(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の少なくとも１つのターゲット核酸を相対定量する方法であって、
（ａ）前記サンプルに含まれる少なくとも１つのターゲット核酸の各々を増幅し、並行して、前記少なくとも１つのターゲット核酸の各々の増幅と相関する信号を取得するステップと、
（ｂ）比較用の核酸の少なくとも１つのサンプルの各々を増幅し、並行して、前記少なくとも１つの比較用の核酸の各々の増幅と相関する信号を取得するステップと、
（ｃ）記録された前記信号からバックグラウンド項が減算されることで、前記取得された信号を、バックグラウンド信号に関して補正するステップと、
（ｄ）ターゲット及び比較用の核酸の各増幅サイクルごとに、サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）を計算するステップであって、サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾が、
0005810078.tif 000005
を用いて計算される、ステップと、
（ｅ）ターゲット及び比較用の核酸について、前記サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）のランダム性の尺度Ｍを計算するステップであって、計算される前記ランダム性の尺度がスペクトルエントロピーであり、前記サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）が配列：
0005810078.tif 000006
として定義され、２Ｌ＋１は、サイクルＣを中心とする前記配列におけるＥ＾の数である、ステップと、
（ｆ）ターゲット及び比較用の核酸について、Ｍがその最小値を持つサイクル数ＣＭを識別するステップと、
（ｇ）前記ランダム性の尺度の計算に使用されたウィンドウの幅を補正するために、ＣＣ＝ＣＭ−Ｌの関係を用いて、ＣＭの値から、特性サイクル数ＣＣを計算するステップと、
（ｈ）ターゲット及び比較用サンプルのＣＣを比較することによって、前記比較用の核酸に対する、前記サンプル中の前記少なくとも１つのターゲット核酸の各々の相対量を求めるステップと、
を含む方法。
【請求項２】
サンプル中の少なくとも１つのターゲット核酸を絶対定量する方法であって、
（ａ）前記サンプルに含まれる前記少なくとも１つのターゲット核酸の各々を増幅するステップと、並行して、前記少なくとも１つのターゲット核酸の各々の増幅と相関する信号を取得するステップと、
（ｂ）既知濃度を有する核酸標準の希釈系列のサンプルを増幅し、並行して、前記標準サンプルの核酸の増幅と相関する信号を取得するステップと、
（ｃ）記録された前記信号からバックグラウンド項が減算されることで、前記取得された信号を、バックグラウンド信号に関して補正するステップと、
（ｄ）ターゲット及び標準サンプルの各増幅サイクルごとに、サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）を計算するステップであって、サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾が、
0005810078.tif 000007
を用いて計算される、ステップと、
（ｅ）ターゲット及び標準サンプルについて、前記サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）のランダム性の尺度Ｍを計算するステップであって、計算される前記ランダム性の尺度がスペクトルエントロピーであり、前記サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）が配列：
0005810078.tif 000008
として定義され、２Ｌ＋１は、サイクルＣを中心とする前記配列におけるＥ＾の数である、ステップと、
（ｆ）ターゲット及び標準サンプルについて、Ｍがその最小値を持つサイクル数ＣＭを識別するステップと、
（ｇ）前記ランダム性の尺度の計算に使用されたウィンドウの幅を補正するために、ＣＣ＝ＣＭ−Ｌの関係を用いて、ＣＭの値から、特性サイクル数ＣＣを計算するステップと、
（ｈ）ターゲット及び標準サンプルのＣＣを比較することによって、前記サンプル中の少なくとも１つのターゲット核酸の各々の初期量を求めるステップと、
を含む方法。
【請求項３】
サンプル中の少なくとも１つのターゲット核酸のＣｔ値を算出する方法であって、
（ａ）前記サンプル中に含まれる少なくとも１つのターゲット核酸の各々を増幅するステップと、
（ｂ）並行して、前記少なくとも１つのターゲット核酸の各々の増幅と相関する信号を取得するステップと、
（ｃ）記録された前記信号からバックグラウンド項が減算されることで、前記取得された信号を、バックグラウンド信号に関して補正するステップと、
（ｄ）各ターゲット核酸の各増幅サイクルごとに、サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）を計算するステップであって、サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾が、
0005810078.tif 000009
を用いて計算される、ステップと、
（ｅ）前記ターゲット核酸の各々について、前記サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）のランダム性の尺度Ｍを計算するステップであって、計算される前記ランダム性の尺度がスペクトルエントロピーであり、前記サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）が配列：
0005810078.tif 000010
として定義され、２Ｌ＋１は、サイクルＣを中心とする前記配列におけるＥ＾の数である、ステップと、
（ｆ）前記ターゲット核酸の各々について、Ｍがその最小値を持つサイクル数ＣＭを識別するステップと、
（ｇ）前記ランダム性の尺度の計算に使用されたウィンドウの幅を補正するために、ＣＣ＝ＣＭ−Ｌの関係を用いて、ＣＭの値から、特性サイクル数ＣＣを計算するステップと、
（ｈ）ＣＣ値をＣｔ値として採用することによってＣＣ値からＣｔ値を計算するステップと、
を含む方法。
【請求項４】
ターゲット核酸の各々についてＭがその最小値を持つサイクル数ＣＭを識別する前記ステップが、
ターゲット及び比較用の核酸について、Ｍが最小に達する最初のサイクル数ＣＭを識別するステップ、
と置き換えられる、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記取得された信号が蛍光信号である、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
核酸増幅が、蛍光標識化されたハイブリダイゼーションプローブ、FRETハイブリダイゼーションプローブ、分子ビーコン、スコーピオンプライマ、Luxプライマ、TaqManプローブ、ＤＮＡ結合染料の少なくとも１つを用いて検出される、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプル中の２以上のターゲット核酸が同時に解析される、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記サンプル中の１つのターゲット核酸が同時に解析される、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
すべてのステップは、人間の対話なしに、完全に自動的に実施される、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法における前記ステップ（ｃ）乃至（ｈ）を実施するための命令を記憶した機械可読媒体。
【請求項１１】
請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法を実施するための情報を含む機械可読メモリ手段を有する核酸サンプルの解析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸定量の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸定量は、分子生物学及び遺伝子調査から診断法及び病原体検出にまで及ぶ多くの分野において重要である。充分な量の核酸が存在する場合、ブロット(blot)技法が定量化のために適用されることができる。しかしながら、これらの技法の制限された感度は、複数のケースにおいてそれらの使用を妨げる。
【０００３】
非常により高い感度が必要とされる場合、ここ最近開発された定量ＰＣＲ方法が、解析ツールを提供する。これらの技法は、ＰＣＲ増幅の間、産物の量が指数関数的に増大するという事実に基づいており、こうして、比較的少ないサイクル数の後に得られる産物の量が、通常の手段（例えば蛍光検出）によって検出されることができる。更に、原則的に、初期に、すなわち増幅の開始時に、存在していた産物の量は、増幅サイクルの数が分かっている場合、増幅終了時に得られる産物の量から求められることができる。
【０００４】
短く述べると、実際に、ターゲット核酸並びに標準及び／又は比較用の核酸が、規定される反応条件下でＰＣＲを受け、ＰＣＲ産物の形成が、増幅プロセスの過程を通じて監視される。ＰＣＲ産物の検出は、例えばターゲットに結合される際に特定の信号を発する蛍光標識化されたハイブリダイゼーションプローブによって、又は二本鎖産物を検出することを可能にするＤＮＡインターカレート蛍光染料によって、達成される。Ｃｔ値として示される特定の蛍光閾値レベルを得るために必要である増幅サイクルの数が、決定され、ターゲット核酸のＣｔ値が、既知濃度をもつ核酸標準の希釈系列のサンプルのＣｔ値と比較される（絶対定量）。ターゲットの絶対量を求めるために、標準曲線が、標準サンプルのＣｔ値から構築され、ターゲットの初期濃度を求めるために使用される。代替として、ターゲットのＣｔ値が、関心のある単一の比較用核酸のＣｔ値と比較される（相対定量）。この場合、ターゲット及び比較用サンプルのＣｔ値の比率が求められ、ターゲット及び比較用の核酸の初期量の比率を算定するために使用される。残念なことに、これらのアプローチの実際の応用は、多くの問題によって難しくなっている。その幾つかについて以下に記述する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
定量ＰＣＲの分野における課題は、短い時間間隔に多数のサンプルを解析するための成長しつつあるニーズに関連する。ますます範囲が広がりつつある定量ＰＣＲのアプリケーションは、例えば臨床業務において、高スループットで非常に多くのサンプルを解析することを要求するので、完全に自動化されることが可能であって、人間の対話をほとんど又は全く必要としない定量ＰＣＲ方法を開発することが必要とされる。これは、幾つかのケースで決定的に重要である。その理由は、人間の対話が要求される場合、（例えば臨床業務における）高スループットのアプリケーションが、要求される短い時間期間内に簡素に実施されることができないからである。
【０００６】
このような自動化された方法によって実現されることができる付加の利点は、定量ＰＣＲの大きく異なるラボラトリプロトコルを現在用いている、それぞれ異なるラボラトリ間での解析データの改善された比較可能性である。上述の問題は、増大する数のラボラトリが基本的なリサーチのために定量ＰＣＲ技法を使用するという観点で、極めて重要である。自動化された方法を、定量実験の目標参照として確立することは、これらのリサーチ努力から非常に大きな利益を得る。
【０００７】
増幅反応の過程を通じて形成されるＰＣＲ産物の典型的なプロットは、増幅プロセスの４つの異なるフェーズを表わす（図１を参照）：（１）蛍光信号がバックグラウンド蛍光及びノイズによって支配される定常期(ground phase)；（２）ＰＣＲ産物からの信号が定常レベルよりも高くなり、指数関数的に増大する対数増殖期(exponential phase)；（３）信号がＰＣＲ試薬の消費及び検出プローブの劣化のようなファクタによって引き起こされる減少する増幅効率のため、指数関数的レートより小さく増大する対数直線期(log-linear phase)；（４）高まる減速及び増幅反応の最終的なストップのため、信号の重要でない上昇を伴うプラトー期(plateau phase)。
【０００８】
見かけは単純明快な概念にもかかわらず、Ｃｔ値を求めるために適切な信号閾値レベルを選択することは、簡単な作業でない。図１のプロットから分かるように、高い閾値レベルを選択することは、増幅反応の対数直線期又はプラトー期のＣｔ値をもたらしうる。これは、反応が、この領域の指数的成長から減速して、核酸の初期量及び現在量の間の相関付けを隠すので、望ましくない。他方、低い閾値レベルを選択することは、増幅反応の定常期に位置するＣｔ値を与えることができるが、そのフェーズでは、ノイズ及びバックグラウンド信号が、測定を難しくしうる。従って、明確に、指数的成長を伴うサイクルに対応するＣｔ値、すなわち対数増殖期のＣｔ値をもたらす閾値レベルを選択することが望ましい。
【０００９】
多くのアプローチが、この目標を達成するために開発されている（例えばJD Durtschi他、Analytical biochemistry 2007 (361) 55-64参照）。基本的な閾値アプローチは、実験者が増幅曲線を見て、自分自身の判断を使って、対数増殖期と交わる適切な信号閾値を選択することを必要とする。信号の絶対レベルは、核酸の長さ及び使用される検出の手段を含む複数のファクタに依存するので、この方法に関する閾値レベルは、各アプリケーションについてチェックされなければならず、必要に応じて調整されなければならない。同様に、fit-point法では、実験者は、自分自身の判断によって適切な閾値レベルを選択しなければならない。しかしながら、記録された信号が閾値と交わるサイクル数にＣｔを割り当てる代わりに、線形回帰（linear fit）が、曲線の対数部分の片対数プロットに合わせてモデル化され、この直線が閾値を超えるサイクルが、Ｃｔとして指定される。別の概念は、二次導関数最大法と呼ばれるものであり、その場合、増幅曲線の二次導関数の最大値が数値的に求められる。対応するサイクルが、対数増殖期の終わりを表すとみなされ、対数増殖期の終わりでは、反応は、減速し始めて直線的成長にうつる。このサイクル数は、ターゲットの量を決定するために、Ｃｔと同様に使用される。基本的な閾値及びfit-point法と対照的に、この方法は、閾値レベルが実験者によって設定される必要がないので、最小限の人間の対話を必要とし又は人間の対話を必要としない。更に別のアプローチは、シグモイドカーブフィッティング方法と呼ばれるものであり、シグモイド関数は、増幅曲線に合わせてモデル化される。曲線の変曲点に対応するサイクル数は、モデルから得られることができ、ターゲットの量を算出するために、Ｃｔと同様に使用される。この方法は、ここでも同様に、最小限の人間の対話を必要とし又は人間の対話を全く必要としない。二次導関数最大法及びシグモイドカーブフィッティング方法は、原則的に、完全な自動化に適しているようにみえる。しかしながら本来、基本的な閾値法及びfit-point法は、人間の対話を必要とするので、自動化に適していない。しかしながら、二次導関数最大法及びシグモイドカーブフィッティング方法は、高い感度を要求するアプリケーションにとって制限された有用性をもつことが分かった（JD Durtschi他、Analytical biochemistry 2007 (361) 55-64）。
【００１０】
従って、本発明の目的は、高い感度による核酸の十分に自動化された定量に適した方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
従って、上述の目的は、本発明に従って、サンプル中の少なくとも１つのターゲット核酸を相対定量する方法であって、
（ａ）サンプル中に含まれる少なくとも１つのターゲット核酸の各々を増幅し、並行して、少なくとも１つのターゲット核酸の各々の増幅に相関する信号を取得するステップと、
（ｂ）比較用の核酸の少なくとも１つのサンプルの各々を増幅し、並行して、少なくとも１つの比較用の核酸の各々の増幅に相関する信号を取得するステップと、
（ｃ）前記取得された信号を、バックグラウンド信号に関して補正するステップと、
（ｄ）ターゲット及び比較用の核酸の増幅サイクルごとに、サイクルツーサイクル(cycle-to-cycle)の増幅効率Ｅ＾（Ｃ）を計算するステップと、
（ｅ）ターゲット及び比較用の核酸について、サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）のランダム性の尺度Ｍを計算するステップと、
（ｆ）ターゲット及び比較用の核酸について、Ｍが最小であるサイクル数（サイクル回数）ＣＭを識別するステップと、
（ｇ）ＣＭの値から、特徴的なサイクル数ＣＣを計算するステップと、
（ｈ）ターゲット及び比較用サンプルのＣＣを比較することによって、比較用の核酸に対する、サンプル中の少なくとも１つのターゲット核酸の各々の相対量を求めるステップと、
を含む方法によって達成される。
【００１２】
代替として、上述の目的は、本発明に従って、サンプル中の少なくとも１つのターゲット核酸を絶対定量する方法であって、
（ａ）サンプル中に含まれる少なくとも１つのターゲット核酸の各々を増幅し、並行して、少なくとも１つのターゲット核酸の各々の増幅と相関する信号を取得するステップと、
（ｂ）既知濃度を有する核酸標準の希釈系列のサンプルを増幅し、並行して、標準サンプル中の核酸の増幅と相関する信号を取得するステップと、
（ｃ）前記取得された信号を、バックグラウンド信号に関して補正するステップと、
（ｄ）ターゲット及び標準サンプルの各増幅サイクルごとに、サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）を計算するステップと、
（ｅ）ターゲット及び標準サンプルについて、サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）のランダム性の尺度Ｍを計算するステップと、
（ｆ）ターゲット及び標準サンプルについて、Ｍが最小であるサイクル数ＣＭを識別するステップと、
（ｇ）ＣＭの値から、特徴的なサイクル数ＣＣを計算するステップと、
（ｈ）ターゲット及び標準サンプルのＣＣを比較することによって、サンプル中の少なくとも１つのターゲット核酸の各々の初期量を求めるステップと、
を含む方法によって達成される。
【００１３】
代替として、上述の目的は、本発明に従って、サンプル中の少なくとも１つのターゲット核酸のＣｔ値を算出する方法であって、
（ａ）サンプル中に含まれる少なくとも１つのターゲット核酸の各々を増幅するステップと、
（ｂ）並行して、少なくとも１つのターゲット核酸の各々の増幅と相関する信号を取得するステップと、
（ｃ）前記取得された信号を、バックグラウンド信号に関して補正するステップと、
（ｄ）ターゲット核酸の各増幅サイクルごとに、サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）を計算するステップと、
（ｅ）ターゲット核酸の各々について、サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）のランダム性の尺度Ｍを計算するステップと、
（ｆ）ターゲット核酸の各々について、Ｍが最小であるサイクル数ＣＭを識別するステップと、
（ｇ）ＣＭの値から、特徴的なサイクル数ＣＣを計算するステップと、
（ｈ）ＣＣ値からＣｔ値を計算するステップと、
を含む方法によって達成される。
【００１４】
得られたＣｔ値は、当分野において知られている方法による核酸定量のために使用されることができる。
【００１５】
代替として、上述の目的は、本発明に従って、サンプル中の少なくとも１つのターゲット核酸を相対定量する方法であって、
（ａ）少なくとも１つのターゲット核酸及び少なくとも１つの比較用の核酸の増幅曲線のために取得された信号を、バックグラウンド信号に関して補正するステップと、
（ｂ）ターゲット及び比較用の核酸の各増幅サイクルごとに、サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）を計算するステップと、
（ｃ）ターゲット及び比較用の核酸について、サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）のランダム性の尺度Ｍを計算するステップと、
（ｄ）ターゲット及び比較用の核酸について、Ｍが最小であるサイクル数ＣＭを識別するステップと、
（ｅ）ＣＭの値から、特徴的なサイクル数ＣＣを計算するステップと、
（ｆ）ターゲット及び比較用サンプルのＣＣを比較することによって、比較用の核酸に対する、サンプル中の少なくとも１つのターゲット核酸の各々の相対量を求めるステップと、
を含む方法によって達成される。
【００１６】
代替として、上述の目的は、本発明に従って、サンプル中の少なくとも１つのターゲット核酸を絶対定量する方法であって、
（ａ）少なくとも１つのターゲット核酸及び既知濃度を有する核酸標準の希釈系列のサンプルの増幅曲線のために取得された信号を、バックグラウンド信号に関して補正するステップと、
（ｂ）ターゲット及び標準サンプルの増幅サイクルごとに、サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）を計算するステップと、
（ｃ）ターゲット及び標準サンプルについて、サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）のランダム性の尺度Ｍを計算するステップと、
（ｄ）ターゲット及び標準サンプルについて、Ｍが最小であるサイクル数ＣＭを識別するステップと、
（ｅ）ＣＭの値から、特徴的なサイクル数ＣＣを計算するステップと、
（ｆ）ターゲット及び標準サンプルのＣＣを比較することによって、サンプル中の少なくとも１つのターゲット核酸の各々の初期量を求めるステップと、
を含む方法によって達成される。
【００１７】
代替として、上述の目的は、本発明に従って、サンプル中の少なくとも１つのターゲット核酸のＣｔ値を算出する方法であって、
（ａ）少なくとも１つのターゲット核酸の増幅曲線のために取得された信号を、バックグラウンド信号に関して補正するステップと、
（ｂ）各ターゲット核酸の各増幅サイクルごとに、サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）を計算するステップと、
（ｃ）ターゲット核酸の各々について、サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）のランダム性の尺度Ｍを計算するステップと、
（ｄ）ターゲット核酸の各々について、Ｍが最小であるサイクル数ＣＭを識別するステップと、
（ｅ）ＣＭの値から、特徴的なサイクル数ＣＣを計算するステップと、
（ｆ）ＣＣ値からＣｔ値を計算するステップと、
を含む方法によって達成される。
【００１８】
得られたＣｔ値は、当分野において知られている方法による核酸定量のために使用されることができる。
【００１９】
更に、本発明は、完全に自動的に実施される、すなわち人間の対話なしに実施される、上述の方法に関する。
【００２０】
加えて、本発明は、上述した方法のステップ（ｃ）乃至（ｈ）を実行するための命令を記憶した機械可読媒体に関する。
【００２１】
更に、本発明は、上述した方法を実施するための情報を含む機械可読メモリ装置を有する核酸サンプルの解析装置に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】増幅プロセスの異なるフェーズを示す、増幅反応の過程を通じて形成されたＰＣＲ産物の一般的なプロットを示す図であって、ＧＰ＝定常期、ＥＰ＝対数増殖期、ＬＰ＝対数直線期、ＰＰ＝プラトー期であり、Ｃは、サイクル数を示し、ＩＣは、記録された信号強度を示す図。
【図２】２５μｌのボリューム中の１０６コピーのＤＮＡの初期量から始まる３ＰＣＲ増幅の数値的に計算されたＥ＾（Ｃ）曲線を示す図。
【図３Ａ】実施例１において得られたバックグラウンド補正された増幅曲線を示す図。
【図３Ｂ】実施例１において得られたスペクトルエントロピーの曲線を示す図であって、スペクトルエントロピー（Ｍ）が、２５μｌ当たり１０６、１０５、１０４、１０３、１０２コピーの濃度を有するサンプルについてサイクル（Ｃ）２０、２３、２６、３１及び３４における特徴的な最小値を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
増幅効率のランダム性の尺度は、増幅の特徴点として使用されることができる明白な最小値を有する。
【００２４】
基本的な閾値法又はfit-point法を使用する、核酸定量の過程における増幅曲線へのＣｔ値の割り当ては、人間の入力を必要とする。実験者は、自分自身の判断に基づいて、増幅が著しく減速する対数増殖期の終了の前に達せられる信号閾値レベルを選ばなければならないが、これはさらに、バックグラウンド信号及びノイズによって支配される定常期の後に達せられる。従って、本来、これらの方法は、自動化には適していない。
【００２５】
対照的に、２次導関数最大法及びシグモイドカーブフィッティング方法は、人間の入力なしに曲線上の特徴点を指定することを含む。従って、原則的に、これらの方法は、自動化に適していなくはないようである。しかしながら最近、２次導関数最大法及びシグモイドカーブフィッティング方法が、低いコピー数のターゲットを定量するためには信頼できないものであることが分かった（JD Durtschi他、Analytical biochemistry 2007 (361) 55-64）。
【００２６】
予想外に、増幅効率のランダム性の尺度のプロットが、明白な最小値又は最小値への明白な遷移を有することがわかった。この最小値又は最小値への遷移に関連するサイクル数は、人間の入力なしに、各増幅曲線に特徴点として割り当てられることができ、低いコピー数のターゲットの定量を含む信頼性のある核酸定量のために使用されることができる。
【００２７】
増幅効率のランダム性の尺度の最小値又は最小値への遷移を特徴点として使用する利点は、このポイントが、通常、対数増殖期の初期部分に位置することに由来する。増幅効率は、例えばＰＣＲ産物及び増幅混合物に存在しうるインヒビタの長さ、ＧＣ含量及びポテンシャル二次構造のような、さまざまなファクタによって影響されるので、増幅効率の違いが当該ステージで限られた影響を与えるように、対数増殖期の初期部分の特徴点を使用することが有利である。
【００２８】
増幅効率のランダム性の尺度の最小値又は最小値への遷移を特徴点として使用する他の利点は、多くのアプリケーションにとって、単一反応バッチにおいて核酸の２以上の種の増幅を実施することが望ましいことである。これにより、多重化タイプの解析（バッチ当たり２以上のターゲット）又は内部標準の使用が、容易にされる。これらのワンポット反応の主な利点は、扱われなければならない反応バッチの数がより少なくて済むこと、及びバッチ内のあらゆる核酸が、ＰＣＲ反応のインヒビタを含みうる同じ化学環境を受けることである。これらのワンポット解析の本質的な必要条件は、それぞれ異なるラベルが、各種の増幅を別個に監視するために各種の核酸のために使用されなければならないことである。この目的のために低濃度で使用されることができる多くの異なる蛍光染料が利用可能である。しかしながら、濃度の増加と共に、蛍光団のインタラクションは、結果として、蛍光信号の外乱をもたらす可能性があり、よって、解析の精度を損なうことがある。従って、蛍光団のこのようなインタラクションを最小限にするために、標識化されたＰＣＲ産物の濃度が比較的低い、対数増殖期の初期部分の特徴点を使用することが有利である。
【００２９】
従って、本発明の別の目的は、定量のために使用される信号が、増幅の対数増殖期の初期部分に得られる信号である、核酸定量方法を提供することである。本発明の好適な実施形態において、増幅の対数増殖期の初期部分は、対数増殖期の前半、対数増殖期の最初の１０サイクル、対数増殖期の最初の５サイクル、対数増殖期の最初の３サイクル又は対数増殖期の１番目のサイクルのうちの１つであると考えられる。
【００３０】
絶対的及び相対的定量
本発明は、核酸を相対定量する方法であって、
（ａ）サンプルに含まれる少なくとも１つのターゲット核酸の各々を増幅し、並行して、少なくとも１つのターゲット核酸の各々の増幅と相関する信号を取得するステップと、
（ｂ）比較用の核酸の少なくとも１つのサンプルの各々を増幅し、並行して、少なくとも１つの比較用の核酸の各々の増幅と相関する信号を取得するステップと、
（ｃ）取得された信号を、バックグラウンド信号に関して補正するステップと、
（ｄ）ターゲット及び比較用の核酸の各増幅サイクルごとに、サイクルツーサイクルのサイクル増幅効率Ｅ＾（Ｃ）を計算するステップと、
（ｅ）ターゲット及び比較用の核酸について、サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）のランダム性の尺度Ｍを計算するステップと、
（ｆ）ターゲット及び比較用の核酸について、Ｍが最小であるサイクル数ＣＭを識別するステップと、
（ｇ）ＣＭの値から、特徴的なサイクル数ＣＣを計算するステップと、
（ｈ）ターゲット及び比較用サンプルのＣＣを比較することによって、比較用の核酸に対する、サンプル中の少なくとも１つのターゲット核酸の各々の相対量を求めるステップと、
を含む方法に向けられる。
【００３１】
本発明は、更に、サンプル中の少なくとも１つのターゲット核酸を絶対定量する方法であって、
（ａ）サンプルに含まれる少なくとも１つのターゲット核酸の各々を増幅し、並行して、少なくとも１つのターゲット核酸の各々の増幅と相関する信号を取得するステップと、
（ｂ）既知濃度を有する核酸標準の希釈系列のサンプルを増幅し、並行して、標準サンプルの核酸の増幅と相関する信号を取得するステップと、
（ｃ）取得された信号を、バックグラウンド信号に関して補正するステップと、
（ｄ）ターゲット及び標準サンプルの各増幅サイクルごとに、サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）を計算するステップと、
（ｅ）ターゲット及び標準サンプルについて、サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）のランダム性の尺度Ｍを計算するステップと、
（ｆ）ターゲット及び標準サンプルについて、Ｍが最小であるサイクル数ＣＭを識別するステップと、
（ｇ）ＣＭの値から、特徴的なサイクル数ＣＣを計算するステップと、
（ｈ）ターゲット及び標準サンプルのＣＣを比較することによって、サンプル中の少なくとも１つのターゲット核酸の各々の初期量を求めるステップと、
を含む方法に向けられる。
【００３２】
本発明は、更に、サンプル中の少なくとも１つのターゲット核酸のＣｔ値を算出する方法であって、
（ａ）サンプルに含まれる少なくとも１つのターゲット核酸の各々を増幅するステップと、
（ｂ）並行して、少なくとも１つのターゲット核酸の各々の増幅と相関する信号を取得するステップと、
（ｃ）取得された信号を、バックグラウンド信号に関して補正するステップと、
（ｄ）ターゲット核酸の各増幅サイクルごとに、サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）を計算するステップと、
（ｅ）ターゲット核酸の各々について、サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）のランダム性の尺度Ｍを計算するステップと、
（ｆ）ターゲット核酸の各々について、Ｍが最小であるサイクル数ＣＭを識別するステップと、
（ｇ）ＣＭの値から、特徴的なサイクル数ＣＣを計算するステップと、
（ｈ）ＣＣ値からＣｔ値を計算するステップと、
を含む方法に向けられる。
【００３３】
得られたＣｔ値は、当分野において知られている方法による核酸定量のために使用されることができる。
【００３４】
本発明は更に、サンプル中の少なくとも１つのターゲット核酸を相対定量する方法であって、
（ａ）少なくとも１つのターゲット核酸及び少なくとも１つの比較用の核酸の増幅曲線のために取得された信号を、バックグラウンド信号に関して補正するステップと、
（ｂ）ターゲット及び比較用の核酸の各増幅サイクルごとに、サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）を計算するステップと、
（ｃ）ターゲット及び比較用の核酸について、サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）のランダム性の尺度Ｍを計算するステップと、
（ｄ）ターゲット及び比較用の核酸について、Ｍが最小であるサイクル数ＣＭを識別するステップと、
（ｅ）ＣＭの値から、特徴的なサイクル数ＣＣを計算するステップと、
（ｆ）ターゲット及び比較用サンプルのＣＣを比較することによって、比較用の核酸に対する、サンプル中の少なくとも１つのターゲット核酸の各々の相対量を求めるステップと、
を含む方法に向けられる。
【００３５】
本発明は、更に、サンプル中の少なくとも１つのターゲット核酸を絶対定量する方法であって、
（ａ）少なくとも１つのターゲット核酸及び既知濃度を有する核酸標準の希釈系列のサンプルの増幅曲線のために取得された信号を、バックグラウンド信号に関して補正するステップと、
（ｂ）ターゲット及び標準サンプルの各増幅サイクルごとに、サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）を計算するステップと、
（ｃ）ターゲット及び標準サンプルについて、サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）のランダム性の尺度Ｍを計算するステップと、
（ｄ）ターゲット及び標準サンプルについて、Ｍが最小であるサイクル数ＣＭを識別するステップと、
（ｅ）ＣＭの値から、特徴的なサイクル数ＣＣを計算するステップと、
（ｆ）ターゲット及び標準サンプルのＣＣを比較することによって、サンプル中の少なくとも１つのターゲット核酸の各々の初期量を求めるステップと、
を含む方法に向けられる。
【００３６】
本発明は、更に、サンプル中の少なくとも１つのターゲット核酸のＣｔ値を算出する方法であって、
（ａ）少なくとも１つのターゲット核酸の増幅曲線のために取得された信号を、バックグラウンド信号に関して補正するステップと、
（ｂ）各ターゲット核酸の各増幅サイクルごとに、サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）を計算するステップと、
（ｃ）ターゲット核酸の各々について、サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）のランダム性の尺度Ｍを計算するステップと、
（ｄ）ターゲット核酸の各々について、Ｍが最小であるサイクル数ＣＭを識別するステップと、
（ｅ）ＣＭの値から、特徴的なサイクル数ＣＣを計算するステップと、
（ｆ）ＣＣ値からＣｔ値を計算するステップと、
を含む方法に向けられる。
【００３７】
得られたＣｔ値は、当分野において知られている方法による核酸定量のために使用されることができる。
【００３８】
本発明による核酸の相対定量とは、解析前に、サンプル中の対応する核酸の量の比率の定量的な測定を得ることをいう。
【００３９】
本発明による核酸の絶対定量とは、解析前に、例えばコピー数又は物質量のようなサンプル中の核酸の量の絶対的な測定を得ることをいう。
【００４０】
本発明に適用できる核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び修飾バックボーン及び／又は塩基構造を有する核酸を含む。通常、増幅は、方法によるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって及び当業者が利用できる測定を用いて、実施される。しかしながら、本発明の目的で、ＰＣＲによって直接増幅されることができない核酸は、当業者に知られている手段によって、ＤＮＡに転写される必要がありうる。ＲＮＡは、例えば、逆転写酵素を使用して増幅前にＤＮＡに転写される必要がありうる。対応する核酸の最初の量の再構成を可能にするために、このような転写プロセスは、ＤＮＡに転写された核酸の量及び転写の過程で生成されたＤＮＡの比率に関して、かなり十分な根拠の仮定を可能にする条件下で実行されなければならない。このタイプの反応条件は、当分野において良く知られている。
【００４１】
本発明を実施する過程で増幅される各核酸は、通常、選択的なやり方で増幅される。ＰＣＲ中に選択的増幅を達成するための１つのやり方は、特異的なプライマの使用である。このようなプライマの設計及び利用は、当業者に良く知られている。
【００４２】
本発明によれば、核酸の増幅と相関する信号は、増幅反応の過程を通じて記録される。増幅反応のすべてのサイクルの過程を通じて記録された信号の表現は、一般に、増幅曲線として示される。通常、このような信号は、蛍光放射であるが、当分野において使用される他の信号が、同様に本発明に含まれる。蛍光放射は、蛍光染料によってリリースされることができ、それらの幾つかは、当分野において知られている。或る蛍光染料は、同じサンプル中の並行な検出を可能にするために十分に分離される吸収及び発光スペクトルを有する。
【００４３】
本発明の目的で、核酸増幅、すなわち増幅反応による核酸の生成は、核酸の増幅と相関する信号を記録することによって検出される。これは、例えば、ターゲットに結合されると特定の信号を発する蛍光標識化されたハイブリダイゼーションプローブによって、又は二本鎖産物を検出することが可能なＤＮＡインターカレート蛍光染料によって、達成されることができる。このような蛍光標識化されたハイブリダイゼーションプローブ及びＤＮＡインターカレート蛍光染料は、当分野において良く知られている。本発明の好適な実施態様において、核酸増幅は、蛍光標識化されたハイブリダイゼーションプローブ、FRETハイブリダイゼーションプローブ、分子ビーコン、スコーピオンプライマ、Luxプライマ、TaqManプローブ、ＤＮＡ結合染料のうち少なくとも１つ用いて、検出される。
【００４４】
本発明は、核酸を解析する方法及び手段を含む。単一の解析が、単一の種のターゲット核酸又は２以上の種のターゲット核酸に向けられることができる。２以上のターゲット核酸が解析を受ける場合、各ターゲット核酸の増幅を監視するために記録される信号は、区別可能な信号、すなわち同時に別個に記録されることができる信号、である必要がある。このような信号を得る方法及び手段は、当分野において良く知られている。例えば十分に分離される吸収及び発光スペクトルを呈する蛍光染料は、同時に、それらの蛍光信号の並行な記録を可能にする。従って、本発明は、サンプル中の幾つかのターゲットを同時に多重解析することを含む。
【００４５】
本発明によれば、比較用の核酸は、ターゲット核酸の相対定量のための基準値を決定するために使用されることができる。１又は幾つかのこのような比較用の核酸は、本発明により使用されることができる。解析前のサンプル中の比較用の核酸の絶対量は、知られている必要がない。セル中のハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡが、例えば、比較用の核酸として使用されることができる。ＰＣＲによって増幅されるために、ｍＲＮＡは、通常、ＤＮＡに事前に転写される。
【００４６】
本発明によれば、既知濃度を有する核酸標準の希釈系列は、ターゲット核酸の絶対定量のための基準値を決定するために使用されることができる。核酸標準のターゲット及び希釈されたサンプルは、それぞれ異なる反応バッチにおいて解析されることができ、又は１つの反応バッチにおいて同時に解析されることができる。同時に１つの反応バッチで解析される場合、それぞれ異なる核酸及び希釈系列のそれぞれ異なるサンプルは、区別可能な信号によって、すなわち同時に別個に記録されることができる信号によって、検出される必要がある。
【００４７】
本発明を実施する際、バックグラウンド項が、記録された信号から減算される。このようなバックグラウンド補正を達成するために、線形曲線が、例えば直線回帰によって、増幅曲線の最初の数サイクルに合わせてモデル化される。好適には、増幅曲線の最初の１０サイクルが、この線形曲線を構築するために使用される。代替として、特に信号にノイズが多い場合、統計的検定方法が、この線形曲線を構築するために適した増幅曲線のサイクルを決定するために使用されることができる。その後、この線形曲線は、増幅曲線から減算される。
【００４８】
本発明によれば、サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾は、以下を使用して計算される：
0005810078.tif 000002
【００４９】
本発明の幾つかの実施形態において、増幅効率Ｅ＾（Ｃ）は、連続的な２より多くのサイクルのＩ〜値を使用して計算され、すなわち、平滑化が適用される。本発明の好適な実施形態において、平滑化は、３、５又は７データポイントを使用して適用される。
【００５０】
図２は、２５μｌ当たり１０６コピーのＤＮＡの初期量から始まる３ＰＣＲ増幅の数値的に計算されたＥ＾（Ｃ）曲線を示している。
【００５１】
本発明により、サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）のランダム性の尺度Ｍが計算される。スペクトルエントロピーは、このようなランダム性の尺度の一例である。スペクトルエントロピーは、以下のように計算されることができる：
【００５２】
（１）Ｅ＾（Ｃ）の配列を以下のように形成する：
0005810078.tif 000003
ここで、２Ｌ＋１は、サイクルＣを中心とするこの配列におけるＥ＾の数である。好適には、Ｌは、３又は４の値をとり、従って、Ｗ（Ｃ）は、７又は９の要素を有する。１より小さい又は増幅曲線の最後の利用できるサイクル数Ｃｍａｘを超えるＥ＾のインデックスを有しないようにするために、Ｃは、
Ｌ＜Ｃ＜＝（Ｃｍａｘ−Ｌ）
のレンジ内でなければならない。；
【００５３】
（２）通常、複素数値である配列Ｓ（Ｃ）を得るために、Ｗ（Ｃ）に離散フーリエ変換（ＤＦＴ）を適用する：
S(C)=DFT{W(C)}=[s(1),s(2),...,s(2N-1),s(2N)]
ここで、２ＮはＤＦＴサイズであり、例えば１６又は３２でありうる。；
【００５４】
（３）Ｓ（Ｃ）の絶対値をとり、その要素の一部により新しい配列を形成する：
P(C)=[|s(2)|,|s(3)|,...,|s(N-1)|,|s(N)|]；
【００５５】
（４）Ｐ（Ｃ）の要素の和を１になるように正規化して、
Ｐｎ（Ｃ）＝Ｐ（Ｃ）／ｓｕｍ｛Ｐ（Ｃ）｝
を得る。ここで、和｛｝は、配列の要素の和を計算する配列演算子である。；
【００５６】
（５）配列Ｐｎ（Ｃ）のスペクトルエントロピー（Ｍ）を、以下のように計算する：
Ｍ（Ｃ）＝ｓｕｍ｛Ｐｎ（Ｃ）＊ｌｏｇ２｛Ｐｎ（Ｃ）｝｝
ここで、乗算＊及び対数演算は、両方とも要素単位（ｅｌｅｍｅｎｔ‐ｗｉｓｅ）である。；
【００５７】
（６）サイクルＣ＋１を中心とすることによって配列Ｗ（Ｃ）を更新し、ステップ（１）−（５）を繰り返す。
【００５８】
上述の方法は、Ｃの関数としてＥ＾（Ｃ）のスペクトルエントロピー（Ｍ）を計算する。スペクトルエントロピーが小さいほど、信号のランダム性の程度が低くなる。
【００５９】
Ｍは、定常期の後に位置する、増幅曲線の対数増殖期にある明白な最小値によって特徴づけられる。
【００６０】
本発明は、ランダム性の他の尺度が使用される実施形態を含む。ランダム性の他の尺度の例は、以下のとおりである：（ａ）多項式カーブフィッティングの残差；（ｂ）ゼロ交差計数；（ｃ）ハイパスフィルタリング後のエネルギー（ＲＭＳ）算出。これらの方法の全ては、上述した配列Ｗ（Ｃ）に作用する。前者の方法（ａ）は、多項式関数が、特定の正確さまで確定関数をフィットさせることが可能であるが、確率的なものではないという概念に基づく。後者の２つの方法（（ｂ）及び（ｃ））は、ノイズがその平均値を中心に決定論的信号より大きく変動し、それにより、より多くのゼロ交差及びエネルギーが生成されるという知見を使用する。
【００６１】
本発明により、Ｍがその最小値を有するサイクル数ＣＭが決定される。ＣＭは、当分野において知られている一般的なアルゴリズムに従って、数値的に得られることができる。本発明のある実施形態において、サイクル数ＣＭは、Ｍが初めてその最小値に達するサイクルとして、決定される。
【００６２】
本発明により、特性サイクル数ＣＣは、ＣＭの値から計算される。この計算は、ランダム性の尺度の計算に使用される任意のウィンドウの幅を補正するために実施される。例えばＭが、上述したスペクトルエントロピーとして計算される場合、ＣＣは、Ｌを減算することによって、ＣＭから得られる：
ＣＣ＝ＣＭ−Ｌ
ここで、Ｌは、配列Ｗ（Ｃ）の展開の半値である。
【００６３】
ランダム性の尺度を計算するために使用される方法に依存して、ＣＭからＣＣを得るための他の方法が、当業者には明らかである。本発明は更に、ＣＣ＝ＣＭの場合、ＣＭの値がＣＣの値として使用される実施形態を含む。
【００６４】
ＣＣ値は、Ｃｔ値（閾値サイクル数）を計算するために使用されることができ、Ｃｔ値は次いで、当業者に知られているやり方で核酸定量を行うために使用されることができる（例えばJD Durtschi他、Analytical biochemistry 2007 (361) 55-64を参照）。本発明の好適な実施態様において、Ｃｔ値は、ＣＣ値をＣｔ値として採用することによって、ＣＣ値から計算され、すなわちＣｔ＝ＣＣである。
【００６５】
本発明によれば、比較用の核酸（＃）に対してターゲット核酸（Ｔ）の相対量（Ｒ）を算出することは、以下を計算することによって達成されることができる：
Ｒ＝２（ＣＣ（Ｔ）−ＣＣ（＃））
ここで、
Ｒ＝ターゲット及び比較用の核酸の量の比率、
ＣＣ（Ｔ）＝ターゲット核酸のＣＣ値、
ＣＣ（＃）＝比較用の核酸のＣＣ値、である。
【００６６】
代替として、増幅効率Ｅに関する情報が利用できる場合、比率Ｒは、以下のように計算されることができる：
Ｒ＝（１＋Ｅ）（ＣＣ（Ｔ）−ＣＣ（＃））
【００６７】
本発明によれば、ターゲット及び標準サンプルのＣＣを比較することによって、サンプル中の各ターゲット核酸の初期量を求めることが、以下によって達成されることができる：
【００６８】
標準サンプルから標準曲線を構築し（標準サンプルの初期濃度対標準サンプルのＣＣ値）、この標準曲線を使用してターゲットのＣＣ値からターゲットの初期濃度を得ること。標準曲線は、ＣＣ値の線形関数対濃度値の対数でありうる。しかしながら、当分野において知られている代替の方法が、同様に本発明によって含められる。
【００６９】
本発明は、自動的に、すなわち人間の対話なしに又は最小限の人間の対話を用いて、本発明の方法を実施することを可能にする方法及び手段を有する。好適な実施形態において、本発明は、人間の対話なしに本発明の方法を実施することを可能にする方法及び手段に向けられる。本発明は、当業者が、人間の対話なしに又は最小限の人間の対話を用いて本発明の方法を実施するために、当分野において利用可能な計測を使用することを可能にする。好適な実施形態において、本発明は、当業者が、人間の対話なしに本発明の方法を実施するために、当分野において利用可能な計測を使用することを可能にする。
【００７０】
機械可読媒体
本発明は、本発明の方法のステップ（ｃ）乃至（ｈ）を実行するための命令を記憶した機械可読媒体に向けられる。
【００７１】
核酸サンプルの解析装置
本発明は、本発明の方法を実施するための情報を含む機械可読メモリ手段を有する核酸サンプルの解析装置に向けられる。
【００７２】
実施例
実施例１
２５μｌのボリューム及び希釈によって得られた２５μｌ当たり１０６、１０５、１０４、１０３、１０２コピーの濃度をもつ黄色ブドウ球菌のＤＮＡサンプル（黄色ブドウ球菌ATCC―25923からクローンされる、pCR2.1―TOPOにおける、４４２Ｓａｕ３Ａｌゲノム断片の５'部分、２５６塩基対）が、ABI 7099HTバージョン2.3リアルタイムＰＣＲサイクラにおける４０サイクルのＰＣＲによって、別々のバイアルにおいて増幅された。ＰＣＲ反応のために、ABIのTaqman Universal PCRマスターミックス及びTaqmanプローブFAM-Black Hole Quencher 1が、使用された。産物の増幅が続けられた。取得された信号は、ＰＣＲの最初の１０サイクルで得られた信号に合わせて線形関数をモデル化し、各サンプルについて得られた増幅曲線からこの線形曲線を減算することによって、バックグラウンド信号に関して補正された。図３Ａは、得られた曲線を示している。サイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）が、下式を使用して増幅曲線ごとに計算された。
0005810078.tif 000004
【００７３】
スペクトルエントロピーは、増幅曲線ごとのサイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）のランダム性の尺度Ｍとして計算された。Ｅ＾（Ｃ）曲線に沿った９ポイントの移動ウィンドウが計算され、これは、ウィンドウ内のデータポイントのランダム性の程度を反映する。結果が図３Ｂに示されている：スペクトルエントロピーＭは、各増幅反応ごとのサイクルツーサイクルの増幅効率Ｅ＾（Ｃ）の明白な最小値を示す。ＣＭについて得られた値は、２５μＬ当たり１０６、１０５、１０４、１０３及び１０２コピーの濃度に関して、それぞれ２０、２３、２６、３１及び３４である。こうして、ＣＣ＝ＣＭ−４によって計算されるＣＣの値は、２５μｌ当たり１０６、１０５、１０４、１０３及び１０２コピーの濃度に関して、それぞれ１６、１９、２２、２７及び３０である。個々のコピー数の対数に対して得られたＣＣ値の直線回帰は、Ｒ２＝０．９９０８のピアソンＬｓ係数を与え、これは、期待される線形関係との結果の良好な適合（フィット）を示す。
【図１】
0005810078.tif 000011
【図２】
0005810078.tif 000012
【図３Ａ】
0005810078.tif 000013
【図３Ｂ】
0005810078.tif 000014