(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式１または２を含む抗菌ペプチド重合体、および前記重合体に連結された細胞表面発現母体を含む、抗菌ペプチド多重合体。
式（１）：Ｎ末端−［抗菌ペプチド−ペプシン切断アミノ酸リンカー］−Ｃ末端
式（２）：Ｎ末端−［ペプシン切断アミノ酸リンカー−抗菌ペプチド］−Ｃ末端
ただし、前記抗菌ペプチドは、ペプシン切断アミノ酸リンカーとは異なるアミノ酸からなり、
前記ペプシン切断アミノ酸リンカーは、ロイシン、フェニルアラニンおよびチロシンからなる群より選択されるいずれか１つ以上のアミノ酸であり、
前記細胞表面発現母体は、外膜タンパク質である。
【請求項２】
前記抗菌ペプチドが、配列番号９ないし２４のいずれか１つのアミノ酸配列を有するものである、請求項１に記載の多重合体。
【請求項３】
前記細胞表面発現母体が、重合体のＮ末端に連結されたものである、請求項１に記載の多重合体。
【請求項４】
前記外膜タンパク質が、大腸菌の外膜タンパク質ＯｍｐＡ、大腸菌の脂質タンパク質（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）のリーダー配列（ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に連結された大腸菌の外膜タンパク質ＯｍｐＡ、大腸菌の外膜タンパク質ＯｍｐＳ、大腸菌の外膜タンパク質ＬａｍＢ、大腸菌の外膜タンパク質ＰｈｏＥ、大腸菌の外膜タンパク質ＯｍｐＣ、大腸菌の外膜タンパク質ＦａｄＬ、サルモネラ菌株の外膜タンパク質ＯｍｐＣおよびシュードモナス菌株の外膜タンパク質ＯｐｒＦからなる群より選択されるものである、請求項１に記載の多重合体。
【請求項５】
前記大腸菌の脂質タンパク質（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）のリーダー配列（ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に連結された大腸菌の外膜タンパク質ＯｍｐＡが、配列番号８のアミノ酸配列からなるものである、請求項４に記載の多重合体。
【請求項６】
前記抗菌ペプチドが、配列番号９のアミノ酸配列を有し、前記ペプシン切断アミノ酸リンカーは、ロイシンであり、前記細胞表面発現母体は、配列番号８のアミノ酸配列を有するものである、請求項１に記載の多重合体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の多重合体をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２５ないし２７のいずれか１つの塩基配列を有するものである、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項７または８に記載のポリヌクレオチドを含む、組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換えベクターで形質転換され、抗菌ペプチド多重合体を細胞表面に発現する、抗菌微生物。
【請求項１１】
前記抗菌微生物が、生体内で抗菌ペプチド多重合体を細胞表面に発現するものである、 請求項１０に記載の微生物。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の多重合体を有効成分として含む、抗菌用薬学組成物。
【請求項１３】
請求項１０または１１に記載の抗菌微生物を有効成分として含む、抗菌用薬学組成物。
【請求項１４】
請求項１０または１１に記載の抗菌微生物を有効成分として含む、抗菌用医薬外品組成物。
【請求項１５】
（ａ）請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗菌ペプチド多重合体をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを製造するステップと、（ｂ）前記組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換体に形質転換するステップと、（ｃ）前記形質転換体を培養して抗菌ペプチド多重合体の発現を誘導するステップとを含む、抗菌ペプチド多重合体を細胞表面に発現する抗菌微生物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプシンによって切断される単量体を１個以上含む抗菌ペプチド重合体、前記重合体に細胞表面発現母体が連結された抗菌ペプチド多重合体およびこれを発現する抗菌微生物、これを含む抗菌用組成物、前記抗菌用組成物を投与して細菌、酵母または真菌による感染性疾患を治療する方法および前記抗菌微生物の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
病原菌から人類を保護するために、多くの抗生剤が発見および開発され使用されてきたが、抗生剤の誤乱用の結果抗生剤耐性菌株が急速に増え、それにつれてむしろ使用可能な抗生剤の数が減少するという問題が生じている。したがって、既存の抗生剤とは異なる活性機序で抗生剤耐性菌活性による耐性の問題を引き起こさず、抗生剤が残留しない新たな物質が求められている。このようなニーズに応じ得る代表的な候補物質として抗菌ペプチドを挙げることができる。
【０００３】
抗菌ペプチドは、既存の抗生剤とは異なり、広範な微生物に対して強力な抗菌力を有し、熱、酸またはアルカリなどに強い理化学的安定性を示し、アミノ酸が５〜５０個と少ない数のアミノ酸からなっているため、抗菌作用後容易に分解され、体内に残留せず、生体内毒性を誘発しないという様々な利点がある。したがって、抗菌ペプチドは、次世代抗生物質としての使用が可能なため、製薬および食品分野などにおける産業的応用可能性が非常に高い。
【０００４】
本発明者らは、すでに広範な菌種に対して強力な抗菌活性を有する抗菌ペプチドに対して韓国国内で登録特許を受けている（特許文献１）。
【０００５】
これらの抗菌ペプチドの産業的利用のためには、経済的に大量生産可能な方法が必然的に要求されるが、既存のペプチドの生産方法では、抗菌ペプチドを安価でかつ大量に供給することができない。すなわち、代表的なペプチド生産方法の化学合成を利用する場合には経済性が低く、遺伝工学技術を利用して微生物から生産する場合には抗菌ペプチドの発現率が低いため、宿主に対する抗菌活性を示すだけでなく発現された抗菌ペプチドが宿主内のタンパク質酵素によって分解されるという問題があった。
【０００６】
また、微生物において抗菌ペプチドを大量に発現させるために、従来は融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ  ｐａｒｔｎｅｒ）を用いて、宿主細胞を殺すことなく宿主の微生物から所望のペプチドを生産する方法が一般的に行われてきた。
【０００７】
しかし、前記方法において、抗菌ペプチドを得るためには、  宿主細胞を溶解して不溶性（ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ）状態の融合タンパク質を得た後、前記融合タンパク質と抗菌ペプチドとの間を切断し、クロマトグラフィー（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）またはイオン交換カラム（ｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｏｌｕｍｎ）で純粋分離しなければならないが、この過程で多量の抗菌ペプチドが失われ、収率が非常に低くなり、抗菌ペプチドの価格が顕著に上昇するという致命的な問題があった。
【０００８】
かかる問題を解決するために、細胞表面発現タンパク質を抗菌ペプチドと融合して抗菌ペプチドを細胞の表面に発現（ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）させようとする試みが行われた。その結果、抗菌ペプチドを細胞の表面に発現させることにより、細胞の破砕過程を省略することができたが、抗菌ペプチドを純粋分離するためには、細胞表面発現タンパク質に別の酵素を処理しなければならず、不純物を除去するために、クロマトグラフィーまたはイオン交換カラムを用いなければならないという欠点が依然としてあった。
【０００９】
また、抗菌ペプチドの分離および精製過程を経ないためには、細胞表面に発現された抗菌ペプチドをそのまま使用する方法があるが、この方法で作製された細胞表面に付着した状態の抗菌ペプチドは抗菌活性が顕著に低減するという致命的な欠点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】韓国登録特許番号第０４４１４０２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
そこで、本発明者らは、抗菌ペプチドの分離および精製過程を経ることなく、これを発現する微生物を生菌状態で用いて生体内で抗菌活性を呈するようにする抗菌ペプチドを開発するために鋭意努力した結果、ペプシンによって切断される単量体からなる抗菌ペプチド多重合体を大腸菌の細胞表面に発現させた場合に、大腸菌から発現された抗菌ペプチドに対する分離および精製過程を経なくても生体内で抗菌活性を示すことを確認し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の目的は、ペプシンによって切断される単量体を１個以上含む抗菌ペプチド重合体、および前記重合体に連結された細胞表面発現母体を含む抗菌ペプチド多重合体を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、ペプシンによって切断される単量体を１個以上含む抗菌ペプチド重合体を提供することである。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、前記抗菌ペプチド多重合体または重合体をコードするポリヌクレオチドを提供することである。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供することである。
【００１６】
本発明のさらに他の目的は、前記抗菌ペプチド多重合体を細胞表面に発現する抗菌微生物を提供することである。
【００１７】
本発明のさらに他の目的は、前記抗菌ペプチド多重合体、抗菌ペプチド重合体または抗菌ペプチド多重合体を細胞表面に発現する抗菌微生物を有効成分として含む抗菌用薬学組成物および医薬外品組成物を提供することである。
【００１８】
本発明のさらに他の目的は、前記抗菌ペプチド多重合体を細胞表面に発現する抗菌微生物の製造方法を提供することである。
【００１９】
本発明のさらに他の目的は、前記抗菌用薬学組成物を投与して細菌、酵母または真菌による感染性疾患を治療する方法を提供することである。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、抗菌ペプチドを生産するために、細胞破砕、抗菌ペプチドの分離および精製過程を経ることなく、これを細胞表面に発現する微生物を生菌状態で直接生体内に投与して抗菌活性を呈するようにすることにより、抗菌ペプチドの生産費用を顕著に低減させ、抗菌ペプチドの普及を誘導できるという効果がある。また、本発明の抗菌ペプチド多重合体または抗菌ペプチド重合体は、生体内酵素のペプシンによって切断されて抗菌ペプチド単量体に分離され、分離された単量体の抗菌力が優れるため、病原性細菌、酵母または真菌による感染性疾患の治療用として、既存の抗生剤を代替して有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】は、本発明の抗菌ペプチド多重合体を細胞表面に発現する抗菌微生物の作用原理を示す図である。
【図２】は、本発明の細胞表面で発現される抗菌ペプチド多重合体の作製過程を示す模式図である。
【図３】は、Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ−Ｈｉｎｇｅ２Ｌｎ  ＤＮＡ切片のサイズを示すアガロースゲルの写真である。
【図４】は、Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ−Ｈｉｎｇｅ２Ｌｎ  ＤＮＡ切片が挿入された組換えベクターｐＬＨｎの模式図である。
【図５】は、形質転換された大腸菌で発現されたＬｐｐ−ＯｍｐＡ−Ｈｉｎｇｅ２Ｌｎ  ＤＮＡ切片のサイズを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真である。Ｍは分子量標準マーカーを示し、ＬＨ０は、細胞表面発現母体だけがＩＰＴＧで発現誘導されたことを示し、ＬＨ１、ＬＨ２およびＬＨ３における矢印は、細胞表面発現母体に連結された抗菌ペプチドＨｉｎｇｅ２Ｌの単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）、二量体（ｄｉｍｅｒ）、三量体（ｔｒｉｍｅｒ）がＩＰＴＧで発現誘導されたことを示す。
【図６】は、抗菌ペプチド多重合体が形質転換された大腸菌の細胞表面で発現されたことを示す共焦点顕微の鏡写真である。ＬＨ０は、細胞表面発現母体だけがＩＰＴＧで発現誘導されたことを示し、ＬＨ１、ＬＨ２およびＬＨ３における矢印は、細胞表面発現母体に連結された抗菌ペプチドＨｉｎｇｅ２Ｌの単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）、二量体（ｄｉｍｅｒ）、三量体（ｔｒｉｍｅｒ）がＩＰＴＧで発現誘導されたことを示す。
【図７】は、抗菌ペプチド多重合体を発現する大腸菌の抗菌力を示すグラフであって、抗菌ペプチドを発現しないＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を陰性対照群（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）の値として活性を０％に指定し、合成した抗菌ペプチド単量体Ｈｉｎｇｅ２Ｌの活性を陽性対照群（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）の値として活性を１００％に指定した時、ペプシンによって切断されたそれぞれの抗菌ペプチド単量体ＬＨ０、ＬＨ１およびＬＨ３の抗菌力を観察した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
前記の目的を達成するための一態様として、本発明は、下記式１または２で表される単量体を１個以上含む抗菌ペプチド重合体、および前記重合体に連結された細胞表面発現母体を含む抗菌ペプチド多重合体を提供する。
式（１）：Ｎ末端−［抗菌ペプチド−ペプシン切断アミノ酸リンカー］−Ｃ末端
式（２）：Ｎ末端−［ペプシン切断アミノ酸リンカー−抗菌ペプチド］−Ｃ末端
ただし、前記抗菌ペプチドは、ペプシン切断アミノ酸リンカーとは異なるアミノ酸からなる。
【００２３】
また、他の態様として、本発明は、前記式１または２で表される単量体を１個以上含む抗菌ペプチド重合体を提供する。
【００２４】
本発明において、用語「抗菌ペプチド重合体」は、ペプシンによって切断される１個以上の単量体がペプシン切断アミノ酸リンカーを介して繰り返し連結された重合体を意味し、用語「抗菌ペプチド多重合体（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」は、前記抗菌ペプチド重合体に細胞表面発現母体が連結され、これを微生物で発現させる場合、微生物の細胞表面で発現可能な多重合体を意味する。
【００２５】
したがって、図１に示されるように、本発明の抗菌ペプチド多重合体は、抗菌ペプチド単量体内のペプシン切断アミノ酸リンカーが生体内消化酵素のペプシンによって切断されることにより、抗菌活性を有する抗菌ペプチド単量体に分離されるため、抗菌ペプチドを微生物から分離および精製することなく、これを発現する微生物を直接生菌状態で生体内に注入すると、抗菌ペプチドの抗菌活性により、病原菌退治および兔疫細胞活性などの効果を生体内で直接発生させることができるという利点がある。
【００２６】
本発明において、前記単量体は、抗菌ペプチドのＮ末端またはＣ末端にペプシン切断アミノ酸リンカーが連結された形態を有する。
【００２７】
前記抗菌ペプチドは、菌細胞内に浸透して作用することにより、バクテリアと真菌を含む広範な微生物に対して強力な抗菌活性を示すペプチドまたはこれらの誘導体であって、ペプシン切断アミノ酸リンカーを構成するアミノ酸は含まない。これは、抗菌ペプチド自体がペプシンによって切断されるのを防止するためのものである。
【００２８】
また、前記抗菌ペプチドは、抗菌活性を有するペプチドまたはこれらの誘導体は含まれるが、好ましくは、 特許文献１に開示された抗菌ペプチドのうち、ペプシン切断アミノ酸リンカーを構成するアミノ酸を含まない抗菌ペプチドまたはこれらの誘導体であり得、より好ましくは、配列番号９ないし２４のいずれか１つのアミノ酸配列を有する抗菌ペプチドまたはこれらの誘導体であり得、さらに好ましくは、配列番号９のアミノ酸配列を有する抗菌ペプチドまたはその誘導体であり得る。
【００２９】
前記ペプシン切断アミノ酸リンカーは、１個以上のアミノ酸からなっていて、ペプチド結合を通じてそれぞれの抗菌ペプチドを相互に連結させるリンカーであると同時に、生体内酵素のペプシンによって切断され、抗菌ペプチド重合体がそれぞれの抗菌ペプチド単量体に分離されるようにする役割を果たす。本発明の抗菌ペプチド多重合体または抗菌ペプチド重合体は、上記式１または２で表される単量体を１個以上含むことができ、形質転換された微生物またはベクターが含むことのできる単量体の個数には制限がないが、好ましくは１個〜４個の単量体を含むことができる。
【００３０】
本発明において、前記ペプシン切断アミノ酸リンカーは、リンカーの両末端が抗菌ペプチドの末端にペプチド結合によって連結されているが、消化酵素のペプシンが作用すると、リンカーの末端と抗菌ペプチドのＮ末端との間に形成されたペプチド結合が切れるようにするアミノ酸配列からなる。
【００３１】
好ましくは、前記ペプシン切断アミノ酸リンカーは、ロイシン（Ｌｅｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）およびチロシン（Ｔｙｒ）からなる群より選択されたいずれか１つ以上のアミノ酸、例えば、１個以上のロイシン、１個以上のフェニルアラニン、１個以上のチロシンまたは１個以上のアミノ酸を含むこれらの組み合わせからなり得、より好ましくは、１個のロイシン、１個のフェニルアラニンまたは１個のチロシンからなり得る。
【００３２】
本発明の一実施例をみると、コンピュータプログラムを用いて抗菌ペプチドのＣ末端に任意のアミノ酸リンカーを介して連結した抗菌ペプチド重合体において、ペプシンによって切断される部位を予測し、その結果、アミノ酸リンカーのうち、１個のロイシン、１個のフェニルアラニンまたは１個のチロシンの末端と抗菌ペプチドのＮ末端との間に形成されたペプチド結合が切れて抗菌ペプチド単量体に分離できることを確認した（実施例１）。
【００３３】
本発明において、前記細胞表面発現母体は、抗菌ペプチド重合体に連結され、抗菌ペプチド多重合体が微生物の細胞表面で発現されるようにする役割を果たす。
【００３４】
前記細胞表面発現母体は、外膜タンパク質、脂質タンパク質（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、オートトランスポーター（ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｏｔｅｒｓ）および表面付属物（ｓｕｒｆａｃｅ  ａｐｐｅｎｄａｇｅ）のＳ層（Ｓ−ｌａｙｅｒ）からなる群より選択されるものであり得、好ましくは、外膜タンパク質（ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であり得、より好ましくは、大腸菌の外膜タンパク質ＯｍｐＡ、大腸菌の脂質タンパク質（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）のリーダー配列（ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に連結された、大腸菌の外膜タンパク質ＯｍｐＡ、大腸菌の外膜タンパク質ＯｍｐＳ、大腸菌の外膜タンパク質ＬａｍＢ、大腸菌の外膜タンパク質ＰｈｏＥ、大腸菌の外膜タンパク質ＯｍｐＣ、大腸菌の外膜タンパク質ＦａｄＬ、サルモネラ菌株の外膜タンパク質ＯｍｐＣおよびシュードモナス菌株の外膜タンパク質ＯｐｒＦからなる群より選択される外膜タンパク質であり得、さらに好ましくは、大腸菌の脂質タンパク質（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）のリーダー配列（ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に連結された大腸菌の外膜タンパク質ＯｍｐＡからなる配列番号８の細胞表面発現母体（Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ）であり得る。
【００３５】
本発明の一実施例では、例示的に、抗菌ペプチドのＣ末端にペプシン切断アミノ酸リンカーで１個のロイシンが付加された抗菌ペプチド単量体（Ｈｉｎｇｅ２Ｌ）からなる抗菌ペプチド重合体Ｈｉｎｇｅ２Ｌ１、Ｈｉｎｇｅ２Ｌ２、Ｈｉｎｇｅ２Ｌ３およびＨｉｎｇｅ２Ｌ４を作製し（実施例２）、抗菌ペプチド重合体のＮ末端に配列番号８のアミノ酸からなる細胞表面発現母体（Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ）が連結された、抗菌ペプチド多重合体Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ−Ｈｉｎｇｅ２Ｌ１、Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ−Ｈｉｎｇｅ２Ｌ２、Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ−Ｈｉｎｇｅ２Ｌ３およびＬｐｐ−ＯｍｐＡ−Ｈｉｎｇｅ２Ｌ４を作製した（実施例３）。
【００３６】
他の態様として、本発明は、本発明の抗菌ペプチド多重合体または抗菌ペプチド重合体をコードするポリヌクレオチドおよびこれを含む組換えベクターを提供する。
【００３７】
本発明において、前記ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド単位体（ｍｏｎｏｍｅｒ）が共有結合によって長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（ｐｏｌｙｍｅｒ）で、一定の長さ以上のＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）またはＲＮＡ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）鎖であって、前記抗菌ペプチド多重合体または抗菌ペプチド重合体をコードするポリヌクレオチドである。
【００３８】
前記抗菌ペプチド多重合体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２５（Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ−Ｈｉｎｇｅ２Ｌ２）、２６（Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ−Ｈｉｎｇｅ２Ｌ３）および２７（Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ−Ｈｉｎｇｅ２Ｌ４）の塩基配列のいずれか１つの塩基配列を有するポリヌクレオチドであり得る。
【００３９】
また、前記抗菌ペプチド重合体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２８（Ｈｉｎｇｅ２Ｌ２）、２９（Ｈｉｎｇｅ２Ｌ３）および３０（Ｈｉｎｇｅ２Ｌ４）の塩基配列のいずれか１つの塩基配列を有するポリヌクレオチドであり得る。
【００４０】
本発明において、前記組換えベクターは、本発明の抗菌ペプチド多重合体または抗菌ペプチド重合体を発現させる微生物を作るために、宿主細胞にＤＮＡを導入して抗菌ペプチド多重合体または抗菌ペプチド重合体を微生物で発現させるための手段であって、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクターなどの公知の発現ベクターを用いることができる。また、ベクターは、ＤＮＡ組換え技術を利用した任意の公知の方法によって当業者が容易に製造することができる。
【００４１】
前記組換えベクターは、ｐＧＥＭ  Ｔ−ｅａｓｙベクターまたはｐＥＴ２１ｃベクターを用いることができ、好ましくは、ｐＥＴ２１ｃベクターを用いることができる。
【００４２】
本発明の組換えベクターは、本発明の抗菌ペプチド多重合体または抗菌ペプチド重合体をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された組換えベクターである。前記「作動可能に連結された」とは、発現調節配列が抗菌ペプチド多重合体または抗菌ペプチド重合体をコードするポリヌクレオチド配列の転写および解読を調節するように連結されたものをいい、発現調節配列（プローモーターを含む）の調節下、ポリヌクレオチド配列が発現され、ポリヌクレオチド配列によってコードされる抗菌ペプチド多重合体または抗菌ペプチド重合体が生成されるように、正確な解読フレームを維持させることを含む。
【００４３】
さらに他の態様として、本発明は、前記組換えベクターで形質転換され、抗菌ペプチド多重合体を細胞表面に発現する抗菌微生物を提供する。
【００４４】
本発明において、前記「抗菌微生物」とは、抗菌ペプチドを細胞表面に発現させ得る微生物を意味し、本発明の抗菌微生物は、細胞内で消化酵素のペプシンによって単量体抗菌ペプチドに切断可能な抗菌ペプチド多重合体を細胞表面に発現させ、前記抗菌微生物自体が体内病原菌を直接殺す作用を行うため、抗生剤の代替剤として使用することができる。
【００４５】
本発明において、「形質転換」という用語は、遺伝子を宿主細胞内に導入して宿主細胞内で発現できるようにすることを意味する。形質転換された遺伝子は、宿主細胞内で発現できるものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されたもの、または染色体外に位置しているものなど制限なく含まれる。
【００４６】
また、前記遺伝子は、ポリペプチドをコード可能なポリヌクレオチドとしてＤＮＡおよびＲＮＡを含む。前記遺伝子は、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、いかなる形態で導入されるものであっても構わない。例えば、前記遺伝子は、それ自体で発現されるのに必要なすべての要素を含むポリヌクレオチド構造体である発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で宿主細胞に導入できる。前記発現カセットは、通常、前記遺伝子に作動可能に連結されているプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終了信号、リボソーム結合部位および翻訳終了信号を含む。前記発現カセットは、自己複製が可能な発現ベクター形態であり得る。また、前記遺伝子は、それ自体またはポリヌクレオチド構造体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよい。
【００４７】
前記抗菌微生物は、抗菌ペプチド多重合体をコーディングするポリヌクレオチドを含む組換えベクターで形質転換され、抗菌ペプチド多重合体を細胞表面に発現可能な微生物であって、例えば、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｕｓ）属、アエロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、エンテロバクテリア（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）属、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属およびコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の微生物であり得る。
【００４８】
好ましくは、前記抗菌微生物は、エシェリキア属の微生物であり得、より好ましくは、大腸菌であり得、さらに好ましくは、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）であり得る。
【００４９】
本発明の一実施例では、例示的に、抗菌ペプチド多重合体をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターで形質転換された大腸菌を作製し（実施例４）、ＩＰＴＧを用いて形質転換された大腸菌で抗菌ペプチド多重合体の発現を誘導した後、細胞表面で抗菌ペプチド多重合体が発現されたか否かを確認した。その結果、細胞表面発現母体に連結された抗菌ペプチドＨｉｎｇｅ２Ｌの単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）、二量体（ｄｉｍｅｒ）、三量体（ｔｒｉｍｅｒ）が大腸菌の細胞表面で発現されたことを確認することができた（実施例５および図６）。
【００５０】
さらに他の態様として、本発明は、本発明の抗菌ペプチド多重合体、抗菌ペプチド重合体または本発明の抗菌微生物を有効成分として含む抗菌用薬学組成物を提供する。
【００５１】
また、さらに他の態様として、本発明は、前記抗菌用薬学組成物を病原性細菌、酵母または真菌による感染性疾患が発病した個体に投与するステップを含む病原性細菌、酵母または真菌による感染性疾患の治療方法を提供する。
【００５２】
本発明において、前記病原性細菌は、動植物の生体に侵入して寄生しながら病気を引き起こしたり害を及ぼしたりするすべての微生物であって、グラム陽性菌およびグラム陰性菌を含み、好ましくは、グラム陽性菌のスタフィロコッカスアウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、グラム陰性菌の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）であり得る。
【００５３】
また、前記病原性酵母および真菌は、病原性を有する酵母および真菌であって、これに制限されないが、例として、カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルスフミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｈｕｍｉｇａｔｕｓ）、サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびクリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）を含む。
【００５４】
本発明において、前記病原性細菌による感染性疾患は、コレラ菌によるコレラ、赤痢菌による細菌性赤痢、百日咳菌による百日咳、腸チフス菌による腸チフス、ジフテリア菌による喉頭ジフテリアおよび鼻ジフテリア、ペスト菌による腺ペストおよび肺ペスト、溶血性連鎖球菌による猩紅熱、丹毒、敗血症および皮膚化膿症、結核菌による肺結核、関節結核、腎臓結核および結核性髄膜炎；サルモネラ菌および腸炎ビブリオなどによる細菌性食中毒であり得る。また、前記病原性酵母および真菌による感染性疾患は、クリプトコックス症（ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ）、カンジダ症（ｃａｎｄｉｄａｓｉｓ）、皮膚糸状菌症（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｏｓｉｓ）、表在性皮膚真菌症（ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｍｙｃｏｓｅｓ）、脳髄膜炎、脳膿瘍、脳腫瘍、ヒストプラズマ症（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ）、ニューモシスティス肺炎またはアスペルギルス症（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ）であり得る。
【００５５】
本発明において、用語「治療」とは、抗菌用薬学組成物の投与により、病原性細菌、酵母または真菌による感染性疾患による症状が好転したり有意に変更するすべての行為を意味し、本発明において、用語「個体」とは、病原性細菌、酵母または真菌による感染性疾患が発病した場合、または発病し得るヒトを含むすべての動物を意味する。
【００５６】
本発明の抗菌用薬学組成物で病原性細菌、酵母または真菌による感染性疾患で闘病中のヒトに投与することにより、病原性細菌、酵母または真菌による感染性疾患を治療することができる。
【００５７】
前記抗菌用薬学組成物の投与経路については、目的組織に到達できる限り、何らかの一般的な経路を通して投与が可能である。本発明の薬学組成物は、目的に応じて、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与が可能であるが、これに制限されない。また、前記薬学組成物は、活性物質が標的細胞に移動可能な任意の装置によって投与できる。
【００５８】
これらの方法により、本発明の抗菌微生物を含む抗菌用薬学組成物を生体内投与する場合、抗菌微生物の細胞表面に発現された抗菌ペプチド多重合体が生体内消化酵素のペプシンによって切断され、抗菌活性を有する抗菌ペプチド単量体に分離されるため、抗菌ペプチドの精製および分離過程を必要としないだけでなく、ペプシンによって単量体に切断された抗菌ペプチドの抗菌活性が優れており、効果的に病原菌を退治する効果を奏することができる。
【００５９】
本発明の一実施例では、例示的に、抗菌ペプチド多重合体を細胞表面で発現する大腸菌にペプシンを処理した後、ペプシンによって分離された抗菌ペプチド単量体の抗菌活性を測定した。測定の結果、グラム陽性菌のスタフィロコッカスアウレウス、グラム陰性菌の大腸菌、および酵母のサッカロマイセスセレビシエに対する優れた抗菌力を保有していることを確認することができた（実施例６および図７）。
【００６０】
本発明において、本発明の抗菌用薬学組成物は、許容可能な担体を含むことができる。薬学的に許容可能な担体を含む前記抗菌用薬学組成物は、経口または非経口の様々な剤形であり得る。製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、１つ以上の化合物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混合して調剤される。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、一般に使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィンのほか、様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレエートのような注射可能なエステルなどが使用可能である。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用可能である。さらに、抗菌用薬学組成物に含まれている抗菌微生物が、抗菌ペプチド多重合体を細胞表面に発現するのに必要な営養分を含むことができる。
【００６１】
前記抗菌用薬学組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤および坐剤からなる群より選択されるいずれか１つの剤形を有することができる。
【００６２】
本発明の前記薬学組成物は、薬学的に有効な量で投与する。用語「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な有益性／有害性の割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効容量水準は、個体の種類および重症度、年齢、性別、薬物の活性、薬物に対する感受性、投与時間、投与経路および排出率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素、およびその他医学分野でよく知られた要素に応じて決定できる。本発明の薬学組成物は、個別治療剤として投与したり他の治療剤と併用して投与可能であり、従来の治療剤とは順次または同時に投与可能であり、単一または多重投与可能である。前記要素をすべて考慮して、副作用なく最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要である。
【００６３】
本発明の組成物は、病原性細菌、酵母または真菌による感染性疾患の治療のために、単独で使用することができ、手術、ホルモン治療、薬物治療および生物学的反応調節剤を用いる方法との併用も可能である。
【００６４】
さらに他の態様として、本発明は、本発明の抗菌微生物を有効成分として含む抗菌用医薬部外品組成物を提供する。すなわち、本発明は、病原性細菌、酵母または真菌による感染性疾患の予防または改善を目的として医薬部外品組成物を提供するものである。
【００６５】
本発明において、前記医薬部外品組成物は、他の医薬部外品または医薬部外品成分と共に使用することができ、通常の方法によって適切に使用可能である。有効成分の混合量は、使用目的（予防、健康または治療的処置）に応じて適宜決定できる。
【００６６】
前記医薬部外品組成物は、消毒清潔剤、シャワーフォーム、口腔清潔剤、ウェットシート、洗剤せっけん、ハンドウォッシュ、加湿器充填剤、マスク、軟膏剤またはフィルター充填剤であり得る。
【００６７】
もう一つの態様として、本発明は、本発明の抗菌ペプチド多重合体を細胞表面に発現する抗菌微生物の製造方法を提供する。
【００６８】
本発明において、前記製造方法は、（ａ）本発明の抗菌ペプチド多重合体をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを製造するステップと、（ｂ）前記組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換体に形質転換するステップと、（ｃ）前記形質転換体を培養して抗菌ペプチド多重合体の発現を誘導するステップとを含む。
【００６９】
前記組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換する方法は、本発明のＤＮＡを含む組換えベクターを当業界で公知の方法、例えば、これに限定されないが、一時的な形質感染（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、微細注射、形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）、細胞融合、カルシウムホスフェート沈殿法、リポソーム媒介の形質感染（ｌｉｐｏｓｅｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ＤＥＡＥデキストラン媒介の形質感染（ＤＥＡＥ  Ｄｅｘｔｒａｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ポリブレン媒介の形質感染（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）などの公知の方法で宿主細胞に導入して形質転換させることができるが、これに限定されるものではない。
【００７０】
前記形質転換体を培養して抗菌ペプチド多重合体の発現を誘導する方法は、当業界で公知の任意の方法を利用することができるが、例えば、大腸菌を培養する一般的な条件である、３７℃、好気条件、ＬＢ培地、ＩＰＴＧの添加による発現の誘導が挙げられる。
【００７１】
本発明の一実施例では、例示的に、ＣａＣｌ２を用いた形質転換方法で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に組換えベクターｐＬＨ０、ｐＬＨ１、ｐＬＨ２およびｐＬＨ３で形質転換し、本発明の抗菌ペプチド多重合体を発現させた（実施例４）。また、図６をみると、前記組換えベクターによって形質転換された大腸菌で抗菌ペプチド多重合体が細胞表面に発現されたことが分かった（図６）。
【００７２】
この方法によって生産された抗菌微生物は、細胞表面にペプシンによって切断される抗菌ペプチド多重合体を発現するため、生菌状態で生体内に投与すると、ペプシンによって抗菌活性を有する抗菌ペプチド単量体に分離されるため、細胞破砕、抗菌ペプチドの分離および精製過程を必要としないだけでなく、分離された抗菌ペプチドが優れた抗菌力を示すため、病原菌を効果的に退治する効果を奏することができる。
【実施例】
【００７３】
以下、本発明を、実施例および実験例によってより詳細に説明する。ただし、下記の実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７４】
ペプシン切断アミノ酸リンカーの配列の決定およびこれを含む抗菌ペプチド単量体の抗菌力の測定
１−１：ペプシン切断アミノ酸リンカーの配列の決定
ペプシンによって単量体に分離される抗菌ペプチド重合体を製造するために、韓国登録特許第０４４１４０２号に開示された配列番号１の抗菌ペプチド（配列番号９：ＲＶＶＲＱＷＰＩＧＲＶＶＲＲＶＶＲＲＶＶＲ）を任意のアミノ酸をリンカーとして用いて連結した抗菌ペプチド重合体において、ペプシンによってアミノ酸リンカーが切断されてそれぞれの単量体に分離されるようにするアミノ酸配列を、コンピュータプログラムツールのＥｘＰＡｓｙ（Ｅｘｐｅｒｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ、スイス）を用いて決定した。その結果、ロイシン、フェニルアラニンおよびチロシンのＣ末端と抗菌ペプチドのＮ末端との間に形成されたペプチド結合がペプシンによって切断されたことを確認し、前記アミノ酸のそれぞれをペプシン切断アミノ酸リンカーとして決定した。
【００７５】
１−２：ペプシン切断アミノ酸リンカーが付加された抗菌ペプチド単量体の抗菌力の測定
抗菌ペプチドにペプシンによって切断されるアミノ酸を添加した抗菌ペプチド重合体のアミノ酸配列を、プログラムによって予測した結果、ロイシン（ｌｕｅｃｉｎｅ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）の後でペプシンが作用したことを確認し、これら３つのペプチドに対して化学合成を通じて純度９５％の抗菌ペプチドを得た。
【００７６】
製造された抗菌ペプチドの微生物に対する抗菌活性を、９６−ウェル微量希釈最小阻害濃度測定法（ｍｉｎｉｍａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）で測定した。バクテリアとカビをトリプチケースソイ寒天培地（ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ；ＴＳＢ）でそれぞれ３７℃と３０℃で一晩中培養した後、これらを新たな培地に接種して２時間培養し、菌株が対数期となるようにした後、１ｍｌ当たり１０５の菌株となるように希釈して９６−ウェルプレートに１０μｌずつ接種し、順次に希釈された抗菌ペプチドを各ウェルに１０μｌずつ処理した。９６−ウェルプレートを１２時間培養して各ウェルの吸光度を測定し、菌株を全く育たないようにする最小濃度を最小阻害濃度として定め、その結果を表１に示した。表１のＨｉｎｇｅ２Ｌ、Ｈｉｎｇｅ２ＦおよびＨｉｎｇｅ２Ｙは、配列番号９の抗菌ペプチドに、それぞれロイシン、フェニルアラニンおよびチロシンが付加された抗菌ペプチドである。
【００７７】
【表１】
0005795079.tif 000002
【００７８】
抗菌力実験の結果、抗菌ペプチドにロイシンのついたペプチドが、グラム陽性菌のスタフィロコッカスアウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ．ａｕｒｅｕｓ）、グラム陰性菌の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ）、酵母のサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に対して２μｌ／ｍｌと、最も優れた抗菌力を保有していることが分かった（表１）。
【実施例２】
【００７９】
ペプシンによって切断される抗菌ペプチド重合体の製造
前記実施例１で決定されたペプシン切断アミノ酸リンカー（ロイシン）を抗菌ペプチドのＣ末端に添加した抗菌ペプチド単量体（Ｈｉｎｇｅ２Ｌ）をコードするＤＮＡ切片を作製し、ベクターにクローニングした。このために、配列番号１（５’−ＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＴＧＴＴＧＴＴＣＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＧＡＴＴＧＧＴＣＧＴＧＴＣＧＴＴＣＧＣＣＧＴＧＴＴＧＴＴＣＧ−３’）および配列番号２（５’−ＧＧＡＴＧＧＡＴＣＣＴＡＡＧＣＡＣＧＣＡＧＡＣＧＡＡＣＧＡＣＧＣＧＡＣＧＡＡＣＡＡＣＡＣＧＧＣＧＡＡＣＧＡＣＡＣＧ−３’）のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号９の抗菌ペプチドのＣ末端にペプシン切断アミノ酸リンカーのロイシンが付加された２２個のアミノ酸からなる抗菌ペプチド単量体をコードする二重鎖のＤＮＡ切片を完成した。ＰＣＲ条件は、９４℃で３０秒間ＤＮＡ変性、５６℃で３０秒間アニーリング、７２℃で３０秒間ＤＮＡを合成し、これを３０回繰り返した。クローニングのために、抗菌ペプチド単量体のＮ末端に制限酵素ＢｂｓＩの認識部位（５’−ＧＡＡＧＡＣ（Ｎ）２▼−３’，３’−ＣＴＴＣＴＧ（Ｎ）６▲−５’）、およびＣ末端にＦｏｋＩの認識部位（５’−ＧＧＡＴＧ（Ｎ）９▼−３’，３’−ＣＣＴＡＣ（Ｎ）１３▲−５’）を導入した。
以後、完成したＤＮＡ切片をｐＧＥＭ  Ｔ−ｅａｓｙベクターに挿入し、ｐＭＢＴ−Ｈと名付けた。
【００８０】
また、抗菌ペプチド重合体を作製するために、ＰＣＲによって作製された抗菌ペプチド単量体Ｈｉｎｇｅ２ＬをコードするＤＮＡ切片を制限酵素ＢｂｓＩおよびＦｏｋＩで切断した後、制限酵素ＢｂｓＩで切断されたｐＭＢＴ−Ｈベクターに挿入し、Ｈｉｎｇｅ２Ｌが２個連結されたｐＭＢＴ−Ｈ２ベクターを作製した。このような過程を繰り返してｐＭＢＴ−Ｈ３、ｐＭＢＴ−Ｈ４・・・ｐＭＢＴ−Ｈｎを作製した（図２）。
【実施例３】
【００８１】
細胞表面発現母体に連結された抗菌ペプチド重合体のＤＮＡ切片の製造およびクローニング
３−１：Ｌｐｐ−ＯｍｐＡに連結された抗菌ペプチド重合体ＤＮＡの作製およびクローニング
抗菌ペプチド重合体を宿主細胞の細胞表面で発現されるようにするために、細胞表面発現母体として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の脂質タンパク質（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）のリーダー配列（ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、および細胞外膜に安定的に付着している大腸菌の外膜タンパク質Ａ（ＯｍｐＡ）の配列の一部を用いた配列番号７の塩基配列を有するＬｐｐ−ＯｍｐＡ  ＤＮＡ切片を作製し、これをベクターにクローニングすることを試みた。
【００８２】
まず、Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ  ＤＮＡ切片を作製するために、配列番号３（５’−ＣＧＣＣＡＴＡＴＧＡＡＡＧＣＴＡＣＴＡＡＡＣＴＧＧＴＡＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＡＣＡＡＴＧＧＣＣＣＧＡＣＣ−３’）、配列番号４（５’−ＧＣＡＡＡＣＡＣＣＧＧＡＧＡＡＡＣＧＣＣＧＧＴＧ−３’）、配列番号５（５’−ＴＴＣＴＣＣＧＧＴＧＴＴＴＧＣＴＧＧＣＧＧＴＧＴＴＧ−３’）および配列番号６（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＡＣＡＣＧＣＡＧＴＣＴＴＣＣＡＣＧＧＧＴＡＧ−３’）のプライマーを合成し、大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型として、９４℃で３０秒間ＤＮＡ変性、５４℃で３０秒間アニーリング、７２℃で１分３０秒間ＤＮＡ合成の過程を３０回繰り返す組換えＰＣＲ方法により、１２３個のアミノ酸からなるＬｐｐ−ＯｍｐＡポリペプチドをコードするＤＮＡ切片（３６９個のヌクレオチド）を完成した。
【００８３】
以後、発現時、アミノ酸の変化が起こらないようにすると同時に効果的なクローニングのために、組換えＰＣＲ方法によって完成したＬｐｐ−ＯｍｐＡ  ＤＮＡ配列の間にある制限酵素ＢｂｓＩの認識部位のうち、３２１番目の配列のＣをＧに、３２４番目の配列のＣをＴに置換し、Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ  ＤＮＡ切片（配列番号７）を作製した。以後、作製されたＬｐｐ−ＯｍｐＡ  ＤＮＡ切片をベクターにクローニングするために、Ｌｐｐ−ＯｍｐＡのＮ末端に制限酵素ＮｄｅＩの認識部位（ＣＡＴＡＴＧ）を導入し、Ｃ末端には、実施例２で作製された抗菌ペプチド重合体ＤＮＡ切片が連結可能に制限酵素ＢｂｓＩの認識部位（５’−ＧＡＡＧＡＣ（Ｎ）２▼−３’，３’−ＣＴＴＣＴＧ（Ｎ）６▲−５’）を挿入し、制限酵素ＢａｍＨＩの認識部位（ＧＧＡＴＣＣ）も導入した。さらに、ＨＩＳ  ｔａｇを挿入して発現が確認できるようにした。
【００８４】
完成したＤＮＡ切片をｐＧＥＭ  Ｔ−ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒに挿入し、これをｐＬＯベクターと名付けた。ｐＬＯベクターは、ＢｂｓＩ切断し、前記実施例２で作製されたｐＭＢＴ−Ｈｎを制限酵素ＢｂｓＩとＦｏｋＩで切断し、抗菌ペプチド重合体Ｈｉｎｇｅ２ＬｎのＤＮＡ切片を、制限酵素によって切断されたｐＬＯベクターとライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）し、Ｌｐｐ−ＯｍｐＡに抗菌ペプチド重合体ＤＮＡが連結されたＤＮＡ切片（Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ−Ｈｉｎｇｅ２Ｌｎ）が挿入されたｐＬＯ−Ｈｉｎｇｅ２Ｌｎベクターを作製した（ｎは、抗菌ペプチド単量体Ｈｉｎｇｅ２Ｌの個数を示す。図２）。
【００８５】
３−２：Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ−Ｈｉｎｇｅ２Ｌｎ  ＤＮＡ切片のサイズの測定
クローニングされたか否かを確認するために、前記実施例３−１で作製されたそれぞれのｐＬＯ−Ｈｉｎｇｅ２Ｌｎベクターに挿入されたＬｐｐ−ＯｍｐＡ−Ｈｉｎｇｅ２Ｌｎ  ＤＮＡ切片のサイズを測定した。
【００８６】
このために、それぞれのｐＬＯ−Ｈｉｎｇｅ２Ｌｎベクターを制限酵素ＮｏｔＩで処理し、ベクターに挿入されたＬｐｐ−ＯｍｐＡ−Ｈｉｎｇｅ２Ｌｎ  ＤＮＡ切片のサイズを確認し、その結果を図３に示した。電気泳動は、１Ｘ  ＴＢＥ（Ｔｒｉｓ、Ｂｏｒｉｃ  ａｃｉｄ、ＥＤＴＡ）バッファー３０ｍｌに１％アガロースゲル０．３ｇを入れて電子レンジで沸騰させた後、型枠に注入して３０分間放置して固くした。以後、Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ−Ｈｉｎｇｅ２Ｌｎ  ＤＮＡ溶液１０μｌに６Ｘ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｄｙｅ２μｌを混合してゲルにローディングし、１００Ｖで４０分間電気泳動した後、ＥｔＢｒ溶液にゲルを２０分間浸漬して染色し、再びゲルを水道水に１５分間浸漬して脱色した。
【００８７】
図３は、Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ−Ｈｉｎｇｅ２Ｌｎ  ＤＮＡ切片のサイズを示す電気泳動写真であって、図３のＭは、ＤＮＡサイズマーカーであり、レーン（ｌａｎｅ）ＬＨ０、ＬＨ１、ＬＨ２、ＬＨ３およびＬＨ４は、Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ−Ｈｉｎｇｅ２Ｌｎ  ＤＮＡ切片のサイズを示す。具体的には、ＬＨ０は、Ｌｐｐ−ＯｍｐＡを示し、ＬＨ１、ＬＨ２、ＬＨ３およびＬＨ４はそれぞれ、細胞表面発現母体のＬｐｐ−ＯｍｐＡに連結された抗菌ペプチド単量体の個数を示す。
【００８８】
したがって、図３に示されるように、細胞表面発現母体のＬｐｐ−ＯｍｐＡに抗菌ペプチド重合体が連結された抗菌ペプチド多重合体、Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ−Ｈｉｎｇｅ２Ｌｎ  ＤＮＡが効果的にベクターにクローニングされたことを確認することができた（図３）。
【実施例４】
【００８９】
細胞表面に抗菌ペプチド多重合体（Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ−Ｈｉｎｇｅ２Ｌｎ）を発現する微生物の作製
図４に示されるように、Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ  ＤＮＡに抗菌ペプチド多重合体およびＨｉｓ  ｔａｇを連結し、この形態で発現できるように組換えベクターを製造した。このために、前記実施例３で作製されたｐＬＯ−Ｈｉｎｇｅ２Ｌｎベクターに制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩを処理し、Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ−Ｈｉｎｇｅ２Ｌｎ  ＤＮＡ切片を得て、ゲル抽出キット（Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を用いて所望の大きさのＤＮＡ片を分離した。
【００９０】
以後、分離されたＤＮＡ片をＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断したｐＥＴ２１ｃベクターに連結させ、ｐＬＨｎ（ｐＬＨ０、ｐＬＨ１、ｐＬＨ２・・・、ｎ＝Ｈｉｎｇｅ２Ｌ単量体の個数）ベクターを製造した（図４）。以後、ＣａＣｌ２を用いた形質転換方法でｐＬＨ０、ｐＬＨ１、ｐＬＨ２およびｐＬＨ３ベクターそれぞれをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）にそれぞれ導入した。
【実施例５】
【００９１】
抗菌ペプチド多重合体（Ｌｐｐ−ＯｍｐＡ−Ｈｉｎｇｅ２Ｌｎ）の細胞表面発現の確認
前記実施例４の形質転換された大腸菌の細胞表面に抗菌ペプチド多重合体が発現されるか否かの確認を試みた。このために、ＬＢ培地（Ｌｕｒｉａ  Ｂｏｔａｎｉ、トリプトン１％、酵母抽出物０．５％、ＮａＣｌ０．５％）を用いて形質転換された大腸菌を培養し、培養液がＯＤ６００＝０．５〜０．６の間の時、０．２ｍＭのＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、抗菌ペプチド多重合体の細胞表面発現を誘導した。発現を誘導した後、４時間後培養液を除去し、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で２回洗浄し、０．２％のＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）が含まれているＰＢＳおよびＨｉｓ−ｔａｇ一次抗体（Ｈｉｓ−ｔａｇ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を共に入れた後、氷で３０分間培養した。培養後、ＰＢＳで２回洗浄し、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）の標識されたＨｉｓ−ｔａｇ二次抗体（ＦＩＴＣ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｈｉｓ  ｔａｇ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を入れた後、光が入らないようにしながら、氷で３０分間培養した。以後、ＰＢＳで再び洗浄をし、大腸菌細胞をＰＢＳで再浮遊（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）させ、これを共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を用いて観察した。
【００９２】
その結果、抗菌ペプチド単量体のない細胞表面発現母体がＩＰＴＧで発現誘導されたことを確認し（ＬＨ０）、細胞表面発現母体と抗菌ペプチド単量体、細胞表面発現母体と二量体、細胞表面発現母体と三量体がＩＰＴＧで発現誘導されたことを確認した（図５）。
【００９３】
また、形質転換された大腸菌において、ＩＰＴＧで発現誘導されたそれぞれの細胞表面発現母体に連結された抗菌ペプチド多重合体ＬＨ１、ＬＨ２、およびＬＨ３が大腸菌の細胞表面で発現されたことを確認することができた（図６）。
【実施例６】
【００９４】
細胞表面に発現された抗菌ペプチド多重合体の抗菌力の確認
前記実施例４で作製された細胞表面に抗菌ペプチド多重合体を発現させる大腸菌の抗菌効果を測定した。形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を１００ｍｌのＬＢ培地で培養し、培養液の懸濁液がＯＤ６００＝０．５〜０．６の間の時、０．２ｍＭ  ＩＰＴＧを添加し、細胞表面発現母体に連結された抗菌ペプチド多重合体の発現を誘導した。発現を誘導してから、４時間後培養液を除去し、ＮＡＰＢ（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）で２回洗浄した後、同じバッファーで再浮遊（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）させ、すべてのサンプル大腸菌は、１Ｘ１０１０ｃｆｕ／ｍｌで数を同一に合わせた。次に、生体の胃と類似の濃度のＨＣｌ水溶液（ＳＧＦ、ｓｉｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｇａｓｔｉｒｃ  ｆｌｕｉｄ；０．０８４Ｎ  ＨＣｌ、３５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ１．２ｏｒ２．０）にペプシンを溶かして大腸菌に処理した後、３０分間培養した。培養後、ペプシンの活性を防ぎ、ｐＨを中和させるために、ＨＣｌ水溶液と同濃度のＮａＯＨ水溶液と混合し、遠心分離して、ペプシンによって切断された抗菌ペプチド単量体以外の細胞残渣を除去した。
【００９５】
ペプシンによって切断された抗菌ペプチド単量体として、グラム陽性菌のスタフィロコッカスアウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、グラム陰性菌の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）および酵母のサッカロミケスケレウィシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いて抗菌力を測定した。
【００９６】
それぞれの菌は、培養中、対数期時に採取し、ＮＡＰＢで２回洗浄した後、再浮遊（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）させ、すべての菌の数を１Ｘ１０５ｃｆｕ／ｍｌに合わせた。９６−ｗｅｌｌプレートにそれぞれの菌およびペプシンによって切断された抗菌ペプチド単量体水溶液を１０μｌずつ分注してよく混合し、３７℃の温度で３時間培養した。３時間後、２Ｘ  ＴＳＢ（Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ）培地を入れ、再び３７℃の温度で１２時間培養した後、ＯＤ５９５値を測定した。
【００９７】
その結果、抗菌ペプチド多重合体中、ＬＨ３の抗菌力が、グラム陽性菌のスタフィロコッカスアウレウスに対して１７．９５％、グラム陰性菌の大腸菌に対して３０％、酵母のサッカロマイセスセレビシエに対して３３．１７％と、最も優れた抗菌力を示した（図７）。この結果は、抗菌ペプチド多重合体に抗菌ペプチド単量体が多量含まれるほどより優れた抗菌活性を示すことを表し、このような抗菌ペプチド多重合体を細胞表面に発現する抗菌微生物を体内に投与した時、病原菌退治および兔疫細胞活性などの抗菌活性を示すことを表す。これにより、抗菌ペプチドの分離および精製過程を経ることなく抗菌ペプチドを用いることができるので、抗菌ペプチドの普及を誘導できるという利点がある。
【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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