(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）アゴニストの有効量を含む代謝性疾患又は状態を治療するための医薬であって、該代謝性疾患が、メタボリックシンドローム（ＭｅｔＳ）、肥満症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、高脂血症、２型糖尿病、非２型糖尿病、１型糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤ）、及び若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）からなる群から選択され、ＦＧＦＲ１アゴニストがＦＧＦＲ２又はＦＧＦＲ３を活性化しない抗ＦＧＦＲ１抗体であって、抗ＦＧＦＲ１抗体が、ペプチド＃２６ ＫＬＨＡＶＰＡＡＫＴＶＫＦＫＣＰ（配列番号２８）又はペプチド＃２８ ＦＫＰＤＨＲＩＧＧＹＫＶＲＹ（配列番号２９）に結合する、医薬。
【請求項２】
抗ＦＧＦＲ１抗体が、ＦＧＦＲ１ｂ及びＦＧＦＲ１ｃの両方に結合する、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
抗体が二重特異性抗体である、請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項４】
抗体はまたβ−クロトーに結合する、請求項３に記載の医薬。
【請求項５】
抗体がＦＧＦＲ１活性のアゴニストであって、抗体がペプチド＃２６ ＫＬＨＡＶＰＡＡＫＴＶＫＦＫＣＰ（配列番号２８）又はペプチド＃２８ ＦＫＰＤＨＲＩＧＧＹＫＶＲＹ（配列番号２９）に結合する、ＦＧＦＲ１に結合する単離された抗体。
【請求項６】
抗体が、ＦＧＦＲ２又はＦＧＦＲ３のアゴニストではない、請求項５に記載の単離された抗体。
【請求項７】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項５又は６に記載の抗体。
【請求項８】
抗体が、ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である、請求項５から７の何れか一項に記載の抗体。
【請求項９】
抗体が、ＳＳＧＹＧＧＳＤＹＡＭＤＹ（配列番号１６）、ＳＧＹＧＧＳＤＹＡＭＤＹ（配列番号１７）、ＥＨＦＤＡＷＶＨＹＹＶＭＤＹ（配列番号１８）、ＴＧＴＤＶＭＤＹ（配列番号１９）、及びＧＴＤＶＭＤＹ（配列番号２０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｂ）アミノ酸配列ＱＱＳＹＴＴＰＰＴ（配列番号２３）を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び（ｃ）Ｘ１がＡ又はＧ、Ｘ２がＤ又はＥ、Ｘ３がＤ又はＹ、Ｘ４がＮ又はＹ、Ｘ５がＡ又はＤ、及びＸ６がＤ又はＹであるＸ１Ｘ２ＩＸ３ＰＸ４ＤＧＸ５ＴＸ６ＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２４）及びＸ１がＤ又はＥ、Ｘ２がＤ又はＹ、Ｘ３がＮ又はＹ、Ｘ４がＡ又はＤ、及びＸ５がＤ又はＹであるＸ１ＩＸ２ＰＸ３ＤＧＸ４ＴＸ５ＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む、請求項５から８の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
抗体が、（ａ）Ｘ１がＳ又はＴ、Ｘ２がＮ又はＳ、Ｘ３がＮ又はＴ、Ｘ４がＷ又はＹ、Ｘ５がＨ又はＳであるアミノ酸配列ＧＦＴＦＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＩＸ５（配列番号２６）を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）Ｘ１がＡ又はＧ、Ｘ２がＤ又はＥ、Ｘ３がＤ又はＹ、Ｘ４がＮ又はＹ、Ｘ５がＡ又はＤ、及びＸ６がＤ又はＹであるＸ１Ｘ２ＩＸ３ＰＸ４ＤＧＸ５ＴＸ６ＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２４）、及びＸ１がＤ又はＥ、Ｘ２がＤ又はＹ、Ｘ３がＮ又はＹ、Ｘ４がＡ又はＤ、及びＸ５がＤ又はＹであるＸ１ＩＸ２ＰＸ３ＤＧＸ４ＴＸ５ＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及びＳＳＧＹＧＧＳＤＹＡＭＤＹ（配列番号１６）、ＳＧＹＧＧＳＤＹＡＭＤＹ（配列番号１７）、ＥＨＦＤＡＷＶＨＹＹＶＭＤＹ（配列番号１８）、ＴＧＴＤＶＭＤＹ（配列番号１９）、及びＧＴＤＶＭＤＹ（配列番号２０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、請求項５から８の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
抗体が、（ａ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＴＳＴＷＩＳ（配列番号７）を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＧＥＩＤＰＹＤＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１０）及びＥＩＤＰＹＤＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）ＳＳＧＹＧＧＳＤＹＡＭＤＹ（配列番号１６）及びＳＧＹＧＧＳＤＹＡＭＤＹ（配列番号１７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、請求項５から８、１０の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
抗体が、（ａ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＮＮＹＩＨ（配列番号８）を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＡＤＩＹＰＮＤＧＤＴＤＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２）及びＤＩＹＰＮＤＧＤＴＤＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）アミノ酸配列ＥＨＦＤＡＷＶＨＹＹＶＭＤＹ（配列番号１８）を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、請求項５から８、１０の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
抗体が、（ａ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＴＳＮＷＩＳ（配列番号９）を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＡＥＩＤＰＹＤＧＡＴＤＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１４）及びＥＩＤＰＹＤＧＡＴＤＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）ＧＴＤＶＭＤＹ（配列番号１９）及びＧＴＤＶＭＤＹ（配列番号２０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、請求項５から８、１０の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
（ａ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号２１）を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）アミノ酸配列ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号２２）を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）アミノ酸配列ＱＱＳＹＴＴＰＰＴ（配列番号２３）を含むＨＶＲ−Ｌ３を更に含む、請求項５から１３の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１５】
配列番号２、３、及び４からなる群から選択されるＶＨ配列を含む、請求項５から１０の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１６】
配列番号６のＶＬ配列を更に含む、請求項５から１０、１５の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１７】
抗体が、多重特異性抗体である、請求項５から１６の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１８】
抗体はまたβ−クロトーに結合する、請求項１７に記載の抗体。
【請求項１９】
抗体がＩｇＧ１抗体である、請求項５から１８の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２０】
請求項５から１９の何れか一項に記載の抗体をコードする単離された核酸。
【請求項２１】
請求項２０に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項２２】
抗体が産生されるように、請求項２１に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗体を産生する方法。
【請求項２３】
宿主細胞から抗体を回収することを更に含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項５から１９の何れか一項に記載の抗体及び薬学的に許容される担体を含む薬学的製剤。
【請求項２５】
医薬としての使用のための、請求項５から１９の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２６】
メタボリックシンドローム（ＭｅｔＳ）、肥満症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、高脂血症、２型糖尿病、非２型糖尿病、１型糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤ）、及び若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）からなる群から選択される代謝性疾患又は状態の治療における使用のための、請求項５から１９、２５の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２７】
インスリンに個体を感作することにおける使用のための、請求項５から１９、２５から２６の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２８】
代謝性疾患又は状態を治療するための医薬の製造における、請求項５から１９、２５から２７の何れか一項に記載の抗体の使用。
【請求項２９】
代謝性疾患又は状態が、メタボリックシンドローム（ＭｅｔＳ）、肥満症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、高脂血症、２型糖尿病、非２型糖尿病、１型糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤ）、及び若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）からなる群から選択される、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
医薬はインスリンに個体を感作するためのものである、請求項２８に記載の使用。
【請求項３１】
請求項５から１９、２５から２７の何れか一項に記載の抗体の有効量を含む、個体において糖尿病を治療するための医薬。
【請求項３２】
他の薬剤がインスリンではないことを条件として、糖尿病を治療するための別の薬剤を更に含む、請求項３１に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１１年５月１６日に出願された米国特許出願第６１／４８６，７３１号、及び２０１１年９月２０日に出願された米国特許出願第６１／５３６，９３６号に対して優先権の利益を主張し、これらの各々の全ての内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ＦＧＦＲ１アンタゴニスト及びそれを使用する方法に関する。
【０００３】
背景
血糖値の制御不能は、様々な代謝条件の根底にある。糖尿病は、グルコースに応答したインスリン分泌の欠陥（１型及び２型糖尿病）、及び骨格筋グルコース取り込みの刺激及び肝臓のグルコース産生の抑制（２型糖尿病）におけるインスリンの有効性の減少から生じる高血糖症症候群である。糖尿病は非常に蔓延した疾患であり、幾人かの糖尿病患者においては治療の選択肢が利用可能であるが、更なる治療法が緊急に必要とされている。
線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）は、ＦＧＦ１９及びＦＧＦ２３を含む内分泌ＦＧＦサブファミリーのメンバーであり、肥満症及び肥満症誘発性脂肪肝及び高血糖症を逆転する潜在的な疾患修飾剤として同定されている（例えば、Kharitonenkov and Larsen, Trends Endocrinol. Metab. 22(3):81-6 (2011); Kharitonenkov et al., J. Clin. Invest. 115: 1627-35 (2005)；国際公開第２０１０／０４２７４７号を参照）。内分泌ＦＧＦ２１タンパク質は３つのＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ１−３）に特異的に結合し、膜結合性共受容体のβ−クロトーと一緒にこれらの受容体によってインスリン抵抗性及び２型糖尿病を改善する。しかし、その開発は、その乏しい薬物動態と生物学的作用機序の理解不足によって妨げられてきた。抗ＦＧＦＲ１アンタゴニスト抗体もまた、糖尿病の治療用に提案されている（国際公開第２００５／０３７２３５号）。しかし、３つのＦＧＦＲのどれがＦＧＦ２１の有益な代謝活性を媒介するのかについての正体は発見されていない。
【０００４】
概要
本発明は、ＦＧＦＲ１の活性化が糖尿病を改善するという発見に一部基づいている。本発明は、アゴニスト抗ＦＧＦＲ１抗体を含むＦＧＦＲ１アゴニスト及びそれを使用する方法を提供する。
【０００５】
一態様において、本発明は、個体に抗線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）アゴニストの有効量を投与することを含む個体における代謝性疾患又は状態を治療する方法を提供し、ここで代謝性疾患は、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、メタボリックシンドローム（ＭｅｔＳ）、肥満症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、高脂血症、高血圧、２型糖尿病、非２型糖尿病、１型糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤ）、及び若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）からなる群から選択される。幾つかの実施態様において、ＦＧＦＲ１アゴニストは、ＦＧＦＲ２又はＦＧＦＲ３を活性化しない。幾つかの実施態様において、ＦＧＦＲ１アゴニストは抗ＦＧＦＲ１抗体である。幾つかの実施態様において、抗ＦＧＦＲ１抗体は２つのＦＧＦＲ１結合部位、例えば完全長抗体又はＦ（ａｂ’）２断片を有する。幾つかの実施態様において、抗体は、ペプチド＃２６ ＫＬＨＡＶＰＡＡＫＴＶＫＦＫＣＰ（配列番号２８）又はペプチド＃２８ ＦＫＰＤＨＲＩＧＧＹＫＶＲＹ（配列番号２９）に結合する。幾つかの実施態様において、抗体は、ペプチド＃２６及びペプチド＃２８の両方に結合する。幾つかの実施態様において、抗ＦＧＦＲ１抗体はＦＧＦＲ１ｂとＦＧＦＲ１ｃの両方に結合する。幾つかの実施態様において、抗体は二重特異性抗体である。幾つかの実施態様において、二重特異性抗体はまた、β−クロトーに結合する。
【０００６】
別の態様において、本発明は、抗体がＦＧＦＲ１活性のアゴニストである、ＦＧＦＲ１に結合する単離された抗体を提供する。幾つかの実施態様において、抗体は、ＦＧＦＲ２又はＦＧＦＲ３のアゴニストではない。幾つかの実施態様において、抗体はモノクローナル抗体である。幾つかの実施態様において、抗体はヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である。幾つかの実施態様において、抗体は、ＳＳＧＹＧＧＳＤＹＡＭＤＹ（配列番号１６）、ＳＧＹＧＧＳＤＹＡＭＤＹ（配列番号１７）、ＥＨＦＤＡＷＶＨＹＹＶＭＤＹ（配列番号１８）、ＴＧＴＤＶＭＤＹ（配列番号１９）、及びＧＴＤＶＭＤＹ（配列番号２０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、（ｂ）アミノ酸配列ＱＱＳＹＴＴＰＰＴ（配列番号２３）を含むＨＶＲ−Ｌ３、及び（ｃ）Ｘ１がＡ又はＧ、Ｘ２がＤ又はＥ、Ｘ３がＤ又はＹ、Ｘ４がＮ又はＹ、Ｘ５がＡ又はＤ、及びＸ６がＤ又はＹであるＸ１Ｘ２ＩＸ３ＰＸ４ＤＧＸ５ＴＸ６ＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２４）及びＸ１がＤ又はＥ、Ｘ２がＤ又はＹ、Ｘ３がＮ又はＹ、Ｘ４がＡ又はＤ、及びＸ５がＤ又はＹであるＸ１ＩＸ２ＰＸ３ＤＧＸ４ＴＸ５ＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、（ａ）Ｘ１がＳ又はＴ、Ｘ２がＮ又はＳ、Ｘ３がＮ又はＴ、Ｘ４がＷ又はＹ、Ｘ５がＨ又はＳであるアミノ酸配列ＧＦＴＦＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＩＸ５（配列番号２６）を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）Ｘ１がＡ又はＧ、Ｘ２がＤ又はＥ、Ｘ３がＤ又はＹ、Ｘ４がＮ又はＹ、Ｘ５がＡ又はＤ、及びＸ６がＤ又はＹであるアミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＩＸ３ＰＸ４ＤＧＸ５ＴＸ６ＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２４）、及びＸ１がＤ又はＥ、Ｘ２がＤ又はＹ、Ｘ３がＮ又はＹ、Ｘ４がＡ又はＤ、及びＸ５がＤ又はＹであるアミノ酸配列Ｘ１ＩＸ２ＰＸ３ＤＧＸ４ＴＸ５ＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及びＳＳＧＹＧＧＳＤＹＡＭＤＹ（配列番号１６）、ＳＧＹＧＧＳＤＹＡＭＤＹ（配列番号１７）、ＥＨＦＤＡＷＶＨＹＹＶＭＤＹ（配列番号１８）、ＴＧＴＤＶＭＤＹ（配列番号１９）、及びＧＴＤＶＭＤＹ（配列番号２０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、（ａ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＴＳＴＷＩＳ（配列番号７）を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＧＥＩＤＰＹＤＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１０）及びＥＩＤＰＹＤＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）ＳＳＧＹＧＧＳＤＹＡＭＤＹ（配列番号１６）及びＳＧＹＧＧＳＤＹＡＭＤＹ（配列番号１７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、（ａ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＮＮＹＩＨ（配列番号８）を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＡＤＩＹＰＮＤＧＤＴＤＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２）及びＤＩＹＰＮＤＧＤＴＤＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）アミノ酸配列ＥＨＦＤＡＷＶＨＹＹＶＭＤＹ（配列番号１８）を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、（ａ）アミノ酸配列ＧＦＴＦＴＳＮＷＩＳ（配列番号９）を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｂ）ＡＥＩＤＰＹＤＧＡＴＤＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１４）及びＥＩＤＰＹＤＧＡＴＤＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び（ｃ）ＧＴＤＶＭＤＹ（配列番号１９）及びＧＴＤＶＭＤＹ（配列番号２０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、（ａ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号２１）を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｂ）アミノ酸配列ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号２２）を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び（ｃ）アミノ酸配列ＱＱＳＹＴＴＰＰＴ（配列番号２３）を含むＨＶＲ−Ｌ３を更に含む。幾つかの実施態様において、抗体は、配列番号２、３、４からなる群から選択されるＶＨ配列を含む。幾つかの実施態様において、抗体は、配列番号６のＶＬ配列を含む。
【０００７】
幾つかの実施態様において、抗ＦＧＦＲ１抗体は２つのＦＧＦＲ１結合部位、例えば完全長抗体又はＦ（ａｂ’）２断片を有する。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は多重特異性抗体である。幾つかの実施態様において、抗体はまた、β−クロトーに結合する。幾つかの実施態様において、抗体はＩｇＧ１抗体である。幾つかの実施態様において、本発明は、本発明の抗体をコードする単離された核酸を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、請求項２１に記載の核酸を含む宿主細胞を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、抗体が産生されるように、請求項２２に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗体を産生する方法を提供する。幾つかの実施態様において、本方法は宿主細胞から抗体を回収することを更に含む。
【０００８】
幾つかの実施態様において、本発明は、本発明の抗体及び薬学的に許容される担体を含む薬学的製剤を提供する。
【０００９】
幾つかの実施態様において、本発明は、医薬として使用するための本発明の抗体を提供する。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、メタボリックシンドローム（ＭｅｔＳ）、肥満症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、高脂血症、高血圧、２型糖尿病、非２型糖尿病、１型糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤ）、及び若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）からなる群から選択される代謝性疾患又は状態の治療に使用するためのものである。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、インスリンに対する個体の感作に使用するためのものである。
【００１０】
幾つかの実施態様において、本発明は、医薬の製造における本発明の抗体の使用を提供する。幾つかの実施態様において、医薬は、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、メタボリックシンドローム（ＭｅｔＳ）、肥満症、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、高脂血症、高血圧、２型糖尿病、非２型糖尿病、１型糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病（ＬＡＤ）、及び若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）からなる群から選択される代謝性疾患又は状態の治療のためのものである。幾つかの実施態様において、医薬は、インスリンに個体を感作するためのものである。
【００１１】
幾つかの実施態様において、本発明は、本発明の抗体の有効量を個体に投与することを含む、個体における糖尿病を治療する方法を提供する。幾つかの実施態様において、本発明は、他の薬剤がインスリンではないことを条件として、糖尿病を治療するために個体に別の薬剤を投与することを更に含む。幾つかの実施態様において、本方法は心臓血管系疾患を治療するために個体に薬剤を投与することを更に含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】図１Ａは、ＦＧＦＲのＥＣＤ断片を精製するために、抗ＦＧＦＲ１抗体の結合を測定するＥＬＩＳＡを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｒ１ＭＡｂ１とＲ１ＭＡｂ２の表面プラズモン共鳴結合定数を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ラットＬ６細胞におけるＧＡＬ−Ｅｌｋ１ルシフェラーゼアッセイを示す。細胞を、ＧＡＬ−Ｅｌｋ１、ＳＶ４０−ウミシイタケルシフェラーゼ、及びＧａｌ応答性ホタルルシフェラーゼレポーターとともに、指示されたＦＧＦＲアイソフォームの発現ベクターでコトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をルシフェラーゼアッセイの前に６時間、Ｒ１Ｍａｂ又は酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ：陽性対照）の濃度を増加させた培地で培養した。転写活性化は、ウミシイタケルシフェラーゼ活性により正規化され相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）として表される相対的なホタルルシフェラーゼ活性によって評価した。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ＦＧＦＲ１ｃはとＫＬＢの両方を発現したＬ６細胞を除き、１Ｃと同様の実験を示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、ＨＥＫ２９３細胞を使用したことを除き、１Ｃと同様の実験を示す。
【図１Ｆ】図１Ｆは、指定される時間に対して指定されるタンパク質の０．５μｇ／ｍｌで処置された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のウエスタンブロット解析を示す。
【図１Ｇ】図１Ｇは、Ｒ１Ｍａｂ（＋）又は対照のＩｇＧ（−）の１ｍｐｋを静脈注射後に、指示された時点で痩せたＣ５７ＢＬ／６マウスから採取され、ウエスタンブロット分析に供された白色脂肪組織（ＷＡＴ）を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、示された用量でのＲ１Ｍａｂ１又は対照ＩｇＧの単回腹腔内注射（矢印）後のｄｂ／ｄｂマウスの血糖（左）及び体重（右）を示す。有意性はグルコースにおいては（対照のＩｇＧに対して）全群において１日〜３０日の間で観察され、体重においては（対照のＩｇＧに対して）全群において第８日で、及び５０ｍｐｋ群において第１２日〜第１８日の間で観察された。Ｎ＝６〜１４，＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１．
【図２Ｂ】図２Ｂは、ランダムに給餌された時のマウス及び一晩絶食させたマウスの血糖値（左）、及び一晩絶食後、及び１ｇ／ｋｇグルコースの腹腔投与後３０分後の血清インスリンレベル（右）を示している。Ｎ＝６〜１４，＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１．
【図２Ｃ】図２Ｃは、３ｍｐｋでのＲ１Ｍａｂ１又は対照ＩｇＧの単回腹腔内注射後のＩｎｓ２Ａｋｉｔａマウスの血糖（左）及び体重（右）を示す。Ｎ＝１０．＊ｐ＜０．０１．
【図２Ｄ】図２Ｄは、１ｍｐｋの用量でのＲ１Ｍａｂ１又は対照ＩｇＧの単回腹腔内注射後のｄｂ／ｄｂマウスの食物摂取（左）、血糖（中央）及び体重（右）を示す。ＰＦ：Ｒ１ＭＡｂ処置群へのペアフィード。Ｎ＝７．＃ｐ＜０．００１（ＩｇＧに対して），＊ｐ＜０．００１（ＰＦ−ＩｇＧに対して）。
【図２Ｅ】図２Ｅは、固定された膵臓切片におけるインスリン陽性面積の定量化を示す。組織は、Ｒ１ＭＡｂ１の３ｍｐｋ（左）又は１ｍｐｋ（右）を単回投与後７日目で収集され、インスリンとグルカゴンに対して染色された。Ｎ＝４〜７．＊＊ｐ＜０．００２．＊＊＊ｐ＜０．００１．
【図３Ａ】図３Ａは、マウス組織におけるＭＡＰＫシグナル伝達の活性化を示す。示された組織は、痩せたＣ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内注射後１５分（２５μｇ／マウスＦＧＦ２１：上）又は１時間（１ｍｐｋ Ｒ１Ｍａｂ１：下）で採取されて、ウェスタンブロット分析に供した。ＰＢＳ（上）及び対照のＩｇＧ（下）を陰性対照として使用した。
【図３Ｂ−Ｄ】図３Ｂ−Ｄは、肝臓（Ｂ）、肝脂質（Ｃ）、及び血清脂質（Ｄ）の代表的なＨ＆Ｅ染色を示す。サンプルは１ｍｐｋ Ｒ１ＭＡｂ１の単回腹腔内注射後７日目に採取した。対照マウスにペアフィードし、体重を正規化した。Ｎ＝７，＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．００１．
【図３Ｅ】図３Ｅは、１ｍｐｋの抗体を注射されたｏｂ／ｏｂ又はトランスジェニックａｐ２−ＳＲＥＢＰ１ｃ（ｓｒｅｂｐ）マウスの代謝パラメータを示す。対照群に体重を標準化するためにペアフィードした（図１１）。インスリン抵抗性指数（ＨＯＭＡ−ＩＲ）の計算のためにグルコース及びインスリンを、３時間の絶食後３日目に測定した。糖負荷試験は、一晩絶食後４日目に１ｇ／ｋｇの腹腔内グルコース注射で行った。組織の重量は、５日目に測定した。Ｎ＝７，＊ｐ＜０．０５，＊＊＊ｐ＜０．０１
【図３Ｆ】図３Ｆは、ＦＧＦ２１（１２ｎｇ／日）を注入する浸透圧ポンプを皮下に移植されたａｐ２−ＳＲＥＢＰマウスの代謝パラメータを示す。１Ｕ／ｋｇのインスリン腹腔内注射によるＩＴＴは４日目に行われた。血清は６日目に採取した。Ｎ＝６〜８．
【図４Ａ】図４Ａは、示されたＫＥＧＧ経路に属する遺伝子について褐色脂肪組織（ＢＡＴ）におけるｍＲＮＡの発現を示す（赤：高発現、青：低発現）。サンプルは１ｍｐｋ Ｒ１ＭＡｂ１の単回腹腔内注射後４日目に採取され、又はペアフィードマウスは対照ＩｇＧを注射された。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ｑＰＣＲによる褐色脂肪組織（ＢＡＴ）内のｍＲＮＡの発現を示す。Ｎ＝６，＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．００１．
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＨＥＫ２９３細胞におけるルシフェラーゼアッセイを示す。グラフは、ＦＧＦ２１及びＲ１ＭＡｂ１の両方が、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合されたＣＲＥＢ（ＧＡＬ−ＣＲＥＢ）を介したＨＥＫ２９３細胞におけるＵＡＳ駆動型ルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写（左の２つのパネル）、又はＣＲＥ駆動型ルシフェラーゼレポーター遺伝子の転写（右の２つのパネル）を用量依存的に誘導することを示している。幾つかの細胞はまた、ＦＧＦＲ１ｃとＫＬＢを発現するようにコトランスフェクトした（赤；グラフの上の曲線）。結果は、ウミシイタケ活性をで規格化したルシフェラーゼ活性の三連の実験の平均を表す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、２５μｇのＦＧＦ２１（＋）又はＰＢＳ（−）を静脈注射後１５分で採取され、ウェスタンブロット解析に供された白色脂肪組織（ＷＡＴ）を示す。
【図４Ｅ】図４Ｅは、ＦＧＦ２１を１μｇ／ｍｌで３０分間処置された分化型初代ヒト脂肪細胞のウェスタンブロット解析を示す。
【図４Ｆ】図４Ｆは、ＦＧＦ２１とＲ１ＭＡｂがシグナル伝達経路を通じて脂肪組織においてＰＧＣ−１αのプログラムを活性化する該シグナル伝達経路のモデルを示す。
【図５】図５に示し、ヘパリンに依存せず、ＦＧＦＲ１に依存したＲ１ＭＡｂ１のアゴニスト活性を示す。ＨＥＫ２９３細胞におけるＧＡＬ−Ｅｌｋ１ルシフェラーゼアッセイ。細胞を、ＧＡＬ−Ｅｌｋ１、ＳＶ４０−ウミシイタケルシフェラーゼ、及びＧａｌ応答性ホタルルシフェラーゼレポーターとともに、示されたようにＦＧＦＲ１ｃ発現ベクターの有無にかかわらずコトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をルシフェラーゼアッセイの前に６時間、示されたように２５μｇ／Ｌのブタヘパリンの有無によらず、Ｒ１Ｍａｂ１の濃度を増加させた培地で培養した。転写活性化は、ウミシイタケルシフェラーゼ活性により正規化され相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）として表される相対的なホタルルシフェラーゼ活性によって評価した。
【図６Ａ】図６Ａは、第０日において３ｍｐｋの用量でのＲ１Ｍａｂ２又は対照ＩｇＧの単回腹腔内注射後のｄｂ／ｄｂマウスの食物摂取（左）、体重（中央）及び血糖（右）を示す。対照マウスはペアフィード（ＰＦ）され、第１１日目まで食物摂取を調節した。第１１日に、Ｒ１ＭＡｂ２で処置されたマウスの食物摂取は正常に戻り、従って、全てのマウスは１１日目（ＡＬ）以後に自由摂取で給餌された。Ｎ＝７〜１２．ｐ＜０．００１．
【図６Ｂ】図６Ｂは、２６日目における図６Ａで使用されたマウスのランダム給餌の血糖値を示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、２８日目において同じマウスを用いて実施された糖負荷試験を示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、３７日目において同じマウスを用いて実施されたインスリン耐性試験（ＩＴＴ）を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、第０日目に１ｍｐｋの用量でＲ１Ｍａｂ１又は対照ＩｇＧの単回腹腔内注射した後のｄｂ／ｄｂマウスの血中グルコース（左）及び体重（右）を示す。対照マウスはＲ１ＭＡｂ処置群に対してペアフィード（ＰＦ）した。Ｎ＝７．＊ｐ＜０．０５（ＰＦ−ＩｇＧに対して）。
【図７Ｂ】図７Ｂは、第０日目に１ｍｐｋでＲ１Ｍａｂ１又は対照ＩｇＧを単回腹腔内注射した後の高脂肪食（ＨＦＤ）給餌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血中グルコース（左）及び体重（右）を示す。Ｎ＝７〜９．＊ｐ＜０．０５．
【図７Ｃ】図７Ｃは、抗体注射後８日目において図７Ｂで用いた高脂肪食（ＨＦＤ）給餌マウスで実施された糖負荷試験を示す。マウスは、一晩絶食後、１ｇ／ｋｇのグルコースが腹腔内注射された。平均体重は、２８．６＋／−０．６（Ｒ１ＭＡｂ１）及び３２．１＋／−０．８（対照のＩｇＧ）であった（ｐ＜０．０１）。Ｎ＝７．
【図７Ｄ】図７Ｄは、３ｍｐｋでのＲ１Ｍａｂ１又は対照ＩｇＧの単回腹腔内注射後のＩｎｓ２Ａｋｉｔａマウスの血中グルコース（左）及び体重（右）を示す。対照マウスにペアフィードし（ＰＦ−ＩｇＧ）、体重を正規化した。＊ｐ＜０．０５．
【図８Ａ】図８Ａは、図４Ｅ中で分析されたｄｂ／ｄｂマウスにおける膵臓ランゲルハンス島の代表的な染色を示す。赤：インスリン、緑：グルカゴン、青：核。Ｒ１ＭＡｂは膵島の全体的な形態に影響を与えなかったことに注意のこと。
【図８Ｂ】図８Ｂは、各動物の各膵島におけるインスリン陽性領域（％）の分布を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、ＩｇＧ及び片腕型（ＯＡ）ＩｇＧの概略図を示す。青：重鎖、緑：軽鎖。赤いアスタリスクは、ＤＡＮＡ変異体において変異された残基のおおよその位置を示している。
【図９Ｂ】図９Ｂは、Ｒ１ＭＡｂ２とＲ１ＭＡｂ２のＤＮＡの変異体（Ｒ１ＭＡｂ２ ＤＡＮＡ）を比較するための、ＦＧＦＲ１ｃを発現するＨＥＫ２９３細胞におけるＧＡＬ−Ｅｌｋに基づくルシフェラーゼアッセイを示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、示された抗体を１ｍｐｋで腹腔内注射する前と７日後のｄｂ／ｄｂマウスの血糖値を示す。対照マウスにペアフィードし、体重を正規化した。
【図９Ｄ】図９Ｄは、ＦＧＦＲのＥＣＤ断片を精製するために、抗体の結合を測定するＥＬＩＳＡを示す。ＯＡ−Ｒ１ＭＡｂ１：Ｒ１ＭＡｂ１の片腕型（ＯＡ）バージョン。
【図９Ｅ】図９Ｅは図９Ｂに類似したＧＡＬ−Ｅｌｋに基づくルシフェラーゼアッセイを示す。
【図９Ｆ】図９Ｆは、指定される時間に対して指定されるタンパク質の０．５μｇ／ｍｌで処置された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のウエスタンブロット解析を示す。
【図９Ｇ】図９Ｇは、第０日において示された抗体を単回腹腔内注射した後のｄｂ／ｄｂマウスの血糖（左）及び体重（右）を示す。Ｎ＝７．＊ｐ＜０．０５（対照のＩｇＧ対３ｍｐｋ Ｒ１ＭＡｂ１），＊＊ｐ＜０．０００５（対照のＩｇＧ対３ｍｐｋ Ｒ１ＭＡｂ１及び対照のＩｇＧ対１ｍｐｋ Ｒ１ＭＡｂ１）。
【図９Ｈ】図９Ｈは、抗体注射の７日後に収集したサンプルからの肝臓及び血清脂質を示す。Ｎ＝７．＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０００５（対照のＩｇＧに対して）。
【図１０】図１０は、肝臓と白色脂肪組織（ＷＡＴ）中でのＫＬＢ及びＦＧＦＲアイソフォームのｍＲＮＡ発現を示す。固形飼料給餌及び高脂肪食（ＨＦＤ）給餌マウスは２５週齢であった。高脂肪食給餌マウスは２１日間高脂肪食であった。＊ｐ＜０．０５又は＊＊ｐ＜０．００１．Ｎ＝６．
【図１１】図１１は、ＦＧＦ２１とＲ１ＭＡｂの活性に関して通常の脂質機能の必要性を示している。第０日目に１ｍｐｋの用量でＲ１Ｍａｂ１又は対照ＩｇＧの単回腹腔内注射した後のｄｂ／ｄｂ又はａｐ２−ｓｒｅｂｐ１ｃトランスジェニックマウスの食糧摂取（左）、血糖（中央）及び体重（右）を示す。同じマウスは、図３Ｅで説明される。Ｎ＝７．＃ｐ＜０．００１（ＩｇＧに対して），＊ｐ＜０．００１（ＰＦ−ＩｇＧに対して）。処置後の測定は注射後１日で行った。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ＨＥＫ２９３細胞における細胞に基づいたルシフェラーゼアッセイを示す。細胞を、示されたＧＡＬ融合タンパク質、ＳＶ４０−ウミシイタケルシフェラーゼ、及びＧａｌ応答性ホタルルシフェラーゼレポーターの発現ベクターでコトランスフェクトした。若干の細胞も、示されるようにＫＬＢの発現ベクターで同時トランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、示されるように、ＦＧＦ２１の発現ベクター又は対照の空のベクターでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からの条件培地を含む培地で培養した。インキュベーションの６時間後、細胞を、ルシフェラーゼアッセイに供した。転写活性化は、ウミシイタケルシフェラーゼ活性により正規化され発光量比（fold induction）として表される相対的なホタルルシフェラーゼ活性によって評価した。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、一部の細胞が以下の核内受容体リガンドで同時処理された、同様のルシフェラーゼアッセイを示す：１ΜＭ Ｗｙ１４６４３（ＰＰＡＲα）、５ｎＭ ＧＷ１０１５１６（ＰＰＡＲδ）、５０ｎＭ ロシグリタゾン（ＰＰＡＲγ）、５０ｎＭ Ｔ０９０１３１７（ＬＸＲα）、５ｎＭ Ｔ３（ＴＲβ）、３０ΜＭ ＣＤＣＡ（ＦＸＲ）。ＦＧＦ２１は、同族リガンド処置の有無にかかわらず、ここでテストされた核内受容体の何れの活性にも影響を与えなかったことに注意のこと。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、ＦＧＦ２１の０．５μｇ／ｍｌで１０分間処置されたＨＥＫ２９３細胞のウエスタンブロット解析を示す。幾つかの細胞は、示されるように、ＦＧＦＲの阻害剤（１００ｎＭ ＰＤ１７３０７４）、ｍＴＯＲの阻害剤（１００ｎＭ ラパマイシン）、ＭＥＫ１／２の阻害剤（１０μＭ Ｕ０１２６）、ＰＩ３Ｋの阻害剤（１μＭ ワートマニン）で予め処置された。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、脂肪組織中の酸化的代謝に関与する下流の遺伝子を示している。
【図１３】図１３は、示された用量でのＲ１ＭＡｂ２（１８２．２と標識），Ｒ１ＭＡｂ３（１８２．５と標識）又は対照のＩｇＧ（抗Ｈｅｒ２）の単回腹腔内注射後のｄｂ／ｄｂマウスの血糖（上）及び体重（下）を示す。Ｎ＝６，＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．００５，＊＊＊ｐ＜０．０００５．Ｒ１ＭＡｂ３は、配列番号６を含むＶＨ及び配列番号４を含むＶＨを含む。
【図１４Ａ】図１４Ａは、痩せたＣ５７ＢＬ／６マウスの、Ｒ１ＭＡｂ１又は対照のＩｇＧを０．５ｍｐｋで単回腹腔内注射した後の、累積食物摂取量、血糖及体重変化を示す。マウスはまた、組換えＦＧＦ２１を１．２ｍｐｋ／日で、又はビヒクル対照（ＰＢＳ）を継続的に注入する（ｃ．ｉ．）ために、第０日目に浸透圧ミニポンプを皮下に移植された。３日目に、マウスを一晩絶食させ、４日目（矢印）にブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）を実施した。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、一晩絶食後の４日目に腹腔内に注射された２ｇ／ｋｇのグルコースを用いて実施されたブドウ糖負荷試験を示す。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、図２Ｃ、１４Ａ及び１４Ｂに示されるマウスの血清解析を示す。血清試料を４時間絶食後５日目に採取した。データは、群あたりｎ＝６匹のマウスの平均値±ＳＥＭを表している；＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１対ＰＢＳ（ｃ．ｉ．）＋ＩｇＧ対照、両側検定で対応のないスチューデントｔ検定による（ｎ．ｓ．＝有意ではない）。
【図１５】図１５は、図２Ｃ及び１４Ａ−１４Ｃで使用されたマウスの肝臓組織から単離したｍＲＮＡを用いた遺伝子発現分析を示す。組織試料を４時間絶食後５日目に単離した。データは、群あたりｎ＝６匹のマウスの平均値±ＳＥＭを表している；＊ｐ＜０．０５，＊＊＊ｐ＜０．００１対ＰＢＳ（ｃ．ｉ．）＋ＩｇＧ対照、両側検定で対応のないスチューデントｔ検定による（ｎ．ｓ．＝有意ではない）。
【図１６】図１６は、図２Ｃ、１４Ａ−１４Ｃ及び１５で使用されたマウスの褐色脂肪組織から単離したｍＲＮＡを用いた遺伝子発現分析を示す。組織試料を４時間絶食後５日目に単離した。データは、群あたりｎ＝６匹のマウスの平均値±ＳＥＭを表している；＊ｐ＜０．０５，＊＊＊ｐ＜０．００１対ＰＢＳ（ｃ．ｉ．）＋ＩｇＧ対照、両側検定で対応のないスチューデントｔ検定による（ｎ．ｓ．＝有意ではない）。
【図１７Ａ】図１７Ａは、ビオチン化ペプチド断片に結合する抗体を測定するＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、ＦＧＦＲ１のアミノ酸配列（アミノ酸１６１−２１２；配列番号２７）、ペプチド＃２６（配列番号２８）及びペプチド＃２８（配列番号２９）のアミノ酸配列を、ＦＧＦＲ２（配列番号３０）、ＦＧＦＲ３（配列番号３１）、及びＦＧＦＲ４（配列番号３２）からのペプチド＃２６に対応するアミノ酸配列及びＦＧＦＲ２（配列番号３３）、ＦＧＦＲ３（配列番号３４）、及びＦＧＦＲ４（配列番号３５）からのペプチド＃２８に対応するアミノ酸配列と共に示す。ＦＧＦＲ１のペプチド＃２６の配列及びペプチド＃２８の配列と、ＦＧＦＲ２〜４の対応する領域の間との相違は囲まれている。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、様々な濃度のＲ１ＭＡｂ１又は対照のＩｇＧの存在下でのＦＧＦ２タンパク質に対するＨｉｓタグ付きＦＧＦＲ１の結合を測定するＥＬＩＳＡの結果を示す。データはＦＧＦＲ１−Ｈｉｓ結合の％として表され、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝３）を意味する。
【図１７Ｄ】図１７Ｄは、様々な濃度の非標識化Ｒ１ＭＡｂ１又はＦＧＦ２１の存在下において、ＫＬＢ及びＦＧＦＲ１ｃの両方を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞へのヨウ素化ＦＧＦ２１の結合を示す（反応はまたＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）及び非特異的結合をブロックする対照のＩｇＧ（３５０ｍＭ）を含んでいた）。データは、反応において総放射性標識化ＦＧＦ２１のうち結合したＦＧＦ２１の％として表される。
【００１３】
本発明の実施態様の詳細な記述
Ｉ．定義
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の変化を含み得る。幾つかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、Ｖはヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に、配列が同一である。
【００１４】
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している本質的な結合親和性を指す。そのパートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例示であって典型的な実施態様は、以下で説明される。
【００１５】
用語「抗ＦＧＦＲ１アゴニスト抗体」は、抗体が、ＦＧＦＲ１の活性化における治療的薬剤として有用であるように、十分な親和性でＦＧＦＲ１に結合することができる抗体を指す。一実施態様において、抗ＦＧＦＲ１抗体の無関係な、非ＦＧＦＲ１タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、抗体のＦＧＦＲ１への結合の約１０％未満である。ある実施態様において、ＦＧＦＲ１へ結合する抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）を有する。
【００１６】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００１７】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨは、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【００１８】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種から由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる起源又は種から由来する抗体を指す。
【００１９】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラスがあり：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、及びこれらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２に、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００２０】
「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）、貪食、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞の活性化を含む。
【００２１】
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での有効な量を指す。
【００２２】
用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。その用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を含む。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで伸長する。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しているか、又は存在していない場合がある。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【００２３】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲのドメインで構成される：ＦＲ１，ＦＲ２，ＦＲ３，及びＦＲ４。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００２４】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【００２５】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本明細書において含まれる。
【００２６】
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリー又は他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【００２７】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的には、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般的には、配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3にあるサブグループである。一実施態様において、ＶＬについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループカッパＩである。一実施態様において、ＶＨについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループＩＩＩである。
【００２８】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来アミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。所定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、全て又は実質的にＦＲの全てが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。
【００２９】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性であり、及び／又は抗原認識に関与している。典型的な超可変ループはアミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる。（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。典型的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２に生じる。（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。ＶＨのＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」をも含む。ＳＤＲは、略称（abbreviated-）ＣＤＲ、又はａ−ＣＤＲと呼ばれる、ＣＤＲの領域内に含まれている。典型的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２に生じる。（Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008）を参照のこと）特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、上掲のＫａｂａｔらに従い、本明細書において番号が付けられる。
【００３０】
「イムノコンジュゲート」は、一つ以上の異種分子にコンジュゲートした抗体である。
【００３１】
「個体」又は「被検体」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。所定の実施態様において、個体又は被検体はヒトである。
【００３２】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。幾つかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定されるように、９５％以上又は９９％の純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばFlatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。
【００３３】
「単離された」核酸は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、しかし、その核酸分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。
【００３４】
「抗ＦＧＦＲ１抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする一以上の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内のそのような核酸分子、及び宿主細胞の一以上の位置に存在するそのような核酸分子を含む。
【００３５】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる変異を含み、又はモノクローナル抗体製剤の製造時に発生し、一般的に少量で存在している変異体などの、可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を一般的に含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。従って、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作成され、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【００３６】
「天然型抗体」は、天然に生じる様々な構造をとる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖から成る約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプのいずれかに割り当てることができる。
【００３７】
用語「パッケージ挿入物」は、効能、用法、用量、投与、併用療法、禁忌についての情報、及び／又はそのような治療用製品の使用に関する警告を含む、治療用製品の商用パッケージに慣習的に含まれている説明書を指すために使用される。
【００３８】
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２もまた、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して所定の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一と一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値が、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したように得られる。
【００３９】
用語「薬学的製剤」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被検体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。
【００４０】
「薬学的に許容される担体」は、被検体に非毒性であり、有効成分以外の製剤処方中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。
【００４１】
特に断らない限り、本明細書で使用する用語「線維芽細胞増殖因子受容体１」又は「ＦＧＦＲ１」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型ＦＧＦＲ１を指す。その用語は、「完全長」、未処理のＦＧＦＲ１並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＦＧＦＲ１を含む。その用語はまた、天然に存在するＦＧＦＲ１の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。例示的なヒトＦＧＦＲ１ｂ及びＦＧＦＲ２ｂのアミノ酸配列はそれぞれ以下に示される：
ＮＴＫＰＮＰＶＡＰＹＷＴＳＰＥＫＭＥＫＫＬＨＡＶＰＡＡＫＴＶＫＦＫＣＰＳＳＧＴＰＮＰＴＬＲＷＬＫＮＧＫＥＦＫＰＤＨＲＩＧＧＹＫＶＲＹＡＴＷＳＩＩＭＤＳＶＶＰＳＤＫＧＮＹＴＣＩＶＥＮＥＹＧＳＩＮＨＴＹＱＬＤＶＶＥＲＳＰＨＲＰＩＬＱＡＧＬＰＡＮＫＴＶＡＬＧＳＮＶＥＦＭＣＫＶＹＳＤＰＱＰＨＩＱＷＬＫＨＩＥＶＮＧＳＫＩＧＰＤＮＬＰＹＶＱＩＬＫＨＳＧＩＮＳＳＤＡＥＶＬＴＬＦＮＶＴＥＡＱＳＧＥＹＶＣＫＶＳＮＹＩＧＥＡＮＱＳＡＷＬＴＶＴＲＰＶＡＫＡＬＥＥＲＰＡＶＭＴＳ（配列番号１）；及び
ＮＴＫＰＮＰＶＡＰＹＷＴＳＰＥＫＭＥＫＫＬＨＡＶＰＡＡＫＴＶＫＦＫＣＰＳＳＧＴＰＮＰＴＬＲＷＬＫＮＧＫＥＦＫＰＤＨＲＩＧＧＹＫＶＲＹＡＴＷＳＩＩＭＤＳＶＶＰＳＤＫＧＮＹＴＣＩＶＥＮＥＹＧＳＩＮＨＴＹＱＬＤＶＶＥＲＳＰＨＲＰＩＬＱＡＧＬＰＡＮＫＴＶＡＬＧＳＮＶＥＦＭＣＫＶＹＳＤＰＱＰＨＩＱＷＬＫＨＩＥＶＮＧＳＫＩＧＰＤＮＬＰＹＶＱＩＬＫＴＡＧＶＮＴＴＤＫＥＭＥＶＬＨＬＲＮＶＳＦＥＤＡＧＥＹＴＣＬＡＧＮＳＩＧＬＳＨＨＳＡＷＬＴＶＬＥＡＬＥＥＲＰＡＶＭＴＳ（配列番号５）。
【００４２】
本明細書で用いられるように、「治療」（及び「治療する（treat）」又は「治療している（treating）」など文法上の変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の過程においてのいずれかで実行できる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び予後の改善を含む。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
【００４３】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の可変重鎖ドメイン及び軽鎖（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む各ドメインを持ち、一般的に似たような構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 91頁 (2007)を参照）。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なＶＬ又はＶＨドメインのそれぞれのライブラリーをスクリーニングするために、抗原に特異的に結合する抗体由来のＶＨ又はＶＬドメインを用いて単離することができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991）を参照。
【００４４】
本明細書で使用される、用語「ベクター」は、それがリンクされている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なようにリンクされている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と言う。
【００４５】
ＩＩ．組成物及び方法
一態様において、本発明は、抗ＦＧＦＲ１アゴニスト抗体の発見及びこのような抗体の治療活性に部分的に基づいている。本発明の抗体は、例えば、糖尿病を含む代謝性疾患の治療のために有用である。
【００４６】
Ａ．典型的な抗ＦＧＦＲ１抗体
一態様において、本発明は、ＦＧＦＲ１に結合する単離された抗体を提供する。ある実施態様において、抗ＦＧＦＲ１抗体は、ＦＧＦＲ１ｂ及び／又はＦＧＦＲ１ｃに結合し、ＦＧＦＲ１活性を刺激する。
【００４７】
一態様において、本発明は、（ａ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１７、配列番号１８又は配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも一、二、三、四、五、又は六のＨＶＲを含む抗ＦＧＦＲ１抗体を提供する。
【００４８】
幾つかの実施態様において、抗ＦＧＦＲ１抗体は、完全ヒト、ヒト化又は非ヒトであってもよい。一実施態様において、抗ＦＧＦＲ１抗体は、上記実施態様の何れかにおけるＨＶＲを含み、更に、アクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。
【００４９】
その他の態様において、抗ＦＧＦＲ１抗体は、以下のような配列番号２、３又は４のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＳＴＷＩＳＷＶＰＧＫＧＬＥＷＶＧＥＩＤＰＹＤＧＤＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＳＧＹＧＧＳＤＹＡＭＤＹＷＧＱ（配列番号２）、
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＮＹＩＨＷＶＰＧＫＧＬＥＷＶＡＤＩＹＰＮＤＧＤＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＨＦＤＡＷＶＨＹＹＶＭＤＹＷＧＱ（配列番号３）、及び
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＳＮＷＩＳＷＶＰＧＫＧＬＥＷＶＡＥＩＤＰＹＤＧＡＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＧＴＤＶＭＤＹＷＧＱ（配列番号４）。
ある実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＦＧＦＲ１抗体は、ＦＧＦＲ１へ結合しその活性を刺激する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号２、３又は４において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意で、抗ＦＧＦＲ１抗体は、配列番号２、３又は４のＶＨ配列を、その配列の翻訳後修飾を含み、含む。
【００５０】
その他の態様において、抗ＦＧＦＲ１抗体が提供され、該抗体は以下の配列番号６のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号６）。所定の実施態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＦＧＦＲ１抗体は、ＦＧＦＲ１へ結合する能力を保持する。ある実施態様において、配列番号６において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、ＨＶＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。任意で、抗ＦＧＦＲ１抗体は、配列番号６のＶＬ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。
【００５１】
その他の態様において、抗ＦＧＦＲ１抗体が提供され、該抗体は、上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＨ、及び上記に与えられた実施態様の何れかにあるＶＬを含む。一実施態様において、抗体は、配列番号２、３、又は４及び配列番号６のそれぞれのＶＨとＶＬを、それらの配列の翻訳後修飾を含み、含む。
【００５２】
本発明の更なる態様では、上記実施態様のいずれかに記載の抗ＦＧＦＲ１抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一実施態様において、抗ＦＧＦＲ１抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）２断片である。その他の態様において、抗体は、全長抗体、例えば、インタクトなＩｇＧ１抗体、又は本明細書において定義された他の抗体クラス又はアイソタイプである。
【００５３】
更なる態様にて、以下のセクション１−７で説明されるように、上記実施態様のいずれかに記載の抗ＦＧＦＲ１抗体は、単独又は組み合わせで、任意の特徴を組み込むことができる：
【００５４】
１．抗体親和性
所定の実施態様において、本明細書において与えられる抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）。
【００５５】
一実施態様において、以下のアッセイにより説明されるように、Ｋｄは、目的の抗体のＦａｂ型とその抗原を用いて実施される放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定される。非標識抗原の滴定系列の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）−標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体被覆プレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する（例えば、Chen, et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)を参照）。アッセイの条件を決めるために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Thermo Scientific）を、５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体（Cappel Labs）を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）にて一晩コートして、その後２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温（およそ２３℃）で２〜５時間、ブロックする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ ＃２６９６２０）に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した目的のＦａｂと混合する（例えば、Presta等,(1997) Cancer Res. 57: 4593-4599の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。ついで目的のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは平衡状態に達したことを確認するまでに長時間（例えばおよそ６５時間）かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で（例えば１時間）インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））を含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０ＴＭ；Ｐａｃｋａｒｄ）を加え、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴＴＭγ計測器（Ｐａｃｋａｒｄ）にて１０分間計測する。最大結合の２０％か又はそれ以下を与える各Ｆａｂの濃度が、競合結合測定における使用のために選択される。
【００５６】
他の実施態様に従って、〜１０反応単位（ＲＵ）の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（BIAcore, Inc., Piscataway, NJ）を用いる表面プラズモン共鳴アッセイを使用してＫｄを測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５, BIAcore Inc．）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化した。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。動力学的な測定のために、Ｆａｂの２倍の段階希釈（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、２５℃で、およそ２５μｌ／分の流速で、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ２０ＴＭ）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（simple one-to-one Langmuir binding model）（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計（stop-flow equipped spectrophometer）（Aviv Instruments）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズのＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯＴＭ分光光度計（ThermoSpectronic）で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）の増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
【００５７】
２．抗体断片
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ，及びｓｃＦｖ断片、及び下記の他の断片を含む。所定の抗体断片の総説については、Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), 頁269-315 (1994)を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５，５７１，８９４号及び第５，５８７，４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつインビボ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。
【００５８】
ダイアボディは２価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号； Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照。トリアボディ及びテトラボディもまたHudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。
【００５９】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。ある実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第６，２４８，５１６ Ｂ１号を参照）。
【００６０】
抗体断片は様々な技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体の分解、並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産を含む。
【００６１】
３．キメラ及びヒト化抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。所定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
【００６２】
所定の実施態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するために、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持したまま、ヒト化されている。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（又はその一部）が、非ヒト抗体から由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する、一以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部をも含む。幾つかの実施態様において、ヒト化抗体の幾つかのＦＲ残基は、例えば抗体特異性又は親和性を回復もしくは改善するめに、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換されている。
【００６３】
ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008）に総説され、更に、 Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)； 米国特許第５，８２１，３３７号、第７，５２７，７９１号、第６，９８２，３２１号、及び第７，０８７，４０９号；Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記述）； Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) （「リサーフェシング」を記述）； Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) （「ＦＲシャッフリング」を記述）；及びOsbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 及びKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) （ＦＲのシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。
【００６４】
ヒト化に用いられ得るヒトフレームワーク領域は、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993))；軽鎖又は重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域（例えば、Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992）；及びPresta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008）を参照）；及びＦＲライブラリスクリーニング由来のフレームワーク領域（例えば、Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997）及び Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)を参照）を含む。
【００６５】
４．ヒト抗体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。
【００６６】
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つ又はインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するかもしくは動物の染色体にランダムに組み込まれている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般的に不活性化される。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、 Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)を参照。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術を記載している、米国特許第６，０７５，１８１号及び６，１５０，５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７，０４１，８７０号及び、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号）も参照のこと。このような動物で生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、更に改変される可能性がある。
【００６７】
ヒト抗体は、ハイブリドーマベース法によって作成することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ細胞株が記載されている。（例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 頁51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); and Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991))。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって生成されたヒト抗体は、Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006）に記載されている。更なる方法は、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している）及びNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) （ヒト−ヒトハイブリドーマを記載している）に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）もまた、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 及びVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)に記載される。
【００６８】
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。このような可変ドメイン配列は、次に所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術が、以下に説明される。
【００６９】
５．ライブラリー由来の抗体
本発明の抗体は、所望の活性又は活性（複数）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、様々な方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてのライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)に総説され、更に、例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004);及びLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)に記載されている。
【００７０】
所定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングされ、ファージライブラリーにランダムに再結合され、その後、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、又はＦａｂ断片のいずれかとして提示する。免疫された起源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性を伴うことなく免疫原に高親和性抗体を提供する。あるいは、ナイーブレパートリーを（例えばヒトから）クローニングして、Griffiths等，EMBO J, 12: 725-734(1993)に記載のように如何なる免疫化を伴うことなく、幅広い非自己抗原及び自己抗原に対する抗体の単一源を提供することが可能である。最終的には、ナイーブライブラリーは、また、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol. 227: 381-388(1992)に記載のように、幹細胞からの再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを利用して高度可変ＣＤＲ３領域をコードせしめ、インビトロでの再配列を達成させることによって合成的に作製することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記述する特許公報は、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、及び米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、第２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号及び第２００９／０００２３６０号を含む。
【００７１】
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片は、本明細書でヒト抗体又はヒト抗体の断片とみなされる。
【００７２】
６．多重特異性抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施態様において、結合特異性の一つはＦＧＦＲ１に対してであり、他は、任意の他の抗原、例えばβ−クロトーに対してである。ある実施態様において、二重特異性抗体は、ＦＧＦＲ１の２つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
【００７３】
多重特異性抗体を作製するための技術は、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)）、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)を参照）及び“knob-in-hole”エンジニアリング（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照）を含む。多重特異抗体はまた、抗体のＦｃ−ヘテロ２量体分子を作成するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号）、２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば米国特許第４，６７６，９８０号、及びBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照）；２重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること（例えば、Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)を参照）；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照）；単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用すること（例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照）；及び、例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって作成することができる。
【００７４】
「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能性抗原結合部位を持つ改変抗体もまた本明細書に含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６Ａ１号を参照）。
【００７５】
本明細書中の抗体又は断片はまた、ＦＧＦＲ１並びにその他の異なる抗原（例えばクロトーβ（米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号参照）に結合する抗原結合部位を含む、「２重作用（Dual Acting）ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」を含む。
【００７６】
７．抗体変異体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終コンストラクトに到達させるために作成され得る。
【００７７】
ａ）置換、挿入、及び欠失変異体
ある実施態様において、一つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換型変異誘発の対象となる部位は、ＨＶＲとＦＲを含む。保存的置換は、表１の「保存的置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更が、表１の「典型的な置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされる。
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【００７８】
アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
【００７９】
置換された変異体の一つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体など）の一以上の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的には、更なる研究のために選択され得られた変異体は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性を減少）を有し、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。典型的な置換型変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて、簡便に生成され得る。簡潔に言えば、一つ以上のＨＶＲ残基が変異し、変異体抗体は、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
【００８０】
変更（例えば、置換）は、例えば抗体の親和性を向上させるために、ＨＶＲで行うことができる。このような変更は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされた残基で（例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照）、及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）で行うことができ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリから構築し選択し直すことによる親和性成熟が、例えばHoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様において、多様性が、種々の方法（例えば、変異性ＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチドを標的とした突然変異誘発）の何れかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、ライブラリーは、所望の親和性を持つ抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するするもう一つの方法は、幾つかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４から６残基）がランダム化されたＨＶＲ指向のアプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発、又はモデリングを用いて、特異的に同定され得る。ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がしばしば標的にされる。
【００８１】
所定の実施態様において、置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限りにおいて、一以上のＨＶＲ内で生じる可能性がある。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的改変（例えば本明細書で与えられる保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。このような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外側であってもよい。上記に与えられた変異体ＶＨ又はＶＬ配列の所定の実施態様において、各ＨＶＲは不変であるか、又はわずか１個、２個又は３個のアミノ酸置換が含まれているかの何れかである。
【００８２】
突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085により説明されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又はグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判断するために、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）に置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入され得る。代わりに、又は更に、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基が、置換の候補として標的とされるか又は排除され得る。変異体はそれらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
【００８３】
アミノ酸配列挿入は、一残基から百以上の残基を含有するポリペプチド長にわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニン残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、酵素に対する抗体のＮ末端又はＣ末端への融合（例えばＡＤＥＰＴの場合）、又は抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。
【００８４】
ｂ）グリコシル化変異体
所定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少するように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、一以上のグリコシル化部位が作成又は削除されるようにアミノ酸配列を変えることによって簡便に達成することができる。
【００８５】
抗体がＦｃ領域を含む場合には、それに付着する糖を変えることができる。哺乳動物細胞によって生成された天然型抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ−結合により一般的に付着した分岐鎖、二分岐オリゴ糖を含んでいる。例えばWright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合した、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸、並びにフコースを含み得る。幾つかの実施態様において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の改変は、一定の改善された特性を有する抗体変異体を作成するために行われ得る。
【００８６】
一実施態様において、抗体変異体は、Ｆｃ領域に（直接又は間接的に）付着されたフコースを欠いた糖鎖構造を有して提供される。例えば、このような抗体のフコース量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％、又は２０％から４０％であり得る。フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定されるＡｓｎ２９７に付着しているすべての糖構造の合計（例えば、コンプレックス、ハイブリッド及び高マンノース構造）に対して、Ａｓｎ２９７の糖鎖中のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）でおよそ２９７の位置に位置するアスパラギン残基を指し、しかし、Ａｓｎ２９７もまた位置２９７の上流又は下流のおよそ±３アミノ酸に、すなわち抗体の軽微な配列変異に起因して、位置２９４と３００の間に配置され得る。このようなフコシル化変異体はＡＤＣＣ機能を改善させた可能性がある。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Presta, L.）；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（協和発酵工業株式会社）を参照。「フコース非修飾」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連する出版物の例としては、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号、国際公開第２０００／６１７３９号、国際公開第２００１／２９２４６号、米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号、米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号、米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号、米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号、米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号、米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号、米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号、国際公開第２００３／０８５１１９号、国際公開第２００３／０８４５７０号、国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００５／０３５７７８号、国際公開第２００５／０５３７４２号、国際公開第２００２／０３１１４０号、Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)が含まれる。非フコシル化抗体を産生する能力を有する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)； 米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８ Ａ１号， Presta, L；及び国際公開第２００４／０５６３１２ Ａ１号， Adams et al.,（特に実施例１１））、及びノックアウト細胞株、アルファ−１、６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）を含む。
【００８７】
抗体変異体は、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分オリゴ糖を更に備えている。このような抗体変異体はフコシル化を減少させ、及び／又はＡＤＣＣ機能を改善している可能性がある。そのような抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Jean-Mairettら）；米国特許第６，６０２，６８４号（Umanaら）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Umanaら）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体変異体も提供される。このような抗体変異体はＣＤＣ機能を改善させた可能性がある。このような抗体変異体は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Patelら）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Raju, S．）；及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Raju, S.）に記載されている。
【００８８】
ｃ）Ｆｃ領域変異体
ある実施態様において、１つ又は複数のアミノ酸改変を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入することができ、それによってＦｃ領域変異体を生成する。Ｆｃ領域の変異体は、１つ又は複数のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域の配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含んでもよい。
【００８９】
ある実施態様において、本発明は、インビボにおける抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣなど）が不要又は有害である用途のための望ましい候補とならしめる、全てではないが一部のエフェクター機能を有する抗体変異体を意図している。インビトロ及び／又はインビボでの細胞毒性アッセイを、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠くが（それゆえ、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認するために行うことができる。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介する初代細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)の464ページの表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986）を参照）及びHellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照）に記述されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Promega, Madison, WI）を参照。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、又は更に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998)に開示されるように、インビボで、例えば動物モデルにおいて評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイはまた、抗体が体Ｃ１ｑを結合することができないこと、したがって、ＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために行うことができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003);及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照）。ＦｃＲｎ結合、及びインビボでのクリアランス／半減期の測定はまた、当該分野で公知の方法を用いて行うことができる（例えば、Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照）。
【００９０】
エフェクター機能が減少した抗体は、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、３２９の一つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２以上での置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【００９１】
ＦｃＲへの結合を改善又は減少させた特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照）。
【００９２】
所定の実施態様において、抗体変異体はＡＤＣＣを改善する１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４における置換（ＥＵの残基番号付け）を含む。
【００９３】
幾つかの実施態様において、改変された（すなわち改善されたか減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を生じる、Ｆｃ領域における改変がなされ、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)に説明される。
【００９４】
増加した半減期を持ち、胎仔への母性ＩｇＧの移送を担う、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 及びKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４Ａ１号（Hinton et al.）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一つ又は複数の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域の残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の一以上の置換、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換を有するものが含まれる（米国特許第７，３７１，８２６号）。
【００９５】
Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；及び、Ｆｃ領域の変異体の他の例に関しては国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
【００９６】
ｄ）システイン操作抗体変異体
ある実施態様において、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂｓ」を作成することが望まれ得る。特定の実施態様において、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で生じる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中でさらに記載されるように、イムノコンジュゲーを作成するために、例えば薬物部分又はリンカー−薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用することができる。ある実施態様において、一以上の以下の残基がシステインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。
【００９７】
ｅ）抗体誘導体
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手される追加の非タンパク質部分を含むように更に改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキソラン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体又はランダム共重合体の何れか）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性に起因して製造における利点を有し得る。ポリマーは何れかの分子量のものであってよく、そして分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合するポリマーの数は変動してよく、そして、一以上の重合体が結合する場合は、それらは同じか又は異なる分子であってよい。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が特定の条件下で治療に使用されるのか等を考慮しながら決定することができる。
【００９８】
別の実施態様において、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体と非タンパク質部分とのコンジュゲートが提供される。一実施態様において、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである（Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005）。放射線は、任意の波長であって良いが、限定されないものの、通常の細胞に害を与えないが、抗体−非タンパク質部分の近位細胞が死滅される温度に非タンパク質部分を加熱する波長が含まれる。
【００９９】
Ｂ．組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４，８１６，５６７号で説明したように、組換えの方法及び組成物を用いて製造することができる。一実施態様において、本明細書に記載される抗ＦＧＦＲ１抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。更なる実施態様において、そのような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一実施態様において、宿主細胞は以下を含む（例えば、以下で形質転換される）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第ニベクター。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様において、抗ＦＧＦＲ１抗体を作る方法が提供され、その方法は、上記のように、抗体の発現に適した条件下で、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、及び必要に応じて、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。
【０１００】
抗ＦＧＦＲ１抗体の組換え生産のために、例えば上述したように、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために１つ以上のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離され、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。
【０１０１】
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は、細菌で産生することができる。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、第５，７８９，１９９号及び第５，８４０，５２３号を参照。（また、大腸菌における抗体の発現を説明している、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), 頁245-254も参照。）発現の後、抗体は可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され得、更に精製することができる。
【０１０２】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含む抗体をコードするベクターのための、適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路が、「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の生成をもたらす。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)、及びLi et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)を参照。
【０１０３】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にSpodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。
【０１０４】
植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。
【０１０５】
脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３細胞又は２９３細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）、例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982）に記載されるＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及びＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), 頁255-268 (2003)を参照。
【０１０６】
Ｃ．アッセイ
本明細書で提供される抗ＦＧＦＲ１抗体は、同定され、当技術分野で公知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ、又は特徴づけることができる。
【０１０７】
１．結合アッセイとその他のアッセイ
一態様において、本発明の抗体は、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法など公知の方法により、その抗原結合活性について試験される。
【０１０８】
２．活性のアッセイ
一態様において、アッセイは、アゴニスト活性を有するそれらの抗ＦＧＦＲ１抗体を同定するために与えられる。例えば、生物学的活性は、例えば、リン酸化ＦＲＳ２ａ、リン酸化ＭＥＫ、リン酸化ＥＲＫ／ＭＡＰＫ、リン酸化ＳＴＡＴ３のレベルを測定することによって、又は本明細書に記載のＧＡＬ−Ｅｌｋ１に基づくルシフェラーゼアッセイを用いて測定することができる、特定の経路のシグナル伝達を活性化する能力を含んでいてもよい（例えば、Wu et al. J. Biol. Chem. 5;282(40):29069-72 (2007)及びWu et al. PLoS One 18;6(3):e17868 (2011)を参照）。インビボ及び／又はインビトロでこのような生物学的活性を有する抗体もまた提供される。
【０１０９】
Ｄ．イムノコンジュゲート
本発明はまた、化学療法剤又は薬物、成長抑制剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位元素など、１つ以上の細胞傷害性薬物にコンジュゲートした本明細書中の抗ＦＧＦＲ１抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
【０１１０】
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、そこでは抗体は、限定されないが、メイタンシノイド（米国特許第５２０８０２０号、第５４１６０６４号及び欧州特許ＥＰ０ ４２５２３５ Ｂ１を参照）；モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５６３５４８３号及び５７８０５８８号及び７４９８２９８号を参照）などのアウリスタチン；ドラスタチン、カリケアマイシン又はその誘導体（米国特許第５７１２３７４号、５７１４５８６号、５７３９１１６号、５７６７２８５号、５７７０７０１号、５７７０７１０号、５７７３００１号、及び５８７７２９６号を参照；Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)；及びLode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998))； ダウノマイシン又はドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002）；及び米国特許第６，６３０，５７９号を参照）；メトトレキサート、ビンデシン、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセルなどのタキサン、トリコテセン、及びＣＣ１０６５を含む一つ以上の薬物とコンジュゲートしている。
【０１１１】
その他の実施態様において、イムノコンジュゲートは、酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートした、本明細書に記載の抗体を含み、限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン（modeccin）Ａ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォーディ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチア（momordica charantia）インヒビター、クルシン（curcin）、クロチン（crotin）、サパオナリア・オフィシナリス（sapaonaria oficinalis）インヒビター、ゲロニン（gelonin）、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）及びトリコテセン（tricothecene）が含まれる。
【０１１２】
その他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性コンジュゲートを形成するために放射性原子にコンジュゲートした本明細書に記載されるような抗体を含む。様々な放射性同位体が放射性コンジュゲートの生産のために入手可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体を含む。検出のためにコンジュゲートを使用するとき、それはシンチグラフィー試験のための放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（磁気共鳴画像化ｍｒｉとしても知られている）のためのスピン標識、例えば再び、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含んでよい。
【０１１３】
抗体と細胞傷害性薬物のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルズベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えばビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などを使用して作成され得る。Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)に記載されるように、例えば、リシンイムノトキシンを調製することができる。カーボン−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのためのキレート剤の例である国際公開第９４／１１０２６号を参照。リンカーは、細胞中に細胞毒性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光解離性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)；米国特許第５，２０８，０２０号）が使用され得る。
【０１１４】
本明細書において、イムノコンジュゲート又はＡＤＣは、限定されないが、市販の（例えばPierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aからの）、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＰＢ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、ＳＶＳＢ（スクシンイミジル（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むクロスリンカー試薬を用いて調製されるコンジュゲートを明示的に意図する。
【０１１５】
Ｅ．診断及び検出のための方法及び組成物
ある実施態様において、本明細書で提供される抗ＦＧＦＲ１抗体の何れかは、生物学的サンプル中のＦＧＦＲ１の存在を検出するのに有用である。本明細書で使用する「検出」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。ある実施態様において、生物学的サンプルは、褐色脂肪組織、膵臓組織、肝臓組織、白色脂肪組織及び腫瘍組織などの細胞又は組織を含む。
【０１１６】
一実施態様において、診断又は検出の方法に使用される抗ＦＧＦＲ１抗体が提供される。更なる態様において、生物学的サンプル中のＦＧＦＲ１の存在を検出する方法が提供される。所定の実施態様において、本方法は、抗ＦＧＦＲ１抗体のＦＧＦＲ１への結合を許容する条件下で、本明細書に記載のように抗ＦＧＦＲ１抗体と生物学的サンプルを接触させること、及び複合体が抗ＦＧＦＲ１抗体とＦＧＦＲ１との間に形成されているかどうかを検出することを含む。そのような方法は、インビトロ又はインビボでの方法であり得る。一実施態様において、例えばＦＧＦＲ１が患者の選択のためのバイオマーカーであるなど、抗ＦＧＦＲ１抗体が抗ＦＧＦＲ１抗体による治療に好適な被検体を選択するために使用される。
【０１１７】
ある実施態様において、標識された抗ＦＧＦＲ１抗体が提供される。標識は、限定されるものではないが、（例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識など）直接検出される標識又は部分、並びに、例えば、酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される酵素又はリガンドのような部分が含まれる。典型的な標識は、限定されないが、ラジオアイソトープ３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシェフェラーゼ、例えばホタルルシェフェラーゼ及び細菌ルシェフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシェフェリン、２，３−ジヒドロフタルジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、色素前駆体を酸化する過酸化水素を利用する酵素、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼと共役したもの、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定な遊離ラジカルなどが含まれる。
【０１１８】
Ｆ．薬学的製剤
本明細書に記載の抗ＦＧＦＲ１抗体の薬学的処方物は、所望の程度の純度を有するその抗体と任意の薬学的に許容される担体（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.: Williams and Wilkins PA, USA (1980））とを、凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに毒性でなく、そしてこれには、限定しないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における典型的な薬学的に許容される担体は、介在性薬物分散剤、例えば、水溶性の中性アクティブヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Baxter International, Inc．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。所定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、ｒＨｕＰＨ２０を含み、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８に開示されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ又は複数の追加のグルコサミノグリカンと組み合わされる。
【０１１９】
典型的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性の抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０１２０】
本明細書の製剤はまた、治療を受けている特定の徴候のために必要な一以上の活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものが含まれる場合がある。例えば、ｇｌｐ−１類似体、合成アミリン、グルカゴン受容体アンタゴニスト（例えば、抗ＧＣＧＲ抗体）、又はレプチンを更に提供することが望ましい場合がある。このような活性成分は、意図した目的のために有効な量で組み合わされ適切に存在する。
【０１２１】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合法によって、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート（methylmethacylate））マイクロカプセル）、コロイド薬物送達系で（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロ・エマルジョンで調製されたマイクロカプセルに封入されてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980）に開示される。
【０１２２】
徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスが成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形をしている。
【０１２３】
インビボ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、達成することができる。
【０１２４】
Ｇ．治療的方法及び組成物
本明細書で提供されるアゴニスト抗ＦＧＦＲ１抗体のいずれかを、治療方法で使用することができる。
【０１２５】
一態様では、医薬として使用するためのアゴニスト抗ＦＧＦＲ１抗体が提供される。更なる態様では、代謝性疾患の治療における使用するためのアゴニスト抗ＦＧＦＲ１抗体が提供される。所定の実施態様において、治療の方法に使用されるアゴニスト抗ＦＧＦＲ１抗体が提供される。所定の実施態様において、本発明は、個体に抗ＦＧＦＲ１抗体の有効量を投与することを含む、代謝性疾患を有する個体を治療する方法における使用のためのアゴニスト抗ＦＧＦＲ１抗体を提供する。一つのそのような実施態様において、本方法は個体に少なくとも一の追加の治療薬剤、例えばｇｌｐ−１類似体、合成アミリン、グルカゴン受容体アンタゴニスト（例えば、抗ＧＣＧＲ抗体）、又はレプチンの有効量を投与することを更に含む。上記実施態様のいずれかに記載の「個体」は、好ましくはヒトである。
【０１２６】
更なる態様にて、本発明は、医薬の製造又は調製におけるアゴニスト抗ＦＧＦＲ１抗体の使用を提供する。一実施態様において、本医薬は代謝性疾患の治療のためのものである。更なる実施態様において、本医薬は、疾患を有する個体に、医薬の有効量を投与することを含む、代謝性疾患を治療する方法で使用するためのものである。一つのそのような実施態様において、本方法は、例えば後述するように、少なくとも１つのさらなる治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。
【０１２７】
更なる態様にて、本発明は、代謝性疾患を治療する方法を提供する。一実施態様において、本方法は、そうした代謝性疾患を有する個体に、アゴニスト抗ＦＧＦＲ１抗体の有効量を投与することを含む。一つのそのような実施態様において、この方法は、後述するように、少なくとも１つのさらなる治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。
【０１２８】
更なる態様において、本発明は、例えば、上記の治療法のいずれかに使用される、本明細書で提供されるアゴニスト抗ＦＧＦＲ１抗体のいずれかを含む薬学的製剤を提供する。一実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供されるアゴニスト抗ＦＧＦＲ１抗体の何れかと、薬学的に許容される担体を含む。その他の実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供されるアゴニスト抗ＦＧＦＲ１抗体のいずれかと、少なくとも１つの更なる治療剤を、例えば後述するように含む。
【０１２９】
本発明の抗体は、治療において、単独で、又は他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の抗体は少なくとも１つの更なる治療剤と同時投与され得る。ある実施態様において、追加の治療剤は、ｇｌｐ−１類似体、合成アミリン、グルカゴン受容体アンタゴニスト（例えば、抗ＧＣＧＲ抗体）、又はレプチンである。
【０１３０】
上記のこうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同一又は別々の製剤に含まれている）、及び、本発明の抗体の投与が、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又はその後に起きうる分離投与を包含する。
【０１３１】
本発明の抗体（及び任意の追加の治療剤）は、任意の適切な手段によって投与することができ、経口、肺内、及び鼻腔内、及び局所治療が所望される場合、病巣内投与が含まれる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存し、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射により行うことができる。限定されないが、様々な時間点にわたる、単一又は複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書で考えられている。
【０１３２】
本発明の抗体は良好な医療行為に合致した方法で処方され、投与され、投薬される。この観点において考慮すべき要因は、治療すべき特定の障害、治療すべき特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者が知る他の要因を包含する。抗体は、必要ではないが任意で、問題となる障害の予防又は治療のために、現在使用中の一又は複数の薬剤ともに処方される。そのような他の薬剤の有効量は製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類及び上記した他の要因に依存する。これらは一般的には本明細書に記載されるのと同じ用量及び投与経路において、又は、本明細書に記載された用量の１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路により使用される。
【０１３３】
疾患の予防又は治療のためには、本発明の抗体の適切な用量（単独で使用されるか、又は、一以上の更なる治療的薬剤との組み合わされる場合）は治療すべき疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体を予防又は治療目的のいずれにおいて投与するか、以前の治療、患者の臨床的履歴及び抗体に対する応答性、及び担当医の判断に依存する。抗体は、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、抗体約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ）が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な一日当たり用量は上記した要因に応じて約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日間以上に渡る反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続するであろう。１つの例示される抗体用量は約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの１つ以上の用量（又はこれらの何れかの組み合わせ）を患者に投与してよい。このような用量は断続的に、例えば毎週又は３週毎（例えば患者が約２から約２０、例えば抗体の約６投与量を受けるように）投与してよい。初期の高負荷用量の後、１つ以上の低用量を投与してよい。しかしながら、他の用量用法も使用してよい。この治療法の進行は従来の手法及び試験により容易にモニタリングされる。
Ｈ．製造品
本発明の他の実施態様において、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器とラベル又は容器上にある又は容器に付属するパッケージ挿入物を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグ等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な物質から形成されうる。容器は、疾患の治療、予防、及び／又は診断に有効である、それ自体か、又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明の抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）組成物が本発明の抗体を包含する組成物を含む第一の容器；及び（ｂ）組成物が更なる細胞障害性又はその他の治療的薬剤を包含する組成物を含む第２の容器を含み得る。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療することに用いることができることを示すパッケージ挿入物をさらに含んでいてもよい。別法として、又は加えて、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器をさらに含んでもよい。これは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの立場から望まれる他の物質のさらに含んでもよい。
【実施例】
【０１３４】
ＩＩＩ．実施例
以下は本発明の方法及び組成物の例である。上記提供される一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
【０１３５】
実施例１：抗ＦＧＦＲ１アゴニスト抗体の産生及び特性評価。
我々は、ファージディスプレイ技術及び抗原としてヒトＦＧＦＲ１ｂ及びｃのＨｉｓタグ付きＩｇＤ２−Ｄ３を用いてＦＧＦＲ１に特異的なモノクローナル抗体を産生した。選択された相補性決定領域（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ３）において、ヒトＩｇＧレパートリーの天然の多様性を模倣する、合成による多様性を持つヒトファージ抗体ライブラリーがパニングのために使用された。Ｆａｂ断片は、Ｍ１３バクテリオファージ粒子の表面に二価で提示された（Lee et al., J. Immunol. Methods 284:119-32 (2004)）。パニングプロトコルは以前に記載されている（Liang et al., J. Mol. Biol. 366:815-29 (2007)）。複数のライブラリから多くのクローンをスクリーニングした後、ＦＧＦＲ１のｂとｃの両方のアイソフォームと結合するユニークで特異的ファージ抗体をファージＥＬＩＳＡによって同定した。ヒトＦＧＦＲへの抗体の結合を試験するために、ＦＧＦＲ１ ＥＣＤ−ヒトＦｃキメラタンパク質の２μｇ／ｍｌを用いた従来のＥＬＩＳＡプロトコルを用いた。
【０１３６】
我々はまた、以下の変更を伴って記述されるように（Ｌｉａｎｇら、前出）、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭＴ１００装置を用いたＢＩＡｃｏｒｅ／ＳＰＲにより測定される、ＦＧＦＲ１に対する抗ＦＧＦＲ１抗体の結合親和性を測定した。マウス抗ヒトＦｃ抗体は、製造者により記載されている手順に従って、遊離アミノ基との直接結合を使用して、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭカルボキシメチル化デキストランＣＭ５チップ上に最初にコーティングした。次いで、抗体はＣＭ５バイオセンサーチップ上に捕捉され、約２００応答単位（ＲＵ）を達成した。結合測定は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０（ＨＢＳ−Ｐ緩衝液）で構成されるランニング緩衝液を用いて行った。ＦＧＦＲ１ ＥＣＤ−Ｈｉｓタンパク質の２倍希釈系列が、ＨＢＳ Ｐ緩衝液中で１．５５０ｎＭの範囲で、２５℃で３０μＬ／分の流速で注射された。会合速度（Ｋｏｎ、モル／秒あたり）及び解離速度（Ｋｏｆｆ、秒あたり）が、単純な一対一のラングミュア結合モデルを用いて計算された（ＢＩＡｃｏｒｅ評価用ソフトウェアのバージョン３．２）。平衡解離定数（Ｋｄ、モルあたり）をｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として算出する。
【０１３７】
独立した実験で上記のように同定された２つの抗ＦＧＦＲ１抗体（ここではＲ１ＭＡｂ１及びＲ１ＭＡｂ２として指定される）は、ＦＧＦＲ１ｂとＦＧＦＲ１ｃに類似の親和性で結合するが、他の何れのＦＧＦＲアイソフォームにも結合しない（図１Ａ及びＢ）。それらのシグナル伝達活性は、内因性のＦＧＦＲを欠くが、各ＦＧＦＲアイソフォーム（及び必要に応じてＫＬＢ）を発現するようにトランスフェクトされたラットＬ６細胞においてＧａｌ−Ｅｌｋ１に基づくルシフェラーゼアッセイを用いて試験した。これらの抗体は、予期せず強力なアゴニストであった：両方のＲ１ＭＡｂが、用量依存的に、しかし細胞が組換えＦＧＦＲ１ｂ又はＦＧＦＲ１ｃを発現する場合にのみルシフェラーゼ活性を誘導し、Ｒ１ＭＡｂがＦＧＦＲ１に対する特異的アゴニストとして作用することを示している（図１Ｃ）。このアッセイ形式では、Ｒ１ＭＡｂは、古典ＦＧＦＲ１リガンドである塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）の活性にはあまり影響を及ぼさなかった（図１Ｄ）。しかし、細胞がＦＧＦＲ１ｃとＫＬＢを発現するときに、Ｒ１ＭＡｂとＦＧＦ２１は相加効果を示した（図１Ｄ）。Ｒ１ＭＡｂ２のＦａｂ断片でなくＦ（ａｂ’）２は、ＦＧＦＲ１依存性アゴニスト活性を示し、Ｒ１ＭａｂはＦＧＦＲ１のホモ二量体化を促進することにより、そのアゴニスト活性を発揮することを示唆している（図１Ｅ）。以前に、ＦＧＦＲ１結合ペプチド及びｃ−ｊｕｎロイシンジッパードメインを含む人工のＦＧＦＲ二量体アゴニストが報告されている。Ｃ１９ｊｕｎと称するこの分子はまたｃ−ｊｕｎドメインを介してヘパリンに結合し、ＦＧＦＲ１活性化のためにヘパリンを必要とする（Ballinger et al., Nature Biotechnol. 17: 1199-1204 (1999)）。対照的、ヘパリンは、ルシフェラーゼアッセイにおいてＲ１ＭＡｂ１のアゴニスト活性に影響を及ぼさなかった（図５）。培養したマウス３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞（図１Ｆ）又はＲ１ＭＡｂを腹腔内に注射されたＣ５７ＢＬ／６マウスの白色脂肪組織（ＷＡＴ）において、ＦＧＦＲの下流のシグナル伝達成分であるＥＲＫ及びＭＥＫ１／２のリン酸化を調べることにより、Ｒ１ＭＡｂ１のヘパリン非依存性のアゴニスト活性がさらに確認された（図１Ｇ）。
【０１３８】
私たちは、Ｒ１ＭＡｂ１とＲ１ＭＡｂ２に結合したＦＧＦＲ１エピトープをマッピングするために実験を行った。我々は、アミノ末端にビオチンタグを持つＦＧＦＲ１配列の部分を表した３０のペプチドを合成し、ＥＬＩＳＡ結合アッセイのためにそれらを使用した。ペプチドのこれらの配列は以下の通りであった。＃１：ＳＳＳＥＥＫＥＴＤＮＴＫＰＮＰＶＡＰＹ（配列番号３６）；＃２：ＰＶＡＰＹＷＴＳＰＥＫＭＥＫＫＬＨＡＶ（配列番号３７）；＃３：ＫＬＨＡＶＰＡＡＫＴＶＫＦＫＣＰＳＳＧ（配列番号３８）；＃４：ＣＰＳＳＧＴＰＮＰＴＬＲＷＬＫＮＧＫＥ（配列番号３９）；＃５：ＫＮＧＫＥＦＫＰＤＨＲＩＧＧＹＫＶＲＹ（配列番号４０）；＃６：ＹＫＶＲＹＡＴＷＳＩＩＭＤＳＶＶＰＳＤ（配列番号４１）；＃７：ＶＶＰＳＤＫＧＮＹＴＣＩＶＥＮＥＹＧＳ（配列番号４２）；＃８：ＮＥＹＧＳＩＮＨＴＹＱＬＤＶＶＥＲＳＰ（配列番号４３）；＃９：ＶＥＲＳＰＨＲＰＩＬＱＡＧＬＰＡＮＫＴ（配列番号４４）；＃１０：ＰＡＮＫＴＶＡＬＧＳＮＶＥＦＭＣＫＶＹ（配列番号４５）；＃１１：ＭＣＫＶＹＳＤＰＱＰＨＩＱＷＬＫＨＩＥ（配列番号４６）；＃１２：ＬＫＨＩＥＶＮＧＳＫＩＧＰＤＮＬＰＹＶ（配列番号４７）；＃１３：ＮＬＰＹＶＱＩＬＫＴＡＧＶＮＴＴＤＫＥ（配列番号４８）；＃１４：ＴＴＤＫＥＭＥＶＬＨＬＲＮＶＳＦＥＤＡ（配列番号４９）；＃１５：ＳＦＥＤＡＧＥＹＴＣＬＡＧＮＳＩＧＬＳ（配列番号５０）；＃１６：ＳＩＧＬＳＨＨＳＡＷＬＴＶＬＥＡＬＥＥ（配列番号５１）；＃１７：ＹＷＴＳＰＥＫＭＥＫＫＬＨＡＶＰＡＡＫ（配列番号５２）；＃１８：ＥＫＭＥＫＫＬＨＡＶＰＡＡＫＴＶＫＦＫ（配列番号５３）；＃１９：ＰＡＡＫＴＶＫＦＫＣＰＳＳＧＴＰＮＰＴ（配列番号５４）；＃２０：ＫＦＫＣＰＳＳＧＴＰＮＰＴＬＲＷＬＫＮ（配列番号５５）；＃２１：ＧＴＰＮＰＴＬＲＷＬＫＮＧＫＥＦＫＰＤ（配列番号５６）；＃２２：ＴＬＲＷＬＫＮＧＫＥＦＫＰＤＨＲＩＧＧ（配列番号５７）；＃２３：ＦＫＰＤＨＲＩＧＧＹＫＶＲＹＡＴＷＳＩ（配列番号５８）；＃２４：ＨＲＩＧＧＹＫＶＲＹＡＴＷＳＩＩＭＤＳ（配列番号５９）；＃２５：ＬＨＡＶＰＡＡＫＴＶＫＦＫＣＰＳＳ（配列番号６０）；＃２６：ＫＬＨＡＶＰＡＡＫＴＶＫＦＫＣＰ（配列番号２８）；＃２７：ＡＶＰＡＡＫＴＶＫＦＫＣＰＳＳＧ（配列番号６１）；＃２８：ＦＫＰＤＨＲＩＧＧＹＫＶＲＹ（配列番号２９）；＃２９：ＫＰＤＨＲＩＧＧＹＫＶＲ（配列番号６２）；＃３０：ＧＴＰＮＰＴＬＲＷＬＫＮ（配列番号６３）。図１７Ａに示すように、Ｒ１ＭＡｂ１とＲ１ＭＡｂ２の両方において、それらが有意な結合を実証している最短のペプチドは、ペプチド＃２６と＃２８であった。
【０１３９】
実施例２：Ｒ１ＭＡｂは持続的な抗糖尿病活性を示す。
我々は、本発明の抗ＦＧＦＲ１抗体が抗糖尿病活性を有するかどうかを糖尿病のマウスモデルを用いて試験した。すべてのマウスは、ジャクソン研究所から購入し、２１℃で病原体を含まない動物施設において、固形飼料（げっ歯類用の標準食（ラボダイエット５０１０、脂肪から１２．７％のカロリー）又は高脂肪、高炭水化物食（Harlan Teklad TD.03584、脂肪から５８．４％のカロリー）及び水へ自由にアクセスできる、標準の１２時間の明／１２時間の暗のサイクルの下で維持された。Ｃ５７ＢＬＫＳ／Ｊのバックグラウンドでのｄｂ／ｄｂマウスはメスであり他のマウスは全てオスであった。全てのマウスは、８ヶ月齢（図３Ｅ）又は４ヶ月齢（図３Ｆ）のａｐ２−ＳＲＥＢＰ１ｃマウス（図３Ｆ）を除いて、約９〜１１週齢での注射のために使用された。ＦＧＦ２１タンパク質の持続注入のため、浸透圧ポンプ（アルゼット（登録商標）２００１）を皮下に移植した。グルコースレベルは、ワンタッチ（登録商標）ウルトラグルコメーターを用いて測定した。肝臓脂質分析のために、脂質をフォルチ法に従って抽出し、５％トリトンＸ−１００を含有するＰＢＳ中に再懸濁した。総コレステロール、トリグリセリド、β−ヒドロキシブチレート（サーモＤＭＡ）及び非エステル化脂肪酸（ロシュ）は酵素反応を用いることにより測定した。血清インスリンレベルは、ＥＬＩＳＡ（Crystal Chem）によって決定した。
【０１４０】
我々は、３、１０、及び５０ｍｇ／ｋｇのＲ１Ｍａｂを高血糖レプチン抵抗性ｄｂ／ｄｂマウスに注入することにより、インビトロ及びインビボでＲ１ＭＡｂのアゴニスト活性を試験した。我々は、血中グルコースレベルが、３つの用量全てで一週間以上にわたって正規化され、グルコースレベルは単回注射後３０日以上対照マウスよりも低いままであり、観察されたグルコース低下作用は予想外に強く長続きすることを観察した（図２Ａ）。これは、一過性であるが、体重の有意な減少に関連付けられていた（図２Ａ）。血清インスリンレベルもＲ１Ｍａｂ１の注射により劇的に減少したため、グルコース低下作用はインスリン感受性の改善による可能性が高かった（図２Ｂ）。我々は、Ｒ１Ｍａｂ２による血糖値において（図６）、そして著しいインスリン耐性、レプチン欠乏のｏｂ／ｏｂマウス、高脂肪食（ＨＦＤ）給餌マウス、及びＩｎｓ２Ａｋｉｔａマウスを含む更なる三匹のマウスモデルにおいて（図２Ｃ及び７）、似たようなＲ１Ｍａｂ誘導性の減少を観察した。ペアフィード実験は、ｄｂ／ｄｂマウス及びＩｎｓ２ＡｋｉｔａマウスにおけるＲ１ＭＡｂ誘導性体重減少は、食物摂取量の減少に起因することを示した；しかし、血糖の観察された減少は、食物摂取とは大部分は無関係である（図２Ｄ及び６−７）。膵臓では、Ｒ１ＭＡｂ１の注射はペアフィード又は非ペアフィード対照マウスのいずれかと比較して各膵島あたりのインスリン陽性領域を増加させた（図２Ｅ及び８）。ＦＧＦＲ１は、膵臓β細胞中で発現され（Hart et al., Nature 408:864-68 (2000)）、ＦＧＦ２１は、β細胞機能をエキソビボで促進する（Wente et al., Diabetes 55:2470-78 (2006)）；したがってβ細胞におけるＦＧＦＲ１の活性化は膵臓のインスリンレベルの増加に直接寄与し得る。これらのデータは、ＦＧＦＲ１（ただしＦＧＦＲ２又はＦＧＦＲ３でなく）の活性化は、組換えＦＧＦ２１の抗糖尿病及び抗高脂血症活性を再現するのに十分であることを実証している。
【０１４１】
Ｒ１ＭＡｂの活性に対するＩｇＧの機能性の重要性を詳細に分析するため、我々は２つのタイプの改変を利用した。Ｆｃ領域内の二重変異（Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ；ＤＡＮＡ）は、ＦｃγＲへの結合及びＩｇＧ分子による免疫エフェクター細胞の動員を消滅させる（Gong et al., 2005）。Ｒ１ＭＡｂ２のアゴニスト又は抗糖尿病活性は、ＤＡＮＡ変異の導入による影響を受けなかった；従って、エフェクター機能はＲ１ＭＡｂ２の抗糖尿病活性に何の役割も果たさない（図９Ａ−Ｃ）。しかしながら、Ｆａｂ断片の一つを欠損した、Ｒ１Ｍａｂ１の片腕型（ＯＡ）バージョン（Atwell et al., J. Mol. Biol. 270:26-35 (1997)）（ＯＡ−Ｒ１ＭＡｂ１）（図９Ａ及びＤ）は、アゴニスト活性の低下を示し（図９Ｅ及びＦ）、血糖、体重、及び肝臓と血清の脂質レベルをｄｂ／ｄｂマウスで低減することができず（図９Ｇ及びＨ）、Ｒ１ＭＡｂのアゴニスト及び抗糖尿病活性の両方とも、Ａｂの二価性に依存していることを示している（我々はまた、一つの抗ＦＧＦＲ１アームのみを持つ（例えば、抗−β−クロトーアームを持つ）二重特異性抗体を試験し、それらが二価の抗ＦＧＦＲ１ Ｒ１ＭＡｂの有利な特質を保持していることを確認しているが）。これらの相関関係は、ＦＧＦＲ１の下流のシグナル伝達経路のＲ１ＭＡｂ誘導性活性化は、恐らくその抗糖尿病作用を媒介することを強く示唆している。
【０１４２】
ＭＡｂは、数多くのヒト疾患の治療のための強力な治療法として出現している。抗ＦＧＦＲ１アゴニストＭａｂの強力な抗高血糖及び脂質低下活性に関する我々の実証は、２型糖尿病及びその他の肥満関連の慢性疾患の治療のため、ＦＧＦＲ１又はＦＧＦＲ１含有受容体複合体を標的とする治療用モノクローナル抗体の開発に向けた新たな道を切り開いている。ＦＧＦＲ１のＭＡｂに基づく標的化は、組換えＦＧＦ２１療法に比べて幾つかの好ましい特性を提供している。第一に、その性質からして、ＭＡｂは、ＦＧＦ２１又は任意の他の非抗体治療用タンパク質と比較して、予測可能で、調節可能で、はるかに優れた薬物動態を提供する。実際、我々は、ｄｂ／ｄｂマウスへのＲ１ＭＡｂ１又はＲ１Ｍａｂ２の１〜３ｍｐｋでの単回腹腔注射が、３０日以上高血糖の著しい持続的改善をもたらすことを実証した（図２及び５）。このような長期持続性血糖作用は、前述の抗糖尿病薬の何れについても報告されていない。
【０１４３】
実施例３：Ｒ１ＭＡｂ及びＦＧＦ２１の糖尿病作用における脂肪組織の重要性。
組換えＦＧＦ２１は、脂肪組織及び肝臓を介してインスリン感受性を改善することが示唆されている（Berglund et al., Endocrinology 150:4084-93 (2009); Li et al., FEBS Letters 583:3230-34 (2009)）。マウスに対するＦＧＦ２１の注入は、以前に報告されたように肝臓、白色脂肪組織（ＷＡＴ）、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、及び膵臓の４つのＫＬＢを発現する組織型で、ＭＥＫ及びＥＲＫのリン酸化を誘発した（図３Ａ、上）（Kurosu et al., J. Biol. Chem. 282: 26687-95 (2007); Xu et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 297(5): E1105-14 (2009)）。対照的に、Ｒ１ＭＡｂ１注入は、肝臓内ではなく脂肪組織及び膵臓内で同じ下流エフェクターのリン酸化を生じ（図４Ａ、下）、肝臓における非常に低いＦＧＦＲ１のｍＲＮＡの発現と一致する（図１０）（Fon Tacer et al., Mol. Endocrinol. 24(10): 2050-64 (2010））。実際、肝臓遺伝子発現の並列比較により、以前に同定された２つのＦＧＦ２１標的遺伝子（レプチン受容体（ＬｅｐＲ）及びサイトカインシグナル伝達２の抑制因子（SOCS2); Coskun et al., Endocrinology 149:6018-27 (2008), Inagaki et al., Cell Metabolism 8:77-83 (2008)）の発現は、Ｒ１ＭＡｂ１によってではなくＦＧＦ２１によって誘導されることが明らかとなった（図１５）。一方、既知のインスリン制御遺伝子（アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ１（ＡＣＣ１）、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）、長鎖脂肪酸ファミリー６のエロンガーゼ（Ｅｌｏｖｌ６）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）−結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）−１、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ））の肝臓での発現は、ＦＧＦ２１とＲ１ＭＡｂ１の両方で同様に改変され、これらの遺伝子は、ホルモン（例えば、インスリン）又は代謝的変化を介して間接的に調節される可能性があることを示唆している。Ｒ１ＭＡｂ１は、単回注射後７日でｄｂ／ｄｂマウスに注入すると、恐らく脂肪組織を介した脂質の再分配により肝臓及び血清の脂質を著しく減少させた（図３Ｂ−Ｄ）。Ｒ１ＭＡｂ１の注入は、ＦＧＦＲ１を発現する２つの癌易発性組織型である肺及び前立腺において、ＭＥＫ又はＥＲＫのリン酸化を誘導しなかった（図３Ａ）。これらの観察は共に、脂肪組織ではなく肝臓がＲ１ＭＡｂとＦＧＦ２１の一般的な代謝活性の中心であることを示唆している。
【０１４４】
この点を更に検討するために、我々は、白色脂肪組織の欠如と褐色脂肪機能不全に起因して、重度のインスリン抵抗性、レプチン欠乏、及び肝腫大を呈示する脂肪萎縮性ａｐ２−ｓｒｅｂｐ１ｃトランスジェニックマウスを使用した（図３Ｅ、１１）（Shimomura et al., Genes Dev. 12:3182-94 (1998); Shimomura et al., Nature 401:73-76 (1999)）。正常な脂肪組織機能は、Ｒ１ＭＡｂ１の代謝活性に必要であるという考えと一致して、１ｍｐｋでの単回の腹腔内注射は、ａｐ２−ｓｒｅｂｐ１ｃマウスではなく対照のｏｂ／ｏｂマウスにおいてのみ、ＨＯＭＡ−ＩＲ及び耐糖能を改善した（図３Ｅ）。食物摂取量は、ｏｂ／ｏｂマウスとａｐ２−ｓｒｅｂｐ１ｃトランスジェニックマウスの両方において、対照のＩｇＧを注射したペアフィードマウスと比較した場合、Ｒ１ＭＡｂ１の注入により減少した（図３Ｅ）。加えて、組換えＦＧＦ２１の持続注入はまた、血清のβ−ヒドロキシ酪酸（すなわちケトン体）の増加及びコレステロールの減少が観察されたものの、ａｐ２−ｓｒｅｂｐ１ｃマウスにおけるインスリン抵抗性を改善できなかった（図３Ｆ）。
【０１４５】
実施例４：Ｒ１ＭＡｂによる褐色脂肪におけるＰＧＣ１−αの活性化。
ＦＧＦ２１は最近、脂肪組織及び肝臓における核内受容体の転写コアクチベーターＰＧＣ−１αタンパク質を活性化し、酸化的代謝に関連する下流遺伝子の発現を誘導することが示唆されている（Chau et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 107:12553-58 (2010); Hondares et al., Cell Metabolism 11:206-12 (2010); Potthoff et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 30;106(26): 10853-8 (2009））。確かに、ｏｂ／ｏｂマウスに注入すると、ＤＮＡマイクロアレイ解析と続く遺伝子セットエンリッチメント解析（gene-set enrichment analysis）によって明らかにされるように、Ｒ１ＭＡｂ１は酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）に関与している遺伝子の褐色脂肪組織（ＢＡＴ）の発現及び脂肪酸代謝を著しく増加させた（図４Ａ）。Ｒ１ＭＡｂ１（及びＦＧＦ２１）はまた、褐色脂肪組織においてＰＧＣ−１α、ＰＧＣ−１β及びその主要な標的であるＣＩＤＥＡとＵＣＰ１の発現を増加させた（定量ＰＣＲによって測定：図４（ｂ）及び１６）。
【０１４６】
ＰＧＣ−１αの転写はプロモーター領域におけるｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥｓ）、及びＣＲＥｓに結合するＣＲＥＢ転写因子を介して調節されている（Herzig et al., Nature 413:179-83 (2001); Karamitri et al., J. Biol. Chem. 284:20738-52 (2009); Muraoka et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 296:E1430-39 (2009); Shi et al., J. Biol. Chem. (2005））。ＫＬＢを発現するＨＥＫ２９３細胞においてＦＧＦ２１により活性化することができる代謝関連転写因子を同定するためのスクリーンにおいて、我々は、ＧＡＬ−ＣＲＥＢ融合タンパク質は、ＦＧＦ２１によって活性化することができることを見出した（図１２Ａ−１２Ｂ）。続いて、我々は、ＦＧＦ２１及びＲ１ＭＡｂ１の両方とも、ＨＥＫ２９３細胞において、ＧＡＬ−ＣＲＥＢレポーター並びにＣＲＥ−ルシフェラーゼレポーターを、用量依存的に活性化することができることを見出した（図４Ｃ）。ＣＲＥＢは下流エフェクターとして機能するという考えと一致して、ＦＧＦ２１は、マウス白色脂肪組織（図４Ｄ）、分化型ヒト初代脂肪細胞（図４Ｅ）、及びＨＥＫ２９３細胞（図１２Ｃ）において、ＣＲＥＢ、及びＥＲＫによって制御される上流のＣＲＥＢキナーゼであるｐ９０ＲＳＫのリン酸化を増加した。このように、ＦＧＦ２１とＲ１ＭＡｂによるＣＲＥＢの活性化はおそらくＰＧＣ−１α及び脂肪組織における酸化的代謝に関与する一連の下流の遺伝子の誘導に寄与している（図４Ｆ及び１２Ｄ）。本明細書で提案される転写調節に加えて、我々はＲ１ＭＡｂによるインビトロ又はインビボでＡＭＰＫ活性化の証拠を観察することができなかったものの（データは非表示）、ＦＧＦ２１は、翻訳後にＡＭＰＫの活性化を介してＰＧＣ−１αを活性化することが報告されている（Chau et al.,前出）。まとめると、我々の結果は、ＦＧＦ２１とＲ１ＭＡｂの抗脂質及び抗糖尿病効果を媒介する脂肪組織におけるＰＧＣ−１αの役割を支持している。
【０１４７】
実施例５：二重特異性抗ＦＧＦＲ１／抗β−クロトー抗体の試験
我々のＲ１ＭＡｂｓとＦＧＦ２１の間の別の重要な違いは、標的受容体の特異性である。ＦＧＦ２１は、ＦＧＦＲ１ｃ、２ｃ、及び３ｃに作用することができるが、その効果は恐らくＫＬＢを発現する組織（即ち、肝臓、脂肪、及び膵臓）に限定されている（Fon Tacer et al., 前出; Kurosu et al., J. Biol. Chem. 282:26687-95 (2007); Ogawa et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 104:7432-37 (2007)。これとは対照的に、我々のＲ１ＭＡｂｓの標的組織はＦＧＦＲ１の発現及び抗体分子の組織分布によって決定されるが、ＫＬＢの発現によって限定される可能性は低い。実際、我々は、Ｒ１ＭＡｂ１で処置したマウスにおいて軽度の低リン血症を観察し、腎臓におけるＦＧＦ２３／クロトー経路の活性化を示唆している。従って、我々は、ファージディスプレイ又はハイブリドーマ技術を用いて二重特異性抗ＫＬＢ／ＦＧＦＲ１二重特異性抗体を生成し（ＦＧＦＲ１ｃ及びＫＬＢを発現するＨＥＫ２９３細胞で免疫したＢＡＬＢｃマウス）、別々の抗ＫＬＢ抗体及びノブとホールの技術を生成した（Merchant et al. Nature Biotechnol. 16(7): 677-81 (1998)）。我々は、ＧＡＬ−Ｅｌｋ１の発現を活性化するこれらの二重特異性抗体の能力を試験し、そしてこれらの抗体は、下流シグナルの活性化においてβ−クロトー及びＦＧＦＲ１の両方の存在に依存することが確認された。我々はまた、抗体の一つは、分化型初代ヒト脂肪細胞において下流のシグナル伝達中間体であるＭＥＫ及びＥＲＫ１／２のリン酸化を増加させることができることを確認した。二重特異性抗体の一つは、マウスのタンパク質と交差反応し、我々は二重特異性抗体のインビボの活性を試験するために、この抗体を使用した。我々は、この二重特異性抗体は、血清のＦＧＦ２３を上昇させずに血糖値を低下させるが、一方対応する対照の抗ＦＧＦＲ１（単一特異性）抗体は同程度まで血糖値を低下させるが血清のＦＧＦ２３のレベルを著しく上昇させることを確認した。
【０１４８】
次に我々は、抗ＦＧＦＲ１アゴニスト抗体の代謝的有益性を提供するために、これらの二重特異性抗体の能力を試験する。我々は、ヒトβ−クロトーを発現するトランスジェニックマウスを作製し（Ｒ１ＭＡｂ１及びＲ１ＭＡｂ２の各々はマウスＦＧＦＲ１を認識する）、そして上述の抗ＫＬＢ／ＦＧＦＲ１二重特異性抗体は、例えば高脂肪食給餌ｈＫＬＢトランスジェニックマウスなどのマウスモデルにおいて耐糖能を改善することを確認する。我々はまた、他のモデル動物（例えば、ラット、ウサギ、カニクイザル及びアカゲザル）においてタンパク質と反応する抗β−クロトー抗体を生成し、代謝的有益性を提供するためにこれらの抗体及び抗ＦＧＦＲ１抗体を用いて構築された二重特異性抗体の能力を同様に試験する。
【０１４９】
前述の発明は、理解を明確にする目的のために例示及び実施例によってある程度詳細に説明してきたが、説明や例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。すべての特許及び本明細書に引用される科学文献の開示は、参照によりその全体が援用される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ−１】
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【図１Ｃ−２】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｆ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ−１】
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【図４Ａ−２】
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【図４Ｄ−Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ｆ】
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【図１２Ｃ】
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【配列表】
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