(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Δ８デサチュラーゼ活性を有して、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する、変異ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は
（ｂ）パート（ａ）のヌクレオチド配列の補体
を含み、補体およびヌクレオチド配列が同数のヌクレオチドからなって１００％相補的である、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
ポリペプチドがΔ８デサチュラーゼ活性を有する、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
【請求項３】
少なくとも１つの制御配列と作動的に連結する、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチドを含んでなる組み換えコンストラクト。
【請求項４】
請求項３に記載の組み換えコンストラクトを含む細胞。
【請求項５】
前記細胞が、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞である請求項４に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物工学の分野にある。より具体的には本発明は、変異Δ８脂肪酸デサチュラーゼをコードする核酸断片の創出、および長鎖多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の製造におけるこれらのデサチュラーゼの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＵＦＡの重要性には議論の余地がない。例えば特定のＰＵＦＡは健康な細胞の重要な生物学的構成要素であり、哺乳類では新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）合成できず、その代わりに食餌中で得なくてはならず、またはリノール酸（ＬＡ、１８：２  ω−６）またはα−リノレン酸（ＡＬＡ、１８：３  ω−３）のさらなる不飽和化および延長によって送達されなくてはならない「必須」脂肪酸としてとして見なされる。さらにＰＵＦＡは、リン脂質またはトリアシルグリセロールなどの形態であってもよい細胞の原形質膜の構成物である。ＰＵＦＡは、（特に発達中の幼児の脳における）適切な発達、組織形成および修復のために必要なものであり、かつ哺乳類における重要ないくつかの生物学的に活性なエイコサノイド前駆物質（例えばプロスタサイクリン、エイコサノイド、ロイコトリエン、プロスタグランジン）である。研究により、長鎖ω−３ＰＵＦＡの大量摂取は、心臓血管保護効果をもたらすことが分かっている（Ｄｙｅｒｂｅｒｇ，Ｊ．ら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ．２８：９５８〜９６６（１９７５年）、Ｄｙｅｒｂｅｒｇ，Ｊ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  ２（８０８１）：１１７〜１１９（１９７８年７月１５日）、Ｓｈｉｍｏｋａｗａ，Ｈ．、Ｗｏｒｌｄ  Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．Ｄｉｅｔ、８８：１００〜１０８（２００１年）、ｖｏｎ  Ｓｃｈａｃｋｙ，Ｃ．およびＤｙｅｒｂｅｒｇ，Ｊ．、Ｗｏｒｌｄ  Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．Ｄｉｅｔ、８８：９０〜９９（２００１年））。文献により、ω−３および／またはω−６ＰＵＦＡの投与によって得られる、多様な症状および疾患（例えば喘息、乾癬、湿疹、糖尿病、癌）に対する多岐にわたる健康上の利点が報告されている。
【０００３】
植物、藻類、真菌、および酵母をはじめとする多様な異なる宿主が、商業的ＰＵＦＡ生産のための手段として調査されている。遺伝子操作は、いくつかの宿主の天然の能力を実質的に改変させて、様々な長鎖ω−３／ω−６ＰＵＦＡを生成できることを実証している。例えばアラキドン酸（ＡＲＡ；２０：４ω−６）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ；２０：５ω−３）、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ；２２：６ω−３）の生成は、全てΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路またはΔ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路のいずれかの発現を必要とする。Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路は、例えばユーグレナ種に存在し、エイコサジエン酸［「ＥＤＡ」；２０：２ω−６］および／またはエイコサトリエン酸［「ＥＴｒＡ」；２０：３ω−３］の生成によって特徴づけられる（図１）。Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路は、藻類、コケ、真菌、線形動物、およびヒトにおいて主として見られ、γ−リノール酸［「ＧＬＡ」；１８：３ω−６］および／またはステアリドン酸［「ＳＴＡ」；１８：４ω−３］）の生成によって特徴づけられる（図１）。
【０００４】
いくつかの用途では、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路が好まれる。しかしΔ８デサチュラーゼについては当該技術分野でよく知られておらず、組み換えΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の構築では選択の余地が限られる。ここまでに、ＥＤＡからジホモ−γ−リノレン酸［２０：３、ＤＧＬＡ］へ、およびＥＴｒＡからエイコサテトラエン酸［２０：４、ＥＴＡ］への双方の転換能力を有する、わずかなΔ８デサチュラーゼが同定されている（ＡＲＡおよびＥＰＡがΔ５デサチュラーゼとの反応に続いて、ＤＧＬＡおよびＥＴＡからそれぞれ引き続いて合成される一方、ＤＨＡ合成は追加的なＣ20/22エロンガーゼおよびΔ４デサチュラーゼの引き続く発現を必要とする）。
【０００５】
いくつかのΔ８デサチュラーゼが知られており、部分的に特性決定されている（例えばミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）からのΔ８デサチュラーゼを参照されたい；Ｗａｌｌｉｓら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．、３６５（２）：３０７〜３１６ページ（１９９９年５月）；国際公開第２０００／３４４３９号パンフレット；米国特許第６，８２５，０１７号明細書；国際公開第２００４／０５７００１号パンフレット；国際公開第２００６／０１２３２５号パンフレット；国際公開第２００６／０１２３２６号パンフレット）。さらに国際公開第２００５／１０３２５３号パンフレット（２００５年４月２２日公開）は、パブロバ・サリナ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｓａｌｉｎａ）からのΔ８デサチュラーゼのアミノ酸および核酸配列を開示する（米国特許出願公開第２００５／０２７３８８５号明細書もまた参照されたい）。Ｓａｙａｎｏｖａら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、５８０：１９４６〜１９５２頁（２００６年））は、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）中で発現させるとＣ20Δ８デサチュラーゼをコードする、自由生活土壌アメーバアカントアメーバ・カステラーニ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ  ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ）からのｃＤＮＡの単離および特性決定について述べている。さらに２００６年４月２８日に出願された同一譲受人の同時係属米国仮特許出願第６０／７９５８１０号明細書は、パブロバ・ルセリ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｌｕｔｈｅｒｉ）（ＣＣＭＰ４５９）からのΔ８デサチュラーゼについてアミノ酸および核酸配列を開示する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがってＰＵＦＡを生成する組み換え経路で使用するための追加的なΔ８デサチュラーゼに対する必要性がなおも残る。出願人らは、合成的に改変された変異ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ８デサチュラーゼを開発することで、既述の必要性を解決した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、Δ８デサチュラーゼ活性を有する変異ポリペプチドをコードする新しい組み換えコンストラクト、およびＰＵＦＡ、および特にω−３および／またはω−６脂肪酸を生成するための植物および酵母中でのそれらの使用に関する。
【０００８】
したがって本発明は、
（ａ）Δ８デサチュラーゼ活性を有して、配列番号１０と同一でない配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する、変異ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
（ｂ）パート（ａ）のヌクレオチド配列の補体
を含んでなる、単離されたポリヌクレオチドを提供し、補体およびヌクレオチド配列は同数のヌクレオチドからなって１００％相補的である。
【０００９】
代案の実施態様では、本発明は、
（ａ）Δ８デサチュラーゼ活性を有して、配列番号１０と同一でない配列番号１９８に記載のアミノ酸配列を有する、変異ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
（ｂ）パート（ａ）のヌクレオチド配列の補体
を含んでなる、単離されたポリヌクレオチドを提供し、補体およびヌクレオチド配列は同数のヌクレオチドからなり、１００％相補的である。
【００１０】
本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、ならびに形質転換されて同ポリペプチドを発現する遺伝的キメラおよび宿主細胞を提供することは、本発明の一態様である。
【００１１】
別の態様では本発明は、（ａ）本発明の酵母細胞を提供するステップと、（ｂ）長鎖多価不飽和脂肪酸が生成する条件下で（ａ）の酵母細胞を成長させるステップを含んでなる、酵母細胞中で長鎖多価不飽和脂肪酸を製造する方法を提供する。
【００１２】
別の態様では、本発明は本発明の酵母から得られる微生物油を提供する。
【００１３】
別の実施態様では、本発明は、
ａ）本発明のΔ８デサチュラーゼポリペプチドをコードして、少なくとも１つの制御配列と作動的に連結する、単離されたポリヌクレオチドを含んでなる第１の組み換えＤＮＡコンストラクト、および
ｂ）少なくとも１つの制御配列と作動的に連結する、単離されたポリヌクレオチドを含んでなる、少なくとも１つの第２の組み換えＤＮＡコンストラクト
を含んでなる、その乾燥細胞重量の少なくとも約２５％を油として産生する油性酵母を提供し、コンストラクトは、Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ14/16エロンガーゼ、Ｃ16/18エロンガーゼ、Ｃ18/20エロンガーゼ、およびＣ20/22エロンガーゼからなる群から選択されるポリペプチドをコードする。
【００１４】
別の態様では本発明は、本発明の微生物油を含んでなる食物または飼料製品を提供する。
【００１５】
別の実施態様では本発明は、
ａ）（ｉ）Δ８デサチュラーゼポリペプチドをコードして、配列番号１０と同一でない配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する組み換えコンストラクト、および
（ｉｉ）エイコサジエン酸源
を含んでなる、油性酵母を提供するステップと、
ｂ）Δ８デサチュラーゼポリペプチドをコードする組み換えコンストラクトが発現して、エイコサジエン酸がジホモ−γ−リノール酸に変換される条件下でステップ（ａ）の酵母を成長させるステップと、
ｃ）場合によりステップ（ｂ）のジホモ−γ−リノール酸を回収するステップと
を含んでなる、ジホモ−γ−リノール酸を生成する方法を提供する。
【００１６】
代案の実施態様では、本発明は
ａ）（ｉ）Δ８デサチュラーゼポリペプチドをコードして、配列番号１０と同一でない配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する組み換えコンストラクト、および
（ｉｉ）エイコサトリエン酸源
を含んでなる、油性酵母を提供するステップと、
ｂ）Δ８デサチュラーゼポリペプチドをコードする組み換えコンストラクトが発現して、エイコサトリエン酸がエイコサテトラエン酸に変換される条件下で、ステップ（ａ）の酵母を成長させるステップと、
ｃ）場合によりステップ（ｂ）のエイコサテトラエン酸を回収するステップと
を含んでなる、エイコサテトラエン酸を生成する方法を提供する。
【００１７】
別の実施態様では本発明は、
ａ）ｉ）少なくとも１つの制御配列と作動的に連結する、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含んでなる第１の組み換えＤＮＡコンストラクト、および
ｉｉ）少なくとも１つの制御配列と作動的に連結する、Δ９エロンガーゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを含んでなる、少なくとも１つの第２の組み換えＤＮＡコンストラクト
を含んでなる、酵母細胞を提供するステップと、
ｂ）（ａ）の酵母細胞にリノレン酸源を提供するステップと、
ｃ）ジホモ−γ−リノール酸が形成される条件下で（ｂ）の酵母細胞を成長させるステップと
を含んでなる、ジホモ−γ−リノール酸を生成する方法を提供する。
【００１８】
生物学的寄託
以下のプラスミドは、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９の米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託され、以下の命名、登録番号、および寄託日を有する（表１）。
【００１９】
表１
ＡＴＣＣ寄託
0005769374.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】代表的なＰＵＦＡ生合成経路である。
【図２】ＥｇＤ８Ｓの位相モデルを示す。
【図３】ＥｇＤ８Ｓ（配列番号１０）、アミロミセス・ルキシイ（Ａｍｙｌｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）のΔ６デサチュラーゼ（配列番号１３）、リゾプス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）のΔ６デサチュラーゼ（配列番号１４）、大型リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）のΔ８脂肪酸デサチュラーゼ様タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＪ０９６７７；配列番号１５）、およびモルティエラ・イザベリナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）のΔ６デサチュラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＧ３８１０４；配列番号１６）のアラインメントを示す。使用したアラインメント法は、「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法」に対応する。
【図４】ＥｇＤ８Ｓ（配列番号１０）、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のチトクロームｂ5（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｐ４０３１２；配列番号１７８）、およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）の有望なチトクロームｂ5１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｏ９４３９１；配列番号１７９）のアラインメントを示す。使用したアラインメント法は、「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法」に対応する。
【図５】（Ａ）ｐＺＫＬｅｕＮ−２９Ｅ３および（Ｂ）ｐＹ１１６のプラスミドマップを提供する。
【図６】（Ａ）ｐＫＵＮＦｍｋＦ２、（Ｂ）ｐＤＭＷ２８７Ｆ、（Ｃ）ｐＤＭＷ２１４、および（Ｄ）ｐＦｍＤ８Ｓのプラスミドマップを提供する。
【図７】変異ＥｇＤ８Ｓ−１および変異ＥｇＤ８Ｓ−２Ｂからの断片のライゲーションによる変異ＥｇＤ８Ｓ−５Ｂの合成を図示する。
【図８Ａ】変異ＥｇＤ８Ｓ−００１および変異ＥｇＤ８Ｓ−００３からの断片のライゲーションによる変異ＥｇＤ８Ｓ−００８の合成を図示する。
【図８Ｂ】同様に、変異ＥｇＤ８Ｓ−００１および変異ＥｇＤ８Ｓ−００４からの断片のライゲーションによる変異ＥｇＤ８Ｓ−００９の合成を図示する。
【図９Ａ】変異ＥｇＤ８Ｓ−００９および変異ＥｇＤ８Ｓ−２３からの断片のライゲーションによる変異ＥｇＤ８Ｓ−０１３の合成を図示する。
【図９Ｂ】同様に、変異ＥｇＤ８Ｓ−００８および変異ＥｇＤ８Ｓ−２８からの断片のライゲーションによる変異ＥｇＤ８Ｓ−０１５の合成を図示する。
【図１０】ＥｇＤ８Ｓ（配列番号１０）、変異ＥｇＤ８Ｓ−２３（配列番号４）、変異ＥｇＤ８Ｓ−０１３（配列番号６）、および変異ＥｇＤ８Ｓ−０１５（配列番号８）のアラインメントを示す。使用したアラインメント法は、「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法」に対応する。
【図１１】（Ａ）ｐＫｏ２ＵＦｍ８および（Ｂ）ｐＫＯ２ＵＦ８２８９からのプラスミドマップを提供する。
【００２１】
本発明は、本明細書の一部を形成する以下の詳細な説明および添付の配列説明からより完全に理解できる。
【００２２】
次の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）、およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。
【００２３】
配列一覧はここにコンパクトディスクで提供される。配列一覧を含むコンパクトディスクの内容は、３７ＣＦＲ１．５２（ｅ）に従って参照によって本願明細書に援用する。コンパクトディスクは三連で提出されて互いに同一である。ディスクは「コピー１−配列一覧」、「コピー２−配列一覧」、およびＣＲＦとラベルされる。ディスクは、２００６年１２月６日に作成された２９３，０００バイトのサイズを有するファイルＣＬ３４９５  Ｓｅｑ  Ｌｉｓｔｉｎｇ＿１１．２７．０６＿ＳＴ２５を含む。
【００２４】
配列番号１〜１７、１９〜２３、１６５、および１７２〜１７７は、表２で同定される遺伝子またはタンパク質をコーディングするＯＲＦ（またはその一部）またはプラスミドである。
【００２５】
表２
核酸およびタンパク質配列番号の要約
0005769374.tif 000003
【００２６】
（表２続き）
0005769374.tif 000004
【００２７】
（表２続き）
0005769374.tif 000005
【００２８】
配列番号１８は、Ｃｒｅリコンビナーゼ酵素によって認識されるＬｏｘＰ組み換え部位に対応する。
【００２９】
配列番号２４〜１６４は、変異部位Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３などからＭ７０までにおいて、特定の標的を定めた変異を作り出すのに使用された、７０対のヌクレオチドプライマー（すなわちそれぞれ１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂなどから６９Ａ、６９Ｂ、７０Ａおよび７０Ｂまで）に対応する。
【００３０】
配列番号１６６〜１７１は、膜二鉄タンパク質のスーパーファミリーに属する膜結合脂肪酸デサチュラーゼの特色をなすＨｉｓに富むモチーフに対応する。
【００３１】
配列番号１８７および１８８は、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼを増幅するのに使用されるプライマーｏＥｕｇＥＬ１−１およびｏＥｕｇＥＬ１−２にそれぞれ対応する。
【００３２】
配列番号１９３は、Ｍ１３Ｆ普遍的プライマーである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本明細書での用法および添付の特許請求の範囲では、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈中に明白な断りがない限り複数への言及を含む。したがって例えば「１つの植物（ａ  ｐｌａｎｔ）」への言及は複数のこのような植物、「１つの細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」への言及は１つ以上の細胞、および当業者に知られているその等価物を含む。
【００３４】
本明細書で引用する全ての特許、特許出願、および公報は、その全体を参照によって援用する。これは具体的には以下の同一譲受人の同時係属出願を含む。米国特許出願第１０／８４０４７８号明細書、米国特許出願第１０／８４０５７９号明細書、および米国特許出願第１０／８４０３２５号明細書（２００４年５月６日出願）、米国特許出願第１０／８６９６３０号明細書（２００４年６月１６日出願）、米国特許出願第１０／８８２７６０号明細書（２００４年７月１日出願）、米国特許出願第１０／９８５２５４号明細書および米国特許出願第１０／９８５６９１号明細書（２００４年１１月１０日出願）、米国特許出願第１０／９８７５４８号明細書（２００４年１１月１２日出願）、米国特許出願第１１／０２４５４５号明細書および米国特許出願第１１／０２４５４４号明細書（２００４年１２月２９日出願）、米国特許出願第１１／１６６９９３号明細書（２００５年６月２４日出願）、米国特許出願第１１／１８３６６４号明細書（２００５年７月１８日出願）、米国特許出願第１１／１８５３０１号明細書（２００５年７月２０日出願）、米国特許出願第１１／１９０７５０号明細書（２００５年７月２７日出願）、米国特許出願第１１／１９８９７５号明細書（２００５年８月８日出願）、米国特許出願第１１／２２５３５４号明細書（２００５年９月１３日出願）、米国特許出願第１１／２５１４６６号明細書（２００５年１０月１４日出願）、米国特許出願第１１／２５４１７３号明細書および米国特許出願第１１／２５３８８２号明細書（２００５年１０月１９日出願）、米国特許出願第１１／２６４７８４号明細書および米国特許出願第１１／２６４７３７号明細書（２００５年１１月１日出願）、米国特許出願第１１／２６５７６１号明細書（２００５年１１月２日出願）、米国仮特許出願第６０／７３９９８９号明細書（２００５年１１月２３日出願）、米国仮特許出願第６０／７９３５７５号明細書（２００６年４月２０日出願）、米国仮特許出願第６０／７９５８１０号明細書（２００６年４月２８日出願）、米国仮特許出願第６０／７９６６３７号明細書（２００６年５月１日出願）および米国仮特許出願第６０／８０１１７２号明細書および米国仮特許出願第６０／８０１１１９号明細書（２００６年５月１７日出願）。
【００３５】
さらに植物中におけるＰＵＦＡ産生に関する同一譲受人の米国特許出願第１０／７７６３１１号明細書（２００４年８月２６日公開）、およびアネキシンプロモーターおよび植物中での導入遺伝子発現におけるそれらの使用に関する米国特許出願第１０／７７６８８９号明細書（２００４年８月２６日公開）は、その全体を参照によって援用する。
【００３６】
本発明は、健康に良いＰＵＦＡを生成するために生化学的経路を操作するために使用してもよい、変異Δ８デサチュラーゼ酵素、および同酵素をコードする遺伝子を提供する。
【００３７】
ここで開示される方法によって作られるＰＵＦＡ、またはその誘導体は、食事代用物、または栄養補給剤、特に乳児用調製粉乳として、静脈内栄養補給を受ける患者のために、または栄養失調を予防しまたは治療するために使用できる。代案としては、通常の使用において受容者が所望量の食事補給を受け入れるように調合された、料理用油、脂肪またはマーガリン中に、純化されたＰＵＦＡ（またはその誘導体）を組み込んでもよい。ＰＵＦＡはまた、医薬または獣医学組成物の構成要素として、抗炎症薬またはコレステロール低下剤として使用されてもよい。
【００３８】
定義
本開示では、いくつかの用語および略語を使用する。以下の定義が提供される。
「読み取り枠」はＯＲＦと略記される。
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略記される。
「米国微生物系統保存機関」はＡＴＣＣと略記される。
「多価不飽和脂肪酸」はＰＵＦＡと略記される。
「トリアシルグリセロール」はＴＡＧと略記される。
【００３９】
「脂肪酸」という用語は、（より長い、およびより短い鎖長の酸の双方も知られているが）約Ｃ12〜Ｃ22の様々な鎖長の長鎖脂肪族酸（アルカン酸）を指す。優勢な鎖長はＣ16〜Ｃ22の間である。「飽和脂肪酸」対「不飽和脂肪酸」、「一不飽和脂肪酸」対「多価不飽和脂肪酸」（または「ＰＵＦＡ」）、および「オメガ−６脂肪酸」（ω−６またはｎ−６）対「オメガ−３脂肪酸」（ω−３またはｎ−３）の間の区別に関する追加的詳細は、国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットで提供されている。
【００４０】
脂肪酸はここで単純な表記体系「Ｘ：Ｙ」によって述べられており、Ｘは特定の脂肪酸中の炭素（Ｃ）原子数であり、Ｙは二重結合の数である。脂肪酸名に続く数は脂肪酸のカルボキシル末端からの二重結合の位置を示し、「ｃ」は二重結合のｃｉｓ型立体配置の接辞である［例えばパルミチン酸（１６：０）、ステアリン酸（１８：０）、オレイン酸（１８：１、９ｃ）、ペトロセリン酸（１８：１、６ｃ）、ＬＡ（１８：２、９ｃ、１２ｃ）、ＧＬＡ（１８：３、６ｃ、９ｃ、１２ｃ）、およびＡＬＡ（１８：３、９ｃ、１２ｃ、１５ｃ）］。特に断りのない限り、１８：１、１８：２、および１８：３は、オレイン酸、ＬＡ、およびＡＬＡ脂肪酸を指す。特に断りのない限り、二重結合はｃｉｓ型立体配置と仮定される。例えば１８：２（９、１２）中の二重結合は、ｃｉｓ型立体配置にあると仮定される。
【００４１】
本開示においてＰＵＦＡを既述するのに使用される命名法を下の表３に示す。「略記法」と題された欄では、オメガ−参照システムが使用されて炭素数、二重結合数、およびオメガ炭素（この目的では番号１）から数えて、オメガ炭素に最も近い二重結合の位置を示唆する。表の残りは、ω−３およびω−６脂肪酸およびそれらの前駆物質の一般名、本明細書全体で使用される略語、および各化合物の化学名を要約する。
【００４２】
表３
多価不飽和脂肪酸および前駆物質の命名法
0005769374.tif 000006
【００４３】
「トリアシルグリセロール」、「油」、および「ＴＡＧ」という用語は、グリセロール分子とエステル化する３個の脂肪酸アシル残基から構成される中性脂質を指す（そしてこのような用語は、本開示の全体を通して区別なく使用される）。このような油は、長鎖ＰＵＦＡ、ならびにより短い飽和および不飽和脂肪酸、および鎖長のより長い飽和脂肪酸を含有できる。したがって「油生合成」は、一般に細胞中でのＴＡＧ合成を指す。
【００４４】
「総脂質および油画分中のパーセント（％）ＰＵＦＡ」とは、これらの画分中の全脂肪酸に対するＰＵＦＡのパーセントを指す。「全脂質画分」または「脂質画分」という用語は、どちらも油性生物中の全脂質（すなわち中性および極性）の合計を指すので、ホスファチジルコリン（ＰＣ）画分、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）画分、およびトリアシルグリセロール（ＴＡＧまたは油）画分内に位置する脂質を含む。しかし「脂質」および「油」という用語は、本明細書全体で同義的に使用される。
【００４５】
「ＰＵＦＡ生合成経路」という用語は、オレイン酸をＬＡ、ＥＤＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡに転換する代謝過程を指す。この過程は、文献で詳しく述べられる（例えば国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットを参照されたい）。簡単に述べると、この過程は、小胞体膜中に存在する一連の特別なデサチュラーゼおよび延長酵素（すなわち「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」）による、炭素原子の添加を通じた炭素鎖延長、および二重結合付加を通じた分子不飽和化を伴う。より具体的には、「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」は、Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ14/16エロンガーゼ、Ｃ16/18エロンガーゼ、Ｃ18/20エロンガーゼおよび／またはＣ20/22エロンガーゼをはじめとする、ＰＵＦＡ生合成に関与するいずれかの酵素（および前記酵素をコードする遺伝子）を指す。
【００４６】
「ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」という用語は、適切な条件下で発現すると、ω−３およびω−６脂肪酸の片方または双方の生成を触媒する酵素をコードする一組の遺伝子を指す。典型的にω−３／ω−６脂肪酸生合成経路に関与する遺伝子は、以下の酵素のいくつかまたは全てをコードする。Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Ｃ18/20エロンガーゼ、Ｃ20/22エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、およびΔ４デサチュラーゼ。代表的な経路を図１に示し、様々な中間体を経由するオレイン酸のＤＨＡへの変換を提供して、ω−３およびω−６脂肪酸の双方が共通の原料からどのように生成できるかを実証する。経路は自然に２つの部分に別れ、１つの部分はω−３脂肪酸、別の部分はω−６脂肪酸のみを発生させる。ω−３脂肪酸のみを発生させる部分をここでω−３脂肪酸生合成経路と称する一方、ω−６脂肪酸のみを発生させる部分はここでω−６脂肪酸生合成経路と称する。
【００４７】
「機能性」という用語は、ここでω−３／ω−６脂肪酸生合成経路に関する文脈で、経路中の遺伝子のいくつか（または全て）が、活性酵素を発現し、生体内触媒作用または基質変換をもたらすことを意味する。いくつかの脂肪酸生成物は、この経路の遺伝子のサブセットの発現のみを必要とするので、「ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」または「機能性ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」は、上の段落で挙げられた全ての遺伝子が必要とされることを暗示しないものとする。
【００４８】
「デサチュラーゼ」と言う用語は、不飽和化できる、すなわち１個もしくはそれ以上の脂肪酸に二重結合を導入して、対象とする脂肪酸または前駆物質を生じさせるポリペプチドを指す。特定の脂肪酸を指すために、本明細書全体を通じたω参照システムの使用にもかかわらず、デルタシステムを使用して基質のカルボキシル末端から数えることで、デサチュラーゼの活性を示す方が都合よい。ここで特に興味深いのは、分子のカルボキシル−末端から数えて８番目および９番目の炭素原子の間で脂肪酸を不飽和化して、例えばＥＤＡからＤＧＬＡ、および／またはＥＴｒＡからＥＴＡへの変換を触媒できるΔ８デサチュラーゼである。その他のデサチュラーゼとしては、１．）ＤＧＬＡからＡＲＡおよび／またはＥＴＡからＥＰＡへの変換を触媒するΔ５デサチュラーゼ、２．）ＬＡからＧＬＡおよび／またはＡＬＡからＳＴＡへの変換を触媒するΔ６デサチュラーゼ、３．）ＤＰＡからＤＨＡへの変換を触媒するΔ４デサチュラーゼ、４．）オレイン酸からＬＡへの変換を触媒するΔ１２デサチュラーゼ、５．）ＬＡからＡＬＡおよび／またはＧＬＡからＳＴＡへの変換を触媒するΔ１５デサチュラーゼ、６．）ＡＲＡからＥＰＡおよび／またはＤＧＬＡからＥＴＡへの変換を触媒するΔ１７デサチュラーゼ、および７．）パルミチン酸からパルミトレイン酸（１６：１）および／またはステアリン酸からオレイン酸（１８：１）への変換を触媒するΔ９デサチュラーゼが挙げられる。当該技術分野では、Δ１５およびΔ１７デサチュラーゼはまた、時としてω−６脂肪酸をそれらのω−３対応物に転換する能力に基づいて、「オメガ−３デサチュラーゼ」、「ｗ−３デサチュラーゼ」、および／または「ω−３デサチュラーゼ」と称される（例えばそれぞれＬＡからＡＬＡ、およびＡＲＡからＥＰＡへの変換）。いくつかの実施態様では、脂肪酸デサチュラーゼのための遺伝子によって適切な宿主を形質転換し、宿主の脂肪酸プロフィールに対するその影響を判定することで、特定の脂肪酸デサチュラーゼの特異性を経験的に判定することが最も望ましい。
【００４９】
ここでの目的では、「ＥｇＤ８」という用語は、ここで配列番号１１によってコードされるミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）から単離されたΔ８デサチュラーゼ（配列番号１２）を指す。国際公開第２００６／０１２３２５号パンフレットおよび国際公開第２００６／０１２３２６号パンフレット［米国特許出願公開第２００５−０２８７６５２−Ａ１号明細書］で述べられているように、ＥｇＤ８は「Ｅｇ５」と１００％同一であり、機能的に同等である。
【００５０】
同様に「ＥｇＤ８Ｓ」という用語は、ここでヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化されたミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来する合成Δ８デサチュラーゼを指す（すなわち配列番号９および１０）。国際公開第２００６／０１２３２５号パンフレットおよび国際公開第２００６／０１２３２６号パンフレットで述べられているように、ＥｇＤ８Ｓは「Ｄ８ＳＦ」と１００％同一であり、機能的に同等である。
【００５１】
「変異ＥｇＤ８Ｓ」という用語は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来する合成Δ８デサチュラーゼ（すなわちＥｇＤ８Ｓ）と比較して、少なくとも１つの変異を有する本発明のΔ８デサチュラーゼを指す。「変異」はあらゆる欠失、挿入、および点変異（またはそれらの組み合わせ）を含んでもよいが、好ましい実施態様では変異ＥｇＤ８Ｓは配列番号２で記載され、（ｉ）配列番号２は４ＳからＡ、５ＫからＳ、１２ＴからＶ、１６ＴからＫ、１７ＴからＶ、５４ＡからＧ、５５ＦからＹ、６６ＰからＱ、６７ＳからＡ、１０８ＳからＬ、１１７ＧからＡ、１１８ＹからＦ、１２０ＬからＭ、１２１ＭからＬ、１２５ＱからＨ、１２６ＭからＬ、１３２ＶからＬ、１３３ＬからＶ、１６２ＬからＶ、１６３ＶからＬ、１７０ＧからＡ、１７１ＬからＶ、２７９ＴからＬ、２８０ＬからＴ、２９３ＬからＭ、３４６ＩからＶ、３４７ＩからＬ、３４８ＴからＳ、４０７ＡからＳ、４０８ＶからＱ、４１８ＡからＧ、４１９ＧからＡ、および４２２ＬからＱからなる群から選択される少なくとも１つの変異を含んでなり、変異は合成コドン最適化ＥｇＤ８Ｓ配列（すなわち配列番号１０）と比較して定義され、（ｉｉ）配列番号２は配列番号１０と１００％同一でない。より好ましい実施態様では、変異ＥｇＤ８Ｓは合成コドン最適化ＥｇＤ８Ｓ配列と比較して少なくとも約１０〜１８個の変異、より好ましくは少なくとも約１９〜２５個の変異、最も好ましくは合成コドン最適化ＥｇＤ８Ｓ配列（すなわち配列番号１０）と比較して少なくとも約２６〜３３個の変異を有する。別の実施態様では、変異ＥｇＤ８ＳのΔ８デサチュラーゼ活性は、合成コドン最適化ＥｇＤ８Ｓ（配列番号１０）のΔ８デサチュラーゼ活性と少なくとも機能的にほぼ同等である。
【００５２】
変異ＥｇＤ８Ｓ配列の酵素活性および特異的選択性がＥｇＤ８Ｓに匹敵すれば、異なるポリペプチド配列にもかかわらず、変異ＥｇＤ８ＳはＥｇＤ８Ｓと「少なくとも機能的にほぼ同等である」。したがって機能的に同等の変異ＥｇＤ８Ｓ配列は、それぞれの酵素の「変換効率」を比較すると、ＥｇＤ８Ｓに比べて実質的に低下していないΔ８デサチュラーゼ活性を有する（すなわち変異ＥｇＤ８Ｓは、ＥｇＤ８Ｓの酵素活性の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８５％、最も好ましくは少なくとも約９５％を有する）。より好ましい実施態様では、ＥｇＤ８Ｓと比較すると変異ＥｇＤ８Ｓは酵素活性および特異的選択性の増大を有する（すなわちＥｇＤ８Ｓの酵素活性の少なくとも約１０５％、より好ましくは少なくとも約１１５％、最も好ましくは少なくとも約１２５％）。
【００５３】
「変換効率」および「％基質変換」という用語は、それによって特定酵素（例えばデサチュラーゼ）が基質を生成物に変換できる効率を指す。変換効率は、次の式に従って測定される。（［生成物］／［基質＋生成物］）*１００。式中、「生成物」は即時の生成物およびそれに由来する経路中の全ての生成物を含む。
【００５４】
「エロンガーゼ系」という用語は、エロンガーゼ系が作用する脂肪酸基質よりも炭素２個分長い脂肪酸を生成する、脂肪酸炭素鎖延長の役割を担う４つの酵素のセットを指す。より具体的には鎖長延長過程は、ＣｏＡがアシルキャリアである脂肪酸シンターゼの協力によって起きる（Ｌａｓｓｎｅｒら、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、８：２８１〜２９２頁（１９９６年））。基質特異的でありまた律速でもあることが分かった第１のステップでは、マロニル−ＣｏＡが長鎖アシル−ＣｏＡと縮合してＣＯ2およびβ−ケトアシル−ＣｏＡを生じる（アシル部分は炭素原子２個分延長されている）。引き続く反応は、β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡへの還元、エノイル−ＣｏＡへの脱水、および延長アシル−ＣｏＡを生じる第２の還元を含む。エロンガーゼ系によって触媒される反応の例は、ＧＬＡからＤＧＬＡ、ＳＴＡからＥＴＡ、およびＥＰＡからＤＰＡへの変換である。
【００５５】
ここでの目的では、第１の縮合反応（すなわちマロニル−ＣｏＡからβ−ケトアシル−ＣｏＡへの変換）を触媒する酵素は、総称的に「エロンガーゼ」と称される。一般にエロンガーゼの基質選択性はいくぶん広いが、鎖長と不飽和度の双方によって差別される。したがってエロンガーゼは異なる特異性を有することができる。例えばＣ14/16エロンガーゼはＣ14基質（例えばミリスチン酸）を利用し、Ｃ16/18エロンガーゼはＣ16基質（例えばパルミチン酸）を利用し、Ｃ18/20エロンガーゼはＣ18基質（例えばＧＬＡ、ＳＴＡ）を利用し、Ｃ20/22エロンガーゼはＣ20基質（例えばＥＰＡ）を利用する。同様にしてΔ９エロンガーゼは、ＬＡおよびＡＬＡからＥＤＡおよびＥＴｒＡへの変換をそれぞれ触媒できる（例えば国際公開第２００２／０７７２１３号パンフレット）。いくつかのエロンガーゼは広い特異性を有し、したがって単一酵素がいくつかのエロンガーゼ反応を触媒できてもよいことに留意することが重要である（例えばそれによってＣ16/18エロンガーゼおよびＣ18/20エロンガーゼの双方として機能する）。
【００５６】
「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」という用語は長鎖ＰＵＦＡを生成するための生合成経路を指し、前記経路は最低限Δ９エロンガーゼおよびΔ８デサチュラーゼを含んでなり、それによってそれぞれＬＡおよびＡＬＡからのＤＧＬＡおよび／またはＥＴＡの生合成を可能にする。この経路は、ＧＬＡおよび／またはＳＴＡの生合成が除外されるので、いくつかの実施態様では有利かもしれない。
【００５７】
「アミノ酸」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの基本的化学構造単位を指す。アミノ酸は、参照によって本明細書に援用するＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１３：３０２１〜３０３０（１９８５年）およびＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２１９（２）：３４５〜３７３（１９８４年）で述べられているＩＵＰＡＣ−ＩＹＵＢ基準に準拠して、アミノ酸のための１文字コードまたは３文字コードのいずれかによって同定される。
【００５８】
「保存的アミノ酸置換」という用語は、タンパク質の化学的または機能的性質を変化させることなしに、特定のタンパク質中のアミノ酸残基を別のアミノ酸で置換することを指す。例えば特定の部位において化学的に等価なアミノ酸の生成をもたらす（しかしコードされた折り畳みタンパク質の構造および機能特性に影響しない）遺伝子中の変更が一般的であることは、当該技術分野でよく知られている。本発明の目的で、「保存的アミノ酸置換」は次の５群の１つ内の交換として定義される。
１．小型脂肪族の非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ［Ａ］、Ｓｅｒ［Ｓ］、Ｔｈｒ［Ｔ］（Ｐｒｏ［Ｐ］、Ｇｌｙ［Ｇ］）
２．極性の負に帯電した残基およびそれらのアミド：Ａｓｐ［Ｄ］、Ａｓｎ［Ｎ］、Ｇｌｕ［Ｅ］、Ｇｌｎ［Ｑ］
３．極性の正に帯電した残基：Ｈｉｓ［Ｈ］、Ａｒｇ［Ｒ］、Ｌｙｓ［Ｋ］
４．大型脂肪族非極性残基：Ｍｅｔ［Ｍ］、Ｌｅｕ［Ｌ］、Ｉｌｅ［Ｉ］、Ｖａｌ［Ｖ］（Ｃｙｓ［Ｃ］）および
５．大型芳香族残基：Ｐｈｅ［Ｆ］、Ｔｙｒ［Ｙ］、Ｔｒｐ［Ｗ］。
したがってわずかに疎水性のアミノ酸であるＡｌａは、別のより疎水性の低い残基（例えばＧｌｙ）によって置換されてもよい。同様に１個の負に帯電した残基による別のもの（例えばＡｓｐによるＧｌｕ）の置換または１個の正に帯電した残基による別のもの（例えばＬｙｓによるＡｒｇ）の置換をもたらす変化は、機能的に同等の生成物を生じることが予期できる。したがって保存的アミノ酸置換は、１．）置換領域内のポリペプチド主鎖構造、２．）標的部位の分子の電荷または疎水性、または３．）側鎖の大半を一般に保つ。さらに多くの場合、タンパク質分子のＮ−末端とＣ−末端部分の修正は、タンパク質活性を変更することが予期されない。
【００５９】
「非保存的アミノ酸置換」という用語は、タンパク質特性に最大変化を生じることが一般に予期されるアミノ酸置換を指す。したがって例えば非保存的アミノ酸置換は、それによって１．）親水性残基が疎水性残基を置換し、それによって置換され（例えばＳｅｒまたはＴｈｒがＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌを置換し、それによって置換される）、２．）ＣｙｓまたはＰｒｏがあらゆるその他の残基を置換し、それによって置換され、３．）電気陽性側鎖を有する残基が電気陰性残基を置換し、それによって置換され（例えばＬｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓがＡｓｐまたはＧｌｕを置換し、それによって置換される）、または４．）かさ高い側鎖を有する残基が側鎖を有さないものを置換し、それによって置換される（例えばＰｈｅがＧｌｙを置換し、それによって置換される）ものである。時折、５群中の２つの間の非保存的アミノ酸置換は、コードされるタンパク質の活性に影響しない。
【００６０】
「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、「核酸断片」、および「単離された核酸断片」という用語は、本明細書で同義的に使用される。ポリヌクレオチドは、場合により合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を含有する、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであってもよい。ＤＮＡのポリマーの形態のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはそれらの混合物の１つ以上のセグメントを含んでなってもよい。
【００６１】
核酸断片は、適切な温度および溶液イオン強度条件下で、核酸断片の一本鎖形態がその他の核酸断片とアニールできる場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの別の核酸断片と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件については良く知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９年）の特に第１１章およびその表１１．１で例証される（参照によってその内容全体を本明細書に援用する）。温度およびイオン強度条件が、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を定める。ストリンジェントな条件は、（遠縁の生物からの相同的配列などの）中程度に類似の断片をスクリーニングするため、そして（近縁の生物からの機能性酵素を複製する遺伝子などの）高度に類似した断片をスクリーニングするために調節できる。ハイブリダイゼーション後の洗浄が、ストリンジェンシー条件を決定する。１つの好ましい条件のセットは、室温において６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで１５分間に始まり、次に４５℃において２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで３０分間を反復し、次に５０℃において０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを３０分間を２回反復する、一連の洗浄を使用する。より好ましいストリンジェントな条件のセットはより高い温度を使用し、そこでは洗浄は、最後の０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中での２回の３０分間の洗浄の温度を６０℃に増大させること以外は上述したのと同一である。別の好ましい高度にストリンジェントな条件のセットは、６５℃において０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での２回の最終洗浄を使用する。さらに別のストリンジェントな条件のセットは、例えば０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでのハイブリダイゼーションを含む。
【００６２】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー次第で塩基間のミスマッチは可能であるが、ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含有することを必要とする。核酸がハイブリダイゼーションする適切なストリンジェンシーは、当該技術分野で良く知られた変数である核酸の長さおよび相補性の程度に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高い程、これらの配列を有する核酸ハイブリッドのＴｍ値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対安定性（より高いＴｍに対応する）は、次の順で低下する。ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さがヌクレオチド１００個を超えるハイブリッドでは、Ｔｍを計算する式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出９．５０〜９．５１参照）。より短かい核酸、すなわちオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションのためにはミスマッチの配置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出１１．７〜１１．８参照）。一実施態様では、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくともヌクレオチド約１０個である。ハイブリダイズ可能な核酸の好ましい最小の長さは少なくともヌクレオチド約１５個、より好ましくは少なくともヌクレオチド約２０個、そして最も好ましくは長さが少なくともヌクレオチド約３０個である。さらに当業者は、プローブの長さなどの要因次第で、温度および洗浄液の塩濃度を必要に応じて調節してもよいことを認識する。
【００６３】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「かなりの部分」とは、当業者による配列の手動評価によって、あるいはＢＬＡＳＴ（「基礎的局在性配列検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ」、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９３年））などのアルゴリズムを使用したコンピュータ自動化アラインメントおよび同定によって、遺伝子またはポリペプチドの推定上の同定を得るのに十分なポリペプチドまたは遺伝子のヌクレオチド配列のアミノ酸配列を含んでなる部分である。一般に推定的にポリペプチドまたは核酸配列が既知のタンパク質または遺伝子に相同的であると同定するためには、１０個以上の隣接するアミノ酸または３０個以上のヌクレオチド配列が必要である。さらにヌクレオチド配列に関して、配列依存遺伝子同定法（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークの原位置ハイブリダイゼーション）において、２０〜３０個の隣接するヌクレオチドを含んでなる遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用しても良い。さらにプライマーを含んでなる特定の核酸断片を得るために、塩基１２〜１５個の短いオリゴヌクレオチドを増幅プライマーとしてＰＣＲで使用しても良い。したがってヌクレオチド配列の「かなりの部分」は、配列を含んでなる核酸断片を特異的に同定、および／または単離できるようにする十分な配列を含んでなる。本明細書は、1つ以上の特定のΔ８デサチュラーゼタンパク質をコードする完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。当業者はここで報告される配列の恩恵を被り、当業者に既知の目的のために、今や開示された配列の全てまたはかなりの部分を使用できる。したがって本発明は、添付の配列表で報告される完全な配列、ならびに上で定義される配列のかなりの部分を含んでなる。
【００６４】
「相補的」という用語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係について述べるために使用される。例えばＤＮＡに関して、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって本発明は、添付の配列一覧で報告されるような完全な配列に相補的な単離された核酸断片、ならびに実質的に類似した核酸配列をもまた含む。
【００６５】
「相同性」、「相同的な」、「実質的に類似した」、および「実質的に相当する」という用語は、本明細書で同義的に使用される。それらは１つ以上のヌクレオチド塩基の変化が、核酸断片が遺伝子発現を仲介する能力、または特定のフェノタイプを生じる能力に影響しない核酸断片を指す。これらの用語はまた、最初の無修飾断片と比較して得られる核酸断片の機能特性を実質的に改変しない、１つ以上のヌクレオチドの欠失または挿入などの本発明の核酸断片の修飾も指す。したがって当業者は理解するように、本発明は特定の例示的配列を超えて包含するものと理解される。
【００６６】
さらに当業者は、本発明によって包含される実質的に類似した核酸配列がまた、ストリンジェントな条件（例えば０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃）下で、ここで例証される配列、またはここで開示される核酸配列のいずれかと機能的に同等である、ここで開示されるヌクレオチド配列のあらゆる部分とハイブリダイズするそれらの能力によっても定義されることを認識する。
【００６７】
「コドン縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響することなく、ヌクレオチド配列の多様性を可能にする遺伝コードの性質を指す。したがって本発明は、配列番号２、１０、および１２に記載の本Δ８デサチュラーゼポリペプチドをコードする、アミノ酸配列の全てまたはかなりの部分をコードするあらゆる核酸断片に関する。当業者は、特定のアミノ酸を特定化するヌクレオチドコドンの使用における、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」についてよく知っている。したがって宿主細胞中の改善された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好むコドン使用頻度に近くなるように遺伝子をデザインすることが望ましい。
【００６８】
ＤＮＡ配列に関連して「化学的に合成された」とは、構成要素ヌクレオチドが、生体外で構築されたことを意味する。ＤＮＡの手動化学合成は確立された手順を使用して達成されてもよく、あるいはいくつかの市販の機器の１つを使用して自動化学合成を実施できる。「合成遺伝子」は、当業者に公知の手順を使用して化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成単位からアセンブルできる。これらの構成単位をライゲーションしアニールして遺伝子セグメントを形成し、次にそれを酵素的にアセンブルして遺伝子全体を構築する。したがって遺伝子をヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のために個別に調整し、宿主細胞のコドンバイアスを反映させることができる。当業者は、コドン利用が宿主によって好まれるコドンに偏っている場合の遺伝子発現成功の可能性を理解する。好ましいコドンの判定は、配列情報が利用できる宿主細胞由来の遺伝子の調査に基づくことができる。
【００６９】
「遺伝子」とは特定のタンパク質を発現する核酸断片を指し、それはコード領域のみを指してもよく、またはコード配列に先行する（５’非コード配列）およびそれに続く（３’非コード配列）制御配列を含んでもよい。「天然遺伝子」とは、自然界にそれ自体の制御配列と共に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界に共に見られない制御およびコード配列を含んでなる天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる起源由来の制御配列およびコード配列、あるいは同一起源由来であるが、自然界に見られるのとは異なる様式で配列される制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物ゲノム中のその天然位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子とは、通常は宿主生物には見られないが、遺伝子移入によって宿主生物に導入された遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物中に挿入された天然遺伝子、天然宿主内の新しい位置に導入された天然遺伝子、あるいはキメラ遺伝子を含んでなることができる。「導入遺伝子」とは、形質転換によってゲノム中に導入された遺伝子である。「コドン最適化遺伝子」とは、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好むコドン使用頻度を模倣するようにデザインされた遺伝子である。
【００７０】
「アレル」は、染色体上の特定遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代案の形態の一つである。染色体上の特定遺伝子座に存在する全てのアレルが同じであれば、その植物はその遺伝子座において同型接合性である。染色体上の特定遺伝子座に存在するアレルが異なれば、植物はその遺伝子座において異種接合体である。
【００７１】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適した制御配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、配列内、または下流（３’非コード配列）に位置して、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。制御配列は次を含んでも良い。プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位、およびステム−ループ構造。
【００７２】
「プロモーター」とは、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節できるＤＮＡ配列を指す。一般にコード配列はプロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーター配列は、近位およびより遠位の上流の要素からなってもよく、後者の要素はエンハンサーと称されることが多い。したがって「エンハンサー」はプロモーター活性を刺激できるＤＮＡ配列であり、プロモーターの生得要素であっても、またはプロモーターのレベルまたは組織特異性を増強するために挿入された異種の要素であってもよい。プロモーターは、その全体を天然遺伝子に由来してもよく、または自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されてもよく、または合成ＤＮＡセグメントを含んでなってさえもよい。異なるプロモーターが、異なる組織または細胞型において、または発達の異なる段階で、または異なる環境または生理学的条件に応えて、遺伝子発現を誘導してもよいことは当業者によって理解される。ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全に確定されていないので、いくつかのバリエーションのＤＮＡ断片が、同一プロモーター活性を有するかもしれないことがさらに認識される。ほとんどの細胞タイプにおいてほとんどの場合に遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。植物細胞中で有用な様々なタイプの新しいプロモーターが絶えず発見されている。多数の例が、Ｏｋａｍｕｒｏ，Ｊ．Ｋ．およびＧｏｌｄｂｅｒｇ，Ｒ．Ｂ．編、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ、１５：１〜８２頁（１９８９年）にある。
【００７３】
「翻訳リーダー配列」とは、遺伝子およびコード配列のプロモーター配列間に位置するポリヌクレオチド配列を指す。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列上流の完全に処理されたｍＲＮＡ中に存在する。翻訳リーダー配列は、一次転写物からｍＲＮＡへの加工、ｍＲＮＡ安定性または翻訳効率に影響するかもしれない。翻訳リーダー配列の例については、（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｒ．およびＦｏｓｔｅｒ、Ｇ．Ｄ．、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３：２２５〜２３６頁（１９９５年））で述べられている。
【００７４】
「３’非−コード配列」、「転写ターミネーター」、および「終止配列」という用語は、コード配列下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これとしては、ｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響できる調節シグナルをコードするポリアデニル化認識配列およびその他の配列が挙げられる。ポリアデニル化シグナルは、通常ｍＲＮＡ前駆物質の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響することで特徴づけられる。３’領域は、随伴コード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響できる。異なる３’非コード配列の使用については、Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ，Ｉ．Ｌ．ら（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１：６７１〜６８０頁（１９８９年））によって例証される。
【００７５】
「ＲＮＡ転写物」は、ＲＮＡポリメラーゼが触媒するＤＮＡ配列の転写に起因する生成物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーであれば、それは一次転写物と称される。ＲＮＡ転写物は、それが一次転写物の転写後プロセッシングに由来するＲＮＡ配列であれば、成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」とは、イントロンがなく、細胞がタンパク質に翻訳できるＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡテンプレートに対して相補的で、酵素逆転写酵素を使用してそれから合成されるＤＮＡを指す。ｃＤＮＡは一本鎖であることができ、またはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片を使用して二本鎖形態に変換できる。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含んで、細胞中または生体外でタンパク質に翻訳できるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的で標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号明細書；国際公開第９９／２８５０８号パンフレット）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝転写物のあらゆる部分、すなわち５’非コード配列、３’非コード配列、イントロン、またはコード配列に対するものであってもよい。「機能性ＲＮＡ」とは、翻訳されなくてもよいが、なおも細胞過程に影響する、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、またはその他のＲＮＡを指す。「補体」および「逆補体」という用語は、ここでｍＲＮＡ転写物に関して同義的に使用され、メッセージのアンチセンスＲＮＡを定義することを意図する。
【００７６】
「作動的に連結する」という用語は、一方の機能がもう一方によって制御されるような、単一核酸断片上の核酸配列の協合を指す。例えばプロモーターがそのコード配列の発現に影響できる（すなわちコード配列がプロモーターの転写制御下にある）場合、それはコード配列と作動的に連結する。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列と作動的に連結できる。
【００７７】
「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」と言う用語は、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を運ぶことが多く、通常環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、あらゆる供給源に由来する一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの配列、ゲノム一体化配列、直鎖または環状のファージまたはヌクレオチド配列を自律的に複製するかもしれず、そこではいくつかのヌクレオチド配列が独自の構成に結合または組み換えされ、それは選択された遺伝子産物のために、適切な３’非翻訳配列と共にプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞中に導入することができる。「発現カセット」とは、外来性遺伝子を含有し、外来性遺伝子に加えて外来性宿主におけるその遺伝子の促進された発現を可能にする要素を有する特定のベクターを指す。
【００７８】
「組み換えコンストラクト」、「発現コンストラクト」、「キメラコンストラクト」、「コンストラクト」、および「組み換えＤＮＡコンストラクト」という用語は、本明細書で同義的に使用される。組み換えコンストラクトは、例えば自然界に一緒には見られない、制御配列およびコード配列などの核酸断片の人為的組み合わせを含んでなる。例えばキメラコンストラクトは、異なる起源に由来する制御配列およびコード配列、または同一起源に由来する制御配列およびコード配列を含んでなってもよいが、自然界に見られるのとは異なる様式で配列される。このようなコンストラクトはそれ自体を使用してもよく、またはベクターと併せて使用してもよい。ベクターを使用する場合、当業者によく知られているように、ベクターの選択は宿主細胞を形質変換するのに使用される方法に左右される。例えばプラスミドベクターが使用できる。当業者は、本発明の単離された核酸断片のいずれかを含んでなる宿主細胞を成功裏に形質変換し、選択し、増殖するためにベクター上に存在しなくてはならない遺伝的要素について十分承知している。当業者はまた、異なる独立した形質転換事象が、異なるレベルおよびパターンの発現をもたらし（Ｊｏｎｅｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２４１１〜２４１８頁（１９８５年）；Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１８：７８〜８６頁（１９８９年））、したがって所望の発現レベルおよびパターンを示す株または系統を得るために多数の事象をスクリーンしなくてはならないことを認識する。このようなスクリーニングは、特にＤＮＡブロットのサザン分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、９８：５０３頁（１９７５年））、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（Ｋｒｏｃｚｅｋ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．、６１８（１〜２）：１３３〜１４５頁（１９９３年））、タンパク質発現のウエスタンおよび／またはＥＬＩＳＡ分析、ＰＵＦＡ生成物の表現型分析またはＧＣ分析によって達成されてもよい。
【００７９】
「発現」という用語は、ここでの用法では、本発明の核酸断片に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指してもよい。
【００８０】
「成熟」タンパク質とは、翻訳後処理ポリペプチド（すなわち一次翻訳生成物中に存在するあらゆるプレ−またはプロペプチドがそれから除去されているもの）を指す。「前駆型」タンパク質とは、ｍＲＮＡの翻訳の一次生成物（すなわちプレ−およびプロペプチドがなおも存在している）を指す。プレ−およびプロペプチドは、細胞内局在化シグナルであってもよいがこれに限定されるものではない。
【００８１】
「形質転換」とは、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす、核および細胞小器官ゲノムの双方を含む宿主生物のゲノムへの核酸断片の転移を指す。対照的に「一時的形質転換」とは、組み込みまたは安定した遺伝形質なしに遺伝子発現をもたらす、宿主生物の核、またはＤＮＡ含有細胞小器官への核酸断片の転移を指す。したがって形質転換のために使用される核酸分子は、例えば自律的に複製するプラスミドであってもよく、またはそれは宿主生物のゲノム中に組み込まれてもよい。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」または「組み換え」または「形質転換」生物と称される。
【００８２】
「アンチセンス阻害」とは、標的タンパク質の発現を抑制できるアンチセンスＲＮＡ転写物の生成を指す。「共抑制」とは、同一のまたは実質的に同様の外来性または内在性遺伝子の発現を抑止できるセンスＲＮＡ転写物の生成を指す（米国特許第５，２３１，０２０号明細書）。センス方向で、内在性ｍＲＮＡとの相同性を有する核酸配列の過剰発現に着目して、植物中の共抑制コンストラクトが以前デザインされており、それは過剰発現配列との相同性を有する全てのＲＮＡの減少をもたらす（Ｖａｕｃｈｅｒｅｔら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、１６：６５１〜６５９頁（１９９８年）；Ｇｕｒａ，Ｎａｔｕｒｅ、４０４：８０４〜８０８頁（２０００年））。この現象の全体的効率は低く、ＲＮＡ減少の程度は大きく変動する。引き続く研究は、発現されるＲＮＡのための潜在的「ステムループ」構造をもたらす、相補的方向のｍＲＮＡをコードする配列の全てまたは一部を組み込んだ「ヘアピン」構造の使用について述べている（国際公開第９９／５３０５０号パンフレット、国際公開第０２／００９０４号パンフレット）。これは回収される遺伝子導入植物において、共抑制の頻度を増大させる。別の変法は、近位ｍＲＮＡをコードする配列の抑制、または「サイレンシング」を誘導するための植物ウィルス配列の使用について述べている（国際公開第９８／３６０８３号パンフレット）。これらの共抑制現象のどちらも機構的に解明されていないが、遺伝的証拠はこの複雑な状況を解明し始めている（Ｅｌｍａｙａｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１０：１７４７〜１７５７頁（１９９８年））。
【００８３】
「油性」という用語は、それらのエネルギー源を脂質の形態で蓄積する傾向がある生物を指す（Ｗｅｅｔｅ、Ｆｕｎｇａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙより、第２版、Ｐｌｅｎｕｍ、１９８０年）。一般にこれらの微生物の細胞油またはＴＡＧ含量はＳ字形曲線に従い、脂質濃度は、それが後期対数増殖期または初期静止増殖期で最大に達するまで増大し、次に後期静止期および死滅相において徐々に減少する（ＹｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉおよびＷａｒｄ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５７：４１９〜２５頁（１９９１年））。
【００８４】
「油性酵母」という用語は、油を作ることができる酵母に分類される微生物を指す。油性微生物がそれらの乾燥細胞重量の約２５％以上を油として蓄積することは珍しくない。油性酵母の例としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８５】
当該技術分野で知られている「％同一性」と言う用語は、配列を比較して判定される２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の関係である。当該技術分野で「同一性」は、場合によってはこのような配列ストリング間の整合によって判定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、１．）「計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＮＹ（１９８８年）、２．）「Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ」（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ、ＮＹ（１９９３年）、３．）「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ」、第一部、（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．、およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）Ｈｕｍａｎｉａ、ＮＪ（１９９４年）、４．）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ、ＮＹ（１９８７年）、５．）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ」（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ、ＮＹ（１９９１年）で述べられているものをはじめとするが、これに限定されるものではない公知の方法によって容易に計算できる。同一性を判定する好ましい方法は、試験される配列間に最良の整合を与えるようにデザインされる。同一性および類似性を判定する方法は、一般に入手できるコンピュータプログラムで体系化されている。
【００８６】
「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖアラインメント法」は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１〜１５３頁（１９８９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ら（１９９２年）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９〜１９１頁に記載）と称されるアラインメント法に相当し、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にある。配列アラインメントおよび％同一性の計算は、ＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムを使用して実施されてもよい。配列の多重アラインメントは、特に断りのない限りデフォルトパラメーター（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）で、Ｃｌｕｓｔａｌアラインメント法（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ、５：１５１１５３頁（１９８９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｄ．Ｇ．ら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、８：１８９〜１９１頁（１９９２年））を使用して実施される。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ法を使用したペアワイズアラインメントおよびタンパク質配列の％同一性計算のためのデフォルトパラメーターは次のとおり。ＫＴＵＰＬＥ  １、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５。Ｃｌｕｓｔａｌプログラムを使用した配列の比較後、同プログラム中の「配列距離」表を見れば「％同一性」を得ることができる。
【００８７】
「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法」は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２：４６７３〜４６８０頁（１９９４年）に記載）と称されるアラインメント法に相当し、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ５．０７プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にある。多重アラインメントおよびタンパク質配列の％同一性計算のためのデフォルトパラメーターは、特に断りのない限り次のとおり。ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、ＤＥＬＡＹ  ＤＩＶＥＲＧＥＮＣＥ  ＳＥＱＳ（％）＝３０、ＤＮＡ  ＴＲＡＮＳＩＴＩＯＮ  ＷＥＩＧＨＴ＝０．５０、タンパク質重量マトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔシリシーズ、およびＤＮＡ重量マトリックス＝ＩＵＢ。ペアワイズアラインメントおよびタンパク質配列％の同一性計算のためのデフォルトパラメーターは、特に断りのない限り次のとおり。ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１、タンパク質重量マトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ２５０、およびＤＮＡ重量マトリックス＝ＩＵＢ。
【００８８】
「ＢＬＡＳＴＮアラインメント法」とは、デフォルトパラメーターを使用してヌクレオチド配列を比較するために国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）によって提供されるアルゴリズムである。
【００８９】
同一または同様の機能または活性を有するポリペプチドをその他の化学種から同定するのに、多くのレベルの配列同一性が有用であることは、当業者によく理解されている。％同一性の有用な例としては、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、または５０％〜１００％のあらゆる整数百分率が挙げられるが、これに限定されるものではない。実際、本発明について述べるのに、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％などの５０％〜１００％のあらゆる整数のアミノ酸同一性が有用であってもよい。またこの単離されたヌクレオチド断片のあらゆる全長または部分的補体も興味深い。
【００９０】
「配列分析ソフトウェア」と言う用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のために有用なあらゆるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、市販のものでも、あるいは独立して開発されても良い。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、１．）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのＧＣＧプログラム一式（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０）、２．）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０年））、および３．）ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）からのＤＮＡＳＴＡＲ、４．）Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）からのＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ、および５．）スミス−ウォーターマン・アルゴリズムを組み入れたＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、１９９２年会議、１１１〜２０、編集者：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。本明細書の文脈では、配列分析ソフトウェアを分析のために使用する場合、分析結果は特に断りのない限り、言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくものと理解される。ここでの用法では、「デフォルト値」とは、最初に初期化されるときにソフトウェアに元からロードされる、あらゆる値またはパラメータの組を意味する。
【００９１】
適切な核酸断片（本発明の単離されたポリヌクレオチド）は、ここで報告されるアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一のポリペプチドをコードする。より好ましい核酸断片は、ここで報告されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％と同一のアミノ酸配列をコードするのに対し、最も好ましいのは少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列をコードする核酸断片である。同一または同様の機能または活性を有するポリペプチドをその他の化学種から同定するのに、多くのレベルの配列同一性が有用であることは、当業者によってよく理解されている。好ましい範囲は上述のとおりであるが、ここでの目的では８５％〜１００％のあらゆる整数百分率が有用である。
【００９２】
適切な核酸断片は、上の相同性を有するだけでなく、典型的に少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０個のアミノ酸、なおもより好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【００９３】
ここで使用される標準リコンビナントＤＮＡおよび分子クローニング技術については当該技術分野で良く知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９年）（下文においてＭａｎｉａｔｉｓ）；Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．、Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．およびＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８４年）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版（１９８７年）でさらに詳しく述べられている。
【００９４】
概要：ω脂肪酸およびトリアシルグリセロールの生合成
オレイン酸がω−３／ω−６脂肪酸に変換される代謝過程は、炭素原子の付加を通じた炭素鎖の延長、および二重結合の付加を通じた分子の不飽和化を伴う。これには、小胞体膜中に存在する一連の特殊不飽和化およびエロンガーゼが必要である。しかし図１に示されて後述されるように、特定のω−３／ω−６脂肪酸生成のための複数の代案経路があることが多い。
【００９５】
具体的には全ての経路は、Δ１２デサチュラーゼによる、オレイン酸から第１のω−６脂肪酸であるＬＡへの最初の変換を必要とする。次に「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」を使用して、ω−６脂肪酸は以下のように形成される。（１）ＬＡがΔ９エロンガーゼによってＥＤＡに変換される；（２）ＥＤＡがΔ８デサチュラーゼによってＤＧＬＡに変換される；（３）ＤＧＬＡがΔ５デサチュラーゼによってＡＲＡに変換される。代案としては「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」は、以下のようにしてω−３脂肪酸の形成のために利用できる。（１）ＬＡがΔ１５デサチュラーゼによって、第１のω−３脂肪酸であるＡＬＡに変換される；（２）ＡＬＡがΔ９エロンガーゼによってＥＴｒＡに変換される；（３）ＥＴｒＡがΔ８デサチュラーゼによってＥＴＡに変換される；（４）ＥＴＡがΔ５デサチュラーゼによってＥＰＡに変換される；（５）ＥＰＡがＣ20/22エロンガーゼによってＤＰＡに変換される；（６）ＤＰＡがΔ４デサチュラーゼによってＤＨＡに変換される。場合によりω−６脂肪酸がω−３脂肪酸に変換されてもよく、例えばＥＴＡおよびＥＰＡは、Δ１７デサチュラーゼ活性によってそれぞれＤＧＬＡおよびＡＲＡから生成される。
【００９６】
ω−３／ω−６脂肪酸の生合成のための代案の経路は、Δ６デサチュラーゼおよびＣ18/20エロンガーゼ（すなわち「Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路」）を利用する。より具体的にはＬＡおよびＡＬＡが、Δ６デサチュラーゼによってそれぞれＧＬＡおよびＳＴＡに変換されてもよく、次にＣ18/20エロンガーゼがＧＬＡをＤＧＬＡに、および／またはＳＴＡをＥＴＡに変換する。
【００９７】
ω−３／ω−６脂肪酸の生成のために特定の宿主生物中で発現することが必要とされる特定の機能性は、宿主細胞（およびその天然ＰＵＦＡプロフィールおよび／またはデサチュラーゼ／エロンガーゼプロフィール）、基質の可用性、およびその所望の最終産物に左右されることが考察される。例えばいくつかの実施態様では、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路によるＰＵＦＡはＧＬＡを欠くことからΔ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路の発現とは対照的に、前者経路の発現が好ましいかもしれない。
【００９８】
当業者は、ω−３／ω−６脂肪酸生合成のために所望される各酵素をコードする、様々な候補遺伝子を同定できるであろう。有用なデサチュラーゼおよびエロンガーゼ配列はあらゆる供給源に由来してもよく、例えば天然供給源（細菌、藻類、真菌、植物、動物など）から単離され、半合成経路によって生成され、または新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）合成される。宿主中に導入されるデサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子の特定の供給源は重大でないが、デサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有する特異的ポリペプチド選択のための考慮事項としては以下が挙げられる。１．）ポリペプチドの基質特異性、２．）ポリペプチドまたはその構成要素が律速酵素であるかどうか、３．）デサチュラーゼまたはエロンガーゼが所望のＰＵＦＡ合成に必須であるかどうか、および／または４．）ポリペプチドが必要とする補助因子。発現したポリペプチドは、好ましくは宿主細胞中のその位置の生化学的環境に適合したパラメーターを有する（国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットを参照されたい）。
【００９９】
追加的実施態様では、特定の各デサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼの変換効率を考慮することもまた有用であろう。より具体的には、各酵素が基質を生成物に変換するのに１００％の効率で機能することは稀なので、宿主細胞中に生成される未精製油の最終脂質プロフィールは、典型的に所望のω−３／ω−６脂肪酸、ならびに様々な上流中間ＰＵＦＡからなる様々なＰＵＦＡの混合物である。したがって、生成物の所望の最終脂質プロフィールを考慮しなければならない所望の脂肪酸生合成を最適化するのに際し、各酵素の変換効率の考慮もまた重要である。
【０１００】
上のそれぞれの考慮を念頭に、公的に入手可能な文献（例えばＧｅｎＢａｎｋ）、特許文献、およびＰＵＦＡ生成能力を有する生物の実験的分析に従って、適切なデサチュラーゼおよびエロンガーゼ活性（例えばΔ６デサチュラーゼ、Ｃ18/20エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ14/16エロンガーゼ、Ｃ16/18エロンガーゼ、Δ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、およびＣ20/22エロンガーゼ）を有する候補遺伝子を同定できる。これらの遺伝子は、特定宿主生物に導入して、生物のＰＵＦＡ合成を可能にしまたは増強するのに適する。
【０１０１】
（飽和および不飽和脂肪酸および短鎖および長鎖脂肪酸をはじめとする）脂肪酸がひとたび生物中で合成されると、それらはトリアシルグリセリド（ＴＡＧ）に組み込まれてもよい。ＴＡＧ（ＰＵＦＡをはじめとする脂肪酸の主要保存単位）は、以下を伴う一連の反応によって形成される。１．）リゾホスファチジン酸を生じる、アシル基転移酵素を通じた１分子のアシル−ＣｏＡのグリセロール−３−リン酸へのエステル化；２．）１，２−ジアシルグリセロールリン酸（一般にホスファチジン酸として同定される）を生じる、アシル基転移酵素を通じたアシル−ＣｏＡの第２の分子のエステル化；３．）１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を生じる、ホスファチジン酸ホスファターゼによるリン酸の除去；および４．）ＴＡＧを形成するアシル基転移酵素の作用による第３の脂肪酸の付加。
【０１０２】
ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ８デサチュラーゼの配列同定
同一譲受人の国際公開第２００６／０１２３２５号パンフレットおよび国際公開第２００６／０１２３２６号パンフレットは、ＥＤＡおよびＥｔｒＡを不飽和化できるミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ８デサチュラーゼ（ここで「Ｅｇ５」として同定され、配列番号２を割り当てられる）を開示する。本願明細書では、「ＥｇＤ８」（ここでの配列番号１１および１２）として述べられているミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ８デサチュラーゼは、Ｅｇ５のヌクレオチドおよびアミノ酸配列と１００％同一かつ同等である。
【０１０３】
当該技術分野でよく知られているように、宿主が好むコドンの使用は、ポリペプチドをコードする外来遺伝子の発現を実質的に増強できるので、コドン最適化は、代案の宿主中で酵素発現をさらに最適化する有用な手段であることができる。したがってミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来して、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成Δ８デサチュラーゼは、国際公開第２００６／０１２３２５号パンフレットおよび国際公開第２００６／０１２３２６号パンフレットでも配列番号１１２および１１３（そこでは「Ｄ８ＳＦ」と命名される）として開示されている。具体的には１２６３ｂｐコード領域の２０７ｂｐ（１６．４％）が修正され、１９２コドンのコドン最適化に相当する。さらに「Ｄ８ＳＦ」は、野生型Ｅｇ５のアミノ酸残基１および２の間に挿入された１個の追加的なバリンアミノ酸を有した。したがってコドン最適化されたデサチュラーゼの全長は４２２個のアミノ酸である。Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中でのコドン最適化された遺伝子（すなわち「Ｄ８ＳＦ」）の発現は、野生型遺伝子（すなわちＥｇ５）よりも効率的なＥＤＡからＤＧＬＡおよび／またはＥＴｒＡからＥＴＡへの不飽和化を実証した。本願明細書では、「ＥｇＤ８Ｓ」（ここでの配列番号９および１０）として述べられているミドリムシ（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来して、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成Δ８デサチュラーゼは、Ｄ８ＳＦのヌクレオチドおよびアミノ酸配列と１００％同一かつ同等である。
【０１０４】
ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来してヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成Δ８デサチュラーゼ内における標的を定めた変異を操作する
配列を合成して配列をまとめる方法は、文献中で確立されている。多くの技術が文献中で一般に用いられて、天然デサチュラーゼ遺伝子の変異が得られる（このような変異は、欠失、挿入、および点変異、またはそれらの組み合わせを含んでもよい）。これは生体内で、それぞれ所望のＰＵＦＡのより長い半減期またはより高い生成速度など、宿主細胞中で機能するためのより望ましい物理的および動力学的パラメーターがある、デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドの生成を可能にする。または必要に応じて、通例の変異誘発、得られた変異ポリペプチドの発現、およびそれらの活性の判定を通じて、対象のポリペプチド（すなわちデサチュラーゼ）の酵素活性に重要な領域を判定できる。前述の野生型（すなわち配列番号１１および１２）および合成のコドン最適化された（配列番号９および１０）Δ８デサチュラーゼに由来する、全てのこのような変異タンパク質およびそれらをコードするヌクレオチド配列は、本発明の範囲内である。
【０１０５】
より具体的には本発明では、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された既知の機能性ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ８デサチュラーゼ（すなわち「ＥｇＤ８Ｓ」、配列番号９および１０に記載される）中に標的を定めた変異を作ることにより、Δ８デサチュラーゼをコードする変異配列が合成的に改変される。得られた変異ＥｇＤ８ＳのΔ８デサチュラーゼ活性に対する各変異の影響をスクリーンした。本発明を制限するものではないが、後述の方法を使用して、合成のコドン最適化されたＥｇＤ８Ｓと比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異（そして約３３個までのアミノ酸変異）を含んでなり、機能的に同等のΔ８デサチュラーゼ活性を有する変異ＥｇＤ８Ｓ酵素（配列番号２）が、究極的に作り出された。
【０１０６】
位相モデルの創出および変異のための適切なアミノ酸部位の同定
デサチュラーゼの進化に基づいたΔ８デサチュラーゼの一般的特徴が、Ｐ．Ｓｐｅｒｌｉｎｇら（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  Ｌｅｕｋｏｔ．Ｅｓｓｅｎｔ．Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ，６８：７３〜９５頁（２００３年）によって詳しく述べられている。Δ６、Δ５、およびΔ４デサチュラーゼと並んで、Δ８デサチュラーゼは、長鎖ＰＵＦＡ「先端」デサチュラーゼとして知られている（メチル−依存性不飽和化とは対照的に、不飽和化は脂肪酸アシル基の既存の二重結合とカルボキシル末端との間で起きる）。これらのデサチュラーゼは、３個のヒスチジンボックス［Ｈ（Ｘ）3-4Ｈ（配列番号１６６および１６７）、Ｈ（Ｘ）2-3ＨＨ（配列番号１６８および１６９）、およびＨ／Ｑ（Ｘ）2-3ＨＨ（配列番号１７０および１７１）］によって特徴づけられ、それらのＮ−末端に電子供与体としての役割を果たす融合チトクロームｂ5領域を有するので、それらはチトクロームｂ5融合スーパーファミリーのメンバーである。チトクロームｂ5領域はまた、酵素活性に必要なことが示されている絶対的に保存されたヘム−結合モチーフ（すなわち「ＨＰＧＧ」）も含有する（Ｊ．Ａ．Ｎａｐｉｅｒら、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  Ｌｅｕｋｏｔ．Ｅｓｓｅｎｔ．Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ，６８：１３５〜１４３頁（２００３年）；Ｐ．Ｓｐｅｒｌｉｎｇら、前出）。最後に、「先端」デサチュラーゼの結晶構造はまだ入手できないが、疎水性親水性指標は、これらのタンパク質のアミノ酸配列のほぼ３０％を占める４〜６個の膜貫通らせんを明らかにする。
【０１０７】
上の総括に基づいて、ＥｇＤ８Ｓ（配列番号１０）のタンパク質配列を具体的に分析し、位相モデル（図２）の創出を可能にした。予期されたように、ＥｇＤ８Ｓは、Ｎ−末端チトクロームｂ5領域（配列番号１０のアミノ酸残基５〜７１の間に位置する）、およびＣ−末端デサチュラーゼ領域（配列番号１０のアミノ酸残基７９〜４０６の間に位置する）の２つの領域を含有した。配列番号１０のアミノ酸残基８８〜１０９、１１３〜１３２、２６６〜２８３、および２８７〜３０９（図２で領域Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶと標識される）において４つの膜貫通らせんが同定され、Ｎ−およびＣ−末端双方が膜の細胞質側に位置した。２つの追加的疎水性領域が、アミノ酸残基１５７〜１７２および２２３〜２４５に位置した。最後に、３個のヒスチジンボックスがアミノ酸残基１４６〜１５０、１８３〜１８７、および３５８〜３６２の間に位置し、保存されたヘム結合モチーフ（「ＨＰＧＧ」）がアミノ酸残基２７〜３０に位置した。
【０１０８】
位相モデル、ＥｇＤ８Ｓとその他の先端デサチュラーゼとのアラインメント、およびＥｇＤ８Ｓのチトクロームｂ5領域とその他のチトクロームｂ5遺伝子とのアラインメントを使用し、引き続いて恐らく変異誘発に適しているとしてＥｇＤ８Ｓ内の７０の部位が選択された（選択のための基準については実施例２で詳述されている）。これらの部位は実施例２の表７で詳述するように、１２６の個々のアミノ酸変異（すなわち５７．９％の保存アミノ酸置換および４２．１％の比保存アミノ酸置換）に相当する。
【０１０９】
ＥｇＤ８Ｓ変異創出のための部位特異的変異誘発
Δ８デサチュラーゼ変異誘発のために多様なアプローチを使用してもよいが、ここでの戦略に基づき、オリゴヌクレオチドが仲介する部位特異的変異誘発を使用して、ＥｇＤ８Ｓ内に特定の点変異を作り出すことが望ましい。さらに多数の部位特異的変異誘発プロトコール（例えばＩｓｈｉｉ，Ｔ．Ｍ．ら．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２９３：５３〜７１頁（１９９８年）；Ｌｉｎｇ  Ｍ．Ｍ．およびＢ．Ｈ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５４：１５７〜１７８頁（１９９７年）；Ｂｒａｍａｎ  Ｊ．（編）、Ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓより、第２版、Ｈｕｍａｎｉａ：Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００２年）；Ｋｕｎｋｅｌ  Ｔ．Ａ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５４：３６７〜３８２頁（１９８７年）；Ｓａｗａｎｏ  Ａ．およびＭｉｙａｗａｋｉ，Ａ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２８：ｅ７８（２０００年））が存在するが、その容易な実行と高効率に基づいてＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用するために選択した。具体的にはキットは、特殊化したベクター、ユニークな制限部位、または多重形質転換を必要とせず、実質的にあらゆる二本鎖プラスミドにおいて部位特異的変異を可能にする。基本的手順は、対象の挿入断片がある超らせん二本鎖ＤＮＡベクターおよび所望の変異を含有する２つの合成オリゴヌクレオチドプライマーを利用する。ＤＮＡポリメラーゼによって、ベクターの逆ストランドにそれぞれ相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを温度サイクル中に延長させた。オリゴヌクレオチドプライマーの組み込みによって、ねじれ型のニックを含有する変異プラスミドが生じた。温度サイクルに続いて、親ＤＮＡテンプレートを消化して、新たに合成された変異ＤＮＡを選択する手段として、（メチル化およびヘミメチル化ＤＮＡに特異的な）ＤｐｎＩエンドヌクレアーゼで生成物を処理した。次に所望の変異を含有するニックのあるベクターＤＮＡを形質転換して、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）宿主中で増殖させた。
【０１１０】
次に上述の技術を使用して、合成ＥｇＤ８Ｓ（ＥｇＤ８Ｓと比較して多重点変異を有するが、酵素のΔ８デサチュラーゼ活性と比較して機能等価を保つ）設計の実現可能性を試験した。具体的にはＥｇＤ８Ｓ（プラスミドコンストラクト内にキメラＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｓ：：ＸＰＲ遺伝子を含んでなる）への部位特異的変異誘発、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）への形質変換、次にＧＣ分析に基づくΔ８デサチュラーゼ活性のスクリーニングによって、選択された個々の点変異を導入した。
【０１１１】
当業者は、Δ８デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を選択するための追加的スクリーニングを思い描くことができるであろう。例えばその中で酵素を含有する調製品が適切な形態の基質脂肪酸と共にインキュベートされ、予測された脂肪酸生成物へのこの基質の変換について分析されるアッセイによって、デサチュラーゼ活性を実証してもよい。代案としてはデサチュラーゼタンパク質をコードすることが提案されているＤＮＡ配列を適切なベクターコンストラクト中に組み込むことによって、常態では特定の脂肪酸基質を不飽和化する能力を有さないタイプの細胞中で、発現させてもよい。次にデサチュラーゼをコードするＤＮＡ配列を含有するベクターで形質転換された細胞、および（例えば空ベクター単独で形質転換された）適切な対照細胞に、適切な形態の基質脂肪酸を供給することで、ＤＮＡ配列によってコードされるデサチュラーゼの活性を実証する。このような実験では、予測された脂肪酸生成物が、デサチュラーゼをコードするＤＮＡ配列を含有する細胞中で検出され、対照細胞中には検出されないことで、デサチュラーゼ活性が確立される。
【０１１２】
上述の実験からの結果は、０％のΔ８デサチュラーゼ活性を有する完全に非機能性の変異Δ８デサチュラーゼをもたらすいくつかの変異の同定をもたらした（例えば４８ＶからＦおよび４９ＭからＬへの同時変異、または３０４ＧからＦおよび３０５ＦからＧへの同時変異）。これにもかかわらず試験された約７５％の個々の変異は、ＥｇＤ８ＳのΔ８デサチュラーゼ活性と比較して、変異酵素のΔ８デサチュラーゼ活性を顕著に減弱させなかった。より具体的にはΔ８デサチュラーゼ活性がＥｇＤ８Ｓ（すなわち配列番号１０）と機能的に同等であり（すなわち１００％）、またはそれを超える好ましい変異として、次の変異が同定された。
【０１１３】
表４
ＥｇＤ８Ｓ中の最初の好ましい変異
0005769374.tif 000007
＊「％活性」は配列番号１０に記載のＥｇＤ８ＳのΔ８デサチュラーゼ活性と比較した、各変異ＥｇＤ８ＳのΔ８デサチュラーゼ活性を指す。
【０１１４】
本発明の有用な変異Δ８デサチュラーゼが、上述の３０の変異の組み合わせに限定されるものではないことは、当業者によって理解されるであろう。例えばＭ３として述べられている変異部位は２つの特定のアミノ酸変異（すなわち１６ＴからＫおよび１７ＴからＶ）を含むが、当業者はΔ８デサチュラーゼ活性が合成のコドン最適化されたＥｇＤ８ＳのΔ８デサチュラーゼ活性と少となくとも機能的にほぼ同等である変異Δ８デサチュラーゼのデザインにおいて、１６ＴからＫまたは１７ＴからＶのいずれかの単一変異が、有用性を有することを予期する。したがって実際は、表４は配列番号１０のΔ８デサチュラーゼ活性と少なくとも機能的にほぼ同等であるΔ８デサチュラーゼ活性を有する変異Δ８デサチュラーゼのデザインにおいて、ここでの目的に有用な５２個の単一アミノ酸変異を表す。
【０１１５】
上の結果に基づいて、合成のコドン最適化されたＥｇＤ８Ｓ配列内に適切な個々のアミノ酸変異を「スタック」するために、実験研究を継続した。これは１〜３３の包括的なあらゆる整数（すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３）である「ｎ」個のアミノ酸変異を有して、ＥｇＤ８Ｓに匹敵するΔ８デサチュラーゼ活性を有する、配列番号２に記載の変異Δ８デサチュラーゼの創出をもたらす。具体的には配列番号２は、４ＳからＡ、５ＫからＳ、１２ＴからＶ、１６ＴからＫ、１７ＴからＶ、５４ＡからＧ、５５ＦからＹ、６６ＰからＱ、６７ＳからＡ、１０８ＳからＬ、１１７ＧからＡ、１１８ＹからＦ、１２０ＬからＭ、１２１ＭからＬ、１２５ＱからＨ、１２６ＭからＬ、１３２ＶからＬ、１３３ＬからＶ、１６２ＬからＶ、１６３ＶからＬ、１７０ＧからＡ、１７１ＬからＶ、２７９ＴからＬ、２８０ＬからＴ、２９３ＬからＭ、３４６ＩからＶ、３４７ＩからＬ、３４８ＴからＳ、４０７ＡからＳ、４０８ＶからＱ、４１８ＡからＧ、４１９ＧからＡ、および４２２ＬからＱからなる群から選択される少なくとも１つの変異を含んでなり、変異はＥｇＤ８Ｓの合成のコドン最適化配列（すなわち配列番号１０）と比較して定義され、配列番号２は配列番号１０と１００％同一でなく、変異ＥｇＤ８ＳはＥｇＤ８Ｓ（配列番号１０）と少なくとも機能的にほぼ同等である。当業者は、上の各変異が互いにあらゆる組み合わせで使用できることを理解するであろう。そしてここで述べられるようなＥｇＤ８および／またはＥｇＤ８Ｓに由来する、全てのこのような変異タンパク質およびそれらをコードするヌクレオチド配列は、本発明の範囲内である。
【０１１６】
より好ましい実施態様では、変異ＥｇＤ８ＳはＥｇＤ８Ｓの合成のコドン最適化配列と比較して、少なくとも約１０〜１８個の保存的および非保存的アミノ酸置換（すなわち変異）、より好ましくは少なくとも約１９〜２５個の保存的および非保存的アミノ酸置換、そして最も好ましくは合成のコドン最適化されたＥｇＤ８Ｓ配列（すなわち配列番号１０）と比較して少なくとも約２６〜３３個の保存的および非保存的アミノ酸置換を有する。したがって例えば好ましい一実施態様では、変異ＥｇＤ８Ｓ−２３（配列番号４）は、配列番号１０で記載される合成のコドン最適化されたＥｇＤ８Ｓ配列と比較して、次の２４個のアミノ酸変異を含んでなる。４ＳからＡ、５ＫからＳ、１２ＴからＶ、１６ＴからＫ、１７ＴからＶ、６６ＰからＱ、６７ＳからＡ、１０８ＳからＬ、１１７ＧからＡ、１１８ＹからＦ、１２０ＬからＭ、１２１ＭからＬ、１２５ＱからＨ、１２６ＭからＬ、１３２ＶからＬ、１３３ＬからＶ、１６２ＬからＶ、１６３ＶからＬ、２９３ＬからＭ、４０７ＡからＳ、４０８ＶからＱ、４１８ＡからＧ、４１９ＧからＡ、および４２２ＬからＱ。ベクターＮＴＩ（登録商標）のＡｌｉｇｎＸプログラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のデフォルトパラメーターを使用した、変異ＥｇＤ８Ｓ−２３アミノ酸配列と配列番号１０の合成のコドン最適化配列とのペアワイズアラインメントは、４２２個のアミノ酸の長さにわたる２つのタンパク質間の９４．３％の配列同一性、および９７．９％のコンセンサスを明らかにした。
【０１１７】
別の好ましい実施態様では、変異ＥｇＤ８Ｓ−０１３（配列番号６）は、配列番号１０で記載される合成のコドン最適化されたＥｇＤ８Ｓ配列と比較して、次の２８個のアミノ酸変異を含んでなる。４ＳからＡ、５ＫからＳ、１２ＴからＶ、１６ＴからＫ、１７ＴからＶ、５４ＡからＧ、５５ＦからＹ、６６ＰからＱ、６７ＳからＡ、１０８ＳからＬ、１１７ＧからＡ、１１８ＹからＦ、１２０ＬからＭ、１２１ＭからＬ、１２５ＱからＨ、１２６ＭからＬ、１３２ＶからＬ、１３３ＬからＶ、１６２ＬからＶ、１６３ＶからＬ、１７０ＧからＡ、１７１ＬからＶ、２９３ＬからＭ、４０７ＡからＳ、４０８ＶからＱ、４１８ＡからＧ、４１９ＧからＡ、および４２２ＬからＱ。ベクターＮＴＩ（登録商標）のＡｌｉｇｎＸプログラムのデフォルトパラメーターを使用した、変異ＥｇＤ８Ｓ−０１３アミノ酸配列と配列番号１０の合成のコドン最適化配列とのペアワイズアラインメントは、４２２個のアミノ酸の長さにわたる、２つのタンパク質間の９３．４％配列同一性および９７．９％コンセンサスを明らかにした。
【０１１８】
別の好ましい実施態様では、変異ＥｇＤ８Ｓ−０１５（配列番号８）は、配列番号１０で記載される合成のコドン最適化されたＥｇＤ８Ｓ配列と比較して、次の３１個のアミノ酸変異を含んでなる。４ＳからＡ、５ＫからＳ、１２ＴからＶ、１６ＴからＫ、１７ＴからＶ、５４ＡからＧ、５５ＦからＹ、６６ＰからＱ、６７ＳからＡ、１０８ＳからＬ、１１７ＧからＡ、１１８ＹからＦ、１２０ＬからＭ、１２１ＭからＬ、１２５ＱからＨ、１２６ＭからＬ、１６２ＬからＶ、１６３ＶからＬ、１７０ＧからＡ、１７１ＬからＶ、２９３ＬからＭ、２７９ＴからＬ、２８０ＬからＴ、３４６ＩからＶ、３４７ＩからＬ、３４８ＴからＳ、４０７ＡからＳ、４０８ＶからＱ、４１８ＡからＧ、４１９ＧからＡ、および４２２ＬからＱ。ベクターＮＴＩ（登録商標）のＡｌｉｇｎＸプログラムのデフォルトパラメーター使用した、変異ＥｇＤ８Ｓ−０１５アミノ酸配列と配列番号１０の合成のコドン最適化配列とのペアワイズアラインメントは、４２２個のアミノ酸の長さにわたる、２つのタンパク質間の９２．７％配列同一性および９７．４％コンセンサスを明らかにした。
【０１１９】
したがって一実施態様では、本発明は、
（ａ）Δ８デサチュラーゼ活性を有して、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する変異ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
（ｂ）ヌクレオチド配列の補体
を含んでなり、補体およびヌクレオチド配列が同数のヌクレオチドからなり１００％相補的であり、
（ｉ）配列番号２が、４ＳからＡ、５ＫからＳ、１２ＴからＶ、１６ＴからＫ、１７ＴからＶ、５４ＡからＧ、５５ＦからＹ、６６ＰからＱ、６７ＳからＡ、１０８ＳからＬ、１１７ＧからＡ、１１８ＹからＦ、１２０ＬからＭ、１２１ＭからＬ、１２５ＱからＨ、１２６ＭからＬ、１３２ＶからＬ、１３３ＬからＶ、１６２ＬからＶ、１６３ＶからＬ、１７０ＧからＡ、１７１ＬからＶ、２７９ＴからＬ、２８０ＬからＴ、２９３ＬからＭ、３４６ＩからＶ、３４７ＩからＬ、３４８ＴからＳ、４０７ＡからＳ、４０８ＶからＱ、４１８ＡからＧ、４１９ＧからＡ、および４２２ＬからＱからなる群から選択される少なくとも１つの変異を含んでなり、変異が合成のコドン最適化配列ＥｇＤ８Ｓ（すなわち配列番号１０）と比較して定義され、
（ｉｉ）配列番号２が配列番号１０と同一でない、
単離されたポリヌクレオチドに関する。
【０１２０】
さらなる好ましい実施態様では、上述のような配列番号２のΔ８デサチュラーゼ活性は、配列番号１０のΔ８デサチュラーゼ活性と少なくとも機能的にほぼ同等である。
【０１２１】
ＥｇＤ８（配列番号１２）またはＥｇＤ８Ｓ（配列番号１０）と少なくとも機能的にほぼ同等であるΔ８デサチュラーゼ活性を有する変異Δ８デサチュラーゼは、配列番号２に記載されるように発生させてもよいことが考察され、（ｉ）配列番号２は、４ＳからＡ、５ＫからＳ、１２ＴからＶ、１６ＴからＫ、１７ＴからＶ、５４ＡからＧ、５５ＦからＹ、６６ＰからＱ、６７ＳからＡ、１０８ＳからＬ、１１７ＧからＡ、１１８ＹからＦ、１２０ＬからＭ、１２１ＭからＬ、１２５ＱからＨ、１２６ＭからＬ、１３２ＶからＬ、１３３ＬからＶ、１６２ＬからＶ、１６３ＶからＬ、１７０ＧからＡ、１７１ＬからＶ、２７９ＴからＬ、２８０ＬからＴ、２９３ＬからＭ、３４６ＩからＶ、３４７ＩからＬ、３４８ＴからＳ、４０７ＡからＳ、４０８ＶからＱ、４１８ＡからＧ、４１９ＧからＡ、および４２２ＬからＱからなる群から選択される、少なくとも１つの変異を含んでなり、変異は合成のコドン最適化配列ＥｇＤ８Ｓ（すなわち配列番号１０）と比較して定義され、（ｉｉ）配列番号２は配列番号１０と１００％同一でない。さらに本発明は、上述の特定の変異だけでなく、化学的に等価なアミノ酸の置換を可能にするものを包含することが理解される。したがって例えばアミノ酸が脂肪族の非極性アミノ酸アラニンで置換される場合、同一部位が化学的に等価なアミノ酸セリンで置換されてもよいことが予期される。
【０１２２】
他の実施態様では、ドメイン交換によって、新しい改善された脂肪酸デサチュラーゼの創出のために、ここで述べられるΔ８デサチュラーゼ核酸断片のいずれかを使用してもよく、Δ８デサチュラーゼ核酸断片のいずれかからの機能ドメインが代案のデサチュラーゼ遺伝子中の機能ドメインで置き換えられ、それによって新しいタンパク質が得られる。
【０１２３】
様々なω−３および／またはω−６脂肪酸の生成方法
適切なプロモーター制御下における、ここで述べられるΔ８デサチュラーゼをコードするキメラ遺伝子の導入は、それぞれ形質転換された宿主生物中のＤＧＬＡおよび／またはＥＴＡ生成の増大をもたらすことが予期される。したがって本発明は、基質が所望の脂肪酸生成物（すなわちＤＧＬＡおよび／またはＥＴＡ）に変換されるように、脂肪酸基質（すなわちＥＤＡまたはＥＴｒＡ）をここで述べられるデサチュラーゼ（すなわちＥｇＤ８またはＥｇＤ８Ｓに由来する変異体、またはその相同体）に曝露するステップを含んでなる、ＰＵＦＡの生成を誘導する方法を包含する。
【０１２４】
より具体的には宿主細胞（例えば油性酵母、ダイズ）中でＤＧＬＡを生成する方法を提供することが本発明の目的であり、宿主細胞は、
ａ．）配列番号１０と１００％同一でない配列番号２に記載のΔ８デサチュラーゼポリペプチドをコードする組み換えコンストラクト、および
ｂ．）ＥＤＡ源
を含んでなり、宿主細胞はΔ８デサチュラーゼが発現して、ＥＤＡがＤＧＬＡに変換されるような条件下で成長させ、ＤＧＬＡは場合により回収される。
【０１２５】
当業者はΔ８デサチュラーゼの広い基質範囲が、ＥＴｒＡからＥＴＡへの変換のための酵素の使用をさらに可能にしてもよいことを認識する。したがって本発明は、ＥＴＡを生成する方法を提供し、宿主細胞は
ａ．）配列番号１０と１００％同一でない配列番号２に記載のΔ８デサチュラーゼポリペプチドをコードする組み換えコンストラクト、および
ｂ．）ＥＴｒＡ源
を含んでなり、宿主細胞はΔ８デサチュラーゼが発現して、ＥＴｒＡがＥＴＡに変換されるような条件下で成長させ、ＥＴＡは場合により回収される。
【０１２６】
代案としては、ω−３脂肪酸の生成のために、ここで述べられる各Δ８デサチュラーゼ遺伝子およびその対応する酵素生成物を間接的に使用できる（国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレット参照）。ω−３／ω−６ＰＵＦＡの間接的生成は、脂肪酸基質が、中間体ステップまたは経路中間体の手段を通じて、所望の脂肪酸生成物に間接的に変換されて起きる。したがってここで述べられるΔ８デサチュラーゼ（すなわちＥｇＤ８またはＥｇＤ８Ｓに由来する変異体またはその相同体）をＰＵＦＡ生合成経路の酵素（例えばΔ６デサチュラーゼ、Ｃ18/20エロンガーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ14/16エロンガーゼ、Ｃ16/18エロンガーゼ、Δ９エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Ｃ20/22エロンガーゼ）をコードする追加的遺伝子と併せて発現させ、長鎖ω−３／ω−６脂肪酸（例えばＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡ）のより高レベルの生成をもたらしてもよいことが考察された。好ましい実施態様では、本発明のΔ８デサチュラーゼは、Δ９エロンガーゼ（例えば配列番号１７３または配列番号１７６に記載のΔ９エロンガーゼ）と併せて最低限に発現される。しかし特定の発現カセット内に含まれる特定の遺伝子は、宿主細胞（およびそのＰＵＦＡプロフィールおよび／またはデサチュラーゼ／エロンガーゼプロフィール）、基質の利用可能性、および所望の最終産物に左右される。
【０１２７】
微生物の発現系、カセットおよびベクター、および形質転換
ここで述べられるΔ８デサチュラーゼ遺伝子および遺伝子産物（すなわちＥｇＤ８またはＥｇＤ８Ｓに由来する変異、またはその相同体）はまた、異種の微生物宿主細胞中で、特に油性酵母細胞（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で生成されてもよい。
【０１２８】
外来タンパク質の高レベル発現を導く制御配列を含有する、微生物の発現システムおよび発現ベクターは、当業者によく知られている。これらのいずれも本配列の遺伝子生成物のいずれかを生成するためのキメラ遺伝子を構築するのに使用できる。次に形質転換を通じてこれらのキメラ遺伝子を適切な微生物に導入して、コードされた酵素の高レベル発現を提供できる。
【０１２９】
適切な微生物の宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはＤＮＡカセットは、当該技術分野でよく知られている。コンストラクト中に存在する配列の特定の選択は、所望の発現生成物（上述）、宿主細胞の性質、および提案される形質転換細胞と非形質転換細胞とを分離する手段に左右される。しかし典型的にベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を導く配列、選択性標識、および自律性複製または染色体組み込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始を制御する遺伝子の５’領域（例えばプロモーター）、および転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域（すなわちターミネーター）を含んでなる。双方の制御領域が形質転換された微生物の宿主細胞の遺伝子由来であることが最も好ましいが、このような制御領域は、必ずしも生成宿主として選択された特定種に天然の遺伝子に由来しなくてよいものと理解される。
【０１３０】
所望の微生物の宿主細胞中で、本Δ８デサチュラーゼＯＲＦの発現を推進するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは多数あり、当業者にはなじみが深い。選択された宿主細胞中でこれらの遺伝子の発現を導くことができる、実質的にあらゆるプロモーターが本発明に適する。微生物の宿主細胞中での発現は、一時的または安定様式で達成できる。一時的発現は、対象とする遺伝子に作動的に結合された、調節可能プロモーターの活性を誘導することで達成できる。安定発現は、対象とする遺伝子に作動的に結合された構成的プロモーターの使用によって達成できる。一例として宿主細胞が酵母菌の場合、酵母菌細胞中で機能する転写および翻訳領域は、特に宿主種から提供される（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で使用するための好ましい転写開始調節領域については、国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットおよび国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットを参照されたい）。構成的または誘導的転写が所望されるかどうか、対象とするＯＲＦを発現する上でのプロモーター効率、構築の容易さなど次第で、いくつかの調節配列のいずれか１つを使用できる。
【０１３１】
翻訳開始コドン「ＡＴＧ」周囲のヌクレオチド配列は、酵母細胞中での発現に影響することが分かっている。所望のポリペプチドが酵母中で不十分に発現される場合、外来性遺伝子のヌクレオチド配列を修正して効率的な酵母翻訳開始配列を含め、最適の遺伝子発現を得ることができる。酵母中での発現のためには、これは、内在性酵母遺伝子、好ましくは高度に発現される遺伝子に、非効率的に発現される遺伝子をインフレームで融合させることで、それを部位特異的変異誘発させて実行できる。代案としては、宿主中のコンセンサス翻訳開始配列を判定して、対象の宿主中における異種遺伝子の最適発現のために、この配列を異種遺伝子中に遺伝子操作できる。
【０１３２】
終結領域は、それから開始領域が得られた遺伝子からのまたは異なる遺伝子からの３’領域に由来することができる。多数の終結領域が知られており、多様な宿主中で満足に機能する（それらが由来するのと同じおよび異なる属と種のどちらで利用する場合も）。終結領域は通常、特定の特質のためでなく、むしろ便宜上から選択される。好ましくは微生物宿主が酵母細胞である場合、終結領域は酵母遺伝子（特にサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）またはクリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ））に由来する。γ−インターフェロンおよびα−２インターフェロンをコードする哺乳類遺伝子の３’領域もまた、酵母中で機能することが知られている。終結制御領域はまた、好ましい宿主に天然である様々な遺伝子に由来してもよい。場合により終結部位は不要であってもよいが、含まれれば最も好ましい。制限は意図しないが、本願明細書の開示において有用な終結領域としては、次が挙げられる。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞外プロテアーゼ（ＸＰＲ；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１７７４１）の約１００ｂｐの３’領域；アシル−ｃｏＡオキシダーゼ（Ａｃｏ３：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３０１およびＮｏ．ＣＡＡ０４６６１；Ｐｏｘ３：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿５０３２４４）ターミネーター；Ｐｅｘ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０５４６１３）ターミネーター；Ｐｅｘ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７５４３３）ターミネーター；Ｌｉｐ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ５００２０）ターミネーター；Ｌｉｐ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ０１２６３２）ターミネーター；および３−オキソアシル−ｃｏＡチオラーゼ（ＯＣＴ；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ６９９８８）ターミネーター。
【０１３３】
当業者は認識しているように、遺伝子をクローニングベクターに単に挿入するだけでは、それが必要なレベルで成功裏に発現することは確証されない。高発現率の必要性に答えて、転写、翻訳、タンパク質安定性、酸素限界、および微生物の宿主細胞からの分泌の側面を制御するいくつかの異なる遺伝的要素を操作することで、多くの特殊化した発現ベクターが作り出されている。より具体的には、遺伝子発現を制御するように操作される分子の特徴のいくつかとして以下が挙げられる。１．）関連転写プロモーターおよびターミネーター配列の性質、２．）クローンされる遺伝子のコピー数、および遺伝子がプラスミド上にあるかまたは宿主細胞のゲノム内に組み込まれるかどうか、３．）合成された外来タンパク質の最終的細胞内位置、４．）宿主生物体中の翻訳効率およびタンパク質の正しい折りたたみ、５．）宿主細胞内のｍＲＮＡおよびクローン遺伝子タンパク質の本質的な安定性、および６．）頻度が宿主細胞の好むコドン使用頻度に近づくようなクローン遺伝子内のコドン使用。これらの各タイプの改変は、ここで述べられる変異Δ８デサチュラーゼの発現をさらに最適化する手段として、本発明中に包含される。
【０１３４】
ひとたび適切な微生物宿主細胞（例えば油性酵母）中での発現に適したポリペプチドをコードするＤＮＡ（例えばプロモーター、ＯＲＦ、およびターミネーターを含んでなるキメラ遺伝子）が得られたら、それを宿主細胞中で自律複製できるプラスミドベクター中に入れ、またはそれを宿主細胞ゲノム中に直接組み込む。発現カセットの組み込みは宿主ゲノム内で無作為に起きることができ、または宿主遺伝子座内の遺伝子組み換えを標的とするのに十分な宿主ゲノムとの相同性領域を含有するコンストラクトの使用を通じて標的を定めることができる。コンストラクトが内在性遺伝子座を標的とする場合、全てまたはいくつかの転写および翻訳調節領域が、内在性遺伝子座によって提供できる。
【０１３５】
本発明では、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で遺伝子を発現する好ましい方法は、宿主ゲノムへの線状ＤＮＡの組み込みによるものであり、特にゲノム内の複数位置への組み込みは、遺伝子の高レベル発現が所望される場合に有用であることができる［例えばＵｒａ３遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ３０６４２１）、Ｌｅｕ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２６０２３０）、Ｌｙｓ５遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３４９２９）、Ａｃｏ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３００）、Ｐｏｘ３遺伝子座（Ｐｏｘ３：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿５０３２４４；またはＡｃｏ３：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３０１）、Δ１２デサチュラーゼ遺伝子座（国際公開第２００４／１０４１６７号パンフレット）、Ｌｉｐ１遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ５００２０）および／またはＬｉｐ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ０１２６３２）中］。
【０１３６】
有利には、５−フルオロオロト酸（５−フルオロウラシル−６−カルボン酸一水和物；「５−ＦＯＡ」）選択（下方）と組み合わせて、Ｕｒａ３遺伝子を繰り返し使用して、遺伝子改変をたやすくヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムに簡便に組み込むことができる。
【０１３７】
２つ以上の遺伝子が別個の複製ベクターから発現される場合、各ベクターが異なる選択手段を有し、その他のコンストラクトとの相同性を欠いて、安定した発現を保ち、コンストラクト間の要素の再集合を妨げることが望ましい。全ての導入された遺伝子が、所望の生成物の合成を提供するのに必要なレベルで発現されるように、調節領域の賢明な選択、導入されたコンストラクトの選択手段および増殖法は、実験的に判定できる。
【０１３８】
対象の遺伝子を含んでなるコンストラクトは、あらゆる標準技術によって微生物宿主細胞に導入されてもよい。これらの技術としては、形質転換（例えば酢酸リチウム形質転換［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９４：１８６〜１８７頁（１９９１年）］）、プロトプラスト融合、弾道衝撃、電気穿孔、微量注入、または宿主細胞に対象の遺伝子を導入するあらゆるその他の方法が挙げられる。油性酵母（すなわちヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））に適用できるより具体的な教示としては、米国特許第４，８８０，７４１号明細書および米国特許第５，０７１，７６４号明細書およびＣｈｅｎ，Ｄ．Ｃ．ら（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４８（２）：２３２〜２３５頁（１９９７年））が挙げられる。
【０１３９】
便宜上、あらゆる方法によって操作されてＤＮＡ配列（例えば発現カセット）を取り込んだ宿主細胞は、ここで「形質転換された」または「組み換え」と称される。形質転換された宿主は発現コンストラクトの少なくとも１つのコピーを有して、遺伝子がゲノム中に組み込まれるか、増幅されるか、または複数コピーを有する染色体外要素上に存在するかどうか次第で、２つ以上を有するかもしれない。
【０１４０】
形質転換宿主細胞は、国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットおよび国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットで述べられているような様々な選択技術によって同定できる。ここで使用するのに好ましい選択方法は、カナマイシン、ハイグロマイシン、およびアミノグリコシドＧ４１８に対する抵抗性、ならびにウラシル、ロイシン、リジン、トリプトファンまたはヒスチジンを欠く培地上で成長する能力である。代案の実施態様では、酵母Ｕｒａ−変異の選択のために５−ＦＯＡが使用される。化合物はオロチジン５’一リン酸脱炭酸酵素（ＯＭＰ脱炭酸酵素）をコードする、機能性ＵＲＡ３遺伝子を有する酵母細胞に対して有毒である。したがってこの毒性に基づいて、５−ＦＯＡはＵｒａ-変異酵母株の選択および同定のために特に有用である（Ｂａｒｔｅｌ，Ｐ．Ｌ．およびＦｉｅｌｄｓ，Ｓ．、Ｙｅａｓｔ  ２−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第７章、１０９〜１４７頁，１９９７年）。より具体的には天然Ｕｒａ３遺伝子を最初にノックアウトして、５−ＦＯＡ抵抗性に基づいて選択が起きるＵｒａ−フェノタイプを有する株を生成できる。次に複数のキメラ遺伝子および新しいＵｒａ３遺伝子のクラスターをヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムの異なる遺伝子座に組み込むことができ、それによってＵｒａ＋フェノタイプを有する新しい株が生成する。引き続く組み込みは、導入されたＵｒａ３遺伝子がノックアウトされると新しいＵｒａ３−株（これもまた５−ＦＯＡ選択を使用して同定される）を生じる。したがって多数回形質転換における選択マーカーとして、Ｕｒａ３遺伝子（５−ＦＯＡ選択と組み合わさった）を使用できる。
【０１４１】
形質転換に続いて、本Δ８デサチュラーゼ（場合により宿主細胞内で同時発現されるその他のＰＵＦＡ酵素）に適した基質が、宿主によって天然にまたは遺伝子導入的に生成されてもよく、またはそれらは外来的に提供されてもよい。
【０１４２】
本遺伝子および核酸断片の発現のための微生物宿主細胞としては、広範な温度およびｐＨ値にわたり、単純または複合糖質、脂肪酸、有機酸、油、およびアルコール、および／または炭化水素をはじめとする、多様な原材料上で、成長する宿主が挙げられる。本発明の遺伝子は、油性酵母（特にヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））中での発現のために単離されている。転写、翻訳、およびタンパク質生合成器官は、高度に保存されているため、あらゆる細菌、酵母、藻類、卵菌類および／または真菌が、本核酸断片発現のための適切な微生物宿主であることが考察される。
【０１４３】
好ましい微生物宿主は油性酵母である。これらの生物は天然に油の合成および蓄積ができ、油は、約２５％を超える細胞乾燥重量、より好ましくは約３０％を超える細胞乾燥重量、最も好ましくは約４０％を超える細胞乾燥重量を構成できる。油性酵母として典型的に同定される属としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。より具体的には例証的な油合成酵母としては、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポマイセス・スターケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェラス（ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プリケリーマ（ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユチリス（ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プランズ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ・グルチヌス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（ｇｒａｍｉｎｉｓ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前カンジダ・リポリチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に分類された）が挙げられる。
【０１４４】
最も好ましいのは油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であり、さらなる実施態様で最も好ましいのはＡＴＣＣ＃２０３６２、ＡＴＣＣ＃８８６２、ＡＴＣＣ＃１８９４４、ＡＴＣＣ＃７６９８２および／またはＬＧＡＭＳ（７）１と称されるＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株である（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ  Ｓ．、およびＡｇｇｅｌｉｓ  Ｇ．、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．８２（１）：４３〜９頁（２００２年））。
【０１４５】
歴史的にＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の様々な株が、イソクエン酸リアーゼ、リパーゼ、ポリヒドロキシアルカノアート、クエン酸；エリトリトール、２−オキソグルタル酸、γ−デカラクトン、γ−ドデカラトン、およびピルビン酸の製造および生成のために使用されている。Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中におけるＡＲＡ、ＥＰＡ、およびＤＨＡ産生を操作するのに適用できる特定の教示は、米国特許出願第１１／２６４７８４号明細書（国際公開第２００６／０５５３２２号パンフレット）、米国特許出願第１１／２６５７６１号明細書（国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット）、および米国特許出願第１１／２６４７３７号明細書（国際公開第２００６／０５２８７１号パンフレット）でそれぞれ提供される。
【０１４６】
その他の好ましい微生物宿主としては、油性細菌、藻類、卵菌綱（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ）、およびその他の真菌が挙げられ、この広範な微生物宿主群の中で特に興味深いのは、ω−３／ω−６脂肪酸を合成する微生物（またはこの目的のために遺伝子改変できるもの［例えばサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのその他の酵母］）である。したがって例えば誘導性プロモーターまたは調節プロモーターの制御下にある本Δ８デサチュラーゼ遺伝子のいずれかによる、モルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）（ＡＲＡの生成のために商業的に使用される）の形質転換は、増大する量のＥＤＡを合成できる形質転換生物を生じる。Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）の形質転換方法については、Ｍａｃｋｅｎｚｉｅら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６６：４６５５頁（２０００年））によって述べられている。同様にヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）微生物の形質転換方法については、米国特許第７，００１，７７２号明細書で開示されている。
【０１４７】
上述の教示に基づいて、一実施態様では、本発明は、
ａ）（ｉ）配列番号１０と同一でない配列番号２に記載のアミノ酸配列を有して、Δ８デサチュラーゼ活性を有する変異ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および
（ｉｉ）それぞれＥＤＡまたはＥＴｒＡのいずれかからなるデサチュラーゼ基質源
を含んでなる油性酵母を提供するステップと、
ｂ）適切な発酵性炭素源の存在下でステップ（ａ）の酵母を成長させ、Δ８デサチュラーゼポリペプチドをコードする遺伝子が発現して、ＥＤＡがＤＧＬＡに変換され、またはＥＴｒＡがＥＴＡに変換されるステップと、
ｃ）場合によりステップ（ｂ）のＤＧＬＡまたはＥＴＡをそれぞれ回収するステップと
を含んでなる、ＤＧＬＡまたはＥＴＡのいずれかをそれぞれ生成する方法に向けたものである。基質供給が必要とされてもよい。
【０１４８】
もちろん油性酵母中で自然に産生されるＰＵＦＡは、１８：２脂肪酸（すなわちＬＡ）、および一般的ではないが１８：３脂肪酸（すなわちＡＬＡ）に限定されるので、本発明のより好ましい実施態様では、油性酵母は遺伝子改変されて、ここで述べられるΔ８デサチュラーゼに加えて、長鎖ＰＵＦＡ生合成に必要な複数の酵素を発現する（それによって例えばＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡの生成を可能にする）。
【０１４９】
具体的には一実施態様では、本発明は、
ａ）少なくとも１つの制御配列と作動的に連結して、変異Δ８デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを含んでなる、第１の組み換えＤＮＡコンストラクト、および
ｂ）Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ14/16エロンガーゼ、Ｃ16/18エロンガーゼ、Ｃ18/20エロンガーゼ、およびＣ20/22エロンガーゼからなる群から選択されるポリペプチドをコードする少なくとも１つの制御配列と作動的に連結して、単離されたポリヌクレオチドを含んでなる、少なくとも１つの追加的組み換えＤＮＡコンストラクト
を含んでなる、油性酵母に関する。
【０１５０】
特に好ましい実施態様では、少なくとも１つの追加的組み換えＤＮＡコンストラクトは、例えばイソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）から単離されおよび／またはそれに由来して、配列番号１７２〜１７４に記載のΔ９エロンガーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ３９０１７４）、またはミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）から単離されおよび／またはそれに由来して、配列番号１７５〜１７７に記載のΔ９エロンガーゼなどのΔ９エロンガーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
【０１５１】
微生物中におけるω−３および／またはω−６脂肪酸生合成の代謝工学
生化学的経路を操作する方法は当業者によく知られており、油性酵母中、特にヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中において、ω−３および／またはω−６脂肪酸生合成を最大化するために、多数の操作が可能であることが予期される。これは直接的にＰＵＦＡ生合成経路内の代謝工学、または様々なその他の代謝経路の追加的協調操作を要するかもしれない。
【０１５２】
ＰＵＦＡ生合成経路内を操作する場合、ＬＡの生成を増大させて、増大したω−６および／またはω−３脂肪酸生成を確実にすることが望ましいかもしれない。Δ９および／またはΔ１２デサチュラーゼをコードする遺伝子の導入および／または増幅が、これを達成してもよい。ω−６不飽和脂肪酸の生成を最大化するために、実質的にＡＬＡを含まない宿主微生物中における生成が有利であることが当業者にはよく知られている。したがって好ましくは宿主は、ＬＡからＡＬＡへの変換を可能にするΔ１５またはω−３タイプデサチュラーゼ活性を除去または阻害して、選択されまたは得られる。代案としてはω−３脂肪酸の生成を最大化する（そしてω−６脂肪酸の合成を最小化する）ことが望ましいかもしれない。この例ではオレイン酸からＬＡへの変換を可能にするΔ１２デサチュラーゼ活性が除去または阻害されている宿主微生物が利用できる。引き続いてＡＬＡのω−３脂肪酸誘導体（例えばＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡ）への変換のために、適切な発現カセットが、適切な基質（例えばＡＬＡ）と共に宿主に導入される。
【０１５３】
代案の実施態様では、エネルギーまたは炭素をめぐってω−３および／またはω−６脂肪酸生合成経路と競合する生化学的経路、または特定のＰＵＦＡ最終産物の生成を妨げる天然ＰＵＦＡ生合成経路酵素を遺伝子中断によって排除し、またはその他の手段によって（例えばアンチセンスｍＲＮＡ）下方制御してもよい。
【０１５４】
ＡＲＡ、ＥＰＡまたはＤＨＡを増大させる手段としてのＰＵＦＡ生合成経路内の操作（およびその関連技術）に関する詳細な考察は、国際公開第２００６／０５５３２２号パンフレット、国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット、および国際公開第２００６／０５２８７１号パンフレットにそれぞれ存在し、ＴＡＧ生合成経路およびＴＡＧ分解経路における望ましい操作（およびその関連技術）についても同様である。
【０１５５】
本発明の文脈で、上述の戦略の内のいずれかによって脂肪酸生合成経路の発現を調節することは有用かもしれない。例えば本発明は、ω−３および／またはω−６脂肪酸の生成のために、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ生合成経路中の鍵酵素をコードする遺伝子を油性酵母に導入する方法を提供する。本Δ８デサチュラーゼ遺伝子をω−３および／またはω−６脂肪酸生合成経路を天然に有さない油性酵母中で発現して、これらの遺伝子の発現を連係させることは、宿主生物の代謝工学のための様々な手段を使用して、好ましいＰＵＦＡ生成物の生成最大化するために特に有用である。
【０１５６】
ＰＵＦＡ産生のための微生物の発酵過程
キメラデサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子の発現が最適化され、好ましいＰＵＦＡの最大かつ最も経済的収率が生じる条件下で、形質転換された微生物宿主細胞を成長させる。一般に、最適化してもよい培地条件としては、炭素源のタイプおよび量、窒素源のタイプおよび量、炭素−対−窒素比、酸素レベル、成長温度、ｐＨ、バイオマス生産相の長さ、油蓄積相の長さ、および細胞収集時間と方法が挙げられる。対象の微生物（すなわちヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））は、一般に複合培地（例えば酵母抽出物−ペプトン−デキストロースブロス（ＹＰＤ））、または成長に必要な構成要素を欠いており、それによって所望の発現カセットの選択を強制する合成最少培地（例えば酵母窒素ベース（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）中で成長させる。
【０１５７】
本発明中の発酵培地は、適切な炭素源を含有しなくてはならない。適切な炭素源については国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットで教示される。本発明で利用される炭素源は、多種多様な炭素含有源を包含してもよいことが考察されるが、好ましい炭素源は、糖、グリセロール、および／または脂肪酸である。最も好ましいのは、１０〜２２個の炭素を含有するグルコースおよび／または脂肪酸である。
【０１５８】
窒素は無機（例えば（ＮＨ４）2ＳＯ4）または有機（例えば尿素またはグルタメート）源から供給されてもよい。適切な炭素および窒素源に加えて、発酵培地はまた、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、ビタミン、および微生物の成長およびＰＵＦＡ産生に必要な酵素的経路の促進に適することが当業者に知られているその他の構成要素も含有しなくてはならない。脂質およびＰＵＦＡの合成を促進するいくつかの金属イオン（例えばＭｎ+2、Ｃｏ+2、Ｚｎ+2、Ｍｇ+2）に、特に注意が払われている（Ｎａｋａｈａｒａ，Ｔ．ら，Ｉｎｄ．Ａｐｐｌ．Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｏｉｌｓ、Ｄ．Ｊ．ＫｙｌｅおよびＲ．Ｃｏｌｉｎ編、６１〜９７頁（１９９２年））。
【０１５９】
本発明における好ましい増殖培地は、一般的に、酵母窒素ベース（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）などの商業的に調製された培地である。その他の合成（ｄｅｆｉｎｅｄ）または合成（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）増殖培地もまた使用してもよく、形質転換宿主細胞の成長に適した培地は、微生物学または発酵化学の当業者に知られている。発酵に適したｐＨ範囲は典型的に約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０の間であり、初期成長条件のための範囲としてｐＨ５．５〜ｐＨ７．５が好ましい。発酵は好気性または嫌気性条件下で実施してもよく、微好気条件が好ましい。
【０１６０】
代謝状態は成長と脂肪の合成／保存との間で「平衡状態」でなくてはならないので、典型的に油性酵母細胞中のＰＵＦＡの高レベルの蓄積は、二段階過程を必要とする。したがって最も好ましくは、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中におけるＰＵＦＡ生成のために、二段階発酵過程が必要である。このアプローチについては国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットで述べられており、様々な適切な発酵過程デザイン（すなわちバッチ、流加および連続）および成長中の考察事項についても同様である。
【０１６１】
ＰＵＦＡ油の精製および加工
ＰＵＦＡは、宿主微生物および植物中に遊離脂肪酸として、またはアシルグリセロール、リン脂質、スルホ脂質または糖脂質などのエステル化形態として存在してもよく、当該技術分野で良く知られている多様な手段を通じて宿主細胞から抽出されてもよい。酵母脂質の抽出技術、品質分析、および合格基準の１つの総説は、Ｚ．Ｊａｃｏｂｓ（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２（５／６）：４６３〜４９１頁（１９９２年））によるものであるＡ．ＳｉｎｇｈおよびＯ．Ｗａｒｄ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４５：２７１〜３１２頁（１９９７年））による後処理プロセスに関する簡潔な概要もまた入手できる。
【０１６２】
一般にＰＵＦＡの純化のための手段としては、有機溶剤による抽出、超音波処理、超臨界流体抽出（例えば二酸化炭素を使用して）、鹸化、および圧搾などの物理的手段、またはそれらの組み合わせが挙げられる。追加的詳細については、国際公開第２００４／１０１７５７号パンフレットの教示を参照されたい。
【０１６３】
好ましい実施態様の説明
本発明の１つの目的は、植物および油性酵母中でΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現を可能にする適切なΔ８デサチュラーゼの合成である。
【０１６４】
同一譲受人の国際公開第２００６／０１２３２５号パンフレットおよび国際公開第２００６／０１２３２６［ＵＳ２００５−０２８７６５２］号パンフレットでは、出願人らは、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）からのΔ８デサチュラーゼ（「Ｅｇ５」）の単離、およびサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中での発現に際しての酵素の機能特性決定について述べる。野生型Ｅｇ５配列は、さらにヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化され、「Ｄ８ＳＦ」と称される合成の機能性コドン最適化Δ８デサチュラーゼの合成がもたらされた。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中における、Ｄ８ＳＦとコドン最適化されたΔ９エロンガーゼ（イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａに由来する）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号３９０１７４）との同時発現に際して、６．４％のＤＧＬＡ（ＧＬＡの同時合成なし）が実証された（国際公開第２００６／０１２３２５号パンフレットの実施例１２、および国際公開第２００６／０１２３２６号パンフレット［米国特許出願公開第２００５−０２８７６５２−Ａ１号明細書］）。
【０１６５】
本願明細書では、「Ｄ８ＳＦ」と称する（ここで「ＥｇＤ８Ｓ」と称する）合成のコドン最適化されたΔ８デサチュラーゼを標的を定めた変異の対象とした。究極的に、合成のコドン最適化されたＥｇＤ８Ｓと比較して少なくとも１つのアミノ酸変異（そして約３３個までのアミノ酸変異）を含んでなる変異ＥｇＤ８Ｓ酵素（配列番号２）が作り出され、（ｉ）少なくとも１つの変異は、４ＳからＡ、５ＫからＳ、１２ＴからＶ、１６ＴからＫ、１７ＴからＶ、５４ＡからＧ、５５ＦからＹ、６６ＰからＱ、６７ＳからＡ、１０８ＳからＬ、１１７ＧからＡ、１１８ＹからＦ、１２０ＬからＭ、１２１ＭからＬ、１２５ＱからＨ、１２６ＭからＬ、１３２ＶからＬ、１３３ＬからＶ、１６２ＬからＶ、１６３ＶからＬ、１７０ＧからＡ、１７１ＬからＶ、２７９ＴからＬ、２８０ＬからＴ、２９３ＬからＭ、３４６ＩからＶ、３４７ＩからＬ、３４８ＴからＳ、４０７ＡからＳ、４０８ＶからＱ、４１８ＡからＧ、４１９ＧからＡ、および４２２ＬからＱからなる群から選択されて、変異は配列番号１０に記載の合成のコドン最適化配列と比較して定義され、（ｉｉ）配列番号２は配列番号１０と同一でなく、（ｉｉｉ）配列番号２は配列番号１０と少なくとも機能的にほぼ同等である。
【０１６６】
本願明細書の教示から、当業者は異種のΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現を通じて、多様なω−３および／またはω−６ＰＵＦＡの生成を可能にするために、Δ８デサチュラーゼをコードする本発明の組み換え遺伝子の商業的有用性を認識するであろう。
【実施例】
【０１６７】
次の実施例で本発明をさらに定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施態様を示しながら、例示の手段としてのみ提供されるものと理解される。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特性を見極めることができ、その趣旨と範囲を逸脱することなく本発明に様々な変更と修正を加えて、それを様々な使用法および条件に適応できる。したがって本明細書で示されて述べられているものに加えて、本発明の様々な修正は、当業者には前述の説明から明らかであろう。このような修正はまた、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【０１６８】
一般方法
実施例で使用する標準組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野でよく知られており、１．）Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）（Ｍａｎｉａｔｉｓ）；２．）Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ、Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ、およびＬ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４年）；および３．）Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版（１９８７年）で述べられる。
【０１６９】
微生物培養の維持および成長に適した材料および方法は、当該技術分野でよく知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術については、次で述べられている。Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ、Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ、Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ、Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ、およびＧ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編、「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４年）、またはＴｈｏｍａｓ，Ｄ．Ｂｒｏｃｋ、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９年）。微生物細胞の成長および維持のために使用される全ての試薬制限酵素および材料は、特に断りのない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。
【０１７０】
一般分子クローニングは、標準法に従って実施された（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）。オリゴヌクレオチドは、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｓｐｒｉｎｇ，ＴＸ）によって合成された。ＤＮＡ配列は、ベクターおよび挿入断片特異的プライマーの組み合わせを使用して、染料ターミネーター技術（米国特許第５，３６６，８６０号明細書；欧州特許第２７２，００７号明細書）を使用して、ＡＢＩ自動配列決定装置上で作り出された。配列編集はシーケンチャー（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）内で実施された。全ての配列は、双方向に少なくとも２回のカバレッジに相当する。遺伝子配列の比較は、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア（ＤＮＡＳｔａｒ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して達成された。代案としては、遺伝的配列の操作は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．から入手できるプログラムスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して達成された。ＧＣＧプログラム「Ｐｉｌｅｕｐ」をｇａｐ  ｃｒｅａｔｉｏｎデフォルト値１２、およびｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎデフォルト値４で使用した。ＧＣＧ「Ｇａｐ」または「Ｂｅｓｔｆｉｔ」プログラムをデフォルトｇａｐ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ  ５０、およびデフォルトｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ  ３で使用した。特に断りのない限り、その他の全例でＧＣＧプログラムのデフォルトパラメーターを使用した。
【０１７１】
略語の意味は次のとおり。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈｒ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μｌ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリトルを意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」マイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋＢ」はキロ塩基を意味する。部および百分率は重量基準であり、温度は摂氏である。
【０１７２】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換および培養
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２、＃７６９８２、および＃９０８１２株は、米国微生物系統保存機関（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から購入した。Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株を通常ＹＰＤ寒天（１％酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％グルコース、２％寒天）上で２８℃で成長させた。
【０１７３】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換は、特に断りのない限りＣｈｅｎ，Ｄ．Ｃ．ら、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８（２）：２３２〜２３５（１９９７年）の方法に従って実施した。簡単に述べると、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）をＹＰＤプレート上に画線培養し、３０℃でおよそ１８時間成長させた。いくつかの大型白金耳を満たす細胞をプレートからこすり取り、平均分子量３３５０の２．２５ｍＬの５０％ＰＥＧ、ｐＨ６．０の０．１２５ｍＬの２Ｍ酢酸Ｌｉ、０．１２５ｍＬの２Ｍ  ＤＴＴ、および５０μｇのせん断サケ精子ＤＮＡを含有する１ｍＬの形質転換緩衝液に再懸濁した。次に約５００ｎｇの直線化プラスミドＤＮＡを１００μＬの再懸濁細胞内でインキュベートし、１５分間隔でボルテックス混合しながら３９℃に１時間保った。細胞を選択培地プレートに蒔いて、３０℃に２〜３日間保った。
【０１７４】
形質転換体の選択のために、最少培地（「ＭＭ」）を一般に使用した。ＭＭの組成は次のとおりである。硫酸アンモニウムまたはアミノ酸なしの０．１７％酵母窒素ベース（（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、２％グルコース、０．１％プロリン、ｐＨ６．１。ウラシルまたはロイシン補給剤を必要に応じて最終濃度０．０１％に添加した（それによってそれぞれ２０ｇ／Ｌの寒天を用いて調製される「ＭＭＵ」または「ＭＭＬｅｕ」選択培地がそれぞれ生じる）。
【０１７５】
代案としては、硫酸アンモニウムまたはアミノ酸なしの０．１７％酵母窒素ベース（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、２％グルコース、０．１％プロリン、７５ｍｇ／Ｌウラシル、７５ｍｇ／Ｌウリジン、９００ｍｇ／Ｌ  ＦＯＡ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）、および２０ｇ／Ｌ寒天を含んでなる、５−フルオロオロト酸（「ＦＯＡ」；５−フルオロウラシル−６−カルボン酸一水和物とも）選択培地上で形質転換体を選択する。
【０１７６】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の脂肪酸分析
脂肪酸分析のために、Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．およびＤｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．（Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、３７：９１１〜９１７頁（１９５９年））で述べられているように、遠心分離によって細胞を収集して脂質を抽出した。ナトリウムメトキシドによる脂質抽出物のエステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し（Ｒｏｕｇｈａｎ，Ｇ．、およびＮｉｓｈｉｄａ，Ｉ．、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２７６（１）：３８〜４６頁（１９９０年））、引き続いて３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）カラムを装着したＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。オーブン温度は、３．５℃／分で１７０℃（２５分間保持）から１８５℃であった。
【０１７７】
直接塩基エステル交換のために、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）培養物（３ｍＬ）を収集して蒸留水で１回洗浄し、真空下においてＳｐｅｅｄ−Ｖａｃ内で５〜１０分間乾燥させた。ナトリウムメトキシド（１００μＬの１％）をサンプルに添加し、次にサンプルをボルテックスして２０分間振盪した。３滴の１Ｍ  ＮａＣｌおよび４００μＬのヘキサンを添加した後、サンプルをボルテックスして遠沈した。上層を除去して、上述のようにＧＣによって分析した。
【０１７８】
実施例１
ＥｇＤ８Ｓの位相モデルの開発
ＢＬＡＳＴＰ分析は、ＥｇＤ８ＳがＮ−末端チトクロームｂ5領域（配列番号１０のアミノ酸残基５〜７１の間に位置する）、およびＣ−末端デサチュラーゼ領域（配列番号１０のアミノ酸残基７９〜４０６の間に位置する）の２つの領域を含有することを示した。Δ８デサチュラーゼ活性に悪影響を与えることなく、ＥｇＤ８Ｓのアミノ酸配列を変位させるために、以下の理論および分析に基づいて位相モデル（図２）を開発した。
【０１７９】
最初にＴＭＨＭＭプログラム（「Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｈｅｌｉｃｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」；ＴＭＨＭＭ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｖ．２．０、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｅｎｍａｒｋ，ＤＫ−２８００  Ｌｙｎｇｂｙ，Ｄｅｎｍａｒｋ）が、ＥｇＤ８Ｓは４つの膜貫通らせん（アミノ酸残基１１３〜１３２、２２３〜２４５、２６６〜２８３、および２８７〜３０９）を有して、Ｎ−末端およびＣ−末端のどちらも膜の細胞質側に位置することを予測した。
【０１８０】
膜結合脂肪酸デサチュラーゼは、ＨＸ(3-4)Ｈ（配列番号１６６および１６７）、ＨＸ(2-3)ＨＨ（配列番号１６８および１６９）、および（Ｈ／Ｑ）Ｘ(2-3)ＨＨ（配列番号１７０および１７１）の３個のＨｉｓに富むモチーフを特徴とする、膜二鉄タンパク質のスーパーファミリーに属する。これらのＨｉｓに富む残基は、膜の細胞質面に位置することが予測され、酵素活性に重要であることが示されている（Ｓｈａｎｋｌｉｎ，Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３：１２７８７〜１２７９４頁（１９９４年）；Ｓｈａｎｋｌｉｎ，Ｊ．およびＣａｈｏｏｎ，Ｅ．Ｂ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４９：６１１〜６４１頁（１９９８年））。配列番号１０中において、これらの３個のヒスチジンボックスはアミノ酸残基１４６〜１５０、１８３〜１８７、および３５８〜３６２の間に位置し、２つの追加的Ｈｉｓ残基はアミノ酸残基２７および５０に位置する。これらの各Ｈｉｓ残基は図２に小さな丸で示される。
【０１８１】
ＴＭＨＭＭ（前出）によって予測されたモデルが変更なしに受容されれば、最初の２つのＨｉｓに富む領域（すなわちアミノ酸残基１４６〜１５０および１８３〜１８７の間に広がる領域）は細胞膜周辺腔に位置し、したがって鉄活性部位におけるそれらの関与を妨げる。
【０１８２】
上述の矛盾は、疎水性親水性指標プロット分析（Ｋｙｔｅ，Ｊ．およびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５７：１０５〜１３２頁（１９８２年））が、第１の予測された膜貫通セグメント（すなわち残基１１３〜１３２）の直前の、アミノ酸残基８８〜１０９の間に位置するもう１つの疎水性領域を予測した際に解決された。Ｎ−末端チトクローム−ｂ5領域は細胞質空間に位置するので、疎水性領域（すなわち残基８８〜１０９）が第１の膜貫通セグメント（すなわち図２に示す領域Ｉ）であることが予測され、一方残基１１３〜１３２に対応する予測された膜貫通セグメントは第２の膜貫通セグメントと指名された（すなわち図２に示す領域ＩＩ）。その結果、最初の２つのＨｉｓに富むモチーフ（すなわちアミノ酸残基１４６〜１５０および１８３〜１８７の間に広がる領域）が細胞質側内にあるよう調節できるように、ＴＭＨＭＭによって当初は膜を貫通することが予測された残基２２３〜２４５の間に見られる膜貫通セグメントは、そうではなくて細胞質面にあることが予測された。
【０１８３】
最後に、疎水性親水性指標プロット分析はまた、第１の２つのＨｉｓに富むモチーフ間の別の疎水性領域（すなわち残基１５７〜１７２）も予測した。デサチュラーゼの基質は高度に疎水性であるので、細胞質膜の脂質二重層内へ分割する見込みが高いことが予期された。これはＨｉｓに富むモチーフからアセンブルされたデサチュラーゼ活性部位が、膜表面に（またははそのすぐそばに）にあるかもしれないことを示唆した。したがって双方の疎水性領域（すなわち残基１５７〜１７２および残基２２３〜２４５）が膜表面近くにあって、活性部位が膜の近くにあることを確実にするという仮説を立てた。
【０１８４】
ＴＭＨＭＭによって予測された最後の２つの膜貫通らせん（すなわち残基２６６〜２８３および２８７〜３０９）は、図２に示される最終位相モデル内に領域ＩＩＩ領域ＩＶとして含まれる。
【０１８５】
したがって図２に描写される位相モデルは、それぞれアミノ酸残基８８〜１０９、１１３〜１３２、２６６〜２８３、および２８７〜３０９に相当する、域領Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶと標識される４つの膜貫通領域を含む。２つの追加的疎水性領域は、アミノ酸残基１５７〜１７２および２２３〜２４５に位置する。最後に「ＩＮ」が細胞質空間に相当する一方、「ＯＵＴ」は細胞膜周辺腔に相当する。
【０１８６】
実施例２
変異のためのアミノ酸残基を選択するための戦略
ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（全ての非重複ＧｅｎＢａｎｋＣＤＳ翻訳と、三次元構造Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎタンパク質データバンク、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベース、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪデータベースに由来する配列とを含んでなる）中に含まれる配列について、類似性のためのＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍａｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１０頁（１９９３年））検索を行って、ＥｇＤ８Ｓ配列に近い相同体を判定した。具体的にはＮＣＢＩによって提供されるＢＬＡＳＴＰアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁（１９９０年））を使用して「ｎｒ」データベース中に含まれる全ての公的に入手可能なタンパク質配列との類似性について、ＥｇＤ８Ｓ（配列番号１０）を比較した。
【０１８７】
ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）から単離されたあらゆるΔ８デサチュラーゼに対する全てのヒットを無視して、ＢＬＡＳＴＰ検索は、ＥｇＤ８Ｓが次のタンパク質に対して最も相同的であることを示した。
【０１８８】
表６
ＢＬＡＳＴＰ分析に基づくＥｇＤ８Ｓの相同的タンパク質
0005769374.tif 000008
＊「％同一性」は、２つのタンパク質間で同一であるアミノ酸の百分率と定義される。
＊＊「％類似性」は、２つのタンパク質間で同一であるまたは保存されているアミノ酸の百分率と定義される。
＊＊＊「期待値」は、絶対的に偶然にこの大きさのデータベース検索で期待される特定スコアでのマッチ数を規定して、マッチの統計学的有意さを推定する。
【０１８９】
Δ８デサチュラーゼ活性に影響することなくＥｇＤ８Ｓ内で変異できるアミノ酸残基を選択するために、以下で概要を述べるように、変異の好ましい標的を同定するための基準のセットが開発された。
【０１９０】
１．ＥｇＤ８Ｓデサチュラーゼ領域の好ましいアミノ酸残基標的（配列番号１０のアミノ酸残基７９〜４０６の間に位置する）は、Ａ．ルキシイ（ｒｏｕｘｉｉ）（前出；「ＡｒＤ６」；配列番号１３）のΔ６デサチュラーゼ、Ｒ．オリゼー（ｏｒｙｚａｅ）のΔ６デサチュラーゼ（前出；「ＲｏＤ６」；配列番号１４）、および大型リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）のΔ８脂肪酸デサチュラーゼ様タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＪ０９６７７；「ＬｍＤ８Ｌ」；配列番号１５）などの代表的なその他のデサチュラーゼ、およびモルティエラ・イザベリナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）のΔ６デサチュラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＧ３８１０４；「ＭｉＤ６」；配列番号１６）と比較して、保存されていない。ＤＮＡＳＴＡＲ（商標）ソフトウェアのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法（緩慢、正確、Ｇｏｎｎｅｔオプション；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２２：４６７３〜４６８０頁（１９９４年））を使用した、これらのタンパク質のアラインメントを図３に示す。これらの５つの異なるデサチュラーゼ中の非保存領域における変化は、ＥｇＤ８ＳのΔ８デサチュラーゼ活性に影響しないと仮定された。
【０１９１】
２．ＥｇＤ８Ｓのチトクロームｂ5領域の好ましいアミノ酸残基標的（配列番号１０のアミノ酸５〜７１の間に位置する）は、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｐ４０３１２；「ＳＣｂ５」；配列番号１７８）およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｏ９４３９１；ＳＰｂ５；配列番号１７９）のチトクロームｂ5遺伝子と比較して、保存されていない。ＤＮＡＳＴＡＲ（商標）ソフトウェアのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ（前出）法を使用した、ＥｇＤ８ＳのＮ−末端部分（すなわち配列番号１０のアミノ酸残基１〜１３６）と、ＳＣｂ５およびＳＰｂ５とのアラインメントを図４に示す。これらの３つの異なるタンパク質の非保存領域中の変化は、ＥｇＤ８Ｓのチトクロームｂ5領域の電子伝達機能に影響せず、したがってΔ８デサチュラーゼ活性に影響しないことが仮定された。
【０１９２】
３．好ましいアミノ酸残基標的は、膜の小胞体（ＥＲ）側に近い膜貫通らせん上にあり、またはＥＲ内腔に露出している。
【０１９３】
４．ＥｇＤ８Ｓ酵素のＮ−末端またはＣ−末端に近い領域内の非保存的残基はより多くの変異に耐えるかもしれないので、好ましいアミノ酸残基標的はこれらの領域に近い。
【０１９４】
上の基準に基づいて、表７で後述するように、ＥｇＤ８Ｓ（すなわち配列番号１０）内の７０個の標的変異部位のセット（１、２または３個のアミノ酸残基を含んでなる）を変異のために選択した。個々の１２６個のアミノ酸残基変異の内、５３個（すなわち４２．１％）は「非保存的アミノ酸置換」として同定され、一方７３個（すなわち５７．９％）は「保存的アミノ酸置換」として同定された。
【０１９５】
表７
標的を定めた変異に適する選択されたアミノ酸残基
0005769374.tif 000009
【０１９６】
実施例３
総脂質の約１７％ＥＤＡを産生するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４００１およびＹ４００１Ｕ株の作成
本実施例は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に由来して、それぞれ総脂質に対して１７％のＥＤＡ（Ｃ２０：２）を産生できる、Ｙ４００１およびＹ４００１Ｕ株の構築について述べる。双方の株を改変して、ＥｇＤ８Ｓの機能発現およびその変異について試験した。したがってΔ８デサチュラーゼ基質ＥＤＡを産生できる宿主株を構築することが必要であった。
【０１９７】
Ｌｅｕ−およびＵｒａ−フェノタイプを有するＹ４００１Ｕ株の開発は、Ｙ２２２４株（野生型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株ＡＴＣＣ＃２０３６２のＵｒａ３遺伝子の自立的変異からのＦＯＡ抵抗性変異）およびＹ４００１株の構築を必要とした。
【０１９８】
Ｙ２２２４株の作成
次のようにして様式Ｙ２２２４株を単離した。ＹＰＤ寒天プレート（１％酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％グルコース、２％寒天）からのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２細胞を２５０ｍｇ／Ｌ５−ＦＯＡ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を含有するＭＭプレート（各７５ｍｇ／Ｌのウラシルおよびウリジン、６．７ｇ／ＬのＹＮＢ、硫酸アンモニア添加、アミノ酸無添加、および２０ｇ／Ｌのグルコース）上に画線培養した。プレートを２８℃でインキュベートして、得られたコロニーから４個を２００ｍｇ／ｍＬの５−ＦＯＡを含有するＭＭプレート、およびウラシルおよびウリジンを欠くＭＭプレート上に個別にパッチして、ウラシルＵｒａ３栄養要求性を確認した。
【０１９９】
総脂質の１７％のＥＤＡを産生するＹ４００１株の作成
Ｙ２２２４株のＬｅｕ２遺伝子座へのコンストラクトｐＺＫＬｅｕＮ−２９Ｅ３（図５Ａ；４つのキメラ遺伝子［Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ16/18エロンガーゼ、および２つのΔ９エロンガーゼ］を含んでなる）の組み込みを通じてＹ４００１株を作り出し、それによってＥＤＡの産生を可能にした。
【０２００】
コンストラクトｐＺＫＬｅｕＮ−２９Ｅ３は次の構成要素を含有した。
【０２０１】
表８
プラスミドｐＺＫＬｅｕＮ−２９Ｅ３（配列番号１７）の説明
0005769374.tif 000010
【０２０２】
（表８続き）
0005769374.tif 000011
【０２０３】
一般方法に従ってプラスミドｐＺＫＬｅｕＮ−２９Ｅ３をＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次にＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２２２４株（すなわちＡＴＣＣ＃２０３６２  Ｕｒａ３−）の形質転換のために使用した。形質転換体細胞をＭＭＬｅｕ培地プレート上に播種して、３０℃に２〜３日間保った。コロニーを拾ってＭＭおよびＭＭＬｅｕ選択プレート上に画線培養した。ＭＭＬｅｕプレート上で成長できたが、ＭＭプレート上で成長できなかったコロニーをＬｅｕ−株として選択した。次にＬｅｕ−株の単一コロニーを３０℃の液体ＭＭＬｅｕに接種して、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集して脂質を抽出し、エステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。
【０２０４】
ＧＣ分析からは、ＥＤＡの存在がｐＺＫＬｅｕＮ−２９Ｅ３の４つのキメラ遺伝子を含有する形質転換体中に示されたが、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｙ２２２４対照株中には示されなかった。選択された３６個のＬｅｕ−株の大部分は、総脂質の約１２〜１６．９％のＥＤＡを産生した。総脂質の約１７．４％、１７％、および１７．５％のＥＤＡを産生する３つの株（すなわち＃１１、＃３０、および＃３４株）があり、それぞれＹ４００１、Ｙ４００２、およびＹ４００３株と称された。
【０２０５】
総脂質の１７％のＥＤＡを産生するＹ４００１Ｕ株（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ−）の作成
Ｙ４００１株中で、プラスミドｐＹ１１６中のＣｒｅリコンビナーゼ酵素の一時的発現を通じてＹ４００１Ｕ株を作り出し（図５Ｂ）、Ｌｅｕ−およびＵｒａ−フェノタイプを生成した。コンストラクトｐＹ１１６は、次の構成要素を含有した。
【０２０６】
表９
プラスミドｐＹ１１６（配列番号１８０）の説明
0005769374.tif 000012
【０２０７】
一般方法に従って、プラスミドｐＹ１１６を新たに成長させたＹ４００１細胞の形質転換のために使用した。２８０μｇ／ｍＬのスルホニル尿素を含有するＭＭＵプレート上に形質転換体細胞を播種して、３０℃に３〜４日間保った。４個のコロニーを拾って、３０℃の３ｍＬの液体ＹＰＤ培地に接種して２５０ｒｐｍ／分で１日間振盪した。液体ＭＭＵ培地で培養物を１：５０，０００に希釈し、新しいＹＰＤプレート上に１００μＬを播種して３０℃に２日間保った。コロニーを拾ってＭＭＬｅｕおよびＭＭＬｅｕ＋Ｕｒａ選択プレート上に画線培養した。ＭＭＬｅｕ＋Ｕｒａプレート上で成長できたが、ＭＭＬｅｕプレート上で成長できなかったコロニーを選択し、ＧＣによって分析してＣ２０：２（ＥＤＡ）の存在を確認した。Ｌｅｕ−およびＵｒａ−フェノタイプを有する１つの株は、総脂質の約１７％ＥＤＡを産生しＹ４００１Ｕと称された。
【０２０８】
実施例４
自己複製型プラスミドｐＦｍＤ８Ｓの作成
本実施例は、キメラＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｓ：：ＸＰＲ遺伝子を含んでなるプラスミドｐＦｍＤ８Ｓの構築について述べる。プラスミドｐＫＵＮＦｍｋＦ２、ｐＤＭＷ２８７Ｆ、およびｐＤＭＷ２１４からの断片を使用して、三元ライゲーションによってプラスミドｐＦｍＤ８Ｓ（配列番号２０；図６Ｄ）を構築した。１〜３コピーがヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中に存在する、自己複製型プラスミドであるプラスミドｐＦｍＤ８Ｓは、以下の実施例５〜１０で述べられているようにＥｇＤ８Ｓの機能発現（およびその変異）を試験するのに利用された。
【０２０９】
プラスミドｐＫＵＮＦｍｋＦ２
ｐＫＵＮＦｍｋＦ２（配列番号２１；図６Ａ；国際公開第２００６／０１２３２６号パンフレット）は、キメラＦＢＡＩＮｍ：：Ｆ．Ｄ１２：：Ｌｉｐ２遺伝子を含んでなるコンストラクトである（「ＦＢＡＩＮｍＫ」はヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーターであり［国際公開第２００５／０４９８０５号パンフレット］、「Ｆ．Ｄ１２」はフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼであり［国際公開第２００５／０４７４８５号パンフレット］、「Ｌｉｐ２」はヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｌｉｐ２ターミネーター配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ０１２６３２）である）。
【０２１０】
プラスミドｐＤＭＷ２８７Ｆ
ｐＤＭＷ２８７Ｆ（配列番号２２；図６Ｂ；国際公開第２００６／０１２３２６号パンフレット）は、野生型ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来して、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、合成Δ８デサチュラーゼを含んでなるコンストラクトである（ＥｇＤ８Ｓは図中で「Ｄ８ＳＦ」として同定される）。デサチュラーゼ遺伝子は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮプロモーター（国際公開第２００５／０４９８０５号パンフレット；図中で「ＦＢＡ１＋イントロン」として同定される）、およびヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｐｅｘ１６遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７５４３３）のＰｅｘ１６ターミネーター配列で挟まれる。
【０２１１】
プラスミドｐＤＭＷ２１４
ｐＤＭＷ２１４（配列番号２３；図６Ｃ；国際公開第２００５／０４９８０５号パンフレット）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の双方の中で複製できるシャトルプラスミドである。それは次の構成要素を含んだ。
【０２１２】
表１０
プラスミドｐＤＭＷ２１４（配列番号２３）説明
0005769374.tif 000013
【０２１３】
プラスミドｐＦｍＤ８Ｓの最終構築
プラスミドｐＫＵＮＦｍｋＦ２（図６Ａ；ＦＢＡＩＮｍプロモーターを含んでなる）のＰｍｅＩ／ＮｃｏＩ断片、およびプラスミドｐＤＭＷ２８７Ｆ（図６Ｂ；合成Δ８デサチュラーゼ遺伝子ＥｇＤ８Ｓを含んでなる）のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ断片を一方向性に使用して、ｐＤＭＷ２１４（図６Ｃ）のＰｍｅＩ／ＮｏｔＩ断片を置き換えた。これはキメラＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｓ：：ＸＰＲ２遺伝子を含んでなるｐＦｍＤ８Ｓ（配列番号２０；図６Ｄ）の発生をもたらした。したがってｐＦｍＤ８Ｓの構成要素は、下の表１１で述べらるとおりである。
【０２１４】
表１１
プラスミドｐＦｍＤ８Ｓ（配列番号２０）の構成要素
0005769374.tif 000014
【０２１５】
実施例５
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中においてΔ８デサチュラーゼ活性を機能的に分析する迅速スクリーニングの開発
部位特異的変異誘発（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）キット、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）により、ｐＦｍＤ８Ｓ（実施例４）をテンプレートとして、および４０対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＥｇＤ８Ｓ（配列番号１０）内の標的に定めたアミノ酸残基を個々に変異させ、４０セットの変異を作り出した。Ｍ１変異（すなわち配列番号１０内の４ＳからＡ、５ＫからＳ）の創出が、プライマー１Ａおよび１Ｂ（それぞれ配列番号２４および２５）などを必要とするように、特定の変異を実施例２の表７に記載されたものから選択し、プライマーペアを配列番号２４〜１６４に記載のオリゴヌクレオチドから選択した。各変異からのプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ２Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質変換した。４０の各形質転換から４個のコロニーを拾って、液体培地中において３７℃で一晩個々に成長させた。プラスミド（すなわち全部で１６０個）をこれらの培養物から単離して、個々に配列決定して変異を確認した。
【０２１６】
一般方法で述べられているように、プラスミドｐＦｍＤ８Ｓおよび単離された変異プラスミドをＹ４００１株に個々に形質変換した（実施例３）。形質転換体をＭＭプレート上で選択した。３０℃で２日間の成長後、形質転換体を各プレートからこすり取って脂質を抽出し、エステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。
【０２１７】
ＧＣ分析は、プラスミドｐＦｍＤ８Ｓがある形質転換体によって、総脂質の約７％のＤＧＬＡおよび１２％のＥＤＡが生成されたことを示した。ＥｇＤ８Ｓが形質転換体中でＥＤＡをＤＧＬＡに変換する平均変換効率は、３６．８％であった。変換効率を次の式に従って測定した。（［生成物］／［基質＋生成物］）*１００。式中、「生成物」は即時の生成物、および経路中のそれに由来する全ての生成物を含む。
【０２１８】
ＥｇＤ８Ｓ内に変異を保有する形質転換体のＧＣ分析は、４０個の変異の内３０個がΔ８デサチュラーゼ活性に影響しないことを示した（プラスミドｐＦｍＤ８Ｓを保有する形質転換体中の合成のコドン最適化されたＥｇＤ８ＳΔ８デサチュラーゼ活性と比較して）。これらの結果は、ここで述べられるスクリーニング手順（すなわちｐＦｍＤ８Ｓを親プラスミドとして、Ｙ４００１株を宿主として）を使用して、ＥｇＤ８Ｓ変異体を迅速にスクリーンして、どの変異がΔ８デサチュラーゼ活性に悪影響を与えるのか同定できることを示唆した。
【０２１９】
これらの結果に基づき、上述の方法を使用して、実施例２の表７に記載された残る３０個の変異を合成した（効率のためにいくつかの変異を組み合わせて導入した）。表１２は、合成のコドン最適化ＥｇＤ８Ｓ（配列番号１０）のΔ８デサチュラーゼ活性と比較して、各変異ＥｇＤ８ＳにもたらされるΔ８デサチュラーゼ活性の％として、各変異部位（すなわちＭ１〜Ｍ７０）に起因するΔ８デサチュラーゼ活性を述べている。下の表に示されるように、Δ８デサチュラーゼ活性は０％〜１２５％の範囲である。
【０２２０】
表１２
変異Δ８デサチュラーゼ活性
0005769374.tif 000015
【０２２１】
0005769374.tif 000016
【０２２２】
0005769374.tif 000017
【０２２３】
0005769374.tif 000018
【０２２４】
0005769374.tif 000019
【０２２５】
0005769374.tif 000020
＊所望の変異が成功裏に生じなかった場合、またはＧＣデータが欠如している場合にＮ／Ａと報告される。
【０２２６】
実施例６
コンストラクトｐＦｍＤ８Ｓ内のＥｇＤ８Ｓの部位特異的変異誘発によるｐＦｍＤ８Ｓ−１、ｐＦｍＤ８Ｓ−００１、ｐＦｍＤ８Ｓ−２Ａ、ｐＦｍＤ８Ｓ−２Ｂ、ｐＦｍＤ８Ｓ−３Ａ、ｐＦｍＤ８Ｓ−３Ｂ、ｐＦｍＤ８Ｓ−００３、ｐＦｍＤ８Ｓ−４、ｐＦｍＤ８Ｓ−００４、ｐＦｍＤ８Ｓ−００５、およびｐＦｍＤ８Ｓ−００６コンストラクトの作成
ＥｇＤ８Ｓ（配列番号９および１０）に多重選択的変異を導入するための継続的部位特異的変異誘発連続ラウンドによって、一連のプラスミドを作り出した。合成のコドン最適化されたＥｇＤ８Ｓを含んでなるｐＦｍＤ８Ｓ（実施例４）を表１３、１４、１６、および１７で開始テンプレートとして使用する一方、それから作り出された変異（すなわち配列番号１０と比較して１１７ＧからＡおよび１１８ＹからＦへの変異を含んでなるｐＦｍＤ８Ｓ−Ｍ４５）を表１５の開始テンプレートとして使用した。変異ＥｇＤ８Ｓ配列を含んでなる得られたプラスミド、ならびにこれらの変異を作り出すのに使用されたプライマーに関する詳細は、下の表１３、１４、１５、１６、および１７で述べられる。
【０２２７】
「導入変異部位」と題された欄は、実施例２の表７に列挙されるような、変異について選択された特定のアミノ酸部位を指す。「ＥｇＤ８Ｓ（配列番号１０）と比較した得られたプラスミド中の総変異」と題された欄では、太字で強調表示されたアミノ酸変異は、指定された部位特異的変異誘発のラウンドにおいて、テンプレート中に存在しない新たに導入された変異に相当する。括弧内に示される数は、ＥｇＤ８Ｓ（配列番号１０）と比較した、得られたプラスミド中の総変異数に相当する。
【０２２８】
表１３
ｐＦｍＤ８Ｓ−１およびｐＦｍＤ８Ｓ−００１コンストラクトの作成
0005769374.tif 000021
【０２２９】
表１４
ｐＦｍＤ８Ｓ−２ＡおよびｐＦｍＤ８Ｓ−００３コンストラクトの作成
0005769374.tif 000022
【０２３０】
表１５
ｐＦｍＤ８Ｓ−２ＢおよびｐＦｍＤ８Ｓ−００４コンストラクトの作成
0005769374.tif 000023
【０２３１】
表１６
ｐＦｍＤ８Ｓ−３Ａ、ｐＦｍＤ８Ｓ−３ＢおよびｐＦｍＤ８Ｓ−００５コンストラクトの作成
0005769374.tif 000024
【０２３２】
表１７
ｐＦｍＤ８Ｓ−４およびｐＦｍＤ８Ｓ−００６コンストラクトの作成
0005769374.tif 000025
【０２３３】
各変異誘発ラウンド後、ＤＮＡ配列決定によって得られたプラスミド中の変異を確認した。さらにプラスミドをＹ４００１株（実施例３）に形質変換して、実施例５で述べられている方法に基づいて活性をアッセイすることで、各変異プラスミド内の各変異ＥｇＤ８ＳのΔ８デサチュラーゼ活性と、ｐＦｍＤ８Ｓ内の合成のコドン最適化されたＥｇＤ８ＳのΔ８デサチュラーゼ活性とを比較した。これらの機能性分析に基づいて、表１１、１２、１３、１４、および１５で作り出された得られたプラスミド内の変異ＥｇＤ８Ｓ遺伝子の全ての２４の変異は、Δ８デサチュラーゼ活性に影響しないことが実証された（すなわちｐＦｍＤ８Ｓ−Ｍ３、ｐＦｍＤ８Ｓ−Ｍ３，１、ｐＦｍＤ８Ｓ−Ｍ３，１，２、ｐＦｍＤ８Ｓ−１、ｐＦｍＤ８Ｓ−００１、ｐＦｍＤ８Ｓ−Ｍ４５、ｐＦｍＤ８Ｓ−Ｍ４５，２１、ｐＦｍＤ８Ｓ−Ｍ４５，２１，１６、ｐＦｍＤ８Ｓ−２Ａ、ｐＦｍＤ８Ｓ−００３、ｐＦｍＤ８Ｓ−Ｍ４５，４６、ｐＦｍＤ８Ｓ−Ｍ４５，４６，１６，２１、ｐＦｍＤ８Ｓ−２Ｂ、ｐＦｍＤ８Ｓ−００４、ｐＦｍＤ８Ｓ−Ｍ４９、ｐＦｍＤ８Ｓ−Ｍ４９，２６、ｐＦｍＤ８Ｓ−３Ａ、ｐＦｍＤ８Ｓ−３Ｂ、ｐＦｍＤ８Ｓ−００５、ｐＦｍＤ８Ｓ−Ｍ５１、ｐＦｍＤ８Ｓ−Ｍ５１，１５、ｐＦｍＤ８Ｓ−Ｍ５１，１５，１４、ｐＦｍＤ８Ｓ−４、およびｐＦｍＤ８Ｓ−００６）。
【０２３４】
実施例７
複数親プラスミドの消化およびライゲーションによる複合コンストラクトｐＦｍＤ８Ｓ−５Ｂの作成
プラスミドｐＦｍＤ８Ｓ−５Ｂは、ＥｇＤ８Ｓの前半内に１６個の変異アミノ酸を含有した。このプラスミドは三元ライゲーションによって作り出され、ｐＦｍＤ８Ｓ−１からの３１８ｂｐのＮｃｏＩ／ＢｇｌＩＩ断片（７個のアミノ酸変異を含有して、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、およびＭ８に相当する）、およびｐＦｍＤ８Ｓ−２Ｂ（９個のアミノ酸変異を含有して、Ｍ１６、Ｍ１８、Ｍ２１、Ｍ４５およびＭ４６に相当する）からの９５４ｂｐのＢｇｌＩＩ／ＮｏｔＩ断片を使用して、ｐＦｍＤ８ＳのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ断片を置き換えた（実施例４；図６Ｄ）。ＤＮＡ配列は、ｐＦｍＤ８Ｓ−５Ｂが予期された１６個のアミノ酸変異をＥｇＤ８Ｓ内に含有することを確認した。
【０２３５】
プラスミドｐＦｍＤ８Ｓ−５Ｂの合成を図７に概略図として示す（図８および９でも同様の形式を使用する）。明確さのために、その中に各変異ＥｇＤ８Ｓが包含されるｐＦｍＤ８Ｓベクター主鎖は図中に含まれない。その代わり変異ＥｇＤ８Ｓに対応する１２７２個の塩基のみが示される（Δ８デサチュラーゼのコード配列はヌクレオチド塩基２〜１２７０に対応する）。したがって図７の「変異ＥｇＤ８Ｓ−１」と標識される変異ＥｇＤ８Ｓ断片は、プラスミドｐＦｍＤ８Ｓ−１内に見られる変異ＥｇＤ８Ｓに対応し、図７の「変異ＥｇＤ８Ｓ−２Ｂ」と標識される変異ＥｇＤ８Ｓ断片は、プラスミドｐＦｍＤ８Ｓ−２Ｂ内に見られる変異ＥｇＤ８Ｓに対応する。
【０２３６】
同様に、各変異ＥｇＤ８Ｓ遺伝子に隣接するＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ制限酵素部位は、図に含まれない。ＮｃｏＩヌクレオチド認識配列（「ＣＣＡＴＧＧ」）は変異ＥｇＤ８Ｓの−２〜＋４領域に対応し、「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの「Ａ」位置は＋１と称される。ＮｏｔＩヌクレオチド認識配列の一部として認識される最初のヌクレオチドは変異ＥｇＤ８Ｓヌクレオチド＋１２７１であり、変異ＥｇＤ８Ｓの「ＴＡＡ」停止コドンは＋１２６９〜＋１２７０に位置する。
【０２３７】
変異部位は各変異ＥｇＤ８Ｓ上で標識される。星印で示される変異部位が単一アミノ酸変異に相当する（すなわちＭ２*は、１２ＴからＶへの変異に相当する）一方、星印を欠くものは２つの個々のアミノ酸変異に相当する（すなわちＭ１は４ＳからＡへ、および５ＫからＳへの変異に相当する）。２つの星印で示される変異部位は、三重アミノ酸変異に対応する（すなわちＭ５１**は変異３４６ＩからＶ、３４７ＩからＬおよび３４８ＴからＳに相当する）。
【０２３８】
各プラスミドをＹ４００１株に形質変換し（実施例３）、実施例５で述べられている方法に基づいて活性をアッセイすることで、ｐＦｍＤ８Ｓ−５Ｂ内の変異ＥｇＤ８Ｓ−５ＢのΔ８デサチュラーゼ活性と、ｐＦｍＤ８Ｓ内の合成のコドン最適化されたＥｇＤ８ＳのΔ８デサチュラーゼ活性とを比較した。この分析に基づいて、ｐＦｍＤ８Ｓ−５Ｂ中の変異ＥｇＤ８Ｓ−５Ｂ内の１６個のアミノ酸変異（すなわち４ＳからＡ、５ＫからＳ、１２ＴからＶ、１６ＴからＫ、１７ＴからＶ、６６ＰからＱ、６７ＳからＡ、１０８ＳからＬ、１２０ＬからＭ、１２１ＭからＬ、１２５ＱからＨ、１２６ＭからＬ、１１７ＧからＡ、１１８ＹからＦ、１３２ＶからＬ、および１３３ＬからＶ、変異部位Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ８、Ｍ１６、Ｍ１８、Ｍ２１、Ｍ４５、およびＭ４６に相当する）はΔ８デサチュラーゼ活性に影響を与えないと判定された。
【０２３９】
実施例８
コンストラクトｐＦｍＤ８Ｓ−５Ｂ内の変異ＥｇＤ８Ｓ−５Ｂの追加的部位特異的変異誘発によるｐＦｍＤ８Ｓ−１２、ｐＦｍＤ８Ｓ−１３、ｐＦｍＤ８Ｓ−２３、およびｐＦｍＤ８Ｓ−２８コンストラクトの作成
ｐＦｍＤ８Ｓ−５Ｂ（実施例７）を開始テンプレートとして使用して、変異ＥｇＤ８Ｓ−５Ｂに多重選択的変異を導入するための継続的部位特異的変異誘発連続ラウンドによって、追加的な一連のプラスミドを作り出した。変異ＥｇＤ８Ｓ配列を含んでなる得られたプラスミド、ならびにこれらの変異を作り出すのに使用されたプライマーに関する詳細は、下の表１８で述べられる。表１８の形式および欄の題名は、上の実施例６で定義されるのと同じである。
【０２４０】
表１８
ｐＦｍＤ８Ｓ−１２、ｐＦｍＤ８Ｓ−１３、ｐＦｍＤ８Ｓ−２３、およびｐＦｍＤ８Ｓ−２８コンストラクトの作成
0005769374.tif 000026
【０２４１】
（表１８続き）
0005769374.tif 000027
【０２４２】
各変異誘発ラウンド後、ＤＮＡ配列決定によって得られたプラスミド中の変異を確認した。さらにプラスミドをＹ４００１株（実施例３）に形質変換して、実施例５で述べられている方法に基づいて活性をアッセイすることで、各変異プラスミド内の各変異ＥｇＤ８ＳのΔ８デサチュラーゼ活性と、ｐＦｍＤ８Ｓ内の合成のコドン最適化されたＥｇＤ８ＳのΔ８デサチュラーゼ活性とを比較した。これらの機能性分析に基づいて、ｐＦｍＤ８Ｓ−１２内の変異ＥｇＤ８Ｓ−１２中の２０個の変異、ｐＦｍＤ８Ｓ−１３内の変異ＥｇＤ８Ｓ−１３中の２３個の変異、ｐＦｍＤ８Ｓ−２３内の変異ＥｇＤ８Ｓ−２３中の２４個の変異、およびｐＦｍＤ８Ｓ−２８内の変異ＥｇＤ８Ｓ−２８中の３３個の変異は、Δ８デサチュラーゼ活性に影響しないことが実証された。
【０２４３】
実施例９
複数親プラスミドの消化およびライゲーションによる複合コンストラクトｐＦｍＤ８Ｓ−００８、ｐＦｍＤ８Ｓ−００９、ｐＦｍＤ８Ｓ−０１３、およびｐＦｍＤ８Ｓ−０１５の作成
プラスミドｐＦｍＤ８Ｓ−００８およびｐＦｍＤ８Ｓ−００９は、ＥｇＤ８Ｓの前半内にそれぞれ２０および２２個の変異アミノ酸を含有した。これらのプラスミドは、それぞれ図８Ａおよび８Ｂに示すように三元ライゲーションによって作り出された（図の形式は実施例７の図７で述べられているのと同じである）。具体的にはｐＦｍＤ８Ｓ−００１からの３１８ｂｐのＮｃｏＩ／ＢｇｌＩＩ断片（変異ＥｇＤ８Ｓ−００１中に９個のアミノ酸変異を含有して、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ８およびＭ３８に相当する）、およびｐＦｍＤ８Ｓ−００３（変異ＥｇＤ８Ｓ−００３内に１１個のアミノ酸変異含有して、Ｍ１６、Ｍ１８、Ｍ２１、Ｍ４５、Ｍ６８、およびＭ６９に相当する）またはｐＦｍＤ８Ｓ−００４（変異ＥｇＤ８Ｓ−００４中に１３個のアミノ酸変異を含有して、Ｍ１６、Ｍ１８、Ｍ２１、Ｍ４５、Ｍ４６、Ｍ６８、およびＭ６９に相当する）のいずれかからの９５４ｂｐのＢｇｌＩＩ／ＮｏｔＩ断片を使用して、ｐＦｍＤ８ＳのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ断片を置き換え（実施例４；図６Ｄ）、ｐＦｍＤ８Ｓ−００８内の変異ＥｇＤ８Ｓ−００８、およびｐＦｍＤ８Ｓ−００９内の変異ＥｇＤ８Ｓ−００９をそれぞれ作り出した。ＤＮＡ配列は、予期されたように、変異ＥｇＤ８Ｓ−００８が２０個のアミノ酸変異、および変異ＥｇＤ８Ｓ−００９が２２個のアミノ酸変異を含有することを確認した。
【０２４４】
図９Ａおよび９Ｂ（図の形式は実施例７の図７で述べられているのと同じである）に示すように、同様の三元ライゲーション戦略を使用して、変異ＥｇＤ８Ｓ−０１３および変異ＥｇＤ８Ｓ−０１５内にそれぞれ２８個と３１個のアミノ酸変異を含有するプラスミドｐＦｍＤ８Ｓ−０１３およびｐＦｍＤ８Ｓ−０１５を作り出した。ｐＦｍＤ８Ｓ−００９（変異ＥｇＤ８Ｓ−００９内に２２個のアミノ酸変異を含有する）またはｐＦｍＤ８Ｓ−００８（変異ＥｇＤ８Ｓ−００８内に２０個のアミノ酸変異を含有する）いずれかからの６３９ｂｐのＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ断片と、ｐＦｍＤ８Ｓ−２３（実施例８、変異ＥｇＤ８Ｓ−２３内に６個のアミノ酸変異を含有して、Ｍ１２、Ｍ１５、Ｍ２６、およびＭ７０に相当する）またはｐＦｍＤ８Ｓ−２８（実施例８、変異ＥｇＤ８Ｓ−２８内に１１個のアミノ酸変異を含有して、Ｍ１２、Ｍ１５、Ｍ２６、Ｍ５１Ｂ、Ｍ６３、およびＭ７０に相当する）のいずれかからの６３３ｂｐのＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ断片とを使用して、ｐＦｍＤ８ＳのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ断片を置き換え（実施例４；図６Ｄ）、それぞれｐＦｍＤ８Ｓ−０１３およびｐＦｍＤ８Ｓ−０１５を作り出した。ＤＮＡ配列は、変異ＥｇＤ８Ｓ−０１３および変異ＥｇＤ８Ｓ−０１５が、それぞれ２８個のアミノ酸変異および３１個のアミノ酸変異を含有することを確認した。
【０２４５】
これらのプラスミドをＹ４００１株（実施例３）に形質変換して、実施例５で述べられている方法に基づいて活性をアッセイすることで、ｐＦｍＤ８Ｓ−００８内の変異ＥｇＤ８Ｓ−００８、ｐＦｍＤ８Ｓ−００９内の変異ＥｇＤ８Ｓ−００９、ｐＦｍＤ８Ｓ−０１３内の変異ＥｇＤ８Ｓ−０１３、およびｐＦｍＤ８Ｓ−０１５内の変異ＥｇＤ８Ｓ−０１５のΔ８デサチュラーゼ活性と、ｐＦｍＤ８Ｓ内の合成のコドン最適化されたＥｇＤ８ＳのΔ８デサチュラーゼ活性とを比較した。これらの機能性分析に基づいて、ｐＦｍＤ８Ｓ−００８内の変異ＥｇＤ８Ｓ−００８中の２０個の変異（すなわち４ＳからＡ、５ＫからＳ、１２ＴからＶ、１６ＴからＫ、１７ＴからＶ、６６ＰからＱ、６７ＳからＡ、１０８ＳからＬ、１２０ＬからＭ、１２１ＭからＬ、１２５ＱからＨ、１２６ＭからＬ、５４ＡからＧ、５５ＦからＹ、１１７ＧからＡ、１１８ＹからＦ、１６２ＬからＶ、１６３ＶからＬ、１７０ＧからＡ、および１７１ＬからＶ、変異部位Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ８、Ｍ１６、Ｍ１８、Ｍ２１、Ｍ３８、Ｍ４５、Ｍ６８、およびＭ６９に相当する）、ｐＦｍＤ８Ｓ−００９内の変異ＥｇＤ８Ｓ−００９中の２２個の変異（すなわち４ＳからＡ、５ＫからＳ、１２ＴからＶ、１６ＴからＫ、１７ＴからＶ、６６ＰからＱ、６７ＳからＡ、１０８ＳからＬ、１２０ＬからＭ、１２１ＭからＬ、１２５ＱからＨ、１２６ＭからＬ、５４ＡからＧ、５５ＦからＹ、１１７ＧからＡ、１１８ＹからＦ、１３２ＶからＬ、１３３ＬからＶ、１６２ＬからＶ、１６３ＶからＬ、１７０ＧからＡ、および１７１ＬからＶ、変異部位Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ８、Ｍ１６、Ｍ１８、Ｍ２１、Ｍ３８、Ｍ４５、Ｍ４６、Ｍ６８、およびＭ６９に相当する）、ｐＦｍＤ８Ｓ−０１３内の変異ＥｇＤ８Ｓ−０１３中の２８個の変異（すなわち４ＳからＡ、５ＫからＳ、１２ＴからＶ、１６ＴからＫ、１７ＴからＶ、６６ＰからＱ、６７ＳからＡ、４０７ＡからＳ、４０８ＶからＱ、４２２ＬからＱ、１０８ＳからＬ、１２０ＬからＭ、１２１ＭからＬ、１２５ＱからＨ、１２６ＭからＬ、２９３ＬからＭ、５４ＡからＧ、５５ＦからＹ、１１７ＧからＡ、１１８ＹからＦ、１３２ＶからＬ、１３３ＬからＶ、１６２ＬからＶ、１６３ＶからＬ、１７０ＧからＡ、１７１ＬからＶ、４１８ＡからＧ、および４１９ＧからＡ、変異部位Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ８、Ｍ１２、Ｍ１５、Ｍ１６、Ｍ１８、Ｍ２１、Ｍ２６、Ｍ３８、Ｍ４５、Ｍ４６、Ｍ６８、Ｍ６９、Ｍ７０に相当する）、またはｐＦｍＤ８Ｓ−０１５内の変異ＥｇＤ８Ｓ−０１５中の３１個の変異（すなわち４ＳからＡ、５ＫからＳ、１２ＴからＶ、１６ＴからＫ、１７ＴからＶ、６６ＰからＱ、６７ＳからＡ、４０７ＡからＳ、４０８ＶからＱ、４２２ＬからＱ、１０８ＳからＬ、１２０ＬからＭ、１２１ＭからＬ、１２５ＱからＨ、１２６ＭからＬ、２９３ＬからＭ、５４ＡからＧ、５５ＦからＹ、１１７ＧからＡ、１１８ＹからＦ、３４６ＩからＶ、３４７ＩからＬ、３４８ＴからＳ、２７９ＴからＬ、２８０ＬからＴ、１６２ＬからＶ、１６３ＶからＬ、１７０ＧからＡ、１７１ＬからＶ、４１８ＡからＧ、および４１９ＧからＡ、変異部位Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ８、Ｍ１２、Ｍ１５、Ｍ１６、Ｍ��８、Ｍ２１、Ｍ２６、Ｍ３８、Ｍ４５、Ｍ５１Ｂ、Ｍ６３、Ｍ６８、Ｍ６９、Ｍ７０に相当する）によって、Δ８デサチュラーゼ活性が影響されないことが実証された。
【０２４６】
図１０は、ＥｇＤ８Ｓ（配列番号１０）、変異ＥｇＤ８Ｓ−２３（配列番号４；実施例８）、変異ＥｇＤ８Ｓ−０１３（配列番号６；実施例９）、および変異ＥｇＤ８Ｓ−０１５（配列番号８；実施例９）のアラインメントを示す。使用したアラインメント法は、「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法」に対応する。
【０２４７】
実施例１０
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムへの組み込みに際しての合成のコドン最適化されたＥｇＤ８Ｓおよびその変異体間のΔ８デサチュラーゼ活性の比較
この実施例は、ｐＦｍＤ８Ｓ−２３、ｐＦｍＤ８Ｓ−０１３、およびｐＦｍＤ８Ｓ−０１５内に含まれるＥｇＤ８Ｓとその変異体のΔ８デサチュラーゼ活性の定量分析について述べている。この比較は、ＥｇＤ８Ｓ（またはその変異体）を含んでなる各キメラ遺伝子をｐＫＯ２ＵＦｋＦ２ベクター主鎖に挿入することを要した。（プラスミドの組み込みはゲノムのその他の部位へのランダム組み込みを通じることもできるが）具体的にはｐＫＯ２ＵＦｋＦ２は、この遺伝子座への組み込みを標的とするようにデザインされた、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子の５’および３’部分を含んでなった。したがってヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノム（すなわち１コピー）中における合成のコドン最適化されたＥｇＤ８Ｓ、変異ＥｇＤ８Ｓ−０２３、変異ＥｇＤ８Ｓ−０１３、および変異ＥｇＤ８Ｓ−０１５を含有するキメラ遺伝子の活性は、プラスミド発現に際して（すなわち１〜３コピーとしてｐＦｍＤ８中での発現を通じて）得られ前の実施例で報告されたΔ８デサチュラーゼ活性レベルとは対照的に、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムへの組み込みに際してより適正に比較できた。
【０２４８】
ｐＫＯ２ＵＦｋＦ２の構成要素は、下の表１９で述べらるとおりである。
【０２４９】
表１９
プラスミドｐＫＯ２ＵＦｋＦ２（配列番号１６５）の構成要素
0005769374.tif 000028
【０２５０】
最初にｐＦｍＤ８ＳからのＳｗａＩ／ＮｏｔＩ断片（キメラＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｓ遺伝子を含んでなり、ＥｇＤ８Ｓは図６Ｄ中で「Ｄ８−補正」として同定される）を使用して、ｐＫＯ２ＵＦｋＦ２のＳｗａＩ／ＮｏｔＩ断片（キメラＦＢＡＩＮｍ：：Ｆ．Ｄ１２遺伝子を含んでなる）を置き換えて、コンストラクトｐＫＯ２ＵＦｍ８（図１１Ａ）を作り出した。同一方法を使用して、ｐＫＯ２ＵＦｋＦ２のＳｗａＩ／ＮｏｔＩ断片をｐＦｍＤ８Ｓ−２３、ｐＦｍＤ８Ｓ−０１３、およびｐＦｍＤ８Ｓ−０１５のＳｗａＩ／ＮｏｔＩ断片でそれぞれ置き換え、それによってコンストラクトｐＫＯ２ＵＦｍ８−２３、ｐＫＯ２ＵＦｍ８−０１３、およびｐＫＯ２ＵＦｍ８−０１５をそれぞれ作り出した。したがって合成のコドン最適化されたＥｇＤ８Ｓ、変異ＥｇＤ８Ｓ−０２３、変異ＥｇＤ８Ｓ−０１３、および変異ＥｇＤ８Ｓ−０１５は、それぞれＦＢＡＩＮｍプロモーターおよびＰｅｘ２０ターミネーターの制御下にある。
【０２５１】
一般方法に従って、プラスミドｐＫＯ２ＵＦｍ８、ｐＫＯ２ＵＦｍ８−２３、ｐＫＯ２ＵＦｍ８−０１３、およびｐＫＯ２ＵＦｍ８−０１５をＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に個々にＹ４００１株の形質転換のために使用した。形質転換に続いて、細胞をＭＭプレート上に播種して、３０℃に２〜３日間保った。
【０２５２】
各形質転換から合計６つの形質転換体を拾って、ＭＭプレート上に再度画線培養した。ひとたび成長したら、これらの株を３０℃の液体ＭＭに個々に接種して、２５０ｒｐｍ／分で振盪しながら１日間成長させた。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出してエステル交換により脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。各Δ８デサチュラーゼのΔ８デサチュラーゼ活性を下の表２０に示す。変換効率は、実施例５で述べられているように計算した。
【０２５３】
表２０
ＥｇＤ８Ｓ中Δ８デサチュラーゼ活性のおよびその変異
0005769374.tif 000029
【０２５４】
特定の各変異ＥｇＤ８Ｓについて観察される異なる変換効率は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノム中における、各遺伝子組み込みのそれぞれの位置に基づく、「位置効果」に起因してもよい。いずれにせよ結果は、変異ＥｇＤ８Ｓ−２３（配列番号４）、変異ＥｇＤ８Ｓ−０１３（配列番号６）、および変異ＥｇＤ８Ｓ−０１５（配列番号８）を含んでなる形質転換体のいくつかが、合成のコドン最適化ＥｇＤ８Ｓ（配列番号１０）と比較して、少なくとも機能的に同等の（または増大した）Δ８デサチュラーゼ活性を有することを実証した。
【０２５５】
実施例１１
総脂質の約１０〜１３．６％のＤＧＬＡを産生するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４０３１、Ｙ４０３２、およびＹ４０３３株の作成
本実施例は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４００１Ｕ（実施例３）に由来して、総脂質に対して１０〜３．６％のＤＧＬＡ（Ｃ２０：３）を産生できる、Ｙ４０３１、Ｙ４０３２、およびＹ４０３３株の構築について述べる。これらの株は改変されて、本発明の変異Δ８デサチュラーゼと、Δ９エロンガーゼとの発現を通じて、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路を発現した。
【０２５６】
より具体的にはコンストラクトｐＫＯ２ＵＦ８２８９（図１１Ｂ；配列番号１８１）を作り出して、Ｙ４００１Ｕ株中のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムのΔ１２遺伝子座に、４つのキメラ遺伝子（１つのΔ１２デサチュラーゼ、変異ＥｇＤ８−２３の２つのコピー、および１つのΔ９エロンガーゼを含んでなる）のクラスターを組み込んだ。コンストラクトｐＫＯ２ＵＦ８２８９は次の構成要素を含有した。
【０２５７】
表２１
プラスミドｐＫＯ２ＵＦ８２８９（配列番号１８１）の説明
0005769374.tif 000030
【０２５８】
（表２１続き）
0005769374.tif 000031
【０２５９】
一般方法に従って、プラスミドｐＫＯ２ＵＦ８２８９をＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次にＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４００１Ｕ株の形質転換（実施例３）のために使用した。形質転換体細胞をＭＭＬｅｕ培養プレート上に播種して、３０℃に２〜３日間保った。コロニーを拾ってＭＭＬｅｕ選択プレート上に３０℃で２日間画線培養した。次にこれらの細胞を３０℃の液体ＭＭＬｅｕに接種して、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。遠心分離によって細胞を収集して脂質を抽出し、脂肪酸メチルエステルをエステル交換によって調製し、引き続いてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。
【０２６０】
ＧＣ分析は、ｐＫＯ２ＵＦ８２８９の４つのキメラ遺伝子を含有する形質転換体中に、ＤＧＬＡの存在を示したが、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｙ４００１Ｕ対照株中には示さなかった。選択された１２株のほとんどが、総脂質の約４〜８％ＤＧＬＡを産生する。総脂質の約１１．３％、１０％、および１３．６％のＤＧＬＡを産生する３つの株（すなわち＃７、＃８、および＃１２株）があり、それらをそれぞれＹ４０３１、Ｙ４０３１、およびＹ４０３３株と称した。
【０２６１】
実施例１２
ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）からのΔ９エロンガーゼの同定
米国仮特許出願第６０／７３９９８９号明細書で開示されている本実施例は、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）（配列番号１７５および１７６）からのΔ９エロンガーゼの単離について述べている。
【０２６２】
ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）の成長条件、脂質プロフィールおよびｍＲＮＡ単離
ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）は、ミシガン州立大学（Ｅａｓｔ  Ｌａｎｓｉｎｇ，ＭＩ）のＲｉｃｈａｒｄ  Ｔｒｉｅｍｅｒ博士の研究室から得られた。５００ｍＬガラス瓶内の２５０ｍＬのミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）（Ｅｇ）培地に、１０ｍＬの活発に成長する培養物から１ｍＬのアリコートを移した。Ｅｇ培地は、９７０ｍＬの水中で、１ｇの酢酸ナトリウム、１ｇのビーフエキス（Ｕ１２６−０１、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、２ｇのバクト（登録商標）トリプトン（０１２３−１７−３、Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、２ｇのバクト（登録商標）酵母抽出物（０１２７−１７−９、Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を合わせて作成した。濾過滅菌後、３０ｍＬの土壌水上清（１５−３７９０、Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｕｐｐｌｙ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ）を無菌的に添加して、最終Ｅｇ培地を得た。ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）培養を２３℃において１６時間の明期、８時間の暗期のサイクルで撹拌せずに２週間にわたり成長させた。
【０２６３】
２週間後、脂質分析のために１０ｍＬの培養を取り除いて１，８００×ｇで５分間遠心分離した。ペレットを水で１回洗浄し、再度遠心分離した。得られたペレットを真空下で５分間乾燥させ、１００μＬの水酸化トリメチルスルホニウム（ＴＭＳＨ）に再懸濁して、室温で振盪しながら１５分間インキュベートした。その後０．５ｍＬのヘキサンを添加して、バイアルを室温で振盪しながら１５分間インキュベートした。Ｏｍｅｇａｗａｘ  ３２０溶融石英キャピラリーカラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｉｎｃ．、カタログ番号２４１５２）を装着したＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０ガスクロマトグラフを使用して、脂肪酸メチルエステル（５μＬヘキサン層からの注入）を分離し定量化した。２２０℃を２．７分間保持し、２０℃／分で２４０℃に増大させ、次にさらに２．３分間保持するように、オーブン温度をプログラムした。キャリアガスはＷｈａｔｍａｎ水素発生装置によって供給された。滞留時間を標準市販メチルエステル（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ  Ｐｒｅｐ，Ｉｎｃ．カタログ番号Ｕ−９９−Ａ）のそれと比較した。
【０２６４】
残る２週間培養（２４０ｍＬ）を１，８００×ｇで１０分間遠心分離してペレット化した。水で１回洗浄し、再度遠心分離した。ＲＮＡ  ＳＴＡＴ−６０（商標）試薬（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ，Ｉｎｃ．、Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）を使用して、提供された製造業者のプロトコール（５ｍＬの試薬を使用して、ＲＮＡを０．５ｍＬの水に溶解する）に従って、得られたペレットから全ＲＮＡを抽出した。このようにして、１ｍｇの総ＲＮＡ（２ｍｇ／ｍＬ）がペレットから得られた。ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して、提供された製造業者のプロトコールに従って１ｍｇの総ＲＮＡからｍＲＮＡを単離した。このようにして、８５μｇのｍＲＮＡが得られた。
【０２６５】
ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）ｃＤＮＡ合成、ライブラリーの構築および配列決定
Ｃｌｏｎｅｍｉｎｅｒ（商標）ｃＤＮＡライブラリー構築キット（カタログ番号１８２４９−０２９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、提供される製造業者のプロトコール（バージョンＢ、２５−０６０８）をに従って、ｃＤＮＡライブラリーを作り出した。非放射性標識法を使用して、ビオチン−ａｔｔＢ２−オリゴ（ｄＴ）プライマーを使用して（上述の）３．２μｇのｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。第１および第２のストランド合成後に、ａｔｔＢ１アダプターを付加し、ライゲートしてカラムクロマトグラフィーを用いてｃＤＮＡをサイズ分画した。画分７および８からのＤＮＡ（サイズ範囲約８００〜１５００ｂｐ）を濃縮し、ｐＤＯＮＲ（商標）２２２に遺伝子組み換えして、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ（商標）ＤＨ１０Ｂ（商標）Ｔ１ファージ−抵抗性細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に形質変換した。ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）ライブラリーをｅｅｇ１ｃと命名した。
【０２６６】
配列決定のために、最初にクローンを３８４−ウェル凍結培地プレート内で成長／凍結された保存グリセロール培養物から回収し、無菌３８４ピンレプリケーター（Ｇｅｎｅｔｉｘ、Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて、ＬＢ＋７５μｇ／ｍＬカナマイシン（複製プレート）を含有する３８４−ウェルマイクロタイタープレート内に複製した。次にＴｅｍｐｌｉｐｈｉ  ＤＮＡ配列決定テンプレート増幅キット法（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、製造業者のプロトコールに従ってプラスミドを単離した。簡単に述べるとＴｅｍｐｌｉｐｈｉ法は、等温ローリングサークル増幅によって、バクテリオファージφ２９ＤＮＡポリメラーゼを使用して、環状一本鎖または二本鎖ＤＮＡを増幅する（Ｄｅａｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、１１：１０９５〜１０９９頁（２００１年）；Ｎｅｌｓｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３２：Ｓ４４〜Ｓ４７頁（２００２年））。３７℃で２０時間成長させた後、複製プレートからの細胞を５μＬの希釈緩衝液に添加して９５℃で３分間変性させ、部分的に細胞を溶解して、変性テンプレートを放出する。次にＴｅｍｐｌｉｐｈｉプレミックス（５μＬ）を各サンプルに添加して、得られた反応混合物を３０℃で１６時間、次に６５℃で１０分間インキュベートして、φ２９ＤＮＡポリメラーゼ活性を不活性化した。増幅サンプルを蒸留水中で１：３に希釈した後に、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ定量化試薬（分子プローブ）を用いて、ＤＮＡ定量化を実施した。
【０２６７】
次に増幅産物を９５℃で１０分間変性させ、Ｍ１３Ｆ汎用プライマー（配列番号１９３）、およびＡＢＩ  ＢｉｇＤｙｅバージョン３．１  Ｐｒｉｓｍ配列決定キットを使用して、３８４−ウェルプレート内で末端配列決定した。配列決定反応のために、１００〜２００ｎｇのテンプレートおよび６．４ｐｍｏｌのプライマーを使用して、次の反応条件を２５回繰り返した。９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、および６０℃で４分間。エタノールベースのクリーンアップ後、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＡＢＩ  ３７３０ｘｌ自動化配列決定装置上で、サイクル配列決定反応生成物を分解して検出した。
【０２６８】
ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）ｃＤＮＡライブラリーｅｅｇ１ｃからの長鎖多価不飽和脂肪酸エロンガーゼ相同体の同定
ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（全ての非重複ＧｅｎＢａｎｋＣＤＳ翻訳と、三次元構造Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎタンパク質データバンク、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベースの最新メジャーリリース、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪデータベースに由来する配列とを含んでなる）に含まれる配列について、類似性のためのＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍａｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０頁（１９９３年））検索を行って、長鎖多価不飽和脂肪酸エロンガーゼ相同体（ＬＣ−ＰＵＦＡ  ＥＬＯ相同体またはΔ９エロンガーゼ）をコードするｃＤＮＡクローンを同定した。国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）によって提供されるＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用して、「ｎｒ」データベース中に含まれる全ての公的に入手可能なＤＮＡ配列との類似性について、上から得られたミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）のｃＤＮＡ配列を分析した。ＤＮＡ配列を全ての読み枠内で翻訳し、ＮＣＢＩによって提供されるＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（ＧｉｓｈおよびＳｔａｔｅｓ、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、３：２６６〜２７２頁（１９９３年））を使用して、「ｎｒ」データベース中に含まれる全ての公的に入手可能なタンパク質配列との類似性について比較した。便宜上、ＢＬＡＳＴによって計算される、ｃＤＮＡ配列と検索されたデータベース中に含まれる配列との単なる偶然によるマッチを観察するＰ−値（確率）は、ここで「ｐＬｏｇ」値として報告され、報告されたＰ−値の対数の負数に相当する。したがってｐＬｏｇ値が大きいほど、ｃＤＮＡ配列とＢＬＡＳＴ「ｈｉｔ」が相同的なタンパク質に相当する可能性が大きくなる。
【０２６９】
クローンｅｅｇ１ｃ．ｐｋ００１．ｎ５．ｆからのヌクレオチド配列を使用したＢＬＡＳＴＸ検索は、ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質と、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）からの長鎖ＰＵＦＡエロンガーゼ（配列番号１７３）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＬ３７６２６（ＧＩ１７２２６１２３）、遺伝子座ＡＡＬ３７６２６、ＣＤＳＡＦ３９０１７４；Ｑｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５１０（３）：１５９〜１６５頁（２００２年））との類似性を明らかにした。クローンｅｅｇ１ｃ．ｐｋ００１．ｎ５．ｆからのｃＤＮＡ挿入断片の一部の配列を配列番号１９４に示す（ｃＤＮＡ挿入断片の５’末端）。上述のようにして、しかしｐｏｌｙ（Ａ）ｔａｉｌ−プライムドＷｏｂｂｌｅＴオリゴヌクレオチドを使用して、ｅｅｇ１ｃ．ｐｋ００１．ｎ５．１のｃＤＮＡ挿入断片の３’末端から追加的配列を得た。簡単に述べると、ＷｏｂｂｌｅＴプライマーは、ｃＤＮＡクローンの３’末端の配列決定に使用される、２１ｍｅｒのｐｏｌｙ（Ｔ）Ａ、ｐｏｌｙ（Ｔ）Ｃ、およびｐｏｌｙ（Ｔ）Ｇの等モル混合物である。
【０２７０】
３’末端配列を配列番号１９５に示す。Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）（バージョン４．２、Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を使用して、５’および３’配列の双方をアラインメントし、得られたｃＤＮＡ配列を配列番号１９６（１２０１ｂｐ）に示す。ｅｅｇ１ｃ．ｐｋ００１．ｎ５．ｆ中のｃＤＮＡからのコード配列の配列決定、および対応する推定されたアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１７５（７７７ｂｐ）および配列番号１７６（２５８アミノ酸）に示す。
【０２７１】
配列番号１７６に記載のアミノ酸配列をＢＬＡＳＴＰによって評価し、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）配列（配列番号１７３）に対して３８．７０（Ｅ値２ｅ−３９）のｐＬｏｇ値を得た。ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼは、Ｊｏｔｕｎ  Ｈｅｉｎ法を使用して、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）Δ９エロンガーゼ配列と３９．４％同一である。Ｊｏｔｕｎ  Ｈｅｉｎ法（Ｈｅｉｎ，Ｊ．Ｊ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．、１８３：６２６〜６４５頁（１９９０年））によって実施された配列％同一性計算は、ペアワイズアラインメントのためのデフォルトパラメーター（ＫＴＵＰＬＥ＝２）で、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ（商標）バイオインフォマティクス演算スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ（商標）Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して行った。ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ法を使用して、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）Δ９エロンガーゼ配列と３１．８％同一である。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ法（Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、５：１５１〜１５３頁（１９８９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、８：１８９〜１９１頁（１９９２年））によって実施した配列％同一性計算は、ペアワイズアラインメントのためのデフォルトパラメーターで（ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５およびＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して行った。ＢＬＡＳＴスコアおよび確率は、ここで配列番号１７５として述べられている核酸断片が、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ全体をコードすることを示唆する。
以下に本発明の態様を示す。
１．（ａ）Δ８デサチュラーゼ活性を有して、配列番号１０と同一でない配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する、変異ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
（ｂ）パート（ａ）のヌクレオチド配列の補体
を含んでなり、補体およびヌクレオチド配列が同数のヌクレオチドからなって１００％相補的である、単離されたポリヌクレオチド。
２．ヌクレオチド配列が配列番号１を含んでなり、配列番号１が配列番号９と同一でない、上記１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
３．（ａ）Δ８デサチュラーゼ活性を有して、配列番号１０と同一でない配列番号１９８に記載のアミノ酸配列を有する、変異ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
（ｂ）パート（ａ）のヌクレオチド配列の補体
を含んでなり、補体およびヌクレオチド配列が同数のヌクレオチドからなって１００％相補的である、単離されたポリヌクレオチド。
４．ヌクレオチド配列が、配列番号９と同一でない配列番号１９７を含んでなる、上記３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
５．Δ８デサチュラーゼ活性を有する、上記１に記載の単離されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
６．Δ８デサチュラーゼ活性を有する、上記３に記載の単離されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。
７．Δ８デサチュラーゼ活性が、配列番号１０に記載のポリペプチドのΔ８デサチュラーゼ活性と少なくとも機能的にほぼ同等である、上記５に記載のポリペプチド。
８．Δ８デサチュラーゼ活性が、配列番号１０に記載のポリペプチドのΔ８デサチュラーゼ活性と少なくとも機能的にほぼ同等である、上記６に記載のポリペプチド。
９．少なくとも１つの制御配列と作動的に連結する、上記１または３のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチドを含んでなる組み換えコンストラクト。
１０．上記１または上記３のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドを含んでなる細胞。
１１．前記細胞が酵母である、上記１０に記載の細胞。
１２．酵母が、その乾燥細胞重量の少なくとも約２５％を油として産生する油性酵母である、上記１１に記載の細胞。
１３．油性酵母が、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される、上記１２に記載の細胞。
１４．（ａ）上記１０に記載の酵母細胞を提供するステップと、
（ｂ）長鎖多価不飽和脂肪酸が生成される条件下で（ａ）の酵母細胞を成長させるステップと
を含んでなる、酵母細胞中で長鎖多価不飽和脂肪酸を製造する方法。
１５．酵母が、その乾燥細胞重量の少なくとも約２５％を油として産生する油性酵母である、上記１４に記載の方法。
１６．酵母がヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種である、上記１５に記載の方法。
１７．上記１２に記載の酵母から得られる微生物油。
１８．ａ）上記１または上記３に記載のΔ８デサチュラーゼポリペプチドをコードして、少なくとも１つの制御配列と作動的に連結する、単離されたポリヌクレオチドを含んでなる第１の組み換えＤＮＡコンストラクト、および
ｂ）少なくとも１つの制御配列と作動的に連結する単離されたポリヌクレオチドを含んでなり、ポリペプチドをコードするコンストラクトが、Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ14/16エロンガーゼ、Ｃ16/18エロンガーゼ、Ｃ18/20エロンガーゼ、およびＣ20/22エロンガーゼからなる群から選択される、少なくとも１つの第２の組み換えＤＮＡコンストラクト
を含んでなる、その乾燥細胞重量の少なくとも約２５％を油として産生する油性酵母。
１９．ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される、上記１８に記載の酵母。
２０．酵母細胞がヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種であり、油がアラキドン酸、エイコサジエン酸、エイコサペンタエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサトリエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、ドコサペンタエン酸、およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される長鎖多価不飽和脂肪酸を含んでなる、上記１９に記載の酵母。
２１．第１の組み換えＤＮＡコンストラクトが、Δ８デサチュラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなり、配列番号２および配列番号１９８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、上記１８に記載の油性酵母。
２２．ａ）（ｉ）Δ８デサチュラーゼポリペプチドをコードして、配列番号１０と同一でない配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する組み換えコンストラクト、および
（ｉｉ）エイコサジエン酸源
を含んでなる、油性酵母を提供するステップと、
ｂ）Δ８デサチュラーゼポリペプチドをコードする組み換えコンストラクトが発現して、エイコサジエン酸がジホモ−γ−リノール酸に変換される条件下で、ステップ（ａ）の酵母を成長させるステップと、
ｃ）場合によりステップ（ｂ）のジホモ−γ−リノール酸を回収するステップと
を含んでなる、ジホモ−γ−リノール酸を生成する方法。
２３．ａ）（ｉ）Δ８デサチュラーゼポリペプチドをコードして、配列番号１０と同一でない配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する組み換えコンストラクト、および
（ｉｉ）エイコサトリエン酸源
を含んでなる、油性酵母を提供するステップと、
ｂ）Δ８デサチュラーゼポリペプチドをコードする組み換えコンストラクトが発現して、エイコサトリエン酸がエイコサテトラエン酸に変換される条件下で、ステップ（ａ）の酵母を成長させるステップと、
ｃ）場合によりステップ（ｂ）のエイコサテトラエン酸を回収するステップと
を含んでなる、エイコサテトラエン酸を生成する方法。
２４．ａ）ｉ）少なくとも１つの制御配列と作動的に連結する上記１または上記３のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドを含んでなる第１の組み換えＤＮＡコンストラクト、および
ｉｉ）少なくとも１つの制御配列と作動的に連結するΔ９エロンガーゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを含んでなる少なくとも１つの第２の組み換えＤＮＡコンストラクト
を含んでなる、酵母細胞を提供するステップと、
ｂ）（ａ）の酵母細胞にリノレン酸源を提供するステップと、
ｃ）ジホモ−γ−リノール酸が形成される条件下で（ｂ）の酵母細胞を成長させるステップと
を含んでなる、ジホモ−γ−リノール酸を生成する方法。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
0005769374.tif 000042
【図６Ｄ】
0005769374.tif 000043
【図７】
0005769374.tif 000044
【図８Ａ】
0005769374.tif 000045
【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
0005769374.tif 000047
【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
0005769374.tif 000049
【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【配列表】
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