(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
スピンラベル化アミノ酸からなる、電子スピン共鳴イメージング（ＥＳＲＩ）用造影剤。
【請求項２】
アミノ酸がメチオニンである、請求項１に記載のＥＳＲＩ用造影剤。
【請求項３】
スピンラベル化アミノ酸を１０ｍＭ以上含有する液体である、請求項１又は２のいずれかに記載のＥＳＲＩ用造影剤。
【請求項４】
悪性腫瘍を画像化するための造影剤である、請求項１〜３のいずれかに記載のＥＳＲＩ用造影剤。
【請求項５】
悪性腫瘍が悪性脳腫瘍である、請求項４に記載のＥＳＲＩ用造影剤。
【請求項６】
アミノ酸をスピンラベルする工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載のＥＳＲＩ用造影剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電子スピン共鳴イメージングにおける造影剤に関する。より詳細に、本発明は、生体内にある腫瘍の局在および質的診断を目的とした、スピンラベル化された細胞膜形成に必須なアミノ酸を利用した電子スピン共鳴イメージング用造影剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
電子スピン共鳴イメージング（以下、「ＥＳＲＩ」と省略する場合もある。）とは、不対電子を有する原子や分子であるフリーラジカルを特異的且つ直接的に検出することを可能にする電子スピン共鳴法（ＥＳＲ）法を利用した画像化方法である。これまでに、ループギャップ共振器によるＥＳＲＩを利用した生体内での酸化ストレス・レドックス代謝部位のイメージング等が試みられている。
【０００３】
例えば、脳虚血後再灌流（非特許文献１）や自然発生高血圧 (非特許文献２)の動物モデルに、血液脳関門（ｂｌｏｏｄ  ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ；ＢＢＢ）を容易に通過するスピンプローブ剤；３−ｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−２，２，５，５−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ−１−ｏｘｙｌ(ＭＣ−ＰＲＯＸＹＬ)を全身投与すると、病変部では対照（正常）と比較し、その消失速度が増加していることがＥＳＲＩで捉えられたことが報告されている。これらの現象は、活性酸素種が発生している部位では抗酸化能が強化されており、新たに投与されたラジカルはより早く消去されることに起因すると考えられている。
【０００４】
非特許文献３、４では、非特許文献１、２と同様の手法で、マウスの下肢に植え込んだ腫瘍における活性酸素種の発生を示している。
【０００５】
以上のような従来のＥＳＲＩの医療分野への応用は、全てニトロキシルラジカルのような物質をスピンプローブ剤として用い、その消失を経時的に画像で追うことで、間接的に生体内での活性酸素種の発生及びその分布を知ることであった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Yamato et al., Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism，29, p.1655-1664, 2009
【非特許文献２】Lee et al., Hypertens Res. Vol. 27, No. 7, p.485-492, 2004
【非特許文献３】Kuppusamy et al., Cancer Research, 58, p.1562-1568, April 1, 1998
【非特許文献４】Takeshita et al., Cancer Research, Vol. 70, No. 10, p. 4133-4140, May 4, 2010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のような現状の下、特に腫瘍領域で、本発明は、従来とは異なるアプローチによる新たなＥＳＲＩを用いた画像化手段及びそれに関連した新たな技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、ＥＳＲＩの医療分野への応用について鋭意研究を重ねた結果、従来のようにスピンプローブ剤を投与するのではなく、活性酸素種の発生が予想される病変部において、消費される代謝物質を予めスピンラベル化し、それを生体内に導入することにより、抗酸素能を上回ったラジカルが蓄積し、本来の意味での造影剤として、病変部の画像化が可能性になるという新たな発想に至った。そして、本発明者等は、腫瘍に対する集積性を有するアミノ酸にラジカルを有する物質でラベル化し、それを腫瘍細胞に取り込ませ、当該細胞におけるスピンラベル化された化合物のＥＳＲスペクトルを測定し、更にはラジカル消去剤であるＬ‐アスコルビン酸で速やかに消去できることを確認した。本発明は、かかる知見に基づいて完成した発明である。
【０００９】
代表的な本発明は以下の通りである。
項１．
スピンラベル化アミノ酸からなる、電子スピン共鳴イメージング（ＥＳＲＩ）用造影剤。
項２．
アミノ酸がメチオニンである、項１に記載のＥＳＲＩ用造影剤。
項３．
スピンラベル化アミノ酸を１０ｍＭ以上含有する液体である、項１又は２のいずれかに記載のＥＳＲＩ用造影剤。
項４．
悪性腫瘍を画像化するための造影剤である、項１〜３のいずれかに記載のＥＳＲＩ用造影剤。
項５．
悪性腫瘍が悪性脳腫瘍である、項４に記載のＥＳＲＩ用造影剤。
項６．
項１〜５のいずれかに記載のＥＳＲＩ用造影剤及びラジカル消去剤を含む、ＥＳＲＩ用キット。
項７．
アミノ酸をスピンラベルする工程を含む、項１〜５のいずれかに記載のＥＳＲＩ用造影剤の製造方法。
項８．
スピンラベル化アミノ酸を悪性腫瘍を患う患者に投与する工程を含む、悪性腫瘍の画像化方法。
項９．
電子スピン共鳴イメージングで画像化する工程を含む、項８に記載の画像化方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の造影剤に組み込んだラジカル種は安定であり、細胞膜の透過性にも優れているため、ＥＳＲ法を用いて簡便且つ非侵襲的にアミノ酸の生体内における移動や変化を画像として追跡できる。特に、本発明の造影剤は、悪性腫瘍への集積性を有するため、生体における悪性腫瘍の分布や増殖の有無の測定、更には悪性腫瘍の治療有効性の視覚的な測定を可能にする。これは、悪性腫瘍におけるアミノ酸を取り込む速度が、その他の細胞よりも速いことに起因する。
【００１１】
また、本発明の造影剤は、放射性物質によるラベル化を必要としないため、従来の陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）用のトレーサーと比較して、患者や医療スタッフの被曝の心配はなく、検査が終了次第速やかにＬ‐アスコルビン酸等のラジカル消去剤によってラジカル化アミノ酸を消去できるので、安全性及び取り扱い性にも優れている。更に、ＰＥＴ用トレーサーの作成には、非常に高価なシンクロトロン加速器が身近に必要となり、ＰＥＴカメラも含めて、その利用が非常に高価なものになる反面、ＥＳＲ腫瘍検出法では、その装置製作費用が２桁から３桁ほど安価である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ラジカル化メチオニン水溶液１５ｍＭについて測定したＥＳＲスペクトルを示す。
【図２】図２は、ラジカル化メチオニン（１０ｍＭ）を取り込ませた腫瘍細胞について測定したＥＳＲスペクトルを示す。
【図３】図３は、ラジカル化メチオニン（１５ｍＭ）を取り込ませた腫瘍細胞について測定したＥＳＲスペクトルを示す。
【図４】図４は、ラジカル化メチオニン（２０ｍＭ）を取り込ませた腫瘍細胞について測定したＥＳＲスペクトルを示す。
【図５】図５は、ラジカル化メチオニン（１５ｍＭ）を取り込ませた腫瘍細胞について測定したＥＳＲスペクトル（Ａ）と、Ｌ‐アスコルビン酸１５ｍＭの取り込みによりＥＳＲスペクトルが消去されたこと（Ｂ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．電子スピン共鳴イメージング用造影剤
一実施形態において、本発明は、スピンラベル化されたアミノ酸からなるＥＳＲＩ用造影剤である。アミノ酸をスピンラベル剤で標識することにより、生体内に導入された当該アミノ酸をＥＳＲ法で検出することが可能となり、検出したシグナルを画像化することによって、その挙動を画像化することができる。
【００１４】
本発明において使用されるアミノ酸としては、細胞に取り込まれるアミノ酸であれば特に制限されない。そのようなアミノ酸には、α−アミノ酸が含まれるが、これ以外にも、α−アミノイソブチル酸、α−アミノシクロブタン−１−カルボン酸、α−アミノシクロペンタン−１−カルボン酸等の合成アミノ酸等も含まれる。これらの中でもＬ型のメチオニン、ロイシン、チロシンなどの天然アミノ酸は腫瘍の検出に有用である。特に、メチオニンは脳腫瘍をはじめ、肺癌、頚部や胸部の悪性腫瘍、リンパ腫などの検出に有用であり、脳腫瘍の質的診断に関してはグルコースよりも優れている。
【００１５】
アミノ酸以外にもフルオロデオキシグルコース、チミジンなどの核酸、コリン、フルオロコリン、酢酸などの膜脂質、ミソニダゾール、及びグルコースやサッカーロース等をスピンラベル化し造影剤として用いることも可能である。
【００１６】
上記に挙げられたアミノ酸、グルコース、核酸、膜脂質などは、スピンラベル剤でスピンラベル化される。スピンラベル化に使用されるスピンラベル剤は、アミノ酸等の代謝物質をラジカル修飾することが可能である限り特に制限されず、当該技術分野において公知のスピンラベル剤を適宜選択して使用することが可能である。好ましくは、空気中で安定であり、化学的変化を受け難く、単離可能であり、分子量が小さく、ラベル化によって生体機能や性質に影響せず、ＥＳＲスペクトルが単純で解析し易い性質を備えたものである。このような条件を満たすものとして一般的にはニトロキシルラジカルを挙げることができる。
【００１７】
ニトロキシルラジカルの中でも、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する能力が高いという観点からＭＣ−ＰＲＯＸＹＬ、３-Ｃａｒｂａｍｏｙｌ−２，２，５，５−ＰＲＯＸＹＬ、３-Ｃａｒｂｏｘｙ−２，２，５，５−ＰＲＯＸＹＬが好ましい。
【００１８】
上述するようなスピンラベル剤によるスピンラベル化アミノ酸は、水溶性であることが好ましい。スピンラベル化剤は通常ラジカルを含む構造部分に親水基を有さないため、アミノ酸が有する親水基を保持することが好ましい。従って合成の際、アミノ酸のカルボキシル基は残しておくことが好ましく、アミノ酸のアミノ基とラベル剤を結合させることが好ましい。例えば、ＭＣ−ＰＲＯＸＹＬを用いてアミノ酸をラベル化する場合は、スピンラベル剤のカルボキシル基とアミノ酸のアミノ基とを脱水縮合により結合させることが好ましい。
【００１９】
その他、商業的に入手可能なスピンラベル剤：３−カルボキシ−２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル、４−アセトアミド−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシル、４−アミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシル、４−カルボキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシル、４−（２−クロロアセトアミド）−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシル、４−シアノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシル、２−（１４−カルボキシテトラデシル）−２−エチル−４，４−ジメチル−３−オキサゾリジニルオキシ、４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシル、４−ベンゾイルオキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシル、４−（２−ヨードアセトアミド）−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシル、４−イソチオシアナト−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシル  フリーラジカル、４−メトキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシル、４−オキソ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシル、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシル、（１−アセチル−２，２，５，５−テトラメチル−３−ピロリン−３−メチル）メタンチオスルフォネート、５−（ジエトキシホスホリル）−５−メチル−１−ピロリン−Ｎ−オキサイド、Ｎ−（１−オキシル−２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジニル）マレイミド、１−オキシル−２，２，５，５−テトラメチル−Δ３−ピロリン−３−メチルメタンチオスルフォネートなども上記好ましい条件を満たすため、適宜選択して使用可能である。
【００２０】
本発明のＥＳＲＩ用造影剤は、スピンラベル化アミノ酸のみから構成されていても、他の薬学的に許容される物質と組合せられた組成物であってもよい。本発明のＥＳＲＩ用造影剤の形態は特に制限されないが、被験者の血中への投与に適した薬学的に許容される溶媒（例えば、生理食塩水や緩衝液）にスピンラベル化アミノ酸が溶解した形態であることが好ましい。より具体的に、本発明のＥＳＲＩ用造影剤は、液剤又は注射剤の形態であることが好ましい。本発明のＥＳＲＩ用造影剤が液状である場合、スピンラベル化アミノ酸の濃度は、ＥＳＲＩ装置を用いて体内でのアミノ酸の挙動をイメージング可能である限り特に制限されないが、 ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＥＳＲスペクトル検出限界濃度（例えば、１０ｍＭ）以上であることが好ましい。また、濃度の上限は、溶解可能限界濃度（例えば、２０ｍＭ以下）であることが好ましい。
【００２１】
本発明のＥＳＲＩ用造影剤が、上記のような液状の形態である場合、当該造影剤には、薬学的に許容される他の添加剤（例えば、可溶化剤、乳化剤、粘度調節剤等）が添加されていてもよい。
【００２２】
本発明のＥＳＲＩ用造影剤の投与形態は、投与されたスピンラベル化アミノ酸の挙動をイメージングすることが可能である限り特に制限されず、例えば、静脈注射、皮下注射、筋肉注射等を挙げることができる。
【００２３】
本発明のＥＳＲＩ用造影剤は、悪性腫瘍のイメージングに好適である。これは、悪性腫瘍によるアミノ酸の取り込み速度が、正常組織における取り込みよりも早いため、結果として、スピンラベル化されたアミノ酸が悪性腫瘍に集積するからである。悪性腫瘍の中でも本発明の造影剤を用いたイメージングに特に適しているのは脳腫瘍である。
【００２４】
本発明のＥＳＲＩ用造影剤を用いて、スピンラベルされたアミノ酸の生体内での挙動又は当該アミノ酸が集積した悪性腫瘍をイメージングする方法は、公知のＥＳＲＩ用の装置を用いて実施することができる。そのような装置は、特に制限されないが、例えば、本発明者等が開発した特開２０１１−１５８３４８や特願２０１０‐１４６５５９に開示される電磁ホーン型電子スピン共鳴装置を用いて実施することができる。特開２０１１−１５８３４８に開示される電磁ホーン型ＥＳＲ装置では、低〜高周波のマイクロ波（Ｌ，ＸおよびＫ−ｂａｎｄ）を使う一方で、（１）大型／多量試料（２） 水溶液や生体試料等誘電ロスの大きな試料（３）導電性試料（４）金属含有試料等極端試料のESR計測に加えて、（５）ESRと他物理量(誘電率)との温度可変同時計測等、極端計測も可能であるため有用である。
【００２５】
好適な一実施形態において、本発明は、少なくともＥＳＲＩ用造影剤及びラジカル消去剤を含むＥＳＲＩ用キットである。本発明のＥＳＲＩ用造影剤を構成するルピンラジカル化アミノ酸は安定な化合物であり、ラジカル化されているため、強い反応性を有するが、後述する実施例に示されるようにアスコルビン酸等のラジカル消去剤によって容易に無害化することが可能である。よって、本発明のＥＳＲＩ用造影剤をラジカル消去剤と組み合わせることによって、より安全性に優れたＥＳＲＩが可能となる。ラジカル消去剤としては、当該技術分野に公知のラジカル消去剤と適宜選択して使用することが可能である。
【実施例】
【００２６】
１．ラジカル化メチオニンの作製
下記の構造式で示されるラジカル化メチオニンをLiu et al., Eur. J. Med. Chem. Vol. 43, p.2610-2614, 2008に記載の方法に従って合成した。
【００２７】
【化１】
0005836135.tif 000002
【００２８】
得られたラジカル化メチオニンを純水に添加し、混合したところ、ラジカル化メチオニンは易溶解性ではなく、20mM以上の水溶液にするのには時間を要した。標準試料のMgO:Mn(II)パウダーと共に、X-bandの高感度TE011モード円筒型共振器で各濃度のラジカル化メチオニン水溶液のＥＳＲスペクトルを測定した。１５ｍＭ水溶液について測定した結果を図１に示す。尚、15ｍMとそれ以上の濃度では、結果に差は見られなかった。
【００２９】
２．腫瘍細胞へのラジカル化メチオニンの導入及びESRスペクトルの測定
ヒトグリア芽細胞腫cell line U251を、Eagle’s Minimum Essential Medium with Eagle’s balanced Saltsを基礎培地とし、１％Non-essential Amino Acids,  1mM Sodium pyruvate, 10% Fetal Bovin Serum, 2mM Glutamin, 1% penicillin/streptomucinを添加した３つのシャーレ培地で培養した。培養５日目にシャーレ内の培養液を捨て、Hank’s bufferd salt solution（HBSS: 136.6mM NaCl, 5.4mM KCl, 4.2mM NaHCO3, 2.7mM Na2HPO4, 1mMCaCl2, 0.44mM KH2PO4, 0.41mM MgSO4, pH7.8）で洗浄後、１〜２mlのHBSS及びラジカル化メチオニン（10mM、15mM及び20mM）を加え、２時間、３７℃で培養した。その後、Tris-Buffered salineで洗浄し、３つのシャーレ内の細胞を１つの試験管に回収し、遠心分離にかけた。回収した細胞の一部を石英製試料管に入れ、X-bandのTE011モード円筒型共振器でESRスペクトルを測定した。結果を図２（１０ｍＭ）、図３（１５ｍＭ）及び図４（２０ｍＭ）に示す。
【００３０】
１０ｍＭよりは１５ｍＭまたは２０ｍＭのラジカル化メチオニンを取り込ませた腫瘍細胞から強いESRスペクトルが測定された。また、各ラジカル化メチオニンと同濃度のＬ‐アスコルビン酸を培地に添加し、２時間培養することより細胞内のラジカルは消去された。１５ｍＭのラジカル化メチオニンと１５ｍＭのＬ−アスコルビン酸を用いた場合の結果を図５（Ｂ）に示す。尚、上段（Ａ）はアスコルビン酸を添加しなかったコントロールである。図５に示される結果は、ラジカル化アミノ酸である本発明のＥＳＲＩ用造影剤は安定な物質であるが、安価なアスコルビン酸等のラジカル消去剤で容易に無害化することが可能であるため、ラジカル消去剤と組み合わせることによって、より安全なＥＳＲＩが可能となることを意味する。
【図１】
0005836135.tif 000003
【図２】
0005836135.tif 000004
【図３】
0005836135.tif 000005
【図４】
0005836135.tif 000006
【図５】
0005836135.tif 000007