(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｉ）のアミノ酸配列を、Ｎ末端から順に有することを特徴とするカルシウムセンサー蛋白質：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の５番目から１０番目に存在するＨｉｓの数が５であるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号６で示されるアミノ酸配列； 
（ｃ）配列番号７で示されるアミノ酸配列； 
（ｄ）前述の（ｃ）の配列と後述の（ｅ）の配列とを連結するＬｅｕ−Ｇｌｕのアミノ酸配列（リンカーＹ）；
（ｅ）配列番号３で示される配列の１５０番目〜２３９番目であって、１５４番目のアミノ酸がＬｙｓに置換され、２０４番目のアミノ酸がＶａｌに置換され、２０６番目のアミノ酸がＡｓｎに置換されているアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号８で示されるアミノ酸配列；
（ｇ）配列番号３で示される配列の１番目〜１４５番目までのアミノ酸配列であって、１０６番目のアミノ酸がＴｙｒに置換され、１２５番目のアミノ酸がＶａｌに置換されているアミノ酸配列；
（ｈ）前述の（ｇ）の配列と後述の（ｉ）の配列とを連結するＴｈｒ−Ａｒｇのアミノ酸配列（リンカーＺ）； 
（ｉ）配列番号９で示される配列の２番目〜１４８番目までのアミノ酸配列であって、３６番目のアミノ酸がＬｅｕに置換され、６０番目のアミノ酸がＡｓｐに置換され、７８番目のアミノ酸がＴｙｒに置換されているアミノ酸配列；
【請求項２】
前記請求項１に記載の蛋白質をコードするカルシウムセンサー遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定部位のアミノ酸を置換した緑色蛍光蛋白質（以下、ＧＦＰ）、又はそのホモログを用いたカルシウムセンサー蛋白質に関する。より具体的には、従来のＧＦＰ又はそのホモログを用いたカルシウムセンサー蛋白質よりも更に感度、反応量の優れたカルシウムセンサー蛋白質、及び前記カルシウムセンサー蛋白質をコードするカルシウムセンサー遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
カルシウムは生体にとって、構造の維持に必須である骨の主要な構成成分であると同時に、筋肉の収縮、神経興奮性やホルモン分泌、酵素活性の変化などの各種の細胞機能の調節因子として、生体機能の維持及び調節に不可欠な役割を担っている。このため、生体内（細胞外及び細胞内）のカルシウム変動を探知し、カルシウム濃度を測定するのに用いられるカルシウムセンサーの重要性が高まっている。
カルシウムセンサーは大きく分けて4種類のものがこれまでに開発されている。以下にその概要を示す。
【０００３】
１）カルシウム感受性の合成色素：カルシウムに感受性のある化学合成された色素であり、現在一般によく使用されている。細胞内において使用する場合は、外部から細胞に取り込ませる必要があるが、特定の細胞のみに色素を取り込ませることは難しく、ガラス針等により細胞に該色素を注入しなければならないという問題点を有する。
【０００４】
２）エクオリン：カルシウムに反応して発光する蛋白質であり、細胞に直接注入するか、該蛋白質を産生する遺伝子を細胞に導入して使用する。細胞内で機能するためには細胞に補酵素を供給する必要があり、また発光が極めて微弱であるという問題点を有する。
【０００５】
３）蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を応用したカルシウム感受性蛋白質：カルシウムに感受性のあるカルモジュリン（ＣａＭ）とそれに結合するミオシン軽鎖キナーゼの一部の配列、二つの色の異なるＧＦＰ又はそのホモログを結合した蛋白質であり、カルシウムがＣａＭに結合するとその構造が変化し、ＦＲＥＴを起こして二つのＧＦＰまたはそのホモログの発する蛍光強度が変化することを利用している。該蛋白質は、細胞に直接注入するか、該蛋白質をコードする遺伝子を細胞に取り込ませて使用する。ＦＲＥＴにおる蛍光変化は軽微であり、さらに一般的に用いられているアルゴンレーザーを搭載したレーザー顕微鏡により測定することが出来ないという問題点がある。
【０００６】
４）一つのＧＦＰからなるカルシウム感受性蛋白質：ＧＦＰのアミノ酸配列（配列番号３）の１４４番と１４６番の間にＣａＭを結合したカルシウム感受性蛋白質であり、カルシウムがＣａＭに結合すると蛋白質の構造が変化し、ＧＦＰの発する蛍光強度が変化することを利用している。該蛋白質も、細胞に直接注入するか、その他遺伝子を細胞に取り込ませて使用する。一般にカルシウムに対する感度が低く、実際の細胞では信号／雑音比が低いため、測定が困難であるという問題点を有する。
【０００７】
本発明者らは、上記４）の応用として、ＧＦＰの蛍光特性を制御することが可能なカルシウムセンサー蛋白質を作成する方法、並びに該方法により作成されるカルシウムセンサー蛋白質、および該カルシウムセンサー蛋白質をコードするカルシウムセンサー遺伝子を提供し（特許文献１）、カルシウムに対する感度が従来のカルシウムセンサーに比して高く、かつ特定細胞への取り込みが容易であり、更に測定に特別な装置及び補酵素等を必要としないカルシウムセンサー蛋白質の作成に成功している（特許文献２）。
【０００８】
しかし、近年、生体内でのカルシウムの微少な変動を感知する必要性が以前にも増して高まっており、上記特許文献１及び特許文献２のカルシウムセンサー蛋白質をもってしても、十分な成果が上げられない状況となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第３６５０８１５号
【特許文献２】特願２００９−２８９７８９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記事情に鑑み、本発明は、従来のカルシウムセンサーよりも、さらに、感度及び反応性に優れたカルシウムセンサー蛋白質、及び、該蛋白質をコードする遺伝子の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１０）に関する。
（１）下記（ａ）〜（ｉ）のアミノ酸配列を、Ｎ末端から順に有することを特徴とするカルシウムセンサー蛋白質：
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列；
（ｂ）３つのアミノ酸からなる配列  Ｍｅｔ−Ｘａａ１−Ｘａａ２（ここでＸａａ１及びＸａａ２はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である）（リンカーＸ）（配列番号２）；
（ｃ）ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質、又はカルモジュリン結合部位を含むその部分アミノ酸配列；
（ｄ）前述の（ｃ）の配列と後述の（ｅ）の配列とを連結する、Ｔｈｒ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ、Ｔｈｒ−Ｔｙｒ、Ｔｈｒ−Ａｓｐ、Ｔｈｒ−Ｃｙｓ、Ｔｈｒ−Ｐｈｅ、Ｔｈｒ−Ｍｅｔ、Ｔｈｒ−Ｔｈｒ、Ｔｈｒ−Ｇｌｕ、Ｔｈｒ−Ｈｉｓ及びＴｈｒ−Ｌｅｕからなる群より選択される何れか一のアミノ酸配列（リンカーＹ）；
（ｅ）配列番号３で示される配列のＸ番目〜２３９番目までのアミノ酸配列であって、１５４番目及び／又は２０４番目及び／又は２０６番目のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したもの（ここで、Ｘは１４９〜１５１任意の位置である）；
（ｆ）前述の（ｅ）の配列と後述の（ｇ）の配列を連結する、６つのアミノ酸配列からなる配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ５−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ６（ここでＸａａ５及びＸａａ６はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である）（配列番号４）；
（ｇ）配列番号３で示される配列の１番目〜Ｙ番目までのアミノ酸配列であって、１０６番目及び／又は１２５番目のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列（ここで、Ｙは１４１〜１４８の任意の位置である）；
（ｈ）前述の（ｇ）の配列と後述の（ｉ）の配列とを連結するアミノ酸配列Ｔｈｒ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ａｒｇ、Ｔｒｐ−Ａｒｇ、Ｔｙｒ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｒｇ又はＴｈｒ（リンカーＺ）； 
（ｉ）配列番号９で示される配列の２番目〜１４８番目までのアミノ酸配列であって、３６番目及び／又は６０番目及び／又は７８番目のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列。
【００１２】
（２）前記（ａ）の配列の５番目から１０番目に存在するＨｉｓの数が０〜５であり、及び／又は前記（ａ）の配列の２番目のＡｒｇが欠失し、及び／又は前記（ｅ）の配列の１５４番目のアミノ酸がＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａに置換され、及び／又は前記（ｅ）の配列の２０４番目のアミノ酸がＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａに置換され、及び／又は前記（ｅ）の配列の２０６番目のアミノ酸がＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａに置換され、及び／又は前記（ｇ）の配列の１０６番目のアミノ酸がＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａに置換され、及び／又は前記（ｇ）の配列の１２５番目のアミノ酸がＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａに置換され、及び／又は前記（ｉ）の配列において、配列番号９で示される配列の３６番目のアミノ酸がＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａに置換され、及び／又は前記（ｉ）の配列において、配列番号９で示される配列の６０番目のアミノ酸がＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａに置換され、及び／又は前記（ｉ）の配列において、配列番号９で示される配列の７８番目のアミノ酸がＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ若しくはＡｌａに置換されることを特徴とする上記（１）に記載のカルシウムセンサー蛋白質。
【００１３】
（３）前記（ｅ）の配列が配列番号３で示される配列の１５０番目〜２３９番目までのアミノ酸配列であり、前記（ｇ）の配列が配列番号３で示される配列の１番目〜１４５番目までのアミノ酸配列であることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載のカルシウムセンサー蛋白質。
【００１４】
（４）前記（ｂ）の配列が配列番号５若しくは配列番号６で示されるアミノ酸配列であり、及び／又は前記（ｃ）の配列が配列番号７で示されるアミノ酸配列であり、及び／又は前記（ｆ）の配列が配列番号８で示されるアミノ酸配列であることを特徴とする上記（１）乃至（３）のいずれかに記載のカルシウムセンサー蛋白質。
【００１５】
（５）前記（ｂ）の配列が配列番号６で示されるアミノ酸配列であり、前記（ｄ）の配列がＬｅｕ−Ｇｌｕであり、前記（ｈ）の配列がＴｈｒ−Ａｒｇであることを特徴とする上記（４）に記載のカルシウムセンサー蛋白質。
【００１６】
（６）前記（ｅ）の配列がアミノ酸の置換を含まない配列番号３で示される配列の１５０番目〜２３９番目までのアミノ酸配列であり、前記（ｇ）の配列が配列番号３で示される配列の１番目〜１４５番目であって、１０６番目のアミノ酸がＴｙｒに置換され、１２５番目のアミノ酸がＶａｌに置換され、前記（ｉ）の配列において、配列番号９で示される配列の３６番目のアミノ酸がＬｅｕ置換されていることを特徴とする上記（５）に記載のカルシウムセンサー蛋白質。
【００１７】
（７）前記（ｅ）の配列が配列番号３で示される配列の１５０番目〜２３９番目であって、１５４番目のアミノ酸がＬｙｓに置換され、２０４番目のアミノ酸がＶａｌに置換され、前記（ｇ）の配列がアミノ酸の置換を含まない配列番号３で示される配列の１番目〜１４５番目までのアミノ酸配列であり、前記（ｉ）の配列において、配列番号９で示される配列の第６０番目のアミノ酸がＡｓｐに置換され、７８番目のアミノ酸がＴｙｒに置換されていることを特徴とする上記（５）に記載のカルシウムセンサー蛋白質。
【００１８】
（８）前記（ａ）の配列の５番目から１０番目に存在するＨｉｓの数が５であり、前記（ｅ）の配列が配列番号３で示される配列の１５０番目〜２３９番目であって、２０６番目のアミノ酸がＡｓｎに置換され、前記（ｇ）の配列がアミノ酸の置換を含まない配列番号３で示される配列の１番目〜１４５番目までのアミノ酸配列であり、前記（ｉ）の配列がアミノ酸の置換を含まない配列番号９で示される配列の２番目〜１４８番目までの配列であることを特徴とする上記（５）に記載のカルシウムセンサー蛋白質。
【００１９】
（９）前記（ａ）の配列の５番目から１０番目に存在するＨｉｓの数が５であり、前記（ｅ）の配列が配列番号３で示される配列の１５０番目〜２３９番目であって、１５４番目のアミノ酸がＬｙｓに置換され、２０４番目のアミノ酸がＶａｌに置換され、２０６番目のアミノ酸がＡｓｎに置換され、前記（ｇ）の配列が配列番号３で示される配列の１番目〜１４５番目であって、１０６番目のアミノ酸がＴｙｒに置換され、１２５番目のアミノ酸がＶａｌに置換され、前記（ｉ）の配列において、配列番号９で示される配列の３６番目のアミノ酸がＬｅｕに置換され、６０番目のアミノ酸がＡｓｐに置換され、７８番目のアミノ酸がＴｙｒに置換されていることを特徴とする上記（５）に記載のカルシウムセンサー蛋白質。
【００２０】
（１０）上記（１）乃至（９）のいずれかに記載の蛋白質をコードするカルシウムセンサー遺伝子。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、従来のカルシウムセンサーに比べ、蛍光強度の変化量が、より安定に、かつ高感度なカルシウムセンサー蛋白質の提供が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、カルシウムセンサー蛋白質（Ｇ−ＣａＭＰ７）のＤＮＡをトランスフェクション法により導入し発現させたヒト子宮癌由来株化細胞（ＨｅＬａ細胞）の画像図である。
【図２】図２は、ＡＴＰに対して、ＨｅＬａ細胞に発現したカルシウムセンサー蛋白質（Ｇ−ＣａＭＰ７）の蛍光強度が変化する様子を示すグラフ図である。
【図３】図３は、従来のカルシウムセンサー蛋白質（Ｇ−ＣａＭＰ４）又は本発明のカルシウムセンサー蛋白質（Ｇ−ＣａＭＰ７）を発現させたＨｅＬａ細胞へのＡＴＰ処理に対する蛍光強度変化量を比較したグラフ図である。
【図４】図４は、精製したカルシウムセンサー蛋白質（Ｇ−ＣａＭＰ４及びＧ−ＣａＭＰ７）のカルシウム濃度と蛍光量との関係を示すグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明のカルシウムセンサー蛋白質は、下記（ａ）〜（ｉ）のアミノ酸配列を、Ｎ末端から順に有することを特徴とする蛋白質である；
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列；
（ｂ）３つのアミノ酸からなる配列  Ｍｅｔ−Ｘａａ１−Ｘａａ２（ここでＸａａ１及びＸａａ２はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である）（リンカーＸ）（配列番号２）；
（ｃ）ミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質、又はカルモジュリン結合部位を含むその部分アミノ酸配列；
（ｄ）前述の（ｃ）の配列と後述の（ｅ）の配列とを連結する、Ｔｈｒ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ、Ｔｈｒ−Ｔｙｒ、Ｔｈｒ−Ａｓｐ、Ｔｈｒ−Ｃｙｓ、Ｔｈｒ−Ｐｈｅ、Ｔｈｒ−Ｍｅｔ、Ｔｈｒ−Ｔｈｒ、Ｔｈｒ−Ｇｌｕ、Ｔｈｒ−Ｈｉｓ及びＴｈｒ−Ｌｅｕからなる群より選択される何れか一のアミノ酸配列（リンカーＹ）；
（ｅ）配列番号３で示される配列のＸ番目〜２３９番目までのアミノ酸配列であって、１５４番目及び／又は２０４番目及び／又は２０６番目のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したもの（ここで、Ｘは１４９〜１５１任意の位置である）；
（ｆ）前述の（ｅ）の配列と後述の（ｇ）の配列を連結する、６つのアミノ酸配列からなる配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ５−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ６（ここでＸａａ５及びＸａａ６はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である）（配列番号４）；
（ｇ）配列番号３で示される配列の１番目〜Ｙ番目までのアミノ酸配列であって、１０６番目及び／又は１２５番目のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列（ここで、Ｙは１４１〜１４８の任意の位置である）；
（ｈ）前述の（ｇ）の配列と後述の（ｉ）の配列とを連結するアミノ酸配列Ｔｈｒ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ａｒｇ、Ｔｒｐ−Ａｒｇ、Ｔｙｒ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｒｇ又はＴｈｒ（リンカーＺ）； 
（ｉ）配列番号９で示される配列の２番目〜１４８番目までのアミノ酸配列であって、３６番目及び／又は６０番目及び／又は７８番目のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列。
【００２４】
ここで、配列（ａ）（配列番号１で示されるアミノ酸配列）は、５番目から１０番目がＨｉｓで構成されているが、このＨｉｓの数は、０〜６の間のいずれであってもよく、好ましくは、０〜５、特に好ましくは５である。また、２番目のＡｒｇは存在していても、欠失していてもよい。
また、上記配列（ｅ）、（ｇ）及び（ｉ）は、少なくとも１の配列（（ｅ）、（ｇ）又は（ｉ））に上述のアミノ酸置換が含まれていればよく、例えば、配列（ｅ）の２０４番目と２０６番目のアミノ酸のみが置換され、配列（ｇ）が配列番号３で示される配列の１番目〜Ｙ番目までのアミノ酸配列であってアミノ酸の置換を含まず（ここで、Ｙは１４１〜１４８の任意の位置である）、配列（ｉ）が配列番号９で示される配列の２番目〜１４８番目までのアミノ酸配列であってアミノ酸の置換を含まないものであってもよい。
【００２５】
上記のカルシウムセンサー蛋白質は、主として、改変ＧＦＰ（ｅ及びｇが該当）、（２）機能性分子（ｃ及びｉが該当）、（３）リンカー（ｄ、ｆ及びｈが該当）から構成されている。
【００２６】
改変ＧＦＰとは、蛍光特性に影響を及ぼすホットスポットアミノ酸残基の近傍でＧＦＰのアミノ酸配列を切断して該蛋白質の構造を改変し、さらに特定部位のアミノ酸残基を置換したものである。
【００２７】
本発明のＧＦＰは、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質である。また、本発明のＧＦＰのホモログとは、配列番号３で示されるアミノ酸と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質のことである。ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質」とは、配列番号３で示されるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、蛍光を発する蛋白質のことであり、例えば、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ等のＧＦＰ色変異体があげられる。
【００２８】
あるいは、配列番号３で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質としては、配列番号３で表わされるアミノ酸配列中の１又は数個（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、蛍光を発する蛋白質のことである。
【００２９】
本発明において、ＧＦＰの蛍光特性に影響を及ぼす「ホットスポットアミノ酸残基」とは、改変ＧＦＰを作成する際に、その改変位置の指標となるＧＦＰ上のアミノ酸残基であり、該アミノ酸残基の近傍でＧＦＰの構造を改変することにより、所望の改変ＧＦＰを作成することを可能とするものである。本発明において推定されるＧＦＰのホットスポットアミノ酸残基は、配列番号３で示されるＧＦＰのアミノ酸配列中、第１４９番目のアミノ酸である。
【００３０】
ＧＦＰの構造を改変するとは、好ましくは、推定されるホットスポットアミノ酸残基の近傍（好ましくは、ホットスポットアミノ酸残基の前後５アミノ酸の範囲内の各位置）でＧＦＰを切断し、さらに切断部位から適切な数のアミノ酸（好ましくは１−１０個のアミノ酸）を除去し、必要に応じてＧＦＰ本来のＮ末端と本来のＣ末端とを適切なアミノ酸配列で連結することをいう。
【００３１】
特定部位のアミノ酸残基を置換した改変ＧＦＰとは、配列番号３で示されるＧＦＰのアミノ酸配列上、特定部位のアミノ酸残基（好ましくは１０６番目及び／又は１２５番目及び／又は１５４番目及び／又は２０４番目及び／又は２０６番目のアミノ酸残基）を、いずれかのアミノ酸に置換（例えば、１０６番目のアミノ酸をＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ又はＡｌａ、特に好ましくは、Ｔｙｒに置換し、及び／又は１２５番目のアミノ酸をＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ又はＡｌａ、特に好ましくは、Ｖａｌに置換し、及び／又は１５４番目のアミノ酸をＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ又はＡｌａ、特に好ましくは、Ｌｙｓに置換し、及び／又は２０４番目のアミノ酸をＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ又はＡｌａ、特に好ましくは、Ｖａｌに置換し、及び／又は２０６番目のアミノ酸をＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ又はＡｌａ、特に好ましくは、Ａｓｎに置換）したＧＦＰを用いて、上記にあるように構造を改変したＧＦＰをいう。
【００３２】
改変ＧＦＰの特に好ましい例としては、配列番号３で示される配列の１５０番目〜２３９番目までのアミノ酸配列であって、１５４番目のアミノ酸をＬｙｓに置換し、２０４番目のアミノ酸をＶａｌに置換し、２０６番目のアミノ酸をＡｓｎに置換したアミノ酸配列をＮ末端側とし、配列番号３で示される配列の１番目〜１４５番目までのアミノ酸であって、１０６番目のアミノ酸をＴｙｒに置換し、１２５番目のアミノ酸をＶａｌに置換したアミノ酸をＣ末端側として、適切なアミノ酸配列により連結したものが挙げられる。
【００３３】
機能性分子とは、機能性分子自身が、該分子に作用する因子の結合等の作用により、立体構造に変化を起こし得る分子であって、改変ＧＦＰに連結することで、自身の立体構造の変化を該改変ＧＦＰに伝え得る分子のことである。この際、該機能性分子は、自身の立体構造の変化を前記改変ＧＦＰに伝えることにより、前記改変ＧＦＰの立体構造を変化させ、蛍光特性を変化させるように機能する。
【００３４】
従って、機能性分子は、自身の立体構造の変化を改変ＧＦＰに伝達し改変ＧＦＰの構造に変化を及ぼし得る位置で、改変ＧＦＰに連結されている必要がある。従って機能性分子は、本来のＧＦＰ構造を改変した部分に近接して連結されていることが好ましい。具体的には、ＧＦＰを切断した位置にリンカー分子を介して連結されていることが好ましい。
【００３５】
このような機能性分子は、一分子であってもよいし、二分子以上であってもよい。二分子の場合、機能性分子に作用する因子は、まず一方の機能性分子の立体構造に変化を及ぼし、次いでその立体構造が改変ＧＦＰの立体構造に変化を起こさせる。本発明における機能性分子としては、カルモジュリン蛋白質とミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質との組み合わせが挙げられる。
【００３６】
また、改変ＧＦＰに連結する機能性分子は、その機能性分子が生体内で発現している通りの全構造を有する必要はなく、機能性分子に作用する因子が結合する部位のみを有する一部構造であってもよい。本発明における好ましい例としては、カルモジュリン蛋白質、及び配列番号７に示すカルモジュリン結合機能を有するミオシン軽鎖キナーゼの一部を機能性分子として挙げることができる。このような機能性分子を改変ＧＦＰに適式に連結することで、該融合蛋白質はカルシウムセンサーとして機能し得る。
【００３７】
ここで機能性分子として使用したラットカルモジュリン蛋白質の１番目のアミノ酸から１４８番目のアミノ酸配列を配列番号９に示す。
【００３８】
リンカーとは、上記改変ＧＦＰの切断部位、該改変ＧＦＰと上記機能性分子間の連結部位、及び改変ＧＦＰと機能性分子を連結してなる蛋白質とそのＮ末端側にあるアミノ酸配列（本発明においては配列番号１で示されるアミノ酸配列）との連結部位に位置する数残基のアミノ酸からなるペプチドである。各リンカー分子を区別するべく、以下のような名称を付している。
【００３９】
改変ＧＦＰと機能性分子からなる融合蛋白質全体のＮ末端に存在する配列番号１で示されるアミノ酸配列（上記配列（ａ））とミオシン軽鎖キナーゼ蛋白質又はカルモジュリン結合部位を含むその部分アミノ酸配列とを連結するリンカーをリンカーＸと称する。リンカーＸは、Ｍｅｔを含む任意のアミノ酸配列であるが、好ましくは１〜１０残基のアミノ酸ペプチドであり、より好ましくは、３つのアミノ酸からなる配列Ｍｅｔ−Ｘａａ１−Ｘａａ２（ここでＸａａ１及びＸａａ２はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である；配列番号２）、さらに好ましくは、Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（配列番号５）またはＭｅｔ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（配列番号６）である。
【００４０】
改変ＧＦＰのＮ末端側と機能性分子を連結するリンカーはリンカーＹと称し、任意のアミノ酸配列であるが、好ましくは０〜１０残基のアミノ酸ペプチドであり、より好ましくは、２つのアミノ酸からなる配列Ｘａａ３−Ｘａａ４（ここでＸａａ３はロイシン、トレオニン及びグリシンからなる群から選択される何れか一のアミノ酸であり、Ｘａａ４は任意のアミノ酸である）、さらに好ましくは、Ｔｈｒ−Ｓｅｒ，Ｇｌｙ−Ｓｅｒ，Ｌｅｕ−Ｇｌｕ，Ｔｈｒ−Ｔｙｒ，Ｔｈｒ−Ａｓｐ，Ｔｈｒ−Ｃｙｓ，Ｔｈｒ−Ｐｈｅ，Ｔｈｒ−Ｍｅｔ，Ｔｈｒ−Ｔｈｒ，Ｔｈｒ−Ｇｌｕ，Ｔｈｒ−Ｈｉｓ，およびＴｈｒ−Ｌｅｕからなる群より選択される何れか一のアミノ酸配列であり、特に好ましくは、Ｌｅｕ−Ｇｌｕである。
【００４１】
改変ＧＦＰのＣ末端側と機能性分子を連結するリンカーはリンカーＺと称し、Ｔｈｒ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ａｒｇ、Ｔｒｐ−Ａｒｇ、Ｔｙｒ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｒｇ又はＴｈｒＴｈｒ−Ａｒｇ又はＴｈｒであり、特に好ましくはＴｈｒ−Ａｒｇである。
【００４２】
なお、ＧＦＰの本来のＮ末端とＣ末端とを連結するアミノ酸ペプチドもリンカーであり、好ましくは、アミノ酸２〜１０残基からなるペプチドであり、Ｇｌｙを多く含むものが好ましく、さらに好ましくは、６つのアミノ酸配列からなる配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ５−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘａａ６（ここでＸａａ５及びＸａａ６はそれぞれ独立して任意のアミノ酸である；配列番号３）であり、特に好ましい例としては、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号８）が挙げられる。
【００４３】
本発明でのカルシウムセンサー蛋白質とは、当該蛋白質に含まれる機能性分子の立体構造に影響を及ぼす因子であるカルシウムを作用させることで該機能性分子の立体構造に影響を与え、該立体構造の変化がカルシウムセンサー蛋白質に含まれる改変ＧＦＰの立体構造に影響を与えることで、該改変ＧＦＰの蛍光特性を可逆的に変化させる蛋白質をいう。この変化は、蛍光顕微鏡若しくはレーザー顕微鏡等で捉えることが出来る程度の変化をいい、好ましくは肉眼で捉えることが出来る程度の変化をいう。蛍光特性の変化が蛍光強度の変化である場合、蛍光の変化量ΔＦ／Ｆが、好ましくは、少なくとも０．１以上変化すること、より好ましくは１以上の範囲で変化することをいう。
【００４４】
本発明において蛍光特性とは、蛍光強度、蛍光波長、蛍光強度比、吸光度、吸光波長などの蛍光特性を指す。本発明では蛍光特性の一例として、蛍光強度を使用する。
【００４５】
本発明において、蛍光特性が蛍光強度である場合、カルシウムセンサー蛋白質は、蛍光を発する状態と蛍光を発しない状態の臨界状態にある。この臨界状態においてカルシウムセンサー蛋白質は、蛍光を発しない状態にあってもよいし、蛍光強度の低い状態にあってもよい。あるいは蛍光強度の高い状態にあってもよい。ここで、蛍光を発しないとは、光学機器を使用して蛍光を確認できないことをいう。蛍光強度が低いとは、カルシウムの存在により、上記の変化量（ΔＦ／Ｆが少なくとも０．１以上変化する量）を示して、蛍光強度が高い状態に変化し得る程度に低いことをいう。同様に、蛍光強度が高いとは、カルシウムの存在により、上記の変化量（ΔＦ／Ｆが少なくとも０．１以上変化する量）を示して、蛍光強度が低い状態に変化し得る程度に高いことをいう。
【００４６】
本発明におけるカルシウムセンサー蛋白質は、従来のカルシウムセンサー蛋白質に比べ、上記のように配列（ａ）、改変ＧＦＰ及びラットカルモジュリンの特定部位のアミノ酸残基を置換し、上記のような特定のリンカーを用いることにより、カルシウム作用時に、より大きな蛍光特性の変化を引き起こすことを特徴とする。ここでより大きな蛍光特性変化とは、蛍光特性の変化が蛍光強度の変化である場合、蛍光の変化量ΔＦ／Ｆが、従来のカルシウムセンサー蛋白質よりも大きく、好ましくは、２倍以上増強されることをいう。
【００４７】
融合蛋白質の作成は、公知の遺伝子工学的手法を用いて行うことができる。例えば、融合したい各蛋白質部分をコードする遺伝子（即ち、特定アミノ酸部位の弛緩を伴う改変ＧＦＰ及び機能性分子をコードする遺伝子）の断片をそれぞれＰＣＲにより作成し、これら断片を繋ぎ合わせることにより融合遺伝子を作成し、次いで、該融合遺伝子を含むプラスミドを所望の細胞に導入して発現させることにより、融合蛋白質は作られる。
【００４８】
また、本発明においてカルシウムセンサー遺伝子は、本発明のカルシウムセンサー蛋白質をコードする遺伝子のことをいう。該カルシウムセンサー遺伝子は、上記にあるように、作成したいカルシウムセンサー蛋白質を構成する各構成部分をコードする遺伝子断片をそれぞれＰＣＲにより作成し、次いで、これら各遺伝子断片を連結させることにより、融合遺伝子の形で作成され得る。
【００４９】
本発明において作成されたカルシウムセンサー蛋白質は、細胞内及び細胞外でカルシウム濃度をより安定に、かつ高感度に測定することが出来る。
【００５０】
例えば、本発明のカルシウムセンサー遺伝子を大腸菌などに導入して予め産生されたカルシウムセンサー蛋白質と検体とを混合することによりカルシウム濃度を測定することが可能である。また、大腸菌などを使用して産生させた蛋白質を、カルシウム濃度を測定したい細胞に直接注入することにより、細胞内のカルシウム濃度を測定することも可能である。あるいは、本発明のカルシウムセンサー遺伝子を、カルシウム濃度を測定したい細胞に導入して細胞に蛋白質を産生させることにより、細胞内のカルシウム濃度を測定することも可能である。
【００５１】
カルシウム濃度の測定は、ある特定の波長の光（例えば、４８８ｎｍの励起光）をカルシウムセンサー蛋白質に当てることにより、該蛋白質の発する蛍光特性を光学機器（例えば、レーザー顕微鏡）で検出することにより行う。なお、濃度測定に使用するカルシウムセンサー蛋白質が、どのくらいのカルシウム濃度でどのような蛍光特性を示すのか、予め調べておくことが必要である。具体的には、例えば、大腸菌により産生したカルシウムセンサー蛋白質により、蛍光分光光度計を用いて種々のカルシウム濃度に対する蛍光強度変化を測定しておくことが必要である（例えば、図４を参照のこと）。本測定により、Ｋｄ６３ｎＭ、Ｈｉｌｌ係数３．８、最大蛍光変化量２５．５という結果を得た。
【００５２】
以下に本発明の実施例を示すが、これらの実施例はあくまでも例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００５３】
本発明のカルシウムセンサー蛋白質であるＧ−ＣａＭＰ７の特性
本発明において開発したカルシウムセンサー蛋白質（Ｇ−ＣａＭＰ７）は、ヒト子宮癌由来株化細胞であるＨｅＬａ細胞に、該蛋白質をコードする遺伝子を導入して、カルシウムセンサーとしての性能評価を行った（図１）。
【００５４】
本発明のカルシウムセンサー蛋白質Ｇ−ＣａＭＰ７を、ＨｅＬａ細胞内にて発現させ、次いで細胞内カルシウムイオン濃度を増大させることが既知である因子として、ＡＴＰ（０．１ｍＭ）を作用させた。その時の反応例を図２に示す。従来のカルシウムセンサー蛋白質（Ｇ−ＣａＭＰ４など）よりも本発明のカルシウムセンサー蛋白質であるＧ−ＣａＭＰ７の方が、より安定に蛍光強度が上昇することがわかった。
【００５５】
本発明のカルシウムセンサー蛋白質Ｇ−ＣａＭＰ７を発現させたＨｅＬａ細胞でのＡＴＰに対する蛍光強度の変化量は、従来の該カルシウムセンサー蛋白質Ｇ−ＣａＭＰ４のそれに比して、４．２倍大きな蛍光変化を確認した（図３）。また、Ｇ−ＣａＭＰ７は、Ｇ−ＣａＭＰ７が由来するＧ−ＣａＭＰ２と比較すると、その蛍光変化は約１０倍以上であり、従来のＧ−ＣａＭＰ２よりも顕著に優れた効果を発揮するカルシウムセンサー蛋白質である。
さらに、精製したカルシウムセンサー蛋白質（Ｇ−ＣａＭＰ７及びＧ−ＣａＭＰ４）のカルシウム濃度と蛍光量との関係を検討した結果、Ｇ−ＣａＭＰ７は、Ｇ−ＣａＭＰ４と比較すると、カルシウムイオンに対する感度が約２倍高く（Ｇ−ＣａＭＰ７のＫｄ値がＧ−ＣａＭＰ４のそれより約２倍低く、かつ両者のＨｉｌｌ係数は同程度である）、カルシウムイオンの有無での蛍光強度変化量が約４．５倍大きい（カルシウムイオンの有無での蛍光強度の比率を求めると、Ｇ−ＣａＭＰ７は２５．５倍であるのに対し、Ｇ−ＣａＭＰ４は５．６倍である）ことを確認した（図４）。
このように本発明のカルシウムセンサー蛋白質は、従来のものに比して、より安定かつ高感度であることが証明されている。
【００５６】
カルシウムセンサー蛋白質Ｇ−ＣａＭＰ７の製法及び測定法
（Ａ）Ｇ−ＣａＭＰ７の製法
（Ａ−１）細菌発現用および哺乳動物発現用のプラスミド構築
Ｇ−ＣａＭＰ７の細菌発現用プラスミドであるｐＲＳＥＴＢ−ＧＣａＭＰ７及び哺乳動物発現用プラスミドであるｐＮ１−ＧＣａＭＰ７は、参考文献１（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．, １０３, ４７５３−４７５８ (２００６)）に記載のｐＲＳＥＴＢ−ＧＣａＭＰ２及びｐＮ１−ＧＣａＭＰ２を後述のように改変することによって構築した。
すなわち、まずＧＣａＭＰ２のアミノ酸配列（配列番号１０）においてカルモジュリン部分のＭｅｔ−３６→Ｌｅｕ（配列番号９において３６番目のＭｅｔ）、及びＧＦＰ部分のＡｓｎ−１０５→Ｔｙｒ（配列番号３において１０６番目のＡｓｎ）、Ｇｌｕ−１２４→Ｖａｌ（配列番号３において１２５番目のＧｌｕ）にアミノ酸置換されるよう、そのｃＤＮＡ配列（配列番号１１）中でカルモジュリン部分のＭｅｔ−３６をコードしている５’−ＡＴＧ−３’を５’−ＣＴＧ−３’に、およびＧＦＰ部分のＡｓｎ−１０５をコードしている５’−ＡＡＣ−３’を５’−ＴＡＣ−３’に、Ｇｌｕ−１２４をコードしている５’−ＧＡＧ−３’を５’−ＧＴＧ−３’に各々変異させてｃｆＧＣａＭＰ２を構築した。
【００５７】
次に、ｃｆＧＣａＭＰ２の配列においてＧＦＰ部分のＭｅｔ−１５３→Ｌｙｓ（配列番号３において１５４番目のＭｅｔ）、Ｔｈｒ−２０３→Ｖａｌ（配列番号３において２０４番目のＴｈｒ）、カルモジュリン部分のＡｓｎ−６０→Ａｓｐ（配列番号９において６０番目のＡｓｎ）、およびＡｓｐ−７８→Ｔｙｒ（配列番号９において７８番目のＡｓｐ）にアミノ酸置換されるよう、そのｃＤＮＡ配列中でＧＦＰ部分のＭｅｔ−１５３をコードしている５’−ＡＴＧ−３’を５’−ＡＡＧ−３’に、Ｔｈｒ−２０３をコードしている５’−ＡＣＣ−３’を５’−ＧＴＴ−３’に、カルモジュリン部分のＡｓｎ−６０をコードしている５’−ＡＡＴ−３’を５’−ＧＡＴ−３’に、およびＡｓｐ−７８をコードしている５’−ＧＡＣ−３’を５’−ＴＡＣ−３’に各々変異させてＧＣａＭＰ６を構築した。
さらにＧＣａＭＰ６の配列においてタグ部分のＨｉｓ６→Ｈｉｓ５、およびＧＦＰ部分のＳｅｒ−２０５→Ａｓｎ（配列番号３において２０６番目のＳｅｒ）にアミノ酸置換されるよう、そのｃＤＮＡ配列中でタグ部分のＨｉｓ６をコードしている５’−ＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴ−３’を５’−ＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴ−３’に、およびＧＦＰ部分のＳｅｒ−２０５をコードしている５’−ＴＣＣ−３’を５’−ＡＡＴ−３’に各々変異させてＧＣａＭＰ７を構築した。
【００５８】
より具体的には、１番目にｐＮ１−ＧＣａＭＰ２およびｐＲＳＥＴＢ−ＧＣａＭＰ２をテンプレートとして以下の合成プライマー（Ｏｐｅｒｏｎ）
５’−ACGGTGCTGCGGTCTCTGGGGCAGA−３’（ｒＣａＭ−３０）（配列番号１２）
５’−AGACCGCAGCACCGTCCCCAGCTCCTT−３’ （ｒＣａＭ−３１）（配列番号１３）
を用いてＰＣＲによる点変異導入を後述の方法で行い、ｐＮ１−ＧＣａＭＰ２（ＣａＭ  Ｍ３６Ｌ）、およびｐＲＳＥＴＢ−ＧＣａＭＰ２（ＣａＭ  Ｍ３６Ｌ）を作成した。
【００５９】
２番目に、ｐＮ１−ＧＣａＭＰ２（ＣａＭ  Ｍ３６Ｌ）およびｐＲＳＥＴＢ−ＧＣａＭＰ２（ＣａＭ  Ｍ３６Ｌ）をテンプレートとして以下の合成プライマー（Ｏｐｅｒｏｎ）
５’−GACGGCTACTACAAGACCCGCGCCG−３’（ＧＣａＭＰ−６６）（配列番号１４）
５’−CTTGTAGTAGCCGTCGTCCTTGAAGAA−３’（ ＧＣａＭＰ−６７）（配列番号１５）
を用いてＰＣＲによる点変異導入を後述の方法で行い、ｐＮ１−ＧＣａＭＰ２（Ｎ１０５Ｙ／ＣａＭ  Ｍ３６Ｌ）およびｐＲＳＥＴＢ−ＧＣａＭＰ２（Ｎ１０５Ｙ／ＣａＭ  Ｍ３６Ｌ）を作成した。
【００６０】
３番目に、ｐＮ１−ＧＣａＭＰ２（Ｎ１０５Ｙ／ＣａＭ  Ｍ３６Ｌ）およびｐＲＳＥＴＢ−ＧＣａＭＰ２（Ｎ１０５Ｙ／ＣａＭ  Ｍ３６Ｌ）をテンプレートとして以下の合成プライマー（Ｏｐｅｒｏｎ）
５’−CGCATCGTGCTGAAGGGCATCGACT−３’（ＧＣａＭＰ−６８）（配列番号１６）
５’−CTTCAGCACGATGCGGTTCACCAGGGT−３’（ ＧＣａＭＰ−６９）（配列番号１７）
を用いてＰＣＲによる点変異導入を後述の方法で行い、ｐＮ１−ｃｆＧＣａＭＰ２およびｐＲＳＥＴＢ−ｃｆＧＣａＭＰ２を作成した。
【００６１】
４番目に、ｐＮ１−ｃｆＧＣａＭＰ２およびｐＲＳＥＴＢ−ｃｆＧＣａＭＰ２をテンプレートとして以下の合成プライマー（Ｏｐｅｒｏｎ）
５’−GACAACCACTACCTGAGCGTGCAGTCCAAACTTTCGAAAG−３’（ＧＣａＭＰ−８４）（配列番号１８）
５’−CTTTCGAAAGTTTGGACTGCACGCTCAGGTAGTGGTTGTC−３’（ ＧＣａＭＰ−８５）（配列番号１９）
を用いてＰＣＲによる点変異導入を後述の方法で行い、ｐＮ１−ｃｆＧＣａＭＰ２（Ｔ２０３Ｖ）およびｐＲＳＥＴＢ−ｃｆＧＣａＭＰ２（Ｔ２０３Ｖ）を作成した。
【００６２】
５番目に、ｐＮ１−ｃｆＧＣａＭＰ２（Ｔ２０３Ｖ）およびｐＲＳＥＴＢ−ｃｆＧＣａＭＰ２（Ｔ２０３Ｖ）をテンプレートとして以下の合成プライマー（Ｏｐｅｒｏｎ）
５’−CAAGAAAAATGAAATACACAGACAGTGAAGAAGAAATTAG−３’（ＧＣａＭＰ−８６ｃｏｒｒ）（配列番号２０）
５’−CTAATTTCTTCTTCACTGTCTGTGTATTTCATTTTTCTTG−３’（ ＧＣａＭＰ−８７ｃｏｒｒ）（配列番号２１）
を用いてＰＣＲによる点変異導入を後述の方法で行い、ｐＮ１−ｃｆＧＣａＭＰ３およびｐＲＳＥＴＢ−ｃｆＧＣａＭＰ３を作成した。
【００６３】
６番目に、ｐＮ１−ｃｆＧＣａＭＰ３およびｐＲＳＥＴＢ−ｃｆＧＣａＭＰ３をテンプレートとして以下の合成プライマー（Ｏｐｅｒｏｎ）
５’−GAACGTCTATATCAAGGCCGACAAGCAG−３’（ＧＦＰ（Ｍ１５３Ｋ））（配列番号２２）
５’−GATGCCGACGGTGATGGCACAATCG−３’（ＣａＭ（Ｎ６０Ｄ））（配列番号２３）
を用いてＰＣＲによる同時多点変異導入を後述の方法で行い、ｐＮ１−ＧＣａＭＰ６およびｐＲＳＥＴＢ−ＧＣａＭＰ６を作成した。
【００６４】
７番目に、ｐＲＳＥＴＢ−ＧＣａＭＰ６をテンプレートとして以下の合成プライマー（Ｏｐｅｒｏｎ）
５’−TCAGATCTCGCCACCATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCAT−３’（Ｎ１ＲＳＥＴｍｏｄ）（配列番号２４）
５’−ATATTTCGAAAGTTTNNNCTGNNNGCTCAGGTAGTGGTTGTCGGG−３’（ＧＣａＭＰ−４４）（配列番号２５）
を用いてセミランダムにＰＣＲによる変異導入を後述の方法で行った。このＰＣＲ産物で大腸菌ＫＲＸを形質転換して明るく緑色蛍光を発し、かつカルシウムの有無での明るさの差が大きいＧＣａＭＰ６の変異体クローンをスクリーニングした結果、ＧＣａＭＰ６（Ｈｉｓ５／Ｓ２０５Ｎ）を発見した。このクローンをＧＣａＭＰ７（配列番号２６（アミノ酸配列）、配列番号２７（核酸配列））と命名した。
【００６５】
引き続きｐＲＳＥＴＢ−ＧＣａＭＰ７をテンプレートとして以下の合成プライマー（Ｏｐｅｒｏｎ）
５’−TCAGATCTCGCCACCATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCAT−３’（ Ｎ１ＲＳＥＴｍｏｄ）（配列番号２８）
５’−GCGCGGCCGCTCACTTCGCTGTCATCATTTGTAC−３’（ｒＣａＭ−１０）（配列番号２９）
を用いてＧＣａＭＰ７の全長ｃＤＮＡを後述のＰＣＲ法で増幅し、ＢｇｌＩＩとＮｏｔＩで消化した１．３７ｋｂの断片をｐＮ１−ＧＣａＭＰ６をＢｇｌＩＩとＮｏｔＩで消化した３．９４ｋｂの断片とＬｉｇａｔｉｏｎさせてｐＮ１−ＧＣａＭＰ７を作成した。
【００６６】
ＰＣＲによる点変異導入は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＩＩ  ＸＬ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用い、操作はそのマニュアルに従って行った。詳細には、テンプレートのプラスミドを５ｎｇ、１０ｘバッファーを２．５μｌ、２．５ｍＭのｄＮＴＰを０．５μｌ、各１０μＭのプライマーを１μｌずつ、ＱｕｉｋＳｏｌｕｔｉｏｎを１μｌ、Ｐｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．５μｌ、水を加えて全量を２５μｌとした混合液を下記の条件に付した。
【００６７】
ステップ１
摂氏９５度  １分
ステップ２
摂氏９５度  ５０秒
摂氏６０度  ５０秒
摂氏６８度  ５分
上記を１８サイクル
ステップ３
摂氏６８度  ７分
上記混合液に２０Ｕ／μｌのＤｐｎＩ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を０．５μｌ加えて摂氏３７度で１時間処理し、ＸＬ−１０Ｇｏｌｄに形質転換して出現したカナマイシン耐性またはアンピシリン耐性の大腸菌より回収した。
【００６８】
ＰＣＲによる同時多点変異導入にはＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  （Ａｇｉｌｅｎｔ）を用い、操作はそのマニュアルに従って行った。詳細には、１００ｎｇ／μｌのテンプレートのプラスミドを１μｌ、１０ｘバッファーを２．５μｌ、２．５ｍＭのｄＮＴＰを１μｌ、各１０μＭのプライマーを０．６μｌずつ、Ｐｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１μｌ、水を加えて全量を２５μｌとした混合液を下記の条件に付した。
【００６９】
ステップ１
摂氏９５度  １分
ステップ２
摂氏９５度  １分
摂氏５５度  １分
摂氏６５度  ９分
上記を３０サイクル
多点変異を含むプラスミドの上記混合液の全量に２０Ｕ／μｌのＤｐｎＩ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を１μｌ加えて摂氏３７度で１時間処理し、この処理後の多点変異を含むプラスミドは後述のようにＸＬ−１０Ｇｏｌｄに形質転換して出現したカナマイシン耐性またはアンピシリン耐性の大腸菌より回収した。
【００７０】
ＰＣＲ法での任意配列の増幅は、テンプレートのプラスミドを１００ｎｇ、１０μＭのフォワードプライマーを１μｌ、１０μＭのリバースプライマーを１μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ）を５μｌ、水を加えて全量を１０μｌとした混合液を下記の条件に付して行った。
【００７１】
ステップ１
摂氏９８度  １０秒
ステップ２
摂氏９８度  １０秒
摂氏５５度  １０秒
摂氏７２度  ２５秒
上記を３０サイクル
ステップ３
摂氏７２度  ３０秒
上記混合液のうち１０μｌを下記の方法でアガロース電気泳動に付し、ＰＣＲ産物の確認を行った。
【００７２】
制限酵素によるＤＮＡの切断はＮＥＢ社、Ｔｏｙｏｂｏ社、またはＴａｋａｒａ社の制限酵素、およびその添付バッファーと添付Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（１００ｘＢＳＡ）を用いて行った。反応は、１〜２μｇのＤＮＡに添付バッファー（３μｌ）、添付１００ｘＢＳＡ（０．３μｌ）および各制限酵素（１０ユニット）を加えて全量を３０μｌとした中で、摂氏３７度で１〜３時間行った。
【００７３】
アガロースゲル（Ａｇａｒｏｓｅ  ＬＥ、ナカライテスク）は、ＴＡＥバッファー（４．９８ｇ／ｌ  Ｔｒｉｓ  ｂａｓｅ（ナカライテスク）、１．１４２ｍｌ／ｌ氷酢酸（ナカライテスク）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８）（Ｄｏｊｉｎｄｏ））にて加熱溶解し、１％または２％となるように調製した。λＨｉｎｄＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ（Ｔｏｙｏｂｏ）または１００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｔｏｙｏｂｏ）をＤＮＡサイズマーカーとして、ＤＮＡ試料は制限酵素に添付されている１０ｘサンプルバッファーを１／１０量と、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）にて１００倍希釈したＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１／１０量加えたものを、ＴＡＥバッファーを用いて１００Vにて電気泳動を行い、Ｓａｆｅ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて検出した。
【００７４】
ゲルからのＤＮＡの回収にはＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用い、操作はそのマニュアルに従って行った。詳細には、まずアガロースゲル電気泳動後Ｓａｆｅ  Ｉｍａｇｅｒ上で目的のバンドをなるべく小さくなるようにメスで切り出し、吸着液を４００μｌ加えて室温に放置してゲルを完全に溶解させた。次に磁性ビーズを３０μｌ加えて時々撹拌しながら室温に２分放置した。ＤＮＡを吸着した磁性ビーズはマグネットスタンドを用いて吸着し、上清は捨てた。回収した磁気ビーズに洗浄液を６００μｌ加えてボルテックスミキサーで１０秒撹拌し、マグネットスタンドを用いてＤＮＡを吸着した磁性ビーズを同様の手法で回収した。これに７５％エタノールを１ｍｌ加えてボルテックスミキサーで１０秒撹拌し、ＤＮＡを吸着した磁性ビーズはマグネットスタンドを用いて回収した。これをスピンダウンして完全に上清を捨て、５５度で2分間乾燥させた後、水又はＴＥを２５〜１００μｌ加えて時々撹拌しながら、室温で２分間放置した。ＤＮＡを解離させた後の磁性ビーズはマグネットスタンドを用いて分離し、ＤＮＡを含む上清を回収した。
【００７５】
Ｌｉｇａｔｉｏｎ反応にはＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ）を用い、操作はそのマニュアルに従って行った。詳細には、約２５ｆｍｏｌのプラスミドベクターおよび約２５〜２５０ｆｍｏｌのインサートＤＮＡの混合溶液に等量のＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｘを添加して混和した後、摂氏１６度℃で３０分間反応させた。
【００７６】
形質転換はＥ．ｃｏｌｉコンピテントセルＤＨ５a（Ｔａｋａｒａ）、ＸＬ−１０Ｇｏｌｄ（Ａｇｉｌｅｎｔ）、またはＫＲＸ（Ｔａｋａｒａ）を用いて行った。詳細には、１００μｌのコンピテントセルを氷上にて溶解し、ＤＮＡ溶液１μｌまたはＬｉｇａｔｉｏｎ反応液１μｌを加えて氷上で３０分間放置した後、摂氏４２度で４５秒間加熱した。その後さらに氷上で５分間放置し、ＬＢ培地５００μｌを加えて摂氏３７度で１時間培養後、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンまたは５０μｇ／ｍｌのカナマイシン（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含む選択培地（ＬＢ培地）に植えて、摂氏３７度にて一晩培養した。翌日、コロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンまたは５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む１〜５ｍｌの液体培地（ＬＢ培地）に植えつぎ、摂氏３７度にて１６時間培養した。
【００７７】
大腸菌からのプラスミドの回収にはＭｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、操作はそのマニュアルに従って行った。詳細には、まず５ｍｌの大腸菌培養液を約２０００ｘｇ、１０分の遠心に付し、上清をデカンテーションまたはピペッティングで除去して大腸菌の沈殿を得た。この沈殿に氷冷したＲＮａｓｅ入りＰ１バッファーを２５０μｌ加えてサスペンドし、Ｐ２バッファーを２５０μｌ加えて室温に５分放置してアルカリＳＤＳにより菌体を破砕した。その後Ｎ３バッファーを３５０μｌ加えて中性化した。その菌体破砕液をｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎに移し、約１３２００ｘｇ、３０秒〜１分の遠心に付してプラスミドをカラムに吸着させた。カラム素通り液はデカンテーションにて除去した。次にカラムにＰＥバッファーを７５０μｌ加えて約１３２００ｘｇ、３０秒〜１分の遠心に付してカラムを洗浄した。カラム素通り液はデカンテーションにて除去した。さらにバッファーを加えずにもう一度約１３２００ｘｇ、３０秒〜１分の遠心に付してカラムに残った液滴を完全に除去した。カラムを新しい回収用マイクロチューブにとりつけ、カラムにＥＢバッファーを５０μｌ加えて約１３２００ｘｇ、３０秒〜１分の遠心に付してカラムからプラスミドを溶出し回収した。
【００７８】
ＬＢ液体培地
１０ｇ／ｌ  Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ（ナカライテスク）、５ｇ／ｌ  Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（ナカライテスク）、５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ（ナカライテスク）、１ｇ／ｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。オートクレーブにて滅菌して調製。
【００７９】
ＬＢ寒天培地
１０ｇ／ｌ  Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ（ナカライテスク）、５ｇ／ｌ  Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（ナカライテスク）、５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ（ナカライテスク）、１ｇ／ｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、１５ｇ／ｌ  Ａｇａｒ（ナカライテスク）。オートクレーブにて滅菌後、温度が45度程度まで下がったところで抗生物質（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンまたは５０μｇ／ｍｌのカナマイシン（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））を加え、プラスチックディシュに流し込んで調製。
【００８０】
ＴＥ（ｐＨ８）（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ, １ｍＭ ＥＤＴＡ）（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）
【００８１】
（Ａ−２）蛋白質の精製
Ｇ−ＣａＭＰ７蛋白質の精製にはこれらの蛋白質がＨｉｓタグを持っていることを利用して、Ｈｉｓタグに特異的に結合するＮｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、操作はそのマニュアルに従って行った。詳細には、ｐＲＳＥＴＢ−ＧＣａＭＰ７をＥ．ｃｏｌｉコンピテントセルＫＲＸに形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ選択培地に植え、摂氏３７度で一晩培養した。コロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌの液体培地（ＬＢ培地）に植えつぎ、摂氏３７度にて１６時間培養した。培養液１０ｍｌをさらに１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２００ｍｌの液体培地（ＬＢ培地）に植えつぎ、吸光度ＯＤ６００で０．５〜１となるまで摂氏３７度で培養した後、最終濃度が１％になるようにラムノース（プロメガ）を加えて、摂氏１８〜２２５度で４〜５時間さらに培養した。
【００８２】
３０００回転１５分遠心して（６２００遠心機、Ｋｕｂｏｔａ）、大腸菌を回収した。１ｍｌのＬＢ培地で大腸菌を懸濁した。摂氏−２０度で３０分凍らせたのち、室温で３０分解凍した。もう１度凍結、解凍を繰り返した。氷上で冷やした４０ｍｌのｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（ナカライテスク）、蛋白分解酵素阻害剤（０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ、５μｇ／ｍｌ  ロイペプチン（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））を加え、よく混ぜて大腸菌を懸濁した。摂氏４度にて１００,０００ｘｇで１５分間遠心し、上清を得た。５Ｍ  ＮａＣｌを最終濃度が０．３Ｍとなるように加え、２ｍｌの５０％  Ｎｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ；蛋白質結合能５〜１０ｍｇ／ｍｌレジン）をさらに加えて１時間室温でおだやかに混ぜて反応させた。反応液を空のカラム（エコノカラム；カラムサイズ  〜２０ｍｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））に移し、余分の液がカラムから滴下してなくなるのを待った。１０ｍｌの洗浄液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ８）（ナカライテスク）、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ（ナカライテスク））で2回洗浄した後、３〜４ｍｌの回収液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ８）（ナカライテスク）、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ（ナカライテスク））にて溶出し、Ｈｉｓタグ付きの蛋白質をカラムから回収した。次に、回収した液を透析チューブ（Ｓａｎｋｏｕｊｕｎｙａｋｕ）に入れて１２５ｍｌまたはそれ以上のＫＭバッファー（０．１Ｍ  ＫＣｌ（ナカライテスク）、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）（Ｄｏｊｉｎｄｏ））で摂氏４度にて透析した。ＫＭバッファーは４〜５時間ごとに交換し、液交換を３回以上行った後、透析チューブから蛋白質の溶液を回収した。
【００８３】
蛋白質の濃度測定にはプロテインアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用い、操作はそのマニュアルに従ってＢｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ, Ｍ. Ｍ. Ａｎａｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ. １９７６, ７２, ２４８―２５４.）で測定した。まず、１０〜２００μｇ／ｍｌとなるように水で希釈した蛋白質の溶液５０μｌにＢｒａｄｆｏｒｄ試薬を１ｍｌ加えて３０分後に５９５ｎｍの吸光度を測定した。蛋白質の基準濃度は牛血清アルブミンを基準蛋白質として用いて測定して求めた。測定は室温にて行った。
【００８４】
（Ｂ）Ｇ−ＣａＭＰ７を用いた測定法
（Ｂ−１）カルシウム結合能の測定
Ｇ−ＣａＭＰ７蛋白質のカルシウム結合能はさまざまなカルシウム濃度溶液中における蛍光強度を測定して得られたカルシウム濃度―蛍光強度の容量反応曲線に基づいて算出した。既述のように精製したＧ−ＣａＭＰ７蛋白質はＫＭバッファーで最終濃度が０．３μＭとなるように希釈した。蛍光強度測定には、蛍光分光光度計Ｆ−２５００（Ｈｉｔａｃｈｉ）を用い４７０ｎｍで励起し５１０ｎｍで蛍光を記録した。まず測定標品に２０ｍＭ  ＢＡＰＴＡ（（Ｄｏｊｉｎｄｏ））を添加してカルシウム非存在下における測定を行った後、逐次ＣａＣｌ２をさまざまな濃度になるように添加して測定した。測定は室温にて行った。
【００８５】
（Ｂ−２）ＨｅＬａ細胞の培養とプラスミドの導入
炭酸ガス培養器を用いて、培地（ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）、１ｘペニシリン・ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ））にてＨｅＬａ細胞を摂氏３７度で培養し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて培養細胞にｐＮ１−ＧＣａＭＰ７のプラスミドを導入した。導入操作は試薬のマニュアルに従って行った。まず、血清を含まないＤＭＥＭ５０μｌでプラスミド０．８μｇを希釈した。次に２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を血清を含まないＤＭＥＭ５０μｌに加え室温で５分放置した。その後両希釈液を混合して室温で２０分放置した。この混合液の全量を２４穴培養シャーレ中のＨｅＬａ細胞に投与してプラスミドを導入した。プラスミドを導入した後細胞は摂氏３７度で１〜３日培養した。
【００８６】
（Ｂ−３）ＨｅＬａ細胞での蛍光測定
蛍光測定にはコンピューターにて制御（アクアコスモス（浜松ホトニクス））されたＣＣＤカメラ（ＯＲＣＡ−ＥＲ、浜松ホトニクス）を搭載した倒立蛍光顕微鏡（ＩＸ７０（オリンパス）、ＮＩＢＡフィルターセット（オリンパス）、対物レンズ２０ｘまたは４０ｘ（オリンパス））を用いた。プラスミドを導入した細胞を顕微鏡にセットし、ＨＢＳバッファー（１０７ｍＭ  NａＣｌ、６ｍＭ  ＫＣｌ、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４（ナカライテスク）、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ナカライテスク）、１１．５ｍＭ  ｇｌｕｃｏｓｅ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｄｏｊｉｎｄｏ）（ｐＨ７．４））を細胞外液として還流し、１００μＭ  ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ）を細胞外に投与して細胞を刺激し、その際に起こる細胞内カルシウム濃度変化を蛍光強度変化として検出した。測定は室温にて行った。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明は、筋肉の収縮、神経興奮性やホルモン分泌、酵素活性の変化などの各種の細胞機能の調節因子として、生体機能の維持および調節に不可欠な役割を担っているカルシウム濃度の生体内での変動を、従来のものに比べ極めて高感度で測定するカルシウムセンサー蛋白質を提供するもので、その利用価値は高く、生体機序の解明や医学・創薬といった分野に大きく貢献するものである。
【図３】
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【図４】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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