(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む、ＨＣＶに対する免疫反応を個体において誘導するための組成物。
【請求項２】
配列番号２をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む、ＨＣＶに対する免疫反応を個体において誘導するための組成物。
【請求項３】
前記核酸分子がＤＮＡ分子である、請求項１〜２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４】
前記核酸分子がプラスミドである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記核酸分子が電気穿孔法により前記個体に導入される、請求項３または４に記載の組成物。
【請求項６】
配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む、ＨＣＶに対する免疫反応を個体において誘導するための組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物を含む医薬組成物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物を含む注射可能な医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物を含む組み換えワクチン。
【請求項１０】
前記組み換えワクチンが組み換えワクシニアワクチンである、請求項９に記載の組み換えワクチン。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物を含む弱毒化生ワクチン。
【請求項１２】
ＨＣＶに対する免疫反応を個体において誘導するための組成物であって、請求項９に記載の組み換えワクチンを含む組成物。
【請求項１３】
ＨＣＶに対する免疫反応を個体において誘導するための組成物であって、請求項１１に記載の弱毒化生ワクチンを含む組成物。
【請求項１４】
前記個体は、ＨＣＶ感染を有すると診断されている、請求項１、２または６に記載の組成物。
【請求項１５】
前記個体は、ＨＣＶ感染を有すると診断されている、請求項１〜６、１２および１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記細胞性反応はＮＳ３およびＮＳ４特異的である、請求項１、２および６のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良型ＨＣＶ、ＨＣＶに対する免疫反応を誘導する改良法、ならびにＨＣＶに対して予防的におよび／または治療的に個体を免疫化する改良法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）は、小さいエンベロープを持つプラス鎖ＲＮＡウイルスであり、現在の感染者が１７億を超える、世界中を悩ます主要な健康上の問題である（Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｂ．Ｊ．ａｎｄ  Ｒ．Ｇ．Ｆｉｎｃｈ，Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ，２００５．１１（２）：ｐ．８６−９４）。全てのヒトウイルスのうち最も繁栄したウイルスの１つであるＨＣＶは、肝細胞に優先的に感染し、全感染患者のうち最大で７０％の肝臓の中で生き残ることができる（Ｂｏｗｅｎ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄ  Ｃ．Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ，Ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ，２００５．４３６（７０５３）：ｐ．９４６−５２）。慢性感染患者の最大３０％が、その患者の生存期間中に、肝硬変および肝細胞ガン（ＨＣＣ）を含む進行性の肝疾患を発症すると推定され、ＨＣＶ感染を世界中の肝移植の主要原因にさせている。さらに、ＨＣＶおよびＨＢＶ感染は、ＨＣＣの全症例の７０％に関わり、世界中のガン死亡の第３番目の主要原因である（Ｌｅｖｒｅｒｏ，Ｍ．，Ｖｉｒａｌ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ：ｔｈｅ  ｃａｓｅ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００６．２５（２７）：ｐ３８３４−４７）。
【０００３】
このウイルスの持続的性質により、ＨＣＶ感染は、治療をすることが非常に困難であり、かつ高価になり得る。ほとんどの感染患者は治療を受けない。しかし、治療を受ける患者は、標準的治療プロトコールに対して平均１７，７００〜２２，０００ドルを支払う（Ｓａｌｏｍｏｎ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｓｔ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎ  ｅｖｏｌｖｉｎｇ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｊａｍａ，２００３．２９０（２）：ｐ．２２８−３７）。ヨーロッパおよび北アメリカにおいて最も流行している遺伝子型１の感染は最も不良な予後を有し、標準的治療を受ける患者が４２％という低さである（Ｍａｎｎｓ，Ｍ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｌｆａ−２ｂ  ｐｌｕｓ  ｒｉｂａｖｉｒｉｎ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｌｆａ−２ｂ  ｐｌｕｓ  ｒｉｂａｖｉｒｉｎ  ｆｏｒ  ｉｎｉｔｉａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ，２００１．３５８（９２８６）：ｐ．９５８−６５）。
【０００４】
したがって、慢性ＨＣＶの感染の高率発生、効果的な治療の欠如および経済的負担が、この病気と闘うための新規免疫療法戦略の開発に対する緊急ニーズを説明する。現在、ＨＣＶに対する予防的または治療的ワクチンはないが、ＨＣＶに対する天然で防御的な免疫が存在する証拠はある（Ｗｅｉｎｅｒ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，２００１．７５（１５）：ｐ．７１４２−８；Ｂａｓｓｅｔｔ，Ｓ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅｓ  ｒｅｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００１．３３（６）：ｐ．１４７９−８７；Ｌａｎｆｏｒｄ，Ｒ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｏｓｓ−ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，２００４．７８（３）：ｐ．１５７５−８１）。大多数の症例において、回復期の人々は急性ＨＣＶ感染に対しては保護されないが、むしろ、感染の慢性状態への進行からは保護される（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ｍ．ａｎｄ  Ｓ．Ａｂｒｉｇｎａｎｉ，Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ．Ｎａｔｕｒｅ，２００５．４３６（７０５３）：ｐ．９６１−６）。ＨＣＶ病原性と主に関連するのは感染の慢性状態であるので、この感染を制御または治療するためのワクチンアプローチの実行可能性について本明細書が論じる。
【０００５】
ウイルス感染と闘うために、このウイルスに対する適応免疫を理解することは、ＤＮＡワクチンなどの戦略を設計するのに重要な意味をもつ。ＨＣＶ感染後７〜８週間以内に、ウイルス特異的抗体が検出されるが（Ｐａｗｌｏｔｓｋｙ，Ｊ．Ｍ．，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ．Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ，１９９９．３１  Ｓｕｐｐｌ  １：ｐ．７１−９）、それらの抗体は再感染に対して保護せず（Ｆａｒｃｉ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｃｋ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｒｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２．２５８（５０７９）：ｐ．１３５−４０；Ｌａｉ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｐｉｓｏｄｅｓ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｉｎ  ｐｏｌｙｔｒａｎｓｆｕｓｅｄ  ｔｈａｌａｓｓａｅｍｉｃ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ｌａｎｃｅｔ，１９９４．３４３（８８９４：ｐ．３８８−９０）、感染の治癒後に完全になくなり得る（Ｃｏｏｐｅｒ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９９９．１０（４）：ｐ．４３９−４９；Ｐｏｓｔ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｅｍｉａ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｉｓｏｎｓ  ｓｔｕｄｙ  ｃｏｈｏｒｔ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，２００４．１８９（１０）：ｐ．１８４６−５５）。その代わりに、初期の、多特異的な、肝内のＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞反応およびＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞反応を開始する感染患者は、ＨＣＶ感染を排除することができる（Ｌｅｃｈｎｅｒ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｐｅｒｓｏｎｓ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，２０００．１９１（９）：ｐ．１４９９−５１２；Ｇｅｒｌａｃｈ，Ｊ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ａｆｔｅｒ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ４（＋）  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１９９９．１１７（４）：ｐ．９３３−４１；Ｔｈｉｍｍｅ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｃｕｔｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，２００１．１９４（１０）：ｐ．１３９５−４０６；Ｇｒａｋｏｕｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，ＨＣＶ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｅｖａｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍｅｍ���ｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｈｅｌｐ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３．３０２（５６４５）：ｐ．６５９−６２）。実際、このウイルスの構造タンパク質、特にＮＳ３タンパク質に対する強力なＴ細胞反応は、急性感染の回復と重要な相関があることが証明された（Ｍｉｓｓａｌｅ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｂｅｈａｖｉｏｒｓ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｖｉｇｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｖｉｒａｌ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，１９９６．９８（３）：ｐ．７０６−１４；Ｄｉｅｐｏｌｄｅｒ，Ｈ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｎｏｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３  ｉｎ  ｖｉｒａｌ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｌａｎｃｅｔ，１９９５．３４６（８９８１）：ｐ．１００６−７）。ＮＳ３特異的Ｔ細胞反応と急性感染の回復との相関、ならびにＮＳ３タンパク質の遺伝的可変性の低さおよび大きな相対サイズが、ＨＣＶのＮＳ３タンパク質を、Ｔ細胞に基づくＤＮＡワクチンの魅力的な標的にさせる。
【０００６】
ＤＮＡワクチンは、弱毒化された生のウイルスワクチンおよび組み換えタンパク質に基づくワクチンなどの、より伝統的なワクチン接種法を上回る多くの概念的利点を有する。ＤＮＡワクチンは、安全で、安定で、簡単に産生でき、かつヒトにおいて十分に耐容性を示し、前臨床試験はプラスミド組み込みの証拠を示さない（Ｍａｒｔｉｎ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｍａｌａｒｉａ  ｖａｃｃｉｎｅ：ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１９９９．１０（５）：ｐ．７５９−６８；Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｗ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｇｅｎｏｍｅ．Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，１９９５．７７２：ｐ．３０−９）。さらに、ＤＮＡワクチンの有効性がベクターに対する前から存在する抗体の力価によって影響されないという事実により、ＤＮＡワクチンは反復投与に十分に適する（Ｃｈａｔｔｅｒｇｏｏｎ，Ｍ．，Ｊ．Ｂｏｙｅｒ，  ａｎｄ  Ｄ．Ｂ．Ｗｅｉｎｅｒ，  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ：ａ  ｎｅｗ  ｅｒａ  ｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ，１９９７．１１（１０）：ｐ．７５３−６３）。しかし、より大きな動物に進んだ場合、ＤＮＡワクチンの臨床上の導入に対する１つの重大な障害は、プラットフォームとなる免疫原性の減少であった（Ｌｉｕ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ  Ｊ．Ｂ．Ｕｌｍｅｒ，Ｈｕｍａｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ａｄｖ  Ｇｅｎｅｔ，２００５．５５：ｐ．２５−４０）。コドン最適化、ＲＮＡ最適化および免疫グロブリンリーダー配列の付加などの、ＤＮＡワクチン免疫原の遺伝子工学処理における最近の技術的進歩が、ＤＮＡワクチンの発現および免疫原性を改良し（Ａｎｄｒｅ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｐ１２０  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，１９９８．７２（２）：ｐ．１４９７−５０３；Ｄｅｍｌ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  Ｇａｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，２００１．７５（２２）：ｐ．１０９９１−１００１；Ｌａｄｄｙ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ−ｂａｓｅｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００７．２５（１６）：ｐ．２９８４−９；Ｆｒｅｌｉｎ，  Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚａ��ｉｏｎ  ａｎｄ  ｍＲＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ３／４Ａ  ｇｅｎｅ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，２００４．１１（６）：ｐ．５２２−３３）、ならびに、近年、電気穿孔法などのプラスミド送達システムの技術を開発した（Ｈｉｒａｏ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ／ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｉｎ  ｐｉｇｓ  ａｎｄ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００８．２６（３）：ｐ．４４０−８；Ｌｕｃｋａｙ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，２００７．８１（１０）：ｐ．５２５７−６９；Ａｈｌｅｎ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ３／４Ａ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｌｏｃａｌ  ＤＮＡ  ｕｐｔａｋｅ，  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ３＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７．１７９（７）：ｐ．４７４１−５３）。さらに、コンセンサス免疫原を使用することで、天然の抗原のみと比較して、細胞性免疫反応の幅を拡大させることができる可能性があることを複数の研究が示唆した（Ｙａｎ．，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＨＩＶ−１  ｓｕｂｔｙｐｅ  Ｂ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，２００７．１５（２）：ｐ．４１１−２１；Ｒｏｌｌａｎｄ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｃｅｓｔｒａｌ  ｃｅｎｔｅｒ−ｏｆ−ｔｒｅｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，２００７．８１（１６）：ｐ．８５０７−１４）。
【０００７】
ＨＣＶのＮＳ３およびＮＳ４をコードするＤＮＡワクチンは、ウェブサイトｗｗｗ．ｅｌｓｅｖｉｅｒ．ｃｏｍ／ｌｏｃａｔｅ／ｖａｃｃｉｎｅ上のオンライン出版の中のＬａｎｇ，Ｋ．Ａらによる論文Ｖａｃｃｉｎｅ  ＸＸ（２００８）ＸＸＸ−ＸＸＸに開示される。
【０００８】
ＨＣＶに対する効果的なワクチンのニーズが依然としてある。ＨＣＶ感染患者を治療する効果的な方法のニーズが依然としてある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
コンセンサスＨＣＶ遺伝子型１ａ／１ｂのＮＳ３およびＮＳ４Ａのアミノ酸配列を含むタンパク質、ならびにかかるタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する。これらの核酸構築物およびこれらの核酸構築物がコードするタンパク質が、抗ＨＣＶ免疫反応を起こすことができる改良型免疫原性標的物を提供する。
【００１０】
かかるタンパク質配列をコードする構築物、かかるタンパク質を含むワクチン、および／またはかかるタンパク質をコードする核酸分子、ならびに抗ＨＣＶ免疫反応を誘導する方法も提供する。
【００１１】
以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子：配列番号１；配列番号１の断片；配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有する配列；および配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有する配列の断片。
【００１２】
本発明は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する：配列番号２をコードするヌクレオチド配列；配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号２をコードするヌクレオチド配列の断片；配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片。
【００１３】
本発明は、かかる核酸分子を含む医薬組成物、およびＨＣＶに対する免疫反応を個体において誘導する方法におけるそれらの医薬組成物の使用をさらに提供し、その方法はかかる核酸分子を含む組成物を個体に投与することを含む。
【００１４】
本発明は、かかる核酸分子を含む組み換えワクチン、およびＨＣＶに対する免疫反応を個体において誘導する方法におけるそれらの組み換えワクチンの使用をさらに提供し、その方法はかかる組み換えワクチンを個体に投与することを含む。
【００１５】
本発明は、かかる核酸分子を含む弱毒化された生の病原体、およびＨＣＶに対する免疫反応を個体において誘導する方法におけるそれらの病原体の使用をさらに提供し、その方法はかかる弱毒化された生の病原体を個体に投与することを含む。
【００１６】
本発明は、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質をさらに提供する：配列番号２；配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有する配列；配列番号２の断片；および配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有する配列の断片。
【００１７】
本発明は、かかるタンパク質を含む医薬組成物、およびＨＣＶに対する免疫反応を個体において誘導する方法におけるそれらの医薬組成物の使用をさらに提供し、その方法はかかるタンパク質を含む組成物を個体に投与することを含む。
【００１８】
本発明は、かかるタンパク質を含む組み換えワクチン、およびＨＣＶに対する免疫反応を個体において誘導する方法におけるそれらの組み換えワクチンの使用をさらに提供し、その方法はかかる組み換えワクチンを個体に投与することを含む。
【００１９】
本発明は、かかるタンパク質を含む弱毒化された生の病原体、およびＨＣＶに対する免疫反応を個体において誘導する方法におけるそれらの病原体の使用をさらに提供し、その方法はかかる弱毒化された生の病原体を個体に投与することを含む。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
配列番号１；
配列番号１の断片；
配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有する配列；および
配列番号１と少なくとも９０％の相同性を有する配列の断片；からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子。
（項目２）
配列番号１を含む、項目１に記載の核酸分子。
（項目３）
配列番号１と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む、項目１に記載の核酸分子。
（項目４）
配列番号１と少なくとも９８％の相同性を有する配列を含む、項目１に記載の核酸分子。
（項目５）
配列番号１からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも９９％の相同性を有する配列を含む、項目１に記載の核酸分子。
（項目６）
配列番号２をコードするヌクレオチド配列；
配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
配列番号２をコードするヌクレオチド配列の断片；および
配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の断片；からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子。
（項目７）
配列番号２をコードするヌクレオチド配列を含む、項目６に記載の核酸分子。
（項目８）
配列番号５を含む、項目１に記載の核酸分子。
（項目９）
配列番号６をコードするヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の核酸分子。
（項目１０）
前記分子がプラスミドである、項目１〜９のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目１１）
項目１〜１０のいずれか一項に記載の核酸分子を含む医薬組成物。
（項目１２）
項目１〜１０のいずれか一項に記載の核酸分子を含む注射可能な医薬組成物。
（項目１３）
ＨＣＶに対する免疫反応を個体において誘導する方法であって、項目１〜９のいずれか一項に記載の核酸分子を含む組成物を、前記個体に投与することを含む。
（項目１４）
前記核酸分子がＤＮＡ分子である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記核酸分子がプラスミドである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記核酸分子が電気穿孔法により前記個体に導入される、項目１４または１５に記載の方法。
（項目１７）
項目１〜９のいずれか一項に記載の核酸分子を含む組み換えワクチン。
（項目１８）
前記組み換えワクチンが組み換えワクシニアワクチンである、項目１７に記載の組み換えワクチン。
（項目１９）
項目１〜９のいずれか一項に記載の核酸分子を含む弱毒化生ワクチン。
（項目２０）
配列番号２；
配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有する配列；
配列番号２の断片；および
配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有する配列の断片；からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（項目２１）
配列番号２を含む、項目２０に記載のタンパク質。
（項目２２）
配列番号２と少なくとも９５％の相同性を有する配列を含む、項目２０に記載のタンパク質。
（項目２３）
配列番号２と少なくとも９８％の相同性を有する配列を含む、項目２０に記載のタンパク質。
（項目２４）
配列番号２と少なくとも９９％の相同性を有する配列を含む、項目２０に記載のタンパク質。
（項目２５）
配列番号６を含む、項目２０に記載のタンパク質。
（項目２６）
項目２０〜２５のいずれか一項に記載のタンパク質を含む医薬組成物。
（項目２７）
項目２０〜２５のいずれか一項に記載のタンパク質を含む注射可能な医薬組成物。
（項目２８）
項目２０〜２５のいずれか一項に記載のタンパク質を含む組み換えワクチン。
（項目２９）
前記組み換えワクチンが組み換えワクシニアワクチンである、項目２８に記載の組み換えワクチン。
（項目３０）
項目２０〜２５のいずれか一項に記載のタンパク質を含む弱毒化生ワクチン。
（項目３１）
ＨＣＶに対する免疫反応を個体において誘導する方法であって、項目２０〜２５のいずれか一項に記載のタンパク質を含む組成物を、前記個体に投与することを含む方法。
（項目３２）
ＨＣＶに対する免疫反応を個体において誘導する方法であって、項目１７、１８、２８および２９のいずれか一項に記載の組み換えワクチンを前記個体に投与することを含む方法。
（項目３３）
ＨＣＶに対する免疫反応を個体において誘導する方法であって、項目１９または３０に記載の弱毒化生ワクチンを前記個体に投与することを含む方法。
（項目３４）
前記個体は、ＨＣＶ感染を有すると診断されている項目１３〜１６および３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＮＳ３の遺伝子型１ａおよび１ｂのそれぞれの配列と比較した、ｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４ＡのＮＳ３の遺伝子型１ａ／１ｂコンセンサス配列の系統発生解析を示す図である。ＮＳ３の遺伝子型１ａ／１ｂコンセンサス配列を、１５個の異なるＨＣＶ遺伝子型１ａ配列および２６個の異なるＨＣＶ遺伝子型１ｂ配列から得た。星は、ＮＳ３の４１個の異なる構成要素の配列と比較した、ＮＳ３コンセンサス配列を示す。
【図２】ｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａのプラスミド地図および配列を示す図である。ＩｇＥリーダー配列、細胞内タンパク質分解の切断部位およびＣ末端ＨＡタグに下線を引く。
【図３】免疫蛍光法（４００倍）によるｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａ発現の検出を示す写真である。Ｈｕｈ７．０をｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａで一過的にトランスフェクトし、Ｃ末端ＨＡタグに対するモノクローナル抗体を用いて、この遺伝子産物の発現を検出した。
【図４】ｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａが、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、強力なＮＳ３およびＮＳ４特異的Ｔ細胞反応を誘導することを示すグラフである。１００万個の脾細胞あたりのＮＳ３およびＮＳ４特異的なＩＦＮ−γスポット形成単位（ＳＦＵ）の数を、ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイを経て測定した。（Ａ）５群のマウス、１群あたり３匹を、ｐＶＡＸ（陰性対象）またはｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａの４つの異なる投与量：５μｇ、１２．５μｇ、２５μｇまたは５０μｇで筋肉注射により免疫化し、続いて、電気穿孔を行った。脾細胞を各マウスから単離し、群ごとに貯蔵し、ｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａタンパク質配列の全長に及ぶ重複ペプチドの５種類の異なるプールで刺激した。（Ｂ）ｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａのマトリックスエピトープの地図作成の結果を示す図である。１２．５μｇのｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａで免疫化したＣ５７ＢＬ／６マウスから脾細胞を単離し、重複ｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａぺプチドの２１種類の異なるプールで刺激した。各ペプチドは２１種類のプールのうちの２つに含まれる。上記のＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて、優性エピトープを同定した。
【図５】ｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａが、アカゲザルにおいて、強力なＮＳ３およびＮＳ４特異的Ｔ細胞反応を誘導することを示すグラフである。（Ａ）免疫化スケジュールを示す。５匹のアカゲザルを１ｍｇのｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａで筋肉注射により免疫化し、続いて、電気穿孔を行った。４週間の間隔をあけて、これらのサルを２回免疫化した。（Ｂ）最初の免疫化前に１度、および各免疫化の２週間後に反応を測定した。１００万個のＰＢＭＣあたりのＮＳ３およびＮＳ４特異的ＩＦＮ−γスポット形成単位（ＳＦＵ）の数を、ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイを経て測定した。
【図６】ｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａが、アカゲザルにおいて広範な細胞性免疫反応を誘導することを示すグラフである。免疫化前および各免疫化２週間後における、５種類のペプチドプールの各々に対する５匹のサルのそれぞれの反応を示す。１００万個のＰＢＭＣあたりのＮＳ３およびＮＳ４特異的ＩＦＮ−γスポット形成単位（ＳＦＵ）の数を、ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイを通して測定した。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本明細書で使用されるとき、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」という語句は、１つの核酸分子が別の１つの核酸分子とハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を表す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる環境において様々である。より長い配列は、より高温で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特異的配列に対する熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、標的配列と相補的なプローブの５０％が、平衡状態でこの標的配列とハイブリダイズする（規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度の下での）温度である。一般に、これらの標的配列はＴｍにおいて過剰に存在するので、これらのプローブの５０％が平衡状態で占有する。一般的に、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３において、塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、一般的に約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に対して少なくとも約３０℃であり、長いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドに対して少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定剤の付加を用いても達成され得る。
【００２２】
ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列相同性を、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９７，  ２５，３３８９，  これは、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる）ならびにＰＡＵＰ＊４．０ｂ１０ソフトウェア（Ｄ．Ｌ．Ｓｗｏｆｆｏｒｄ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて測定してもよい。「類似度のパーセンテージ」を、ＰＡＵＰ＊４．０ｂ１０ソフトウェア（Ｄ．Ｌ．Ｓｗｏｆｆｏｒｄ，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて計算する。コンセンサス配列の平均類似度を、系統樹の全配列と比較して計算する。
【００２３】
簡潔に述べると、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌを表すＢＬＡＳＴアルゴリズムは、配列類似度の決定に適している（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３−４１０，これは、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる）。ＢＬＡＳＴ解析を行うソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公表されている。このアルゴリズムは、データベース配列中の同一の長さのワードと整列させた場合、ある正の値の域値スコア（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｖａｌｕｅｄ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｓｃｏｒｅ）Ｔと一致するかまたはそれを満足させる問い合わせ配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、ハイスコアな配列の対（ＨＳＰｓ）を最初に同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア域値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ  ｗｏｒｄ  ｓｃｏｒｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，前出）。これらの最初の近隣ワードヒットは、それらを含むＨＳＰｓを見出す検索を開始するための種として機能する。このワードヒットは、累積のアラインメントスコアが増加することができる限り、各配列に沿って両方向に拡大される。各方向のワードヒットの拡大は、以下の場合に停止される：１）累積のアラインメントスコアが、その最大達成値からＸ量低下する場合；２）１つ以上の負のスコア残基アラインメント（ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｃｏｒｉｎｇ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）の蓄積により、累積スコアが０以下になる場合；または３）いずれかの配列の末端に到達する場合。ＢｌａｓｔアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。Ｂｌａｓｔプログラムは、初期設定として、ワード長（Ｗ）が１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，８９，１０９１５−１０９１９参照、これは、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる）アラインメント（Ｂ）が５０、期待値（Ｅ）が１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を使用する。ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０，５８７３−５７８７、これは、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる）およびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴは、２つの配列間の類似度の統計解析を行う。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似度の１つの測定は、２つのヌクレオチド配列間の一致が偶然に生じる確立の指標を与える最小合計確立（ｓｍａｌｌｅｓｔ  ｓｕｍ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸と他の核酸の比較における最小合計確立が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は別の核酸と類似するとみなされる。
【００２４】
本明細書で使用されるとき、「遺伝子構築物」という用語は、タンパク質をコードする核酸配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を表す。コード配列は、この核酸分子が投与される個体の細胞において発現を指示することができる、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節要素と作動可能に連結された開始および終止シグナルを含む。
【００２５】
本明細書で使用されるとき、「発現できる型」という用語は、タンパク質をコードするコード配列と作動可能に連結した必須の調節配列を含む遺伝子構築物を表し、個体の細胞に存在する時、このコード配列は発現する。
【００２６】
免疫原によって誘導される細胞性免疫反応を高めるための多面的戦略から生じる改良型ワクチンを開示する。改変したコンセンサス配列を作製した。コドン最適化、ＲＮＡ最適化、および高効率な免疫グロブリンリーダー配列の付加を含む遺伝子改変も開示する。この新規の構築物を、対応するコドン最適化免疫原よりも強力で、広範な細胞性免疫反応を引き起こすように設計した。
【００２７】
改良型ＨＣＶワクチンは、抗ＨＣＶを誘導することができる免疫原として改良型ワクチンを特に効果的にさせるエピトープを有するタンパク質、およびエピトープを有するタンパク質をコードする遺伝子構築物に基づく。したがって、ワクチンは治療的または予防的に免疫反応を誘導し得る。いくつかの実施形態において、この免疫原を送達する手段には、ＤＮＡワクチン、組み換えワクチン、タンパク質サブユニットワクチン、この免疫原を含む組成物、弱毒化ワクチンまたは不活化ワクチンがある。いくつかの実施形態において、このワクチンは、以下を含む群から選択される組み合わせを含む：１つ以上のＤＮＡワクチン、１つ以上の組み換えワクチン、１つ以上のタンパク質サブユニットワクチン、この免疫原を含む１つ以上の組成物、１つ以上の弱毒化ワクチンおよび１つ以上の不活化ワクチン。
【００２８】
いくつかの実施形態によると、ワクチンが個体に送達され、この個体の免疫システムの活性を調節し、それによって、ＨＣＶに対する免疫反応が高まる。このタンパク質をコードする核酸分子がこの個体の細胞に取り込まれると、このヌクレオチド配列がこれらの細胞において発現し、それによって、このタンパク質が個体に送達される。プラスミドなどの核酸分子上のこのタンパク質のコード配列を、組み換えワクチンの一部としておよび弱毒化ワクチンの一部として、単離したタンパク質またはベクターのタンパク質部分として、送達する方法を提供する。
【００２９】
ＨＣＶに対して予防的および／または治療的に個体を免疫化する組成物ならびに方法を提供する。
【００３０】
この免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を送達するための組成物を、調節要素と作動可能に連結する。組成物には、この免疫原をコードするプラスミド、この免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えワクチン、本発明のタンパク質をコードするおよび／または本発明のタンパク質を含む弱毒化された生の病原体；本発明のタンパク質を含む不活化病原体；または本発明のタンパク質を含むリポソームもしくはサブユニットワクチンなどの組成物が含まれてもよい。本発明は、さらに、組成物を含む注射可能な医薬組成物に関する。
【００３１】
配列番号１は、ＨＣＶタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４ＡのＨＣＶ遺伝子型１ａ／１ｂコンセンサス免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む。配列番号１は、ＨＣＶタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４ＡのＨＣＶ遺伝子型１ａ／１ｂコンセンサス免疫原をコードするヌクレオチド配列に連結されたＩｇＥリーダー配列をさらに含む。配列番号２は、ＨＣＶタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４ＡのＨＣＶ遺伝子型１ａ／１ｂコンセンサス免疫原のアミノ酸配列を含む。配列番号２は、コンセンサス免疫原配列に連結されたＩｇＥリーダー配列をさらに含む。このＩｇＥリーダー配列は配列番号４であり、配列番号３によってコードされ得る。
【００３２】
いくつかの実施形態において、ワクチンは配列番号４、または配列番号４をコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、好ましくは、配列番号２または配列番号２をコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、好ましくは、配列番号１を含む。ワクチンは、好ましくは、配列番号４のＩｇＥリーダー配列またはこのＩｇＥリーダー配列をコードする核酸配列を含む。
【００３３】
配列番号１の断片は、９０以上のヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態において、配列番号１の断片は、１８０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、２７０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、３６０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、４５０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、５４０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、６３０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、７２０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、８１０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、９００以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、９９０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、１０８０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、１１７０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、１２６０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、１３５０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、１４４０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、１５３０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、１６２０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、１７１０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、１８００以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、１８９０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、１９８０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、２０７０以上のヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態において、配列番号１の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列を含んでもよい。いくつかの実施形態において、配列番号１の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列を含まない。配列番号１の断片は、１８０未満のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、２７０未満のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、３６０未満のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、４５０未満のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、５４０未満のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、６３０未満のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、６７５未満のヌクレオチドを含んでもよい。
【００３４】
配列番号２の断片は、３０以上のアミノ酸を含んでもよい。いくつかの実施形態において、配列番号２の断片は、６０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、９０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、１２０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、１５０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、１８０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、２１０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、２４０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、２７０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、３００以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、３３０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、３６０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、３９０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、４２０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、４５０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、４８０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、５１０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、５４０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、５７０以上のアミノ酸を、くつかの実施形態において、６００以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、６３０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、６６０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、６９０以上のアミノ酸を含んでもよい。配列番号２の断片は、９０未満のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、１２０未満のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、１５０未満のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、１８０未満のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、２１０未満のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、２４０未満のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、２７０未満のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、３００未満のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、３３０未満のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、３６０未満のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、３９０未満のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、４２０未満のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、４５０未満のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、４８０未満のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、５４０未満のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、６００未満のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、６６０未満のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、６９０未満のアミノ酸を含んでもよい。
【００３５】
配列番号５は、ＨＣＶタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４ＡのＨＣＶ遺伝子型１ａ／１ｂコンセンサス免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む。配列番号６は、ＨＣＶタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４ＡのＨＣＶ遺伝子型１ａ／１ｂコンセンサス免疫原のアミノ酸配列を含む。
【００３６】
配列番号５の断片は、９０以上のヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態において、配列番号５の断片は、１８０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、２７０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、３６０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、４５０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、５４０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、６３０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、７２０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、８１０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、９００以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、９９０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、１０８０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、１１７０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、１２６０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、１３５０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、１４４０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、１５３０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、１６２０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、１７１０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、１８００以上のヌクレオチドを含んでもよい。配列番号５の断片は、１８０未満のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、２７０未満のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、３６０未満のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、４５０未満のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、５４０未満のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、６３０未満のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、６７５未満のヌクレオチドを含んでもよい。
【００３７】
配列番号６の断片は、３０以上のアミノ酸を含んでもよい。いくつかの実施形態において、配列番号６の断片は、６０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、９０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、１２０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、１５０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、１８０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、２１０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、２４０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、２７０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、３００以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、３３０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、３６０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、３９０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、４２０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、４５０以上のアミノ酸を、いくつかの実施形態において、４８０以上のアミノ酸を含んでもよい。配列番号６の断片は、９０未満のアミノ断を、いくつかの実施形態において、１２０未満のアミノ断を、いくつかの実施形態において、１５０未満のアミノ断を、いくつかの実施形態において、１８０未満のアミノ断を、いくつかの実施形態において、２１０未満のアミノ断を、いくつかの実施形態において、２４０未満のアミノ断を、いくつかの実施形態において、２７０未満のアミノ断を、いくつかの実施形態において、３００未満のアミノ断を、いくつかの実施形態において、３３０未満のアミノ断を、いくつかの実施形態において、３６０未満のアミノ断を、いくつかの実施形態において、３９０未満のアミノ断を、いくつかの実施形態において、４２０未満のアミノ断を、いくつかの実施形態において、４５０未満のアミノ断を含んでもよい。
【００３８】
いくつかの実施形態によると、免疫原に対する免疫反応を個体において誘導する方法は、ＨＣＶタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４ＡのＨＣＶ遺伝子型１ａ／１ｂコンセンサス免疫原のアミノ酸配列、もしくはその機能的断片、またはその発現できるコード配列をこの個体に投与することを含む。いくつかの実施形態は、ＨＣＶタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４ＡのＨＣＶ遺伝子型１ａ／１ｂコンセンサス免疫原のアミノ酸配列またはその断片をコードする単離した核酸分子を含む。いくつかの実施形態は、ＨＣＶタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４ＡのＨＣＶ遺伝子型１ａ／１ｂコンセンサス免疫原のアミノ酸配列またはその断片をコードする組み換えワクチンを含む。いくつかの実施形態は、ＨＣＶタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４ＡのＨＣＶ遺伝子型１ａ／１ｂコンセンサス免疫原のアミノ酸配列またはその断片を含むサブユニットワクチンを含む。いくつかの実施形態は、ＨＣＶタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４ＡのＨＣＶ遺伝子型１ａ／１ｂコンセンサス免疫原のアミノ酸配列またはその断片を含む弱毒化生クチンおよび／または不活化ワクチンを含む。
【００３９】
改良型ワクチンは、抗ＨＣＶ免疫反応を誘導することができる免疫原として改良型ワクチンを特に効果的にさせるエピトープを有するタンパク質、およびエピトープを有するタンパク質をコードする遺伝子構築物を含む。したがって、治療的または予防的に免疫反応を誘導するために、ワクチンを提供することができる。いくつかの実施形態において、この免疫原を送達する手段には、ＤＮＡワクチン、組み換えワクチン、タンパク質サブユニットワクチン、この免疫原を含む組成物、弱毒化ワクチンまたは不活化ワクチンがある。いくつかの実施形態において、このワクチンは、以下を含む群から選択される組み合わせを含む：１つ以上のＤＮＡワクチン、１つ以上の組み換えワクチン、１つ以上のタンパク質サブユニットワクチン、この免疫原を含む１つ以上の組成物、１つ以上の弱毒化ワクチン、１つ以上の不活化ワクチン。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によると、ワクチンが個体に送達され、この個体の免疫システムの活性を調節し、それによって、免疫反応が高まる。このタンパク質をコードする核酸分子がこの個体の細胞に取り込まれると、このヌクレオチド配列がこれらの細胞において発現し、それによって、このタンパク質がこの個体に送達される。本発明の態様は、プラスミドなどの核酸分子上のこのタンパク質のコード配列を、組み換えワクチンの一部として、弱毒化ワクチンの一部として、単離したタンパク質またはベクターのタンパク質部分として、送達する方法を提供する。
【００４１】
本発明のいくつかの態様によると、予防的におよび／または治療的に個体を免疫化する組成物ならびに方法が提供される。
【００４２】
ＤＮＡワクチンは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，７３９，１１８号、同第５，８１７，６３７号、同第５，８３０，８７６号、同第５，９６２，４２８号、同第５，９８１，５０５号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号、同第５，６７６，５９４号、および本明細書で引用する優先出願に記載されており、これらは参照により本明細書に各々が組み込まれる。それらの出願に記載される送達プロトコールに加えて、ＤＮＡを送達する代替方法は、米国特許第４，９４５，０５０号および同第５，０３６，００６号に記載されており、これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる。
【００４３】
本発明は、改良型弱毒化生ワクチン、改良型不活化ワクチン、および抗原をコードする外来遺伝子を送達するために組み換えベクターを使用する改良型ワクチン、さらにサブユニットワクチンおよび糖たんぱく質ワクチンに関する。弱毒化生ワクチン、外来抗原を送達するために組み換えベクターを使用するワクチン、サブユニットワクチンおよび糖タンパク質ワクチンの例は、米国特許第４，５１０，２４５号、同第４，７９７，３６８号、同第４，７２２，８４８号、同第４，７９０，９８７号、同第４，９２０，２０９号、同第５，０１７，４８７号、同第５，０７７，０４４号、同第５，１１０，５８７号、同第５，１１２，７４９号、同第５，１７４，９９３号、同第５，２２３，４２４号、同第５，２２５，３３６号、同第５，２４０，７０３号、同第５，２４２，８２９号、同第５，２９４，４４１号、同第５，２９４，５４８号、同第５，３１０，６６８号、同第５，３８７，７４４号、同第５，３８９，３６８号、同第５，４２４，０６５号、同第５，４５１，４９９号、同第５，４５３，３６４号、同第５，４６２，７３４号、同第５，４７０，７３４号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４８２，７１３号、同第５，５９１，４３９号、同第５，６４３，５７９号、同第５，６５０，３０９号、同第５，６９８，２０２号、同第５，９５５，０８８号、同第６，０３４，２９８号、同第６，０４２，８３６号、同第６，１５６，３１９号および同第６，５８９，５２９号に記載されており、これらは参照により本明細書に各々が組み込まれる。
【００４４】
細胞に取り込まれると、この遺伝子構築物は、機能している染色体外分子としてこの細胞内に存在したままであってもよくおよび／またはこの細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれてもよい。ＤＮＡは細胞内に導入されてもよく、そこで、のプラスミドの形態の別々の遺伝物質として留まる。あるいは、染色体に組み込むことができる直鎖ＤＮＡを、この細胞に導入してもよい。この細胞にＤＮＡを導入する場合、染色体へのＤＮＡ組み込みを促進する薬剤を加えてもよい。組み込みを促進するのに有用なＤＮＡ配列が、このＤＮＡ分子に含まれてもよい。あるいは、ＲＮＡをこの細胞に投与してもよい。セントロメア、テロメアおよび複製開始点を含む直鎖ミニ染色体としてこの遺伝子構築物を提供することも考えられる。遺伝子構築物は、細胞内で生存する弱毒化された生の微生物または組み換え微生物ベクターの遺伝物質の一部のままであってもよい。遺伝子構築物は、組み換えウイルスワクチンのゲノムの一部であってもよく、ここで、この遺伝物質はこの細胞の染色体に組み込まれるかまたは染色体外に留まるかのいずれかである。遺伝子構築物は、核酸分子の遺伝子発現に必要な調節要素を含む。この要素は、プロモーター、開始コドン、終止コドン、およびポリアデニル化シグナルを含む。さらに、大抵、エンハンサーは、標的タンパク質または免疫調節タンパク質をコードする配列の遺伝子発現に必要とされる。これらの要素は、所望のタンパク質をコードする配列に作動可能に連結されること、およびこれらの調節要素は、これらが投与される個体において作動可能である必要がある。
【００４５】
開始コドンおよび終止コドンは、一般に、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部であると考えられる。しかし、これらの要素は、この遺伝子構築物が投与される個体において機能的である必要がある。開始および終止コドンはコード配列と共にフレームの中になければならない。
【００４６】
使用されるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルは、個体の細胞内で機能的でなければならない。
【００４７】
本発明を実行するのに、特にヒトの遺伝子ワクチンの産生において有用なプロモーターの例として、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、マウス乳ガンウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、例えばウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ最初期プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターならびにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンおよびヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子由来のプロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。
【００４８】
本発明を実行するのに、特にヒトの遺伝子ワクチンの産生において有用なポリアデニル化シグナルの例として、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびＬＴＲポリアデニル化シグナルが挙げられるが、それらに限定されない。特に、プラスミドｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）内のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルと称されるＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを使用する。
【００４９】
ＤＮＡ発現に必要な調節要素に加えて、他の要素もこのＤＮＡ分子の中に含まれてもよい。かかる追加の要素はエンハンサーを含む。このエンハンサーは、以下を含む群から選択されてもよいがそれらに限定されない：ヒトアクチンエンハンサー、ヒトミオシンエンハンサー、ヒトヘモグロビンエンハンサー、ヒト筋肉クレアチンエンハンサーおよびＣＭＶ、ＲＳＶおよびＥＢＶのエンハンサーなどのウイルスエンハンサー。
【００５０】
遺伝子構築物は、染色体外にこの遺伝子構築物を維持し、細胞内でこの構築物の複数のコピーを産生するために、哺乳類複製開始点が供給され得る。インビトロジェン（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のプラスミドｐＶＡＸ１、ｐＣＥＰ４およびｐＲＥＰ４は、組み込まれることなく、高コピーのエピソーム複製を行うエプスタイン・バーウイルス複製開始点および核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含む。
【００５１】
免疫化の適用に関連するいくつかの好ましい実施形態において、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および追加として、かかる標的タンパク質に対する免疫反応をさらに高めるタンパク質の遺伝子を含む１つ以上の核酸分子を送達する。かかる遺伝子の例として、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６ならびにシグナル配列が除去され、任意でＩｇＥのシグナルペプチドを含むＩＬ−１５を含むＩＬ−１５などの他のサイトカインおよびリンホカインをコードする遺伝子が挙げられる。有用であり得る他の遺伝子には、以下をコードする遺伝子が含まれる：ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌα、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異型、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２およびそれらの機能的断片。
【００５２】
何らかの理由で、この遺伝子構築物を受け取る細胞を除去することが望ましい場合、細胞破壊の標的として機能を果たす追加の要素を加えてもよい。発現できる型のヘルペスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を、この遺伝子構築物に含めることができる。薬剤ガンシクロビルをこの個体に投与することができ、かつこの薬剤は、ｔｋを産生する全細胞を選択的に死滅させ、したがって、この遺伝子構築物と共に細胞の選択的破壊のための手段を提供する。
【００５３】
タンパク質産生を最大限するため、この構築物が投与される細胞における遺伝子発現に十分に適した調節配列を選択してもよい。さらに、細胞内で最も効率的に転写されるコドンを選択してもよい。当業者は、細胞内で機能的なＤＮＡ構築物を作製することができる。
【００５４】
いくつかの実施形態において、本明細書記載のタンパク質のコード配列がＩｇＥシグナルペプチドに連結される核酸構築物が提供され得る。いくつかの実施形態において、本明細書記載のタンパク質は、ＩｇＥシグナルペプチドに連結される。
【００５５】
タンパク質が用いられるいくつかの実施形態において、例えば、当業者は、周知の技術を用いて、本発明のタンパク質を産生および単離することができる。タンパク質が用いられるいくつかの実施形態において、例えば、当業者は、周知の技術を用いて、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ分子を、周知の発現系で使用するために市販の発現ベクターに挿入することができる。例えば、市販のプラスミドｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるタンパク質産生のために使用してもよい。例えば、市販のプラスミドｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を、酵母のサッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株におけるタンパク質産生のために使用してもよい。例えば、市販のＭＡＸＢＡＣ（登録商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を昆虫細胞におけるタンパク質産生ために使用してもよい。例えば、市販のプラスミドｐｃＤＮＡ  ＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ）を、チャイニーズハムスター卵巣細胞などの哺乳類細胞におけるタンパク質産生のために使用してもよい。当業者は、通例の技術およびすぐに入手できる出発原料によりタンパク質を産生するために、これらの市販の発現ベクターおよび発現系または他のものを使用することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）参照、これらは参照により本明細書に組み込まれる）。従って、所望のタンパク質を原核細胞系および真核細胞系の両方において準備することができ、このタンパク質の一連のプロセシング型をもたらす。
【００５６】
当業者は、他の市販の発現ベクターおよび発現系を使用してもよく、または周知の方法およびすぐに入手できる出発原料を用いてベクターを産生してもよい。プロモーターおよびポリアデニル化シグナル、ならびに好ましくはエンハンサーなどの必須の制御配列を含む、様々な種類の宿主に対する発現系は、すぐに入手でき、当業者に知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）参照。遺伝子構築物は、この構築物がトランスフェクトされる細胞株において機能的なプロモーターと作動可能に連結されたタンパク質コード配列を含む。構成的プロモーターの例として、サイトメガロウイルスまたはＳＶ４０のプロモーターが挙げられる。誘導できるプロモーターの例として、マウス乳腺白血病ウイルスまたはメタロチオネインプロモーターが挙げられる。当業者は、すぐに入手できる出発物質から、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡで細胞をトランスフェクトするのに有用な遺伝子構築物を容易に作製することができる。このタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを用いて、適合性宿主を形質転換し、その後、外来ＤＮＡの発現が起こる条件下で培養し、維持する。
【００５７】
産生させたタンパク質を、必要に応じて、当業者に知られる方法で、これらの細胞を溶解することによって培養物から回収するか、または培地から回収した。当業者は、周知の方法を用いて、かかる発現系を用いて産生されるタンパク質を単離することができる。上記の特異的タンパク質と特異的に結合する抗体を用いて天然源からタンパク質を精製する方法を、組み換えＤＮＡ法によって産生されるタンパク質の精製に同様に適用してもよい。
【００５８】
組み換え技術によるタンパク質産生に加えて、自動化ペプチド合成機も使用して、本質的には純粋な単離されるタンパク質を産生してもよい。かかる技術は当業者に周知であり、置換を有する誘導体がＤＮＡコード化タンパク質産生に供給されない場合に有用である。
【００５９】
ＤＮＡ注射（ＤＮＡワクチンとも称される）、組み換えアデノウイルス、組み換えアデノウイルス関連ウイルスおよび組み換えワクシニアなどの組み換えベクターを含むいくつかの周知の技術のいずれかを用いて、これらの核酸分子を送達してもよい。
【００６０】
投与経路には、筋肉内経路、鼻腔内経路、腹腔内経路、皮内経路、皮下経路、静脈内経路、動脈内経路、眼球内経路、および経口経路、ならびに粘膜組織への吸入剤もしくは坐薬による、例えば、膣、直腸、尿道、頬および舌下の組織へ洗浄による局所的経路、経皮的経路が含まれるが、それらに限定されない。好ましい投与経路には、筋肉内注射、腹腔内注射、皮内注射および皮下注射が含まれる。遺伝子構築物は、電気穿孔の方法および装置、従来の注射器、無針注射器具、または「微粒子銃によって行われる銃撃」を含むがそれらに限定されない手段により投与されてもよい。
【００６１】
これらのＤＮＡワクチンの送達を促進するのに好ましい電気穿孔装置および電気穿孔法の例には、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈらにより出願された米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号（これらの内容は、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる）に記載される例が含まれる。３５ＵＳＣ１１９（ｅ）条の下、２００６年１０月１７日に出願された米国特許仮出願第６０／８５２，１４９号および２００７年１０月１０日に出願された米国特許仮出願第６０／９７８，９８２号の利益を主張する、２００７年１０月１７日に出願された同時係属で共同所有の米国特許出願第１１／８７４０７２号（これらの全ては、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる）に提供されるＤＮＡワクチンの送達を促進する電気穿孔装置および電気穿孔法も好ましい。
【００６２】
以下は、電気穿孔技術を用いた実施形態の例であり、上記で論じた特許参考文献により詳細に論じられる：電気穿孔装置は、使用者により事前に設定された電流入力と同じような定電流を生み出すエネルギーのパルスを、哺乳類の所望の組織へ送達するように配置され得る。電気穿孔装置は、電気穿孔構成要素および電極集合体またはハンドル集合体を含む。電気穿孔構成要素は、制御装置、電流波形発生器、インピーダンス試験器、波形自動記録装置、入力要素、状況報告要素、伝達ポート、記録構成要素、電源、および電源スイッチを含む電気穿孔装置の１つ以上の様々な要素を含むこと、および取り込むことができる。電気穿孔構成要素は、電気穿孔装置の１つの要素として機能することができ、他の要素は、電気穿孔構成要素と連通する別々の要素（または構成要素）である。いくつかの実施形態において、電気穿孔構成要素は、電気穿孔装置の２つ以上の要素として機能し得、それは電気穿孔構成要素から分離した電気穿孔装置のさらに他の要素と連通することができる。要素は１つの装置として、または互いに連通する別々の要素として機能することができるので、改良型ＨＣＶワクチンを送達するために電気穿孔技術を用いることは、１つの電気機械装置または機械装置の一部として存在する電気穿孔装置の要素に限定されない。電気穿孔構成要素は、所望の組織に定電流を生み出すエネルギーパルスを送達することができ、フィードバック機構を含む。電極集合体は、空間的配置に複数の電極を有する電極アレイを含み、電極集合体は、電気穿孔構成要素からエネルギーパルスを受け取り、電極を通して所望の組織にエネルギーパルスを送る。複数の電極の少なくとも１つは、エネルギーパルスの送達の間は中性で、所望の組織のインピーダンスを測定し、電気穿孔構成要素へそのインピーダンスを伝える。フィードバック機構は、測定されたインピーダンスを受け取ることができ、定電流を維持するために、電気穿孔構成要素により送達されたエネルギーパルスを調節することができる。
【００６３】
いくつかの実施形態において、複数の電極は、分散的パターンでエネルギーパルスを送達することができる。いくつかの実施形態において、複数の電極は、プログラムされた順番の下で、電極制御を介して分散的パターンでエネルギーパルスを送達することができ、使用者は、プログラムされた順番を電気穿孔構成要素に入力する。いくつかの実施形態において、プログラムされた順番は、順に送達された複数のパルスを含み、複数のパルスの各パルスは、インピーダンスを測定する１つの中性極と共に少なくとも２つの活性電極により送達され、複数のパルスの次のパルスは、インピーダンスを測定する１つの中性極と共に少なくとも２つの活性電極の別の１つによって送達される。
【００６４】
いくつかの実施形態において、フィードバック機構は、ハードウェアまたはソフトウェアのいずれかによって行われる。好ましくは、フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路によって行われる。好ましくは、このフィードバックは、毎５０μｓ、２０μｓ、１０μｓまたは１μｓで生じるが、好ましくはリアルタイムなフィードバックつまり瞬間的（すなわち、反応時間を決定するための利用できる技術によって決定されるような事実上の瞬間的）である。いくつかの実施形態において、中性電極は、所望の組織においてインピーダンスを測定し、そのインピーダンスをフィードバック機構へ伝達し、フィードバック機構はそのインピーダンスに応答し、事前設定電流と同じような値で定電流を維持するためにエネルギーパルスを調節する。いくつかの実施形態において、フィードバック機構は、エネルギーパルス送達の間、連続的に、瞬間的に定電流を維持する。
【００６５】
いくつかの実施形態において、この核酸分子を、ポリヌクレオチド機能的エンハンサーまたは遺伝子ワクチン促進剤と併用して、これらの細胞に送達する。ポリヌクレオチド機能的エンハンサーは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号および１９９４年１月２６日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９号に記載されており、これらは参照により本明細書に各々組み込まれる。遺伝子ワクチン促進剤は、１９９４年４月１日に提出された米国特許第０２１，５７９号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。核酸分子と併用して投与する助剤を、核酸分子の投与前後に、これらの核酸分子との混合物として投与するか、または別々に、同時に投与してもよい。さらに、トランスフェクション剤および／または複製剤および／または炎症性薬剤として機能し得、ＧＶＦと一緒に投与され得る他の薬剤には、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦ、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５などの増殖因子、サイトカインおよびリンホカイン、ならびに線維芽細胞増殖因子、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）などの表面活性剤、フロイント完全アジュバンド、モノホスホリルリピドＡ（ＷＬ）を含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体およびスクアレンスクアレンなどの小胞が含まれ、かつヒアルロン酸も、この遺伝子構築物と併用して投与するのに使用してもよい。いくつかの実施形態において、免疫調節タンパク質を、ＧＶＦとして使用してもよい。いくつかの実施形態において、送達および取り込みを高めるために、この核酸分子をＰＬＧと関連して提供する。
【００６６】
本発明による医薬組成物は、約１ｎｇ〜約２０００μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、本発明による医薬組成物は、約５ｎｇ〜約１０００μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、これらの医薬組成物は、約１０ｎｇ〜約８００μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、これらの医薬組成物は、約０．１〜約５００μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、これらの医薬組成物は、約１〜約３５０μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、これらの医薬組成物は、約２５〜約２５０μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、これらの医薬組成物は、約１００〜約２００μｇのＤＮＡを含む。
【００６７】
本発明による医薬組成物を、使用する投与方法に従って処方する。医薬組成物が注射可能な医薬組成物である場合において、注射可能な医薬組成物は無菌で、発熱物質も粒子も含まない。好ましくは、等張製剤を使用する。一般に、等張性の添加材には、塩化ナトリウム、Ｄ型グルコース、マンニトール、ソルビトールおよび乳糖が含まれ得る。場合によっては、リン酸緩衝食塩水などの等張液が好ましい。安定剤には、ゼラチンおよびアルブミンが含まれる。いくつかの実施形態において、血管収縮剤がこの製剤に加えられる。
【００６８】
本発明のいくつかの実施形態によると、免疫反応を誘導する方法が提供される。このワクチンは、タンパク質に基づく、弱毒化生ワクチン、細胞ワクチン、組み換えワクチンまたは核酸もしくはＤＮＡワクチンであってもよい。いくつかの実施形態において、粘膜免疫反応を誘導する方法を含む、免疫原に対する免疫反応を個体において誘導する方法は、ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質およびそれらの機能的断片またはそれらの発現できるコード配列のうちの１つ以上を、本発明のタンパク質をコードする単離した核酸分子および／または本発明のタンパク質をコードする組み換えワクチン、および／または本発明のタンパク質のサブユニットワクチンおよび／または弱毒化生ワクチンおよび／または不活化ワクチンと組み合わせて、この個体に投与することを含む。ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質およびそれらの機能的断片のうちの１つ以上を、免疫原をコードする単離した核酸分子；および／または免疫原をコードする組み換えワクチンおよび／または免疫原を含むサブユニットワクチンおよび／または弱毒化生ワクチンおよび／または不活化ワクチンの投与前に、それと同時に、またはその後に投与してもよい。いくつかの実施形態において、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣおよびそれらの機能的断片からなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードする単離した核酸分子を、この個体に投与する。
【００６９】
本発明は、以下の実施例においてさらに明らかにされる。この実施例は本発明の実施形態を示すが、単なる説明の目的で与えられるということが理解されるべきである。上記の議論およびこの実施例から、当業者は本発明の本質的特徴を突き止めることができ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な使用および条件に本発明を適用するために、本発明の様々な変更および改良を行うことができる。したがって、本明細書に示され、記載される改良に加えて、本発明の様々な改良は、先の記載から当業者に明らかになる。かかる改良は、添付の特許請求の範囲に入ることも意図される。
【００７０】
米国特許、米国特許出願、および本開示の中で引用される参考文献の各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００７１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、現在の感染者が１７億を超え、世界の人口のおおよそ３％に匹敵する、世界中を悩ます主要な健康問題である。ＨＣＶは、肝細胞に優先的に感染し、感染患者のうち７０％以下の肝臓の中で生き残ることができる。慢性感染患者の３０％以下が、ＨＣＶ感染の結果として進行性の肝疾患を発症し始め、このウイルスを世界中の肝移植の主要原因とさせている。現在、ＨＣＶに対するワクチンはない。多段階式アプローチを使用して、強力な細胞性免疫を誘導することができる、新規の遺伝子型１ａ／１ｂコンセンサスＨＣＶ  ＮＳ３／ＮＳ４ＡＤＮＡワクチンを開発した。この構築物は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびアカゲザルにおいて、強力な抗ＮＳ３／ＮＳ４ＡのＴ細胞反応を誘導することができる。
【００７２】
材料および方法
ＮＳ３／ＮＳ４ＡのＨＣＶ遺伝子型１ａ／１ｂコンセンサス配列の作製
ＮＳ３のコンセンサス配列を、１５個の異なる遺伝子型１ａ配列および２６個の異なる遺伝子型１ｂ配列から作製した。ＮＳ４Ａのコンセンサス配列を、１５個の異なる遺伝子型１ａ配列および１９個の異なるＨＣＶ遺伝子型１ｂ配列から作製した。これらの配列を、標本誤差を避けるために複数の国々から選んだＧｅｎＢａｎｋから入手し、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ（ｖｅｒｓｉｏｎ  １．８）ソフトウェアを用いて整列させ、最終のＮＳ３／ＮＳ４Ａコンセンサス配列を作製した。
【００７３】
ＮＳ３／ＮＳ４Ａコンセンサス配列の追加的改変
コンセンサスＮＳ３／ＮＳ４Ａ配列を、ＩｇＥリーダー配列、細胞内タンパク質分解の切断部位およびＣ末端ＨＡタグを付加することによりさらに改変した（図１）。ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）（ＧＥＮＥＡＲＴ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、この最終配列をコドンおよびＲＮＡ最適化した。
【００７４】
ＨＣＶのＮＳ３／ＮＳ４ＡのＤＮＡ免疫原
最終のコンセンサスＮＳ３／ＮＳ４Ａ融合遺伝子（ＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａ）を合成し、ＧＥＮＥＡＲＴ（Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、配列を検証した。ＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４ＡをＢａｍＨ１およびＮｏｔ１で消化し、ＣＭＶプロモーターの制御下の臨床用発現ベクターｐＶＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。この最終構築物をｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａと命名した。
【００７５】
免疫蛍光法
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造業者の指針に従い、Ｈｕｈ７．０細胞をｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａで一過的にトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後、これらの細胞を透過処理し、この融合構築物のＣ末端ＨＡタグに対するマウスモノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、続いて、ＴＲＩＴＣ結合ヤギ抗マウス２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、タンパク質発現を調べた。
【００７６】
マウス試験
免疫化／電気穿孔
メスの６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスをジャクソン研究所から購入し、米国国立衛生研究所およびペンシルベニア大学の動物の施設保護および使用に関する委員会（ＩＡＣＵＣ）の指針に従って飼育した。
【００７７】
このマウスを１群あたり３匹のマウスに分け、ｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａまたは空の発現ベクターｐＶＡＸ（陰性対照）のいずれかで免疫化した。各マウスに、２週間の間隔をあけて、３回の筋肉内注射を行った。各筋肉注射後、２６ゲージのステンレス鋼電極から成る３つの電極アレイを筋肉に穏やかに挿入し、短方形波の定電流ＥＫＤを施した。
【００７８】
脾細胞の単離
３回目の免疫化の１週間後にこれらのマウスを屠殺し、グループごとにそれらの脾臓を貯蔵した。Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ  ｍａｃｈｉｎｅを用いて、これらの脾臓を粉砕し、得られた産物を４０μＭの細胞濾過器に通過させ、これらの脾細胞を単離した。これらの細胞を、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）で５分間処理し、ＲＢＣを除去した。脾細胞の溶解後、１０％ＦＢＳを加えたＲＰＭＩ培地に再懸濁した。血球計を用いて、細胞数を測定した。
【００７９】
ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ
マウスＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイを、以前に記載されたように行った（Ｙａｎ．，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＨＩＶ−１  ｓｕｂｔｙｐｅ  Ｂ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，２００７．１５（２）：ｐ．４１１−２１）。ｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａタンパク質の８個のアミノ酸が重複し、そのタンパク質の全長に及ぶ１５ｍｅｒのペプチドの５種類の異なるプールで、脾細胞を刺激した。これらのペプチドをインビトロジェン社が合成し、１ペプチドあたり２μｇ／ｍｌの濃度で保存した。１ウェルあたり２００，０００細胞の濃度でこれらの脾細胞を蒔き、スポット形成単位（ＳＦＵ）の平均数を、グラフ化の目的のために、１×１０６脾細胞に調製した。
【００８０】
エピトープの地図作成
これらの１５ｍｅｒの重複ペプチドを２１種類の別々のプールの中で貯蔵し、それぞれのペプチドはこれらの２１種類のプールのうちの２つのプールに含まれる。その後、上記のＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、脾細胞を各プールで刺激した。
【００８１】
アカゲザル試験
試験設計および免疫化
実験動物の管理および使用の指針に従って、インド生まれの合計５匹のアカゲザルを使用し、飼育した。プラスミドを調製し、ＨＰＬＣ精製し（ＶＧＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｍｍｕｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）、１％（重量／重量）ポリ−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム塩（ＭＷ＝１０．５ｋＤａ）（Ｓｉｇｍａ）で調製した滅菌水で希釈した。
【００８２】
これらのアカゲザルに筋肉注射を行い、続いて、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）適応性定電流電気穿孔装置および電極アレイを用いて電気穿孔を行った。０．７５ｍｌ量の中の１ｍｇのｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａを各々のサルに注射し、続いて、０．５アンペアの定電流で、各々１秒間空けて、５２ｍ秒の長さのパルスを３回与えた。各々のサルを、４週間の間隔を空けて、２回免疫化した。
【００８３】
血液採取およびＰＢＭＣ単離
最初の免疫化の前に１度および各免疫化の２週間後に、これらのアカゲザルの採血を行った。これらの動物を、ケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ）およびアセプロマジン（０．１ｍｇ／ｋｇ）の混合物で麻酔した。血液をＥＤＴＡ試験管に採取し、標準的なフィコール・ハイパック密度勾配遠心分離法を用いて、ＰＢＭＣを単離した。単離したＰＢＭＣを完全培地（２ｍＭ／ＬのＬ−グルタミン、１０％熱失活ＦＢＳ、１×抗生物質／抗真菌剤、および５５μＭ／Ｌのβ−メルカプトエタノールを加えたＲＰＭＩ  １６４０）に再懸濁した。
【００８４】
ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイを、スウェーデンのマブテック社（ＭａｂＴｅｃｈ）の検出抗体および捕捉抗体を用いて、以前に記載されたように行った（Ｂｏｙｅｒ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，ＳＩＶ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ＩＬ−１２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ＣＤ８  ＳＩＶ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｐｒｉｍａｔｏｌ，２００５．３４（５−６）：ｐ．２６２−７０）。
【００８５】
結果
ＨＣＶ構造タンパク質ＮＳ３／ＮＳ４Ａの新規ＨＣＶ遺伝子型１ａ／１ｂコンセンサス融合免疫原の構築
ＨＣＶの高変異率により、様々なウイルス株に対する防御のためだけでなく、ウイルスのエスケープ変異体に対する保護による慢性感染患者における制御を維持するために、複数の免疫標的部位を有する免疫原の設計が重要である。ワクチンとの関連でコンセンサス免疫原を使用することは、天然の免疫原のみを有するワクチンと比較して、より広範な免疫反応を引き起こすことができる可能性があることを、以前の研究結果は報告している。これらの研究結果に基づき、ＮＳ３／ＮＳ４Ａタンパク質に対する免疫反応の幅を拡大させることを期待して、ＨＣＶ遺伝子型１ａ／１ｂのＮＳ３／ＮＳ４Ａコンセンサス配列をコードする構築物を設計した。このコンセンサス配列を、ＧｅｎＢａｎｋから入手した合計７５種類の異なる配列から作製した。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ（ｖｅｒｓｉｏｎ  １．８）ソフトウェアを用いて、単一のコンセンサス配列を作製するのに必要とされる複数のアラインメントを作成した（図１）。
【００８６】
図２に示すように、このコンセンサス免疫原をさらに改変し、発現および免疫原性を増加させた。ＮＳ３タンパク質の安定性、発現および免疫原性を高める能力について報告されたことにより、ＮＳ４Ａをこの構築物の中に含めた（Ｆｒｅｌｉｎ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｏｗ  ｄｏｓｅ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｇｕｎ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ（ＮＳ）３  ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＮＳ４Ａ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ＮＳ３／４Ａ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，２００３．１０（８）：ｐ．６８６−９９；Ｗｏｌｋ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ，ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ  ｔｒａｎｓ−ｃｌｅａｖａｇｅ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ＮＳ３−ＮＳ４Ａ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，２０００．７４（５）：ｐ．２２９３−３０４；Ｔａｎｊｉ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＳ４Ａ  ｈａｓ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｖｉｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，１９９５．６９（３）：ｐ．１５７５−８１）。正確な折りたたみ、およびより有効なＣＴＬプロセシングを確実にするために、２つのタンパク質配列間に、細胞内タンパク質分解の切断部位を導入した。さらに、この構築物の発現をさらに高めるために、ＩｇＥリーダー配列を、ＮＳ３タンパク質の開始コドンの上流に結合させ、この構築物全体を、ヒトにおける発現のためにコドンおよびＲＮＡ最適化を行った。遺伝子工学処理して合成した最終のＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａ遺伝子は２１６９塩基長であり、ＢａｍＨ１およびＮｏｔ１制限酵素部位を用いて、臨床用の発現ベクターｐＶＡＸにサブクローニングした。
【００８７】
ｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａの発現
Ｈｕｈ７．０細胞株をｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａで一過的トランスフェクションすることにより、ｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａの発現を確認した（図３）。翻訳されたタンパク質を、この構築物のＣ末端ＨＡタグに対するモノクローナル抗体で検出し、免疫蛍光法を用いて視覚化した。陰性対照として、細胞を空のｐＶＡＸベクターでも一過的にトランスフェクトし、モノクローナル抗ＨＡ抗体で染色した。
【００８８】
ｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４ＡでのＣ５７ＢＬ／６マウスの免疫化は、強力な細胞性ＮＳ３およびＮＳ４Ａ特異的免疫反応を誘導する。
ｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａが、マウスにおいて細胞性免疫反応を誘導することができるかどうかを調べるために、ｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａの発現の確認後、マウスをこの構築物で筋肉注射により免疫化し、続いて、電気穿孔を行った。４種類の異なる投与量のｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａを用いて、Ｃ５７ＢＬ／６を３回免疫化した。これらのマウスを３回目の免疫化の１週間後に屠殺し、ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて、この構築物に対する細胞性免疫反応を測定した。ｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａの８個のアミノ酸が重複し、その配列に及ぶ１５ｍｅｒのペプチドの５種類のプールで、ワクチン接種したマウスの脾細胞を刺激した。図４Ａに示すように、ｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａは、投与量に関わらず、強い細胞性免疫反応を誘導することができる。
【００８９】
次に、基質エピトープの地図作成技術を用いて、ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、ｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａの主要エピトープを同定した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａの主要エピトープを、ＮＳ３タンパク質のＣ末端近傍に位置するペプチド８９（ＬＹＲＬＧＡＶＱＮＥＶＴＬＴＨ（配列番号９））に位置付けた（図４Ｂ）。このことは、ペプチド８９の中に含まれるＧＡＶＱＮＥＶＴＨ（配列番号１０）の９個のアミノ酸配列を、主要Ｈ−２ｂ  ＣＴＬエピトープと同定した以前の研究により支持される。この発見は、発明者らのコンセンサス免疫原の正常で効果的なプロセシングを主張する。
【００９０】
ｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａでのアカゲザルの免疫化は、強力な細胞性ＮＳ３およびＮＳ４Ａ特異的免疫反応を誘導する。
小動物モデルにおいては免疫原性があるが、より大きな動物に進んだ場合、一般的に、ＤＮＡワクチンは有効性を失った。しかし、ｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａによって引き起こされるマウスにおける強力な細胞性免疫反応に促されたため、発明者らはより大きな動物モデルにおけるこの構築物の免疫原性を試験することを決めた。アカゲザルを、ＩＭ／ＥＰによりｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａで、４週間の間隔を空けて、２回免疫化した（図５Ａ）。最初の免疫化の前に１度および各免疫化の２週間後に、これらの動物の採血を行った。これらの動物のｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａに対する免疫反応をＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて調べた。図５Ｂに、３つの時点のそれぞれについて、全５種類のペプチドプールに対する各サルの反応および平均の群の反応のまとめを示す。細胞性免疫反応は、免疫化前の採血と最初の免疫化の後には検出できなかったが、２回目の免疫化後に、これらの反応は、平均５５５＋／−２８０  ＳＦＵ／１０６ＰＢＭＣにまで劇的に増加した。したがって、わずか２回の免疫化後に、ｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａは、確実なＮＳ３およびＮＳ４特異的な細胞性免疫反応を引き起こすことができた。
【００９１】
ｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａは、アカゲザルにおいて広範な細胞性免疫反応を引き起こす。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける免疫化とは異なり、免疫反応の大部分は、単一ペプチドプールの中に含まれるｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａの１つの主要なエピトープに向けられ、免疫化されたサルの大部分（５匹中４匹）は、ｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａの少なくとも２つ以上のペプチドプールに対して、強力な細胞性免疫反応を引き起こすことができた（図６）。さらなるエピトープ地図作成試験を計画するが、このことは、アカゲザルはＮＳ３／ＮＳ４Ａタンパク質内の複数の部位に対して細胞性免疫反応を引き起こすことができたことを示唆する。したがって、アカゲザルにおいて、ｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａのコンセンサス配列は、ＮＳ３／ＮＳ４Ａタンパク質に対する強力で、広範な細胞性免疫反応を引き起こすことができる。
【００９２】
考察
急性感染から回復するＨＣＶ感染患者は、初期の、多特異性ＣＤ４＋ヘルパーおよびＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞反応を開始することができると知られている。ＨＣＶ特異的ＣＴＬ反応は、慢性感染患者におけるウイルス複製の制御に重要であることも報告された（Ｒｅｈｅｒｍａｎｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，１９９６．９８（６）：ｐ．１４３２−４０；Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９７．１５８（３）：ｐ．１４７３−８１）。さらに具体的には、このウイルスの構造タンパク質、特にＮＳ３タンパク質に対する強力なＴ細胞反応は、急性感染のクリアランスと重要な関連があることが報告された。ＨＣＶウイルスの高変異率により、ＮＳ３などのこのウイルスの比較的保存された構造タンパク質は、Ｔ細胞に基づくワクチンに対して魅力的な候補である。
【００９３】
ＤＮＡワクチンは、強力なＴ細胞反応を引き起こすのに十分適している。Ｔｈ２反応を生み出す傾向にある組み換えタンパク質での免疫化とは異なり、抗原の細胞内送達および細胞内プロセシングの能力により、ＤＮＡワクチンは強力なＴｈ１反応を誘導することができる。さらに、理論上、ＤＮＡワクチンは無制限の追加免疫能力を有し、組み換えウイルスベクターを用いた場合のような、プラスミドに対する中和抗体の誘導を心配することなく、望むだけ頻繁に再投与することができる。
【００９４】
急性感染のクリアランスおよび慢性感染の制御におけるＮＳ３特異的Ｔ細胞反応の重要性およびＤＮＡ免疫化の明確な利点により、ＨＣＶタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４Ａの遺伝子型１ａおよび１ｂのコンセンサス配列をコードする新規ＨＣＶ  ＤＮＡワクチン（ｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａ）を作製した。ＤＮＡワクチンは、小動物において、強力な細胞性免疫反応を引き起こすことができるが、より大きな動物モデルに導入する場合、臨床環境へのＤＮＡワクチンの採用に対する重大な障害は、プラットフォームとなる免疫原性の減少であった。したがって、発明者らの構築物の有効性を改善するために、その設計および投与の両方において、コドンおよびＲＮＡ最適化、ＩｇＥリーダー配列の付加、および電気穿孔法を用いたこの構築物の投与を含む多段階アプローチを採用した；これらの改良が、ＤＮＡワクチンの発現および免疫原性を増加させることが証明された。
【００９５】
しかし、ＨＣＶの高変異率により、この免疫原の中の複数部位を標的とする強力でありかつ広範な細胞性免疫反応を引き起こすことができる構築物は、様々なこのウイルス株に対する免疫力をさらにいっそう促進することができ、かつ、ウイルスのエスケープ変異体に対する保護により、感染患者においてこのウイルスをさらに制御することができる可能性がある。以前の研究は、１つのコンセンサス免疫原を作製するために、複数の配列を組込むことが、より広範な免疫反応生み出すことができると報告している。したがって、発明者らの構築物設計の一部として、１つのコンセンサス免疫原を作製するために、発明者らは、ＮＳ３／ＮＳ４Ａタンパク質の７５種類の異なるＨＣＶ遺伝子型１ａ／１ｂ配列を組込んだ。
【００９６】
構築物ｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａを細胞培養で発現させ、３回の免疫化後に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて強力なＮＳ３およびＮＳ４特異的Ｔ細胞反応を誘導することができ、わずか２回の免疫化後に、より大きな動物であるアカゲザルにおいて、強力でありかつ広範なＮＳ３およびＮＳ４Ａ特異的Ｔ細胞反応を引き起こすことができる。実際、ＮＳ３特異的免疫反応を観察するわずか２回のＤＮＡワクチン試験のうちの１つが、アカゲザルにおいて誘導した。両方の試験は、同様の配列最適化法、プラスミド送達システムおよび同一のワクチン接種スケジュールを用いるが、動物を５ｍｇのＤＮＡにより３回免疫化した以前の試験と比較して、この構築物は、より低い免疫化および１／５量のＤＮＡで、非常に高いＮＳ３特異的免疫反応を誘導することができた（Ｃａｐｏｎｅ，  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｇｅｎｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ａ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００６．１７７（１０）：ｐ．７４６２−７１）。さらに、ｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａは、アカゲザルにおいて広範な反応を引き起こすことができる。１つのペプチドプールの中に含まれる１つの主要なエピトープに反応したＣ５７ＢＬ／６マウスとは異なり、大多数のアカゲザルが、複数のペプチドプールに対して強力な細胞性免疫反応を引き起こすことができたことは、これらのサルが、ｐＣｏｎＮＳ３／ＮＳ４Ａの中の複数のエピトープに対する反応を開始することができることを示唆する。
（配列表）
配列番号１
GGTACCGGATCCGCCACCATGGACTGGACCTGGATTCTGTTCCTCGTGGCTGCTGCTACAAGAGTGCACAGCGCCCCCATCACCGCCTACGCCCAGCAGACCAGGGGCCTGCTGGGCTGCATCATCACCAGCCTGACCGGCAGGGACAAGAACCAGGTGGAGGGCGAGGTGCAGGTGGTGTCCACCGCCACCCAGAGCTTTCTGGCCACCTGCATCAACGGCGTGTGCTGGACCGTGTACCATGGAGCCGGCAGCAAGACCCTGGCCGGACCCAAGGGCCCCATCACCCAGATGTACACCAACGTGGATCAGGATCTGGTCGGGTGGCCTGCCCCTCCTGGCGCCAGAAGCCTGACCCCCTGCACCTGCGGCAGCAGCGACCTGTACCTGGTGACCCGGCACGCCGACGTGATCCCCGTGCGGCGGAGAGGCGATTCCCGGGGCAGCCTGCTGTCCCCCAGGCCCATCAGCTACCTGAAGGGCAGCAGCGGCGGACCCCTGCTGTGCCCTAGCGGCCACGCCGTGGGCATCTTCAGAGCCGCCGTGTGCACCAGGGGCGTGGCCAAGGCCGTGGACTTCATCCCCGTGGAGAGCATGGAAACCACCATGCGGAGCCCCGTGTTCACCGACAACAGCAGCCCCCCAGCTGTGCCCCAGACCTTCCAGGTGGCACATCTGCACGCCCCTACCGGCAGCGGCAAGAGCACCAAGGTGCCAGCCGCCTATGCCGCCCAGGGCTACAAGGTGCTGGTGCTGAACCCCTCCGTCGCTGCTACACTGGGCTTCGGCGCCTACATGAGCAAGGCCCACGGCATCGACCCCAACATCCGGACCGGCGTGCGGACCATCACCACAGGCGCCCCTATCACATACAGCACCTACGGCAAGTTTCTGGCCGACGGCGGCTGTAGCGGCGGAGCCTACGACATCATCATCTGCGACGAGTGCCACAGCACCGACTCCACCTCCATCCTGGGCATCGGCACCGTGCTGGACCAGGCCGAGACCGCCGGAGCCAGACTGGTGGTGCTGGCCACCGCCACACCCCCTGGCAGCGTGACCGTGCCCCACCCCAATATCGAGGAAGTGGCCCTGAGCAACACCGGCGAGATCCCTTTCTACGGCAAGGCCATCCCCATCGAGGCCATCAAGGGCGGCAGGCACCTGATCTTTTGCCACAGCAAGAAGAAGTGCGACGAGCTGGCCGCCAAGCTGTCCGCCCTGGGCCTGAACGCCGTGGCCTACTACCGGGGCCTGGACGTGAGCGTGATCCCCACCTCCGGCGACGTGGTCGTGGTCGCCACAGACGCCCTGATGACCGGCTTCACCGGCGACTTCGACAGCGTGATCGACTGCAACACCTGCGTGACCCAGACCGTGGATTTCAGCCTGGACCCCACCTTCACCATCGAGACCACCACCGTGCCTCAGGACGCCGTGAGCAGAAGCCAGCGGAGGGGCCGGACCGGCAGAGGCAGGCCCGGCATCTACCGGTTCGTGACCCCTGGCGAGCGGCCCAGCGGCATGTTCGACAGCAGCGTGCTGTGCGAGTGCTACGACGCCGGCTGCGCTTGGTATGAGCTGACCCCTGCCGAGACCAGCGTGCGGCTGCGGGCCTACCTGAACACCCCAGGCCTGCCCGTGTGCCAGGACCACCTGGAATTCTGGGAGAGCGTGTTTACCGGCCTGACCCACATCGACGCCCACTTTCTGAGCCAGACCAAGCAGGCCGGCGACAACTTCCCCTACCTGGTGGCCTACCAGGCCACCGTGTGCGCCAGAGCCCAGGCCCCTCCCCCCAGCTGGGACCAGATGTGGAAGTGCCTGATCCGGCTGAAGCCCACCCTGCACGGCCCAACCCCCCTGCTGTACCGGCTGGGCGCCGTGCAGAACGAGGTGACCCTGACCCACCCTATCACCAAGTACATCATGGCCTGCATGAGCGCCGACCTGGAAGTGGTGACCAGAGGCCGGAAGCGGAGAAGCAGCACCTGGGTGCTCGTCGGCGGAGTGCTGGCTGCTCTCGCCGCCTACTGCCTGACCACCGGCAGCGTGGTGATCGTGGGCCGGATCGTGCTGTCCGGCAAGCCCGCCATCATCCCCGACCGGGAGGTGCTGTACCAGGAATTCGACGAAATGGAAGAGTGCTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCTGATGAGCGGCCGCGAGTCT
配列番号２
MDWTWILFLVAAATRVHSAPITAYAQQTRGLLGCIITSLTGRDKNQVEGEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTVYHGAGSKTLAGPKGPITQMYTNVDQDLVGWPAPPGARSLTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSSGGPLLCPSGHAVGIFRAAVCTRGVAKAVDFIPVESMETTMRSPVFTDNSSPPAVPQTFQVAHLHAPTGSGKSTKVPAAYAAQGYKVLVLNPSVAATLGFGAYMSKAHGIDPNIRTGVRTITTGAPITYSTYGKFLADGGCSGGAYDIIICDECHSTDSTSILGIGTVLDQAETAGARLVVLATATPPGSVTVPHPNIEEVALSNTGEIPFYGKAIPIEAIKGGRHLIFCHSKKKCDELAAKLSALGLNAVAYYRGLDVSVIPTSGDVVVVATDALMTGFTGDFDSVIDCNTCVTQTVDFSLDPTFTIETTTVPQDAVSRSQRRGRTGRGRPGIYRFVTPGERPSGMFDSSVLCECYDAGCAWYELTPAETSVRLRAYLNTPGLPVCQDHLEFWESVFTGLTHIDAHFLSQTKQAGDNFPYLVAYQATVCARAQAPPPSWDQMWKCLIRLKPTLHGPTPLLYRLGAVQNEVTLTHPITKYIMACMSADLEVVTRGRKRRSSTWVLVGGVLAALAAYCLTTGSVVIVGRIVLSGKPAIIPDREVLYQEFDEMEECYPYDVPDYA
配列番号３
GGTACCGGATCCGCCACCATGGACTGGACCTGGATTCTGTTCCTCGTGGCTGCTGCTACAAGAGTGCACAGC
配列番号４
MDWTWILFLVAAATRVHS
配列番号５
GCCCCCATCACCGCCTACGCCCAGCAGACCAGGGGCCTGCTGGGCTGCATCATCACCAGCCTGACCGGCAGGGACAAGAACCAGGTGGAGGGCGAGGTGCAGGTGGTGTCCACCGCCACCCAGAGCTTTCTGGCCACCTGCATCAACGGCGTGTGCTGGACCGTGTACCATGGAGCCGGCAGCAAGACCCTGGCCGGACCCAAGGGCCCCATCACCCAGATGTACACCAACGTGGATCAGGATCTGGTCGGGTGGCCTGCCCCTCCTGGCGCCAGAAGCCTGACCCCCTGCACCTGCGGCAGCAGCGACCTGTACCTGGTGACCCGGCACGCCGACGTGATCCCCGTGCGGCGGAGAGGCGATTCCCGGGGCAGCCTGCTGTCCCCCAGGCCCATCAGCTACCTGAAGGGCAGCAGCGGCGGACCCCTGCTGTGCCCTAGCGGCCACGCCGTGGGCATCTTCAGAGCCGCCGTGTGCACCAGGGGCGTGGCCAAGGCCGTGGACTTCATCCCCGTGGAGAGCATGGAAACCACCATGCGGAGCCCCGTGTTCACCGACAACAGCAGCCCCCCAGCTGTGCCCCAGACCTTCCAGGTGGCACATCTGCACGCCCCTACCGGCAGCGGCAAGAGCACCAAGGTGCCAGCCGCCTATGCCGCCCAGGGCTACAAGGTGCTGGTGCTGAACCCCTCCGTCGCTGCTACACTGGGCTTCGGCGCCTACATGAGCAAGGCCCACGGCATCGACCCCAACATCCGGACCGGCGTGCGGACCATCACCACAGGCGCCCCTATCACATACAGCACCTACGGCAAGTTTCTGGCCGACGGCGGCTGTAGCGGCGGAGCCTACGACATCATCATCTGCGACGAGTGCCACAGCACCGACTCCACCTCCATCCTGGGCATCGGCACCGTGCTGGACCAGGCCGAGACCGCCGGAGCCAGACTGGTGGTGCTGGCCACCGCCACACCCCCTGGCAGCGTGACCGTGCCCCACCCCAATATCGAGGAAGTGGCCCTGAGCAACACCGGCGAGATCCCTTTCTACGGCAAGGCCATCCCCATCGAGGCCATCAAGGGCGGCAGGCACCTGATCTTTTGCCACAGCAAGAAGAAGTGCGACGAGCTGGCCGCCAAGCTGTCCGCCCTGGGCCTGAACGCCGTGGCCTACTACCGGGGCCTGGACGTGAGCGTGATCCCCACCTCCGGCGACGTGGTCGTGGTCGCCACAGACGCCCTGATGACCGGCTTCACCGGCGACTTCGACAGCGTGATCGACTGCAACACCTGCGTGACCCAGACCGTGGATTTCAGCCTGGACCCCACCTTCACCATCGAGACCACCACCGTGCCTCAGGACGCCGTGAGCAGAAGCCAGCGGAGGGGCCGGACCGGCAGAGGCAGGCCCGGCATCTACCGGTTCGTGACCCCTGGCGAGCGGCCCAGCGGCATGTTCGACAGCAGCGTGCTGTGCGAGTGCTACGACGCCGGCTGCGCTTGGTATGAGCTGACCCCTGCCGAGACCAGCGTGCGGCTGCGGGCCTACCTGAACACCCCAGGCCTGCCCGTGTGCCAGGACCACCTGGAATTCTGGGAGAGCGTGTTTACCGGCCTGACCCACATCGACGCCCACTTTCTGAGCCAGACCAAGCAGGCCGGCGACAACTTCCCCTACCTGGTGGCCTACCAGGCCACCGTGTGCGCCAGAGCCCAGGCCCCTCCCCCCAGCTGGGACCAGATGTGGAAGTGCCTGATCCGGCTGAAGCCCACCCTGCACGGCCCAACCCCCCTGCTGTACCGGCTGGGCGCCGTGCAGAACGAGGTGACCCTGACCCACCCTATCACCAAGTACATCATGGCCTGCATGAGCGCCGACCTGGAAGTGGTGACCAGAGGCCGGAAGCGGAGAAGCAGCACCTGGGTGCTCGTCGGCGGAGTGCTGGCTGCTCTCGCCGCCTACTGCCTGACCACCGGCAGCGTGGTGATCGTGGGCCGGATCGTGCTGTCCGGCAAGCCCGCCATCATCCCCGACCGGGAGGTGCTGTACCAGGAATTCGACGAAATGGAAGAGTGCTACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCTGATGAGCGGCCGCGAGTCT
配列番号６
APITAYAQQTRGLLGCIITSLTGRDKNQVEGEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTVYHGAGSKTLAGPKGPITQMYTNVDQDLVGWPAPPGARSLTPCTCGSSDLYLVTRHADVIPVRRRGDSRGSLLSPRPISYLKGSSGGPLLCPSGHAVGIFRAAVCTRGVAKAVDFIPVESMETTMRSPVFTDNSSPPAVPQTFQVAHLHAPTGSGKSTKVPAAYAAQGYKVLVLNPSVAATLGFGAYMSKAHGIDPNIRTGVRTITTGAPITYSTYGKFLADGGCSGGAYDIIICDECHSTDSTSILGIGTVLDQAETAGARLVVLATATPPGSVTVPHPNIEEVALSNTGEIPFYGKAIPIEAIKGGRHLIFCHSKKKCDELAAKLSALGLNAVAYYRGLDVSVIPTSGDVVVVATDALMTGFTGDFDSVIDCNTCVTQTVDFSLDPTFTIETTTVPQDAVSRSQRRGRTGRGRPGIYRFVTPGERPSGMFDSSVLCECYDAGCAWYELTPAETSVRLRAYLNTPGLPVCQDHLEFWESVFTGLTHIDAHFLSQTKQAGDNFPYLVAYQATVCARAQAPPPSWDQMWKCLIRLKPTLHGPTPLLYRLGAVQNEVTLTHPITKYIMACMSADLEVVTRGRKRRSSTWVLVGGVLAALAAYCLTTGSVVIVGRIVLSGKPAIIPDREVLYQEFDEMEEC
配列番号７
TACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCCTGA
配列番号８
YPYDVPDYA
配列番号９
LYRLGAVQNEVTLTH  
配列番号１０
GAVQNEVTH
【図１】
0005753090.tif 000002
【図２】
0005753090.tif 000003
【図３】
0005753090.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図６】
0005753090.tif 000007
【配列表】
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