(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬ）非依存的かつ顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）非依存的な樹状細胞（ＤＣ）のインビトロ生成方法におけるマクロファージ−コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）の使用であって、
（ａ）造血前駆体細胞を培養すること；および
（ｂ）マクロファージ−コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を投与すること
を含む使用。
【請求項２】
ＤＣが形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）および／または通常型樹状細胞（ｃＤＣ）である、請求項１の使用。
【請求項３】
前駆体細胞が骨髄細胞である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
Ｍ−ＣＳＦの投与前および投与後に樹状細胞の数が定量され、Ｍ−ＣＳＦ投与後のＤＣの数が、Ｍ−ＣＳＦ投与前のＤＣの数より増加する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
ｐＤＣおよび／またはｃＤＣの数が少なくとも一つの細胞表面マーカーのレベルを測定することによって定量される、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
ｐＤＣの数を定量するための少なくとも一つの細胞表面マーカーがＣＤ１１ｃ、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ４５ＲＡ、ＰＤＣＡ−１、ＣＣＲ９、Ｌｙ４９Ｑ、Ｌｙ６Ｃ、Ｓｉｇｌｅｃ−Ｈ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４、ＣＤ１２３、ＢＤＣＡ−２、またはＢＤＣＡ−４である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
ｃＤＣの数を定量するための少なくとも一つの細胞表面マーカーがＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｓｉｒｐ−アルファ、ＤＥＣ−２０５、ＭＨＣＩＩ、３３Ｄ１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＢＤＣＡ−１、ＢＤＣＡ−３、またはＣＬＥＣ９Ａである、請求項５または６に記載の使用。
【請求項８】
ＤＣが収集される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
生成したＤＣによって産生されるサイトカインが集められる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
産生されるサイトカインがインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１６（ＩＬ−１６）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−２３（ＩＬ−２３）、インターロイキン−２７（ＩＬ−２７）、インターロイキン−２８（ＩＬ−２８）、インターロイキン−２９（ＩＬ−２９）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦ−β）およびケモカインを含む群より選択される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
産生されるサイトカインがＩＦＮ−αである、請求項９または１０に記載の使用。
【請求項１２】
ＤＣを抗原にばく露することをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
抗原が腫瘍、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、プリオン、植物、軟体動物、節足動物に由来するか、または脊椎動物毒素に由来する、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
ＤＣを少なくとも一つの刺激剤にばく露することによってＤＣを刺激することをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
少なくとも一つの刺激剤がＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＴＬＲアゴニスト、ウイルス、細菌、真菌、植物またはその一部である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
Ｍ−ＣＳＦがウイルスベクターに入れて投与される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
ウイルスベクターがポックスウイルスベクターである、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
ポックスウイルスベクターがワクシニアウイルスである、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
ワクシニアウイルスベクターが修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａ：  ＭＶＡ）ベクターである、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
Ｍ−ＣＳＦがポリペプチドとして投与されるか、細胞中で発現される核酸として投与される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
核酸がＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
ヒトを含む動物中で抗原に対する免疫応答を誘導するための、Ｍ−ＣＳＦを含有する医薬組成物であって、前記誘導が、以下：
（Ａ）ヒトを含む動物から造血前駆体細胞を取り出すこと；
（Ｂ）その前駆体細胞を培養すること；
（Ｃ）その培養細胞に、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬ）および顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を同時投与することなく、Ｍ−ＣＳＦを投与すること；
（Ｄ）樹状細胞（ＤＣ）を生成させること；
（Ｅ）そのＤＣを抗原にばく露すること；
（Ｆ）ばく露されたＤＣを収集すること；および
（Ｇ）収集されたＤＣをヒトを含むその動物に再導入すること
を含む医薬組成物。
【請求項２３】
抗原が腫瘍、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、プリオン、植物、軟体動物、節足動物に由来するか、または脊椎動物毒素に由来する、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
ヒトを含む動物に抗原を投与することをさらに含む、請求項２２または請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
動物が増殖性障害および／または自己免疫疾患を患っているヒト患者である、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
造血前駆体細胞から前記前駆体細胞をＭ−ＣＳＦで刺激することによって生成される樹状細胞であって、樹状細胞の生成がＦｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬ）および顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）に依存しない、樹状細胞。
【請求項２７】
前記前駆体細胞が骨髄細胞である、請求項２６に記載の樹状細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、樹状細胞形成を誘導する方法および誘導された樹状細胞を治療剤として使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞（DC）は免疫系における重要な意志決定因子である。例えばDCは抗体産生やキラー細胞形成などの適応免疫応答を惹起する。DCは免疫応答の量および質も指示し、例えばアレルギー性、炎症性、または寛容誘発性免疫応答が開始されるべきかどうかを決定する。
【０００３】
DCには表現型および機能が明確に異なるサブセットが数多く存在する（1）。血中および免疫器官中には稀であるが、DCには二つの主要サブグループ、すなわち形質細胞様DC（pDC）と通常型DC（cDC）とが含まれる（2）。マウスにおけるcDCには、CD4-CD8+、CD4+CD8-およびCD4-CD8-という少なくとも3つのサブセットが含まれる。CD8+cDCは表面マーカーCD8ααを発現させ、ウイルス感染に対するキラー細胞誘導を可能にする抗原の交差提示にとって、最も重要な細胞である。CD8+ cDCは、炎症性免疫応答とって不可欠なサイトカインであるインターロイキン12を多量に産生することもできる。CD8- cDC集団は、多量のケモカインを産生すること、およびT細胞への抗原のMHCII提示により適していることが知られている。pDCは、ウイルスDNAまたはウイルスRNAに応答して多量の抗ウイルス性および免疫保護性サイトカイン、例えばI型インターフェロン（IFN-I）を産生する抗ウイルス細胞である。
【０００４】
他の免疫細胞と同じように、DCは増殖因子およびサイトカインの影響を受けて造血幹細胞および後期前駆体から発生する。顆粒球-マクロファージ-コロニー刺激因子（GM-CSF）は、造血前駆体細胞および単球を、GM-DCと呼ばれるDCが発生するように誘導する（3〜5）。ただし、GM-CSFまたはGM-CSF受容体が欠損しているマウスはDC数にそれほど大きな減少を示さないので、GM-DCはリンパ器官における定常状態DCサブセットの大部分というわけではない（6）。しかし、マウスに安定化GM-CSFをインビボ適用すると、CD8-cDCのレベルは増加するが、pDCのレベルは増加しない（10）。そのうえ、GM-CSFはpDCの生成をインビトロで遮断することが示されている（7）。
【０００５】
Fms様チロシンキナーゼ3リガンド（FL）も、cDCとpDCの両方を含むDCの、骨髄（BM）前駆体細胞からの発生を（8，9）、インビトロとインビボの両方で誘導する（10〜13）。DC（FL-DCと呼ばれるもの）の発生におけるFLの役割は、FL欠損マウス（FLKO）のリンパ器官においてpDC（9）とcDC（14）の数がどちらも激しく減少することにより、決定的に証明されている。
【０００６】
エクスビボ単離pDCまたはFL生成pDCは、Toll様受容体（TLR）7および9ならびにそれらの各リガンドRNAおよびDNAを介した直接刺激に、高レベルのインターフェロン-アルファ（IFN-α）を産生することによって応答する。cDCを含む他の細胞タイプも、活性ウイルスまたはトランスフェクトされたDNAもしくはRNAに応答して、IFN-αを産生するように誘導されうる。しかし、cDCによるIFN-α産生は、PKR、RIG-I、MDA5およびTLR-3を含むTLR7およびTLR9非依存的経路、ならびに今のところ未同定の細胞質DNA認識複合体によって媒介される（15〜17）。このようにpDCは、IFN-αの高レベル産生にTLR7およびTLR 9を利用する唯一の細胞である。さらにまた、例えばCpGモチーフ含有オリゴヌクレオチド（CpG-ODN A型）などの一定の核酸分子は、極めて高レベルのIFN-αをもっぱらpDCでのみ誘導する（18）。したがって、A型CpG-ODNに応答して起こるIFN-α産生は、混合細胞集団におけるpDCの存在に関する機能試験である（17）。
【０００７】
マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF；CSF-1とも呼ばれる）に対する受容体の下流にコードされたGFPを利用する研究から、pDCサブセットとcDCサブセットの分化中に、M-CSF受容体が転写されることは明らかである（26）。また、M-CSF欠損マウス（op/opマウス）はDCサブセットの数が減少しているという報告がある（26）。さらにまた、DCとマクロファージは、共通の前駆細胞から発生しうる（41）。別の報告は、一部のDC（ただしpDCではない）がM-CSFを含む増殖因子の組合せの影響を受けて発生することを示している（42）。それでもなお、GM-CSFおよびFLはDCの発生を誘導することが示されているのに対し、M-CSFは、DCではなく、単球の発生およびマクロファージの分化を誘導すると、常に考えられてきた（34）。
【０００８】
例えば侵襲性真菌感染症の処置など、限定された状況においてではあるものの、治療的処置としてのM-CSFの作用は以前に調べられている（39）。M-CSFで処置された患者が、患者のDCに何らかの変化を示したかどうかはわからない。
【０００９】
DCの数の増加は、一定の状況では、治癒効果を持ちうる。例えば、新生児個体では、DCが多いほど感染症との戦いに役立つだろう。同様に、HIV感染、一定のがん、アレルギーを患っている個体、移植を受けた個体、放射線療法もしくは化学療法のせいで、または一定の薬を服用しているために、免疫力が低下している個体は、DCの数が減少している場合がある。これらの個体では、pDCおよびcDCを含むDCの数を増加させることが望ましいだろう。このように、当技術分野では、インビトロまたはインビボでのDCの誘導および生成方法が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明はM-CSFによる前駆体造血細胞からのDCの誘導を提供する。具体的に述べると、前記誘導は、FLによる誘導には依存しない。既に上で概説したように、Flt3リガンド（FL）は、造血系の細胞に制限されるFlt3受容体に結合する可溶性増殖因子である。本発明の方法によって誘導されるDCは、例えばIFN-Iなどの抗ウイルス性サイトカインを産生することなどによって、免疫応答を調節することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、M-CSFがCpGに応答してIFN-αを産生するようにBM培養物を誘導するという予想外の知見に基づく。事実、これらのM-CSF誘導BM細胞は、表現型および機能が、pDCおよびcDCに似ており、pDCおよびcDCと呼ばれる。
【００１２】
FLとM-CSFの受容体（それぞれFlt3およびc-fms）はグループIII受容体チロシンキナーゼであり、構造の同一性を共有している。しかし、FL受容体またはM-CSF受容体のどちらかを阻害した実験によって証明されるように、M-CSFによるDC分化の誘導はFL受容体との交差反応を伴わない。さらにまた、pDC集団とcDC集団の両方が、FLノックアウトマウス（FLKO）由来のM-CSF BM培養物中で発生したことから、これらの細胞のM-CSF誘導が内在性FLの間接的貢献を必要とする可能性は排除される。最後に、野生型マウスまたはFLKOマウスをM-CSFで処置したところ、インビボでpDCおよびcDCが発生した。
【００１３】
これらの結果は、M-CSFはpDCおよびcDCの発生を誘導することができ、その誘導がFLによる誘導には依存しないことを示している。自然界のインビボ環境では、FLとM-CSFの両方が一緒になって、正常なDCホメオスタシスを誘導し調節するように働く可能性がある。これは、DCを強化する感染およびDCレベルの増加または減少をもたらす免疫状態が、しばしば、循環FLレベルの増加と関連し、これと同じ状態の一部が、循環M-CSFレベルを強化するとも報告されているからである。例えば、ランゲルハンス細胞組織球症は患者の血清中に増加したFLおよびM-CSFを示し（28）、循環FLを増加させることが示されたウイルス感染はM-CSFも増加させ（29〜32）、全身性エリテマトーデス（SLE）患者の血清ではFLが増加しており（33）、SLEの動物モデルはM-CSFレベルの上昇を示す（34）。しかし、本明細書で示すように、M-CSFは明らかにFLに依存せずに作用してDC発生を誘導することができる。M-CSFは誘導されるがFLは誘導されないという条件またはその逆の条件が存在する可能性がある。このように、いくつかの条件において、他の増殖因子の影響を受けることなくM-CSFまたはFLに由来するDCが誘導されうる。
【００１４】
本発明の方法は、個体へのインビボ適用後に、pDCおよびcDCのレベルを増加させることを可能にする。これらの細胞は感染に対する防御に使用することができ、免疫応答を開始または指示することができる。また本発明は、csf-1突然変異を伴わないがん、例えば限定するわけではないが、M-CSF処置に対してまだ応答性であるタイプの急性骨髄性白血病（AML、急性骨髄性白血病とも呼ばれる）や、過剰に活性なFlt3に対する治療を受けている患者を含む、増殖性障害に対する治療的および予防的処置にもなる。本発明は、医薬品として使用するためのM-CSFも包含する。さらにまた本発明は、SLEなどの自己免疫疾患に対する治療的および予防的処置にも及ぶ。また本発明は、がんなどの増殖性疾患およびSLEなどの自己免疫疾患を処置するためのM-CSFにも向けられる。
【００１５】
本発明の一実施形態では、造血前駆体細胞をM-CSFの存在下で培養することにより、DCをインビトロで産生することができる。誘導されうる造血前駆体細胞は、限定するわけではないが、例えば骨髄細胞である。好ましい一実施形態では、前記DCの産生がFLに依存しない。
【００１６】
さらにもう一つの実施形態では、M-CSFによりインビトロで誘導されたDCを使って、サイトカインを産生させることができる。産生されるこれらのサイトカインには、IFN-I（例えばIFN-αおよびIFN-β）、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-16、IL-18、IL-23、IL-27、IL-28、IL-29、TNF-α、TNF-βおよびケモカインが含まれるが、これらに限るわけではない。好ましい一実施形態では、産生されるサイトカインがインターフェロン-α（IFN-α）である。サイトカインはインビトロで産生させるか、またはM-CSF誘導DCを動物に導入した後にインビボで産生させることができる。インビボでは、誘導されたDCが自然免疫応答または適応免疫応答を刺激する。
【００１７】
本発明のさらに別の実施形態では、M-CSFによりインビトロで誘導されたDCを抗原にばく露して、特異的免疫応答を刺激することができる。
【００１８】
本発明のさらなる実施形態では、M-CSFによって生成させたDCを使って、他の免疫細胞における免疫応答を刺激することができる。
【００１９】
本発明は、インビトロで樹状細胞（DC）を増加させる方法であって、造血前駆体細胞を培養すること；DCの数を定量するか、またはその骨髄内のDCを全て排除すること；マクロファージ-コロニー刺激因子（M-CSF）を投与すること；M-CSFの投与後に存在する樹状細胞の数を定量することを含み、M-CSF投与後のDCの数がM-CSF投与前のDCの数よりも増加する方法を包含する。好ましい一実施形態では、前記増加がFLに依存しない。本発明の実施形態では、前駆体細胞が骨髄細胞である。本発明の別の実施形態では、DCが形質細胞様樹状細胞（pDC）であり、少なくとも一つの細胞表面マーカー（CD11c、CD45R、CD45RA、PDCA-1、CCR9、Ly49Q、Ly6C、Siglec-H、HLA-DR、CD4、CD123、BDCA-2、BDCA-4を含むが、これらに限るわけではない）のレベルを測定することによってpDCの数が定量される。本発明の別の実施形態では、DCが、少なくとも一つの細胞表面マーカー（CD11c、CD11b、CD4、CD8、Sirp-アルファ、DEC-205、MHCII、33D1、HLA-DR、およびBDCA-1を含むが、これらに限るわけではない）のレベルを測定することによって定量される通常型樹状細胞（cDC）である。本発明の別の実施形態では、M-CSFがポックスウイルスベクター（MVAベクターを含むが、これに限るわけではない）に入れて投与される。本発明の別の実施形態では、M-CSFが別のウイルスベクターに入れて投与される。本発明のさらに別の実施形態では、DCを増加させる方法が、DCを刺激剤にばく露することによってDCを刺激することをさらに含み、その刺激剤には、TLRアゴニスト、ウイルス、細菌、真菌、植物、もしくはその一部、またはサイトカイン（IFN-I、IL-10、IL-12、IL-6、およびTNF-αを含むが、これらに限るわけではない）が含まれるが、これらに限るわけではない。本発明の実施形態は、収集された樹状細胞を動物中に再導入するステップも含む。本発明のさらに別の実施形態において、DCはpDCもしくはcDCまたはその両方であることができる。
【００２０】
本発明のもう一つの実施形態は、動物中で樹状細胞を増加させる方法であって、その動物にM-CSFを抗原と同時投与することを含み、その同時投与がその動物におけるDCの数の増加をもたらす方法である。好ましい一実施形態では、前記増加がFLに依存しない。本発明のさらなる実施形態は、腫瘍、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、プリオン、植物、軟体動物、節足動物、または脊椎動物毒素に由来する抗原を含む。本発明の別の実施形態では、動物がマウスまたはヒトである。本発明は、pDCまたはcDCであるDCを包含する。本発明の別の実施形態では、M-CSFがポックスウイルスベクター（MVAベクターを含むが、これに限るわけではない）に入れて投与される。本発明の別の実施形態では、M-CSFが別のウイルスベクターに入れて投与される。本発明のさらにもう一つの実施形態では、M-CSFがプラスミドに入れて投与されるか、RNAによって投与される。
【００２１】
本発明のさらにもう一つの実施形態は、樹状細胞を産生する方法であって、造血前駆体細胞を培養すること、その培養細胞にM-CSFを投与すること、樹状細胞を生成させること、およびその樹状細胞を収集することを含む方法である。前記生産はFLに依存しない。本発明の実施形態において、本方法は、その樹状細胞を抗原にばく露することを、さらに含むことができる。本発明は、限定するわけではないが、腫瘍、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、プリオン、植物、軟体動物、節足動物、または脊椎動物毒素に由来する抗原を含む抗原を包含する。本発明の実施形態は、動物から前駆体細胞を取り出すこと、および収集された樹状細胞をその動物に再導入することも含む。本発明のさらに別の実施形態において、DCはpDCまたはcDCであることができる。本発明は、M-CSFが培養細胞にポリペプチドとして投与されるか、または培養細胞中で発現される核酸（この場合、核酸はDNAまたはRNAである）として投与される実施形態も包含する。本発明は、M-CSFがポックスウイルスベクター（修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（MVA）ウイルスベクターを含むが、これに限るわけではない）に入れて培養細胞に投与される方法も包含する。
【００２２】
本発明のさらにもう一つの実施形態は、動物中で一つ以上の抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、動物から造血前駆体細胞を取り出すこと、その前駆体細胞を培養すること、その培養細胞にM-CSFを投与すること、樹状細胞を生成させること、その樹状細胞を抗原にばく露すること、感作樹状細胞（primed dendritic cells）を収集すること、およびその感作樹状細胞をその動物に再導入することを含む方法を包含する。本発明において、抗原は、腫瘍、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、プリオン、植物、軟体動物、節足動物、または脊椎動物に由来する（毒素を含む）。本発明の実施形態は、その動物に対して腫瘍抗原を投与することも含む。本発明のさらに別の実施形態では、動物が全身性エリテマトーデス（SLE）を患っているヒト患者であり、抗原がSLE関連自己抗体の抗イディオタイプまたは相補性決定領域（CDR）に基づくペプチドを含む（45，46）。
【００２３】
本発明の実施形態は、Flt3またはc-kitを阻害するための化学療法を受けている、急性骨髄性白血病（AML）またはALLに罹患したヒト患者である動物も包含し、抗原は、その患者の突然変異したまたは重複したFlt3またはc-kitに由来する、正常型のそれら受容体中には存在しない新規ペプチドを含みうる（47）。
【００２４】
本発明のもう一つの実施形態は、インターフェロン-α（IFN-α）を産生する方法であって、造血前駆体細胞を培養すること、培養細胞にM-CSFを投与すること、およびIFN-αを集めることを含む方法である。
【００２５】
本発明のさらにもう一つの実施形態は、AMLを患っている患者を処置する方法であって、AMLを患っているその患者にM-CSFを投与すること、およびその患者におけるDCの数を増加させることを含む方法である。
【００２６】
本発明のさらにもう一つの実施形態は、SLEを患っている患者を処置する方法であって、SLEを患っているその患者にM-CSFを投与すること、およびその患者におけるDCの数を増加させることを含む方法である。
【００２７】
本発明は、医薬品として使用するためのM-CSFも包含する。具体的に述べると、本発明は、がんもしくは白血病（特にAML）などの増殖性疾患を処置するための、および/またはSLEなどの自己免疫疾患を処置するためのM-CSFに向けられる。
【００２８】
本発明のさらにもう一つの実施形態は、免疫応答を刺激する方法であって、造血前駆体細胞を培養すること、培養細胞にM-CSFを投与すること、DCを生成させること、そのDCを免疫細胞にばく露することを含み、その免疫細胞が刺激されて免疫応答を生じる方法である。免疫細胞はT細胞（調節性T細胞、サプレッサーT細胞、キラーT細胞を含むが、これらに限るわけではない）、ヘルパーT細胞（調節性T細胞、サプレッサーT細胞、またはキラーT細胞を含むが、これらに限るわけではない）、B細胞、ナチュラルキラー細胞、またはマクロファージであることができる。免疫応答の刺激はインビトロまたはインビボで達成することができる。さらにまた、免疫応答は抗アレルギー免疫応答、抗敗血症（anti-septic）免疫応答、抗移植片（anti-graft）免疫応答、抗腫瘍免疫応答、抗自己免疫応答、寛容誘発性免疫応答、抗病原体免疫応答、または調節性免疫応答であることができる。
【００２９】
本発明のもう一つの実施形態は、造血前駆体細胞から前記前駆体細胞のM-CSF刺激によって生成される樹状細胞に関する。
【００３０】
本発明のさらにもう一つの実施形態は、M-CSFをコードする核酸配列を含む組換えポックスウイルスに関する。具体的に述べると、前記核酸配列は前記ポックスウイルスのウイルスゲノム中に含まれる。前記ポックスウイルスには修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（MVA）が含まれるが、これに限るわけではない。
【００３１】
好ましい一実施形態では、前記MVAが以下の性質の少なくとも一つを持つことを特徴とする：
（i）ニワトリ胚線維芽細胞（CEF）ではインビトロで増殖的複製（reproductive replication）能を持つが、ヒトケラチノサイト細胞株（HaCaT）、ヒト胎児腎臓細胞株（293）、ヒト骨骨肉腫細胞株（143B）、およびヒト子宮頚部腺癌細胞株（HeLa）では増殖的複製能を持たない、
（ii）成熟BおよびT細胞を産生する能力を持たず、したがって重度の免疫欠陥を持ち、複製ウイルスに対する感受性が高いマウスモデルにおいて、複製することができない、および
（iii）DNAプライム/ワクシニアウイルスブーストレジメンと比較して、少なくとも同じレベルの特異的免疫応答を、ワクシニアウイルスプライム/ワクシニアウイルスブーストレジメンで誘導する。
【００３２】
本発明のさらなる実施形態によれば、MVAは、上述の有利な性質のうち少なくとも二つまたは三つ全てを持つことを特徴とする。
【００３３】
特に好ましい一実施形態では、MVAが、ソールズベリー（英国）のEuropean Collection of Cell Cultures（ECACC）に番号V00083008として寄託されているMVAワクシニアウイルスおよびその派生株である。この寄託されたウイルスを以下、MVA-BNともいう。
【００３４】
上に概説した組換えポックスウイルスは、少なくとも一つの抗原および/または抗原エピトープをコードする配列から選択される異種核酸配列をさらに含んでもよい。
【００３５】
本発明は、そのような組換えポックスウイルスと薬学的に許容できる担体、希釈剤および/または添加剤とを含む医薬組成物またはワクチンにも関係する。
【００３６】
さらにもう一つの実施形態において、本発明は、医薬品またはワクチンとして使用するための、M-CSFをコードする核酸配列を含む組換えポックスウイルスに関する。さらにまた本発明は、増殖性疾患および/または自己免疫疾患を処置するための、本明細書に概説するM-CSFをコードする核酸配列を含む組換えポックスウイルスも包含する。増殖性疾患は既に上で特定したものであり、がんおよび白血病を含むが、これらに限るわけではない。好ましい一実施形態では、前記白血病のタイプがAMLである。自己免疫疾患は本願において既に特定したものであり、SLEを含むが、これに限るわけではない。
【００３７】
もう一つの実施形態において、本発明は、造血前駆体細胞から樹状細胞（DC）を生成させるための、上記組換えポックスウイルスおよび/または上記医薬組成物の使用に関する。
【００３８】
本発明のさらにもう一つの実施形態は、動物中で抗原に対する免疫応答を誘導するためのキットであって、M-CSFをコードする核酸配列を含む組換えポックスウイルスを第1バイアル中に含み、抗原を第2バイアル中に含むキットである。前記キットの好ましい一実施形態では、樹状細胞（DC）を生成および/または増加させるために組換えポックスウイルスが動物に投与され、次いで、DCが生成および/または誘導された後に、前記抗原が前記動物に投与される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】M-CSFは、FLの非存在下でさえ、BM細胞からのpDCおよびcDC発生を引き出す。A．B220+およびCD11c+細胞を枯渇させたC57BL/6 BM細胞の同型（replicate）ウェルを、M-CSF（20ng/ml）（0日目に添加し、3日目に再び添加）と共に、またはFL（35ng/ml）（0日目にのみ添加）と共に、6日間インキュベートした。0〜6日目のそれぞれにおいて、別々のウェルを、CpG-2216で終夜刺激するか、刺激せずに放置し、その上清をIFN-αについてアッセイした。B．B220+およびCD11c+細胞を枯渇させたC57BL/6 BM細胞を、M-CSF（20ng/ml）（0日目に添加し、3日目に再び添加）と共にインキュベートした。6日目に細胞を収集し、CD11cおよびCD435RA発現を検出するために、細胞を抗体で染色した。pDC集団およびcDC集団の表現型を持つ細胞を、左パネルに四角く囲んで示す。pDC集団とcDC集団のそれぞれにおける細胞の数を右パネルに示し、同様にB220+およびCD11c+細胞を枯渇させたBM細胞を使って6日目のFL生成DCまたは培地のみから得られた数と比較する。C．FLを欠くマウスから得たBM細胞から、同じように、B220+およびCD11c+細胞を枯渇させ、同型ウェル中でFL、M-CSF（3日目にも追加供給）と共に0〜6日間インキュベートした。0〜6日目のそれぞれにおいて、別々のウェルをCpG-2216で終夜刺激するか、刺激せずに放置し、その上清をIFN-αについてアッセイした（左パネル）。FLKO培養物中に6日目に存在するpDC集団およびcDC集団を右パネルに示す。表示したデータは、複数時点に関する3回の類似する実験を代表する1実験（A)、複数時点に関して行った1実験ならびに6日目および0日目時点に関する3回の追加実験（C、左パネル）、6日目FL培養物の3実験を代表する1実験および6日目M-CSF培養物の5回を上回る実験（B）、そして4回の実験を代表する1実験（C、右パネル）から得たものである。BおよびC（右パネル）の培地のみ対照培養物では、検出可能なM-DCは存在しなかった。
【図２】FL-pDCおよびエクスビボ単離脾臓pDCと比較したM-pDCの表面表現型。6日目のM-CSF培養物（中実のヒストグラム）、FL培養物（灰色の中空ヒストグラム）、または新鮮単離脾臓DC（黒いヒストグラム）から得られる染色された細胞を、PI陰性細胞の中でCD11cおよびCD45RAまたはCD45Rの発現について選択することにより、pDCにゲートをかけた。pDC表面における一連の表面マーカーの発現を示す。明灰色ヒストグラムは、各染色内でのM-pDCのバックグラウンド染色を表す。また、全てのM-pDCはCD3、CD19、CD49bおよびNK1.1の発現を欠いていた。表示の表面表現型は、M-pDCに関する2〜5回の実験、FL-pDCに関する2〜3回の実験、および脾臓pDCに関する2回の実験を代表する1実験から得たものである。
【図３】M-pDCは、TLR9刺激に応答して活性化され、IFN-αを産生し、TLR7刺激に応答して他のサイトカインを産生する。高度に精製され選別されたM-pDCまたはFL-pDCを表示のTLRリガンドと共に18時間インキュベートした。pDCの表面表現型を解析した（AおよびB）。灰色のヒストグラムは培地のみで培養された細胞の表面発現レベルを示し、黒いヒストグラムは表示の刺激物質中で培養細胞の発現レベルを示す。上清を、IFN-αの存在（C）についてELISAで、またはIL-6およびTNF-αの産生（D）についてサイトメトリック・ビーズ・アッセイ（Cytometric Bead Assay：CBA）でアッセイした。IFN-γ、IL-10、IL-12p70またはMCP-1は、CBAでは、M-pDC上清中に検出されなかった。表示のデータは、3回の実験（AおよびB）、5回の実験（C）ならびに3回の実験（D）を代表する1実験から得たものである。エラーバーは重複試料の範囲を表す。
【図４】M-DCの生成はc-FMSインヒビターによって阻害される。同型M-CSFおよびFL培養を、ある範囲のA：cFMS受容体チロシンキナーゼインヒビター濃度またはB：Flt3インヒビター濃度の存在下または非存在下で、並行して行った。培養期間の最後に細胞を計数した。インヒビターなしの培養物から収集された細胞の数を100％に設定した。インヒビターを含有する培養物から得られる細胞を、インヒビターの非存在下で得られる細胞の百分率として表した。各パネルに表示するデータは、各インヒビターについて行った2回の実験を代表するそれぞれ1実験から得たものである。
【図５】M-CSF処置はインビボでDC数を増加させる。FLKOマウスを、0.01％BSA/PBS中のM-CSF 10μg/日または賦形剤のみ（対照）で、5日連続してip処置した。DCをFLKO脾臓から精製し、CD11cおよびCD45RAで染色し、ゲートをかけてAに示す。全脾細胞ならびにpDC集団およびcDC集団を数え上げ、賦形剤処置マウスと比較した増加倍率として示す（B）。データは、同じ日に解析した対照マウスと比較した2回の別個の実験内の3匹のマウス個体からプールした。
【図６】CLPはM-pDCの主要産生細胞であり、CMPは主としてM-cDCを産生する。UBC-GFP BM細胞だけを含有する対照M-CSF培養物では、全ての細胞が高レベルのGFPを発現させ、FITC（GFP）チャンネルで強く蛍光を発した（A、左パネル）。UBC-GFP BM培養物中にスパイクしたC57BL/6前駆細胞の子孫に、FITC/GFPneg細胞としてゲートをかけた（A、右パネル）。CLP、CMPまたはGMPの段階希釈液（625〜39細胞相当を図示している）を、1ml中のUBC-GFP BM細胞1.0×106個に加え、M-CSF培養を6日間行った。GFPnegPIneg細胞にゲートをかけ、CD45RAおよびCD11cで染色した。得られたM-DCプロットをBに示し、M-pDCおよびM-cDCを決定するために使用したゲートを左上の等高線に示す。Bの培養物中に得られたM-pDCおよびM-cDCの絶対数をCに示す。表示のデータは1回の実験から得たものである。同様の結果がもう一つの実験でも得られた。D．CLP上のCD115（M-CSFR）およびCD135（Flt3）の発現を示す。灰色のヒストグラムはPEコンジュゲートアイソタイプ対照で染色したCLPを表す。染色は、類似する結果を与えた2回の個別の実験（CD115）で行い、これらの実験の一方にはCD135染色も含めた。
【図７】FL誘導cDC（FL-cDC）およびエクスビボ単離脾臓cDCと比較したM-cDCの表面表現型。図7はM-CSF誘導cDC（M-cDC）の表面表現型を図示している。6日目のM-CSF培養物（中実のヒストグラム）、FL培養物（灰色の中空ヒストグラム）、または新鮮単離脾臓DC（黒いヒストグラム）から得られる染色された細胞を、PI陰性細胞の中でCD11cの発現およびCD45RAまたはCD45Rの欠如について選択することにより、cDCにゲートをかけた。cDC表面における一連の表面マーカーの発現を示す。明灰色のヒストグラムは、各染色内でのM-cDCのバックグラウンド染色を表す。また、全てのM-cDCはCD3、CD19、CD49bおよびNK1.1の発現を欠いていた。表示の表面表現型は、M-cDCに関する2〜5回の実験、FL-cDCに関する2〜3回の実験、および脾臓cDCに関する2回の実験を代表する1実験から得たものである。
【図８】M-DCの生成はc-FMSインヒビターによって阻害される。同型M-CSFおよびFL培養を、ある範囲のA：cFMS受容体チロシンキナーゼインヒビター濃度またはB：Flt3インヒビター濃度の存在下または非存在下で、並行して行った。培養期間の最後に細胞を計数した。インヒビターなしの培養物から収集された細胞の数を100％に設定した。インヒビターを含有する培養物から得られる細胞を、インヒビターの非存在下で得られる細胞の百分率として表した。各パネルに表示するデータは、各インヒビターについて行った2回の実験を代表するそれぞれ1実験から得たものである。           ［好ましい実施形態の詳細な説明］
【００４０】
本発明は、M-CSFが、FLの非存在下に、インビトロで、IFN-α産生（図1）ならびに造血前駆体細胞からのpDCおよびcDCの発生（図2）を誘導することを示す実験結果によって裏付けられる。これらのM-CSF誘導pDCおよびcDCは、FLによって誘導されるpDCおよびcDCまたはインビボで発生するものと表現型が同一であり（図3および5）、IFN-Iなどの抗ウイルス性サイトカインを産生する（図4）。さらにまた、M-CSF受容体の阻害は、M-CSF誘導活性が、FL受容体flt3との交差反応としてではなく、それ自身の受容体を介して起こることを証明している（図6）。最後に、M-CSFはインビボでpDCおよびcDCをFL非依存的経路で誘導することが明らかになった（図7）。
【００４１】
本発明の実施形態の説明において、「誘導」という用語は、細胞の形態および/または生理機能の変化をもたらすシグナルの導入を指す。「発生」という用語は、遺伝的に決定された経路に沿った細胞の形態および生理機能の改変を指す。「分化」という用語は、ある前駆体細胞からより特殊化した細胞タイプへの細胞の発生を指す。「細胞表面マーカー」という用語は、ある細胞の表面上にあって、他の任意の細胞またはその細胞の発生経路における他の細胞から見て、その細胞に特異的であるタンパク質または他の分子を指す。「前駆体細胞」という用語は、何らかのシグナルによる誘導後に、より分化した細胞へと発生する能力を持つ、分化度の低い細胞を指す。造血前駆体細胞には骨髄細胞が含まれるが、これに限るわけではない。「FLに依存しない」または「FLの非存在下で」という用語は、本発明の方法では、使用する各培養培地にFLを添加することなく、DCが誘導され、増加し、かつ/または産生されることを示す。
【００４２】
本発明の一実施形態では、DCがインビトロで産生される。例えば後述の実施例1に記載する手法をはじめとする（ただしこれに限るわけではない）当業者に知られる技法によって、造血前駆体細胞を培養し、DCを収集することができる。DCの数は直接的に定量することができる。例えばDCの数は、DC細胞表面抗原、例えばLy49Q、CD4、MHCII、B7H1、CD81、CD62L、およびCD11b、CD45RA、およびF4/80を、当業者に知られる技法で測定することによって、定量することができる。これらの技法には、例えば後述の実施例1に記載する方法による表面染色および蛍光活性化細胞選別（FACS）などが含まれるが、これらに限るわけではない。DCの数は間接的に定量することもできる。例えばDCの数は、サイトカイン産生量のDC特異的な増加を測定することによって定量することができる。サイトカイン産生量、IFN-I、IFN-α、IL-12 p70、IL-6、TNF-α、MCP-1およびIFN-γの定量は、当業者に知られる技法で達成することができる。これらの技法には、後述の実施例1に記載するELISAが含まれるが、これに限るわけではない。サイトカイン産生量の増加倍率には、1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、または10倍以上を含めることができるが、これらに限るわけではない。
【００４３】
本発明の実施形態では、M-CSFおよび/または抗原を培養細胞にタンパク質として投与することができる。M-CSFタンパク質は、当業者に知られる方法、例えば限定するわけではないが、インビトロ原核および真核発現系で、製造することができる。
【００４４】
本発明の実施形態では、M-CSFを、インビトロで培養細胞に、例えば限定するわけではないが1〜100ng/ml、1〜75ng/ml、1〜50ng/ml、1〜25ng/ml、1〜10ng/ml、10〜100ng/ml、10〜75ng/ml、25〜100ng/ml、50〜100ng/ml、75〜100ng/ml、25〜75ng/ml、または50〜75ng/mlなどのレベルで、好ましくは10〜50ng/ml、最も好ましくは20ng/mlで、投与することができる。
【００４５】
M-CSFおよび/または抗原は、M-CSFをコードし、培養細胞内でのその発現を指示するDNAまたはRNAの導入によって、培養細胞に投与することもできる。この投与方法のための技法には、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび形質導入のための技法が含まれるが、これらに限るわけではない。M-CSFは、M-CSFを産生するための遺伝情報を保持するウイルスを使った感染によって細胞に投与することもできる。そのようなウイルスの限定でない例は、DISC-ヘルペスウイルスおよびポックスウイルス、例えば限定するわけではないが修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（MVA）である。
【００４６】
国際公開第02/42480号（この文献は特に参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、安全性が強化された新規MVA株が開発されている。これらの株は、次に挙げる有利な性質を少なくとも一つは持つことを特徴とする：
（i）ニワトリ胚線維芽細胞（CEF）ではインビトロで増殖的複製能を持つが、ヒト細胞株では、ヒトケラチノサイト細胞株HaCaT、ヒト胎児腎臓細胞株293、ヒト骨骨肉腫細胞株143B、およびヒト子宮頚部腺癌細胞株HeLaにおいてそうであるように、増殖的複製能を持たない；
（ii）成熟BおよびT細胞を産生する能力を持たず、したがって重度の免疫欠陥を持ち、複製ウイルスに対する感受性が高いマウスモデルにおいて、複製することができない；および
（iii）DNAプライム/ワクシニアウイルスブーストレジメンと比較して、少なくとも同じレベルの特異的免疫応答を、ワクシニアウイルスプライム/ワクシニアウイルスブーストレジメンで誘導する。
【００４７】
開発された株の一つはEuropean Collection of Animal Cell Cultures（ECACC）に受託番号V00083008として寄託されている。この株は、国際公開第02/42480号では全体を通して、「MVA-BN」と呼ばれている。
【００４８】
「増殖的複製能を持たない」という用語は、そのウイルスが、細胞株293（ECACC番号85120602）、143B（ECACC番号91112502）、HeLa（ATCC番号CCL-2）およびHaCat（Boukampら, J. Cell Biol. 106(3):761-71 (1988)）などのヒト細胞株において、いくつかの具体的MVA株について国際公開第02/42480号の実施例1で概説されているような条件下で、1未満の増幅比を示すことを意味する。
【００４９】
国際公開第02/42480号によれば、「インビボで複製することができない」とは、ヒトおよび国際公開第02/42480号に記載のマウスモデルにおいて複製しないウイルスを指す。
【００５０】
当業者はこれらの投与方法についてよく知っている。DCへのM-CSFまたは抗原の投与は、DCをM-CSFまたは抗原に「ばく露」させることになる。
【００５１】
本発明の別の実施形態では、抗原をDCにM-CSFと同時投与することができる。これらの抗原には、ウイルス（限定でない例として、インフルエンザ、HIV、CMV、EBV、ヒトパピローマウイルス、アデノウイルス、HBV、HCVおよびワクシニア）、細菌、真菌、寄生虫、プリオン、および腫瘍細胞（腫瘍抗原）上に存在する抗原、ならびにウイルス、細菌、真菌、寄生虫、軟体動物、節足動物、および脊椎動物に由来する毒素抗原が含まれるが、これらに限るわけではない。本発明の実施形態において、抗原は、自己抗体由来のペプチドであって、SLEを処置するための抗原になりうるもの、および突然変異型のFlt3またはc-kitに対応するペプチドであって、AMLを処置するための抗原になりうるものも含むことができる。
【００５２】
「同時投与」という用語は、動物または培養細胞への二つ以上の物質の投与を指す。同時投与は同時に行うことも、逐次的に行う（一方の物質を投与した後に他方を投与する）こともできる。逐次的に投与される場合、2番目の物質は、限定するわけではないが、1分以内、2分以内、5分以内、10分以内、30分以内、1時間以内、2時間以内、8時間以内、12時間以内、24時間以内、2日以内、3日以内、7日以内、14日以内、または1ヶ月以内であることができる。本発明の実施形態では、M-CSFの投与によって生成されるDCが、抗原の同時投与によって、抗原にも「ばく露」される。
【００５３】
「腫瘍抗原」という用語は、一定の腫瘍性疾患に関連する抗原を指す。腫瘍抗原は、ほとんどの場合、その腫瘍を発生させる宿主のゲノムによってコードされる抗原である。したがって厳密な意味では、腫瘍抗原は外来抗原ではない。しかし、腫瘍抗原は腫瘍中には有意な量で見出されるのに対して、正常組織中の腫瘍抗原の量はかなり少なく、ほとんどの場合、腫瘍抗原は正常組織には全く見出されない。腫瘍抗原の例には、黒色腫のgp75抗原、子宮頸がんのパピローマウイルスタンパク質、およびB細胞リンパ腫の腫瘍特異的イディオタイプタンパク質などがある。
【００５４】
本発明のさらなる実施形態では、M-CSF生成DCを使って、インビボまたはインビトロで、他の免疫細胞における免疫応答を刺激する。これらの免疫細胞には、T細胞（限定するわけではないが、調節性またはサプレッサーT細胞、キラーT細胞（CTL）、およびヘルパーT細胞（限定するわけではないが、Th1、Th2、およびTh17を含む）を含む）、B細胞、ナチュラルキラー細胞（NK細胞）、およびマクロファージが含まれるが、これらに限るわけではない。刺激された細胞は、免疫応答を開始させるために、インビボで動物に導入することができる。そのような免疫応答には、抗アレルギー応答、抗敗血症応答、抗移植片拒絶応答、抗腫瘍応答、抗自己免疫疾患応答、寛容誘発性免疫応答、抗病原体免疫応答、および調節性免疫応答が含まれるが、これらに限るわけではない。
【００５５】
M-CSF生成DCを刺激剤にばく露することもでき、その場合、「刺激剤」はDCからの特異的応答を誘導するタンパク質および他の分子である。本発明の刺激剤には、TLRアゴニスト、ウイルス、細菌、真菌、植物、寄生虫もしくはその一部、またはサイトカイン、例えば限定するわけではないが、IFN-I、IL-6、IL-10、IL-12およびTNF-αが含まれるが、これらに限るわけではない。
【００５６】
本発明の別の実施形態では、M-CSFが動物に投与される。「動物」という用語は、限定するわけではないが脊椎動物、最も好ましくは哺乳動物、例えば限定するわけではないがヒト、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、ネコ、イヌ、マウス、およびラットを包含する。
【００５７】
本発明の別の実施形態では、抗原をM-CSFと同時投与することができる。これらの抗原には、ウイルス（限定でない例として、インフルエンザ、HIV、CMV、EBV、ヒトパピローマウイルス、アデノウイルス、HBV、HCVおよびワクシニア）、細菌、真菌、寄生虫、プリオン、および腫瘍細胞（腫瘍抗原）上に存在する抗原、ならびにウイルス、細菌、真菌、寄生虫、軟体動物、節足動物、および脊椎動物に由来する毒素抗原が含まれるが、これらに限るわけではない。本発明の実施形態において、抗原は、自己抗体由来のペプチドであって、SLEを処置するための抗原になりうるもの、および突然変異型のFlt3またはc-kitに対応するペプチドであって、AMLを処置するための抗原になりうるものも含むことができる。
【００５８】
M-CSFおよび/または抗原は、タンパク質、DNA、RNA、またはウイルスとして動物に投与することができる。動物へのタンパク質の投与は、限定するわけではないが経口、経皮、経粘膜投与によって、または注射（非経口）によって、達成することができる。投与される用量は、どのタイプの投与を使用するかに依存して変動しうる。M-CSFおよび抗原の薬学的に許容できる製剤は当技術分野では知られている。担体または賦形剤を使って医薬組成物を製造することができる。担体の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、さまざまな糖、例えばラクトース、グルコース、もしくはスクロース、またはさまざまなタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、および生理的に適合する溶媒が含まれるが、これらに限るわけではない。生理的に適合する溶媒には、注射用水（WFI）、食塩溶液、およびデキストロースの滅菌溶液が含まれるが、これらに限るわけではない。M-CSFは、例えば限定するわけではないが静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、経口、経粘膜、直腸、または経皮を含む異なる経路によって、投与することができる。
【００５９】
インビボでは、M-CSFおよび/または抗原が、0.01μg〜100mg/日、0.1μg〜100mg/日、1μg〜100mg/日、10μg〜100mg/日、100μg〜100mg/日、1mg〜100mg/日、10mg〜100mg/日、50〜100mg/日、0.01μg〜10mg/日、0.1μg〜10mg/日、1μg〜10mg/日、10μg〜10mg/日、100μg〜10mg/日、1〜10mg/日、10〜50mg/日、0.01μg〜1mg/日、0.1μg〜1mg/日、1μg〜1mg/日、10μg〜1mg/日、100μg〜1mg/日、1〜10mg/日、または1〜50mg/日のレベルで動物に投与される。齧歯動物への投与の場合、1〜20μg/日のレベルは好ましく、10μg/日は最も好ましい。ヒトの場合、1〜50mg/日のレベルは好ましく、25mg/日は最も好ましい。M-CSFは、限定するわけではないが0.5μg〜10g/g体重/日、1μg〜10g/g体重/日、10μg〜10g/g体重/日、100μg〜10g/g体重/日、1g〜10g/g体重/日、0.5μg〜1g/g体重/日、1μg〜1g/g体重/日、10μg〜1g/g体重/日、または100μg〜1g/g体重/日（好ましくは0.5μg/g体重/日）などの、単位体重ベースで動物に投与することもできる。本発明では他の投薬量も考えられ、それらは当業者に知られるアッセイを使って決定することができる。
【００６０】
本発明のさらなる実施形態には、動物から単離された前駆体細胞へのM-CSFの投与が含まれる。これらの細胞はM-CSFによってインビトロで誘導され、抗原にばく露され、治療効果または予防効果を求めてその動物に戻される。そのような「エクスビボ」療法のための技法は、記載のとおり（36、37、44）、当業者には知られている。本発明ではエクスビボ療法のための他の技法も考えられる。
【００６１】
インビトロで造血前駆体細胞を誘導するために、例えば後述の実施例1に記載する手法をはじめとする（ただしこれに限るわけではない）当業者に知られる技法によって、細胞を培養し、DCを収集することができる。この実施形態では、DC細胞表面抗原、例えばCD11c、Ly49Q、CD4、CD8、CD22、DEC-205、33D1、PDCA-1、BDCA-1、BDCA-2、BDCA-4、CD25、CD80、CD86、CD40、CD69、Siglec-H、Ly6C、CCR9、HLA-DR、CD123、MHCII、B7H1、CD81、CD62L、CD11b、CD45R、CD45RA、およびF4/80を、当業者に知られる技法で観察することによって、DCが特徴づけられる。これらの技法には、例えば後述の実施例1に記載する方法による表面染色および蛍光活性化細胞選別（FACS）などが含まれるが、これらに限るわけではない。限定するわけではないが、IFN-I、IFN-α、IL-12 p70、IL-6、TNF-α、MCP-1およびIFN-γなどといったサイトカイン産生量の定量も、使用することができる。これは当業者に知られる技法で達成される。これらの技法には、後述の実施例1に記載するELISAが含まれるが、これに限るわけではない。
【００６２】
エクスビボ療法が関わる本発明の実施形態では、M-CSFおよび/または抗原を培養細胞にインビトロでタンパク質として投与することができる。M-CSFタンパク質は、当業者に知られる方法、例えば限定するわけではないがインビトロ原核および真核発現系で、製造することができる。
【００６３】
本発明の実施形態では、M-CSFおよび/または抗原が培養細胞に、例えば限定するわけではないが1〜100ng/ml、1〜75ng/ml、1〜50ng/ml、1〜25ng/ml、1〜10ng/ml、10〜100ng/ml、10〜75ng/ml、25〜100ng/ml、50〜100ng/ml、75〜100ng/ml、25〜75ng/ml、または50〜75ng/mlのレベルで、好ましくは10〜50ng/ml、最も好ましくは20ng/mlで、インビトロ投与される。
【００６４】
M-CSFおよび/または抗原は、M-CSFをコードし、培養細胞内でのその発現を指示するDNAまたはRNAの導入によって、培養細胞に投与することもできる。この投与方法のための技法には、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび形質導入のための技法が含まれるが、これらに限るわけではない。M-CSFおよび/または抗原は、M-CSFおよび/または抗原を産生するための遺伝情報を保持するウイルスを使った感染によって細胞に投与することもできる。そのようなウイルスの限定でない例は、DISC-ヘルペスウイルスおよびポックスウイルス、例えば限定するわけではないが修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（Modified Vaccinia virus Ankara: MVA）である。MVAの株、MVA-BNは、European Collection of Animal Cell Cultures（ECACC）に受託番号V00083008として寄託されている。当業者はこれらの投与方法についてよく知っている。
【００６５】
いくつかの自己免疫疾患、例えば限定するわけではないがSLEは、Toll様受容体9（TLR9）によって媒介されることが示されている（38）。TLR9はDNAを認識し、一定の条件下では、自己免疫疾患において自己DNAを認識することができる。これらの疾患では、TLR9が自己DNAに結合すると、TLR9を発現させるB細胞が増殖することになる。また、pDCもTLR9-DNA複合体によって活性化され、増加したレベルのIFN-Iを産生し、それが疾患をさらに悪化させる。pDCのFL誘導は、それがpDC発生を誘導する際に絶え間ない刺激を加えることにより、この悪化の一因になる。本発明の実施形態は、SLEなどの自己免疫疾患を患っている患者にM-CSFが投与され、それがM-CSFによって誘導される新しいDCを感作するように作用するという、より良い治療レジメンを提供する。しかし、FLによる処置とは対照的に、DCが誘導されるだけでなく、M-CSFはTLR9および自己DNA複合体に対するその応答もダウンレギュレートする（23）。このようにM-CSF誘導DCは、患者における特異的免疫応答、例えば限定するわけではないが悪化した自己免疫反応の下方調整を、追加のTLR9 IFN-I産生およびB細胞刺激をトリガーすることなく、促進することができる。
【００６６】
本発明のもう一つの実施形態では、増殖性障害のための治療レジメンが提供される。そのような増殖性障害には、白血病などのがんタイプが含まれる。これらの白血病には、AMLが含まれるが、これに限るわけではない。AMLおよび他の白血病は、FLの受容体であるFlt3の活性化によって媒介される（39，48〜50）。したがって、本発明のこの実施形態では、DCの発生を誘導するために患者にFLを投与すると、疾患を悪化させることになるだろう。これに対し、本発明では、FLで腫瘍細胞をさらに刺激することなく、腫瘍細胞に対する免疫応答を与えるようにDCを誘導することができるように、M-CSFを腫瘍抗原と一緒に白血病（AMLを含むが、これに限るわけではない）を持つ患者に投与する。Flt3のインヒビターも白血病を処置するためにM-CSFと一緒に使用することができる。Flt3のインヒビターは当業者には知られている。
【００６７】
本発明の実施形態は、他の増殖性障害（骨髄系統、リンパ球系統もしくは赤血球系統、またはその前駆体細胞から生じる造血系の過形成/新生物細胞が関わる造血新生物障害を含むが、これに限るわけではない）の処置にも向けられる。これらには、赤芽球性白血病、急性前骨髄性白血病（APML）、慢性骨髄性白血病（CML）、リンパ系悪性疾患、例えば限定するわけではないが急性リンパ芽球性白血病（ALL）（B系統ALLおよびT系統ALLを含む）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、前リンパ球性白血病（PLL）、ヘアリー細胞白血病（HLL）およびワルデンストレーム・マクログロブリン血症（WM）が含まれるが、これらに限るわけではない。他の形態の悪性リンパ腫には、非ホジキンリンパ腫およびその変種、末梢T細胞リンパ腫、成人T細胞白血病/リンパ腫（ATL）、皮膚T細胞性リンパ腫（CTCL）、大型顆粒リンパ球性白血病（LGF）、ホジキン病およびリード-シュテルンベルク病が含まれるが、これらに限るわけではない。
【００６８】
また本発明の実施形態は、限定するわけではないが、呼吸器系癌、胃腸系癌、泌尿生殖器系癌、精巣癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系癌、および黒色腫を含む上皮または内分泌組織の悪性疾患の処置も包含する。典型的な癌には、子宮頸、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸および卵巣の組織から形成されるものが含まれるが、これらに限るわけではない。
【００６９】
さらにまた、本発明の実施形態は、造血前駆体細胞から前記前駆体細胞のM-CSF刺激によって生成される樹状細胞を包含する。好ましい一実施形態では、前記樹状細胞の生成がFLに依存しない。生成された樹状細胞はcDCタイプまたはpDCタイプでありうる。造血前駆体細胞には骨髄細胞が含まれるが、これに限るわけではない。M-CSF刺激によって樹状細胞を生成させるための方法は、本明細書で詳しく説明する。
【００７０】
本発明はさらに、M-CSFをコードする核酸配列を含む組換えポックスウイルスに関する。本発明によれば、ポックスウイルスは任意のポックスウイルスであることができる。したがってポックスウイルスは、チョルドポックスウイルス亜科およびエントモポックスウイルス亜科の任意のウイルスであることができる（「Fields Virology」第3版（Lippincott-Raven Publishers、米国フィラデルフィア、ISBN 0-7817-0253-4）の第83章を参照されたい）。組換えポックスウイルスをヒトを含む哺乳類動物で遺伝子を発現させるために使用する場合は、チョルドポックスウイルス亜科のウイルスが特に好ましい。チョルドポックスウイルス亜科に属する特に好ましい属は、オルトポックスウイルス、パラポックスウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルスおよびスイポックスウイルスである。最も好ましいのはオルトポックスウイルスおよびアビポックスウイルスである。アビポックスウイルスの例はカナリア痘ウイルスおよび鶏痘ウイルスである。オルトポックスウイルスの例はワクシニアウイルスである。本発明に従って使用することができるワクシニアウイルス株は、コペンハーゲン（Copenhagen）株、ワイエス（Wyeth）株、ウェスタンリザーブ（Western Reserve）株、エルストリー（Elstree）株、NYCBH株など、任意のワクシニアウイルス株であることができる。特に好ましいのは修飾ワクシニア・アンカラ（MVA）である。
【００７１】
MVAは、ワクシニアウイルスのアンカラ株（CVA）をニワトリ胚線維芽細胞で516代にわたって連続継代することによって作出された（概要については、Mayr, A.ら, Infection 3, 6-14 [1975]を参照されたい）。これらの長期間にわたる継代の結果、得られたMVAウイルスではそのゲノム配列のうち約31キロ塩基が欠失しており、したがって宿主細胞は鳥類細胞に著しく制限されると記載されている（Meyer, H.ら, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038 [1991]）。得られたMVAは著しく病原性であることが、さまざまな動物モデルで示されている（Mayr, A.およびDanner, K.[1978] Dev. Biol. Stand. 41:225-34）。
【００７２】
本発明では任意のMVA株を使用することができる。好ましい一実施形態では、MVAが次の有利な性質を少なくとも一つ、二つ、または好ましくは三つ持つことを特徴とする：
（i）ニワトリ胚線維芽細胞（CEF）ではインビトロで増殖的複製能を持つが、ヒト細胞株では、ヒトケラチノサイト細胞株HaCaT、ヒト胎児腎臓細胞株293、ヒト骨骨肉腫細胞株143B、およびヒト子宮頚部腺癌細胞株HeLaにおいてそうであるように、増殖的複製能を持たない；
（ii）成熟BおよびT細胞を産生する能力を持たず、したがって重度の免疫欠陥を持ち、複製ウイルスに対する感受性が高いマウスモデルにおいて、複製することができない；および
（iii）DNAプライム/ワクシニアウイルスブーストレジメンと比較して、少なくとも同じレベルの特異的免疫応答を、ワクシニアウイルスプライム/ワクシニアウイルスブーストレジメンで誘導する。
【００７３】
ブダペスト条約の要件に従って寄託された、本発明で使用されるMVAウイルス株の例は、英国ソールズベリーのEuropean Collection of Animal Cell Cultures（ECACC）に受託番号ECACC V94012707およびECACC V00120707としてそれぞれ寄託されたMVA 572株およびMVA 575株である。好ましい一実施形態では、前記MVAが、「MVA-BN」と表示される、英国ソールズベリーのEuropean Collection of Cell Cultures（ECACC）に番号V00083008として寄託されたMVAワクシニアウイルスおよびその派生株である。
【００７４】
ある実施形態では、本発明のポックスウイルスが少なくとも一つの異種核酸配列を含む。以下、通常は自然界においてそのウイルスと密接に関連して見出されることがない核酸配列の任意の組合せについて「異種」という用語を使用し、そのようなウイルスを「組換えウイルス」ともいう。好ましくは異種核酸配列は、少なくとも一つの抗原、抗原エピトープ、および/または治療化合物をコードする配列である。抗原エピトープおよび/または抗原は、感染性因子の抗原エピトープおよび/または抗原であることができる。感染性因子はウイルス、真菌、病原性単細胞真核または原核生物、および寄生生物であることができる。ウイルスは、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、パラミクソウイルス、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスのファミリー、または出血熱を引き起こすウイルスから選択することができる。感染性因子は炭疽菌であることができる。
【００７５】
さらにもう一つの実施形態によれば、上述した抗原エピトープの選択に加えて、もう一つのポックスウイルス異種配列源またはワクシニア異種配列源から異種配列を選択することもできる。これらのウイルス配列は、そのウイルスの宿主スペクトルまたは免疫原性を調整するために使用することができる。
【００７６】
さらにもう一つの実施形態において、本発明のポックスウイルスは、治療化合物を発現させる異種遺伝子/核酸をコードしうる。ウイルス中の異種核酸がコードする「治療化合物」は、例えばアンチセンス核酸などの治療核酸、または所望の生物学的活性を持つペプチドもしくはタンパク質であることができる。
【００７７】
さらにもう一つの好ましい実施形態によれば、異種核酸配列の発現は、好ましくはポックスウイルスプロモーター、より好ましくはワクシニアウイルスプロモーターの転写制御を受けるが、これに限るわけではない。
【００７８】
さらにもう一つの実施形態によれば、異種核酸配列の挿入は、好ましくは、ウイルスゲノムの非必須領域に行われる。本発明のもう一つの好ましい実施形態では、異種核酸配列が、ポックスウイルスゲノム（PCT/EP96/02926に開示されているMVAを含むが、これに限るわけではない）中の天然の欠失部位に挿入される。ポックスウイルスゲノム中に異種配列を挿入する方法は、当業者には知られている。
【００７９】
さらなる実施形態によれば、本発明は、ワクチンまたは医薬品として使用するための本発明の組換えポックスウイルスに関する。本発明は、上で特定した増殖性疾患および/または自己免疫疾患を処置するための、本明細書に記載するM-CSFをコードする核酸配列を含む組換えポックスウイルスにも関係する。さらにまた本発明は、増殖性疾患および/または自己免疫疾患を処置するための医薬組成物を製造するための、M-CSFをコードする核酸配列を含む組換えポックスウイルスの使用も包含する。
【００８０】
より一般的に述べると、本発明は、本発明の組換えポックスウイルスを含むワクチンまたは医薬組成物に関する。ワクチンまたは医薬組成物を製造し、動物または人体に投与できるようにする方法は、当業者には知られている。ベクターがポックスウイルスベクターまたはワクシニアウイルスベクター、特にMVAベクターなどのウイルスベクターである場合は、当業者の知識に従って、例えば静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮内または皮下投与などにより、それを動物または人体に投与することもできる。
【００８１】
医薬組成物またはワクチンは、一般に、本発明のプロモーター、発現カセットまたはベクターに加えて、一つ以上の薬学的に許容できかつ/または承認された担体、添加剤、抗生物質、保存剤、佐剤、希釈剤および/または安定剤を含みうる。そのような補助物質は、水、食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質などであることができる。適切な担体は、典型的には、大きくてゆっくり代謝される分子、例えばタンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー、脂質集合体などである。
【００８２】
医薬組成物またはワクチンを製造するには、本発明の組換えポックスウイルス、特に組換えMVAなどの組換えワクシニアウイルスを、生理的に許容できる形態に変換する。ワクシニアウイルス、特にMVAの場合は、これを、痘瘡に対するワクチン接種に用いられるポックスウイルスワクチンの製造における経験に基づいて行うことができる（Stickl,H.ら [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392に記載されている）。例えば精製ウイルスは、約10mMトリス、140mM NaCl pH7.4中に製剤化して、5×108 TCID50/mlの力価で、-80℃で保存される。ワクチン注射剤を製造するには、例えば本発明の組換えウイルスの粒子101〜109個を、リン酸緩衝食塩水（PBS）中、2％ペプトンおよび1％ヒトアルブミンの存在下に、アンプル中、好ましくはガラスアンプル中で凍結乾燥する。あるいは、ワクチン注射剤を、製剤中のウイルスの段階的凍結乾燥によって製造することもできる。この製剤は、さらに、例えばマンニトール、デキストラン、糖、グリシン、乳糖もしくはポリビニルピロリドンなどの添加剤、または、インビボ投与に適した酸化防止剤もしくは不活性ガス、安定剤または組換えタンパク質（例えばヒト血清アルブミン）などの他の添加剤も含むことができる。凍結乾燥に適した典型的なウイルス含有製剤は、10mMトリス緩衝液、140mM NaCl、18.9g/lデキストラン（MW36000〜40000）、45g/)ショ糖、0.108g/l L-グルタミン酸一カリウム塩一水和物、pH7.4を含む。次に、ガラスアンプルを密封して、4℃〜室温で数ヶ月間保存することができる。しかし、必要がない限り、アンプルは-20℃未満の温度で保存することが好ましい。
【００８３】
ワクチン接種または治療を行うには、上記の凍結乾燥品を0.1〜0.5mlの水性溶液、好ましくは水、生理食塩水またはトリス緩衝液に溶解し、それを全身的または局所的に、すなわち非経口投与、筋肉内投与、または当業者に知られている他の任意の投与経路によって、投与することができる。当業者であれば、投与様式、用量および投与回数を、既知の方法で最適化することができる。
【００８４】
さらにもう一つの実施形態において、本発明は、造血前駆体細胞から樹状細胞（DC）を生成させるための、本発明の組換えポックスウイルスまたは医薬組成物の使用に関する。
【００８５】
本発明は、動物中で抗原に対する免疫応答を誘導するためのキットも包含する。本発明の一実施形態において、キットは、本発明の組換えウイルスを第1バイアル/容器に含み、抗原（それに対する免疫応答を誘導させようとするもの）を第2バイアル/容器に含む。ウイルスは組換えポックスウイルス、特にMVAにとって異種である追加ヌクレオチド配列を含有する組換えMVAであることができる。好ましい一実施形態では、組換えポックスウイルスが、M-CSFをコードする核酸を含むMVAウイルスである。特に好ましい一実施形態では、上記のキットが、M-CSFをコードする遺伝子を含む本発明の組換えポックスウイルスを第1バイアルに含み、上述の抗原を第2バイアルに含む。キットは、第1ステップとして、動物中で樹状細胞（DC）を増加および/または生成させるために、本発明の組換えポックスウイルスを含む第1バイアルを前記動物に投与するようにという指示も含む。第1バイアルは、動物から取り出された造血前駆体細胞に、インビトロおよび/またはエクスビボで投与することもできる。M-CSFの添加後に樹状細胞が増加および/または生成したかどうかを決定するための方法は、本明細書に詳しく説明する。前記樹状細胞を生成させた後に、抗原を含む第2バイアルを、生成した樹状細胞にインビトロおよび/またはエクスビボで投与することができる。次に、そのばく露された樹状細胞を、動物に再導入することができる。あるいは、抗原を含む第2バイアルを動物にインビボで投与することもできる。
【００８６】
以下の詳細な実施例は、本発明をより良く理解する一助となるように記載するものである。しかし本発明はこれらの実施例に限定されるわけではない。本発明の他の実施形態は、ここに開示する本発明の明細および実施を検討することにより、当業者には明白になるだろう。
【実施例】
【００８７】
＜実施例１＞
材料と方法
マウス−C57BL/6マウスはHarlan Winkelmann（ドイツ・ボルヒェン）から入手し、6〜10週齢で使用した。FLKOマウスは記載（14）されているように開発され、チューリッヒ大学の実験動物学研究所（Institute of Labortierkunde）で繁殖された。ユビキチンプロモーター下の緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現させるマウス［C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J、以下UBC-GFPマウスともいう］はCharles River Laboratories（ドイツ・ズルツフェルト）から購入した。動物実験は、現地政府の動物倫理委員会の承認を受けて、そのガイドラインに従って行った。
【００８８】
抗体および試薬−組換え（rec）flagタグ付きマウス（mu）FLは、先に記述したように（10）、自社において、CHO細胞中で発現させ、精製した。recmuM-CSFおよびrechuM-CSFをTebu-Bio（ドイツ・フランクフルト）から、またrechuM-CSFをR&D Systems（ドイツ・ウィースバーデン）から入手した。cFMS受容体チロシンキナーゼインヒビター（カタログ番号344036）はEMD Biosciences（ドイツ・ダルムシュタット）から入手した。CpGモチーフを含有するオリゴヌクレオチド（CpG2216およびCpG1668）は、公表された配列（35）に従い、TIB MOLBIOL（ドイツ・ベルリン）によって合成された。イミキモド（R837）およびパルミトイル-3-システイン-セリン-リジン-4（Pam-3-Cys）はInvivoGen（米国サンディエゴ）から購入した。ポリ(シチジル-イノシン)酸（ポリI:C）、リポ多糖（LPS）および7-アリル-7,8-ジヒドロ-8-オキソグアノシン（ロキソリビン）はSigma-Aldrich（ドイツ・タウフキルヒェン）から購入した。全ての抗体は、別段の言明がない限り、次の例外を除いて、Becton Dickinson（ドイツ）から入手した：精製およびFITCコンジュゲート抗CD11c（ラットクローン223H7）および抗Ly49Q（Biozol Diagnostica Vertrieb GmbH、ドイツ・エーヒンク）、抗mPDCA-1（Miltenyi Biotec、ドイツ・ベルギッシュグラートバッハ）および抗F4/80（NatuTec GmbH、ドイツ・フランクフルト）、抗CD117-PeCy7（クローン2B8）、抗CD34-Pe（クローンRAM34）（NatuTec GmbH、ドイツ・フランクフルト）および抗CD115（クローンAFS98、およびアイソタイプ対応ラットIgG2a対照）。もう一つのM-CSR mAb（クローン604B5 2E11、Serotec GmbH、ドイツ・デュッセルドルフ）も使用したが、このmAbによる染色は、クローンAFS98とは異なり、全BMでは極めて低く、このクローンを使ってCLP上のM-CSFR発現を検出することはできなかったことに注意すべきである。エクスビボDC精製（21）用の枯渇カクテルにその上清を使用した多くのハイブリドーマは、Ken Shortman教授（WEHI、オーストラリア・メルボルン）から提供された。
【００８９】
M-CSFおよびFL BM培養物−BM細胞をマウスの大腿骨および脛骨から洗い出した。赤血球溶解緩衝液（Sigma-Aldrich）を使ってBM細胞懸濁液から赤血球を枯渇させた。次にBM細胞を直接または枯渇後に培養した。枯渇させるには、BM細胞をCD11cおよびCD45R（B220）に対するラット抗体と共に30分間インキュベートした後、ヤギ抗ラット磁気ビーズ（Qiagen、ドイツ・ヒルデン）と共に30分間インキュベートした。この枯渇手法により、常に、全BM細胞の65〜80％が除去された。ラット抗体の非存在下で、ビーズのみによる枯渇でも、おそらくはFcR/Ig相互作用により、約50％のBM細胞が枯渇されることに注意すべきである。全BM細胞または枯渇BM細胞は、10％FCS、50μM β-メルカプトエタノール、100IU/mlペニシリン/ストレプトマイシン（完全培地）および20ng/mlのrecmuM-CSFもしくはrechu-MCSFまたは35ng/mlのrecmuFLを補足したRPMI-1640培地（Gibco）中、1.5×106細胞/mlで、5％CO2を含有する湿潤雰囲気下、37℃で6〜8日間培養した。M-CSF培養物には新鮮なM-CSFを培地交換なしで3日ごとに供給した。
【００９０】
M-CSFまたはFL BM培養物の表面染色−収集した細胞を、2％FCSおよび2mM EDTAを含有するPBS（FACS緩衝液）中で洗浄した。次に、1mg/ml精製抗CD16/32モノクローナル抗体（クローン2.4G2）と共に氷上で20分間インキュベートすることによって、FcR結合をブロックした。次に、等体積の2×濃縮特異抗体染色剤を細胞懸濁液に加え、さらに20分間インキュベートした。細胞をFACS緩衝液中で洗浄し、1μg/mlヨウ化プロピジウムを含有するFACS緩衝液に再懸濁した。
【００９１】
DCサブセットの活性化およびELISAによるサイトカイン産生の解析−無選別M-CSFもしくはFL BM培養物または選別DC（0.25〜0.5×106細胞/ml）を、刺激剤を添加してまたは添加せずに、完全培地中で18〜24時間刺激する。使用した刺激剤は次のとおりである：1μg/ml Pam-3-Cys、100μg/mlポリ(I:C)、1μg/ml LPS、1μg/ml R837、1mMロキソリビン、0.5μM CpG2216、0.5μM CpG1668。培養上清をIFN-αの存在について、以前記述したように（21）、2部位（two-site）ELISAによってアッセイした。他のサイトカイン（IL-12 p70、IL-6、TNF-α、MCP-1およびIFN-γ）はサイトメトリック・ビーズ・アレイ（Cytometric Bead Array）マウス炎症キット（Mouse Inflammation Kit）（Becton Dickinson）を使って測定した。刺激されたDCを上述のようにブロックし、CD8α、CD40、CD69、CD80およびCD86に対する抗体で染色した。
【００９２】
インビボM-CSF処置−野生型マウスおよびFLKOマウスを、0.01％BSA中のM-CSF 10μg（体積100μl）または賦形剤のみで、5日間連続してip処置した。その5日間の最後にマウスを屠殺した。腹膜を完全培地で3回洗った後、DC精製用に臓器を集めた。
【００９３】
エクスビボDC精製−M-CSF処置マウスまたは賦形剤処置マウスの脾臓から、基本的に以前述べたように（21）、マウス容量オスモル濃度（308mOsm）に調節したFACS緩衝液、RPMIおよび1.077A Nycodenz（Progen Biotechnik GmbH、ドイツ・ハイデルベルク）を使って、DCを精製した。
【００９４】
前駆細胞の培養．CMP（Lin-Sca-1-ckit+CD34+FcRint）、CLP（Lin-Sca-1+c-kitintIL-7R+Thy-1-）または顆粒球/マクロファージ前駆細胞（GMP、Lin-Sca-1-c-kit+CD34+FcRhi）を、以前述べたように21、C57BL/6 BMから単離し、FACS-ARIA装置で純度95％超まで選別した。2500個の細胞およびその段階2倍希釈液を、24ウェルプレートに入っているUBC-GFP BM細胞の1ml懸濁液に加えた。最終UBC-GFP BM細胞濃度を1.0×106細胞/mlとした。M-CSF培養またはFL培養をこれらのウェルで上述のように行った。6日後に試料を数え上げ、FACSで解析し、C57BL/6前駆細胞から生じた子孫にGFPneg細胞としてゲートをかけた。CLP（Lin-Sca-1+c-kitintIL-7R+Thy-1-）上のM-CSFR（CD115）およびFlt3（CD135）発現を解析するために、リニエージ枯渇（lineage depleted）細胞をまずSca-1-FITCおよびThy-1-PE抗体で染色し、Sca-1+Thy-1-細胞を選別した。次に、これらの前濃縮細胞（再分析したところ純度＞95％）をCD117-PE-CY7、IL-7R-APCおよびCD115-PEまたはCD135-PEのどちらか一方で染色した。
＜実施例２＞
【００９５】
M-CSFと共に培養した全BM細胞はCpG-ODNに応答するIFN-αの強力な産生細胞である
マウス骨髄（BM）細胞をFLと共に8〜10日間培養すると、定常状態マウス脾臓のDC集団とよく似た何百万もの高度に純粋なpDCおよびcDCの生成が起こると報告されている（19）。これらのFL培養物内でのpDC発生の動態をルーチン的に調べるために、マルチウェルフォーマットでFLと共にインキュベートされた全BM細胞のIFN-α産生能を、0〜7日の時間経過にわたって解析した。M-CSFはBM細胞からマクロファージを生成させるために日常的に使用されるので、陰性対照として、並行して全BM細胞をM-CSFと共に培養した。通常、培地およびM-CSFは数日ごとに交換され、7日以上の培養期間の最後に接着細胞だけが収集される（17）。しかしそうではなく、M-CSF培養物をFL培養物と全く同じように処理し、全M-CSF培養物のウェル（接着細胞と非接着細胞を含む）をCpG-2216に応答して起こるIFN-α産生について解析した。意外なことに、M-CSF培養物において、IFN-αが高レベルに誘導された。そのうえ、CpG-2216に応答して産生されるIFN-αが培養時間と共に増加したことから、M-CSF培養中にIFN-α産生細胞が生成されつつあることが暗示された（図1A）。
＜実施例３＞
【００９６】
M-CSF BM培養物中で誘導されたIFN-α産生細胞はpDCの特徴を示すが、FLの影響を受けずに発生する
全BM細胞からpDCおよびcDCを枯渇させると、BM細胞のCpG誘導IFN-α産生能が枯渇した。DC枯渇BM細胞をM-CSFと共に6日間培養したところ、強力なIFN-α産生能が、M-CSF培養物の非接着細胞中に再び検出された。
【００９７】
非接着性M-CSF生成細胞がpDCに予想される表現型を示すかどうかを決定するために、それらをCD11cおよびCD45RAで染色した。実際、培養物内の細胞のうち10〜20％の集団が、高レベルのCD45RAと中レベルのCD11cを発現させると共に、CD3、CD19またはCD49bまたはNK1.1発現を欠き、側方散乱および前方散乱は少なく、これは、pDCの表現型と一致した（図1Bおよび未掲載データ）。
【００９８】
pDCの収量はFLで得られるものよりかなり少なかったものの、M-CSFがpDC発生を誘導しうることは明らかだった。二つの培養物を6日間の培養後に並べて比較したところ、M-CSFの効率はFLの約10分の1だった（図1B）。比較のために6日目を選択した理由は、この段階後にM-CSF培養物が著しく酸性になること、および培養物から選別されたDC集団は培養中ではるかに急速に死滅し、サイトカインを産生できなかったからである。
【００９９】
pDCのM-CSF誘導が内在性FLを要求するかどうかを決定するために、FL遺伝子が除去されているマウス（FLKOマウス）からの同型BM培養物を調べた。FLKOマウスのBM培養物から得られる全細胞数は、培養をM-CSFを添加して行うかFLを添加して行うかにかかわらず減少したことから（図1c）、FLの非存在下でもpDCが発生することが示された。まず最初にDC集団を枯渇させ、外因性M-CSFのみの存在下で、FLの潜在的影響が及ばない状態でBMを培養することにより、pDCの表現型および形態を持つ細胞が産生されることは、明らかだった。これらのM-CSF生成pDCをM-pDCと呼ぶ。
＜実施例４＞
【０１００】
M-pDCの詳細な表面表現型
野生型マウスおよびFLKOマウス由来のM-pDCの詳細な表現型決定により、誘発されたpDCは40個を越える表面マーカーに関して同一の表現型を示したことがわかる。FLを使ってインビトロで生成されたpDC（FL-pDC）と比較したところ、これら二つの異なるサイトカインで生成されるpDC間では、数多くの細胞表面マーカーが異なっていた。実際、図2に示すように、M-pDCは、多くのマーカーについて、FL-pDCとエクスビボ単離脾臓pDCの中間であると思われるような表現型を示した。pDCの分化マーカーとして認識される分子；Ly49Q（20）、CD4（21）およびMHCIIは全て、M-pDC上の方がFL-pDC上よりも多く、脾臓pDC上のレベルに極めて近い。M-pDCはエクスビボ脾臓pDCと同程度に高レベルのLy6Cを発現させる。pDCはLy6C-前駆体から発生することが最近示されたので、M-pDCはpDC発生においてFL-pDCとは異なるさらに分化した状態を表す（22）。
【０１０１】
M-pDC上でのB7H1、CD81、CD62LおよびCD11bの表面発現も、FL-pDCよりもエクスビボpDCに方に似ている。対照的に、M-pDCは最低レベルのCD44を発現させ、脾臓pDCによって発現される高レベルとFL-pDCによって発現される低レベルとの間を埋める幅の表面CD24を発現させる。またM-pDCは低レベルのF4/80を発現させる。低いF4/80発現はM-pDCに「骨髄系」の表現型を付与する。M-pDCは極めて低レベルのCD11b（FL-pDCの10分の1程度）を発現させ、Ly6Gを発現させない。
＜実施例５＞
【０１０２】
高度に精製されたM-pDCはTLR7およびTLR9のリガンドによって活性化される
FL-pDCおよびエクスビボpDCと同様に、M-pDCはTLR3、TLR4またはGM-CSFに対するリガンドでは活性化されなかったが、TLR2リガンドPam-3-Cysに対して極めて微小な表面活性化を示した（図3A）。これらの刺激に対するM-pDCの生存率は極めて低かった（＜5％）、未掲載データ。
【０１０３】
FL-pDCおよびエクスビボpDCと同様に、選別されたM-pDCは、CD8α、CD69、CD86およびCD40の増加した発現が示すとおり（図3Bおよび未掲載データ）、TLR7およびTLR 9のリガンドで活性化された。M-pDCだけが、TLR7およびTLR 9リガンドに対して検出可能なサイトカインを産生した（図3Cおよび未掲載データ）。A型CpG-ODN（CpG2216）に応答して、M-pDCは高レベルのIFN-αを産生した（図3C）。M-pDCによって産生されたIFN-αの絶対量はFL-pDCによって産生された量の2分の1程度だった。TLR7およびTLR 9リガンドによって誘導される他のサイトカインには、IL-6およびTNF-αが含まれた（図3D）。M-pDCはFL-pDCと類似するレベルのIL-6を産生したが、FL-pDCよりも高レベルのTNF-αを産生した。M-pDCによるIL-10、IL-12p70、MCP-1およびIFN-γの産生も調べたが、これらのサイトカインはいずれも検出されなかった。
【０１０４】
終夜刺激後に、M-pDCを表現型の変化について調べた。M-pDCは、FL-pDCおよびエクスビボpDCと同様に、TLR刺激を受けて、増加したレベルのCD8a、CD69、CD86およびCD40を発現させた。
＜実施例６＞
【０１０５】
M-CSF BM培養物では通常型DCも発生する
図1に示すように、M-CSF BM培養物では、CD45RAまたはT、BもしくはNK細胞マーカーを同時に発現させないCD11c+細胞も誘導された。pDCと同様に、これらの細胞はFLKOマウスのBM培養物でも発生した。これらの細胞の表面表現型解析により、それらは、補助刺激マーカーおよびMHCIIを発現させる通常型（c）DCに似ていることがわかる（図7）。M-CSF BM培養物内で生成したM-cDCは、FL-cDCと同様に、活性化マーカー（CD80、CD86、CD40、MHCII）に関して不均一であったが、全体として、FL培養物中で誘導されたcDCよりも高レベルなこれらのマーカーを示した。FL-DC培養物では、CD11bloCD24hicDCは、CD8+CD11b-CD24hiCD205+脾臓cDC等価物に相当する。M-CSF培養物中で生成したcDCは、低レベルのCD11bを発現させる細胞を含有するが、それらはFL-cDCには存在する極めて高レベルなCD24を発現させる細胞を欠くことから、それらはおそらくCD8+cDC等価物を産生しないことが示唆される。TLR刺激時に、cDCは活性化されて、成熟エクスビボ活性化cDCに類似した。
【０１０６】
興味深いことに、M-cDCおよびM-pDCの活性化において、それらはTLR9リガンドによく応答した。これは、TLR9をダウンレギュレートし、その結果として、TLR9リガンドに対してあまり応答しないM-CSF培養物内のマクロファージとは、極めて異なるシナリオである。
＜実施例７＞
【０１０７】
M-pDC生成は活性c-fmsに依存する
BM骨髄球系共通前駆細胞（CMP）およびリンパ球系共通前駆細胞（CLP）内のFlt3+細胞が、マウスリンパ器官内でのcDCおよびpDCの前駆体であることは、以前に示されており（24、25）、DC発生にとってFLは不可欠であると考えられていた。したがって、FLの非存在下でのDCの生成、特に典型的な単球性ポエチンによるpDCの生成は、予想外だった。図1に示すように、M-pDCは明らかにFLの非存在下で発生するが、それらはFL-pDCに対して多くの類似点も示す。M-CSFおよびFLが、各々の受容体Flt3およびc-fmsと同様に、構造的類似性を持つことから、M-CSFがFlt3を介してシグナルしているかどうかを調べた。すなわちM-CSFが、同様にFlt3を介してシグナルするFL代替物として作用してM-CSF誘導「FL-DC」を生成させるのかどうかを調べた。
【０１０８】
受容体チロシンキナーゼのインヒビターは数多く存在し、その交差反応性のレベルはさまざまである。インヒビターの一つ、cFMS受容体チロシンキナーゼインヒビター（Calbiochem）（これは、高度に特異的なc-fmsインヒビターであると報告されている）を使用した。事実、cFMS受容体チロシンキナーゼインヒビターは、幅広い濃度範囲でM-CSFの造血作用を完全に遮断した（図6）。最も高いインヒビター濃度ではFLによるDCの生成も遮断した。しかし、0.63〜1.3μMの範囲で使用したcFMSインヒビターは、FLが媒介するFL-DC生成に対してわずかな影響しか持たなかった（図4Aおよび図8）。これらと同じ低濃度でもM-DC生成は遮断されたので、M-pDC生成にはFlt3受容体チロシンキナーゼを介したM-CSF作用が関与しない。c-fmsインヒビターは高濃度ではプロミスキャス（promiscuous）な受容体チロシンキナーゼインヒビターであるようだが、低濃度ではFL-DC生成を阻害せず、これが実際にc-fms特異的であることが証明される。全く対照的に、Flt3インヒビター（Flt3インヒビターII、Calbiochem）はFL-DCの生成に関して著しく阻害的であるが、M-DCの生成についてはそうでない（図4Bおよび図8）。このようにM-pDCおよびM-cDCは、インビトロで、Flt3およびFLには依存せずに、M-CSFにより、c-FMSシグナリングを介して生成されうる。
＜実施例８＞
【０１０９】
M-CSFはインビボでM-pDCおよびM-cDC生成を誘導する
M-CSFの遺伝子に突然変異を持つために機能的なM-CSFを欠くop/opマウスは、減少した脾臓DC数を示すことが、最近、報告された27。具体的にはcDCは約2分の1に減少し、pDCは約3分の1に減少した。これは、実質的に、FLを欠くマウスに見られる効果ほどの効果ではなかったが、それでもなお、M-CSFの欠如がDC数の減少をもたらしたことから、M−CSFはDCポエチンであるという仮定が実証された。MacDonaldら（2005）によって始められた研究をさらに検証するべく、M-CSFが実際にインビボでDC数を増加させうるかどうかを解析するために、マウスにM-CSFを投与した。先行技術の他の参考文献によれば、10〜200μ/日の範囲にある一連の外因性M-CSF濃度が投与されている。使用されたM-CSFの供給源は広範囲にわたってさまざまであり、その結果、比活性も同様である。したがって、投与すべきM-CSFの最適レベルまたは飽和レベルを判定することは不可能である。そのうえ、M-CSFは循環中でわずか10分という極めて短い半減期を持つことが報告されている28。決定された比活性を持つ市販のM-CSFには法外なコストがかかるので、「原理証明（proof of principal）」実証実験を行い、10μg/日のM-CSFをC57BL/6マウスまたはFLKOマウスに5日間投与した。この量は増減せず、適用期間の延長も試みなかった。しかし、5日間の適用後には、調べたマウスの腹腔洗浄液中にF4/80hi細胞の著しい増加が観察されることは明らかだった（未掲載データ）。前記の知見はM-CSFが実際にインビボで作用を誘導していることを示す。
【０１１０】
脾臓中のDC集団を解析することにより、M-CSFは、pDC数とcDC数の両方について、約2倍という再現可能な増加を誘導していることが明らかになった。この増加はC57BL/6マウスおよびFLKOマウスにおいて明白だった（図5）。cDC亜集団をより詳しく調べたところ、CD8+集団およびCD8-集団がかなり均一に増加していることが示された（未掲載データ）。図5Aで明らかなように、M-CSF処置後に精製された低密度（light density）非DCの増加はあったものの、M-CSF処置は全脾細胞の増加を誘導しなかった（図5B）。CD11cintCD45RA-およびCD45RAhiCD11c-/lo細胞は潜在的に未成熟DC集団を含有しうるが、それはこれ以上調べなかった。DCに似た細胞のより大規模な増加（6倍を超える増加）が、調べたC57BL/6マウスの腹腔洗浄液でも明白だった（未掲載データ）。
【０１１１】
これは、M-CSFが、pDCおよびcDCをインビトロで誘導するだけでなく、インビボでも、FLの非存在下でさえ、DC数を増加させる能力を持つことを示す、初めての証拠である。
＜実施例９＞
【０１１２】
M-DC前駆体能を持つ前駆細胞集団
インビボでもインビトロでもFLの非存在下で生成されうるDCサブタイプの同定は、直ちに、それらの前駆体細胞の性質の問題を提起する。この因子が初期系統前駆細胞に作用してM-DCを生成させるのか、それとも、M-CSFは伝統的には「骨髄系」の増殖因子であると考えられているので、骨髄系統内の後期前駆体に作用してM-DCを生成させるのかを考察した。CMP、GMPおよびCLPをマウスBMから精製した。精製細胞集団の段階希釈液を「フィーダー」UBC-GFP BM細胞と混合し、M-CSF培養を6日間行った。
【０１１３】
3つの前駆体集団のそれぞれの子孫を解析したところ、分化拘束された（committed）GMPは、前記培養条件ではM-DC産生能を持たないことが明らかになった（図6Bおよび6C）。CMPは極めて効率のよいM-cDCの前駆体であり、インプット前駆細胞1個あたり8〜10個のM-cDCを産生したが、このレベルはインプット細胞数が156を下回ると劇的に低下した。これはおそらく、M-cDCがCMPの小さな亜集団から生じていることを示唆するのだろう。これに対し、CLPは、M-pDC生成に関してCMPより少なくとも10倍は効率がよかった。CLPはインプット前駆細胞1個あたり少なくとも10個のM-pDCおよび約5個のM-cDCというアウトプットを生じた（図6Bおよび6C）。これらのデータは、CMPおよびCLPがどちらも、M-CSFに応答してM-DCを生成させることができる前駆細胞であることを示している。驚いたことに、CLPは最も効率のよいM-pDC前駆細胞だった。本発明者らはCLPをM-CSFR（CD115）に対する抗体で染色した（図6D）。CLゲート内の細胞の約20％が高レベルのCD115を発現させた。並行して行ったFlt3（CD135）染色は、CLPの大半がCD135+であり、したがってCD115+細胞の少なくとも一部はCD135+でもあるに違いないことを示した。そのうえ、CLPの多くは、アイソタイプ対応対照のバックグラウンドをわずかに上回る極めて低いCD115を発現させたことから、多くのCLPは、実際、本明細書に記載のDC培養中でM-CSFに応答するために必要な受容体を備えていることが示された。
【０１１４】
このように、本明細書に記載のＭ−ＤＣは、インビトロおよびインビボで、おそらくＣＬＰおよびＣＭＰ前駆細胞集団内の前駆体から生じるのだろう。
引用文献
以下の引用文献が引用される。各引用文献の内容全体は、依拠され、参照により本開示に組み込まれる。
１．  Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｋ．Ｉｎａｂａ．  １９９９．  Ｍｙｅｌｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ．  Ｂｉｏｌ．  ６６：２０５−２０８．  
２．  Ｓｈｏｒｔｍａｎ，Ｋ．  ａｎｄ  Ｙ．Ｊ．Ｌｉｕ．  ２００２．  Ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ．  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２：１５１−１６１．  
３．  Ｓｃｈｅｉｃｈｅｒ，Ｃ．，  Ｍ．Ｍｅｈｌｉｇ，  Ｒ．Ｚｅｃｈｅｒ，  ａｎｄ  Ｋ．Ｒｅｓｋｅ．  １９９２．  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ：  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｌｏｗ  ｄｏｓｅｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １５４：２５３−２６４．  
４．  Ｉｎａｂａ，Ｋ．，  Ｍ．Ｉｎａｂａ，  Ｎ．Ｒｏｍａｎｉ，  Ｈ．Ａｙａ，  Ｍ．Ｄｅｇｕｃｈｉ，  Ｓ．Ｉｋｅｈａｒａ，  Ｓ．Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，  ａｎｄ  Ｒ．Ｍ．Ｓｔｅｉｎｍａｎ．  １９９２．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ．  Ｊ  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７６：１６９３−１７０２．  
５．  Ｓａｌｌｕｓｔｏ，Ｆ．  ａｎｄ  Ａ．Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ．  １９９４．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｙ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ  ｂｙ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｌｕｓ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ４  ａｎｄ  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ．  Ｊ  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７９：１１０９−１１１８．  
６．  Ｖｒｅｍｅｃ，Ｄ．，  Ｇ．Ｊ．Ｌｉｅｓｃｈｋｅ，  Ａ．Ｒ．Ｄｕｎｎ，  Ｌ．Ｒｏｂｂ，  Ｄ．Ｍｅｔｃａｌｆ，  ａｎｄ  Ｋ．Ｓｈｏｒｔｍａｎ．  １９９７．  Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｏｒｇａｎｓ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２７：４０−４４．  
７．  Ｇｉｌｌｉｅｔ，Ｍ．，  Ａ．Ｂｏｏｎｓｔｒａ，  Ｃ．Ｐａｔｕｒｅｌ，  Ｓ．Ａｎｔｏｎｅｎｋｏ，  Ｘ．Ｌ．Ｘｕ，  Ｇ．Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，  Ａ．Ｏ’Ｇａｒｒａ，  ａｎｄ  Ｙ．Ｊ．Ｌｉｕ．  ２００２．  Ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｉｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ＦＬＴ３−ｌｉｇａｎｄ  ａｎｄ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ  １９５：９５３−９５８．  
８．  Ｂｒａｓｅｌ，Ｋ．，  Ｓ．Ｔ．Ｄｅ，  Ｊ．Ｌ．Ｓｍｉｔｈ，  ａｎｄ  Ｃ．Ｒ．Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ．  ２０００．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｆｌｔ３−ｌｉｇａｎｄ−ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．  Ｂｌｏｏｄ  ９６：３０２９−３０３９．  
９．  Ｂｒａｗａｎｄ，Ｐ．，  Ｄ．Ｒ．Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ，  Ｂ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，  Ｋ．Ｂｒａｓｅｌ，  Ｃ．Ｒ．Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ，  ａｎｄ  Ｔ．Ｄｅ  Ｓｍｅｄｔ．  ２００２．  Ｍｕｒｉｎｅ  ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｐｒｅ−ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｆｌｔ３  ｌｉｇａｎｄ−ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ａｒｅ  ｉｍｍａｔｕｒｅ  ＡＰＣｓ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６９：６７１１−６７１９．  
１０．  Ｏ’Ｋｅｅｆｆｅ，Ｍ．，  Ｈ．Ｈｏｃｈｒｅｉｎ，  Ｄ．Ｖｒｅｍｅｃ，  Ｊ．Ｐｏｏｌｅｙ，  Ｒ．Ｅｖａｎｓ，  Ｓ．Ｗｏｕｌｆｅ，  ａｎｄ  Ｋ．Ｓｈｏｒｔｍａｎ．  ２００２．  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎ  １，  Ｆｌｔ−３  ｌｉｇａｎｄ，  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ，  ａｎｄ  ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｂｌｏｏｄ  ９９：２１２２−２１３０．  
１１．  Ｐｕｌｅｎｄｒａｎ，Ｂ．，  Ｊ．Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，  Ｓ．Ｂｕｒｋｅｈｏｌｄｅｒ，  Ｅ．Ｋｒａｕｓ，  Ｅ．Ｇｕｉｎｅｔ，  Ｃ．Ｃｈａｌｏｕｎｉ，  Ｄ．Ｃａｒｏｎ，  Ｃ．Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ，  Ｊ．Ｄａｖｏｕｓｔ，  Ｊ．Ｆａｙ，  ａｎｄ  Ｋ．Ｐａｌｕｃｋａ．  ２０００．  Ｆｌｔ３−ｌｉｇａｎｄ  ａｎｄ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｍｏｂｉｌｉｚｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６５：５６６−５７２．  
１２．  Ｍａｒａｓｋｏｖｓｋｙ，Ｅ．，  Ｋ．Ｂｒａｓｅｌ，  Ｍ．Ｔｅｅｐｅ，  Ｅ．Ｒ．Ｒｏｕｘ，  Ｓ．Ｄ．Ｌｙｍａｎ，  Ｋ．Ｓｈｏｒｔｍａｎ，  ａｎｄ  Ｈ．Ｊ．ＭｃＫｅｎｎａ．  １９９６．  Ｄｒａｍａｔｉｃ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｍａｔｕｒｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｆｌｔ３  ｌｉｇａｎｄ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｍｉｃｅ：  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ  １８４：１９５３−１９６２．  
１３．  Ｂｊｏｒｃｋ，Ｐ．  ２００１．  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｆｌｔ３  ｌｉｇａｎｄ  ａｎｄ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｍｉｃｅ．  Ｂｌｏｏｄ  ９８：３５２０−３５２６．  
１４．  ＭｃＫｅｎｎａ，Ｈ．Ｊ．，  Ｋ．Ｌ．Ｓｔｏｃｋｉｎｇ，  Ｒ．Ｅ．Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｋ．Ｂｒａｓｅｌ，  Ｓ．Ｔ．Ｄｅ，  Ｅ．Ｍａｒａｓｋｏｖｓｋｙ，  Ｃ．Ｒ．Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ，  Ｄ．Ｈ．Ｌｙｎｃｈ，  Ｊ．Ｓｍｉｔｈ，  Ｂ．Ｐｕｌｅｎｄｒａｎ，  Ｅ．Ｒ．Ｒｏｕｘ，  Ｍ．Ｔｅｅｐｅ，  Ｓ．Ｄ．Ｌｙｍａｎ，  ａｎｄ  Ｊ．Ｊ．Ｐｅｓｃｈｏｎ．  ２０００．  Ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｆｌｔ３  ｌｉｇａｎｄ  ｈａｖｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ，  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ，  ａｎｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｌｏｏｄ  ９５：３４８９−３４９７．  
１５．  Ｉｓｈｉｉ，Ｋ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｓ．Ａｋｉｒａ．  ２００６．  Ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ，  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ，  ＤＮＡ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７：５２５−５３２．  
１６．  Ｄｉｅｂｏｌｄ，Ｓ．Ｓ．，  Ｍ．Ｍｏｎｔｏｙａ，  Ｈ．Ｕｎｇｅｒ，  Ｌ．Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ，  Ｐ．Ｒｏｙ，  Ｌ．Ｅ．Ｈａｓｗｅｌｌ，  Ａ．Ａｌ  Ｓｈａｍｋｈａｎｉ，  Ｒ．Ｆｌａｖｅｌｌ，  Ｐ．Ｂｏｒｒｏｗ，  ａｎｄ  Ｒｅｉｓ  ｅ  Ｓｏｕｓａ．  ２００３．  Ｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｓｗｉｔｃｈｅｓ  ｎｏｎ−ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｈｉｇｈ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｅｒｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４２４：３２４−３２８．  
１７．  Ｈｏｃｈｒｅｉｎ，Ｈ．，  Ｂ．Ｓｃｈｌａｔｔｅｒ，  Ｍ．Ｏ’Ｋｅｅｆｆｅ，  Ｃ．Ｗａｇｎｅｒ，  Ｆ．Ｓｃｈｍｉｔｚ，  Ｍ．Ｓｃｈｉｅｍａｎｎ，  Ｓ．Ｂａｕｅｒ，  Ｍ．Ｓｕｔｅｒ，  ａｎｄ  Ｈ．Ｗａｇｎｅｒ．  ２００４．  Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ−１  ｉｎｄｕｃｅｓ  ＩＦＮ−ａｌｐｈａ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｖｉａ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ９−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  −ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ  １０１：１１４１６−１１４２１．  
１８．  Ｋｒｕｇ，Ａ．，  Ｓ．Ｒｏｔｈｅｎｆｕｓｓｅｒ，  Ｖ．Ｈｏｒｎｕｎｇ，  Ｂ．Ｊａｈｒｓｄｏｒｆｅｒ，  Ｓ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，  Ｚ．Ｋ．Ｂａｌｌａｓ，  Ｓ．Ｅｎｄｒｅｓ，  Ａ．Ｍ．Ｋｒｉｅｇ，  ａｎｄ  Ｇ．Ｈａｒｔｍａｎｎ．  ２００１．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣｐＧ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＦＮ−ａｌｐｈａ／ｂｅｔａ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３１：２１５４−２１６３．  
１９．  Ｎａｉｋ，Ｓ．Ｈ．，  Ａ．Ｉ．Ｐｒｏｉｅｔｔｏ，  Ｎ．Ｓ．Ｗｉｌｓｏｎ，  Ａ．Ｄａｋｉｃ，  Ｐ．Ｓｃｈｎｏｒｒｅｒ，  Ｍ．Ｆｕｃｈｓｂｅｒｇｅｒ，  Ｍ．Ｈ．Ｌａｈｏｕｄ，  Ｍ．Ｏ’Ｋｅｅｆｆｅ，  Ｑ．Ｘ．Ｓｈａｏ，  Ｗ．Ｆ．Ｃｈｅｎ，  Ｊ．Ａ．Ｖｉｌｌａｄａｎｇｏｓ，  Ｋ．Ｓｈｏｒｔｍａｎ，  ａｎｄ  Ｌ．Ｗｕ．  ２００５．  Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｌｅｎｉｃ  ＣＤ８＋  ａｎｄ  ＣＤ８−  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｆｍｓ−ｌｉｋｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３  ｌｉｇａｎｄ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７４：６５９２−６５９７．  
２０．  Ｏｍａｔｓｕ，Ｙ．，  Ｔ．Ｉｙｏｄａ，  Ｙ．Ｋｉｍｕｒａ，  Ａ．Ｍａｋｉ，  Ｍ．Ｉｓｈｉｍｏｒｉ，  Ｎ．Ｔｏｙａｍａ−Ｓｏｒｉｍａｃｈｉ，  ａｎｄ  Ｋ．Ｉｎａｂａ．  ２００５．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  ｂｙ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ＮＫ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，  Ｌｙ４９Ｑ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７４：６６５７−６６６２．    ２１．  Ｏ’Ｋｅｅｆｆｅ，Ｍ．，  Ｈ．Ｈｏｃｈｒｅｉｎ，  Ｄ．Ｖｒｅｍｅｃ，  Ｉ．Ｃａｍｉｎｓｃｈｉ，  Ｊ．Ｌ．Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｅ．Ｍ．Ａｎｄｅｒｓ，  Ｌ．Ｗｕ，  Ｍ．Ｈ．Ｌａｈｏｕｄ，  Ｓ．Ｈｅｎｒｉ，  Ｂ．Ｓｃｏｔｔ，  Ｐ．Ｈｅｒｔｚｏｇ，  Ｌ．Ｔａｔａｒｃｚｕｃｈ，  ａｎｄ  Ｋ．Ｓｈｏｒｔｍａｎ．  ２００２．  Ｍｏｕｓｅ  ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ：  ｌｏｎｇ−ｌｉｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ，  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｉｎ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，  ｔｈａｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ｉｎｔｏ  ＣＤ８（＋）  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｏｎｌｙ  ａｆｔｅｒ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｔｉｍｕｌｕｓ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ  １９６：１３０７−１３１９．  
２２．  Ｋｒｅｉｓｅｌ，Ｆ．Ｈ．，  Ａ．Ｂｌａｓｉｕｓ，  Ｄ．Ｋｒｅｉｓｅｌ，  Ｍ．Ｃｏｌｏｎｎａ，  ａｎｄ  Ｍ．Ｃｅｌｌａ．  ２００６．  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｖｅｌｏｐ  ｆｒｏｍ  ｍｕｒｉｎｅ  ＣＤ３１（ｈｉｇｈ）／Ｌｙ６Ｃ（−）  ｍａｒｒｏｗ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２４２：９１−９８．  
２３．  Ｓｗｅｅｔ，Ｍ．Ｊ．，  Ｃ．Ｃ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  Ｄ．Ｐ．Ｓｅｓｔｅｒ，  Ｄ．Ｘｕ，  Ｒ．Ｃ．ＭｃＤｏｎａｌｄ，  Ｋ．Ｊ．Ｓｔａｃｅｙ，  Ｄ．Ａ．Ｈｕｍｅ，  ａｎｄ  Ｆ．Ｙ．Ｌｉｅｗ．  ２００２．  Ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ−１  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ＣｐＧ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ９  ｂｕｔ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６８：３９２−３９９．  
２４．  Ｄ’Ａｍｉｃｏ，Ａ．  ａｎｄ  Ｌ．Ｗｕ．  ２００３．  Ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｐｒｅｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｆｌｔ３．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ  １９８：２９３−３０３．  
２５．  Ｋａｒｓｕｎｋｙ，Ｈ．，  Ｍ．Ｍｅｒａｄ，  Ａ．Ｃｏｚｚｉｏ，  Ｉ．Ｌ．Ｗｅｉｓｓｍａｎ，  ａｎｄ  Ｍ．Ｇ．Ｍａｎｚ．  ２００３．  Ｆｌｔ３  ｌｉｇａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｒｏｍ  Ｆｌｔ３＋  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ａｎｄ  ｍｙｅｌｏｉｄ−ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｔｏ  Ｆｌｔ３＋  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｊ  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９８：３０５−３１３．  
２６．  ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｋ．Ｐ．，  Ｖ．Ｒｏｗｅ，  Ａ．Ｄ．Ｃｌｏｕｓｔｏｎ，  Ｊ．Ｋ．Ｗｅｌｐｌｙ，  Ｒ．Ｄ．Ｋｕｎｓ，  Ｊ．Ｌ．Ｆｅｒｒａｒａ，  Ｒ．Ｔｈｏｍａｓ，  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．Ｈｉｌｌ．  ２００５．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＩＬ−１０−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７４：１８４１−１８５０．  
２７．  Ｂａｒｔｏｃｃｉ，Ａ．，  Ｄ．Ｓ．Ｍａｓｔｒｏｇｉａｎｎｉｓ，  Ｇ．Ｍｉｇｌｉｏｒａｔｉ，  Ｒ．Ｊ．Ｓｔｏｃｋｅｒｔ，  Ａ．Ｗ．Ｗｏｌｋｏｆｆ，  ａｎｄ  Ｅ．Ｒ．Ｓｔａｎｌｅｙ．  １９８７．  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｏｗｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ  ８４：６１７９−６１８３．  
２８．  Ｒｏｌｌａｎｄ，Ａ．，  Ｌ．Ｇｕｙｏｎ，  Ｍ．Ｇｉｌｌ，  Ｙ．Ｈ．Ｃａｉ，  Ｊ．Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，  Ｋ．ＭｃＣｌａｉｎ，  ａｎｄ  Ａ．Ｋ．Ｐａｌｕｃｋａ．  ２００５．  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ−ｐｏｉｅｔｉｎｓ  ｉｎ  Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ  ｃｅｌｌ  ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｏｓｉｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７４：３０６７−３０７１．  
２９．  Ｇｕｈａ−Ｔｈａｋｕｒｔａ，Ｎ．  ａｎｄ  Ｊ．Ａ．Ｍａｊｄｅ．  １９９７．  Ｅａｒｌｙ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｎｄ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｍＲＮＡｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ，  ｐｏｌｙ  ［ｒＩ：ｒＣ］，  ｏｒ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ＬＰＳ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  １．  Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．  １７：１９７−２０４．  
３０．  Ｖｏｌｌｓｔｅｄｔ，Ｓ．，  Ｍ．Ｏ’Ｋｅｅｆｆｅ，  Ｂ．Ｒｙｆ，  Ｂ．Ｇｌａｎｚｍａｎｎ，  Ｈ．Ｈｏｃｈｒｅｉｎ，  ａｎｄ  Ｍ．Ｓｕｔｅｒ．  ２００６．  Ｔｈｅ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｔｈｅ  ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ＩＦＮ−ａｌｐｈａ  ｄｅｐｅｎｄｓ  ｏｎ  Ｆｌｔ３  ｌｉｇａｎｄ  ａｎｄ  ｐＤＣ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３６：１２３１−１２４０．  
３１．  Ｆｒａｎｃｈｉｎｉ，Ｍ．，  Ｈ．Ｈｅｆｔｉ，  Ｓ．Ｖｏｌｌｓｔｅｄｔ，  Ｂ．Ｇｌａｎｚｍａｎｎ，  Ｍ．Ｒｉｅｓｅｎ，  Ｍ．Ａｃｋｅｒｍａｎｎ，  Ｐ．Ｃｈａｐｌｉｎ，  Ｋ．Ｓｈｏｒｔｍａｎ，  ａｎｄ  Ｍ．Ｓｕｔｅｒ．  ２００４．  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｉｃｅ  ｎｅｏｎａｔａｌｌｙ  ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｔｏ  ｎａｉｖｅ  ｏｎｅ−ｗｅｅｋ−ｏｌｄ  ｍｉｃｅ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７２：６３０４−６３１２．  
３２．  Ｉｔｏｈ，Ｙ．，  Ｔ．Ｏｋａｎｏｕｅ，  Ｓ．Ｓａｋａｍｏｔｏ，  Ｋ．Ｎｉｓｈｉｏｊｉ，  ａｎｄ  Ｋ．Ｋａｓｈｉｍａ．  １９９７．  Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ  ｏｎ  ｓｅｒｕｍ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ．  Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ．  ２６：２４４−２５２．  
３３．  Ｇｉｌｌ，Ｍ．Ａ．，  Ｐ．Ｂｌａｎｃｏ，  Ｅ．Ａｒｃｅ，  Ｖ．Ｐａｓｃｕａｌ，  Ｊ．Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，  ａｎｄ  Ａ．Ｋ．Ｐａｌｕｃｋａ．  ２００２．  Ｂｌｏｏｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ＤＣ−ｐｏｉｅｔｉｎｓ  ｉｎ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．  Ｈｕｍ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６３：１１７２−１１８０．  
３４．  Ｃｈｉｔｕ，Ｖ．  ａｎｄ  Ｅ．Ｒ．Ｓｔａｎｌｅｙ．  ２００６．  Ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ−１  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：３９−４８．  
３５．  Ｓｐｉｅｓ，Ｂ．，  Ｈ．Ｈｏｃｈｒｅｉｎ，  Ｍ．Ｖａｂｕｌａｓ，  Ｋ．Ｈｕｓｔｅｒ，  Ｄ．Ｈ．Ｂｕｓｃｈ，  Ｆ．Ｓｃｈｍｉｔｚ，  Ａ．Ｈｅｉｔ，  ａｎｄ  Ｈ．Ｗａｇｎｅｒ．  ２００３．  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ９  （ＴＬＲ９）  ｂｕｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＴＬＲ９−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７１：５９０８−５９１２．  
３６．  Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６．  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｂ−Ｃｅｌｌ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｐｕｌｓｅｄ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ２：５２−５８．
３７．  Ｐａｇｌｉａ，  ｅｔ  ａｌ．  １９９６．  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  Ｌｏａｄｅｄ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ｗｉｔｈ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｉｍｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｔｕｍｏｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ．  Ｊ．Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９９６，１８３：  ３１７−２２．
３８．  Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ａｎｄ  Ｓｈｌｏｍｏｃｈｉｋ．  ２００７．  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｕｐｕｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｙ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｓｅｍｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９：  １１−２３．
３９．  Ｓｗｅｅｔ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２．  Ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ−１  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ＣｐＧ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ９  ｂｕｔ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６８：  ３９２−９９．
４０．  Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４．  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ：  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＦＬＴ３  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ＦＬＴ３／ＩＴＤ  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ．  Ａｉ  Ｚｈｅｎｇ，，  ２３：１２１８−２１  ［ａｂｓｔｒａｃｔ  ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｉｎ  Ｅｎｇｌｉｓｈ］．
４０．  Ｈｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２．  Ｔｈｅｒｅｐｅｕｔｉｃ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｔｏ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｐｈａｇｏｃｙｔｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  Ｃｏｌｏｎｙ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ，  Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｃｏｌｏｎｙ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ，  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｃｏｌｏｎｙ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ，  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ．  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．，  １８５：  １４９０−５０１．
４１．  Ｆｏｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６．  Ａ  Ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３１１：８３−８７．
４２．  Ｔａｋａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５．  Ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ−１  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｂｙ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｈｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  ＸＳ  Ｓｅｒｉｅｓ）  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５４：５１２８−３５．
４３．  Ｃｈｉｔｏ  ａｎｄ  Ｓｔａｎｌｅｙ，  ２００６．  Ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ−１  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２８：３９−４８．
４４．  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．  ７，１９８，９４８．
４５．  Ｓｔｏｌｌ  ＭＬ，  Ｐｒｉｃｅ  ＫＤ，  Ｓｉｌｖｉｎ  ＣＪ，  Ｊｉａｎｇ  Ｆ，  Ｇａｖａｌｃｈｉｎ  Ｊ．  ２００７．  
Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｌｕｐｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｅｌａｙｓ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｕｐｕｓ  ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  （ＳＷＲｘＮＺＢ）Ｆ（１）  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ．Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．  （Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ）  
４６．  Ｚｈａｎｇ  Ｗ，  Ｆｒａｎｋ  ＭＢ，  Ｒｅｉｃｈｌｉｎ  Ｍ．  ２００２．  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ａｎｔｉ−ｄｓＤＮＡ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｌｕｐｕｓ，  １１（６）：３６２−９．  
４７．  Ｇｒａｆ  Ｃ，  Ｈｅｉｄｅｌ  Ｆ，  Ｔｅｎｚｅｒ  Ｓ，  Ｒａｄｓａｋ  ＭＰ，  Ｓｏｌｅｍ  ＦＫ，  Ｂｒｉｔｔｅｎ  ＣＭ，  Ｈｕｂｅｒ  Ｃ，  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｔ，  Ｗｏｌｆｅｌ  Ｔ．  ２００６．  Ａ  ｎｅｏｅｐｉｔｏｐｅ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ＦＬＴ３  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｔａｎｄｅｍ  ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ  （ＦＬＴ３−ＩＴＤ）  ｉｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ｌｅｕｋｅｍｉａ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｌｏｏｄ．  （Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ）．
４８．  Ｋａｐｐｅｌｍａｙｅｒ  Ｊ，  Ｕｄｖａｒｄｙ  Ｍ，  Ａｎｔａｌ−Ｓｚａｌｍａｓ  Ｐ．  ２００７．  Ｐｇｐ  ａｎｄ  ＦＬＴ３：  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｈａｔ  ｌｅａｄ  ｔｏ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．  Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．，  １４：５１９−３０．
４９．  Ｚｈｅｎｇ  Ｒ，  Ｓｍａｌｌ  Ｄ．  ２００５．  Ｍｕｔａｎｔ  ＦＬＴ３  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ａ  ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．  Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ．  ４６：１６７９−８７．  
５０．  Ａｄｖａｎｉ  ＡＳ．  ２００５．  ＦＬＴ３  ａｎｄ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ：  ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ．  １１：３４４９−５７．
本願は、特許請求の範囲に記載の発明に関するものであるが、他の態様として以下も包含し得る。
１．  インビトロで樹状細胞（ＤＣ）を増加させる方法であって、
（Ａ）造血前駆体細胞を培養すること；
（Ｂ）ＤＣの数を定量すること；
（Ｃ）マクロファージ−コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を投与すること；
（Ｄ）Ｍ−ＣＳＦの投与後に存在する樹状細胞の数を定量すること
を含み、Ｍ−ＣＳＦ投与後のＤＣの数がＭ−ＣＳＦ投与前のＤＣの数より増加する方法。
２．  前駆体細胞が骨髄細胞である、上記１に記載の方法。
３．  ＤＣが形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）である、上記１に記載の方法。
４．  ｐＤＣの数が少なくとも一つの細胞表面マーカーのレベルを測定することによって定量される、上記３に記載の方法。
５．  少なくとも一つの細胞表面マーカーがＣＤ１１ｃ、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ４５ＲＡ、ＰＤＣＡ−１、ＣＣＲ９、Ｌｙ４９Ｑ、Ｌｙ６Ｃ、Ｓｉｇｌｅｃ−Ｈ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４、ＣＤ１２３、ＢＤＣＡ−２、またはＢＤＣＡ−４である、上記４に記載の方法。
６．  樹状細胞が通常型樹状細胞（ｃＤＣ）である、上記１に記載の方法。
７．  ｃＤＣの数が少なくとも一つの細胞表面マーカーのレベルを測定することによって定量される、上記６に記載の方法。
８．  少なくとも一つの細胞表面マーカーがＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｓｉｒｐ−アルファ、ＤＥＣ−２０５、ＭＨＣＩＩ、３３Ｄ１、ＨＬＡ−ＤＲ、またはＢＤＣＡ−１である、上記７に記載の方法。
９．  Ｍ−ＣＳＦがポックスウイルスベクターに入れて投与される、上記１に記載の方法。
１０．  ポックスウイルスベクターが修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａ：  ＭＶＡ）ベクターである、上記９に記載の方法。
１１．  ＤＣを少なくとも一つの刺激剤にばく露することによってＤＣを刺激することをさらに含む、上記１に記載の方法。
１２．  少なくとも一つの刺激剤がＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＴＬＲアゴニスト、ウイルス、細菌、真菌、植物またはその一部である、上記１１に記載の方法。
１３．  動物から前駆体細胞を取り出すこと、および収集した樹状細胞をその動物に再導入することをさらに含む、上記１に記載の方法。
１４．  動物中で樹状細胞（ＤＣ）を増加させる方法であって、その動物にＭ−ＣＳＦを抗原と同時投与することを含み、その同時投与がその動物におけるＤＣの数の増加をもたらす方法。
１５．  抗原が腫瘍、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、プリオン、植物、軟体動物、節足動物、または脊椎動物毒素に由来する、上記１４に記載の方法。
１６．  動物がマウスである、上記１４に記載の方法。
１７．  樹状細胞（ＤＣ）を生産する方法であって、
（Ａ）造血前駆体細胞を培養すること；
（Ｂ）その培養細胞にＭ−ＣＳＦを投与すること；
（Ｃ）ＤＣを生成させること；および
（Ｄ）そのＤＣを収集すること
を含む方法。
１８．  ＤＣを抗原にばく露することをさらに含む、上記１７に記載の方法。
１９．  抗原が腫瘍、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、プリオン、植物、軟体動物、節足動物、または脊椎動物毒素に由来する、上記１８に記載の方法。
２０．  動物から前駆細胞を取り出すこと、および収集された樹状細胞をその動物に再導入することをさらに含む、上記１７に記載の方法。
２１．  動物がヒトである、上記１４または上記１７のいずれか一項の方法。
２２．  樹状細胞がｐＤＣである、上記１４または１７のいずれか一項の方法。
２３．  樹状細胞がｃＤＣである、上記１４または１７のいずれか一項に記載の方法。
２４．  Ｍ−ＣＳＦが培養細胞にポリペプチドとして投与されるか、培養細胞中で発現される核酸として投与される、上記１７に記載の方法。
２５．  核酸がＤＮＡまたはＲＮＡである、上記２３に記載の方法。
２６．  Ｍ−ＣＳＦがポックスウイルスベクターに入れて培養細胞に投与される、上記１７に記載の方法。
２７．  ポックスウイルスベクターが修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）ベクターである、上記２６に記載の方法。
２８．  動物中で抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、
（Ａ）動物から造血前駆体細胞を取り出すこと；
（Ｂ）その前駆体細胞を培養すること；
（Ｃ）その培養細胞にＭ−ＣＳＦを投与すること；
（Ｄ）樹状細胞（ＤＣ）を生成させること；
（Ｅ）そのＤＣを抗原にばく露すること；
（Ｆ）ばく露されたＤＣを収集すること；および
（Ｇ）収集されたＤＣをその動物に再導入すること
を含む方法。
２９．  抗原が腫瘍、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、プリオン、植物、軟体動物、節足動物に由来するか、または脊椎動物毒素に由来する、上記２８に記載の方法。
３０．  抗原を動物に投与することをさらに含む、上記２８に記載の方法。
３１．  動物が全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を患っているヒト患者であり、抗原がＳＬＥ関連自己抗体の抗イディオタイプまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来するペプチドである、上記２８に記載の方法。
３２．  動物が急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を患っているヒト患者であり、抗原が患者の突然変異したもしくは重複したＦｌｔ３受容体、または突然変異したｃ−ｋｉｔ受容体に由来する新規ペプチドを含む、上記２８に記載の方法。
３３．  動物がヒトである、上記２８に記載の方法。
３４．  インビトロでサイトカインを産生する方法であって、
（Ａ）造血前駆体細胞を培養すること；
（Ｂ）その培養細胞にＭ−ＣＳＦを投与すること；および
（Ｃ）産生されたサイトカインを集めること
を含む方法。
３５．  産生されるサイトカインが、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βおよびケモカインを含む群から選択される、上記３４に記載の方法。
３６．  産生されるサイトカインがインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）である、上記３４に記載の方法。
３７．  増殖性障害を患っている患者を処置する方法であって、前記患者にＭ−ＣＳＦを投与することによって前記患者におけるＤＣの数を増加させることを含む方法。
３８．  増殖性障害を患っている患者を処置するための医薬組成物を製造するためのＭ−ＣＳＦの使用であって、前記患者へのＭ−ＣＳＦの投与が前記患者におけるＤＣの数を増加させる使用。
３９．  前記増殖性疾患が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を含む群より選択されるがんである、上記３７または３８に記載の方法または使用。
４０．  自己免疫疾患を患っている患者を処置する方法であって、前記患者にＭ−ＣＳＦを投与することによって前記患者におけるＤＣの数を増加させることを含む方法。
４１．  自己免疫疾患を患っている患者を処置するための医薬組成物を製造するためのＭ−ＣＳＦの使用であって、前記患者へのＭ−ＣＳＦの投与が前記患者におけるＤＣの数を増加させる使用。
４２．  前記自己免疫疾患が全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である、上記４０および４１に記載の方法または使用。
４３．  免疫応答を刺激する方法であって、
（Ａ）造血前駆体細胞を培養すること；
（Ｂ）その培養細胞にＭ−ＣＳＦを投与すること；
（Ｃ）樹状細胞（ＤＣ）を生成させること；および
（Ｄ）そのＤＣを免疫細胞にばく露すること
を含み、その免疫細胞が刺激されて免疫応答を生じる方法。
４４．  免疫細胞がＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、またはマクロファージである、上記４３に記載の方法。
４５．  Ｔ細胞が調節性Ｔ細胞、サプレッサーＴ細胞、またはキラーＴ細胞である、上記４３に記載の方法。
４６．  ヘルパーＴ細胞がＴｈ１、Ｔｈ２、またはＴｈ１７細胞である、上記４４に記載の方法。
４７．  ＤＣがインビトロで免疫細胞にばく露される、上記４３に記載の方法。
４８．  ＤＣがインビボで免疫細胞にばく露される、上記４３に記載の方法。
４９．  免疫応答が抗アレルギー免疫応答、抗敗血症免疫応答、抗移植片免疫応答、抗腫瘍免疫応答、抗自己免疫応答、寛容誘発性免疫応答、抗病原体免疫応答、または調節性免疫応答である、上記４３に記載の方法。
５０．  造血前駆体細胞から前記前駆体細胞のＭ−ＣＳＦ刺激によって生成される樹状細胞。
５１．  前記前駆体細胞が骨髄細胞である、上記５０に記載の樹状細胞。
５２．  Ｍ−ＣＳＦをコードする核酸配列を含む組換えポックスウイルス。
５３．  前記ポックスウイルスが修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）である、上記５２に記載の組換えポックスウイルス。
５４．  前記ＭＶＡが、以下の性質を少なくとも一つは持つことを特徴とする、上記５２に記載の組換えポックスウイルス：
（ｉ）ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）ではインビトロで増殖的複製能を持つが、ヒトケラチノサイト細胞株（ＨａＣａＴ）、ヒト胎児腎臓細胞株（２９３）、ヒト骨骨肉腫細胞株（１４３Ｂ）、およびヒト子宮頚部腺癌細胞株（ＨｅＬａ）では増殖的複製能を持たない、
（ｉｉ）成熟ＢおよびＴ細胞を産生する能力を持たず、したがって重度の免疫欠陥を持ち、複製ウイルスに対する感受性が高いマウスモデルにおいて、複製することができない、および
（ｉｉｉ）ＤＮＡプライム／ワクシニアウイルスブーストレジメンと比較して、少なくとも同じレベルの特異的免疫応答を、ワクシニアウイルスプライム／ワクシニアウイルスブーストレジメンで誘導する。
５５．  上記の有利な性質を少なくとも二つは持つ、上記５４に記載の組換えポックスウイルス。
５６．  上記の有利な性質を三つとも持つ、上記５４に記載の組換えポックスウイルス。
５７．  前記ＭＶＡがソールズベリー（英国）のＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に番号Ｖ０００８３００８として寄託されているＭＶＡワクシニアウイルスおよびその派生株である、上記５４に記載の組換えポックスウイルス。
５８．  少なくとも一つの抗原および／または抗原エピトープをコードする配列から選択される異種核酸配列をさらに含む、上記５２〜５７のいずれか一項に記載の組換えポックスウイルス。
５９．  ワクチンまたは医薬品としての上記５２〜５８のいずれか一項に記載の組換えポックスウイルス。
６０．  増殖性および／または自己免疫疾患を処置するための上記５２〜５８のいずれか一項に記載の組換えポックスウイルス。
６１．  増殖性および／または自己免疫疾患を処置するための医薬組成物を製造するための上記５２〜５８のいずれか一項に記載の組換えポックスウイルスの使用。
６２．  上記５２〜５８のいずれか一項に記載の組換えポックスウイルスと薬学的に許容できる担体、希釈剤および／または添加剤とを含む医薬組成物またはワクチン。
６３．  ワクチンまたは医薬品を製造するための上記５２〜５８のいずれか一項に記載の組換えポックスウイルスの使用。
６４．  造血前駆体細胞から樹状細胞（ＤＣ）を生成させるための上記５２〜５８のいずれか一項に記載の組換えポックスウイルスまたは上記６２に記載の医薬組成物の使用。
６５．  動物中で抗原に対する免疫応答を誘導するためのキットであって、上記５２〜５８のいずれか一項に記載の組換えポックスウイルスを第１バイアル中に含み、抗原を第２バイアル中に含むキット。
６６．  組換えポックスウイルスを含む前記第１バイアルが、樹状細胞（ＤＣ）を生成させかつ／または増加させるために動物に投与され、次いで、ＤＣが生成されかつ／または増加した後に、前記抗原を含む前記第２バイアルが前記動物に投与される、上記６５に記載のキット。
【図１】
0005721428.tif 000002
【図２】
0005721428.tif 000003
【図３】
0005721428.tif 000004
【図４】
0005721428.tif 000005
【図５】
0005721428.tif 000006
【図６】
0005721428.tif 000007
【図７】
0005721428.tif 000008
【図８】
0005721428.tif 000009