(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
デングＤＩＩＩドメインポリペプチドを発現するコード化ヌクレオチド配列であって、前記ポリペプチドが４種の異なるデングウイルスサブタイプに由来するＤＩＩＩドメインを含む配列と、
哺乳類内における前記ポリペプチドの発現を調節し、前記コード化ヌクレオチド配列に機能的に連結するプロモータと、
を含む、哺乳類内でデングウイルスの４種全てのサブタイプに対する免疫反応を誘発するポリペプチドを発現させることができ、ここで、前記コード化ヌクレオチド配列が配列番号５で表されるものである、核酸コンストラクト。
【請求項２】
前記コード配列のＮ−末端に機能的に連結し、前記プロモータに機能的に連結するＩｇＥリーダー配列をさらに含む、請求項１に記載の核酸コンストラクト。
【請求項３】
前記コード配列のＣ−末端に結合したポリアデニル化配列をさらに含む、請求項１又は２に記載の核酸コンストラクト。
【請求項４】
前記核酸コンストラクトのコドンが最適化されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
【請求項５】
哺乳類内で免疫反応を誘発するのに有効な量の共通デング抗原を哺乳類の細胞内で発現させることができるＤＮＡプラスミドであって、前記共通デング抗原が、デングウイルス−サブタイプ１、デングウイルス−サブタイプ２、デングウイルス−サブタイプ３、若しくはデングウイルス−サブタイプ４の共通ＤＩＩＩドメイン、又はこれらの組み合わせを含むＤＮＡプラスミドと、
製薬上許容できる賦形剤と、
を含む、哺乳類内で複数のデングウイルスサブタイプに対する免疫反応を生じさせることができるＤＮＡプラスミドワクチンであって、
前記ＤＮＡプラスミドが、前記共通デング抗原をコード化するコード配列に機能的に連結するプロモータを含み、前記共通ＤＩＩＩドメインが配列番号１０で表される配列から成る、ＤＮＡプラスミドワクチン。
【請求項６】
前記ＤＮＡプラスミドが、前記コード配列のＮ−末端に結合し、前記プロモータに機能的に連結するＩｇＥリーダー配列をさらに含む、請求項５に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
【請求項７】
前記ＤＮＡプラスミドワクチンが、前記コード配列のＣ−末端に結合したポリアデニル化配列をさらに含む、請求項５又は６に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
【請求項８】
前記ＤＮＡプラスミドのコドンが最適化されている、請求項５〜７のいずれか一項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
【請求項９】
前記製薬上許容できる賦形剤がアジュバントである、請求項５〜８のいずれか一項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
【請求項１０】
前記アジュバントが、ＩＬ−１２及びＩＬ−１５から成る群から選択される、請求項９に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
【請求項１１】
前記製薬上許容できる賦形剤がトランスフェクション促進剤である、請求項５〜８のいずれか一項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
【請求項１２】
前記トランスフェクション促進剤が、ポリアニオン、ポリカチオン、又は脂質である、請求項１１に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
【請求項１３】
前記トランスフェクション促進剤が、６ｍｇ／ｍＬ未満の濃度のポリ−Ｌ−グルタミン酸である、請求項１１に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
【請求項１４】
前記ＤＮＡプラスミドワクチンが、１ｍｇ／ｍＬ以上の全ＤＮＡプラスミド濃度を有する、請求項５〜１３のいずれか一項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
【請求項１５】
前記ＤＮＡプラスミドが複数の独特なＤＮＡプラスミドを含み、前記複数の独特なＤＮＡプラスミドのそれぞれが、デングウイルス−サブタイプ１、デングウイルス−サブタイプ２、デングウイルス−サブタイプ３、若しくはデングウイルス−サブタイプ４、又はこれらの組み合わせに由来するＤＩＩＩドメインを含むポリペプチドをコード化している、請求項５〜１４のいずれか一項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
【請求項１６】
前記コード化ヌクレオチド配列が配列番号５を含む、請求項１５に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
【請求項１７】
デングウイルスＤＩＩＩドメインを発現する少なくとも２種の異なるＤＮＡプラスミドを含む、請求項１６に記載のＤＮＡプラスミドワクチンであって、前記プラスミドが、
共通デングウイルス−サブタイプ１ ＤＩＩＩドメインをコード化する配列を含むＤＮＡプラスミド、
共通デングウイルス−サブタイプ２ ＤＩＩＩドメインをコード化する配列を含むＤＮＡプラスミド、
共通デングウイルス−サブタイプ３ ＤＩＩＩドメインをコード化する配列を含むＤＮＡプラスミド、及び
共通デングウイルス−サブタイプ４ ＤＩＩＩドメインをコード化する配列を含むＤＮＡプラスミド、
から成る群から選択される、ＤＮＡプラスミドワクチン。
【請求項１８】
共通デングウイルス−サブタイプ１ ＤＩＩＩドメインをコード化する配列を含むＤＮＡプラスミド、
共通デングウイルス−サブタイプ２ ＤＩＩＩドメインをコード化する配列を含むＤＮＡプラスミド、
共通デングウイルス−サブタイプ３ ＤＩＩＩドメインをコード化する配列を含むＤＮＡプラスミド、及び
共通デングウイルス−サブタイプ４ ＤＩＩＩドメインをコード化する配列を含むＤＮＡプラスミド、
を含む、請求項１７に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
【請求項１９】
前記共通デングウイルス−サブタイプ１ ＤＩＩＩドメインが配列番号１である、請求項１７に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
【請求項２０】
前記共通デングウイルス−サブタイプ２ ＤＩＩＩドメインが配列番号２である、請求項１７に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
【請求項２１】
前記共通デングウイルス−サブタイプ３ ＤＩＩＩドメインが配列番号３である、請求項１７に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
【請求項２２】
前記共通デングウイルス−サブタイプ４ ＤＩＩＩドメインが配列番号４である、請求項１７に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
【請求項２３】
前記哺乳類がヒト以外の霊長類である、請求項５〜２２のいずれか一項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
【請求項２４】
前記免疫反応が体液性反応である、請求項５〜２３のいずれか一項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
【請求項２５】
前記免疫反応が細胞性反応である、請求項５〜２３のいずれか一項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
【請求項２６】
前記免疫反応が、体液性反応と細胞性反応との組み合わせである、請求項５〜２３のいずれか一項に記載のＤＮＡプラスミドワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００８年１月１１日出願の米国仮出願第６１／０２０，４９０号の利益を請求し、その全文を参照することにより本明細書に組み込む。
【０００２】
本発明は、改善されたデングワクチン、免疫反応を誘導するための、並びに個体をデングウイルスに対して予防的に及び／又は治療的に免疫するための改善された方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
デングウイルス（ＤＥＮＶ）は、デング熱（ＤＦ）及び重篤な生命を脅かす疾病であるデング出血熱／デング熱ショック症候群（ＤＨＦ／ＤＳＳ）を引き起こす新興蚊媒介病原体である。ＤＥＮＶは、フラビウイルス科のフラビウイルス属に属する、小さな、エンベロープを有する、プラス鎖ＲＮＡウイルスである。４種の異なるサブタイプ又は血清型のデングウイルス（ＤＶ−１〜ＤＶ−４）が、ネッタイシマカ及びヒトスジシマカ種の蚊にかまれることを通してヒトに伝染する。毎年５０００万〜１億例のＤＦ及び２５０，０００〜５０００００例のＤＨＦが発生すると推定されている。世界の人口の５分の２がデング熱の流行地で生活しており、年間５０００万〜１億例のデング熱感染が発生しているため、デング熱は重要な国際的公衆衛生問題となっている。さらに、２５億人が、有効な介入の存在しない、世界の亜熱帯及び熱帯地方において、感染する危険性がある。
【０００４】
１００を超える熱帯の国々が風土性のデングウイルス感染症を有しており、ＤＨＦは６０を超えるこれらの国々で記録されている。ＤＦ／ＤＨＦのサーベイランスは大部分の国で不満足なものであり、過去において主にＤＨＦに焦点をあてたものである；よって毎年発生するＤＦの数は推定でしかあり得ない。しかしながら、１９９８年に、アジア及びアメリカ全体で広範囲にわたって病気が流行し、１２０万例を超えるＤＦ／ＤＨＦが世界保健機関（ＷＨＯ）に報告された。ＤＨＦの地球的規模の報告は、過去２０年間で平均して５倍増加している。２１世紀の初頭には、流行の活動性に応じて、毎年５０００万〜１億例のＤＦ及び数十万例のＤＨＦが発生すると推定される。国によって致死率（ＣＦＲ）は変動するが、ある国では１０〜１５％と高く、他の国では１％未満である場合もある。
【０００５】
デングウイルスには４種のサブタイプ：デング−１（ＤＶ−１）、デング−２（ＤＶ−２）、デング−３（ＤＶ−３）、及びデング−４（ＤＶ−４）が存在する。これらのサブタイプはそれぞれ、フラビウイルス科内で抗原性の異なるサブグループを形成する。それらは１０個のタンパク質：３つの構造タンパク質と７個の非構造タンパク質をコード化している、エンベロープを有するＲＮＡウイルスである。構造タンパク質は、カプシド（Ｃ）、エンベロープ（Ｅ）、及び前膜前駆体（ｐｒｅＭ）である。ＤＶの細胞内ライフサイクルは、ウイルスの細胞内への受容体媒介エンドサイトーシスから始まり、続いてウイルスエンベロープタンパク質が後期エンドソーム膜と融合し、これにより複製のためにウイルスゲノムが細胞質に放出される。
【０００６】
ＤＶによる感染は、無症候性である場合もあり、又は発熱、悪寒、前頭部痛、筋肉痛、関節痛、及び発疹を特徴とする場合もある。続いて異なる血清型に感染すると、血漿漏出又は出血（デング出血熱）及びショック（デング熱ショック症候群）を伴う、より重篤な疾患の徴候が生じる場合がある。ＤＥＮＶ感染の病原性を理解するために、長年にわたって広範囲な研究が行われてきたが、特異的抗ＤＶ化合物の開発はほとんど進展していない。現在、米国で承認されているデング感染に対する特異的抗ウイルス剤又はワクチンは存在しない。
【０００７】
成熟デングウイルス粒子の表面上に存在する主な構造タンパク質である、エンベロープ（Ｅ）グリコシル化タンパク質は、Ｉ型内在性膜タンパク質である。成熟デングのＥタンパク質は、逆平列方式で（頭−尾配向）ホモダイマーを形成することが実証されている。各モノマーは３つの異なるドメイン、つまりドメインＩ（ＤＩ、主要なＮ−末端ドメイン）、ドメインＩＩ（ＤＩＩ、二量体化ドメイン）、及びドメインＩＩＩ（ＤＩＩＩ、免疫グロブリン（Ｉｇ）様Ｃ−末端タンパク質）に折り畳まれる。Ｅタンパク質のＤＩＩＩドメインは、Ｃ末端の１００アミノ酸（残基３０３〜３９５）から成る。このドメインは、受容体認識及び結合ドメインであることが示唆されている。ＤＩＩＩタンパク質に存在するＩｇ様折り畳みは、一般的に付着機能を有する構造に会合する。このドメインは、先端がＥタンパク質の他の部分のいずれよりも、ウイルス粒子表面からさらに突出した状態で、ウイルス表面に対して垂直に延在する。加えて、組み換えＤＩＩＩタンパク質及びフラビウイルスのＥタンパク質のＤＩＩＩに対して生成された抗体はともに、標的細胞内へのフラビウイルスの侵入を阻害し得ることが研究により実証されている。さらに、Ｅタンパク質のＤＩＩＩに突然変異を有するフラビウイルスは、弱毒性、又は免疫中和を免れる能力を示す。
【０００８】
デングウイルス感染に対する安全かつ有効なワクチンの開発は、依然として主な公衆衛生の目的である。デングウイルスに対する免疫と主に関連のあるのが中和抗体の存在であると考えられるならば、ワクチン候補を比較し、最適化するための必須条件は、ワクチンにより誘発される中和抗体反応を正確に測定する能力である。４種全ての血清型に由来する弱毒化生ウイルスを含有するワクチンの組み合わせは、いくつかの合併症を生じさせることが示されている（Guy B, Almond JW, Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2008 Mar;31(2-3):239-52）。さらに、デング抗原のアデノウイルスに基づいた送達に関する報告がわずかしかない。それにもかかわらず、アデノウイルス系に関してよく認識されている問題は、人口の大部分がアデノウイルスの１種に対する抗体を有することが知られており、このような既存の抗体がこれらのアデノ由来ワクチンを無効にする可能性があることである。
【０００９】
したがって、複数の、好ましくはデングウイルスの４種の血清型全てに対する広い免疫、又は普遍的免疫を提供するワクチン、好ましくは全ての血清型にわたる経済的かつ有効なワクチンの開発が依然として必要である。さらに、予防的に又は治療的に、デングウイルスに対する免疫を提供するために、ＤＮＡワクチン又はＤＮＡプラスミドワクチンのようなワクチンを投与する有効な方法も依然として必要である。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の１つの態様は、デングウイルスの２種以上のサブタイプに対して、哺乳類内で免疫反応を誘発するポリペプチドを発現させることができる核酸コンストラクトを提供する。核酸コンストラクトは、コード化ヌクレオチド配列と、前記コード化ヌクレオチド配列に機能的に連結しているプロモータとを含む。該コード化ヌクレオチド配列は、少なくとも２種の異なるデングウイルスサブタイプに由来するエンベロープタンパク質のドメインＩＩＩ（ＤＩＩＩドメイン又はＤＩＩＩ）を含むポリペプチドを発現させる。該プロモータは、哺乳類内における該ポリペプチドの発現を調節する。
【００１１】
本発明の別の態様は、哺乳類内でデングウイルスの複数のサブタイプに対する免疫反応を生じさせ得るＤＮＡプラスミドワクチンを提供する。ＤＮＡプラスミドワクチンは、哺乳類内で共通デング抗原を発現させ得るＤＮＡプラスミドと、製薬上許容できる賦形剤とを含む。ＤＮＡプラスミドは、共通デングＤＩＩＩ抗原をコード化するコード配列に機能的に連結しているプロモータを含む。共通デング抗原は、デングウイルス−サブタイプ１、デングウイルス−サブタイプ２、デングウイルス−サブタイプ３、又はデングウイルス−サブタイプ４の共通ＤＩＩＩドメインを含む。
【００１２】
本発明の別の態様は、ＤＮＡプラスミドワクチンを哺乳類の組織に送達することを含む工程であって、前記ＤＮＡプラスミドワクチンが、哺乳類内で免疫反応を誘発するために、哺乳類の細胞内でウイルスの複数のサブタイプに由来する複数の共通抗原を発現させることができるＤＮＡプラスミドを含み、前記複数の共通抗原がウイルスの少なくとも２種の異なるサブタイプに由来する抗原ドメインを含む工程と、定電流でエネルギーのパルスを用いて組織の細胞を電気穿孔処理して、ＤＮＡプラスミドの細胞への侵入を可能にする工程と、を含む、哺乳類内でウイルスの複数のサブタイプに対する免疫反応を誘発する方法を提供する。
【００１３】
本発明の多くの目的及び利点は、添付図面を参照することにより、当業者がより理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】デングウイルスエンベロープの３次元高次構造モデルとともに、デングウイルスゲノムの構成の概略図を示す。
【図２】４種のデングサブタイプ全てに由来するＤＩＩＩドメイン及びユニバーサルＤＩＩＩバンドを示すゲル写真を示す。
【図３】ヒトコドン最適化ユニバーサルデングＤＩＩＩ（ＤＶ−Ｕ）の構成及びＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩの共通アミノ酸配列を示す。
【図４ａ】それぞれが１種のサブタイプのＤＩＩＩドメインを有する４種のプラスミドのプラスミドマップを示す。
【図４ｂ】ＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩを含むプラスミドのプラスミドマップを示す。
【図５】４種のサブタイプ全てに由来する、ＤＩＩＩを発現している細胞におけるＤＩＩＩのｍＲＮＡ転写産物、及びｐＶＡＸにクローニングされたＤＶ−Ｕ断片のゲル写真を示す。
【図６】ＲＤ細胞内の、ＦＬＡＧＧＥＤ−エピトープを有する、ＤＶ  ＤＩＩＩワクチンコンストラクトの発現の間接免疫蛍光分析（ＩＦＡ）の写真を示す。
【図７】ＤＩＩＩ産物のインビトロ翻訳を示すゲル写真である。
【図８】大腸菌溶菌液及びＤＩＩＩ産物を検出するＮｉカラム精製したサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図９】ＤＶのワクチン接種スキームのタイムラインを示す。
【図１０】ｐＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩを接種されたマウスに由来する抗ＤＩＩＩ血清と、Ｎｉ−コーティングされたＥＬＩＳＡプレート上に捕捉されたＤＶ−１〜ＤＶ−４からのＤＩＩＩ抗原との間の特異的反応を示す、スペクトル値の棒グラフを示す。
【図１１】ｐＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩを接種したマウスに由来する抗ＤＩＩＩ血清を用いたウェスタンブロット分析による、ＤＩＩＩタンパク質の免疫検出を示すゲル写真を示す。
【図１２】ｐＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩを接種したマウスに由来する抗ＤＩＩＩ血清を用いた、個々の及び複合ＤＩＩＩドメインの特異的染色を示す写真を示す。
【図１３】ｐＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩを接種したマウスに由来する血清による、ＤＶ−２に感染したＶｅｒｏ細胞の染色を示す写真を示す。
【図１４】ＤＶ−２に対する中和抗体力価を示す棒グラフを示す。
【図１５】ｐＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩ血清による、デングウイルスに感染した細胞の染色を示す写真を示す。
【図１６】４種全てのデングサブタイプに対するＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩ血清の中和効果を示すグラフを示す。
【図１７】Ｂ細胞ＥＬＩスポットアッセイ：ｐＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩによる抗ＤＩＩＩ抗体分泌細胞の誘導の結果を示すグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下の簡潔にした、又は短縮した定義を、本発明の好ましい実施形態の理解を助けるために提供する。本明細書に提供される簡潔した定義は、決して排他的ではなく、技術分野又は辞書の意味において理解される定義とも矛盾しない。簡潔にした定義は、当該技術分野において知られている定義を補足する又はより明確に定義するために本明細書に提供される。
【００１６】
定義
本明細書で使用するとき、ヌクレオチド及びアミノ酸の配列相同性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９７，２５，３３８９、この全文は参照することにより本明細書に組み込まれる）、及びＰＡＵＰ*  ４．０ｂ１０ソフトウェア（Ｄ．Ｌ．Ｓｗｏｆｆｏｒｄ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて決定することができる。簡潔に述べると、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌの略語である）は、配列の類似性を決定するのに好適である（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３−４１０、この全文は参照することにより本明細書に組み込まれる）。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）を通して公的に入手可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される１つの類似性の尺度は、最小合計確率（smallest sum probability）（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチド配列間の一致が偶発する可能性の指標を提供する。例えば、試験核酸と他の核酸との比較における最小合計確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は別の核酸に類似しているとみなされる。「類似性の百分率」は、ＰＡＵＰ*  ４．０ｂ１０ソフトウェア（Ｄ．Ｌ．Ｓｗｏｆｆｏｒｄ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて計算することができる。共通配列の平均類似性は、系統樹中の全ての配列を比較して計算される。
【００１７】
本明細書で使用するとき、用語「核酸コンストラクト」は、タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含むＤＮＡ又はＲＮＡ分子を指す。コード配列、つまり「コード化核酸配列」は、核酸分子が投与される個体の細胞内で発現を指示することができるプロモータ及びポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに機能的に連結した開始及び終結シグナルを含んでもよい。
【００１８】
本明細書で使用するとき、用語「発現可能形」とは、個体の細胞内に存在するとき、コード配列が発現するように、タンパク質をコード化しているコード配列に機能的に連結している必須調節エレメントを含む核酸コンストラクトを指す。
【００１９】
用語「定電流」は、組織に送出される電気パルスの持続中、同じ組織、若しくは前記組織を画定する細胞が受ける又は感じる電流を定義するために、本明細書で使用される。該電気パルスは、本明細書に記載する電気穿孔装置から送出される。この電流は、電気パルスが維持されている間、前記組織内で一定のアンペア数を保つ、なぜなら本明細書で提供する電気穿孔装置が好ましくは即時フィードバックを有するフィードバックエレメントを有するためである。該フィードバックエレメントは、パルスの持続している間中、組織（又は細胞）の抵抗を測定し、同じ組織内で電気パルスの間中（マイクロ秒の単位で）、及びパルスとパルスの間、電流を一定に保つよう、電気エネルギーの出力を変化させる（例えば、電圧を上げる）ことができる。いくつかの実施形態では、該フィードバックエレメントはコントローラを含む。
【００２０】
用語「フィードバック」又は「電流フィードバック」は互換的に用いられ、提供される電気穿孔装置の能動的応答を意味し、これは電極間の組織内における電流を測定し、電流を一定水準に維持するために適宜ＥＰ装置により送出されるエネルギーの出力を変化させることを含む。この一定水準は、パルスシーケンス又は電気処理の開始前に、ユーザによって予め設定される。好ましくは、フィードバックは、電気穿孔装置の電気穿孔コンポーネント、例えば、コントローラにより達成される、なぜならその中の電気回路が電極間の組織内の電流を継続的にモニタし、モニタした電流（又は組織内の電流）と予め設定した電流とを比較し、継続的にエネルギー出力調整を行って、モニタした電流を予め設定した水準に維持するためである。いくつかの実施形態では、フィードバックループは、アナログ閉ループフィードバックであるため、即時的である。
【００２１】
用語「電気穿孔」、「電気透過処理」、又は「界面動電エンハンスメント（electro-kinetic enhancement）」（「ＥＰ」）は、本明細書では互換的に用いられ、生体膜において微細経路（細孔）を生じさせるための膜貫通電場パルスの使用を指し、それらの微細経路の存在により、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬物、イオン、及び／又は水が、細胞膜の片側から他の側に通過することが可能になる。
【００２２】
用語「分散電流」は、本明細書では、本明細書に記載する電気穿孔装置の種々の針電極アレイから送出される電流パターンを定義するために使用され、前記パターンは電気穿孔される組織のあらゆる領域において電気穿孔に関連する熱応力の発生を最小限に抑える、又は好ましくはなくす。
【００２３】
用語「フィードバック機構」は、本明細書で使用するとき、ソフトウェア又はハードウェア（又はファームウェア）のいずれかにより実行されるプロセスを指し、このプロセスは所望の組織のインピーダンス（エネルギーのパルスの送出前、中、及び／又は後）を受け、現在の値、好ましくは電流と比較し、送出されるエネルギーのパルスを調整して、予め設定した値を得る。用語「インピーダンス」は、本明細書ではフィードバック機構について論じるとき使用され、オームの法則にしたがって電流値に変換して、それにより予め設定した電流との比較を可能にすることができる。好ましい実施形態では、「フィードバック機構」は、アナログ閉ループ回路により実行される。
【００２４】
用語「免疫反応」は、本明細書で使用され、提供されるＤＮＡプラスミドワクチンを介した、デング抗原、例えば、ユニバーサルデング抗原の導入に応答した、宿主の、例えば、哺乳類の免疫系の活性化を意味する。該免疫反応は、細胞性若しくは体液性応答の形、又はその両方であってもよい。
【００２５】
用語「共通」又は「共通配列」は、本明細書で使用され、特定のデングサブタイプの複数の菌株の配列比較の分析（これによりサブタイプ−１、サブタイプ−２、サブタイプ−３、サブタイプ−４の共通デングＤＩＩＩ配列、及び以下に記載するユニバーサルデングが得られる）に基づいて構築された、合成核酸配列又は対応するポリペプチド配列を意味する。該共通ユニバーサルデングを用いて、デングウイルスの複数のサブタイプ又は血清型に対して広く免疫を誘導することができる。
【００２６】
用語「アジュバント」は、本明細書で使用され、本明細書に記載するＤＮＡプラスミドワクチンに添加されて、以後記載するＤＮＡプラスミド及びコード化核酸配列によりコード化されるデング抗原の抗原性を高める任意の分子を意味する。
【００２７】
用語「サブタイプ」又は「血清型」は、本明細書では互換的に用いられ、ウイルス、例えば、デングウイルスに関連し、あるサブタイプが異なるサブタイプとは別の免疫系により認識されるような、ウイルス抗原の遺伝的変異体を意味する。例えば、デングウイルスのサブタイプ１は、デングウイルスのサブタイプ２とは免疫学的に区別できる。
【００２８】
本発明の１つの態様は、デングウイルスの２種以上のサブタイプに対する哺乳類の免疫反応を誘発するポリペプチドを発現させることができる核酸コンストラクトを提供する。該核酸コンストラクトは、コード化ヌクレオチド配列と、前記コード化ヌクレオチド配列に機能的に連結しているプロモータとを含む。該コード化ヌクレオチド配列は、デングウイルス少なくとも２種の異なるサブタイプのＤＩＩＩドメインを含むポリペプチドを発現させる。該プロモータは、哺乳類内における該ポリペプチドの発現を調節する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、当該核酸コンストラクトはさらに、コード配列のＮ−末端に機能的に連結しており、プロモータに機能的に連結しているＩｇＥリーダー配列を含んでもよい。好ましくは、ＩｇＥリーダーは配列番号１１の配列を有する。当該核酸コンストラクトはまた、コード配列のＣ末端に付着したポリアデニル化配列を含んでもよい。好ましくは、当該核酸コンストラクトはコドンが最適化されている。
【００３０】
いくつかの実施形態では、該コード化配列は、デングウイルス−サブタイプ１、デングウイルス−サブタイプ２、デングウイルスサブタイプ−３、及びデングウイルスサブタイプ−４に由来するＤＩＩＩドメインを含むポリペプチドをコード化する。好ましい実施形態では、該コード化ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５から成る群から選択される。
【００３１】
いくつかの実施形態では、該コード化ヌクレオチド配列は発現カセットの一部であり、以下のヌクレオチド配列：配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６を含んでもよい。該発現カセットは（５‘末端から３’末端へ）：ＫｐｎＩ部位、ＩｇＥリーダー、コード化配列（ＤＩＩＩ）、２つの終止コドン、及びＰｓｔＩ部位を含む。利用可能な技術を備える当業者は、いずれかのスプライシング部位（ＫｐｎＩ又はＰｓｔＩ）を別のスプライシング部位に、ＩｇＥリーダー配列を別のシグナル若しくは標的リーダー配列に、及び／又は終止コドンをより多い若しくは少ない数の終止コドンに置換することによりカセットを改変することができる。
【００３２】
本発明の別の態様は、哺乳類内でデングウイルスの複数のサブタイプに対する免疫反応を生じさせ得るＤＮＡプラスミドワクチンを提供する。該ＤＮＡプラスミドワクチンは、哺乳類内で共通デング抗原を発現させることができるＤＮＡプラスミドと、製薬上許容できる賦形剤とを含む。該ＤＮＡプラスミドは、共通デング抗原をコード化するコード配列に機能的に連結しているプロモータを含む。該共通デング抗原は、デングウイルス−サブタイプ１、デングウイルス−サブタイプ２、デングウイルス−サブタイプ３、又はデングウイルス−サブタイプ４の共通デングＤＩＩＩドメインを含む。好ましくは、該ＤＮＡプラスミドは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０から成る群から選択される共通デングＤＩＩＩドメインをコード化する共通デング抗原を含む。配列番号１０の配列を有する、共通ＤＩＩＩドメインであるＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩは、ＤＩＩＩの４種のサブタイプのそれぞれ（ＤＶ−１−ＤＩＩＩ、ＤＶ−２−ＤＩＩＩ、ＤＶ−３−ＤＩＩＩ、及びＤＶ−４−ＤＩＩＩ）を連結しているリンカー配列（これは既知の切断部位である配列ＲＧＲＫＲＲＳを有し、ＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩを特定のサブタイプの別個のＤＩＩＩ配列に切断することを可能にする）から成る。しかしながら、該リンカー配列は、類似の特徴を有する当該技術分野において利用可能な任意の他のリンカー配列であってもよく；現在利用されているＲＧＲＫＲＲＳをこのようなリンカーに置換することは、当該技術分野の通常の技能の範囲内である。
【００３３】
いくつかの実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドは該コード配列のＮ−末端に結合し、プロモータに機能的に連結しているＩｇＥリーダー配列をさらに含む。好ましくは、該ＩｇＥリーダーは配列番号１１の配列を有する。当該ＤＮＡプラスミドは、該コード配列のＣ末端に結合したポリアデニル化配列をさらに含んでもよい。好ましくは、当該ＤＮＡプラスミドはコドンが最適化されている。
【００３４】
いくつかの実施形態では、製薬上許容できる賦形剤はアジュバントである。好ましくは、該アジュバントは、ＩＬ−１２及びＩＬ−１５から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、製薬上許容できる賦形剤は、トランスフェクション促進剤である。好ましくは、該トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン、又は脂質であり、より好ましくはポリ−Ｌ−グルタミン酸である。好ましくは、ポリ−Ｌ−グルタミン酸の濃度は、６ｍｇ／ｍＬ未満である。好ましくは、当該ＤＮＡプラスミドワクチンは、１ｍｇ／ｍＬ以上の全ＤＮＡプラスミド濃度を有する。
【００３５】
いくつかの実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドは、それぞれがデングウイルス−サブタイプ１、デングウイルス−サブタイプ２、デングウイルス−サブタイプ３、又はデングウイルス−サブタイプ４に由来するＤＩＩＩドメインを含むポリペプチドをコード化する複数の独特なＤＮＡプラスミドを含む。
【００３６】
当該ＤＮＡプラスミドワクチンは、コード化ヌクレオチド配列：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５、好ましくは配列番号５を含むＤＮＡプラスミドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドは、コード化ヌクレオチド配列：配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４の少なくとも２つを含む。いくつかの実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドは配列番号１及び配列番号２を含み；いくつかの実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドは配列番号１及び配列番号３を含み；いくつかの実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドは配列番号１及び配列番号４を含み；いくつかの実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドは配列番号２及び配列番号３を含み；いくつかの実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドは配列番号２及び配列番号４を含み；いくつかの実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドは配列番号３及び配列番号４を含み、いくつかの実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドは配列番号１、配列番号２、及び配列番号３を含み；いくつかの実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドは配列番号１、配列番号２、及び配列番号４を含み；いくつかの実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドは配列番号１、配列番号３、及び配列番号３を含み；いくつかの実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドは配列番号２、配列番号３、及び配列番号４を含み；又は、いくつかの実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドは配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４を含む。好ましくは、当該ＤＮＡプラスミドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４を含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドワクチンは、デングウイルスＤＩＩＩドメインを発現する少なくとも２種の異なるＤＮＡプラスミドを含み、前記プラスミドは、共通デングウイルス−サブタイプ１  ＤＩＩＩドメインをコード化している配列を含むＤＮＡプラスミド、共通デングウイルス−サブタイプ２  ＤＩＩＩドメインをコード化している配列を含むＤＮＡプラスミド、共通デングウイルス−サブタイプ３  ＤＩＩＩドメインをコード化している配列を含むＤＮＡプラスミド、及び共通デングウイルス−サブタイプ４  ＤＩＩＩドメインをコード化している配列を含むＤＮＡプラスミドから成る群から選択される。いくつかの実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドワクチンは、４種の共通デングウイルスサブタイプＤＩＩＩドメイン（サブタイプ１〜４）を含んでもよい。
【００３８】
いくつかの実施形態では、共通デングウイルス−サブタイプ１  ＤＩＩＩドメインは、配列番号１を含む核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、共通デングウイルス−サブタイプ２  ＤＩＩＩドメインは、配列番号２を含む核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、共通デングウイルス−サブタイプ３  ＤＩＩＩドメインは、配列番号３を含む核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、共通デングウイルス−サブタイプ４  ＤＩＩＩドメインは、配列番号４を含む核酸配列を有する。
【００３９】
いくつかの実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドワクチンが免疫反応を生じさせる哺乳類は、霊長類である。好ましくは、哺乳類は霊長類である。該免疫反応は、体液性応答又は細胞性応答のいずれであってもよく、好ましくは両方である。
【００４０】
本発明の別の態様は、ＤＮＡプラスミドワクチンを哺乳類の組織に送達する工程と、ＤＮＡプラスミドの細胞内への侵入を可能にするのに有効な定電流でエネルギーのパルスにより組織の細胞を電気穿孔処理する工程と、を含む、哺乳類内でデングウイルスの複数のサブタイプに対する免疫反応を誘発する方法を提供する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、免疫反応の誘発方法は、当該ＤＮＡプラスミドワクチンを、皮内、皮下、又は筋肉組織に注入する、送達工程を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、免疫反応の誘発方法は、組織に送出されるのに望ましい電流を予め設定する工程と、予め設定した電流に等しい定電流でエネルギーのパルスにより細胞を電気穿孔処理する工程と、をさらに含んでもよい。
【００４３】
いくつかの実施形態では、免疫反応の誘発方法は、電気穿孔処理された細胞のインピーダンスを測定する工程と、電気穿孔処理された細胞内において定電流を維持するために、測定されたインピーダンスに対してエネルギーのパルスのエネルギーレベルを調整する工程と、をさらに含む。測定及び調整工程は、好ましくはエネルギーのパルスの存続期間内に行う。
【００４４】
いくつかの実施形態では、当該電気穿孔処理工程は、分散パターンのエネルギーのパルスを送出するパルスシーケンスパターンにしたがって、複数の電極にエネルギーのパルスを送出する工程を含む。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドワクチンはアジュバントをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、該アジュバントは、シグナル配列が欠失し、所望によりＩｇＥからのシグナルペプチドを含むＩＬ−１５を含む、アルファ−インターフェロン、ガンマ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、表皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引性ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６から成る群から選択される。有用なアジュバントである可能性のある他の遺伝子としては、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１−アルファ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐ１５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異形、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ  ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０  ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、及びそれらの機能的断片をコード化しているものが挙げられる。いくつかの好ましい実施形態では、アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、又はＭＥＣから選択される。
【００４６】
いくつかの実施形態では、製薬上許容できる賦形剤はトランスフェクション促進剤であり、これは免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）のような界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレン及びスクアレンのような小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、若しくはナノ粒子、又は他の既知のトランスフェクション促進剤を含んでもよい。好ましくは、該トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＬＧＳ）を含むポリカチオン、又は脂質である。好ましくは、該トランスフェクション促進剤はポリ−Ｌ−グルタミン酸であり、より好ましくは、ポリ−Ｌ−グルタミン酸は６ｍｇ／ｍＬ未満の濃度でＤＮＡプラスミドワクチン中に存在する。いくつかの実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドワクチン中のポリ−Ｌ−グルタミン酸濃度は、４ｍｇ／ｍＬ未満、２ｍｇ／ｍＬ未満、１ｍｇ／ｍＬ未満、０．７５０ｍｇ／ｍＬ未満、０．５００ｍｇ／ｍＬ未満、０．２５０ｍｇ／ｍＬ未満、０．１００ｍｇ／ｍＬ未満、０．０５０ｍｇ／ｍＬ未満、又は０．０１０ｍｇ／ｍＬ未満である。
【００４７】
いくつかの実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドワクチンは哺乳類に送達されて、免疫反応を誘発することができ、好ましくは該哺乳類は、ヒト及び非ヒト霊長類を含む霊長類、ウシ、ブタ、ニワトリ、イヌ、又はフェレットである。より好ましくは、該哺乳類はヒト霊長類である。
【００４８】
本発明の１つの態様は、哺乳類内でウイルスの複数のサブタイプに対する免疫反応を誘発する諸方法に関する。これらの方法は、ＤＮＡプラスミドワクチンを哺乳類の組織に送達する工程と、ＤＮＡプラスミドの細胞への侵入を可能にするのに有効な定電流でエネルギーのパルスにより組織の細胞を電気穿孔処理する工程とを含む。当該ＤＮＡプラスミドワクチンは、哺乳類内で免疫反応を誘発するために、哺乳類の細胞内でウイルスの複数のサブタイプに由来する複数の共通抗原を発現することができるＤＮＡプラスミドを含み、前記複数の共通抗原はウイルスの少なくとも２種の異なるサブタイプに由来する抗原ドメインを含む。該ウイルスは、異なる血清型を有することが知られている多数のウイルス、好ましくは異なる血清型にわたって高度に保存されている抗原ドメインを有するウイルスのうち１種から選択することができる。好ましくは、該ウイルスは、西ナイルウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス、インフルエンザウイルス、又はデングウイルスから選択される。
【００４９】
本発明の１つの態様は、哺乳類内でデングウイルスの複数のサブタイプに対する免疫反応を誘発する諸方法に関する。これらの方法は、哺乳類の組織にＤＮＡプラスミドワクチンを送達する工程であって、当該ＤＮＡプラスミドワクチンが、哺乳類内で免疫反応を誘発するために、哺乳類の細胞内で共通デング抗原を発現させることができるＤＮＡプラスミドを含み、共通デング抗原が、少なくとも２種のデングサブタイプ、好ましくは４種全てのデングサブタイプに由来するエンベロープタンパク質のドメインＩＩＩをコードする共通配列を含む工程を含む。該デングサブタイプとしては、サブタイプ−１、サブタイプ−２、サブタイプ−３、及びサブタイプ−４が挙げられる。免疫反応の誘発方法は、ＤＮＡプラスミドの細胞内への侵入を可能にするのに有効な定電流でエネルギーのパルスにより組織の細胞を電気穿孔処理する工程を含む。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は送達工程を含み、これはＤＮＡプラスミドワクチンを皮内、皮下、又は筋肉組織に注入することを含む。好ましくは、これらの方法は、インビボ電気穿孔装置を用いて、組織に送達されることが望ましい電流を予め設定する工程と、予め設定した電流に等しい定電流でエネルギーのパルスにより組織の細胞を電気穿孔処理する工程とを含む。いくつかの実施形態では、当該電気穿孔処理工程は、電気穿孔処理された細胞のインピーダンスを測定する工程と、測定されたインピーダンスに対してエネルギーのパルスのエネルギー水準を調整して、電気穿孔処理された細胞内で定電流を維持する工程とをさらに含み、前記測定及び調整工程はエネルギーのパルスの存続期間内に行う。
【００５１】
いくつかの実施形態では、当該電気穿孔処理工程は、分散パターンでエネルギーのパルスを送出するパルスシーケンスパターンにしたがって複数の電極にエネルギーのパルスを送出することを含む。
【００５２】
本発明はまた、デングウイルスの少なくとも１種のサブタイプの断片ではないものに実質的に類似する、哺乳類内で免疫反応を誘発することができるポリペプチドをコード化する複数のＤＮＡ断片を含む。これらのＤＮＡ断片は、本明細書で提供する特定のコード化核酸配列に適用するとき、配列番号１、２、３、４、及び５を含む、本発明の種々のコード化ヌクレオチド配列の少なくとも１つから選択され、以下に記載の複数のＤＮＡ断片のいずれかであってもよい。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ断片は、３０個以上、４５個以上、６０個以上、７５個以上、９０個以上、１２０個以上、１５０個以上、１８０個以上、２１０個以上、２４０個以上、２７０個以上、３００個以上、３２０個以上、３４０個以上、又は３６０個以上のヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ断片は、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）リーダー配列のコード配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ断片は、６０個未満、７５個未満、９０個未満、１２０個未満、１５０個未満、１８０個未満、２１０個未満、２４０個未満、２７０個未満、３００個未満、３２０個未満、３４０個未満、又は３６０個未満のヌクレオチドを含んでもよい。好ましくは、これらのＤＮＡ断片は、配列番号１、２、３、４、又は５の断片であり、より好ましくは、配列番号１、２、３、又は４の断片である。
【００５３】
本発明は、コード化ヌクレオチド配列によりコード化されるポリペプチドを含み、配列番号６、７、８、９、又は１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでもよい。本発明はまた、デングの少なくとも１種のサブタイプの断片ではないものに実質的に類似する、哺乳類内で免疫反応を誘発することができるポリペプチド断片を含む。これらのポリペプチド断片は、本明細書で提供する特定のポリペプチド配列に適用するとき、配列番号５、６、７、８、９、及び１０を含む、本発明の種々のポリペプチド配列の少なくとも１つから選択され、以下に記載のポリペプチド断片のいずれかであってもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は、１５個以上、３０個以上、４５個以上、６０個以上、７５個以上、９０個以上、１００個以上、１１０個以上、又は１２０個以上のアミノ酸を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチド断片は、３０個未満、４５個未満、６０個未満、７５個未満、９０個未満、１００個未満、１１０個未満、又は１２０個未満のアミノ酸を含んでもよい。好ましくは、これらのポリペプチド断片は、配列番号５、６、７、８、９、又は１０の断片であり、より好ましくは、配列番号５、６、７、８、又は９の断片である。
【００５４】
デングの少なくとも１種のサブタイプの断片ではないものに実質的に類似する、哺乳類内で免疫反応を誘発する機能的断片の決定は、当業者により容易に決定できる。該断片はまた、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のような、公的に入手可能なデータベースにより提供されるように、少なくとも１つ、好ましくはさらに多い抗原エピトープを含むように分析され得る。加えて、免疫反応研究は、以下の実施例に示すように、マウス、並びに抗体力価及びＥＬＩスポット分析を用いて、日常的に評価することができる。
【００５５】
ワクチン
いくつかの実施形態では、本発明は、タンパク質、及びタンパク質をそれに対して免疫反応が誘発され得る免疫原として特に有効にするエピトープを有するタンパク質をコード化する遺伝子コンストラクトを提供することにより、改善されたワクチンを提供する。したがって、ワクチンは、治療的又は予防的免疫反応を誘導するために提供できる。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態によると、本発明によるワクチンは、個体に送達されて、個体の免疫系の活性を調節し、それによって免疫反応を高める。タンパク質をコード化する核酸分子が個体の細胞に取り込まれると、ヌクレオチド配列が細胞内で発現し、それによりタンパク質が個体に送達される。本発明の態様は、プラスミドのような、核酸分子上のタンパク質のコード配列を送達する方法を提供する。
【００５７】
本発明のいくつかの態様によると、予防的に及び／又は治療的に個体を免疫する組成物及び方法が提供される。
【００５８】
細胞に取り込まれたとき、ＤＮＡプラスミドは、別個の遺伝物質として細胞内に留まることができる。あるいは、ＲＮＡを細胞に投与してもよい。また、セントロメア、テロメア、及び複製起点を含む直線状ミニ染色体として遺伝子コンストラクトを提供することも意図される。遺伝子コンストラクトは、核酸分子の遺伝子発現に必須である調節エレメントを含む。該エレメントとしては、プロモータ、開始コドン、終止コドン、及びポリアデニル化シグナルが挙げられる。加えて、標的タンパク質又は免疫調節タンパク質をコード化する配列の遺伝子発現にはエンハンサが必要であることが多い。これらのエレメントが、所望のタンパク質をコード化する配列に機能的に連結し、調節エレメントが投与された個体内で機能することが必要である。
【００５９】
開始コドン及び終止コドンは、一般に、所望のタンパク質をコード化するヌクレオチド配列の一部であると考えられる。しかしながら、これらのエレメントは、核酸コンストラクトが投与される哺乳類内で機能することが必要である。これらの開始及び終止コドンは、コード配列とインフレームでなければならない。
【００６０】
用いられるプロモータ及びポリアデニル化シグナルは、個体の細胞内で機能しなければならない。
【００６１】
特にヒト用の遺伝子ワクチンの生成において、本発明の実施に有用なプロモータの例としては、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のプロモータ、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、ウシ免疫不全症ウイルス（ＢＩＶ）のようなヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）プロモータ、モロニーウイルス、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）、ＣＭＶ前初期プロモータのようなサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、並びにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、及びヒトメタロチオネインのようなヒト遺伝子由来のプロモータが挙げられるが、これらに限定されず、他の実施形態では、プロモータは天然又は合成の、筋肉又は皮膚特異的プロモータのような組織特異的プロモータであってもよい。このようなプロモータの例は、米国特許出願公開第２００４０１７５７２７号に記載され、この全文は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００６２】
特にヒト用の遺伝子ワクチンの生成において、本発明の実施に有用なポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、及びヒトβ−グロビンポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。具体的には、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルと呼ばれる、ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）内のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを用いてもよい。
【００６３】
ＤＮＡ発現に必要な調節エレメントに加えて、他のエレメントもＤＮＡ分子に含まれてよい。このような追加エレメントとしては、エンハンサが挙げられる。当該エンハンサは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、並びにＣＭＶ、ＲＳＶ、及びＥＢＶ由来のもののようなウイルスエンハンサが挙げられるが、これらに限定されない群から選択してもよい。
【００６４】
遺伝子コンストラクトは、コンストラクトを染色体外に維持し、細胞内で複数コピーのコンストラクトを生成させるために、哺乳類の複製起点を備えてもよい。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）製のプラスミドｐＶＡＸ１、ｐＣＥＰ４、及びｐＲＥＰ４は、エプスタインバーウイルスの複製起点、及び組み込み無しでハイコピーエピゾーム複製を生じさせる核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含む。
【００６５】
タンパク質の産生を最大化するために、コンストラクトが投与される細胞内における遺伝子発現に非常に適した調節配列を選択してもよい。さらに、宿主細胞内で最も効率よく転写される前記タンパク質をコード化するコドンを選択してもよい。当業者は、細胞内で機能するＤＮＡコンストラクトを作製することができる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質のコード配列がＩｇＥシグナルペプチドに連結している核酸コンストラクトを提供することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質は、ＩｇＥシグナルペプチドに連結している。
【００６７】
タンパク質が用いられるいくつかの実施形態では、例えば、当業者は、周知の技術を用いて、周知の技術を用いて本発明のタンパク質を産生及び単離することができる。タンパク質が用いられるいくつかの実施形態では、例えば、当業者は、周知の技術を用いて、周知の発現系で使用するための市販の発現ベクターに、本発明のタンパク質をコード化するＤＮＡ分子を挿入することができる。例えば、市販のプラスミドｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるタンパク質を産生させるために用いてもよい。市販のプラスミドｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を、例えば、酵母の出芽酵母株における産生に用いてもよい。市販のＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を、例えば、昆虫細胞における産生に用いてもよい。市販のプラスミドｐｃＤＮＡ又はｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳類細胞における産生に用いてもよい。当業者は、これらの市販の発現ベクター及び系、又は他のものを用いて、日常的な技術及び容易に入手可能な出発物質によりタンパク質を産生させることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照）。よって、所望のタンパク質は、核細胞及び真核細胞系の両方において調製することができ、これによりタンパク質のプロセシングされた形態のスペクトルが生じる。
【００６８】
当業者は、他の市販の発現ベクター及び系を用いてもよく、又は周知の方法及び容易に入手可能な出発物質を用いてベクターを作製してもよい。プロモータ及びポリアデニル化シグナルのような必須制御配列、好ましくはエンハンサを含む発現系は、容易に入手可能であり、種々の宿主について当該技術分野において既知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照。遺伝子コンストラクトは、コンストラクトがトランスフェクトされる、細胞株又は標的組織の細胞内で機能するプロモータに機能的に連結しているタンパク質コード配列を含む。構成的プロモータの例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）又はＳＶ４０由来のプロモータが挙げられる。誘導性プロモータの例としては、マウス乳房白血病ウイルス又はメタロチオネインプロモータが挙げられる。当業者は、容易に入手可能な出発物質から、細胞に、本発明のタンパク質をコード化するＤＮＡをトランスフェクトするのに有用な遺伝子コンストラクトを容易に作製することができる。タンパク質をコード化するＤＮＡを含む発現ベクターを用いて、続いて培養され、外来ＤＮＡが発現する条件下で維持される、適合性宿主を形質転換する。
【００６９】
産生されたタンパク質を、細胞を溶解させることにより培養物から、又は必要に応じて、かつ当該技術分野において既知である培養培地から回収する。当業者は、周知の技術を用いて、このような発現系を用いて産生されたタンパク質を単離することができる。上記のような特定のタンパク質に特異的に結合する抗体を用いて、天然材料由来のタンパク質を精製する方法を同様に適用して、組み換えＤＮＡ方法論により産生されたタンパク質を精製してもよい。
【００７０】
組み換え技術によるタンパク質産生に加えて、自動ペプチド合成機を使用して、単離された本質的に純粋なタンパク質を作製することもできる。このような技術は当業者に周知であり、ＤＮＡがコード化しているタンパク質の産生において置換を有する誘導体が提供されない場合有用である。
【００７１】
核酸分子は、インビボ電気穿孔処理、リポソームに媒介される、ナノ粒子で促進される、組み換えアデノウイルス、組み換えアデノウイルス関連ウイルス及び組換えワクチニアウイルスのような組み換えベクターを伴う又は伴わない、ＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）を含むいくつかの周知技術のどの技術を用いて送達してもよい。好ましくは、本明細書に記載するＤＮＡプラスミドのような核酸分子は、インビボ電気穿孔処理とともに、ＤＮＡ注入を介して送達される。
【００７２】
投与経路としては、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、眼内、及び経口、並びに局所的、経皮的、吸入若しくは坐薬により、又は膣、直腸、尿道、口腔、及び舌下組織のような粘膜組織の洗浄等による投与経路が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい投与経路としては、筋肉内、腹腔内、皮内、及び皮下注入が挙げられる。遺伝子コンストラクトは、従来の注射器、無針注射装置、「微粒子銃遺伝子銃（microprojectile bombardment gone gun）」、又は電気穿孔（ＥＰ）、「流体力学法」、若しくは超音波のような他の物理的方法が挙げられるが、これらに限定されない手段により投与できる。
【００７３】
本発明のＤＮＡワクチンの送達を促進するのに好ましい電気穿孔装置及び電気穿孔法の例としては、米国特許第７，２４５，９６３号（Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉら）、米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号（Ｓｍｉｔｈら）に記載されているものが挙げられ、これらの全文は参照することにより本明細書に組み込まれる。また、２００７年１０月１７日に出願された同時係属及び共同保有米国特許出願第１１／８７４０７２号（米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づいて２００６年１０月１７日出願の米国仮出願第６０／８５２，１４９号、及び２００７年１０月１０日出願の同第６０／９７８，９８２号に対する利益を請求する）（これら全ての全文は参照することにより本明細書に組み込まれる）に提供されているＤＮＡワクチンの送達を促進するための電気穿孔装置及び電気穿孔法も好ましい。
【００７４】
米国特許第７，２４５，９６３号（Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉら）は、体内又は植物内の選択された組織の細胞への生体分子の導入を促進するためのモジュール電極システム、及びその使用について記載している。当該モジュール電極システムは、複数の針電極、皮下針、プログラム可能な定電流パルスコントローラから複数の針電極に導電性連結を提供する電気コネクタ、及び電源を備える。オペレータは、支持体構造上に実装された複数の針電極を掴握し、それを体内又は植物内の選択された組織にしっかりと挿入することができる。次いで、皮下針を介して、生体分子を選択された組織に送達する。プログラム可能な定電流パルスコントローラが作動し、定電流電気パルスを複数の針電極に印加する。印加された定電流電気パルスは、複数の電極間の生体分子の細胞内への導入を促進する。米国特許第７，２４５，９６３号の全文は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００７５】
米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号（Ｓｍｉｔｈら）は、体内又は植物内の選択された組織への生体分子の導入を有効に促進するために用いることができる電気穿孔装置について記載している。当該電気穿孔装置は、その操作がソフトウェア又はファームウェアにより定められる動電装置（「ＥＫＤ装置」）を備える。該ＥＫＤ装置は、ユーザ制御及びパルスパラメータの入力に基づいて配列された電極間に一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを生じさせ、電流波形データの保存及び獲得を可能にする。当該電気穿孔装置はまた、一連の針電極、注射針用の中心注入チャネル、及び取り外し可能なガイドディスクを有する置換可能な電極ディスク備える。米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号の全文は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００７６】
米国特許第７，２４５，９６３号及び米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号に記載の電極アレイ及び方法は、筋肉のような組織だけでなく、他の組織又は器官へも深く浸透するよう適応している。電極アレイの構成に起因して、注射針（選択した生体分子を送達するための）はまた、標的器官に完全に挿入され、注射は電極により予め線引きされた領域において、標的組織に垂直に投与される。米国特許第７，２４５，９６３号及び米国特許出願公開第２００５／００５２６３号に記載されている電極は、好ましくは長さ２０ｍｍの２１ゲージである。
【００７７】
以下は、本発明の方法の例であり、上述の参考特許でより詳細に論じられている：電気穿孔装置は、哺乳類の所望の組織に、ユーザが予め設定した電流入力に類似する定電流を生じさせるエネルギーのパルスを送出するよう構成することができる。該電気穿孔装置は、電気穿孔コンポーネント及び電極アセンブリ又はハンドルアセンブリを備える。該電気穿孔コンポーネントは、コントローラ、電流波形発生器、インピーダンス試験機、波形自動記録装置、入力エレメント、状況報告エレメント、通信ポート、記憶コンポーネント、電源、及び電源スイッチを含む、電気穿孔装置の１つもしくは複数の種々のエレメントを含んでもよく、組み込んでもよい。該電気穿孔コンポーネントは、電気穿孔装置の１つのエレメントとして機能することができ、他のエレメントは、電気穿孔コンポーネントと通信している別のエレメント（又はコンポーネント）である。いくつかの実施形態では、該電気穿孔コンポーネントは、電気穿孔装置の１つもしくは複数のエレメントとして機能することができ、これは電気穿孔コンポーネントから離れた電気穿孔装置のさらに他のエレメントと通信できる。本発明は、エレメントが１つの装置又は互いに通信する別個のエレメントとして機能することができるので、１つの電気機械的又は機械装置の一部として存在する電気穿孔装置のエレメントにより制限されない。当該電気穿孔コンポーネントは、所望の組織で定電流を生じさせるエネルギーのパルスを送出することができ、フィードバック機構を含む。該電極アセンブリは、空間的配置で複数の電極を有する電極アレイを含み、前記電極アセンブリは電気穿孔コンポーネントからエネルギーのパルスを受け取り、それを電極を通して所望の組織に送出する。複数の電極の少なくとも１つは、エネルギーのパルスの送出中中性であり、所望の組織内のインピーダンスを測定し、インピーダンスを電気穿孔コンポーネントに伝える。該フィードバック機構は、測定されたインピーダンスを受信することができ、電気穿孔コンポーネントにより送出されたエネルギーのパルスを調整して、定電流を維持することができる。
【００７８】
いくつかの実施形態では、複数の電極は、分散パターンでエネルギーのパルスを送出することができる。いくつかの実施形態では、複数の電極は、プログラムされたシーケンス下で電極の制御を通して分散パターンでエネルギーのパルスを送出することができ、前記プログラムされたシーケンスはユーザにより電気穿孔コンポーネントに入力される。いくつかの実施形態では、プログラムされたシーケンスは、順に送出されるエネルギーのパルスを含み、前記複数のパルスの各パルスはインピーダンスを測定する１つの中性電極により少なくとも２つの活性電極により送出され、前記複数のパルスの次のパルスはインピーダンスを測定する１つの中性電極により少なくとも２つの活性電極のうち異なる１つにより送出される。
【００７９】
いくつかの実施形態では、該フィードバック機構は、ハードウェア又はソフトウェアのいずれか一方により実施される。好ましくは、該フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路により実施される。好ましくは、このフィードバックは、５０μｓ、２０μｓ、１０μｓ、又は１μｓ毎に生じるが、好ましくはリアルタイムフィードバック又は同時（すなわち、応答時間を決定するために利用可能な技術により決定したとき、実質的に同時）である。いくつかの実施形態では、中性電極は所望の組織におけるインピーダンスを測定し、そのインピーダンスをフィードバック機構に伝え、該フィードバック機構は該インピーダンスに応答し、エネルギーのパルスを調整して、予め設定した電流に類似する値に定電流を維持する。いくつかの実施形態では、該フィードバック機構は、定電流をエネルギーのパルスの送出中継続的かつ即座に維持する。
【００８０】
製薬上許容できる賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、又は希釈剤のような機能分子を含んでもよく、これらの分子は既知であり一般に容易に入手可能である。好ましくは、製薬上許容できる賦形剤は、アジュバント又はトランスフェクション促進剤である。いくつかの実施形態では、核酸分子、又はＤＮＡプラスミドは、ポリヌクレオチド機能強化剤又は遺伝子ワクチン促進剤（つまりトランスフェクション促進剤）の投与と併せて、細胞に送達される。ポリヌクレオチド機能強化剤は、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号、及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９号（１９９４年１月２６日出願）に記載されており、これらはそれぞれ参照することにより本明細書に組み込まれる。遺伝子ワクチン促進剤は、米国出願第０２１，５７９号（１９９４年４月１日出願）に記載されており、これらは参照することにより本明細書に組み込まれる。トランスフェクション促進剤は、核酸分子との混合物として核酸分子と併せて投与されてもよく、又は核酸分子の投与と同時に、その前若しくは後に、別々に投与されてもよい。トランスフェクション促進剤の例としては、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）のような界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、並びにスクアレン及びスクアレンのような小胞が挙げられ、ヒアルロン酸を遺伝子コンストラクトと併せて投与してもよい。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチンはまた、脂質、レシチンリポソーム又はＤＮＡ−リポソーム混合物（例えば、国際公開第９３２４６４０号を参照）のような当該技術分野において既知である他のリポソームを含むリポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、若しくはナノ粒子のようなトランスフェクション促進剤、又は他の既知のトランスフェクション促進剤を含んでもよい。好ましくは、該トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＬＧＳ）を含むポリカチオン、又は脂質である。
【００８１】
いくつかの好ましい実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドは、このような標的タンパク質に対する免疫反応をさらに高めるタンパク質の遺伝子であるアジュバントとともに送達される。このような遺伝子の例は、アルファ−インターフェロン、ガンマ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、表皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びシグナル配列が欠失し、所望によりＩｇＥからのシグナルペプチドを含むＩＬ−１５を含むＩＬ−１５のような他のサイトカイン及びリンホカインをコード化するものである。有用である可能性のある他の遺伝子としては、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１□、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異形、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ  ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０  ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、及びそれらの機能的断片をコード化しているものが挙げられる。
【００８２】
本発明によるＤＮＡプラスミドワクチンは、約１ナノグラム〜１０ミリグラム、約１マイクログラム〜約１０ミリグラム、又は好ましくは約０．１マイクログラム〜約１０ミリグラム、又はより好ましくは約１００マイクログラム〜約１ミリグラムの量のＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、本発明によるＤＮＡプラスミドワクチンは、約５ナノグラム〜約１０００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドワクチンは、約１０ナノグラム〜約８００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドワクチンは、約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドワクチンは、約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドワクチンは、約２５〜約２５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、当該ＤＮＡプラスミドワクチンは、約１００マイクログラム〜約１ミリグラムのＤＮＡを含む。
【００８３】
本発明によるＤＮＡプラスミドワクチンは、用いられる投与方式に応じて製剤化される。ＤＮＡプラスミドワクチンが注入可能な組成物である場合、それらは無菌である、及び／又はピロゲンを含まない、及び／又は微粒子を含まない。等張製剤が好ましくは用いられる。一般に、等張化剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースを挙げることができる。いくつかの場合には、リン酸緩衝生理食塩水のような等張溶液が好ましい。安定剤としては、ゼラチン及びアルブミンが挙げられる。いくつかの実施形態では、血管収縮剤が製剤に添加される。いくつかの実施形態では、ＬＧＳ若しくは他のポリカチオン、又はポリアニオンのような、製剤が室温又は周囲温度で長期間安定であることを可能にする安定剤が製剤に添加される。
【００８４】
いくつかの実施形態では、哺乳類内で共通デング抗原に対する免疫反応を誘発する方法としては、粘膜の免疫反応を誘導する方法が挙げられる。このような方法としては、上記のような共通デング抗原を含むＤＮＡプラスミドと組み込わせられた、ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質、及びそれらの機能的断片、又はそれらの発現可能なコード配列のうち１種もしくは複数種を哺乳類に投与することが挙げられる。ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質、及びそれらの機能的断片は、本明細書で提供するＤＮＡプラスミドデングワクチンの投与前、投与と同時、又は投与後に投与してもよい。いくつかの実施形態では、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣ、及びそれらの機能的断片から成る群から選択される１種もしくは複数種のタンパク質をコード化する単離核酸分子を哺乳類に投与する。
【実施例】
【００８５】
本発明は、以下の実施例においてさらに説明される。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例示のためだけに提供されることを理解すべきである。上記議論及びこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的な特徴を解明し、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく、本発明の種々の変更及び修正を行って、それを種々の用途及び条件に適合させることができる。よって、本明細書に示し、記載したものに加えて、本発明の種々の修正は、前述の記載から当業者に明らかになる。このような修正もまた、添付の特許請求の範囲の範囲内であることを意図する。
【００８６】
好ましくは、本明細書に記載の筋肉又は皮膚ＥＰ装置とともに用いるためのＤＮＡ製剤は、高いＤＮＡ濃度を有し、好ましくは、皮膚への送達に最適である少容量、好ましくは小注入容量、理想的には２５〜２００マイクロリットル（μＬ）中に、１マイクログラム〜数十マイクログラムの量、好ましくはミリグラムの量のＤＮＡを含む濃度を有する。いくつかの実施形態では、当該ＤＮＡ製剤は、１ｍｇ／ｍＬ以上（ｍｇ（ＤＮＡ）／製剤の容量）のような高いＤＮＡ濃度を有する。より好ましくは、当該ＤＮＡ製剤は、２００μＬのフォーミュラ中にグラムの量のＤＮＡ、より好ましくは１００μＬのフォーミュラ中に１グラムの量のＤＮＡを提供するＤＮＡ濃度を有する。
【００８７】
本発明のＥＰ装置とともに用いるためのＤＮＡプラスミドは、既知の装置及び技術の組み込わせを用いて製剤化又は製造することができるが、好ましくは２００９年１月１日に、米国特許出願公開第２００９０００４７１６号として公開された、米国特許出願第１２／１２６６１１号に記載されている、最適化プラスミド製造技術を用いて製造される。いくつかの例では、これらの研究で用いられたＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で製剤化してもよい。製造技術はまた、米国特許出願公開第２００９０００４７１６号に記載されているもの、及び２００７年７月３日に発行された、米国特許第７，２３８，５２２号に記載されているものに加えて、当業者に一般に知られている種々の装置及びプロトコルを含む、又は組み込む。本明細書に記載されているＥＰ装置及び送達技術とともに用いられる高濃度のプラスミドにより、合理的低容量でＩＤ／ＳＤ空間にプラスミドを投与することが可能になり、発現及び免疫効果を高めるのに役立つ。刊行物、米国特許出願公開第２００９０００４７１６号、及び米国特許第７，２３８，５２２号は、その全文が本明細書に組み込まれる。
【実施例１】
【００８８】
デングＤＩＩＩ発現コンストラクト
標本抽出バイアスを避けるために、ＧｅｎｅＢａｎｋから、異なる地理的集団のおよそ１５種のサブタイプ配列を収集した。用いた配列は全て非組み換えであった。デングエンベロープ（デングＥ）ＤＩＩＩ配列の多重配列比較を、アプリケーションＣｌｕｓｔａｌ  Ｘ（バージョン１．８１）を用いて実行し、ここでペアワイズ配列比較パラメータは、ギャップ開始ペナルティ（gap opening penalty）として１０、ギャップ伸長ペナルティ（gap extension penalty）として０．１を用いて、動的な、時間はかかるが正確なプログラミング（dynamic slow-accurate programming）に設定した。多重配列比較パラメータは、０．２に等しいギャップ伸長ペナルティを含んでいた。多重配列比較を実施し、手動でいくつかの軽微な調整を行った後、デングＥ共通ヌクレオチド配列を得た。推定アミノ酸配列を用いて、コドン間に挿入されるように配列比較ギャップの導入を導いた。コドンの最適化及びＲＮＡの最適化を、ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（ＧＥＮＥＡＲＴ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて実施した。コドンを最適化した合成配列をさらに、ｐＶＡＸの哺乳類発現プラスミドのＫｐｎＩ／ＰｓｔＩ部位にクローニングした。
【００８９】
図１は、デングポリペプチドの構成及びデングＥの立体配座の特性を示す。デングＥは、３つの異なるドメイン：Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩから成る。デングＥ  ＤＩＩＩドメインのアミノ酸配列を、ＮＣＢＩのデータベースから選択し、整合して、共通配列：ＤＶ−１−ＤＩＩＩ（配列番号１）、ＤＶ−２−ＤＩＩＩ（配列番号２）、ＤＶ−３−ＤＩＩＩ（配列番号３）、及びＤＶ−４−ＤＩＩＩ（配列番号４）を得た。異なる株由来のアミノ酸配列を、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ７（ＤＮＡ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、整合のために構築した。Ｋｏｚａｋ配列に先行するＩｇＥリーダー配列を、コード配列のＮ−末端に融合させた。アミノ酸配列に基づいて、ヒトの最適化合成遺伝子配列を、Ｇｅｎｅａｒｔ  Ｉｎｃ製のソフトウェアツールを用いて作製し、ｐＶＡＸベクターにクローニングした。サブタイプ−１、−２、−３、及び−４のデングエンベロープＤＩＩＩドメインをコード化している発現ベクターを、それぞれｐＤＶ−１−ＤＩＩＩ、ｐＤＶ−２−ＤＩＩＩ、ｐＤＶ−３−ＤＩＩＩ、及びｐＤＶ−４−ＤＩＩＩと称する。プラスミドマップを図４ａに提供する。
【００９０】
タンパク質分解的切断配列により分離された４つのＤＩＩＩドメインを全て組み込わせたコンストラクト（ユニバーサル又はユニバーサルＤＩＩＩ）を構築し、ＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩ（配列番号５）と称する。図３は、オープンリーディングフレームの構成の概略図、並びに合成されたヒトの最適化遺伝子に基づくアミノ酸配列を示す。ＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩをｐＶＡＸベクターにクローニングして、ユニバーサル発現コンストラクトｐＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩを作製した。このプラスミドマップは図４ｂに見ることができる。
【実施例２】
【００９１】
哺乳類系におけるデングＤＩＩＩドメインの発現
ヒトスジシマカＣ６／３６細胞、Ｖｅｒｏ、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＲＤ、及びＢＨＫ細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。Ｃ６／３６細胞を、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリンＧ（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、Ｌ−グルタミン、及び非必須アミノ酸を添加したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中にて、５％ＣＯ２、２８℃で維持した。Ｖｅｒｏ細胞を、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清、ペニシリンＧ（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、Ｌ−グルタミン、及び非必須アミノ酸を添加した、１１５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）−Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中にて、５％ＣＯ２、３７℃で維持した。ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、及びＲＤ細胞を、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清、ペニシリンＧ（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を添加した、ＤＭＥＭ培地中にて、５％ＣＯ２、３７℃で維持した。
【００９２】
利用したウイルスは、ＤＥＮＶ１ウイルス、ＤＥＮＶ２、原型ＤＥＮＶ３（Ｈ８７株）、及び原型ＤＥＮＶ４（Ｈ２４１）を含んでいた。デングウイルスを用いた実験では全て、４回未満細胞培養で継代されていた臨床用ウイルス分離株及びストックを用いた。ウイルスストックは、１ｍＬのＥＭＥＭ−２％  ＦＢＳで希釈した、２００μＬのウイルスを含む、７５ｃｍ2の組織培養フラスコに、Ｃ６／３６細胞を単層で植菌することにより得た。１時間後、２％のＦＢＳを添加した１４ｍＬのＥＭＥＭを添加し、細胞を５％ＣＯ２、２８℃で１０日間培養した。細胞から上清を取り除き、２０００×ｇで５分間遠心分離して、細胞残屑を沈殿させた。上清を分注し、８０℃で保存した。ＤＥＮＶ１をＶｅｒｏ細胞中で増殖及び継代し、一方ＤＥＮＶ４（Ｈ２４１）は上記のようにＣ６／３６細胞中で増殖させ、Ｖｅｒｏ細胞で１回継代した。
【００９３】
ＲＴ−ＰＣＲ法を利用して、ＤＩＩＩドメインをコードしているｍＲＮＡ転写産物の存在を検出した、なぜならｐＶＡＸに基づくデングＤＩＩＩワクチンコンストラクトは、追加の合成エピトープを含まないためである。ヒト横紋筋肉種細胞株、ＲＤ細胞に、ＤＩＩＩ発現コンストラクト（独立に、４種の血清型のうちそれぞれ１種及びユニバーサル）をトランスフェクトし、トランスフェクションの２日後、トランスフェクトした細胞から全ＲＮＡを調製した。各デングウイルスの血清型に特異的なプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを実行し、それぞれのＤＩＩＩドメインを増幅した。図５は、３６０ｂｐの長さの断片を表すバンドにより表される、トランスフェクトされた細胞に由来する増幅したＤＩＩＩ断片を示すゲルの写真である。偽の（Mock）トランスフェクトした細胞（空のｐＶＡＸベクターをトランスフェクトした）は、このような増幅産物を示さなかった。この研究により、トランスフェクトされた細胞から、ＤＩＩＩ発現のためのｍＲＮＡ転写産物の存在が確認された。よって、これらのＤＮＡコンストラクトは、タンパク質産物の発現を示唆する。
【００９４】
これらのｐＶＡＸに基づくＤＮＡコンストラクトに加えて、類似のタンパク質産物を発現するために一組のＤＮＡコンストラクトをさらに構築した。これらのコンストラクトは、デングウイルスＤＩＩＩドメインと免疫検出目的のための合成ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．）エピトープとの融合物（ＦＬＡＧＧＥＤ−コンストラクトと称される）を含んでいた。ＲＤ細胞にＦＬＡＧＧＥＤ−コンストラクトをトランスフェクトし、トランスフェクションの３６時間後、細胞を抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．）を用いて免疫蛍光アッセイにより分析した。
【００９５】
タンパク質の細胞質内局在パターンから証明されるように、ｐＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩの、４種のＤＩＩＩドメイン（個別に、及び複合ＤＩＩＩドメイン）又はユニバーサルＤＩＩＩ（ユニバーサルデング抗原）の全ての発現パターンは同じであった（図６を参照）。完全長デングＥの発現により、典型的な細胞質内パターンが得られることが、いくつかの報告により十分立証されている。よって、ＤＩＩＩの発現パターンは、単独で、完全長デングＥの発現パターンに一致する。放射性標識デングＥ  ＤＩＩＩタンパク質が、これらのＦＬＡＧＧＥＤ−コンストラクトから生じ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離された。これらのタンパク質の移動度は、図７のゲル写真に示すように、およそ１６ｋＤａの質量のタンパク質に一致する。複合ＤＩＩＩドメインの分子質量は、およそ５０ｋＤａの質量であると思われた。
【実施例３】
【００９６】
細菌発現及び精製系を用いた４種のサブタイプ全てからのＤＥＮＶ  Ｅ  ＤＩＩＩタンパク質の合成及び産生
４種のデング血清型全てのＤＩＩＩドメインを表すエンベロープ領域（２９５〜４１５）は、コード化ＤＩＩＩドメインを含むｐＱＥベクターを用いて形質転換することにより大腸菌内で発現させた。デングＥ−ＤＩＩＩの予測される大きさは約１６ｋＤａである。細菌溶菌液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）は、（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）ＩＰＴＧ−誘導性大腸菌培養物内で、予想された大きさのタンパク質が過剰発現したことを示した。ＩＰＴＧは、ベータ−ラクトシダーゼの活性を誘導するために、アロラクトースの分子擬態として一般的に用いられている。さらに、Ｎｉ−カラム（ポリヒスチジンでタグ付けされた組み換えタンパク質に結合する能力を有するＮｉでキレート化されたカラム）で溶出された画分に見られるタンパク質のバンドの出現は、ＩＰＴＧ処理された溶菌液を含むカラム中に見られる目立つバンドの移動度に一致する。未処理及びＩＰＴＧ処理されたサンプルの両方の、ｐＱＥ−ベクターを形質転換したサンプルの溶菌液（図８、最初の２つのレーン）は、ＤＩＩＩドメインに一致するタンパク質バンドを示さなかった。この結果は、精製されたタンパク質が、ＩＰＴＧにより誘導したとき、ｐＱＥベクター発現コンストラクトから発現したデングＤＩＩＩドメインであることを裏付ける。
【実施例４】
【００９７】
（ＣＥＬＬＥＣＴＲＡを用いる）ＥＰによるｐＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩワクチン候補のマウスの免疫化、及びＤＩＩＩドメインに対するＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩ血清の特異性
図９に示したスケジュールにしたがって、マウスをプラスミドＤＮＡコンストラクト（上記実施例１に記載）で免疫した。
【００９８】
４週齢のＢａｌｂ／ｃマウスの群（ｎ＝４）を、１５μｇのｐＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩ及び残りの個々のＤＩＩＩ発現ベクターで筋肉内免疫した。ｐＶＡＸを対照ベクターとして用いた。免疫前に、予め免疫した血液サンプルを、眼の静脈を通して採血するための不変的プロトコルを用いて収集した。方形波パルスを全ての実験で用い（Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，２００３）、定電流ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）電気穿孔機（ＶＧＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｂｌｕｅ  Ｂｅｌｌ，ＰＡ）により送出した。３つの電極アレイ（３−ＥＡ）をマウスの実験で用いた。３−ＥＡは、非導電性プラスチックで一緒に保持された、２つの長辺の長さが０．５ｍｍ、短辺の長さが０．３ｍｍである、二等辺三角形の配置の３つの２６−ゲージの固体ステンレス鋼電極から成る。マウスの実験に特異的なＥＰ条件は、定電流、０．１Ａｍｐ、３つのパルス、５２ｍｓｅｃ／パルス、パルス間４秒を用いた。プラスミド注入とＥＰとの間の時間のずれは約２０秒であった。
【００９９】
プラスミド投与／ＥＰの事象の順序は、以下のように実施した：使い捨て電極アセンブリをハンドルのレセプタクル内に置き、ハンドル上にある開始ボタンを押し、動物実験群の番号を入力し、インスリン注射器を用いて５０μＬのＤＮＡコンストラクト（全ＤＮＡ１５μｇ）プラスミドを注入し、針をすぐに注入部位の周囲の領域に入れ、ハンドル上の開始ボタンを押し、４秒数えた後、パルスを送出した。電気穿孔の５秒後、該アレイを筋肉からそっと取り出した。全ての処理中、全ての電極を完全に筋肉に挿入した。全てのＤＮＡを、エンドトキシンを含まないＱｉａｇｅｎカラムを用いて調製した。動物を、ペンシルバニア大学の、温度管理された、光サイクル施設で飼育し、動物の世話は、国立衛生研究所及びペンシルバニア大学の指針の下で行った。
【０１００】
３度目の追加免疫後に得られた個々のマウスの血清サンプルを、ＥＬＩＳＡによりＤＥＮＶ抗体力価についてアッセイした。全てのマウスが抗ＤＩＩＩ抗体を産生した。免疫されたマウスにより産生された抗ＤＥＮＶ  Ｅ  ＤＩＩＩ抗体の力価を、捕捉抗原として精製されたＤＩＩＩ断片を用いてＥＬＩＳＡアッセイにより決定した。これらの抗原を、ＮｉでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに捕捉し、次いで、ｐＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩを接種されたマウスの血清に対して試験した。図１０に示すように、ｐＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩで免疫されたマウスに由来する血清は、高水準のＥＬＩＳＡ反応性を示し、一方ｐＶＡＸで免疫されたマウスの血清の反応性はごくわずかであった（データは示さない）。また、ｐＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩを接種する前のマウスと接種した後のマウスとの間には、抗ＤＩＩＩドメイン抗体の産生に関して大きな違いがあった。個々のＤＩＩＩドメイン発現コンストラクトにより産生された抗体力価の水準は、ｐＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩワクチン候補により誘発された抗体力価より著しく低かった。このＥＬＩＳＡデータに基づいて、以後の全ての分析では、ｐＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩワクチン候補で免疫されたマウスから採取した抗ＤＩＩＩ血清を用いて進めることにした。
【０１０１】
ｐＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩコンストラクトで免疫されたマウスから収集した血清の、４種の血清型全てのＤＩＩＩドメインと反応する能力を調べた。ＩＰＴＧ−誘導性細菌溶菌液、並びに４種全ての血清型の精製されたＤＩＩＩドメインを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、潜在的抗デングＤＩＩＩ血清としてｐＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩ血清を用いて、ウエスタンブロッティング分析により免疫プローブ化（immunoprobe）した。ＨＲＰ−抱合抗マウス抗体を用いて、抗原−抗体複合体を検出し、化学発光系を用いて免疫反応を検出した。Ｄ−Ｕ血清は、明らかに、４種全ての血清型のＩＰＴＧ−誘導性溶菌液、並びにＮｉ−溶出サンプルの両方のＤＩＩＩタンパク質を認識した。粗溶菌液に由来する他のタンパク質サンプルに結合することなく、ＤＩＩＩ抗原に特異的に結合することにより、血清とＤＩＩＩ抗原との間の特異的反応についての直接的な証拠が得られた（図１１における、多量体バンドを含む、分離されたバンドを参照）。該血清は、精製されたＤＩＩＩ断片が示した質量に等しい、約１６ｋＤａの質量の分子を同定した。
【０１０２】
ＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩ血清はまた、個々に４つのＤＩＩＩドメイン全てでトランスフェクトされた細胞内に発現したＤＩＩＩ抗原に結合できるかどうかを検証するために試験した。この目的のために、ＨｅＬａ細胞に、これらのＤＩＩＩコード化ｐＶＡＸ発現コンストラクトを一過的にトランスフェクトし、トランスフェクションの３６時間後、免疫蛍光分析のために当該細胞を固定した。
【０１０３】
まず、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、デングワクチンコンストラクト及びｐＶＡＸ（１ｍｇ／ウェル）で当該細胞をトランスフェクトした。抗マウスデング抗体又はｐＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩを接種したマウスの血清とともにトランスフェクトした細胞を９０分間インキュベートした後、スライドを、テトラメチルローダミンイソチオシアネート抱合二次抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに４５分間インキュベートした。４０，６−ジアミド−２−フェニルインドールヒドロクロリド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、二次抗体溶液に添加して、核を対比染色し、所与の視野で利用可能な細胞の核の総数を示した。蛍光顕微鏡（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）用のＰｈａｓｅ  ３  Ｐｒｏプログラムを用いて画像を解析した。
【０１０４】
抗ＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩ血清は、トランスフェクトされなかった及びｐＶＡＸでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ，Ｖａから入手）の両方を全く染色しなかった。しかしながら、ＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩ血清は、ＤＩＩＩ抗原のみを高度に特異的に染色した（図１２）。最も重要なことに、ＤＩＩＩ発現細胞は、主に細胞質局在パターンを示した。この観察結果は、図６に示すようなＦＬＡＧ−エピトープと融合したＤＩＩＩタンパク質を標的とする抗ＦＬＡＧ抗体を用いて、ＦＬＡＧ−エピトープでタグ付けされたＤＩＩＩ発現ベクターにより実行した免疫蛍光研究と一致する。
【実施例５】
【０１０５】
ｐＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩを接種されたマウスの抗ＤＩＩＩ血清の、元来の立体構造のＥの生ウイルス粒子のインタクトなＤＩＩＩドメインへの結合
ＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩ血清を、デング−２に感染した細胞に対して、抗ＤＩＩＩ血清がデング−２ウイルスに反応できるかどうかを見るために試験した。天然では、ＤＩＩＩドメインは、該ウイルスの外表面上のデングＥの三次元立体構造のピーク領域に位置すると考えられる。
【０１０６】
デング−２ウイルスは、ＢＨＫ−２１（仔ハムスター腎細胞株；ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ）細胞内で増幅して、高い力価を獲得した。さらに、高力価のウイルスストックを用いて、Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ）を感染させた。感染の４日後、デング−２に感染した細胞を、上記実施例４に概略を示したプロトコルにしたがって、抗ＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩ血清で染色し、続いてＦＩＴＣ−抱合抗マウス抗体で染色した。抗ＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩ血清は、未感染細胞では、異なる染色パターンもまったく示さなかった。この血清は、デング−２サブタイプのウイルスに感染した細胞にのみ反応した。ｐＶＡＸを接種されたマウスから採取した血清もまた、デング−２に感染したＶｅｒｏ細胞及び感染していないＶｅｒｏ細胞の両方に反応しなかった。よって、ＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩを接種されたマウスのみが、デングＥのＤＩＩＩドメインを認識できる抗ＤＩＩＩ抗体を産生した（図１３）。
【０１０７】
ＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩ血清を、４種のデングサブタイプ全てに感染した細胞に対して、抗ＤＩＩＩ血清がこれらの４種に感染した細胞全てに反応できるかどうかを見るために試験した。
【０１０８】
チャンバ−スライド内で一晩増殖させたＶｅｒｏ細胞に、４種全てのサブタイプの高力価ウイルスストックを感染させた。感染の４日後、デングに感染した細胞を、既に概略を示したプロトコルにしたがって、抗ＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩ血清で染色し、続いてＦＩＴＣ−抱合抗マウス抗体で染色した。抗ＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩ血清は、未感染細胞では、異なる染色パターンもまったく示さなかった。この血清は、デングサブタイプに感染した細胞にのみ反応した。興味深いことに、ｐＶＡＸを接種されたマウスから採取した血清はまた、デングに感染したＶｅｒｏ細胞及び感染していないＶｅｒｏ細胞とまったく反応しなかった。よって、ＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩを接種されたマウスのみが、デングビリオンのＥのＤＩＩＩドメインを認識できる抗ＤＩＩＩ抗体を産生した（図１５）。上方のパネルは、感染した細胞を示し、下方のパネルは視野内で利用可能な細胞の核内容物を示すためにＤＡＰＩ染色した同じ視野を示す。この観察結果は、ＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩを接種されたマウスに存在する抗ＤＩＩＩ抗体と、ＤＩＩＩ抗原との間の特異的相互作用だけでなく、この抗体が元来の立体構造でデングウイルス自体のＥのインタクトなＤＩＩＩドメインに反応できることも示す。
【実施例６】
【０１０９】
デングウイルスの種々のサブタイプに対する抗ＤＩＩＩ血清の中和能力
ＤＥＮＶ１、−２、−３、及び−４感染性の、ｐＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩ又は予め免疫した血清（対照）に対して産生された血清の中和能力を、プラーク中和アッセイを用いて決定した。プラーク還元中和試験を、Ｒｕｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ（Ａ  Ｐｌａｑｕｅ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  Ｄｅｎｇｕｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  １９６７．  ｐ．２８５−２９０）、Ｋｏｃｈｅｌ，Ｔ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｄｅｎｇｕｅ−１  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｎ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｄｅｎｇｕｅ−２  ｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｎｇｕｅ  ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ．  Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ，  ２００２．  ３６０（９３２９）：ｐ．３１０−３１２）、及びＷｕ，Ｓ．−Ｊ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｅｎｇｕｅ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ．２００１．ｐ．２７９４−２７９８）のプロトコルを修正したものを用いて実施した。
【０１１０】
ウイルスストック及びｐＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩを接種されたマウスの抗ＤＩＩＩ血清の様々な希釈物を混合し、得られた混合物をエッペンドルフチューブ内でＤ１０培地（１０％のウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ−培地；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２００マイクロリットルにした。これらの混合物をインキュベータ内で３７℃で１時間維持し、次いで細胞に添加して（細胞は組織培養チャンバスライド上に一晩播種した）、Ｖｅｒｏ細胞の感染を可能にした。ウイルス混合物とともに１時間インキュベートした後、該細胞をＰＢＳで十分に洗浄し、細胞培地とともにさらにインキュベートするために４日間インキュベートチャンバ内に放置した。このアッセイの対照は、（１）未感染Ｖｅｒｏ細胞、（２）ウイルスストックに感染し、いずれの血清でも処理されていない細胞、及び（３）ウイルスストックに感染し、ｐＶＡＸを接種されたマウスの血清で処理した細胞を含んでいた。
【０１１１】
ｐＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩを接種したマウスの抗ＤＩＩＩ血清は、全くあいまい性（ambiguity）なくデング−２に感染した細胞を染色した（図１３）。加えて、当該血清は、未感染細胞を全く染色しなかった。染色により、感染した細胞の数が最も多く観察されたのは、いずれの血清でも処理されなかったウイルスストックであった。ウイルスに感染した細胞の数は、未処理ウイルスストックを受けた細胞より、抗ＤＩＩＩ血清で処理されたウイルスストックに感染した細胞において減少したことが見出された。よって、抗ＤＩＩＩ血清でウイルスストックを処理することにより、図１４に示す棒グラフに見られるように、デング−２の力価が低下した。
【０１１２】
類似の中和結果が、上記で用いた、デング−２ウイルスストックの代わりに、デング−１、−３、及び−４サブタイプのウイルスストックを用いることにより得られた。ｐＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩを接種したマウスの抗ＤＩＩＩ血清は、全くあいまい性なく４種のデングサブタイプ全てに感染した細胞を染色した。加えて、当該血清は、未感染細胞を全く染色しないことが観察された。染色により、感染した細胞の数が最も多く観察されたのは、いずれの血清でも処理されていないウイルスストックであった。ウイルスに感染した細胞の数は、未処理ウイルスストックを受けた細胞より、抗ＤＩＩＩ血清で処理されたウイルスストックで処理した細胞において著しく減少したことが見出された。よって、抗ＤＩＩＩ血清でウイルスストックを処理することにより、感染性デングウイルスの力価が低下した。それ故、ｐＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩを接種したマウスの血清は、４種全てのデングサブタイプに対して中和能力を示す抗ＤＩＩＩ抗体を含んでいた。
【０１１３】
さらに、ｐＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩ血清の中和効果を試験して、デング感染により引き起こされる細胞変性効果に対するその影響を決定した。図１６は、種々のデングサブタイプとともにＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩ血清を用いて得られた中和データを示す（データはＳｏｕｔｈｅｒｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤから得た）。この図は、ＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩ血清が、最大１：１１００の希釈倍率まで４種全てのデングウイルスのサブタイプを中和する能力を有することを示す。ｐＶＡＸを接種されたマウスから採取した血清は、どのデングウイルスサブタイプも中和しなかった。
【実施例７】
【０１１４】
デングＥ  ＤＩＩＩ抗原に対するＢ細胞の活性化
ＤＩＩＩ−ＤＮＡを接種したマウスのマウス脾臓を調製して、ＤＩＩＩタンパク質に対する抗体を産生することができるＢ細胞の頻度を測定した。
【０１１５】
デングタンパク質懸濁液を解凍し、試験管をボルテックスして、細かいタンパク質微粒子を懸濁させた。再懸濁したタンパク質の少量の一定分量を、緩衝液ＴＵ（６２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／８Ｍ  尿素、ｐＨ  ８．０）に溶解させて、１０μｇ／ｍＬ溶液を作製した。デングタンパク質はこの緩衝液に可溶性であった。１００μＬ（１μｇ）の希釈したタンパク質の一定分量を、Ｐｉｅｒｃｅ  ＨｉｓＧｒａｂ銅コーティング高結合能プレートのウェルに塗布し、これらの抗原をコーティングしたＮｉ−プレートを、日常的なプロトコル（Ｙａｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  Ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ａｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＨＩＶ−１  Ｓｕｂｔｙｐｅ  Ｂ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ−ｂａｓｅｄ  Ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ＤＮＡ  Ｖａｃｃｉｎｅ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．１５（２）：ｐ．４１１−４２１）にしたがって、さらに分析した。同じプロトコルを、マウス及びサルモデルに関するさらなる研究に適用する。ＩＦＮ−ガンマＥＬＩスポットアッセイでは、４種全ての血清型のＤＩＩＩ領域にまたがる１０個の重複アミノ酸を含む１５ｍｅｒのペプチドを抗原刺激物として用いる。これらのアッセイは、抗原に曝露されたマウス及びサル被験体の脾臓から採取した細胞を用いた。
【０１１６】
ＥＬＩスポットアッセイの結果は、上記ＤＩＩＩ抗体のＥＬＩＳＡデータと一致する。ＤＩＩＩに特異的なマウス抗体分泌細胞は、個々のＤＩＩＩドメインのみを受けた群より、ｐＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩを接種されたマウスで高頻度に観察された（図１７）。まとめると、ＥＬＩスポット結果は、ＥＬＩＳＡ研究により決定されたように、ＤＩＩＩ特異的抗体の力価に対応する、高親和性抗原特異的Ｂ細胞の活性化を示した。
【実施例８】
【０１１７】
アカゲザルにおけるデング中和抗体の産生
アカゲザルに、ｐＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩデング発現コンストラクトを接種することができる。３度の追加免疫後、抗体力価を評価し、サルを４種全てのデングウイルス血清型を用いて抗原曝露することができる。
【０１１８】
アカゲザルは、実験の開始前２ヶ月間馴化させた。研究は、以下のように進めることができる：０週−最初の免疫（プラスミド用量投与）及びベースライン採血の実施；２週−採血の実施；３週−２回目の免疫（プラスミド用量投与）の実施；５週−採血の実施；６週−３回目の免疫（プラスミド用量投与）及び採血の実施；８週−採血の実施。
【０１１９】
被験体を、およそ１ｍｇ／ｍＬ（好ましくは約１０ｍｇ／ｍＬ）の濃度のｐＤＶ−Ｕ−ＤＩＩＩ製剤及び残りの個々のＤＩＩＩ発現ベクターで筋肉内免疫した。ｐＶＡＸを対照ベクターとして用いてもよい。方形波パルスを全ての実験で用い（Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，２００３）、定電流ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）電気穿孔機（ＶＧＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｂｌｕｅ  Ｂｅｌｌ，ＰＡ）で送出した。ＥＰ条件は、以下のように選択する：０．５Ａｍｐ、３パルス、５２ｍｓｅｃ、パルス間１秒。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
0005788676.tif 000018
【図１７】
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【配列表】
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