(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シルクセリシンからなるセリシンナノファイバーであって、該シルクセリシンが、裸蛹（遺伝子記号Ｎｄ）、セリシン蚕（遺伝子記号Ｎｄ−ｓ）もしくはセリシンホープの繭層由来のセリシン、またはこれらカイコの幼虫体内から取り出した絹糸腺内の液状セリシンもしくはこの液状セリシンを凝固させたセリシンからなり、該シルクセリシンをトリフルオロ酢酸で溶解したセリシン溶液から得られたセリシンナノファイバーであることを特徴とするセリシンナノファイバー。
【請求項２】
前記シルクセリシンが、セリシン分子内にエポキシ化合物による処理でエポキシ化合物が導入されてなるセリシンか、二塩基酸無水物による処理で二塩基酸無水物がセリシンの塩基性アミノ酸側鎖と結合し、カルボキシル基が導入されてなるセリシンか、またはアルデヒド化合物による処理でセリシン分子間が架橋されてなるセリシンであることを特徴とする請求項１に記載のセリシンナノファイバー。
【請求項３】
裸蛹（遺伝子記号Ｎｄ）、セリシン蚕（遺伝子記号Ｎｄ−ｓ）もしくはセリシンホープの繭層、またはこれらカイコの幼虫体内から取り出した絹糸腺内の液状セリシンもしくはこの液状セリシンを凝固させたセリシンからなるシルクセリシンをトリフルオロ酢酸で溶解してなるセリシン溶液を用い、エレクトロスピニングしてなることを特徴とするセリシンナノファイバーの製造方法。
【請求項４】
前記エレクトロスピニングした後、得られたセリシンナノファイバーを水不溶化処理してなることを特徴とする請求項３に記載のセリシンナノファイバーの製造方法。
【請求項５】
前記水不溶化処理が、アルコールと間接的に接触させるかまたはアルデヒド化合物を作用させる第１工程と、エポキシ化合物または二塩基酸無水物を作用させる第２工程とからなることを特徴とする請求項４に記載のセリシンナノファイバーの製造方法。
【請求項６】
シルクセリシンの分子内に二塩基酸無水物による処理でカルボキシル基が導入されてなる水不溶性のセリシンナノファイバーからなることを特徴とする金属イオン吸着材。
【請求項７】
前記セリシンナノファイバーを構成するシルクセリシンが、裸蛹（遺伝子記号Ｎｄ）、セリシン蚕（遺伝子記号Ｎｄ−ｓ）もしくはセリシンホープの繭層由来のセリシン、またはこれらカイコの幼虫体内から取り出した絹糸腺内の液状セリシンもしくはこの液状セリシンを凝固させたセリシンであることを特徴とする請求項６に記載の金属イオン吸着材。
【請求項８】
シルクセリシンの分子内にエポキシ化合物による処理でエポキシ化合物が導入されてなるかまたは二塩基酸無水物による処理でカルボキシル基が導入されてなる水不溶性のセリシンナノファイバーであって、裸蛹（遺伝子記号Ｎｄ）、セリシン蚕（遺伝子記号Ｎｄ−ｓ）もしくはセリシンホープの繭層由来のセリシン、またはこれらカイコの幼虫体内から取り出した絹糸腺内の液状セリシンもしくはこの液状セリシンを凝固させたセリシンからなる該シルクセリシンをトリフルオロ酢酸で溶解したセリシン溶液から得られたセリシンナノファイバーからなることを特徴とする染色機能増強材。
【請求項９】
シルクセリシンの分子内にエポキシ化合物による処理でエポキシ化合物が導入されてなる水不溶性のセリシンナノファイバーであって、裸蛹（遺伝子記号Ｎｄ）、セリシン蚕（遺伝子記号Ｎｄ−ｓ）もしくはセリシンホープの繭層由来のセリシン、またはこれらカイコの幼虫体内から取り出した絹糸腺内の液状セリシンもしくはこの液状セリシンを凝固させたセリシンからなる該シルクセリシンをトリフルオロ酢酸で溶解したセリシン溶液から得られたセリシンナノファイバーからなることを特徴とする耐薬品性増強材。
【請求項１０】
裸蛹（遺伝子記号Ｎｄ）、セリシン蚕（遺伝子記号Ｎｄ−ｓ）もしくはセリシンホープの繭層由来のセリシン、またはこれらカイコの幼虫体内から取り出した絹糸腺内の液状セリシンもしくはこの液状セリシンを凝固させたセリシンからなるシルクセリシンとシルクフィブロインとの複合体からなり、該複合体をトリフルオロ酢酸で溶解した溶液から得られたセリシン・フィブロイン複合ナノファイバーであることを特徴とするセリシン・フィブロイン複合ナノファイバー。
【請求項１１】
シルクセリシンをトリフルオロ酢酸で溶解してなるセリシン溶液と、シルクフィブロインをトリフルオロ酢酸で溶解してなるフィブロインスポンジとからなる複合溶液を用い、エレクトロスピニングしてなることを特徴とするセリシン・フィブロイン複合ナノファイバーの製造方法。
【請求項１２】
前記複合溶液が、裸蛹（遺伝子記号Ｎｄ）、セリシン蚕（遺伝子記号Ｎｄ−ｓ）もしくはセリシンホープの繭層、またはこれらカイコの幼虫体内から取り出した絹糸腺内の液状セリシンもしくはこの液状セリシンを凝固させたセリシンをトリフルオロ酢酸で溶解してなるセリシン溶液と、シルクフィブロインをトリフルオロ酢酸で溶解してなるフィブロインスポンジとからなる複合溶液であることを特徴とする請求項１１に記載のセリシン・フィブロイン複合ナノファイバーの製造方法。
【請求項１３】
前記エレクトロスピニングした後、得られたセリシン・フィブロイン複合ナノファイバーを水不溶化処理してなることを特徴とする請求項１１または１２に記載のセリシン・フィブロイン複合ナノファイバーの製造方法。
【請求項１４】
前記水不溶化処理が、アルコールと間接的に接触させるかまたはアルデヒド化合物を作用させる第１工程と、エポキシ化合物または二塩基酸無水物を作用させる第２工程とからなることを特徴とする請求項１３に記載のセリシン・フィブロイン複合ナノファイバーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セリシンナノファイバーおよびその製造方法、金属イオン吸着材、染色機能増強材、耐薬品増強材、ならびにセリシン・フィブロイン複合ナノファイバーおよびその製造方法に関し、特にセリシンを多量に吐糸するセリシン蚕品種由来のセリシンを用いるセリシンナノファイバーおよびこれを水不溶化したセリシンナノファイバーならびにそれらの製造方法に関すると共に、水不溶化したセリシンナノファイバーからなる金属イオン吸着材、耐薬品性増強材および染色性増強材に関する。本発明はまた、セリシン・フィブロイン複合ナノファイバーおよびその製造方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
生糸の本体は絹フィブロイン繊維（以下、シルクフィブロインまたは単にフィブロインともいう）であり、絹フィブロイン繊維は膠着物質のシルクセリシン（以下、シルクセリシンまたは単にセリシンという）で被覆されている。絹フィブロイン繊維である絹糸は衣料材料として古くから使用されてきたのに対し、膠着物質のセリシンは、生糸から絹糸を製造する過程、製糸工程、あるいは生糸の仕上げ過程において重要な役割を果たすものである。セリシンは、その殆どが、生糸が絹製品になるまでの最終段階では除去されてしまい、最終製品では絹フィブロイン繊維の絹糸が利用されているに過ぎない。このため、セリシンは、研究対象になり難く、副産物としてセリシンを多目的に利用する技術開発が重要であるにもかかわらず、その応用や利用の技術の開発は極めて遅れている。
【０００３】
セリシンは、膠質絹タンパク質であり、繭糸の表面を覆い、グリシン、アラニンの他、セリン、スレオニン、アスパラギン酸等の化学反応性に富む嵩高いアミノ酸から構成されている。繭糸から生糸、生糸から絹織物を製造する諸過程で、セリシンは絹糸の溶解性を制御し、高品質な絹糸を製造する上で重要な意味を持つ。また、接着機能タンパク質として極めて重要な役割を果たす。絹繊維を衣料素材として利用する場合、繭糸を覆うシルクセリシンの殆どは除去・廃棄されてしまうため、セリシンは貴重な未利用資源である。我が国の繭生産量は６８３トン、世界の主要な養蚕国の中国繭生産量は６４万トン（平成１６年度統計）であり、我が国だけでも１３４トン、中国では何と１３万トンのセリシンが全く利用されないまま廃棄されている計算となる。こうした未利用資源を新たな素材（例えば、エレクトロスピニング技術を利用して製造するナノファイバー形状の素材等）として広範な産業分野で利活用することが強く望まれてきた。しかし、いまだにその有効な利活用法は開発されていない。
【０００４】
繭糸や生糸を熱水あるいはアルカリ水溶液で加熱処理すると、水溶解性のシルクセリシンは溶出し、その溶出液がシルクセリシン水溶液となる。これをポリエチレン膜の上に拡げて蒸発乾燥固化すると、乾燥固化条件によっても異なるが、粉末状態または脆い膜状のシルクセリシンが得られる。しかし、セリシンは水に対する溶解度が高いため、その使用用途が限定されるので、広い用途を目的とするためには、水不溶性のセリシンを開発することが必要である。
【０００５】
従来、フィブロイン繊維、フィブロイン膜、またはフィブロイン粉末を溶解して、エレクトロスピニングする際の溶媒としては、ヘキサフルオロアセトン１．５水和物 （Ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｏｎｅ（ＨＦＡｃ）１．５ｈｙｄｒａｔｅ、例えば、和光純薬工業（株）製）、ヘキサフルオロイソプロパノール（１，１，１，３，３，３  Ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏ−２−ｐｒｏｐａｎｏｌ（ＨＦＩＰ）、例えば、和光純薬工業（株）製)等が使用されていた。すなわち、（１）絹フィブロイン繊維を溶解する際にはＨＦＡｃを用いる技術が知られ、（２）繭糸を精練してセリシンを除去した絹フィブロイン繊維を溶解する際にはＨＦＩＰを用いる技術が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００６】
しかし、セリシン蚕の繭層の溶液を作製する場合、従来のエレクトロスピニングで使用されている上記溶媒（ＨＦＡｃ、ＨＦＩＰ）では、セリシン蚕の繭層の溶解量が十分でなく、また、溶解時にセリシン蚕の繭層の分子量を大幅に低下させるという問題があるため、これらの溶媒を使用することができない。しかし、セリシンの分子量を低下させることなくセリシン蚕の繭層を溶解させ、エレクトロスピニングに利用できるセリシン溶液とするための溶媒について、また、セリシン溶液を用い、所望の諸物性を備えたナノスケールのセリシンナノファイバーを製造することは、いまだ提案されておらず、そのようなセリシンナノファイバーを製造する技術の開発が強く望まれてきた。
【０００７】
上記した「セリシン蚕の繭層」という用語は、セリシン繭幼虫が作った繭層を意味するが、以下では、単に「セリシン繭層」とも称す。また、上記した「セリシン繭層の分子量の低下」とは、正確には、セリシン繭層を構成するセリシン分子の分子量が低下することを言うが、以下、単に「セリシン繭層の分子量の低下」または「セリシンの分子量の低下」とも称す。
【０００８】
本発明者らは、家蚕または野蚕由来の絹タンパク質水溶液を透析して絹タンパク質ドープを調製した後、この絹タンパク質ドープを用いてエレクトロスピニングにより絹タンパク質ナノファイバーを製造する方法および得られた絹タンパク質ナノファイバーを提案した（例えば、特許文献２参照）。この場合、絹タンパク質ドープ（水溶液）として絹セリシンドープ（水溶液）を用い、エレクトロスピニングして絹セリシンナノファイバーを製造し、所望によりルコールのみにて水不溶化を行ったことを提案した。
【０００９】
セリシンを有機溶媒に溶かした溶液を用い、エレクトロスピニングして製造できるセリシンナノファイバーは、そのままでは水に極めて溶解し易いため、応用範囲は限られてしまうという問題があるので、新しい応用を拓くには、水溶解性セリシンナノファイバーを水不溶性に変える必要があるが、こうした目的に合致した効率的な水不溶化処理方法はいまだ知られていない。また、セリシンの分子量を低下させることなく、効率よく溶解できれば、セリシンにカイコ由来のフィブロインを複合した新素材が製造できるはずであるが、そのような溶媒および新素材についてもいまだ知られていない。
【００１０】
また、本発明者らは、商品化したセリシンパウダーを８５℃の加熱水溶液に溶解してなるセリシン水溶液をエレクトロスピニングすることでセリシンナノファイバーを製造することを提案した（特開２０１０−２７０４２６号）。セリシンパウダーを使用するには、加熱した水溶液にセリシンパウダーを溶解する。セリシン濃度を４０ｗｔ％〜６０ｗｔ％の濃度範囲に設定してエレクトロスピニングすると、平均繊維径とその標準偏差が微少なセリシンナノファイバーが製造できることが知られている。しかし、セリシン繭層を溶解させる溶媒、溶解条件、セリシン濃度、エレクトロスピニング条件によっては、製造されるセリシンナノファイバー中にビーズ状の形態が存在する場合がある。
【００１１】
セリシン繭層として、セリシンを大量に生産する新蚕品種「セリシンホープ」が知られており（例えば、特許文献３参照）、このセリシンホープのセリシン繭層を用いてハイドロゲル、セリシン多孔質体を製造する技術が知られている（例えば、特許文献４参照）。これによるとセリシンホープのセリシン繭層を臭化リチウム水溶液で溶解させてなる溶液に１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣ緩衝液（ｐＨ９）を加えた後、弱アルカリ性に調整する。透析チューブに入れて純水で透析を繰りかえし、濾過を行い、セリシン水溶液を調製する。このセリシン水溶液にエタノールを添加して超音波処理することでセリシンハイドロゲルができる。また、このセリシン水溶液を−２５℃で凍結させて水分を除去することでセリシン多孔質体が製造できる。しかしながら、セリシンホープ繭層を用いて新素材を製造する技術はこの技術以外には知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特表２００６−５０４４５０号公報
【特許文献２】特開２０１０−１５０７１２号公報
【特許文献３】特開２００１−２４５５５０号公報
【特許文献４】特開２００６−１１１６６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、上述の従来技術の問題点を解決することにあり、カイコ由来のセリシンを、十分な量で溶解する有機溶媒であって、かつその際にセリシンの分子量低下のない所望の有機溶媒に溶解して得た溶液を用いて、エレクトロスピニングにより得られる所望の特性を有するセリシンナノファイバーおよびその製造方法を提供すると共に、このセリシンナノファイバーを効率的に水不溶化し、次いで化学加工処理したセリシンナノファイバーにより染色性を増強し（染色増強材）、金属イオンを効果的に吸着し（金属イオン吸着材）、または優れた耐薬品性を付与する（耐薬品性増強材）ことができるセリシンナノファイバーおよびそれを製造するための技術を提供することにある。
【００１４】
本発明の課題はまた、上記従来技術の問題点を解決し、カイコ由来のセリシンを素材にしたセリシン溶液を用いてエレクトロスピニングし、平均繊維径と繊維径分布の制御を可能とするセリシンナノファイバーの効率的、経済的な製造技術を提供することにある。
【００１５】
本発明の課題はさらに、シルクセリシンとシルクフィブロインとからなるセリシン・フィブロイン複合ナノファイバーおよびその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、遺伝的に多くのセリシンを含むセリシン繭層を有機溶媒に溶解し、この溶液を用いてエレクトロスピニングすることで、微細なセリシンナノファイバーを製造すると共に、セリシンナノファイバーを水不溶化し、次いで化学加工処理した水不溶化セリシンナノファイバーの染色性を調べると共に、この水不溶化セリシンナノファイバーの各種用途（例えば、金属イオン吸着材、薬品抵抗性素材、抗菌活性素材、耐熱安定性素材等）を研究することで、多様な機能を持ち、産業資材として多面的に利用できる素材開発を進めてきた。
【００１７】
シルクセリシンをどのような有機溶媒に溶かすのか、その溶解温度と溶解時間について、そしてエレクトロスピニング条件について検証した。また、この特定の有機溶媒に溶解して得られたセリシン溶液を用い、エレクトロスピニングして製造できるセリシンナノファイバーは、高い水溶解性を示す。この水溶解性セリシンナノファイバーを染色したり、金属吸着実験を行ったり、酸やアルカリの水溶液による溶解性実験等を行うために、これらの実験に先立って、セリシンナノファイバーをセリシンの貧溶媒で処理することで水不溶化処理を行う水不溶化したセリシンナノファイバーを製造するための方法を確立した。すなわち、第１工程でアルコールまたはアルデヒド化合物を水溶解性セリシンナノファイバーに作用させ、第２工程でエポキシ化合物、二塩基酸無水物またはＥＤＴＡ二塩基酸無水物を作用させて化学加工処理した水不溶化セリシンナノファイバーを製造し、このセリシンナノファイバーがアルカリ・酸の水溶液に対して溶解しないこと、金属イオン吸着性および抗菌活性を有すること、ならびに染色増強性を有すること等を見出し、本発明を完成させるに至った。なお、第１工程でアルコールなどを作用させて水不溶化するのは、第２工程において水を用いた系で処理する場合に、セリシンがその化学加工処理中に溶解してしまわないようにするためである。また、本発明で「水不溶化」といった場合、文意により、第１工程（アルコール処理など）による場合および第２工程（化学加工処理）による場合の一方または両方を含む場合がある。
【００１８】
また、裸蛹（遺伝子記号Ｎｄ）、セリシン蚕（Ｎｄ−ｓ）または新蚕品種・セリシンホープに由来する蚕品種のセリシン繭層を有機溶媒で溶解し、この溶液を用いてエレクトロスピニングすることにより、所望の平均繊維径の小さい、しかも繊維径分布が少ないセリシンナノファイバーを効率的に製造することが可能となり、従来技術の問題を解決することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１９】
本発明に使用できる蚕の絹糸腺、繭層または繭は、下記の４種類の蚕品種に由来するものであれば使用が可能である。例えば、セリシンＮ、セリシンＮｄ蚕、Ｎｄ−ｓ蚕およびセリシンホープ等の蚕品種（注：カイコの幼虫を意味する）に由来する繭層を構成するセリシン、またはこれらカイコ幼虫の体内から取り出した絹糸腺内の液状セリシンもしくはこの液状セリシンを凝固させたセリシンを例示でき、セリシンホープを特に好ましく用いることができる。
【００２０】
（１）形質名  裸蛹、遺伝子記号Ｎｄで表されるカイコ（Ｎａｋｅｄ  ｐｕｒａ中部及び後部糸腺の退化により吐糸が不能で裸蛹となる）。
【００２１】
（２）形質名  橋本裸蛹、遺伝子記号ＮｄＨで表されるカイコ（Ｎａｋｅｄ  ｐｕｒａ  ｏｆ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ：Ｎｄと性状は同じ）。
【００２２】
（３）形質名  セリシン繭、遺伝子記号Ｎｄ−ｓ（ｓｅｒｉｃｉｎ  ｃｏｃｏｏｎ後部糸腺の退化によりフィブロイン合成が負で、セリシンだけからなる繭をつくる）。
上記（１）〜（３）における３種類のカイコの特性は、蚕糸学用語辞典、Ｐａｇｅ２４４、日本蚕糸学会、１９７９に基づく。
【００２３】
（４）セリシンホープと呼ばれるカイコ。
蚕品種セリシンホープは、中国品種「ＣＳ８３」系統に品種「Ｎｄ系統」を交配し、さらに戻し交配等を行い、作製した品種である（特許文献３：特開２００１−２４５５５０）。蚕品種セリシンホープは、フィブロイン合成能が退化しており、セリシンを多量に生産する（（４）の文言は特許文献４：特開２００６−１１１６６７号公報より引用）。セリシンホープは、独立行政法人農業生物資源研究所が開発し、蚕品種として特許されており、この蚕の特徴は、セリシンを合成する絹糸腺が大部分で、フィブロインを合成する部分がほとんど発達していない。そのため、セリシンホープが作る繭は通常の品種より繭層が薄く小さい（高原社ＨＰより）。
【００２４】
本発明のセリシンナノファイバーは、シルクセリシンからなり、該シルクセリシンが、裸蛹（遺伝子記号Ｎｄ）、セリシン蚕（遺伝子記号Ｎｄ−ｓ）もしくはセリシンホープの繭層由来のセリシン、またはこれらカイコの幼虫体内から取り出した絹糸腺内の液状セリシンもしくはこの液状セリシンを凝固させたセリシンンからなり、該シルクセリシンをトリフルオロ酢酸で溶解したセリシン溶液から得られたセリシンナノファイバーであることを特徴とする。
【００２５】
前記シルクセリシンが、セリシン分子内にエポキシ化合物による処理でエポキシ化合物が導入されてなるセリシンか、二塩基酸無水物による処理で二塩基酸無水物がセリシンの塩基性アミノ酸側鎖と結合し、その結果、カルボキシル基が導入されてなるセリシンか、またはアルデヒド化合物による処理でセリシン分子間が架橋されてなるセリシンであることを特徴とする。
【００２６】
本発明のセリシンナノファイバーの製造方法は、裸蛹（遺伝子記号Ｎｄ）、セリシン蚕（遺伝子記号Ｎｄ−ｓ）もしくはセリシンホープの繭層、またはこれらカイコの幼虫体内から取り出した絹糸腺内の液状セリシンもしくはこの液状セリシンを凝固させたセリシンからなるシルクセリシンをトリフルオロ酢酸で溶解してなるセリシン溶液を用い、エレクトロスピニングしてなることを特徴とする。
【００２８】
前記セリシンナノファイバーの製造方法において、エレクトロスピニングした後、得られたセリシンナノファイバーを水不溶化処理してなることを特徴とする。
【００２９】
前記セリシンナノファイバーの製造方法において、水不溶化処理が、アルコールと間接的に接触させるかまたはアルデヒド化合物を作用させる第１工程と、エポキシ化合物または二塩基酸無水物を作用させる第２工程とからなることを特徴とする。
【００３０】
本発明の金属イオン吸着材は、シルクセリシンの分子内に二塩基酸無水物による処理でカルボキシル基が導入されてなる水不溶性のセリシンナノファイバーからなることを特徴とする。
【００３１】
前記金属イオン吸着材において、セリシンナノファイバーを構成するシルクセリシンが、裸蛹（遺伝子記号Ｎｄ）、セリシン蚕（遺伝子記号Ｎｄ−ｓ）もしくはセリシンホープの繭層由来のセリシン、またはこれらカイコの幼虫体内から取り出した絹糸腺内の液状セリシンもしくはこの液状セリシンを凝固させたセリシンであることを特徴とする。
【００３２】
本発明の染色機能増強材は、シルクセリシンの分子内にエポキシ化合物による処理でエポキシ化合物が導入されてなるか、または二塩基酸無水物による処理でカルボキシル基が導入されてなる水不溶性のセリシンナノファイバーであって、裸蛹（遺伝子記号Ｎｄ）、セリシン蚕（遺伝子記号Ｎｄ−ｓ）もしくはセリシンホープの繭層由来のセリシン、またはこれらカイコの幼虫体内から取り出した絹糸腺内の液状セリシンもしくはこの液状セリシンを凝固させたセリシンからなる該シルクセリシンをトリフルオロ酢酸で溶解したセリシン溶液から得られたセリシンナノファイバーからなることを特徴とする。
【００３４】
本発明の耐薬品性増強材は、シルクセリシンの分子内にエポキシ化合物による処理でエポキシ化合物が導入されてなる水不溶性のセリシンナノファイバーであって、裸蛹（遺伝子記号Ｎｄ）、セリシン蚕（遺伝子記号Ｎｄ−ｓ）もしくはセリシンホープの繭層由来のセリシン、またはこれらカイコの幼虫体内から取り出した絹糸腺内の液状セリシンもしくはこの液状セリシンを凝固させたセリシンからなる該シルクセリシンをトリフルオロ酢酸で溶解したセリシン溶液から得られたセリシンナノファイバーからなることを特徴とする。
【００３６】
本発明のセリシン・フィブロイン複合ナノファイバーは、裸蛹（遺伝子記号Ｎｄ）、セリシン蚕（遺伝子記号Ｎｄ−ｓ）もしくはセリシンホープの繭層由来のセリシン、またはこれらカイコの幼虫体内から取り出した絹糸腺内の液状セリシンもしくはこの液状セリシンを凝固させたセリシンからなるシルクセリシンとシルクフィブロインとの複合体からなり、該複合体をトリフルオロ酢酸で溶解した溶液から得られたセリシン・フィブロイン複合ナノファイバーであることを特徴とする。
【００３８】
本発明のセリシン・フィブロイン複合ナノファイバーの製造方法は、シルクセリシンをトリフルオロ酢酸で溶解してなるセリシン溶液と、シルクフィブロインをトリフルオロ酢酸で溶解してなるフィブロインスポンジとからなる複合溶液を用い、エレクトロスピニングしてなることを特徴とする。
【００３９】
前記セリシン・フィブロイン複合ナノファイバーの製造方法において、複合溶液が、裸蛹（遺伝子記号Ｎｄ）、セリシン蚕（遺伝子記号Ｎｄ−ｓ）もしくはセリシンホープの繭層、またはこれらカイコの幼虫体内から取り出した絹糸腺内の液状セリシンもしくはこの液状セリシンを凝固させたセリシンをトリフルオロ酢酸で溶解してなるセリシン溶液と、シルクフィブロインをトリフルオロ酢酸で溶解してなるフィブロインスポンジとからなる複合溶液であることを特徴とする。
【００４０】
前記セリシン・フィブロイン複合ナノファイバーの製造方法において、エレクトロスピニングした後、得られたセリシン・フィブロイン複合ナノファイバーを水不溶化処理してなることを特徴とする。
【００４１】
前記セリシン・フィブロイン複合ナノファイバーの製造方法において、水不溶化処理が、アルコールと間接的に接触させるかまたはアルデヒド化合物を作用させる第１工程と、エポキシ化合物または二塩基酸無水物を作用させる第２工程とからなることを特徴とする。
【発明の効果】
【００４２】
本発明によれば、カイコ由来のセリシン（例えば、裸蛹（遺伝子記号Ｎｄ）、セリシン蚕（遺伝子記号Ｎｄ−ｓ）もしくは新蚕品種・セリシンホープからの繭層由来のセリシン）をＴＦＡ等の有機溶媒に溶解してなるセリシン溶液を用いてエレクトロスピニングし、平均繊維径と繊維径分布との制御を可能とする所望のセリシンナノナノファイバーを効率的、経済的に製造する技術を提供できるという効果を奏する。
【００４３】
また、本発明によれば、エレクトロスピニングして得られた水溶解性のセリシンナノファイバーを水不溶性にすることができるので、金属イオン吸着材、染色機能増強材、抗菌活性素材、耐薬品性素材等として利用できるという効果を奏する。
【００４４】
さらに、本発明によれば、上記セリシン溶液と絹タンパク質であるフィブロインの溶液とを用いてエレクトロスピニングし、平均繊維径と繊維径分布との制御を可能とする所望のセリシン・フィブロイン複合ナノファイバーを効率的、経済的に製造する技術を提供できるという効果を奏する。
【００４５】
なお、本発明によれば、上記水溶解性のセリシンナノファイバーは、極細であることに加え、生体適合性素材であり、かつ生分解性であるため、体内に移植しても体内酵素で分解するという生化学特性を有する。
【００４６】
上記したように、本発明の水溶解性セリシンナノファイバーは、生体適合性のよいシルクのセリシンに由来するので、有用な細胞を培養・増殖させるための再生医療材料として利用でき、その表面積は極めて大きいため、様々な生体細胞（骨細胞、肝細胞、平滑筋細胞、神経細胞、繊維芽細胞等）との親和性の良さから短時間での細胞増殖が可能なため、医用材料として利用でき、再生医療工学、創傷材料等のヘルスケアー分野、バイオテクノロジー分野、エネルギー分野における新素材として有望である。
【００４７】
本発明の水溶解性セリシンナノファイバーは、絹タンパク質の持つ生体適合性に加えて、保水性、保湿性、生分解性に優れ、紫外線のエネルギーを吸収する性質を持ち、かつ有効表面積が広いという諸特性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】実施例４において製造された水溶解性のセリシンナノファイバーの形態を示すＳＥＭ画像。
【図２】比較例１において製造された水溶解性のセリシンナノファイバーの形態を示すＳＥＭ画像。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本発明に係るセリシンナノファイバーの実施の形態によれば、セリシンナノファイバーは、裸蛹（遺伝子記号Ｎｄ）、セリシン蚕（遺伝子記号Ｎｄ−ｓ）もしくはセリシンホープの繭層由来のシルクセリシン、またはこれらカイコの幼虫体内から取り出した絹糸腺内の液状セリシンもしくはこの液状セリシンを凝固させたセリシンからなり、エレクトロスピニングにより得られる。
【００５０】
上記したシルクセリシンは、遺伝的にセリシンからなる繭層を作るセリシンを多量に製造する裸蛹（遺伝子記号Ｎｄ）、セリシン蚕（遺伝子記号Ｎｄ−ｓ）あるいは新蚕品種・セリシンホープ幼虫に由来するセリシンホープの繭層由来のものである。従来技術には、例えば、セリシンホープ繭層を溶解するための最適な溶媒について、また、セリシンホープ繭層をその溶媒に溶解して得たセリシンホープ繭層溶液を用いてエレクトロスピニングする技術については、全く開示も示唆もされていない。セリシンホープ繭層を効率的に、かつセリシンの分子量を急激に低下させずに溶解できる溶媒で溶解して得たセリシンホープ繭層の溶液を用いてエレクトロスピニングすることで、各種産業資材として利用できるセリシンナノファイバーが製造できれば新たな用途に利用できる素材となり得るであろう。従来はこうした技術の提案がないために素材開発が遅れていた。
【００５１】
本発明によれば、セリシンを溶媒に溶かした溶液を用い、エレクトロスピニングして製造できるセリシンナノファイバーは、水に極めて溶解し易く、用途に限界がある。そのため、新しい応用を拓くには、水溶解性セリシンナノファイバーを水不溶性に変える必要があったが、従来技術には、こうした目的に合致した効率的な水不溶化処理方法は開示も示唆もされていない。セリシンの分子量を低下させることなく効率よく溶解できれば、セリシンにカイコ由来のフィブロインを複合した新素材の製造もできるはずである。
【００５２】
本発明でエレクトロスピニングする原料であるセリシンを得るためには次のような方法がある。絹糸本体の成分であるフィブロインを生合成する組織である後部絹糸腺が遺伝的に退化した突然変異系統である裸蛹（遺伝子記号Ｎｄ）、セリシン蚕（遺伝子記号Ｎｄ−ｓ）、または先端技術で育成して得られ、最近特許になった第３３７４１７７号（発明の名称：セリシンを大量に生産する蚕品種）に記載された「セリシンホープ」のセリシンホープ繭層が好ましく利用できる。あるいはまた、これらカイコの幼虫体内から取り出した絹糸腺内の液状セリシンやこの液状セリシンを凝固させたセリシンも用いることができる。
【００５３】
遺伝子記号ＮｄおよびはＮｄ−ｓ、ならびにセリシンホープ幼虫におけるセリシンの吐糸量、幼虫の大きさ、強健度、営繭性などは全く異なる。
【００５４】
これらの突然変異種の蚕品種について詳細に説明する。こうした突然変異種としては次の２種がある。
（１）フィブロインをほとんど合成せず、セリシンのみ（含量９９％以上）を合成する裸蛹系統（「Ｎｄ系統」）。
（２）フィブロイン約３０％、セリシン約７０％の組成から成るタンパク質を生産するセリシン蚕系統「Ｎｄ−ｓ系統」（特許文献３：特開２００１−２４５５５０参照）。
【００５５】
しかし、上記突然変異種であるカイコは、絹タンパク質の生産量が１頭当たり３０ｍｇ内外と非常に少なく、セリシン１ｇを生産するには、Ｎｄ系統で約５５頭、Ｎｄ−Ｓ系統で釣８０頭を飼育する必要があり、両系統ともセリシンの生産量が著しく低い(特開２００１−２４５５５０参照)。これに対して、本発明で最も効率的に利用できるセリシンホープ繭層は、１頭当たりの吐糸量が約９５ｍｇ、セリシン量の割合が９９％で、交雑種に比べてセリシン生産量が１．２〜１．３倍であるセリシンＮ（セリシンホープ蚕品種）（注：セリシンの含量、１頭当たりの吐糸量、フィブロイン含量についての記述は、特開２００１−２４５５５０参照）である。
【００５６】
本発明によれば、セリシンを多量に製造するセリシン繭層を用いることが好ましく、こうしたセリシンを用い、エレクトロスピニングしてなるセリシンナノファイバー、およびその製造方法が提供される。本発明によればまた、エレクトロスピニングにより得られたセリシンナノファイバーを水不溶化処理することにより、金属イオン吸着性セリシンナノファイバー、酸やアルカリに対する耐薬品性が増強したセリシンナノファイバー、および染色性が向上したセリシンナノファイバーを提供できる。
【００５７】
本発明では、上記したように、セリシンを多量に吐糸するセリシンホープのセリシン繭層、Ｎｄカイコのセリシン繭層がセリシンナノファイバーを製造するのに好ましく利用できる。但し、これらカイコの繭層には、上記のとおり重量比で数％のフィブロインが含まれるが、残りのタンパク質はセリシンであるため、これらカイコ繭層は実質的にはセリシンから構成されていると考えてよい。
【００５８】
これらのセリシン繭層は、本発明者らが出願した先願で用いたセリシンパウダーとは異なり溶媒に対する溶解性も大きく相違する。セリシン繭層はカイコが吐糸して製造されたものであり、繊維構造を持つが、セリシンパウダーは家蚕繭糸のセリシンを粉末化したものであるため繊維構造を持たず、熱水には溶解し易い。セリシン繭層の熱水に対する溶解性は低く、本発明で用いるセリシンを多量に吐糸するセリシン繭層は、８５℃の加熱温水で処理しても溶解率は低く５％程度を示す程度に過ぎない。本発明に従ってセリシンナノファイバーを製造するために用いる素材は、セリシンホープのセリシン繭層、Ｎｄカイコのセリシン繭層等であり、セリシンパウダーでないため、どんな溶媒で溶解するとよいか、セリシンの最適濃度はどの位か等の情報は全く不明であった。
【００５９】
こうしたセリシンホープのセリシン繭層、セリシンカイコのセリシン繭層、Ｎｄカイコのセリシン繭層を原料として用い、エレクトロスピニングしてセリシンナノファイバーを製造するに際して、セリシンナノファイバーの平均繊維径や繊維径分布をいかに微少にするかの技術的な開示はこれまで無い。そこで、これらの問題解決を可能とする、経済的でかつ効率的なセリシンナノファイバーの製造技術の出現が強く望まれてきた。 
【００６０】
本発明のセリシンホープのセリシン繭層、セリシンカイコのセリシン繭層、Ｎｄカイコのセリシン繭層を溶解する際に、フィブロインを溶解するための従来公知の上記溶媒で溶解するかどうかは一切不明であった。
【００６１】
本発明では、上記セリシン繭層の分子量を低下させずにエレクトロスピニング用の溶液を製造する最善の方法を試行錯誤的に工夫しながら検討し、最適溶媒と最適エレクトロスピニング条件を解明し本発明を完成させた。
【００６２】
エレクトロスピニング法でセリシン溶液を用いてセリシンナノファイバーを製造する際に、セリシン溶液を用い、エレクトロスピニングして平均繊維径と繊維径分布を制御したセリシンナノファイバーを効率的にしかも経済的に製造することが製造上の重要な要件であった。
【００６３】
本発明では、セリシン繭層を溶解する溶媒を試行錯誤的に検索した結果、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）が特に優れた溶解性を示し、かつセリシン繭層の分子量を急激に低下することがなく、その結果、セリシン繭層のＴＦＡ溶液を用いてエレクトロスピニングすることで、所望のセリシンナノファイバーを効率的に経済的に製造することが可能となった。こうした方法でセリシン繭層の溶液を用いてエレクトロスピニングすると、セリシンからなり、表面積が極めて大きいセリシンナノファイバーが製造でき、その結果、有用細胞を効率的に増殖させるための再生医療材料としての利用価値は高く、様々な生体細胞との親和性が良く、短時間に細胞増殖が可能となるため再生医用材料として広範に利用できる。
【００６４】
セリシンナノファイバーは、例えば染色工程では高温水溶液系に接触するため、素材が水溶解性であると染色することはできない。エレクトロスピニングしてなるセリシンナノファイバーは、水溶解性であり、極めて吸湿性が高いので、染色素材以外に、金属イオン吸着材、耐薬品性素材として使用するには、予め水不溶性にしておくことが必要であり、本発明によれば、より満足すべき特性を有する水不溶化したセリシンナノファイバーの製造が可能となった。
【００６５】
上記したように、本発明における素材は、シルクセリシンを特異的に生合成する蚕（遺伝子記号がＮｄ−ｓ、Ｎｄで表されるセリシン幼虫）由来のセリシン繭層、特に好ましくはセリシンホープ幼虫のセリシン繭層である。
【００６６】
セリシンホープ幼虫を例にとり、以下説明する。セリシンホープ幼虫体内からセリシンを取り出すには次のようにするとよい。成熟したセリシンホープ幼虫体内から絹糸腺を取り出し、水洗いして絹糸腺細胞をピンセットで除去すると、液状のセリシンが得られるので、これを、蒸留水を入れたシャーレに浸漬し、５℃で４時間放置すると、均一なセリシン水溶液が製造できる。このセリシン水溶液をセルロース製透析膜で蒸留水により十分に置換した後、無菌環境下、扇風機で送風乾燥してセリシンの濃度を高めると高分子量の所定濃度のセリシン水溶液が製造できる。本発明によれば、この絹糸腺から取り出して調製したセリシン水溶液を用いてエレクトロスピニングしても良いが、このセリシン水溶液を蒸発・乾燥・固化して粉末状のセリシンを得た後、この粉末状のセリシンを所定の有機溶媒に溶解して所定濃度を有するセリシン溶液を調製し、この溶液を用いてエレクトロスピニングすることにより、所望のセリシンナノファイバーを製造することが好ましい。
【００６７】
セリシンを構成する主要なアミノ酸はセリンである。シルクセリシンには、その他に、側鎖が長くて嵩高いアルギニン、ヒスチジン、リジン等の化学反応性に富むアミノ酸が多く含まれる。繭糸をアルカリ抽出して得られるセリシンは水溶解性であるため、高温の水に長時間晒されるとセリシンは膨潤し、ついには溶解してしまう。そのため、グラフト加工処理や化学加工処理、あるいは染色処理の工程の対象には、水に溶解しない水不溶性のセリシンを用いることが必要である。また、従来の方法でセリシンを染色するには、高温度で長時間、水溶液系の染色浴で処理するため、水不溶化したセリシンを用い、水溶液系によらない染色浴での染色をする必要がある。
【００６８】
本発明において、セリシンまたはセリシン繭層を溶解し、セリシンナノファイバーを製造するために使用できる溶媒としては、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、蟻酸（ＦＡ）、ヘキサフルオロアセトン（ＨＦＡｃ）１．５水和物、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）等を利用できる。しかし、分子量を低下させることなく、溶解性に優れた溶媒としてはＴＦＡまたはＦＡが好ましく利用でき、ＴＦＡが特に好ましく利用できる。
【００６９】
本発明によれば、セリシン溶液を製造するためのセリシン原料は、上記したように、裸蛹（遺伝子記号Ｎｄ）の繭層、セリシン蚕（Ｎｄ−ｓ）の繭層、または新蚕品種・セリシンホープに由来するセリシンホープの繭層である。これらの試料をＴＦＡまたはＦＡ等の有機酸で溶解したセリシンの溶液を使用してエレクトロスピニングすることが好ましい。
【００７０】
裸蛹、シルクセリシン繭、シルクセリシンホープのカイコ幼虫は成熟すると繊維状のセリシンを吐糸する。この未処理未加工の繊維状セリシンは熱水には一部溶解するが、試料の全量を溶解することは無い。こうしたセリシンをＴＦＡ等の有機溶媒に溶解した溶液を用い、エレクトロスピニングして製造できるセリシンナノファイバーは、高い水溶解性を示すため、セリシンナノファイバーを用いて、染色したり、金属吸着実験を行ったり、酸やアルカリ水溶液による溶解性実験を行うには、これらの実験に先立ってセリシンナノファイバーを水に対して不溶化処理し、かつまた染色にあたっては染色効率をよくするため、水溶液系ではなく溶媒系の染色浴で、かつできる限り低温で染色することが可能な染色技術の開発が望まれてきた。
【００７１】
ところで、従来法で極細のセリシンナノファイバーを製造するには、ドープ濃度、印加電圧、陽極・陰極間距離（紡糸距離ともいう）、溶液送り出し速度等の紡糸条件を変えながらナノファイバーの最適製造条件を試行錯誤的に検討する必要があった。本発明でも、セリシン溶液を使用し、エレクトロスピニングして製造されるセリシンナノファイバーの平均繊維径（サイズ）を極細にするには、セリシンを溶解する溶媒の種類、セリシン溶液の濃度、エレクトロスピニングの紡糸条件（印加電圧、紡糸距離、紡糸速度）を試行錯誤的に変えながら所望する条件に合う最適条件を探すことで、所望するセリシンナノファイバーを製造する必要がある。本発明では、以下の実施例に記載するように、エレクトロスピニング条件、セリシン溶液の濃度、紡糸距離、印加電圧を変える実験を主に行った。
【００７２】
本発明におけるシルクセリシンはまた、蚕が作った繭糸から取り出すことも可能であるし、蚕の絹糸腺内のセリシンを利用することも可能である。
【００７３】
セリシンホープ繭層をＴＦＡに溶解して得られるセリシンＴＦＡ溶液の濃度は、１ｗｔ％〜１５ｗｔ％が好ましく、２ｗｔ％〜１５ｗｔ％が特に好ましい。セリシン溶液の濃度が１ｗｔ％未満と低すぎると、エレクトロスピニング効率が良くなく、セリシン溶液の濃度が１５ｗｔ％を超えると、エレクトロスピニングの際、紡糸口でセリシンが凝固したり、安定した紡糸ができなかったり、紡糸口から良好なセリシンジェットが噴出しないので、表面が平滑な極細のセリシンナノファイバーが製造できないという問題がある。
【００７４】
セリシン溶液を用い、エレクトロスピニングして製造されるセリシンナノファイバーの形態上の評価は次のようにして行う。すなわち、セリシンナノファイバーの平均繊維径がどれほどか、そのバラツキの指標である平均繊維径の標準偏差はどれほどか、あるいは陰極板上に集積するナノファーバーに粒状の「ビーズ」の付着が見られるかを観察することにより行われる。
【００７５】
これらのセリシンナノファイバーの紡糸状態に及ぼすエレクトロスピニング紡糸条件で特に重要なものは、セリシン溶液濃度、印加電圧、紡糸口から陰極金属板までの紡糸距離である。
【００７６】
従って、セリシンナノファイバーをエレクトロスピニングにより製造する決め手としては、セリシン溶液濃度、印加電圧、紡糸距離が重要な要因となる。エレクトロスピニングの紡糸条件が一定であれば、セリシン溶液濃度が希薄なほどナノファイバーの平均繊維径は細くなる傾向にある。セリシン溶液濃度が１ｗｔ％未満だと、紡糸口からシルクドープを微細に放出しても、陰極板上ではナノファイバーの形態とならず、極微細な粒子（ビーズ）状となってしまうし、セリシン溶液濃度が１５ｗｔ％を超えると、電圧を印加してもセリシンジェットが紡糸口から噴出しないという問題が生ずる。
【００７７】
本発明で用いることができるエレクトロスピニング装置は、特別の仕様の装置でなくてもよく、従来の既知の装置で良い。
【００７８】
本発明で用いるエレクトロスピニング装置は、高圧電源、ポリマー溶液の貯蔵タンク、陽極に接続する紡糸口、およびアースされ陰極に接続する陰極板（コレクター）から構成される。
【００７９】
セリシン溶液を試料貯蔵容器（タンク）に入れ、既知の操作に従ってエレクトロスピニングすれば良く、例えば、紡糸口と陰極板間に１０〜３０ｋＶの電圧を印加すると、セリシン溶液表面の過剰電荷が表面張力を越える時、セリシン溶液の表面積が最大となるようにセリシン溶液のジェットが噴射し、超微細なセリシンナノファイバーとなって陰極板（コレクター）に向かって噴射し、金属製の陰極板上にセリシンナノファイバーが積層する。
【００８０】
上記したように、セリシンナノファイバーを効率よく製造するためには、セリシン溶液を製造するためにセリシンをどのような溶媒で溶解するか、セリシン溶液の最適濃度は何ｗｔ％とするか、印加電圧をどのように設定するかが重要な要因である。
【００８１】
また、セリシンホープ繭層を溶解するための従来の溶媒はＨＦＩＰ、ＨＦＡｃであるが、分子量を低下することなく効率的に溶解するにはＴＦＡやＦＡが好ましく用いられ、特にＴＦＡが好ましく用いられる。
【００８２】
本発明者らは、上記したように、セリシンをＴＦＡ等の有機溶媒に溶解し、この溶液を用いてエレクトロスピニングし、セリシンナノファイバーを製造しているが、製造されたセリシンナノファイバーは高い水溶解性を示すため、セリシンナノファイバーを用いて、染色したり、金属吸着実験を行ったり、酸やアルカリ水溶液による溶解性実験を行うには、これらの実験に先立ってセリシンナノファイバーを水に対する不溶化処理をさせることで素材が広範に利用できることを見出し、本発明を完成するに至ったが、以下、水不溶化したセリシンナノファイバーの製造方法、本発明の優れた金属イオン吸着性、染色性、耐薬品性を有するセリシンナノファイバーおよびその製造方法、および染色方法等についてその好ましい実施の形態を詳細に説明する。
【００８３】
セリシンとしては、上記したように、セリシン蚕由来の液状セリシンあるいはセリシン蚕幼虫が吐き出すセリシン繭であっても同様に利用できる。セリシン蚕であれば、遺伝子記号がＮｄ、Ｎｄ−ｓで表されるカイコ由来のシルクセリシンが利用できる。
【００８４】
以下、金属イオン吸着性、耐薬品性および染色性に関して説明する。
【００８５】
金属イオン吸着性：
セリシン溶液を用い、エレクトロスピニングして製造できるセリシンナノファイバーは水に溶解してしまうが、水不溶化処理した後に二塩基酸無水物等で化学加工処理してカルボキシル基を導入した水不溶化セリシンナノファイバーは金属イオンを吸着するための基材やその他の基材として利用できる。これは、セリシンを構成するグルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸側鎖が金属イオンを配位する拠点となるためである。
【００８６】
耐薬品性：  
セリシンナノファイバーの耐薬品性を向上させるためには、まずセリシンナノファイバーを水不溶化処理した後、エポキシ化合物で化学加工処理するとよい。エポキシ化合物でセリシンナノファイバーを化学加工処理する方法は次の通りである。
【００８７】
例えば、グリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセ化成工業株式会社製、商品名：デナコールＥＸ−３１３およびＥＸ−３１４）等のように３官能性エポキシ化合物や、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ナガセ化成工業株式会社製、商品名：デナコールＥＸ−８１０）等のような２官能性エポキシ化合物を用いて化学加工処理すれば良い。
【００８８】
セリシンナノファイバーの化学加工処理において、エポキシ化合物を溶解するための有機溶媒としては、従来公知の有機溶媒を利用できる。このようなものとしては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦと略記することもある）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯと略記することもある）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡと略記することもある）、テトラヒドロフラン、ピリジン等が挙げられる。本発明においては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の使用が特に好ましい。
【００８９】
上記した化学加工処理は、例えば、エポキシ化合物を、試料重量に対して２０倍（浴比１：２０と略記することもある）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、この溶液を逆流冷却器を付けた１００ｍＬのナス型フラスコに入れ、試料がＤＭＦ中に完全に浸漬するように留意しながら、ウォーターバス中で、７５〜８０℃の間で時間を変えて反応させることにより実施できる。なお、エポキシ化合物は、例えば、１００ｍＬのＤＭＦに２０ｇ含まれるようにする。反応終了後、試料を取り出し、ＤＭＦで洗浄し、続いて５５℃のアセトンで洗浄することで未反応試薬を除去する。最終的に水で洗浄し、乾燥後重量を測定し、公知の方法で化学加工の有無を確認する。
【００９０】
セリシンナノファイバーへのエポキシ化合物による化学加工処理は、化学反応時の反応温度６０〜９０℃で実施される。反応温度が６０℃より低すぎると反応効率が良くなく、反応温度が９０℃を超えると反応が短時間に進んでしまい、反応量を制御でき難くなる等の問題がある。有機溶媒中におけるエポキシ化合物の濃度は、５〜３０ｗｔ％であればよい。濃度が５ｗｔ％未満となると反応効率が低下するという問題があり、また、３０ｗｔ％を超えると、有機溶媒に無駄に溶解する酸無水物量が増えるため、経済的ではないし、かつ反応温度を上げると短時間に反応効率が上がりすぎてしまい、加工効率を制御することが困難となるという問題がある。
【００９１】
なお、開放容器中で、７５℃以上の温度で化学加工処理すると、反応時間が長時間に及ぶので溶媒が蒸発し、これに伴い加工試薬濃度が変化し、セリシンナノファイバーの化学加工処理の程度を制御することが困難となる。そのため、化学加工処理は逆流冷却器を付けたナス型フラスコ、三角フラスコ等内で行うことが望ましい。
【００９２】
染色性：
セリシンナノファイバーの染色性を増強するための化学加工処理は次のようにする。まず、セリシンナノファイバーを、アルコールで水不溶化処理した後またはアルデヒド化合物で水不溶化処理した後、この水不溶化した試料にエポキシ化合物もしくは二塩基酸無水物で化学加工処理することで染料が吸着する拠点となるカルボキシル基やエポキシ基を予め導入しておく。この場合、水不溶化した試料に対して、エポキシ化合物で処理した後にさらに二塩基酸無水物で化学加工処理しても、染色性増強効果は得られる。
【００９３】
上記二塩基酸無水物としては、無水コハク酸（ＳＡ）、無水グルタル酸（ＧＡ）、無水イタコン酸（ＩＡ）、無水フタル酸（ＰＡ）または無水ｏ−スルホベンゾイル無水物（ＯＳＢＡ）が例示できる。こうした二塩基酸無水物を有機溶媒に溶解し、その中にセリシンナノファイバー等の試料を入れ、予め一定時間加熱加工しておくことで、染料を吸着するカルボキシル基が確実に導入でき、その結果、塩基性染料で良く染まるようになる。
【００９４】
二塩基酸無水物で予め化学加工処理したセリシンナノファイバーを染色するには、エタノール溶媒染色するとよく、染料を含む所定のエタノール濃度の水溶液中での溶媒染色が最適である。塩基性染料を溶解したエタノール水溶液による溶媒染色で処理したセリシンナノファイバーは、未加工未処理に較べて多くの染料を吸着することができる。染色には加熱した染色浴を使用することはなく、室温付近の染色加工でよく、時間は３０分以上、好ましくは１時間程度がよい。
【００９５】
アルデヒド化合物としては、例えばパラホルムアルデヒドのようなホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒド等を挙げることができ、エポキシ化合物は上記した通りである。
【００９６】
例えば、二塩基酸無水物濃度は１００ｍＬのＤＭＦに５〜２０ｇ含まれるようにし、試料に対して２０倍（浴比１：２０と略記することもある）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、この溶液を、逆流冷却器を付けた１０ｍＬのナス型フラスコに入れ、試料がＤＭＦ中に完全に浸漬するように留意しながら、７５〜８０℃のウォーターバス中で、随時、時間を変えて反応させることにより実施できる。
【００９７】
反応終了後、試料を取り出し、ＤＭＦで洗浄し、続いて５５℃のアセトンで洗浄することで未反応試薬を除去する。最終的に水で洗浄し、化学加工処理前後の試料量の変化から加工率を求める。
【００９８】
染料は水に良く溶けた状態で水不溶性のセリシンナノファイバー内に入り込み、吸着する。試料への染料の吸着度合いは、染料を含むエタノール水溶液濃度に依存し、染色浴のエタノール濃度は低くもなく、高くもない値、例えば４０〜７０ｖ／ｖ％の濃度範囲が好ましい。染色浴中のエタノール濃度が７０ｖ／ｖ％を超えると、染料はセリシンナノファイバー内に入り難くなり、染着状態が悪化する。また、エタノール濃度が４０ｖ／ｖ％未満であると、染着量は減少するが、セリシンナノファイバーが膨潤し溶解する恐れがある。
【００９９】
セリシンナノファイバーを溶媒染色で染める詳細な染色方法は次の通りである。
【０１００】
エタノールで水不溶化したセリシンナノファイバーはエタノール溶媒染色法で染色できる。染色浴はエタノールと水との混合で組成比はエタノール濃度４０〜７０％であればよい。浴比が１：２００となるようにして、エタノール染色浴にサンプルを入れ、室温で１時間静置すると染色が可能となる。染料濃度は０．１〜０．５％でよい。未加工セリシンにはＯｒａｎｇｅ  ２などの酸性染色で染めるとよいし、グルタル酸無水物（ＧＡ）で予め試料にカルボキシル基を導入したセリシンナノファイバーは塩基性染料で染色するとよい。
【０１０１】
次に、水不溶化処理について、纏めて記載する。水溶解性のセリシンナノファイバーを水不溶性にするには次のようにするとよい。
【０１０２】
例えば、７０ｖ／ｖ％のメタノール水溶液または７０ｖ／ｖ％のエタノール水溶液をポリスチレン容器の底部分に入れ、これらの水溶液が直接セリシンナノファイバーに触れないように上げ底付きの台にセリシンナノファイバーを置く。ポリスチレン容器に蓋をして室温で２日間静置すると、ポリスチレン容器内部はアルコールにより蒸気圧が高まり、アルコールはセリシンナノファイバーに吸着される。ポリスチレン容器から試料を取りだし、室温で乾燥すると水不溶性のセリシンナノファイバーが製造できる。これが第１工程である。この場合、温度を高くすれば、吸着時間は短くなる。
【０１０３】
溶解性のセリシンナノファイバーを完全に水不溶化するには、上記したようにアルコールで水不溶化する第１工程か、または以下の（ａ）のパラホルムアルデヒドで水不溶化する第１工程を経れば良く、次いで染色性の向上などのために、水不溶性セリシンナノファイバーに対して、以下の化学加工処理（ｂ）の第２工程を行う。
【０１０４】
（ａ）和光純薬工業（株）製の商品：４％パラホルムアルデヒド試薬０．１ｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液ｐＨ７．４にセリシンナノファイバーを室温で２時間浸漬処理した後、試料を取り出し十分に水洗いを行い標準状態で乾燥させる。こうして製造したセリシンナノファイバーは、水不溶性である。
【０１０５】
（ｂ）３官能性エポキシ化合物であるグリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセ化成工業（株）製、商品名：デナコールＥＸ−３１３およびＥＸ−３１４）または２官能性エポキシ化合物であるエチレングリコールジグリシジルエーテル（ナガセ化成工業（株）製、商品名：デナコールＥＸ−８１０）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、この溶液を逆流冷却器を付けた１００ｍＬのナス型フラスコに入れ、セリシンナノファイバーがＤＭＦ中に完全に浸漬するように留意しながら、ウォーターバス中で、７５〜８０℃で２時間化学反応を行った。反応終了後、試料を取り出し、ＤＭＦで洗浄し、続いて５５℃のアセトンで洗浄することで未反応試薬を除去する。最終的に水で洗浄して室温で乾燥させる。このように第２工程の化学加工処理を行うことにより染色性などの向上した水不溶化ナノファイバーが得られる。
【０１０６】
上記第１工程のアルコール処理を  更に詳細に説明する。エレクトロスピニングで製造したセリシンナノファイバーに水・アルコールの混合溶液を作用させる際、ポリスチレン容器の底部分に水・アルコールを入れ、セリシンナノファイバーが水・アルコールに触れないようにして水・アルコール蒸気に一定時間晒すことが効率的である。しかるのち、プラスチック容器からセリシンナノファイバーを取り出した後、室温の標準状態で軽く乾燥させるとよい。不溶化には公知のアルコールを用いることができ、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどが例示できる。水・アルコール混合溶液において、まず水がセリシンに浸透し、構造を弱め、しかるのち、アルコールが弱まった構造部分に入り込み、脱水効果を与えセリシンが結晶化するのであろう。そのため、アルコール溶液に水を所望により適当量入ることが必要であり、セリシン繭層を結晶化させるためのアルコール濃度は、通常、３０〜９０ｖ／ｖ％、好ましくは４０〜８０ｖ／ｖ％である。３０ｖ／ｖ％未満ではアルコールによる脱水作用が少なくなり結晶化効果が薄れる傾向があり、９０ｖ／ｖ％を超えると水による拡散が不十分となり、結晶化度を向上させることは困難となる傾向がある。
【０１０７】
メタノール、エタノールを用いるときは所望により水を加えアルコール濃度６０〜８０ｖ／ｖ％のアルコール水溶液を用い、セリシン繭層を室温で５分以上浸漬した後に取り出し、室温で乾燥するとよい。浸漬用アルコールが６０ｖ／ｖ％未満であると結晶化速度が遅くなり、十分に結晶化しない傾向があり、また８０ｖ／ｖ％を超えるとサンプル中に水が拡散しなくなり、逆に結晶化が進まなくなる傾向がある。
【０１０８】
上記第２工程としての（ｂ）の化学加工処理を更に詳細に説明する。
【０１０９】
セリシンナノファイバーの染色性を向上させるためには、水不溶性のセリシンナノファイバーをエポキシ化合物で化学加工処理するとよい。例えば、グリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセ化成工業（株）製、商品名：デナコールＥＸ−３１３およびＥＸ−３１４）のように３官能性エポキシ化合物や、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ナガセ化成工業（株）製、商品名：デナコールＥＸ−８１０）のような２官能性エポキシ化合物を用いて化学加工処理することができる。
【０１１０】
シルクセリシンへの化学加工処理において、エポキシ化合物、二塩基酸無水物に対する有機溶媒としては、従来公知の有機溶媒を利用できる。このようなものとしては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦと略記することもある）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯと略記することもある）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡと略記することもある）、テトラヒドロフラン、ピリジン等が挙げられる。本発明においては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の使用が特に好ましい。
【０１１１】
本発明によれば、上記したセリシン溶液を用いてエレクトロスピニングするに際して、
セリシンナノファイバーに第二物質としてカイコ由来の絹フィブロイン（単に、フィブロインということもある）を複合してセリシン・フィブロイン複合ナノファイバーを提供することができる。この絹フィブロインの原料としては、絹糸を溶解して製造できるフィブロインスポンジを原料として用いることができる。このフィブロインスポンジは、次のようにして製造できる。
【０１１２】
例えば、絹フィブロイン繊維を臭化リチウム、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、硝酸アンモニウム等の加熱した中性塩水溶液（例えば、６０℃の７Ｍの臭化リチウム水溶液）で溶解し、セルロース製透析膜で水と置換する透析法を採用する。その結果得られる、絹フィブロイン以外の夾雑物が除去された絹フィブロイン水溶液にメタノールやエタノール等のアルコールを添加して凝固させた後、凍結乾燥することでフィブロインスポンジ（シルクスポンジともいう）が製造できる。このシルクスポンジを、時間をかけながらＴＦＡ、ＨＦＡｃ、ＨＦＩＰ、ＦＡ等（ＴＦＡ、ＦＡが好ましく、ナノファイバー製造の効率的、経済的な視点からすると、ＴＦＡが特に好ましい）に溶解してシルクのフィブロイン溶液（フィブロインドープ）を調製することができる。このフィブロイン溶液を用いてエレクトロスピニングする。
【０１１３】
例えば、セリシンホープ繭層をＴＦＡに溶解してなるセリシンＴＦＡ溶液に、シルクスポンジをＦＡまたはＴＦＡに溶解したフィブロイン溶液を複合して製造できるセリシン・フィブロイン複合溶液を用いてエレクトロスピニングすることで、セリシン・フィブロイン複合ナノファイバーを製造できる。
【０１１４】
このセリシン・フィブロイン複合ナノファイバーの場合、セリシンナノファイバーについて上記したセリシン溶液、エレクトロスピニング技術、アルコールやパラホルムアルデヒドによる水不溶化処理、化学加工処理、ならびに金属イオン吸着性、耐薬品性および染色性に関する記載は、全て適用され得るので、その詳細については説明しない。
【実施例】
【０１１５】
以下、本発明を実施例および比較例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【０１１６】
実施例で使用する試料特性の測定方法は次の通りである。本発明で調製したセリシンナノファイバーやセリシン・フィブロイン複合ナノファイバーの理化学的特性を明らかにするため次の項目の試験を行った。
（１）酸溶解度（Ａｃｉｄ）およびアルカリ溶解度（Ａｌｋａｌｉ）：
６５℃の４Ｍ塩酸水溶液および０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液のそれぞれにサンプルを１時間浸漬処理し、処理前後の重量変化から酸溶解度とアルカリ溶解度とを評価した。
【０１１７】
酸溶解度またはアルカリ溶解度＝｛（Ｍｂ−Ｍａ）／Ｍｂ｝×１００ 
上式において、Ｍｂは、薬品処理前のサンプル重量（１０５℃で１時間３０分乾燥）であり、Ｍａは、薬品処理後のサンプル重量（１０５℃で１時間３０分乾燥）である。
【０１１８】
（２）金属吸着量の定量：
アルコール処理により水不溶化したセリシンナノファイバーを、更にＥＤＴＡ二塩基酸無水物を含み加熱した有機溶媒で処理することで金属イオンの配位基となるＥＤＴＡをセリシンナノファイバーに導入して金属イオン吸着用の試料を製造した。これを０．５ｍＭの硝酸銀水溶液あるいは０．５ｍＭの硝酸銅水溶液に浸漬することで、銀イオンあるいは銅イオンを吸着させた。セリシンに吸着した金属イオン量はパーキンエルマー社製のプラズマ原子吸光スペクトロメーター（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｐｌａｓｍａ−Ａｔｏｍｉｃ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＩＣＰ−ＡＥＳ））を用いて定量した。５〜１０ｍｇの試料を、ミクロウェーブ加水分解炉（ＭＤＳ−８１ＤＣＣＥＭ）を用いて２ｍＬの６５％硝酸で完全に加水分解し、実験時にさらに１０ｍＬの水を加え、ＩＣＰ−ＡＥＳ分析を行った。金属イオンの吸着量は、試料重量（ｇ）あたりの金属イオン量をｍｍｏｌで表示した。
【０１１９】
（３）抗菌性評価：
加熱溶解後５５℃に保持した半合成脇本培地またはキングＢ培地２５ｍＬと、トマトかいよう病細菌（濃度１０９／ｍＬ）２ｍＬとを混合し、この混合物をシャーレに流し込んで平板状に固めた。この菌液混合平板培地上に約１ｃｍ四方の試料膜（水不溶化セリシンナノファイバー）を置き、試料全体を培地に密着させた。これを２０〜２５℃に保ち、所定の経過時間毎に検定試料付近の培地での菌増殖阻害程度を、試料の周囲に現れる阻止円の大きさをｍｍ単位で実測し、阻止円のサイズ変化から抗菌活性の有無、優劣を評価した。
【０１２０】
（４）染色方法：
水不溶化セリシンナノファイバーの染色には、エタノール・水の混合水溶液系を染色浴にした「溶媒染色法」によることが最適である。溶媒染色法によると、未加工・未処理のセリシンナノファイバーは、酸性染料で効率的に染まるが、化学加工処理によりカルボキシル基等を導入した水不溶化セリシンナノファイバーは、塩基性染料で特異的に染色できるようになる。  
【０１２１】
エタノールと水との混合溶液からなる染色浴を用い、０．２％の塩基性染料Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｂｌｕｅ（日本化薬株式会社製）を含む有機溶媒系で染色するとよい。浴比を１：１００に設定し、染色は、室温で１時間処理することが好都合である。
【０１２２】
溶媒染色法では次の染料を用いることができる。
Ｅｔｈｙｌ  Ｖｉｏｌｅｔ（東京化成工業株式会社製、ＭＷ＝５６０、Ｃ．Ｉ．Ｎ．：Ｃ．Ｉ．Ｂａｓｉｃ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４  Ｃ．Ｉ．＝ ４２６００）。
Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｂｌｕｅ（純正化学株式会社製、ＭＷ＝３２０、Ｃ．Ｉ．Ｎ．：Ｃ．Ｉ．Ｂａｓｉｃ  Ｂｌｕｅ  ９  Ｃ．Ｉ．＝ ５２０１５）。
Ａｃｉｄ  Ｒｅｄ  １８（日本化薬株製、商品名：Ａｃｉｄ  Ｓｃａｒｌｅｔ  ３Ｂ） 
但し、ＭＷは分子量、  Ｃ．Ｉ．はＣｏｌｏｒ  Ｉｎｄｅｘ組成番号、 Ｃ．Ｉ．Ｎ．は Ｃｏｌｏｒ  Ｉｎｄｅｘ  Ｇｅｎｅｒｉｃ名を意味する。
【０１２３】
（５）染着率：
染着率（％）は、水不溶化セリシンナノファイバーの染着前および染着後における染色浴中の染料濃度変化から求めた。染着前、染着後における染色浴に対して、最大吸収波長６６２ｎｍあるいは染料に特有な２９６ｎｍにおける吸光度を島津自記分光光度計（ＭＰＣ−３１００／ＵＶ−３１００Ｓ)を用いて求め、予め作成した既知濃度−吸光度関係の検量線にあてはめて染色浴濃度を求めた。染着率は下記の式から計算した。
染着率（％）＝［（染着前の染色浴濃度−染着後の染色浴濃度）／（染色前の染色浴濃度）］×１００
【０１２４】
実施例および比較例で使用する試料は下記の通りである。
（１）セリシンパウダー（粉末状態を呈するもの）：
本発明で比較のために使用するセリシンパウダーは、和光純薬工業株製の商品名：セリシンパウダー（１６７−２２６８１、Ｌｏｔ  ＣＤＲ４２５８、１ｇ）である。本発明では、セリシンパウダーとはこの商品を意味するが、明細書の一部の個所では、セリシンパウダー以外の粉末状セリシンをいう場合もある。
【０１２５】
（２）セリシンホープのセリシン繭層（セリシンホープ繭層ともいう）：
セリシン繭層は、高原社市販の商品であり、商品名はセリシンホープ・コクーン、企画番号は、ＳＨＣ−１−１５０であり、２５０ｇ単位で購入できる。この試料には無機物、脂質（０．１６％）、尿酸（０．００６％）が含まれる（高原社ＨＰ：http://www.kougensha.com/hanbai/sericin.html参照）
【０１２６】
セリシンホープ・コクーンを本発明の実験で使用するには、試料に含まれる脂質を除去することが必要である。そのため、予めアルコール（例えば、メタノール、エタノールなど）水溶液に浸漬し脂質を除いた後、アルコールから取り出し室温で軽く乾燥させるとよい。
【０１２７】
（３）シルクスポンジ（フィブロインスポンジともいう）：
家蚕から得られた生糸を、濃度０．０７％炭酸ナトリウム溶液を用いて１時間煮沸してシルクセリシンを除去した後の精練絹（絹フィブロイン繊維）６．５ｇを温度７５℃、９．５モルの臭化リチウム水溶液に溶解し、５℃の蒸留水で４日間透析し、ＬｉイオンとＢｒイオンを除去して、濃度１．８％の絹フィブロイン水溶液を得た。この濃度１．８％の絹フィブロイン水溶液３００ｍＬに９９％メタノール２０ｍＬを加え、室温で静置するとフィブロイン水溶液がゲル化して沈殿を生じた。これを凍結乾燥装置に入れて減圧下で乾燥することによりシルクスポンジを製造した。
【０１２８】
（４）エレクトロスピニングによるナノファイバー製造方法：
セリシン溶液を用い、カトーテック株式会社（カトーテツク）製のエレクトロスピニング装置によりセリシンナノファイバー（またはセリシンとフィブロインとからなるセリシン・フィブロイン複合ナノファイバー）を製造した。所定濃度のセリシン溶液（またはセリシン溶液とフィブロイン溶液との複合溶液）をポリマー溶液貯蔵タンクに充填した。ポリマー溶液貯蔵タンクに陽極電極を付けた紡糸口から陰極板間に印加電圧を加えた。陽極・陰極間の距離は自由に変化させることが可能である。
【０１２９】
この場合、テルモ株式会社製、テルモノンベベル針（２２Ｇ  Ｘ  １１／２”（０．７０×３８ｍｍ）を紡糸口のノズルとして用いた。株式会社トップ製・ロックタイプ・螺旋式の５ｍＬトッププラスチックシリンジをポリマー貯蔵タンクとして使用した。
【０１３０】
両極に印加電圧を加えると、陽極に接続する紡糸口から静電力により陰極板に向かって極めて微細なセリシン溶液が噴射され、陰極板上にセリシンナノファイバー（またはセリシン・フィブロイン複合ナノファイバー）が積層した。陰極板に付着したセリシンナノファイバー（またはセリシン・フィブロイン複合ナノファイバー）に金イオンのコーティングを施し、走査型電子顕微鏡でナノファイバーの形態を観察し、ナノファイバーの太さ（サイズ）を評価した。
【０１３１】
以下の実施例では、エレクトロスピニングの条件を詳細に記述するようにしたが、紡糸条件の記載の無い場合は、印加電圧２０ｋＶ、紡糸距離１５ｃｍであることを意味する。
【０１３２】
なお、本発明では、セリシン溶液（またはセリシン・フィブロイン複合溶液）の濃度はすべてｗｔ％で表示した。
【０１３３】
（５）ナノファイバーの平均繊度径と標準偏差：
エレクトロスピニングで製造したセリシンナノファイバー（またはセリシン・フィブロイン複合ナノファイバー）にイオンコーターで厚さ３００Åの金のコーティングを施した。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により異なる視野１０箇所のナノファイバー画像を撮影し、画像をプリンターで印刷した。画像に記載されたスケールを基に各視野につき１０ヶ所の繊維径を計測した。このようにして合計１００個所の繊維径から、平均繊維径と標準偏差（ＳＤ）を計測した。
【０１３４】
（６）耐薬品安定セリシン：
酸性水溶液またはアルカリ性水溶液の作用を受けるとエレクトロスピニングにより製造されたセリシンナノファイバーは溶解する。このセリシンナノファイバーの耐薬品性を向上させるには、エポキシ化合物で予めセリシンを化学修飾するとよい。エポキシ化合物の中で化学反応性が高く、安定して化学加工処理ができるのはエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＧＥ）であり、エポキシ化合物の中で最も使いやすい。ＥＧＤＧＥは２官能性エポキシ化合物であるため、セリシン分子間を架橋結合し、セリシンの塩基性アミノ酸であるＴｙｒ、Ｓｅｒなどのフェニル基のＯＨと化学結合し、その結果、アルカリや酸の水溶液に対する耐薬品性が向上する。セリシン・フィブロイン複合ナノファイバーの場合も同様である。
【０１３５】
アルコール等で水不溶化したセリシンナノファイバーに対してグラフト加工処理も化学加工処理をもすることもできるし、グルタル酸無水物で化学修飾してカルボキシル基を導入した水不溶化セリシンナノファイバーは塩基性染料でよく染まるようになる。また、エポキシ化合物で化学加工処理した水不溶化セリシンナノファイバーは酸やアルカリなどの薬品に溶解し難くなる。さらに、無水フタル酸を含むＤＭＳＯでセリシンナノファイバーを化学修飾すると、強くて堅いゴム状セリシンナノファイバーとなる。セリシン・フィブロイン複合ナノファイバーの場合も同様である。
【０１３６】
（７）金属イオンの吸着および定量方法：
被測定試料を、硝酸カリウムを含む０．５ｍＭの硝酸銀水溶液および硝酸銅水溶液（アンモニア水を加えてｐＨを１１．４に調整）のそれぞれに室温で３０時間浸漬することで金属イオンを吸着させた。
【０１３７】
被測定試料に吸着した金属イオンを、パーキンエルマー社製のプラズマ原子吸光スペクトルメーター（ＩＣＰ−ＡＥＳ）を用いて分析した。５〜１０ｍｇの試料を、ミクロウェーブ加水分解炉（ＭＤＳ−８１ＤＣＣＥＭ）を用いて２ｍＬの６５％硝酸で完全に加水分解し、実験時さらに１０ｍＬの水を加え、ＩＣＰ−ＡＥＳ分析を行った。金属イオンの吸着量は、試料重量あたりの金属イオン量をｍｍｏｌで表した。
【０１３８】
エレクトロスピニングにより製造した状態の従来のセリシンナノファイバーは本来水に溶解し易いが、本発明で使用する裸蛹（遺伝子記号Ｎｄ）、セリシン蚕（遺伝子記号Ｎｄ−ｓ）または新蚕品種・セリシンホープに由来する蚕品種のセリシン繭層は、水中にいれても全量が溶解することは無い。エレクトロスピニングを行うための溶媒としては、（１）ヘキサフルオロアセトン（ＨＦＡｃ）１．５水和物（和光純薬工業（株）製））（特開２００４−６８１６１）、（２）ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）（和光純薬工業（株）製)）（特表２００６−５０４４５０）、または（３）ヘキサフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を利用できる。しかし、セリシンホープ繭層の分子量を低下させることなく、エレクトロスピニングのために好ましく利用できる溶媒はＴＦＡである。セリシン・フィブロイン複合ナノファイバーの場合も同様である。
【０１３９】
セリシンホープ繭層をＴＦＡで溶解してなる溶液を従来既知のエレクトロスピニング装置で紡糸して製造できるセリシンナノファイバーは水溶解性であるため、エレクトロスピニング紡糸直後のセリシンナノファイバーは応用範囲が限られる。産業資材として利用する場合には、水不溶化処理や化学加工処理を施すことが必要不可欠である。セリシン・フィブロイン複合ナノファイバーの場合も同様である。
【実施例１】
【０１４０】
本実施例では、セリシンホープ繭層溶解のための溶媒探索を行った。
【０１４１】
０．０４ｇのセリシンホープ繭層を２５℃および５０℃に調整した１．１６０ｇの溶媒（ＴＦＡ、ＨＦＩＰ、ＦＡ、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ）に２時間浸漬し、セリシンホープ繭層の溶解状態を調べた。得られた結果を表１および２に示す。ＴＦＡはトリフルオロ酢酸、ＨＦＩＰはヘキサフルオロイソプロパノール、ＦＡは蟻酸、ＤＭＳＯはジメチルスルホキシド、ＤＭＦはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドである。
【０１４２】
【表１】
0005761736.tif 000002
【０１４３】
【表２】
0005761736.tif 000003
【０１４４】
上記表１および２において、溶解状態は、次のカテゴリーで判定した。
◎：完全に溶解した。
△：試料の一部が溶解しゲル状態になったが、膜としては使用可能である。
×：試料は全く溶解しなかった。
【０１４５】
上記表から次のことが分かる。セリシンホープ繭層を効率的に溶解する溶媒は、ＴＦＡである。セリシンホープ繭層を上記温度のＴＦＡに溶解し、この溶液をポリスチレン膜からなる基材の表面に塗布し、溶媒を蒸発させて乾燥固化して得られたセリシン膜は、透明で、かつしなやかな膜であった。このことから、セリシンホープ繭層をＴＦＡで溶解すればセリシンホープ繭層の分子量は大幅に低下しないことが分かる。分子量の低下が顕著であると、得られるセリシン膜は脆弱となり、ボロボロの粉末状態になるからである。また、上記５種類の溶媒中、ＴＦＡ以外にＦＡも使用は可能であると考えられる。
【実施例２】
【０１４６】
本実施例では、セリシンホープ繭層のＴＦＡ溶液から製造したセリシン膜の形状を観測し、所見を述べる。
【０１４７】
セリシンホープ繭層（ＳＣ）およびセリシンパウダー（ＳＰ）のそれぞれを２５℃のＴＦＡに２４時間かけて完全に溶解させて、一定濃度（３ｗｔ％、６ｗｔ％）のセリシン溶液をポリスチレン（Ｓｔ）基材表面に拡げて室温のドラフト中で送風乾燥させてＴＦＡを蒸発させ、乾燥固化させてセリシン膜を調製した。得られたセリシン膜の形状と機械的特性を調べた。得られた観察結果を表３に示す。
【０１４８】
【表３】
0005761736.tif 000004
【０１４９】
表３中で、３％ＳＣとは、セリシンホープ繭層を２５℃のＴＦＡに溶解して調製した濃度３ｗｔ％セリシンのＴＦＡ溶液、３％ＳＰとは、セリシンパウダーをＴＦＡに溶解して調製した濃度３ｗｔ％のセリシン溶液を意味する。
【０１５０】
表３において、形状および所見は次のカテゴリーで判定した。
形状：
◎：良好な透明膜状態。
○：透明膜状態。
【０１５１】
所見：
△：送風乾燥後のセリシン膜はポリスチレン基材から容易に剥離できる。
▲：送風乾燥後のセリシン膜はポリスチレン基材に強固に付着し、剥離は容易ではない。
【０１５２】
上記表３から次のことが分かる。セリシンホープ繭層をＴＦＡに溶解してなる３ｗｔ％のセリシンホープＴＦＡ溶液をポリスチレン基材表面に塗布し、蒸発乾燥固化して得られたセリシン膜は透明でしなやかであった。
【０１５３】
一方、セリシンパウダーをＴＦＡに溶解してなる溶液をポリスチレン基材表面に塗布し、乾燥固化して得られたセリシン膜は、ポリスチレン基材表面でネバネバした状態であり、ポリスチレン基材表面を強固に被覆してしまい剥離できなかった。
【０１５４】
以上のことは、セリシンホープ繭層をＴＦＡに溶解しても分子量は大幅に低下していないが、セリシンパウダーをＴＦＡに溶解すると分子量低下が起こる可能性があることを示唆する。本発明の目的を達成するためには、セリシンパウダーよりもセリシン繭層が好ましい。
【実施例３】
【０１５５】
本実施例では、各種濃度のセリシンＴＦＡ溶液を用いて得られたセリシン膜の形状を観測し、所見を述べる。 
【０１５６】
セリシンホープ繭層を４０℃のＴＦＡに３日間浸漬して完全に溶解させてなる各種濃度のセリシンＴＦＡ溶液をポリスチレン基材表面に拡げ、室温、ドラフト中で送風乾燥し、ＴＦＡを蒸発させ、乾燥固化させてセリシン膜を調製した。得られたセリシン膜の形状と所見の観察結果を表４に示す。
【０１５７】
【表４】
0005761736.tif 000005
【０１５８】
表４において、２％ＳＣとは、セリシンホープ繭層を４０℃のＴＦＡに溶解して調製したセリシンホープ繭層の濃度２ｗｔ％ＴＦＡ溶液を意味する。４％ＳＣ、６％ＳＣ、８％ＳＣ、１０％ＳＣ、および１２％ＳＣもこれに準ずる。
【０１５９】
表４において、形状および所見は次のカテゴリーで判定した。
形状：
◎：良好な透明膜状態。
×：暗茶褐色。
所見：
△：送風乾燥後のセリシン膜はポリスチレン基材から容易に剥離できる。    
【０１６０】
表４から明らかなように、セリシンホープ繭層を４０℃のＴＦＡで溶解して得られた２ｗｔ％〜８ｗｔ％のセリシン溶液を原料にして、ポリスチレン基材表面に塗布し、乾燥固化させると透明で強靱なセリシン膜が製造できる。
【実施例４】
【０１６１】
本実施例では、各種濃度のセリシンホープ繭層のＴＦＡ溶液を用いてエレクトロスピニングし、セリシンナノファイバーを製造した。
【０１６２】
セリシンホープ繭層を２５℃のＴＦＡに浸漬し、浸漬時間（溶解時間）を変えて溶解させ、濃度２ｗｔ％〜１２ｗｔ％のセリシンＴＦＡ溶液を作製した。得られた濃度２ｗｔ％〜１２ｗｔ％のセリシンＴＦＡ溶液を用い、室温でエレクトロスピニングしてセリシンナノファイバーを製造した。
【０１６３】
エレクトロスピニングの条件：紡糸距離は１５ｃｍ、印加電圧は２５ｋＶ、紡糸速度は０．０６ｃｍ／ｍｉｎとした。
【０１６４】
得られたセリシンナノファイバーの形態をＳＥＭ観察し、セリシンナノファイバーの平均繊維径、標準偏差、ナノファイバー繊維径の最大値と最小値、およびナノファイバーの形状を表５に集約する。
【０１６５】
【表５】
0005761736.tif 000006
【０１６６】
表５において、２％−０．５ｄとは、２５℃のＴＦＡに０．５日（１２時間）かけてセリシン繭層を完全に溶解し、セリシン繭層のＴＦＡ濃度が２ｗｔ％である試料溶液を意味する。４％−２．５ｄ、６％−４ｄ、８％−４ｄ、１０％−７ｄ、１２％−４ｄもこれに準じる。繊維径とは、製造したセリシンのナノファイバーの平均繊維径（ｎｍ）であり、最大径および最小径とは、製造したセリシンのナノファイバーをＳＥＭ観察した際、観察できるセリシンナノファイバーの最大の繊維径（ｎｍ）と最小の繊維径（ｎｍ）である。
【０１６７】
セリシンナノファイバーの形状は、次のカテゴリーで表示した。
◎：超微細なナノファイバー
○：超微細なナノファイバーにビーズ状の形態が極わずか存在する。
【０１６８】
表５におけるセリシンＴＦＡ溶液のうち、その代表例として、６ｗｔ％−４ｄセリシンＴＦＡ溶液を用いてエレクトロスピニングして製造したセリシンナノファイバーの形態を走査型電子顕微鏡で観察し、このＳＥＭ画像を図１に示す。図１から明らかなように、ビーズ形状の存在は全く認められず表面が平滑なセリシンナノファイバーであった。ビーズ形状の存在が少ないため優れたセリシンナノファイバーである。
【０１６９】
表５から明らかように、２ｗｔ％〜１２ｗｔ％濃度で、２５℃の浸漬温度（溶解温度）、０．５日〜７日の浸漬時間（溶解時間）で得られたセリシンホープ繭層のＴＦＡ溶液を用いてエレクトロスピニングしたところ、種々の平均繊維径を有するセリシンナノファイバーを製造できた。従って、用途に目的に合わせて各種繊維径のセリシンナノファイバーを提供できることが分かる。セリシンＴＦＡ溶液の濃度が２ｗｔ％〜８ｗｔ％、好ましくは２ｗｔ％〜６ｗｔ％である場合に、平均繊維径が極細となり、繊維径分布が狭く、利用価値の高いセリシンナノファイバーを提供できる。なお、ビーズ形状の存在が少なければ、ビーズ形状が混じったセリシンナノファイバーでも、それに合った用途で利用可能である。このエレクトロスピニングの結果と実施例３における成膜の結果とは若干異なり、必ずしも直接的な関係はないことが分かった。
【実施例５】
【０１７０】
セリシンホープ幼虫のセリシンホープ繭層の代わりに、突然変異系統である裸蛹（遺伝子記号Ｎｄ）あるいはセリシン蚕（Ｎｄ−ｓ）幼虫のセリシン繭層を用い、実施例４と同様の方法で試料をＴＦＡに浸漬し、２５℃で４日溶解して６ｗｔ％のセリシン溶液をエレクトロスピニングしても図１と同様に良好なセリシンナノファイバーが製造できた。また、２ｗｔ％〜１２ｗｔ％濃度で、２５℃の浸漬温度（溶解温度）、０．５日〜７日の浸漬時間（溶解時間）で得られた上記セリシン繭層のＴＦＡ溶液を用いてエレクトロスピニングしたところ、実施例４の場合とほぼ類似した傾向が確認された。
【実施例６】
【０１７１】
セリシンホープ幼虫のセリシンホープ繭層の代わりに、突然変異系統である裸蛹（遺伝子記号Ｎｄ）、セリシン蚕（遺伝子記号Ｐｎｄ、Ｎｄ-２３、Ｎｄ強、Ｎｄ−ｓおよびＮｄＨ）の幼虫の各種セリシン繭層を用い、実施例４と同様の方法で試料をＦＡ（蟻酸）、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、ＨＦＩＰ（１,１,１,３,３,３−ヘキサフルオロ２プロパノール）に浸漬し、２５℃または４０℃で溶解時間を変えて各種セリシン繭層の溶解状態を評価した。溶解条件は次の通りである。０．００５ｇセリシン繭層を０．００２ｇの有機溶媒に溶解した。得られた結果のうち、Ｎｄ、Ｎｄ−ｓ、セリシンホープ、ＮｄＨについての結果を表６および７に示す。
【０１７２】
【表６】
0005761736.tif 000007
【０１７３】
表６中の溶解条件の略符合は次のことを意味する。
ＦＡ１５、ＦＡ３９、ＦＡ６５：セリシン繭層をＦＡ中、室温で、それぞれ、１５、３９、６５時間浸漬した。
ＦＡ２０Ｄ：セリシン繭層をＦＡ中、室温で２０日間浸漬した。
ＴＦＡおよびＨＦＩＰの場合は、ＦＡに準ずる。
【０１７４】
表６中の溶解状態は次の３種類で評価した。
−：溶解しない。
±：試料は部分的に溶解する。
＋：溶解する。
【０１７５】
表６から次のことがわかる。各種セリシン繭層を室温のＦＡ、ＴＦＡ、ＨＦＩＰの溶媒で溶解しようとすると、使用できる溶媒はＴＦＡであり、溶解時間は２０日であった。ただし、溶解時間が長いと試料の分子量が低下してしまい良好なエレクトロスピニングができ難いという問題がある。
【０１７６】
【表７】
0005761736.tif 000008
【０１７７】
表７中の溶解条件の略符合は、表６の場合と同様である。
【０１７８】
表７から次のことがわかる。各種セリシン繭層を４０℃のＦＡ、ＴＦＡ、ＨＦＩＰの溶媒で溶解しようとすると、使用できる溶媒はＴＦＡであり、溶解時間は３９時間もくしは５０時間であった。
【０１７９】
各種セリシン繭層を各種温度の溶媒に溶かし、あるいは各種の溶解時間をかけることで、溶媒中に溶解したセリシン分子量の低下が起こる可能性がある。エレクトロスピニングで製造できるセリシンナノファイバーの利用用途を考えると、セリシン分子量が高いことが望まれる。そのため、試料調製条件として穏やかな条件下でのセリシン溶液を製造することが望ましい。セリシン溶解条件が極端に厳しいと、例えば溶媒温度が高く、溶解時間が長いと、セリシン分子量が著しく低下し、その結果、エレクトロスピニングできない場合がある。セリシン分子量が一定以上あることが、エレクトロスピニング状態を良くし、その結果、製造できるセリシンナノファイバーの用途を広範なものにするための条件である。
【実施例７】
【０１８０】
本実施例では、セリシンホープ繭層を４０℃のＴＦＡに浸漬し、溶解時間を変えて溶解させ、濃度２ｗｔ％〜１２ｗｔ％のセリシンＴＦＡ溶液を用い、室温でエレクトロスピニングしてセリシンナノファイバーを製造した。
【０１８１】
エレクトロスピニング紡糸条件：紡糸距離は１５ｃｍ、印加電圧は２５ｋＶ、紡糸速度は０．０６ｃｍ／ｍｉｎとした。
【０１８２】
セリシンナノファイバーの繊維径（これは平均繊維径であり、以下、単に繊維径ということもある）、その標準偏差、ナノファイバー繊維径の最大値と最小値およびナノファイバーの形状を表８に集約する。
【０１８３】
【表８】
0005761736.tif 000009
【０１８４】
表８において、２％−０．５ｄとは、４０℃のＴＦＡに０．５日（１２時間）かけてセリシン繭層を完全に溶解し、セリシン繭層のＴＦＡ濃度が２ｗｔ％である試料溶液を意味する。４％−０．５ｄ、６％−１ｄ、８％−１ｄ、１０％−１ｄ、および１２％−１ｄもこれに準じる。
【０１８５】
また、セリシンナノファイバーの形状は、次のカテゴリーで表示した。
◎：超微細なナノファイバー
○：超微細なナノファイバーにビーズ状の形態が極わずか存在する。
【０１８６】
表８から明らかように、２ｗｔ％〜１２ｗｔ％濃度で、４０℃の浸漬温度（溶解温度）、０．５日〜１日の浸漬時間（溶解時間）で得られたセリシンホープ繭層のＴＦＡ溶液を用いてエレクトロスピニングしたところ、種々の平均繊維径を有するセリシンナノファイバーを製造できた。従って、用途に目的に合わせて各種繊維径のセリシンナノファイバーを提供できることが分かる。セリシンＴＦＡ溶液の濃度が２ｗｔ％〜６ｗｔ％である場合に、平均繊維径が極細となり、繊維径分布が狭く、利用価値の高いセリシンナノファイバーを提供できる。なお、ビーズ形状の存在が少なければ、ビーズ形状が混じったセリシンナノファイバーでも、それに合った用途で利用可能である。
【０１８７】
表８からはまた、セリシンホープ繭層をＴＦＡに溶解してなる溶液濃度が６ｗｔ％以下であり、溶解時間が１日程度と短い程、エレクトロスピニングしてなるセリシンナノファイバーの平均繊度径は減少し、繊維径のバラツキは小さくなるが、ビーズ形状が若干存在することが分かる。
【実施例８】
【０１８８】
本実施例では、セリシン濃度とセリシン溶解時間との関係を検討した。
【０１８９】
セリシンホープ繭層を２５℃のＴＦＡに溶解時間を変えて溶解させ、濃度１０％のセリシンＴＦＡ溶液を作製した。これとは別に、セリシンホープ繭層を４０℃のＴＦＡに溶解時間を変えて溶解させ、濃度６ｗｔ％のセリシンＴＦＡ溶液を作製した。これらのセリシンＴＦＡ溶液を用い、室温でエレクトロスピニングしてセリシンナノファイバーを製造した。
【０１９０】
エレクトロスピニング紡糸条件：紡糸距離は１５ｃｍ、印加電圧は２５ｋＶ、紡糸速度は０．０６ｃｍ／ｍｉｎとした。
【０１９１】
得られたセリシンナノファイバーの形態をＳＥＭ観察し、セリシンナノファイバーの繊維径（平均繊維径）、その標準偏差、セリシンナノファイバー繊維径の最大値と最小値、およびセリシンナノファイバーの形状を表９に集約する。
【０１９２】
【表９】
0005761736.tif 000010
【０１９３】
表９において、２５−１０％−４ｄとは、２５℃のＴＦＡに４日かけてセリシン繭層を完全に溶解し、セリシン繭層のＴＦＡ濃度が１０ｗｔ％である試料溶液を意味する。２５−１０％−７ｄ、２５−１０％−１１ｄ、４０−６％−０．５ｄ、４０−６％−１ｄ、および４０−６％−４ｄもこれに準じる。
【０１９４】
セリシンナノファイバーの形状は、次のカテゴリーで表示した。
◎：超微細なナノファイバー
○：超微細なナノファイバーにビーズ状の形態が極わずか存在する。
●：超微細なナノファイバーにビーズ状の形態が少し多めに存在する。
【０１９５】
表９から明らかなように、セリシンホープ繭層をＴＦＡに溶解してなるセリシンＴＦＡ溶液の濃度が同じであれば、溶解温度が２５℃でも４０℃でも、セリシンホープ繭層を溶解する時間が長くなるとセリシンナノファイバーの平均繊度径は減少して極細になり、繊維径のバラツキは小さくなることが分かる。恐らく、セリシン分子量の低下の幅が一定値以内の許容範囲であるので、セリシンＴＦＡ溶液の表面張力が低下し、セリシンＴＦＡ溶液を用いてエレクトロスピニングする際の溶液ジェットが良好となるからであると思われる。しかし、溶解時間が長くなる程、セリシン分子量が低下する可能性があるためか、ビーズ状の形態が多くなる。
【実施例９】
【０１９６】
本実施例では、セリシン濃度を一定とし、セリシン溶解時間とセリシン濃度との関係を検討した。
【０１９７】
セリシンホープ繭層を、２５℃あるいは４０℃の溶解温度で、溶解時間を変えてＴＦＡに溶解させ、濃度２ｗｔ％のセリシンＴＦＡ溶液を作製した。これらのセリシンＴＦＡ溶液を用い、室温でエレクトロスピニングしてセリシンナノファイバーを製造した。
【０１９８】
エレクトロスピニング紡糸条件：紡糸距離は１５ｃｍ、印加電圧は２５ｋＶ、紡糸速度は０．０６ｃｍ／ｍｉｎとした。
【０１９９】
得られたセリシンナノファイバーの形態をＳＥＭ観察し、セリシンナノファイバーの繊維径（平均繊維径）、その標準偏差、セリシンナノファイバー繊維径の最大値と最小値、およびセリシンナノファイバーの形状を表１０に集約する。
【０２００】
【表１０】
0005761736.tif 000011
【０２０１】
セリシンナノファイバーの形状は、次のカテゴリーで表示した。
◎：超微細なナノファイバー
○：超微細なナノファイバーにビーズ状の形態が極わずか存在する。
●：超微細なナノファイバーにビーズ状の形態が少し多めに存在する。
【０２０２】
上記条件下で、セリシンホープ繭層のＴＦＡ溶液を用い、エレクトロスピニングして得た結果を示す表１０から次のことが分かる。
【０２０３】
セリシンＴＦＡ溶液の濃度が同一であれば、セリシン繭層をＴＦＡに溶解する温度が高温となると、エレクトロスピニングで得られるセリシンナノファイバーの平均繊維径と標準偏差は減少する傾向が見られる。また、溶解する温度が２５℃であれば、溶解時間が長いとセリシンナノファイバーの平均繊維径と標準偏差は減少する傾向が見られる。これは、セリシン分子量の低下割合が顕著ではないためであると推測される。しかし、溶解温度が２５℃で溶解時間が４日で調製したセリシンＴＦＡ溶液では、超微細セリシンナノファイバーを製造することができず、不定形のビーズの出現率が顕著となる。溶解温度が２５℃から４０℃になり、溶解時間が１日もしくはそれ以上となると不定形のビーズの出現率が増加する。これは、セリシン分子量の低下割合が顕著となるためであると推測される。
【０２０４】
広い用途に利用できるセリシンナノファイバーは、ビーズ形態の出現率が少なく、繊維径が細くて平滑であり、かつ繊維径分布が狭い、すなわち標準偏差が小さいセリシンナノファイバーである。こうした特性を持つセリシンナノファイバーを製造するには、２５℃でセリシンホープ繭層をＴＦＡに溶解する際、溶解時間が１日以下に、また４０℃でセリシンホープ繭層をＴＦＡに溶解するには、溶解時間が半日以下にすることが必要である。
【実施例１０】
【０２０５】
本実施例では、セリシンナノファイバーの平均繊維径に及ぼす紡糸距離の影響について検討した。
【０２０６】
セリシンホープ繭層を４０℃のＴＦＡに１５時間かけて溶解し、濃度４％のセリシンＴＦＡ溶液を作製した。このセリシンＴＦＡ溶液を用い、室温でエレクトロスピニングしてセリシンナノファイバーを製造した。
【０２０７】
エレクトロスピニング紡糸条件：印加電圧は２５ｋＶ、紡糸速度は０．０６ｃｍ／ｍｉｎ、紡糸距離は６、９、１２、１５ｃｍに設定してセリシンナノファイバーを製造した。
【０２０８】
得られたセリシンナノファイバーの形態をＳＥＭ観察し、セリシンナノファイバーの繊維径（平均繊維径）、その標準偏差、ナノファイバー繊維径の最大値と最小値、およびナノファイバーの形状を表１１に集約する。
【０２０９】
【表１１】
0005761736.tif 000012
【０２１０】
セリシンナノファイバーの形状は、次のカテゴリーで表示した。
◎：超微細なナノファイバー
【０２１１】
表１１から明らかなように、採用したエレクトロスピニング条件下、セリシンＴＦＡ溶液の濃度が同一であれば、エレクトロスピニング紡糸で得られるセリシンナノファイバーの平均繊維径は、紡糸距離（６、９、１２、１５ｃｍ）が増加すると、紡糸距離１５ｃｍの場合を除いて、次第に増加する傾向があるが、標準偏差には大きな違いは見られない。上記紡糸距離の範囲内であれば、良好なセリシンナノファイバーを製造できる。なお、紡糸距離は、セリシン溶液が紡糸口のノズルから噴射され、溶媒が十分に蒸発した状態でセリシンナノファイバーが陰極板上に堆積するように、エレクトロスピニング条件に応じて選択すればよい。それにより、所望の平均繊維径、繊維径分布のセリシンナノファイバーを製造できる。
【実施例１１】
【０２１２】
本実施例では、セリシンナノファイバーの繊維径に及ぼす印加電圧の影響について検討した。
【０２１３】
セリシンホープ繭層を４０℃のＴＦＡに１５時間かけて溶解させ、４ｗｔ％のセリシンＴＦＡ溶液を作製し、この溶液を用い、室温でエレクトロスピニングしてセリシンナノファイバーを製造した。
【０２１４】
エレクトロスピニング紡糸条件：紡糸距離は１５ｃｍ、紡糸速度は０．０６ｃｍ／ｍｉｎとした。
【０２１５】
印加電圧を７、１１、１８、２５、３２、および３６ｋＶに設定してセリシンナノファイバーを製造した。得られたセリシンナノファイバーの形態をＳＥＭ観察し、セリシンナノファイバーの繊維径（平均繊維径）、その標準偏差、ナノファイバー繊維径の最大値と最小値、およびナノファイバーの形状を表１２に集約する。
【０２１６】
【表１２】
0005761736.tif 000013
【０２１７】
セリシンナノファイバーの形状は、次のカテゴリーで表示した。
◎：超微細なナノファイバー
【０２１８】
表１２から明らかなように、採用したエレクトロスピニング条件下、印加電圧（７、１１、１８、２５、３２、および３６ｋＶ）を増加させてエレクトロスピニングを行っても、得られるセリシンナノファイバーの平均繊維径とその標準偏差、最大径、最小径には大きな違いは見られず、また、得られるセリシンナノファイバーは全て超極細である。
【実施例１２】
【０２１９】
本実施例では、セリシンナノファイバーの繊維径に及ぼす紡糸速度の影響について検討した。
【０２２０】
セリシンホープ繭層を４０℃のＴＦＡに１５時間かけて溶解し、濃度４ｗｔ％のセリシンＴＦＡ溶液を作製した。このセリシンＴＦＡ溶液を用い、室温でエレクトロスピニングしてセリシンナノファイバーを製造した。
【０２２１】
エレクトロスピニング紡糸条件：紡糸距離は１５ｃｍ、印加電圧は２５ｋＶとし、紡糸速度を０．０２０、０．０６０、０．０８０、０．１５０、および０．２５０ｃｍ／ｍｉｎに設定して、セリシンナノファイバーを製造した。得られたセリシンナノファイバーの形態をＳＥＭ観察し、セリシンナノファイバーの繊維径（平均繊維径）、その標準偏差、ナノファイバー繊維径の最大値と最小値、およびナノファイバーの形状を表１３に集約する。
【０２２２】
【表１３】
0005761736.tif 000014
【０２２３】
セリシンナノファイバーの形状は、次のカテゴリーで表示した。
◎：超微細なナノファイバー
【０２２４】
表１３から明らかなように、採用したエレクトロスピニング条件下、セリシンＴＦＡ溶液の濃度が同一であれば、紡糸速度（０．０２０、０．０６０、０．０８０、０．１５０、および０．２５０ｃｍ／ｍｉｎ）が増加すると、エレクトロスピニングで得られるセリシンナノファイバーの平均繊維径とその標準偏差は、次第に増加する。従って、遅い紡糸速度でエレクトロスピニングすることで、所望する小さい繊維径で、繊維径のバラツキがない極細のセリシンナノファイバーが製造できる。
【０２２５】
（比較例１）
本比較例では、セリシンパウダーを用い、セリシンＴＦＡ溶液濃度を変えて、セリシンナノファイバーを製造した。
【０２２６】
市販品のセリシンパウダーを２５℃のＴＦＡに入れ、浸透機を用いて攪拌しながら１０時間かけて完全に溶解し、濃度１．３、２．６、３．８、６．２、８．５、９．６、１１．７、１４．２、１６．５、２０．９および２２．９ｗｔ％のセリシンＴＦＡ溶液を作製した。このセリシンＴＦＡ溶液を用い、室温でエレクトロスピニングしてセリシンナノファイバーを製造した。
【０２２７】
エレクトロスピニング紡糸条件：紡糸距離は１５ｃｍ、印加電圧は２５ｋＶ、紡糸
速度は０．０６０ｃｍ／ｍｉｎとして、セリシンナノファイバーを製造した。得られたセリシン集積物とセリシンナノファイバーの形態をＳＥＭ観察し、セリシンナノファイバーの繊維径（平均繊維径）、その標準偏差、セリシンナノファイバー繊維径の最大値と最小値、およびセリシンナノファイバーの形状を表１４に集約する。
【０２２８】
【表１４−１】
0005761736.tif 000015
【０２２９】
【表１４−２】
0005761736.tif 000016
【０２３０】
セリシン集積物あるいはセリシンナノファイバーの形状は、次のカテゴリーで表示した。
△：超微細なナノファイバー
▲：超微細なナノファイバーにビーズ状の形態が極わずか存在する。
▽：超微細なナノファイバーにビーズ状の形態が少し多めに存在する。
▼：集積物の殆どがビーズ状の形態である。
【０２３１】
表１４中の６．２ｗｔ％セリシンＴＦＡ溶液用い、エレクトロスピニングして製造した（水溶解性の）セリシンナノファイバーの形態を走査型電子顕微鏡で観察した。得られたＳＥＭ画像を図２に示す。図２から明らかなように、セリシンナノファイバーの他に、ビーズ形態の存在量が多く、エレクトロスピニングで得られる集積物の殆どがビーズ状の形態であった。その他の濃度の場合も、同様な結果が得られた。
【０２３２】
本比較例において製造したセリシンパウダーを使用してなるセリシンナノファイバーには、実施例４の６ｗｔ％−４ｄセリシンホープ繭層のＴＦＡ溶液をエレクトロスピニングして製造した（水溶解性の）セリシンナノファイバー（図１）に比べて、多くのビーズの存在が確認された。セリシン繭層を使用することで、ビーズ形状の存在は全く認められず、表面が平滑なセリシンナノファイバーであって、平均繊維径が小さく、繊維径のバラツキが小さい極細のセリシンナノファイバーが製造できることが分かった。
【０２３３】
（比較例２）
本比較例では、セリシンパウダーを用い、セリシンＴＦＡ溶液の濃度を変えて、セリシンナノファイバーを製造した。
【０２３４】
市販品のセリシンパウダーを２５℃のＴＦＡに入れ、浸透機を用いて攪拌しながら４日間かけて完全に溶解し、濃度１．３、２．６、３．８、６．２、８．５、９．６、１１．７、１４．２、１６．５、２０．９および２２．９ｗｔ％のセリシンＴＦＡ溶液を作製した。このセリシンＴＦＡ溶解を用い、室温でエレクトロスピニングしてセリシンナノファイバーを製造した。
【０２３５】
エレクトロスピニング紡糸条件：紡糸距離は１５ｃｍ、印加電圧は２５ｋＶ、紡糸速度０．０６０ｃｍ／ｍｉｎとして、セリシンナノファイバーを製造した。得られたセリシンナノファイバーの形態をＳＥＭ観察し、セリシンナノファイバーの繊維径（平均繊維径）、その標準偏差、セリシンナノファイバー繊維径の最大値と最小値、およびセリシンナノファイバーの形状を表１５に集約する。
【０２３６】
【表１５−１】
0005761736.tif 000017
【０２３７】
【表１５−２】
0005761736.tif 000018
【０２３８】
セリシン集積物あるいはセリシンナノファイバーの形状は、次のカテゴリーで表示した。
△：超微細なナノファイバー
▽：超微細なナノファイバーにビーズ状の形態が少し多めに存在する。
【０２３９】
表１５に示したエレクトロスピニングして製造した全ての（水溶解性の）セリシンナノファイバーの形態を走査型電子顕微鏡で観察したところ、図２の場合と同様に、セリシンナノファイバーの他に、ビーズ形態の存在量が多く、エレクトロスピニングで得られる集積物の殆どがビーズ状の形態であった。
【実施例１３】
【０２４０】
本実施例では、セリシンホープ繭層とフィブロイン（シルク）スポンジとからなるセリシン・フィブロイン複合溶液を用いてセリシン・フィブロイン複合ナノファイバーを製造し、このナノファイバーの平均繊維径、その標準偏差、その形状を検討した。
【０２４１】
セリシンホープ繭層とフィブロインスポンジとからなるセリシン・フィブロイン複合溶液は、次のようにして作製した。
【０２４２】
まず、フィブロインスポンジ（ＳＦＰ）を次のようにして製造した。絹フィブロイン繊維を６０℃、９Ｍの臭化リチウム水溶液に溶解し完全に溶解し、この溶液をセルロース製透析膜に入れ、５日間水と置換して２．３％の絹フィブロイン水溶液を調製した。１Ｌ絹フィブロイン水溶液に７ｍＬのメチルアルコールを添加し、２時間静置した後、凍結乾燥することでフィブロインスポンジを製造した。セリシンホープ繭層（ＳＣ）とフィブロインスポンジ（ＳＦＴ）との重量組成比が１００／０、７５／２５、５０／５０、２５／７５、０／１００となるように秤量してガラス瓶に入れた。７．２ｗｔ％濃度となるように、各試料に所定量のＴＦＡを加えて４０℃で２４時間加熱して試料を完全に溶解した。かくして得られたセリシンホープ繭層溶液、セリシン・フィブロイン複合溶液およびフィブロイン溶液のそれぞれの溶液を用い、室温でエレクトロスピニングした。得られたセリシンナノファイバー、セリシン・フィブロイン複合ナノファイバーおよびフィブロインナノファイバーをＳＥＭ測定して、それぞれの平均繊維径とその標準偏差を求めると共に、その形状を観測した。得られた結果を表１６に集約する。
【０２４３】
エレクトロスピニング紡糸条件：紡糸距離は１５ｃｍ、印加電圧は２５ｋＶ、紡糸速度は０．０６０ｃｍ／ｍｉｎとした。
【０２４４】
【表１６】
0005761736.tif 000019
【０２４５】
表１６中、１００／０、７５／２５、５０／５０、２５／７５、および０／１００は、それぞれ、セリシンホープ繭層とフィブロインスポンジとの重量比が１００／０、７５／２５、５０／５０、２５／７５、および０／１００であることを意味する。
【０２４６】
セリシンナノファイバーの形状は、次のカテゴリーで表示した。
△：超微細なナノファイバー。
▲：超微細なナノファイバーにビーズ状の形態が極わずか存在する。
▽：超微細なナノファイバーにビーズ状の形態が少し多めに存在する。
【０２４７】
上記表１６から明らかなように、セリシン繭層ＴＦＡにフィブロインスポンジＴＦＡを混ぜた溶液を用いてエレクトロスピニングすると、セリシン・フィブロイン複合ナノファイバーが製造できる。
【０２４８】
フィブロイン含量が増すとセリシン・フィブロイン複合ナノファイバーの平均繊維径は減少する傾向にあり、ビーズ形状物は次第に減少する。
【実施例１４】
【０２４９】
本実施例では、セリシンホープ繭層ＴＦＡ溶液から得られたセリシン膜に対する水不溶化処理について検討した。
【０２５０】
セリシンホープ繭層を２５℃のＴＦＡに４日間浸漬し、完全に溶解させて製造した８ｗｔ％セリシンホープ繭層ＴＦＡ溶液をポリスチレン膜上に広げ、１時間送風乾燥させることで透明なセリシン膜を製造した。１００ｍｇのセリシン膜を１５ｍＬの２５℃の蒸留水に浸漬したところ３時間でセリシン膜は完全に溶解し、水溶解性セリシン膜であることが分かった。
【０２５１】
次に、水溶解性セリシン膜に対して下記のような２工程の処理で水不溶化処理を行った。
【０２５２】
第１工程：７０ｖ／ｖ％のメタノールあるいは７０ｖ／ｖ％のエタノール水溶液に水溶解性セリシン膜を室温で１０分間浸漬処理した後、このアルコール溶液から試料を引き上げ、室温で乾燥させて第１工程の水不溶化処理を行った。
【０２５３】
第２工程：上記アルコール処理による第１工程または下記の（ａ）工程により完全に水不溶化した試料をさらに化学加工処理する（下記（ｂ））ことで、化学加工された水不溶化膜を製造できた。
【０２５４】
（ａ）上記アルコール処理による第１工程の代わりに、水溶解性セリシン膜を、和光純薬工業株式会社の商品：４％パラホルムアルデヒド試薬０．１ｍｏｌ／Ｌ、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に、室温で２時間浸漬処理した後、試料膜を取り出し十分に水洗いを行い、標準状態で乾燥させた。かくして製造したセリシン膜は水に浸漬しても溶解しなかった。
【０２５５】
（ｂ）３官能性エポキシ化合物であるグリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセ化成工業株式会社製、商品名：デナコールＥＸ−３１３およびＥＸ−３１４）あるいは２官能性エポキシ化合物であるエチレングリコールジグリシジルエーテル（ナガセ化成工業株式会社製、商品名：デナコールＥＸ−８１０）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、この溶液を逆流冷却器を付けた１００ｍＬのナス型フラスコに入れ、試料がＤＭＦ中に完全に浸漬するように留意しながら、ウォーターバス中で、７５〜８０℃で２時間化学反応を行った。反応終了後、試料を取り出し、ＤＭＦで洗浄し、続いて５５℃のアセトンで洗浄することで未反応試薬を除去した。最終的に水で洗浄した。乾燥後、重量測定によると、エポキシ化合物で処理したセリシン膜の加工率は８．７％であった。これを水に浸漬しても試料膜は溶解しなかった。
【０２５６】
上記では、セリシン膜について述べたが、セリシンナノファイバーの場合も、以下の（ｃ）のようにパラホルムアルデヒド処理により水不溶化し、または上記したアルコール処理により水不溶化し、次いで化学加工処理（ｂ）することにより、化学加工された水不溶化ナノファイバーを製造できる。
【０２５７】
（ｃ）和光純薬工業株式会社の商品・４％パラホルムアルデヒド試薬０．１  ｍｏｌ／Ｌおよびリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用い、水溶解性セリシンナノファイバーを４％パラホルムアルデヒド固定液で浸漬し、概ね２時間〜１０時間静置することで水不溶化したセリシンナノファイバーが製造できた。
【０２５８】
上記工程でセリシンナノファイバーを水不溶化できたので、用途に応じて水溶性および水不溶性のセリシンナノファイバーを適宜選択して利用できるというメリットがある。
【実施例１５】
【０２５９】
本実施例では、セリシンホープ繭層ＴＦＡ溶液を用い、エレクトロスピニングして得られたセリシンナノファイバーに対する水不溶化処理について検討した。
【０２６０】
実施例４における６ｗｔ％−４ｄセリシンＴＦＡ溶液用い、実施例４記載の方法でエレクトロスピニングして製造した水溶解性のセリシンナノファイバーを上記実施例１４と同様に、アルコール処理または上記パラホルムアルデヒド処理（ｃ）により完全に水不溶性にし、その後で、（ｂ）の化学加工処理工程で処理することで染色性などの向上した水不溶性のセリシンナノファイバーを製造した。
【０２６１】
ただし、水溶解性のセリシンナノファイバーは、実施例１４における水溶解性セリシン膜とは異なり、アルコール処理による前処理では、実施例１４とは少し異なる工夫を要する。水溶解性のセリシンナノファイバーは実施例１４のセリシン膜とは異なり、アルコール水溶液に直接浸漬することはできないので、蓋付きのポリスチレン容器を用い、容器の底部分に７０ｖ／ｖ％のエタノール水溶液を入れ、アルコール水溶液がセリシンナノファイバーに触れないように配置した試料台上に試料を置いた。ポリスチレン容器に蓋をして室温で２日間静置すると、ポリスチレン容器内部はアルコールの蒸気圧が高まりセリシンナノファイバーに吸着された。ポリスチレン容器から試料を取りだし、室温で乾燥することで水不溶性のセリシンナノファイバーを製造できた。続いて、実施例１４記載の第２工程（ｂ）処理により染色性が向上した水不溶性のセリシンナノファイバーを製造することができた。
【０２６２】
第１工程（ｃ）の後に第２工程（ｂ）処理を行うことにより染色性が向上した不溶性のセリシンナノファイバーを製造することができた。
【実施例１６】
【０２６３】
本実施例では、セリシンホープ繭層とフィブロインスポンジとからなるセリシン・フィブロイン複合溶液を用いてセリシン・フィブロイン複合ナノファイバーを製造し、このナノファイバーの平均繊維径、その標準偏差、その最大径と最小径を検討した。
【０２６４】
セリシンホープ繭層（ＳＣ）とフィブロインスポンジ（ＳＦＰ）とからなるセリシン・フィブロイン複合溶液を、実施例１３記載の方法に準じて次のようにして製造した。
【０２６５】
セリシンホープ繭層とフィブロインスポンジとの重量組成比が１００／０、７５／２５、５０／５０、２５／７５、および０／１００となるように、セリシンホープ繭層の重量とフィブロインスポンジの重量とを秤量してガラス瓶に入れた。すなわち、セリシンホープ繭層のＴＦＡ溶液、フィブロインスポンジのＴＦＡ溶液およびセリシン・フィブロイン複合物のＴＦＡ溶液の濃度がすべて７．２ｗｔ％となるようにセリシンホープ繭層とフィブロインスポンジとにＴＦＡを所定量加え、４０℃で２４時間加熱して試料を完全に溶解した。かくして得られた試料ＴＦＡ溶液を用いて室温でエレクトロスピニングした。得られた試料ナノファイバーをＳＥＭ測定して、セリシン・フィブロイン複合ナノファイバーの繊維径（平均繊維径）、標準偏差、複合ナノファイバーの繊維径の最大値（最大径）と最小値（最小径）とを求めた。得られた結果を表１７に集約する。
【０２６６】
エレクトロスピニング紡糸条件：紡糸距離は１５ｃｍ、印加電圧は２５ｋＶ、紡糸速度は０．０６０ｃｍ／ｍｉｎとした。
【０２６７】
【表１７】
0005761736.tif 000020
【０２６８】
表１７において、７．２−ＳＣとは、セリシンホープ繭層を４０℃で２４時間加熱して試料を完全にＴＦＡに溶解した７．２ｗｔ％のセリシンＴＦＡ溶液、２５−ＳＣ−７５−ＳＥＰとは、セリシンホープ繭層を４０℃で２４時間加熱して試料を完全にＴＦＡに溶解した７．２ｗｔ％のセリシンＴＦＡ溶液とフィブロインスポンジを４０℃で２４時間加熱してなる７．２ｗｔ％のフィブロインＴＦＡ溶液との２５：７５混合溶液、５０−ＳＣ−５０−ＳＥＰとは、セリシンホープ繭層を４０℃で２４時間加熱して試料を完全にＴＦＡに溶解した７．２ｗｔ％のセリシンＴＦＡ溶液とフィブロインスポンジを４０℃で２４時間加熱してなる７．２ｗｔ％のフィブロインＴＦＡ溶液との５０：５０混合溶液、７５−ＳＣ−２５−ＳＦＰとは、セリシンホープ繭層を４０℃で２４時間加熱して試料を完全にＴＦＡに溶解した７．２ｗｔ％のセリシンＴＦＡ溶液とフィブロインスポンジを４０℃で２４時間加熱してなる７．２ｗｔ％のフィブロインＴＦＡ溶液との７５：２５混合溶液、７．２−ＳＦＰとは、フィブロインスポンジを４０℃で２４時間加熱してなる７．２ｗｔ％のフィブロインＴＦＡ溶液を意味する。
【０２６９】
表１７から明らかなように、セリシンホープ繭層のＴＦＡ溶液を用い、室温でエレクトロスピニングして製造できるセリシンナノファイバーの平均繊維径とその標準偏差は最も大きかったが、セリシン溶液にフィブロイン溶液を加えることで、平均繊維径とその標準偏差は低下した。
【実施例１７】
【０２７０】
本実施例では、実施例１６記載の方法に従って得られたセリシン・フィブロイン複合ナノファイバー（２５−ＳＣ−７５−ＳＦＰ、５０−ＳＣ−５０−ＳＦＰおよび７５−ＳＣ−２５−ＳＦＰ）に対して、実施例１５記載の方法に従って水不溶化処理を行った。
【０２７１】
すなわち、この複合ナノファイバーに対して、第１工程としてアルコール（メタノール）処理または上記（ａ）のアルデヒド処理をして完全に水不溶化し、次いで第２工程として上記（ｂ）の化学加工処理を行った。その結果、化学加工された完全に水不溶性のセリシン・フィブロイン複合ナノファイバーを製造することができた。
【実施例１８】
【０２７２】
本実施例では、化学加工処理して得られた水不溶化セリシンナノファイバーへの金属イオン吸着について検討した。
【０２７３】
実施例１５の方法で第１工程のアルコール処理を実施して水不溶化処理した後、第２工程（ｂ）の処理に準じてＥＤＴＡ二塩基酸無水物による化学加工処理を行った。すなわち、ＥＤＴＡ二塩基酸無水物１０ｗｔ％を含むＤＭＳＯ中にアルコールにより水不溶化処理したセリシンナノファイバーを浸漬し、７５℃で２時間処理し、加工率５．２％の水不溶性のセリシンナノファイバーを製造した。未加工の家蚕絹糸および上記方法で化学加工処理して製造した水不溶性のセリシンナノファイバーを、抗菌性の金属である銀および銅イオンを含む水溶液に浸漬して金属イオンを吸着させた。また、銀イオンを吸着させたセリシンナノファイバーに対するトマトかいよう病細菌の増殖抑止効果に関する抗菌活性の評価も行った。なお、ほぼ同一の上記加工率を持つ家蚕絹糸への金属イオンの吸着、銀イオンの抗菌活性も行った。かくして得られた銀イオンおよび銅イオンの吸着量（ｍｍｏｌ／ｇ）と、抗菌活性の評価結果を表１８に示す。
【０２７４】
【表１８】
0005761736.tif 000021
【０２７５】
表１８から明らかなように、家蚕絹糸を金属イオン水溶液に浸漬した場合、極微量の銀イオン、銅イオンは吸着するが、予めＥＤＴＡ二塩基酸無水物により化学加工処理した水不溶性のセリシンナノファイバーには多量の金属イオン量が吸着し、これに伴い抗菌活性も向上する。化学加工処理したセリシンナノファイバーへの金属イオン吸着量は、家蚕絹糸への金属イオン吸着量の２〜３倍であった。また、化学加工処理したセリシンナノファイバーの抗菌活性は、家蚕絹糸の抗菌活性の１．５倍以上の高い値を示した。なお、セリシン・フィブロイン複合ナノファイバーの場合も上記と同様であった。
【０２７６】
しかし、未加工のセリシンナノファイバーの場合、水溶性であるため、測定できなかった。
【実施例１９】
【０２７７】
本実施例では、化学加工処理して製造した水不溶化セリシンナノファイバーへの耐薬品抵抗性について検討した。
【０２７８】
実施例１５記載の方法に従って第１工程のアルコール処理を行った後、第２工程の（ｂ）処理を行った。すなわち、化学加工処理して得られた水不溶化セリシンナノファイバーの酸およびアルカリによる耐薬品抵抗性を調べた。
【０２７９】
上記（ｂ）処理の詳細は次の通りであった。エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＧＥ）５％を含むトリクロロエチレン中に第１工程で処理した水不溶性のセリシンナノファイバーを浸漬し、７０℃で２時間化学加工処理を行い、加工率が５．２％のエポキシ加工した水不溶性のセリシンナノファイバーを調製した。かくして得られた水不溶性のセリシンナノファイバーを６５℃の４Ｍ塩酸水溶液および０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液中で１時間加水分解処理を行い、試料の重量変化から酸およびアルカリに対する溶解度を評価した。得られた結果を表１９に集約する。
【０２８０】
【表１９】
0005761736.tif 000022
【０２８１】
表１９において未処理試料とは、実施例４に記載したように、６ｗｔ％のセリシンＴＦＡ溶液（６ｗｔ％−４ｄ）を用い、エレクトロスピニングして製造した水溶解性のセリシンナノファイバーを意味する。表１９において、酸溶解度、アルカリ溶解度の値が大きいほど、試料が酸あるいはアルカリ溶液で溶解してしまい易いことを意味し、数値が小さいほど酸あるいはアルカリ溶液に晒しても溶解しないこと、すなわち耐薬品性が高いことを意味する。
【０２８２】
表１９から明らかなように、未加工試料は酸あるいはアルカリ水溶液による浸漬処理で試料は完全に溶解してしまうが、エポキシ加工された水不溶化セリシンナノファイバーは溶解し難くなり耐薬品性が向上したことが分かる。なお、セリシン・フィブロイン複合ナノファイバーの場合も上記と同様であった。
【０２８３】
（参考例１）
本参考例では、セリシンホープ繭層（以下の表２０では「セリシン繭層」と略記する。）を用いて、染色性について検討した。
セリシンホープ繭層を次の方法で染色した。塩基性染料であるＥｔｈｙｌ  Ｖｉｏｌｅｔを濃度の異なるエタノール水溶液に溶解した系でセリシンホープ繭層を染色することによりセリシンホープ繭層の染色挙動を調べた。すなわち、 塩基性染料のＥｔｈｙｌ  Ｖｉｏｌｅｔ(Ｃ．Ｉ．Ｂａｓｉｃ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４)（Ｃ．Ｉ．Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  Ｎｏ．４２６００，Ｃ．Ｉ．：  Ｃｏｌｏｕｒ  Ｉｎｄｅｘ）あるいは酸性染料Ａｚｏｐｈｌｏｘｉｎｅ（Ｃ．Ｉ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｄ  １）を、その濃度が０．２ｇ／Ｌとなるように０〜１００％エタノールに完全に溶解したものを染色浴とした。０．５ｇのセリシンホープ繭層を染料濃度が０．２ｇ／Ｌの０〜１００％エタノール水溶液２０ｍＬに浸漬し、室温で１時間静置することで染色を行った。得られた結果を表２０に示す。
【０２８４】
【表２０】
0005761736.tif 000023
【０２８５】
表２０における染色程度の評価基準は以下の通りである。
＋：シルクセリシンが濃い紫色に染まり、染まり方が良好である。
−：シルクセリシンは淡い紫色しか染まらず、染色状態は良くない。
±：染色状態は、良いとも悪いとも言えない。
【０２８６】
溶媒法においてセリシンを染色するには、溶媒染色浴に水が所定量含まれ、２０〜８０％エタノール濃度となると良い。
【実施例２０】
【０２８７】
本実施例では、化学加工処理した水不溶化セリシンナノファイバーへの染色について検討した。
【０２８８】
実施例４に記載した６ｗｔ％のセリシンＴＦＡ溶液（６ｗｔ％−４ｄ）を用い、エレクトロスピニングして製造した水溶解性のセリシンナノファイバーを実施例１４の方法で第１工程のメタノールで前処理を実施し、または上記したパラホルムアルデヒド試薬で前処理（ｃ）を実施して水不溶性のセリシンナノファイバーを作製し、次いで以下のような化学加工処理をして得られたセリシンナノファイバーへの染色を行った。
【０２８９】
まず、水不溶性のセリシンナノファイバーを５％のグルタル酸無水物（ＧＡ）を含むＤＭＦ中に浸漬し、７５℃で１時間および６時間処理することにより、それぞれ、ＧＡによる加工率２０％、１５％のセリシンナノファイバーを製造した。このＧＡ加工したセリシンナノファイバーを、水とエタノールとが等量ずつ混合された混合溶媒にメチレンブルーを溶解させて調製した塩基性染料であるメチレンブルー（Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｂｌｕｅ）により溶媒染色法で染色した。具体的な染色方法は次の通りである。
【０２９０】
水とエタノールからなる混合溶媒に、０．２％となるようにメチレンブルーを溶解し、２５℃で１時間静置して得た塩基性染料を用いてセリシンナノファイバーを染色した。染色後、遠心分離で染色浴に分散したセリシン粉末を沈殿分離して除去した。染色残液の吸光度測定を行い、セリシンナノファイバーへの染料の吸着率を評価した。
【０２９１】
染色後の残液自体の濃度は濃いため、染色残液５ｍＬを２５ｍＬの蒸留水で薄め、Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｂｌｕｅの吸収が最大となる６６２ｎｍもしくは２９６ｎｍにおける吸光度（Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）値を、島津製作所製自記分光光度計（ＵＶ−３１００Ｓ）で求めた。染色残液の吸光度からセリシンナノファイバーの染色挙動を調べた。得られた値を表２１に示す。
【０２９２】
【表２１】
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【０２９３】
表２１から明らかなように、グルタル酸無水物で化学加工処理したセリシンナノファイバーにはカルボキシル基が導入されるので、溶媒染色法で用いた塩基性染料によく染まるようになる。加工率２０％のセリシンナノファイバーは未加工セリシンナノファイバーのほぼ２．２倍の値となった。なお、セリシン・フィブロイン複合ナノファイバーの場合も上記と同様であった。
【０２９４】
上記では、水とエタノールとが等量ずつ混合された混合溶媒にメチレンブルーを溶解させて調製した塩基性染料を使用したが、１５％エタノールおよび７５％エタノールを用いた場合も同様な染着率が得られた。従って、溶媒染色法でセリシン繭層を染色するには１５〜７５％のエタノール水溶液を用いることで高い先着率が得られる。
【０２９５】
無水グルタル酸の代わりに、無水コハク酸、無水フタル酸あるいは無水ｏ−スルホ安息香酸（ＯＳＢＡ）で化学加工処理しても上記実施例と同様に、良好な染色ができた。なお、セリシン・フィブロイン複合ナノファイバーの場合も上記と同様であった。
【実施例２１】
【０２９６】
本実施例では、不溶化セリシンナノファイバーへの染色について検討した。  
実施例４に記載したように、６ｗｔ％のセリシンＴＦＡ溶液（６ｗｔ％−４ｄ）を用い、エレクトロスピニングして製造した水溶解性のセリシンナノファイバーを実施例１４の方法で第１工程のメタノールで前処理を実施し、または上記したパラホルムアルデヒド試薬で前処理（ｃ）を実施して水不溶性のセリシンナノファイバーを作製し、得られたセリシンナノファイバーへの染色を行った。
【０２９７】
塩基性染料のＥｔｈｙｌ  Ｖｉｏｌｅｔ（Ｃ．Ｉ．  Ｂａｓｉｃ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４）  （Ｃ．Ｉ．Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  Ｎｏ．４２６００、Ｃ．Ｉ：Ｃｏｌｏｕｒ  Ｉｎｄｅｘ）または酸性染料のＡｚｏｐｈｌｏｘｉｎｅ（Ｃ．Ｉ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｄ  １）を用い、濃度が０．２ｇ／Ｌとなるように１００％エタノールに完全に溶解したものを染色浴とした。０．５ｇの不溶化セリシンナノファイバーをこの染色浴２０ｍＬに浸漬し、室温で１時間静置することで染色を行った。
【０２９８】
不溶化セリシンナノファイバーへの染色前後の染色浴の吸光度変化から染着量を求めた。塩基性染料または酸性染料を溶解した１００％エタノールの染色浴で室温１時間染色したときの染着率を表２２に示す。また、エタノール０％すなわち蒸留水中に酸性染料（Ａｃｉｄ  Ｒｅｄ  １８（Ｓｃａｒｌｅｔ  ３Ｒ））を溶解した染色浴を用い室温で染色したときの染着率を求め、表２２に合わせて示す。
【０２９９】
【表２２】
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【０３００】
表２２から明らかなように、１００％エタノールに塩基性染料や酸性染料を溶解した染色浴でセリシンホープ繭層から得られた不溶化セリシンナノファイバーを染色しても良好には染まらない（染着率は低い）。セリシンナノファイバーの染色を効率よく進める上では、染色浴に水を所定量（例えば、アルコール濃度が１５〜７５％となるように）加えることが必要である。これは、染色浴中の水がセリシンナノファイバーを膨潤させるので、染料が拡散し易くなるためである。なお、セリシン・フィブロイン複合ナノファイバーの場合も上記と同様であった。
【０３０１】
本実施例では、実施例２０のように化学加工処理をしていないが、染色は可能であった。しかし、実施例２０の場合の方が染色性は増加した。
【実施例２２】
【０３０２】
本実施例では、セリシンナノファイバーへの染色性増強処理について検討した。
【０３０３】
実施例４に記載したように、６ｗｔ％のセリシンＴＦＡ溶液（６ｗｔ％−４ｄ）を用い、エレクトロスピニングして製造した水溶解性のセリシンナノファイバーを実施例１４記載の方法に従ってメタノールで前処理し、続いて二塩基酸無水物である無水グルタル酸（ＧＡ）あるいは無水フタル酸（ＰＡ）で化学加工処理し、加工率が異なるセリシンナノファイバーを製造し、以下記載するように、エタノール溶媒染色法で染色した。
【０３０４】
なお、エタノール濃度を５０％とし、染料としてＣ．Ｉ．Ｂａｓｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ  １４を用い、染料濃度を０．２％とし、染色温度と時間とを、それぞれ、２５℃、１時間とした。染着程度は目視により次の３段階で評価した。また、Ｃ．Ｉ．Ｂａｓｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ  １４の代わりにＭｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｂｌｕｅを用いた場合についても染色実験を行った。
【０３０５】
Ｃ．Ｉ．Ｂａｓｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ  １４およびＭｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｌｕｅを用いた染色実験で染着度合いを次の評価基準で求めたものを、それぞれ、Ｏ染着程度、Ｍ染着程度と略記する。得られた結果を表２３に示す。
【０３０６】
【表２３】
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【０３０７】
表２３中、Ｃｏｎｔは、メタノールで水不溶化したセリシンナノファイバーであり、ＧＡおよびＰＡは、それぞれ、無水グルタル酸および無水フタル酸で化学加工処理した水不溶性のセリシンナノファイバーを意味する。
【０３０８】
表２３中、染着程度の評価基準は次の通りである。
＋：染料による染着程度がやや薄い。
＋＋：染料による染着程度が普通。
＋＋＋：染料による染着が著しく濃い。
【０３０９】
表２３の結果から、化学加工処理で不溶化セリシンナノファイバーにカルボキシル基を導入することにより、また、用いた化学修飾試薬が疎水性の高いものであると、塩基性染料による染着率が著しく向上することが確かめられた。
【０３１０】
なお、セリシン・フィブロイン複合ナノファイバーの場合も上記と同様であった。また、二塩基酸無水物である無水コハク酸（ＳＡ）および無水ｏ−スルホ安息香酸（ＯＳＢＡ）で化学加工処理した場合も、上記と同様な結果が得られた。
【産業上の利用可能性】
【０３１１】
本発明によれば、カイコ由来のセリシンを十分な量溶解する溶媒であって、かつその際のセリシンの分子量低下のない所望の溶媒に溶解して得た溶液を用いて、エレクトロスピニングにより、平均繊維径と繊維径分布の制御を可能とするセリシンナノナノファイバーの効率的、経済的な製造技術を提供することができると共に、このセリシンナノファイバーを効率的に水不溶化することができ、この不溶化したセリシンナノファイバーを染色したり（染色性増強材）、金属イオンを効果的に吸着する金属イオン吸着材としたり、あるいは耐薬品性に優れた耐薬品性増強材としたりすることができるセリシンナノファイバーを製造するための技術を提供することができる。また、このエレクトロスピニングにより得られたセリシンナノファイバーは水溶解性であり、有用細胞を効率的に増殖させるための再生医療材料としての利用価値は高く、様々な生体細胞との親和性が良く、短時間に細胞増殖が可能となるため再生医用材料として広範に利用できる。従って、本発明は、各種の産業分野で利用可能である。
【図１】
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【図２】
0005761736.tif 000028