(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子組織と両親媒性分子の層内の膜たんぱく質との相互作用を感知する方法であって、
センサ要素のアレイを有するセンサ装置を提供する段階であって、各センサ要素は、膜たんぱく質が挿入できる両親媒性分子の層を支持するように配置され、且つそれぞれの電極を含んでおり、また各センサ要素は、両親媒性分子の層が形成されたかどうかに応じて、また挿入された膜たんぱく質の数に応じて変化する性能の質を備え、分子組織と両親媒性分子の層内の膜たんぱく質との相互作用に応じた電極の電気信号を出力するように配置されている、センサ装置を提供する段階と、
それぞれが前記センサ要素の１つからの電気信号を増幅することのできる複数の検出チャンネルを有する検出回路を提供する段階であって、前記アレイ内のセンサ要素の数は検出チャンネルの数よりも多い、検出回路を提供する段階と、
前記検出チャンネルをそれぞれのセンサ要素に選択的に接続することのできるスイッチ装置を提供する段階と、
前記検出チャンネルから出力される増幅された電気信号に基づいて、両親媒性分子の層が形成され且つ受容できる数の有効膜たんぱく質が挿入されたセンサ要素それぞれに前記検出チャンネルを選択的に接続するように前記スイッチ装置を制御する段階と
を含む方法。
【請求項２】
前記膜たんぱく質がイオンチャンネルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記両親媒性分子の層が脂質二重層である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記方法が、分子組織と両親媒性分子の層内の膜たんぱく質との相互作用における確率論的な物理事象の発生を感知する方法である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記スイッチ装置を制御する段階が、個々の確率論的な物理事象を感知するのに必要な時間よりも長い時間に亘って、検出チャンネルをそれぞれのセンサ要素に選択的に接続するようにスイッチ装置を制御することからなる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記スイッチ装置を制御する段階が、両親媒性分子の層が形成され且つ受容できる数の有効膜たんぱく質が挿入されたそれぞれのセンサ要素に連続的に検出チャンネルを選択的に接続するようにスイッチ装置を制御することからなる、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記スイッチ装置を制御する段階が、両親媒性分子の層が形成され且つ受容できる数の有効膜たんぱく質が挿入されたそれぞれのセンサ要素に検出チャンネルの全てを選択的に接続するようにスイッチ装置を制御することからなる、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記スイッチ装置を制御する段階が、形成された両親媒性分子の層および挿入された受容できる数の有効膜たんぱく質を有さなくなるそれぞれのセンサ要素から検出チャンネルを選択的に切断し、両親媒性分子の層が形成され且つ受容できる数の有効膜たんぱく質が挿入された異なるそれぞれのセンサ要素に、切断された検出チャンネルを再接続するようにスイッチ装置を制御することからなる、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記センサ要素が各々、本体に形成され且つそれぞれの電極を中に配置したウェルを有する、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
分子組織と両親媒性分子の層内の膜たんぱく質との相互作用を感知する装置であって、
センサ要素のアレイを有するセンサ装置であって、各センサ要素は、膜たんぱく質が挿入できる両親媒性分子の層を支持するように配置され、且つそれぞれの電極を含んでおり、また各センサ要素は、両親媒性分子の層が形成されたかどうかに応じて、また挿入された膜たんぱく質の数に応じて変化する性能の質を備え、分子組織と両親媒性分子の層内の膜たんぱく質との相互作用に応じた電極の電気信号を出力するように配置されている、センサ装置と、
それぞれが前記センサ要素の１つからの電気信号を増幅することのできる複数の検出チャンネルを有する検出回路であって、前記アレイ内のセンサ要素の数は検出チャンネルの数よりも多い、検出回路と、
前記検出チャンネルをそれぞれのセンサ要素に選択的に接続することのできるスイッチ装置と、
前記検出チャンネルから出力される増幅された電気信号に基づいて、両親媒性分子の層が形成され且つ受容できる数の有効膜たんぱく質が挿入されたセンサ要素それぞれに前記検出チャンネルを選択的に接続するように前記スイッチ装置を制御するスイッチ制御装置と
を有する装置。
【請求項１１】
前記膜たんぱく質がイオンチャンネルである、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記両親媒性分子の層が脂質二重層である、請求項１０または１１に記載の装置。
【請求項１３】
前記スイッチ制御装置が、分子組織と両親媒性分子の層内の膜たんぱく質との相互作用における個々の確率論的な物理事象を感知するのに必要な時間よりも長い時間に亘って、検出チャンネルをそれぞれのセンサ要素に選択的に接続するようにスイッチ装置を制御する、請求項１０から１２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１４】
前記スイッチ制御装置が、両親媒性分子の層が形成され且つ受容できる数の有効膜たんぱく質が挿入されたそれぞれのセンサ要素に連続的に検出チャンネルを選択的に接続するようにスイッチ装置を制御する、請求項１０から１３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１５】
前記スイッチ制御装置が、両親媒性分子の層が形成され且つ受容できる数の有効膜たんぱく質が挿入されたそれぞれのセンサ要素に検出チャンネルの全てを選択的に接続するスイッチ装置を制御するように配置される、請求項１０から１４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１６】
前記スイッチ制御装置が、形成された両親媒性分子の層および挿入された受容できる数の有効膜たんぱく質を有さなくなるそれぞれのセンサ要素から検出チャンネルを選択的に切断し、両親媒性分子の層が形成され且つ受容できる数の有効膜たんぱく質が挿入された異なるそれぞれのセンサ要素に、切断された検出チャンネルを再接続するようにスイッチ装置を制御する、請求項１０から１５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１７】
前記センサ要素が各々、本体に形成され且つそれぞれの電極を中に配置したウェルを有する、請求項１０から１６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１８】
前記センサ制御装置が、検出チャンネルをそれぞれのセンサ要素に選択的に接続した後、形成された両親媒性分子の層および挿入された受容できる数の有効膜たんぱく質を有さなくなったかどうかを決定するために、検出チャンネルから出力される増幅された電気信号を監視し、有さなくなった場合に、検出チャンネルから出力される増幅された電気信号に基づいて、両親媒性分子の層が形成され且つ受容できる数の有効膜たんぱく質が挿入された異なるセンサ要素に選択的に前記検出チャンネルを接続するように配置される、請求項１０から１７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１９】
前記スイッチ装置が複数のスイッチ要素を有し、各スイッチ要素は、検出チャンネルの１つを、センサ要素の所定の群におけるいずれかのセンサ要素に選択的に接続するように配置される、請求項１０から１８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２０】
前記スイッチ要素が、Ｎ型マルチプレクサであり、前記所定の群がＮ個のセンサ要素を有する、請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
前記スイッチ装置が、検出チャンネルのいずれか１つをセンサ要素のいずれか１つに選択的に接続するように配置された複数のスイッチ要素を有する、請求項１０から１８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２２】
前記検出装置が、それぞれ積分増幅回路と、積分増幅回路の出力に接続される標本および保持回路を含む、請求項１０から２１のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２３】
前記センサ装置が、更に、全てのセンサ要素に共通の共通電極を有する、請求項１０から２２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２４】
バイアス源と、該バイアス源を前記センサ要素のいずれか１つに選択的に接続することのできる更なるスイッチ装置とを更に有する、請求項１０から２３のいずれか１項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、センサ要素を用いた物理現象の検出に関する。本発明の態様は、例えば、脂質二重層に挿入される膜たんぱく質との分子組織の相互作用に関係する事象のような、確率的物理事象の検出への特殊用途を有している。
【背景技術】
【０００２】
分子組織の検出を行なうために、脂質二重層に挿入された膜たんぱく質を使うことは開示されている。分子組織の膜たんぱく質との相互作用は、例えば、たんぱく質間隙である膜たんぱく質を流れるイオン電流を調節する、脂質二重層を横切って生じる電気信号を調節することができる。従って、調節特性の変化を検出するように脂質二重層を横切って生じる電気信号を監視することによって、分子組織の膜たんぱく質との相互作用を感知することができるのである。この原理に基づいて、様々な技術が提案されており、１つの例がＷＯ２００８／１０２１２０号公報に開示されている。
【０００３】
この技術を使っての分子組織の感知は、蛍光標識と検出の必要なく、単一分子と分子組織を直接識別する方法を提供する。ＤＮＡやその他の核酸の順序付け、安全と防御のために化学的或いは生物学的分子の感知、診断学のための生物学的標識の検出、薬剤開発のためのイオンチャンネルスクリーニング、生物学的分子間の相互作用のラベルフリー分析のような幅広い適用可能範囲がある。
【０００４】
しかし、基本的な原理や利点が確立されているとはいえ、この技術を比較的複雑で高価にし、拡大するのを困難にするような技術的な制限が存在する。典型的には、例えば、一列のセンサ要素を使うことにより、多くの相互作用を検出することが望まれるが、このことは、実用上および費用上の不利益を生ずる。
【０００５】
具体的な制約は、相互作用は単一の分子組織に関わっているので、関連する電気信号が非常に小さな大きさであり、非常に短い時間生じることである。その結果、相互作用の検出を可能にする十分な時間分解能を備えたセンサ要素それぞれからの電気信号を増幅するのに十分な感度を有する検出回路を使う必要がある。そのような検出回路は、典型的には、相互作用が検知されるセンサ要素のそれぞれに分離検出チャンネルを必要とする。しかし、この制約は、技術の費用に影響する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように、多くの商用利用のために、一列のセンサ要素を使って比較的多くの分子組織の相互作用を検出するが、比較的低コストである技術を開発することが望ましい。また、多くの商用利用のために、比較的小さなサンプル量に適用される技術が望ましい。
【０００７】
同様の問題が、脂質二重層における膜たんぱく質の使用に加えて、分子相互作用を検出するための他の技術や、物理現象を検知するための他の技術に当てはまる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１の態様によれば、物理現象を感知する方法であって、それぞれの電極を含む一列のセンサ要素で、各センサ要素が変化する性能の質を備えた物理現象に依存する電極の電気信号を出力するように配置されているセンサ要素を有するセンサ装置を提供し、
それぞれセンサ要素の１つからの電気信号を増幅することのできる複数の検出チャンネルを有する検出回路であって、列における該センサ要素の数は検出チャンネルの数よりも多い検出回路を提供し、
検出チャンネルをそれぞれのセンサ要素に選択的に接続することのできるスイッチ装置を提供し、
前記検出チャンネルから出力される増幅された電気信号に基づいて性能の容認できる質を有するセンサ要素それぞれに検出チャンネルを選択的に接続するためにスイッチ装置を制御することを特徴とする方法が提供される。
【０００９】
本発明の第２の態様によれば、物理現象を感知する装置であって、それぞれの電極を含む一列のセンサ要素で、各センサ要素が物理現象に依存する電極の電気信号を出力するように配置されており、該センサ要素が性能の変化する質を有しているようなセンサ要素を有するセンサ装置と、
それぞれセンサ要素の１つからの電気信号を増幅することのできる複数の検出チャンネルを有する検出回路であって、列における該センサ要素の数は検出チャンネルの数よりも多い検出回路と、
検出チャンネルをそれぞれのセンサ要素に選択的に接続することのできるスイッチ装置と、
前記検出チャンネルから出力される増幅された電気信号に基づいて性能の容認できる質を有するセンサ要素それぞれに検出チャンネルを選択的に接続するためにスイッチ装置を制御するように配置されたスイッチ制御装置とを備えたことを特徴とする装置が提供される。
【００１０】
このように、本発明は、物理現象の検出が性能の変化する質を有しているという認識に基づいている。例えば、脂質二重層における分子組織の膜たんぱく質との相互作用のような確率論的な物理事象の発生を検出した場合に、個々のセンサ要素は、脂質二重層の形成または挿入する膜たんぱく質の数における、異なる質の性能を有する。このことは、特定のセンサ要素が全く物理事象を検出できないような性能の質の変化や、異なるセンサ要素が異なる質の信号を出力することになりうる。
【００１１】
本発明は、センサ要素の数が電気信号を増幅するのに使われる検出チャンネルの数よりも多いような、一列のセンサ要素を使うことによってこの評価を利用する。検出チャンネルをそれぞれのセンサ要素に選択的に接続することによって、検出チャンネルが使われる効率を上げることができる。与えられた数の検出チャンネルでは、この効率の増加は、列に含まれるセンサ要素の数における冗長性を提供することによって効率的に達成される。
【００１２】
効率の増加は、検出チャンネルへの接続のための、性能の受け入れ可能な質を有するセンサ要素を選択する能力によって生じる。例えば、脂質二重層における膜たんぱく質との分子組織の相互作用である確率論的な物理事象の発生を検出する場合には、センサ要素の利用における非効率が、個々の脂質二重層において挿入する膜たんぱく質の数の統計的な変化のために典型的に生ずる。この統計的な変化は、いくつかのセンサ要素のみが挿入される膜たんぱく質の受け入れ可能な数を必然的に有するということを意味している。本発明は、検出チャンネルが、受け入れ可能な性能の質を有しているセンサ要素に選択的に接続されるので、検出チャンネルを使うことの効率の増加を提供する。
【００１３】
以下により詳細に論じる例においては、４の控えめな冗長性因子でさえ、ピーク効率は、３６％から８０％以上に改善されえ、検出チャンネルのよりよい使用をなす。
【００１４】
検出チャンネル３０は、センサ要素よりも典型的に著しく製造に費用がかかる。例えば、ある型の装置１においては、センサ装置２は、使い捨てできるくらいに十分に安価である。従って、与えられた数の有効な検出チャンネル３０を達成するために、検出チャンネルの利用の効率増加は、より少ない検出チャンネルが提供される必要があるので、全体として、装置のコストの減少へと導く。先の例に基づいて、３６％の効率で作動する検出チャンネルを有する５６９検出回路からと同じ質の有効な検出チャンネルの達成２０５の性能が、８０％の効率で作動する検出チャンネルを有する２５６検出回路から達成されうる。
【００１５】
本発明の別の利点は、冗長性がセンサ要素の効率の変化に大きな程度の交差を提供し、これにより、より均一な全体効率を維持することである。同様に、性能の質が作用の間に受容可能でなくなるようなセンサ要素が潜在的に可能であることである。性能の質が低下するセンサは、実際、センサアレイの正しい機能を阻害するようになりうるし、接続される検出チャンネルだけでなく他のチャンネルにも影響するのである。従って、センサを選択しない或いは、隔離する能力は、問題の検出チャンネルへの有用な信号を潜在的に回復するのと同様に全センサアレイの継続的な作動に極めて有益である。
【００１６】
その電気的な機能に関しては、スイッチ装置とスイッチ制御装置は、例えば、イメージセンサにおけるように、センサ要素への検出チャンネルの接続における時分割多重化（ＴＤＭ）を採用する公知のセンサ装置において用いられるものと同様である。そのような公知のセンサ装置においては、個々の検出チャンネルは、あらゆるセンサ要素からの増幅された出力信号を順番に出力するために、１群のセンサ要素の連続的なものに接続される。ＴＤＭの目的は、制限された数の検出チャンネルを備えたアレイの全てのセンサ要素からの信号を出力することである。全てのセンサ要素の出力が関係しているので、そのようなＴＤＭは、ＴＤＭ期間に対する低帯域を有する個々のセンサ要素からの関連する出力信号に依存しており、個々のセンサ要素が検出チャンネルに接続されない時に生じる出力信号の特性が失われない。例えば、ＴＤＭは、ＴＤＭ期間の信号を積算するセンサ要素によく適用される。
【００１７】
対照的に、本発明は、性能の質が変化するセンサ要素の冗長供給に関連する。受容可能な性能の質を有するように冗長群から選択される唯一のセンサ要素は、各検出チャンネルに接続される。増加された効率の利益を得るための技術の本質的な部分は、検出チャンネルに接続されていない他のセンサ要素の出力信号が失われないことである。このように、本発明は、検出チャンネルがセンサ要素に接続されるための平均期間よりも短い期間に生じる確率論的な物理事象の検出に適用可能である。
【００１８】
本発明は、分子組織の、例えば、脂質二重層における膜たんぱく質との相互作用のような確率的な物理事象の感知への特有の適用を有している。この分野では、センサ要素が、受容可能或いは不可能な性能の変化する質を有することが典型的である。例えば、脂質二重層における膜たんぱく質を用いるセンサ要素の場合、性能の質は、脂質二重層が形成するかどうか、および挿入する有効な膜たんぱく質の数の点で異なる。反対に、確率的な感知のこの分野では、感度の厳密な要求および検出チャンネルの時間分解能は、本発明の利点が特に強いことを意味している。
【００１９】
本発明は、また、それぞれ基板に形成されたウェルを有し、各電極が配置されるセンサ要素を使って感知することへの特有の適用を有している。
【００２０】
しかし、本発明は、物理現象に依存する電極で電気信号を出力するように配置される１列のセンサ要素によって任意の物理現象の感知へ一般的に適用可能であり、センサ要素は、可変の性能の質を有している。ここで、「物理」なる用語は、化学や生化学の分野における現象を含むあらゆる型の物理現象を示唆するように使われている。実際、本発明は、これらの分野における特有の適用を有している。
【００２１】
センサ要素は、固体状あるいは、生物学的イオンチャンネルのようなイオンチャンネルを有してもよい。好ましくは、例えば、溶血素である、膜たんぱく質イオンチャンネルのような生物学的イオンチャンネルである。
【００２２】
生物学的イオンチャンネルは、典型的には、膜に存在する。一般的に、膜は、イオンチャンネルが自然に生じるようになっている。膜は、固体状膜または生物学的膜である。生物学的膜は、脂質二重層を有し、これは、支持構造に固定される。
【００２３】
固体状膜は、例えば、ミクロ電子工学材料や、Ｓｉ３Ｎ４、Ａｌ２Ｏ３、ＳｉＯのような絶縁材料や、ポリアミドのような有機および無機ポリマや、テフロン（登録商標）のようなプラスチックや、２要素追加硬化シリコンラバーやガラスのようなエラストマなどの有機および無機材料を含む。
【００２４】
固体状膜は、支持上のフィルムやコーティングのような層であってもよい。
【００２５】
物理事象が、分子組織のイオンチャンネルとの相互作用であるとき、センサ要素は、相互作用の間にまたはその後に分子組織に相互作用する、酵素のような、分子モータを追加的に有してもよい。分子モータの例は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、エクソヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ファージモータプロテイン、逆転写酵素、ＤＮＡトランスロカーゼを含む。
【００２６】
本発明の実施例は、添付の図面を参照して、非限定的な例によって説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、脂質二重層に挿入される膜たんぱく質との分子組織の相互作用を感知する装置の概略図である。
【図２】図２は、装置の感知装置の一部の断面図である。
【図３】図３は、装置の検知回路の図である。
【図４】図４は、複数のウェルにおける冗長性の異なる水準でのウェルに挿入される膜たんぱく質の平均数に対する検出チャンネルの利用効率の図である。
【図５】図５は、冗長性の異なる水準でのウェルに挿入される膜たんぱく質の平均数に対して冗長性がないことに対する効率における利益の図である。
【図６】図６は、検出回路の修正形の図である。
【図７】図７は、検出回路のスイッチ装置の概略図である。
【図８】図８は、検出回路のスイッチ装置の代替形の概略図である。
【実施例】
【００２８】
まず、図１に概略的に示す脂質二重層における膜たんぱく質との分子組織の相互作用を感知する装置１を示す。この装置１は、データプロセッサ４に検出される検出回路３に接続されるセンサ装置２を有している。
【００２９】
このセンサ装置２は、参照として組み入れられる国際出願ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号公報に詳細に記載された装置である。そこに教示しているものに制限されることなく、センサ装置２は、本体２０からなる図２の断面図に示される構成を有しており、本体には、各々ウェル電極２２を有する凹部である複数のウェル２１が形成されている。多くのウェル２１は、装置１のデータ収集率を最適にするために設けられている。一般に、いくつのウェルがあってもよいが、典型的には、２５６または１０２４のウェルがあるが、図２には、ほんのわずかのウェル２１のみが示されている。
【００３０】
本体２０は、本体２０上に延びるカバー２３によって覆われ、各ウェル２１が開口するチャンバ２４を画定するように中空である。共通電極２５は、チャンバ２３内に配列される。
【００３１】
センサ装置２は、脂質二重層２６または各ウェル２１を横切る両親媒性分子の層を形成し、分子たんぱく質を脂質二重層２６に挿入するために準備される。この準備は、国際出願ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号公報に詳細に記載された技術と材料を使って達成されるが、以下のように要約できる。チャンバ２４の水溶液の残量からウェル２１の水溶液を分離する各ウェル２１を横切って脂質二重層２６を形成するために、水溶液がチャンバ２４に導入される。膜たんぱく質が、例えば、チャンバ２４に導入される前後に水溶液に導入されることによって、または、チャンバ２４の内面に堆積されることによって、水溶液中に提供される。膜たんぱく質は、自発的に脂質二重層２６に水溶液から挿入する。そのような自発的な挿入は、動的なプロセスであり、典型的にポアソン分布を有する個々の脂質二重層に挿入される膜たんぱく質の数に統計的な変化がある。
【００３２】
何らの与えられたウェル２１に関しては、脂質二重層２６が形成され、膜たんぱく質がそこに挿入されると、脂質二重層２６を横切る出力電気信号は相互作用に依存し、相互作用は特徴的に変化を引き起こすので、ウェル２１は、確率論的な物理事象である、分子組織と膜たんぱく質間の相互作用を感知するセンサとして使われ得る。例えば、膜たんぱく質がたんぱく質ポアである場合、ポアを通るイオンの流れを修正してポアを通る電流の特徴的な変化を生成する、たんぱく質ポアと特定の分子組織(検体)との間の相互作用が典型的にある。分子組織は、例えば、ＤＮＡ基のような、分子または分子の一部であってもよい。そのような相互作用は、非常に短く、各相互作用を検出したいのなら、高度の時間分解能と連続的な監視が必要である。
【００３３】
しかし、センサ要素としてのウェル２１の性能の質は、可変である。実際、形成の高効率は達成されうるが、脂質二重層は意味を成さず、ウェル２１は何の性能も有しない。更に著しくは、脂質二重層に挿入する有効な膜たんぱく質の数の変化が、性能の質に影響する。何らの膜たんぱく質が挿入しなければ、ウェル２１は性能を有さないことが明らかである。性能の質は、挿入する有効な膜たんぱく質の数によって変化する。例えば、変性されるために、所望の確率論的な感知のために有効ではない膜たんぱく質を挿入することがある。一般に、受容できる有効膜たんぱく質の数は、実行される確率論的感知の型に依存する。以下の例では、受容可能な性能の質は、単一の有効膜たんぱく質の挿入であり、複数の膜たんぱく質が受容できない。他の状況では、複数の有効膜たんぱく質の挿入は、受け入れられる。
【００３４】
検出回路３が図３に示すように配置されており、センサ装置２は、概略的に示されている。センサ装置２においては、ウェル２１が群に分割されている。図３では、群は４つのウェル２１からなり、群は、一般に、複数のウェル２１からなる。検出回路３は、各群のウェル２１と関連する検出チャンネル３０を有している。明瞭化のために、図３は、単一群のウェル２１と単一の検出チャンネル３０を示しているが、典型的には、図３に示すように配置された関連する検出チャンネル３０を各々備えた、複数群のウェル２１が設けられる。例えば、ある適用では、センサ装置２は、全部で４０９６のウェル２１と１０２４の検出チャンネル３０からなる。
【００３５】
装置１は、検出チャンネル３０を群のウェル２１のいずれか１つに選択的に接続できるスイッチ装置３１を更に含んでいる。特に、スイッチ装置３１は、１−４マルチプレクサ(一般には、１−ＮマルチプレスクサのＮは、群におけるウェル２１の数である)であって、これは、各々ウェル２１の１つのウェル電極２２と検出チャンネル３０の入力に接続される共通コンタクト３３の間に接続される４つのスイッチ３２を有している。
【００３６】
スイッチ３２は、原理的には、何らの型のアナログスイッチであるが、好ましくは、トランジスタによって形成される半導体スイッチであり、好ましくは、電界効果トランジスタである。スイッチ３２は、開放されるスイッチ３２を通って接続されないか、ラッチ３４からスイッチ３２に接続されないウェル２１から検出チャンネル３０に最小の漏れを提供するように選択される。動的充填注入効果は、ほとんどの時間で静的構成におけるスイッチで装置１を動作することにより避けられる。
【００３７】
スイッチ装置３１の状態は、デコーダロジック３５によって受信される制御信号によってラッチ３４を制御するデコーダロジック３５によって制御されるデジタルラッチ３４に蓄えられるデータによって制御され、いずれか１つのスイッチ３２が一度に閉鎖されて、対応するウェル２１を検出チャンネル３０に接続する。デコーダロジック３５は、各群のウェル２１に対してスイッチ装置３１が、他の群に関するスイッチの状態に影響することなく切り換えられるようにする。
【００３８】
スイッチ装置３１の構成を急速に変更することができるようにする要求はない。典型的には、変更は、分の時間係数で要求され、完全な更新は、０．１秒から１秒の時間係数で達成可能である。ラッチ３４をシフトレジスタとして実行し、デコーダロジック３５のための一連のデータインターフェースを実行することが容認され、好ましくは、異なる信号を利用する。
【００３９】
ウェル２１は、共通電極３５に接続されたバイアス電源３６によって検出チャンネル３０の入力に関してバイアスされる。典型的には、バイアス電圧は、−２００ミリボルトに達する。
【００４０】
検出チャンネル３０に積極的に接続されないウェル２１は、ウェル２１の流体を介して共通電極２５の位置に浮かぶことができ、従って、電流を通過しない。このことは、二重層２６を有さないウェル２１によって増幅飽和のための位置を削減する。デコーダロジック３５は、スイッチ３２の全てが開く状態を提供するためにラッチ３４を制御し、これにより、群の全てのウェル２１が浮くことができるようになる。この状態で、検出チャンネル３０は、入力電流を有さず、ウェル２１は電流を通さない。
【００４１】
コストを下げるために、検出回路３は、センサ装置２から分割して提供される半導体チップに実行される。しかし、代替的に、検出回路３のいくつかの構成要素、例えば、スイッチ装置３１、ラッチ３４とデコーダロジック３５をセンサ装置２に一体化された分割した半導体チップに実行することができる。これは、相互接続の要求を減じることができるが、センサ装置２が制御信号をデコーダロジック３５に供給するための少しのデジタル制御線を持つことを要求する。
【００４２】
随意的には、検出回路３は、作動ウェル２１によって通過される電流に等しい、公知の大きさの較正電流、典型的には−５０ｐＡから−１００ｐＡの電流を検出チャンネル３０に検査目的で供給するために、以下のように配置されえ、検出回路３の機能性は、いかなる化学の導入よりも前に確実にされる。検出回路３は、較正電流を供給するために作動可能な較正源３７と、較正源３７と共通コンタクト３３の間に接続されるスイッチ３８を有している。スイッチ３８は、ウェル２１に代えて、検出チャンネル３０への較正源３７の接続を可能にするために、スイッチ装置３１と同様にして、ラッチ３４とデコーダロジック３５によって制御される。
【００４３】
スイッチ装置３１によって接続されるウェル２１から電気信号を増幅するために、各検出チャンネル３０は以下のように配置される。検出チャンネル３０は、従って、関連する相互接続によって起こる特性の変化を検出するために、十分な分解能を有する非常に小さな電流を増幅するように設計されている。検出チャンネル３０は、また、そのような相互作用を検出するのに必要な時間分解能を提供するのに十分な高帯域を備えるように設計される。この制約は、敏感で、それ故、高価な構成要素を必要とする。
【００４４】
検出チャンネル３０は、異なる増幅器である電荷増幅器４０を含み、この増幅器は、検出チャンネル３０の入力からなり共通コンタクト３３に接続される反転入力と、内部照合線源４１に接続される非反転入力を有する。バイアス源３６は、センサ装置２の共通電極２５と電荷増幅器４０の非反転入力の間に接続され、バイアス電圧をその間にかける。
【００４５】
電荷増幅器４０は、電荷増幅器４０の反転入力と電荷増幅器４０の出力の間に接続されるコンデンサ４２によって、積分増幅器として配置される。制御スイッチ４３は、電荷増幅器４０によって行われる積分を制御するために、コンデンサ４２に並行に接続される。電荷増幅器４０は、ウェル２１から供給される電球を積分し、各積分期間に供給される電荷を代表する出力を提供する。ここで、積分期間とは、電流を代表する一定持続時間であり、一定持続時間は、接続されるウェル２１で生じる事象の監視のための十分な分解能を与えるだけ短いものである。
【００４６】
電荷増幅器４０の出力は、並行に配置され、随意的に電圧利得を備えた２つのサンプルホールド増幅器４４に接続される。使用に当たって、サンプルホールド増幅器４４は、各積分期間の最初と最後に積分電荷増幅器４０の出力をサンプルし保持するために制御スイッチ４３に同期的に切り換えられる相関ダブルサンプリングを提供するように作動される。有用な信号が、サンプルホールド増幅器４４の２つの出力間の違いを取ることによって導出される。サンプリング率は、出力信号を時間分解するのに十分高い。サンプルホールド増幅器４４によって出力された増幅信号は、全ての検出チャンネル３０によって出力された増幅信号を多重化し、その信号をデータプロセッサ４に供給するマルチプレクサ４５に供給される。マルチプレクサ４５は、アナログデジタルコンバータ４６を介してデータプロセッサ４に接続されたシフトレジスタでもよいが、一般には、マルチプレクサ４５は、サンプルホールド増幅器４４とマルチプレクサ４５間に生じるアナログデジタル変換をするデジタル装置を有する何らの適切な形式でもよい。
【００４７】
また、各検出チャンネル３０は、並行に配置され、交互に使われて、各電荷増幅器がリセットされて他の電荷増幅器が積分を実行する優れた効率を提供するような、２つの電荷増幅器を備えてもよい。
【００４８】
共通電極２５を介してウェル２１を横切って適用される電位を反転することによってたんぱく質ポアである膜たんぱく質を取り除くことが必要になることがある。これを有効にするために、電荷増幅器４０への入力は、(典型的には、−５０ｐＡから−１００ｐＡの大きさの、標準電流に類似の大きさの)マイナス電流が提供される時でも、一定のバイアス電位に維持するように設計される。
【００４９】
データプロセッサ４は、検出回路３０から出力される、各検出チャンネル３０からの信号を受信し処理する。データプロセッサ４は、増幅された信号を蓄え処理する。
【００５０】
データプロセッサ４は、制御信号をデコーダ回路３５に供給することによって、検出回路３の作動を制御し、切り換え制御装置として作動する。データプロセッサ４は、適切なプログラムを動かすマイクロプロセッサでもよいし、専用のハードウェアを含んでもよい。データプロセッサ４は、デスクトップやラップトップのようなコンピュータに挿入されるカードでもよい。そのようなコンピュータは、増幅された信号を使用者に表示するためのグラフィックツールを含んでもよいし、関連する相互作用に依存する増幅された信号の分析を提供してもよい。
【００５１】
作動においては、データプロセッサ４は、各検出チャンネル３０によって出力された増幅された信号４０を監視し、それに基づいてスイッチ装置３１を制御する。特に、データプロセッサ４は、検出チャンネル３０を、性能の受容可能な質、すなわち、この例では、脂質二重層２６が単一の膜たんぱく質を有する脂質二重層を横切って形成されること、を有するウェル２１の１つに接続するために、スイッチ装置３１を制御する。
【００５２】
このために、データプロセッサ４は、上記したように、センサ装置２が、使用者によって準備されると、センサ選択工程を行う。
【００５３】
このセンサ選択工程において、スイッチ装置３１は、各群に関して、ウェル２１のそれぞれに連続的に検出チャンネル３０を接続するように制御される。この工程において、増幅された信号は、脂質二重層が形成されたかどうか、挿入された膜たんぱく質の数を、各ウェル２１に関して決定するように監視される。このことは、例えば、参照によって組み入れられるＷＯ２００８／１０２１２０号公報(国際出願ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６２号)に開示される分析技術を使って、ウェル２１の物理状態の特徴である信号を検出するために、増幅された信号を分析することによって達成可能である。性能の受容可能な質を有するウェル２１は、このようにして増幅信号に基づいて検出される。
【００５４】
センサ選択工程においては、群の各ウェル２１は、検査されるか、または、性能の受容可能な質を有するウェル２１が検出されるとすぐに、工程は停止する。いずれにしても、スイッチ装置３１は、引き続き切り換えられて、検出チャンネル３０を、性能の受容可能な質を有するウェル２１に接続する。その後、ウェル２１からの増幅された信号は、ウェル２１における事象の感知を可能にするように監視される。
【００５５】
理想的には、検出チャンネル３０の各々は、スイッチ装置３１によってウェル２１に接続される。しかし、ウェル２１が性能の受容できる質を有していないなら、スイッチ装置３１は、引き続き切り換えられて、群の全てのウェル２１から検出チャンネル３０を切り離す。この場合、ウェル２１の性能の質が受容可能になったかどうかを検出する所定の時間の後に、センサ選択工程は繰り返される。
【００５６】
検出チャンネル３０は、スイッチ装置３１によって連続的に、すなわち、複数のウェル２１を横切る検出チャンネル３０を走査することなく、ウェル２１に接続される。これは、存続しないウェル２１における事象を感知する必要のためである。これは、入射光がセンサ要素で積分され、増幅器が引き続きセンサ要素の走査された線に接続されるようなＣＭＯＳ光センサとは対照的である。
【００５７】
同様に、それに続く作用の間に、増幅された信号は、例えば、脂質二重層２６に挿入されるようになる第２膜たんぱく質によって、または、脂質二重層２６から分離する挿入された膜たんぱく質によって、与えられたウェル２１の性能の質が受容できなくなるかどうかを検出するために監視される。この場合、スイッチ装置３１は、引き続き、性能の受容可能な質を有する異なるウェル２１に検出チャンネル３０を接続するように切り換えられる。異なるウェル２１は、性能の受容可能な質を有するようにあらかじめ決定されたウェル２１でもよいし、センサ選択工程を再び実行することによって選択されてもよい。検出チャンネル３０は、有用なデータを供給し続け、装置１の効率は、回復される。しかし、受容できなくなるウェル２１の性能の質は比較的まれであることは注目される。典型的には、ウェル２１の性能の質は、膜たんぱく質と分子組織の間の関連する相互作用の多くの発生を感知するのに十分な期間受容可能なままである。従って、検出チャンネル３０がセンサ要素に接続される平均期間は、個々の事象を感知するのに必要な時間よりも長い。
【００５８】
検出チャンネル３０の数と比べて、ウェル２１の数における冗長性は、検出チャンネル３０が使われる効率を、以下のように増加する。
【００５９】
膜たんぱく質の脂質二重層２６への挿入は、ポアソン統計に従う任意の工程である。これは、ウェル２１ごとの膜たんぱく質の平均数が１であったとしても、十分な数のウェル２１は、０、２またはそれ以上の挿入される膜たんぱく質を有し、これらのウェル２１は有用ではない、ということを意味している。例えば、特定の例では、ウェル２１でちょうど１つの膜たんぱく質を発見する最大可能性は、約３６％であり、これは、条件が最適である場合にのみ達成できることが分かった。膜たんぱく質の濃度の大小は、利用可能なウェル２１の減少（特に露光の現象）に速やかに帰結する。実施可能な実施例において達成できるであろう効率の現在の見積もりは、約２０％である。
【００６０】
ウェル２１の数における冗長性の欠如において、１０２４の検出チャンネル３０を有する装置１のための重大性は、せいぜい、約３６８の作動ウェル２１だけを処理できるということである。残りのウェル２１とその検出チャンネル３０は、利用可能ではない。同様にして、１２８の検出チャンネル３０を有する装置１のためには、性能の受容可能な質を有するウェル２１の数は、せいぜい４６くらいであると思われる。与えられた適用に要求される、与えられた数のウェル２１を、冗長性なく達成するために、たくさんの検出チャンネル３０を備えた装置を提供する必要がある。しかし、検出チャンネル３０は高価なので、たくさんの使えないデータを作って捨てる必要を生じることと同様に、コストと信頼性の点で逆効果である。しかし、装置１におけるウェル２１の数の冗長性は、検出チャンネルの利用における効率の増加によってこの結果を処理するのである。
【００６１】
脂質二重層２６は、現在の目的では、１００％に近いと思われる効率で形成される。膜たんぱく質は、濃度と露光時間が、ウェル２１あたりの膜たんぱく質の平均値を１に近いところに調節する解決策を使って挿入される。ウェル２１は、実際、同一サイズの脂質二重層２６を有しないので、その捕獲効率は、変化する。これは、ポアソン確率と組み合わせて、ウェル２１あたりの膜たんぱく質２１の数を増やす。装置１は、センサ装置２がどのウェル２１が有効で有用な膜たんぱく質を有するかを検出する特徴がある。
【００６２】
各群のウェル２１の数をＮとすると、各検出チャンネル３０は、１つだけのウェル２１の代わりにＮ個のウェル２１にアクセスすることになり、Ｎ個のウェル２１の１つが性能の受容可能な質を有する可能性が大きくなる。アレイ特徴フェーズの終わりに、装置１は、多くの利用可能なウェルを用意できていることが期待される。この背景は、以下のように理解される。
【００６３】
１つだけの膜たんぱく質を与えられたウェル２１に挿入する確率Ｐ１は、脂質二重層２６の面積に依存する定義された平均値を有するポアソン分布と、溶解状態の膜濃度と、脂質二重膜２６が膜たんぱく質溶液に露出する時間に従う。各検出チャンネル３０がＮ個のウェル２１にアクセスする効率は、Ｎ個のウェル２１の少なくとも１つが挿入されるちょうど１つの膜たんぱく質を有する確率によって与えられる。Ｎ個のウェル２１のうちの１つ以上が、挿入される１つの膜たんぱく質を有すると、装置１は、余分なデータを集めない。全効率は、何らの与えられたウェル２１がちょうど１つの挿入された膜たんぱく質を有してない確率Ｑ(Ｑ＝１−Ｐ１)から計算される。Ｎ個のウェルの全てが挿入される１つ以外の膜たんぱく質を有する確率は、単純にＱＮである。少なくとも１つのウェル２１が挿入される単一の膜たんぱく質を有する確率は、それ故、（１−ＱＮ）である。
【００６４】
これらの確率に基づいて、ウェル２１の数における冗長性の異なる度合に対するウェル２１ごとの膜たんぱく質の平均の数での変化の全効率（すなわち、受容可能な性能の質を備えたウェル２１を有する検出チャンネルの比率）がどのように検出チャンネル３０ごとの１つのウェル２１（すなわち、冗長性無し）からチャンネルごとに８つのウェル２１に上昇するかをシミュレーションする。結果は、チャンネル効率を示す図１と、冗長性のない場合と比較した効率ゲインを示した図２に示される。第１曲線（Ｎ＝１）は、各検出チャンネル３０が１つのウェル２１にアクセスし、上記したように、約０．３６のピーク効率を有する場合を示している。利用可能なウェル２１の数が増加すると、効率は上昇する。上昇は最初急であるが、チャンネルごとのウェル２１の数が増加するとゆっくりになる。例えば、検出チャンネル３０ごとに４つのウェル２１の冗長性は、約８３％のピーク効率を提供する。
【００６５】
上昇する冗長性は、曲線におけるピークをわずかに平らにし、ウェル２１あたりの膜たんぱく質の平均の数が大きな要素によって変化したとしても、高効率が維持されることを意味する。これは、システムにおける変動性にいくらかの弾性を与える。
【００６６】
ピーク効率は、ウェル２１あたり１つの膜たんぱく質を平均で得られるが、図５の曲線の形状は、ウェル２１ごとの膜たんぱく質の平均の数が最適値からかけ離れている、特に低い側にかけ離れていると、冗長性が不釣合いな平均を与えるということを示している。冗長性は、ウェル２１あたりの膜たんぱく質の減少した平均値によって生じる効率の損失を（完全に補正することなく）相殺するゲイン要素を与えるように作用する。これは、装置１に大きな公差を与えることに等しい。
【００６７】
表１は、４つ折り変形の膜たんぱく質露出を超えての冗長性要素の機能としての最大電圧効率（溶液が脂質二重層２６に接触している時間によって増加された膜たんぱく質溶液の濃度）を示す。
【００６８】
【表１】
0005781502.tif 000002
【００６９】
冗長性が増加すると、露出の機能としての全効率変化は減少する。
【００７０】
このように、少量の冗長性は、表２に示したように、装置の全効率を改善する。表２は、異なると見做される膜たんぱく質挿入効率（ＰＩＥ）のための性能の受容可能な質を有するウェル２１の数を示している。
【００７１】
【表２】
0005781502.tif 000003
【００７２】
明らかに改善が示されている。例えば、２０４８のウェル２１(４つ折りの冗長性)を備えた５１２の検出チャンネル３０を有する装置１は、最適条件を下回る性能の受容できる質を有し、約２０％だけの増幅器チャンネルが非活動である、４０８のウェル２１を与えることが期待される。この性能の質は、１０２４のウェル２１を備えた１０２４の検出チャンネル３０を有する装置が最適条件を下回る性能の受容できる質を有する３６８のウェル２１だけを与えることが期待される、冗長性無しに期待されるものと対照的であり、これは、性能の悪い質のために２倍の検出チャンネル３０を必要とするのである。
【００７３】
上記の実施例は、各検出チャンネル３０を与えられた群のＮ個のウェル２１、例えば、１からＮのマルチプレクサに選択的に接続するスイッチ装置３１を使う。これは、図７に概略的に示されており、例えば、２つの検出チャンネル３０への接続のために２つの郡に配置された８つのウェル２１がある。スイッチ装置３１は、ウェル２１が属する群に対して、各ウェル電極２２と共通コンタクト３３間に接続されるスイッチ３２を含む。
【００７４】
代替として、原理的には、ウェル２１のいずれかをウェル２１のいずれかへの検出チャンネル３０に選択的に接続するスイッチ装置３１を用いることができ、例えば、クロスバースイッチを使うことができる。これは、図８に概略的に図示されており、例えば、２つの検出チャンネル３０への接続のために配置された８つのウェル２１が示される。スイッチ装置３１は、各ウェル電極２２と各共通コンタクト３３間を接続するスイッチ３２を備えている。これは、与えられた程度の冗長性のための効率ゲインを更に改善する。ウェル２１の数は、ウェル２１を経験する期待される確率を反映する要素によって検出チャンネル３０の数を超えており、原理的には、この要素が十分に高ければ、１００％効率に接近することも可能である。しかし、この接近は、複雑で著しいコストの増加を伴い、特に、ウェル２１と検出チャンネル３０の数が増加すると、要求されるスイッチ３２の数がウェル２１の数と検出チャンネル３０の数の積になる。
【００７５】
このような効率の増加は、以下のような利点を提供する。
【００７６】
重要なことは、何らの与えられた適用に要求されるウェル２１の与えられた数から得るのに必要とされる検出チャンネル３０の数が減少することである。ウェル２１が共通の工程によって形成される単なる凹部であるのに対して、検出チャンネル３０は感度のよい電子部品を含んでいるので、検出チャンネル３０は、より複雑で製造するのに費用がかかる。同様に、センサ装置２と検出回路３間には、少数の接続が必要とされる。このように、検出チャンネル３０の数の減少は、装置１全体としてのコストを下げ、信頼性と製造歩留まりを改善する。検出回路３の大きさもまた、減らされる。
【００７７】
同様にして、検出回路３からデータプロセッサ４へ送られる生データの量も減少する。これは、帯域を減らし、（ハードウェアとソフトウェア資源を含む）データプロセッサの資源の利用効率を上げ、そして、コストを下げる。または、処理資源の与えられた利用可能性が、使われるセンサ装置２のサイズを増やす。
【００７８】
解析される試料の量が限られる場合の利点として、相互作用に利用可能な分子組織の数の実用上の制限がある。センサ要素の使用の効率の上昇は、利用可能な相互作用の大部分が検出回路によって検出されることを意味している。よって、大量のデータを得るのに必要な場合に、相互作用の数を増やすことは、適用において重要である。
【００７９】
図６に示された検出回路３の改良された形態が記載される。図３に示した検出回路３と共通する要素は、共通する参照番号を付し、繰り返しの説明はなさない。
【００８０】
図３に示す検出回路３において、たんぱく質ポアである膜たんぱく質を取り除くことは、共通電極２５に適用される逆バイアスを反転することによって達成される。これは効果的であるが、全体センサ装置２での一時的なデータロスを生じるという不運なほうの影響がある。
【００８１】
図６に示される検出回路３０の改良形は、他のウェル２１に影響することなく、選択されたセンサウェル２１を横切って反転電位を与える機能を提供する。
【００８２】
上記したように、共通電極２５は、内部照合線源４１によって提供される内部照合電圧Ｖｒを超えるバイアス源３６によって提供される電圧Ｖｂを維持し、これにより検出チャンネル３０に接続されるウェル２１が要求される順方向バイアスを経験する。スイッチ装置３１は、ウェル電極２５がウェル電位が浮くようにする検出チャンネル３０への入力から孤立するようにする。
【００８３】
検出回路３０は、障害物除去バイアス源４７と、４つのスイッチ４９を備え障害物除去バイアス源４７の出力をウェル２１の１つのウェル電極２２に選択的に接続するスイッチ装置３１と同一の構成を有する更なるスイッチ装置４８を追加的に含んでいる。更なるスイッチ装置４８は、ラッチ３４とデコーダロジック３５によって制御される。障害物除去バイアス源４７は、たんぱく質ポアを除去するのに十分なバイアス電圧Ｖｕを提供する。信頼できる障害物除去を確保するために、原理的に必須ではないが、逆バイアスが典型的である。
【００８４】
データプロセッサ４は、増幅された信号を監視する一方、たんぱく質ポアが塞がれて、データプロセッサが塞がれたたんぱく質ポアに接続されたスイッチ３２を開放するようにスイッチ装置３１を制御し、塞がれたたんぱく質ポアを有するウェル２１に接続されたスイッチ４９を閉鎖するように更なるスイッチ装置４８を制御する。これにより、ウェル２１のウェル電極２２が逆バイアスになり、たんぱく質ポアを除去する。そのような障害物除去をするのに十分な時間の後、スイッチ４９は、逆バイアスを切断するように開放され、スイッチ３２は、検出チャンネル３０を関連するウェル２１に再接続するように閉鎖される。
【００８５】
上記した装置１は、脂質二重層２６における膜たんぱく質との分子組織の相互作用である物理現象を感知するように設計されている。しかし、これによって達成される利点は、センサ要素の性能の質が可変であるような他の物理現象を感知することに同様に利用可能である。例えば、物理事象の発生から独立した電極に電気信号を出力することによって物理事象の発生を感知するように配置された１列のセンサ要素によって、分子組織の他の型の相互作用および／または他の型の物理事象を検知する装置において、同様の利点が達成され、ここで、センサ要素の性能の質は、可変である。基板に形成されたウェルを有し、各電極を内部に配置するセンサ要素を使って感知するための装置において、同様の利点が達成される。
【００８６】
上記の例においては、センサ要素として作用するウェル２１の性能の質は、単一の有効な膜たんぱく質がウェル２１を横切って脂質二重層に挿入されるかどうかに基づいて受容可能か否かを決定される。しかし、他の性能の質の手段が、他の型の感知に適切である。性能の質の手段は、上記の例のように、センサ要素が作動しているか否かの単純な決定であるが、他の状況では、例えば、センサ要素に関連するゲインやノイズのような、出力信号の質の定量的な手段でありうる。例えば、脂質二重層における膜たんぱく質との分子組織の相互作用を確率論的に感知する分野では、出力信号の質は、挿入される膜たんぱく質の数（複数の膜たんぱく質が望ましい）や、脂質二重層の面積や電極性能のようなパラメータで変化しうるノイズや、電極性能のようなパラメータで変化しうるドリフトに依存するかもしれない。
【００８７】
請求の範囲に規定した特徴は、組み合わせて使いうるものとする。
【図１】
0005781502.tif 000004
【図２】
0005781502.tif 000005
【図３】
0005781502.tif 000006
【図４】
0005781502.tif 000007
【図５】
0005781502.tif 000008
【図６】
0005781502.tif 000009
【図７】
0005781502.tif 000010
【図８】
0005781502.tif 000011