(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＢＤＶのｐＶＰ２タンパク質またはそのフラグメントからなるサブユニット（ａ）、および
配列番号６からなるサブユニット（ｂ）
を含んでいる融合タンパク質によって形成され、前記フラグメントは、ＶＰ２４４１、ＶＰ２４４３、ＶＰ２４４６、ＶＰ２４４９、ＶＰ２４５０およびＶＰ２４５２からなる群より選ばれる、キメラウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項２】
前記サブユニット（ｂ）が、前記サブユニット（ａ）のカルボキシル末端に連結されている、請求項１に記載のキメラウイルス様粒子。
【請求項３】
前記サブユニット（ｂ）が、前記サブユニット（ａ）のカルボキシル末端に連結されており、該サブユニット（ａ）と該サブユニット（ｂ）との間には１０個以下のアミノ酸のリンカーポリペプチドが配置されている、請求項２に記載のキメラウイルス様粒子。
【請求項４】
前記配列番号６が配列番号４のＲ４５２に連結されている、請求項２または３に記載のキメラウイルス様粒子。
【請求項５】
前記融合タンパク質が、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する、請求項４に記載のキメラウイルス様粒子。
【請求項６】
前記サブユニット（ｂ）が、前記サブユニット（ａ）に挿入されている、請求項１に記載のキメラウイルス様粒子。
【請求項７】
１５個以下のアミノ酸のリンカーポリペプチドを１つまたは２つさらに含んでおり、前記１５個以下のアミノ酸のリンカーポリペプチドが、前記サブユニット（ｂ）のアミノ配列と前記サブユニット（ａ）のアミノ酸配列との間に配置されている、請求項６に記載のキメラウイルス様粒子。
【請求項８】
前記配列番号６が、前記配列番号４のアミノ酸Ｌ４３６とアミノ酸Ｋ４３７の間に含まれる、請求項６または７に記載のキメラウイルス様粒子。
【請求項９】
前記融合タンパク質が、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する、請求項８に記載のキメラウイルス様粒子。
【請求項１０】
前記配列番号６が、前記配列番号４のアミノ酸Ａ４４１とアミノ酸Ｆ４４２との間に挿入されている、請求項６または７に記載のキメラウイルス様粒子。
【請求項１１】
前記融合タンパク質が、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載のキメラウイルス様粒子。
【請求項１２】
前記配列番号６が、前記配列番号４のアミノ酸Ａ４５０とアミノ酸Ｉ４５１との間に挿入されている、請求項６または７に記載のキメラウイルス様粒子。
【請求項１３】
前記融合タンパク質が、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載のキメラウイルス様粒子。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のキメラウイルス様粒子を得るためのプロセスであって、キメラウイルス様粒子を形成するために、請求項１〜１３のいずれかに記載の融合タンパク質の発現および該融合タンパク質のアセンブリを可能にする条件下にて、該融合タンパク質をコードする核酸を含んでいる宿主細胞を培養する工程を包含する、プロセス。
【請求項１５】
前記キメラウイルス様粒子を分離培養する工程または該粒子を精製する工程をさらに包含する、請求項１４に記載のキメラウイルス様粒子を得るための、プロセス。
【請求項１６】
薬剤を調製するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のキメラウイルス様粒子の、使用。
【請求項１７】
ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる腫瘍形成を予防するおよび／または処置するための薬剤を調製するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のキメラウイルス様粒子の、使用。
【請求項１８】
子宮頸癌を予防するおよび／または処置するための薬剤を調製するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のキメラウイルス様粒子の、使用。
【請求項１９】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のキメラウイルス様粒子を含んでいる、薬学的組成物。
【請求項２０】
薬学的に受容可能なビヒクルをさらに含んでいる、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
別の有効成分をさらに含んでいる、請求項１９または２０に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）によって生じる腫瘍形成を処置するための治療ワクチンに関する。特に、本発明のワクチンは、パピローマウイルス抗原を含むビルナウイルスのキメラウイルス様カプシドによって形成される。
【０００２】
［背景技術］
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、子宮内新生物を発生させる主な原因であり、そして他の腫瘍形成（例えば、肛門癌、外陰癌、陰茎癌または中咽頭扁平上皮癌）と頻繁に関連付けられている。ＨＰＶの感染は、進行の種々の段階において、局所的な腫瘍形成の形態にて現れ得るまで何年間も気づかれずに進行し得る。そのために、前癌性の細胞を同定するために、および原因ウイルスの型がどこに適用されているかを確認するために、定期的なスミア試験が、女性に対して行われる。子宮内での局所的な腫瘍形成と関連するＨＶＰの最も一般的な系統は、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８であり、子宮頸癌の全てのケースの内の７０％が関連している。これらのＨＰＶの発癌性効果は、感染された基底上皮細胞のゲノムにおいて、そのゲノムの一部の組込みによって、特に初期発現遺伝子Ｅ６およびＥ７の組込みによって媒介される。
【０００３】
現在、パピローマウイルスによる感染を防ぐための予防ワクチン（例えば、Ｇａｒｄａｓｉｌ（登録商標）およびＣｅｒｖａｒｉｘ（登録商標））が、市場に存在する。これらのワクチンは、ヒトパピローマウイルス系統である、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−１１およびＨＰＶ−６による感染を妨げるに効果的であるが、上記ＨＰＶが感染細胞を前癌性の細胞に形質転換することについての、治療の観点でのそれらのワクチンの効率は今までに証明されていない。
【０００４】
米国だけで毎年１０００万人の女性が、ＨＰＶと接触していると見積もられており、そしてこれらの女性の２３％の女性が、その生涯のいくつかの時点で、子宮内での局所的な腫瘍形成（すなわちＣＩＮ（子宮頚部上皮内腫瘍））を、いくつかの程度まで発症することが予測されている（Hoory T el al. (2008) J. Formos Med. Assoc 107(3):198-217）。さらに、世界中で毎年２７５，０００人の女性が、ＣＩＮが不運にも発症した結果として、子宮頸癌によって死亡している。現在、定期的な婦人科の検査およびＣＩＮの外科的な除去による、子宮頸癌の予防および監視プログラムが効果的であるが、手術に関連する費用および潜在的な合併症を防ぐ、非侵襲性の治療的アプローチを頼りにすることが望まれている。
【０００５】
パピローマウイルスのＥ６抗原および／またはＥ７抗原を含む、ＣＩＮを処置するための治療ワクチンの開発において、前例がある（Lin Y. et al. (2007) Frontier in Bioscience, 12: 246-264; Leggatt GR et al. (2007) Current Opin. Immunology, 19: 232-238; Hung CF et al. (2007) Exp. Mol. Med, 39(6):679-689; Hoory T et al. (2008) J. Formos Med. Assoc, 107(3):198-217）。これらは、ＤＮＡワクチン（Yan Q. et al (2007) Gynecologic Onco., 104:199-206; Yan J. et al. (2009) Vaccine, 27:431-440）、裸のペプチドに基づいたワクチン（Daffarin PM. et al (2007) J. Translational Med., 5:26; Toubaji A. et al. (2007) Vaccine, 25: 5882-5891; Smith KA. et al. (2009) Clin. Cancer Res. 15(19):6167-6176）、およびＨＰＶ抗原が他の生物学的な実体と結合または融合したワクチン（例えば、Bordetella pertussisのアデニル酸シクラーゼ（Preville X. et al. (2005) Cancer Res., 65(2):641-649）、細胞傷害性Ｔリンパ球の抗原４（ＣＴＬＡ４）（Zheng Y.et al. (2009) J. Microbiol., 46(6):728-736）またはClostridium thermocellumの１，３−１，４  β−グルカナーゼ（Venuti A. et al. (2009) Vaccine, 27 (25-26):3395-3397））を含む。生物学的なマクロ構造上の抗原提示を用いるウイルスの場合、１つの例は、疾患に関係する抗原を含むウイルス構造タンパク質に基づいて形成されたキメラウイルス様粒子（ＶＬＰ）からなる。この場合、Ｂ型肝炎のＶＬＰにおけるＥ７抗原を含む前例がある（Tindle RW. et al. Virology (1994) 1;200(2):547-57）。抗原提示のために提案されたＶＬＰの中には、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）に由来するものがある。ＩＢＤＶは、ビルナウイルス科に属し、鳥類にガンボロ病を引き起こす原因因子である。ＩＢＤＶのウイルス粒子は、Ｔ＝１３の対称性を有する正二十面体であり、構造タンパク質ＶＰ３（２９ｋＤａ）によってその内側を強化されたタンパク質ＶＰ２（２９ｋＤａ）の２６０の三量体によって形成される。ビリオンの正常なアセンブリにおいて、ウイルスカプシドのタンパク質成分は、５１２アミノ酸のＶＰ２前駆体（ｐＶＰ２５１２）、ＶＰ４およびＶＰ３を放出するための、前駆体ポリペプチドｐＶＰ２−ＶＰ４−ＶＰ３（１０９ｋＤａ）のタンパク質分解に由来する。ｐＶＰ２５１２のカルボキシル末端におけるアミノ酸の引き続く除去は、ビリオン中に存在する４４１アミノ酸のＶＰ２（ＶＰ２４４１）の成熟形態を生じさせる（Da Costa B. et al. J. Virology (2002) 76(5):2393-2402）。種々の系統のＩＢＤＶに見出されるＶＰ２は、８０％よりも多くのタンパク質配列相同性を示す。他のビルナウイルス科のＶＰ２は、水性ビルナウイルスの場合に約４０％、ショウジョウバエのビルナウイルスの場合に約３０％のＩＢＤＶタンパク質配列相同性を共有する（Coulibaly F. et al. (2005) Cell 25,120(6):761-772）。
【０００６】
真核生物細胞におけるＩＢＤＶの前駆体ポリペプチドｐＶＰ２−ＰＶ４−ＰＶ３の発現は、ＩＢＤＶのネイティブなカプシドと同一の、Ｔ＝１３の対称性を有する正二十面体のＶＬＰを生じる（Martinez-Torrecuadrada JL. et al. (2001) J. Virology 75(22):10815-10828）。同時に、ＩＢＤＶの他のタンパク質の非存在下での、真核生物細胞におけるＶＰ２の発現は、ＩＢＤＶを含むものよりも小さな、Ｔ＝１３の対称性を有する正二十面体のＶＬＰの形成を生じる（Martinez-Torrecuadrada JL. et al. (2003) Vaccine 21(17-18):1952-1960）。これは、ＶＰ２のカルボキシル末端での融合に基づく、Ｔ＝１のＶＬＰにおける足および口の疾患のＢＴ抗原を含むキメラＶＬＰの設計および発現に用いられている（WO2007009673）。
【０００７】
真核生物の発現システムにおいて、Ｔ＝１のＶＬＰを効果的に形成させるためのＶＰ２の融合または挿入の能力は、ＶＰ２の長さ（WO2005105834; Saugar I. et al. (2005) Structure 13(7):1007-1117）に、ＶＰ２の配列への挿入物の挿入位置に、そしてＶＰ２中に導入された挿入物の配列（Remond M. et al (2009) Vaccine. 27(1):93-8）に、大いに依存する。しかし、得られたキメラＶＬＰの、動物モデルにおいて好適な免疫応答を誘導するための能力は、予測することができない。
【０００８】
［発明の詳細］
ＨＰＶに対する治療ワクチンの設計において、特定のかつ効果的である細胞性免疫応答を生成したＨＰＶ抗原提示システムを有することが望まれる。本発明は、ＨＰＶによって誘導された腫瘍を処置するための、効果的な治療ワクチンを得ることを目的として、ＩＢＤＶのＶＰ２の配列とＨＰＶのＥ７の配列とを組み合わせる。ワクチンの生成において、Ｅ７またはＶＰ２の配列が理想であり得るか、あるいはＶＰ２を用いたＥ７の融合または挿入の位置が理想的であり得るかどうかは、自明でない。この理由として、本発明において、ＩＢＤＶのＶＰ２中にＥ７を融合および挿入することに基づいたＴ＝１のキメラＶＬＰの探索プロセスが行われ、ＨＰＶによって生じた病変の処置において最も効果的なキメラＶＬＰが選択されている。
【０００９】
本発明の目的は、ヒトパピローマウイルスによって生じる腫瘍形成の処置において効果的であるワクチンを提供することである。本発明の治療ワクチンは、ヒトのＨＰＶのＥ７タンパク質の配列および伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのＶＰ２の配列の、融合および挿入に基づいて形成されたキメラウイルス様粒子からなる。行った探索プロセスおよび選択プロセスは、ＩＢＤＶのＶＰ２４５２を用いたＨＰＶのＥ７Δ１−４４の融合および挿入に基づいた、より高い抗腫瘍効果および本発明の目的を有するウイルス様の粒子を生じた。
【００１０】
本発明は、ＨＰＶの癌原遺伝子の配列を含む、ビルナウイルスのＶＰ２に基づくキメラウイルス様粒子（ＶＬＰ）に関する。ビルナウイルスに関連しない配列の、ＶＰ２における融合または挿入は、タンパク質の三次元構造の改変をしばしば生じ、この改変は、効果的な様式にて、自己組織化する能力、およびウイルス様カプシドを形成する能力をネガティブに影響する。このネガティブな効果は、挿入の位置だけでなく、挿入物のアミノ酸配列および挿入物の長さに依存する。したがって、挿入位置および挿入されたアミノ酸配列が、キメラＶＬＰの効果的な形成を生じるという推測は自明でない。同時に、ＨＰＶの腫瘍形成配列を含むＶＬＰの形成は、腫瘍に対する効果的な治療ワクチンを生成させるために十分な条件でなく、これは形成されたキメラＶＬＰ上のＥ７抗原の最終的な配置に依存する。
【００１１】
本発明のキメラＶＬＰは、選択プロセスにより得られる。選択プロセスにおいて、ＶＬＰを形成するためのＥ７の最適な配列が同定され、そしてＨＰＶ−１６の腫瘍形成性タンパク質Ｅ６およびＥ７を発現している腫瘍の処置において、より強い効力のキメラＶＬＰを生じさせる、ＶＰ２における融合または挿入の位置が同定される。
【００１２】
第一に、実施例１に非限定的に記載されているように、Ｅ７の短縮化された配列の、カルボキシル末端にて短縮化されたＶＰ２の配列のカルボキシル末端への融合物が評価される。他には、アミノ酸１〜３５が欠失されたＥ７の配列（Ｅ７Δ１−３５）［配列番号３］の、カルボキシル末端にて短縮化された、アミノ酸４５２から開始するＶＰ２（ＶＰ２４５２）［配列番号４］のカルボキシル末端への融合物が評価される。発現を改善するために、ＶＰ２４５２のカルボキシル末端からのアミノ酸除去によって生じるＶＰ２４４１、ＶＰ２４４３、ＶＰ２４４６、ＶＰ２４４９およびＶＰ２４５０のカルボキシル末端への、Ｅ７Δ１−３５の種々の融合物がまた、評価される。融合物ＶＰ２４５２−Ｅ７Δ１−３５［配列番号５］のキメラＶＬＰの生産における能力を超えるケースはない。より大きな発現を生じさせる、ＶＰ２のカルボキシル末端に融合されたＥ７の配列を選択するために、ＶＰ２４５２のカルボキシル末端への、短縮化されたＥ７の配列（Ｅ７Δ１−４０、Ｅ７Δ１−４１、Ｅ７Δ１−４４）の融合物が評価される。短縮化されたＥ７であるＥ７Δ１−４４［配列番号６］と、ＶＰ２４５２［配列番号４］のカルボキシル末端のアルギニン（Ｒ）との融合は、キメラＶＬＰの生産における、評価された他のものより優れた能力を有する構築物ＶＰ２４５２−Ｅ７Δ１−４４［配列番号７］を生じる。同時に、アミノ酸配列ＶＰ２４５２−Ｅ７Δ１−４４を有するＶＬＰは、動物モデルにおいてＨＰＶ−１６のタンパク質Ｅ６およびタンパク質Ｅ７を発現する腫瘍を除去するに効果的であることを証明し、本発明の好ましい実施形態を示す。したがって、本発明は、アミノ酸４５２からカルボキシル末端にて短縮化されたＶＰ２（ＶＰ２４５２）のカルボキシル末端に融合された、ＨＰＶ−１６のＥ７の配列からアミノ酸１〜４４が欠失されたもの（Ｅ７Δ１−４４）に基づくキメラウイルス様粒子を含む。これらの融合が７〜１０個のアミノ酸の配列において、特に、ＶＰ２４５２とＥ７Δ１−４４との間の融合位置において、クローニング配列を使用した結果として、改変および挿入を含み得ることが意図される。
【００１３】
第二に、実施例２に非限定的に記載されているように、ＨＰＶ−１６中のＥ７の配列の無作為の挿入が評価される。ここで、アミノ酸４５２からカルボキシル末端にて短縮化されたＶＰ２（ＶＰ２４５２）の配列［配列番号４］と異なる点にてアミノ酸１〜４４が欠失されている（Ｅ７Δ１−４４）［配列番号６］。ＨＰＶ−１６の腫瘍形成タンパク質Ｅ６およびＥ７を発現している皮下の腫瘍の処置にこえる効力についてより大きな潜在性を有する候補の同定および選択のプロセスは、以下のステップに従って行われる。第一のステップにて、ＶＰ２中のＥ７Δ１−４４の無作為の挿入が行われ、ＶＬＰの十分な発現を生じない構築物の全てが除去される。第二のステップにて、ＶＬＰを十分に産生する候補であり、かつＥ７Δ１−４４の配列を含むことを証明する候補の選択プロセスが行われる。第三のステップにて、タンパク質Ｅ７に対する顕著な細胞性免疫応答を生成する上記キメラＶＬＰが選択される。第四のステップにて、Ｅ７の発現と関連している腫瘍形成の動物モデルにおいて抗腫瘍効果を提供する、選択されたキメラＶＬＰの能力が評価される。上記プロセスの最終的な結果として、本発明の好ましい実施形態を示す３つのキメラＶＬＰが選択される。その３つのキメラＶＬＰは、Ｅ７Δ１−４４の配列が４３６位におけるロイシン（Ｌ）と４３７位におけるリジン（Ｋ）との間に挿入されているＶＰ２４５２（Ｌ４３６↑Ｅ７Δ１−４４↑Ｋ４３７）［配列番号８］；Ｅ７Δ１−４４の配列が４４１位におけるアラニン（Ａ）と４４２位におけるフェニルアラニン（Ｆ）との間に挿入されているＶＰ２４５２（Ａ４４１↑Ｅ７Δ１−４４↑Ｆ４４２）［配列番号９］；Ｅ７Δ１−４４の配列が４５０位におけるアラニン（Ａ）と４５１位におけるイソロイシン（Ｉ）との間に挿入されているＶＰ２４５２（Ａ４５０↑Ｅ７Δ１−４４↑Ｆ４５１）［配列番号１０］である。
【００１４】
したがって、本発明は、アミノ酸位Ｌ４３６↑Ｋ４３７、Ａ４４１↑Ｆ４４２およびＡ４５０↑Ｉ４５１におけるアミノ酸４５２からカルボキシル末端にて短縮化されたＶＰ２（ＶＰ２４５２）に挿入されたアミノ酸１〜４４（Ｅ７Δ１−４４）が除去された、ＨＰＶ−１６のＥ７の配列に基づくキメラウイルス様粒子を記載する。これらの融合物が、クローニング配列の使用の結果として、および挿入の可撓性を増加させるインカ―の付加の結果として、挿入物の各末端での１５個以下のアミノ酸配列における、特に、ＶＰ２４５２とＥ７Δ１−４４との間の融合位置におけるバリエーションおよび挿入を含むことが予測される。
【００１５】
本発明の第一の局面は、融合タンパク質（以下、本発明の融合タンパク質）によって形成されるキメラウイルス様粒子（ＶＬＰ）（以下、本発明のキメラＶＬＰ）に関し、本発明のキメラＶＬＰは、ビルナウイルスのｐＶＰ２タンパク質またはそのフラグメントからなるサブユニット（ａ）、および、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の初期発現タンパク質Ｅ６またはＥ７あるいはそのフラグメントからなるサブユニット（ｂ）を含んでいる。
【００１６】
用語「ウイルス様カプシド」、「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」は、ウイルス構造タンパク質のアセンブリによって形成される三次元のナノ構造をいう。本発明において、本発明のウイルス様粒子を形成するウイルス構造タンパク質は、ビルナウイルスのｐＶＰ２タンパク質またはそのフラグメント、およびＨＰＶの初期発現タンパク質Ｅ６もしくはＥ７またはそれらのフラグメントを含んでいる融合タンパク質である。
【００１７】
用語「ビルナウイルス」は、バルチモア分類に従えば、グループＩＩＩに属するビルナウイルス科の任意のウイルスをいう。ビルナウイルス科は、トリビルナウイルス類、アクアビルナウイルス類、ブロスナウイルス（Ｂｌｏｓｎａｖｉｒｕｓ）類および昆虫ビルナウイルス類からなる。好ましくは、ビルナウイルスは、トリビルナウイルス類であり、より好ましくは、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）である。
【００１８】
用語「伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス」または「ＩＢＤＶ」は、ビルナウイルス科のウイルス、および鳥類にガンボロ病を引き起こしかつバルチモア分類のグループＩＩＩに属するトリビルナウイルス類のウイルスをいう。好ましくは、上記ＩＢＤＶは、ソロア系統ＩＢＤＶである。
【００１９】
ビルナウイルスゲノムは、５個のタンパク質をコードする、ＡおよびＢといわれる二本鎖ＲＮＡの２つのリンカー分子によって形成される。セグメントＡに埋め込まれた遺伝子ＶＰ２は、タンパク質ＶＰ２の前駆体タンパク質（ｐＶＰ２）をコードする。タンパク質分解によるｐＶＰ２のカルボキシル末端の除去は、成熟したＶＰ２を生じ、これはウイルスカプシドを構成する主要なタンパク質である。
【００２０】
本明細書中にて開示されている、用語「ｐＶＰ２タンパク質」または「ｐＶＰ２」は、ビルナウイルスの遺伝子ＶＰ２によってコードされたＶＰ２の前駆体タンパク質をいう。好ましくは、この用語は、ＩＢＤＶの５１２アミノ酸のＶＰ２（ＶＰ２５１２）の前駆体タンパク質をいう。
【００２１】
ソロア系統ＩＢＤＶのタンパク質ＶＰ２５１２のアミノ酸配列［配列番号１］は、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）にアクセッション番号ＡＡＤ３０１３６にて受託されている。ＩＢＤＶの他の系統におけるタンパク質ＶＰ２５１２は、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を示す。したがって、好ましい実施形態において、用語ｐＶＰ２は、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するタンパク質をいう。より好ましい実施形態においては、用語ｐＶＰ２は配列番号１をいう。
【００２２】
本明細書中にて使用される用語「同一性」は、比較した２つのアミノ酸配列の間にて一致したアミノ酸の割合をいう。２つのアミノ酸配列の間に存在する同一性の百分率は、例えば、好適な配列比較ソフトウェアを用いて、当業者によって容易に同定され得る。
【００２３】
本明細書中にて使用される用語「フラグメント」は、少なくとも４００個のアミノ酸の、ＶＬＰを形成し得るｐＶＰ２タンパク質の一部をいう。したがって、この用語は、ＩＢＤＶの４４１アミノ酸の成熟したＶＰ２タンパク質（ＶＰ２４４１）を含む。
【００２４】
本発明の上記の第一の局面の好ましい実施形態において、本発明のキメラＶＬＰを形成する融合タンパク質のサブユニット（ａ）は、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有するタンパク質またはそのフラグメントからなる。より好ましい実施形態において、本発明のキメラＶＬＰを形成する融合タンパク質のサブユニット（ａ）は、配列番号１を有するタンパク質またはそのフラグメントからなる。さらにより好ましい実施形態において、本発明のキメラＶＬＰを形成する融合タンパク質のサブユニット（ａ）は、配列番号４からなる。
【００２５】
用語「ヒトパピローマウイルス」または「ＨＰＶ」は、バルチモア分類のグループＩに属し、そのため二本鎖ＤＮＡゲノムを有する、パピローマウイルス科のウイルスをいう。ヒトパピローマウイルスの１００よりも多い異なる型が知られている。子宮内での腫瘍形成にもっとも頻繁に関連しているＨＰＶの系統は、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８である。これらの腫瘍形成の効果は、感染した基底上皮細胞のゲノムにおける、そのゲノムの一部、特に初期発現遺伝子Ｅ６およびＥ７の組込みによって媒介される。
【００２６】
用語「初期発現タンパク質Ｅ６」、「初期発現癌原遺伝子Ｅ６」または「Ｅ６」は、ＨＰＶの、より好ましくはＨＰＶ−１６またはＨＰＶ−１８の初期発現遺伝子Ｅ６によってコードされるタンパク質をいう。
【００２７】
用語「初期発現タンパク質Ｅ７」、「初期発現癌原遺伝子Ｅ７」または「Ｅ７」は、ＨＰＶの、より好ましくはＨＰＶ−１６またはＨＰＶ−１８の初期発現遺伝子Ｅ７によってコードされるタンパク質をいう。
【００２８】
ＨＰＶタイプ１６の初期発現タンパク質Ｅ７のアミノ酸のプロトタイプの配列［配列番号２］は、ＮＣＢＩにてアクセッション番号ＮＰ＿０４１３２６にて受託されている。したがって、好ましい実施形態において、用語初期発現タンパク質Ｅ７は、配列番号２と少なくとも３０％、４０％、５０％、７０％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するタンパク質をいう。より好ましい実施形態において、用語ＨＰＶの初期発現タンパク質Ｅ７は、配列番号２をいう。
【００２９】
本発明の上記の第一の局面の別の好ましい実施形態において、本発明のキメラＶＬＰを形成する融合タンパク質のサブユニット（ｂ）は、配列番号２と少なくとも３０％の同一性を有するタンパク質またはそのフラグメントからなる。より好ましい実施形態において、本発明のキメラＶＬＰを形成する融合タンパク質のサブユニット（ｂ）は、配列番号２を有するタンパク質またはそのフラグメントからなる。さらにより好ましい実施形態において、本発明のキメラＶＬＰを形成する融合タンパク質のサブユニット（ｂ）は、配列番号６からなる。
【００３０】
本発明の上記の第一の局面の別の好ましい実施形態において、本発明のキメラＶＬＰを形成する融合タンパク質を生じるために、サブユニット（ｂ）は、サブユニット（ａ）のカルボキシル末端に連結されている。この連結は、直接的であってもリンカーポリペプチドによってもよい。
【００３１】
本明細書中にて使用される用語「リンカーポリペプチド」または「リンカー」は、サブユニット（ｂ）のアミノ酸配列とサブユニット（ａ）のアミノ酸配列との間に配置されている、好ましくは２０個以下のアミノ酸長の、より好ましくは１５個以下のアミノ酸長の、さらに好ましくは１０個以下のアミノ酸長の短いアミノ酸配列をいう。
【００３２】
上記連結が、本発明のＶＬＰを形成する融合タンパク質のサブユニット（ａ）と（ｂ）との間を直接的である場合、以下のダイアグラムにて示すように、サブユニット（ａ）のカルボキシル末端のアミノ酸は、サブユニット（ｂ）のアミノ末端のアミノ酸とのペプチド結合を形成する：
【００３３】
【化１】
0005795319.tif 000002
【００３４】
ここで、（ａ）はサブユニット（ａ）を表し、（ｂ）はサブユニット（ｂ）を表し、Ｎｔは、対応するサブユニットのアミノ末端を表し、Ｃｔは、対応するサブユニットのカルボキシル末端を表し、そして  〜  は本発明の融合タンパク質の異なるユニットの間のペプチド結合を表す。
【００３５】
本発明のＶＬＰを形成する融合タンパク質のサブユニット（ａ）と（ｂ）との間の結合がポリペプチドのリンカーを用いて行われる場合、以下のダイアグラムにて示すように、サブユニット（ａ）のカルボキシル末端のアミノ酸は、リンカーペプチド（ｐ）のアミノ末端のアミノ酸とのペプチド結合を形成し、リンカーポリペプチドのカルボキシル末端のアミノ酸は、サブユニット（ｂ）のアミノ酸末端のアミノ酸との結合を形成する：
【００３６】
【化２】
0005795319.tif 000003
【００３７】
ここで、（ａ）はサブユニット（ａ）を表し、（ｂ）はサブユニット（ｂ）を表し、（ｐ）はリンカーポリペプチドを表し、Ｎｔは、対応するサブユニットまたリンカーポリペプチドのアミノ末端を表し、Ｃｔは、対応するサブユニットまたはポリのカルボキシル末端を表し、そして  〜  は本発明の融合タンパク質の異なるユニットの間のペプチド結合を表す。
【００３８】
別の好ましい実施形態において、本発明のキメラＶＬＰを形成する融合タンパク質を生じさせるために、サブユニット（ｂ）は、サブユニット（ａ）に挿入される。表現「挿入される（挿入された）」は、サブユニット（ａ）のアミノ酸配列が、２つの部分（ａ１）と（ａ２）とに分けられ、これらの間にサブユニット（ｂ）のアミノ酸配列が見出されることを意味する。
【００３９】
本発明のＶＬＰを形成する融合タンパク質のサブユニット（ａ）と（ｂ）との間の結合が直接的である場合、以下のダイアグラムにて示すように、サブユニット（ａ）の一部（ａ１）のカルボキシル末端のアミノ酸は、サブユニット（ｂ）のアミノ末端のアミノ酸とのペプチド結合を形成し、サブユニット（ｂ）のカルボキシル末端のアミノ酸は、サブユニット（ａ）の一部（ａ２）のアミノ末端のアミノ酸とのペプチド結合を形成する：
【００４０】
【化３】
0005795319.tif 000004
【００４１】
ここで、（ａ１）はサブユニット（ａ）の一部を表し、（ａ２）はサブユニット（ａ）の別の一部を表し、（ｂ）はサブユニット（ｂ）を表し、Ｎｔは、対応するサブユニットのアミノ末端を表し、Ｃｔは、対応するサブユニットのカルボキシル末端を表し、そして  〜  は本発明の融合タンパク質の異なるユニットの間のペプチド結合を表す。
【００４２】
本発明のＶＬＰを形成する融合タンパク質のサブユニット（ａ）と（ｂ）との間の結合が、２つのリンカーポリペプチド（これらは同一であっても異なってもよい。）によって達成される場合、以下のダイアグラムにて示すように、サブユニット（ａ）の一部（ａ１）のカルボキシル末端のアミノ酸は、第一のリンカーポリペプチド（ｐ１）のアミノ末端のアミノ酸とのペプチド結合を形成し、第一のリンカーポリペプチド（ｐ１）のカルボキシル末端のアミノ酸は、サブユニット（ｂ）のアミノ末端のアミノ酸との結合を形成し、サブユニット（ｂ）のカルボキシル末端のアミノ酸は、第二のリンカーポリペプチド（ｐ２）のアミノ末端のアミノ酸とのペプチド結合を形成し、そして第二のリンカーポリペプチド（ｐ２）のカルボキシル末端のアミノ酸は、サブユニット（ａ）の一部（ａ２）のアミノ末端のアミノ酸との結合を形成する：
【００４３】
【化４】
0005795319.tif 000005
【００４４】
ここで、（ａ１）はサブユニット（ａ）の一部を表し、（ａ２）はサブユニット（ａ）の別の一部を表し、（ｂ）はサブユニット（ｂ）を表し、（ｐ１）は第一のリンカーポリペプチドを表し、（ｐ２）は第二のリンカーポリペプチドを表し、Ｎｔは、対応するサブユニットまたはリンカーポリペプチドのアミノ末端を表し、Ｃｔは、対応するサブユニットまたはリンカーポリペプチドのカルボキシル末端を表し、そして〜は本発明の融合タンパク質の異なるユニットの間のペプチド結合を表す。
【００４５】
本発明のＶＬＰを形成する融合タンパク質のサブユニット（ａ）と（ｂ）との間の結合が、１つのリンカーペプチドのみで達成される場合、以下のダイアグラムにて示すように、サブユニット（ｂ）は一方の末端にてサブユニット（ａ）の一部の１つとペプチド結合によって直接的に連結され、他方の末端にてサブユニット（ａ）の一部の１つとペプチド結合によって連結される：
【００４６】
【化５】
0005795319.tif 000006
【００４７】
ここで、（ａ１）はサブユニット（ａ）の１つの一部を表し、（ａ２）はサブユニット（ａ）の別の一部を表し、（ｂ）はサブユニット（ｂ）を表し、（ｐ）はリンカーポリペプチドを表し、Ｎｔは、対応するサブユニットまたはリンカーポリペプチドのアミノ末端を表し、Ｃｔは、対応するサブユニットまたはリンカーポリペプチドのカルボキシル末端を表し、そして〜は本発明の融合タンパク質の異なるユニットの間のペプチド結合を表す。
【００４８】
本発明の上記の第一の局面の好ましい実施形態は、配列番号４および配列番号６を含んでいる融合タンパク質によって形成されるキメラＶＬＰに関する。より好ましい実施形態は、配列番号４および配列番号６を含みかつ１５個以下のアミノ酸のリンカーポリペプチドを１つまたは複数個さらに含んでいる融合タンパク質によって形成されるキメラＶＬＰに関する。
【００４９】
本発明の上記の第一の局面のより好ましい実施形態は、配列番号４および配列番号６を含んでいる融合タンパク質によって形成されるキメラＶＬＰに関し、ここで、配列番号６は、配列番号４の４５２位のアルギニン（Ｒ４５２）と配列番号６の１位のアラニン（Ａ１）との間でのペプチド結合によって、配列番号４のカルボキシル末端に連結されている。
【００５０】
本発明の上記の第一の局面の別のより好ましい実施形態は、配列番号４および配列番号６を含んでいる融合タンパク質によって形成されるキメラＶＬＰに関し、ここで、配列番号６は、配列番号４のカルボキシル末端に連結されており、上記キメラＶＬＰは、配列番号４と配列番号６との間に配置されている１０個以下のアミノ酸のリンカーポリペプチドをさらに含んでいる。このリンカーポリペプチドは、配列番号４の４５２位のアルギニン（Ｒ４５２）とそのリンカーポリペプチドのアミノ末端によって連結されており、配列番号６の１位のアラニン（Ａ１）とそのリンカーポリペプチドのカルボキシル末端によって連結されている。さらにより好ましい実施形態は、アミノ酸配列が配列番号７である融合タンパク質によって形成されたキメラＶＬＰに関する。
【００５１】
本発明の上記の第一の局面の別の好ましい実施形態は、配列番号４および配列番号６を含んでいる融合タンパク質によって形成されるキメラＶＬＰに関し、ここで、配列番号６は、配列番号４に挿入されている。配列番号６の挿入の結果として、配列番号４は、２つの部分に分けられている。より好ましい実施形態は、配列番号４および配列番号６を含んでいる融合タンパク質によって形成されるキメラＶＬＰに関し、ここで、配列番号６は配列番号４に挿入されており、そして上記キメラＶＬＰは、１５個以下のアミノ酸の１つまたは２つのリンカーポリペプチドをさらに含んでおり、これらのリンカーポリペプチドの各々が、挿入の結果として配列番号４が分けられた２つの部分のアミノ酸配列と配列番号６のアミノ酸配列との間に配置されている。
【００５２】
本発明の上記の第一の局面の好ましい実施形態は、配列番号４および配列番号６を含んでいる融合タンパク質によって形成されるキメラＶＬＰに関し、ここで、配列番号６は、配列番号４の４３６位のロイシン（Ｌ４３６）と４３７位のリジン（Ｋ４３７）との間に挿入されている。より好ましい実施形態は、配列番号４および配列番号６を含んでいる融合タンパク質によって形成されるキメラＶＬＰに関し、ここで、配列番号６は、配列番号４のアミノ酸Ｌ４３６とアミノ酸Ｋ４３７との間に挿入されており、上記キメラＶＬＰは、１５個以下のアミノ酸の１つまたは２つのリンカーポリペプチドをさらに含んでおり、これらのリンカーポリペプチドの各々が、挿入の結果として配列番号４が分けられた２つの部分のアミノ酸配列と配列番号６のアミノ酸配列との間に配置されている。本発明の上記の第一の局面のさらに好ましい実施形態は、アミノ酸配列が配列番号８である融合タンパク質によって形成されるキメラＶＬＰに関する。
【００５３】
好ましい実施形態は、配列番号４および配列番号６を含んでいる融合タンパク質によって形成されるキメラＶＬＰに関し、ここで、配列番号６は、配列番号４の４４１位のアラニン（Ａ４４１）と４４２位のフェニルアラニン（Ｆ４４２）との間に挿入されている。より好ましい実施形態は、配列番号４および配列番号６を含んでいる融合タンパク質によって形成されるキメラＶＬＰに関し、ここで、配列番号６は、配列番号４のアミノ酸Ａ４４１とアミノ酸Ｆ４４２との間に挿入されており、上記キメラＶＬＰは、１５個以下のアミノ酸の１つまたは２つのリンカーポリペプチドをさらに含んでおり、これらのリンカーポリペプチドの各々が、挿入の結果として配列番号４が分けられた２つの部分のアミノ酸配列と配列番号６のアミノ酸配列との間に配置されている。本発明の上記の第一の局面のさらに好ましい実施形態は、アミノ酸配列が配列番号９である融合タンパク質によって形成されるキメラＶＬＰに関する。
【００５４】
好ましい実施形態は、配列番号４および配列番号６を含んでいる融合タンパク質によって形成されるキメラＶＬＰに関し、ここで、配列番号６は、配列番号４の４５０位のアラニン（Ａ４５０）と４５１位のイソロイシン（Ｉ４４２）との間に挿入されている。より好ましい実施形態は、配列番号４および配列番号６を含んでいる融合タンパク質によって形成されるキメラＶＬＰに関し、ここで、配列番号６は、配列番号４のアミノ酸Ａ４５０とアミノ酸Ｉ４５１との間に挿入されており、上記キメラＶＬＰは、１５個以下のアミノ酸の１つまたは２つのリンカーポリペプチドをさらに含んでおり、これらのリンカーポリペプチドの各々が、挿入の結果として配列番号４が分けられた２つの部分のアミノ酸配列と配列番号６のアミノ酸配列との間に配置されている。本発明の上記の第一の局面のさらに好ましい実施形態は、アミノ酸配列が配列番号１０である融合タンパク質によって形成されるキメラＶＬＰに関する。
【００５５】
本発明の第二の局面は、本発明のキメラＶＬＰを得るためのプロセスに関し、本プロセスは、キメラＶＬＰを形成するために、上記の融合タンパク質の発現および上記融合タンパク質のアセンブリを可能にする条件下にて、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含んでいる宿主細胞を培養する工程を包含する。
【００５６】
本発明の上記の第二の局面の好ましい実施形態は、本発明のキメラＶＬＰ粒子を得るためのプロセスに関し、本プロセスは、キメラＶＬＰを形成するために、上記の融合タンパク質の発現および上記融合タンパク質のアセンブリを可能にする条件下にて、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含んでいる宿主細胞を培養する工程を包含し、上記キメラＶＬＰを単離する工程または精製する工程をさらに包含する。
【００５７】
本発明の融合タンパク質は、当該分野において周知の遺伝子操作技術のリコンビナントによって取得され得る。本発明の融合タンパク質をコードする核酸（以下、本発明の核酸）の配列は、任意の合成方法または任意の生物学的方法（例えば、好適な配列の制限、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介した目的のタンパク質のＤＮＡ配列の増幅が挙げられるが、これらに限定されない。）によって取得され得る。
【００５８】
核酸は、遺伝子構築物（以下、本発明の遺伝子構築物）中に含まれ得る。本発明の遺伝子構築物は、本発明の核酸を含み得、本発明の核酸は、本発明の核酸の発現を調節する配列と作動可能に連結されており、これにより発現カセットを構築する。
【００５９】
「作動可能に連結される（作動可能に連結された）」は、記載された成分が、意図された様式にて機能することを可能にする関係を有して配置されていることをいう。核酸に「作動可能に連結された」制御配列は、核酸をコードする配列の発現が達成される様式にてその核酸に連結される。
【００６０】
「制御配列」は、連結される配列の発現に影響を及ぼす核酸の配列をいう。上記制御配列は、例えば、プロモーター、開始シグナル、終結シグナル、強調遺伝子またはサイレンサーが挙げられるが、これらに限定されない。用語「制御配列」は、発現のために存在が必要である成分を含むことが意図されており、その存在が有利であるさらなる成分を含み得る。
【００６１】
好ましい実施形態において、本発明の遺伝子構築物は、
ａ．プロモーター、
ｂ．転写開始シグナル、
ｃ．転写終結シグナル、
ｄ．ポリアデニル化シグナル、または
ｅ．転写活性化因子
を含むリストの制御配列の少なくとも１つに作動可能に連結された本発明の核酸を含む。
【００６２】
本明細書中にて使用される場合、用語「プロモーター」は、転写開始点に関して、５’位に配置されているＤＮＡの領域をいい、プロモーターは、動物細胞における上記転写に必要であり、そして動物細胞における上記転写を促進する。この用語の例として、構成的プロモーター、細胞型に特異的なプロモーターまたは組織に特異的なプロモーター、あるいは誘導性のプロモーターまたは抑制可能なプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
上記制御配列は、本発明の核酸が発現されるべき細胞の起源に依存する。特定の実施形態において、本発明の核酸に連結された発現制御配列は、原核生物および原核生物細胞（例えば、細菌（ただし、これに限定されない。））にて機能的である；別の特定の実施形態において、上記発現制御配列は、真核生物および真核生物細胞（例えば、酵母細胞または動物細胞）にて機能的である。
【００６４】
本発明の核酸または本発明の遺伝子構築物は、例えば、裸の核酸またはベクターの形態（これらに限定されない。）によって、宿主細胞といわれる細胞の中に導入され得る。。
【００６５】
本明細書中にて使用される用語「クローニングベクター」は、自己複製能を失うことなく、別のＤＮＡのフラグメントが組み込まれ得るＤＮＡの分子をいう。発現ベクターの例は、プラスミド、コスミッド、ＤＮＡファージまたは人工的な酵母染色体であるが、これらに限定されない。
【００６６】
本明細書中にて使用される場合、用語「発現ベクター」は、宿主細胞といわれる細胞の内に導入された後にクローン化される核酸を発現するために好適なクローニングベクターをいう。上記核酸は、一般に、制御配列と作動可能に連結されている。
【００６７】
本明細書中にて使用される場合、用語「宿主細胞」は、発現ベクター、クローニングベクターまたは他の任意のＤＮＡ分子を受け取る任意の原核生物または任意の真核生物をいう。
【００６８】
本発明の第三の局面は、薬物、好ましくはワクチンの製造における、本発明のキメラＶＬＰの使用に関する。
【００６９】
本発明の第四の局面は、ＨＰＶ、好ましくはＨＰＶ−１６によって引き起こされる感染を予防および／または処置するための薬物の製造における、本発明のキメラＶＬＰの使用に関する。
【００７０】
本発明の第五の局面は、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる腫瘍形成を予防および／または処置するための薬物の製造における、本発明のキメラＶＬＰの使用に関する。
【００７１】
本発明の第六の局面は、本発明のキメラＶＬＰを含んでいる薬学的組成物（以下、本発明の薬学的組成物）に関する。
【００７２】
本発明の上記の第六の局面の好ましい実施形態は薬学的組成物に関し、本組成物は、本発明のキメラＶＬＰを含んでおり、薬学的に受容可能なビヒクルをさらに含んでいる。本発明の上記の第六の局面の好ましい別の実施形態は薬学的組成物に関し、本組成物は、本発明のキメラＶＬＰを含んでおり、別の活性要素（principle）をさらに含んでいる。本発明の上記の第六の局面のより好ましい実施形態は薬学的組成物に関し、本組成物は、本発明のキメラＶＬＰ、薬学的に受容可能なビヒクル、およびさらなる別の活性要素を含んでいる。
【００７３】
本明細書中にて使用される場合、用語「活性要素」、「活性物質」、「薬学的に活性な物質」、「活性成分」または「薬学的に活性な成分」は、疾患の、診断、回復、緩和、処置または予防に対して、薬学的な活性あるいは他の種々の効果を潜在的に提供する任意の成分、あるいはヒトまたは動物の身体の構造または機能に影響を及ぼす任意の成分をいう。
【００７４】
本発明の薬学的組成物は、当該分野において公知の種々の形態を介する投与のために処方され得る。このような処方物は、動物、より好ましくはヒトを含む哺乳動物に、種々の経路（非経口、腹腔内、静脈内、皮肉内、硬膜外、脊髄内、基質内、関節内、関節滑液嚢内、くも膜下腔内、病巣内、動脈内、嚢内、心臓内、筋肉内、鼻腔内、頭蓋内（ｉｎｔｒａｃｒａｎｅａｌ）、皮下、眼窩内または局所が含まれるが、これらに限定されない。）を介して投与され得る。
【００７５】
治療的有効量を得るための投薬量は、種々の因子（例えば、動物の年齢、体重、性別または寛容）に依存する。本明細書にて使用される観点において、「治療的有効量」の発現は、必要とされる効果を生じる薬学的に有効な組成物の量をいい、そして、他の要因の中から、この組成物に固有の特徴、および達成されるべき治療効果によって、一般的に決定される。このような組成物において用いられ得る薬学的に受容可能な、「アジュバント」すなわち「ビヒクル」は、当該分野において公知のビヒクルである。
【００７６】
明細書および特許請求の範囲の全体にわたって、「含む（comprise）」およびその変形は、他の技術的特徴、付加物、構成要素またはステップを考慮することが意図される。当業者にとって、本発明の、他の目的、利点および特徴は、記載から一部推測され、本発明の実証から一部推測される。添付の図面および以下の実施例は、例証の目的で提供されるが、本発明を限定することが意図されていない。
【００７７】
［図面の簡単な説明］
［図１］は、発現融合タンパク質ａ）ＶＰ２４５２−Ｅ７Δ１−４４；ｂ）ＶＰ２４５２（Ｌ４３６↑Ｅ７Δ１−４４↑Ｋ４３７）；ｃ）ＶＰ２４５２（Ａ４４１↑Ｅ７Δ１−４４↑Ｆ４４２）；ｄ）ＶＰ２４５２（Ａ４５０↑Ｅ７Δ１−４４↑Ｉ４５１）から生じるウイルス様粒子の走査型電子顕微鏡によるマイクロ写真を示す。各写真（左、下）における点線は、増幅した部分に対応する。スケールバーは、各写真に示す。
【００７８】
［図２］は、ＴＣ１／Ａ２細胞を用いて皮下に異種間移植された２５日後のＣ５７ＢＬ／６−ＴｇＮ（ＨＬＡ―Ａ２．１）マウスを示す：（Ａ）約１ｃｍ３の腫瘍を示しているコントロールＶＬＰ（ＶＰ２４５２）を用いたマウスのワクチン；（Ｂ）コントロールＶＬＰ（ＶＰ２４５２）を用いてワクチン接種したマウスの剖検；（Ｃ）Ｅ７の配列を含むＶＬＰを用いてワクチン接種したマウスの代表的な写真を示し、これには腫瘍がない。
【００７９】
［実施例］
本明細書において提供される、以下の特定の実施例は、本発明の特徴を例証する役割を果たす。これらの実施例は、単に例示の目的のために含まれ、本明細書中にて権利主張される発明を限定するものとして解釈されるべきでない。したがって、以下に開示される実施例は、本発明を適用する分野を制限することなく、本発明を例証する。
【００８０】
［実施例１：連続的なスクリーニングプロセスによる、ＶＰ２とＨＰＶのＥ７配列とのカルボニル末端融合に基づくキメラＶＬＰの研究および選択］
ＨＰＶによって引き起こされた腫瘍形成を処置することに効果的なキメラウイルス様粒子を同定することを目的として、カルボキシル末端の異なる点において短縮化したＶＰ２およびＨＰＶの種々のＥ７配列を含んでいる、種々の構築物を作製した。この趣旨のために、４５２位、４５０位、４４９位、４４６位、４４３位、４４１位におけるアミノ酸のカルボキシル末端にて短縮化したＶＰ２（ＶＰ２４５２、ＶＰ２４５０、ＶＰ２４４９、ＶＰ２４４６、ＶＰ２４４３、ＶＰ２４４１）を発現する発現プラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＴＭ）、ならびにカルボキシル末端にて制限酵素部位ＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩをカルボキシル末端に含んでいるＶＰ２（ｐＥＳＣ−ＵＲＡ／ＶＰ２４５２  ＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ；ｐＥＳＣ−ＵＲＡ／ＶＰ２４５０  ＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ；ｐＥＳＣ―ＵＲＡ／ＶＰ２４４９  ＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ；ｐＥＳＣ−ＵＲＡ／ＶＰ２４４６  ＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ；ｐＥＳＣ−ＵＲＡ／ＶＰ２４４３  ＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ；およびｐＥＳＣ−ＵＲＡ／ＶＰ２４４１  ＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ）を発現する、発現プラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＴＭ）中に、ＤＮＡ構築物を作製した。種々のＶＰ２のカルボキシル末端におけるＨｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩの二重消化に続いて、腫瘍形成力に関連するアミノ酸配列１〜３５を除去してあるのＨＰＶ−１６のＥ７タンパク質（Ｅ７Δ１−３５）を発現している配列をクローニングした。表１に示すように、得られた種々の発現ベクター（融合タンパク質ＶＰ２４５２−Ｅ７Δ１−３５［配列番号５］を発現するｐＥＳＣ−ＵＲＡ／ＶＰ２４５２−Ｅ７Δ１−３５、融合タンパク質ＶＰ２４５０−Ｅ７Δ１−３５［配列番号１１］を発現するｐＥＳＣ−ＵＲＡ／ＶＰ２４５０−Ｅ７Δ１−３５、融合タンパク質ＶＰ２４４９−Ｅ７Δ１−３５［配列番号１２］を発現するｐＥＳＣ−ＵＲＡ／ＶＰ２４４９−Ｅ７Δ１−３５、融合タンパク質ＶＰ２４４６−Ｅ７Δ１−３５［配列番号１３］を発現するｐＥＳＣ−ＵＲＡ／ＶＰ２４４６−Ｅ７Δ１−３５、融合タンパク質ＶＰ２４４３−Ｅ７Δ１−３５［配列番号１４］を発現するｐＥＳＣ−ＵＲＡ／ＶＰ２４４３−Ｅ７Δ１−３５、融合タンパク質ＶＰ２４４１−Ｅ７Δ１−３５［配列番号１５］を発現するｐＥＳＣ−ＵＲＡ／ＶＰ２４４１−Ｅ７Δ１−３５）を用いて形質転換されたSaccharomyces cerevisiae Y449におけるＶＬＰを生産する能力を、タンパク質ＶＰ２４５２［配列番号４］を発現するｐＥＳＣ−ＵＲＡ／ＶＰ２４５２のその能力と比較した。同じ実験の一部として、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ／ＶＰ２４５２のＨｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩのＨｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ二重消化、およびＨＰＶ−１６のＥ７タンパク質を発現している種々の配列のクローニングに基づいてであるＶＰ２４５２のカルボキシル末端への融合物をまた作製した。ここで、上記Ｅ７タンパク質は、融合タンパク質ＶＰ２４５２−Ｅ７Δ１−４０［配列番号１６］を発現するためにアミノ酸１〜４０（Ｅ７Δ１−４０）を除去しており、融合タンパク質ＶＰ２４５２−Ｅ７Δ１−４１［配列番号１７］を発現するためにアミノ酸１〜４１（Ｅ７Δ１−４１）を除去しており、および融合タンパク質ＶＰ２４５２−Ｅ７Δ１−４４［配列番号７］を発現するためにアミノ酸１〜４４（Ｅ７Δ１−４４）を除去しておいた。表１に示すように、得られた種々の発現ベクター（ｐＥＳＣ−ＵＲＡ／ＶＰ２４５２−Ｅ７Δ１−４０、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ／ＶＰ２４５２−Ｅ７Δ１−４１、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ／ＶＰ２４５２−Ｅ７Δ１−４４）を用いて形質転換されたSaccharomyces cerevisiae Y449におけるＶＬＰを生産する能力を、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ／ＶＰ２４５２ＨｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩのその能力と比較した。ＶＬＰを生産する種々の構築物の能力を、ＶＬＰの三次元構造を認識する立体配置的な抗体によって決定し、その後にＥＬＩＳＡタイプの免疫アッセイによって分析した。同時に、４８時間にわたる酵母の培養、遠心分離法による濃縮、機械的な溶菌、硫酸アンモニウム中での沈降、ゲル濾過クロマトグラフィーによる精製といった標準的なプロセスの後に、形態学的な研究およびインビボ試験のためのキメラＶＬＰおよびコントロールＶＬＰの生産および精製を行った。全ての場合において、ＶＬＰが存在することを電子顕微鏡によって確認し、生産されたキメラＶＬＰを、変性された条件下でのポリアクリルアミドゲル中のタンパク質電気泳動によって定量化した。
【００８１】
評価したキメラＶＬＰの生産における能力を、表１に示した。選択プロセスにおける次のステップとして、コントロールＶＰ２４５２−Ｅ７Δ１−３５よりも好適または優れているＶＬＰの生産能力を有する構築物の発現により得られるＶＬＰの免疫応答を誘導する能力を評価した。要約すると、マウスモデル中の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）にて反応の誘導を測定するにあたって、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを目的とした。この趣旨のために、組織適合性複合体ＨＬＡ−２を用いてヒト化した、Ｃ５７ＢＬ／６−ＴｇＮ（ＨＬＡ−Ａ２．１）１Ｅｎｇｅ／Ｊトランスジェニックマウスを用いた。８つのグループにて、０日目および１４日目におけるキメラＶＬＰの皮下投与によって、マウスに接種した。２０日目に、動物を安楽死させ、脾臓を摘出し、そして脾細胞を分離した。一度分離した脾細胞をＩＬ−２存在下にて培養し、その後にＨＰＶ−１６のタンパク質Ｅ７の特定のペプチド（Ｔエピトープ）を用いて２４時間にわたって刺激を与えた。インキュベーションした後に、その活性化の測定として、ＣＴＬｓのクローンにおけるＩＦＮ−γの発現を評価した。評価したキメラＶＬＰの各々におけるＨＰＶ−１６のタンパク質Ｅ７のＴエピトープに対する、特異的ＣＴＬ応答を誘導する能力を、表１に示した。ここで「＋」の数は、誘導された応答の強度を表す。
【００８２】
選択プロセスにおける最後のステップとして、ＶＬＰの生産における能力の最も高い値を用いた、キメラＶＬＰの抗腫瘍活性およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおける最良の結果を評価した。抗腫瘍活性を評価するために、腫瘍を誘導する細胞および動物モデルを用いた。ここで、ＨＰＶ−１６の腫瘍抗原Ｅ６およびＥ７を過剰発現している、５×１０５個の細胞ＴＣ１／Ａ２（Peng S. et al. Gene Therapy, 13:257-265 (2006)に従った。）を、組織適合性複合体ＨＬＡ−２を用いてヒト化した、Ｃ５７ＢＬ／６−ＴｇＮ（ＨＬＡ−Ａ２．１）１Ｅｎｇｅ／Ｊマウス中の皮下に移植した。動物を１０のグループに分け、腫瘍を導入した５日後および１２日後に、それぞれの動物に皮下投与によって５０μｇの、キメラＶＬＰまたはコントロールＶＬＰを投与した。定期的に、腫瘍の発達を測定し、動物の体重をモニタリングした。１ｃｍ３を超える体積の腫瘍を有する動物を安楽死させた。腫瘍モデルＴＣ１／Ａ２に対するキメラＶＬＰの治療的効果を表１に示した。表１は、腫瘍を誘導した後の６０日間生存した動物の百分率を示す。
【００８３】
このプロセスの最終的な結果として、構築物ＶＰ２４５２−Ｅ７Δ１−４４を含んでいるキメラＶＬＰを選択した。ここで短縮化したＥ７であるＥ７Δ１−４４の配列を４５２位のアルギニン（Ｒ）にてＶＰ２のカルボキシル末端に融合させた。
【００８４】
【表１】
0005795319.tif 000007
【００８５】
［実施例２：ヒトパピローマウイルスによって引き起こされた腫瘍形成に対する治療的効果を有するキメラＶＬＰの、連続的なスクリーニングプロセスによる、クローニング、研究および選択］
第一のステップにて、１〜４４のアミノ酸（Ｅ７Δ１−４４）を除去しておいたＥ７の非形質転換領域をコードする配列のＶＰ２遺伝子において、無作為の挿入のプロセスを行った。これについて、その配列の全体にわたって、転移因子Ｍｕを任意の挿入を含む、アミノ酸４５２をカルボキシル末端として短縮化したＶＰ２（ＰＶ２４５２）のライブラリを調製した。次のステップにおいて、転移因子Ｍｕの挿入を、その末端に、カナマイシン耐性遺伝子、ならびに独自の制限酵素認識部位ＮｏｔＩおよびＳｐｅＩを含んでいる挿入物［配列番号１８］によって置き換えた。クローンの挿入物によって、３つの可能性のある各リーディングフレームにて、クローン化するために、末端に、（ＮｏｔＩと適合性がある）Ｂｓｐ１２０ＩおよびＳｐｅＩを含むために合成したＨＰＶ−１６の挿入物Ｅ７Δ１−４４［配列番号１９］または挿入物Ｅ７Δ１−４４（リンカー）［配列番号２０］の組込みを促進させた。挿入物Ｅ７Δ１−４４または挿入物Ｅ７Δ１−４４（リンカー）の融合によって、ＶＰ２４５２とＥ７Δ１−４４との間の融合した点において、さらなるアミノ酸を生成した。挿入物Ｅ７Δ１−４４（リンカー）は、挿入の柔軟性を向上するために導入されたＥ７Δ１−４４の２つの末端（「リンカー」）にて、配列ＧＧＧＧＳをさらに含む。
【００８６】
ＮｏｔＩおよびＳｐｅＩを用いてライブラリを二重消化し、ならびに、フラグメント存在下にてＥ７Δ１−４４またはＥ７Δ１−４４（リンカー）のＢｓｐ１２０ＩおよびＳｐｅＩを用いた連結の後に、Ｅ７Δ１−４４の任意の挿入を含むＶＰ２４５２のライブラリを得るために、Ｅ．ｃｏｌｉの電子の適格細胞を形質転換した。このライブラリを拡大し、２％のグルコースを有するＹＮＢ／ＣＳＭ−ＵＲＡ媒体を含んでいるペトリ皿上に、次いでシードする生物酵母Ｙ４４９を形質転換するために、ライブラリから得られた１０μｇのＤＮＡを用いた。約１００００個の得られたクローンを、ガラクトースを含んでいる、選択したペトリ皿に移動させた。その選択によって得られたコロニーを、コロニーの免疫ブロットによる同定のために、ＶＰ２およびＥ７を発現するＰＶＤＦ膜に移した。
【００８７】
第二のステップにて、ＶＬＰの生産における能力が効果的であり、Ｅ７Δ１−４４を含む、組換え型の酵母のクローンの選択プロセスを行った。この趣旨のために、ＶＰ２およびＥ７に対するコロニーの免疫ブロットにおける最も高いシグナルを有する５０個のクローンを発現する条件下にて、培養液を調製し、４８時間にわたるインキュベーションの後に、ＶＰ２によって形成されたＶＬＰの三次元構造を特定的に認識する抗体を含むＥＬＩＳＡタイプのアッセイによって、ＶＬＰの量が同定されているタンパク質の抽出物を調製した。最初のスクリーニングにおいて、ＶＬＰの生産において最も高い能力を有するそれらの構築物を選択した。選択されたクローンのそれぞれのＤＮＡの抽出物の順序によって、Ｅ７Δ１−４４の完全な配列の存在およびその挿入の位置を確認した。表２に示するように、このような方法にて、挿入物Ｅ７Δ１−４４を含んでいるＶＰ２４５２のＶＬＰを発現しており、そしてコントロールのＶＰ２４５２のＶＬＰと比較して６％〜２０％の生産能力を有する、１２個のクローンを同定した。
【００８８】
同時に、４８時間にわたる標準的な酵母の培養プロセス、遠心分離法による濃縮、機械的な溶菌、硫酸アンモニウム中での沈降、ゲル濾過クロマトグラフィーによる精製の後に、形態学的な研究およびインビボ試験のための、キメラＶＬＰおよびコントロールＶＬＰの生産ならびに精製を行った。全ての場合において、ＶＬＰが存在することを電子顕微鏡によって確認し、生産されたキメラＶＬＰを、変性された条件下でのポリアクリルアミドゲル中のタンパク質電気泳動法よって定量化した。
【００８９】
第三のステップにて、Ｅ７に対して重要な免疫応答を生成するキメラＶＬＰを選択した。この目的のために、最も高い生産能力を有するそれら構築物によって生じたキメラＶＬＰの免疫応答を誘導する能力を評価した。要約すると、マウスモデル中の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）にて応答の誘導を測定するにあたって、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを目的とした。この趣旨のために、組織適合性複合体ＨＬＡ−２を用いて「ヒト化した」Ｃ５７ＢＬ／６−ＴｇＮ（ＨＬＡ−Ａ２．１）１Ｅｎｇｅ／Ｊトランスジェニックマウスを用いた。８つのグループにて、０日目および１４日目におけるキメラＶＬＰの皮下投与によって、マウスに接種した。２０日目に、動物を安楽死され、脾臓を摘出し、そして脾細胞を分離した。一度分離した脾細胞をＩＬ−２存在下にて培養し、その後にＨＰＶ−１６のタンパク質Ｅ７の特定のペプチド（Ｔエピトープ）を用いて２４時間にわたって刺激を与えた。インキュベーションした後に、その活性化の測定として、ＣＴＬｓのクローンにおけるＩＦＮ−γの発現を評価した。評価したキメラＶＬＰの各々におけるＨＰＶ−１６のタンパク質Ｅ７のエピトープに対する、特異的ＣＴＬ応答を誘導する能力を、表１に示した。ここで「＋」の数は、誘導された応答の強度を表す。
【００９０】
選択プロセスにおける第四のステップとして、最も高いＶＬＰの生産能力を有するキメラＶＬＰの抗腫瘍活性、およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおける最良の結果を評価した。抗腫瘍活性を評価するために、腫瘍を誘導する細胞および動物モデルを用いた。ここで、ＨＰＶ−１６の腫瘍抗原Ｅ６およびＥ７を過剰発現している、５×１０５個の細胞ＴＣ１／Ａ２（Peng S. et al. Gene Therapy, 13:257-265 (2006)に従った。）を、組織適合性複合体ＨＬＡ−２を用いてヒト化した、Ｃ５７ＢＬ／６−ＴｇＮ（ＨＬＡ−Ａ２．１）１Ｅｎｇｅ／Ｊマウス中の皮下に移植した。動物を８のグループに分け、腫瘍を導入した５日後および１２日後に、それぞれの動物に皮下投与によって５０μｇの、キメラＶＬＰまたはコントロールＶＬＰを投与した。定期的に、腫瘍の発達を測定し、動物の体重をモニタリングした。１ｃｍ３を超える体積の腫瘍を有する動物を安楽死させた。腫瘍モデルＴＣ１／Ａ２に対するキメラＶＬＰの治療的効果を表２に示した。表２は、腫瘍を誘導した後の６０日間生存した動物の百分率を示す。
【００９１】
このプロセスの最終的な結果として、本発明の目的である３つのキメラＶＬＰを選択した。すなわち：
ａ）ＶＰ２４５２（Ｌ４３６↑Ｅ７Δ１−４４↑Ｋ４３７）［配列番号８］：Ｅ７Δ１−４４の配列が、アミノ酸長４５２のＶＰ２の４３６位におけるロイシン（Ｌ）と４３７位におけるリジン（Ｋ）との間に挿入されるキメラＶＬＰ；
ｂ）ＶＰ２４５２（Ａ４４１↑Ｅ７Δ１−４４↑Ｆ４４２）［配列番号９］：Ｅ７Δ１−４４の配列が、アミノ酸長４５２のＶＰ２の４４１位におけるアラニン（Ａ）と４４２位におけるフェニルアラニン（Ｆ）との間に挿入されるキメラＶＬＰ；および
ｃ）ＶＰ２４５２（Ａ４５０↑Ｅ７Δ１−４４↑Ｆ４５１）［配列番号１０］：Ｅ７Δ１−４４の配列が、アミノ酸長４５２のＶＰ２の４５０位におけるアラニン（Ａ）と４５１位におけるイソロイシン（Ｉ）との間に挿入されるキメラＶＬＰ
である。
【００９２】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】ウイルス様粒子の走査型電子顕微鏡によるマイクロ写真を示す。
【図２】ＴＣ１／Ａ２細胞を用いて皮下に異種間移植された２５日後のＣ５７ＢＬ／６−ＴｇＮ（ＨＬＡ―Ａ２．１）マウスを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【配列表】
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