(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
原発腫瘍の成長を阻害するための医薬品を調製するための、少なくとも一つの抗ＣＤ１５１抗体またはその抗原結合断片の利用方法。
【請求項２】
前記少なくとも一つの抗ＣＤ１５１抗体またはその抗原結合断片が腫瘍細胞の増殖を阻害する能力を有することを特徴とする、請求項１に記載の利用方法。
【請求項３】
前記少なくとも一つの抗ＣＤ１５１抗体またはその抗原結合断片が、腫瘍細胞における前記ＣＤ１５１タンパク質の転移促進活性を阻害する能力を有することを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の利用方法。
【請求項４】
前記少なくとも一つの抗ＣＤ１５１抗体またはその抗原結合断片が、腫瘍細胞の細胞侵入を阻害する能力を有することを特徴とする、請求項１〜請求項３のいずれか一つに記載の利用方法。
【請求項５】
前記少なくとも一つの抗ＣＤ１５１抗体またはその抗原結合断片が、腫瘍細胞の細胞接着を阻害する能力を有することを特徴とする、請求項１〜請求項４のいずれか一つに記載の利用方法。
【請求項６】
前記少なくとも一つの抗ＣＤ１５１抗体またはその抗原結合断片が、ＣＤ１５１タンパク質のアミノ酸４０〜５７（配列番号６）と１１３〜２２１（配列番号４）にそれぞれ対応する細胞外ループ１（ＥＣ１）および／または２（ＥＣ２）に含まれるエピトープと結合する能力を有することを特徴とする、請求項１〜請求項５のいずれか一つに記載の利用方法。
【請求項７】
前記少なくとも一つの抗ＣＤ１５１抗体またはその抗原結合断片が、ＣＤ１５１タンパク質の１９４位、１９５位、および１９６位（ＱＲＤ194〜196）にそれぞれあるアミノ酸であるグルタミン、アルギニン、およびアスパラギン酸を少なくとも含むＥＣ２領域のエピトープと結合する能力を有することを特徴とする、請求項６に記載の利用方法。
【請求項８】
前記少なくとも一つの抗ＣＤ１５１抗体またはその抗原結合断片がモノクローナル抗体で構成されることを特徴とする、請求項１〜請求項７のいずれか一つに記載の利用方法。
【請求項９】
前記少なくとも一つの抗ＣＤ１５１抗体またはその抗原結合断片がＴＳ１５１抗体で構成され、前記抗体が、
−配列がそれぞれ配列番号７、８、および９である、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３という３つの重鎖のＣＤＲと、
−配列がそれぞれ配列番号１１、１２、および１３である、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３という３つの軽鎖のＣＤＲ
を含むことを特徴とする、請求項１〜請求項８のいずれか一つに記載の利用方法。
【請求項１０】
前記抗ＣＤ１５１抗体が配列番号１０の配列を含んだ重鎖と配列番号１４の配列を含んだ軽鎖を含むことを特徴とする、請求項９に記載の利用方法。
【請求項１１】
前記少なくとも一つの抗ＣＤ１５１抗体またはその抗原結合断片がＴＳ１５１ｒ抗体で構成され、前記抗体が、
−配列がそれぞれ配列番号１５、１６、および１７である、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３という３つの重鎖のＣＤＲと、
−配列がそれぞれ配列番号１９、２０、および２１である、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３という３つの軽鎖のＣＤＲ
を含むことを特徴とする、請求項１〜請求項８のいずれか一つに記載の利用方法。
【請求項１２】
前記抗ＣＤ１５１抗体が配列番号１８の配列を含んだ重鎖と配列番号２２の配列を含んだ軽鎖を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の利用方法。
【請求項１３】
前記癌が、結腸癌、肺癌、前立腺癌、または膵臓癌で構成されることを特徴とする、請求項１〜請求項１２のいずれか一つに記載の利用方法。
【請求項１４】
薬学的に許容可能な少なくとも一つの担体をさらに含む製薬組成物の調製を目的とする、請求項１〜請求項１３のいずれか一つに記載の利用方法。
【請求項１５】
ＣＤ１５１タンパク質と結合する能力を有しかつ原発腫瘍の成長を阻害する能力を有する少なくとも一つの抗ＣＤ１５１抗体またはその抗原結合断片を活性成分として含むことを特徴とする、原発腫瘍の成長の阻害を目的とした組成物。
【請求項１６】
前記少なくとも一つの抗ＣＤ１５１抗体またはその抗原結合断片が、
−  配列がそれぞれ配列番号７、８、および９である、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３という３つの重鎖のＣＤＲと、配列がそれぞれ配列番号１１、１２、および１３である、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３という３つの軽鎖のＣＤＲを含むＴＳ１５１抗体、または
−  配列がそれぞれ配列番号１５、１６、および１７である、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３という３つの重鎖のＣＤＲと、配列がそれぞれ配列番号１９、２０、および２１である、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３という３つの軽鎖のＣＤＲを含むＴＳ１５１ｒ抗体
の中から選択されるモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
さらに少なくとも一つの細胞傷害剤／細胞増殖抑制剤および／または細胞毒および／または放射性元素および／またはモノクローナル抗体を含むことを特徴とする、請求項１５または請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
原発腫瘍の成長を阻害するための医薬品を調製するための、請求項１５〜請求項１７のいずれか一つに記載の組成物の利用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍の成長を阻害する能力を有する抗ＣＤ１５１抗体の新規な利用方法に関するものであり、前記抗体は特に、マウス由来のモノクローナル抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体である。一つの特定の様相によると、
本発明はこれらの抗体またはそれらの機能的断片を、癌の予防的処置および／または治療的処置のための医薬品として利用することを目的とする。また、本発明は、たとえばその他の抗体および／もしくは抗癌剤と結合しているこのような抗体、または毒素と複合しているこのような抗体を含んでいる、製品および／または組成物と、ある種の癌の予防および／または治療を目的としたそれらの利用方法とを含んでいる。
【背景技術】
【０００２】
ＰＥＴＡ−３またはＳＦＡ−１とも呼ばれるＣＤ１５１は、テトラスパニンファミリーに属する膜タンパク質の一つである（Ｂｏｕｃｈｅｉｘ  ｅｔ  Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，２００１，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５８，１１８９−１２０５、Ｈｅｍｌｅｒ，２００１，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５５，１１０３−１１０７）。ヒトにおいて、ＣＤ１５１は２５３個のアミノ酸を有し、４つの膜断片と、細胞外ループとも呼ばれる、２つの細胞外ドメインＥＣ１（１８個のアミノ酸、配列［４０〜５７］）およびＥＣ２（１０９個のアミノ酸、配列［１１３〜２２１］）とを含む。しかし、ヌクレオチド配列レベルでは、ＣＤ１５１の二つの変異体が今までに同定されていることに留意すべきであり、該変異体とは、一つは３９５位と４０９位にそれぞれヌクレオチドＡとＣを含むものであり（配列番号１）［Ｆｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｌｏｏｄ  ８６（４），１３４８−１３５５］、もう一つは、同じ位置に、ヌクレオチドＡとＣの代わりにヌクレオチドＧとＴを含むものである［Ｈａｓｅｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（５），３２５８−３２６３］。したがって、ペプチド配列レベルでの変異、すなわち、それぞれ１３２位と１３７位にあるＫ（Ｌｙｓ）残基とＰ（Ｐｒｏ）残基の、Ｒ（Ａｒｇ）残基とＳ（Ｓｅｒ）残基への変異が観察されることがある［Ｆｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｌｏｏｄ  ８６（４），１３４８−１３５５／Ｈａｓｅｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（５），３２５８−３２６３］。
【０００３】
ＣＤ１５１は多くの癌、たとえば肺癌［Ｔｏｋｕｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７，４１０９−４１１４］、結腸癌［Ｈａｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８９，１５８−１６７］、前立腺癌［Ａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ．１３，１７１７−１７２１］、または膵臓癌［Ｇｅｓｉｅｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１１，２８４０−２８５２］のような癌において過剰発現する。
【０００４】
さまざまなタイプの細胞におけるＣＤ１５１の機能と発現をインビトロで阻害するための、ＣＤ１５１を発現しないノックアウトマウス、抗ＣＤ１５１抗体、およびｓｉＲＮＡの利用によって、ＣＤ１５１が、細胞接着（Ｎｉｓｈｉｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２，１９３９−１９４４、Ｗｉｎｔｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １７，２７０７−２７２１）、細胞運動（Ｋｏｈｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９７，３３６−３４３）、細胞移動（Ｙａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  ９，２７５１−２７６５、Ｔｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９，３８１２−３８２０、Ｐｅｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１４，１１２６−１１３５、Ｋｌｏｓｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３６，４０８−４１６）、細胞浸潤（Ｋｏｈｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９７，３３６−３４３、Ｓｈｉｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．８５，１４８９−１５０６、Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１，２４２７９−２４２９２）、および血管新生（Ｙａｎｅｚ−Ｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４１，７９１−８０４、Ｓｉｎｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１２，８３３−８４４、Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ）といった、癌に関わる複数の現象に関与していることが示されている。
【０００５】
テトラスパニンの注目すべき特性の一つは、それらが互いに結し、その他多数の表面分子とも結合することで、構造化された高分子複合体を形成する能力である。これらの複合体の内部において、それぞれのテトラスパニンは一つまたは複数の表面分子と特異的に結合し、一つのテトラスパニンおよび一つのパートナー分子で構成される初期複合体を形成する。テトラスパニンは原形質膜の特徴的なミクロドメインを組織することができ、該ドメインにおいて、テトラスパニンは機能的に結合できるパートナー分子を集める。テトラスパニンが関与する相互作用の全体は「テトラスパニン・ネットワーク」または「テトラスパニン・ウェブ」と名付けられている。
【０００６】
ＣＤ１５１は細胞の表面でさまざまな膜タンパク質と相互作用する。ある種の洗浄剤の作用に抵抗性を有する非常に安定した複合体が、とりわけ、ラミニンの受容体であるインテグリンによって明らかにされており、より特徴的には、好ましいリガンドがラミニン５であるインテグリンα３β１またはα６β４によって明らかになっている（Ｙａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  ９，２７５１−２７６５、Ｌａｍｍｅｒｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００，７６１６−７６２１）。この結合には、ＣＤ１５１とインテグリンとの細胞外ドメインが関与する。ＥＣ２ループ内にある、ＣＤ１５１の配列ＱＲＤ［１９４〜１９６］は、この結合において非常に重要であるが、それは、この部位の変異によりある種のインテグリンとの相互作用の損失が引き起こされるからである（Ｋａｚａｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５８，１２９９−１３０９）。他方、ＣＤ１５１／インテグリンα６β４／ｃ−Ｍｅｔ（ＨＧＦ受容体）による機能的な三重複合体が、腫瘍細胞において明らかにされている（Ｋｌｏｓｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３６，４０８−４１６）。ＲＮＡ干渉による細胞の処理によってＣＤ１５１の発現が阻害されることによって、ＨＧＦによって誘発される細胞の成長と細胞移動の阻害が引き起こされる。
【０００７】
テトラスパニン・ネットワークの形成に必要な、同一の細胞の内部におけるＣＤ１５１とその他のテトラスパニンとの相互作用は、ＣＤ１５１の膜領域と原形質領域に依存すると考えられるが、それは、ＥＣ２ループの削除がＣＤ１５１とその他のテトラスパニンとの結合を断たないことが示されているからである（Ｂｅｒｄｉｔｃｈｅｖｓｋｉ，２００１，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１４，４１４３−４１５１）。
【０００８】
ＣＤ１５１は、さまざまなシグナル伝達経路、たとえばＰＩ４−キナーゼとの結合を介したホスホイノシチド経路（Ｙａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  ９，２７５１−２７６５）、ＦＡＫ、Ｓｒｃ、ｐ３８−ＭＡＰＫ、およびＪＮＫのリン酸化を介したｃ−Ｊｕｎシグナル伝達経路（Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、ＰＫＣによるインテグリンのリン酸化（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，２５００５−２５０１３）、ＲｈｏファミリーのＧＴＰａｓｅの活性化（Ｓｈｉｇｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６３，１６５−１７６）といった経路を変化させることで、細胞接着、細胞移動、および細胞浸潤といった現象を調節することができる。
【０００９】
細胞間の同種親和性型の相互作用も細胞運動とメタロプロテイナーゼＭＭＰ−９の発現が増大する原因である（Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。これらのＣＤ１５１−ＣＤ１５１細胞間相互作用は、ＦＡＫ、Ｓｒｃ、ｐ３８−ＭＡＰＫ、およびＪＮＫのリン酸化を介したｃ−Ｊｕｎの活性化を引き起こす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
これまで、ＣＤ１５１タンパク質の利点にも関わらず、唯一の治療目的の抗体、つまり５０−６モノクローナル抗体しか生成されていない。
【００１１】
ＣＤ１５１に対する５０−６モノクローナル抗体（ＩｇＧ１アイソタイプ）は、マウスにおいて、ＨＥｐ−３ヒト扁平上皮癌細胞を用いたサブトラクティブ免疫法（Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）によって生成されている（Ｔｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９，３８１２−３８２０）。
【００１２】
５０−６抗体は、ＣＤ１５１を過剰発現するようにトランスフェクトされたヒト子宮頸癌ＨｅＬａ細胞とＨＥｐ−３細胞の移動と、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）によって誘発される絨毛尿膜血管新生モデルにおける血管新生とをインビトロで阻害することができる。該抗体はニワトリの胚の２つのモデルにおいて、ＨＥｐ−３細胞の接種によって誘発される転移をインビボで阻害する（Ｔｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９，３８１２−３８２０）。これらのモデルにおいて、５０−６抗体の阻害活性は、肺の抽出物におけるｈｕＰＡ（ヒトウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子）タンパク質の活性を測定することで判定される。筆者らによると、この測定値は、肺におけるヒト細胞の存在を反映するものである。測定の後、細胞の接種の後に抗体を注入する「自然転移」と呼ばれるモデルにおいて、５０−６抗体によって誘発される転移（ニワトリ胚の肺におけるＨＥｐ−３細胞の播種）が、対照抗体と比較して７４％に減少すると推定され、細胞と抗体が同時に接種される「実験的転移」と呼ばれるモデルでは５７％に減少すると推定される。筆者らによると、インビボで見られる５０−６抗体の抗腫瘍特性は細胞増殖抑制作用または細胞傷害作用とは関係していないようであるが、それは、該抗体がＨＥｐ−３細胞のインビトロでの増殖に対してはいかなる作用も示さないからである。
【００１３】
５０−６抗体を産生するハイブリドーマは、ＡＴＣＣにおいてＣＲＬ−２６９６という番号で利用可能である（５０−６［ＰＴＡ−２２７］という番号で最初に寄託されたハイブリドーマ）。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
全般的な様相によると、本発明は、癌治療を対象とした医薬品を調製するために、ＣＤ１５１タンパク質と結合することができ、したがって腫瘍の成長を阻害することのできる、少なくとも一つの抗体またはその機能的断片の利用方法を対象としている。
【００１５】
いくつかの実験的研究によって、転移のサプレッサーまたはプロモーターとして作用する、転移形成におけるテトラスパニンの主要な役割が示されている。つまり、ＣＤ９、ＣＤ６３、またはＣＤ８２といったテトラスパニンのトランスフェクションによって癌株の潜在的な転移が減少する。逆に、テトラスパニンＣＤ１５１およびＣｏ−０２９の発現は、逆の効果を生じさせるようである。したがって、これらの２つのテトラスパニンは転移のプロモーターであると考えられる。これらの結果は、多くの癌において（乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、結腸癌、前立腺癌、黒色腫など）、ＣＤ９およびＣＤ８２が、転移のあるときには原発腫瘍ではあまり発現しないこと、およびそれらの発現の低下によって生存率の低さが予測されることを示した、さまざまな臨床研究と一致している。肺癌において、ＣＤ９とＣＤ８２の発現の双方の減少は、これら二つの抗原の一方だけの発現が減少したときよりも潜在的な転移がより大きいことと相関している。
【００１６】
いくつかのレトロスペクティブな研究によって、ＣＤ１５１の過剰発現が、肺癌、結腸癌、および前立腺癌のようないくつかの癌の攻撃性に関連しており、悪い予後診断の原因の一つとして考えられることが示されている（Ｔｏｋｕｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７，４１０９−４１１４、Ｈａｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８９，１５８−１６７、Ａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ．１３，１７１７−１７２１）。これらの場合、実際、生存率の平均は、腫瘍がＣＤ１５１を発現していない患者と比べ、腫瘍がＣＤ１５１を発現する患者において低い。
【００１７】
さまざまなヒト腫瘍株（ＨｅＬａ、ＲＰＭＩ１４７８８、Ａ１７２、ＨＴ１０８０）におけるＣＤ１５１の過剰発現は、対応する遺伝子のトランスフェクションによって誘発され、トランスフェクトされた細胞の運動、移動、および浸潤の増大を引き起こす（Ｔｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９，３８１２−３８２０、Ｋｏｈｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９７，３３６−３４３）。これらの現象は抗ＣＤ１５１抗体の存在下では阻害される。
【００１８】
他の様相によると、本発明による抗体の機能的断片は、たとえば、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片（ｓｃは一本鎖を意味する）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’ 断片、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片すなわち二重特異性抗体、あるいは、ポリ（エチレン）グリコール（「ペグ化」）といったポリ（アルキレン）グリコールの付加のような化学的修飾によって半減期が延長されたあらゆる断片（Ｆｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧ、もしくはＦａｂ’−ＰＥＧと呼ばれるペグ化された断片）（「ＰＥＧ」は英語名称ポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｈｌｅｎｅ）Ｇｌｙｃｏｌ）による）、または、リポゾーム、ミクロスフィア、もしくはＰＬＧＡへの包入によって半減期が延長されたあらゆる断片からなり、前記断片は通常、部分的ではあっても、該断片が由来する抗体の活性を示すことができる。
【００１９】
好ましくは、前記機能的断片は、該断片が由来する抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の部分的配列で構成されるか、あるいは該配列を含むものであり、前記部分的配列は、該配列が由来する抗体と同一の結合特異性と、十分な親和性、好ましくは該配列が由来する抗体の親和性の少なくとも１／１００に等しい、より好ましくは少なくとも１／１０の親和性を保持するために十分なものである。
【００２０】
このような機能的断片は、該断片が由来する抗体の配列の最低でも５つの連続するアミノ酸、好ましくは１０、１５、２５、５０、および１００個の連続するアミノ酸を含むものである。
【００２１】
好ましくは、これらの機能的断片はＦｖ、ｓｃＦＶ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）、ｓｃＦｖ−Ｆｃすなわち二重特異性抗体のタイプの断片であり、該断片は通常、該断片が由来する抗体と同一の固定特性を有している。本発明によると、本発明の抗体断片は、前述した抗体から、ペプシンもしくはパパインといった酵素による消化および／または化学的還元によるジスルフィド架橋の切断といった方法で得ることができる。また、本発明に含まれる抗体の断片は、当業者によってもよく知られている遺伝子組換え技術、または、たとえばＡｐｐｌｉｅｄ社によって提供されているようなペプチド自動合成器を用いたペプチド合成によって得ることもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の一つの様相によると、用いられる抗体はマウスモノクローナル抗体からなる。
【００２３】
本発明による抗体にはまた、キメラ抗体またはヒト化抗体も含まれる。
【００２４】
キメラ抗体とは、所与の種の抗体に由来する天然の可変領域（軽鎖および重鎖）と、該領域と結合した、前記所与の種とは異なる種の抗体の軽鎖および重鎖の定常領域とを含む抗体を意味する。
【００２５】
本発明にしたがって用いられるキメラタイプの抗体またはその断片は、遺伝子組換え技術を用いて調製することができる。たとえば、キメラ抗体は、プロモーターと、本発明による、ヒトではない、特にマウスのモノクローナル抗体の可変領域をコードする配列と、ヒト抗体の定常領域をコードする配列とを含んだ組換えＤＮＡをクローニングすることで得ることができる。このような組換え遺伝子によってコードされる本発明のキメラ抗体は、たとえばマウス−ヒトキメラであり、この抗体の特異性はマウスのＤＮＡに由来する可変領域によって決定され、そのアイソタイプはヒトのＤＮＡに由来する定常領域によって決定される。キメラ抗体の調製方法については、たとえばＶｅｒｈｏｅｙｎ  ｅｔ  ａｌ．（ＢｉｏＥｓｓａｙｓ，８：７４，１９８８）を参照することができる。
【００２６】
ヒト化抗体とは、ヒトではないものに由来する抗体に由来するＣＤＲ領域を含む抗体を指し、抗体分子のその他の部分は一つの（または複数の）ヒト抗体に由来している。さらに、骨格部分（ＦＲと称される）のいくつかの残基は、結合親和性を保持するために修飾することができる（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５，１９８６、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６，１９８８、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７，１９８８）。
【００２７】
ヒト化抗体またはその機能的断片は当業者に知られた技術で調製することができる（たとえば、Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５０：２８４４−２８５７，１９９２、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．，１０：１−１４２，１９９２、またはＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６９−１７５，１９９２に記載されている技術）。このようなヒト化抗体は、それらのインビボでの予防処置および／または治療処置の方法における使用に好ましい。その他のヒト化技術も当業者に知られており、該技術とは、たとえば、ＰＤＬにより記載されている「ＣＤＲ移植」の技術であり、該技術は、欧州特許第０４５１２６１号明細書、欧州特許第０６８２０４０号明細書、欧州特許第０９３９１２７号明細書、欧州特許第０５６６６４７号明細書、またはさらには米国特許第５５３０１０１号明細書、米国特許第６１８０３７０号明細書、米国特許第５５８５０８９号明細書、および米国特許第５６９３７６１号明細書の対象となっている。また、米国特許第５６３９６４１号明細書、米国特許第６０５４２９７号明細書、米国特許第５８８６１５２号明細書、および米国特許第５８７７２９３号明細書を引用することもできる。
【００２８】
驚くべきことに、そして当業者側の予想に反して、本発明は、血管新生および／または転移形成を阻害する能力とは独立して腫瘍細胞の増殖と原発腫瘍の成長を阻害することのできる、上述した抗ＣＤ１５１抗体またはその機能的断片のうちの一つの利用方法を初めて記載するものである。
【００２９】
したがって、本出願に記載される抗体は腫瘍の成長をごく早期に阻害する能力を有している。
【００３０】
この、本発明の対象である抗体の抗腫瘍活性は、ＣＤ１５１に対する抗体の新規でかつ予想外の特性を構成するが、それは、今までに記載されているいかなる抗ＣＤ１５１抗体もこのタイプの活性を有していないからである。したがって、本発明の対象である抗体は、以前に記載されている抗体と比べて、とりわけ５０−６抗体と比べて、異なる、かつ追加の特性を有するが、それは、この抗体の抗腫瘍特性が腫瘍細胞の増殖に対する効果とは関連しないからである。
【００３１】
この結果は、ＣＤ１５１と原発腫瘍の成長との関連性を、さらにはＣＤ１５１とインビボでの腫瘍細胞の増殖との関連性を初めて明らかにするものでもある。実際、今まではＣＤ１５１の前転移性の活性と前血管新生活性だけが記載されている。
【００３２】
器官または組織の細胞の無秩序な増殖は、癌の初期段階の一つである。腫瘍細胞は、対象となる器官または組織の内部における細胞増殖の正常な制約を受けることができなくなった細胞である。腫瘍の成長は指数関数的であり、腫瘍細胞は成長因子および血管新生因子の影響下において、過剰に増殖する。
【００３３】
主要な様相によると、本発明は、原発腫瘍の成長と腫瘍細胞の増殖とを阻害する能力を有する少なくとも一つの抗ＣＤ１５１抗体またはその機能的断片の利用方法に関するものである。
【００３４】
より特徴的には、本発明は、原発腫瘍の治療を目的とした医薬品を調製するための、ＣＤ１５１タンパク質と結合する能力を有する少なくとも一つの抗体またはその機能的断片の利用方法に関するものである。
【００３５】
さらに、本出願人は、あらゆる理論に縛られることなく、癌治療の枠組みにおける抗ＣＤ１５１抗体の利用が、血管新生の阻害だけではなく、ＣＤ１５１の転移促進活性の阻害という点でも利点を有していることを提唱する。
【００３６】
したがって、本発明は、腫瘍細胞における前記ＣＤ１５１タンパク質の転移促進活性を阻害する能力を有する上述した抗体またはその機能的断片の利用方法を説明するものである。
【００３７】
より特徴的には、本出願人は、この阻害は転移過程のさまざまな段階の阻害、とりわけ、細胞接着、細胞移動、および／または細胞浸潤といった段階の阻害として現れると考えている。
【００３８】
前記促進活性の通常の過程、より特徴的には、腫瘍播種および転移プロセスの過程は以下の通りである。
１／タンパク質分解酵素（メタロプロテイナーゼなど）による、ラミニン、コラーゲン、またはフィブロネクチンのような構造タンパク質で構成される基底膜および細胞外マトリクスの分解を必要とする、原発腫瘍細胞による支持組織への浸潤、
２／組織を通過して血流に入る、腫瘍細胞の移動、
３／血管壁への接着と器官内での定着、
４／血管からの脱出（浸潤の新たな過程）と新しい環境への適応（増殖および血管新生）である。
【００３９】
細胞移動は胚の発生の際に不可欠である。細胞移動は成体ではあまり多くないが、リンパ球、マクロファージ、および線維芽細胞といったある種のタイプの細胞は、成体において恒常性を維持するために、免疫応答、炎症、および創傷治癒の間も移動し続ける。しかしながら、病理学レベルでは、腫瘍細胞の移動は、転移段階への腫瘍の進行に大きく寄与する。一定数の化学走化性因子がこの移動の原因であり、該因子は、腫瘍細胞に由来するか、または宿主に由来する。これらの因子のうち、成長因子（とりわけ血管新生を刺激する因子）、コラーゲン分解ペプチド、ラミニンやフィブロネクチンのような接着タンパク質が挙げられる。
【００４０】
特徴的な様相によると、本発明は、腫瘍細胞の細胞移動を阻害する能力を有する少なくとも一つの抗ＣＤ１５１抗体またはその機能的断片の利用方法に関するものである。
【００４１】
浸潤は腫瘍の悪性度、つまり、腫瘍が元の場所からはみ出して隣接する組織や離れた組織に広がることを示す、主要な兆候である。浸潤性の特徴は細胞の通常の特性の消失の結果である。通常、大半の組織の細胞は、接着分子を用いるデスモソームと呼ばれる構造によって互いに接着しており、上皮では、該上皮の厚さを限定している基底膜にも接着している。腫瘍細胞はこれらの通常の特性を失い、新たな特性を得る。腫瘍細胞間の結合は解かれ、腫瘍細胞は互いに解放される。該細胞は移動性を得て、該移動性によって、ときには結合組織線維をたどりながら、最初の場所から離れて隣接組織へと浸透（浸潤）することが可能となる。通常は基底膜に接している上皮や、それに由来する悪性腫瘍にとって、この膜が、越えるべき最初の障害である。該膜は腫瘍細胞が分泌する酵素（プロテアーゼ、カテプシン）によって分解、溶解される。この基底膜の破壊は、通常は白血球によって分泌され、通常の活性から逸脱している酵素によって、強化されることがある。細胞の振る舞いにおけるこれらすべての生物学的および分子的な修飾が浸潤の条件である。
【００４２】
もう一つの様相によると、本発明は、腫瘍細胞の細胞浸潤を阻害することのできる、少なくとも一つの抗ＣＤ１５１抗体またはその機能的断片の利用方法に関するものである。
【００４３】
生物の細胞は互いに接着するとともに、該細胞を取り囲む細胞外マトリクスにも接着している。細胞接着は、細胞の生存、増殖、または分化といった生理学的な細胞の現象の大半に関与する遍在的なメカニズムであるが、同時に、該メカニズムは、たとえば癌や転移現象のようなさまざまな病理学的状況にも関与するものである。カドヘリンまたはインテグリンといった、細胞表面のさまざまなタンパク質が細胞接着に関与する。
【００４４】
好ましくは、本発明による利用方法は、主に細胞接着の阻害に基づくものである。
【００４５】
もう一つの様相によると、本発明は、腫瘍細胞の細胞接着を阻害することのできる、少なくとも一つの抗ＣＤ１５１抗体またはその機能的断片の利用方法に関するものである。
【００４６】
上述したように、ＣＤ１５１タンパク質はテトラスパニンファミリーに属しており、したがって、細胞外ループとも呼ばれる２つの細胞外ドメインＥＣ１（１８個のアミノ酸、配列［４０〜５７］）およびＥＣ２（１０９個のアミノ酸、配列［１１３〜２２１］）を含んでいる。
【００４７】
本発明によると、用いられる抗体は、細胞外ドメインに位置する少なくとも一つのエピトープと結合する能力を有している。好ましくは、前記抗体はＥＣ１ループおよび／またはＥＣ２ループに固定される。
【００４８】
より詳細には、本発明の好ましい実施態様では、ＣＤ１５１タンパク質のアミノ酸４０〜５７（配列番号６）とアミノ酸１１３〜２２１（配列番号４）にそれぞれ対応する細胞外ループ１（ＥＣ１）および／または２（ＥＣ２）に含まれるエピトープ、好ましくはＥＣ２に含まれるエピトープに結合する能力を有する、少なくとも一つの抗ＣＤ１５１抗体またはその機能的断片の利用方法が記載される。
【００４９】
ＥＣ１ループ［４０〜５７］は１８個のアミノ酸を含み、理論的には２００２．２Ｄａの分子量を有する。
【００５０】
ＥＣ２ループ［１１３〜２２１］はＮ−グリコシル化部位（Ａｓｎ１５９残基）と、３つのジスルフィド架橋を形成する６つのシステイン残基とを有している。テトラスパニン、とりわけＣＤ１５１のＥＣ２ループの構造モデルは、テトラスパニンＣＤ８１のＥＣ２ループの三次元構造に基づいて提案されている（Ｓｅｉｇｎｅｕｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，４００５５−４００６４）。このモデルによると、テトラスパニンは、比較的保存され、３つのαヘリックスで構成されている共通のフレームワークと、特異的な可変領域とを有している。ＣＤ１５１に関しては、このフレームワークは領域［１１３〜１５７］と［２０９〜２２１］からなり、可変領域は領域［１５８〜２０８］からなると考えられている。
【００５１】
ＥＣ２ループの可変領域は、インテグリンファミリーのタンパク質とのＣＤ１５１の特異的な相互作用に、より特徴的に関与すると考えられる。定方向変異実験によって、とりわけ、ラミニンの受容体である、ある種のインテグリン、たとえばインテグリンα３β１またはインテグリンα６β４とのＣＤ１５１の結合において、領域［１９３〜２０８］、より詳細にはトリペプチドＱＲＤ［１９４〜１９６］と１９２位のシステイン残基が重要であることが示されている（Ｋａｚａｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５８，１２９９−１３０９）。
【００５２】
より好ましくは、本発明は、ＣＤ１５１タンパク質の１９４位、１９５位、および１９６位（ＱＲＤ１９４〜１９６）にそれぞれあるアミノ酸であるグルタミン、アルギニン、アスパラギン酸を少なくとも含むＥＣ２領域のエピトープに結合する能力を有する、少なくとも一つの抗ＣＤ１５１抗体またはその機能的断片の利用方法を対象としている。
【００５３】
もう一つの様相によると、本発明が主として、モノクローナル抗体からなる少なくとも一つの抗ＣＤ１５１抗体またはその機能的断片の利用方法からなることを理解されたい。
【００５４】
「モノクローナル抗体」とは、ほぼ均質な抗体群に由来する抗体を意味する。より詳細には、群の個々の抗体は、場合によっては起こりうるわずかな変異を除いて同一であるが、該変異は自然に生じうるものであり、ごくわずかな割合で生じるものである。換言すれば、モノクローナル抗体は単一の細胞クローン（たとえばハイブリドーマ、均質な抗体をコードするＤＮＡ分子によってトランスフェクトされた真核宿主細胞、均質な抗体をコードするＤＮＡ分子によってトランスフェクトされた原核宿主細胞など）の増殖によって生じる均質な抗体からなり、該モノクローナル抗体は、通常、同一のクラスおよびサブクラスの重鎖と、単一のタイプの軽鎖とによって特徴づけられる。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原に対するものである。さらに、異なる決定基すなわちエピトープに対する異なる抗体を慣例的に含んだポリクローナル抗体の調製とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一のエピトープに対するものである。
【００５５】
本発明の特徴的な実施態様によると、用いられるモノクローナル抗体は、ＴＳ１５１抗体またはＴＳ１５１ｒ抗体から選択される。明細書の以下の記載において、ＴＳ１５１ｒとＴＳ１５１Ｒという表現は互換できるものとする。
【００５６】
したがって、本発明は、ＴＳ１５１抗体および／またはＴＳ１５１ｒ抗体からなる少なくとも一つの抗ＣＤ１５１抗体またはその機能的断片の利用方法を記載する。
【００５７】
より詳細には、ＴＳ１５１抗体は、少なくとも、
−配列がそれぞれ配列番号７、８、および９である、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３という３つの重鎖のＣＤＲと、
−配列がそれぞれ配列番号１１、１２、および１３である、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３という３つの軽鎖のＣＤＲ
を含むことで定義される。
【００５８】
もう一つの実施態様によると、ＴＳ１５１抗体は、配列番号１０の配列を含んだ重鎖と配列番号１４の配列を含んだ軽鎖を含むことを特徴としている。
【００５９】
以下の表１にこれらの要素をまとめる。
【００６０】
【表１】
0005757646.tif 000002
【００６１】
ＴＳ１５１ｒ抗体に関しては、これは、少なくとも、
−配列がそれぞれ配列番号１５、１６、および１７である、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３という３つの重鎖のＣＤＲと、
−配列がそれぞれ配列番号１９、２０、および２１である、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３という３つの軽鎖のＣＤＲ
を含むことで定義される。
【００６２】
もう一つの実施態様によると、ＴＳ１５１ｒ抗体は、配列番号１８の配列を含んだ重鎖と配列番号２２の配列を含んだ軽鎖を含むことを特徴としている。
【００６３】
以下の表２にこれらの要素をまとめる。
【００６４】
【表２】
0005757646.tif 000003
【００６５】
もう一つの実施態様にしたがって、以下の表３にＴＳ１５１抗体とＴＳ１５１ｒ抗体のヌクレオチド配列をまとめる。
【００６６】
【表３】
0005757646.tif 000004
【００６７】
前記抗体の生成は実施例１で詳述する。これらの２つの抗体は異なるエピトープに対するものであるが、それは、ＴＳ１５１はＣＤ１５１がインテグリンに結合しているときまたは細胞表面上で自由なときにＣＤ１５１を認識するのに対し（Ｃｈｏｍｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．３１２，９８３−９９５）、ＴＳ１５１ｒはＣＤ１５１−インテグリン複合体を認識しないからである（Ｓｅｒｒｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４０，１０３−１１１、Ｇｅａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ５８，１４１−１５３、Ｋａｚａｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５８，１２９９−１３０９、Ｓｔｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１５，１１６１−１１７３）。ＴＳ１５１ｒによって認識されるエピトープはＥＣ２ループに位置し、Ｑ１９４、Ｒ１９５、およびＤ１９６残基を有している（Ｋａｚａｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５８，１２９９−１３０９）。したがって、この抗体は、少なくとも部分的には、ＣＤ１５１の、インテグリンとの相互作用に関与する部位に対するものである。Ｃ１９２残基もＴＳ１５１ｒによるＣＤ１５１の認識に関与すると考えられる（Ｋａｚａｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５８，１２９９−１３０９）。ＴＳ１５１抗体のエピトープは、ＴＳ１５１ｒのエピトープとは異なってはいるが、正確には判定されていない。
【００６８】
ＴＳ１５１ｒ抗体によるヒトケラチノサイト（上皮細胞株ＨａＣａＴ）の治療は、細胞−細胞接触の消失、細胞骨格の再配列、インテグリンα６β４の細胞内再分布、そしてラミニン１での細胞移動の増加を引き起こす（Ｃｈｏｍｅｔｏｎ  ｅｔ．ａｌ．，２００６，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．３１２，９８３−９９５）。
【００６９】
より詳細には、好ましい用いられる抗体はＴＳ１５１抗体からなる。
【００７０】
好ましくは、癌治療の枠組みにおける抗ＣＤ１５１抗体の利用方法は、特に同一のＣＤ１５１受容体を過剰発現する癌において正当性が認められる。
【００７１】
このような癌は、結腸癌［Ｈａｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８９（２００３）：１５８−１６７］、肺癌、好ましくは小細胞肺癌ではない肺癌［Ｔｏｋｕｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７（２００１）：４１０９−４１１４］、前立腺癌［Ａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  １３（２００４）：１７］、および膵臓癌［Ｇｅｓｉｅｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１１（２００５）：２８４０−２８５２］からなる。
【００７２】
したがって、本発明は癌治療を目的とする上述した抗体の利用方法を特許請求の範囲に記載するものであり、前記癌は、好ましくは結腸癌、肺癌、前立腺癌、または膵臓癌からなる。
【００７３】
また、本発明は、抗体からなる化合物、またはそれらの誘導化合物もしくは機能的断片を活性成分として有する、薬学的組成物にも関するものであり、該組成物は、好ましくは賦形剤および／または薬学的に許容可能な担体を添加されている。
【００７４】
より詳細には、本発明は、さらに少なくとも一つの薬学的に許容可能な担体を含んだ薬学的組成物の調製を目的とした、本発明による抗体の利用方法を対象とするものである。
【００７５】
本明細書において、薬学的に許容可能な担体とは、製薬組成物に含まれるが副作用を引き起こさない一つの化合物または化合物の組み合わせを意味し、該担体によって、たとえば、一つまたは複数の活性成分の投与を容易にすること、生物における該活性成分の寿命および／もしくは効率を高めること、溶液へのその溶解度を高めること、またはその保存効率を向上させることが可能となる。これらの薬学的に許容可能な担体はよく知られており、選択される一つまたは複数の活性化合物の性質および投与方法に応じて当業者によって適合化されるものである。
【００７６】
好ましくは、これらの化合物は全身経路、特に静脈経路、筋肉経路、皮内経路、腹腔内経路、もしくは皮下経路、または経口経路によって投与される。より好ましくは、本発明による抗体を含んだ組成物は、時間間隔をあけて、数回投与される。
【００７７】
それらの最適な投与方法、薬量、および製剤形状は、患者に適合した治療の確立において通常考慮される基準、たとえば患者の肉体年齢または体重、全身状態の重篤度、治療への許容性、および確認されている副作用などに応じて決定することができる。
【００７８】
本発明では、活性成分として、ＣＤ１５１タンパク質と結合する能力を有する少なくとも一つの抗ＣＤ１５１抗体またはその機能的断片を含むことを特徴とする、癌治療のための組成物が説明される。
【００７９】
本発明では、活性成分として、ＣＤ１５１タンパク質と結合する能力および／またはその転移促進活性を阻害する能力を有する少なくとも一つの抗ＣＤ１５１抗体またはその機能的断片を含むことを特徴とする、癌治療のための組成物が説明される。
【００８０】
本発明では、活性成分として、原発腫瘍の成長を阻害することのできる少なくとも一つの抗ＣＤ１５１抗体またはその機能的断片を含むことを特徴とする、癌治療のための組成物が説明される。
【００８１】
本発明の他の様相では、ＴＳ１５１抗体またはＴＳ１５１ｒ抗体から選択されるモノクローナル抗体である少なくとも一つの抗ＣＤ１５１抗体またはその機能的断片を含んだ組成物が説明される。
【００８２】
本発明のもう一つの特徴によると、ＴＳ１５１抗体およびＴＳ１５１ｒ抗体またはそれらの機能的断片の組み合わせを含んだ組成物が特許請求の範囲に記載される。
【００８３】
文献から、ＣＤ１５１タンパク質は癌において、特に結腸癌［Ｈａｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８９（２００３）：１５８−１６７］、小細胞肺癌ではない肺癌［Ｔｏｋｕｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７（２００１）：４１０９−４１１４］、前立腺癌［Ａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  １３（２００４）：１７１７−１７２１］、および膵臓癌［Ｇｅｓｉｅｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１１（２００５）：２８４０−２８５２］において過剰発現することが判明している。
【００８４】
当然、上記リストは例として示すものであって、あらゆる癌がＣＤ１５１タンパク質を過剰発現し、したがって、本発明にしたがって治療することができると理解されるべきである。
【００８５】
本発明の補助的な他の実施態様は、同時利用、別々の利用、または時間間隔をあけた利用を目的とした組み合わせ製品として、細胞傷害／細胞増殖抑制剤および／またはモノクローナル抗体をさらに含んでいる、上述した組成物からなる。
【００８６】
したがって、本発明は、同時利用、別々の利用、または時間間隔をあけた利用を目的とした組み合わせ製品として、少なくとも一つの細胞傷害／細胞増殖抑制剤および／または細胞毒および／または放射性元素および／またはモノクローナル抗体をさらに含むことを特徴とする、上述した組成物にも関するものである。
【００８７】
「同時利用」とは、同一の剤形に含まれた、本発明による組成物の二つの化合物を投与することを意味する。
【００８８】
「別々の利用」とは、異なる剤形に含まれる、本発明による組成物の二つの化合物を一度に投与することを意味する。
【００８９】
「時間間隔をあけた利用」とは、それぞれが異なる剤形に含まれた、本発明による組成物の二つの化合物を連続して投与することを意味する。
【００９０】
通常、本発明による組成物は癌治療の効率を著しく高める。言い換えれば、本発明による抗体の治療効果は、細胞傷害剤の投与によって予期しないほど高まる。本発明による組成物によって生じる次に大きな利点は、より少ない活性成分の有効量を用いることが可能となることに関するものであり、このことによって、副作用、特に細胞傷害剤の影響が現れるリスクを避けることまたは減少させることが可能となる。さらに、本発明によるこの組成物によって、より早く期待される治療効果に達することが可能となる。
【００９１】
「抗癌治療剤」または「細胞傷害剤」とは、患者に投与されたときに、患者における癌の成長を治療または予防する物質であると理解される。このような活性剤の非限定的な例としては、「アルキル化」剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、分裂抑制剤、クロマチン機能の阻害剤、抗血管新生剤、抗エストロゲン、抗アンドロゲン、または免疫調節物質を挙げることができる。
【００９２】
このような活性剤は、たとえば、ＶＩＤＡＬにおいて、「細胞傷害性」の欄における癌腫学および血液学に関わる化合物についてのページで引用されており、参照によってこの文献に引用されるこれらの細胞傷害化合物は、ここでは好ましい細胞傷害剤として挙げられる。
【００９３】
「アルキル化剤」とは、細胞の内部のあらゆる分子、好ましくは核酸（たとえばＤＮＡ）と共有結合することができるかまたは該分子をアルキル化することができる、あらゆる物質を指す。このようなアルキル化剤の例としては、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、塩酸塩、ピポブロマン、プレドニムスチン、リン酸ナトリウム、もしくはエストラムスチンのようなナイトロジェンマスタード、シクロホスファミド、アルトレタミン、トロホスファミド、スルホホスファミド、もしくはイホスファミドのようなオキサザホスホリン、チオテパ、トリエチレンアミン、もしくはアルテトラミン（ａｌｔｅｔｒａｍｉｎｅ）のようなアジリジンもしくはエチレンイミン、カルムスチン、ストレプトゾシン、フォテムスチン、もしくはロムスチンのようなニトロソウレア、ブスルファン、トレオスルファン、もしくはインプロスルファンのようなスルホン酸アルキル、ダカルバジンのようなトリアゼン、またはさらに、シスプラチン、オキサリプラチン、もしくはカルボプラチンのようなプラチン複合体を挙げることができる。
【００９４】
「代謝拮抗剤」とは、ある種の活性、一般的にはＤＮＡ合成に干渉して、細胞の成長および／または代謝をブロックする物質を指す。代謝拮抗剤の例として、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、５−フルオロデオキシウリジン、カペシタビン、シタラビン、フルダラビン、シトシンアラビノシド、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、６−チオグアニン（６−ＴＧ）、クロロデオキシアデノシン、５−アザシチジン、ゲムシタビン、クラドリビン、デオキシコホルマイシン、およびペントスタチンを挙げることができる。
【００９５】
「抗腫瘍抗生物質」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはタンパク質の合成を予防または阻害することのできる化合物を指す。このような抗腫瘍抗生物質の例には、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ミトキサントロン、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、プリカマイシン、ミトマイシンＣ、ブレオマイシン、およびプロカルバジンが含まれる。
【００９６】
「分裂阻害剤」は、細胞周期および分裂の通常の進行を防ぐものである。通常、微小管阻害剤またはパクリタキセルおよびドセタキセルのような「タキソイド」は分裂を阻害する能力を有している。また、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンのようなビンカアルカロイドも、分裂を阻害する能力を有している。
【００９７】
「クロマチン機能阻害剤」または「トポイソメラーゼ阻害剤」とは、トポ−イソメラーゼＩおよびＩＩのようなクロマチンモデリングタンパク質の正常な機能を阻害する物質を指す。このような阻害剤の例には、トポイソメラーゼＩとしては、カンプトテシン、およびイリノテカンまたはトポテカンのようなその誘導体が含まれ、トポイソメラーゼＩＩとしては、エトポシド、リン酸エトポシド、およびテニポシドが含まれる。
【００９８】
「抗血管新生剤」とは、血管の成長を阻害するあらゆる薬剤、化合物、物質、または活性剤を指す。抗血管新生剤の例には、限定的ではないが、ラゾキシン、マリマスタット、バチマスタット、プリノマスタット、タノマスタット、イロマスタット、ＣＧＳ−２７０２３Ａ、ハロフジノン、ＣＯＬ−３、ネオバスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、サリドマイド、ＣＤＣ５０１、ＤＭＸＡＡ、Ｌ−６５１５８２、スクアラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、インターフェロン−α、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン−１２、ＩＭ８６２、アンジオスタチン、およびビタキシンが含まれる。
【００９９】
「抗エストロゲン」または「抗エストロゲン剤」とは、エストロゲンの作用を減少させ、該作用に拮抗し、または該作用を阻害するあらゆる物質を指す。このような活性剤の例は、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ヨードキシフェン、アナストロゾール、レトロゾール、およびエキセメスタンである。
【０１００】
「抗アンドロゲン」または「抗アンドロゲン剤」とは、アンドロゲンの作用を減少させ、該作用に拮抗し、または該作用を阻害するあらゆる物質を指す。抗アンドロゲンの例は、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、スピロノラクトン、酢酸シプロテロン、フィナステリド、およびシメチジンである。
【０１０１】
免疫調節物質は免疫系を刺激する物質である。このような免疫調節物質の例には、インターフェロンや、アルデスロイキン、ＯＣＴ−４３、デニロイキンジフチトクス、もしくはインターロイキン−２のようなインターロイキン、タソネルミンのような腫瘍壊死因子、または、レンチナン、シゾフィラン、ロキニメクス、ピドチモド、ペガデマーゼ、チモペンチン、ポリＩ：Ｃ、もしくは５−フルオロウラシルと組み合わせたレバミソールのようなその他のタイプの免疫調節物質が含まれる。
【０１０２】
より詳細については、当業者は「ｔｒａｉｔｅ  ｄｅ  ｃｈｉｍｉｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｑｕｅ，Ｖｏｌ．６，Ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒａｕｘ  ｅｔ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｄａｎｓ  ｌｅ  ｔｒａｉｔｅｍｅｎｔ  ｄｅｓ  ｃａｎｃｅｒｓ，ｅｄｉｔｉｏｎ  ＴＥＣ＆ＤＯＣ，２００３」という表題の、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｆｒａｎｃａｉｓｅ  ｄｅｓ  Ｅｎｓｅｉｇｎａｎｔｓ  ｄｅ  Ｃｈｉｍｉｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｑｕｅによって編集されたマニュアルを参照することができる。
【０１０３】
好ましいモノクローナル抗体は、受容体ＩＧＦ−ＩＲ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦなどのチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害する能力を有する単離された抗体（もしくは当業者に知られているその他のあらゆる抗腫瘍抗体）、または、前記受容体によって促進される増殖活性および／もしくは抗アポトーシス活性および／もしくは血管新生活性および／もしくは転移性播種の誘導活性を阻害する能力を有する該抗体の機能的断片および誘導化合物から選択される。
【０１０４】
特に好ましい実施態様において、本発明による組み合わせ製品としての前記組成物は、同時利用に際して前記細胞傷害剤が前記抗体に化学的に結合していることを特徴としている。
【０１０５】
特に好ましい実施態様において、本発明による前記組成物は、前記細胞傷害／細胞増殖抑制剤が、紡錘体の阻害剤または安定剤、好ましくはビノレルビンおよび／またはビンフルニンおよび／またはビンクリスチンから選択されることを特徴としている。
【０１０６】
前記細胞傷害剤と本発明による前記抗体の結合を促進するために、とりわけ、結合すべき二つの化合物の間に、ポリエチレングリコールのようなポリ（アルキレン）グリコールまたはアミノ酸のようなスペーサー分子を導入することができるか、または、その他の実施態様では、本発明による前記抗体と反応する能力を有する機能が導入されている前記細胞傷害剤の活性誘導体を用いることができる。これらの結合技術は当業者によく知られており、本明細書では詳述しない。
【０１０７】
本発明は、もう一つの様相では、少なくとも前記抗体の一つ、またはその誘導体化合物もしくは機能的断片の一つが細胞毒素および／または放射性元素と複合していることを特徴とする組成物に関するものである。
【０１０８】
好ましくは、前記毒素または前記放射性元素は腫瘍細胞の成長または増殖を妨げることができ、とりわけ、前記腫瘍細胞を完全に不活性化することができる。
【０１０９】
さらに好ましくは、前記毒素は、腸内細菌の毒素、とりわけ、シュードモナス菌の外毒素Ａである。
【０１１０】
治療に用いられる、抗体と好適に複合する放射性元素（または放射性アイソトープ）は、ガンマ線を放射する放射性アイソトープであり、好ましくは、ヨウ素１３１、イットリウム９０、金１９９、パラジウム１００、銅６７、ビスマス２１７、およびアンチモン２１１である。ベータ線およびアルファ線を放射する放射性アイソトープも治療に用いることができる。
【０１１１】
本発明による少なくとも一つの抗体またはその機能的断片と複合する毒素または放射性元素とは、前記毒素または前記放射性元素を少なくとも一つの前記抗体に結合させることを可能にするあらゆる手段、とりわけ、結合分子の導入を伴ってまたは伴わずに二つの化合物の共有結合によって結合させる手段を指す。
【０１１２】
全部または一部の複合元素の化学的（共有）結合、静電結合、または非共有結合を可能とする活性剤のうち、特に、ベンゾキノン、カルボジイミドを挙げることができ、より具体的には、ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］−カルボジイミド塩酸塩）、ジマレイミド、ジチオビス−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）、紫外線（Ｕ．Ｖ．）と反応し、好ましくは、Ｎ−［４−（アジドサリチルアミノ）ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−イル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、および６−ヒドラジノ−ニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）である、一つまたは複数のフェニルアジド基を伴う一つまたは複数の基を有する「架橋剤」と呼ばれる活性剤を挙げることができる。
【０１１３】
もう一つの結合形態、特に放射性元素についての結合形態は、二官能性イオンキレート剤を利用することにあり得る。
【０１１４】
これらのキレート剤のうち、金属、特に放射性金属と免疫グロブリンを結合させるために開発されたＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）またはＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）から誘導されるキレート剤を挙げることができる。したがって、ＤＴＰＡおよびその誘導体を炭素鎖上においてさまざまな基で置換することで、リガンド−金属複合体の安定性と剛性を高めることができる（Ｋｒｅｊｃａｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７７）、Ｂｒｅｃｈｂｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）、Ｇａｎｓｏｗ（１９９１）、米国特許第４８３１１７５号明細書）。
【０１１５】
たとえば、医学および生物学で長い間、遊離形態また金属イオンとの複合体の形態で非常に幅広く使われているＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）およびその誘導体は、金属イオンとの安定したキレートを形成し、癌治療における放射性免疫複合体を発達させるための抗体のような、治療上または診断上の利点を有するタンパク質と結合するという、注目すべき特徴を有している（Ｍｅａｓｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）、Ｇａｎｓｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０））。
【０１１６】
さらに、本発明は、医薬品の調製を目的とした本発明による組成物の利用方法も含むものである。
【０１１７】
したがって、本発明は、より特徴的には、癌治療を対象とした医薬品の調製を目的とした、上述の組成物の利用方法を対象とするものである。予防および／または治療することのできる癌のうち、結腸癌、肺癌、前立腺癌、または膵臓癌が好ましい。
【０１１８】
さらに、特に進歩的かつ好適な様相によると、本発明は、原発腫瘍の治療を目的とした医薬品を調製するための、上述した組成物の利用方法を対象とするものである。
【０１１９】
また、本発明は、ＣＤ１５１受容体を発現するかまたは過剰発現する細胞への生物学的に活性な化合物の特異的なターゲティングのための、医薬品の調製を目的とした、本発明による抗体の利用方法も対象としている。
【０１２０】
ここでは、生物学的に活性な化合物とは、細胞活性、特に細胞の成長、増殖、遺伝子の転写または翻訳を変化させる、とりわけ阻害する能力を有する、あらゆる化合物を指すものである。
【０１２１】
本発明のその他の特徴と利点は、実施例および以下に説明する図面を伴う以下の記載において明らかになるものである。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】図１はＥＣ１ループおよびＥＣ２ループが明示された配列である、ＣＤ１５１タンパク質のヌクレオチド配列およびタンパク質配列を示している。
【図２】図２は、ＣＤ１５１タンパク質が構成の一部であるテトラスパニンの構造、特に二つの細胞外ループＥＣ１およびＥＣ２を示す概略図である。
【図３】図３は、Ａ５４９同所性モデルにおけるＰＢＳと対照抗体との比較を示している。
【図４】図４は、同所性モデルにおけるＴＳ１５１抗体のインビボでの抗腫瘍活性の評価を示している。免疫不全マウス（ｎ＝１０）に、胸膜内経路によって１×１０６個のＡ５４９細胞を移植した。移植の７日後、マウスを、５００μｇの攻撃投与量のＴＳ１５１抗体を用いて腹腔内経路で処置し、続いて、週に二回、５週間にわたって、マウス毎に２５０μｇの投与量で処理した。同一の投与計画に従い、対照群はＰＢＳを注射した。
【図５】図５は、前立腺癌を有する患者におけるＣＤ１５１分子の発現を示している。各記号は一人の患者の研究に対応し、各患者について、上部パネルは腫瘍に隣接する正常組織に対応し、下部パネルは腫瘍組織に対応している。
【図６】図６は、肺癌を有する患者におけるＣＤ１５１分子の発現を示している。各記号は一人の患者の研究に対応し、各患者について、上部パネルは腫瘍に隣接する正常組織に対応し、下部パネルは腫瘍細胞に対応している。
【図７】図７は、ＰＣ３異種移植モデルにおけるＴＳ１５１抗体およびＴＳ１５１Ｒ抗体のインビボでの活性を示している。ＰＣ３細胞をスイスヌードマウス（ｎ＝６）に皮下移植した。細胞移植の５日目後、マウスに腹腔内経路によって、２ｍｇ／マウスの攻撃投与量の試験抗体を投与し、続いて、１ｍｇ／マウスの投与量のこれらの抗体を週に二回投与した。腫瘍の容積をπ／６×長さ×幅×厚みという式によって評価し、結果の統計的評価にマン・ホイットニー検定を実施した。
【図８】図８は、ウェスタンブロット法によるヒト型のＣＤ１５１に対するＴＳ１５１抗体およびＴＳ１５１ｒ抗体の特異性の評価を示している。
【図９】図９は、ラミニン５へのＡ５４９細胞の接着の阻害を示している。Ａ／さまざまな抗インテグリン抗体による細胞接着の阻害。Ｂ／ＴＳ１５１／抗インテグリンα３抗体の組み合わせによる細胞接着の阻害。
【実施例１】
【０１２３】
実施例１：ＴＳ１５１ｒ抗体およびＴＳ１５１抗体の生成
ＴＳ１５１ｒ抗体の生成
ＴＳ１５１ｒ抗体を生成するため、１０７個のＨｅＬａ細胞を用い、ＢＡＬＢ／ｃマウスを腹腔内経路によって免疫した。３回の免疫と最後の追加免疫注射の後、マウスの脾臓細胞を、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎによって説明されている従来的な技術によってＰ３Ｘ６３ＡＧ８骨髄腫細胞と融合させた（５×１０７個の脾臓細胞／３×１０７個の骨髄腫細胞）。融合により生じたハイブリドーマの上澄みを、フローサイトメトリーによって、ＨｅＬａ細胞を認識する能力についてスクリーニングし、次に、洗浄剤Ｂｒｉｊ９７の存在下で調製したＨｅＬａ細胞の溶解物からＣＤ１５１を免疫沈降させる能力と、ＣＤ９を共免疫沈降させる能力とに関してスクリーニングした。ＴＳ１５１ｒ抗体はこれらのさまざまな特性を有することが明らかとなった。
【０１２４】
ＴＳ１５１抗体の生成
ＴＳ１５１抗体を生成するために、１０７個のＪｕｒｋａｔ細胞と、１０７個のＨＥＬ細胞を用い、腹腔内経路でＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した（２回の免疫）。Ｊｕｒｋａｔ細胞とＨＥＬ細胞の溶解物から得たＡＤＡＭ１０タンパク質を含んだタンパク質複合体を用いた最後の追加免疫注射の後、脾臓細胞を、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎによって説明されている従来的な技術によってＰ３Ｘ６３ＡＧ８骨髄腫細胞と融合させた（５×１０７個の脾臓細胞／３×１０７個の骨髄腫細胞）。融合によって生じたハイブリドーマの上澄みを、まず、フローサイトメトリーによって、Ｊｕｒｋａｔ細胞とＨＥＬ細胞を認識する能力についてスクリーニングした。次に、洗浄剤Ｂｒｉｊ９７の存在下で調製した細胞溶解物からＣＤ１５１を免疫沈降させる能力と、その他のテトラスパニンを共免疫沈降させる能力に関してＴＳ１５１抗体を選別した。
【実施例２】
【０１２５】
実施例２：Ａ５４９同所性モデルにおけるＴＳ１５１抗体とＴＳ１５１ｒ抗体の抗腫瘍活性のインビボでの評価
材料と方法
ＣＤ１５１タンパク質の発現を確認した後（データは示していない）、ＡＴＣＣに由来するＡ５４９細胞を、Ｆ１２Ｋ培地、１０ｍＭのグルタミン、１０％ＦＣＳにおいて通常通りに培養した。これらの細胞を移植の２日前に分裂させることで、該細胞が成長の指数増殖期となるようにした。移植に関しては、７週齢の免疫不全マウスに麻酔をかけた後、１×１０６個のＡ５４９細胞を胸膜内経路で投与した。原発腫瘍は急速に成長し、４日で、縦隔、肺、および隔壁を含む、注射部位に隣接する構造に侵入した。病気をより良く模倣するために、治療の開始は細胞移植の７日後にようやく初めて、腹腔内経路によって開始した。５００μｇ／マウスの攻撃投与量を注射した後、精製したＴＳ１５１抗体を週に２回、５週間にわたって、２５０μｇ／マウスの投与量で投与した。先に行った実験によって、ＩｇＧ１アイソタイプの対照を投与しても動物の生存率にいかなる影響もないことが示されているため、ＰＢＳを投与したマウスの群を対照として入れた。
【０１２６】
図３は、予備データに由来するものであり、抗ＣＤ１５１抗体で観察される活性の特異性を示している。実際、アイソタイプの対照として用いたマウスのＩｇＧ１（ｍＩｇＧ１）による動物の治療は、このＩｇＧ１が、この抗体の担体として用いたＰＢＳを注射した動物の生存率にいかなる影響も有していないことを示している。
【０１２７】
このモデルの評価パラメータは動物の生存率であり、抗腫瘍活性は、Ｔ／Ｃ％＝治療した動物の生存率の平均／対照群の動物の生存率の平均×１００という計算によって表される。１２５％以上のＴ／Ｃ％が製品の活性を示すと考えられている。
【０１２８】
結果
図４は、計算されたＴ／Ｃ％が１４０％である、ＴＳ１５１抗体の抗腫瘍活性を示している。
【実施例３】
【０１２９】
実施例３：Ａ５４９同所性モデルにおけるＴＳ１５１抗体と５０−６抗体のインビボでの抗腫瘍活性の比較
材料と方法
実施したプロトコルは上記実施例２と同じである。
【０１３０】
結果
得られたデータは、ＴＳ１５１抗体が５０−６抗体の示したものを明らかに上回る抗腫瘍活性を有することを明らかに示しており、該５０−６抗体は、１１８のＴ／Ｃ％、すなわち１２５％という閾値よりも低い値しか示さなかった（データは示していない）。
【０１３１】
得られた結果、つまり上記で定義した計算によるＴ／Ｃ％を、以下の表４に示す。
【０１３２】
【表４】
0005757646.tif 000005
【実施例４】
【０１３３】
実施例４：ＣＤ１５１分子の発現の研究
前立腺癌または肺癌を有する患者に由来するヒト組織のサンプルにおいて、ＣＤ１５１タンパク質の発現を免疫組織化学によって研究した。これらの患者については、腫瘍に隣接する正常組織のスライドも利用可能であり、したがって、腫瘍組織対正常組織の発現レベルを較正するために該スライドも含めた。
【０１３４】
これらの実験において、市販の「組織アレイ」タイプのスライドを用いた。脱ろう後、ペプシンを含んだ酵素溶液（Ｌａｂｖｉｓｉｏｎ、品番ＡＰ−９００７−００５）を用いて抗原のアンマスキングを３０℃で行った。この段階の後には、０．３％の過酸化水素水溶液（Ｓｉｇｍａ）において、切片のインキュベーションによって内因性ペルオキシダーゼを取り除く過程を行なった。Ｕｌｔｒａ−Ｖ−Ｂｌｏｃｋ溶液（Ｌａｂｖｉｓｉｏｎ、品番ＴＡ−１２５−ＵＢ）を用いて非特異的部位の飽和を行い、市販のマウス抗ＣＤ１５１抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃｈ、品番ＭＣＡ１８５６）を５μｇ／ｍｌの最終濃度で用いて標識した。マウスのＩｇＧ１アイソタイプの対照抗体（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、品番Ｘ０９３１）を実験の陰性対照として用いた。標識の視覚化を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｄｕａｌ  Ｌｉｎｋ視覚化システム（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、品番Ｋ４０６１）によって行い、ペルオキシダーゼの基質であるＤＡＢの基準は、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎのＳ３３０９である。
【０１３５】
図５に示した結果は、前立腺癌を発症している何人かの患者がＣＤ１５１分子を過剰発現していることを示している。この過剰発現は試験した患者の２０％で非常に著しいか（患者ＡおよびＣ）または穏やか（患者ＡおよびＤ）であるとすることができる。内皮細胞レベルを除き、対応する正常な前立腺組織はＣＤ１５１を発現しないかまたはほとんど発現せず、発現した場合にも、腺タイプの構造に限定されていると考えられることに注目すべきである。患者ＥはＣＤ１５１を発現しない腫瘍の例である。
【０１３６】
肺癌の場合（図６）、穏やかな発現（患者Ａ）から強い発現（患者Ｂ）が正常な肺組織のいくつかの細胞で観察された。しかし、腫瘍組織は強く標識された細胞の非常に高い密度を示している（患者ＡおよびＢ）。患者ＣはＣＤ１５１を発現しない腫瘍の例である。
【実施例５】
【０１３７】
実施例５：ヌードマウスにおける皮下移植したＰＣ３腫瘍のインビボでの成長に対するＴＳ１５１抗体およびＴＳ１５１Ｒ抗体の効果
前立腺の「組織アレイ」において免疫組織化学によって得られた結果を考慮して、ＰＣ３腫瘍の異種移植片に対する抗ＣＤ１５１抗体の評価を計画した。ＰＣ３株は、ＡＴＣＣに由来する、アンドロゲンに依存しない前立腺株であり、Ｆ１２Ｋ培地＋１０％ＦＣＳ＋Ｌ−グルタミンで培養した。評価のために、５×１０６個のＰＣ３細胞をスイスヌードマウスの右脇腹に移植した。移植の５日後、腫瘍の容積に基づいて動物を無作為抽出し、３つの比較群に配分した。選択した移植動物群における腫瘍の容積は、治療０日目で４１ｍｍ３から４７ｍｍ３であった（π／６×長さ×幅×厚みという式で計算した容積）。それから、動物に、試験すべき精製した抗体またはＰＢＳを投与した。抗体の投与量および注射の頻度は、２ｍｇの攻撃投与量／投与の抗体で、１ｍｇの維持投与量／投与を週に２回である。
【０１３８】
図７に示した結果は、試験した二つの抗体（ＴＳ１５１およびＴＳ１５１Ｒ）が同様に振る舞い、スイスヌードマウスの皮下位置に移植されたＰＣ３腫瘍の成長を非常に著しく阻害することを表している。以下の表５にこれらの結果の統計分析結果をまとめる。
【０１３９】
【表５】
0005757646.tif 000006
【０１４０】
図８に示している平行して行った研究は、マウス受容体とのいかなる交差反応も示すことなく、ＴＳ１５１抗体とＴＳ１５１Ｒ抗体がヒトのＣＤ１５１分子を特異的に認識することを表している。したがって、この所見は、ヌードマウスにおける異種移植片モデルで観察された活性が、移植されたヒトの組織に対する直接的な効果にのみ因ると考えられることを示唆しており、したがって、ＴＳ１５１抗体およびＴＳ１５１Ｒ抗体の、腫瘍間質細胞またはマウスの内皮細胞とのあらゆる干渉を排除している。また、ＴＳ１５１およびＴＳ１５１Ｒは二つのマウスＩｇＧ１であり、したがって、当業者に知られているように、観察された活性が、マウスにおいてマウスＩｇＧ２ａ型抗体によって特に媒介される、ＡＤＣＣタイプとＣＤＣタイプのエフェクター機能に関連している可能性はほとんどない。
【０１４１】
したがって、これらの結果全体は、ＴＳ１５１抗体およびＴＳ１５１Ｒ抗体によるインビボでの腫瘍細胞の増殖の阻害に直接関連する活性メカニズムに合致している。
【実施例６】
【０１４２】
実施例６：ＴＳ１５１抗体およびＴＳ１５１ｒ抗体の特異性
ウェスタンブロットによってＴＳ１５１抗体とＴＳ１５１ｒ抗体の特異性を評価した。ヒトとマウスの、肺、膵臓、および結腸の組織の溶解物（Ｂｉｏｃｈａｉｎ、１０μｇの全タンパク質）、ならびに、段階的に増加する量のＨＴ−２９細胞溶解物（１０、２０、および５０μｇの全タンパク質）を、４〜１２％アクリルアミドゲル（ＢｉｏＲａｄ）の上に置いた。電気泳動の後（非還元条件）、タンパク質をニトロセルロース膜に移した。次に、転写膜を、精製したＴＳ１５１抗体とＴＳ１５１ｒ抗体と共にインキュベートし、そして、ペルオキシダーゼに結合したマウスのウサギ抗Ｉｇポリクローナル抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてインキュベートした後に、ＥＣＬタイプの視覚化を行った。
【０１４３】
ＴＳ１５１抗体およびＴＳ１５１ｒ抗体は、ＨＴ−２９細胞とさまざまなヒト由来組織の溶解物におけるＣＤ１５１のウェスタンブロットによる認識で確認されたように（図８）、ヒト型のＣＤ１５１に対する特異性を示した。マウスから採取したさまざまな組織の溶解物においてマウスのＣＤ１５１に対する反応性がないことが、ヒト型のＣＤ１５１に対するＴＳ１５１抗体とＴＳ１５１ｒ抗体の特異性を確証している。
【実施例７】
【０１４４】
実施例７：細胞接着の阻害
ＣＤ１５１が結合することのできるインテグリンα３β１とインテグリンα６β４のリガンドであるラミニン５に対する腫瘍細胞の接着実験を、９６ウェルプレートで行った。ラミニン５（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、１μｇ／ｍｌで２００μｌ）を３７℃で１時間固定した後、ウェルに２ｍｇ／ｍｌ（２００μｌ、３７℃で１時間）のＢＳＡを満たした。懸濁させたＡ５４９細胞を５−クロロメチルフルオレセインジアセテート（ＣＭＦＤＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、抗体の存在下（１００μｌ）または不存在下で、ウェルあたり１０００００個の細胞（１００μｌ）の割合で加えた。１５分、３０分、または６０分にわたって３７℃でインキュベートした後、接着していない細胞を除去した。ルミノメーター（Ｍｉｔｈｒａｓ、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）を用いた化学発光の読み取りの後、接着した細胞のパーセンテージをＣＭＦＤＡで標識した細胞のスケールを用いて判定した。抗ＣＤ１５１抗体ＴＳ１５１および抗インテグリンα３抗体Ｐ１Ｂ５、抗α６抗体ＮＫＩ−Ｇｏ３、および抗β４抗体ＡＳＣ−３（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を、２０μｇ／ｍｌの最終濃度で評価した。大腸菌の膜タンパク質に対する９Ｇ４抗体をアイソタイプの対照として用いた。
【０１４５】
抗インテグリンα３抗体Ｐ１Ｂ５がラミニン５へのＡ５４９細胞の接着を阻害するのに対し（図９Ａ）、抗インテグリンα６抗体ＮＫＩ−Ｇｏ３および抗インテグリンβ４抗体ＡＳＣ−３は同一のリガンドへのＡ５４９細胞の接着を阻害しなかった。しかし、時間に応じた阻害の消失が確認された。Ｐ１Ｂ５によって誘発される阻害は、実際１５分では９０％を超えているが、１時間後にはおよそ２０％に落ちる。Ｐ１Ｂ５抗体と抗インテグリンα６抗体ＮＫＩ−Ｇｏ３または抗インテグリンβ４抗体ＡＳＣ−３との結合によって、１時間後の強い接着阻害を維持することが可能となる。すなわち、該阻害は、抗α６抗体との結合では９０％を超え、抗β４抗体との組み合わせではおよそ７０％である。これらの結果は、Ａ５４９細胞が、まずインテグリンα３β１を介してラミニン５に接着し、次にインテグリンα６β４を介して接着することを証明している。
【０１４６】
抗ＣＤ１５１抗体ＴＳ１５１は単独で使ったときにはＡ５４９細胞のラミニン５への接着を阻害しない（図９Ｂ）。次に、Ａ５４９細胞の接着に対するＴＳ１５１とＰ１Ｂ５の組み合わせの効果を評価し、上述した組み合わせと比較した。このＴＳ１５１／Ｐ１Ｂ５の組み合わせは、抗α６抗体／抗α３抗体および抗β４抗体／抗α３抗体の結合に匹敵する結果を示した。実際、１時間後にもおよそ８０％の接着阻害の維持が観察された。したがって、ＴＳ１５１抗体は、インテグリンα６β４に対するアンタゴニスト効果を介して、Ａ５４９細胞の接着を阻害する能力を有していると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０１４７】
【非特許文献１】Ｂｏｕｃｈｅｉｘ  ｅｔ  Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，２００１，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５８，１１８９−１２０５
【非特許文献２】Ｈｅｍｌｅｒ，２００１，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５５，１１０３−１１０７
【図１】
0005757646.tif 000007
【図２】
0005757646.tif 000008
【図３】
0005757646.tif 000009
【図４】
0005757646.tif 000010
【図５】
0005757646.tif 000011
【図６】
0005757646.tif 000012
【図７】
0005757646.tif 000013
【図８】
0005757646.tif 000014
【図９Ａ】
0005757646.tif 000015
【図９Ｂ】
0005757646.tif 000016
【配列表】
0005757646000001.app