(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)  ＨＶＲ−Ｌ１がアミノ酸配列RASQDVDTSLA(配列番号：８７)を含み、
(ii) ＨＶＲ−Ｌ２がアミノ酸配列SASFLYS(配列番号：８８)を含み、
(iii)ＨＶＲ−Ｌ３がアミノ酸配列QQSTGHPQT(配列番号：８９)を含み、
(iv) ＨＶＲ−Ｈ１がアミノ酸配列GFTFTSTGIS(配列番号：８４)を含み、
(v)  ＨＶＲ−Ｈ２がアミノ酸配列GRIYPTSGSTNYADSVKG(配列番号：８５)を含み、そして、
(vi) ＨＶＲ−Ｈ３がアミノ酸配列ARTYGIYDLYVDYTEYVMDY(配列番号：８６)を含む、
抗ＦＧＦＲ３アンタゴニスト抗体。
【請求項２】
抗体が、配列番号：１３２を含む重鎖可変領域と配列番号：１３３を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１に記載の抗ＦＧＦＲ３アンタゴニスト抗体。
【請求項３】
抗体が、以下の性質の一又は複数を含む、請求項１又は２のいずれか一項に記載の抗ＦＧＦＲ３アンタゴニスト抗体。
（ａ）１×１０−８以上の強さのＫｄでヒトＦＧＦＲ３を結合する、
（ｂ）アミノ酸配列LAVPAANTVRFRCPA(配列番号：１７９)および／またはSDVEFHCKVYSDAQP(配列番号：１８０)と、少なくとも９０％、９５％、又は９８％の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを結合する、
（ｃ）ＦＧＦＲ３レセプターと該レセプターの他のユニットとの二量体化を阻害し、これによってレセプターの活性化が阻害される、及び、
（ｄ）(a) ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＲ２４８Ｃと、(b) 一又は複数のＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９ＣおよびＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＧ３７２Ｃを阻害する。
【請求項４】
抗体が、以下の性質の一又は複数を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗ＦＧＦＲ３アンタゴニスト抗体。
（ａ）抗体依存性細胞媒介細胞障害活性を有する、
（ｂ）ＦＧＦＲ３下方制御を誘導しない、
（ｃ）抗体の二価の様式がアゴニスト機能を備えていない、
（ｄ）ＦＧＦＲ３ ＩＩＩｂの残基１５４、１５５、１５８、１５９、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７７、２０２、２０５、２０７、２１０、２１２、２１４、２１６、２１７、２４１、２４６、２４７、２４８、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、３１４、３１５、３１６、３１７および／または３１８の少なくとも１、２、３、４又はすべての数以下の任意の数に結合する。
【請求項５】
抗体がフレームワーク配列を含み、該フレームワーク配列の少なくとも一部がヒトコンセンサスフレームワーク配列である、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗ＦＧＦＲ３アンタゴニスト抗体。
【請求項６】
抗体がヒトκサブグループコンセンサスフレームワーク配列及び／又は重鎖ヒトサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク配列を含む、請求項５に記載の抗ＦＧＦＲ３アンタゴニスト抗体。
【請求項７】
抗体がＦｃ領域を含み、前記Ｆｃ領域がアミノ酸残基に１以上の変化を含み、これによってエフェクター機能が低減される、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗ＦＧＦＲ３アンタゴニスト抗体。
【請求項８】
抗体がＩｇＧ１クラスであり、変異Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ（ＥＵインデックスによる番号付け）を含む、請求項７に記載の抗ＦＧＦＲ３アンタゴニスト抗体。
【請求項９】
抗体がモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、親和性成熟抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体および抗体断片からなる群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗ＦＧＦＲ３アンタゴニスト抗体。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターを含むインビトロの宿主細胞。
【請求項１３】
抗ＦＧＦＲ３抗体の製造方法であって、ポリヌクレオチドが発現するように、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することを含む方法。
【請求項１４】
培養物から抗体を回収することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体と薬学的に許容可能な担体とを含有してなる薬学的製剤。
【請求項１６】
細胞増殖を阻害する、及び／又は、癌細胞を枯渇させるための、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗ＦＧＦＲ３アンタゴニスト抗体を含む薬剤。
【請求項１７】
癌を治療するための、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗ＦＧＦＲ３アンタゴニスト抗体を含む医薬。
【請求項１８】
癌が、固形腫瘍、多発性骨髄腫、膀胱癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、甲状腺癌、頭頸部癌、肝癌、乳癌、胃癌、移行上皮癌及び結腸直腸癌からなる群から選択される、請求項１７に記載の医薬。
【請求項１９】
癌が、ＦＧＦＲ３活性化及び／又はＦＧＦＲ３過剰発現と関連している、請求項１７に記載の医薬。
【請求項２０】
骨格疾患を治療又は予防するための、請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗ＦＧＦＲ３アンタゴニスト抗体を含む医薬。
【請求項２１】
骨格疾患が、軟骨発育不全症、軟骨異栄養症、矮小発育症、致死性骨異形成症及び頭蓋骨癒合症症候群からなる群から選択される、請求項２０に記載を含む医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願についての相互参照）
本出願は、２００９年３月２５日に出願の米国特許出願第６１／１６３２２２号の優先権を主張し、この内容は出典明記によって本明細書中に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、概して分子生物学の分野に関する。特に本発明は、抗ＦＧＦＲ３抗体およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
線維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)およびそのレセプター(ＦＧＦＲ)は、胚発生、組織恒常性および代謝の間に重要な役割を果たす(１−３)。ヒトにおいては、２２つのＦＧＦ(ＦＧＦ１−１４、ＦＧＦ１６−２３)とチロシンキナーゼドメインを有する４つのＦＧＦレセプター(ＦＧＦＲ１−４)がある。ＦＧＦＲは、細胞外リガンド結合領域とともに、２又は３の免疫グロブリン様ドメイン(ＩｇＤ１−３)、単回膜貫通領域および細胞質、スプリット(split)チロシンキナーゼドメインからなる。ＦＧＦＲ１、２および３はそれぞれ、ＩＩＩｂおよびＩＩＩｃと称される２つの主要なオルターナティブスプライスアイソフォームを有する。これらのアイソフォームは、ＩｇＤ３の後半のおよそ５０アミノ酸が異なり、異なった組織分布およびリガンド特異性を有する。一般に、ＩＩＩｂアイソフォームは上皮細胞にみられるのに対して、ＩＩＩｃは間葉系細胞に発現される。ヘパラン硫酸プロテオグリカンに呼応してＦＧＦを結合すると、ＦＧＦＲは、二量化して、特定のチロシン残基でリン酸化される。これにより、ＦＧＦＲ基質２α(ＦＲＳ２α)などの重要なアダプタータンパク質の動員が促され、分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ(ＭＡＰＫ)およびＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ経路(１、３、４)を含む複数のシグナル伝達カスケードの活性化が引き起こされる。その結果、ＦＧＦ及びその同族レセプターは、系統に依存する様式で、増殖、分化、移動および生存を含む細胞過程の多くの系統を制御する。
異常に活性化されたＦＧＦＲは特定のヒトの悪性腫瘍に関連していた(１、５)。特に、ｔ(４；１４)(ｐ１６.３；ｑ３２)染色体転座は、多発性骨髄腫患者のおよそ１５〜２０％に生じ、ＦＧＦＲ３の過剰発現を引き起こし、全体の生存率の低下と相関している(６−９)。ＦＧＦＲ３は培養物中の骨髄腫細胞株への化学的抵抗性の付与と関連しており(１０)、これは、従来の化学療法に対してｔ(４；１４)＋患者の臨床効果が劣ることと一致している(８)。突然変異的に活性化されたＦＧＦＲ３の過剰発現は、造血性細胞および線維芽細胞(１１−１４、１５)、トランスジェニックマウスモデル(１６)およびマウスの骨髄移植モデル(１６、１７)において腫瘍化転換を十分に誘導する。したがって、ＦＧＦＲ３は、多発性骨髄腫の潜在的治療的標的として提唱されている。実際、ＦＧＦＲを標的とする様々な小分子インヒビターは、ＦＧＦＲ３に選択的ではなく、特定の他のキナーゼに対して交差阻害活性を有するにもかかわらず、培養物中及びマウスモデルのＦＧＦＲ３陽性骨髄腫細胞に対して細胞障害性を示した(１８−２２)。
【０００４】
ＦＧＦＲ３過剰発現は、膀胱癌の高分画においても報告されている(２３、２４)。さらに、ＦＧＦＲ３内の体細胞活性化突然変異は、６０〜７０％の乳頭および１６〜２０％の筋肉浸潤性膀胱カルチノーマにおいて同定された(２４、２５)。細胞培養実験において、ＲＮＡ干渉(１１、２６)又はＦＧＦＲ３単鎖Ｆｖ抗体断片は膀胱癌細胞増殖を阻害した(２７)。最近の研究では、ＦＧＦＲ３抗体−毒素コンジュゲートが、腫瘍へのＦＧＦＲ３媒介毒素運搬により膀胱癌細胞株の移植片増殖を低減することが示された(２８)。しかしながら、ＦＧＦＲ３シグナル伝達が実際に膀胱腫瘍のインビボ増殖の発癌作動機構であるかどうかは不明なままである。さらに、膀胱癌においてＦＧＦＲ３を標的とする治療的可能性はインビボモデルに基づいては決定されなかった。ＦＧＦＲ３および抗ＦＧＦＲ３抗体に関する出版物には、米国特許公開２００５／０１４７６１２；Rauchenberger et al, J Biol Chem 278 (40): 38194-38205 (2003)；国際公開２００６／０４８８７７；Martinez-Torrecuadrada et al, (2008) Mol Cancer Ther 7(4): 862-873；国際公開２００７／１４４８９３；Trudel et al. (2006) 107(10): 4039-4046；Martinez-Torrecuadrada et al (2005) Clin Cancer Res 11 (17): 6280-6290；Gomez-Roman et al (2005) Clin Cancer Res 11:459-465；Direnzo, R et al (2007) Proceedings of AACR Annual Meeting, Abstract No. 2080；国際公開２０１０／００２８６２が含まれる。
治療薬として開発されるのに適した臨床特性を有する薬剤が継続して求められていることは明白である。本明細書において記述される発明は、この必要性を満たし他の利点を提供する。
特許出願及び出版物を含み、本明細書中に引用されるすべての文献は出典明記によってその全体が援用される。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、様々なＦＧＦＲ３結合剤(例えば抗体およびその断片)の同定にある程度基づく。ＦＧＦＲ３は重要かつ有益な治療的標的を示し、本発明はＦＧＦＲ３への薬剤の結合に基づく組成物および方法を提供する。本明細書において記述するように、本発明のＦＧＦＲ３結合剤は、ＦＧＦＲ３シグナル伝達経路の発現および／または活性と関係している病的状態を標的とする際に用いられる、重要な治療用及び診断用薬剤を提供する。したがって、本発明は、ＦＧＦＲ３結合に関連した方法、組成物、キットおよび製造品を提供する。
本発明はＦＧＦＲ３に結合する抗体を提供する。一態様では、本発明は、ＦＧＦＲ３を結合する単離された抗体を特徴とする。いくつかの実施態様では、抗体は、ＦＧＦＲ３ ＩＩＩｂアイソフォームおよび／またはＦＧＦＲ３ ＩＩＩｃアイソフォームを結合する。いくつかの実施態様では、抗体は、変異したＦＧＦＲ３(例えば一又は複数のＦＧＦＲ３ ＩＩＩｂ  Ｒ２４８Ｃ、Ｓ２４９Ｃ、Ｇ３７２Ｃ、Ｙ３７５Ｃ、Ｋ６５２Ｅ、および／または一又は複数のＦＧＦＲ３ ＩＩＩｃ  Ｒ２４８Ｃ、Ｓ２４９Ｃ、Ｇ３７０Ｃ、Ｙ３７３Ｃ、Ｋ６５０Ｅ)を結合する。いくつかの実施態様では、抗体は、単量体ＦＧＦＲ３(例えば単量体ＦＧＦＲ３ ＩＩＩｂおよび／またはＩＩＩｃアイソフォーム)を結合する。いくつかの実施態様では、抗体は、例えば二量体ＦＧＦＲ３型と比較して単量体ＦＧＦＲ３型を安定化させるなどして、単量体ＦＧＦＲ３の形成を促進する。
一態様では、本発明は、単離された抗ＦＧＦＲ３抗体であって、この抗体の完全長ＩｇＧ型は１×１０−７以上の強さのＫｄでヒトＦＧＦＲ３を結合する抗体を提供する。当分野で確立されているように、そのレセプターに対するリガンドの結合親和性は様々なアッセイの何れかを用いて決定され、様々な定量値で表される。したがって、一実施態様では、結合親和性は、Ｋｄ値として表され、固有の結合親和性を(例えば、最小の結合活性効果によって)反映する。一般に、そして、好ましくは、無細胞又は細胞関連の環境の何れであっても、結合能はインビトロで測定される。例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)およびＥＬＩＳＡなどの本明細書中に記載の物を含め、当分野で公知の多くのアッセイの何れかを用いて、結合親和性の測定値を得ることができる。いくつかの実施態様では、抗体の完全長ＩｇＧ型は、１×１０−８以上の強さのＫｄで、１×１０−９以上の強さのＫｄで、又は１×１０−１０以上の強さのＫｄでヒトＦＧＦＲ３を結合する。
【０００６】
一般に、本発明の抗ＦＧＦＲ３抗体はアンタゴニスト抗体である。ゆえに、一態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、ＦＧＦＲ３活性(例えばＦＧＦＲ３-ＩＩＩｂおよび／またはＦＧＦＲ３-ＩＩＩｃ活性)を阻害する。いくつかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体(一般に二価の様式のもの)は、実質的なＦＧＦＲ３アゴニスト機能を備えていない。いくつかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ３アンタゴニスト抗体(一般に二価の様式のもの)は、ほとんどないしは全くＦＧＦＲ３アゴニスト機能を備えていない。一実施態様では、本発明の抗体(一般に二価の様式のもの)は、統計学的に有意であるバックグラウンドレベルを上回るＦＧＦＲ３アゴニスト活性レベルを表さない。
一態様では、ＦＧＦＲ３に対する抗体の結合は、レセプターの他のユニットとのレセプターの二量体化を阻害し、それによって、(少なくともある程度レセプター二量体化の欠如により)レセプターの活性化が阻害される。阻害は直接的ても間接的でもよい。
一態様では、本発明は、実質的なアポトーシス活性を保有しない(例えば、例えば移行上皮癌細胞又は多発性骨髄腫細胞、例としてｔ(４；１４)転座のようなＦＧＦＲ３転座を含む多発性骨髄腫細胞などの細胞のアポトーシスを誘導しない)抗ＦＧＦＲ３抗体を提供する。いくつかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、ほとんどないしは全くアポトーシス機能を備えていない。いくつかの実施態様では、ＦＧＦＲ３抗体は、統計学的に有意であるバックグラウンドレベルを上回るアポトーシス機能を表さない。
【０００７】
一態様では、本発明は、実質的なＦＧＦＲ３下方制御を誘導しない抗ＦＧＦＲ３抗体を提供する。いくつかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、ほとんどないしは全くレセプター下方制御を誘導しない。いくつかの実施態様では、ＦＧＦＲ３抗体は、統計学的に有意であるバックグラウンドレベルを上回るレセプター下方制御を誘導しない。
一態様では、本発明は、エフェクター機能を備えている抗ＦＧＦＲ３抗体を提供する。一実施態様では、エフェクター機能は抗体依存性細胞性細胞毒性(ＡＤＣＣ)を含む。一実施態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体(いくつかの実施態様ではネイキッド抗ＦＧＦＲ３抗体)は細胞、いくつかの実施態様では多発性骨髄腫細胞(転座、例えばｔ(４；１４)転座を含む多発性骨髄腫細胞など)を殺すことが可能である。いくつかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、細胞につきおよそ１００００以上のＦＧＦＲ３分子(例えば、細胞につきおよそ１１０００、およそ１２０００、およそ１３０００、およそ１４０００、およそ１５０００、およそ１６０００、およそ１７０００、およそ１８０００以上のＦＧＦＲ３分子)を発現する細胞を殺すことが可能である。他の実施態様では、細胞は、細胞につきおよそ２０００、およそ３０００、およそ４０００、およそ５０００、およそ６０００、およそ７０００、およそ８０００以上のＦＧＦＲ３分子を発現する。
【０００８】
一態様では、本発明の抗ＦＧＦＲ３抗体は、恒常的なＦＧＦＲ３活性を阻害する。いくつかの実施態様では、恒常的ＦＧＦＲ３活性は、リガンド依存性のＦＧＦＲ３恒常的活性である。いくつかの実施態様では、恒常的ＦＧＦＲ３活性は、リガンド非依存性の恒常的ＦＧＦＲ３活性である。
一態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、ＦＧＦＲ３-ＩＩＩｂＲ２４８Ｃに対応する突然変異を含むＦＧＦＲ３を阻害する。ここで使用するように、「ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＲ２４８Ｃに対応する突然変異を含む」なる用語は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＲ２４８ＣおよびＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＲ２４８Ｃ、並びにＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ Ｒ２４８に対応する位置にＲからＣへの突然変異を含む他のＦＧＦＲ３型を包含すると理解される。当分野の技術者は、例えばＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ配列をＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ配列を整列配置してＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ内のＲ２４８位に対応するＦＧＦＲ３内の位置を同定するなど、それぞれのＦＧＦＲ３配列間の対応する残基を同定するためにどのようにＦＧＦＲ３配列を整列配置するかを理解する。いくつかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＲ２４８Ｃおよび／またはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＲ２４８Ｃを阻害する。
【０００９】
一態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅに対応する突然変異を含むＦＧＦＲ３を阻害する。便宜上、「ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅに対応する突然変異を含む」なる用語は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２ＥおよびＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＫ６５０Ｅ、並びにＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ Ｋ６５２に対応する位置にＫからＥへの突然変異を含む他のＦＧＦＲ３型を包含すると理解される。当分野の技術者は、例えばＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ配列をＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ配列を整列配置してＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ内のＫ６５２位に対応するＦＧＦＲ３内の位置を同定するなど、それぞれのＦＧＦＲ３配列間の対応する残基を同定するためにどのようにＦＧＦＲ３配列を整列配置するかを理解する。いくつかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅおよび／またはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＫ６５０Ｅを阻害する。
一態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９Ｃに対応する突然変異を含むＦＧＦＲ３を阻害する。便宜上、「ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９Ｃに対応する突然変異を含む」なる用語は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９ＣおよびＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＳ２４９Ｃ、並びにＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ Ｓ２４９に対応する位置にＳからＣへの突然変異を含む他のＦＧＦＲ３型を包含すると理解される。いくつかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９Ｃおよび／またはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＳ２４９Ｃを阻害する。
一態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＧ３７２Ｃに対応する突然変異を含むＦＧＦＲ３を阻害する。便宜上、「ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＧ３７２Ｃに対応する突然変異を含む」なる用語は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＧ３７２ＣおよびＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＧ３７０Ｃ、並びにＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ Ｇ３７２に対応する位置にＧからＣへの突然変異を含む他のＦＧＦＲ３型を包含すると理解される。いくつかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＧ３７２Ｃおよび／またはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＧ３７０Ｃを阻害する。
一態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃに対応する突然変異を含むＦＧＦＲ３を阻害する。便宜上、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃに対応する突然変異を含む」なる用語は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５ＣおよびＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＹ３７３Ｃ、並びにＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ Ｓ２４９に対応する位置にＳからＣへの突然変異を含む他のＦＧＦＲ３型を包含すると理解される。いくつかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃおよび／またはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＹ３７３Ｃを阻害する。
【００１０】
一態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、(ａ) ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅと、(ｂ) ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＲ２４８Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９ＣおよびＦＧＦＲ３ＩＩＩｂ Ｇ３７２Ｃの一又は複数を阻害する。
一態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、(ａ) ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＫ６５０Ｅと、(ｂ) ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＲ２４８Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＹ３７３Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＳ２４９ＣおよびＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ Ｇ３７０Ｃの一又は複数を阻害する。
一態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、(ａ) ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＲ２４８Ｃと、(ｂ) ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９ＣおよびＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＧ３７２Ｃの一又は複数を阻害する。
一態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、(ａ) ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＲ２４８Ｃと、(ｂ) ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＫ６５０Ｅ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＹ３７３Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＳ２４９ＣおよびＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＧ３７０Ｃの一又は複数を阻害する。
一態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、(ａ) ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＧ３７２Ｃと、(ｂ) ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９ＣおよびＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＲ２４８Ｃの一又は複数を阻害する。
一態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、(ａ) ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＧ３７０Ｃと、(ｂ) ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＫ６５０Ｅ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＹ３７３Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＳ２４９ＣおよびＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＲ２４８Ｃの一又は複数を阻害する。
一態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＲ２４８Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９ＣおよびＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＧ３７２Ｃを阻害する。
一態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＲ２４８Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＫ６５０Ｅ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＹ３７３Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＳ２４９ＣおよびＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＧ３７０Ｃを阻害する。
【００１１】
一態様では、本発明は、
(a) 
(i)  RASQDVDTSLA(配列番号：８７)である配列Ａ１−Ａ１１を含むＨＶＲ−Ｌ１、
(ii) SASFLYS(配列番号：８８)である配列Ｂ１-Ｂ７を含むＨＶＲ−Ｌ２、
(iii)QQSTGHPQT(配列番号：８９)である配列Ｃ１−Ｃ９を含むＨＶＲ−Ｌ３ 、
(iv) GFTFTSTGIS(配列番号：８４)である配列Ｄ１-Ｄ１０を含むＨＶＲ−Ｈ１、
(v)  GRIYPTSGSTNYADSVKG(配列番号：８５)である配列Ｅ１−Ｅ１８を含むＨＶＲ−Ｈ２、
(vi) ARTYGIYDLYVDYTEYVMDY(配列番号：８６)である配列Ｆ１-Ｆ２０を含むＨＶＲ−Ｈ３、から選択される少なくとも１、２、３、４又は５の高頻度可変領域(ＨＶＲ)と、
(b) 少なくとも１の変異ＨＶＲであって、この変異ＨＶＲ配列が配列番号：１−１８、４８−１３１および１４０−１４５に示される配列の少なくとも１残基(少なくとも２残基、少なくとも３以上の残基)の修飾を含む変異ＨＶＲと
を含んでなる単離された抗ＦＧＦＲ３抗体を提供する。修飾は、置換、挿入又は欠失であることが望ましい。
いくつかの実施態様では、ＨＶＲ−Ｌ１変異体は、以下の位置：Ａ５(Ｖ又はＤ)、Ａ６(Ｖ又はＩ)、Ａ７(Ｄ、Ｅ又はＳ)、Ａ８(Ｔ又はＩ)、Ａ９(Ａ又はＳ)およびＡ１０(Ｖ又はＬ)のいずれかの組合せで１〜６(１、２、３、４、５又は６)の置換を含む。いくつかの実施態様では、ＨＶＲ−Ｌ２変異体は、以下の位置：Ｂ１(Ｓ又はＧ)、Ｂ４(Ｆ又はＳ又はＴ)およびＢ６(Ａ又はＹ)のいずれかの組合せで１〜２(１又は２)の置換を含む。いくつかの実施態様では、ＨＶＲ−Ｌ３変異体は、以下の位置：Ｃ３(Ｇ又はＳ又はＴ)、Ｃ４(Ｔ又はＹ又はＡ)、Ｃ５(Ｇ又はＳ又はＴ又はＡ)、Ｃ６(Ａ又はＨ又はＤ又はＴ又はＮ)、Ｃ７(Ｑ又はＰ又はＳ)およびＣ８(Ｓ又はＹ又はＬ又はＰ又はＱ)のいずれかの組合せで１〜６(１、２、３、４、５又は６)の置換を含む。いくつかの実施態様では、ＨＶＲ−Ｈ１変異体は、以下の位置：Ｄ３(Ｓ又はＴ)、Ｄ５(Ｗ又はＹ又はＳ又はＴ)、Ｄ６(Ｓ又はＧ又はＴ)のいずれかの組合せで１〜３(１、２又は３)の置換を含む。いくつかの実施態様では、ＨＶＲ−Ｈ２変異体は、以下の位置：Ｅ２(Ｒ又はＳ)、Ｅ６(Ｙ又はＡ又はＬ又はＳ又はＴ)、Ｅ７(Ａ又はＱ又はＤ又はＧ又はＹ又はＳ又はＮ又はＦ)、Ｅ８(Ａ又はＤ又はＧ)、Ｅ９(Ｔ又はＳ)、Ｅ１０(Ｋ又はＦ又はＴ又はＳ)、Ｅ１１(Ｙ又はＨ又はＮ又はＩ)のいずれかの組合せで１〜６(１、２、３、４、５又は６)の置換を含む。
【００１２】
一態様では、本発明は、
(a) 
(i)  Ｘ１がＶ又はＤであり、Ｘ２がＶ又はＩであり、Ｘ３がＤ、Ｅ又はＳであり、Ｘ４がＴ又はＩであり、Ｘ５がＡ又はＳであり、Ｘ６がＶ又はＬである、配列ＲＡＳＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ａ(配列番号：１４６)を含むＨＶＲ−Ｌ１、 
(ii) Ｘ１がＳ又はＧであり、Ｘ２がＡ又はＹである、配列Ｘ１ＡＳＦＬＸ２Ｓ(配列番号：１４７)を含むＨＶＲ−Ｌ２、
(iii)Ｘ１がＧ、Ｓ又はＴであり、Ｘ２がＴ、Ｙ又はＡであり、Ｘ３がＧ、Ｓ、Ｔ又はＡであり、Ｘ４がＡ、Ｈ、Ｄ、Ｔ又はＮであり、Ｘ５がＱ、Ｐ又はＳであり、Ｘ６がＳ、Ｙ、Ｌ、Ｐ又はＱである、配列ＱＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｔ(配列番号：１４８)を含むＨＶＲ−Ｌ３、
(iv) Ｘ１がＳ又はＴであり、Ｘ２がＷ、Ｙ、Ｓ又はＴであり、Ｘ３がＳ、Ｇ又はＴである、配列ＧＦＸ１ＦＸ２Ｘ３ＴＧＩＳ(配列番号：１４９)を含むＨＶＲ−Ｈ１、
(v)  Ｘ１がＹ、Ａ、Ｌ、Ｓ又はＴであり、Ｘ２がＡ、Ｑ、Ｄ、Ｇ、Ｙ、Ｓ、Ｎ又はＦであり、Ｘ３がＡ、Ｄ又はＧであり、Ｘ４がＴ又はＳであり、Ｘ５がＫ、Ｆ、Ｔ又はＳであり、Ｘ６がＹ、Ｈ、Ｎ又はＩである、配列ＧＲＩＹＰＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＹＡＤＳＶＫＧ(配列番号：１５０)を含むＨＶＲ−Ｈ２、
(vi) 配列ＡＲＴＹＧＩＹＤＬＹＶＤＹＴＥＹＶＭＤＹ(配列番号：１５１)を含むＨＶＲ−Ｈ３
から選択される少なくとも１、２、３、４又は５の高頻度可変領域(ＨＶＲ)
を含む単離された抗ＦＧＦＲ３抗体を提供する。
いくつかの実施態様では、ＨＶＲ−Ｌ１は、Ｘ１がＶ又はＤであり、Ｘ２がＤ、Ｅ又はＳであり、Ｘ３がＴ又はＩであり、Ｘ４がＡ又はＳである、配列ＲＡＳＱＸ１ＶＸ２Ｘ３Ｘ４ＶＡ(配列番号：１５２)を含む。いくつかの実施態様では、ＨＶＲ−Ｌ３は、Ｘ１がＳ、Ｇ又はＴであり、Ｘ２がＹ、Ｔ又はＡであり、Ｘ３がＴ又はＧであり、Ｘ４がＴ、Ｈ又はＮであり、Ｘ５がＰ又はＳであり、Ｘ６がＰ、Ｑ、Ｙ又はＬである、配列ＱＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｔ(配列番号：１５３)を含む。いくつかの実施態様では、ＨＶＲ−Ｈ２は、Ｘ１がＴ又はＬであり、Ｘ２がＮ、Ｙ、Ｓ、Ｇ、Ａ又はＱであり、Ｘ３がＮ又はＨである、配列ＧＲＩＹＰＸ１Ｘ２ＧＳＴＸ３ＹＡＤＳＶＫＧ(配列番号：１５４)を含む。
【００１３】
他の態様では、本発明は、１、２、３、４、５又は６のＨＶＲを含む単離された抗ＦＧＦＲ３抗体であり、この各々のＨＶＲは配列番号：１−１８、４８−１３１及び１４０−１４５から選択される配列を含むか、からなるか又は基本的にからなり、配列番号：１、７、１３、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、９６、１０２、１０８、１１４、１２０、１２６又は１４３はＨＶＲ−Ｈ１に対応し、配列番号：２、８、１４、４９、５５、６１、６７、７３、７９、８５、９１、９７、１０３、１０９、１１５、１２１、１２７又は１４４はＨＶＲ−Ｈ２に対応し、配列番号：３、９、１５、５０、５６、６２、６８、７４、８０、８６、９２、９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８又は１４５はＨＶＲ−Ｈ３に対応し、配列番号：４、１０、１６、５１、５７、６３、６９、７５、８１、８７、９３、９９、１０５、１１１、１１７、１２３、１２９又は１４０はＨＶＲ−Ｌ１に対応し、配列番号：５、１１、１７、５２、５８、６４、７０、７６、８２、８８、９４、１００、１０６、１１２、１１８、１２４、１３０又は１４１はＨＶＲ−Ｌ２に対応し、配列番号：６、１２、１８、５３、５９、６５、７１、７７、８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、１３１又は１４２はＨＶＲ−Ｌ３に対応するものである抗ＦＧＦＲ３抗体を特徴とする。
一態様では、本発明は、配列番号：１、７、１３、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、９６、１０２、１０８、１１４、１２０、１２６又は１４３の配列を含むＨＶＲ−Ｈ1を含む抗ＦＧＦＲ３抗体を提供する。
一態様では、本発明は、配列番号：２、８、１４、４９、５５、６１、６７、７３、７９、８５、９１、９７、１０３、１０９、１１５、１２１、１２７又は１４４の配列を含むＨＶＲ−Ｈ2を含む抗ＦＧＦＲ３抗体を提供する。
一態様では、本発明は、配列番号：３、９、１５、５０、５６、６２、６８、７４、８０、８６、９２、９８、１０４、１１０、１１６、１２２、１２８又は１４５の配列を含むＨＶＲ−Ｈ3を含む抗ＦＧＦＲ３抗体を提供する。
一態様では、本発明は、配列番号：４、１０、１６、５１、５７、６３、６９、７５、８１、８７、９３、９９、１０５、１１１、１１７、１２３、１２９又は１４０の配列を含むＨＶＲ−Ｌ1領域を含む抗ＦＧＦＲ３抗体を提供する
一態様では、本発明は、配列番号：５、１１、１７、５２、５８、６４、７０、７６、８２、８８、９４、１００、１０６、１１２、１１８、１２４、１３０又は１４１の配列を含むＨＶＲ−Ｌ2領域を含む抗ＦＧＦＲ３抗体を提供する。
一態様では、本発明は、配列番号：６、１２、１８、５３、５９、６５、７１、７７、８３、８９、９５、１０１、１０７、１１３、１１９、１２５、１３１又は１４２の配列を含むＨＶＲ−Ｌ３領域を含む抗ＦＧＦＲ３抗体を提供する。
【００１４】
一態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、順に各々配列番号：１、２、３を含むＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、順に各々配列番号：４、５、６を含むＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含んでなる。
他の態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、順に各々配列番号：７、８、９を含むＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、順に各々配列番号：１０、１１、１２を含むＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含んでなる。
他の態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、順に各々配列番号：１３、１４、１５を含むＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、順に各々配列番号：１６、１７、１８を含むＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含んでなる。
他の態様において、抗ＦＧＦＲ３抗体は、順に各々配列番号：４８、４９、５０を含むＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、順に各々配列番号：５１、５２、５３を含むＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含んでなる。
他の態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、順に各々配列番号：５４、５５、５６を含むＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、順に各々配列番号：５７、５８、５９を含むＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含んでなる。
他の態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、順に各々配列番号：６０、６１、６２、６３を含むＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、順に各々配列番号：６３、６４、６５を含むＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含んでなる。
他の態様において、抗ＦＧＦＲ３抗体は、順に各々配列番号：６６、６７、６８を含むＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、順に各々配列番号：６９、７０、７１を含むＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含んでなる。
他の態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、順に各々配列番号：７２、７３、７４を含むＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、順に各々配列番号：７５、７６、７７を含むＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含んでなる。
他の態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、順に各々配列番号：７８、７９、８０を含むＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、順に各々配列番号：８１、８２、８３を含むＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含んでなる。
他の態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、順に各々配列番号：８４、８５、８６を含むＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、順に各々配列番号：８７、８８、８９を含むＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含んでなる。
他の態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、順に各々配列番号：９０、９１、９２を含むＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、順に各々配列番号：９３、９４、９５を含むＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含んでなる。
他の態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、順に各々配列番号：９６、９７、９８を含むＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、順に各々配列番号：９９、１００、１０１を含むＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含んでなる。
他の態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、順に各々配列番号：１０２、１０３、１０４を含むＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、順に各々配列番号：１０５、１０６、１０７を含むＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含んでなる。
他の態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、順に各々配列番号：１０８、１０９、１１０を含むＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、順に各々配列番号：１１１、１１２、１１３を含むＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含んでなる。
他の態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、順に各々配列番号：１１４、１１５、１１６を含むＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、順に各々配列番号：１１７、１１８、１１９を含むＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含んでなる。
他の態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、順に各々配列番号：１２０、１２１、１２２を含むＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、順に各々配列番号：１２３、１２４、１２５を含むＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含んでなる。
他の態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、順に各々配列番号：１２６、１２７、１２８を含むＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、順に各々配列番号：１２９、１３０、１３１を含むＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含んでなる。
他の態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、順に各々配列番号：１４０、１４１、１４２を含むＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、及び／又は、順に各々配列番号：１４３、１４４、１４５を含むＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２およびＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含んでなる。
配列番号：１−１８、４８−１３１および１４０−１４５のアミノ酸配列は、図１に示す個々のＨＶＲ(すなわちＨ１、Ｈ２又はＨ３)に関して番号をつけられ、その番号付けは後述するカバット番号付けシステムと一致している。
【００１５】
他の態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、配列番号：１３２を含む重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。
他の態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、配列番号：１３３を含む軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含む。
他の態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、配列番号：１３２を含む重鎖可変領域と配列番号：１３３を含む軽鎖可変領域とを含む。
他の態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、配列番号：１３４を含む重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。
他の態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、配列番号：１３５を含む軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含む。
他の態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、配列番号：１３９を含む軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含む。
他の態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、配列番号：１３４を含む重鎖可変領域と配列番号：１３５を含む軽鎖可変領域とを含む。
他の態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、配列番号：１３６を含む重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。
他の態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、配列番号：１３７を含む軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含む。
他の態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、配列番号：１３６を含む重鎖可変領域と配列番号：１３７を含む軽鎖可変領域とを含む。
他の態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、配列番号：１３８を含む重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。
他の態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、配列番号：１３９を含む軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含む。
他の態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、配列番号：１３８を含む重鎖可変領域と配列番号：１３９を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００１６】
一態様では、本発明は、
(a) 配列SASSSVSYMH(配列番号：１５５)、SASSSVSYMH(配列番号：１５６)又はLASQTIGTWLA(配列番号：１５７)を含むＨＶＲ−Ｌ１、  
(b) 配列TWIYDTSILAS(配列番号：１５８)、RWIYDTSKLAS(配列番号：１５９)又はLLIYAATSLAD(配列番号：１６０)を含むＨＶＲ−Ｌ２、 
(c) 配列QQWTSNPLT(配列番号：１６１)、QQWSSYPPT(配列番号：１６２)又はQQLYSPPWT(配列番号：１６３)を含むＨＶＲ−Ｌ３、 
(d) 配列GYSFTDYNMY(配列番号：１６４)、GYVFTHYNMY(配列番号：１６５)又はGYAFTSYNMY(配列番号：１６６)を含むＨＶＲ−Ｈ１、
(e) 配列WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(配列番号：１６７)、WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(配列番号：１６８)又はWIGYIDPYIGGTSYNQKFKG(配列番号：１６９)を含むＨＶＲ−Ｈ２、そして、
(f) 配列ASPNYYDSSPFAY(配列番号：１７０)、ARGQGPDFDV(配列番号：１７１)又はARWGDYDVGAMDY(配列番号：１７２)を含むＨＶＲ−Ｈ３
からなる群から選択される少なくとも１、２、３、４、５及び／又は６の高頻度可変領域(ＨＶＲ)配列を含む抗ＦＧＦＲ３抗体を提供する。
【００１７】
一態様では、本発明は、
(a) 配列SASSSVSYMH(配列番号：１５５)を含むＨＶＲ−Ｌ１、  
(b) 配列TWIYDTSILAS(配列番号：１５８)を含むＨＶＲ−Ｌ２、 
(c) 配列QQWTSNPLT(配列番号：１６１)を含むＨＶＲ−Ｌ３、
(d) 配列GYSFTDYNMY(配列番号：１６４)を含むＨＶＲ−Ｈ１、
(e) 配列WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(配列番号：１６７)を含むＨＶＲ−Ｈ２、および
(f) 配列ASPNYYDSSPFAY(配列番号：１７０)を含むＨＶＲ−Ｈ３
からなる群から選択される少なくとも１、２、３、４、５及び／又は６の高頻度可変領域(ＨＶＲ)配列を含む抗ＦＧＦＲ３抗体を提供する。
一態様では、本発明は、
(a) 配列SASSSVSYMH(配列番号：１５６)を含むＨＶＲ−Ｌ１、
(b) 配列RWIYDTSKLAS(配列番号：１５９)を含むＨＶＲ−Ｌ２、
(c) 配列QQWSSYPPT(配列番号：１６２)を含むＨＶＲ−Ｌ３、
(d) 配列GYVFTHYNMY(配列番号：１６５)を含むＨＶＲ−Ｈ１、
(e) 配列WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(配列番号：１６８)を含むＨＶＲ−Ｈ２、および
(f) 配列ARGQGPDFDV(配列番号：１７１)を含むＨＶＲ−Ｈ３
からなる群から選択される少なくとも１、２、３、４、５及び／又は６の高頻度可変領域(ＨＶＲ)配列を含む抗ＦＧＦＲ３抗体を提供する。
一態様では、本発明は、
(a) 配列LASQTIGTWLA(配列番号：１５７)を含むＨＶＲ−Ｌ１、
(b) 配列LLIYAATSLAD(配列番号：１６０)を含むＨＶＲ−Ｌ２、
(c) 配列QQLYSPPWT(配列番号：１６３)を含むＨＶＲ−Ｌ３、
(d) 配列GYAFTSYNMY(配列番号：１６６)を含むＨＶＲ−Ｈ１、
(e) 配列WIGYIDPYIGGTSYNQKFKG(配列番号：１６９)を含むＨＶＲ−Ｈ２、および、
(f) 配列ARWGDYDVGAMDY(配列番号：１７２)を含むＨＶＲ−Ｈ３
からなる群から選択される少なくとも１、２、３、４、５及び／又は６の高頻度可変領域(ＨＶＲ)配列を含む抗ＦＧＦＲ３抗体を提供する。
【００１８】
一態様では、本発明は、(a) (i) 配列SASSSVSYMHを含むＨＶＲ−Ｌ１(配列番号：１５５)、(ii) 配列TWIYDTSILAS(配列番号：１５８)を含むＨＶＲ−Ｌ２及び(iii) 配列QQWTSNPLT(配列番号：１６１)を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖と、(b) (i) 配列GYSFTDYNMY(配列番号：１６４)を含むＨＶＲ−Ｈ１、(ii) 配列WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(配列番号：１６７)を含むＨＶＲ−Ｈ２及び(iii) 配列ASPNYYDSSPFAY(配列番号：１７０)を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖とを含んでなる抗ＦＧＦＲ３抗体を提供する。
一態様では、本発明は、(a) (i) 配列SASSSVSYMH(配列番号：１５６)を含むＨＶＲ−Ｌ１、(ii) 配列RWIYDTSKLAS(配列番号：１５９)を含むＨＶＲ−Ｌ２及び(iii) 配列QQWSSYPPT(配列番号：１６２)を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖と、および／または、(b) (i) 配列GYVFTHYNMY(配列番号：１６５)を含むＨＶＲ−Ｈ１、(ii) 配列WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(配列番号：１６８)を含むＨＶＲ−Ｈ２及び(iii) 配列ARGQGPDFDV(配列番号：１７１)を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖とを含んでなる抗ＦＧＦＲ３抗体を提供する。
【００１９】
一態様では、本発明は、(a) (i) 配列LASQTIGTWLA(配列番号：１５７)を含むＨＶＲ−Ｌ１、(ii) 配列LLIYAATSLAD(配列番号：１６０)を含むＨＶＲ−Ｌ２及び(iii) 配列QQLYSPPWT(配列番号：１６３)を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖と、および／または、(i) 配列GYAFTSYNMY(配列番号：１６６)を含むＨＶＲ−Ｈ１、(ii) 配列WIGYIDPYIGGTSYNQKFKG(配列番号：１６９)を含むＨＶＲ−Ｈ２及び(iii) 配列ARWGDYDVGAMDY(配列番号：１７２)を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖とを含んでなる抗ＦＧＦＲ３抗体を提供する。本発明の抗体のいくつかの実施態様は、ヒト化４Ｄ５抗体(ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８)(ハーセプチン(登録商標)、Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA)(米国特許第６４０７２１３号およびLee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-1093にも示される)の軽鎖可変ドメインを含む。その配列を以下の配列番号：１７３に示す。
0005757534.tif 000002
(ＨＶＲ残基を下線で示す)。
一実施態様では、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８軽鎖可変ドメイン配列は、位置３０、６６および９１(それぞれ上の太字／斜体で示すＡｓｎ、ＡｒｇおよびＨｉｓ)の一又は複数で修飾される。特定の実施態様では、修飾したｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８配列は、位置３０のＳｅｒ、位置６６のＧｌｙおよび／または位置９１のＳｅｒを含む。したがって、一実施態様では、本発明の抗体は、以下の配列番号：１７４に示す配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
0005757534.tif 000003
(ＨＶＲ残基を下線で示す)。
ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８に関して置換した残基は太字／斜体で示す。
【００２０】
本発明の抗体は、ＦＧＦＲ３への結合活性が実質的に保持されるならば、任意の適切なフレームワーク可変ドメイン配列を含んでよい。例えば、いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、ヒトのサブグループＩＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。これらの抗体の一実施態様では、フレームワークコンセンサス配列は、位置７１、７３および／または７８に置換を含む。これらの抗体のいくつかの実施態様では、位置７１はＡであり、７３はＴであり、および／または、７８はＡである。一実施態様では、これらの抗体は、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８(ハーセプチン(登録商標)、Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA)(米国特許第６４０７２１３号及び同第５８２１３３７号およびLee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-1093にも示される)の重鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む。一実施態様では、これらの抗体はさらに、ヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。特定の実施態様では、これらの抗体は米国特許第６４０７２１３号及び同第５８２１３３７号に示す、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８の軽鎖ＨＶＲ配列を含む。一実施態様では、これらの抗体は、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８(ハーセプチン(登録商標)、Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA)(米国特許第６４０７２１３号及び同第５８２１３３７号およびLee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-1093にも示される)の軽鎖可変ドメイン配列を含む。
【００２１】
一実施態様では、本発明の抗体は重鎖可変ドメインを含み、そのフレームワーク配列は配列番号：１９および２０３−２０５、２０および２０６−２０８、２１および２０９−２１１、２２および２１２−２１４、２３および２１５−２１７、２４および２１８−２２０、２５および２２１−２２３、２６および２２４−２２６、２７および２２７−２２９、２８および２３０−２３２、２９および２３３−２３５、３０および２３６−２３８、３１および２３９−２４１、３２および２４２−２４４、３３および２４５−２４７、３４および２４８−２５０、３５および２５１−２５３、３６および２５４−２５６、および／または３７および２５７−２５９の配列を含み、ＨＶＲ  Ｈ１、Ｈ２及びＨ３配列はそれぞれ配列番号：１３、１４および／または１５である。他の実施態様では、フレームワーク配列は、配列番号：１９および２０３−２０５、２０および２０６−２０８、２１および２０９−２１１、２２および２１２−２１４、２３および２１５−２１７、２４および２１８−２２０、２５および２２１−２２３、２６および２２４−２２６、２７および２２７−２２９、２８および２３０−２３２、２９および２３３−２３５、３０および２３６−２３８、３１および２３９−２４１、３２および２４２−２４４、３３および２４５−２４７、３４および２４８−２５０、３５および２５１−２５３、３６および２５４−２５６、および／または３７および２５７−２５９の配列を含み、ＨＶＲ  Ｈ１、Ｈ２及びＨ３配列は、それぞれ配列番号：４８、４９及び／又は５０である。さらに他の実施態様では、フレームワーク配列は、配列番号：１９および２０３−２０５、２０および２０６−２０８、２１および２０９−２１１、２２および２１２−２１４、２３および２１５−２１７、２４および２１８−２２０、２５および２２１−２２３、２６および２２４−２２６、２７および２２７−２２９、２８および２３０−２３２、２９および２３３−２３５、３０および２３６−２３８、３１および２３９−２４１、３２および２４２−２４４、３３および２４５−２４７、３４および２４８−２５０、３５および２５１−２５３、３６および２５４−２５６、および／または３７および２５７−２５９の配列を含み、ＨＶＲ  Ｈ１、Ｈ２及びＨ３配列は、それぞれ配列番号：８４、８５および／または８６である。さらなる実施態様では、フレームワーク配列は、配列番号：１９および２０３−２０５、２０および２０６−２０８、２１および２０９−２１１、２２および２１２−２１４、２３および２１５−２１７、２４および２１８−２２０、２５および２２１−２２３、２６および２２４−２２６、２７および２２７−２２９、２８および２３０−２３２、２９および２３３−２３５、３０および２３６−２３８、３１および２３９−２４１、３２および２４２−２４４、３３および２４５−２４７、３４および２４８−２５０、３５および２５１−２５３、３６および２５４−２５６、および／または３７および２５７−２５９の配列を含み、ＨＶＲ  Ｈ１、Ｈ２及びＨ３配列は、それぞれ配列番号：１０８、１０９および／または１１０である。
【００２２】
特定の実施態様では、本発明の抗体は軽鎖可変ドメインを含み、そのフレームワーク配列は配列番号：３８および２６０−２６２、３９および２６３−２６５、４０および２６６−２６８および／または４１および２６９−２７１の配列を含み、ＨＶＲ  Ｌ１、Ｌ２及びＬ３配列は、それぞれ配列番号：１６、１７および／または１８である。他の実施態様では、本発明の抗体は軽鎖可変ドメインを含み、そのフレームワーク配列は配列番号：３８および２６０−２６２、３９および２６３−２６５、４０および２６６−２６８および／または４１および２６９−２７１の配列を含み、ＨＶＲ  Ｌ１、Ｌ２及びＬ３配列はそれぞれ配列番号：５１、５２および／または５３である。他の実施態様では、本発明の抗体は軽鎖可変ドメインを含み、そのフレームワーク配列は配列番号：３８および２６０−２６２、３９および２６３−２６５、４０および２６６−２６８および／または４１および２６９−２７１の配列を含み、ＨＶＲ  Ｌ１、Ｌ２及びＬ３配列はそれぞれ配列番号：８７、８８及び／又は８９である。さらに他の実施態様では、本発明の抗体は軽鎖可変ドメインを含み、そのフレームワーク配列は配列番号：３８および２６０−２６２、３９および２６３−２６５、４０および２６６−２６８および／または４１および２６９−２７１の配列を含み、ＨＶＲ  Ｌ１、Ｌ２及びＬ３配列はそれぞれ配列番号：１１１、１１２および／または１１３である。
【００２３】
他の態様では、本発明の抗体は、配列番号：１３２の配列を含む重鎖可変ドメインおよび／または配列番号：１３３の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。他の態様では、本発明の抗体は、配列番号：１３４の配列を含む重鎖可変ドメインおよび／または配列番号：１３５の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。他の態様では、本発明の抗体は、配列番号：１３６の配列を含む重鎖可変ドメインおよび／または配列番号：１３７の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。他の態様では、本発明の抗体は、配列番号：１３８の配列を含む重鎖可変ドメインおよび／または配列番号：１３９の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
一態様では、本発明は、以下のアミノ酸配列：LAVPAANTVRFRCPA(配列番号：１７９)および／またはSDVEFHCKVYSDAQP(配列番号：１８０)を含むか、から基本的になるか、からなるポリペプチドを結合する抗ＦＧＦＲ３抗体を提供する。
いくつかの実施態様では、抗体は、成熟したヒトＦＧＦＲ３アミノ酸配列のアミノ酸番号１６４−１７８および／または２６９−２８３を含むか、から基本的になるか、からなるポリペプチドを結合する。
一実施態様では、本発明の抗ＦＧＦＲ３抗体は、配列LAVPAANTVRFRCPA(配列番号：１７９)および／またはSDVEFHCKVYSDAQP(配列番号：１８０)と、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を特異的に結合する。
【００２４】
一態様では、本発明の抗ＦＧＦＲ３抗体は、ＦＧＦＲ３ ＩＩＩｂポリペプチドの残基１５４、１５５、１５８、１５９、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７７、２０２、２０５、２０７、２１０、２１２、２１４、２１６、２１７、２４１、２４６、２４７、２４８、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、３１４、３１５、３１６、３１７および／または３１８、、又はＦＧＦＲ３ ＩＩＩｃポリペプチドの相当する残基の少なくとも１、２、３、４ないしはすべて以下の任意の数に結合する。当業者は、それぞれのＦＧＦＲ３配列間の対応する残基を同定するためにＦＧＦＲ３配列をどのように整列配置するかを理解する。２以上の残基の組合せは、ＦＧＦＲ３ ＩＩＩｂポリペプチドの残基１５４、１５５、１５８、１５９、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７７、２０２、２０５、２０７、２１０、２１２、２１４、２１６、２１７、２４１、２４６、２４７、２４８、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、３１４、３１５、３１６、３１７および／または３１８、又はＦＧＦＲ３ ＩＩＩｃポリペプチドの相当する残基の何れかを含みうる。いくつかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、ＦＧＦＲ３ ＩＩＩｂポリペプチドの残基１５８、１５９、１６９、１７０、１７１、１７３、１７５、２０５、２０７および／または３１５、又はＦＧＦＲ３ ＩＩＩｃポリペプチドの相当する残基の少なくとも１、２、３、４ないしはすべて以下の任意の数に結合する。いくつかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は、ＦＧＦＲ３ ＩＩＩｂポリペプチドの残基１５８、１７０、１７１、１７３、１７５および／または３１５、又はＦＧＦＲ３ ＩＩＩｃポリペプチドの相当する残基の少なくとも１、２、３、４ないしはすべて以下の任意の数に結合する。
一態様では、本発明は、ＦＧＦＲ３への結合について上記いずれかの抗体と競合する抗ＦＧＦＲ３抗体を提供する。一態様では、本発明は、上記いずれかの抗体と同じか又は類似するＦＧＦＲ３上のエピトープに結合する抗ＦＧＦＲ３抗体を提供する。
【００２５】
公知、そして以下により詳細に記述されるように、文脈及び当分野で公知の様々な定義に応じて、抗体の高頻度可変領域を正確に示すアミノ酸位／境界は異なってもよい(以下に記載する)。可変ドメイン内のいくつかの位置は、一判断基準の下で高頻度可変領域内にあるとみなされるが、他の判断基準の下では高頻度可変領域の外であるとみなされる点において、ハイブリッド高頻度可変位置と考えられうる。これらの一又は複数の位置もまた、伸長した高頻度可変領域内にみられうる(さらに後述する)。
いくつかの実施態様では、抗体はモノクローナル抗体である。他の実施態様では、抗体はポリクローナル抗体である。いくつかの実施態様では、抗体は、キメラ抗体、親和性成熟抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体からなる群から選択される。ある実施態様では、抗体は抗体断片である。いくつかの実施態様では、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆａｂ'-ＳＨ、Ｆ(ａｂ')２又はｓｃＦｖである。
いくつかの実施態様では、ＦＧＦＲ３抗体は、Ｆｃ領域を含む一アーム抗体であり(すなわち、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインが単一の抗原結合アームを形成する)、このときＦｃ領域は第一および第二のＦｃポリペプチドを含み、第一および第二のＦｃポリペプチドは、複合体で存在し、前記抗原結合アームを含むＦａｂ分子と比較して前記抗体断片の安定性を増加させるＦｃ領域を形成する。例として国際公開２００６／０１５３７１を参照のこと。
【００２６】
一実施態様では、抗体は、キメラ抗体、例えば異種性の非ヒト、ヒト、又はヒト化の配列(例えばフレームワークおよび／または定常ドメイン配列)に融合させた非ヒトドナー由来の抗原結合配列を含む抗体である。一実施態様では、非ヒトドナーはマウスである。さらなる実施態様では、抗原結合配列は合成されるもので、例えば突然変異誘発(例えばファージディスプレイスクリーニングなど)によって得られる。特定の実施態様では、本発明のキメラ抗体は、マウスのＶ領域およびヒトのＣ領域を有する。一実施態様では、マウスの軽鎖Ｖ領域は、ヒトのカッパ軽鎖に融合する。他の実施態様では、マウスの重鎖Ｖ領域は、ヒトのＩｇＧ１ Ｃ領域に融合する。
本発明のヒト化抗体は、フレームワーク領域(ＦＲ)内にアミノ酸置換を有するものや、融合させたＣＤＲ内に変異を有する親和性成熟変異体が含まれる。ＣＤＲ又はＦＲ内の置換されたアミノ酸は、ドナー又はレシピエント抗体に存在するものに限定しない。他の実施態様では、本発明の抗体はさらに、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ機能の亢進およびＢ細胞殺傷を含むエフェクター機能の改善を引き起こすＦｃ領域内のアミノ酸残基の変化を含む。本発明の他の抗体には、安定性を改善する特定の変化を有するものが含まれる。他の実施態様では、本発明の抗体はさらに、エフェクター機能の低減、例えばＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ機能の低減および／またはＢ細胞殺傷の低減を引き起こすＦｃ領域内のアミノ酸残基の変化を含む。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞上のヒトの補体因子Ｃ1ｑおよび／またはヒトのＦｃレセプターへの結合の減少(例えば結合の欠如）を特徴とする。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、ヒトのＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の減少（例えば結合の欠如）を特徴とする。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、ＩｇＧクラス（例えばＩｇＧ１又はＩｇＧ４）であり、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｇ２３６、Ｄ２６５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ａ３２７、Ａ３３０、Ｐ３３１および／またはＰ３２９（ＥＵインデックスに従った番号付け）に少なくとも一の突然変異を含む。いくつかの実施態様では、抗体は突然変異Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ又はＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａを含む。
【００２７】
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに付着する糖質は変更しうる。例えば、抗体のＦｃ領域に付着するフコースを欠く成熟した糖質構造を有する抗体は、米国特許公開２００３／０１５７１０８(Presta, L.)に記述される。米国特許公開２００４／００９３６２１(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)も参照のこと。抗体のＦｃ領域に付着する糖質にバイセクティング(bisecting)Ｎ‐アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)を有する抗体は、国際公開２００３／０１１８７８、Jean-Mairet et al.、及び米国特許第６６０２６８４号、Umana et al.に挙げられる。抗体のＦｃ領域に付着するオリゴ糖に少なくとも一のガラクトース残基を有する抗体は、国際公開１９９７／３００８７、Patel et al.に報告される。変更した糖質がＦｃ領域に付着している抗体については、国際公開１９９８／５８９６４(Raju, S.)及び国際公開１９９９／２２７６４(Raju, S.)も参照のこと。修飾したグリコシル化を有する抗原結合分子については米国特許第２００５／０１２３５４６(Umana et al.)も参照のこと。一態様では、本発明は、本明細書に示す何れかの抗原結合配列を含むＦＧＦＲ３結合ポリペプチドであって、ＦＧＦＲ３、例えばヒトおよび／またはカニクイザルおよび／またはマウスのＦＧＦＲ３に特異的に結合するＦＧＦＲ３結合ポリペプチドを提供する。
本発明の抗体は、ＦＧＦＲ３(例えばＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂおよび／またはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ)を結合(例えば特異的に結合)し、いくつかの実施態様では、ＦＧＦＲ３シグナル伝達(例えばＦＧＦＲ３リン酸化)および／または任意の生物学上関連するＦＧＦＲ３および／またはＦＧＦＲ３リガンドの生体経路の破壊、および／または腫瘍、細胞増殖性疾患又は癌の治療及び／又は予防；および／またはＦＧＦＲ３発現および／または活性(例えばＦＧＦＲ３発現および／または活性の増加)と関係している疾患の治療又は予防の一又は複数の態様を調整(例えば阻害)しうる。いくつかの実施態様では、ＦＧＦＲ３抗体は、ＦＧＦＲ３(例えばヒト又はマウスのＦＧＦＲ３)からなるか又は基本的にからなるポリペプチドに特異的に結合する。いくつかの実施態様では、抗体は１×１０−７Ｍ以上の強さのＫｄでＦＧＦＲ３を特異的に結合する。
【００２８】
いくつかの実施態様では、本発明の抗ＦＧＦＲ３抗体は、米国特許公開２００５／０１４７６１２に記載の抗ＦＧＦＲ３抗体(例えば抗体ＭＳＰＲＯ２、ＭＳＰＲＯ１２、ＭＳＰＲＯ５９、ＭＳＰＲＯ１１、ＭＳＰＲＯ２１、ＭＳＰＲＯ２４、ＭＳＰＲＯ２６、ＭＳＰＲＯ２８、ＭＳＰＲＯ２９、ＭＳＰＲＯ４３、ＭＳＰＲＯ５５)、Rauchenberger et al, J Biol Chem 278 (40): 38194-38205 (2003)に記載の抗体；ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００６／０４８８７７に記載の抗体(例えば抗体ＰＲＯ−００１)、Martinez-Torrecuadrada et al, Mol Cancer Ther (2008) 7(4): 862-873に記載の抗体(例えばｓｃＦｖαＦＧＦＲ３３Ｃ)、Direnzo, R et al (2007) Proceedings of AACR Annual Meeting, Abstract No. 2080に記載の抗体(例えばＤ１１)、又は国際公開２０１０／００２８６２に記載の抗体(例えば抗体１５Ｄ８、２７Ｈ２、４Ｅ７、２Ｇ４、２０Ｂ４)ではない。
一態様では、本発明は、本発明の一又は複数の抗体と担体を含む組成物を提供する。一実施態様では、担体は薬学的に許容可能である。
他の態様では、本発明は、本発明のＦＧＦＲ３抗体をコードする核酸を提供する。
さらに他の態様では、本発明は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。
更なる態様では、本発明は、本発明の一又は複数の核酸と担体を含む組成物を提供する。一実施態様では、担体は薬学的に許容可能である。
一態様では、本発明は、本発明の核酸又はベクターを含む宿主細胞を提供する。ベクターは、任意の種類、例えば発現ベクターなどの組換えベクターであってよい。任意の様々な宿主細胞が使われてよい。一実施態様では、宿主細胞は原核細胞、例えば大腸菌である。他の実施態様では、宿主細胞は、真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞などの哺乳類の細胞である。
【００２９】
更なる態様では、本発明は、本発明の抗体の作製方法を提供する。例えば、本発明は、抗ＦＧＦＲ３抗体(本明細書で定義するように、完全長抗体およびその断片を含む)の作製方法であって、抗体をコードする本発明の組み換えベクターを適切な宿主細胞において発現させることと、抗体を回収することを含む方法を提供する。いくつかの実施態様では、前記方法は、核酸が発現されるように抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含む。いくつかの実施態様では、前記方法はさらに、宿主細胞培養物から抗体を回収することを含む。いくつかの実施態様では、抗体は、宿主細胞培養液から回収される。いくつかの実施態様では、前記方法はさらに、回収した抗体を薬学的な担体、賦形剤又は担体と組合せ、ヒト化抗体を含む薬学的製剤を調製することを含む。
【００３０】
一態様では、本発明は、容器と、容器に内包される組成物とを具備し、この組成物が本発明の一又は複数のＦＧＦＲ３抗体を含むものである製造品を提供する。一実施態様では、組成物は本発明の核酸を含む。他の実施態様では、抗体を含む組成物はさらに担体を含有し、いくつかの実施態様ではそれは薬学的に許容可能なものである。一実施態様では、本発明の製造品はさらに、組成物(例えば抗体)を個体に投与するための指示書(例えば本明細書に記載の何れかの方法のための指示)を具備する。
他の態様では、本発明は、本発明の一又は複数の抗ＦＧＦＲ３抗体を含有する組成物を収容する第一容器と、バッファを収容する第二容器とを具備するキットを提供する。一実施態様では、バッファは薬学的に許容可能である。一実施態様では、抗体を含有する組成物はさらに担体を含み、いくつかの実施態様ではそれは薬学的に許容可能なものである。他の実施態様では、キットはさらに、個体に組成物(例えば抗体)を投与するための指示を具備する。
【００３１】
更なる態様では、本発明は本発明の抗ＦＧＦＲ３抗体の医薬としての使用を提供する。
更なる態様では、本発明は、ＦＧＦＲ３活性化および／または発現(実施態様によっては過剰発現)と関係している病的状態などの疾患を治療または予防する際に使用するための、本発明の抗ＦＧＦＲ３抗体を提供する。いくつかの実施態様では、疾患は、癌、腫瘍および／または細胞増殖性疾患である。いくつかの実施態様では、癌、腫瘍および／または細胞増殖性疾患は、多発性骨髄腫又は膀胱癌(例えば移行上皮癌)、乳癌又は肝癌である。
更なる態様では、本発明は、骨格疾患などの疾患を治療または予防する際に使用するための、本発明の抗ＦＧＦＲ３抗体を提供する。いくつかの実施態様では、疾患は、軟骨発育不全症、軟骨異栄養症、矮小発育症、致死性骨異形成症(ＴＤ；臨床型ＴＤ1およびＴＤＩＩ)又は頭蓋骨癒合症症候群である。
更なる態様では、本発明は、細胞増殖を低減する際に使用するための、本発明の抗ＦＧＦＲ３抗体を提供する。
【００３２】
更なる態様では、本発明は、細胞を殺す際に使用するための、本発明の抗ＦＧＦＲ３抗体を提供する。いくつかの実施態様では、細胞は多発性骨髄腫細胞である。いくつかの実施態様では、細胞はＡＤＣＣで殺される。いくつかの実施態様では、抗体はネイキッド抗体である。いくつかの実施態様では、細胞はＦＧＦＲ３を過剰発現する。
更なる態様では、本発明は、多発性骨髄腫細胞などの細胞を枯渇させる際に使用するための、本発明の抗ＦＧＦＲ３抗体を提供する。いくつかの実施態様では、細胞はＡＤＣＣで殺される。いくつかの実施態様では、抗体はネイキッド抗体である。いくつかの実施態様では、細胞はＦＧＦＲ３を過剰発現する。
【００３３】
更なる態様では、本発明は、ＦＧＦＲ３活性化および／または発現(実施態様によっては過剰発現)と関係している病的状態などの疾患の治療的及び／又は予防的な処置のための医薬の調製における、本発明の抗ＦＧＦＲ３抗体の使用を提供する。いくつかの実施態様では、疾患は、癌、腫瘍および／または細胞増殖性疾患である。いくつかの実施態様では、癌、腫瘍および／または細胞増殖性疾患は、多発性骨髄腫又は膀胱癌(例えば移行上皮癌)、乳癌又は肝癌である。いくつかの実施態様では、疾患は、骨格疾患、例えば軟骨発育不全症、軟骨異栄養症、矮小発育症、致死性骨異形成症(ＴＤ；臨床型ＴＤ１およびＴＤＩＩ)、又は頭蓋骨癒合症症候群である。
一態様では、本発明は、ＦＧＦＲ３活性化および／または発現(実施態様によっては過剰発現)と関係している病的状態などの疾患の治療的及び／又は予防的な処置のための医薬の調製における、本発明の核酸の使用を提供する。いくつかの実施態様では、疾患は、癌、腫瘍および／または細胞増殖性疾患である。いくつかの実施態様では、癌、腫瘍および／または細胞増殖性疾患は、多発性骨髄腫又は膀胱癌(例えば移行上皮癌)、乳癌又は肝癌である。いくつかの実施態様では、疾患は、骨格疾患、例えば軟骨発育不全症、軟骨異栄養症、矮小発育症、致死性骨異形成症(ＴＤ；臨床型ＴＤ１およびＴＤＩＩ)、又は頭蓋骨癒合症症候群である。
【００３４】
他の態様では、本発明は、ＦＧＦＲ３活性化および／または発現(実施態様によっては過剰発現)と関係している病的状態などの疾患の治療的及び／又は予防的な処置のための医薬の調製における、本発明の発現ベクターの使用を提供する。いくつかの実施態様では、疾患は、癌、腫瘍および／または細胞増殖性疾患である。いくつかの実施態様では、癌、腫瘍および／または細胞増殖性疾患は、多発性骨髄腫又は膀胱癌(例えば移行上皮癌)、乳癌又は肝癌である。いくつかの実施態様では、疾患は、骨格疾患、例えば軟骨発育不全症、軟骨異栄養症、矮小発育症、致死性骨異形成症(ＴＤ；臨床型ＴＤ１およびＴＤＩＩ)、又は頭蓋骨癒合症症候群である。
さらに他の態様では、本発明は、ＦＧＦＲ３活性化および／または発現(実施態様によっては過剰発現)と関係している病的状態などの疾患の治療的及び／又は予防的な処置のための医薬の調製における、本発明の宿主細胞の使用を提供する。いくつかの実施態様では、疾患は、癌、腫瘍および／または細胞増殖性疾患である。いくつかの実施態様では、癌、腫瘍および／または細胞増殖性疾患は、多発性骨髄腫又は膀胱癌(例えば移行上皮癌)、乳癌又は肝癌である。いくつかの実施態様では、疾患は、骨格疾患、例えば軟骨発育不全症、軟骨異栄養症、矮小発育症、致死性骨異形成症(ＴＤ；臨床型ＴＤ１およびＴＤＩＩ)、又は頭蓋骨癒合症症候群である。
更なる態様では、本発明は、ＦＧＦＲ３活性化および／または発現(実施態様によっては過剰発現)と関係している病的状態などの疾患の治療的及び／又は予防的な処置のための医薬の調製における、本発明の製造品の使用を提供する。いくつかの実施態様では、疾患は、癌、腫瘍および／または細胞増殖性疾患である。いくつかの実施態様では、癌、腫瘍および／または細胞増殖性疾患は、多発性骨髄腫又は膀胱癌(例えば移行上皮癌)、乳癌又は肝癌である。いくつかの実施態様では、疾患は、骨格疾患、例えば軟骨発育不全症、軟骨異栄養症、矮小発育症、致死性骨異形成症(ＴＤ；臨床型ＴＤ１およびＴＤＩＩ)、又は頭蓋骨癒合症症候群である。
【００３５】
一態様では、本発明も、ＦＧＦＲ３活性化および／または発現(実施態様によっては過剰発現)と関係している病的状態などの疾患の治療的及び／又は予防的な処置のための医薬の調製における、本発明のキットの使用を提供する。いくつかの実施態様では、疾患は、癌、腫瘍および／または細胞増殖性疾患である。いくつかの実施態様では、癌、腫瘍および／または細胞増殖性疾患は、多発性骨髄腫又は膀胱癌(例えば移行上皮癌)、乳癌又は肝癌である。いくつかの実施態様では、疾患は、骨格疾患、例えば軟骨発育不全症、軟骨異栄養症、矮小発育症、致死性骨異形成症(ＴＤ；臨床型ＴＤ１およびＴＤＩＩ)、又は頭蓋骨癒合症症候群である。
更なる態様では、本発明は、細胞増殖の阻害のための医薬の調製における本発明の抗ＦＧＦＲ３抗体の使用を提供する。更なる態様では、本発明は細胞殺傷のための医薬の調製における本発明の抗ＦＧＦＲ３抗体の使用を提供する。いくつかの実施態様では、細胞は多発性骨髄腫細胞である。いくつかの実施態様では、細胞はＡＤＣＣで殺される。いくつかの実施態様では、抗体はネイキッド抗体である。いくつかの実施態様では、細胞はＦＧＦＲ３を過剰発現する。
更なる態様では、本発明は、多発性骨髄腫細胞などの細胞を枯渇させるための医薬の調製における本発明の抗ＦＧＦＲ３抗体の使用を提供する。いくつかの実施態様では、細胞はＡＤＣＣで殺される。いくつかの実施態様では、抗体はネイキッド抗体である。いくつかの実施態様では、細胞はＦＧＦＲ３を過剰発現する。
【００３６】
本発明は、発現及び／又はシグナル伝達の増加又は望ましくない発現及び／又はシグナル伝達といったＦＧＦＲ３の発現および／またはシグナル伝達と関係している疾患を調節するために有用な方法および組成物を提供する。
本発明の方法を用いて任意の適切な病理学的状態に作用させることができる。例示的な疾患は、本明細書に記載され、非小細胞肺癌、卵巣癌、甲状腺癌、精巣癌、子宮体癌、頭頸部癌、脳癌(例えば神経芽細胞腫又は髄膜腫)、皮膚癌(例えばメラノーマ、基底細胞癌又は扁平上皮癌)、膀胱癌(例えば移行上皮癌)、乳癌、胃癌、結腸直腸癌(ＣＲＣ)、肝細胞癌、子宮頸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、および血液学的な悪性腫瘍(例えばＴ細胞急性リンパ芽球性白血病(Ｔ−ＡＬＬ)、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病(Ｂ−ＡＬＬ)、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、Ｂ細胞悪性腫瘍、ホジキンリンパ腫、および多発性骨髄腫)からなる群から選択される癌が含まれる。いくつかの実施態様では、疾患は浸潤性移行上皮癌である。いくつかの実施態様では、疾患は多発性骨髄腫である。他の例示的な疾患には、骨格疾患、例えば軟骨発育不全症、軟骨異栄養症、矮小発育症、致死性骨異形成症(ＴＤ；臨床型ＴＤ１およびＴＤＩＩ)、又は頭蓋骨癒合症症候群である。
【００３７】
ある実施態様では、癌は、ＦＧＦＲ３を発現し、ＦＧＦＲ３を増幅し、ＦＧＦＲ３を転座させ、および／または、ＦＧＦＲ３を変異させた。ある実施態様では、癌は活性化されたＦＧＦＲ３を発現する。ある実施態様では、癌は、転座したＦＧＦＲ３(例えばｔ(４；１４)転座)を発現する。ある実施態様では、癌は、恒常的にＦＧＦＲ３を発現する。いくつかの実施態様では、恒常的なＦＧＦＲ３は、チロシンキナーゼドメインおよび／または膜近傍ドメインおよび／またはリガンド-結合ドメインに突然変異を含む。ある実施態様では、癌は、リガンド非依存性ＦＧＦＲ３を発現する。いくつかの実施態様では、癌は、リガンド依存性ＦＧＦＲ３を発現する。
【００３８】
いくつかの実施態様では、癌は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４８Ｃに対応する突然変異を含むＦＧＦＲ３を発現する。いくつかの実施態様では、癌は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４８Ｃおよび／またはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＳ２４８Ｃを発現した。
いくつかの実施態様では、癌は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅに対応する突然変異を含むＦＧＦＲ３を発現する。いくつかの実施態様では、癌は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅおよび／またはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＫ６５０Ｅを発現した。
ＦＧＦＲ３は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９Ｃに対応する突然変異を含む。いくつかの実施態様では、癌は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９Ｃおよび／またはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＳ２４９Ｃを発現する。
一態様では、癌は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＧ３７２Ｃに対応する突然変異を含むＦＧＦＲ３を発現する。いくつかの実施態様では、癌は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＧ３７２Ｃおよび／またはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＧ３７０Ｃを発現する。
一態様では、癌は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃに対応する突然変異を含むＦＧＦＲ３を発現する。いくつかの実施態様では、癌は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃおよび／またはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃＹ３７３Ｃを発現する。
いくつかの実施態様では、癌は、(ａ) ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅおよび(ｂ) ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＲ２４８Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９ＣおよびＦＧＦＲ３ＩＩＩｂＧ３７２Ｃの一又は複数を発現する。
いくつかの実施態様では、癌は、(ａ) ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＲ２４８Ｃおよび(ｂ) ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９ＣおよびＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＧ３７２Ｃの一又は複数を発現する。
いくつかの実施態様では、癌は、(ａ) ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＧ３７２Ｃおよび(ｂ) ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９ＣおよびＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＲ２４８Ｃの一又は複数を発現する。
いくつかの実施態様では、癌は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＲ２４８Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９ＣおよびＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＧ３７２Ｃを発現する。
ある実施態様では、癌は、コントロール試料(例えば正常組織の試料)又はレベルと関連してホスホ-ＦＧＦＲ３、ホスホ-ＦＲＳ２および／またはホスホ-ＭＡＰＫの増加したレベルを発現する。
【００３９】
いくつかの実施態様では、癌は、細胞につきおよそ１００００以上のＦＧＦＲ３分子(例えば１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、１６０００、１７０００、１８０００以上のＦＧＦＲ３レセプター)を(例えば細胞表面上に)発現する。いくつかの実施態様では、癌は、およそ１３０００のＦＧＦＲ３分子を発現する。他の実施態様では、癌は、およそ５０００、６０００、７０００、８０００又はそれ以上のＦＧＦＲ３分子を発現する。いくつかの実施態様では、癌は、およそ４０００、３０００、２０００、１０００又はそれ以下のＦＧＦＲ３分子を発現する。いくつかの実施態様では、癌は、およそ１０００未満のＦＧＦＲ３分子を発現する。
一実施態様では、本発明の方法で標的とされる細胞は癌細胞である。例えば、癌細胞は、乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞(例えば非小細胞肺癌細胞)、甲状腺癌細胞、多発性骨髄腫細胞、精巣癌細胞、乳頭カルシノーマ細胞、大腸癌細胞、膵臓癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頚癌細胞、中枢神経系癌細胞、骨原性肉種細胞、腎臓カルシノーマ細胞、肝細胞癌細胞、膀胱癌細胞(例えば移行上皮癌細胞)、胃カルシノーマ細胞、頭頸部扁平上皮癌細胞、メラノーマ細胞、白血病細胞、多発性骨髄腫細胞(例えばｔ(４:１４) ＦＧＦＲ３転座を含む多発性骨髄腫細胞)および大腸腺腫細胞からなる群から選択されるものであってよい。一実施態様では、本発明の方法で標的とされる細胞は、過剰増殖性および／または過形成性細胞である。他の実施態様では、本発明の方法で標的とされる細胞は、形成異常細胞である。さらに他の実施態様では、本発明の方法で標的とされる細胞は、転移性細胞である。
【００４０】
一態様では、本発明は、被検体の細胞増殖の阻害方法であって、被検体に抗ＦＧＦＲ３抗体の有効量を投与して細胞増殖を低減することを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、被検体の細胞の殺傷方法であって、被検体に抗ＦＧＦＲ３抗体の有効量を投与して、細胞を殺すことを含む方法を提供する。いくつかの実施態様では、細胞は多発性骨髄腫細胞である。いくつかの実施態様では、細胞はＡＤＣＣで殺される。いくつかの実施態様では、抗体はネイキッド抗体である。いくつかの実施態様では、細胞はＦＧＦＲ３を過剰発現する。
一態様では、本発明は、被検体の細胞(例えば多発性骨髄腫)の枯渇方法であって、被検体に抗ＦＧＦＲ３抗体の有効量を投与して、細胞を殺すことを含む方法を提供する。いくつかの実施態様では、細胞はＡＤＣＣで殺される。いくつかの実施態様では、抗体はネイキッド抗体である。いくつかの実施態様では、細胞はＦＧＦＲ３を過剰発現する。
一態様では、本発明は、骨格疾患を治療又は予防するための方法を提供する。いくつかの実施態様では、疾患は、軟骨発育不全症、軟骨異栄養症、矮小発育症、致死性骨異形成症(ＴＤ；臨床型ＴＤ１およびＴＤＩＩ)、又は頭蓋骨癒合症症候群である。
本発明の方法は、他の処理工程を更に含んでよい。例えば、一実施態様では、方法は、標的とした細胞および／または組織(例えば癌細胞)が放射線治療又は化学療法剤にさらされる工程を更に含む。
【００４１】
一態様では、本発明は、他の治療薬(例えば抗脈管形成剤、他の抗体、化学療法剤、細胞障害性剤、免疫抑制剤、プロドラッグ、サイトカイン、細胞障害性放射線療法、副腎皮質ステロイド、制吐剤、癌ワクチン、鎮痛剤又は増殖阻害性剤)の有効量と組み合わせて抗ＦＧＦＲ３抗体の有効量の投与を含む方法を提供する。例えば、抗ＦＧＦＲ３抗体は、様々な腫瘍性又は非腫瘍性状態を治療するために抗癌剤又は抗血管新生剤と組み合わせて用いられる。ある例では、抗ＦＧＦＲ３抗体が、ベルケイド、レブリミド、タモキシフェン、レトロゾール、エキセメスタン、アナストロゾール、イリノテカン、セツキシマブ、フルベストラント、ビノレルビン、ベバシズマブ、ビンクリスチン、シスプラチン、ゲムシタビン、メトトレキセート、ビンブラスチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ペメトレキセド、５‐フルオロウラシル、ドキソルビシン、ボルテゾミブ、レナリドミド、デキサメサゾン、メルファラン、プレドニゾン、ビンクリスチンおよび／またはサリドマイドと組み合わせて用いられる。
治療される特定の癌指標に従い、本発明の併用療法は、他の治療薬、例えば化学療法剤、又は放射線療法又は手術などの他の療法と組み合わされうる。多くの公知の化学療法剤が、本発明の併用療法において使われてよい。好ましくは、特定の指標の治療のための標準物質である化学療法剤が使われるであろう。併用して用いられる各々の治療薬の用量又は頻度は、他の薬剤(一又は複数)を用いない場合の相当薬剤の用量又は頻度と同じか又はそれより少ないのが好ましい。
他の態様では、本発明は、検出可能な標識を含む、本明細書中に記載の何れかの抗ＦＧＦＲ３抗体を提供する。
他の態様では、本発明は、本明細書中に記載の何れかの抗ＦＧＦＲ３抗体とＦＧＦＲ３の複合体を提供する。いくつかの実施態様では、複合体はインビボ又はインビトロである。いくつかの実施態様では、複合体は癌細胞を含む。いくつかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ３抗体は検出可能に標識される。
更なる実施態様
実施態様１．  (i)  Ｘ１がＶ又はＤであり、Ｘ２がＶ又はＩであり、Ｘ３がＤ、Ｅ又はＳであり、Ｘ４がＴ又はＩであり、Ｘ５がＡ又はＳであり、Ｘ６がＶ又はＬである、配列ＲＡＳＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ａ(配列番号：１４６)を含むＨＶＲ−Ｌ１、
(ii) Ｘ１がＳ又はＧであり、Ｘ２がＡ又はＹである、配列Ｘ１ＡＳＦＬＸ２Ｓ(配列番号：１４７)を含むＨＶＲ−Ｌ２、
(iii)Ｘ１がＧ、Ｓ又はＴであり、Ｘ２がＴ、Ｙ又はＡであり、Ｘ３がＧ、Ｓ、Ｔ又はＡであり、Ｘ４がＡ、Ｈ、Ｄ、Ｔ又はＮであり、Ｘ５がＱ、Ｐ又はＳであり、Ｘ６がＳ、Ｙ、Ｌ、Ｐ又はＱである、配列ＱＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｔ(配列番号：１４８)を含むＨＶＲ−Ｌ３、
(iv)  Ｘ１がＳ又はＴであり、Ｘ２がＷ、Ｙ、Ｓ又はＴであり、Ｘ３がＳ、Ｇ又はＴである、配列ＧＦＸ１ＦＸ２Ｘ３ＴＧＩＳ(配列番号：１４９)を含むＨＶＲ−Ｈ１、
(v) Ｘ１がＹ、Ａ、Ｌ、Ｓ又はＴであり、Ｘ２がＡ、Ｑ、Ｄ、Ｇ、Ｙ、Ｓ、Ｎ又はＦであり、Ｘ３がＡ、Ｄ又はＧであり、Ｘ４がＴ又はＳであり、Ｘ５がＫ、Ｆ、Ｔ又はＳであり、Ｘ６がＹ、Ｈ、Ｎ又はＩである、配列ＧＲＩＹＰＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＹＡＤＳＶＫＧ(配列番号：１５０)を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び、
(vi) 配列ＡＲＴＹＧＩＹＤＬＹＶＤＹＴＥＹＶＭＤＹ(配列番号：１５１)を含むＨＶＲ−Ｈ３、
を含む、単離された抗ＦＧＦＲ３アンタゴニスト抗体。
実施態様２．  (i)  ＨＶＲ−Ｌ１が、Ｘ１がＶ又はＤであり、Ｘ２がＤ又はＳであり、Ｘ３がＴ又はＩであり、Ｘ４がＡ又はＳである、配列ＲＡＳＱＸ１ＶＸ２Ｘ３Ｘ４ＶＡ(配列番号：１５２)を含み、
(ii)  ＨＶＲ−Ｌ３が、Ｘ１がＳ、Ｇ又はＴであり、Ｘ２がＹ、Ｔ又はＡであり、Ｘ３がＴ又はＧであり、Ｘ４がＴ、Ｈ又はＮであり、Ｘ５がＰ又はＳであり、Ｘ６がＰ、Ｑ、Ｙ又はＬである、配列ＱＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｔ(配列番号：１５３)を含み、及び／又は、
(iii)  ＨＶＲ−Ｈ２が、Ｘ１がＴ又はＬであり、Ｘ２がＮ、Ｙ、Ｓ、Ｇ、Ａ又はＱであり、Ｘ３がＮ又はＨである、配列ＧＲＩＹＰＸ１Ｘ２ＧＳＴＸ３ＹＡＤＳＶＫＧ(配列番号：１５４)を含む、
実施態様１に記載の抗ＦＧＦＲ３アンタゴニスト抗体。
実施態様３．  (i)  ＨＶＲ−Ｌ１が配列RASQDVDTSLA(配列番号：８７)を含み、
(ii) ＨＶＲ−Ｌ２が配列SASFLYS(配列番号：８８)を含み、
(iii)ＨＶＲ−Ｌ３が配列QQSTGHPQT(配列番号：８９)を含み、
(iv) ＨＶＲ−Ｈ１が配列GFTFTSTGIS(配列番号：８４)を含み、
(v)  ＨＶＲ−Ｈ２が配列GRIYPTSGSTNYADSVKG(配列番号：８５)を含み、そして、
(vi) ＨＶＲ−Ｈ３が配列ARTYGIYDLYVDYTEYVMDY(配列番号：８６)を含む、
実施態様１に記載の抗ＦＧＦＲ３アンタゴニスト抗体。
実施態様４．  (i)  ＨＶＲ−Ｌ１が配列RASQDVSTAVA(配列番号：５１)を含み、
(ii)  ＨＶＲ−Ｌ２が配列SASFLYS(配列番号：５２)を含み、
(iii)ＨＶＲ−Ｌ３が配列QQTYTTSLT(配列番号：５３)を含み、
(iv) ＨＶＲ−Ｈ１が配列GFTFTSTGIS(配列番号：４８)を含み、
(v)  ＨＶＲ−Ｈ２が配列GRIYPLYGSTHYADSVKG(配列番号：４９)を含み、そして、
(vi) ＨＶＲ−Ｈ３が配列ARTYGIYDLYVDYTEYVMDY(配列番号：５０)を含む、
実施態様２に記載の抗ＦＧＦＲ３アンタゴニスト抗体。
実施態様５．  抗体が、配列番号：１３２を含む重鎖可変領域と配列番号：１３３を含む軽鎖可変領域とを含む、実施態様３に記載の抗ＦＧＦＲ３アンタゴニスト抗体。
実施態様６．  (i)  配列番号：１３４を含む重鎖可変領域と配列番号：１３５を含む軽鎖可変領域、又は、
(ii) 配列番号：１３６を含む重鎖可変領域と配列番号：１３７を含む軽鎖可変領域
を含む、実施態様１に記載の抗ＦＧＦＲ３アンタゴニスト抗体。
実施態様７．  抗体が、以下の性質の一又は複数を含む、  実施態様１から６のいずれか一に記載の抗ＦＧＦＲ３アンタゴニスト抗体。
（ａ）１×１０−８以上の強さのＫｄでヒトＦＧＦＲ３を結合する、
（ｂ）アミノ酸配列LAVPAANTVRFRCPA(配列番号：１７９)および／またはSDVEFHCKVYSDAQP(配列番号：１８０)と、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを結合する、
（ｃ）ＦＧＦＲ３レセプターと該レセプターの他のユニットとの二量体化を阻害し、これによってレセプターの活性化が阻害される、及び、
（ｄ）(a) ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＲ２４８Ｃと、(b) 一又は複数のＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＫ６５２Ｅ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＹ３７５Ｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９ＣおよびＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＧ３７２Ｃを阻害する。
実施態様８．  抗体が、以下の性質の一又は複数を含む、実施態様１から６のいずれか一に記載の抗ＦＧＦＲ３アンタゴニスト抗体。
（ａ）抗体依存性細胞媒介細胞障害活性を有する、
（ｂ）実質的なＦＧＦＲ３下方制御を誘導しない、
（ｃ）抗体の二価の様式が実質的なアゴニスト機能を備えていない、
（ｄ）ＦＧＦＲ３ ＩＩＩｂの残基１５４、１５５、１５８、１５９、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７７、２０２、２０５、２０７、２１０、２１２、２１４、２１６、２１７、２４１、２４６、２４７、２４８、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、３１４、３１５、３１６、３１７および／または３１８の少なくとも１、２、３、４又はすべての数以下の任意の数に結合する。
実施態様９．  抗体がフレームワーク配列を含み、該フレームワーク配列の少なくとも一部がヒトコンセンサスフレームワーク配列である、実施態様１から６のいずれか一に記載の抗ＦＧＦＲ３アンタゴニスト抗体。
実施態様１０．  抗体がヒトκサブグループコンセンサスフレームワーク配列及び／又は重鎖ヒトサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク配列を含む、実施態様９に記載の抗ＦＧＦＲ３アンタゴニスト抗体。
実施態様１１．  抗体がＦｃ領域内のアミノ酸残基に変化を含み、これによってエフェクター機能が低減される、実施態様１から６のいずれか一に記載の抗ＦＧＦＲ３アンタゴニスト抗体。
実施態様１２．  抗体がＩｇＧ１クラスであり、変異Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ（ＥＵインデックスによる番号付け）を含む、実施態様１１に記載の抗ＦＧＦＲ３アンタゴニスト抗体。
実施態様１３．  抗体がモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、親和性成熟抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体および抗体断片からなる群から選択される、実施態様１から６のいずれか一に記載の抗ＦＧＦＲ３アンタゴニスト抗体。
実施態様１４．  実施態様１から６のいずれか一に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
実施態様１５．  実施態様１４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
実施態様１６．  実施態様１５に記載のベクターを含むインビトロの宿主細胞。
実施態様１７．  抗ＦＧＦＲ３抗体の製造方法であって、ポリヌクレオチドが発現するように、実施態様１から６のいずれか一に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養し、場合によって、培養物から抗体を回収することを含む方法。
実施態様１８．  実施態様１から６のいずれか一に記載の抗体と薬学的に許容可能な担体とを含有してなる薬学的製剤。
実施態様１９．  細胞増殖を阻害する、及び／又は、癌細胞を枯渇させるための、実施態様１から６のいずれか一に記載の抗ＦＧＦＲ３アンタゴニスト抗体の使用。
実施態様２０．  癌を治療するための、実施態様１から６のいずれか一に記載の抗ＦＧＦＲ３アンタゴニスト抗体の使用。
実施態様２１．  癌が、固形腫瘍、多発性骨髄腫、膀胱癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、甲状腺癌、頭頸部癌、肝癌、乳癌、胃癌、移行上皮癌及び結腸直腸癌からなる群から選択される、実施態様２０に記載の使用。
実施態様２２．  癌が、ＦＧＦＲ３活性化及び／又はＦＧＦＲ３過剰発現と関連している、実施態様２０に記載の使用。
実施態様２３．  骨格疾患を治療又は予防するための、実施態様１から６のいずれか一に記載の抗ＦＧＦＲ３アンタゴニスト抗体の使用。
実施態様２４．  骨格疾患が、軟骨発育不全症、軟骨異栄養症、矮小発育症、致死性骨異形成症及び頭蓋骨癒合症症候群からなる群から選択される、実施態様２３に記載の使用。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１Ａ−Ｃ】抗ＦＧＦＲ３抗体の重鎖および軽鎖のＨＶＲループ配列。図は、重鎖ＨＶＲ配列、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３と、軽鎖ＨＶＲ配列、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３を示す。配列番号付けは以下の通りである： クローン１８４．６(ＨＶＲ−Ｈ１は配列番号：１であり、ＨＶＲ−Ｈ２は配列番号：２であり、ＨＶＲ−Ｈ３は配列番号：３であり、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号：４であり、ＨＶＲ−Ｌ２は配列番号：５であり、ＨＶＲ−Ｌ３は配列番号：６である)。クローン１８４.６.１(ＨＶＲ−Ｈ１は配列番号：７であり、ＨＶＲ−Ｈ２は配列番号：８であり、ＨＶＲ−Ｈ３は配列番号：９であり、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号：１０であり、ＨＶＲ−Ｌ２は配列番号：１１であり、ＨＶＲ−Ｌ３は配列番号：１２である)。クローン１８４.６.５８(ＨＶＲ−Ｈ１は配列番号：１３であり、ＨＶＲ−Ｈ２は配列番号：１４であり、ＨＶＲ−Ｈ３は配列番号：１５であり、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号：１６であり、ＨＶＲ−Ｌ２は配列番号：１７であり、ＨＶＲ−Ｌ３は配列番号：１８である)。クローン１８４.６.６２(ＨＶＲ−Ｈ１は配列番号：４８であり、ＨＶＲ−Ｈ２は配列番号：４９であり、ＨＶＲ−Ｈ３は配列番号：５０であり、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号：５１であり、ＨＶＲ−Ｌ２は配列番号：５２であり、ＨＶＲ−Ｌ３は配列番号：５３である)。クローン１８４.６.２１(ＨＶＲ−Ｈ１は配列番号：５４であり、ＨＶＲ−Ｈ２は配列番号：５５であり、ＨＶＲ−Ｈ３は配列番号：５６であり、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号：５７であり、ＨＶＲ−Ｌ２は配列番号：５８であり、ＨＶＲ−Ｌ３は配列番号：５９である)。クローン１８４.６.４９(ＨＶＲ−Ｈ１は配列番号：６０であり、ＨＶＲ−Ｈ２は配列番号：６１であり、ＨＶＲ−Ｈ３は配列番号：６２であり、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号：６３であり、ＨＶＲ−Ｌ２は配列番号：６４であり、ＨＶＲ−Ｌ３は配列番号：６５である)。クローン１８４.６.５１(ＨＶＲ−Ｈ１は配列番号：６６であり、ＨＶＲ−Ｈ２は配列番号：６７であり、ＨＶＲ−Ｈ３は配列番号：６８であり、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号：６９であり、ＨＶＲ−Ｌ２は配列番号：７０であり、ＨＶＲ−Ｌ３は配列番号：７１である)。クローン１８４.６.５２(ＨＶＲ−Ｈ１は配列番号：７２であり、ＨＶＲ−Ｈ２は配列番号：７３であり、ＨＶＲ−Ｈ３は配列番号：７４であり、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号：７５であり、ＨＶＲ−Ｌ２は配列番号：７６であり、ＨＶＲ−Ｌ３は配列番号：７７である)。クローン１８４.６.９２(ＨＶＲ−Ｈ１は配列番号：７８であり、ＨＶＲ−Ｈ２は配列番号：７９であり、ＨＶＲ−Ｈ３は配列番号：８０であり、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号：８１であり、ＨＶＲ−Ｌ２は配列番号：８２であり、ＨＶＲ−Ｌ３は配列番号：８３である)。クローン１８４.６.１.Ｎ５４Ｓ(ＨＶＲ−Ｈ１は配列番号：８４であり、ＨＶＲ−Ｈ２は配列番号：８５であり、ＨＶＲ−Ｈ３は配列番号：８６であり、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号：８７であり、ＨＶＲ−Ｌ２は配列番号：８８であり、ＨＶＲ−Ｌ３は配列番号：８９である)。クローン１８４.６.１.Ｎ５４Ｇ(ＨＶＲ−Ｈ１は配列番号：９０であり、ＨＶＲ−Ｈ２は配列番号：９１であり、ＨＶＲ−Ｈ３は配列番号：９２であり、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号：９３であり���ＨＶＲ−Ｌ２は配列番号：９４であり、ＨＶＲ−Ｌ３は配列番号：９５である)。クローン１８４.６.１.Ｎ５４Ａ(ＨＶＲ−Ｈ１は配列番号：９６であり、ＨＶＲ−Ｈ２は配列番号：９７であり、ＨＶＲ−Ｈ３は配列番号：９８であり、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号：９９であり、ＨＶＲ−Ｌ２は配列番号：１００であり、ＨＶＲ−Ｌ３は配列番号：１０１である)。クローン１８４.６.１.Ｎ５４Ｑ(ＨＶＲ−Ｈ１は配列番号：１０２であり、ＨＶＲ−Ｈ２は配列番号：１０３であり、ＨＶＲ−Ｈ３は配列番号：１０４であり、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号：１０５であり、ＨＶＲ−Ｌ２は配列番号：１０６であり、ＨＶＲ−Ｌ３は配列番号：１０７である)。クローン１８４.６.５８.Ｎ５４Ｓ(ＨＶＲ−Ｈ１は配列番号：１０８であり、ＨＶＲ−Ｈ２は配列番号：１０９であり、ＨＶＲ−Ｈ３は配列番号：１１０であり、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号：１１１であり、ＨＶＲ−Ｌ２は配列番号：１１２であり、ＨＶＲ−Ｌ３は配列番号：１１３である)。クローン１８４.６.５８.Ｎ５４Ｇ(ＨＶＲ−Ｈ１は配列番号：１１４であり、ＨＶＲ−Ｈ２は配列番号：１１５であり、ＨＶＲ−Ｈ３は配列番号：１１６であり、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号：１１７であり、ＨＶＲ−Ｌ２は配列番号：１１８であり、ＨＶＲ−Ｌ３は配列番号：１１９である)。クローン１８４.６.５８.Ｎ５４Ａ(ＨＶＲ−Ｈ１は配列番号：１２０であり、ＨＶＲ−Ｈ２は配列番号：１２１であり、ＨＶＲ−Ｈ３は配列番号：１２２であり、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号：１２３であり、ＨＶＲ−Ｌ２は配列番号：１２４であり、ＨＶＲ−Ｌ３は配列番号：１２５である)。クローン１８４.６.５８.Ｎ５４Ｑ(ＨＶＲ−Ｈ１は配列番号：１２６であり、ＨＶＲ−Ｈ２は配列番号：１２７であり、ＨＶＲ−Ｈ３は配列番号：１２８であり、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号：１２９であり、ＨＶＲ−Ｌ２は配列番号：１３０であり、ＨＶＲ−Ｌ３は配列番号：１３１である)。クローン１８４.６.１.ＮＳ Ｄ３０Ｅ(ＨＶＲ−Ｈ１は配列番号：１４３であり、ＨＶＲ−Ｈ２は配列番号：１４４であり、ＨＶＲ−Ｈ３は配列番号：１４５であり、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号：１４０であり、ＨＶＲ−Ｌ２は配列番号：１４１であり、ＨＶＲ−Ｌ３は配列番号：１４２である)。アミノ酸位は後述するカバット番号付けシステムに従って番号を付す。
【図２Ａ】抗ＦＧＦＲ３抗体１８４.６.１.Ｎ５４Ｓ、１８４.６.５８および１８４.６.６２の重鎖可変領域のアミノ酸配列と軽鎖可変領域を示す。
【図２Ｂ】抗ＦＧＦＲ３抗体１Ｇ６、６Ｇ１および１５Ｂ２の高頻度可変領域。
【図３Ａ−Ｂ】本発明を実施する際に使用される、例示的なアクセプターヒトコンセンサスフレームワーク配列を表す。配列識別子は以下の通りである。可変重鎖(ＶＨ)コンセンサスフレームワーク(図３Ａ、３Ｂ)。ヒトＶＨサブグループIコンセンサスフレームワークからカバットＣＤＲを除いたもの(配列番号：１９および２０３−２０５)。ヒトＶＨサブグループIコンセンサスフレームワークから伸長した高頻度可変領域を除いたもの(配列番号：２０および２０６−２０８、２１および２０９−２１１、２２および２１２−２１４)。ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワークからカバットＣＤＲを除いたもの(配列番号：２３および２１５−２１７)。ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワークから伸長した高頻度可変領域を除いたもの(配列番号：２４および２１８−２２０、２５および２２１−２２３、２６および２２４−２２６)。ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワークからヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークとカバットＣＤＲを除いたもの(配列番号：２７および２２７−２２９)。ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークから伸長した高頻度可変領域を除いたもの(配列番号：２８および２３０−２３２、２９および２３３−２３５、３０および２３６−２３８)。ヒトＶＨアクセプターフレームワークからカバットＣＤＲを除いたもの(配列番号：３１および２３９−２４１)。ヒトＶＨアクセプターフレームワークから伸長した高頻度可変領域を除いたもの(配列番号：３２および２４２−２４４、３３および２２４５−２４７)。ヒトＶＨアクセプター２フレームワークからカバットＣＤＲを除いたもの(配列番号：３４および２４８−２５０)。ヒトＶＨアクセプター２フレームワークから伸長した高頻度可変領域を除いたもの(配列番号：３５および２５１−２５３、３６および２５４−２５６、３７および２５７−２５９)。
【図４】可変軽鎖(ＶＬ)コンセンサスフレームワーク。ヒトＶＬκサブグループIコンセンサスフレームワーク(配列番号：３８および２６０−２６２)。ヒトＶＬκサブグループＩＩコンセンサスフレームワーク(配列番号：３９および２６３−２６５)。ヒトＶＬκサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク(配列番号：４０および２６６−２６８)。ヒトＶＬκサブグループＩＶコンセンサスフレームワーク(配列番号：４１および２６９−２７１)。
【図５】ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８軽鎖のフレームワーク領域配列(配列番号：４２-４５)および重鎖のフレームワーク領域配列(配列番号：４６、４７、１７５、１７６)を示す。上付／太字の数はカバットによるアミノ酸位を示す。
【図６】ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８軽鎖の修飾／変異フレームワーク領域配列(配列番号：４２、４３、１７７、４５)および重鎖の修飾／変異フレームワーク領域配列(配列番号：４６、４７、１７８および１７６)を示す。上付／太字の数はカバットによるアミノ酸位を示す。
【図７Ａ−Ｃ】膀胱癌細胞ＲＴ１１２のＦＧＦＲ３ノックダウンは、増殖を阻害し、インビトロでＧ1細胞周期静止を誘導し、インビトロで腫瘍増殖を抑制する。３つの異なるＦＧＦＲ３ ｓｈＲＮＡをＴｅｔ誘導発現ベクターにクローニングした。ＦＧＦＲ３ ｓｈＲＮＡ又はコントロールｓｈＲＮＡを安定して発現するＲＴ１１２細胞をピューロマイシン選別によって得た。(Ａ) ドキシサイクリン(Ｄｏｘ、０、０．１および１μｇ／ｍｌ、左から右に)のある場合又はない場合で処置した選択クローンにおけるＦＧＦＲ３発現を示す代表的なブロット。(Ｂ) ＲＴ１１２安定細胞による[３Ｈ]-チミジン取込み。ＲＴ１１２安定クローンを１μｇ／ｍｌドキシサイクリンの有無の下で培養させた後、[３Ｈ]-チミジン(１ウェルにつき１μＣｉ)とともに１６時間インキュベートした。取り込まれた[３Ｈ]-チミジンの数は、ドキシサイクリン誘導のない細胞のものに規準化した。誤差バーはＳＥＭを表す。(Ｃ) ＲＴ１１２安定細胞のＤＮＡ蛍光フローサイトメトリー棒グラフ。コントロールｓｈＲＮＡ又はＦＧＦＲ３ ｓｈＲＮＡ４を発現するＲＴ１１２クローンを、１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンの有無の下で７２時間培養し、核をプロピジウムヨウ素(ＰＩ)にて染色した。ＦＧＦＲ３ ｓｈＲＮＡ２および６について類似の結果が得られた(図１６)。
【図７Ｄ】(Ｄ) マウスにおけるコントロールｓｈＲＮＡ(処置群につきｎ＝９)又はＦＧＦＲ３ ｓｈＲＮＡ４(処置群につきｎ＝１１)を発現するＲＴ１１２細胞の増殖。マウスに、５％スクロースのみ又は１ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリンを添加したものを投与し、腫瘍サイズを週に２回計測した。誤差バーはＳＥＭを表す。ＦＧＦＲ３ ｓｈＲＮＡ２および６について類似の結果が得られた(図１６)。下パネル：コントロールｓｈＲＮＡ又はＦＧＦＲ３ ｓｈＲＮＡ４安定細胞異種移植片組織から抽出した腫瘍溶解物におけるＦＧＦＲ３タンパク質の発現。
【図８Ａ−Ｅ】Ｒ３ＭａｂはＦＧＦ／ＦＧＦＲ３相互作用を遮断する。(Ａ) Ｒ３ＭａｂによるヒトＦＧＦＲ３の選択的結合。ヒトＦＧＦＲ１-４  Ｆｃキメラタンパク質を固定し、Ｒ３Ｍａｂとともにインキュベートした。抗ヒトＦａｂ抗体を使用して特異的な結合を検出した。(Ｂ−Ｃ) Ｒ３ＭａｂによるヒトＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ(Ｂ)又はＩＩＩｃ(Ｃ)に対するＦＧＦ１結合のブロック。ビオチン化したＦＧＦ１特異的ポリクローナル抗体を用いて特異的結合が検出された。(Ｄ−Ｅ) Ｒ３ＭａｂによるヒトＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ(Ｄ)又はＩＩＩｃ(Ｅ)に対するＦＧＦ９結合のブロック。ビオチン化したＦＧＦ９特異的ポリクローナル抗体を用いて特異的な結合が検出された。誤差バーは、平均の標準誤差(ＳＥＭ)を表し、記号より小さい場合もある。
【図９Ａ−Ｃ】Ｒ３Ｍａｂは、野生型及び変異したＦＧＦＲ３により作動されるＢａ／Ｆ３細胞増殖を阻害する。(Ａ) 野生型ヒトＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂを発現するＢａ／Ｆ３細胞の生存に対するＲ３Ｍａｂの阻害効果。細胞を、ＦＧＦ１がない培地(ＦＧＦ１なし)、又は１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１と１０μｇ／ｍｌヘパリン単独を含む培地(ＦＧＦ１)、又はコントロール抗体(コントロール)又はＲ３Ｍａｂを併用した培地中で培養した。細胞生存率は、抗体とともに７２時間インキュベートした後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-Ｇｌｏ(Promega)にて評価した。(Ｂ) Ｂａ／Ｆ３−ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＷＴ安定細胞におけるＲ３ＭａｂによるＦＧＦＲ３およびＭＡＰＫリン酸化の阻害。細胞は、コントロールＡｂ(Ctrl)、Ｒ３Ｍａｂの漸減量(それぞれ１、０．２、０．０４μｇ／ｍｌ)を含むＰＢＳ、又はＰＢＳ単独(Mock)とともに３時間プレインキュベートした後に、１５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１と１０μｇ／ｍｌヘパリン(＋)又はヘパリン単独(−)にて１０分間処理した。溶解物をイムノブロットし、ＦＧＦＲ３及びｐ４４／４２ ＭＡＰＫのリン酸化をそれぞれｐＦＧＦＲＹ６５３／６５４およびｐＭＡＰＫＴｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４に対する抗体にて評価した。(Ｃ) 公開されたデータ(３２)を基に、膀胱癌におけるＦＧＦＲ３突然変異ホットスポットと頻度の略図(示した配列番号はＦＧＦＲ３ ＩＩＩｂアイソフォームアミノ酸配列に基づく)。ＴＭ、膜貫通領域；ＴＫ１およびＴＫ２、チロシンキナーゼドメイン１および２。
【図９Ｄ−Ｈ】(Ｄ−Ｈ) 癌関連ＦＧＦＲ３変異を発現するＢａ／Ｆ３細胞の生存率に対するＲ３Ｍａｂの阻害効果。Ｇ３７２ＣはＩＩＩｃアイソフォーム由来であり、その他はＩＩＩｂアイソフォーム由来である。すべての変異体の配列番号付けはＦＧＦＲ３ ＩＩＩｂアイソフォームアミノ酸配列に基づく(Ｇ３７２Ｃ変異体を含む、これはＦＧＦＲ３ ＩＩＩｃアイソフォームアミノ酸配列に基づくとＧ３７０Ｃとなる)。細胞生存率は、(Ａ)に記載のように抗体とともに７２時間インキュベートした後に評価した誤差バーはＳＥＭを表す。
【図１０Ａ−Ｂ】Ｒ３Ｍａｂ Ｆａｂ断片とヒトＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂのＩｇＤ２−Ｄ３との間の複合体のＲ３Ｍａｂのエピトープマッピングと結晶構造。(Ａ) Ｒ３Ｍａｂに対するヒトＦＧＦＲ３の１３ペプチドスパニングＩｇＤ２−Ｄ３の結合によって決定されるエピトープ。各々ビオチン化したペプチドは、ストレプトアビジンをコートしたマイクロタイターウェルで捕獲し、Ｒ３Ｍａｂとともにインキュベートした。ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を使用して特異的に結合したＲ３Ｍａｂを検出した。(Ｂ) ヒトＦＧＦＲ３のペプチド３(LAVPAANTVRFRCPA (配列番号：179))と１１(SDVEFHCKVYSDAQP (配列番号：180))の、ヒトＦＧＦＲ１の細胞外セグメント(ペプチド３：HAVPAAKTVKFKCPS (配列番号：181)；ペプチド１１：SNVEFMCKVYSDPQP (配列番号：182))との配列アライメント。一次ＦＧＦ２-ＦＧＦＲ１相互作用、ヘパリン結合およびレセプター-レセプター会合に関与するＦＧＦＲ１残基をそれぞれ、太字、斜体および下線を付した書体で示す。ＦＧＦＲ１残基の機能的割当は、Plotnikov et al.(３４)に基づく。
【図１０Ｃ−Ｆ】(Ｃ) ヒトＦＧＦＲ３ ＩｇＤ２−Ｄ３と複合体化したＲ３Ｍａｂ Ｆａｂ(リボン−螺旋、軽鎖−灰色、重鎖−黒色で示す)の構造(分子表面−白色で示す)。リガンド結合および二量体化に関与するレセプター残基を、Plotnikov et al.(３４)に基づいてそれぞれ灰色／陰影線及び濃い灰色に色分けする。(Ｄ) 結晶構造の拡大図は、ＦａｂのＣＤＲ−Ｈ３及び−Ｈ２が、ＦＧＦＲ３のＩｇＤ２およびＩｇＤ３との主要な相互作用部位を構成することを示す。(Ｅ) ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−ＦＧＦ１複合体(ＰＤＢコード１ＲＹ７)のＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ−Ｆａｂ複合体との重ね合わせ。ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃおよびＦＧＦ１をそれぞれ灰色及び濃い灰色に色分けする。ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂを白色で、Ｆａｂの軽鎖を淡い灰色で、重鎖を濃い灰色で示す。ＩｇＤ２は重ね合わせのアンカーとして用いた。Ｒ３Ｍａｂが結合した場合にＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂのＩｇＤ３がなす構造および新規な立体構造のウェル上のＩｇＤ２を示す。(Ｆ) ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−ＦＧＦ１複合体(ＰＤＢコード１ＲＹ７)のＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ−Ｆａｂ複合体との重ね合わせの他の略図。ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃおよびＦＧＦ１の分子表面を、それぞれ灰色／網状および濃い灰色／ドット状で示す。ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂを白色で、Ｆａｂの軽鎖を灰色で、重鎖を黒色で示す。ＩｇＤ2は重ね合わせのアンカーとして用いた。Ｒ３Ｍａｂが結合した場合にＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂのＩｇＤ３がなす構造および新規な立体構造のウェル上のＩｇＤ２を示す。
【図１１Ａ−Ｅ】Ｒ３Ｍａｂは、野生型または変異したＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃを発現する膀胱癌細胞における増殖、クローン増殖およびＦＧＦＲ３シグナル伝達を阻害する。(Ａ) 膀胱癌細胞株ＲＴ１１２におけるＲ３Ｍａｂによる[３Ｈ]-チミジン取込みの阻害。誤差バーはＳＥＭを表す。(Ｂ) 処置培地単独(Mock)又はコントロール抗体(Ctrl)と比較した、膀胱癌細胞株ＲＴ１１２におけるＲ３Ｍａｂ(１５μｇ／ｍｌ)によるＦＧＦ１活性化ＦＧＦＲ３シグナル伝達の遮断。細胞溶解物を抗ＦＧＦＲ３抗体にて免疫沈降し、抗ホスホチロシン抗体(４Ｇ１０)にてＦＧＦＲ３リン酸化について評価した。溶解物をイムノブロットして、ＡＫＴ(ｐＡＫＴＳ４７３)およびｐ４４／４２ ＭＡＰＫ(ｐＭＡＰＫＴｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４)のリン酸化を検出した。(Ｃ) 処置培地単独(Mock)又はコントロール抗体(Ctrl)と比較した、膀胱癌細胞株ＵＭＵＣ-１４(ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃを持つ)におけるＲ３Ｍａｂ(１０μｇ／ｍｌ)によるクローン増殖の阻害。(Ｄ) １２ウェルの複製物から、１ウェルにつき直径１２０μｍより大きなコロニー数を示す(Ｃ)の試験の定量。誤差バーはＳＥＭを表す。Ｍｏｃｋ又はＣｔｒｌに対してＰ＜３．４×１０−９。(Ｅ) Ｒ３Ｍａｂ(１５μｇ／ｍｌ)によるＵＭＵＣ-１４細胞におけるＦＧＦＲ３リン酸化の阻害。(Ｂ)のようにＦＧＦＲ３リン酸化を分析した。この細胞株におけるＦＧＦＲ３の恒常的リン酸化を示す。
【図１２Ａ−Ｃ】Ｒ３Ｍａｂは、単量体状態の方へ二量体−単量体平衡を促すことによって、ジスルフィド結合したＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃ二量体の定常状態レベルを低減する。(Ａ) ＵＭＵＣ-１４細胞におけるＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃ二量体に対するＲ３Ｍａｂの効果。細胞はＲ３Ｍａｂ(１５μｇ／ｍｌ)又はコントロール抗体(Ctrl)とともに３時間インキュベートし、全細胞溶解物を非還元及び還元条件下にてイムノブロットにて分析した。(Ｂ) ＵＭＵＣ-１４細胞におけるＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃ二量体−単量体平衡に対する遊離スルフヒドリルブロッカーＤＴＮＢの効果。ＵＭＵＣ-１４細胞はＤＴＮＢの濃度を上げながら３時間処理し、(Ａ)のように細胞溶解物を分析した。(Ｃ) インビトロでの精製組換えＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃ二量体に対するＲ３Ｍａｂの効果。ＩｇＤ２−Ｄ３から成るＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃ二量体は、サイズ排除カラムにより精製し、ＰＢＳ(Mock)、コントロール抗体(Ctrl)又はＲ３Ｍａｂとともに３７℃でインキュベートした。試料は、非還元条件下でのイムノブロット分析のために示した時間に採取した。ＦＧＦＲ３二量体−単量体は、抗ＦＧＦＲ３ハイブリドーマ抗体６Ｇ１(Ａ−Ｃ)を使用して検出した。
【図１３Ａ−Ｃ】Ｒ３Ｍａｂは、膀胱癌細胞の異種移植片増殖およびＢａ／Ｆ３−ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃの同種異系移植片増殖を阻害する。(Ａ) ベヒクルコントロールと比較した、既に定着したＲＴ１１２膀胱癌異種移植片の増殖に対するＲ３Ｍａｂの効果。１群につきｎ＝１０。(Ｂ) Ｒ３ＭａｂによるＲＴ１１２腫瘍組織におけるＦＧＦＲ３シグナル伝達の阻害。異なる実験において、１５ｍｇ／ｋｇのコントロール抗体(Ctrl)又はＲ３Ｍａｂにて４８時間又は７２時間処理したＲＴ１１２異種移植片腫瘍は、回収し(１群につきｎ＝３)、ホモジナイズし、イムノブロットによってＦＲＳ２およびＭＡＰＫの活性化について分析した。(Ｃ) 既に定着したＢａ／Ｆ３−ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃ同種異系移植片の増殖に対するＲ３Ｍａｂの効果。１群につきｎ＝１０。
【図１３Ｄ−Ｅ】(Ｄ) 既に定着したＵＭＵＣ-１４膀胱癌異種移植片の増殖に対するＲ３Ｍａｂの効果（１群につきｎ＝１０）。(Ｅ) ＵＭＵＣ-１４腫瘍組織におけるＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃ二量体及びシグナル伝達に対するＲ３Ｍａｂの効果。３０ｍｇ／ｋｇのコントロール抗体(Ctrl)又はＲ３Ｍａｂにて２４時間又は７２時間処理したＵＭＵＣ-１４異種移植片腫瘍は、回収し(１群につきｎ＝３)、ホモジナイズし、ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃ二量体−単量体並びにイムノブロットによるＭＡＰＫ活性化について分析したＦＧＦＲ３二量体−単量体は、腫瘍溶解物のマウスＩｇＧからの干渉を回避するために抗ＦＧＦＲ３ウサギポリクローナル抗体ｓｃ９００７を使用して検出した。誤差バーはＳＥＭを表す。
【図１４Ａ−Ｄ】ＡＤＣＣは、ｔ(４；１４)陽性多発性骨髄腫モデルにおけるＲ３Ｍａｂの抗腫瘍有効性に寄与する。(Ａ−Ｂ) 既に定着したＯＰＭ２(Ａ)およびＫＭＳ１１(Ｂ)の骨髄腫異種移植片の増殖に対するＲ３Ｍａｂの効果。１群につきｎ＝１０。(Ｃ−Ｆ) 細胞培養物中のＲ３Ｍａｂによって誘導される、骨髄腫細胞株ＯＰＭ２(Ｃ)およびＫＭＳ１１(Ｄ)、又は膀胱癌細胞株ＲＴ１１２(Ｅ)およびＵＭＵＣ-１４(Ｆ)の細胞溶解性。
【図１４Ｅ−Ｈ】(Ｃ−Ｆ) 細胞培養物中のＲ３Ｍａｂによって誘導される、骨髄腫細胞株ＯＰＭ２(Ｃ)およびＫＭＳ１１(Ｄ)、又は膀胱癌細胞株ＲＴ１１２(Ｅ)およびＵＭＵＣ-１４(Ｆ)の細胞溶解性。骨髄腫又は膀胱癌細胞は、Ｒ３Ｍａｂ又はコントロール抗体の存在下で新しく単離したヒトＰＢＭＣとともにインキュベートした。細胞障害性は、上清に放出されるＬＤＨを測定することによって決定した。(Ｇ−Ｈ) 既に定着したＯＰＭ２(Ｇ)およびＫＭＳ１１(Ｈ)の骨髄腫異種移植片の増殖に対するＲ３Ｍａｂ又はそのＤＡＮＡ変異体の効果。１群につきｎ＝１０。誤差バーはＳＥＭを表し、記号より小さい場合がある。
【図１５Ａ−Ｄ】ｓｉＲＮＡによるＦＧＦＲ３のノックダウンは膀胱癌細胞株の細胞増殖を阻害する。６〜７つの異なるＦＧＦＲ３ ｓｉＲＮＡｓと３つの非特異的コントロールｓｉＲＮＡを、Genentechにおいて設定し、合成した。膀胱癌細胞株ＲＴ１１２(Ａ)、ＳＷ７８０(Ｂ)、ＲＴ４(Ｃ)およびＵＭＵＣ-１４(Ｄ)は、９６ウェルプレートに播き(１ウェルにつき３０００細胞)、終夜をかけて接着させ、ＲＮＡｉＭａｘ(Invitrogen)と複合体化させた２５ｎＭのｓｉＲＮＡを過渡的に形質移入させた。形質移入の７２時間後に、[３Ｈ]-チミジン(１ウェルにつき１μＣｉ)を培養物(Ａ、ＣおよびＤ)に加え、さらに１６時間インキュベートした。取り込まれた[３Ｈ]-チミジンはＴｏｐＣｏｕｎｔにて定量化した。データは、ＲＮＡｉＭａｘ単独(Mock)を形質移入した細胞からのものに対して規準化した。誤差バーはＳＥＭを表す。下パネル：ｓｉＲＮＡ形質移入細胞におけるＦＧＦＲ３発現を示す代表的なブロット。(Ｂ) 細胞生存率は、形質移入の９６時間後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-Ｇｌｏ(Promega)にて測定した。誤差バーはＳＥＭを表す。
【図１６Ａ】膀胱癌細胞株ＲＴ１１２のＦＧＦＲ３ノックダウンは、インビトロでＧ１細胞周期静止を誘導し、インビボで腫瘍増殖を抑制する。３つの異なるＦＧＦＲ３ ＲＮＡを設定し、Ｔｅｔ誘導性ｓｈＲＮＡ発現レトロウイルスベクターにクローニングした。ＦＧＦＲ３ ｓｈＲＮＡ又はコントロールｓｈＲＮＡを発現するＲＴ１１２安定クローンは、ピューロマイシン選別にて決定した。(Ａ) １μｇ／ｍｌのドキシサイクリンの有無により７２時間処理した後に、ＦＧＦＲ３ ｓｈＲＮＡ２又はｓｈＲＮＡ６を発現するＲＴ１１２安定細胞から得たプロピジウムヨウ素(ＰＩ)染色核のＤＮＡ蛍光フローサイトメトリーヒストグラム。
【図１６Ｂ】(Ｂ) ｎｕ／ｎｕマウスにおけるＦＧＦＲ３ ｓｈＲＮＡ２−４(１処理群につきｎ＝１１)又はＦＧＦＲ３ｓｈＲＮＡ６−１６(１処理群につきｎ＝１０)を発現するＲＴ１１２安定細胞の増殖。腫瘍保持マウスに５％スクロースのみ(●)又は５％スクロースと１ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリン(■)を与え、腫瘍は週に２回カリパスにて測定した。誤差バーはＳＥＭを表す。
【図１７】野生型および変異したＦＧＦＲ３によって促されるＢａ／Ｆ３細胞増殖に対する抗ＦＧＦＲ３ハイブリドーマ抗体１６Ｇ、６Ｇ１および１５Ｂ２の効果。抗ＦＧＦＲ３ハイブリドーマ抗体は、ＢＡＬＢ／ｃマウスをヒトＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ／Ｆｃ又はヒトＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ／Ｆｃキメラにて免疫化することによって生成した。融合したハイブリドーマ細胞は、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ(登録商標)ハイブリドーマ選別キット(StemCell Technologies, Inc., Vancouver, BC, Canada)のメディウムＤのヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン選別を使用して選択した。ハイブリドーマ抗体は、ＥＬＩＳＡによってＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂおよびＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃへの結合能について、ＦＡＣＳによって細胞表面ＦＧＦＲ３の認識能について連続的にスクリーニングした。次いで、選別したハイブリドーマは限界希釈によってクローニングした。１６Ｇ、６Ｇ１および１５Ｂ２のクローンを用いて、図９Ａに記載したのと同様に、野生型又は変異したＦＧＦＲ３を発現するＢａ／Ｆ３細胞の増殖に対する効果を評価する。誤差バーはＳＥＭを表す。
【図１８Ａ−Ｂ】ペプチドマッピングおよび結晶構造解析によって決定されるＲ３Ｍａｂエピトープの比較。(Ａ) ヒトＦＧＦＲ３の細胞外ＩｇＤ２−Ｄ３セグメントと複合体化したＲ３Ｍａｂ Ｆａｂ断片の構造によって明らかとなったエピトープ。Ｆａｂの重鎖および軽鎖が接触するＦＧＦＲ３残基はそれぞれ黒色及び灰色に色分けした。(Ｂ) ＦＧＦＲ３に対するペプチド３および１１の位置。
【図１９Ａ−Ｅ】Ｒ３Ｍａｂは、野生型又は変異したＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃを含む膀胱癌細胞の増殖およびＦＧＦＲ３シグナル伝達を阻害する。(Ａ) 膀胱癌細胞株ＲＴ４におけるＲ３Ｍａｂによる細胞生存率の阻害。細胞生存率は、抗体とともに９６時間インキュベートした後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-Ｇｌｏ(Promega)にて評価した。誤差バーはＳＥＭを表す。(Ｂ) 膀胱癌細胞株ＲＴ４におけるＲ３Ｍａｂ(１５ｕｇ／ｍｌ)によるＦＧＦ１活性化ＦＧＦＲ３シグナル伝達の遮断。(Ｃ) 膀胱癌細胞株ＲＣＣ-９７-７(ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃを含む)におけるＲ３Ｍａｂによる[３Ｈ]-チミジン取込みの阻害。誤差バーはＳＥＭを表す。(Ｄ) Ｒ３Ｍａｂ(１５ｕｇ／ｍｌ)によるＴＣＣ−９７−７細胞のＦＧＦＲ３リン酸化の阻害。(Ｅ) コントロール抗体(Ctrl)と比較した、Ｒ３Ｍａｂ(１５ｕｇ／ｍｌ)とともに３時間インキュベートした後のＴＣＣ−９７−７細胞のＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃ二量体の減少。
【図２０Ａ−Ｂ】ＵＭＵＣ-１４細胞におけるＲ３ＭａｂおよびＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃ二量体の内部移行に対するエンドサイトーシスインヒビターの効果。(Ａ) Ｒ３Ｍａｂの内部移行に対するエンドサイトーシスインヒビターの効果。様々なエンドサイトーシスインヒビター又はＤＭＳＯにて３７℃で１時間予め処理したＵＭＵＣ-１４細胞は、Ｒ３Ｍａｂ(１５ｕｇ／ｍｌ)とともに３７℃で３時間インキュベートして、内部移行させた。低ｐＨ洗浄を行い、細胞表面Ｒ３Ｍａｂを取り除き、内部移行した抗体を可視化した。細胞を固定し、Ａｌｅｘａ４８８標識抗ヒトＩｇＧにて染色した。共焦点電子顕微鏡法を使用して撮像した。(Ｂ) Ｒ３Ｍａｂにて処理したＵＭＵＣ-１４細胞におけるＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃ二量体に対するエンドサイトーシスインヒビターの効果。様々なエンドサイトーシスインヒビター又はＤＭＳＯにて３７℃で１時間予め処理したＵＭＵＣ-１４細胞は、ｍｏｃｋ(レーン１)、コントロール抗体(レーン２)又はＲ３Ｍａｂ(１５ｕｇ／ｍｌ、レーン３)とともに３７℃で３時間インキュベートした。細胞溶解物は、イムノブロットによって非還元又は還元条件下でＦＧＦＲ３タンパク質について分析した。クロルプロマジン(クラトリンが媒介するエンドサイトーシスのインヒビター)およびゲニステイン(エンドサイトーシスのパンインヒビター)はＲ３Ｍａｂ内部移行を遮断したが、ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃ二量体のＲ３Ｍａｂ誘導性減少に対しては効果を示さなかったことを注記する。
【図２１】非還元条件下での単量体および二量体のＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃに対する異なる抗ＦＧＦＲ３抗体の検出感度。ＵＭＵＣ-１４細胞は、Ｒ３Ｍａｂ(レーン１)、コントロールＩｇＧ１(レーン２)又はＰＢＳ(レーン３)にて３時間処理した後に細胞溶解し、細胞溶解物は還元又は非還元の条件下でイムノブロット分析を行った。６Ｇ１(Genentechで生成されるマウスハイブリドーマ抗体)は、ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃ二量体および単量体を両方検出したのに対して、ｓｃ９００７(ウサギポリクローナル抗体、Santa Cruz Biotechnology)又はｓｃ１３１２１(マウスハイブリドーマ抗体、Santa Cruz Biotechnology)は選択的に二量体ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃを検出したことを注記する。
【図２２Ａ−Ｃ】ｔ(４；１４)＋多発性骨髄腫細胞の増殖に対するＲ３Ｍａｂの効果。(Ａ) ＵＴＭＣ-２細胞による[３Ｈ]-チミジン取込みに対するＲ３Ｍａｂの阻害効果。ＵＴＭＣ-２細胞は、２５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ９と５ｕｇ／ｍｌのヘパリン又はヘパリン単独(ＦＧＦ９なし)の存在下でＲ３Ｍａｂ又はコントロール抗体を含む培地中で生育させた。６日間のインキュベートの後に、[３Ｈ]-チミジンを添加して１６時間インキュベートした。データは、ＦＧＦ９および抗体の非存在下で生育させた細胞からのものに対して規準化した。(Ｂ−Ｃ) ＯＰＭ２(Ｂ)およびＫＭＳ１１(Ｃ)細胞による[３Ｈ]-チミジン取込みに対するＲ３Ｍａｂの効果。１．５％ＦＢＳ培地中で生育させた細胞は、Ｒ３Ｍａｂ又はコントロール抗体にて６日間処理した。データは処理していない細胞からのものに対して規準化した。誤差バーＳＥＭを表す。
【図２３Ａ】骨髄腫および膀胱癌細胞におけるＦＧＦＲ３の細胞表面発現レベル。(Ａ) ＦＡＣＳ分析によって評価した骨髄腫細胞および膀胱癌細胞における細胞表面ＦＧＦＲ３発現。細胞は、ヒトＦＧＦＲ３に対するフィコエリトリンコンジュゲートマウスｍＡｂ(ＦＡＢ７６６Ｐ、R&D Systems)又はフィコエリトリンコンジュゲートアイソタイプコントロールマウスＩｇＧ１(BD Pharmingen)にて染色した。
【図２３Ｂ】(Ｂ) 骨髄腫細胞および膀胱癌細胞におけるＦＧＦＲ３密度のスキャッチャード分析。Ｒ３Ｍａｂは、放射ヨウ素標識し、過剰な非標識抗体と懸濁して細胞とともにインキュベートした。室温で２時間インキュベートした後、細胞は、遠心分離法にてペレット化し、２回洗浄した。特異的に結合した１２５Ｉを決定した。レセプター密度および結合親和性(Ｋｄ)は２つの結合実験からの平均を表す。
【図２４Ａ−Ｂ】膀胱カルシノーマ細胞の異種移植片増殖に対するＲ３Ｍａｂ又はそのＤＡＮＡ変異体の効果。(Ａ) 既に定着したＲＴ112腫瘍の増殖に対するＲ３Ｍａｂ及びそのＤＡＮＡ変異体(各々５０ｍｇ／ｋｇ)の効果。(Ｂ) 既に定着したＵＭＵＣ-１４腫瘍の増殖に対するＲ３Ｍａｂ及びそのＤＡＮＡ変異体(各々５０ｍｇ／ｋｇ)の効果。誤差バーはＳＥＭを表す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
（本発明の詳細な説明）
本明細書中の発明は、発現及び／又は活性の増加又は望ましくない発現及び／又は活性といった、ＦＧＦＲ３の発現及び／又は活性と関連する病的状態の治療又は予防などに有用である抗ＦＧＦＲ３抗体を提供する。いくつかの実施態様では、本発明の抗体を用いて腫瘍、癌、及び／又は細胞増殖性疾患を治療する。
他の態様では、本発明の抗ＦＧＦＲ３抗体は、様々な組織及び細胞種でのＦＧＦＲ３の検出といった、ＦＧＦＲ３の検出及び／又は単離のための試薬として有用である。
本発明はさらに、抗ＦＧＦＲ３抗体の製造方法及び使用方法と、抗ＦＧＦＲ３抗体をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００４４】
一般的な技術
本明細書中に記載又は引用される技術及び手順は、一般に十分に理解されるものであり、当業者によって、従来の方法論を用いて共通して実施されるものである。その例として、以下の文献に記載される方法論が広く利用されている。Sambrook 等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, 等 編集, (2003))、the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames 及び G. R. Taylor 編集 (1995))、Harlow and Lane, 編集 (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL、及びANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, 編集 (1987))。
【００４５】
定義
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療的な使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、タンパク質は、(１)ローリー法で測定した場合９５％を越える抗体、最も好ましくは９９重量％を超えるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なほど、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ(ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動)により均一になるまで充分なほど精製される。抗体の自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツでの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一の精製工程により調製される。
【００４６】
「単離された」核酸分子は、同定され、核酸の天然源に通常付随している少なくとも一の汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。故に、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在する核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色体位置にある核酸(例えば抗体コード核酸)を通常発現する細胞に含まれる核酸分子を含む。
【００４７】
「Kabatに記載の可変ドメイン残基番号付け」又は「Kabatに記載のアミノ酸位番号付け」なる用語及びその異なる言い回しは、Kabat 等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)の抗体の編集の軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインに用いられる番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを用いると、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲ内の短縮又は挿入に相当する２、３のアミノ酸又は付加的なアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインには、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基(例えばKabatによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど)と、Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸の挿入(Kabatによる残基５２ａ)を含んでもよい。残基のKabat番号は、「標準の」Kabat番号付け配列によって抗体の配列の相同領域でアライメントすることによって与えられる抗体について決定してもよい決定した。
【００４８】
ここで用いる「実質的に類似」又は「実質的に同じ」なる句は、当業者が２つの数値(一般的には、本発明の抗体に関連するものと参照／比較抗体に関連する他のもの)の差異に、該値(例えばＫｄ値)によって測定される生物学的性質上わずかに又は全く生物学的及び／又は統計学的有意差がないと認められるほど、２つの数値が十分に高く類似していることを意味する。前記２つの値間の差異は、参照／比較抗体の値の好ましくは約５０％未満、好ましくは約４０％未満、好ましくは約３０％未満、好ましくは約２０％未満、好ましくは約１０％未満である。
【００４９】
一般的に「結合親和性」は、分子(例えば抗体)の単一結合部位とその結合パートナー(例えば抗原)との間の非共有結合的な相互作用の総合的な強度を意味する。特に明記しない限り、「結合親和性」は、結合対のメンバー(例えば抗体と抗原)間の１：１相互作用を反映する内因性結合親和性を意味する。一般的に、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離定数(Ｋｄ)として表される。望ましくは、Ｋｄは１×１０−７、１×１０−８、５×１０−８、１×１０−９、３×１０−９、５×１０−９、又はさらに１×１０−１０以上の強さである。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当業者に公知の共通した方法によって測定することができる。低親和性抗体は抗原にゆっくり結合して素早く解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は抗原により密接により長く結合したままとなる。結合親和性の様々な測定方法が当分野で公知であり、それらの何れかを本発明のために用いることができる。以下に具体的な例示的実施態様を記載する。
【００５０】
一実施態様では、本発明の「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、段階的な力価の非標識抗原の存在下で、最小濃度の(１２５Ｉ)-標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する以下のアッセイで示されるような(Chen,等, (1999) J. Mol Biol 293:865-881)、所望の抗体のＦａｂ型(バージョン)とその抗原を用いて実行される放射性標識した抗原結合アッセイ(ＲＩＡ)で測定される。アッセイの条件を決めるために、ミクロタイタープレート(Dynex)を５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体(Cappel Labs)を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム(ｐＨ９．６)にて一晩コートして、その後２％(w/v)のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温(およそ２３℃)で２〜５時間、ブロックする。非吸着プレート(Nunc#269620)に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した所望のＦａｂと混合する(例えば、Presta等, (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ-１２の評価と一致する)。ついで所望のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは確実に平衡状態に達するまでに長時間(例えば６５時間)かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で(例えば１時間)インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質(MicroScint-20; Packard)を加え、プレートをTopcountγ計測器(Packard)にて１０分間計測する。最大結合の２０％か又はそれ以下濃度のＦａｂを選択してそれぞれ競合結合測定に用いる。他の実施態様によると、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のBIAcoreTM-2000又はBIAcoreTM-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)にて表面プラズモン共鳴アッセイを行ってＫｄ又はＫｄ値を測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシニミド(ＮＨＳ)で活性化した。抗原を１０ｍＭ 酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)で５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈し、結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂ(０．７８ｎＭから５００ｎＭ)を２５℃、およそ２５μｌ／分の流量で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳに注入した。いくつかの実施態様では、表面プラスモン共鳴アッセイ法に以下の変更が用いられる：およそ４００ＲＵを達成するように抗体をＣＭ５バイオセンサーチップに固定し、動態学的測定のために、標的タンパク質の２倍段階希釈物(例えばＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ又は-ＩＩＩｃ)(６７ｎＭから開始)をおよそ３０ｕｌ／分の流速で２５℃のＰＢＳＴバッファに注入する。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(Ｋｏｎ)と解離速度(Ｋｏｆｆ)を算出した。平衡解離定数(Ｋｄ)をＫｏｆｆ／Ｋｏｎ比として算出した。例として、Chen, Y.,等, (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ(ｐＨ７．２)、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体(Ｆａｂ型)の蛍光放出強度(励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ)における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
【００５１】
また、本発明の「結合速度」又は「会合の速度」又は「会合速度」又は「ｋｏｎ」は、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のBIAcoreTM-2000又はBIAcoreTM-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いた前述と同じ表面プラズモン共鳴アッセイにて測定される。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシニミド(ＮＨＳ)で活性化した。抗原を１０ｍＭ 酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)で５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈し、結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。その後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂ(０．７８ｎＭから５００ｎＭ)を２５℃、およそ２５μｌ／分の流量で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳに注入した。いくつかの実施態様では、表面プラスモン共鳴アッセイ法に以下の変更が用いられる：およそ４００ＲＵを達成するように抗体をＣＭ５バイオセンサーチップに固定し、動態学的測定のために、標的タンパク質の２倍段階希釈物(例えばＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ又は-ＩＩＩｃ)(６７ｎＭから開始)をおよそ３０ｕｌ／分の流速で２５℃のＰＢＳＴバッファに注入する。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(Ｋｏｎ)と解離速度(Ｋｏｆｆ)を算出した。平衡解離定数(Ｋｄ)をＫｏｆｆ／Ｋｏｎ比として算出した。例として、Chen, Y.,等, (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照。しかし、上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ(ｐＨ７．２)、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体(Ｆａｂ型)の蛍光放出強度(励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ)における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定するのが好ましい。
【００５２】
ここで使用される「ベクター」という用語は、それが結合している他の核酸を輸送することのできる核酸分子を意味するものである。一つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは付加的なＤＮＡセグメントが結合されうる円形の二重鎖ＤＮＡループを意味する。他の型のベクターはファージベクターである。他の型のベクターはウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムへ結合させうる。所定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内において自己複製することができる(例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターとエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、宿主ゲノムと共に複製する。更に、所定のベクターは、それらが作用可能に結合している遺伝子の発現を指令し得る。このようなベクターはここでは「組換え発現ベクター」(又は単に「組換えベクター」)と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形をとる。本明細書では、プラスミドが最も広く使用されているベクターの形態であるので、「プラスミド」と「ベクター」を相互交換可能に使用する場合が多い。
【００５３】
ここで交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体(アナログ)、又はＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより、もしくは合成反応によりポリマー中に取り込み可能な任意の基質とすることができる。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前又は後になされ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは合成後に、例えば標識との結合により、さらに修飾されてもよい。他のタイプの修飾には、例えば「キャップ(caps)」、類似体との自然に生じたヌクレオチドの一又は複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結(例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマート等)及び荷電連結(ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等)を有するもの、ペンダント部分、例えばタンパク質(例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ply-L-リジン等)を含むもの、インターカレータ(intercalators)を有するもの(例えばアクリジン、ソラレン等)、キレート剤を含むもの(例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属等)、アルキル化剤を含むもの、修飾された連結を含むもの(例えばアルファアノマー核酸等)、並びにポリヌクレオチド(類)の未修飾形態が含まれる。さらに、糖類中に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えばホスホナート基、ホスファート基で置き換えられてもよく、標準的な保護基で保護されてもよく、又は付加的なヌクレオチドへのさらなる連結を調製するように活性化されてもよく、もしくは固体又は半固体支持体に結合していてもよい。５'及び３'末端のＯＨはホスホリル化可能であり、又は１〜２０の炭素原子を有するアミン又は有機キャップ基部分で置換することもできる。また他のヒドロキシルは標準的な保護基に誘導体化されてもよい。さらにポリヌクレオチドは当該分野で一般的に知られているリボース又はデオキシリボース糖類の類似形態のものをさらに含み、これらには例えば２'-Ｏ-メチル-、２'-Ｏ-アリル、２'-フルオロ又は２'-アジド-リボース、炭素環式糖の類似体、アルファ-アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース類又はリキソース類、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、及び非塩基性ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。一又は複数のホスホジエステル連結は代替の連結基で置き換えてもよい。これらの代替の連結基には、限定されるものではないが、ホスファートがＰ(Ｏ)Ｓ(「チオアート」)、Ｐ(Ｓ)Ｓ(「ジチオアート」)、「(Ｏ)ＮＲ２(「アミダート」)、Ｐ(Ｏ)Ｒ、Ｐ(Ｏ)ＯＲ'、ＣＯ又はＣＨ２(「ホルムアセタール」)と置き換えられた実施態様のものが含まれ、ここでそれぞれのＲ及びＲ'は独立して、Ｈ又は、エーテル(-Ｏ-)結合を含んでいてもよい置換もしくは未置換のアルキル(１-２０Ｃ)、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケ��ル又はアラルジル(araldyl)である。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。先の記述は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含むここで引用される全てのポリヌクレオチドに適用される。
【００５４】
ここで使用される場合、「オリゴヌクレオチド」とは、短く、一般的に単鎖であり、また必ずしもそうではないが、一般的に約２００未満のヌクレオチド長さの、一般的に合成のポリヌクレオチドを意味する。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」なる用語は、相互に排他的なものではない。ポリヌクレオチドについての上述した記載はオリゴヌクレオチドと等しく、十分に適用可能である。
【００５５】
ここで同定したＧＤＭポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、特定のＧＤＭポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を測定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ(ＤＮＡＳＴＡＲ)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ-２プログラム用の完全なソースコードが下記の表Ａに提供されている配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成され、ソースコードは米国著作権庁, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能であり、例えば国際公開２００７／００１８５１に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸ(登録商標)オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ(登録商標)Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
【００５６】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ａと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ｂと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
いくつかの実施態様では、２以上のアミノ酸配列は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％の同一性である。いくつかの実施態様では、２以上のアミノ酸配列は、少なくとも９５％、９７％、９８％、９９％又はさらに１００％の同一性である。特に断らない限りは、ここでの全ての％アミノ酸配列同一性値は、直ぐ上のパラグラフに示したようにＡＬＩＧＮ-２コンピュータプログラムを用いて得られる。
【００５７】
本願明細書において用いられるように、「ＦＧＦＲ３」なる用語は、特別に又は文脈上別途示されない限り、任意の(天然に生じるもの又は合成のもののいずれにせよ)天然の又は変異形のＦＧＦＲ３ポリペプチド(例えばＦＧＦＲ３-ＩＩＩｂアイソフォーム又はＦＧＦＲ３-ＩＩＩｃアイソフォーム)を指す。「天然の配列」なる用語は、特に天然に生じる切断型(例えば、細胞外ドメイン配列又は膜貫通サブユニット配列)、天然に生じる変異型(例えば、選択的スプライシング型)及び天然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。「野生型ＦＧＦＲ３」なる用語は、一般に、天然に生じるＦＧＦＲ３タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。「野生型ＦＧＦＲ３配列」なる用語は、一般に、天然に生じるＦＧＦＲ３においてみられるアミノ酸配列を指す。
本明細書中で使用する「ＦＧＦＲ３リガンド」(「ＦＧＦ」と互換性を持って称される)なる用語は、特別に又は文脈上別途示さない限り、任意の天然の又は変異体の(天然であっても合成であっても)ＦＧＦＲ３リガンド(例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ２３)ポリペプチドを指す。「天然の配列」なる用語は、具体的には、天然に生じた切断型(例えば、細胞外ドメイン配列又は膜貫通サブユニット配列)、天然に生じる変異型(例えば、オルタナティブスプライス型)及び天然に生じる対立遺伝子変異型を包含する。「野生型ＦＧＦＲ３リガンド」なる用語は、一般に、天然に生じるＦＧＦＲ３リガンドタンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。「野生型ＦＧＦＲ３リガンド配列」なる用語は、一般に、天然に生じるＦＧＦＲ３リガンドに見られるアミノ酸配列を指す。
【００５８】
「ＦＧＦＲ３活性化」は、ＦＧＦＲ３レセプターの活性化又はリン酸化を指す。通常、ＦＧＦＲ３活性化により、シグナル伝達が生じる(例えば、ＦＧＦＲ３レセプター又は基質ポリペプチドのチロシン残基をリン酸化するＦＧＦＲ３レセプターの細胞内キナーゼドメインによって生じる)。ＦＧＦＲ３活性化は、対象のＦＧＦＲ３レセプターにＦＧＦＲリガンドが結合することにより媒介されうる。ＦＧＦＲ３へのＦＧＦＲ３リガンド(例えばＦＧＦ１又はＦＧＦ９など)の結合により、ＦＧＦＲ３のキナーゼドメインが活性化され、このことによりＦＧＦＲ３のチロシン残基のリン酸化、及び／又は他の基質ポリペプチド(一又は複数)のチロシン残基のリン酸化が生じる。
本明細書中で用いる「恒常的」なる用語は、例えばレセプターキナーゼ活性に用いられると、リガンド又は他の活性化分子の存在に依存しないレセプターの恒常的なシグナル伝達活性を指す。レセプターの性質によって、すべての活性が恒常的であってもよいし、レセプターの活性が他の分子(例えばリガンド)の結合によってさらに活性化されてもよい。レセプターの活性化を引き起こす細胞の現象は当業者に周知である。例えば、活性化には、例えば二量体化、三量体化など高次のレセプター複合体への多量体化が含まれる。複合体は、単一種のタンパク質、すなわちホモ複合体を含んでよい。あるいは、複合体は、少なくとも２の異なるタンパク質種、すなわちヘテロ複合体を含んでよい。例えば、複合体形成は、細胞の表面上のレセプターの正常型又は変異型の過剰発現によって生じうる。また、複合体形成は、レセプター内の特定の突然変異又は複数の突然変異によって生じうる。
【００５９】
ここで用いる「リガンド非依存性」なる用語は、例えばレセプターシグナル伝達活性に対して用いられると、リガンドの存在に依存しないシグナル活性を指す。リガンド非依存的なキナーゼ活性を有するレセプターは、キナーゼ活性の他の活性化を起こすために、そのレセプターへのリガンドの結合を必ずしも妨げるわけでない。
ここで用いる「リガンド依存性」なる用語は、例えばレセプターシグナル伝達活性に対して用いられると、リガンドの存在に依存するシグナル伝達活性を指す。
「遺伝子増幅」なる語句は、遺伝子又は遺伝子断片の複数のコピーが特定の細胞又は細胞株において形成されるプロセスを指す。複製された領域(増幅されたＤＮＡのストレッチ)は、しばしば「アンプリコン」と称される。通常は、生成されるメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)の量、即ち遺伝子発現レベルも、発現される特定遺伝子の作成されたコピー数に比例して増加する。
「チロシンキナーゼインヒビター」は、ＦＧＦＲ３レセプターなどのチロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性をある程度阻害する分子である。
【００６０】
「ＦＧＦＲ３の発現、増幅又は活性化を示す」癌又は生体試料は、診断試験において、ＦＧＦＲ３を発現（過剰発現を含む）する、ＦＧＦＲ３遺伝子を増幅した、及び／又はＦＧＦＲ３の活性化又はリン酸化を示すものである。
「ＦＧＦＲ３活性化を示す」癌又は生体試料は、診断試験において、ＦＧＦＲ３の活性化又はリン酸化を示すものである。このような活性化は、直接的に（例えばＦＧＦＲ３のリン酸化をＥＬＩＳＡで測定することによって）或いは間接的に決定することができる。
「恒常的なＦＧＦＲ３活性化を示す」癌又は生体試料は、診断試験において、ＦＧＦＲ３の恒常的な活性化又はリン酸化を示すものである。このような活性化は、直接的に（例えばＦＧＦＲ３のリン酸化をＥＬＩＳＡで測定することによって）或いは間接的に決定することができる。
「ＦＧＦＲ３増幅を示す」癌又は生体試料は、診断試験において、ＦＧＦＲ３遺伝子を増幅したものである。
「ＦＧＦＲ３転座を示す」癌又は生体試料は、診断試験において、ＦＧＦＲ３遺伝子を転座したものである。ＦＧＦＲ３転座の例はｔ(４；１４)転座であり、それはいくつかの多発性骨髄腫腫瘍に起こる。
【００６１】
本明細書において「ホスホ-ＥＬＩＳＡアッセイ」は、リン酸化されたＦＧＦＲ３、基質又は下流のシグナル伝達分子を検出するために、一又は複数のＦＧＦＲ３、基質又は下流のシグナル分子のリン酸化が試薬、通常抗体を使用した酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)において評価されるアッセイである。いくつかの実施態様では、リン酸化したＦＧＦＲ３又はｐＭＡＰＫを検出する抗体が用いられる。アッセイは、好ましくは新鮮又は凍結生体試料からの細胞溶解物に実行してよい。
「リガンド非依存性のＦＧＦＲ３の活性化を示す」癌又は生物学的試料は、診断検査において、ＦＧＦＲ３のリガンド非依存性の活性化又はリン酸化を示すものである。このような活性化は直接的に(例えばＦＧＦＲ３のリン酸化をＥＬＩＳＡで測定することによって)又は間接的に測定されうる。
「リガンド依存性のＦＧＦＲ３の活性化を示す」癌又は生物学的試料は、診断検査において、ＦＧＦＲ３のリガンド依存性の活性化又はリン酸化を示すものである。このような活性化は直接的に(例えばＦＧＦＲ３のリン酸化をＥＬＩＳＡで測定することによって)又は間接的に測定されうる。
「リガンド非依存性のＦＧＦＲ３活性化を示す」癌又は生物学的試料は、診断検査において、ＦＧＦＲ３のリガンド依存性の活性化又はリン酸化を示すものである。このような活性化は直接的に(例えばＦＧＦＲ３のリン酸化をＥＬＩＳＡで測定することによって)又は間接的に測定されうる。
【００６２】
「ＦＧＦＲ３過剰発現又は増幅」を有する癌細胞は、同じ組織タイプの非癌細胞と比較してＦＧＦＲ３タンパク質又は遺伝子の有意に高いレベルを有するものである。このような過剰発現は、遺伝子増幅によって、または、増加した転写ないし翻訳によって生じうる。ＦＧＦＲ３過剰発現又は増幅は、細胞の表面上に存在するＦＧＦＲ３タンパク質の増加したレベルを評価することによる診断又は予後アッセイにおいて(例えば免疫組織化学アッセイ；ＩＨＣによって)決定されうる。あるいは又はさらに、例えば、蛍光インサイツハイブリダイゼーション；（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月公開の国際公開９８／４５４７９参照）、サザンブロッティング、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術、例えばリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＲＴ-ＰＣＲ）により、細胞のＦＧＦＲ３コード化核酸のレベルを測定してもよい。上記のアッセイとは別に、種々のインビボアッセイは、熟練技術者に入手可能である。例えば、患者の体内にある細胞を、例えば、放射活性アイソトープのような検出可能な標識で場合によって標識した抗体に曝してもよく、患者の細胞への抗体の結合は、例えば、放射活性の外部スキャンニングによって、又は以前に抗体へ曝した患者から取り出した生検を分析することによって、評価することができる。
本明細書で使用される「変異」なる用語は、特定のタンパク質又は核酸（遺伝子、ＲＮＡ）のアミノ酸配列又は核酸配列が、それぞれ野生型のタンパク質又は核酸とは異なることを意味する。変異したタンパク質又は核酸は、遺伝子の、一方の対立遺伝子（ヘテロ接合性）又は両方の対立遺伝子（ホモ接合性）に発現されるか、又はそのような対立遺伝子に見られ、体細胞性又は生殖系列でありうる。本発明では、変異は通常体細胞性である。変異には、挿入、欠失、及び点変異（単一のヌクレオチド／アミノ酸多形を含む）のような配列再構成が含まれる。
【００６３】
「阻害する」とは、基準より活性、機能及び／又は量を減少させる又は低減させることである。
薬剤が対象のポリペプチド(例えばＦＧＦ１又はＦＧＦ９などのＦＧＦＲリガンド)の少なくとも一の機能的な活性を模倣する場合に、薬剤は「アゴニスト活性又は機能」を所有する。
本細書において使われる「アゴニスト抗体」は、対象のポリペプチド(例えばＦＧＦ１又はＦＧＦ９などのＦＧＦＲリガンド)の少なくとも一の機能的な活性を模倣する抗体である。
タンパク質の「発現」とは、遺伝子にコードされた情報のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転換と、それに続くタンパク質への変換とを指す。
ここで、対象のタンパク質（例えばＦＧＦレセプター又はＦＧＦレセプターリガンド）を「発現する」試料又は細胞は、タンパク質をコードするｍＲＮＡ、又はその断片を含むタンパク質が、試料又は細胞中に存在することが確認されているものである。
「イムノコンジュゲート」（「抗体−薬剤コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」と互換可能）は、化学療法剤、薬剤、増殖阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、又は動物を起源とする酵素的に活性な毒素又はその断片）、或いは放射性同位元素（例えばラジオコンジュゲート）といった一又は複数の細胞障害剤を意味する。
【００６４】
本明細書で使用される「Ｆｃ領域」なる用語は、概して、Ｃ末端ポリペプチド配列がインタクト抗体のパパイン消化によって取得されうる免疫グロブリン重鎖のＣ末端ポリペプチド配列を含んでなる二量体複合体を指す。Ｆｃ領域は、天然Ｆｃ配列又は変異Ｆｃ配列を含むことができる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ配列の境界は変化しうるが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ配列はおよそＣｙｓ２２６の位置又はおよそＰｒｏ２３０の位置のアミノ酸残基からＦｃ配列のカルボキシル末端まで伸びると定義される。免疫グロブリンのＦｃ配列は、通常、二つの定常ドメイン、即ちＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含み、場合によってはＣＨ４ドメインを含む。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムによれば残基４４７)は、例えば、抗体の精製中に又は抗体をコードする核酸を組み換え遺伝子操作することによって、取り除かれてもよい。したがって、本発明によるＦｃ領域を有する抗体を含んでなる組成物は、Ｋ４４７を有する抗体、すべてのＫ４４７残基が除去された抗体、又はＫ４４７残基を有する抗体と有さない抗体との混合物を含みうる。
ここでの「Ｆｃポリペプチド」は、Ｆｃ領域を形成するポリペプチドの一つを意味する。Ｆｃポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の好適な免疫グロブリンから得ることができる。いくつかの実施態様では、Ｆｃポリペプチドは、野生型のヒンジ配列の一部又はすべてを（一般的にはそのＮ末端に）含有してなる。いくつかの実施態様では、Ｆｃポリペプチドは、機能的ヒンジ配列又は野生型ヒンジ配列を含有していない。
【００６５】
「ブロッキング」抗体又は抗体「アンタゴニスト」は、それが結合する抗原の生物機能を抑制又は低減するものである。好ましいブロッキング抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性を完全に抑制する。
「ネイキッド抗体」は、異種性分子（例えば細胞障害性部分又は放射標識）にコンジュゲートしていない抗体である。
指定された抗体の「生物学的特性」を有する抗体は同じ抗原に結合する他の抗体とは区別されるその抗体の生物学的特性の一又は複数を保有するものである。
対象の抗体が結合する抗原上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載のものなどの常套的な交差遮断(cross-blocking)アッセイを行ってもよい。
【００６６】
本発明のアミノ酸配列を含む抗体又はポリペプチドの半減期を増大させるために、例えば米国特許第５７３９２７７号に記載のように、抗体(特に抗体断片)へサルベージレセプター結合エピトープ接着させることができる。例えば、サルベージレセプター結合エピトープをコードする核酸分子は、操作した核酸分子によって発現される融合タンパク質が本発明のポリペプチド配列とサルベージレセプター結合エピトープを含むように、本発明のポリペプチド配列をコードする核酸のフレーム内に連結させることができる。ここで使用される場合の「サルベージレセプター結合エピトープ」なる用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加させる原因であるＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを意味する(例えば、Ghetie, V等, (2000) Ann. Rev. Immunol. 18:739-766, 表１)。Ｆｃ領域内に置換を有する抗体および血清半減期が増大した抗体については、国際公開００／４２０７２、国際公開０２／０６０９１９； Shields, R.L., ら,  (2001) JBC 276(9):6591-6604；Hinton, P.R., (2004) JBC 279(8):6213-6216)にも記載されている。他の実施態様では、例えば他のポリペプチド配列に接着させることによっても血清半減期が増大しうる。例えば、血清アルブミンが抗体又はポリペプチドに結合するように、抗体又は本発明の方法に有用な他のポリペプチドをＦｃＲｎレセプター又は血清アルブミン結合ペプチドに結合する血清アルブミン又は血清アルブミンの一部に接着させることができ、例としてこのようなポリペプチド配列は国際公開０１／４５７４６に開示されている。好適な実施態様では、接着した血清アルブミンペプチドはアミノ酸配列DICLPRWGCLW(配列番号：１８３)を含む。他の実施態様では、Ｆａｂの半減期はこれらの方法によって増大する。血清アルブミン結合ペプチド配列については、Dennis, M.S., ら., (2002) JBC 277(38):35035-35043も参照のこと。
「断片」とは、好ましくは、参照核酸分子又はポリペプチドの全体の長さの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上を含むポリペプチド又は核酸分子の一部を意味する。断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００、２００、３００、４００、５００、６００又はそれ以上のヌクレオチド、ないしは１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、１９０、２００アミノ酸又はそれ以上を含みうる。
【００６７】
本明細書において使われる、本発明の抗体に関する「わずか又は全くアゴニスト機能がない」という語句は、例えば被検体への投与により抗体が生物学上有意な量のアゴニスト活性を誘発しないことを意味する。当分野においてよく理解されるように、本発明の抗体と参照相対物とが比較される限りにおいて、活性の量は量的又は質的に決定されうる。活性は、例えば本明細書中に記載のものを含み、当分野で知られた任意のアッセイ又は技術によって測定又は検出されうる。本発明の抗体およびその参照相対物の活性の量は、並行して又は別に実行して決定されうる。いくつかの実施態様では、本発明の二価抗体は実質的なアゴニスト機能を備えていない。
「アポトーシス」及び「アポトーシス活性」という用語は広義に使用され、典型的には、細胞質の凝集、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体ＤＮＡの分解又はミトコンドリア機能の喪失を含む一又は複数の特徴的な細胞変化を伴う、哺乳動物における細胞死の規則的又はコントロールされた形態を称す。この活性は、当該技術で知られた技術、例えば細胞生死判別アッセイ、ＦＡＣＳ分析又はＤＮＡ電気泳動法、そしてより詳細にはアネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡大、細胞断片化、及び／又は膜ベジクル(アポトーシス体と呼ばれる)の生成により、決定し測定することができる。
【００６８】
「抗体」及び「イムノグロブリン」なる用語は互換性をもって広義な意味で使われ、モノクローナル抗体(例えば完全長又は無傷のモノクローナル抗体)、ポリクローナル抗体、単価抗体、多価抗体、多特異性抗体(例えば所望の生物学的活性を示す限りの二重特異性抗体)及び本明細書で記載される抗体断片が含まれる。抗体はヒト、ヒト化及び／又は親和性成熟したものであり得る。
【００６９】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の相補性決定領域(ＣＤＲ)又は高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つのＣＤＲにより連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat等, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, BEthesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞性細胞毒性への抗体の関与を示す。
【００７０】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。二本鎖のＦｖ種において、この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖の可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ種において、一つの重鎖及び一つの軽鎖の可変ドメインはフレキシブルなペプチドリンカーによって共有結合されて、軽鎖及び重鎖が「二量体」構造類似体内で二本鎖Ｆｖ種内のものに結合しうる。この配置において、各可変ドメインの３つのＣＤＲは相互に作用してＶＨ-ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が一つの遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。また、抗体断片の他の化学結合も知られている。
【００７１】
任意の脊椎動物種からの抗体(イムノグロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
イムノグロブリンの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、イムノグロブリンは異なるクラスが割り当てられる。イムノグロブリンには５つの主なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、更にそれらは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２等のサブクラス(アイソタイプ)に分かれる。イムノグロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。イムノグロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られている。「抗体断片」は完全な抗体の一部のみを含んでなるものであり、その一部は、完全な(インタクトな)抗体に存在する場合のその一部に通常関連する機能の少なくとも一、好ましくはその機能のほとんどないしはすべてを保持することが好ましい。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；単鎖抗体分子；及び、抗体断片から形成される多特異性抗体が含まれる。一実施態様では、抗体断片は完全な抗体の抗原結合部位を含んでなるために、抗原結合能を有する。他の実施態様では、抗体断片は、例えばＦｃ領域を含んでなるものは、完全な抗体に存在する場合のＦｃ領域に通常関連する生物学的な機能、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期の調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合の少なくとも一を保持する。一実施態様では、抗体断片は、完全な抗体と実質的に類似したインビボ半減期を有する一価性抗体である。例えば、このような抗体断片は、インビボ安定性を断片に与えることができるＦｃ配列に結合した抗原結合アームを含んでもよい。
【００７２】
本願明細書において、用いられる「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、配列中の高頻度に可変している及び／又は構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。通常、抗体は、ＶＨ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)の３つと、ＶＬ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)の３つの計６つの高頻度可変領域を含んでなる。多くの高頻度可変領域が描写されており、本願明細書において、包含される。Kabat相補性決定領域(ＣＤＲ)は、配列多様性に基づいており、最も一般的に用いられるものである(Kabat 等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothiaは、代わりに構造的ループの位置を指す(Chothia 及びLesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。ＡｂＭ高頻度可変領域は、KabatＣＤＲとChothia構造ループとが組み合わさったものであり、Oxford Molecular's AbM抗体モデリングソフトウェアにより使用されている。「接触」高頻度可変領域は、利用できる複雑な結晶構造の分析に基づくものである。これら高頻度可変領域の残基を以下に示す。
【００７３】
カバットループ    ＡｂＭ       Chothia       接触
L1   L24-L34      L24-L34      L26-L32      L30-L36
L2   L50-L56      L50-L56      L50-L52      L46-L55
L3   L89-L97      L89-L97      L91-L96      L89-L96
H1   H31-H35B     H26-H35B     H26-H32      H30-H35B
(カバット番号付け)
H1   H31-H35      H26-H35      H26-H32      H30-H35 
(Chothia番号付け)
H2   H50-H65      H50-H58      H53-H55      H47-H58
H3   H95-H102     H95-H102     H96-H101     H93-H101
【００７４】
高頻度可変領域は、次のような「拡大高頻度可変領域」を含むことができる、即ち、ＶＬの２４−３６又は２４−３４(Ｌ１)、４６−５６又は５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)と、ＶＨの２６−３５(Ｈ１)、５０−６５又は４９−６５(Ｈ２)及び９３−１０２、９４−１０２、又は９５−１０２(Ｈ３)である。可変ドメイン残基には、これら各々を規定するために、上掲のKabat等に従って番号を付した。
本願明細書において、定められるように、「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は高頻度可変領域残基以外のその可変ドメイン残基である。
【００７５】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト免疫グロブリンから得られた最小配列を含むキメラ抗体である。多くの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又はほとんど全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、状況に応じて免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。また、以下の概説文献及びここに挙げる引用文献も参照のこと：Vaswani及びHamilton, Ann. Allergy, Asthma &amp; Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)。
【００７６】
「キメラ」抗体(免疫グロブリン)は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来の抗体あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体あるいは他の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である「キメラ」抗体、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りそれら抗体の断片を有する(アメリカ特許番号4,816,567、及び、Morrison 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。本明細書中で用いられるヒト化抗体は、キメラ抗体のサブセットである。
【００７７】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般的に、ｓｃＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
【００７８】
「抗原」は、抗体が選択的に結合しうる予め決められた抗原である。標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン又は他の天然に生じる化合物ないしは合成化合物であってもよい。標的抗原はポリペプチドであることが望ましい。
【００７９】
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成が可能であるリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディーは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びHollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。
「ヒト抗体」は、ヒトにより生成される抗体のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を有するもの、及び／又は本明細書中に開示したヒト抗体をつくるためのいずれかの技術を使用して、つくられたものである。この定義におけるヒト抗体は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特別に除く。
【００８０】
「親和性成熟」抗体は、その1つ以上のCDRに1つ以上の変更を有する抗体であって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性を向上させる。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks他は、Bio/Technology, 10:779-783(1992年)において、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas他、Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994)；Schier他、Gene, 169:147-155 (1995)；Yelton他、J. Immunol., 155:1994-2004 (1995)；Jackson他, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995)；及びHawkins他, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
【００８１】
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域(天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域)に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)；貪食作用；細胞表面レセプター(例えば、Ｂ細胞レセプター)のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
【００８２】
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」又は「ＡＤＣＣ」とは、ある種の細胞障害細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球及びマクロファージ)上に存在するＦｃレセプター(ＦｃＲｓ)と結合した分泌Ｉｇにより、これらの細胞障害エフェクター細胞が抗原-担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒により標的細胞を死滅させることを可能にする細胞障害性の形態を意味する。抗体は細胞障害細胞を「備えて」おり、これはこのような死滅には絶対に必要なものである。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) の４６４頁の表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性をアッセイするために、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイにおいて有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ細胞)が含まれる。代わりとして、もしくは付加的に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes等, (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価することが可能である。
【００８３】
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行することが望ましい。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が好適である。エフェクター細胞は天然源、例えば血液から単離してもよい。
【００８４】
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するものである。好適なＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(ガンマレセプター)と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ(「活性型レセプター」)及びＦｃγＲＩＩＢ(「阻害型レセプター」)が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ＩＴＡＭ)を含んでいる。阻害型レセプターＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター阻害性モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif ;ＩＴＩＭ)を含んでいる(Daeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照)。ＦｃＲsに関しては、 Ravetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994); 及びde Haas等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。将来的に同定されるものも含む他のＦｃＲsはここでの「ＦｃＲ」という言葉によって包含される。また、該用語には、母性ＩｇＧの胎児への移送を担い(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976) Kim等, J. Immunol.24:249 (1994))、免疫グロブリンのホメオスタシスを調節する新生児性レセプターＦｃＲｎも含まれる。国際公開公報００／４２０７２(Presta) にＦｃＲへの結合を向上又は減弱させた抗体変異型が述べられている。この特許公開の内容はここに出典明記により具体的に組み込まれる。Shields等, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照のこと。
ＦｃＲｎへの結合の測定方法は公知である(例としてGhetie 1997, Hinton 2004を参照)。インビボでのヒトＦｃＲｎへの結合とヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス又は形質転換されたヒト細胞株、又はＦｃ変異形ポリペプチドを投与された霊長類動物においてアッセイすることができる。
【００８５】
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。典型的な補体経路の活性化は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、同族抗原と結合した(適切なサブクラスの)抗体に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。
Ｆｃ領域アミノ酸配列を変更してＣ１ｑ結合能力が増大又は減少したポリペプチド変異体は、米特許第６１９４５５１号Ｂ１及び国際公開公報９９／５１６４２に記述される。それらの特許文献の内容は、出典明記によって、特別に本願明細書に組み込まれるものとする。またIdusogie 等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)を参照のこと。
【００８６】
「Ｆｃ領域含有ポリペプチド」なる用語は、Ｆｃ領域を含む抗体もしくはイムノアドヘンシンのようなポリペプチドを指す。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムに従うと残基４４７)は、例えば、ポリペプチドの精製中又はポリペプチドをコードする核酸を組み換え操作することによって除去してもよい。したがって、本発明のＦｃ領域を有するポリペプチドを含んでなる組成物は、Ｋ４４７を有するポリペプチド集団、すべてのＫ４４７が除去されたポリペプチド集団、又はＫ４４７残基を有するポリペプチドとＫ４４７残基を有さないポリペプチドの混合集団を包含しうる。
【００８７】
本願明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られるＶＬ又はＶＨフレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「から得られる」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含有するか、又は既存のアミノ酸配列変化を含有してもよい。既存のアミノ酸変化が存在する場合、好ましくは５つのみ、好ましくは４つ以下、又は３つ以下の既存のアミノ酸変化が存在する。既存のアミノ酸変化がＶＨ中に存在する場合、好ましくは、それらの変化は位置７１Ｈ、７３Ｈ及び７８Ｈの内の３つ、２つ又は１つのみである、例えば、それらの位置のアミノ酸残基は、７１Ａ、７３Ｔ及び／又は７８Ａであってよい。一実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【００８８】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選別において、最も共通して生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。通常、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列は、可変ドメイン配列のサブグループから選別する。通常、Kabat等によると、配列のサブグループはサブグループである。一実施態様では、ＶＬについて、Kabat等によると、前記サブグループはサブグループκIである。一実施態様では、ＶＨについて、Kabat等によると、前記サブグループはサブグループIIIである。
【００８９】
「ＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワーク」は、Kabat等の可変重鎖サブグループIIIのアミノ酸配列から得られるコンセンサス配列を含有する。一実施態様では、ＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は、以下の配列のそれぞれの少なくとも一部又は全部を含む。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (配列番号:184)-H1-WVRQAPGKGLEWV (配列番号:185)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (配列番号:186)-H3-WGQGTLVTVSS (配列番号:187)。
「ＶＬサブグループIコンセンサスフレームワーク」は、Kabat等の可変軽鎖κサブグループIのアミノ酸配列から得られたコンセンサス配列を含んでなる。一実施態様では、ＶＨサブグループIコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は、以下の配列のそれぞれの少なくとも一部又は全部を含む。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (配列番号:188)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY (配列番号:189)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (配列番号:190)-L3-FGQGTKVEIK (配列番号:191)。
【００９０】
ここで用いる「抗体変異体」又は「抗体変異」は、抗体のアミノ酸配列変異体であってその種依存的抗体の一又は複数のアミノ酸残基が変更しているものを指す。このような変異体は、必然的に種依存的抗体と１００％未満の配列同一性又は類似性がある。ある実施態様では、抗体変異体は、種依存性抗体の重鎖又は軽鎖の可変ドメインの何れかのアミノ酸配列と、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性又は類似性があるアミノ酸配列を有するであろう。この配列に対する同一性又は類似性は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入し最大の配列同一性パーセントを達成した後に種依存的抗体残基と同一(つまり同じ残基)又は類似(つまり共通の側鎖特性に基づく同じグループのアミノ酸残基、下を参照)である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセントとしてここで定義される。可変ドメインの外側の抗体配列中へのＮ末端、Ｃ末端、又は内部の伸展、欠失、又は挿入は何れも配列同一性又は類似性に影響を及ぼすものとはみなされない。
【００９１】
「疾病」又は「疾患」は、本発明の物質／分子又は方法を用いた治療によって利益を得る任意の症状である。これには、問題とする疾患に哺乳動物がかかりやすくなる病理学的症状を含む慢性及び急性の疾病又は疾患を含む。限定的なものではなく、ここで治療する疾患の例には、悪性及び良性の腫瘍；癌腫、芽腫及び肉腫が含まれる。  
「治療」は、治療的処置および予防又は防止的な手段の両方を指す。治療を必要とするものには、良性、前癌性又は非転移性の腫瘍を既に有しているもの、並びに癌の発生又は再発が予防されるべきものも含まれる。
「治療上の有効量」なる用語は、哺乳動物の疾患又は疾病を治療又は予防するための治療薬の量を指す。癌の場合、薬剤の治療上の有効量は、癌細胞の数を減少；原発性腫瘍サイズを低減；周辺臓器への癌細胞浸潤の阻害(すなわち、ある程度の遅延及び好ましくは停止)；腫瘍転移の阻害(すなわち、ある程度の遅延及び好ましくは停止)；ある程度の腫瘍増殖の阻害；及び／又は疾患が関与する一又は複数の症状のある程度の軽減をしうる。ある程度、薬剤は、増殖を妨げ及び／又は現存の癌細胞を殺し得、細胞分裂停止性及び／又は細胞障害性である。癌治療に対しては、インビボにおける効力は、例えば生存期間、病状の進行時間(ＴＴＰ)、応答速度(ＲＲ)、応答期間、及び／又は生活の質の評価により測定される。
【００９２】
「癌」及び「癌性」なる用語は、一般的に制御不能な細胞増殖に特徴がある哺乳動物の生理学的状態を指すか又は記述する。良性及び悪性の癌はこの定義に含まれる。「初期癌」又は「初期腫瘍」とは、侵襲性あるいは転移性でないか、又はステージ０、Ｉ、又はＩＩの癌として分類される癌を意味する。癌の例には、カルチノーマ、リンパ腫、芽細胞腫(髄芽細胞腫および網膜芽細胞腫を含む)、肉腫(脂肪肉腫および滑液細胞肉腫を含む)、神経内分泌腫瘍(カルチノイド腫瘍、ガストリノーマおよび膵島細胞癌を含む)、中皮腫、シュワン細胞腫(聴神経腫瘍を含む)、髄膜腫、腺癌、メラノーマおよび白血病又はリンパ性悪性腫瘍を含むが、これらに限定されるものではない。このような癌のより具体的な例には、扁平細胞癌(例えば上皮扁平細胞癌)、小細胞肺癌(ＳＣＬＣ)、非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、消化系癌を含む胃(gastric、stomach)癌、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌(転移性乳癌を含む)、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮カルチノーマ、唾液腺カルチノーマ、腎臓又は腎癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門部のカルチノーマ、陰茎カルチノーマ、精巣癌、食道癌、胆道の腫瘍、並びに頭頸部癌、及び多発性骨髄腫が含まれる。
【００９３】
「前癌性」なる用語は、典型的に癌に進行する又は癌に発達する症状ないし成長を指す。「前癌性の」成長は、細胞周期調節、細胞性増殖又は分化のマーカーによって測定されうる、異常な細胞周期調節、増殖又は分化によって特徴が示される細胞を有する。
「形成異常」は、組織、臓器又は細胞の任意の異常な成長ないしは発達を意味する。好ましくは、形成異常は高いグレードであるか、前癌性である。
「転移」とは、その原発性部位から体の他の場所への癌の蔓延を意味する。癌細胞は、原発性腫瘍から切り離れ、リンパ管および血管へ浸透し、血流を循環し、身体の至る所の正常組織の離れた病巣で成長しうる(転移)。転移は局所又は遠位でありうる。転移は経時的な過程であり、原発性腫瘍から切り離れ、血流を駆けめぐり、遠位部位に止まる腫瘍細胞に付随するものである。新たな部位で、細胞は、血液供給を確立し、成長して生命を脅かす体積を形成しうる。
腫瘍細胞内の刺激性分子および阻害性分子の経路はこの作用を制御するものであり、腫瘍細胞と遠位部位の宿主細胞との間の相互作用も有意である。
【００９４】
「非転移性」とは、良性である癌、又は原発部位に止まり、リンパ管や血管系ないしは原発部位以外の組織に浸透しない癌を意味する。一般的に、非転移性癌は、ステージ０、Ｉ又はＩＩの癌、場合によってステージＩＩＩの癌のいずれかの癌である。
【００９５】
「原発性腫瘍」又は「原発性癌」は元の癌を意味し、被検体の身体の他の組織、臓器又は部位に位置する転移性病巣を意味しない。
「良性腫瘍」又は「良性癌」は、元の部位に限局したままである腫瘍を意味し、遠位の部位への浸潤、侵入又は転移の能力を有さない。
「腫瘍量」は、体内の癌細胞の数、腫瘍のサイズ、又は癌の量を意味する。また、腫瘍量(tumor burden)は腫瘍負荷(tumor load)とも称される。
「腫瘍数」は腫瘍の数を意味する。
【００９６】
「被検体」は、哺乳類、例えば限定するものではないが、ヒト又はヒト以外の哺乳動物、例としてウシ、ウマ科、イヌ、ヒツジ又はネコを意味する。被検体はヒトであることが望ましい。
「抗癌療法」なる用語は、癌を治療する際に有用な療法を指す。抗癌治療剤の例には、限定するものではないが、例えば、手術、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞障害剤、放射線療法に用いる薬剤、抗血管新生剤、アポトーシス剤、抗チューブリン薬剤、および癌を治療するための他の薬剤、抗ＣＤ２０抗体、血小板由来増殖因子インヒビター(例えばＧｌｅｅｖｅｃＴＭ(メシル酸イマチニブ))、ＣＯＸ-２インヒビター(例えばセレコキシブ)、インターフェロン、サイトカイン、以下の標的ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＰＤＧＦＲ−β、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ又はＶＥＧＦレセプター(一又は複数)、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２および他の生理活性かつ有機化学的薬剤などの一又は複数に結合するアンタゴニスト(例えば中和抗体)が含まれる。また、その組合せが本発明に包含される。
【００９７】
ここで用いられる「細胞障害性剤」は、細胞の機能を阻害又は抑制し、および／又は細胞破壊を起こす物質を意味する。この用語は、放射性同位元素(例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０およびＲｅ１８６)、化学治療薬、および細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素又はその断片を意味する。
【００９８】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、癌の治療に有用な化学的化合物が含まれる。化学療法剤の例には、チオテパおよびシクロスホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、およびウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)およびトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類およびメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins)(特にブラタシン(bullatacin)およびブラタシノン(bullatacinone))；カンプトセシン(合成類似体トポテカン(topotecan)を含む)；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin)；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)およびバイゼレシン(bizelesin)合成類似体を含む)；クリプトフィシン(cryptophycin)(特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８)；ドラスタチン(dolastatin)；デュオカルマイシン(duocarmycin )(合成類似体、ＫＷ−２１８９およびＣＢＩ−ＴＭ１を含む)； エレトロビン(eleutherobin)；パンクラチスタチン(pancratistatin)；サルコディクチン(sarcodictyin)；スポンジスタチン(spongistatin)；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１、例えば、Agnew  Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照のこと；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ)を含むダイネミシン(dynemicin)；クロドロネート(clodronate)などのビスホスホネート(bisphosphonates)；エスペラマイシン(esperamicin)； 同様にネオカルチノスタチン発光団および関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団)、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin)、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ(登録商標)ドキソルビシン (モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin)、イダルビシン、マセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン(mitomycins)、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイ���ン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセートおよび５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)のような抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル(eniluracil)；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシン(maytansine)およびアンサマイトシン(ansamitocin)のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)およびアングイデン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ara-C」)；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばタキソール(登録商標)パクリタキセル、(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)、ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭ クレモフォール(Cremophor)を含まない、アルブミン設計のナノ粒子形状のパクリタキセル(American  Pharmaceutical  Partners, Schaumberg, Illinois)およびタキソテア(登録商標)ドキセタキセル、(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；クロランブシル；ＧＥＭＺＡＲ(登録商標)ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチンおよびカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；ミトキサントン；ビンクリ���チン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ(登録商標)ビノレルビン；ナベルビン(Navelbine)；ノバントロン(novantrone)；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；イリノテカン(カンプトサル(Camptosar)、ＣＰＴ-１１)(５−ＦＵおよびリューコボリンとのイリノテカンの治療処方を含む)；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド類；カペシタビン(capecitabine)；コンブレタスタチン(combretastatin)；ＶＥＬＣＡＤＥ ボルテゾミブ；ＲＥＶＬＩＭＩＤ レナリドミド；リューコボリン(leucovorin)(ＬＶ)；オキサリプラチン(oxaliplatin)、オキサリプラチン治療処方(FOLFOX)を含む；ＰＫＣ−αのインヒビター、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ(例として、エルロチニブ(erlotinib)(ＴａｒｃｅｖａＴＭ))および細胞増殖を減少させるＶＥＧＦ−Ａ、並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００９９】
また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、抗エストロゲンおよび選択的エストロゲンレセプターモジュレーター(ＳＥＲＭ)など、例えばタモキシフェン(ＮＯＬＶＡＤＥＸ(登録商標)タモキシフェンを含む)、ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、およびＦＡＲＥＳＴＯＮ・トレミフェン(Fareston)；アロマターゼ酵素を阻害するアロマターゼ阻害物質、それらは副腎でのエストロゲン産生を調節するものであり、例えば４(５)-イミダゾール類、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ(登録商標)メゲストロールアセテート、ＡＲＯＭＡＳＩＮ(登録商標)エキセメスタン、ホルメスタイン(formestanie)、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ(登録商標)ゾロゾール(vorozole)、ＦＥＭＡＲＡ(登録商標)レトロゾールおよびＡＲＩＭＩＤＥＸ(登録商標)アナストロゾール；；および抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン；並びにトロキサシタビン(troxacitabine)(1,3-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に不粘着性細胞増殖に関係するシグナル伝達経路の遺伝子の発現を抑制するもの、例えばＰＫＣ−ａｌｐｈａ、ラルフおよびＨ−Ｒａｓ；リボザイム、例えばＶＥＧＦ発現インヒビター(例えばＡＮＧＩＯＺＹＭＥ(登録商標)リボザイム)およびＨＥＲ２発現インヒビター；遺伝子治療ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチンおよびＶＡＸＩＤ(登録商標)ワクチン)などのワクチン；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ(登録商標)ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ(登録商標)トポイソメラーゼ１インヒビター；ＡＢＡＲＥＬＩＸ(登録商標)rmRH；ビノレルビン(Vinorelbine)およびエスペラミシン(Esperamicins)(米国特許第４６７５１８７号を参照)並びに上記のものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【０１００】
この出願で用いられる用語「プロドラッグ」は、親薬剤に比較して腫瘍細胞に対する細胞障害性が低く、酵素的に活性化又はより活性な親形態に変換される製薬的活性物質の前駆体又は誘導体形態を意味する。例えば、Wilman, 「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」, Biochemical Society Transactions, 14, :375-382, 615th Meeting, Belfast (1986)、およびStella 等, 「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」、Directed Drug Delivery, Borchardt等(編), 247-267項, Humana Press (1985)参照。本発明のプロドラッグは、限定するものではないが、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ-アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β-ラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５-フルオロシトシンおよび他の５-フルオロウリジンプロドラッグを含む。限定はしないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞障害性剤の例には、前記の化学療法剤が含まれる。
【０１０１】
「放射線療法」とは、正常に機能する能力を制限するため又は全く細胞を破壊するために、細胞に十分な損傷を誘導する有向性のγ線又はβ線の使用を意味する。治療の用量および治継続期間を決定するためには公知の多くの方法があることは明らかであろう。典型的な治療は、１回の投与として、１日当たり１０〜２００単位(グレイ)の典型的な用量として施される。
【０１０２】
「生体試料」(「試料」又は「組織ないし細胞試料」と交換可能に称される)は、個体から入手した様々な種類の試料を包含し、診断アッセイ又はモニタリングアッセイに用いられうる。この定義には、血液及び生体起源の他の液体試料、生検標本や組織培養物やそれらに由来する細胞などの固形組織試料、及びこれらのプロジェニーが包含される。また、この定義には、入手後何らかの方法、例えば試薬で処理する、可溶化する、又はタンパク質やポリヌクレオチドなどの特定の成分について濃縮する、又は切片化のために半流動性基質ないしは固形基質に包埋することによって操作してある試料が含まれる。「生体試料」なる用語は臨床試料を包含し、培養物中の細胞、細胞上清物、細胞溶解物、血清、血漿、体液、及び組織試料も含む。生体試料の供給源は、新鮮な、凍結された及び／又は保存されていた臓器や組織試料又は生検又は吸引による固形組織；血液又は血液成分；大脳脊髄液、羊水、腹水又は間質液などの体液；被検体の妊娠期又は発生期の任意の時期の細胞であってもよい。いくつかの実施態様では、生体試料は原発性腫瘍又は転移性腫瘍から得られる。生体試料は、防腐剤、抗凝血物質、バッファ、固定液、栄養分、抗生物質など天然の組織にはもともと混在していない化合物を含んでもよい。
【０１０３】
本明細書中の組織試料の「切断部分」とは、組織試料の一部又は一片、例えば組織試料から切り出した組織又は細胞の一薄片を意味する。組織試料の複数の切断部分は採取され、本発明の分析に供されうることが理解される。いくつかの実施態様では、組織試料の同じ切断部分は形態学的及び分子的レベルで分析されるか、タンパク質及び核酸の両方に関して分析される方法を含む。
本明細書中で用いられる「標識」なる言葉は、核酸プローブや抗体などの試薬に直接的又は間接的にコンジュゲートないしは融合され、コンジュゲートないしは融合した試薬の検出を容易にする化合物又は組成物を指す。標識自体が検出可能なもの(例えば放射性標識又は蛍光性標識)であってよく、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物ないしは組成物の化学的変化を触媒するものであってもよい。
【０１０４】
本発明の組成物及び方法
本発明は、医薬組成物を含む組成物であって、抗ＦＧＦＲ３抗体を含んでなる組成物、及び、抗ＦＧＦＲ３抗体をコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含する。本明細書で用いられるように、組成物は、ＦＧＦＲ３に結合する一又は複数の抗体、及び／又はＦＧＦＲ３に結合する一又は複数の抗体をコードする配列を含む一又は複数のポリヌクレオチドを含有する。さらに、これらの組成物は、適切な担体、例えばバッファなどの薬学的に受容可能な賦形剤を含みうる。これは当分野で周知である。
【０１０５】
また、本発明は、単離された抗体及びポリヌクレオチドの実施態様を包含する。また、本発明は、実質的に純粋な抗体及びポリヌクレオチドの実施態様を包含する。
また、本発明は、抗ＦＧＦＲ３抗体(本明細書に記載のもの又は当分野で知られるもの)を使用した、疾患、例えば多発性骨髄腫又は移行段階カルチノーマ(例えば浸潤性移行段階カルチノーマ)の治療方法を包含する。
【０１０６】
組成物
本発明の抗ＦＧＦＲ３抗体は望ましくはモノクローナルである。また、本明細書中で提供される抗ＦＧＦＲ３抗体のＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆａｂ'-ＳＨ及びＦ(ａｂ')２断片も本発明の範囲内に包含される。これらの抗体断片は、従来の方法、例えば酵素消化により作製されるか、組換え体技術により生成されてもよい。このような抗体断片は、キメラでもよいし、ヒト化のものでもよい。これらの断片は、後述する診断目的及び治療目的のために有用である。
【０１０７】
モノクローナル抗体は実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、わずかながら存在しうる天然に生じる突然変異体を除いて同一のものである。よって、「モノクローナル」との修飾詞は、別個の抗体の混合物ではなく、抗体の特性を示すものである。
本発明の抗ＦＧＦＲ３モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作製することができる。
【０１０８】
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを免疫化し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を誘導する。一般的に、ＦＧＦＲ３への抗体は、ＦＧＦＲ３とアジュバントを複数回皮下(ｓｃ)又は腹腔内(ｉｐ)に注射することにより動物内に生じる。ＦＧＦＲ３は当分野で公知の方法を用いて調製されうる。その方法のいくつかは本明細書中でさらに記載される。例えば、ヒト及びマウスのＦＧＦＲ３の組み換え産生は以下に記載される。一実施態様では、動物を、免疫グロブリン重鎖のＦｃ部位に融合したＦＧＦＲ３で免疫化する。好適な実施態様では、動物を、ＦＧＦＲ３−ＩｇＧ１融合タンパク質で免疫化する。通常、動物は、一リン酸化リピドＡ(ＭＰＬ)／トレハロースジクリノミコレート(trehalose dicrynomycolate)(ＴＤＭ) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT)によりＦＧＦＲ３の免疫原性コンジュゲート又は誘導体に対して免疫化され、該溶液は複数の部位の皮下に注射される。２週後に、動物を追加免役する。７〜１４日後、動物から採血して、血清を抗ＦＧＦＲ３力価について検定する。力価がプラトーになるまで動物を追加免役する。
【０１０９】
別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,59-103頁(Academic Press, 1986))。
【０１１０】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
【０１１１】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫系、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、San Diego, California USAから入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及びアメリカ培養細胞系統保存機関、Rockville, Maryland USAから入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されたものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
【０１１２】
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、ＦＧＦＲ３に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunsonほか, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【０１１３】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地には、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が包含される。加えて、該ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインA-SEPHAROSE、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
【０１１４】
本発明の抗ＦＧＦＲ３抗体は、所望される活性を有する合成抗体クローンをスクリーニングするために、コンビナトリアルライブラリを用いて同定することができる。原則として、合成抗体クローンを、ファージコートタンパク質と融合した抗体可変領域(Fv)の種々の断片を表示するファージを有するファージライブラリをスクリーニングすることによって選択される。このようなファージライブラリは、所望される抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによって選別される。所望される抗原と結合することができるFv断片を発現するクローンは抗原へ吸収され、それによって、ライブラリの非結合クローンから分離される。次いで、この結合クローンは、抗原から溶出させることが可能であり、抗原吸収／溶出の付加的サイクルによってさらに濃縮することができる。本発明の任意の抗ＦＧＦＲ３抗体は、興味の対象であるファージクローンを選択するために適切な抗原スクリーニング手法を設計し、続いて、興味の対象であるファージクローンからのＦｖ配列、及びKabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3に記載の適切な定常領域(Fc)配列を用いての全長抗ＦＧＦＲ３抗体クローンの構築によって得ることができる。
【０１１５】
抗体の抗原結合ドメインは、約１１０アミノ酸の２つの可変(Ｖ)領域である軽(ＶＬ)及び重(ＶＨ)鎖で形成され、その双方には、３つの超可変ループ又は相補鎖決定領域(ＣＤＲ)が存在する。可変ドメインは、Winter等，Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455(1994)に記載のように、ＶＨ及びＶＬが短くて柔軟なペプチドを介して共有結合している一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)断片として、又は定常ドメインと融合して非共有的に相互作用しているＦａｂ断片のいずれかとしてファージ上に機能的に表示することができる。ここで用いられているように、ｓｃＦｖコード化ファージクローン、及びＦａｂコード化ファージクローンは、総称して「Ｆｖファージクローン」又は「Ｆｖクローン」と呼ぶ。
【０１１６】
ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)によって分離してクローンし、ファージライブラリにおいてランダムに組み換えられることが可能であり、それは、Winter等，Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455(1994)に記載のように抗原結合クローンについて探索することが可能である。免疫化したソースからのライブラリは、ハイブリドーマを構成する必要がなく、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、天然レパートリーをクローニングして、Griffiths等，EMBO J, 12: 725-734(1993)に記載のようにどんな免疫化もせずに、幅広い非自己及びまた自己抗原に対するヒト抗体の単一のソースを提供することが可能である。最終的には、天然ライブラリは、また、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol. 227: 381-388(1992)に記載のように、幹細胞からの再配列されていないV遺伝子セグメントをクローニングし、及びランダム配列を有するＰＣＲプライマーを利用して高度可変ＣＤＲ３領域をコードし、インビトロでの再配列を完成させることによって合成的に作製することができる。
【０１１７】
繊維状ファージは、マイナーコートタンパク質ｐＩＩＩへの融合によって、抗体断片を表示するのに用いられる。この抗体断片は、一本鎖Ｆｖ断片として表示することが可能であり、そのＶＨ及びＶＬドメインは、例えば、Marks等，J. Mol. Biol. 222: 581-597(1991)に記載のような、又は、例えば、Hoogenboom等，Nucl. Acids. Res., 19: 4133-4137(1991)に記載のような、１つの鎖はｐＩＩＩと融合し、もう一方の鎖は、幾つかの野生型コートタンパク質を置換することによってファージ表面上に表示されるようになるＦａｂコートタンパク質構造のアセンブリがある細菌宿主細胞のペリプラズムへ分泌されるＦａｂ断片のように、柔軟なポリペプチドスペーサーによって同じポリペプチド鎖上に連結されている。
【０１１８】
一般的に、抗体遺伝子断片をコードする核酸は、ヒト又は動物から収集した免疫細胞から得られる。抗ＦＧＦＲ３クローンに有利になるように偏ったライブラリが望ましい場合には、個体をＦＧＦＲ３で免疫化して抗体応答を生成させ、そして、脾臓細胞及び／又は他の末梢血リンパ球(ＰＢＬ)である循環Ｂ細胞を、ライブラリ構築のために回収する。好ましい実施態様では、ＦＧＦＲ３免疫化により、ＦＧＦＲ３に対するヒト抗体を産生するＢ細胞が生じるように、抗ＦＧＦＲ３クローンに好ましいヒト抗体遺伝子断片ライブラリは、機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを有する(及び、機能的な内因性抗体産生系を欠く)トランスジェニックマウスにおける抗ＦＧＦＲ３抗体応答を生成することによって得られる。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスの作製は以下に記載する。
【０１１９】
抗ＦＧＦＲ３反応細胞集団のさらなる濃縮は、適切なスクリーニング手法を利用してＦＧＦＲ３特異的膜結合抗体を発現するＢ細胞を単離すること、例えば、ＦＧＦＲ３アフィニティクロマトグラフィーによる細胞分離、又は蛍光色素標識ＦＧＦＲ３への細胞の吸着とその後の蛍光標示式細胞分取器(ＦＡＣＳ)によって得ることができる。
【０１２０】
あるいは、非免疫化供与体からの脾臓細胞及び／又はＢ細胞又は他のＰＢＬの利用によって可能性のある抗体レパートリーのより良い表示が提供され、また、ＦＧＦＲ３が免疫原ではない任意の動物(ヒト又は非ヒト)種を利用した抗体ライブラリの構築が可能となる。インビトロの抗体遺伝子コンストラクトを取り込むライブラリに関しては、幹細胞を個体から収集して非再配列の抗体遺伝子セグメントをコードする核酸を提供する。対象の免疫細胞は、種々の動物種、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ目、オオカミ、犬科、ネコ科、ブタ、ウシ、ウマ、及びトリ種等から得ることができる。
【０１２１】
抗体可変遺伝子セグメント(ＶＨ及びＶＬセグメントを含む)をコードする核酸を、興味の対象の細胞から回収して増幅した。再配列したＶＨ及びＶＬ遺伝子ライブラリの場合では、その所望するＤＮＡは、Orlandiら，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989)に記載されているように、リンパ球からのゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを単離し、再配列したＶＨ及びＶＬ遺伝子の５'及び３'末端と一致するプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を行うことによって得ることが可能であり、よって発現のための多様なＶ遺伝子レパートリーを作製することができる。このＶ遺伝子は、Orlandi等, (1989)及びWardら，Nature, 341: 544-546(1989)に記載のように、成熟Ｖドメインをコードするエクソンの５'末端のバックプライマーとＪセグメントに基づいた前方向プライマーにより、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡから増幅することが可能である。しかしながら、ｃＤＮＡからの増幅のためには、バックプライマーは、また、Jonesら，Biotechnol., 9:88-89(1991)に記載のようにリーダーエクソンに、前方向プライマーは、Sastryら，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86:5728-5732(1989)に記載のように定常領域内に基づくことが可能である。相補性を最大にするために、Orlandiら(1989)又はSastryら(1989)に記載のように、縮重をプライマーへ取り込むことが可能である。好ましくは、例えば、Marksら，J. Mol. Biol., 222: 581-597(1991)の方法に記載のように、又はOrumら，Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498(1993)の方法に記載のように、免疫細胞の核酸試料に存在するすべての入手可能なＶＨ及びＶＬ配列を増幅するために、各Ｖ遺伝子ファミリーを標的にしたＰＣＲプライマーを用いて、そのライブラリの多様性を最大にする。発現ベクターへの増幅ＤＮＡのクローニングに関しては、希な制限部位を、Orlandiら(1989)に記載のように、又はClacksonら，Nature, 352: 624-628(1991)に記載のようにタグ付加したプライマーによるさらなるＰＣＲ増幅によって、ＰＣＲプライマー内の１つの末端へタグとして導入することができる。
【０１２２】
合成的に再配列したＶ遺伝子のレパートリーは、Ｖ遺伝子セグメントからインビボで誘導することができる。殆どのヒトＶＨ遺伝子セグメントはクローニング及び配列決定(Tomlinson等, J. Mol. Biol. 227: 776-798(1992)に報告されている)、そしてマッピングがされている(Matsudaら，Nature Genet., 3: 88-94(1993))；これらクローニングされたセグメント(Ｈ１及びＨ２ループのすべての主要なコンホメーションを含む)は、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol. 227: 381-388(1992)に記載のように、多様な配列と長さのＨ３ループをコードするＰＣＲプライマーによる多様なＶＨ遺伝子レパートリーを作製するのに用いられる。ＶＨレパートリーは、また、Barbas等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461(1992)に記載されているように、単一の長さの長いＨ３ループに焦点を合わせたすべての配列多様性をともなって作製することができる。ヒトＶκ及びＶλセグメントはクローニング及び配列決定がなされ(Williams及びWinter， Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461(1993))、合成軽鎖レパートリーを作製するのに利用することができる。ＶＨ及びＶＬフォールドの範囲及びＬ３及びＨ３の長さに基づく合成的Ｖ遺伝子レパートリーは、相当に構造的多様性を有する抗体をコードする。ＤＮＡをコードするＶ遺伝子の増幅に続いて、生殖系のＶ遺伝子セグメントは、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol. 227: 381-388(1992)の方法に従ってインビトロで再配列することができる。
【０１２３】
抗体断片のレパートリーは、幾つかの方法でＶＨ及びＶＬ遺伝子レパートリーを共に組み合わせることによって構築することができる。各レパートリーを異なるベクターで作製し、そのベクターを、例えばHogrefe等, Gene, 128: 119-126(1993)に記載のようにインビトロで、又はコンビナトリアル・インフェクション、例えばWaterhouse等, Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266(1993)に記載のloxP系によってインビボで作製することが可能である。このインビボの組み換え手法では、大腸菌の形質転換効率によって強いられるライブラリの大きさの限界を克服するために、二本鎖種のＦａｂフラグメントが利用される。ナイーブのＶＨ及びＶＬレパートリーは、１つはファージミドへ、そして他はファージベクターへと個別にクローニングされる。この２つのライブラリは、その後、各細胞が異なる組み合わせを有し、そのライブラリの大きさが、存在する細胞の数(約１０１２クローン)によってのみ限定されるように、ファージミド含有細菌のファージ感染によって組み合わせられる。双方のベクターは、ＶＨ及びＶＬ遺伝子が単一のレプリコンへ組み換えられ、ファージビリオンへ共にパッケージされるように、インビボの組み換えシグナルを有する。これら巨大なライブラリは、良好な親和性(約１０-8MのKｄ-1)の多くの多様な抗体を提供する。
【０１２４】
別法として、このレパートリーは、例えばBarbas等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982(1991)に記載のように同じベクターへ連続してクローニング、又は、Clakson等, Nature, 352: 624-628(1991)に記載のようにＰＣＲ後に、クローニングすることでアセンブリすることができる。ＰＣＲアセンブリは、また、柔軟なペプチドスペーサーをコードしているＤＮＡとＶＨ及びＶＬ ＤＮＡを連結させて、単鎖のＦｖ(ｓｃＦｖ)レパートリーを形成することに利用することができる。さらに他の技術では、「細胞内でのＰＣＲアセンブリ」は、Embleton等, Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837(1992)に記載のように、ＰＣＲによってリンパ球内のＶＨ及びＶＬ遺伝子を組み合わせて、その後、連結した遺伝子のレパートリーをクローニングするのに利用される。
【０１２５】
ナイーブのライブラリ(天然又は合成のいずれか)によって産生された抗体は中度の親和性(約１０６〜１０７M-1のKd-1)である可能性があるが、Winterら(1994), 上掲に記載のように第二番目のライブラリから構築して遊離することによって、親和性成熟をもインビトロで模倣することが可能である。例えば、Hawkins等, J. Mol. Biol. 226: 889-896(1992)の方法、又はGram等, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580(1992)の方法においてエラー・プローンポリメラーゼ(Leung等, Technique, 1:11-15(1989)で報告されている)を利用することによって、突然変異をインビトロでランダムに導入することができる。さらには、１つ又はそれより多いＣＤＲをランダムに変異させることによって、例えば、選択した個々のＦｖクローンにおいて、対象のＣＤＲまで及ぶランダム配列を有するプライマーによるＰＣＲを利用して、そしてより高い親和性クローンをスクリーニングすることで親和性成熟をおこなうことが可能である。国際公開第９６０７７５４号(１９９６年３月１４日に公開)は、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域へ突然変異生成を誘導して軽鎖遺伝子のライブラリを作製する方法を記載している。その他の有効な手法は、Marks等, Biotechnol. 10: 779-783(1992)に記載のように、非免疫化供与体から得られた天然で発生するＶドメイン変異体のレパートリーによるファージディスプレイによって選択されたＶＨ又はＶＬドメインを組み換えること、及び数回のチェーン・シャッフリングにおいてより高い親和性についてスクリーニングすることである。この技術は、１０-9Mの範囲の親和性の抗体及び抗体断片の産生を可能にする。
【０１２６】
ＦＧＦＲ３核酸およびアミノ酸配列は当分野で知られている。ＦＧＦＲ３をコードする核酸配列は、ＦＧＦＲ３の所望の領域のアミノ酸配列を使用して設計されうる。周知であるように、ＦＧＦＲ３には２つの主要なスプライスアイソフォーム、つまりＦＧＦＲ３ ＩＩＩｂおよびＦＧＦＲ３ ＩＩＩｃがある。ＦＧＦＲ３配列は当分野において周知であり、ＵｎｉＰｒｏＫＢ／Ｓｗｉｓｓ-Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ２２６０７(ＦＧＦＲ３ ＩＩＩｃ)又はＰ２２６０７＿２(ＦＧＦＲ３ ＩＩＩｂ)の配列を含んでよい。ＦＧＦＲ３突然変異が同定されており、当分野において周知であり、(ＵｎｉＰｒｏＫＢ／Ｓｗｉｓｓ-Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ２２６０７(ＦＧＦＲ３ ＩＩＩｃ)又はＰ２２６０７＿２(ＦＧＦＲ３ ＩＩＩｂ)に示される配列に関して)以下の突然変異が含まれる：
ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ      ＦＧＦＲ３ ＩＩＩｃ
Ｒ２４８Ｃ                Ｒ２４８Ｃ
Ｓ２４９Ｃ                Ｓ２４９Ｃ
Ｇ３７２Ｃ                Ｇ３７０Ｃ
Ｙ３７５Ｃ                Ｙ３７３Ｃ
Ｇ３８２Ｒ                Ｇ３８０Ｒ
Ｋ６５２Ｅ                Ｋ６５０Ｅ
【０１２７】
ＦＧＦＲ３をコードする核酸は、当分野で公知の様々な方法によって調製できる。これらの方法には、Engels 等, Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28: 716-734 (1989)に記載の何れかの方法、例えばトリエステル、亜リン酸エステル、ホスホラミダイト及びＨ-ホスホン酸塩方法による化学的な合成法が含まれるがこれに限定されるものではない。一実施態様では、発現宿主細胞に好ましいコドンが、ＦＧＦＲ３コード化ＤＮＡの設定に用いられる。これに対して、ＦＧＦＲ３をコードするＤＮＡは、ゲノムないしｃＤＮＡのライブラリから単離できる。
【０１２８】
ＦＧＦＲ３をコードするＤＮＡ分子の構築に続いて、そのＤＮＡ分子は、プラスミド等の発現ベクターの発現コントロール配列と作用可能に連結し、このコントロール配列は、そのベクターで形質転換した宿主細胞によって認識される。一般的に、プラスミドベクターは、その宿主細胞と適合する種から誘導された複製及びコントロール配列を有する。このベクターは、通常は、形質転換細胞で表現型の選択を提供することが可能なタンパク質をコードする配列だけでなく複製部位を有する。原核宿主細胞及び真核宿主細胞での発現に好適なベクターは当分野で公知であり、さらにそのいくつかを本明細書に記載する。酵母菌などの原核生物、又は哺乳動物などの多細胞生物由来の細胞が用いられうる。
【０１２９】
場合によっては、ＦＧＦＲ３をコードするＤＮＡは宿主細胞によって培地中への発現産物の分泌を生じさせる分泌リーダー配列に作用可能に結合される。分泌リーダー配列の例には、stII、エコチン(ecotin)、lamB、ヘルペスGD、lpp、アルカリホスファターゼ、インベルターゼ、及びアルファ因子が含まれる。ここでの使用にまた適しているのはプロテインＡの３６アミノ酸リーダー配列である(Abrahmsen等, EMBO J., 4:3901(1985))。
【０１３０】
宿主細胞はこの発明の上述の発現又はクローニングベクターでトランスフェクトされ、好ましくは形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように変性された一般的な培養液中で培養される。
【０１３１】
トランスフェクションとは、実際に任意のコード化配列が発現するかどうか分からない宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。トランスフェクションの多くの方法は、通常の技能を有する技術者に知られており、例えば、ＣａＰＯ４沈降法及び電気穿孔法がある。一般に成功したトランスフェクションは、宿主細胞内で該ベクターの働きの兆候が現れた時に認識される。
【０１３２】
形質転換とは、ＤＮＡが染色体外成分として又は染色体組み込みによってのいずれかで複製可能となるように、生物にＤＮＡを導入することを意味する。用いる宿主細胞によって、その細胞に適した基本的な技術を用いて形質転換は行われる。形質転換法は当分野で公知であり、そのいくつかをさらに本明細書中に記載する。
【０１３３】
ＦＧＦＲ３を産生するために用いる原核生物宿主細胞は、一般的に、上掲のSambrook等に記載のように培養することが可能である。
ＦＧＦＲ３を産生するために使用される哺乳動物宿主細胞は、様々な培地で培養することができる。その培地は当分野で周知であり、そのいくつかを本明細書中に記載する。
この開示で言及している宿主細胞には、宿主動物内の細胞だけでなくインビトロ培養物の細胞が含まれる。
【０１３４】
ＦＧＦＲ３の精製は、当分野で認識される方法を用いて実施される。そのいくつかを本明細書中に記載する。
ファージディスプレイクローンのアフィニティークロマトグラフィー分離での利用のために、例えば、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、ガラスビーズ、セルロース、種々のアクリルコポリマー、ヒドロキシルメタクリルゲル、ポリアクリル及びポリメタクリルコポリマー、ナイロン、中性及びイオン性担体等の適切な基質へ精製したＦＧＦＲ３を付着させることが可能である。基質へのＦＧＦＲ３タンパク質の付着は、Methods in Enzymology, ４４巻(1976)に記載されている方法によって完遂することができる。アガロース、デキストラン又はセルロース等の多糖類基質へタンパク質リガンドを付着させるために広く用いられている技術には、ハロゲン化シアンによる担体の活性化、それに続く、活性化基質へのペプチドリガンドの第１級脂肪族又は芳香族アミンのカップリングが含まれる。
【０１３５】
あるいは、ＦＧＦＲ３は、吸収プレートのウェルをコーティングするために利用すること、吸収プレートへ付着させた宿主細胞上で発現させるか又はセルソーティングで利用すること、又はストレプトアビジンでコーティングしたビーズによる捕獲のためにビオチンとコンジュゲートすること、又はファージディスプレイライブラリをパニングするためのあらゆる他の当該分野の方法において利用することが可能である。
【０１３６】
吸着剤との少なくともファージ粒子の一部分の結合に適した条件下で、ファージライブラリの試料を固定化ＦＧＦＲ３と接触させる。通常は、ｐＨ、イオン強度、温度等を含む条件を選択して、生理学的条件を模倣する。固相と結合したファージを洗浄し、その後、例えばBarbas等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982(1991)に記載されているように酸で、又は例えばMarks等, J. Mol. Biol. 222: 581-597(1991)に記載にされているようにアルカリで、又は例えばClackson等, Nature, 352: 624-628(1991)の抗原競合法に類似の手法であるＦＧＦＲ３抗原競合によって溶出する。ファージは、１回目の選択で２０〜１，０００倍に濃縮することが可能である。さらには、この濃縮したファージを細菌培養液で生育させ、さらなる回の選択に供することが可能である。
【０１３７】
選択の効率は多くの要因に依存し、それには、洗浄の間の解離の動力学、そして単一のファージ上の複数の抗体断片が同時に抗原と関われるかどうかということが含まれる。一次解離定数(及び弱い結合親和性)を有する抗体は、短い洗浄、多価ファージディスプレイ及び固相の抗原の高いコーティング密度の利用によって保持することが可能である。高い密度は、多価相互作用を介してファージを安定化するだけでなく、解離したファージの再結合に有利に作用する。遅い解離動力学(及び良好な結合親和性)を有する抗体の選択は、Bass等, Proteins, 8: 309-314(1990)及び国際公開第９２／０９６９０号に記載されているような長い洗浄と単価ファージディスプレイの利用、そしてMarks等, Biotechnol., 10: 779-783(1992)に記載されているような抗原の低度のコーティング密度によって促進することが可能である。
【０１３８】
親和性に僅かな違いがあったとしても、ＦＧＦＲ３に対する異なる親和性のファージ抗体の中で選択することは可能である。しかしながら、選択した抗体のランダム変異(例えば、上記の幾つかの親和性成熟の技術で行われているような)は、多くの変異を生じやすく、その殆どが抗原と結合し、僅かがより高い親和性である。ＦＧＦＲ３を限定すると、希な高い親和性のファージが競合して除かれることが可能である。すべてのより高い親和性の変異を保持するために、ファージは、過度のビオチン化ＦＧＦＲ３とインキュベートすることが可能であるが、ＦＧＦＲ３に対する標的モル濃度親和定数よりも低いモル濃度のビオチン化ＦＧＦＲ３とインキュベートできる。次いで、高親和性結合ファージをストレプトアビジンでコーティングした常磁性体ビーズによって捕獲することが可能である。そのような「平衡捕獲」は、結合の親和性に従い、親和性の低い過度のファージから、僅かに２倍高い親和性の変異体クローンの単離を可能にする感度で抗体を選択することを可能にする。固相と結合したファージを洗浄するのに用いる条件を操作して、解離定数を基礎として識別することも可能である。
【０１３９】
抗ＦＧＦＲ３クローンは活性選択されうる。一実施態様では、本発明は、ＦＧＦＲ３レセプターとそのリガンド(例えばＦＧＦ１及び／又はＦＧＦ９)との結合をブロックするＦＧＦＲ３抗体を提供する。このようなＦＧＦＲ３抗体に対応するＦｖクローンは、(1) 上記のようなファージライブラリからＦＧＦＲ３クローンを単離して、場合によって、好適な宿主細胞で個体集団を成長させることによって、ファージクローンの単離した母集団を増幅する、(2) 望ましいブロック活性及び非ブロック活性のそれぞれについて第二タンパク質とＦＧＦＲ３を選択する、(3) 固定されたＦＧＦＲ３に抗ＦＧＦＲ３ファージクローンを吸着する、(4) 過剰量の第二タンパク質を用いて、第二タンパク質の結合決定基と共有するかオーバーラップするＦＧＦＲ３−結合決定基を認識する任意の望ましくないクローンを溶出する、そして、(5) 工程(4)の後に吸着されたまま残ったクローンを溶出する、ことによって選別できる。場合によって、所望のブロック／非ブロック特性を有するクローンを、本明細書に記載の選別手順を一又は複数回繰り返すことによって、さらに濃縮できる。
【０１４０】
ハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡ又は本発明のファージディスプレイＦｖクローンは、常法を用いて(例えば、ハイブリドーマの対象の領域をコードする重鎖及び軽鎖又はファージＤＮＡ鋳型を特異的に増幅するように設定したオリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより)即座に分離されて、配列決定される。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外では抗体タンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌での組み換え発現に関する概説論文には、Skerra等, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPluckthun, Immunol. Revs. 130: 151-188(1992)が含まれる。
【０１４１】
本発明のＦｖクローンをコードするＤＮＡは、重鎖及び／又は軽鎖定常領域をコードする公知のＤＮＡ配列(例えば好適なＤＮＡ配列は上掲のカバット等から得ることができる)と組み合わせて、完全長ないし一部の重鎖及び／又は軽鎖をコードするクローンを形成できる。このために、何れかのアイソタイプの定常領域、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ定常領域を用いることができることが理解されるであろう。このような定常領域は任意のヒト又は動物種から得ることができる。ある動物(例えばヒト)種の可変ドメインＤＮＡから得て、次いで「ハイブリッド」である完全長重鎖及び／又は軽鎖のコード配列を形成するために他の動物種の定常領域ＤＮＡに融合したＦｖクローンは、本明細書で用いられる「キメラ」及び「ハイブリッド」抗体の定義に含まれる。好適な実施態様では、ヒト可変ＤＮＡから得たＦｖクローンをヒト定常領域ＤＮＡに融合して、すべてのヒト、完全長ないし一部の重鎖及び／又は軽鎖のコード配列を形成する。
【０１４２】
また、本発明のハイブリドーマ由来の抗ＦＧＦＲ３抗体をコードするＤＮＡは、例えば、ハイブリドーマクローン由来の相同的マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を置換すること(例えばMorrison等, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:6851(1984)の方法)によって修飾することができる。ハイブリドーマ又はＦｖクローン由来の抗体ないし抗体断片をコードするＤＮＡは、免疫グロブリンコード化配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード化配列の全て又は一部を共有結合させることによってさらに修飾することができる。そのように、「キメラ」又は「ハイブリッド」抗体は、本発明のＦｖクローン又はハイブリドーマクローン由来の抗体の結合特異性を有するように調製される。
【０１４３】
抗体断片
本発明は抗体断片を包含する。特定の場合では、全抗体よりも抗体断片の利用に利点がある。より小さいサイズの断片によりクリアランスが速くなり、固形腫瘍へのアクセスが改善されうる。
【０１４４】
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、完全な抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片はすべて、大腸菌で発現され、分泌されるため、この断片の大規模産生が容易となる。抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含有する、インビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ(ａｂ')２断片は米国特許第５８６９０４６号に記載される。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である。国際公開９３/１６１８５；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。Ｆｖ及びｓＦｖは、定常領域が欠けている完全な結合部を有する唯一の種である；したがって、それらは、インビボでの使用の間の非特異的結合を減らすために適する。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ末端又はカルボキシ末端の何れかで、エフェクタータンパク質の融合物を得るために構築されうる。上掲のAntibody Engineering, ed. Borrebaeckを参照。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。このような直線状の断片は単特異的又は二重特異的であってもよい。
【０１４５】
ヒト化抗体
本発明はヒト化抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化する様々な方法は従来からよく知られている。例えば、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する高頻度可変領域配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４８１６５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくつかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
【０１４６】
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク領域として受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623(1993))。
【０１４７】
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、ある方法によって、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接的かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【０１４８】
ヒト抗体
本発明のヒト抗ＦＧＦＲ３抗体は、上記のように、ヒト由来のファージディスプレイライブラリから選択したＦｖクローン可変ドメイン配列を公知のヒト定常ドメイン配列と結合することによって構築することができる。あるいは、本発明のヒトモノクローナル抗ＦＧＦＲ３抗体は、ハイブリドーマ法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の生産のためのヒトミエローマ及びマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株は，例えば，Kozbor, J. Immunol. 133, 3001(1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及びBoerner 等, J. Immunol., 147: 86 (1991)によって記載されている。
【０１４９】
免疫化することで、内因性免疫グロブリンの生産なしに、ヒト抗体の完全なレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物(例えばマウス)を生産することが現在は可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系変異体マウスでの抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子のホモ接合体欠失は、内因性抗体の生産の完全な阻害をもたらすことが記載されている。そのような生殖細胞系変異体マウスでのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子配列の転移は、抗原の挑戦によってヒト抗体の生産を引き起こす。例えば、Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-255(1993)；Jakobovits等, Nature 362, 255-258(1993)を参照のこと。
【０１５０】
また、遺伝子シャフリングは、ヒト抗体が開始非ヒト、例えば齧歯類の抗体と類似した親和性及び特性を有している場合、非ヒト、例えば齧歯類の抗体からヒト抗体を得るために使用することもできる。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法により、上記のファージディスプレイ技術により得られた非ヒト抗体断片の重鎖可変領域遺伝子又は軽鎖可変領域遺伝子の何れかをヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換し、非ヒト鎖／ヒト鎖ｓｃＦｖないしＦａｂキメラの集団を作成する。抗原を選択することにより、ヒト鎖が初めのファージディスプレイクローンにおいて一致した非ヒト鎖の除去により破壊された抗原結合部位を回復する、非ヒト鎖／ヒト鎖キメラｓｃＦｖないしＦａｂが単離される、つまり、エピトープがヒト鎖のパートナーの選択をつかさどる(インプリントする)。残りの非ヒト鎖を置換するためにこの工程を繰り返すと、ヒト抗体が得られる(１９９３年４月１日公開のＰＣＴ特許出願ＷＯ９３／０６２１３を参照)。伝統的なＣＤＲ移植による非ヒト抗体のヒト化と異なり、この技術により、非ヒト起源のＦＲ又はＣＤＲ残基を全く持たない完全なヒト抗体が得られる。
【０１５１】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒト抗体ないしヒト化抗体である。この場合、結合特異性の一つはＦＧＦＲ３に対するものであり、他方は任意の他の抗原に対するものである。例示的な二重特異性抗体は、ＦＧＦＲ３の２つの異なるエピトープに結合しうる。また、二重特異性抗体はＦＧＦＲ３を発現する細胞に細胞障害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はＦＧＦＲ３結合アーム及び細胞障害剤(例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は完全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
【０１５２】
二重特異性抗体を作製する方法は当該分野において既知である。二重特異性抗体の伝統的な組み換え産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの重鎖は異なる特異性を持っている(Millstein等, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が１９９３年５月１３日に公開の国際公報９３／０８８２９及びTraunecker等、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
【０１５３】
異なったより好適なアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、コンストラクトに使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、２又は３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０１５４】
このアプローチ法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公報９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【０１５５】
他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【０１５６】
二特異性抗体とは架橋抗体や「ヘテロ抱合抗体」を含む。例えば、ヘテロ抱合体の一方の抗体がアビジンと結合し、他方はビオチンと結合していても良い。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせること(米国特許第４６７６９８０号)及びＨＩＶ感染の治療(国際公報９１/００３６０、国際公報９２/００３７３及び欧州特許第０３０８９号)等の用途が提案されている。ヘテロ抱合抗体は適当な架橋方法によって生成できる。当技術分野においては、適切な架橋剤は周知であり、それらは複数の架橋法と共に米国特許第４６７６９８０号などに記されている。
【０１５７】
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は完全な抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【０１５８】
最近の進歩により大腸菌からＦａｂ'-ＳＨ断片を直接回収することが容易となっており、これにより化学的にカップリングされて二重特異性抗体にを形成する。Shalaby 等, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)は、完全なヒト化二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の産生について記述している。各々のＦａｂ'断片は大腸菌から別々に分泌されて、インビトロで化学的にカップリングされて、二重特異性抗体を形成する。したがって、形成された二重特異性抗体は、ＨＥＲ２を過剰発現する細胞及び正常ヒトT細胞に結合するだけでなく、ヒト胸部腫瘍の標的に対するヒト細胞毒性リンパ球の溶解活性を引き起こすことができた。
【０１５９】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産された。Kostelny等, J.Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させられた。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片製造方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等, J.Immunol. 147:60(1991)。
【０１６０】
多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び／又は異化)されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(ＩｇＭクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は３ないし８、好ましくは４の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖(好ましくは２つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖(類)は２又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖(類)はＶＤ１-(Ｘ１)ｎ-ＶＤ２-(Ｘ２)ｎ-Ｆｃを有し、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖の一つであり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は：ＶＨ-ＣＨ１-柔軟なリンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも２つ(好ましくは４つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約２〜約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはＣＬドメインを更に有する。
【０１６１】
抗体変異体
いくつかの実施態様では、ここに開示する抗体のアミノ酸配列の修飾を考える。例えば、抗体の結合親和性及び／又は生物学的特性を向上することができれば望ましい。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体の核酸に適切なヌクレオチド変化を導入して、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、抗体のアミノ酸配列内の残基の、例えば、欠失型、又は挿入或いは置換を含む。最終構成物が所望する特徴を有していれば、欠失、挿入又は置換をどのように組合せてもよい。アミノ酸変化は、配列ができるときに被検体の抗体アミノ酸配列に導入されうる。
【０１６２】
突然変異誘発に好ましい位置である抗体の特定の残基又は領域の同定に有益な方法は、Cunningham及びWellsによりScience, 244:1081-1085 (1989年)に開示されているように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的となる残基又は残基の組が同定され(例えば、arg、asp、his、lys、及びgluなどの荷電した残基)、中性の、又は負に荷電したアミノ酸(最も好ましくはアラニン又はポリアラニン)で置換され、アミノ酸の抗原との相互作用に影響を与える。次いで、置換に対する機能的感受性を示しているそれらアミノ酸位置を、置換の部位において、又は置換の部位のために、さらなる、又は他の変異体を導入することにより精製する。このように、アミノ酸配列変異体を導入する部位は予め決定されるが、突然変異自体の性質は予め決定する必要は無い。例えば、任意の部位における突然変異の機能を分析するために、標的コドン又は領域においてａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を実行し、発現した免疫グロブリンを所望の活性についてスクリーニングする。
【０１６３】
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００以上の残基を有するポリペプチドまでの長さに亘るアミノ−末端融合及び／又はカルボキシ−末端融合、ならびに、単一又は多重アミノ酸残基の配列内挿入を含む。端末挿入の例には、Ｎ−末端メチオニル残基を持つ抗体、又は細胞障害性ポリペプチドに融合した抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体の血清半減期を増加させるポリペプチド又は(例えばＡＤＥＰＴのための)酵素の抗体のＮ−末端又はＣ−末端への融合が含まれる。
【０１６４】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン(ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸)のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを意味するが、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた用いられる。
【０１６５】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列(Ｎ結合グリコシル化部位のもの)を含むように変化させることによって簡便に達成される。該変化は、元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(Ｏ-結合グリコシル化部位の場合)。
【０１６６】
抗体がＦｃ領域を含有する場合、それに接着する炭水化物を変更してもよい。例えば、抗体のＦｃ領域に接着するフコースを欠損する成熟炭水化物構造の抗体は、米国公開特許第２００３／０１５７１０８号(Presta, L.)に記載される。米国公開特許第２００４／００９３６２１号(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.)も参照のこと。抗体のＦｃ領域に接着した炭水化物内のＮ-アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)を二分する抗体は、国際公報第０３／０１１８７８号、Jean-Mairet 等、及び米国特許第６６０２６８４号、Umana 等に参照されている。抗体のＦｃ領域に接着するオリゴサッカライド内の少なくとも一のガラクトース残基を有する抗体は、国際公報第９７／３００８７号、Patel 等に報告される。また、抗体のＦｃ領域に接着する変更された炭水化物を有する抗体については、国際公報第９８／５８９６４号(Raju, S.)及び国際公報第９９／２２７６４号(Raju, S.)も参照のこと。また、修飾されたグリコシル化を有する抗原結合分子については、米国公開特許第２００５／０１２３５４６号(Umana 等)を参照。
【０１６７】
本明細書中の好適なグリコシル化変異形はＦｃ領域を含有し、Ｆｃ領域に接着される炭水化物構造はフコースを欠いている。このような変異形は改善されたＡＤＣＣ機能を有する。場合によって、Ｆｃ領域は、更にＡＤＣＣを改善する一つ以上のアミノ酸置換、例えばＦｃ領域の位置２９８、３３３及び／又は３３４の置換(Ｅｕ残基番号付け)を更に含む。「脱フコース化」又は「フコース欠失」抗体に関する文献の例には以下のものを含む：米国公開番号２００３／０１５７１０８；国際公報２０００／６１７３９；国際公報２００１／２９２４６；米国公開番号２００３／０１１５６１４；米国公開番号２００２／０１６４３２８；米国公開番号２００４／００９３６２１；米国公開番号２００４／０１３２１４０；米国公開番号２００４／０１１０７０４；米国公開番号２００４／０１１０２８２；米国公開番号２００４／０１０９８６５；国際公報２００３／０８５１１９；国際公報２００３／０８４５７０；国際公報２００５／０３５５８６；国際公報２００５／０３５７７８；；国際公報２００５／０５３７４２；Okazaki 等 J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)；及びYamane-Ohnuki 等 Biotech. Bioeng.87: 614 (2004)。脱フコース化抗体を産生する細胞株の例として、タンパク質フコース化欠失Ｌｅｃ１３ ＣＨＯ細胞 (Ripka 等 Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国公開番号２００３／０１５７１０８, Presta, L；及び国際公報２００４／０５６３１２, Adams 等, 特に実施例１１)、及びノックアウト細胞株、例としてα-１,６-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８,-ノックアウトＣＨＯ細胞 (Yamane-Ohnuki 等 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004))などがある。
【０１６８】
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子において少なくとも一つのアミノ酸(少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４以上)残基に異なる残基が挿入されている。置換突然変異について最も関心ある部位は高度可変領域を含むが、ＦＲ交互変化も考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表１に示す。これらの置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表１に「例示的置換」と名前を付けた又はアミノ酸の分類を参照して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入して、生成物をスクリーニングしてよい。
【０１６９】
0005757534.tif 000004
【０１７０】
抗体の生物学的性質における実質的な修飾は、(ａ)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、(ｂ)標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は(ｃ)側鎖の嵩を維持するそれらの効果において実質的に異なる置換を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる：
(１)疎水性：ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile；
(２)中性の親水性：cys、ser、thr、asn、gln；
(３)酸性：asp、glu；
(４)塩基性：his、lys、arg；
(５)鎖配向に影響する残基：gly、pro； 及び
(６)芳香族：trp、tyr、phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
【０１７１】
ある型の置換変異体は、親抗体(例えば、ヒト化又はヒト抗体)の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的に、さらなる発展のために選択され、得られた変異体は、それらが作製された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を作製する簡便な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性突然変異を含む。簡潔に言えば、幾つかの高頻度可変領域部位(例えば６−７部位)を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された多価抗体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物としてディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体と抗原の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択する。
【０１７２】
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、限定するものではないが、天然源からの単離(天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合)又は初期に調製された抗体の変異体又は非変異体のオリゴヌクレオチド媒介(又は部位特異的)突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製を含む。
【０１７３】
本発明の免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域内に一以上のアミノ酸修飾を導入してＦｃ領域変異型を生成することが望ましい。Ｆｃ領域変異体は、ヒンジシステイン修飾を含む、一以上のアミノ酸位置でのアミノ酸修飾(例えば、置換)を有するヒトＦｃ領域配列(例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域)を含みうる。
当分野での記載や教示に従って、ある実施態様では、本発明の方法を用いた抗体が野生型の対応抗体と比較して例えばＦｃ領域内に一以上の変異を有することを考慮する。にもかかわらず、この抗体はその野生型対応物と比較して治療的有用性を示す実質的に同じ特徴を維持している。例えば、国際公開９９／５１６４２などに記載のようにＣ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)を変更する(すなわち改良又は減少する)結果となるＦｃ領域内に特定の変異を生じさせることが考えられる。また、Ｆｃ領域変異型の他の例に関するDuncan & Winter Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第５６４８２６０号；米国特許第5,624,821号；及び国際公開公報94/29351を参照。国際公開公報００／４２０７２(Presta)及び国際公開公報２００４／０５６３１２(Lowman)は、ＦｃＲへの結合が改善したか、減退した抗体変異体を開示している。これらの特許文献の内容は出典明記によって、本明細書に特別に組み込まれる。また、Shields 等 J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照のこと。半減期が増加して、胎児への母性ＩｇＧの移送を担う(Guyer 等, J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim 等, J. Immunol. 24:249 (1994))新生児Ｆｃレセプター(ＦｃＲｎ)への結合が改善している抗体は、米国特許公開２００５／００１４９３４Ａ１ (Hinton 等)に開示されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を向上させる一又は複数の置換を有するＦｃ領域を含んでなる。Ｆｃ領域アミノ酸配列が変更されてＣ１ｑ結合能力が増加したか減少したポリペプチド変異体は、米国特許第６１９４５５１号Ｂ１、国際公開公報９９／５１６４２に開示される。これらの特許文献の内容は出典明記によって、本明細書に特別に組み込まれる。また、Idusogie 等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)を参照のこと。
【０１７４】
抗体誘導体
本発明の抗体は当該分野において知られ直ぐに利用できる更なる非タンパク質性部分を含むように更に修飾することができる。好ましくは、抗体の誘導体化に適した部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-１,３-ジオキソラン、ポリ-１,３,６-トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーかランダムコポリマー)、及びデキストラン又はポリ(ｎ-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中におけるその安定性のために製造の際に有利であろう。ポリマーは任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じでも異なった分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、限定されるものではないが、その抗体誘導体が定まった条件下での治療に使用されるかどうか、改善される抗体の特定の性質又は機能を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
【０１７５】
所望の特性を有する抗体のスクリーニング
本発明の抗体は当該分野で知られている様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び生物学的機能について特徴付けることができる(そのいくつかはここで開示される)。いくつかの実施態様では、抗体は、ＦＧＦ(例えばＦＧＦ１及び／又はＦＧＦ９)結合の低減又はブロック、ＦＧＦＲ３活性化の低減又はブロック、ＦＧＦＲ３下流分子のシグナル伝達の低減又はブロック、リガンド(例えばＦＧＦ１、ＦＧＦ９)へのＦＧＦＲ３結合の破壊又はブロック、ＦＧＦＲ３二量体化の低減又はブロック、単量体ＦＧＦＲ３の形成の促進、単量体ＦＧＦＲ３への結合、及び／又は腫瘍、細胞増殖性疾患又は癌の治療及び／又は予防；及び／又はＦＧＦＲ３の発現及び／又は活性(例えばＦＧＦＲ３の発現及び／又は活性の増加)と関連する疾患の治療又は予防の何れか一又は複数に特徴がある。いくつかの実施態様では、抗体は、ＦＧＦＲ３活性化の増加、ＦＧＦＲ３下流分子のシグナル伝達の増加、アポトーシスの活性、ＦＧＦＲ３下方制御、およびエフェクター機能(例えばＡＤＣＣ活性)について選別される。
【０１７６】
精製された抗体は、限定されるものではないが、Ｎ末端シークエンシング、アミノ酸解析、非変性サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)、質量分析、イオン交換クロマトグラフィー及びパパイン消化を含む一連のアッセイによって更に特徴付けることができる。
【０１７７】
本発明の特定の実施態様では、ここで生産された抗体はその生物学的活性について分析される。ある実施態様では、本発明の抗体はその抗原結合活性について試験される。当該分野で知られ、ここで使用することができる抗原結合アッセイには、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ(酵素結合免疫吸着検定法)、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びプロテインＡイムノアッセイのような技術を用いた任意の直接的又は競合的結合アッセイが制限なく含まれる。抗原結合及び他のアッセイは以下の実施例の項で解説する。
【０１７８】
細胞増殖を阻害する抗ＦＧＦＲ３抗体が望ましい場合、候補抗体は細胞増殖の阻害を測定する、インビトロおよび／またはインビボアッセイにおいて試験されてよい。アポトーシスを促進するかまたは促進しない抗ＦＧＦＲ３抗体が望ましい場合、候補抗体はアポトーシスを測定するアッセイにおいて試験されてよい。癌細胞の成長および／または増殖を調べるため、又は、癌細胞のアポトーシスを決定するための方法は当分野で周知であり、いくつかをここに記載し例示する。細胞成長および／または増殖ないしはアポトーシスを決定するための例示的な方法には、例えば、ＢｒｄＵ取込みアッセイ、ＭＴＴ、[３Ｈ]-チミジン取込み(例えばＴｏｐＣｏｕｎｔアッセイ(PerkinElmer))、細胞生存率アッセイ(例えばＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-Ｇｌｏ(Promega))、ＤＮＡ断片化アッセイ、カスパーゼ活性化アッセイ、トリパンブルー除去、クロマチン形態アッセイなどが含まれる。
【０１７９】
一実施態様では、本発明は、エフェクター機能を備えている抗体を意図する。ある実施態様では、抗体のＦｃ活性が測定される。インビボ及び／又はインビトロ細胞障害アッセイを行って、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃレセプター(ＦｃＲ)結合アッセイを行って、抗体がＦｃγＲ結合を欠損している(すなわちＡＤＣＣ活性をほとんど欠損している)が、ＦｃＲｎ結合能は維持していることを確認することができる。ＡＤＣＣに関与している第一細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲIIIのみを発現しており、その一方で単核細胞はＦｃγＲI、ＦｃγＲII及びＦｃγＲIIIを発現している。造血系細胞でのＦｃＲ発現については、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)の464頁の表3に要約されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの例は、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されている。ＡＤＣＣ活性を検出するためのアッセイも本明細書中に例示する。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー(ＮＫ)細胞が含まれる。あるいは、又は加えて、対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes 等. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されているような動物モデル内でインビボに評価することができる。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを行って、抗体がＣ１ｑに結合できない、つまりＣＤＣ活性を欠損していることを確認してもよい。補体活性化を評価するために、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載のように、ＣＤＣアッセイを行ってもよい。また、ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期測定を、当分野で公知の方法を用いて行うことができる。その例を実施例の項目に記載する。
【０１８０】
単量体ＦＧＦＲ３を結合する抗ＦＧＦＲ３抗体が望ましい場合、候補抗体は、単量体ＦＧＦＲ３への結合と単量体ＦＧＦＲ３の形成の促進を測定するアッセイ(例えばインビトロアッセイ)において試験されてよい。このようなアッセイは当分野で知られており、いくつかのアッセイはここに記載し例示される。
ＦＧＦＲ３二量体化を阻害する抗ＦＧＦＲ３抗体が望ましい場合、例えば本明細書中に記述され例証されるように、候補抗体は二量体化アッセイにおいて試験されてよい。
いくつかの実施態様では、候補抗体のＦＧＦＲ３アゴニスト機能が決定される。ＦＧＦＲ３抗体のアゴニスト機能又は活性を評価する方法は当分野で知られており、そのいくつかもここに記載され例証される。
いくつかの実施態様では、ＦＧＦＲ３レセプター下方制御を促進するＦＧＦＲ３抗体の能力は、例えばここに記載され例証される方法を用いて決定される。一実施態様では、ＦＧＦＲ３抗体は、適切な試験細胞、例えば膀胱癌細胞株(例えばＲＴ１１２)とともにインキュベートされ、適切な期間の後に、細胞溶解物が回収され、総ＦＧＦＲ３レベルが調べられる。また、候補ＦＧＦＲ３抗体とインキュベートした後に、ＦＡＣＳ分析を用いて表面ＦＧＦＲ３レセプターレベルを調べてよい。
【０１８１】
ベクター、宿主細胞及び組換え方法
本発明の抗体の組み換え生成のために、コードする核酸を単離して、更なるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製ベクターに挿入する。抗体をコードするＤＮＡは従来の手順で簡単に単離し、配列決定される(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて)。多くのベクターが利用可能である。用いる宿主細胞にある程度依存してベクターを選択する。一般的に、好適な宿主細胞は原核生物又は真核生物(一般的に哺乳動物)由来の細胞である。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ定常領域を含め、任意のアイソタイプの定常領域がこの目的のために使われてもよく、このような定常領域はヒト又は動物種の何れかから得られうることは理解されるであろう。
【０１８２】
a. 原核生物の宿主細胞を用いた抗体生成
i. ベクターの構築
本発明の抗体のポリペプチド成分をコードしているポリヌクレオチド配列は標準的な組換え技術を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列はハイブリドーマ細胞のような抗体産生細胞から単離し配列決定することができる。あるいは、ポリヌクレオチドはヌクレオチド合成機又はＰＣＲ法を使用して合成することができる。ひとたび得られると、ポリペプチドをコードしている配列は原核生物宿主中で異種ポリヌクレオチドを複製し、発現することが可能な組換えベクター中に挿入される。当該分野において入手でき知られている多くのベクターを本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主として、ベクターに挿入される核酸のサイズとベクターで形質転換される特定の宿主に依存する。各ベクターは、機能(異種性ポリヌクレオチドの増幅又は発現ないしその両方)及び属する特定の宿主細胞への適合性に応じて、様々な成分を含む。一般的に、限定するものではないが、ベクター成分には複製起源、選択マーカー遺伝子、プロモータ、リボゾーム結合部位(ＲＢＳ)、シグナル配列、異種性核酸挿入及び転写終末配列が含まれる。
【０１８３】
一般には、レプリコン及び宿主細胞と適合性のある種に由来するコントロール配列を含んでいるプラスミドベクターが、宿主細胞と関連して使用される。そのベクターは、通常、複製開始点並びに形質転換細胞において表現型の選択を提供可能なマーキング配列を有する。例えば、一般的に大腸菌は、大腸菌種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換する。ｐＢＲ３２２はアンピシリン(Ａｍｐ)及びテトラサイクリン(Ｔｅｔ)耐性のコード遺伝子を含んでいるため、形質転換細胞を容易に同定することができる。ｐＢＲ３２２、その誘導体又は他の微生物プラスミド又はバクテリオファージも外来性タンパク質を発現する微生物によって使用可能なプロモータを含むか、含むように変更される。特定の抗体の発現に使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例はCarter等の米国特許第５６４８２３７号に詳細に記載されている。
【０１８４】
また、レプリコン及び宿主微生物と適合性のあるコントロール配列を含んでいるファージベクターを、これらの宿主との関連でトランスフォーミングベクターとして使用することができる。例えば、λＧＥＭ.ＴＭ.-１１のようなバクテリオファージを、大腸菌ＬＥ３９２のような感受性の宿主細胞を形質転換するために使用できる組換えベクターを作製する際に利用することができる。
【０１８５】
本発明の発現ベクターは各ポリペプチド成分をコードする２又はそれ以上のプロモータ−シストロン(翻訳単位)対を含みうる。プロモーターはその発現を調節するシストロンの上流(５')に位置している非翻訳配列である。原核生物のプロモーターは典型的には誘導性と構成的との二つのクラスのものがある。誘導性プロモーターは、例えば栄養分の有無又は温度の変化のような、培養条件の変化に応答してその調節下でシストロンの転写レベルを増大させるように誘導するプロモーターである。
【０１８６】
様々な潜在的宿主細胞によって認識されるプロモータが非常にたくさん公知となっている。選択したプロモーターを、制限酵素消化によって供給源ＤＮＡからプロモータを除去し、本発明のベクター内に単離したプロモータを挿入することによって軽鎖又は重鎖をコードするシストロンＤＮＡに作用可能に連結することができる。天然プロモーター配列と多くの異種プロモーターの双方を、標的遺伝子の増幅及び／又は発現を生じさせるために使用することができる。ある実施態様では、天然の標的ポリペプチドプロモーターと比較して、一般的に発現する標的遺伝子をより多く転写させ、効率をよくするので、異種プロモーターが有用である。
【０１８７】
原核生物宿主での使用に好適なプロモーターには、ＰｈｏＡプロモーター、βガラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃ又はｔｒｃプロモーターが含まれる。しかし、細菌中で機能性である他のプロモーター(例えば他の既知の細菌又はファージプロモーター)も好適である。そのヌクレオチド配列は発表されており、よって当業者は、任意の必要とされる制限部位を供給するリンカー又はアダプターを使用して標的軽鎖及び重鎖をコードするシストロンにそれらを作用可能に結合させることができる(Siebenlist等 (1980) Cell 20:269)。
【０１８８】
本発明の一態様では、組換えベクター内の各シストロンは、膜を貫通して発現されるポリペプチドの転写を誘導する分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列はベクターの成分でありうるか、ベクター中に挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部でありうる。この発明の目的のために選択されるシグナル配列は宿主細胞によって認識されプロセシングされる(つまりシグナルペプチダーゼにより切断される)ものでなければならない。異種ポリペプチドに天然のシグナル配列を認識せずプロセシングする原核生物宿主細胞に対しては、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンＩＩ(ＳＴＩＩ)リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ及びＭＢＰからなる群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。一実施態様では、発現系の双方のシストロンに使用されるシグナル配列はＳＴＩＩシグナル配列又はその変異体である。
【０１８９】
他の態様では、本発明による免疫グロブリンは宿主細胞の細胞質内で産生されるので、各シストロン内に分泌シグナル配列の存在は必要でない。この点において、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖は発現され、折り畳まれ、集合して細胞質内に機能的免疫グロブリンを形成する。ジスルフィド結合形成に好適な細胞質条件を示し、発現したタンパク質サブユニットを好適に折り畳み、集合することができる宿主系が存在する(例として大腸菌ｔｒｘＢ−系)。Proba及びPluckthun Gene, 159:203 (1995)。
【０１９０】
本発明の抗体を発現するのに適した原核生物宿主細胞には、古細菌及び真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物が含まれる。有用な細菌の例には、エシェリキア属(例えば大腸菌)、バシラス属(例えば枯草菌)、エンテロバクター属、シュードモナス種(例えば緑膿菌)、ネズミチフス菌、霊菌(Serratia marcescans)、クレブシエラ属、プロテウス属、赤痢菌、根粒菌、ビトレオシラ(Vitreoscilla)又はパラコッカス(Paracoccus)が含まれる。一実施態様では、グラム陰性菌が使用される。一実施態様では、大腸菌細胞が本発明の宿主として使用される。大腸菌株の例として、遺伝子型W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR を有する３３Ｄ３株(米国特許第5,639,635号)を含むW3110株 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), 1190-1219頁；ATCC寄託番号27,325)及びその誘導体が含まれる。また、大腸菌294 (ATCC 31,446), 大腸菌B, 大腸菌λ 1776 (ATCC 31,537)及び大腸菌RV308(ATCC 31,608) など、他の株及びその誘導体も好適である。この例は限定的なものでなく例示的なものである。定義した遺伝子型を有する上記の何れかの細菌の誘導体の構築方法は当業者に公知であり、例として, Bass等, Proteins, 8:309-314 (1990)に記載されている。一般的に、細菌細胞中でのレプリコンの複製能を考慮して適した細菌を選択することが必要である。ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、又はｐＫＮ４１０のようなよく知られたプラスミドを使用してレプリコンを供給する場合、例えば、大腸菌、セラシア属、又はサルモネラ種を宿主として好適に用いることができる。典型的に、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌しなければならず、望ましくは更なるプロテアーゼインヒビターを細胞培養中に導入することができる。
【０１９１】
ii. 抗体産生
上述した発現ベクターで宿主細胞を形質転換又は形質移入し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように修飾された通常の栄養培地中で培養する。
形質転換とは、ＤＮＡを原核生物宿主中に導入し、そのＤＮＡを染色体外要素として、又は染色体組込みによって複製可能にすることを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換はそのような細胞に適した標準的技術を使用してなされる。塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は実質的な細胞壁障害を含む細菌細胞のために一般に使用される。形質転換のための他の方法はポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。さらに別の方法はエレクトロポレーションである。
【０１９２】
本発明のポリペプチドを生産するために使用される原核生物細胞は当該分野で知られ、選択された宿主細胞の培養に適した培地中で増殖させられる。好適な培地の例には、ルリア培地(ＬＢ)プラス必須栄養分サプリメントが含まれる。ある実施態様では、培地は発現ベクターを含む原核生物細胞の増殖を選択的に可能にするために、発現ベクターの構成に基づいて選択される選択剤をまた含む。例えば、アンピシリンがアンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖用培地に加えられる。
【０１９３】
炭素、窒素及び無機リン酸源の他に任意の必要なサプリメントを、単独で、又は複合窒素源のような他のサプリメント又は培地との混合物として導入される適切な濃度で含有させられうる。場合によっては、培養培地はグルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリトリトール及びジチオトレイトールからなる群から選択される一又は複数の還元剤を含みうる。
【０１９４】
原核生物宿主細胞は適切な温度で培養される。例えば、大腸菌の増殖に対しては、好適な温度は約２０℃から約３９℃、より好ましくは約２５℃から約３７℃の範囲、更により好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは、主として宿主生物に応じて、約５から約９の範囲の任意のｐＨでありうる。大腸菌に対しては、ｐＨは好ましくは約６．８から約７．４、より好ましくは約７．０である。
【０１９５】
本発明の発現ベクターに誘導性プロモータが用いられる場合、プロモータの活性に適する条件下でタンパク質発現を誘導する。本発明の一態様では、ポリペプチドの転写制御のためにＰｈｏＡプロモータが用いられる。したがって、形質転換した宿主細胞を誘導のためにリン酸限定培地で培養する。好ましくは、リン酸限定培地はＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である(例として、Simmons等, J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147を参照)。様々な他の誘導因子は用いるベクターコンストラクトに応じて当業者に知りうるように用いてよい。
【０１９６】
一実施態様では、発現された本発明のポリペプチドは宿主細胞の細胞膜周辺中に分泌され、そこから回収される。タンパク質の回収は、一般的には浸透圧ショック、超音波処理又は溶解のような手段によって典型的には微生物を破壊することを含む。ひとたび細胞が破壊されると、細胞片又は全細胞を遠心分離又は濾過によって除去することができる。タンパク質は、例えばアフィニティー樹脂クロマトグラフィーによって更に精製することができる。あるいは、タンパク質は培養培地に輸送しそこで分離することができる。細胞を培養物から除去することができ、培養上清は濾過され、生成したタンパク質の更なる精製のために濃縮される。発現されたポリペプチドを更に単離し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(ＰＡＧＥ)及びウェスタンブロットアッセイ法のような一般的に知られている方法を使用して同定することができる。
【０１９７】
本発明の一側面では、抗体産生は発酵法によって多量に受け継がれる。組換えタンパク質の生産には様々な大規模流加発酵法を利用することができる。大規模発酵は少なくとも１０００リットルの容量、好ましくは約１０００から１０００００リットルの容量である。これらの発酵槽は、酸素と栄養分、特にグルコース(好ましい炭素／エネルギー源)を分散させる撹拌翼を使用する。小規模発酵とは一般におよそ１００リットル以下の容積で、約１リットルから約１００リットルの範囲でありうる発酵槽での発酵を意味する。
【０１９８】
発酵法では、タンパク質の発現の誘導は、典型的には、細胞が適切な条件下にて、初期定常期に細胞があるステージで、所望の密度、例えば約１８０−２２０のＯＤ５５０まで増殖したところで開始される。当該分野で知られ上述されているように、用いられるベクターコンストラクトに応じて、様々なインデューサーを用いることができる。細胞を誘導前の短い時間の間、増殖させてもよい。細胞は通常約１２−５０時間の間、誘導されるが、更に長い又は短い誘導時間としてもよい。
【０１９９】
本発明のポリペプチドの生産収量と品質を改善するために、様々な発酵条件を変更することができる。例えば、分泌される抗体ポリペプチドの正しい組み立てとフォールディングを改善するために、例えばＤｓｂタンパク質(ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ及び／又はＤｓｂＧ)又はＦｋｐＡ(シャペロン活性を持つペプチジルプロピルシス、トランス-イソメラーゼ)のようなシャペロンタンパク質を過剰発現する更なるベクターを用いて宿主原核細胞を同時形質転換させることができる。シャペロンタンパク質は細菌宿主細胞中で生産される異種性タンパク質の適切な折り畳みと溶解性を容易にすることが実証されている。Chen等 (1999) J Bio Chem 274:19601-19605；Georgiou等, 米国特許第６０８３７１５号；Georgiou等, 米国特許第６０２７８８８号；Bothmann及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105；Ramm及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113；Arie等 (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210。
【０２００】
発現された異種タンパク質(特にタンパク分解を受けやすいもの)のタンパク質分解を最小にするために、タンパク質分解酵素を欠くある種の宿主株を本発明に用いることができる。例えば、原核生物宿主細胞株を改変して、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ及びその組合せのような既知の細菌プロテアーゼをコードしている遺伝子に遺伝子突然変異を生じさせることができる。幾つかの大腸菌プロテアーゼ欠損株が利用でき、例えば、上掲のJoly等 (1998)；Georgiou等, 米国特許第５２６４３６５号；Georgiou等, 米国特許第５５０８１９２号；Hara等 (1996) Microbial Drug Resistance 2:63-72に記載されている。
ある実施態様では、タンパク質溶解性酵素を欠損した、一以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換した大腸菌株を本発明の発現系の宿主細胞として用いる。
【０２０１】
iii. 抗体精製
当分野で公知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の方法は好適な精製手順の例である：免疫親和性又はイオン交換カラムによる分画化、エタノール沈降法、逆相ＨＰＬＣ、シリカ又はＤＥＡＥなどの陽性交換樹脂によるクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈降法及び、例えばSephadex G-75を用いたゲル濾過法。
【０２０２】
一態様では、固形層に固定したプロテインＡを本発明の完全長抗体産物の免疫親和性精製法に用いる。プロテインＡは抗体のＦｃ領域に高い親和性で結合する黄色ブドウ球菌から単離した４１ｋＤの細胞壁タンパク質である。Lindmark等 (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13。プロテインＡを固定した固形層は、ガラス又はシリカ表面、より好ましくは孔を調節したガラスカラム又はケイ酸カラムを含むカラムが好ましい。ある方法では、カラムは非特異的な混入物の接着を防ぐためにグリセロールなどの試薬でコートされている。
【０２０３】
精製の初めの工程では、上記に記載のように細胞培養物からの調製物をプロテインＡ固定固形層に適応し、プロテインＡに対象とする抗体を特異的に結合させる。ついで、固形層を洗浄して、固形層に非特異的に結合した混入物を除去する。最後に、対象とする抗体を溶出により固形層から除去する。
【０２０４】
b. 真核生物の宿主細胞を用いた抗体の生成
一般的に、ベクターは、限定するものではないが、以下の一以上を含む：シグナル配列、複製起点、一以上のマーカ遺伝子、エンハンサー因子、プロモータ及び転写終末因子。
【０２０５】
(i) シグナル配列成分
真核生物の宿主細胞に用いるベクターは、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいは対象とするポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドを含んでいてもよい。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。
このような前駆体領域のＤＮＡは、多価抗体をコードするＤＮＡに読み取り枠を一致させて結合される。
【０２０６】
(ii) 複製開始点
一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である。例えば、ＳＶ４０開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる。
【０２０７】
(iii) 選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(ａ)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(ｂ)必要があれば栄養要求性欠陥を補い、又は(ｃ)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
【０２０８】
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、抗体核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することを可能にするもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Ｍｔｘ)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞である(例として、ATCC CRL-9096)。
あるいは、抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照のこと。
【０２０９】
(iv) プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物体によって認識され抗体ポリペプチド核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。真核生物のプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に見出されるＡＴリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
【０２１０】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗体ポリペプチドの転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(ＳＶ４０)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を更に含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現させる系が、米国特許第4419446号に開示されている。この系の変形例は米国特許第4601978号に開示されている。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
【０２１１】
(v) エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物によるこの発明の抗体ポリペプチドをコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体ポリペプチドコード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされうるが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【０２１２】
(vi) 転写終末成分
また、真核生物宿主細胞に用いられる発現ベクターは、典型的には、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、抗体をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
【０２１３】
(vii) 宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、脊椎動物の宿主細胞を含む本明細書中に記載の高等真核生物細胞を含む。培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１);ヒト胚腎臓株(２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977))；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))；マウスのセルトリ細胞(ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))；サルの腎細胞 (ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０); アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞 (Ｗ１３８, ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞 (ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞;ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
【０２１４】
(viii) 宿主細胞の培養
本発明の抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ),(シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、GENTAMYCINTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０２１５】
(ix) 抗体の精製
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内で生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＰｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
【０２１６】
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる(Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986))。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Bakerbond ABXＴＭ樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー(ポリアスパラギン酸カラム)、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
予備的精製工程に続いて、目的の抗体及び混入物を含む混合液をｐＨ約２．５−４．５、好ましくは低塩濃度(例として、約０−０．２５Ｍ塩)の溶出緩衝液を用いて低ｐＨ疎水性作用クロマトグラフィを行う。
【０２１７】
イムノコンジュゲート
また、本発明は、化学療法剤、薬剤、成長阻害剤、毒素(例えば、細菌、糸状菌、植物又は動物由来の酵素活性性毒素、又はその断片)、又は放射性同位体(すなわち放射性コンジュゲート)などの細胞毒性剤にコンジュゲートした本明細書中に記載の何れかの抗ＦＧＦＲ３抗体を含む、イムノコンジュゲート(「抗体−薬剤コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」と交換可能に称される)を提供する。
【０２１８】
細胞障害性又は細胞分裂停止性の薬剤、すなわち癌治療における腫瘍細胞を殺す又は阻害するための薬剤の局部運搬に抗体−薬剤コンジュゲートを用いると(Syrigos及びEpenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172；米国特許第4,975,278号)、腫瘍への薬剤成分の標的とする運搬とそこでの細胞内集積が可能となるものであり、この非コンジュゲート薬物作用剤の全身性投与により正常細胞並びに除去しようとする腫瘍細胞への毒性が容認できないレベルとなりうる(Baldwin等, (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,」 in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pincheraら. (ed.s), pp. 475-506)。これによって、最小限の毒性で最大限の効果を求める。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体はこの方策に有用であるとして報告されている(Rowland等, (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87)。この方法に用いる薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキサート及びビンデジンが含まれる(Rowland等, (1986)、上掲)。抗体−毒素コンジュゲートに用いる毒素には、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、ゲルダナマイシン(Mandlerら(2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581；Mandlerら(2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028；Mandlerら(2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、メイタンシノイド(EP 1391213；Liu等, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)、及びカリケアマイシン(Lode等, (1998) Cancer Res. 58:2928；Hinman等, (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)などのリシン、小分子毒素などの植物毒が含まれる。該毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合又はトポイソメラーゼ阻害を含む機能によりその細胞障害性及び細胞分裂停止性の効果に影響しうる。ある種の細胞障害性剤は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートした場合に、不活性又は活性が低減する傾向がある。
【０２１９】
ゼバリン(ZEVALIN)(登録商標)(イブリツモマブチウキセタン(ibritumomab tiuxetan), Biogen/Idec)は正常及び悪性のＢリンパ球の細胞表面上にみられるＣＤ２０抗原に対するマウスＩｇＧ１κモノクローナル抗体と111In又は90Y放射性同位体とがチオウレアリンカーキレート剤にて結合した抗体−放射性同位体コンジュゲートである(Wiseman等, (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77；Wiseman等, (2002) Blood 99(12):4336-42；Witzig等, (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63；Witzig等, (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69)。ゼバリンはＢ細胞非ホジキン性リンパ球(ＮＨＬ)に対して活性を有するが、投与によってほとんどの患者に重症で長期の血球減少を引き起こす。カリケアマイシンに連結したｈｕＣＤ３３抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるマイロターグ(MYLOTARG)(登録商標)(ゲムツズマブオゾガミシン(gemtuzumab ozogamicin), Wyeth Pharmaceuticals)は、急性骨髄性白血病の治療用注射剤として2000年に認可された(Drugs of the Future (2000) 25(7):686；米国特許第4970198号；同第5079233号；同第5585089号；同第5606040号；同第5693762号；同第5739116号；同第5767285号；同第5773001号)。ジスルフィドリンカーＳＰＰを介してメイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結しているｈｕＣ２４２抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるカンツズマブメルタンシン(Cantuzumab mertansine)(Immunogen, Inc.)は、ＣａｎＡｇを発現する癌、例として大腸、膵臓、胃などの治療用に第ＩＩ相試験へと進んでいる。メイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結している抗前立腺特異的膜抗原(ＰＳＭＡ)モノクローナル抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるＭＬＮ−２７０４(Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.)は、前立腺癌の潜在的治療の開発段階にある。アウリスタチン(auristatin)ペプチド、アウリスタチンＥ(ＡＥ)及びモノメチルアウリスタチン(ＭＭＡＥ)、ドラスタチン(dolastatin)の合成類似体は、キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６(癌細胞上のルイスＹに特異的)及びｃＡＣ１０(血液系悪性腫瘍上のＣＤ３０に特異的)(Doronina等, (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784)にコンジュゲートしており、治療的開発段階にある。
【０２２０】
免疫複合体(イムノコンジュゲート)の生成に有用な化学治療薬を本明細書中(例えば、上記)に記載した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP-S)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。例として1993年10月28日に公開の国際公開公報93/21232を参照のこと。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。抗体及び細胞障害性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートＨＣＬ等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物(ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(トリエン２，６-ジイソシアネート等)、及びビス-活性フッ素化合物(１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等)を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。国際公開９４／１１０２６参照。
抗体のコンジュゲートと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウロスタチン、トリコセン(trichothene)及びＣＣ１０６５、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体が、ここで考察される。
【０２２１】
i. メイタンシン及びメイタンシノイド
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは一又は複数のメイタンシノイド分子と結合している本発明の抗体(完全長又は断片)を含んでなる。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第4,137,230号；同4,248,870号；同4,256,746号；同4,260,608号；同4,265,814号；同4,294,757号；同4,307,016号；同4,308,268号；同4,308,269号；同4,309,428号；同4,313,946号；同4,315,929号；同4,317,821号；同4,322,348号；同4,331,598号；同4,361,650号；同4,364,866号；同4,424,219号；同4,450,254号；同4,362,663号；及び同4,371,533号に開示されている。
メイタンシノイド薬剤成分は、(i) 発酵又は化学修飾、発酵産物の誘導体化によって調製するために相対的に利用可能である(ii) 抗体に対する非ジスルフィドリンカーによる共役に好適な官能基による誘導体化に従う、(iii) 血漿中で安定、そして(iv) 様々な腫瘍細胞株に対して有効であるため、抗体薬剤コンジュゲートの魅力的な薬剤成分である。
【０２２２】
メイタンシノイドを含有するイムノコンジュゲート、その作製方法及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第５２０８０２０号、同５４１６０６４号、欧州特許第０４２５２３５ Ｂ１号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有するイムノコンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞障害性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ-２／ｎｅｕオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ.１に結合しているイムノコンジュゲートが記載されている。ＴＡ.１-メイタンシノイドコンジュゲートの細胞障害性はヒト乳癌株化細胞ＳＫ-ＢＲ-３におけるインビトロで試験され、細胞当たり３×１０５ＨＥＲ-２表面抗原が発現した。薬剤コンジュゲートにより、遊離のメイタンシノイド剤に類似した細胞障害度が達成され、該細胞障害度は、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることにより増加する。Ａ７-メイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいては低い全身性細胞障害性を示した。
【０２２３】
抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子に抗体を化学的に結合させることにより調製される。例えば、米国特許第５２０８０２０号（この開示内容は出典明記により特別に組み込まれる）を参照。１分子の毒素／抗体は、裸抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３−４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５２０８０２０号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
【０２２４】
例えば、米国特許第５２０８０２０号又は欧州特許第０４２５２３５ Ｂ１号、Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)、及び２００４年１０月８日に出願の米国特許出願番号１０／９６０６０２(これらの開示内容は出典明記により特別に組み込まれる)に開示されているもの等を含め、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。リンカー成分ＳＭＣＣを含んでなる抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、２００４年１０月８日に出願の米国特許出願番号１０／９６０６０２に開示されるように調製されうる。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。更なる結合基を本願明細書中に記載し、例示する。
【０２２５】
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合により提供されるＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)及びＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737[1978])が含まれる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。好ましい実施形態において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ-３位で形成される。
【０２２６】
ii. アウリスタチン類及びドラスタチン類
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは、ドラスタチン又はドロスタチンペプチジル類似体及び誘導体、アウリスタチン(auristatin) (米国特許第5635483号；同第5780588号)にコンジュゲートした本発明の抗体を含んでなる。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解及び核と細胞の分割を妨げ(Woyke 等 (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584)、抗癌活性(米国特許第5663149号)及び抗真菌性活性(Pettit 等 (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)を有することが示されている。ドラスタチン又はアウリスタチン薬剤成分は、ペプチジル薬剤分子のＮ(アミノ)末端又はＣ(カルボキシル)末端により抗体に接着しうる(国際公開公報02/088172)。
例示的なアウリスタチンの実施態様は、Ｎ末端連結モノメチルアウリスタチン薬剤成分ＤＥ及びＤＦを含み、２００４年１１月５日に出願の米国継続特許番号１０／９８３３４０、"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"に開示される。この開示内容は出典明記によってその全体が特別に組み込まれる。
【０２２７】
一般的に、ペプチドベースの薬剤成分は、２以上のアミノ酸及び／又はペプチド断片間でペプチド結合を形成することによって調製されうる。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野において周知の液相合成方法に従って調製することができる(E. Schroder and K. Lubke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Pressを参照)。アウリスタチン／ドラスタチン薬剤成分は、米国特許第5635483号；同第5780588号；Pettit 等 (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 5463-5465；Pettit 等 (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277；Pettit, G.R., 等 Synthesis, 1996, 719-725；及びPettit 等 (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863の方法に従って調製されうる。また、Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7): 778-784; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、２００４年１１月５日に出願の米国継続特許出願１０／９８３３４０も参照のこと。これらは出典明記によってその全体が本願明細書中に組み込まれる(例えば、リンカー及びモノメチルバリン化合物、例えばＭＭＡＥ及びリンカーにコンジュゲートしたＭＭＡＦの調整方法を開示している)。
【０２２８】
iii. カリケアマイシン
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した本発明の抗体を含んでなる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第5712374号、同5714586号、同5739116号、同5767285号、同5770701号、同5770710号、同5773001号、同5877296号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
【０２２９】
iv. 他の細胞障害剤
本発明の抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５-フルオロウラシル、米国特許第5053394号、同5770710号に記載されており、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第5877296号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(PAPI、PAPII及びPAP-S)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ)との間に形成されるイムノコンジュゲートをさらに考察する。
【０２３０】
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗体を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートが検出に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、mriとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
【０２３１】
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第94/11026号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号)。
本発明の化合物は、限定するものではないが、架橋剤：市販されている(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより)ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ (succinimidyl-(4-ビニルスルホン)安息香酸塩)にて調製したＡＤＣが特に考えられる。2003-2004 Applications Handbook and Catalogの467-498頁を参照。
【０２３２】
v. 抗体薬剤コンジュゲートの調製
本発明の抗体薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)において、抗体(Ａｂ)を、リンカー(Ｌ)を介して、一つ以上の薬剤部分(Ｄ)、例えば抗体につき約１〜約２０の薬剤部分にコンジュゲートする。式ＩのＡＤＣはいくつかの手段、当業者に公知の有機化学反応、状態及び試薬を用いて調製されうる：(1) 共有結合の後に薬剤部分Ｄと反応してＡｂ-Ｌを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた抗体の求核基の反応；及び(2) 共有結合の後に抗体の求核基と反応してＤ-Ｌを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた薬剤部分の求核基の反応、が含まれる。ＡＤＣを調製するための更なる方法は本願明細書中に記載される。
Ａｂ−(Ｌ−Ｄ)ｐ            Ｉ
リンカーは、一つ以上のリンカー成分から成ってもよい。例示的なリンカー成分は、６-マレイミドカプロイル(「ＭＣ」)、マレイミドプロパノイル(「ＭＰ」)、バリン-シトルリン(「val-cit」)、アラニン-フェニルアラニン(「ala-phe」)、ｐ-アミノベンジルオキシカルボンイル(「ＰＡＢ」)、Ｎ-スクシンイミジル４(２-ピリジルチオ)ペンタノエート(「ＳＰＰ」)、Ｎ-スクシンイミジル４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１カルボキシレート(「ＳＭＣＣ」)、及びＮ-スクシンイミジル(４-イオド-アセチル)アミノ安息香酸エステル(「ＳＩＡＢ」)を含む。更なるリンカー成分は当分野で公知であり、そのいくつかは本願明細書において、記述される。また、"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、２００４年１１月５日に出願した米出願番号１０／９８３３４０を参照。その内容は出典明記により本願明細書に組み込まれる。
【０２３３】
いくつかの実施態様では、リンカーはアミノ酸残基を含みうる。例示的なアミノ酸リンカー成分には、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド又はペンタペプチドなどがある。例示的なジペプチドは、バリン-シトルリン(vc又はval-cit)、アラニン-フェニルアラニン(af又はala-phe)を含む。例示的なトリペプチドは、グリシン-バリン-シトルリン(gly-val-cit)及びグリシン-グリシン-グリシン(gly-gly-gly)を含む。アミノ酸リンカー成分を含んでなるアミノ酸残基は、天然に生じるもの、並びに微量のアミノ酸及び非天然に生じるアミノ酸類似体、例えばシトルリンを含む。アミノ酸リンカー成分は設定され、特に酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ及びＤ又はプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断の選択性に最適化できる。
【０２３４】
抗体上の求核基には、限定するものでなく、以下のものを含む：(i) Ｎ末端アミン基、(ii) 側鎖アミン基、例えばリシン、(iii) 側鎖チオール基、例えばシステイン、及び(iv) 抗体がグリコシル化される糖水酸基又はアミノ基。アミン、チオール及び水酸基は、求核であり、反応して、リンカー部分上の求電子性の群及びリンカー試薬により共有結合を形成することができる：(i) 活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸及び酸ハロゲン化物；(ii) アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；(iii) アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド群、が含まれる。特定の抗体は、還元しうる鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、還元剤、例えばＤＴＴ(ジチオトレイトール)による処置によって、リンカー試薬を用いたコンジュゲート反応を行ってもよい。ゆえに、各々のシステイン架橋は、理論的には、２の反応性のチオール求核基を形成する。チオールにアミンを転換させる２-イミノチオラン(トラウトの試薬)を用いてリシンを反応させることによって抗体に付加的な求核基を導入することができる。反応性のチオール基は、１、２、３、４又はそれ以上のシステイン残基を導入する(例えば、一又は複数の非天然のシステインアミノ酸残基を含んでなる変異体抗体を調製する)ことによって抗体に導入されてよい。
【０２３５】
また、本発明の抗体薬剤コンジュゲートは、抗体を修飾して求電子性の部分を導入する(リンカー試薬又は薬剤上の求核置換基と反応させることができる)ことによって生成してもよい。グリコシル化された抗体の糖質を、例えば過ヨウ素酸塩酸化剤を用いて酸化して、リンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応するアルデヒド又はケトン基を形成させてもよい。生じたイミンシッフ塩基群が安定結合を形成するか、又は例えば安定アミン結合を形成させるホウ化水素試薬によって、還元してもよい。一実施態様では、ガラクトースオキシダーゼ又はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩の何れかによるグリコシル化抗体の炭水化物部分の反応により、薬剤(Hermanson, Bioconjugate Techniques)上の適当な基と反応することができるタンパク質のカルボニル(アルデヒド及びケトン)基が生じうる。他の実施態様では、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含んでいるタンパク質はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩と反応して、第一のアミノ酸の代わりにアルデヒドを生成する(Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146；米国特許第５３６２８５２号)。このようなアルデヒドは、薬剤部分又はリンカー求核基と反応することができる。
【０２３６】
同様に、薬剤部分上の求核基には、限定するものではないが、以下のものを含む：反応して、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子性の基と共有結合することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸エステル及びアリールヒドラジド基：(i) 活性エステル(例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸及び酸ハロゲン化物)；(ii) アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；(iii) アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド基、が含まれる。
別法として、抗体及び細胞障害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを個体に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から非結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【０２３７】
抗ＦＧＦＲ３抗体の使用方法
本発明は、治療薬の活性から有利な効果を提供することを意図した特定の治療計画の一部としてのＦＧＦＲ３抗体の使用を特徴とする。本発明は、様々な段階における様々な種類の癌の治療に特に有用である。
【０２３８】
癌という用語は、増殖異常の集合を包含し、限定しないが、前癌性の増殖、良性腫瘍、及び悪性腫瘍を含んでいる。良性腫瘍は、原発部位に局在したままであり、遠隔部位への浸潤能、侵入能、又は転移能を有していない。悪性腫瘍は周辺の他の組織に侵入してそれらの組織を損傷する。悪性腫瘍は、通常は血流を介して又はリンパ節が位置するリンパ系を介して、原発部位を離れて身体の他の部分へ広がる(転移する)能力を獲得することができる。原発腫瘍は、腫瘍が生じた組織の種類により分類され、転移性腫瘍は、癌細胞が由来する組織によって分類される。時間の経過に伴い、悪性腫瘍の細胞は異常性となって、正常細胞とは外観を異にする。このような癌細胞の外観の変化は腫瘍悪性度と呼ばれ、癌細胞は、高分化型（低悪性度）、中程度に分化型、低分化型、又は未分化型（高悪性度）と表わされる。高分化型細胞は、極めて正常な外観を有し、それらの細胞の起源である正常細胞に類似している。未分化細胞は、異常性が高いためにもはやそれら細胞の起源を決定することができない細胞である。
【０２３９】
癌ステージ分類システムは、解剖学的に癌がどの程度まで広がっているかを表わして、同じステージグループ内において、患者に対して同じような予後及び治療を付与しようとするものである。幾つかの試験を実行することにより、癌のステージ分類を補助することができ、そのような試験には、組織診と、胸部レントゲン検査、マンモグラフィ、骨スキャン、ＣＴスキャン、及びＭＲＩスキャンのような特定の画像化とが含まれる。患者の全体的な健康状態を評価し、癌が特定の器官に広がっているかどうかを検出するために、血液検査及び臨床評価も使用される。
【０２４０】
癌のステージ分類を行うために、アメリカ癌合同委員会（the American Joint Committee on Cancer）は、まず、癌、特に固形腫瘍を、ＴＮＭ分類システムを用いて文字により分類している。これは、癌を、文字Ｔ（腫瘍の大きさ）、Ｎ（触知可能なリンパ節）、及び／又はＭ（転移）で表わすものである。Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、及びＴ４は、原発病巣が大きくなっていることを表わし、Ｎ０、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３は、徐々にリンパ節の合併症が進行していることを表わし、Ｍ０及びＭ１は遠隔転移の有無を示している。
【０２４１】
第２のステージ分類法は、全病期分類（Overall Stage Grouping）又はローマ数字式分類（Roman Numeral Staging）として知られ、原発病巣の大きさとリンパ節への伝播と遠隔転移の存在を組み合わせて、癌を段階０〜ＩＶに分類するものである。このシステムでは、症例は、ローマ数字Ｉ〜ＩＶにより示される４つのステージにグループ分けされるか、又は「再発性」と分類される。乳癌の腺管上皮内癌又は非浸潤性小葉癌といった幾つかの症例の場合、ステージ０は「上皮内」又は「Tis」と呼ばれる。高悪性度の腺腫もステージ０に分類される。概して、ステージＩの癌は小さく局在化した癌であり、通常治癒可能であるが、ステージＩＶは、通常、手術不可能な癌又は転移性の癌を表わす。ステージＩＩ及びＩＩＩの癌は、通常、局所的に進行しており、及び／又は局所的リンパ節の関与を示している。一般に、ステージの番号が大きい程、腫瘍の大きさ、及び／又は近くのリンパ節及び／又は原発腫瘍に隣接する器官への伝播を含め、疾病が広範囲に亘ることを示す。このようなステージは正確に規定されているが、定義は、各種の癌によって異なっており、当業者に周知である。
【０２４２】
ＮＣＩの監視、疫学、及び遠隔成績プログラム（ＳＥＥＲ）のような多くの癌の記録では、略式のステージ分類を使用する。このシステムは、すべての種類の癌に使用されている。これは、癌の症例を以下の５つの主要なカテゴリにグループ分けするものである。
上皮内：  それが生じた細胞の層にのみ存在する早期癌
限局：    転移の証拠は無く、それが生じた器官に限定されている癌
隣接転移：最初の（原発）部位を越えて近くのリンパ節又は器官及び組織に広がった癌
遠隔転移：原発部位から遠隔器官又は遠隔リンパ節に広がった癌
不明：    ステージを示す十分な情報がない症例を表わすために使用される。
【０２４３】
加えて、原発腫瘍が除去されてから数か月又は数年後に、癌が再発することは珍しくない。可視の腫瘍が全て根絶された後に再発する癌は、再発性癌と呼ばれる。原発腫瘍の領域において再発する疾病は、局所的に再発性であり、転移として再発する癌は遠隔再発と呼ばれる。
【０２４４】
腫瘍は固形腫瘍であるか、或いは非固形腫瘍又は軟組織腫瘍でありうる。軟組織腫瘍の例には、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、成人急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、成熟Ｂ細胞急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、前リンパ球性白血病、又はヘアリーセル白血病）、或いはリンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、又はホジキン病）が含まれる。固形腫瘍には、血液、骨髄、又はリンパ系以外の身体組織のあらゆる癌が含まれる。固形腫瘍は更に、上皮細胞を起源とするものと、非上皮細胞を起源とするものとに分けられる。上皮細胞固形腫瘍の例には、胃腸管、大腸、乳房、前立腺、肺、腎、肝、膵臓、卵巣、頭頚部、口腔、胃の腫瘍、十二指腸、小腸、大腸、肛門、胆嚢、大陰唇、上咽頭、皮膚、子宮、雄性生殖器、尿路、膀胱、及び皮膚の腫瘍が含まれる。非上皮起源の固形腫瘍には、肉腫、脳腫瘍、及び骨腫瘍が含まれる。腫瘍の他の例は定義の項に記載される。
【０２４５】
幾つかの実施態様では、本発明の患者に対し、例えば治療前、及び／又は治療中、及び治療後に診断試験を行う。一般に、診断試験が実施される場合、治療を必要とする患者から試料を採取することができる。対象が癌に罹患している場合、試料は腫瘍試料、又はその他生物学的試料でありえ、例えば、限定しないが、血液、尿、唾液、腹水、又は血清及び血漿のような派生物などを含む生物学的流体である。
【０２４６】
本明細書において、生物学的試料は、固定された試料、例えばホルマリン固定されてパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）試料であるか、又は凍結された試料である。
【０２４７】
ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を決定する種々の方法は、限定しないが、遺伝子発現プロファイリング、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣ）を含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、マイクロアレイ分析、ＳＡＧＥ法、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ、大規模並行シグネチャー配列決定（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現分析、プロテオミクス、免疫組織化学（ＩＨＣ）などを含む。好ましくは、ｍＲＮＡは定量される。このようなｍＲＮＡ分析は、好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の技術を使用して、又はマイクロアレイ分析により実行される。ＰＣＲを使用する場合、ＰＣＲの好ましい形態は定量的リアルタイムＰｃＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）である。一実施態様では、上記遺伝子のうちの一又は複数の発現は、例えば同じ腫瘍種類の他の試料と比較して、中央値以上である場合に陽性発現とみなされる。中央値発現レベルは、基本的に、遺伝子発現の測定と同時に決定することができるか、又は事前に決定することができる。
【０２４８】
ＲＮＡ源として固定パラフィン包埋組織を用いる遺伝子発現プロファイリングの典型的なプロトコールのステップは、ｍＲＮＡの単離、精製、プライマーの伸張、及び増幅を含み、様々な出版物の記事に記載されている（例えば、Godfrey ら J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); Spechtら、Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)）。簡単に説明すると、典型的なプロセスは、厚さ約１０マイクログラムのパラフィン包埋腫瘍組織の試料を切断することから開始される。次いでＲＮＡを抽出し、タンパク質及びＤＮＡを除去する。ＲＮＡ濃度の分析後に、必要に応じてＲＮＡ修復ステップ及び／又は増幅ステップを含み、遺伝子に特異的なプロモーターを用いてＲＮＡを逆転写し、その後ＰＣＲを行う。最後に、データを分析することにより、試験した腫瘍試料において特定された特徴的な遺伝子発現に基づいて、患者が受けることができる最善の治療オプションを特定する。
【０２４９】
遺伝子又はタンパク質の発現の検出は、直接的に又は間接的に決定することができる。
（直接的に又は間接的に）癌におけるＦＧＦＲ３の発現又は転座又は増幅を決定することができる。様々な診断／予後判定アッセイがこのために利用可能である。一実施態様では、ＦＧＦＲ３過剰発現は、ＩＨＣによって分析することができる。腫瘍生検由来のパラフィン包埋組織切片に対してＩＨＣアッセイを行い、次のようなＦＧＦＲ３タンパク質染色強度基準と合致させてもよい：
スコア０：染色が観察されないか、又は膜染色が腫瘍細胞の１０％未満で観察される。
スコア１＋：わずかに／弱く認知できる程度の膜染色が１０％を上回る腫瘍細胞に検出される。細胞膜の一部のみが染色される。
スコア２＋：弱いないしは中程度の完全な膜染色が腫瘍細胞の１０％を越えて観察される。
スコア３＋：中程度から強い完全な膜染色が１０％を上回る腫瘍細胞に観察される。
【０２５０】
幾つかの実施態様では、ＦＧＦＲ３の過剰発現に関して０又は１＋スコアを呈する腫瘍は、ＦＧＦＲ３を過剰発現しないことを特徴としうるものであるのに対し、２＋又は３＋スコアを呈する腫瘍は、ＦＧＦＲ３の過剰発現を特徴としうる。
【０２５１】
幾つかの実施態様では、ＦＧＦＲ３を過剰発現する腫瘍は、細胞１つ当たりに発現されるＦＧＦＲ３分子のコピーの数に対応する免疫組織化学的スコアにより評価することができ、生化学的に定量化することができる。すなわち：
０＝０〜９０コピー／細胞
１＋＝少なくとも約１００コピー／細胞
２＋＝少なくとも約１０００コピー／細胞
３＋＝少なくとも約１００００コピー／細胞
【０２５２】
或いは、又は加えて、ＦＩＳＨアッセイを、ホルマリン固定、パラフィン包埋された腫瘍組織に実施して、腫瘍において(ある場合には)ＦＧＦＲ３増幅又は転座の存在及び／又は範囲を決定することができる。
【０２５３】
ＦＧＦＲ３活性は、直接的に（例えば、ホスホ−ＥＬＩＳＡ試験、又はリン酸化したレセプターを定量化する他の方法により）、或いは間接的に（例えば、活性化した下流のシグナル伝達経路成分の検出、レセプター二量体（例えば、ホモ二量体、ヘテロ二量体）の検出、遺伝子発現プロファイルの検出などにより）、定量化することができる。
【０２５４】
同様に、恒常的なＦＧＦＲ３活性化及び／又はリガンド非依存性又はリガンド依存性ＦＧＦＲ３は、直接的又は間接的に（例えば、恒常的活性と相関するレセプター変異の検出、恒常的活性と相関するレセプター増幅の検出などにより）、定量化することができる。
【０２５５】
核酸突然変異の検出のための方法は当分野で公知である。しばしば、必ずしもそうではないが、突然変異が存在するかどうかの決定のために望ましい量の材料を得るために、試料中の標的核酸を増幅する。増幅技術は公知技術である。例えば、増幅された産物は、突然変異が予測される特定のアミノ酸配列位置／核酸配列位置を含む限り、対象とするタンパク質をコードするすべての核酸配列を包含してもよいし、しなくてもよい。
【０２５６】
一例では、変異の存在は、試料からの核酸を、突然変異した核酸をコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブと接触させ、該ハイブリダイゼーションを検出することによって決定することができる。一実施態様では、プローブは例えば放射性同位元素(３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ等)、蛍光剤(ローダミン、フルオレセン等)又は発色剤で検出可能に標識される。いくつかの実施態様では、プローブはアンチセンスオリゴマー、例えばＰＮＡ、モルホリノ-ホスホロアミデート類、ＬＮＡ又は２'-アルコキシアルコキシである。プローブは約８ヌクレオチドから約１００ヌクレオチド、又は約１０から約７５、あるいは約１５から約５０、又は約２０から約３０でありうる。他の態様では、本発明の核酸プローブは試料中においてＦＧＦＲ３突然変異を同定するためのキットとして提供され、該キットは、ＦＧＦＲ３をコードする核酸中の突然変異の部位に隣接して又は特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。該キットはキットを使用してハイブリダイゼーション試験の結果に基づいてＦＧＦＲ３アンタゴニストでＦＧＦＲ３突然変異を含む腫瘍を有する患者を治療するための指示書を更に含みうる。
【０２５７】
また、突然変異は、野生型ＦＧＦＲ３をコードする対応する核酸の電気泳動移動度と増幅された核酸の電気泳動移動度とを比較することによって検出することができる。移動度の相違は、増幅された核酸配列での突然変異の存在を示すものである。電気泳動移動度は、例えばポリアクリルアミドゲル上での、任意の適切な分子分離技術により測定されうる。
【０２５８】
また、核酸を、酵素突然変異検出法(Enzymatic Mutation Detection (EMD))(Del Tito等, Clinical Chemistry 44:731-739, 1998)を使用して突然変異の検出について分析することができる。ＥＭＤはバクテリオファージリゾルベースＴ４エンドヌクレアーゼVIIを使用し、これは、点突然変異、挿入及び欠失などの核酸変異から生じる塩基対ミスマッチによって引き起こされる構造的歪みを検出し切断するまで二本鎖ＤＮＡに沿ってスキャンする。例えばゲル電気泳動によってリゾルベース切断により形成された２つの短い断片の検出は突然変異の存在を示している。ＥＭＤ法の利点は、増幅反応から直接アッセイされた点突然変異、欠失及び挿入を同定する単一のプロトコールであり、試料を精製する必要がなく、ハイブリダイゼーション時間を短縮し、信号対雑音比を増大させることである。２０倍までの過剰な正常核酸及び４ｋｂのサイズまでの断片を含む混合試料をアッセイすることができる。しかしながら、ＥＭＤスキャンは突然変異陽性試料中に生じる特定の塩基変化を同定せず、必要ならば特異的な突然変異を同定するために更なる配列決定手順を必要とする。ＣＥＬI酵素は米国特許第５８６９２４５号に実証されているようにリゾルベースＴ４エンドヌクレアーゼVIIと同様にして使用することができる。
【０２５９】
突然変異を検出するための他の簡便なキットは、ヘモクロマトーシスを引き起こすＨＦＥ、ＴＦＲ２及びＦＰＮ１遺伝子における多重突然変異の検出のためのヘマクロマトーシスストリップアッセイ(Haemochromatosis  StripAssayTM)(Viennalabs http://www.bamburghmarrsh.com/pdf/4220.pdf)に類似したリバースハイブリダイゼーションテストストリップである。そのようなアッセイは、ＰＣＲによる増幅に続く配列特異的ハイブリダイゼーションに基づいている。単一突然変異アッセイに対しては、マイクロプレートベースの検出系を適用することができる一方、多重突然変異アッセイに対しては、ストリップは「マクロ-アレイ」として使用することができる。キットは試料調製、増幅及び突然変異検出のための直ぐに使用できる試薬を含みうる。多重増幅プロトコルは利便性を提供し、非常に限られた体積の試料の試験を可能にする。直接的なストリップアッセイ(StripAssay)態様を使用して、２０及びそれ以上の突然変異の試験を、高価な装置を用いないで５時間未満で完了させることができる。ＤＮＡが試料から単離され、標的核酸がインビトロで増幅され(例えばＰＣＲ)、一般的には単一(「多重(multiplex)」)増幅反応においてビオチン標識される。増幅産物は、プローブが平行線又はバンドとして固定されているストリップのような固体担体上に固定されたオリゴヌクレオチドプローブ(野生型及び変異型特異的)に選択的にハイブリダイズされたものである。結合したビオチン標識単位複製配列はストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ及び有色基質を使用して検出される。そのようなアッセイは本発明の突然変異の全て又は任意のサブセットを検出することができる。特定の突然変異プローブバンドに対しては３種のシグナル伝達パターンの一つが可能である：(i) 正常な核酸配列を示す野生型プローブに対してのみのバンド、(ii) ヘテロ接合遺伝子型を示す野生型及び突然変異双方のプローブに対するバンド、及び(iii) ホモ接合突然変異遺伝子型を示す突然変異プローブだけに対するバンド。従って、ある態様では、本発明は、本発明の突然変異を検出する方法であって、増幅産物がリガンドを含むように、試料から標的のＦＧＦＲ３核酸配列を単離及び／又は増幅し、増幅産物を、リガンドに対する検出可能な結合対を含むプローブであって本発明の突然変異体に特異的にハイブリダイズ可能なプローブに接触させ、ついで上記増幅産物に対する上記プローブのハイブリダイゼーションを検出する方法が更に提供される。一実施態様では、リガンドはビオチンであり、結合対はアビジン又はストレプトアビジンを含む。一実施態様では、結合対は、有色基質で検出可能なストレプトアビジン-アルカリ性である。一実施態様では、プローブは例えばストリップ上に固定されており、そこで、異なった突然変異に相補的であるプローブが互いに分離される。あるいは、増幅された核酸は、放射性同位元素で標識され、その場合、プローブは検出可能な標識を含む必要はない。
【０２６０】
野生型遺伝子の改変は、挿入、逆位、削除、及び／又は点変異といった突然変異の全ての形態を包含する。一実施態様では、突然変異は体細胞性である。体細胞性突然変異は、特定の組織、例えば腫瘍組織においてのみ発生し、生殖系列細胞に遺伝しないものである。生殖系列細胞突然変異は、あらゆる身体組織において見られる。
【０２６１】
標的核酸を含有する試料は、当分野で周知な、腫瘍の特定の種類や位置に適した方法によって入手できる。組織生検は、腫瘍組織の代表的な部分を得るために用いることが多い。これに対して、腫瘍細胞は、対象とする腫瘍細胞を含むことがわかっている又は含むと思われる組織／体液の形態で間接的に入手できる。例えば、肺癌病変の試料は、切除術、気管支鏡検査法、細針吸引、気管支のブラッシングによって、又は、痰、肋膜体液又は血液から入手してもよい。突然変異遺伝子又は遺伝子産物は、腫瘍から、又は、他の体試料、例えば尿、痰又は血清から検出できる。腫瘍試料中の突然変異標的遺伝子ないし遺伝子産物の検出のための上記に記載の同じ技術を他の体試料に応用できる。癌細胞は腫瘍からはがれて、このような体試料中に出現する。このような体試料のスクリーニングによって、癌などの疾患の診断を簡単かつ迅速に行うことができる。加えて、治療の経過は、突然変異標的遺伝子ないし遺伝子産物についてこのような体試料を試験することによって、より容易にモニタリングすることができる。
【０２６２】
腫瘍細胞の組織調製物を濃縮する方法は公知技術である。例えば、組織は、パラフィン切片又はクリオスタット切片から単離してもよい。また、癌細胞は、フローサイトメトリ又はレーザー捕獲顕微解剖によって正常細胞から切り離してもよい。正常細胞から腫瘍を分離するためのこれら並びに他の技術は公知技術である。腫瘍組織が正常細胞と非常に混濁している場合、突然変異の検出はより難しいが、混入及び／又は偽陽性／陰性の結果を最小化する技術が公知である。そのいくつかを以下に記述する。例えば、試料は、対象とする腫瘍細胞と結合するが対応する正常細胞とは結合しない、又はその逆も可であることがわかっているバイオマーカー(突然変異を含む)の存在について評価してもよい。
【０２６３】
標的核酸中の点突然変異の検出は、当該分野でよく知られている技術を使用して標的核酸を分子クローニングし、核酸を配列決定することによって達成することができうる。あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を使用して、腫瘍組織からのゲノムＤＮＡ調製物から直接的に標的核酸配列を増幅させることができる。ついで、増幅された配列の核酸配列を決定し、それから突然変異を同定することができる。増幅技術は当該分野でよく知られており、Saiki等, Science 239:487, 1988；米国特許第４６８３２０３号；及び米国特許第４６８３１９５号に記載されている。
【０２６４】
適切なプライマーの設計及び選択は、従来技術において確立されていることに注意されたい。
【０２６５】
また、当該分野で知られているリガーゼ連鎖反応を、標的核酸配列を増幅させるために使用することができる。例としてWu等, Genomics, Vol. 4, pp.560-569 (1989)を参照。さらに、対立遺伝子特異的ＰＣＲとして知られている技術を使用することができる。例としてRuano及びKidd, Nucleic Acids Research, Vol. 17, p. 8392, 1989を参照。この技術によれば、特定の標的核酸突然変異にその３'末端でハイブリダイズするプライマーが使用される。特定の突然変異が存在していない場合は、増幅産物は観察されない。欧州特許出願公開第０３３２４３５号及び Newton等, Nucleic Acids Research, Vol. 17, p.7, 1989に開示されたAmplification Refractory Mutation System (ARMS) もまた使用することができる。遺伝子の挿入及び欠失もまたクローニング、配列決定及び増幅によって検出することができる。また、遺伝子又は周りのマーカー遺伝子に対する制限酵素断片長多型(ＲＦＬＰ)プローブを、多型断片における対立遺伝子の改変又は挿入をスコア付けするために使用することができる。一本鎖ＤＮＡ高次構造多型(ＳＳＣＰ)解析もまた対立遺伝子の塩基変化変異体を検出するために使用することができる。例としてOrita等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 86, pp. 2766-2770, 1989,及びGenomics, Vol. 5, pp. 874-879, 1989を参照。また、当該分野で知られているような挿入及び欠失を検出する他の方法を使用することができる。 
【０２６６】
野生型遺伝子の改変は野生型遺伝子発現産物の改変に基づいて検出することもできる。そのような発現産物にはｍＲＮＡ並びにタンパク質産物の双方が含まれる。点突然変異は、ｍＲＮＡから作製されたｃＤＮＡの分子クローニングによって又はｍＲＮＡを増幅し配列決定することによって、検出することができる。クローン化ｃＤＮＡの配列は当該分野でよく知られたＤＮＡ配列決定法を使用して決定することができる。ｃＤＮＡはまたポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)によって配列決定することもできる。
【０２６７】
ミスマッチは、１００％相補的ではないハイブリダイズした核酸二本鎖である。完全な相補性の欠如は欠失、挿入、逆位、又は置換又はフレームシフト突然変異によりうる。ミスマッチの検出は標的の核酸中における点突然変異を検出するために使用することができる。これらの技術は配列決定よりも感受性が低いが、より簡便に多数の腫瘍試料に対して実施することができる。ミスマッチ切断技術の一例はリボヌクレアーゼ保護法であり、これは、Winter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 82, p.7575, 1985及びMeyers等, Science, Vol. 230, p.1242, 1985に詳細に記載されている。例えば、本発明の方法は、ヒトの野生型標的核酸に相補的である標識されたリボプローブの使用を伴いうる。リボプローブと腫瘍試料由来の標的核酸は一緒にアニール(ハイブリダイズ)され、続いて二本鎖ＲＮＡ構造中の幾らかのミスマッチを検出することができる酵素リボヌクレアーゼＡで消化される。ミスマッチがリボヌクレアーゼＡによって検出される場合、それはミスマッチ部位で切断される。よって、アニールされたＲＮＡ調製物が電気泳動ゲルマトリックスで分離されると、ミスマッチがリボヌクレアーゼＡによって検出され切断された場合、リボプローブとｍＲＮＡ又はＤＮＡに対する完全長二本鎖ＲＮＡよりも小さいＲＮＡ産物が見られる。リボプローブは標的核酸ｍＲＮＡ又は遺伝子の完全長である必要はないが、標的核酸の一部であり、変異していると思われる部位を含むものである。リボプローブが標的核酸ｍＲＮＡ又は遺伝子のセグメントのみを含む場合、多くのこれらプローブを使用してミスマッチに対する全標的核酸配列をスクリーニングすることが望ましい。
【０２６８】
同様な形で、ＤＮＡプローブを用いて、酵素的又は化学的切断などを介して、ミスマッチを検出することができる。例としてCotton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 85, 4397, 1988；及びShenk等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 72, p. 989, 1975を参照のこと。あるいは、ミスマッチは、マッチした二本鎖に対するミスマッチの二本鎖の電気泳動移動度における変化によって検出することができる。例としてCariello, Human Genetics, Vol. 42, p.726, 1988を参照のこと。リボプローブかＤＮＡプローブの何れかを用いて、突然変異を含みうる標的核酸ｍＲＮＡ又はＤＮＡはハイブリダイゼーション前に増幅させることができる。標的核酸のＤＮＡの変化は、例えば欠失及び挿入のように特に変化が全体的な再配列である場合は、サザンハイブリダイゼーションを使用して検出することもできる。
【０２６９】
また、増幅された標的核酸のＤＮＡ配列を、対立遺伝子特異的プローブを使用してスクリーニングすることもできる。これらのプローブは核酸オリゴマーであり、その各々が既知の突然変異を有する標的核酸遺伝子の領域を含む。例えば、一つのオリゴマーは、標的遺伝子配列の一部に対応する、約３０ヌクレオチド長でありうる。そのような一連の対立遺伝子特異的プローブの使用によって、標的核酸増幅産物をスクリーニングし、標的遺伝子中における過去に同定された突然変異の存在を同定することができる。増幅された標的核酸配列との対立遺伝子特異的プローブのハイブリダイゼーションは例えばナイロンフィルターで実施することができる。ストリンジェントなハイブリダイズ条件下での特定のプローブのハイブリダイゼーションは、対立遺伝子特異的プローブにおけるものと同じ突然変異が腫瘍組織に存在していることを示している。
【０２７０】
野生型標的遺伝子の改変はまた対応する野生型タンパク質の改変についてスクリーニングすることによっても検出することができる。例えば、標的遺伝子産物と免疫反応性であるモノクローナル抗体、その例として遺伝子産物(タンパク質)の特定の変異した位置に結合することがわかっている抗体を用いて組織をスクリーニングすることができる。例えば、用いる抗体が、欠失したエキソンに結合する抗体又は、標的タンパク質の欠失した部位を含んでなる立体配位的なエピトープに結合する抗体でありうる。同種抗原の欠如が突然変異を示すであろう。また、突然変異対立遺伝子の産物に特異的な抗体を突然変異遺伝子産物の検出に使用することができる。抗体はファージディスプレイライブラリーから同定することができる。そのような免疫学的アッセイは当該分野で知られている任意の簡便な形態で行うことができる。これらには、ウェスタンブロット、免疫組織化学的アッセイ及びＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。改変されたタンパク質を検出するための任意の手段を、野生型標的遺伝子の改変を検出するために使用することができる。
【０２７１】
プライマー対はポリメラーゼ連鎖反応などの核酸増幅技術を用いて標的核酸のヌクレオチド配列の決定のために有用である。一本鎖ＤＮＡプライマーの対は標的配列を刺激増幅するために標的核酸配列内又は該標的核酸配列を囲む配列にアニーリングすることができる。対立遺伝子特異的プライマーもまた使用することができる。このようなプライマーは特定の突然変異標的配列にのみアニールし、よって鋳型としての突然変異標的配列の存在下でのみ産物を増幅する。引き続いての増幅された配列のクローニングを容易にするために、プライマーはその末端に付属した制限酵素部位配列を有しうる。そのような酵素及び部位は当該分野でよく知られている。そのプライマー自体は、当該分野でよく知られている技術を使用して合成することができる。一般に、プライマーは、商業的に入手できるオリゴヌクレオチド合成機を使用して作製することができる。特定のプライマーの設定は十分に当業者の技量の範囲内である。
【０２７２】
核酸プローブは多くの目的のために有用である。それらはゲノムＤＮＡへのサザンハイブリダイゼーションにおいて、また上で既に検討した点突然変異を検出するためのリボヌクレアーゼ保護法において使用することができる。プローブは標的核酸増幅産物を検出するために使用することができる。それらはまた他の技術を使用して野生型遺伝子又はｍＲＮＡとのミスマッチを検出するために使用することもできる。ミスマッチは酵素(例えばＳ１ヌクレアーゼ)か、化学物質(例えばヒドロキシルアミン又は四酸化オスミウム及びピペリジン)か、又は完全にマッチしたハイブリッドと比較した場合のミスマッチハイブリッドの電気泳動移動度の変化の何れかを使用して検出することができる。これらの技術は当該分野で知られている。Novack等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.83, p.586, 1986を参照。一般に、プローブはキナーゼドメイン外の配列に相補的である。一連の核酸プローブを用いて、標的核酸中の突然変異を検出するためのキットを構成することができる。そのキットにより、対象とする標的配列の広い領域へのハイブリダイゼーションが可能になる。プローブは互いにオーバーラップしていてもよいし又は近接していてもよい。
【０２７３】
リボプローブをｍＲＮＡとのミスマッチを検出するために使用する場合、それは標的遺伝子のｍＲＮＡに相補的である。よって、リボプローブは、センス鎖に相補的であるため、対応する遺伝子産物をコードしていない点でアンチセンスプローブである。リボプローブは一般に放射性、比色性、又は蛍光定量物質で標識され、これは当該分野で知られている任意の手段によって達成することができる。リボプローブがＤＮＡとのミスマッチを検出するために使用される場合、それは何れの極性でも、センス又はアンチセンスでもありうる。同様に、ＤＮＡプローブを、ミスマッチを検出するために使用することもできる。
【０２７４】
場合によっては、癌はＦＧＦＲ３を過剰発現してもよいし、しなくてもよい。レセプターの過剰発現は、細胞表面上に存在するレセプタータンパク質のレベルの上昇を（例えば免疫組織化学アッセイ；ＩＨＣにより）評価することにより、診断又は予後判定アッセイにおいて決定することができる。或いは又は加えて、例えば蛍光インサイツハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ、１９９８年１０月に公開の国際公開第９８／４５４７９号参照)、サザンブロッティング、又はポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)技術、例えば定量的リアルタイムＰＣＲ(ＲＴ-ＰＣＲ)によって、細胞内のレセプターコード化核酸のレベルを測定してもよい。上記のアッセイを除き、技術者は様々なインビボアッセイを利用することができる。例えば、場合によって、検出可能な標識、例えば放射性同位体で標識した抗体に患者の体内の細胞を曝し、例えば放射能の外的スキャンによって、又は前もって抗体に曝される患者から採取した生検を分析することによって、患者の細胞に対する抗体の結合を評価してもよい。
【０２７５】
化学療法剤
本発明の併用療法は、更に、一又は複数の化学療法剤を含むことができる。併用投与は、別個の製剤又は単一の医薬的製剤を用いた同時投与又は同時発生的投与と、好ましくは両方（又は全て）の活性剤の生物学的活性が同時に発揮される期間を提供する、順序を問わない継続的投与とを含む。
【０２７６】
投与される場合、化学療法剤は普通、そのような薬剤に既知の用量で投与されるか、場合によっては薬剤の併用作用又は代謝拮抗性の化学療法剤の投与に起因する有害な副作用により用量が低減される。このような化学療法剤の調製及び投与計画は、製造者の指示に従って、又は当業者の経験的決定により、使用することができる。
【０２７７】
併用可能な様々な化学療法剤は本明細書中に開示した。
いくつかの実施態様では、組み合わせる好ましい化学療法剤は、レナリドミド (ＲＥＶＬＩＭＩＤ)、プロテアソームインヒビター(例えばボルテゾミブ (ＶＥＬＣＡＤＥ)及びＰＳ３４２)、ｂｏｒａタキソイド（ドセタキセル及びパクリタキセルを含む）、ビンカ（例えばビノレルビン又はビンブラスチン）、白金化合物（例えばカルボプラチン又はシスプラチン）、アロマターゼ阻害剤（例えばレトロゾール、アナストロゾール、又はエキセメスタン）、抗エストロゲン（例えばフルベストラント又はタモキシフェン）、エトポシド、チオテパ、シクロホスファミド、メトトレキサート、リポソームドキソルビシン、ペグ化リポソームドキソルビシン、カペシタビン、ゲムシタビン、メルタリン(melthalin)、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ＣＯＸ-２インヒビター(たとえばセレコキシブ)又はステロイド(例えばデキサメサゾンおよびプレドニゾン)からなる群より選択される。いくつかの実施態様(例えば、ｔ(４；１４)＋多発性骨髄腫の治療に伴う実施態様)では、デキサメサゾンとレナリドミド、又はデキサメサゾン、又はボルテゾミブ、又はビンクリスチン、ドキソルビシンとデキサメタゾン、又はサリドマイドとデキサメタゾン、又はリポソームドキソルビシン、ビンクリスチンとデキサメタゾン、又はレナリドミドとデキサメサゾン、又はボルテゾミブとデキサメタゾン、又はボルテゾミブ、ドキソルビシン、とデキサメタゾンが組み合わされる。いくつかの実施態様(例えば膀胱癌を伴う実施態様)では、ゲムシタビンとシスプラチン、又はタキサン(例えばパクリタキセル、ドセタキセル)、又はペメトレキセド、又はメトトレキセート、ビンブラスチン、ドキソルビシンとシスプラチン、又はカルボプラチン、又は５-フルオロウラシルと組み合わせたマイトマイシンＣ、又はシスプラチン、又はシスプラチンと５-フルオロウラシルが組み合わされる。
【０２７８】
製剤、用量、及び投与
本発明に使用される治療薬の製剤、用量、及び投与は、良質な医療慣行（good medical practice）に則って決定される。この文脈で考慮すべき要素には、治療対象となる特定の障害、特定の治療対象、個々の患者の臨床的状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与計画、併用される薬剤同士の相互作用、及び医療従事者に既知のその他の要素が含まれる。
【０２７９】
治療的製剤は、従来技術に既知の標準的方法を用いて、所望の純度を有する有効成分と、任意の生理学的に許容可能な担体と、賦形剤又は安定剤（Remington’s Pharmaceutical Sciences (第20版)、A. Gennaro編, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA）とを混合することにより調製される。許容可能な担体には、生理食塩水又はリン酸塩のようなバッファと、クエン酸塩及びその他の有機酸；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミンなどのタンパク質と、ゼラチン又は免疫グロブリン；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシンのようなアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコースを含むその他の炭水化物、マンノース、又はデキストリン；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトール又はソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成対イオン；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ、又はＰＥＧのような非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０２８０】
随意で、しかし好ましくは、製剤は、製薬的に許容可能な塩、好ましくは塩化ナトリウムを、好ましくはほぼ生理的濃度で含んでいる。随意で、本発明の製剤は、製薬的に許容可能な保存料を含むことができる。幾つかの実施態様では、保存料の濃度は０．１〜２．０％（典型的にｖ／ｖで）である。適切な保存料には、薬剤的従来技術において既知のものが含まれる。ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、及びプロピルパラベンが好ましい保存料である。場合によっては、本発明の製剤は、製薬的に許容可能な界面活性剤を０．００５〜０．０２％の濃度で含むことができる。
【０２８１】
本明細書における製剤は、治療される特定の徴候に必要な二つ以上の活性化合物、好ましくは互いに逆に作用しない相補的活性を有する化合物を含むこともできる。このような分子は、適切には、意図された目的に有効な量で併用される。
【０２８２】
有効成分は、例えばコアセルベーション技術により、又は界面重合、例えばそれぞれコロイド性薬剤送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及び名のカプセル）又はマクロエマルシンの、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルにより、マイクロカプセルに封入された形態に調製することもできる。このような技術は、上掲のRemington’s Pharmaceutical Sciencesに開示されている。
【０２８３】
徐放性製剤を調整してもよい。徐放性製剤の適切な例として、抗体を含む固形疎水性ポリマーの半透性基質を上げることができ、この基質は、有形物、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態である。徐放性基質の例には、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリル酸）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌグルタミン酸及びγエチル−Ｌ−グルタミンの共重合体、非分解性エチレン−ビニルアセテート、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸共重合体及びリュープロリド酢酸塩からなる注射可能な微粒子）のような、分解性の乳酸−グリコール酸の共重合体、並びにポリ−Ｄ−（−）３−ヒドロキシブチル酸が含まれる。エチレンビニルアセテート及び乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、１００日に亘る分子の放出を可能にし、一方、特定のハイドロゲルは、それよりも短期間に亘ってタンパク質を放出する。カプセル封入された抗体は、体内に長時間留まるとき、３７℃で水分に曝されることにより、変性又は凝集し、その結果生物学的活性を失い、場合によっては免疫原生が変化する。関与する機序に応じて、安定化のために合理的な戦略を講じることができる。例えば、凝集の機序が、チオ−ジスルフィド交換により分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることが発見された場合、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液の凍結、水分含有率の制御、適切な添加剤の使用、及び特定のポリマー基質組成物の開発により、安定化させることができる。
【０２８４】
本発明の治療薬は、ヒト患者に対し、ボーラスとしての静脈内投与、或いは、一定の時間に亘る持続点滴、筋肉内投与、口腔内投与、脳脊髄内投与、皮下投与、関節内投与、髄膜内投与、くも膜下腔内投与、経口投与、局所投与、又は吸入といった既知の方法に従って、投与することができる。治療的適用のために、エキソビボ戦略も使用することができる。エキソビボ戦略では、対象から採取した細胞に、ＦＧＦＲ３アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを形質移入又は形質導入する。次いで、形質移入又は形質導入された細胞を対象に戻す。細胞は、限定しないが、造血性細胞（例えば、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞）、繊維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、又は筋細胞を含む、広範な種類のあらゆる細胞とすることができる。
【０２８５】
例えば、ＦＧＦＲ３アンタゴニストが抗体である場合、この抗体は、非経口的投与、皮下投与、腹腔内投与、肺内投与、及び鼻腔内投与、局所的免疫抑制治療に望ましい場合は病巣内投与を含む任意の適切な手段により投与される。非経口注入には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、又は皮下投与が含まれる。加えて、抗体は、特に抗体の用量を減らしながら、パルス注入により適切に投与される。好ましくは、投薬は、投与期間の長短に応じて、注射により、最も好ましくは静脈内注入又は皮下注入により、行われる。
【０２８６】
別の実施例では、ＦＧＦＲ３アンタゴニスト化合物は、障害又は腫瘍の位置が許す場合、局所的に、例えば直接的注入により投与され、注入は周期的に反復可能である。また、ＦＧＦＲ３アンタゴニストは、局所的再発又は転移を防止又は低減するために、患者の全身に、又は腫瘍細胞に直接、例えば腫瘍の外科的切除後に、腫瘍又は腫瘍病床に対して送達することができる。
【０２８７】
併用療法における治療薬の投与は、所定の期間（通常は、選択される組み合わせに応じて、数分、数時間、数日、又は数週）に亘って行うことができる。併用療法は、このような治療薬を連続して、即ち各治療薬を異なる時間に投与する投与方法、並びに、このような治療薬、又は少なくとも二つの治療薬をほぼ同時に投与する投与方法を包含する。
【０２８８】
治療薬は、同じ経路又は異なる経路により投与することができる。例えば、組み合わせた抗ＦＧＦＲ３抗体を静脈内注により投与してもよいし、組み合わせた化学療法剤を経口投与してもよい。別の方法では、例えば、特定の治療薬に応じて、両方の治療薬を経口投与するか、又は両方の治療薬を静脈内注入することができる。治療薬を投与する順番は、特定の薬剤に応じて変更することもできる。
【０２８９】
例えば、一又は複数の別個の投与を行うか、又は連続注入を行うかに関係なく、疾病の種類及び重症度に応じて、患者に投与される各治療薬の初回の候補用量は、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。典型的な一日当たりの用量は、上記要素に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上に亘りうる。数日間以上に亘って反復投与する場合、状態に応じて、上記方法によって測定した場合に癌が治療されるまで治療を持続する。しかしながら、他の投与計画も有用でありうる。
【０２９０】
本出願では、遺伝子療法によるＦＧＦＲ３抗体の投与を考慮する。例えば、１９９６年３月１４日に公開された、細胞内抗体を生成するための遺伝子療法の使用に関する国際公開第９６／０７３２１号を参照されたい。
【０２９１】
製造品
本発明の他の態様では、上記の疾患の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。該製造品は容器と該容器上又は該容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、症状を治療、予防及び／又は診断するために有効な組成物単独又は他の組成物と組み合わせる組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる(例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる)。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明の抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が癌などの選択された症状の治療に使用されることを示す。更に、製造品は、(a)本発明の抗体を含有する組成物を中に収容する第一の容器と、(b)更なる細胞障害剤を含有する組成物を中に収容する第二の容器とを具備する。本発明のこの実施態様における製造品は、第一及び第二の抗体組成物を特定の症状、例えば癌の治療に使用することができることを示しているパッケージ挿入物を更に含んでよい。あるいは、もしくはさらに、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の(又は第三の)容器を更に具備してもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０２９２】
後述は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上述した概要に基づいて、他に様々な実施態様が実施可能であることを理解されたい。
【実施例】
【０２９３】
材料および方法
細胞株および細胞培養
細胞株ＲＴ４はアメリカ培養細胞系統保存機関から入手した。細胞株ＲＴ１１２、ＯＰＭ２およびＢａ／Ｆ３は、ドイツ微生物及び細胞培養物保存機関(DSMZ, (Germany))から購入した。多発性骨髄腫細胞株ＫＭＳ１１は川崎医科大学(日本)のオオツキタケミ医師よりご提供頂いた。膀胱癌細胞株ＴＣＣ−９７−７は、セントジェームズ大学病院(Leeds, UK)のMargaret Knowles博士から譲り受けた。ＵＭＵＣ-１４細胞株は、H.B. Grossman博士(現在Texas M.D. Anderson癌センター大学、テキサス州)から入手した。細胞は、１０％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)(Sigma)、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンおよびＬ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ培地にて、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で維持した。
【０２９４】
ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃ二量体化試験
ＵＭＵＣ-１４細胞は、システインを含まない培地中で生育させ、Ｒ３Ｍａｂ又はＤＴＮＢにて３時間処理し、細胞溶解物を還元又は非還元条件下でイムノブロット分析を行った。インビトロ二量体化試験のために、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂＳ２４９Ｃ(残基１４３−３７４)を、ｐＡｃＧＰ６７Ａベクターにクローニングし、Ｔ.ｎｉプロ細胞に発現させた。組換えタンパク質は、Ｎｉ-ＮＴＡカラムの後にＳｕｐｅｒｄｅｘＳ２００カラムにより精製した。二量体ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃは、２５ｍＭ トリス(ｐＨ７．５)および３００ｍＭ ＮａＣｌにて溶出した。Ｒ３Ｍａｂ(１μＭ)は、ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃ二量体(０．１μＭ)とともに３７℃かつ以下の条件下でインキュベートした：１００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４(ｐＨ７．５)、２５μＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．７５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ。示した時点に反応の一定量を採取し、β-メルカプトエタノールを含まない試料バッファを添加することによって反応を止めた。二量体-単量体をイムノブロットにて分析した。
【０２９５】
異種移植片試験
すべての試験はジェネンテクの施設内動物取扱委員会の承認を得た。雌ｎｕ／ｎｕマウス又はＣＢ17重症複合免疫不全症(ＳＣＩＤ)マウス（６〜８週齢）は、Charles River Laboratory (Hollister, CA)から購入した。雌胸腺欠損ヌードマウスは、国立癌研究所-フレデリック癌センターから入手した。マウスは特定病原体感染防止条件下で維持した。ＲＴ１１２ ｓｈＲＮＡ安定細胞(７×１０６)、ＲＴ１１２(７×１０６)、Ｂａ／Ｆ３−ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃ(５×１０６)、ＯＰＭ２(１５×１０６)、又は、ＫＭＳ１１細胞(２０×１０６)は、ＨＢＳＳ／マトリゲル(１:１ｖ／ｖ、BD Biosciences)中０．２ｍｌの体積でマウスの脇側に皮下移植した。ＵＭＵＣ-１４細胞(５×１０６)はマトリゲルなしで移植した。腫瘍はカリパスを使用して週２回測定し、腫瘍体積は以下の式を使用して算出した：Ｖ＝０.５ａ×ｂ２、このａ及びｂはそれぞれ腫瘍の長さおよび幅である。平均腫瘍体積が１５０〜２００ｍｍ３に達したところで、マウスをランダムに１０匹の群に分け、ＨＢＳＳに希釈したコントロールヒトＩｇＧ１又はＲ３Ｍａｂ(０．３〜５０ｍｇ／ｋｇ)を週２回腹膜内(ｉ.ｐ)投与した。コントロール動物はベヒクル(ＨＢＳＳ)単独を与えた。
【０２９６】
統計学
集積したデータは平均＋／−ＳＥＭで表した。２群間の比較のために不対のスチューデントｔ検定(両側)を用いた。ｐ＜０．０５の値は、すべての実験において統計学的に有意であるとみなした。
【０２９７】
ＦＧＦＲ３ ｓｈＲＮＡ安定細胞の生成
記述される(１)ように、３つの独立したＦＧＦＲ３ ｓｈＲＮＡをｐＨＵＳＨベクターにクローニングした。試験に使用するＦＧＦＲ３ ｓｈＲＮＡの配列は以下の通りである：ｓｈＲＮＡ２：5'GATCCCCGCATCAAGCTGCGGCATCATTCAAGAGATGATGCCGCAGCTTGATGCTTTTTTGGAAA(配列番号：１９２)；ｓｈＲＮＡ４：5'-GATCCCCTGCACAACCTCGACTACTA TTCAAGAGATAGTAGTCGAGGTTGTGCATTTTTTGGAAA-3'(配列番号：１９３)；ｓｈＲＮＡ６：5'-GATCCCCAACCTCGACTACTACAAGATTCAAGAGATCTTGTAGTAGTCGAGGTTTTTTTTGGAAA-3'(配列番号：１９４)。すべてのコンストラクトは配列決定によって確認した。ＥＧＦＰコントロールｓｈＲＮＡは、我々の以前の研究(５０)に記述した。ｓｈＲＮＡを含有するレトロウイルスは、ＶＳＶ−Ｇ (Clontech Laboratories)とｐＨＵＳＨ-ＦＧＦＲ３ ｓｈＲＮＡコンストラクトをＧＰ２−２９３パッケージ細胞(Clontech Laboratories, Mountain View, CA)に同時形質移入することによって作製し、形質移入の７２時間後にウイルス上清を回収し、形質導入実験のために遠心分離法にて細胞片を清浄化した。
ＲＴ１１２細胞は、テトラサイクリンを含まないＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地(Clontech Laboratories)中で維持し、４μｇ／ｍｌポリブレンの存在下でレトロウイルス上清を導入した。感染の７２時間後に、２μｇ／ｍｌのピューロマイシン(Clontech Laboratories)を培地に加え、ｓｈＲＮＡを発現する安定クローンを選択した。安定細胞を単離し、０．１又は１μｇ／ｍｌのドキシサイクリン(Clontech Laboratories)にて４日間処理し、ＦＧＦＲ３タンパク質発現の誘導ノックダウンをウェスタンブロット解析にて評価した。記述される(５１)ように細胞周期分析を行った。
【０２９８】
ＦＧＦＲ３に特異的なファージ抗体の選別
選択した相補性決定領域(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ３)内に合成多様性を有するヒトファージ抗体ライブラリで、ヒトＩｇＧレパートリの天然の多様性を模倣するものをパニングに用いた。Ｆａｂ断片は、Ｍ１３バクテリオファージ粒子の表面上に二価で表出した(５２)。ヒトのＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂおよびＩＩＩｃのＨｉｓタグ付加ＩｇＤ２−Ｄ３を抗原として用いた。９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐイムノプレート(Nunc)を、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ-Ｈｉｓタンパク質又はＦＧＦＲ３−ＩＩＩＣ-Ｈｉｓタンパク質(１０μｇ／ｍｌ)にて４℃で終夜をかけてコートし、１％ＢＳＡを添加したＰＢＳＴバッファ(０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳ)にて１時間かけてブロックした。抗体ファージライブラリを添加して、室温(ＲＴ)で終夜インキュベートした。プレートはＰＢＳＴバッファにて洗浄し、結合したファージは５０ｍＭ ＨＣｌおよび５００ｍＭ ＮａＣｌにて３０分間溶出し、等量の１Ｍ トリス塩基にて中和した。回収したファージは大腸菌ＸＬ−１ブルー細胞中で増幅された。その後の選別ラウンドでは、ファージ抗体のインキュベート時間を２時間に減らし、プレート洗浄のストリンジェンシーを徐々に上げた(５３)。ＦＧＦＲ３のＩＩＩｂおよびＩＩＩｃアイソフォームに結合する固有かつ特異的なファージ抗体は、ファージＥＬＩＳＡおよびＤＮＡ配列決定によって識別した。スクリーニングした４００クローンのうち、４つを選択し、個別のクローンのＶＬ及びＶＨ領域をそれぞれＬＰＧ３およびＬＰＧ４ベクターにクローニングすることによって完全長ＩｇＧに再編成し、哺乳動物細胞に過渡的に発現させ、プロテインＡカラムにて精製した(５４)。親和性成熟のためにクローン１８４．６を選択した。
【０２９９】
親和性成熟のために、Ｍ１３バクテリオファージの表面上に一価性Ｆａｂを表出するファジミド(５２)を、ファージＡｂの軽鎖(ＶＬ)および重鎖(ＶＨ)可変ドメインを融合させるためのライブラリ鋳型として用いた。停止コドンはＣＤＲ-Ｌ３に組み込んだ。記述される(５３)ように、親和性成熟のためにソフトランダム化方策を適用した。ＣＤＲループ、Ｈ１／Ｈ２／Ｌ３、Ｈ３／Ｌ３又はＬ１／Ｌ２／Ｌ３の２つの異なる組合せをランダム化のために選択した。親和性成熟したクローンを選択するために、ファージライブラリを、ＦＧＦＲ３ ＩＩＩｂ又はＩＩＩｃ-Ｈｉｓタンパク質に対して分類し、記述される(５２)ように、第一ラウンドではプレート分類を行い、その後溶液相分類を４ラウンド行った。５ラウンドのパニングの後、記述される(５５)ように、ハイスループット単一点競合ファージＥＬＩＳＡを用いて迅速に高親和性クローンをスクリーニングした。ＦＧＦＲ３−Ｈｉｓの非存在下のものに対して１０ｎＭ ＦＧＦＲ３−Ｈｉｓ存在下での４５０ｎｍの吸光度の比率が低いクローンを、以降の特徴付けのために選択した。
【０３００】
クローン１８４.６.１、１８４.６.２１、１８４.６.４９、１８４.６.５１、１８４.６.５８、１８４.６.６２および１８４.６.９２は、Ｂａ／Ｆ３−ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ、Ｂａ／Ｆ３−ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃおよびＢａ／Ｆ３−ＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ細胞株の生存度を有意に低減し、クローン１８４.６.５２はＢａ／Ｆ３−ＦＧＦＲ３−Ｓ２４９Ｃ細胞株の生存度を有意に低減した。阻害活性の増加は、アッセイした細胞株に応じて、親クローン１８４．６よりおよそ５０倍(クローン１８４.６.５２)からおよそ１００倍(クローン１８４.６.１、１８４.６.２１、１８４.６.４９、１８４.６.５１、１８４.６.５８、１８４.６.６２および１８４.６.９２)である。ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂおよびＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃに対するクローン１８４.６.１、１８４.６.５８および１８４.６.６２の結合動態は、以下の通りにＢＩＡｃｏｒｅを使用して決定した：
ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ ＫＤ(Ｍ)    ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ ＫＤ(Ｍ)
１８４.６         ３.８０Ｅ-０８                  １.１０Ｅ-０７
１８４.６.１      ２.６４Ｅ-１０                  １.４４Ｅ-０９
１８４.６.５８    １.９０Ｅ-１０                  ８.８０Ｅ-１０
１８４.６.６２    １.２０Ｅ-１０                  ２.２４Ｅ-０９
また、クローン１８４.６.１、１８４.６.５８および１８４.６.６２は、Ｂａ／Ｆ３−ＦＧＦＲ３細胞、ＲＴ１１２細胞およびＯＰＭ２細胞のＦＧＦＲ３下流シグナル伝達の阻害の改善を示した。
【０３０１】
クローン１８４.６.１を選択した。配列修飾であるＮ５４ＳをＨＶＲ  Ｈ２の残基５４に導入して製造可能性を向上させ、クローン１８４.６.１Ｎ５４Ｓを作製した。クローン１８４.６.１および１８４.６.１Ｎ５４Ｓは、Ｂａ／Ｆ３細胞生存率アッセイにおいて類似の結合動態(Ｂｉａｃｏｒｅアッセイにて測定)と類似の活性を表した。更なるＨＶＲ  Ｈ２変異体を作製した。Ｎ５４Ｓはクローン１８４.６.５８に導入し、Ｎ５４Ｇ、Ｎ５４Ａ又はＮ５４Ｑはクローン１８４.６.１および１８４.６.５８に導入した。これらのクローンは、Ｂａ／Ｆ３細胞生存率アッセイにおいて親クローン１８４.６.１又は１８４.６.５８に相当する活性を示した。
他の配列修飾であるＤ３０Ｅをクローン１８４.６.１Ｎ５４ＳのＨＶＲ  Ｌ１に導入して、クローン１８４.６.１ＮＳＤ３０Ｅを作製した。クローン１８４.６.１ＮＳＤ３０Ｅおよびクローン１８４.６.１Ｎ５４Ｓは、ＢＡ／Ｆ３細胞生存率アッセイにおいて親クローン１８４.６.１又は１８４.６.５８に相当する結合動態と活性を示した。
ここで使用する「Ｒ３Ｍａｂ」は、抗ＦＧＦＲ３抗体クローン１８４.６.１Ｎ５４Ｓ、１８４.６.１又は１８４．６を指す。以下の図に示す結果を導く実験以外では、「Ｒ３Ｍａｂ」と示す図及び実験においてクローン１８４.６.１Ｎ５４Ｓを用いた(使用した抗体は括弧に示す)：図９Ｂ(クローン１８４.６.１)、１０(クローン１８４．６)、１１Ａ及びＢ(クローン１８４．６)、１３(クローン１８４.６.１)、１４Ａ(クローン１８４.６.１)、１４Ｂ、ＧおよびＨ(クローン１８４．６)、１９(クローン１８４.６.１)、そして、２２ＢおよびＣ(クローン１８４.６.１)。
【０３０２】
抗体結合親和性を決定するためのＢＩＡｃｏｒｅ／表面プラズモン共鳴法(ＳＲＰ)分析
ＦＧＦＲ３に対するＲ３Ｍａｂの結合親和性は、以下の変更を加えて、記述される(５２)ように、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-３０００計測器を使用してＢｉａｃｏｒｅ／ＳＲＰにより測定した。Ｒ３Ｍａｂは、およそ４００反応単位(ＲＵ)に達するようにＣＭ５バイオセンサーチップ上に直接コートした。動態学的測定のために、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ又はＩＩＩｃ-Ｈｉｓタンパク質の２倍段階希釈物(６７ｎＭから始める)を、３０μｌ／分の流量で２５℃でＰＢＳＴバッファに注入した。会合速度(Ｋｏｎ、ｍｏｌ／ｓあたり)および解離速度(Ｋｏｆｆ、ｓあたり)は、単一の１対１ラングミュア結合モデル(ＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトバージョン３．２)を使用して算出した。平衡解離定数(Ｋｄ、ｍｏｌあたり)は、Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比率として算出した。
ＦＧＦＲ３に対するマウスハイブリドーマ抗体の結合親和性は、以下の通りにＢｉａｃｏｒｅ／ＳＲＰによって測定した。ヒトのＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ又はＩＩＩｃは、およそ５０ＲＵの応答単位(ＲＵ)を達成するように、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ ＣＭ５センサーチップの３つの異なるフローセル(ＦＣ)、ＦＣ２、ＦＣ３およびＦＣ４上へカップリングさせた。製造業者によって提供されるプロトコールを使用して、アミノ基によるランダムなカップリングによって固定化を行った。センサーグラムは、３０μｌ／分の流量で２倍に増加する、２５０ｎＭから０．４８ｎＭの段階溶液を注入することによって、２５℃でのこれら表面に対するハイブリドーマ由来抗ＦＧＦＲ３マウスＩｇＧ又はＦａｂ断片の結合について記録した。各注入の間に、１０ｍＭのグリシン-ＨＣｌ、ｐＨ１．７をバッファとして用い、センサーチップを再生させた。参照セル(ＦＣ１)からのシグナルは、ＦＣ２、ＦＣ３およびＦＣ４で観察されたセンサーグラムから減算した。反応速度定数は、製造業者が提供するＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフト(バージョン３．２)を用いて１：１ラングミュア結合モデルに従って、データの非線形回帰フィッティングにより算出した。
【０３０３】
ＥＬＩＳＡ結合試験
ヒトのＦＧＦＲ１-ＩＩＩｂ、ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ２-ＩＩＩｂおよびＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂおよびＩＩＩｃの細胞外ドメイン(ＥＣＤ)およびＦＧＦＲ４をコードするｃＤＮＡを、ｐＲＫベースのベクターにクローニングし、ヒトＦＧＦＲ−ヒトＦｃキメラタンパク質を生成した。過渡的にチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞を形質移入させることによって組換えタンパク質を生成し、プロテインＡ親和性クロマトグラフィにて精製した。ヒトＦＧＦＲに対する抗体の結合を試験するために、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルプレート(Nunc)は、２μｇ／ｍｌのＦＧＦＲ ＥＣＤ−ヒトＦｃキメラタンパク質５０μｌにて４℃で終夜かけてコートした。リン酸塩緩衝食塩水(ＰＢＳ)／３％ＢＳＡにてブロックした後、ＦＧＦＲ３抗体を加え、室温で２時間インキュベートした。特異的に結合したＦＧＦＲ３抗体は、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＦａｂおよびＴＭＢペルオキシダーゼ色素発生基質(KPL, Gaithersburg, MD)を使用して検出した。
ＦＧＦ／ＦＧＦＲ３相互作用に対するＦＧＦＲ３への抗体の効果を試験するために、ＦＧＦＲ３−Ｆｃキメラタンパク質を、抗ヒト免疫グロブリンＦｃγ断片-特異的抗体(Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)にてコートしたＭａｘｉｓｏｒｐプレート上に捕獲させた。洗浄後、漸増濃のＦＧＦＲ３抗体をプレートに添加し、３０分間インキュベートした。次いで、ＦＧＦ１又はＦＧＦ９およびヘパリンを加えて室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄して、ビオチン化ＦＧＦ１特異的ポリクローナル抗体(ＢＡＦ２３２)又はビオチン化ＦＧＦ９抗体(ＢＡＦ２７３、R&D Systems)とともに１時間インキュベートし、その後ストレプトアビジン-ＨＲＰおよびＴＭＢにて検出した。
【０３０４】
Ｂａ／Ｆ３−ＦＧＦＲ３安定細胞の生成
完全長ヒトＦＧＦＲ３ ＩＩＩｂ又はＩＩＩｃをコードするｃＤＮＡを、ｐＱＣＸＩＰベクター(Clontech Laboratories, Mountain View, CA)にクローニングし、ｐＱＣＸＩＰ-ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ又はＩＩＩｃを生成した。特定の突然変異、すなわちＲ２４８Ｃ、Ｓ２４９Ｃ、Ｇ３７２Ｃ、Ｙ３７５ＣおよびＫ６５２Ｅは、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ(Stratagene, La Jolla, CA)によりｃＤＮＡに導入した。野生型又は変異型ＦＧＦＲ３を発現するＢａ／Ｆ３安定細胞を生成するために、様々なｐＱＣＸＩＰ-ＦＧＦＲ３コンストラクトを、ＶＳＶ−Ｇプラスミド(Clontech Laboratories)によりパッケージ細胞ＧＰ2-２９３に同時形質移入した。２μｇ／ｍｌのピューロマイシンにて２週間かけて選別した後、野生型又は変異型ＦＧＦＲ３を発現する細胞を、フィコエリトリンコンジュゲート抗ヒトＦＧＦＲ３ ｍＡｂ(ＦＡＢ７６６Ｐ、R&D Systems)にて染色し、機能的アッセイのために蛍光標示式細胞分取器(ＦＡＣＳ)似て選別した。９６ウェルマイクロタイタープレートの細胞増殖アッセイに、以下の細胞密度を用いた：野生型ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂおよびＦＧＦＲ３−Ｋ６５２Ｅを発現する細胞には５０００の細胞／ウェル；残りは１００００の細胞／ウェル。細胞は、１０％ウシ胎児血清、１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ１さらに１０μｇ／ｍｌ ヘパリンを添加したＲＰＭＩ１６４０(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)に播いた。Ｒ３Ｍａｂは示した濃度で添加し、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ実験では２０００〜０．４９ｎｇ／ｍｌ(４倍の階段希釈)、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ実験では５０００〜１．２ｎｇ／ｍｌ(４倍の階段希釈)のマウスハイブリドーマＦＧＦＲ３抗体を添加した。７２時間のインキュベートの後、細胞生存率をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-Ｇｌｏ (Promega, Madison, WI)にて評価した。
【０３０５】
細胞増殖アッセイ
ＲＴ１１２、ＲＴ４およびＴＣＣ−９７−７細胞の増殖アッセイのために、３０００細胞／ウェルを９６ウェルマイクロタイタープレートに播き、終夜をかけて接着させた。次いで培地を、示した濃度のコントロール又はＲ３Ｍａｂを有する低血清培地(０．５％ＦＢＳ)と交換した。４日間インキュベートした後、１μＣｉの[メチル-３Ｈ]チミジン(PerkinElmer, Waltham, MA)を各ウェルに添加し、更に１６時間インキュベートした。細胞は、パッカードＦｉｌｔｅｒｍａｔｅ回収器を使用してＵｎｉＦｉｌｔｅｒｓへ移し、増殖する細胞のゲノムＤＮＡに取り込まれる[３Ｈ]-チミジンをＴｏｐＣｏｕｎｔ(PerkinElmer)を使用して測定した。場合によって、細胞生存率は、抗体とともに４日間インキュベートした後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-Ｇｌｏ(Promega)にて評価した。値は４つの平均＋／−ＳＥとして表した。
【０３０６】
クローン増殖アッセイ
細胞コロニー形成能に対するＲ３Ｍａｂの効果は、すでに記述されているプロトコール(５０)に従って評価した。簡単にいえば、４００のＵＭＵＣ-１４細胞は、１０％ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ培地を含む６ウェルプレートに播き、終夜をかけて接着させた。次いで、０．１％ＢＳＡ培地に希釈したＲ３Ｍａｂ抗体又はコントロール抗体は、１０μｇ／ｍｌの終濃度になるように加えた。等量の０．１％ＢＳＡ培地単独(Mock)を他のコントロールとして使いた。コントロール群の細胞が十分に大きなコロニーを形成するまで、細胞はおよそ１２日間インキュベートした。コロニーは０．５％クリスタルバイオレットにて染色し、コロニーの数およびサイズをＧｅｌＣｏｕｎｔ(Oxford, UK)を使用して数量化した。直径１２０μｍより大きなコロニー数は平均＋／−ＳＥＭ(ｎ＝１２)として表した。
【０３０７】
免疫沈降およびイムノブロッティング分析
ＦＧＦＲ３シグナル伝達に対する抗体の効果を調べるために、細胞は、処置を開始する前に無血清培地中で終夜をかけて飢餓状態にした。細胞は、０．１％ＢＳＡ(ｗ／ｖ)、ＲＰＭＩ１６４０培地に希釈した抗体、または０．１％ＢＳＡ培地単独(Mock)とともにインキュベートした。３７℃で３時間の後に、ＦＧＦ１(１５ｎｇ／ｍｌの終濃度)およびヘパリン(５〜１０μｇ／ｍｌの終濃度)を試料の半分に添加した。コントロールとして、同量のヘパリン単独を残りの半分に加えた。インキュベートを１０分間続けた。吸引によって上清を取り除き、細胞は、氷温のＰＢＳにて洗浄し、１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウムおよび完全プロテアーゼインヒビター反応混液(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)を添加したＲＩＰＡバッファ(Upstate, Charlottesville, VA)に溶解した。溶解物は、遠心分離法によって不溶性物質を取り除いた。
ＦＧＦＲ３は、ウサギポリクローナル抗体(ｓｃ-１２３、Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)を使用して免疫沈降し、ナトリウムドデシル-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ-ＰＡＧＥ)およびウエスタンブロットにて分析した。リン酸化されたＦＧＦＲ３はホスホチロシンに対するモノクローナル抗体(４Ｇ１０、Upstate)にて評価した。総ＦＧＦＲ３はＦＧＦＲ３に対するモノクローナル抗体(ｓｃ-１３１２１、Santa Cruz Biotechnology)によって探索した。ＦＧＦＲ３シグナル伝達経路のリン酸化および活性化は以下の抗体を使用して探索した：抗ＦＧＦＲＹ６５３／６５４、抗ＦＲＳ２αＹ１９６、抗ホスホｐ４４／４２ ＭＡＰＫＴ２０２／Ｙ２０４、抗総ｐ４４／４２ ＭＡＰＫおよび抗ＡＫＴＳ４７３は、Cell Signaling Technology (Danvers, MA)から入手し、抗総ＦＲＳ２α(ｓｃ-８３１８)はSanta Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)から購入した。ブロットは、化学発光基質(ECL Plus, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)を使用して視覚化した。
【０３０８】
抗体エピトープマッピング
Ｒ３Ｍａｂのエピトープを決定するために、１３の重なり合うペプチド(各々１５アミノ酸の長さ)を、ヒトＦＧＦＲ３の細胞外ドメインの残基１３８〜３１０をカバーするように合成した。ペプチドは、Ｃ末端でビオチン化し、終夜をかけてストレプトアビジンプレート(Pierce, Rockford, IL)に捕獲させた。ＰＢＳ／３％ＢＳＡにてブロックした後、プレートは、Ｒ３Ｍａｂとともにインキュベートし、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ(Jackson Immunoresearch)及びＴＭＢペルオキシダーゼ色素発生基質(KPL, Gaithersburg, MD)を用いて検出した。
マウス抗ヒトＦＧＦＲ３ハイブリドーマ抗体１Ｇ６、６Ｇ１および１５Ｂ２をＥＬＩＳＡアッセイにて試験し、それらの結合エピトープを同定した。１Ｇ６、６Ｇ１および１５Ｂ２はヒトＦＧＦＲ３  ＩｇＤ２−ＩｇＤ３(ＩＩＩｂおよびＩＩＩｃアイソフォームの両方)に結合するのに対して、５Ｂ８はヒトＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂのＩｇＤ２−ＩｇＤ３を結合するのみである。競合アッセイでは、１Ｇ６、６Ｇ１および１５Ｂ２はおのおの競合してヒトＦＧＦＲ３を結合したことから、１Ｇ６、６Ｇ１および１５Ｂ２が重なり合うエピトープを有することを示唆する。ハイブリドーマ抗体のいずれもがファージ抗体１８４．６と競合しなかったことから、ハイブリドーマ抗体が１８４．６とは異なるエピトープ(一又は複数)を有することを示唆する。
【０３０９】
マウス抗ＦＧＦＲ３抗体１Ｇ６、６Ｇ１および１５Ｂ２の調製および分子クローニング
ＢＡＬＢ／ｃマウスは、一リン酸化リピドＡ／トレハロースジコリノミコレートアジュバント(Corixa, Hamilton, MT)に再懸濁した２．０μｇのＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ(ｒｈＦＧＦＲ３(ＩＩＩＢ)／ＦＣキメラ(R&D Systems、カタログ＃１２６４-ＦＲ、ロット＃ＣＹＨ025011)、又は２．０μｇのＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ(ｒｈＦＧＦＲ３(ＩＩＩｃ)／Ｆｃキメラ、R&D Systems、カタログ＃７６６-ＦＲ、ロット＃ＣＷＺ０５５０４１)を、週に２回各々の後足蹠に投与して１２回免疫化した。最終抗原投与の３日後に、電気的融合(Hybrimune, Cyto Pulse Sciences, Glen Burnie, Maryland)により、膝窩リンパ節をマウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ.Ｕ.1と融合した。融合したハイブリドーマ細胞は、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ(登録商標)ハイブリドーマ選別キット(StemCell Technologies, Inc., Vancouver, BC, Canada)のメディウムＤのヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン(ＨＡＴ)選別を使用して融合していない膝窩節又は骨髄腫細胞から選択した。はじめにＥＬＩＳＡによって培養物上清をＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂおよびＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃと結合する能力についてスクリーニングし、次に対象のハイブリドーマを、形質移入したＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ Ｂａ／Ｆ細胞およびコントロールＢａ／Ｆに対するＦＡＣＳによってその染色能についてスクリーニングした。次いで選択したハイブリドーマは限界希釈にてクローニングした。
【０３１０】
ＲＮｅａｓｙミニキット(Qiagen, Germany)を用いてマウス抗ヒトＦＧＦＲＩＩＩモノクローナル抗体１Ｇ６および１５Ｂ２を生産するハイブリドーマ細胞から総ＲＮＡを抽出した。可変軽鎖(ＶＬ)および可変重鎖(ＶＨ)ドメインは以下の変性プライマーによるＲＴ−ＰＣＲを使用して増幅した： 
１Ｇ６：
軽鎖(ＬＣ)フォワード：5'-GTCAGATATCGTKCTSACMCARTCTCCWGC-3'(配列番号：１９５)
重鎖(ＨＣ)フォワード：5'-GATCGACGTACGCTGAGATCCARYTGCARCARTCTGG-3'(配列番号：１９６)
６Ｇ１：
軽鎖(ＬＣ)フォワード：5'-GTCAGATATCGTGCTGACMCARTCTCC-3'(配列番号：１９７)
重鎖(ＨＣ)フォワード：5'-GATCGACGTACGCTGAGATCCARYTGCARCARTCTGG-3'(配列番号：１９８)
１５Ｂ２：
軽鎖(ＬＣ)フォワード：5'-GTACGATATCCAGATGACMCARTCTCC-3'(配列番号：１９９)
重鎖(ＨＣ)フォワード：5'-GATCGACGTACGCTGAGATCCARYTGCARCARTCTGG-3'(配列番号：２００)
３つすべてのクローンの軽鎖および重鎖リバースプライマーは以下のとおりである：
軽鎖リバース：5'-TTTDAKYTCCAGCTTGGTACC-3'(配列番号：２０１)
重鎖リバース：5'-ACAGTGGGCCCTTGGTGGAGGCTGMRGAGACDGTGASHRDRGT-3'(配列番号：２０２)。
【０３１１】
フォワードプライマーは、ＶＬおよびＶＨ領域のＮ末端アミノ酸配列に特異的であった。ＬＣおよびＨＣのリバースプライマーは、定常軽鎖(ＣＬ)および定常重鎖ドメイン１(ＣＨ1)の領域にそれぞれアニールするように設定し、これらは種間で高く保存されている。
増幅されたＶＬは、ヒトκ定常ドメインを含むｐＲＫ哺乳動物細胞発現ベクター(Shields et al, (2000) J. Biol. Chem. 276:659)にクローニングした。増幅されたＶＨは、完全長ヒトＩｇＧ１定常ドメインをコードするｐＲＫ哺乳動物細胞発現ベクターに挿入した。重鎖および軽鎖の配列は従来法を使用して決定した。
【０３１２】
結晶化、構造測定および分子構造精密化
ヒトＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ ＥＣＤ(残基１４３−３７４)は、ｐＡｃＧＰ６７Ａベクター(BD Bioscience, San Jose, CA)にクローニングし、Ｔ.ｎｉプロ細胞で生産させ、Ｎｉ-ＮＴＡカラムの後にサイズ排除クロマトグラフィを用いて精製した。Ｒ３Ｍａｂ Ｆａｂは、大腸菌で発現させ、プロテインＧアフィニティーカラム、ＳＰセファロースカラムおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムにより順に精製した。Ｆａｂ−ＦＧＦＲ３複合体は、過剰量のＦＧＦＲ３ ＥＣＤとともにＦａｂをインキュベートすることによって生成し、次いでその複合体を脱グリコシル化し、２０ｍＭ ＴｒｉｓＣｌ ｐＨ７．５および２００ｍＭ ＮａＣｌバッファのＳｕｐｅｒｄｅｘ-２００サイズカラムにより精製した。複合体含有分画をプールし、２０ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、結晶化実験に使用した。構造測定に使用する結晶は、蒸気拡散法を使用して４℃で以下の条件：０．１Ｍ カコジル酸ナトリウム ｐＨ６．５、４０％ＭＰＤおよび５％ＰＥＧ８０００で大きくした。データは、ＨＫＬ２０００およびＳｃａｌｅｐａｃｋ(５６)を使用して処理した。構造は、プログラムＰｈａｓｅｒ(５７)および１ＲＹ３(ＦＧＦＲ３)と１Ｎ８Ｚ(Ｆａｂ断片)の座標を用いた分子置換により解析した。モデルはプログラムＣｏｏｔ(５８)を用いて完了し、構造はプログラムＲｅｆｍａｃ(５９)にて２０．４％／２４．３％のＲ／Ｒｆｒｅｅへ精密化した。座標および構造因子は受入コード３ＧＲＷによりタンパク質データバンクに寄託し、２００９年３月２５日に出願のＵＳＳＮ第６１／１６３２２２号にも開示される。その内容は出典明記によってここに援用される。
【０３１３】
ＡＤＣＣアッセイ
ヒトのＰＢＭＣは、ヘパリンで凝血防止した血液のフィコール勾配遠心分離法によって単離し、ＡＤＣＣは、標的として多発性骨髄腫細胞株ＯＰＭ２又はＫＭＳ１１ないしは膀胱癌細胞株ＲＴ１１２又はＵＭＵＣ−１４を、エフェクター細胞としてＰＢＭＣを、１:１００の標的：エフェクター比率で用いて測定した。標的細胞(１００００細胞／ウェル)は、Ｒ３Ｍａｂ又はコントロールヒトＩｇＧ１にて３７℃で４時間かけて処理した。細胞障害性は、製造業者の指示(Promega, Madison, WI)に従ってＣｙｔｏＴｏｘ-ＯＮＥ 均一メンブラン完全性アッセイを使用してＬＤＨ放出を測定することによって決定した。結果は、式：細胞障害性(％)＝[(実験上の細胞溶解−実験上の自然発生的な細胞溶解)／(標的最大細胞溶解−標的自然発生的な細胞溶解)]×１００を使用して特異的な細胞溶解の割合として表す。式中、自然発生的な細胞溶解は抗体がない場合の非特異的な細胞溶解であり、標的最大細胞溶解は１％トリトンＸ−１００によって誘導される。
【０３１４】
結果
ＦＧＦＲ３の誘導可能なｓｈＲＮＡノックダウンはインビボで膀胱癌増殖を低減する
インビボの膀胱腫瘍増殖についてのＦＧＦＲ３の重要性を評価する前段階として、発明者等はインビトロでのＦＧＦＲ３ノックダウンの効果を調べた。いくつかのＦＧＦＲ３小干渉(ｓｉ)ＲＮＡは、ＷＴ(ＲＴ１１２、ＲＴ４、ＳＷ７８０)又は変異型(ＵＭＵＣ-１４、Ｓ２４９Ｃ突然変異)のＦＧＦＲ３を発現する膀胱癌細胞株のＦＧＦＲ３を効率良く下方制御した。４つすべての細胞株でのＦＧＦＲ３ノックダウンは、培養物中の増殖を有意に抑制した(図１５)。次に、発明者等は、ドキシサイクリン誘導ＦＧＦＲ３ ｓｈＲＮＡを発現するＲＴ１１２安定細胞株を生成した。ドキシサイクリンによって３つの独立したＦＧＦＲ３ ｓｈＲＮＡを誘導するとＦＧＦＲ３発現が減少したのに対し、ＥＧＦＰを標的とするコントロールｓｈＲＮＡの誘導は効果を示さなかった(図７Ａ)。外因性ＦＧＦの非存在下では、ドキシサイクリン処置により、異なるＦＧＦＲ３ ｓｈＲＮＡを発現する細胞による[３Ｈ]-チミジン取込みが減少したがコントロールｓｈＲＮＡでは減少しなかったことから(図７Ｂ)、ＦＧＦＲ３ノックダウンが増殖を阻害することが確認された。さらに、指数的に成長するＲＴ１１２細胞の分析から、ドキシサイクリンによる７２時間の処置によってＦＧＦＲ３をノックダウンすると、細胞周期のＳ及びＧ２期の細胞の割合が顕著にかつ特異的に減少し、同時にＧ１期の細胞が増加したことが明らかとなった(図７Ｃ)。２つの他のＦＧＦＲ３ ｓｈＲＮＡによっても同様な効果が観察された(図１６Ａ)。標準以下のジプロイドＤＮＡを含む細胞の有意な数は検出されなかったことから、アポトーシスレベルは変化しないことが示唆される。したがって、ＲＴ１１２細胞の増殖に対するＦＧＦＲ３ノックダウンの阻害作用は、主に細胞周期進行の減衰による。
次に、発明者等は、マウスにおいて定着したＲＴ１１２腫瘍異種移植片の増殖に対するＦＧＦＲ３ノックダウンの効果を評価した。ＦＧＦＲ３ノックダウンは腫瘍増殖を実質的かつ特異的に抑制した(図７Ｄ、上パネルおよび図１６Ｂ)。４５日目の腫瘍試料の分析から、コントロールｓｈＲＮＡと比較して、ＦＧＦＲ３ ｓｈＲＮＡのドキシサイクリン誘導による有効なＦＧＦＲ３ノックダウンが確認された(図７Ｄ、下パネル)。これらの結果は、ＦＧＦＲ３がＲＴ１１２膀胱癌細胞の増殖にとってインビトロ及びインビボの両方においてきわめて重要であることを示す。
【０３１５】
ブロック用抗ＦＧＦＲ３モノクローナル抗体の生成
さらに腫瘍増殖におけるＦＧＦＲ３の重要性を調べ、治療的標的としてのこのレセプターの能力を調べるために、発明者等は、ファージディスプレイ手法を使用して拮抗性抗ＦＧＦＲ３モノクローナル抗体(Ｒ３Ｍａｂともいう)を発達させた。発明者等は、リガンド結合とＦＧＦＲ３による二量体化の両方をブロックする能力、及びＷＴ ＦＧＦＲ３だけでなくこのレセプターの最も一般的な癌関連突然変異体を阻害する固有の能力に基づいて、この特定の抗体を選択した(下記参照)。Ｒ３ＭａｂはＦＧＦＲ３の細胞外ＩｇＤ２及びＩｇＤ３ドメインを標的とする。ＦＧＦＲ３の細胞外ＩｇＤ２及びＩｇＤ３ドメインはＦＧＦ結合に必要かつ十分である(４)。Ｒ３Ｍａｂは、ヒトＦＧＦＲ３のＩＩＩｂおよびＩＩＩｃアイソフォームを結合したが、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２又はＦＧＦＲ４への検出可能な結合を示さなかった(図８Ａ)。Ｂｉａｃｏｒｅ分析は、Ｒ３Ｍａｂがネズミ科、カニクイザルおよびヒトのＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃに対して類似する見かけの親和性があったことを示した(データは示さない)。ヒトＦＧＦＲ３に対するＲ３Ｍａｂの親和性を表２に示す。
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次に、発明者等は、ＦＧＦ１およびＦＧＦ９へのＦＧＦＲ３結合をブロックするＲ３Ｍａｂの能力を試験した。Ｒ３Ｍａｂは、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ及び−ＩＩＩｃへのＦＧＦ１の結合を強く阻害し、その最大半量阻害濃度(ＩＣ５０)はそれぞれ０．３ｎＭおよび１．７ｎＭであった(図８Ｂ、Ｃ)。同様に、Ｒ３Ｍａｂは、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ及び−ＩＩＩｃへのＦＧＦ９結合をに効率良くブロックし、そのＩＣ５０はそれぞれ１．１ｎＭおよび１．３ｎＭであった(図８Ｄ、Ｅ)。
【０３１６】
Ｒ３ＭａｂはＷＴ ＦＧＦＲ３およびその最も一般的な癌関連変異体を阻害する
Ｒ３ＭａｂがＷＴ又は変異型ＦＧＦＲ３によって促される細胞増殖を阻害するか否かを調べるために、発明者等は、マウスのプロＢ細胞Ｂａ／Ｆ３内の異所性ＦＧＦＲ３発現がインターロイキン(ＩＬ)-３非依存的、ＦＧＦ１依存的な増殖及び生存をもたらすという所見を利用した(２９)。ＦＧＦ１およびＩＬ−３の非存在下では、ＷＴ ＦＧＦＲ３を安定して発現するＢａ／Ｆ３細胞は生存可能でなかったのに対し、ＦＧＦ１は大いにそれらの増殖を亢進した(図９Ａ)。Ｒ３Ｍａｂは、用量依存的様式でＦＧＦ１刺激Ｂａ／Ｆ３−ＦＧＦＲ３細胞増殖を特異的に遮断した(図９Ａ)。次に、発明者等は、これらの細胞におけるＦＧＦＲ３シグナル伝達に対するＲ３Ｍａｂの影響を評価した。ＦＧＦ１はＦＧＦＲ３のリン酸化と活性化及びｐ４４／４２ ＭＡＰＫの同時活性化を誘導したのに対し、Ｒ３Ｍａｂは両分子の活性化を効果的に抑制した(図９Ｂ)。
【０３１７】
膀胱癌では、ＦＧＦＲ３の体細胞活性化突然変異は、ＩｇＤ２とＩｇＤ３間のリンカー領域、細胞外膜近傍ドメイン又はキナーゼドメイン内にクラスター化している(図９Ｃ)。細胞外ミスセンス置換は、多くの場合不対のシステインを引き起こし、ＦＧＦＲ３のリガンド非依存性二量体化が生じる。これらの突然変異によって、おそらく細胞質のキナーゼドメインの方向に対して差動性の影響があるために、有意に異なるレベルの恒常的ＦＧＦＲ３活性化が生じる(３０、３１)。最も頻度が高い突然変異は、Ｓ２４９Ｃ、Ｙ３７５Ｃ、Ｒ２４８Ｃ、Ｇ３７２ＣおよびＫ６５２Ｅであり、これらは合わせて膀胱癌(３２)のすべてのＦＧＦＲ３突然変異の９８％を占める。発明者等は、最適な治療薬は、特定の癌において過剰発現しているＷＴ ＦＧＦＲ３タンパク質だけでなく、最も一般的な腫瘍関連ＦＧＦＲ３変異体も遮断すべきであると結論付けた。さらにＲ３Ｍａｂを評価するために、発明者等は、各々の５の最も一般的なＦＧＦＲ３変異体変異体を安定して発現しているＢａ／Ｆ３細胞株を生成した。すべての変異体は細胞表面に類似するレベルで発現され、システイン変異体はリガンドなしで自発的に二量体化した(データは示さない)。異なるシステイン変異体を発現する細胞株は、ＦＧＦ１に対して可変性の増殖応答を示し、これは以前の所見と一致していた(３０、３１)。既に報告される(３３)ように、ＦＧＦＲ３Ｒ２４８Ｃを発現する細胞は恒常的、リガンド非依存性の増殖を表し、ＦＧＦ１には応答性でない(図９Ｄ)。同様に、最も頻度の高い突然変異であるＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃは、リガンド非依存性の増殖をもたらした(図９Ｅ)。注目すべきことに、Ｒ３Ｍａｂは、どの変異体が促す恒常的増殖であっても抑制した(図９Ｄ、Ｅ)。膜近傍ドメイン突然変異ＦＧＦＲ３Ｇ３７２Ｃ(図９Ｆ)又はＦＧＦＲ３Ｙ３７５Ｃ(図９Ｇ)を発現する細胞は増殖のためにＦＧＦ１を必要とし、それらの増殖はＲ３Ｍａｂによって完全に遮断された。ＦＧＦＲ３Ｋ６５２Ｅを発現する細胞は、弱いリガンド非依存性の増殖と、ＦＧＦ１に応答した有意な増殖を示した(３３)。Ｒ３Ｍａｂは、ＦＧＦＲ３Ｋ６５２Ｅの弱い基礎活性に影響しなかったが(データは示さない)、この変異体によって媒介されるリガンド誘導性増殖をほとんど無効にした(図９Ｈ)。ゆえに、Ｒ３Ｍａｂは、ＦＧＦＲ３のＷＴおよび一般的な癌関連変異体を阻害する固有の能力を有する。さらに、Ｒ３Ｍａｂは検出可能なアゴニスト活性を示さなかった。
【０３１８】
別の取り組みとして、発明者等は、複数のマウス抗ヒトＦＧＦＲ３ハイブリドーマ抗体を生成し、特徴付けした。ハイブリドーマ抗体はいずれも発明者等が試験した癌関連ＦＧＦＲ３変異体を全く阻害せず(図１７)、それらはＲ３Ｍａｂとエピトープが重なっていなかった。
さらに、すべてのハイブリドーマ抗体は、癌関連のＦＧＦＲ３変異体であるＲ２４８ＣおよびＳ２４９Ｃの増殖を強く刺激し、そして、変異体Ｙ３７５ＣおよびＧ３７０Ｃの増殖をいくらか刺激する、アゴニスト活性を示した。試験するＦＧＦＲ３変異体に応じて、ハイブリドーマ抗体は、以下のような異なるレベルのアンタゴニストおよびアゴニスト活性を示した。
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ゆえに、ハイブリドーマ抗体は、様々なＦＧＦＲ３変異体によって促されるＢａ／Ｆ３細胞増殖に対して予測不可能な差動的効果を示した。
【０３１９】
マウス抗ヒトＦＧＦＲ３ハイブリドーマ抗体の特徴付け
マウス抗ヒトＦＧＦＲ３ハイブリドーマ抗体は、以下の通りにさらに特徴付けされた。
(１) ヒトＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂおよびＩＩＩｃアイソフォームへのＦＧＦ１結合を阻害する、抗ＦＧＦＲ３マウスハイブリドーマ抗体の能力を試験するためのアッセイにおいて、抗体１Ｇ６、６Ｇ１および１５Ｂ２は、用量依存的様式でヒトのＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂおよびＩＩＩｃアイソフォームへのＦＧＦ１の結合を遮断することができた。およそ２０００〜０．４９ｎｇ／ｍｌの抗体濃度範囲を試験したところ、抗体１Ｇ６、６Ｇ１および１５Ｂ２は、０．６９、０．８７および０．７２ｎＭのＩＣ５０値でＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂへのＦＧＦ１結合を遮断した。およそ５０００〜１．２ｎｇ／ｍｌの抗体濃度範囲を試験したところ、抗体１Ｇ６、６Ｇ１および１５Ｂ２は、それぞれ０．５７、３．４および０．７ｎＭのＩＣ５０値でＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃへのＦＧＦ１結合を遮断した。 
(２) ヒトのＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂおよびＩＩＩｃアイソフォームへのＦＧＦ９結合を阻害する、抗ＦＧＦＲ３マウスハイブリドーマ抗体の能力を試験するためのアッセイにおいて、抗体１Ｇ６、６Ｇ１および１５Ｂ２は、用量依存的様式でヒトのＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂおよびＩＩＩｃアイソフォームへのＦＧＦ１の結合を効果的に遮断した。およそ２０００〜０．４９ｎｇ／ｍの抗体濃度範囲を試験したところ、抗体１Ｇ６、６Ｇ１および１５Ｂ２はそれぞれ０．１３、０．１６および０．０７ｎＭのＩＣ５０値でＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂへのＦＧＦ９結合を遮断した。およそ５０００〜１．２ｎｇ／ｍｌの抗体濃度範囲を試験したところ、抗体１Ｇ６、６Ｇ１および１５Ｂ２はそれぞれ０．１３、０．１１および０．０７ｎＭのＩＣ５０値でＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃへのＦＧＦ９結合を遮断した。
【０３２０】
(３) 完全長抗ＦＧＦＲ３マウスハイブリドーマ抗体１Ｇ６、６Ｇ１および１５Ｂ２の結合親和性はＢｉａｃｏｒｅ分析を使用して決定した。この分析の結果を表３に示す。
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【０３２１】
(４) ヒトのＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ又はＩＩＩｃによって促されるＢａ／Ｆ３細胞増殖を阻害する、抗ＦＧＦＲ３マウスハイブリドーマ抗体の能力を試験するためのアッセイにおいて、抗体１Ｇ６、６Ｇ１および１５Ｂ２は、用量依存的様式でヒトのＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ又はＩＩＩｃによって促されるＢａ／Ｆ３細胞増殖を遮断することができた。およそ０．０１〜１００ｕｇ／ｍｌの抗体濃度範囲を試験したところ、抗体１Ｇ６、６Ｇ１および１５Ｂ２は、それぞれ３〜５ｎＭ、３ｎＭおよび６〜８ｎＭのＩＣ５０値でＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂによって促されるＢａ／Ｆ３細胞増殖を遮断し、それぞれ１０〜３５ｎＭ、２４ｎＭおよび６０ｎＭのＩＣ５０値でＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃによって促されるＢａ／Ｆ３細胞増殖を遮断した。
(５) ヒトＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂを発現するＢａ／Ｆ３細胞のＦＧＦ１誘導性シグナル伝達を阻害する、抗ＦＧＦＲ３マウスハイブリドーマ抗体の能力を試験するためのアッセイにおいて、およそ０．２５〜６．７５ｕｇ／ｍｌの抗体濃度範囲を試験したところ、抗体１Ｇ６、６Ｇ１および１５Ｂ２は用量依存的様式でヒトＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂを発現するＢａ／Ｆ３細胞のＦＧＦ１誘導性シグナル伝達を遮断することができた。この実験には２５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１を用いた。ＦＧＦ１の非存在下では、抗体処置はＦＧＦＲ３活性化に対して影響がなかった。
(６) ヒトＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃを発現するＢａ／Ｆ３細胞のＦＧＦ１誘導性シグナル伝達を阻害する、抗ＦＧＦＲ３マウスハイブリドーマ抗体の能力を試験するためのアッセイにおいて、およそ０．２５〜６．７５ｕｇ／ｍｌの抗体濃度範囲を試験したところ、抗体１Ｇ６、６Ｇ１および１５Ｂ２は用量依存的様式でヒトＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃを発現するＢａ／Ｆ３細胞のＦＧＦ１誘導性シグナル伝達を遮断することができた。この実験には２５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１を用いた。ＦＧＦ１の非存在下では、抗体処置はＦＧＦＲ３活性化に対して影響がなかった。
【０３２２】
Ｒ３ＭａｂとＦＧＦＲ３との相互作用のための構造基準
ＦＧＦＲ３との相互作用のＲ３Ｍａｂの機序をより深く理解するために、発明者等は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ ＩｇＤ２及びＤ３の領域にわたっている１３の重なり合うペプチドのパネルを合成し、Ｒ３Ｍａｂへのそれらの結合を試験した。ペプチド３(残基１６４−１７８)および１１(残基２６９−２８３)はＲ３Ｍａｂへの特異的な結合を示し、ペプチド３は強い相互作用を有していた(図１０Ａ)ことは、ＦＧＦＲ３上の対応する領域がＲ３Ｍａｂによる認識のために重要であることを示唆する。ＦＧＦ２と複合体化したＦＧＦＲ１の以前の結晶学的試験から、ＦＧＦ及びヘパリンへの直接結合並びにレセプター二量体化に関与する重要なレセプター残基が同定された(３４)。ＦＧＦＲ１の機能的に重要な部位とＦＧＦＲ３ペプチド３および１１のアラインメントにより、これらのペプチドが、直接のＦＧＦ２結合、レセプター二量体化、並びにヘパリンとの相互作用に必須な対応するＦＧＦＲ１残基を包含することが明らかとなった(図１０Ｂ)。これらのデータは、ＦＧＦＲ３上のＲ３Ｍａｂのエピトープがリガンド会合およびレセプター-レセプター相互作用に関与するレセプター残基とオーバーラップすることを示す。
【０３２３】
次に発明者等は、Ｒ３ＭａｂのＦａｂ断片とヒトＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂの細胞外ＩｇＤ２−Ｄ３領域の間の複合体を結晶化させ、２．１Å分解能のＸ線構造を決定した(図１０Ｃ、Ｄ；表４)。この複合体において、溶媒にアクセス可能な表面領域のおよそ１４００Å２および１５００Å２はそれぞれ、ＦＧＦＲ３およびＦａｂに埋没されている。埋没した界面のおよそ８０％がＩｇＤ２を含むのに対し、残りはリンカーおよびＩｇＤ３領域を伴う。複合体のＦａｂ側では、埋没した界面のおよそ４０％は相補性決定領域(ＣＤＲ)-Ｈ３、２０％はＣＤＲ-Ｈ２、２０％はＣＤＲ-Ｌ２を伴っており、他のＣＤＲおよびフレームワーク残基はわずかに寄与している。特に、ＣＤＲ-Ｈ３のアミノ酸(ＡＡ)は２つのβ鎖を形成し、これはＩｇＤ２のβシートを伸展する(図１０Ｄ)。様々な二量体ＦＧＦ：ＦＧＦＲ複合体において以前に同定されているように(例えば、ＰＤＢコード１ＣＶＳ(３４)；及び、図１０Ｃ、灰色／斜交平行模様及び濃い灰色の領域)、Ｆａｂは、ＦＧＦＲ３のＦＧＦ結合部位を構成するＡＡ、並びにレセプター二量体化界面を形成する残基と相互作用する。結晶学によって同定される相互作用界面は、ペプチドに基づくデータと十分に一致していた(図１８Ａ、Ｂ)。まとめると、これらの結果から、Ｒ３Ｍａｂがどのようにリガンド結合を阻害しているかが明らかとなり、さらにＦＧＦＲ３に対するＲ３Ｍａｂの結合がレセプター二量体化を妨げうることが示唆される。Ｒ３Ｍａｂと接触するＦＧＦＲ３アミノ酸を表５に示す。この構造についての結晶学的座標は受入コード3ＧＲＷでタンパク質データバンクに受託されている。
【０３２４】
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0005757534.tif 000009
0005757534.tif 000010
【０３２５】
発明者等は、Ｒ３Ｍａｂ-ＦＧＦＲ３構造を、ＦＧＦ１と複合体になったＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃの既に公開されている構造と比較した(４、３５)(図１０Ｅ、１０Ｆ)。抗体−レセプターとリガンド−レセプター複合体を重ね合わせると、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃとＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂを区別する領域を除き、個々のレセプタードメイン内に主要な立体配座的相違はないことが明らかとなった。しかしながら、ＩｇＤ２と比較したときのＩｇＤ３の定位は大きく異なっていた(図１０Ｅ、白と灰色；図１０Ｆ、白と灰色の網模様)。ＩｇＤ２およびＩｇＤ３の相対的位置がリガンド結合に重要であるので、Ｒ３Ｍａｂ結合によりＩｇＤ３が取る選択的立体構造により、ＦＧＦＲ３とのリガンド相互作用を妨げるための更なるメカニズムがあるかもしれない。
【０３２６】
Ｒ３Ｍａｂは、膀胱癌細胞の内在性ＷＴおよび変異型ＦＧＦＲ３を阻害する
Ｒ３Ｍａｂが膀胱癌細胞においてＦＧＦＲ３機能を抑制しうるか否かを評価するために、発明者等は最初にＷＴ ＦＧＦＲ３を発現するＲＴ１１２およびＲＴ４細胞株を調べた。Ｒ３Ｍａｂは、ＲＴ１１２細胞による[３Ｈ]-チミジン取込みを強く阻害し(図１１Ａ)、ＲＴ４細胞増殖の中程度ではあるが有意な抑制を示した(図１９Ａ)。ＦＧＦＲ３活性化に対するＲ３Ｍａｂの効果を調査するために、発明者等は、ＲＴ１１２細胞におけるＦＧＦＲ３のリン酸化を調べた。Ｂａ／Ｆ３−ＦＧＦＲ３細胞の結果(図９Ｂ)と一致して、Ｒ３ＭａｂはＦＧＦ１誘導性ＦＧＦＲ３リン酸化を顕著に低減した(図１１Ｂ)。次に発明者等は、ＦＧＦＲ３シグナル伝達の３つの下流メディエーターであるＦＲＳ２、ＡＫＴおよびｐ４４／４２ ＭＡＰＫのリン酸化を調べた。ＦＧＦ１はＲＴ１１２細胞においてこれら分子を強く活性化したのに対して、Ｒ３Ｍａｂはこの活性化を有意に低減した(図１１Ｂ)。同様に、Ｒ３Ｍａｂは、ＲＴ４細胞におけるＦＧＦＲ３とＭＡＰＫのＦＧＦ１誘導性リン酸化を抑制した(図１９Ｂ)。
【０３２７】
次に発明者等は、Ｒ３Ｍａｂがヒトの膀胱癌細胞の内在性変異型ＦＧＦＲ３の活性化を阻害することができるか否かを調査した。Ｓ２４９Ｃは、膀胱癌において最も頻度の高いＦＧＦＲ３突然変異である(図９Ｃ)。２つの入手可能な細胞株であるＵＭＵＣ-１４およびＴＣＣ−９７−７は、変異したＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃ対立遺伝子を持つ(文献 ３６、データは示さない)。Ｒ３Ｍａｂは培養中のＵＭＵＣ-１４細胞の指数的増殖に影響しなかったが(データは示さない)、これらの細胞のクローン増殖を有意に低減した(図１１Ｃ)。具体的には、Ｒ３Ｍａｂは、直径１２０μｍより大きなコロニーの数をコントロール抗体と比較しておよそ７７％低減した(図１１Ｄ)。さらに、Ｒ３Ｍａｂは、培養中のＴＣＣ−９７−７細胞による[３Ｈ]-チミジン取込みを阻害した(図１９Ｃ)。
Ｓ２４９Ｃ突然変異は、ＦＧＦＲ３のリガンド非依存的活性化を起こすことが報告されている(２６、３０)。実際、ＦＧＦＲ３Ｓ２４９ＣはＵＭＵＣ-１４細胞およびＴＣＣ−９７−７細胞のＦＧＦ１処理に関係なく恒常的にリン酸化されたのに対して、Ｒ３Ｍａｂは両細胞株においてコントロール抗体と比較してＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃの恒常的リン酸化を低減した(図１１Ｅ、１９Ｄ)。
【０３２８】
Ｒ３ＭａｂはＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃによる二量体形成を阻害する
膀胱癌細胞の恒常的ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃシグナル伝達および増殖を阻害するＲ３Ｍａｂの能力は驚くべきであったことから、この変異体はジスルフィド結合した、リガンド非依存的二量体化を経ると考えられる(２６、３０)。Ｒ３ＭａｂがＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃをどのように阻害するかを調べるために、発明者等は、ＵＭＵＣ-１４細胞におけるこの変異体のオリゴマー状態に対するＲ３Ｍａｂの効果を調べた。還元条件下で、ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃは、およそ９７ｋＤａの単一バンドとして移動し、これは単量体のサイズと一致している(図１２Ａ)。非還元条件下で、コントロール抗体にて処理した細胞では、ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃの大きな分画が、ＦＧＦ１の添加にかかわらずおよそ２００ｋＤａのバンドとして出現した。このバンドは恒常的二量体状態を示す(図１２Ａ)。Ｒ３Ｍａｂ処理は、実質的に二量体の量を減少させ、同時に単量体を増加させた(図１２Ａ)。ＦＧＦ１処理とは関係なく常に、Ｒ３Ｍａｂは、ＴＣＣ−９７−７細胞におけるＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃ二量体のレベルを低減した(図１９Ｅ)。
Ｒ３Ｍａｂは膀胱癌細胞におけるＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃ二量体レベルをどのように低下させるのであろうか。一つの仮説は、抗体が誘導するＦＧＦＲ３内部移行によりＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃ二量体を、エンドソーム又はライソソームにより輸送を破壊する可能性である。発明者等は、エンドサイトーシスによる薬理的介入によってこの可能性を試験した。ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃ内部移行を実質的に遮断したにもかかわらず(図２０Ａ、Ｂ)、Ｒ３Ｍａｂは、様々なエンドサイトーシスインヒビターによって前処理したＵＭＵＣ-１４細胞の二量体の量を減少させた。ゆえに、Ｒ３Ｍａｂによる二量体破壊はエンドサイトーシスとは無関係である。他の仮説は、細胞性ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃが単量体−二量体が動的に平衡して存在する可能性である。したがって、単量体ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃに対するＲ３Ｍａｂの結合は、二量体形成を妨げることができ、このことにより単量体状態の方へ平衡が移る。この可能性を調べるために、発明者等は、非細胞浸透剤５,５'ジチオビス２−ニトロ安息香酸(ＤＴＮＢ)を使用した。この試薬は不対システインの遊離スルフヒドリル基と選択的に反応し、その基を遮断する(３７)。ＤＴＮＢによるＵＭＵＣ-１４細胞の処理により、二量体を犠牲にしてＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃ単量体の集積が引き起こされたことから(図１２Ｂ)、ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃが単量体と二量体が動的に平衡した状態で存在することを示す。
Ｒ３Ｍａｂがこの平衡に影響するか否かを試験するために、発明者等は、ＦＧＦＲ３Ｓ２４９ＣのＩｇＤ２−Ｄ３ドメインを含む可溶性組換えタンパク質を生成し、サイズ排除クロマトグラフィにて二量体を単離した。発明者等は、非常に低い濃度の還元剤(２５μＭのＤＴＴ)の存在下で、バッファ又は抗体とともに二量体をインキュベートし、非還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによってレセプターのオリゴマー状態を分析した。Ｒ３Ｍａｂは、ｍｏｃｋ又は抗体コントロールと比較して、およそ５０ｋＤａではなく、単量体のＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃを表すおよそ２５ｋＤａのバンドの出現を有意に促進した(図１２Ｃ)。実際、二量体の減少は、Ｒ３Ｍａｂの存在下では２時間で実質的に完全となった。これらの結果は、Ｒ３Ｍａｂが、ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃの単量体と二量体の平衡状態を単量体の方へ移動することを示す。
【０３２９】
Ｒ３ＭａｂはＦＧＦＲ３下方制御を促進しない
発明者等は、ＦＧＦＲ３抗体処理細胞でのＦＧＦＲ３内部移行と分解を分析することによって、ＦＧＦＲ３下方制御に対するＲ３Ｍａｂ(クローン１８４.６.１)および抗ＦＧＦＲ３ハイブリドーマ抗体の効果を調べた。野生型ＦＧＦＲ３(ＲＴ１１２)又は変異型ＦＧＦＲ３(ＴＣＣ９７-７ではＳ２４９Ｃ)を発現する膀胱癌細胞株は、Ｒ３Ｍａｂ又はハイブリドーマ抗体１Ｇ６又は６Ｇ１にて４〜２４時間処理し、次いで、細胞溶解物を総ＦＧＦＲ３レベルのウエスタンブロット分析のために回収した。Ｒ３ Ｍａｂによる処理はＦＧＦＲ３レベルを低減しなかったのに対して、ハイブリドーマｍａｂ １Ｇ６および６Ｇ１による処理はＦＧＦＲ３レベルを有意に低減した。これらの結果は、Ｒ３ ＭａｂはＦＧＦＲ３下方制御を促進しなかったのに対して、ｍａｂ １Ｇ６および６Ｇ１はＦＧＦＲ３レセプター内部移行と下方制御を促進したことを示唆した。異なる実験において、表面ＦＧＦＲ３レベルをＦＡＣＳ分析を使用して調べた。ＵＭＵＣ-１４細胞(ＦＧＦＲ３ Ｓ２４９Ｃ突然変異を含む)をＲ３Ｍａｂ(クローン１８４.６.１)にて２４時間処理すると、細胞表面ＦＧＦＲ３レベルはわずかに増加した。これらの結果は、Ｒ３Ｍａｂ処理がＦＧＦＲ３下方制御を促進しなかったことを示す。
【０３３０】
Ｒ３Ｍａｂは複数の腫瘍モデルにおいて増殖とＦＧＦＲ３シグナル伝達を阻害する
次に発明者等は、インビボでの膀胱癌細胞の増殖に対するＲ３Ｍａｂの効果を調べた。発明者等は、ｎｕ／ｎｕマウスにＲＴ１１２細胞(ＷＴ ＦＧＦＲ３を発現するもの)を注射し、腫瘍をおよそ１５０ｍｍ３の平均体積にまで大きくし、ベヒクル又はＲ３Ｍａｂを週２回動物に投薬した。２７日目のコントロールと比較して、５又は５０ｍｇ／ｋｇのＲ３Ｍａｂ処置はそれぞれ、腫瘍増殖をおよそ４１％又は７３％抑制した(図１３Ａ)。処置後４８時間又は７２時間に収集した腫瘍溶解物の分析は、Ｒ３Ｍａｂがリン酸化ＦＲＳ２のレベルを顕著に低減したことを示した(図１３Ｂ)。興味深いことに、総ＦＲＳ２αタンパク質レベルはＲ３Ｍａｂ処置腫瘍においても低かったことから、ＦＧＦＲ３阻害はさらにＦＲＳ２αの下方制御も引き起こすことが示唆される。また、Ｒ３Ｍａｂは、総ＭＡＰＫレベルに影響することなく、腫瘍のリン酸化ＭＡＰＫの量を下げた(図１３Ｂ)。ゆえに、Ｒ３Ｍａｂは、ＷＴ ＦＧＦＲ３によるシグナル伝達を遮断すると同時にＲＴ１１２腫瘍異種移植片の増殖を阻害する。
次に発明者等は、変異型ＦＧＦＲ３を発現する異種移植片の増殖に対するＲ３Ｍａｂの効果を調査した。Ｒ３Ｍａｂ処置は、Ｂａ／Ｆ３−ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃ腫瘍の進行を大きく低減した(図１３Ｃ)。さらに、Ｒ３Ｍａｂは、ＵＭＵＣ-１４膀胱カルチノーマ異種移植片の増殖を有意に阻害した(図１３Ｄ)。Ｒ３Ｍａｂが生体内でＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃ活性化に影響を与えるかどうか評価するために、我々は、治療の後、２４時間又は７２時間集められる腫瘍溶解物のＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃ二量体のレベルを評価した。非還元条件下での、ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃ二量体の量は、コントロール群と比較してＲ３Ｍａｂ処置腫瘍では実質的により低かったのに対して、還元条件下で検出される量で見ると、総ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃレベルはほとんど変化を示さなかった(図１３Ｅ)。細胞培養物での結果に反して、腫瘍溶解物ではＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃ単量体の見かけの蓄積が観察されなかった(図１３Ｅと１２Ａ)。これは、この試験で用いたウサギポリクローナル抗ＦＧＦＲ３抗体による非還元条件下での単量体ＦＧＦＲ３についての弱い検出感度によるものであるかもしれない(図２１)。重要なことに、Ｒ３ＭａｂもＵＭＵＣ-１４腫瘍におけるＭＡＰＫのリン酸化および活性化を有意に阻害したことから(図１３Ｅ)、Ｒ３ＭａｂはインビボでのＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃの活性を阻害することが示唆される。発明者等は、いずれのインビボ試験においても有意な体重喪失ないし他の全体的な異常を観察しなかった。さらに、マウスに行った安全性試験では、ヒト及びマウスのＦＧＦＲ３の両方に対して同じ親和性で結合するＲ３Ｍａｂは、膀胱を含むいずれの臓器においても認められる毒性を示さなかった(データは示さない)。まとめると、これらのデータは、Ｒ３Ｍａｂに複数回曝すとマウスに十分な耐性ができることを示す。
【０３３１】
多発性骨髄腫異種移植片モデルのＲ３Ｍａｂの抗腫瘍活性はＡＤＣＣを伴う
Ｒ３Ｍａｂが多発性骨髄腫の治療的能力を持つか否かを評価するために、発明者等はまず、培養中の３つのｔ(４；１４)＋細胞株の増殖および生存に対するＲ３Ｍａｂの効果を試験した。ＵＴＭＣ-２細胞はＷＴ ＦＧＦＲ３を持つが、ＯＰＭ２およびＫＭＳ１１はそれぞれＫ６５０ＥおよびＹ３７３Ｃ置換を持つ(７)。培養物では、Ｒ３Ｍａｂは、ＵＴＭＣ-２細胞のＦＧＦ９誘導性増殖を完全に抑止した(図２２Ａ)。Ｒ３Ｍａｂは、ＯＰＭ２細胞の増殖を緩やかに阻害したが、ＫＭＳ１１細胞の増殖に対しては外見上効果を示さなかった(図２２Ｂ、Ｃ)。ＵＴＭＣ-２細胞はマウスにおいて腫瘍を形成しないので、発明者等はＯＰＭ２およびＫＭＳ１１腫瘍に対するＲ３Ｍａｂの有効性を評価した。Ｒ３Ｍａｂは、両細胞株の異種移植片腫瘍増殖をほぼ完全に無効化した(図１４Ａ、Ｂ)。
インビトロ及びインビボでのＯＰＭ２およびＫＭＳ１１腫瘍細胞に対するＲ３Ｍａｂの活性の明らかな相違から、Ｒ３Ｍａｂは、これらＦＧＦＲ３過剰発現腫瘍に対してＦｃ媒介性免疫エフェクター機能を支持する可能性が示唆された。両細胞株は、補体経路の２つのインヒビターであるＣＤ５５およびＣＤ５９を高いレベルで発現する(データは示さない)。したがって、補体依存性細胞障害能は観察されなかった(データは示さない)。次いで、発明者等はＡＤＣＣに注目した。抗体が標的細胞上のその抗原と結合し、そのＦｃ領域を経て、免疫エフェクター細胞に発現されるＦｃγレセプター(ＦｃγＲ)を係合する場合に、ＡＤＣＣが生じる(３８)。インビトロでＡＤＣＣを試験するために、発明者等は、Ｒ３Ｍａｂ又はコントロール抗体の存在下で、新たに単離したヒト末しょう血単核細胞(ＰＢＭＣ)とともにＫＭＳ１１又はＯＰＭ２細胞をインキュベートした。Ｒ３Ｍａｂは、両骨髄腫細胞株に対して有意なＰＢＭＣ細胞溶解活性を媒介した(図１４Ｃ、Ｄ)。それに反して、Ｒ３Ｍａｂは、膀胱癌ＲＴ１１２又はＵＭＵＣ-１４細胞の細胞溶解を支持しなかった(図１４Ｅ、Ｆ)。スキャッチャード分析によって測定されるように、多発性骨髄腫細胞は、膀胱カルチノーマ細胞株より実質的に多い細胞−表面ＦＧＦＲ３を発現する(細胞につきおよそ５〜６倍のレセプター；図２３Ａ、Ｂ)。
インビボでのＲ３Ｍａｂの活性へのＡＤＣＣの寄与を調べるために、発明者等は、既に特徴付けしたＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ(ＤＡＮＡ)突然変異を抗体のＦｃドメインに導入した。抗体のＦｃドメイン内のこの二重置換はＦｃγＲへの結合を無効にし(３９)、これが免疫エフェクター細胞の動員を妨げる。ＤＡＮＡ突然変異は、インビトロでのＦＧＦＲ３へのＲ３Ｍａｂ結合もＦＧＦＲ３活性の阻害も変更せず、マウスでのＲ３Ｍａｂの薬物動態も変化させなかった(データは示さない)。しかしながら、ＯＰＭ２又はＫＭＳ１１異種移植片に対するインビボ活性を実質的に無効化した(図１４Ｇ、Ｈ)。それに反して、ＤＡＮＡ突然変異は、ＲＴ１１２およびＵＭＵＣ-１４膀胱癌異種移植片に対するＲ３Ｍａｂの抗腫瘍活性を変更しなかった(図２４Ａ、Ｂ)。まとめると、これらの結果は、Ｆｃ依存的なＡＤＣＣが、ＯＰＭ２およびＫＭＳ１１多発性骨髄腫異種移植片に対するＲ３Ｍａｂの有効性において重要な役割を果たすことを示唆する。
【０３３２】
更なる異種移植片試験
Ｒ３Ｍａｂ(クローン１８４.６.１Ｎ５４Ｓ)は以下の通りにさらに特徴付けした。
(ａ) Ｒ３Ｍａｂは、基本的に上述のように、肝癌細胞株(Ｈｕｈ７)に基づいて腫瘍異種移植片モデルを使用してインビボ有効性について試験した。５ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇの抗体濃度で試験すると、Ｒ３Ｍａｂはインビボで有意に腫瘍増殖を阻害した。腫瘍増殖は、コントロール動物の腫瘍増殖と比較しておよそ５０％阻害された。 
(ｂ) Ｒ３Ｍａｂは、基本的に上述のように、ＦＧＦＲ３を発現した乳癌細胞株(Ｃａｌ-５１)に基づいて腫瘍異種移植片モデルを使用してインビボ有効性について試験した。この有効性試験の結果は、およそ１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの抗体濃度で試験すると、Ｒ３Ｍａｂ抗体はインビボの腫瘍を阻害することが可能であったことを示した。腫瘍増殖は、コントロール動物の腫瘍増殖と比較しておよそ３０％阻害された。
考察
予後の悪いｔ（４；１４）＋多発性骨髄腫患者とＦＧＦＲ３過剰発現との間の関連および幾つかの実験モデルにおける活性型ＦＧＦＲ３の形質転換活性は、ＦＧＦＲ３を決定的な発癌駆動体として確立し、したがって、この血液悪性腫瘍における潜在的な治療標的として確立している。対照的に、膀胱癌腫におけるＦＧＦＲ３の高頻度の変異および／または過剰発現の報告にもかかわらず、この上皮悪性腫瘍におけるＦＧＦＲ３シグナル伝達の重要な役割は、インビボで確立されていない。さらに、膀胱癌におけるＦＧＦＲ３の治療可能性は、未だ見出されていない。我々は、ＦＧＦＲ３による遺伝的または薬理学的介入が、マウスにおいて幾つかのヒト膀胱癌異種移植片の増殖を阻害することを示す。これらの結果は、ＦＧＦＲ３機能は、この設定において腫瘍増殖に決定的であることを実証し、このレセプターの発癌駆動体および膀胱癌における治療標的としての潜在的重要性を明示する。ＦＧＦＲ３機能の遮断は、ＷＴまたは変異ＦＧＦＲ３いずれかの異種移植片発現の増殖を同様に阻害し、そのことにより、このレセプターの両方の形態が、膀胱腫瘍進行に有意に寄与し得ることを示唆する。膀胱癌におけるよりもずっと頻度が低いが、ＦＧＦＲ３変異または過剰発現は、他の充実性悪性腫瘍においても見出されていて、これらとしては、子宮頸癌（４０）、肝細胞癌（４１）および非小細胞肺癌（４２、４３）が挙げられ、さらなる種類の上皮癌に対するＦＧＦＲ３の寄与の可能性を示唆する。
多様な悪性腫瘍におけるＦＧＦＲ３の明らかな関与は、このレセプターを、標的治療の興味深い候補と考えられる。ＦＧＦＲ３キナーゼ活性を阻害し得る低分子化合物は記載されているが、ＦＧＦＲファミリー内のキナーゼドメインの近密な相同性は、ＦＧＦＲ３選択的インヒビターの開発を妨げる。報告されたインヒビターの選択性の欠如は、特定の癌の種類の生物学に対するＦＧＦＲ３の相対的な寄与を見分けることを困難にする；さらに、最大投薬レベルをキャッピングし、したがってＦＧＦＲ３の最適阻害を限定することにより、安全性の義務を保持し得る。したがって、ＦＧＦＲ３の選択的かつ特異的標的化を達成するために、我々は、抗体ベースの戦略に立ち返る。我々は、最適な治療抗体は、ＷＴをブロックし得るのみならず、ＦＧＦＲ３の癌関連突然変異にも打ち勝つことを証明する。さらに、ＦＧＦＲ３の二量体化はその活性化に決定的であるので、リガンド結合をブロックするのみならずレセプター二量体化を妨害する抗体が、より優れている場合がある。さらなる望ましい特性としては、Ｆｃ-媒介型エフェクター機能を支持する能力、および全長抗体の天然のフレームワークによって与えられる長い血清半減期が挙げられる。我々は、抗体分子を同定するための我々のスクリーニングおよび操作の努力に集中した。これは、これらの特徴全てを合わせて、Ｒ３Ｍａｂの発生へと導いた。結合研究は、Ｒ３Ｍａｂが、リガンドと競合してＦＧＦＲ３のＩＩＩｂアイソフォームとＩＩＩｃアイソフォームとの両方と相互作用する能力を実証した。形質移入されたＢａＦ／３細胞株によるさらなる実験は、Ｒ３ＭａｂがＷＴと蔓延している癌関連ＦＧＦＲ３変異体との両方をブロックする顕著な能力を確認した。さらに、Ｒ３Ｍａｂは、幾つかの膀胱癌の異種移植片モデル（この疾患における最も一般的なレセプターの変異体であるＷＴＦＧＦＲ３またはＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃのいずれかを発現する）において、有意な抗腫瘍活性を働かせた。薬理動態学研究は、これらのモデルにおける抗腫瘍活性Ｒ３Ｍａｂは、ＦＧＦＲ３シグナル伝達の阻害に基づき、このことは、下流のメディエータＦＲＳ２αおよびＭＡＰＫの低減したリン酸化によって明らかである。これらのデータは、我々のＦＧＦＲ３  ｓｈＲＮＡ研究によって実証されたとおり、ＦＧＦＲ３は膀胱癌進行に必要であるという結論をさらに補強する。
膀胱癌におけるＦＧＦＲ３変異は、充実性悪性腫瘍におけるタンパクキナーゼの最も頻繁な発癌性改変の１つを表し、これは、メラノーマにおけるＢ-Ｒａｆの一般的な変異（４５）を思い起こさせる。ＦＧＦＲ３における変異の活性化のほとんどは、不対のシステインを生じ、これは、リガンド非依存性レセプター二量体化および種々の程度の構成的活性化を導く。一価の抗ＦＧＦＲ３  Ｆａｂフラグメントを用いた以前の研究は、特定のＦＧＦＲ３変異体に対する差次的阻害活性を示した（４６）；しかし、この可変の効果の分子基盤は、調査されていない。一価の抗体フラグメントと比較して、二価の抗体は、抗原のクラスター形成を誘導する能力を有し、レセプターチロシンキナーゼの場合には、レセプターオリゴマー化および活性化を引き起こし得る。全長の、二価の構造にもかかわらず、Ｒ３Ｍａｂは、ＷＴ  ＦＧＦＲ３および広範な範囲のＦＧＦＲ３変異体（リガンド依存的（ＦＧＦＲ３Ｇ３７２Ｃ、ＦＧＦＲ３Ｙ３７５Ｃ）、構成的活性型（ＦＧＦＲ３Ｒ２４８Ｃ、ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃ）、またはその両方（ＦＧＦＲ３Ｋ６５２Ｅ）である改変体を含む）の普遍的な阻害を示す。これらの結果は、以下の疑問を引き起こす：いかにしてＲ３ＭａｂはＷＴと種々のＦＧＦＲ３変異体（ジスルフィド結合改変体を含む）との両方に対して拮抗するのか？
ＦＧＦＲ１との配列アラインメントに基づき、Ｒ３Ｍａｂによって認識されるペプチドエピトープは、リガンドおよびヘパリンへの結合ならびにレセプター二量体化に関与するＦＧＦＲ３残基と重なっている。この結論は、Ｒ３ＭａｂとＦＧＦＲ３の細胞外領域との複合体の結晶学研究によって確認された。Ｘ線構造は、この抗体が、リガンド-レセプター相互作用ならびにレセプター-レセプター接触のために決定的であるＩｇＤ２およびＩｇＤ３の領域と結合する。したがって、Ｒ３Ｍａｂは、リガンド結合およびレセプター二量体化の妨害について、ＷＴ  ＦＧＦＲ３の両方をブロックし得る。Ｒ３Ｍａｂは、ＦＧＦＲ３Ｋ６５２Ｅを阻害するために類似のメカニズムを使用し得る。ＦＧＦＲ３Ｋ６５２Ｅは、低い構成活性を有するが、リガンドに完全な活性化を要求する。さらに、Ｒ３Ｍａｂ結合は、ＩｇＤ２に関して、ＦＧＦＲ３  ＩｇＤ３の相対的な配向を変える。この知見は、この抗体が、シグナル伝達に貢献しない構造を強いることによって、レセプター活性を阻害し得るという形式的な可能性（さらなる研究を必要とする概念）を惹起する。
いかにしてＲ３Ｍａｂが不対システインを有するＦＧＦＲ３改変体をブロックするのかに関する識見をより得るために、我々は、最も一般的な変異体であるＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃを、より詳細に分析した。遊離のスルフヒドリルブロッカーＤＴＮＢによる実験は、ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃのモノマー状態とダイマー状態との間の動的平衡を示した。外因性の酸化還元調節因子によって調整される酸価状態と還元状態との間の類似の平衡が、ＮＭＤＡレセプターについて報告されている（４６）。ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃを発現している膀胱癌細胞のＲ３Ｍａｂと一緒のインキュベーションは、レセプターダイマーの量を低下させ、同時にモノマーのレベルを上昇させる。さらに、ＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃの精製ＩｇＤ２-Ｄ３フラグメントは、溶液中にダイマーを形成した；Ｒ３Ｍａｂと共にインキュベートした場合、ダイマーは、着実に消滅し、一方、モノマーＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃが蓄積した。構造分析と考えあわせると、これらの結果は、Ｒ３ＭａｂがモノマーＦＧＦＲ３Ｓ２４９Ｃを捕捉し、その二量体化を阻害することを示唆する。時間経過と共に、Ｒ３Ｍａｂは、モノマー状態に向かう平衡に映り、構成的レセプター活性をブロックする。このメカニズムはまた、いかにしてＲ３ＭａｂがＦＧＦＲ３の他のシステイン変異体を阻害するかを説明し得る。
本研究の別の重要な知見は、インビボにおけるｔ（４；１４）＋多発性骨髄腫細胞株ＯＰＭ２およびＫＭＳ１１に対するＲ３Ｍａｂの強力な抗腫瘍活性であった。対照的に、Ｒ３Ｍａｂは、培養におけるこれらの細胞の増殖または生存に対し、中程度から最小限までの影響を有した。ＯＰＭ２細胞およびＫＭＳ１１細胞は、ＦＧＦＲ３の比較的高い細胞表面レベルを発現する（ＲＴ１１２膀胱癌腫細胞およびＵＭＵＣ-１４膀胱癌腫細胞よりも５?６倍高い）。これらの高い抗原密度は、Ｒ３ＭａｂがＦｃγＲ-保有免疫エフェクター細胞の効率的な漸加およびＡＤＣＣの活性化を支持することを許容し得る。実際、ヒトＰＢＭＣの存在下で、Ｒ３Ｍａｂは、ＯＰＭ２細胞およびＫＭＳ１１細胞の細胞溶解を媒介するが、ＲＴ１１２膀胱癌細胞またはＵＭＵＣ-１４膀胱癌細胞にはしなかった。さらに、ＦｃγＲ結合ができないＲ３ＭａｂのＤＡＮＡ変異体版は、インビボでＫＭＳ１１またはＯＰＭ２の増殖に影響を有さなかったが、Ｒ３Ｍａｂに類似のＲＴ１１２腫瘍およびＵＭＵＣ-１４腫瘍の増殖はなお抑制する。合わせると、これらのデータは、Ｒ３Ｍａｂが抗腫瘍活性の二重メカニズムを有することを示す：（ａ）低い表面レベルのＷＴまたは変異体ＦＧＦＲ３を発現する細胞において、リガンド依存性シグナル伝達または構成的シグナル伝達をブロックする；（ｂ）比較的高い表面ＦＧＦＲ３レベルを発現する細胞において、ＡＤＣＣを誘導する。
我々の結果はまた、幾つかの新たな疑問を惹起する。第１に、本研究で試験された膀胱癌細胞株は、Ｒ３Ｍａｂに対して何故変動する感受性を示したのか分からない。このような差次的な反応は、標的治療において一般的であるが、個々の腫瘍の異なった遺伝的構造の反映であり得る。実際、Ｈｅｒ２-陽性乳癌細胞は、抗-Ｈｅｒ２抗体に対して変動する感受性を示し（４８）、これは、抗-ＥＧＦＲ抗体に対する種々の癌細胞が示す（４９）のと同様である。この文脈において、ＷＴおよび変異体ＦＧＦＲ３を有する、膀胱癌についてのさらなるインビボモデルの開発が、動物におけるＦＧＦＲ３分子に対する感受性を評価するために、緊急に必要である。さらに、予測的なバイオマーカーの解明は、ＦＧＦＲ３-標的治療より最適な利益を得ることができる患者を同定することを助け得る。第２に、Ｒ３Ｍａｂは我々が試験したモデルにおいて腫瘍回帰を誘導しないので、未来の研究は、Ｒ３Ｍａｂが確立した治療剤と恊働できるか否かを探求しなければならない。
結論において、我々の知見は、膀胱癌増殖に重要であるとしてＷＴおよび変異体ＦＧＦＲ３の両方に関係し、したがって、血液性悪性腫瘍から上皮性悪性腫瘍まで、インビボでのこのレセプターの発癌性の関与を拡張する。さらに、我々の結果は、ＷＴおよび変異体ＦＧＦＲ３の両方が、腫瘍において完全長の抗体に効果的に標的化され得、この完全長の抗体は、リガンド結合、レセプター二量体化およびシグナル伝達をブロックする能力と、ＡＤＣＣによる腫瘍細胞溶解を促進させる能力とを合わせることを実証する。これらの結果は、本レセプターに関連する多様な悪性腫瘍における抗体ベースのＦＧＦＲ３-標的治療を調査するための、強力な理論的根拠を提供する。
【０３３３】
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【０３３４】
前述の本発明は、理解を明確にするために図と実施例とを挙げてある程度詳細に記述されているが、この記述及び実施例は本発明の範囲を制限するように解釈されるものではない。
【図１Ａ】
0005757534.tif 000011
【図１Ｂ】
0005757534.tif 000012
【図１Ｃ】
0005757534.tif 000013
【図２Ａ】
0005757534.tif 000014
【図２Ｂ】
0005757534.tif 000015
【図３Ａ】
0005757534.tif 000016
【図３Ｂ】
0005757534.tif 000017
【図４】
0005757534.tif 000018
【図５】
0005757534.tif 000019
【図６】
0005757534.tif 000020
【図７Ａ−Ｃ】
0005757534.tif 000021
【図７Ｄ】
0005757534.tif 000022
【図８Ａ−Ｅ】
0005757534.tif 000023
【図９Ａ−Ｃ】
0005757534.tif 000024
【図９Ｄ−Ｈ】
0005757534.tif 000025
【図１０Ａ−Ｂ】
0005757534.tif 000026
【図１０Ｃ−Ｆ】
0005757534.tif 000027
【図１１Ａ−Ｅ】
0005757534.tif 000028
【図１２Ａ−Ｃ】
0005757534.tif 000029
【図１３Ａ−Ｃ】
0005757534.tif 000030
【図１３Ｄ−Ｅ】
0005757534.tif 000031
【図１４Ａ−Ｄ】
0005757534.tif 000032
【図１４Ｅ−Ｈ】
0005757534.tif 000033
【図１５Ａ−Ｂ】
0005757534.tif 000034
【図１５Ｃ−Ｄ】
0005757534.tif 000035
【図１６Ａ】
0005757534.tif 000036
【図１６Ｂ】
0005757534.tif 000037
【図１７】
0005757534.tif 000038
【図１８Ａ−Ｂ】
0005757534.tif 000039
【図１９Ａ−Ｅ】
0005757534.tif 000040
【図２０Ａ−Ｂ】
0005757534.tif 000041
【図２１】
0005757534.tif 000042
【図２２Ａ−Ｃ】
0005757534.tif 000043
【図２３Ａ】
0005757534.tif 000044
【図２３Ｂ】
0005757534.tif 000045
【図２４Ａ−Ｂ】
0005757534.tif 000046
【配列表】
0005757534000001.app