(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式１−１：
0005721853.tif 000010
のフタロシアニン系化合物とアセチル化された生体適合性多糖類が結合して構成された癌の光力学診断用または治療用結合体であって、前記生体適合性多糖類が、コンドロイチン硫酸であり；並びに、前記結合体が、平均粒径１００〜２５０ｎｍであるナノ粒子であり、及び前記結合体が、前記生体適合性多糖類と前記フタロシアニン系化合物とのエステル結合により形成される、前記結合体。
【請求項２】
前記フタロシアニン系化合物は近赤外線で蛍光を示すことを特徴とする請求項１に記載の癌の光力学診断用または治療用結合体。
【請求項３】
前記生体適合性多糖類に癌細胞標的物質がさらに結合されている請求項１に記載の癌の光力学診断用または治療用結合体。
【請求項４】
前記癌細胞標的物質は葉酸、またはＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＣＤ３４、若しくはＢｃｌ−２タンパク質に対するモノクローナル抗体である請求項３に記載の癌の光力学診断用または治療用結合体。
【請求項５】
生体適合性多糖類をアセチル化させるステップと、
前記アセチル化された生体適合性多糖類を有機溶媒に溶解するステップと、
前記生体適合性多糖類に以下の式１−１：
0005721853.tif 000011
のフタロシアニン系化合物と触媒を添加して感光剤を前記生体適合性高分子に結合するステップと、を含む癌の光力学診断用または治療用結合体の製造方法であって、前記生体適合性多糖類が、コンドロイチン硫酸であり；並びに、前記結合体が、平均粒径１００〜２５０ｎｍであるナノ粒子であり、及び前記結合体が、前記生体適合性多糖類と前記フタロシアニン系化合物とのエステル結合により形成される、前記結合体の製造方法。
【請求項６】
前記触媒は、４−ヒドロキシメチル安息香酸（ＤＭＡＰ）または１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）である請求項５に記載の癌の光力学診断用または治療用結合体の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の結合体を含む、癌診断用または治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光力学診断または治療のためのアセチル化された生体適合性多糖類とフタロシアニン系化合物が結合した複合体およびその製造方法に関し、より具体的には、癌細胞に対する蓄積率と標的率に優れ、癌細胞以外の細胞に対しては安定性に優れるように前記アセチル化多糖類とフタロシアニン系化合物が結合してなる生体適合性複合体およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光力学療法（Photodynamic Therapy；ＰＤＴ）は、感光性物質（photosensitizer、以下「感光剤」とする）を用いて、手術を行うことなく癌などの難病を治療したりニキビなどの疾患を治療する技術である。このような光力学療法（ＰＤＴ）は、２１世紀初頭から活発な研究が行われ、現在に至っては癌の診断と治療、自家骨髄移植、抗生剤、ＡＩＤＳ治療、皮膚移植や関節炎などの治療に免疫性を高めるために用いられており、その応用範囲は徐々に拡大している。
【０００３】
特に、癌の治療に用いられるＰＤＴは、光に敏感な反応を示す物質である感光剤を体内に投与すると外部から光を照射した場合に、体内の豊富な酸素と外部光による化学反応により一重項酸素（singlet oxygen）またはフリーラジカル（free radical）が生成され、このような一重項酸素またはフリーラジカルが各種病変部位や癌細胞の細胞死を誘導して破壊する原理を用いた治療法である。
【０００４】
現在、ＰＤＴに用いられている感光剤としては、ポルフィリン（porphyrin）誘導体、クロリン（chlorin）、バクテリオクロリン（bacteriochlorin）、フタロシアニン（phthalocyanine）、５−アミノ−レブリン酸（5-amino-levulinic acid）誘導体などが知られており、感光剤としての環状テトラピロール誘導体は、癌細胞に選択的に蓄積されるだけでなく、化合物の特徴上、蛍光や燐光を示すことで腫瘍の早期診断試薬としても活用できる特徴がある。また、環状テトラピロールの内部に金属が結合されているメタロポルフィリン（metalloporphyrin）は結合された金属の種類に応じて様々な特性を示すため、メタロポルフィリンをＭＲＩ（magnetic resonance imaging）時の造影剤（contrasting agent）として用いて癌細胞などの腫瘍細胞の早期診断に応用することもある。また、最も広く知られた感光剤である５−アミノ−レブリン酸誘導体は、使用方法が単純で分子量が小さくて皮膚浸透が比較的容易であり、副作用が少なくて安全であるという利点がある。また、環状テトラピロールのピロール基がベンゼン環に抱合され（conjugation）、アザ窒素（aza nitrogen）で連結された形態であるフタロシアニンとフタロシアニンのベンゼン環にもう一つのベンゼン環が抱合されたナフタロシアニンの内部に金属が結合されているメタロプタロシアニン系（metallophthalocyanine）化合物は、通常のポルフィリン系より高い吸収波長とモル吸光係数を有すると報告されている。
【０００５】
光力学治療は、正常細胞をそのまま維持して癌細胞のみを選択的に除去することができるという利点があり、ほとんどの場合、全身麻酔の危険性を排除し、簡単な局所麻酔だけでも手術が可能であるなど、施術が容易であるという利点もある。
【０００６】
ただし、光力学治療は、光が透過することのできない体積が大きい腫瘍細胞に適用することは困難であり、特に感光剤は体内代謝が遅くて体内に長く残り光毒性の副作用をもたらし、腫瘍内での蓄積が困難であるため腫瘍内の感光剤の濃度が低く効率的な治療効果を示すことができないという問題点がある。
【０００７】
また、このような光力学治療は、感光剤の半減期が長いため施術後に光のない環境で生活しなければならない不都合があり、腫瘍への蓄積が困難であるという欠点を有しており、治療以外の長期間、治療化合物が体内にたまるためこれによる体内の各種副作用を誘発することもある。それだけでなく、光力学治療用に用いられている感光剤の場合、ほとんどが親水性製品であり皮膚への浸透が困難であるため、長期にわたり複数回治療しなければならず、治療のために多くの時間がかかるという問題点がある。
【０００８】
したがって、癌細胞に対して特異的に蓄積率が高く、副作用がなく、治療効果に優れるだけでなく、生体適合性多糖類を効率的に活用することができる新たな光力学治療剤の開発が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記従来技術の問題点を鑑みてなされたものであり、感光剤であるフタロシアニン系化合物の腫瘍細胞での蓄積率を高めるとともに癌細胞に対してのみ特異的に細胞毒性を示し、癌細胞以外では蛍光干渉による光毒性を著しく低減する新たな光力学診断用または治療用結合体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
フタロシアニンに−ＣＯＯＨまたは−ＣＯＯＨで置換されたベンゼン環を導入したフタロシアニン系化合物またはナフタロシアニン化合物と、有機溶媒に容易に溶解しない生体適合性多糖類をアセチル化して化学的性質を改質した前記多糖類を複合することにより、即ち、詳細には、感光剤の腫瘍組織内への蓄積率を高め、癌細胞以外では蛍光干渉により近赤外線を照射する際にも細胞毒性を示さないアセチル化された生体適合性多糖類と、より高い吸光係数と近赤外線領域での吸収を示す感光剤が結合された複合体を製造し、本発明を完成した。
【００１１】
したがって、本発明は、アセチル化された生体適合性多糖類と感光剤が結合して構成された光力学診断用または治療用結合体を提供する。
【００１２】
また、本発明は、生体適合性多糖類をアセチル化させるステップと、前記アセチル化された生体適合性多糖類を有機溶媒に溶解するステップと、前記生体適合性多糖類にフタロシアニン系化合物と触媒を添加して前記感光剤を前記生体適合性高分子に結合するステップと、を含む光力学診断用または治療用結合体の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明による前記光力学診断用または治療用結合体は、アセチル化された生体適合性多糖類とフタロシアニン系化合物を結合して製造されたものであり、体内における癌細胞への蓄積が容易であり、蛍光干渉により、蓄積されていない物質に近赤外線波長の光を照射しても細胞毒性を示さないという利点がある。また、癌細胞への蓄積が行われると、癌細胞内の酵素によって生体適合性多糖類と感光剤との結合が切断され、この際、近赤外線波長の光照射時に細胞毒性を示すことで近赤外線を照射する際に抗癌効果を極大化することができ、蛍光を示すことで映像化にも使用することができるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】アセチル化された生体適合性多糖類にフタロシアニン系化合物を結合させた本発明の生体適合性結合体が癌細胞内で細胞毒性を示すメカニズムを示した説明図である。
【図２】フタロシアニン、ナフタロシアニン、クロリン、バクテリオクロリン感光剤の吸光度を示した図である。
【図３】実施例で用いられたフタロシアニン系化合物のＭａｌｄｉ−ＴＯＦ分析結果を示した図である。
【図４】コンドロイチン硫酸とフタロシアニン系化合物がエステル結合によって結合されたＡｃ−Ｃｓ−Ｚｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨ結合体の構造式を示した図である。
【図５】Ａｃ−Ｃｓ−Ｚｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨのＮＭＲ分析結果を示した図である。
【図６】Ａｃ−Ｃｓ−Ｚｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨのＦＴ−ＩＲ分析結果を示した図である。
【図７】本発明の一実施例によって製造された光力学診断用または治療用結合体（ナノマイクロスフェア）を光散乱装置および電子顕微鏡を用いて観察したものであり、本発明の実施例１で製造されたＡｃ−Ｃｓ−Ｚｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨがナノマイクロスフェア形態をなした時のサイズ分布と形態を観察した結果である。
【図８】本発明の一実施例によって製造された光力学診断用または治療用結合体（ナノマイクロスフェア）を光散乱装置および電子顕微鏡を用いて観察したものであり、本発明の実施例１で製造されたＡｃ−Ｃｓ−Ｚｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨがナノマイクロスフェア形態をなした時のサイズ分布と形態を観察した結果である。
【図９】本発明の一実施例によって製造された光力学診断用または治療用結合体（ナノマイクロスフェア）を光散乱装置および電子顕微鏡を用いて観察したものであり、本発明の実施例１で製造されたＡｃ−Ｃｓ−Ｚｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨがナノマイクロスフェア形態をなした時のサイズ分布と形態を観察した結果である。
【図１０】本発明の一実施例によって製造された光力学診断用または治療用結合体（ナノマイクロスフェア）を光散乱装置および電子顕微鏡を用いて観察したものであり、本発明の実施例１で製造されたＡｃ−Ｃｓ−Ｚｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨがナノマイクロスフェア形態をなした時のサイズ分布と形態を観察した結果である。
【図１１】本発明の一実施例によって製造された光力学診断用または治療用結合体（ナノマイクロスフェア）を光散乱装置および電子顕微鏡を用いて観察したものであり、本発明の実施例１で製造されたＡｃ−Ｃｓ−Ｚｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨがナノマイクロスフェア形態をなした時のサイズ分布と形態を観察した結果である。
【図１２】本発明の一実施例によって製造された本発明のナノマイクロスフェア、すなわち実施例１で製造されたＡｃ−Ｃｓ−Ｚｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨに対して蛍光干渉効果が現れた時と現れなかった時の蛍光グラフを比較して示したものであり、様々な濃度のＡｃ−Ｃｓ−Ｚｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨと、ＤＭＳＯ上と脱イオン水（Di-water）上での蛍光値を改質していないＺｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨとを比較観察して示したものである。
【図１３】本発明の一実施例によって製造された本発明のナノマイクロスフェア、すなわち実施例１で製造されたＡｃ−Ｃｓ−Ｚｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨに対するレーザの照射による一重項酸素の生成能を示したグラフであり、ここで、●−は、改質化していないＺｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨのＤＭＳＯ上での酸素生成を示したものであり、−○−、−▼−、−△−は、それぞれ、本発明によるナノマイクロスフェア（Ａｃ−Ｃｓ−Ｚｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨ）１ｍｇ、２ｍｇ、５ｍｇのＤＭＳＯ上での酸素生性能を示したものである。
【図１４】本発明の一実施例によって製造された本発明のナノマイクロスフェア、すなわち実施例２で製造されたＡｃ−Ｃｓ−Ｚｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨナノマイクロスフェア１０μｇを癌細胞がない培養液Ａおよび癌細胞がある培養液Ｂにそれぞれ処理して、癌細胞の酵素作用によって分解されて発色する蛍光の程度をイメージで示した結果である。
【図１５】本発明の一実施例によって製造された本発明のナノマイクロスフェア、すなわち実施例１で製造されたＡｃ−Ｃｓ−Ｚｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨおよび対照群として用いた改質化されていないＺｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨをそれぞれ細胞に吸収させ、レーザを照射した後にＭＴＴ試薬を用いて細胞死を観察したものを比較して示したグラフであり、レーザ照射を８分間行い、改質していないＺｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨのレーザを照射していないもの（●−）と照射したもの（−○−）の細胞死の程度を比較して示した。
【図１６】本発明の一実施例によって製造された本発明のナノマイクロスフェア、すなわち実施例１で製造されたＡｃ−Ｃｓ−Ｚｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨおよび対照群として用いた改質化されていないＺｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨをそれぞれ細胞に吸収させ、レーザを照射した後にＭＴＴ試薬を用いて細胞死を観察したものを比較して示したグラフであり、レーザ照射を８分間行い、本発明の結合体であるＡｃ−Ｃｓ−Ｚｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨのレーザを照射していないもの（●−）と照射したもの（−○−）の細胞死の程度を比較して示した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、感光剤であるフタロシアニン系化合物とアセチル化された生体適合性多糖類が結合して構成された光力学診断用または治療用結合体を提供する。
【００１６】
本発明によるフタロシアニン系化合物とアセチル化された生体適合性多糖類が結合された光力学診断用または治療用結合体は、癌組織または癌細胞への蓄積率と標的率を高め、癌組織または癌細胞以外では蛍光干渉による光毒性を著しく低減することができる新たな光力学治療方法の手段であり、アセチル化された生体適合性多糖類が感光剤であるフタロシアニン系化合物と結合している光力学診断用または治療用結合体を提供する。
【００１７】
通常、生体適合性多糖類は水では溶解度が高いが、有機溶媒での溶解度が低くて従来の有機溶媒に容易に溶解しないため、このような多糖類を化学的に結合させることが困難である。しかし、本発明によると、前記多糖類をアセチル化して有機溶媒での溶解度を高めることで様々な化学的改質を可能にすることを特徴とする。さらに、従来の感光剤のみを用いた光力学治療剤は、疎水性が高くて注射剤として使用するには適しないだけでなく、癌細胞の蓄積効率と標的効率が低くて蛍光干渉を起こすことができず、体内で一般細胞にも影響を及ぼすことがあるため、局所にのみ投与しなければならなかったが、本発明によると、前記アセチル化により別の癌細胞標的物質なしに生体適合性多糖類自体でも癌細胞の表面に過発現している様々な受容体のうち標的化している一部の受容体と結合して癌組織への蓄積効率を高めることができ、以降、酵素作用によって容易に分解する。この際、蛍光干渉が解除されて近赤外線波長帯に光を照射すると癌細胞を消滅することができる。
【００１８】
本発明において、前記フタロシアニン系化合物と生体適合性多糖類の結合は、癌細胞内に蓄積する際に酵素の作用によってフタロシアニン系化合物と生体適合性多糖類との結合を切断できるものであれば特に制限されず、例えば、アミド結合（amide bond）、すなわち、−ＣＯ−ＮＨ−結合またはエステル結合（esterbond）であってもよく、生体適合性多糖類のＣＨ２ＯＨ基とフタロシアニン系化合物に導入した−ＣＯＯＨ基が結合して形成されるエステル結合が好ましい。エステル結合は、アミド結合をはじめその他の結合に比べて体内での分解効率が高くて、少量の感光剤だけでも高い治療効果を有することができるという有用性があるためである。
【００１９】
また、本発明による前記光力学診断用または治療用結合体は、親水性である生体適合性アセチル化多糖類誘導体と疎水性である感光剤のバランスにより水系で安定的にナノサイズの自己組立体（Self-assembly）であるナノゲルまたはナノマイクロスフェアの形態を有することができる。
【００２０】
本発明によるアセチル化された多糖類にフタロシアニン系化合物を結合させる結合体の製造方法は、有機溶媒に容易に溶解しない多糖類をアセチル化させることでＤＭＳＯやホルムアミドなどの有機溶媒上で感光剤であるフタロシアニン系化合物を用いて製造できるという有用性を特徴とする。以下、本発明による光力学診断用または治療用結合体の製造方法についてステップ別に、より詳細に記述する。
【００２１】
第１段階：生体適合性多糖類をアセチル化する段階
本発明の光力学診断用または治療用結合体を製造するためには、まず生体適合性多糖類をアセチル化する。
【００２２】
前記多糖類は、生体内で生体適合性および生分解性に優れる必要があり、生体内で安定性に優れるだけでなく、癌組織に効果的に蓄積される特性が必要である。
【００２３】
本発明で用いることができる多糖類としては生体内で生体適合性を有する多糖類または多糖類誘導体であれば何れも使用可能であり、プルラン（pullulan）、ヒアルロン酸（hyaluronic acid）、デキストラン（dextran）またはコンドロイチン硫酸（chondroitin sulfate）を用いることができ、これに制限されるものではない。本発明の一実施例ではコンドロイチン硫酸誘導体を用いた。
【００２４】
本発明で用いることができる前記多糖類のうちプルランは、黒色酵母（Aureobasidium pullulans、（ＤＥ  ＢＡＲＹ）ＡＲＮ．）から生成した多糖類を分離精製して得られる物質であり、主成分は中性多糖類である。プルランは水に容易に溶解する反面、アルコール類と油類には溶解しない特性を有しており、他のガム類に比べて粘度は低い方に属するが、酸、アルカリ、熱などに対して安定している。特に、被膜性の他に強い粘着力を有しており、平均分子量は２００，０００と１００，０００の２種類があり、粘度は室温で１〜２ｃｐｓである。
【００２５】
【化１】
0005721853.tif 000002
【００２６】
また、本発明で用いることができる多糖類であるヒアルロン酸は、コンドロイチン硫酸などと共に主なムコ多糖類として知られている。ヒアルロン酸は、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸が交互に鎖状に結合した化合物であり、目の硝子体や臍帯などに存在しており、粘性が大きく、細菌の侵入や毒物の浸透を防止するために重要である。これは植物のペクチン質と類似しており、ヒアルロニダーゼによって加水分解される。１９３４年ウシの硝子体膜からマイアが初めて取得し、硝子体膜（hyaloid）のウロン酸という意味で名付けた。これに両親媒性を与え、有機溶媒における溶解度を高めるためにピリジンと無水酢酸をホルムアミド上で結合する。
【００２７】
【化２】
0005721853.tif 000003
【００２８】
また、本発明で用いることができる多糖類であるコンドロイチン硫酸は、軟骨の主成分として知られたＮ−アセチルガラクトサミン／ウロン酸（グルクロン酸またはイズロン酸）／硫酸からなる多糖類であり、皮膚／臍帯／肉芽など各種結合組織にも含有されている。
【００２９】
ウロン酸の種類と硫酸基の結合位置によってＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅなどの型に分けられる。
【００３０】
【化３】
0005721853.tif 000004
【００３１】
前記本発明による高分子は、市販のものを購入して用いるか、当業界に公知の方法により天然から分離および精製して用いることができ、好ましくは、高分子物質に存在する不純物を除去し、純度を高めるためにきれいに精製して用いることができる。
【００３２】
また、前記アセチル化は、前記多糖類、すなわち前記高分子を有機溶媒に溶解した後、前記溶解された溶液にピリジンおよび無水酢酸を添加して行うことができ、コンドロイチン硫酸をホルムアミド溶媒に溶解した後、ピリジンおよび無水酢酸を添加して１０〜１４時間室温より高い温度条件で撹拌する過程によりアセチル化させることができる。
【００３３】
【化４】
0005721853.tif 000005
【００３４】
第２段階：アセチル化された生体適合性多糖類を有機溶媒に溶解する段階
前記アセチル化された多糖類を有機溶媒に溶解する過程は、多糖類が有機溶媒下で十分に溶解されるように適量の有機溶媒を用いることが好ましく、この際、有機溶媒の使用量が多すぎる場合にはＤＭＳＯやホルムアミドのように溶媒の種類によって以降透析により除去する過程が非常に複雑になり、有機溶媒の使用量が少なすぎる場合には高分子が互いに凝集する現象が生じ得る。
【００３５】
本発明で用いることができる有機溶媒は、これに制限されるものではないが、例えば、ＤＭＳＯ、ホルムアミド（formamide）およびＤＭＦであってもよく、ＤＭＳＯまたはホルムアミドであってもよい。
【００３６】
第３段階：感光剤をアセチル化された生体適合性高分子に結合する段階
第２段階によりアセチル化された生体適合性多糖類（すなわち、高分子）を有機溶媒に溶解した後、これにフタロシアニン系化合物と触媒を添加して前記フタロシアニン系化合物を前記生体適合性多糖類に結合する。
【００３７】
フタロシアニン系化合物と生体適合性多糖類の結合は、癌細胞内に蓄積する際に酵素の作用によってフタロシアニン系化合物と生体適合性多糖類との結合を切断することができるエステル結合またはアミド結合を形成するが、生体適合性高分子のＣＨ２ＯＨ基とフタロシアニン系化合物に導入した−ＣＯＯＨ基が結合して形成されるエステル結合になることができる。
【００３８】
本発明において、前記フタロシアニン系化合物は近赤外線で蛍光を示し、疎水性を有し、カルボキシル化した化合物であり、−ＣＯＯＨ基を含むものを用いることができ、近赤外線範囲に反応し、−ＣＯＯＨ基を有するフタロシアニン系化合物であればその種類は制限されない。
【００３９】
本発明の具体例によると、前記フタロシアニン系化合物は、中心構造に金属イオンを含んでいるフタロシアニン、その誘導体、ナフタロシアニンまたはその誘導体であってもよく、この際、前記中心金属イオンは、Ｚｎ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｇａ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｎｉ、ＰまたはＣｒであってもよい。
【００４０】
より具体的に、本発明によるフタロシアニン系化合物は下記化学式１の化合物であってもよい。
【００４１】
【化５】
0005721853.tif 000006
【００４２】
ここで、前記Ｒ１Ｒ２、Ｒ３乃至Ｒ４は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−ＣＯＯＨ、−ＳＯ３Ｈ、またはＣＯＯＨ若しくは−ＳＯ３Ｈで置換若しくは非置換のベンゼン環であってもよく、前記Ｍは、Ｚｎ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｇａ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｎｉ、ＰまたはＣｒであってもよい。
【００４３】
本発明の一実施例では、下記化学式１−１で表されるフタロシアニン系化合物を用いた。
【００４４】
【化６】
0005721853.tif 000007
【００４５】
本発明の一実施例で用いた前記化学式１−１のフタロシアニン系化合物は、従来の感光剤に比べて６００〜８００ｎｍの近赤外線波長で高いモル吸光係数を有するため、標的癌の内部までの深い浸透力を有しており、高いモル吸光係数特性によって少量の投入で所望の効果が得られるという点において優れた光力学治療剤として利用可能な物質である。
【００４６】
前記結合反応時の触媒は、フタロシアニン系化合物の−ＣＯＯＨ基を活性化させる作用を行う物質であり、フタロシアニン系化合物とともにＤＭＳＯやホルムアミドなどの有機溶媒に溶解させて用いるが、前記触媒としては、例えば、４−ヒドロキシメチル安息香酸（4-hydroxymethylbenzoic acid；ＤＭＡＰ）または１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（1,3-dicyclohexyl carbodiimide；ＤＣＣ）を用いてもよい。
【００４７】
また、生体適合性多糖類にフタロシアニン系化合物をエステル結合により結合させる反応は、分子量が相対的に大きい多糖類と分子量が相対的に小さい触媒およびフタロシアニン系化合物を反応させるものであるため、好ましくは、生体適合性多糖類に有機溶媒に溶解されたフタロシアニン系化合物と触媒の混合溶液を一滴ずつ滴下しながら反応させて、前記高分子と感光剤とのエステル結合が十分に形成されるようにする。また、前記反応は、合成がうまく行われるように４５〜５０時間程度、水分および光のない環境で均一に混ぜながら反応させることができる。
【００４８】
上述した方法の反応過程により、生体適合性多糖類にフタロシアニン系化合物が結合して構成された本発明の光力学診断用または治療用結合体を製造することができる。
【００４９】
この際、前記結合過程で用いた有機溶媒を除去する段階を追加することが好ましいが、有機溶媒の除去は、当業界において通常用いられる濾過または透析の方法などを用いることができ、好ましくは、透析膜を用いて有機溶媒を除去することができる。
【００５０】
透析膜により有機溶媒を除去する場合には、透析膜が熱に弱い特性を有するため透析過程において周辺の温度が高すぎず、室温を維持するように留意しなければならない。より具体的に、ＤＭＳＯやホルムアミドと水が接する際に生じる熱によって透析膜が損傷しやすいため反応液を透析膜に入れる前に反応させた容器に若干の水を添加してから冷やす。次に、反応液を透析膜に入れて有機溶媒が完全に除去されるまで水槽に入れて蒸留水を入れ替えることが好ましい。
【００５１】
また、透析過程を経た反応溶液を凍結乾燥する段階を追加することができるが、凍結乾燥により生体適合性多糖類にフタロシアニン系化合物が結合された結合体を容易に回収することができる。前記凍結乾燥は、当業界に公知の方法であれば何れも使用することができ、好ましくは、液体窒素を用いて凍結乾燥させることができるが、液体窒素上で約５分〜１５分間反応溶液を完全に冷却した後、真空乾燥機を用いて水分を完全に蒸発させて目的とする結合体を回収することができる。
【００５２】
次に、凍結乾燥により得られた結合体は、未反応物質を除去するために前記ＤＭＳＯやホルムアミドなどの有機溶媒に再度溶解した後、前記透析による溶媒除去および凍結乾燥の段階を繰り返して回収することができ、これによって純度を高めることができる。
【００５３】
本発明の一実施例では、生体適合性多糖類としてコンドロイチン硫酸をピリジンおよび無水酢酸を添加してアセチル化させ、感光剤としてフタロシアニン系化合物を用いて前記アセチル化された多糖類に結合する過程により光力学診断のための生体適合性高分子と感光剤の結合体を製造しており、製造過程を模式図で示すと次のとおりである。
【００５４】
【化７】
0005721853.tif 000008
【００５５】
これにより、本発明は、アセチル化された多糖類とフタロシアニン系化合物を結合させた光力学診断または治療のための結合体の製造方法を提供することができ、より具体的に、前記方法は、生体適合性多糖類をアセチル化する段階と、前記生体適合性多糖類を有機溶媒に溶解する段階と、前記生体適合性多糖類に有機溶媒に溶解されたフタロシアニン系化合物と触媒を添加して前記多糖類を前記フタロシアニン系化合物に結合する段階と、を含むことができる。
【００５６】
また、上述した方法によって製造された本発明の光力学診断用または治療用結合体は、水系において安定的にナノ粒子、すなわち、ナノゲルまたはナノマイクロスフェアの形態であることができ、平均粒径は１００〜２５０ｎｍであることができる。
【００５７】
本発明の一実施例によると、本発明の結合体の製造過程において疎水性であるフタロシアニン系化合物の濃度を変えて結合体を製造した後、各結合体のサイズおよび形態を動的光散乱機器および電子顕微鏡を用いて測定した結果、フタロシアニン系化合物を多く用いるほど疎水性が増加し、互いの凝集力が増加して結合体（ナノマイクロスフェア）のサイズが減少することが分かった。
【００５８】
一方、従来用いられた光力学診断用または治療用感光剤は、癌細胞の蓄積率と標的率が低く、蛍光干渉を起こすことができないため、光を照射すると体内で一般細胞、すなわち正常細胞にも細胞毒性が示され、治療効果が低く、様々な副作用を誘発するという問題点があった。
【００５９】
しかし、本発明による光力学診断用または治療用結合体は、血液循環時または正常組織では近赤外線を照射する際にも細胞毒性を示さない反面、癌組織または癌細胞に対してのみ選択的に標的、蓄積および分解されて、近赤外線波長の光を照射すると、一重項酸素またはフリーラジカルを生成して細胞毒性を示して癌組織の細胞死を誘導することにより光力学治療の効能を最大化することができるという特徴がある。
【００６０】
さらに、癌組織または癌細胞への選択的な標的のために、本発明の光力学診断用または治療用結合体は、癌細胞標的物質をさらに含むことができる。光力学治療において疎水性感光剤のみを用いる場合、これを静脈注射すると血液内でタンパク質と結合し、これは細胞の表面に位置する受容体を介して細胞の内部に移動すると知られているが、このような場合には感光剤の細胞選択特異性が単純に感光剤の疎水性のみによって規定され、また組織または細胞での残留時間も場合によって多くの差を示すため好ましくない。また、これは光力学治療の効果を減少させ、治療後に再発確率を増加させる要因として指摘されて来た。
【００６１】
このような問題点を解消する方法としては、特定の部位に選択的に作用するか否かを単純に各種の感光剤を用いた試行錯誤を経て選別する方法にのみ依存している。しかし、本発明でのように感光剤を効果的に組織特異的に伝達するために癌細胞標的物質をさらに結合すると、癌細胞に対する選択性をより高めることができる。癌細胞の表面には特異な受容体が多量発現しており、正常細胞ではなく癌細胞にのみ効果的に標的および浸透されることができる。
【００６２】
本発明において、癌細胞標的物質とは、癌細胞の特異な受容体に結合することができるものであり、前記癌細胞標的物質は、例えば、葉酸、またはＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＣＤ３４またはＢｃｌ−２タンパク質に対するモノクローナル抗体であってもよい。
【００６３】
また、本発明の光力学診断用または治療用結合体は、レーザ照射時に細胞毒性を誘発させ得る一重項酸素またはフリーラジカル生成能を有しているが、本発明の一実施例によると、本発明で製造した結合体、すなわちナノマイクロスフェアは陽性対照群として用いたフタロシアニン系化合物と一重項酸素の生成程度が類似していることが分かった。
【００６４】
本発明の他の一実施例によると、癌細胞に蓄積されなかった本発明の光力学診断用または治療用結合体が細胞に対して毒性を示すか否かを確認する実験を行ったが、体内と類似した条件である水系では前記結合体がナノマイクロスフェアの形態を構成して蛍光干渉を起こすため、近赤外線波長の光を照射しても全く反応がないことが分かった。反面、癌細胞に蓄積された場合には細胞毒性を示して癌細胞の細胞死が増加することが分かった。
【００６５】
したがって、本発明者らは、このような結果により本発明の結合体は、癌細胞に蓄積されなかった場合には光を照射しても反応性を示さないため、細胞毒性を示さず体内で安定しており、癌細胞に蓄積された場合にのみ細胞毒性を示して治療効果を示すという事実が分かった。
【００６６】
また、本発明の結合体は、癌細胞に選択的に標的および浸透されると癌細胞の酵素作用、すなわち生体内酵素であるエステラーゼ（esterase）などの酵素によりエステル結合が切断（分解）されて蛍光干渉が解除されることで蛍光を示す特徴がある。
【００６７】
したがって、本発明は、本発明の結合体が癌組織または癌細胞に選択的に蓄積される場合、癌細胞内の酵素作用によって蛍光干渉が解除され、レーザの照射によって癌細胞にのみフタロシアニン感光剤が蛍光発色を示すことができるため、このような蛍光の有無により癌を診断することもできる。
【００６８】
さらに、本発明は、本発明による前記結合体を有効成分として含む癌治療用組成物を提供することができる。
【００６９】
本発明において、「治療」とは、他に言及しない限り、前記用語が適用される疾患または疾病、または前記疾患または疾病の一つ以上の症状を逆転または緩和させたり、その進行を抑制または予防することを意味する。
【００７０】
本発明による前記癌治療用組成物は、薬学的に有効な量の本発明の光力学診断用または治療用結合体を単独で含むか一つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤などの追加成分を含むことができる。前記の薬学的に有効な量とは、癌の症状を予防、改善および治療するために十分な量を意味する。
【００７１】
本発明による光力学診断用または治療用結合体の薬学的に有効な量は、０．５〜１００ｍｇ／ｄａｙ／体重ｋｇであり、好ましくは０．５〜５ｍｇ／ｄａｙ／体重ｋｇである。しかし、前記薬学的に有効な量は、疾患症状の程度、患者の年齢、体重、健康状態、性別、投与経路および治療期間などに応じて適切に変化させることができる。
【００７２】
前記の薬学的に許容される追加成分とは、生理学的に許容され、人間に投与される際に、通常胃腸障害、めまいなどのアレルギー反応またはこれと類似した反応を起こさないものを言う。前記担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストローズ、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油が挙げられる。また、充填剤、抗凝血剤、滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤および防腐剤などをさらに含むことができる。
【００７３】
また、本発明の組成物は、哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速、持続または遅延された放出を提供するように当業界に公知の方法を用いて剤形化されることができる。剤形は、粉末、顆粒、錠剤、エマルジョン、シロップ、エアロゾル、軟質または硬質のゼラチンカプセル、滅菌注射溶液、滅菌粉末の形態であることができる。
【００７４】
本発明による癌治療用組成物は、経口、経皮、皮下、静脈または筋肉を含む様々な経路を介して投与されることができ、活性成分の投与量は投与経路、患者の年齢、性別、体重および患者の重症度などの様々な要素によって適切に選択されることができる。
【００７５】
また、本発明による結合体または前記結合体を含む組成物を用いて疾病を治療または診断する場合に用いることができる光源としては、これに制限されないが、超音波照射放出器、光放出ダイオード、レーザダイオード、染料レーザ、ハロゲン化金属ランプ、フラッシュランプ、機械的にフィルタリングした蛍光光源、機械的にフィルタリングした白熱光源、およびフィラメント光源を含む生体外光照射のための光源と、光力学治療用レーザファイバーなどを含む生体内光照射のための光源からなる群から選択される一つ以上のものを用いることができ、本発明において前記感光剤は、６００ｎｍ〜７００ｎｍ範囲の近赤外線光線で活性を示すことができる。
【００７６】
また、本発明による前記結合体は、親水性の多糖類と疎水性のフタロシアニン系化合物を含んでおり、前記結合体がナノマイクロスフェアの形態で存在することができるが、前記ナノマイクロスフェアは治療学的活性を示す薬物または生物製剤をさらに含むことができ、好ましくは、抗癌剤を含むことができる。この際、前記薬物または生物製剤はナノマイクロスフェアの内部に封入された形態で含まれることができる。
【００７７】
以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。これら実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものにすぎず、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは当業界において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００７８】
＜実施例１＞光力学診断用または治療用ナノマイクロスフェアの製造
＜１−１＞フタロシアニン系化合物の製造
＜１−１−１＞前駆体Ｒ１の合成
４−メトキシ−３，６−テルト−ブチルフェノール（4-methoxy-3,6-tert-butylphenol）３.６６ｇ（１５.６ｍｍｏｌ）と４−ニトロフタロニトリル（4-nitrophthalonitrile）２.７０ｇ（１５.６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ１００ｍＬに入れてＮ２パージ（Purge）後、還流（reflux）温度まで昇温した。還流開始から４時間になるまでＫ２ＣＯ３を２.８６ｇ投入し、２４時間維持した。
【００７９】
２４時間還流した後、水を１００ｍＬ添加して撹拌し、Ｋ２ＣＯ３とＤＭＳＯ除去して若干粘度のある白色の物質を析出した。これにエーテルを十分に入れて生成物（Product）のみ抽出した後、蒸発器で乾燥して淡黄色（Pale yellow）の生成物１−１−１を得た。
【００８０】
＜１−１−２＞−ＣＯＯＨ前駆体Ｒ２の合成
ペンチル−４−ヒドロキシベンゾエイト（Pentyl-4-hydroxybenzoate）２.４０５ｇ（１２.３７ｍｍｏｌ）と４−ニトロフタロニトリル２ｇ（１１.５６ｍｍｏｌ）を無水のＤＭＳＯ８２.５ｍＬに入れてＮ２パージ後、還流温度まで昇温した。還流開始から４時間になるまで毎時間ごとにＫ２ＣＯ３を１.０５４ｇ投入し、２９時間維持し、ＴＬＣ上で４−ニトロフタロニトリルが除去されたことを確認した。
【００８１】
２９時間還流した後、蒸発器で乾燥して得られた濃い褐色の生成物をＥＡと水を十分に入れて全て溶解してから抽出し、分離した水層は、再度ＥＡを入れて複数回繰り返して抽出して得られた溶液（solution）を約１５０ｍＬのみが残るまで蒸発器で乾燥し、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液２００ｍＬで洗浄した。分液漏斗（separatory funnel）で均一に混ぜた後、ＥＡ層はＭｇＳＯ４を通過させて得て、蒸発器により再度乾燥して濃い褐色の液状生成物を得て、カラムにより純粋に分離した物質約１ｇの液状生成物１−１−２を得た。
【００８２】
＜１−１−３＞フタロシアニン誘導体合成
前記製造された１−１−２のベンゾエイト（Benzoate）前駆体０．３３４ｇと１−１−１のアルキル（alkyl）前駆体０．８３７ｇを無水のペンタノール５０ｍＬに入れてＺｎＣｌ２０．４０９ｇを添加した後、Ａｒガスを十分に入れた。反応液を１５０℃まで昇温した後、ＤＢＵを２.２５ｍＬ滴下してから２４時間還流を行った。２４時間後に蒸発を行って濃い青緑色の生成物を得た。得られた生成物をＭＣとＭｅＯＨを用いるカラムクロマトグラフィーにより精製して青緑色の固相物質１−１−３を得た。
【００８３】
得られた１−１−３をＴＨＦ４０ｍＬに溶解した後、ＬｉＯＨ  Ｈ２Ｏ（１ｇ、２３.３４ｍｍｏｌ）をメタノール：Ｈ２Ｏ  ７:３に溶解した溶液と混合した後、７５℃まで昇温して１７時間還流を行った。１７時間還流を行ってから溶液を蒸発させた後、残渣を約１００ｍＬのＭＣに溶解して０．１Ｍ  ＨＣｌ水溶液を滴下（dropwise）しながらｐＨ２で滴定し、室温で３時間撹拌した。次に、水を十分に入れて抽出（ＭｇＳＯ４通過）し、ＣＨＣｌ３とＭｅＯＨでカラムを行い、最終の生成物はＭａｌｄｉ−ＴＯＦで分子量を確認し、結果を図３に示した。
【００８４】
前記実施例により下記化学式１−１の構造式を有するフタロシアニン系化合物を取得した。
【００８５】
【化８】
0005721853.tif 000009
【００８６】
＜１−２＞コンドロイチン硫酸のアセチル化
コンドロイチン硫酸（０．５ｇ）を１０ｍＬのホルムアミド溶媒に溶解した。その後、ピリジン５５μＬと無水酢酸５５μＬを入れた後、温度を若干高める条件である５５℃で約１２時間均一に混ぜながら反応させた。このようにして反応が終了したサンプルは透析膜を介して透析してから凍結乾燥させて回収した。
【００８７】
＜１−３＞アセチル化されたコンドロイチン硫酸と感光剤の結合
前記＜１−２＞で凍結乾燥により回収されたアセチル化されたコンドロイチン硫酸５０ｍｇを水分を除去した有機溶媒であるＤＭＳＯまたはホルムアミド１０ｍＬにそれぞれ溶解した。一方、感光剤として＜１−１＞で製造したフタロシアニン系化合物１ｍｇ、２ｍｇ、５ｍｇをそれぞれＤＭＡＰおよびＤＣＣとともにＤＭＳＯやホルムアミド３ｍＬに十分に溶解して−ＣＯＯＨ基を活性化させた。アセチル化されたコンドロイチン硫酸が溶解している前記有機溶媒１０ｍＬに−ＣＯＯＨ基が活性化された前記それぞれの感光剤溶液３ｍＬを一滴ずつ滴下した後、均一に混ぜながら約４８時間十分にエステル結合反応を行い、反応が終了した溶液は前記実施例＜１−２＞の方法と同一の過程により回収して冷凍保管することにより本発明による光力学治療または診断用結合体であるナノマイクロスフェアを製造し、それぞれのサンプルに対してそれぞれＡｃ−Ｃｓ−Ｚｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨ１、Ａｃ−Ｃｓ−Ｚｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨ２およびＡｃ−Ｃｓ−Ｚｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨ３と称した。
【００８８】
図４はコンドロイチン硫酸と化学式１−１のフタロシアニン系化合物がエステル結合によって結合されたＡｃ−Ｃｓ−Ｚｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨ結合体の構造式を示しており、また図６に示されたように、Ａｃ−Ｃｓ−Ｚｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨのＦＴ−ＩＲ分析結果を見ると、Ａｃ−Ｃｓ−Ｚｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨデータが生体適合性高分子とフタロシアニン系化合物の結合の特性であるエステル結合特性を示す１７３０ｃｍ−１でピークが現われることを確認した。
【００８９】
＜実施例２＞ナノマイクロスフェアの特性分析
＜２−１＞ナノマイクロスフェアのサイズおよび形態測定
前記実施例１で製造したアセチル化されたコンドロイチン硫酸にフタロシアニン系化合物を結合した生体適合物質の三つのサンプルを１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解して動的光散乱法（Dynamic light scattering、ＤＬＳ）を用いてサイズを測定し、電子顕微鏡（Field emissionscanning electromicroscopy、ＦＥ−ＳＥＭ）を用いて形態を確認した。この際、サイズの正確な測定のために０．１ＭのＮａＣｌで希釈してサイズを測定した。前記結果は図７から図１１にそれぞれ示した。生体適合性多糖類であるコンドロイチン硫酸にフタロシアニン系化合物がエステル結合により結合されて形成されたナノマイクロスフェアのサイズおよび形態は、図９から図１１に示したように、１００〜８００ｎｍに分布し、約２３０ｎｍに集中していることが分かる。また、３Ａにおいて、大きい粒子は感光剤の量が少ない場合（Ａｃ−Ｃｓ−Ｚｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨ１）を示しており、小さい粒子は感光剤の量が多い場合（Ａｃ−Ｃｓ−Ｚｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨ２）を示すため、多糖類に結合する感光剤が多いほど疎水性が増加して互いの凝集力が強くなり、マイクロスフェアのサイズが減少することが分かった。
【００９０】
＜２−２＞蛍光干渉有無の確認
前記実施例１で取得したＡｃ−Ｃｓ−Ｚｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨをＤＭＳＯと脱イオン水に様々な濃度でそれぞれ溶解した後、コダック社製イメージステーションと蛍光スペクトロフォトメーターを用いて蛍光現象を確認した（図１２）。６５０〜７５０ｎｍの波長範囲で測定する際にＤＭＳＯすなわち有機溶媒上（Ａ）では濃度によって蛍光の強度とイメージが相違したが、脱イオン水では自体蛍光干渉が生じてＤＭＳＯに比べて著しく低い蛍光が示された。これはＡｃ−Ｃｓ−Ｚｎ−ＣＯＯＨが有機溶媒上ではマイクロスフェアが形成されず、蛍光干渉が生じない反面、脱イオン水上でナノマイクロスフェアを形成しながら蛍光干渉現象が生じた結果であると考えられる。このような結果により、本発明者らは光力学治療で癌細胞に蓄積されなかったナノマイクロスフェアの場合、細胞毒性を示さないため体内で安定的に用いることができるということが分かった。
【００９１】
＜２−３＞ナノマイクロスフェアの一重項酸素生成能の評価
前記実施例１のＡｃ−Ｃｓ−Ｚｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨ結合体を光力学診断または治療剤としての使用可能性を検証するために改質化されていない実施例１−１で製造したフタロシアニン系感光剤と比較してレーザの照射による一重項酸素生成能を測定した。まずＡｃ−Ｃｓ−Ｚｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨ結合体と改質化されていないフタロシアニン系感光剤を有機溶媒であるＤＭＦとＰＢＳ２ｍＬにそれぞれ（フタロシアニン系感光剤１.５μｇ／ｍＬ）溶解した後、一重項酸素を検出することができる少量の９，１０−ジメチルアントラセン（9,10-dimethylanthracene）を入れて２０μｇ／ｍＬの濃度に合わせた。フタロシアニン系感光剤が一重項酸素を生成することができると知られた６７０ｎｍ波長のレーザを用いて４０秒間隔でレーザを照射した後、蛍光スペクトロフォトメーター（Spectro-fluorephotometer）を用いてＥｘ３６０ｎｍ、Ｅｍ３８０〜５５０ｎｍで蛍光を測定した。前記実験を行った結果、図１３に示されたように、本発明のＡｃ−Ｃｓ−Ｚｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨ結合体は改質化されていないＺｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨとほぼ同一の一重項酸素を生成することができることを確認した。これにより本発明のナノマイクロスフェアが標的細胞（癌細胞）内で一重項酸素の生成により癌細胞を消滅させることができることが分かった。
【００９２】
＜２−４＞癌細胞の酵素作用による蛍光干渉の解除測定実験
１×１０４の細胞数で分注したＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレートで培養した後、前記細胞に本発明のナノマイクロスフェアを１０μｇで処理してから、コダック社製イメージステーション機器を用いて蛍光現象を観察した。この際、対照群としてはＨｅＬａ細胞のない培養液に本発明のナノマイクロスフェアを処理したものを用いた。その結果、図１４に示されたように、ＨｅＬａ細胞のない一般培養液のウェルでは蛍光干渉が解除されなかったが、ＨｅＬａ細胞が分注している培養液のウェルでは培養時間が経過するほど蛍光干渉が解除されて蛍光を示すことを観察することができた。したがって、本発明者らは、前記結果により本発明で製造したナノマイクロスフェアの場合、癌細胞に標的および蓄積されると癌細胞の酵素作用によって蛍光干渉が解除され、以降近赤外線波長の光を照射すると感光剤によって癌細胞を消滅させる過程により癌を治療することができるという事実が分かった。
【００９３】
＜２−５＞細胞毒性評価実験
前記実施例１で製造した本発明によるナノマイクロスフェアに対して細胞毒性試験を行った。まず癌細胞としてＨｅＬａ細胞を１０％のＦＢＳと１％のペニシリンが含まれているＲＰＭＩ１６４０培養液で５％ＣＯ２および３７℃の温度条件で培養した。次に、細胞毒性実験は、前記培養されたＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレートに１×１０４細胞数で分注して２４時間培養させた後、翌日、本発明によるナノマイクロスフェア（１.２５ｍｇの感光剤が添加されたナノマイクロスフェア）を濃度別に希釈して１００μＬずつ各ウェルに添加した。
【００９４】
次に、ナノマイクロスフェアが細胞に作用するように１２時間さらに培養器で培養した後、近赤外線波長帯の光（６７０ｎｍ）で１.２Ｊ／ｃｍ２の量で照射した。この際、サンプルと比較して濃度と処理時間は同一であるが、前記光の照射は受けていない細胞群を対照群として用いた。次に、培養器でまた一日培養させた。
【００９５】
最後に、培養が終了した細胞にＭＴＴ試薬（3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide）を２０μＬずつ入れて３〜４時間また培養した。４時間後に培養液とＭＴＴ試薬などを全て除去してＤＭＳＯ１５０μＬずつを加えて細胞に形成された青紫色を帯びる非水溶性ホルマザン（formazan）を溶解した。その後、ＥＬＩＺＡ分析器を用いて５９５ｎｍで吸光度を測定することで形成されたホルマザンの量を比較し、細胞の生存率および複合体の細胞毒性が分かった（図１５、図１６）。
【００９６】
その結果、図１５、図１６に示したように、本発明で製造した改質されていないＺｎ−Ｐｃ−ＣＯＯＨおよびナノマイクロスフェアを細胞にそれぞれ添加して培養した後、近赤外線を照射しなかった場合には照射時間に関係なく細胞死が生じない反面、近赤外線を照射した場合には照射時間に比例して細胞死が生じて細胞生存率が減少することが分かった。これにより、感光剤は前記実施結果のように光を照射した場合にのみ一重項酸素を生成して細胞を消滅することができることをさらに確認することができ、ナノマイクロスフェアの場合、細胞に添加されると高分子によって独立した蛍光干渉が酵素によって解除されて正常な一重項酸素を生成して細胞死を起こすことを確認することができた。
【００９７】
以上、本発明についてその好ましい実施例を中心に説明した。
【００９８】
本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者は、本発明が本発明の本質的な特性から外れない範囲で変形された形態に実現されることができることを理解することができる。したがって、開示された実施例は限定的な観点ではなく、説明的な観点で考慮すべきである。本発明の範囲は上述した説明ではなく、特許請求範囲に示されており、それと同等な範囲内にある全ての差異は本発明に含まれると解釈すべきである。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明は、体内で癌細胞への蓄積が容易であり、蓄積されなかった物質は蛍光干渉によって近赤外線波長の光を照射しても細胞毒性を示さないことができる。また、癌細胞への蓄積が行われると癌細胞内の酵素によって生体適合性多糖類と感光剤との結合が切断され、この際、近赤外線波長の光照射時に細胞毒性を示すことで近赤外線を照射する際に抗癌効果を極大化することができ、蛍光を示すことで映像化にも使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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