(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−２の作動薬ポリペプチドであって、生来のＩＬ−２の配列と９５％以上の相同性によって特徴付けられ、かつ、前記ポリペプチドが、制御性Ｔ細胞をインビトロ及び／又はインビボで刺激することにおいて少なくとも１０００倍少ない効果性であり、かつより大きいインビボ治療有効性を示す、上記作動薬ポリペプチドであって、
前記ポリペプチドが、
（ｉ）  変異Ｒ３８Ｋ、Ｆ４２Ｉ、Ｙ４５Ｎ、Ｅ６２Ｌ、Ｅ６８Ｖを含むポリペプチド、
（ｉｉ）  変異Ｒ３８Ｋ、Ｆ４２Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｅ６８Ｖを含むポリペプチド、
（ｉｉｉ）  変異Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｉ、Ｙ４５Ｎ、Ｅ６２Ｌ、Ｅ６８Ｖを含むポリペプチド、
（ｉｖ）  変異Ｒ３８Ｋ、Ｆ４２Ｋ、Ｙ４５Ｒ、Ｅ６２Ｌ、Ｅ６８Ｖを含むポリペプチド、
（ｖ）  変異Ｒ３８Ｋ、Ｆ４２Ｉ、Ｙ４５Ｅ、Ｅ６８Ｖを含むポリペプチド、及び
（ｖｉ）  変異Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６２Ａを含むポリペプチド
からなる群から選択される、
上記作動薬ポリペプチド。
【請求項２】
キャリアタンパク質とカップリングした、請求項１に記載の免疫変調ポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項３】
前記キャリアタンパク質が、アルブミンである、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記キャリアタンパク質が、ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域である、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
活性成分として請求項１に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする、癌及び慢性感染疾患の治療において有用な医薬組成物。
【請求項６】
活性成分として請求項２〜４のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、癌及び慢性感染疾患の治療において有用な医薬組成物。
【請求項７】
請求項１に記載のポリペプチドを含む、免疫系を変調させるための医薬組成物。
【請求項８】
請求項１に記載のポリペプチドを含む、慢性疾患の治療において有用な医薬組成物。
【請求項９】
活性成分として請求項１に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする、癌ワクチンに対する細胞性及び／又は体液性応答を増強させることに有用な医薬組成物。
【請求項１０】
活性成分として請求項２〜４のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含むことを特徴とする、癌ワクチンに対する細胞性及び／又は体液性応答を増強させることに有用な医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学に関する。具体的には、もとの分子の作動薬作用を有するが、予期せずして優れた治療有効性を示した天然分子類似体による免疫系の治療的変調に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン２（ＩＬ２）は、Ｔ細胞のためとして記載された最初の増殖因子であった。その発見以来、そのインビトロのＴ細胞の増殖及び生存を促進する能力（Ｓｍｉｔｈ，ＫＡ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４０，１１６９−７６）、並びにウイルス感染（Ｂｌａｔｔｍａｎ，ＪＮら（２００３）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，５４０−７）又はワクチン（Ｆｉｓｈｍａｎ，Ｍ．ら（２００８）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３１，７２−８０，Ｋｕｄｏ−Ｓａｉｔｏ，Ｃ．ら（２００７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５６，１８９７−９１０；Ｌｉｎ，ＣＴ．ら（２００７）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．１１４，８６−９３）に関連してのＴ免疫応答をブーストする能力が観察された。しかしながら、ＩＬ−２のＴ免疫応答の促進因子としてのこの古典的な役割は、このサイトカインが自然制御性Ｔ細胞ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋（Ｔｒｅｇ）のためのホメオスタティック増殖因子であることを示す数多くの実験データ（Ａｌｍｅｉｄａ，ＡＲ．ら（２００２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９，４８５０−６０；ｄｅ  ｌａ  Ｒｏｓａ，Ｍ．ら（２００４）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４，２４８０−８，Ｍａｌｅｋ；ＴＲら（２００４）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４，６６５−７４）によって、最近疑問視されてきている。
【０００３】
インターロイキン２は、制御性Ｔ細胞がＣＤ４  Ｔヘルバー細胞、細胞毒性ＣＤ８  Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞といった他のエフェクター細胞の活性及び拡張を抑制するための機構における主要な役回りであるとしても提唱されてきている。とりわけ、制御性Ｔ細胞がＩＬ−２のレベルの局所的減少を誘導して他のＴ細胞を抑制することが、最近提唱されてきている（Ｐａｎｄｉｙａｎ，Ｐ．ら（２００７）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．８，１３５３−１３６２）。この抑制的効果は、
ａ）エフェクターＴ細胞が新規なＩＬ−２を産生することを直接阻害する、それらの能力（Ａｌｍｅｉｄａ，ＡＲ．ら（２００２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９，４８５０−６０；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔ．ら（１９９８）Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０，１９６９−８０；Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，ＡＭ．ら（１９９８）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８８，２８７−９６；Ｗｏｌｆ，Ｍ．ら（２００１）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１，１６３７−４５）、
ｂ）それらの微小環境に存在するＩＬ−２を急速に隠退させ、内部吸収しかつ分解する、それらの能力（Ｐａｎｄｉｙａｎ，Ｐ．ら（２００７）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．８，１３５３−６２）及び
ｃ）ＩＬ−２受容体のα鎖を過剰発現させて（Ｋｕｎｉｙａｓｕ，Ｙ．ら（２０００）Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２，１１４５−１１５５）、ＩＬ−２の濃度が低い時にＩＬ−２のより効率的な使用を可能にさせる、それらの能力
に基づいている。
【０００４】
まとめると、ＩＬ−２は、異なる細胞集団の生物学的活性に非常に関連性のある、高い多面性のサイトカインである。この性質は、ＩＬ−２を免疫応答の制御における重要な結節点にするものであり、治療及び複合免疫変調のための魅力的な標的にするものである。
【０００５】
ＩＬ−２は、数年の間癌治療において使用されてきている。とりわけ、高い用量でのそれの使用は、転移性メラノーマ及び腎細胞癌の治療のためにいくつかの国で承認された治療である。しかしながら、患者におけるＩＬ−２の直接の使用は、それの毒性効果及び低い有効性によって厳しく制限されている。そのようなわけで、適性のある患者のわずか２０％だけがＩＬ−２に基づく治療を受容し、治療されたそれらの患者のわずか１７％のみが目的の応答を示す。この劇的な臨床的設置の不履行についてのあり得そうな説明は、生来のＩＬ−２による治療が、望ましい免疫刺激をしくじらせる制御性Ｔ細胞の集団をも刺激することである（Ａｈｍａｄｚａｄｅｈ，Ｍ．ら（２００６）Ｂｌｏｏｄ．１０７，２４０９−１４）。今日では、大量の前臨床の証拠がこの考えを支持する。とりわけ、マウスモデルでの実験は、インビボで注射されたＩＬ−２の主要な活性が自然制御性Ｔ細胞のホメオスタティック拡張であることを示す。
【０００６】
ＩＬ−２治療の毒性効果を緩和するためにいくつかの戦略が開発されてきている。これらの戦略の中のいくつかは、ＩＬ−２の変異された改変体の使用に基づくものであり、この分子の力量を、主に高親和性受容体（α、β及びγ鎖）による、そして中程度の親和性受容体（β及びγ鎖）によるものではないシグナルにまで増加させるために設計されている。その基本的な考えは、観察された毒性効果の要因となっていると信じられているＮＫ細胞におけるシグナリングではなく、Ｔ細胞におけるシグナリングを促進することである。引き続いての発明は、下記の仕事、米国特許第７，１８６，８０４号、米国特許第７，１０５，６５３号、米国特許第６，９５５，８０７号、米国特許番号第５，２２９，１０９号、米国特許出願第２００５０１４２１０６号に沿ったものである。これらの発明のいずれも、減少した自然制御性Ｔ細胞を刺激する能力に基づいての、インビボの生来のＩＬ−２よりも大きい治療有効性を有するＩＬ−２のムテインに関したものではないことに注意することが重要である。
【０００７】
ＩＬ−２の他の変異された改変体が、これらの薬理学的活性を増加させる目的で、例えば、その折畳みを改良したり又はそれらの血中寿命を増加させることによって、創出されてきている。中でも、引き続いての発明は、下記の仕事、米国特許番号第４，９５９，３１４号、米国特許番号第５，１１６，９４３号、米国特許番号第４，８５３，３３２号に沿ったものである。繰り返すと、これらのムテインのいずれも、制御性Ｔ細胞を活性化させる能力が減少したり、より大きな治療有効性を示したりするものはない。
【０００８】
最後に、文献で述べるべきこととして、制御性Ｔ細胞の活性をインビボで変調又は低減することを提唱している治療剤の多数の提唱が存在している（Ｋｒｅｉｔｍａｎ，Ｒ．Ｊ．（２００９）Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ．１５，２６５２−６４；Ｌｉｔｚｉｎｇｅｒ，Ｍ．Ｔ．，Ｆｅｒｎａｎｄｏ，Ｒ．，Ｃｕｒｉｅｌ，Ｔ．Ｊ．，Ｇｒｏｓｅｎｂａｃｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｓｃｈｌｏｍ，Ｊ．及びＰａｌｅｎａ，Ｃ．（２００７）Ｂｌｏｏｄ．１１０，３１９２−２０１；Ｍｏｒｓｅ，Ｍ．Ａ．，Ｈｏｂｅｉｋａ，Ａ．Ｃ．，Ｏｓａｄａ，Ｔ．，Ｓｅｒｒａ，Ｄ．，Ｎｉｅｄｚｗｉｅｃｋｉ，Ｄ．，Ｌｙｅｒｌｙ，Ｈ．Ｋ．及びＣｌａｙ，Ｔ．Ｍ．（２００８）Ｂｌｏｏｄ．１１２，６１０−８；Ｏｎｉｚｕｋａ，Ｓ．，Ｔａｗａｒａ，Ｉ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｊ．，Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｓ．，Ｆｕｊｉｔａ，Ｔ．及びＮａｋａｙａｍａ，Ｅ．（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９，３１２８−３３；Ｑｕｅｚａｄａ，Ｓ．Ａ．，Ｐｅｇｇｓ，Ｋ．Ｓ．，Ｃｕｒｒａｎ，Ｍ．Ａ．及びＡｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．（２００６）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１１６，１９３５−４５）。これらの治療剤は、癌の直接の治療として又はワクチンの効果を増強するために、動物モデルにおいて又は患者においてさえも、試験されてきている。より良好な又はより効果的な免疫応答を促進するために、ＩＬ−２の活性を変調することを提唱しているいくつかの報告、とりわけモノクローナル抗体もまた、存在している（Ｂｏｙｍａｎ，Ｏ．，Ｋｏｖａｒ，Ｍ．，Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ｐ．，Ｓｕｒｈ，Ｃ．Ｄ．及びＳｐｒｅｎｔ，Ｊ．（２００６）Ｓｃｉｅｎｃｅ．３１１，１９２４−１９２７；Ｂｏｙｍａｎ，Ｏ．ら（２００６）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．６，１３２３−３１；Ｋａｍｉｍｕｒａ，Ｄ．ら（２００６）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７，３０６−１４；Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｍ．，Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ａ．，Ｂｅｎｄｅｒ，Ｊ．，Ｋａｐｐｌｅｒ，Ｊ．及びＭａｒｒａｃｋ，Ｐ．（２００２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９９，８８３２−７；Ｔｏｍａｌａ，Ｊ．，Ｃｈｍｅｌｏｖａ，Ｈ．，Ｍｒｋｖａｎ，Ｔ．，Ｒｉｈｏｖａ，Ｂ．及びＫｏｖａｒ，Ｍ．（２００９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８３，４９０４−４９１２）。しかしながら、我々の知識では、ＩＬ−２の変異された改変体に基づいての、減少した自然制御性Ｔ細胞を刺激する能力に基づいてより大きな治療有効性を獲得する可能性を示す報告は、存在していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、移植可能なマウス腫瘍モデルにおける生来のＩＬ−２よりも大きい治療有効性を示す、ＩＬ−２の変異された改変体の産生に関する。これらのムテインはＩＬ−２活性の部分的作動薬であることにより特徴付けられ、自然制御性Ｔ細胞（Ｔ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）をインビトロ及び／又はインビボで刺激する能力がとりわけ低いことによって選別される。これらのムテインのインビボでの治療有効性によって、転移性腫瘍におけるＩＬ−２治療を改良するための実践的解決が提供される。とりわけ、これらのムテインは、生来のＩＬ−２治療において観察された制約を解消するための道筋、それはインビボでの自然制御性Ｔ細胞を拡張する能力の改良に由来している、を提供するであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、変異されてしまった数個のアミノ酸を除いて、ヒトＩＬ−２と一次配列を共有するポリペプチドに関する。導入された変異は、これらのポリペプチドのインビトロ及びインビボで制御性Ｔ細胞（Ｔ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）を刺激する能力を実質的に低減させ、マウスの移植可能な腫瘍の治療においてＩＬ−２により大きい有効性を与える。本発明は、これらの変異された改変体の単独での、又はワクチンと組み合わせての、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性が関係している癌又は感染といった疾患の治療のための治療的使用をもまた包含する。
【００１１】
本発明は、ＩＬ−２に基づいての免疫変調の現在の戦略の実質的な改良を、癌の直接的治療のために及び異なるワクチンと組み合わせての両方で、可能にする。とりわけ、生来のＩＬ−２を本明細書に記載の変異された改変体で置換することにより、所望の治療効果を著しく低減させる制御性Ｔ細胞の拡張を回避するであろう。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（ＩＬ−２類似体ポリペプチドの取得）
本発明は、１００〜５００アミノ酸の長さのポリペプチド、好ましくは１４０残基のサイズで、その分子量は明らかに少なくとも１５ｋＤであるポリペプチドに関する。これらのポリペプチドは、生来のＩＬ−２との高い配列同一性、９０％より高い、を維持する。これらの配列の領域では、生来のＩＬ−２と比較して３〜６個の変異を含む。これらの位置では、これらのポリペプチドは生来のＩＬ−２での同じ位置におけるものと異なるアミノ酸残基を導入して変異される。もとの残基を置き換えるアミノ酸は、もとのアミノ酸のものと全く異なる物理化学的特性を有し、極性残基を非極性、非荷電性を荷電性、大型を小型に、酸性を塩基性に変え、その他変更をするように選択される。
【００１３】
本発明のポリペプチドは、免疫変調性ポリペプチド、ＩＬ−２類似体又はＩＬ−２ムテイン、その他の名称として呼んでもよい。これらのポリペプチドは、ＩＬ−２受容体複合体の３Ｄ構造（ＰＤＢ公開データベースで入手可能）に基づいて設計され、溶媒に顕著に露出するするアミノ酸であって、異なる種からのＩＬ−２（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースから入手した配列）において高く保存されているアミノ酸に対応するＩＬ−２の位置において主に変異を導入している。上述した型の溶媒に露出するアミノ酸は、ＲＡＳＭＯＬ、ＳｗｉｓｓＰＤＢｖｉｅｗｅｒなどといったタンパク質構造の可視化のためのバイオインフォマティックスソフトウエアを使用して同定される。ＩＬ−２の配列における保存された位置は、複数配列アラインメントのためのバイオインフォマティックスソフトウエア、例えば、Ｆａｓｔａ、ＣｌｕｓｔｅｒＷなどを使用して同定した。
【００１４】
本発明のポリペプチドは、タンパク質合成を含めた、種々の戦略によって取得することができる。それらは、遺伝子工学技術によっても、例えば、それらを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）といったバクテリア又は他のバクテリアにおいて、またＮＳＯ細胞といった哺乳細胞又は他の哺乳細胞においても発現させることによっても、取得することができた。特定の位置での点変異は、ポリメラーゼ鎖反応アッセイ（ＰＣＲ）による部位指向変異導入技術によっても取得してよい。
【００１５】
予期せずして、本発明者らは、生来のＩＬ−２の従来的使用について、これらのムテインの実質的な有利点を見出した。この有利点は、制御性Ｔ細胞の拡張を回避するそれの能力に由来する、腫瘍治療におけるそれらの増加した有効性に依拠する。
【００１６】
（生物学的活性に関してのＩＬ−２のペプチド類似体の選別）
本発明のポリペプチドは、下記の特性により選別される。
１）生来のＩＬ−２の作動薬作用。この特性は、ＣＴＬＬ２又はＫｉｔｔ２２５といったＩＬ−２に依存する細胞ラインでのインビトロ増殖アッセイにおいて直接評価することができ、又はマウス及び／又はヒトＴリンパ球の混合物でのアッセイによって評価することができる。これらのムテインは、これらの試行において将来のＩＬ−２のものより５〜５０倍少ない特異的刺激活性を有していなければならない。
２）生来のＩＬ−２と比較しての、制御性Ｔ細胞の集団をインビトロで及び／又はインビボで刺激する許容能力の欠失。この特性は、例えば、生来のＩＬ−２のものと比較しての、本発明のムテインの実験未使用マウスから精製されインビトロで抗ＣＤ３抗体で刺激されたＴ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の拡張を直接誘導する能力を検討することによって評価することができる。これらのムテイン又は生来のＩＬ−２をマウス中に５日間腹腔内又は皮下注射して、拡張又は制御性Ｔ細胞（ＴＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）の集団の増殖の速度の増加に対する効果を評価することによっても、それを評価することができる。変異されたＩＬ−２のＴｒｅｇ細胞に対する活性は、これらの試行において生来のＩＬ−２のものよりも少なくとも１０００倍低くなければならない。
３）動物モデルにおける生来のＩＬ２についての増加した治療効果。この特性は、例えば、移植可能な腫瘍モデル（例えば、Ｂ１６メラノーマ）における単独治療としてのムテイン及び生来のＩＬ−２の抗腫瘍又は抗転移効果を比較することによって、評価することができる。目的のワクチンに対する細胞性及び／又は体液性応答の相乗的効果を通じても、それを評価することができる。そのムテインは、等しいタンパク質の合計質量のＩＬ−２及びムテインを含む用量において、生来のＩＬ−２よりも大きい治療有効性を示さなければならない。
【００１７】
本発明は、とりわけ表１に特定されるムテインに関する。これらのムテインは、上述した特性を与える複数のアミノ酸の置換を有する。
【表１】
0005761831.tif 000002
【００１８】
本発明は、上述したクラスのＩＬ−２ムテインに対して、特に表１に記載されるものに対しての追加の改変をもまた含む。ＩＬ−２受容体の特定の構成要素に対するそれらの親和性を増加させるものであってもなくても、しかし制御性Ｔ細胞を刺激することのない作動薬性質に影響を与えることなくあるいは改良し、又はそれらのインビボ薬力学を改善する：半減期を増大させ若しくはＴ細胞による内部吸収を減少させる。これらの追加の変異は、バイオインフォマティクスツールによる推論的設計によって、又は異なる性質のコンビナトリアル分子ライブラリー（ファージライブラリー、酵母又はバクテリアでの遺伝子発現ライブラリー）を使用して取得してもよい。
【００１９】
本発明の別の態様は、上記した免疫変調性ポリペプチドのいずれかにキャリアタンパク質がカップリングした融合タンパク質に関する。キャリアタンパク質は、アルブミン又はヒト免疫グロブリンのＦｃ領域となることができる。
【００２０】
（ＩＬ−２類似体ポリペプチドの治療適用）
本発明はまた、活性成分として本発明によって開示されたＩＬ−２のムテイン及びその類似体を含む医薬組成物、及び制御性Ｔ細胞が特に関連する癌又は慢性感染といった疾患における自然の又はワクチン誘導の免疫応答を増強するための潜在的な治療適用もまた含む。
【００２１】
治療的使用のために、本発明のポリペプチドは、独立して又は治療作用を促進若しくは増強する他のポリペプチド若しくは他の物質と組み合わせて、被検キャリアに投与されるべきである。投与経路は、薬物の非経口投与のための技術常識によって記載されるいかなる投与経路であってもよい。好ましくは、静脈内、筋肉内、皮下又は腫瘍内に投与されるべきである。
【００２２】
本明細書に記載のポリペプチドは、生来のＩＬ２の代替として、癌若しくは慢性感染の治療において又はワクチンに対する細胞性及び／又は体液性応答を増強させるために使用される医薬組成物の一部として投与されてもまたよい。本発明のポリペプチドは、癌のための治療ワクチンと組み合わせて、又は制御性Ｔ細胞が関連する感染性疾患における予防薬ワクチンとともに使用することができる。
【００２３】
所望の治療効果を得るために、本発明のポリペプチドは、末梢リンパ節での又は検討中の疾患に関連する末梢部位での濃度がムテインが免疫刺激効果を示す濃度の範囲内にあることを確実にするために十分に高い用量で投与されるべきである。それゆえに、問題の用量は、疾患の型及び検討中の投与経路に従って調整するべきである。例えば癌治療の場合では、抗腫瘍免疫応答の刺激を確実にするような腫瘍の内部の及び／又は局所リンパ節でのムテインの濃度を達成するために用量を調整するべきである。検討される用量範囲は、一用量あたり何百マイクログラムから何百ミリグラムまでの範囲となることができる。ムテインが生来のＩＬ−２での伝統的治療を置き換える際の適用のためには、使用されるムテイン用量は、生来のＩＬ−２のために伝統的に使用されたものより活性で少ないか又は等しい（ＣＴＬＬ２ラインでのアッセイを使用して決定される）ものであるべきである。
【００２４】
適用する投与の回数もまた、問題となるムテインの生体内分布に従って調整するべきである。一般に、前述の有効的なレベルは連続した２〜３０日の間維持されるべきである。例えば、ムテインをキャリアタンパク質にカップリングする場合には、その投与の頻度はそれに従って調整されるものであろうことに、注意するべきである。生来のＩＬ−２が置き換えられる適用のためには、ムテインの投与のスキームは伝統的治療で使用されるものと同様であってもよい。
【００２５】
治療作用は、疾患の症状の完全な又は部分的な寛解によって理解するべきである。癌においては、中でも、腫瘍体積の減少又は再発までの時間の増加が疾患の寛解の判断基準となるであろう。
【００２６】
本発明のポリペプチドは、とりわけ、メラノーマ及び腎臓腫瘍といった腫瘍の治療において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ムテインの取得。ａ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中の電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により評価した大腸菌の株ＢＬ２１ＤＥ３におけるムテインの発現。レーン１：ＢＬ２１ＤＥ３株の全タンパク質、発現の陰性対照。レーン２及び３：この株において達成された発現レベルの２つの例、矢印はムテインに対応するバンドを指示する。ｂ）タンパク質の主要な最終精製工程を示す逆相クロマトグラム、矢印は目的のタンパク質に対応するピークを指示する。ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価したムテインの精製。１：封入体単離のプロセスの結果。２：逆相による精製の後に取得したムテイン。
【図２】ＩＬ−２ムテインの作動薬性質の評価。ａ）フローサイトメトリーによるムテインのＣＴＬＬ２細胞ラインの表面への結合能力の測定。ＩＬ−２及びムテインの両方とも抗６ＨｉｓタグＭＡｂを使用して検出した。ｂ）グラフは、生来のＩＬ−２と比較した、ムテインのＩＬ−２依存性Ｔ細胞ラインＣＴＬＬ２の増殖を誘導する能力を示す。増殖はＭＴＴ取り込みによって測定した。
【図３】ムテインは制御性Ｔ細胞の増殖をインビトロで誘導しない。ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスリンパ節から精製したＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋集団の純度を示すフローサイトメトリーグラフ。ｂ）Ｔｒｅｇ細胞をインビトロで抗ＣＤ３  ｍＡｂで刺激し、生来のＩＬ−２をそれに０．５ｎｇ／ｍＬの濃度で又は３２ｎｇ／ｍＬの濃度でムテインを７２時間の間投与した。グラフは、いかなるサイトカインを添加しなかった対照と比較しての各処理の後で回収した生存細胞の数を示す。選択した濃度は、各分子がＣＴＬＬ２ラインの同じ増殖を誘導する濃度に対応する。
【図４】ムテインによる処理の細胞集団の増殖に対する効果の評価。ａ）ムテインで５日間処理したマウスの脾臓の相対的重量の数量化。処理したマウスの脾臓の重量は対照群のものより統計的に高かった。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ非母数試験及びＤｕｎｎ多重比較。ｂ）Ｔ  ＣＤ８＋細胞の集団の測定。グラフはこの集団の百分率を示す。
【図５】ムテインは、メラノーマＭＢ１６Ｆ０ラインの実験的転移モデルにおける転移の現象において、生来のＩＬ−２よりも効率的である。ａ）各処理のための肺の代表的な写真。ｂ）各群における肺転移の数量化。
【図６】ムテイン及びＯＶＡ／ＶＳＳＰワクチンの組合せでの治療は、ワクチンの抗腫瘍効果を相乗化させる。腫瘍保持マウスをＯＶＡ／ＶＳＳＰワクチン単独で又はムテインと組み合わせて処理した。グラフは腫瘍増殖曲線を示す。組合せで処理した群は腫瘍増殖のより大きな低減を示し、対照群からは統計的に異なっていた。
【実施例】
【００２８】
（例１．ＩＬ−２ムテインの設計）
ムテインは、基礎としてデータベースＰＤＢ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）におけるヒトＩＬ−２の報告された構造及びＳｗｉｓｓｐｒｏｔ  データベースで入手可能である種々の種におけるＩＬ−２のアミノ酸配列を使用して、バイオインフォマティクス技術から計算手法的に設計された。いくつかのムテインを、溶媒に露出した高度に保存された残基における３〜６個の変異（非保存性アミノ酸置換を導入する）を含んで設計した。これらのムテインは、６ヒスチジンの標的配列をアミノ末端に含むｐＥＴ２８ａベクターにおけるプラスミド構築物から大腸菌において発現した。ムテインは逆相によって精製され（図１）、高純度（＞９５％）が得られた。得られたムテインは、インビトロ及びインビボの両方での実験的アッセイにおいて特性によって選別され、本発明の本文に記載される３つの基本特性を示した。構築したすべてのムテインのうちで、表１は、感知されるほどに制御性Ｔ細胞を刺激することなくＩＬ−２の活性の作動薬となるという所望の特性を有し、移植可能なマウス腫瘍の治療において生来のＩＬ−２よりも大きい治療有効性を示す、一組の特異的な変異を記載する。表２は、他の構築されたムテインであって、所望の特性を示さなかったものを示す。
【表２】
0005761831.tif 000003
【００２９】
（例２．設計したＩＬ−２ムテインの作動薬性質の呈示）
図２は、表１で述べたムテインがＣＴＬＬ２細胞ラインの表面上のＩＬ−２受容体の構成成分にどのように結合するかを図示する（図２ａ）。構築したムテインは、ＩＬ−２に対する高親和性受容体及び中程度親和性受容体の両方を表面上に有することが知られるＣＴＬＬ２細胞に結合する。我々のアッセイで検出された結合は、生来のＩＬ−２で得られたものと同様であるように見える。図２ｂは、表１に示されるムテインのＣＴＬＬ２細胞ラインの増殖を刺激する許容能力を図示する（図２ｂ）。これらのムテインは、このアッセイにおいてＩＬ−２の活性の部分的作動薬として振舞う。その特異的活性は、生来のＩＬ−２のものより５〜５０倍低い。
【００３０】
（例３．ＩＬ−２ムテインの制御性Ｔ細胞に対する効果）
表１に記載されるムテインは、インビトロで制御性Ｔ細胞を刺激する許容能力が非常に低いことを示す（図３）。この図に示されるように、生来のＩＬ−２は、プレートに結合した抗ＣＤ３抗体で刺激された制御性Ｔ細胞（Ｔ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）の強い増殖を誘導することができる。生来のＩＬ−２のものより著しく高い質量濃度での表１に記載のムテインは、制御性Ｔ細胞を刺激しなかった。使用されるムテインの量が増加してＣＴＬＬ２ラインによる増殖アッセイにおける生来のＩＬ−２と活性において等価となる量を使用するようになる場合になったとしても、上記した結果は有効である。表１に記載されるムテインは、典型的に、生来のＩＬ−２のものより少なくとも１０００倍低い、制御性Ｔ細胞を刺激する許容能力を呈する。
【００３１】
（例４．設計したムテインのインビボ免疫刺激活性の特徴化）
表１に記載されたムテインは、増加したインビボ免疫刺激許容能力を示す。図４ａ、ｂは、２０μｇのムテインを２日量で腹腔内投与しての５日間の処理の後の、実験未使用マウスにおける生来のＩＬ２のものより大きい巨脾症をムテインがどのように誘導するのかを示す。この刺激は、Ｔ  ＣＤ８＋リンパ球のような、エフェクター集団の明確な増加と連関する。関連して観察されるように、我々は、これらのムテインでの処理は、生来のＩＬ２の場合で観察されたものと対照的に、制御性Ｔ細胞（Ｔ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）の拡張を刺激しない（図４ｃ、ｄ）。
【００３２】
（例５．移植可能な腫瘍のマウスモデルにおけるムテインの治療有効性の測定）
移植可能な腫瘍のマウスモデルにおける設計したムテインの治療有効性における増加を証明した。表１に記載されるムテインは、ＭＢ１６マウスメラノーマモデルにおける肺転移の治療に対する増加した有効性を示す。図５は、表１におけるムテインの２０μｇの２日量で腹腔内投与による５日間の治療が、等用量の生来のＩＬ−２で治療した群では観察されていない強力な抗転移効果を、どの程度有するのかを示す。
【００３３】
（例６．抗腫瘍ワクチン効果を可能にするためのムテイン許容能力の測定）
設計されたムテインの抗腫瘍ワクチン効果を可能にするための許容能力を証明した。ＯＶＡ抗原を発現するために遺伝学的に改変された腫瘍細胞ラインである、ＥＧ７細胞ラインでの原発腫瘍モデルを使用した。腫瘍保持マウスを、ＶＳＳＰでアジュバント化したＯＶＡ単独で、又はムテインと組み合わせて免疫化した。図６は、腫瘍増殖の低減が、ワクチン単独で処理したマウスよりも、組合せで処理したマウスについて、大きかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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