(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つのケイ質化合物を含有する、レジオネラ属バクテリアを培養、検出および／または同定するための反応培地であって、前記ケイ質化合物が非極性シリカであることを特徴とする反応培地。
【請求項２】
前記非極性シリカの濃度が０．０１〜１００ｇ／ｌであることを特徴とする、請求項１に記載の反応培地。
【請求項３】
前記非極性シリカの濃度が１〜５ｇ／ｌであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の反応培地。
【請求項４】
蛍光性又は発色性酵素基質を更に含む、請求項１から３の何れか一項に記載の反応培地。
【請求項５】
前記蛍光性又は発色性酵素基質は、酸化還元酵素基質または加水分解酵素基質である、請求項４に記載の反応培地。
【請求項６】
レジオネラ属バクテリアの選択培養を可能にする選択混合物を更に含む、請求項１から５の何れか一項に記載の反応培地。
【請求項７】
レジオネラ属バクテリアを培養、検出および／または同定するための、少なくとも一つのケイ質化合物を含む反応培地の使用であって、前記ケイ質化合物が非極性シリカであることを特徴とする反応培地の使用。
【請求項８】
前記非極性シリカに加えて、粘土を含む、請求項７に記載の反応培地の使用。
【請求項９】
前記非極性シリカの濃度が０．０１〜１００ｇ／ｌである、請求項７または８に記載の反応培地の使用。
【請求項１０】
前記非極性シリカの濃度が１〜５ｇ／ｌであることを特徴とする、請求項７から９の何れか一項に記載の反応培地の使用。
【請求項１１】
蛍光性又は発色性酵素基質を含む、請求項７から１０の何れか一項に記載の反応培地の使用。
【請求項１２】
前記蛍光性又は発色性酵素基質が酸化還元酵素基質または加水分解酵素基質である、請求項１１に記載の反応培地の使用。
【請求項１３】
レジオネラ属バクテリアの選択培養を可能にする選択混合物を含む、請求項７から１２の何れか一項に記載の反応培地の使用。
【請求項１４】
レジオネラ属バクテリアを検出および／または同定する方法であって、
（ａ）請求項１から６の何れか一項に記載の反応培地に、レジオネラ属バクテリアを含む可能性がある試料を接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）の前記反応培地をインキュベートする工程、および
（ｃ）レジオネラ属バクテリアの存在を検出する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はレジオネラ用の反応培地、更には前記培地の使用とこの培地を使用する方法に関する。
【０００２】
レジオネラ（レジオネラ属の種）は、ヒトの感染症、時には致死感染症を引き起こすことができる、水分環境（天然生態系と水分配ネットワーク）のバクテリアである。レジオネラ属のいくつかの種はヒトにおいて見つかっているが、最も重要なものはレジオネラ・ニューモフィラ（L.pneumophila）であり、それはレジオネラ症の症例のほぼ９０％の原因である。他の種（例えばレジオネラ・ジョーダニス）は、通常は免疫抑制された個体で分離される。レジオネラ症は、重症の急性肺疾患によって特徴づけられる呼吸器病であり、その感染はレジオネラが、たとえば冷却塔、空調システム、健康ランド、シャワーなど混入することによっておこる。２から１０日の潜伏期間後、患者は、インフルエンザ様症候群を示す。この後に、胃腸の問題（下痢、おう吐）又は時には神経病学的な問題（せん妄、嗜眠状態、混乱）さえをも伴った高熱、胸膜炎および激しい咳きが引き続いて起る。
２００５年には、フランスでは１５００件以上、ヨーロッパでは約５７００件が報告された。米国では、ＣＤＣ (Centers for Disease Control and Prevention) は、年間８０００〜１８０００件のレジオネラ症があると推定している。
【０００３】
レジオネラ症は非定型の典型的な肺疾患であり、特性がないので、レジオネラ症の診断は非常に複雑である。死亡率は平均して症例の２０％であり、コミュニティ・ケースではむしろ低いが、一方、院内ケースにおいては高い。早期診断は、適切な治療を患者に提供するために不可欠である。
診断は、以下の方法に従って実施することができる：
・直接の免疫蛍光法による同定。
主要なレジオネラ・ニューモフィラ亜群に対する抗体を用いて試料上で実施する。この方法では、可溶性抗原を示すことが可能である。主に使用する方法は、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着測定法）、ＲＩＡ（放射免疫学アッセイ）またはＩＣＭ（膜上の免疫クロマトグラフィー）である。これらの技術の主な欠点は、それらが特定のレジオネラ・ニューモフィラ亜群が存在する可能性のみを検出することができることである；
・間接免疫蛍光法によるＬＰＳ  Ｏ抗原に対する抗体の血清学的診断。この方法は、レジオネラ・ニューモフィラ亜群１だけを同定することが可能であり、マイコバクテリウム、レプトスピラ、クラミジア属、マイコプラズマ属、シュードモナス属、フラボバクテリウム属などとの交差反応による偽陽性の危険性が高い；
・培養方法による細菌の同定。レジオネラを増殖させることは困難である。レジオネラが血液寒天培地上で培養されず、ｐＨは厳しく制御されなければならず（６．９＋／−０．２）、バクテリアの必要条件を満たされなければならないためである。したがって、培養は、一般的には、ＡＣＥＳバッファー、Ｌ‐システインおよび鉄（これらの最後の２成分は必須の増殖因子である）を添加したＢＣＹＥ（緩衝活性炭酵母抽出物：Buffered Charcoal Yeast Extract）寒天；又はＧＶＰＣ寒天で実施される。コロニーは、３７℃で４８時間のインキュベーションにより観察することができる。レジオネラの同定は、大部分のレジオネラ種、特にレジオネラ・ニューモフィラの単離を促進する特異的な選択培地であるＧＶＰＣレジオネラ培地（ビオメリュー）上で実施することができる。３つの抗生物質の最適化された混合物によって、この培地は、グラム陽性菌、大部分のグラム陰性菌、酵母およびカビの増殖を抑制することができる。しかしながら、この培養培地はレジオネラによって産生されるか、又は培地（イースト抽出物、寒天等）に存在するか、培地の加圧滅菌（レジオネラにとって毒であるフリーラジカルも形成する）によって産生される毒性化合物を吸着するための活性炭を含む。結果として、これらの培地は黒色であり、培地の読みとりを促進できる発色性又は蛍光性酵素基質の組込みに不適当である。
【０００４】
本発明は、レジオネラ属バクテリア用の新規な反応培地を提供することによって従来技術の問題を解決することを目的とする。
【０００５】
驚くべきことに、本発明者は、反応培地のケイ質化合物の使用がレジオネラの迅速且つ簡便な検出を可能にすることを示した。
【０００６】
本発明を示す前に、以下の定義は、本発明のより良好な理解を提供するために与えられるが、決して限定的ではない。
【０００７】
「反応培地」なる用語は、微生物（例えばレジオネラ）の代謝の発現および／または増殖のために必要な全ての成分を含んで成る培地を意味することを目的とする。反応培地は、固体、半固体または液体であってもよい。「固形培地」なる用語は、例えば、ゲル化された培地を意味することを目的とする。寒天は、微生物を培養するための微生物学の従来のゲル化剤であるが、それはゲルライト、ゼラチン、アガロースまたは他の天然または人工のゲル化剤を使用してもよい。本発明による反応培地は、レジオネラの増殖を可能にしなければならない。
【０００８】
反応培地は、一つ以上の成分、例えばアミノ酸、糖質、ヌクレオチド、ミネラル、ビタミンなどを組合せて含むことができる。培地は、着色剤を更に含んでもよい。例えば、着色剤として、エバンスブルー、ニュートラルレッド、乳白剤（例えば酸化チタン）、ニトロアニリン、マラカイトグリーン、ブリリアントグリーン、一つ以上の代謝インジケータ、一つ以上の代謝調節剤などを挙げることができる。
反応培地は、培養培地、検出（revealing)培地または培養且つ検出培地であってもよい。検出培地の場合、微生物は接種の前に培養され、培養且つ検出培地の場合、検出培地は培養培地をも構成する。当業者は、２つの培地が容易に比較できるように成っている双プレートを使用することができ、それはさまざまな基質またはさまざまな選択混合物を含み、その上に同じ生物学的サンプルが置かれる。
【０００９】
選択混合物なる用語は、特定の微生物の選択培養を可能にする化合物の混合物を意味することを目的とする。本発明において、選択混合物は、レジオネラの選択培養を可能にすることができる。上記の培地は、特に以下の化合物：グリシン、硫酸ポリミキシンＢ、バンコマイシンまたはセファマンドール、シクロヘキシミドまたはアニソマイシンまたは他にナタマイシンを単独でまたは組合わせて含む。
選択培地は、更に、特定のレジオネラ種（たとえばレジオネラ・ニューモフィラ）の選択培養を可能にすることができる。この場合、選択混合物は、特に以下の化合物：グリシン、硫酸ポリミキシンＢ、バンコマイシンまたはセファマンドール、シクロヘキシミド、アニソマイシン、ナタマイシン、ブロムクレゾールパープル、ブロムチモールブルーを単独でまたは組合わせて含む。
【００１０】
ケイ質化合物は、成分シリコンを含んでいる任意の化合物を意味することを目的とする。非限定的に、天然又は合成ゼオライト、粘土、好ましくはイライト、モンモリロナイト、好ましくはセピオライト、または非極性シリカなどを挙げることができる。 
非極性シリカは、非極性の化学官能基、最も一般的には少なくとも２つの炭素原子を有するアルキル化された鎖がグラフトされている１又は複数のシリカ粒子を意味することを目的とする。好ましくは、それらは４から２４の炭素原子、さらにより好ましくは１８の炭素原子（オクタデシル）、８つの炭素原子（オクチル）または４つの炭素原子（ブチル）を有する。この非極性シリカはオクタデシルシリカまたはオクチル・シリカであることが望ましい。 
【００１１】
酵素基質なる用語は、酵素によって代謝されうる分子であって、生成物を生じることで、微生物の直接的または間接的な検出を可能にする分子を意味することを意図する。天然基質又は合成基質であってもよい。基質の代謝によって、反応培地の生理化学的性質または生物細胞に変化が生じる。この変化は物理化学的方法によって、特に光学的方法で、オペレータによる目によって、または計測器、分光法、電気的方法、磁気的方法などによって検出されることができる。好ましくは、それは、吸収、蛍光または発光の変性のような、光学的性質の変化である。
蛍光性又は発色性酵素の基質なる用語は、分子の代謝が基質とは異なる蛍光または色を有する生成物を生み出す分子を意味することを目的とする。
【００１２】
本発明において、酵素の基質は、酸化還元酵素基質および加水分解酵素基質から選択されることが好ましい。この基質は、ニトロレダクターゼ、酸化還元酵素、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ、脱水素酵素、スーパーオキシドジスムターゼ、オシダーゼ、ペプチダーゼ、ヌクレアーゼまたはエステラーゼ基質であることが好ましい。
発色性基質として、アリザリン、α-グルコシダーゼ基質、特にアリザリン-α-グルコシドを元にしたものを挙げることができる。蛍光性基質として、特許ＥＰ０６４１３５１（Enzymatic analysis using substrates that yield fluorescent precipitates", Haugland et al.) 又は特許出願ＦＲ０７／５５３７１に記載のクマリン、レダクターゼ基質、特にニトロレダクターゼ基質、より好ましくは特許出願ＦＲ０７／５５３７３または特許ＥＰ１１２４９８６に記載されているものを挙げることができる。酸化還元酵素の酵素活性のための基質として、特にレダクターゼ基質、好ましくはニトロレダクターゼ基質を挙げることができる。すでにアリザリン-α-グルコシドを含んでいる培地に、第２の酵素基質、特に第２のα-グルコシダーゼ基質を導入することは、培地で増殖する他の属からレジオネラを区別することを高めることができる。
【００１３】
生物学的試料なる用語は、気管支、気管又は肺吸引試料または胸膜液試料からの、気管支肺胞洗浄からの、喀痰からの、血液からのまたは肺生検からの、まれに関節滑液または心膜液からの臨床試料；体液又は食物試料を意味することを目的とする。従って、この試料は液体であっても固体であってもよく、非限定的に、血液、血漿、尿または糞便由来の臨床試料、または鼻から、のどから、皮膚から、損傷からまたは脳脊髄液から得られた試料、または水（飲み水）由来の食物試料を挙げることができる。
【００１４】
環境試料なる用語は、水標本を意味することを目的とし、非限定的に、給水ネットワーク、空調システム、冷却塔、噴霧器、霧吹きなどを挙げることができる。
【００１５】
この点で、本発明は、第１に、少なくとも一つの非極性シリカを含んで成る、レジオネラ属のバクテリアを培養および／または検出および／または同定するための反応培地に関する。前記非極性シリカはオクタデシルシリカであることが好ましい。好ましくは、前記非極性シリカは、粘土、好ましくはセピオライトと組合わせられる。好ましくは、オクタデシルシリカは、セピオラオトと組合わせられる。
本発明の好ましい一実施形態によれば、更に前記反応培地は、酵素基質を含む。好ましくは、前記酵素基質は、蛍光性または発色性であり、好ましくは発色性の酵素基質である。前記蛍光性又は発色性酵素基質は、酸化還元酵素基質または加水分解酵素基質であることが望ましい。
【００１６】
本発明の好ましい一実施形態によれば、非極性シリカの濃度は、０．０１〜１００ｇ／ｌ、好ましくは１〜５ｇ／ｌである。本発明による培地が粘土と組合わせて非極性シリカを含む場合には、粘土の濃度は、０．０１〜１００ｇ／ｌ、好ましくは１〜５ｇ／ｌである。
本発明の好ましい一実施形態によれば、反応培地は、更にレジオネラ属バクテリアの選択培養を可能にする選択混合物を含む。
好ましくは、この選択混合物は、単独でまたは組合せにより、グリシン、硫酸ポリミキシンＢ、バンコマイシン、シクロヘキシミド、アニソマイシン、ブロムクレゾールパープルまたはブロムチモールブルーを含む。上記の培地の使用は、レジオネラ属バクテリアの選択的検出を可能にする。
本発明による培地は、レジオネラの特定の種（例えばレジオネラ・ニューモフィラ）の選択培養を可能にする選択混合物を含んでもよい。そのとき、この選択混合物は、単独でまたは組合せで、グリシン、硫酸ポリミキシンＢ、バンコマイシン、キノロンまたはフルオロキノロン、シクロヘキシミド、アニソマイシン、ブロムクレゾールパープルまたはブロムチモールブルーを含むことが好ましい。選択性の違いは、また、２．５ｇ／ｌ〜７．５ｇ／ｌの範囲でグリシン濃度を変化させることによって得ることができる(Glycine-containing selective medium for isolation of Legionellaceae from environmental specimens, Robert M. Wadowski and Robert B. Yee)。
【００１７】
本発明は、レジオネラ属バクテリアの培養、検出および／または同定のために、少なくとも一つのケイ質化合物を含んで成る反応培地の使用にも関する。前記ケイ質化合物は非極性シリカおよび／または粘土であることが望ましい。前記非極性シリカはオクタデシルシリカであることが望ましい。前記粘土はセピオライトであることが望ましい。
本発明の好ましい一実施形態によれば、使用する反応培地中のケイ質化合物の濃度は、０．０１〜１００ｇ／ｌ、好ましくは１〜５ｇ／ｌである。使用する反応培地がケイ質化合物の組合せを含む場合には、各々の化合物の濃度は、０．０１〜１００ｇ／ｌ、好ましくは１〜５ｇ／ｌである。
【００１８】
最後に、本発明は、レジオネラ属バクテリアを検出および／または同定する方法に関するものであり、該方法は、
ａ）上記の反応培地にレジオネラ属バクテリアを含む可能性がある試料を接触させる工程、
ｂ）インキュベートする工程、および
ｃ）レジオネラ属バクテリアの検出する工程を含む。
【００１９】
インキュベーションは、好ましくは３０℃〜５０℃、より好ましくは３６℃〜４２℃で実施される。レジオネラは、着色又は蛍光性のコロニーを得ることを可能にするα-グルコシダーゼまたは酸化還元酵素活性によって検出されることが好ましい。他属のコロニーは、それらが抑制されなかったならば、無色であるか、レジオネラ属のものと色が異なるか、色または蛍光が同一である。
【００２０】
インキュベーション時間は、レジオネラ属バクテリアの増殖を可能にし、それらの検出を可能にする。非限定的に、４８〜７２時間のインキュベーションは適切であるが、より短いインキュベーションも可能である。
この培地が使われる場合、レジオネラは着色又は蛍光性のコロニーを得ることを可能にする酸化還元酵素活性によって検出されることが好ましい。他のバクテリアは抑制されるか、無色であるか、レジオネラのものとは色または蛍光が異なるか、または色または蛍光が同一である。
【００２１】
下記の実施例は、説明のために与えられるものであり、限定するものではない。それらは、より明らかに本発明を理解することを可能にする。
【実施例】
【００２２】
（実施例１）
レジオネラ属のさまざまな菌株は、５つの異なる培地上で試験された。次に、皿は、７２時間および９６時間のインキュベーション後に読みとられる。
１．  培地と微生物
以下の組成を有する培地を使用した（組成、ｇ/ｌ）：
イースト抽出物：１０ｇ／ｌ  
α‐ケトグルタール酸：１ｇ／ｌ  
ＡＣＥＳ／ＫＯＨ：４／１．６５ｇ／ｌ
グリシン：３ｇ／ｌ
塩酸システイン：０．４ｇ／ｌ
ピロリン酸第二鉄：０．２５ｇ／ｌ
グルタチオン：５ｇ／ｌ
寒天：１７ｇ／ｌ。
５ｇ／ｌの非極性シリカ（オクタデシルシリカ、培地１）、５ｇ／ｌの極性シリカ（シリカゲル、培地２）、５ｇ／ｌの高極性シリカ（３−アミノプロピルシリカ、培地３）または５ｇ／ｌの非極性シリカ（オクチルシリカ、培地４）をこの培地に加えた。
ＢＣＹＥ培地（Feeley et al, J Clin Microbiol. 1979 10:437-41) は、増殖制御として働いた培地であった。
２．  テスト
培地をペトリ皿に分配した。さまざまなレジオネラ属の菌株は、３つのクワドラント・ストリーキングによって接種した。皿は、ＣＯ２の存在下で、３７℃で９６時間インキュベートした。読取りは、７２時間および９６時間のインキュベーション後に、実施された。
３．  結果
結果を下記の表に記録する：
0005769174.tif 000002
Ｍ（かたまり）カラムの記号「１」、「２」または「３」は、１つ、２つ又は３つのクワドラントにおける試験された菌株の増殖を示す；「０」は、増殖が無かったことを示す。
コロニー（Ｃ）のサイズは、ミリメータで示す。
４．  解釈
非極性の性質のシリカを含有するシリカは、試験された全ての菌株の増殖を可能にし、その増殖はＢＣＹＥ培地より大きかった。
【００２３】
（実施例２）
レジオネラ属のさまざまな菌株は、８つの異なる培地で試験された。次に、皿は、７２時間および９６時間のインキュベーション後に読み取られた。
１．  培地と微生物
以下の組成を有する培地が使用された（組成、ｇ／ｌ）：
イースト抽出物：１０ｇ／ｌ
α‐ケトグルタール酸：１ｇ／ｌ  
ＡＣＥＳ／ＫＯＨ：４／１．６５ｇ／ｌ
グリシン：３ｇ／ｌ
塩酸システイン：０．４ｇ／ｌ
ピロリン酸第二鉄：０．２５ｇ／ｌ
グルタチオン：５ｇ／ｌ
寒天：１７ｇ／ｌ。
１ｇ／ｌの非極性シリカ（オクタデシルシリカ、培地Ｔ）、又はそれぞれ、０．１、０．５、１、２．５、５、７．５または１０ｇ／ｌのセピオライト（培地１、２、３、４、５、６および７）をこの培地に加えた。
２．  テスト
培地をペトリ皿に分配した。さまざまなレジオネラ属の菌株は、３つのクワドラント・ストリーキングによって接種された。皿は、ＣＯ２の存在下で、３７℃で９６時間インキュベートされた。読取りは、７２時間および９６時間のインキュベーション後に、実施された。
３．  結果
結果を下記の表に記録する：
0005769174.tif 000003
Ｍ（かたまり）カラムの記号「１」、「２」または「３」は、１つ、２つ又は３つのクワドラントにおける試験された菌株の増殖を示す；「０」は、増殖が無かったことを示す。コロニー（Ｃ）のサイズは、ミリメータで示す。
４．解釈
５〜１０ｇ／ｌの濃度でセピオライトを含有する培地は、レジオネラ・ニューモフィラの増殖を可能にし、その増殖が対照培地と実質的に同一だった。
【００２４】
（実施例３）
レジオネラ属のさまざまな菌株は、３つの異なる培地上で試験された。次に、皿は、７２時間および９６時間のインキュベーション後に読み取られた。
１．  培地と微生物
以下の組成を有する培地が使用された（組成、ｇ/ｌ）。
イースト抽出物：１０ｇ／ｌ
α‐ケトグルタール酸：１ｇ／ｌ
ＡＣＥＳ／ＫＯＨ：４／１．６５ｇ／ｌ
グリシン：３ｇ／ｌ
塩酸システイン：０．４ｇ／ｌ
ピロリン酸第二鉄：０．２５ｇ／ｌ
グルタチオン：５ｇ／ｌ
オクタデシルシリカ：１ｇ／ｌ。
１７ｇ／ｌの寒天（培地Ｔ）、１７ｇ／ｌのゲルライト（培地Ｔ１）および５ｇ／ｌのセピオライトと１７ｇ／ｌの寒天（培地Ｔ２）をこの培地に加えた。
２．  テスト
培地をペトリ皿に分配した。さまざまなレジオネラ属の菌株は、３つのクワドラント・ストリーキングによって接種した。皿は、ＣＯ２の存在下で、３７℃で９６時間インキュベートした。読取りは、７２時間および９６時間のインキュベーション後に、実施された。
３．  結果
結果を下記の表に記録する：
0005769174.tif 000004
Ｍ（かたまり）カラムの記号「１」、「２」または「３」は、１つ、２つ又は３つのクワドラントにおける試験された菌株の増殖を示す；「０」は、増殖が無かったことを示す。コロニー（Ｃ）のサイズは、ミリメータで示す。
４．  解釈
ここで試験した全ての培地は、大きな単離コロニー・サイズを有する全てのレジオネラの増殖を可能にした。
【００２５】
（実施例４）
レジオネラ属のさまざまな菌株は、ニトロレダクターゼ、すなわち、2-（5’-フルオロ-2’-ニトロフェニル）ベンゾチアゾールのための蛍光性基質を含んで成る、本発明の培地上で試験された。次に、皿は、７２時間、９６時間および１２０時間のインキュベーション後に読み取られた。
１．  培地と微生物
以下の組成を有する培地を使用した（組成、ｇ/ｌ）：
イースト抽出物：１０ｇ／ｌ
α‐ケトグルタール酸：１ｇ／ｌ
ＡＣＥＳ／ＫＯＨ：４／１．６５ｇ／ｌ
グリシン：３ｇ／ｌ
塩酸システイン：０．４ｇ／ｌ
ピロリン酸第二鉄：０．２５ｇ／ｌ
グルタチオン：５ｇ／ｌ
寒天：１７ｇ／ｌ
オクタデシルシリカ：１ｇ／ｌ。
蛍光性基質2-（5’-フルオロ-2’-ニトロフェニル）ベンゾチアゾールの保存溶液は、ＤＭＳＯタイプの溶媒で５０ｇ／ｌに調製した。基質の最終濃度５ｍｇ／ｌに対応する量を、前記の溶解した培地に加えた。
２．  テスト
培地は、直径５５ｍｍのペトリ皿に注入され、次にレジオネラ属の菌株は、０．５マクファーランドの懸濁液から３つのクワドランドストリーキングによって接種をされた。皿は、３７℃で５日間インキュベートされた。
３．  結果
形成されるコロニーは、７２、９６および１２０時間のインキュベーション後に、視覚的に調べられた。蛍光（３６６ナノメートルのＵＶランプ下で読みとられる）、更には強度を書き留めた。
結果は、下記の表に記録される：
0005769174.tif 000005
0005769174.tif 000006
０は、単離コロニーの欠如か、又は蛍光の欠如を示す。蛍光強度は、０（蛍光なし）から４（非常に強い蛍光）の範囲のスケールで読みとられる。
４．  解釈
蛍光性基質を含む本発明による培地は、試験される全ての菌株の増殖およびレジオネラの簡単な検出を可能にした。
【００２６】
（実施例５）
レジオネラ属のさまざまな菌株は、α−グルコシダーゼ、すなわちアリザリン−α−グルコシド用の発色性基質を含んで成る本発明の培地上試験された。次に、皿は、７２時間および９６時間のインキュベーション後に読み取られた。
１．  培地と微生物
以下の組成を有する培地が使用された（組成、ｇ/ｌ）：
イースト抽出物：１０ｇ／ｌ
α‐ケトグルタール酸：１ｇ／ｌ
ＡＣＥＳ／ＫＯＨ：４／１．６５ｇ／ｌ
グリシン：３ｇ／ｌ
塩酸システイン：０．４ｇ／ｌ
ピロリン酸第二鉄：０．２５ｇ／ｌ
グルタチオン：５ｇ／ｌ
寒天：１７ｇ／ｌ
オクタデシルシリカ：１ｇ／ｌ。
発色性基質（アリザリン-α-グルコシド）の保存溶液は、ＤＭＳＯタイプの溶媒で４０ｇ／ｌに調製された。基質の最終濃度５０ｍｇ／ｌに対応する量を、前記の溶解した培地に加えた。同様に、クエン酸鉄の保存溶液は、浸透水で調製され、次に溶液はろ過され、１００ｍｇ／ｌで培地に加えた。
２．  テスト
培地は直径５５ｍｍのペトリ皿に注入され、次にレジオネラ属の菌株は０．５マクファーランドの懸濁液から３つのクワドランド・ストリーキングで接種をされた。皿は、３７℃で４日間インキュベートされた。
３．  結果
形成されたコロニーは、７２と９６時間のインキュベーション後に、視覚的に調べられた。着色、更には強度が、書きとめられた。結果は、下記の表に記録される：
0005769174.tif 000007
０は、増殖の欠如か、又は単離コロニーの欠如か、又は着色の欠如を示す。着色強度は、０（着色なし）から４（非常に強い強度）の範囲のスケールで読みとられた。
色はピンク色（Ｐと示す）から、Ｐｖｉ（ピンク／紫色）を経て、紫色（Ｖｉ）まで変化する。
４．  解釈
発色性基質を含む本発明の培地は、試験した８／１０菌株の増殖を可能にし、かたまりとコロニーのピンクから紫色の着色の出現により、レジオネラの簡単な検出を可能にした。