(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小流体デバイスを用いて試料中のＤＮＡを精製する方法であって、
（ａ）微小流体デバイスの混合領域において試料と溶解緩衝液とを混合する工程と、
（ｂ）微小流体デバイスの細胞溶解領域において細胞の核膜を溶解することなく試料中の細胞の細胞膜を選択的に溶解して、細胞から無傷の核を生成する工程と、
（ｃ）試料からの無傷の核を、フィルタを使用して交流濾過によって微小流体デバイスの細胞トラップ領域にトラップし、試料の他の成分を、フィルタを通して微小流体デバイスの廃棄物回収領域に流す工程と、
（ｄ）フィルタによってトラップされた無傷の核を溶解する工程と、
（ｅ）ＤＮＡを溶解核から遊離させる工程と、
（ｆ）遊離したＤＮＡを微小流体デバイスのＤＮＡ回収領域に回収する工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
試料は白血球、細菌および／またはウィルスを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料は、細胞膜の選択的溶解の前に、最初に白血球が濃縮されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
フィルタによってトラップされた無傷の核を溶解する工程およびＤＮＡを溶解核から遊離させる工程は、フィルタによってトラップされた無傷の核に溶出緩衝液を流すことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
溶出緩衝液は、トリス緩衝液、ＫＣｌおよび両性イオンを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
溶出緩衝液は増幅反応緩衝液である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
フィルタによってトラップされた無傷の核は、トラップされた核に熱を加えることによって溶解される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
トラップされた核は、３５℃から９５℃の範囲の温度で１から１０分間にわたって加熱される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
トラップされた核は、５０℃の温度で７分間にわたって加熱される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
溶解核から遊離したＤＮＡは、ＤＮＡに溶出緩衝液を流すことによって、微小流体デバイスのＤＮＡ回収領域に流れる、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
試料からのＤＮＡを精製するための微小流体デバイスであって、
（ａ）試料ポートからの試料と溶解緩衝液ポートからの溶解緩衝液との混合を可能にするように構成されている微小流体デバイスの混合領域と流体連通する試料ポートおよび溶解緩衝液ポートと、
（ｂ）混合領域と流体連通する細胞溶解領域であって、溶解緩衝液が、細胞の核膜を溶解することなく試料中の細胞の細胞膜を選択的に溶解して、試料中の細胞から無傷の核を生成することを可能にするように構成されている細胞溶解領域と、
（ｃ）試料からの無傷の核が交流濾過によってフィルタによってトラップされ、試料の他の成分がフィルタを通して微小流体デバイスの廃棄物回収領域に流れる核トラップ領域であって、前記細胞溶解領域と流体連通する核トラップ領域と、
（ｄ）無傷の核の核膜を溶解してＤＮＡを遊離させる核溶解領域と、
（ｅ）トラップされた無傷の核から遊離したＤＮＡが回収される前記微小流体デバイス内のＤＮＡ回収領域と
を含むことを特徴とする微小流体デバイス。
【請求項１２】
核トラップ領域および核溶解領域と流体連結する溶出緩衝液ポートをさらに含み、溶出緩衝液ポートからの溶出緩衝液は、核トラップ領域および核溶解領域を流れることによって、トラップされた無傷の核の核膜を溶解してＤＮＡを遊離させるように制御することができる、請求項１１に記載の微小流体デバイス。
【請求項１３】
溶出緩衝液はトリス緩衝液、ＫＣｌおよび両性イオンを含む、請求項１２に記載の微小流体デバイス。
【請求項１４】
核膜を溶解することによってＤＮＡを遊離させるのに十分な熱を核溶解領域における無傷の核に供給するように構成されている熱源をさらに含む、請求項１１に記載の微小流体デバイス。
【請求項１５】
熱源は、核を３５℃から９５℃の範囲の温度で１から１０分間にわたって加熱するように制御されている、請求項１４に記載の微小流体デバイス。
【請求項１６】
熱源は、核を５０℃の温度で７分間にわたって加熱するように制御されている、請求項１５に記載の微小流体デバイス。
【請求項１７】
溶解核から遊離したＤＮＡは、溶出緩衝液をＤＮＡに流すことによって微小流体デバイスのＤＮＡ回収領域に流れる、請求項１４に記載の微小流体デバイス。
【請求項１８】
フィルタは、シリコン、ガラス、ポリマー、ポリエステル、ポリカーボネートまたはニトロセルロースで構成されている、請求項１１に記載の微小流体デバイス。
【請求項１９】
フィルタは丸形または長方形である、請求項１１に記載の微小流体デバイス。
【請求項２０】
フィルタは、５００ｎｍから１０μｍの孔径を有する、請求項１１に記載の微小流体デバイス。
【請求項２１】
フィルタは、０．５μｍから１０μｍの孔径を有する、請求項２０に記載の微小流体デバイス。
【請求項２２】
複数の層を含む、請求項１１に記載の微小流体デバイス。
【請求項２３】
微小流体デバイスは、
（１）溶解緩衝液ポート、試料ポート、溶出緩衝液ポート、精製ＤＮＡ回収ポートおよび廃棄物ポートを含む第１の層と、
（２）溶解緩衝溶液および試料を微小流体デバイスの混合領域に輸送するマイクロチャネルネットワークを含む第２の層と、
（３）マイクロチャネルネットワークを含む第３の層と、
（４）第２の層と第３の層の間に配置されたフィルタと
をさらに含み、
試料および溶解緩衝溶液は、混合領域で混合し、マイクロチャネル内を細胞溶解領域まで流れ、試料および溶解緩衝溶液は、細胞溶解領域からフィルタを通して核トラップ領域に流れ、試料の他の成分は、フィルタを通して第３の層にあるマイクロチャネルに流れ、微小流体デバイスの廃棄物回収領域に達し、核から遊離したＤＮＡは、フィルタを通して第３の層に配置されたマイクロチャネルに流れ、ＤＮＡ回収領域に達する、請求項２２に記載の微小流体デバイス。
【請求項２４】
（１）溶解緩衝液ポート、試料ポート、溶出緩衝液ポート、精製ＤＮＡ回収ポートおよび廃棄物ポートを含む第１の層、
（２）溶解緩衝溶液および試料を微小流体デバイスの混合領域に輸送するマイクロチャネルネットワークを含む第２の層、
（３）流体が第２の層におけるマイクロチャネルからフィルタ上に流れる孔を含む第３の層、
（４）流体がフィルタから、廃棄物回収領域およびＤＮＡ回収領域をさらに含む第５の層に配置されたマイクロチャネルに流れる孔を含む第４の層をさらに含む、請求項２２に記載の微小流体デバイス。
【請求項２５】
試料からのＤＮＡを精製するための微小流体デバイスであって、
（ａ）溶解緩衝液を試料と混合することにより、細胞の核膜を溶解することなく試料中の細胞の細胞膜を選択的に溶解して、試料中の細胞から無傷の核を生成することを可能にするように構成されている細胞溶解領域、
（ｂ）無傷の核がフィルタによって試料の他の成分から遊離する交流濾過領域であって、前記フィルタは、無傷の核がフィルタは通過せず、試料の他の成分がフィルタを通過し、交流濾過領域を流れるように制御されている交流緩衝液によって運び出されるような孔径を有する、交流濾過領域、
（ｃ）精製核が下流分析のために流れる前記交流濾過領域と流体連通するインターフェースチャネル
を含むことを特徴とする微小流体デバイス。
【請求項２６】
交流濾過領域は、
（ｉ）細胞溶解領域と流体連通し、細胞溶解領域から無傷の核および試料の他の成分を受け取るように構成されている微小流体分離チャネルであって、フィルタは、微小流体チャネル内に構築されている微小流体分離チャネルと、
（ｉｉ）交流緩衝液が微小流体分離チャネルにわたってフィルタを通して流れることを可能にするように構成されている交流緩衝液ポートと
を含み、
交流緩衝液は、分離チャネルにわたって流れるときに、フィルタを通した分離チャネルからの試料の前記他の内容物の除去を容易にし、無傷の核は分離チャネルを流れる、請求項２５に記載の微小流体デバイス。
【請求項２７】
溶解した試料および交流緩衝液の一方の流れが圧力差によって誘導され、溶解した試料および交流緩衝液の他方の流れが圧力差または電気泳動電圧ポテンシャルによって誘導される、請求項２５に記載の微小流体デバイス。
【請求項２８】
フィルタの孔径は２μｍから１０μｍである、請求項２５に記載の微小流体デバイス。
【請求項２９】
フィルタの孔径は５μｍである、請求項２８に記載の微小流体デバイス。
【請求項３０】
フィルタは膜である、請求項２５に記載の微小流体デバイス。
【請求項３１】
フィルタはアレイ状の柱である、請求項２５に記載の微小流体デバイス。
【請求項３２】
交流濾過領域は、無傷の核、細菌およびウィルスを、溶解した試料から分離するように構成されている、請求項２５に記載の微小流体デバイス。
【請求項３３】
交流濾過領域は、無傷の核を分離するための第１のフィルタ、細菌を分離するための第２のフィルタおよびウィルスを分離するための第３のフィルタを含む、請求項３２に記載の微小流体デバイス。
【請求項３４】
第１のフィルタは交流緩衝液ポートの最も近くに配置され、第２のフィルタは交流緩衝液ポートのその次に近くに配置され、第３のフィルタは交流緩衝液ポートから最も離れて配置されている、請求項３３に記載の微小流体デバイス。
【請求項３５】
第１のフィルタの孔径は２μｍから１０μｍであり、第２のフィルタの孔径は０．２μｍから２μｍであり、第３のフィルタの孔径は１０ｎｍから４００ｎｍである、請求項３３に記載の微小流体デバイス。
【請求項３６】
第１のフィルタの孔径は８μｍであり、第２のフィルタの孔径は０．４μｍであり、第３のフィルタの孔径は１００ｎｍである、請求項３５に記載の微小流体デバイス。
【請求項３７】
微小流体デバイスは、２つ以上の交流濾過領域をさらに含み、交流濾過領域はそれぞれ、細胞溶解領域から溶解した試料の一部を受け取り、それぞれ１つまたは複数のインターフェースチャネルと流体連通する、請求項２５に記載の微小流体デバイス。
【請求項３８】
１つの交流濾過領域のフィルタは、１つの他の交流濾過領域の孔径と異なる孔径を有する、請求項３７に記載の微小流体デバイス。
【請求項３９】
交流濾過領域からの無傷の核を濃縮する核濃縮領域をさらに含む、請求項２５に記載の微小流体デバイス。
【請求項４０】
核濃縮領域は、試料投入部と、試料排出部と、無傷の核が壁部を流れるのを妨げ、試料の他の内容物が前記壁部を流れることを可能にするように構成されている壁部とを有する濃縮チャネルを含む、請求項３９に記載の微小流体デバイス。
【請求項４１】
前記壁部はフィルタである、請求項４０に記載の微小流体デバイス。
【請求項４２】
フィルタは、濃縮チャネルに沿って配置された一組の柱を含む、請求項４１に記載の微小流体デバイス。
【請求項４３】
試料は白血球を含む、請求項２５に記載の微小流体デバイス。
【請求項４４】
下流分析は、核酸を増幅する増幅反応、および／または増幅産物の有無を判定するための検出手順を含む、請求項２５に記載の微小流体デバイス。
【請求項４５】
試料中の細胞からのＤＮＡを精製するための微小流体システムであって、
（ａ）微小流体デバイスと、
（ｂ）溶解緩衝液を試料と混合することにより、細胞の核膜を溶解することなく試料中の細胞の細胞膜を選択的に溶解して、試料中の細胞から無傷の核を生成することを可能にするように構成されている微小流体デバイス内の細胞溶解領域と、
（ｃ）無傷の核がフィルタによって試料の他の成分から分離される、微小流体デバイス内の交流濾過領域であって、前記フィルタは、無傷の核がフィルタを通過せず、試料の他の成分がフィルタを通過し、交流濾過領域を流れるように制御されている交流緩衝液によって運び出されるような孔径を有する、交流濾過領域と、
（ｄ）無傷の核の核膜が溶解されてＤＮＡが遊離し、交流濾過領域と流体連通する、微小流体デバイス内の核溶解領域と、
（ｅ）核酸を増幅する、微小流体デバイス内の増幅反応領域と、
（ｆ）増幅産物の有無を判定するための、微小流体デバイス内の検出領域と
を含むことを特徴とする微小流体システム。
【請求項４６】
核溶解領域は増幅反応領域の一部である、請求項４５に記載のシステム。
【請求項４７】
領域（ｂ）〜（ｄ）が１つの微小流体デバイスに存在し、領域（ｅ）および（ｆ）が第２の微小流体デバイスに存在する、請求項４５に記載のシステム。
【請求項４８】
微小流体デバイスを用いて試料中の細胞からＤＮＡを精製する方法であって、
（ａ）前記微小流体デバイスの混合領域において細胞を含む試料を溶解緩衝液と混合する工程であって、溶解緩衝液は、核膜を溶解することなく細胞膜を選択的に溶解する工程と、
（ｂ）前記微小流体デバイスの細胞溶解領域において細胞の核膜を溶解させることなく試料中の細胞の細胞膜を選択的に溶解して、細胞から無傷の核を生成する工程と、
（ｃ）前記微小流体デバイスの交流濾過領域において無傷の核を試料から分離する工程であって、前記交流濾過領域は、無傷の核がフィルタを通過することができず、試料の他の成分がフィルタを通過し、交流濾過領域を流れるように制御されている交流緩衝液によって運び出されるような孔径を有するフィルタを含む工程と、
（ｄ）精製核を下流分析のために、前記交流濾過領域と流体連通するインターフェースチャネルに流す工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４９】
溶解した試料および交流緩衝液の一方の流れを圧力差によって誘導し、溶解した試料および交流緩衝液の他方の流れを電気泳動電圧ポテンシャルによって誘導することをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記交流濾過領域において無傷の核、細菌およびウィルスを溶解した試料から分離することをさらに含み、無傷の核、細菌およびウィルスはそれぞれ、交流緩衝液とともに個別のチャネルに遊離する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記交流濾過領域において無傷の核、細菌およびウィルスを、それぞれ異なる孔径を有する一連のフィルタによって溶解した試料から分離することをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
無傷の核を下流分析のために送る前に、無傷の核を濃縮することをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
溶解した試料の一部をそれぞれ受け取る２つ以上の交流濾過領域を利用して、溶解した試料から無傷の核を分離することをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
試料中の細胞からのＤＮＡを精製することは、試料中の白血球からのＤＮＡを精製することを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５５】
試料中の核酸の有無を判定する方法であって、
（ａ）前記微小流体デバイスの混合領域において細胞を含む試料を溶解緩衝液と混合する工程であって、溶解緩衝液は、核膜を溶解することなく細胞膜を選択的に溶解する工程と、
（ｂ）前記微小流体デバイスの細胞溶解領域において細胞の核膜を溶解させることなく試料中の細胞の細胞膜を選択的に溶解して、細胞から無傷の核を生成する工程と、
（ｃ）前記微小流体デバイスの交流濾過領域において無傷の核を試料から分離する工程であって、前記交流濾過領域は、無傷の核がフィルタを通過することができず、試料の他の成分がフィルタを通過し、交流濾過領域を流れるように制御されている交流緩衝液によって運び出されるような孔径を有するフィルタを含む工程と、
（ｄ）微小流体デバイスにおいて核を溶解して核酸を遊離させる工程と、
（ｅ）微小流体デバイスにおいて核酸を増幅する工程と、
（ｆ）増幅産物の有無を判定する工程であって、増幅産物の存在が、試料中の核酸の存在を示す工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５６】
試料はヒトの血液試料であり、細胞膜の選択的溶解の前に、最初に白血球が濃縮されている、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
工程（ａ）〜（ｄ）が１つの微小流体デバイスで実施され、工程（ｅ）および（ｆ）が第２の微小流体デバイスで実施される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
工程（ａ）〜（ｃ）が１つの微小流体デバイスで実施され、工程（ｄ）〜（ｆ）が第２の微小流体デバイスで実施される、請求項５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、２００８年７月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／０８１，９６７号の利点を主張するものである。本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＦＯＲ  ＤＮＡ  ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ  ＯＮ  Ａ  ＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩＣ  ＤＥＶＩＣＥ」という名称で、Ｍｉｃｈｅｌｅ  Ｒ．Ｓｔｏｎｅを発明者とする、２００９年７月１７日に出願された米国特許出願第 号（代理人整理番号３４００−１６５）に関連する。
【０００２】
本発明は、微小流体ＤＮＡ試料の調製のための方法およびシステムに関する。より具体的には、本発明の実施形態は、微小流体デバイス（マイクロ流体素子）を用いて患者試料からＤＮＡを単離するための方法およびシステム、ならびに微小流体デバイスを用いた増幅反応および熱融解分析の実施などの下流側処理のためのＤＮＡの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
核酸の検出は、医学、法医学、工業的処理、作物および動物飼育ならびに多くの他の分野の中心である。疾患状態（例えば癌）、感染性生体（例えばＨＩＶ）、遺伝子系列および遺伝子マーカ等を検出する能力は、疾患診断および予後、マーカ支援選択、犯罪場面の正確な特定、工業的生体を繁殖させる能力および多くの他の技術のための幅広い技術である。対象となる核酸の完全性の判定は、感染または癌の病理に関連し得る。少量の核酸を検出するための最も強力かつ基本的な技術の１つは、核酸配列の一部またはすべてを何度も複製し、次いで増幅産物を分析することである。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、恐らく、多くの異なる増幅技術のなかで最も良く知られている。
【０００４】
ＰＣＲは、核酸分析のためのより高感度な方法の１つである。しかし、血液を含む臨床試料中の多くの物質は、ＰＣＲに影響を与え、ＰＣＲ結果に重大な誤差をもたらし得る。したがって、ＤＮＡ単離および精製は、ＤＮＡ分析のための方法にとって重要である。従来のＤＮＡ調製は、大容量の試料を必要とし、長時間の処理を必要とする。微小流体技術は、ＤＮＡ試料調製のためにはるかに少ない試料およびより短い時間を使用することを可能にする。固相抽出法が、ＤＮＡ試料調製に適用された。ＤＮＡが固相上で選択的に抽出され、試料中の他の物質が抽出カラムから洗い流される。例えば、Ｂｒｅａｄｍｏｒｅら（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７５（８）：１８８０〜１８８６頁、２００３年）は、ガラスマイクロチップに充填され、ゾル−ゲル内に固定化されたシリカビーズを使用するマイクロチップに基づくＤＮＡ精製方法を報告した。あるいは、ＤＮＡ単離は、核サイズの篩によって達成することができる。
【０００５】
ＤＮＡは、細胞の核にしか存在しないため、核を試料から選択的に単離することによってＤＮＡ試料を調製することができる。伝統的な核単離は、遅く、低効率である。一般に、核単離は、核を無傷に維持しながら、細胞膜を選択的に溶解することによって実施される。次いで、核を遠心、沈降または篩によって単離する。Ｄｉｇｎａｎｉら（Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １１：１４７５〜１４８９頁、１９８３年）は、遠心による試料からの核の単離を報告した。米国特許第５，４４７，８６４号には、ＤＮＡメッシュを使用して核を単離する方法が開示されている。米国特許第６，８５２，８５１号には、複数の半径方向に分散したマイクロチャネルを含む微細加工装置で核を単離する方法が開示されている。米国特許第６，９９２，１８１号には、ＤＮＡまたは細胞核を精製するためのＣＤデバイスの使用が記載されている。この方法は、ＤＮＡおよび核の流れを阻止するための隔壁をチャネル内に使用して、ＤＮＡおよび細胞核を単離するために可動部および遠心力を必要とする。Ｐａｌａｎｉａｐｐａｎら（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７６：６２４７〜６２５３頁、２００４年）は、迅速な赤血球溶解のための連続流微小流体デバイスを報告した。ＶａｎＤｅｌｉｎｄｅｒら（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７８：３７６５〜３７１１頁、２００６年）は、成形微小流体デバイスでの連続的交流の全ヒト血液からの血漿の分離を報告した。微小流体チャネルにおける溶解緩衝液と血液試料との混合を促進するために、Ｐａｌａｎｉａｐｐａｎら（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７８：５４５３〜５４６１頁、２００６年）は、ダブルヘリングボーン微小隆起でパターン化されたチャネル床を有する微小流体チャネルを報告した。ＶａｎＤｅｌｉｎｄｅｒら（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７９：２０２３〜２０３０頁、２００７年）は、粒子および細胞のための微小流体交流での灌流を記載している。粒子は、主要チャネル内を流れ、灌流は、側方チャネルを流れて、懸濁の媒体を交換する。
【０００６】
核を細胞から単離することによってＤＮＡを精製する現行の技術にはいくつかの問題がある。第一に、従来の手法は遅い。通常、従来の手法は、細胞溶解から核単離まで完成するのに何時間もかかる。例えば、米国特許第６，８５２，８５１号に記載されている精製方法は、メッシュがマイクロチャネルに組み込まれた複数のマイクロチャネルで実施される。しかし、マイクロチャネルのサイズが限定されるため、方法では、１００ｎｌから１μｌの限られた試料サイズしか扱うことができない。別の問題は、ＤＮＡおよび／または核を膜から遊離させる方法に伴うものである。例えば、米国特許第５，４４７，８６４号では、核を膜から遊離させるためにＤＮＡアーゼが使用されている。しかし、ＤＮＡアーゼを加えると、下流処理が行き詰まる。米国特許第５，４４７，８６４号では、ＤＮＡを遊離させるために、硫酸ドデシルナトリウム溶液またはプロテイナーゼＫを使用して核被覆を破壊する。しかし、これらの溶解試薬も下流処理を酷く阻害する。従来の核溶解方法は、高濃度の塩化ナトリウム（０．５Ｍ）を使用して、核膜を破壊することである。しかし、高濃度の塩化ナトリウムも下流処理を阻害する。
【０００７】
加えて、現行の技術は、ＤＮＡ結合および洗浄のための特定の緩衝液を必要とし、そのほとんどがＰＣＲなどの下流用途に適合しない。これらの技術は、また、精製される全体量のＤＮＡにおいて広範な効率性を有する。これは、試料を微小流体に使用するときに重大な問題になり得る。典型的にはＤＮＡ精製に必要とされる複数の試薬は、弁などの可動部を固相抽出における複数の試薬の導入のために微小流体デバイスに構築することを必要とする。微小流体システムでは、固相抽出または複数試薬の使用が複雑化し、システムの故障を招き得る。
【０００８】
下流用途での使用のために核を取り込み、または試料集団から特定の細胞を分離するための様々な方法が存在するが、これらの方法には、細胞核を抽出し、増幅反応および検出分析などの微小流体処理および下流処理に好適である細胞核に含まれる核酸を単離することが可能な単一デバイスが記載されていない。したがって、ＤＮＡ単離のための微小流体システムおよび方法を開発する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国仮特許出願第６１／０８１，９６７号
【特許文献２】米国特許出願第    号（代理人整理番号３４００−１６５）
【特許文献３】米国特許第５，４４７，８６４号
【特許文献４】米国特許第６，８５２，８５１号
【特許文献５】米国特許第６，９９２，１８１号
【特許文献６】米国特許第７，２６２，２８３号
【特許文献７】米国特許出願公開第２００８／０００３５８８号
【特許文献８】米国特許出願公開第２００８／０１３０９７１号
【特許文献９】米国特許出願公開第２００８／０１７６２３０号
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００９／００５３７２６号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｂｒｅａｄｍｏｒｅら（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７５（８）：１８８０〜１８８６頁、２００３年）
【非特許文献２】Ｄｉｇｎａｎｉら（Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １１：１４７５〜１４８９頁、１９８３年）
【非特許文献３】Ｐａｌａｎｉａｐｐａｎら（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７６：６２４７〜６２５３頁、２００４年）
【非特許文献４】ＶａｎＤｅｌｉｎｄｅｒら（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７８：３７６５〜３７１１頁、２００６年）
【非特許文献５】Ｐａｌａｎｉａｐｐａｎら（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７８：５４５３〜５４６１頁、２００６年）
【非特許文献６】ＶａｎＤｅｌｉｎｄｅｒら（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７９：２０２３〜２０３０頁、２００７年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、微小流体ＤＮＡ試料の調製のための方法およびシステムに関する。より具体的には、本発明の実施形態は、微小流体デバイス（マイクロ流体素子）を用いる患者試料からＤＮＡを単離するための方法およびシステム、ならびに微小流体デバイスを用いる増幅反応および熱融解分析の実施などの下流側の処理のためのＤＮＡの使用に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
一態様において、本発明は、微小流体デバイスを用いる試料（例えば患者試料または他の試料）からのＤＮＡを精製する方法を提供する。この態様によれば、方法は、（ａ）微小流体デバイスの混合領域において試料と溶解緩衝液を混合すること、（ｂ）微小流体デバイスの細胞溶解領域において細胞の核膜を溶解することなく試料中の細胞の細胞膜を選択的に溶解して、細胞から無傷の核を生成すること、（ｃ）試料からの無傷の核を膜によって微小流体デバイスの細胞トラップ領域にトラップし、試料の他の成分を、膜を通して微小流体デバイスの廃棄物回収領域に流すこと、（ｄ）膜にトラップされた無傷の核を溶解すること、（ｅ）ＤＮＡを溶解核から遊離させること、および（ｆ）遊離したＤＮＡを微小流体デバイスのＤＮＡ回収領域に回収することを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態において、試料は、例えば、血液試料、尿試料、唾液試料、痰試料、髄液試料、体液試料、または白血球を含有する組織試料であり得る患者試料である。他の実施形態において、患者試料は、白血球を含む。さらなる実施形態において、患者試料は、細胞膜の選択的溶解の前に、最初に白血球が濃縮されている。いくつかの実施形態において、白血球の濃縮は、濾過によって実施される。さらなる実施形態において、白血球の濃縮は、抗体を使用して実施される。いくつかの実施形態において、抗体は、ビーズ、磁性ビーズ、粒子、ポリマービーズ、クロマトグラフィー樹脂、濾紙、膜またはヒドロゲルなどの固相に結合される。
【００１４】
いくつかの実施形態において、選択的溶解は、そのままのまたは白血球濃縮の後の患者試料を、細胞の核を無傷に維持しながら細胞膜を選択的に透過化処理する緩衝液（本明細書では溶解緩衝液または核単離緩衝液と称する）と接触させることによって実施される。これらの特性を有する核単離緩衝液は、当業者に周知である。細胞膜を選択的に溶解するための核単離緩衝液を含む製品は、市販されている。緩衝液を含む好適な商品としては、Ｎｕｃｌｅｉ  ＥＺ  Ｐｒｅｐ  Ｎｕｃｌｅｉ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＮＵＣ−１０１）（Ｓｉｇｍａ、米国ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、Ｎｕｃｌｅａｒ／Ｃｙｔｏｓｏｌ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｋ２６６−１００）（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、米国カリフォルニア州Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ）、ＮＥ−ＰＥＲ  Ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｐｉｅｒｃｅ、米国イリノイ州Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｍｇｅｎｅｘ，Ｃｏｒｐ．、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）およびＱｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ）が挙げられるが、それらに限定されない。米国特許第５，４４７，８６４号、米国特許第６，８５２，８５１号および米国特許第７，２６２，２８３号をも参照されたい。問題の核のタイプは、どの核単離緩衝液が必要であるかを決定づけ得ることが既知である。異なる細胞タイプに対して好適な選択的溶解緩衝液を調製するために最適化できる要因の説明については米国特許第５，４４７，８６４号を参照されたい。
【００１５】
一実施形態において、溶解緩衝液は低張性緩衝液である。例えば、市販の低張性溶解緩衝液のＮｕｃｌｅｉ  ＥＺ溶解緩衝液（Ｎ３４０８）をＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入することができる。Ｎｕｃｌｅｉ  ＥＺ  Ｐｒｅｐ  Ｎｕｃｌｅｉ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｎｕｃ−１０１）というキットもＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能である。１０倍の低張性溶液の一般的な処方物は、１５ｍＭのＭｇＣｌ２および１００ｍＭのＫＣｌを含む１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）である。別の実施形態において、溶解緩衝液は、洗剤を含む低張性緩衝液である。好適な洗剤としては、硫酸ラウリルリチウム、デオキシコール酸ナトリウムおよびチャプスなどのイオン性洗剤、またはトリトンＸ−１００、ツイーン２０、Ｎｐ−４０およびＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０などの非イオン性洗剤が挙げられるが、それらに限定されない。別の実施形態において、溶解緩衝液は等張性緩衝液である。例えば、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈは、等張性溶解緩衝液を含有するＣｅｌＬｙｔｉｃ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔというキットを提供する。５倍の等張性溶解緩衝液の一般的な処方物は、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１５ｍＭのＣａＣｌ２および１．５Ｍのスクロースを含む５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）である。さらなる実施形態において、緩衝液は、イオン性洗剤または非イオン性洗剤であってよい洗剤を含む等張性緩衝液である。他の実施形態において、選択的溶解は、弱洗剤を含む低張性溶解緩衝液を使用して実施される。さらなる実施形態において、患者試料と低張性溶解緩衝液とを１：１の割合で混合する。さらなる実施形態において、細胞膜の選択的溶解は、赤血球を完全に溶解する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、膜にトラップされた無傷の核を溶解する工程、およびＤＮＡを溶解核から遊離させる工程は、膜にトラップされた無傷の核に溶出緩衝液を流すことを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、溶出緩衝液は、ＤＮＡが相溶する緩衝液である。他の実施形態において、溶出緩衝液は、トリス緩衝液、ＫＣｌおよび両性イオンを含む。一実施形態において、両性イオンは、ベタイン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、水酸化トリメチルアミンまたは臭化トリメチルアミンである。他の実施形態において、溶出緩衝液は、非アッセイ特異的増幅試薬を含むことができる増幅反応緩衝液である。さらなる実施形態において、増幅反応緩衝液は、非アッセイ特異的ＰＣＲ試薬を含むことができるＰＣＲ緩衝液である。さらなる実施形態において、溶出緩衝液は、ＤＮＡに結合する染料を含む。さらなる実施形態において、染料は、チャネルにおけるＤＮＡの量を定量するのに有用である。さらなる実施形態において、核を熱によって溶解して、ＤＮＡを核から遊離させる。いくつかの実施形態において、核は、増幅反応の前に加熱される。他の実施形態において、核は、増幅反応時に加熱され、核溶解領域は、増幅反応が実施される微小流体デバイスの最初の領域である。
【００１８】
いくつかの実施形態において、膜にトラップされた無傷の核は、トラップされた核を加熱することによって溶解される。一実施形態において、トラップされた核は、約３５℃から９５℃の範囲の温度で約１から１０分間にわたって加熱される。別の実施形態において、トラップされた核は、約５０℃の温度で約７分間にわたって加熱される。さらなる実施形態において、溶解核から遊離したＤＮＡは、溶出緩衝液をＤＮＡに流すことによって、微小流体デバイスのＤＮＡ回収領域に流れる。いくつかの実施形態において、溶出緩衝液は、本明細書に記載されている通りである。
【００１９】
別の態様において、本発明は、患者試料からのＤＮＡを精製するための微小流体デバイスを提供する。この態様によれば、微小流体デバイスは、微小流体デバイスの混合領域と流体連通する試料ポートおよび溶解緩衝液ポートを含む。混合領域は、試料ポートからの患者試料と溶解緩衝液ポートからの溶解緩衝液との混合を可能にするように構成されている。微小流体デバイスは、混合領域と流体連通する細胞溶解領域をさらに含む。細胞溶解領域は、溶解緩衝液が、細胞の核膜を溶解することなく、患者試料中の細胞の細胞膜を選択的に溶解して、患者試料中の細胞から無傷の核を生成することを可能にするように構成されている。微小流体デバイスは、患者試料からの無傷の核が膜にトラップされ、患者試料の他の成分が膜を通して微小流体デバイスの廃棄物回収領域に流れる核トラップ領域をさらに含む。核トラップ領域は、細胞溶解領域と流体連通する。微小流体デバイスは、無傷の核の核膜を溶解してＤＮＡを遊離させる核溶解領域をさらに含む。微小流体デバイスは、トラップされた無傷の核から遊離したＤＮＡが回収される微小流体デバイス内のＤＮＡ回収領域をさらに含む。
【００２０】
いくつかの実施形態において、微小流体デバイスは、核トラップ領域および核溶解領域と流体連通する溶出緩衝液ポートをさらに含む。溶出緩衝液ポートからの溶出緩衝液は、核トラップ領域および核溶解領域を流れて、トラップされた無傷の核の核膜を溶解してＤＮＡを遊離させるように制御することができる。一実施形態において、溶出緩衝液は、ＤＮＡが相溶する緩衝液である。他の実施形態において、溶出緩衝液は、トリス緩衝液、ＫＣｌおよび両性イオンを含む。一実施形態において、両性イオンは、ベタイン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド、塩酸トリメチルアミンまたは臭化トリメチルアミンである。他の実施形態において、溶出緩衝液は、非アッセイ特異的増幅試薬を含むことができる増幅反応緩衝液である。さらなる実施形態において、増幅反応緩衝液は、非アッセイ特異的ＰＣＲ試薬を含むことができるＰＣＲ緩衝液である。
【００２１】
いくつかの実施形態において、微小流体デバイスは、核膜を溶解することによってＤＮＡを遊離させるのに十分な熱を核溶解領域における無傷の核に供給するように構成されている熱源をさらに含む。一実施形態において、熱源は、核を約３５℃から９５℃の範囲の温度で約１から１０分間にわたって加熱するように制御されている。別の実施形態において、熱源は、核を約５０℃の温度で約７分間にわたって加熱するように制御されている。
【００２２】
いくつかの実施形態において、溶解核から遊離したＤＮＡは、溶出緩衝液をＤＮＡに流すことによって微小流体デバイスのＤＮＡ回収領域に流れる。他の実施形態において、膜は、シリコン、ガラス、ポリマー、ポリエステル、ポリカーボネートまたはニトロセルロースで構成されている。さらなる実施形態において、膜は、丸形または長方形である。一実施形態において、膜は、約５００ｎｍから１０μｍの孔径を有する。別の実施形態において、膜は、約０．５μｍから１０μｍの孔径を有する。
【００２３】
いくつかの実施形態において、微小流動デバイスは、複数の層を有する。一実施形態において、微小流体デバイスは、（１）溶解緩衝液ポート、患者試料ポート、溶出緩衝液ポート、精製ＤＮＡ回収ポートおよび廃棄物ポートを含む第１の層と、（２）溶解緩衝溶液および患者試料を微小流体デバイスの混合領域に輸送するマイクロチャネルネットワークを含む第２の層と、（３）マイクロチャネルネットワークを含む第３の層と、（４）第２の層と第３の層の間に配置された膜とをさらに含む。いくつかの実施形態において、患者試料および溶解緩衝溶液は、混合領域で混合し、マイクロチャネル内を細胞溶解領域まで流れ、患者試料および溶解緩衝溶液は、細胞溶解領域から膜を通して核トラップ領域に流れ、患者試料の他の成分は、膜を通して第３の層におけるマイクロチャネルに流れ、微小流体デバイスの廃棄物回収領域に達し、核から遊離したＤＮＡは、膜を通して第３の層に配置されたマイクロチャネルに流れ、ＤＮＡ回収領域に達する。
【００２４】
他の実施形態において、微小流体デバイスは、（１）溶解緩衝液ポート、患者試料ポート、溶出緩衝液ポート、精製ＤＮＡ回収ポートおよび廃棄物ポートを含む第１の層、（２）溶解緩衝溶液および患者試料を微小流体デバイスの混合領域に輸送するマイクロチャネルネットワークを含む第２の層、（３）流体が第２の層にあるマイクロチャネルから膜上に流れる孔を含む第３の層、（４）流体が膜から、廃棄物回収領域およびＤＮＡ回収領域をさらに含む第５の層に配置されたマイクロチャネルに流れる孔を含む第４の層をさらに含む。
【００２５】
別の態様において、本発明は、患者試料からのＤＮＡを精製するための別の微小流体デバイスを提供する。この態様によれば、微小流体デバイスは、溶解緩衝液を患者試料と混合することにより、細胞の核膜を溶解することなく患者試料中の細胞の細胞膜を選択的に溶解して、患者試料中の細胞から無傷の核を生成することを可能にするように構成されている細胞溶解領域を含む。微小流体デバイスは、無傷の核をフィルタによって患者試料の他の成分から分離する交流濾過領域をさらに含む。フィルタは、無傷の核がフィルタを通過せず、患者試料の他の成分がフィルタを通過し、交流濾過領域を流れるように制御されている交流緩衝液によって運び出されるような孔径を有する。微小流体デバイスは、精製核が下流分析のために流れる前記交流濾過領域と流体連通するインターフェースチャネルをさらに含む。
【００２６】
いくつかの実施形態において、交流濾過領域は、細胞溶解領域と流体連通し、細胞溶解領域から無傷の核および患者試料の他の成分を受け取るように構成されている微小流体分離チャネルを含む。フィルタは、微小流体チャネル内に構築されている。交流濾過領域は、交流緩衝液が微小流体分離チャネルにわたってフィルタを通して流れることを可能にするように構成されている交流緩衝液ポートをさらに含む。交流緩衝液は、分離チャネルにわたって流れるときに、フィルタを通した分離チャネルからの患者試料の他の内容物の除去を容易にする。無傷の核は、分離チャネルを流れる。
【００２７】
いくつかの実施形態において、溶解した患者試料および交流緩衝液の一方の流れが圧力差によって誘導され、溶解した患者試料および交流緩衝液の他方の流れが電気泳動電圧ポテンシャルによって誘導される。一実施形態において、フィルタの孔径は、約２μｍから１０μｍである。別の実施形態において、フィルタの孔径は、約５μｍである。一実施形態において、フィルタは膜である。別の実施形態において、フィルタは、サイズ排除隔壁として形成するアレイ状の柱である。
【００２８】
いくつかの実施形態において、交流濾過領域は、無傷の核、細菌およびウィルスを、溶解した患者試料から分離するように構成されている。一実施形態において、交流濾過領域は、無傷の核を分離するための第１のフィルタ、細菌を分離するための第２のフィルタおよびウィルスを分離するための第３のフィルタを含む。別の実施形態において、第１のフィルタは交流緩衝液ポートの最も近くに配置され、第２のフィルタは交流緩衝液ポートのその次に近くに配置され、第３のフィルタは交流緩衝液ポートから最も離れて配置されている。一実施形態において、第１のフィルタの孔径は約２μｍから１０μｍであり、第２のフィルタの孔径は約０．２μｍから２μｍであり、第３のフィルタの孔径は約１０ｎｍから４００ｎｍである。別の実施形態において、第１のフィルタの孔径は約８μｍであり、第２のフィルタの孔径は約０．４μｍであり、第３のフィルタの孔径は約１００ｎｍである。
【００２９】
いくつかの実施形態において、微小流体デバイスは、１つを超える交流濾過領域をさらに含み、交流濾過領域はそれぞれ、細胞溶解領域から溶解した患者試料の一部を受け取り、それぞれ１つまたは複数のインターフェースチャネルと流体連通する。一実施形態において、１つの交流濾過システムのフィルタは、１つの他の交流濾過システムの孔径と異なる孔径を有する。
【００３０】
いくつかの実施形態において、微小流体デバイスは、交流濾過領域からの無傷の核を濃縮する核濃縮領域をさらに含む。一実施形態において、核濃縮領域は、試料投入部と、試料排出部と、無傷の核が壁部を流れるのを妨げ、患者試料の他の内容物が前記壁部を流れることを可能にするように構成されている壁部とを有する濃縮チャネルを含む。一実施形態において、壁部はフィルタである。別の実施形態において、フィルタは、濃縮チャネルに沿って配置された一組の柱を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態において、患者試料は、本明細書に記載されている通りである。他の実施形態において、患者試料は白血球を含む。さらなる実施形態において、下流分析は、核酸を増幅する増幅反応、および／または増幅産物の有無を判定するための検出手順を含む。
【００３２】
別の態様において、本発明は、患者試料からのＤＮＡを精製するための微小流体システムを提供する。この態様によれば、微小流体システムは、微小流体デバイスを含む。システムは、溶解緩衝液を患者試料と混合することにより、細胞の核膜を溶解することなく患者試料中の細胞の細胞膜を選択的に溶解して、患者試料中の細胞から無傷の核を生成することを可能にするように構成されている微小流体デバイス内の細胞溶解領域をさらに含む。システムは、無傷の核がフィルタによって患者試料の他の成分から分離される、微小流体デバイス内の交流濾過領域をさらに含む。フィルタは、無傷の核がフィルタを通過せず、患者試料の他の成分がフィルタを通過し、交流濾過領域を流れるように制御されている交流緩衝液によって運び出されるような孔径を有する。システムは、無傷の核の核膜が溶解されてＤＮＡが遊離する、微小流体デバイス内の核溶解領域をも含む。核溶解領域は、交流濾過領域と流体連通する。システムは、核酸を増幅する、微小流体デバイス内の増幅反応領域、および増幅産物の有無を判定するための、微小流体デバイス内の検出領域をさらに含む。
【００３３】
いくつかの実施形態において、核溶解領域は、増幅反応領域の一部である。他の実施形態において、それらの領域は個別の微小流体デバイスに存在する。一実施形態において、細胞溶解領域、交流濾過領域および核溶解領域が１つの微小流体デバイスに存在し、増幅領域および検出領域が第２の微小流体デバイスに存在する。
【００３４】
別の態様において、本発明は、微小流体デバイスにおいて患者試料からのＤＮＡを精製するための方法を提供する。この態様によれば、方法は、前記微小流体デバイスの混合領域において細胞を含む患者試料を溶解緩衝液と混合することを含む。溶解緩衝液は、核膜を溶解することなく細胞膜を選択的に溶解する。方法は、微小流体デバイスの細胞溶解領域において細胞の核膜を溶解させることなく患者試料中の細胞の細胞膜を選択的に溶解して、細胞から無傷の核を生成することも含む。方法は、前記微小流体デバイスの交流濾過領域において無傷の核を患者試料から分離することをさらに含む。交流濾過領域は、無傷の核がフィルタを通過せず、患者試料の他の成分がフィルタを通過し、交流濾過領域を流れるように制御されている交流緩衝液によって運び出されるような孔径を有するフィルタを含む。方法は、精製核を下流分析のために、前記交流濾過領域と流体連通するインターフェースチャネルに流すことをさらに含む。
【００３５】
いくつかの実施形態において、方法は、溶解した患者試料および交流緩衝液の一方の流れを圧力差によって誘導し、溶解した患者試料および交流緩衝液の他方の流れを電気泳動電圧ポテンシャルによって誘導することをさらに含む。他の実施形態において、方法は、前記交流濾過領域において無傷の核、細菌およびウィルスを溶解した患者試料から遊離させることをさらに含み、無傷の核、細菌およびウィルスはそれぞれ、交流緩衝液とともに個別のチャネルに遊離する。別の実施形態において、方法は、前記交流濾過領域において無傷の核、細菌およびウィルスを、それぞれ異なる孔径を有する一連のフィルタによって溶解した患者試料から分離することをさらに含む。別の実施形態において、方法は、下流分析のために無傷の核を送る前に、無傷の核を濃縮することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、溶解した患者試料の一部をそれぞれ受け取る２つ以上の交流濾過領域を利用して、溶解した患者試料から無傷の核を分離することをさらに含む。いくつかの実施形態において、患者試料は本明細書に記載されている通りである。他の実施形態において、患者試料中の細胞からのＤＮＡを精製することは、患者試料中の白血球からのＤＮＡを精製することを含む。
【００３６】
別の態様において、本発明は、患者試料中の核酸の有無を判定する方法を提供する。この態様によれば、方法は、前記微小流体デバイスの混合領域において細胞を含む患者試料を溶解緩衝液と混合することを含む。溶解緩衝液は、核膜を溶解することなく細胞膜を選択的に溶解する。方法は、微小流体デバイスの細胞溶解領域において細胞の核膜を溶解することなく、患者試料中の細胞の細胞膜を選択的に溶解して、細胞から無傷の核を生成することをも含む。方法は、微小流体デバイスの交流濾過領域において無傷の核を患者試料から分離することをさらに含む。交流濾過領域は、無傷の核がフィルタを通過せず、患者試料の他の成分がフィルタを通過し、交流濾過領域を流れるように制御されている交流緩衝液によって運び出されるような孔径を有するフィルタを含む。方法は、微小流体デバイスにおいて核を溶解して核酸を遊離させることをさらに含む。方法は、微小流体デバイスにおいて核酸を増幅すること、および増幅産物の有無を判定することをさらに含む。増幅産物の存在は、患者試料中の核酸の存在を示す。
【００３７】
いくつかの実施形態において、患者試料は本明細書に記載されている通りである。他の実施形態において、患者試料は白血球を含む。さらなる実施形態において、方法は、細胞膜の選択的溶解の前に患者試料の白血球を濃縮することをさらに含む。白血球の濃縮は、本明細書に記載の通り実施することができる。さらなる実施形態において、患者試料と溶解緩衝液の混合、選択的溶解、無傷の核の分離、および核の溶解が１つの微小流体デバイスで実施され、増幅および検出が第２の微小流体デバイスで実施される。他の実施形態において、患者試料と溶解緩衝液の混合、選択的溶解および無傷の核の分離が１つの微小流体デバイスで実施され、核の溶解、増幅および検出が第２の微小流体デバイスで実施される。
【００３８】
別の態様において、本発明は、ＤＮＡを患者試料中の細胞から分離するための別の微小流体システムを提供する。この態様によれば、微小流体システムは、核膜を溶解することなく細胞膜を選択的に溶解する溶解緩衝液を貯蔵するための溶解緩衝液貯蔵デバイスを含む。システムは、溶出緩衝液を貯蔵するための溶出緩衝液貯蔵デバイスをも含む。システムは、患者試料を受け取るための複数のチャンバを有する試料カードをさらに含む。試料カードにおける各チャンバは、導入口、フィルタおよび排出口を含む。システムは、試料カードの各チャンバへの溶解緩衝液および溶出緩衝液の流れを制御するための流れ制御システムをさらに含む。流れ制御システムは、溶解緩衝液が細胞膜を選択的に溶解して、核と細胞片を遊離して、細胞片を、フィルタを通して、フィルタにトラップされる患者試料中の核の核膜を溶解せずに試料カードの下に配置可能である廃棄物容器に流すように、試料カードの各チャンバへの溶解緩衝液の流れを制御する。システムは、前記フィルタにトラップされた核を溶解し、ＤＮＡを遊離させるのに十分に試料カードにおけるフィルタを加熱するための温度制御システムをさらに含む。システムは、複数のＤＮＡ試料ウェルおよびＤＮＡ試料排出口を含むインターフェース・チップをも含む。インターフェース・チップは、試料カードの下に配置可能であり、前記フィルタにトラップされた溶解核から遊離したＤＮＡを受け取るように構成されている。システムは、温度制御システムおよび流れ制御システムと連通する主コントローラをさらに含む。
【００３９】
いくつかの実施形態において、温度制御システムは、加熱源および熱センサを含む。他の実施形態において、流れ制御システムは、ポンプおよび溶液送出チップを含み、溶液送出チップは、溶解緩衝液および溶出緩衝液を試料カードの各チャンバに送出するための複数のチャネルを含む。さらなる実施形態において、流れ制御システムは、圧力制御システムをさらに含む。圧力制御システムは、空気源、試料カードの各チャンバへの溶出緩衝液および溶解緩衝液の送出を制御するための圧力センサを含む。いくつかの実施形態において、試料カードの複数のチャンバは、互いに流体連通する。他の実施形態において、試料カードはディスポーザブルである。いくつかの実施形態において、試料カードは、複数の異なる患者試料を収容するように構成されている。他の実施形態において、試料カードは、１つの患者試料を複数のチャンバに収容するように構成されている。
【００４０】
別の態様において、本発明は、患者試料中の核酸の有無を判定するための微小流体システムを提供する。この態様によれば、微小流体システムは、試料調製領域、増幅反応領域および検出領域を含む微小流体デバイスを含む。試料調製領域は、核膜を溶解することなく細胞膜を選択的に溶解する溶解緩衝液を貯蔵するための溶解緩衝液貯蔵デバイスを含む。試料調製領域は、溶出緩衝液を貯蔵するための溶出緩衝液貯蔵デバイスをも含む。試料調製領域は、患者試料を受け取るための複数のチャンバを有する試料カードをさらに含む。各チャンバは、導入口、フィルタおよび排出口を含む。試料カードは、前記微小流体デバイスの前記試料調製領域に除去可能に挿入可能である。試料調製領域は、前記試料カードの各チャンバへの溶解緩衝液および溶出緩衝液の流れを制御するための流れ制御システムをも含む。流れ制御システムは、溶解緩衝液が細胞膜を選択的に溶解して、核と細胞片を遊離して、細胞片を、フィルタを通して、フィルタにトラップされる患者試料中の核の核膜を溶解せずに試料カードの下に配置可能である廃棄物容器に流すように、試料カードの各チャンバへの溶解緩衝液の流れを制御する。試料調製領域は、前記フィルタにトラップされた核を溶解し、ＤＮＡを遊離させるのに十分に試料カードにおけるフィルタを加熱するための温度制御システムをさらに含む。試料調製領域は、複数のＤＮＡ試料ウェルおよびＤＮＡ試料排出口を含むインターフェース・チップをさらに含み、前記インターフェース・チップは、試料カードの下に配置可能であり、前記フィルタにトラップされた溶解核から遊離したＤＮＡを受け取るように構成されている。微小流体システムは、温度制御システム、流れ制御システムおよび微小流体チップと連通する主コントローラをさらに含む。一実施形態において、主コントローラは、インターフェース・チップから微小流体チップの増幅領域および／または検出領域までのＤＮＡの流れを制御する。
【００４１】
いくつかの実施形態において、温度制御システムは、加熱源および熱センサを含む。他の実施形態において、流れ制御システムは、ポンプおよび溶液送出チップを含み、溶液送出チップは、溶解緩衝液および溶出緩衝液を試料カードの各チャンバに送出するための複数のチャネルを含む。いくつかの実施形態において、試料カードの複数のチャンバは、流体連通する。他の実施形態において、流れ制御システムは、圧力制御システムをさらに含み、圧力制御システムは、空気源、試料カードの各チャンバへの溶出緩衝液および溶解緩衝液の送出を制御するための圧力センサを含む。いくつかの実施形態において、試料カードの複数のチャンバは流体連通し、１つのチャンバにおける患者試料を他のチャンバに誘導することができる。他の実施形態において、試料カードはディスポーザブルである。
【００４２】
別の態様において、本発明は、患者試料中の細胞からＤＮＡを単離するための方法を提供する。この態様によれば、方法は、（ｉ）各チャンバが導入口、フィルタおよび排出口を含む、患者試料を受け取るための複数のチャンバを有し、前記微小流体システムに除去可能に挿入可能である試料カードと、（ｉｉ）試料カードの各チャンバへの溶解緩衝液および溶出緩衝液の流れを制御するための流れ制御システムと、（ｉｉｉ）試料カードにおけるフィルタを加熱するための温度制御システムと、（ｉｖ）試料カードの下に配置可能である廃棄物容器と、（ｖ）複数のＤＮＡ試料ウェルおよびＤＮＡ試料排出口を含み、試料カードの下に配置可能であるインターフェース・チップとを含む微小流体システムを作製することを含む。
【００４３】
方法は、患者試料を試料カードのチャンバに充填することをも含む。方法は、試料カードを微小流体システムに挿入することをさらに含む。方法は、溶解緩衝液を試料カードのチャンバに送出し、核の核膜を溶解することなく患者試料の細胞膜を選択的に溶解して、溶解緩衝液、無傷の核および細胞片を含む溶液を製造することをも含む。方法は、溶解緩衝液および細胞片を、フィルタを通して廃棄物容器に誘導することによって、無傷の核をフィルタにトラップするように流れ制御システムを制御することをさらに含む。方法は、フィルタを加熱して、フィルタにトラップされた無傷の核を溶解させることによって、ＤＮＡを遊離させるように温度制御システムを制御することをも含む。方法は、溶出緩衝液を試料カードのチャンバに送出することをさらに含む。方法は、溶出緩衝液およびＤＮＡをインターフェース・チップにおけるＤＮＡ試料ウェルに誘導するように流れ制御システムを制御することをさらに含む。いくつかの実施形態において、溶解緩衝液を試料カードのチャンバに繰り返し送出してフィルタを洗浄する。
【００４４】
本発明の上記および他の実施形態を、添付の図面を参照しながら以下に説明する。
【００４５】
本明細書に組み込まれ、明細書の一部を構成する添付の図面は、本発明の様々な実施形態を例示する。図面において、同様の参照番号は、同一または機能的に類似の要素を示す。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ＤＮＡ調製および分析システムの機能構成図である。
【図２】本発明の一実施形態による微小流体ＤＮＡ試料調製デバイスの概略図である。
【図３Ａ】本発明の一実施形態による多層微小流体試料調製デバイスを示す図である。
【図３Ｂ】本発明の一実施形態による多層微小流体試料調製デバイスの縦断面図である。
【図３Ｃ】本発明の一実施形態による多層微小流体試料調製デバイスの横断面図である。
【図４】本発明の一実施形態による多層微小流体試料調製デバイスの分解図である。
【図５】図４の微小流体試料調製デバイスの層１の上面図である。
【図６】図４の微小流体試料調製デバイスの層１の縦断面図である。
【図７】図４の微小流体試料調製デバイスの層２の上面図である。
【図８】図４の微小流体試料調製デバイスの層３の上面図である。
【図９】図４の微小流体試料調製デバイスの層３の縦断面図である。
【図１０】図４の微小流体試料調製デバイスの層４の上面図である。
【図１１】図４の微小流体試料調製デバイスの層４の縦断面図である。
【図１２】図４の微小流体試料調製デバイスの層５の上面図である。
【図１３】図４の微小流体試料調製デバイスの層５の縦断面図である。
【図１４】本発明の一実施形態によるプロセスを示すフローチャートである。
【図１５Ａ】膜による核のトラップを示す図である。図１５Ａは、核をトラップする前の膜を示す図である。
【図１５Ｂ】膜による核のトラップを示す図である。図１５Ｂは、蛍光染料で染色された核をトラップした後の膜を示す図である。
【図１６】実験の結果を示すグラフである。
【図１７】本発明の他の実施形態による試料調製のための交流微小流体デバイスの概略図である。
【図１８】本発明の一実施形態による交流フィルタの概略図である。
【図１９】本発明の他の実施形態による交流フィルタの概略図である。
【図２０】本発明のさらなる実施形態による試料調製のための交流微小流体デバイスの概略図である。
【図２１】図２０に示される交流微小流体デバイスの横断面図である。
【図２２】本発明の実施形態による試料濃縮器を示す図である。
【図２３】本発明の他の実施形態による試料調製のためのシステムを示す図である。
【図２４】本発明の一実施形態による試料調製のためのプロセスを示すフローチャートである。
【図２５】本発明の一実施形態による、試料中の核酸の有無を判定するためのプロセスを示すフローチャートである。
【図２６】本発明の他の実施形態による試料調製のための微小流体デバイスの概略図である。
【図２６】本発明の一実施形態による流れ制御システムの構成図である。
【図２７】本発明の一実施形態による試料カードを示す図である。
【図２８】本発明の別の実施形態による試料カードを示す図である。
【図２９】本発明の一実施形態による流れ制御システムを示す図である。
【図３０】本発明の一実施形態による溶液送出チップを示す図である。
【図３１】本発明の一実施形態による圧力制御チップを示す図である。
【図３２】本発明の一実施形態による試料調製のためのプロセスを示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
図１は、本発明のいくつかの実施形態による微小流体ＤＮＡ分析システム１００を示す。図１に示されるように、システム１００は、ＤＮＡ試料調製サブシステム１０２（「試料調製ユニット」としても知られる）、ＤＮＡ増幅、分析および検出サブシステム１０４および主制御システム１０１を含む。本出願は、主として、試料調製ユニット１０２に向けられ、先に出願された出願にはサブシステム１０４の様々な実施形態が記載されている（例えば、いずれもその全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２００８／０００３５８８号、米国特許出願公開第２００８／０１３０９７１号、米国特許出願公開第２００８／０１７６２３０号および米国特許出願公開第２００９／００５３７２６号参照）。
【００４８】
図２は、本発明の一実施形態による試料調製ユニット１０２の構成要素２００の概略図を示す。より具体的には、図２は、微小流体ＤＮＡ試料調製デバイス２００の概略図を示す。図２に示されるように、デバイス２００は、チップ２０１、溶解緩衝液を貯蔵するためのチップ２０１に形成されたウェル２０２、およびチップ２０１に形成された混合領域２０８にウェル２０２を流体接続することによって、ウェル２０２内の溶解緩衝液が混合領域２０８に移動するための流路を提供する、チップ２０１に形成された１つまたは複数の微小流体チャネル２０６を含む。デバイス２００は、分析すべき試料（例えば血液試料）を貯蔵するための、チップ２０１に形成された試料ウェル２０４をも含む。ウェル２０２のように、ウェル２０４は、チップ２０１に形成された１つまたは複数のチャネル２０５を介して混合領域２０８と流体連通接続されている。
【００４９】
混合領域２０８は、ウェル２０４からの試料とウェル２０２からの溶解緩衝液とを混合することを可能にするように構成されている。単に小さなチャネルであってよい混合領域２０８は、チップ２０１に形成された微小流体チャネル２０９を介してチップ２０１に配置されたフィルタ２１０（例えば浸透膜または他のフィルタ）と流体連通接続されている。いくつかの実施形態において、フィルタ２１０は、シリコン、ガラス、ポリマー、ポリエステル、ポリカーボネートおよびニトロセルロースの１種または複数種の任意の組合せで構成される。フィルタ２１０は、丸形、長方形または他の形状であってよい。いくつかの実施形態において、フィルタ２１０は、いくつかの孔を含み、孔径は、５００ナノメートル（ｎｍ）から１０マイクロメートル（μｍ）の範囲であってよい。例えば、いくつかの実施形態において、孔径は、約０．５μｍから１０μｍの範囲である。図１５ａおよび１５ｂは、フィルタ２１０の例示的な実施形態を示す。
【００５０】
チャネル２０９は、細胞溶解領域として機能するように構成されている。すなわち、チャネル２０９は、ウェル２０２からの溶解緩衝液が、細胞の核膜を溶解することなく、ウェル２０４からの患者試料中の細胞の細胞膜を選択的に溶解して、患者試料中の細胞から無傷の核を生成することを可能にするように構成されている。例えば、細胞溶解領域において、赤血球は、フィルタ２１０に達する前に破壊されてよく、白血球は、混合物がフィルタ２１０に達したときに核が無傷であるように部分的に溶解される。
【００５１】
図２にさらに示されるように、廃棄物ウェル２１２、ＤＮＡ回収ウェル２１４および溶出緩衝液ウェル２１６もチップ２０１に形成される。また、ウェル２１２、２１４および２１６の各々は、それぞれ微小流体チャネル２１３、２１５および２１７を介してフィルタ２１０と流体連通接続されている。いくつかの実施形態において、使用時に、ウェル２１６は、例えば、トリス緩衝液、ＫＣｌおよび／または両性イオンであり得る溶出緩衝液を貯蔵する。主制御システム１０１は、図１に示されるように、溶出緩衝液をフィルタ２１０に流すことができる。
【００５２】
チップ２００の使用時に、フィルタ２１０は、試料からの無傷の核がフィルタ２１０によってトラップされ、患者試料の他の成分が、フィルタ２１０を通して、廃棄物回収領域２１２に流れる核トラップ領域を形成する。フィルタ２１０は、また、無傷の核の核膜を溶解してＤＮＡを遊離させる核溶解領域として機能する。遊離したＤＮＡは、ＤＮＡ回収領域２１４に流される。
【００５３】
図２にさらに示されるように、デバイス２００は、熱源２５０を含むことができる。熱源２５０をチップ２０１の中または上に形成することができ、あるいはチップ２０１から構造的に分離させることができる。熱源２５０は、電気ヒータ（すなわち電気エネルギーを熱に変換するデバイス）または他のタイプの熱生成装置であってよい。熱源２５０を、主コントローラ１０１のモジュール、または主コントローラ１０１と連通する個別の構成要素であってよい温度コントローラ２５２によって制御することができる。熱源２５０は、所望の時間に熱をフィルタ２１０に伝達するように制御、構成および配置される。例えば、無傷の核がフィルタ２１０によってトラップされると、熱をフィルタ２１０に伝達させるように熱源２５０を制御することができ、その熱は、好ましくは、核の核膜を溶解し、またはその溶解を容易にすることによって、核膜に含まれるＤＮＡを遊離させるのに十分なものである。
【００５４】
いくつかの実施形態において、チップ２０１は多層チップである。すなわち、チップ２０１は、２つ以上の基板を含むことができる。次に、図３Ａ〜３Ｃを参照すると、デバイス２００の多層実施形態が示されている。図３Ａの非限定的な実施形態において、デバイス２００は、６つの層を含む。しかし、より少ない、またはより多くの層を使用することも可能である。図３Ｂは、図３Ａに示される実施形態によるデバイス２００の縦断面図を示し、図３Ｃは、図３Ａに示される実施形態によるデバイス２００の横断面図を示す。
【００５５】
図４は、図３Ａに示されるデバイス２００の実施形態の分解図を示す。その上面図が図５に示される第１の層（または上層）４０１において、ウェル２０２、２０４および２１６が、それぞれ溶解緩衝液、試料および溶出緩衝液を収容するために形成される。層４０１には、ＤＮＡ回収ウェル２１４と流体連通する貫通孔４０２および廃棄物ウェル２１２と流体連通する貫通孔４０４も形成される。１つの非限定的な実施形態において、層４０１は、好ましくは、約５ミリメートルの厚さであり、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）から構成される。さらなる実施形態において他の厚さおよび材料をこの層に使用することもできる。
【００５６】
層４０１の縦断面図である図５および図６にさらに示されるように、ウェル２０２は、流体がウェルからチャネル２０６に流れることができるように底面にポート４０５を有する。同様に、ウェル２０４は、流体がウェル２０４からチャネル２０５に流れることができるように底面にポート４０６を有する。したがって、ポート４０５および４０６は、混合領域２０８と流体連通する。同様に、ウェル２１６は、流体がウェル２１６からチャネル２１７に流れることができるようにその底面にポート４０７を有する。図４に示されるように、チャネル２０５、２０６および２１７は、デバイス２００の第２の層４１１に形成させる。
【００５７】
図７は、第２の層４１１の上面図である。図７に示されるように、第２の層４１１には、混合領域２０８、チャネル２０９、貫通孔４１３、４１４および４１５ならびに閉鎖底ウェル４１６、４１７および４１８が形成される。チャネル２０９は、混合領域２０８で形成することができる溶解緩衝液と試料の混合物が、孔４１３に流れてデバイス２００の第３の層４２１まで降下することができるように、混合領域２０８を孔４１３と流体接続する。同様に、チャネル２１７は、溶出緩衝液がウェル２１６から孔４１３に流れ、デバイス２００の第３の層に降下することができるように、溶出緩衝液ウェル２１６の孔４０７の真下に位置するウェル４１８を孔４１３と接続する。貫通孔４１４は、流体が孔４１４を通して孔４０４に流れることができるように貫通孔４０４の下に位置し、貫通孔４１５は、流体が孔４１５を通して孔４０２に流れることができるように貫通孔４０２の下に位置する。１つの非限定的な実施形態において、デバイス２００の第２の層４１１は、１５０マイクロメートルの厚さの環式オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）フィルムを含むことができる。さらなる実施形態において、他の厚さおよび材料をこの層に使用することもできる。
【００５８】
図８は、貫通孔４２２、４２３および４２４を含む第３の層４２１の上面図を示す。貫通孔４２２は、流体が孔４２２を通して孔４１４に流れることができるように貫通孔４１４の下に位置し、貫通孔４２３は、流体が孔４１３を通して孔４２３に流れることができるように貫通孔４１３の下に位置し、貫通孔４２４は、流体が孔４２３を通して孔４１５に流れることができるように貫通孔４１５の下に位置する。図９は、層４２１の縦断面図を示す。１つの非限定的な例において、デバイス２００の第３の層４２１は、１ミリメートルの厚さのＰＭＭＡ基板を含むことができる。さらなる実施形態において、他の厚さおよび材料をこの層に使用することもできる。
【００５９】
図１０は、貫通孔４３２、４３３および４３４を含む第４の層４３１の上面図を示す。貫通孔４３２は、流体が孔４３２を通して孔４２２に流れることができるように貫通孔４２２の下に位置し、貫通孔４３３は、流体が孔４２３を通して孔４３３に流れることができるように貫通孔４２３の下に位置し、貫通孔４３４は、流体が孔４３４を通して孔４２４に流れることができるように貫通孔４２４の下に位置する。図１１は、層４２１の縦断面図を示す。１つの非限定的な実施形態において、デバイス２００の第４の層４３１は、１ミリメートルの厚さのＰＭＭＡ基板を含むことができる。さらなる実施形態において、他の厚さおよび材料をこの層に使用することもできる。
【００６０】
図４に示されるように、フィルタ２１０は、デバイス２００の第３の層と第４の層との間に狭持される。いくつかの実施形態において、フィルタ２１０を、以上に記載されているシリコン、ガラス、ポリマー、ポリエステル、ポリカーボネートおよびニトロセルロースの１種または複数種の任意の組合せで構成することができる。１つの非限定的な実施形態において、フィルタ２１０は、約９ｍｍ×９ｍｍであり、約１０μｍの厚さを有する。さらなる実施形態において、フィルタは、他の厚さおよび寸法を有することができる。
【００６１】
図１２は、第５の層４４１の上面図を示す。その図に示されるように、閉鎖底ウェル２１２、４４３および２１４が層４４１の上面に形成される。層４４１の上面には、微小流体チャネル２１５、ならびにウェル４４３と廃棄物回収ウェル２１２とを接続するチャネル２１３も形成される。閉鎖底ウェル２１２、４４３および２１４は、それぞれ貫通孔４３２、４３３、４３４の下に位置する。図１３は、層４４１の縦断面図を示す。１つの非限定的な実施形態において、デバイス２００の第５の層４４１は、１５０マイクロメートルの厚さのＣＯＣフィルムを含むことができる。さらなる実施形態において、他の厚さおよび材料をこの層に使用することもできる。
【００６２】
図４に示されるように、デバイス２００の第６の層は基部層４５１である。１つの非限定的な実施形態において、層４５１は、ＰＭＭＡで構成された１ミリメートルの厚さの基板を含むことができる。さらなる実施形態において、他の厚さおよび材料をこの層に使用することもできる。いくつかの実施形態において、第３、第４および第６の層を除去することによって、３層デバイスを作製する。
【００６３】
次に図１４を参照すると、デバイス２００を使用して分析のためのＤＮＡを調製するためのプロセス１４００を示すフローチャートが示されている。プロセス１４００は、試料（例えば、白血球を含む血液の試料）を試料ウェル２０４に導入する工程１４０２から開始することができる。工程１４０４において、溶解緩衝液を溶解緩衝液ウェル２０２に導入する。工程１４０５において、溶解緩衝液を、ポート４０５およびチャネル２０６を通してウェル２０２から混合領域２０８に流す。同時に、またはほぼ同時に、試料を、ポート４０６およびチャネル２０５を通して試料ウェル２０４から混合領域２０８に流す。工程１４０６において、溶解緩衝液と試料が混合領域２０８で混合し、混合物は、チャネル２０９を介してフィルタ２１０に流される。試料が白血球を含む実施形態において、試料を混合領域２０８に導入する前に試料の白血球を濃縮することができる。
【００６４】
溶解緩衝液／患者試料混合物がチャネル２０９に存在し、フィルタ２１０に向かって移動している間に、溶解緩衝液は、工程１４０７に反映されているように、細胞の核膜を溶解することなく患者試料中の細胞の細胞膜を選択的に溶解して、細胞から無傷の核を生成する。混合物がフィルタ２１０に達すると、混合物は、好ましくは、患者試料からの遊離した無傷の核を含む。工程１４０８において、無傷の核はフィルタ２１０によってトラップされ、廃棄物（すなわち試料の他の成分および溶解緩衝液）は、フィルタ２１０を通過し、チャネル２１３を介して廃棄物回収ウェル２１２に移動させられる。
【００６５】
工程１４１０において、フィルタ２１０にトラップされた無傷の核を溶解することによって、ＤＮＡを溶解核から遊離させる。いくつかの実施形態において、無傷の核を溶解する工程は、ウェル２１６における溶出緩衝液を、チャネル２１７を介してフィルタ２１０に流すこと、および／またはヒータ２５０を使用して、トラップされた核を加熱することを含む。いくつかの実施形態において、溶出緩衝液は、トリス緩衝液、ＫＣｌおよび／または両性イオンを含む。いくつかの実施形態において、溶出緩衝液は、増幅反応緩衝液である。熱を使用して、トラップされた核を溶解する実施形態において、トラップされた核を摂氏約３５度から摂氏９５度の範囲の温度で約１から１０分間にわたって加熱することができる。例えば、一実施形態において、トラップされた核を約摂氏５０度の範囲の温度で約７分間にわたって加熱することができる。
【００６６】
工程１４１２において、無傷のトラップされた核を溶解した後、核から遊離したＤＮＡをＤＮＡ回収ウェル２１４で回収する。例えば、遊離したＤＮＡは、フィルタ２１０からチャネル２１５を介してウェル２１４に流れる。いくつかの実施形態において、遊離したＤＮＡは、溶出緩衝液が、ポート４０７からチャネル２１７に流れ、次いでチャネル２１７をフィルタ２１０に流れ、遊離したＤＮＡが溶出緩衝液と混合するフィルタ２１０を通して、次いでチャネル２１５を通してウェル２１４に流れるようにウェル２１６から溶出緩衝液を流すことによってウェル２１４に流れる。ウェル２１４に存在すると、遊離したＤＮＡおよび溶出緩衝液を含む混合物を、いずれもウェル２１４と流体連通する貫通孔４０２、４１５、４２４および４３４を介してチップ２０１から除去することができる。
【００６７】
図示されていないが、デバイス２００を、以上に記載されているように様々な緩衝液、試料および混合物を流すための流れ制御システム（例えば、１つまたは複数のポンプを含むシステム）に連結することができることが当技術分野で良く知られている。また、デバイス２００を微小流体プラットフォームと連結することができる。デバイス２００によって精製されたＤＮＡは、ポンプによって微小流体プラットフォームにおけるウェルに直接送出され、他のＰＣＲ成分とさらに混合し得る。
【００６８】
図１５Ａおよび図１５Ｂは、本発明の一実施形態による、膜による核酸のトラップを示す。具体的には、図１５Ａは、膜が染料染色核をトラップする前に膜から放射された蛍光を示し、図１５Ｂは、膜が染料染色核をトラップした後に膜から放射された蛍光を示す。
【００６９】
図１６を参照すると、上記方法を使用することにより達成された結果を示すグラフが示されている。特に、９つの患者血液試料を使用してＤＮＡ精製を試験した。この方法を使用して、精製ＤＮＡを得た後に、精製ＤＮＡ試料の一部分をピコグリーン法（全ＤＮＡ濃度を測定するための蛍光に基づく方法）によって定量した。精製ＤＮＡ試料の別の部分をリアルタイムＰＣＲによって定量した。それらの結果は、リアルタイムＰＣＲの結果が、有意な量の阻害が精製ＤＮＡ試料に存在しないことを示すピコグリーンアッセイに相当することを示している。
【００７０】
以下の表は、デバイス２００の上記構成要素の多くのものについての代表的な寸法を示す。これらの寸法は、例示であり、限定する意図はまったくない。
【表１】
0005795255.tif 000002
【００７１】
次に図１７を参照すると、本発明の他の実施形態による試料調製サブシステム１０２の様々な構成要素の概略図が示されている。図１７に示されるように、システム１０２は、試料（例えば、白血球および赤血球を含む血液の試料）を収容するための試料ウェル１７０２、溶解緩衝液を収容するための溶解緩衝液ウェル１７０４、ならびにそれぞれチャネル１７０３および１７０５を介してウェル１７０２および１７０４と流体連通するチャネル１７０６を含むことができる。チャネル１７０６は、細胞溶解領域として機能することができる。すなわち、ウェル１７０２からの溶解緩衝液を試料ウェル１７０４からの試料と混合させることで、細胞の核膜を溶解することなく試料中の細胞の細胞膜を選択的に溶解して、試料中の細胞から無傷の核を生成することを可能にするように、チャネル１７０６を構成することができる。
【００７２】
図１７にさらに示されるように、システム１０２は、チャネル１７０６と流体連通する交流濾過領域１７０８を含むことができる。いくつかの実施形態において、領域１７０８において、無傷の核（または白血球もしくは他の目標成分）は、目標成分（例えば無傷の核）が、交流濾過領域を流れるように制御されている交流緩衝液によって運び出されるのを防止するが、患者試料の他の成分がフィルタを通して流れ、交流緩衝液によって運び出されるような孔径をそれぞれ有する１つまたは複数の交流フィルタ１７１０によって試料の他の成分（例えば、タンパク質および他のＰＣＲ阻害剤）から分離される。図１７に示される非限定的な実施形態において、交流濾過領域１７０８は、平行に接続された４つの交流フィルタ１７１０を含む。他の実施形態において、領域１７０８は、１つ、２つ、３つまたは５つ以上のフィルタ１７１０を有することができる。また、いくつかの実施形態において、いくつかのフィルタ１７１０を縦列に配置することができる。さらに、各フィルタ１７１０は、異なる平均孔径を有することができる。
【００７３】
システム１０２は、交流濾過領域１７０８と流体連通され、交流濾過領域からの無傷の核を濃縮する濃縮器領域１７１２を含むこともできる。インターフェース領域１７１４は、濃縮器１７１２と流体連通されていてよい。本明細書に説明するように、精製された無傷の核は、好ましくは、濃縮器１７１２から出て、精製核を下流処理および分析のために流す１つまたは複数のインターフェースチャネルを含むインターフェース領域１７１４に入る。
【００７４】
図１８は、さらに、交流フィルタ１７１０の一実施形態を示す。図１８に示されるように、交流フィルタ１７１０は、図１７に示されるように細胞溶解領域１７０６および濃縮器１７１２と流体連通される微小流体分離チャネル１８０２を含む。チャネル１８０２は、チャネル１７０６からチャネル１８０２に入る流体が、濃縮領域１７１２に流体が達してそこに入るようにチャネル１８０２を流れることができるように構成されている。フィルタ１８１０およびフィルタ１８１２は、チャネル１８０２の中央部に配置される。フィルタ１８１０および１８１２は、分離チャンバ１８１４を形成するように配置される。
【００７５】
実施に際して、溶解緩衝液／試料混合物がチャネル１８０２を（すなわち入力端１８３２から出力端１８３４まで）流れている間に、交流流体は、交流緩衝液入力ポート１８０４を介して、フィルタ１８１０および１８１２を有するチャネル１８０２の部分に導入される。交流流体は、交流緩衝液出力ポート１８０６を介してチャネル１８０２のこの部分から出る。有利には、ポート１８０４を介してチャネル１８０２に入る交流流体を、最初にフィルタ１８１０に流し、次いで分離チャンバ１８１４に流し、次いでフィルタ１８１２に流し、最後に出口ポート１８０６を介してチャネル１８０２から流出させる差（例えば、圧力差または電圧差、例えば電気泳動電圧ポテンシャル、または重力場）がポート１８０４と１８０６の間に存在する。チャネル１８０２に入る流体を端１８３２から端１８３４まで流す力（例えば、圧力、電気、重力）も存在する。（点線によって示されるように）交流緩衝液が分離チャンバ１８１４を流れると、交流緩衝液は、フィルタ１８１０および１８１２とともに、細胞溶解領域１７０６からチャネル１８０２に流れる混合物の他の成分からの無傷の核の分離を容易にする。より具体的には、フィルタ１８１２および１８１０の孔径は、無傷の核がフィルタ１８１２を通過せず、端１８３２から端１８３４までの流体の流れによって濃縮器領域１７１２に向かって誘導されるのに対して、試料の他のより小さい成分がフィルタ１８１２を通して誘導され、交流緩衝液の交流を介して出口ポート１８０６に向かって誘導される孔径である。このようにして、無傷の核（または目標物質）を試料の他の成分から効率的に分離することができる。好ましくは、１つのタイプの力（例えば空気圧）を使用して、チャネル１８０２に入る流体を端１８３２から端１８３４まで流し、異なるタイプの力（例えば電場、重力）を使用して、交流流体を１８０４から１８０６まで流す。
【００７６】
いくつかの実施形態において、フィルタ１８１０および１８１２の孔径は、約１μｍから１５μｍである。例えば、フィルタ１８１２の孔径は約５μｍであってよい。いくつかの実施形態において、フィルタ１８１０および１８１２は、膜および／またはアレイ状の柱からなるか、またはそれらを含むことができる。
【００７７】
次に図１９を参照すると、別の実施形態による交流フィルタ１７１０が示されている。図１９に示されるように、交流フィルタ１７１０は、微小流体分離チャネル１９０２を含むことができる。例示的な実施形態において、フィルタ１９１０、１９１２、１９１６および１９１８は、チャネル１９０２の中央部に配置される。フィルタ１９１０、１９１２、１９１６および１９１８は、分離チャンバ１９１４ａ、１９１４ｂおよび１９１４ｃを形成するように配置される。
【００７８】
実施に際して、溶解緩衝液／試料混合物が、チャネル１９０２を（例えば、入力端１９３２から出力端１９３４ａに向かって）流れている間に、交流流体は、交流緩衝液入力ポート１９０４を介して、フィルタを有するチャネル１９０２の部分に導入される。交流流体は、交流緩衝液出力ポート１９０６を介して、フィルタを有するチャネル１９０２の部分から出る。有利には、ポート１９０４を介してチャネル１９０２に入る交流流体を、最初にフィルタ１９１０に流し、次いで分離チャンバ１９１４ａに流し、次いでフィルタ１９１２に流し、次いで分離チャンバ１９１４ｂに流し、次いでフィルタ１９１６に流し、次いで分離チャンバ１９１４ｃに流し、次いでフィルタ１９１８に流し、最後に出口ポート１９０６を介してチャネル１９０２から流出させる差（例えば、圧力差または電圧差、例えば電気泳動電圧ポテンシャル）がポート１９０４と１９０６の間に存在する。分離チャンバ１９１４ａ、１９１４ｂおよび１９１４ｃに入る流体を、それぞれ端１９３４ａ、１９３４ｂおよび１９３４ｃに向けて流す差（例えば圧力または電気）も存在する。交流緩衝液が分離チャンバ１９１４ａを流れると、交流緩衝液は、分離チャンバ１９１４ａを形成するフィルタとともに、分離チャンバに流れる混合物の他の成分からの所望の成分（例えば、無傷の核、細菌、ウィルス）の分離を容易にする。
【００７９】
より具体的には、例えば、フィルタ１９１２および１９１０の孔径は、無傷の核がフィルタ１９１２を通過せずに、差によって端１９３４に向かって誘導されるのに対して、試料の他のより小さい成分（例えば、細菌、ウィルスまたは廃棄物）が、交流緩衝液の流れによってフィルタ１９１２を介して分離チャンバ１９１４ｂに誘導される孔径である。例えば、フィルタ１９１２の平均孔径は、約１μｍから１５μｍであってよい。一実施形態において、平均孔径は約８μｍである。
【００８０】
フィルタ１９１６の孔径は、細菌がフィルタ１９１６を通過せずに、差によって端１９３４ｂに向かって誘導されるのに対して、試料の他のより小さい成分（例えばウィルス）が、交流緩衝液の流れによってフィルタ１９１６を介して分離チャンバ１９１４ｃに誘導される孔径であってよい。例えば、フィルタ１９１６の平均孔径は、約０．２μｍから２μｍであってよい。一実施形態において、平均孔径は約０．４μｍである。フィルタ１９１８の孔径は、ウィルスがフィルタ１９１８を通過せずに、差によって端１９３４ｃに向かって誘導されるのに対して、試料の他のより小さい成分が、フィルタ１９１８を介して誘導され、交流緩衝液の交流を介して出口ポート１９０６に向かって誘導される孔径であってよい。例えば、フィルタ１９１８の平均孔径は、約１０ｎｍから４００μｍであってよい。一実施形態において、平均孔径は約１００ｎｍである。チャンバ１９１４ｂ内の流体が端１９３４ｂに向かって流れるように、ポート１９６１を使用して、ポート１９６１と端１９３４ｂの間に圧力差を生成することができる。同様に、チャンバ１９１４ｃ内の流体が端１９３４ｃに向かって流れるように、ポート１９６２を使用して、ポート１９６２と端１９３４ｃの間に圧力差を生成することができる。
【００８１】
以上のように、一実施形態によれば、図１９に示される交流フィルタ１７１０を使用して、個別の目標回収ポートに回収された試料から無傷の核、細菌およびウィルスを分離することができる。
【００８２】
次に図２０を参照すると、フィルタ１７１０の層状実施形態が示されている。図２０に示されるように、フィルタ１７１０は３つの層、すなわち上層２００２、中層２００４および下層２００６を含むことができる。フィルタ２００８を上層２００２に形成することができ、１つまたは複数の分離チャネル２０１０を中層２００４に形成することができ、フィルタ２０１２を下層２００６に形成することができる。フィルタ１７１０のこの実施形態の断面図を示す図２１に示されるように、分離チャネル２０１０の少なくとも一部分が層２００４の上面から層２００４の底面に伸びる。図２１に示されるように、層２００２は、フィルタ２００８がチャネル２０１０の上部に存在することによってチャネル２０１０の上部多孔質壁を形成するように層２００４の上部に配置される。同様に、図２１に示されるように、層２００６は、フィルタ２０１２がチャネル２０１０の下に存在することによって、チャネル２０１０の下部多孔質壁を形成するように層２００４の下に配置される。
【００８３】
実施に際して、溶解緩衝液／試料混合物が、チャネル２０１０を（すなわち、入力端２００６から出力端２０１４まで）流れている間に、交流流体は、交流緩衝液入力ポート（不図示）を介して、フィルタ２００８および２０１２を有するチャネル２０１０の部分に導入される。交流流体は、交流緩衝液出力ポート（不図示）を介してチャネル２０１０のこの部分から出る。先の実施形態のように、チャネル２０１０に入る交流流体を、最初にフィルタ２００８に流し、次いで分離チャンバに流し、次いでフィルタ２０１２に流し、最後に出口ポートを介してチャネルから流出させる差（例えば、圧力差または電圧差、例えば電気泳動電圧ポテンシャル、または重力場）が交流緩衝液入力ポートと出力ポートの間に存在する。チャネル２０１０に入る流体を端２００６から端２０１４まで流す力（例えば、圧力、電気、重力）も存在する。先の実施形態のように、交流緩衝液が分離チャンバを流れると、交流緩衝液は、フィルタ２００８および２０１２とともに、例えば細胞溶解領域１７０６からチャネル２０１０に流れる混合物の他の成分からの無傷の核の分離を容易にする。
【００８４】
再び上記の図１７を参照すると、システム１０２は、さらに図２２に示されるように濃縮器１７１２を含むことができる。図２２に示されるように、１つの例示的な実施形態による濃縮器１７１２は、全体的に三角形の形状のチャネル２２０８（すなわち、入力端から出力端にかけてチャネルの幅が大きくなるチャネル）を含む。チャネル２２０８の入力端において、流体（例えば、血液試料および溶解緩衝液からの何らかの廃棄物成分を含む、交流濾過領域１７０８で回収された精製試料）がチャネル２２０８に入るための手段を提供する導入口２２０２が存在する。チャネル２２０８の反対側の端（すなわち出力端）において、さらなる廃棄物がチャネル２２０８から出るための手段をそれぞれ提供する２つの廃棄物排出口（２２０４ａおよび２２０４ｂ）、ならびに所望の濃縮流体がチャネル２２０８から出るための手段を提供する試料排出口２２０６が存在する。図２２にさらに示されるように、２つのフィルタ（２２１０ａおよび２２１０ｂ）がチャネル２２０８に配置され、ともにチャネル２２０８に分離チャンバ２２１２を形成する。分離チャンバ２２１２は、導入口２２０２の下流に位置する流体入口点２２１４、およびチャネル２２０８の出力端に隣接し、排出口２２０６と流体連通するが、廃棄物排出口２２０４のいずれとも流体連通しない流体出口点２２１６を含む。
【００８５】
再び図１７を参照すると、無傷の核が濾過領域１７０８から出た後に、無傷の核、ならびに濾過領域１７０８によって除去されなかった任意の廃棄物が濃縮器１７１２のチャネル２２０８に流れることがわかる。再び図２２を参照すると、無傷の核および任意の廃棄物がチャネル２２０８に入ると、混合物は、例えば、チャネル２２０８の入力端と出力端の間の圧力差（または他の力）によって分離チャンバ２２１２に流れることになる。混合物がチャンバ２２１２に存在するときは、混合物の一部がフィルタ２２１０ａを介して廃棄物排出口２２０４ａに向かって流れ、一部がフィルタ２２１０ｂを通して廃棄物排出口２２０４ｂに向かって流れ、残りがチャンバ２２１２の全長に沿ってチャネル２２２３に流れ、究極的には排出口２２０６に達する。例えば、チャンバ２２１２内の圧力は、排出口２２０４ａ、２２０４ｂおよび２２０６における圧力より高くなることによって、混合物の一部を排出口に流すことができる。有利には、フィルタ２２１０は、混合物における無傷の核が、フィルタを通過し、またはフィルタに入ることができないが、廃棄物がフィルタを流れることができるように構成されている。よって、チャンバ２２１２を出る混合物は、チャンバ２２１２に入った混合物より高濃度の無傷の核を有することになる。
【００８６】
図１７に示されるように、濃縮器１７１２の排出口２２０６は、インターフェース領域１７１４のインターフェースチャネルの導入口と流体連通する。よって、上記のいくつかの実施形態において、濃縮量の無傷の核を含む混合物は、さらなる試験および分析のためにインターフェース領域１７１４のインターフェースチャネルに流れることができる。
【００８７】
さらに、一実施形態によるインターフェース領域１７１４が図２３に示されている。図２３に示されるように、インターフェース領域１７１４は、例えば８つの微小流体チャネルなどのいくつかの微小流体チャネル２３０４を含むことができる。いくつかの実施形態において、濃縮器１７１２から出る無傷の核は、当技術分野で知られるようにチャネル２３０４に流される。やはり当技術分野で知られるように、無傷の核の流れとして、無傷の核からのＤＮＡを、核を溶解することによって遊離させることができる。例えばＰＣＲ技術を使用して、無傷の核から遊離したＤＮＡを、それらがチャネル２３０４を移動しているときに増幅することができる。実施形態において、温度制御システム２３０６は、チャネル２３０４を流れるＤＮＡの温度を制御してＰＣＲ反応を生じさせる。したがって、チャネル２３０４の一部分を増幅領域と見なすことができる。チャネル２３０４からの蛍光発光を記録することによって、ＤＮＡの増幅を検出するようにチャネル２３０４に対して相対的にカメラ２３０４を配置することができる。ＤＮＡを増幅し、ＤＮＡの増幅を検出するためのシステムおよび方法は、上記特許に記載されている。
【００８８】
いくつかの実施形態において、濃縮器を使用せず、交流濾過領域１７０８からの精製された無傷の傷をインターフェース領域１７１４に直接流す。
【００８９】
次に図２４を参照すると、図１７に示されるシステムを使用するための本発明の一実施形態によるプロセス２４００を示すフローチャートが示されている。プロセス２４００は、ウェル１７０２からの流体（例えば血液試料）とウェル１７０４からの溶解緩衝液とを混合する工程２４０２から開始してよい。すなわち、血液試料および溶解緩衝液を、それぞれウェル１７０２および１７０４から流出させ、試料と溶解緩衝液が混合するチャネル１７０６に流す。いくつかの実施形態において、圧力差または電気泳動電圧を生成することによって、流体をウェル１７０２および１７０４から流出させることができる。
【００９０】
工程２４０４において、混合物がチャネル１７０６に沿って流れている間に、溶解緩衝液は、細胞溶解領域１７０６において、細胞の核膜を溶解することなく試料中の細胞の細胞膜を選択的に溶解して、細胞から無傷の核を生成する。
【００９１】
工程２４０６において、無傷の核は、無傷の核がフィルタを通過することができず、患者試料の他の成分がフィルタを通過し、交流濾過領域を流れるように制御されている交流緩衝液によって運び出されるような孔径を有する１つまたは複数の交流フィルタ１７１０を含む交流濾過領域１７０８において試料から分離される。いくつかの実施形態において、交流緩衝液は、圧力差または電気泳動電圧によって交流濾過領域を誘導される。任意選択である工程２４０８において、無傷の核が濃縮器１７１２によって濃縮される。工程２４１０において、濃縮した核は、下流分析のためにインターフェースチャネル１７１４を流される。
【００９２】
いくつかの実施形態において、交流領域は、試料からの無傷の核だけでなく、細菌およびウィルスをも濾別するための複数のフィルタを有することができる。例えば、交流濾過領域は、図１９に関連して以上に記載されているように、３つのフィルタ、すなわち試料から核を分離するためのフィルタ、試料から細菌を分離するためのフィルタ、および試料からウィルスを分離するためのフィルタを有することができる。他の実施形態において、交流フィルタ１７１０は、出力端１８３４からの精製試料が、さらなる精製のために、入力端１８３２に再循環されて分離チャンバをさらに通過するように構成されている。一実施形態において、この再循環は、チャネル接続出力端１８３４に入力端１８３２を設けて、その間の流体の流れを可能にし、例えば圧力差によって流体を出力端から入力端に制御可能に誘導することによって遂行される。
【００９３】
次に図２５を参照すると、本発明の一実施形態による、患者試料中の核酸の有無を判定するプロセス２５００を示すフローチャートが示されている。プロセス２５００は、細胞を含む患者試料と溶解緩衝液を微小流体デバイスの混合領域（例えば領域１７０６）において混合し、溶解緩衝液が核膜を溶解することなく細胞膜を選択的に溶解する工程２５０２から開始することができる。次に、工程２５０４において、溶解緩衝液は、細胞の核膜を溶解することなく、患者試料中の細胞の細胞膜を混合領域１７０６（「細胞溶解領域」としても知られる）において選択的に溶解して、細胞から無傷の核を生成する。工程２５０６において、無傷の核は、上記のように交流濾過領域１７０８において患者試料から分離される。工程２５０８において、核を溶解して核酸を遊離させる。工程２５１０において、核酸が増幅される（例えば、ＰＣＲを使用して増幅される）。工程２５１２において、増幅産物の有無が判定され、増幅産物の存在は、患者試料中の核酸の存在を示す。いくつかの実施形態において、患者試料は、細胞膜の選択的溶解の前に最初に白血球が富化される。いくつかの実施形態において、工程２５０２〜２５０８は、１つの微小流体デバイスで実施され、工程２５１０〜２５１２は、異なる微小流体デバイスで実施される。他の実施形態において、工程２５０２〜２５０６は、１つの微小流体デバイスで実施され、工程２５０８〜２５１２は、異なる微小流体デバイスで実施される。
【００９４】
次に図２６を参照すると、別の実施形態によるサブシステム１０２が示されている。図２６に示されるように、試料調製サブシステム１０２は、１つまたは複数の患者試料を保持するように構成されている１つまたは複数のチャンバ２６０１を有する試料カード２６００を含む。１つまたは複数のチャンバ２６０１の各々は、導入口２６０２、フィルタ２６０３および排出口２６０４を含む。試料カード２６００は、試料カード２６００に１つまたは複数の患者試料を充填し、次いでそれを試料調製サブシステム１０２に挿入することを可能にする試料調製サブシステム１０２に除去可能に挿入可能である。各導入口２６０２は、互いに流体連通されていても、いなくてもよい１つまたは複数のチャネルをさらに含む。図２７は、さらに、１つまたは複数のチャンバ２６０１を含む試料カード２６００の一実施形態を示す。図２７に示されるように、各チャンバ２６０１は、導入口２６０２、フィルタ２６０３および排出口２６０４を含む。フィルタ孔径は、１から１５μｍであってよく、好ましくは約５μｍである。
【００９５】
図２６に示されるように、試料調製サブシステム１０２は、導入口２６０２を介する溶解緩衝液貯蔵デバイス２６０６から試料カード２６００の各チャンバ２６０１への溶解緩衝液の流れを制御する流れ制御システム２６０５を含む。溶解緩衝液貯蔵デバイス２６０６に含まれる溶解緩衝液は、細胞膜を選択的に溶解して核と細胞片を遊離させる。次いで、流れ制御システム２６０５は、細胞片および溶解緩衝液をフィルタ２６０３に流し、排出口２６０４に流し、除去可能に挿入可能な廃棄物容器２６０７に流し、核をフィルタ２６０３にとラップさせておく。廃棄物容器２６０７は、細胞片および溶解緩衝液をチャンバ２６０１から受け取るために排出口２６０４の下に配置可能である。溶解緩衝液は、患者試料からの核を溶解しない。流れ制御システム２６０５は、導入口２６０２を介する溶出緩衝液貯蔵デバイス２６０８から試料カード２６００の各チャンバ２６０１への溶出緩衝液の流れをも制御する。
【００９６】
図２６に示されるように、試料調製サブシステム１０２は、試料カード２６００の温度を制御する温度制御システム２６０９を含む。温度制御システム２６０９は、試料カード２６００を加熱して、フィルタ２６０３にトラップされた核を溶解させることによって、核のＤＮＡを遊離させる。この実施形態において、温度制御システムは、センサ２６１０および熱源２６１１を使用して、試料カードを制御可能かつ効果的に加熱し無傷の核を溶解する。
【００９７】
図２６は、さらに、試料調製サブシステム１０２に除去可能に挿入可能なインターフェース・チップ２６１２を示す。インターフェース・チップ２６１２は、試料カード２６００の下に配置可能であり、フィルタ２６０３にトラップされた溶解核から遊離したＤＮＡを受け取るように構成されている。図２６に示されるように、インターフェース・チップ２６１２は、１つまたは複数のＤＮＡ試料排出口２６１４と流体連通する１つまたは複数のＤＮＡ試料ウェル２６１３を含む。ＤＮＡ試料ウェル２６１３は、サブシステム１０２に挿入されると、試料カード２６００からの排出口２６０４とそれぞれ整列して、ＤＮＡが排出口２６０４を介して試料カード２６００から出るときに、各ＤＮＡ試料ウェル２６１３が溶解核によって遊離したＤＮＡを回収することを可能にする。
【００９８】
この実施形態において、主コントローラ１０１は、温度制御システム２６０９および流れ制御システム２６０５と連通する。当業者が認識するように、主コントローラ１０１には、例えば汎用コンピュータまたは特殊用途コンピュータなどの多くの選択肢が存在する。当技術分野で既知の他の特殊化制御装置も主コントローラ１０１の目的に対応することが可能である。
【００９９】
図２８を参照すると、複数のチャンバ２６０１が流体チャネル２８００によって接続された試料カード２６００が示されている。この実施形態において、流体チャネル２８００を使用してチャンバ２６０１を接続すると、異なる数の試料を異なる容量で試験することが可能になる。例えば、すべてのチャンバ２６０１が流体チャネル２８００を介して流体連通されている、図示された実施形態において、流体連通されているすべてのチャンバ２６０１が同じ試料を含むため、試料カード２６００は、１つの患者試料をより大きな容量で試験することを可能にする。あるいは、図２７に示されるように、チャンバ２６０１のいずれもが流体連通されていなければ、試料カード２６００は、各試料が同じまたは異なる患者からの試料であり得る複数の患者試料を同時に試験することを可能にする。チャンバ２６０１のいずれもが流体連通されていないときは、試験される患者試料の数が、試料カード２６００上のチャンバ２６０１の数によって制限される。
【０１００】
図２８は、すべてのチャンバ２６０１が接続されていることを示しているが、他の配置も考えられる。試料カード２６００上で互いに接続されたチャンバ２６０１の数は、所望の数の患者試料および所望の容量の各患者試料の試験に対応する多くの異なる組合せであり得る。例えば、試料カードＡ２００は、流体チャネル２８００を介してチャンバ２６０１を２つずつ接続するように構成され、異なる患者試料の数を半分に減少させながら、試験される各患者試料の容量を２倍にする。試料カード２６００を、各用途の試験要件に応じた様々な材料から構成することができ、試料カード２６００は、各試験用途の要件を反映するために再利用可能であるか、またはディスポーザブルであり得る。
【０１０１】
図２９は、さらに、一実施形態による流れ制御システム２６０５を示す。図２９に示されるように、流れ制御システム２６０５は、主コントローラ１０１によって制御され、ポンプ２９００、圧力制御システム２９０１、溶液送出チップ２９０２および圧力制御チップ２９０３を含む。圧力制御システム２９０１は、空気源、ならびに流れ制御システム２６０５が、溶液を移動させるための圧力を使用した溶出緩衝液および溶解緩衝液の試料カード２６００への送出を制御することを可能にする圧力センサを含む。溶液送出チップ２９０２は、溶解緩衝液および溶出緩衝液を試料カード２６００の各チャンバ２６０１に送出するための複数のチャネルを含む。圧力制御チップ２９０３は、試料カード２６００の各チャンバ２６０１に圧力を与えるための複数のチャネルを含む。この実施形態は、流れ制御システム２６０５における溶液送出チップ２９０２、ポンプ２９００および圧力制御システム２９０１の使用を示すが、異なる構成要素を異なる組合せで使用することができる。例えば、圧力制御システム２９０１を使用せずに、ポンプ２９００および溶液送出チップ２９０２を使用することができる。別の実施形態において、圧力制御システム２９０１は、試料カード２６００の各チャンバ２６０１における空気圧を制御するための複数のチャネルを含むことができる。
【０１０２】
図３０を参照すると、一実施形態による溶液送出チップ２９０２が示されている。図３０に示されるように、溶液送出チップは、試料カードのチャンバ２６０１と流体連通する複数のチャネル３０００を含む。チャネル３０００は、ポンプ２９００から緩衝液を受け取る１つまたは複数の溶液導入口３００１を含む。チャネル３０００は、溶解緩衝液および溶出緩衝液を、溶液送出チップ２９０２の溶液排出口３００２を介して試料カード２６００のチャンバ２６０１に送出することを可能にする試料カード２６００の導入口２６０２と流体連通する１つまたは複数の溶液導入口３００２をさらに含む。
【０１０３】
図３１を参照すると、一実施形態による圧力制御チップ２９０３が示されている。図３１に示されるように、圧力制御チップ２９０３は、複数の圧力チャネル３１００を含み、各圧力チャネル３１００は、圧力導入口３１０１および圧力排出口３１０２と流体連通する。この実施形態において、各圧力チャネルは、同じ圧力導入口３１０１と流体連通するが、２つ以上の圧力導入口３１０１が存在し得る他の実施形態も考えられる。圧力導入口３１０１は、圧力を圧力制御チップ２９０３に加えるために、圧力制御システム２９０１と流体連通する。圧力排出口３１０２は、試料カード２６００の導入口２６０２と流体連通して、圧力制御チップ２９３が試料カード２６００のチャンバ２６０１に圧力を加えることを可能にする。
【０１０４】
図３２は、患者試料中のＤＮＡを単離するための方法３２００を示すフローチャートである。方法３２００は、図２６に示されるシステムに限定されないが、この方法の１つの好適な実施形態は、図２６に示されるシステムと類似のシステムを利用することができ、図２６は、この方法を説明するのに役立つ参照目的で使用される。図３２に示されるように、工程３２０２において、（ｉ）各チャンバ２６０１が導入口２６０２、フィルタ２６０３および排出口２６０４を含む複数のチャンバ２６０１を有し、試料調製サブシステム１０２に除去可能に挿入可能である試料カード２６００と、（ｉｉ）試料カード２６００の各チャンバ２６０１への溶解緩衝液および溶出緩衝液の流れを制御するための流れ制御システム２６０５と、（ｉｉｉ）試料カード２６００におけるフィルタ２６０３を加熱するための温度制御システム２６０９と、（ｉｖ）試料カード２６００の下に配置可能である除去可能に挿入可能な廃棄物容器２６０７と、（Ｖ）複数のＤＮＡ試料ウェル２６１３およびＤＮＡ試料排出口２６１４を含み、試料カード２６００の下に配置可能であるインターフェース・チップ２６１２とを含む試料調製システム１０２が示されている。
【０１０５】
工程３２０４において、患者試料を試料カード２６００のチャンバ２６０１に充填する。工程３２０６において、患者試料を含む試料カード２６００を試料調製システム１０２に挿入する。工程３２０８において、流れ制御システム２６０５は溶解緩衝液を、溶解緩衝液貯蔵デバイス２６０６から導入口２６０２を介して試料カード２６００のチャンバ２６０１に送出する。溶解緩衝液は、核の核膜を溶解することなく患者試料の細胞膜を選択的に溶解する。反応により、試料カード２６００のチャンバ２６０１に、溶解緩衝液、無傷の核および細胞片を含む溶液を生成する。工程３２１０において、除去可能に挿入可能な廃棄物容器２６０７は、試料カード２６００の下に配置され、流れ制御システム２６０５は、チャンバ２６０１のフィルタ２６０３を通して溶液を誘導するように動作する。フィルタ２６０３は、溶液からの無傷の核をトラップし、溶液緩衝液および細胞片は、流れ制御システム２６０５によって排出口２６０４を介してチャンバ２６０１から導出される。溶解緩衝液および細胞片は、廃棄物容器２６０７における排出口２６０４を介してチャンバ２６０１から出るときに回収される。
【０１０６】
工程３２１２において、温度制御システム２６０９は、フィルタ２６０３を加熱することで、フィルタ２６０３にトラップされた無傷の核を加熱するように動作する。無傷の核を加熱すると、核が溶解してＤＮＡを核から遊離させる。工程３２１４において、流れ制御システム２６０５は溶出緩衝液を、溶出緩衝液貯蔵デバイス２６０８から導入口２６０２を介して試料カード２６００のチャンバ２６０１に送出するように動作する。工程３２１６において、インターフェース・カード２６１２は、試料カード２６００の下に配置され、流れ制御システム２６０５は溶出緩衝液およびＤＮＡを、チャンバ２６０１の排出口２６０４を通して誘導し、溶解核をフィルタ２６０３上に残すように動作する。溶出緩衝液およびＤＮＡは、排出口２６０４を介してチャンバ２６０１から出た後に、インターフェース・チップ２６１２のＤＮＡ試料ウェル２６１３に堆積される。したがって、この方法は、ＤＮＡを患者試料から単離することを可能にする。
【０１０７】
上記ＤＮＡ単離に続く任意選択の工程は、流れ制御デバイス２６０５を使用して、溶解緩衝液を溶解緩衝液収容デバイス２６０６から試料カード２６００のチャンバ２６０１に送出し、次いでフィルタ２６０３を洗浄するために流れ制御システム２６０５の動作によって排出口２６０４を介して溶液をチャンバ２６０１から導出することであり得る。この任意選択の工程を複数回繰り返して、フィルタ２６０３の所望のレベルの洗浄を確保することができる。
【０１０８】
以上に本発明の様々な実施形態を説明したが、それらは、例示のみを目的として示されており、限定するものでないことが理解されるべきである。したがって、本発明の幅および範囲は、上記例示的な実施形態のいずれによっても限定されるべきでない。上記実施形態の改変形態は、先述の説明を読めば、当業者に明らかになり得る。本発明者らは、当業者が改変形態を適宜採用することを想定しており、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載されているのと異なる形態で実施されることを意図する。よって、本発明は、適用可能な法律によって承認される本明細書に添付された特許請求の範囲に記載の主題のすべての変更形態および均等物を含む。さらに、本明細書に他に指定されておらず、文脈と明らかに矛盾しなければ、そのすべての可能な改変形態における上記要素の任意の組合せが本発明に包含される。
【０１０９】
また、以上に記載され、図面に例示される方法は、一連の工程として示されているが、これは例示のみのために示されたものである。よって、いくつかの工程を追加することができ、いくつかの工程を省略することができ、工程の順序を入れ替えることができ、いくつかの工程を並行して実施できることが考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図１５Ｂ】
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