(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＹＡＭＨ（配列番号５）のＣＤＲ−Ｈ１アミノ酸配列、
ＡＩＴＷＮＳＧＨＩＤＹＡＤＳＶＥＧ（配列番号６）のＣＤＲ−Ｈ２アミノ酸配列、
ＶＳＹＬＳＴＡＳＳＬＤＹ（配列番号７）のＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列、
ＲＡＳＱＳＩＲＮＹＬＳ（配列番号１９８）のＣＤＲ−Ｌ１アミノ酸配列、
ＡＡＳＴＬＱＳ（配列番号９）のＣＤＲ−Ｌ２アミノ酸配列、および
ＱＲＹＮＲＡＰＹＴ（配列番号１０）のＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列
を有する６個のＣＤＲを含む抗ＴＮＦ−α抗体、またはその抗ＴＮＦ−α結合性断片。
【請求項２】
それぞれヒト抗体もしくはヒト化抗体、またはヒト抗体もしくはヒト化抗体の抗ＴＮＦ−α結合性断片である、請求項１の抗ＴＮＦ−α抗体または抗ＴＮＦ−α結合性断片。
【請求項３】
ＩｇＧである、請求項１または２の抗ＴＮＦ−α抗体または抗ＴＮＦ−α結合性断片。
【請求項４】
ＩｇＧ１である、請求項１から３のいずれか一項の抗ＴＮＦ−α抗体または抗ＴＮＦ−α結合性断片。
【請求項５】
フコシル化されていない、請求項１から４のいずれか一項の抗ＴＮＦ−α抗体または抗ＴＮＦ−α結合性断片。
【請求項６】
ＦｃγＲへの結合を増強する、Ｆｃ領域内の１以上の突然変異を含む、請求項１から５のいずれか一項の抗ＴＮＦ−α抗体または抗ＴＮＦ−α結合性断片。
【請求項７】
ＦｃＲｎへの結合を増強する、Ｆｃ領域内の１以上の突然変異を含む、請求項１から６のいずれか一項の抗ＴＮＦ−α抗体または抗ＴＮＦ−α結合性断片。
【請求項８】
ＣＨ２の２５０位およびＣＨ３の４２８位において、ＦｃＲｎへの結合を増強する重鎖定常領域変異を含む、請求項１から７のいずれか一項の抗ＴＮＦ−α抗体または抗ＴＮＦ−α結合性断片。
【請求項９】
ＣＨ２において置換Ｔ２５０Ｑを含む、請求項１から８のいずれか一項の抗ＴＮＦ−α抗体または抗ＴＮＦ−α結合性断片。
【請求項１０】
ＣＨ３において置換Ｍ４２８Ｌを含む、請求項１から９のいずれか一項の抗ＴＮＦ−α抗体または抗ＴＮＦ−α結合性断片。
【請求項１１】
前記置換以外は、配列番号２に対応するＶＨ配列および配列番号４に対応するＶＬ配列を有する、請求項１から１０のいずれかの抗ＴＮＦ−α抗体または抗ＴＮＦ−α結合性断片。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか記載の抗ＴＮＦ−α抗体または抗ＴＮＦ−α結合性断片と医薬上許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１３】
ヒト患者における免疫障害の治療において使用するための、請求項１２の医薬組成物。
【請求項１４】
該免疫障害が関節リウマチ、慢性炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、尋常性乾癬またはクローン病である、請求項１３の医薬組成物。
【請求項１５】
該免疫障害が関節リウマチである、請求項１４の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願への相互参照
本出願は、2009年4月16日に出願された米国仮出願番号61/170,053の利益を請求するものであり、その内容はすべて参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
２．配列リストへの参照
同時に提出される配列リストは参照により本明細書に組み入れられる。
【０００３】
３．発明の分野
本発明は、抗ＴＮＦ−α抗体、抗ＴＮＦ−α抗体を含む医薬組成物、およびそのような抗体の治療用途に関する。
【背景技術】
【０００４】
４．背景
腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）は、免疫系の細胞により放出され該細胞と相互作用する炎症性サイトカインである。ＴＮＦ−αは、慢性関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎および多発性硬化症のような慢性疾患を含む幾つかのヒト疾患においてアップレギュレーションされることが示されている。例えば、ＴＮＦ−αのレベルの上昇は慢性関節リウマチ患者の滑液において見られ、慢性関節リウマチの特徴である病的炎症および関節破壊の両方において重要な役割を果たしている。
【０００５】
ヒトＴＮＦ−αは１７ｋＤａのタンパク質であり、その活性形態はホモ三量体として存在する（Ｐｅｎｎｉｃａら，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７２４−７２９；Ｄａｖｉｓら，１９８７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６：１３２２−１３２６；Ｊｏｎｅｓら，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：２２５−２２８）。ＴＮＦ−αは、ほとんどの細胞型上で同時発現される構造的には関連しているが機能的には異なる２つの細胞表面受容体であるｐ５５およびｐ７５との相互作用により、その生物学的効果を発現する（Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒら，１９９０，Ｃｅｌｌ  ６１：３５１−９；Ｓｍｉｔｈら，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８（４９５８）：１０１９−２３）。ｐ５５はｐ５５Ｒ、ｐ５５ＴＮＦＲ、ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲ  Ｉ；ＴＮＦＲ  １およびＴＮＦＲＳＦＩａとしても公知である。ｐ７５はｐ７５Ｒ、ｐ７５ＴＮＦＲ、ＣＤ１２０ｂ、ＴＮＦＲ  ＩＩ、ＴＮＦＲ  ２およびＴＮＦＲＳＦＩｂとしても公知である。また、どちらの受容体も、ＴＮＦ−αに結合しうる可溶性分子としてタンパク質分解的に放出される。
【０００６】
疾患、特に慢性関節リウマチの治療方法としてのＴＮＦ−α活性の抑制は、抗体および可溶性受容体のようなインヒビターを使用する多種多様な手段により達成されている。具体例には、ヒト免疫グロブリンのＦｃ部分に連結された２つのｐ７５可溶性ＴＮＦ受容体ドメインを含む組換え融合タンパク質である、ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）としてＩｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより販売されているエタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）が含まれる。ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）としてＣｅｎｔｏｃｏｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより販売されているインフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）は、マウス抗ＴＮＦ−α可変ドメインとヒトＩｇＧ１定常ドメインとを有するキメラ抗体である。他のインヒビターには、天然ＴＮＦ−αと三量体を形成し受容体結合を妨げる操作されたＴＮＦ−α分子が含まれる（Ｓｔｅｅｄら，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：１８９５−１８９８；ＷＯ  ０３／０３３７２０；ＷＯ  ０１／６４８８９）。ＴＮＦ−α活性を抑制するこれらの現在の方法は、ｐ５５およびｐ７５受容体の両方へのＴＮＦ−αの結合を遮断する（例えば、Ｍｅａｓｅ，２００５，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ  ５（１１）：１４９１−１５０４を参照されたい）。ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）としてＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより販売されているアダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）は、組換え完全ヒト抗ＴＮＦ−α抗体である（ＴｕｓｓｉｒｏｔおよびＷｅｎｄｌｉｎｇ，２００４，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．５：５８１−５９４）。アダリムマブはＴＮＦ−αに特異的に結合し、ｐ５５およびｐ７５細胞表面ＴＮＦ−α受容体とのその相互作用を遮断する。アダリムマブはまた、補体依存性細胞傷害性（「ＣＤＣ」）および抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（「ＡＤＣＣ」）によりインビトロで表面ＴＮＦ−α発現細胞を細胞溶解する。アダリムマブはリンホトキシン（ＴＮＦ−β）には結合せず、また、それを不活性化しない。アダリムマブはまた、白血球遊走を引き起こす接着分子のレベルの変化を含む、ＴＮＦにより誘導または調節される生物学的応答をモジュレーションする（ＥＬＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１では１〜２×１０−１０ＭのＩＣ５０でそれが生じる。）。
【０００７】
アダリムマブは、ヒト抗体であるにもかかわらず、ヒトに投与された場合に免疫応答を惹起しうる。そのような免疫応答は、循環からの、抗体またはその断片の免疫複合体性排除を引き起こし、反復投与を、治療に不適当なものにし、それにより、患者にとっての治療利益を低下させ、該抗体の再投与を制限しうる。
【０００８】
したがって、例えば、低い投与量で投与されうる、アダリムマブより高い親和性を有する変異体、またはアダリムマブと比較して低下した免疫原性を有する変異体を作製することにより、これらの問題の１以上を克服する改良された抗ＴＮＦ−α抗体またはその断片を得ることが必要とされている。
【０００９】
本出願の第４節または他のいずれかの節におけるいずれの参考文献の引用または特定も、そのような参考文献が本開示の先行技術として利用可能であると自認するものと解釈されてはならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第０３／０３３７２０号
【特許文献２】国際公開第０１／６４８８９号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｐｅｎｎｉｃａら，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７２４−７２９
【非特許文献２】Ｄａｖｉｓら，１９８７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６：１３２２−１３２６
【非特許文献３】Ｊｏｎｅｓら，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：２２５−２２８
【非特許文献４】Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒら，１９９０，Ｃｅｌｌ  ６１：３５１−９
【非特許文献５】Ｓｍｉｔｈら，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８（４９５８）：１０１９−２３
【非特許文献６】Ｓｔｅｅｄら，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：１８９５−１８９８
【非特許文献７】Ｍｅａｓｅ，２００５，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ  ５（１１）：１４９１−１５０４
【非特許文献８】ＴｕｓｓｉｒｏｔおよびＷｅｎｄｌｉｎｇ，２００４，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．５：５８１−５９４
【発明の概要】
【００１２】
５．概要
本開示は、抗ＴＮＦ−α抗体Ｄ２Ｅ７と比較して改善された、ＴＮＦ−αへの結合、および／またはＤ２Ｅ７と比較して低下した免疫原性を有する、抗ＴＮＦ−α抗体Ｄ２Ｅ７の変異体に関する。Ｄ２Ｅ７は、本明細書において（アミノ末端からカルボキシ末端の順に）ＣＤＲ−Ｈ１（配列番号５）、ＣＤＲ−Ｈ２（配列番号６）およびＣＤＲ−Ｈ３（配列番号７）と称される３つの重鎖ＣＤＲ、ならびに本明細書において（アミノ末端からカルボキシ末端の順に）ＣＤＲ−Ｌ１（配列番号８）、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号））およびＣＤＲ−Ｌ３（配列番号１０）と称される３つの軽鎖ＣＤＲを有する。本開示の抗ＴＮＦ−α抗体および抗ＴＮＦ−α結合性断片は、一般に、Ｄ２Ｅ７と比較して少なくとも１つのＣＤＲにおいて少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。
【００１３】
ある態様においては、少なくとも１つのアミノ酸置換または置換の組合せは表１１、表１２および／または表２５から選択される。他の突然変異（置換、欠失または挿入を含む）は表１３−２５のいずれかから選択されうる。
【００１４】
ある態様においては、本開示は、抗ＴＮＦ−α抗体Ｄ２Ｅ７と比較して改善された、ＴＮＦ−αへの結合特性、例えば、改善された親和性を有する、抗ＴＮＦ−α抗体Ｄ２Ｅ７の変異体に関する。特定の実施形態においては、本開示の抗体は、ＴＮＦ−αに対する、Ｄ２Ｅ７より大きな親和性、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅにより測定された場合の、改善されたＫＤ、および／または競合ＥＬＩＳＡにより測定された場合の、改善された親和性を有する。
【００１５】
ある態様においては、該抗ＴＮＦ−α抗体および抗ＴＮＦ−α結合性断片は、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号９）におけるＳ３Ｋ、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号９）におけるＳ３Ｒ、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号９）におけるＳ３Ｎ、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号９）におけるＴ４Ｈ、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号９）におけるＴ４Ｑ、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号９）におけるＴ４Ｖ、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号９）におけるＴ４Ｆ、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号９）におけるＴ４Ｗ、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号９）におけるＴ４Ｙ、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号９）におけるＬ５Ｒ、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号９）におけるＬ５Ｋ、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号９）におけるＱ６Ｋ、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号９）におけるＱ６Ｒ、ＣＤＲ−Ｈ１（配列番号５）におけるＤ１Ｇ、ＣＤＲ−Ｈ１（配列番号５）におけるＹ２Ｈ、ＣＤＲ−Ｈ１（配列番号５）におけるＡ３Ｇ、およびＣＤＲ−Ｈ２（配列番号６）におけるＴ３Ｎから選択される少なくとも１つの置換を含む。改善された親和性変異体抗ＴＮＦ−α抗体および抗ＴＮＦ−α結合性断片内に組込まれうる追加的な突然変異は、脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅ）置換、例えば、表１１に記載されているもの、およびＴＮＦ−αに抗ＴＮＦ−α抗体および抗ＴＮＦ−α結合性断片が結合する能力を破壊しない他の突然変異、例えば置換、例えば、表１３から２４に記載されている公知突然変異または表２５に記載されている突然変異でありうる。
【００１６】
ある態様においては、該抗ＴＮＦ−α抗体および抗ＴＮＦ−α結合性断片は、ＣＤＲ−Ｌ２におけるＴ４Ｆ、ＣＤＲ−Ｌ２におけるＴ４Ｗ、ＣＤＲ−Ｌ２におけるＴ４Ｙ、ＣＤＲ−Ｌ２におけるＬ５Ｒ、ＣＤＲ−Ｌ２におけるＱ６Ｒ、ＣＤＲ−Ｈ１におけるＹ２Ｈ、ＣＤＲ−Ｈ１におけるＡ３Ｇ、およびＣＤＲ−Ｈ２におけるＴ３Ｎから選択される少なくとも１つの置換を含む。そのような抗ＴＮＦ−α抗体および抗ＴＮＦ−α結合性断片内に組込まれうる追加的な突然変異または突然変異の組合せは表１１および１３から２５の１以上から選択されうる。
【００１７】
ある他の態様においては、該抗ＴＮＦ−α抗体および抗ＴＮＦ−α結合性断片は、ＣＤＲ−Ｌ２におけるＴ４Ｆ、ＣＤＲ−Ｌ２におけるＴ４Ｗ、ＣＤＲ−Ｌ２におけるＴ４Ｙ、ＣＤＲ−Ｌ２におけるＬ５Ｒ、ＣＤＲ−Ｌ２におけるＱ６Ｒ、ＣＤＲ−Ｈ１におけるＹ２Ｈ、ＣＤＲ−Ｈ１におけるＡ３Ｇ、およびＣＤＲ−Ｈ２におけるＴ３Ｎから選択される少なくとも１つの置換を含む。そのような抗ＴＮＦ−α抗体および抗ＴＮＦ−α結合性断片内に組込まれうる追加的な突然変異または突然変異の組合せは表１１および１３から１８の１以上から選択されうる。
【００１８】
さらに他の態様においては、該抗ＴＮＦ−α抗体および抗ＴＮＦ−α結合性断片はＣＤＲ−Ｌ１における置換Ｇ５Ｓ＋Ａ１１ＳまたはＧ５Ｓ＋Ａ１１Ｇを含む。そのような抗ＴＮＦ−α抗体および抗ＴＮＦ−α結合性断片内に組込まれうる追加的な突然変異または突然変異の組合せは表１１から２５の１以上から選択されうる。
【００１９】
ある態様においては、該抗ＴＮＦ−α抗体および抗ＴＮＦ−α結合性断片は、表１１、１２および２５から選択される少なくとも１つの置換と組合されたＣＤＲ−Ｌ２におけるＳ３Ｎ、ＣＤＲ−Ｌ２におけるＴ４Ｖ、ＣＤＲ−Ｌ２におけるＱ６Ｋ、およびＣＤＲ−Ｈ１におけるＤ１Ｇから選択される置換を含む。そのような抗ＴＮＦ−α抗体および抗ＴＮＦ−α結合性断片内に組込まれうる追加的な突然変異または突然変異の組合せは表１１から２４の１以上から選択されうる。
【００２０】
ある態様においては、該抗ＴＮＦ−α抗体および抗ＴＮＦ−α結合性断片は、ＣＤＲ−Ｌ２におけるＳ３Ｋ、ＣＤＲ−Ｌ２におけるＳ３Ｒ、ＣＤＲ−Ｌ２におけるＴ４Ｈ、ＣＤＲ−Ｌ２におけるＴ４Ｑ、ＣＤＲ−Ｌ２におけるＴ４Ｆ、ＣＤＲ−Ｌ２におけるＴ４Ｗ、ＣＤＲ−Ｌ２におけるＴ４Ｙ、ＣＤＲ−Ｌ２におけるＬ５Ｒ、ＣＤＲ−Ｌ２におけるＬ５Ｋ、ＣＤＲ−Ｌ２におけるＱ６Ｒ、ＣＤＲ−Ｈ１におけるＹ２Ｈ、ＣＤＲ−Ｈ１におけるＡ３Ｇ、およびＣＤＲ−Ｈ２におけるＴ３Ｎから選択される少なくとも１つの置換と組合されたＣＤＲ−Ｌ２におけるＳ３Ｎ、ＣＤＲ−Ｌ２におけるＴ４Ｖ、ＣＤＲ−Ｌ２におけるＱ６Ｋ、およびＣＤＲ−Ｈ１におけるＤ１Ｇから選択される置換を含む。
【００２１】
ある態様においては、該抗ＴＮＦ−α抗体および抗ＴＮＦ−α結合性断片は、ＣＤＲ−Ｌ２におけるＳ３Ｋ、Ｔ４Ｈ、Ｌ５ＲおよびＱ６Ｒ；Ｓ３Ｋ、Ｔ４Ｑ、Ｌ５ＲおよびＱ６Ｋ；Ｓ３Ｋ、Ｔ４ＹおよびＬ５Ｋ；Ｓ３ＫおよびＴ４Ｙ；Ｓ３Ｎ、Ｔ４Ｖ、Ｌ５ＲおよびＱ６Ｋ；Ｓ３Ｎ、Ｔ４Ｗ、Ｌ５ＲおよびＱ６Ｒ；Ｓ３Ｒ、Ｔ４ＦおよびＬ５Ｒ；Ｓ３Ｒ、Ｔ４Ｆ、Ｌ５ＲおよびＱ６Ｒ；Ｓ３Ｒ、Ｔ４ＨおよびＱ６Ｋ；Ｓ３Ｒ、Ｔ４Ｗ、Ｌ５ＫおよびＱ６Ｒ；Ｔ４Ｈ、Ｌ５ＫおよびＱ６Ｋ；Ｔ４Ｈ、Ｌ５ＫおよびＱ６Ｒ；Ｔ４Ｗ、Ｌ５ＲおよびＱ６Ｒ；ならびにＴ４ＹおよびＬ５Ｒの少なくとも１つから選択される置換の組合せを含み、ここで、６個のＣＤＲは全体で、抗体Ｄ２Ｅ７のＣＤＲ配列と比較して１７個までのアミノ酸置換を有する。該抗ＴＮＦ−α抗体または抗ＴＮＦ−α結合性断片は、場合によっては、表１１から２４の１以上から選択されうる１以上の追加的な突然変異または突然変異の組合せを含む。
【００２２】
ある態様においては、該抗ＴＮＦ−α抗体および抗ＴＮＦ−α結合性断片はＣＤＲ−Ｌ２におけるＳ３Ｋ、Ｓ３Ｒ、Ｓ３Ｎ、Ｔ４Ｆ、Ｔ４Ｗ、Ｔ４Ｙ、Ｔ４Ｈ、Ｔ４Ｑ、Ｔ４Ｖ、Ｌ５Ｒ、Ｌ５Ｋ、Ｑ６ＲおよびＱ６Ｋを含む。そのような抗ＴＮＦ−α抗体および抗ＴＮＦ−α結合性断片内に組込まれうる追加的な突然変異または突然変異の組合せは表１１から２４の１以上から選択されうる。
【００２３】
他の態様においては、本開示は、抗ＴＮＦ−α抗体Ｄ２Ｅ７と比較して低下した免疫原性を有する、抗ＴＮＦ−α抗体Ｄ２Ｅ７の変異体に関する。ある態様においては、該ＴＮＦ−α抗体および抗ＴＮＦ−α結合性断片は、Ｒ７Ｑ；Ａ１１Ｓ；Ｒ７Ｑ＋Ａ１１Ｓ；Ｎ８Ｔ；Ｎ８Ｔ＋Ａ１１Ｓ；Ｉ６Ｔ；Ａ１１Ｇ；Ｉ６Ｔ＋Ａ１１Ｇ；Ｑ４Ｇ；Ｑ４Ｇ＋Ａ１１Ｓ；Ｑ４Ｇ＋Ａ１１Ｇ；Ｑ４Ｈ；Ｑ４Ｈ＋Ａ１１Ｓ；Ｑ４Ｒ；Ｑ４Ｒ＋Ａ１１Ｓ；Ｇ５Ｓ；Ｇ５Ｓ＋Ａ１１Ｓ；Ｎ８Ｓ＋Ａ１１Ｓ；Ｉ６Ｔ＋Ａ１１Ｓ；およびＮ８Ｔ＋Ａ１１Ｇから選択される、ＣＤＲ−Ｌ１（配列番号８）における少なくとも１つの置換または置換の組合せを含む。低下した抗原性を有するそのような抗ＴＮＦ−α抗体および抗ＴＮＦ−α結合性断片内に組込まれうる追加的な突然変異は、ＴＮＦ−αに対する結合特性を改善する置換、例えば、表１２および／または表２５に記載されているもの、ならびにＴＮＦ−αに該抗ＴＮＦ−α抗体および抗ＴＮＦ−α結合性断片が結合する能力を破壊しない他の突然変異（例えば、置換）、例えば、表１３から２５に記載されている公知突然変異（これらに限定されるものではない）を含む。
【００２４】
ある態様においては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体および抗ＴＮＦ−α結合性断片は、Ｄ２Ｅ７のＶＨおよびＶＬ配列に対して８０％から９９％の配列同一性を有するＶＨおよびＶＬ配列を有し、Ｄ２Ｅ７と比較して少なくとも１つのＣＤＲにおける少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。特定の実施形態においては、Ｄ２Ｅ７のＶＨおよびＶＬ配列と比較した場合の重鎖および軽鎖に関する配列同一性（％）は、それぞれ独立して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性から選択される。
【００２５】
ある態様においては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体および抗ＴＮＦ−α結合性断片は、Ｄ２Ｅ７のＣＤＲと比較して、それらのＣＤＲに１７個までのアミノ酸置換を有する。その標的結合能を維持している１７個のアミノ酸置換を有する変異抗体はＢｏｓｔｒｏｍら，２００９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２３：１６１０−１４に従い作製されうる。本開示の抗ＴＮＦ−α抗体および抗ＴＮＦ−α結合性断片はまた、抗体Ｄ２Ｅ７のＣＤＲ配列と比較して、それらのＣＤＲに１６個まで、１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、または４個までのアミノ酸置換を有しうる。
【００２６】
特定の実施形態においては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体または抗ＴＮＦ−α結合性断片は、独立して、
・Ｄ２Ｅ７の対応ＣＤＲと比較して、１個まで、または２個まで、または３個までのＣＤＲ−Ｈ１置換；
・Ｄ２Ｅ７の対応ＣＤＲと比較して、１個まで、２個まで、３個まで、４個まで、５個まで、または６個までのＣＤＲ−Ｈ２置換；
・Ｄ２Ｅ７の対応ＣＤＲと比較して、１個まで、２個まで、３個まで、４個まで、または５個までのＣＤＲ−Ｈ３置換；
・Ｄ２Ｅ７の対応ＣＤＲと比較して、１個まで、２個まで、３個まで、または４個までのＣＤＲ−Ｌ１置換；
・Ｄ２Ｅ７の対応ＣＤＲと比較して、１個まで、２個まで、３個まで、または４個までのＣＤＲ−Ｌ２置換；および
・Ｄ２Ｅ７の対応ＣＤＲと比較して、１個まで、２個まで、３個まで、または４個までのＣＤＲ−Ｌ３置換を有する。
【００２７】
本開示は更に、Ｄ２Ｅ７と比較して増加した、ＴＮＦ−αに対する親和性、および／またはＤ２Ｅ７と比較して低下した免疫原性を有する、修飾された抗ＴＮＦ−α抗体および抗ＴＮＦ−α結合性断片を含む医薬組成物を提供する。
【００２８】
ある態様においては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体または抗ＴＮＦ−α結合性断片は二重特異性抗体、または二重特異性抗体のＴＮＦ−α結合性断片でありうる。該二重特異性抗体はＴＮＦ−αおよび別の炎症性サイトカイン（例えば、リンホトキシン、インターフェロン−γまたはインターロイキン−１）に特異的でありうる。
【００２９】
本開示の抗ＴＮＦ−α抗体または抗ＴＮＦ−α結合性断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を本発明において提供し、同様に、核酸を含むベクターを提供する。また、抗ＴＮＦ−α抗体または抗ＴＮＦ−α結合性断片をコードするヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換された原核宿主細胞および真核宿主細胞、ならびに該核酸配列を発現するように操作された真核（例えば、哺乳類）宿主細胞を、本発明において提供する。宿主細胞を培養することによる抗ＴＮＦ−α抗体および抗ＴＮＦ−α結合性断片の製造方法も提供する。
【００３０】
本開示の抗ＴＮＦ−α抗体または抗ＴＮＦ−α結合性断片は、免疫障害、例えば全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、チロイドーシス（ｔｈｙｒｏｉｄｏｓｉｓ）、移植片対宿主病、強皮症、糖尿病、グレーブス病、サルコイドーシス、慢性炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎またはクローン病の治療に有用である。
【００３１】
特許出願においては一般的なとおり、文脈に明らかに矛盾しない限り、単数形の表現は１以上の対象物を表すことに注目されるべきである。本出願においては、特許出願において一般的なとおり、「または」なる語は、選言的な「または」あるいは連言的な「および」を意味するものとして用いられる。
【００３２】
本明細書に記載されている全ての刊行物を参照により本明細書に組み入れることとする。本明細書に含まれている文書、法令、資料、装置、物品などのいずれの考察も、専ら、本開示の背景的状況を提供することを目的としたものである。これらの事物の全てが先行技術の基礎を構成すること、また、それが本出願の優先日の前にどこかに存在しておりそれらが本開示の関連分野における一般的知識であったことを自認するものと解釈されるべきではない。
【００３３】
本開示の特徴および利点は、その実施形態の以下の詳細な説明から更に明らかとなろう。
【００３４】
６．表および図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】表１は、免疫原性に関して試験された、それぞれＤ２Ｅ７  ＶＨペプチドおよびＤ２Ｅ７  ＶＬペプチドを示す。
【図２】表２は、Ｄ２Ｅ７における、特定されたＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープ領域を示す。ＣＤＲ領域が下線で示されている。
【図３】表３はＨＬＡクラスＩＩ相関、およびＤ２Ｅ７ＶＬ領域ペプチドエピトープに対する応答の相対危険度を示す。
【図４】表４はＤ２Ｅ７  ＶＬ  ＣＤＲ１エピトープ変異体の配列を示す。合計９９個のドナーを試験した。応答の数、応答の割合（％）および平均刺激指数が、試験された各ペプチドに関して示されている。
【図５】表５は、Ｄ２Ｅ７の免疫原性を低下させるための、ＣＤＲ−Ｌ１における候補突然変異を示す。表５におけるアミノ酸の番号づけはＤ２Ｅ７軽鎖の場合における位置に対応している。
【図６】表６は、Ｄ２Ｅ７と比較して有意に低下した結合をもたらさないＣＤＲ−Ｌ１における置換に関するＢＩＡｃｏｒｅおよびＥＬＩＳＡの結果を示す。表６におけるアミノ酸の番号づけはＤ２Ｅ７軽鎖の場合における位置に対応している。結合のＫＤ（ＢＩＡｃｏｒｅにより測定された場合）およびＩＣ５０（ＥＬＩＳＡにより測定された場合）における改善は「ＷＴｘ」により示されている。ＣＶ％は合計値尺度に対する割合（％）としての標準偏差を意味する。
【図７−１】表７は、Ｄ２Ｅ７エピトープに対する全ての単一および二重突然変異に関するＴ細胞アッセイの結果を示す。ペプチド１は親ペプチドである。該親ペプチドに対する修飾は太字で示されている。
【図７−２】表７は、Ｄ２Ｅ７エピトープに対する全ての単一および二重突然変異に関するＴ細胞アッセイの結果を示す。ペプチド１は親ペプチドである。該親ペプチドに対する修飾は太字で示されている。
【図８】表８は、専らＴ細胞アッセイ結果に基づく好ましいエピトープペプチド変異体を示す。表８におけるアミノ酸の番号づけはＤ２Ｅ７軽鎖の場合における位置に対応している。
【図９】表９は、好ましい変異体エピトープペプチドを含有するように構築された抗体の抗増殖生物活性を示す。親物質は未修飾Ｄ２Ｅ７抗体である。表９におけるアミノ酸の番号づけはＤ２Ｅ７軽鎖の場合における位置に対応している。
【図１０】表１０は、ＢＩＡｃｏｒｅにより分析された場合の、ＴＮＦ−αに対するＤ２Ｅ７および該Ｄ２Ｅ７変異体の結合速度論を示す。表１０におけるアミノ酸の番号づけはＤ２Ｅ７軽鎖の場合における位置に対応している。
【図１１】表１１は、免疫原性を低下させるためにＤ２Ｅ７関連抗体内に組込まれうるＣＤＲ−Ｌ１置換または置換の組合せを示す。
【図１２】表１２は、Ｄ２Ｅ７と比較して改善されたＫＤ（ＢＩＡｃｏｒｅにより分析された場合）、親和性（ＥＬＩＳＡにより分析された場合）またはそれらの両方をもたらす、ＣＤＲ−Ｌ１以外のＣＤＲアミノ酸置換を示す。表１２におけるアミノ酸の番号づけはＤ２Ｅ７軽鎖および重鎖の場合における位置に対応している。結合のＫＤ（ＢＩＡｃｏｒｅにより測定された場合）およびＩＣ５０（ＥＬＩＳＡにより測定された場合）における改善は「ＷＴｘ」により示されている。ＣＶ％は合計値尺度に対する割合（％）としての標準偏差を意味し、「ＮＤ」は「不実施」を意味する。
【図１３】表１３は、本開示の抗体内に組込まれうる、ＣＤＲ−Ｈ１における既知突然変異を示す。
【図１４】表１４は、本開示の抗体内に組込まれうる、ＣＤＲ−Ｈ２における既知突然変異を示す。単一の枠内の２個のアミノ酸の含有は、該ＣＤＲへの付加または挿入を含むＣＤＲ変異体を示す。枠の陰影は、陰影付きのアミノ酸残基を欠くＣＤＲ変異体を示す。
【図１５】表１５は、本開示の抗体内に組込まれうる、ＣＤＲ−Ｈ３における既知突然変異を示す。
【図１６】表１６は、本開示の抗体内に組込まれうる、ＣＤＲ−Ｌ１における既知突然変異を示す。単一の枠内の２個のアミノ酸の含有は、該ＣＤＲへの付加または挿入を含むＣＤＲ変異体を示す。
【図１７】表１７は、本開示の抗体内に組込まれうる、ＣＤＲ−Ｌ２における既知突然変異を示す。単一の枠内の２個のアミノ酸の含有は、該ＣＤＲへの示されている付加的なＮ末端アミノ酸を含むＣＤＲ変異体を示す。
【図１８−１】表１８は、本開示の抗体内に組込まれうる、ＣＤＲ−Ｌ３における既知突然変異を示す。単一の枠内の２個のアミノ酸の含有は、該ＣＤＲへの示されている付加的なＮ末端アミノ酸を含むＣＤＲ変異体を示す。
【図１８−２】表１８は、本開示の抗体内に組込まれうる、ＣＤＲ−Ｌ３における既知突然変異を示す。単一の枠内の２個のアミノ酸の含有は、該ＣＤＲへの示されている付加的なＮ末端アミノ酸を含むＣＤＲ変異体を示す。
【図１９】表１９は、本開示の抗体内に組込まれうる、ＣＤＲ−Ｈ１における他の既知突然変異を示す。
【図２０】表２０は、本開示の抗体内に組込まれうる、ＣＤＲ−Ｈ２における他の既知突然変異を示す。
【図２１】表２１は、本開示の抗体内に組込まれうる、ＣＤＲ−Ｈ３における他の既知突然変異を示す。
【図２２】表２２は、本開示の抗体内に組込まれうる、ＣＤＲ−Ｌ１における他の既知突然変異を示す。
【図２３】表２３は、本開示の抗体内に組込まれうる、ＣＤＲ−Ｌ２における他の既知突然変異を示す。
【図２４】表２４は、本開示の抗体内に組込まれうる、ＣＤＲ−Ｌ３における他の既知突然変異を示す。
【図２５】表２５は、Ｄ２Ｅ７と比較して改善されたＫＤ（ＢＩＡｃｏｒｅにより分析された場合）、親和性（ＥＬＩＳＡにより測定された場合）またはそれらの両方をもたらす、ＣＤＲ−Ｌ２における点突然変異の組合せを示す。該点突然変異は、単独で又は組合されて、本開示の抗体内に組込まれうる。
【図２６】図１Ａは、下線付き太字で示されたＣＤＲ領域を含有するＤ２Ｅ７重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を示す。
【図２７】図１ＢはＤ２Ｅ７のＣＤＲ配列および対応配列識別記号を示す。
【図２８】図１Ｃは重鎖ＣＤＲの番号付けと重鎖カバト（Ｋａｂａｔ）番号付けとの対応表を示す。
【図２９】図１Ｄは軽鎖ＣＤＲの番号付けと軽鎖カバト（Ｋａｂａｔ）番号付けとの対応表を示す。
【図３０】図１Ｅは、米国特許第６，０９０，３８２号に公開されているＤ２Ｅ７の重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（それぞれ配列番号１および配列番号３）を示す。
【図３１】図２はＤ２Ｅ７  ＶＬペプチドの応答率（％）（下図）および平均刺激指数（上図）を示す。
【図３２】図３はＤ２Ｅ７  ＶＨペプチドの平均刺激指数（上図）および応答率（％）（下図）を示す。ペプチド番号２７は、１つのドナーにおいて、異常な刺激指数を有し、より濃い陰影で示されている。
【図３３】図４はＤ２Ｅ７  ＶＬ  ＣＤＲ１エピトープペプチド変異体を示す。白抜きの記号は該データセット内の未修飾親ペプチドの複数の再試験を示す。黒塗りの記号は特有のペプチドアラニンスキャン変異体を表す。最も低下した応答を誘発する変異体が示されている。
【図３４】図５はＤ２Ｅ７  ＶＬ  ＣＤＲ１エピトープペプチド変異体を示す。白抜きの記号は該データセット内の未修飾親ペプチドの複数の再試験を示す。黒塗りの記号は特有のペプチド変異体を表す。最も低下した応答を誘発する変異体が円で示されている。この図は表７からのデータをグラフ表示したものである。
【図３５】図６はＤ２Ｅ７変異抗体の競合ＥＬＩＳＡの結果を示す。ＥＬＩＳＡプレートをＴＮＦ−αでコートした。ビオチン化Ｄ２Ｅ７を単一濃度で全てのウェルに含有させ、該変異抗体を滴定した。各抗体に関してＩＣ５０値を計算した。該実験を３回行った。Ｙ軸は該親抗体の結合に対する割合（％）としての平均結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
７．詳細な説明
７．１  抗ＴＮＦ−α抗体
本開示は抗ＴＮＦ−α抗体を提供する。特に示さない限り、「抗体」（Ａｂ）なる語は、特定の抗原に特異的に結合し該抗原に対して免疫学的に反応性である免疫グロブリン分子を意味し、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、遺伝的な操作などにより修飾された形態の抗体、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体、ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）およびテトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ））ならびに抗体の抗原結合性断片、例えばＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧおよびｓｃＦｖ断片（これらに限定されるものではない）を含む。さらに、特に示さない限り、「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、タンパク質に特異的に結合しうる完全分子および抗体断片（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片）を含むと意図される。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は完全抗体のＦｃ断片を欠き、動物または植物の循環からより迅速に消失し、完全抗体より非特異的な組織結合を引き起こしうる（Ｗａｈｌら，１９８３，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６）。
【００３７】
「ｓｃＦｖ」なる語は、通常抗体からの重鎖および軽鎖の可変ドメインが連結されて１本の鎖を形成している、一本鎖Ｆｖ抗体を意味する。
【００３８】
「ＶＨ」なる語は、Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはＦａｂの重鎖を含む、抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域を意味する。「ＶＬ」なる語は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂの軽鎖を含む、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を意味する。抗体（Ａｂ）および免疫グロブリン（Ｉｇ）は、同じ構造特性を有する糖タンパク質である。抗体は特定の標的に対する結合特異性を示すが、免疫グロブリンは、抗体と、標的特異性を欠く他の抗体様分子との両方を含む。天然抗体および免疫グロブリンは、通常、２つの同一軽（Ｌ）鎖と２つの同一重（Ｌ）鎖とから構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖はアミノ末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、そしてそれに続いて幾つかの定常ドメインを有する。各軽鎖はアミノ末端（ＶＬ）に可変ドメインを有し、カルボキシ末端に定常ドメインを有する。
【００３９】
本開示の抗ＴＮＦ−α抗体はヒトＴＮＦ−αに結合し、細胞におけるＴＮＦ−α受容体活性を抑制する。いずれか１つの理論に束縛されるものではないが、該抗体は低親和性ＴＮＦ−α受容体（ｐ７５）および高親和性ＴＮＦ−α受容体（ｐ５５）の両方へのＴＮＦ−αの結合を低下させる、と本発明者らは考えている。
【００４０】
本開示の抗ＴＮＦ−α抗体は、抗体Ｄ２Ｅ７（アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）またはＨＵＭＩＲＡ（登録商標）としても公知である。）のＣＤＲに配列において関連している相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。
【００４１】
ＣＤＲは軽鎖および重鎖可変ドメインの両方における超可変領域としても公知である。可変ドメインの、より高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と称される。当技術分野で公知のとおり、抗体の超可変領域を定めるアミノ酸位置／境界は、当技術分野で公知の種々の定義および状況に応じて様々となりうる。可変ドメイン内の幾つかの位置は混成的な超可変位置とみなされうる。なぜなら、これらの位置は、ある１つの基準に基づけば超可変領域内に存在するとみなされうるが、異なる基準に基づけば超可変領域以外に存在するとみなされうるからである。また、これらの位置の１以上は拡張（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）超可変領域内に見出されうる。本開示は、これらの混成的超可変位置における修飾を含む抗体を提供する。天然重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、βシート構造を連結する（そして場合によっては該βシートの一部を形成する。）ループを形成する３つのＣＤＲにより連結されたβシート配置を主にとることにより、４つのＦＲ領域を含む。各鎖内のＣＤＲは、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順序で、ＦＲ領域により、接近して連結されており、他方の鎖からのＣＤＲと共に、抗体の標的結合部位の形成に関与する（Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．１９８７）を参照されたい）。本明細書中で用いる、免疫グロブリンアミノ酸残基の番号付けは、特に示さない限り、Ｋａｂａｔらの免疫グロブリンアミノ酸残基の番号付け体系に従って行われる。
【００４２】
Ｄ２Ｅ７の重鎖および軽鎖可変領域の配列は、それぞれ配列番号２および配列番号４により表され、それぞれ配列番号１および配列番号３によりコードされる。重鎖および軽鎖可変領域の配列は図１Ａにも示されている。Ｄ２Ｅ７のＣＤＲの配列およびそれらの対応識別記号は図１Ｂに示されている。Ｄ２Ｅ７（米国特許第６，０９０，３８２号に公開されているもの）の重鎖および軽鎖可変領域は図１Ｃに示されている。配列番号２または配列番号４をコードするいずれのヌクレオチド配列も本開示の組成物および方法において使用されうる。
【００４３】
本開示は更に、Ｄ２Ｅ７のＣＤＲ配列に関連したＣＤＲ配列を含む抗ＴＮＦ−α抗体断片を提供する。「抗体断片」なる語は、完全長抗体の一部分、一般には標的結合または可変領域を意味する。抗体断片の具体例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片が含まれる。「Ｆｖ」断片は、完全な標的認識および結合部位を含有する最小抗体断片である。この領域は、非共有結合により固く結合した、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとの二量体（ＶＨ−ＶＬ二量体）からなる。各可変ドメインの、３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の標的結合部位を定めるのは、この配置においてである。しばしば、６つのＣＤＲが標的結合特異性を該抗体に付与する。しかし、いくつかの場合には、単一可変ドメイン（または標的に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえも、標的を認識しそれに結合する能力を有しうる。「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は単一のポリペプチド鎖内に抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む。一般に、Ｆｖポリペプチドは更に、標的結合のための所望の構造をｓｃＦｖが形成するのを可能にする、ＶＨおよびＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーを含む。「単一ドメイン抗体」は、ＴＮＦ−αに対する十分な親和性を示す単一のＶＨまたはＶＬドメインから構成される。特定の実施形態においては、単一ドメイン抗体はラクダ科動物抗体である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：２５−３８を参照されたい）。
【００４４】
Ｆａｂ断片は軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）とを含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１以上のシステインを含む数個の残基が重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に付加されている点で、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆ（ａｂ’）断片は、Ｆ（ａｂ’）２ペプシン消化産物のヒンジシステインにおけるジスルフィド結合の切断により製造される。抗体断片の付加的化学カップリングは当業者に公知である。
【００４５】
ある実施形態においては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体はモノクローナル抗体である。本明細書中で用いる「モノクローナル抗体」なる語は、ハイブリドーマ技術により製造された抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」は、任意の真核生物、原核生物またはファージクローンを含む単クローンに由来する抗体を意味し、それが製造された方法には無関係である。本開示に関して有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術、またはそれらの組合せの使用を含む、当技術分野で公知の多種多様な技術を用いて製造されうる。本開示の抗ＴＮＦ−α抗体には、キメラ抗体、霊長類化抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体が含まれる。
【００４６】
本開示の抗ＴＮＦ−α抗体はキメラ抗体でありうる。本明細書中で用いる「キメラ」抗体なる語は、例えばラットまたはマウス抗体のような非ヒト免疫グロブリンに由来する可変配列と、典型的にはヒト免疫グロブリン鋳型から選択されるヒト免疫グロブリン定常領域とを有する抗体を意味する。キメラ抗体の製造方法は当技術分野で公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９（４７１９）：１２０２−７；Ｏｉら，１９８６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４−２２１；Ｇｉｌｌｉｅｓら，１９８５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２；米国特許第５，８０７，７１５号、第４，８１６，５６７号および第４，８１６３９７号（それらの全体を参照により組み入れることとする。）を参照されたい。
【００４７】
本開示の抗ＴＮＦ−α抗体はヒト化されうる。非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらの断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の標的結合性サブドメイン）である。一般に、該ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全ては非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てはヒト免疫グロブリン配列のものに対応する。該ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分（典型的には、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のもの）を含みうる。抗体のヒト化の方法は当技術分野で公知である。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−７；米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号および第６，１８０，３７０号（Ｑｕｅｅｎらに対するもの）；ＥＰ２３９４００；ＰＣＴ公開ＷＯ  ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；ＥＰ５９２１０６；ＥＰ５１９５９６；Ｐａｄｌａｎ，１９９１，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２８：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら，１９９４，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．７：８０５−８１４；Ｒｏｇｕｓｋａら，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：９６９−９７３；ならびに米国特許第５，５６５，３３２号（それらの全ての全体を参照により本明細書に組み入れることとする。）を参照されたい。
【００４８】
本開示の抗ＴＮＦ−α抗体はヒト抗体でありうる。ヒト患者の治療には完全「ヒト」抗ＴＮＦ−α抗体が望ましいであろう。本明細書中で用いる「ヒト抗体」には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、または１以上のヒト免疫グロブリンに関してトランスジェニックである、内因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体が含まれる。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを使用するファージディスプレイ法を含む当技術分野で公知の種々の方法により製造されうる。米国特許第４，４４４，８８７号および第４，７１６，１１１号；ならびにＰＣＴ公開ＷＯ  ９８／４６６４５；ＷＯ  ９８／５０４３３；ＷＯ  ９８／２４８９３；ＷＯ  ９８／１６６５４；ＷＯ  ９６／３４０９６；ＷＯ  ９６／３３７３５；およびＷＯ  ９１／１０７４１（それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする。）を参照されたい。また、ヒト抗体は、機能性内因性免疫グロブリンを発現し得ないがヒト免疫グロブリン遺伝子を発現しうるトランスジェニックマウスを使用して製造されうる。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ  ９８／２４８９３；ＷＯ  ９２／０１０４７；ＷＯ  ９６／３４０９６；ＷＯ  ９６／３３７３５；米国特許第５，４１３，９２３号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，５６９，８２５号、第５，６６１，０１６号、第５，５４５，８０６号、第５，８１４，３１８号、第５，８８５，７９３号、第５，９１６，７７１号および第５，９３９，５９８号（それらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする。）を参照されたい。また、Ｍｅｄａｒｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、Ａｓｔｅｌｌａｓ  Ｐｈａｒｍａ（Ｄｅｅｒｉｅｌｄ，ＩＬ）、Ａｍｇｅｎ（Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）およびＲｅｇｅｎｅｒｏｎ（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）のような企業が、前記と同様の技術を用いる選択された抗原に対するヒト抗体の提供に関わっているであろう。選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と称される技術を用いて製造されうる。このアプローチにおいては、同一エピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導するために、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を使用する（Ｊｅｓｐｅｒｓら，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３）。
【００４９】
本開示の抗ＴＮＦ−α抗体は霊長類化されうる。「霊長類化抗体」なる語は、サル可変領域とヒト定常領域とを含む抗体を意味する。霊長類化抗体の製造方法は当技術分野において公知である。例えば、米国特許第５，６５８，５７０号、第５，６８１，７２２号および第５，６９３，７８０号（それらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする。）を参照されたい。
【００５０】
本開示の抗ＴＮＦ−α抗体は二重特異性抗体でありうる。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル（しばしば、ヒトまたはヒト化）抗体である。本開示においては、該結合特異性の１つはＴＮＦ−αに対するものであることが可能であり、もう１つは、任意の他の抗原、例えば細胞表面タンパク質、受容体、受容体サブユニット、組織特異的抗原、ウイルス由来タンパク質、ウイルスコード化エンベロープタンパク質、細菌由来タンパク質または細菌表面タンパク質などに対するものでありうる。
【００５１】
本開示の抗ＴＮＦ−α抗体には、誘導体化抗体が含まれる。限定的なものではないが、例えば、誘導体化抗体は、典型的には、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化、アミド化、公知の保護／遮蔽基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結（抗体コンジュゲートの考察は第７．６節を参照されたい）などにより修飾される。多数の化学修飾はいずれも、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成など（これらに限定されるものではない）を含む公知技術により行われうる。また、例えばａｍｂｒｘ技術（例えば、Ｗｏｌｆｓｏｎ，２００６，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３（１０）：１０１１−２を参照されたい）を用いて、該誘導体に１以上の非天然アミノ酸を含有させることが可能である。
【００５２】
本開示の更にもう１つの実施形態においては、該抗ＴＮＦ−α抗体またはその断片は、対応する野生型配列と比較して少なくとも１つの定常領域媒介生物学的エフェクター機能を改変するように修飾された配列を有する抗体または抗体断片でありうる。例えば、いくつかの場合には、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体は、未修飾抗体と比較して少なくとも１つの定常領域媒介生物学的エフェクター機能を低下させるように、例えばＦｃ受容体（ＦｃγＲ）への結合を低下させるように修飾されうる。ＦｃγＲ結合は、ＦｃγＲ相互作用に必要な特定の領域において抗体の免疫グロブリン定常領域セグメントを突然変異させることにより低下されうる（例えば、ＣａｎｆｉｅｌｄおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ，１９９１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３−１４９１；ならびにＬｕｎｄら，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２６５７−２６６２を参照されたい）。該抗体のＦｃγＲ結合能における低下は、ＦｃγＲ相互作用に依存する他のエフェクター機能、例えばオプソニン作用、食作用および抗原依存性細胞傷害（「ＡＤＣＣ」）をも低下させうる。
【００５３】
本開示の他の実施形態においては、抗ＴＮＦ−α抗体またはその断片は、未修飾抗体と比較して少なくとも１つの定常領域媒介生物学的エフェクター機能を獲得または改善するように、例えばＦｃγＲ相互作用を増強するように修飾されうる（例えば、ＵＳ  ２００６／０１３４７０９を参照されたい）。例えば、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体は、対応する野生型定常領域より大きな親和性でＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢおよび／またはＦｃγＲＩＩＩＡに結合する定常領域を有しうる。
【００５４】
したがって、本開示の抗体は、オプソニン作用、食作用またはＡＤＣＣの増強または低下をもたらす生物活性における改変を有しうる。そのような改変は当技術分野で公知である。例えば、ＡＤＣＣ活性を低下させる抗体における修飾は米国特許第５，８３４，５９７号に記載されている。典型的なＡＤＣＣ低下性変異体は、残基２３６が欠失しており残基２３４、２３５および２３７（ＥＵ番号付けを使用）がアラニンで置換されている「突然変異３」（米国特許第５，８３４，５９７号の図４に示されている。）に相当する。
【００５５】
いくつかの実施形態においては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体は低レベルのフコースを有するか又はフコースを欠く。フコースを欠く抗体は、特に低用量の抗体において、ＡＤＣＣ活性の増強に相関されている。Ｓｈｉｅｌｄｓら，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａら，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６−７３を参照されたい。フコース低含有抗体の製造方法は、ラット骨髄腫ＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６６２）内での増殖を含む。ＹＢ２／０細胞は低レベルのＦＵＴ８  ｍＲＮＡを発現し、これは、ポリペプチドのフコシル化に必要な酵素であるα−１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードしている。
【００５６】
さらにもう１つの態様においては、該抗ＴＮＦ−α抗体またはその断片は、胎児Ｆｃ受容体ＦｃＲｎへのそれらの結合親和性を増強または軽減するように修飾された抗体または抗体断片であることが可能であり、そのような修飾は、例えば、ＦｃＲｎ相互作用に関与する特定の領域において免疫グロブリン定常領域セグメントを突然変異させることにより行われうる（例えば、ＷＯ  ２００５／１２３７８０を参照されたい）。特定の実施形態においては、重鎖定常領域のアミノ酸残基２５０、３１４および４２８の少なくとも１つが単独またはそれらの任意の組合せで、例えば、２５０および４２８位、または２５０および３１４位、または３１４および４２８位、または２５０、３１４および４２８位（２５０および４２８位がより特異的な組合せである。）において置換されるように、ＩｇＧクラスの抗ＴＮＦ−α抗体が突然変異している。２５０位に関しては、該置換アミノ酸残基は、トレオニン以外の任意のアミノ酸残基、例えばアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファンまたはチロシン（これらに限定されるものではない）でありうる。３１４位に関しては、該置換アミノ酸残基は、ロイシン以外の任意のアミノ酸残基、例えばアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンまたはチロシン（これらに限定されるものではない）でありうる。４２８位に関しては、該置換アミノ酸残基は、メチオニン以外の任意のアミノ酸残基、例えばアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンまたはチロシン（これらに限定されるものではない）でありうる。適当なアミノ酸置換の具体的な組合せは米国特許第７，２１７，７９７号の表１に特定されており、その表の全体を参照により本明細書に組み入れることとする。そのような突然変異はＦｃＲｎへの抗体の結合を増強し、これは該抗体の分解を防ぎ、その半減期を増加させる。
【００５７】
さらに他の態様においては、抗ＴＮＦ−α抗体は、ＪｕｎｇおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０：９，９５９−９６６；Ｙａｚａｋｉら，２００４，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．１７（５）：４８１−９．Ｅｐｕｂ  ２００４  Ａｕｇ  １７；および米国特許出願第２００７／０２８０９３１号に記載されているとおり、その超可変領域の１以上に挿入された１以上のアミノ酸を有する。
【００５８】
７．２  核酸および発現系
本開示は、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体をコードする核酸分子および宿主細胞を含む。
【００５９】
本開示の抗ＴＮＦ−α抗体は宿主細胞内での免疫グロブリン軽鎖および重鎖遺伝子の組換え発現により製造されうる。抗体を組換え発現させるためには、抗体の免疫グロブリン軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡ断片を含有する１以上の組換え発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクトして、該軽鎖および重鎖を該宿主細胞内で発現させ、場合によっては、該宿主細胞を培養している培地内にそれらを分泌させ、該培地から該抗体を回収することが可能である。抗体重鎖および軽鎖遺伝子を得、これらの遺伝子を組換え発現ベクター内に組込み、該ベクターを宿主細胞内に導入するためには、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ（編），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，１９８９）ならびに米国特許第４，８１６，３９７号に記載されているような標準的な組換えＤＮＡ法を用いる。
【００６０】
１つの実施形態においては、該抗ＴＮＦ−α抗体は、１以上のＣＤＲにおける変化を除き、Ｄ２Ｅ７に類似している（以下、「Ｄ２Ｅ７関連」配列を有すると称される。）。もう１つの実施形態においては、該抗ＴＮＦ−α抗体は、１以上のフレームワーク領域における変化を除き、Ｄ２Ｅ７に類似している。さらにもう１つの実施形態においては、該抗ＴＮＦ−α抗体は、１以上のＣＤＲにおける及び１以上のフレームワーク領域における変化を除き、Ｄ２Ｅ７に類似している。そのような抗ＴＮＦ−α抗体をコードする核酸を得るためには、まず、軽鎖および重鎖可変領域をコードするＤＮＡ断片を得る。これらのＤＮＡは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、軽鎖および重鎖可変配列をコードする生殖系列ＤＮＡまたはｃＤＮＡの増幅および修飾により得られうる。ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は当技術分野において公知である（例えば、“ＶＢＡＳＥ”ヒト生殖系列配列データベース（ｈｕｍａｎ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅ）を参照されたい；また、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２Ｔ：１１６−１９８；およびＣｏｘら，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６（それらのそれぞれの内容を参照により本明細書に組み入れることとする。）を参照されたい）。Ｄ２Ｅ７の重鎖または軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ断片（その配列は図１Ｃに示されている。）は合成可能であり、通常の突然変異誘発技術を用いる、本明細書に記載の変異体を作製するための突然変異誘発のための鋳型として使用可能であり、あるいは、該変異体をコードするＤＮＡ断片を直接的に合成することが可能である。
【００６１】
Ｄ２Ｅ７またはＤ２Ｅ７関連ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られたら、これらのＤＮＡ断片を更に、標準的な組換えＤＮＡ技術により操作して、例えば、可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子に変換することが可能である。これらの操作において、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ断片を、別のタンパク質、例えば抗体定常領域または可動性（ｆｌｅｘｉｂｌｅ）リンカーをコードする別のＤＮＡ断片に機能的に連結する。この文脈で用いる「機能的に連結」なる語は、それらの２つのＤＮＡ断片によりコードされるアミノ酸配列がインフレームのままとなるように、それらの２つのＤＮＡ断片が連結されていることを意味すると意図される。
【００６２】
ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３および場合によってはＣＨ４）をコードする別のＤＮＡ分子に機能的に連結することにより、ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡを完全長重鎖遺伝子に変換することが可能である。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野において公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）、これらの領域を含むＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅により得られうる。該重鎖定常領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域でありうるが、ある実施形態においては、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子の場合、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に機能的に連結されうる。
【００６３】
ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域（ＣＬ）をコードする別のＤＮＡ分子に機能的に連結することにより、ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡを完全長軽鎖遺伝子（およびＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することが可能である。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野において公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２））、これらの領域を含むＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅により得られうる。該軽鎖定常領域はカッパまたはラムダ定常領域でありうるが、ある実施形態においてはカッパ定常領域である。ｓｃＦｖ遺伝子を作製するためには、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ断片を、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４〜Ｓｅｒ）３をコードする可動性（ｆｌｅｘｉｂｌｅ）リンカーをコードする別の断片に機能的に連結して、該可動性リンカーにより連結されたＶＬおよびＶＨ領域が連続的一本鎖タンパク質として発現されうるようにする（例えば、Ｂｉｒｄら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４を参照されたい）。
【００６４】
本開示の抗ＴＮＦ−α抗体を発現させるためには、前記のとおりに得られた部分的または完全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを、該遺伝子が転写および翻訳制御配列に機能的に連結されるように、発現ベクター内に挿入する。この文脈においては「機能的に連結」なる語は、抗体遺伝子がベクター内に連結されて、該ベクター内の転写および翻訳制御配列が、該抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するそれらの意図される機能を果たすことを意味すると意図される。該発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞に和合性となるように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は別々のベクター内に挿入されることが可能であり、あるいはより典型的には、両方の遺伝子は同一発現ベクター内に挿入される。
【００６５】
該抗体遺伝子は該発現ベクター内に標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的制限部位の連結、または制限部位が存在しない場合には平滑末端連結）により挿入される。Ｄ２Ｅ７またはＤ２Ｅ７関連軽鎖または重鎖配列の挿入の前に、該発現ベクターは抗体定常領域配列を既に含有していることが可能である。例えば、Ｄ２Ｅ７またはＤ２Ｅ７関連ＶＨおよびＶＬ配列を完全長抗体遺伝子に変換するための１つのアプローチは、それぞれ重鎖定常および軽鎖定常領域を既にコードしている発現ベクター内にそれらを挿入して、ＶＨセグメントを該ベクター内のＣＨセグメントに機能的に連結し、ＶＬセグメントを該ベクター内のＣＬセグメントに機能的に連結することである。それに加えて又はその代わりに、該組換え発現ベクターは、宿主細胞からの該抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードしていることが可能である。該抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが該抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、該ベクター内にクローニングされうる。シグナルペプチドは免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）でありうる。
【００６６】
該抗体鎖遺伝子に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞内での該抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を含有する。「調節配列」なる語は、プロモーター、エンハンサー、および該抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御する他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むと意図される。そのような調節配列は、例えばＧｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０）に記載されている。調節配列の選択を含む該発現ベクターの設計は、形質転換すべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような要因に左右されうる、と当業者に理解されるであろう。哺乳類宿主細胞発現のための適当な調節配列には、哺乳類細胞における高レベルのタンパク質発現を導くウイルス要素、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーターおよび／またはエンハンサー（例えば、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーターおよび／またはエンハンサー（例えば、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス由来のプロモーターおよび／またはエンハンサー（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーが含まれる。ウイルス調節要素およびその配列の更に詳細な説明は、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉによる米国特許第５，１６８，０６２号、Ｂｅｌｌらによる米国特許第４，５１０，２４５号およびＳｃｈａｆｆｎｅｒらによる米国特許第４，９６８，６１５号を参照されたい。
【００６７】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、追加的配列、例えば、宿主細胞内での該ベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択可能マーカー遺伝子を含有しうる。選択可能マーカー遺伝子は、該ベクターが導入された宿主細胞の選択を促進する（例えば、全てＡｘｅｌらによる米国特許第４，３９９，２１６号、第４，６３４，６６５号および第５，１７９，０１７号を参照されたい）。例えば、典型的には、選択可能マーカー遺伝子は、薬物、例えばＧ４１８、ピューロマイシン、ブラスチシジン、ヒグロマイシンまたはメトトレキセートに対する耐性を、該ベクターが導入された宿主細胞に付与する。適当な選択可能マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅を伴うＤＨＦＲ−宿主細胞における使用のためのもの）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のためのもの）が含まれる。軽鎖および重鎖の発現のためには、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを標準的な技術により宿主細胞内にトランスフェクトする。「トランスフェクション」なる語の種々の形態は、原核または真核宿主細胞内への外因性ＤＮＡの導入のために一般に用いられる多種多様な技術、例えばエレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを含むと意図される。
【００６８】
本開示の抗体を原核または真核宿主細胞内で発現させることが可能である。ある実施形態においては、適切にフォールディングされ免疫学的に活性な抗体の最適分泌のために、抗体の発現を真核細胞、例えば哺乳類宿主細胞内で行う。本開示の組換え抗体を発現させるための典型的な哺乳類宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ，１９８２，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されているＤＨＦＲ選択可能マーカーと共に使用される、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載されているＤＨＦＲ−  ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞およびＳＰ２／０細胞が含まれる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳類宿主細胞内に導入する場合、該抗体は、該宿主細胞内での該抗体の発現または該宿主細胞が培養されている培地内への該抗体の分泌を可能にするのに十分な時間にわたって該宿主細胞を培養することにより製造される。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて培地から回収されうる。宿主細胞は、完全抗体の一部分、例えばＦａｂ断片またはｓｃＦｖ分子を製造するためにも使用されうる。前記方法の変法は本開示の範囲内であると理解される。例えば、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体の軽鎖または重鎖の一方（両方ではない）をコードするＤＮＡで宿主細胞をトランスフェクトすることが望ましいであろう。
【００６９】
組換えＤＮＡ技術は、ＴＮＦ−αへの結合に必要でない軽鎖および重鎖の一方または両方をコードするＤＮＡの一部または全部を除去するためにも使用されうる。そのようなトランケート化ＤＮＡ分子から発現される分子も本開示の抗体に含まれる。
【００７０】
また、標準的な化学的架橋法により本開示の抗体を二次抗体に架橋することにより、一方の重鎖および一方の軽鎖が本開示の抗体であり、他方の重鎖および軽鎖がＴＮＦ−α以外の抗原に特異的である二官能性抗体が製造されうる。二官能性抗体をコードするように操作された核酸を発現させることによっても、二官能性抗体が製造されうる。
【００７１】
ある実施形態においては、軽鎖および／または重鎖ＣＤＲ内のアミノ酸残基を突然変異させることにより、二重特異性抗体、すなわち、同一結合部位を使用してＴＮＦ−αおよび無関係な抗原に結合する抗体が製造されうる。種々の実施形態においては、ＴＮＦ−αおよび別の抗原、例えば別の炎症性サイトカイン（例えば、リンホトキシン、インターフェロン−γまたはインターロイキン−１）に結合する二重特異性抗体は、抗原結合部位の周辺部のアミノ酸残基を突然変異させることにより製造される（例えば、Ｂｏｓｔｒｏｍら，２００９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２３：１６１０−１６１４を参照されたい）。二重官能性抗体は、二重特異性抗体をコードするように操作された核酸を発現させることにより製造されうる。
【００７２】
本開示の抗体ＴＮＦ−α抗体の組換え発現のために、本開示の２つの発現ベクター（第１ベクターは重鎖由来ポリペプチドをコードし、第２ベクターは軽鎖由来ポリペプチドをコードする。）で宿主細胞をコトランスフェクトすることが可能である。典型的には、それらの２つのベクターはそれぞれ、別々の選択可能マーカーを含有する。あるいは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの両方をコードする単一のベクターが使用されうる。
【００７３】
Ｄ２Ｅ７の１以上の部分をコードする、またはＤ２Ｅ７のＣＤＲ配列に関連したＣＤＲ配列を有する抗ＴＮＦ−α抗体の１以上の部分をコードする核酸を作製したら、更なる改変または突然変異を該コード化配列内に導入して、例えば、種々のＣＤＲ配列を有する抗体、Ｆｃ受容体に対する親和性が減少した抗体、または種々のサブクラスの抗体をコードする核酸を作製することが可能である。
【００７４】
本開示の抗ＴＮＦ−α抗体は化学合成（例えば、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，１９８４  Ｔｈｅ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．に記載されている方法）によっても製造されうる。変異抗体は、無細胞形態を使用することによっても製造されうる（例えば、Ｃｈｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉａ  Ｎｏ．２，２００１（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を参照されたい）。
【００７５】
本開示の抗ＴＮＦ−α抗体が組換え発現により製造されたら、それは、免疫グロブリン分子の精製のための当業者に公知のいずれかの方法により、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特に、プロテインＡまたはプロテインＧ選択後のＴＮＦ−αに対する親和性、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質の精製のためのいずれかの他の標準的な技術により精製されうる。さらに、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体またはその断片は、精製を促進するための、本明細書に記載されている又は当技術分野で公知の異種ポリペプチド配列に融合されうる。
【００７６】
抗ＴＮＦ−α抗体は、単離されたら、所望により、例えば高速液体クロマトグラフィー（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷｏｒｋおよびＢｕｒｄｏｎ編，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８０）を参照されたい）により、またはＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上のゲル濾過クロマトグラフィーにより、更に精製されうる。
【００７７】
７．３  抗ＴＮＦ−α抗体の生物活性
ある実施形態においては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体は、例えばＴＮＦ−αへの結合に関するＤ２Ｅ７との競合またはＴＮＦ−α活性の中和のような或る生物活性を有する。
【００７８】
したがって、ある実施形態においては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体はＴＮＦ−αへの結合に関してＤ２Ｅ７と競合する。ＴＮＦ−αへの結合に関して競合する能力は、競合アッセイを用いて試験されうる。競合アッセイの一例においては、ＴＮＦ−αを、固体表面、例えばマイクロウェルプレート上に、該プレートをＴＮＦ−αの溶液（例えば、ＰＢＳ中、１μｇ／ｍＬの濃度、４℃で一晩）と接触させることにより付着させる。該プレートを洗浄し（例えば、ＰＢＳ中の０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）、ブロッキングする（例えば、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）中）。亜飽和量のビオチン化Ｄ２Ｅ７（８０ｎｇ／ｍＬ）と未標識Ｄ２Ｅ７（「参照」抗体）または競合抗ＴＮＦ−α抗体（「試験」抗体）［ＥＬＩＳＡバッファー（例えば、ＰＢＳ中の１％  ＢＳＡおよび０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）中で系列希釈（例えば、２．８μｇ／ｍＬ、８．３μｇ／ｍＬまたは２５μｇ／ｍＬの濃度）されたもの］の混合物をウェルに加え、プレートを、穏やかに振とうしながら１時間温置する。該プレートを洗浄し、ＥＬＩＳＡバッファー中で希釈された１μｇ／ｍＬ  ＨＲＰ結合ストレプトアビジンを各ウェルに加え、該プレートを１時間温置した。プレートを洗浄し、結合抗体を基質（例えば、ＴＭＢ，Ｂｉｏｆｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｏｗｉｎｇｓ  Ｍｉｌｌｓ，ＭＤ）の添加により検出した。該反応を停止バッファー（例えば、Ｂｉｏ  ＦＸ  Ｓｔｏｐ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ｂｉｏｆｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｏｗｉｎｇｓ  Ｍｉｌｌｓ，ＭＤ）の添加により停止させ、マイクロプレートリーダー（例えば、ＶＥＲＳＡｍａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して吸光度を６５０ｎｍで測定した。本開示の抗ＴＮＦ−α抗体とＤ２Ｅ７との競合を試験するために、この競合アッセイの変法も使用されうる。例えば、ある態様においては、該抗ＴＮＦ−α抗体を参照抗体として使用し、Ｄ２Ｅ７を試験抗体として使用する。また、可溶性ＴＮＦ−αの代わりに、培養内で細胞表面（例えば哺乳類細胞、例えば２９３Ｓ）上で発現される膜結合性ＴＮＦ−αを使用することが可能である。あるいは、可溶性Ｄ２Ｅ７および試験抗体の代わりに、培養内で細胞表面（例えば哺乳類細胞、例えば２９３ｃ１８）上で発現されるものを使用することも可能である。一般に、約１０４から１０６個のトランスフェクタント、例えば約１０５個のトランスフェクタントを使用する。競合アッセイのための他の形態が当技術分野で公知であり、使用可能である。
【００７９】
種々の実施形態においては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体は、該抗ＴＮＦ−α抗体が０．０８μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬの濃度またはいずれかの前記値の間の範囲の濃度（例えば、２μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬの範囲の濃度）で使用された場合、標識Ｄ２Ｅ７の結合を少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはいずれかの前記値の間の範囲の百分率だけ低下させる（例えば、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体は標識Ｄ２Ｅ７の結合を５０％から７０％低下させる。）。
【００８０】
他の実施形態においては、Ｄ２Ｅ７は、Ｄ２Ｅ７が０．４μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬの濃度またはいずれかの前記値の間の範囲の濃度（例えば、２μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬの範囲の濃度）で使用された場合、本開示の標識抗ＴＮＦ−α抗体の結合を少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはいずれかの前記値の間の範囲の百分率だけ低下させる（例えば、Ｄ２Ｅ７は本開示の標識された抗ＴＮＦ−α抗体の結合を５０％から７０％低下させる。）。
【００８１】
他の態様においては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体は、例えば細胞傷害性、有糸分裂誘発、サイトカイン誘導および接着分子の誘導のようなインビトロアッセイの範囲においてＴＮＦ−α活性を抑制する。あるいは、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体の活性は、例えば逆シグナリングの誘導能、サイトカイン誘導、接着分子の誘導、ＣＤＣおよびＡＤＣＣのように、細胞上で天然で又は組換え的に発現された膜結合性ＴＮＦ−αを使用するインビトロアッセイにより測定されうる。ＴＮＦ−αに感受性である細胞（例えば、Ｌ９２９）を使用して可溶性ＴＮＦ−α細胞傷害性の抑制を測定する典型的なＴＮＦ−α中和アッセイを以下に記載する。本開示の抗ＴＮＦ−α抗体の活性を評価するために、他のＴＮＦ−α細胞傷害性アッセイも使用されうる。
【００８２】
したがって、典型的な実施形態においては、抗ＴＮＦ−α細胞傷害性アッセイは、３×１０４個のマウスＬ９２９細胞を平底９６ウェルマイクロタイタープレートの個々のウェル内にプレーティングすることを含む。該細胞を加湿５％  ＣＯ２  恒温槽内で３７℃で一晩温置する。翌日、該抗ＴＮＦ−α抗体の系列希釈物（例えば、０．７１２μｇ／ｍＬ、０．９４９μｇ／ｍＬ、１．２７μｇ／ｍＬ、１．６９μｇ／ｍＬ、２．２５μｇ／ｍＬまたは３μｇ／ｍＬ）を２５μＬの無血清培地内で調製し、細胞に加える（例えば、１５０μＬの培養内の最終濃度は１１９ｎｇ／ｍＬ、１５８ｎｇ／ｍＬ、２１１ｎｇ／ｍＬ、２８２ｎｇ／ｍＬ、３７５ｎｇ／ｍＬまたは５００ｎｇ／ｍＬである。）。３７℃、５％  ＣＯ２における２時間の温置の後、ＴＮＦ−αを４０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２４０ｎｇ／ｍＬの２５μＬ）の最終濃度で加え、該細胞を３７℃、５％  ＣＯ２で更に４８時間温置した。生存度アッセイ（例えば、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、該ウェルを、対照プレート（これは、ある実施形態においては、抗ＴＮＦ−α抗体と共に温置されずに、例えば、イソタイプ対照抗体と共に温置され、ＴＮＦ−αで処理され、他の実施形態においては、Ｄ２Ｅ７で処理された）と比較して細胞傷害性に関して評価する。ＴＮＦ−α中和アッセイのための他の形態は当技術分野において公知であり、使用可能である。
【００８３】
種々の実施形態においては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体は、該抗ＴＮＦ−α抗体が２ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬの濃度またはいずれかの前記値の間の範囲の濃度（例えば、１μｇ／ｍＬから５μｇ／ｍＬの範囲の濃度）で使用された場合、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはいずれかの前記値の間の範囲の百分率だけＴＮＦ−αを中和する（例えば、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体はＴＮＦ−α活性を５０％から７０％中和する。）。いくつかの実施形態においては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体は、ＴＮＦ−αの中和において、Ｄ２Ｅ７の少なくとも８０％有効、少なくとも９０％有効、少なくとも１００％有効、少なくとも１１０％有効、少なくとも１２５％有効または少なくとも１５０％有効であり、１１０％まで有効、１２５％まで有効、１５０％まで有効または２００％まで有効であり、あるいは前記値のいずれかのペアの間のいずれかの範囲まで有効（例えば、ＴＮＦ−αの中和においてＤ２Ｅ７の８０％から１２５％有効またはＤ２Ｅ７の１２５％から２００％有効）である。
【００８４】
ある実施形態においては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体はＴＮＦ−αに対する高い結合親和性を有する。特定の実施形態においては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体は特定の会合速度定数（ｋｏｎまたはｋａ値）、解離速度定数（ｋｏｆｆまたはｋｄ値）、親和性定数（ＫＡ値）、解離定数（ＫＤ値）および／またはＩＣ５０値を有する。ある態様においては、そのような値は以下の実施形態から選択される。
【００８５】
７．４  抗ＴＮＦ−α抗体の動力学的特性
特定の実施形態においては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体は、少なくとも１０５  Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０５  Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６  Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６  Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０７  Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７  Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０８  Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎまたは前記値のいずれかのペアの間のいずれかの範囲のｋｏｎ（例えば、５×１０５から５×１０６  Ｍ−１ｓ−１または１０７から１０８  Ｍ−１ｓ−１）で、ＴＮＦ−αに結合する。
【００８６】
もう１つの実施形態においては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体は、５×１０−１ｓ−１以下、１０−１ｓ−１以下、５×１０−２ｓ−１以下、１０−２ｓ−１以下、５×１０−３ｓ−１以下、１０−３ｓ−１以下、５×１０−４ｓ−１以下、１０−４ｓ−１以下、５×１０−５ｓ−１以下、１０−５ｓ−１以下、５×１０−６ｓ−１以下、１０−６ｓ−１以下、５×１０−６ｓ−１以下、１０−６ｓ−１以下、５×１０−７ｓ−１以下、１０−７ｓ−１以下、５×１０−８ｓ−１以下、１０−８ｓ−１以下、５×１０−９ｓ−１以下、１０−９ｓ−１以下、５×１０−１０ｓ−１以下、１０−１０ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度または前記値のいずれかのペアの間のいずれかの範囲のｋｏｆｆ（例えば、５×１０−４から１０−６ｓ−１、または５×１０−５から５×１０−８ｓ−１）で、ＴＮＦ−αに結合する。
【００８７】
もう１つの実施形態においては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体は、少なくとも１０１１  ｎＭ−１、少なくとも５×１０１１  ｎＭ−１、少なくとも１０１２  ｎＭ−１、少なくとも５×１０１２  ｎＭ−１、少なくとも１０１３  ｎＭ−１、少なくとも５×１０１３  ｎＭ−１、少なくとも１０１４  ｎＭ−１、少なくとも５×１０１４  ｎＭ−１、少なくとも１０１５  ｎＭ−１、少なくとも５×１０１５  ｎＭ−１、少なくとも１０１６  ｎＭ−１、少なくとも５×１０１６  ｎＭ−１、少なくとも１０１７  ｎＭ−１、少なくとも５×１０１７  ｎＭ−１、少なくとも１０１８  ｎＭ−１、少なくとも５×１０１８  ｎＭ−１、少なくとも１０１９  ｎＭ−１、少なくとも５×１０１９  ｎＭ−１、少なくとも１０２０  ｎＭ−１、少なくとも５×１０２０  ｎＭ−１、少なくとも１０２１  ｎＭ−１、少なくとも５×１０２１  ｎＭ−１、少なくとも１０２２  ｎＭ−１、少なくとも５×１０２２  ｎＭ−１、少なくとも１０２３  ｎＭ−１、少なくとも５×１０２３  ｎＭ−１、少なくとも１０２４  ｎＭ−１、少なくとも５×１０２４  ｎＭ−１のＫＡ（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）または前記値のいずれかのペアの間のいずれかの範囲のＫＡ（例えば、５×１０１４から１０２２  ｎＭ−１または１０１１から５×１０１８  ｎＭ−１）で、ＴＮＦ−αに結合する。
【００８８】
他の実施形態においては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体は、５×１０７  ｎＭ以下、１０７  ｎＭ以下、５×１０６  ｎＭ以下、１０６  ｎＭ以下、５×１０５  ｎＭ以下、１０５  ｎＭ以下、５×１０４  ｎＭ以下、１０４  ｎＭ以下、５×１０３  ｎＭ以下、１０３  ｎＭ以下、５×１０２  ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、９０ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、７０ｎＭ以下、６０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、３．８ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１．５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、５×１０−１  ｎＭ以下、１０−１  ｎＭ以下、５×１０−２  ｎＭ以下、１０−２  ｎＭ以下、５×１０−３  ｎＭ以下、１０−３  ｎＭ以下、５×１０−４  ｎＭ以下、１０−４  ｎＭ以下、５×１０−５  ｎＭ以下、１０−５  ｎＭ以下、５×１０−６  ｎＭ以下、１０−６  ｎＭ以下のＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）または前記値のいずれかのペアの間のいずれかの範囲のＫＤ（例えば、５×１０７から５０ｎＭまたは１５ｎＭから５×１０−３  ｎＭ）で、ＴＮＦ−αに結合する。
【００８９】
ある特定の実施形態においては、本開示のＴＮＦ−α抗体は、約０．１ｎＭから約１ｎＭ、または約０．１ｎＭから約２ｎＭ、または約０．１ｎＭから約３ｎＭ、または約０．１ｎＭから約４ｎＭ、または約０．１ｎＭから約５ｎＭ、または約０．１ｎＭから約６ｎＭ、または約０．１ｎＭから約７ｎＭ、または約０．１ｎＭから約８ｎＭ、または約０．１ｎＭから約９ｎＭ、または約０．１ｎＭから約１０ｎＭ、または約０．０１ｎＭから約０．１ｎＭ、または約０．０１ｎＭから約１ｎＭ、または約０．０１ｎＭから約２ｎＭ、または約０．０１ｎＭから約３ｎＭ、または約０．０１ｎＭから約４ｎＭ、または約０．０１ｎＭから約５ｎＭ、または約０．０１ｎＭから約６ｎＭ、または約０．０１ｎＭから約７ｎＭ、または約０．０１ｎＭから約８ｎＭ、または約０．０１ｎＭから約９ｎＭ、または約０．６ｎＭから約１．１ｎＭ、または約０．７ｎＭから約１．２ｎＭ、または約０．５ｎＭから約５ｎＭのＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）で、ＴＮＦ−αに結合する。他の特定の実施形態においては、抗ＴＮＦ−α抗体は、約５ｎＭ、約３．５ｎＭ、約１．５ｎＭ、約１ｎＭ、約０．５ｎＭ、約０．１ｎＭ、約０．０５ｎＭまたは約０．０１ｎＭのＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）で、ＴＮＦ−αに結合する。特定の実施形態においては、ＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）値は、当技術分野でよく知られているか又は本明細書に記載されているアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、等温滴定熱量測定（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ；ＩＴＣ）、ＢＩＡｃｏｒｅまたは蛍光偏光アッセイにより決定される。
【００９０】
いくつかの実施形態においては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体はＴＮＦ−αに結合し、５×１０７  ｎＭ未満、１０７  ｎＭ未満、５×１０６  ｎＭ未満、１０６  ｎＭ未満、５×１０５  ｎＭ未満、１０５  ｎＭ未満、５×１０４  ｎＭ未満、１０４  ｎＭ未満、５×１０３  ｎＭ未満、１０３  ｎＭ未満、５×１０２  ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、９０ｎＭ未満、８０ｎＭ未満、７０ｎＭ未満、６０ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、１２ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、１ｎＭ未満、５×１０−１  ｎＭ未満、１０−１  ｎＭ未満、５×１０−２  ｎＭ未満、１０−２  ｎＭ未満、５×１０−３  ｎＭ未満、１０−３  ｎＭ未満、５×１０−４  ｎＭ未満もしくは１０−４  ｎＭ未満のＩＣ５０値または前記値のいずれかのペアの間のいずれかの範囲のＩＣ５０値（例えば、５×１０７から５０ｎＭまたは１５ｎＭから５×１０−３  ｎＭ）で、ｐ５５、ｐ７５またはそれらの両方へのＴＮＦ−αの結合を抑制する。ＩＣ５０は、当技術分野でよく知られているか又は本明細書に記載されている方法、例えばＥＬＩＳＡにより測定されうる。
【００９１】
他の実施形態においては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体はＴＮＦ−αに結合し、５×１０７  ｎＭ未満、１０７  ｎＭ未満、５×１０６  ｎＭ未満、１０６  ｎＭ未満、５×１０５  ｎＭ未満、１０５  ｎＭ未満、５×１０４  ｎＭ未満、１０４  ｎＭ未満、５×１０３  ｎＭ未満、１０３  ｎＭ未満、５×１０２  ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、９０ｎＭ未満、８０ｎＭ未満、７０ｎＭ未満、６０ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、１２ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、１ｎＭ未満、５×１０−１  ｎＭ未満、１０−１  ｎＭ未満、５×１０−２  ｎＭ未満、１０−２  ｎＭ未満、５×１０−３  ｎＭ未満、１０−３  ｎＭ未満、５×１０−４  ｎＭ未満もしくは１０−４  ｎＭ未満のＩＣ５０値または前記値のいずれかのペアの間のいずれかの範囲のＩＣ５０値（例えば、５×１０７から５０ｎＭまたは１５ｎＭから５×１０−３  ｎＭ）で、ＴＮＦ−αを中和する。抗ＴＮＦ−α抗体のＩＣ５０を測定するために用いられうる典型的な中和アッセイは後記第７．５節に記載されている。
【００９２】
ある特定の実施形態においては、抗ＴＮＦ−α抗体はＴＮＦ−αに結合し、約１ｎＭから約１０ｎＭ、約１ｎＭから約１５ｎＭ、約１ｎＭから約２０ｎＭ、約１ｎＭから約２５ｎＭ、約１ｎＭから約３０ｎＭ、約１ｎＭから約４０ｎＭ、約１ｎＭから約５０ｎＭ、約１０ｎＭから約１０２ｎＭ、約１０２ｎＭから約１０３ｎＭ、約１０ｎＭから約１０４ｎＭ、約１０４ｎＭから約１０５ｎＭ、約１０５ｎＭから約１０６ｎＭ、または約１０６ｎＭから約１０７ｎＭのＩＣ５０値で、ｐ５５、ｐ７５またはそれらの両方へのＴＮＦ−αの結合を抑制し、あるいはＴＮＦ−α中和アッセイにおけるＴＮＦ−α活性を抑制する。
【００９３】
ある特定の実施形態においては、抗ＴＮＦ−α抗体はＴＮＦ−αに結合し、約５ｎＭから約１０ｎＭ、約５ｎＭから約１５ｎＭ、約１０ｎＭから約１５ｎＭ、約１０ｎＭから約２０ｎＭ、約１０ｎＭから約３０ｎＭ、約１０ｎＭから約４０ｎＭ、約１０ｎＭから約５０ｎＭ、約１ｎＭから約１００ｎＭ、約１０ｎＭから約１００ｎＭ、約２０ｎＭから約１００ｎＭ、約３０ｎＭから約１００ｎＭ、約４０ｎＭから約１００ｎＭ、約５０ｎＭから約１００ｎＭ、約１５ｎＭから約２５ｎＭ、または約１５ｎＭから約２０ｎＭのＩＣ５０値で、ｐ５５、ｐ７５またはそれらの両方へのＴＮＦ−αの結合を抑制し、あるいはＴＮＦ−α中和アッセイにおけるＴＮＦ−α活性を抑制する。
【００９４】
前記実施形態の或る態様においては、該ＩＣ５０は、０．００１μＭ、０．００５μＭ、０．０１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、９００μＭ、１０００μＭの濃度または前記値のいずれかのペアの間のいずれかの範囲の濃度（例えば、０．０１から５０μＭ、または１０μＭから１００μＭ）のＴＮＦ−αの存在下で測定される。
【００９５】
ある実施形態においては、本開示の抗体の動力学的特性は、比較アッセイにおいて、Ｄ２Ｅ７抗体に匹敵するか、またはＤ２Ｅ７抗体に比べて改善されている。例えば、ある実施形態においては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体は、Ｄ２Ｅ７のｋｏｎの０．２×（倍）〜５×の範囲のｋｏｎ速度、例えば、Ｄ２Ｅ７のｋｏｎの０．２×のｋｏｎ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｎの０．３×のｋｏｎ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｎの０．４×のｋｏｎ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｎの０．５×のｋｏｎ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｎの０．６×のｋｏｎ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｎの０．７×のｋｏｎ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｎの０．８×のｋｏｎ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｎの０．９×のｋｏｎ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｎの１×のｋｏｎ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｎの１．１×のｋｏｎ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｎの１．２×のｋｏｎ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｎの１．３×のｋｏｎ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｎの１．４×のｋｏｎ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｎの１．５×のｋｏｎ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｎの１．７５×のｋｏｎ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｎの２×のｋｏｎ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｎの２．２５×のｋｏｎ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｎの２．５×のｋｏｎ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｎの２．７５×のｋｏｎ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｎの３×のｋｏｎ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｎの３．５×のｋｏｎ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｎの４×のｋｏｎ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｎの４．５×のｋｏｎ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｎの５×のｋｏｎ、または前記値のいずれかのペアの間の範囲のｋｏｎ、例えば、Ｄ２Ｅ７のｋｏｎの０．７×〜１．５×のｋｏｎ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｎの０．９×〜１．３×のｋｏｎ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｎの０．８×〜２×のｋｏｎ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｎの０．９×〜３×のｋｏｎなどで、ＴＮＦ−αに結合する。
【００９６】
いくつかの実施形態においては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体は、Ｄ２Ｅ７のｋｏｆｆの０．２×（倍）〜５×の範囲のｋｏｆｆ速度、例えば、Ｄ２Ｅ７のｋｏｆｆの０．２×のｋｏｆｆ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｆｆの０．３×のｋｏｆｆ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｆｆの０．４×のｋｏｆｆ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｆｆの０．５×のｋｏｆｆ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｆｆの０．６×のｋｏｆｆ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｆｆの０．７×のｋｏｆｆ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｆｆの０．８×のｋｏｆｆ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｆｆの０．９×のｋｏｆｆ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｆｆの１×のｋｏｆｆ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｆｆの１．１×のｋｏｆｆ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｆｆの１．２×のｋｏｆｆ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｆｆの１．３×のｋｏｆｆ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｆｆの１．４×のｋｏｆｆ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｆｆの１．５×のｋｏｆｆ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｆｆの１．７５×のｋｏｆｆ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｆｆの２×のｋｏｆｆ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｆｆの２．２５×のｋｏｆｆ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｆｆの２．５×のｋｏｆｆ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｆｆの２．７５×のｋｏｆｆ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｆｆの３×のｋｏｆｆ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｆｆの３．５×のｋｏｆｆ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｆｆの４×のｋｏｆｆ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｆｆの４．５×のｋｏｆｆ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｆｆの５×のｋｏｆｆ、または前記値のいずれかのペアの間の範囲のｋｏｆｆ、例えば、Ｄ２Ｅ７のｋｏｆｆの０．７×〜１．５×のｋｏｆｆ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｆｆの０．９×〜１．３×のｋｏｆｆ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｆｆの０．８×〜２×のｋｏｆｆ、Ｄ２Ｅ７のｋｏｆｆの０．９×〜３×のｋｏｆｆなどで、ＴＮＦ−αに結合する。
【００９７】
他の実施形態においては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体は、Ｄ２Ｅ７のＫＡの０．０４×から２５×の範囲のＫＡ（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）、例えば、Ｄ２Ｅ７のＫＡの０．０４×のＫＡ、Ｄ２Ｅ７のＫＡの０．１×のＫＡ、Ｄ２Ｅ７のＫＡの０．２５×のＫＡ、Ｄ２Ｅ７のＫＡの０．５×のＫＡ、Ｄ２Ｅ７のＫＡの０．６×のＫＡ、Ｄ２Ｅ７のＫＡの０．７×のＫＡ、Ｄ２Ｅ７のＫＡの０．８×のＫＡ、Ｄ２Ｅ７のＫＡの０．９×のＫＡ、Ｄ２Ｅ７のＫＡの１×のＫＡ、Ｄ２Ｅ７のＫＡの１．１×のＫＡ、Ｄ２Ｅ７のＫＡの１．２５×のＫＡ、Ｄ２Ｅ７のＫＡの１．５×のＫＡ、Ｄ２Ｅ７のＫＡの１．７５×のＫＡ、Ｄ２Ｅ７のＫＡの２×のＫＡ、Ｄ２Ｅ７のＫＡの２．５×のＫＡ、Ｄ２Ｅ７のＫＡの３×のＫＡ、Ｄ２Ｅ７のＫＡの４×のＫＡ、Ｄ２Ｅ７のＫＡの４×％のＫＡ、Ｄ２Ｅ７のＫＡの５×のＫＡ、Ｄ２Ｅ７のＫＡの７．５×のＫＡ、Ｄ２Ｅ７のＫＡの１０×のＫＡ、Ｄ２Ｅ７のＫＡの１２．５×のＫＡ、Ｄ２Ｅ７のＫＡの１５×のＫＡ、Ｄ２Ｅ７のＫＡの２０×のＫＡ、Ｄ２Ｅ７のＫＡの２５×のＫＡ、または前記値のいずれかのペアの間の範囲のＫＡ、例えば、Ｄ２Ｅ７のＫＡの０．７×〜１．２５×のＫＡ、Ｄ２Ｅ７のＫＡの０．９×〜１．５×のＫＡ、Ｄ２Ｅ７のＫＡの０．９×〜２×のＫＡ、Ｄ２Ｅ７のＫＡの０．８×〜１．７５×のＫＡ、Ｄ２Ｅ７のＫＡの０．９×〜５×のＫＡ、あるいは本明細書に開示されているｋｏｎおよびｋｏｆｆ速度から計算されうるいずれかの値または範囲で、ＴＮＦ−αに結合する。
【００９８】
他の実施形態においては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体は、Ｄ２Ｅ７のＫＤの０．０４×〜２５×の範囲のＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）、例えば、Ｄ２Ｅ７のＫＤの０．０４×のＫＤ、Ｄ２Ｅ７のＫＤの０．１×のＫＤ、Ｄ２Ｅ７のＫＤの０．２５×のＫＤ、Ｄ２Ｅ７のＫＤの０．５×のＫＤ、Ｄ２Ｅ７のＫＤの０．６×のＫＤ、Ｄ２Ｅ７のＫＤの０．７×のＫＤ、Ｄ２Ｅ７のＫＤの０．８×のＫＤ、Ｄ２Ｅ７のＫＤの０．９×のＫＤ、Ｄ２Ｅ７のＫＤの１×のＫＤ、Ｄ２Ｅ７のＫＤの１．１×のＫＤ、Ｄ２Ｅ７のＫＤの１．２５×のＫＤ、Ｄ２Ｅ７のＫＤの１．５×のＫＤ、Ｄ２Ｅ７のＫＤの１．７５×のＫＤ、Ｄ２Ｅ７のＫＤの２×のＫＤ、Ｄ２Ｅ７のＫＤの２．５×のＫＤ、Ｄ２Ｅ７のＫＤの３×のＫＤ、Ｄ２Ｅ７のＫＤの４×のＫＤ、Ｄ２Ｅ７のＫＤの４×％のＫＤ、Ｄ２Ｅ７のＫＤの５×のＫＤ、Ｄ２Ｅ７のＫＤの７．５×のＫＤ、Ｄ２Ｅ７のＫＤの１０×のＫＤ、Ｄ２Ｅ７のＫＤの１２．５×のＫＤ、Ｄ２Ｅ７のＫＤの１５×のＫＤ、Ｄ２Ｅ７のＫＤの２０×のＫＤ、Ｄ２Ｅ７のＫＤの２５×のＫＤ、または前記値のいずれかのペアの間の範囲のＫＤ、例えば、Ｄ２Ｅ７のＫＤの０．７×〜１．２５×のＫＤ、Ｄ２Ｅ７のＫＤの０．９×〜１．５×のＫＤ、Ｄ２Ｅ７のＫＤの０．９×〜２×のＫＤ、Ｄ２Ｅ７のＫＤの０．８×〜１．７５×のＫＤ、Ｄ２Ｅ７のＫＤの０．９×〜５×のＫＤ、あるいは本明細書に開示されているｋｏｎおよびｋｏｆｆ速度から計算されうるいずれかの値または範囲で、ＴＮＦ−αに結合する。
【００９９】
いくつかの実施形態においては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体はＴＮＦ−αに結合し、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の５０％から２００％のＩＣ５０値、例えば、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の５０％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の６０％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の７０％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の７５％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の８０％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の９０％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の９５％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の１００％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の１１０％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の１２０％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の１２５％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の１３０％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の１４０％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の１５０％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の１６０％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の１７０％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の１７５％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の１８０％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の１９０％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の２００％のＩＣ５０、または前記値のいずれかのペアの間のいずれかの範囲、例えば、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の７５％〜１２５％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の９０％〜１３０％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の９５％〜１２５％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の９０％〜１１０％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の９０％〜１８０％のＩＣ５０、またはＤ２Ｅ７のＩＣ５０の８０％〜１７５％のＩＣ５０で、ｐ５５、ｐ７５またはそれらの両方へのＴＮＦ−αの結合を抑制する。他の実施形態においては、単一ＣＤＲ置換は、Ｄ２Ｅ７と比較した場合のＩＣ５０における前記相違をもたらすことが可能であり、一方、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体は、そのような置換、およびＤ２Ｅ７と比較した場合の１６個までの追加的置換を含みうる。
【０１００】
他の実施形態においては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体はＴＮＦ−αに結合し、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の５０％から２００％のＩＣ５０値、例えば、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の５０％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の６０％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の７０％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の７５％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の８０％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の９０％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の９５％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の１００％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の１１０％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の１２０％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の１２５％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の１３０％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の１４０％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の１５０％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の１６０％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の１７０％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の１７５％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の１８０％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の１９０％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の２００％のＩＣ５０、または前記値のいずれかのペアの間のいずれかの範囲、例えば、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の７５％〜１２５％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の９０％〜１３０％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の９５％〜１２５％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の９０％〜１１０％のＩＣ５０、Ｄ２Ｅ７のＩＣ５０の９０％〜１８０％のＩＣ５０、またはＤ２Ｅ７のＩＣ５０の８０％〜１７５％のＩＣ５０で、ＴＮＦ−αを中和する。他の実施形態においては、単一ＣＤＲ置換は、Ｄ２Ｅ７と比較した場合のＩＣ５０における前記相違をもたらすことが可能であり、一方、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体は、そのような置換、およびＤ２Ｅ７と比較した場合の１６個までの追加的置換を含みうる。
【０１０１】
７．５  抗ＴＮＦ−α抗体の免疫原性の低下
ある態様においては、本開示は、Ｄ２Ｅ７と比較して低下した免疫原性を有する抗ＴＮＦ−α抗体を提供する。本開示はまた、Ｄ２Ｅ７のＣＤＲと比較してＣＤＲにおける複数のアミノ酸置換（ここで、少なくとも１つの置換が、Ｄ２Ｅ７と比較して該抗体の免疫原性を低下させる。）を有する抗ＴＮＦ−α抗体を提供する。ある実施形態においては、免疫原性の低下は、１以上のＴ細胞エピトープの消失または軽減をもたらす１以上のアミノ酸置換から生じる。
【０１０２】
ある態様においては、低下した免疫原性を有する本開示の抗ＴＮＦ−α抗体は、Ｄ２Ｅ７に匹敵する又はＤ２Ｅ７と比較して改善された生物活性（例えば、ＴＮＦ−αに対する親和性またはＴＮＦ−α活性の中和）を有する。そのような特性は、例えば、前記第７．３節に記載されている方法により試験されうる。
【０１０３】
ある実施形態においては、本開示のＴＮＦ−α抗体の免疫原性はＤ２Ｅ７抗体と比較して低下している。そのような抗体は一般に、配列番号８１および／または配列番号８２および／または配列番号８３に対応する領域において、重鎖および／または軽鎖可変領域と比較した場合の変異配列を有する。該抗体は一般に、配列番号８１、配列番号８２および配列番号８３に対応する１個、２個または全３個の配列における１個、２個または３個のアミノ酸置換を有するが、１個、２個または全３個の領域における４個または５個までの置換が本発明において想定される。
【０１０４】
Ｄ２Ｅ７と比べて低い免疫原性を抗体を与える典型的なＣＤＲ−Ｌ１置換を表１１に挙げる。本開示の抗体は、表１１に挙げられている置換のいずれか又は該置換の組合せ、および場合によっては、１以上の追加的な置換、例えば、表１２〜２５のいずれかにおけるＣＤＲ突然変異の単独体または組合せを含みうる。
【０１０５】
本開示において用いる「低下した免疫原性（免疫原性の低下）」なる語は、配列番号８１、配列番号８２または配列番号８３と比較した場合の変異配列が、それぞれ配列番号８１、配列番号８２または配列番号８３のペプチドと比較して低下した、末梢血単核細胞における増殖応答を惹起することを示す。該増殖応答を評価するために用いられうる典型的な増殖アッセイを後記第８節に記載する。増殖応答の低下は応答の割合（％）、刺激指数またはそれらの両方として表されうる。
【０１０６】
他の実施形態においては、配列番号８１、配列番号８２または配列番号８３の配列を有するペプチドと比較して、該変異配列は、少なくとも２５％少ない応答、少なくとも３０％少ない応答、少なくとも３５％少ない応答、少なくとも４０％少ない応答、少なくとも４５％少ない応答、少なくとも５０％少ない応答、少なくとも６０％少ない応答、少なくとも６５％少ない応答、少なくとも７０％少ない応答、少なくとも７５％少ない応答、少なくとも８０％少ない応答、少なくとも８５％少ない応答、少なくとも９０％少ない応答、少なくとも９５％少ない応答、少なくとも１００％少ない応答、または前記値のいずれかの間の範囲の応答の減少、例えば、２５％〜７５％少ない応答、５０％〜９０％少ない応答、６０％〜１００％少ない応答、７０％〜９０％少ない応答などを与える。
【０１０７】
他の実施形態においては、該変異配列は、それぞれ配列番号８１、配列番号８２または配列番号８３のペプチドにより惹起される刺激指数より少なくとも５％低い、少なくとも１０％低い、少なくとも１５％低い、少なくとも２０％低い、少なくとも２５％低い、少なくとも３０％低い、少なくとも３５％低い、または少なくとも４０％低い刺激指数を与え、あるいは、配列番号８１、配列番号８２または配列番号８３のペプチドと比較して前記値のいずれかの間の範囲だけ低下した、例えば、５％〜２０％低い、１０％〜３０％低い、２５％〜３５％低い、３０％〜４０％低いなどの刺激指数を与える。
【０１０８】
Ｄ２Ｅ７と比較して低下した免疫原性を有する抗ＴＮＦ−α抗体の典型的な実施形態は、表１１に記載されているＣＤＲ置換または置換の組合せの１以上を含む。
【０１０９】
７．６  抗体コンジュゲート
本開示の抗ＴＮＦ−α抗体には、例えば、該抗体へのいずれかのタイプの分子の共有結合により修飾されており、該共有結合がＴＮＦ−αへの結合を妨げないように修飾された抗体コンジュゲートが含まれる。
【０１１０】
ある態様においては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体はエフェクター部分または標識にコンジュゲート化されうる。本明細書中で用いる「エフェクター部分」なる語は、例えば抗腫瘍性物質、薬物、毒素、生物学的に活性なタンパク質、例えば酵素、他の抗体または抗体断片、合成または天然重合体、核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）、放射性核種、特に放射性ヨウ素、放射性同位体、キレート化金属、ナノ粒子およびレポーター基、例えば蛍光化合物、またはＮＭＲもしくはＥＳＲ分光法により検出されうる化合物を含む。
【０１１１】
一例においては、抗ＴＮＦ−α抗体は、与えられた生物学的応答を修飾するために、エフェクター部分、例えば細胞毒性分子、放射性核種または薬物部分にコンジュゲート化されうる。該エフェクター部分は、タンパク質またはポリペプチド、例えば、毒素（例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素またはジフテリア（Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）毒素）、シグナリング分子（例えば、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子または組織プラスミノーゲンアクチベーター）、血栓性物質または抗血管新生物質（例えば、アンジオスタチンまたはエンドスタチン）または生体応答調節物質、例えば、サイトカインまたは増殖因子（例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または神経成長因子（ＮＧＦ））（これらに限定されるものではない）でありうる。
【０１１２】
もう１つの例においては、該エフェクター部分は細胞毒素または細胞毒性物質でありうる。細胞毒素および細胞毒性物質の具体例には、タキソール（ｔａｘｏｌ）、シトカラシン（ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ）Ｂ、グラミシジン（ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎ）Ｄ、臭化エチジウム、エメチン（ｅｍｅｔｉｎｅ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、コルヒシン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノラビシン（ｄａｕｎｏｒａｂｉｃｉｎ）、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎ  ｄｉｏｎｅ）、ミトザントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ミトラマイシン（ｍｉｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アクチノマイシン（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）Ｄ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン（ｐｒｏｃａｉｎｅ）、テトラカイン（ｔｅｔｒａｃａｉｎｅ）、リドカイン（ｌｉｄｏｃａｉｎｅ）、プロプラノロール（ｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌ）およびピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）ならびにそれらの類似体またはホモログが含まれる。
【０１１３】
エフェクター部分には、限定的なものではないが、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、５−フルオロウラシル  デカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化物質（例えば、メクロルエタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、チオエパ  クロラムブシル（ｔｈｉｏｅｐａ  ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、ジブロモマンニトール（ｄｉｂｒｏｍｏｍａｎｎｉｔｏｌ）、ストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）Ｃ５およびｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルブシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）（旧名：ダウノマイシン）およびドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ））、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）（旧名：アクチノマイシン）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、マイトラマイシン（ｍｉｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）またはデュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、および抗有糸分裂物質（例えば、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）およびビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ））も含まれる。
【０１１４】
他のエフェクター部分には、放射性核種、例えば、１１１Ｉｎおよび９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリフォルニウム２５２、イリジウム１９２およびタングステン１８８／レニウム１８８（これらに限定されるものではない）、ならびに薬物、例えば、アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩインヒビター、タキソイドおよびスラミン（ｓｕｒａｍｉｎ）（これらに限定されるものではない）が含まれうる。
【０１１５】
そのようなエフェクター部分を抗体にコンジュゲート化するための技術が当技術分野においてよく知られている（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｐｐ．６２３−５３（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編，１９８７））；Ｔｈｏｒｐｅら，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８およびＤｕｂｏｗｃｈｉｋら，１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８３：６７−１２３を参照されたい）。
【０１１６】
一例においては、該抗体またはその断片は、共有結合（例えば、ペプチド結合）により、抗体のＮ末端、Ｃ末端または内部を介して、別のタンパク質（またはその一部分；例えば、該タンパク質の少なくとも１０、２０または５０アミノ酸部分）のアミノ酸配列に融合される。該抗体またはその断片は、もう一方のタンパク質に、該抗体の定常ドメインのＮ末端において連結されうる。そのような融合体を作製するためには、例えば、ＷＯ  ８６／０１５３３およびＥＰ０３９２７４５に記載されているとおり、組換えＤＮＡ法が用いられうる。もう１つの例においては、該エフェクター分子はインビボにおける半減期を増加させ、および／または免疫系の上皮障壁を越える抗体の運搬を促進しうる。このタイプの適当なエフェクター分子の具体例には、重合体、アルブミン、アルブミン結合性タンパク質またはアルブミン結合性化合物、例えばＷＯ  ２００５／１１７９８４に記載されているものが含まれる。
【０１１７】
ある態様においては、抗ＴＮＦ−α抗体は小分子毒素にコンジュゲート化される。ある典型的な実施形態においては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体はドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）またはドラスタチンペプチド性類似体もしくは誘導体、例えばオーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）（米国特許第５，６３５，４８３号および第５，７８０，５８８号）にコンジュゲート化される。該ドラスタチンまたはオーリスタチン薬物部分は、該抗体に、そのＮ（アミノ）末端、Ｃ（カルボキシル）末端または内部を介して結合されうる（ＷＯ  ０２／０８８１７２）。典型的なオーリスタチン実施形態は、米国特許第７，４９８，２９８号（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする。）（例えば、リンカー、およびリンカーにコンジュゲート化されるＭＭＡＥおよびＭＭＡＦのようなモノメチルバリン化合物の製造方法を開示している。）に開示されているとおり、Ｎ末端連結モノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥおよびＤＦを含む。
【０１１８】
他の典型的な実施形態においては、小分子毒素には、カリケアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）（米国特許第５，２０８，０２０号）、トリコテン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｎｅ）およびＣＣ１０６５が含まれるが、これらに限定されるものではない。本開示の１つの実施形態においては、該抗体は１以上のメイタンシン分子（例えば、抗体分子１個当たり約１〜約１０個のメイタンシン分子）にコンジュゲート化される。メイタンシンは、例えば、Ｍａｙ−ＳＳ−Ｍｅに変換されることが可能であり、これはＭａｙ−ＳＨ３に還元され、抗体との反応に付されて（Ｃｈａｒｉら，１９９２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１）、メイタンシノイド−抗体またはメイタンシノイド−Ｆｃ融合コンジュゲートを与えうる。同様に使用されうるカリケアミシンの構造類似体には、γ１１，γ３１，γ３１  Ｎ−アセチル−γ１１、ＰＳＡＧおよびθ１１（Ｈｉｎｍａｎら，１９９３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：３３３６−３３４２；Ｌｏｄｅら，１９９８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：２９２５−２９２８；米国特許第５，７１４，５８６号；米国特許第５，７１２，３７４号；米国特許第５，２６４，５８６号；米国特許第５，７７３，００１号）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１１９】
本開示の抗体は標的化運搬のためにリポソームにもコンジュゲート化されうる（例えば、Ｐａｒｋら，１９９７，Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０：３９９−４３５；Ｍａｒｔｙ  ＆  Ｓｃｈｗｅｎｄｅｎｅｒ，２００４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １０９：３８９−４０１を参照されたい）。
【０１２０】
一例においては、本開示の抗体はポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に結合されうる。１つの特定の例においては、該抗体は抗体断片であり、該ＰＥＧ部分は、該抗体断片内に位置するいずれかの利用可能なアミノ酸側鎖または末端アミノ酸官能基、例えば、いずれかの遊離アミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシルまたはカルボキシル基を介して結合されうる。そのようなアミノ酸は該抗体断片内に天然に存在することが可能であり、あるいは組換えＤＮＡ法を用いて該断片内に操作処理されうる。例えば、米国特許第５，２１９，９９６号を参照されたい。２以上のＰＥＧ分子を結合させるために複数の部位が使用されうる。ＰＥＧ部分は、該抗体断片内に位置する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して共有結合されうる。結合点としてチオール基が利用される場合、適当に活性化されたエフェクター部分（例えば、チオール選択的誘導体、例えば、マレイミドおよびシステイン誘導体）が使用されうる。
【０１２１】
特定の例においては、抗ＴＮＦ−α抗体コンジュゲートは、ＰＥＧ化された［すなわち、例えばＥＰ０９４８５４４に開示されている方法により、ＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））が共有結合している］修飾Ｆａｂ’断片である。Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ（編），Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ，編，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ，１９９７）；およびＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（Ｍ．ＡｓｌａｍおよびＡ．Ｄｅｎｔ編，Ｇｒｏｖｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８）；およびＣｈａｐｍａｎ，２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５４：５３１−５４５も参照されたい。ＰＥＧはヒンジ領域内のシステインに結合されうる。一例においては、ＰＥＧ修飾Ｆａｂ’断片は、修飾ヒンジ領域内の単一のチオール基に共有結合したマレイミド基を有する。リシン残基は該マレイミド基に共有結合されることが可能であり、該リシン残基上のアミン基のそれぞれに、約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）重合体が結合されうる。したがって、該Ｆａｂ’断片に結合されるＰＥＧの全分子量は約４０，０００Ｄａでありうる。
【０１２２】
本明細書中で用いる「標識」なる語は、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体に直接的または間接的にコンジュゲート化されうる検出可能な化合物または組成物を意味する。該標識自体が検出可能であることが可能であり（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）、あるいは酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物または組成物の化学変化を触媒しうる。有用な蛍光部分には、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリンなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。有用な酵素標識には、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１２３】
とりわけ診断目的に有用な追加的な抗ＴＮＦ−α抗体コンジュゲートを以下の第７．７節に記載する。
【０１２４】
７．７  抗ＴＮＦ−α抗体の診断用途
本開示の抗ＴＮＦ−α抗体［例えばビオチン化、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはいずれかの他の検出可能部分（第７．６節に記載されているものを含む）により修飾された抗体を含む］は診断目的に有利に使用されうる。
【０１２５】
特に、該抗ＴＮＦ−α抗体は、例えば、インビトロおよびインビボ診断方法を含む、ＴＮＦ−αの精製または検出（これらに限定されるものではない）に使用されうる。例えば、該抗体は、生物学的サンプル中のＴＮＦ−αのレベルを定性的および定量的に測定するためのイムノアッセイにおいて有用である。例えば、Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８）（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする。）を参照されたい。１つの実施形態においては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体は、血清中のＴＮＦ−αのレベルを検出および定量するために使用されうる。
【０１２６】
本開示は更に、診断用物質にコンジュゲート化された抗体またはその断片を含む。該抗体は、例えば、特定の細胞、組織または血清における、関心のある標的の発現を検出するために診断用に使用されることが可能であり、あるいは例えば、与えられた治療計画の効力を決定するための臨床試験法の一部として、免疫応答の発生もしくは進行をモニターするために診断用に使用されうる。検出は、該抗体を検出可能物質に結合させることにより促進されうる。検出可能物質の具体例には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々の陽電子放出トモグラフィーを使用する陽電子放出金属、および非放射性常磁性金属イオンが含まれる。該検出可能物質は、当技術分野で公知の技術を用いて、該抗体（またはその断片）に直接的に又は中間体（例えば、当技術分野で公知のリンカー）を介して間接的に結合またはコンジュゲート化されうる。酵素標識の具体例には、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（例えば、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが含まれる。適当な補欠分子族複合体の具体例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれ、適当な蛍光物質の具体例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが含まれ、発光物質の一例には、ルミノールが含まれ、生物発光物質の具体例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが含まれ、適当な放射性物質の具体例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎまたは９９Ｔｃが含まれる。
【０１２７】
本開示は、本開示の１以上の抗ＴＮＦ−α抗体（場合によっては、これは検出可能部分にコンジュゲート化されている。）を使用して生物学的サンプル（個体の細胞、組織または体液）を接触させ、該サンプルがＴＮＦ−α発現に関して陽性であるか否か、または該サンプルが、対照サンプルと比較して変化（例えば、減少または増加）した発現を示すかどうかを検出することを含む、ＴＮＦ−αの発現の検出を提供する。
【０１２８】
本方法を用いて診断されうる疾患には、本明細書に記載されている疾患が含まれるが、これらに限定されるものではない。ある実施形態においては、該組織または体液は末梢血、末梢血白血球、生検組織、例えば肺または皮膚生検および組織である。
【０１２９】
７．８  抗ＴＮＦ−α抗体を使用する治療方法
７．８．１  臨床的有用性
本開示のＴＮＦ−α抗体は、種々の免疫および自己免疫病理の障害または症状ならびに炎症疾患の治療に有用である。本開示の抗ＴＮＦ−α抗体で治療されうるＴＮＦ−α関連病理および疾患には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない。
【０１３０】
・急性および慢性免疫および自己免疫病理、例えば全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、チロイドーシス（ｔｈｙｒｏｉｄｏｓｉｓ）、移植片対宿主病、強皮症、糖尿病、グレーブス病など；
・急性または慢性細菌感染、急性および慢性寄生生物および／または細菌、ウイルスまたは真菌感染症、例えばエイズ（悪液質、自己免疫障害、エイズ痴呆症候群および感染症のような続発症を含む）から生じる敗血症症候群、悪液質、循環虚脱およびショック（これらに限定されるものではない）を含む感染症；
・炎症疾患、例えば、慢性炎症病理および血管炎症病理、例えば、サルコイドーシス、慢性炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎およびなどのクローン病、および播種性血管内凝固、アテローム性動脈硬化症および川崎病（これらに限定されるものではない）のような血管炎症病理；
・神経変性疾患、限定的なものではないが例えば、脱髄疾患、例えば、多発性硬化症および急性横断性脊髄炎；錐体外路および小脳障害、例えば、皮質脊髄系の病変；大脳基底核の障害または小脳障害；多動性運動障害、例えば、ハンチントン舞踏病および老人性舞踏病、薬剤誘発性運動障害、例えば、ＣＮＳ、ドーパミン受容体を遮断する薬物により誘発されるもの；運動減少運動障害、例えば、パーキンソン病；進行性核上性麻痺、小脳および脊髄小脳障害、例えば、小脳の非構造的（ａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ）病変；脊髄小脳変性（脊髄性運動失調症、フリードライヒ失調症、小脳皮質変性、多系統変性症（Ｍｅｎｃｅｌ，Ｄｅｊｅｒｉｎｅ−Ｔｈｏｍａｓ，Ｓｈｉ−ＤｒａｇｅｒおよびＭａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ）；ならびに全身性障害（レフサム病、無βリポタンパク血症、運動失調、毛細血管拡張およびミトコンドリア多系統障害）；脱髄核障害、例えば多発性硬化症、急性横断性脊髄炎；運動単位の障害、例えば、神経原性筋萎縮（前角細胞変性、例えば、筋萎縮性側索硬化症、乳児脊髄性筋萎縮および若年性脊髄性筋萎縮）；アルツハイマー病；中年期におけるダウン症候群；びまん性レビー小体病；レヴィー小体型老年痴呆、ウェルニッケコルサコフ症候群；慢性アルコール依存症；クロイツフェルトヤコブ病；亜急性硬化性全脳炎；ハラーホルデン−スパッツ病、拳闘家痴呆、またはそれらのいずれかの下位概念；
・ＴＮＦ−α分泌性腫瘍を含む悪性疾患、またはＴＮＦ−αが関わる他の悪性疾患、例えば、白血病（急性、慢性骨髄性、慢性リンパ性および／または骨髄異形成症候群）；リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫）、例えば、悪性リンパ腫（バーキットリンパ腫または菌状息肉腫）；ならびに
・アルコール誘発性肝炎。
【０１３１】
ある特定の実施形態においては、本開示の抗体は、以下の１以上を治療するために使用される：
・成人における中等度ないし重度の慢性関節リウマチ（ＲＡ）、
・４歳以上の小児における中等度ないし重度の多関節若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、
・成人における乾癬性関節炎（ＰＳＡ）、
・成人における強直性脊椎炎（ＡＳ）、
・通常の治療に十分に応答していない成人における中等度ないし重度のクローン病（ＣＤ）、
・中等度ないし重度の慢性尋常性乾癬（Ｐｓ）。
【０１３２】
したがって、本開示は、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体を患者に投与することを含む、治療を要する患者における前記疾患のいずれかの治療方法を提供する。場合によっては、該糖よは、例えば１日後、２日後、３日後、５日後、１週間後、２週間後、３週間後、１ヵ月後、５週間後、６週間後、７週間後、８週間後、２ヵ月後または３ヵ月後に反復される。該反復投与は、同じ用量または異なる用量で行われうる。該投与は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回またはそれ以上反復されうる。例えば、ある投与計画に従い、患者は、長期間、例えば６ヶ月、１年またはそれ以上にわたり、抗ＴＮＦ−α療法を受ける。患者に投与される抗ＴＮＦ−α抗体の量は、ある実施形態においては、治療的有効量である。本明細書中で用いる、ＴＮＦ−α抗体の「治療的有効」量は、１回量として、または治療計画の経過にわたって、例えば１週間、２週間、３週間、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年またはそれ以上にわたって投与されうる。典型的な治療計画は後記第７．１１節に記載されている。
【０１３３】
本開示においては、疾患の治療は、いずれかの臨床段階または徴候におけるいずれかの形態の該疾患を有すると既に診断されている患者の治療、該疾患の症状もしくは徴候の発生もしくは進展もしくは激化もしくは悪化の遅延、ならびに／または該疾患の予防および／もしくは該疾患の重症度の軽減を含む。
【０１３４】
本開示の抗ＴＮＦ−α抗体が投与される「対象」または「患者」は、好ましくは哺乳動物、例えば非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）または霊長類（例えば、サルまたはヒト）である。ある実施形態においては、該対象または患者はヒトである。ある態様においては、該ヒトは小児患者である。他の態様においては、該ヒトは成人患者である。
【０１３５】
７．９  医薬組成物および投与経路
本開示の抗ＴＮＦ−α抗体、および場合によっては１以上の追加的治療用物質、例えば後記第７．１０節に記載されている併用治療用物質を含む組成物を本発明において提供する。該組成物は、通常、医薬上許容される担体を通常は含む無菌医薬組成物の一部分として供給される。この組成物は、（それを患者に投与する所望の方法に応じた）いずれかの適当な形態でありうる。
【０１３６】
本開示の抗ＴＮＦ−α抗体は、例えば経口、経皮、皮下、鼻腔内、静脈内、筋肉内、眼内、局所、鞘内および脳室内のような種々の経路により患者に投与されうる。いずれかの与えられた場合における最も適した投与経路は、個々の抗体、対象ならびに疾患の性質および重症度ならびに該対象の全身状態に左右されるであろう。
【０１３７】
本明細書に記載されている適応症の治療のためには、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体の有効量は、治療される状態、投与経路ならびに対象の年齢、体重および状態に応じて、単一（例えば、ボーラス）投与、複数回の投与または連続投与当たり約０．００１から約７５ｍｇ／ｋｇの範囲、あるいは単一（例えば、ボーラス）投与、複数回の投与または連続投与当たり０．０１〜５００μｇ／ｍＬの血清濃度を与える範囲、あるいはその中のいずれかの有効な範囲または値でありうる。ある実施形態においては、各用量は、約０．５μｇから約５０μｇ／ｋｇ体重、例えば、約３μｇから約３０μｇ／ｋｇ体重の範囲でありうる。該抗体は水溶液として製剤化されることが可能であり、皮下注射により投与されうる。
【０１３８】
医薬組成物は、用量当たりに本開示の抗ＴＮＦ−α抗体の所定量を含有する単位投与形として、簡便に提供されうる。そのような単位は、例えば、５ｍｇから５ｇ、例えば、１０ｍｇから１ｇ、または２０から５０ｍｇ（これらに限定されるものではない）を含有しうる。該開示において用いられる医薬上許容される担体は、例えば、治療すべき状態または投与経路に基づいて、多種多様な形態をとりうる。
【０１３９】
本開示の抗ＴＮＦ−α抗体の治療用製剤は、所望の純度を有する該抗体を、当技術分野において典型的に使用される随意的な（すなわち、所望により使用されうる。）医薬上許容される担体、賦形剤または安定剤（それらの全ては本明細書においては「担体」と称される。）、すなわち、緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張化剤、ノニオン界面活性剤、抗酸化剤および他の種々の添加物と混合することにより、凍結乾燥製剤または水溶液として貯蔵用に製造されうる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｏｓｏｌ編，１９８０）を参照されたい。そのような添加物は、使用される投与量および濃度において被投与者にとって無毒性でなければならない。
【０１４０】
緩衝剤は、生理的条件に近い範囲にｐＨを維持するのを助ける。それは約２ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の濃度で存在しうる。本開示で使用される適当な緩衝剤には、有機および無機の両方の酸ならびにそれらの塩、例えば、クエン酸バッファー（例えば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸バッファー（例えば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸バッファー（例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸バッファー（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸バッファー（例えば、グルコン酸−グリコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グリウコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸バッファー（例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸バッファー（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物など）、および酢酸バッファー（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物など）が含まれる。また、リン酸バッファー、ヒスチジンバッファーおよびトリメチルアミン塩、例えばＴｒｉｓが使用されうる。
【０１４１】
微生物の成長を阻害するために保存剤が添加可能であり、保存剤は、０．２％〜１％（ｗ／ｖ）の範囲の量で加えられうる。本開示において使用される適当な保存剤には、フェノール、ベンジルアルコール、メタ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ベンザルコニウムハリド（例えば、クロリド、ブロミドおよびヨージド）、ヘキサメトニウムクロリド、およびアルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、および３−ペンタノールが含まれる。時には「安定剤」として公知である等張化剤が、本開示の液体組成物の等張性を確保するために添加可能であり、該等張化剤には、多価糖アルコール、例えば、三価以上の糖アルコール、例えば、グリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールが含まれる。安定剤は、増量剤から、該治療用物質を可溶化し又は変性もしくは容器壁への付着を防ぐのを助ける添加剤までの、機能における範囲にわたる、賦形剤の広い範疇を意味する。典型的な安定剤は、多価糖アルコール（前記に列挙されているもの）；アミノ酸、例えばアルギニン、リシン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニンなど、有機糖または糖アルコール、例えば、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、グリセロールなど、例えば、シクリトール、例えば、イノシトール；ポリエチレングリコール、アミノ酸重合体；硫黄含有還元剤、例えば、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウム；低分子量ポリペプチド（例えば、１０残基以下のペプチド）；タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性重合体、例えば、ポリビニルピロリドン  単糖類、例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース；二糖類、例えば、ラクトース、マルトース、スクロース、および三糖類、例えば、ラフィノース；ならびに多糖類、例えばデキストランでありうる。安定剤は、活性タンパク質の重量に対して０．１から１０，０００重量部の範囲で存在しうる。
【０１４２】
該治療用物質を可溶化するのを助け、該治療用タンパク質の攪拌誘発性凝集を防ぐために、ノニオン界面活性剤または表面活性剤（「湿潤剤」としても公知である。）が添加可能であり、これはまた、該タンパク質の変性を引き起こすことなくストレス化せん断表面に該製剤が付されることを可能にする。適当なノニオン界面活性剤には、ポリソルベート（２０、８０など）、ポリオキサマー（１８４、１８８など）、プルロニックポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０など）が含まれる。ノニオン界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍＬから約１．０ｍｇ／ｍＬ、例えば、約０．０７ｍｇ／ｍＬから約０．２ｍｇ／ｍＬの範囲で存在しうる。
【０１４３】
他の種々の賦形剤には、増量剤（例えば、デンプン）、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）および共存溶媒が含まれる。本開示の抗ＴＮＦ−α抗体に適した更に詳細な製剤は、米国特許出願第２００４／００３３２２８  Ａ１（その内容の全体を参照により本明細書に組み入れることとする。）に開示されている。
【０１４４】
本発明における製剤は、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体に加えて、併用（組合せ）療法物質をも含有しうる。適当な併用療法物質の具体例は後記第７．１０に記載されている。
【０１４５】
皮下投与のための投与スケジュールは、疾患のタイプ、疾患の重症度および該抗ＴＮＦ−α抗体に対する患者の感受性を含む幾つかの臨床的要因に応じて、６ヶ月に１回、５ヶ月に１回、４ヶ月に１回、３ヶ月に１回、２ヶ月に１回、１ヶ月に１回から、隔週、毎週または毎日まで、様々となりうる。
【０１４６】
本開示の抗ＴＮＦ−α抗体の投与量は、個々の抗体、自己免疫または炎症疾患のタイプ、対象ならびに該疾患の性質および重症度、該対象の身体状態、治療計画（例えば、併用治療用物質が使用されるかどうか）、ならびに選択される投与経路によって異なり、適当な投与量は当業者により容易に決定されうる。
【０１４７】
ヒトおよび動物における自己免疫または炎症疾患の治療および／または予防には、いずれかの適当な投与経路、例えば注射、および抗体に基づく臨床製品のための当技術分野で公知の他の投与経路を用いて、抗ＴＮＦ−α抗体を含む医薬組成物が、治療的または予防的有効量（例えば、自己免疫もしくは炎症疾患の抑制および／または自己免疫もしくは炎症疾患症状の軽減をもたらす投与量）で患者（例えば、ヒト対象）に投与されうる。
【０１４８】
本開示の抗ＴＮＦ−α抗体の個々の投与の最適な量および間隔は、治療される状態の性質および程度、投与の形態、経路および部位、ならびに治療される個々の対象の年齢および状態により決定され、使用すべき適当な投与量は最終的には医師により決定される、と当業者により認識されるであろう。この投与は適当な頻度で反復されうる。副作用が生じたら、通常の臨床的慣例に従い、投与の量および／または頻度を改変し又は減少させることが可能である。
【０１４９】
７．１０  併用療法
本開示の抗ＴＮＦ−α抗体が使用されうる併用法を以下に記載する。本開示の併用法は、少なくとも２つの物質を患者に投与することを含み、それらのうちの第１の物質は本開示の抗ＴＮＦ−α抗体であり、追加的な物質は併用療法物質である。該抗ＴＮＦ−α抗体および該併用療法物質は同時、連続的または別々に投与されうる。
【０１５０】
本開示の併用療法はより大きな相加効果をもたらして、該抗ＴＮＦ−α抗体および併用療法物質のいずれもが単独で治療的に有効な量で投与されない場合であっても治療利益を与えうる。
【０１５１】
本方法においては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体および該併用療法物質は、同時または連続的に、共同的に投与されうる。本明細書中で用いる、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体および該併用療法物質が、連続的に投与されると称されるのは、それらが、同一日に、例えば、患者の同一訪問中に、患者に投与される場合である。連続的投与は１、２、３、４、５、６、７または８時間間隔で行われうる。一方、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体および該併用療法物質が別々に投与されると称されるのは、それらが、異なる日に患者に投与される場合であり、例えば、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体および該併用療法物質は１日、２日または３日、１週間、２週間または１ヶ月間隔で投与されうる。本開示の方法においては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体の投与は該併用療法物質の投与の前または後に行われうる。
【０１５２】
非限定的な一例としては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体および併用療法物質は或る期間にわたって共同的に投与され、ついで第２の期間においては、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体および該併用療法物質の投与が交互に行われうる。
【０１５３】
本開示の抗ＴＮＦ−α抗体および併用療法物質を投与する潜在的な相乗効果のため、そのような物質は、それらの物質の一方または両方が単独で投与される場合には治療的に有効ではない量で投与されうる。
【０１５４】
ある態様においては、該併用療法物質は抗リウマチ薬、抗炎症物質、化学療法物質、放射線治療、免疫抑制物質または細胞毒性薬である。
【０１５５】
抗リウマチ薬には、オーラノフィン（ａｕｒａｎｏｆｉｎ）、アザチオプリン（ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ）、クロロキン（ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）、Ｄ−ペニシラミン（ｐｅｎｉｃｉｌｌａｍｉｎｅ）、金ナトリウムチオマラートヒドロキシクロロキン、ミオクリシン（Ｍｙｏｃｒｉｓｉｎ）およびスルファサルジンメトトレキセート（ｓｕｌｆａｓａｌｚｉｎｅ  ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１５６】
抗炎症物質には、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、ペンタザ（ｐｅｎｔａｓａ）、メサラジン（ｍｅｓａｌａｚｉｎｅ）、アサコール（ａｓａｃｏｌ）、リン酸コデイン（ｃｏｄｅｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ベノリラート（ｂｅｎｏｒｙｌａｔｅ）、フェンブフェン（ｆｅｎｂｕｆｅｎ）、ナプロシン（ｎａｐｒｏｓｙｎ）、ジクロフェナック（ｄｉｃｌｏｆｅｎａｃ）、エトドラック（ｅｔｏｄｏｌａｃ）およびインドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ）、アスピリン（ａｓｐｉｒｉｎ）およびイブプロフェン（ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１５７】
化学療法物質には、放射性分子、毒素（細胞毒または細胞毒性物質とも称される。）（これは、細胞の生存能に有害である任意の物質を含む）、物質、および化学療法化合物を含有するリポソームまたは他の小胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。適当な化学療法物質の具体例には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：１−デヒドロテストステロン、５−フルオロウラシルデカルバジン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アクチノマイシン（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）Ｄ、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、アルデスロイキン（ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ）、アルキル化剤、アロプリノール（ａｌｌｏｐｕｒｉｎｏｌ）ナトリウム、アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、アミホスチン（ａｍｉｆｏｓｔｉｎｅ）、アナストロゾール（ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）、アントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ）、抗有糸分裂物質、シスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、ジアミノジクロロ白金、アントラサイクリン、抗生物質、代謝拮抗物質、アスパラギナーゼ、ＢＣＧ生（小胞内）、リン酸ベタメタゾンナトリウムおよび酢酸ベタメタゾン、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、硫酸ブレオマイシン、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、ロイコウオリン（ｌｅｕｃｏｕｏｒｉｎ）カルシウム、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）（ＣＣＮＵ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）（ＢＳＮＵ）、クロラムブシル（Ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、クラドリビン（Ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、コルヒシン（Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎ）、コンジュゲート化エストロゲン、シクロホスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、シクロトスファミド（Ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、シタラビン（Ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、シタラビン、サイトカラシン（ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ）Ｂ、サイトキサン（Ｃｙｔｏｘａｎ）、デカルバジン（Ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ダクチノマイシン（Ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ダクチノマイシン（旧名：アクチノマイシン）、ダウニルビシン（ｄａｕｎｉｒｕｂｉｃｉｎ）ＨＣＬ、クエン酸ダウノルビシン、デニリューキン・ジフチトックス（ｄｅｎｉｌｅｕｋｉｎ  ｄｉｆｔｉｔｏｘ）、デクスラゾキサン（Ｄｅｘｒａｚｏｘａｎｅ）、ジブロモマンニトール、ジヒドロキシアントラシンジオン、デセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、メシル酸ドラセトロン（ｄｏｌａｓｅｔｒｏｎ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）ＨＣＬ、ドロナビノール（ｄｒｏｎａｂｉｎｏｌ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｌ−アスパラギナーゼ、エオロシキシマブ（ｅｏｌｏｃｉｘｉｍａｂ）、エメチン（ｅｍｅｔｉｎｅ）、エポクチン（ｅｐｏｅｔｉｎ）−α、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）Ｌ−アスパラギナーゼ、エステル化エストロゲン、エストラジオール、エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）リン酸ナトリウム、臭化エチジウム、エチニルエストラジオール、エチドロナート（ｅｔｉｄｒｏｎａｔｅ）、エトポシドシトロロルム因子（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ  ｃｉｔｒｏｒｏｒｕｍ  ｆａｃｔｏｒ）、リン酸エトポシド、フィルグラスチム（ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）、フロクスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、フルコナゾール（ｆｌｕｃｏｎａｚｏｌｅ）、リン酸フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、フルオロウラシル、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、フォリン酸、ジェムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）ＨＣＬ、グルココルチコイド、酢酸ゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）、グラミシジン（ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎ）Ｄ、グラニセトロン（ｇｒａｎｉｓｅｔｒｏｎ）ＨＣＬ、ヒドロキシ尿素、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）ＨＣＬ、イフォスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、インターフェロンαα−２ｂ、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）ＨＣＬ、レトロゾール（ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ）、ロイコボリン（ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ）カルシウム、酢酸ロイプロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）、レバミゾール（ｌｅｖａｍｉｓｏｌｅ）ＨＣＬ、リドカイン（ｌｉｄｏｃａｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、メクロルエタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）ＨＣＬ、酢酸メドロキシプロゲステロン（ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、酢酸メゲストロール（ｍｅｇｅｓｔｒｏｌ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）ＨＣＬ、メルカプチプリン（ｍｅｒｃａｐｔｉｐｕｒｉｎｅ）、メスナ（ｍｅｓｎａ）、メトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、メチルテストステロン、ミトラマイシン（ｍｉｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）Ｃ、ミトタン（ｍｉｔｏｔａｎｅ）、ミトザントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ニルタミド（ｎｉｌｕｔａｍｉｄｅ）、酢酸オクトレオチド（ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ）、オンダセトロン（ｏｎｄａｎｓｅｔｒｏｎ）ＨＣＬ、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、パミドロナート（ｐａｍｉｄｒｏｎａｔｅ）二ナトリウム、ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、ピロカルピン（ｐｉｌｏｃａｒｐｉｎｅ）ＨＣＬ、プリマイシン（ｐｌｉｍｙｃｉｎ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）インプラントを伴うポリフェプロサン（ｐｏｌｉｆｅｐｒｏｓａｎ）２０、プルフィマー（ｐｏｒｆｉｍｅｒ）ナトリウム、プロカイン（ｐｒｏｃａｉｎｅ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）ＨＣＬ、プロプラノロール（ｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、サルグラモスチム（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ）、ストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、タキソール（ｔａｘｏｌ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）、テトラカイン（ｔｅｔｒａｃａｉｎｅ）、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）  クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）ＨＣＬ、クエン酸トレミフェン（ｔｏｒｅｍ��ｆｅｎｅ）、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、トレチノイン（ｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）、バルルビシン（ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）、硫酸ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、硫酸ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）および酒石酸ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）。
【０１５８】
本開示の更に他の態様においては、該併用療法物質は本開示の抗ＴＮＦ−α抗体以外のＴＮＦ−αアンタゴニストである。そのようなＴＮＦ−αアンタゴニストの具体例には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：可溶性ＴＮＦ−α受容体；エタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）（ＥＮＢＲＥＬ（商標）；Ｉｍｍｕｎｅｘ）またはその断片、誘導体もしくは類似体；インフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）；Ｃｅｎｔａｃｏｒ）またはその誘導体、類似体もしくは抗原結合性断片；ＩＬ−１０（これは、インターフェロン−γ活性化マクロファージによりＴＮＦ−α産生を遮断することが知られている。）（Ｏｓｗａｌｄら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：８６７６−８６８０）、ＴＮＦＲ−ＩｇＧ（Ａｓｈｋｅｎａｚｉら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０５３５−１０５３９）；マウス製品ＴＢＰ−Ｉ（Ｓｅｒｏｎｏ／Ｙｅｄａ）；ワクチンＣｙｔｏＴＡｂ（Ｐｒｏｔｈｅｒｉｃｓ）；アンチセンス分子１０４８３８（ＩＳＩＳ）；ペプチドＲＤＰ−５８（ＳａｎｇＳｔａｔ）；サリドマイド（Ｃｅｌｇｅｎｅ）；ＣＤＣ−８０１（Ｃｅｌｇｅｎｅ）；ＤＰＣ−３３３（Ｄｕｐｏｎｔ）；ＶＸ−７４５（Ｖｅｒｔｅｘ）；ＡＧＩＸ−４２０７（ＡｔｈｅｒｏＧｅｎｉｃｓ）；ＩＴＦ−２３５７（Ｉｔａｌｆａｒｍａｃｏ）；ＮＰＩ−１３０２１−３１（Ｎｅｒｅｕｓ）；ＳＣＩＯ−４６９（Ｓｃｉｏｓ）；ＴＡＣＥ標的物（Ｉｍｍｕｎｉｘ／ＡＨＰ）；ＣＬＸ−１２０５００（Ｃａｌｙｘ）；チアゾロピリム（Ｔｈｉａｚｏｌｏｐｙｒｉｍ）（Ｄｙｎａｖａｘ）；オーラノフィン（ａｕｒａｎｏｆｉｎ）（Ｒｉｄａｕｒａ）（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；キナクリン（ｑｕｉｎａｃｒｉｎｅ）（メパクリンジクロロヒドラート）；テニダップ（ｔｅｎｉｄａｐ）（Ｅｎａｂｌｅｘ）；メラニン（Ｍｅｌａｎｉｎ）（Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）；およびＵｒｉａｃｈによる抗ｐ３８  ＭＡＰＫ物質。
【０１５９】
抗ＴＮＦ−α抗体との併用に有用な他の第２療法物質、およびそのような第２療法物質との併用療法が有用な個々の適応症は、ＷＯ  ２００４／００４６３３（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする。）に開示されている。
【０１６０】
７．１１  治療計画
本開示は、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体の投与を含む治療計画（治療レジメン）を提供する。該治療計画は、患者の年齢、体重および病態によって異なるであろう。該治療計画は２週間ないし無期限に継続されうる。特定の実施形態においては、該治療計画は２週間から６ヶ月、３ヶ月から５年間、６ヶ月から１または２年間、８ヶ月から１８ヶ月間などの期間にわたって継続される。該治療計画は非可変用量計画または多可変用量計画、例えば、ＷＯ  ２００５／１１０４５２（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする。）に記載されているものでありうる。
【０１６１】
後記の典型的投与計画に関しては、該抗ＴＮＦ−α抗体は、皮下投与のために、無菌の保存剤非含有溶液として投与されうる。
【０１６２】
ある実施形態においては、該薬物産物は、１ｍＬの予め充填されたガラスシリンジが封入された１回使用のための予め充填されたペン（ｐｅｎ）として、あるいは１回量の１ｍＬの予め充填されたガラスシリンジとして供給される。成人患者の場合、ある実施形態においては、該シリンジは、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体を含む０．８ｍＬの医薬上許容される溶液を運搬する。特定の実施形態においては、該抗体に加えて、該溶液は、４．９３ｍｇの塩化ナトリウム、０．６９ｍｇの一塩基性リン酸ナトリウム二水和物、１．２２ｍｇの二塩基性リン酸ナトリウム二水和物、０．２４ｍｇのクエン酸ナトリウム、１．０４ｍｇのクエン酸一水和物、９．６ｍｇのマンニトール、０．８ｍｇのポリソルベート８０および注射用水（ＵＳＰ）を含有し、必要に応じて、ｐＨを調節するために水酸化ナトリウムが添加される。小児患者の場合、ある実施形態においては、該シリンジは、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体を含む０．４ｍＬの医薬上許容される溶液を運搬する。特定の実施形態においては、該抗体に加えて、該溶液は、２．４７ｍｇの塩化ナトリウム、０．３４ｍｇの一塩基性リン酸ナトリウム二水和物、０．６１ｍｇの二塩基性リン酸ナトリウム二水和物、０．１２ｍｇのクエン酸ナトリウム、０．５２ｍｇのクエン酸一水和物、４．８ｍｇのマンニトール、０．４ｍｇのポリソルベート８０および注射用水（ＵＳＰ）を含有し、必要に応じて、ｐＨを調節するために水酸化ナトリウムが添加される。
【０１６３】
慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎および強直性脊椎炎の治療の場合、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体は１０から５０ｍｇ（例えば、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇまたは５０ｍｇ）の用量で隔週で投与されうる。メトトレキセート、グルココルチコイド、サリシラート、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬または他の疾患緩和（ｄｉｓｅａｓｅ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ）抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）の投与が、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体での治療中に継続されうる。慢性関節リウマチにおいては、メトトレキセートを同時服用していない患者のなかには、隔週から毎週へと投与頻度を増加させることにより追加的な利益を得る者もあるかもしれない。
【０１６４】
若年性特発性関節炎の治療の場合、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体は、患者の体重に応じた用量で投与される。ある非限定的な実施形態においては、体重１５ｋｇ（３３  ｌｂ）から３０ｋｇ（６６  ｌｂ）以下の小児患者に対する用量は、隔週で投与される５〜２５ｍｇ（例えば、５ｍｇ、７．５ｍｇ、１０ｍｇ、１２．５ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇまたは２５ｍｇ）の範囲である。ある非限定的な実施形態においては、体重３０ｋｇ（６６  ｌｂ）を超える小児患者に対する用量は、隔週で投与される１０から５０ｍｇ（例えば、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇまたは５０ｍｇ）の範囲である。メトトレキセート、グルココルチコイド、サリシラート、ＮＳＡＩＤまたは鎮痛薬の投与が、該抗ＴＮＦ−α抗体での治療中に継続されうる。
【０１６５】
クローン病の治療の場合、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体は、ある非限定的な実施形態においては、初期には（第１日において、または第１日と第２日との間で分割して）４０〜２８０ｍｇ（例えば、４０ｍｇ、８０ｍｇ、１００ｍｇ、１２０ｍｇ、１４０ｍｇ、１６０ｍｇ、１８０ｍｇ、２００ｍｇ、２４０ｍｇまたは２８０ｍｇ）の用量で投与され、ついで２週間後（第１５日）に該初期用量の約４０％から６０％（例えば、５０％）の用量で投与されうる。２週間後（第２９日）に、該初期用量の２０％から３０％（例えば、２５％）の維持量が隔週で投与される。アミノサリシラート、コルチコステロイドおよび／または免疫調節物質（例えば、６−メルカプトプリンおよびアザチオプリン）の投与が、該抗ＴＮＦ−α抗体での治療中に継続されうる。
【０１６６】
プラーク（ｐｌａｑｕｅ）乾癬の治療の場合、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体は、ある非限定的な実施形態においては、初期には４０〜１６０ｍｇ（例えば、４０ｍｇ、８０ｍｇ、１００ｍｇ、１２０ｍｇ、１４０ｍｇまたは１６０ｍｇ）の用量で投与され、ついで、該初期投与の１週間後から、該初期用量の半分の用量で隔週で投与されうる。
【０１６７】
７．１２  診断キットおよび医薬キット
本開示の抗ＴＮＦ−α抗体（抗体コンジュゲートを含む）を含有する医薬キットが本開示に含まれる。該医薬キットは、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体（例えば、凍結乾燥形態または水溶液として）と以下のものの１以上とを含むパッケージである：
・併用療法物質、例えば、前記第７．１０節に記載されているもの；
・該抗ＴＮＦ−α抗体を投与するための装置、例えばペン（ｐｅｎ）、針および／またはシリンジ；ならびに
・該抗体が凍結乾燥形態である場合に該抗体を再懸濁させるための医薬等級の水またはバッファー。
【０１６８】
ある態様においては、該抗ＴＮＦ−α抗体の各単位用量は別々にパッケージングされ、キットは１以上の単位用量（例えば、２単位用量、３単位用量、４単位用量、５単位用量、８単位用量、１０単位用量またはそれ以上）を含有しうる。特定の実施形態においては、そのような１以上の単位用量はそれぞれ、シリンジまたはペン内に収容される。
【０１６９】
本開示の抗ＴＮＦ−α抗体（抗体コンジュゲートを含む）を含有する診断キットも本発明に含まれる。該診断キットは、本開示の抗ＴＮＦ−α抗体（例えば、凍結乾燥形態または水溶液として）と、診断アッセイを行うのに有用な１以上の試薬とを含むパッケージである。該抗ＴＮＦ−α抗体が酵素で標識されている場合、該キットは、該酵素に必要な基質および補因子（例えば、検出可能な発色団または発蛍光団を与える基質前駆体）を含む。また、他の添加物、例えば、安定剤、バッファー（例えば、ブロックバッファーまたは細胞溶解バッファー）などが含まれうる。ある実施形態においては、診断キットに含まれる抗ＴＮＦ−α抗体は固体表面上に固定化され、あるいは、該抗体が固定化されうる固体表面（例えば、スライド）が該キットに含まれる。そのような種々の試薬の相対量は、該アッセイの感度を実質的に最適化する該試薬の溶液中の濃度を与えるように多種多様となりうる。特定の実施形態においては、該抗体および１以上の試薬は、適当な濃度を有する試薬溶液を溶解時に与える賦形剤を含む乾燥粉末、通常は凍結乾燥粉末として（個別に又は組合されて）提供されうる。
【実施例】
【０１７０】
８．実施例１：Ｄ２Ｅ７の脱免疫化変異体の特定
８．１  材料および方法
８．１．１  ペプチド
Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ（Ａｄｅｌａｉｄｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）による多ピン（ｍｕｌｔｉ−ｐｉｎ）形態を使用して、ペプチドを合成した。Ｄ２Ｅ７軽鎖および重鎖Ｖ領域の配列を、合計６９ペプチドに関して、１２アミノ酸だけ重複する１５マーペプチド（図１および表１）として合成した。ペプチドを凍結乾燥させ、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に約１〜２ｍｇ／ｍＬで再懸濁させた。ストックペプチドを−２０℃で凍結状態で維持した。
【０１７１】
８．１．２  ヒト末梢血単核細胞
地域の献血者（ドナー）のバフィコート製品をＳｔａｎｆｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入した。バフィコート物質を、カルシウムもマグネシウムも含有しないＤＰＢＳで１：１（ｖ：ｖ）で希釈した。５０ｍＬ  円錐遠心分離チューブ（ＳａｒｓｔｅｄまたはＣｏｓｔａｒ）内で、希釈バフィコート物質（２５〜３５ｍＬ）の下層に１２．５ｍＬのＦｉｃｏｌｌＰａｑｕｅ−ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を加えた。該サンプルを９００ｇで室温で３０分間遠心分離した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を該境界から集めた。ＤＰＢＳを加えて最終体積を５０ｍＬとし、該細胞を３５０ｇで５分間遠心分離した。ペレット化細胞をＤＰＢＳに再懸濁させ、計数した。
【０１７２】
８．１．３  樹状細胞
樹状細胞の単離のために、Ｔ７５培養フラスコ（Ｃｏｓｔａｒ）内の合計体積３０ｍＬのＡＩＭ  Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に１０８個の新鮮に単離されたＰＢＭＣを播いた。９０％  ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１０％  ＤＭＳＯ中、過剰のＰＢＭＣを５×１０７  細胞／ｍｌで−８０℃で凍結した。Ｔ７５フラスコを５％  ＣＯ２中、３７℃で２時間温置した。非付着細胞を除去し、付着単層をＤＰＢＳで洗浄した。樹状細胞を単球から分化させるために、８００単位／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と５００単位／ｍＬのＩＬ−４（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）とを含有する３０ｍＬのＡＩＭ  Ｖ培地を加えた。フラスコを５日間温置した。第５日に、ＩＬ−１α（Ｅｎｄｒｏｇｅｎ）およびＴＮＦ−α（Ｅｎｄｒｏｇｅｎ）を５０ｐｇ／ｍＬおよび０．２ｎｇ／ｍｌまで加えた。フラスコを更に２日間温置した。第７日に、０．５から１．０ｍｇのマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する３ｍＬの１００ｍＭ  ＥＤＴＡの添加（１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１６．５から３３μｇ／ｍＬ  マイトマイシンＣの最終濃度）により、樹状細胞を集めた。あるいは、固定のために、樹状細胞に４，０００ラドを照射した。フラスコを５％  ＣＯ２中、３７℃で更に１日間温置した。樹状細胞を集め、ＡＩＭ  Ｖ培地で２〜３回洗浄した。
【０１７３】
８．１．４  細胞培養
第７日に、予め凍結された自己ＰＢＭＣを３７℃の水浴内で急速解凍した。細胞を直ちにＤＰＢＳまたはＡＩＭ  Ｖ培地内に希釈し、３５０ｇで５分間遠心分離した。磁気ビーズ（Ｅａｓｙ−Ｓｅｐ  ＣＤ４＋キット，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用するネガティブ選択によりＣＤ４＋細胞を富化した。自己ＣＤ４＋  Ｔ細胞および樹状細胞を、９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ９０７７）のウェル当たり２×１０４個の樹状細胞当たり２×１０５個のＣＤ４＋  Ｔ細胞の比率で共培養した。ペプチドを約５μｇ／ｍＬで加えた。対照ウェルはＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）ビヒクルのみを０．２５％  ｖ：ｖで含有していた。陽性対照ウェルはＤＭＳＯを０．２５％で、破傷風トキソイド（Ｌｉｓｔ  ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓまたはＣａｌＢｉｏＣｈｅｍ）を１μｇ／ｍＬで含有していた。培養物を５日間温置した。第５日に、０．２５μＣｉ／ウェルのトリチウム化チミジン（ＡｍｅｒｓｈａｍまたはＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を加えた。第６日に、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ  Ｃｅｌｌハーベスターを使用して、培養物をフィルターマットに集めた。Ｗａｌｌａｃ  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ  １４５０シンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、シンチレーション計数を行った。
【０１７４】
８．１．５  データ分析
６〜１２重複実験の個々の結果を平均することにより、平均バックグラウンドＣＰＭ値を計算した。４つの陽性対照ウェルのＣＰＭ値を平均した。各ペプチドに関して、重複実験または三重重複実験に付されたウェルを平均した。該陽性対照および該ペプチドウェルに関する刺激指数値を、該平均実験ＣＰＭ値を該平均対照値で割り算することにより算出した。データセットに含まれるためには、該破傷風トキソイド陽性対照ウェルにおいて３．０より大きな刺激指数が要求された。２．９５以上の刺激指数を与えるペプチドに関する応答に注目した。８１名のドナーの一群からの末梢血サンプルを使用して、ペプチドを試験した。全てのペプチドに対する応答をまとめた。試験した各ペプチドに関して、２．９５以上の刺激指数で応答したドナー集団の割合（％）を計算した。また、全ドナーに関する平均刺激指数を計算した。
【０１７５】
８．１．６  ＨＬＡ遺伝子型分析
商業的に入手可能なＤｙｎａｌ  ＲＥＬＩ型決定キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＫ）を使用して、各ドナーに関してＨＬＡ  ＤＲＢ１およびＨＬＡ  ＤＱＢ１対立遺伝子を決定した。低ストリンジェンシーＳＳＯの結果が記載されている。カイ２乗分析（１自由度）を用いて、いずれかの与えられたペプチドに対する応答性に関してＨＬＡ相関（アソーシエーション）を決定した。応答者および非応答者集団の両方に対立遺伝子が存在する場合には、相対危険度値が記載されている。
【０１７６】
８．１．７  Ｄ２Ｅ７変異抗体の競合ＥＬＩＳＡ
ＰＢＳ中で１μｇ／ｍＬの濃度のＴＮＦ−αの溶液とマイクロウェルプレートを４℃で一晩接触させることにより、ＴＮＦ−αを該マイクロウェルプレート上に付着させた。該プレートをＰＢＳ中の０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０中で洗浄し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）中でブロッキングした。亜飽和量のビオチン化Ｄ２Ｅ７（８０ｎｇ／ｍＬ）と未標識Ｄ２Ｅ７（「参照」抗体）または競合性抗ＴＮＦ−α抗体（「試験」抗体）（２．８μｇ／ｍＬ、８．３μｇ／ｍＬまたは２５μｇ／ｍＬの濃度の系列希釈物）との、ＥＬＩＳＡバッファー（例えば、ＰＢＳ中の１％  ＢＳＡおよび０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）中の混合物をウェルに加え、プレートを、穏やかに振とうしながら１時間温置した。該プレートを洗浄し、ＥＬＩＳＡバッファー中で希釈された１μｇ／Ｌ  ＨＲＰ結合ストレプトアビジンを各ウェルに加え、該プレートを１時間温置した。プレートを洗浄し、結合抗体をＴＭＢ（Ｂｉｏｆｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｏｗｉｎｇｓ  Ｍｉｌｌｓ，ＭＤ）の添加により検出した。停止バッファー（例えば、Ｂｉｏ  ＦＸ  Ｓｔｏｐ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ｂｉｏｆｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｏｗｉｎｇｓ  Ｍｉｌｌｓ，ＭＤ）の添加により該反応を停止し、マイクロプレートリーダー（例えば、ＶＥＲＳＡｍａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して吸光度を６５０ｎｍで測定した。各抗体に関してＩＣ５０値を計算した。該実験は３回行い、親抗体結合結果に対する割合（％）として平均結果が示されている。
【０１７７】
８．１．８  バイオアッセイ
３×１０４個のマウスＬ９２９細胞を平底９６ウェルマイクロタイタープレートの個々のウェル内にプレーティングした。該細胞を加湿５％  ＣＯ２恒温槽内で３７℃で一晩温置した。翌日、該抗体ＴＮＦ−α抗体の系列希釈物（例えば、０．７１２μｇ／ｍＬ、０．９４９μｇ／ｍＬ、１．２７μｇ／ｍＬ、１．６９μｇ／ｍＬ、２．２５μｇ／ｍＬまたは３μｇ／ｍＬ）を２５μＬの無血清培地内で調製し、（１５０μＬの培養内の最終濃度が１１９ｎｇ／ｍＬ、１５８ｎｇ／ｍＬ、２１１ｎｇ／ｍＬ、２８２ｎｇ／ｍＬ、３７５ｎｇ／ｍＬまたは５００ｎｇ／ｍＬとなるように）細胞に加えた。５％  ＣＯ２中、３７℃で２時間の温置の後、２５μＬの２４０ｎｇ／ｍＬ  溶液のＴＮＦ−αを加えて最終濃度を４０ｎｇ／ｍＬとし、該細胞を５％  ＣＯ２中、３７℃で４８時間、更に温置した。ＴＮＦ−αで処理されたがイソタイプ対照抗体または親抗体（Ｄ２Ｅ７）と共に温置された対照プレートと比較して、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ生存度アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて該細胞を細胞傷害性に関して評価した。ＩＣ５０値を決定し、親Ｄ２Ｅ７結果に対する割合（％）として表した。
【０１７８】
８．１．９  ＢＩＡｃｏｒｅによるＤ２Ｅ７変異体の動力学的分析
ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００および３０００表面プラズモン共鳴系（ＢＩＡｃｏｒｅ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用することにより、抗ＴＮＦ−α抗体の結合親和性を測定した。標準的なＢＩＡｃｏｒｅアミンカップリング試薬（Ｎ−エチル−Ｎ’−ジメチルアミノ−プロピルカルボジイミド，ＥＤＣ；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド，ＮＨＳ；およびエタノールアミンＨＣｌ，ｐＨ８．５）を使用して、まず、ポリクローナルヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）をバイオセンサー表面に固定化し、ついで、５μＬ／分の低い流量での平行表面上の抗ＴＮＦ−α抗体（Ｄ２Ｅ７およびＤ２Ｅ７変異体）の捕捉を行った。２５〜６０ＲＵの低いＲｍａｘが得られるように、ＲＬを低く維持した。陰性対照として使用する参照表面上では該抗体の捕捉は行われなかった。ついでＴＮＦ−αを８０μＬ／分の流量で３分間にわたって全ての流動セル内に注入して結合をモニターし、ついでＨＢＳ−Ｐランニングバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ  塩化ナトリウム，０．００５％  Ｐ−２０，ｐＨ７．４）の３０分間の流動により解離相をモニターした。各サイクルにおいて、０ｎＭから１２８の範囲の６つの異なるＴＮＦ濃度および４倍の増加量でＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を該表面上に注入した。各サイクルの終了時に２つの短いパルスにおいて１００μＬ／分の流量で１．５％  Ｈ３ＰＯ４で該表面を再生させた。
【０１７９】
ＢＩＡ評価プログラムを使用して、種々の濃度のＴＮＦ−αから集めたセンサーグラムデータの全体的分析から各ＴＮＦ−αおよび抗体ペアの結合動力学を計算した。参照表面およびバッファーのみの対照（０ｎＭのＴＮＦ−α）からのバックグラウンド応答を除外するために、各分析において二重参照を適用した。１：１ラングミュア結合を質量転移モデルと共に用いて該センサーグラムの会合および解離相を同時にフィットさせることにより、各結合ペアの解離定数（ＫＤ）、会合速度定数（ｋｏｎ）および解離速度定数（ｋｏｆｆ）を得た。
【０１８０】
８．２  結果
８．２．１  Ｄ２Ｅ７  ＶＨおよびＶＬ領域におけるＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープの特定
ＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープペプチドを、８１名のドナーの集団における該ペプチドに対する応答率の分析により特定した。Ｄ２Ｅ７重鎖および軽鎖を示す試験した全てのペプチドに関する平均応答率および標準偏差を計算した。平均バックグラウンド応答＋３標準偏差と同じ又はそれより大きな応答率を潜在的ＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープとみなした。Ｄ２Ｅ７軽鎖Ｖ領域に関しては、３２個のペプチドを試験し（図２）、これは５．０９＋３．５３％の平均バックグラウンド応答率を示した。バックグラウンドを超える３標準偏差は１５．６８％と決定された。８位における１個のペプチドが、Ｄ２Ｅ７軽鎖ペプチドデータセットにおいて、１７．２８％の応答率で、このレベルの応答を示した（図２）。また、１１位におけるペプチドは１２．３５％の非常に高い応答率を示した。Ｄ２Ｅ７重鎖Ｖ領域に関しては、３７個のペプチドを試験した（図３）。平均バックグラウンド応答率は２．６４＋２．０４％であった。バックグラウンドを超える３標準偏差は８．７８％であった。Ｄ２Ｅ７重鎖データセット内の１個のペプチド（番号２０）が８．６４％の応答率を示した（図３）。
【０１８１】
該データセット内の全てのペプチドに関して平均刺激指数を計算した。軽鎖ペプチド番号８は１．９７＋０．０８ｓ．ｅ．ｍ．の高い平均刺激指数を示した。番号１１におけるペプチドは１．６３＋０．３２ｓ．ｅ．ｍ．の平均刺激指数を与えた。軽鎖データセットにおけるペプチド番号２７は１．８３の平均ＳＩを示した。これは、このペプチドに対する２９の異常に高い刺激指数を有する単一ドナーによるものである。重鎖ペプチド番号２０は１．３４＋０．０５ｓ．ｅ．ｍ．の平均刺激指数値を示した。これらの値の全ては、それらの２つのデータセットにおける全てのペプチドに関して、平均刺激指数より有意に高い（全６８個の重鎖および軽鎖ペプチドに関して１．０２＋０．０２）。
【０１８２】
これらのデータは、Ｄ２Ｅ７内に２つの主要ＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープ領域が存在することを示している（表２）。ＶＨ領域においては、エピトープは、フレームワーク２とＣＤＲ２との結合部を含むペプチド２０位において見出される。表２においては、ＣＤＲ由来アミノ酸が下線で示されている。軽鎖においては、２以上のＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープを含有しうる大きな領域はペプチド番号８および番号１１を含む。これらのペプチドは軽鎖のフレームワーク１、ＣＤＲ１およびフレームワーク２の部分に広がる。
【０１８３】
８．２．２  ＶＬエピトープペプチドに対する応答によるＨＬＡ相関
該ペプチドデータセットにおける全８１名のドナーのＨＬＡクラスＩＩ遺伝子型を、低ストリンジェンシーＳＳＯのＰＣＲに基づく方法を用いて決定した。特定のＨＬＡ対立遺伝子の存在とそれらの２つのＶＬペプチドに対する応答との間の相関（アソーシエーション）をカイ２乗分析により決定した。フィッシャーＰ値および相対危険度を全てのＨＬＡ型および両方のペプチドに関して決定した（表３）。ＨＬＡ  ＤＲまたはＤＱ型とＶＬペプチド番号８（Ｔ２２−Ｙ３６）に対する応答との間に有意な相関性は存在しなかった。この結果は、該ペプチドが、広範に無差別な様態でＨＬＡクラスＩＩ分子に結合しうることを示唆している。ＶＬペプチド番号１１（Ｎ３１−Ｋ４５）に対するＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖応答はＨＬＡ−ＤＱ２の存在と厳密に相関していた（ｐ＝０．００３；相対危険度＝７．７）。ＨＬＡ−ＤＲ３はＨＬＡ−ＤＱ２に対して連鎖不平衡であるため、このペプチドに対する応答とＨＬＡ−ＤＲ３との間の相関は存在するが、統計的有意性に達しなかった（ｐ＝０．１０；相対危険度３．３）。ＨＬＡ−ＤＱ２に加えて、ＨＬＡ−ＤＲ１２とＮ３１−Ｋ４５に対する応答との間の相関が見出された（ｐ＝０．０３；相対危険度５．２）。全応答者が少なすぎたため、ＶＨペプチド番号２０に対するＨＬＡ応答は試験されなかった。それらの２つのＶＬペプチドに対する応答は異なるものであったため、それらは別々のペプチドエピトープに相当すると結論づけられうる。したがって、Ｄ２Ｅ７  ＶＨおよびＶＬ領域は３つの顕著なペプチドエピトープ領域を含有する。
【０１８４】
８．２．３  免疫原性低下変異体の特定
アラニンスキャン修飾：  Ｄ２Ｅ７軽鎖の２１アミノ酸の配列はＴ２２−Ｙ３６およびＮ３１−Ｋ４５にエピトープを含む。選択した２１アミノ酸の配列はＣ２３−Ｋ４５であった。アラニン修飾を各アミノ酸において施した（表４）。９９名のドナーの集団を該変異ペプチドで試験した（図４）。親物質としての２１マーを該ペプチド集団において４回作製した。これらの４個の重複体は、該アッセイの再現性に関する対照として使用される。平均親ペプチド応答は、３０％のＣＶ％で８．３％であった。したがって、５．８％未満の平均割合を有する変異ペプチドは、低下した応答率を有するとみなすことが可能であった。最も低下した変異体はＣ２３Ａ（２．０２％）およびＰ４０Ａ（３．０３％；図４を参照されたい）であった。２３位のシステインは非変異体であり、したがって、タンパク質全体における修飾のための良好な候補ではない。また、プロリン残基の特有の性質のため、この残基の修飾が機能性変異抗体を与えるとは考えにくい。第３の候補はＹ３２Ａ（４．０４％）であろう。また、５．０５％の平均応答率を与えた幾つかの変異体が存在する。これらの変化も有効かもしれないが、低下した免疫原性および機能活性の両方に関して全タンパク質分子として試験される必要があろう。
【０１８５】
Ｄ２Ｅ７  ＶＨエピトープペプチドの配列に基づくアラニン修飾ペプチドの集団も試験した（データ非表示）。重複試験における親未修飾ペプチドの応答率は非常に低かった。したがって、このペプチドは更なる研究に付されなかった。
【０１８６】
抗原結合研究：  Ｄ２Ｅ７抗体のＣＤＲ−Ｌ１領域を包括的突然変異分析に付した。該突然変異分析と共に行った抗原結合研究に基づき、ＴＮＦ−αへの該抗体の親和性を有意には低下させない、ＣＤＲ−Ｌ１領域内の一組の候補アミノ酸置換が特定された（表５）。該候補ＣＤＲ−Ｌ１置換を含有する幾つかの変異抗体を、ＢＩＡｃｏｒｅおよびＥＬＩＳＡを用いて分析した（表６）。抗体分子全体の親和性を保有する一方でアミノ酸配列を改変する特性を有するＣＤＲ−Ｌ１領域内のアミノ酸修飾を含有するペプチドを作製した（表７）。単一アミノ酸修飾体または二重修飾体として、該修飾エピトープペプチドを試験した。該二重修飾体は３２位にグルタミンまたはグリシンを、あるいは３４位にセリンまたはグリシンを含有していた。親２１マーペプチドの２回の合成を含めて、合計７９個のペプチドを試験した。合計１０２人のドナーを該変異ペプチドで試験し、結果を図５に示す。該親ペプチドの平均応答率は１０．３＋２．１％であった。応答率が該親物質からの３標準偏差未満となるためには、該応答率は４％未満となろう。該親ペプチドに関する平均刺激指数は１．４９＋０．１５であった。刺激指数が該親応答の３標準偏差未満に達するためには、それは１．０３以下となろう。
【０１８７】
Ｙ３２ＧおよびＹ３２Ｑ突然変異の、後続の親和性測定は、このアミノ酸修飾が抗原結合に負の影響を及ぼすことを示した。したがって、この修飾を含有する全てのペプチドを該分析から除外した。合計１０個のペプチドを更なる研究のために選択した。全ての選択されたペプチドは４％未満の応答率を示した。しかし、該ペプチドはいずれも、該平均親応答の３標準偏差未満の刺激指数を示さなかった（表８）。
【０１８８】
８．２．４  修飾Ｄ２Ｅ７変異抗体の親和性および生物活性試験
１０個のＤ２Ｅ７  ＶＬ領域構築物を未修飾ＶＨ領域と共にヒトＩｇＧ１含有プラスミド内にクローニングし、一過性トランスフェクションにより２９３Ｔ／１７細胞系において発現させ、抗体をプロテインＡまたはプロテインＧ親和性により精製した。精製された抗体を競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＴＮＦ−α結合に関して試験した。全１０個の変異体がＴＮＦ−α結合に関して未修飾Ｄ２Ｅ７と競合した。しかし、Ｑ２７Ｒ＋Ａ３４Ｓ変異体のほぼ等しい親和性からＮ３１Ｓ＋Ａ３４Ｓ変異体の親和性における１０倍低下までの範囲の親和性が示された（図６）。
【０１８９】
ＴＮＦ−α毒性バイオアッセイを行った。Ｌ２９２細胞を９６ウェルプレート内に播き、一定濃度のＴＮＦ−αを該培地に加えた。該変異抗体を該培地内に滴定した。各変異体に関してＥＣ５０値を決定した（表９）。同様に、変異体Ｑ２７Ｒ＋Ａ３４Ｓは、親Ｄ２Ｅ７抗体とほぼ等しいＥＣ５０値を示した。
【０１９０】
最後に、ＴＮＦ−αに対する該抗体の親和性をＢＩＡｃｏｒｅ分析により決定した（表１０）。試験した１０個の変異体のうち、Ｑ２７Ｈ＋Ａ３４Ｓ、Ｑ２７Ｒ＋Ａ３４ＳおよびＧ２８Ｓ＋Ａ３４Ｓ変異体は全て、Ｄ２Ｅ７に類似した会合および解離速度を示した。該変異体の最終親和性値は１３０ｐＭの範囲内であり、一方、Ｄ２Ｅ７は、これらの実験において１１４ｐＭの測定親和性を示した。
【０１９１】
９．実施例２：ＴＮＦ−αに対する親和性の増加を示すＤ２Ｅ７の変異体の特定
Ｄ２Ｅ７と比較して増加した、ＴＮＦ−αに対する親和性を示す突然変異体を特定するために、Ｄ２Ｅ７抗体を包括的突然変異分析に付した。ＴＮＦ−αに対する候補突然変異体の、増加した親和性を、Ｄ２Ｅ７と比較したそれらの特性を証明するために、ＥＬＩＳＡおよびＢＩＡｃｏｒｅにより分析した。
【０１９２】
９．１  材料および方法
９．１．１  競合ＥＬＩＳＡ
第８．１．７節に記載されているとおりに競合ＥＬＩＳＡアッセイを行った。ＥＬＩＳＡを２回重複して行い、ＩＣ５０における平均改善倍数をＷＴ／ｘとして示した。
【０１９３】
９．１．２  ＢＩＡｃｏｒｅ
第８．１．９節に記載されているとおりにＢＩＡｃｏｒｅアッセイを行った。
【０１９４】
９．２  結果
Ｄ２Ｅ７と比較した場合のＫＤの改善（ＢＩＡｃｏｒｅによる測定において）、ＥＬＩＳＡにおける競合能の改善またはそれらの両方を示したＤ２Ｅ７のＣＤＲ変異体を表１２および２５に示す。
【０１９５】
１０．特定の実施形態、参考文献の引用
本出願において引用されている全ての刊行物、特許、特許出願および他の文書の全体を、各個の刊行物、特許、特許出願または他の文書があらゆる目的で参照により本明細書に組み入れられると個々に示されている場合と同等に、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れることとする。
【０１９６】
種々の特定の実施形態を例示し説明してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の変更が施されうると理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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