(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験サンプル中のＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８型を増幅するためのプライマーセットであって、
（ａ）配列番号１、配列番号２および配列番号３またはそれらの相補体の配列を有する３個のフォワードプライマー、ならびに
（ｂ）配列番号４および配列番号５またはその相補体の配列を有する２個のリバースプライマー
を含む、プライマーセット。
【請求項２】
試験サンプル中のＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８型を検出するためのプライマーおよびプローブセットであって、
（ａ）配列番号１、配列番号２および配列番号３またはそれらの相補体の配列を有する３個のフォワードプライマー、および配列番号４および配列番号５またはその相補体の配列を有する２個のリバースプライマー、ならびに
（ｂ）配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１、またはそれらの相補体の配列を有する１４個のプローブ
を含む、プライマーおよびプローブセット。
【請求項３】
試験サンプル中のＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８型の１以上を検出するための方法であって、
（ａ）配列番号１、配列番号２および配列番号３またはそれらの相補体の配列を有する３個のフォワードプライマー、ならびに配列番号４および配列番号５またはその相補体の配列を有する２個のリバースプライマーと試験サンプルとを、第１標的配列を生成する増幅条件下で接触させる工程、ならびに
（ｂ）第１標的配列と、該試験サンプル中のＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８型の１以上の存在の指標としての１４個のプローブとの間のハイブリダイゼーションを検出する工程であって、該１４個のプローブが、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１、またはそれらの相補体の配列を有する工程、
を含む、方法。
【請求項４】
それぞれのプローブが検出可能標識で標識されている、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
検出可能標識が、それぞれのプローブの５’末端に結合した蛍光部分を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
それぞれのプローブが更に、その３’末端に結合した消光部分を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
更に、
（ａ）配列番号６またはその相補体の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号７またはその相補体の配列を有するリバースプライマーと試験サンプルとを、第２標的配列を生成する増幅条件下で接触させる工程、ならびに
（ｂ）第２標的配列と、該試験サンプル中のヒトベータグロビンの存在の指標としての配列番号２２またはその相補体の配列を有するプローブとの間のハイブリダイゼーションを検出する工程
を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
試験サンプル中のＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８型を検出するためのキットであって、
（ａ）配列番号１、配列番号２および配列番号３またはそれらの相補体の配列を有する３個のフォワードプライマー、
（ｂ）配列番号４および配列番号５またはその相補体の配列を有する２個のリバースプライマー、
（ｃ）増幅試薬、ならびに
（ｄ）配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１、またはそれらの相補体の配列を有するプローブ
を含む、キット。
【請求項９】
試験サンプル中のＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８型を検出するためのプライマーおよびプローブキットであって、
（ａ）配列番号１、配列番号２および配列番号３またはそれらの相補体の配列を有する３個のフォワードプライマー、および配列番号４および配列番号５またはその相補体の配列を有する２個のリバースプライマー、
（ｂ）配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１、またはそれらの相補体の配列を有する１４個のプローブ、および
（ｃ）増幅試薬
を含む、プライマーおよびプローブキット。
【請求項１０】
キットが更に、試験サンプル中のヒトベータグロビンを検出するための、配列番号６またはその相補体の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号７またはその相補体の配列を有するリバースプライマーと、配列番号２２またはその相補体の配列を有するプローブとを含む、請求項９に記載のプライマーおよびプローブキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試験サンプル中のヒトパピローマウイルス、ヒトベータグロビン配列およびヒトパピローマウイルスおよびヒトベータグロビン配列を検出するためのプライマー、プローブ、プライマーセット、プライマーおよびプローブセット、方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
パピローマウイルスは、ヒトおよび動物の皮膚および粘膜に感染するＤＮＡウイルスである。約１３０の型のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）が特定されており、そのうちの３０〜４０の型は性的接触により伝染し、肛門性器領域に感染する。これらのＨＰＶ型のなかには性器疣贅を引き起こすものもあれば、顕著な感染徴候を何ら引き起こさないものもある。少なくとも１４のＨＰＶ型、すなわち、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８型が、子宮頚癌に対する高いリスクに関連づけられている。これらの高リスク型ＨＰＶの検出は子宮頚癌の予防において重要である。
【０００３】
全てのＨＰＶ型のゲノムは同様に組織化されている。幾つかの初期（Ｅ）および後期（Ｌ）タンパク質が特異的にコードされている。ＤＮＡ複製にはＥ１およびＥ２タンパク質が要求される。上皮の上層におけるウイルスゲノムの複製にはＥ４およびＥ５タンパク質が要求される。Ｅ６およびＥ７タンパク質は発癌性であり、細胞を不死化するよう及びゲノム不安定性を誘導するよう協同的に働く。Ｌ１およびＬ２タンパク質はウイルスカプシドを形成し、上皮の上層において感染の後期に発現される。ゲノムのもう１つの部分、すなわち、長制御領域（ｌｏｎｇ−ｃｏｎｔｒｏｌ−ｒｅｇｉｏｎ）（ＬＣＲ）は、ウイルスゲノムの適切な複製およびウイルス遺伝子の発現に必要な調節性ＤＮＡ配列のほとんどを含有する。
【０００４】
高リスク型ＨＰＶを検出するための種々の方法が案出されている。多数はＨＰＶゲノム内の特有の配列の検出に基づくものである。例えば、ＨＰＶ  ３５型の遺伝子の一部に相補的なＤＮＡまたはＲＮＡプローブが、例えば米国特許第４，８４９，３３２号に、試験サンプル中のこのＨＰＶ型の存在に関するスクリーニングにおいて有用であると記載されている。発癌性ＨＰＶ型を検出するのに有用な他のプローブ配列が米国特許第６，２６５，１５４号に開示されている。米国特許第５，７０５，６２７号は、縮重または混合コンセンサスプライマーを使用してＨＰＶ  ＤＮＡを増幅し検出するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用、およびそれに続く、遺伝子型特異的ＤＮＡプローブの混合物を使用する型判別を教示している。コンセンサスプライマーを使用する他の例は米国特許第５，３６４，７５８号およびＫｌｅｔｅｒ，Ｂ．ら，Ａｍ．Ｊ．ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９８，１５３（６）：１７３１−３９に見出されうる。さらに、当技術分野で公知の方法の多くは、試験サンプル中のヒトベータグロビン配列を検出することをも含む。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第４，８４９，３３２号明細書
【特許文献２】米国特許第６，２６５，１５４号明細書
【特許文献３】米国特許第５，７０５，６２７号明細書
【特許文献４】米国特許第５，３６４，７５８号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋｌｅｔｅｒ，Ｂ．ら，Ａｍ．Ｊ．ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９８，１５３（６）：１７３１−３９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前記のとおり、高リスクＨＰＶ型を検出するための種々の方法が当技術分野で公知である。そのような方法が存在するにもかかわらず、（１）単一反応において複数のＨＰＶ遺伝子型を検出しうると同時に或る特異的遺伝子型の検出を他の遺伝子型の検出から識別しうる、（２）ＨＰＶ型間の交差反応を全く示さない、（３）確固たる臨床感受性および特異性をもたらす、ならびに（４）ハイスループットおよび効率的処理をもたらす新規方法が当技術分野で必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
概括
１つの実施形態においては、本発明は、試験サンプル中のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８型を増幅するためのプライマーに関する。該プライマーは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５およびそれらの相補体よりなる群から選択される配列を有する。
【０００９】
もう１つの実施形態においては、本発明は、試験サンプル中のＨＰＶ  １６、１８、３１、３５、３９、４５、５１、５２、５８、５９または６６型を検出するためのプローブに関する。該プローブは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０およびそれらの相補体よりなる群から選択される配列を有する。
【００１０】
さらにもう１つの実施形態においては、本発明は、試験サンプル中のヒトベータグロビン配列を増幅するためのプライマーに関する。該プライマーは、配列番号６、配列番号７、配列番号６の相補体、配列番号７の相補体またはそれらのいずれかの組合せの配列を有する。
【００１１】
さらにもう１つの実施形態においては、本発明は、試験サンプル中のヒトベータグロビン配列を検出するためのプローブに関する。該プローブは配列番号２２またはその相補体の配列を有する。
【００１２】
さらにもう１つの実施形態においては、本発明は、試験サンプル中のＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８型を増幅するためのプライマーセットに関する。該プライマーセットは以下のものを含む：
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、それらの相補体およびそれらのいずれかの組合せよりなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのフォワードプライマー、ならびに
（ｂ）配列番号４、配列番号５、それらの相補体およびそれらのいずれかの組合せよりなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリバースプライマー。
【００１３】
特に、前記プライマーセットは、配列番号１、配列番号２および配列番号３またはそれらの相補体の配列を有するフォワードプライマーを含みうる。前記プライマーセットは、配列番号４および配列番号５またはそれらの相補体の配列を有するリバースプライマーを含みうる。あるいは、該プライマーセットは、配列番号１、配列番号２および配列番号３またはそれらの相補体の配列を有するフォワードプライマーと、配列番号４および配列番号５またはそれらの相補体の配列を有するリバースプライマーとを含みうる。
【００１４】
さらにもう１つの実施形態においては、本発明は、試験サンプル中のＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８型を検出するためのプライマーおよびプローブセットに関する。該プライマーおよびプローブセットは、
（ａ）配列番号１、配列番号２および配列番号３またはそれらの相補体の配列を有する３個のフォワードプライマー、ならびに配列番号４および配列番号５またはそれらの相補体の配列を有する２個のリバースプライマーと、
（ｂ）配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１またはそれらの相補体の配列を有する１４個のプローブとを含む。
【００１５】
さらにもう１つの実施形態においては、本発明は、試験サンプル中のヒトベータグロビンを検出するためのプライマーおよびプローブセットに関する。該プライマーおよびプローブセットは、
（ａ）配列番号６またはその相補体の配列を有するフォワードプライマー、および配列番号７またはその相補体の配列を有するリバースプライマーと、
（ｂ）配列番号２２またはその相補体の配列を有するプローブとを含む。
【００１６】
さらにもう１つの実施形態においては、本発明は、試験サンプル中のＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８型の１以上を検出するための方法に関する。該方法は、
（ａ）配列番号１、配列番号２および配列番号３またはそれらの相補体の配列を有する３個のフォワードプライマーならびに配列番号４および配列番号５またはそれらの相補体の配列を有する２個のリバースプライマーと試験サンプルを、第１標的配列を生成する増幅条件下で接触させ、
（ｂ）第１標的配列と、該試験サンプル中のＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８型の１以上の存在の指標としての少なくとも１つのプローブとの間のハイブリダイゼーションを検出する工程を含み、ここで、該プローブは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１またはそれらの相補体の配列を有する。
【００１７】
前記方法において、該増幅条件は、適当な増幅試薬の存在下で行われる増幅反応に該試験サンプルを付すことを含む。また、該増幅反応は、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ（限定的なものではないが例えばＴａｑ−Ｍａｎ（登録商標）アッセイ）または逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用することを含みうる。
【００１８】
前記方法において、少なくとも１つのプローブは、検出可能な標識で標識されている。当技術分野で公知のとおり、該検出可能標識は少なくとも１つのプローブに直接的に結合されうる。あるいは、該検出可能標識は少なくとも１つのプローブに間接的に結合されうる。さらに、該検出可能標識は直接的に検出可能でありうる。あるいは、該検出可能標識は間接的に検出可能でありうる。例えば、該検出可能標識は、少なくとも１つのプローブの５’末端に結合した蛍光部分を含みうる。さらに、少なくとも１つのプローブは更に、その３’末端に結合した消光部分を含みうる。
【００１９】
また、前記方法は更に、
（ａ）配列番号６またはその相補体の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号７またはその相補体の配列を有するリバースプライマーと試験サンプルを、第２標的配列を生成する増幅条件下で接触させ、
（ｂ）第２標的配列と、該試験サンプル中のヒトベータグロビンの存在の指標としての配列番号２２またはその相補体の配列を有するプローブとの間のハイブリダイゼーションを検出する工程を含みうる。
【００２０】
さらにもう１つの実施形態においては、本発明は、試験サンプル中のＨＰＶ  １６型、１８型またはＨＰＶ  １６型および１８型の両方を検出する、および／または識別するための方法に関する。該方法は、
（ａ）配列番号１、配列番号２および配列番号３またはそれらの相補体の配列を有する３個のフォワードプライマーならびに配列番号４および配列番号５またはそれらの相補体の配列を有する２個のリバースプライマーと試験サンプルを、第１標的配列を生成する増幅条件下で接触させ、
（ｂ）第１標的配列と以下のもの：
（ｉ）ＨＰＶ  １６型の存在の指標としての配列番号８またはその相補体の配列を有する第１プローブ（第１プローブは第１検出可能標識で標識されている。）、
（ｉｉ）ＨＰＶ  １８型の存在の指標としての配列番号９またはその相補体の配列を有する第２プローブ（第２プローブは第２検出可能標識で標識されており、さらに、第２検出可能標識は、第１検出可能標識とは異なる検出可能標識である。）、
（ｉｉｉ）ＨＰＶ  ３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６または６８型の存在の指標としての配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１またはそれらの相補体の配列を有する１以上の追加的プローブ（そのような１以上の追加的プローブのそれぞれは同一の第３検出可能標識で標識されており、さらに、第３検出可能標識は、第１検出可能標識および第２検出可能標識とは異なる検出可能標識である。）との間のハイブリダイゼーションを検出する工程を含む。
【００２１】
前記方法において、該増幅条件は、適当な増幅試薬の存在下で行われる増幅反応に該試験サンプルを付すことを含む。また、該増幅反応は、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ（限定的なものではないが例えばＴａｑ−Ｍａｎ（登録商標）アッセイ）またはＲＴ−ＰＣＲを使用することを含みうる。
【００２２】
さらにもう１つの実施形態においては、本発明は、試験サンプル中のヒトベータグロビンを検出するための方法に関する。該方法は、
（ａ）配列番号６またはその相補体の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号７またはその相補体の配列を有するリバースプライマーと試験サンプルを、第１標的配列を生成する増幅条件下で接触させ、
（ｂ）第１標的配列と、該試験サンプル中のヒトベータグロビンの存在の指標としての配列番号２２またはその相補体の配列を有するプローブとの間のハイブリダイゼーションを検出する工程を含みうる。
【００２３】
前記方法において、該増幅条件は、適当な増幅試薬の存在下で行われる増幅反応に該試験サンプルを付すことを含む。また、該増幅反応は、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ（限定的なものではないが例えばＴａｑ−Ｍａｎ（登録商標）アッセイ）またはＲＴ−ＰＣＲを使用することを含みうる。
【００２４】
前記方法において、少なくとも１つのプローブは、検出可能な標識で標識されている。該検出可能標識は少なくとも１つのプローブに直接的に結合されうる。あるいは、該検出可能標識は少なくとも１つのプローブに間接的に結合されうる。さらに、該検出可能標識は直接的に検出可能でありうる。あるいは、該検出可能標識は間接的に検出可能でありうる。例えば、該検出可能標識は、少なくとも１つのプローブの５’末端に結合した蛍光部分を含みうる。さらに、少なくとも１つのプローブは更に、その３’末端に結合した消光部分を含みうる。
【００２５】
また、前記方法は更に、
（ａ）配列番号１、配列番号２および配列番号３またはそれらの相補体の配列を有する３個のフォワードプライマーならびに配列番号４および配列番号５またはそれらの相補体の配列を有する２個のリバースプライマーと試験サンプルを、第２標的配列を生成する増幅条件下で接触させ、
（ｂ）第２標的配列と、該試験サンプル中のＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８型の１以上の存在の指標としての配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１またはそれらの相補体の配列を有する少なくとも１つのプローブとの間のハイブリダイゼーションを検出する工程を含む。
【００２６】
さらにもう１つの態様においては、本発明は、試験サンプル中のＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８型を検出するためのキットに関する。該キットは、
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、それらの相補体およびそれらのいずれかの組合せよりなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのフォワードプライマー、
（ｂ）配列番号４、配列番号５、それらの相補体およびそれらのいずれかの組合せよりなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリバースプライマー、ならびに
（ｃ）増幅試薬を含む。
【００２７】
前記キットは更に、少なくとも１つのプローブをも含むことが可能であり、ここで、少なくとも１つのプローブは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１またはそれらの相補体よりなる群から選択される。
【００２８】
前記キットは更に、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１またはそれらの相補体の配列を有するプローブを含む。
【００２９】
さらにもう１つの態様においては、本発明は、試験サンプル中のＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８型を検出するためのプライマーおよびプローブキットに関する。該キットは、
（ａ）配列番号１、配列番号２および配列番号３またはそれらの相補体の配列を有する３個のフォワードプライマーならびに配列番号４および配列番号５またはそれらの相補体の配列を有する２個のリバースプライマー、
（ｂ）配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１またはそれらの相補体の配列を有する１４個のプローブ、ならびに
（ｃ）増幅試薬を含む。
【００３０】
前記キットは更に、試験サンプル中のヒトベータグロビンを検出するための、配列番号６またはその相補体の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号７またはその相補体の配列を有するリバースプライマーと、配列番号２２またはその相補体の配列を有するプローブとを含みうる。
【００３１】
さらにもう１つの態様においては、本発明は、試験サンプル中のヒトベータグロビンを検出するためのプライマーおよびプローブキットに関する。該キットは、
（ａ）配列番号６またはその相補体の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号７またはその相補体の配列を有するリバースプライマー、
（ｂ）配列番号２２またはその相補体の配列を有するプローブ、ならびに
（ｃ）増幅試薬を含む。
【００３２】
前記キットは更に、
（ｄ）配列番号１、配列番号２および配列番号３またはそれらの相補体の配列を有する３個のフォワードプライマーならびに配列番号４および配列番号５またはそれらの相補体の配列を有する２個のリバースプライマー、ならびに
（ｅ）試験サンプル中のＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８型を検出するための配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１またはそれらの相補体の配列を有する１４個のプローブを含みうる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、実施例４に記載されているとおり、培養ＨＰＶ陽性細胞系からのスパイク化（ｓｐｉｋｅｄ）細胞の量とベータグロビンシグナルとの間の関係、および１２０６個の患者子宮頚試料の集団に関するベータグロビンサイクル数の分布を示す。
【図２】図２は、実施例４に記載されているとおり、１２０６個の患者子宮頚試料の集団に関するベータグロビンサイクル数の分布を示す。前記図１に記載されている関係に関する四分位点。
【図３Ａ】図３Ａは、実施例５に記載されているとおり、配列番号１〜５を含むプライマー混合物とＧＰ５＋およびＧＰ６＋プライマー（配列番号２３〜２４）との分析性能の比較を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、実施例５に記載されているとおり、配列番号１〜５を含むプライマー混合物とＧＰ５＋およびＧＰ６＋プライマー（配列番号２３〜２４）との分析性能の比較を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、実施例５に記載されているとおり、配列番号１〜５を含むプライマー混合物とＧＰ５＋およびＧＰ６＋プライマー（配列番号２３〜２４）との分析性能の比較を示す。
【図３Ｄ】図Ｄは、実施例５に記載されているとおり、配列番号１〜５を含むプライマー混合物とＧＰ５＋およびＧＰ６＋プライマー（配列番号２３〜２４）との分析性能の比較を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、実施例５に記載されているとおり、ＨＰＶ  １６、１８、３１、５２および５９型に特異的な本発明のプローブ（配列番号８〜１０、１６および１９）と米国特許第６，２６５，１５４Ｂ１号に開示されている同一ＨＰＶ型に関するプローブ配列との分析性能の比較を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、実施例５に記載されているとおり、ＨＰＶ  １６、１８、３１、５２および５９型に特異的な本発明のプローブ（配列番号８〜１０、１６および１９）と米国特許第６，２６５，１５４Ｂ１号に開示されている同一ＨＰＶ型に関するプローブ配列との分析性能の比較を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、実施例５に記載されているとおり、ＨＰＶ  １６、１８、３１、５２および５９型に特異的な本発明のプローブ（配列番号８〜１０、１６および１９）と米国特許第６，２６５，１５４Ｂ１号に開示されている同一ＨＰＶ型に関するプローブ配列との分析性能の比較を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、実施例５に記載されているとおり、ＨＰＶ  １６、１８、３１、５２および５９型に特異的な本発明のプローブ（配列番号８〜１０、１６および１９）と米国特許第６，２６５，１５４Ｂ１号に開示されている同一ＨＰＶ型に関するプローブ配列との分析性能の比較を示す。
【図４Ｅ】図４Ｅは、実施例５に記載されているとおり、ＨＰＶ  １６、１８、３１、５２および５９型に特異的な本発明のプローブ（配列番号８〜１０、１６および１９）と米国特許第６，２６５，１５４Ｂ１号に開示されている同一ＨＰＶ型に関するプローブ配列との分析性能の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
詳細な説明
本発明は、試験サンプル中のＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８型を増幅および／または検出するために使用されうるプライマー、プローブ、プライマーセットならびにプライマーおよびプローブセットに関する。本発明はまた、本明細書にのプライマーおよびプローブセットを使用する試験サンプル中のＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８型の検出方法に関する。さらに、本発明はまた、試験サンプル中のヒトベータグロビン配列を増幅および／または検出するために使用されうるプライマー、プローブならびにプライマーおよびプローブセットに関する。試験サンプル中のヒトベータグロビンを増幅および／または検出するために使用されるプライマーおよびプローブは、ＨＰＶアッセイにおける内部対照アンプリコンを生成させるために使用されうる。さらに、本発明はまた、本明細書にのプライマーおよびプローブセットを使用する試験サンプル中のヒトベータグロビン配列の検出方法に関する。本発明はまた、試験サンプル中のＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８型ならびに／またはヒトベータグロビン配列を検出するためのキットに関する。
【００３５】
本発明のプライマーおよびプローブセットは確固たる臨床感度および特異性をもたらす。また、本明細書にのプライマーおよびプローブセットはＨＰＶ型間の交差反応性を全く示さない。さらに、本発明のプライマーおよびプローブセットは単一反応において複数のＨＰＶ遺伝子型を検出しうると同時に、ある遺伝子型の検出を他の遺伝子型の検出から識別（例えば、部分的遺伝子型判別）しうる。最後に、本発明のプライマーおよびプローブセットはハイスループットおよび効率的処理をもたらす。
【００３６】
Ａ．定義
本明細書中で用いる単数形表現は、文脈に矛盾しない限り、複数形対応物を含む。本明細書における数的範囲の列挙に関しては、同程度の精度でその間に介在する各数字が明らかに含まれる。例えば、範囲６〜９の場合には、６および９に加えて７および８の数字が含まれ、範囲６．０〜７．０の場合には、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９および７．０の数字が明らかに含まれる。
【００３７】
ａ）アンプリコン
本明細書中で用いる「アンプリコン」なる語は天然または人工増幅反応の産物を意味する。アンプリコンの一例は、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、競合ＲＴ−ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ギャップＬＣＲ、鎖置換（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）増幅（ＳＤＡ）、核酸配列に基づく（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ）増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）増幅（ＴＭＡ）などにより産生されたＤＮＡまたはＲＮＡ産物（通常は遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡのセグメント）である。
【００３８】
ｂ）増幅、増幅方法または増幅反応
本明細書中で用いる「増幅」、「増幅方法」または「増幅反応」は本明細書において互換的に用いられ、試験サンプル中の特異的核酸（全てのタイプのＤＮＡまたはＲＮＡ）配列（例えば、標的配列または標的核酸）の集団の呈示量を増加させるための方法またはプロセスを意味する。本発明において用いられうる増幅方法の具体例には、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、競合ＲＴ−ＰＣＲ、ＬＣＲ、ギャップＬＣＲ、ＳＤＡ、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡなど（それらの全ては当業者に公知である。）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
ｃ）増幅条件
本明細書中で用いる「増幅条件」なる語は、プライマー配列のアニーリングおよび／または伸長を促進する条件を意味する。そのような条件は当業者によく知られており、選択される増幅方法に左右される。例えば、ＰＣＲ増幅条件は、一般に、サーマルサイクリング（加熱サイクル循環）、例えば、２以上の温度の間の反応混合物のサイクリングを含む。等温増幅反応においては、反応を開始させるために初期温度上昇が必要かもしれないが、増幅は、サーマルサイクリングを伴わずに生じる。増幅条件は、温度および温度サイクリング、バッファー、塩、イオン強度、ｐＨなど（これらに限定されるものではない。）を含む全ての反応条件を含む。
【００４０】
ｄ）増幅試薬
本明細書中で用いる「増幅試薬」なる語は、増幅反応において使用される試薬を意味し、バッファー、試薬、逆転写および／またはポリメラーゼ活性またはエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素；酵素補因子、例えばマグネシウムまたはマンガン、塩；ならびにデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、例えばデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）およびデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）（これらに限定されるものではない。）を含みうる。増幅試薬は、用いられる増幅方法に応じて当業者により容易に選択されうる。
【００４１】
ｅ）直接的に検出可能および間接的に検出可能
本明細書中で検出可能標識または検出可能部分に関して用いられる場合の「直接的に検出可能」なる語は、該検出可能標識または検出可能部分が、検出可能となるために更なる反応または操作を要しないことを意味する。例えば、蛍光部分は蛍光分光法により直接的に検出可能である。これに対して、本明細書中で検出可能標識または検出可能部分に関して用いられる場合の「間接的に検出可能」なる語は、該検出可能標識または検出可能部分が、更なる反応または操作の後で検出可能となることを意味する。例えば、ハプテンは、蛍光色素のようなレポーターに結合した適当な抗体との反応の後で検出可能となる。
【００４２】
ｆ）発蛍光団、蛍光部分、蛍光標識または蛍光色素
「発蛍光団」、「蛍光部分」、「蛍光標識」および「蛍光色素」なる語は本明細書においては互換的に用いられ、１つの波長の電磁放射の量子を吸収し、それに応答して異なる波長、典型的にはより長い波長の１以上の光子を放出する分子を意味する。多種多様な構造および特徴の多数の蛍光色素が本発明の実施における使用に適している。核酸分子を蛍光標識するための方法および物質は公知である（Ｒ．Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  １９９２−１９９４”，５ｔｈ  Ｅｄ．，１９９４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．を参照されたい。）。好ましくは、蛍光標識または部分は高い効率で光を吸収し放出し（例えば、用いられる励起波長における高いモル吸収係数および高い蛍光量子収率を示し）、光安定性を示す（例えば、分析を行うのに必要な時間内に光励起に際して有意な分解を受けない。）。それ自体が直接的に検出可能である代わりに、幾つかの蛍光色素は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）と称される過程において、エネルギーを別の蛍光色素に転移し、その第２の色素が検出シグナルを生成する。そのようなＦＲＥＴ蛍光色素ペアも「蛍光部分」なる語に含まれる。物理的に連結された蛍光レポーター／消光剤部分も本発明の範囲内である。これらの態様においては、該蛍光レポーターおよび消光剤部分が、例えばプローブの末端において、接近して維持されている場合、該消光剤部分は該レポーター部分からの蛍光シグナルの検出を妨げる。それらの２つの部分が、例えばＤＮＡポリメラーゼによる切断の後に、物理的に分離されると、該レポーター部分からの蛍光シグナルが検出可能となる。
【００４３】
ｇ）ハイブリダイゼーション
本明細書中で用いる「ハイブリダイゼーション」なる語は、ワトソン−クリック塩基対形成または非カノニカル塩基対形成により複合体を形成するのに十分な程度に相補的である核酸配列の間の複合体の形成を意味する。例えば、プライマーが標的配列（鋳型）に「ハイブリダイズ」する場合、そのような複合体（またはハイブリッド）は、ＤＮＡ合成を開始するために例えばＤＮＡポリメラーゼにより要求されるプライミング機能を発揮するのに十分な程度に安定である。ハイブリダイズする配列は、安定なハイブリッドを形成するために完全な相補性を有する必要はない、と当業者に理解されるであろう。多くの場合、塩基の約１０％未満がミスマッチ状態である場合に、安定なハイブリッドが生じるであろう。したがって、本明細書中で用いる「相補的」なる語は、アッセイ条件下、対応相補体と安定な二重鎖を形成するオリゴヌクレオチドに関するものであり、一般に約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％以上の相同性が存在する場合を意味する。少なくとも所望のレベルの相補性を有する配列が安定にハイブリダイズする一方で、より低い相補性を有する配列は安定にハイブリダイズしないような、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを推定し調節する方法は、当業者に理解されている。ハイブリダイゼーション条件およびパラメーターの具体例は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，１９８９，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ：Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，１９９４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：Ｓｅｃａｕｃｕｓ，ＮＪに見出されうる。
【００４４】
ｈ）標識（された）、または検出可能標識で標識（された）
本明細書中で用いる「標識（された）」および「検出可能標識（または物質もしくは部分）で標識（された）」なる語は本明細書において互換的に用いられ、物体（例えば、プライマーまたはプローブ）が、例えば別の物体（例えば、増幅産物またはアンプリコン）への結合の後で、可視化されうることを意味する。好ましくは、該検出可能標識は、測定されうるシグナルをそれが生成するように、そしてその強度が結合物体の量に関連づけられる（例えば、比例する）ように選択される。核酸分子（例えば、プライマーおよびプローブ）を標識および／または検出するための多種多様な系が当技術分野でよく知られている。標識核酸は、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、化学的な又はその他の手段により直接的または間接的に検出可能である標識の取り込み又は該標識への結合により調製されうる。適当な検出可能物質には、放射性核種、発蛍光団、化学発光物質、微粒子、酵素、比色標識、磁気標識、ハプテン、モレキュラービーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ）、アプタマービーコンなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４５】
ｉ）プライマー
「プライマー」なる語は、ヌクレオチドおよび核酸重合のための物質（例えば、ＤＮＡ依存性またはＲＮＡ依存性ポリメラーゼ）の存在下、適当な増幅条件（例えば、バッファー、塩、温度およびｐＨ）下に配置された場合に、核酸（全てのタイプのＤＮＡまたはＲＮＡ）の相補鎖であるプライマー伸長産物の合成の開始点として作用しうるオリゴヌクレオチドを意味する。該プライマーは一本鎖または二本鎖でありうる。二本鎖の場合、該プライマーを、伸長産物を調製するために使用する前に、まず、その鎖の分離を可能にするために処理する（例えば、変性させる）ことが可能である。そのような変性工程は、典型的には、熱を用いて行われるが、別法として、アルカリの使用およびそれに続く中和により行われうる。本発明のプライマーは、約１５〜５０ヌクレオチド長、好ましくは約２０〜約４０ヌクレオチド長、最も好ましくは約２２〜３０ヌクレオチド長の長さを有する。本発明のプライマーは、本明細書に更に詳しく記載されているものに加えて、追加的なヌクレオチドを含有しうる。例えば、ＳＤＡにおいて使用されるプライマーは、標的結合配列の５’側に制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むことが可能であり（米国特許第５，２７０，１８４号および第５，４５５，１６６号を参照されたい。）、ＮＡＳＢＡおよびＴＭＡプライマーは、該プライマーの標的結合配列に連結されたＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むことが可能である。そのような特殊化配列を、選択される増幅反応において使用される標的結合配列に連結するための方法は、当業者によく知られている。また、ある場合には、プライマーは検出可能標識で標識されうる。
【００４６】
「フォワードプライマー」なる語は、標的配列（例えば、鋳型鎖）にハイブリダイズ（またはアニール）するプライマーを意味する。「リバースプライマー」なる語は、標的配列の相補鎖にハイブリダイズ（またはアニール）するプライマーを意味する。フォワードプライマーは、リバースプライマーに対して５’側で、標的配列にハイブリダイズする。
【００４７】
ｊ）プライマーセット
本明細書中で用いる「プライマーセット」なる語は、関心のある標的配列または標的核酸（例えば、ＨＰＶ内の標的配列）の増幅を、一緒になってプライミングしうる２以上のプライマーを意味する。ある実施形態においては、「プライマーセット」なる語は、増幅すべき標的配列または標的核酸の５’末端にハイブリダイズする５’（上流）プライマー（またはフォワードプライマー）と、増幅すべき標的配列または標的核酸の相補体にハイブリダイズする３’（下流）プライマー（またはリバースプライマー）とを含む、プライマーのペアを意味する。そのようなプライマーセットまたはプライマーペアはＰＣＲ増幅反応において特に有用である。
【００４８】
ｋ）プローブ
本明細書中で用いる「プローブ」なる語は、適当な増幅条件下の標的配列の少なくとも一部（例えば、増幅された標的配列の一部）に選択的にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドを意味する。一般に、プローブ配列は、「相補的」（すなわち、コードまたはセンス鎖（＋）に相補的）または「逆相補的」（すなわち、アンチセンス鎖（−）に相補的）のいずれかであると認められる。本発明のプローブは、約１０〜５０ヌクレオチド、好ましくは約１２〜３５ヌクレオチド、最も好ましくは１４〜２５ヌクレオチドの長さを有する。ある場合には、プローブは検出可能標識で標識されうる。
【００４９】
ｌ）プライマーおよびプローブセット
本明細書中で用いる「プライマーおよびプローブセット」なる語は、標的配列または標的核酸の増幅を一緒になってプライミングしうる２以上のプライマーと、標的配列または標的核酸を検出しうる少なくとも１つのプローブとを含む組合せを意味する。該プローブは、一般に、増幅産物（またはアンプリコン）の鎖にハイブリダイズして、増幅産物／プローブハイブリッドを形成し、これは、当業者に公知の通常の技術を用いて検出されうる。
【００５０】
ｍ）標的配列または標的核酸
「標的配列」および「標的核酸」なる語は本明細書において互換的に用いられ、その存在または非存在の検出が望まれるものを意味する。本発明の文脈においては、標的配列は、好ましくは、１以上のプライマーが複合体を形成する核酸配列を含む。該標的配列は、適当な増幅条件下でプローブが安定なハイブリッドを形成する、プローブにハイブリダイズする領域をも含みうる。当業者に認識されるとおり、標的配列は一本鎖または二本鎖でありうる。本発明の文脈においては、関心のある標的配列はＨＰＶのＬ１領域内またはヒトベータグロビン遺伝子のオープンリーディングフレーム内に位置する。
【００５１】
ｎ）試験サンプル
本明細書中で用いる「試験サンプル」なる語は、一般に、関心のあるアナライト、例えばＨＰＶ、特にＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８型、ヒトベータグロビン配列またはそれらの組合せを含有することが疑われる及び／又は試験される生物学的物質を意味する。該試験サンプルは、いずれかの生物学的起源、例えば子宮頚、膣または肛門スワブまたはブラシ、あるいは生理的流体、例えば全血、血清、血漿、間質流体、唾液、眼水晶体液、脳脊髄液、汗、尿、乳、腹水、粘液、鼻水、喀痰、滑液、腹膜液、膣液、月経、羊水、精液など（これらに限定されるものではない。）に由来しうる。該試験サンプルは、生物学的起源から得られたままの状態で直接的に、あるいは該サンプルの特性を修飾するための前処理の後で使用されうる。例えば、そのような前処理は、血液から血漿を調製し、粘液を希釈することなどを含みうる。前処理の方法は、濾過、沈殿、希釈、蒸留、混合、濃縮、妨害成分の不活性化、試薬の添加、細胞溶解などをも含みうる。さらに、液体媒体を形成させるために又はアナライトを遊離させるために固体試験サンプルを修飾することも有益かもしれない。
【００５２】
Ｂ．プライマー、プローブならびにプライマーおよびプローブセット
１つの実施形態においては、本発明は、試験サンプル中のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８型を増幅するための１以上のプライマーに関する。そのような１以上のプライマーは、以下の表Ａに示す配列のいずれか、以下の表Ａに示すいずれかの配列の相補体ならびに以下の表Ａに示す配列および／またはそれらの相補体の組合せのいずれかを含む又はそれらよりなる配列を有するプライマーを含みうる。
【００５３】
【表１】
0005795259.tif 000002
【００５４】
１つの態様においては、本発明は、表Ａに記載されているプライマーの１以上を含有する、試験サンプル中のＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８型を増幅するためのプライマーセットに関する。特に、該プライマーセットは以下のものを含みうる：
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、それらの相補体（例えば、配列番号１、配列番号２または配列番号３の相補体の１以上）およびそれらのいずれかの組合せよりなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのフォワードプライマー、ならびに
（ｂ）配列番号４、配列番号５、それらの相補体（例えば、配列番号４または配列番号５の相補体の１以上）およびそれらのいずれかの組合せよりなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのリバースプライマー。
【００５５】
もう１つの実施形態においては、本発明は、試験サンプル中のＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８型を検出するための１以上のプローブに関する。そのような１以上のプローブは、以下の表Ｂに示す配列のいずれか、以下の表Ｂに示すいずれかの配列の相補体ならびに以下の表Ｂに示す配列および／またはそれらの相補体の組合せのいずれかを含む又はそれらよりなる配列を有するプローブを含みうる。例えば、そのような１以上のプローブは、以下の表Ｂに挙げられているただ１つのプローブ、または以下の表Ｂに挙げられているプローブの１つのただ１つの相補体（例えば、（ａ）配列番号８、（ｂ）配列番号１０の相補体、（ｃ）配列番号１２または（ｄ）配列番号２１）、以下の表Ｂに挙げられているプローブの全て（配列番号８〜２１）、以下の表Ｂに挙げられている全てのプローブの相補体（配列番号８〜２１の相補体）、あるいは以下の表Ｂに挙げられているプローブおよび／または以下の表Ｂに挙げられているプローブの相補体の組合せのいずれか（例えば、（ａ）配列番号１０および配列番号１６；（ｂ）配列番号８、配列番号９の相補体、配列番号１０、配列番号１５および配列番号２１；（ｃ）配列番号８の相補体、配列番号９の相補体および配列番号１６；（ｄ）配列番号１１、配列番号１７、配列番号１８の相補体および配列番号２０の相補体；（ｅ）配列番号８、配列番号９、配列番号１２の相補体、配列番号１４の相補体および配列番号２０；または（ｆ）配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０）でありうる。
【００５６】
【表２】
0005795259.tif 000003
【００５７】
もう１つの実施形態においては、本発明は、前記表Ａに記載されているプライマーの１以上と前記表Ｂに記載されているプローブの１以上とを含有する、試験サンプル中のＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８型を検出するためのプライマーおよびプローブセットに関する。例えば、該プライマーおよびプローブセットは以下のものを含みうる：
（ａ）配列番号１、配列番号２および配列番号３またはそれらの相補体の配列を有する少なくとも１つのフォワードプライマー、ならびに配列番号４および配列番号５またはそれらの相補体の配列を有する少なくとも１つのリバースプライマー、ならびに
（ｂ）配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１またはそれらの相補体の配列を有する少なくとも１つのプローブ。
【００５８】
好ましくは、該プライマーおよびプローブセットは、
（ａ）配列番号１、配列番号２および配列番号３またはそれらの相補体の配列を有する３個のフォワードプライマー、ならびに配列番号４および配列番号５またはそれらの相補体の配列を有する２個のリバースプライマーと、
（ｂ）配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１またはそれらの相補体の配列を有する１４個のプローブとをを含む。
【００５９】
さらにもう１つの実施形態においては、本発明は、試験サンプル中のヒトベータグロビン配列を増幅するためのプライマーに関する。そのような１以上のプライマーは、以下の表Ｃに示す配列のいずれか、以下の表Ｃに示すいずれかの配列の相補体ならびに以下の表Ｃに示す配列および／またはそれらの相補体の組合せのいずれかを含む又はそれらよりなる配列を有するプライマーでありうる。
【００６０】
【表３】
0005795259.tif 000004
【００６１】
さらにもう１つの実施形態においては、本発明は、試験サンプル中のヒトベータグロビン配列を検出するためのプローブに関する。該プローブは、ａｃｔｇｇｇｃａｔｇ  ｔｇｇａｇａｃａｇａ（配列番号２２）またはその相補体の配列を含む又はそれらよりなる配列を有する。
【００６２】
さらにもう１つの実施形態においては、本発明は、配列番号６、配列番号７、配列番号６の相補体および配列番号７の相補体よりなる群から選ばれる少なくとも２つのプライマーを含む、試験サンプル中の内因性ヒトベータグロビンを増幅するためのプライマーセットに関する。好ましくは、該プライマーセットは配列番号６および配列番号７を含む。
【００６３】
さらにもう１つの実施形態においては、本発明は、前記表Ｃに記載されているプライマーまたはそれらの相補体の１以上と配列番号２２またはその相補体の配列を有するプローブとを含有する、試験サンプル中の内因性ヒトベータグロビンを検出するためのプライマーおよびプローブセットに関する。例えば、該プライマーおよびプローブセットは、
（ａ）配列番号６、配列番号７、配列番号６の相補体または配列番号７の相補体の配列を有する少なくとも１つのプライマーと、
（ｂ）配列番号２２またはその相補体の配列を有するプローブとを含みうる。
【００６４】
好ましくは、該プライマーおよびプローブセットは、
（ａ）配列番号６またはその相補体の配列を有するフォワードプライマー、および配列番号７またはその相補体の配列を有するリバースプライマーと、
（ｂ）配列番号２２またはその相補体の配列を有するプローブとを含む。
【００６５】
試験サンプル中のヒトベータグロビンを増幅し検出するための前記のプライマーおよびプローブは、ＨＰＶアッセイにおける内部対照（ＩＣ）アンプリコンを得るために使用されうる。ＨＰＶアッセイにおけるヒトベータグロビンの検出は、細胞妥当性、サンプル抽出および増幅の有効性に関するサンプル妥当性対照として役立つ。より詳しくは、この内部対照は、各試験サンプルが正確なＨＰＶ検出のための十分な細胞投入を有し適切に加工されていることを証明するために役立ち、さらに、増幅のインヒビターが存在するかどうかを示す。
【００６６】
１以上のオリゴヌクレオチド類似体は、本発明のプライマーおよびプローブに基づいて製造されうる。そのような類似体は代替的構造、例えばペプチド核酸、すなわち「ＰＮＡ」（例えば、天然に存在する核酸のリン酸糖バックボーンの代わりにペプチド様バックボーンを有する分子）を含有しうる。これらの代替的構造も本発明に含まれる。同様に、本発明のプライマーおよびプローブは核酸塩基の欠失、付加および／または置換を含有しうると理解される。ただし、そのような改変はこれらの配列の特性に負の影響を及ぼすものであってはならない。特に、該改変は、本明細書にのプライマーおよびプローブのハイブリダイズ特性の有意な低下をもたらすべきではない。
【００６７】
本発明のプライマーおよびプローブは、当技術分野で公知の種々の方法のいずれかにより製造されうる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，１９８９，２．Ｓｕｐｐ．Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，１９９０，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ“Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ）”，１９９３，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；“ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ”，１９９５，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；および“Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，２００２，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編），５．Ｓｕｐｐ．Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：Ｓｅｃａｕｃｕｓ，  ＮＪを参照されたい。）。例えば、本明細書にのプライマーおよびプローブは、化学合成、および鋳型に基づく重合（例えば、Ｎａｒａｎｇら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，．１９７９，６８：９０−９８；Ｂｒｏｗｎら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９７９，６８：１０９−１５１およびＢｅｌｏｕｓｏｖら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９７，２５：３４４０−３４４４に記載されているとおり）により製造されうる。
【００６８】
例えば、プライマーおよびプローブは、ホスホロアミダイト法に基づく自動化固相法を用いて製造されうる。そのような方法においては、各ヌクレオチドは、３’末端において固体支持体に結合されている伸長中のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端に個々に付加される。該付加ヌクレオチドは、５’位においてジメトキシトリチル（またはＤＭＴ）基により保護された３価３’−ホスホロアミダイトの形態である。塩基誘発性ホスホルアミダイトカップリング後、５価ホスホトリエステル中間体を与える穏やかな酸化およびＤＭＴ除去はオリゴヌクレオチド伸長のための新たな部位をもたらす。ついで該プライマーまたはプローブを該固体支持体から切断し、該ホスホジエステルおよび環外アミノ基を水酸化アンモニウムで脱保護する。これらの合成は、オリゴ合成装置、例えばＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ＤｕＰｏｎｔ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）またはＭｉｌｌｉｇｅｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から商業的に入手可能なもので行われうる。あるいは、本発明のプライマーおよびプローブは、例えばＭｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）、ＢｉｏＳｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）およびその他多数を含む当技術分野でよく知られた種々の商業的入手元で特別に製造され注文されうる。
【００６９】
本発明のプライマーおよびプローブの精製は、必要な場合または望まれる場合には、当技術分野でよく知られている種々の方法のいずれかにより行われうる。プライマーおよびプローブの精製は、天然アクリルアミドゲル電気泳動、例えばＰｅａｒｓｏｎら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．，１９８３，２５５：１３７−１４９に記載されているアニオン交換ＨＰＬＣまたは逆相ＨＰＬＣ（ＭｃＦａｒｌａｎｄら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９７９，７：１０６７−１０８０を参照されたい。）。
【００７０】
該プライマーおよびプローブの配列は、化学分解（Ｍａｘａｍら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８０，６５：４９９−５６０を参照されたい。）、マトリックス支援レーザー脱着イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析（Ｐｉｅｌｅｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９３，２１：３１９１−３１９６を参照されたい。）（これらに限定されるものではない。）、アルカリホスファターゼおよびエキソヌクレアーゼ消化の組合せの後の質量分析（Ｗｕら．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００１，２９０：３４７−３５２）などを含む当技術分野で公知のいずれかの適当な配列決定方法を用いて確認されうる。
【００７１】
前記で既に記載したとおり、修飾プライマーおよびプローブは、当技術分野で公知の幾つかの手段のいずれかを用いて製造されうる。そのような修飾の非限定的な具体例には、メチル化、「キャップ（ｃａｐ）」、類似体による天然ヌクレオチドの１以上の置換、およびヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結を有するもの（例えば、メチルホスホナート、ホスホトリエステル、ホスホロアミダート、カルバマートなど）または荷電連結（例えば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアートなど）が含まれる。プライマーおよびプローブは、１以上の追加的な共有結合部分、例えばタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなど）、インターカレーター（例えば、アクリジン、プソラレンなど）、キレーター（例えば、金属、放射性金属、酸化性金属などをキレート化するためのもの）およびアルキレーターを含有しうる。プライマーおよびプローブは、メチルもしくはエチルホスホトリエステルまたはアルキルホスホルアミダート連結の形成により誘導体化されうる。さらに、本発明のプライマー、プローブまたはプライマーおよびプローブは検出可能標識によっても修飾されうる。
【００７２】
前記で言及されているとおり、本発明の或る実施形態においては、該プライマー、プローブまたは該プライマーおよびプローブの両方は、増幅／検出方法において使用される前に、検出可能標識または部分により標識されうる。好ましくは、本明細書にの方法において使用する場合、１以上のプローブが検出可能標識または部分により標識される。検出可能標識の役割は増幅標的配列（例えば、アンプリコン）の可視化および検出を可能にすることである。好ましくは、該検出可能標識は、測定されうるシグナルをそれが生成するように、そしてその強度が、分析される試験サンプル中の増幅産物の量に関連づけられる（例えば、比例する）ように選択される。
【００７３】
１以上のプローブと検出可能標識との間の結合は共有結合または非共有結合でありうる。標識プローブは、検出可能部分の取り込み、または検出可能部分への結合により製造されうる。標識は核酸配列に直接的または（例えば、リンカーを介して）間接的に結合されうる。種々の長さのリンカーまたはスペーサーアームが当技術分野で公知であり、商業的に入手可能であり、立体障害を軽減するように又は生じる標識分子に他の有用な若しくは所望の特性を付与するように選択されうる（例えば、Ｍａｎｓｆｉｅｌｄら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，１９９５，９：１４５−１５６を参照されたい。）。
【００７４】
プローブのようなオリゴヌクレオチドを標識するための方法は当業者に公知である。標識プロトコールおよび標識検出技術の総説は例えばＬ．Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００２，３９：１１４−１２９；ｖａｎ  Ｇｉｊｌｓｗｉｊｋら，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．，２００１，１：８１−９１；およびＪｏｏｓら，Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９４，３５：１３５−１５３に見出されうる。標準的な核酸標識方法には、放射性物質の取り込み、蛍光色素（Ｓｍｉｔｈら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８５，１３：２３９９−２４１２を参照されたい。）または酵素（Ｃｏｎｎｏｌｙら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１９８５，１３：４４８５−４５０２を参照されたい。）の直接的結合；核酸分子を免疫化学的に又は他のアフィニティー反応により検出可能にする該核酸分子の化学的修飾（Ｂｒｏｋｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９７８，５：３６３−３８４；Ｂａｙｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｎａｌｙｓｉｓ，１９８０，２６：１−４５；Ｌａｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１９８１，７８：６６３３−６６３７；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８３，１１：６１６７−６１８４；Ｂｒｉｇａｔｉら，Ｖｉｒｏｌ．，１９８３，１２６：３２−５０；Ｔｃｈｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８４，８１：３４６６−３４７０；Ｌａｎｄｅｇｅｎｔら，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，１９８４，１５：６１−７２；およびＡ．Ｈ．Ｈｏｐｍａｎら，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，１９８７，１６９：３５７−３６８を参照されたい。）；酵素媒介標識方法、例えばランダムプライミング、ニックトランスレーション、ＰＣＲおよびターミナルトランスフェラーゼによるテーリング（酵素標識に関する総説は、例えばＴｅｍｓａｍａｎｉら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９６，５：２２３−２３２を参照されたい。）が含まれる。
【００７５】
多種多様な検出可能標識のいずれかが本発明において使用されうる。適当な検出可能標識には、種々のリガンド、放射性核種（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ、１３１Ｉなど）；蛍光色素；化学発光物質（例えば、アクリジニウムエステル、安定化ジオキセタンなど）；分光的に分離可能な無機蛍光半導体ナノ結晶（例えば、量子ドット）、金属ナノ粒子（例えば、金、銀、銅および白金）またはナノクラスター；酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；比色標識（例えば、色素、コロイド金など）；磁気標識（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標））；ならびにビオチン、ジオキシゲニンまたは他のハプテンが含まれ（これらに限定されるものではない。）、抗血清またはモノクローナル抗体のためのタンパク質が利用可能である。
【００７６】
ある実施形態においては、本発明の検出プローブは蛍光標識される。多種多様な化学構造および物理特性の多数の公知蛍光標識部分が本発明の実施における使用に適している。適当な蛍光色素には、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡから入手可能なＱｕａｓａｒ（登録商標）色素、フルオレセインおよびフルオレセイン色素、例えばフルオレセインイソチオシアニンまたはＦＩＴＣ、ナフトフルオレセイン、４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシ−フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン（例えば、ＦＡＭ）、ＶＩＣ、ＮＥＤ、カルボシアニン、メロシアニン、シチリル色素、オキソノール色素、フコエリトリン、エリトロシン、エオシン、ローダミン色素（例えば、カルボキシテトラメチルローダミンまたはＴＡＭＲＡ、カルボキシローダミン６Ｇ、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、リッサミンローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミンまたはＴＭＲ）、クマリンおよびクマリン色素（例えば、メトキシクマリン、ジアルキルアミノクマリン、ヒドロキシクマリンおよびアミノメチルクマリンまたはＡＭＣＡ）、オレゴングリーン色素（例えば、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４）、テキサスレッド、テキサスレッド−Ｘ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｒｅｄ（商標）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｇｒｅｅｎ（商標）、シアニン色素（例えば、Ｃｙ−３（商標）、Ｃｙ−５（商標）、Ｃｙ−３．５（商標）、Ｃｙ−５．５（商標））、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（アレクサフラウアー）色素（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０）、ＢＯＤＩＰＹ色素（例えば、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５）、ＩＲＤｙｅｓ（例えば、ＩＲＤ  ４０、ＩＲＤ  ７００、ＩＲＤ  ８００）などが含まれるが、これらに限定されるものではない。使用されうる他の適当な蛍光色素、およびプローブのようなオリゴヌクレオチドに蛍光色素を連結または取り込むための方法の具体例は、ＲＰ  Ｈａｕｇｌａｎｄ，“Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ＲｅｓｅａｒｃｈＣｈｅｍｉｃａｌｓ”，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．（１９９２年６月）に見出されうる。蛍光色素および標識キットは例えばＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（Ｂｅ��ｅｒｌｙ，ＭＡ）から商業的に入手可能である。
【００７７】
幾つかの蛍光基（ドナー）は、それ自体が直接的に検出可能である代わりに、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の過程において別の蛍光基（アクセプター）にエネルギーを転移し、その第２の基が検出可能な蛍光シグナルを生成する。これらの実施形態においては、該プローブは、例えば、増幅された標的配列にハイブリダイズした場合に検出可能となりうる。本発明における使用に適したＦＲＥＴアクセプター／ドナーペアの具体例には、例えば、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ／ＦＩＴＣ、ＩＡＥＤＡＮＳ／５−（ヨードアセトミド）フルオレセイン、Ｂ−フィコエリトリン／Ｃｙ−５およびＥＤＡＮＳ／Ｄａｂｃｙｌが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７８】
物理的に連結された蛍光レポーター／消光分子の使用も本発明の範囲内である。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイにおける（例えば、米国特許第５，２１０，０１５号、第５，８０４，３７５号、第５，４８７，７９２号および第６，２１４，９７９号に記載されているとおり）またはモレキュラービーコンズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ）としての（例えば、Ｔｙａｇｉら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９６，１４：３０３−３０８；Ｔｙａｇｉら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９８，１６：４９−５３；Ｋｏｓｔｒｉｋｉｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２７９：１２２８−１２２９；Ｓｏｋｏｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１９９８，９５：１１５３８−１１５４３；Ｍａｒｒａｓら，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ，１９９９，１４：１５１−１５６；ならびに米国特許第５，８４６，７２６号、第５，９２５，５１７号、第６，２７７，５８１号および第６，２３５，５０４号に記載されているとおり）そのような系の使用は当業者によく知られている。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ形態では、該増幅反応の産物は、それが「リアルタイム」様態で形成されるにつれて検出されうる。その結果、該反応混合物が増幅条件下にある間に、増幅産物／プローブハイブリッドが形成され、検出される。
【００７９】
本発明の幾つかの実施形態においては、該ＰＣＲ検出プローブは、５’末端において蛍光部分で、そして３’末端において消光部分で標識されたＴａｑＭａｎ（登録商標）様プローブである。ＴａｑＭａｎ（登録商標）様プローブで使用される適当な発蛍光団および消光剤は米国特許第５，２１０，０１５号、第５，８０４，３７５号、第５，４８７，７９２号および第６，２１４，９７９号ならびにＷＯ  ０１／８６００１（それらのそれぞれを参照により本明細書に組み入れることとする。）に開示されている。消光剤の具体例には、ＤＡＢＣＹＬ（例えば、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸）スクシンイミジルエステル、ジアリールローダミンカルボン酸、スクシンイミジルエステル（またはＱＳＹ−７）および４’，５’−ジニトロフルオレセインカルボン酸、スクシンイミジルエステル（またはＱＳＹ−３３）（それらの全てはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（これはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡの一部である。）から入手可能である。）、クエンチャー１（Ｑ１；Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡから入手可能）、または「ブラックホールクエンチャー（Ｂｌａｃｋ  ｈｏｌｅ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ」ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２およびＢＨＱ−３（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡから入手可能）が含まれるが、これらに限定されるものではない。ある実施形態においては、該ＰＣＲ検出プローブは、５’末端においてＦＡＭで、そして３’末端においてＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）またはＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）ｐｌｕｓ（共にＢｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡから入手可能）で標識されたＴａｑＭａｎ（登録商標）様プローブである。
【００８０】
また、通常の又は修飾されたヌクレオチドの「尾部（ｔａｉｌ）」が検出目的でプローブに付加されうる。該尾部に相補的であり１以上の検出可能標識（例えば、発蛍光団、酵素、または放射能標識された塩基）を含有する核酸との第２のハイブリダイゼーションは該アンプリコン／プローブハイブリッドの可視化を可能にする。
【００８１】
個々の標識技術の選択は状況に左右され、例えば標識方法の容易さ及びコスト、使用される異なる検出可能標識の間のスペクトル間隔、所望のサンプル標識の質、ハイブリダイゼーション反応に対する（例えば、ハイブリダイゼーション過程の速度および／または効率に対する）検出可能部分の効果、用いられる増幅方法の性質、検出系の性質、検出可能標識により生成されるシグナルの性質および強度などのような幾つかの要因によって決まるであろう。
【００８２】
Ｃ．増幅方法
試験サンプル中のＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８型標的配列ならびにヒトベータグロビン標的配列を増幅するための本発明のプライマーまたはプライマーセットの使用は、いずれかの特定の核酸増幅技術またはそのいずれかの特定の変法に限定されるものではない。実際、本発明のプライマーおよびプライマーセットは、当技術分野で公知の種々の核酸増幅方法（例えば、Ｋｉｍｍｅｌら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９８７，１５２：３０７−３１６；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，１９８９，２．Ｓｕｐｐ．Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；“Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編），２００２，５．Ｓｕｐｐ．Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：Ｓｅｃａｕｃｕｓ，ＮＪを参照されたい。）のいずれかにおいて使用されうる。
【００８３】
そのような核酸増幅方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＰＣＲは、“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ（編），１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；“ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ”，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ（編），１９９５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；“Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ｂａｓｉｃ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＰＣＲ．Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”，ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら（編），１９９１，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄ；Ｓａｉｋｉら，Ｎａｔｕｒｅ，１９８６，３２４：１６３；ならびに米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号および第４，８８９，８１８号（これらに限定されるものではない。）（それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする。）のような多数の参考文献に記載されている。ＴａｑＭａｎ（登録商標）に基づくアッセイ（Ｈｏｌｌａｎｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，１９９１，８８：７２７６−７２８０を参照されたい。）および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（またはＲＴ−ＰＣＲ；例えば米国特許第５，３２２，７７０号および第５，３１０，６５２号（それらのそれぞれを参照により本明細書に組み入れることとする。）に記載されている。）を含むＰＣＲの変法も含まれる。
【００８４】
一般に、ＰＣＲにおいては、プライマーのペアを、対象から得た試験サンプルに過剰に加えて（したがって該試験サンプルと接触させて）、該標的核酸の相補鎖にハイブリダイズさせる。該プライマーのそれぞれを、該標的配列を鋳型として使用して、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長させる。該伸長産物は、元の標的鎖からの解離（変性）の後、標的自体となる。ついで新たなプライマーをハイブリダイズさせ、該ポリメラーゼにより伸長させ、該サイクルを繰返して、アンプリコンのコピーの数を指数関数的に増加させる。ＰＣＲ反応においてプライマー伸長産物を産生しうるＤＮＡポリメラーゼの具体例には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、種々の入手元（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から入手可能な、テルムス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）から単離された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、テルムス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）、バシラス・ステレオサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅｒｅｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、組換えテルムス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ｒＴｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）またはテルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（「Ｖｅｎｔ」ポリメラーゼ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＲＮＡ標的配列は、ｍＲＮＡをｃＤＮＡへ逆転写（ＲＴ）し次いでＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を行うこと（前記のとおり）により増幅されうる。あるいは、米国特許第５，３２２，７７０号（これを参照により本明細書に組み入れることとする。）に記載されているとおり、両方の工程に単一酵素が使用されうる。
【００８５】
前記の酵素的熱増幅方法に加えて、本発明のプライマーおよびプライマーセットを使用してＨＰＶまたはベータグロビン標的配列を増幅するために等温酵素的増幅反応が用いられうる（Ａｎｄｒａｓら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００１，１９：２９−４４）。これらの方法には、転写媒介増幅（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＭＡ；ＴＭＡはＫｗｏｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：１１７３−１１７７；Ｇｉａｃｈｅｔｔｉら，Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００２，４０：２４０８−２４１９；および米国特許第５，３９９，４９１号に記載されている。）；セルフサステインド配列複製（Ｓｅｌｆ−Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（３ＳＲ；３ＳＲはＧｕａｔｅｌｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０，８７：１８７４−１８４８；およびＦａｈｙら，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９１，１：２５−３３）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＮＡＳＢＡ；ＮＡＳＢＡはＫｉｅｖｉｔｓら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９１，３５：２７３−２８６；および米国特許第５，１３０，２３８号に記載されている。）および鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ；ＳＤＡはＷａｌｋｅｒら，ＰＮＡＳ，１９９２，８９：３９２−３９６；ＥＰ  ０  ５００  ２２４  Ａ２に記載されている。）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００８６】
鎖置換増幅は、制限エンドヌクレアーゼがその標的ＤＮＡの未修飾鎖に切れ目を入れる能力と、該切れ目における３’末端を伸長させ該下流ＤＮＡ鎖を一定温度で除去するエキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼの作用とを併せ持つ（Ｗａｌｋｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２を参照されたい。）。ＳＤＡにおいて使用されるプライマーは、標的結合配列の５’側の部位における制限エンドヌクレアーゼ認識を含む（米国特許第５，２７０，１８４号および第５，３４４，１６６号（それらのそれぞれを参照により本明細書に組み入れることとする。）を参照されたい。）。
【００８７】
核酸配列に基づく増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ）は、低い等温度、一般には４１℃で協同的に作用する３種の酵素（例えば、ＲＮアーゼＨ、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ）を利用する（Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９１，３５０：９１−９２；Ｃｈａｎら，Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９９，１０：１８５−１９６を参照されたい。）。ＮＡＳＢＡ反応の産物は主として一本鎖ＲＮＡである。
【００８８】
セルフサステイニング配列複製（Ｓｅｌｆ  Ｓｕｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（３ＳＲ）反応は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の等温増幅のための非常に効率的な方法である。３ＳＲ系は、ＡＭＶ逆転写酵素、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮアーゼＨおよびＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ）の集合的活性を含む。
【００８９】
転写媒介増幅（ＴＭＡ）は、プライマー領域において操作されたプロモーターからＲＮＡを得るためのＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡを得るための逆転写酵素、および該ＲＮＡをｃＤＮＡから除去するためのＲＮアーゼＨを利用する（Ｇｕａｔｅｌｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０を参照されたい。）。
【００９０】
ＮＡＳＢＡ、３ＳＲおよびＴＭＡプライマーは、該プライマーの標的結合配列に連結されたＲＮＡポリメラーゼプロモーターを要する。該プライマー内への取り込みのためのプロモーターまたはプロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼにより特異的に認識される核酸配列（天然に存在するもの、合成的に製造されたもの、または制限消化の産物のいずれか）であり、ここで、該ＲＮＡポリメラーゼは、その配列を認識し、それに結合し、転写の過程を開始させて、それによりＲＮＡ転写産物を与える。有用なプロモーターの具体例には、あるバクテリオファージポリメラーゼにより認識されるもの、例えば、バクテリオファージＴ３、Ｔ７もしくはＳＰ６に由来するもの、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するプロモーターが含まれる。
【００９１】
Ｄ．検出方法
本発明の或る実施形態においては、本明細書にのプローブは、該増幅反応により生じた増幅産物を検出するために使用される。本明細書にのプローブは、よく知られた種々の均一または不均一法を用いて使用されうる。
【００９２】
均一検出方法には、該プローブに結合しており標的配列の存在下でシグナルを放出するＦＲＥＴ標識、モレキュラービーコンズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ）（Ｔｙａｇｉら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９６，１４：３０３−３０８；Ｔｙａｇｉら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９８，１６：４９−５３；Ｋｏｓｔｒｉｋｉｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２７９：１２２８−１２２９；Ｓｏｋｏｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１９９８，９５：１１５３８−１１５４３；Ｍａｒｒａｓら，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．，１９９９，１４：１５１−１５６；ならびに米国特許第５，８４６，７２６号、第５，９２５，５１７号、第６，２７７，５８１号および第６，２３５，５０４号を参照されたい。）およびＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（米国特許第５，２１０，０１５号、第５，８０４，３７５号、第５，４８７，７９２号および第６，２１４，９７９号ならびにＷＯ  ０１／８６００１を参照されたい。）の使用が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの検出技術を用いて、該増幅反応の産物は、それが形成されるにつれて、すなわち、リアルタイム様態で検出されうる。その結果、該反応混合物が増幅条件下にある間に、増幅産物／プローブハイブリッドが形成され、検出される。
【００９３】
ある実施形態においては、本発明のプローブはＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイにおいて使用される。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイにおいては、蛍光シグナルの生成をモニターすることにより、加熱サイクリングと共に、分析を行う。該アッセイ系は、標的コピー数の決定を可能にする定量的データを生成する能力を有する。例えば、１以上のＨＰＶ型またはヒトベータグロビン配列の予め定量された懸濁液の系列希釈を用いて、標準曲線が作成可能であり、それに対して、未知サンプルが比較可能である。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイは、前記のとおり、蛍光レポーター色素と消光部分との両方で標識されたプローブを消化するために、例えば、内因性５’ヌクレアーゼ活性を有するＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（商標）ＤＮＡポリメラーゼを使用して、簡便に行われる。該プローブが消化されるにつれて増幅サイクル中に生じる蛍光の変化を測定し、蛍光部分と消光部分とを分離し、標的配列の増幅に比例する蛍光シグナルの増加を引き起こさせることにより、アッセイ結果を得る。
【００９４】
均一検出方法の他の具体例には、ハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）が含まれる。そのようなアッセイにおいては、非ヌクレオチド系リンカーアーム化学（米国特許第５，５８５，４８１号および第５，１８５，４３９号を参照されたい。）を用いて、高化学発光性分子であるアクリジニウムエステル（ＡＥ）（Ｗｅｅｋｓら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１９８３，２９：１４７４−１４７９；Ｂｅｒｒｙら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１９８８，３４：２０８７−２０９０を参照されたい。）で該プローブを標識する。化学発光はアルカリ性過酸化水素でのＡＥの加水分解により誘発される。この場合、該加水分解は、励起されたＮ−メチルアクリドンを与え、ついでこれは光の放出と共に不活性化される。標的配列の非存在下では、ＡＥの加水分解は迅速である。しかし、該プローブが標的配列に結合している場合には、ＡＥの加水分解の速度は著しく低下する。したがって、ハイブリダイズしたＡＥ標識プローブおよびハイブリダイズしていないＡＥ標識プローブが、物理的分離を要することなく、溶液中で直接的に検出可能である。
【００９５】
不均一検出系も当技術分野でよく知られており、一般には、増幅された配列を反応混合物中の他の物質から分離するために捕捉物質を使用する。捕捉物質は、典型的には、１以上の特異的結合配列でコーティングされた固体支持物質（例えば、マイクロタイターウェル、ビーズ、チップなど）を含む。結合配列は、本発明のオリゴヌクレオチドプローブに付加された尾部配列に相補的でありうる。あるいは、結合配列は捕捉オリゴヌクレオチドの配列に相補的であることが可能であり、それ自体が、プローブの尾部配列に相補的な配列を含みうる。該捕捉物質に結合した増幅産物／プローブハイブリッドを残りの反応混合物から分離した後、該増幅産物／プローブハイブリッドはいずれかの検出方法（例えば、本明細書に記載されているもの）を用いて検出されうる。
【００９６】
Ｅ．試験サンプル中のＨＰＶおよびヒトベータグロビンの検出
もう１つの実施形態においては、本発明は、（ａ）試験サンプル中のＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８型の存在を検出するための方法、（ｂ）試験サンプル中のヒトベータグロビン配列を検出するための方法、ならびに（ｃ）試験サンプル中のＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８型とヒトベータグロビン配列との存在を検出するための方法を提供する。
【００９７】
典型的には、本発明の方法は、まず、試験サンプルを被験者（対象）から得ることを含む。試験サンプルが得られうる被験者はいずれかの哺乳動物である。好ましくは、哺乳動物には、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ウマ、非ヒト霊長類およびヒトが含まれるが、これらに限定されるものではない。試験サンプルは、当業者に公知の通常の技術を用いて被験者から得られうる。好ましくは、試験サンプルは、（ｉ）ＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８型の少なくとも１つ、ならびに／または（ｉｉ）少なくとも１つのヒトベータグロビン配列を含有する又はその疑いがある。
【００９８】
試験サンプルを被験者から得た後、本明細書に開示されているプライマーセットまたはプライマーおよびプローブセットの少なくとも１つからのプライマー（および場合によっては１以上のプローブ）と該試験サンプルを接触させて、反応混合物を形成させる。ついで該反応混合物を増幅条件下に配置する。該プライマーは該試験サンプル中のいずれかのＨＰＶ核酸およびいずれかのヒトベータグロビン核酸にハイブリダイズする。該サンプル中に存在するＨＰＶまたはヒトグロビン核酸を増幅させ、少なくとも１つの増幅産物（すなわち、少なくとも１つの標的配列）を得る。
【００９９】
少なくとも１つの増幅産物と本発明のプローブの少なくとも１つ（例えば、本明細書にのプライマーおよびプローブセットからの１以上のプローブ）との間のハイブリダイゼーションを検出することにより、少なくとも１つの増幅産物を検出する。特に、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１またはそれらの相補体の配列を有するプローブの１以上での少なくとも１つの増幅産物の検出は試験サンプル中のＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８型の少なくとも１つの存在を示す。配列番号２２またはその相補体の配列を有するプローブと該増幅産物とのハイブリダイゼーションの検出は試験サンプル中のヒトベータグロビン配列の存在を示す。好ましくは、本発明の方法は、試験サンプル中のＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８型ならびにヒトベータグロビン配列（対照として加えられたもの）の少なくとも１つを検出することを含む。最も好ましくは、少なくとも１つのＨＰＶ型およびヒトベータグロビン配列の検出は同時に行われる。
【０１００】
また、本発明の方法は、試験サンプルにおいて存在し検出されたＨＰＶ型を部分的に遺伝子型判別（例えば、識別）するためにも用いられうる。例えば、試験サンプル中に存在する異なるＨＰＶ型の同定を促進するために、本明細書にの方法において用いられるプローブのそれぞれは、異なる色の光を放出する異なる検出可能標識で標識されうる。しかし、好ましくは、本発明の方法における使用の場合、配列番号８の配列を有するプローブは、特有の色（例えば、赤）を放出する第１検出可能標識で標識され、配列番号９の配列を有するプローブは、同様に特有の色（例えば、緑）を放出し第１検出可能標識とは異なる第２検出可能標識で標識される。配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１またはそれらの相補体の配列を有するプローブの１以上をも配列番号８および９と共に該方法において使用する場合には、これらのプローブのそれぞれは同一の検出可能標識で標識されうるであろう（すなわち、それぞれは、第３の特有の色（例えば、黄）を放出する第３検出可能標識で標識されるであろう）。したがって、本明細書にのＨＰＶプローブ（表Ｂを参照されたい。）と共に種々のタイプの標識を使用することは、試験サンプル中のＨＰＶの存在を検出することだけでなく、該サンプル中に存在する特定の型を特異的に同定することも可能にする。試験サンプル中のＨＰＶ  １６型および１８型の検出および／または識別（例えば、配列番号８および配列番号９の配列を有するプローブを使用することによるもの）が有用かつ重要である。なぜなら、これらの２つのＨＰＶ型が子宮頚癌の少なくとも７０％を引き起こすからである。
【０１０１】
Ｆ．キット
もう１つの実施形態においては、本発明は、本明細書にの方法に従う、ＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８型ならびにヒトベータグロビン配列の検出に有用な物質および試薬を含むキットを提供する。該キットは診断検査所、実験研究所または開業医により使用されうる。ある実施形態においては、該キットは、本明細書のＢ節にのプライマーセットまたはプライマーおよびプローブセットの少なくとも１つ、および場合によっては増幅試薬を含む。各キットは、好ましくは、特定の増幅方法のための増幅試薬を含む。したがって、ＮＡＳＢＡでの使用に適合化されたキットは、好ましくは、標的結合配列に連結されたＲＮＡポリメラーゼプロモーターと共にプライマーを含有し、一方、ＳＤＡでの使用に適合化されたキットは、好ましくは、標的結合配列の５’側に制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むプライマーを含有する。同様に、該キットがＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイのような５’ヌクレアーゼアッセイにおける使用に適合化された場合、本発明のプローブは少なくとも１つの蛍光レポーター部分と少なくとも１つの消光部分を含有しうる。
【０１０２】
適当な増幅試薬は更に、例えば、バッファー、試薬、逆転写酵素および／もしくはポリメラーゼ活性またはエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、酵素補因子、例えばマグネシウムまたはマンガン；塩；該増幅反応を行うのに適したデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の１以上を含む。例えば、ＮＡＳＢＡでの使用に適合化されたキットは適当な量の逆転写酵素、ＲＮアーゼＨおよびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを含有しうる。ＮＡＳＢＡのような転写増幅反応に適合化されたキットにおいては、例えば、該増幅反応を増強することが知られているＤＭＳＯを含有するバッファーが含まれうる。
【０１０３】
方法に応じて、キットは更に、洗浄バッファー、ハイブリダイゼーションバッファー、標識バッファー、検出手段および他の試薬の１以上を含みうる。該バッファーおよび／または試薬は、好ましくは、該キットが意図する個々の増幅／検出技術に最適化される。該方法の種々の工程を行うためのこれらのバッファーおよび試薬を使用するためのプロトコールも該キットに含まれうる。
【０１０４】
さらに、キットは、増幅効率に関する検査基準としての、該増幅の失敗による偽陰性試験結果の発生を防ぐための、細胞妥当性、サンプル抽出を確認するなどのための内部対照を備えていることが可能である。最適な内部対照配列は、それが増幅反応における標的核酸配列と競合しないように選択される。好ましくは、該内部対照は、本明細書においてＢ節に既に記載されているベータグロビンプライマー（すなわち、配列番号６、配列番号７、配列番号６の相補体または配列番号７の相補体の少なくとも１つ）とプローブ（すなわち、配列番号２２または配列番号２２の相補体）とを含む。
【０１０５】
キットは、核酸抽出前の増幅前の試験サンプルからの核酸の単離のための試薬をも含有しうる。
【０１０６】
該試薬は固体（例えば、凍結乾燥体）または液体形態で供給されうる。本発明のキットは、場合によっては、それぞれの個々のバッファーおよび／または試薬のための種々の容器（例えば、バイアル、アンプル、試験管、フラスコまたはボトル）を含みうる。各成分は、一般に、そのそれぞれの容器内にアリコート化されるものが、または濃縮形態で提供されるものが好適であろう。増幅／検出アッセイの或る工程を行うのに適した他の容器も提供されうる。個々の容器は、好ましくは、市販用に密閉されて維持される。
【０１０７】
キットは、本明細書にの増幅試薬およびプライマーセットまたはプライマーおよびプローブを使用するための説明、試験サンプルを加工し、核酸分子を抽出し、および／または試験を行うための説明、ならびに得られた結果を解釈するための説明、ならびに政府機関により規定された形態の注意書きをも含みうる。そのような説明は、場合によっては、印刷された形態、またはＣＤ、ＤＶＤもしくは記録媒体の他のフォーマットでありうる。
【０１０８】
限定的でない例示として、本開示の具体例を以下に示すこととする。
【実施例１】
【０１０９】
材料および方法
Ａ．ＨＰＶおよびベータグロビンのプライマーおよびプローブの設計
実施例２〜６において使用する全てのオリゴヌクレオチドは、当業者に公知の標準的なオリゴヌクレオチド合成法を用いて合成した。該プローブの全ては、当技術分野で公知の通常の技術を用いて標識された、５’末端に発蛍光団を有し３’末端に消光部分を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。該５’標識はＶＩＣ（この緑色標識色素は、ＨＰＶ１６に特異的なプローブ（すなわち、配列番号８；Ｂ節の表Ｂを参照されたい。）を標識するために使用した。）、ＮＥＤ（この黄色標識は、ＨＰＶ１８に特異的なプローブ（すなわち、配列番号９；Ｂ節の表Ｂを参照されたい。）を標識するために使用した。）、ＦＡＭ（この青色標識色素は、ＨＰＶ３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６または６８に特異的なプローブ（例えば、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１；Ｂ節の表Ｂを参照されたい。）を標識するために使用した。）、またはウエーサー（Ｑｕａｓａｒ）（ヒトベータグロビン配列番号２２に対するもの）である。３’標識はブラックホールクエンチャー（Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）（ＢＨＱ）、例えばＢＨＱ１−ｄＴ（ＨＰＶ１６、３１、３３、３５、４５、５１、５６、５９、６６または６８に特異的なプローブ（Ｂ節の表Ｂを参照されたい。）を標識するために使用した。）、ＢＨＱ２−ｄＴ（ＨＰＶ１８（Ｂ節の表Ｂを参照されたい。）またはヒトベータグロビン（配列番号２２）に特異的なプローブを標識するために使用した。）、またはＢＨＱ１プラス（ＨＰＶ３９、５２または５８に特異的なプローブ（Ｂ節の表Ｂを参照されたい。）を標識するために使用した。）である。
【０１１０】
Ｂ．リアルタイムＰＣＲ
磁気微粒子技術を用いて、サンプルからＨＰＶ  ＤＮＡを抽出し、濃縮し、精製した。該技術は、核酸を捕捉し、該粒子を洗浄して未結合サンプル成分を除去する（例えば、米国特許第５，２３４，８０９号を参照されたい。）。該結合核酸を溶出し、増幅に備えた。保存されたＬ１領域を標的化する３個のフォワードプライマー（すなわち、配列番号１、配列番号２および配列番号３；Ｂ節の表Ａを参照されたい。）および２個のリバースプライマー（すなわち、配列番号４および配列番号５；Ｂ節の表Ａを参照されたい。）のＨＰＶプライマー混合物を、ＨＰＶ標的を増幅するために使用した。それらの３個のフォワードプライマー（配列番号１〜３）および２個のリバースプライマー（配列番号４〜５）は本明細書においては「ＨＰＶプライマー混合物」と総称される。１４個のヒト（ＨＲ）ＨＰＶ遺伝子型（ＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８型）に関するシグナルを遺伝子型特異的プローブ（すなわち、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１；Ｂ節の表Ｂを参照されたい。）で生成させた。これらのプローブの１４個全ては本明細書においては「ＨＰＶプローブセット」と総称される。ヒトベータグロビン標的を、内因性ヒトベータグロビン配列を標的化するプライマーセット（配列番号６および７）で増幅し、ベータグロビンプローブ（配列番号２２）で検出した。該ＰＣＲ反応は、該プライマーおよびプローブのほかに、１４単位のＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ酵素、７ｍＭ  塩化マグネシウム（活性化試薬として）および他の増幅試薬（Ｔｒｉｓバッファー中に０．６ｍＭ  ｄＮＴＰ、７３．５ｎＭ  ＲＯＸ基準色素を含有する。）よりなるものであった。
【０１１１】
以下のサイクリング条件を用いて、Ａｂｂｏｔｔ  ｍ２０００ｒｔ装置（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｃ．，Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ，ＩＬ）上でリアルタイム増幅／検出を行った：９２℃で１０分間の１サイクル；９１℃で３０秒間および５４℃で３０秒間の４サイクル；９１℃で３０秒間、５２℃で３０秒間（サイクル当たり１秒間の自動伸長を伴う）および５０℃で４０秒間の３８サイクル。該３８サイクルの読取り工程（５０℃）中に蛍光測定を記録した。
【実施例２】
【０１１２】
遺伝子型包含性および部分的遺伝子型判別
この実施例においては、１４個の遺伝子型のそれぞれからのＨＰＶ  ＤＮＡ標的を含有する５１個のサンプルを、個別に及び組合せて、実施例１のＨＰＶプライマー混合物およびＨＰＶプローブセットを使用して試験した。実施例１に記載されているとおりにリアルタイムＰＣＲを行った。各ＨＰＶ  ＤＮＡ標的を反応当たり４００，０００コピーの濃度で試験した。以下の表１に示すとおり、前記の５１個のサンプルからの結果は、単一の遺伝子型を有する１４個のサンプル、２個の遺伝子型を有する２５個のサンプルおよび３個の遺伝子型を有する１２個のサンプルを含んでいた。また、表１に示すとおり、これらの結果は正確に示されており、ＨＰＶ  １６およびＨＰＶ  １８  ＤＮＡの存在または非存在は各場合において正確に判別された。この実施例は、そのような特有のＨＰＶプライマー混合物およびＨＰＶプローブセットが１４個のＨＲ  ＨＰＶ遺伝子型（ＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６および６８）を検出しＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８をその他の１２個のＨＲ  ＨＰＶ遺伝子型から識別しうることを実証している。
【０１１３】
【表４】
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【実施例３】
【０１１４】
プローブハイブリダイゼーション特異性
実施例１に記載されているＨＰＶプローブセットのハイブリダイゼーション特異性を示すために、２つの研究を行った。反応当たり約１０，０００，０００コピーの濃度の個々のＨＰＶプラスミドＤＮＡ標的の存在下、単一のＨＲ  ＨＰＶプローブ（表２を参照されたい。）を使用して、または全１４個のＨＲ  ＨＰＶプローブ（表３を参照されたい。）を含有する混合物を使用して、実施例１に記載されているとおりにリアルタイムＰＣＲを行った。表２および３に示されているそれらの２つの研究の結果は、選択されたＨＰＶプローブの特異性を示している。
【０１１５】
【表５】
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【０１１６】
【表６】
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【実施例４】
【０１１７】
細胞妥当性対照としてのベータグロビンの検出
ヒトベータグロビンを細胞妥当性対照として利用するためには、リアルタイムＰＣＲの結果の分析から得られたサイクル数（ＣＮ）における場合と同様に、該ベータグロビンシグナルが臨床試料からの細胞投入の量の指標となるべきである。
【０１１８】
培養ＨＰＶ陽性細胞系からの細胞投入の量とベータグロビンシグナルとの間の相関性を評価するための研究を行った。該ベータグロビンシグナルと細胞投入量との間の相関性を図１に示す。以前のＣＮにより示されたとおり、該研究は、細胞投入の濃度の増加が、より高いベータグロビン検出効率と相関することを示している。
【０１１９】
また、臨床サンプルにおけるベータグロビンＣＮ分布を評価するための別の研究を行った。ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（登録商標）溶液（Ｃｙｔｙｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）中に集められた１２０６個の患者子宮頚試料を分析し、図２に示す。該集団の２５％、５０％および７５％四分位値は、それぞれ、２１．２９、２２．４１および２３．７８のベータグロビンＣＮを有し、１７．４７の最小ＣＮおよび３６．０１の最大ＣＮを有する。この研究は、ベータグロビンが細胞妥当性対照として利用されうることを示している。
【０１２０】
実施例１に記載されているヒトベータグロビンプライマーおよびプローブをリアルタイムＰＣＲにおいて使用して、図１および２に示す結果を得た。
【実施例５】
【０１２１】
プライマーおよびプローブ設計の分析性能
この実施例は２つの研究の結果を示す。第１の研究は、一般に使用されるコンセンサスＧＰ５＋／ＧＰ６＋プライマー（ＧＰ５＋プライマー；ＴＴＴＧＴＴＡＣＴＧＴＧＧＴＡＧＡＴＡＣＴＡＣ−３’（配列番号２３）、ＧＰ６＋プライマー：５’−ＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＴＧＴＡＡＡＴＣＡＴＡＴＴＣ−３’（配列番号２４））と比較して改善された、実施例１のＨＰＶプライマー混合物の分析性能を示した。この研究は、実施例１に記載されているとおりにリアルタイムＰＣＲを用いて行った。本発明の特有のＨＰＶプライマー混合物とコンセンサスＧＰ５＋／ＧＰ６＋プライマーとの性能を、ＣＮ値を用いて評価した。結果を表４および図３Ａ〜３Ｄに示す。性能の改善（ＣＮ改善値＞１）が１０／１３のＨＰＶ遺伝子型で観察された（表４）。大きな改善（ＣＮ改善値＞１０）がＨＰＶ遺伝子型３９、５１、５２および６８で観察され、図３Ａ〜３Ｄに示されている。
【０１２２】
【表７】
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【０１２３】
第２の研究では、ＨＰＶ  １６、１８、３１、３５、３９、４５、５１、５２、５８および５９型に特異的な本発明の特有のプローブの幾つか（配列番号８〜１０、１２〜１６および１８〜１９）の分析性能を、米国特許第６，２６５，１５４Ｂ１号に開示されている同じＨＰＶ型に関するプローブ配列（表５を参照されたい。）と比較して調べた。リアルタイムＰＣＲにおいて試験した場合の直接比較を可能にするために、米国特許第６，２６５，１５４号のプローブを、実施例１に記載されているとおりに標識した。該性能を、ＣＮ値および蛍光シグナルを用いて評価した。結果を表６、表７および図４Ａ〜４Ｅに示す。性能の改善（ＣＮ改善値＞１および蛍光シグナル＞０．１）が５／１０のＨＰＶ遺伝子型で観察された（表６および表７）。ＣＮおよび蛍光シグナルにおける有意な改善がＨＰＶ遺伝子型１６、１８、３１、５２および５９で観察され、図４Ａ〜４Ｅに示されている。
【０１２４】
【表８】
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【０１２５】
【表９】
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【０１２６】
【表１０】
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【実施例６】
【０１２７】
本発明のプライマーおよびプローブの臨床性能
ＨＲ  ＨＰＶの検出のための実施例１に記載されているＨＰＶプライマー混合物およびＨＰＶプローブセットを使用するアッセイの感度および特異性を、ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（登録商標）溶液（Ｃｙｔｙｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）中に集められた４４１個の患者子宮頚試料を試験することにより評価した。子宮頚試料の高リスクＨＰＶ状態を、Ａｂｂｏｔｔ  ＲｅａｌＴｉｍｅ  ＨＲ  ＨＰＶアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）とｈｃ２高リスクＨＰＶ  ＤＮＡ試験（「ＨＣ２」）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡから商業的に入手可能）との一致により、そしてＬＩＮＥＡＲ  ＡＲＲＡＹ  ＨＰＶ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｔｅｓｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂａｓｅｌ，ＣＨから商業的に入手可能；“Ｌｉｎｅａｒ  Ａｒｒａｙ”）を使用する不一致結果の試料の更なる分析により判定した。これらのアッセイまたは試験の３つ全ては、該製造業者の説明に従い行った。合計２２７個の試料が両方のアッセイにより検出され、１７９個の試料はいずれのアッセイによっても検出されなかった。３５個の不一致試料の結果をＬｉｎｅａｒ  Ａｒｒａｙにより解析した。２３８個の陽性試料のうち、２３１個はＡｂｂｏｔｔ  ＲｅａｌＴｉｍｅ  ＨＲ  ＨＰＶアッセイにより検出され、２３４個はＨＣ２により検出された。２０３個の解析された陰性試料のうち、２０３はＡｂｂｏｔｔ  ＲｅａｌＴｉｍｅ  ＨＲ  ＨＰＶアッセイによっては検出されず、１７９個はＨＣ２によっては検出されなかった。以下の表８に示すとおり、ＨＲ  ＨＰＶの検出に関するＡｂｂｏｔｔ  ＲｅａｌＴｉｍｅ  ＨＲ  ＨＰＶアッセイの感度は９７％であり、ＨＣ２アッセイのそれは９８％であった。Ａｂｂｏｔｔ  ＲｅａｌＴｉｍｅ  ＨＲ  ＨＰＶアッセイの特異性は１００％であり、ＨＣ２アッセイの特異性は８８％であった。
【０１２８】
【表１１】
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【０１２９】
本発明の目標を実施し、記載されている目的および利点ならびにそれらにおいて固有のものを達成するように本発明は十分に適合化されることを、当業者は容易に理解するであろう。本明細書に記載されている分子複合体および方法、手順、処理、分子、特異的化合物は、好ましい実施形態の現時点での代表的なものであり、典型的なものであり、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書に開示されている本発明に対して種々の置換および修飾が施されうることが当業者に直ちに明らかであろう。
【０１３０】
本明細書に記載されている全ての特許および刊行物は、本発明が関連している当業者の水準を示すものである。全ての特許および刊行物を、各個の刊行物が参照により本明細書に組み入れられると具体的かつ個別に示されているのと同様に、参照により本明細書に組み入れることとする。
【０１３１】
本明細書に例示的に記載されている本発明は、本明細書に具体的に開示されていないいずれの要素または限定をも伴うことなく適切に実施されうる。用いられている用語および表現は限定のためではなく説明のための用語として用いられ、そのような用語および表現の使用においては、示され記載されている特徴またはそれらの一部の均等物のいずれの除外をも意図するものではない。特許請求されている本発明の範囲内で種々の修飾が可能であると認識される。したがって、本発明は好ましい実施形態により具体的に開示されていると理解されるべきである。本明細書に開示されている概念の随意的な特徴、修飾および変更は当業者に委ねられることが可能であり、そのような修飾および変更は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内であるとみなされる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【配列表】
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