した。これに、２５分間、冷たい４％パラホルムアルデヒドを含有する第２の固定液を後続させた。動物を断頭し、脳および骨を露出し、頭全体を、１０％中性ホルムアルデヒド溶液中に浸漬させ、一晩保管した。ＰＢＳを用いてすすいだ後、脳は、エタノールを用いて脱水し、パラフィン中に包埋した。ミクロトームを使用して、前頭葉から始まり小脳に向かう６μｍ厚の冠状切片のグループを収集し、連続でマウントした。すべての切片をマウントし、標準的なＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ（Ｈ＆Ｅ）およびＢｅｔａ  Ａｍｙｌｏｉｄ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇを用いて染色し、病変または神経変性の形跡を検査した。すべての切片は、光学顕微鏡を用いて検査した（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ  ２  ｐｌｕｓ  ＨＡＬ  １００、最終的な拡大×４００）。切片のデジタル画像は、コンピュータに連結させたカメラ（ｌｅｉｃａ）を使用して得た。
【０１１７】
Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ（Ｈ＆Ｅ）染色プロトコール
スライドホルダー（ガラスまたは金属）中に、パラフィン切片を含有するスライドを配置する。
３×３’キシレン（エタノールを使用する前に過剰キシレンを吸い取る）（ＳｔａｔＬａｂ  ＃８４００、実験室グレード、Ａｎａｐａｔｈ  ｂｒａｎｄ、Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ、ＴＸ）
３×３’１００％エタノール
１×３’９５％エタノール
１×３’８０％エタノール
１×５’脱イオン水
を使用して、切片を脱パラフィンし、再水和する。
切片は水中にあるが、酸化粒子を除去するためにＫｉｍｗｉｐｅを用いてヘマトキシリンの表面をすくい取る。ヘマトキシリンに入れる前にスライドホルダーから過剰な水を吸い取る。
ヘマトキシリン染色は、
１×３’ヘマトキシリン（Ｐｏｌｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＃ｓ２１２Ａ、氷酢酸を有するＨａｒｒｉｓヘマトキシリン、Ｂａｙｓｈｏｒｅ、ＮＹ）
脱イオン水を用いてすすぐ
１×５’水道水（染色が現像されるのを可能にするため）
酸性エタノール中に８〜１２回浸す（速やかに）（脱染するため）
すすぐ  ２×１’水道水
すすぐ  １×２’脱イオン水（この段階で一晩放置することができる）
を含む
エオシンに入れる前にスライドホルダーから過剰な水を吸い取る。
エオシン染色および脱水：
１×３０秒間  エオシン（エオシンのより古いバッチについては最大４５秒間）（Ｐｏｌｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＃ｓ１７６、Ｅｏｓｉｎ  Ｐｈｌｏｘｉｎｅ  ｓｔａｉｎ、Ｂａｙｓｈｏｒｅ、ＮＹ）
３×５’９５％エタノール
３×５’１００％エタノール（キシレンに入れる前に過剰エタノールを吸い取る）
２×１５’キシレン
キシレン中にスライドを一晩放置して、水を十分に除去することができる。
気泡を残さないように注意しながら、ガラス棒を使用して、スライド上にＰｅｒｍｏｕｎｔ（キシレンベース）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＃ＳＰ１５−１００、組織学的封入剤）を一滴のせる。
スライド上にカバーガラスを角度をつけて置き、そっと倒す。カバーガラスの下にＰｅｒｍｏｕｎｔを広げて、組織をすべて覆う。
フード中で一晩乾燥する。
【０１１８】
Ｂｅｔａ  Ａｍｙｌｏｉｄ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇプロトコール
ベータアミロイドは、脳中に見つけられた、細胞外線維状タンパク質の沈着物である。それは、アミロイドコアおよび神経炎斑の主要なタンパク質構成成分であり、神経原線維変化中の沈着物としても見つけられている。ヒトでは、アルツハイマー病は、老年認知症の最も一般的な原因であり、脳中の異常性線維状タンパク質の沈着物によって特徴づけられる。ベータアミロイド沈着物はまた、レビー小体認知症、ダウン症候群、アミロイド症（ダッチタイプ）中でおよびグアム  パーキンソン−認知症複合中で検出される。アルツハイマー病を有する脳組織に加えてこれらの疾患を有する脳組織を、ポジティブコントロールとして使用した。
【０１１９】
固定ステップ：ホルマリン固定パラフィン包埋切片
ポジティブコントロール：アルツハイマー病、レビー小体認知症、ダウン症候群、アミロイド症（ダッチタイプ）を有するおよびグアム  パーキンソン−認知症複合の脳組織。
溶液および試薬：
一次抗体：
マウス抗ベータアミロイド（クローン：６Ｆ／３Ｄ）（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ、Ｃａｔ＃  ＮＣＬ−Ｂ−Ａｍｙｌｏｉｄ）。最適な希釈度１：１００。種反応性：ヒト、マウス（より多くの情報については抗体データシートを参考にされたい）。
二次抗体：
ウマ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ビオチン化（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｔ＃  ＢＡ−２０００）。最適な希釈度１：５００。
検出試薬：
ＨＲＰ−ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｔ＃  ＳＡ−５００４）。最適な希釈度１：５００
手順：
１．パラフィン切片を蒸留水へ。
２．エピトープ回復：ギ酸エピトープ回復方法を使用する。
３．各２分間、洗浄緩衝液を２回交換して切片をすすぐ。
４．血清ブロッキング：３０分間、正常ウマ血清ブロッキング溶液と共に切片をインキュベートして、免疫グロブリンの非特異的結合をブロックする。
５．一次抗体：室温で１時間、一次抗体希釈緩衝液中で１：１００に希釈したマウス抗ベータアミロイド（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ、Ｃａｔ＃  ＮＣＬ−Ｂ−Ａｍｙｌｏｉｄ）と共に切片をインキュベートする。
６．２×２分間、洗浄緩衝液中ですすぐ。
７．ペルオキシダーゼブロッキング：１０分間、ペルオキシダーゼブロッキング溶液中で切片をインキュベートして、内因性のペルオキシダーゼ活性をブロッキングする。
８．３×２分間、洗浄緩衝液中ですすぐ。
９．二次抗体：室温で３０分間、二次抗体希釈緩衝液中で希釈したビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧと共に切片をインキュベートする。
１０．３×２分間、洗浄緩衝液中ですすぐ。
１１．検出：室温で３０分間、ＨＲＰ−ストレプトアビジン希釈緩衝液中で希釈したＨＲＰ−ストレプトアビジンと共に切片をインキュベートする。
１２．３×２分間、洗浄緩衝液中ですすぐ。
１３．色素原／基質：５〜１０分間、ＤＡＢペルオキシダーゼ基質溶液中で切片をインキュベートする。
１４．蒸留水中で短時間すすぐ。
１５．所望される場合、Ｇｉｌｌのヘマトキシリン溶液またはＭａｙｅｒのヘマトキシリン溶液を用いる対比染色。
１６．５分間、水道水中ですすぐ。
１７．２分間、９５％エタノール、２×３分間、１００％エタノールを通して脱水する。
１８．２×３分間、キシレン中できれいにする。
１９．永久封入剤を用いてカバーガラス。
結果：染色パターン：ポジティブ染色は、老年斑コア、斑周辺、およびびまん性斑中で観察することができる。アルツハイマー病のいくつかの症例では、染色は、血管壁および細胞外神経原線維変化中で観察することができる。
注釈：
１．関連プロトコール：Ｔａｕ（Ｔａｕ−２）（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ）
２．アビジン／ビオチンブロッキングは、腎臓、肝臓、前立腺、結腸、および腸などのある種の組織について内因性のビオチン活性をブロックするために必要とされる可能性があり、これらは、内因性のビオチンを含有している可能性がある。凍結切片については、液体窒素中での冷却後のイソペンタン中でスナップ凍結した新鮮な組織を、クリオモールド中でＯＣＴ化合物中に包埋する。４〜８ｕｍのクリオスタット切片に切り、スーパーフロストプラススライド（ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  ｐｌｕｓ  ｓｌｉｄｅ）上にマウントする。必要となるまで−８０℃でスライドを保管する。染色の前に、３０分間、室温でスライドを風乾し、５分間、氷冷アセトン中で固定する。さらに３０分間風乾する。次いで、日常的な免疫染色についてステップ３から始める。
【実施例６】
【０１２０】
アルツハイマー病の予防についての水迷路の結果
６、８、１０、１２、および１４月齢時にワクチン接種した１６月齢マウスの水迷路の結果。
【０１２１】
【表６】
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【０１２２】
６、８、１０、および１２月齢時にワクチン接種した１３月齢マウスの水迷路の結果。
【０１２３】
【表７】
0005829377.tif 000008
【実施例７】
【０１２４】
混合遺伝子ワクチン接種の脳組織像
ＤＮＡワクチンベクターのみ（図２ａ）またはＩＬ−４、ＩＬ−１０、脳由来神経成長因子（ＮＧＦ）、およびＡｐｏ−Ｅ２遺伝子を含有するＤＮＡワクチンの混合物（図２ｂ）を与えられた１８月齢アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）トランスジェニックマウスからの海馬領域のマウス脳組織は、上記に記載されるように処理した。マウスは、６、８、１０、１２、１４、および１６月齢時に筋肉内にワクチン接種して治療した。各混合ＤＮＡワクチン接種治療の投薬量は、４つの遺伝子のそれぞれについて注射当たり、約１００マイクログラムとした（合計約４００マイクログラム）。凍結脳組織は、蛍光ラベル抗アミロイドタンパク質抗体を用いて染色した。未治療マウス脳中に大量のアミロイド組織があり（図２ａ）、混合ＤＮＡワクチン治療マウス脳中でアミロイドタンパク質は著しく減少した（図２ｂ）。
【０１２５】
他に定義されない限り、本明細書に使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当技術分野の熟練者によって一般に理解されるように、同じ意味を有する。
【０１２６】
例示的に本明細書に記載される発明は、本明細書に明確に開示されていない任意の１つまたは複数のエレメント、１つまたは複数の限定の非存在下で、適切に実施することができる。したがって、たとえば、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などは、限定を伴うことなく広範囲に解釈されるものとする。さらに、本明細書に用いられる用語および表現は、限定的なものではなく、説明的な用語として使用され、そのような用語および表現の使用に、示され、記載される特徴またはその部分の任意の等価物を除外する意図はないが、様々な修正は、請求される発明の範囲内で可能であることが認識される。
【０１２７】
したがって、本発明は、好ましい実施形態によって明確に開示されているが、本明細書に開示されるそこに具体化される発明の任意の特徴、修正、改良、および変形は、当業者らによって用いられてもよく、そのような修正、改良、および変形は本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。本明細書で提供される物質、方法、および実施例は好ましい実施形態を代表するものであり、例示的なものであり、発明の範囲を限定するものではない。
【０１２８】
本発明は、広く、包括的に本明細書に記載されている。属の開示内にあるより狭い種および亜属群のそれぞれもまた発明の一部を形成する。これは、削除された物質が本明細書に明確に記載されているかどうかに関わらず、属から任意の主題を除く条件でまたはそういったマイナスの限定を伴って、本発明の属の説明を含む。
【０１２９】
加えて、本発明の特徴または態様が、マーカッシュグループに関して記載される場合、当業者らは、本発明もまた、それによって、任意の個々のメンバーまたはマーカッシュグループのメンバーのサブグループに関して記載されることを認識するであろう。
【０１３０】
刊行物、特許出願、特許、および本明細書に言及される他の参考文献はすべて、あたかもそれぞれが参照によって個々に組み込まれるのと同じ程度に、それらの全体が参照によって明確に組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が規制するものとする。
【０１３１】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲に述べられる。
【０１３２】
配列表
【数１−１】
0005829377.tif 000009
【数１−２】
0005829377.tif 000010
【数１−３】
0005829377.tif 000011
【数１−４】
0005829377.tif 000012
【数１−５】
0005829377.tif 000013
【数１−６】
0005829377.tif 000014
【数１−７】
0005829377.tif 000015
【数１−８】
0005829377.tif 000016
【図１ａ】
0005829377.tif 000017
【図１ｂ】
0005829377.tif 000018
【図１ｃ】
0005829377.tif 000019
【図１ｄ】
0005829377.tif 000020
【図１ｅ】
0005829377.tif 000021
【図２】
0005829377.tif 000022
【配列表】
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