(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の表現型の細胞を生成する方法であって、
骨髄性の共通前駆細胞に由来する細胞である第１の細胞；
リンパ系の共通前駆細胞に由来する第２の細胞；および
リンパ系の共通前駆細胞に由来する第３の細胞をハイブリダイズして、表現型の可塑性を示すハイブリッド細胞を製造する工程、ならびに
当該ハイブリッド細胞を所定の環境にさらし、上記所定の表現型の細胞にする工程を包含しており、
上記所定の環境は、胸腺のストロマ細胞、サイトカイン、成長因子、免疫グロブリン、受容体リガンド、またはこれらの組合せを含んでおり、
上記所定の表現型は、Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄性細胞からなる群から選択されるか、または上記ハイブリッド細胞に関連する脱分化した表現型であり、
上記脱分化した表現型は、ＣＤ３４、ＣＤ１０、Ｐａｘ−５またはλ様の少なくとも１つの発現を包含している、方法。
【請求項２】
上記第２の細胞がＢリンパ球系統に由来する細胞であり、上記第３の細胞がＴリンパ球系統に由来する細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は、骨髄性単球の前駆体、単核球、マクロファージ、好酸球、好中球、樹状細胞、または好塩基球である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は、以下のＣＤ抗原：ＣＤ１６、ＣＤ１５またはＣＤ１４の少なくとも１つを提示している、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は単核球である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は骨髄性単球の前駆体である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は不死化された細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は、脾臓、末梢血、臍帯血、または骨髄に由来するものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
Ｂリンパ球系統に由来する上記細胞は、プレＢ細胞、未成熟なＢ細胞、ナイーブＢ細胞、活性化Ｂ細胞、またはエフェクターＢ細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
上記エフェクターＢ細胞はプラズマ細胞または抗原を経験したＢ細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｂリンパ球系統に由来する上記細胞は、以下のＣＤ抗原：ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ７２またはＣＤ５の少なくとも１つを提示している、請求項２または９に記載の方法。
【請求項１２】
Ｔリンパ球系統に由来する上記細胞は、プレＴ細胞、未成熟なＴ細胞、ナイーブＴ細胞、活性化Ｔ細胞またはエフェクターＴ細胞である、請求項２〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
Ｔリンパ球系統に由来する上記細胞は、以下のＣＤ抗原：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５またはＣＤ８の少なくとも１つを提示している、請求項２または１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｂリンパ球系統に由来する上記細胞は不死化された細胞である、請求項２〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
Ｔリンパ球系統に由来する上記細胞は不死化された細胞である、請求項２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
Ｂリンパ球系統に由来する上記細胞はリンパ組織に由来するものである、請求項２〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
Ｔリンパ球系統に由来する上記細胞はリンパ組織に由来するものである、請求項２〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
上記リンパ組織は、末梢血、臍帯血、脾臓、骨髄、胸腺、扁桃腺、咽頭扁桃腺、および領域リンパ節から選択される、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
上記細胞の少なくとも１つはヒト細胞である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
上記細胞の少なくとも１つはマウス細胞である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞はＫ５６２細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
上記第２の細胞または第３の細胞はＷＩＬ２ＮＳ細胞またはＭＯＬＴ４細胞である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
Ｂリンパ球系統に由来する上記細胞はＷＩＬ２ＮＳ細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
Ｔリンパ球系統に由来する上記細胞はＭＯＬＴ４細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項２５】
上記第１の細胞はＫ５６２細胞であり、上記第２の細胞はＷＩＬ２ＮＳ細胞であり、上記第３の細胞はＭＯＬＴ４細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
上記第１の細胞はＫ５６２細胞であり、上記第２の細胞は初代培養されたＢ細胞であり、上記第３の細胞は初代培養されたＴ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
上記Ｂ細胞およびＴ細胞はＣＤ５を発現している、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
上記Ｂ細胞はＣＤ２０およびＣＤ７２を発現しており、上記Ｔ細胞はＣＤ４およびＣＤ８を発現している、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
上記第１の細胞は初代培養されたヒト単核球であり、上記第２の細胞はＷＩＬ２ＮＳ細胞であり、上記第３の細胞は初代培養されたＴ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
上記第１の細胞は初代培養されたヒト骨髄単核球性の前駆体であり、上記第２の細胞はＷＩＬ２ＮＳ細胞であり、上記第３の細胞は初代培養されたヒトＴ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
上記第１の細胞はＫ５６２細胞であり、上記第２の細胞はＷＩＬ２ＮＳ細胞であり、上記第３の細胞は初代培養されたＴ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
上記ハイブリッド細胞が、幹細胞とさらにハイブリダイズされている、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
上記サイトカインまたは成長因子は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１β、ＩＬ−７、ＩＬ−２３、ＴＧＦ−β、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＦＮ−γからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
上記免疫グロブリンは、抗ＩＬ−４、抗ＩＦＮ−γ、および抗ＣＤ３／ＣＤ２８からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
上記受容体リガンドはＦｌｔ３リガンドまたはＣＤ４０リガンドである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、細胞の分化、特に表現型の可塑性を示すハイブリッド細胞、およびこれらの細胞を生成する方法に関する。また、本発明は、所望の表現型の特定の細胞を生成する方法に関する。さらに、本発明は、より初期の前駆状態への脱分化能を有しているハイブリッド細胞を生成する方法に関する。さらに、本発明は、例えば組織生成ための、種々の用途におけるハイブリッド細胞の使用を意図している。
【０００２】
〔背景技術〕
本明細書の全体を通じての従来技術のあらゆる議論は、当該従来技術が広く公知であるか、または当該分野においてよく知られている一般的な知識の一部を形成していることの自認として決して見做されるべきではない。
【０００３】
体細胞を再生する幹細胞の能力および幹細胞としての細胞区分の特異な可塑性に対する報告は、標的細胞の修復の実現性を広げている。造血性の幹細胞（ＨＳＣ）は、自己再生能、および特定の微小環境にさらすことによって種々の特殊化された血液細胞型（系統（lineage））を生成する潜在性の両方を示す。異なる血液細胞の分化の過程（すなわち造血）は、発生プログラムが脊椎動物においてどのように確立され、実行されるのか、および血液形成の恒常性が白血病においてどのように変更されるのかを試験する有用なモデルをもたらす。最近の知見は、これがどのように実現されるのかを示すだけでなく、インビボにおける組織の幹細胞の非常な可塑性を示している。
【０００４】
造血は、初めに未分化の前駆体（progenitor）を生じ、それから複数または単一の系統経路に下って分化する能力の変更をともなっている前駆体（precursor）を生じるＨＳＣを用いて階層的な様式において通常、表される。特定の系統に拘束された細胞の可塑性を調べる研究によって、系統の転換の過程は形質転換および／または腫瘍遺伝子の発現を必要としたが見出されている。さらに、系統の転換についての証拠が認められたときに、系統の転換は小さい割合の細胞にのみ生じていると分かった（Klinken et al, Cell 53: 857-867, 1988; Graf et at, Blood 99: 3089-3101, 2002）。
【０００５】
５−アザシスチジンを用いて処理したアベルソンウイルス性の形質転換したプレＢ細胞を用いた実験によって、マクロファージ様の特性（プラスティックに付着する能力、ならびに食作用およびエステラーゼ活性が挙げられる）を示す細胞の部分集合が生じた（Boyd et al, Nature 297:691-693, 1982）。より最近の実験によって、Ｂリンパ細胞株または前白血病骨髄Ｂ細胞系統における腫瘍遺伝子Ｅ−ｍｙｃおよびｖ−ｒａｆの同時発現は、それらのマクロファージへの転換を導き得ることが証明されている。これらのトランスフェクトされたマクロファージ様細胞は、骨髄性単球の複数のマーカー（例えばコロニー刺激受容体１）を有しており、リゾチームを発現していたが、元の細胞の特徴（例えば免疫グロブリンの再構成）を保持していた。また、マクロファージへの変化に加えて、Ｂ細胞系統はｍａｘ遺伝子のトランスフェクションによって顆粒球への変化について報告された（Lindeman et al, Immunity 1: 517-527, 1994）。注目すべきことに、導入遺伝子を発現している細胞の非常にわずかな割合のみが実際に系統を転換しており、１つの系統から他の系統への変化は、完全に理解されていない複雑な過程であることを示している（Klinken et al, Cell 53: 857-867, 1988; Borzello et al, Mol. Cell Biol. 10:2703-2714, 1990）。
【０００６】
造血性系統の可塑性を研究する代替の実験的な方法は、遺伝子ノックアウトマウスの生成に関していた。特に、Ｐａｘ−５をノックアウトしたマウスに由来するＢ細胞系統は、プレＢ細胞の特性（例えば、ＣＤ１９ではなく、Ｂ２２０、ＡＡ４．１、ＳＬ鎖およびｃ−Ｋｉｔ（低い）の発現）を示した。また、これらの細胞は、多能性の幹細胞の特性（例えば、インターロイキン７（ＩＬ−７）の存在下におけるストロマ細胞に対する継続的な自己再生、移植後の骨髄へのホーミング、ならびにインビボおよびインビトロの両方における造血細胞のほとんどの種類への分化能）を示した。異なるサイトカインまたは異なる成長因子の存在下において増殖させると、それらは異なる細胞の種類の範囲に分化した。例えば、ＩＬ−２を用いた処理によってナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）への転換が生じ、ＣＳＦ−１および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を用いた処理によって樹状細胞への転換を生じ、ＣＳＦ−１を用いた処理によってマクロファージへの転換を生じ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、幹細胞因子（ＳＣＦ）および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を用いた処理によって好中球への転換を生じた（Nutt et al, Nature 401: 556-562, 1999）。
【０００７】
可塑性がＰａｘ−５ノックアウトマウスに由来する細胞を用いて証明されると思われるが、野生型のマウスからのプレＢ細胞の培養物には疑問があるため、Ｐａｘ−５ノックアウトのプレＢ細胞と類似の表現型を示す細胞は、野生型の動物にほとんど存在していない（Kee et al, Curr. Opin. Immunol. 13: 180-185, 2001）。
【０００８】
リンパ系の共通前駆細胞（ＣＬＰ）の可塑性を調べる、遺伝子導入マウスを用いた他の研究によって、ＩＬ−７の存在下においてストロマ細胞上で培養され場合にヒトＩＬ−２受容体β鎖を遺書的に発現する遺伝子導入マウスの系統に由来するＣＬＰはＢ細胞およびＮＫ細胞に分化することが示された。ＩＬ−２が培養物に加えられた場合、それらは顆粒球およびマクロファージを形成した。しかし、これらの結果は、同じ条件下に成長させた対照ＣＬＰから再現され得なかった（Kondo et al, Nature 407: 383-386, 2000）。したがって、これらの研究の結果は、細胞の可塑性の誘導が拘束された細胞によって通常に発現されない遺伝子の発現を必要とすることを示唆していると考えられる。
【０００９】
上述の実験において詳述された表現型の可塑性を示す細胞は、マウスのリンパ腫に由来するか、腫瘍遺伝子によって形質転換された細胞であるか、または変異によって変化したかのいずれかであった。通常のＢ細胞の可塑性に関するデータがわずかに存在している。一連の実験によって、ＩＬ−３、ＩＬ−６およびＧＭ−ＣＳＦとともに培養した場合に、成体のマウスに由来するＣＤ１９陽性、ＤＪ再構成陽性、およびＢ２２０陰性のＢ細胞の、接着性のマクロファージ様細胞への転換が説明された。しかし、ＮＫ細胞またはＴ細胞への転換は実現不可能であった（Montecino-Rodriguez et al, Nat. Immunol. 2: 83-88, 2001）。
【００１０】
骨髄球系統からＢリンパ球系統への逆転換についてごくわずかなデータが利用できる。試みられている実験は、Ｅ２Ａ遺伝子、ＥＢＦ遺伝子およびＲＡＧ遺伝子によってコードされている初期のＢリンパ球系統に特異的な転写因子の強制的な発現について主に関していた。例えば、Ｅ２Ａの強制的な発現は、細胞にそれらの吸着特性を失わさせ、Ｍａｃ−１およびｃ−ｆｍｓの発現を下方制御させ、Ｂリンパ球系統に特異的な多くの遺伝子を誘導（ミトゲンに応じたκ鎖の形成能が挙げられる）させた（Kee et al, J. Exp. Med. 188: 699-713, 1998）。これらの細胞が完全なＢリンパ球系統の表現型を獲得しなかったことは、Ｅ２Ａ遺伝子、ＥＢＦ遺伝子およびＲＡＧ遺伝子の発現の組合せが系統の特異化に十分ではなく、付加的な遺伝子が関与する必要があることを示唆している（Romanow et al, Mol. Cell 5: 343-353, 2000）。
【００１１】
また、Ｔリンパ球系統およびマクロファージの間における起こり得る転換の例がある。胸腺のストロマ細胞株に由来する純化されたプロＴ細胞の部分集合は、条件培地において培養された場合に機能的なマクロファージを生成した。同じ転換は、ＩＬ−６、ＩＬ−７およびマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ；ＣＳＦ−１）の存在下に認められたが、非常に低い頻度であった（Lee et al, J. Immunol. 166: 5964-5989, 2001）。
【００１２】
最も説明がなされている分化転換は、ほぼ間違いなく、骨髄球−赤血球の区分内における可塑性である。この分野におけるほとんどの実験は、強制的な転写因子の発現に基づいている。１つの系統から他の系統への培養した細胞株の直接的な分化を可能にする最も再現性があり、予測可能な実験系は、Ｍｙｂ−Ｅｔｓをコードしている白血球ウイルスによるトリの赤血球巨核球の前駆細胞の形質転換に基づいている。これらのＥ２６−ＭＥＰ細胞は、巨核球細胞および幹細胞の表面マーカー（例えば、ＭＥＰ２１／トロンボムチン／ＰＣＬＰ１およびＧＰＩＩａＩＩｂ／ＣＤ４１（Graf et al, Cell 70:201-213, 1992; McNagny et al, J. Cell. Biol. 138:1395-14-7, 1997）、ならびにＧＡＴＡ−１およびＦＯＧ−１）の多くを発現しているが、骨髄性単核球の表面マーカーを発現しておらず、ＰＵ．１、Ｃ／ＥＢＰαおよびＣ／ＥＢＰβを発現していないか、または低レベルに発現している。ｖ−Ｅｔｓがこれらの細胞において不活性化される場合、それらは赤血球細胞に分化する（Golay et al, Cell 55: 1147-1158, 1987; Rossi et al, Curr. Biol. 6: 866-872, 1988）。代替的に、Ｍｙｂの不活性化はこれらの細胞の血小板への分化を導く（Frampton et al, EMBO J. 14: 2866-2875, 1995）。レトロウイルス性の形質転換を介してか、またはタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化によってｒａｓ経路の腫瘍遺伝子の導入を通じて、細胞は拘束されて、シグナルの強度に依存して好酸球または骨髄芽球になる（Graf et al, Cell 70:201-213, 1992; Rossi et al, EMBO J. 15: 1894-1901, 1996）。
【００１３】
多能性または分化状態の維持は、持続的な過程の結果であること、および単一（または少数）の核制御因子の活性化もしくは抑制は、分化、系統の転換、もしくは脱分化を導き得ることが広く知られている（Orkin, Nature Rev. Genet. 1: 57-64, 2000）。これに関連して、それらの発現において特定の系統に制限されている核の転写因子の研究は、それらが細胞の分化に対して固有の遺伝子発現プログラムを確立しているので、特に関心がもたれている。成長因子は、造血の維持、細胞の生存能力および増殖に重要であり、それらは経路の分化にとって必ずしも指導的ではない（Sokolovsky et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 6573-6575, 1998; Stoffel et al, Proc Natl. Acad. Sci. USA 96: 698-702, 1999）。
【００１４】
系統分化の複雑さは、所定の因子が発現されている濃度またはレベルが系統の分化の方向に影響し得ることを示す研究によってさらに証明されている。特に、形質転換されたトリの前駆体の系（Kulessa et al, Genes Dev. 9: 1250-1262, 1995）において、系統の結果はＧＡＴＡ−１発現のレベルと相関した。低レベルにおいてそれは好酸球を生じ、高レベルにおいてそれは赤血球細胞および巨核球細胞を産生した。また最近、高レベルのＰＵ．１がマクロファージの発生を支持し、低レベルにおいてＢ細胞が生成されることが見出されている（DeKoter et al, Science 288: 146-149, 2000）。
【００１５】
また最近、ＨＳＣは組織の異なる種類に寄与する顕著な能力を有していることが明らかになっている。したがって、細胞の可塑性を制御する能力または導入する能力は、潜在的に多くの有用な用途を有している。例えば、ＦＡＨチロシナーゼ欠乏症の機能的な肝臓の再構成は、高度に純化されたＨＳＣを用いることによって実現された。肝細胞は、内胚葉に由来しており、したがって中胚葉に由来するＨＳＣは内胚葉性の派生物に転換する能力を有していると思われる（Lagasse et al, Nature Med. 6: 1229-1234, 2000）。他の一連の実験はＨＳＣの非常に高い可塑性を指摘しており、これらの細胞の機能的な能力に関するデータは示されていないが、これによって、骨髄に由来する単一の幹細胞は多くの器官における種々の表皮組織に対する低レベルの寄与を証明している（Krause et al, Cell 105: 369-377, 2001）。濃縮された骨髄性の集団に由来する成体の幹細胞を用いた最近の実験によって、心筋梗塞の後に筋細胞を修復する能力がさらに示された（Orlic et al, Ann. NY Acad. Sci. 938: 221-230, 2001; Orlic et al, Nature 410: 701-705, 2001; Jackson et al, J. Clin. Invest. 107: 1395-1402, 2001）。
【００１６】
以上において詳述した研究によって、細胞に可塑性を導入することの理解および可能性は、例えば組織再生における、潜在的に有用な用途を有していることが明らかに示されている。
【００１７】
また、造血細胞はより初期の前駆状態に逆分化し得るか、または脱分化し得るという証拠が増えている。例えば、ｖ−ｍｙｂの温度感受性（ｔｓ）変異体によって形質転換されたトリの骨髄単球性の細胞は、未成熟な表現型を示し、許容性の温度において骨髄芽球と類似している。しかし、非許容性の温度において、それらは、食作用を示す吸着性のマクロファージ様細胞に移行し、分裂を中断する。低速度撮影の実験によって、許容性の温度に変化した後の２または３日以内に、この過程は芽細胞の形態を獲得し、細胞周期にふたたび入ることをともなって可逆性であったことが示された（Beug et al, Genes Dev. 1: 277-286, 1987）。
【００１８】
環境の操作によって単一の細胞集団から機能的に分化した骨髄性細胞またはリンパ系細胞の生成を可能にする再生可能で安定なモデルが存在しないため、今のところ、分化転換を調べる研究の大部分は非ヒト細胞を用いてなされている。
【００１９】
現在、造血系統内のすべての分化転換の研究は生体宿主への移植を必要とする非ヒトモデルにおいて実施されている。さらに、これらのモデル系は異なる系統に切り替わる高頻度の細胞について証明されておらず、したがってインビトロおよびインビボにおける研究の効率を制限している。最も注目すべきことに、これらのモデル（例えば、遺伝子導入動物から単離された細胞または人工的に形質転換された細胞）は、天然に存在していない細胞の表現型の使用をしばしば含んでいる。
【００２０】
成熟エフェクター細胞の分化転換に関する利用可能なデータは限られているか、またはない。これは、Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄性細胞の成熟した表現型のマーカー、特にＣＤ１９、ＣＤ４もしくはＣＤ３、およびＣＤ１５といったマーカーを含んでいる細胞系または動物モデルが不足していることから生じている。Ｂリンパ球系統の分化転換をともなう実験の大部分は、成熟したＣＤ１９陽性細胞への転換について非常に低い頻度を有しているプレＢ細胞に関する。Ｂリンパ球系統および骨髄球、Ｔリンパ球および骨髄球の間における転換はわずかな成功を収めているが、Ｂリンパ球系統およびＴリンパ球系統の間の転換は認められていない。
【００２１】
従来技術の少なくとも１つの不都合の克服もしくは改善、または有用な代替物を提供することが本発明の目的である。
【００２２】
〔発明の概要〕
多重の融合細胞は不安定であり、融合に関連する細胞が多いほど、生じるハイブリッド細胞の不安定性が増すことが一般的に認められている。意外にも、本発明において、いくつかの細胞（例えば、３つの細胞）の融合から生じるハイブリッド細胞は、機能的な安定性を示す。特に、異なる系統に由来する細胞は体細胞性に融合されるか、またはハイブリダイズされて、実質的に安定なキメラ／ハイブリッド細胞を形成し得ることを見出している。より詳細には、本発明は、三重のハイブリッドを生じる少なくとも３つの親細胞のハイブリダイゼーションに基づいて生成される系統交雑のキメラ／ハイブリッド細胞に関する。ここで、少なくとも２つの親細胞は、異なる系統に由来しており、骨髄腫細胞はハイブリダイゼーションに関わっていない。
【００２３】
意外にもまた、本発明の安定なキメラ／ハイブリッド細胞は、所望の表現型（例えば、（複数の）所定の外来因子を用いた処理による所望の系統）の細胞に変化可能な表現型的可塑性を示すことを見出している。これらの因子としては、サイトカイン、成長因子、免疫グロブリン、受容体リガンド、細胞（例えば、ストロマ細胞）またはこれらの組合せが挙げられ得る。
【００２４】
細胞の表現型を変えるこれまでに公知の方法は、例えば腫瘍遺伝子発現の変更または形質転換動物からの細胞の単離による、細胞の形質転換を包含している。これらの方法は、技術的に複雑であり、細胞の表現型的可塑性の低いレベルを常にともなっている非能率的な結果をもたらす。さらに、これらの公知の方法は、ヒト細胞に対して容易に採用され得ない。
【００２５】
本発明は、効率的な分化転換（trans-differentication）または脱分化を可能にする安定な細胞系を提供するという点について、これまでに公知の方法を超えて顕著な利点を提供する。さらに、本発明は、ヒト細胞の分化転換または脱分化を可能にする。
【００２６】
一実施形態において、本発明は、細胞分化の過程（例えば血液細胞の分化（すなわち造血））を調べるための多用途の簡便なモデル系を提供することに関する。また、本発明は、遺伝的なプログラムが脊椎動物においてどのように確立され、実行されているのかを試験するための有用なモデルを提供することに関する。また、本発明は、細胞の悪性腫瘍化の機能（例えば、血液形成の恒常性がどのようにして白血病に変質されるのか）の理解をもたらすことに関する。
【００２７】
また、代替的な実施形態において、本発明は、疾患の処置の用途（例えば、特定の細胞または組織の生成）に使用され得る表現型可塑性を発現する細胞の生成に関する。
【００２８】
本発明は、分化過程のモデル系の研究の代わりを果たし得る。また、成熟した細胞から特定の細胞への分化能または脱分化能が好都合であり得る状況があり得る。例えば、ある患者は、分化経路におけるある点における変異に起因して特定の表現型を有している細胞を十分に産生する能力を欠いている。例えば、彼らは、プレＢ細胞を有し得るが、成熟Ｂ細胞を有し得ない。そのような患者からプレＢ細胞を単離すること、およびそれらをＢ細胞にすることは、役には立たない。しかし、変異のない、彼らの他の細胞種は本発明を用いてＢ細胞に分化転換され得る。
【００２９】
ある実施形態において、本発明は、必要に応じてＢ細胞、Ｔ細胞または骨髄性単球細胞を生成可能な造血性分化転換系（ＨＴＳ）の創出に関する。
【００３０】
一実施形態において、細胞の可塑性を示す３種のハイブリッド細胞は、１つの骨髄単核性の前駆体（不死または初代培養（primary）のいずれか）、１つのＢ細胞（不死または初代培養のいずれか）、および１つのＴ細胞（不死または初代培養のいずれか）のハイブリダイゼーションによって生成され得る。ここで、上記ハイブリッド細胞は、ハイブリダイゼーションに使用したすべての細胞種に由来する特定のＣＤマーカー（例えば、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ４）を発現している。しかし、当業者は、本発明がこれらの特定のマーカーを発現するハイブリッド細胞に限定されないことを理解する。
【００３１】
ある特定の実施形態において、本発明のハイブリッド細胞は、例えば
１つの骨髄単球性の共通前駆体Ｋ５６２（ＣＤ７２＋ＣＤ１５＋）、１つの初代Ｂ細胞（ＣＤ１９）、および１つのＴ細胞（ＣＤ４）−ＫＢＴ；
１つの骨髄単球性の共通前駆体Ｋ５６２、不死のＢ細胞ＷＩＬ２ＮＳ、および不死のＴ細胞ＭＯＬＴ−ＫＭＷ；または
初代培養された骨髄ＣＤ３４＋ＣＤ１５＋細胞に由来する１つの骨髄単球性の共通前駆体、１つの不死のＢ細胞ＷＩＬ２ＮＳおよび初代培養された１つのＴ細胞−ＷＴＭ
のハイブリダイゼーションによって生成され得る。
【００３２】
特に好ましい実施形態において、本発明のハイブリッド細胞は、種々の因子（例えば、サイトカイン、成長因子、免疫グロブリン、受容体リガンド、ストロマ細胞といった細胞もしくはこれらの組合せ）にそれらをさらすこと、または所望の細胞種とさらにハイブリダイズすることのいずれかによって、必要に応じてＢ細胞、Ｔ細胞または骨髄単球性の細胞に分化され得る。他の実施形態において、本発明のハイブリッド細胞は、他の細胞（例えば、例えばＣＤ３４を発現する前駆細胞、またはＣＤ３４を発現する細胞）とさらにハイブリダイズすることによって分化され得る。
【００３３】
第１の局面によれば、本発明は、所定の表現型の細胞を生成する方法を提供する。当該方法は、
未拘束（uncommitted）の前駆細胞に由来する細胞、または幹細胞である第１の細胞；
リンパ系の共通前駆細胞に由来する第２の細胞；および
リンパ系の共通前駆細胞に由来する第３の細胞をハイブリダイズして、ハイブリッド細胞を生成する工程、ならびに
当該ハイブリッド細胞が所定の表現型の上記細胞になる所定の環境に当該ハイブリッド細胞をさらす工程を包含している。
【００３４】
一実施形態において、上記所定の表現型は、Ｂ細胞、Ｔ細胞または骨髄性細胞である。代替的な実施形態において、上記表現型は、例えばＣＤ３４、ＣＤ１０、Ｐａｘ−５またはλ様のうちの１つ以上の発現を包含している。
【００３５】
ある実施形態において、上記第１の細胞は骨髄性の共通前駆細胞に由来し、上記第２の細胞はＢリンパ球系統に由来する細胞であり、上記第３の細胞はＴリンパ球系統に由来する細胞である。
【００３６】
骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は骨髄単球性の前駆細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好中球、樹状細胞または好塩基球であることが好ましい。したがって、本発明は、骨髄単球性の前駆細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好中球、樹状細胞または好塩基球、Ｂリンパ細胞ならびにＴリンパ細胞をハイブリダイズする工程を包含している、所定の表現型の細胞を生成する方法を提供することが明らかである。
【００３７】
骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は、以下のＣＤ抗原：ＣＤ１６、ＣＤ１５またはＣＤ１４の少なくとも１つを提示していることが好ましい。したがって、本発明は、以下のＣＤ抗原：ＣＤ１６、ＣＤ１５またはＣＤ１４の少なくとも１つを提示している骨髄性の共通前駆細胞、Ｂリンパ細胞ならびにＴリンパ細胞をハイブリダイズすることを包含している、所定の表現型の細胞を生成する方法を提供することが明らかである。
【００３８】
一実施形態において、骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は単球である。したがって、本発明は、単球、Ｂリンパ細胞およびＴリンパ細胞をハイブリダイズすることを包含している、所定の表現型の細胞を生成する方法を提供することが明らかである。
【００３９】
一実施形態において、骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は初代培養された骨髄単球性の前駆細胞である。したがって、本発明は、初代培養された骨髄単球性の前駆細胞、Ｂリンパ細胞およびＴリンパ細胞をハイブリダイズすることを包含している、所定の表現型の細胞を生成する方法を提供することが明らかである。
【００４０】
一実施形態において、骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は不死化された細胞である。したがって、本発明は、骨髄単球性の前駆細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好中球、樹状細胞または好塩基球から選択される不死化された細胞、Ｂリンパ細胞およびＴリンパ細胞をハイブリダイズすることを包含している、所定の表現型の細胞を生成する方法を提供することが明らかである。
【００４１】
他の実施形態において、骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は、脾臓、末梢血、臍帯血または骨髄に由来するものである。したがって、本発明は、脾臓、末梢血、臍帯血または骨髄に由来する骨髄性の共通前駆細胞、Ｂリンパ細胞ならびにＴリンパ細胞をハイブリダイズすることを包含している、所定の表現型の細胞を生成する方法を提供することが明らかである。
【００４２】
他の実施形態において、Ｂリンパ球系統に由来する上記細胞は、プレＢ細胞、未成熟なＢ細胞、ナイーブＢ細胞、活性化Ｂ細胞、またはエフェクターＢ細胞である。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞もしくは幹細胞、プレＢ細胞、未成熟なＢ細胞、ナイーブＢ細胞、活性化Ｂ細胞、またはエフェクターＢ細胞から選択されるＢリンパ細胞、ならびにＴリンパ細胞をハイブリダイズすることを包含している、所定の表現型の細胞を生成する方法を提供することが明らかである。
【００４３】
一実施形態において、Ｂリンパ球系統に由来する上記細胞はプラズマ細胞または抗原を経験した（antigen-experienced）Ｂ細胞である。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞もしくは幹細胞、プラズマ細胞または抗原を経験したＢ細胞、ならびにＴリンパ細胞をハイブリダイズすることを包含している、所定の表現型の細胞を生成する方法を提供することが明らかである。
【００４４】
一実施形態において、Ｂリンパ球系統に由来する上記細胞は、以下のＣＤ抗原：ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ７２またはＣＤ５の少なくとも１つを提示している。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞もしくは幹細胞、以下のＣＤ抗原：ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ７２またはＣＤ５の少なくとも１つを提示しているＢリンパ細胞、ならびにＴリンパ細胞をハイブリダイズすることを包含している、所定の表現型の細胞を生成する方法を提供することが明らかである。
【００４５】
一実施形態において、Ｔリンパ球系統に由来する上記細胞は、プレＴ細胞、未成熟なＴ細胞、ナイーブＴ細胞、活性化Ｔ細胞またはエフェクターＴ細胞である。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞もしくは幹細胞、Ｂリンパ細胞、ならびにプレＴ細胞、未成熟なＴ細胞、ナイーブＴ細胞、活性化Ｔ細胞またはエフェクターＴ細胞から選択されるＴリンパ細胞をハイブリダイズすることを包含している、所定の表現型の細胞を生成する方法を提供することが明らかである。
【００４６】
一実施形態において、Ｔリンパ球系統に由来する上記細胞は、以下のＣＤ抗原：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５またはＣＤ８の少なくとも１つを提示している。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞もしくは幹細胞、Ｂリンパ細胞、ならびに以下のＣＤ抗原：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５またはＣＤ８の少なくとも１つを提示しているＴリンパ細胞をハイブリダイズすることを包含している、所定の表現型の細胞を生成する方法を提供することが明らかである。
【００４７】
一実施形態において、Ｂリンパ球系統に由来する上記細胞は不死化された細胞である。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞もしくは幹細胞、不死化されたＢリンパ細胞、ならびにＴリンパ細胞をハイブリダイズすることを包含している、所定の表現型の細胞を生成する方法を提供することが明らかである。
【００４８】
一実施形態において、Ｔリンパ球系統に由来する上記細胞は不死化された細胞である。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞もしくは幹細胞、Ｂリンパ細胞、ならびに不死化されたＴリンパ細胞をハイブリダイズすることを包含している、所定の表現型の細胞を生成する方法を提供することが明らかである。
【００４９】
一実施形態において、Ｂリンパ球系統に由来する上記細胞はリンパ組織に由来するものである。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞もしくは幹細胞、リンパ組織に由来するＢリンパ細胞、ならびにＴリンパ細胞をハイブリダイズすることを包含している、所定の表現型の細胞を生成する方法を提供することが明らかである。
【００５０】
一実施形態において、Ｔリンパ球系統に由来する上記細胞はリンパ組織に由来するものである。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞もしくは幹細胞、Ｂリンパ細胞、ならびにリンパ組織に由来するＴリンパ細胞をハイブリダイズすることを包含している、所定の表現型の細胞を生成する方法を提供することが明らかである。
【００５１】
ここで、本発明の方法に包含されているＢリンパ細胞またはＴリンパ細胞はリンパ組織に由来するものである。当該リンパ組織は、末梢血、臍帯血、脾臓、骨髄、胸腺、扁桃腺、咽頭扁桃腺および領域リンパ節から好ましく選択される。
【００５２】
一実施形態において、本発明の方法に包含されている細胞の少なくとも１つはヒト細胞である。また、本発明の方法はヒト細胞以外（例えばマウス細胞）の細胞を包含し得ることが明らかである。
【００５３】
一実施形態において、骨髄性の共通前駆細胞に由来する細胞はＫ５６２細胞である。したがって、本発明は、Ｋ５６２細胞、Ｂリンパ細胞およびＴリンパ細胞をハイブリダイズすることを包含している、所定の表現型の細胞を生成する方法を提供することが明らかである。
【００５４】
一実施形態において、上記第２の細胞または上記第３の細胞はそれぞれＷＩＬ２ＮＳまたはＭＯＬＴ５細胞である。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞、ＷＩＬ２ＮＳ細胞およびＴリンパ細胞をハイブリダイズすることを包含している、所定の表現型の細胞を生成する方法を提供することが明らかである。また、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞、Ｂリンパ細胞およびＭＯＬＴ４細胞をハイブリダイズすることを包含している、所定の表現型の細胞を生成する方法を提供する。
【００５５】
一実施形態において、上記第１の細胞はＫ５６２細胞であり、上記第２の細胞はＷＩＬ２ＮＳ細胞であり、上記第３の細胞はＭＯＬＴ４細胞である。
【００５６】
他の実施形態において、上記第１の細胞はＫ５６２細胞であり、上記第２の細胞は初代培養されたＢ細胞であり、上記第３の細胞は初代培養されたＴ細胞である。
【００５７】
他の実施形態において、上記第１の細胞は初代培養されたヒト単球であり、上記第２の細胞はＷＩＬ２ＮＳ細胞であり、上記第３の細胞は初代培養されたＴ細胞である。
【００５８】
他の実施形態において、上記第１の細胞は初代培養されたヒト骨髄単球性の前駆体であり、上記第２の細胞はＷＩＬ２ＮＳ細胞であり、上記第３の細胞は初代培養されたヒトＴ細胞である。
【００５９】
他の実施形態において、上記第１の細胞はＫ５６２細胞であり、上記第２の細胞はＷＩＬ２ＮＳ細胞であり、上記第３の細胞は初代培養されたＴ細胞である。
【００６０】
さらなる実施形態において、上記第１の細胞は初代培養されたマウス単球であり、上記第２の細胞はＳＰ２細胞であり、上記第３の細胞は初代培養されたマウスＴ細胞である。
【００６１】
ある実施形態において、上記Ｂ細胞および上記Ｔ細胞はＣＤ５を発現している、代替的な実施形態において、上記Ｂ細胞はＣＤ２０およびＣＤ７２を発現しており、上記Ｔ細胞はＣＤ４およびＣＤ８を発現している。
【００６２】
ある実施形態において、本発明の方法によって生成された上記ハイブリッド細胞は他の細胞とさらにハイブリダイズされる。ここで、当該他の細胞は例えば、幹細胞または前駆細胞であり得る。
【００６３】
ある実施形態において、上記所定の環境は、胸腺のストロマ細胞、サイトカイン、成長因子、免疫グロブリン、受容体リガンドまたはこれらの組合せを包含している。したがって、本発明の方法は、上述のような３つの細胞：例えば
未拘束の前駆細胞に由来する第１の細胞；
リンパ系の共通前駆細胞に由来する第２の細胞；および
リンパ系の共通前駆細胞に由来する第３の細胞
をハイブリダイズして、ハイブリッド細胞を生成すること、ならびに当該ハイブリッド細胞が所定の表現型の細胞になるような胸腺のストロマ細胞、サイトカイン、成長因子、免疫グロブリン、受容体リガンドまたはこれらの組合せに当該ハイブリッド細胞をさらすことを提供することが明らかである。
【００６４】
ある実施形態において、上記所定の環境に包含されている上記サイトカインまたは成長因子は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１β、ＩＬ−７、ＩＬ−２３、ＴＧＦ−β、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＦＮ−γからなる群から選択される。
【００６５】
ある実施形態において、上記免疫グロブリンは、抗ＩＬ−４、抗ＩＦＮ−γおよび抗ＣＤ３／ＣＤ２８からなる群から選択される。
【００６６】
ある実施形態において、上記受容体リガンドはＦｉｔ３リガンドまたはＣＤ４０である。
【００６７】
ある局面において、本発明は、
未拘束の前駆細胞に由来する第１の細胞；
リンパ系の共通前駆細胞に由来する第２の細胞；および
リンパ系の共通前駆細胞に由来する第３の細胞
のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。ここで、上記第１の細胞は骨髄腫細胞ではない。
【００６８】
一実施形態において、上記第２の細胞はＢリンパ球系統に由来する細胞であり、上記第３の細胞はＢリンパ球系統に由来する細胞である。
【００６９】
他の実施形態において、上記第２の細胞はＢリンパ球系統に由来する細胞であり、上記第３の細胞はＴリンパ球系統に由来する細胞である。
【００７０】
上記第１の細胞は骨髄性の共通前駆細胞に由来する細胞であることが好ましい。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞もしくは幹細胞、および２つのＢリンパ細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。また、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞もしくは幹細胞、Ｂリンパ細胞およびＴリンパ細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
【００７１】
骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は、骨髄単球性の前駆細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好中球、樹状細胞または好塩基球であることが好ましい。したがって、本発明は、骨髄単球性の前駆細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好中球、樹状細胞または好塩基球、ならびに２つのＢリンパ細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。また、本発明は、骨髄単球性の前駆細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好中球、樹状細胞または好塩基球、Ｂリンパ細胞ならびにＴリンパ細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
【００７２】
骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は、以下のＣＤ抗原：ＣＤ１６、ＣＤ１５またはＣＤ１４の少なくとも１つを提示していることが好ましい。したがって、本発明は、以下のＣＤ抗原：ＣＤ１６、ＣＤ１５またはＣＤ１４の少なくとも１つを提示している骨髄性の共通前駆細胞、ならびに２つのＢリンパ細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。また、本発明は、以下のＣＤ抗原：ＣＤ１６、ＣＤ１５またはＣＤ１４の少なくとも１つを提示している骨髄性の共通前駆細胞、Ｂリンパ細胞およびＴリンパ細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
【００７３】
一実施形態において、骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は単球である。したがって、本発明は、単球ならびに２つのＢリンパ細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。また、本発明は、単球、Ｂリンパ細胞ならびにＴリンパ細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
【００７４】
他の実施形態において、骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は初代培養された骨髄単球性の前駆細胞である。したがって、本発明は、初代培養された骨髄単球性の前駆細胞、および２つのＢリンパ細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。また、本発明は、初代培養された骨髄単球性の前駆細胞、Ｂリンパ細胞、およびＴリンパ細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
【００７５】
一実施形態において、骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞は不死化された細胞である。したがって、本発明は、骨髄単球性の前駆細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好中球、樹状細胞または好塩基球から選択される不死化された細胞、ならびに２つのＢリンパ細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。また、本発明は、骨髄単球性の前駆細胞、単球、マクロファージ、好酸球、好中球、樹状細胞または好塩基球から選択される不死化された細胞、Ｂリンパ細胞、ならびにＴリンパ細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
【００７６】
他の実施形態において、骨髄性の共通前駆体細胞に由来する上記細胞は、脾臓、末梢血、臍帯血または骨髄に由来するものである。したがって、本発明は、脾臓、末梢血、臍帯血または骨髄に由来する骨髄性の共通前駆体細胞、ならびに２つのＢリンパ細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。また、本発明は、脾臓、末梢血、臍帯血または骨髄に由来する骨髄性の共通前駆体細胞、Ｂリンパ細胞、ならびにＴリンパ細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
【００７７】
他の実施形態において、Ｂリンパ球系統に由来する上記細胞は、プレＢ細胞、未成熟なＢ細胞、ナイーブＢ細胞、活性化Ｂ細胞またはエフェクターＢ細胞である。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆体細胞または幹細胞、ならびにプレＢ細胞、未成熟なＢ細胞、ナイーブＢ細胞、活性化Ｂ細胞、またはエフェクターＢ細胞から選択される２つのＢリンパ細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。また、本発明は、骨髄性の共通前駆体細胞または幹細胞、プレＢ細胞、未成熟なＢ細胞、ナイーブＢ細胞、活性化Ｂ細胞またはエフェクターＢ細胞から選択されるＢリンパ細胞、ならびにＴリンパ細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
【００７８】
一実施形態において、上記エフェクターＢ細胞はプラズマ細胞または抗原を経験したＢ細胞である。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆体細胞または幹細胞、ならびにプラズマ細胞または抗原を経験したＢ細胞から選択される２つのＢリンパ細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。また、本発明は、骨髄性の共通前駆体細胞または幹細胞、プラズマ細胞または抗原を経験したＢ細胞から選択されるＢリンパ細胞、ならびにＴリンパ細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
【００７９】
一実施形態において、Ｂリンパ球系統に由来する上記細胞は以下のＣＤ抗原：ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ７２またはＣＤ５の少なくとも１つを提示している。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆体細胞または幹細胞、ならびに以下のＣＤ抗原：ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ７２またはＣＤ５の少なくとも１つを提示している２つのＢリンパ細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。また、本発明は、骨髄性の共通前駆体細胞または幹細胞、以下のＣＤ抗原：ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ７２またはＣＤ５の少なくとも１つを提示しているＢリンパ細胞、ならびにＴリンパ細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
【００８０】
一実施形態において、Ｔリンパ球系統に由来する上記細胞は、プレＴ細胞、未成熟なＴ細胞、ナイーブＴ細胞、活性化Ｔ細胞またはエフェクターＴ細胞である。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆体細胞または幹細胞、、Ｂリンパ細胞、ならびにプレＴ細胞、未成熟なＴ細胞、ナイーブＴ細胞、活性化Ｔ細胞またはエフェクターＴ細胞から選択されるＴリンパ細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
【００８１】
一実施形態において、Ｔリンパ球系統に由来する上記細胞は、以下のＣＤ抗原：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５またはＣＤ８の少なくとも１つを提示している。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆体細胞または幹細胞、、Ｂリンパ細胞、ならびに以下のＣＤ抗原：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５またはＣＤ８の少なくとも１つを提示しているＴリンパ細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
【００８２】
一実施形態において、Ｂリンパ球系統に由来する上記細胞は不死化された細胞である。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆体細胞または幹細胞、ならびに不死化された細胞の少なくとも１つであり得る２つのＢリンパ細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。また、本発明は、骨髄性の共通前駆体細胞または幹細胞、不死化されたＢリンパ細胞、ならびにＴリンパ細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
【００８３】
一実施形態において、Ｔリンパ球系統に由来する上記細胞は不死化された細胞である。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆体細胞または幹細胞、Ｂリンパ細胞、ならびに不死化されたＴリンパ細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
【００８４】
一実施形態において、Ｂリンパ球系統に由来する上記細胞はリンパ組織に由来するものである。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆体細胞または幹細胞、ならびにリンパ組織に由来する２つのＢリンパ細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。また、本発明は、骨髄性の共通前駆体細胞または幹細胞、リンパ組織に由来するＢリンパ細胞、ならびにＴリンパ細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
【００８５】
一実施形態において、Ｔリンパ球系統に由来する上記細胞はリンパ組織に由来するものである。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆体細胞または幹細胞、Ｂリンパ細胞、ならびにリンパ組織に由来するＴリンパ細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
【００８６】
ここで、本発明のハイブリッド細胞に含まれている上記Ｂリンパ細胞または上記Ｔリンパ細胞はリンパ組織に由来しており、当該リンパ組織は、末梢血、臍帯血、脾臓、骨髄、胸腺、扁桃腺、咽頭扁桃腺、および領域リンパ節から好ましく選択される。
【００８７】
一実施形態において、本発明のハイブリッド細胞の生成に包含されている上記細胞の少なくとも１つはヒト細胞である。また、本発明のハイブリッド細胞はヒト細胞以外の細胞（例えばマウス細胞）を包含し得ることが明らかである。
【００８８】
一実施形態において、骨髄性の共通前駆細胞に由来する上記細胞はＫ５６２細胞である。したがって、本発明は、Ｋ５６２細胞、ならびに２つのＢリンパ細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供することが明らかである。また、本発明は、Ｋ５６２細胞、不死化されたＢリンパ細胞、ならびにＴリンパ細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
【００８９】
一実施形態において、上記第２の細胞または上記第３の細胞はそれぞれＷＩＬ２ＮＳ細胞またはＭＯＬＴ４細胞である。したがって、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、ＷＩＬ２ＮＳ細胞ならびにＴリンパ細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供することが明らかである。また、本発明は、骨髄性の共通前駆細胞または幹細胞、Ｂリンパ細胞、ならびにＭＯＬＴ４細胞のハイブリダイゼーションによって生成されたハイブリッド細胞を提供する。
【００９０】
一実施形態において、上記第１の細胞はＫ５６２細胞であり、上記第２の細胞はＷＩＬ２ＮＳ細胞であり、上記第３の細胞はＭＯＬＴ４細胞である。
【００９１】
他の実施形態において、上記第１の細胞はＫ５６２細胞であり、上記第２の細胞は初代培養されたＢ細胞であり、上記第３の細胞は初代培養されたＴ細胞である。
【００９２】
他の実施形態において、上記第１の細胞はヒト単球であり、上記第２の細胞はＷＩＬ２ＮＳ細胞であり、上記第３の細胞は初代培養されたＴ細胞である。
【００９３】
他の実施形態において、上記第１の細胞は初代培養されたヒト骨髄性単球であり、上記第２の細胞はＷＩＬ２ＮＳ細胞であり、上記第３の細胞は初代培養されたＴ細胞である。
【００９４】
他の実施形態において、上記第１の細胞はＫ５６２細胞であり、上記第２の細胞はＷＩＬ２ＮＳ細胞であり、上記第３の細胞は初代培養されたＴ細胞である。
【００９５】
他の実施形態において、上記第１の細胞は初代培養された単球であり、上記第２の細胞はＷＩＬ２ＮＳ細胞であり、上記第３の細胞はＷＩＬ２ＮＳ細胞である。
【００９６】
他の実施形態において、上記第１の細胞は初代培養された単球であり、上記第２の細胞はＳＰ２細胞であり、上記第３の細胞は初代培養されたマウス細胞である。
【００９７】
他の実施形態において、上記第１の細胞は初代培養されたマウス単球であり、上記第２の細胞はＳＰ２細胞であり、上記第３の細胞はＳＰ２細胞である。
【００９８】
他の実施形態において、上記第１の細胞は初代培養されたヒト単球またはマウス単球であり、上記第２の細胞はＷＩＬ２−ＮＳ細胞であり、上記第３の細胞はＳＰ２細胞である。
【００９９】
一実施形態において、本発明のハイブリッド細胞は所望のタンパク質を発現する。一実施形態において、上記タンパク質は外来性のタンパク質である。他の実施形態において、上記タンパク質は組換えタンパク質である。上記タンパク質はサイトカイン（すなわちコロニー刺激因子またはインターロイキン）であることが好ましい。一実施形態において、上記タンパク質はＧＭ−ＣＳＦである。他の実施形態において、上記タンパク質はインターロイキン２である。さらに他の実施形態において、上記タンパク質は受容体またはそれらの断片である。さらに他の実施形態において、上記タンパク質は可溶性の受容体である。
【０１００】
一実施形態において、上記タンパク質はヒトＩＬ−４受容体α鎖である。他の実施形態において、上記タンパク質はＩｇＭである。さらに他の実施形態において、上記タンパク質はＩｇＧである。さらに他の実施形態において、上記タンパク質はＣＤ５４である。
【０１０１】
一実施形態において、本発明のハイブリッド細胞の生成に使用されるハイブリダイゼーションは電気的な手段によって実現される。他の実施形態において、本発明のハイブリッド細胞の生成に使用されるハイブリダイゼーションは化学的な手段によって実現される。
【０１０２】
一実施形態において、本発明のハイブリッド細胞は所望のタンパク質を発現している細胞とさらにハイブリダイズされる。
【０１０３】
一実施形態において、本発明のハイブリッド細胞の生成に使用されるハイブリダイゼーションは３つの個々の細胞をハイブリダイズすることによって実施される。
【０１０４】
他の実施形態において、本発明のハイブリッド細胞の生成に使用されるハイブリダイゼーションは細胞の３つの集団を用いて実施される。ここで、各細胞集団は同一の細胞種または表現型を複数含んでいる。
【０１０５】
一実施形態において、本発明のハイブリッド細胞は、特定の細胞種を規定するマーカーに関して濃縮されて、タンパク質の発現が所望の翻訳後修飾または所望の機能性を示すことを可能にする。
【０１０６】
〔定義〕
本発明に照らして、「含んでいる（comprise）」および「含んでいる（comprising）」などは、それらの排他的な意味ではなく、「包含しているが、これに限定されない」というそれらの包括的な意味において解釈されるべきである。
【０１０７】
（ハイブリッド細胞）
ハイブリッド細胞は、２以上のゲノムに由来する構成要素を含んでいる細胞（接合体およびそれらの派生物以外）である。それは、例えば２以上の生物学的な細胞（親細胞）の、体細胞ハイブリダイゼーション（または全細胞ハイブリダイゼーション）から構築される細胞である。親細胞は、同じ系統（または種）または異なる系統（または種）のいずれかから入手され得る。同じ系統および種から生成されたハイブリッド細胞は自己ハイブリッド（auto-hybrid）と呼ばれ、一方、異なる系統のハイブリッド細胞は異種ハイブリッドと呼ばれる。
【０１０８】
（キメラ細胞）
キメラ細胞は、２以上の異なる種に由来するゲノムを有している、人工的に生成されたハイブリッド細胞である。
【０１０９】
（系統交雑のハイブリッド細胞）
系統交雑のハイブリッド細胞は、異なる細胞系統に由来する２以上の細胞に由来するゲノムを有している人工的に生成されたハイブリッド細胞である。造血細胞は２つの主な系統：リンパ球系（Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞）ならびに骨髄系（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球および好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）に分けられる。
【０１１０】
（トリハイブリッド細胞（tri-hybrid cell））
トリハイブリッド細胞は、３つの細胞に由来するゲノムを有している、人工的に生成されたハイブリッド細胞である。
【０１１１】
（安定な）
細胞に言及するときに、「安定な」という用語は、所定の成長パラメータもしくは生産パラメーターの一貫性を証明する細胞の能力、または増加する世代数に対して細胞株の生産特性の一貫性を意味する。安定な形質転換体に言及して用いられるとき、それは、比較的に一定のレベルにおいて導入遺伝子を、実質的に無期限に発現する細胞株を意味する。
【０１１２】
（体細胞ハイブリダイゼーション）
本明細書に照らして、「体細胞ハイブリダイゼーション」という用語は、細胞の原形質膜が良好に接触するよう誘導され、接触点において親細胞の原形質膜の可逆的な破壊が同時に誘導され、新たに形成された単一細胞の外膜の内部にそれぞれの親細胞の本体または細胞小器官が組み込まれるような方法において、単一の生細胞が２以上の二倍体（非生殖細胞）の細胞（親細胞）から生成される過程を指す。新たに形成された単一の細胞はハイブリダイズされた細胞またはハイブリッド細胞と呼ばれる。
【０１１３】
（幹細胞）
「幹細胞」という用語は、有糸分裂による分裂能および種々の異なる細胞型への分化能を有している特殊化していない細胞（unspecialised cell）を指す。幹細胞は、胚性幹細胞、臍帯に由来する「成熟な」幹細胞または成体に由来する幹細胞を包含し得る。幹細胞は、すべての細胞型に分化する無制限の能力を有している細胞、すなわち全能細胞を包含している。また、幹細胞は、特殊化した細胞（例えば、全能性、多能性、低能性（oligopotent）または単能性幹細胞）への分化能に制限されている細胞を包含し得る。
【０１１４】
（不死化された細胞）
「不死化された細胞」という用語は、無制限に成長する能力を有している細胞を指す。不死化された細胞はインビボの悪性腫瘍または胚に由来し得ることが明確であろう。代替的に、不死化された細胞は、無制限に成長する能力を誘導する処理を細胞に施すことによって入手し得る。これら処理は、例えば、インビトロの形質転換処理（例えばウイルス遺伝子の導入）を包含し得る。当該ウイルス遺伝子は、例えば、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）  Ｔ抗原、アデノウイルス  Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ、ならびにヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）  Ｅ６およびＥ７である。代替的に、不死化された細胞はテロメラーゼ逆転写酵素タンパク質（ＴＥＲＴ）の発現または他の方法を経た細胞に由来し得る。また、不死化された細胞は、発癌遺伝子の発現が改変されている細胞に由来し得る。不死化された細胞は無制限に成長する能力を誘導する任意の処理（ＵＶ照射、または不死化の機構が不明である任意の形質転換を包含しているが、これらに限定されない）に由来し得る。
【０１１５】
（骨髄腫細胞）
「骨髄腫細胞」という用語は、プラズマ細胞の悪性腫瘍を指す。
【０１１６】
（ハイブリドーマ）
「ハイブリドーマ」という用語は、免疫化された動物の脾臓に由来するＢ細胞と、骨髄腫細胞とのハイブリダイゼーションによって生成される細胞を指す。ハイブリドーマはモノクローナル抗体の産生能を有している不死化された細胞である。
（表現型）
「表現型」という用語は、細胞の物理的特性または形態を指す。例えば、表現型は、特定の細胞系統（例えば、リンパ球系統または骨髄球系統）に関し得る。代替的に、「表現型」という用語は、１つ以上の分子（例えば、細胞の表面上の分子（例えばＣＤマーカー）または細胞内の分子（例えば転写因子））の発現に関し得る。
【０１１７】
（未拘束の前駆細胞）
「未拘束の前駆細胞」という用語は、任意の特定の系統に拘束されることなく、一部の種類の細胞にのみ分化し得るが、自己をもはや回復し得ない幹細胞の初期の子孫を指す。
【０１１８】
（骨髄性の共通前駆細胞）
骨髄性の共通前駆細胞は、骨髄系統に制限された造血幹細胞の子孫であり、巨核球／赤血球または顆粒球／マクロファージ前駆細胞のいずれかになり得るが、リンパ球系細胞になり得ない。
【０１１９】
（リンパ系の共通前駆細胞）
リンパ系の共通前駆細胞は、リンパ球系統に制限された造血幹細胞の子孫であり、Ｂ、Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞になり得るが、骨髄細胞になり得ない。
【０１２０】
（Ｂリンパ球系統に由来する細胞）
Ｂリンパ球系統に由来する細胞は、Ｂ細胞の任意の型になるＢ系統の分化の後の、リンパ系の共通前駆細胞に由来する任意の細胞である。
【０１２１】
（Ｔリンパ球系統に由来する細胞）
Ｔリンパ球系統由来の細胞は、Ｔ細胞の任意の型になるＴ系統の分化の後の、リンパ球共通前駆体に由来する任意の細胞である。
【０１２２】
（顆粒球−マクロファージ前駆細胞）
顆粒球−マクロファージ前駆細胞は、骨髄性の共通前駆細胞に由来しており、顆粒球および単球の系統に分化するが、巨核球および赤血球の系統には分化しない前駆細胞である。
【０１２３】
（巨核球−赤血球前駆細胞）
巨核球−赤血球前駆細胞は、骨髄性の共通前駆細胞に由来しており、巨核球および赤血球の系統に分化するが、顆粒球および単球の系統には分化しない前駆細胞である。
【０１２４】
（プレＢ細胞）
プレＢ細胞は、膜結合型ＩｇＭの重鎖が代替軽鎖と共に発現している段階において発達中のＢ細胞である。
【０１２５】
（未成熟なＢ細胞）
未成熟なＢ細胞は、抗体の位置の組換え段階においてＶＪがＬ鎖上に再構成され、ＶＤＪがＨ鎖上（ＩｇＭ受容体の発現がみられる）に再構成される骨髄において発達中のＢ細胞を指す。
【０１２６】
（ナイーブＢ細胞）
ナイーブＢ細胞は、その表面の免疫グロブリンの無作為な遺伝子再構成を経て骨髄において分化し、成熟しているが、末梢において対応する抗原といまだに接触していない成熟Ｂ細胞である。
【０１２７】
（活性化Ｂ細胞）
Ｔ依存性の様式または非依存性の様式におけるクローン性増殖、およびプラズマ細胞への最終分化の組合せを生じるＢＣＲを介した抗原認識を通じて、末梢において対応する抗原に接触した成熟Ｂ細胞型である。
【０１２８】
（エフェクターＢ細胞）
エフェクターＢ細胞は、特定の抗原に特異的な抗体および免疫系の他の細胞を機能させるために過剰のサイトカインを分泌する短期生存型のＢ細胞の一種である、抗体分泌プラズマ細胞としばしば同義である。
【０１２９】
（記憶Ｂ細胞）
記憶Ｂ細胞は、初期の免疫反応の間に接触した抗原に特異的である活性化Ｂ細胞から形成された長期生存型のＢ細胞であり、同じ抗原に対する２回目のばくろに続く迅速な応答が可能である。
【０１３０】
（プラズマ細胞）
プラズマ細胞は、最終的な有糸分裂後の短期生存型の免疫系の細胞であり、ＣＤ４＋リンパ球（Ｔｈ細胞）による刺激によってＢ細胞から分化し、大量の抗体を分泌する。
【０１３１】
（前Ｔ細胞）
前Ｔ細胞は、ＴＣＲのβ鎖が二重陰性（ＣＤ４−ＣＤ８−）のＴ細胞（ＣＤ３＋）において発現しており、ＶｂＤｂＪｂが揃いっている段階において発達中のＴ細胞である。
【０１３２】
（未成熟Ｔ細胞）
未成熟Ｔ細胞は、骨髄から胸腺に移動しているが、そのＴＣＲの再構成もしくは自己の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子上に提示された自己ペプチドに対するＴＣＲ結合能についての選択が完了していないか、またはそれぞれＭＨＣクラスＩもしくはＩＩ分子に対する細胞のＴＣＲ特異性と正確に相互関係を示すＴキラー系統もしくはＴヘルパー系統への分化を経ていない発達中のＴ細胞である。系統分化は補助受容体分子であるＣＤ８またはＣＤ４の一方の発現を喪失することによって表現型として特徴付けられる。
【０１３３】
（ナイーブＴ細胞）
骨髄において分化し、そのＴＣＲの再構成を伴う胸腺における中心的な選択のポジティブおよびネガティブな過程および補助受容体分子の１つの喪失を首尾よく経ているが、末梢において対応する抗原といまだに接触していない成熟Ｔ細胞。
【０１３４】
（活性化Ｔ細胞）
活性化Ｔ細胞は、抗原提示細胞上における主要組織適合遺伝子複合体ペプチド（ペプチド：ＭＨＣの複合体）およびＢ７ファミリーメンバーのそれぞれによる、細胞表面上のＴＣＲおよびＣＤ２８の両方の結合を通して、抗原特異的なエフェクターＴ細胞になりつつあるＴ細胞である。
【０１３５】
（エフェクターＴ細胞）
エフェクターＴ細胞は、細胞に適切なペプチド：ＭＨＣの複合体を有している当該細胞との接触によって即座に応答可能な短期生存型のＴリンパ球の一種である。
【０１３６】
〔図面の簡単な説明〕
図１．同定および分取−精製したＣＤ７１＋Ｋ５６２細胞。
【０１３７】
図２．ＣＤ１５陽性およびＣＤ７１陽性のＫ５６２細胞のＦＡＣＳプロファイル；（ａ）元のＣＤ７１に関して濃縮されたＫ５６２細胞の集団の約１８％がＣＤ１５について陽性（Ｒ１領域）であり、（ｂ）培養物における２ヵ月後のＣＤ１５陽性のＫ５６２細胞の再分析。
【０１３８】
図３．培養物における４８時間後の、ＣＤ３４＋に関して濃縮されたＡＭＬの単球細胞からの、ＣＤ３４陽性、およびＣＤ３４＋およびＣＤ３４＋ＣＤ１５＋の細胞の分取。
【０１３９】
図４．マウス抗ヒトＣＤ１９抗体およびマウス抗ヒトＣＤ５抗体を用いて染色した臍帯血の単球細胞のＦＡＣＳプロファイル。
【０１４０】
図５．マウス抗ヒトＣＤ３抗体およびマウス抗ヒトＣＤ５抗体を用いて染色した臍帯血の単球細胞のＦＡＣＳプロファイル。
【０１４１】
図６．マウス抗ヒトＣＤ２０抗体およびマウス抗ヒトＣＤ７２抗体を用いて染色した臍帯血の単球細胞のＦＡＣＳプロファイル。
【０１４２】
図７．ＣＤ３およびＣＤ５４について染色した扁桃腺の単球細胞の典型的なＦＡＣＳプロファイル。
【０１４３】
図８．ＩｇＭおよびＩｇＧ陽性の培養リンパ球の存在；（Ａ）５日後の培養物において、ＣＤ１９＋細胞の１８％がＩｇＭ陽性であり、１％のみがその表面に検出可能なＩｇＧを有しており、（Ｂ）１日後の、ＩｇＭ陽性のリンパ球の割合がわずか２％まで減少し、ＩｇＧ陽性の細胞の割合が１５％まで増加した。
【０１４４】
図９．ＨＴＳ−ＫＭＷ細胞についてのＣＤ発現のＦＡＣＳプロファイル、および異なる表現型の細胞集団についての分取領域。
【０１４５】
図１０．初代培養された混合した脾臓のリンパ球上におけるＣＤ４およびＣＤ１９の発現、分取したＣＤ４およびＣＤ１９の集団、ならびに生じたＨＴＳ−ＫＢＴ細胞株；（ａ）初代培養された脾臓のリンパ球のＣＤ４およびＣＤ１９の発現；（ｂ）分取したＣＤ１９＋細胞の純度のプロファイル（９８．１％）；（ｃ）分取したＣＤ４＋細胞の純度のプロファイル（９６．８％）；（ｄ）ＨＴＳ−ＫＢＴ細胞上におけるＣＤ１９およびＣＤ４の共発現。ＨＴＳ−ＫＢＴ細胞集団の９９％以上がＢ細胞およびＴ細胞の両方についてのマーカーを共発現している。
【０１４６】
図１１．不死化した１つの骨髄性細胞、および抗原を経験した、初代培養された２つのリンパ球に由来するＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ上におけるＣＤ１９、ＣＤ３およびＣＤ５の発現：（ａ）ＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ細胞表面上におけるＣＤ１９およびＣＤ５の発現；（ｂ）ＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ細胞上におけるＣＤ３およびＣＤ５の発現。
【０１４７】
図１２．不死化した１つの骨髄性細胞、および骨髄および胸腺に由来する初代培養された２つのリンパ球に由来するＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ細胞上におけるＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ７２およびＣＤ２０の表面発現：（ａ）ＨＴＳ−ＫＢＴＤＰの表面上におけるＣＤ４およびＣＤ８の発現；（ｂ）ＨＴＳ−ＫＢＴＤＰの表面上におけるＣＤ４およびＣＤ７２の発現；（ｃ）ＨＴＳ−ＫＢＴＤＰの表面上におけるＣＤ２０およびＣＤ８の発現。
【０１４８】
図１３．骨髄単球性の前駆細胞に由来するＨＴＳ−ＷＴＭ細胞の表面上におけるＣＤ発現：（Ａ）ＣＤ１９、ＣＤ４およびＣＤ１５を用いた３色染色、（Ｂ）
骨髄単球性の前駆体に由来するＣＤ３４およびＣＤ１５、ならびにエフェクターＴ細胞に由来するＣＤ４を用いた３色染色。
【０１４９】
図１４．ＣＤ４表現型を促進する環境における８日後の、ＨＴＳ−ＫＭＷ．６、ＨＴＳ−ＷＴＭ．６およびＨＴＳ−．１２の培養物におけるＣＤ４、ＣＤ１９およびＣＤ１５の代表的な染色プロファイル（ここで、１００％の細胞がそれらの細胞表面におけるマーカーとしてＣＤ４のみを保持していた（ＣＤ４のみが陽性の細胞））。図示していないが、ＨＴＳ−ＫＭＷ．１培養物において、単独のＣＤ４＋細胞は三重陽性のＣＤ１５＋ＣＤ１９＋ＣＤ４＋の細胞の１００％のからなる開始集団のうち４９％を示し、ＨＴＳ−ＫＢＴにおいて、二重陽性のＣＤ１９＋ＣＤ４＋の集団の最初の１００％のうち５０％に達し、ＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．１において、三重陽性のＣＤ３＋ＣＤ１９＋ＣＤ５＋の集団のうち１００％のうち６１％に達し、ＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．４において、ＣＤ３＋細胞の１００％のうち７４％に達し、ＨＴＳ−ＷＴＭ．１において、三重陽性のＣＤ１５＋ＣＤ１９＋ＣＤ４＋の集団のうち８２％に達し、ＨＴＳ−ＷＴＭ．７において、ＣＤ１５＋ＣＤ３４＋ＣＤ４＋の表現型の三重陽性の集団の１００％のうち７１％に達した。
【０１５０】
図１５．ＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．１２培養物におけるＣＤ８、ＣＤ１９およびＣＤ１５についての代表的な染色プロファイル（ここで、ＣＤ８＋を促進する環境へのばくろの１４日後に１００％の細胞がＣＤ８について陽性に染色された）。図示していないが、ＫＢＴＡＥ．１において、ＣＤ８のみが陽性の細胞の数は三重陽性のＣＤ３＋ＣＤ１９＋ＣＤ５＋の集団の１００％のうち５３％に達し、ＫＢＴＡＥ．４において、単独のＣＤ３＋の手段の１００％のうち６１％に達し、ＨＴＳ  ＫＢＴＤＰ．１およびＨＴＳ  ＫＢＴＤＰ．４において、これらの数はＣＤ４＋ＣＤ８＋ＣＤ２０＋ＣＤ７２＋およびＣＤ４＋ＣＤ８＋ＣＤ２０−ＣＤ７２−の集団の１００％のうち、それぞれ７２％および８６％であった。
【０１５１】
図１６．ＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．４培養物（Ａ）およびＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．１２培養物（Ｂ）のうちＣＤ８のみが陽性の細胞における、ヒトＩＬ−２およびヒトＩＦＮ−γの細胞内産生。両方の培養物は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γまたは両方を産生する細胞を含んでおり、ＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．１２培養物は広範囲のＩＬ−２の産生レベルを有しており、一方でＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．４培養物は広範囲のＩＦＮ−γ濃度を示した。
【０１５２】
図１７．ＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．４培養物（Ａ）およびＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．１２培養物（Ｂ）のうちＣＤ８のみが陽性の細胞における、細胞内のパーフォリンおよびグランザイムＡの典型的なプロファイル。
【０１５３】
図１８．Ｂリンパ球を促進する環境における７日後の、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ１５抗体を用いたＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．６培養物の典型的な染色。
【０１５４】
図１９．マクロファージを許容する成長培地における８日後のＨＴＳ培養物から生成された細胞の付着性の形態。
【０１５５】
図２０．細胞の少ない割合がいまだにＣＤ４について陽性であり、７％の細胞が骨髄性単球のＣＤ１５を保持しており、ＣＤ１９の発現が完全に消失していることを示している、マクロファージを許容する成長培地における８日後のＨＴＳ−ＷＴＭ．４細胞上におけるＣＤ１９、ＣＤ１５およびＣＤ４発現のプロファイル。
【０１５６】
図２１．マクロファージを許容する成長培地における８時間後のＨＴＳ−ＷＴＭ．４細胞の表面におけるマクロファージ様マーカーの発現。
【０１５７】
図２２．マクロファージを許容する成長培地における８時間後のＨＴＳ−ＷＴＭ．４培養物に由来するＣＤ６４陽性のマクロファージによる１０００ｎｍの微粒子の食作用。
【０１５８】
図２３．マクロファージを許容する成長培地における８時間後のＬＰＳ刺激したＨＴＳ−ＷＴＭ．４細胞による一酸化窒素の生成。
【０１５９】
図２４．初代培養されたＣＤ５４＋のヒトＴ細胞を用いた体細胞ハイブリダイゼーションによってＴ細胞に分化転換されたＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．６に由来するＣＤ１９＋Ｂリンパ球によるＣＤ３およびＣＤ５４発現の典型的なプロファイル。
【０１６０】
図２５．ＣＤ３発現の消失および表面ＩｇＧの獲得を示している、ＣＤ４０活性化のＩｇＭ陽性のＢ細胞を用いた体細胞ハイブリダイゼーション後のＣＤ３＋ＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．４細胞の分化転換の代表的なプロファイル。
【０１６１】
図２６．ＣＤ１９＋細胞の１００％の同質な培養物から開始され、ＨＴＳ−ＫＭＷ．１と比べて脱分化の徴候を示しているＨＴＳ−ＷＴＭ培養物１および７における初期Ｂ細胞の発生マーカーについてのＲＴ−ＰＣＲ転写物。両方のＨＴＳ−ＷＴＭにおけるＣＤ１０の上方制御およびるＨＴＳ−ＷＴＭ．７におけるＣＤ３４の出現をともなう、Ｐａｘ−５およびλ様転写物の存在は、環境条件の変化に応じた初期段階のＢ細胞への、成熟なＢ細胞の分化転換を示している。
【０１６２】
図２７．単一細胞の操作／供給系。
【０１６３】
図２８．ガラスのマイクロピペット。
【０１６４】
図２９．微小電極。
【０１６５】
図３０．平行な２つの微小電極。
【０１６６】
図３１．組織培養プレートのウェルにおける２つの微小電極。
【０１６７】
図３２．２つの微小電極の中間にある３つの細胞の上面図。
【０１６８】
図３３．図３２の側面図。
【０１６９】
〔発明を実施するための形態〕
本発明の好ましい実施形態は、添付の図面を参照した以下の非限定的な例によってさらに説明される。
【０１７０】
＜実施例１＞
１．細胞の選択、細胞の操作、および単一細胞のクローニング
以下の実施例は、ＨＴＳの生成および所望のタンパク質の発現に用いる哺乳類細胞株および初代培養された細胞の、選択および単離（または分取）を包含している細胞の調製について記載している。特定の特性を有している細胞の単一集団を得るための特定の選択法の選択、または特定の表現型の細胞を単離するための特定の（複数の）マーカーの使用は、まったく限定的ではなく、むしろ暗示的である。他の細胞マーカーまたは分取の手順は、同様の結果を出すために用いられ得る。
【０１７１】
１．１．不死化したヒト細胞株からの細胞の選択
ＮａＨＣＯ３（JRH Biosciences）、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Sigma）、４ｍＭのＬ−グルタミン（Sigma）によって改変し、１０％のウシ胎児血清ＦＣＳ（JRH Biosciences）を補ったＲＰＭＩ１６４０（Roswell Park Memorial Institute培地）を用いて、加湿した５％のＣＯ２雰囲気の３７℃のＣＯ２インキュベーターにおいて、標準的な（通常の）条件下において、すべての不死の細胞株（下記を参照）を懸濁培養において成長させた。特に記載がない限り、本明細書に記載の組織培養培地（ＴＣ培地）は、本発明に関するすべての不死の細胞株、初代培養された癌細胞、初代培養された細胞培養および樹立したトリハイブリッド細胞株を培養するための標準培地である。一般的に、用いたすべての不死の細胞株、初代培養された癌細胞および初代培養された細胞を抗生物質のない環境において培養した。しかし、危険性の高いバクテリアおよび／または真菌による汚染の疑いがある場合、２％のアンピシリン（５０００ユニット）／ストレプトマイシン（５ｍｇ）溶液（Sigma）を標準培地に加えた。
【０１７２】
本発明に使用されたヒトの細胞株は以下の通りである：
骨髄性の共通前駆体系統、Ｋ５６２（ヒトの慢性骨髄性白血病に由来する細胞株）、
Ｔリンパ球系統、ＭＯＬＴ４（ヒトのＴリンパ芽球）および
Ｂリンパ球系統、ＷＩＬ２ＮＳ（ヒトＢＴリンパ芽球）。
【０１７３】
１．１．１．単一細胞の供給系（single-cell delivering system）
細胞の単離または分取、細胞の操作および単一細胞のクローニングは、本発明を通して重要な工程である。ここには、我々は目的の単一細胞の操作および／またはクローニングのために確立した単一細胞の供給系について説明する。単一細胞の供給系（図２７）は、ガラスのマイクロピペット、１ｍｌのシリンジおよび１次元簡易操作装置（one-dimensional coarse manipulator）から主に構成される。図２８は、目的の単一細胞を拾い上げるために用いられるガラスのＬ字型マイクロピペットを示す。このピペットを、ヘマトクリットキャピラリーチューブ（７５ミリメートル（ｍｍ）の長さ、それぞれ１．５ｍｍおよび１．１０ｍｍの外径および内径）から作製した。熱を用いることによって、チューブの一端を、約２５０〜３００マイクロメートル（μｍ）の内径および約３０μｍの先端の壁厚を有している先端（１）が得られるように引っ張った。マイクロピペットの他端には手を加えなかった（２）。細胞供給系（図２７）において、シリンジ（４）を簡易操作装置上に載せ、同様に簡易操作装置を磁気スタンド（１６）に載せている。この系は、シリンジのピストン（６）がシリンジに対して前方または後方に非常にゆっくりと動かされ得るように機能する。目的の単一細胞を操作するために、柔軟性のある医療用品質のチューブ（３）を用いて、図に示されるようにシリンジをマイクロピペット（２）の手を加えていない端に接続しなければならない。この単一細胞の供給系は、任意の細胞操作の前に、７０％のアルコールを用いて数回にわたって洗浄することによって殺菌し、最終的に、必要なあらゆる適切な組織培養培地または溶液によって気泡を含ずに満たされる必要がある。
【０１７４】
１．１．２．単一細胞のクローニング
各細胞株由来の細胞のクローンを単一細胞のクローニングによって樹立した。本発明において用いられる任意の生物学的な細胞（例えば、Ｋ５６２細胞株の細胞）の単一細胞のクローニングまたは操作の方法を以下に記載する。
【０１７５】
５μｌのＫ５６２細胞の細胞懸濁液を、対数期においてその培養物から採取し、１５０μｌのＴＣ培地が入っている組織培養９６ウェルプレート（ＴＣプレート, Becton and DickinsonまたはBD）のウェルの中に入れた。このウェルを「細胞保存ウェル」と称した。このプレートを倒立顕微鏡（Axiovert 40C, Carl Zeiss）のＸＹ顕微鏡ステージの上に置いた。単一細胞の操作／クローニング工程の前に、気泡を含んでいないＴＣ培地によってマイクロピペット（図２８）を完全に満たした。単一細胞の供給系（図２７）のマイクロピペット、チューブおよびシリンジを、１次元簡易操作装置（５）（Narishege）の上に載せた。マイクロピペットの先端（１）を、顕微鏡の視野の中心に位置するように配置した。Ｋ５６２の単一細胞の操作およびクローニングのために、マイクロピペットを細胞保存ウェルの中へ挿入した。シリンジのピストンを吸い込む方向へ非常にゆっくりと動かすことによって、Ｋ５６２の単一細胞をマイクロピペットの中に入れた。マイクロピペットを細胞保存ウェルから引き出した。顕微鏡のステージを細胞保存ウェルから隣接したウェル（「クローニングウェル」と称する）へ横方向に動かし、その後マイクロピペットをこのクローニングウェルに挿入することによって、マイクロピペット中の単一細胞をマイクロピペットから静かに放出した。シリンジのピストンを放出する方向へ非常にゆっくりと動かすことによって、これを行った。細胞保存ウェルから単一細胞を採取し、この単一細胞をクローニングウェルに入れる工程を、ＴＣプレートあたり６０個の単一細胞クローンを得るまで複数回にわたって繰り返した。３７℃、５％ＣＯ２において管理した加湿したインキュベーター（Thermoline Scientific）において、このクローニングプレートを１０日間にわたってインキュベートした。インキュベーションの期間中、定期的に各クローニングウェル中の培地を新鮮なＴＣ培地と交換した。各クローニングウェルからの各クローンの細胞増殖を２４時間毎に記録した。インキュベーションの期間の終了時において、Ｋ５６２細胞のクローン数を決めた。増殖速度が最大であるクローンまたは細胞表面上に発現している目的のマーカー（例えば、Ｋ５６２細胞上におけるＣＤ７１トランスフェリン受容体）のレベルが最大であるクローンを、トリハイブリッドの生成またはさらなる実験のために選択した。
【０１７６】
１．１．３  ＣＤ７１＋細胞の分取
一例として、以下の方法は、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を用いた、Ｋ５６２細胞株からの、骨髄単球性の系統のＣＤ７１陽性細胞の細胞選択および分取について説明する。
【０１７７】
この目的のために、２％のウシ血清アルブミンＢＳＡ（Sigma）を含んでいる１００μｌのリン酸緩衝溶液（Dulbeco PBS）に懸濁させた１×１０５個のＫ５６２細胞を、２０μｌの抗ＣＤ７１（BD Pharmingen）に結合させたフィコエリスリン（ＰＥ）またはＰＥを結合させた同位体対照抗体ＩｇＧ２ａ，κ（BD Pharmingen）のいずれかとともに、３０分間にわたって、室温の暗所においてインキュベートした。インキュベーション混合物を１ｍｌのＰＢＳを用いて希釈し、染色した細胞を３００ｇにおいて１０分間にわたって遠心することによって回収した。１ｍｌのＰＢＳを用いてさらに洗浄した後、染色した細胞を１ｍｌのＰＢＳに懸濁して、直ちにＦＡＣＳ（BD FACSCalibur）を用いて分析した。図１はＫ５６２細胞株のＣＤ７１＋細胞のプロファイルを示す。ＣＤ７１＋陽性細胞を絞り込み（gate）、分取した（図１ａ）。元のＫ５６２集団の約６５％がＣＤ７１について陽性であった。さらなる実験のために、分取した細胞を３００ｇにおいて１０分間にわたって遠心分離し、１ｍｌのＰＢＳに懸濁させた。図１ｂにおいて示されるような純度分析のために、１００ｍｌの懸濁したＣＤ７１＋の分取した細胞を回収した。９９％の純度のＣＤ７１＋の分取した細胞を得た。細胞分取の後、このＫ５６２細胞株のＣＤ７１＋細胞をさらなる実験に用いたか、または標準的な培養条件下の培養に置き、ＣＤ７１に関して濃縮されているＫ５６２細胞として特徴付けた。ＣＤ７１に関して濃縮されているＷＩＬ２ＮＳおよびＣＤ７１に関して濃縮されているＭＯＬＴ４の培養を確立するために、同様の方法論を用いた。
【０１７８】
１．２  骨髄単球性の細胞の単離
骨髄単球性の前駆細胞は、不死化した骨髄単球性の任意の細胞株または初代培養された造血組織（例えば骨髄）に由来し得る。以下は、ヒトの骨髄細胞株Ｋ５６２および骨髄サンプルからの骨髄単球性の前駆細胞を単離する例である。
【０１７９】
１．２．１  ＣＤ７１＋Ｋ５６２培養物からの骨髄性単球細胞の選択
細胞のハイブリダイゼーション実験にとっての細胞の骨髄単球性の表現型を確認するために、ＣＤ７１＋Ｋ５６２細胞はＦＡＣＳ分析および続く分取を用いてＣＤ１５＋細胞に関してさらに濃縮された。
【０１８０】
項目１．１．３に記載のＣＤ７１に関して濃縮された細胞を、ＰＥ抗ヒトＣＤ７１およびＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ１５（BD Pharmingen）を用いて標識した。洗浄したＣＤ７１に関して濃縮された１×１０５のＫ５６２細胞を２％のＢＳＡを含有している１００μｌのＰＢＳに懸濁させ、抗ヒトＣＤ７１−ＰＥ抗体および抗ヒトＣＤ１５−ＦＩＴＣ抗体、または陰性の同位体対照の抗体、またはＦＩＴＣおよびＰＥ標識した陰性の同位体対照の抗体のいずれかとともに、室温の暗所において３０分間にわたってインキュベートした。１ｍｌのＰＢＳを用いてインキュベーション混合物を希釈し、染色した細胞を１０分間にわたる３００ｇにおける遠心分離によって回収した。１ｍｌのＰＢＳを用いた付加的な洗浄の後に、染色した細胞を１ｍｌのＰＢＳに懸濁させ、FACS Calibur（BD）を用いて直ちに分析した。
【０１８１】
典型的なＦＡＣＳプロファイルを図２ａに示す。培養物における５ヶ月の後に、ＣＤ−に関して濃縮されたＫ５６２細胞の９９％はＣＤ７１について陽性を保持しており、約１８％が表面にＣＤ１５を発現していた。ＣＤ７１およびＣＤ１５の両方について陽性の細胞が絞り込まれ（図２ａ）、分取された。分取された細胞は１０分間にわたる３００ｇにおける遠心分離によって回収され、さらなる実験のために１ｍｌのＰＢＳに懸濁された。２ヶ月間の培養に続いて、分取された細胞はＣＤ７１およびＣＤ１５の共発現についてふたたび分析された（図２ｂ）。その結果は、精製された細胞の約９８％がＣＤ７１およびＣＤ１５の両方を保持していたことを示している。その表面にＣＤ７１およびＣＤ１５の両方をより初期に発現していた細胞のいくつかはそれらのＣＤ１５の発現を消失することが見出され（図２ｂ）、Ｋ５６２細胞における骨髄単球性の系統に対する拘束が安定ではなく可逆的であることを示唆している。
【０１８２】
１．２．２  初代細胞からの未拘束の骨髄単球性の前駆細胞の選択
一例として、以下の方法は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の患者から得られた骨髄サンプルに由来する未拘束の細胞または骨髄性の細胞の選択について説明する。
【０１８３】
ＡＭＬの患者からの骨髄吸引物は説明および同意の後に得られた。実験の実施前にＡＭＬであると明らかに診断されている患者からサンプルを取り出した。項目１．３．１に記載のように同じ密度勾配遠心分離手法を用いてＡＭＬの単核細胞を単離し、ＦＡＣＳを用いてサンプルからＣＤ３４＋細胞を分取するか、または単離した。
【０１８４】
上記において得られた単核細胞を染色するか、または標識するために、マウス抗ヒトＣＤ３４−ＰＥ抗原（BD Pharmingen）またはＰＥ同位体対照抗体（BD Pharmingen）の１０μｌを、染色培地（ＰＢＳ＋５％のＢＳＡ）における１×１０６の単核細胞の所定の分取物の１００μｌに加えた。所定の分取物について、染色混合物を３０分間にわたって氷上においてインキュベートした。１０ｍｌの氷冷した染色培地を細胞のペレットに加え、３５０ｇおよび４℃において７分間にわたって遠心分離した。上清を吸出し、それから同じ体積の氷冷した染色培地を加えたチューブを軽く叩くことによって細胞のペレットを再懸濁させた。染色した細胞を遠心分離し、もう一度、氷冷した染色培地において洗浄した。標識した細胞を染色培地に懸濁させ、ＦＡＣＳにかけた。ＣＤ３４＋細胞の集団について適切に分取するゲートを設定した後に、細胞の画分を回収した。ＣＤ３４＋細胞を、直ちに使用したか、または骨髄単球性の細胞に関する濃縮のために培養物として置かれた。
【０１８５】
集積培養のために、４０×１０３の濃縮されたＣＤ３４＋細胞を、合成細胞外マトリクスを用いてあらかじめ被覆された１２ウェルのプレートに播いた。５７ｍＭのβ−メルカプトエタノール（Sigma）、１ｍＭのヒドロコルチゾン、２０ｎｇ／ｍｌのヒトのインターロイキン−３（ＩＬ−３）および２０ｎｇ／ｍｌのヒトの顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を補った完全ＴＣ培地において細胞を広げた。培養の４８時間後に、細胞をＦＡＣＳを用いてＣＤ１５発現についてさらに選択した。
【０１８６】
細胞の蛍光染色のために、マウス抗ヒトＣＤ１５−ＦＩＴＣ（BD Pharmingen）およびマウス抗ヒトＣＤ３４−ＰＥ（BD Pharmingen）を使用し、また、この項目の前半に記載した類似の細胞染色方法を採用した。ＦＡＣＳを用いて染色したサンプルを分析した。ＣＤ３４およびＣＤ１５陽性の細胞集団（ＣＤ３４＋ＣＤ１５＋）およびＣＤ３４陽性およびＣＤ１５陰性の細胞集団（ＣＤ３４＋ＣＤ１５−）について適切に分取するゲートを設定した後に、画分を回収した。
【０１８７】
培養の４８時間後における、ＣＤ３４＋細胞およびＣＤ３４＋ＡＭＬ細胞上のＣＤ１５発現についての典型的な発現プロファイルおよび分取するゲートを図３に示す。試験したＡＭＬ単核細胞の約５４％はＣＤ１５について陽性であり、ＣＤ３４発現を維持しており、残りの細胞集団は骨髄単球系統に拘束されることなくＣＤ３４発現を維持していた。ＣＤ３４＋ＣＤ１５＋細胞を分化転換系を構築する実験に使用し、未拘束のＣＤ３４＋細胞を脱分化実験に使用した。
【０１８８】
１．３  リンパ球の単離
分化転換系の確立のために、リンパ球を不死化した特定の細胞の任意の種類、または初代培養されたリンパ球のいずれかから誘導し得る。不死化されたＷＩＬ２ＮＳ細胞株およびＭＯＬＴ４細胞株にそれぞれ由来するＢリンパ球およびＴリンパ球の調製は、項目１．１．３に記載されている。初代培養されたリンパ球は任意のリンパ組織（例えば、末梢血、臍帯血、脾臓、骨髄、胸腺、扁桃腺、咽頭扁桃腺および領域リンパ節）から単離され得る。第１の段階において、単核細胞を分離するためにすべてのリンパ組織を処理した。
【０１８９】
１．３．１．骨髄、末梢血または臍帯血からのヒトの単核細胞の単離
説明および同意の後に、末梢血のサンプルを健康な個人から収集した。各血液サンプルはヘパリン処理されたチューブ（Vacutainer, BD）に回収し、プールし、ＲＰＭＩ１６４０を用いて希釈した。
【０１９０】
骨髄生検を受け、血液異常のない正常な骨髄を有している患者から、ヒト骨髄の吸引物を得た。このサンプルをＲＰＭＩ１６４０を用いて１：３の割合に希釈した。
【０１９１】
ヒト臍帯血のサンプルを、説明および同意の後、正常な満期経膣出産児から得た。乳児の出産および臍帯の結さつの後、胎盤の娩出の前に、各臍帯血をヘパリン処理した６０ｍｌのシリンジを用いて収集した。各サンプルをＲＰＭＩ１６４０を用いて希釈した。
【０１９２】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）および臍帯血単核細胞（ＵＣＢＭＣ）をFicoll-Paque（Amersham Pharmacia）による密度遠心分離によって調製した。要約すると、２０ｍｌのシリンジに取り付けたカニューレチューブを用いて、１０ｍｌのFicoll-Paqueを２０ｍｌの細胞懸濁液の下に層化した。サンプルの細胞を４℃、１７００ｒｐｍ（７００ｇ）において、４０分間にわたって遠心分離した。境界面にある細胞を回収し、５０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０、２０００ｒｐｍ（１０００ｇ）における１０分間にわたる遠心によって洗浄した。上清を捨て、ペレット化した細胞を４０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０に再懸濁させ、１３００ｒｐｍ（４００ｇ）において１０分間にわたって遠心分離した。赤血球および血小板を、それぞれ０．８３％（ｗｔ／ｖｏｌ）のＮＨ４Ｃｌを用いた溶解およびＰＢＳを用いて１：２の割合に希釈したFicoll-Paqueによる２回目の遠心によって除去した。
【０１９３】
単離した単核細胞を、培養、またはＦＡＣＳを介した細胞の特異的な画分への分析および分取に用いた。
【０１９４】
１．３．２．固形のリンパ組織からのヒト単核細胞の単離
以下の方法は、脾臓から単核細胞を単離するために本発明において使用された手法を説明する。同じ方法は、胸腺、扁桃腺または領域リンパ節から単核細胞を単離するために使用され得る。また、細胞の染色方法および分取方法が示されている。
【０１９５】
脾臓のサンプルを、国際的な倫理指針にしたがって、臓器移植ドナーから得た。脾臓細胞を単離するまでの間、約２×２×３ｃｍの脾臓のブロックのそれぞれを、４℃のＲＰＭＩ１６４０に保存した。シリンジのピストンを用いて無菌のふるいのメッシュに各ブロックを通して、小さい断片に切断した。それから、２０Ｕ／ｍｌのタイプＶＩＩコラーゲナーゼ（Sigma）および２０Ｕ／ｍｌのＤＮａｓｅ（Sigma）を用いて、室温の完全培地において３０分間にわたって消化することによって、細胞を酵素的に分離した。１０ｍＭになるようＥＤＴＡを加えて、室温において５分間にわたって攪拌することによって、この細胞集団をさらに分離した。それから、酵素消化を停止させるために完全培地を用いて脾臓細胞を２回にわたって洗浄し、ＲＰＭＩ１６４０に再懸濁させた。これらの条件は非酵素的な分離工程と比べて表面分子の発現に影響を与えなかった（McIlroy et al 1995）。赤血球の除去を除いて、項目１．３．１に記載のように、密度勾配遠心分離によってこれらの脾臓細胞の懸濁液から脾臓の単核細胞を単離した。この脾臓の単核細胞をＲＰＭＩ１６４０に再懸濁させ、細胞濃度を１ｍｌあたり１×１０６に調節した。細胞の生存率は、トリパンブルー排除によって決定したところ、９８％を超えていた。
【０１９６】
１．３．３．ヒトの脾臓および末梢血からの成熟Ｂ細胞およびヘルパーＴ細胞の単離
組織サンプルをまず、項目１．３．１および項目１．３．２に記載のように単核細胞集団を抽出するために処理した。次いで、蛍光細胞染色、続いて細胞分取を、単核細胞集団の単離から４時間以内に行った。この細胞を、染色するまで標準的な培養条件（項目１．１参照）下に完全培地に懸濁させた。
【０１９７】
以下は、初代培養された細胞からのＢ細胞およびＴ細胞の染色および分取の例である。通常、Ｂ細胞およびヘルパーＴ細胞の選択はそれぞれＣＤ１９およびＣＤ４の表面発現に基づいていた。
【０１９８】
要約すると、それぞれ１０μｌのマウス抗ヒトＣＤ１９−ＦＩＴＣ結合抗体（BD Pharmingen）およびマウス抗ヒトＣＤ４−ＰＥ結合抗体（BD Pharmingen）または適切な同位体対照を、染色用培地（ＰＢＳ＋５％ＢＳＡ）における単核細胞の１００μｌの分取物（１×１０５の細胞を含んでいる）に加えた。分取物の単核細胞集団のために、染色混合物を氷上で３０分間にわたってインキュベートした。１０ｍｌの氷冷した染色用培地を染色混合物に加え、３５０ｇ、４℃において７分間にわたって遠心分離した。上清を吸引し、次いで同じ容積の氷冷した染色用培地を加えたチューブを軽くたたくことによって細胞ペレットを再懸濁させ。染色した細胞を遠心分離し、氷冷した染色用培地において再び洗浄した。この工程を他の分取物に対して繰り返した。ＦＡＣＳを用いて染色した細胞を分析した。少なくとも２００００の絞り込んだ結果を各サンプルに関して分析した。ＣＤ１９陽性Ｂ細胞集団（ＣＤ１９＋ＣＤ４−）またはＣＤ４陽性Ｔ細胞集団（ＣＤ４＋ＣＤ１９−）にとって適切な分取ゲートを設定し、画分を回収した。各画分のうち１ｍｌを純度分析のために回収し、各画分の残りをさらなる実験のために完全培地に懸濁させた。
【０１９９】
適切なアダプターを備えているマイクロ遠心チューブに少数の細胞（≦５×１０５個）を直接分取した。分取の前に、補完したＲＰＭＩ１６４０の少量（０．１から０．２ｍｌ）を回復チューブに加えて、分取したサンプルと混合させ、分取した細胞の生存性を向上させた。許容される回復した細胞の数が供給された分取の後、２０μｌの分取した細胞の各サンプルをその純度の変化を再分析するために染色用培地を用いて１：１０に希釈した。許容可能な純度は≧９５％であった。分取したサンプルの１ｍｌにつき、２０から４０μｌのＦＣＳをさらに加え、続いて３５０ｇ、４℃において７分間にわたって遠心分離した。次いで、細胞を標準的な組織培養培地に再懸濁させた。十分な細胞が利用可能であれば、収量を決定するためにその数を数えた。
【０２００】
抗ヒトＣＤ１９−ＦＩＴＣおよび抗ヒトＣＤ４−ＰＥによって標識した脾臓のサンプルのＦＡＣＳプロファイルを図０１ａに示し、分取したＣＤ１９＋Ｂ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の純度分析のプロファイルを図１０ｂおよび図１０ｃに示す。画分における細胞の純度は、ＣＤ１９＋細胞については９８％を超え、ＣＤ４＋細胞については９６％を超えた。
【０２０１】
末梢血由来のＣＤ１９＋およびＣＤ４＋細胞についての分取および純度のプロファイルは基本的に脾臓のサンプル由来のものと同様であるが、わずかな数の各細胞集団を得たのみであった。
【０２０２】
１．３．４．ヒトの臍帯血からのＣＤ５陽性の（抗原を経験した）Ｂ細胞およびＣＤ５陰性の（ナイーブ）Ｂ細胞の単離
項目１．３．１に記載のように、単核細胞を臍帯血のサンプルから調製した。蛍光細胞染色、続く細胞分取を単核細胞集団の単離から４時間以内に行った。この特定の例において、上述の方法（項目１．３．３）にしたがって、ヒトの臍帯血からのＣＤ５陰性（ナイーブ）Ｂ細胞およびＣＤ５陽性（抗原を経験した）Ｂ細胞の分取を、マウス抗ヒトＣＤ５−ＦＩＴＣ抗体（BD Pharmingen）、マウス抗ヒトＣＤ１９−ＰＥ抗体（BD Pharmingen）または適切な同位体対照を用いて行った。
【０２０３】
ＦＡＣＳを用いて染色した細胞を分析した。少なくとも２００００のゲートした結果を各サンプルについて分析した。ＣＤ５陰性Ｂ細胞集団（ＣＤ１９＋ＣＤ５−）またはＣＤ５陽性Ｂ細胞集団（ＣＤ１９＋ＣＤ５＋）にとって適切な分取ゲートを設定し、多数の画分を回収した。図４はマウス抗ヒトＣＤ１９およびマウス抗ヒトＣＤ５を用いて染色したサンプルの典型的なプロファイルを示す。
【０２０４】
サンプル中のＢ細胞の割合は４から１９．２％に及び、ＣＤ５＋Ｂ細胞は移動した全リンパ球の０．８から７．２％に及んだ。
【０２０５】
１．３．５．ヒトの臍帯血からのＣＤ５陽性の（抗原を経験した）Ｔ細胞およびＣＤ５陰性の（ナイーブ）Ｔ細胞の単離
項目１．３．１の記載と同様の方法を用いて、単核細胞を臍帯血のサンプルから調製した。蛍光細胞染色、続いて細胞分取を単核細胞集団の単離から４時間以内に行った。この特定の実施例において、上述した細胞の方法（項目１．３．３）にしたがって、ヒトの臍帯血からのＣＤ５陽性（抗原を経験した）Ｔ細胞およびＣＤ５陰性（ナイーブ）Ｔ細胞の分取を、マウス抗ヒトＣＤ５−ＦＩＴＣ抗体（BD Pharmingen）、マウス抗ヒトＣＤ３−ＰＥ抗体（BD Pharmingen）または適切な同位体対照を用いて行った。ＦＡＣＳを用いて染色した細胞を分析した。少なくとも２００００の絞り込んだ結果を分析した。ＣＤ５陰性Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ５−）またはＣＤ５陽性Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ５＋）のいずれか一方を含んでいる画分を回収するために、分取ゲートを設定した。図５はマウス抗ヒトＣＤ３抗体およびマウス抗ヒトＣＤ５抗体を用いて染色したサンプルの典型的なプロファイルを示す。
【０２０６】
分取した集団を回復および分析するために用いた実質的に同様の方法については、項目１．３．３に記載している。
【０２０７】
サンプルにおけるＴ細胞の割合は１．７から１３．５％に及び、ＣＤ５＋Ｔ細胞は移動した全リンパ球の０．４から１．３％に及んだ。
【０２０８】
１．３．６．骨髄性のヒト単核細胞の集団からの、初期Ｂ細胞、ＣＤ２０およびＣＤ７２に基づいて活性化されて生じたＢ細胞の単離
上述の方法（項目１．３．１）を用いて、単核細胞を骨髄から抽出した。蛍光細胞染色に続く細胞分取を単核細胞集団の単離から４時間以内に行った。活性化Ｂ細胞の染色および分取は、上記の項目１．３．３に記載されている。すなわち、１０μｌのマウス抗ヒトＣＤ７２−ＦＩＴＣ抗体（BD Pharmingen）および２０μｌのマウス抗ヒトＣＤ２０−ＰＥ抗体（BD Pharmingen）または適切な同位体対照（ＰＥマウスＩｇＧ２ｂ，κ抗体）を用いた。ＦＡＣＳを用いて染色した細胞を分析した。プレＢ細胞、休止Ｂ細胞、活性化Ｂ細胞、濾胞樹状細胞からなるＣＤ２０陽性集団（ＣＤ２０＋ＣＤ７２−）、または初期Ｂ細胞（ＣＤ２０−ＣＤ７２＋）もしくは活性化Ｂ細胞（ＣＤ２０＋ＣＤ７２＋）からなるＣＤ７２陽性細胞のいずれか一方を含んでいる画分を回収するために、分取ゲートを設定した。図６はマウス抗ヒトＣＤ２０およびマウス抗ヒトＣＤ７２抗体を用いて染色したサンプルの典型的なプロファイルを示す。
【０２０９】
項目１．３．３の記載と実質的に同様の方法を、分取した細胞を回復および分析するために用いた。
【０２１０】
代表的に、骨髄単核細胞集団の約１０〜１５％がＣＤ２０およびＣＤ７２の両方について陽性であり；細胞の９〜１２％がＣＤ２０について陽性であるが、ＣＤ７２について陰性であり；約８％がＣＤ７２のみについて陽性であった。
【０２１１】
１．３．７．磁気ビーズ分取による胸腺細胞の亜集団の単離
ＭＡＣＳ  ＣＤ４  Ｍｕｌｔｉｓｏｒｔキット（Miltenyi Biotec GmbH）を用いて、ＣＤ４−ＣＤ８−二重陰性の胸腺細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性の胸腺細胞、ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋単独陽性の胸腺細胞の集団を、製造者の手順にしたがって分取した。要約すると、項目１．３．２の記載と同様の方法を用いて回収した胸腺細胞をＣＤ４  Ｍｕｌｔｉｓｏｒｔ  ＣＤ４マイクロビーズと共に３０分間にわたってインキュベートした。５ｍＭのＥＤＴＡおよび０．５％のＢＳＡを含んでいるＰＢＳを用いて洗浄した後、標識した細胞を磁気カラムによって分離した。陽性として選択された胸腺細胞（磁気カラム上に保持された）はＣＤ４＋単独陽性およびＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性の細胞集団を含んでいた。一方、ＣＤ４が減少した細胞集団（カラムから逃れた）はＣＤ８＋単独陽性およびＣＤ４−ＣＤ８−二重陰性の細胞を含んでいた。ＣＤ４陽性として選択された細胞集団からマイクロビーズを除去するために、ＭＡＣＳ  Ｍｕｌｔｉｓｏｒｔ分離試薬と共に細胞をインキュベートした。２０分後に消化を止め、細胞をＣＤ８マイクロビーズによって３０分間にわたって標識した。ＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性の胸腺細胞を正の選択によって得た。一方、ＣＤ４＋単独陽性細胞は細胞集団が枯渇したことがわかった。ＣＤ４の枯渇した細胞集団をＣＤ８マイクロビーズと共に３０分間にわたってインキュベートした。標識した細胞を磁気カラムにかけた後、ＣＤ８＋単独陽性の細胞を、ＣＤ４−ＣＤ８−二重陰性の胸腺細胞から分離できた。４つの異なる胸腺細胞亜集団の純度をフローサイトメトリー解析によって評価した。許容される純度は９５％より高いものである。
【０２１２】
１．３．８  ヒトの扁桃腺からのＣＤ５４＋Ｔ細胞の単離
項目１．３．２に記載の方法を用いて、単核細胞をヒト扁桃腺から抽出した。蛍光細胞染色に続く細胞分取を単核細胞集団の単離から４時間以内に行った。ＣＤ５４＋Ｔ細胞（細胞間接着分子−１またはＩＣＡＭ−１）を単核扁桃細胞集団から抽出し、マウス抗ヒトＣＤ３−ＰＥ抗体（BD Pharmingen）およびマウス抗ヒトＣＤ５４−ＦＩＴＣ抗体（BD Pharmingen）または適切な同位体対照の使用は項目１．３．５に記載のような細胞染色／分取方法を用いて選択した。ＦＡＣＳを用いて染色した細胞を分析した。ＣＤ３＋Ｔ細胞（すなわちＣＤ３＋ＣＤ５４−細胞）または活性化ＣＤ５４＋Ｔ細胞（すなわちＣＤ３＋ＣＤ５４＋細胞）のいずれか一方を含んでいる画分を回収するために、分取ゲートを設定した。図７はマウス抗ヒトＣＤ３案乳亜およびマウス抗ヒトＣＤ５４抗体を用いて染色したサンプルのＦＡＣＳプロファイルを示す。ＣＤ３＋細胞をＨＴＳの生成のために用い、一方でＣＤ５４＋活性化Ｔ細胞を発現実験のために用いた。
【０２１３】
その結果は、Ｔ細胞が扁桃腺から単離した単核細胞の大部分（８２％）を構成しているが、９％のみがＣＤ５４＋Ｔ細胞であることを示した。
【０２１４】
１．４．ＩｇＭおよびＩｇＧを分泌しているヒトのリンパ球の生成および選択
マウス抗ヒトＣＤ１５４抗体（BD Pharmingen）によって被覆した丸底９６ウェルプレート（Corning）のウェルに、精製したＢ細胞（項目１．３．３参照）を３．７５×１０５／ｍｌにおいて播いた。１０％の熱不活性化尿素−低ＩｇＧ  胎児ウシ血清、ＦＢＳ（Gibco/BRL）ならびに１００Ｕ／ｍｌのヒトインターロイキン４（ＩＬ−４）（R&D systems）および５０ｎｇ／ｍｌのヒトインターロイキン１０（ＩＬ１０）を補った（培養３日目の後に加えた）完全ＲＰＭＩ２６４０培地において、この細胞を培養した。培養物を２から３日毎に培養培地の半分を交換することによって新しく補給した。細胞生存率および細胞数を、血球計算板を用いて、トリパンブルー排除によって３回にわたって評価した。５日目および１０日目において、培養したリンパ球を、回収し、ＰＢＳにおいて２回にわたって洗浄して、マウス抗ヒトＣＤ１９−ＰＥ抗体、マウス抗ヒトＩｇＭ−ＦＩＴＣ抗体またはマウス抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ抗体（全てBD Pharmingen製）を用いたＦＡＣＳによって分析した。すべての染色を、１×１０６の細胞あたり１μｇの各抗体を用いて４℃において行った。すべての分析において、９５％を超える細胞が同位体適合の陰性対照の染色にしたがったマーカーの組について二重陰性であった。死細胞および残骸を含んでいる領域を分析から排除した。すべての分析を５０００から１００００の生細胞を絞り込むことによって行った。
【０２１５】
培養したリンパ球におけるＩｇＭおよびＩｇＧ陽性細胞の典型的なプロファイルを図８に示す。５日間の培養の後、ＣＤ１９＋細胞の１８％がＩｇＭ陽性であり、わずか１％が表面上に検出可能なＩｇＧを有していた。一方、１０日後には、ＩｇＧ陽性細胞の割合は１５％まで増加したが、ＩｇＭ陽性単球の割合はわずか２％まで減少した。適切なゲートを設定した後、ＩｇＭ陽性およびＩｇＧ陽性な画分を分取した。
【０２１６】
培養物におけるＩｇＭおよびＩｇＧの濃度を９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートおよびプラスチックに吸着させたヒトμ鎖およびγ鎖に対するヤギの親和性精製した抗体を用いた標準的なＥＬＩＳＡによって決定した。結合した抗体をＨＲＰを結合させたヒツジ抗ヒトＩｇ抗体によって明確にした。すべての抗体はSigma製であった。ＡＢＴＳを基質として用い、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。表１は、５日後および１０日後にＢリンパ球の培養物において検出されたＩｇＭおよびＩｇＧのレベルを要約したものである。
【０２１７】
【表１】
0005757942.tif 000002
ＩｇＭの生産は５日間の培養の後に低下した一方で、ＩｇＧの生産は増加した。
【０２１８】
＜実施例２＞
２．体細胞ハイブリダイゼーション
体細胞ハイブリダイゼーションの種々の方法が当該技術において周知である。これらとしては、例えば、センダイウイルスのような融合性（fusagenic）ウイルスを用いる生物学的方法（Kohler and Milstein, 1975）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる化学的方法（Wojciezsyn, et al, 1983）、および電界を用いる電気的方法（Neil, and Zimmermann, 1993）が挙げられるが、これらに限られない。各方法は目的の細胞の原形質膜が可逆的に透過可能となり、ハイブリダイズすることを誘導し得るか、または引き起こし得る。
【０２１９】
上述した細胞ハイブリダイゼーション法とは関係なく、細胞ハイブリダイゼーションを達成するために、２つの不可欠な段階が原則として必要とされる。第一に、ハイブリダイズさせたい細胞の原形質膜を、良好に細胞膜と接触させる必要がある。第二に、接触点における原形質膜の可逆的な破壊が同時に誘導される必要がある。
【０２２０】
電気的な細胞ハイブリダイゼーション法に関して、目的の細胞を、適切なフィールド周波数を有している交流電界（ＡＣ電界）を用いて良好に細胞膜と接触させ、次いでＡＣ電界と同時に短い電気パルスにさらしたときにハイブリダイズを誘導し得る。
【０２２１】
さらに詳しく述べると、電気的な細胞ハイブリダイゼーションは次の物理現象；誘電泳動（ＤＥＰ）および原形質細胞膜の電気的な破壊を伴う。
【０２２２】
誘電泳動（Pohl,1978）は、生物学な細胞のような誘電体粒子が適切な溶液に懸濁され、適切な周波数の不均一なＡＣ電界にさらされる場合に、その誘電体粒子の運動を説明する現象である。細胞の運動は、（ｉ）例えば１００ｍＭのソルビトールに懸濁されているＳｐ２細胞に対する０．５〜２．０メガヘルツ（ＭＨｚ）のフィールド周波数における、誘電体粒子の転移または移動（Mahaworasilpa, 1992）、および（ｉｉ）例えば１００ｍＭのソルビトールに懸濁されているＳｐ２細胞に対する２〜１０キロヘルツ（ｋＨｚ）のフィールド周波数における、誘電体粒子の回転（Mahaworasilpa, 1992）として説明され得ることがよく報告される。不均一電界は１対の電極（例えば、多数の配置において設計され得る電気的な円筒形の金属線）を横切る電界を印加することによって発生させ得る。最も広く用いられている配置は平行な電極配置（図３０）である。不均一電界の存在において、ＤＥＰは誘電体粒子（すなわち生物細胞）を互いに引きつけさせ、同時に最も強い電界の領域に向かって移動させ得る。その結果、一続きの細胞（a chain or string of cells）を形成し、次は良好な細胞膜の接触を誘引する。細胞が適度に低い電気伝導度の溶液に懸濁されている場合に、細胞の引き合いは強く促進される。
【０２２３】
適切なハイブリダイゼーション溶液に懸濁されている細胞が適切なパルス振幅およびパルス幅を伴っている電気パルスにさらされる場合に、細胞膜の電気的な破壊が誘導され得る（Zimmermann, 1982）。様々なパルス幅、例えば１から２００マイクロ秒（μ秒）の方形波パルスが、ハイブリダイズされる細胞のタイプに依存して広く用いられる。
【０２２４】
２．１．電気的な細胞ハイブリダイゼーション系
本発明のいくつかの実施形態において、電気的な細胞技術をトリハイブリッドのようなハイブリダイズされた細胞の生成に用い得る。
【０２２５】
２．１．１．細胞操作系
細胞ハイブリダイゼーションの前に目的の個々の細胞を増殖させるため、上述した単一細胞の増殖／供給系（項目１．１．１）を本発明を通じて用いた。
【０２２６】
２．１．２．微小電極
本発明において、２つのＬ字型の微小電極を用いた。図２９は被覆されていない直径１２８μｍのニッケル合金から作製した微小電極（７）を示す。微小電極の柄を、外径１．５ｍｍのヘマトクリットキャピラリーチューブ（８）によって覆った。微小電極のＬ字型部（９および１０）を、電極の水平な部分および垂直な部分の両方の表面の一致する領域が、培地または適切な溶液にさらされるように配置した（Mahaworasilpa, 1992）。細胞ハイブリダイゼーションの工程の前に、２つの微小電極を２つの微細マイクロマニピュレーター（fine micromanipulators）（各微小電極について１つずつ）の上に載せた。これらの微小電極を各電極の平行な電極配置が得られるような方法において設計した（図３０）。各微細マイクロマニピュレーターを水圧によって駆動させし、０．５μｍの精度の動きがＸ、ＹまたはＺ方向において行えるようにした。
【０２２７】
２．１．３．細胞チャンバおよび構成
図３１は標準的な９６ウェル平底ＴＣプレートのウェルにおける２つの平行な電極を示す。このウェルは本発明のいくつかの実施形態において、細胞ハイブリダイゼーションのチャンバーの役割を果たす。細胞ハイブリダイゼーションを行うため、微小電極を標準的な９６ウェル組織培養プレートのウェル（１２）に入っている適切な培地（１１）に沈めた。図３２および図３３はそれぞれ、平行な電極配置の上面図および側面図を示す。ここでは、例えば、ハイブリダイズされるべくあらかじめ選択された３つの細胞をそれらが適切なＡＣ電界の存在において一続きの細胞に整列するまたは形成することを誘導し得るようにおいて、平行な電極の間に置く。
【０２２８】
＜実施例３＞
３．電気的な細胞ハイブリダイゼーション法による造血性の分化転換系を確立する例
以下の項目は、異なる系統もしくは細胞型であるか、または同じ系統／もしくは細胞型であるが異なる表現型である、いずれかに由来する細胞のハイブリダイゼーションによって得た造血性の分化転換系（ＨＴＳ）の生成の例を提供する。安定な各トリハイブリッドが親細胞の表現型の特性を同時に有していることを確認するために分析を行った。この確認は系統特異的な細胞表面マーカー、系統特異的なマーカーの細胞内発現、系統特異的なマーカーのＲＮＡ転写産物の存在、核型分類、および／または系統特異的なタンパク質の分泌の分析に基づいた。以下の例は分化転換系の最も典型的な表現型の特性について説明する。しかし、これらの例は、選択した特定のマーカーに限定されない。
【０２２９】
３．１．不死化された１つの骨髄単球性の前駆体、不死化された１つのリンパ球および不死化された１つのＴリンパ球に由来するＨＴＳ  −  ＨＴＳ−ＫＭＷ
一例として、この種のＨＴＳを、１つの不死化した骨髄単球性の前駆体Ｋ５６２細胞、不死化した１つのＴリンパ球ＭＯＬＴ４細胞、および不死化した１つのＢリンパ球ＷＩＬ２ＮＳ細胞をハイブリダイズすることによって生成した。このようにして得られたＨＴＳをＨＴＳ−ＫＭＷ系と名付けた（続いてその識別番号を付与した）。ＨＴＳ−ＫＭＷを確立する工程に関する以下の段階、溶液（ハイブリダイゼーション、培養および回復培地）および本発明に用いるパラメーターを以下に記載する。
【０２３０】
３．１．１．ＨＴＳ−ＫＭＷのための細胞調製
Ｋ５６２、ＷＩＬ２ＮＳ、およびＭＯＬＴ４細胞株を我々の標準培地（項目１．１参照）において培養し、５％のＣＯ２の３７℃の加湿インキュベータにおいてインキュベートした。定法にしたがって、各細胞株を３日毎に継代した。細胞ハイブリダイゼーションの前に、最も速い増殖速度を有している細胞型の安定な各クローンを、項目１．１．２に記載の手順を用いて樹立した。いくつかの実験において、項目１．１．３に記載のように樹立したＣＤ７１＋に関して濃縮されている細胞集団を用いた。また、いくつかの事例において、ＣＤ７１＋に関して濃縮されているＫ５６２集団のＣＤ１５＋細胞（項目１．１．３）を用いた。
【０２３１】
３．１．２．ＨＴＳ−ＫＭＷを確立するための細胞ハイブリダイゼーション手法
ＴＣ９６ウェルプレートの少数のウェルを細胞ハイブリダイゼーションウェルとして用いた。各ウェルを約１５０μｌのハイブリダイゼーション培地によって満たした。この培地は、２４０ｍＭのソルビトール（Sigma）、２．０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４（Sigma）、０．４ｍＭのＣａＣｌ２（Sigma）、０．２ｍＭのＭｇ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２（Sigma）および０．２ｍＭのＣａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２（Sigma）を含んでおり、０．２％のウシ血清アルブミン、ＢＳＡ（Sigma）によって補われていた。電気的な細胞ハイブリダイゼーションの前に、あらかじめ選択した細胞型の各クローンの細胞を一度ハイブリダイゼーション培地において数分間にわたって洗浄し、新鮮なハイブリダイゼーション培地を含んでいるウェルに移した。このウェルはプレハイブリダイゼーションウェルとして設計した。細胞ハイブリダイゼーションの工程の前に、選択した各クローンの単一の洗浄した細胞を項目１．１．１にしたがって、３つの細胞（選択した各クローンから１つずつ）のみを１対の同一の平行な電極（ウェルの底に沈めた（図３３において示されるように））の間に置くように操作した。電極の距離は４００マイクロメートル（すなわち４００μｍ）において設定した。
【０２３２】
電気的な細胞ハイブリダイゼーションを実施するために、まず、０．８ＭＨｚの周波数および１メートルあたり約５０〜６０キロボルト（例えば５０〜６０ｋＶ／ｍ）の場の強度を有している交流（ＡＣ）電界を、誘電泳動，ＤＥＰによって３つの細胞の互いにおける引き合いを誘導するまで、数秒間にわたって電極の間に印加し、一続きの細胞を形成させた。この工程は良好な細胞膜接触をこれら細胞に起こさせた。細胞をＫ５６２細胞が細胞の列の中央にあるような方法において配置した（図３２または３３参照）。次いで、３秒間隔の２回にわたる電気的方形波パルスをＡＣ電界と同時に印加した。約１７０ｋＶ／ｍの強度および７５マイクロ秒（例えば７５μ秒）のパルス幅を伴う各パルスを用いた。２回目の方形波パルスの終了後、ＡＣ電界をさらに５秒間にわたって連続的に維持し、単一のトリハイブリダイズされた細胞への細胞ハイブリダイゼーションが得られた。本発明のいくつかの実施形態に関して、３つの細胞のハイブリダイゼーションは同時に起こり得ないことが観察された。すなわち、まず３つのうち２つの細胞のハイブリダイゼーションがしばしば起こり、続いて３つ目の細胞のハイブリダイゼーションが起こる。いくつかの事例において、３つの細胞の完全なハイブリダイゼーションを得るために、さらなる方形波パルスを必要とした。新しく生成したトリハイブリダイズされた分化転換細胞を次いで、ハイブリダイゼーションウェルから回復ウェルに移した。１つの回復ウェルはハイブリダイゼーションウェルの列と異なる列に位置していた。各回復ウェルは１５０μｌの標準ＴＣ培地（項目１．１参照）を含んでいた。新しく樹立した各分化転換細胞を、回復ウェルあたり１つの分化転換細胞において、３７℃、５％のＣＯ２容量に制御された加湿インキュベーターにおいて数日間にわたってインキュベートした。大多数の分化転換トリハイブリッド細胞は細胞ハイブリダイゼーションの実施後３６時間以内に分裂することがわかった。インキュベーション期間の終了時において、各回復ウェル中の培地を新鮮な標準培地と適切に交換した。このことは各分化転換トリハイブリッドのクローンの細胞増殖を刺激した。２または３日後、分裂している細胞または生き残っている細胞を各回復ウェルから同定し、標準的な２４ウェルＴＣプレートのウェルに播き、１組の分化転換トリハイブリッドのクローンの基とした。各分化転換トリハイブリッドのクローンを、１０ミリリットル（ｍｌ）の我々の標準培養培地（項目１．１参照）を入れた２５ｃｍ２ＴＣフラスコに移してさらなる分析のために適切に標識する前に、２４ウェルプレートにおいてさらに１週間にわたって培養した。一群の安定な分化転換トリハイブリッド細胞を生成するために、電気的な細胞ハイブリダイゼーションの全工程および分化転換トリハイブリッドの回復の工程を複数回にわたって繰り返した。
【０２３３】
３．１．３．ＨＴＳ−ＫＭＷの系統マーカーのプロファイル
確立されたＨＴＳ−ＫＭＷ細胞株上の系統特異的なマーカーの共発現の確認の例が以下に示されている。
【０２３４】
ＨＴＳ−ＫＭＷ細胞株を通常の培養条件下において６ヶ月間にわたって樹立した後、ＨＴＳ−ＫＭＷ細胞集団を、骨髄系統、Ｂリンパ系統、およびＴリンパ系統に特異的なＣＤマーカーの発現について分析した。
【０２３５】
次のＣＤマーカー：ＷＩＬ２ＮＳ由来のＣＤ１９、Ｋ５６２由来のＣＤ１５およびＭＯＬＴ４由来のＣＤ４の共発現を確認するために、三色のＦＡＣＳ分析（tri-colour FACS analysis）を用いた。
【０２３６】
要約すると、５％のＢＳＡを含んでいるＰＢＳにおいて１×１０６／ｍｌの濃度であるＨＴＳ−ＫＭＷ細胞のうち１００μｌを、１００μｌのＰＢＳに懸濁させ、０．５ｍｇ／１００ｍｌのマウス抗ヒトＣＤ１５−ＰｅｒＣＰ抗体、０．２５ｍｇ／１００ｍｌのマウス抗ヒトＣＤ４−ＰＥ抗体および１．０ｍｇ／１００ｍｌのマウス抗ヒトＣＤ１９−ＦＩＴＣ抗体、または適切な同位体対照と共に、４℃において３０分間にわたってインキュベートした。すべてのマウス抗ヒト抗体はBD Pharmingenから入手した。ＰＢＳを用いた十分な洗浄の後、標識した細胞をFACSCaliburフローサイトメーターおよびCellQuest Proソフトウェアを用いて分析した。
【０２３７】
図９はＨＴＳ−ＫＭＷ細胞の典型的なＦＡＣＳプロファイルを示す。ＨＴＳ−ＫＭＷ細胞は系統特異的な特性が不死化表現型に由来するが、骨髄が支配的である、混合表現型（mixed phenotypes）の異種の細胞集団を含んでいることを、このＦＡＣＳプロファイルは示唆している。しかし、６２％のＨＴＳ−ＫＭＷ細胞が骨髄およびＴリンパ球の表現型を共有し、２８％のＨＴＳ−ＫＭＷ細胞がＴおよびＢリンパ球の表現型を発現している。
【０２３８】
３．１．４．ＨＴＳ−ＫＭＷからの、異なる表現型の集団の単離
ＨＴＳ−ＫＭＷ細胞は、異なる６つの表現型の集団、詳細には：（１）ＣＤ１５＋ＣＤ１９＋ＣＤ４＋；（２）ＣＤ１５＋ＣＤ１９＋ＣＤ４−；（３）ＣＤ１５＋ＣＤ１９−ＣＤ４＋；（４）ＣＤ１５−ＣＤ１９＋ＣＤ４＋；（５）ＣＤ１５−ＣＤ１９＋ＣＤ４−；（６）ＣＤ１５−ＣＤ１９−ＣＤ４＋にさらに分取された。
【０２３９】
分取領域は図９に示されているように設定された。異なる細胞集団についての分取ゲートは、以下に規定されている通りであった：（１）ＣＤ１５＋ＣＤ１９＋ＣＤ４＋の細胞集団を、ＨＴＳ−ＫＭＷ．１と命名し、Ｒ３およびＲ６の領域の両方にあるものをカウントし；（２）ＣＤ１５＋ＣＤ１９＋ＣＤ４−の細胞集団を、ＨＴＳ−ＫＭＷ．２と命名し、Ｒ５およびＲ２の領域の両方にあるものをカウントし；（３）ＣＤ１５＋ＣＤ１９−ＣＤ４＋の細胞集団を、ＨＴＳ−ＫＭＷ．３と命名し、Ｒ６およびＲ１の領域の両方にあるものをカウントし；（４）ＣＤ１５−ＣＤ１９＋ＣＤ４＋の細胞集団を、ＨＴＳ−ＫＭＷ．４と命名し、Ｒ４およびＲ３の領域の両方にあるものをカウントし；（５）ＣＤ１５−ＣＤ１９＋ＣＤ４−の細胞集団を、ＨＴＳ−ＫＭＷ．５と命名し、Ｒ７およびＲ２の領域の両方にあるものをカウントし；（６）ＣＤ１５−ＣＤ１９−ＣＤ４＋の細胞集団を、ＨＴＳ−ＫＭＷ．６と命名し、Ｒ４およびＲ１の領域の両方にあるものをカウントした。分取された細胞の集団を新たな培養培地に移し、通常の培養条件の下に別の培養物として成長させた。細胞の各集団の純度は、分取の直後に許容される９８％の純度を有していることが確認された。
【０２４０】
３．２．不死化された１つの骨髄単球性の前駆体、初代培養された１つのＢリンパ球および初代培養された１つのＴリンパ球に由来するＨＴＳ  −  ＨＴＳ−ＫＢＴ
一例として、この種のＨＴＳを、Ｋ５６２細胞に由来する不死化した１つの骨髄細胞、初代培養された１つのヒトＢ細胞および初代培養された１つのヒトＴ細胞の体細胞ハイブリダイゼーションによって生成した。この種のＨＴＳをＨＴＳ−ＫＢＴと名付け、その後ろに識別番号を付与した。
【０２４１】
３．２．１．ＨＴＳ−ＫＢＴを確立するための細胞調製
ＨＴＳ−ＫＢＴのトリハイブリッドの生成前のＫ５６２細胞の調製については、上述の通りである（項目１．１．３）。（ｉ）脾臓、末梢血または臍帯血に由来する成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）；骨髄に由来する初期Ｂ細胞（ＣＤ２０−ＣＤ７２＋）；骨髄に由来する活性化Ｂ細胞（ＣＤ２０＋ＣＤ７２＋）；臍帯血に由来する、抗原を経験したＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ５＋）、および（ｉｉ）脾臓および末梢血に由来するヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋）、脾臓、末梢血、臍帯血および胸腺に由来する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）；臍帯血に由来する、抗原を経験したＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ５＋）；臍帯血に由来するＣＤ３＋Ｔ細胞；胸腺に由来する二重陽性のＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ８＋）を含んでいるＫＢＴ系統交雑のトリハイブリッドの生成に用いた初代培養された細胞を実験において用いた。初代培養された種々のリンパ球の、種々のリンパ組織からの単離は、項目１．３に上述されている。
【０２４２】
３．２．２．ＨＴＳ−ＫＢＴを確立する細胞ハイブリダイゼーション手法
ＨＴＳ−ＫＢＴの確立のための細胞ハイブリダイゼーションの手順は、培地ならびにＡＣ電界およびパルスを変更したことを除いて、ＨＴＳ−ＫＢＴの確立のために用いたもの（項目３．１．２）と同様である。これらの実験において用いたハイブリダイゼーション培地は、２３０ｍＭのソルビトール、１．８ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｍＭのＣａＣｌ２、０．２ｍＭのＭｇ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２および０．３ｍＭのＣａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２を含んでおり、０．３％のＢＳＡによって補われていた。０．５ＭＨｚおよび６５〜７５ｋＶ／ｍのＡＣ電界を、それぞれ１００μ秒のパルス幅および１７５〜１８５ｋＶ／ｍの強度を伴う３秒間隔における３回にわたる連続した方形波パルスと同時に印加した。３回目の方形波パルスの終了後、ＡＣ電界をさらに５秒間にわたって連続的に出力し、細胞のハイブリダイゼーションが系統交雑のトリハイブリッドを生成するという結果になった。
この新しく作り出した分化転換ハイブリッド細胞のインキュベーションおよびＨＴＳトリハイブリッドの回復手順は、上述されている（項目３．１．２）。
【０２４３】
３．２．３．ＨＴＳ−ＫＢＴの系統マーカーのプロファイル
確立されたＨＴＳ−ＫＢＴ細胞上における系統特異的なマーカーの共発現の確認の例が以下に示されている。
【０２４４】
３．２．３．１  不死化された１つの骨髄性細胞、初代培養された１つの成熟Ｂリンパ球および初代培養された１つのエフェクターＴヘルパー細胞から確立されているＨＴＳ−ＫＢＴのマーカープロファイル
ＨＴＳ−ＫＢＴ細胞株を、例えば、通常の培養条件下において数ヶ月間にわたって樹立した後、この細胞株を系統特異的なＣＤマーカーの発現について分析した。ハイブリダイゼーション前の細胞の調製（項目１．３．３）についての記載と同様の手順を用いて、ＨＴＳ−ＫＢＴ細胞株の細胞をマウス抗ヒトＣＤ１９およびＣＤ４抗体を用いて標識した。図１０（ｄ）は、１つの不死の骨髄単球細胞および初代培養された２つの細胞から樹立したＨＴＳ−ＫＢＴ細胞株のＦＡＣＳプロファイル（ＣＤ１９およびＣＤ４標識）を示す。代表的に、このような安定な系統交雑のトリハイブリッドにおける９９％を超える細胞が、親である初代培養された細胞と同様の密度を伴って、ＢおよびＴ細胞の両方に関するＣＤマーカーを発現していた。
【０２４５】
３．２．３．２  不死化された１つの骨髄性細胞、および抗原を経験した、初代培養された２つのリンパ球（Ｂ細胞およびＴ細胞）から確立されているＨＴＳ−ＫＢＴのマーカープロファイル
他の実施形態において、１つのＫ５６２細胞、抗原を経験した１つのＢ細胞および抗原を経験した１つのＴ細胞に由来するＨＴＳ−ＫＢＴ細胞株を樹立した。ＨＴＳ−ＫＢＴのこのバリアントをＨＴＳ−ＫＢＴＡＥと命名した。この細胞をＦＡＣＳを用いてＣＤ１９、ＣＤ３およびＣＤ５の共発現について分析した。
【０２４６】
要約すると、細胞ハイブリダイゼーション前の細胞の調製（項目１．３．３）と同様の手順を用いて、この細胞をマウス抗ヒトＣＤ５−ＦＩＴＣ抗体およびマウス抗ヒトＣＤ１９−ＰＥ抗体またはマウス抗ヒトＣＤ４−ＰＥ抗体を用いて標識した。図１２はこのようなＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ細胞株の細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。この結果は、ＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ細胞集団の５〜１０％がＣＤ５分子の細胞表面発現を維持する一方で、ＣＤ３または／およびＣＤ１９について陽性であることによって、その抗原ばくろの記憶を保持していたことを示す。また、ＣＤ５陰性細胞集団の少なくとも８３％がＢ系統（ＣＤ１９）およびＴ系統（ＣＤ３）マーカーの両方を共発現していた。
【０２４７】
３．２．３．３  ＨＴＳ−ＫＢＴＡＥからの異なる表現型の集団の単離
ＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ細胞は、異なる６つの表現型の集団、詳細には：（１）ＣＤ３＋ＣＤ１９＋ＣＤ５＋；（２）ＣＤ３＋ＣＤ１９＋ＣＤ５−；（３）ＣＤ３＋ＣＤ１９−ＣＤ５＋；（４）ＣＤ３＋ＣＤ１９−ＣＤ５−；（５）ＣＤ３−ＣＤ１９＋ＣＤ５＋；（６）ＣＤ３−ＣＤ１９＋ＣＤ５−にさらに分取された。
【０２４８】
分取領域は図１１に示されるように設定された。異なる細胞の集団についての分取ゲートは以下のように規定された：（１）ＣＤ３＋ＣＤ１９＋ＣＤ５＋の細胞の集団をとＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．１と命名し、Ｒ２およびＲ４の領域の両方においてカウントし；（２）ＣＤ３＋ＣＤ１９＋ＣＤ５−の細胞の集団をとＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．２と命名し、Ｒ１およびＲ３の領域の両方においてカウントし；（３）ＣＤ３＋ＣＤ１９−ＣＤ５＋の細胞の集団をとＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．３と命名し、Ｒ２の領域にはなくＲ４の領域にあるものをカウントし；（４）ＣＤ３＋ＣＤ１９−ＣＤ５−の細胞の集団をとＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．４と命名し、Ｒ１の領域にはなくＲ３の領域にあるものをカウントし；（５）ＣＤ３−ＣＤ１９＋ＣＤ５＋の細胞の集団をとＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．５と命名し、Ｒ４の領域になくＲ２の領域にあるものをカウントし；（６）ＣＤ３−ＣＤ１９＋ＣＤ５−の細胞の集団をとＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．６と命名し、Ｒ３の領域になくＲ１の領域にあるものをカウントした。分取された細胞の集団を新たな培養培地に移し、通常の培養条件の下に別の培養物として成長させた。細胞の各集団の純度は、分取の直後に許容される９８％の純度を有していることが確認された。
【０２４９】
３．２．３．４  不死化された１つの骨髄性の細胞、活性化されたＢ細胞、および初代培養された二重陽性の未拘束のエフェクターＴ細胞から確立されているＨＴＳ−ＫＢＴのマーカープロファイル
他の実施形態において、１つのＫ５６２、胸腺から単離した１つのＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ８＋について二重陽性）および骨髄から単離した１つの活性化Ｂ細胞（ＣＤ２０＋およびＣＤ７２＋）の細胞ハイブリダイゼーションに由来するＨＴＳ−ＫＢＴ細胞株を樹立した。ＨＴＳ−ＫＢＴのこのバリアントを、ＨＴＳ−ＫＢＴＤＰと命名した。この細胞を細胞表面上におけるＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０およびＣＤ７２の共発現について分析した。
【０２５０】
要約すると、初代培養されたリンパ球の単離（項目１．３）についての記載と同様の手順を用いて、ＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ細胞を、（１）マウス抗ヒトＣＤ４−ＰＥおよびマウス抗ヒトＣＤ７２−ＦＩＴＣ抗体の組合せ、（２）マウス抗ヒトＣＤ２０−ＰＥおよびマウス抗ヒトＣＤ８−ＦＩＴＣ抗体の組合せ、または（３）マウス抗ヒトＣＤ４−ＰＥおよびマウス抗ヒトＣＤ８−ＦＩＴＣ抗体の組み合わせのいずれかを用いて標識した。図１２はこのようなＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す。
【０２５１】
この結果（図１２参照）は、ＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ細胞の９９％がその表面上に二重陽性のＴ細胞由来のＣＤ４またはＣＤ８のいずれかを発現しており、６６〜７１％の細胞がＣＤ４について陽性であり、８８〜８９％の細胞がＣＤ８について陽性であった。これらの細胞の６０％において、ＣＤ４およびＣＤ８の発現は同時に起こっていた。二重陽性の胸腺細胞に由来するＣＤ４について陽性であるが、６１％の細胞が同様に骨髄の活性化Ｂ細胞に由来するＣＤ７２について陽性であった。しかし、ＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ集団の９４％がそれらの表面上にＣＤ７２を発現していた。一方、ＣＤ８陽性細胞の３１％がＣＤ２０を共発現していた。ＣＤ２０陽性細胞の総数は３９％であった。
【０２５２】
３．２．３．５  ＨＴＳ−ＫＢＴＤＰからの異なる表現型の集団の単離
ＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ細胞は、異なる１５の表現型の集団、詳細には：（１）ＣＤ４＋ＣＤ８＋ＣＤ２０＋ＣＤ７２＋；（２）ＣＤ４＋ＣＤ８＋ＣＤ２０＋ＣＤ７２−；（３）ＣＤ４＋ＣＤ８＋ＣＤ２０−ＣＤ７２＋；（４）ＣＤ４＋ＣＤ８＋ＣＤ２０−ＣＤ７２−；（５）ＣＤ４＋ＣＤ８−ＣＤ２０＋ＣＤ７２＋；（６）ＣＤ４＋ＣＤ８−ＣＤ２０＋ＣＤ７２−；（７）ＣＤ４＋ＣＤ８−ＣＤ２０−ＣＤ７２＋；（８）ＣＤ４＋ＣＤ８−ＣＤ２０−ＣＤ７２−；（９）ＣＤ４−ＣＤ８＋ＣＤ２０＋ＣＤ７２＋；（１０）ＣＤ４−ＣＤ８＋ＣＤ２０＋ＣＤ７２−；（１１）ＣＤ４−ＣＤ８＋ＣＤ２０−ＣＤ７２＋；（１２）ＣＤ４＋ＣＤ８＋ＣＤ２０−ＣＤ７２−；（１３）ＣＤ４−ＣＤ８−ＣＤ２０＋ＣＤ７２＋；（１４）ＣＤ４−ＣＤ８−ＣＤ２０＋ＣＤ７２−；（１５）ＣＤ４−ＣＤ８−ＣＤ２０−ＣＤ７２＋にさらに分取された。
【０２５３】
分取領域は図１２に示されるように設定された。異なる細胞の集団についての分取ゲートは以下のように規定された：（１）ＣＤ４＋ＣＤ８＋ＣＤ２０＋ＣＤ７２＋の細胞集団を、ＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．１と命名し、Ｒ２、Ｒ５およびＲ８のすべての３つの領域にあるものをカウントし；（２）ＣＤ４＋ＣＤ８＋ＣＤ２０＋ＣＤ７２−の細胞集団を、ＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．２と命名し、Ｒ２、Ｒ８およびＲ４のすべての３つの領域にあるものをカウントし；（３）ＣＤ４＋ＣＤ８＋ＣＤ２０−ＣＤ７２＋の細胞集団を、ＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．３と命名し、Ｒ２、Ｒ５およびＲ９のすべての３つの領域にあるものをカウントし；（４）ＣＤ４＋ＣＤ８＋ＣＤ２０−ＣＤ７２−の細胞集団を、ＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．４と命名し、Ｒ２、Ｒ４およびＲ９のすべての３つの領域にあるものをカウントし；（５）ＣＤ４＋ＣＤ８−ＣＤ２０＋ＣＤ７２＋の細胞集団を、ＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．５と命名し、Ｒ１、Ｒ５およびＲ７のすべての３つの領域にあるものをカウントし；（６）ＣＤ４＋ＣＤ８−ＣＤ２０＋ＣＤ７２−の細胞集団を、ＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．６と命名し、Ｒ１、Ｒ４およびＲ７のすべての３つの領域にあるものをカウントし；（７）ＣＤ４＋ＣＤ８−ＣＤ２０−ＣＤ７２＋の細胞集団を、ＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．７と命名し、Ｒ１、Ｒ５およびＲ１２のすべての３つの領域にあるものをカウントし；（８）ＣＤ４＋ＣＤ８−ＣＤ２０−ＣＤ７２−の細胞集団を、ＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．８と命名し、Ｒ１、Ｒ４およびＲ１２のすべての３つの領域にあるものをカウントし；（９）ＣＤ４−ＣＤ８＋ＣＤ２０＋ＣＤ７２＋の細胞集団を、ＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．９と命名し、Ｒ３、Ｒ６およびＲ８のすべての３つの領域にあるものをカウントし；（１０）ＣＤ４−ＣＤ８＋ＣＤ２０＋ＣＤ７２−の細胞集団を、ＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．１０と命名し、Ｒ３、Ｒ１１およびＲ８のすべての３つの領域にあるものをカウントし；（１１）ＣＤ４−ＣＤ８＋ＣＤ２０−ＣＤ７２＋の細胞集団を、ＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．１１と命名し、Ｒ３、Ｒ６およびＲ９のすべての３つの領域にあるものをカウントし；（１２）ＣＤ４＋ＣＤ８＋ＣＤ２０−ＣＤ７２−の細胞集団を、ＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．１２と命名し、Ｒ３、Ｒ１１およびＲ９のすべての３つの領域にあるものをカウントし；（１３）ＣＤ４−ＣＤ８−ＣＤ２０＋ＣＤ７２＋の細胞集団を、ＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．１３と命名し、Ｒ１０、Ｒ６およびＲ７のすべての３つの領域にあるものをカウントし；（１４）ＣＤ４−ＣＤ８−ＣＤ２０＋ＣＤ７２−の細胞集団を、ＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．１４と命名し、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ７のすべての３つの領域にあるものをカウントし；（１５）ＣＤ４−ＣＤ８−ＣＤ２０−ＣＤ７２＋の細胞集団を、ＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．１５と命名し、Ｒ１０、Ｒ６およびＲ１２のすべての３つの領域にあるものをカウントした。分取された細胞の集団を新たな培養培地に移し、通常の培養条件の下に別の培養物として成長させた。細胞の各集団の純度は、分取の直後に許容される９８％の純度を有していることが確認された。
【０２５４】
３．３  骨髄単球性の初代培養された前駆体、不死化されたＢリンパ球および初代培養されたＴリンパ球に由来するＨＴＳ  −  ＨＴＳ−ＷＴＭ
一例として、骨髄に由来する初代培養された１つの骨髄性の前駆体、ＷＩＬ２ＮＳ細胞株に由来する不死化された１つのヒトＢ細胞、および初代培養されたヒトＴ細胞の体細胞ハイブリダイゼーションによって、この種のＨＴＳを作製した。
【０２５５】
３．３．１．ＨＴＳ−ＷＴＭを確立するための細胞調製
ＨＴＳ−ＷＴＭの作製に使用したＷＩＬ２ＮＳの調製については、項目１．１．３にすでに記載されている。脾臓、末梢血、臍帯血および胸腺に由来するヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋）の初代培養された細胞をこれらの実験に使用した。初代培養された種々のリンパ球の、種々のリンパ組織からの単離についてはすでに記載されている（項目１．３）。初代培養された骨髄性の前駆細胞は項目１．２．２に記載されているＣＤ３４＋ＣＤ１５＋骨髄単核球に由来する。
【０２５６】
３．３．２．ＨＴＳ−ＷＴＭを確立するための細胞ハイブリダイゼーション手法
ＨＴＳ−ＷＴＭの生成のための細胞ハイブリダイゼーションの手順は、培地を変更したことを除いて、ＨＴＳ−ＷＴＭの生成のために用いたもの（項目３．１．２参照）と同様であった。これらの実験において用いたハイブリダイゼーションの培地は、２３５ｍＭのソルビトール、１．８ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｍＭのＣａＣｌ２、０．３ｍＭのＭｇ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２および０．２５ｍＭのＣａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２（Sigma）を含んでおり、０．３％のＢＳＡによって補われていた。項目３．２．２の記載とまったく同じ電気的な手順をＷＴＭの生成のために用いた。この新しく作り出した各分化転換ハイブリッド細胞のインキュベーションおよびＨＴＳトリハイブリッド回復の手順については、項目３．１．２に記載されている。
【０２５７】
３．３．３．ＨＴＳ−ＷＴＭの系統マーカーのプロファイル
確立されたＨＴＳ−ＷＴＭ細胞上における系統特異的なマーカーの共発現の確認の例が以下に示されている。
【０２５８】
３．３．３．１  初代培養された骨髄性の１つの前駆体、不死化された１つのリンパ球および初代培養された１つのＴ細胞から確立されたＨＴＳ−ＷＴＭのマーカープロファイル
ＷＩＬ２ＮＳ細胞株に由来する不死化された１つのＢリンパ球、初代培養された１つのＴ細胞、および１つの骨髄単球性の前駆体の細胞ハイブリダイゼーションに由来するＨＴＳ−ＷＴＭ細胞株を通常の条件の下（項目１．１を参照）に６ヶ月間にわたって培養した後に、ＨＴＳ−ＷＴＭ細胞の集団を系統特異的なＣＤマーカーの発現について分析した。ＣＤ１９（Ｂ系統）、ＣＤ４（Ｔ系統）、ＣＤ１５（骨髄系統）およびＣＤ３４（前駆細胞）に関する表面マーカーの発現を分析した。要約すると、マウス抗ヒトＣＤ１９−ＰＥ抗体、マウス抗ヒトＣＤ４−ＦＩＴＣ抗体（BD Pharmingen）およびマウス抗ヒトＣＤ１５ＰｅｒＣＰ抗体の組合せ、またはマウス抗ヒトＣＤ３４−ＰＥ抗体、マウス抗ヒトＣＤ４−ＦＩＴＣ抗体およびマウス抗ヒトＣＤ１５−ＰｅｒＣＰ抗体の組合せを用いて、このＨＴＳ−ＷＴＭ細胞株の細胞を標識した。上述の手法（項目１．３．３）にしたがって細胞の染色を実施した。ＣＤ３４＋ＣＤ１５＋骨髄単球性の前駆細胞に由来するＨＴＳ−ＷＴＭ細胞の典型的な発現プロファイルが図１３に示されている。ＨＴＳ−ＷＴＭの約８１％はＢ系統および骨髄単球性の表現型を共有しており（ＣＤ３４＋ＣＤ１５＋）、またＣＤ４＋細胞の３４％はそれらの表面にＣＤ３４を維持しており、ＣＤ３４＋細胞の６８％はＣＤ１５を発現していることが分析によって示された。興味深いことに、ＣＤ３４およびＣＤ１５が同じ起源（骨髄単球性の前駆細胞）に由来するにもかかわらず、ＣＤ３４＋細胞の２８％はＣＤ１５の発現を維持していない。
【０２５９】
３．３．３．２  ＨＴＳ−ＷＴＭからの異なる表現型の集団の単離
ＨＴＳ−ＷＴＭ細胞は、異なる６つの表現型の集団、詳細には：ＣＤ１５、ＣＤ１９およびＣＤ４の発現に基づいて、（１）ＣＤ１５＋ＣＤ１９＋ＣＤ４＋；（２）ＣＤ１５−ＣＤ１９−ＣＤ４−；（３）ＣＤ１５＋ＣＤ１９−ＣＤ４＋；（４）ＣＤ１５−ＣＤ１９＋ＣＤ４＋；（５）ＣＤ１５−ＣＤ１９＋ＣＤ４−；（６）ＣＤ１５−ＣＤ１９−ＣＤ４＋；またはＣＤ１５、ＣＤ３４およびＣＤ４の発現に基づいて、（７）ＣＤ１５＋ＣＤ３４＋ＣＤ４＋；（８）ＣＤ１５＋ＣＤ３４＋ＣＤ４−；（９）ＣＤ１５＋ＣＤ３４−ＣＤ４＋；（１０）ＣＤ１５−ＣＤ３４＋ＣＤ４＋；（１１）ＣＤ１５−ＣＤ３４＋ＣＤ４−；（１２）ＣＤ１５−ＣＤ３４−ＣＤ４＋にさらに分取された。
【０２６０】
分取領域を図１３（Ａ）および１３（Ｂ）に示されるように設定した。ＣＤ１５、ＣＤ１９およびＣＤ４の発現に基づく異なる細胞の集団についての分取ゲートは以下のように規定された：（１）ＣＤ１５＋ＣＤ１９＋ＣＤ４＋の細胞集団を、ＨＴＳ−ＷＴＭ．１と命名し、Ｒ３およびＲ６の両方の領域にあるものをカウントし；（２）ＣＤ１５−ＣＤ１９−ＣＤ４−の細胞集団を、ＨＴＳ−ＷＴＭ．２と命名し、Ｒ６およびＲ１の両方の領域にあるものをカウントし；（３）ＣＤ１５＋ＣＤ１９−ＣＤ４＋の細胞集団を、ＨＴＳ−ＷＴＭ．３と命名し、Ｒ５およびＲ３の両方の領域にあるものをカウントし；（４）ＣＤ１５−ＣＤ１９＋ＣＤ４＋の細胞集団を、ＨＴＳ−ＷＴＭ．４と命名し、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の領域にはなくＲ５の領域にあるものをカウントし；（５）ＣＤ１５−ＣＤ１９＋ＣＤ４−の細胞集団を、ＨＴＳ−ＷＴＭ．５と命名し、Ｒ５およびＲ６のの領域にはなくＲ４の領域にあるものをカウントし；（６）ＣＤ１５−ＣＤ１９−ＣＤ４＋の細胞集団を、ＨＴＳ−ＷＴＭ．６と命名し、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の領域にはなくＲ２の領域にあるものをカウントした。分取された細胞の集団を新たな培養培地に移し、通常の培養条件の下に別の培養物として成長させた。細胞の各集団の純度は、分取の直後に許容される９８％の純度を有していることが確認された。
【０２６１】
図１３ＢはＣＤ１５、ＣＤ３４およびＣＤ４の発現に基づく異なる細胞集団についての分取ゲートを示している。上記ゲートは以下のように規定された：（７）ＣＤ１５＋ＣＤ３４＋ＣＤ４＋の細胞集団を、ＨＴＳ−ＷＴＭ．７と命名し、Ｒ３およびＲ６の両方の領域にあるものをカウントし；（８）ＣＤ１５＋ＣＤ３４＋ＣＤ４−の細胞集団を、ＨＴＳ−ＷＴＭ．８と命名し、Ｒ１およびＲ６の両方の領域にあるものをカウントし；（９）ＣＤ１５＋ＣＤ３４−ＣＤ４＋の細胞集団を、ＨＴＳ−ＷＴＭ．９と命名し、Ｒ２およびＲ５の両方の領域にあるものをカウントし；（１０）ＣＤ１５−ＣＤ３４＋ＣＤ４＋の細胞集団を、ＨＴＳ−ＷＴＭ．１０と命名し、Ｒ３およびＲ４の両方の領域にあるものをカウントし；（１１）ＣＤ１５−ＣＤ３４＋ＣＤ４−の細胞集団を、ＨＴＳ−ＷＴＭ．１１と命名し、Ｒ１およびＲ４の両方の領域にあるものをカウントし；（１２）ＣＤ１５−ＣＤ３４−ＣＤ４＋の細胞集団を、ＨＴＳ−ＷＴＭ．１２と命名し、Ｒ２の領域にはなくＲ４、Ｒ５およびＲ６の領域にはなくＲ２の領域にあるものをカウントした。分取された細胞の集団を新たな培養培地に移し、通常の培養条件の下に別の培養物として成長させた。細胞の各集団の純度は、分取の直後に許容される９８％の純度を有していることが確認された。
【０２６２】
＜実施例４＞
４．環境条件の変化による異なる細胞表現型へのＨＴＳ細胞の分化転換
この実施例は、細胞系統に許容性の環境または細胞系統を促進する環境への所定のＨＴＳ細胞のばくろを通じた、異なる表現型への細胞の分化転換の実現可能なモデルのいくつかを示している。
【０２６３】
４．１．ＣＤ４＋Ｔ細胞へのＨＴＳ細胞の分化転換
以下の亜集団：ＨＴＳ−ＫＭＷ．１、ＨＴＳ−ＫＭＷ．６、ＨＴＳ−ＫＢＴ、ＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．１、ＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．４、ＨＴＳ−ＷＴＭ．１、ＨＴＳ−ＷＴＭ．６、ＨＴＳ−ＷＴＭ．７およびＨＴＳ−ＷＴＭ．１２に由来しており、項目３．１．４、項目３．２．３．１、項目３．２．３．３および項目３．３．３．２に記載されているように作製されたＨＴＳ細胞、ならびにＫ５６２細胞、ＷＩＬ２ＮＳ細胞およびＭＯＬＴ４細胞の対照培養物を新たな培養培地に移し、細胞の濃度を１ｍｌにつき２５００００細胞または５０００００細胞に調整した。１０Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−２（BD Biosciences）、１ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−１β（BD Biosciences）、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２３（R&D Systems）、１μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−４、１μｇ／ｍｌの抗ＩＦＮ−γおよび細胞につき１ビーズの割合の抗ＣＤ３／ＣＤ２８活性化ビーズ（Invitrogen）を細胞培養物に補い、Ｕ底の９６ウェルプレート（Corning）に、ウェルにつき２００μｌにおいて播いた。０．１、１および１０ｎｇ／ｍｌにおける増加する濃度のＴＧＦ−βを一連の４つのウェルに加えた。３日目および５日目に培養培地を、すべてのサイトカインおよび抗体を含んでいる新たな培地に置き換えた。８日目に、抗ＣＤ４、抗ＣＤ１９およびＣＤ１５を用いて細胞を、染色し、項目１．３．３に記載の通りにフローサイトメトリーによって分析した。染色の前に５０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ、５００ｎｇ／ｍｌのイオノマイシンおよび１倍のBD GoldgiStopを用いて５時間にわたって細胞を活性化した。
【０２６４】
それから、項目３．１．３に記載の通りにマウス抗ヒトＣＤ４−ＰＥ抗体、マウス抗ヒトＣＤ１９−ＦＩＴＣ抗体、マウス抗ヒトＣＤ１５−ＰｅｒＣＰ抗体を用いて、細胞を標識した。図１４は、培養物におけるＣＤ４、ＣＤ１９およびＣＤ１５についての三重染色の代表的なプロファイルを示しており、ここで、ＣＤ４＋細胞への分化っを誘導された後に１００％の細胞が表面上にＣＤ４のみを発現した。ＨＴＳ−ＫＭＷ．１培養物において、ＣＤ４＋単独の細胞は、三重陽性の（ＣＤ１５＋ＣＤ１９＋ＣＤ４＋）細胞の純粋な集団から開始された細胞集団の全体のうち４９％に達した。ＣＤ４＋単独の細胞は、ＨＴＳ−ＫＢＴにおいて、最初の二重陽性の（ＣＤ１９＋ＣＤ４＋）集団の１００％うち５０％に達し；ＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．１において、三重陽性の（ＣＤ３＋ＣＤ１９＋ＣＤ５＋）集団の１００％のうち６１％に達し；ＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．４において、最初のＣＤ３＋細胞の１００％のうち７４％に達し；ＨＴＳ−ＷＴＭ．１において、三重陽性の（ＣＤ１５＋ＣＤ１９＋ＣＤ４＋）集団の１００％のうち８２％に達し；ＨＴＳ−ＷＴＭ．７における７１５が、ＣＤ１５＋ＣＤ３４＋ＣＤ４＋表現型の三重陽性の集団から単独のＣＤ４陽性の細胞になった。Ｋ５６２細胞、ＷＩＬ２ＮＳ細胞およびＭＯＬＴ４細胞の対照細胞は、変わらないそれらのマーカー発現プロファイルを維持した。
【０２６５】
４．１．１  ＨＴＳから生成されたＣＤ４＋Ｔ細胞の性質決定
ＣＤ４＋Ｔ細胞に誘導されたＨＴＳ培養物から生成された単独陽性のＣＤ４＋細胞を、マーカー発現および機能的な性質決定のさらなる分析のために分取した。許容される純度はＣＤ４＋Ｔ細胞の全体集団の９８％であった。
【０２６６】
４．１．１．１  ＨＴＳから生成されたＣＤ４＋細胞の表現型プロファイル
Ｔリンパ球許容性のＨＴＳ培養物に由来する単独陽性のＣＤ４細胞を、ＣＤ４＋Ｔ細胞の表面に限定的に発現されているか、またはＣＤ８＋Ｔ細胞の機能にとって重要な、細胞表面上における以下の分子の発現について、さらに分析した。当該分子は、ＴＣＲαβ−Ｔ細胞受容体；ＣＤ２５−活性化Ｔ細胞によって発現されるＩＬ−２受容体αであり、ＣＤ４との組合せにおいてＣＤ４＋Ｔ細胞の制御性サブセットを意味する；ＣＤ２７−Ｔ細胞の共刺激に関与する；ＣＤ２８−ナイーブＴ細胞の活性化を意味する；ＣＤ６２Ｌ−ナイーブＴ細胞およびメモリＴ細胞上に発現され、ホーミングに関与する；ＣＤ６９−活性化Ｔ細胞上におけるシグナル伝達分子；ＣＤ９５−活性化によって上方制御される；ＣＤ４５ＲＯ−活性化Ｔ細胞またはメモリＴ細胞を意味する、である。各マーカーの発現をＣＤ４と組み合わせて評価した。この目的のために、項目１．３．３に記載の同じ手法に本質的にしたがって、マウス抗ヒトＣＤ４−ＰＥと、マウス抗ヒトＣＤ２５−ＦＩＴＣ、マウス抗ヒトＣＤ２７−ＦＩＴＣ、マウス抗ヒトＣＤ６２Ｌ−ＦＩＴＣ、マウス抗ヒトＣＤ６９−ＦＩＴＣまたはマウス抗ヒトＣＤ９５−ＦＩＴＣとの組合せを用いて、細胞を染色した。表２には、異なるＨＴＳ培養物に由来するＣＤ４＋Ｔリンパ球の表現型プロファイルが要約されている。
【０２６７】
種々の培養物からの細胞のすべてはそれらの表面上にＴＣＲの成熟形態を発現しており、ＣＤ発現プロファイルはＨＴＳ培養物において生成された種々のＣＤ４＋サブセットを示している。種々の活性化分子について発現レベルと顕著に相関するＣＤ６２Ｌ発現による徴候として、細胞はホーミングついての異なる能力を示した。特に初代培養された骨髄単球性の前駆細胞から生じているＴＨＳ−ＷＴＭにおいて、活性化ヘルパーＴ細胞のサブセットだけでなく、Ｔ細胞のＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性サブセットを生成可能であった。
【０２６８】
【表２】
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４．１．１．２  ＨＴＳから生成されたＣＤ４＋細胞によるサイトカイン産生
Ｔ細胞許容性のＨＴＳ培養物から生成された単独陽性のＣＤ４＋細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）を用いた４日間にわたるポリクロナル活性化に続いく、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの産生について、さらに分析した。平底の９６ウェルプレートの１ウェルにつき、２００μｌの完全培地における２０００００細胞を播いた。上清を取り出し、それぞれのＥＬＩＳＡキット（すべてInvitrogenから購入した）によって分析した。表３はＨＴＳ培養物に由来するポリクロナル性に刺激されたＣＤ４＋におけるサイトカイン産生の典型的なプロファイルを表している。
【０２６９】
【表３】
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サイトカインプロファイルは、炎症性の優勢なプロファイルから制御性の優勢なプロファイルまでの範囲にあるＴ細胞許容性の環境においてＨＴＳ培養物から生成されたＣＤ４＋細胞における異なるＴ細胞サブセットの存在をを再確認している。
【０２７０】
４．２．細胞傷害性ＣＤ８＋細胞へのＨＴＳ細胞の分化転換
以下のＴＨＳ集団：項目３．２．３．３に記載のＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．１およびＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．４；項目３．２．３．５に記載のＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．１、ＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．４およびＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．１２に由来する細胞、ならびにＫ５６２の対照培養物を細胞傷害性のＣＤ８＋Ｔリンパ球の分化に使用した。
【０２７１】
この目的のために、対照のＫ５６２細胞、および各ＨＴＳ集団に由来する細胞を、単層のヒト胸腺ストロマ細胞を用いて被覆した２４ウェルプレートのウェルごとに１０００００細胞において播いた。０．５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼおよび１Ｕ／ｍｌのＤＮａｓｅＩを有しているＰＢＳにおいて、常に攪拌しながら６０分間にわたって３７℃においてインキュベートすることによって単一の細胞の懸濁物に消化された胸腺の細かく刻んだ小片から、胸腺ストロマ細胞を調製した。培養培地（ＲＰＭＩ１６４０：１０％のＦＣＳ、１０ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１０ｐｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン）を用いて１回にわたって、細胞の懸濁物を洗浄した。２４ウェルプレートにおける２ｍｌの培養培地の入った１ウェルごとに１０８細胞の新しい細胞または低温保存の細胞のいずれかを用いて、胸腺ストロマ細胞の培養物を確立した。２日後に、培養培地を用いて３回にわたって洗浄することによって、吸着していない細胞を除去した。それから、少なくとも週に２回、交換された培養培地に単層を維持させた。また、１％の非必須アミノ酸、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−７および１００Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−２（BD Bioscience）を、ＨＴＳ培養物に補った。５日目および１０日目に培養培地を、サイトカインを含んでいる新たな培地に交換した。
【０２７２】
１４日目に、ＣＤ８、ＣＤ１９およびＣＤ１５の発現についてＨＴＳ培養物を分析した。この目的のために、それから、項目１．３．３に記載の通りに、マウス抗ヒトＣＤ８−ＰＥ、マウス抗ヒトＣＤ１９−ＦＩＴＣおよびマウス抗ヒトＣＤ１５−ＰｅｒＣｐを用いて細胞を標識した。図１５は、ＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．１２における系統マーカーの典型的なプロファイルを示しており、ここで、ＣＤ８＋細胞への分化を誘導した後に、１００％の細胞が単独陽性（ＣＤ８＋）の表現型を示した。ＫＢＴＡＥ．１において、単独陽性のＣＤ８細胞の数は、三重陽性のＣＤ３＋ＣＤ１９＋ＣＤ５＋集団の１００％に基づいて５３％に達し、ここで、ＫＢＴＡＥ．４における当該数は単独ＣＤ３＋集団の１００％に基づいて６１％であった。ＨＴＳ  ＫＢＴＤＰ．１およびＨＴＳ  ＫＢＴＤＰ．４において、単独ＣＤ８＋細胞の割合は、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ＣＤ２０＋ＣＤ７２＋の集団およびＣＤ４＋ＣＤ８＋ＣＤ２０−ＣＤ７２−の集団の１００％のうち７２％および８６％に上った。対照のＫ５６２培養物において変化は認められなかった。
【０２７３】
４．２．１．  ＨＴＳ細胞から生成されたＣＤ８＋細胞の性質決定
細胞傷害性のＴ細胞へと誘導されたＨＴＳ培養物から生成された単独陽性のＣＤ８＋細胞を、マーカー発現および機能的な性質決定のさらなる分析のために分取した。
【０２７４】
４．２．１．１  ＨＴＳ細胞から生成されたＣＤ８＋細胞の表現型プロファイル
Ｔリンパ球許容性のＨＴＳ培養物に由来する単独陽性のＣＤ８細胞を、細胞傷害性Ｔ細胞の表面に限定的に発現されているか、またはＣＤ８＋Ｔ細胞の機能にとって重要な、細胞表面上における以下の分子の発現について、さらに分析した。当該分子は、ＴＣＲαβ−Ｔ細胞受容体；ＣＤ８αおよびＣＤ８β（ここで、β鎖の下方制御は抗原ばくろ前を意味する）；ＣＤ２７−Ｔ細胞の共刺激に関与する；ＣＤ２８−ナイーブＴ細胞の活性化を意味する；ＣＤ６２Ｌ−ナイーブＴ細胞およびメモリＴ細胞上に発現され、ホーミングに関与する；ＣＤ９５−活性化によって上方制御される；ＣＤ４５ＲＯ−活性化Ｔ細胞またはメモリＴ細胞を意味する、である。まず、項目１．３．３に記載の手法に本質的にしたがって、抗ヒトＣＤ８α−ＰＥ（BD Pharmingen）および抗ヒトＣＤ８β−ＦＩＴＣ（BD Pharmingen）を用いて、細胞を標識した。続く染色において、抗ヒトＴＣＲαβ−ＦＩＴＣ、抗ヒトＣＤ２７−ＦＩＴＣ、抗ヒトＣＤ２８−ＦＩＴＣ、抗ヒトＣＤ６２Ｌ−ＦＩＴＣまたは抗ヒトＣＤ４５ＲＯ−ＦＩＴＣ（すべてBD Pharmingenから購入した）と組み合わせて、抗ヒトＣＤ８β−ＦＩＴＣを使用した。表４には、異なるＨＴＳ培養物に由来するＣＤ８＋Ｔリンパ球の表現型プロファイルが要約されている。
【０２７５】
【表４】
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マーカーの分析によって、種々の集団におけるすべての細胞はＣＤ８についてα鎖およびβ鎖の両方をともなう、ＴＣＲαβの発現について同質であることが明らかになった。しかし、細胞の集団は、他のマーカーの同質の発現を示すだけでなく、活性化、ホーミングおよびメモリに関与するマーカーの異なる程度の発現を示した。
【０２７６】
４．２．１．２  ＨＴＳ細胞から生成されたＣＤ８＋細胞によるサイトカイン産生
ＴＨＳ培養物から生成された単独陽性のＣＤ８細胞を、細胞内のＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の産生について分析した。この目的のために、５０ｎｇ／ｍｌのホルボールエステルおよび５００ｎｇ／ｍｌのイオナマイシン（ionamycyne）を用いた通常の培養条件において、Ｔリンパ球の条件におけるＨＴＳ培養物に由来する単独陽性のＣＤ８細胞を刺激した。１時間後に、２００ｎｇ／ｍｌのブレフェルディンＡを加え、１５分間にわたって２０℃の４％のパラホルムアルデヒドにおいて細胞を固定した。３回にわたる洗浄サイクルの後に、細胞を、サポニンを用いて透過化処理し、抗ＩＬ−２−ＰＥ（Pharmingen）、抗ＩＦＮ−γーＦＩＴＣまたは同位体対照を用いて染色した。図１６は、ＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．４およびＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．１２の培養物の単独陽性のＣＤ８細胞における細胞内のＩＬ−２およびＩＦＮ−γの典型的なプロファイルを示している。両方の培養物はＩＬ−２、ＩＦＮ−γまたはその両方を産生している細胞を含んでおり、ＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．１２培養物は、ＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．４培養物が広範囲のＩＦＮ−γ濃度を有しているのに対して、ＩＬ−２について広範囲の産生レベルを有していた。
【０２７７】
４．２．１．３  ＨＴＳ細胞から生成されたＣＤ８＋細胞の細胞傷害性エフェクター機能
細胞内の細胞傷害性の顆粒の産生は、最終分化したＴ細胞を示す主なエフェクター機能である。細胞内の細胞傷害性の顆粒の検出のために、Ｔリンパ球許容性の条件におけるＨＴＳ培養物に由来する単独陽性のＣＤ８細胞を、４％のパラホルムアルデヒドを用いて１５分間にわたって２０℃において固定した。洗浄後に、細胞を、サポニンを用いて透過化処理し、抗パーフォリン−ＰＥ抗体（BD Pharmingen）および抗グランザイムＡ−ＦＩＴＣ抗体、同位体対照を用いて染色した。図１７は、ＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．４およびＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．１２の培養物の単独陽性のＣＤ８細胞における細胞内のパーフォリンおよびグランザイムＡの典型的なプロファイルを示している。両方の内容物は、機能的に分化した細胞傷害性Ｔ細胞を示すパーフォリン、グランザイムＡまたはその両方のいずれかについて陽性の細胞を含んでいた。両方の培養物における単独のＣＤ８陽性細胞の約４０％がそのような表現型を獲得していた。
【０２７８】
４．３．ＨＴＳからＢリンパ球へのＨＴＳ細胞の分化転換
以下のＨＴＳ集団：項目３．１．４に記載のＨＴＳ−ＫＭＷ．１およびＨＴＳ−ＫＭＷ．５；項目３．２．３．１に記載のＨＴＳ−ＫＢＴ；項目３．２．３．３に記載のＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．１およびＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．６；項目３．２．３．５に記載のＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．１およびＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．１３；項目３．３４に記載のＨＴＳ−ＷＴＭ．１およびＨＴＳ−ＷＴＭ．７に由来する細胞、ならびにＫ５６２、ＷＩＬ２ＮＳおよびＭＯＬＴ４の対照培養物を、ヒトの骨髄ストロマ細胞株ＨＳ−５の存在下におけるＢリンパ球の分化に使用した。４ｍＭのＬ−グルタミン、１．５ｇ／Ｌのジカルボン酸ナトリウムおよび１０％（ｖ／ｖ）のＦＣＳを補ったダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において、ＨＳ−５細胞を定法にしたがって維持した。分化実験の１日前または２日前に、ＨＳ−５細胞を、２４ウェルのプレートの、１ｍｌの培養培地の入ったウェルごとに６００００細胞、または平底の９６ウェルプレートの、１００μｌの培養培地の入ったウェルごとに６０００細胞においてに播いた。ＨＳ−５成長培地の除去、ならびに２４ウェルのプレートの、１ｍｌのウェルごとに１０００〜４０００細胞、および９６ウェルプレートの、１００μｌのウェルごとに１００細胞において、選択したＨＴＳ細胞の集団を播くことによって、Ｂリンパ球分化の共培養を開始した。Ｂリンパ球系統を促進する添加剤、特に可溶性の４ｎｇ／ｍｌのＣＤ４０Ｌ（Invitrogen）、１０ｎｇのヒトＩＬ−４（Invitrogen）、５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−５（Invitrogen）、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−６（Invitrogen）、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１０（Invitrogen）、５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２（Invitrogen）、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Invitrogen）、２０ｎｇ／ｍｌのＦｉｔ３リガンド（Invitrogen）、２０ｎｇ／ｍｌの幹細胞由来因子（BD Bioscience）、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−３（Invitrogen）および５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０ｍＡｂのアゴニスト（クローンＨＭ４０−３、BD Bioscience）を、標準的な培養培地に補った。５日目および７日目に、培養培地をＢリンパ球系統を促進する添加剤を補った新たな培地に交換した。ＨＴＳ−ＫＭＷ．１、ＨＴＳ−ＫＭＷ．５、ＨＴＳ−ＫＢＴ、ＨＴＳ−ＷＴＭ．１、ＨＴＳ-ＷＴＭ．７ならびにＫ５６２、ＭＯＬＴ４およびＷＩＬ２ＮＳの対照培養物に由来する吸着しなった細胞を、回収し、マウス抗ヒトＣＤ４−ＦＩＴＣ、マウス抗ヒトＣＤ１９−ＰＥおよびマウス抗ヒトＣＤ１５−ＰｅｒＣＰを用いて染色し、項目１．３．３に記載の通りにフローサイトメトリーによって分析した。図１８は、Ｂリンパ球に分化を誘導された後の、１００％のＣＤ１９＋細胞を有しているＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．６の典型的な染色プロファイルを示している。ＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．１およびＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．６の場合に、抗ヒトＣＤ４−ＦＩＴＣの代わりに抗ヒトＣＤ３−ＦＩＴＣを用いて、吸着しなかった細胞を染色した。ＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．１およびＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．１３の培養物について、マウス抗ヒトＣＤ２０−ＰＥを抗ＣＤ１９−ＰＥの代わりに用いた。
【０２７９】
４．３．１  ＨＴＳ細胞から生成されたＣＤ１９＋細胞の性質決定
Ｂリンパ球のＨＴＳ培養物に由来する単独陽性のＣＤ１９細胞を分取し、Ｂ特異的な転写物および機能的な特性（例えば、免疫グロブリンの分泌およびプラズマ細胞への分化）の存在、Ｂ細胞マーカーについてさらに分析した。
【０２８０】
４．３．１．１  他のＢ細胞マーカー表面発現
Ｂリンパ球に関して促進されたＨＴＳ培養物に由来するＣＤ１９＋細胞を、Ｂ細胞の表面上に限定的に発現されているか、またはＢ細胞の機能にとって重要な以下の分子の発現についてさらに分析した。当該分子は、ＣＤ１ｃ−抗原提示における特殊な役割を有している、β２−ミクログロブリンと会合するＭＨＣクラスＩ様分子；ＣＤ１０−Ｂ細胞の発生に関与している亜鉛金属プロテアーゼ；ＣＤ２０−Ｂ細胞活性化分子；ＣＤ２２−単球およびＴ細胞とのＢ細胞の相互作用を担っている成熟Ｂ細胞上に発現されている接着分子；ＣＤ３８−細胞活性化；ＣＤ４０−アポトーシスからのＢ細胞の開放、およびアイソタイプ転換に関与するＢ細胞の分化および共刺激である；表面ＩｇＭおよびＩｇＧ、である。
【０２８１】
この目的のために、マウス抗ヒトＣＤ１ｃ−ＰＥ抗体、マウス抗ヒトＣＤ１０−ＦＩＴＣ抗体、マウス抗ヒトＣＤ２０−ＰＥ抗体、マウス抗ヒトＣＤ２２−ＦＩＴＣ抗体、マウス抗ヒトＣＤ３８−ＦＩＴＣ抗体、マウス抗ヒトＣＤ４０−ＦＩＴＣ抗体、マウス抗ヒトＩｇＧ−ＰＥ抗体、マウス抗ヒトＩｇＭ−ＰＥ抗体（BD Pharmingen）を用いて、Ｂリンパ球に関して促進されたＨＴＳ培養物に由来するＣＤ１９＋細胞を標識した。本質的に同じ染色手法は、項目１．３．３に記載の通りにしたがった。表５には、異なるＨＴＳ培養物に由来するＢリンパ球の表現型のプロファイルが要約されている。
【０２８２】
【表５】
0005757942.tif 000006
Ｋ５６２、ＷＩＬ２ＮＳおよびＭＯＬＴ４の対照培養物において、新たなマーカー発現、上方制御または下方制御は認められなかった。
【０２８３】
ＣＤ５＋Ｂ細胞に本来的に由来するＨＳＴ−ＫＢＴＡＥの集団を、Ｂリンパ球を促進する環境において培養した場合に、より活性化されたＣＤ２０＋細胞、より成熟したＣＤ２２＋細胞およびより成熟したＣＤ４０＋細胞が検出された。また、ＬＰＳ刺激後にこれらの培養物がＩｇＧ陽性の細胞をより含んでいた（表６）ことを考えると、結果は、機能的なＢ細胞およびプラズマ細胞への、これらの特定の集団の分化能を示している。
【０２８４】
細胞表面上（特にＨＴＳ−ＷＴＭ培養物）におけるＩｇＭ発現の消失と結びついているプレＢ細胞にとってのマーカーである、細胞表面におけるＣＤ１０の出現は、より初期のプレＢ細胞へのＣＤ１９＋細胞の脱分化を強く示唆している。
【０２８５】
４．３．１．２  プラズマ細胞への分化能
１４日目に、３．５ｍｇ／ｍｌのリポ多糖（Sigma）に培養物をさらして、Ｂリンパ球を活性化させ、プラズマ細胞の形成を誘導した。９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート、およびヒトμ鎖およびγ鎖に対する親和性精製された、プラスティックに吸着させたヤギ抗体を用いた標準的なＥＬＩＳＡによって、すべてのＨＴＳ−Ｂリンパ球の培養物について、分泌されたＩｇＭおよびＩｇＧを定量化した。ＨＲＰを結合させたヒツジ抗ヒトＩｇ抗体を用いて、結合した抗体を顕示化した。使用したすべての抗体はSigmaから入手した。ＡＢＴＳを基質として使用し、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。表６には、ＬＰＳばくろ後のＣＤ１９＋細胞の表現型プロファイルが示されており、表７には、７日後および１７日後におけるＢリンパ球培養物において検出されたＩｇＭおよびＩｇＧのレベルが要約されている。
【０２８６】
【表６】
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ＣＤ２２＋細胞の数が、ＣＤ４０＋陽性の細胞およびＩｇＧを有している細胞の増加をもとなって、増加しているので、ＨＴＳ−ＫＢＴ培養物における単独のＣＤ１９＋細胞の数の減少はプラズマ細胞へのさらなる分化の結果と考えられ得る。また、ＷＴＭ培養物におけるより未成熟なＣＤ１０＋プレＢ細胞の数はＣＤ４０＋およびＣＤ２２＋の陽性細胞の増加にともなって減少した。
【０２８７】
ＥＬＩＳＡの結果は、ＩｇＧが始めて検出された場合に、ＬＰＳ刺激した培養物（特にＨＴＳ−ＫＢＴ培養物）における成熟Ｂ細胞からプラズマ細胞へのある程度の発達があることを確かめている。
【０２８８】
【表７】
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【０２８９】
４．４．マクロファージへのＨＴＳ細胞の分化転換
以下の亜集団ＨＴＳ−ＷＴＭ．４に由来しており、項目３．３に記載されているＨＴＳ細胞およびＷＩＬ２ＮＳの対照培養物を新たな培養培地に移し、細胞濃度を１ｍｌにつき１０００００〜２０００００細胞に調整した。５０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−７（Invitrogen）、５０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−６（Invitrogen）、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−３（Invitrogen）、１００ｎｇ／ｍｌのヒトＭ−ＣＳＦ（BD Bioscience）、３０ｎｇ／ｍｌのヒトＧＭ−ＣＳＦ（BD Bioscience）および５０ｎｇ／ｍｌのＦｉｔ３Ｌ（Invitrogen）を細胞培養物に補い、当該細胞培養物を平底の２４ウェルプレートの１ウェルにつき１ｍｌにおいて播いた。３〜４日ごとに、新たな培養培地を培養培地の半分と置き換えることによって、新たな培養培地を継ぎ足した。図１９は８日後におけるＨＴＳ培養物の形態を示しており、ここで、細胞を接着細胞の成長特性について評価した。
【０２９０】
それから、項目１．３．３に記載の通りにマウス抗ヒトＣＤ４抗体、マウス抗ヒトＣＤ１９抗体およびマウス抗ヒトＣＤ１５抗体を用いて、細胞を標識した。図２０は、８日間にわたるマクロファージ許容性の培養の後に、細胞の大部分がＣＤ１５を除いたすべてのマーカーの発現を消失していることを示しており、ここで、約７％の細胞が骨髄単球系統のマーカーについて陽性を維持していた。２％の細胞のみがＣＤ４について陽性であり、ＣＤ１９について陰性であった。対照のＷＩＬ２ＮＳ培養物には何らの変化も認められなかった。
【０２９１】
４．４．１  ＨＴＳ細胞から生成されたマクロファージの性質決定
ＨＴＳ細胞から生成されたマクロファージを、他のマクロファージ系統のマーカーおよび機能的な能力の発現についての分析に供した。
【０２９２】
４．４．１．１  他のマクロファージマーカーの発現
また、ヒトマクロファージを排他的に特徴付ける単一のマーカーがないので、マクロファージ系統の特徴であるＣＤ１１ｂ、ＣＤ８６、ＣＤ６４、ＣＤ１４およびＣＤ１１５の発現について、ＨＴＳ細胞から生成された接着性の細胞をさらに分析した。この目的のために、抗ヒトＣＤ１１ｂ−ＰＥ抗体、抗ヒトＣＤ８６−ＦＩＴＣ抗体、抗ヒトＣＤ６４−ＦＩＴＣ抗体、抗ヒトＣＤ１４−ＰＥ抗体および抗ヒトＣＤ１１５−ＰＥ抗体（BD Pharmingen）を用いて、マクロファージに関して促進されたＨＴＳ培養物を標識した。ＣＤ１１５−ＰＥ抗体を除くすべてのマーカーについての実質的に同じ染色手法は、項目１．３．３の記載にしたがった。Ｍ−ＣＳＦの、その受容体ＣＤ１１５に対する結合は、受容体の内部移行を生じ、したがって表面染色の強度を低減させ得る。したがって、表面および細胞内のＣＤ１１５が評価され得るように、抗ＣＤ１１５−ＰＥを用いた染色の前に、細胞を、固定し、Cytofix/Cytopermキット（BD Biosciences）を用いて透過化処理した。マクロファージ許容性の培地においてから８日後に細胞表面上におけるマクロファージ様因子の発現について、５つの別の培養物を分析した。図２１には、ＨＴＳ細胞上におけるマクロファージ様ＣＤマーカーの分布（平均±標準偏差）が要約されており、ここで、約９６％の細胞がＣＤ１１ｂについて陽性であり、９５％の細胞がＣＤ６４について陽性であり、６１％の細胞がＣＤ８６について陽性であり、５６％の細胞がＣＤ１４について陽性であり、４２％の細胞がＣＤ１１５について陽性であった。これらのマーカーのいくつかが顆粒球および樹状細胞（ＤＣ）上において種々のレベルとして発現され得ることを考えて、ヒトのＣＤ１ａ、ＣＤ８３、ＣＤ１５およびＣＤ３についてのついての付加的な染色を、項目１．３．３に記載の手法を用いて実施した。染色は、わずかに認められた（ＣＤ１５）か、認められなかった。これらの結果は、マクロファージ許容性の培地に移されると、ＨＴＳ細胞がマクロファージの機能（例えば、吸着（ＣＤ１１ｂ）、増殖（Ｍ−ＣＳＦにとっての受容体であるＣＤ１１５）、食作用（ＣＤ８６）および免疫食作用（ＩｇＧにとっての受容体であるＣＤ６４））にとって決定的な表面分子を獲得することを示している。
【０２９３】
４．４．１．２  ＨＴＳ細胞から生成されたマクロファージの機能的な性質決定
機能的な特性を評価するために、ＨＴＳにおいて生成されたマクロファージを、食作用能および一酸化窒素（ＮＯ）の生成についてさらに分析した。
【０２９４】
蛍光微粒子（分子プローブ）を捕食する能力によるフローサイトメトリーによって、食作用能を評価した。マクロファージ許容性の培地において８日後に、５μｇ／ｍｌのＬＰＳ（Sigma）および蛍光フィコエリトリン（ＰＥ）標識を有しているカルボキシル化した４０ｎｍおよび１００ｎｍのポリスチレン微粒子とともに、２４ウェルプレートにおいて１ｍｌにつき１００００００細胞として、１８時間にわたってＨＴＳ細胞をインキュベートした。細胞を、回収し、氷冷した２％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ／ＰＢＳにおけるＣＤ６４に対する抗ヒトのＦＩＴＣを結合した抗体とともに４５分間にわたって、氷上においてインキュベートし、２回にわたって洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。図２２は、マクロファージに関して促進されたＨＴＳ細胞における食作用活性の典型的なプロファイルを示している。約９４％の細胞が小さなビーズおよび大きなビーズに対する食作用活性を示した。
【０２９５】
１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ、１００Ｕ／ｍｌのヒトインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、またはその両方とともに、２００μｌの総量におけるウェルにつき２０００００細胞に播いた平底の９６ウェルプレートにおいて、マクロファージに関して促進されたＨＴＳ細胞を培養することによって、ＮＯの生成を評価した。一昼夜の刺激の後に、５０μｌのGriess試薬（１％のスルファニルアミド、０．１％のナフチレンジアミン２塩酸塩、２．５％のＨ３ＰＯ４）とともに、５分間にわたって室温において５０μｌの無細胞の上清をインキュベートし、５５０ｎｍにおける吸光度をマクロプレートリーダにおいて選択した。硝酸ナトリウムの標準曲線の直線回帰からＮＯの濃度を決定した。図２３に示されるように、マクロファージ許容性の培地にさらされた後のＨＳＴ細胞は、ＬＰＳおよびＩＦＮを用いた刺激に応じて一酸化炭素を生成した。
【０２９６】
＜実施例５＞
５．成熟した表現型の細胞とのハイブリダイゼーションによる異なる細胞表現型へのＨＴＳ細胞の分化転換
ＨＴＳの汎用性および利用される機序に対する非感受性をさらに証明するために、ＨＴＳ細胞を、成熟エフェクターＴ細胞または成熟エフェクターＢ細胞とハイブリダイズした。また、異なる表現型の細胞を分化転換させるために、同じ方法が使用され得る。
【０２９７】
５．１  初代培養されたＣＤ５４＋Ｔ細胞とのハイブリダイゼーションによるＣＤ４陽性Ｔ細胞へのＨＴＳ細胞の分化転換
ＨＴＳ亜集団に由来するＢ細胞を、電気的な細胞ハイブリダイゼーションを介したＣＤ５４＋Ｔ細胞への分化転換に使用した。詳細には、項目３．１．４に記載のＨＴＳ−ＫＭＷ．５（単独のＣＤ１９＋細胞）、項目３．２．３．３に記載のＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．６（単独のＣＤ１９＋細胞）、および項目３．２．３．５に記載のＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．１３（ＣＤ２０＋ＣＤ７２＋細胞）に由来する細胞を、この特定の実施例における分化転換に使用した。項目１．３．８に記載の通りに単離した、初代培養されたヒトＣＤ５４陽性Ｔ細胞を、ＣＤ５４＋Ｔ細胞の供給源として使用した。ハイブリダイゼーション手法は対応するＨＴＳの作製のために使用された手法（項目３．１．２を参照）と本質的に同じであった。生じた混成体が安定した後に、それらを、標準的な培養条件の下に細胞株として維持し（項目１．１を参照）、項目１．３．３に記載の手法にしたがって表面マーカー発現について分析した。すべてのＢ細胞の亜集団は、それらのＣＤ１９＋を消失して分化転換し、図２４Ａにおける代表的な例による証拠としてＣＤ３＋になった。それらをＣＤ５４発現についてさらに分析した。簡単に説明すると、項目１．３．８（ＣＤ５４＋Ｔ細胞の単離）に記載と同じ手法にしたがって、マウス抗ヒトＣＤ５４−ＦＩＴＣ抗体およびマウス抗ヒトＣＤ３−ＰＥ抗体を用いて、１００μｌの分取物につき１×１０５細胞を標識した。ＣＤ５４について陽性の細胞の数は図２４（Ｂ）に示されているように４２〜８５％の範囲であった。
【０２９８】
５．２  初代培養されたＩｇ分泌Ｂ細胞とのハイブリダイゼーションによるＣＤ陽性Ｂ細胞へのＨＴＳ細胞の分化転換
以下のＨＴＳ亜集団に由来するＴ細胞を免疫グロブリン（Ｉｇ）分泌細胞への分化転換に使用した。この目的のために、項目３．１．４に記載のＨＴＳ−ＫＭＷ．６（単独のＣＤ４＋集団）、項目３．２．３．３に記載のＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．４（単独のＣＤ３＋集団）、項目３．２．３．５に記載のＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．４（ＣＤ４＋ＣＤ８＋集団）を使用した。項目１．４に記載の通りに単離した、ＣＤ４０活性化の初代培養されたＩｇＭ陽性Ｂ細胞またはＩｇＧ陽性Ｂ細胞を、初代培養された分泌Ｂ細胞の供給源として使用した。電気的な細胞ハイブリダイゼーション手法は、項目３．１．２に記載されているような対応するＨＴＳの作製に使用した手法と本質的に同じであった。生じた混成体が安定した後に、それらを、維持し、ＣＤ１９、ＣＤ４０および表面Ｉｇについて分析した。すべてのＨＴＳ亜集団はそれらのＴ細胞マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８）を消失して分化転換し、ＣＤ１９、ＣＤ４０およびｓＩｇの陽性細胞になった。図２５は、ＣＤ３発現の消失および表面ＩｇＭの獲得を示しているＣＤ４０活性化のＩｇＭ陽性Ｂ細胞とのハイブリダイゼーションの後における分化転換したＣＤ３＋ＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．４細胞の代表的な例を示している。
【０２９９】
Ｂ細胞に分化転換したＴ細胞培養物の上清を、ＩｇＭまたはＩｇＧの存在について、上述のＥＬＩＳＡ（項目１．４を参照）によって分析した。細胞を、ウェルにつき１×１０５細胞において丸底の９６ウェルプレートに播き、標準的な培養条件の下に２４時間にわたって培養した。結果は表８にまとめられている。各値は３つの独立した測定の平均値±標準偏差として示されている。
【０３００】
【表８】
0005757942.tif 000009
【０３０１】
＜実施例６＞
６．環境条件の変化へのばくろを介した、ＨＴＳ細胞に由来する成熟Ｂリンパ球の脱分化
項目４．３．１．１に記載されている通りにＢリンパ球を促進する環境において培養され、ＨＴＳ−ＷＴＭ．１およびＨＴＳ−ＷＴＭ．７に由来するＣＤ１９＋細胞は、他のＢリンパ球マーカーの発現について調べたとき、低い程度に成熟したＢ細胞種への脱分化の徴候（特にＣＤ１０発現の上方制御および表面ＩｇＧ発現の下方制御）を示した（項目４．３．１．１）。これらの培養物において惹起された脱分化過程を確認するために、項目７．１に記載の造血性の幹細胞を促進する環境に細胞を置き、そのような培養の５日後に、初期の他のＢ細胞マーカー（例えば、Ｐａｘ−５、λ様およびＣＤ３４）の転写物の存在について確認した。
【０３０２】
簡単に説明すると、ＲＮｅａｓｙキット（RNeasy Mini kit、Qiagen）を用いて培養した細胞から総ＲＮＡを調製した。ｃＤＮＡキット（Amersham Pharmacia）を用いて製造者の手順にしたがってｃＤＮＡ合成を実施し、本質的にSewing et alによって説明されている通りにＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応混合物っをアガロースゲル（２％）電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。オリゴヌクレオチドのプライマー対は以下の配列を有していた：
ヒトβ２ミクログロブリン：センス、
５４℃における5’ACCCCCACTGAAAAAGATGA3’（配列番号１）、およびアンチセンス、5’ATCTTCAAACCTCCATGATG3’（配列番号２）；ＣＤ３４：６４℃におけるセンス、5’CTCTTCTGTCCAGTCACAGACC3’（配列番号３）、およびアンチセンス、5’GAATAGCTCTGGTGGCTTGCAA3’（配列番号４）；ＣＤ１０：６５℃におけるセンス、5’CTGTGACAATGATCGCACTCTATG3’（配列番号５）、およびアンチセンス、5’GATTCCAGTGCATTCATAGTAATCTC3’（配列番号６）；λ様：６７℃におけるセンス、5’ATGCATGCGGCCGCGGCATGTGTTTGGCAGC3’（配列番号７）、およびアンチセンス、5’ATCCGCGGCCGCATCGATAGGTCACCGTCAAGATT3’（配列番号８）；Ｐａｘ−５：６４℃におけるセンス、5’AGCAGGACAGGACATGGAGGA3’（配列番号９）、およびアンチセンス5’ATCCTGTTGATGGAACTGACGC3’（配列番号１０）；ＣＤ１９：６７℃におけるセンス、5’TCACCGTGGCAACCTGACCATG3’（配列番号１１）、およびアンチセンス5’GAGACAGCACGTTCCCGTTACTG3’（配列番号１２）；ＶＨコンセンサス−Ｃμ：６０℃におけるセンス、5’GACACGGCCGTGTATTACTG3’（配列番号１３）、およびアンチセンス、5’ATCCGCGGCCGCGGAATTCTCACACAGGAGAC-GA3’（配列番号１４）；Ｖｋコンセンサス、：６７℃におけるセンス、5*ATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTG3*（配列番号１５）、およびアンチセンス5’ATGCGGCCGCGGGAAGATGAAGACAGATG3’（配列番号１６）。
【０３０３】
図２６は、ＨＴＳ−ＷＴＭ培養物が初期のＢ細胞の発達のための転写物（例えばＰａｘ−５およびλ様）の発現を、当該転写物を含んでいないＨＴＳ−ＷＴＭ．１培養物と比べたとき、実際に示したことを示している。さらに、ＣＤ３４がまた、ＨＴＳ−ＷＴＭ．７培養物において転写されている。この結果は、環境条件の変化に応じた、初期段階のＢ細胞への成熟ＣＤ１９＋細胞の脱分化を強く示唆している。
【０３０４】
＜実施例７＞
７．体細胞ハイブリダイゼーションを介した、ＨＴＳ細胞に由来する異なる表現型の成熟細胞の脱分化
ＨＴＳのさらなる可塑性を証明するために、種々のＨＴＳ培養物に由来する、表現型について区別される亜集団を、初期の造血性幹細胞との体細胞ハイブリダイゼーションを介した脱分化に供した。ＣＤ３４＋の骨髄幹細胞を項目１．２．２に記載のように選択した。体細胞ハイブリダイゼーションのための実質的に同じ手順を、項目３．１．２に記載のように利用した。
【０３０５】
７．１  ＨＴＳ細胞から分化転換したＢ細胞の脱分化
Ｂリンパ球を促進する環境において成長させたＫＢＴＡＥ．６およびＫＭＷ．５の培養物に由来するＢ細胞を、この特定の例に使用した。両方の培養物におけるすべての細胞の１００％がＣＤ１９＋陽性であるような純度について、培養物を選択した。Ｂリンパ球促進環境にさらした後のこれらの培養物のマーカー発現プロファイルは、表５にまとめられている（項目４．３．１．１を参照）。ＫＭＷ．５はＨＴＳの生成に使用された３つの細胞のすべてが不死化の表現型を有していた場合を代表しており、ＫＢＴＡＥ．６は、不死化の骨髄性の前駆細胞、初代培養されたＢリンパ球および初代培養されたＴリンパ球に由来していた。骨髄に由来するＣＤ３４＋幹細胞とのハイブリダイゼーションの後に、２０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−６、３００ｎｇ／ｍｌのヒトＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌのヒトｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド（ｈＦＴ３Ｌ）、２０ｎｇ／ｍｌのヒトトロンボポエチン（ｈＴＰＯ）、および６０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−３を補った標準的な培養培地において、ＨＴＳ培養物を成長させた。培養の１ヶ月間後に、ＣＤ３４およびＣＤ１３０、ならびに項目４．３．１．１に記載のＢリンパ球関連マーカーの発現について、細胞の集団を分析した。骨髄からのＣＤ３４＋細胞の単離について記載されている通りの同じ方法を利用して（項目１．２参照）、項目１．２．２に記載の同じマウス抗体ならびにマウス抗ヒトＣＤ３４−ＰＥおよびマウス抗ヒトＣＤ１３０−ＦＩＴＣを用いて、細胞を標識した。表９には、脱分化開始後における細胞のＣＤプロファイルがまとめられている。
【０３０６】
【表９】
0005757942.tif 000010
【０３０７】
７．２  ＨＴＳ細胞から分化転換したＣＤ４＋Ｔ細胞の脱分化
Ｔリンパ球を促進する環境において成長させたＫＭＷ．６の培養物に由来するＣＤ４＋細胞を、この特定の例に使用した。培養物におけるすべての細胞の１００％がＣＤ４＋陽性であるような純度について、培養物を選択した。Ｔリンパ球を促進する環境にさらした後のこれらのＨＴＳ培養物のマーカー発現プロファイルは表２にまとめられている（項目４．１．１．１参照）。骨髄に由来するＣＤ３４＋幹細胞とのハイブリダイゼーションの後に、造血幹細胞（ＨＳＣ）の成長を促進する種々のサイトカインを補った標準的な培養培地において、ＨＴＳ培養物を成長させた（項目７．１参照）。ＨＳＣ環境における１ヶ月間の後に、ＣＤ３４およびＣＤ１３０、ならびに項目４．１．１．１に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞関連マーカーの発現について、細胞を分析した。以下の表１０には、脱分化したＣＤ４＋細胞の表面上におけるＣＤ発現のプロファイルが示されている。
【０３０８】
【表１０】
0005757942.tif 000011
【０３０９】
７．３  ＨＴＳ細胞から分化転換したＣＤ８＋Ｔ細胞の脱分化
細胞の大部分は、それらのＣＤ４およびＴＣＲの発現を消失し、ＣＤ２５の発現について上方制御を受け、ＣＤ３４の発現を獲得していた。
【０３１０】
Ｔリンパ球を促進する環境において成長させたＫＢＴＤＰ．１２の培養物に由来するＣＤ８＋細胞を、この特定の例に使用した。培養物におけるすべての細胞の１００％がＣＤ８＋陽性であるような純度について、培養物を選択した。Ｔリンパ球を促進する環境にさらした後のこれらのＨＴＳ培養物のマーカー発現が、表４にまとめられている（項目４．２．１．１参照）。骨髄に由来するＣＤ３４＋幹細胞とのハイブリダイゼーションの後に、造血幹細胞（ＨＳＣ）の成長を促進する種々のサイトカインを補った標準的な培養培地において、細胞を成長させた（項目７．１参照）。ＨＳＣ環境における１ヵ月間の後に、ＣＤ３４およびＣＤ１３０、ならびに項目４．２．１．１に記載のＣＤ８＋細胞関連マーカーについて、細胞を分析した。以下の表１１には、脱分化したＣＤ８＋細胞の表面上におけるＣＤ発現のプロファイルがまとめられている。
【０３１１】
【表１１】
0005757942.tif 000012
ほとんどすべての細胞がそれらのＣＤ８およびＴＣＲの発現を消失し、ＣＤ３４の発現を獲得していた。
【０３１２】
特定の例を参照して本発明について説明しているが、本明細書に記載の本発明の広範な原理および精神にしたがって、本発明は多くの他の形態として具体化され得ることが、当業者によって適切に理解されるであろう。
【０３１３】
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【図面の簡単な説明】
【０３１４】
【図１】同定し、分取−精製したＣＤ７１＋Ｋ５６２細胞を示す図である。
【図２】ＣＤ１５陽性およびＣＤ７１陽性のＫ５６２細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す図である。
【図３】培養物における４８時間後の、ＣＤ３４＋について濃縮されたＡＭＬの単球細胞からの、ＣＤ３４陽性、およびＣＤ３４＋およびＣＤ３４＋ＣＤ１５＋の細胞の分取を示す図である。
【図４】マウス抗ヒトＣＤ１９抗体およびマウス抗ヒトＣＤ５抗体を用いて染色した臍帯血の単球細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す図である。
【図５】マウス抗ヒトＣＤ３抗体およびマウス抗ヒトＣＤ５抗体を用いて染色した臍帯血の単球細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す図である。
【図６】マウス抗ヒトＣＤ２０抗体およびマウス抗ヒトＣＤ７２抗体を用いて染色した臍帯血の単球細胞のＦＡＣＳプロファイルを示す図である。
【図７】ＣＤ３およびＣＤ５４について染色した扁桃腺の単球細胞の典型的なＦＡＣＳプロファイルを示す図である。
【図８】ＩｇＭおよびＩｇＧ陽性の培養リンパ球の存在を示す図である。
【図９】ＨＴＳ−ＫＭＷ細胞についてのＣＤ発現のＦＡＣＳプロファイル、および異なる表現型の細胞集団についての分取領域を示す図である。
【図１０】初代培養された混合した脾臓のリンパ球上におけるＣＤ４およびＣＤ１９の発現、分取したＣＤ４およびＣＤ１９の集団、ならびに生じたＨＴＳ−ＫＢＴ細胞株を示す図である。
【図１１】不死化した１つの骨髄性細胞、および抗原を経験した、初代培養された２つのリンパ球に由来するＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ上におけるＣＤ１９、ＣＤ３およびＣＤ５の発現を示す図である。
【図１２】不死化した１つの骨髄性細胞、および骨髄および胸腺に由来する初代培養された２つのリンパ球に由来するＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ細胞上におけるＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ７２およびＣＤ２０の表面発現を示す図である。
【図１３】骨髄単球性の前駆細胞に由来するＨＴＳ−ＷＴＭ細胞の表面上におけるＣＤ発現を示す図である。
【図１４】ＣＤ４表現型を促進する環境における８日後の、ＨＴＳ−ＫＭＷ．６、ＨＴＳ−ＷＴＭ．６およびＨＴＳ−．１２の培養物におけるＣＤ４、ＣＤ１９およびＣＤ１５の代表的な染色プロファイルを示す図である。
【図１５】ＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．１２培養物におけるＣＤ８、ＣＤ１９およびＣＤ１５についての代表的な染色プロファイルを示す図である。
【図１６】ＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．４培養物およびＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．１２培養物のうちＣＤ８のみが陽性の細胞における、ヒトＩＬ−２およびヒトＩＦＮ−γの細胞内産生を示す図である。
【図１７】ＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．４培養物およびＨＴＳ−ＫＢＴＤＰ．１２培養物のうちＣＤ８のみが陽性の細胞における、細胞内のパーフォリンおよびグランザイムＡの典型的なプロファイルを示す図である。
【図１８】Ｂリンパ球を促進する環境における７日後の、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ１５抗体を用いたＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．６培養物の典型的な染色を示す図である。
【図１９】マクロファージを許容する成長培地における８日後のＨＴＳ培養物から生成された細胞の付着性の形態を示す図である。
【図２０】マクロファージを許容する成長培地における８日後のＨＴＳ−ＷＴＭ．４細胞上におけるＣＤ１９、ＣＤ１５およびＣＤ４発現のプロファイルを示す図である。
【図２１】マクロファージを許容する成長培地における８時間後のＨＴＳ−ＷＴＭ．４細胞の表面におけるマクロファージ様マーカーの発現を示す図である。
【図２２】マクロファージを許容する成長培地における８時間後のＨＴＳ−ＷＴＭ．４培養物に由来するＣＤ６４陽性のマクロファージによる１０００ｎｍの微粒子の食作用を示す図である。
【図２３】マクロファージを許容する成長培地における８時間後のＬＰＳ刺激したＨＴＳ−ＷＴＭ．４細胞による一酸化窒素の生成を示す図である。
【図２４】初代培養されたＣＤ５４＋のヒトＴ細胞を用いた体細胞ハイブリダイゼーションによってＴ細胞に分化転換されたＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．６に由来するＣＤ１９＋Ｂリンパ球によるＣＤ３およびＣＤ５４発現の典型的なプロファイルを示す図である。
【図２５】ＣＤ３発現の消失および表面ＩｇＧの獲得を示している、ＣＤ４０活性化のＩｇＭ陽性のＢ細胞を用いた体細胞ハイブリダイゼーション後のＣＤ３＋ＨＴＳ−ＫＢＴＡＥ．４細胞の分化転換の代表的なプロファイルを示す図である。
【図２６】ＨＴＳ−ＷＴＭ培養物１および７における初期Ｂ細胞の発生マーカーについてのＲＴ−ＰＣＲ転写物を示す図である。
【図２７】単一細胞の操作／供給系を示す図である。
【図２８】ガラスのマイクロピペットを示す図である。
【図２９】微小電極を示す図である。
【図３０】平行な２つの微小電極を示す図である。
【図３１】組織培養プレートのウェルにおける２つの微小電極を示す図である。
【図３２】２つの微小電極の中間にある３つの細胞の上面図である。
【図３３】図３２の側面図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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