(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）スタチンの投与前および投与後において、心疾患を罹患した患者における細胞内のＳｍｇＧＤＳ発現量を測定する工程、および、
（２）前記工程（１）で測定されたＳｍｇＧＤＳ発現量を基準に前記患者に対するスタチンの種類および／または投与量の範囲を予測する工程
を含む、心疾患を罹患した患者へのスタチンの用法および／または用量を予測する方法。
【請求項２】
前記心疾患が、心血管肥大症、心筋細胞肥大症、心血管周囲線維化、冠動脈硬化症、高血圧症または心不全である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記スタチンが、アトルバスタチン、ジヒドロコンパクチン、ベルバスタチン、カルバスタチン、セリバスタチン、クリルバスタチン、ダルバスタチン、フルバスタチン、グレンバスタチン、フルインドスタチン、ベロスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、コンパクチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、リバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、シリバスタチン、ＣＩ−９８１およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記基準が、スタチン投与後のＳｍｇＧＤＳ発現量がスタチン投与前のＳｍｇＧＤＳ発現量の１．４倍以上である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スタチンの用法・用量を決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（スタチン）は、臨床現場において、冠動脈疾患の第１次および第２次予防に対して広く使用されているコレステロール低下剤である（非特許文献１および２を参照）。さらに、近年、スタチンに脂質低下作用に加え心血管病に対して保護的に働く作用（いわゆる多面的効果）があることが報告され、脚光を浴びている（非特許文献３および４を参照）。スタチンの多面的作用は、細胞内タンパク質の翻訳後制御を担うイソプレノイドの合成減少によって媒介されるとされている（非特許文献１を参照）。すなわち、Ｒｈｏ、ＲａｃおよびＲａｓなどの低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性は、膜への局在およびＧＴＰアーゼ活性がそれらタンパク質のイソプレニル化に依存するものであり、スタチンの多面的効果を媒介すると考えられている（非特許文献５および６を参照）。
【０００３】
本発明者らは、正常な健康被験者において、低用量スタチン（アトルバスタチンおよびプラバスタチンの２０ｍｇ／日を一週間投与）が、循環白血球中のＲｈｏＡ／Ｒｈｏキナーゼ活性を抑制することなく、Ｒａｃ１活性のみを著しく阻害することを以前に実証した（非特許文献７を参照）。Ｒａｃ１は、活性酸素種（ＲＯＳ）を産生する際、重要な役割を有することが知られている。Ｒａｃ１が、ＲＯＳ産生を増加させ、心筋肥大やリモデリングを増加させることが報告されていることから、心血管肥大の重要なメディエーターである可能性が示唆されている（非特許文献８を参照）。
【０００４】
アンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）により誘導される心肥大を有するマウスモデルにおいて、シンバスタチンが心臓および血管平滑筋中のＲａｃ１の下流に存在するニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）オキシダーゼ活性を阻害することが報告されている（非特許文献９および１０を参照）。これらの知見はヒト心臓組織の解析により支持されており、スタチンは、Ｒａｃ１の活性化によるＲＯＳ産生を抑制することが報告されている（非特許文献１１を参照）。これにより本発明者らは、低用量スタチンの多面的効果が、Ｒｈｏ／Ｒｈｏキナーゼ経路よりむしろＲａｃ１経路の阻害によって主として媒介されることを提案した（非特許文献７を参照）。
【０００５】
低分子量ＧＴＰ結合タンパク質ＧＤＰ解離刺激因子（ＳｍｇＧＤＳ）は、アルマジロ（ＡＲＭ）タンパクファミリーの中で、唯一グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）にも属している（非特許文献１２および１３を参照）。最近、心疾患におけるＧＥＦの役割が脚光を浴びている（非特許文献１４〜１６を参照）。また、精製されたＳｍｇＧＤＳが低分子量ＧＴＰアーゼのＣ末端の多塩基領域（ＰＢＲ）と相互作用し、ＧＥＦ機能によって、ＲｈｏＡおよびＲｈｏＣを活性化することが報告されている（非特許文献１７を参照）。さらに、Ｒａｃ１のＰＢＲに、ＲｈｏＡには存在しない機能性核移行シグナル（ＮＬＳ）配列が存在することが報告されている（非特許文献１３を参照）。ＮＬＳを有するＲａｃ１は、ＳｍｇＧＤＳと結合し、核内へ移行することにより、プロテアソーム系によって分解される可能性がある（非特許文献１８を参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Scandinavian SimvastatinSurvival Study Group. Randomized trial of cholesterol lowering in 4444 patientswith coronary heart disease: the Scandinavian Survival Study (4S). Lancet 344,1383-1389 (1994)
【非特許文献２】Levine, G.N., Keaney,Jr., J.F. & Vita, J.A., N. Engl. J. Med. 332, 512-521 (1995)
【非特許文献３】Davignon J., Circulation109, 39-43 (2004)
【非特許文献４】Rikitake, Y., Liao, J.K.,Circ. Res. 97, 1232-1235 (2005)
【非特許文献５】Hall, A., Science 279,509-514 (1998)
【非特許文献６】Takemoto, M., Liao JK., Arterioscler.Thromb. Vasc. Biol. 21, 1712-1719 (2001)
【非特許文献７】Rashid M. et al., Circ.J. 73, 361-370 (2009)
【非特許文献８】Brown J.H., Del Re,D.P., Sussman, M.A., Circ. Res. 98, 730-742 (2006)
【非特許文献９】Takemoto M. et al., J.Clin. Invest. 108, 1429-1437 (2001)
【非特許文献１０】Wassmann, S. et al., Mol.Pharmacol. 59, 646-654 (2001)
【非特許文献１１】Maack, C. et al., Circulation108, 1567-1574 (2003)
【非特許文献１２】Yamamoto, T. et al., J.Biol. Chem. 265, 16626-16634 (1990)
【非特許文献１３】Williams, C.L., Cellsignal. 15, 1071-1080 (2003)
【非特許文献１４】Guilluy, C. et al., Nat.Med. 16, 183-190 (2010)
【非特許文献１５】Sauzeau, V., Sevilla,M.A., Montero, M.J. & Bustelo, X.R., J. Clin. Invest. 120, 315-330 (2010)
【非特許文献１６】Sauzeau, V. et al., Nat.Med. 12, 841-845 (2006)
【非特許文献１７】Hamel, B. et al., J.Biol. Chem. 286, 12141-12148 (2011)
【非特許文献１８】Lannning, C.C. et al., J.Biol. Chem. 279, 44197-44210 (2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の通り、Ｒｈｏ、ＲａｃおよびＲａｓなどの低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性とスタチンの多面的効果との間には、なんらかの関係性があると考えられている。しかし、低用量スタチンの多面的作用の分子機序については、未だ不明な点が多い。
【０００８】
また、本発明者らは、低用量スタチンの多面的効果がＲａｃ１経路の阻害によって主として媒介される可能性を提案した。しかし、低用量スタチンによるＲａｃ１シグナル経路の選択的阻害の分子機序は未だ解明されていない。また、そのことに起因して、現在臨床的に用いられているスタチンのほとんどが、高コレステロール血症に対する治療薬として用いられており、心疾患、たとえば、心血管肥大症への適用について十分に検討されていない。
【０００９】
そこで、本発明は、スタチンによるＲａｃ１シグナル経路の選択的阻害の分子機序の一端を解明することにより、心疾患を罹患している患者に対して、スタチンの用法・用量を決定する方法を提供することを、発明が解決しようとする課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、これまでに得られた知見について検討を重ねたところ、スタチンによるＲａｃ１シグナル経路の選択的阻害に係る分子メカニズムにおいて、ＳｍｇＧＤＳが重要な役割を果たすのではないかと仮定した。そこで、鋭意研究開発を進めて得られた本発明者らの結果は、動物およびヒトにおいて、核内Ｒａｃ１の分解の増大をもたらすスタチンの多面的効果の分子機序では、ＳｍｇＧＤＳが重大な役割を果たすという最初の証拠となるものである。この分子メカニズムは図６により概略される。
【００１１】
まず、スタチンは、細胞質中のＳｍｇＧＤＳ発現を増加させる。第２に、ＳｍｇＧＤＳはＲａｃ１と結合して、核へ輸送する。第３に、Ｒａｃ１は核プロテアソームによって分解される。第４に、Ｒａｃ１の分解はＲＯＳ産生の減少を引き起こす。最後に、このＲＯＳ産生の減少は心血管の保護、すなわち、心血管肥大症、心筋細胞肥大症、血管周囲線維化症または冠動脈硬化症といった心疾患の治療や予防に関するスタチンの多面的効果が引き起こされる（図６）。本発明は、このような知見に基づいて完成された発明である。
【００１２】
したがって、本発明によれば、（１）スタチンの投与前および投与後において、心疾患を罹患した患者における細胞内のＳｍｇＧＤＳ発現量を測定する工程、および、（２）前記工程（１）で測定されたＳｍｇＧＤＳ発現量を基準に前記患者に対するスタチンの種類および／または投与量を決定する工程を含む、心疾患を罹患した患者へのスタチンの用法および／または用量を決定する方法が提供される。
【００１３】
好ましくは、前記心疾患が、心血管肥大症、心筋細胞肥大症、心血管周囲線維化、冠動脈硬化症、高血圧症または心不全である。
【００１４】
好ましくは、前記スタチンが、アトルバスタチン、ジヒドロコンパクチン、ベルバスタチン、カルバスタチン、セリバスタチン、クリルバスタチン、ダルバスタチン、フルバスタチン、グレンバスタチン、フルインドスタチン、ベロスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、コンパクチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、リバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、シリバスタチン、ＣＩ−９８１およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される。
【００１５】
好ましくは、前記基準が、スタチン投与後のＳｍｇＧＤＳ発現量がスタチン投与前のＳｍｇＧＤＳ発現量の１．４倍以上である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の方法によれば、心疾患を罹患している患者に対して、使用すべきスタチンの種類および／または投与量を決定することにより、スタチンの用法・用量を決定することができる。本発明の方法の利点としては、疾患の症状ではなく、細胞内ＳｍｇＧＤＳ発現量を確認することにより、迅速かつ客観的に、治療時のスタチンの用法・用量を決定できる。 
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１ａ】図１ａは、スタチンがＧＳＫ−３β経路を介してＨＵＶＥＣ中のＳｍｇＧＤＳを増加させたことを示す図である。ＨＵＶＥＣを用いてアトルバスタチン（ＡＴＯＲ）を２４時間作用させた後のＳｍｇＧＤＳタンパク質の発現量を示す（ｎ＝３）。結果は平均値±ｓ．ｅ．ｍとして表される。
【図１ｂ】図１ｂは、スタチンがＧＳＫ−３β経路を介してＨＵＶＥＣ中のＳｍｇＧＤＳを増加させたことを示す図である。ＨＵＶＥＣを用いてピタバスタチン（ＰＩＴＡ）を２４時間作用させた後のＳｍｇＧＤＳタンパク質の発現量を示す（ｎ＝３）。結果は平均値±ｓ．ｅ．ｍとして表される。
【図１ｃ】図１ｃは、スタチンがＧＳＫ−３β経路を介してＨＵＶＥＣ中のＳｍｇＧＤＳを増加させたことを示す図である。ＨＵＶＥＣを用いてＧＳＫ−３β阻害薬であるＳＢ２１６７６３を２４時間作用させた後のＳｍｇＧＤＳタンパク質の発現量を示す（ｎ＝３）。結果は平均値±ｓ．ｅ．ｍとして表される。
【図１ｄ】図１ｄは、スタチンがＧＳＫ−３β経路を介してＨＵＶＥＣ中のＳｍｇＧＤＳを増加させたことを示す図である。ＨＵＶＥＣを用いてＲｈｏキナーゼ阻害薬を２４時間作用させた後のＳｍｇＧＤＳタンパク質の発現量を示す（ｎ＝３）。結果は平均値±ｓ．ｅ．ｍとして表される。
【図１ｅ】図１ｅは、スタチンがＧＳＫ−３β経路を介してＨＵＶＥＣ中のＳｍｇＧＤＳを増加させたことを示す図である。ＨＵＶＥＣを用いて、アトルバスタチンおよびピタバスタチンに加えてファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ、１０μＭ）およびゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ、１０μＭ）を作用させた後のＳｍｇＧＤＳタンパク質の発現量を示す（ｎ＝３）。結果は平均値±ｓ．ｅ．ｍとして表される。
【図２ａ】図２ａは、ＨＵＶＥＣの細胞分画中のタンパク質発現に対するアトルバスタチンの影響を示した図である。アトルバスタチン（ＡＴＯＲ、１０μＭ）を用いてＨＵＶＥＣを２４時間インキュベーションした後のウエスタンブロット解析結果を示す。
【図２ｂ】図２ｂは、ＨＵＶＥＣ細胞分画中のタンパク質発現に対するアトルバスタチンの影響を示した図である。Ｒａｃ１の定量解析結果を示す（ｎ＝３）。結果は平均値±ｓ．ｅ．ｍとして表される。
【図２ｃ】図２ｃは、ＨＵＶＥＣ細胞分画中のタンパク質発現に対するアトルバスタチンの影響を示した図である。ＳｍｇＧＤＳの定量解析結果を示す（ｎ＝３）。結果は平均値±ｓ．ｅ．ｍとして表される。
【図２ｄ】図２ｄは、ＨＵＶＥＣ細胞分画中のタンパク質発現に対するアトルバスタチンの影響を示した図である。核分画中のＲａｃ１発現について、アトルバスタチンに加えてプロテアソーム阻害剤（ＭＧ−１３２）を作用させた際の影響を示す（ｎ＝３）。結果は平均値±ｓ．ｅ．ｍとして表される。
【図２ｅ】図２ｅは、ＨＵＶＥＣ中のタンパク質発現に対するアトルバスタチンの影響を示した図である。コントロールまたはＳｍｇＧＤＳのｓｉＲＮＡを導入し、４８時間後、アトルバスタチンを加え、２４時間作用させた後のＲａｃ１の発現量を示す（ｎ＝３）。結果は平均値±ｓ．ｅ．ｍとして表される。
【図２ｆ】図２ｆは、酸化ストレスに対するアトルバスタチンの影響を示した図である。ＨＵＶＥＣをアトルバスタチン（１μＭ）で２４時間プレインキュベートし、１μＭのＡｎｇＩＩを３時間作用させた後のＨＵＶＥＣのジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）染色の結果を示す。
【図２ｇ】図２ｇは、酸化ストレスに対するアトルバスタチンの影響を示した図である。輝度定量解析の結果を示す（ｎ＝８）。結果は平均値±ｓ．ｅ．ｍとして表される。
【図３ａ】図３ａは、スタチンによる改善作用がＡｎｇＩＩ誘導型心臓肥大および線維化を有するＳｍｇＧＤＳ欠損マウスにおいて見られないことを示した図である。コントロール（−）、アトルバスタチン（ＡｎｇＩＩ＋ＡＴＯＲ、１０ｍｇ／ｋｇ／日）またはプラバスタチン（ＡｎｇＩＩ＋ＰＲＡ、５０ｍｇ／ｋｇ／日）のいずれかで処理したＡｎｇＩＩ投与マウスおよびＡｎｇＩＩ投与マウス（溶媒投与、ＡｎｇＩＩ（＋））における心臓のマッソン・トリクローム染色の結果を示す。心筋の肥大（上部）。間質性心筋の線維化（中間）。冠動脈の血管周囲領域の線維化（下部）。
【図３ｂ】図３ｂは、スタチンによる改善作用がＡｎｇＩＩ誘導型心臓肥大および線維化を有するＳｍｇＧＤＳ欠損マウスにおいて見られないことを示した図である。溶媒またはスタチンを投与されたＳｍｇＧＤＳ＋／＋マウスおよびＳｍｇＧＤＳ＋／−マウスの心臓重量／体重比を、ＡｎｇＩＩ注入の２週間後に測定した結果を示す（ｎ＝１０）。結果は平均値±ｓ．ｅ．ｍとして示される。
【図３ｃ】図３ｃは、スタチンによる改善作用がＡｎｇＩＩ誘導型心臓肥大および線維化を有するＳｍｇＧＤＳ欠損マウスにおいて見られないことを示した図である。溶媒またはスタチンで処理されたＳｍｇＧＤＳ＋／＋マウスおよびＳｍｇＧＤＳ＋／−マウスの心筋細胞の断面積を、ＡｎｇＩＩ注入の２週間後に測定した結果を示す（ｎ＝１０）。結果は平均値±ｓ．ｅ．ｍとして示される。
【図３ｄ】図３ｄは、スタチンによる改善作用がＡｎｇＩＩ誘導型心臓肥大および線維化を有するＳｍｇＧＤＳ欠損マウスにおいて見られないことを示した図である。間質性心筋の線維化の定量解析結果を示す（ｎ＝１０）。結果は平均値±ｓ．ｅ．ｍとして示される。
【図３ｅ】図３ｅは、スタチンによる改善作用がＡｎｇＩＩ誘導型心臓肥大および線維化を有するＳｍｇＧＤＳ欠損マウスにおいて見られないことを示した図である。血管周囲領域の線維化の定量解析結果を示す（ｎ＝１０）。結果は平均値±ｓ．ｅ．ｍとして示される。
【図３ｆ】図３ｆは、スタチンによる改善作用がＡｎｇＩＩ誘導型心臓肥大および線維化を有するＳｍｇＧＤＳ欠損マウスにおいて見られないことを示した図である。心臓血管のリモデリングの定量解析結果を示す（ｎ＝１０）。結果は平均値±ｓ．ｅ．ｍとして示される。
【図４ａ】図４ａは、スタチンによる改善作用がＡｎｇＩＩ誘導型の心臓拡張機能障害を有するＳｍｇＧＤＳ欠損マウスにおいて見られないことを示した図である。コントロール（−）、アトルバスタチン（ＡｎｇＩＩ＋ＡＴＯＲ、１０ｍｇ／ｋｇ／日）またはプラバスタチン（ＡｎｇＩＩ＋ＰＲＡ、５０ｍｇ／ｋｇ／日）のいずれかで処理されたＡｎｇＩＩ投与マウスおよびＡｎｇＩＩ投与マウス（溶媒投与、ＡｎｇＩＩ（＋））の超音波心臓検査の結果を示す。図４ａは、心臓の壁厚についての結果を示す（ｎ＝１０）。結果は平均値±ｓ．ｅ．ｍとして示される。
【図４ｂ】図４ｂは、スタチンによる改善作用がＡｎｇＩＩ誘導型の心臓拡張機能障害を有するＳｍｇＧＤＳ欠損マウスにおいて見られないことを示した図である。コントロール（−）、アトルバスタチン（ＡｎｇＩＩ＋ＡＴＯＲ、１０ｍｇ／ｋｇ／日）またはプラバスタチン（ＡｎｇＩＩ＋ＰＲＡ、５０ｍｇ／ｋｇ／日）のいずれかで処理されたＡｎｇＩＩ投与マウスおよびＡｎｇＩＩ投与マウス（溶媒投与、ＡｎｇＩＩ（＋））の超音波心臓検査の結果を示す。図４ｂは、左室内径短縮率についての結果を示す（ｎ＝１０）。結果は平均値±ｓ．ｅ．ｍとして示される。
【図４ｃ】図４ｃは、スタチンによる改善作用がＡｎｇＩＩ誘導型の心臓拡張機能障害を有するＳｍｇＧＤＳ欠損マウスにおいて見られないことを示した図である。コントロール（−）、アトルバスタチン（ＡｎｇＩＩ＋ＡＴＯＲ、１０ｍｇ／ｋｇ／日）またはプラバスタチン（ＡｎｇＩＩ＋ＰＲＡ、５０ｍｇ／ｋｇ／日）のいずれかで処理されたＡｎｇＩＩ投与マウスおよびＡｎｇＩＩ投与マウス（溶媒投与、ＡｎｇＩＩ（＋））の超音波心臓検査の結果を示す。図４ｃは、Ｅ／Ａ比についての結果を示す（ｎ＝１０）。結果は平均値±ｓ．ｅ．ｍとして示される。
【図４ｄ】図４ｄは、スタチンによる改善作用がＡｎｇＩＩ誘導型の心臓拡張機能障害を有するＳｍｇＧＤＳ欠損マウスにおいて見られないことを示した図である。コントロール（−）、アトルバスタチン（ＡｎｇＩＩ＋ＡＴＯＲ、１０ｍｇ／ｋｇ／日）またはプラバスタチン（ＡｎｇＩＩ＋ＰＲＡ、５０ｍｇ／ｋｇ／日）のいずれかで処理されたＡｎｇＩＩ投与マウスおよびＡｎｇＩＩ投与マウス（溶媒投与、ＡｎｇＩＩ（＋））の超音波心臓検査の結果を示す。図４ｄは、心拍数についての結果を示す（ｎ＝１０）。結果は平均値±ｓ．ｅ．ｍとして示される。
【図５ａ】図５ａは、スタチンがヒトにおいてＳｍｇＧＤＳを増加させることを示した図である。ヒトの循環白血球中のＳｍｇＧＤＳのタンパク質量を示す。プラバスタチン（ＰＲＡ、２０ｍｇ／日）またはアトルバスタチン（ＡＴＯＲ、２０ｍｇ／日）を２週間投与した後、投与前と比較して著しくＳｍｇＧＤＳ値を増加させることを示した図である（ｎ＝２０）。結果は平均値±ｓ．ｄとして示される。
【図５ｂ】図５ｂは、スタチンがヒトにおいてＳｍｇＧＤＳを増加させることを示した図である。ヒトのＳｍｇＧＤＳ変化およびＬＤＬコレステロール変化の間の相関を示す（ｎ＝２０）。
【図５ｃ】図５ｃは、スタチンがヒトにおいてＳｍｇＧＤＳを増加させることを示した図である。ヒトのＳｍｇＧＤＳ変化およびＬＤＬコレステロール変化の間の相関を示す（ｎ＝２０）。
【図５ｄ】図５ｄは、スタチンがヒトにおいてＳｍｇＧＤＳを増加させることを示した図である。ヒトのＳｍｇＧＤＳ変化およびＭＤＡ−ＬＤＬコレステロール変化の間の相関を示す（ｎ＝２０）。
【図５ｅ】図５ｅは、スタチンがヒトにおいてＳｍｇＧＤＳを増加させることを示した図である。ヒトのＳｍｇＧＤＳ変化およびＭＤＡ−ＬＤＬコレステロール変化の間の相関を示す（ｎ＝２０）。
【図６】図６は、スタチンの多面的効果の新規分子機序を概略化した図である。低用量スタチンは、ＧＳＫ−３βを介してＳｍｇＧＤＳを増加させる。増加したＳｍｇＧＤＳは、Ｒａｃ１と結合し、核に移行させる。核内に移行したＲａｃ１は、プロテアソームにより分解される。Ｒａｃ１の分解は、ＲＯＳの産生を減らし、最終的に、心筋細胞肥大や線維化、そして心肥大を抑制し、スタチンの多面的作用をもたらす。
【図７ａ】図７ａは、ＨＵＶＥＣの細胞分画中のタンパク質発現に対するピタバスタチンの影響を示した図である。ピタバスタチン（ＰＩＴＡ、１μＭ）を用いてＨＵＶＥＣを２４時間インキュベーションした後のウエスタンブロット解析結果を示す。
【図７ｂ】図７ｂは、ＨＵＶＥＣの細胞分画中のタンパク質発現に対するピタバスタチンの影響を示した図である。Ｒａｃ１およびＳｍｇＧＤＳの定量解析結果を示す（ｎ＝３）。結果は平均値±ｓ．ｅ．ｍとして表される。
【図７ｃ】図７ｃは、ＨＵＶＥＣ細胞分画中のタンパク質発現に対するピタバスタチンの影響を示した図である。ＳｍｇＧＤＳの定量解析結果を示す（ｎ＝３）。結果は平均値±ｓ．ｅ．ｍとして表される。
【図７ｄ】図７ｄは、ＨＵＶＥＣ細胞分画中のタンパク質発現に対するピタバスタチンの影響を示した図である。核分画中のＲａｃ１発現について、ピタバスタチンに加えてプロテアソーム阻害剤（ＭＧ−１３２）を作用させた際の影響を示す（ｎ＝３）。結果は平均値±ｓ．ｅ．ｍとして表される。
【図７ｅ】図７ｅは、ＨＵＶＥＣ中のタンパク質発現に対するピタバスタチンの影響を示した図である。コントロール、またはＳｍｇＧＤＳのｓｉＲＮＡを導入し、４８時間後、ピタバスタチンを加え、２４時間作用させた後のＲａｃ１の発現量を示す（ｎ＝３）。結果は平均値±ｓ．ｅ．ｍとして表される。
【図８ａ】図８ａは、酸化ストレスに対するピタバスタチンの影響を示した図である。ＨＵＶＥＣをピタバスタチン（０．１μＭ）で２４時間プレインキュベートし、１μＭのＡｎｇＩＩを３時間作用させた後のＨＵＶＥＣのジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）染色の結果を示す。
【図８ｂ】図８ｂは、酸化ストレスに対するピタバスタチンの影響を示した図である。輝度定量解析の結果を示す（ｎ＝８）。結果は平均値±ｓ．ｅ．ｍとして表される。
【図９】図９は、臨床研究の実験計画のフロー図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の詳細について説明する。
【００１９】
本発明によれば、以下の工程を含む、心疾患を罹患した患者へのスタチンの用法、用量またはそれらの両方を決定する方法が提供される。
（１）スタチンの投与前および投与後において、心疾患を罹患した患者における細胞内のＳｍｇＧＤＳ発現量を測定する工程（以下、工程（１）ともよぶ。）
（２）前記工程（１）で測定されたＳｍｇＧＤＳ発現量を基準に前記患者に対するスタチンの種類および／または投与量を決定する工程（以下、工程（２）ともよぶ。）
【００２０】
心疾患とは、心臓の疾患の総称である。本発明の方法は、スタチンの多面的効果の一つとしてスタチンが活性酸素種（ＲＯＳ）を減少させることに基づいていることから、本発明の方法において対象となる心疾患は、ＲＯＳに起因する心疾患が好ましく、たとえば、心血管肥大症、心筋細胞肥大症、心血管周囲線維化、冠動脈硬化症、高血圧症、心不全などである。
【００２１】
本発明の方法において対象となる心疾患を罹患した患者は、特に制限されず、現に心疾患を罹患している患者のみならず、心疾患の既往歴がある者、遺伝的または体質的に心疾患に罹患するおそれがある者、他の疾患との関係で心疾患に罹患する可能性がある者などを含む。また、心疾患の進行の程度についても特に制限はない。
【００２２】
スタチンは、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤ともいわれ、図６に示すＲｈｏ／Ｒｈｏ−キナーゼ経路におけるＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸塩へ変換する反応を触媒する酵素であるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを阻害する薬剤として知られている。スタチンとしては、種々のものが知られており、現在臨床で使用されているものの他にも、販売または開発が中止になったもの、現在臨床実験が進められているものなどがある。本発明の方法において対象となるスタチンは、特に制限はなく、スタチンとして知られているもののすべてを含むが、好ましくは、アトルバスタチン、ジヒドロコンパクチン、ベルバスタチン、カルバスタチン、セリバスタチン、クリルバスタチン、ダルバスタチン、フルバスタチン、グレンバスタチン、フルインドスタチン、ベロスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、コンパクチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、リバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、シリバスタチン、ＣＩ−９８１およびそれらの薬学的に許容される塩である。
【００２３】
本明細書におけるスタチンは、化合物としてのスタチンに限らず、スタチンと賦形剤とを配合してなるスタチン製剤を含む。スタチン製剤としては、たとえば、アトルバスタチン塩を有効成分とするリピトール錠、プラバスタチン塩を有効成分とするメバロチン錠などが挙げられる。
【００２４】
スタチンは、これまで高脂血症や高コレステロール血症の治療剤として臨床的に使用されており、心血管肥大症や心筋細胞肥大症などの心疾患の治療剤としては臨床的に使用されていない。本発明の方法は、このような現状を鑑みて、心疾患へのスタチンの臨床的応用を促進することを目的としてなされたものである。したがって、本発明は、スタチンの臨床的応用のさらなる可能性を追求した、画期的な発明である。本発明の方法によれば、心疾患の治療の選択肢が広がることから、本発明は患者および医師の双方にとって非常に有益なものである。
【００２５】
本発明の方法における工程（１）では、スタチンの投与前および投与後において、心疾患を罹患した患者における細胞内のＳｍｇＧＤＳ発現量を測定する。ＳｍｇＧＤＳ発現量の測定は、当業者により知られている細胞内タンパク質を定量化する方法を応用して実施できるが、たとえば、心疾患を罹患した患者から生体試料を採取し、次いで生体試料における細胞を単離し、次いで細胞をホモジナイズしてＳｍｇＧＤＳを含む溶解物を取得し、次いでＳｍｇＧＤＳを定量することにより実施する。
【００２６】
より具体的には、絶食条件下で心疾患を罹患した患者の静脈血を採血し、次いで白血球を単離し、次いで単離した白血球を適当な緩衝液を用いて数回洗浄し、次いで洗浄した白血球を溶解用緩衝液に加えて超音波などで破砕して細胞溶解液を得て、次いで得られた細胞溶解液を試料として抗ＳｍｇＧＤＳ抗体などを用いてウエスタンブロット解析を実施することにより白血球内のＳｍｇＧＤＳを定量する。なお、細胞溶解液を細胞下分画して、細胞内でのＳｍｇＧＤＳの偏在を調べるなどしてもよい。
【００２７】
ＳｍｇＧＤＳ発現量の測定は、スタチンの投与前、たとえばスタチンを投与する直前、および投与後、たとえばスタチンを投与した２４時間後の少なくとも２回、心疾患を罹患した患者から採取した生体試料に基づいて実施する。
【００２８】
本発明の方法における工程（２）では、工程（１）で測定されたＳｍｇＧＤＳ発現量を基準に心疾患を罹患した患者に対するスタチンの種類、投与量またはそれらの両方を決定する。本発明の方法は、スタチンのＲＯＳの減少効果に基づいて、心疾患を罹患した患者に対してスタチンの臨床的応用を促すものである。スタチンのＲＯＳ減少効果は、スタチンがＧＳＫ−３βを阻害し、それによりＧＳＫ−３βが標的とするＳｍｇＧＤＳが細胞内で増加またはその活性が増強することによってもたらされる。すなわち、ＳｍｇＧＤＳは核にＲａｃ１を輸送する。Ｒａｃ１は核プロテアソームによって分解される。Ｒａｃ１分解はＲＯＳ生産の減少を引き起こす。ＲＯＳ生成量の上昇は心筋細胞の肥大および血管周囲の線維化を引き起こすので、Ｒａｃ１が媒介するＲＯＳ生成量の減少化は心血管の肥大を減少させることにつながる。したがって、スタチンを心疾患患者に投与した際にＳｍｇＧＤＳの細胞内発現量が上昇していれば、該患者において心疾患の改善が見込める。
【００２９】
本発明の方法において、スタチン投与前と投与後の細胞内ＳｍｇＧＤＳ発現量を比較し、投与後の発現量が投与前の発現量と変わらない、または減少している場合、投与すべきスタチンの種類を変える、スタチンの投与量を増量する、それらの両方を実施するといった選択肢を取り得る。いずれの選択肢を採用するかはスタチンの投与回数や投与期間などを考慮して決定すればよく、たとえば、はじめにスタチンの投与量を増量し、次いで投与前後で細胞内ＳｍｇＧＤＳ発現量に差異が見られない場合は、スタチンの種類を変えるよう決定できる。これとは逆に、投与後のＳｍｇＧＤＳ発現量が投与前のＳｍｇＧＤＳ発現量よりも増加している場合は、スタチンの投与量を変えないように決定する。
【００３０】
また、実施例において示されている通り、プラバスタチンの１０ｍｇ投与により、被験者においては、ＬＤＬコレステロールの減少は認められるけれども、ＳｍｇＧＤＳの増加が認められない場合がある。この場合、ＬＤＬコレステロールの増減を基準としては、スタチン投与量の増量や薬剤変更は考慮され得ず、心疾患を罹患した患者に対してスタチンの有効量を投与できない。したがって、本発明の方法を採用することによりはじめて、細胞内ＳｍｇＧＤＳ発現量の増減を基準とすることにより、心疾患を罹患した患者に対して適切なスタチンの有効量を投与することが可能となる。
【００３１】
図５ａの結果を考慮すれば、スタチンの１０ｍｇ投与を２０ｍｇ投与へ変更することにより細胞内ＳｍｇＧＤＳ発現量は１．４倍以上増加し得ることから、スタチン投与後のＳｍｇＧＤＳ発現量がスタチン投与前のＳｍｇＧＤＳ発現量の１．４倍以上であるか否かを基準として、スタチンの種類や投与量を決定するのが好ましい。
【００３２】
本発明の方法は、本発明の目的を達成し得る範囲において、工程（１）および工程（２）のそれぞれの工程の前後に他の工程を組み入れることを排除しない。また、本発明の方法により心疾患患者に対して有益なスタチンの種類および投与量を決定することができるが、本発明の方法と合わせて心疾患の程度の指標となる様々な数値や症状などと組み合わせて、スタチンの種類および投与量を決定できる。
【００３３】
当業者であれば、本発明の方法の有用性について、後述する実施例において示されている種々の実験結果により把握できる。そのような結果の一例として、培養内皮細胞において、スタチンは、メバロン酸塩またはＲｈｏ／Ｒｈｏキナーゼ経路と無関係にＳｍｇＧＤＳ発現を増強し、Ｒａｃ１分解を増加させ、かつ、ＲＯＳの生成量を増加させたとの結果；ＳｍｇＧＤＳ欠損マウスではスタチンの心血管の保護効果は見られなかったとの結果；正常な健常個体においてスタチンは著しくＳｍｇＧＤＳ発現を増加させたとの結果；ＳｍｇＧＤＳ発現量と酸化ストレスマーカーとの間に有意な逆相関があったとの結果；総コレステロールまたはＬＤＬコレステロールと酸化ストレスマーカーとの間に相関は見られなかったとの結果などである。当業者であれば、これらの結果を参照することにより、メバロン酸塩およびＲｈｏ／Ｒｈｏキナーゼ経路の阻害に加えて、Ｒａｃ１分解の増加を媒介するスタチンの有益かつ新規な活性メカニズムを認識し、ひいては本発明の方法が有益かつ新規なものであることを認識し得る。
【００３４】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【実施例】
【００３５】
第１  実験方法の概要
ＨＵＶＥＣをスタチンにより２４時間処理し、次いで回収した。処理後、溶解バッファーを細胞に加え、次いで超音波処理をした。タンパク質発現値をウエスタンブロット解析によって測定した。細胞分画は市販の細胞分画キットを用いて実施した。ＳｍｇＧＤＳに対するｓｉＲＮＡの導入はチリらの文献（Ｔｈｉｌｌ，Ｒ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｗ．Ｂ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｃ．Ｌ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０４，  １７６０−１７７０（２００８））に従い行った。ＨＵＶＥＣにおいてｓｉＲＮＡを用いてＳｍｇＧＤＳをノックダウンした後、Ｒａｃ１発現量およびＡｎｇＩＩ誘導性ＲＯＳ生産量をサトーらの文献（Ｓａｔｏｈ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１５，６４９−６５６（２００８））の記載に従って測定した。ＳｍｇＧＤＳ欠損マウスは大阪府立成人病センター研究所から入手した（タカクラらの文献（Ｔａｋａｋｕｒａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １１，１８７５−１８８６（２０００））を参照）。マウスのＡｎｇＩＩ誘導心血管肥大モデルは、ヤギらの文献（Ｙａｇｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１０２，６８−７６（２００８））の記載に従って作製した。２週間、毎日、強制経口投与によってマウスにスタチンを投与した。ＡｎｇＩＩを浸透圧ポンプにて２週間持続投与後、本発明者らは超音波診断システムを使用して左心室機能および心臓の重量を測定した。上記ヤギらの文献に記載されている通り、断面積、壁厚および線維化を測定するために組織学的実験を実施した。ヒトの研究は、日本の東北大学病院にて、単一施設の、無作為化された交差実験として実施した。合計２０人の健康な被験者に２週に渡って、毎日、２０ｍｇのアトルバスタチンまたは２０ｍｇのプラバスタチンのいずれかを無作為に投与した。２週に渡る休薬期間を経た後、次いで２週に渡って、被験者に別の薬剤を服用させるように切り替えた。脂質プロファイル、ＰＭＮＬ中のＳｍｇＧＤＳ発現値、および薬物安全性を測定するために、治療前およびスタチンの最後の摂取の２４時間後に、絶食条件下で静脈血を採血した。リューらの文献（Ｌｉｕ，Ｐ．Ｙ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｈ．，Ｌｉｎ，Ｌ．Ｊ．，Ｌｉａｏ，Ｊ．Ｋ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．４９，１６１９−１６２４（２００７））に記載されたものをわずかに修正した方法に従って白血球を単離した。
【００３６】
第２  実験の詳細
１  細胞培養および薬剤処理
ヒト臍帯静脈の内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（タカラＢｉｏ社、大津、日本）を、培地（ＥＧＭ−２、ロンザ）にて、５％  ＣＯ２にて３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、異なる濃度（１−３０μＭ）の各スタチン（アトルバスタチンおよびピタバスタチン）、ＧＳＫ−３β阻害剤（塩化リチウム、シグマ）またはＲｈｏキナーゼ阻害剤（ヒドロキシファスジル）を用いて細胞を２４時間処理した。本発明者らは、スタチンと共にファルネシルピロリン酸（シグマ）もしくはゲラニルゲラニルピロリン酸（シグマ）を用いて２４時間、またはプロテアソーム阻害剤であるＭＧ−１３２（カルバイオケム）を用いて１４時間、ＨＵＶＥＣを共処理した。各薬剤処理後、細胞を、氷冷したリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２度洗浄し、次いで溶解用緩衝液を加えた後に超音波で処理した。細胞下分画をＱｐｒｏｔｅｏｍｅ細胞コンパートメントキット（キアゲン）を用いて実施した。
【００３７】
２  ウエスタンブロット解析
ＨＵＶＥＣおよびヒトＰＭＮＬにおけるＲｈｏＡ、Ｒａｃ１およびＳｍｇＧＤＳの発現値を定量するために、同数のタンパク質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードし、ＰＶＤＦ膜（ＧＥヘルスケア）に転写した。さらに転写後のＰＶＤＦ膜を、抗ＲｈｏＡ（サンタクルズ）、抗Ｒａｃ１（ミリポア）、抗ＳｍｇＧＤＳ（ＢＤトランスダクション・ラボ）、抗β−アクチン（シグマ）、抗ＧＡＰＤＨ（サンタクルズ）、抗ＴＩＭ２３（ＢＤトランスダクション・ラボ）および抗ＬＡＭＩＮ  Ａ／Ｃ（ＢＤトランスダクション・ラボ）を用いて、イムノブロットした。ホースラディシュ・ペルオキシダーゼをコンジュゲートしたウサギ抗マウス、ヤギ抗ウサギまたはロバ抗ヤギＩｇＧ抗体でインキュベートした後に、増強型化学発光システム（ＥＣＬウェスタンブロッティング検出キット、ＧＥヘルスケア）を用いてブロットを視覚化した。濃度解析はイメージＪ（ＮＩＨ）ソフトウェアを用いて実施した。
【００３８】
３  ＨＵＶＥＣへのｓｉＲＮＡの導入
ＳｍｇＧＤＳに対するｓｉＲＮＡはＱｉａｇｅｎから購入した。Ｑｉａｇｅｎによって設計された機能的な非標的ｓｉＲＮＡを、コントロールとして使用した。１０ｎＭのコントロールｓｉＲＮＡまたは１０ｎＭのＳｍｇＧＤＳに特異的なｓｉＲＮＡのいずれかをＨｉＰｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬（キアゲン）を用いてＨＵＶＥＣに導入した。導入から７２時間後、細胞をウエスタンブロット解析またはＲＯＳ解析によって解析した。
【００３９】
４  活性酸素種解析
ＨＵＶＥＣ中の細胞内ＲＯＳ生産をサトーらの文献（Ｓａｔｏｈ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．、  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１５，６４９−６５６（２００８））の記載に従って測定した。本発明者らは５％ＣＯ２において３７℃で３時間、ＡｎｇＩＩ（１μＭ、和光）を用いてＨＵＶＥＣを処理した。次いでＰＢＳでＨＵＶＥＣを洗浄し、さらに３７℃で３０分間、２，７−ジクロロフルオレセインジアセテート（Ｈ２ＤＣＦ−ＤＡ）（５μＭ、ケイマン）を用いてＨＵＶＥＣを染色した。蛍光顕微鏡（バイオレボ、キーエンス）を用いて緑蛍光（４８８ｎｍ）でＲＯＳの産生を可視化した。相対的な蛍光強度をＢＺ−ＩＩアナライザー（キーエンス）ソフトウェアで測定した。
【００４０】
５  心血管の肥大の解析および定量化
本発明者らは、東北大学大学院医学部動物実験委員会により承認された実験プロトコルに従ってマウス実験のすべてを実施した。本発明者らは、低用量スタチンの多面的効果に対するＳｍｇＧＤＳ欠損の影響を評価するために、ＡｎｇＩＩ誘発性心肥大モデル（ヤギらの文献(Ｙａｇｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１０２，６８−７６（２００８））を参照）を使用した。本発明者らは、１０週齢のオスＳｍｇＧＤＳ＋／＋同腹子コントロールマウスおよびＳｍｇＧＤＳ＋／−マウスに２週に渡って２．０ｍｇ／ｋｇ／日のＡｎｇＩＩまたは食塩水を投与した。本発明者らは、無菌食塩水にＡｎｇＩＩを溶かし、浸透ミニポンプ（アルゼットモデル２００２，アルゼ社）によって該溶液を投与した。本発明者らは、イソフルオランにより動物に麻酔をかけた。本発明者らは、イソフルオランで麻酔をかけたマウスの背部の皮下にポケットを作製し浸透圧ポンプを留置し縫合した。ＡｎｇＩＩまたは食塩水を投与したマウスの両方を、毎日、２週に渡って、強制経口投与によってスタチンまたは溶媒のいずれかを投与した。すべての切開部位は感染せずに治癒した。ポンプ移植から２週間後に、非侵襲性テール−カフシステム（ＭＫ−２０００、室町）を使用して収縮血圧を測定した。血漿脂質（トリグリセリド、総コレステロール、ＬＤＬコレステロールおよびＨＤＬコレステロール）を、スカイライトバイテックによる高速液体クロマトグラフィーシステムで解析した。心エコー解析を超音波診断システム（Ｖｅｖｏ  ２１００、ビジュアルサイエンス社）を使用して実施した。マウスの毛を刈り、心拍数を約５００ｂｐｍで維持し、左心室のＭモードイメージを記録した。パーセントの室内径短縮率（ＦＳ）および相対的な壁厚を、イケダらの文献（Ｉｋｅｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０，２９６６１−２９６６６（２００５））の記載に従って計算した。
【００４１】
６  スタチンの血漿中濃度
本発明者らは、ヒガシらの文献（Ｈｉｇａｓｈｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９３，７６７−７７５（２００３））の記載に従って、２週に渡ってマウスを処理した後に、スタチン（アトルバスタチンおよびプラバスタチン）の血漿中濃度を測定した。
【００４２】
７  ヒト臨床実験
本プロトコルは、東北大学大学院医学部の臨床研究倫理委員会によって承認された。また、書面による同意を得た後に、２０人の正常健常志願者（表１）を募集した。
【表１】
0005757569.tif 000002
【００４３】
スタチン投与の前およびその最中に、異常な肝臓または腎臓の機能不全を含んでいた方は、除外した。志願者は、２週間のウォッシュアウト間隔を有する無作為交差方法で、２週に渡ってプラバスタチン（２０ｍｇ／日）またはアトルバスタチン（２０ｍｇ／日）を服用した。
【００４４】
８  統計解析
２群間のパラメーターの比較を、スチューデントｔ検定で実施した。統計解析について、一元配置分散分析の後、ダネット検定を実施した。統計的有意差はＪＭＰ  ８（ＳＡＳインスティチュート）で評価した。＜０．０５のＰ値は、統計的に有意であると考えられた。
【００４５】
第３  結果
１  ＨＵＶＥＣにおけるスタチンによるＳｍｇＧＤＳの増加効果
本発明者らは、２種のスタチン（アトルバスタチン、１０μＭおよび３０μＭ；ならびにピタバスタチン１μＭおよび１０μＭ）を用いて２４時間処理した培養ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）内のＳｍｇＧＤＳ発現について検討した。これらの２種のスタチンは、濃度依存的に、ＨＵＶＥＣ中のＳｍｇＧＤＳ発現量を増加させた（図１ａ、ｂ）。これは、スタチンがＳｍｇＧＤＳ発現量を増加させるクラス効果を有するという新規な発見である。
【００４６】
次に、本発明者らは、スタチンがＳｍｇＧＤＳ発現量を増加させるメカニズムについて検討した。スタチンが、ＳｍｇＧＤＳと同じＡＲＭタンパク質ファミリーのメンバーであるβ−カテニンを増大させるとの報告がある（ベルグマンらの文献（Ｂｅｒｇｍａｎｎ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．３７，  ６８１−６９０（２００４））を参照）。これは、グリコゲンシンセターゼキナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）のスタチンによる阻害およびそれによるβ−カテニンのリン酸化の阻害によって引き起こされる（リューらの文献（Ｌｉｕ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １０８，８３７−８４７（２００２））、サリンらの文献（Ｓａｌｉｎｓ，Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．  ４１２，２１１−２１６（２００７））を参照）。リン酸化されたβ−カテニンはユビキチン化されプロテアソームにより分解されるため、β−カテニンのリン酸化の阻害は、β−カテニンの安定性を増加させる。以前に示されているように、ＧＳＫ−３β阻害剤は、β−カテニンの発現量を増加させる（サリンらの文献（Ｓａｌｉｎｓ，Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｌｅｔｔ．  ４１２，２１１−２１６（２００７））を参照））。したがって、本発明者らは、ＨＵＶＥＣ内のＳｍｇＧＤＳ発現量について、ＧＳＫ−３β阻害剤であるＳＢ２１６７６３の作用を検討した。本発明者らが期待した通り、ＳＢ２１６７６３は濃度依存的に、ＳｍｇＧＤＳ発現量を増加させた（図１ｃ）。
【００４７】
次に、本発明者らは、コレステロール生合成経路中の重要な生成物であるファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）およびゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）のようなイソプレノイドが、ＳｍｇＧＤＳ発現量のスタチン誘導型増加を媒介する可能性を検討した（ゴールドステインらの文献（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｂｒｏｗｎ，  Ｍ．Ｓ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４３，４２５−４３０（１９９０））を参照）。ＦＰＰおよびＧＧＰＰが細胞内タンパク質の翻訳後修飾および小型ＧＴＰアーゼの膜への局在ならびにそれらの活性をコントロールするので、それらのタンパク質は、スタチンの多面的効果に中心的な役割を果たすと考えられている（ヴァン・アエルストらの文献（Ｖａｎ  Ａｅｌｓｔ，Ｌ．，Ｄ’Ｓｏｕｚａ−Ｓｃｈｏｒｅｙ，Ｃ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１１，２２９５−２３２２（１９９７））、ワンらの文献（Ｗａｎｇ，  Ｃ．Ｙ．，Ｌｉｕ，Ｐ．Ｙ．，Ｌｉａｏ，Ｊ．Ｋ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  １４，３７−４４（２００８））、ゾウらの文献（Ｚｈｏｕ，Ｑ．，Ｌｉａｏ，Ｊ．Ｋ．，Ｃｉｒｃ．Ｊ．７４，８１８−８２６（２０１０））らの文献を参照）。ＳｍｇＧＤＳのスプライシング変異体が低分子量ＧＴＰアーゼのプレニル化および膜への局在をコントロールすることもまた報告されている（バーグらの文献（Ｂｅｒｇ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５，３５２５５−３５２６６（２０１０））を参照）。したがって、本発明者らは、ＨＵＶＥＣ内のＳｍｇＧＤＳ発現量について、スタチン共処理によるＦＰＰおよびＧＧＰＰの影響を検討した。重要なことに、本発明者らの期待に反して、ＦＰＰまたはＧＧＰＰは、スタチンによるＳｍｇＧＤＳ発現量の増加を阻害しなかった（図１ｂ）。したがって、ＳｍｇＧＤＳ発現量を増加させるスタチンの影響はこれらのイソプレノイドにより媒介されないことが示された。
【００４８】
次に、ＧＥＦ機能がＲｈｏキナーゼによって制御されると報告されているので（タケフジらの文献（Ｔａｋｅｆｕｊｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３５５，７８８−７９４（２００７））を参照）、本発明者らはＳｍｇＧＤＳ発現値の増加がＲｈｏキナーゼ経路へのスタチンの阻害作用によりもたらされる可能性について検討した。本発明者らは、ＨＵＶＥＣにＲｈｏキナーゼ阻害剤であるヒドロキシファスジル（ｈｙｄｒｏｘｙｆａｓｕｄｉｌ）（ＨＦ）を作用させたが、ＨＦはＳｍｇＧＤＳ発現量を増加させなかった（図１ｃ）。したがって、ＳｍｇＧＤＳ発現を増加させるスタチンの作用は、Ｒｈｏキナーゼ経路の阻害によって媒介されないと考えられる。これらの結果から、スタチンがＧＳＫ−３β経路の阻害によってＳｍｇＧＤＳ発現量を増加させることを示した。
【００４９】
２  スタチンのＳｍｇＧＤＳを介したＲＯＳ産生量の抑制
ＨＵＶＥＣにおけるＳｍｇＧＤＳ、Ｒａｃ１およびＲｈｏＡの局在および発現量についてのスタチンの影響を検討するために、本発明者らはスタチンで２４時間処理した後の、ＨＵＶＥＣの細胞質、膜および核分画におけるタンパク質発現量を調べた。その結果、アトルバスタチンは細胞質のＳｍｇＧＤＳ量を増加させ、核内のＲａｃ１量を減少させた（図２ａ−ｃ）。ピタバスタチンもまた細胞質のＳｍｇＧＤＳ量を増加させ、かつ、核内のＲａｃ１量を減少させた（図７ａ−ｃ）。これは、スタチンが核内Ｒａｃ１量を減少させる最初の報告である。
【００５０】
次に、本発明者らは、スタチンが核内のＲａｃ１量を減少させるメカニズムについて検討した。Ｒａｃ１が核のプロテアソームによって分解させられることが報告されている（ラニングらの文献（Ｌａｎｎｉｎｇ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７９，４４１９７−４４２１０（２００４））を参照）。そこで、本発明者らはＨＵＶＥＣをスタチンおよびプロテアソーム阻害剤（ＭＧ−１３２）で処理した。本発明者らが期待した通り、ＭＧ−１３２はアトルバスタチンが引き起こす核内のＲａｃ１発現量の減少を阻害した（図２ｄ）。同様の結果はピタバスタチンでも得られた（図７ｃ）。以上より、スタチンが、Ｒａｃ１の核内プロテアソーム分解を促進させることを実証している。
【００５１】
さらに、本発明者らは、ＳｍｇＧＤＳをｓｉＲＮＡによってノックダウンしたＨＵＶＥＣにおけるスタチンの作用を検討した。コントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞において、アトルバスタチンは、総細胞におけるＲａｃ１発現量を減少させた（図２ｅ）。しかしながら、ＳｍｇＧＤＳのｓｉＲＮＡを導入した細胞では、アトルバスタチンによるＲａｃ１発現量減少作用は認められなかった（図２ｅ）。同様の結果はピタバスタチンを用いても得られた（図７ｄ）。したがって、本発明者らは、スタチンがＳｍｇＧＤＳを介してＲａｃ１分解を促進させるということを明確に示すことができた。
【００５２】
さらに、本発明者らは、スタチンの抗酸化作用を評価することによって、スタチンの多面的効果がＲａｃ１分解を担う可能性を調べた。スタチンがＡｎｇＩＩ誘導型ＲＯＳ産生量を減少させることが報告されている（ワスマンらの文献（Ｗａｓｓｍａｎｎ，  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５９，６４６−６５４（２００１））、カストディスらの文献（Ｃｕｓｔｏｄｉｓ，Ｆ．，Ｅｂｅｒｌ，Ｍ．，Ｋｉｌｔｅｒ，  Ｈ．，Ｂｏｈｍ，Ｍ．，Ｌａｕｆｓ，Ｕ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．  Ｒｅｓ．７１，  ３４２−３５１（２００６））を参照）。コントロールのｓｉＲＮＡを導入した細胞では、アトルバスタチン（１μＭ）は、ＡｎｇＩＩ誘導型ＲＯＳ産生量を減少させた（図２ｆ、ｇ）。対照的に、ＳｍｇＧＤＳのｓｉＲＮＡを導入した細胞では、アトルバスタチン（１μＭ）は、ＡｎｇＩＩ誘導型ＲＯＳ産生を減少させることができなかった（図２ｆ、ｇ）。同じ結果はさらにピタバスタチン（０．１μＭ）を用いても得られた（図８ａ、ｂ）。
【００５３】
３  ＳｍｇＧＤＳ欠損マウスにおいてスタチンの多面的作用は消失する
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで発見されたスタチンの作用がさらにｉｎ  ｖｉｖｏにおいて機能するかどうかを検討するために、本発明者らは、ＡｎｇＩＩにより誘導されるマウス心肥大および心拡張機能障害モデルを用いてスタチンの多面的効果を調べた。
【００５４】
スタチンが、血圧または血漿コレステロール値に依存せず、ＡｎｇＩＩ誘導マウス心肥大および心拡張機能障害モデルの病態を改善することが報告されている（タケモトらの文献（Ｔａｋｅｍｏｔｏ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８，１４２９−１４３７（２００１））、ヤギらの文献（Ｙａｇｉ，Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１０２，６８−７６（２００８））を参照）。この改善作用は、スタチンの多面的効果であると考えられている。
【００５５】
ＡｎｇＩＩを２週に渡ってＳｍｇＧＤＳ＋／−および同腹子（ＳｍｇＧＤＳ＋／＋）マウスに持続投与した。収縮期血圧は、ＡｎｇＩＩの投与によりＳｍｇＧＤＳ＋／−および同腹子マウスの両方において上昇した（表２）。
【表２】
0005757569.tif 000003
【００５６】
また、ＡｎｇＩＩの投与により血漿の総およびＬＤＬ−コレステロール値は、上昇する傾向にあった（表２）。
【００５７】
さらに、ＡｎｇＩＩ投与開始より２週間スタチン（アトルバスタチン、１０ｍｇ／ｋｇ／日、またはプラバスタチン、５０ｍｇ／ｋｇ／日）を強制経口投与する群を設けた。本発明者らは、最終投与２４時間後のスタチンの血漿中濃度を測定した（表３）。
【表３】
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【００５８】
本発明者らは、マウスのスタチンの血漿中濃度がヒトにおける２４時間血漿中濃度（Ｃ２４ｈ）と同等であることを確認した。溶媒およびスタチン投与群の間の血圧または血漿の脂質プロファイルに有意差はなかった（表２）。
【００５９】
心臓の重量の測定および心臓切除の顕微鏡検査により、ＡｎｇＩＩにより心筋細胞および心筋の肥大を誘導し、著しい間質の線維化血管周囲の線維化および冠動脈の肥厚を誘発することを確認した（図３ａ−ｃ）。同腹子マウスでは、ＡｎｇＩＩ誘導型心肥大および線維化に対するスタチンの保護効果が見られた。しかし、ＳｍｇＧＤＳ＋／−マウスでは、スタチンの保護効果は見られなかった（図３ａ−ｆ）。さらに、本発明者らは、超音波検査法を使用して、これらのマウスの心機能を評価した（図４ａ−ｄ）。ＬＶ短縮率（ＬＶＦＳ）（ＬＶの収縮機能の指標）はＡｎｇＩＩまたはスタチン処理のいずれによっても有意な影響を受けなかった（図４ｂ）。しかし、ＡｎｇＩＩの投与は、コントロールおよびＳｍｇＧＤＳ＋／−マウスの両方において、ＬＶ拡張機能の指標であるＥ／Ａを顕著に悪化させた（図４ｃ）。対照的に、スタチン処理は、ＡｎｇＩＩによって引き起こされたＬＶ拡張機能障害を改善した（図４ｃ）。ＳｍｇＧＤＳ＋／−マウスでは、ＬＶの心拡張機能障害について、スタチンの改善効果は認められなかった（図４ｃ）。
【００６０】
４  ヒトにおけるスタチンによるＳｍｇＧＤＳに対する作用
最後に、本発明者らは、２週に渡って経口的にプラバスタチンおよびアトルバスタチン（それぞれ、２０ｍｇ／日）を投与して、健常成人におけるＳｍｇＧＤＳ発現についてのスタチンの効果を調べた（図９）。両スタチンは、健常成人においても、総コレステロールおよびＬＤＬコレステロールの血中濃度を減少させた（表４）。
【表４】
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【００６１】
循環血白血球中のＳｍｇＧＤＳ発現は、プラバスタチンまたはアトルバスタチン服用後に有意に増加された（図５ａ）。２０名の平均で、プラバスタチンの２０ｍｇ投与によりＳｍｇＧＤＳは約１．４倍増加した。同様に、アトルバスタチンの２０ｍｇ投与により、ＳｍｇＧＤＳは約１．５倍増加した。さらに予備検討においてプラバスタチンの１０ｍｇ投与ではＳｍｇＧＤＳの増加が認められなかった４例の被験者について、プラバスタチンの２０ｍｇ投与によってＳｍｇＧＤＳが増加していることが確認できた。同様に、上記４例の被験者のうち３例の被験者については、プラバスタチンからアトルバスタチンへ切り替えることにより、ＳｍｇＧＤＳ増加作用が認められた。なお、この４例の被験者のＬＤＬコレステロールは減少していたことにより、高コレステロール血症を治療目的とする場合は、投与量の増量や薬剤変更の対象とはならない。興味深いことに、プラバスタチン（親水性スタチン）およびアトルバスタチン（脂溶性スタチン）の両方ともヒトにおけるＳｍｇＧＤＳ発現量に同程度の漸増的な効果を発揮し、ヒトにおけるＳｍｇＧＤＳ量の増加というスタチンのクラス効果を示唆する結果となった。
【００６２】
さらに、酸化ストレスマーカーの１つであるマロンジアルデヒド修飾（ＭＤＡ）−ＬＤＬコレステロールは、スタチン処理により減少し（表４）、ＳｍｇＧＤＳ変化量およびＭＤＡ−ＬＤＬコレステロール量の間で、有意な逆相関関係が認められた。しかし、総コレステロールまたはＬＤＬコレステロール量との間においては、相関関係は認められなかった（図５ｂ−ｅ）。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図２ｇ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図７ｅ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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