(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）、（２）及び（３）からなる群より選ばれる少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドを含むＡＢＣＧ２遺伝子の多型検出用プローブ。
（１）配列番号７で示される塩基配列からなり５’末端の塩基が蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（２）配列番号１４で示される塩基配列からなり５’末端の塩基が蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（３）配列番号２１で示される塩基配列からなり３’末端の塩基が蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少または増加する、請求項１に記載の多型検出用プローブ。
【請求項３】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少する、請求項１に記載の多型検出用プローブ。
【請求項４】
融解曲線分析用のプローブである、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項５】
請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の多型検出用プローブを用いるＡＢＣＧ２遺伝子の多型検出方法。
【請求項６】
請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の前記（１）、（２）及び（３）からなる群れより選ばれる少なくとも２種の多型検出用プローブを用いるＡＢＣＧ２遺伝子の多型検出方法。
【請求項７】
（Ｉ）請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ及び試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチド及び前記一本鎖核酸をハイブリダイズさせてハイブリッドを得ることと、
（ＩＩ）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定することと、
（ＩＩＩ）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を測定することと、
（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ＡＢＣＧ２遺伝子における多型の存在を検出することと、
を含む、請求項５又は請求項６に記載の多型検出方法。
【請求項８】
さらに、前記（Ｉ）のハイブリッドを得る前または前記（Ｉ）ハイブリッドを得ることと同時に核酸を増幅することを含む、請求項７に記載の多型検出方法。
【請求項９】
請求項５〜請求項８のいずれか１項に記載の多型検出方法により、ＡＢＣＧ２遺伝子における多型を検出することと、
検出された多型の有無に基づいて、薬剤に対する耐性または薬剤の薬効を判定することと、
を含む、薬剤の薬効判定方法。
【請求項１０】
請求項５〜請求項８のいずれか１項に記載の多型検出方法により、ＡＢＣＧ２遺伝子の多型を検出することと、
検出された多型の有無に基づいて、疾患の罹患リスクを予測することと、
を含む、疾患予測方法。
【請求項１１】
請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の多型検出用プローブを含む、多型検出用試薬キット。
【請求項１２】
配列番号１に示す塩基配列において、前記（１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域を増幅可能なプライマーセット、
配列番号２に示す塩基配列において、前記（２）の蛍光標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域を増幅可能なプライマーセット、又は
配列番号３に示す塩基配列において、前記（３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域を増幅可能なプライマーセット
のいずれかのプライマーセットの少なくとも一つをさらに含む、請求項１１に記載の多型検出用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多型検出用プローブ、多型検出方法、薬効評価方法、疾患予測方法及び多型検出用試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、高尿酸血症の治療標的分子としては、尿酸の再吸収トランスポーターであるＵｒａｔｅトランスポーター（ＵＲＡＴ１／ＳＬＣ２２Ａ１２）や、グルコーストランスポーター９（ＧＬＩＴ９／ＳＬＣ２２Ａ１２）が知られていた。
近年、ＢＣＲＰ(ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ)とも呼ばれているＡＢＣＧ２（ＡＴＰ-ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｓｕｂ-ｆａｍｉｌｙ Ｇ ｍｅｍｂｅｒ ２）遺伝子が、高容量性の排尿トランスポーターをコードしていることが明らかになった。
【０００３】
また、ＡＢＣＧ２遺伝子の多型の存在が、痛風の発症リスクの増加に関連することが示唆され、ＡＢＣＧ２遺伝子は痛風の主要な病因遺伝子であることが明らかになった（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
さらに、ＡＢＣＧ２遺伝子の多型の存在が、胎盤におけるタンパク発現異常と関連があることも示唆されており（例えば、非特許文献２参照）、ＡＢＣＧ２遺伝子の多型を短時間に低コストで簡便に測定する方法が待ち望まれている。
【０００５】
遺伝子の多型を測定する方法としては、測定したい塩基を含む部分を増幅するよう設計されたプライマーを用いてＰＣＲを行い、当該特定塩基における変異の有無で切断の有無が分かれるような制限酵素で切断し、その後電気泳動で切断されたかどうかを検出するという方法（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法）が知られている（例えば、非特許文献３参照）。
【０００６】
また、変異を含む領域をＰＣＲ法で増幅した後、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいて塩基配列の変異を解析する方法も知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００７】
しかしながら、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法では、ＰＣＲ反応後に増幅産物を取り出して制限酵素処理を行う必要がある。そのため、増幅産物が次の反応系に混入する恐れがあり、これに起因して偽陽性、偽陰性の結果が得られてしまう場合がある。また、ＰＣＲ終了後、制限酵素で処理を行い、その後電気泳動を行うため、検出までに必要な時間も非常に長くなってしまう場合がある。さらに、操作が複雑なため、自動化が困難である。
そのため、ＡＢＣＧ２遺伝子多型検出のためのさらなる技術開発が待ち望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００２−１１９２９１号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】実験医学  ２０１０年、第２８巻、第８号、ｐ．１２８５−１２８９
【非特許文献２】Ｄｒｕｇ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．,２００５年、第３３巻、第１号、ｐ．９４−１０１
【非特許文献３】Ｇｅｎｅｔ．Ｍｏｌ．Ｒｅｓ．、２０１０年、第９巻、第１号、ｐ．３４−４０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ＡＢＣＧ２遺伝子の多型を、高い感度で、簡便に検出することを可能にする多型検出用プローブ、これを用いる多型検出方法を提供することを課題とする。また、本発明は、当該検出方法を用いた薬効評価方法や疾患予測方法を提供することを課題とする。さらに本発明は、当該検出用プローブを用いた多型検出用試薬キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題を解決するための具体的手段は以下の通りである。
＜１＞  下記（１）、（２）及び（３）からなる群より選ばれる少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドを含むＡＢＣＧ２遺伝子の多型検出用プローブ。
（１）配列番号７で示される塩基配列からなり５’末端の塩基が蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（２）配列番号１４で示される塩基配列からなり５’末端の塩基が蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（３）配列番号２１で示される塩基配列からなり３’末端の塩基が蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。
＜２＞  前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少又は増加する、＜１＞記載の多型検出用プローブ。
＜３＞  前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少する、＜１＞記載の多型検出用プローブ。
＜４＞  融解曲線分析用のプローブである、＜１＞〜＜３＞のいずれか記載の多型検出用プローブ。
＜５＞  ＜１＞〜＜４＞のいずれか記載の多型検出用プローブを用いるＡＢＣＧ２遺伝子の多型検出方法。
＜６＞  ＜１＞〜＜４＞のいずれか記載の前記（１）、（２）及び（３）からなる群より選ばれる少なくとも２種の多型検出用プローブを用いる＜５＞記載の多型検出方法。
＜７＞  （Ｉ）＜１＞〜＜４＞のいずれか記載の多型検出用プローブ及び試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチド及び前記一本鎖核酸をハイブリダイズさせてハイブリッドを得ることと、（ＩＩ）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定することと、前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を測定することと、（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ＡＢＣＧ２遺伝子における多型の存在を検出することと、を含む、＜５＞又は＜６＞記載の多型検出方法。
＜８＞  さらに、前記（Ｉ）のハイブリッドを得る前または前記（Ｉ）ハイブリッドを得ることと同時に核酸を増幅することを含む、＜７＞記載の多型検出方法。
＜９＞  ＜５＞〜＜８＞のいずれか記載の多型検出方法により、ＡＢＣＧ２遺伝子における多型を検出することと、検出された多型の有無に基づいて、薬剤に対する耐性または薬剤の薬効を判定することと、を含む、薬剤の薬効判定方法。
＜１０＞  ＜５＞〜＜８＞のいずれか記載の多型検出方法により、ＡＢＣＧ２遺伝子の多型を検出することと、検出された多型の有無に基づいて、疾患の罹患リスクを予測することと、を含む、疾患予測方法。
＜１１＞  ＜１＞〜＜４＞のいずれか記載の多型検出用プローブを含む、多型検出用試薬キット。
＜１２＞  配列番号１に示す塩基配列において、前記（１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域を増幅可能なプライマーセット、配列番号２に示す塩基配列において、前記（２）の蛍光標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域を増幅可能なプライマーセット、又は配列番号３に示す塩基配列において、前記（３）の蛍光標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域を増幅可能なプライマーセットのいずれかのプライマーセットの少なくとも一つをさらに含む、＜１１＞記載の多型検出用試薬キット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ＡＢＣＧ２遺伝子の多型を、高い感度で、簡便に検出することを可能にする多型検出用プローブ、これを用いる多型検出方法を提供することができる。また、本発明によれば、当該検出方法を用いた薬効評価方法や疾患予測方法を提供することができる。さらに本発明によれば、当該検出用プローブを用いた多型検出用試薬キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】（Ａ）核酸混合物の融解曲線、及び（Ｂ）微分融解曲線の一例を示す図である。
【図２】（Ａ）及び（Ｂ）は、本発明の実施例１−１にかかる多型検出用プローブを用いて得られた融解曲線である。
【図３】本発明の実施例１−２にかかる多型検出用プローブを用いて得られた融解曲線である。
【図４】（Ａ）〜（Ｈ）は、本発明の実施例２にかかる多型検出用プローブを用いて得られた融解曲線である。
【図５】（Ａ）〜（Ｃ）は、本発明の実施例３にかかる多型検出用プローブを用いて得られた融解曲線である。
【図６】（Ａ）〜（Ｃ）は、本発明の実施例４にかかる多型検出用プローブを用いて得られた融解曲線である。
【図７】（Ａ）〜（Ｃ）は、本発明の実施例４にかかる多型検出用プローブを用いて得られた融解曲線である。
【図８】（Ａ）及び（Ｂ）は、本発明の比較例１にかかる多型検出用プローブを用いて得られた融解曲線である。
【図９】本発明の比較例１にかかる多型検出用プローブを用いて得られた融解曲線である。
【図１０】（Ａ）〜（Ｈ）は、本発明の比較例２にかかる多型検出用プローブを用いて得られた融解曲線である。
【図１１】（Ａ）〜（Ｃ）は、本発明の比較例３にかかる多型検出用プローブを用いて得られた融解曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のプローブは、Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ２、Ｐ２’、Ｐ３及びＰ３’からなる群より選ばれる少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドを含むＡＢＣＧ２遺伝子の多型検出用プローブである。
【００１５】
本発明によれば、ＡＢＣＧ２遺伝子の多型を高い感度で簡便に検出することができる。
【００１６】
ＡＢＣＧ２遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎｅＩＤ:９４２９、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．０００００４（バージョン：０００００４．１１）に該当する配列のうち８９０１１４１５番目の塩基〜８９０８００１０番目の塩基の配列に相当する。本明細書では、当該８９０１１４１５番目の塩基〜８９０８００１０番目の塩基の配列を「ＡＢＣＧ２遺伝子の塩基配列」とする。
【００１７】
本明細書において、検出対象である試料中の一本鎖核酸、多型検出用プローブ又はプライマーは個々の配列に関して、これら互いの相補的な関係に基づいて記述された事項は、特に断らない限り、それぞれの配列と、各配列に対して相補的な配列とについても適用される。各配列に対して相補的な当該配列について本発明の事項を適用する際には、当該相補的な配列が認識する配列は、当業者にとっての技術常識の範囲内で、対応する本明細書に記載された配列に相補的な配列に、明細書全体を読み替えるものとする。
【００１８】
本明細書において、「Ｔｍ値」とは、二本鎖核酸が解離する温度（解離温度：Ｔｍ）であって、一般に、２６０ｎｍにおける吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。即ち、二本鎖核酸、例えば、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。Ｔｍ値は、この現象に基づき設定される。
本発明において、オリゴヌクレオチドの配列に関して「３’末端から数えて１〜３番目」という場合は、オリゴヌクレオチド鎖の３’末端を１番目として数える。同様に「５’末端から数えて１〜３番目」という場合は、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端を１番目として数える。
【００１９】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本明細書において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明について説明する。
【００２０】
＜多型検出用プローブ＞
本発明の多型検出用プローブ（以下、単に「プローブ」ともいう）は、下記、Ｐ１’、Ｐ２、Ｐ２’、Ｐ３及びＰ３’からなる群から選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチド（以下、単に「蛍光標識オリゴヌクレオチド」ともいう）を含む。
【００２１】
（Ｐ１）配列番号１に示す塩基配列において、３０１番目〜３１１番目の塩基を含む塩基長１１〜５０の塩基配列に相補的な配列であり、３１１番目の塩基に対応する塩基がグアニンである以外は配列番号１に相補的な配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、３１１番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ１’）配列番号１に示す塩基配列において、３０１番目〜３１１番目の塩基を含む塩基長１１〜５０の塩基配列に相補的な配列であり、３１１番目の塩基に対応する塩基がグアニンである以外は配列番号１と同一の塩基を有する配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、３１１番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ２）配列番号２に示す塩基配列において、２３４番目〜２５１番目の塩基を含む塩基長１８〜５０の塩基配列に相補的な配列であり、２５１番目の塩基に対応する塩基がグアニンである以外は配列番号２に相補的な配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、２５１番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ２’）配列番号２に示す塩基配列において、２３４番目〜２５１番目の塩基を含む塩基長１８〜５０の塩基配列に相補的な配列であり、２５１番目の塩基に対応する塩基がグアニンである以外は配列番号２と同一の塩基を有する配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、２５１番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ３）配列番号３に示す塩基配列において、１５２番目〜１６１番目の塩基を含む塩基長１０〜５０の塩基配列に相補的な配列であり、１５２番目の塩基に対応する塩基がグアニンである以外は配列番号３に相補的な配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１５２番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ３’）配列番号３に示す塩基配列において、１５２番目〜１６１番目の塩基を含む塩基長１０〜５０の塩基配列に相補的な配列であり、１５２番目の塩基に対応する塩基がグアニンである以外は配列番号３と同一の塩基を有する配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、１５２番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。
【００２２】
かかる特定の蛍光標識オリゴヌクレオチドの少なくとも１種を含むことで、ＡＢＣＧ２遺伝子の多型を高い感度で、簡便に検出することができる。
【００２３】
配列番号１に示す塩基配列は、ＡＢＣＧ２遺伝子の塩基配列の一部であって、ＡＢＣＧ２遺伝子の１番目〜６８５９５番目の塩基のうち、１８５９７番目〜１９１９６番目の６０１塩基に対応するものである。
ＡＢＣＧ遺伝子の野生型では、配列番号１に示す塩基配列の３０１番目に対応する塩基は、Ｇ（グアニン）であるが、変異型においてはＡ（アデニン）に変異している。
また、野生型のＡＢＣＧ２遺伝子では、ＡＢＣＧ２トランスポーターのアミノ酸配列のうち、１２番目のアミノ酸はバリン（Ｖａｌ）であるが、変異型のＡＢＣＧ２遺伝子では、メチオニン（Ｍｅｔ）である（以下、「Ｖ１２Ｍ変異」と称する。）。
【００２４】
また前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおいて、「３１１番目の塩基に対応する塩基」とは、配列番号１に示す塩基配列における３１１番目の塩基Ｇ（グアニン）に対する相補的な塩基Ｃ（シトシン）である。
前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおいては、この蛍光標識された相補的な塩基Ｃが５’末端から数えて１〜３番目のいずれかの位置に存在することができる。また、５’末端に存在することができる。これにより、例えば、多型検出感度がより向上する。また、Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドを生産性よく得ることができる。
【００２５】
前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列の３０１番目の塩基における多型を検出することができるプローブである。この塩基は、野生型であればＧ、変異型ではＡである。
【００２６】
前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長は１１〜５０であることを要する。塩基長が１０以下や、５１以上である場合には、ＡＢＣＧ２遺伝子多型の検出感度が低下する。また、前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長としては、多型検出感度の観点より、１１〜４０、１１〜２８、又は１４〜１８としうる。
また前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長を変化させることで、例えばＰ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドがその相補鎖（標的配列）と形成するハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を、所望の値に調整することができる。
【００２７】
本発明の前記Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、３１１番目の塩基がグアニンである以外は、配列番号１に示す塩基配列に相補的な配列に対して相同性を有する。
具体的には、本発明の前記Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列に対して、８０％以上の同一性を示す。
【００２８】
また、検出感度の観点より、８５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９５％以上の同一性、９６％以上の同一性、９７％以上の同一性、９８％以上の同一性又は９９％以上の同一性を示してもよい。
本発明の前記Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドと、配列番号１に相補的な配列であり、３１１番目の塩基に対応する塩基がグアニンである以外は配列番号１に相補的な配列とを比較した際の同一性が８０％未満である場合には、変異型のＡＢＣＧ２遺伝子を含む試料核酸に対する検出感度が低くなる。
【００２９】
本発明の前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、３１１番目の塩基がグアニンである以外は、配列番号１と同一の塩基を有する配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【００３０】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１）  に記載の方法等に従って行うことができる。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。典型的なストリンジェントな条件とは、例えば、カリウム濃度は約２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、及びマグネシウム濃度は約１．０ｍＭ〜約５．０ｍＭ中において、ハイブリダイゼーションを行う条件があげられる。本発明の条件の１例としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、２５ｍＭのＫＣｌ、及び１．５ｍＭのＭｇＣｌ２中においてハイブリダイゼーションを行う条件が、挙げられるが、これに限定されるものではない。その他、ストリンジェントな条件としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１）に記載されている。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。当業者は、ハイブリダイゼーション反応や、ハイブリダイゼーション反応液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。
【００３１】
以下に本発明におけるＰ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおける塩基配列の一例を表１に示すが、本発明はこれらに限定されない。
なお、表１では、配列番号１の３０１番目の塩基に対応する塩基を大文字で表記し、当該配列番号１の３０１番目の塩基に対応する塩基がＣ、Ｔ、Ａ又はＧの場合であるオリゴヌクレオチドと、それぞれの蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリッドのＴｍ値を合わせて示した。
ここでＴｍ値は、Ｍｅｌｔｃａｌｃ  ９９  ｆｒｅｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｃｏｍ／）を用い、設定条件：Ｏｌｉｇｏｃｏｎｃ［μＭ］０．２、Ｎａ ｅｑ．［ｍＭ］５０の条件で算出した。
【００３２】
【表１】
0005757908.tif 000002
【００３３】
本発明において、Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした場合のＴｍ値（表１におけるＴｍ（ｍｔ（Ａ）））と、配列番号１の３０１番目の塩基に対応する塩基のみが非相補的なＤＮＡとハイブリダイズした場合のＴｍ値（表１におけるＴｍ（ＷＴ（Ｇ）））との差は、例えば１．０℃以上、２．０℃以上、又は３．０℃以上等にすることができる。前記Ｔｍ値の差が４．０℃以上であることで、例えば、配列番号１における３０１番目の塩基の変異をより高感度に検出することができる。
【００３４】
配列番号２に示す塩基配列は、ＡＢＣＧ２遺伝子の塩基配列の一部であって、ＡＢＣＧ２遺伝子の１番目〜６８５９５番目の塩基のうち２６８２１番目〜２７３００番目の４８０塩基に対応するものである。
ＡＢＣＧ２遺伝子の野生型では、配列番号２に示す塩基配列の２３４番目に対応する塩基は、Ｃ（シトシン）であるが、変異型においてはＴ（チミン）に変異している。
また、野生型のＡＢＣＧ２遺伝子では、ＡＢＣＧ２トランスポーターのアミノ酸配列のうち、１２６番目のアミノ酸はグルタミン（Ｇｌｎ）であるが、変異型のＡＢＣＧ２遺伝子では、終止コドン（Ｘ）である（以下、「Ｑ１２６Ｘ変異」と称する。）。
【００３５】
また前記Ｐ２又はＰ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおいて、「２５１番目の塩基に対応する塩基」とは、配列番号２に示す塩基配列における２５１番目の塩基Ｇ（グアニン）に対する相補的な塩基Ｃ（シトシン）である。
前記Ｐ２又はＰ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおいては、この蛍光標識された相補的な塩基Ｃが５’末端から数えて１〜３番目のいずれかの位置に存在することができる。また、５’末端に存在することができる。これにより、例えば、多型検出感度がより向上する。また、Ｐ２又はＰ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドを生産性よく得ることができる。
【００３６】
前記Ｐ２又はＰ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号２に示す塩基配列の２３４番目の塩基における多型を検出することができるプローブである。この塩基は、野生型であればＣ、変異型ではＴである。
【００３７】
前記Ｐ２又はＰ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長は１８〜５０であることを要する。前記Ｐ２又はＰ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が、１７以下や、５１以上である場合には、多型検出感度が低下する。また、前記Ｐ２又はＰ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長は、多型検出感度の観点より、１８〜４０、２０〜３０、又は２２〜２６としうる
また前記Ｐ２又はＰ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長を変化させることで、例えばＰ２又はＰ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドがその標的配列と形成するハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を、所望の値に調整することができる。
【００３８】
本発明の前記Ｐ２の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、２５１番目の塩基がグアニンである以外は、配列番号２に示す塩基配列に相補的な配列に対して相同性を有する。
具体的には、本発明の前記Ｐ２の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号２に示す塩基配列に相補的な塩基配列に対して、８０％以上の同一性を示す。
【００３９】
また、検出感度の観点より、８５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９５％以上の同一性、９６％以上の同一性、９７％以上の同一性、９８％以上の同一性又は９９％以上の同一性を示してもよい。
本発明の前記Ｐ２の蛍光標識オリゴヌクレオチドと、配列番号２に相補的な配列であり、２５１番目の塩基に対応する塩基がグアニンである以外は配列番号２に相補的な配列とを比較した際の同一性が８０％未満である場合には、変異型のＡＢＣＧ２遺伝子を含む試料核酸に対する検出感度が低くなる。
【００４０】
本発明の前記Ｐ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、２５１番目の塩基に対応する塩基がグアニンである以外は配列番号２と同一の塩基を有する配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。なお、ハイブリダイゼーションを行う方法、及びストリンジェントな条件については、前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドと同様の方法、及び同様の条件で行えばよい。
【００４１】
以下に本発明におけるＰ２又はＰ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおける塩基配列の一例を表２に示すが、本発明はこれらに限定されない。
なお、表２では、配列番号２の２３４番目の塩基に対応する塩基を、下線を付した大文字で表記し、当該配列番号２の２３４番目の塩基に対応する塩基がＡ、Ｇ、Ｔ又はＣの場合であるオリゴヌクレオチドと、それぞれの蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリッドのＴｍ値を合わせて示した。Ｔｍ値は、上記と同様にして算出した。また、下線を付していない大文字で表記された塩基は、配列番号２の２４５番目のＷに対応する塩基を示す。
【００４２】
【表２】
0005757908.tif 000003
【００４３】
本発明において、Ｐ２又はＰ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが相補的な塩基配列を有するＤＮＡとハイブリダイズした場合のＴｍ値（表２におけるＴｍ（ｍｔ（Ｔ）））と、配列番号２における２３４番目の塩基に対応する塩基のみが非相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした場合のＴｍ値（表２におけるＴｍ（ＷＴ（Ｃ）））との差は、１．０℃以上、２．０℃以上、３．０℃以上にすることができる。前記Ｔｍ値の差が４．０℃以上であることで、例えば、配列番号２における２３４番目の塩基の変異をより高感度に検出することができる。
【００４４】
配列番号３に示す塩基配列は、ＡＢＣＧ２遺伝子の塩基配列の一部であって、ＡＢＣＧ２遺伝子の１番目〜６８５９５番目の塩基のうち２７５２８番目〜２７８６８番目の３４１塩基に対応するものである。
ＡＢＣＧ２遺伝子の野生型では、配列番号３に示す塩基配列の１６１番目に対応する塩基は、Ｃ（シトシン）であるが、変異型においてはＡ（アデニン）に変異している。
また、野生型のＡＢＣＧ２遺伝子では、ＡＢＣＧ２トランスポーターのアミノ酸配列のうち、１４１番目アミノ酸はグルタミン（Ｇｌｎ）であるが、変異型のＡＢＣＧ２遺伝子では、リシン（Ｌｙｓ）である（以下、「Ｑ１４１Ｋ変異」と称する。）。
【００４５】
また前記Ｐ３又はＰ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおいて、「１５２番目の塩基に対応する塩基」とは、配列番号３に示す塩基配列における１５２番目の塩基Ｇ（グアニン）に対する相補的な塩基Ｃ（シトシン）である。
前記Ｐ３又はＰ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおいては、この蛍光標識された相補的な塩基Ｃが３’末端から数えて１〜３番目のいずれかの位置に存在することができる。また、３’末端に存在することができる。これにより、例えば、多型検出感度がより向上する。また、Ｐ３又はＰ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドを生産性よく得ることができる。
【００４６】
前記Ｐ３又はＰ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号３に示す塩基配列の１６１番目の塩基における多型を検出することができるプローブである。この塩基は、野生型であればＣ、変異型ではＡである。
【００４７】
前記Ｐ３又はＰ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長は１０〜５０であることを要する。前記Ｐ３又はＰ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長は１０〜４０、１５〜３０、又は１８〜２２としうる。この範囲の塩基長により、例えば、多型検出感度がより向上する。
また前記Ｐ３又はＰ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長を変化させることで、例えばＰ３又はＰ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドがその標的配列と形成するハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を、所望の値に調整することができる。
【００４８】
本発明の前記Ｐ３の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、１５２番目の塩基がグアニンである以外は、配列番号３に示す塩基配列に相補的な配列に対して相同性を有する。
具体的には、本発明の前記Ｐ３の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号３に示す塩基配列に相補的な塩基配列に対して、８０％以上の同一性を示す。
【００４９】
また、検出感度の観点より、８５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９５％以上の同一性、９６％以上の同一性、９７％以上の同一性、９８％以上の同一性又は９９％以上の同一性を示してもよい。
本発明の前記Ｐ３の蛍光標識オリゴヌクレオチドと、配列番号３に相補的な配列であり、１５２番目の塩基に対応する塩基がグアニンである以外は配列番号３に相補的な配列とを比較した際の同一性が８０％未満である場合には、変異型のＡＢＣＧ２遺伝子を含む試料核酸に対する検出感度が低くなる。
【００５０】
本発明の前記Ｐ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、１５２番目の塩基に対応する塩基がグアニンである以外は配列番号３と同一の塩基を有する配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。なお、ハイブリダイゼーションを行う方法、及びストリンジェントな条件については、前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドと同様の方法、及び同様の条件で行えばよい。
【００５１】
以下に本発明におけるＰ３又はＰ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおける塩基配列の一例を表３に示すが、本発明はこれらに限定されない。
なお、表３では、配列番号３の１６１番目の塩基に対応する塩基を大文字で表記し、当該配列番号３の１６１番目に対応する塩基がＴ、Ｇ及びＡ、Ｃの場合であるオリゴヌクレオチドと、それぞれの蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリッドのＴｍ値を合わせて示した。Ｔｍ値は、上記と同様にして算出した。
【００５２】
【表３】
0005757908.tif 000004
【００５３】
本発明において、Ｐ３又はＰ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした場合のＴｍ値（表３におけるＴｍ（ｍｔ（Ａ）））と、配列番号３における１６１番目の塩基に対応する塩基のみが非相補的なＤＮＡとハイブリダイズした場合のＴｍ値（表３におけるＴｍ（ＷＴ（Ｃ）））との差は、例えば１．０℃以上、２．０℃以上、又は３．０℃以上等にすることができる。前記Ｔｍ値の差が４．０℃以上であることで、例えば、配列番号３における１６１番目の塩基の変異をより高感度に検出することができる。
【００５４】
本発明における前記Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ２、Ｐ２’、Ｐ３及びＰ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、前記Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ２、Ｐ２’、Ｐ３及びＰ３’のいずれかの蛍光標識オリゴヌクレオチドに塩基が挿入、欠失又は置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドも包含される。
当該塩基が挿入、欠失又は置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドは、前記Ｐ１〜Ｐ３のいずれかの蛍光標識オリゴヌクレオチドと同等程度の作用を示せばよく、塩基が挿入、欠失又は置換されている場合、その挿入、欠失又は置換の位置は、特に限定されない。挿入、欠失又は置換した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、例えば１塩基から１０塩基、１塩基から５塩基等が挙げられる。
【００５５】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少（消光）するかまたは増加する蛍光標識オリゴヌクレオチドとすることができる。その中でも標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少する蛍光標識オリゴヌクレオチドとすることができる。このような蛍光消光現象（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）を利用したプローブは、一般的に、グアニン消光プローブと呼ばれており、いわゆるＱ  Ｐｒｏｂｅとして知られている。中でも、オリゴヌクレオチドを３'末端もしくは５'末端がＣとなるように設計し、その末端のＣが、Ｇに近づくと発光が弱くなるように蛍光色素で標識化されたオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００５６】
なお、Ｑ  Ｐｒｏｂｅを用いた検出方法以外にも、公知の検出様式を適用してもよい。このような検出様式としては、Ｔａｑ−ｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ法、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ法、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ｂｅａｃｏｎ法又はＭＧＢ  Ｐｒｏｂｅ法などを挙げることができる。
【００５７】
前記蛍光色素としては、特に制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられる。これらの蛍光色素の市販品としては、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ、ＦＡＭ、Ｃｙ３およびＣｙ５、ＴＡＭＲＡ等が挙げられる。
蛍光標識オリゴヌクレオチドの検出条件は特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定できる。例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅは、検出波長４４５ｎｍ〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５ｎｍ〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬは、検出波長５２０ｎｍ〜５５５ｎｍで検出できる。
このような蛍光色素を有するプローブを使用すれば、それぞれの蛍光シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの結合は、通常の方法、例えば特開２００２−１１９２９１号公報等に記載の方法に従って行うことができる。
【００５８】
また前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、３'末端にリン酸基が付加されてもよい。蛍光標識オリゴヌクレオチドの３'末端にリン酸基を付加させておくことにより、プローブ自体が遺伝子増幅反応によって伸長することを十分に抑制できる。後述するように、変異の有無を検出するＤＮＡ（標的ＤＮＡ）は、ＰＣＲ等の遺伝子増幅法によって調製することができる。その際、３'末端にリン酸基が付加された蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いることで、これを増幅反応の反応液中に共存させることができる。
すなわち、蛍光標識オリゴヌクレオチドの３'末端にリン酸基を付加させておくことで、プローブ自体が遺伝子増幅反応によって伸長することを十分に抑制できる。また、３'末端に前述のような標識化物質（蛍光色素）を付加することによっても、同様の効果が得られる。
【００５９】
上記塩基配列を有し、５’末端または３’末端のＣが蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドの具体例を以下に示す（大文字の塩基は変異点を示し、Ｐはリン酸基を示す。また、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＦＬ及びＴＡＭＲＡは、それぞれ前記蛍光色素を示す。）。ただし、本発明における蛍光標識オリゴヌクレオチドは以下のものに限定されない。
【００６０】
【表４】
0005757908.tif 000005
【００６１】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドはＡＢＣＧ２遺伝子における多型、特にＶ１２Ｍ変異、Ｑ１２６Ｘ変異又はＱ１４１Ｋ変異を検出する多型検出用プローブとして使用することができる。
また、ＡＢＣＧ２遺伝子多型検出用プローブは、融解曲線分析用のプローブとして使用することができる。
【００６２】
なお、本発明に係る前記Ｐ１〜Ｐ３の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの合成方法として知られている公知の方法、例えば特開２００２−１１９２９１号公報等に記載の方法に従って作製することができる。
【００６３】
＜多型検出方法＞
多型の検出方法は、前記蛍光標識ヌクレオチドを用いてＡＢＣＧ２遺伝子の多型を検出する方法であれば、特に制限されない。前記蛍光標識ヌクレオチドを用いる多型検出方法の一例として、Ｔｍ解析を利用した多型検出方法について、以下に説明する。
【００６４】
本発明の多型検出方法は、ＡＢＣＧ２遺伝子における多型の検出方法であって、下記工程（Ｉ）〜（ＩＶ）を含むことを特徴とする。なお、本発明の多型検出方法は、前記蛍光検出用プローブを使用することが特徴であって、その他の構成や条件等は、以下の記載に制限されない。
（Ｉ）前記多型検出用プローブ及び試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチド及び前記一本鎖核酸をハイブリダイズしてハイブリッドを得ること。
（ＩＩ）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定すること。
（ＩＩＩ）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を測定すること。
（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、ＡＢＣＧ２遺伝子における多型の存在を検出すること。
【００６５】
また、本発明にかかる検出方法は、上記工程（Ｉ）〜（ＩＶ）の他に、下記工程（Ｖ）を含んでいてもよい。
（Ｖ）前記多型の存在に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、多型を有する一本鎖核酸の存在比を検出すること。
また、本発明においては、上記工程（Ｉ）〜（ＩＶ）又は上記工程（Ｉ）〜（Ｖ）に加えて、さらに、工程（Ｉ）のハイブリッドを得る前又は工程（Ｉ）のハイブリッドを得ることと同時に、核酸を増幅することを含んでいてもよい。
【００６６】
なお、（ＩＩＩ）でＴｍ値を測定することには、ハイブリッドの解離温度を評価することだけでなく、ハイブリット形成体の融解時に温度に応じて変動する蛍光シグナルの微分値の大きさを評価することを含む。微分値の大きさにより、多型を有する塩基配列（ＤＮＡ）の存在比を評価することができる。
【００６７】
本発明において、試料中の核酸は、一本鎖核酸でもよいし二本鎖核酸であってもよい。前記核酸が二本鎖核酸の場合は、例えば、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることに先立って、加熱により前記試料中の二本鎖核酸を融解（解離）させて一本鎖核酸とすることができる。二本鎖核酸を一本鎖核酸に解離することによって、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズが可能となる。
【００６８】
本発明において、検出対象である試料に含まれる核酸は、例えば、生体試料に元来含まれる核酸でもよいが、検出精度が向上できることから、生体試料に元来含まれている核酸を鋳型としてＰＣＲ等によりＡＢＣＧ２遺伝子の変異した部位を含む領域を増幅させた増幅産物であることが挙げられる。増幅産物の長さは、特に制限されないが、例えば、５０ｍｅｒ〜１０００ｍｅｒ、又は８０ｍｅｒ〜２００ｍｅｒにすることができる。また、試料中の核酸は、例えば、生体試料由来のＲＮＡ（トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等）からＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ）により合成したｃＤＮＡであってもよい。
【００６９】
本発明において、前記試料中の核酸に対する、本発明の多型検出用プローブの添加割合（モル比）は特に制限されない。試料中のＤＮＡに対して例えば１倍以下が挙げられる。また、十分な検出シグナル確保の観点より、前記試料中の核酸に対する、本発明の多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、０．１倍以下としうる。
ここで、試料中の核酸とは、例えば、検出目的の多型が発生している検出対象核酸と前記多型が発生していない非検出対象核酸との合計でもよいし、検出目的の多型が発生している検出対象配列を含む増幅産物と前記多型が発生していない非検出対象配列を含む増幅産物との合計でもよい。なお、試料中の核酸における前記検出対象核酸の割合は、通常、不明であるが、結果的に、前記多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、検出対象核酸（検出対象配列を含む増幅産物）に対して１０倍以下としうる。また、前記多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、検出対象核酸（検出対象配列を含む増幅産物）に対して、５倍以下、又は３倍以下としうる。また、その下限は特に制限されないが、例えば、０．００１倍以上、０．０１倍以上、又は０．１倍以上としうる。
【００７０】
前記ＤＮＡに対する本発明のプローブの添加割合は、例えば、二本鎖核酸に対するモル比でもよいし、一本鎖核酸に対するモル比でもよい。
【００７１】
本発明において、Ｔｍ値を決定するための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、前記多型検出用プローブに付加した標識のシグナルに基づくシグナルであって、一本鎖ＤＮＡと前記多型検出用プローブとのハイブリッド形成の状態に応じて変動するシグナルを測定することができる。このため、前記多型検出用プローブとして、前述の蛍光標識オリゴヌクレオチドを使用することができる。前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、例えば、標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少（消光）する蛍光標識オリゴヌクレオチド、または標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が増加する蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。
前者のようなプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成している際には蛍光シグナルを示さないか、蛍光シグナルが弱いが、加熱によりプローブが解離すると蛍光シグナルを示すようになるか、蛍光シグナルが増加する。
また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成することによって蛍光シグナルを示し、加熱によりプローブが解離すると蛍光シグナルが減少（消失）する。したがって、この蛍光標識に基づく蛍光シグナルの変化を蛍光標識特有の条件（蛍光波長等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行ならびにＴｍ値の決定を行うことができる。
【００７２】
次に、本発明の多型検出方法について、蛍光色素に基づくシグナルの変化を検出する方法について具体的例を挙げて説明する。なお、本発明の多型検出方法は、前記多型検出用プローブを使用すること自体が特徴であり、その他の工程や条件については何ら制限されない。
【００７３】
核酸増幅を行う際の鋳型となる核酸を含む試料としては、核酸、特にＡＢＣＧ２遺伝子を含んでいればよく、特に制限されない。例えば、大腸や肺等の組織、白血球細胞等の血球、全血、血漿、喀痰、口腔粘膜懸濁液、爪や毛髪等の体細胞、生殖細胞、乳、腹水液、パラフィン包埋組織、胃液、胃洗浄液、尿、腹膜液、羊水、細胞培養などの任意の生物学的起源に由来する又は由来しうるものを挙げられる。なお、試料の採取方法、核酸を含む試料の調製方法等は、制限されず、いずれも従来公知の方法が採用できる。また、鋳型となる核酸は、該起源から得られたままで直接的に、あるいは該サンプルの特性を改変するために前処理した後で使用することができる。
例えば、全血を試料とする場合、全血からのゲノムＤＮＡの単離は、従来公知の方法によって行うことができる。例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キット（商品名ＧＦＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等が使用できる。
【００７４】
以下に本発明の多型検出方法において使用できる一本鎖核酸の塩基配列の例を示す。なお、これらは例示であって、本発明を制限するものではない。
【００７５】
前記配列番号１に示す塩基配列の３０１番目の塩基における多型を検出するための一本鎖核酸としては、以下の塩基配列からなる群から選択される少なくとも１種の一本鎖核酸を用いることができる。
【００７６】
【表５】
0005757908.tif 000006
【００７７】
さらに、前記配列番号２に示す塩基配列の２３４番目の塩基における多型を検出するための一本鎖核酸としては、以下の塩基配列からなる群から選択される少なくとも１種の一本鎖核酸を用いることができる。
【００７８】
【表６】
0005757908.tif 000007
【００７９】
さらに、前記配列番号３に示す塩基配列の１６１番目の塩基における多型を検出するための一本鎖核酸としては、以下の塩基配列からなる群から選択される少なくとも１種の一本鎖核酸を用いることができる。
【００８０】
【表７】
0005757908.tif 000008
【００８１】
次に、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドを含む多型検出用プローブを添加する。
前記多型検出用プローブは、単離したゲノムＤＮＡを含む液体試料に添加してもよいし、適当な溶媒中でゲノムＤＮＡと混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものが挙げられる。
【００８２】
前記多型検出用プローブの添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、後述するＰＣＲ等の増幅処理を行う場合、増幅処理の後に、ＰＣＲ増幅産物に対して添加してもよいし、増幅処理前に添加してもよい。
このようにＰＣＲ等による増幅処理前に前記検出用プローブを添加する場合は、例えば、前述のように、その３'末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加したりすることができる。
【００８３】
核酸増幅の方法としては、例えばポリメラーゼを用いる方法等が挙げられる。その例としては、ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法等が挙げられる。ポリメラーゼを用いる方法により増幅する場合は、本発明プローブの存在下で増幅を行うことができる。用いるプローブ及びポリメラーゼに応じて、増幅の反応条件等を調整することは当業者であれば容易である。これにより、核酸の増幅後にプローブのＴｍ値を解析するだけで多型を評価できるので、反応終了後増幅産物を取り扱う必要がない。よって、増幅産物による汚染の心配がない。また、増幅に必要な機器と同じ機器で検出することが可能なので、容器を移動する必要がなく、自動化も容易である。
【００８４】
またＰＣＲ法に用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、通常用いられるＤＮＡポリメラーゼを特に制限なく用いることができる。例えば、ＧｅｎｅＴａｑ（ニッポンジーン社製）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）、Ｔａｑ  ポリメラーゼ等を挙げることができる。
ポリメラーゼの使用量としては、通常用いられている濃度であれば特に制限はない。例えば、Ｔａｑポリメラーゼを用いる場合、例えば、反応溶液量５０μｌに対して０．０１Ｕ〜１００Ｕの濃度とすることができる。これにより、ＡＢＣＧ２遺伝子多型の検出感度が高まるなどの傾向がある。
【００８５】
またＰＣＲ法は、通常用いられる条件を適宜選択することで行うことができる。
なお、増幅の際、リアルタイムＰＣＲによって増幅をモニタリングし、試料に含まれるＤＮＡ（検出対象配列）のコピー数を調べることもできる。すなわち、ＰＣＲによるＤＮＡ（検出対象配列）の増幅に従ってハイブリッドを形成するプローブの割合が増えるので蛍光強度が変動する。これをモニタリングすることで、試料に含まれる検出対象配列（正常ＤＮＡまたは変異ＤＮＡ）のコピー数や存在比を検出することができる。
【００８６】
本発明の多形検出方法においては、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドと、試料中の一本鎖核酸とを接触させて、両者をハイブリダイズさせる。試料中の一本鎖核酸は、例えば、上記のようにして得られたＰＣＲ増幅産物を解離することで調製することができる。
【００８７】
前記ＰＣＲ増幅産物の解離（解離工程）における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されない。例えば、８５℃〜９５℃である。加熱時間も特に制限されない。加熱時間は、例えば１秒〜１０分、又は１秒〜５分としうる。
【００８８】
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、４０℃〜５０℃である。
【００８９】
ハイブリダイズ工程の反応液における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応液におけるＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１μＭ〜１μＭ、又は０．１μＭ〜０．５μＭとしうる。前記蛍光標識オリゴヌクレオチドの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲であり、例えば、０．００１μＭ〜１０μＭ、又は０．００１μＭ〜１μＭとしうる。
【００９０】
そして、得られた前記一本鎖ＤＮＡと前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光シグナルの変動を測定する。例えば、Ｑ  Ｐｒｏｂｅを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、解離した状態に比べて蛍光強度が減少（または消光）する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００９１】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃、又は２５℃〜７０℃としうる。終了温度は、例えば、４０℃〜１０５℃としうる。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．１℃／秒〜２０℃／秒、又は０．３℃／秒〜５℃／秒としうる。
【００９２】
次に、前記シグナルの変動を解析してＴｍ値として決定する。具体的には、得られた蛍光強度から各温度における微分値（−ｄ蛍光強度／ｄｔ）を算出し、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。また、単位時間当たりの蛍光強度増加量（蛍光強度増加量／ｔ）が最も高い点をＴｍ値として決定することもできる。なお、標識化プローブとして、消光プローブではなく、ハイブリッド形成によりシグナル強度が増加するプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
【００９３】
また、本発明においては、前述のように、ハイブリッドを加熱して、温度上昇に伴う蛍光シグナル変動（好ましくは蛍光強度の増加）を測定するが、この方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。すなわち、前記プローブを添加した試料の温度を降下させてハイブリッドを形成する際の前記温度降下に伴う蛍光シグナル変動を測定してもよい。
【００９４】
具体例として、Ｑ  Ｐｒｏｂｅを使用した場合、前記プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離状態にあるため蛍光強度が大きいが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記加熱した試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。
他方、ハイブリッド形成によりシグナルが増加する標識化プローブを使用した場合、前記プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離状態にあるため蛍光強度が小さい（または消光）が、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光強度が増加するようになる。したがって、例えば、前記試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００９５】
本発明の多型検出方法においては、目的とする塩基を含む領域を増幅可能であれば、増幅する方法としては特に制限されず、例えば、既述のＰＣＲ法を用いることができる。
目的とする塩基を含む領域は、前記配列番号１に示す塩基配列における３０１番目の塩基を含む塩基配列又は前記配列番号２に示す塩基配列における２３４番目の塩基を含む塩基配列又は前記配列番号３に示す塩基配列における１４１番目の塩基を含む塩基配列で、それぞれ塩基長５０〜５００の領域、５０〜３００の領域、又は５０〜２００の領域が挙げられる。
【００９６】
ＰＣＲ法に適用するプライマーは、本発明の多型検出用プローブがハイブリダイゼーションできる領域が増幅できるものであれば特に制限されず、配列番号１で示される塩基配列から、当業者であれば適宜設計することができる。プライマーの長さ及びＴｍ値は、１２ｍｅｒ〜４０ｍｅｒ及び４０℃〜７０℃、又は１６ｍｅｒ〜３０ｍｅｒ及び５５℃〜６０℃にすることができる。
また、プライマーセットの各プライマーの長さは同一でなくてもよいが、両プライマーのＴｍ値はほぼ同一（又は、Ｔｍ値の両プライマーでの差が５℃以内）にすることができる。
【００９７】
以下に本発明の多型検出方法において、本発明の多型検出用プローブがハイブリダイズする領域を含む塩基配列の増幅に使用できるプライマーの例を示す。なお、これらは例示であって、本発明を制限するものではない。
【００９８】
前記配列番号１に示す塩基配列の３０１番目の塩基における多型を検出するためのプライマーとしては、下記Ｐ４又はＰ５で表されるオリゴヌクレオチドのうち少なくともいずれか一方であればよい。
（Ｐ４）配列番号１に示す塩基配列において、１９８〜２３０番目の塩基を含む塩基長３３〜５０の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有するオリゴヌクレオチド。また、前記Ｐ４のオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１に示す塩基配列において１９８〜２３０番目の塩基に対応する塩基を含む塩基長３３〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであってもよい。前記Ｐ４のオリゴヌクレオチドとしては、前記Ｐ４のオリゴヌクレオチドの塩基が挿入、欠失又は置換したオリゴヌクレオチドであってもよい。
（Ｐ５）配列番号１に示す塩基配列において、３３２〜３５３番目の塩基を含む塩基長２２〜５０の塩基配列に相補的な配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有するオリゴヌクレオチド。また、前記Ｐ５のオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１に示す塩基配列において３３２〜３５５３番目の塩基に対応する塩基を含む塩基長２２〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであってもよい。前記Ｐ５のオリゴヌクレオチドとしては、前記Ｐ５のオリゴヌクレオチドの塩基が挿入、欠失又は置換したオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００９９】
以下に、本発明の多型検出方法における前記配列番号１に示す塩基配列における３０１番目の塩基を含む領域の増幅に使用できるプライマーの一例を示す。
【０１００】
【表８】
0005757908.tif 000009
【０１０１】
また、前記配列番号１に示す塩基配列の３０１番目の塩基における多型を検出するためには、前記Ｐ４及びＰ５で表される各オリゴヌクレオチドを、一対のプライマーセットとして用いることができる。
【０１０２】
前記配列番号２に示す塩基配列の２３４番目の塩基における多型を検出するためのプライマーとしては、下記Ｐ６又はＰ７で表されるオリゴヌクレオチドのうち少なくともいずれか一方であればよい。
（Ｐ６）配列番号２に示す塩基配列において、１３２〜１５７番目の塩基を含む塩基長２６〜５０の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有するオリゴヌクレオチド。また、前記Ｐ６のオリゴヌクレオチドとしては、配列番号２に示す塩基配列において１３２〜１５７番目の塩基に対応する塩基を含む塩基長２６〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであってもよい。前記Ｐ６のオリゴヌクレオチドとしては、前記Ｐ６のオリゴヌクレオチドの塩基が挿入、欠失又は置換したオリゴヌクレオチドであってもよい。
（Ｐ７）配列番号２に示す塩基配列において、２６８〜２９５番目の塩基を含む塩基長２８〜５０の塩基配列に相補的な配列対して少なくとも８０％以上の同一性を有するオリゴヌクレオチド。また、前記Ｐ７のオリゴヌクレオチドとしては、配列番号２に示す塩基配列において２６８〜２９５番目の塩基に対応する塩基を含む塩基長２８〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであってもよい。前記Ｐ７のオリゴヌクレオチドとしては、前記Ｐ７のオリゴヌクレオチドの塩基が挿入、欠失又は置換したオリゴヌクレオチドであってもよい。
【０１０３】
以下に、本発明の多型検出方法における前記配列番号２に示す塩基配列における２３４番目の塩基を含む領域の増幅に使用できるプライマーの一例を示す。
【０１０４】
【表９】
0005757908.tif 000010
【０１０５】
また、前記配列番号２に示す塩基配列の２３４番目の塩基における多型を検出するためには、前記Ｐ６及びＰ７で表される各オリゴヌクレオチドを、一対のプライマーセットとして用いることができる。
【０１０６】
前記配列番号３に示す塩基配列の１６１番目の塩基における多型を検出するためのプライマーとしては、下記Ｐ８又はＰ９で表されるオリゴヌクレオチドのうち少なくともいずれか一方であればよい。
（Ｐ８）配列番号３に示す塩基配列において、１２１〜１４５番目の塩基を含む塩基長２５〜５０の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有するオリゴヌクレオチド。また、前記Ｐ８のオリゴヌクレオチドとしては、配列番号３に示す塩基配列において１２１〜１４５番目の塩基に対応する塩基を含む塩基長２５〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであってもよい。前記Ｐ８のオリゴヌクレオチドとしては、前記Ｐ８のオリゴヌクレオチドの塩基が挿入、欠失又は置換したオリゴヌクレオチドであってもよい。
（Ｐ９）配列番号３に示す塩基配列において、２１４〜２３５番目の塩基を含む塩基長２２〜５０の塩基配列に相補的な配列対して少なくとも８０％以上の同一性を有するオリゴヌクレオチド。また、前記Ｐ９のオリゴヌクレオチドとしては、配列番号３に示す塩基配列において２１４〜２３５番目の塩基に対応する塩基を含む塩基長２２〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであってもよい。前記Ｐ９のオリゴヌクレオチドとしては、前記Ｐ９のオリゴヌクレオチドの塩基が挿入、欠失又は置換したオリゴヌクレオチドであってもよい。
【０１０７】
以下に、本発明の多型検出方法における前記配列番号３に示す塩基配列における１６１番目の塩基を含む領域の増幅に使用できるプライマーの一例を示す。
【０１０８】
【表１０】
0005757908.tif 000011
【０１０９】
また、前記配列番号３に示す塩基配列の１６１番目の塩基における多型を検出するためには、前記Ｐ８及びＰ９で表される各オリゴヌクレオチドを、一対のプライマーセットとして用いることができる。
【０１１０】
ハイブリダイゼーションを行う方法についてはプローブの項において記載した方法に従えばよく、ストリンジェントな条件についてもプローブの項において記載の条件と同様の条件を適用することができる。また、同一性の範囲や、挿入、欠失又は置換についても、プローブの項に記載したものと同様の範囲を適用することができる。
【０１１１】
なお、本発明の多型検出方法においては、本発明の多型検出用プローブとして、前記Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ２、Ｐ２’、Ｐ３及びＰ３’からなる群より選ばれる蛍光標識オリゴヌクレオチドの２種以上を併用してもよい。これによりＡＢＣＧ２遺伝子の多型を同時、且つ簡便に検出することができる。
また、前記Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ２、Ｐ２’、Ｐ３及びＰ３’からなる群より選ばれる蛍光標識オリゴヌクレオチドの２種以上を併用し、Ｖ１２Ｍ変異、Ｑ１２６Ｘ変異及びＱ１４１Ｋ変異からなる群より選ばれる少なくとも２種の変異を検出することで、例えば、ＡＢＣＧ２遺伝子に由来するＡＢＣＧ２トランスポーターの機能をより精度よく予測することができる。例えば、前記Ｐ１と前記Ｐ２の蛍光標識オリゴヌクレオチドの組み合わせ、前記Ｐ２と前記Ｐ３の蛍光標識オリゴヌクレオチドの組み合わせ等が組合せとしては挙げられ、前記Ｐ２と前記Ｐ３の蛍光標識オリゴヌクレオチドの組み合わせが挙げられる。
【０１１２】
＜薬効判定方法＞
本発明の薬効判定方法は、上述した多型検出方法によりＡＢＣＧ２遺伝子の多型を検出すること、及び、前記検出結果に基づいて薬剤に対する耐性又は薬剤の薬効を判定することを含む。
本発明のＡＢＣＧ２遺伝子の多型検出方法によれば、ＡＢＣＧ２遺伝子の変異の有無と種類とを検出することができ、特にＶ１２Ｍ変異、Ｑ１２６Ｘ変異又はＱ１４１Ｋ変異を高い感度で簡便に検出することができる。
これにより多型の有無や変異配列と正常配列の存在比に基づいて薬剤に対する耐性や薬剤の薬効を判定することができる。そして、本発明の薬効判定方法は、変異の有無や変異配列の存在比に基づいて、薬剤の投与量の増加、他の治療薬への変更等への切り替え等の疾病の治療方針を決定するのに有用である。
また、判定対象となる薬剤としては、具体的には、痛風治療薬、高尿酸血症治療薬等が挙げられ、特に痛風治療薬及び高尿酸血症治療薬が挙げられる。
【０１１３】
＜疾患予測方法＞
本発明の疾患予測方法は、上述した多型検出方法によりＡＢＣＧ２遺伝子の多型を検出すること、及び、前記検出結果に基づいて疾患の罹患リスクを予測することを含む。
本発明のＡＢＣＧ２遺伝子の多型検出方法によれば、ＡＢＣＧ２遺伝子の変異の有無と種類とを検出することができ、特にＶ１２Ｍ変異、Ｑ１２６Ｘ変異又はＱ１４１Ｋ変異を高い感度で簡便に検出することができる。
そのため、本発明によれば、検出された多型の有無に基づき、疾患の罹患リスクを予測することができる。ＡＢＣＧ２遺伝子型の組み合わせと疾患の発症リスクなどについては、具体的には、実験医学  ２０１０年、第２８巻、第８号、ｐ．１２８５−１２８９、
Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙＶｏｌｕｍｅ  ６４，  Ｉｓｓｕｅ  ５，  Ａｒｔｉｃｌｅ  ｆｉｒｓｔ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ：  １７  ＭＡＹ  ２００７等に記載の内容を参照することにより予測を行うことが可能である。
また、予測対象となる疾患としては、具体的には、痛風、高尿酸血症、ポルフィリン症等が挙げられ、特に痛風及び高尿酸血症が挙げられる。
【０１１４】
＜多型検出用試薬キット＞
本発明の多型検出用試薬キットは、前記配列番号１に示す塩基配列における３０１番目の塩基の変異を検出可能な多型検出用プローブ、前記配列番号２に示す塩基配列における２３４番目の塩基の変異を検出可能な多型検出用プローブ又は前記配列番号３に示す塩基配列における１６１番目の塩基の変異を検出可能な多型検出用プローブの少なくとも１種を含むものである。これにより、本発明の多型検出用試薬キットはＡＢＣＧ２遺伝子の多型を検出可能である。
【０１１５】
また、本発明における多型検出用試薬キットは、２種以上の前記蛍光標識オリゴヌクレオチドを含むものであってもよい。
多型検出用プローブとして２種以上の蛍光標識オリゴヌクレオチドを含む場合、それぞれの蛍光標識オリゴヌクレオチドは混合された状態で含まれていても、別個に含まれていてもよい。
【０１１６】
２種以上の前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは発光波長が互いに異なる蛍光色素で標識化されていてもよい。
このように蛍光色素の種類を変えることで、同じ反応系であっても、それぞれの蛍光標識オリゴヌクレオチドについての検出を同時に行うことも可能になる。
【０１１７】
また、本発明における多型検出用試薬キットは、上述の検出対象となるＡＢＣＧ２遺伝子多型を含む配列を増幅可能なプライマーをさらに含んでいてもよい。これにより、本発明における多型検出用試薬キットは、精度よくＡＢＣＧ２遺伝子の多型の検出を行うことができる。
なお、多型検出用試薬キットに含まれ得るプローブ及びプライマーについては、前述した事項をそのまま適用することができる。
【０１１８】
本発明にかかる多型検出用試薬キットは、配列番号１に示す塩基配列の３０１番目の塩基における多型を検出する試薬（３０１検出試薬）を含んでいてもよい。試薬としては、前記Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドと、Ｐ４及びＰ５で表されるプライマーからなる群のうち少なくとも一つとが挙げられる。
本発明にかかる多型検出用試薬キットは、配列番号２に示す塩基配列の２３４番目の塩基における多型を検出する試薬（２３４検出試薬）を含んでいてもよい。試薬としては、前記Ｐ２の蛍光標識オリゴヌクレオチドと、Ｐ６及びＰ７で表されるプライマーからなる群のうち少なくとも一つとが挙げられる。
本発明にかかる多型検出用試薬キットは、配列番号３に示す塩基配列の１６１番目の塩基における多型を検出する試薬（１６１検出試薬）を含んでいてもよい。試薬としては、前記Ｐ３の蛍光標識オリゴヌクレオチドと、Ｐ８及びＰ９で表されるプライマーからなる群のうち少なくとも一つとが挙げられる。
本発明にかかる多型検出用試薬キットは、前記３０１検出試薬、前記２３４検出試薬又は前記１６１検出試薬を一種単独で用いてもよく、二種以上を併用してもよい。
【０１１９】
また、前記Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、具体的には、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドで構成されてもよい。
前記Ｐ２の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、具体的には、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドで構成されてもよい。
前記Ｐ３の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、具体的には、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドで構成されてもよい。
【０１２０】
本発明における検出用試薬キットは、前記プローブ及び前記プライマーの他に、本発明の検出方法における核酸増幅を行うのに必要とされる試薬類、特にＤＮＡポリメラーゼを用いる増幅のためのプライマーをさらに含んでいてもよい。
また、プローブ、プライマー及びその他の試薬類は、別個に収容されていてもよいし、それらの一部が混合物とされていてもよい。
なお、「別個に収容」とは、各試薬が非接触状態を維持できるように区分けされたものであればよく、必ずしも独立して取り扱い可能な個別の容器に収容される必要はない。
多型部位を含む配列（プローブがハイブリダイズする領域）を増幅可能なプライマーセットを含むことで、例えば、より高感度に多型を検出することができる。
【０１２１】
さらに本発明の多型検出用試薬キットは、前記多型検出用プローブを使用して、検出対象である核酸を含む試料について微分融解曲線を作成し、そのＴｍ値解析を行って、ＡＢＣＧ２遺伝子における多型を検出することが記載された取扱い説明書、又は検出用試薬キットに含まれる若しくは追加的に含むことが可能な各種の試薬について記載された使用説明書を含むことができる。
【実施例】
【０１２２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【０１２３】
＜実施例１＞
実施例１−１：一本鎖核酸とプローブとのＴｍ解析
全自動ＳＮＰｓ検査装置ＩＳ−５３１０（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（商標）、アークレイ社製）と下記表１１に記載した処方の検査用試薬を用いて、Ｔｍ解析を行った。
【０１２４】
【表１１】
0005757908.tif 000012
【０１２５】
Ｔｍ解析は、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で、４０℃から７５℃まで温度を上昇させ、この間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。励起波長を３６５ｎｍ〜４１５ｎｍとし、測定波長を４４５ｎｍ〜４８０ｎｍとして、蛍光標識プローブに由来する蛍光強度の変化をそれぞれ測定した。
【０１２６】
その結果、野生型（配列番号１の３０１番目の塩基がＧ）と、変異型（Ｖ１２Ｍ、配列番号１の３０１番目の塩基がＡ）との両方のピークを検出できることが確認できた。野生型のＴｍ値は４９℃であり、変異型のＴｍ値は５６℃であった。
図２に、Ｔｍ解析により得られた野生型（Ａ）及び変異型（Ｂ）のグラフを示す。なお、縦軸は蛍光強度の温度微分値を表し、横軸は温度をそれぞれ表す。
【０１２７】
実施例１−２：ヒトゲノムとプローブとのＴｍ解析
変異の検出対象試料としてヒトゲノム（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて、ＰＣＲ及びＴｍ解析を行った。なお、当該ヒトゲノムは、全血から常法により精製し、１μｌ(１００ｃｐ／μｌ)の量で用いた。
全自動ＳＮＰｓ検査装置ＩＳ−５３１０（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（商標）、アークレイ社製）と下記表１２に記載した処方の検査用試薬を用いて、ＰＣＲ及びＴｍ解析を行った。
ＰＣＲは、９５℃で６０秒処理した後、９５℃で１秒及び６０℃で３０秒を１サイクルとして、５０サイクル繰り返した。
またＴｍ解析は、ＰＣＲの後、９５℃で１分、４０℃で６０秒処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で、４０℃から７５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。なお、励起波長を３６５ｎｍ〜４１５ｎｍとし、測定波長を４４５ｎｍ〜４８０ｎｍとして、蛍光標識プローブに由来する蛍光強度の変化をそれぞれ測定した。
【０１２８】
【表１２】
0005757908.tif 000013
【０１２９】
その結果、検出対象試料として全血から精製したヒトゲノムを用いた場合にも、野生型（配列番号１の３０１番目の塩基がＧ）と、変異型（Ｖ１２Ｍ、配列番号１の３０１番目の塩基がＡ）との両方のピークを検出できることが確認できた。Ｔｍ値は４７℃及び５２℃であった。Ｔｍ解析により得られたグラフを図３に示す。なお、縦軸は蛍光強度の温度微分値を表し、横軸は温度をそれぞれ表す。
【０１３０】
また上記記載のプローブ、プライマー及び一本鎖核酸の詳細を以下に示した。なお、プローブにおけるＰは３’末端がリン酸化されていることを示す。
【０１３１】
【表１３】
0005757908.tif 000014
【０１３２】
＜実施例２＞
実施例１−１において、一本鎖核酸とプローブを下記表１４に記載のものに変更したこと及び、Ｔｍ解析における励起波長を４２０ｎｍ〜４８５ｎｍとし、測定波長を５２０ｎｍ〜５５５ｎｍとしたこと以外は、実施例１−１と同様にして、Ｔｍ解析を行った。
【０１３３】
【表１４】
0005757908.tif 000015
【０１３４】
上記記載のプローブ及び一本鎖核酸の詳細を以下に示した。
【０１３５】
【表１５】
0005757908.tif 000016
【０１３６】
その結果、野生型（配列番号２の２３４番目の塩基がＧ）１及び２と、変異型（Ｑ１２６Ｘ、配列番号２の２３４番目の塩基がＣ）１及び２との両方のピークを検出できることが確認できた。さらに、ヒトゲノムタイプの野生型の一本鎖核酸と変異型の一本鎖核酸とを１：１で混合した混合型１〜４を用いた場合にも、ピークを検出できることが確認できた。
野生型１及び野生型２のＴｍ値はいずれも５０℃であり、変異型１及び変異型２のＴｍ値はいずれも５７℃であった。
また、混合型１のＴｍ値は５０℃と５６℃であり、混合型２のＴｍ値は５０℃と５６℃であり、混合型３のＴｍ値は４８℃と５６℃であり、混合型４のＴｍ値は４９℃と５７℃であった。
図４にＴｍ解析により得られた野生型１（Ａ）、野生型２（Ｃ）、変異型１（Ｂ）、変異型２（Ｄ）、混合型１（Ｅ）、混合型２（Ｆ）、混合型３（Ｇ）及び混合型４（Ｈ）のグラフをそれぞれ示す。なお、縦軸は蛍光強度の温度微分値を表し、横軸は温度をそれぞれ表す。
【０１３７】
＜実施例３＞
実施例１−１において、一本鎖核酸とプローブを下記表１６に記載のものに変更したこと及び、Ｔｍ解析における励起波長を５２０ｎｍ〜５５５ｎｍとし、測定波長を５８５ｎｍ〜７００ｎｍとしたこと以外は、実施例１−１と同様にして、Ｔｍ解析を行った。
【０１３８】
【表１６】
0005757908.tif 000017
【０１３９】
上記記載のプローブ及び一本鎖核酸の詳細を以下に示した。
【０１４０】
【表１７】
0005757908.tif 000018
【０１４１】
その結果、野生型（配列番号３の１６１番目の塩基がＣ）と、変異型（Ｑ１４１Ｋ、配列番号２の１６１番目の塩基がＡ）との両方のピークを検出できることが確認できた。さらに、ヒトゲノムタイプの野生型の一本鎖核酸と変異型の一本鎖核酸とを１：１で混合した混合型を用いた場合にも、ピークを検出できることが確認できた。
野生型のＴｍ値は５６℃であり、変異型のＴｍ値は６４℃であり、混合型のＴｍ値は５５℃と６３℃であった。
図５にＴｍ解析により得られた野生型（Ａ）、変異型（Ｂ）及び混合型（Ｃ）のグラフを示す。なお、縦軸は蛍光強度の温度微分値を表し、横軸は温度をそれぞれ表す。
【０１４２】
＜実施例４＞
全自動ＳＮＰｓ検査装置ＩＳ−５３１０（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（商標）、アークレイ社製）と下記表１８に記載した処方の検査用試薬を用いて、Ｔｍ解析を行った。
【０１４３】
【表１８】
0005757908.tif 000019
【０１４４】
上記記載のプライマー及びプローブの詳細を以下に示した。
【０１４５】
【表１９】
0005757908.tif 000020
【０１４６】
Ｔｍ解析条件は、９５℃で１分処理した後、９５℃で１秒及び６０℃で３０秒を１サイクルとして、５０サイクル繰り返した。その後、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で、４０℃から６０℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。なお、励起波長および測定波長はそれぞれ３６５ｎｍ〜４１５ｎｍおよび４４５ｎｍ〜４８０ｎｍ(Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ)、４２０ｎｍ〜４８５ｎｍおよび５２０ｎｍ〜５５５ｎｍ(ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ)、５２０ｎｍ〜５５５ｎｍおよび５８５ｎｍ〜７００ｎｍ(ＴＡＭＲＡ)で、蛍光標識プローブに由来する蛍光強度の変化をそれぞれ測定した。
【０１４７】
鋳型としては、全血と精製ゲノム（２０００コピー／ｔｅｓｔ）とを、それぞれ用いた。なお、全血の調整方法は、以下の通りである。
全血１０μｌを７０μｌの希釈液１に加え、よく混合した後、この混合液１０μｌを７０μｌの希釈液２に加える。この混合液１７μｌを９５℃１０分で加熱すると４μｌの前処理済全血が得られる。これを１ｔｅｓｔあたりの鋳型として使用した。
【０１４８】
【表２０】
0005757908.tif 000021
【０１４９】
【表２１】
0005757908.tif 000022
【０１５０】
その結果、鋳型として全血を用いた場合及び精製ヒトゲノムを用いた場合のいずれも、Ｖ１２Ｍ変異、Ｑ１２６Ｘ変異及びＱ１４１Ｋ変異の全てのピークを確認することができた。
全血の場合も、精製ヒトゲノムの場合も、Ｖ１２Ｍ変異はＴｍ値が４７℃と５２℃であり、Ｑ１２６Ｘ変異はＴｍ値が４５℃であり、Ｑ１４１Ｋ変異はＴｍ値が５０℃であった。
図６にＴｍ解析により得られた全血（Ｖ１２Ｍ変異）（Ａ）、全血（Ｑ１２６Ｘ変異）（Ｂ）及び全血（Ｑ１４１Ｋ変異）（Ｃ）のグラフを示し、図７に精製ヒトゲノム（Ｖ１２Ｍ変異）（Ａ）、精製ヒトゲノム（Ｑ１２６Ｘ変異）（Ｂ）及び精製ヒトゲノム（Ｑ１４１Ｋ変異）（Ｃ）のグラフを示す。なお、縦軸は蛍光強度の温度微分値を表し、横軸は温度をそれぞれ表す。
【０１５１】
＜比較例１＞
プローブと一本鎖核酸とを以下のものに変更した以外は、実施例１−１と同様にして、Ｔｍ解析を行った。
【０１５２】
【表２２】
0005757908.tif 000023
【０１５３】
上記記載のプローブ及び一本鎖核酸の詳細は、下記表２３に記載の通りである。
【０１５４】
【表２３】
0005757908.tif 000024
【０１５５】
その結果、野生型（配列番号１の３０１番目の塩基がＧ）と、変異型（Ｖ１２Ｍ、配列番号１の３０１番目の塩基がＡ）との両方のピークを検出できることが確認できた。野生型のＴｍ値は４９℃であり、変異型のＴｍ値は５７℃であった。
図８にＴｍ解析により得られた野生型（Ａ）及び変異型（Ｂ）のグラフを示す。なお、縦軸は蛍光強度の温度微分値を表し、横軸は温度をそれぞれ表す。
【０１５６】
また、プローブを、５ＰＢ-ＡＢＣＧ２  Ｖ１２Ｍ-Ａ-Ｒ１から、５ＰＢ-ＡＢＣＧ２  Ｖ１２Ｍ-Ａ-ＦＩに変更した以外は、実施例１−２と同様の方法により、ヒトゲノムとプローブとのＴｍ解析を行った。
【０１５７】
その結果、検出対象試料として全血から精製したヒトゲノムを用いた場合には、変異型のＴｍ値は５５℃と検出できたものの、野生型のＴｍ値を検出することができなかった。
Ｔｍ解析により得られたグラフを図９に示す。なお、縦軸は蛍光強度の温度微分値を表し、横軸は温度をそれぞれ表す。
【０１５８】
＜比較例２＞
実施例２において、プローブを、５ＦＬ-ＡＢＣＧ２  Ｑ１２６Ｘ-Ｔ-ＲＩから、３ＦＬ-ＡＢＣＧ２  Ｑ１２６Ｘ-Ｔ-Ｒ２に変更した以外は、実施例２と同様にして、Ｔｍ解析を行った。
【０１５９】
上記記載のプローブの詳細を以下に示した。
【０１６０】
【表２４】
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【０１６１】
その結果、野生型１及び２と、変異型２、混合型１〜４では、ピークを検出することが確認できた。一方、変異型１では野生型のＴｍ値周辺に擬似ピークが確認され、混合型と誤認してしまう可能性が示唆された。
野生型１のＴｍ値は５２℃、野生型２のＴｍ値は４９℃、変異型１のＴｍ値は５７℃、変異型２のＴｍ値はいずれも５６℃、混合型１のＴｍ値は５１℃と５７℃、混合型２のＴｍ値は４９℃と５６℃、混合型３のＴｍ値は５１℃と５６℃、混合型４のＴｍ値は５０℃と５７℃であった。
図１０にＴｍ解析により得られた野生型１（Ａ）、野生型２（Ｃ）、変異型１（Ｂ）、変異型２（Ｄ）、混合型１（Ｅ）、混合型２（Ｆ）、混合型３（Ｇ）及び混合型４（Ｈ）のグラフをそれぞれ示す。なお、縦軸は蛍光強度の温度微分値を表し、横軸は温度をそれぞれ表す。
【０１６２】
＜比較例３＞
実施例３において、プローブを、３Ｔ-ＡＢＣＧ２-ｍｔ-Ｒ１から、５Ｔ-ＡＢＣＧ２-ｍｔ-Ｒ２に変更した以外は、実施例３と同様にして、Ｔｍ解析を行った。
【０１６３】
上記記載のプローブの詳細を以下に示した。
【０１６４】
【表２５】
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【０１６５】
その結果、野生型（配列番号３の１６１番目の塩基がＣ）、変異型（Ｑ１４１Ｋ、配列番号２の１６１番目の塩基がＡ）、混合型のいずれにおいてもピークを確認することはできなかった。
図１１にＴｍ解析により得られた野生型（Ａ）、変異型（Ｂ）及び混合型（Ｃ）のグラフを示す。なお、縦軸は蛍光強度の温度微分値を表し、横軸は温度をそれぞれ表す。
【０１６６】
以上から、本発明の多型検出用プローブを用いることで、ＡＢＣＧ２遺伝子の多型のうち、Ｖ１２Ｍ変異、Ｑ１２６Ｘ変異及びＱ１４１Ｋ変異を高い頻度で検出することができ、１試薬を用いて同時に複数の多型を簡便に検出することができ、さらに、ＡＢＣＧ２遺伝子の多型を、全血を精製することなく、直接簡便に検出することができることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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