(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療上有効な量の以下の式Ｉに係るビタミンＤ化合物を含む、高眼圧を下げるための医薬組成物であって、前記化合物を対象の少なくとも一方の眼に投与したとき、前記対象の眼内圧が少なくとも１５％低下される、医薬組成物。
【化１】
0005753386.tif 000010
［式中、Ｒは、次の式
【化２】
0005753386.tif 000011
で示される基であり、
Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、メチル若しくは３’−ヒドロキシプロピリジンであり、又は＝ＣＨ２若しくはメチレンとして一緒にされ；Ｒ３及びＲ４は、Ｈ、アルキル（１〜３の炭素）、アルコキシから選択され、互いに同一であっても異なっていてもよく；Ｘは、ヒドロキシル基又は保護されたヒドロキシル基であり；Ａが酸素であれば、そのときＲ４は存在しないという条件でＡは酸素又は炭素であり、Ｃ及びＤは、Ｈであるか又は＝ＣＨ２として一緒にされる基である。］
【請求項２】
前記式Ｉ中、Ｒは、次の式
【化３】
0005753386.tif 000012
で示される基あり、前記基におけるＲ３及びＲ４は、Ｈ、アルキル（１〜３の炭素）、アルコキシから選択され、互いに同一であっても異なっていてもよく；Ｘは、ヒドロキシル基又は保護されたヒドロキシル基であり；Ａが酸素であれば、そのときＲ４は存在しないという条件でＡが酸素又は炭素である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記式Ｉ中、Ｒは、次の式
【化４】
0005753386.tif 000013
で示される基であり、前記基におけるＲ３及びＲ４は、Ｈ、アルキル（１〜３の炭素）、アルコキシから選択され、互いに同一であっても異なっていてもよく；Ｘは、ヒドロキシル基又は保護されたヒドロキシル基である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記式Ｉ中、Ｒは、次の式
【化５】
0005753386.tif 000014
で示される基であり、前記基におけるＲ３及びＲ４は、Ｈ、アルキル（１〜３の炭素）、アルコキシから選択され、互いに同一であっても異なっていてもよく；Ｘは、ヒドロキシル基又は保護されたヒドロキシル基であり；Ａが酸素であれば、そのときＲ４は存在しないという条件でＡが酸素又は炭素である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記少なくとも一方の眼に投与される前記ビタミンＤ化合物の用量が、１日当たり０．２μｇ〜１ｍｇである請求項１記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記医薬組成物が外用製剤である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記外用製剤が点眼剤である請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ビタミンＤ化合物が、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３）、２−メチレン−１９−ノル−（２０Ｓ）−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、１α，２５−ジヒドロキシ−１９−ノル−ビタミンＤ３、２−（３’−ヒドロキシプロピリデン）−１９−ノル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（Ｅ−異性体）、１７−２０デヒドロ−２−メチレン−１９−ノル−（２０Ｓ）−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（Ｅ及びＺ−異性体）、２６−ホモ−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、２６，２７−ジメチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、２５−ヒドロキシビタミンＤ３から成る群から選択される請求項１記載の医薬組成物。
【請求項９】
治療上有効な量の以下の式Ｉに係るビタミンＤ化合物を含む、高い眼内圧に関連した緑内障を予防するための組成物であって、前記緑内障を発症するリスクのある対象に、前記化合物を少なくとも一方の眼に投与したとき、前記対象の眼内圧が少なくとも１５％低下されることにより、前記緑内障の発症が妨げられる、医薬組成物。
【化６】
0005753386.tif 000015
［式中、Ｒは、次の式
【化７】
0005753386.tif 000016
で示される基であり、前記基におけるＲ１及びＲ２は、Ｈ、メチル若しくは３’−ヒドロキシプロピリジンであり、又は＝ＣＨ２若しくはメチレンとして一緒にされ；Ｒ３及びＲ４は、Ｈ、アルキル（１〜３の炭素）、アルコキシから選択され、互いに同一であっても異なっていてもよく；Ｘは、ヒドロキシル基又は保護されたヒドロキシル基であり；Ａが酸素であれば、そのときＲ４は存在しないという条件でＡは酸素又は炭素であり、Ｃ及びＤは、Ｈであるか又は＝ＣＨ２として一緒にされる。］
【請求項１０】
前記少なくとも一方の眼に投与される前記ビタミンＤ化合物の用量が、１日当たり０．２μｇ〜１ｍｇである請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ビタミンＤ化合物の用量が５μｇ／日より多い請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記医薬組成物が外用製剤である請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１３】
以下の式Ｉに係るビタミンＤ化合物
【化８】
0005753386.tif 000017
［式中、Ｒは、次の式
【化９】
0005753386.tif 000018
で示される基であり、前記基におけるＲ１及びＲ２は、Ｈ、メチル若しくは３’−ヒドロキシプロピリジンであり、又は＝ＣＨ２若しくはメチレンとして一緒にされ；Ｒ３及びＲ４は、Ｈ、アルキル（１〜３の炭素）、アルコキシから選択され、互いに同一であっても異なっていてもよく；Ｘは、ヒドロキシル基又は保護されたヒドロキシル基であり；Ａが酸素であれば、そのときＲ４は存在しないという条件でＡは酸素又は炭素であり、Ｃ及びＤは、Ｈであるか又は＝ＣＨ２として一緒にされる。］を含む、前記化合物を対象の少なくとも一方の眼に投与したとき、前記対象の眼内圧が少なくとも１５％低下されることにより高眼圧を下げるため、又は、緑内障を発症するリスクのある対象に、前記化合物を少なくとも一方の眼に投与したとき、前記対象の眼内圧が少なくとも１５％低下されることにより高い眼内圧に関連した緑内障を予防するためのキットであって、前記キットが、使用のための指示書を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビタミンＤ化合物及び眼内圧を下げ、対象において高眼圧症を治療するための高眼圧症治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
高い眼内圧（ＩＯＰ）は少なくとも２つの視覚系の障害における構成要素である。第１の障害は、原発開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）であり、それは高いＩＯＰと進行性の視神経症を合わせたものであり、結果として視神経頭の特徴的な陥没及び相当する視野の欠損を生じる。第２の障害は、高眼圧症（ＯＨＴ）であり、ＩＯＰが上昇するが、視神経頭に対する緑内障性の損傷は認められず、検出可能な視野は変化しない。高いＩＯＰは緑内障性の視神経症[Armaly, 1980]及びそのほかの視野障害の発症では重大なリスク因子である。たとえば、ＯＨＴの人々の４％[Kass, 2002]〜２０％[Ontoso, 1997] の間が５年以内に視野欠陥を発症する。
【０００３】
高いＩＯＰはＰＯＡＧの構成要素ではあるが、緑内障の一部のほかの形態には高いＩＯＰは関与しない。正常眼圧緑内障（ＮＴＧ）は、視神経頭の類似の損傷と類似の視野欠損を特徴とするが、高いＩＯＰを含まない臨床的実体である。ＰＯＡＧは２１ｍｍｇのＩＯＰの分割点を用いてＮＴＧから任意で区別される[Vass, 2007]。
【０００４】
高眼圧は、ＰＯＡＧの最強の既知のリスク因子である。眼内圧（ＩＯＰ）は、毛様体における房水（ＡｑＨ）の産生によって、及び線維柱帯(ＴＭ)とブドウ膜強膜の排出経路を介したＡｑＨの排出によって決定される。ＩＯＰは、主として従来の流出系を介したＡｑＨの排出への抵抗が高まった結果として生じ、細胞外マトリクスの体積の増加と細胞質の低下に関連する[Clark, 2003]。
【０００５】
しかしながら、ＩＯＰの正常な調節及び網膜の神経節細胞の機能は大部分不明のままである。ＩＯＰ及びＯＨＴの背後にある細胞性及び生化学的なメカニズムに関して知識の一般的な欠如が存在し、そのことによってＯＨＴに関与する分子事象を特定するのが難しくなっている。ＰＯＡＧの遺伝学の理解はほとんどなく、そのもとにある細胞生物学の知識もほとんどない[Tan, 2006]。
【０００６】
緑内障の形態すべての治療の主な目標は視覚機能の保護である。この目標を達成する治療法に不可欠なのはＩＯＰを下げることである。ＩＯＰを下げることは、視神経の損傷及び視野の欠如を減らすのに有効であることが示されているので、緑内障の管理において治療法の大黒柱である[Kaufman, 2006]。現在臨床で使用されている緑内障防止薬のすべては、水性流のダイナミズムに対する作用のメカニズムに従って２つのカテゴリーに分類することができる。一方は、水の産生を抑制する薬剤の群（α−及びβ−アドレナリン作用性の遮断剤、炭酸脱水素酵素阻害剤、及びＮａ+／Ｋ+−ＡＴＰ分解酵素阻害剤）であり、他方は、圧力に感受性（おそらく線維柱帯）の流出経路を増強する（コリン作動薬、ＭＭＰ活性剤及びタンパク質キナーゼ阻害剤）又は圧力に非感受性（ブドウ膜強膜）の流出を高める（プロスタグランジン）ことによって水の流出を促進する群である[Clark, 2003; Institute, 2006; Orihashi, 2005; Marquis, 2005]。各経路を介した流れの量の評価は測定技法に左右される[Lim, 2008]。
【０００７】
ＯＨＴ、ＩＯＰ及び緑内障の従来の治療は、ＩＯＰを下げるために房水の流出を高める又は房水の流入を減らすためのシグナル伝達経路において受容体で作用する又はメディエータとして作用する小さな分子の使用に頼っている。緑内障の現在の薬物治療では、５つの主な部類の薬物が現在、臨床使用で利用可能である。これらには、α−アドレナリン作用性作動薬、β−アドレナリン作用性作動薬（β−遮断剤）、炭酸脱水素酵素阻害剤（ＣＡＩ）、コリン作動薬及びプロスタグランジン（ＰＧ）化合物が挙げられる。眼における房水の産生を減らすことによって（α−及びβ−アドレナリン作用性の遮断剤、炭酸脱水素酵素阻害剤、及びＮａ+／Ｋ+−ＡＴＰ分解酵素阻害剤）、又は従来の経路（コリン作動薬、ＭＭＰ活性剤及びタンパク質キナーゼ阻害剤のようにシュレム管を介して）を介した若しくはブドウ膜強膜の流出経路（ＰＧ）を介した流出を改善することによってＩＯＰを下げる[Clark, 2003; Institute, 2006; Orihashi, 2005; Marquis, 2005]。時間の経過とともに、ほとんどの患者は１種類を超えて、単剤で又は種々の組み合わせで薬物を使用するようになり、様々な作用メカニズムを持つ異なった部類の化合物で試してみる。上述の治療剤はすべて１以上の重大な且つ望ましくない副作用を有する[Kaufman, 2006]。
【０００８】
従って、最小限の又は有益な副作用を有する新規の部類の有効なＩＯＰを下げる化合物に対するニーズが存在する。高眼圧症及び緑内障の治療のための副作用の少ない新規の、さらに有効な及びさらに選択性の化合物の検索は、眼内圧の調節に関与する分子メカニズムを理解することに寄与する可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、以下の式Ｉで示されるビタミンＤ化合物及び眼内圧を下げ、対象において高眼圧症を治療するための高眼圧症治療剤を提供することを目的としている。
【化１】
0005753386.tif 000002
［式中、Ｒは、次の式
【化２】
0005753386.tif 000003
で示される基であり、式中、Ｒ1及びＲ2は、Ｈ、メチル若しくは３’−ヒドロキシプロピリジンであり、又は＝ＣＨ2若しくはメチレンとして一緒にされ；Ｒ3及びＲ4は、Ｈ、アルキル（１〜３の炭素）、アルコキシから選択され、互いに同一であっても異なっていてもよく；Ｘは、ヒドロキシル基又は保護されたヒドロキシル基であり；Ａが酸素であれば、そのときＲ4は存在しないという条件でＡは酸素又は炭素であり、Ｃ及びＤは、Ｈであるか又は＝ＣＨ2として一緒にされる。］
【００１０】
前記ビタミンＤ化合物によれば、対象の眼内圧は少なくとも１５％低下される。前記ビタミンＤ化合物は、患者における緑内障を防ぐ方法と同様に、対象の片方又は両方の眼における眼内圧を下げるのに使用されてもよい。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
好まれるバージョンでは、本発明の化合物は、外用製剤、たとえば、点眼剤として１日当たり約０．２μｇ〜約１ｍｇに及ぶ量で投与される。
【００１２】
さらに好まれるバージョンでは、ビタミンＤ化合物は、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（１，２５−（ＯＨ）2Ｄ3）、２−メチレン−１９−ノル−（２０Ｓ）−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3、１α，２５−ジヒドロキシ−１９−ノル−ビタミンＤ2、２−（３’−ヒドロキシプロピリデン）−１９−ノル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（Ｅ−異性体）、１７−２０デヒドロ−２−メチレン−１９−ノル−（２０Ｓ）−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（Ｅ−及びＺ−異性体）、２６−ホモ−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3、２６，２７−ジメチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3、又は２５−ヒドロキシビタミンＤ3から成る群から選択される。
【００１３】
式Ｉに係る化合物と使用のための指示書を含むキットが提供される。本発明の化合物及び方法は多数の利点を提供する。たとえば、化合物は、片方の眼を治療するだけである一方で両方の眼における高眼圧を下げるのに使用することができる。さらに、化合物は、従来の高眼圧治療に共通する重大で且つ望ましくない副作用を有さない。さらにその上、本発明の化合物は安定であり、容易に処方される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】反対の眼は治療せず片方の眼に５μＬのプロピレングリコールで１日２回の治療を５回行った後のＩＯＰの応答（平均＝８）を表す。
【図２】片方の眼に５μＬのプロピレングリコール中５μｇの１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3で、及びビヒクル（反対の眼に５μＬのプロピレングリコール）で１日２回の治療を５回行った後のＩＯＰの応答を表す。（Ａ）（平均＝８）（Ｂ）（平均＝５）
【図３】片方の眼に５μＬのプロピレングリコール中５μｇのＡＧＫで、及び反対の眼にビヒクル（５μＬのプロピレングリコール）で１日２回の治療を５回行った後のＩＯＰの応答を表す。
【図４】片方の眼に５μＬのプロピレングリコール中６μｇの２ＭＤで、及び反対の眼にビヒクル（５μＬのプロピレングリコール）で１日２回の治療を５回行った後のＩＯＰの応答を表す。
【図５】片方の眼に５μＬのプロピレングリコールを５回局所適用し、反対の眼は治療しなかったサルにおける平均血清Ｃａ2+レベル（ｎ＝４）を表す。
【図６】片方の眼に５μＬのプロピレングリコール中５μｇの１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3を局所適用し＃１〜５、反対の眼に５μＬのプロピレングリコールを局所適用したサルにおける平均血清Ｃａ2+レベル（ｎ＝８）を表す。
【図７】片方の眼に５μＬのプロピレングリコール中５μｇのＡＧＲを５回局所適用し、反対の眼に５μＬのプロピレングリコールを５回局所適用した後のサルにおける平均血清Ｃａ2+レベル（ｎ＝４）を表す。
【図８】片方の眼に５μＬのプロピレングリコール中６μｇの２ＭＤを５回局所適用し、反対の眼に５μＬのプロピレングリコールを５回局所適用した後のサルにおける平均血清Ｃａ2+レベル（ｎ＝８）を表す。
【図９Ａ】サルの眼における１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3の５回の片側局所適用の後のＩＯＰ低下の用量依存性を表す。
【図９Ｂ】異なったビタミンＤ化合物の適用後のＩＯＰ低下の比率を表す棒グラフである。
【図９Ｃ】プロピレングリコール（ＰＧ）の効果（１０％）を差し引いた後の異なったビタミンＤ化合物の適用後のＩＯＰ低下の比率を表す棒グラフである。ΔＩＯＰが負であれば、治療はＩＯＰを低下させたのであり、望ましい効果である。
【図１０】ＩＯＰの調節に関与するビタミンＤによって調節される代表的な遺伝子の発現を表す（黒棒：ラット腸細胞、白棒：マウス頭蓋冠細胞）。図１０Ａは、１，２５−（ＯＨ）2Ｄ3によって下方調節される遺伝子：ＣＡＩ：炭酸脱水素酵素Ｉ、ＡＣＥ：アンギオテンシンＩ−変換酵素、ＡＣＴＡ１：アクチンアルファ１、ＡＣＴＧ２：アクチンガンマ２、ＡＴＰ１Ａ１：Ｎａ+／Ｋ+輸送ＡＴＰ分解酵素α１ポリペプチド、ＡＱＰ１：アクアポリン、ＣＥＡＣＡＭ１：ＣＥＡ関連の細胞接着分子１、ＦＮ１：フィブロネクチン１、ＣＤ４４：ヒアルロン酸受容体又は細胞接着分子（ＣＤ４４）、及びＴＩＭＰ３：メタロプロテイナーゼ３の組織阻害剤を示す。図１０Ｂは、１，２５−（ＯＨ）2Ｄ3によって上方調節される遺伝子：ＰＧＥＲ４：プロスタグランジンＥ受容体亜型４、ＭＭＰ３、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４：マトリクスメタロプロテイナーゼ３、１１、１３、１４を示す。倍数変化は、２〜３のマイクロアレイ実験の平均である。
【図１１】０．１μｇ（三角、ｎ＝７）、１μｇ（四角、ｎ＝７）、及び５μｇ（丸、ｎ＝８）の１，２５−（ＯＨ）2Ｄ3の片側局所投与の後の正常眼圧のカニクイザルの（Ａ）対照の眼（ビヒクル、５μＬのプロピレングリコール）及び（Ｂ）ビタミンＤ（５μＬのプロピレングリコール中１，２５−（ＯＨ）2Ｄ3）で処理した眼におけるＩＯＰの変化（％；平均値±ＳＥＭ）を表す（実施例３を参照のこと）。１日目（ｄ１）での予備処理ＩＯＰは、０．１μｇのビタミンＤで処理される眼で１７．５±０．５ｍｍＨｇであり、対照の眼で１７．０±０．５ｍｍＨｇであり、１μｇのビタミンＤで処理される眼で１９±０．９ｍｍＨｇであり、対照の眼で２０．０±０．９ｍｍＨｇであり、５μｇのビタミンＤで処理される眼で１８．９±０．７ｍｍＨｇであり、対照の眼で１８．５±０．９ｍｍＨｇであった。（＃）、（＊）両側性の対応のあるｔ−検定（ｐ＜０．０５）により、それぞれ１μｇと５μｇの１，２５−（ＯＨ）2Ｄ3による処理実験における１日目のベースラインから有意差がある。ｄ＝日。
【図１２】３０分間隔で測定した時間に対してプロットした房水流出率（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝８、群Ａと群Ｂを合わせた、表２を参照のこと）を表す（最初の９０分のベースラインに関して標準化した）。白四角は正常眼圧のカニクイザルの対照の眼におけるビヒクル（プロピレングリコール）による潅流に相当し、黒丸は反対側の眼におけるビタミンＤ（プロピレングリコール中１，２５−（ＯＨ）2Ｄ3）による潅流に相当する（実施例３を参照のこと）。９０分間全体のデータを分析した場合、又は３０分の増分を分析した場合、眼の間に有意差はなかった。両側性の対応のあるｔ−検定による１．０からの有意差：＊ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
明細書及びクレームにおいて、用語「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」と「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は制限がなく、「含むが、それらに限定されない」ことを意味するように解釈されるべきである。これらの用語は、さらに限定的な用語「から本質的に成る」及び「から成る」を包含する。
【００１６】
本明細書及び添付のクレームで使用されるとき、単一形態の不定冠詞（「ａ」、「ａｎ」）及び定冠詞（「ｔｈｅ」）は、文脈が特に明瞭に指示しない限り、複数の参照を含む。同様に、用語「ａ」（又は「ａｎ」）、「１以上の」及び「少なくとも１つの」は本明細書では相互交換可能に使用することができる。用語「含むこと」、「含むこと」「特徴とする」及び「有する」は相互交換可能に使用することができることも言及される。
【００１７】
ビタミンＤ化合物について使用される略記は以下のとおりである：ＰｒＧｌはプロピレングリコールを表し、１，２５は１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（１，２５−（ＯＨ）2Ｄ3）を表し、２ＭＤは２−メチレン−１９−ノル−（２０Ｓ）１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3を表し、ＡＧＲは２−（３’−ヒドロキシプロピリデン）−１９−ノル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（Ｅ−異性体）を表し、ＢＨは２−メチレン−１９−ノル−（２０Ｓ）−１−ヒドロキシ−ビスホモプレグナカルシフェロール（２ＭｂｉｓＰ）を表し、２０Ｒ−ＭＤは２−メチレン−１９−ノル−（２０Ｓ）１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3を表し、ＺＰは１α，２５−ジヒドロキシ−１９−ノル−ビタミンＤ2（ゼンプラー又はパリカルシトール）を表し、Ｅ又はＺは１７−２０デヒドロ−２−メチレン−１９−ノル−（２０Ｓ）１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（Ｅ及びＺ−異性体）を表し、２６−Ｈｏｍｏは２６−ホモ−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3を表し、２６，２７−ジエチルは２６，２７−ジメチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3を表し、ＶｔＤ3はビタミンＤ3を表し、１α−（ＯＨ）Ｄ3は１α−ヒドロキシビタミンＤ3を表し、２５（ＯＨ）Ｄ3は２５−ヒドロキシビタミンＤ3を表す。
【００１８】
特に定義されない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語はすべて、本発明が属する当該技術の当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で具体的に言及される出版物及び特許はすべて、本発明と関連して使用されてもよい出版物で報告される化学物質、機器、統計的解析及び方法論を記載する及び開示することを含むことを目的として、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。本明細書で引用される文献はすべて当該技術の技量のレベルを示すと解釈されるべきである。以前の発明のお陰でそのような開示の日時を早めるような権利が本発明にはないという了解として解釈されるものは本明細書にはない。
【００１９】
前世紀の初頭以来、ビタミンＤは哺乳類におけるカルシウムとリンの恒常性の主な調節因子として及びくる病の予防と治療のための主な化合物として立証されている。何十年もの研究によってビタミンＤ（そのホルモン的形態、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（１，２５−（ＯＨ）2Ｄ3）は、癌、糖尿病、自己免疫疾患、高血圧症などの広いスペクトルの疾患を予防し、治療することができる[DeLuca, 2008]。しかしながら、ここで我々は初めて、ビタミンＤ（１，２５−（ＯＨ）2Ｄ3）が高眼圧を下げるための非常に強力で有望な化合物であることを示す。以下に記載するように、眼に対するビタミンＤの片側性の局所適用が治療した眼及び対照の眼双方で眼内圧を大きく下げるので、眼の房水の形成又は排出率を変えることなく、先例なく強い両側性の降圧効果を示す。
【００２０】
本発明は、患者における高眼圧（ＯＨＴ）を下げる方法であり、該方法は、少なくとも一方の眼で高い眼圧を示す対象の少なくとも一方の眼に、治療上有効量の以下の式のビタミンＤ化合物を投与することを含む。
【化３】
0005753386.tif 000004
［式中、Ｒは、次の式
【化４】
0005753386.tif 000005
｛式中、Ｒ1及びＲ2は、Ｈ、メチル若しくは３’−ヒドロキシプロピリジンであり、又は＝ＣＨ2若しくはメチレンとして一緒にされ；Ｒ3及びＲ4は、Ｈ、アルキル（１〜３の炭素）、アルコキシから選択され、互いに同一であっても異なっていてもよく；Ｘは、ヒドロキシル基又は保護されたヒドロキシル基であり；Ａが酸素であれば、そのときＲ4は存在しないという条件でＡは酸素又は炭素であり、Ｃ及びＤは、Ｈであるか又は＝ＣＨ2として一緒にされる基であって、式Ｉに係る化合物を投与すると、眼内圧は好ましくは少なくとも１５％低下するものである。｝］で示される基である。
【００２１】
「高眼圧」は、正常より高い、通常２１ｍｍＨｇを一貫して超える眼内圧を意味する。
【００２２】
「下げること」は対象の高眼圧を、眼当たり少なくとも５％、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１５〜５０％下げることを意味する。
【００２３】
対象においてＯＨＴを下げることによって、本発明の化合物及び方法は、緑内障及び高い眼内圧を示すそのほかの障害の新規の治療を提供する。本発明の目的で、「治療すること」又は「治療」は、疾患、症状又は障害と闘う目的で対象の管理及び世話を記載する。その用語は、予防的、すなわち、予防的治療及び緩和的治療の双方を包含する。治療することは、本発明の化合物を投与して症状若しくは合併症の発症を防ぐこと、症状若しくは合併症を緩和すること、又は疾患、症状若しくは障害を排除することを含む。
【００２４】
好ましい実施態様では、幾つかの方法で上述の治療の成功を評価する。通常、冒された眼（単数）又は眼（複数）の眼内圧を測定し、ＯＨＴ低下の比率を算出する[Kass, 2002]。「測定する」は、デジタル眼圧測定法（圧入法）、マクラコフの眼圧計(圧痕圧平眼圧測定法）、眼圧測定機器（圧痕圧平眼圧測定法）、ウルフ眼圧計（圧入法）、ゴールドマン眼圧計（圧平眼圧測定法）、及び／又は非接触眼圧計（圧入法）を含むが、これらに限定されない当該技術で既知のいずれかの方法を介してＩＯＰ（「眼圧測定法」）を測定することを意味する。或いは、視力の変化を直接測定してもよい。
【００２５】
「対象」は、哺乳類及び非哺乳類を意味する。「哺乳類」は、ヒト、非ヒト霊長類、たとえば、チンパンジー、そのほかの類人猿及びサルの種；家畜、たとえば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ及びブタ；愛玩動物、たとえば、ウサギ、イヌ及びネコ；ラット、マウス、及びモルモットなどを含む実験動物を含むが、これらに限定されない多数の哺乳類の部類を意味する。非哺乳類の例には、トリなどが挙げられるが、これらに限定されない。用語「対象」は特定の年齢又は性別を示さない。
【００２６】
「投与すること」は、生体、好ましくは全身性の循環にコルヒチン新配糖体を導入するための手段を意味する。例には、経口、頬内、舌下、肺内、経皮、経粘膜の投与、並びに皮下、腹腔内、静脈内及び筋肉内の注射が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
「治療上有用な量」は、疾患を治療するために対象に投与された際、疾患のそのような治療を達成するのに十分な化合物の量を意味する。「治療上有用な量」は、化合物、治療される疾患の状態、治療される重症度又は疾患、対象の年齢及び相対的な健康状態、投与の経路及び形態、主治医又は担当獣医の判断、及びそのほかの因子によって変化する。好ましい実施態様では、治療上有効な量は各眼にて高眼圧を少なくとも１０％〜５０％下げるのに十分なビタミンＤ化合物の量を意味する。少なくとも２０％ＯＨＴを下げることは緑内障のほとんどの患者で緑内障の進行を遅くする。少なくとも２０％ＯＨＴを下げることはまた、高眼圧症患者で５０％の保護利益を生じるが、視神経円板又は視野の悪化を生じない[Kass, 2002; Kanner, 2006; National Eye Institute website at www.nei.nih.gov] 。
【００２８】
「ビタミンＤ化合物」は、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（１，２５−（ＯＨ）2Ｄ3）、２−メチレン−１９−ノル−（２０Ｓ）１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（Ｅ−異性体）、１α，２５−ジヒドロキシ−１９−ノル−ビタミンＤ2、２−メチレン−１９−ノル−（２０Ｓ）−１−ヒドロキシ−ビスホモプレグナカルシフェロール、２−（３’−ヒドロキシプロピリデン）−１９−ノル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（Ｅ−異性体）、１７−２０デヒドロ−２−メチレン−１９−ノル−（２０Ｓ）１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（Ｅ及びＺ−異性体）、２６−ホモ−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3、２６，２７−ジメチル−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3、ビタミンＤ3、２５−ヒドロキシビタミンＤ3を含む上述のビタミンＤの式の化合物又は誘導体を意味する。
【００２９】
本発明はまた、治療上有効な量の以下の式のビタミンＤ化合物をリスクのある患者の少なくとも一方の眼に投与することを含む、緑内障を発症するリスクのある患者で緑内障を防ぐ方法も提供する。
［
【化５】
0005753386.tif 000006
｛式中、Ｒは、次の式
【化６】
0005753386.tif 000007
式中、Ｒ1及びＲ2は、Ｈ、メチル若しくは３’−ヒドロキシプロピリジンであり、又は＝ＣＨ2若しくはメチレンとして一緒にされ；Ｒ3及びＲ4は、Ｈ、アルキル（１〜３の炭素）、アルコキシから選択され、互いに同一であっても異なっていてもよく；Ｘは、ヒドロキシル基又は保護されたヒドロキシル基であり；Ａが酸素であれば、そのときＲ4は存在しないという条件でＡは酸素又は炭素であり、Ｃ及びＤは、Ｈであるか又は＝ＣＨ2として一緒にされる基であって、式Ｉの化合物を投与した後、対象は緑内障を発症しないものである。｝］で示される基である。
【００３０】
「緑内障」は、視神経を損傷し、視覚を損なう（失明に進行することもある）眼疾患を意味する。
【００３１】
緑内障を「発症するリスク」は、高眼圧の家族歴のある対象、又は乏しい視力、乏しいからだの健康などを含む、高眼圧のリスク因子を示す対象を意味する。
【００３２】
出願者らは、一方の眼の治療の結果が両側性のＩＯＰの応答であることに言及する。従って、治療は両方の眼でも一方いずれかの眼でもよく、結果的にＯＨＴの奏功する治療を生じる。たとえば、ＯＨＴを示す第１の眼のいずれかを治療することによって、又は場合によっては第２の眼だけを治療することによって第１の眼のＯＨＴが低下してもよい。好ましい方法では、ＯＨＴを示す目を本発明の化合物で治療して少なくとも１０％ＯＨＴを低下させる。
【００３３】
しかしながら、第１の眼がＯＨＴを呈しているが、本発明の化合物によるその眼の直接的な治療ができない（たとえば、眼がしっかり包帯されて点眼剤を受け取れない）場合、本発明の化合物によって第２の眼（ＯＨＴを呈していてもよいし、呈していなくてもよい）を治療することによって第１の眼におけるＯＨＴを下げてもよい。治療されていない第１の眼におけるＯＨＴは通常、治療された眼に比べてＯＨＴでおよそ２０％少ない低下を経験する。当業者は、治療を提供してこの両側性の応答を補償するやり方を理解するであろう。
【００３４】
（投与及び用量）
【００３５】
本発明の組成物は眼自体の症状又は眼を取り囲む組織を治療的に処理することが意図される。本発明の組成物は、治療上活性のある量で、普通、１日当たり約０．２μｇ〜１ｍｇ、好ましくは１日当たり５μｇ、最も好ましくは１０μｇ（±１０％）に及ぶ量で本発明の局所送達方式に組み込まれてもよい。
【００３６】
組成物を毎日患者に適用してもよい。好まれる実施態様の１つでは、組成物は、直接治療される各眼について１日に１〜２回患者に適用されてもよい。治療上有効な量で眼の表面全体に組成物を適用してもよく、本発明の組成物が投与される患者の、たとえば、年齢及び身体全体の健康状態に左右される正確な量が考慮されなければならない。従って、１０歳未満の患者が、さらに年取った患者に使用されるものより少なくてもよい本発明のビタミンＤ化合物の濃度で治療されるであろう。熟練した主治医は濃度におけるこれらの変動を容易に調整することができる。内科医の技量と組み合わせた場合本明細書で設定される詳細は、内科医が特定の患者について治療投薬計画を最大化するのを容易に可能にするであろう。
【００３７】
ほかの薬物を眼に投与する既知の手段によって本発明の組成物を眼に投与することができる。たとえば、好適に処方された組成物を点眼剤の形態で又は眼内挿入物と共に投与することができる。好適な処方はまた、生理学的に眼に許容できる標準の眼用ビヒクルを組み入れる。そのようなビヒクルは、所望のような溶液又は軟膏であることができる。さらに、本発明の組成物は、当該技術で周知の非活性の眼科的に許容可能なキャリアと共に、又は眼のほかの症状、たとえば、感染、アレルギー又は炎症の治療が処方されるそのほかの活性のある薬物と共に単位投与量形態で処方することができる。
【００３８】
用語「単位投与量形態」は、本明細書で使用されるとき、ヒト及び動物の対象について単位の投与量として好適な物理的に分離した単位を指し、各単位は必要とされる医薬用の希釈剤、キャリア又はビヒクルと共同して所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の有効物質を含有する。本発明の新規の単位投与量形態は、（ａ）有効物質の独特の特徴及び達成されるべき治療効果と、（ｂ）ヒトでの治療的使用についてそのような有効物質を配合する技術に特有の限界によって決定付けられ、直接左右される。本発明に係る好適な単位投与量形態の例は、錠剤、カプセル、眼内挿入物、液滴、前述のいずれかの分離した複数、及び当該技術で既知のようなそのほかの形態である。本発明の組成物は、それ自体当該技術で利用可能であり、確立された手順で容易に調製することができる医薬物質の採用によって容易に調製されてもよい。
【００３９】
本発明の組成物は点眼剤としてのさらなる処方なしで眼に適用されてもよい。本発明の組成物は、局所適用のための薬学上許容可能なキャリアと一緒に溶液、軟膏、クリーム、ジェル、スプレー又はそのほかの形態にて製剤化されてもよい。本発明の組成物は、外用医薬剤としてさらに製剤化することなく、希釈された形態又は濃縮された形態のいずれかで単独で適用されてもよい。本発明の組成物と保存剤を含有するが、実質的な濃度の濃厚剤を含まない溶液、すなわち、希釈された水性製剤はエアゾールポンプによって冒された表面にスプレーすることができる。この種の送達は、広い範囲を治療するのに、又は点眼剤の投与に問題を有する対象に使用するのに価値がある。
【００４０】
本発明の組成物はまた、抗生剤、抗真菌剤及びそのほかの抗ウイルス化合物を含む抗微生物剤を含有する医薬製剤で使用されてもよく、それは、基本的組成物の活性を補足してもよく、又は補完してもよい。好適な抗生剤には、テトラサイクリン、ポリミキシンＢ，又は局所組成物で使用されるそのほかの一般的な抗生剤、特に店頭販売の製剤が挙げられる。有用な抗真菌剤の例には、トルナフテート及びミカチンが挙げられる。抗ウイルス剤の例には、天然の又は組換えのインターフェロン、同様にヌクレオシド類似体、たとえば、アシクロビルが挙げられる。カンファーやメントールのような逆刺激剤、ベンジルアルコール、レゾシノール及びフェノールのような乾燥剤、硫酸亜鉛やタンニン酸のような収斂剤も、たとえば、皮膚軟化剤、保存剤、抗酸化剤、着色添加剤、潤滑剤又は保湿剤のようなそのほかの種類の作用剤ができるように、組成物に添加することができる。
【００４１】
ほとんど相対的に不活性の局所キャリアにて本発明の組成物を調製してもよい。一般に組成物は、本発明の生理学的に活性のある化合物を効果的に保持することが可能である幾つかの形態、たとえば、ポリマー、ヒドロゲル、クリーム、ゲル、軟膏、ワックス及び／又は溶液を必要とすればよい。これらの製剤のそれぞれは、微生物増殖阻害剤（保存剤）及び上述のそのほかの添加剤と同様に本発明の組成物を含有する。そのようなキャリアの多くは日常的に使用され、標準の医薬教科書を参照して入手することができる。例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコールコポリマー、及び一部の水溶性ゲルが挙げられる。好まれるキャリアは乳化したクリームであるが、そのほかのキャリア、たとえば、その中で本発明の組成物が分散可能であるワセリン又は鉱油をベースにした軟膏を代用することができる。
【００４２】
本発明の組成物及び安定剤を含有するゲル、すなわち、濃厚にした水性ポリマー又はアルコール溶液は透明であってもよく、及び／又は好適な染料で着色してもよい。好適な濃厚剤には、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン又はポリアクリル酸塩が挙げられてもよい。ヒドロゲルを用いて、本発明の生理学的に活性のある化合物の徐放を眼に提供してもよい[Eremeev, 2006]。
【００４３】
本発明の実践で採用される軟膏は、従来のビヒクルと共に既知の医薬技法を利用して調製されてもよい。たとえば、親水性又は疎水性の軟膏がキャリアとして採用されてもよい。しかしながら、炭化水素とワックス誘導体に基づいたワセリンゼリーのような疎水性の軟膏は、皮膚への浸透を遅らせる可能性があるので、親水性の軟膏ほど有効でなくてもよい。従って、プロピレングリコール、ポリアルキレングリコール及びポリエチレングリコールコポリマーに基づくもののような親水性軟膏が軟膏製剤として好まれる。プロピレングリコールは基剤としてポリエチレングリコールより好ましい。ワックス製剤は、簡単な適用が主な目的である場合、場合によっては採用されてもよい。
【００４４】
そのほかの好適な方法にて本発明の組成物を製剤化することができる。たとえば、ジクロフェナックナトリウムを溶解し、塩化ナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及び界面活性剤を含有する調製物に無菌濾過によって加える。次いでこの混合物を既知の技法によって、たとえば、水酸化ナトリウムの添加によって適当なｐＨに調整してもよい。ほかの方法は当業者に明らかであろう。
【００４５】
本発明の組成物は、界面活性剤、及び所望であれば、追加の薬物、緩衝液、抗酸化剤、等張化調整剤、保存剤、濃厚剤又は粘度改変剤などを含む補助剤も含有してもよい。製剤における添加剤には望ましくは、塩化ナトリウム、ＥＤＴＡ（二ナトリウム、エデト酸塩）、及び／又はＢＡＫ（塩化ベンザルコニウム）又はソルビン酸が挙げられてもよい。追加の添加剤には、抗酸化剤、芳香剤、着色剤、水、保存剤（抗酸化剤又は抗微生物剤）、潤滑剤、保湿剤又は乾燥剤が挙げられてもよい。
【００４６】
水性懸濁液として組成物が製剤化されてもよい。一般に、局所の眼科投与に好適な水性懸濁液は、当業者に精通した技法に従って製剤化され、投与されてもよい。仕上げた懸濁液は、光暴露からそれらを保護するために不透明又は茶色の容器にて、不活性の雰囲気下で好ましくは保存される。これらの水性懸濁液は、保存剤を含まない、単回用量の再び密栓できない容器にて包装することができる。これによって、液滴又はリボンとして眼に送達されるべき単回用量の薬物が可能になり、次いで使用後、容器を捨てる。そのような容器は、特に水銀の保存剤を含有する眼科薬物から生じるのが認められているような、角膜上皮の保存剤に関連する刺激及び感作の可能性を排除する。所望であれば、特に本発明の水性懸濁液の相対的に低い粘度によって必要に応じて１日何度でも眼に一滴ずつ投与される一定で正確な投与量が可能になるので、複数回用量の容器も使用することができる。
【００４７】
本発明の水性懸濁液は、眼への投与の前にそれが有していた眼における同一の粘度又は実質的に同一の粘度をそれが保持するように製剤化することができる。或いは、本発明の懸濁液は、涙液と接触した際、高いゲル化があるように製剤化することができる。たとえば、ＤＵＲＡＳＩＴＥ（商標）は、より低いｐＨで眼に投与すると、涙に接触してＤＵＲＡＳＩＴＥ（商標）システムは膨潤する。このゲル化又はゲル化の増大が懸濁された薬剤粒子の取り込みをもたらし、それによって眼における組成物の残留時間を延ばす。
【００４８】
本発明に従って使用される水溶液は、たとえば、レミングトンの薬学科学（第１４版、マックパブリッシング社）の第８３章に述べられた手順に従って製剤化してもよい。そのような眼科溶液は無菌であり、使用中、無菌性を維持するために細菌学的な保存剤を含有してもよい。たとえば、塩化ベンザルコニウムのような四級アンモニウム静菌剤がこの目的に申し分ない。所望であれば、抗酸化剤も用いてもよい。例証として、好適な抗酸化剤には、重硫酸ナトリウム、Ｎ−アセチルシステイン塩、アスコルビン酸ナトリウム、及び薬学技術で既知のそのほかの水溶性の眼科的に許容可能な抗酸化剤が挙げられる。
【００４９】
実施態様の１つでは、本発明の組成物は不溶性のポリマーを組み入れて、時間をかけて放出するゲル又は液状の滴を提供する組成物は、懸濁剤として水溶性のポリマー又は水不溶性のポリマーを含有してもよい。そのような可溶性ポリマーの例は、ヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロース性ポリマーである。水不溶性のポリマーは好ましくは架橋されたカルボキシビニルポリマーである。ポリマーは、懸濁液の総重量を基にして約０．１〜約６．５重量％、さらに好ましくは約１．０〜約１．３重量％の架橋されたカルボキシビニルポリマーを含んでもよい。本発明での使用及びそれらを製作する方法に好適なカルボキシ含有のポリマーは、参照によって本明細書に組み入れられ、信頼される、Ｄａｖｉｓらに対する米国特許第５，１９２，５３５号に記載されている。これらポリマーのキャリアには、軽く架橋したカルボキシ含有ポリマー（たとえば、ポリカルボフィル）、デキストラン、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール４００、及びそのほかのポリマー性の粘滑剤、たとえば、ポリビニルピロリドン、多糖類ゲル及びＧＥＬＲＩＴＥ（商標）が挙げられる。ポリカルボフィルを含有する、たとえば、ＤＵＲＡＳＩＴＥ（商標）のようなカルボキシ含有ポリマー方式、制御された速度で薬剤を放出する徐放性の局所眼科送達方式も使用してもよい。
【００５０】
本発明の水性混合物は、水性懸濁液の総重量を基にして約０．１〜約６．５重量％、好ましくは約０．５〜約４．５重量％に及ぶ量の懸濁された軽く架橋したポリマー粒子も含有してもよい。それらは、生理学的に又は眼科学的に有害な構成成分を有さない純水、無菌水、好ましくは脱イオン水又は蒸留水を用いて調製し、生理学的に及び眼科学的に許容できるｐＨ調整用の酸、塩基、又は緩衝液、たとえば、酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸、塩酸などのような酸、水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、ＴＨＡＭ（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）などのような塩基、及びクエン酸／デキストロース、重炭酸ナトリウム、塩化アンモニウム、及び前述の酸と塩基の混合物のような塩及び緩衝液を用いて、約４．０〜約６．８、好ましくは約５．５〜約６．５のｐＨに調整する。
【００５１】
水性懸濁液を製剤化する場合、適当な量の生理学的に及び眼科学的に許容できる塩を用いて浸透圧を約１０ミリオスモル（ｍＯＳＭ）〜約４０ｍＯＳＭに調整してもよい。塩化ナトリウムは、近似生理的流体よりも好まれ、塩化ナトリウムの量は、水性懸濁液の総重量を基にして約０．０１〜約１重量％、好ましくは約０．０５〜約０．４５重量％に及び、上述の範囲内での浸透圧を与える。カチオン、たとえば、カリウム、アンモニウムなど及びアニオン、たとえば、塩化物、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩、重炭酸塩、硫酸塩、重硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなどで構成される１以上の塩の相当の量を塩化ナトリウムに加えて又はその代わりに加えて、上述の範囲内での浸透圧を達成する。糖、たとえば、マンニトール、デキストロース、グルコース、又はそのほかのポリオールを加えて浸透圧を調整してもよい。
【００５２】
上述の範囲内から選択される不溶性の軽く架橋したポリマー粒子の量とｐＨと浸透圧は、互いに相関し、２５番のスピンドルと１３Ｒの小型試料アダプタを備えたブルックフィールドデジタルＬＶＴ粘度計を１２ｒｐｍで用いて室温（２５℃）で測定したとき、約５００〜約１００，０００センチポイズ、好ましくは約５，０００〜約３０，０００又は約５，０００〜約２０，０００センチポイズに及ぶ粘度を有する水性懸濁液を得る架橋の程度と相関する。本発明の処方は、選択される投与経路に適合する粘度を有するべきである。約３０，０００＝液滴までの粘度。約３０，０００〜約１００，０００センチポイズがリボン形態での眼科投与に有利な粘度の範囲である。たとえば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースのような水溶性ポリマーを使用する場合、粘度は通常、約１０〜約４００センチポイズ、さらに通常では約１０〜約２００センチポイズ又は約１０〜約２５センチポイズである。
【００５３】
（キット）
【００５４】
本発明の代替の実施態様では、本発明を実施するためのキットが提供される。実施態様の１つでは、キットは本発明に係るビタミンＤ化合物と使用のための指示書を含む。
【００５５】
好ましい実施態様では、キットは、本発明に係る少なくとも１種のビタミンＤ化合物の粉状化形態を含み、その際、粉状化ビタミンＤ化合物は、たとえば、二重シリンジ装置にて即時の使用のためにユーザーによって水和され、迅速にゲル化する前駆体の液体を形成する。任意で、キットはビタミンＤを溶解するための溶液を含有してもよい。
【００５６】
代替の実施態様では、キットは、生理的条件で使用するために製剤化され、送達され、保存された本発明に係る少なくとも１種のビタミンＤ化合物を含む。
【００５７】
「使用のための指示書」は、本明細書で述べられる目的の１つのために本発明の有用性を伝達するのに使用される出版物、記録、又は表現のそのほかの媒体を意味する。キットの教材は、たとえば、本発明を含有する容器に添付され、又は本発明を含有する容器と一緒に発送される。或いは、教材は容器と別に発送することができ、又は教材と生体適合性のヒドロゲルが受け取り手によって共同して使用されるという意図をもってインターネットのウエブサイトにて電子的にアクセス可能な形態で提供することができる。
【００５８】
以下の実施例は当然、説明目的のみで提供され、本発明の範囲を限定することを決して意図するものではない。実際、前述の説明及び以下の実施例から、本明細書で示し、記載されたものに加えた本発明の種々の改変が当業者に明らかになるであろうし、それらは添付のクレームの範囲内に入る。
【実施例】
【００５９】
以下に記載される実施例は、本発明のビタミンＤ化合物が、眼内圧（ＩＯＰ）を下げ、それに罹った対象において高眼圧（ＯＨＴ）を下げることができることを示す。これらの実施例は、緑内障のような障害を治療する及び予防するためのビタミンＤ化合物のさらなる開発のための基礎を提供する。ビタミンＤが内因的に合成される「マジック丸薬」であり、又は「サンシャイン」ビタミンが多数の疾患を予防し、治療することができることを考えると、高眼圧症及び緑内障の治療へのその使用はそのほかの肯定的な、有益な副作用を提供してもよい。
【００６０】
（実施例１）
【００６１】
１，２５（ＯＨ）2Ｄ3、ＡＧＲ及び２ＭＤによるＯＨＴの治療
【００６２】
以下の実施例は、霊長類の眼内圧を下げることによってＯＨＴを下げるのに使用される化合物と方法を開示する。
【００６３】
（材料及び方法）
【００６４】
１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（１，２５（ＯＨ）2Ｄ3）、ＡＧＲ及び２ＭＤの化合物は、純度≧９８％だった。
【００６５】
（動物、麻酔）
【００６６】
ＩＯＰと局所点眼投与のために、いずれかの性別の体重３〜７ｋｇの正常眼圧成熟カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）をケタミンＨＣｌ（３〜２５ｍｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇで補完した）のｉ．ｍ．によって麻酔した。サルはすべて測定時のスリットランプ生体顕微鏡によって眼の異常はなかった。サルはウィスコンシン−マジソン大学の霊長類センターから提供された。実験はすべて、眼科及び視覚の研究における動物の使用に関するＡＲＶＯの声明に従って行った。
【００６７】
（処理及びＩＯＰの測定）
【００６８】
涙液層の指標としてＨＡＬＦ−ＡＮＤ−ＨＡＬＦ（商標）のクリーム溶液（ボーデン）を用いた小型化したゴールドマン圧平眼圧計によって、サルを頭ホルダーに入れて寝かし、眼を心臓より４〜８ｃｍ上に位置させて眼内圧（ＩＯＰ）を測定した。各プロトコールの最初のＩＯＰ測定の前にスリットランプですべてのサルを調べた。各眼についてＩＯＰを２又は３回測定して、ベースラインとして平均した。
【００６９】
ケタミン（ＫＥＴＡＪＥＣＴ(商標）、ミズーリ州、セントジョセフのフェニックス・ファーマシューティカル、ｉ．ｍ．にて３〜２５ｍｇ／ｋｇ、必要に応じて１〜１０ｍｇ／ｋｇで補完した）の麻酔下で、普通７：３０〜９ａｍの間にベースラインＩＯＰを測定した（５分離して２回読み取り；ＩＯＰのベースラインの測定値が互いの２〜３ｍｍＨｇの範囲内でなければ、５分後に３回目の読み取りを行った）。ベースラインＩＯＰは可能であれば、少なくとも１５ｍｍＨｇであった。ベースラインの血液試料は、大腿動脈又は静脈、又は時には上腕静脈（１〜２ｍＬ）から取った。これを凝固させ、遠心して（３０００ｒｐｍ、１０分間、Ｄｅｍｏｎ／ＩＥＣ  ＮＨ−ＳＩＩ遠心分離機）、血清を取り出し、１週間以内で−２０℃にて凍結した。腕又は脚に巻いたカフからのＤｉｎａｍａｐモニターによってベースラインの収縮期、拡張期及び平均の動脈圧、並びに心拍数を記録した。
【００７０】
ベースラインの測定後、眼を上に向けてサルを仰臥させ、瞼を開いたままにした。５μＬの試験物質又はビヒクルの液滴を相対する眼に送達した。瞼を少なくとも３０秒間開いたままにし、さらに３０秒間、眼を上の位置に維持させた。次いでサルをケージに戻し、覚醒させた。午後、朝の処理から少なくとも６時間後、別の処理を投与した。第２日目に午前と午後、投与を繰り返した。
【００７１】
５回目の処理の前、第３日目に、ベースラインのＩＯＰ、生体顕微鏡法及びＭＡＰを決定した。予備試験は、これらの処理の後効果は認められるが、単一の処理後では認められないことを示した。５回目の投与に続いて、１、２、３、４、５、６、７、８、１２（できれば）、２４時間及び時に４８時間にてＩＯＰを測定した。生体顕微鏡法は１、３、６、２４時間及び時に４８時間にて実施した。３日目のＭＡＰ（一部のプロトコール）は、１、２、３、４、５、６、７、８、２４時間及び時にできれば４８時間にて測定した。５回目の処理の後、血液試料を６、２４時間及び時には４８時間にて採取した。一部のプロトコールについては、各処理の前にもＩＯＰを測定し、朝の処理の前にＭＡＰを測定し、午後の処理の前に血液を採取した。その後のスクリーニングのプロトコールはＭＡＰ及び採血を含まず、ベースライン及び５回目の処理の前、と５回目の処理後１〜６時間にＩＯＰを測定するだけである。
【００７２】
（データの解析）
【００７３】
応答の信頼できる定量的な、統計的に試験できる推定値を得るために、任意の薬剤用量についておよそ８〜１０回の実験が必要とされることを我々は経験的に見つけ出した。本式の試料サイズの算出は、以下で記載されるようにこの印象を確証している。一般的に言えば、我々は、ベースライン値（非薬剤について調整される、又は非刺激に関連するベースラインの浮動）の＞２５％である平均の生理的応答及び＞１．５％の平均応答のＳＤを同定したかった。試料サイズの算出には以下の標準的な方程式を用いた：Ｎ＝２（Ｚα＋Ｚβ）2／δ／σ）2、式中、それぞれ片側及び両側の５％の有意性についてＺα＝１．６４５又は１．９６０、それぞれ８０％及び９０％の検出力についてＺβ＝０．８４又は１．２８２、パラメータの測定におけるδは集団の標準偏差であり、σは差（すなわち、応答）である（δとσは同じ単位を有さなければならない）。その方程式から、８０％の検出力で片側５％の有意レベルでの対応のある検定で１．５標準偏差の差異を検出するには５．５回の実験が必要とされる一方で、９０％の検出力で両側５％の有意レベルでのそのような差異を検出するには９．３回の実験を必要とすることが分かった。
【００７４】
データは平均値±ｓ．ｅ．ｍ．で表す。１．０に比べた比又は０．０に比べた差異についての両側性の対応のあるｔ検定によって有意性を判定した。
【００７５】
（結果）
【００７６】
（眼圧降下剤としてのビタミンＤ化合物(図１）)
【００７７】
ＩＯＰに対するプロピレングリコールビヒクルのみの効果を処理していない反対側の眼にて昼間のＩＯＰと比較した。最初の処理に先立って、処理眼と対照眼のベースラインＩＯＰはそれぞれ１８．８±１．２ｍｍＨｇと１９．３±１．３ｍｍＨｇであった（ｎ＝８）。５回目の処理に先立って、ベースラインと比較したいずれかの眼にＩＯＰの差異はなかった。５回目の処理後、双方の眼で次の８時間にわたってＩＯＰは４〜１５％徐々に低下した。処理眼のＩＯＰはほぼすべての時点で一貫しているが、有意ではなく対照眼より低かった。ＩＯＰの昼間の低下は以前報告されている[Gabelt, 1994]。どの時点においても眼の炎症はなかった。
【００７８】
（１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（図２Ａと２Ｂ））
【００７９】
最初の処理に先立って、処理眼と対照眼のベースラインＩＯＰはそれぞれ１８．９±０．７ｍｍＨｇと１８．５±０．９ｍｍＨｇであった（ｎ＝８）。５回目の処理に先立って、処理眼と対照眼の双方におけるＩＯＰはおよそ３〜４ｍｍＨｇ（約１７％、ｐ＜０．０５、ｎ＝８）ベースラインより低かった。５回目の処理後、１〜４時間、さらに１〜２ｍｍＨｇ（約２０〜３０％の全体的な低下、ｐ＜０．０２）低下し続けたが、その後２４〜４８時間でベースラインに徐々に戻った。処理眼のＩＯＰはほぼすべての時点で一貫しているが、有意ではなく対照眼より低かった。どの時点においても眼の炎症はなかった。
【００８０】
（ＡＧＲ（図３））
【００８１】
最初の処理に先立って、処理眼と対照眼のベースラインＩＯＰはそれぞれ１６．５±１．３ｍｍＨｇと１５．９±１．６ｍｍＨｇであった（ｎ＝４）。５回目の処理に先立って、処理眼と対照眼の双方においてＩＯＰはベースラインと差異はなかった。５回目の処理後、３時間の時点を除いて、ＩＯＰは処理眼において有意に低下しなかった。対照眼でのＩＯＰに変化はなく、どの時点でも眼間に差異はなかった。どの時点においても眼の炎症はなかった。
【００８２】
（２ＭＤ（図４））
【００８３】
最初の処理に先立って、処理眼と対照眼のベースラインＩＯＰはそれぞれ１８．９±１．０ｍｍＨｇと１８．８±０．８ｍｍＨｇであった（ｎ＝８）。５回目の処理に先立って、処理眼と対照眼の双方においてＩＯＰはベースラインと差異はなかった。５回目の処理後、ビヒクルのみで見られた昼間の低下に類似して次の８時間かけてＩＯＰは徐々に低下した。６時間と７時間で小さな薬剤効果があった。どの時点においても眼の炎症はなかった。
【００８４】
（ビタミンＤ化合物の眼局所適用後の血清Ｃａ2+レベル）
【００８５】
処理後血清Ｃａ2+レベルの有意な上昇がなかったということ(図５〜８）は、ビタミンＤ化合物がおそらく全身性の循環には入らないことを示している。
【００８６】
（考察）
【００８７】
サルにおいてプロピレングリコール（ビヒクル）はＩＯＰを変化させなかった。同一用量で適用されたビタミンＤ3化合物：５回の単眼局所処理（１日当たり１０μｇで２回局所処理）は、化合物の構造（１，２５（ＯＨ）2Ｄ3＞２ＭＤ＞ＡＧＲ）によって眼の降圧効果を示した。さらに強い応答（４０％までのＩＯＰの低下）は１，２５（ＯＨ）2Ｄ3について見られた。ＩＯＰの低下は両側性であり、又は一方の眼の処理は未知のメカニズムによって反対側の対側性の眼におけるＩＯＰの低下を引き起こす。
【００８８】
片側性の局所投与１，２５（ＯＨ）2Ｄ3に続く両側性のＩＯＰを低下する応答は、全身性の吸収又はサルが眼をこすることによる対側性の眼への移動のためであってもよい。投与された体積は小さく（５μＬ）ても１，２５（ＯＨ）2Ｄ3の用量は非常に高いので、全身性の吸収による移動は可能である。ＩＯＰ実験が行われている間、この投与に続く全時間、サルは麻酔されていたので５回目の投与後の効果を説明できないが、こすることによってサルが物質を反対の眼に移すことも可能である。いずれの化合物の投与も５回の投与の後、血清Ｃａ2+レベルが有意に上昇しなかったという事実（図６〜８）は、ビタミンＤ3化合物が体系に入ることに反論する。ビタミンＤ3化合物は脂溶性が高いので、能血管関門を貫通する可能性があり、ＣＮＳを介したそのほかの幾つかの化合物で提案されているように[Gabelt, 1994]、未だ特定されていない中枢のメカニズムによってＩＯＰの効果に介在する可能性がある。別の可能性は、眼の中での求心性から遠心性のメカニズムである。さらに低い用量の１，２５（ＯＨ）2Ｄ3を調べることがこれらの可能性を解明するのに役立ってもよい。
【００８９】
眼内圧に対する局所投与されたβ−遮断剤の対側性の効果は、１，６３６人の対象を伴った高眼圧治療試験（ＯＨＴＳ）においてさらに確認された。局所適用されたβ−遮断剤の対側性の効果のメカニズムに関する最も広く受け入れられている理論は、主として鼻涙粘膜を介したβ−遮断剤の全身性の吸収が結果的に、血流を介した対側性の眼へのβ−遮断剤の移動を生じるというものである。或いは、全身性の吸収が結果的に、対側性の眼における眼内圧に対する中枢が介在する効果を生じてもよい。対側性の効果の大きさと最も強く相関する因子は、処理眼におけるＩＯＰ低下の大きさである。治療効果が大きければ大きいほど、対側性の眼におけるＩＯＰの低下も大きい。従って、対側性の眼を「対照」として利用すると、治療効果を過少評価する可能性がある。
【００９０】
２番目に最も影響を及ぼす因子は対側性の眼におけるベースラインＩＯＰであった。対側性の眼のベースラインＩＯＰが高ければ高いほど対側性の眼におけるＩＯＰの低下は大きく、このことは再び、対側性の眼を「対照」として利用すると、結果的に治療効果の過少評価を生じることになる[Piltz, 2000]。試験眼に入れられた薬物による未処理眼の汚染も示唆されている。あまり広く保持されてはいない別の仮説は、一方の眼の眼内圧の変化が結果的に隣の眼において反射的な眼内圧の変化を生じる同感性眼内反応である[Piltz, 2000]。
【００９１】
同じ場合では、対側性のＩＯＰの応答は、部分的に中枢神経系における効果が介在する。放射性標識した８−ヒドロキシ−２−ジプロピルアミノテトラリンの局所投与で示されたように、対側性の眼に対する全身性循環を介した薬剤の再分布は最小であり、それは、対側性の眼圧降下反応の理由としての薬剤の再分布に反論する[Chidlow, 1999]。７−ヒドロキシ−２−ジプロピルアミノテトラリン（７−ＯＨ−ＤＰＡＴ）、ドーパミンＤ3嗜好性受容体作動薬の局所、片側性の適用は、用量依存性に両側性に眼内圧（ＩＯＰ）を下げた。７−ＯＨ−ＤＰＡＴのＤ3受容体が介在する作用の主な部位は、ウサギの毛様体における節後交感神経末端に位置する。末梢交感神経系の活性の抑制は、７−ＯＨ−ＤＰＡＴによる房水の流れの抑制に役割を担っている[Chu, 2000]。
【００９２】
対側性の応答はまた、緑内障患者の治療における選択的レーザー線維柱帯形成術の後にも認められた。
【００９３】
（実施例２）
【００９４】
ビタミンＤ化合物による処理に続くＩＯＰの低下の測定
【００９５】
サルの処理及び眼内圧（ＩＯＰ）の測定
【００９６】
いずれかの性別の成熟カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）をケタミンＨＣｌ（最初１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇで補完）の筋肉内注射で麻酔した。涙液層の指標として用いたクリームと共にゴールドマン圧平眼圧計[Kaufman, 1980]によってベースラインの予備処理ＩＯＰを測定した[Croft, 1997]。２つのベースラインＩＯＰ測定を５分離して取った。次いで、プロピレングリコール中の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（１，２５（ＯＨ）2Ｄ3）（０．１〜５μｇ）を一方の眼に、ビヒクル（プロピレングリコール）を反対の眼に１日２回、５回の処理についてサルを局所処理した。１分離して液滴を角膜の真ん中に投与する一方で、サルを仰臥位に置き、液滴後少なくとも３０秒間その瞼を開いたままにした。午後の処理に先立ってＩＯＰを測定した。第３日目に、午前の処理に先立ってＩＯＰを測定した。５回目の処理の後、ＩＯＰを８時間にわたって１時間ごとに、及び１２、２４と４８時間に測定した。最初のＩＯＰ測定に先立って、及び３時間と６時間（適宜２４、４８時間）にスリットランプの検査（生体顕微鏡的細胞又は炎症の存在を判定する）を行った。生体顕微鏡法を１回目と５回目の処理に先立って及び５回目の処理後３時間と６時間に行った。試験間でサルを少なくとも２週間休息させた。各処理群に８匹のサルがいた。
【００９７】
図９Ｂ及び９Ｃは、サルの眼における５回の局所片側性適用の結果としての異なったビタミンＤ化合物の最大眼圧降下効果（ＩＯＰ低下の比率として）の要約を示す。ほとんどの化合物は４匹のサルの群で調べた。群におけるサルの数が異なる場合、棒グラフの横に位置するボックスでそれを示す。一部の化合物は２つの棒グラフで表すが、１つは群で使用したサルすべてについてであり、第２の棒グラフは、元々低いＩＯＰを有した又は実験中何かよくないものを有したサルを排除した後、表される（再び、群の数を棒グラフの横のボックスに示す）。
【００９８】
（実施例３）
【００９９】
房水の動態を変えることなく眼内圧を下げること
【０１００】
（材料及び方法）
【０１０１】
動物実験はすべて、ウィスコンシン大学ＩＡＣＵＣ及び米国国立衛生研究所の指針、及び眼科と視覚の研究における動物の使用に関するＡＲＶＯ声明に従って実施した。
【０１０２】
（動物及び餌）
【０１０３】
オスのスプラーグ・ドーリー系の離乳したばかりのラットをハーラン（インディアナ州、インディアナポリス）から入手し、０．４７％のカルシウム及び０．３％のリン（Ｐｉ）を含有し、１週間に３回、０．１ｍＬの大豆油中の５００μｇのＤＬ−α−トコフェロール、６０μｇのメナヂオン、及び４０μｇのβ−カロテンで補完した高度に精製したビタミンＤ欠乏食で維持した（ＡＥＫ）[Suda, 1970]。ラットは、吊り下げ式のワイヤケージに収容し、１２時間の明暗サイクルで維持した。ビタミンＤ欠乏食を食べさせたラットは白色光の部屋で維持し、紫外線とビタミンＤの可能な供給源をすべて排除した。１４週齢にて血清カルシウム濃度を測定するために尾から採血した。重度の低カルシウム血症を用いてビタミンＤ欠乏を確認した。
【０１０４】
（動物及び麻酔）
【０１０５】
ＩＯＰ、局所液滴投与及び房水の流れの測定のために、いずれかの性別の体重３〜７ｋｇの正常眼圧の成熟カニクイザルをケタミンＨＣｌ（３〜２５ｍｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇで補完）のｉ．ｍ．で麻酔した。測定時、サルはすべて、スリットランプ生体顕微鏡法による眼の異常はなかった。房水流出率の測定については、ケタミンのｉ．ｍ．誘導に続いて動物にナトリウムペントバルビタール（１５ｍｇ／ｋｇ、５〜１０ｍｇ／ｋｇで補完）の静注を行った。
【０１０６】
（血清カルシウムの分析）
【０１０７】
ラットの血液試料は尾動脈から得た。サルの血液試料は大腿動脈から得た。２５℃にて１１００ｇで１５分間、全血を遠心して血清を得た。血清カルシウム濃度は、３１１０原子吸光分光光度計（コネチカット州、ノーウォークのパーキンエルマー）を用いて、１ｇ／ＬのＬａＣｌ3(Halloran and DeLuca, 1981)で１：４０に希釈した血清で測定した。
【０１０８】
（ラットのマイクロアレイ試験の実験設計）
【０１０９】
ビタミンＤ欠乏ラットに、エタノールに溶解した体重ｋｇ当たり７３０ｎｇの１，２５（ＯＨ）2Ｄ3又はエタノール（対照）を一気に静注した。ラットをイソフルオランで麻酔し、投与又はビヒクルの注射後、１、３、６、１０及び２４時間に断頭した。各時点の各群にラットは３匹いた。その際、血清カルシウム濃度の変化を判定するために採血を行った。各ラットについて、始めの１５ｃｍの腸（十二指腸）を取り出し、縦方向に細かく切り、スライドグラスにこすり付けた。２％のβ−メルカプトエタノール（ＰｏｌｙＡＴｒａｃｔシステム、ウィスコンシン州、マジソンのプロメガ社）で補完したＧＴＣ抽出緩衝液と共に粘膜をバイアルに入れ、ＰｏｗｅｒＧｅｎ７００（ペンシルベニア州、ピッツバーグのフィッシャーサイエンティフィック）による高速でホモジネートし、液体窒素で瞬間凍結し、−８０℃に保存した。実験は二つ組で行った。
【０１１０】
（ラットのｍＲＮＡの調製）
【０１１１】
各時点で、１，２５（ＯＨ）2Ｄ3処理した３匹のラット又はビヒクル処理した３匹のラットのプールしたホモジネート粘膜からポリ（Ａ+）ＲＮＡを単離した。ＰｏｌｙＡＴｒａｃｔシステム（ウィスコンシン州、マジソンのプロメガ社）を用いてｍＲＮＡを単離した。ＲＮｅａｓｙキット（カリフォルニア州、チャッツワースのキアゲン）を用いてｍＲＮＡを精製した。アガロースゲル電気泳動、ＵＶ吸収分光光度計によって、及びアギレントバイオアナライザー２１００（カリフォルニア州、パロアルトのアギレントテクノロジーズ）の使用によって、ポリ（Ａ+）ＲＮＡの質、整合性及び量を判定した。
【０１１２】
（マウスのマイクロアレイ試験のための実験設計とＲＮＡの調製）
【０１１３】
マウス胎児の一次頭蓋冠細胞を単離し、記載されたように[Shevde, 2002]１０％ＦＢＳを含有するαＭＥＭで培養した。細胞を２×６ウエルのプレート（５×１０5個／ウエル）に入れ、１日目と４日目に培養液を交換して培養した。４日目に一方のプレートを１，２５（ＯＨ）2Ｄ3（最終濃度１０ｎＭ）で処理した。２番目のプレートは対照として用いた。１，２５（ＯＨ）2Ｄ3と共にインキュベートして２４時間後、細胞を回収して、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（カリフォルニア州、カールズバッドのインビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ）によって全ＲＮＡを単離した。ＲＮｅａｓｙキット（カリフォルニア州、チャッツワースのキアゲン）を用いてｍＲＮＡをさらに精製した。アガロースゲル電気泳動及びＵＶ吸収分光光度計によって全ＲＮＡの質、整合性及び量を評価した。実験は三つ組みで行った。
【０１１４】
（マイクロアレイのプローブの調製）
【０１１５】
すべてアフィメトリクス遺伝子発現マニュアル（カリフォルニア州、サンタクララのアフィメトリクス社）に従って、スーパースクリプトチョイスシステム（カリフォルニア州、カールズバッドのインビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ）を用いて、３μｇのラットのポリアデニル化ポリ（Ａ+）ＲＮＡ又は１３μｇのマウスの全ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成した。フェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈殿に続いて、ｃＤＮＡ鋳型とバイオアレイハイイールドインビトロ転写キット（ニューヨーク州、フェーミンデールのエンゾライフサイエンシズ）を用いてビオチン標識の試験管内の転写反応を行った。１×断片化緩衝液（４０ｍＭのトリス酢酸塩、ｐＨ８．１、１００ｍＭの酢酸カリウム、３０ｍＭの酢酸マグネシウム）にて最終濃度０．７〜１．１μｇ／μＬでｃＲＮＡを断片化した。断片化前（０．５ｋｂ以上）及び断片化後（３５〜２００塩基の断片）のｃＲＮＡのサイズをアガロースゲル電気泳動によって確認した。
【０１１６】
（マイクロアレイのハイブリッド形成手順）
【０１１７】
記載されたように(Kutuzova, 2004)、ウィスコンシン−マジソン大学のバイオテクノロジーセンターの遺伝子発現センターによってハイブリッド形成反応及び自動ハイブリッド形成手順が実施された。アフィメトリクステスト３アレイにて各プローブを調べ、ｃＤＮＡ及びｃＲＮＡの質をアレイ内のハウスキーピング遺伝子（ユビキチン、ラットのグリセアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、β−アクチン及びヘキソキナーゼ）の３’／５’の比によって判定した。試料がアフィメトリクステスト３アレイの品質管理を通過すれば、それをアフィメトリクス高密度ラットオリゴヌクレオチドアレイ（ラットの発現アレイ２３０．２．０）又はマウスのアレイ（マウスゲノム４３０。２．０アレイ）とハイブリッド形成させた（アフィメトリクスのＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）発現解析技術マニュアル；ｈｔｔｐ：／／ｗΛｖｗ．ａｆｆｙｍｅ１ｒｉｘ．ｃｏｍ／ｓｕｐｐｏｒｔ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ／ｍａｎｕａｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｍａｎｕａｌ．ａｆｆｘ）。アフィメトリクスのマイクロアレイスイートソフトウエアのバージョン５．０（ＭＡＳ５．０）を用いて発現データを解析した。ビヒクル処理したラットに対して１，２５（ＯＨ）2Ｄ3処理したラットの各時点についての比較の表はエクセル（マイクロソフト）で生成した。各比較については、対照（ビヒクル処理）に比べた１，２５（ＯＨ）2Ｄ3処理を計算し、及びアレイで示される各ｃＤＮＡについては、比（たとえば、１，２５（ＯＨ）2Ｄ3／対照）と処理された１，２５（ＯＨ）2Ｄ3及びビヒクルについての強度の絶対的差異を計算した。マイクロアレイのデータは、以前記載されたように定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）によって検証した(Kutuzova, 2004)。
【０１１８】
（サルの処理及び眼内圧（ＩＯＰ）の測定）
【０１１９】
涙液層の指標として用いたクリームと共にゴールドマン圧平眼圧計[Kaufman, 1980]によってベースラインの予備処理ＩＯＰを測定した[Croft, 1997]。２つのベースラインＩＯＰ測定を５分離して取った。次いで、プロピレングリコール中の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（１，２５（ＯＨ）2Ｄ3）（０．１〜５μｇ）を一方の眼に、ビヒクル（プロピレングリコール）を反対の眼に１日２回、５回の処理についてサルを局所処理した。１分離して液滴を角膜の真ん中に投与する一方で、サルを仰臥位に置き、液滴後少なくとも３０秒間その瞼を開いたままにした。午後の処理に先立ってＩＯＰを測定した。第３日目に、午前の処理に先立ってＩＯＰを測定した。５回目の処理の後、ＩＯＰを８時間にわたって１時間ごとに、及び１２、２４と４８時間に測定した。最初のＩＯＰ測定に先立って、及び３時間と６時間（適宜２４、４８時間）にスリットランプの検査（生体顕微鏡的細胞又は炎症の存在を判定する）を行った。試験間でサルを少なくとも２週間休息させた。各試験群に８匹のサルがいた。
【０１２０】
（房水形成試験）
【０１２１】
以前記載されたように眼科走査蛍光光度分析（フルオロトロンマスター、カリフォルニア州、マウンテンビューのオクマトリクス社）によって房水形成率を測定した。ビタミンＤ又はビヒクルによる４回目の処理（上記参照）の後少なくとも３０分にフルオレセインの液滴を投与した。５回目の処理の前、３日目にＩＯＰを測定し、生体顕微鏡法を実施した。５回目の処理後、処理の１時間後に始めて６回の二つ組走査を回収するまで１時間ごとに走査を行った。ベースラインの走査は、処理試験の前２週間以内と処理試験後少なくとも２週間に６時間得た。１．０からの差異の比率についての対応のあるｔ検定によって処理後の房水形成率を、前後のベースライン走査の平均及びビヒクル処理の眼と比べた。各処理群についてサルは８匹だった。
【０１２２】
（房水流出率試験）
【０１２３】
Ｂｒａｒａｎｙのパーフサンド液[Barany, 1964]を伴った前房の２レベルの定圧潅流によって、ペントバルビタールで麻酔した[Gabelt, 2004]サルにおいて房水流出率を測定した（ｎ＝８）。４匹のサル（Ａ群）について、１μｇの１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（１，２５（ＯＨ）2Ｄ3）１μＬを一方の眼（処理眼）の前房に与え、又は１μＬのプロピレングリコールを隣の眼（対照眼）の前房に与えた。４匹のサル（Ｂ群）には、５μＬのプロピレングリコール中５μｇのビタミンＤ又はビヒクル（５μＬのプロピレングリコール）によって１日２回、２日間局所で処理した。
【０１２４】
３日目のベースラインの房水流出率の測定に続いて、５回目の処理は、１μｇの１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（１，２５（ＯＨ）2Ｄ3）１μＬを一方の眼（処理眼）の前房に、又は１μＬのプロピレングリコールを隣の眼（対照眼）の前房に、単回ボーラス注射として投与した。注射に続いて、リザーバからの流れによって処理ボーラスを５分間洗った。角膜に冷風を吹きつけ対流を創ることによって前房の内容物を混合した。７５分間リザーバを閉じ、次いで再び開いて、房水流出率を６０〜９０分間測定した。データは、６０〜９０分間全体について及び３０分間の区間について平均し、次いでベースライン及びビヒクル処理された眼と比較した。１．０からの差異の比についての両側性の対応のあるｔ検定によって比を比較した。
【０１２５】
（結果）
【０１２６】
ビタミンＤはＩＯＰの調節に関与する遺伝子の発現を調節する
【０１２７】
我々は、[Kutuzova, 2004]で記載したように我々が選択した新規のビタミンＤ標的遺伝子を特定するためにラットとマウスのマイクロアレイを用いた。包括的なマイクロアレイのデータ解析は、ＩＯＰの調節に関与することが知られている遺伝子の発現を１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（１，２５（ＯＨ）2Ｄ3）が変化させることを示した。見い出された関連した最大の変化には、炭酸脱水素酵素（ＣＡＩ）、アンギオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）及びアクチンα（ＡＣＴＡＩ）のｍＲＮＡ発現の強い抑制が挙げられた(図１０Ａ）。１，２５（ＯＨ）2Ｄ3のよる有意な下方調節は、アクチンγ（ＡＣＴＧ２）、Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰ分解酵素α１（ＡＴＰ１Ａ１）、アクアポリン１（ＡＱＰ１）、癌胎児性抗原に関連する細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ）、フィブロネクチン１（ＦＮ１）、ＣＤ４４及びメタロプロテイナーゼ３の組織阻害剤（ＴＩＭＰ３）であった（図１０Ａ）。有意な低下は、ＰＧＥ２に対するプロスタグランジンＥ受容体４（ＰＴＧＥＲ４）並びにマトリクスメタロプロテイナーゼ３（ＭＭＰ３）、１１（ＭＭＰ１１）及び１３（ＭＭＰ１３）の発現において見い出された。我々の試験では、圧誘導の恒常性の応答の間にヒト線維柱帯（ＴＭ）にて一貫して上方調節されることが見い出された幾つかのほかの遺伝子（血管活性腸管ペプチド、トポイソメラーゼＩ、ＭＭＰ２）の発現をビタミンＤは低下させた[Vittitow, 2004]。
【０１２８】
１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3の局所適用は非ヒト霊長類にてＩＯＰを両側性に強く下げる
【０１２９】
１日目（ｄ１）での予備処理ＩＯＰ（平均±ＳＥＭ）は、５μｇのビタミンＤで処理される眼において１８．９±０．７ｍｍＨｇであり、対照の眼において１８．５±０．９ｍｍＨｇであった。３日目（ｄ３）の５回目の処理に先立って、ＩＯＰは両方の眼でおよそ２０％（３ｍｍＨｇ）有意に低下した（ｐ＜０．０５）（図１１Ａと１１Ｂ）。本発明のビタミンＤ化合物又はビヒクルによる５回目の局所処理に続いて、次の１〜４時間にわたって対照眼ではさらに７％（１．５ｍｍＨｇ）及びビタミンＤ処理眼では１０％（２．５ｍｍＨｇ）ＩＯＰは両側性に低下し、その後、４８時間後の予備処理ベースライン近くまで徐々に戻った（図１１）。対照に比べて５μｇのビタミンＤ処理眼のＩＯＰ低下がやや大きいと思われる（２７％対３０％）が、１２時間以上の時間を除いて２つの眼の間に有意差はなかった（図１１）。別の実験では、処理されていない対側の眼ではビヒクル（プロピレングリコール）のみはＩＯＰにほとんど又はまったく効果を有さなかった（データは示さず）。
【０１３０】
ビタミンＤによるＩＯＰの低下は用量依存性であった
【０１３１】
１μｇのビタミンＤによる片側の局所処理はＩＯＰを両側性に低下させるが、さらに強くＩＯＰを下げる５μｇの１，２５（ＯＨ）2Ｄ3による処理よりも少ない程度に、処理眼より少なく隣の対照眼で低下させる（３０％対２０％）（図１１）。０．１μｇの１，２５（ＯＨ）2Ｄ3はいずれの眼でもＩＯＰに有意な効果を有さなかった（図１１）。
【０１３２】
ビタミンＤはサルにおいて血清カルシウムのレベルを変化させない
【０１３３】
ビタミンＤは血清カルシウムのレベルを維持するように機能するので[DeLuca, 2008]、我々は、局所で適用したビタミンＤが十分なレベルに達して全身性の効果を生じるかどうかの指標としてサルにおける血清カルシウムのレベルをモニターした。一方の眼に片側性に局所適用することによって５μｇの１，２５（ＯＨ）2Ｄ3で３日間処理した（合計５回の局所適用）サルにおいて、血清カルシウムのレベルが変化しなかった（図６）ということは、１，２５（ＯＨ）2Ｄ3が、血清カルシウムのレベルの上昇を特徴とする全身性の効果を引き起こすほど十分なレベルで全身性の循環に入らなかったことを示している。
【０１３４】
ビタミンＤはサルにおける房水の動態に影響を有さない
【０１３５】
ＩＯＰが両側性に強く低下させられた場合、ベースライン又は処理後のどの時間間隔と比べても、ビヒクル対照眼又は５μｇのビタミンＤ処理眼における房水形成率に変化はなかった（表１、図１１）。
【０１３６】
【表１】
0005753386.tif 000008
【０１３７】
５μｇの１，２５（ＯＨ）2Ｄ3又はビヒクル（プロピレングリコール）の局所適用後のカニクイザルの眼における房水形成（ＡＨＦ）（μＬ／分）
【０１３８】
房水形成は、ビタミンＤ又は反対の眼に対するビヒクルの１日２回の局所処理５回目の後１〜６時間の区間の間で蛍光光度分析によって測定した（材料及び方法を参照のこと）。房水形成の単位は、μＬ／分である。データは平均値±ＳＥＭである。Ｒｘは処理（ビタミンＤ又はビヒクル）、ｎ＝６。
【０１３９】
ベースライン房水流出率をサルの２つの群（Ａ及びＢ）で調べた（材料及び方法を参照のこと）。Ａ群（ｎ＝４）は、一方の眼におけるプロピレングリコール１μＬ中の１μｇの１，２５（ＯＨ）2Ｄ3又は対照眼における１μＬのビヒクル、プロピレングリコールの単回ボーラス前房内注射によって処理した。Ｂ群（ｎ＝４）は、プロピレングリコール５μＬ中の５μｇのビタミンＤ又はビヒクル（５μＬのプロピレングリコール）によって１日２回２日間、局所で処理した。次いで、３日目のベースライン房水流出率の測定に続いて、５回目の処理を１μｇの１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3（１，２５（ＯＨ）2Ｄ3）１μＬを一方の眼（処理眼）の前房に、又は１μＬのプロピレングリコールを隣の眼（対照眼）の前房に、単回ボーラス注射として投与した。
【０１４０】
【表２】
0005753386.tif 000009
【０１４１】
ビタミンＤ（１，２５（ＯＨ）2Ｄ3）（処理眼）又はビヒクル（プロピレングリコール）（対照眼）の局所及び／又は前房内の適用後のサルの眼における９０分間の累積房水流出率
【０１４２】
データは平均値±ＳＥＭである。房水流出率の単位はμＬ／分／ｍｍＨｇであり、比には単位がない。ベースラインの測定に続いて、前房内の１μｇのビタミンＤを一方の眼に、ビヒクル（１μＬ）を反対の眼に投与した。処理後の房水流出率の測定は、ビタミンＤの投与後７５分で開始し、９０分間継続した。３日目におけるＡ群と同様の前房内処理を伴った５μｇビタミンＤ又はビヒクル２日間（４回の処理）の局所処理（材料及び方法を参照のこと）。９０分間全体のデータを解析した場合、又は３０分間の増分を解析した場合、眼の間に有意差は見られなかった。両側性の対応のあるｔ−検定による１．０からの有意な差：＊ｐ＜０．０５。
【０１４３】
我々は、各処理のＡ群及びＢ群(表２）におけるビタミンＤで処理した眼とビヒクルで処理した眼の間で累積９０分間の房水流出率を比較し、それらをベースラインの房水流出率と比較した。各処理群における双方の眼について９０分間全体の房水流出率には増加があったが、ビタミンＤとビヒクル処理の眼の間（表２）にも、双方の群間にも、又は我々が双方の群のデータ（表２）を組み合わせた場合にも有意差は見られなかった。９０分間全体のデータを解析した場合も、３０分間の増分を解析した場合も、眼の間に有意差は見られなかった。
【０１４４】
房水流出率の比（３０分区間としての）の時間的経過については、応答に明白な差異がなかったので（表２、図１２）、サルの双方の群の結果を合わせた（ｎ＝８）。ボーラス注射後の最初の３０分間で双方の眼で房水流出率の軽い有意ではない上昇があり（対照眼で３３％、ビタミンＤ処理眼で１１％）、その後それぞれ、ビヒクル処理の眼とビタミンＤ処理の眼にて６０分で８０〜６０％及び９０分で１１０〜１１５％の有意な差異があった(図１２）。双方の眼（ビヒクル処理の眼とビタミンＤ処理の眼）における房水流出率は同じ程度にベースラインを超えて上昇したので（前房内注射後９０分で約１００％）、[Rasmussen, 2007]で記載されたことに類似して、我々は、これらの両側性の房水流出率の上昇を非ヒト種で起きることが知られている単なる「洗い流し」現象[Scott, 2007]とみなす。それは真の両側性の房水流出率の上昇にせいであり、それが、我々が発見したビタミンＤによる強い両側性のＩＯＰの低下（図１２）を刺激したという幾らかの可能性は依然としてあってもよい。ブドウ膜強膜の流出がＩＯＰ−ビタミンＤの低下効果に関与するかどうかに関する見識を提供する追加の実験は当然である。ＩＯＰの応答の両側性の性質のために、ほとんどの有望なアプローチはピロカルピンによって毛様筋を抑制することに含まれ、ビタミンＤ処理の前にブドウ膜強膜の流出経路を遮断する[Crawford, 1987] 。
【０１４５】
（考察）
【０１４６】
かねて、マイクロアレイ試験によって、ラットの腸においてＣａ2+の吸収と免疫調節に関与する多数の新規のビタミンＤ標的遺伝子が特定されたということは、ビタミンＤが誘導するＣａ2+吸収の新規の経路を示唆している[Kutuzova, 2004]。本明細書で提示したラットとマウスにおける包括的なマイクロアレイのデータ解析は、ＩＯＰの調節に関与することが知られている、新規のビタミンＤが調節する遺伝子を示している。我々がビタミンＤ処理後に認めた遺伝子発現における多数の変化は房水の形成及び排出の調節に関係する。我々のマイクロアレイ試験はまた、ビタミンＤが調節する遺伝子発現は、線維柱帯細胞のデキサメタゾン処理に関連する事象を否定してもよく、それによって感受性の個体におけるステロイドで誘発された緑内障の治療を提供する。
【０１４７】
上述のマイクロアレイ試験に加えて、我々は、局所投与及び／又は前房内投与後の非ヒト霊長類においてＩＯＰ、房水形成及び房水流出率に対するビタミンＤの効果を検討した。
【０１４８】
眼の排出経路の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）構成要素が房水の流れへの抵抗性、それ故ＩＯＰへの抵抗性の重大な決定因子であることは長い間示唆されている[Kaufman, 1984]。その代謝、合成、及び環境を変えることに対する応答に影響するＥＣＭの分子及び因子は、高眼圧に対する感受性の重要な構成要素である。アクチンの細胞骨格を崩壊させることによって線維柱帯での流出を高めることを達成することができる。細胞骨格効果を持つ化合物は、実質的に長期間のＩＯＰ低下についての治療の可能性を提供する。現在のＩＯＰ低下剤はほとんど、房水の産生を抑制するか、又は毛様筋を介して流出を高めるので、ＴＭを介して房水の流れを低下させる。現在知られているＩＯＰ低下剤はすべて多かれ少なかれ、重篤な副作用を有する[Kaufman, 2006]。
【０１４９】
ベタガン（登録商標）（レボブノロール）又はキサラタン（登録商標）（ラタノプロスト）のようなＩＯＰを下げる従来の治療は、一過性の眼の焼けるような感じ及び刺すような痛み、眼瞼結膜炎、心拍数及び血圧の低下、虹彩毛様体炎、頭痛、一過性の運動失調、目眩、無気力、蕁麻疹、黄斑浮腫、掻痒感、角膜感受性の低下、上気道感染／感冒及び／又は発疹又はアレルギー反応を含む副作用を起こすことができる。これらの副作用のいずれも本発明の化合物では見られていない。
【０１５０】
ビタミンＤは、たとえば、くる病、癌、糖尿病及び自己免疫疾患のような広いスペクトルの疾患を予防し、治療することができる[DeLuca, 2004, 2008]。ビタミンＤの別の生物学的機能は、生体内物質及び生体異物の解毒作用に関与する遺伝子を調節することである[Kutuzova, 2007]。ビタミンＤの活性型は、高親和性ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）との会合及びそれに続くレチノイドＸ受容体とのヘテロ二量体形成においてリガンド活性化転写因子として作用し、特定のＤＮＡ−ビタミンＤ応答エレメント（ＶＤＲＥ）と結合して多種類の遺伝子を転写活性化する又は転写抑制する１，２５−ジヒドロビタミンＤ3、又はカルシトリオール（１，２５（ＯＨ）2Ｄ3）、セコステロイドホルモンである[Jones, 1998]。活性型ビタミンＤ（１，２５（ＯＨ）2Ｄ3）によって処理したラット（生体内）[Kutuzova, 2004] 及びマウス（試験管内）での我々のマイクロアレイ試験から、我々は、ビタミンＤが調節する細胞骨格、細胞外マトリクス、細胞接着の遺伝子、及びそのほかのタンパク質及び酵素の遺伝子は、ＩＯＰの調節に関与することが知られていることを発見した（図１０）。
【０１５１】
アクチン脱重合化薬が房水流出率を高め、ＩＯＰを下げるので、細胞骨格の動態は線維柱帯の機能及び房水流出の調節に関係するとみなされている。アクチンの細胞骨格を崩壊させる薬剤は生体内でＩＯＰを下げ、房水流出率を高める。我々はここで、ビタミンＤが、主な細胞骨格タンパク質（アクチンα及びγ）の発現を強く下方調節し、細胞接着に関与するタンパク質（ＣＥＡＣＡＭ及びＣＤ４４）及びフィブロネクチンＩ−ＥＣＭの組織化と細胞の相互作用に関与する主なＥＣＭタンパク質の１つの発現を低下させることを初めて示している（図１０Ａ）。アクチンの崩壊は細胞接着に変化をもたらし、結果的に線維柱帯の弛緩を生じ、流体流出に利用できる領域を増やすことができる[Tian, 2008]。ＣＥＡＣＡＭは流出経路で検討されていないが、一般に細胞接着分子の減少は線維柱帯を介した流出を高めることが期待される[Kuespert, 2006]。ビタミンＤ処理後に我々が認めたフィブロネクチンＩ及びＣＤ４４の減少も、細胞接着の崩壊及び収縮性分子の減少の結果として流出抵抗性を低下させることによって高い流体流出をもたらす可能性がある[Wordinger, 2007; Acott, 2008; Tan, 2006]。
【０１５２】
ビタミンＤはマトリクスメタロプロテイナーゼの発現を高め（図１０Ｂ）、その阻害因子の発現を低下させた（図１０Ａ）。マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）とその阻害因子はＥＣＭ物質を作り直す。高いレベルのマトリクスメタロプロテイナーゼは細胞外マトリクスを作り直すことができ、結果的に流体流出の向上及びＩＯＰの低下を生じる[Tan, 2006]。
【０１５３】
我々がここで初めて提示する、ＩＯＰの低下に関与することも知られている、ビタミンＤによって下方調節されるほかの部類の遺伝子は、トランスポーター及びチャンネル：アクアポリン１（ＡｑＰ１）及びナトリウム−カリウムＡＴＰ分解酵素（ＡＴＰ１Ａ１）である（図１０Ａ）。Ａｑｐ１は、水のチャンネルであり、房水の産生及び流出の部位で発現される。アクアポリン水チャンネル遺伝子を欠損したマウスは、正常対照よりも低い房水流入と低いＩＯＰを有する[Zhang, 2002]。従って、アクアポリンを阻害することは緑内障治療で利用されてもよい。色素沈着のない毛様上皮におけるＡＴＰ１Ａ１は房水形成に関与する[Riley, 1986]。強心配糖体（たとえば、ウアバイン）又はバナジウム酸塩によって毛様体突起のＡＴＰ１Ａ１を阻害することは、実験動物[Podos, 1984; Dismuke, 2009]及びヒト[Podos, 1989]において房水の形成及びＩＯＰを有意に低下させる。
【０１５４】
以前[Kutuzova, 2004]、我々はビタミンＤによってその発現が劇的に抑制され、ＩＯＰの低下に関係する、アンギオテンシン１変換酵素（ＡＣＥ）及び炭酸脱水素酵素（ＣＡＩ）を含むほかの遺伝子を特定した（図１０Ａ）。炭酸脱水素酵素阻害剤は緑内障治療に広く採用され、房水形成を抑制することによってＩＯＰを下げる[Mincione, 2007; Supuran, 2008]。
【０１５５】
ＡＣＥは、アンギオテンシンＩ（ＡｎｇＩ）をアンギオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）に変換し、次いでバソプレシンの放出を高めることによって血圧を調節するレニン・アンギオテンシン系の重要な部分であることが知られている。ＡＣＥはまた血管拡張剤、ブラジキニンを不活化する。これらの効果双方が動脈血圧を上昇させる。ＡＣＥ阻害剤は高血圧の治療に広く使用されている。眼がレニン・アンギオテンシン系を含有し、それがＩＯＰの調節に関与するという証拠もある。眼の組織及び流体におけるＡＣＥ活性の存在、アンギオテンシノーゲンとアンギオテンシンＩＩの濃度、及びアンギオテンシンＩＩＡＴ１受容体の密度がヒトを始めとする幾つかの種で明らかにされている[Wallow, 1993; Cullinane, 2002; Vaajanen, 2008]。高血圧ラットにおける最近の試験は、血圧とＩＯＰの強い正の相関を示唆した[Vaajanen, 2008]。
【０１５６】
血圧とＩＯＰの強い相関は、眼及び血管系の双方で圧力を制御していてもよい共通するメカニズムと共通する遺伝子を示唆しているヒトの包括的試験でも立証された[Klein, 2005; Duggal, 2007]。ＡＣＥ阻害剤の局所投与及び経口投与は、動物モデル及びヒトでＩＯＰを下げることが示されており；それらは現在、緑内障治療剤として開発中である[Constad, 1988; Costagliola, 1995]。長年の疫学試験及び臨床試験によってヒト集団におけるビタミンＤと血圧の逆相関が確立された(Li, Y.C., 2003)。ビタミンＤはレニン・アンギオテンシン系の強力な抑制剤であり、血圧を低下させることができる[Li, 2004]。以前記載されたビタミンＤによるＡＣＥ発現の強い阻害[Kutuzova, 2004]は、動脈血圧及びＩＯＰ双方のビタミンＤによる低下効果に関与する多数の遺伝因子の１つであってもよい。
【０１５７】
プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）類似体の眼圧降下効果には眼に存在する複数のプロスタグランジン受容体が介在するので、プロスタグランジンＥ２のプロスタグランジンＥ受容体４（ＥＰ４）の発現におけるビタミンＤが誘導する有意な上昇もＩＯＰの低下に寄与してもよい[Takamatsu, 2000]。プロスタグランジンは、ＴＭにおけるＥＣＭを分解して流出を高めるマトリクスメタロプロテイナーゼを誘導する。従って、ビタミンＤによって刺激されたＥＰ４受容体の高い発現もＩＯＰの低下に寄与してもよい。
【０１５８】
現在の試験は、局所に適用されたビタミンＤが実際に非ヒト霊長類で実質的にＩＯＰを下げることができるので、ビタミンＤとその全部類の化合物は緑内障治療剤として使用される可能性を有することを明らかにしている。ビタミンＤを使用してＩＯＰを下げる可能性を支持する以前の唯一知られた試験は５０年以上も前に行われ、ビタミンＤ2（ビタミンＤ3ではない）の単回筋肉内注射を数人の緑内障患者に投与した場合、一部の患者にＩＯＰの低下が認められた[Guist, 1953]。
【０１５９】
しかしながら、これらのデータは統計的に有意ではなく、繰り返されたことがないので、結果の再現性に関する疑問は未解決のままだった。さらにビタミンＤ2又はエルゴカルシフェロールは、植物が供給源であることが多く、ビタミンＤの内因性のヒト型（ビタミンＤ3）ではなく、生体内での効果ははるかに低い。ビタミンＤがＩＯＰの調節において、だからＰＯＡＧにおいて役割を担うという我々の考えを支持するほかの間接的な証拠は、白人集団に比べてアフリカ系集団のＰＯＡＧに対する優勢な感受性を示す疫学試験に由来する[Miao, 2008; Lucas, 2008]。色素沈着が皮膚でのビタミンＤの産生を低下させるという事実のために、ヨーロッパ家系の個人に比べてアフリカ家系の個人はおよそ２倍低い血清ビタミンＤ（２５（ＯＨ）Ｄ）のレベルを有することが知られている [Harris, 2006; Zadshir, 2005]。ビタミンＤが低い状態は、高血圧症、糖尿病にさらに罹り易い[Harris, 2006]、及び末梢動脈性疾患のさらに高い罹患率[Reis, 2008]のこの集団を説明してもよい。
【０１６０】
我々は、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ3又はカルシトリオールの局所適用後、用量依存性に非ヒト霊長類にてＩＯＰを有意に低下させ、１２時間を超えて続く長い効果を持つことを示した（図１１）。低い用量でさえ片側に局所適用した後、ＩＯＰの低下は両側性に生じた（図１１Ａ）。一部の作用剤による両側性のＩＯＰの低下のメカニズムは明瞭には理解されていないし、説明されていない。対側性効果についての可能性のあるメカニズムの１つは、鼻涙粘膜を介した局所適用された薬剤の血液循環への対側の眼への全身性吸収であり(Piltz, 2000)、たとえば、検出可能なレベルのカルシウムチャンネル遮断剤、フルナリジンがその局所投与後のウサギで報告された[Maltese, 2003]。
【０１６１】
別の可能性は、化合物がＣＮＳ又は末梢神経系を介して作用するということである[Trzeciakowski, 1987]。一部の治験担当医師は、ＩＯＰの変化が、知覚神経線維、交感神経線維及び副交感神経線維（視神経及び顔面の双方で）の刺激後に記録されたので、ＩＯＰの最も重要な調節因子として神経系を考慮しなければならないと強調している[tenTusscher, 1994]。カンナビノイド、オピオイド、及びプロスタグランジンも両側性にＩＯＰを低下させるが、ビタミンＤと同程度ではない[Rasmussen, 2007; Kaufman 2008]。Ｃａ2+チャンネル遮断剤、α2−及びβ−アドレナリン作用性拮抗剤も両側性のＩＯＰの低下を生じるが、普通、処理眼に比べて対照眼ではさほど顕著ではない[Wang, 2008; Gabelt, 1994; Piltz, 2000]。このことは、本発明の化合物が、うつ病、脳腫瘍、アルツハイマー病、パーキンソン病などのような神経系（ＣＮＳ／ＰＮＳ）の障害を治療するのに有用であることを示唆している。
【０１６２】
検討の第１段階として、我々は房水形成過程を調べた。ビタミンＤは房水形成を変化させないことが我々の実験から明瞭に明らかになった（表１）。次に我々は、ビタミンＤ処理したサルの眼において房水流出率を調べ、ビヒクルで処理した眼及びビタミンＤで処理した眼の双方が房水流出率で同一の上昇を経験していることを示した（表２、図１２）。ビヒクルで処理した眼及びビタミンＤで処理した眼の双方におけるビタミンＤによって刺激された適度な房水流出率の上昇は、ヒトを除くあらゆる種に共通する「洗い流し」現象の結果であると思われ、その際、生理学的眼圧での眼の潅流は結果的に測定された房水流出率における体積依存性の上昇を生じる[Scott, 2007]。カッパオピオイド作動薬、ブレマゾシンで処理したサルにおける「洗い流し」とみなされた房水流出率の両側性の上昇について類似の結果が認められた[Rasmussen, 2007]。
【０１６３】
我々の試験では、ビタミンＤは房水の流れも房水流出率も変化させなかったので、非ヒト霊長類において房水の動態を達成しなかった。このことは、ほかの既知の眼圧降下剤すべてと全く対照的であり、ＩＯＰを下げるビタミンＤのメカニズムがほかの眼圧降下剤とは異なりうることを示唆している。ＩＯＰの調節に関与するここで提示された種々のビタミンＤ標的遺伝子を考えると、ビタミンＤが幾つかのメカニズムを介してＩＯＰを下げる可能性を有することを示唆する強い証拠がある。
【０１６４】
上記の記載、添付の図面及びその説明は本発明の限定ではなく説明を意図するものであることが言及されるべきである。本発明の多数の主題と変化が、この中で、及び開示の観点で熟練者に示唆されるであろう。そのような主題と変化のすべては、本明細書の熟考の範囲内である。たとえば、本発明が上記で概説された種々の例となる実施態様と併せて記載されている一方で、既知であれ、稀であれ、又は現在のところ予期されなくてもよい種々の代替物、改変、変化、改善及び／又は実質的な同等物が当業者に明らかになってもよい。種々の変更は、本発明の精神と範囲から逸脱することなく行われてもよい。従って、本発明は、これら例となる実施態様の既知の又は後で開発された代替物、改変、変化、改善及び／又は実質的な同等物のすべてを包含するように意図される。
【０１６５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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