(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の半導体ナノ粒子を集積してなる半導体ナノ粒子集積体と、
該半導体ナノ粒子集積体を被覆するシェル材と
を含み、
前記シェル材が、
前記半導体ナノ粒子集積体を構成するいかなる半導体に対しても、より大きなバンドギャップエネルギーを有し、且つ、
前記半導体ナノ粒子が、蛍光を発する
シェル材被覆半導体ナノ粒子集積体。
【請求項２】
前記半導体ナノ粒子集積体が、
前記半導体ナノ粒子を構成するいかなる半導体に対しても、同等またはより大きなバンドギャップエネルギーを有する半導体からなるマトリクス部分をさらに含有する請求項１に記載のシェル材被覆半導体ナノ粒子集積体。
【請求項３】
前記半導体ナノ粒子が、コア／シェル構造を有する請求項１〜２のいずれかに記載のシェル材被覆半導体ナノ粒子集積体。
【請求項４】
II−VI族半導体化合物、III−V族半導体化合物およびIV−VI族半導体化合物からなる群から選択される１種以上の半導体化合物から構成される請求項１〜３のいずれかに記載のシェル材被覆半導体ナノ粒子集積体。
【請求項５】
前記半導体化合物が、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅ、ＨｇＴｅ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＰｂＴｅ、ＡｌＮ、ＡｌＰ、ＡｌＡｓ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＰ、ＩｎＮ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓからなる群から選択される請求項４に記載のシェル材被覆半導体ナノ粒子集積体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発光強度の高い半導体ナノ粒子集積体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオイメージングにおける標識剤として蛍光発光する半導体ナノ粒子が用いられている。そして、半導体ナノ粒子の一粒子当たりの輝度が高いほど視認性の点で有利なことから、一粒子当たりの輝度のより高い粒子が望まれている。
【０００３】
蛍光発光する半導体ナノ粒子としては、II−VI族、及びIII−Ｖ族の化合物半導体ナノ粒子が広く知られている。一般的に、コア半導体ナノ粒子のみでは発光強度は低いが、コア粒子にシェルを付加させたコア／シェル構造を有する半導体ナノ粒子にすると発光強度が数倍から数十倍向上する。これはコア粒子よりもバンドギャップの広い半導体材料をシェルとして用いることにより、量子井戸構造が形成され量子閉じ込め効果により発光効率が著しく向上するためと考えられている。
【０００４】
また、バイオ標識体をより高輝度化させる１つの手法として、半導体ナノ粒子の集積化が考えられている。即ち、半導体ナノ粒子を集積化させることにより、１粒子あたりの発光強度を向上させる技術である。
【０００５】
しかし、半導体ナノ粒子は一般的に球状であるため、集積化させた場合、半導体ナノ粒子間に空隙、発光に関与しない空間ができてしまう。この空間は励起光を受光できない領域であり、半導体ナノ粒子集積体１粒子の発光効率を考えた場合、集積前の半導体ナノ粒子に比べて、１粒子単位体積あたりの発光効率が低下することになる。例えば、近年、半導体ナノ粒子をガラス等のマトリクス中に分散固定する形で閉じ込める蛍光ガラス粒子が提案されている。これに関連して、特許文献１には、テルル化カドミウムナノ粒子やセレン化亜鉛ナノ粒子を、有機アルコキシシラン存在下ゾル−ゲル法を用いて、珪素を含むマトリクス中に分散させることにより蛍光体が得られることが記載されている。また、特許文献２には、テルル化カドミウムナノ粒子を、有機アルコキシシラン存在下ゾル−ゲル法を用いて得られた、蛍光ガラス粒子が記載されている。
【０００６】
このような蛍光ガラス粒子では、半導体ナノ粒子間がガラス材で満たされているが、ガラス材は一般的にバンドギャップエネルギーが大きく、通常バイオイメージングの励起光で用いられる可視光は吸収できず、集積体の単位体積あたりの発光効率の減少が生じる。また、半導体ナノ粒子集積体の最外層部では一般的にダングリングボンド等の局在準位が存在することが多く、この準位において、発光に寄与しない電子正孔対の再結合が生じ、こちらによっても発光効率の低下する問題が生じている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００４／０００９７１号パンフレット
【特許文献２】特開２００５−２８１０１９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記課題・状況に鑑みてなされたものであり、その解決課題は、高い発光強度を有する半導体ナノ粒子集積体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る上記課題は、以下の［１］〜［５］に示す手段により解決される。
［１］  複数の半導体ナノ粒子を集積してなる半導体ナノ粒子集積体と、
該半導体ナノ粒子集積体を被覆するシェル材と
を含み、
前記シェル材が、
前記半導体ナノ粒子集積体を構成するいかなる半導体に対しても、より大きなバンドギャップエネルギーを有し、且つ、
前記半導体ナノ粒子が、蛍光を発する
シェル材被覆半導体ナノ粒子集積体。
【００１１】
［２］  前記半導体ナノ粒子集積体が、
前記半導体ナノ粒子を構成するいかなる半導体に対しても、同等またはより大きなバンドギャップエネルギーを有する半導体からなるマトリクス部分をさらに含有する前記［１］に記載のシェル材被覆半導体ナノ粒子集積体。
【００１２】
［３］  前記半導体ナノ粒子が、コア／シェル構造を有する前記［１］〜［２］のいずれかに記載のシェル材被覆半導体ナノ粒子集積体。
［４］  II−VI族半導体化合物、III−V族半導体化合物およびIV−VI族半導体化合物からなる群から 選択される１種以上の半導体化合物から構成される前記［１］〜［３］のいずれかに記載のシェル材被覆半導体ナノ粒子集積体。
【００１３】
［５］  前記半導体化合物が、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅ、ＨｇＴｅ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＰｂＴｅ、ＡｌＮ、ＡｌＰ、ＡｌＡｓ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＰ、ＩｎＮ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓからなる群から選択される前記［４］に記載のシェル材被覆半導体ナノ粒子集積体。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のシェル材被覆半導体ナノ粒子集積体は、ナノ粒子集積体全体で励起光を吸収すること、および、最外層をシェル材で被覆することにより、発光効率が改善される。したがって、本発明は、高い発光強度を有する半導体ナノ粒子集積体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明に係るシェル材被覆コアシェル半導体ナノ粒子（ａ）の構造及び励起時のエネルギー移動の様子を、コアシェル半導体ナノ粒子（ｂ）と比較して示す図である。
【図２】本願実施例・比較例で得られた各種粒子または集積体について、粒子径と輝度との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明について、図１を参照しながら具体的に説明する。
〔シェル材被覆半導体ナノ粒子集積体〕
本発明に係るシェル材被覆半導体ナノ粒子集積体１００は、
半導体ナノ粒子１１０を複数個含有する半導体ナノ粒子集積体１０１と、
該半導体ナノ粒子集積体１０１を被覆するシェル材１０２と
を含む。
【００１７】
ここで本発明は、外部から与えられたエネルギーを内部に閉じ込めるために、半導体ナノ粒子集積体１０１をシェル材１０２が被覆した構造を有しているという点に最大の特徴がある。これについて、図１を用いて説明する。
【００１８】
シェル材１０２が被覆した構造を有さない従来の半導体ナノ粒子集積体２００では、外部から与えられたエネルギーが集積体内部に伝達し、半導体ナノ粒子１１０に届いたところで半導体ナノ粒子１１０を構成する半導体の電子が励起される。そして、この励起された電子が励起状態から基底状態に戻る際に、バンドギャップに対応する波長の蛍光を発光する。ここで図１（ｂ）には、半導体ナノ粒子１１０として、コア１１１と内部シェル１１２とからなるコアシェル半導体ナノ粒子が含まれる従来の半導体ナノ粒子集積体２００を示したが、この場合には、通常コア１１１において蛍光発光が生じることになる。
【００１９】
ただ、従来の半導体ナノ粒子集積体２００では、外部から与えられたエネルギーの一部が、集積体内部に伝達することなく外部に流出することから、外部から与えられたエネルギーから光エネルギーへの変換が充分に行われない。
【００２０】
これに対して、本発明に係るシェル材被覆半導体ナノ粒子集積体１００では、半導体ナノ粒子集積体１０１を被覆するシェル材１０２によって、外部から半導体ナノ粒子集積体１０１に与えられたエネルギーが外部に流出することを防ぐことができるので、外部から与えられたエネルギーを効率よく光エネルギーに変換することができ、これによって、蛍光強度を高めることができるのである。本発明においては、このような効果を確実に発揮できるよう、シェル材１０２は、半導体ナノ粒子集積体１０１を構成するいかなる半導体に対しても、より大きなバンドギャップを有する材質からなることが好ましい。そのようなシェル材１０２を有するシェル材被覆半導体ナノ粒子集積体１００では、図１（ａ）に示すように、半導体ナノ粒子集積体１０１に届いた外部からのエネルギーが、半導体ナノ粒子集積体１０１とシェル材１０２との間に形成されたエネルギー障壁によって外部に流出しにくくなり、半導体ナノ粒子１１０を構成する半導体の電子をより多く励起させることができる。
【００２１】
なお、本明細書において、「蛍光」は、外部からのＸ線、紫外線または可視光線の照射を受けて励起し、励起状態から基底状態に到る過程における発光を指す。したがって、本発明にいう「蛍光」は、励起状態から基底状態に戻るときの遷移態様の如何を問うものでなく、励起一重項からの失活に伴う発光である狭義の蛍光であってもよいし、三重項からの失活に伴う燐光であってもよい。
・半導体
本発明で用いられる半導体は、良導体と絶縁体との中間の電気的性質を示す物質であり、外部から一定のエネルギーを受けることによって電子が励起し、その後励起状態から基底状態に戻る過程で蛍光発光を生じさせるものであれば特に限定はない。
【００２２】
ただ、本発明では、半導体ナノ粒子集積体１０１を構成する半導体は、可視領域から近赤外領域における蛍光発光を生じさせるようなバンドギャップを有する半導体が好ましく、具体的には、２００〜７００ｎｍの範囲内の波長の紫外〜可視光により励起されたときに、４００〜９００ｎｍの範囲内の波長の可視〜近赤外光の発光を示すことが好ましい。そのような半導体として、II−VI族、III−V族およびIV−VI族の無機半導体が好適に用いられる。ここで、II−VI族の無機半導体の好適な例として、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅ、ＨｇＴｅが、IV−VI族の無機半導体の好適な例として、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＰｂＴｅが、III−V族の無機半導体の好適な例として、ＡｌＮ、ＡｌＰ、ＡｌＡｓ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＩｎＮ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓがそれぞれ挙げられる。また、II−VI族、III−V族およびIV−VI族の無機半導体のほかに、Ｓｉ、ＧｅのようなIV族の無機半導体を用いることもできる。以上に挙げた無機半導体は、２以下の元素からなるものに限られるものでなく、ＩｎＧａＰなどのように３以上の元素からなるものであってもよい。
【００２３】
一方、上記II−VI族、III−V族およびIV−VI族の無機半導体などの半導体は、シェル材１０２を構成する材質としても用いることができるが、この場合、半導体ナノ粒子集積体１０１を構成するいかなる半導体に対しても、より大きなバンドギャップを有する半導体を、シェル材１０２を構成する材質として採用することが好ましい。
・半導体ナノ粒子集積体
本発明のシェル材被覆半導体ナノ粒子集積体１００を構成する半導体ナノ粒子集積体１０１は、複数の半導体ナノ粒子１１０を集積してなるものである。具体的には、図１（ａ）に示すように、複数の半導体ナノ粒子１１０がシェル材１２０によって集積した構造を有している。つまり、本発明のシェル材被覆半導体ナノ粒子集積体１００を構成する半導体ナノ粒子集積体１０１自体は、図１（ｂ）に示されるような従来の半導体ナノ粒子集積体と同様の構造を有している。
【００２４】
この半導体ナノ粒子集積体１０１は、図１（ｂ）に示されるような従来の半導体ナノ粒子集積体２００と同様、蛍光体として機能する。
なお、本明細書において、「半導体ナノ粒子集積体」とは、複数の半導体ナノ粒子が相互に接触した状態で集まった集合体を含有してなる粒子のことをいう。
【００２５】
半導体ナノ粒子
本発明において、半導体ナノ粒子集積体１０１を構成する半導体ナノ粒子１１０は、本発明のシェル材被覆半導体ナノ粒子集積体１００において、外部から与えられたエネルギーを受けて励起し、励起状態から基底状態に戻る過程で蛍光を発する役割を有する。
【００２６】
本発明において、半導体ナノ粒子１１０は、上記「半導体」の項で上述した半導体を含んでおり、このような半導体として、特に、ＣｄＳｅ、ＩｎＰがより好ましく用いられる。
【００２７】
半導体ナノ粒子１１０を構成する半導体は、１種単独であってもよく、あるいは、２種以上を組み合わせたものであってもよい。ここで、半導体ナノ粒子１１０として２種以上の半導体を用いる場合、１種単独の半導体からなる半導体ナノ粒子を２種以上組み合わせて半導体ナノ粒子１１０として用いてもよく、２種以上の混合物からなる１種類の半導体ナノ粒子を半導体ナノ粒子１１０として用いてもよく、あるいは、２種以上の混合物からなる半導体ナノ粒子を２種以上組み合わせたものを半導体ナノ粒子１１０として用いてもよい。
【００２８】
また、半導体ナノ粒子１１０は、全体として均一な構造を有していてもよいし、構成成分の組成が異なる２以上の構造を有していてもよいし、あるいは、構成成分の組成が位置によって連続的に変化する構造を有していてもよい。本発明においては、発光効率の高い点から、半導体ナノ粒子１１０がコア／シェル構造を有することが特に好ましい。すなわち、本発明の好適な態様において、半導体ナノ粒子１１０は、図１（ａ）に示すように、コア１１１と、該コア１１１を被覆する内部シェル１１２とからなるコアシェル半導体ナノ粒子である。この場合、コア１１１の平均粒径が０．５〜１５ｎｍであることが好ましい。このようなコアシェル半導体ナノ粒子を２種以上組み合わせたものを半導体ナノ粒子１１０として用いうることはいうまでもない。
【００２９】
また、粒径によっても発光波長が変わるという半導体ナノ粒子の性質に着目すると、２種以上の発光波長を有するシェル材被覆半導体ナノ粒子集積体１００を得るために、構成成分が同じで粒径のみが異なる２種以上の半導体ナノ粒子を、半導体ナノ粒子１１０として用いることもできる。
【００３０】
ただ、いずれの場合にも、半導体ナノ粒子１１０を構成する半導体は、本発明のシェル材被覆半導体ナノ粒子集積体１００を構成するそれ以外の部分を構成するいかなる半導体に対しても、同等またはそれより小さいバンドギャップエネルギーを有することが好ましく、少なくとも、シェル材１０２を構成する材質よりも小さいバンドギャップエネルギーを有することが好ましい。
【００３１】
また、半導体ナノ粒子１１０は、合成過程で用いうる安定剤、界面活性剤、溶媒など、蛍光体としての構成半導体の機能を損なわないその他の成分を含んでいてもよい。
ここで、半導体ナノ体粒子１１０の平均粒径は、半導体ナノ粒子集積体１０１としての粒径がナノサイズ（１〜１０００ｎｍ）におさまるよう、１〜２０ｎｍであることが好ましい。
マトリクス部分
本発明において、半導体ナノ粒子集積体１０１は、複数個の上記半導体ナノ粒子１１０がそれ自体で互いに凝集しあうことにより集積されてなる集積体であってもよいが、半導体ナノ粒子集積体１０１における半導体ナノ粒子１１０同士の結合をより強固にする上では、複数個の半導体ナノ粒子１１０がマトリクス部分１２０を介して互いに結着することにより集積されてなる集積体であることが好ましい。
【００３２】
本発明では、このマトリクス部分１２０が、上記半導体ナノ粒子１１０を構成するいかなる半導体に対しても、同等またはより大きなバンドギャップエネルギーを有する半導体からなることが好ましい。言い換えると、本発明では、半導体ナノ粒子集積体１０１が、上記半導体ナノ粒子１１０を構成するいかなる半導体に対しても、同等またはより大きなバンドギャップエネルギーを有する半導体からなるマトリクス部分をさらに含有することが好ましい。かかる場合、マトリクス部分１２０に届いた外部からのエネルギーが、半導体ナノ粒子１１０に移行しやすくなり、半導体ナノ粒子１１０から発せられる蛍光の発光強度を大きくすることができるからである。ここで、マトリクス部分１２０を構成しうる具体的な半導体として、上記「半導体」の項で上述した各種半導体が挙げられる。
【００３３】
ここで、マトリクス部分１２０を構成しうる半導体は、上記半導体ナノ粒子１１０を構成する半導体と同じ成分組成を有してもよいし、上記半導体ナノ粒子１１０を構成する半導体とは異なる成分組成を有してもよい。例えば、半導体ナノ粒子１１０を構成する半導体としてＣｄＳを用い、シェル材１０２を構成する半導体としてＺｎＳを用いる場合に、マトリクス部分１２０を構成する半導体としてＣｄxＺｎ(1-x)Ｓ（ｘは０より大きく１より小さい。例えば、０．５）で示される複合半導体を用いることもできる。
【００３４】
本発明では、マトリクス部分１２０を構成する材質として上記半導体以外の材質を用いることを妨げるものではないが、従来公知の半導体ナノ粒子集積体を得るために多用されるシリカ、ポリスチレンポリマーなどバンドギャップが非常に大きい材質を用いると、シェル材１０２を構成する材質よりバンドギャップが大きくなる場合があり、シェル材１０２による被覆を行っても可視光から近赤外領域において蛍光発光の増強効果が得られないことがある。
【００３５】
また、マトリクス部分１２０についても、上記半導体ナノ粒子１１０と同様、合成過程で用いうる安定剤、界面活性剤、溶媒などその他の成分を含んでいてもよい。
本発明においては、複数の半導体ナノ粒子１１０を集積してなる半導体ナノ粒子集積体１０１は、通常ナノサイズ（１〜１０００ｎｍ）、好ましくは５〜１０００ｎｍ、より好ましくは５０〜５００ｎｍの平均粒径を有する。なお、本明細書において、「平均粒径」というときは、特に別の記載がない限り体積平均粒径を意味する。
【００３６】
また、本発明において、半導体ナノ粒子集積体１０１に内包される半導体ナノ粒子１１０の内包数については、特に限定はされないものの、多ければ多いほどよく、例えば粒径が１００ｎｍの半導体ナノ粒子集積体では、内包数１００以上が好ましい。
・シェル材
本発明のシェル材被覆半導体ナノ粒子集積体１００を構成するシェル材１０２は、前記半導体ナノ粒子集積体１０１を被覆するものである。このシェル材１０２は、外部から与えられた励起エネルギーを閉じ込めて、半導体ナノ粒子集積体１０１の内部に送り込む役割を有している。したがって、本発明では、シェル材１０２が、半導体ナノ粒子集積体１０１を構成するいかなる半導体に対しても、より大きいバンドギャップを有する材質からなることが好ましい。本発明の好適な態様では、シェル材被覆半導体ナノ粒子集積体１００において、バンドギャップが、シェル材１０２、マトリクス部分１２０、半導体ナノ粒子１１０の順に次第に小さくなっている。
【００３７】
ここで、本発明においては、シェル材１０２が、半導体ナノ粒子集積体１０１を構成するいかなる半導体に対しても、より大きいバンドギャップを有する半導体からなることが特に好ましい。ここで、シェル材１０２を構成しうる具体的な半導体として、上記「半導体」の項で上述した各種半導体が挙げられるが、バンドギャップの大きな半導体が好ましい。とりわけ、可視〜近赤外光領域で発光を生じない半導体が好ましく、可視光領域で発光しにくいＺｎＳが特に好ましい。
【００３８】
ただ、本発明においては、シェル材１０２を構成する半導体は、半導体ナノ粒子集積体１０１を構成するいかなる半導体に対しても大きいバンドギャップを有する半導体からなるものである限り、マトリクス部分１２０を構成する半導体および半導体ナノ粒子１１０を構成する半導体と共通の元素を含むものであってもよい。また、シェル材１０２を構成する半導体が、マトリクス部分１２０を構成する半導体との関係で成分組成のみが異なるものであってもよい。
【００３９】
ここで、本発明のシェル材被覆半導体ナノ粒子集積体１００において、
半導体ナノ粒子１１０の全体または内部シェル１１２を構成する半導体が、ＭＸなる組成を有し（ここで、ＭはII族、III族またはIV族の元素であり、ＸはV族またはVI族の元素である。）、
シェル材１０２を構成する半導体が、前記元素Ｍとは異なるII族、III族またはIV族の元素Ｍ'と前記元素Ｘを含み、
マトリクス部分１２０を構成する半導体が、ＭxＭ’(1-x)Ｘ（ここで、０＜ｘ＜１）の組成を有する複合半導体からなる
場合について見ると、前記シェル材１０２を構成する半導体は、Ｍ'Ｘなる組成を有する半導体であってもよいし、あるいは、ＭyＭ’(1-y)Ｘ（ここで、０＜ｙ＜ｘ＜１）なる組成を有する複合半導体であってもよい。
【００４０】
より具体的な例を示すと、本発明のシェル材被覆半導体ナノ粒子集積体１００において、
半導体ナノ粒子１１０の全体または内部シェル１１２を構成する半導体がＣｄＳからなり、
シェル材１０２を構成する半導体が、ＺｎとＳを含み、
マトリクス部分１２０を構成する半導体が、ＣｄxＺｎ(1-x)Ｓ（ここで、０＜ｘ＜１）の組成を有する複合半導体からなる
場合では、前記シェル材１０２を構成する半導体は、ＺｎＳであってもよいし、あるいは、ＣｄyＺｎ(1-y)Ｓ（ここで、０＜ｙ＜ｘ＜１）なる組成を有する複合半導体であってもよい。
【００４１】
本発明では、シェル材１０２を構成する材質として上記半導体以外の材質を用いることを妨げるものではない。ただ、ガラスなどシリカ系の材質でシェル材１０２を構成する場合、おそらく半導体ナノ粒子集積体１０１を構成する半導体の結晶格子構造に歪みを与える等の何らかの原因により、内部にある本発明の蛍光増強効果が充分に得られない場合がある。
【００４２】
本発明のシェル材被覆半導体ナノ粒子集積体１００においては、シェル材１０２による被覆を有した状態での平均粒径が、６〜１１００ｎｍであることが好ましい。
≪シェル材被覆半導体ナノ粒子集積体の製造方法≫
本発明に係るシェル材被覆半導体ナノ粒子集積体１００は、特にその製造方法には制限はないものの、通常、半導体ナノ粒子集積体１０１を製造してから、シェル材１０２による被覆を施すことによって得ることができる。半導体ナノ粒子集積体１０１の製造およびシェル材１０２による被覆は、いずれも従来公知の手法を用いて行うことができる。
・半導体ナノ粒子集積体１０１の製造方法
本発明に係るシェル材被覆半導体ナノ粒子集積体１００を構成する半導体ナノ粒子集積体１０１は、従来公知の方法を用いて製造することができる。
【００４３】
具体的な方法として、液相法および気相法を挙げることができる。
液相法
本発明では、半導体ナノ粒子１１０の製造方法として、液相法を好適に用いることができる。液相法では、半導体ナノ粒子１１０を構成する各半導体は、対応半導体前駆体を適当な溶媒中で化学反応させることにより得られる。液相法に基づく製造方法としては、沈殿法、共沈法、ゾル−ゲル法、均一沈殿法、還元法などがある。そのほかに、逆ミセル法、超臨界水熱合成法、などもナノ粒子を作製する上で優れた方法である（例えば、特開２００２−３２２４６８号、特開２００５−２３９７７５号、特開平１０−３１０７７０号、特開２０００−１０４０５８号公報等を参照。）。
【００４４】
ここで、液相法により、半導体ナノ粒子集積体１０１を製造する場合において、半導体前駆体を還元反応により還元する工程を有していてもよい。
また、液相法による反応に際しては、半導体前駆体の反応を界面活性剤の存在下で行う工程を有する態様が好ましい。また、形成した半導体ナノ粒子１１０（、および、該当する場合には、コア１１１）が反応過程で不用意に凝集しないよう、トリ−ｎ−オクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）などの安定剤の存在下で行う工程を有する態様が好ましい。なお、本発明で用いられる半導体前駆体は、上記の半導体材料として用いられる元素を含む化合物であり、たとえば半導体がＳｉの場合、半導体前駆体としてはＳｉＣｌ4などが挙げられる。その他半導体前駆体としては、ＩｎＣｌ3、Ｐ（ＳｉＭｅ3）3、ＺｎＭｅ2、ＣｄＭｅ2、ＧｅＣｌ4、トリブチルホスフィンセレンなどが挙げられる。
【００４５】
半導体前駆体から所要の半導体に導く際の反応温度としては、半導体前駆体の沸点以上かつ溶媒の沸点以下であれば、特に制限はないが、７０〜１１０℃の範囲が好ましい。
〈還元剤〉
半導体前駆体を還元する還元剤としては、従来周知の種々の還元剤を反応条件に応じて選択し用いることができる。本発明においては、還元力の強さの観点から、水素化アルミニウムリチウム（ＬｉＡｌＨ4）、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ4）、水素化ビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウムナトリウム、水素化トリ（ｓｅｃ−ブチル）ホウ素リチウム（ＬｉＢＨ（ｓｅｃ−Ｃ4Ｈ9）3）及び水素化トリ（ｓｅｃ−ブチル）ホウ素カリウム、水素化トリエチルホウ素リチウムなどの還元剤が好ましい。特に、還元力の強さから水素化アルミニウムリチウム（ＬｉＡｌＨ4）が好ましい。
【００４６】
〈溶媒〉
半導体前駆体の分散用溶媒としては、従来周知の種々の溶媒を使用できるが、エチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、ｔ−ブチルアルコール等のアルコール類、トルエン、デカン、ヘキサンなどの炭化水素類溶媒を使用することが好ましい。本発明においては、特に、トルエン等の疎水性の溶媒が分散用溶媒として好ましい。
【００４７】
〈界面活性剤〉
界面活性剤としては、従来周知の種々の界面活性剤を使用でき、陰イオン、非イオン、陽イオン、両性界面活性剤が含まれる。なかでも第四級アンモニウム塩系である、テトラブチルアンモニウムクロリド、ブロミド又はヘキサフルオロホスフェート、テトラオクチルアンモニウムブロミド（ＴＯＡＢ）、またはトリブチルヘキサデシルホスホニウムブロミドが好ましい。特に、テトラオクチルアンモニウムブロミドが好ましい。
【００４８】
なお、液相法による反応は、液中の溶媒を含む化合物の状態により大きく変化する。単分散性の優れたナノサイズの粒子を製造する際には、特に注意を要する必要がある。例えば、逆ミセル反応法では、界面活性剤の濃度や種類により、反応場となる逆ミセルの大きさや状態が変わってくるため、ナノ粒子が形成される条件が限られてしまう。したがって、界面活性剤と溶媒とを適切に組み合わせることが必要となる。
【００４９】
気相法
本発明では、半導体ナノ粒子１１０の製造方法として、気相法を用いてもよい。気相法による製造方法としては、（１）対向する原料半導体を電極間で発生させた第一の高温プラズマによって蒸発させ、減圧雰囲気中において無電極放電で発生させた第二の高温プラズマ中に通過させる方法（例えば特開平６−２７９０１５号公報参照。）、（２）電気化学的エッチングによって、原料半導体からなる陽極からナノ粒子を分離・除去する方法（例えば特表２００３−５１５４５９号公報参照。）、（３）レーザーアブレーション法（例えば特開２００４−３５６１６３号参照。）、（４）高速スパッタリング法（例えば特開２００４−２９６７８１号参照。）などが用いられる。また、原料ガスを低圧状態で気相反応させて、粒子を含む粉末を合成する方法も、好ましく用いられる。
【００５０】
半導体ナノ粒子集積体１０１の形成
本発明では、上記液相法または気相法などの方法により半導体ナノ粒子１１０を製造した後に、得られた半導体ナノ粒子１１０を適当な方法により集積させることにより半導体ナノ粒子集積体１０１を得ることができる。このとき、複数の半導体ナノ粒子１１０が相互に接触した状態で集まった集合体を、マトリクス部分１２０の構築を行うことなくそのまま半導体ナノ粒子集積体１０１として用いてもよいが、より強固な集積体を得る観点からは、半導体ナノ粒子１１０を適当な方法によって凝集させて一旦集積体前駆体（複数の半導体ナノ粒子が相互に接触した状態で集まった集合体）とし、これに対して、上記液相法などの方法によってマトリクス部分１２０の形成を行うことが好ましい。
【００５１】
本発明に係る半導体ナノ粒子の集積体前駆体は、半導体ナノ粒子形成過程、又は形成後の分散過程において、半導体ナノ粒子及びその材料を殆ど溶解しない貧溶媒を使用することにより形成することができる。
【００５２】
ここで、貧溶媒としては、例えば、アルコール類（メタノール、エタノール、プロパノール等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）を用いることができる。
・シェル材１０２の製造方法
また、本発明に係るシェル材被覆半導体ナノ粒子集積体１００を構成するシェル材１０２についても、従来公知の方法を用いることができる。ここで、半導体から構成されるシェル材１０２を製造するにあたっては、上記半導体ナノ粒子集積体１０１の製造方法と同様の方法を用いることができる。
〔本発明に係るシェル材被覆半導体ナノ粒子集積体の応用〕
以下において、代表的な応用例について説明する。
【００５３】
・生体物質標識剤とバイオイメージング
本発明のシェル材被覆半導体ナノ粒子集積体１００は、特にその用途に制限があるわけではないものの、生体物質標識剤の用途に好適に用いることができる。本発明に係る生体物質標識剤は、シェル剤被覆半導体ナノ粒子集積体１００が、有機分子を介して分子標識物質と結合した構造を有している。ここで、標的（追跡）物質を有する生細胞もしくは生体に、本発明に係る生体物質標識剤を添加することで、標的物質と結合もしくは吸着し、当該結合体もしくは吸着体に所定の波長の励起光を照射し、当該励起光に応じて蛍光半導体微粒子から発生する所定の波長の蛍光を検出することにより、上記標的（追跡）物質の蛍光動態イメージングを行うことができる。
【００５４】
すなわち、本発明に係る生体物質標識剤は、バイオイメージング法（生体物質を構成する生体分子やその動的現象を可視化する技術手段）に利用することができる。
シェル材被覆半導体ナノ粒子集積体の親水化処理
上述したシェル材被覆半導体ナノ粒子集積体１００表面は、未だ表面処理を行っていない状態では、一般的には、疎水性であるため、例えば生体物質標識剤として使用する場合は、このままでは水分散性が悪く、半導体ナノ粒子集積体が凝集してしまう等の問題がある。そのため、シェル材被覆半導体ナノ粒子集積体１００の表面に親水化処理を行って、親水化半導体ナノ粒子集積体とすることが好ましい。
【００５５】
親水化処理の方法としては例えば、表面に付着した親油性成分をピリジン等で除去した後に、シェル材被覆半導体ナノ粒子集積体１００表面に表面修飾剤を化学的および／または物理的に結合させる方法がある。表面修飾剤としては、親水基として、カルボキシル基・アミノ基を持つものが好ましく用いられ、具体的にはメルカプトプロピオン酸、メルカプトウンデカン酸、アミノプロパンチオールなどがあげられる。具体的には、例えば、Ｇｅ／ＧｅＯ2型ナノ粒子１０-5ｇをメルカプトウンデカン酸０．２ｇが溶解した純水１０ｍｌ中に分散させて、４０℃、１０分間攪拌し、シェルの表面を処理することで無機ナノ粒子のシェルの表面をカルボキシル基で修飾することができる。
【００５６】
〔生体物質標識剤〕
本発明に係る生体物質標識剤は、上述したように得られた親水化半導体ナノ粒子集積体と、分子標識物質と有機分子を介して結合させて得られる。
【００５７】
分子標識物質
本発明に係る生体物質標識剤は分子標識物質が目的とする生体物質と特異的に結合および／または反応することにより、生体物質の標識が可能となる。
【００５８】
当該分子標識物質としては、例えば、ヌクレオチド鎖、抗体、抗原、糖鎖及びシクロデキストリン等が挙げられる。ここで、分子標識物質としてトラスツズマブなどの抗体医薬を用いる場合、本発明に係る生体物質標識剤は、このような抗体医薬が認識するHER2などのガンマーカーが組織切片などに存在するかどうかを確認するための組織染色に用いることができる。
【００５９】
有機分子
本発明に係る生体物質標識剤は、親水化半導体ナノ粒子集積体と、分子標識物質とが有機分子により結合されていることが好ましい。当該有機分子としては半導体ナノ粒子集積体と分子標識物質とを結合できる有機分子であれば特に制限はないが、例えば、タンパク質中でも、アルブミン、ミオグロビンおよびカゼイン等、またタンパク質の一種であるアビジンをビオチンと共に用いることも好適に用いられる。上記結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着および化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合などの結合力の強い結合が好ましい。
【００６０】
具体的には、シェル材被覆半導体ナノ粒子集積体１００をメルカプトウンデカン酸で親水化処理した場合は、有機分子としてアビジンおよびビオチンを用いることができる。この場合上記親水化半導体ナノ粒子集積体のカルボキシル基はアビジンと好適に共有結合し、アビジンがさらにビオチンと選択的に結合し、ビオチンがさらに分子標識物質と結合することにより生体物質標識剤となる。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
［各種測定方法］
・粒径の測定方法
本願において、コアシェル構造を持つ半導体ナノ粒子及び半導体ナノ粒子集積体の粒径（体積平均粒径）は、動的光散乱法による粒径測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓ）を用いて、半導体ナノ粒子又は集積体作製直後（凝集前）の粒径分布を測定することにより求めた。なお、平均粒径（体積平均粒径）は、粒径分布のピーク（中心）位置の粒径とした。
【００６２】
・各集積体への半導体ナノ粒子の内包数の算出方法
また、半導体ナノ粒子集積体、および、シェル材被覆半導体ナノ粒子集積体に内包される半導体ナノ粒子の計算は以下のようにして行った。
【００６３】
まず、半導体ナノ粒子の元素比を、シーケンシャル形高周波プラズマ発光分析装置（ＩＣＰＳ−７５００  島津製作所製）を用いて計測する。その後、再シェリングされた半導体ナノ粒子集積体の元素比を上記高周波プラズマ発光分析装置（ＩＣＰ−ＡＥＳ）で計測することにより、再シェリングに用いられた濃度を計算する。半導体ナノ粒子、半導体ナノ粒子集積体の密度は既知であるので、上記動的光散乱法で計算した平均粒径と合わせて内包数を見積もることが可能である。内包数は多ければ多いほど好ましく、例えば粒径が１００ｎｍの半導体ナノ粒子集積体では、内包数１００以上が好ましい。
【００６４】
［調製例１−１：ＣｄＳｅ半導体ナノ粒子の合成］
ＣｄＳｅ半導体ナノ粒子１の合成は以下のように行った。
Ａｒ気流下、トリ−ｎ−オクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）７．５ｇに、ステアリン酸２．９ｇ、ｎ−テトラデシルホスホン酸６２０ｍｇ、及び、酸化カドミウム２５０ｍｇを加え、３７０℃に加熱混合した。これを２７０℃まで放冷させた後、トリブチルフォスフィン２．５ｍｌにセレン２００ｍｇを溶解させた溶液を加えることによって、ＣｄＳｅ混合液を得た。そして、このＣｄＳｅ混合液に貧溶媒であるアセトンを加えて沈殿を生じさせ、上澄みを除去し減圧乾燥したところ、ＴＯＰＯで被覆されたＣｄＳｅ半導体ナノ粒子１を得た。
【００６５】
［調製例１−２：ＣｄＳｅ半導体ナノ粒子集積体の合成］
ＣｄＳｅ半導体ナノ粒子集積体２は次のような手順で作製した。
まず、上記調製例１−１で得られたＣｄＳｅ混合液を放冷し、室温まで冷却した後に貧溶媒であるエタノールをＣｄＳｅ半導体ナノ粒子１の１０倍モル量加えて沈殿を生じさせ、上澄みを除去することでＣｄＳｅ半導体ナノ粒子集積体前駆体２２を得た。次にこのＣｄＳｅ半導体ナノ粒子集積体前駆体２２にオクタデセン２ｍｌを加え、溶媒をオクタデセンに再置換した。その際、ＣｄＳｅ半導体ナノ粒子集積体前駆体２２は、個々のＣｄＳｅ半導体ナノ粒子１に再分散することなく、オクタデセン添加前の形態、粒子径を維持したままであった。このＣｄＳｅ半導体ナノ粒子集積前駆体２２のオクタデセン混合液を窒素雰囲気中で、８０℃に加熱し、酢酸カドミウムと酢酸亜鉛とドデカンチオールを、原料ＣｄＳｅ半導体ナノ粒子１の１ｍｇに対して１００ｍｇずつ添加し、その後、８０℃から２３０℃に昇温し、３０分反応させることでＣｄＳｅ半導体ナノ粒子集積体２の混合液を得た。
【００６６】
すなわち、このＣｄＳｅ半導体ナノ粒子集積体２は、ＣｄＳｅ半導体ナノ粒子１を、ＣｄxＺｎ(1-x)Ｓからなるマトリクスで集積してなるものである。
［実施例１：シェル材被覆ＣｄＳｅ半導体ナノ粒子集積体３の合成］
ＣｄＳｅ半導体ナノ粒子集積体２をＺｎＳシェルで被覆してなるシェル材被覆ＣｄＳｅ半導体ナノ粒子集積体の合成を、以下の手順に従って行った。
【００６７】
上記調製例１−２で得られたＣｄＳｅ半導体ナノ粒子集積体２の混合液を三つ口フラスコに移し、８０℃に加熱し、ステアリン酸亜鉛および硫黄を加えた（量はＺｎ／Ｓ＝１でＣｄＳｅ半導体ナノ粒子集積体の１０倍モル量のＺｎＳとなるように加えた）。そして、得られる混合物を８０℃から２３０℃に昇温し、その後２３０℃で３０分間反応させたところ、シェル材被覆ＣｄＳｅ半導体ナノ粒子集積体３の混合液を得た。
【００６８】
［調製例２−１：ＣｄＳｅ／ＣｄＳコアシェル半導体ナノ粒子の合成］
上記調製例１−１で得られたＣｄＳｅ半導体ナノ粒子１  １５０ｍｇに、ＴＯＰＯ１５ｇを加えて加熱し、引き続き２７０℃でトリオクチルホスフィン１０ｍｌに酢酸カドミウム１．１ｇとトリオクチルホスフィンスルフィド１．１ｇを溶解した溶液を加えたところ、ＣｄＳｅ／ＣｄＳコアシェル半導体ナノ粒子４の混合液を得た。
【００６９】
［調製例２−２：ＣｄＳｅ／ＣｄＳコアシェル半導体ナノ粒子集積体の合成］
ＣｄＳｅ／ＣｄＳコアシェル半導体ナノ粒子集積体５は次のような手順で作製した。まず、上記調製例２−１で得られたＣｄＳｅ／ＣｄＳコア／シェル半導体ナノ粒子４の混合液を放冷し、室温まで冷却した後に貧溶媒であるエタノールをＣｄＳｅ／ＣｄＳコアシェル半導体ナノ粒子４の１０倍モル量加えて沈殿を生じさせ、上澄みを除去することでＣｄＳｅ／ＣｄＳコアシェル半導体ナノ粒子集積体前駆体５５を得た。次にこのＣｄＳｅ／ＣｄＳコアシェル半導体ナノ粒子集積体前駆体５５にオクタデセンを加え、溶媒をオクタデセンに再置換した。その際、ＣｄＳｅ／ＣｄＳコアシェル半導体ナノ粒子集積体前駆体５５は、個々のＣｄＳｅ／ＺｎＳコア／シェル半導体ナノ粒子４に再分散することなく、オクタデセン添加前の形態、粒子径を維持したままであった。このＣｄＳｅ／ＣｄＳコアシェル半導体ナノ粒子集積前駆体５５のオクタデセン混合液を窒素雰囲気中で、８０℃に加熱し、酢酸カドミウムと酢酸亜鉛とドデカンチオールを、原料ＣｄＳｅ／ＣｄＳコアシェル半導体ナノ粒子４の１ｍｇに対して１００ｍｇずつ添加し、その後、８０℃から２３０℃に昇温し、３０分反応させることでＣｄＳｅ／ＣｄＳコアシェル半導体ナノ粒子集積体５の混合液を得た。
【００７０】
すなわち、このＣｄＳｅ／ＣｄＳコアシェル半導体ナノ粒子集積体５は、ＣｄＳｅ／ＣｄＳコアシェル半導体ナノ粒子４を、ＣｄxＺｎ(1-x)Ｓからなるマトリクスで集積してなるものである。
【００７１】
［実施例２：シェル材被覆ＣｄＳｅ／ＣｄＳコアシェル半導体ナノ粒子集積体６の合成］
ＣｄＳｅ／ＣｄＳコアシェル半導体ナノ粒子集積体５をＺｎＳシェルで被覆してなるシェル材被覆ＣｄＳｅ／ＣｄＳコアシェル半導体ナノ粒子集積体６の合成を、以下の手順に従って行った。
【００７２】
上記調製例２−２で得られたＣｄＳｅ／ＣｄＳコアシェル半導体ナノ粒子集積体５を三つ口フラスコに移し、８０℃に加熱し、ステアリン酸亜鉛および硫黄を加えた（量はＺｎ／Ｓ＝１でＣｄＳｅ半導体ナノ粒子集積体の１０倍モル量のＺｎＳとなるように加えた）。そして、得られる混合物を８０℃から２３０℃に昇温し、その後２３０℃で３０分間反応させたところ、シェル材被覆ＣｄＳｅ／ＣｄＳコアシェル半導体ナノ粒子集積体６の混合液を得た。
【００７３】
［比較例１：ＣｄＳｅ／ＺｎＳコアシェル半導体ナノ粒子含有シリカ粒子］
比較例として、特開２００５−２８１０１９号公報記載の実施例１に従い、シリカマトリクス中にＣｄＳｅ／ＺｎＳコアシェル半導体ナノ粒子１０が存在する半導体ナノ粒子集積体１３を作製した。
【００７４】
ＣｄＳｅ／ＺｎＳコアシェル半導体ナノ粒子分散液を２５℃、ｐＨ＝１０の条件下、界面活性剤としてチオグリコール酸を加えることにより水溶化した。その後、疎水性有機溶媒としてのイソオクタン（２，２，４−トリメチルペンタン）２５ｍｌに、逆ミセル（逆マイクロエマルジョン）を形成させるために必要な界面活性剤ビス（２−エチルヘキシル）スルホこはく酸ナトリウム（エーロゾルＯＴ）（「ＡＯＴ」とも表記する。）１．１１１５ｇを溶解し、次に、この溶液を撹拌しながら、水０．７４ｍｌと、上記の水溶化ＣｄＳｅ／ＺｎＳコアシェル半導体ナノ粒子溶液０．３ｍｌ加えて溶解した。次に、この溶液を撹拌しながら、ゾル−ゲルガラスの前駆体として、アルコキシドであるテトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）０．３９９ｍｌ、および、有機アルコキシシランである３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ）０．０７９ｍｌを加えた。
【００７５】
この分散液を２日間撹拌することによりシリカマトリクス中にＣｄＳｅ／ＺｎＳコアシェル半導体ナノ粒子が存在する半導体ナノ粒子集積体７とした。
［結果］
以上で得た各種半導体ナノ粒子集積体についての内容と輝度測定の結果をまとめて表１、図１、図２に示す。ここで、上記実施例１で得られたシェル材被覆ＣｄＳｅ半導体ナノ粒子集積体３および上記実施例２で得られたシェル材被覆ＣｄＳｅ／ＣｄＳコアシェル半導体ナノ粒子集積体６は、半導体ナノ粒子集積体１０１が、ＺｎＳかなるシェル材１０２によって被覆された構造を有している一方で、上記調製例１−２で得られたＣｄＳｅ半導体ナノ粒子集積体２および上記調製例２−２で得られたＣｄＳｅ／ＣｄＳコアシェル半導体ナノ粒子集積体５は、シェル材１０２による被覆を有さない構造を有している。例えば、シェル材被覆ＣｄＳｅ／ＣｄＳコアシェル半導体ナノ粒子集積体６およびＣｄＳｅ／ＣｄＳコアシェル半導体ナノ粒子集積体５は、それぞれ、図１（ａ）および図１（ｂ）に示すような構造を有している。そして、ＣｄＳｅ半導体ナノ粒子集積体２、およびＣｄＳｅ／ＣｄＳコアシェル半導体ナノ粒子集積体５は、ＣｄＳとＺｎＳとからなるマトリクス部分１２０によって、上記調製例１で得られたＣｄＳｅ半導体ナノ粒子１および上記調製例３で得られたＣｄＳｅ／ＣｄＳコアシェル半導体ナノ粒子４を半導体ナノ粒子１１０としてそれぞれ集積した構造を有している。
【００７６】
【表１】
0005761102.tif 000002
ここで、輝度測定は、光源として１４６ｎｍの真空紫外線ランプ（ウシオ社製）を使用し、真空チャンバー内にサンプルをセットし、真空度１．３３×１０Ｐａにて一定距離から照射し励起発光を輝度計で測定することによって行った。輝度の値については調製例２−１のＣｄＳｅ／ＺｎＳコアシェル半導体ナノ粒子４における輝度を３としたときの相対値で示した。得られた粒子及び集積体における結果は、表１の「発光強度」に示してある。
【００７７】
また、半導体ナノ粒子及び半導体ナノ粒子集積体の粒径（体積平均粒径）は、動的光散乱法による粒径測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓ）を用いて、半導体ナノ粒子又は集積体作製直後（凝集前）の粒径分布を測定することにより求めた。なお、平均粒径（体積平均粒径）は、粒径分布のピーク（中心）位置の粒径とした。
【００７８】
また、半導体ナノ粒子の内包数の計算は以下のようにして行った。
まず、半導体ナノ粒子の元素比を、シーケンシャル形高周波プラズマ発光分析装置（ＩＣＰＳ−７５００  島津製作所製）を用いて計測した。その後、再シェリングされた半導体ナノ粒子集積体の元素比を上記高周波プラズマ発光分析装置（ＩＣＰ−ＡＥＳ）で計測することにより、再シェリングに用いられた濃度を計算した。半導体ナノ粒子、再シェリング化合物の密度は既知であるので、上記動的光散乱法で計算した平均粒径と合わせて内包数を見積もった。
【符号の説明】
【００７９】
１００・・・シェル材被覆半導体ナノ粒子集積体
１０１・・・半導体ナノ粒子集積体
１０２・・・シェル材
１１０・・・半導体ナノ粒子
１１１・・・コア
１１２・・・内部シェル
１２０・・・マトリクス部分
２００・・・従来の半導体ナノ粒子集積体
【図１】
0005761102.tif 000003
【図２】
0005761102.tif 000004