(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域が欠失したゲノム構造を有する枯草菌変異株に、異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子を導入して作製される組換え枯草菌であって、ｍａｌＡ遺伝子が削除又は不活性化された組換え枯草菌。
【請求項２】
前記枯草菌変異株が、更に以下の領域のうちの１つ又は２つ以上が欠失したゲノム構造を有する、請求項１記載の組換え枯草菌：
ｙｂｂＵ−ｙｂｆＩ領域、ｙｄｊＭ−ｃｏｔＡ領域、ｙｅｆＡ−ｙｅｓＸ領域、ｙｆｉＢ−ｙｆｉＸ領域、ｙｈｃＥ−ｙｈｃＵ領域、ｙｈａＵ−ｙｈａＬ領域、ｙｊｂＸ−ｙｊｌＢ領域、ｘｋｄＡ−ｙｋｃＣ領域、ｂｐｒ−ｙｌｍＡ領域、ｆｌｇＢ−ｃｈｅＤ領域、ｙｎｆＦ−ｐｐｓＡ領域、ｙｏｘＣ−ｙｏｂＯ領域、ｓｐｏＶＡＦ−ｓｐｏＩＩＡＡ領域、ｓｐｏＩＩＩＡＨ−ｙｑｈＶ領域、ｙｔｖＢ−ｙｔｑＢ領域、ｙｔｅＡ−ｙｔａＢ領域、ｙｕａＪ−ｙｕｇＯ領域、ｙｕｓＪ−ｍｒｇＡ領域、ｇｅｒＡＡ−ｙｖｒＩ領域、ｙｖａＭ−ｙｖｂＫ領域、ａｒａＥ−ｙｖｅＫ領域、ｙｖｄＥ−ｙｖｃＰ領域、ｇｅｒＢＡ−ｙｗｓＣ領域、ｙｗｒＫ−ｙｗｑＭ領域、ｓｐｏＩＩＩＤ−ｙｗｏＢ領域、ｓｌｐ−ｙｌａＦ領域、ｌｉｃＨ−ｓｉｇＹ領域、ｙｑｅＦ−ｙｒｈＫ領域、ｙｕｚＥ−ｙｕｋＪ領域及びｙｎｃＭ−ｙｎｄＮ領域。
【請求項３】
異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域から選ばれる１以上の領域が作動可能に連結されている、請求項１又は２記載の組換え枯草菌。
【請求項４】
異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が作動可能に連結されている、請求項１から３のいずれか１項記載の組換え枯草菌。
【請求項５】
前記分泌シグナル領域が、バチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、前記転写開始制御領域及び前記翻訳開始制御領域が、当該セルラーゼ遺伝子の上流０．６〜１ｋｂ領域由来のものである、請求項３又は４記載の組換え枯草菌。
【請求項６】
前記転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、配列番号３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６５９の塩基配列、又は当該塩基配列のいずれかと９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片である、請求項５記載の組換え枯草菌。
【請求項７】
前記異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子が、バチルス属細菌のアルカリセルラーゼ遺伝子である、請求項１から６のいずれか１項記載の組換え枯草菌。
【請求項８】
前記アルカリセルラーゼ遺伝子が、配列番号３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子、又は当該塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片である、請求項７記載の組換え枯草菌。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１項記載の組換え枯草菌を用いる異種タンパク質又は異種ポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産に用いる組換え枯草菌、及びそれを用いたタンパク質又はポリペプチドの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品の醸造をはじめとして、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等の工業的生産など、多岐に渡って実施されている。またその用途も、食品をはじめとして、医薬、洗剤、化粧品等の日用品、あるいは各種化成品原料に至るまで、幅広い分野に広がっている。
【０００３】
微生物を用いた有用物質の工業的生産における一つの重要課題として、当該有用物質の生産性向上が挙げられる。従来、当該課題を解決するため、突然変異等の遺伝学的手法による高生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いた、より効率的な高生産菌の育種が行われている。更に、近年のゲノム解析技術の急速な発展を受け、対象とする微生物のゲノム情報を解読し、これらを積極的に産業に応用する試みもなされている。例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｍａｒｂｕｒｇ  Ｎｏ．１６８系統株など、宿主微生物として安全かつ優良と認められた微生物菌株に更に改良を加えた菌株が開発されている。
【０００４】
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において、マルトースは、フォスフォエノールピルビン酸依存性の糖トランスポーター（ＰＴＳ：Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌ  ｐｙｒｕｖａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ）の一つであるＭａｌＰにより細胞内に取り込まれた後（非特許文献１）リン酸化され、マルトース６リン酸に変換される。更に、マルトース６リン酸は、６−ホスホ−α−グルコシダーゼ活性を有するＭａｌＡによりグルコース及びグルコース６リン酸へと分解され、解糖系で代謝される。ＭａｌＡをコードする遺伝子ｍａｌＡはｍａｌＡ−ｇｌｖＲ−ｍａｌＰオペロンを構成することが知られている（非特許文献２）。
【０００５】
本出願人は、過去の特許出願（特許文献１）において、枯草菌１６８株（野生株）を親株としてｍａｌＰ（当時の名称はｇｌｖＣ）及びｇｌｖＲを欠失させた株で酵素セルラーゼ及びα−アミラーゼの生産量が向上することを報告している。しかしながら、ｍａｌＡ遺伝子の欠失による酵素生産量への影響に関しては明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−１５１９８３号公報
【特許文献２】特開２００７−１３００１３号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊ．ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８８，１１，ｐ．３９１１−３９２２，２００６
【非特許文献２】Ｊ．ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８３，１７，ｐ．５１１０−５１２１，２００１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、タンパク質又はポリペプチドの生産性向上を可能とする組換え枯草菌、更には当該組換え枯草菌を用いたタンパク質又はポリペプチドの製造方法の提供に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産にとって不要あるいは有害な働きをする遺伝子群をゲノム上から削除した枯草菌を宿主として用い、その宿主のｍａｌＡ遺伝子を削除又は不活性化し、更に目的の異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子を導入することにより、当該異種タンパク質又はポリペプチドの生産が顕著に向上することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、以下の（１）から（９）に係るものである。
（１）  ｐｒｏｐｈａｇｅ６領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４領域、ＰＢＳＸ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３領域、ｓｐｂ領域、ｐｋｓ領域、ｓｋｉｎ領域、ｐｐｓ領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域が欠失したゲノム構造を有する枯草菌変異株に、異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子を導入して作製される組換え枯草菌であって、ｍａｌＡ遺伝子が削除又は不活性化された組換え枯草菌。
（２）  前記枯草菌変異株が、更に以下の領域のうちの１つ又は２つ以上が欠失したゲノム構造を有する、上記（１）記載の組換え枯草菌：
ｙｂｂＵ−ｙｂｆＩ領域、ｙｄｊＭ−ｃｏｔＡ領域、ｙｅｆＡ−ｙｅｓＸ領域、ｙｆｉＢ−ｙｆｉＸ領域、ｙｈｃＥ−ｙｈｃＵ領域、ｙｈａＵ−ｙｈａＬ領域、ｙｊｂＸ−ｙｊｌＢ領域、ｘｋｄＡ−ｙｋｃＣ領域、ｂｐｒ−ｙｌｍＡ領域、ｆｌｇＢ−ｃｈｅＤ領域、ｙｎｆＦ−ｐｐｓＡ領域、ｙｏｘＣ−ｙｏｂＯ領域、ｓｐｏＶＡＦ−ｓｐｏＩＩＡＡ領域、ｓｐｏＩＩＩＡＨ−ｙｑｈＶ領域、ｙｔｖＢ−ｙｔｑＢ領域、ｙｔｅＡ−ｙｔａＢ領域、ｙｕａＪ−ｙｕｇＯ領域、ｙｕｓＪ−ｍｒｇＡ領域、ｇｅｒＡＡ−ｙｖｒＩ領域、ｙｖａＭ−ｙｖｂＫ領域、ａｒａＥ−ｙｖｅＫ領域、ｙｖｄＥ−ｙｖｃＰ領域、ｇｅｒＢＡ−ｙｗｓＣ領域、ｙｗｒＫ−ｙｗｑＭ領域、ｓｐｏＩＩＩＤ−ｙｗｏＢ領域、ｓｌｐ−ｙｌａＦ領域、ｌｉｃＨ−ｓｉｇＹ領域、ｙｑｅＦ−ｙｒｈＫ領域、ｙｕｚＥ−ｙｕｋＪ領域及びｙｎｃＭ−ｙｎｄＮ領域。
（３）  異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域から選ばれる１以上の領域が作動可能に連結されている、上記（１）又は（２）に記載の組換え枯草菌。
（４）  異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が作動可能に連結されている、上記（１）から（３）のいずれか１つに記載の組換え枯草菌。
（５）  前記分泌シグナル領域が、バチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、前記転写開始制御領域及び前記翻訳開始制御領域が、当該セルラーゼ遺伝子の上流０．６〜１ｋｂ領域由来のものである、上記（３）又は（４）記載の組換え枯草菌。
（６）  前記転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、配列番号３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６５９の塩基配列、又は当該塩基配列のいずれかと７０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、又は当該塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片である、上記（４）記載の組換え枯草菌。
（７）  前記異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子が、バチルス属細菌のアルカリセルラーゼ遺伝子である、上記（１）から（６）のいずれか1つに記載の組換え枯草菌。
（８）  前記アルカリセルラーゼ遺伝子が、配列番号３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子、又は当該塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、又は当該塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片である、上記（７）記載の組換え枯草菌。
（９）  上記（１）から（８）のいずれか１つに記載の組換え枯草菌を用いる異種タンパク質又は異種ポリペプチドの製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本願発明の組換え枯草菌を用いれば、目的タンパク質又はポリペプチドを効率よく大量生産することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＳＯＥ−ＰＣＲによる遺伝子欠失用ＤＮＡ断片の調製、及び当該ＤＮＡ断片を用いて標的遺伝子を欠失する（薬剤耐性遺伝子と置換）方法を模式的に示した図。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本願発明の組換え枯草菌は、そのゲノムの一部が欠失した枯草菌変異株を親株として用い、ｍａｌＡ遺伝子を削除又は不活性化させ、更に異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子を導入して作製される。
【００１４】
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）とは、好気性のグラム陽性桿菌で、芽胞を形成する真正細菌の一種である。枯草菌は、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されており、またタンパク質と菌体外に分泌生産させる能力を有するため、本願発明にとり有用な微生物といえる。
【００１５】
本願発明において用いる枯草菌としては、そのゲノムの大領域、すなわちｐｒｏｐｈａｇｅ６（ｙｏａＶ−ｙｏｂＯ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１（ｙｂｂＵ−ｙｂｄＥ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４（ｙｊｃＭ−ｙｊｄＪ）領域、ＰＢＳＸ（ｙｋｄＡ−ｘｌｙＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５（ｙｎｘＢ−ｄｕｔ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３（ｙｄｉＭ−ｙｄｊＣ）領域、ｓｐｂ（ｙｏｄＵ−ｙｐｑＰ）領域、ｐｋｓ（ｐｋｓＡ−ｙｍａＣ）領域、ｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域、ｐｐｓ（ｐｐｓＥ−ｐｐｓＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２（ｙｄｃＬ−ｙｄｅＪ）領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｙｒａＫ）領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域を欠失させて構築した株が用いられ、具体的には、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｍａｒｂｕｒｇ  Ｎｏ．１６８（枯草菌１６８株）を野生株とし、当該大領域を欠失させて構築した枯草菌ＭＧＢ８７４株が挙げられる（特許文献２）。これらの欠失領域はまた、表１に示す一対のオリゴヌクレオチドセットにより挟み込まれる領域として表すことができる。
【００１６】
【表１】
0005829802.tif 000002
【００１７】
枯草菌１６８株の全塩基配列及び遺伝子は既に報告されており、またインターネット公開されている（Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９−２５６，１９９７及びＢＳＯＲＦ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ［ｈｔｔｐ：／／ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／］；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＬ００９１２６．２［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／３８６８０３３５］）。当業者は、これらの情報源から得た枯草菌１６８株のゲノム情報、例えばＧｅｎＢａｎｋ：ＡＬ００９１２６．２［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／３８６８０３３５］に基づいて、ＭＧＢ８７４株のゲノムから欠失させるべき上記表２に示した遺伝子領域を見出すことができる。ここで、欠失させるべき遺伝子領域は、公開されている枯草菌１６８株の遺伝子の塩基配列に対して１又は複数個の塩基における天然又は人工的に引き起こされた欠失、置換、挿入、付加等の変異を含み得る塩基配列を有し得る。変異し得る塩基の個数の範囲は、枯草菌１６８株のゲノムとの対応関係が認識できる限り特に限定されないが、例えば、枯草菌１６８株のゲノム領域の塩基配列に対して５０％以上の同一性、好ましくは６０％以上の同一性、より好ましくは７０％以上の同一性、更に好ましくは８０％以上の同一性、更により好ましくは９０％以上の同一性、なお好ましくは９５％以上の同一性を有する範囲が挙げられる。上記「付加」には、塩基配列の一末端及び両末端への塩基の付加が含まれる。
【００１８】
本発明に係る枯草菌変異株は、上記枯草菌変異株ＭＧＢ８７４株のゲノム領域から、更にゲノム領域を欠失させたゲノム構造を有してもよい。具体的には、当該枯草菌変異株は、枯草菌１６８株のゲノム上における表２に示す遺伝子領域のうちの少なくとも１つを、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４株のゲノム領域から更に欠失させたゲノム構造を有してもよい。当該欠失領域としては、表２に示される遺伝子領域及び当該領域に相当する領域が挙げられる。
【００１９】
【表２】
0005829802.tif 000003
【００２０】
本発明において削除すべきｍａｌＡ遺伝子（ＢＳＯＲＦ  Ｇｅｎｅ  Ｅｎｔｒｙ  Ｎｏ．：ＢＧ１１８３９、ＥＣ３．２．１．１２２）の遺伝子産物であるＭａｌＡタンパク質は、α−グルコシダーゼ活性を有し、マルトースを分解してグルコースに変換する。ｍａｌＡ遺伝子はｍａｌＰ遺伝子及びｇｌｖＲ遺伝子と共にｍａｌＡ−ｇｌｖＲ−ｍａｌＰオペロンを構成し、マルトースの代謝活動に関与する。
【００２１】
これらｍａｌＡ遺伝子以外の遺伝子の欠失又は不活化との組み合わせにより、異種タンパク質又は異種ポリペプチドの生産性向上に対するより大きな効果が期待される。
【００２２】
本発明に係るｍａｌＡ遺伝子が削除又は不活性化された組換え枯草菌は、例えば相同組換えにより標的遺伝子を削除又は不活性化する方法など、既に報告された方法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２３，２６８（１９９０）等）を繰り返すことによって構築される。
【００２３】
また、ランダムな遺伝子の削除又は不活性化についてもランダムにクローニングしたＤＮＡ断片を用いて上述の方法と同様な相同組換えを起こさせる方法や、親微生物にγ線等を照射すること等によっても実施可能である。
【００２４】
本発明では、上記のｍａｌＡ遺伝子内に他のＤＮＡ断片を挿入する方法、あるいは当該遺伝子の転写・翻訳開始領域を変異させる方法等によって目的遺伝子を不活性化しても本発明の目的を達成できるが、標的遺伝子を物理的に削除する方がより好ましい。また、削除又は不活性化する遺伝子は１つでもよいが、２つ以上の遺伝子の削除を組み合わせてもよい。更に本発明の組換え枯草菌の構築には、マルトースの膜透過関与以外の遺伝子群の削除又は不活性化を組み合わせることも可能であり、生産性向上に対してより大きな効果が期待される。
【００２５】
本発明における、ｍａｌＡ遺伝子の削除又は不活性化の具体例として、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，７７，６１，（１９８９））によって調製される削除用ＤＮＡ断片を用いた二重交差法による削除方法について説明するが、本発明における遺伝子削除方法はこの方法に限定されるものではない。
【００２６】
本方法で用いる削除用ＤＮＡ断片は、削除対象遺伝子の上流に隣接する約０．２〜３ｋｂ断片と、同じく下流に隣接する約０．２〜３ｋｂ断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片を挿入して構築した断片である。まず、１回目のＰＣＲによって、削除対象遺伝子の上流断片及び下流断片、並びに薬剤耐性マーカー遺伝子断片の３断片を調製するが、この際、例えば、上流断片の下流末端に薬剤耐性マーカー遺伝子の上流側１０〜３０塩基対配列、逆に下流断片の上流末端には薬剤耐性マーカー遺伝子の下流側１０〜３０塩基対配列が付加されるようにデザインされたプライマーを用いる（図１）。
【００２７】
次いで、１回目に調製した３種類のＰＣＲ断片を鋳型とし、上流断片の上流側プライマーと下流断片の下流側プライマーを用いて２回目のＰＣＲを行うことによって、上流断片の下流末端及び下流断片の上流末端に付加した薬剤耐性マーカー遺伝子配列において、薬剤耐性マーカー遺伝子断片とのアニーリングが生じ、ＰＣＲ増幅の結果、上流側断片と下流側断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子が挿入されたＤＮＡ断片が得られる（図１）。
【００２８】
表３に示したプライマーセットと適当な鋳型ＤＮＡを用い、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメーラーゼ（宝酒造）などの一般のＰＣＲ用酵素キット等を用いて、“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｂ．Ａ．Ｗｈｉｔｅ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ２５１（１９９３）、Ｇｅｎｅ，７７，６１，（１９８９）等に示される通常の条件によりＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、各遺伝子の削除用ＤＮＡ断片が得られる。
【００２９】
かくして得られた削除用ＤＮＡ断片を、コンピテント法等によって細胞内に導入すると、削除対象遺伝子の上流及び下流の、上記削除用ＤＮＡ断片との相同領域おいて、細胞内での遺伝子組換えが生じ、削除対象遺伝子が薬剤耐性遺伝子で置換された細胞を、薬剤耐性マーカーによる選抜により単離できる（図１）。即ち、表３に示したプライマーセットを用いて調製した削除用ＤＮＡ断片を導入した場合、薬剤を含む寒天培地上に生育するコロニーを単離し、目的の遺伝子が削除されて薬剤耐性遺伝子と置換していることを、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法などによって確認すればよい。
【００３０】
次に、かくして得られた本発明に係る枯草菌変異株に、目的とする異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入することによって、本発明の組換え枯草菌を得ることができる。
【００３１】
当該組換え枯草菌を用いて異種タンパク質又はポリペプチドを製造する場合、上記目的タンパク質又はポリペプチドの遺伝子の上流に、当該遺伝子の転写、翻訳、分泌を制御する制御領域を、適切な形で結合させるのが望ましい。かかる制御領域としては、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域並びに分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域などが挙げられる。特に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が結合されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の開始コドンから始まる長さ０．６〜１ｋｂの上流領域であるものが、異種タンパク質又はポリペプチド遺伝子と作動可能に連結されていることが望ましい。例えば、特開２０００−２１００８１号公報や特開平４−１９０７９３号公報等に記載されているバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、すなわちＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）、ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８８６）由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域が目的のタンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と作動可能に連結されていることが望ましい。より具体的には、前記転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、配列番号３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６５９の塩基配列、又は当該塩基配列のいずれかと７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有し、且つ遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、又は当該塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片が、上記の異種タンパク質又はポリペプチド遺伝子と作動可能に連結していることが望ましい。ここで、上記塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片とは、上記塩基配列の一部を欠失しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を保持しているＤＮＡ断片を意味する。また、ここで、作動可能に連結されている（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）とは、上記の制御配列が機能してコード配列によりコードされた目的タンパク質の発現が制御されうる位置関係で、当該制御配列と当該コード配列とが配置していることを指す。具体例としては、プロモーターとそれに隣接する目的遺伝子とが、当該プロモーターの方向に沿って、当該遺伝子が発現しうる状態で配置していることを指す。また、ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）］に記載の条件等が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％  ＳＤＳ、５×デンハート液及び１００ｍｇ／ｍＬ  ニシン精子ＤＮＡを含む溶液中で、プローブと共に６５℃で８〜１６時間インキュベートし、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００３２】
異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を細胞内で発現させるためには、当該遺伝子を含むＤＮＡ断片を、適切なベクターに挿入した発現プラスミドを構築し、当該発現プラスミドを宿主に導入して形質転換する必要がある。当該発現ベクターとしては、枯草菌体内で自立複製可能なベクターが好適であり、例えばシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられるが、特に限定されない。
【００３３】
ポリペプチドとは一般に、直鎖状に連結したアミノ酸のポリマーを指し、タンパク質とは一般に、５０以上のアミノ酸からなる１つ以上のポリペプチドのことを指すが、本願においてはこれらの用語は交換可能に用いられるものとする。
【００３４】
本発明の組換え枯草菌を用いて生産する異種タンパク質又はポリペプチドとしては、例えば食品用、医薬用、化粧用、洗浄用、繊維処理用、検査用に用いられる各種産業用酵素や、生理活性ペプチドなどが挙げられる。また、産業用酵素の機能別には、酸化還元酵素（オキシドレダクターゼ）、転移酵素（トランスフェラーゼ）、加水分解酵素（ヒドロラーゼ）、脱離酵素（リアーゼ）、異性化酵素（イソメラーゼ）、合成酵素（リガーゼ／シンセターゼ）等が含まれるが、好適にはセルラーゼ、α−アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素が挙げられ、より好ましくはセルラーゼが挙げられる。
【００３５】
より具体的な例として、配列番号３で示される塩基配列によりコードされるバチルス属細菌ＫＳＭ−Ｓ２３７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）由来のアルカリセルラーゼや、配列番号１１９で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８８６）由来のアルカリセルラーゼ、配列番号４又は１１９で示されるアミノ酸配列の１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するアルカリセルラーゼが挙げられ、更には、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼが挙げられる。
【００３６】
また、α−アミラーゼの具体例としては、微生物由来のα−アミラーゼが挙げられ、特にバチルス属細菌由来の液化型アミラーゼや、配列番号１２０で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌ＫＳＭ−Ｋ３８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９４６）由来のアルカリアミラーゼ、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミラーゼ、配列番号１２０で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなりアミラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。また、プロテアーゼの具体例としては、微生物由来、特にバチルス属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼや、配列番号１２１で示されるアミノ酸配列からなるバチルス  クラウジ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）ＫＳＭ−Ｋ１６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３３７６）由来のアルカリプロテアーゼ、あるいは当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりプロテアーゼ活性を有するタンパク質、配列番号１２１で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなりプロテアーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００３７】
本発明において、アミノ酸配列及び塩基配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，（１９８５））によって計算される。より具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００３８】
本願発明の別の態様は、上述した組換え枯草菌を用いる異種タンパク質又は異種ポリペプチドの製造方法に関する。
【００３９】
本発明の組換え枯草菌は、上記の異種タンパク質又はポリペプチド遺伝子を含むＤＮＡ断片と適当なプラスミドベクターを結合させた組換えプラスミドを、一般的な形質転換法によって宿主となる枯草菌変異株に取り込ませることによって得られる。また、当該ＤＮＡ断片に宿主ゲノムとの適当な相同領域を結合したＤＮＡ断片を用い、宿主ゲノムに直接組み込むことによって本発明の組換え枯草菌を得てもよい。
【００４０】
上記の組換え枯草菌を用いた異種タンパク質又はポリペプチドの製造は、上記異種タンパク質又はポリペプチドの遺伝子を上記のとおり宿主となる枯草菌変異株に導入して得られる菌株を、例えば同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種して培養して行うことができる。培養方法は、原則的には一般的な微生物の培養方法であってもよく、通常、液体培養による振盪培養、通気撹拌培養等の好気的条件下で実施するのが好ましい。培養終了後、培養液を遠心分離し、得られる上清又は菌体から、目的の異種タンパク質又はポリペプチドを、硫安沈殿やクロマトグラフィなどを適宜組み合わせ、常法に従い抽出・精製することにより得ることができる。
【００４１】
以下の実施例において、本発明の組換え枯草菌の構築方法及び当該組換え枯草菌を用いたタンパク質の製造方法について説明するが、本願発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４２】
枯草菌ＭＧＢ８７４株のｍａｌＡ遺伝子を削除した組換え枯草菌株の構築、並びに当該組換え枯草菌を用いたセルラーゼの生産方法について、以下に具体的に説明する。
【００４３】
以下の実施例におけるＤＮＡ断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）と付属の試薬類を用いた、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）によるＤＮＡ増幅により行った。ＰＣＲ反応液は、適宜希釈した鋳型ＤＮＡを１μＬ、センス及びアンチセンスプライマーを各々２０ｐｍｏｌ、及びＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを２．５Ｕ添加し、更に総反応液量を５０μＬとすることにより調製した。ＰＣＲ反応条件は、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で１〜５分間（目的増幅産物に応じて調整。目安は１ｋｂあたり１分間）の３段階の温度変化を３０サイクル繰り返した後、７２℃で５分間反応、とした。
【００４４】
また、以下の実施例において、遺伝子の上流及び下流とは、複製開始点からの位置を指すのではなく、上流とは各操作・工程において対象となる遺伝子の開始コドンの５’側に続く領域を指し、一方下流とは各操作・工程において対象となる遺伝子の終止コドンの３’側に続く領域を指すものとする。
【００４５】
更に、以下の実施例における各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９−２５６，（１９９７）で報告され、ＪＡＦＡＮ：Ｊａｐａｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＢＳＯＲＦ  ＤＢ）としてインターネットで公開された枯草菌ゲノムデータ（ｈｔｔｐ：／／ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／２００４年３月１０日更新）に基づき記載する。
【００４６】
枯草菌の形質転換は、コンピテントセル法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９３，１９２５（１９６７））により行った。すなわち、枯草菌株をＳＰＩ培地（０．２０％  硫酸アンモニウム、１．４０％  リン酸水素二カリウム、０．６０％  リン酸二水素カリウム、０．１０％  クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０％  グルコース、０．０２％  カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｍＭ  硫酸マグネシウム、０．２５μＭ  塩化マンガン、５０μｇ／ｍＬ  トリプトファン）中で、３７℃で、生育度（ＯＤ６００）の値が約１となるまで振盪培養し、振盪培養後、培養液の一部を９倍量のＳＰＩＩ培地（０．２０％  硫酸アンモニウム、１．４０％  リン酸水素二カリウム、０．６０％  リン酸二水素カリウム、０．１０％  クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０％  グルコース、０．０１％  カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｍＭ  硫酸マグネシウム、０．４０μＭ  塩化マンガン、５μｇ／ｍＬ  トリプトファン）に接種し、更に生育度（ＯＤ６００）の値が約０．４となるまで振盪培養することにより、枯草菌株のコンピテントセルを調製した。
【００４７】
次いで調製したコンピテントセル懸濁液（ＳＰＩＩ培地における培養液）１００μＬに、各種ＤＮＡ断片を含む溶液（ＳＯＥ−ＰＣＲの反応液等）を５μＬ添加し、３７℃で１時間振盪培養後、適切な薬剤を含むＬＢ寒天培地（１％  トリプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、１．５％  寒天）に全量を塗沫した。３７℃での静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲを行い、目的とするゲノム構造の改変がなされたことを確認した。
【００４８】
目的のタンパク質を発現するプラスミドの宿主微生物への導入は、プロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８，１１１（１９７９））により行った。組換え枯草菌によるタンパク質生産用の培養として、ＬＢ培地（１％  トリプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ）、及び２×Ｌ−マルトース培地（２％  トリプトン、１％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、７．５％  マルトース、７．５ｐｐｍ  硫酸マンガン４〜５水和物）を用いた。
【００４９】
（実施例１：ｍａｌＡ遺伝子欠失株の構築）
ｍａｌＡ遺伝子（配列番号１）はｍａｌＡ−ｇｌｖＲ−ｍａｌＰオペロンの先頭に位置する遺伝子であり、本遺伝子を欠失する際には、ｍａｌＡの下流遺伝子であるｇｌｖＲ及びｍａｌＰの発現に影響を与えない形で欠失株の構築を行わなければならない。そこで、本発明においては、ｍａｌＡの構造遺伝子をネオマイシン耐性遺伝子のＯＲＦ（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）と置換する方法により、ｍａｌＡ遺伝子欠失株を構築した。枯草菌ＭＧＢ８７４株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表３に示したｍａｌＡＦＷ１とｍａｌＡ／ｎｅｏｆ２．Ｒ、及びｍａｌＡ／ｎｅｏｒ２．ＦとｍａｌＡ  ＲＶの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のｍａｌＡ遺伝子の上流に隣接する１．０ｋｂｐ断片（Ａ）、及び下流に隣接する１．０ｋｂｐ断片（Ｂ）をそれぞれ調製した。また、ネオマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドｐＵＢ１１０（Ｐｌａｓｍｉｄ  １５：９３−１０３．（１９８６））を鋳型として、表３に示したnｅｏｆ２及びnｅｏｒ２のプライマーセットを用いて、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｃ）を調製した。次に、得られた（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の３断片を混合して鋳型とし、ｍａｌＡ  ＦＷ２とｍａｌＡ  ＲＶ２のプライマーを用いてＰＣＲを行ない、３断片を（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）の順になるように結合させ、遺伝子欠失用のＤＮＡ断片を得た（図１参照）。このＤＮＡ断片を用いて、上述したコンピテントセル法により、枯草菌１６８株及びＭＧＢ８７４株を形質転換し、ネオマイシン（１０ｍｇ／Ｌ）及びマルトース（１ｇ／Ｌ）を含むＬＢ寒天培地上で生育したコロニーを形質転換体として単離した。マルトース存在下でｍａｌＡ−ｇｌｖＲ−ｍａｌＰオペロンの発現が誘導されるため（Ｊ．ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８３，１７，５１１０，(２００１)）、形質転換体ではネオマイシン耐性遺伝子が発現し、ネオマイシンを含むＬＢ寒天培地上でも生育可能となる。
【００５０】
得られた形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行った結果、ｍａｌＡ遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子と置換され、ｍａｌＡ遺伝子欠失株となっていることが確認された。以上のようにして得られたｍａｌＡ欠失株のうち、枯草菌１６８株を親株として構築した株を１６８ΔｍａｌＡ株と、枯草菌ＭＧＢ８７４株を親株として構築した株を８７４ΔｍａｌＡ株とした。
【００５１】
【表３】
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【００５２】
（実施例２：セルラーゼ生産性評価）
実施例１にて得られた１６８ΔｍａｌＡ株、８７４ΔｍａｌＡ株及び対照として、親株である枯草菌１６８株、ＭＧＢ８７４株に、アルカリセルラーゼ遺伝子を導入した。具体的には、バチルス属細菌  ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）由来のＳ２３７セルラーゼ遺伝子（特開２０００−２１００８１号公報参照）（配列番号３）をコードするＤＮＡ断片（３．１ｋｂ；配列番号３の塩基番号１３〜３１２４）を鋳型として、表４に示されるプライマーＥｇｌ−Ｓ２３７．Ｆ及びプライマーＥｇｌ−Ｓ２３７．Ｒのプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、シャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫのＢａｍＨＩ制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を構築し、プロトプラスト形質転換法によって各菌株に導入した。
【００５３】
【表４】
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【００５４】
得られた菌株を、５ｍＬのＬＢ培地で、３０℃で１５時間振盪培養し、更にこの培養液０．６ｍＬを３０ｍＬの２×Ｌ−マルトース培地（２％  トリプトン、１％  酵母エキス、１％  塩化ナトリウム、７．５％  マルトース、７．５ｐｐｍ  硫酸マンガン４−５水和物、１５ｐｐｍ  テトラサイクリン）に接種し、３０℃で３日間振盪培養した。この際、測定誤差を算出する目的で、培養を３回行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を算出した。セルラーゼ活性測定は、１／７．５Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４  和光純薬工業社製）で適宜希釈したサンプル溶液５０μＬに０．４ｍＭ  ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロトリオシド（生化学工業社製）を５０μＬ添加して混合し、３０℃にて反応させた際に遊離するｐ−ニトロフェノールの量を、４２０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４２０ｎｍ）変化により定量することにより行った。セルラーゼ活性は、１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１Ｕとして定義した。生産性の比較は、親株の生産性を１００％とする相対値により行った（表５：表中の値は平均値±標準偏差（Ｎ＝３）を示す）。この結果、親株としてＭＧＢ８７４株を用いた場合、親株に１６８株を用いた場合と比較し、ｍａｌＡ欠失により高いアルカリセルラーゼの分泌生産量向上効果が確認された。
【００５５】
【表５】
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【図１】
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【配列表】
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