(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取された試料中の腸内細菌叢を解析し、グラム陰性菌のグラム陽性菌に対する比率を基準とするがん及び／又は発がんリスクの検査法。
【請求項２】
請求項１記載のがん及び／又は発がんリスクの検査法であって、
検査対象とするがんが、消化器がん、肝がん、胆管がん、肺がんの少なくとも１つから選ばれることを特徴とする検査法。
【請求項３】
請求項１記載のがん及び／又は発がんリスクの検査法であって、
被験者から採取された試料が、血液、唾液、口腔洗浄液、消化管液、消化管洗浄液、糞便、尿、喀痰、肺洗浄液、気管洗浄液であることを特徴とする検査法。
【請求項４】
がん及び／又は発がんリスクの検査キットであって、
腸内細菌叢を構成するグラム陽性菌とグラム陰性菌を識別する試薬を含むことを特徴とする
請求項１記載のがん及び／又は発がんリスクの検査を行うためのキット。
【請求項５】
発がんリスクを軽減する医薬化合物をスクリーニングする方法であって、
腸内細菌叢のグラム陰性菌のグラム陽性菌に対する比率を指標とすることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん及び／又は発がんリスクを検査する方法及び医薬のスクリーニング方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
がんは多段階の遺伝子変異によって起こる病気であり、いくつかの遺伝子が損傷し、細胞が制限なく増え続けることにより起こることが明らかにされている。正常細胞にＤＮＡ損傷を引き起こすストレスが加わって、遺伝子に損傷が生じても、通常は修復機構により元通りに修復される。しかしながら、細胞に強いストレスが加わった場合には、アポトーシスと呼ばれる細胞死が起こったり、細胞周期チェックポイントで細胞周期が停止し、不可逆的に細胞増殖が停止する。この不可逆的に細胞増殖が停止する現象を「細胞老化（senescence）」と称し、アポトーシスとならぶ重要な発がん防止機構であると考えられている（非特許文献１〜４）。【０００３】
アポトーシスとは異なり、細胞老化を起こしても細胞がすぐに死滅するわけではなく、生体内に長期間生存し続ける。最近、細胞老化を起こすと様々な炎症性サイトカインが大量に分泌されることが明らかになってきた（非特許文献５、６）。この細胞老化に伴う炎症性サイトカイン分泌現象はsenescence-associated secretory phenotype（ＳＡＳＰ）又はsenescence-messaging secretome（ＳＭＳ）と呼ばれており、慢性炎症や慢性炎症を素地とする発がんの原因のひとつとなる可能性が示唆されている（非特許文献５〜７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Sharpless NE, DePinho RA., Cancer: crime and punishment.Nature. (2005) Vol. 436(7051):636-7
【非特許文献２】Adams PD., Healing and hurting: molecular mechanisms, functions, and pathologies of cellular senescence., Mol Cell. (2009) Vol. 36(1):2-14
【非特許文献３】Collado M., & Serrano, M. Senescence in tumours: evidence from mice and humans., Nat Rev Cancer. (2010) Vol.10(1):51-7.
【非特許文献４】Kuilman, T. et al. The essence of senescence. Genes Dev. (2010) Vol.24, 2463-2479.
【非特許文献５】Coppe J.P., et al., Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor., PLoS Biol. (2008) Vol.6(12):2853-68.
【非特許文献６】Rodier F., & Campisi, J., Four faces of cellular senescence., J Cell Biol. (2011) Vol.192(4):547-56.
【非特許文献７】Kuilman, T. & Peeper, D. S. , Senescence-messaging secretome: SMS-ing cellular stress. (2009)Nature Rev. Cancer Vol. 9, 81-94.
【非特許文献８】Ohtani N. and Hara E., Roles and mechanisms of cellular senescence in regulation of tissue homeostasis., (2013) Cancer Sci.
【非特許文献９】Davalos et al., Senescent cells as a source of inflammatory factors for tumor progression., Cancer Metastasis (2010) June; 29(2): 273-283.
【非特許文献１０】Ohanna et al., Senescent cells develop a PARP-1 and nuclear factor-kB-associated secretome (PNAS),, Genes Dev. (2011) 25: 1245-1261.
【非特許文献１２】Nagashima K. et al., Phylogenetic Analysis of 16S Ribosomal RNA Gene Sequences from Human Fecal Microbiota andImproved Utility of Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism Profiling. (2006)Bioscience and Microflora, Vol.25,No.3 , pp.99-107.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ＳＡＳＰと発がん機構との関連については不明の点も多い。また、ＳＡＳＰを介した発がん機構が明らかになれば、発がんの初期の段階、又は発がんリスクの高い個体の検出を行うことや、発がん機構に基づいて医薬化合物のスクリーニングを行うことが可能となる。【０００６】
本発明者らは、肝がん及び肺がんが多発する発がんモデルを開発し、発がん機構について解析を行った。その結果、腸内細菌叢の変化によりグラム陽性菌率が上昇し、このグラム陽性菌により産生されるデオキシコール酸の血中濃度が上昇することを明らかにした。さらに、デオキシコール酸が肝星細胞に細胞老化を引き起こし、肝星細胞がＳＡＳＰ因子を分泌するようになることでその周囲の肝実質細胞の発がんが促進されるという機構を明らかにした。【０００７】
本発明は、上記発がん機構の解明に基づき、腸内細菌叢の変化を検出することによって、発がんリスクの高い個体の検出や、がんの早期発見につながる検査方法を提供することを課題とする。また、腸内細菌叢の変化を指標として医薬化合物をスクリーニングする方法及び医薬組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明のがん及び／又は発がんリスクの検査法は、被験者から採取された試料中の腸内細菌叢を解析し、グラム陰性菌のグラム陽性菌に対する比率を基準とすることを特徴とする。
【０００９】
本発明者らは、発がんモデルの解析により、腸内細菌叢の変化によりがんが発症することを明らかにした。したがって、腸内細菌叢を解析することによって、発がんリスクを検査することが可能となる。【００１０】
特に、発がんしている、又は、発がんリスクの高い個体では、グラム陽性菌とグラム陰性菌の比率が正常個体と比較して著しく異なっていることが明らかとなった。本発明者らの見出したがん発症の機構に鑑みると、発がんに先立って腸内細菌叢が変化しているものと考えられる。そのため、グラム陽性菌とグラム陰性菌の比率を解析することにより、がん発生に先立って発がんリスクを検出できる。
【００１２】
モデル動物の解析により、二次胆汁酸を産生する菌の増加と、がん発症との間に相関が見られた。さらに、デオキシコール酸の血中濃度を測定すると、がんを発症している個体では優位に血中濃度が上昇していることが明らかとなった。【００１３】
本発明のがん及び／又は発がんリスクの検査法は、検査対象とするがんが、消化器がん、肝がん、胆管がん、肺がんの少なくとも１つから選ばれることを特徴とする。【００１４】
モデル動物の解析により、腸内細菌叢の変化と二次胆汁酸を産生する菌の増加と肝がん、肺がんの増加が直接的に明らかとなった。また、疫学的に肥満との関連が認められている消化器がん、胆管がんも、本発明者らが明らかにした発がん機構に鑑みれば、本発明の検査法の対象となることは明らかである。【００１５】
本発明のがん及び／又は発がんリスクの検査法は、被験者から採取された試料が、血液、唾液、口腔洗浄液、消化管液、消化管洗浄液、糞便、尿、喀痰、肺洗浄液、気管洗浄液であることを特徴とする。腸内細菌を検出、又は腸内細菌の代謝物を測定できる試料であれば、どのようなものでもかまわないが、血液、唾液、口腔洗浄液、消化管液、消化管洗浄液、糞便、尿、喀痰、肺洗浄液、気管洗浄液であることが好ましい。検出すべき腸内細菌やその生産物が多く含まれる試料だからである。特に、糞便や血液は測定感度、試料の得やすさから好適である。【００１８】
本発明のがん及び／又は発がんリスクの検査キットは、腸内細菌叢を構成するグラム陽性菌とグラム陰性菌を識別する試薬を含むことを特徴とする。試薬としては、腸内細菌叢を構成する細菌の生産物、さらには細菌の代謝によって特徴的な変化（酸化、還元、分解など）を検出する試薬を含む。
【００１９】
本発明者らは、腸内細菌叢の変化と発がん、発がんリスクに相関があることを見出した。したがって、腸内細菌叢の変化を検出するものであればどのようなものであっても、発がんや発がんリスクの検出に用いることができる。例えば、腸内細菌叢を構成する特定の細菌を識別するＰＣＲプライマー等を使用することができる。
【００２０】
本発明の発がんリスクを軽減する医薬化合物をスクリーニングする方法は、腸内細菌叢のグラム陰性菌のグラム陽性菌に対する比率を指標とすることを特徴とする。
【００２１】
本発明者らが明らかにした発がん機構によれば、腸内細菌叢の変化が発がんリスクを高める。したがって、ヒトの腸内細菌叢の構成を指標として、これらに対し効果を有する化合物をスクリーニングすればよい。ヒトの腸内細菌は、他の動物でも常在菌として生息しているものであるから、動物を用いてスクリーニングを行ったり、また、細菌の培養系を用いて行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】野生型マウスを用いた肥満によりがんを多発する発がんモデルの作成、及び結果を示す。Ａ．高脂肪食飼育による発がんモデルの飼育スケジュールを模式的に示す。Ｂ.通常食（ＮＤ）及び高脂肪食飼育マウス（ＨＦＤ）の肝臓所見を示す。Ｃ．通常食及び高脂肪食飼育マウスのがん発症率を示す。Ｄ．平均肝がん数とそのサイズ分布を示す。
【図２】通常食及び高脂肪食飼育マウスの肝星細胞（α−平滑筋アクチン陽性細胞）での細胞老化マーカー、ＳＡＳＰ関連マーカー、ＤＮＡ損傷マーカーの発現割合を示す。
【図３】抗生物質投与による肝がん発症率の変化を示す。Ａ．高脂肪食飼育による発がんモデルに抗生物質投与をする場合の飼育スケジュールを模式的に示す。Ｂ．抗生物質投与によるバクテリア１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子量の変化を示す。Ｃ．抗生物質投与が肝がん発症に及ぼす効果を示す。各群の肝臓所見を示す。Ｄ．平均肝がん数とそのサイズ分布を示す。
【図４】肥満による腸内細菌叢の変化を示す。
【図５】デオキシコール酸の肝がん発症に対する影響を示す。Ａ．高脂肪食、抗生物質カクテル投与飼育マウスにデオキシコール酸を投与する飼育スケジュールを模式的に示す。Ｂ．コントロール群（高脂肪食+抗生物質カクテル投与）、及びデオキシコール酸投与群（高脂肪食+抗生物質カクテル投与+デオキシコール酸投与）における肝臓所見を示す。Ｃ．各群での平均肝がん数とそのサイズ分布を示す。Ｄ．デオキシコール酸を投与したマウスの肝星細胞（α−平滑筋アクチン陽性細胞）での細胞老化マーカー、ＳＡＳＰ関連マーカー、ＤＮＡ損傷マーカーの発現割合を示す。
【図６】無菌環境での肝がん誘発実験を示す。Ａ．腸内細菌を保有しない無菌マウス（Germ Free）及び常在菌を保有するマウス（Control）に、ＤＭＢＡ処理後、高脂肪食飼育を与え飼育し、３０週齢時の肝臓所見を示す。Ｂ．平均肝がん数とそのサイズ分布を示す。
【図７】肥満により腸内細菌叢の変化が起こり肝がんを発症する機構を模式的に示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
［がん及び／又は発がんリスクを検査する方法］
本発明者らの動物モデルを用いたがん発症機構の研究により、腸内細菌叢の変化によってがん発症が引き起こされることが明らかとなった。したがって、腸内細菌叢の変化を指標として、がん及び／又は発がんリスクを検出することができる。
【００３０】
腸内細菌叢の変化は、がん発症に先立って起こるものであるから、がんを発症する前に発がんリスクとして検出することが可能である。これまで実用化されているいわゆるがんマーカーは発がんを検出するものであるのに対し、本発明では、がん発症前に発がんリスクを検出可能である点で非常に画期的である。すなわち、本発明の発がん及び／又は発がんリスク検出方法は、発がん機構の非常に初期のステップを検出するものであり、がんの早期診断、早期発見に寄与するものである。また、以下の実施例で示すように、がん発症を検出可能であることはいうまでもない。
【００３１】
さらに、腸内細菌叢という複数の菌のバランスでがんのリスクやがん発症を検出可能である点で非常にユニークである。
【００３２】
（検査方法の対象となる動物）
ここで、本発明に係るがん及び／又は発がんリスクを検査する方法の被験動物は、腸内細菌叢の変化と発がんに関連のある動物であれば特に制限されないが、ヒト、及び、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、サル等の実験動物、イヌ、ネコ等のペット、ヤギ、ウシ、ヒツジ等の家畜等の哺乳動物が挙げられる。
【００３３】
（判定の方法）
本発明に係るがん及び／又は発がんリスクを検査する方法をヒトに対して行う場合、例えば、健康診断等で、定期的に被験個体の腸内細菌叢を解析し、一定以上の変化が認められた場合にその被験個体ががんに罹患している、又は発がんリスクが高いと予測することができる。あるいは、健常群、高発がんリスク群、がん罹患群について腸内細菌叢の範囲を設定し、被験個体の腸内細菌叢が高発がんリスク群の範囲に該当した場合にその被験個体の発がんリスクが高いと予測し、被験個体の腸内細菌叢ががん罹患群の範囲に該当した場合にその被験個体ががんに罹患していると予測することができる。
【００３４】
特に、腸内細菌叢の変化が示唆されている症状を呈する被験個体、例えば、健康診断等で既にＢＭＩ値から肥満と診断された被験個体群について、本発明に係る検査方法を適用することにより、発がんの早期発見や発がんリスクを検査することが可能である。また、特定のがんについて発がんリスクが高いことが示唆される被験個体、例えば、肝がんについては、脂肪肝、ＮＡＳＨ（非アルコール性脂肪肝）等の症状を呈する被験個体、また、肺がんについては、常習的に喫煙している被験個体に対しても、積極的に本発明に係る検査方法を適用することにより、発がんの早期発見や発がんリスクを検査することが可能である。
【００３５】
（腸内細菌叢の検出の方法）
腸内細菌叢の変化は、例えば、グラム陽性菌とグラム陰性菌の比率の変化により検出することができる。
【００３６】
被験個体ががんに罹患、又は、発がんリスクが高いと判断する腸内細菌叢の基準の設定は、当業者が適宜設定すればよいが、その個体の健常時、あるいは、健常群の腸内細菌叢の解析結果を基に設定した基準に比較し、グラム陽性菌のグラム陰性菌に対する比率が増加している場合に、その個体ががんに罹患、又は、発がんリスクが高いと予測してもよい。
【００３９】
腸内細菌叢の変化は、グラム染色剤、グラム陽性菌とグラム陰性菌を識別するＰＣＲプライマー等、グラム陽性菌と陰性菌を識別可能な試薬を適宜用いて解析することができる。ＰＣＲ法を用いる場合、検出用のプライマー、ＰＣＲ条件等は当業者が設計及び設定することが可能である。
【００４０】
また、実施例で示すようにＳＡＳＰは血流にのったデオキシコール酸により誘導される。ＳＡＳＰは、様々な種類の細胞において細胞老化に伴い認められ、周辺領域の細胞のがん化に関与する。したがって、デオキシコール酸を産生する腸内細菌を解析してがんの罹患、又は、発がんリスクを判定してもよい。デオキシコール酸を産生する腸内細菌としては、グラム陽性菌に限らず、例えば、一次胆汁酸から二次胆汁酸を産生する酵素である7α-dehydrogenaseを有する腸内細菌であればどのような菌を検出対象としてもよい。例えば、前述のクロストリジウム属（グラム陽性、嫌気性）、及び、バクテロイデス属（グラム陰性、嫌気性）に属する腸内細菌が挙げられる。
【００４１】
（腸内細菌産生産物の検出方法）
腸内細菌叢の変化の解析は、腸内細菌が産生する物質を検出することによっても行うことができる。
【００４２】
グラム陽性菌とグラム陰性菌の比率を解析する場合、グラム陽性菌の産生する物質、及び、グラム陰性菌の産生する物質の両方を検出すればよい。例えば、クロストリジウム属クラスターＸＩに属する菌をはじめ、クロストリジウム属に属する菌は、一次胆汁酸から二次胆汁酸を産生する7α-dehydrogenaseを有しているから、二次胆汁酸を検出対象とすることができる。二次胆汁酸としては、例えば、デオキシコール酸、及び、リトコール酸が挙げられるが、デオキシコール酸を産生する菌が多く、血中等での濃度が高いことからデオキシコール酸を検出することが好ましい。
【００４３】
ここで、腸内細菌が産生する物質の検出方法は、検出対象の物質が検出できればどのような方法を用いても良い。例えば、ガスクロマトグラフィー等のクロマトグラフィーによる方法、マススペクトロメトリー法、特異的抗体を用いた検出方法が挙げられる。これらの検出方法に関する検出条件等は、当業者が適宜設定することができる
（試料）
本発明に係るがん又は発がんリスクを検出する方法において、腸内細菌叢を解析する試料としては、被験個体から採取され、腸内細菌が含まれる試料であれば特に限定されず、例えば、糞便、尿、喀痰、消化管液、消化管洗浄液、肺洗浄液、気管洗浄液、唾液、口腔洗浄液、生検試料が好ましく、被験個体の負担を考慮すると、糞便又は唾液がさらに好ましく、糞便が最も好ましい。
【００４４】
また、腸内細菌が産生する物質を測定する場合の試料としては、被験個体から採取され、腸内細菌が産生する物質が含まれている試料であれば特に限定されず、例えば、血液、糞便、尿、喀痰、消化管液、消化管洗浄液、肺洗浄液、気管洗浄液、唾液、口腔洗浄液、生検試料が好ましく、被験個体の負担及び検出感度を考慮すると、糞便、尿、唾液、血液がさらに好ましく、血液が最も好ましい。
【００４５】
（がんの種類）
ＳＡＳＰは肝星細胞だけでなく、様々な種類の細胞において細胞老化に伴い認められる現象であり、その細胞の周辺領域の細胞のがん化に関与することが知られている。ＳＡＳＰ現象は、メラノサイト、繊維芽細胞、内皮細胞等の種々の細胞、乳腺、前立腺、皮膚等の種々の組織で示唆されており（非特許文献９）、メラノーマの発症にＳＡＳＰが関与することも報告されている（非特許文献１０）。実施例で示すようにＳＡＳＰは血流にのったデオキシコール酸により誘導されるので、デオキシコール酸等の二次胆汁酸の血中濃度の高い個体では、肝臓の肝星細胞以外でも、ＳＡＳＰ誘導が生じると理解できる。実施例で用いた発がんモデルは、肥満及び発がん物質により発がんを誘導したモデルであるが、腸内細菌叢の変化によって引き起こされるＳＡＳＰが原因となっているがんであればどのようながんであっても、本発明に係るがん及び／又は発がんリスクを検出する方法の対象となる。実際に、実施例１の発がんモデルでは、疫学的に肥満との相関が指摘される肝がんだけではなく、肺がんの発症率も増加している。すなわち、本発明に係るがん又は発がんリスクの検出方法の対象となるがん種は、固形がんであればどのようなものでもよい。中でも、食道がん、胃がん、胆嚢がん、肝がん、胆管がん、膵臓がん、大腸がん等の消化器がんをはじめとする、ヒトにおいて疫学的に肥満と相関が示されているがん、及び、肝がんとならんで発がんモデルにおいてがんが高率に発症することが示された肺がんでは、特に感度良く検出が可能である。
【００４６】
（キット）
本発明に係る検査用キットは、被験個体のがんの罹患、又は、発がんリスクを検査するためのキットであって、被験個体から採取された試料中の細菌叢、又は、前記細菌叢の産生する物質を検出するための試薬を含むことを特徴とする。
【００４７】
例えば、グラム陽性菌とグラム陰性菌を識別することのできるＰＣＲプライマー等、グラム陽性菌と陰性菌を識別可能な試薬を含むことを特徴とする。
【００４９】
具体的な態様としては、遺伝子検出用のプライマーを搭載したＤＮＡチップや、特定の細菌のタンパク質に対する抗体を固定化したプロテインチップやマイクロプレート、ストリップ、マイクロビーズなどを用いたＥＬＩＳＡ法を挙げることができる。
【００５１】
簡便なＤＮＡチップやＥＬＩＳＡ法は、医薬品候補化合物のスクリーニング法のみならず、発がんリスク患者のモニタリングにも利用でき、有用性が高い。
【００５２】
［スクリーニング方法］
本発明者らが解明した、腸内細菌叢の変化から、がん発症までの多段階にわたる機構を基に、以下に例示するスクリーニング方法によって、発がんリスクを低減する作用を有する化合物を選択することができる。
【００５３】
例えば、このスクリーニング方法では、マウス等、実験動物を用いて腸内細菌叢の変化を指標としたり、あるいは、腸内細菌の培養系、発がんモデル培養細胞系を用いることができる。
【００５４】
選択された化合物の種類によって、その用途を定めることができるが、発がんリスク軽減のためには、医薬化合物として、あるいは、食品成分としての用途が好ましい。
【００５５】
本発明のスクリーニング方法により選択された医薬化合物は、発がんリスクの軽減作用を有し、がんの予防につながる新しいコンセプトの医薬を開発することができる。
（実験動物を用いたスクリーニング方法）
具体的なスクリーニング方法としては、腸内細菌叢を変化させた実験動物を用い、候補物質を一定期間投与する。ここで、腸内細菌叢を変化させた実験動物としては、例えば、以下で示す実施例１の肥満モデル動物系を用いることができる。実施例１に記載のように、肥満によって、腸内細菌叢を変化させることができれば、マウスに限らず一般的に用いられているラット、ウサギ等どのような動物を用いることもできる。ここで、実施例の発がんモデルマウスはＣ５７ＢＬ／６であるが、どのような系統のマウスでも用いることができる。
【００５６】
さらに、ここでは発がんモデルとして発がん物質を用いてがんを発症させているが、腸内細菌叢の変化をモニターするだけであれば、必ずしも発がんを誘導する必要はない。
【００５７】
また、腸内細菌叢は、動物の食餌に特定の細菌を混ぜて与える等により、人為的に変化させることも可能である。
【００５８】
上記のような実験動物に一定期間、候補物質を投与し、実験動物の腸内細菌叢の変化を検出する。
【００５９】
実験動物に対する、候補物質の投与は、食餌や飲み水に混ぜて与えることもできるし、あるいは、強制的に一定量シリンジ等を用いて投与してもよい。
【００６０】
また、投与する時期に関しても、候補物質に合わせて適宜投与すればよい。さらに、母乳に分泌される物質であれば、母マウスの食餌、又は飲み水に混ぜることによって、出生時から候補物質に曝露することも可能である。
【００６１】
腸内細菌叢の変化の検出方法は、「がん又は発がんリスクを検出する方法」で説明した腸内細菌叢の変化の検出方法と同様に行うことができ、グラム陽性菌とグラム陰性菌との比率を検出すればよい。
【００６２】
ここで、実施例に示すように、腸内細菌が産生する二次胆汁酸が発がんに関連しているから、腸内細菌叢を変化させるのに限らず、血中の二次胆汁酸濃度を増加させた実験動物を用い、血中の二次胆汁酸濃度を低下させる作用を有する化合物を選択してもよい。
【００６３】
（培養系によるスクリーニング方法）
腸内細菌の培養系を用いることによって、実験動物を用いるよりも多くの候補物質を短時間にスクリーニングし、効率よく目的化合物を選択することが可能である。
【００６４】
具体的には、例えば、発がんリスクとの相関の高い腸内細菌を当業者に周知の方法で培養し、候補物質を作用させる。この腸内細菌の増殖を指標として、候補物質に発がんリスク軽減作用があるか否かを判定することができる。例えば、腸内細菌が発がんリスクを高める菌である場合、増殖を抑制する化合物を選択すればよく、一方、腸内細菌が発がんリスクを低下させる菌である場合、増殖を促進する化合物を選択すればよい。
【００６５】
あるいは、腸内細菌の産生する二次胆汁酸を指標として、候補物質に発がんリスク軽減作用があるか否かを判定することができる。又は、腸内細菌の二次胆汁酸産生活性を指標として、候補物質に発がんリスク軽減作用があるか否かを判定することができる。
【００６６】
さらに、発がんモデル培養細胞系を用いることによっても、候補物質をスクリーニングすることが可能である。
【００６７】
具体的には、例えば、培養細胞の培養液に候補物質を添加し、ここに二次胆汁酸を作用させ、細胞老化を誘導する。二次胆汁酸の作用によって、培養細胞が細胞老化を示さなければ、候補物質が、二次胆汁酸の活性を阻害又は抑制する作用を有すると判断できる。すなわち、発がんリスク軽減作用があるものと判定することができる。スクリーニングの精度を考慮すると、培養細胞は、実際に発がんリスクを軽減させる対象の動物種及びがん種の培養細胞であることが好ましい。ここで、細胞老化の有無は、培養液中のＳＡＳＰ因子の測定、あるいは、細胞老化マーカーの発現の有無等、細胞老化の周知の指標を使用して調べることができる。
［医薬組成物、治療方法］
本発明のスクリーニング方法により選択された化合物は、発がんリスクを軽減するため、あるいは、発がん予防のための医薬組成物の有効成分として使用することができる。
【００６８】
このような医薬組成物は、特に、発がんリスクが高いと考えられる対象に投与することが有効である。個体の発がんリスクは、本発明の発がんリスクの検出方法によって判定することができる。
【００６９】
投与対象動物は、腸内細菌叢の変化と発がんに関連のある動物であれば特に制限されないが、ヒト、及び、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、サル等の実験動物、イヌ、ネコ等のペット、ヤギ、ウシ、ヒツジ等の家畜等の哺乳動物が挙げられる。
【００７０】
実施例３及び４で示すように、抗生物質、特に、グリコペプチド系の抗生物質であるバンコマイシンは、グラム陽性菌に対して抗菌性があることから、腸内環境を改善し、発がんを抑制するために有効である。したがって、発がんリスクの高い患者に対して、バンコマイシン等、グリコペプチド系の抗生物質を投与することによって、発がんリスクを軽減する効果が期待できる。
【００７１】
ここで、グリコペプチド系の抗生物質と同様の効果が期待できる物質として、ペニシリン系抗生物質（例えば、アンピシリン）、アミノグリコシド系抗生物質（ネオマイシン）、リファマイシン系抗生物質（リファンピシン）が例示できる。また、これらの抗生物質と同様の効果が期待できる物質として、メトロニダゾール化合物が例示できる。
【実施例】
【００７２】
［実施例１：がんを多発する発がんモデルの作成］
図１Ａに本発明で用いた発がんモデルの作成方法を示す。野生型（Ｃ５７ＢＬ／６）の新生仔マウスに、発がん物質であるＤＭＢＡ（7,12-dimethylbenz [a] anthracene）を０．５％含むアセトン溶液を背部に１回塗布した。仔マウスは母マウスとともに、通常食（ＮＤ）又は高脂肪食（ＨＦＤ）で４週目まで共に飼育した。高脂肪食は米国Research Diets社のD12492（Rodent Diet with 60% kcal%Fat）を用いている。生後４週で離乳させた後も、仔マウスは引き続き通常食又は高脂肪食で飼育した。３０週で肝臓及び肺を摘出し、がん発生の有無を解析した。解剖時のマウスの平均体重は通常食飼育マウスでは平均３３ｇ、高脂肪食飼育マウスでは平均５１ｇであり、高脂肪食飼育マウスは、通常食飼育マウスに比べて約１．５倍の体重であった。【００７３】
図１Ｂは通常食、高脂肪食で飼育したマウスの肝臓の代表的な解剖所見を示す。高脂肪食で飼育したマウスの肝臓は肥大し、脂肪肝となり肝がん（△で示す）が多発している。【００７４】
図１Ｃに食餌によるがん発生の比率を示す。正常食飼育マウス（ｎ＝９）では５％のマウスで肺がんが生じていたが、９５％のマウスはがん発生が見られなかった。これに対し、高脂肪食飼育マウス（ｎ＝１８）では６８％のマウスが肝がんを、３２％のマウスが肝がんと肺がんの両方を併発していた。【００７５】
図１Ｄには、各飼育群で生じていた平均肝がん数とそのサイズ分布を示したものである。高脂肪食飼育群では１個体に多数のがんが生じており、そのサイズも２ｍｍ以上の大きなサイズのがんが半数以上を占めている。一方、正常食飼育群では、肝がんの発生は全く観察されなかった。【００７６】
ここでは、高脂肪食飼育によって、マウスを肥満させた場合に肝がん、肺がんが多発することを示しているが、本発明者らは、遺伝的肥満マウスとして知られているob/obマウスを用いた場合でも同様の結果を得ている。すなわち、ob/obマウス新生仔をＤＭＢＡ処理後、通常食で飼育した場合でも同様に肝がんが多発する。【００７７】
本発明の発がんモデルマウスは、肝がんの発症率は１００％と、高率にがんを発症する。したがって、基礎研究だけではなく、医薬のスクリーニングにも好適に用いることができる。以下、発がんモデルマウスを用いて、がん発症の機構の解析を行った。【００７８】
［実施例２：肝星細胞の細胞老化によるＳＡＳＰ誘導と肝がん発症］
最近、いくつかの分泌因子ががん発生リスクを増加することが示唆されており、それらの中にはＳＡＳＰ因子に分類されるものも含まれていた（非特許文献８）。【００７９】
これまでの解析の結果、肝臓でＳＡＳＰ因子を分泌する細胞は、肝星細胞であることが明らかになった。そこで、高脂肪食飼育マウス及び正常食飼育マウスの肝臓で細胞染色を行い、肝星細胞に細胞老化が生じ、ＳＡＳＰが観察されるか解析を行った。【００８０】
肝星細胞の細胞マーカーであるα−平滑筋アクチンと、細胞老化を誘導するｐ２１、ｐ１６、ＤＮＡ損傷応答に関わるマーカーである５３ＢＰ１、γＨ２ＡＸのｆｏｃｉ、ＳＡＳＰの主要な因子であるＩＬ−６、Ｇｒｏ‐α、ＣＸＣＬ９との二重染色を行い、細胞老化、ＳＡＳＰ因子を分泌している肝星細胞の割合を解析した。【００８１】
図２に結果を示す。高脂肪食飼育マウスの肝臓では、細胞老化を誘導するｐ２１、ｐ１６の発現、ＤＮＡ損傷応答に関わるマーカーである５３ＢＰ１、γＨ２ＡＸのｆｏｃｉが観察されるのに対し、通常飼育マウスの肝星細胞では、これらタンパク質の発現は観察されなかった。また、高脂肪食飼育マウスの肝星細胞では細胞老化が起こりＳＡＳＰ因子を分泌していることがＩＬ−６、Ｇｒｏ‐α、ＣＸＣＬ９の発現により示された。【００８２】
また、細胞老化の誘導因子であるｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１の発現を非侵襲的に観察可能なｐ２１−ｐ−ｌｕｃマウスを用い、実施例１の発がんモデルと同様にＤＭＢＡ処理後、高脂肪食飼育によって肝がん誘発実験を行い、バイオルミネッセンスイメージングによるｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１の発現を観察した。【００８３】
データは示さないが、肝がん領域にｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１の発現が観察されたことから、細胞老化と肝がん発症の相関が示された。【００８４】
以上の結果から、肝星細胞の細胞老化によりＳＡＳＰが生じること、ＳＡＳＰが肝がん発症に密接に関わっていることが示される。【００８５】
［実施例３：腸内細菌叢の改善による発がん抑制効果］
本発明の発がんモデルでは、肝星細胞の細胞老化に伴うＳＡＳＰを介していることが明らかとなった。【００８６】
ＳＡＳＰは個体の加齢や、酸化ストレス等、様々な原因によって生じることが知られている。しかしながら、本発明で用いた実験モデルは肥満によるものであり、これまでＳＡＳＰを誘因する原因として知られているものではない。本モデルにおいてＳＡＳＰを誘導している原因を解析するために、肥満によって生じる様々な変化を解析した結果、腸内細菌叢の変化がＳＡＳＰ誘導に相関があることが明らかになった。【００８７】
図３Ａに実験系を示す。野生型マウス新生仔に対し、ＤＭＢＡ塗布を行い、高脂肪食飼育を行った。１３週から抗生物質カクテル（４Ａｂｘ、抗生物質カクテル投与群）又はバンコマイシン（ＶＣＭ、バイコマイシン投与群）を飲み水に混ぜて投与し、飼育開始から３０週目に肝臓を摘出し、肝がん発症の解析を行った。一方、コントロール群は、１３週目までと同様に飼育を続けた。抗生物質カクテルには、アンピシリン（１ｇ/ｌ）、ネオマイシン（１ｇ/ｌ）、メトロニダゾール（１ｇ/ｌ）及びバンコマイシン（５００ｍｇ/ｌ）が含まれている。バンコマイシン単独投与の場合はバンコマイシン５００ｍｇ/ｌで投与した。【００８８】
図３Ｂは、各群３匹ずつのマウスにおける抗生物質投与後１７週、すなわち生後３０週の腸内細菌の１６ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子量を示す。抗生物質カクテルにより完全に、また、バンコマイシンによっても、腸内細菌の量が非常に少なくなっていることが示された。【００８９】
各群のマウスを３０週目に解剖し肝がん発症の解析を行った（図３Ｃ，Ｄ）。コントロール群では肝がん発症が認められたが、一方、抗生物質カクテル投与群、バンコマイシン投与群では、全く発症しないか、又はコントロールに比べて肝がんの数は著しく少なく、大きさは小さかった。【００９０】
この結果は、がん発症より前の腸内細菌叢の状態が、がんを誘発することを示している。したがって、肝がん発症に先立つ腸内細菌の変化を捉えることができれば、これをがん発症の指標として、がん発症リスクを検出することが可能である。【００９１】
［実施例４：がん発症に関連する腸内細菌の探索］
本実施例では、がん発症に関連する腸内細菌の探索のため、腸内細菌叢がどのように変化しているかを解析した（図４）。図３Ａに示した実験系で、通常食飼育、高脂肪食飼育、高脂肪食飼育で飼育するとともにバンコマイシンを与えた群の３群で、飼育開始から３０週目の糞を回収し、腸内細菌叢の解析を行った。【００９２】
腸内細菌叢の同定はＰＣＲ法により解析した（非特許文献１１、１２）。具体的には、糞便よりＤＮＡを抽出、精製し、ユニバーサルプライマーを使用して多種類の菌の１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子をＰＣＲ増幅し、さらにＶ１‐Ｖ４の超可変領域を増幅し同定を行った。【００９３】
通常食飼育（ｎ＝５）では、グラム陰性菌が５４％〜７９％、グラム陽性菌が２０．９〜４５％（うち、クロストリジウム属クラスターＸＩ：０％）であった。高脂肪食飼育（ｎ＝４）では、グラム陰性菌が１．５〜２２％、グラム陽性菌が７７．４〜９８．４％（うち、クロストリジウム属クラスターＸＩ：３．４〜１８％）であった。バンコマイシン投与（ｎ＝２）では、グラム陰性菌が９８〜９９．８％、グラム陽性菌が０〜１．９％（うち、クロストリジウム属クラスターＸＩ：０％）であった。【００９４】
以上の比率の平均値を図４に示す。通常食飼育マウス群（ＮＤ）は、グラム陰性菌が平均６５％であるのに対し、高脂肪食飼育マウス群（ＨＦＤ）では、平均８％と著しく減少し、平均８８％をグラム陽性菌が占めていた。グラム陽性菌の中でもクロストリジウム属クラスターＸＩが平均１３％と、非常に多くの割合を占めていた。【００９５】
また、高脂肪食飼育で飼育するとともにバンコマイシン投与したマウス群（ＨＦＤ+ＶＣＭ）では、グラム陰性細菌叢が平均９９％とほとんどを占めていた。【００９６】
これら腸内細菌叢の変化と、がん発症とを比較し、グラム陽性菌の比率増加と、肝がん発症のリスク上昇の相関が明らかとなった。加えて、クロストリジウム属クラスターＸＩの増加と、肝がん発症のリスク上昇の相関が明らかとなった。【００９７】
したがって、腸内細菌叢のグラム陰性菌とグラム陽性菌の比率を解析し、グラム陽性菌の比率の増加によって肝がん発症リスクを検査することができる。また、腸内クロストリジウム属クラスターＸＩを検出することにより、肝がん発症リスクを検査することができる。【００９８】
上記結果はマウスモデルを用いた結果であるが、ヒトにおいても同様の手法により、がん発症と相関する腸内細菌叢を同定することが可能である。また、グラム陰性菌とグラム陽性菌の比率や、同定されたがん発症と相関する特定の菌を検出することにより、がん発症のリスクを検査することができる。【００９９】
［実施例５：デオキシコール酸によるＳＡＳＰを介した発がん誘発］
クロストリジウム属クラスターＸＩは二次胆汁酸を産生する菌であることから、二次胆汁酸と肝がん発症の関連の解析を行った。【０１００】
高脂肪食飼育マウスに、飼育開始から１３週目から抗生物質カクテルを投与して飼育し、このマウスに体重１ｇあたり４０μｇのデオキシコール酸（ＤＣＡ）、又はコントロールとして溶媒（Ｖｅｈｉｃｌｅ）のみを週に３回経口投与した（図５Ａ）。【０１０１】
図５Ｂに両者の代表的な肝臓所見を示す。デオキシコール酸を投与したマウスでは、多数の肝がんが生じているのに対し（図中、△で示している。）、コントロールとして溶媒のみを投与したマウス群では、がん発生がほとんど見られなかった。図５Ｃに個体あたりの平均的な肝がん数、及びその大きさを示している（ｎ＝３）。コントロールとして溶媒のみを投与したマウス群では、ほとんどがんが発生しておらず、また、発生していても、がんのサイズが小さかった。一方、デオキシコール酸投与群では、個体あたり平均２５以上と、がんが多発しており、またそのサイズも大きかった。【０１０２】
上記解析より、デオキシコール酸が肝がん発症を引き起こしていることが示された。【０１０３】
これらマウスの血中のデオキシコール酸を測定したところ、高脂肪食飼育マウスでは通常飼育マウスの３倍のデオキシコール酸濃度であるのに対し、抗生物質カクテルを同時に投与したものでは、デオキシコール酸は検出限界以下であった。【０１０４】
したがって、血中のデオキシコール酸濃度が健常者の数倍程度であっても、発がんリスクが高まることが予測される。【０１０５】
ここにデータは示さないが、肝星細胞の培養細胞を１０％Dulbecco's modified Eagle's medium（１０％ＦＢＳ添加、３％Ｏ２、５％ＣＯ２）において培養し、２００μＭのデオキシコール酸を添加すると、細胞老化を引き起こす活性酸素（ＲＯＳ）の増加や、ＳＡＳＰ関連因子の発現が確認された。したがって、デオキシコール酸に代表される二次胆汁酸が非常に低濃度であっても、発がんリスクが高まることが示唆される。【０１０６】
さらに、肝臓に運ばれたデオキシコール酸が、肝星細胞でＳＡＳＰを誘導していることを免疫染色法を用いて確認した。【０１０７】
図５Ｄに示すように、デオキシコール酸投与群では、ＳＡＳＰを誘導することが知られているｐ２１、ＳＡＳＰ因子であるＩＬ−１β、ＩＬ−６，Ｇｒｏ‐αが発現しているのに対し、コントロール群では発現が確認されなかった。【０１０８】
［実施例６：腸内細菌叢の有無による発がんリスク］
実施例３、４に示すように、抗生物質投与によって、腸内細菌数を減少させることにより、肝発がんのリスクが減少することが示された。そこで、腸内細菌を保有しない無菌環境でマウスを飼育し、実施例１と同様に新生仔マウスにＤＭＢＡ処理し、高脂肪食で飼育し、体重が４５ｇ以上になった肥満したマウスについて３０週齢時に肝がん発症の有無を解析した。【０１０９】
無菌マウスは腸内細菌がいないため、常在菌のいるマウス（平均体重約５７ｇ）に比べ肥満しにくく平均体重は約４８ｇであった。【０１１０】
図６Ａに各群の典型的なマウスの肝臓所見を示す。図６Ａ中、肝がんは△で示す。図６Ｂに個体あたりの平均的な肝がん数、及びその大きさを示している。なお、コントロールマウスは６匹、無菌マウスは９匹の平均を示している。【０１１１】
常在菌のいるマウス（コントロールマウス）では肝がん発症が見られるのに対し、腸内細菌叢を保有しない無菌マウスでは、肥満状態であるにもかかわらず、がん発症が抑制されていた。【０１１２】
無菌マウスでは、肥満であるにもかかわらず、肝がんを発症のリスクが低いという結果は、腸内細菌の有無が肝がん発症と相関していることを示す。さらに、実施例５の結果を鑑みると、腸内細菌が二次胆汁酸を産生し、肝がん発症に深く関与していることを示す。【０１１３】
実施例２〜６の結果から、がん発症には以下の機構が働いているものと考えられる（図７）。腸内細菌叢の変化、特にデオキシコール酸を産生するクリストリジウム属クラスターＸＩに属する腸内細菌の増加が起こり、その結果、血中のデオキシコール酸濃度が上昇する。肝がんの場合であれば、デオキシコール酸は腸肝循環によって、肝臓に運ばれて肝星細胞の細胞老化を引き起こし細胞老化した肝星細胞はＳＡＳＰ因子を分泌する。このＳＡＳＰは肝星細胞の周囲肝実質細胞の細胞増殖を誘導し、肝がん発症を引き起こす。【０１１４】
本発明によれば、腸内細菌叢の変化はがん発症に先立ち生じることから、腸内細菌叢の変化を捉えることにより、がん発症のリスクを検査することが可能である。腸内細菌叢の変化は、グラム陰性菌、グラム陽性菌のバランスとして検査することもできるし、二次胆汁酸の検出によっても可能である。【０１１５】
また、上記実施例のモデルマウスの系を用い、さらに候補化合物を投与することにより、肝がん発症を抑制する化合物を探索することも可能である。したがって、新規の医薬化合物のスクリーニングを行うこともできる。【０１１６】
本発明による医薬化合物のスクリーニング方法は、発生したがんに対しても効果を有するが、さらに発がんリスクを軽減する医薬用途化合物を選定するたことも可能である。【０１１７】
すなわち、本発明では腸内細菌叢の改善を図ることによって、発がんが抑制されることが示された。したがって、当該スクリーニング方法によれば、発がんリスクを軽減する医薬用途化合物を探索することができる。【０１１８】
特に、腸内細菌叢の変化が、消化器がん、肝がん、胆管がん、肺がんを誘発する可能性が示されたことから、これらの疾患を有する患者、あるいは疾患のリスクを有する者に投与可能な医薬のスクリーニングを行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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