(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソQC阻害剤を含む、炎症性の疾患又は容態を治療及び／又は予防するための医薬組成物であって、該炎症性の疾患又は容態が、
a．慢性及び急性炎症、
b．他の炎症性疾患、
c．神経炎症、及び
d．神経炎症から結果として生じ得る神経変性疾患
からなる群から選択され；
前記イソQC阻害剤が式（I）の化合物
【化１】
0005788320.tif 000122
又はそのすべての互変異性体及び立体異性体、又はそれらの医薬として許容し得る塩、溶媒和物、若しくは多形体であり、式中：
R1は、
【化２】
0005788320.tif 000123
を表し、又はR1は、
【化３】
0005788320.tif 000124
を表し、
式中、Aは非分岐の若しくは分岐したC1-6アルキレン鎖を表し、又はAは分岐したC1-6アルキレン鎖を表し、又はAは(CH2)aCR5R6(CH2)bを表し（式中、a及びbは独立して、0〜5の整数を表し、但し、a＋b＝0〜5であり、かつR5及びR6が、それらの結合する炭素と共にC3-C5シクロアルキル基を形成するアルキレンである）、かつR11、R12、及びR13は独立して、H若しくはC1-2アルキルを表し；
R2は、C1-8アルキル、アリール、又はヘテロアリールを表し；
ここで、上記のアリール基は、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ-、ハロゲン、及びヒドロキシルから選択される1つ以上の基によって任意に置換してもよく；
或いはR2は、フェニルによって置換されたフェニル、若しくはヘテロシクリルに縮合したフェニルを表し；
R3は、Hを表し、又はR2及びR3が結合して、フェニルに縮合したカルボシクリル環を形成し；
R4は、H、又は-C1-8アルキルを表し；
Xは、O又はSを表し；かつ
Yは、O又はSを表す、前記医薬組成物。
【請求項２】
炎症性の疾患又は容態を治療及び／又は予防する薬剤の製造のためのイソQC阻害剤の使用であって、該炎症性の疾患又は容態が、
a．慢性及び急性炎症、
b．他の炎症性疾患、
c．神経炎症、及び
d．神経炎症から結果として生じ得る神経変性疾患
からなる群から選択され；
前記イソQC阻害剤が式（I）の化合物
【化４】
0005788320.tif 000125
又はそのすべての互変異性体及び立体異性体、又はそれらの医薬として許容し得る塩、溶媒和物、若しくは多形体であり、式中：
R1は、
【化５】
0005788320.tif 000126
を表し、又はR1は、
【化６】
0005788320.tif 000127
を表し、
式中、Aは非分岐の若しくは分岐したC1-6アルキレン鎖を表し、又はAは分岐したC1-6アルキレン鎖を表し、又はAは(CH2)aCR5R6(CH2)bを表し（式中、a及びbは独立して、0〜5の整数を表し、但し、a＋b＝0〜5であり、かつR5及びR6が、それらの結合する炭素と共にC3-C5シクロアルキル基を形成するアルキレンである）、かつR11、R12、及びR13は独立して、H若しくはC1-2アルキルを表し；
R2は、C1-8アルキル、アリール、又はヘテロアリールを表し；
ここで、上記のアリール基は、C1-6アルキル、C1-6アルコキシ-、ハロゲン、及びヒドロキシルから選択される1つ以上の基によって任意に置換してもよく；
或いはR2は、フェニルによって置換されたフェニル、若しくはヘテロシクリルに縮合したフェニルを表し；
R3は、Hを表し、又はR2及びR3が結合して、フェニルに縮合したカルボシクリル環を形成し；
R4は、H、又は-C1-8アルキルを表し；
Xは、O又はSを表し；かつ
Yは、O又はSを表す、前記使用。
【請求項３】
前記炎症性疾患が、関節リウマチ、粥状硬化、再狭窄、膵炎、及び骨粗鬆症から選択される慢性及び急性炎症である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記炎症性疾患が、神経因性疼痛、移植片拒絶反応／移植片不能／移植性脈管障害、HIV感染／エイズ、妊娠中毒症、結節性硬化症、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発性神経根症、及び多発性硬化症から選択される、請求項１又は３記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記炎症性疾患が神経炎症である、請求項１又は３記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記炎症性疾患が、神経炎症から結果として生じ得る神経変性疾患である、請求項１又は３記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記神経変性疾患が、軽度認知障害（MCI）、アルツハイマー病、ダウン症候群における神経変性、家族性英国型認知症、及び家族性デンマーク型認知症から選択される、請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記イソQC阻害剤と組み合わせて、抗炎症薬、向知性薬、神経保護薬、抗パーキンソン病薬、アミロイドタンパク質沈着阻害剤、βアミロイド合成阻害剤、抗うつ薬、抗不安薬、抗精神病薬、及び抗多発性硬化症薬、アンギオテンシン変換酵素（ACE）の阻害剤、アンギオテンシンII受容体遮断薬、利尿薬、カルシウムチャネル遮断薬（CCB）、β遮断薬、血小板凝集阻害剤、コレステロール吸収モジュレーター、HMG-Co-A還元酵素阻害剤、高密度リポタンパク質（HDL）を増加させる化合物、レニン阻害剤、IL-6阻害剤、抗炎症性コルチコステロイド、抗増殖薬、一酸化窒素ドナー、細胞外マトリックス合成の阻害剤、増殖因子又はサイトカインシグナル伝達阻害剤、MCP-1アンタゴニスト、及びチロシンキナーゼ阻害剤からなる群から選択されるさらなる薬剤を含む、請求項１又は３〜７のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記疾患及び／又は容態がヒトを苦しめる、請求項１又は３〜８のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項１０】
R1が、
【化７】
0005788320.tif 000128
を表す、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１１】
R1が、
【化８】
0005788320.tif 000129
を表し、
式中、Aが、非分岐の若しくは分岐したC1-6アルキレン鎖を表し、又はAが、分岐したC1-6アルキレン鎖を表し、又はAが(CH2)aCR5R6(CH2)bを表し、かつ
R11、R12、及びR13が独立して、H若しくはC1-2アルキルを表す、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記式（I）の化合物が下記式：
【化９】
0005788320.tif 000130
（式中、R2、R3、R4、X、及びYは請求項１に定義されるとおりである。）によって表される、請求項１又は３〜１１のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項１３】
R2が-ビフェニル-4-イルである、請求項１又は３〜１２のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項１４】
R2が、同じでも又は異なってもよく、かつ、ハロ、OH、C1-3アルキル、C1-3ハロアルキル、C1-3アルコキシ、C1-3ハロアルコキシから選択される1、2、又は3個の置換基によって任意に置換されたフェニルを表す、請求項１又は３〜１３のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項１５】
R2が、n-プロピルオキシによって置換されたフェニルである、請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１６】
R3がHを表す、請求項１又は３〜１５のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項１７】
R2及びR3が結合して、フェニルに縮合したカルボシクリル環を形成する、請求項１又は３〜１５のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項１８】
R4がHを表す、請求項１又は３〜１７のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項１９】
XがOを表す、請求項１又は３〜１８のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項２０】
YがOを表す、請求項１又は３〜１９のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項２１】
式（I）の化合物が
【化１０】
0005788320.tif 000131
によって表され、式中、R2及びR3は請求項１に定義されるとおりである、請求項１又は３〜２０のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項２２】
式（I）の化合物が、
5-(ベンゾ[c][1,2,5]チアジアゾール-6-イル)-1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-フェニルイミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2-ヒドロキシ-5-メチルフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2-フルオロ-5-トリフルオロメチル)フェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2-ブロモ-5-フルオロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-プロポキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-クロロ-3-トリフルオロメチル)フェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(3-フルオロ-4(トリフルオロメチル)フェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(3-ヒドロキシ-4-メトキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンズイミダゾール-5-イル)-5-(1,1'-ビフェニル-4-イル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(3-クロロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-クロロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2-クロロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-フルオロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2,3-ジヒドロベンゾ[b][1,4]ジオキシン-7-イル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-フェニルイミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-(2-ブロモ-4-フルオロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-(4-プロポキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-(3-フルオロ-4-(トリフルオロメチル)フェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-[3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル]-5-(4-ビフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-(3-クロロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-(2-クロロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(3-(5-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-フェニルイミダゾリジン-2,4-ジオン；
5-(2-ブロモ-5-フルオロフェニル)-1-(3-(5-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(3-(5-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-(4-プロポキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-[3-(5-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル]-5-(4-フェニルフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
5-(3-クロロフェニル)-1-(3-(5-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(3-(4-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-フェニルイミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-[3-(4-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル]-5-(4-ビフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
5-(3-クロロフェニル)-1-(3-(4-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
3-(1H-ベンズイミダゾール-5-イル)-1',3'-ジヒドロ-2H,5H-スピロ[イミダゾリジン-4,2'-インデン]-2,5-ジオン；
5-(ベンゾ[c][1,2,5]チアジアゾール-6-イル)-1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-2-チオキソイミダゾリジン-4-オン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-フェニル-2-チオキソイミダゾリジン-4-オン；
1-(1H-ベンズイミダゾール-5-イル)-5-(1,1'-ビフェニル-4-イル)-2-チオキソイミダゾリジン-4-オン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(3-ヒドロキシ-4-メトキシフェニル)-2-チオキソイミダゾリジン-4-オン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-フェニル-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン；
1-(1H-ベンズイミダゾール-5-イル)-5-(1,1'-ビフェニル-4-イル)-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン；
3-(1H-ベンズイミダゾール-5-イル)-5-チオキソ-1',3'-ジヒドロ-2H-スピロ[イミダゾリジン-4,2'-インデン]-2-オン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-クロロフェニル)-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2,3,4-トリフルオロフェニル)-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-6-イル)-5-(4-ブロモ-2-フルオロフェニル)-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2,3-ジフルオロ-4-メチルフェニル)-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-クロロ-3-メチルフェニル)-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-3-メチル-5-フェニルイミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(H-イミダゾ[1,2-a]ピリジン-7-イル)-5-フェニルイミダゾリジン-2,4-ジオン；
又はそのすべての互変異性体及び立体異性体、又はそれらの医薬として許容し得る塩、溶媒和物、若しくは多形体から選択される、請求項１又は３〜２１のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記イソQC阻害剤が、下記構造を有する1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-プロポキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン：
【化１１】
0005788320.tif 000132
又はそのすべての互変異性体及び立体異性体、又はそれらの医薬として許容し得る塩、溶媒和物、若しくは多形体である、請求項１又は３〜２２のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記炎症性疾患が、関節リウマチ、粥状硬化、再狭窄、膵炎、及び骨粗鬆症から選択される慢性及び急性炎症である、請求項２記載の使用。
【請求項２５】
前記炎症性疾患が、神経因性疼痛、移植片拒絶反応／移植片不能／移植性脈管障害、HIV感染／エイズ、妊娠中毒症、結節性硬化症、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発性神経根症、及び多発性硬化症から選択される、請求項２又は２４記載の使用。
【請求項２６】
前記炎症性疾患が神経炎症である、請求項２又は２４記載の使用。
【請求項２７】
前記炎症性疾患が、神経炎症から結果として生じ得る神経変性疾患である、請求項２又は２４記載の使用。
【請求項２８】
前記神経変性疾患が、軽度認知障害（MCI）、アルツハイマー病、ダウン症候群における神経変性、家族性英国型認知症、及び家族性デンマーク型認知症から選択される、請求項２７記載の使用。
【請求項２９】
前記薬剤が、前記イソQC阻害剤と組み合わせて、抗炎症薬、向知性薬、神経保護薬、抗パーキンソン病薬、アミロイドタンパク質沈着阻害剤、βアミロイド合成阻害剤、抗うつ薬、抗不安薬、抗精神病薬、及び抗多発性硬化症薬、アンギオテンシン変換酵素（ACE）の阻害剤、アンギオテンシンII受容体遮断薬、利尿薬、カルシウムチャネル遮断薬（CCB）、β遮断薬、血小板凝集阻害剤、コレステロール吸収モジュレーター、HMG-Co-A還元酵素阻害剤、高密度リポタンパク質（HDL）を増加させる化合物、レニン阻害剤、IL-6阻害剤、抗炎症性コルチコステロイド、抗増殖薬、一酸化窒素ドナー、細胞外マトリックス合成の阻害剤、増殖因子又はサイトカインシグナル伝達阻害剤、MCP-1アンタゴニスト、及びチロシンキナーゼ阻害剤からなる群から選択されるさらなる薬剤を含む、請求項２又は２４〜２８のいずれか一項記載の使用。
【請求項３０】
前記疾患及び／又は容態がヒトを苦しめる、請求項２又は２４〜２９のいずれか一項記載の使用。
【請求項３１】
R1が、
【化１２】
0005788320.tif 000133
を表す、請求項２記載の使用。
【請求項３２】
R1が、
【化１３】
0005788320.tif 000134
を表し、
式中、Aが、非分岐の若しくは分岐したC1-6アルキレン鎖を表し、又はAが、分岐したC1-6アルキレン鎖を表し、又はAが(CH2)aCR5R6(CH2)bを表し、かつ
R11、R12、及びR13が独立して、H若しくはC1-2アルキルを表す、請求項２記載の使用。
【請求項３３】
前記式（I）の化合物が下記式：
【化１４】
0005788320.tif 000135
（式中、R2、R3、R4、X、及びYは請求項２に定義されるとおりである。）によって表される、請求項２又は２４〜３２のいずれか一項記載の使用。
【請求項３４】
R2が-ビフェニル-4-イルである、請求項２又は２４〜３３のいずれか一項記載の使用。
【請求項３５】
R2が、同じでも又は異なってもよく、かつ、ハロ、OH、C1-3アルキル、C1-3ハロアルキル、C1-3アルコキシ、C1-3ハロアルコキシから選択される1、2、又は3個の置換基によって任意に置換されたフェニルを表す、請求項２又は２４〜３４のいずれか一項記載の使用。
【請求項３６】
R2が、n-プロピルオキシによって置換されたフェニルである、請求項３５記載の使用。
【請求項３７】
R3がHを表す、請求項２又は２４〜３６のいずれか一項記載の使用。
【請求項３８】
R2及びR3が結合して、フェニルに縮合したカルボシクリル環を形成する、請求項２又は２４〜３６のいずれか一項記載の使用。
【請求項３９】
R4がHを表す、請求項２又は２４〜３８のいずれか一項記載の使用。
【請求項４０】
XがOを表す、請求項２又は２４〜３９のいずれか一項記載の使用。
【請求項４１】
YがOを表す、請求項２又は２４〜４０のいずれか一項記載の使用。
【請求項４２】
式（I）の化合物が
【化１５】
0005788320.tif 000136
によって表され、式中、R2及びR3は請求項２に定義されるとおりである、請求項２又は２４〜４１のいずれか一項記載の使用。
【請求項４３】
式（I）の化合物が、
5-(ベンゾ[c][1,2,5]チアジアゾール-6-イル)-1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-フェニルイミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2-ヒドロキシ-5-メチルフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2-フルオロ-5-トリフルオロメチル)フェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2-ブロモ-5-フルオロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-プロポキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-クロロ-3-トリフルオロメチル)フェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(3-フルオロ-4(トリフルオロメチル)フェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(3-ヒドロキシ-4-メトキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンズイミダゾール-5-イル)-5-(1,1'-ビフェニル-4-イル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(3-クロロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-クロロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2-クロロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-フルオロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2,3-ジヒドロベンゾ[b][1,4]ジオキシン-7-イル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-フェニルイミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-(2-ブロモ-4-フルオロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-(4-プロポキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-(3-フルオロ-4-(トリフルオロメチル)フェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-[3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル]-5-(4-ビフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-(3-クロロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-(2-クロロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(3-(5-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-フェニルイミダゾリジン-2,4-ジオン；
5-(2-ブロモ-5-フルオロフェニル)-1-(3-(5-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(3-(5-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-(4-プロポキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-[3-(5-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル]-5-(4-フェニルフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
5-(3-クロロフェニル)-1-(3-(5-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(3-(4-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-フェニルイミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-[3-(4-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル]-5-(4-ビフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
5-(3-クロロフェニル)-1-(3-(4-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
3-(1H-ベンズイミダゾール-5-イル)-1',3'-ジヒドロ-2H,5H-スピロ[イミダゾリジン-4,2'-インデン]-2,5-ジオン；
5-(ベンゾ[c][1,2,5]チアジアゾール-6-イル)-1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-2-チオキソイミダゾリジン-4-オン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-フェニル-2-チオキソイミダゾリジン-4-オン；
1-(1H-ベンズイミダゾール-5-イル)-5-(1,1'-ビフェニル-4-イル)-2-チオキソイミダゾリジン-4-オン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(3-ヒドロキシ-4-メトキシフェニル)-2-チオキソイミダゾリジン-4-オン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-フェニル-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン；
1-(1H-ベンズイミダゾール-5-イル)-5-(1,1'-ビフェニル-4-イル)-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン；
3-(1H-ベンズイミダゾール-5-イル)-5-チオキソ-1',3'-ジヒドロ-2H-スピロ[イミダゾリジン-4,2'-インデン]-2-オン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-クロロフェニル)-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2,3,4-トリフルオロフェニル)-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-6-イル)-5-(4-ブロモ-2-フルオロフェニル)-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2,3-ジフルオロ-4-メチルフェニル)-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-クロロ-3-メチルフェニル)-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-3-メチル-5-フェニルイミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(H-イミダゾ[1,2-a]ピリジン-7-イル)-5-フェニルイミダゾリジン-2,4-ジオン；
又はそのすべての互変異性体及び立体異性体、又はそれらの医薬として許容し得る塩、溶媒和物、若しくは多形体から選択される、請求項２又は２４〜４２のいずれか一項記載の使用。
【請求項４４】
前記イソQC阻害剤が、下記構造を有する1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-プロポキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン：
【化１６】
0005788320.tif 000137
又はそのすべての互変異性体及び立体異性体、又はそれらの医薬として許容し得る塩、溶媒和物、若しくは多形体である、請求項２又は２４〜４３のいずれか一項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、グルタミニルペプチドシクロトランスフェラーゼ様タンパク質（QPCTL）の阻害剤、並びに炎症性の疾患又は障害の治療及び／又は予防のための該阻害剤の使用に関する。
さらに、本発明は、該阻害剤の使用に基づいた診断キット及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルタミニルシクラーゼ（QC、EC 2.3.2.5）は、アンモニアの遊離下におけるN末端のグルタミン残基のピログルタミン酸（pGlu*）への分子内環化を触媒する。QCは、Messerによって1963年に熱帯植物パパイアのラテックスから最初に単離された（Messer, M.の文献（1963 Nature 4874、1299））。24年後、対応する酵素活性が動物下垂体において発見された（Busby, W. H. J.らの文献（1987 J Biol Chem 262、8532-8536）；Fischer, W. H.及びSpiess, J.の文献（1987 Proc Natl Acad Sci U S A 84、3628-3632））。哺乳動物QCについては、QCによるGlnのpGluへの変換を、TRH、及びGnRHの前駆体について示すことができた（Busby, W. H. J.らの文献（1987 J Biol Chem 262、8532-8536）；Fischer, W. H.及びSpiess，J.の文献（1987 Proc Natl Acad Sci U S A 84、3628-3632））。加えて、QCの初期の局在性実験では、示唆されたペプチドホルモン成熟における機能を更に改善するウシ下垂体におけるその推定上の触媒作用の産物との共局在を明らかにした（Bockers, T. M.らの文献（1995 J Neuroendocrinol 7、445-453））。対照的に、植物QCの生理機能は、あまり明らかではない。パパイア由来の酵素の場合、病原性微生物に対する植物防御における役割が示唆された（El Moussaoui, A.らの文献（2001 Cell Mol Life Sci 58、556-570））。その他の植物由来の推定上のQCが、配列比較によって最近同定された（Dahl, S. W.らの文献（2000 Protein Expr Purif 20、27-36））。しかし、これらの酵素の生理機能は、いまだあいまいである。
【０００３】
植物及び動物由来の公知のQCは、基質のN末端の位置のL-グルタミンに対して厳密な特異性を示し、これらの動力学的挙動は、ミカエリス‐メンテンの式に従うことが見いだされた（Pohl, T.らの文献（1991 Proc Natl Acad Sci U S A 88、10059-10063）；Consalvo, A. P.らの文献（1988 Anal Biochem 175、131-138）；Gololobov, M. Y.らの文献（1996 Biol Chem Hoppe Seyler 377、395-398））。しかし、パパイア由来のQCの一次構造と哺乳類由来の高度に保存されたQCの一次構造との比較では、何ら配列相同性は明らかにならなかった（Dahl, S. W.らの文献（（2000）Protein Expr Purif 20、27-36））。植物QCは、新たな酵素ファミリーに属すると思われるのに対して（Dahl, S. W.らの文献（（2000）Protein Expr Purif 20、27-36））、哺乳類のQCは、細菌アミノペプチダーゼに対して明白な配列相同性を有することが見いだされ（Bateman, R. C.らの文献（2001 Biochemistry 40、11246-11250））、植物及び動物由来のQCが異なる進化の起源を有するという結論に至った。
【０００４】
最近、組換えヒトQCに加え、脳抽出物由来のQC活性は、N-末端グルタミニルに加えグルタミン酸の両方の環化を触媒することが示された。シクラーゼが触媒したGlu1-変換は、およそpH6.0で好ましいのに対し、pGlu-誘導体へのGln1-変換は、至適pHおよそ8.0で生じるという知見は、最も特筆すべきである（Schillingらの文献（2004, FEBS-Letters 563 (1-3) 191-196））。pGlu-Aβ-関連ペプチドの形成は、組換えヒトQCの阻害及びブタ下垂体抽出物由来のQC-活性の阻害により抑制することができるので、酵素QCは、アルツハイマー病治療のための薬物開発の標的である（Schillingらの文献（2008, Nature Medicine 14, 1106-1111））。
その上、「イソQC」又は「QPCTL」と呼ばれるQCのイソ酵素が存在することが、最近WO 2008/034891に示された。
【０００５】
走化性サイトカイン（ケモカイン）は、白血球を誘引して活性化するタンパク質であり、炎症において基本的役割を担うと考えられる。ケモカインは、N末端のシステイン残基の様相によって分類される4群に分けられる（「C」-；「CC」-；「CXC」-、及び「CX3C」-ケモカイン）。「CXC」-ケモカインは、好中球に対して優先して作用する。対照的に、「CC」-ケモカインは、優先して単球を炎症部位に誘引する。単球浸潤は、多数の疾患容態における重要な事象であると考えられる（Gerard, C.及びRollins, B. J.の文献 （（2001）Nat. Immunol 2、108-115）；Bhatia, M.らの文献（（2005）Pancreatology. 5, 132-144）；Kitamoto, S., Egashira K.及びTakeshita, A.の文献（（2003）J Pharmacol Sci. 91, 192-196））。ケモカインの1つのファミリーとしてのMCPファミリーは、4つのメンバー（MCP-1〜4）からなり、単球を誘引することに対して好性を示すが、それらの潜在能力に相違を示す（Luini, W.らの文献（（1994）Cytokine 6、28-31）；Uguccioni, M.らの文献（（1995）Eur J Immunol 25、64-68））。
【０００６】
多数の研究が、特に、粥状硬化（Gu, L.らの文献（（1998）Mol. Cell 2、275-281）；Gosling, J.らの文献（（1999）J Clin. Invest 103、773-778））；関節リウマチ（Gong,J. H.らの文献（（1997）J Exp. Med 186、131-137）；Ogata, H.らの文献（（1997）J Pathol. 182, 106-114））；膵炎（Bhatia, M.らの文献（2005）（Am. J Physiol Gastrointest.Liver Physiol 288、G1259-G1265））；アルツハイマー病（Yamamoto M.らの文献（（2005）Am. J Pathol. 166, 1475-1485））；肺線維症（Inoshima, I.らの文献（（2004）Am. J Physiol Lung Cell Mol. Physiol 286、L1038-L1044））；腎臓線維症（Wada, T.らの文献（（2004）J Am. Soc. Nephrol. 15、940-948））、及び移植片拒絶反応（Saiura, A.らの文献（（2004）Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24  1886-1890））の発症に関するMCP-1の重要な役割を強調してきた。更にまた、MCP-1は、妊娠中毒症においても（Katabuchi, H.らの文献（（2003）Med Electron Microsc. 36、253-262））、腫瘍発症（Ohta, M.らの文献（（2003）Int. J Oncol. 22, 773-778）；Li, S.らの文献（（2005）J Exp. Med 202、617-624））、神経因性疼痛（White, F. A.らの文献（（2005）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A））、及びエイズ（Park, I. W., Wang、J. F.及びGroopman, J. E.（（2001）Blood 97, 352-358）；Coll, B.らの文献（（2006）Cytokine 34、51-55））におけるパラ分泌因子としても、役割を担っているかもしれない。
【０００７】
ヒト、及び齧歯類MCP-1の成熟形態は、グルタミニルシクラーゼ（QC）によって、N末端のピログルタミル（pGlu）残基を有するように翻訳後修飾される。MCP-1の走化性能は、そのN末端によって媒介されるため（Van Damme, J.らの文献（（1999）Chem Immunol 72、42-56））、N末端のpGlu修飾は、アミノペプチダーゼによるN末端分解に対して該タンパク質を耐性にし、これは重要なものである。人工的な伸長、又は分解は、機能喪失を引き起こすが、MCP-1は、なおもその受容体（CCR2）に結合する（Proost, P.らの文献（（1998）J Immunol 160、4034-4041）；Zhang, Y. J.らの文献（1994、J Biol. Chem 269、15918-15924）；Masure, S.らの文献（1995 J Interferon Cytokine Res. 15、955-963）；Hemmerich, S.らの文献（（1999）Biochemistry 38、13013-13025））。
【０００８】
多数の疾患容態におけるMCP-1の主要な役割のため、抗MCP-1ストラテジーが必要とされる。従って、MCP-1の作用を阻害する経口的に利用できる低分子化合物は、薬物開発のための有望な候補である。このような化合物は、例えば、WO 2008/104580に示されるQCの阻害剤である。
【０００９】
冠血流を制限し又は妨げる粥状硬化病変は、虚血性心疾患に関連した死亡率の主要な原因であり、毎年500,000〜600,000人の死を生じる。閉塞した動脈を開放するための経皮経管的冠動脈形成術（PTCA）は、1996年に米国において550,000人を超える患者、及び世界中で945,000人を超える患者において行われた（Lemaitreら、1996）。この技術の主要な制限は、PTCAの直後（急性閉塞）、及び長期間（再狭窄）の両方の、PTCA後の血管閉鎖の問題であり：部分的病変患者の30％、及び慢性総病変患者の50％は、血管形成術の後に再狭窄に進行するであろう。加えて、再狭窄は、伏在静脈バイパス移植を受けている患者においても重大な問題である。急性閉塞の機序には、いくつかの因子が関与するようであり、新たに開放された血管の損傷を受けた長さに沿って結果として生じる動脈の閉鎖、及び／又は血小板の沈着を伴う血管反跳、続くフィブリン／赤血球血栓の形成により生じ得る。
【００１０】
血管形成術後の再狭窄は、よりゆっくりとした過程であり、粘着性血小板からの細胞由来増殖因子の放出を伴い、その後の内膜平滑筋細胞の増殖、及び血管過形成に寄与する炎症細胞の局所浸潤を伴う、決定的とまではいかない血栓症の初期の形成に関与する。これらの血栓症、細胞増殖、細胞遊走、及び炎症のうちの複数の過程が、それぞれ再狭窄過程に寄与するようであることに留意することが重要である。
【００１１】
米国では、30〜50%の再狭窄の割合は、再狭窄による危険性のある120,000〜200,000人の米国患者と解釈される。このような患者の80％のみが、繰り返し血管形成術を選び（残りの20％が、冠状動脈バイパス移植を選ぶ）、これが残りの20％のための冠状動脈バイパス移植の費用に追加される場合、再狭窄治療のための合計費用は、米国において容易に何十億ドルもの金額になる。従って、再狭窄をうまく予防することにより、有意な治療的利益だけでなく、有意な保健医療の節約をもたらし得る。
【００１２】
先に概略したように、単球化学誘引物質タンパク質1（MCP-1、CCL2）は、炎症の部位への白血球、特に単球、マクロファージ、及びT細胞の輸送を調節する強力な走化性サイトカイン（CCケモカイン）のファミリーに属する（Charo, I.F.及びTaubman, M. B. の文献（（2004） Circ. Res. 95, 858-866））。例えば血管疾患におけるMCP-1の役割の他に、説得力のある証拠が、アルツハイマー病（AD）におけるMCP-1の役割を示す（Xia, M.Q.及びHyman, B.T. （（1999）J Neurovirol. 5, 32-41））。老人斑における、及び反応性ミクログリアにおけるMCP-1の存在、中枢神経系の常在性マクロファージが、ADに罹患している患者の脳において観察された（Ishizuka, K.らの文献（（1997）Psychiatry Clin. Neurosci. 51, 135-138））。アミロイド-βタンパク質（Aβ）による単球及びミクログリアへの刺激は、インビトロにおいてケモカイン分泌を誘導し（Meda, L.らの文献（1996）J Immunol 157、1213-1218；Szczepanik, A.M.らの文献（2001）J Neuroimmunol. 113、49-62）、マウス海馬へのAβ（1-42）の脳血管内注入は、インビボにおいて有意にMCP-1を増加させる。その上、Aβ沈着は、ミクログリア細胞を誘引及び活性化し、該細胞にMCP-1などの炎症性メディエーターを産生させて、これが次にさらなる走化性、活性化、及び組織損傷を誘導するようにフィードバックを引き起こす。Aβ沈着の部位では、また、活性化されたミクログリアがAβペプチドを貪食して、活性化の増幅を引き起こす（Rogers, J.及びLue, L.F. の文献（（2001）Neurochem. Int. 39, 333-340））。
【００１３】
ADのための3xTgマウスモデルにおけるケモカイン発現の試験では、ニューロン炎症がプラーク形成に先行すること、及びMCP-1が11倍にアップレギュレートされることが明らかになった。更にまた、MCP-1のアップレギュレーションは、最初の細胞内Aβ沈着の発生と相関するようである（Janelsins, M.C.らの文献（（2005）J Neuroinflammation. 2, 23））。ADのためのTg2575マウスモデルとMCP-1を過剰発現するマウスモデルとの交雑では、Aβ沈着周辺に高いミクログリア蓄積を示し、この蓄積は、単一のトランスジェニックTg2576同腹仔と比較して、高い量の散在性プラークを伴った（Yamamoto,, M.らの文献（（2005）Am. J Pathol. 166, 1475-1485））。
【００１４】
MCP-1レベルは、AD患者、及び軽度認知障害（MCI）を示す患者の脳脊髄液において高い（Galimberti, D.らの文献（（2006）Arch. Neurol. 63, 538-543））。更にまた、MCP-1は、MCI患者及び初期AD患者の血清において高いレベルを示す（Clerici, F.らの文献（（2006）Neurobiol. Aging 27、1763-1768））。
【００１５】
骨粗鬆症は、典型的にエストロゲンの枯渇の結果として骨を損失する疾患である。破骨細胞形成の過程は、骨粗鬆症における中心的な役割を担っている。破骨細胞形成は、単球及びマクロファージの系列からの前破骨細胞（preosteoclast）の増殖だけでなく、該細胞の破骨細胞への分化にも関与する多工程事象である。高い破骨細胞活性は、エストロゲン欠乏によって仲介される骨の損失についての主な理由である。Binderらは、ケモカイン受容体CCR2が、閉経後骨粗鬆症に至る病理機序に関与することを示している。Ccr2-/-マウスは、エストロゲン欠乏により仲介された骨損失から保護され、この効果は、破骨細胞を介して仲介された（Binderらの文献（2009 Nat Med. Apr; 15(4), 417-24））。その上また、エストロゲンは、MCP-1をダウンレギュレートすることも示されており、閉経前及び閉経後の女性を比較する試験は、後者の群においてMCP-1の高い発現があることを示した。Binderらはさらに、MCP-1欠乏マウスが中間的な骨表現型のみを示すことを、すなわち、MCP-1が骨粗鬆症において役割を担っているCCR2についての唯一のリガンドではないことを発見した。Binderらは、CCR2のリガンドでもあるMCP-3が、CCR2の存在下で同様の破骨細胞形成促進性効果を有し、MCP-1と置換することができることを示した（Binderらの文献（2009 Nat Med. Apr; 15(4), 417-24））。
【００１６】
このように、炎症性疾患の治療のための新規の可能性を提供することが本発明の目的である。特に、4つのメンバー（MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-3、及びMCP-4）からなるケモカインのMCPファミリーに影響を与える改善されたアプローチを提供することが望ましい。より特別には、ケモカインMCP-1に影響を与える改善されたアプローチを提供することが、本発明の目的である。
これらの目的は、本発明によって解決される。
【発明の概要】
【００１７】
（発明の要旨）
本発明は、イソグルタミニルペプチドシクロトランスフェラーゼ（イソQC）の阻害剤、並びに下記から選択される炎症性疾患からなる群から選択される疾患又は障害の治療及び／又は予防のための該阻害剤の使用に関する
a．慢性及び急性炎症、例えば関節リウマチ、粥状硬化、再狭窄、膵炎、骨粗鬆症
b．他の炎症性疾患、例えば、神経因性疼痛、移植片拒絶反応／移植片不能／移植性脈管障害、HIV感染／エイズ、妊娠中毒症、結節性硬化症、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発性神経根症、及び多発性硬化症、
c．神経炎症、並びに
d．神経炎症の結果として生じ得る神経変性疾患、例えば、軽度認知障害（MCI）、アルツハイマー病、ダウン症候群における神経変性、家族性英国型認知症、及び家族性デンマーク型認知症。
【００１８】
イソQCの阻害剤は、ペプチドホルモン及びケモカイン、例えばケモカインMCP-1、MCP-2、MCP-3、及び／又はMCP-4のN末端におけるpGlu形成の重要な工程を予防する経口的に利用可能な低分子化合物である。結果として、イソQC阻害に起因して、MCP-1、MCP-2、MCP-3、及び／又はMCP-4のN末端は、pGlu残基によって保護されない。代わりに、N末端は、アミノぺプチダーゼ、例えばジペプチジルペプチダーゼ様ジペプチジルペプチダーゼ4、他のアミノぺプチダーゼ、例えば、アミノぺプチダーゼP又はアミノぺプチダーゼN、並びに内皮上及び血液循環内に豊富にある線維芽細胞活性化タンパク質（FAP、セプラーゼ）によって切断する傾向にあるグルタミン-プロリンモチーフを有する。この切断の結果、N末端を切断されたMCP-1、MCP-2、MCP-3、及び／又はMCP-4の形成が生じる。これらの分子は次に、CCR2受容体におけるアンタゴニスト性作用を展開し、それゆえ、単球関連疾患容態は効率よく阻害される。この点において特に好ましいのは、MCP-1のN末端におけるpGlu形成の阻害である。
【００１９】
（定義）
（酵素阻害剤）
可逆的酵素阻害剤は、競合的阻害剤、非競合的可逆的阻害剤、ゆっくりと結合し又は密に結合する阻害剤、遷移状態類似体、及び多基質類似体を含む。
【００２０】
競合的阻害剤は、
i）酵素との非共有結合性相互作用
ii）酵素活性部位についての基質との競合
を示す。
可逆的酵素阻害剤の主要な作用機序、及び解離定数の定義は、以下の通りに視覚化することができる：
【化１】
0005788320.tif 000002
【００２１】
酵素阻害剤[E-I］複合体の形成は基質の結合を妨げ、従って、反応は、正常な生理学的産物Pへ進むことができない。阻害剤濃度[I］が高いほど、より高い[E-I］を生じて、基質が結合することのできる遊離酵素が少ししか残らない。
【００２２】
非競合的可逆的阻害剤は、
i）活性部位以外の部位（アロステリックな結合部位）に結合する
ii）酵素の高次構造上の変化を生じさせて、触媒活性を低下又は停止させる。
【００２３】
緩慢結合、又は緊密結合する阻害剤は、
i）阻害剤と酵素の間の平衡にゆっくりと到達する競合的阻害剤であり、
ii）（kオンが、緩徐である）おそらく酵素、又は阻害剤において生じなければならない高次構造上の変化に起因して
a）たいてい遷移状態類似体であり
b）酵素濃度と同様の濃度において有効であり（nM以下のKD値）
c）kオフ値が非常に低いため、この種の阻害剤は、「ほぼ」不可逆的である。
【００２４】
遷移状態類似体は、酵素で触媒される反応の遷移状態を模倣する競合的阻害剤である。酵素触媒作用は、遷移状態のエネルギーの低下によって生じ、従って、基質結合よりも遷移状態結合が選択される。
【００２５】
多基質類似体
2つ以上の基質を含む反応については、2つ以上の基質に似ている構造的特徴を含む競合的阻害剤又は遷移状態類似体を設計することができる。
【００２６】
不可逆的酵素阻害剤：結合していない酵素及び阻害剤と酵素阻害剤複合体の間の平衡（E＋I＜―――＞E-I）を完全に共有結合でE-I側に押しやり（〜100 kcal/mol）、阻害を不可逆的にする。
【００２７】
（親和性標識薬剤）
活性部位に配向した不可逆的阻害剤（競合的不可逆的阻害剤）は、酵素（可逆的な特異的結合）によって、続いて共有結合形成によって認識され、かつ、
i）基質、遷移状態、又は産物に構造的に類似し、薬物と標的酵素の間で特異的に相互作用することができ、
ii）反応性官能基（例えば、求核試薬、-COCH2Br）を含み、共有結合を形成することができる。
【００２８】
下記の反応スキームは、その標的酵素を用いて活性部位に配向した試薬を説明し、式中、KDは、解離定数であり、かつk失活は、共有結合形成の速度である。
【化２】
0005788320.tif 000003
【００２９】
機序に基づいた酵素失活剤（自殺的阻害剤とも呼ばれる）は、酵素の触媒の能力によって反応性の形態（活性化型）に形質転換される酵素活性部位に結合する活性部位に配向した試薬（非反応性）である。一旦活性化されると、阻害剤と酵素の間に共有結合が形成される。
【００３０】
下記の反応スキームは、機序に基づいた酵素失活剤の作用機序を示し、式中KDは、解離複合体であり、k2は、一旦酵素に結合した阻害剤の活性化の速度であり、k3は、活性化された阻害剤Pの酵素からの（産物は、なおも反応性であり得る）解離の速度であり、かつk4は、活性化された阻害剤と酵素との間の共有結合形成の速度である。
【化３】
0005788320.tif 000004
【００３１】
失活（共有結合形成、k4）は、解離（k3）の前に生じなければならず、さもなければ、ここで、反応性の阻害剤は、環境に放出される。分配比、k3/k4：不活性化に対する放出された産物の比は、系の効率的な不活性化、及び最小の望ましくない副反応のために最小化されるべきである。
【００３２】
大きな分配比では（解離を選択する。）、非特異的反応を引き起こす。
【００３３】
非競合的酵素阻害剤：非競合的阻害剤（ES複合体に対してのみ結合する阻害剤）の定義として、以下の平衡を想定することができる：
【化４】
0005788320.tif 000005
【００３４】
ES複合体は、Ksと同じ解離定数で基質を分離するが、ESI複合体は、それを分離しない（すなわち、ゼロに等しいKs値を有する）。ミカエリス-メンテン型酵素のKmは、低いことが予想される。基質濃度を増大させるとESI濃度の増大を引き起こし（反応産物へと進行することができない複合体）、従って、阻害は、除去することができない。
【００３５】
可逆的酵素阻害剤が、本発明では好ましい。
競合的酵素阻害剤が、本発明では最も好ましい。
【００３６】
「Ki」、又は「KI」、及び「KD」という用語は、酵素に対する阻害剤の結合、及びその後の遊離を説明する結合定数である。別の尺度は、「IC50」値であり、これは、阻害剤濃度を反映し、かつ所与の基質濃度にて、50％の酵素活性を生じる。
【００３７】
（医薬として許容し得る塩）
遊離化合物とこれらの塩又は溶媒和物の形態の化合物の間の緊密な関係からみて、化合物又は阻害剤が、それぞれ、この状況において引用されるときはいつでも、対応する塩又は溶媒和物も意図されるが、ただし、このようなものが本状況下で可能であり、又は適切であることを条件とする。
【００３８】
本発明の阻害剤の塩及び溶媒和物、並びに医薬に使用するために適したそれらの生理的に機能的な誘導体は、対イオン又は関連する溶媒が医薬として許容し得るものである。しかし、医薬として許容し得ない対イオン又は関連する溶媒を有する塩及び溶媒和物も、例えばその他の化合物並びにその医薬として許容し得る塩及び溶媒和物の製造における中間体として使用するために、本発明の範囲内である。
【００３９】
本発明に従った適切な塩には、有機及び無機の両方の酸又は塩基を用いて形成されたものを含む。医薬として許容し得る酸付加塩には、以下から形成されたものを含む：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、クエン酸、酒石酸、リン酸、乳酸、ピルビン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、トリフェニル酢酸、スルファミン酸、スルファニル酸、コハク酸、シュウ酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、オキサロ酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、アリールスルホン酸（例えば、p-トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、又はナフタレンジスルホン酸）、サリチル酸、グルタル酸、グルコン酸、トリカルバリル酸、ケイ皮酸、置換されたケイ皮酸（例えば、4-メチル、及び4-メトキシケイ皮酸を含むフェニル、メチル、メトキシ、又はハロ置換されたケイ皮酸）、アスコルビン酸、オレイン酸、ナフトエ酸、ヒドロキシナフトエ酸（例えば1-、又は3-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸）、ナフタレンアクリル酸（例えば、ナフタレン-2-アクリル酸）、安息香酸、4-メトキシ安息香酸、2-、又は4-ヒドロキシ安息香酸、4-クロロ安息香酸、4-フェニル安息香酸、ベンゼンアクリル酸（例えば1,4-ベンゼンジアクリル酸）、イセチオン酸、過塩素酸、プロピオン酸、グリコール酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、パモ酸、シクロヘキサンスルファミン酸、サリチル酸、サッカリン酸、及びトリフルオロ酢酸。医薬として許容し得る塩基塩には、アンモニウム塩、ナトリウム及びカリウムの塩などのアルカリ金属塩、カルシウム及びマグネシウムの塩などのアルカリ土類金属塩、並びにジシクロヘキシルアミン及びN-メチル-D-グルタミンなどの有機塩基を有する塩を含む。
【００４０】
本発明の阻害剤のすべての医薬として許容し得る酸付加塩形態は、本発明の範囲によって包含されることが意図される。
溶媒和物の例には、水和物を含む。
【００４１】
（多形結晶形）
更にまた、阻害剤の結晶形のいくつかは、多形として存在してもよく、それ自体、本発明に含まれることが意図される。加えて、化合物のいくつかは、水との溶媒和物（すなわち、水和物）、又は普遍的な有機溶媒との溶媒和物を形成するであろうし、このような溶媒和物も、また本発明の範囲内に包含されることが意図される。これらの塩を含む阻害剤はまた、それらの水和物の形態で得ることもでき、又はこれらの結晶化のために使用されるその他の溶媒を含む。
【００４２】
（プロドラッグ）
本発明は、その範囲内に本発明の阻害剤のプロドラッグを更に含む。一般に、このようなプロドラッグは、インビボで所望の治療活性のある阻害剤に容易に変換できる阻害剤の機能的誘導体であるだろう。従って、これらの場合、本発明の治療の方法において、「投与すること」という用語には、項目に挙げた阻害剤のうちの1つ以上に関するプロドラッグバージョンだが、対象への投与後にインビボで上記の指定した阻害剤に変換するプロドラッグバージョンを用いての、記載した種々の障害の治療を包含するであろう。例えば、適切なプロドラッグ誘導体の選択、及び製造のための従来の手順は、例えばH. Bundgaardの文献（「プロドラッグの設計（"Design of Prodrugs"）」, Elsevier, 1985）、及び特許出願DE 198 28 113、DE 198 28 114、WO99/67228、及びWO99/67279に説明されており、これらは、引用により本明細書中に完全に組み込まれている。
【００４３】
（保護基）
本発明の阻害剤の製造のための方法のいずれの間にも、関係する分子のいずれかに対して感応基若しくは反応基を保護することが必要であり及び／又は望ましいかもしれない。これは、引用により本明細書中に完全に組み込まれているJ.F.W. McOmieの文献（「有機化学における保護基（Protective Groups in Organic Chemistry）」, Plenum Press, 1973）；並びにT.W. Greene及びP.G.M. Wutsの文献（「有機合成における保護基（Protective Groups in Organic Synthesis）」, John Wiley & Sons, 1991）において説明した保護基などの、従来の保護基によって達成してもよい。保護基は、当該技術分野において公知の方法を使用して、都合の良いその後の段階で除去してもよい。
【００４４】
本明細書に使用される「組成物」という用語は、治療的有効量の問題の化合物を含む産物、並びに項目に挙げた化合物の組み合わせから直接的に又は間接的に生じる任意の産物を包含することが意図される。
【００４５】
（化学的定義）
本明細書及び特許請求の範囲を通じて、表現「アルキル」は、特に限定しない限りは、C1-12アルキル基、適切にはC1-6アルキル基、例えばC1-6アルキル基、例えばC1-4アルキル基を意味する。アルキル基は、直鎖又は分岐鎖であってよい。適切なアルキル基には、例えばメチル、エチル、プロピル（例えばn-プロピル及びイソプロピル）、ブチル（例えばn-ブチル、iso-ブチル、sec-ブチル及びtert-ブチル）、ペンチル（例えばn-ペンチル）、ヘキシル（例えばn-ヘキシル）、ヘプチル（例えばn-ヘプチル）及びオクチル（例えばn-オクチル）を含む。例えば、「アルコキシ」、「ハロアルキル」及び「チオアルキル」の表現において、表現「アルキ（alk）」は、「アルキル」の定義に従い解釈されるべきである。典型的なアルコキシ基には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ（例えばn-プロポキシ）、ブトキシ（例えばn-ブトキシ）、ペントキシ（例えばn-ペントキシ）、ヘキソキシ（例えばn-ヘキソキシ）、ヘプトキシ（例えばn-ヘプトキシ）及びオクトキシ（例えばn-オクトキシ）を含む。典型的なチオアルキル基には、メチルチオ-を含む。典型的なハロアルキル基には、フルオロアルキル、例えばCF3を含む。
【００４６】
表現「アルケニル」は、特に限定しない限りは、C2-12アルケニル基、適切にはC2-6アルケニル基、例えば、C2-4アルケニル基を意味し、少なくとも1個の二重結合を任意の所望する位置に含み、かつ三重結合は含まない。アルケニル基は、直鎖又は分岐鎖であってよい。1個の二重結合を含む典型的なアルケニル基には、プロペニル及びブテニルを含む。2個の二重結合を含む典型的なアルケニル基には、ペンタジエニル、例えば(1E,3E)-ペンタジエニルを含む。
【００４７】
表現「アルキニル」は、特に限定しない限りは、C2-12アルキニル基、適切にはC2-6アルキニル基、例えば、C2-4アルキニル基を意味し、少なくとも1個の三重結合を任意の所望する位置に含み、かつ1個以上の二重結合を含んでいても含んでいなくてもよい。アルキニル基は、直鎖又は分岐鎖であってよい。典型的なアルキニル基には、プロピニル及びブチニルを含む。
表現「アルキレン」は、式-(CH2)n-の鎖を意味し、式中nは、特に限定しない限りは、整数であり、例えば2〜5である。
【００４８】
表現「シクロアルキル」は、特に限定しない限りは、C3-10シクロアルキル基（すなわち、3〜10個の環炭素原子）、より適切にはC3-8シクロアルキル基、例えばC3-6シクロアルキル基を示す。典型的なシクロアルキル基には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル及びシクロオクチルを含む。環炭素原子の最も適切な数は、3〜6個である。
【００４９】
表現「シクロアルケニル」は、特に限定しない限りは、C5-10シクロアルケニル基（すなわち5〜10個の環炭素原子）、より適切にはC5-8シクロアルケニル基、例えばC5-6シクロアルケニル基を示す。典型的なシクロアルケニル基には、シクロプロペニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル及びシクロオクテニルを含む。環炭素原子の最も適切な数は、5〜6個である。
【００５０】
表現「カルボシクリル」は、特に限定しない限りは、すべての環原子が炭素であり、かつ3〜12個の炭素原子を、適切には3〜10個の炭素原子を、より適切には3〜8個の炭素原子を含む、任意の環系を示す。カルボシクリル基は、飽和又は部分的に不飽和であってよいが、芳香環は含まない。カルボシクリル基の例には、単環式、二環式、及び三環式の環系を含み、特に単環式及び二環式の環系である。他のカルボシクリル基には、架橋した環系（例えばビシクロ[2.2.1]ヘプテニル）を含む。カルボシクリル基の具体例は、シクロアルキル基である。カルボシクリル基の更なる例は、シクロアルケニル基である。
【００５１】
表現「ヘテロシクリル」は、特に限定しない限りは、1個以上（例えば1、2又は3個）の環原子が、N、S及びOから選択されるヘテロ原子により置換されているカルボシクリル基を指す。ヘテロシクリル基の具体例は、シクロアルキル基（例えばシクロペンチル、又はより特別にはシクロヘキシル）であり、1個以上（例えば1、2又は3個、特に1又は2個、特別には1個）の環原子が、N、S又はOから選択されるヘテロ原子により置換されている。1個のヘテロ原子を含む典型的なヘテロシクリル基には、ピロリジン、テトラヒドロフラン及びピペリジンを含み、並びに2個のヘテロ原子を含む典型的なヘテロシクリル基には、モルフォリン及びピペラジンを含む。ヘテロシクリル基の更なる具体例は、1個以上（例えば1、2又は3個、特に1又は2個、特別には1個）の環原子が、N、S及びOから選択されるヘテロ原子により置換されているシクロアルケニル基（例えばシクロヘキセニル基）である。このような基の例は、ジヒドロピラニル（例えば3,4-ジヒドロ-2H-ピラン-2-イル-）である。
【００５２】
表現「アリール」は、特に限定しない限りは、C6-12アリール基、適切にはC6-10アリール基、より適切にはC6-8アリール基を示す。アリール基は、少なくとも1個の芳香環（例えば1又は2又は3個の環）を含む。1個の芳香環を伴う典型的アリール基の例は、フェニルである。2個の芳香環を伴う典型的アリール基の例は、ナフチルである。
【００５３】
表現「ヘテロアリール」は、特に限定しない限りは、1個以上（例えば、1、2、3又は4個、適切には1、2又は3個）の環原子が、N、S及びOから選択されるヘテロ原子により置換されているアリール残基か、若しくはさもなければN、S及びOから選択される1個以上（例えば、1、2、3又は4個、適切には1、2又は3個）の環原子を含む5員の芳香環を示す。1個のヘテロ原子を有する典型的な単環式ヘテロアリール基には下記を含む：5員環（例えば、ピロール、フラン、チオフェン）；及び6員環（例えば、ピリジン-2-イル、ピリジン-3-イル、及びピリジン-4-イルなどのピリジン）である。2個のヘテロ原子を有する典型的な単環式ヘテロアリール基には下記を含む：5員環（例えば、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、イミダゾール-1-イル、イミダゾール-2-イル、イミダゾール-4-イルなどのイミダゾール）；6員環（例えば、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン）。3個のヘテロ原子を有する典型的な単環式ヘテロアリール基には下記を含む：1,2,3-トリアゾール及び1,2,4-トリアゾール。4個のヘテロ原子を有する典型的な単環式ヘテロアリール基にはテトラゾールを含む。典型的な二環式ヘテロアリール基には下記を含む：インドール（例えば、インドール-6-イル）、ベンゾフラン、ベンズチオフェン（benzthiophene）、キノリン、イソキノリン、インダゾール、ベンズイミダゾール、ベンズチアゾール（benzthiazole）、キナゾリン及びプリン。
【００５４】
表現「-アルキルアリール」は、特に限定しない限りは、アルキレン部分、例えばC1-4アルキレン部分を介して結合されているアリール残基を示す。
表現「-アルキルヘテロアリール」は、特に限定しない限りは、アルキレン部分、例えばC1-4アルキレン部分を介して結合されているヘテロアリール残基を示す。
【００５５】
用語「ハロゲン」又は「ハロ」は、フッ素（F）、塩素（Cl）及び臭素（Br）を含む。
用語「アミノ」は、-NH2基を指す。
用語「フェニルによって置換されたフェニル」はビフェニルを指す。
【００５６】
用語「
【化５】
0005788320.tif 000006
」は、立体化学が定義されていない単結合を示す。
ベンズイミダゾリルが、下記式：
【化６】
0005788320.tif 000007
として表されるベンズイミダゾリル-5-イルとして示される場合、当業者は、下記式：
【化７】
0005788320.tif 000008
として表されるベンズイミダゾール-6-イルが等価の構造であることを認識するであろう。本明細書で採用されるように、2つの形態のベンズイミダゾリルは、用語「ベンズイミダゾール-5-イル」によって包含される。
このことは、すべての同様の状況に準用して適用する。
【００５７】
（本草薬製剤のための担体及び添加物）
例えば懸濁液、エリキシル剤、及び溶液などの液体経口製剤については、適切な担体、及び添加物には、水、グリコール、油、アルコール、調味料、保存料、着色料等を都合よく含んでいてもよく；例えば散剤、カプセル剤、ジェルキャップ剤、及び錠剤などの固体経口製剤については、適切な担体及び添加物には、デンプン、糖、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤等を含む。
【００５８】
混合物に添加することができる担体には、適切な結合剤、懸濁剤、潤滑剤、香料、甘味料、保存料、コーティング、崩壊剤、色素、及び着色料を含むがこれらに限定されるわけではない、必要かつ不活性な医薬賦形剤を含む。
【００５９】
標的可能な薬剤担体としての可溶性重合体には、パルミトイル残基（類）で置換された、ポリビニルピロリドン、ピラン共重合体、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドフェノール、又はポリエチレンオキシドポリリジンを含むことができる。更に、本発明の阻害剤は、薬物の徐放性／持効性を達成するのに有用な生分解性重合体の種類、例えばポリ乳酸、ポリ-イプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリル酸、及び架橋されたか、又は両親媒性のヒドロゲルのブロック共重合体に結合していてもよい。
【００６０】
適切な結合剤には、デンプン、ゼラチン、グルコース、又はβ-乳糖などの天然の糖、トウモロコシ甘味料、アカシア、トラガカント、又はオレイン酸ナトリウムなどの天然及び合成ゴム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等を含むが、これらに限定されるわけではない。
崩壊剤には、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンゴム等を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００６１】
（アンタゴニスト）
本明細書で使用される用語「アンタゴニスト」は、QPCTLに結合した場合に、QPCTLの生物学的又は免疫学的活性の効果の量又は時間を低下させる阻害剤分子、例えば、該ぺプチダーゼの酵素活性を低下させて、QPCTL基質のN末端におけるGlu残基又はGln残基を環化させる阻害剤分子を指す。アンタゴニストには、タンパク質、核酸、炭水化物、抗体、又はQPCTLの効果を低下させるその他の分子を含んでもよく；例えば、該アンタゴニストには、QPCTLに結合し、かつ競合的又は非競合的な種類の機序によってQPCTLを失活させる低分子及び有機化合物を含んでもよい。QPCTLの低分子阻害剤が好ましい。QPCTLの競合的低分子阻害剤が最も好ましい。
【００６２】
（QC）
本明細書で使用される用語「QC」は、グルタミニル-ペプチドシクロトランスフェラーゼ（QPCT）と同義のグルタミニルシクラーゼ（QC）を含み；その一方で、イソQCはQC様酵素を指し、グルタミニル-ペプチドシクロトランスフェラーゼ様タンパク質（QPCTL）と同義である。QC及びQC様酵素は、「QC活性」又は「イソQC活性」としてさらに定義される類似の酵素活性を有する。しかしながら、QC様酵素は基本的に、その分子構造がQCとは異なり得る。
【００６３】
本実施態様記載の及び本発明の説明を通じての用語「グルタミニルシクラーゼ（QC）」は、種々の種、例えば、哺乳類、昆虫、又は植物のQC由来のグルタミニルシクラーゼ酵素を含む。好ましくは、本発明の説明を通じての本実施態様記載のグルタミニルシクラーゼ（QC）は、哺乳類QCであり、より好ましくは例えばマウス又はラット由来の齧歯類QCであるが、最も好ましくは、ヒトQCである。
【００６４】
同様に、本発明の説明を通じての本実施態様記載の用語「イソ-グルタミニルシクラーゼ（イソQC、QPCTL）」は、種々の種、例えば、哺乳類、昆虫、又は植物のイソQC由来のイソ-グルタミニルシクラーゼを含む。好ましくは、本実施態様記載の及び本発明の説明を通じてのイソ-グルタミニルシクラーゼ（イソQC）は、哺乳類イソQCであり、より好ましくは例えばマウス又はラット由来の齧歯類イソQCであるが、最も好ましくはヒトイソQCである。イソグルタミニルシクラーゼ酵素は、その核酸配列及びアミノ酸配列においてグルタミニルシクラーゼ酵素とは異なる。
【００６５】
（QC活性）
「QC活性」は、グルタミニルシクラーゼ（QC、QPCT）及びQC様酵素（QPCTL）の触媒活性として定義される。これらの酵素は、腎臓、肝臓、腸、脳、及び脳脊髄液等の体液を含む哺乳類の身体の種々の組織において見つかっており、該酵素は、生物学的に活性のあるペプチドのN末端でグルタミン又はグルタミン酸を高い特異性で環化させる。
【００６６】
特に、本明細書で使用される用語「QC活性」又は「イソQC活性」は、アンモニアの遊離の下でN末端グルタミン残基からピログルタミン酸（pGlu*）への、又はN末端L-ホモグルタミン若しくはL-α-ホモグルタミンから環状ピロ-ホモグルタミン誘導体への分子内環化として定義される。したがって、スキーム1及び2を参照されたい。
【化８】
0005788320.tif 000009
【化９】
0005788320.tif 000010
【００６７】
（EC）
本明細書で使用される用語「EC」は、EC（グルタミン酸シクラーゼ）活性としてさらに定義される、ECとしてのグルタミニルシクラーゼ（QC、QPCT）及びQC様酵素（QPCTL）の活性を含む。
【００６８】
（EC活性）
本明細書で使用される用語「EC活性」は、グルタミニルシクラーゼ（QC、QPCT）及びQC様酵素（QPCTL）によるN末端グルタミン酸残基のピログルタミン酸（pGlu*）への分子内環化として定義される。その点においてはスキーム3を参照されたい。
【化１０】
0005788320.tif 000011
【００６９】
（（イソ）QC阻害剤）
用語「（イソ）QC阻害剤」又は「（イソ）グルタミニルシクラーゼ阻害剤」は一般的に、当業者に公知であり、好ましくは阻害剤と個々の酵素との直接的な相互作用によって、グルタミニルシクラーゼ（QPCT）の若しくはイソグルタミニルシクラーゼ酵素（QPCTL）の触媒活性を、又はそれらのグルタミルシクラーゼ（EC）活性を阻害する酵素阻害剤を意味する。
【００７０】
（選択的イソQC阻害剤）
本明細書で定義される用語「選択的イソQC阻害剤」は、イソグルタミニルシクラーゼ（イソQC、QPCTL）の触媒活性を阻害するが、グルタミニルシクラーゼ（QC、QPCT）の触媒活性を阻害する能力を有さないか又は該能力のより低い酵素阻害剤を意味する。グルタミニルシクラーゼ（QC）の阻害についてKi値よりも10％低いKi値を有するイソグルタミニルシクラーゼ（イソQC）を阻害する選択的イソQC阻害剤が好ましい。より好ましくは、イソグルタミニルシクラーゼ（イソQC、QPCTL）の阻害についての選択的イソQC阻害剤のKi値は、グルタミニルシクラーゼ（QC）の阻害についての選択的イソQC阻害剤のKi値よりも50％低い。グルタミニルシクラーゼ（QC）の阻害についての選択的イソQC阻害剤のKi値よりも1オーダーの程度ほど低い選択的イソQC阻害剤がさらにより好ましい。より好ましくは、イソグルタミニルシクラーゼ（イソQC、QPCTL）の阻害についての該選択的イソQC阻害剤のKi値は、グルタミニルシクラーゼ（QC）の阻害についての該選択的イソQC阻害剤のKi値よりも2オーダーの程度ほど低い。イソグルタミニルシクラーゼ（イソQC、QPCTL）の阻害についての選択的イソQC阻害剤のKi値がグルタミニルシクラーゼ（QC）の阻害についての選択的イソQC阻害剤のKi値よりも3オーダーの程度ほど低い選択的イソQC阻害剤がさらにより好ましい。グルタミニルシクラーゼ（QC）を阻害しない選択的イソQC阻害剤が最も好ましい。
【００７１】
（イソQC阻害の効力）
イソQC阻害との相関の点で、好ましい実施態様において、対象となる方法及び医薬的用途は、イソQC阻害についてのKi が10μM以下の、より好ましくは0.01μM以下の、又は最も好ましくは0.001μM以下である阻害剤を利用する。実際、より低いμMの、好ましくはnMの、さらにより好ましくはpMのKi値を有する阻害剤が熟慮される。このように、活性薬が簡便のため「イソQC阻害剤」として本明細書に記載されているが、このような名称が、本発明の対象を特定の作用機序に限定するよう意図しているものではないことは理解されるであろう。
【００７２】
（イソQC阻害剤の分子量）
一般に、対象の方法又は医学的用途に関するイソQC阻害剤は、例えば分子量が1000g/mol以下、500g/mol以下、好ましくは400g/mol以下、及びさらにより好ましくは350g/mol以下、及びさらには300g/mol以下の分子量を有する小分子であろう。
【００７３】
（対象）
本明細書で使用される用語「対象（subject）」は、治療、観察、又は実験の対象（object）であった動物、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトである。
【００７４】
（治療的有効量）
本明細書で使用される用語「治療的有効量」は、研究者、獣医、医師、又は他の臨床医によって調べられている組織の系、動物、又はヒトにおける、治療されている疾患又は障害の症状の軽減を含む生物学的又は医学的応答を惹起する活性化合物又は医薬剤の量を意味する。
【００７５】
（医薬として許容し得る）
本明細書で使用されるように、用語「医薬として許容し得る」は、ヒトでの用途及び獣医学的な用途の両方を包含する：例えば、用語「医薬として許容し得る」は、獣医学的に許容し得る化合物、又はヒトの医学及び保健医療において許容し得る化合物を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１は、H-Gln-AMCのpGlu-AMCへの、阻害剤塩酸1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-3-(3,4-ジメトキシフェニル)チオ尿素による、ヒトイソQCにより触媒された変換の阻害を示す。データは、線形競合的阻害を考慮するミカエリス-メンテンの動力学的モデルに従って評価した。阻害剤濃度は下記のとおりであった：
【表１】
0005788320.tif 000012
決定したKi値は、240±8nMであった。
【図２】図２は、RT-PCRによるイソQC発現の分析を示す。SH-SY5Y、LN405、HaCaT、及びHep-G2における検出。  レーン：bp、DNA標準物質ｌ1、SH-SY5Y由来のヒトイソQCの増幅したPCR産物；2、LN405由来のヒトイソQCの増幅したPCR産物；3、HaCaT由来のヒトイソQCの増幅したPCR産物；4、Hep-G2由来のヒトイソQCの増幅したPCR産物。
【図３】図３は、酵母ピキア・パストリスにおいて異種性に発現したヒトイソQCタンパク質コンストラクトの模式図を提供する。2つの変異をいくつかのタンパク質において導入し、位置55におけるグリコシル化部位（I55N）及び位置351における変異したシステイン残基（C351A）をもたらした。発現のために、膜貫通ドメインを含むN末端を酵母の分泌シグナル（YSS）によって置換した。N末端分泌シグナルを含むコンストラクトは、培地へと効率よく分泌されることになっていた。
【図４】図４は、発現している酵母細胞の培地において決定したイソQC活性を示す。膜貫通ドメインにより、未処置のコンストラクトは培地へと分泌されなかった（未実施）。グリコシル化（I55N）によって起因して、タンパク質は最も効率よく分泌される。また、変異C351Aは、培地において検出されたより高いイソQC活性を結果的に生じた。
【図５】図５は、トランスジェニックピキア・パストリス株の培地由来のコンストラクトYSShイソQCI55NC351A C-Hisに基づいたヒトイソQCの精製を示す。IMAC（固定化金属アフィニティクロマトグラフィー、レーン3）、HIC（疎水性相互作用クロマトグラフィー、レーン4）、及び脱塩（レーン5）の組み合わせによって、イソQCを精製した。酵素のグリコシル化は、タンパク質の泳動におけるシフトを結果として生じる酵素の脱グリコシル化による証拠（レーン6）であった。レーン1、タンパク質標準物質：レーン2、精製前の培地。
【図６】図６は、形質転換した大腸菌の細胞均質化液由来のコンストラクトGST-hイソQC C-Hisに基づいたヒトイソQCの精製を示す。IMAC（固定化金属アフィニティクロマトグラフィー、レーン3）、GST-アフィニティ（レーン4）、脱塩（レーン5）、及びイオン交換クロマトグラフィー（レーン6）によって、イソQCを精製した。レーン1、タンパク質標準物質：レーン2、精製前の細胞均質化液。酵母及び大腸菌において発現したhイソQC間の分子量の差は、N末端のGST-タグ融合に起因する。発現したコンストラクトは、図の上側部分において模式的に提供される。
【図７】図７は、ヒトイソQC（YSShイソQCI55NC351A C-His）、GST-hイソQC、及びヒトQCによるの変換についての特異性定数を示す。GST-hイソQCの特異性は最も低く、次いで、YSShイソQCI55NC351A C-Hisであった。最も高い特異性は、ヒトQCを示し、より高い全体的な酵素活性を示した。
【図８】図８は、酵母において発現したヒトイソQC（hイソQC）を及びヒトQC（hQC）を使用して研究した触媒作用のpH依存性を示す。両タンパク質は、pH7〜8の間に至適pHを示す。適合した曲線は、触媒作用に影響を及ぼす3つの解離群に基づいており、1つは酸性pHにおいてであり、2つは塩基性pHにおいてである。
【図９】図９は、LN405細胞におけるマウスイソQC（m-イソQC）の細胞内局在を示す：（a）代替的な開始メチオニンンMetI又はMetIIのうちの1つで開始するm-イソQC-EGFP融合タンパク質の局在、並びに（b）MetI又はMetIIで開始し、Ser55（付番は、N末端アミノ酸位置1を表すMetIに基づいており、図１５と比較されたい。）で終止するm-イソQCのN末端配列、及びC末端EGFP融合からなる融合タンパク質。ゴルジ複合体は、抗マンノシダーゼII抗体を使用して染色した。共局在は、EGFP蛍光及びCy3蛍光の重ね合わせ（混合）によって示す。
【図１０】図１０は、LN405細胞におけるラットイソQC（r-イソQC）の細胞内局在を示す：（a）代替的な開始メチオニンMetIのうちの1つ又はMetIIを使用して開始するr-イソQC-EGFP融合タンパク質の局在、並びに（b）MetI又はMetIIで開始してSer55（付番はN末端アミノ酸位置1を表すMetIに基づいており、図１５と比較されたい。）で終止するr-イソQCのN末端配列、及びC末端EGFP融合からなる融合タンパク質の局在の局在を示す。ゴルジ複合体は、抗マンノシダーゼII抗体を使用して染色した。共局在は、EGFP蛍光及びCy3蛍光の重ね合わせ（混合）によって示す。
【図１１】図１１は、SH-SY5Y細胞におけるマウス-イソQC（m-イソQC）の細胞内局在を示す：（a）代替的な開始メチオニンMetI又はMetIIで開始するm-イソQC-EGFP融合タンパク質の局在、並びに、（b）MetI又はMetIIで開始し、Ser55（付番はN末端アミノ酸位置1を表すMetIに基づいており、図１５と比較されたい。）で終止するm-イソQCのN末端配列、及びC末端EGFP融合からなる融合タンパク質の局在。ゴルジ複合体は、抗マンノシダーゼII抗体を使用して染色した。共局在は、EGFP蛍光及びCy3蛍光の重ね合わせ（混合）によって示す。
【図１２】図１２は、SH-SYS5細胞におけるラット-イソQC（r-イソQC）の細胞内局在を示す：（a）代替的な開始メチオニンMetI又はMetIIで開始するr-イソQC-EGFP融合タンパク質の局在、並びに、（b）MetI又はMetIIで開始し、Ser55（付番はN末端アミノ酸位置1を表すMetIに基づいており、図１５と比較されたい。）で終止するN末端配列、及びC末端EGFP融合からなる融合タンパク質の局在。ゴルジ複合体は、抗マンノシダーゼII抗体を使用して染色した。共局在は、EGFP蛍光及びCy3蛍光の重ね合わせ（混合）によって示す。
【図１３】図１３は、RAW細胞におけるマウスQC（mQPCT）及びマウスイソQC（mQPCTL）の発現の特徴づけのための定量的PCRの結果を示す。（a）アガロースゲル電気泳動を使用したPCR増幅産物の分析。M- 100bpラダー（Peglab, Erlangen, Germany）、脳：脳組織から単離したRNAの産物、B16：B16メラノーマ細胞から単離したRNAの産物、RAW：RAW264.7細胞から単離したRNAの産物。（b）プライマー対QPCT F5/R6、F3/R2、及びF3/R20を使用した増幅曲線。
【図１４】図１４は、LPS（1μg/mL）による24時間の処理後のTHP1細胞におけるヒトQC（hQPCT）及びヒトイソQC（hQPCTL）の遺伝子発現についての定量的PCR結果を示す。
【図１５】図１５は、ヒト、マウス、及びラットのイソQCの配列比較を示す。該タンパク質は、83％の配列同一性を共有する。2つの異なる有望な開始メチオニンが太線で強調されている。
【図１６】図１６は、発酵後のマウスイソQCの精製を説明するSDS-PAGE分析を示す。タンパク質をクーマシー染色によって可視化した。レーン1、分子量標準物質（キロダルトン）（Dual Color, Bio-Rad）；レーン2、発現後の上清；レーン3、拡張したベッド様式における初期の疎水性相互作用クロマトグラフィー後のマウス-イソQCを含む画分；レーン4、疎水性相互作用クロマトグラフィー後のマウス-イソQC；レーン5、UnoQカラム後のマウス-イソQC。レーン6  ゲル濾過及び脱グリコシル化酵素EndoHFによる処理後のマウス-イソQC。イソQCタンパク質は、50kDa〜70kDaのタンパク質に相当する。脱グリコシル化タンパク質は、37kDaにおけるタンパク質バンドに相当する。マウスイソQCを均一になるまで精製した。
【図１７】図１７は、SDS-PAGEによって分析したラット-イソQCの精製を説明する。レーンは下記を表す：レーン1ｌラット-イソQC発酵後の上清；レーン2  金属アフィニティクロマトグラフィー後のラット-イソQC含有画分；レーン3  疎水性相互作用クロマトグラフィー後のラット-イソQCタンパク質、レーン4  脱塩カラム後の精製したラット-イソQC；イソQCタンパク質は、50kDa〜70kDaのタンパク質に相当する。均質な脱グリコシル化したラット-イソQCは、37kDaにおけるタンパク質バンド（レーン5）に相当し、脱グリコシル化酵素EndoHFは、75kDaに泳動する。クーマシー染色によってタンパク質を可視化した。ラット-イソQCを均質になるまで精製した。
【図１８】図１８は、マウス-イソQC及びヒトイソQCによるジペプチド-代替物、ジペプチド、及びオリゴペプチドの変換についての特異性定数を示す。最高の特異性は、マウス-イソQCによって呈され、より高い全体的な酵素活性を示している。
【図１９】図１９は、異なるQCコンストラクト及びイソQCコンストラクトを使用するHEK293細胞のトランスフェクション後のヒトイソQC抗体pAb3284の決定についてのウェスタンブロット分析を示す（トランスフェクトしたコンストラクトにつき、32μLの破砕した細胞及び32μLの1：10に濃縮した培地をSDSゲルに負荷した。）。  （a）レーン1、精製したヒトイソQC（500ng）；レーン2、ヒトイソQCをトランスフェクトした細胞；レーン3、ヒトイソQC発現後の培地；レーン4、ヒトQCを使用したトランスフェクション後の細胞；レーン5、ヒトQC発現後の培地；レーン6、ラット-イソQC発現後の細胞；レーン7、ラット-イソQC発現後の培地；レーン8、ラットQC発現後の細胞；レーン9、ラットQC発現後の培地。特異的ヒトイソQC抗体pAb 3284を使用するタンパク質検出。  （b）特異的ヒトQC抗体（pAb 8695）を使用した、Restore（商標）Western Blot Stropping Buffer（Thermo Scientific）による洗浄後のウェスタンブロットの顕色
【図２０】図２０は、ウェスタンブロット分析による異なる哺乳類種由来の細胞におけるイソQCの基本的な発現レベルの決定を示す。破砕した細胞由来の120μgのタンパク質をSDSゲルに負荷し、レーン1、精製したヒトイソQC（10ng）；レーン2、HEK293細胞（ヒト）；レーン3、SH-SY5Y（ヒト）；レーン4、U343（ヒト）；レーン5、RAW（マウス）；レーン6、N2a（マウス）；レーン7、PC12（ラット）であった。  （a）ヒトイソQC抗体pAb 3284によるタンパク質の検出。  （b）ラット-イソQC抗体pAb 3286によるタンパク質の検出。
【図２１】図２１は、ヒトCCL2（MCP-1）と組換えヒトDP4とのインキュベーションを示す。  （a）組換えヒトDP4によるCCL2（Q1-76）の切断（1：200）。  （b）ヒトCCL2と組換えヒトイソQCとのインキュベーション（1：1000）（CCL(pGlu1-76)）後のDP4とのインキュベーション（1：200）。示された時点について切断を最長4時間モニターし、Maldi-TOF MSを使用して産物を分析した。
【図２２】図２２は、ヒトCCL8（MCP-2）と組換えヒトDP4とのインキュベーションを示す。  （a）組換えヒトDP4によるCCL8（Q1-76）（10μg/mL）の切断（1：100）。  （b）ヒトCCL8と組換えヒトイソQCとのインキュベーション（1：1000）（CCL8(pGlu1-76)）後の、DP4とのインキュベーション（1：200）。示された時点について切断を最長4時間までモニターし、Maldi-TOF MSを使用して産物を分析した。
【図２３】図２３は、ヒトCCL7（MCP-3）と組換えヒトDP4とのインキュベーションを示す。  （a）組換えヒトDP4によるCCL7（Q1-76）（10μg/mL）の切断（1：2000）。  （b）ヒトCCL7とヒト組換えイソQCとのインキュベーション（CCL7(pGlu1-76)）後のDP4とのインキュベーション（1：200）。示された時点について切断を最長4時間までモニターし、Maldi-TOF MSを使用して産物を分析した。
【図２４】図２４は、ヒトCCL13（MCP-4）と組換えヒトDP4とのインキュベーションを示す。  （a）組換えヒトDP4によるCCL13（Q1-76）（10μg/mL）の切断（1：2000）。  （b）ヒトCCL13と組換えヒトイソQCとのインキュベーション（1：1000）（CCL13(pGlu1-76)）後のDP4とのインキュベーション（1：200）。示された時点について切断を最長4時間までモニターし、Maldi-TOF MSを使用して産物を分析した。
【図２５】図２５の（ａ）は、チオグリコラート（thioglycollate）誘発性腹膜炎における単球浸潤に及ぼすQC／イソQC阻害剤イソQC-Iの効果を示す（平均±平均値の標準誤差、1群につきn＞5）。チオグリコラート（TG）及び阻害剤を腹腔内注射により適用した。表面マーカー7/4について陽性であり（7/4(高)）かつマーカーLy6Gについて弱い免疫反応を有する（Ly6G(低)）細胞は、浸潤した単球集団を表す。真の計数ビーズ（BD）を使用するサイトフルオロメトリーによって、陽性細胞集団を計数した。  （b）は、対照動物及びチオグリコラートのみを注射した動物と比較した、チオグリコラートを注射しかつ異なる用量のイソQC-Iで処理したマウスの洗浄液におけるMCP-1 N1pE濃度の決定を示す。
【図２６】図２６は、混合型雄／雌野生型同腹仔（WT）と比較した、混合型雄／雌ホモ接合型（HOM）QPCTLノックアウト動物における単球（a）及び顆粒球（b）の浸潤を示す。動物にチオグリコラート（Thio）又は塩類溶液（PBS）を注射した（***、P＜0.001；分散分析、次いでTuckeyの事後分析）。
【図２７】図２７は、混合型雄／雌野生型同腹仔（WT）と比較した、チオグリコラートを注射した混合型雄／雌ホモ接合型（HOM）QPCTLノックアウト動物において特異的ELISAを使用した総MCP-1（黒い棒）及びpGlu-MCP-1（白い棒）の分析を示す（**、p＜0.01、Studentのt検定）。
【図２８】図２８の（a）は、QPCTLノックアウト動物（HOM）及び野生型同腹仔（WT）から単離した刺激していないPBMC（-LPS）と比較した、LPS刺激したPBMC（+LPS）において特異的ELISAを使用した総MCP-1（黒い棒）及びpGlu-MCP-1（白い棒）の分析を示す。  （b）は、LPS刺激の不在下（-LPS）又は存在下（+LPS）でのQPCTLノックアウト動物（白い棒）及び野生型同腹仔（黒い棒）由来のpGlu-MCP-1と総MCP-1の％比を示す（***、p＜0.001；二元配置分散分析、次いでBonferroniの事後検定）。
【図２９】図２９の（a）は、異なる比の亜鉛対酵素を使用するマウス-イソQC、マウスQC、及びキイロショウジョウバエ由来のQC（DromeQC）の再活性化を示す。再活性化の前に、500mM NaClを含む1,10-フェナントロリン含有50mMビストリス，pH6.8で、1％を下回る残効性まで酵素を失活させた。その後、500ｍM NaCl及び50g/L Chelexを含む50mMビストリス，pH6.8に対する透析に酵素を供した。失活したタンパク質への異なる濃度のZnSO4の添加によって、再活性化を実施した。  （b）酵素を完全に再活性化するのに必要な亜鉛を決定するために、マウス-イソQCを亜鉛イオンで再活性化する際のタンパク質対亜鉛の含有量を増大させていった。500mM NaClを含む1,10-フェナントロリン含有50mMビストリス，pH6.8を使用して失活を実施した。
【図３０】図３０は、失活下及び再活性化したマウスイソQCの二次構造のCD分光分析を示す。タンパク質を10mMリン酸カリウム緩衝液，pH6.8に溶解した。二次構造の概算によって、両酵素について50％のαヘリックス及び26％のβターンが明らかとなった。亜鉛イオンは、二次構造に及ぼす影響を発揮していない。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
（発明の詳細な説明）
特に、本発明は以下の項目に関する：
1．a．慢性及び急性炎症、例えば、関節リウマチ、粥状硬化、再狭窄、膵炎、骨粗鬆症、
b．他の炎症性疾患、例えば、神経因性疼痛、移植片拒絶反応／移植片不能／移植性脈管障害、HIV感染／エイズ、妊娠中毒症、結節性硬化症、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発性神経根症、及び多発性硬化症、
c．神経炎症、並びに
d．神経炎症から結果として生じ得る神経変性疾患、例えば、軽度認知障害（MCI）、アルツハイマー病、ダウン症候群における神経変性、家族性英国型認知症、及び家族性デンマーク型認知症
からなる群から選択される炎症性の疾患又は容態を治療及び／又は予防するためのイソQC阻害剤。
2．a．慢性及び急性炎症、例えば、関節リウマチ、粥状硬化、再狭窄、膵炎、骨粗鬆症、
b．他の炎症性疾患、例えば、神経因性疼痛、移植片拒絶反応／移植片不能／移植性脈管障害、HIV感染／エイズ、妊娠中毒症、結節性硬化症、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発性神経根症、及び多発性硬化症、
c．神経炎症、並びに
d．神経炎症から結果として生じ得る神経変性疾患、例えば、軽度認知障害（MCI）、アルツハイマー病、ダウン症候群における神経変性、家族性英国型認知症、及び家族性デンマーク型認知症
からなる群から選択される炎症性の疾患又は容態を治療及び／又は予防するためのイソQC阻害剤の使用。
3．a．慢性及び急性炎症、例えば、関節リウマチ、粥状硬化、再狭窄、膵炎、骨粗鬆症、
b．他の炎症性疾患、例えば、神経因性疼痛、移植片拒絶反応／移植片不能／移植性脈管障害、HIV感染／エイズ、妊娠中毒症、結節性硬化症、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発性神経根症、及び多発性硬化症、
c．神経炎症、並びに
d．神経炎症から結果として生じ得る神経変性疾患、例えば、軽度認知障害（MCI）、アルツハイマー病、ダウン症候群における神経変性、家族性英国型認知症、及び家族性デンマーク型認知症
からなる群から選択される炎症性の疾患又は容態を治療及び／又は予防する薬剤の製造のためのイソQC阻害剤の使用。
4．a．慢性及び急性炎症、例えば、関節リウマチ、粥状硬化、再狭窄、膵炎、骨粗鬆症、
b．他の炎症性疾患、例えば、神経因性疼痛、移植片拒絶反応／移植片不能／移植性脈管障害、HIV感染／エイズ、妊娠中毒症、結節性硬化症、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発性神経根症、及び多発性硬化症、
c．神経炎症、並びに
d．神経炎症から結果として生じ得る神経変性疾患、例えば、軽度認知障害（MCI）、アルツハイマー病、ダウン症候群における神経変性、家族性英国型認知症、及び家族性デンマーク型認知症
からなる群から選択される炎症性の疾患又は容態を治療及び／又は予防する方法であって、治療的有効量のイソQC阻害剤を該治療及び／又は予防を必要とする対象に投与する、該方法。
5．前記炎症性疾患が、関節リウマチ、粥状硬化、再狭窄、膵炎、及び骨粗鬆症から選択される慢性及び急性炎症である、項目1〜4のいずれか一項記載のイソQC阻害剤、使用、又は方法。
6．前記炎症性疾患が、神経因性疼痛、移植片拒絶反応／移植片不能／移植性脈管障害、HIV感染／エイズ、妊娠中毒症、結節性硬化症、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発性神経根症、及び多発性硬化症から選択される、項目1〜4のいずれか一項記載のイソQC阻害剤、使用、又は方法。
7．前記炎症性疾患が神経炎症である、項目1〜4のいずれか一項記載のイソQC阻害剤、使用、又は方法。
8．前記炎症性疾患が、神経炎症から結果として生じ得る神経変性疾患である、項目1〜4のいずれか一項記載のイソQC阻害剤、使用、又は方法。
9．前記神経変性疾患が、軽度認知障害（MCI）、アルツハイマー病、ダウン症候群における神経変性、家族性英国型認知症、及び家族性デンマーク型認知症から選択される、項目8記載のイソQC阻害剤、使用、又は方法。
10．前記イソQC阻害剤が、抗炎症薬、向知性薬、神経保護薬、抗パーキンソン病薬、アミロイドタンパク質沈着阻害剤、βアミロイド合成阻害剤、抗うつ薬、抗不安薬、抗精神病薬、及び抗多発性硬化症薬、アンギオテンシン変換酵素（ACE）の阻害剤、アンギオテンシンII受容体遮断薬、利尿薬、カルシウムチャネル遮断薬（CCB）、β遮断薬、血小板凝集阻害剤、コレステロール吸収モジュレーター、HMG-Co-A還元酵素阻害剤、高密度リポタンパク質（HDL）を増加させる化合物、レニン阻害剤、IL-6阻害剤、抗炎症性コルチコステロイド、抗増殖薬、一酸化窒素ドナー、細胞外マトリックス合成の阻害剤、増殖因子又はサイトカインシグナル伝達阻害剤、MCP-1アンタゴニスト、及びチロシンキナーゼ阻害剤からなる群から選択されるさらなる薬剤と組み合わせて投与される、項目1〜9のいずれか一項記載のイソQC阻害剤、使用、又は方法。
11．前記疾患及び／又は容態がヒトを苦しめる、項目1〜10のいずれか一項記載のイソQC阻害剤、使用、又は方法。
12．項目1〜9のいずれか一項記載のイソQC阻害剤又は項目10記載の組み合わせを含む医薬組成物。
13．前記イソQC阻害剤が式（I）の化合物、又はそのすべての互変異性体及び立体異性体、又はそれらの医薬として許容し得る塩、溶媒和物、若しくは多形体
【化１１】
0005788320.tif 000013
であり、式中：
R1は、-C3-8カルボシクリル-ヘテロアリール、-C2-6アルケニルヘテロアリール、-C1-6アルキルヘテロアリール、又は(CH2)aCR5R6(CH2)bヘテロアリールを表し、式中、a及びbは独立して、0〜5の整数を表し、但し、a＋b＝0〜5であり、かつR5及びR6が、それらの結合する炭素と共にC3-C5シクロアルキル基又は二環式ヘテロアリール基を形成するアルキレンであり；
ここで、上記のヘテロアリール基のいずれも、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C1-6ハロアルキル、-C1-6チオアルキル、-SOC1-4アルキル、-SO2C1-4アルキル、C1-6アルコキシ-、-O-C3-8シクロアルキル、C3-8シクロアルキル、-SO2C3-8シクロアルキル、-SOC3-6シクロアルキル、C3-6アルケニルオキシ-、C3-6アルキニルオキシ-、-C(O)C1-6アルキル、-C(O)OC1-6アルキル、C1-6アルコキシ-C1-6アルキル-、ニトロ、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシル、-C(O)OH、-NH2、-NHC1-4アルキル、-N(C1-4アルキル)(C1-4アルキル)、-C(O)N(C1-4アルキル)(C1-4アルキル)、-C(O)NH2、-C(O)NH(C1-4アルキル)、及び-C(O)NH(C3-10シクロアルキル)から選択される1つ以上の基によって任意に置換してもよく；
かつここで、上記のカルボシクリル基のいずれも、C1-4アルキル、オキソ、ハロゲン、及びC1-4アルコキシから選択される1つ以上の基によって任意に置換してもよく；
R2は、C1-8アルキル、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、ヘテロシクリル、-C1-4アルキルアリール、-C1-4アルキルヘテロアリール、-C1-4アルキルカルボシクリル、又はC1-4アルキルヘテロシクリルを表し；
ここで、上記のアリール基及びヘテロアリール基のいずれも、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C1-6ハロアルキル、-C1-6チオアルキル、-SOC1-4アルキル、-SO2C1-4アルキル、C1-6アルコキシ-、-O-C3-8シクロアルキル、C3-8シクロアルキル、-SO2C3-8シクロアルキル、-SOC3-6シクロアルキル、C3-6アルケニルオキシ-、C3-6アルキニルオキシ-、-C(O)C1-6アルキル、-C(O)OC1-6アルキル、C1-6アルコキシ-C1-6アルキル-、ニトロ、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシル、-C(O)OH、-NH2、-NHC1-4アルキル、-N(C1-4アルキル)(C1-4アルキル)、-C(O)N(C1-4アルキル)(C1-4アルキル)、-C(O)NH2、-C(O)NH(C1-4アルキル)、及び-C(O)NH(C3-10シクロアルキル)から選択される1つ以上の基によって任意に置換してもよく；
かつここで、上記のカルボシクリル基及びヘテロシクリル基のいずれも、C1-4アルキル、オキソ、ハロゲン、及びC1-4アルコキシから選択される1つ以上の基によって任意に置換してもよく；
或いはR2は、フェニルによって置換されたフェニル、単環式ヘテロアリール基によって置換されたフェニル、ベンジルオキシによって置換されたフェニル、カルボシクリルに縮合したフェニル、ヘテロシクリルに縮合したフェニル、-C1-4アルキル(フェニルによって置換されたフェニル)、-C1-4アルキル(単環式ヘテロアリール基によって置換されたフェニル)、-C1-4アルキル(ベンジルオキシによって置換されたフェニル)、-C1-4アルキル(任意に置換されたカルボシクリルに縮合した任意に置換されたフェニル)、又はC1-4アルキル(任意に置換されたヘテロシクリルに縮合した任意に置換されたフェニル)を表し；
ここで、上記のフェニル基、ベンジルオキシ基、及びヘテロアリール基のいずれも、C1-4アルキル、ハロゲン、及びC1-4アルコキシから選択される1つ以上の基によって任意に置換してもよく、かつここで、上記のカルボシクリル基及びヘテロシクリル基のいずれも、C1-4アルキル、オキソ、ハロゲン、及びC1-4アルコキシから選択される1つ以上の基によって任意に置換してもよく；
R3は、H、-C1-4アルキル、又はアリールを表し；
ここで、上記のアリールは、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C1-6ハロアルキル、-C1-6チオアルキル、-SOC1-4アルキル、-SO2C1-4アルキル、C1-6アルコキシ-、-O-C3-8シクロアルキル、C3-8シクロアルキル、-SO2C3-8シクロアルキル、-SOC3-6シクロアルキル、C3-6アルケニルオキシ-、C3-6アルキニルオキシ-、-C(O)C1-6アルキル、-C(O)OC1-6アルキル、C1-6アルコキシ-C1-6アルキル-、ニトロ、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシル、-C(O)OH、-NH2、-NHC1-4アルキル、-N(C1-4アルキル)(C1-4アルキル)、-C(O)N(C1-4アルキル)(C1-4アルキル)、-C(O)NH2、-C(O)NH(C1-4アルキル)、及び-C(O)NH(C3-10シクロアルキル)から選択される1つ以上の基によって任意に置換してもよく；
或いは、R2及びR3は、1つ以上のC1-2アルキル基によって任意に置換されたカルボシクリル環を形成するよう結合し；
或いは、R2及びR3は、フェニルに縮合したカルボシクリル環を形成するよう結合し、ここで、上記のカルボシクリル及び／又はフェニルは、C1-4アルキル、ハロゲン、及びC1-4アルコキシから選択される1つ以上の基によって任意に置換してもよく；
或いは、R2及びR3は、単環式ヘテロアリールに縮合したカルボシクリル環を形成するよう結合し、ここで、上記のカルボシクリル及び／又はヘテロアリールは、C1-4アルキル、ハロゲン、及びC1-4アルコキシから選択される1つ以上の基によって任意に置換してもよく；
R4は、H、-C1-8アルキル、-C(O)C1-6アルキル、又はNH2を表し；
Xは、O又はSを表し；かつ
Yは、O又はSを表す、項目1〜12のいずれか一項記載のイソQC阻害剤、使用、方法、又は医薬組成物。
14．R1が、二環式ヘテロアリール基を表す、項目13記載のイソQC阻害剤、使用、方法、又は医薬組成物。
15．R1が、1個又は2個の窒素原子を含む5員環に縮合したベンゼン環又はピリジン環を表す、項目14記載のイソQC阻害剤、使用、方法、又は医薬組成物。
16．結合点が、ベンゼン環又はピリジン環を介している、項目15記載のイソQC阻害剤、使用、方法、又は医薬組成物。
17．R1が、
【化１２】
0005788320.tif 000014
イミダゾ[1,2-a]ピリジン、又はベンゾ[c][1,25]チアジアゾリルである、項目16記載のイソQC阻害剤、使用、方法、又は医薬組成物。
18．R1が、
【化１３】
0005788320.tif 000015
を表す、項目17記載のイソQC阻害剤、使用、方法、又は医薬組成物。
19．R1が-C1-6アルキルヘテロアリールを表す、項目18記載のイソQC阻害剤、使用、方法、又は医薬組成物。
20．R1のヘテロアリール基が、C1-4アルキル、C1-4アルコキシ-、及びハロゲンから選択される1つ以上の置換基によって任意に置換された1〜3個の窒素原子を含む5員環である、項目19記載のイソQC阻害剤、使用、方法、又は医薬組成物。
21．前記ヘテロアリール基が、
【化１４】
0005788320.tif 000016
である、項目20記載のイソQC阻害剤、使用、方法、又は医薬組成物。
22．R1が、
【化１５】
0005788320.tif 000017
を表し、
式中、Aが、非分岐の若しくは分岐したC1-6アルキレン鎖を表し、又はAが、分岐したC1-6アルキレン鎖を表し、又はAが(CH2)aCR5R6(CH2)bを表し、
かつR11、R12、及びR13が独立して、H若しくはC1-2アルキルを表す、項目13記載のイソQC阻害剤、使用、方法、又は医薬組成物。
23．R1が、
【化１６】
0005788320.tif 000018
を表し、
式中、Bが、結合、-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(Me)-、-CH(Me)-CH2-、又は-CH2-CH(Me)-を表し、かつ
R14及びR15が独立して、H又はC1-2アルキルを表す、項目14又は項目19記載のイソQC阻害剤、使用、方法、又は医薬組成物。
24．下記式：
【化１７】
0005788320.tif 000019
（式中、R2、R3、R4、X、及びYが請求項１３に定義されるとおりである。）によって表される、項目13〜23のいずれか一項記載のイソQC阻害剤、使用、方法、又は医薬組成物。
25．R2が、アリール、ヘテロアリール、フェニルによって置換されたフェニル、ヘテロシクリルに縮合したフェニルを表し、又はR2及びR3が結合して、フェニルに縮合したカルボシクリル環を形成し；上記のアリール、ヘテロアリール、フェニル、ヘテロシクリル、及びカルボシクリルが任意に置換されている、項目13〜24のいずれか一項記載のイソQC阻害剤、使用、方法、又は医薬組成物。
26．R2が、フェニルによって置換されたフェニルを表し、上記のフェニル基が、同じでも又は異なってもよくかつハロ、OH、C1-3アルキル、C1-3ハロアルキル、C1-3アルコキシ、C1-3ハロアルコキシから選択される1つ以上の置換基によって任意に置換されている、項目25記載のイソQC阻害剤、使用、方法、又は医薬組成物。
27．R2が-ビフェニル-4-イルである、項目26記載のイソQC阻害剤、使用、方法、又は医薬組成物。
28．R2が、同じでも又は異なってもよくかつハロ、OH、C1-3アルキル、C1-3ハロアルキル、C1-3アルコキシ、C1-3ハロアルコキシから選択される1、2、又は3個の置換基によって任意に置換されたフェニルを表す、項目25記載のイソQC阻害剤、使用、方法、又は医薬組成物。
29．R2が、n-プロピルオキシによって置換されたフェニルである、項目28記載のイソQC阻害剤、使用、方法、又は医薬組成物。
30．R3がHを表す、項目13〜29のいずれか一項記載のイソQC阻害剤、使用、方法、又は医薬組成物。
31．R2及びR3が結合して、フェニルに縮合したカルボシクリル環を形成する、項目13〜25のいずれか一項記載のイソQC阻害剤、使用、方法、又は医薬組成物。
32．R4がHを表す、項目13〜31のいずれか一項記載のイソQC阻害剤、使用、方法、又は医薬組成物。
33．XがOを表す、項目13〜32のいずれか一項記載のイソQC阻害剤、使用、方法、又は医薬組成物。
34．YがOを表す、項目13〜33のいずれか一項記載のイソQC阻害剤、使用、方法、又は医薬組成物。
35．式（I）の化合物が
【化１８】
0005788320.tif 000020
によって表され、式中、R2及びR3が項目13に定義されるとおりである、項目13〜34のいずれか一項記載のイソQC阻害剤、使用、方法、又は医薬組成物。
36．式（I）の化合物が、
5-(ベンゾ[c][1,2,5]チアジアゾール-6-イル)-1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-フェニルイミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2-ヒドロキシ-5-メチルフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2-フルオロ-5-トリフルオロメチル)フェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2-ブロモ-5-フルオロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-プロポキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-クロロ-3-トリフルオロメチル)フェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(3-フルオロ-4(トリフルオロメチル)フェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(3-ヒドロキシ-4-メトキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンズイミダゾール-5-イル)-5-(1,1'-ビフェニル-4-イル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(3-クロロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-クロロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2-クロロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-フルオロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2,3-ジヒドロベンゾ[b][1,4]ジオキシン-7-イル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-フェニルイミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-(2-ブロモ-4-フルオロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-(4-プロポキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-(3-フルオロ-4-(トリフルオロメチル)フェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-[3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル]-5-(4-ビフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-(3-クロロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-(2-クロロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(3-(5-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-フェニルイミダゾリジン-2,4-ジオン；
5-(2-ブロモ-5-フルオロフェニル)-1-(3-(5-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(3-(5-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-(4-プロポキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-[3-(5-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル]-5-(4-フェニルフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
5-(3-クロロフェニル)-1-(3-(5-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-(3-(4-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-フェニルイミダゾリジン-2,4-ジオン；
1-[3-(4-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル]-5-(4-ビフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
5-(3-クロロフェニル)-1-(3-(4-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)イミダゾリジン-2,4-ジオン；
3-(1H-ベンズイミダゾール-5-イル)-1',3'-ジヒドロ-2H,5H-スピロ[イミダゾリジン-4,2'-インデン]-2,5-ジオン；
5-(ベンゾ[c][1,2,5]チアジアゾール-6-イル)-1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-2-チオキソイミダゾリジン-4-オン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-フェニル-2-チオキソイミダゾリジン-4-オン；
1-(1H-ベンズイミダゾール-5-イル)-5-(1,1'-ビフェニル-4-イル)-2-チオキソイミダゾリジン-4-オン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(3-ヒドロキシ-4-メトキシフェニル)-2-チオキソイミダゾリジン-4-オン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-フェニル-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン；
1-(1H-ベンズイミダゾール-5-イル)-5-(1,1'-ビフェニル-4-イル)-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン；
3-(1H-ベンズイミダゾール-5-イル)-5-チオキソ-1',3'-ジヒドロ-2H-スピロ[イミダゾリジン-4,2'-インデン]-2-オン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-クロロフェニル)-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2,3,4-トリフルオロフェニル)-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-6-イル)-5-(4-ブロモ-2-フルオロフェニル)-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2,3-ジフルオロ-4-メチルフェニル)-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-クロロ-3-メチルフェニル)-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン；
1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-3-メチル-5-フェニルイミダゾリジン（phenylimida4zolidine）-2,4-ジオン；
1-(H-イミダゾ[1,2-a]ピリジン-7-イル)-5-フェニルイミダゾリジン-2,4-ジオン；
又はそのすべての互変異性体及び立体異性体、又はそれらの医薬として許容し得る塩、溶媒和物、若しくは多形体から選択される、項目13〜35のいずれか一項記載のイソQC阻害剤、使用、方法、又は医薬組成物。
37．前記イソQC阻害剤が、1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-プロポキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオンの化合物であり、下記構造：
【化１９】
0005788320.tif 000021
、又はそのすべての互変異性体及び立体異性体、又はそれらの医薬として許容し得る塩、溶媒和物、若しくは多形体を有する、項目1〜36のいずれか一項記載のイソQC阻害剤、使用、方法、又は医薬組成物。
38．イソQC阻害剤を含む診断アッセイ。
39．前記イソQC阻害剤が、項目13〜37のいずれか一項において定義したようなその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、及び立体異性体を含む化合物である、項目38記載の診断アッセイ。
40．前記イソQC阻害剤が、(1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-プロポキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオンである、項目38又は39のいずれか一項記載の診断アッセイ。
41．項目1〜9のいずれか一項において定義したような疾患及び／又は容態のいずれか1つを診断する方法であって、
-該疾患及び／又は容態で苦しめられていることが疑われる対象から試料を収集する工程、
-該試料をイソQC阻害剤と接触させる工程、及び
-該対象が該疾患及び／又は容態によって苦しめられているか否かを決定する工程、
を含む、該方法。
42．前記対象がヒトである、項目41記載の方法。
43．前記イソQC阻害剤が、項目13〜31のいずれか一項において定義したようなその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、及び立体異性体を含む化合物である、項目41又は42記載の方法。
44．前記イソQC阻害剤が、1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-プロポキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオンである、項目41〜43のいずれか一項記載の方法。
45．前記試料が、血液試料、血清試料、脳脊髄液の試料、又は尿試料である、項目41〜44のいずれか一項記載の方法。
46．検出手段として項目38〜40のいずれか一項記載の診断アッセイと決定手段とを含む、項目41〜45のいずれか一項記載の方法を実施するための診断キット。
47．前記イソQC阻害剤が、配列番号11、12、13、14、15、16、17、18、57、58、59、若しくは60のいずれかの配列を含むポリペプチド又は配列番号2、3、4、5、6、7、8、9、53、54、55、若しくは56のいずれかの配列を含む核酸によってコードされるポリペプチドの群から選択されるポリペプチドのいずれか1つを阻害する、上記の項目のいずれか一項記載のイソQC阻害剤、使用、方法、キット、又は医薬組成物。
48．前記イソQC阻害剤が、配列番号11若しくは12のいずれかの配列を含むポリペプチド又は配列番号2若しくは3のいずれかの配列を含む核酸によってコードされるポリペプチドの群から選択されるポリペプチドのいずれか1つを阻害する、上記の項目のいずれか一項記載のイソQC阻害剤、使用、方法、キット、又は医薬組成物。
49．前記イソQC阻害剤が、配列番号11の配列を含むポリペプチド又は配列番号2の配列を含む核酸によってコードされるポリペプチドを阻害する、上記の項目のいずれか一項記載のイソQC阻害剤、使用、方法、キット、又は医薬組成物。
50．前記イソQC阻害剤が、配列番号12の配列を含むポリペプチド又は配列番号3の配列を含む核酸によってコードされるポリペプチドを阻害する、上記の項目のいずれか一項記載のイソQC阻害剤、使用、方法、キット、又は医薬組成物。
【００７８】
非常に驚くべきことに、特にイソQCの阻害剤は、選択的阻害に十分に適しており、炎症性疾患の治療において使用するのに特に十分に適していることが本発明を用いて示された。イソQC阻害と炎症性疾患の間のこの特別な関係は、驚くべきことであり、炎症性容態の治療において明確な利点を提供する。
【００７９】
（a）慢性及び急性の炎症、例えば、関節リウマチ、粥状硬化、再狭窄、膵炎、骨粗鬆症、
（b）他の炎症性疾患、例えば、神経因性疼痛、移植片拒絶反応／移植片不能／移植性脈管障害、HIV感染／エイズ、妊娠中毒症、結節性硬化症、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発性神経根症、及び多発性硬化症、
（c）神経炎症、並びに
（d）神経炎症から結果として生じ得る神経変性疾患、例えば、軽度認知障害（MCI）、アルツハイマー病、ダウン症候群における神経変性、家族性英国型認知症、及び家族性デンマーク型認知症
から選択される慢性又は急性の炎症を治療するためのイソQC阻害剤の効果は、本発明の実施例12、15、及び17において説明されるインビボアッセイを使用して試験することができる。
粥状硬化又は多発性硬化症を治療する方法におけるイソQC阻害剤の使用が、本発明に従ってさらに好ましい。
【００８０】
加えて、また、本発明者は、QPCTLノックアウトマウスにおける炎症性ケモカインに及ぼすイソQCの失活の効力についての概念の遺伝的証拠を提供し、すなわち、QPCTLノックアウトマウスから単離された末梢血単核細胞は、実施例17に示されるように、LPS刺激後にN末端でpGlu修飾された少量のMCP-1しか生じず、QPCTLノックアウト動物におけるチオグリコラートの適用は、腹膜への単球の浸潤を刺激しない。しかしながら、QPCTL野生型同腹仔において、イソQC活性が存在し、結果的にMCPの適切な成熟が生じたので、単球の浸潤が検出された（実施例16及び図26a）。これらの結果は、MCP-1、MCP-2、MCP-3、及びMCP-4のような炎症性サイトカインの成熟についてのイソQCの信頼性を、逆の場合、これらのケモカインの成熟を防止し、それにより炎症性疾患を予防及び治療する上でのイソQC阻害の効力を明確に証明している。
【００８１】
QPCTLは、全長のタンパク質、代替的なスプライス形態、サブユニット、及び変異体を含むグルタミニルシクラーゼ並びに該グルタミニルシクラーゼをコードするヌクレオチド配列と関連したタンパク質のファミリーの新規のメンバーを構成するグルタミニルシクラーゼ活性を有するタンパク質である。
【００８２】
グルタミニルシクラーゼに対する有意な配列類似性を有するこれらのQPCTLタンパク質（配列番号1の核酸配列、配列番号10のタンパク質配列）は、ヒト（ヒトイソQCとしてさらに命名）（GenBank受託番号NM_017659）、マウス（GenBank受託番号NM_027455）、カニクイザル（GenBank受託番号AB168255）、アカゲザル（GenBank受託番号XM_001110995）、ネコ（GenBank受託番号XM_541552）、ラット（GenBank受託番号XM_001066591）、ウシ（GenBank受託番号BT026254）由来のタンパク質（QPCTL）、又は少なくとも50％／75％の配列同一性／類似性、好ましくは70％／85％の配列同一性／類似性、最も好ましくは90％／95％の配列同一性／類似性を有するそれらの類似体である。
【００８３】
個々のタンパク質は配列を配列番号11〜18に与える。これらのタンパク質についてコードする核酸配列をさらに開示する（配列番号2〜9）。
【表２】
0005788320.tif 000022
0005788320.tif 000023
0005788320.tif 000024
0005788320.tif 000025
【００８４】
イソQC阻害剤
QPCTL酵素活性阻害剤の具体的な例を以下に説明する。阻害剤は例えば、QPCTLシクラーゼ活性の阻害剤、又はそれに替わるものとして、QPCTLが相互作用するタンパク質へのQPCTLの結合活性の阻害剤であり得る。このような阻害剤の具体的な例には、例えば、所望の細胞種に導入することができる培地中に処方される抗QPCTL抗体、ペプチド、タンパク質断片、又は低分子ペプチジルプロテアーゼ阻害剤、又は低分子非ペプチド有機分子阻害剤を含むことができる。或いは、このような阻害剤は、細胞仲介性エンドサイトーシス及び他の受容体仲介性事象による導入のための標的リガンドに結合することができる。このような方法は以下にさらに説明され、本明細書に記載されたQPCTLヌクレオチド及びアミノ酸の配列を与えられた当業者によって実施することができる。
【００８５】
QPCTLの阻害剤としても有用であり得るQCの有用な阻害剤は、特に該阻害剤の構造及びその製造に関するWO 2004/098591、WO 2005/075436、WO 2008/055945、WO 2008/055947、WO 2008/055950、WO 2008/065141、WO 2008/110523、WO 2008/128981、WO 2008/128982、WO 2008/128983、WO 2008/128984、WO 2008/128985、WO 2008/128986、及びWO 2008/128987において説明されており、それらのすべての内容は全体として本明細書に組み込まれている。
【００８６】
本発明に記載の用途及び方法に適したあり得るQPCTL阻害剤は、先の項目13の下で説明した式（I）の化合物
【化２０】
0005788320.tif 000026
である。
【００８７】
カルボシクリル及びヘテロシクリルが置換される場合、典型的には、これらは1個又は2個の置換基（例えば、1個の置換基）によって置換される。典型的には、該置換基はメチルである。より典型的には、カルボシクリル基及びヘテロシクリル基は非置換である。
【００８８】
アリールおよびヘテロアリールが置換される場合、典型的には、これらは1個、2個又は3個（例えば、1個又は2個）の置換基によって置換される。アリール及びヘテロアリールに対する置換基は、C1-6アルキル（例えば、メチル）、C2-6アルケニル（例えば、ブテン-3-イル）、C2-6アルキニル（例えば、ブチン-3-イル）、C1-6ハロアルキル（例えば、フルオロメチル、トリフルオロメチル）、-C1-6チオアルキル（例えば、-S-メチル）、-SOC1-4アルキル（例えば、-SOメチル）、-SO2C1-4アルキル（例えば、-SO2メチル）、C1-6アルコキシ-（例えば、メトキシ、エトキシ）、-O-C3-8シクロアルキル（例えば、-O-シクロペンチル）、C3-8シクロアルキル（例えば、シクロプロピル、シクロヘキシル）、-SO2C3-8シクロアルキル（例えば、-SO2シクロヘキシル）、-SOC3-6シクロアルキル（例えば、-SOシクロプロピル）、C3-6アルケニルオキシ-（例えば、-O-ブテン-2-イル）、C3-6アルキニルオキシ-（例えば、-O-ブテン-2-イル）、-C(O)C1-6アルキル（例えば、-C(O)エチル）、-C(O)OC1-6アルキル（例えば、-C(O)O-メチル）、C1-6アルコキシ-C1-6アルキル-（例えば、メトキシ-エチル-）、ニトロ、ハロゲン（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ）、シアノ、ヒドロキシル、-C(O)OH、-NH2、-NHC1-4アルキル（例えば、-NHメチル）、-N(C1-4アルキル)(C1-4アルキル)（例えば、-N(メチル)2)、-C(O)N(C1-4アルキル)(C1-4アルキル)（例えば、-C(O)N(メチル)2)、-C(O)NH2及び-C(O)NH(C1-4アルキル)（例えば、-C(O)NHメチル）、-C(O)NH(C3-10シクロアルキル)（例えば、-C(O)NHシクロプロピル）から選択される。より典型的には、置換基は、C1-6アルキル（例えば、メチル）、C1-6ハロアルキル（例えば、C1-6フルオロアルキル、例えば、CF3）、C1-6アルコキシ（例えば、OMe）、ハロゲン及びヒドロキシから選択されるであろう。
【００８９】
本発明の一実施態様において、R1は、二環式ヘテロアリール基を表す。適切な二環式ヘテロアリール基には、例えば、9〜10員の、しかし特に9員のヘテロアリール基を含む。適切には、該ヘテロアリール基は、窒素原子、例えば1個又は2個の窒素原子を含む。特に適切な二環式ヘテロアリール環には、1個又は2個の窒素原子を含む9員のヘテロアリール環を含む。いくつかの場合において、彼ヘテロアリール基は、N、O、又はSから選択される追加的なヘテロ原子、しかし特にSを任意に含んでもよい。適切には、9員のヘテロアリール環は、1個又は2個の窒素原子を含む5員環に縮合したベンゼン環又はピリジン環を含む。より適切には、該ヘテロアリール環は、1個又は2個の窒素原子を含む5員環に縮合したベンゼン環を含む。いくつかの場合、5員環はまた、N、O、若しくはSから選択される追加的なヘテロ原子、しかし特にSを含んでもよいが、より適切な化合物において、ヘテロアリール基はS原子を含まない。これらの縮合したヘテロアリール系において、結合点は最も適切には、ベンゼン環又はピリジン環を介している。
【００９０】
上記のヘテロアリール基は通常、非置換であろうけれども、適切にはアルキル（MeなどのC1-4アルキル）、アルコキシ-（例えば、OMeなどのC1-4アルコキシ-）、及びハロゲン（例えば、F）から選択される1個以上の置換基、適切には1個又は2個の置換基によって置換してもよい。
【００９１】
一般式（I）の化合物に存在し得る5員環に縮合したフェニル基を含む二環式ヘテロアリール基に関する具体的な例には、例えば下記式を含む：
【化２１】
0005788320.tif 000027
これらの基は、先に記載したとおり置換してもよい。
【００９２】
特に適切な二環式ヘテロアリール基の例には、1H-ベンズイミダゾリル、イミダゾ[1,2-a]ピリジン、及びベンゾ[c][1,25]チアジアゾリルを含む。1H-ベンゾイミダゾール-5-イルが特に適切である。
【００９３】
代替的な実施態様において、R1は、-C3-8カルボシクリル-ヘテロアリール、-C2-6アルケニルヘテロアリール、-C1-6アルキルヘテロアリール、又は(CH2)aCR5R6(CH2)bヘテロアリールを表す。R1が-C1-6アルキルヘテロアリールである化合物が特に適切である。
【００９４】
該実施態様において、R1のヘテロアリール基は、二環式、例えば、先に記載した基のうちの1つであってもよい。しかしながら、より適切なヘテロアリール基は、単環、特に5員環又は6員環、より特別には5員環である。典型的には、該ヘテロアリール基は、窒素含有複素環基であり、より典型的には1〜3個の窒素原子を含む。適切には、ヘテロアリール基はS原子を含まない。上記のヘテロアリール基は、非置換であってもよいか又は、1個以上の置換基、適切にはアルキル（例えば、MeなどのC1-4アルキル）、アルコキシ-（例えば、OMeなどのC1-4アルコキシ-）、及びハロゲン（例えば、F）から選択される1個若しくは2個の置換基によって適切に置換してもよいかのいずれかである。
【００９５】
適切な単環式ヘテロアリール基に関する特別な例には、2個又は3個の窒素原子を含む5員環を含み、該環は（例えば特に、メチルなどの1個又は2個の基、例えば下記式によって任意に置換してもよい：
【化２２】
0005788320.tif 000028
特に適切なヘテロアリール基は、先に示したとおり任意に置換してもよいイミダゾール-1-イルであるが、メチルは特に適切な置換基である。
【００９６】
R1が-C3-8カルボシクリル-ヘテロアリールを表す場合、カルボシクリルの例には、シクロアルキル（例えば、シクロヘキシル）及びシクロアルケニル（例えば、シクロヘキセニル）を含む。典型的な-C3-8カルボシクリル-ヘテロアリール基は、3-イミダゾール-1-イル-シクロヘキシル-である。
R1が-C2-6アルケニルヘテロアリールを表す場合、C2-6アルケニルの例には、C2-4アルケニル、特にプロペニルを含む。典型的な-アルケニルヘテロアリール基は、3-イミダゾール-1-イル-プロパ-2-エニル-である。
【００９７】
R1が(CH2)aCR5R6(CH2)bヘテロアリール（式中、a及びbは独立して0〜5の整数を表し、但し、a＋b＝0〜5でありかつR5及びR6はそれらの結合する炭素原子と共にC3-C5シクロアルキル基を形成するアルキレンである。）を表す場合、例には下記式を含む：
【化２３】
0005788320.tif 000029
【００９８】
該実施態様の特に適切な化合物は、R1が-C1-6アルキルヘテロアリールを表す化合物である。このような化合物において、C1-6アルキルの例には、C1-5アルキル又はC1-4アルキル、特にC2-5アルキル又はC2-4アルキルを含む。該アルキル基は直鎖又は分岐鎖であってもよく、かつ該アルキル基が分岐鎖である例には下記式を含む
【化２４】
0005788320.tif 000030
。
最も適切には、該アルキル基は、-CH2-、-(CH2)2、又は-(CH2)3-であり、-(CH2)3-が特に適切である。特に適切な-アルキルヘテロアリール基は、3-イミダゾール-1-イル-プロピル-である。
【００９９】
一実施態様において、R1は、下記式を表し
【化２５】
0005788320.tif 000031
、式中Aは、非分岐C1-6アルキレン鎖（例えば、非分岐C1-5アルキレン鎖、例えば、非分岐C1-4アルキレン鎖、例えば、非分岐C1-3アルキレン鎖）を表し、又はAは、分岐C1-6アルキレン鎖を表し（例えば、式中1個以上の（例えば、1個又は2個の）分岐鎖は、同じか又は異なる位置における1つ以上の（例えば、1個又は2個の）メチル基からなる。）、又はAは、(CH2)aCR5R6(CH2)bを表し、かつ
R11、R12、及びR13は独立して、H又はC1-2アルキルを表す。
【０１００】
さらなる実施態様において、R1は下記式を表し
【化２６】
0005788320.tif 000032
、式中Bは、結合、-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(Me)-、-CH(Me)-CH2-、又は-CH2-CH(Me)-を表し、かつ
R14及びR15は独立して、H又はC1-2アルキルを表す。
【０１０１】
なおも別の実施態様において、R1は下記式を表し
【化２７】
0005788320.tif 000033
、式中Cは、結合、-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(Me)-、-CH(Me)-CH2-、又は-CH2-CH(Me)-を表し、かつ
R16及びR17は独立して、H又はC1-2アルキルを表す。
【０１０２】
別の実施態様において、R1は下記式を表し
【化２８】
0005788320.tif 000034
、式中Dは、結合、-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(Me)-、-CH(Me)-CH2-、又は-CH2-CH(Me)-を表し、かつ
R18及びR19は独立して、H又はC1-2アルキルを表す。
【０１０３】
特に適切な化合物において、R1は下記式を表す
【化２９】
0005788320.tif 000035
。
一実施態様において、R14はHを表し、かつR15はHを表す。別の実施態様において、R14はHを表し、かつR15はC1-2アルキルを表す。第三の実施態様において、R14はC1-2アルキルを表し、かつR15はHを表す。
【０１０４】
このような化合物において、Bは、結合、-CH2-、又は-CH2-CH2-を表す。特に適切な実施態様において、Bは結合を表す。別の実施態様において、Bは-CH2-を表す。第三の実施態様において、Bは-CH2-CH2-を表す。
【０１０５】
或いは、R1は、下記式を表す
【化３０】
0005788320.tif 000036
。
R11は適切にはHを表し、
R12は適切にはH又はメチルを表す。
R13は適切にはH又はメチルを表す。
本発明の一実施態様において、R12はHを表し、かつR13はメチルを表す。別の実施態様において、R12はメチルを表し、かつR13はHを表す。第三の実施態様において、R12はHを表し、かつR13はHを表す。
【０１０６】
適切には、Aは非分岐C2-5アルキレン鎖を表す。一実施態様において、Aは-(CH2)2-を表す。別の実施態様において、Aは-(CH2)3-を表す。第三の実施態様において、Aは-(CH2)4-を表す。さらなる実施態様において、Aは-(CH2)5-を表す。より適切には、Aは-(CH2)2-、-(CH2)4-、又は-(CH2)5-を表す。一実施態様において、Aは-(CH2)3-を表す。別の実施態様において、Aは-(CH2)4-を表す。
或いは、Aは分岐C2-5アルキレン鎖を表す。
【０１０７】
一実施態様において、Aは-(CH2)3-を表さない。
Aが、同じ位置で2個のアルキレン置換基によって置換されたC2-5アルキレン鎖を表す場合（ここで、2個のアルキレン置換基は互いに結合して、C3-5スピロ-シクロアルキル基を形成する。）、該スピロ-シクロアルキル基は適切には、C3スピロ-シクロアルキルである。
【０１０８】
或いは、R1は、下記式を表す
【化３１】
0005788320.tif 000037
。
一実施態様において、R16はHを表し、かつR17はHを表す。別の実施態様において、R16はHを表し、かつR17はC1-2アルキルを表す。第三の実施態様において、R16はC1-2アルキルを表し、かつR17はHを表す。
適切には、Cは、結合、-CH2-、又は-CH2CH2-を表す。一実施態様において、Cは結合を表す。別の実施態様において、Cは-CH2-を表す。第三の実施態様において、Cは-CH2CH2-を表す。
【０１０９】
或いは、R1は、下記式を表す
【化３２】
0005788320.tif 000038
。
一実施態様において、R18はHを表し、かつR19はHを表す。別の実施態様において、R18はHを表し、かつR19はC1-2アルキルを表す。第三の実施態様において、R18はC1-2アルキルを表し、かつR19はHを表す。
適切には、Dは、結合、-CH2-、又は-CH2CH2-を表す。一実施態様において、Dは結合を表す。別の実施態様において、Dは-CH2-を表す。第三の実施態様において、Dは-CH2CH2-を表す。
【０１１０】
より適切には、R1は、下記式を表す
【化３３】
0005788320.tif 000039
。
最も適切には、R1は、下記式を表す
【化３４】
0005788320.tif 000040
。
特に適切な実施態様において、式（I）の化合物は、下記式によって表される
【化３５】
0005788320.tif 000041
。
最も適切には、式（I）の化合物は、下記式によって表される
【化３６】
0005788320.tif 000042
。
【０１１１】
R2が-C1-8アルキルを表す場合、例には、メチル、エチル、プロピル（例えば、n-プロピル、イソプロピル）、ブチル（例えば、n-ブチル- sec-ブチル、イソブチル、及びtert-ブチル）、ペンチル（例えば、n-ペンチル、3,3,-ジメチルプロピル）、ヘキシル、ヘプチル、及びオクチルを含む。
【０１１２】
R2が、任意に置換されたアリールを表す場合、アリールは典型的にはフェニルを表してもよい。典型的な置換フェニル基には、2,4-ジクロロフェニル-、2,4-ジフルオロフェニル-、2,4-ジメトキシフェニル-、2,4-ジメチルフェニル-、2,4-ビス(トリフルオロメチル)フェニル-、2,4,6-トリフルオロフェニル-、2,4,6-トリメチルフェニル-、2,6-ジクロロフェニル-、2,6-ジフルオロフェニル-、2,6-ジメトキシフェニル-、2-イソプロピル-6-メチルフェニル-、3-(シクロペンチルオキシ)-4-メトキシフェニル-、3,4,5-トリメトキシフェニル-、3,4-ジメトキシフェニル-、3,4-ジクロロフェニル-、3,4-ジメチルフェニル-、3,4,5-トリフルオロフェニル-、3,5-ビス(トリフルオロメチル)フェニル-、3,5-ジメトキシフェニル-、3-メトキシフェニル-、4-(トリフルオロメチル)フェニル-、4-ブロモ-2-(トリフルオロメチル)フェニル-、4-ブロモフェニル-、4-クロロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル-、4-クロロフェニル-、4-シアノフェニル-、4-エトキシフェニル-、4-エチルフェニル-、4-フルオロフェニル-、4-イソプロピルフェニル-、4-メトキシフェニル-を含む。或いは、R2は、非置換フェニル-を表してもよい。さらなる典型的な置換フェニル基には、2,3,4-トリフルオロフェニル、2,3-ジフルオロ-4-メチルフェニル、2-ブロモ-4-フルオロフェニル-、2-ブロモ-5-フルオロフェニル-、2-クロロフェニル-、2-フルオロ-5-(トリフルオロメチル)フェニル-、2-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル-、2-ヒドロキシ-5-メチルフェニル-、3-クロロフェニル-、3-フルオロ-4-(トリフルオロメチル)フェニル-、3-ヒドロキシ-4-メトキシフェニル-、4-ブロモ-2-フルオロフェニル、4-クロロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル-、4-クロロ-3-メチルフェニル、4-クロロフェニル-、4-フルオロフェニル-、及び4-プロポキシフェニル-を含む。
【０１１３】
R2が、任意に置換されたアリールを表し、かつアリールがナフチルを表す場合、例には、非置換ナフチル（例えば、ナフタレン-1-イル、ナフタレン-2-イル、ナフタレン-3-イル）、及び置換ナフチル（例えば、4-メチル-ナフタレン-2-イル、5-メチル-ナフタレン-3-イル-、7-メチル-ナフタレン-3-イル-、及び4-フルオロ-ナフタレン-2-イル-）を含む。
【０１１４】
R2が、任意に置換されたヘテロアリールを表す場合、例には、任意に置換してもよい単環（例えば、5員環又は6員環）及び二環（例えば、9員環又は10員環）を含む。例となる5員環には、ピロリル（例えば、ピロール-2-イル）及びイミダゾリル（例えば、1H-イミダゾール-2-イル又は1H-イミダゾール-4-イル）、ピラゾリル（例えば、1H-ピラゾール-3-イル）、フラニル（例えば、フラン-2-イル）、チアゾリル（例えば、チアゾール-2-イル）、チオフェニル（例えば、チオフェン-2-イル、チオフェン-3-イル）を含む。例となる6員環には、ピリジニル（例えば、ピリジン-2-イル及びピリジン-4-イル）を含む。言及してもよい具体的な置換基は、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル（例えば、メチル）、及びアルコキシ-（例えば、メトキシ-）から選択される1個以上の、例えば1個、2個、又は3個の基である。例となる置換5員環には、4,5-ジメチル-フラン-2-イル-、5-ヒドロキシメチル-フラン-2-イル-、5-メチル-フラン-2-イル-、及び6-メチル-ピリジン-2-イル-を含む。一例の置換6員環は、1-オキシ-ピリジン-4-イル-である。例となる9員環には、1H-インドリル（例えば、1H-インドール-3-イル、1H-インドール-5-イル）、ベンゾチオフェニル（例えば、ベンゾ[b]チオフェン-3-イル、特に2-ベンゾ[b]チオフェン-3-イル）、ベンゾ[1,2,5]-オキサジアゾリル（例えば、ベンゾ[1,2,5]-オキサジアゾール-5-イル）、ベンゾ[1,2,5]-チアジアゾリル（例えば、ベンゾ[1,2,5]-チアジアゾール-5-イル、ベンゾ[1,2,5]チアジアゾール-6-イル）を含む。例となる10員環には、キノリニル（例えば、キノリン-3-イル、キノリン-4-イル、キノリン-8-イル）を含む。言及してもよい具体的な置換基は、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル（例えば、メチル）、及びアルコキシ-（例えば、メトキシ-）から選択される1個以上の、例えば、1個、2個、又は3個の基である。例となる置換9員環には、1-メチル-1H-インドール-3-イル、2-メチル-1H-インドール-3-イル、6-メチル-1H-インドール-3-イルを含む。例となる置換10員環には、2-クロロ-キノリン-3-イル、8-ヒドロキシ-キノリン-2-イル、オキソ-クロメニル（例えば、4-オキソ-4H-クロメン-3-イル）、及び6-メチル-4-オキソ-4H-クロメン-3-イルを含む。
【０１１５】
R2がカルボシクリルを表す場合、例にはシクロアルキル及びシクロアルケニルを含む。シクロアルキルの例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、及びシクロヘプチルを含む。シクロアルケニルの例には、シクロヘキセニル（例えば、シクロヘキサ-2-エニル、シクロヘキサ-3-エニル）を含む。置換カルボシクリルの例には、2-メチル-シクロヘキシル-、3-メチル-シクロヘキシル-、4-メチル-シクロヘキシル-、2-メチル-シクロヘキサ-2-エニル、2-メチル-シクロヘキサ-3-エニル、3-メチル-シクロヘキサ-3-エニル、3-メチル-シクロヘキサ-3-エニルを含む。
【０１１６】
R2が、（任意に置換してもよい）ヘテロシクリルを表す場合、例には、テトラヒドロフラニル、モルフォリニル、ピペリジニル、3,4-ジヒドロ-2H-ピラニル、ピロリジニル、メチルテトラヒドロフラニル-（例えば、5-メチルテトラヒドロフラン-2-イル-）を含む。
【０１１７】
R2が-C1-4アルキルアリールを表す場合、例には、フェニルがアルキル、フルオロアルキル、ハロゲン、及びアルコキシ（例えば、メチル、トリフルオロメチル、tert-ブチル、クロロ、フルオロ、及びメトキシ）から選択される1個以上の基によって置換され、かつ例えばアルキルがC1-4アルキルである-アルキル(置換フェニル)を含む。別の具体的な基は、-アルキル(二環式アリール)であり、例えばここで、二環式アリールは任意に置換されたナフチルである。さらなる具体的な基はベンジルである。  
【０１１８】
R2が-C1-4アルキルヘテロアリール（式中、ヘテロアリールは任意に置換されている。）を表す場合、例には、メチルヘテロアリール及び-エチルヘテロアリール（例えば、1-ヘテロアリールエチル-及び2-ヘテロアリールエチル-）、-プロピルヘテロアリール、及び-ブチルヘテロアリール（式中、ヘテロアリールは任意に置換されている。）を含む。-アルキルヘテロアリール基の具体的な例には、ピリジニルメチル-、N-メチル-ピロール-2-メチル- N-メチル-ピロール-2-エチル-、N-メチル-ピロール-3-メチル-、N-メチル-ピロール-3-エチル-、2-メチル-ピロール-1-メチル-、2-メチル-ピロール-1-エチル-、3-メチル-ピロール-1-メチル-、3-メチル-ピロール-1-エチル-、4-ピリジノ-メチル-、4-ピリジノ-エチル-、2-(チアゾール-2-イル)-エチル-、2-エチル-インドール-1-メチル-、2-エチル-インドール-1-エチル-、3-エチル-インドール-1-メチル-、3-エチル-インドール-1-エチル-、4-メチル-ピリジン-2-メチル-、4-メチル-ピリジン-2-イル-エチル-、4-メチル-ピリジン-3-メチル-、4-メチル-ピリジン-3-エチル-を含む。
【０１１９】
R2が（任意に置換してもよい）-C1-4アルキル-カルボシクリルを表す場合、例には、-メチル-シクロペンチル、-メチル-シクロヘキシル、-エチル-シクロヘキシル、-プロピル-シクロヘキシル、-メチル-シクロヘキセニル、-エチル-シクロヘキセニル、-メチル(4-メチルシクロヘキシル)、及び-プロピル(3-メチルシクロヘキシル)を含む。
【０１２０】
R2が、（任意に置換してもよい）-C1-4アルキルヘテロシクリルを表す場合；例には、-メチル-テトラヒドロフラニル（例えば、-メチル-テトラヒドロフラン-2-イル、-メチル-テトラヒドロフラン-3イル）、-エチル-テトラヒドロフラニル、-メチル-ピペリジニルを含む。
【０１２１】
R2が、フェニルによって置換されたフェニル、又は単環式ヘテロアリール基によって置換されたフェニルを表し、ここで、上記フェニル基及びヘテロアリール基がいずれも任意に置換してもよい場合、典型的には、窒素原子に直接結合したフェニル環は非置換であり、かつ末端フェニル環又は単環式ヘテロアリール環は、1個、2個、又は3個の置換基（例えば、1個又は2個、例えば、1個）によって任意に置換されている。典型的には、末端フェニル基又は単環式ヘテロアリール基は非置換である。典型的には、末端フェニル基又は単環式ヘテロアリール基は、4位で他のフェニル基を置換する。
R2が、フェニルによって置換されたフェニルを表し、ここで、上記のフェニル基のいずれも任意に置換してもよい場合、例には-ビフェニル-4-イルを含む。
【０１２２】
R2が、単環式ヘテロアリール基によって置換されたフェニルを表し、ここで、上記フェニル基及びヘテロアリール基のいずれも任意に置換してもよい場合、例には4-(オキサゾール-5-イル)フェニル-を含む。
【０１２３】
R2が、ベンジルオキシによって置換されたフェニルを表し、ここで上記フェニル基及びベンジルオキシ基のいずれも任意に置換してもよい場合、例には、4-ベンジルオキシ-フェニル-、4-(3-メチルベンジルオキシ)フェニル-、及び4-(4-メチルベンジルオキシ)フェニル-を含む。
【０１２４】
R2が、任意に置換されたカルボシクリルに縮合した任意に置換されたフェニルを表す場合、例には、インダニル（例えば、インダン-4-イル-、2-メチル-インダン-4-イル-）、インデニル、及びテトラリニルを含む。
R2が、任意に置換されたヘテロシクリルに縮合した任意に置換されたフェニルを表す場合、例には、ベンゾ[1,3]ジオキソ-4-イル-及び2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-4-イル-を含む。
【０１２５】
R2が、-C1-4アルキル(フェニルによって置換されたフェニル)を表す場合、例にはビフェニル-4-イル-メチル-を含む。
R2が、-C1-4アルキル(単環式ヘテロアリール基によって置換されたフェニル)を表す場合、例には、4-(オキサゾール-5-イル)フェニル-メチル-を含む。
【０１２６】
R2が、-C1-4アルキル(ベンジルオキシによって置換されたフェニル)を表し、ここで、上記フェニル基及びベンジルオキシ基のいずれも任意に置換してもよい場合、例には、4-ベンジルオキシ-フェニル-メチル-、4-(3-メチルベンジルオキシ)フェニル-メチル-、及び4-(4-メチルベンジルオキシ)フェニル-メチル-を含む。
【０１２７】
R2が、-C1-4アルキル(任意に置換されたカルボシクリルに縮合した任意に置換されたフェニル)を表す場合、例には、インダニル-メチル-（例えば、インダン-4-イル-メチル-、2-メチル-インダン-4-イル-メチル-）、インデニル-メチル、及びテトラリニル-メチル-を含む。
【０１２８】
R2が、-C1-4アルキル(任意に置換されたヘテロシクリルに縮合した任意に置換されたフェニル)を表す場合；例には、ベンゾ[1,3]ジオキソ-4-イル-メチル-及び2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-4-イル-メチル-を含む。
【０１２９】
適切には、R2は、アリール、ヘテロアリール、フェニルによって置換されたフェニル、ヘテロシクリルに縮合したフェニルを表し、又はR2及びR3は結合して、フェニルに縮合したカルボシクリル環を形成し、上記アリール基、ヘテロアリール基、フェニル基、ヘテロシクリル基、及びカルボシクリル基は任意に置換されている。
【０１３０】
より適切には、R2は、アリール、ヘテロアリール、フェニルによって置換されたフェニル、又はヘテロシクリルに縮合したフェニルを表し、上記アリール基、ヘテロアリール基、フェニル基、及びヘテロシクリル基は任意に置換されている。
【０１３１】
一実施態様において、R2は、任意に置換されたヘテロアリールを表す。R2が、任意に置換されたヘテロアリールを表す場合、R2は適切には、ベンゾ[c][1,2,5]チアジアゾール-6-イルを表す。
【０１３２】
一実施態様において、R2がフェニルによって置換されたフェニルを表す場合、上記フェニル基は、例えば、同じでも異なってもよくかつハロ、OH、C1-3アルキル、C1-3ハロアルキル、C1-3アルコキシ、C1-3ハロアルコキシから選択される1個以上の置換基によって任意に置換される。R2が、フェニルによって置換されたフェニルを表す場合、R2は適切には、-ビフェニル-4-イルを表す。
【０１３３】
一実施態様において、R2は、任意に置換されたヘテロシクリルに縮合した任意に置換されたフェニルを表す。R2が、任意に置換されたヘテロシクリルに縮合した任意に置換されたフェニルを表す場合、R2は適切には、2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-4-イル-を表す。
【０１３４】
さらなる実施態様において、R2は、任意に置換されたアリール、特に任意に置換されたフェニルを表す。この種類の適切な化合物において、R2は、1個以上の置換基によって任意に置換されたフェニルを表す。一般に、R2が任意に置換されたフェニルである場合、該R2は、非置換であるか又は、同じでも異なってもよくかつハロ、OH、C1-3アルキル、C1-3ハロアルキル、C1-3アルコキシ、C1-3ハロアルコキシから選択される1個、2個、若しくは3個の置換基を有する。これらの置換基の具体的な例には、F、Cl、Br、OH、メチル、トリフルオロメチル、エチル、n-プロピル、メトキシ、エトキシ、及びn-プロポキシを含む。
特に適切なR2基は、n-プロピルオキシによって置換されたフェニル、特に4-n-プロポキシフェニルである。
【０１３５】
R3が、-C1-4アルキルを表す場合、例には、メチル、エチル、プロピル（例えば、n-プロピル、イソプロピル）、及びブチル（例えば、n-ブチル- sec-ブチル、イソブチル、及びtert-ブチル）を含む。
R3が、任意に置換されたアリールを表す場合、アリールは典型的には、フェニルを表し得る。典型的な置換フェニル基には、2,4-ジクロロフェニル-、2,4-ジフルオロフェニル-、2,4-ジメトキシフェニル-、2,4-ジメチルフェニル-、2,4-ビス(トリフルオロメチル)フェニル-、2,4,6-トリフルオロフェニル-、2,4,6-トリメチルフェニル-、2,6-ジクロロフェニル-、2,6-ジフルオロフェニル-、2,6-ジメトキシフェニル-、2-イソプロピル-6-メチルフェニル-、3-(シクロペンチルオキシ)-4-メトキシフェニル-、3,4,5-トリメトキシフェニル-、3,4-ジメトキシフェニル-、3,4-ジクロロフェニル-、3,4-ジメチルフェニル-、3,4,5-トリフルオロフェニル-、3,5-ビス(トリフルオロメチル)フェニル-、3,5-ジメトキシフェニル-、3-メトキシフェニル-、4-(トリフルオロメチル)フェニル-、4-ブロモ-2-(トリフルオロメチル)フェニル-、4-ブロモフェニル-、4-クロロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル-、4-クロロフェニル-、4-シアノフェニル-、4-エトキシフェニル-、4-エチルフェニル-、4-フルオロフェニル-、4-イソプロピルフェニル-、4-メトキシフェニル-を含む。或いは、R3は、非置換フェニル-を表してもよい。さらなる典型的な置換フェニル基には、2-ブロモ-4-フルオロフェニル-、2-ブロモ-5-フルオロフェニル-、2-クロロフェニル-、2-フルオロ-5-(トリフルオロメチル)フェニル-、2-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル-、2-ヒドロキシ-5-メチルフェニル-、3-クロロフェニル-、3-フルオロ-4-(トリフルオロメチル)フェニル-、3-ヒドロキシ-4-メトキシフェニル-、4-クロロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル-、4-クロロフェニル-、4-フルオロフェニル-、及び4-プロポキシフェニル-を含む。
【０１３６】
R2及びR3が結合して、1つ以上のC1-2アルキル基によって任意に置換されたカルボシクリル環を形成する場合、例には、シクロアルキル（例えば、シクロプロピル、シクロペンチル、及びシクロヘキシル）並びにシクロアルケニル（例えば、シクロヘキセニル）を含む。
R2及びR3が結合して、フェニルに縮合したカルボシクリル環を形成する場合；例には、インダニル（例えば、インダン-2-イル）及びテトラリニルを含む。
【０１３７】
R2及びR3が結合して単環式ヘテロアリールに縮合したカルボシクリル環を形成する場合；例には、6員のヘテロアリールに縮合した5員のカルボシクリル、6員のヘテロアリールに縮合した6員のカルボシクリル、5員のヘテロアリールに縮合した5員のカルボシクリル、及び5員のヘテロアリールに縮合した6員のカルボシクリルを含む。カルボシクリルが縮合した単環式ヘテロアリールは、少なくとも1個のヘテロ原子を含む（例えば、1個、2個、又は3個のヘテロ原子、例えば1個又は2個の、例えば1個のヘテロ原子）。
適切には、R3はHを表すか又は、R2及びR3は結合して、フェニルに縮合したカルボシクリル環を形成する。最も適切にはR3はHを表す。
【０１３８】
R4が-C1-8アルキルを表す場合、例にはメチル、エチル、プロピル（例えば、n-プロピル、イソプロピル）、ブチル（例えば、n-ブチル- sec-ブチル、イソブチル、及びtert-ブチル）、ペンチル（例えば、n-ペンチル、3,3-ジメチルプロピル）、ヘキシル、ヘプチル、及びオクチルを含む。
R4が-C(O)C1-6アルキルを表す場合；例には、-C(O)メチル、-C(O)エチル、-C(O)プロピル、及び-C(O)ブチルなどの-C(O)C1-4アルキルを含む。
適切には、R4は、H、-C1-8アルキル、又は-C(O)C1-6アルキルを表す。より適切には、R4はH又は-C1-8アルキル、例えばH又はメチルを表す。最も適切には、R4はHを表す。
【０１３９】
一実施態様において、XはOを表す。代替的な実施態様において、XはSを表す。
一実施態様において、YはOを表す。代替的な実施態様において、YはSを表す。
一実施態様において、XはOを表しかつYはSを表す。代替的な実施態様において、XはSを表しかつYはOを表す。適切には、X及びYは両方ともOを表す。
【０１４０】
最も特別には、式（I）の化合物は下記式によって表される
【化３７】
0005788320.tif 000043
0005788320.tif 000044
（式中R2及びR3は先に定義したとおりである。）。
最も適切には、式（I）の化合物は下記式によって表される
【化３８】
0005788320.tif 000045
（式中R2及びR3は先に定義したとおりである。）。
【０１４１】
本発明の化合物は、いくつかの利点を有し、それにより中枢神経系におけるQC関連疾患の治療に特に有用となっており、すなわち本発明の化合物は強力なQC阻害剤であり、好ましいlogBBを有し、脳中で高濃度に達する。
【０１４２】
一般式（I）の特に適切な化合物は、下記から選択される：
1．  5-(ベンゾ[c][1,2,5]チアジアゾール-6-イル)-1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)イミダゾリジン-2,4-ジオン
2．  1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-フェニルイミダゾリジン-2,4-ジオン
3．  1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2-ヒドロキシ-5-メチルフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン
4．  1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2-フルオロ-5-トリフルオロメチル)フェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン
5．  1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2-ブロモ-5-フルオロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン
6．  1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-プロポキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン
7．  1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-クロロ-3-トリフルオロメチル)フェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン
8．  1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(3-フルオロ-4-(トリフルオロメチル)フェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン
9．  1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(3-ヒドロキシ-4-メトキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン
10．  1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン
11．  1-(1H-ベンズイミダゾール-5-イル)-5-(1,1'-ビフェニル-4-イル)イミダゾリジン-2,4-ジオン
12．  1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(3-クロロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン
13．  1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-クロロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン
14．  1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2-クロロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン
15．  1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-フルオロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン
16．  1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2,3-ジヒドロベンゾ[b][1,4]ジオキシン-7-イル)イミダゾリジン-2,4-ジオン
17．  1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-フェニルイミダゾリジン-2,4-ジオン
18．  1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-(2-ブロモ-4-フルオロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン
19．  1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-(4-プロポキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン
20．  1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-(3-フルオロ-4-(トリフルオロメチル)フェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン
21．  1-[3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル-5-(4-ビフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン
22．  1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-(3-クロロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン
23．  1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-(2-クロロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン
24．  1-(3-(5-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-フェニルイミダゾリジン-2,4-ジオン
25．  5-(2-ブロモ-5-フルオロフェニル)-1-(3-(5-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)イミダゾリジン-2,4-ジオン
26．  1-(3-(5-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-(4-プロポキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン
27．  1-[3-(5-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル]-5-(4-フェニルフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン
28．  5-(3-クロロフェニル)-1-(3-(5-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)イミダゾリジン-2,4-ジオン
29．  1-(3-(4-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-フェニルイミダゾリジン-2,4-ジオン
30．  1-[3-(4-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル]-5-(4-ビフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン
31．  5-(3-クロロフェニル)-1-(3-(4-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)イミダゾリジン-2,4-ジオン
32．  3-(1H-ベンズイミダゾール-5-イル)-1',3'-ジヒドロ-2H,5H-スピロ[イミダゾリジン-4,2'-インデン]-2,5-ジオン
33．  5-(ベンゾ[c][1,2,5]チアジアゾール-6-イル)-1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-2-チオキソイミダゾリジン-4-オン
34．  1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-フェニル-2-チオキソイミダゾリジン-4-オン
35．  1-(1H-ベンズイミダゾール-5-イル)-5-(1,1'-ビフェニル-4-イル)-2-チオキソイミダゾリジン-4-オン
36．  1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(3-ヒドロキシ-4-メトキシフェニル)-2-チオキソイミダゾリジン-4-オン
37．  1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-フェニル-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン
38．  1-(1H-ベンズイミダゾール-5-イル)-5-(1,1'-ビフェニル-4-イル)-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン
39．  3-(1H-ベンズイミダゾール-5-イル)-5-チオキソ-1',3'-ジヒドロ-2H-スピロ[イミダゾリジン-4,2'-インデン]-2-オン
40．  1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-クロロフェニル)-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン
41．  1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2,3,4-トリフルオロフェニル)-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン
42．  1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-6-イル)-5-(4-ブロモ-2-フルオロフェニル)-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン
43．  1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2,3-ジフルオロ-4-メチルフェニル)-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン
44．  1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-クロロ-3-メチルフェニル)-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン
45．  1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-3-メチル-5-フェニルイミダゾリジン-2,4-ジオン
46．  1-(H-イミダゾ[1,2-a]ピリジン-7-イル)-5-フェニルイミダゾリジン-2,4-ジオン；
又はそのすべての互変異性体及び立体異性体を含むそれらの医薬として許容し得る塩、溶媒和物、若しくは多形体。
【０１４３】
この点において式（I）の特に適切な化合物は、実施例6の化合物1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-プロポキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオンであり、該化合物は下記構造を有する：
【化３９】
0005788320.tif 000046
式（I）の化合物は、R2及びR3が結合する炭素原子においてキラル中心を有し、本発明者は、式（I）の化合物における鏡像異性体の各々を単離することに成功している。例えば、実施例6の化合物の場合、本発明者は、(R)-1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-プロポキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン及び(S)-1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-プロポキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオンの両方を単離している。
【０１４４】
（治療的用途）
哺乳類におけるイソQC（QPCTL）の生理的基質は、例えば、アミロイドβ-ペプチド（3-40）（配列番号91）、（3-42）（配列番号92）、（11-40）（配列番号93）、及び（11-42）（配列番号94）、ABri（配列番号95）、ADan（配列番号96）、ガストリン（配列番号97）、ニューロテンシン（配列番号98）、FPP（配列番号99）、CCL2（配列番号100）、CCL7（配列番号101）、CCL8（配列番号102）、CCL13（配列番号103）、CCL16（配列番号104）、CCL18（配列番号105）、フラクタルキン（配列番号106）、オレキシンA（配列番号107）、[Gln5]-サブスタンスP（5-11）（配列番号108）、及びペプチドQYNAD（配列番号109）である。本発明記載のイソQC阻害剤及び／又は組み合わせ並びに、少なくとも1種のイソQC阻害剤を含む医薬組成物は、QC活性の調節により治療することができる容態の治療に有用である。
【０１４５】
グルタミン酸は、アミロイドβ-ペプチド（Aβ）の3、11、及び22位で見つかっている。該位置のうち、22位のグルタミン酸（E）からグルタミン（Q）への突然変異（アミロイド前駆体タンパク質APP 693、Swissprot P05067に相当）は、いわゆるオランダ型脳動脈アミロイドーシス変異として説明されている。
3、11、及び／又は22位にピログルタミン酸残基を伴うβ-アミロイドペプチドは、アミロイドβ-ペプチド1-40（42／43）よりも、より細胞傷害性があり、かつより疎水性であることが説明されている（Saido T.C.の文献（2000 Medical Hypotheses 54(3): 427-429））。
【０１４６】
複数のN-末端変種、例えばAβ（3-40）、Aβ（3-42）、Aβ（11-40）、及びAβ（11-42）は、異なる部位でのβ-セクレターゼ酵素であるアミロイド前駆体タンパク質βサイト切断酵素（BACE）によるか（Huse JT.らの文献（2002 J. Biol. Chem. 277 (18):16278-16284））、及び／又は全長ペプチドAβ（1-40）及びAβ（1-42）からのアミノペプチダーゼプロセシング若しくはジペプチジルアミノペプチダーゼプロセシングにより、作製することができる。すべての場合において、その後N-末端に生じるグルタミン酸残基のピログルタミン酸への環化は、イソQCにより触媒することができる。
【０１４７】
CCL2（MCP-1）、CCL7（MCP-3）、CCL8（MCP-2）、CCL13（MCP-4）、CCL16、CCL18、及びフラクタルキンは、骨髄前駆細胞の増殖の抑制、腫瘍、炎症性宿主応答、癌、乾癬、関節リウマチ、粥状硬化、脈管炎、体液性及び細胞性免疫応答、内皮での白血球接着及び遊走プロセス、炎症性腸疾患、再狭窄、肺線維症、肺高血圧症、肝線維症、肝硬変、腎硬化症、心室リモデリング、心不全、臓器移植後の動脈疾患、及び静脈移植血管の不全などの病態生理学的容態において、重要な役割を担っている。これらのペプチドの各々のN末端はグルタミニル残基で始まり、次に、N末端を生じるグルタミニル残基のピログルタミン酸への環化は、イソQCによって触媒することができる。
【０１４８】
最近、多発性硬化症又はギラン・バレー症候群に罹患した患者の脳脊髄液（CSF）中で、健常者と比べ、高いレベルのペンタペプチドQYNADが同定された（Brinkmeier H.らの文献（Nature Medicine 6, 808-811 (2000)））。ペンタペプチド
【化４０】
0005788320.tif 000047
の作用機序、特にナトリウムチャネルと相互作用しかつ該チャネルを遮断して、その結果軸索機能障害の促進をもたらし、そのことが中枢神経系の炎症性自己免疫疾患に関与する、該ペンタペプチドの有効性に関する文献においては大きな矛盾が存在する。しかし最近になって、QYNADではなく、その環化したピログルタミン酸型であるpEYNADが活性型であり、これがナトリウムチャネルを遮断し、その結果軸索機能障害の促進をもたらすことを示すことができた。ナトリウムチャネルは、有髄軸索において高密度で発現し、哺乳類の脳及び脊髄内で軸索に沿った活動電位を伝導する上で必須の（obligatory）役割を担っている。従ってナトリウムチャネルは、炎症性自己免疫疾患、特に多発性硬化症、ギラン・バレー症候群及び慢性炎症性脱髄性多発性神経根症の病態生理のいくつかの局面に関与していることが推測される。
【０１４９】
更にQYNADは、イソQCの基質であり、これはまた哺乳動物の脳、特にヒト脳内にも存在する。イソQCは、pEYNADの前駆体QYNADからのpEYNADの形成を効果的に触媒する。
【０１５０】
従って本発明は、下記からなる群から選択される疾患を予防又は軽減又は治療するための薬剤の製造のための式（I）の化合物の使用を提供する
a．慢性及び急性の炎症、例えば、関節リウマチ、粥状硬化、再狭窄、膵炎、骨粗鬆症、
b．他の炎症性疾患、例えば、神経因性疼痛、移植片拒絶反応／移植片不能／移植性脈管障害、HIV感染／エイズ、妊娠中毒症、結節性硬化症、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発性神経根症、及び多発性硬化症、
c．神経炎症、並びに
d．神経炎症から結果として生じ得る神経変性疾患、例えば、軽度認知障害（MCI）、アルツハイマー病、ダウン症候群における神経変性、家族性英国型認知症、及び家族性デンマーク型認知症。
【０１５１】
慢性及び急性の炎症、例えば、関節リウマチ、粥状硬化、再狭窄、膵炎、及び骨粗鬆症のためのイソQC阻害剤の使用が、本発明に従って好ましい。
【０１５２】
関節リウマチ及び／又は粥状硬化の治療のためのイソQC阻害剤の使用が特に好ましい。
多発性硬化症の治療のためのイソQC阻害剤の使用がさらに好ましい。
神経炎症の治療のためのイソQC阻害剤の使用がもっとも好ましい。
【０１５３】
特に、神経炎症から結果として生じ得る軽度認知障害（MCI）、アルツハイマー病、ダウン症候群における神経変性、家族性英国型認知症、及び家族性デンマーク型認知症の治療のためのイソQC阻害剤の使用が好ましい。
【０１５４】
さらなる実施態様において、本発明は、上記の疾患又は容態を予防又は治療することを必要とする対象に、医薬的有効量のイソQC阻害剤又はその医薬として許容し得る塩を投与することを含む、該疾患又は容態を予防又は治療する方法を提供する。
【０１５５】
加えて、本発明は、任意の上記の疾患又は容態の予防又は治療のための薬剤の製造のためのイソQC阻害剤又はその医薬として許容し得る塩の使用を提供する。
【０１５６】
上記治療方法における使用又は医薬用途のために、任意のイソQC阻害剤を採用してもよい。式（I）のイソQC阻害剤が好ましい。以下の表に列挙した実施例1〜46のイソQC阻害剤がより好ましい。イソQC-Iとして本明細書でさらに引用される式
【化４１】
0005788320.tif 000048
の実施例6（1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-プロポキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン）は、該治療方法における使用又は医薬用途にとって最も好ましい。
【表３】
0005788320.tif 000049
0005788320.tif 000050
0005788320.tif 000051
0005788320.tif 000052
0005788320.tif 000053
0005788320.tif 000054
0005788320.tif 000055
【０１５７】
（一般的な合成の説明）
（方法1（実施例1〜32））
【化４２】
0005788320.tif 000056
対応するアミン（1当量）を無水EtOH（0.01モルの出発材料の場合25mL）に溶解した。アルデヒド（1当量）又はケトンを添加し、混合物を25〜30℃で一晩撹拌した（薄層クロマトグラフィー（TLC）（溶離剤：10％（v/v）メタノール含有CHCl3、Alugram（登録商標）SIL G Silica-Gel 60、Rf 0.2mm）によるシッフ塩基形成の完了のための反応コントロール）。
【０１５８】
エチレングリコール（0.01モルの出発材料の場合25mL）を添加し、溶液を0〜5℃に冷却した後、対応するイソニトリル（1当量）、KOCN（1当量）、及び塩化ピリジニウム（1当量）を添加した。混合物を0〜5℃で2.5時間、次に室温で一晩撹拌した。
【０１５９】
その後、TFA（10％（v/v））の水溶液を、0.01モルの出発材料の場合150mL添加し、混合物を50〜60℃で一晩撹拌した。その後、EtOH及びTFAを蒸発させ、残余の水溶液を半分取クロマトグラフィーに供した。
生成物の遊離塩基を水に懸濁し、1当量のNaOH（水溶液）を添加した。溶液を凍結させ、凍結乾燥に供した。
【０１６０】
（方法2（実施例33〜36））
【化４３】
0005788320.tif 000057
5-アミノベンズイミダゾール（1当量）を無水EtOH（0.01モルの出発材料の場合25mL）に溶解した。アルデヒド（1当量）を添加し、混合物を25〜30℃で一晩撹拌した（TLC（溶離剤：10％（v/v）メタノール含有CHCl3、Alugram（登録商標）SIL G Silica-Gel 60上、Rf0.2mm）によるシッフ塩基形成の完了のための反応コントロール）。
【０１６１】
エチレングリコール（0.01モルの出発材料の場合25mL）を添加し、溶液を0〜5℃に冷却した後、対応するイソニトリル（1当量）、KSCN（1当量）、及び塩化ピリジニウム（1当量）を添加した。混合物を0〜5℃で2.5時間、次に室温で一晩撹拌した。
【０１６２】
その後、TFA（10％（v/v））の水溶液を、0.01molの出発材料の場合150mL添加し、混合物を50〜60℃で一晩撹拌した。その後、EtOH及びTFAを蒸発させ、残余の水溶液を分取HPLCに供した。
【０１６３】
（方法3：（実施例37〜44））
【化４４】
0005788320.tif 000058
4-メチルイミノ-イムダゾルジン（imdazoldine）-2-オンが、方法1において説明したアミン、アルデヒド、メチルイソニトリル、及びKOCNの反応から結果として生じた。
1当量の対応する4-メチルイミノ-イムダゾルジン-2-オンを1.25MのHCl含有メタノール（無水、0.25mmolの出発材料につき1mL）に溶解し、1当量の1.5当量の硫化ナトリウム含有溶液を密封したマイクロ波容器に加える。反応混合物をマイクロ波において140℃で20分間加熱する。
【０１６４】
溶媒の蒸発後、粗反応生成物をH2O／EtOAcで抽出する。有機相をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、除去する。結果として生じる反応生成物を半分取HPLCによって精製する。
【０１６５】
（方法4（実施例45、46）：）
【化４５】
0005788320.tif 000059
アミン（1当量）をCH2Cl2に溶解し、ジ-(1H-イミダゾール-1-イル)メタノン（1当量）を0℃で添加した。混合物を室温で4時間撹拌した。その後、1当量の対応するアミンを添加した（塩酸を適用する場合、1当量のTEAを追加的に添加した。）。次に、混合物を室温でさらに12時間撹拌した。溶媒を除去し、結果として生じる尿素をクロマトグラフィーに供した。
【０１６６】
尿素又はチオ尿素をHCl：AcOH（1：40（v/v））の混合物に溶解し、対応するグリオキサルを添加した。グリオキサルの量は、1当量の尿素の量に対応していた。混合物を還流下で4時間維持した。その後、溶媒を除去し、結果として生じる生成物を分取HPLCによって精製した。
【０１６７】
（方法5）
【化４６】
0005788320.tif 000060
1当量のアルデヒドをAcOH（4mmolの出発材料の場合5mL）に溶解し、1.1当量のアミンを添加した。その混合物に、1当量のトリメチルシリルシアニド（TMSCN）を添加した。混合物を室温で1.5時間撹拌した。
【０１６８】
その後、混合物を氷／アンモニア（4mmolの出発材料の場合、12mLの25％NH3溶液を含む。）に注いだ。水性層をCH2Cl2によって3回抽出し、有機相を組み合わせ、乾燥させ、濾過し、溶媒を除去した。残余物を濃HClに再度溶解し、40℃で一晩維持した。水を添加し、NaOHを添加することによって溶液を中和した。水相をCH2Cl2によって3回抽出した後、有機層を組み合わせて乾燥させた。
【０１６９】
溶媒を除去し、残余の油を下記の代替法のうちのいずれかに供した：
a）生成物を無水CHCl3に取り、EtO(CO)Cl及びトリエチルアミンを添加した。混合物を還流下で12時間維持した。その後、溶媒を除去し、残余の油を無水EtOHに溶解し、NaOEtを添加した。還流下で溶液を10時間維持し；又は
b）生成物をトルエンに溶解し、カルボニルジイミダゾール及びトリエチルアミンを添加した。溶液を還流下で18時間維持し、又は
c）生成物をホルムアミドに取り、200℃で2時間維持した。
【０１７０】
（半分取HPLC法）
本システムは、Luna（登録商標）100-7 C18半分取用カラム（Phenomenex.長さ：250mm、直径：21mm）を装備したMerck-Hitachi社の装置（モデルLaChrom）から構成された。本化合物は、勾配を用いて流速6mL/分で精製し；これにより、溶離剤（A）はアセトニトリルであり、溶離剤（B）は水であり、両方とも0.1％(v/v)トリフルオロ酢酸を含有し、下記勾配を適用した：0分〜40分。40〜95％の（A）。
【０１７１】
（実施例の合成）
（実施例1：5-(ベンゾ[c][1,2,5]チアジアゾール-6-イル)-1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)イミダゾリジン-2,4-ジオン）
方法1において説明したとおり、5-アミノベンズイミダゾール5.32g（40mmol）、ベンゾ[c][1,2,5]チアジアゾール-6-イル-カルボアルデヒド6.56g（40mmol）、n-ブチルイソニトリル4.24mL（40mmol）、及びKOCN 3.28g（40mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化４７】
0005788320.tif 000061
【０１７２】
（実施例2：1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-フェニルイミダゾリジン-2,4-ジオン
方法1において説明したとおり、5-アミノベンズイミダゾール1.331g（10mmol）、ベンズアルデヒド1.02mL（10mmol）、ベンジルイソニトリル1.22mL（10mmol）、及びKOCN 0.84g（10mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化４８】
0005788320.tif 000062
【０１７３】
（実施例3：1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2-ヒドロキシ-5-メチルフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン）
方法1において説明したとおり、5-アミノベンズイミダゾール0.4g（3.0mmol）、2-ヒドロキシ-5-メチルフェニルカルボアルデヒド0.409g（3.0mmol）、n-ブチルイソニトリル0.316mL（3.0mmol）、及びKOCN 0.244g（0.2mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化４９】
0005788320.tif 000063
【０１７４】
（実施例4：1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2-フルオロ-5-(トリフルオロメチル)フェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン）
方法1において説明したとおり、5-アミノベンズイミダゾール0.213g（1.6mmol）、2-フルオロ-5-(トリフルオロメチル)フェニルカルボアルデヒド0.362mL（1.6mmol）、n-ブチルイソニトリル0.169mL（1.6mmol）、塩化ピリジニウム0.185g（1.6mmol）、及びKOCN 0.13g（1.6mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化５０】
0005788320.tif 000064
【０１７５】
（実施例5：1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2-ブロモ-5-フルオロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン）
方法1において説明したとおり、5-アミノベンズイミダゾール0.213g（1.6mmol）、2-ブロモ-5-フルオロフェニルカルボアルデヒド0.325（1.6mmol）、n-ブチルイソニトリル0.169mL（1.6mmol）、塩化ピリジニウム0.185g（1.6mmol）、及びKOCN 0.13g（1.6mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化５１】
0005788320.tif 000065
【０１７６】
（実施例6：1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-プロポキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン）
方法1において説明したとおり、5-アミノベンズイミダゾール0.213g（1.6mmol）、4-プロポキシフェニルカルボアルデヒド0.253mL（1.6mmol）、n-ブチルイソニトリル0.169mL（1.6mmol）、塩化ピリジニウム0.185g（1.6mmol）、及びKOCN 0.13g（1.6mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化５２】
0005788320.tif 000066
【０１７７】
（実施例7：1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-クロロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン）
方法1において説明したとおり、5-アミノベンズイミダゾール0.213g（1.6mmol）、4-クロロ-3-(トリフルオロメチル)フェニルカルボアルデヒド0.23mL（1.6mmol）、n-ブチルイソニトリル0.169mL（1.6mmol）、塩化ピリジニウム0.185g（1.6mmol）、及びKOCN 0.13g（1.6mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化５３】
0005788320.tif 000067
【０１７８】
（実施例8：1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(3-フルオロ-4-(トリフルオロメチル)フェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン）
方法1において説明したとおり、5-アミノベンズイミダゾール0.133g（1mmol）、3-フルオロ-4-(トリフルオロメチル)フェニルカルボアルデヒド0.192g（1mmol）、n-ブチルイソニトリル0.083g（1mmol）、塩化ピリジニウム0.185g（1.6mmol）、及びKOCN 0.081g（1mmol）から出発して、本化合物を合成した。
収量：0.151g（40％）；MS m/z 379.2 (M+H)+
【０１７９】
（実施例9：1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(3-ヒドロキシ-4-メトキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン）
方法1において説明したとおり、5-アミノベンズイミダゾール0.213g（1.6mmol）、3-ヒドロキシ-4-メトキシフェニルカルボアルデヒド0.244g（1.6mmol）、n-ブチルイソニトリルn-ブチルイソニトリル0.169mL（1.6mmol）、塩化ピリジニウム0.185g（1.6mmol）、及びKOCN 0.13g（1.6mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化５４】
0005788320.tif 000068
【０１８０】
（実施例10：1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン）
方法1において説明したとおり、5-アミノベンズイミダゾール0.133g（1mmol）、2-ヒドロキシ-3-メトキシフェニルカルボアルデヒド0.153g（1mmol）、n-ブチルイソニトリル0.106mL（1mmol）、及びKOCN 0.082g（1mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化５５】
0005788320.tif 000069
【０１８１】
（実施例11：1-(1H-ベンズイミダゾール-5-イル)-5-(1,1'-ビフェニル-4-イル)イミダゾリジン-2,4-ジオン）
方法1において説明したとおり、5-アミノベンズイミダゾール0.133g（1mmol）、1,1'-ビフェニル-4-イルカルボアルデヒド0.183（1mmol）、n-ブチルイソニトリルn-ブチルイソニトリル0.106mL（1mmol）、及びKOCN 0.082g（1mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化５６】
0005788320.tif 000070
【０１８２】
（実施例12：1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(3-クロロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン）
方法1において説明したとおり、5-アミノベンズイミダゾール2.13g（16mmol）、3-クロロベンズアルデヒド2.24g（16mmol）、n-ブチルイソニトリル1.69mL（16mmol）、KOCN 1.3g（16mmol）、及び塩化ピリジニウム1.85g（16mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化５７】
0005788320.tif 000071
【０１８３】
（実施例13：1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-クロロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン）
方法1において説明したとおり、5-アミノベンズイミダゾール0.213g（1.6mmol）、4-クロロベンズアルデヒド0.224g（1.6mmol）、n-ブチルイソニトリル0.169mL（1.6mmol）、塩化ピリジニウム0.185g（1.6mmol）、及びKOCN 0.130g（1.6mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化５８】
0005788320.tif 000072
【０１８４】
（実施例14：1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2-クロロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン）
方法1において説明したとおり、5-アミノベンズイミダゾール0.213g（1.6mmol）、2-クロロベンズアルデヒド0.225mg（1.6mmol）、n-ブチルイソニトリル0.169mL（1.6mmol）、塩化ピリジニウム0.185g（1.6mmol）、及びKOCN 0.130g（1.6mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化５９】
0005788320.tif 000073
【０１８５】
（実施例15：1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-フルオロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン）
方法1において説明したとおり、5-アミノベンズイミダゾール0.134g（1mmol）、4-フルオロベンズアルデヒド0.125g（1mmol）、n-ブチルイソニトリル0.106mL（1mmol）、塩化ピリジニウム0.116g（1mmol）、及びKOCN 0.082g（1mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化６０】
0005788320.tif 000074
【０１８６】
（実施例16：1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2,3-ジヒドロベンゾ[b][1,4]ジオキシン-7-イル)イミダゾリジン-2,4-ジオン）
方法1において説明したとおり、5-アミノベンズイミダゾール0.134g（1mmol）、2,3-ジヒドロベンゾ[b][1,4]ジオキシン-7-イルカルボアルデヒド0.165g（1mmol）、n-ブチルイソニトリル0.106mL（1mmol）、塩化ピリジニウム0.116g（1mmol）、及びKOCN 0.082g（1mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化６１】
0005788320.tif 000075
【０１８７】
（実施例17：1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-フェニルイミダゾリジン-2,4-ジオン）
方法1において説明したとおり、3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピルアミン1.0g（7.98mmol）、ベンズアルデヒド0.807mL（7.98mmol）、ベンジルイソニトリル0.972mL（7.98mmol）、塩化ピリジニウム0.920、及びKOCN 0.648g（7.98mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化６２】
0005788320.tif 000076
【０１８８】
（実施例18：1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-(2-ブロモ-4-フルオロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン）
方法1において説明したとおり、3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピルアミン0.358mL（3mmol）、2-ブロモ4-フルオロベンズアルデヒド0.610g（3mmol）、ベンジルイソニトリル0.365mL（3mmol）、塩化ピリジニウム0.347g（3mmol）、及びKOCN 0.243g（3mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化６３】
0005788320.tif 000077
【０１８９】
（実施例19：1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-(4-プロポキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン）
方法1において説明したとおり、3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピルアミン0.358mL（3mmol）、4-プロポキシフェニルカルボアルデヒド0.492g（3mmol）、n-ブチルイソニトリル0.315mL（3mmol）、塩化ピリジニウム0.347g（3mmol）、及びKOCN 0.243g（3mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化６４】
0005788320.tif 000078
【０１９０】
（実施例20：1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-(3-フルオロ-4-(トリフルオロメチル)フェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン）
方法1において説明したとおり、3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピルアミン0.358mL（3mmol）、3-フルオロ-4-(トリフルオロメチル)フェニルカルボアルデヒド0.576g（3mmol）、n-ブチルイソニトリル0.315mL（3mmol）、塩化ピリジニウム0.347g（3mmol）、及びKOCN 0.243g（3mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化６５】
0005788320.tif 000079
【０１９１】
（実施例21：1-[3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル]-5-(4-ビフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン）
方法1において説明したとおり、3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピルアミン0.358mL（3mmol）、4-フェニルベンズアルデヒド0.546g（3mmol）、n-ブチルイソニトリル0.315mL（3mmol）、塩化ピリジニウム0.347g（3mmol）、及びKOCN 0.243g（3mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化６６】
0005788320.tif 000080
【０１９２】
（実施例22：1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-(3-クロロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン）
方法1において説明したとおり、3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピルアミン0.358mL（3mmol）、3-クロロフェニルカルボアルデヒド0.42g（3mmol）、n-ブチルイソニトリル0.315mL（3mmol）、塩化ピリジニウム0.347g（3mmol）、及びKOCN 0.243g（3mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化６７】
0005788320.tif 000081
【０１９３】
（実施例23：1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-(2-クロロフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン）
方法1において説明したとおり、3-(1H-イミダゾール-1-イ（y）)プロピルアミン0.358mL（3mmol）、2-クロロベンズアルデヒド0.420g（3mmol）、n-ブチルイソニトリル0.315mL（3mmol）塩化ピリジニウム0.347g（3mmol）、及びKOCN 0.243g（3mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化６８】
0005788320.tif 000082
【０１９４】
（実施例24：1-(3-(5-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-フェニルイミダゾリジン-2,4-ジオン）
方法1において説明したとおり、(3-(5-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)アミン0.278g（2mmol）、ベンズアルデヒド0.202mL（2mmol）、ベンジルイソニトリル0.245mL（2mmol）塩化ピリジニウム0.231g（2mmol）、及びKOCN 0.165g（2mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化６９】
0005788320.tif 000083
【０１９５】
（実施例25：5-(2-ブロモ-5-フルオロフェニル)-1-(3-(5-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)イミダゾリジン-2,4-ジオン）
方法1において説明したとおり、(3-(5-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)アミン0.278g（2mmol）、2-ブロモ-5-フルオロフェニルカルボアルデヒド0.406g（2mmol）、ベンジルイソニトリル0.245mL（2mmol）塩化ピリジニウム0.231g（2mmol）、及びKOCN 0.165g（2mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化７０】
0005788320.tif 000084
【０１９６】
（実施例26：1-(3-(5-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-(4-プロポキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン）
方法1において説明したとおり、(3-(5-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)アミン0.278g（2mmol）、4-プロポキシフェニルカルボアルデヒド0.316mL（2mmol）、ベンジルイソニトリル0.245mL（2mmol）、塩化ピリジニウム0.231g（2mmol）、及びKOCN 0.165g（2mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化７１】
0005788320.tif 000085
【０１９７】
（実施例27：1-[3-(5-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル]-5-(4-フェニルフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン）
方法1において説明したとおり、(3-(5-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)アミン0.278g（2mmol）、4-フェニルベンズアルデヒド0.364g（2mmol）、ベンジルイソニトリル0.245mL（2mmol）塩化ピリジニウム0.231g（2mmol）、及びKOCN 0.165g（2mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化７２】
0005788320.tif 000086
【０１９８】
（実施例28：5-(3-クロロフェニル)-1-(3-(5-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)イミダゾリジン-2,4-ジオン）
方法1において説明したとおり、(3-(5-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)アミン0.278g（2mmol）、3-クロロフェニルカルボアルデヒド0.226mL（2mmol）、ベンジルイソニトリル0.245mL（2mmol）塩化ピリジニウム0.231g（2mmol）、及びKOCN 0.165g（2mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化７３】
0005788320.tif 000087
【０１９９】
（実施例29：1-(3-(4-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-5-フェニルイミダゾリジン-2,4-ジオン）
方法1において説明したとおり、3-(4-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピルアミン0.250g（1.8mmol）、ベンズアルデヒド0.182mL（1.8mmol）、ベンジルイソニトリル0.220mL（1.8mmol）塩化ピリジニウム0.210g（1.8mmol）、及びKOCN 0.150g（1.8mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化７４】
0005788320.tif 000088
【０２００】
（実施例30：1-[3-(4-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル]-5-(4-ビフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン）
方法1において説明したとおり、3-(4-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピルアミン0.250g（1.8mmol）、4-フェニル-ベンズアルデヒド0.220g（1.8mmol）、ベンジルイソニトリル0.220mL（1.8mmol）、塩化ピリジニウム0.210g（1.8mmol）、及びKOCN 0.150g（1.8mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化７５】
0005788320.tif 000089
【０２０１】
（実施例31：5-(3-クロロフェニル)-1-(3-(4-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)イミダゾリジン-2,4-ジオン）
方法1において説明したとおり、3-(4-メチル-1H-イミダゾール-1-イル)プロピルアミン0.250g（1.8mmol）、3-クロロフェニルカルボアルデヒド0.204mL（1.8mmol）、ベンジルイソニトリル0.220mL（1.8mmol）塩化ピリジニウム0.210g（1.8mmol）、及びKOCN 0.150g（1.8mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化７６】
0005788320.tif 000090
【０２０２】
（実施例32：3-(1H-ベンズイミダゾール-5-イル)-1',3'-ジヒドロ-2H,5H-スピロ[イミダゾリジン-4,2'-インデン]-2,5-ジオン）
方法1において説明したとおり、5-アミノベンズイミダゾール0.4g（3mmol）、インダン-2-オン0.4g（3mmol）、n-ブチルイソニトリル0.316mL（3mmol）、塩化ピリジニウム0.347g（3mmol）、及びKOCN 0.244g（3mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化７７】
0005788320.tif 000091
【０２０３】
（実施例33：5-(ベンゾ[c][1,2,5]チアジアゾール-6-イル)-1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-2-チオキソイミダゾリジン-4-オン）
方法2において説明したとおり、5-アミノベンズイミダゾール0.013g（0.1mmol）、ベンゾ[c][1,2,5]チアジアゾール-6-イルカルボアルデヒド0.016g（0.1mmol）、n-ブチルイソニトリル0.010mL（0.1mmol）、塩化ピリジニウム0.012g（0.1mmol）、及びKSCN 0.01g（0.1mmol）から出発して、本化合物を合成した。
収量：0.0045g（12％）；MS m/z 367.2 (M+H)+；HPLC（λ＝220nm, [B]）：室温1.91分（94％）。
【０２０４】
（実施例34：1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-フェニル-2-チオキソイミダゾリジン-4-オン）
方法2において説明したとおり、5-アミノベンズイミダゾール0.013g（0.1mmol）ベンズアルデヒド0.01mL（0.1mmol）、n-ブチルイソニトリル0.010mL（0.1mmol）、塩化ピリジニウム0.012g（0.1mmol）、及びKSCN 0.01g（0.1mmol）から出発して、本化合物を合成した。
収量：0.0069g（22％）；MS m/z 309.3 (M+H)+；HPLC（λ＝220nm, [B]）：室温1.52分（96％）
【０２０５】
（実施例35：1-(1H-ベンズイミダゾール-5-イル)-5-(1,1'-ビフェニル-4-イル)-2-チオキソイミダゾリジン-4-オン）
方法2において説明したとおり、5-アミノベンズイミダゾール0.013g（0.1mmol）、4-フェニルベンズアルデヒド0.018g（0.1mmol）、n-ブチルイソニトリル0.010mL（0.1mmol）、塩化ピリジニウム0.012g（0.1mmol）、及びKSCN 0.01g（0.1mmol）から出発して、本化合物を合成した。
収量：0.00346g（8.9％）；MS m/z 385.5 (M+H)+；HPLC（λ＝220nm, [B]）：室温2.93分（96％）。
【０２０６】
（実施例36：1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(3-ヒドロキシ-4-メトキシフェニル)-2-チオキソイミダゾリジン-4-オン）
方法2において説明したとおり、5-アミノベンズイミダゾール0.013g（0.1mmol）、3-ヒドロキシ-4-メトキシフェニルカルボアルデヒド0.015g（0.1mmol）、n-ブチルイソニトリル0.010mL（0.1mmol）、塩化ピリジニウム0.012g（0.1mmol）、及びKSCN 0.01g（0.1mmol）から出発して、本化合物を合成した。
収量：0.00162g（3.5％）；MS m/z 355.3 (M+H)+；HPLC（λ＝220nm, [B]）：室温0.81分（92％）。
【０２０７】
（実施例37：1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-フェニル-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン）
方法3において説明したとおり、1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-4-(メチルイミノ)-5-フェニルイミダゾリジン-2-オン0.076g（0.25mmol）、及びNa2S 0.029g（0.375mmol）から出発して、本化合物を合成した。
収量：0.0092g（12％）；MS m/z 309.5 (M+H)+；HPLC（λ＝220nm, [B]）：室温2.61分（64％）。
【０２０８】
（実施例38：1-(1H-ベンズイミダゾール-5-イル)-5-(1,1'-ビフェニル-4-イル)-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン）
方法3において説明したとおり、1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-4-(メチルイミノ)-5-(1,1'-ビフェニル-4-イル)イミダゾリジン-2-オン0.095g（0.25mmol）Na2S 0.029g（0.375mmol）から出発して、本化合物を合成した。
収量：0.00036g（0.37％）；MS m/z 385.4 (M+H)+；HPLC（λ＝220nm, [B]）：室温3.02分（97％）。
【０２０９】
（実施例39：3-(1H-ベンズイミダゾール-5-イル)-5-チオキソ-1',3'-ジヒドロ-2H-スピロ[イミダゾリジン-4,2'-インデン]-2-オン）
方法3において説明したとおり、3-(1H-ベンズイミダゾール-5-イル)-4-(メチルイミノ)-1',3'-ジヒドロ-2H-スピロ[イミダゾリジン-4,2'-インデン]-2-オン0.082g（0.25mmol）及びNa2S 0.029g（0.375mmol）から出発して、本化合物を合成した。
収量：0.0016g（1.9％）；MS m/z 335.2 (M+H)+；HPLC（λ＝220nm, [D]）：室温2.81分（84％）。
【０２１０】
（実施例40：1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-クロロフェニル)-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン）
方法3において説明したとおり、1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-クロロフェニル)-4-(メチルイミノ)イミダゾリジン-2-オン0.084g（0.25mmol）及びNa2S 0.029g（0.375mmol）から出発して、本化合物を合成した。
収量：0.00088g（1.0％）；MS m/z 343.8 (M+H)+；HPLC（λ＝220nm, [D]）；室温2.73分（99％）。
【０２１１】
（実施例41：1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2,3,4-トリフルオロフェニル)-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン）
方法3において説明したとおり、1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2,3,4-トリフルオロフェニル)-4-(メチルイミノ)イミダゾリジン-2-オン0.090g（0.25mmol）及びNa2S 0.029g（0.375mmol）から出発して、本化合物を合成した。
収量：0.00613g（6.7％）；MS m/z 363.2 (M+H)+；HPLC（λ＝220nm, [D]）：室温2.02分（97％）。
【０２１２】
（実施例42：1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-6-イル)-5-(4-ブロモ-2-フルオロフェニル)-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン）
方法3において説明したとおり、1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-ブロモ-2-フルオロフェニル)-4-(メチルイミノ)イミダゾリジン-2-オン0.100g（0.25mmol）及びNa2S 0.029g（0.375mmol）から出発して、本化合物を合成した。
収量：0.00071g（0.6％）；MS m/z 406.2 (M+H)+；HPLC（λ＝220nm, [D]）：室温2.94分（90％）。
【０２１３】
（実施例43：1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2,3-ジフルオロ-4-メチルフェニル)-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン）
方法3において説明したとおり、1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(2,3-ジフルオロ-4-メチルフェニル)-4-(メチルイミノ)イミダゾリジン-2-オン0.088g（0.25mmol）及びNa2S 0.029g（0.375mmol）から出発して、本化合物を合成した。
収量：0.0055g（6.1％）；MS m/z 359.2 (M+H)+；HPLC（λ＝220nm, [D]）：室温3.12分（97％）。
【０２１４】
（実施例44：1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-クロロ-3-メチルフェニル)-4-チオキソイミダゾリジン-2-オン）
方法3において説明したとおり、1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-クロロ-3-メチルフェニル)-4-(メチルイミノ)イミダゾリジン-2-オン0.088g（0.25mmol）及びNa2S 0.029g（0.375mmol）から出発して、本化合物を合成した。
収量：0.00221g（2.4％）；MS m/z 357.2 (M+H)+；HPLC（λ＝220nm, [D]）：室温3.21分（80％）。
【０２１５】
（実施例45：1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-3-メチル-5-フェニルイミダゾリジン-2,4-ジオン）
方法4に従って、5-アミノベンズイミダゾール0.266g（2mmol）、ジ-(1H-イミダゾール-1-イル)メタノン0.324g（2mmol）、塩酸メチルアミン0.135g（2mmol）TEA 0.255mL（2mmol）、及びフェニルグリオキサル水和物0.102g（0.67mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化７８】
0005788320.tif 000092
【０２１６】
（実施例46：1-(H-イミダゾ[1,2-a]ピリジン-7-イル)-5-フェニルイミダゾリジン-2,4-ジオン）
方法4に従って、1-(H-イミダゾ[1,2-a]ピリジン-7-イル)尿素0.03g（0.170mmol）及びフェニルグリオキサル水和物0.028g（0.20mmol）から出発して、本化合物を合成した。
【化７９】
0005788320.tif 000093
【０２１７】
特に、適切な化合物は、式
【化８０】
0005788320.tif 000094
の実施例6（1-(1H-ベンゾ[d]イミダゾール-5-イル)-5-(4-プロポキシフェニル)イミダゾリジン-2,4-ジオン）（イソQC-I）である。
【０２１８】
（鏡像異性体の分離）
実施例化合物6の鏡像異性体を、溶媒混合物を含む水で溶出する逆相HPLC（RP-HPLC）によって分離した。
【表４】
0005788320.tif 000095
【０２１９】
個別の鏡像異性体の阻害効力を下記のとおり決定した：
【表５】
0005788320.tif 000096
阻害効力は、以下の生物学的実施例において述べた阻害剤アッセイ方法を使用して得た。
【０２２０】
好ましい実施態様において、本発明は、抗認知症薬、神経保護薬、抗パーキンソン病薬、アミロイドタンパク質沈着阻害剤、βアミロイド合成阻害剤、抗うつ薬、抗不安薬、抗精神病薬、及び抗多発性硬化症薬からなる群から選択される少なくとも1つの他の薬剤と任意に組み合わせて少なくとも1つのイソQC阻害剤を含む組成物、好ましくは医薬組成物を提供する。
【０２２１】
より具体的には、上記の他の薬剤は、抗炎症薬、βアミロイド抗体、システインプロテアーゼ阻害剤、PEP阻害剤、LiCl、アセチルコリンエステラーゼ（AChE）阻害剤、PIMTエンハンサー、βセクレターゼの阻害剤、γセクレターゼの阻害剤、中性エンドペプチダーゼの阻害剤、ホスホジエステラーゼ-4（PDE-4）の阻害剤、TNFα阻害剤、ムスカリン性M1受容体アンタゴニスト、NMDA受容体アンタゴニスト、σ-1受容体阻害剤、ヒスタミンH3アンタゴニスト、免疫調節薬、免疫抑制薬、MCP-1アンタゴニスト、又は、アンテグレン（ナタリズマブ）、Neurelan（ファムプリジン（fampridine）-SR）、キャンパス（アレムツズマブ）、IR 208、NBI 5788/MSP 771（チプリモチド）、パクリタキセル、Anergix.MS（AG 284）、SH636、ディフェリン（CD271、アダパレン）、BAY 361677（インターロイキン-4）、マトリックス-メタロプロテイナーゼ阻害剤（例えば、BB 76163）、インターフェロンτ（トロホブラスチン）、及びSAIK-MSからなる群から選択される薬剤からなる群から選択される。
【０２２２】
さらに、本発明は、他の上記の薬剤のうちの少なくとも1つと任意に組み合わせて、少なくとも1つのイソQC阻害剤を含む、例えば非経口投与、経腸投与、又は経口投与のための医薬組成物を提供する。
【０２２３】
方法は、少なくとも1つのイソQC阻害剤と他の薬剤のうちの少なくとも1つとの同時投与、又はその連続投与のいずれかを含む。
同時投与には、少なくとも1つのイソQC阻害剤とその他の薬剤のうちの少なくとも1つとを含む製剤の投与、又は各薬剤の個別の製剤の本質的に同時の投与を含む。
【０２２４】
本発明の目的に特に有用なのは、イソQC阻害剤とMCP-1アンタゴニストとの併用である。MCP-1アンタゴニストは例えば、抗MCP-1抗体、好ましくはモノクローナル又はヒト化モノクローナル抗体、MCP-1発現阻害剤、CCR2-アンタゴニスト、TNFα阻害剤、VCAM-1遺伝子発現阻害剤、及び抗C5aモノクローナル抗体から選択してもよい。イソQC阻害剤とMCP-1アンタゴニストとのこのような併用は、一般に、炎症性疾患の治療に有用であり得る。
【０２２５】
特に、下記の併用は、本発明の目的に有用であると考えられる：
−粥状硬化の治療及び／又は予防のための、イソQC阻害剤、特にイソQC-Iと、アトルバスタチンとの併用
−再狭窄の予防及び／又は治療のための、イソQC阻害剤、特にイソQC-Iと、免疫抑制薬、好ましくはラパマイシンとの併用
−再狭窄の予防及び／又は治療のための、イソQC阻害剤、特にイソQC-Iと、免疫抑制薬、好ましくはパクリタキセルとの併用
−多発性硬化症の予防及び／又は治療のための、イソQC阻害剤、特にイソQC-Iと、インターフェロン、好ましくはアロネックス（Aronex）との併用
−多発性硬化症の予防及び／又は治療のための、イソQC阻害剤、特にイソQC-Iと、インターフェロン、好ましくはベタフェロンとの併用
−多発性硬化症の予防及び／又は治療のための、イソQC阻害剤、特にイソQC-Iと、インターフェロン、好ましくはレビフとの併用
−多発性硬化症の予防及び／又は治療のための、イソQC阻害剤、特にイソQC-Iと、コパクソンとの併用
−再狭窄の予防及び／又は治療のための、イソQC阻害剤、特にイソQC-Iと、デキサメタゾンとの併用
−粥状硬化の予防及び／又は治療のための、イソQC阻害剤、特にイソQC-Iと、デキサメタゾンとの併用
−関節リウマチの予防及び／又は治療のための、イソQC阻害剤、特にイソQC-Iと、デキサメタゾンとの併用
−再狭窄の予防及び／又は治療のための、イソQC阻害剤、特にイソQC-Iと、HMG-CoA-レダクターゼ阻害剤との併用、ここでHMG-CoA-レダクターゼ阻害薬は、アトルバスタチン、セリバスタチン、フラバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン及びシンバスタチンから選択される
−粥状硬化の予防及び／又は治療のための、イソQC阻害剤、特にイソQC-Iと、HMG-CoA-レダクターゼ阻害剤との併用、ここでHMG-CoA-レダクターゼ阻害薬は、アトルバスタチン、セリバスタチン、フラバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン及びシンバスタチンから選択される
−関節リウマチの予防及び／又は治療のための、イソQC阻害剤、特にイソQC-Iと、HMG-CoA-レダクターゼ阻害剤との併用、ここでHMG-CoA-レダクターゼ阻害薬は、アトルバスタチン、セリバスタチン、フラバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン及びシンバスタチンから選択される
−軽度認知障害の予防及び／又は治療のための、イソQC阻害剤、好ましくはイソQC-Iと、アミロイド-β抗体との併用、ここでアミロイド-β抗体はAcl-24である、
−アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための、イソQC阻害剤、好ましくはイソQC-Iと、アミロイド-β抗体との併用、ここでアミロイド-β抗体はAcl-24である、
−ダウン症候群における神経変性の予防及び／又は治療のための、イソQC阻害剤、好ましくはイソQC-Iと、アミロイド-β抗体との併用、ここでアミロイド-β抗体はAcl-24である、
−軽度認知障害の予防及び／又は治療のための、イソQC阻害剤、好ましくはイソQC-Iと、βセクレターゼ阻害剤との併用、ここでβセクレターゼ阻害剤は、WY-25105、GW-840736X及びCTS-21166から選択される、
−アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための、イソQC阻害剤、好ましくはイソQC-Iと、βセクレターゼ阻害剤との併用、ここでβセクレターゼ阻害剤は、WY-25105、GW-840736X及びCTS-21166から選択される、
−ダウン症候群における神経変性の予防及び／又は治療のための、イソQC阻害剤、好ましくはイソQC-Iと、βセクレターゼ阻害剤との併用、ここでβセクレターゼ阻害剤は、WY-25105、GW-840736X及びCTS-21166から選択される、
−軽度認知障害の予防及び／又は治療のための、イソQC阻害剤、好ましくはイソQC-Iと、γ-セクレターゼ阻害剤との併用、ここでγ-セクレターゼ阻害剤は、LY-450139、LY-411575及びAN-37124から選択される、
−アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための、イソQC阻害剤、好ましくはイソQC-Iと、γ-セクレターゼ阻害剤との併用、ここでγ-セクレターゼ阻害剤は、LY-450139、LY-411575及びAN-37124から選択される、
−ダウン症候群における神経変性の予防及び／又は治療のための、イソQC阻害剤、好ましくはイソQC-Iと、γ-セクレターゼ阻害剤との併用、ここでγ-セクレターゼ阻害剤は、LY-450139、LY-411575及びAN-37124から選択される、
−軽度認知障害の予防及び／又は治療のための、イソQC阻害剤、好ましくはイソQC-Iと、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤との併用、ここでアセチルコリンエステラーゼ阻害剤は、ドネペジル及びジメボンから選択される、
−アルツハイマー病の予防及び／又は治療のための、イソQC阻害剤、好ましくはイソQC-Iと、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤との併用、ここでアセチルコリンエステラーゼ阻害剤は、ドネペジル及びジメボンから選択される、
−ダウン症候群における神経変性の予防及び／又は治療のための、イソQC阻害剤、好ましくはイソQC-Iと、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤との併用、ここでアセチルコリンエステラーゼ阻害剤は、ドネペジル及びジメボンから選択される。
【０２２６】
このような併用療法は、粥状硬化、関節リウマチ、再狭窄、膵炎、骨粗鬆症、及び多発性硬化症のような炎症性疾患、並びに軽度認知障害（MCI）、アルツハイマー病、ダウン症候群における神経変性、家族性英国型認知症、家族性デンマーク型認知症のような神経炎症及び神経炎症の結果として生じる疾患の治療にとくに有用である。
【０２２７】
このような併用療法は、いずれかの薬剤単独で生じるであろうよりも良好な治療効果（増殖がほとんどなく、かつ増殖のための刺激である炎症もほとんどない。）を結果として生じ得る。
【０２２８】
化合物は、静脈内、経口、皮下、筋肉内、皮内、非経口的、及びこれらの組み合わせを含むがそれらに限定されない任意の従来の投与経路によって患者に投与してもよい。
【０２２９】
さらなる好ましい形態の実施において、本発明は、少なくとも1つの本発明の化合物、又はその塩を、任意に1つ以上の医薬として許容し得る担体及び／又は溶媒と組み合わせて含む医薬組成物、すなわち薬剤に関する。
【０２３０】
医薬組成物は、例えば、非経口的、又は経腸製剤の形態であっても、適切な担体を含んでいてもよく、又はこれらは、経口投与のために適した適切な担体を含んでいてもよい経口製剤の形態でもよい。好ましくは、これらは、経口製剤の形態である。
【０２３１】
本発明に従って投与されるイソQC活性の阻害剤は、阻害剤として、又は阻害剤、基質、偽基質、イソQC発現の阻害剤、結合タンパク質、若しくは哺乳類におけるイソQCタンパク質濃度を減少させる酵素タンパク質の抗体と組み合わせて医薬として投与可能な（administrable）製剤、又は製剤複合体に使用してもよい。本発明の化合物は、個々に治療を患者、及び疾患に合わせることができ、特に、個々の不耐性、アレルギー、及び副作用を回避することができる。
【０２３２】
また、本化合物は、時間の関数として、異なる程度の活性を示す。これにより、治療を提供する医師は、具体的な患者の個々の状況に対して異なる応答をする機会が与えられ：彼は、正確に、一方では、作用開始の速度、及び一方では、作用の期間、及び特に作用の強度を調整することができる。
【０２３３】
化合物は、例えば従来技術から知られている希釈剤、賦形剤、及び／又は担体のような慣習的な添加物と組み合わせて活性成分を含む医薬品製剤の形態で、都合よく投与してもよい。例えば、これらは、非経口的に（例えば、生理塩類溶液において静脈内に）、又は経腸的に（例えば経口的に、慣習的な担体と共に製剤して）投与することができる。
【０２３４】
それらの内因的安定性、及びそれらの生物学的利用能に応じて、所望のMCP活性の減少を達成するために、1つ、又は複数の化合物の用量を1日あたりに与えることができる。例えば、ヒトにおけるこのような用量範囲は、1日あたり体重キログラムあたり約0.01mg〜250mgの化合物の範囲、好ましくは1日あたり体重キログラムあたり約0.01〜100mgの化合物の範囲、より好ましくは1日あたり体重キログラムあたり0.01〜10mgであってもよい。
【０２３５】
本発明に従って用いた化合物は、公知の様式に従って、それ自体を、例えば錠剤、（かむことができる）カプセル剤、糖衣錠、丸剤、坐剤、顆粒、エアロゾル、シロップ、ドロップ、液体、固体、及びクリーム様の乳剤、並びに懸濁液などの従来の製剤に、並びに／又は坐剤としても若しくは鼻内噴霧溶液としても、不活性な、無毒の、医薬として適切な担体、及び添加物、又は溶媒を使用して、変換することができる。これらの製剤のそれぞれにおいて、治療的に有効な化合物は、好ましくは混合物全体のおよそ0.1〜80重量％、より好ましくは1〜50重量％濃度で、言及した薬用量の許容範囲が得られるほど十分な量で存在する。
【０２３６】
製剤は、例えば溶媒及び／又は担体を用いて活性成分を希釈することによって、任意に乳化剤、及び／又は分散剤を用いて、有利に製造してもよく、例えば、水が希釈剤として使用される場合、有機溶媒を任意に補助的な溶媒として使用することができる。
【０２３７】
本発明と関連して有用な賦形剤の例には、以下を含む：水、パラフィン（例えば天然の油留分）、植物油（例えば、菜種油、落花生油、ゴマ油）、アルコール（例えばエチルアルコール、グリセロール）、グリコール（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール）などの無毒の有機溶媒；固体担体、例えば、天然の粉末状ミネラル（例えば、高度に分散されたシリカ、ケイ酸）、糖（例えば、粗糖、乳糖、及びデキストロース）；非イオン性、及び陰イオン性の乳化剤などの乳化剤（例えば、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、スルホン酸アルキル、及びアリールスルホナート）、分散剤（例えば、リグニン、亜硫酸蒸煮液、メチルセルロース、デンプン、及びポリビニルピロリドン）、及び潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、滑石、ステアリン酸、及びラウリル硫酸ナトリウム）、及び任意に調味料。
【０２３８】
投与は、好ましくは経腸的、又は非経口的に、特に経口的に通常の様式で実施してもよい。経腸投与の場合、錠剤は、言及した担体に加えて、デンプン、好ましくはジャガイモデンプン、ゼラチン等などの、種々の添加物と共に、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、及びリン酸カルシウムなどのさらなる添加物を含んでいてもよい。更にまた、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、及び滑石などの潤滑剤を、錠剤化するために同時に使用することができる。経口投与が意図される水性懸濁液、及び／又はエリキシルの場合、種々の味調整剤又は着色剤を、上述の賦形剤に加えて活性成分に添加することができる。
【０２３９】
非経口投与の場合、適切な液体担体を使用して、活性成分の溶液を使用することができる。一般に、静脈内投与の場合、有効な結果を得るために1日あたりおよそ0.01〜2.0mg/体重kg、好ましくはおよそ0.01〜1.0mg/体重kgの量を投与することが有利であることが見いだされており、経腸投与の場合、薬用量は、1日あたりおよそ0.01〜2mg/体重kgに、好ましくはおよそ0.01〜1mg/体重kgである。
【０２４０】
それにもかかわらず場合によっては、実験動物若しくは患者の体重に応じて、又は投与経路の種類により、また、動物の種、及び医薬に対するその個々の応答、又は投与が実施される間隔にも基づいて、明示された量から逸脱することが必要であってもよい。従って、一部の場合では、上述した最小量未満の使用で十分かもしれないが、他の場合には、言及した上限を上回らなければならないであろう。相対的に多くの量が投与される場合、該量を1日にわたって数回の単一用量に分けることが望ましいかもしれない。ヒトの医療における投与のためには、同じ薬用量の許容範囲が提供される。上記の所見は、その場合に類似して適用される。
【０２４１】
上記の開示は、全般的に本発明を説明する。より完全な理解は、以下の図、及び実施例を参照することによって得ることができる。これらの実施例は、単に例証目的のためにのみ説明してあり、本発明の範囲を限定することは意図するものではない。具体的な用語を本明細書に使用したが、このような用語は、説明的な意味でありかつ限定のためではないことが意図されている。
【実施例】
【０２４２】
（実施例1：ヒトイソQCの製造）
（細胞株及び培地）
アフリカミドリザル腎臓細胞株COS-7、ヒト神経芽細胞腫細胞株SH-SY5Y、ヒトアストロサイトーマ細胞株LN405、ヒト角質細胞腫（keratinocytoma）細胞株HaCaT、及びヒト肝細胞癌細胞株Hep-G2を、37℃で、5％CO2（HaCaT、Hep-G2、COS-7）又は10％CO2（SH-SY5Y、LN405）の高湿大気下で、適切な細胞培地（Cos-7、SH-SY5Y、LN405、HaCaTについてはDMEM、10％FBS）（Hep-G2についてはRPMI1640、10％FBS）において培養した。
【０２４３】
（RT-PCRを使用したヒトイソQC発現の分析）
RNeasy Mini Kit（Qiagen）を使用してSH-SY5Y、LN405、HaCaT、及びHep-G2細胞から全RNAを単離し、SuperScript II（Invitrogen）によって逆転写した。その後、プライマーイソQCh-1（センス、配列番号19）及びイソQCh-2（アンチセンス、配列番号20）を使用して、生じたcDNA産物を、Herculase Enhanced DNA Polymerase（Stratagene）を有する25μLの反応液に1：12.5で希釈したものにおいて、ヒトイソQCを増幅した。Strataprep PCR Purification Kit（Stratagene）を利用して、Hep-G2のPCR産物を精製し、配列決定によって確認した。
【０２４４】
（結果）
（RT-PCRを用いたヒトイソQC発現の分析）
ヒトイソQCの転写産物は、細胞株SH-SY5Y（図２、レーン1）、LN405（図２、レーン2）、HaCaT（図２、レーン3）、及びHep-G2（図２、レーン4）において存在することがわかった。Hep-G2のPCR産物を配列決定により確認した。
【０２４５】
（ヒトイソQCの単離）
ヒトイソQCの全長cDNAを、RT-PCRを用いてHep-G2細胞から単離した。簡潔には、Hep-G2細胞の全RNAをSuperScript II（Invitrogen）によって逆転写した。その後、プライマーイソQChu-1（センス、配列番号21）及びイソQChu-2（アンチセンス、配列番号22）を使用して、生じたcDNA産物を、Herculase Enhanced DNA Polymerase（Stratagene）を有する25μLの反応液に1：12.5で希釈したものにおいて、ヒトイソQCを増幅した。
【０２４６】
（実施例2：哺乳類細胞培養におけるヒトイソQCの製造及び発現）
（ヒトイソQC-EGFP融合タンパク質をコードするプラスミドベクターの分子クローニング）
すべてのクローニング手順は、標準的な分子生物学の技術を適用して実施した。ヒト細胞におけるヒトイソQC-EGFP融合タンパク質の発現のために、ベクターpEGFP-N3（Invitrogen）を使用した。メチオニンI又はメチオニンIIのいずれかで始まる天然のヒトイソQC cDNAを、高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）をコードしたプラスミドと、フレームにおいてN末端で融合した。プライマーイソQC EGFP-1 Met I（配列番号23）及びイソQC EGFP-3（配列番号25）を、メチオニンIで開始するヒトイソQCの増幅に使用し、プライマーイソQC EGFP-2 Met II（配列番号24）及びイソQC EGFP-3（配列番号25）を、メチオニンIIで開始するヒトイソQCの増幅に使用した。EcoRI及びSalIの制限部位を採用するベクターpEGFP-N3（Invitrogen）に断片を挿入し、正確な挿入を配列決定によって確認した。その後、細胞培養目的のために、EndoFree Maxi Kit（Qiagen）を使用してベクターを単離した。
【０２４７】
（hイソQCのN末端配列のクローニング手順）
加えて、増幅のために、EGFP-1（センス）（配列番号48）及びEGFP-2（アンチセンス）（配列番号49）を使用して、ベクターpEGFP-N3（Invitrogen）のEGFP配列をベクターpcDNA 3.1（Invitrogen）に導入した。断片をpcDNA 3.1のXhoI部位へと導入した。メチオニンIで開始するhイソQCのN末端断片についてはイソQC EGFP-1 Met I（センス、配列番号23）及び（アンチセンス）としてhイソQC SS EGFP pcDNA（配列番号50）を、並びにメチオニンIIで開始するhイソQCのN末端断片についてはイソQC EGFP-2 Met II（センス、配列番号24）及び（アンチセンス）としてのhイソQC SS EGFP pcDNA（配列番号50）を使用して、メチオニンI及びIIで開始し、セリン53で各々終止するhイソQCのN末端配列を、C末端でベクターpcDNA 3.1におけるEGFPと融合させた。断片をベクターpcDNA 3.1のEcoRI及びNotI制限部位へと挿入した。その後、細胞培養目的のために、EndoFree Maxi Kit（Qiagen）を使用してベクターを単離した。
【０２４８】
（hイソQC及びhQCの自然な発現のためのクローニング手順）
hQCについてはプライマーhQC-1（センス）（配列番号45）及びhQC-2（アンチセンス）（配列番号46）を、メチオニンIで開始するhイソQCについてはイソQC EGFP-1 Met I（センス）（配列番号23）及び（アンチセンス）としてのhイソQC pcDNA（配列番号47）を、並びにメチオニンIIで開始するhイソQCについてはイソQC EGFP-2 Met II（センス）（配列番号24）及び（アンチセンス）としてのhイソQC pcDNA（配列番号47）を利用した増幅後に、天然のhQCをベクターpcDNA 3.1 (+)（Invitrogen）のHindIII及びNotI制限部位に挿入し、天然のhイソQCをEcoRI及びNotI制限部位に挿入した。
【０２４９】
（FLAGでタグ付けしたhイソQC及びhQCのためのクローニング手順）
プライマーhQC-1（センス）（配列番号45）及び（アンチセンス）としてのhQC C-FLAG pcDNA（配列番号51）を適用した増幅後に、ヒトQCをC末端FLAGタグとともにベクターpcDNA 3.1のHindIII及びNotI制限部位にクローニングした。メチオニンIで開始するhイソQCについては、プライマーイソQC EGFP-1 MetI（センス）（配列番号23）及び（アンチセンス）としてのhイソQC C-FLAG pcDNA（配列番号52）を、メチオニン2で開始するhイソQCについては、プライマーイソQC EGFP-2 Met II（センス）（配列番号24）及び（アンチセンス）としてのhイソQC C-FLAG pcDNA（配列番号52）を使用する増幅後に、ヒトイソQCをC末端FLAGタグとともにpcDNA 3.1に挿入した。
【０２５０】
（実施例3：哺乳類細胞におけるヒトイソQCの免疫組織化学的染色）
（COS-7及びLN405のトランスフェクション及び組織化学的染色）
メチオニンI又はメチオニンIIのいずれかで開始するヒトイソQC-EGFP融合タンパク質の発現のために、カバーガラスを含む6ウェルのディッシュでCOS-7及びLN405を培養した。80％培養密度まで細胞を増殖させ、製造元のマニュアルに従ってLipofectamin2000（Invitrogen）を用いてトランスフェクトし、トランスフェクション溶液において5時間インキュベートした。その後、溶液を適切な増殖培地と交換し、細胞を一晩増殖させた。
【０２５１】
翌日、細胞をD-PBS（Invitrogen）で2回洗浄し、−20℃の氷冷メタノールを用いて10分間固定した後、室温でD-PBSを用いて10分間の洗浄工程を3回実施した。ゴルジ領域の染色のために、抗体をD-PBSに1：50で希釈したウサギ抗マンノシダーゼIIポリクローナル抗体（Chemicon）とともに、COS-7及びLN405を3時間インキュベートした。COS-7及びLN405におけるミトコンドリアの染色のために、抗体をD-PBSに1：100で希釈したマウス抗ヒトミトコンドリアモノクローナル抗体（Chemicon）とともに、細胞を室温で3時間インキュベートした。その後、細胞をD-PBSで10分間、3回洗浄した。ゴルジ領域について染色した細胞を、Rhodamin-RedX（Dianova）と結合したヤギ抗ウサギIgG二次抗体とともに、室温で暗所で45分間インキュベートした。ミトコンドリアについて染色した細胞を、Rhodamin-RedX（Dianova）と結合したヤギ抗マウスIgG二次抗体とともに、室温で暗所で45分間インキュベートした。その後、細胞をD-PBSで室温で5分間、3回洗浄し、最後に、カバーガラスを顕微鏡スライド上にシティフルオア（citifluor）（Citifluor Ltd.）とともに載せた。細胞を蛍光顕微鏡（Carl-Zeiss）下で観察した。
【０２５２】
（結果）
（1．LN405のトランスフェクション及び組織化学的染色）
細胞株LN405におけるメチオニンI及びメチオニンIIで開始するヒトイソQC-EGFP融合タンパク質の発現（緑色蛍光）は、結果として生じるタンパク質の区画化を結果的に生じる。マンノシダーゼII抗体を用いたLN405のゴルジ領域の対比染色（赤色蛍光）及びマンノシダーゼIIによるヒトイソQC-EGFPのその後の重ね合わせは、ゴルジ区画内でのヒトイソQC-EGFP融合タンパク質の局在性を示唆している。これにより、メチオニンIIで開始するヒトイソQCが、ヒトイソQC融合タンパク質のゴルジ局在を生じるのに十分であることが明白である。
【０２５３】
メチオニンI及びIIで開始するヒトイソQC-EGFP融合タンパク質の発現（緑色蛍光）及びミトコンドリアについての対比染色（赤色蛍光）は、重ね合わせ後の混合した画像の黄色の彩色がないことにより、ミトコンドリア内でメチオニンI又はIIで開始するヒトイソQC-EGFP融合タンパク質の局在性を示さなかった。
【０２５４】
（2．COS-7のトランスフェクション及び組織化学的染色）
細胞株LN405におけるメチオニンI及びメチオニンIIで開始するヒトイソQC-EGFP融合タンパク質の発現に類似して、COS-7におけるメチオニンI及びメチオニンIIで開始するヒトイソQC-EGFP融合タンパク質の発現は、結果として生じるタンパク質の区画化（緑色蛍光）を結果的に生じる。マンノシダーゼII抗体を用いたCOS-7細胞のゴルジ領域の対比染色（赤色蛍光）及びマンノシダーゼIIを用いたヒトイソQC-EGFPのその後の重ね合わせは、COS-7のゴルジ区画内でのヒトイソQC-EGFP融合タンパク質の局在性を示唆している。また、COS-7細胞において、メチオニンIIで開始するヒトイソQC-EGFP融合タンパク質の発現は、ゴルジ局在を生じるのに十分である。
【０２５５】
期待されたように、COS-7におけるメチオニンI及びIIで開始するヒトイソQC-EGFP融合タンパク質の発現（緑色蛍光）及びミトコンドリアについての対比染色（赤色蛍光）は、重ね合わせ後に混合した画像に黄色の彩色がなかったことにより、ミトコンドリア内でメチオニンI又はIIで開始するヒトイソQC-EGFP融合タンパク質の局在を結果的に生じなかった。
【０２５６】
（実施例4：大腸菌におけるヒトイソQCの発現及び精製）
（宿主の系及び培地）
プラスミドの増殖のために大腸菌株DH5αを用い、ヒトイソQCの発現のために大腸菌株BL21を用いた。製造元の説明書（Qiagen（DH5α），Stratagene（B21））に従って、大腸菌株を増殖させ、形質転換し、分析した。大腸菌に必要な培地、すなわち、ルリア・ベルターニ（LB）培地を、製造元の推奨に従って製造した。
【０２５７】
（ヒトイソQCをコードするプラスミドベクターの分子クローニング）
標準的な分子生物学の技術を適用して、すべてのクローニング手順を実施した。大腸菌BL21における発現のために、ベクターpET41a（Novagen）を用いた。コドン30（メチオニンIIから計数）で開始する成熟ヒトイソQCのcDNAを、GST-タグをコードしたプラスミドとフレームにおいて融合させた。プライマーhイソQC pET41a-1（配列番号26）及びhイソQC pET41a-2（配列番号27）を利用した増幅（表5）の後に、エンテロキナーゼ及びC末端(His)6-タグについてはN末端プロテーゼ切断部位を導入した。サブクローニング後、SpeI及びEcoR Iの制限部位を採用する発現ベクターに、断片を挿入した。
【０２５８】
（大腸菌BL21における発現及び精製）
ヒトイソQCをコードするコンストラクトを、BL21細胞へと形質転換し（Stratagene）、37℃で選択的LBアガープレート上で増殖させた。1％グルコースを含むLB培地において、タンパク質の発現を37℃で実施した。およそ0.8のOD600に到達した後、20μM IPTGを用いてイソQC発現を37℃で4時間誘導した。細胞を遠心分離（4000×g、20分）によって培地から分離し、PBS（140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4、pH7,3）に再懸濁し、1周期の凍結及び融解後に1周期のフレンチプレスによって溶解した。リン酸含有緩衝液（50mM Na2HPO4、500mM NaCl、pH7.3）を用いて、細胞溶解液を1.5Lの最終容積に希釈し、13.400×g、4℃で1時間遠心分離した。遠心分離後、Bradfordの方法を用いて、結果として生じる上清のタンパク質濃度を決定した。必要な場合、溶液を再度希釈して、0.6mg／mLの総タンパク質終濃度を得た。4工程プロトコールを利用して、GST-イソQC融合タンパク質を精製した（表6）。精製を図５のSDS-PAGE分析によって示す。
【０２５９】
（実施例5：グルタミニルシクラーゼ活性についてのアッセイ）
（蛍光アッセイ）
すべての測定は、マイクロプレート用NovoStar読み取り装置（BMG Labtechnologies）により30℃で行った。QC活性は、H-Gln-βNAを用い、蛍光定量により評価した。試料は、最終容積250μl中における、0.2mM蛍光発生基質20mM 、0.25Uピログルタミルアミノぺプチダーゼ（Qiagen, Hilden, Germany）含有0.05Mトリス／HCl（pH8.0）、及び適宜希釈した一定分量のイソQCからなった。励起／発光波長は、320／410nmであった。該アッセイ反応は、グルタミニルシクラーゼの添加により開始した。イソQC活性は、アッセイ条件下でのβ-ナフチルアミンの標準曲線から決定した。1単位は、記載した条件下で、1分間にH-Gln-βNAから1μmolのpGlu-βNAの形成を触媒するイソQC量と定義されている。
【０２６０】
第二の蛍光アッセイにおいて、イソQC活性は、H-Gln-AMCを基質として用いて決定した。反応は、マイクロプレート用NOVOStar読み取り装置（BMG labtechnologies社）を利用して、30℃で行った。該試料は、最終容積250μl中における、変動濃度の蛍光発生基質、0.1Uピログルタミルアミノペプチダーゼ（Qiagen）含有0.05Mトリス／HCl（pH8.0）、及び適宜希釈した一定分量のイソQCで構成された。励起／発光波長は、380／460nmであった。該アッセイ反応は、グルタミニルシクラーゼの添加により開始した。QC活性は、アッセイ条件下での7-アミノ-4-メチルクマリンの標準曲線から決定した。動力学的データは、GraFitソフトウェアを用いて評価した。
【０２６１】
（イソQCの分光光度アッセイ）
このアッセイを用いて、ほとんどのイソQC基質の動力学的パラメータを決定した。イソQC活性は、補助的な酵素としてグルタミン酸デヒドロゲナーゼを利用す不連続アッセイ（Schilling, S. らの文献（2003 Biol Chem 384, 1583-1592））を用い、分光光度的に分析した。試料は、最終容積250μl中における、各イソQC基質、0.3mM NADH、14mMα-ケトグルタル酸、及び30U/mLグルタミン酸デヒドロゲナーゼからなった。反応は、イソQCの添加により出発し、吸光度の低下を340nmで8〜15分間モニタリングすることにより追跡した。初速度を評価し、酵素活性を、アッセイ条件下でのアンモニアの標準曲線から決定した。すべての試料は、マイクロプレート用Sunrise読み取り装置を用い、30℃で測定した。動力学的データは、GraFitソフトウェアを用いて評価した。
【０２６２】
（阻害剤アッセイ）
阻害剤の試験に関して、試料組成物は、推定阻害化合物を添加したこと以外は、先に記載したものと同じであった。イソQC-阻害に関する迅速試験について、試料は、4mMの各阻害剤及び1KMの基質濃度を含んでいた。阻害の詳細な研究及びKi-値の決定については、補助的な酵素に及ぼす阻害剤の影響を最初に調べた。あらゆる場合において、検出されたいずれの酵素についても影響はなく、従ってイソQC阻害の信頼できる決定が可能であった。阻害定数は、GraFitソフトウェアを用い、反応進行曲線のセットを、競合的阻害に関する一般式にあてはめることにより評価した。
【０２６３】
（結果）
種々の異なる基質をヒトイソQCによる変換に関して評価した（表4）。分析した基質はすべてイソQCによって変換され、ヒトQCと類似した、全体的に比較的緩んだ特異性を示した（Schilling, S.らの文献（2003 Biol Chem. 384, 1583-1592））。N末端グルタミニル残基に隣接した大きな疎水性アミノ酸を有する基質、例えばGln-AMCについて、最大の特異性定数（kcat/KM）を観察した。対照的に、ヒトイソQCにおける負に帯電した残基は、Gln-Gluについて観察されたように、特異性において激烈な低下をもたらし、イソQCの負に帯電した活性部位を示した。ヒトQCと比較して、両方の組換えイソQCはより低い酵素活性を発揮した（図７）。その差は、最大1オーダーの程度であった。イソQCの特異性によると、酵素がインビボで異なる基質の変換を生じる、すなわち、イソQCが、多くの異なる生理学的基質の発生に関与していると仮定することは妥当である。
【０２６４】
ヒトイソQC活性をイミダゾール誘導体によって競合的に阻害した（表7、図１）。イミダゾール及びベンズイミダゾールについての阻害定数Kiは、ヒトQCについて先に得られた値と非常に類似していた。しかしながら、Kiにおける10倍の低下が、強力なQC阻害剤である塩酸1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-3-(3,4-ジメトキシフェニル)チオ尿素について観察された。このように、キレート部分の結合様式、すなわちイミダゾール環は、非常に類似しているようである。おそらく、このことは、イミダゾール塩基性窒素によるQC及びイソQCの活性部位である亜鉛イオンの錯体形成の結果として生じている。塩酸1-(3-(1H-イミダゾール-1-イル)プロピル)-3-(3,4-ジメトキシフェニル)チオ尿素についてのKi値における差は、両酵素の活性部位がわずかな差を呈していることを明確に示している。それゆえ、1つの酵素アイソフォームについて選択性を発揮する阻害剤を生じることは可能である。選択的阻害剤は、上記の疾患の治療にとって有益である。
その上、ヒトイソQC活性を式（I）の実施例化合物によって阻害した（表7A）。
【表６】
0005788320.tif 000097
【表７】
0005788320.tif 000098
0005788320.tif 000099
0005788320.tif 000100
【表８】
0005788320.tif 000101
【表９】
0005788320.tif 000102
【表１０】
0005788320.tif 000103
【０２６５】
（実施例6：ピキア・パストリスにおけるヒトイソQCの発現及び精製）
（宿主株及び培地）
プラスミドの増殖のために大腸菌株DH5αを用い、酵母におけるヒトイソQCの発現のためにピキア・パストリス株X-33を用いた。製造元の説明書（Qiagen（DH5α）、Invitrogen（X-33））に従って、大腸菌及びピキア・パストリスを増殖させ、形質転換し、及び分析した。大腸菌に必要な培地、すなわち、ルリア・ベルターニ（LB）培地を製造元の推奨に従って製造した。ピキア・パストリスに必要な培地、すなわち、BMMY、BMGY、YPD、YPDS、及び抗生物質の濃縮物、すなわちZeocinを、ピキアマニュアル（invitrogen、カタログ番号K1740-01）に説明されているとおり製造した。また、該マニュアルには酵母の取り扱いについての関連するすべての説明を含む。
【０２６６】
（ヒトイソQCをコードするプラスミドベクターの分子クローニング）
標準的な分子生物学の技術を適用して、すべてのクローニング手順を実施した。ピキア・パストリスX-33における発現のために、pPiCZαA（invitrogen）を用いた。コドン30（メチオニンIIから計数）で開始する成熟ヒトイソQCのcDNAを、タンパク質を分泌経路へと配向させるα因子をコードするプラスミドとフレームにおいて融合させた。プライマーhイソQC HIS C-Term pPICZAA-1（配列番号28）又はhイソQC HIS N-Term pPICZAA-1（配列番号29）をセンスプライマーとして、かつhイソQC HIS N-Term pPICZAA-2（配列番号30）及びhイソQC HIS C-Term pPICZAA-2（配列番号32）（表5）をアンチセンスプライマーとして利用した増幅の後、NotI及びEcoR Iの制限部位を採用する発現ベクターに断片を挿入した。コンストラクトに応じて、突然変異をコドン55（Ile）及び351（Cys）に導入した。標準的なPCR技術に次いで、DpnIを用いる親DNAの消化（quik-change II 位置指定突然変異誘発キット、Stratagene、カタログ番号200524）に従って、突然変異誘発を実施した。生じたコンストラクトを図３において模式的に説明する。
【０２６７】
（ピキア・パストリスの形質変換及び小規模発現）
製造元の説明書（BioRad）に従った電気穿孔によるピキア・パストリアコンピテント細胞の形質転換のために、1〜2μgのプラスミドDNAを適用した。100μg/mLのZeocinを含むプレートにおいて選択を実施した。イソQC発現に関して組換え酵母クローンを試験するために、2mLのBMGYを含む10mLのコニカルチューブにおいて組換え体を24時間増殖させた。その後、酵母を遠心分離し、0.5％メタノールを含む2mLのBMMYにおいて再懸濁した。メタノールを24時間ごとに約72時間添加することによって、この濃度を維持した。その後、上清におけるイソQCの活性を決定した。最大活性を呈するクローンをさらなる実験及び発酵のために選択した。発現したコンストラクトに応じて、培地におけるイソQC活性は異なった（図４）。
【０２６８】
ピキア・パストリスにおけるhイソQCの発現及び精製
ピキア・パストリスにおけるイソQCの大規模発現のために、小規模発現において説明した条件を維持したが、総容積は8Lであった。振蘯フラスコにおいて発現を実施した。発現後、遠心分離によって細胞を培地から分離し（1500×g、20分）、ペレットを廃棄した。上清のpH値を中性に調整し、再度遠心分離し、第一の精製工程に適用した。3工程プロトコールを利用して、イソQCタンパク質を精製した（表8）。精製を図５におけるSDS-PAGE分析によって説明する。
【表１１】
0005788320.tif 000104
【０２６９】
（結果）
メチロトローフ酵母であるピキア・パストリスにおいてヒトイソQCをうまく発現させた。酵母における最良の発現条件を選択するために、いくつかの異なるコンストラクトを生じた（図３）。図４において示すように、発現している細胞の培地において発現及び存在するイソQCの活性は、発現したコンストラクトに応じて変動する。コンストラクトYSShイソQCN55IC351A C-His及びYSShイソQCN55I C-Hisから観察できるように、グリコシル化部位の導入は結果的に、適切な分泌を生じた。培地における最大活性により、コンストラクトYSShイソQCN55IC351A C-Hisを大規模に発現して精製した。表8に説明したとおり精製を実施し、精製の収率は59％であった。より低い分子量への泳動におけるシフトによって証明されるように、見かけの均質なタンパク質をグリコシル化した（図５）。グリコシル化は、酵素の触媒活性に影響を及ぼさなかった。
【０２７０】
（実施例7：hイソQCのpH依存性）
H-Gln-βNAを用いた蛍光定量アッセイ（実施例5において説明）を適用して、触媒特異性のpH依存性を研究した。7μMの基質濃度で、すなわち、[S]≪KMで反応を実施した。それゆえ、観察した特異性定数は、基質変換の推移曲線（progress curve）の初速度から直接推定することができた。これらの研究において、反応緩衝液は、0.075M酢酸、0.075M MES、及び0.15Mトリスからなり、HCl又はNaOHを用いて所望のpHに調整した。緩衝液は、非常に広範なpH範囲にわたって、一定のイオン強度を保証した。下記の等式：
kcat／KM(pH)＝kcat／KM(限界値)×1／(1＋[H+]／KHS＋KE1／[H+]＋KE1／[H+]×KE2／[H+])
（式中、kcat／KM(pH)は、pH依存性の（観察された）動力学的パラメータを示す。）
を用いて、獲得した酵素動力学的データの評価を実施した。kcat／KM(限界値)は、pH依存性の（「限界の」）値を示す。KHS、KE1、及びKE2は、酸性pH範囲における解離群の解離定数、及び酵素の2つの解離群をそれぞれ示した。GraFitソフトウェア（バージョン5.0.4、ウィンドウズ用、ERITHACUS SOFTWARE Ltd., Horley, UK）を用いて、すべての動力学的データの評価を実施した。
【０２７１】
（結果）
hイソQCは、pH7〜8における特異性に関する至適pHを示す。このように、触媒の至適pHは、ヒトQCと非常に類似している。3つの解離群に基づいたモデルに従ったデータの適合によって結果的に、hイソQC及びhQCのpH依存性の良好な解釈がもたらされた（図８）。このように、両酵素反応の触媒作用は、類似の解離群によって影響されており、類似の触媒機序を一般に示唆している。
【０２７２】
唯一のpKaがhイソQCとhQCの間で有意に異なっていることは明らかである。hQCにおいて、pKaは、基質の解離定数のpKaに相当する。おそらく、hQCとhイソQCの間のわずかな差は、イソQC触媒において生じる構造的な変化（誘導された適合）に起因し、そのことが、pH依存性に影響を及ぼす。
【０２７３】
（実施例8：（イソ）グルタミルシクラーゼ活性の研究）
ヒトQCについて、該酵素がN末端グルタミン酸のピログルタミン酸への環化を触媒することが説明されている。それゆえ、QCは、pGlu修飾されたアミロイドペプチドの作製に関与している。
【０２７４】
グルタミン酸の環化を研究するために、ヒトQC及びヒトイソQCを精製し、Aβ(3-11)からのpGlu修飾されたアミロイドβ(3-11)［pGlu-Aβ(3-11)］の形成をモニターした。反応物は、20μL基質（Aβ(3-11)、2.5mMストック溶液含有50mM Mes緩衝液、pH6.5）及び80μL酵素（0.62mg/mL hQCストック溶液；0.61mg/mL hイソQCストック溶液含有50ｍM Mes pH6.5）からなった。試料（15μL）を0時間後、6時間後、24時間後、48時間後、及び72時間後に摘出し、反応を終止させるために5分間煮沸した。基質変換の分析をMaldi-Tof質量分析によってモニターした。基質及び産物は、それらの分子量において水の分子である18Daほど異なっており、これは環化中に放出される。
【０２７５】
図９において示されるように、ヒトQC及びヒトイソQC（YSShイソQCI55NC351A）は、Aβ(3-11)のpGlu-Aβ(3-11)への変換を触媒する。しかしながら、両試料における等しいタンパク質濃度に基づいて、N末端グルタミン酸のhイソQCによる変換がhQCと比較して非常に遅いと結論付けることができる。このように、グルタミニル基質の変換についてのより低い特異性定数も、グルタミニル基質を用いて観察される。失活した酵素を用いたこれらの条件下では環化は観察されなかった（Schilling, S.らの文献（2004 FEBS Lett. 563, 191-196））。
【０２７６】
（実施例9：哺乳類細胞培養物におけるヒトMCP-1の製造及び発現）
（細胞株及び培地）
ヒト神経芽細胞腫細胞株SH-SY5Y、ヒト胚腎臓細胞株HEK293、及びヒト単球細胞株THP-1を適切な細胞培地（DMEM、SH-SY5Y、及びHEK293のための10%のFBS）（RPMI1640、THP-1のための10%のFBS）において、5％CO2（HEK293、THP-1）又は10％CO2（SH-SY5Y）の加湿された大気下で、37℃で培養した。
【０２７７】
（ヒトMCP-1の単離）
ヒトMCP-1の全長cDNAは、RT-PCRを使用してSH-SY5Y細胞から単離した。SH-SY5Y細胞の全RNAをSuperScript II（Invitrogen）によって逆転写して、その後にヒトMCP-1を、プライマーhMCP-1-1（センス）、及びhMCP-1-2（アンチセンス）（表9）を使用して、Pfu-DNA-Polymerase（Promega）で、25μl反応において産生したcDNA産物の1：12.5希釈で増幅させた。生じるPCR産物は、HindIII及びNotI制限部位を使用してベクターpcDNA 3.1へとクローニングし、配列をDNA配列決定によって確認した。
【０２７８】
（ヒトMCP-1の位置指定突然変異誘発）
成熟ヒトMCP-1の第1の（ΔQ1）並びに第1及び第2の（ΔQ1P2）アミノ酸の欠失は、ΔQ1（表9）のためにプライマーΔQ1-1、及びΔQ1-2、並びにΔQ1P2（表9）のためにプライマーΔQ1P2-1及びΔQ1P2-2を使用して、位置指定突然変異誘発によって作製した。親DNAは、Dpn Iで消化した。成熟ヒトMCP-1の欠失ΔQ1及びΔQ1P2をもつpcDNA 3.1プラスミドを、大腸菌JM109に形質転換した。アンピシリン耐性クローンを配列決定によって確認して、その後EndoFree Maxi Kit（Qiagen）を使用して細胞培養目的のために単離した。
【０２７９】
（HEK293細胞におけるヒトMCP-1のN末端変異体の発現）
ヒトMCP-1のN末端変異体の発現のためには、HEK293細胞をコラーゲンIコーティングした6ウェルディッシュにおいて培養して、80%の培養密度まで培養し、製造元のマニュアルに従ってLipofectamin2000（Invitrogen）を使用してトランスフェクトし、トランスフェクション溶液において5時間インキュベートした。その後、細胞を通常の増殖培地で一晩回復させた。その翌日、細胞を増殖培地において更に24時間インキュベートした。QC阻害の有効性の解析のために、細胞を特異的阻害剤の不在下又は存在下で24時間インキュベートした。24時間後、ヒトMCP-1変異体を含む培地を収集して、走化性能について遊走アッセイで調査した。更にまた、細胞培養上清の一定分量を、ヒトMCP-1-ELISA（Pierce）を使用するヒトMCP-1濃度の定量化のために、−80℃にて貯蔵した。
【０２８０】
（トランスウェル走化性アッセイ）
走化性アッセイは、5μmの孔径をもつ24ウェルTransWellプレート（Corning）を使用して行った。HEK293に発現したヒトMCP-1変異体を含む培地を化学誘引物質として使用した。これを助けるために、600μlのN末端ヒトMCP-1変異体の培地をRPMI1640における無希釈、又は1：3、1：10、及び1：30希釈で、TransWellプレートの下部チャンバーに適用した。更にまた、ベクター対照をトランスフェクトしたHEK293細胞の無希釈培地を、ネガティブ対照として下部チャンバーに適用した。THP-1細胞を収集して、1×106個／100μlの濃度でRPMI1640中に再懸濁して、100μlの一定分量で上部チャンバーに適用した。細胞を37℃で2時間化学誘引物質の方へ遊走させた。その後に、上部チャンバーの細胞を廃棄して、下部チャンバーを50μlの70mM EDTA含有PBSと混合して、37℃で15分間インキュベートして、メンブレンに付着した細胞を遊離させた。その後、下部チャンバーに遊走した細胞を、細胞計数システム（Scharfe System）を使用して計数した。走化性指数は、刺激に遊走した細胞をネガティブ対照に遊走した細胞で除することによって算出した。
【表１２】
0005788320.tif 000105
【０２８１】
（実施例10：ラット及びマウスのイソQCの細胞内局在）
（A．クローニング手順）
EGFPをタグ付けしたラット及びマウスのイソQCに関するクローニングのために、ベクターpEGFP-N3（Invitrogen）のEGFP配列をベクターpcDNA 3.1（Invitrogen）に、プライマー1（センス）（配列番号61）及び2（アンチセンス）（配列番号62）（以下の表10参照）を増幅のために用いて導入した。断片をpcDNA 3.1のXhoI部位に導入した。生じたベクターをpcDNA-EGFPと命名した。MetI（配列番号53）又はMetII（配列番号54）のいずれかで開始する天然マウス-イソQC、及びMetI（配列番号55）又はMetII（配列番号56）のいずれかで開始するラット-イソQCのcDNAを、ベクターpcDNA-EGFPにおけるEGFPとフレームにおいてC末端で融合させた。プライマー3（センス）（配列番号63）及び4（アンチセンス）（配列番号64）（表10）を、MetIで開始するマウス-イソQC（配列番号53）の増幅のために用い、プライマー5（センス）（配列番号65）及び4（アンチセンス）（配列番号64）（表10）を、MetIIで開始するマウス-イソQC（配列番号54）の増幅のために用いた。プライマー6（センス）（配列番号66）、7（アンチセンス）（配列番号67）、並びに5（センス）（配列番号65）、及び7（アンチセンス）（配列番号67）（表10）をそれぞれ、MetI（配列番号55）並びにMetII（配列番号56）で開始するラット-イソQCの増幅のために用いた。EcoRI及びNotIの制限部位を採用するベクターpcDNA-EGFPに断片を挿入し、断片の正確な挿入を配列決定によって確認した。また、MetI及びMetIIで各々開始し、セリン55（MetIから計数）で終止するマウス-イソQC（両方に関して配列番号57及び58）並びにMetI及びMetIIで各々開始し、セリン55（MetIから計数）で終止するラット-イソQC（両方に関して配列番号59及び60）を、プライマー3（センス）（配列番号63）及びプライマー8（アンチセンス）（配列番号68）（表10）をMetIで開始するマウス-イソQCのN末端断片について、並びにプライマー5（センス）（配列番号65）及びプライマー8（アンチセンス）（配列番号68）（表10）をMetIIで開始する断片について用いて、ベクターpcDNA-EGFPにおけるEGFPとC末端で融合させた。ラット-イソQCのN末端断片を、プライマー6（センス）（配列番号66）及びプライマー9（アンチセンス）（配列番号69）（表10）をMetIで開始するものについて、並びにプライマー5（センス）（配列番号65）及びプライマー9（アンチセンス）（配列番号69）（表10）をMetIIで開始するものについて用いて増幅させた。その後、すべてのベクターを細胞培養目的のために、EndFree Maxi Kit（Qiagen）を用いて単離した。
【表１３】
0005788320.tif 000106
【０２８２】
（B．哺乳類細胞の培養及びトランスフェクション）
ヒトアストロサイトーマ細胞株LN405及びヒト神経芽細胞種細胞株SH-SY5Yを、適切な細胞培養液（ダルベッコ変法イーグル培地、10％ウシ胎仔血清）において、10％CO2の加湿した大気下で、37℃で培養した。トランスフェクションのために、LN405細胞及びSH-SY5Y細胞を2ウェルチャンバースライド（BD Falcon）において培養し、80％培養密度まで増殖させ、製造元のマニュアルに従って、Lipofectamin2000（Invitrogen）及び（工程Aにおいて先に得られた）個々のプラスミドを含む溶液におけるインキュベーションによってトランスフェクトした。5時間後に溶液を適切な増殖培地と交換し、細胞を一晩増殖させた。
【０２８３】
（C．組織化学的分析）
組織化学的分析のために、トランスフェクションの1日後に、LN405細胞及びSH-SY5Y細胞をD-PBS（Invitrogen ）で2回洗浄し、氷冷メタノールを用いて−20℃で10分間固定した後、D-PBSの室温で5分間の3回の洗浄工程を実施した。ゴルジ複合体の染色のために、LN405細胞及びSH-SY5Y細胞を、抗体をD-PBSに1：100に希釈した抗マンノシダーゼIIポリクローナル抗体（Chemicon）とともに室温で3時間インキュベートした。その後、細胞をD-PBSで5分間、3回洗浄した。細胞を、Cy3を結合したヤギ抗ウサギIgG二次抗体とともに暗所で室温で45分間インキュベートした。その後、試料をD-PBSで5分間、3回洗浄し、核の染色のために1μg/mLの4',6-ジアミジン-2'-フェニルインドール-（DAPI）溶液（Roche）とともにインキュベートし、D-PBSで1回洗浄した。カバーガラスを顕微鏡スライドの上にCitifluor（Citiflour Ltd., Leicester, UK）とともに載せた。細胞を共焦点レーザー走査顕微鏡（Carl-Zeiss）で観察した。
【０２８４】
（D．結果）
哺乳類細胞におけるマウス-イソQC及びラット-イソQCの細胞内局在並びに推定上の開始メチオニンの関連性を研究するために、メチオニンI（MetI）又はメチオニンII（MetII）のいずれかで開始するマウス-イソQC-EGFP融合体及びラット-イソQC-EGFP融合体を作製した。ヒトLN405細胞及びSH-SY5Y細胞を一過性にトランスフェクトし、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて細胞内分布を検討した。マウス-イソQC(MetI)-EGFP及びラット-イソQC-(MetI)-EGFP融合タンパク質の発現は結果的に、導入遺伝子を発現する事実上すべての細胞の核の近くに明瞭な染色を生じた（図９ａ、１０ａ、１１ａ、及び１２ａ）。細胞性マンノシダーゼIIの対比染色によって、LN405及びSH-SY5Yにおけるゴルジ複合体内に、マウス-イソQC(MetI)-EGFP及びラット-イソQC(MetI)-EGFPの存在が明らかとなった。マウス-イソQC(MetII)-EGFP及びラット-イソQC(MetII)-EGFP融合タンパク質の発現は結果的に、非常に類似した蛍光染色を生じ、このことは、マンノシダーゼIIの局在性と十分に一致した（図９ａ、１０ａ、１１ａ、及び１２ａ）。このように、マウス-イソQC及びラットイソQCの細胞内分布は、N末端メチオニンとは無関係である。
【０２８５】
予想したN末端シグナルアンカーが、ゴルジ複合体内のマウス-イソQC及びラット-イソQCの保持の原因であるかどうかを明らかにするために、推定上のシグナルアンカー配列を含む、MetI及びMetIIで開始するシグナルペプチドをEGFPとフレーム内でクローニングした。結果として生じるベクターであるマウス-イソQC(MetI)シグナル配列（SS）EGFP、マウス-イソQC(Met)SS EGFP、ラット-イソQC(MetI)SS EGFP、及びラット-イソQC(MetII)SS EGFPを、先に説明したように、LN405細胞及びSH-SY5Y細胞において発現させ、該発現も共焦点レーザー走査顕微鏡によって分析した。4つのベクターの発現は結果的に、全長の融合タンパク質について観察されるのと同じゴルジ複合体局在を生じた（図９ｂ、１０ｂ、１１ｂ、及び１２ｂ）。結果的に、イソQCのN末端配列は、マウス-イソQC及びラット-イソQCの小胞体膜への同時翻訳での転位を生じ、かつゴルジ複合体内での保持を生じた。さらにその上、マウス-イソQC(MetII)SS EGFP及びラット-イソQC(MetII) SS EGFPの発現により、ゴルジ保持信号は、配列番号58及び60の両方のそれぞれの配列のメチオニン19残基及びセリン55残基の間で、総体的にマッピングすることができる。
【０２８６】
（実施例11：RAW264.7細胞及びTHR-1細胞におけるQC（QPCT）及びイソQC（QPCTL）の遺伝子発現）
（A．RAW264.7細胞の特徴づけ）
マウス単球／マクロファージ細胞株RAW264.7（以下：RAW）をCLS（Eppelheim, Germany）から得た。NucleoSpin RNA IIキット（Macherey Nagel）を用いて、製造元の説明書に従って、RNAを単離した。1000ng定量のRNAを、ランダムプライマー（Roche）及びSuperscript II（Invitrogen）を用いてcDNAに逆転写した。QuantiTect SYBR Green RT-PCRキット（Qiagen）を用いてRotorgene3000（Corbett Research）において定量的リアルタイムPCRを実施した。適用したプライマーを表11A及び11Bに示す。
【０２８７】
95℃における最初の15分間の活性化工程を実施した後、95℃における15秒間の変性、60℃（Qiagenプライマーについては55℃）における20秒間のアニーリング、72℃における20秒間の伸長を45周期実施した。遺伝子発現をRotorgeneソフトウェア、バージョン4.6を用いて定量モードで決定した。PCRの検証については、産物融解曲線を作製し、アンプリコンをアガロースゲル電気泳動によって確認した。
【０２８８】
（B．THP-1細胞の特徴づけ）
THP1（ヒト急性単球性白血病）細胞をCLS（Eppelheim, Germany）から得た。RNAの単離、cDNAの合成、及びPCRを、RAW細胞について説明したとおり実施した。ヒトQPCT及びヒトQPCTLの定量のために用いたプライマーを表12に示す。
【０２８９】
（c．結果）
マウスQPCT（mQPCT）のエクソン1内の産物を増幅しているプライマー対を用いて、PCR産物を得ることができた（図１３（ａ）、プライマー対F5／F6（配列番号70及び73）、F5／R14（配列番号70及び74）、F5／R16（配列番号70及び75）；表11A参照）。対照的に、エクソン2からエクソン7までの領域に結合するプライマー対は、RAW細胞から単離したcDNAを用いた産物を検出しなかった（図１３（ａ）、プライマー対F5／R12（配列番号70及び76）、F5／R20（配列番号70及び77）、F3／R4（配列番号71及び78）、F3／R20（配列番号70及び77）、F3／R2（配列番号70及び79）、F11／R22（配列番号72及び80）、表11A、Qiagenから得たプライマー）。すべてのプライマー対は、B16マウスメラノーマ細胞から及びマウス脳組織から単離したcDNAを用いて産物を増幅した。結果的に、RAW細胞は、全長のmQPCT mRNAを発現しなかった。RAW細胞、B16細胞、及びマウス脳組織は、マウスQPCTL（mQPCTL）を発現した（表11B、図１３（ａ））。RAW細胞は、全長のmQPCT RNAを発現しなかったが、mQPCTLを発現した；それゆえ、この細胞株は、mQPCTL活性の阻害剤をインビトロで試験するための有用なツールである。
【０２９０】
【表１４】
0005788320.tif 000107
【表１５】
0005788320.tif 000108
【表１６】
0005788320.tif 000109
【表１７】
0005788320.tif 000110
加えて、ヒトTHP1細胞は、ヒトQPCT（hQPCT）mRNA及びヒトQPCTL（hQPCTL）mRNAの両方を発現した。THP1細胞をLPS（1μg/mL）で24時間処理することによって、hQPCT mRNAレベルが増大したのに対し、hQPCTL RNAは一定のレベルを示した（図１４）。THP1細胞は、QPCT（QC）及びQPCTL（イソQC）の阻害剤についてのインビトロでのヒトスクリーニングモデルとして使用することができる。
【表１８】
0005788320.tif 000111
【０２９１】
（実施例12：RAW264.7細胞及びTHP-1細胞における異なるイソQC阻害剤の効力）
（RAW264.7におけるpGlu-MCP-1形成の阻害）
マウス単球／マクロファージ細胞株RAW264.7を用いて、LPS刺激後の細胞によって分泌されるMCP-1のN末端ピログルタミン酸（pGlu）の形成に及ぼすグルタミニルシクラーゼ（QC）阻害剤及びイソグルタミニルシクラーゼ（QPCTL）阻害剤の効果を調べた。96ウェルマイクロプレートにおいて1ウェルあたり40.000個／100μLを蒔種し、10％FBS及びゲンタマイシン（Invitrogen）を含むDMEM（Invitrogen）において増殖させた。24時間後、培地を、適切な濃度の阻害剤又は対照物（DMSO）を含む150μLのDMEM/10％FBS/ゲンタマイシンに交換した。阻害剤スクリーニング実験のために、試験化合物を10μMの終濃度で用いた。各化合物につき、4回の複製を実施した。30分後、阻害剤適用細胞を、LPS（10ng/mL、大腸菌株055:B5由来、Sigma）の添加によって刺激した。LPS刺激の24時間後、上清を回収し、MCP-1の分析まで−20℃で保存した。特異的ELISAによって、総MCP-1及びpGlu1-MCP-1（mMCP-1 N1pE）を決定した。
【０２９２】
（B．総mMCP-1及びmMCP-1 N1pEの検出のためのELISA）
総mMCP-1及びmMCP-1 N1pEの決定のために、特異的ELISAを展開した。簡潔には、コーティング緩衝液（PBS、pH7.4）において96ウェルプレートの1ウェルあたり、25ngの捕捉抗体ウサギ抗mJE（Peprotech）をコーティングした。プレートを室温で一晩インキュベートした。その後、各ウェルを200μLのブロッキング緩衝液（タンパク質非含有（TBS）ブロッキング緩衝液（Perbio））の添加によって2時間ブロッキングした後、300μLの洗浄緩衝液（タンパク質非含有T20（TBS）ブロッキング緩衝液（Perbio））を用いて3回洗浄した。希釈緩衝液（タンパク質非含有T20（TBS）ブロッキング緩衝液）を用いて、標準ペプチド（Peprotech）及び試料を希釈し、100μLを試験プレートに適用した。試験試料及び標準ペプチドのインキュベーションを室温で2時間実施した後、洗浄緩衝液を用いてプレートを3回洗浄した。mMCP-1 N1pEの検出のために、抗pE1-MCP-1特異的モノクローナル抗体クローン4B8（Probiodrugによって製造、0.65mg/mL）を0.25μg/mLの濃度で、1：2000の希釈における抗マウスHRP接合体（KPL）との組み合わせで適用した。総MCP-1の検出のために、ラット抗マウスMCP-1（R＆D Systems、1mg/mL）を0.25μg/mLの濃度で、1：2000の希釈における抗ラットHRP接合体（Sigma）との組み合わせで適用した。抗体を希釈緩衝液において希釈し、各ウェルに100μLの容積で適用し、室温で2時間インキュベートした。その後、ウェルを300μLの洗浄緩衝液で5回洗浄した後、各ウェルに100μLの容積で色素原SureBlue（KPL）を適用した。暗所で30分間インキュベートした後、50μLの停止溶液（1.2N H2SO4）を用いて該反応を抑止し、450nmで吸光度を決定した。550nmの基準波長を、450nmにおける試料吸光度から減算した。
【０２９３】
（C．結果）
RAW264.7細胞におけるmMCP-1 N1pEアッセイを用いて、マウスQC陰性かつマウスイソQC陽性の細胞株RAW264.7によるpGlu1-MCP-1の形成を抑制するQC阻害剤の有効性を示すことができた。ヒトイソQCについての阻害剤定数とpGlu-MCP-1形成の阻害との相関が認められた。イソQCの強い阻害を示す化合物（Ki＜100nM）のみがpGlu-MCP-1の形成を効率よく阻害できるのに対し、強いQC阻害剤であるが弱いイソQC阻害剤は、RAW264.7細胞におけるpGlu-MCP-1形成における弱い細胞性効力しか示さない。
このように、RAW細胞は、QCによる基質変換の影響を潜在的に妨害することとは無関係にイソQCの阻害を研究するための優れた系を提供する。
【０２９４】
（実施例13：ウェスタンブロットによるタンパク質検出のための方法を含む、異なる哺乳類起源由来のイソQCの単離及び特徴づけのための方法）
（A．宿主株及び培地）
大腸菌株DH5αをプラスミドの増殖のために用い、ピキア・パストリス株X-33を酵母におけるヒトイソQCの発現のために用いた。大腸菌株及びピキア・パストリス株を製造元の説明書（Qiagen（DH5α）、Invitrogen（X-33））に従って増殖させ、形質転換し、及び分析した。大腸菌に必要な培地、すなわち、ルリア・ベルターニ（LB）培地を製造元の推奨に従って製造した。ピキア・パストリスに必要な培地、すなわち、BMMY、BMGY、YPD、YPDS、及び抗生物質の濃縮物、すなわちZeocinを、ピキアマニュアル（Invitrogen、カタログ番号K1740-01）において説明されているとおり製造した。また、該マニュアルには、酵母の取り扱いについてのすべての関連する説明も含む。
【０２９５】
（B．マウスイソQCをコードするプラスミドベクターの分子クローニング）
標準的な分子生物学の技術を適用して、すべてのクローニング手順を実施した。ピキア・パストリスX-33における発現のために、pPiCZαAベクター（Invitrogen）を用いた。オープンリーディングフレームのコドン43（Glu43）で開始する成熟マウスイソQCのcDNA（メチオニンIIから計数、すなわち、図１５において示されるように、膜貫通配列は取り除かれ、酵母発現ベクターには挿入されていない。）を、分泌経路にタンパク質を配向させるpPiCZαA-プラスミドでコードしたα因子分泌シグナルとフレームにおいて融合させた。プライマー10（センス）（配列番号83）及びプライマー11（アンチセンス）（配列番号84）（表13）を利用するマウスイソQCの増幅後、断片を、NotI及びEcoR Iの制限部位を採用する発現ベクターへと挿入した。グリコシル化部位の挿入のために、プライマー12（センス）（配列番号85）及びプライマー13（アンチセンス）（配列番号86）（表13）によって、イソQCのオープンリーディングフレームのコドン56に突然変異を導入した（Ile56Asn）（メチオニンIIが該タンパク質の最初のアミノ酸であると再度仮定）。標準的なPCR技術に従って突然変異誘発を実施した後、DpnIを用いて親DNAを消化した（quik-change II位置指定突然変異誘発キット、Stratagene、カタログ番号200524）。
【表１９】
0005788320.tif 000112
【０２９６】
（C．ピキア・パストリスの形質転換及び小規模発現）
製造元の説明書（BioRad）に従って、電気穿孔によるピキア・パストリスコンピテント細胞の形質転換のために、1〜2μgのプラスミドDNAを適用した。100μg/mLのZeocinを含むプレートにおいて選択を実施した。マウスイソQC発現のための組換え酵母クローンを試験するために、2mLのBMGYを含む10mLのコニカルチューブにおいて細胞を24時間増殖させた。その後、酵母を遠心分離し、0.5％メタノールを含む2mLのBMMYにおいて再懸濁した。この濃度を、メタノールを24時間ごとに約72時間添加することによって維持した。その後、上清におけるQC活性を決定した。最大活性を示すクローンをさらなる実験及び発酵のために選択した。
【０２９７】
（D．ピキア・パストリスにおけるマウスイソQCの発現及び精製）
ピキア・パストリスにおけるイソQCの大規模発現を、5L反応器において実施した（Biostad B；Braun Biotech, Melsungen, Germany）。簡潔には、微量の塩を追加したpH5.5の基礎塩培地において発酵を実施した。まず、バイオマスを1回分及び流加相において、唯一の炭素源としてのグリセロールを用いて約28時間蓄積した。Invitrogenによって推奨される3工程特性に従ったメタノール供給によって、イソQCの発現をおよそ65時間の完全発酵のために開始した。発現後、細胞を遠心分離（8000×g、20分）によって培地から分離し、ペレットを廃棄した。アンモニアを上清に0.8Mの終濃度まで添加し、その後再度遠心分離し、結果として生じる上清を、第一の精製工程のためにさらに用いた。4工程プロトコールを利用して、イソQCタンパク質を精製した（表14）。精製したタンパク質をQC活性の決定及び金属含有量の分析のために用いた。精製を図１６において示す。
【表２０】
0005788320.tif 000113
【０２９８】
（E．QC活性の決定のための蛍光定量アッセイ及び分光光度アッセイ）
これらのアッセイを、実施例5において説明したとおり実施した。
（F．ピキア・パストリスにおけるラット-イソQCの発現及び精製）
（ラットイソQCをコードするプラスミドベクターの分子クローニング）
標準的な分子生物学の技術を適用して、すべてのクローニング手順を実施した。ピキア・パストリスX-33における発現のために、pPiCZαAベクター（Invitrogen）を用いた。オープンリーディングフレームのコドン43（Glu43）で開始する成熟ラットイソQCのcDNA（メチオニンIIから計数、図１５）を、分泌経路にタンパク質を配向させるα因子をコードしたプラスミドとフレームにおいて融合させた。プライマー14（配列番号87）をセンスとして、かつプライマー15（配列番号88）をアンチセンスとして利用する増幅（表15）の後、断片を、NotI及びEcoRIの制限部位を採用する発現ベクターへと挿入した。プライマー16（センス）（配列番号89）及びプライマー17（アンチセンス）（配列番号90）を用いて、突然変異をコドン56において導入した（Ile56Asn）。標準的なPCR技術に続いてDpnIを用いた親DNAの消化に従って、突然変異誘発を実施した（quik-change II位置指定突然変異誘発キット、Stratagene、カタログ番号200524）。
【０２９９】
（ピキア・パストリスにおけるラットイソQCの発現及び精製）
ピキア・パストリスにおけるイソQCの大規模発現を、5L反応器において実施した（Biostad B；Braun Biotech, Melsungen, Germany）。簡潔には、微量の塩を追加したpH5.5の基礎塩培地において発酵を実施した。まず、バイオマスを1回分及び流加相において、唯一の炭素源としてのグリセロールを用いて約28時間蓄積した。Invitrogenによって推奨される3工程特性に従ったメタノール供給によって、イソQCの発現をおよそ65時間の完全発酵時間のために開始した。発現後、細胞を遠心分離（8000×g、20分）によって培地から分離し、ペレットを廃棄した。上清のpH値を中性に調整し、再度遠心分離し、第一の精製工程のために適用した。3工程プロトコールを利用して、イソQCタンパク質を精製した（表16）。精製を図１７におけるSDS-PAGE分析によって示す。
【表２１】
0005788320.tif 000114
【表２２】
0005788320.tif 000115
【０３００】
（G．イソQC特異的抗体の作製及びウェスタンブロット分析によるイソQCの検出）
精製した組換えタンパク質ヒトイソQC及びラットイソQCタンパク質をアジュバントとともに用いて、ウサギを免疫した。5回の注射の後、ウサギを屠殺し、抗体をレクチンアフィニティカラムクロマトグラフィーによって精製した。2個体のウサギを、ヒトイソQC（h-イソQC）を用いて免疫し、さらに2個体は、ラットイソQC（r-イソQC）の注射を受けた。
【０３０１】
天然イソQCの検出のために、ヒトイソQC（pAb 3284）及びラットイソQC（pAb 3286）に対する特異的ポリクローナル抗体（両方ともProbiodrug AGによって展開及び製造された）を得た。抗体の特異性を特徴づけるために、HEK293細胞をヒトイソQC、ヒトQC、ラットイソQC、及びラットQCでトランスフェクトした。細胞（2×106）及び培地をQC及びイソQCの発現について分析した。さらに、異なる哺乳類種由来のトランスフェクトしていない細胞（3×106）（HEK293細胞、SH-SY5Y細胞、U343細胞、RAW264.7細胞、N2a細胞、及びPC12細胞）を基本的なイソQC発現について分析した。イムノブロッティングのために、200μLのRIPA緩衝液（Pierce）を用いて細胞を破砕し、10秒間超音波処理した。タンパク質を、トリス-グリシンの系の、4〜20％勾配のSDS-PAGEゲル（Serva）に負荷し、分離した。タンパク質を、セミドライ条件を用いてニトロセルロースメンブレン（Roth）に転移した。その後、メンブレンを、5％（w/v）ドライミルク含有TBS-T［20mMトリス/HCl（pH7.5）、500mM NaCl、0.05％（v/v）トゥイーン20］を用いて2時間ブロッキングした。イソQCの検出のために、抗体を5％ドライミルク含有TBS-Tに1：1000希釈し、4℃で一晩インキュベートした。製造元の指針に従って、西洋ワサビペルオキシダーゼ接合二次抗体（抗ウサギ、Cell Signaling）及びSuperSignal West Pico System（Pierce）を適用することによってブロットを顕色させた。
【０３０２】
（H．結果）
（（1）マウスイソQCの発現及び精製）
メチロトローフ酵母であるピキア・パストリスにおいてマウスイソQCをうまく発現させた。位置56におけるグリコシル化部位を含むグルタミン酸43で開始するタンパク質を5Lの生物反応器における発酵によって、大規模で発現させた。表14において説明したように精製を実施した。精製手順は結果的に、均質な組換えタンパク質の単離を生じた（図１６）。
【０３０３】
（（2）ラットイソQCの発現及び精製）
メチロトローフ酵母であるピキア・パストリスにおいてラットイソQCをうまく発現させた。（ピキア・パストリスにおけるh-イソQCの発現に従った）位置56におけるグリコシル化部位を含むグルタミン酸43で開始するタンパク質は、発酵によって大規模に発現させることができた。表16において説明したように精製を実施した。精製手順は結果的に、均質な組換えタンパク質の単離を生じた（図１７）。
【０３０４】
（（3）マウスイソQC及びラットイソQCの特徴づけ）
いくつかの異なるペプチド基質を分析した（表17）。すべての基質がマウスイソQC及びラットイソQCによって変換され、ヒトイソQCと類似の広範な基質特異性を示唆した。最大特異性定数（kcat/KM）を、N末端グルタミニル残基に隣接した大きな疎水性アミノ酸を有する基質、すなわちGln-Phe-Ala（QFA）について観察した。対照的に、該位置で負に帯電した残基は、Gln-Glu（QE）について観察されるように特異性における顕著な低下をもたらし、マウスイソQCの負に帯電した活性部位を示した。ヒトイソQCと比較して、マウスイソQCは、2〜3倍高い酵素活性を発揮した（図18）。広範な特異性は、本発明において説明したすべてのイソQCによる多くの異なる生理学的基質の変換を支持している。
【表２３】
0005788320.tif 000116
【０３０５】
（（4）ウェスタンブロット分析）
（先のG．において作製した）ポリクローナルイソQC抗体の特異性を調べるために、HEK293細胞にヒトイソQC、ラットイソQC、ヒトQC、及びラットQCをトランスフェクトし、ウェスタンブロットを用いて発現を分析した（図１９）。ヒトイソQC抗体pAb 8695の適用によって、ヒトイソQC、ヒトQC、ラットイソQC、及びラットQCをトランスフェクトした細胞における37kDaにおけるバンドが検出された。最も高強度のシグナルは、ヒトイソQCをトランスフェクトしたHEK293細胞において観察された（図１６ａ）。イソQCは、ゴルジ複合体に局在する酵素である。従って、ヒトイソQCをトランスフェクトした細胞由来のシグナルが期待された。シグナル強度における差は、基本的に発現したヒトイソQCの検出を示した。Restore（商標）Western Blot Stripping Buffer（Thermo Scientific）を用いたウェスタンブロットメンブレンを洗浄して、ヒトQC抗体pAb 8695とともにインキュベートした後、hQCをトランスフェクトした細胞の培地におけるシグナルが現れた（図１９ｂ）。このように、作製したポリクローナルh-イソQC抗体は、イソQCとQCの間に交差反応を示さない。
【０３０６】
ヒトイソQC及びラットイソQCの基本的な発現が、新規の抗体pAb 3284及びpAb 3286を適用して検出することができるかどうかを分析するために、いくつかの異なるトランスフェクトしていない細胞株を分析した（図２０）。（h-イソQC免疫化ウサギから単離した）抗体pAb 3284並びにヒト細胞株HEK293、SH-SY5Y、及びU343由来の細胞抽出物を適用して、37kDaにおけるh-イソQCのシグナルを検出した。シグナルは、マウス細胞株RAW及びN2aにおいて、並びにラット細胞株PC12において検出されなかった。ラットイソQC抗体（pAb 3286）を用いたウェスタンブロットは、マウス及びラットにおいて37kDaのタンパク質を可視化するが、ヒト細胞株においては可視化しない。それゆえ、この抗体は、ラット及びマウスのイソQCを検出することができる。従って、両抗体は、ヒトイソQC又は齧歯類（ラット及びマウス）イソQCのいずれかに特異的である。このように、基本的に発現したイソQCの検出は、ウェスタンブロット分析において先のG．において説明したポリクローナル抗体を用いて実行することができる。その上、該抗体は、解読に適用することができ、2つの潜在的な開始メチオニンのいずれか（図１５）を、ヒト及びラットのような異なる生物において用いる。Met I及びMet IIで開始するタンパク質間の分子量の差のため、本発明において説明したウェスタンブロット分析は、該タンパク質間を識別するのに用いることができる。
【０３０７】
呈したデータは、研究のすべての細胞株においてイソQCの発現を立証している。イソQCについて本発明において説明した抗体を適用した免疫検出は初めて、ある種の炎症、特に神経炎症の特徴づけ及び検出のための新規の分析手順の開発に有用であり得る。
【０３０８】
（実施例14：MCP-1（CCL2）、MCP-2（CCL8）、MCP-3（CCL7）、及びMCP-4（CCL13）のN末端におけるヒトイソQCにより触媒されるpGlu形成）
（A．マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析）
マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析を、線形時間の飛行分析装置を備えたVoyager De-Pro（Applied Biosystems, Darmstadt）を用いて実施した。機器には337nmの窒素レーザー、電位加速源、及び1.4mの飛行チューブが装備されていた。検出器の操作は、正イオンモードであった。試料（5μL）を等容積のマトリックス溶液と混合した。マトリックス溶液としてシナピニン酸を用い、20mgのシナピニン酸（Sigma-Aldrich）を1mLのアセトニトリル／0.1％TFA含有水（1：1（v/v））に溶解することによって製造した。少量（およそ1μL）のマトリックス-分析物混合物をプローブチップに転移した。
【０３０９】
（B．組換えヒトDP4によるN末端分解）
別個の実験において、N末端グルタミンで開始する全長の組換えケモカインCCL21(Q)-76（MCP-1）、CCL71(Q)-76（MCP-3）、CCL81(Q)-76（MCP-2）、及びCCL131(Q)-75（MCP-4）の各1つを25mMトリス／HCl pH7.6に、CCL2については20μg/mL、並びにCCL7、8、及び13については10μg/mLの濃度で個別に溶解した。個々のCCLを組換えヒトイソQCとともに37℃で2時間プレインキュベートした後、組換えヒトDP4（Probiodrug）とともに37℃でインキュベートし、又は前もってイソQCを適用せずにDP4とともにインキュベートするかのいずれかであった。結果として生じるDP4切断産物を、示された時点において最長4時間まで分析した。切断産物を、Maldi-TOF質量分析を用いて分析した。
【０３１０】
（C．結果）
ヒトDP4のヒトMCPへの適用は、ヒト組換えMCPのN末端配列（Gln-Pro）がDP4切断部位に似ているので、最初の2つのアミノ酸のN末端分解をもたらす（図２１ａ、２２ａ、２３ａ、２４ａ）。対照的に、MCP-1、MCP-2、MCP-3、及びMCP-4と組換えヒトイソQCとのプレインキュベーションは、ヒトMCPをヒトDP4によるさらなる切断から保護するN末端のpGlu残基の形成をもたらす（図２１ｂ、２２ｂ、２３ｂ、２４ｂ）。それゆえ、すべてのヒトMCPであるMCP-1（CCL2）、MCP-2（CCL8）、MCP-3（CCL7）、及びMCP-4（CCL13）は、インビトロでのヒトイソQCの基質である。
【０３１１】
（実施例15：C57/B16J野生型マウスにおけるチオグルコール酸誘発性腹膜炎）
（A．実験手順）
C57/B16JマウスをCharles River Laboratories（Kisslegg, Germany）から購入した。各実験につき、マウスを齢及び性別で符合させた。25mL／体重kgの滅菌8％（w/v）チオグリコール酸（Sigma-Aldrich）の腹腔内注射を用いて、腹膜炎を誘発させた。チオグリコール酸刺激の30分前に、動物に、異なる用量のイソQC阻害剤イソQC-Iを注射した。腹膜の洗浄のために、動物を、2％イソフルランを用いて麻酔した。チオグリコール酸注射の4時間後に8mLの滅菌PBSを用いて腹膜を洗浄することによって、腹膜滲出液を回収した。1mLの洗浄液の細胞を遠心分離（300g、10分）によって回収し、BD Trucountチューブのための製造元の説明書に従って染色した（BD Trucountチューブ；カタログ番号340334；BD Biosciences, Heidelberg, Germany）。細胞をCD16/32（Caltag）で4℃で15分間ブロッキングし、7/4-FITC（Serotec, Dusseldorf, Germany）／Ly6G-PE（Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany）及びIgG1-PE（BD）／IgG2a-FITC（Miltenyi）をアイソタイプ対照として用いて、室温で15分間染色した。染色後、赤血球をBD FACSLyse（BD）で暗所で室温で15分間溶解した。PBSによる洗浄後、フローサイトメトリー分析を、基準標準物質としての1試料あたり5000個のビーズに基づいたBD FACSCalibur（BD）において実施した。
【０３１２】
（B．結果）
C57/B16Jマウスの腹膜へのチオグリコール酸の注射後、この区画への単球の浸潤を、FACS分析を用いて検出した。このモデルにおけるQC／イソQC特異的阻害剤であるイソQC-Iの適用は、浸潤している単球の用量依存的減少を引き起こす。現象はすでに、6mg/kgのイソQC-Iを用いて観察することができた。18mg/kgは、基線値まで単球の浸潤を減少させ、塩類溶液単独を注射した場合にこのことは検出された（図２５ａ）。同様に、個々の洗浄液におけるpGlu-MCP-1の決定は、pGlu含有量の減少を示し、標的酵素における阻害剤の作用に応じた治療効果を示唆している（図２５ｂ）。
【０３１３】
（実施例16：イソQC（QPCTL）ノックアウトマウスにおけるチオグリコール酸誘発性腹膜炎）
QPCTLノックアウトマウスをゲノム突然変異誘発アプローチにおいて作出した。
QPCTLノックアウト動物におけるチオグリコール酸の適用は、腹膜への単球の浸潤を刺激しない。しかしながら、QPCTL野生型同腹仔において、イソQCの活性が存在しており、結果的にMCPの適切な成熟を生じているので、単球の浸潤が検出された（図２６ａ）。顆粒球の浸潤は、イソQC（QPCTL）ノックアウトによって影響されなかった（図２６ｂ）。単球の低い浸潤は、QPCTLノックアウトマウスにおける低濃度のpGlu-MCP-1と相関していたのに対し、総MCP-1レベルは正常のままであった（図２７）。それゆえ、マウスイソQCノックアウトは、pGlu-MCP-1形成の影響を有し、pGlu-MCP-1の減少は、この動物モデルの腹膜への単球の動員に及ぼす影響を有する。加えて、原理の遺伝子的立証は、チオグリコール酸誘発性腹膜炎におけるイソQC阻害剤の適用の特異性を実証している。該実験によって、イソQCの阻害がpGlu-MCPの非活性化を結果的に生じ、それゆえ、炎症性疾患のための新規の治療戦略であることが立証されている。
【０３１４】
（実施例17：イソQC（QPCTL）ノックアウトマウスから単離されたPBMCのLPS刺激）
（A．血漿及びPBMCの単離）
末梢血単核細胞（PBMC）の単離のために、QPCTLノックアウト動物及び野生型同腹仔を、2％イソフルランを用いて麻酔し、ヘパリン処理した血液を心穿刺により回収した。その後、血液を、同じ遺伝的背景を有する動物からプールし（それぞれ、イソQCホモ接合性ノックアウト動物及び野生型動物）、ヘパリン処理した血液を1000×gで10分間遠心分離して得た血漿を回収した。血漿を一定分量で分注し、−80℃で保存した。沈降した血液細胞を細胞培養液（RPMI1640、10％FBS、100μg/mLゲンタマイシン）において再懸濁した。
【０３１５】
PBMCの単離のために、密度勾配を用い：15mLのLSM 1077（リンパ球分離培地、PAA）を50mLのLeucosepチューブ（Greiner）に満たした。培地を1000×gで1分間遠心分離した。その後、血液細胞をLeucosepチューブ（Greiner）へといっぱいに注いだ。溶液を1000×gで10分間、渦巻を回避するための活性化した減速をせずに遠心分離した。上部相を1cm覆う液体を廃棄して、試料の血小板の混入を回避した。その後、培地を完全に回収し、それにより、Leucosepチューブ内の環状リングは、ペレット化した赤血球を有するPBMC画分の混入を防止した。PBMCを、10mLの滅菌PBSを用いて2回洗浄した後、遠心分離した。最後に、細胞を培養液（RPMI 1640、10％FBS、50μg/mLゲンタマイシン）で再懸濁し、25cm2の組織培養フラスコに蒔種し、37℃及び5％CO2で一晩増殖させた。翌日、PBMCはプラスチックに接着していた。それゆえ、リンパ球を含む上清を除去し、細胞をPBSで1回洗浄した後、Accutase（PAA）を用いてはがした。遠心分離後、細胞を、Neubauer計数チャンバーを用いて計数し、培養液（RPMI1640、10％FBS、50μg/mLゲンタマイシン）において96ウェルプレートに転移した。最終的な細胞密度は、1ウェルあたり約1×105個であった。大腸菌株O55:B5（Sigma）由来の10μg/mLのLPSを用いて細胞を24時間刺激した。その後、培地を回収し、総MCP-1及びpGlu-MCP-1特異的ELISAを用いて分析した。
【０３１６】
（B．結果）
QPCTLノックアウトマウス及び野生型同腹仔から単離したPBMCの刺激は、培養上清における高い総MCP-1濃度をもたらす。刺激していないPBMCは、少量の総MCP-1しか分泌しない（図２８ａ）。野生型動物由来の細胞の培地において検出された総MCP-1レベルは、ノックアウト動物由来の個々の細胞と比較して高い。野生型PBMCから分泌されるMCP-1は、pGlu修飾したN末端を有しており、等量の総MCP-1及びpGlu-MCP-1によって示されている（図２８ａ、２８ｂ）。対照的に、QPCTLノックアウトマウス由来の細胞は、ELISAによって検出される少量のpGlu-MCP-1（図２８ａ）及び野生型同腹仔における90％超と比較したおよそ10％の低い比のpGlu-MCP-1対総MCP-1（図２８ｂ）によって示されるように、N末端でpGlu修飾された微量のMCP-1しか生じない。
【０３１７】
（実施例18：マウスイソQCの亜鉛含有量の決定）
（A．TXRF測定）
マウスイソQCの精製後に、10mMトリス-HCl、pH7.6においてあらかじめ平衡化しておいたSephadex G-25迅速脱塩カラム（1.0×10cm）を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって酵素を脱塩した。タンパク質を3mg/mLに濃縮した。全反射X線蛍光（TXRF）を用いて元素分析を実施した。溶出緩衝液を背景対照として用いた。5μLの希釈していない試料溶液又は対照緩衝液をTXRFクォーツガラス試料支持体に適用し、赤外線照射の下で乾燥させた。その後、5μLの希釈したSe標準水溶液（内部標準物質、Aldrich；Taufkirchen, Germany）を各試料に添加し、再度乾燥させた。X線蛍光信号を100秒間回収した。すべての決定について、Link QX 2000検出器／分析装置（Oxford Instruments, High Wycombe, UK）に接続したモリブデン及びタングステン主要X線源を含むExtra II TXRFモジュール（Seifert, Ahrensburg, Germany）を用いた。X線源は、50kV及び38mAで操作した。
【０３１８】
（B．失活／再活性化）
マウスイソQC及びマウスQCを、5mMの1,10-フェナントロリン、5mM EDTA、500mM NaCl含有50mMビストリス（pH6.8）を含む1.0Lの緩衝液に対する4℃における一晩の透析によって、マウスイソQC及びマウスQCを失活させた。1Lの、50g/LのChelex-100（Bio-RAD, Munich）を含む50mMビストリス（pH6.8）、500mM NaCl、又は50g/LのChelex-100を含む10mM NaH2PO4（pH6.8）に対する4℃での透析によって、キレート剤をアポ酵素から分離した。透析の2時間後及び4時間後に、緩衝液を2回交換した。最終的な透析は5時間実施した。すべての緩衝液を金属非含有ポリスチレン容器において製造した。その後、アポ酵素を4℃、20.000×gで1時間遠心分離し、タンパク質濃度をUV吸光度によって決定した。
【０３１９】
再活性化実験を、20μLのアポ酵素含有ビス-トリス緩衝液とともに20μLの遷移金属溶液を室温で15分間インキュベートすることによって実施した。最後に、先に記載したとおり酵素活性を評価したが、例外は、緩衝液中に存在する外来の亜鉛イオンによる酵素の迅速な再活性化を回避するために、反応緩衝液は2mMのEDTAを含んでいたことであった。
【０３２０】
（C．CD分光分析）
分光分析のために、タンパク質を10mM NaH2PO4において調製した。マウスQC及びマウスイソQCのCDスペクトルを、1mm経路長のクォーツキュベットを用いるJasco J-715スペクトル偏光計で獲得した。190〜260nmの10回走査の平均を算出し、緩衝液スペクトルの減算によってスペクトルを補正した。二次構造要素の％を、Yangの方法に基づいたJasco二次構造概算プログラムを用いて算出した。アポ酵素及び酵素の再活性化を、分光分析後のQC活性測定によって確認した。
【０３２１】
（D．結果）
マウスQCについて、1mol亜鉛／酵素molの金属含有量を先に決定した。また、QCの亜鉛結合モチーフは、イソQCの配列において保存されている。それゆえ、マウスイソQCの金属含有量を、TXRFを用いて分析した。3つの独立した酵素試料の測定によって、亜鉛0.99±0.38mol／酵素molの亜鉛含有量を決定した。このように、イソQCタンパク質は、本発明において初めて示されるように、単一の亜鉛メタロ酵素を表す。
【０３２２】
ヒトイソQCについて、1,10-フェナントロリン、ジピコリン酸、及びEDTAのような複素環式キレート剤によって、該タンパク質を失活させることができることが示された。5mMの1,10-フェナントロリン及び5mMのEDTAを含む緩衝液に対する透析は結果的に、マウスイソQCの失活を生じた。キレート剤の除去後、ZnSO4の添加によって、結果的にマウスイソQCの完全な再活性化が生じた。該結果を実証するために、異なる量の亜鉛をアポ酵素（マウスイソQC、マウスQC、及びキイロショウジョウバエ（Drome）QC）に対して滴定した（図２９）。検査したすべての酵素は、1mol亜鉛／酵素molを添加することによって及び2mol亜鉛／酵素molを用いて100％再活性化する。0.5の亜鉛／酵素molの比で、少なくとも60％の活性に到達した。
【０３２３】
さらに、他の金属イオンによるマウスイソQCの再活性化を検討した。1molコバルト／酵素molの添加によって、再活性化を達成した。しかしながら、最終的な活性は、亜鉛イオンによる再活性化と比較して50％に過ぎなかった。カルシウムイオン又はマンガンイオンを用いて再活性化は達成されなかった。
【０３２４】
タンパク質構造に及ぼす亜鉛結合の影響を調べるために、アポ酵素の及び再活性化したマウスイソQCの二次構造を、190〜260nmのCDスペクトルを介して評価した。両方の場合において、二次構造の算出によって、50％のαへリックス部分が明らかとなった。このように、亜鉛結合は、全体的な二次構造に及ぼす影響を何ら有していない。このことは、金属イオンが触媒の役割を主として担っていることを支持している。
【０３２５】
（略語）
【表２４】
0005788320.tif 000117
0005788320.tif 000118
0005788320.tif 000119
0005788320.tif 000120
0005788320.tif 000121
【図１】
0005788320.tif 000138
【図２】
0005788320.tif 000139
【図３】
0005788320.tif 000140
【図４】
0005788320.tif 000141
【図５】
0005788320.tif 000142
【図６】
0005788320.tif 000143
【図７】
0005788320.tif 000144
【図８】
0005788320.tif 000145
【図９】
0005788320.tif 000146
【図１０】
0005788320.tif 000147
【図１１】
0005788320.tif 000148
【図１２】
0005788320.tif 000149
【図１３】
0005788320.tif 000150
【図１４】
0005788320.tif 000151
【図１５】
0005788320.tif 000152
【図１６】
0005788320.tif 000153
【図１７】
0005788320.tif 000154
【図１８】
0005788320.tif 000155
【図１９（ａ）】
0005788320.tif 000156
【図１９（ｂ）】
0005788320.tif 000157
【図２０（ａ）】
0005788320.tif 000158
【図２０（ｂ）】
0005788320.tif 000159
【図２１】
0005788320.tif 000160
【図２２】
0005788320.tif 000161
【図２３】
0005788320.tif 000162
【図２４】
0005788320.tif 000163
【図２５】
0005788320.tif 000164
【図２６】
0005788320.tif 000165
【図２７】
0005788320.tif 000166
【図２８】
0005788320.tif 000167
【図２９】
0005788320.tif 000168
【図３０】
0005788320.tif 000169
【配列表】
0005788320000001.app
0005788320000002.xml