(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類間質幹細胞の集団であって、該細胞の３０％またはそれ以上がＳｙｎｄｅｃａｎ−２について陽性である、細胞の集団。
【請求項２】
前記細胞がマウス、ラット、ウマまたはヒト細胞である、請求項１に記載の細胞の集団。
【請求項３】
前記細胞がヒト細胞である、請求項２に記載の細胞の集団。
【請求項４】
前記細胞の４０％またはそれ以上がＳｙｎｄｅｃａｎ−２について陽性である、請求項１から３のいずれかに記載の細胞の集団。
【請求項５】
前記細胞の５０％またはそれ以上がＳｙｎｄｅｃａｎ−２について陽性である、請求項１から４のいずれかに記載の細胞の集団。
【請求項６】
前記細胞の７５％またはそれ以上がＳｙｎｄｅｃａｎ−２について陽性である、請求項１から５のいずれかに記載の細胞の集団。
【請求項７】
間質幹細胞の単離方法であって、Ｓｙｎｄｅｃａｎ−２の発現に基づき哺乳類細胞の混合集団から細胞を単離する工程を含む、方法。
【請求項８】
ヒト細胞の単離のための、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
マウス、ラットまたはウマ細胞の単離のための、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記哺乳類細胞の混合集団が、骨髄、脂肪組織、骨格筋、子宮内膜、胎盤、臍帯血、臍帯、ウォートンジェリーおよび多能性細胞由来細胞から選択される供給源から得られる、請求項７から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
骨形成細胞および脈管形成細胞の単離のための、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
間質細胞の単離のための、請求項７から１１のいずれかに記載の方法であって、それらの単離された細胞から細胞の集団を誘導する工程をさらに含む、方法。
【請求項１３】
細胞のクローン性集団を得る方法であって、請求項７から１１のいずれかに記載の方法に従って単一細胞を単離する工程；および該単一細胞から細胞のクローン性集団を誘導する工程を含む、方法。
【請求項１４】
組織を得る方法であって、請求項７から１３のいずれかに従って細胞を得る工程、およびそこから組織を得る工程を含む、方法。
【請求項１５】
前記組織が骨である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記組織が軟骨である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記組織が腱である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１から６のいずれかに記載の細胞の使用を含むアッセイ。
【請求項１９】
動物において疾患または障害を治療するための医薬組成物であって、請求項１から６のいずれかに記載の細胞を含む、組成物。
【請求項２０】
前記動物がヒトである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水を含み、かつ必要に応じて、ジメチルスルホキシド、ヒト血清アルブミン、ヒアルロン酸およびコラーゲンの１つ以上もまた含む、請求項１９または２０に記載の組成物。
【請求項２２】
動物の疾患または障害の治療に使用するための、請求項１から６のいずれかに記載の細胞。
【請求項２３】
前記動物がヒトである、請求項２２に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞を単離する方法、単離した細胞から得られた幹細胞の集団、およびそれらの集団の使用ならびにそれから誘導された細胞および組織の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９６０年代から７０年代にかけて、Friedensteinとその仲間達は、骨形成能−骨髄（ＢＭ）細胞の異所移植により明らかにされた−が、ＢＭ単核細胞（ＭＮＣ）のマイナーな亜集団と関連したことを示した（Friedenstein、１９９０にて概説）。これらのＭＮＣは、それらがプラスチックの組織培養容器に迅速に接着すること、および培養におけるそれらの後代が線維芽細胞様の外観を示すことにより、造血ＭＮＣの大部分から区別可能であり、このことは、ＢＭの間質部分起源であることを示唆した。ＢＭ間質を供給源として樹立するとともに、Friedenstein、Owenと仲間達は、ＢＭ細胞懸濁液をクローン密度で播種することが、単一細胞から始まる別々のコロニーの樹立を生じたことを示すことによって、第２のブレークスルーをもたらした（線維芽細胞様コロニー形成単位、ＣＦＵ−Ｆ［Friedensteinら、１９７０］）。
【０００３】
FriedensteinおよびOwenは後に、このＣＦＵ−Ｆ生成細胞を間質幹細胞（ＳＳＣ）と称した（OwenおよびFriedenstein、１９８８）。本明細書中でＳＳＣと言う場合、その最初の細胞の定義に基づいている。
【０００４】
ＢＭ由来ＳＳＣは、骨、脂肪または軟骨を生じ、かつ強力な免疫調節および血管由来のタンパク質を分泌するプラスチック接着性（ＰＡ）で線維芽細胞様ＭＮＣの混合した集団において同定され得る。前臨床研究は、ＰＡ−ＳＳＣがインビボで強力な免疫調節および脈管形成応答を仲介することを示している。最近、臨床試験は、４０の異なる変性疾患、自己免疫疾患および虚血性疾患においてＰＡ−ＳＳＣを試験している。
【０００５】
ヒト骨髄中、８００００ＭＮＣ毎に約１つのＢＭ単核細胞（ＭＮＣ）が、ＣＦＵ−Ｆ形成ＳＳＣである。今日までに、最も簡単でよく使用される、ＢＭからこれらのＳＳＣを単離する方法は、前述の組織培養プラスチックへの接着性に依存し、これによれば、ＭＮＣを１０−１４日間培養させるものであり、その間に、ＣＦＵ−Ｆが、１：８００００の認識頻度で接着し、コロニーを形成する。１０−１４日目に、これらのＣＦＵ−Ｆをトリプシン切断により収穫し、血清豊富な培地に１ｃｍ２あたり３−８０００ＣＦＵ−Ｆの密度で再プレーティングする。次いで、これらのＣＦＵ−Ｆを、生化学的および細胞学的評価ができる十分な細胞数が得られるまで、インビトロで増殖させる。このアプローチは広く使われているが、臨床使用のためのＳＳＣの定義づけや精製には不十分と見なされている。なぜなら、プレーティングされた１：８００００のＢＭＭＮＣのみがＳＳＣであり、この方法は、関連製品の臨床認可に必要な適正製造基準（good manufacturing protocols）を満たさない。
【０００６】
それゆえ、先行技術では、幹細胞集団は、プラスチック表面に接着する初期能力に基づいて同定されてきた。この最初のスクリーニングから、表面上で個々のコロニー形成単位からクローン性集団として、細胞集団が得られる。これらはまた、文献中で「間葉系幹細胞」と名付けられていた。しかし、単離された細胞中には非間葉系幹細胞も含まれ得るため、この用語は不正確かもしれない。既知の単離アプローチでは、これらの既知の細胞集団は、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）およびＣＤ２７１について陽性である幹細胞に由来する。それにもかかわらず、臨床上の観点では、これらの細胞は本質的に未同定である。
【０００７】
これらの既知の単離細胞から、例えば、単一の単離細胞からのクローン増幅（clonal expansion）によって、細胞集団が調製され、そして移植に使用される。しかしながら、結果は様々であり、移植した細胞集団が、バッチ毎にやや異なり、かつ予期し得ない要素を伴って挙動する場合がある。
【０００８】
先行技術の細胞集団は、骨および脂肪および軟骨を形成する傾向にあるが、制御が制限されており、骨または軟骨が必要な場合に、しばしば脂肪を生産する。逆に、例えば、脂肪を生産する細胞を得ることが好まれる際には、これらの脂肪産生細胞は不確かにしか得られない。
【０００９】
顕著な問題は、開始する細胞集団が本質的に未確定であることである。プラスチックへの接着に基づく単離は、細胞型の十分に技術的な確定（definition）ではない。例えば、先述のマーカー（ＡＬＰおよびＣＤ２７１）について選択した場合でさえ、細胞または子孫におけるこれらのマーカーの発現は培養に際して急速に消失し、効果的に不確定な集団を残す。細胞の有用な特性もまた、時間とともに減少または消失する−不確定な細胞集団と共にもう一つの問題である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の全体的な目的は、少なくとも当該技術の代替となる、間質幹細胞および細胞集団およびそれらに由来する組織の単離方法を提供することであり、そして本発明の特定の実施形態の目的は、例えば、得られた細胞の増大された確定を通じて、改良されている方法、または、例えば、それらを臨床応用により適したものにする、それらの特性の増大された信頼性によって、改良されている細胞および組織を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、複数の哺乳類種において発現されるマーカーまたは抗原の発現に基づく、間質幹細胞、特にヒト間質幹細胞の予測単離（prospective isolation）に基づく。本発明の方法および細胞集団において、細胞は、特定の異種間のマーカーの発現に基づきソートされ（これを予測単離という）、次いで、細胞の培養物を得、細胞の同定に任せ、すなわち、線維芽細胞のコロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｆ）であり、クローン増幅され得る。クローン増幅後に得られた細胞集団は、その後、治療、移植および他の用途に提案される。
【００１２】
したがって、本発明は、間質幹細胞の単離方法であって、マーカーの発現に基づき哺乳類細胞の混合集団から細胞を単離する工程を含み、ここで
該マーカーが抗体に結合し、かつここで
該抗体が、ヒト、マウス、ラット、ウマ、ウサギおよびブタ細胞から選択される少なくとも１つの他の哺乳類種の細胞上に見出されるマーカーと交差反応する、方法を提供する。
【００１３】
本発明は、間質幹細胞の単離方法であって、マーカーの発現に基づき哺乳類細胞の混合集団から細胞を単離する工程を含み、ここで該マーカーが該哺乳類細胞によって発現され、かつここで対応するマーカーがまた、ヒト、マウス、ラット、ウマ、ウサギおよびブタ細胞から選択される少なくとも１つの他の哺乳類種の細胞上で発現される、方法を提供する。
【００１４】
好ましくは、マーカーは、ヒト間質幹細胞およびマウス間質幹細胞上、またはヒト間質幹細胞およびラット間質幹細胞上、またはこれら３つ全ての上で見出される。ある実施形態では、マーカーはＳＤＣ２である。
【００１５】
より具体的には、本発明は、ヒト間質幹細胞の単離方法を提供し、この方法は、ＣＤ４５について陰性でありかつさらなる細胞表面マーカーについて陽性であるヒト骨髄由来の細胞の単離を含み、ここで該さらなる細胞表面マーカーは抗体に結合し、かつここで該抗体は、マウス、ラット、ウマ、ウサギおよびブタ細胞から選択される少なくとも１つの他の哺乳類種の細胞上に見出される細胞表面マーカーと交差反応する。より具体的には、本発明は、ヒト間質幹細胞の単離方法を提供し、この方法は、ＦＡＰアルファについて陽性でありかつさらなる細胞表面マーカーについて陽性であるヒト骨髄由来の細胞の単離を含み、ここで該さらなる細胞表面マーカーは抗体に結合し、かつここで該抗体は、マウス、ラット、ウマ、ウサギおよびブタ細胞から選択される少なくとも１つの他の哺乳類種の細胞上に見出される細胞表面マーカーと交差反応する。
【００１６】
好ましくは、さらなるマーカーは、ヒト間質幹細胞およびマウス間質幹細胞上、またはヒト間質幹細胞およびラット間質幹細胞上、または３つ全ての上に見出される。ある実施態様においては、さらなるマーカーはＮＧ２または、特にＳＤＣ２である。
【００１７】
細胞の集団を得る方法もまた提供され、この方法は、本発明に従って細胞を単離する工程、およびそれらの単離された細胞から集団を誘導する工程を含む；そして細胞のクローン性集団を得る方法が提供され、この方法は、本発明に従って単一細胞を単離する工程、およびその単一細胞から細胞のクローン性集団を誘導する工程を含む。
【００１８】
それにより得られた細胞もまた、本発明により提供される−それゆえ、間質細胞（好ましくは間質幹細胞）の集団は、マーカーに関して濃縮されている。濃縮は、細胞３０％またはそれ以上、３５％またはそれ以上、４０％またはそれ以上が、マーカーについて陽性である細胞であり得る。ある実施形態では、マーカーはＮＧ２または、特にＳＤＣ２である。
【００１９】
本発明の特定の細胞集団が、
ヒト間質幹細胞を提供し、
ヒト間質幹細胞から細胞のクローン性集団を誘導し、そして
必要に応じて、培養において細胞をさらに増殖（growing）および／または増幅（expanding）および／または継代させることにより得られ、
ここで該ヒト間質幹細胞は、骨髄から単離され、ＣＤ４５の発現について陰性であり、かつ該さらなる細胞表面マーカーの発現について陽性であり、
ここで該さらなる細胞表面マーカーは、抗体に結合し、ここで該抗体は、マウス、ラット、ウマ、ウサギおよびブタ細胞から選択される少なくとも１つの他の哺乳類種の細胞上に見い出される細胞表面マーカーと交差反応する。
【００２０】
本発明のさらなる特定の細胞集団が、
ヒト間質幹細胞を提供し、
ヒト間質幹細胞から細胞のクローン性集団を誘導し、そして
必要に応じて、培養において細胞をさらに増殖および／または増幅および／または継代させることにより得られ、
ここで該ヒト間質幹細胞は、骨髄から単離され、ＦＡＰアルファの発現について陽性であり、かつ該さらなる細胞表面マーカーの発現について陽性であり、ここで該さらなる細胞表面マーカーは、抗体に結合し、ここで該抗体は、マウス、ラット、ウマ、ウサギおよびブタ細胞から選択される少なくとも１つの他の哺乳類種の細胞上に見い出される細胞表面マーカーと交差反応する。
【００２１】
細胞の使用（例えば、アッセイにおける）がそうであるように、本発明により、細胞からの生産物（例えば、骨、軟骨腱および他の間質幹細胞生産物）が提供される。
【００２２】
本発明は、特定のマーカー発現に基づく所望の間質幹細胞の同定を可能にし、予測的に（prospectively）精製されかつ確定した細胞およびそれらから誘導された集団を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、ヒト肺線維芽細胞ではなく、ヒト間質幹細胞の抗ＳＤＣ２抗体による標識を示す。緑色の線は、細胞の抗ＳＤＣ２−ＡＰＣ染色を示す。赤色の線は、適当な対照抗体（ラットＩｇＧ２Ｂアイソタイプ対照−ＡＰＣ；Ｒ＆Ｄ＃ＩＣ０１３Ａ；クローン−１４１９４５）での標識を示す。青色の線は、抗ＰＤＧＲＦＲａ−ＡＰＣ抗体（R&D Systems＃ＦＡＢ１２６４Ａ；クローン−ＰＲａ２９２）を用いたＭＲＣ５の陽性対照標識を示す。
【図２】図２は、ＣＤ２７１ｂｒｉｇｈｔ／ＤＣ４５ｌｏｗヒト骨髄単核細胞のＳＤＣ２−ＡＰＣ抗体による標識を示す。データは、前述のＳＤＣ２−ＡＰＣ、ＣＤ２７１−ＰＥおよびＣＤ４５―ＦＩＴＣ（両方ともＢＤより）で染色した３．５×１０７ＢＭＭＮＣの蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）プロファイルを示す。ＣＤ４５−ＦＩＴＣ染色は、ＢＭＭＮＣを３つの集団、（Ａ）ＣＤ４５−ｖｅ−青、（Ｂ）ＤＣ４５ｌｏｗ−オレンジおよび（Ｃ）ＣＤ４５ｈｉｇｈ−グリーンへのゲーティングを可能にした。（Ｂ）において、希少ＴＰ  ＳＤＣ＋ｖｅ／ＣＤ２７１ｂｒｉｇｈｔ／ＤＣ４５ｌｏｗ細胞は青色である；
【図３】図３は、ＳＤＣ＋／ＣＤ２７１ｂｒｉｇｈｔ／ＤＣ４５ｌｏｗでソートされた骨髄単核細胞におけるＣＦＵ−Ｆの促進された濃縮を示す。データは、前述のＳＤＣ２−ＡＰＣ、ＣＤ２７１−ＰＥおよびＣＤ４５−ＦＩＴＣ（両方ともＢＤより）で染色された１０７ＢＭＭＮＣの蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）プロファイルを示す；
【図４】図４は、９６ウェルプレートの、細胞あたりのＳＤＣ＋／ＣＤ２７１ｂｒｉｇｈｔ／ＣＤ４５単核細胞数の関数としてクローンが形成されなかったウェルの百分率を示す。
【図５】図５は、クローンの集団倍加数を示す。
【図６】図６は、インビトロにおける２％および１９％の酸素分圧でのＳＤＣ２＋間質幹細胞のＧＡＧ堆積を示す。ＳＤＣ２＋ＳＳＣ誘導微量ペレットからの代表的なサフラニンＯ染色組織切片を示す。
【図７】図７は、インビトロにおけるＳＤＣ２＋およびＳＤＣ２−（それぞれＳ２＋およびＳ２−と記した）間質幹細胞の脂質堆積を示す。
【図８】図８は、インビトロにおける骨形成刺激に応答したＳＤＣ２＋およびＳＤＣ２−間質幹細胞のカルシウム堆積を示す。
【図９】図９は、インビトロにおける軟骨形成刺激に応答したＳＤＣ２＋およびＳＤＣ−間質幹細胞のＧＡＧ堆積を示す。
【図１０】図１０は、インビトロの血管形成刺激に応答したＳＤＣ２＋およびＳＤＣ２−間質幹細胞の相対的なＨＵＶＥＣ臍帯形成を示す。
【図１１】図１１は、希少ＣＤ４５−／ＳＤＣ＋ヒト骨髄単核細胞が間質幹細胞マーカーＣＤ２７１、ＣＤ１４６およびＮＧ２を発現することを示す。
【図１２】図１２は、ウサギ骨髄から単離された間質幹細胞のＳＤＣ２の発現を示す。
【図１３】図１３は、コンフルエンスでのウマ骨髄に由来する間質幹細胞におけるＳＤＣ２レベルの増加を示し、ブタ骨髄に由来する間質幹細胞は低酸素分圧においてＳＤＣ２を発現する。
【図１４】図１４は、コンフルエンスでのラット骨髄の３株に由来する間質幹細胞におけるＳＤＣ２のレベルの増加を示す。
【図１５】図１５は、ＳＤＣ２およびＳｃａＩについての共染色によるＣＤ４５−単核細胞のＦＡＣＳ単離を示す。
【図１６】図１６は、ＳＤＣ＋／ＳｃａＩ選択されたマウス単核細胞におけるＣＦＵ−Ｆの促進された濃縮を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
それゆえ、本発明は、間質幹細胞の単離方法であって、細胞表面マーカーの発現に基づき哺乳類細胞の混合集団から細胞を単離する工程を含み、ここで
該細胞表面マーカーが抗体に結合し、かつここで
該抗体が、ヒト、マウス、ラット、ウマ、ウサギおよびブタ細胞から選択される少なくとも１つの他の哺乳類種の細胞上に見出される細胞表面マーカーと交差反応する、
方法を提供する。
【００２５】
抗体は、ヒト細胞上の細胞表面マーカーを認識し得、かつマウス、ラット、ウマ、ウサギおよびブタ細胞から選択される少なくとも１つの他の哺乳類細胞上の細胞表面マーカーと交差反応し得る。使用時に、そのような方法は、ヒト、マウス、ラット、ウマ、ウサギおよびブタ細胞、特にヒト細胞の単離に適している。
【００２６】
抗体は、ウマ細胞上の細胞表面マーカーを認識し得、かつヒト、マウス、ラット、ウサギおよびブタ細胞から選択される少なくとも１つの他の哺乳類細胞上の細胞表面マーカーと交差反応し得る。使用時に、そのような方法は、ヒト、マウス、ラット、ウマ、ウサギおよびブタ細胞、特に、ウマ細胞の単離に適している。
【００２７】
同様に、本発明は、間質幹細胞の単離方法であって、細胞表面マーカーの発現に基づき哺乳類細胞の混合集団から細胞を単離する工程を含み、ここで該細胞表面マーカーが該哺乳類細胞によって発現され、かつここで対応する細胞表面マーカーがまた、ヒト、マウス、ラット、ウマ、ウサギおよびブタ細胞から選択される少なくとも１つの他の哺乳類種の細胞上で発現される、方法を提供する。
【００２８】
例えば、ヒト細胞を単離するために、マーカーは、ヒト細胞上で発現され得、かつ対応するマーカーは、マウス、ラット、ウマ、ウサギ、およびブタ細胞から選択される少なくとも１つの他の哺乳類細胞上で発現され得る。例えば、ウマ細胞を単離するために、抗体は、ウマ細胞上で発現され得、かつ対応するマーカーは、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびブタ細胞から選択される少なくとも１つの他の哺乳類細胞上で発現され得る。ヒト細胞上のマーカーへの結合に基づいてヒト細胞をソートするために抗体が用いられ得、かつその同じ抗体が他の哺乳類種の細胞をソートするために用いられ得る場合、マーカーは対応するマーカーである。
【００２９】
それゆえ、本発明の予測間質幹細胞単離は、共通の抗体への異なる哺乳類種のマーカーの結合を参照して、種を超えて見出されるマーカーを使用する。以下に記載する特定の実施形態では、ヒトＳＤＣ２に対する抗体は、ヒト間質幹細胞に結合して、これを単離するのに使用され得、かつまた、マウス、ラット、ウマおよびウサギにおける間質幹細胞にも結合して、これを単離するために使用され得る。
【００３０】
抗体は、少なくとも３種の、少なくとも４種、または少なくとも５種の哺乳類種の細胞上のマーカーと結合し得、または交差反応し得る。
【００３１】
別に、本発明は、間質幹細胞集団を得る、または誘導する方法を提供し、この方法は、例えば、ヒト間質幹細胞の単離のために、ヒトと、マウス、ラット、ウサギ、ウマおよびブタ細胞の少なくとも他の１つとにおいて同様に発現されるマーカーの発現に基づく細胞の予測単離を含む。
【００３２】
本発明のある実施形態では、間質幹細胞は、少なくともヒトおよびマウス間質幹細胞において、少なくともヒトおよびラット間質幹細胞において、または、少なくともヒト、マウスおよびラット間質幹細胞において発現されるマーカーの発現に従って単離される。それゆえ、例えば、ＳＤＣ２に対する抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、ウマおよびラットにおける間質幹細胞の対応する集団を単離するのに用いられ得る。ＮＧ２およびＦＡＰアルファに対する他の既知の抗体（その詳細は下記）が、ヒト、マウスおよびラットにおける間質幹細胞の対応する集団を単離するのに用いら得る。それゆえ、両方または３つ全ての種からの対応する間質幹細胞集団およびその誘導物が、平行して、または比較するために、または、他の間質幹細胞に関する研究をするに先だって１つの種の間質細胞の分析を行うために得られる。
【００３３】
それらから幹細胞を単離するために出発細胞の様々な供給源が適している。ある供給源は、哺乳類細胞の混合集団であり、骨髄、脂肪組織、骨格筋、子宮内膜、胎盤、臍帯、臍帯血およびウォートンジェリーであり得る。ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ウマおよびブタ細胞の供給源が用いられ得、そして特定の例では、ヒト細胞が用いられてきた。実施例で用いられた１つの供給源は、骨髄であり、そして特定の好ましい供給源は、ヒト骨髄である。他の供給源は、細胞であり、例えばＳＳＣであり、ヒト多能性細胞に由来するものである。一例では、ｈＥＳ細胞由来のヒトＳＳＣを使用した。
【００３４】
本発明の使用にあたっては、初期ソートは、第一のマーカー（例えば、ＳＤＣ２）の発現のみに基づいて行われ得る。この方法は、一般的に、望まない細胞（間質幹細胞ではなく、例えば、Ｂ細胞またはＴ細胞かもしれない細胞を意味する）をも単離する。しかしながら、ＣＦＵを単離するさらなる工程により、これらの望まない細胞は、それらがコロニーを形成しないので失われ得る。そのため、ＣＦＵを形成可能な所望の間質細胞のみがその後にクローン性集団を生じるので、このレベルのソーティングは受容可能である。
【００３５】
本発明のある実施形態では、細胞は、２つの別々のマーカーの発現に基づいて単離される。細胞の組合せ選択は、陽性／陽性細胞の選択であり得、これは、細胞が、第一のマーカーの発現について陽性であり、かつ第二のマーカーの発現について陽性であれば選択されることを意味する。選択はまた、陽性／陰性、陰性／陽性または陰性／陰性でもあり得る。
【００３６】
それゆえ、本発明の組合せ方法は、典型的には、本明細書中の他で記載されたいずれかの方法の１つまたはそれ以上または全ての特徴の組合せであるが、第一のマーカーとは異なるさらなる細胞表面マーカーの発現に基づき細胞を単離する工程を含む。これは、第二のマーカーと呼ばれ得る。命名は単にマーカーが互いに異なることを示すためであって、そのマーカーに従う選択または単離のタイミングにおいて時間的に異なることを示すものではない。マーカーに基づく選択は、通常、同時であり得る単一のソーティングまたは単離で行われるが、利用可能な技術によってこれを可能とする限り、いかなる順序にて連続的であってもよい。
【００３７】
１つの適した第二のマーカーはＣＤ４５である。適切に、ＣＤ４５陰性の細胞が選択される。さらなる適切なマーカーはＦＡＰアルファである；適切にＦＡＰアルファ陽性細胞が選択される。適切な第一の細胞表面マーカーはＳＤＣ２およびＮＧ２を含む。
【００３８】
本発明のもう１つの使用では、最初のソートはＣＤ４５発現に基づき行われ、陰性の画分が選択される。別のソートが第一のマーカー（例えば、ＳＤＣ２）に基づき行われる。陽性の画分が取得され得るか、または陰性の画分が取得され得る。実施において、一般的には、ソーティングは同時に行われる。逐次ソーティングでは、細胞生存性が劇的に減少し得る。
【００３９】
本発明の特定の方法において、第一のマーカーについて陽性の細胞が選択される；これらの方法は、骨形成細胞および脈管形成細胞の単離に適している。
【００４０】
本発明の他の特定の方法においては、第一のマーカーについて陰性の細胞が選択される；これらの方法は、脂質形成細胞の単離に適している。
【００４１】
ヒト間質幹細胞の具体的な単離方法は、ヒト骨髄から、第一のマーカーについて陽性で、ＣＤ４５について陰性である細胞を単離する工程を含む。ここで、第一のマーカーは抗体に結合し、かつ当該抗体は、マウス、ラット、ウマ、ウサギおよびブタ細胞から選択される少なくとも１つの他の哺乳類種の細胞上に見出されるマーカーと交差反応する。第一のマーカーは好ましくはＳＤＣ２であり、単離には、ＳＤＣ２に結合し、かつヒト、マウス、ラット、ウマ、ウサギの全てに関する対応するマーカーと交差反応する抗体が使用される。第一のマーカーはＮＧ２であってもよく、単離は、ヒトＮＧ２に結合しかつマウス、ラット、ウマ、ウサギおよびブタ細胞の１つまたはそれ以上においてＮＧ２に対応するマーカーと交差反応する抗体を使用する。
【００４２】
組合せマーカーソーティングはまた、３つの異なるマーカーによるソーティング（例えば、第二のマーカー、次いで、２またはそれ以上の第一のマーカーに基づくソーティング）を含み得る。ＮＧ２によるソーティングは、ＳＤＣ２＋ｖｅ集団をさらに分割するために使用され得る。
【００４３】
本発明の特定の単離された間質幹細胞は、以下である：
（ｉ）ＣＤ４５−ｖｅ，ＳＤＣ２＋ｖｅ
（ｉｉ）ＣＤ４５−ｖｅ，ＳＤＣ２−ｖｅ
（ｉｉｉ）ＣＤ４５−ｖｅ，ＳＤＣ２＋ｖｅ，ＮＧ２＋ｖｅ
（ｉｖ）ＣＤ４５−ｖｅ，ＳＤＣ２＋ｖｅ，ＮＧ２−ｖｅ
（ｖ）ＦＡＰアルファ＋ｖｅ，ＳＤＣ２＋ｖｅ
（ｖｉ）ＦＡＰアルファ＋ｖｅ，ＳＤＣ２−ｖｅ
（ｖｉｉ）ＦＡＰアルファ＋ｖｅ，ＳＤＣ２＋ｖｅ，ＮＧ２＋ｖｅ
（ｖｉｉｉ）ＦＡＰアルファ＋ｖｅ，ＳＤＣ２＋ｖｅ，ＮＧ２−ｖｅ
【００４４】
単離された細胞から、細胞培養物および集団が得られ得る。これは、単離された細胞（例えば、少なくとも最初はＣＤ４５陰性およびＳＤＣ２陽性、またはＣＤ４５陰性およびＳＤＣ２陰性である細胞）のクローン増幅により、次いで、得られた細胞の継続した増殖または培養により達成され得る。この継続した増殖および培養および継代により得られた細胞は、初期には、当初単離された細胞と同じマーカースペクトルを示す傾向にあることに注意されたい。時間とともに、その発現パターンは変化し得る。しかし、結果として得られる集団の特性は、初期の単離の基準（例えば、少なくとも初期にはＣＤ４５陰性およびＳＤＣ２陽性であるか、またはＣＤ４５陰性およびＳＤＣ２陰性である細胞）と関連している。
【００４５】
単離された細胞から、単離に用いられたマーカーまたは抗原の発現により測定される高い均質性を持つ細胞培養物および集団が一般に得られ得る。それゆえ、第一の細胞表面マーカーを高レベルで発現する哺乳類間質細胞集団もまた、本発明によって提供される。第一のマーカーを発現する細胞の％は、５０％またはそれ以上、６０％またはそれ以上、７０％またはそれ以上、７５％またはそれ以上、８０％またはそれ以上、または９０％またはそれ以上であり得る。以下により詳細に記載される本発明の特定の実施形態では、初期の細胞集団は、第一のマーカーを９５％またはそれ以上のレベルで発現する。陽性である細胞とは、細胞表面でまたは上に測定した場合に陽性であること、例えば、マーカーに対する標識した抗体を使用して検出可能であることをいう。
【００４６】
細胞集団はまた、例えば、培養および／または継代によって、上記から誘導され得るものであり、そしてそうすることにおいて、第一のマーカーの発現が残っている細胞の比率が減少し得るが、それでもなお、マーカーに基づいて選択されない集団中のそれよりは高い細胞集団である。それゆえ、第一のマーカーを高レベルで発現するさらなる哺乳類細胞集団もまた、本発明によって提供される。第一のマーカーを発現する細胞の％は、３０％またはそれ以上、４０％またはそれ以上、５０％またはそれ以上、または直前に列挙されたレベルであり得る。本発明の細胞集団は、特定された純度を有し、確定される。細胞は、マーカーの発現に基づいて同定／選択され得、そして直ちに使用され得、細胞の十分純粋な集団が得られたかを決定するために培養の必要はない。
【００４７】
本発明の特定の実施態様では、マーカーはＮＧ２または、特にＳＤＣ２である。
【００４８】
それゆえ、哺乳類間質幹細胞の集団が提供され、ここで細胞の７５％またはそれ以上が細胞表面マーカーについて陽性であり、かつ対応する細胞表面マーカーがまた、ヒト、マウス、ラット、ウマ、ウサギおよびブタ細胞から選択される少なくとも１つの他の哺乳類種の細胞上でも発現される。マーカーは、ヒト細胞上で適切に発現され、かつ対応するマーカーは、マウス細胞上で、および必要に応じてまた、ラット、ウマ、ウサギおよびブタ細胞から選択される少なくとも１つの他の哺乳類細胞上でも発現される。マーカーは、ヒト細胞上で適切に発現され、かつ対応するマーカーは、ラット細胞上で、および必要に応じてまたマウス、ウマ、ウサギおよびブタ細胞から選択される少なくとも１つの他の哺乳類細胞上でも発現される。間質幹細胞のもう１つの例となる集団は、細胞の７５％またはそれ以上がＳＤＣ２陽性であり、そしてこれらの細胞は骨形成性であった。さらに、細胞は、第２のマーカーの発現レベルによって付加的に特徴づけられ得る。第２のマーカーを発現する細胞の％は、５０％またはそれ以上、６０％またはそれ以上、７０％またはそれ以上、７５％またはそれ以上、８０％またはそれ以上、または９０％またはそれ以上であり得る。以下により詳細に記載される本発明の特定の実施形態では、初期の細胞集団の９５％またはそれ以上の細胞が第２のマーカーについて陽性である。細胞は、別に、第２のマーカーについて陰性であり得る。第２のマーカーを発現しない細胞の％は、５０％またはそれ以上、６０％またはそれ上、７０％またはそれ以上、７５％またはそれ以上、８０％またはそれ以上、または９０％またはそれ以上であり得る。以下により詳しく記載される本発明の特定の実施形態では、初期の細胞集団中の９５％またはそれ以上の細胞が第２のマーカーについて陰性である。骨形成性で脈管形成の間質幹細胞の１つの例となる集団は、細胞の７５％またはそれ以上がＳＤＣ２陽性であり、そして細胞の７５％またはそれ以上がＣＤ４５陰性である。
【００４９】
本発明により、第１のマーカーの発現が低レベルの細胞集団もまた提供される。第１のマーカーを発現しない細胞の％は、５０％またはそれ以上、６０％またはそれ以上、７０％またはそれ以上、７５％またはそれ以上、８０％またはそれ以上、または９０％またはそれ以上であり得る。以下により詳細に記載される本発明の特定の実施形態では、初期の細胞集団が、第１のマーカーを５％またはそれ以下のレベルで発現するか、または第１のマーカーについて陰性と見なされる。１つの例となる間質幹細胞の集団においては、細胞の７５％またはそれ以上がＳＤＣ２陰性であり、そして脂質生成細胞である。さらに、細胞は、第２のマーカーの発現レベルにより付加的に特徴づけられ得る。第２のマーカーを発現する細胞の％は、５０％またはそれ以上、６０％またはそれ以上、７０％またはそれ以上、７５％またはそれ以上、８０％またはそれ以上、または９０％またはそれ以上であり得る。細胞は、別に、第２のマーカーについて陰性であり得る。第２のマーカーを発現しない細胞の％は、５０％またはそれ以上、６０％またはそれ以上、７０％またはそれ以上、７５％またはそれ以上、８０％またはそれ以上、または９０％またはそれ以上であり得る。以下により詳細に記載される本発明の特定の実施形態では、初期の細胞集団中の９５％またはそれ以上の細胞が第２マーカーについて陰性である。脂質生成間質幹細胞の１つの例となる集団は、細胞の７５％またはそれ以上がＳＤＣ２陰性であり、そして細胞の７５％またはそれ以上がＣＤ４５陰性である。
【００５０】
従って、本発明はまた、細胞の集団を得る方法であって、記載された方法に従って細胞を単離する工程、およびそれらの単離された細胞から集団を誘導する工程を含む、方法をも提供する。そして本発明はさらに、細胞のクローン性集団を得る方法であって、記載された方法に従って単一細胞を単離する工程、およびその単一細胞から細胞のクローン性集団を誘導する工程を含む、方法を提供する。一般的に、培養は、初期の細胞集団を得ること、そして次いでさらに細胞を培養中で増殖および／または増幅および／または継代させることを含む。ＳＤＣ２は、以下に記載される特定の実施例中の特徴的なマーカーである。
【００５１】
以下の特定の実施例に記載された細胞集団が得られ、そしてこれらが有用な特性を示すことがわかった。それゆえ、本発明により、記載され、請求された方法に従って得られ得る細胞の集団がさらに提供される。細胞集団は、好ましくは、ヒト、ウマ、ウサギ、マウスおよび／またはラット細胞である。
【００５２】
特定の実施形態の細胞の集団が、
ヒト間質幹細胞を提供し、
ヒト間質幹細胞から細胞のクローン性集団を誘導し、
必要に応じて、培養において細胞をさらに増殖および／または増幅および／または継代させることにより得られ、
ここでヒト間質幹細胞は、骨髄から単離され、ＣＤ４５の発現について陰性であり、かつさらなる細胞表面マーカーの発現について陽性であり、ここで当該さらなる細胞表面マーカーは、抗体に結合し、かつここで当該抗体は、マウス、ラット、ウマ、ウサギおよびブタ細胞から選択される少なくとも１つの他の哺乳類種の細胞上に見い出される細胞表面マーカーと交差反応する。
【００５３】
本発明により組織が提供され、これは、記載された方法に従って細胞を得、そしてそこから組織を得ることによる。それゆえ、骨、軟骨および腱から選択される組織が得られ得る。脂肪組織または再建手術のための組織もまた得られ得る。
【００５４】
本発明のさらなる使用は、単離された細胞およびその子孫を使用するアッセイのための細胞およびアッセイを提供することにある。それゆえ、アッセイを行う方法は、記載された方法に従って細胞を得る工程、およびアッセイにおいてそれらの細胞を使用する工程を含む。
【００５５】
先行技術の細胞集団は、記載されたように、骨、脂肪および軟骨を形成する傾向にあるが、制御が制限されており、骨または軟骨が必要とされる際に脂肪を形成することがある。脂肪を形成しない傾向である本発明の細胞集団が調製され得る。これは利点である。実に脂肪を形成する傾向がある本発明の別の細胞集団が、調製され得る。それゆえ、使用者には、特定の細胞マーカー選択基準に基づき、細胞特性の強化された制御および予測性が得られ得る。
【００５６】
本発明の特定の細胞集団の利点は、別の言い方で、すなわち、ＣＤ４５陰性、ＳＤＣ２陽性細胞についていえば、骨形成性であり、これらが高頻度で骨および軟骨生成細胞集団を生じる傾向にあることであり得る。結果が混合し、そして骨および軟骨を得る再現性が低いという先行技術の困難性は、これにより解決され得る。今取得可能な特定の細胞集団は、さらなる利点を有し得る。例えば、ＳＤＣ２陽性集団は、より脈管形成性であって、血管系を形成させるように隣接細胞を誘導するようである。これは、改善された血管系から利益を得る疾患（例えば、虚血性疾患）を治療するのに有利である。
【００５７】
加えて、ＳＤＣ２陽性集団は、本発明の特定の方法において、細胞および子孫に存続するマーカーの参照によって、先行技術よりもより高度に確定した出発細胞から誘導される。それ自体、これは利点である。この細胞集団は、受容可能に確定した集団である。
【００５８】
本発明のさらなる潜在的な利点は、初期細胞集団の予測単離に使用されるマーカーが、他の種における細胞集団の予測単離にもまた有用であることである。それゆえ、特定の実施形態において、ＳＤＣ２は、ヒト、マウス、ラット、ウマ、ウサギの全てを通じて共通である。結果として、例えば、マウス細胞において、対応する集団を単離することができ、それから、マウス細胞での研究からヒト細胞での研究にあてはめることができる。マウスにおける確定した集団がデータを得るために用いられ得、そのデータは、次いでさらに、他の種、特にヒト細胞の対応する確定した集団において取得され得る。先行技術の間葉系幹細胞の集団（すなわち、既知の予測単離を用いて得られた集団）にあてはまると考えられる問題は、例えば、マウス細胞の単離に用いられたマーカーが、ヒト細胞において対応する発現パターンを有さないことである。それゆえ、本発明は、マウスおよびヒト、またはマウスおよびウマなどのような種間平行集団（cross species parallel populations）を、確定した細胞集団に提供し得る。これは、前臨床および臨床研究を容易にする。なぜなら、１つの種の細胞で最初にされた実験から得られる知識を、他の種の対応する確定した細胞集団に関する後の研究に移すことができるからである。
【００５９】
本発明の細胞および組織、ならびに該細胞および組織を含む組成物は、様々な哺乳類の状態および疾患を治療するのに用いられ得、特に、存在するＳＳＣ生産物から誘導された細胞および生産物を使用して治療可能なものが挙げられる。細胞および組織は、樹状細胞と相互作用してＩＦＮ−β分泌を活発にし得、これゆえ、腫瘍抑制剤として使用され得る。一般に、癌が、本発明を用いて治療され得る。癌としては、特に、肝細胞癌、子宮頸がん、膵がん、前立腺ガン、線維肉腫、髄芽（細胞）腫および星状細胞腫が挙げられる。肺疾患が治療され得、急性肺損傷（ＡＬＩ）；急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；特発性肺線維症（ＩＰＦ）が挙げられる。細胞および組織は、以下を治療するのに用いられ得る：敗血症および敗血症誘発多臓器不全、骨髄移植（ＢＭＴ）または造血幹細胞（ＨＳＣ）拒絶；固形臓器移植（ＳＯＴ）拒絶（肝臓、腎臓、皮膚、角膜、心臓、肺を含む）；急性毒素誘発肝不全；自己免疫性肝炎；原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）および原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）；骨壊死；変性円板疾患；関節リウマチ；変形性関節症および糖尿病患者の遅延性骨治癒；ウェゲナー肉芽腫症（ＷＧ）を含む自己免疫性腎炎；やけど、重度のやけど；筋萎縮性疾病および萎縮性症候群（サルコペニアを含む）；悪液質および筋ジストロフィー（DuchenneおよびBecker）を含む他の筋萎縮性疾患；鬱血性心不全、急性心筋梗塞および発作；１型糖尿病；２型糖尿病；糖尿病性網膜症および他の網膜症；糖尿病性腎症および他の腎症；糖尿病性神経障害および他の神経障害；非治癒糖尿病性潰瘍；糖尿病性心筋症および他の筋疾患；アテローム性動脈硬化症；末梢動脈障害疾患および重症虚血肢；ブドウ膜炎；（湿式または乾式）急性黄斑変性（ＡＭＤ）；網膜および角膜障害；自己免疫胃炎（ＡＩＧ）のような自己免疫状態；移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）；多発性硬化症および脱髄疾患；甲状腺疾患；炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎および瘻管が生じるクローン病を含む）；硬皮症；紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）；グレーブス病；および自己免疫リンパ増殖疾患（ＡＬＰＳ）。
【００６０】
細胞および組織はまた、特定の様々なウマの症状を治療するのにも用いられ得る。蹄葉炎、腱損傷および運動誘発性肺出血（ＥＩＰＨ）は−「出血」または「出血性発作」としても知られる−が挙げられる。
【００６１】
また、本発明により、動物、特に哺乳類、例えばヒトまたはウマ、の疾患または障害を治療するための医薬組成物が提供される。医薬組成物は、動物において疾患または障害を治療するために効果的な量で、本発明の細胞または組織を適切に含む。このようにして、細胞は、受容可能な薬学的キャリアとともに投与され得る。例えば、細胞は、注射用の薬学的に受容可能な液体培地中の細胞懸濁液として投与され得る。液体培地の例は、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水であり、必要に応じて付加的な物質（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびヒト血清アルブミン）もまた含む。一般的に、細胞および組織は、存在する間葉系幹細胞およびそれから誘導された同様の生産物および組織について知られているような、様々な様式で投与される。それらは、全身投与（例えば、静脈内注入によって）され得るか、または直接注入であり得る。組成物は、マトリックスまたは足場を含有し得、あるいは細胞または組織が、原位置にマトリックスまたは足場を既に含む部位内に注射により投与され得る。それゆえ、細胞または組織は、ヒアルロン酸、コラーゲンまたは他の細胞外マトリックスと組み合わせて投与され得る。本発明の細胞および組織に準用され得るさらなる処方および投与の例は、当該分野において、例えば、ＷＯ２００１０８０８６５、ＥＰ２５４５９２８およびＷＯ１９９９０６１５８７において見出され得る。動物の治療方法が提供され、この方法は、本発明の組成物を動物に投与する工程を含む。本発明の細胞または組織は、動物の疾患または障害の治療に用いるために提供される。この方法および使用の実施形態は、本明細書中に記載された本発明の一般的な実施形態を含む。
【００６２】
同定したマーカーに基づくソーティングおよび単離を行うのに適した抗体が、当業者にとって入手可能である。ヒトＮＧ２／ＭＣＳＰ抗体が、R&D Systems, Inc.（614 McKinley Place NE, Minneapolis, MN 55413, USA）からマウスＩｇＧ１クローン＃７．１カタログ番号ＭＡＢ２５８５１として入手可能である。ＮＧ２（Ｇ−２０）抗体が、Santa Cruz Biotechnology, Inc. (2145 Delaware Avenue, Santa Cruz, California, 5060, USA)から入手可能である（参照：ｓｃ−３０９２３，マウス、ラット、ヒト、ウマ、イヌ、ウシおよびブタと反応性である）；ブロッキングペプチド、ｓｃ−３０９２３Ｐもまた入手可能である。ヒト線維芽細胞活性化タンパク質α／ＦＡＰ抗体、カタログ番号：ＡＦ３７１５が、R&D Systems, Inc.から入手可能である。ＦＡＰアルファ（Ｙ−１６）抗体がSanta Cruz Biotechnology, Inc.から入手可能であり、これは、少なくともヒト、ラットおよびマウスと反応性であり、そしてウマ、イヌ、ウシ、ブタおよびトリとも反応性である。抗線維芽細胞活性化タンパク質、アルファ抗体、ａｂ２８２４３が、Abcam（330 Cambridge Science Park, Cambridge, CB4 0FL, UK）から入手可能であり、これは、少なくともマウス、ラットおよびヒトと反応性である。シンデカン２抗体、ｏｒｂ１３４８１（少なくともヒト、マウスおよびラットと反応性である）が、Biorbyt Ltd.（12 Pembroke Avenue, Denny Industrial Centre, Waterbeach, Cambridge, CB25 9QR, UK）から入手可能である。特定の実施例に使用したＳＤＣ２抗体、カタログ番号：ＭＡＢ２９６５１（クローン３０５５０７）が、R&D Systems, Incから入手可能であり、これは、ヒト、マウス、ラット、ウマ、ウサギおよびブタと反応性である。
【００６３】
ＳＤＣ２（フィブログリカンおよび今ではＣＤ３６２とも呼ばれる）は、最初は、肺で発現される主要なヘパラン硫酸（ＨＳ）グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）含有細胞表面タンパク質の１つとして生化学的に特徴づけられた。ＳＤＣ２は、脊椎動物におけるこの１回膜貫通ファミリーの４つのメンバーのうちの１つである。本明細書においては、「Ｓ２」および「ＳＤＣ２」という場合は、ＳＤＣ２をいう。
【００６４】
本発明は、添付の図を参照しながら、特定の実施形態においてここに記載される。
【００６５】
我々は、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）フルオロクローム（R&D Systems番号ＦＡＢ２９６５Ａ；クローン３０５５１５）に結合させたヒトＳＤＣ２に対するラットＩｇＧ２Ｂモノクロ−ナル抗体を、ＳＤＣ２タンパク質の発現が対照のヒト胎児肺線維芽細胞株のＭＲＣ５と比べてヒトＳＳＣの細胞表面上に濃縮されているかを示すために使用した。ＳＳＣ増殖培地（ａＭＥＭ／１０％ＰＡＡ  ＦＳＣ；ＮＵＮＣ  Ｔ１７５フラスコ）中で培養したＭＲＣ５肺線維芽細胞は、ＳＤＣ２を発現しなかった（図１）。対照として、我々は、ＭＲＣ５線維芽細胞がＰＤＧＦＲａマーカー（ＣＤ１４０ａ−ＡＰＣ）を発現することを示している。これらのデータは、ＳＤＣ２タンパク質の発現が対照の肺線維芽細胞と比べてヒトＳＳＣの表面上に濃縮されることを示唆している（図１）。
【００６６】
この時点で、ＢＭからのＳＳＣの抗体に基づく精製についての技術水準は、リーズ大学（McGonagle博士およびJones博士）により報告された抗ＣＤ２７１（ＬＮＧＦＲ）および抗ＣＤ４５抗体の組合せを使用することからなる。ＣＤ４５ｌｏｗ／ＣＤ２７１ｂｒｉｇｈｔ細胞のこの単離により、全てのＣＦＵ−Ｆ（ＳＳＣ）を捕獲することが示された。
【００６７】
しかしながら、ＣＤ２７１「ｂｒｉｇｈｔ」細胞の確定は、実験室から実験室に渡って統一することが困難であり得る。この抗ＳＤＣ２抗体がＣＤ４５ｌｏｗ／ＣＤ２７１ｂｒｉｇｈｔ  ＢＭＭＮＣを共染色するかを調べるために、ゴールウェイ大学病院（ＧＵＨ）のClinical Research Facility（ＣＲＦ）において、Ruth Morrell博士によりドナーＣＲＦＧ＃０００７から３０ｍｌのヒトＢＭが吸引された。
【００６８】
ＢＭＭＮＣ（５×１０８）がフィコール遠心により単離され、ＰＢＳで洗浄され、ＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁され、Ｈｕｍａｎ  ＦＣ−Ｂｌｏｃｋ（Miltenyi、ＵＫ）でブロックされた。ＢＭＭＮＣ（４×１０７）は、抗ＳＤＣ２−ＡＰＣ（Ｒ＆Ｄ）、抗ＣＤ２７１−ＰＥ（ＢＤ）、抗ＣＤ４５−ＦＩＴＣ（ＢＤ）およびＳｙｔｏｘ／ＤＡＰＩ生死判別色素で染色された。細胞は、アイルランド国立大学ゴールウェイ校（ＮＵＩ Galway）にてBecton Dickinson AriaIIでＦＡＣＳにより分析された。
【００６９】
図２は、ＳＤＣ２／ＣＤ２７１／ＣＤ４５三重染色サイトメトリー実験からの代表的なヒストグラム／ドットプロットを示す。図２Ｂは、ＣＤ４５マーカー（オレンジ）を低／中レベルで発現するＢＭＭＮＣを示す。他の報告と一致して、我々は、ＣＤ２７１陽性細胞がＣＤ４５ｌｏｗ集団内に見出されることを発見し（図２Ｂ）、そしてこれらの実験において、我々は、抗ＳＤＣ２−ＡＰＣ抗体がＣＤ４５ｌｏｗ／ＣＤ２７１陽性細胞を標識したことに留意した。特に、抗ＳＤＣ２−ＡＰＣ抗体は、ＣＤ４５ｌｏｗ／ＣＤ２７１ｂｒｉｇｈｔ  ＢＭＭＮＣを標識している。ＳＤＣ２＋／ＣＤ４５ｌｏｗ／ＣＤ２７１＋三重陽性（ＴＰ）集団は、ＢＭＭＮＣ内で希少であり、頻度は１：１６０００から１：２３０００であった。
【００７０】
図３は、ＳＤＣ２＋／ＣＤ２７１＋／ＣＤ４５−ＭＮＣ画分が、天然のソート前の（pre-sorted）ＢＭＭＮＣに比べて３０００倍多くのＣＦＵ―Ｆ／ＳＳＣを含有することを示す。逆に、ＣＤ２７１＋集団のＳＤＣ２陰性画分は、顕著な数のＣＦＵ−Ｆ／ＳＳＣを保持していない。
【００７１】
単一細胞ＦＡＣＳソーティング実験を行って、ＳＤＣ２＋／ＣＤ２７１＋集団内のクローン化可能細胞の数を数えた。単一のＳＤＣ２＋／ＣＤ２７１＋／ＣＤ４５−ＭＮＣを、９６ウェルプレート内のウェルあたり１、３および２０細胞でソートした。限界希釈分析により、ウェル当たり１細胞で、９６ウェルプレートあたり１６−１７クローンが形成したことが明らかになった（図４）。１６クローン全てが増殖性であり、１５−２０集団倍加を経ることができた（図５）。特に、選択されたＳＤＣ２＋クローンは、インビトロにおける微量培養に応答して顕著な軟骨形成を経ることができた。５クローン全てが、低（２％）酸素分圧で培養した際に、促進されたグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の堆積を示した（図６）。
【００７２】
ソート前の（親の）ＳＳＣに比べた場合、ＦＡＣＳでソートし、培養で増幅させたＳＤＣ２＋ＳＳＧは、１４日分化のレジメにわたる強力な脂質形成培地でのインビトロにおける刺激に応答して、脂肪の堆積が顕著に減衰した（図７）（オイルレッドＯ染色、抽出および定量により可視化）。逆に、ＳＤＣ２−ＳＳＣおよびソート前（pre-sort）ＳＳＣに比べ、ＳＤＣ２＋ＳＳＣは、骨形成培地を用いた１４日の誘導に応答して、カルシウムの堆積の促進およびマトリックス石灰化の促進を引き起こす（それぞれカルシウム抽出およびアリザリンレッドＳ染色で測定した）（図８）。特に、軟骨形成微量培養に供した際、ＳＳＣの３つの集団間に違いは見られなかった（図９）。
【００７３】
ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、栄養豊富なマトリゲル上にプレート後２４時間以内に血管形成索状細管を形成することができる。マトリゲル上でＨＵＶＥＣと１：１の割合でＳＤＣ２＋ＳＳＣを共培養すると、２４時間で、安定な血管細管の数の３倍の増加を引き起こす(図１０)。
【００７４】
最後に、ヒトＳＤＣ２＋／ＣＤ４５−  ＭＮＣはまた、ＣＤ１４６、ＮＧ２（ＣＳＰＧ４）およびＣＤ２７１を含む鍵となる間質マーカーを発現する（図１１）。
【００７５】
図１２は、ヤギのＢＭおよび脂肪ＭＮＣならびにウサギＢＭ組織に由来するＳＳＣのフローサイトメトリーのヒストグラムを示す。ＳＤＣ２マーカーはヤギＳＳＣ上では検出可能ではないようであるが、顕著なレベルのＳＤＣ２タンパク質がウサギＳＳＣ上に検出され得る（図１２）。
【００７６】
ＳＤＣ２タンパク質の検出の増加は、コンフルエントな培養に応答して、培養ウマＳＳＣ中で増加される（図１３）。ＳＤＣ２タンパク質はまた、低酸素分圧で培養した際のブタＳＳＣの亜集団中で検出され得る（図１３）。
【００７７】
ＳＤＣ２マーカーは、ラットＳＳＣの表面上で発現される（図１４）。ウマＳＳＣにおいて見られたように、ＳＤＣ２タンパク質は、コンフルエンスに応答してラットＳＳＣの表面で増加する。このパターンは、３つの典型的に使用されるラットの実験室系統、すなわち、ダーク・アグーチ、スプラーグ・ドーリーおよびルイスの骨髄由来のＳＳＣにおいて見られ得る（図１４）。
【実施例】
【００７８】
（実施例１．１−骨髄吸引物の単離）
ヒト骨髄試料を健常ボランティア（ｎ＝３）の後腸骨稜から、これらの患者から書面による同意を得た上で得た。欧州連合組織指令2006/17/EC（EU Tissue Directive 2006/17/EC）の要件に従って、患者は、ＨＩＶ  ＩおよびＩＩ、Ｈｅｐ  Ａ／Ｃ、ＨｂｓＡｇ、抗ＨＢコア、梅毒およびＣＭＶについてのウイルス試験を受けた。ＢＳＣにおいて、試料をプールし、７．５ｍＬの一定分量に分け、そして密度勾配遠心分離に供する。
【００７９】
（実施例１．２−密度勾配遠心分離（フィコール）によるヒトＳＳＣの単離および増幅）
無菌操作下での生物学的安全キャビネットにおいて、７．５ｍＬのフィコールを５０ｍＬ遠心チューブにピペット注入する。塊を除くために、３０ｍＬのＢＭを１００ミクロンセル篩（BD Falcon）を通して、５０ｍＬ遠心チューブに濾過した。濾過した骨髄をＤ−ＰＢＳ中に１／１希釈し、次いで、フィコールを含有する４つのチューブ間で等分に分割し、３５°〜４５°の角度に置いたチューブの側面上でＢＭをゆっくりとピペッティングし、フィコールをかき乱したりまたは泡を生じさせたりすることなく、ＢＭが確実にゆっくりと放出するようにした。次いで、管を９００ｇにて２２分間遠心し、分画試料を形成するように遠心分離のブレーキをゼロに設定した。遠心分離後、管の中身は三層を形成した：上層は血漿であり、薄層のバフィーコートはＭＮＣを含有し、フィコールの透明層、および最下層は、赤血球細胞（red blood cells）成分−赤血球（erythrocytes）および顆粒球−を含有する。バフィーコートを注意深く吸引除去し、注意深く、周囲の細胞をかき乱すことがないようにした。次いで、これらの細胞を別の５０ｍＬ遠心チューブに移し、そして４５ｍＬのＤ−ＰＢＳ中に再懸濁した。次いで、これらのチューブを３５０ｇにて１０分間遠心した。上清を吸引し、そしてペレットを５ｍＬ完全培地中に再懸濁した。次いで、これらを３５０ｇにて１０分間遠心した。上清を吸引し、そしてペレットを５ｍＬのＤ−ＰＢＳ中にプールした。
【００８０】
（実施例１．３−ＣＦＵ−Ｆプレート播種）
直接プレーティングまたはフィコールを介した単核細胞の単離後、両セットの細胞から９×１０６細胞を単離し、そして３×１０６ＭＮＣ／プレートの播種密度で三連にて１０ｃｍディッシュ中に播種した。これらの細胞を洗浄し、上記に概説したように培養中の細胞と同時に栄養を与えた。
【００８１】
（実施例１．４−クリスタルバイオレットＣＦＵ−Ｆ染色）
１２〜１４日目に、細胞を固定し、そしてＣＦＵ−Ｆ分析のために染色した。プレートから培地を吸引し、そしてＤ−ＰＢＳ中でプレートを３回洗浄し、残存する培地を除去した。−２０℃で保存した８ｍＬの９５％メタノールを細胞上で１０分間ピペッティングし、そして穏やかに旋回させることにより、細胞を固定した。プレートからメタノールを吸引し、そして細胞をＤ−ＰＢＳを用いて１回洗浄した。次いで、８ｍＬのクリスタルバイオレット（０．５％クリスタルバイオレット、９９．５％メタノール）をプレートに添加し、そしてプレートを穏やかに旋回した。１０〜１５分間、プレートを放置した。過剰なクリスタルバイオレットを吸引し、そして細胞をＤ−ＰＢＳを用いて３回洗浄し、残存する過剰な染料を除去した。次いで、プレートをひっくり返し、そして終夜乾燥させた。次いで乾燥したプレートを、フラットベッドスキャナを用いて画像化した。次いでコロニーを計数し、そして倒立光学顕微鏡（Olympus CKx41）下、外観検査にて特徴づけた。５０＋より大きなクラスターで構成されたコロニーをＣＦＵとして計数した。
【００８２】
（実施例２−単核細胞および間質幹細胞の抗体分析）
表１は、実施例１で生成した単核細胞および間質幹細胞のプロファイリングに用いた抗体の詳細を示す。
【００８３】
【表１】
0005829765.tif 000002
【００８４】
（ブロッキング溶液調製）
ブロッキング溶液を、５０ｍＬチューブ内で１ｍＬのＦＢＳを４９ｍＬのＤ−ＰＢＳに添加することにより調製した。
【００８５】
（試料調製）
細胞を３７℃にてトリプシン処理し、そして１５ｍＬチューブ内の培地に移した。細胞を４００ｇにて５分間遠心した。上清を吸引し、そして細胞を５ｍＬ完全培地中に再懸濁した。トリパンブルーを用いて細胞計数および生存度試験を行った。次いで、細胞を４００ｇにて５分間遠心し、そして上清を吸引した。次いでブロッキング溶液を細胞ペレットに添加し、１×１０６細胞／ｍＬに細胞を再懸濁した。
【００８６】
（ＳＳＣの染色（FACS Canto上の分析））
冷蔵庫からＰＥ標識抗体を取り出し、そして９６ウェル丸底プレート（Sarstedt）およびブロッキング溶液と共に氷上に置いた。１×１０５細胞（１００μＬ）を氷上の９６ウェルプレートの１２ウェルの各々にピペット注入した（各抗体につき１つ、および非染色細胞につき１つ）。次いで、プレートを４００ｇ、４℃にて４分間遠心した。細胞ペレットをかき乱すことがないように上清を注意深く吸引し、そして５０μＬのブロッキング溶液を各ウェルに添加し、溶液のピペッティングによってペレットを再懸濁した。
【００８７】
（実施例３−ＳＳＣの軟骨形成分化）
表２は、不完全軟骨形成培地（ＩＣＭ）の組成を示す。
【００８８】
【表２】
0005829765.tif 000003
【００８９】
３７℃温浴を用いて細胞を解凍し、そして１５ｍＬチューブ内の培地に迅速に移し、１ｍＬの培地でこのクリオバイアル（cryovial）を洗い出した。細胞を４００ｇにて５分間遠心した。上清を吸引し、そして細胞を５ｍＬ完全培地中に再懸濁した。細胞計数を行い、そして２〜２．５×１０５細胞／ペレット間のペレットを形成するのに十分な細胞を採取した。各試料につき、４つの陽性培養および２つの陰性培養を設定した。再度、細胞を４００ｇにて５分間遠心し、培地を除去した。上清を吸引し、そして細胞を３ｍＬ不完全軟骨形成培地（ＩＣＭ）中に再懸濁した。３ｍＬ細胞懸濁液を１５ｍＬチューブに分けた（陽性ペレットにつき２ｍＬ、陰性ペレットにつき１ｍＬ）。チューブを１００ｇにて５分間遠心した。形成される各ペレットにつき、陽性ペレット用の細胞を５００μＬの完全軟骨形成培地（ＣＣＭ）中に再懸濁した。ＣＣＭは、ＩＣＭとＩＣＭ１ｍＬ当たり０．５μＬのＴＧＦ−βとからなる。
【００９０】
形成される各ペレットにつき、陰性ペレット用の細胞を５００μＬのＩＣＭ中に再懸濁した。細胞をスクリューキャップ付きエッペンドルフチューブに移し、そしてスイングアウトローター中で１００ｇにて５分間遠心した。チューブのキャップを緩めてガス交換を行い、３７℃にて５％ＣＯ２にてＢＳＣ中で培養した。培地を２日毎に交換した。これは、ペレットをかき乱すことなくできるだけ多くの培地を吸引し、そして陽性ペレットおよび陰性ペレットのそれぞれにつき、ＣＣＭまたはＩＣＭのいずれかと置き換えることにより行った。２１日目に、培地の全てを吸引除去し、そしてＤ−ＰＢＳ中で２回洗浄することにより、細胞ペレットを採取した。ペレットを風乾し、そして４つの陽性ペレットのうち３つをＧＡＧ測定に用い、他の１つを組織検査に用いた。ＧＡＧ測定用ペレットを−２０℃にて保存し、そして組織検査用ペレットを１時間、１０％ホルマリン中に固定し、次いで処理の準備ができるまで水中に保存した。
【００９１】
（実施例４−軟骨形成アッセイ）
（ＤＭＭＢストック溶液の調製）
１６ｍｇのＤＭＭＢを５ｍＬの試薬グレードの１００％エタノール中に終夜溶解させた。２．７３ｇのＮａＣｌおよび３．０４ｇのグリシンを９７５ｍＬの脱イオン水に添加した。０．６９ｍＬの濃ＨＣｌ（１１．６Ｍ）をこの溶液に添加して混合した。溶解したＤＭＭＢをこの溶液に添加した。次いでＤＭＭＢの容器を、ＤＭＭＢ溶液の全てが移るまでＤＩ水で繰り返し濯いだ。ｐＨを１Ｍ  ＨＣｌで３．０に調整した。容積を脱イオン水で１Ｌに調整し、そして溶液をアルミ箔内にラッピングすることにより光から保護した。
【００９２】
パパイン溶液を、１ｍｇのパパイン（Sigma P4762）を９．７５ｍＬの温希釈緩衝液中に溶解することにより調製した。希釈パパインは、２５０μＬのこの溶液を１０ｍＬの希釈緩衝液に添加することにより調製した。
【００９３】
２００μＬのパパイン溶液を各ペレットに添加し、そして６０℃のオーブン内で終夜消化させた。次いで、試料をボルテックスし、ペレットを分散させた。コンドロイチン−６−硫酸（Sigma C4384）を用いて標準物を作製した。これは、４ｍｇのコンドロイチン−６−硫酸を１０ｍＬの希釈緩衝液に添加し、４００μｇ／ｍＬストックを作製することにより行った。次いで、これを希釈し、４０μｇ／ｍｌ溶液を得た。表３に示すように、この４０μｇ／ｍＬ溶液から以下のように希釈を行った。
【００９４】
【表３】
0005829765.tif 000004
【００９５】
５０μＬの標準物および試料を９６ウェルプレートの各ウェルに三連にて添加した。２００μＬのＤＭＭＢストック溶液を各ウェルに添加し、室温（ＲＴ）にて５分間インキュベートした。プレートを５９５ｎｍにて吸光度プレートリーダーを用いて読み取った。０μＬ  ＧＡＧ／ウェルを含有する標準物についての吸光度読み取り値をブランク値として用い、他の吸光度読み取り値から差し引いた。
【００９６】
（ピコグリーン（PicoGreen）を用いるＤＮＡの測定）
１×ＴＥ溶液を、クワントイットキット（Quant iT Kit）（Sigma P7589）中に提供された２０×ストック溶液を希釈水中に２０分の１に希釈することにより調製した。希釈したピコグリーン溶液を、ＤＭＳＯをｄＨ２Ｏ中に２００分の１に希釈することにより調製した。ＤＮＡストック（１００μｇ／ｍＬ）を１×ＴＥ中に５０倍希釈し、最終濃度２μｇ／ｍＬとした。ＤＮＡ標準物を表４に示すように調製した。
【００９７】
【表４】
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【００９８】
パパイン消化試料（上記にて概説）をさらに１×ＴＥ中に２５倍希釈した。１００μＬの標準物および試料を９６ウェルブラックプレートに三連にて添加した。反応は光によって影響されるため、プレートは黒くなければならない。１００μＬのピコグリーン溶液を各標準物および試料のウェルに添加し、そして２〜３分間インキュベートさせた。プレートは、蛍光プレートリーダー上で読み取った。まず４８５ｎｍにてプレートを励起させ、次いで５３８ｎｍにて読み取った。
【００９９】
（実施例５−ＳＳＣの脂肪形成分化）
表５は、脂肪形成誘導培地の組成を示す。
【０１００】
【表５】
0005829765.tif 000006
【０１０１】
表６は、脂肪形成維持培地の組成を示す。
【０１０２】
【表６】
0005829765.tif 000007
【０１０３】
３７℃温浴を用いて細胞を解凍し、そして１５ｍＬチューブ内の培地に迅速に移し、１ｍＬの培地でこのクリオバイアルを洗い出した。細胞を４００ｇにて５分間遠心した。上清を吸引し、そして細胞を５ｍＬ完全培地中に再懸濁した。細胞計数を行い、そして平底を有する２４ウェルプレート中でコンフルエンシー（４×１０４細胞／ウェル）に細胞を播種するのに十分な１０細胞を採取した。４つの試験ウェルおよび４つの対照ウェルを設定した。細胞を各ウェル内の１ｍＬの培地中に播種した。細胞を３７℃にて５％ＣＯ２にてインキュベートし、そして４８時間後、細胞はプラスチックへの接着が見られ、コンフルエントに見えた。試験ウェルに、完全培地を１ｍＬの脂肪形成誘導培地と置き換えて、３日間放置した。対照ウェルを完全培地と置き換えた。脂肪形成誘導培地において３日後、試験ウェル中の培地を１ｍＬ／ウェルの維持培地と置き換え、１日〜３日間の間で放置した。次いで、これを１ｍＬ／ウェルの維持培地と置き換えた。このプロセスを３回繰り返した。維持培地への最後の培地変更後、細胞を５〜７日間培地中に放置した後、採取した。
【０１０４】
（実施例６−脂肪形成アッセイ）
（オイルレッドＯ染色）
オイルレッドＯ作業溶液を、６部のオイルレッドＯ試薬溶液を４部のｄＨ２Ｏと混合することにより調製した。溶液を１０分間静置させ、次いでワットマン１番濾紙（Whattman no.1 Filter paper）を通して濾過した。
【０１０５】
培地を吸引し、そして細胞をＤ−ＰＢＳ中で２回洗浄した。次いで細胞をＲＴにて１時間１０％ホルマリン中に固定した。ホルマリンを吸引し、そしてプレートをｄＨ２Ｏ中で濯いだ。５００μＬのオイルレッドＯ作業溶液を各ウェルにピペッティングし、細胞の層を被覆した。プレートを８の字の動きにゆっくりと旋回させてオイルレッドＯを細胞全体にわたって均一に広げた後、５分間放置した。染料を吸引し、そして過剰の染料を２ｍＬ／ウェルの６０％イソプロパノールを添加することにより除去した。プレートを再度８の字の動きに回転させた後、イソプロパノールを吸引した。水がプレートから滑らかに流れ落ちるまで、水道水でプレートを濯いだ。次いで、試料を画像化までｄＨ２Ｏ中に保存した。
【０１０６】
（染色した脂質の抽出）
試料の画像化後、ウェルから水を吸引した。オイルレッドＯを、イソプロパノール（２×５００μＬ）を数回ウェルの表面全体にわたってピペッティングすることにより抽出した。次いで、イソプロパノールおよび染料をエッペンドルフチューブに移した。試料を５００ｇにて２分間遠心し、試料中の残渣を沈殿させた。各試料につき２００μＬの抽出した染色物を９６ウェルプレートに三連にて添加した。染色を５２０ｎｍにてプレートリーダーを用いて測定した。
【０１０７】
（実施例７−ＳＳＣの骨形成分化）
表７は、骨形成分化培地の組成を示す。
【０１０８】
【表７】
0005829765.tif 000008
【０１０９】
３７℃温浴を用いて細胞を解凍し、そして１５ｍＬチューブ内の培地に迅速に移し、１ｍＬの培地でこのクリオバイアルを洗い出した。細胞を４００ｇにて５分間遠心した。上清を吸引し、そして細胞を５ｍＬ完全培地中に再懸濁した。細胞計数を行い、そして平底を有する２４ウェルプレート中でコンフルエンシー（４×１０４細胞／ウェル）に細胞を播種するのに十分な細胞を採取した。４つの試験ウェルおよび４つの対照ウェルを設定した。細胞を各ウェル内の１ｍＬの培地中に播種した。細胞を３７℃にて５％ＣＯ２にてインキュベートし、そして４８時間後、細胞はプラスチックへの接着が見られ、コンフルエントに見えた。試験ウェル中の培地を骨形成培地と置き換え、そして対照ウェル中の培地を完全培地と置き換えた。全てのウェル中の培地を週に２回交換した。１０日目と１７日目との間に細胞を採取した。
【０１１０】
（骨形成アッセイ）
４つの試験ウェルの１つおよび対照ウェルをアリザリンレッド染色に用いる。他の３つをカルシウム定量に用いた。
【０１１１】
（アリザリンレッド染色）
２％アリザリンレッドＳ溶液を２ｇのアリザリンレッドＳを１００ｍＬのｄＨ２Ｏ中に溶解することにより調製した。溶液を混合し、そしてｐＨは染色プロセスに必須であるので、ｐＨを、１％水酸化アンモニウムを用いて約４．１〜４．３に調整した。各ウェルから培地を吸引した。培地の染色が起こらないようにするため、細胞をＤ−ＰＢＳ中で２回洗浄して残りの培地を除去した。９５％メタノールを、９５ｍＬの１００％メタノールを５ｍＬの水で希釈することにより調製した。次いで、メタノールを氷中にて低温になるまで保存した。細胞を１０分間、氷冷メタノール中に固定した。メタノールを吸引し、そして細胞をｄＨ２Ｏ中で濯いだ。５００μＬの２％アリザリンレッドＳをウェルに添加し、そして５分間放置した。時折、プレートを８の字の動きに穏やかに回転させた。５分後、カルシウム染色を可視化した。細胞をｄＨ２Ｏ中で濯ぎ、そしてOlympus CKx４１を用いて画像化した。
【０１１２】
（カルシウムアッセイ）
０．５Ｍ  ＨＣｌを４．３ｍＬの１１．６Ｍ  ＨＣｌを９５．７ｍＬの水中に希釈することにより調製した。ウェルから培地を吸引し、そしてウェルをＤ−ＰＢＳ中で２回洗浄して残りの培地を除去した。０．２ｍＬの０．５Ｍ  ＨＣｌを各ウェルに添加し、そして細胞を、セルスクレーパーを用いてウェルから掻き出し、ラベルしたエッペンドルフチューブ内に集めた。溶液を、暗冷室内にて細胞振盪器上で終夜振盪して放置した。試料を短時間遠心し、細胞片を沈殿させた。カルシウムアッセイはスタンビオキット（Stanbio Kit）を用いて行った。結合試薬および作業染料が１：１の作業溶液を調製した。
【０１１３】
表８は、カルシウムアッセイ標準物の組成を示す。
【０１１４】
【表８】
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【０１１５】
標準物および試料を９６ウェルプレートに三連にてプレートした。１０μＬの０．５Ｍ  ＨＣｌを各標準物ウェルに添加した。１０μＬの試料を各ウェルに添加した。２００μＬの作業溶液を全ての標準物および試料のウェルに対して添加した。吸光度を５５０〜６５０ｎｍにてビクター３  １４２０（Victor3TM 1420）を用いて読み取った。
【０１１６】
ＳＤＣ２は、Ｃ５７／ＢＩ６系統に由来するＣＤ４５−ｖｅマウスＢＭＭＮＣに対して表面上でＳｃａ１と共染色した。さらに、マウス骨髄からのＳＤＣ２＋／Ｓｃａ１＋  ＭＮＣのＦＡＣＳソーティングは、ＳＤＣ２が、プレートしたソート前のＭＮＣに比較して、有意に増大した頻度にてＣＦＵ−Ｆを形成し得るＳＳＣの自己再生亜集団をマークすることを明らかにしている。
【０１１７】
（実施例８−ヒト多能性細胞からのＳＤＣ２＋細胞）
我々は、骨髄由来の細胞（ＢＭ−）との比較のために、ヒト多能性細胞（この場合、ＥＳ細胞（ＥＳ−））からＳＤＣ２を発現する細胞の集団を得た。
【０１１８】
ＢＭ−ＳＳＣおよびＥＳ−ＳＳＣ（ミリポアヒト間葉系幹細胞（Millipore Human Mesenchymal Stem Cells）（ｈＥＳ細胞由来））を完全培地（ＢＭ−ＳＳＣ：α−ＭＥＭ、１０％  ＦＢＳ；ＥＳ−ＳＳＣ：ミリポアフィブロＧＲＯＴＭＬＳ完全培地キット（Millipore FibroGROTM LS Complete Media Kit）中に６ウェルプレート（Nunc）のウェルあたり１０５細胞の密度でプレートし、そして終夜放置して接着させた。細胞を、それらがサブコンフルエントレベル（約６０％コンフルエント）およびコンフルエントレベル（１００％コンフルエント）に達した時点で採取した。
【０１１９】
「伝統的な（classical）」ＳＳＣマーカーのフローサイトメトリー分析からの結果は、ＢＭ−ＳＳＣおよびＥＳ−ＳＳＣにてＣＤ７３の同様の発現があったことを示した。マーカーＣＤ１０５の発現は、コンフルエント培養およびサブコンフルエント培養の両方で同じであった；ＣＤ１０５発現は、コンフルエンシーの増大と共に減少するようであった。ＢＭ−ＳＳＣおよびＥＳ−ＳＳＣによるＳＤＣ２発現は、コンフルエント培養条件およびサブコンフルエント培養条件で一貫していた；ＳＤＣ２を発現するＢＭ−ＳＳＣの集団のパーセンテージはコンフルエント培養で増大し、ＥＳ−ＳＳＣについてはコンフルエント培養およびサブコンフルエント培養の両方において一貫して高い。ＥＳ−ＳＳＣによるＳＤＣ２発現のＲＦＩはより高い。
【０１２０】
したがって、ＳＤＣ２を発現するｈＥＳ由来間質幹細胞、および、したがってＳＤＣ２について濃縮された細胞集団は、ｈＥＳ細胞およびｈｉＰＳ細胞を含むヒト多能性細胞から直接得られ得る。
【０１２１】
（実施例９−ラットにおける人工呼吸器誘発肺損傷の治療におけるＳＤＣ２＋細胞）
（方法および材料）
全ての研究は、アイルランド国立大学ゴールウェイ校の動物生命倫理委員会（the Animal Ethics Committee of the National University of Ireland, Galway）によって認可され、そしてアイルランドの保健医療省（the Department of Health, Ireland）からの許諾の下に実施した。
【０１２２】
（ｈＳＳＣ単離および培養）
前述の通りに、ヒトＳＳＣ（ｈＳＳＣ）を成人のボランティアから単離した。吸引後、骨髄を組織培養フラスコにプレートした。接着した細胞を８０％コンフルエントまで増殖させ、次いでトリプシン処理し、そして培養物を４継代まで増幅させて、その後それらを実験に使用した。国際的なガイドラインに従って、ＳＳＣを特徴づけた。線維芽細胞（対照細胞として使用）を前述の通りに安定細胞系から得た。
【０１２３】
シリーズ１［人工呼吸器誘発肺損傷］
・成体雄スプラーグ・ドーリーラットを麻酔し、経口気管内に挿管し、そして無作為抽出して、損傷的な機械的換気（injurious mechanichal ventilation）に供した。
・以下の人工呼吸器設定を用いた：Ｐｉｎｓｐ ３５ｃｍＨ２Ｏ、呼吸速度１８分−１およびＰＥＥＰ ０ｃｍＨ２Ｏ。呼吸静的コンプライアンス（respiratory static compliance）が50%減少した時、動物を回復させた。
・回復後、動物を無作為抽出して、四群設計（four group design）にて以下の静脈内投与を行った：（ｉ）ビヒクル（ＰＢＳ、３００μＬ）；（ｉｉ）線維芽細胞（４×１０６細胞）；（ｉｉｉ）ヒトＳＳＣ（４×１０６細胞）または（ｉｖ）本発明の細胞、ヒトＳ２＋ＳＳＣと称する（４×１０６細胞）。
・ＡＬＩ後の回復の程度および炎症応答を２４時間後に評価した。
【０１２４】
シリーズ２［低一回換気量保護的換気］
・成体雄スプラーグ・ドーリーラットを麻酔し、経口気管内に挿管し、そして無作為化して、低一回換気量（low stretch）の機械的換気に供した。
・「低一回換気量」プロトコルは、以下の設定を伴う９０分間の機械的換気からなった：ＦｉＯ２  ０．３、呼吸速度８０分−１、一回換気量６ｍｌ・ｋｇ−１および終末呼気陽圧 ２ｃｍＨ２Ｏ。
・回復後、動物を無作為抽出して、六群設計（six group design）にて以下の静脈内投与を行った：（ｉ）ビヒクル（ＰＢＳ、３００μＬ）；（ｉｉ）線維芽細胞（４×１０６細胞）；または（ｉｉｉ）気管内ヒトＳＳＣ（４×１０６細胞）。
・ＡＬＩ後の回復の程度および炎症応答を２４時間後に評価した。
【０１２５】
統計解析
全てのデータの分布を、コルモゴロフ・スミルノフ検定（Kolmogorov-Smirnov test）を用いて正規性について調べた。データの解析を一元配置分散分析（one-way ANOVA）後にスチューデント・ニューマン・クールズ（Student-Newman-Keuls）によって、またはクラスカル・ウォリス（Kruskalis-Wallis）の後にマン・ホイットニイのＵ検定（Mann-Whitney U test）によって、適宜多重比較のためにボンフェローニ補正（Bonferroni correction）と共に行った。基底のモデル仮説を適切な残差プロットに基づいて適切であると判断した。両側検定p値が＜0.05である場合を有意とみなした。
【０１２６】
（結果）
換気誘発ＡＬＩからの回復促進におけるＳ２＋ＳＳＣの有効性
４０匹の動物を実験プロトコルに入れ、各ＶＩＬＩ群につき１０匹を割り当てた。４匹のＶＩＬＩ動物（２匹をビヒクル受容に割り当て、そして２匹を線維芽細胞受容に割り当てた）は、損傷プロトコルで生き残らなかった。全ての他の動物は、損傷プロトコルおよび続く処置割り当てで生き残った。ビヒクル対照群および線維芽細胞群にそれぞれ８匹の動物を入れ、ｈＳＳＣおよびＳ２＋ＳＳＣについて、それぞれ１０匹の動物に受容させた。
【０１２７】
ベースライン特性：損傷前変数（pre-injury variables）、損傷的換気の期間または生じた肺損傷の程度に関して、ベースラインではＶＩＬＩ群間に差異はなかった（表９）。
【０１２８】
【表９】
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【０１２９】
Ｓ２＋ＳＳＣは、ＶＩＬＩ後の肺機能および構造を回復した：Ｓ２＋ＳＳＣ療法は、ビヒクルと比較した肺胞気−動脈血酸素勾配が減少したことによって示されるように、動脈血酸素化の回復を促進した（ｐ＜０．０５）。Ｓ２＋ＳＳＣ療法に応じた肺生理機能におけるさらなる機能回復が、ビヒクルに比較して呼吸器系静的コンプライアンスにおいて有意な改善（ｐ＜０．０１）を示したことによって示された。
【０１３０】
Ｓ２＋ＳＳＣは、肺の湿潤：乾燥重量比の減少および肺胞液タンパク質濃度の減少によって示されるように、肺微小血管透過性を改善した（表１０）。ｈＳＳＣは、肺構造の回復を増大した。Ｓ２＋ＳＳＣは、肺胞組織体積割合の減少により示されるように、肺胞肥厚を減少し、そして気腔体積割合の増大によって示されるように、気腔体積の回復を増大した（表１０）。
【０１３１】
【表１０】
0005829765.tif 000011
【０１３２】
Ｓ２＋ＳＳＣは、ＶＩＬＩ後の炎症を調節した：Ｓ２＋ＳＳＣは、ＢＡＬ（気管支肺胞洗浄）液中の総炎症細胞数を減少し、そして肺好中球蓄積を実質的に低下した（ｐ＜０．００１）。Ｓ２＋ＳＳＣおよび未分化ｈＳＳＣともに、ＶＩＬＩ後の炎症応答の調節に等しく有効であった（表１１）。
【０１３３】
【表１１】
0005829765.tif 000012
【０１３４】
「非損傷」パラメーターに対する影響：動脈ｐＨ、ＰＣＯ２、重炭酸イオン（bicarbonate）、塩基過剰、乳酸（lactate）または平均動脈圧のいずれに対しても、Ｓ２＋ＳＳＣまたは未分化ｈＳＳＣの影響はなかった（データは示さず）。
【０１３５】
低一回換気量換気後の動物におけるＳ２＋ＳＳＣの影響
１６匹の動物について実験プロトコルを始め、各群につき４匹を割り当てた。全ての動物は、損傷プロトコルおよび続く処置割り当てで生き残った。
【０１３６】
ベースライン特性：損傷前変数（pre-injury variables）、損傷的換気の期間または生じた肺損傷の程度に関して、ベースラインでは保護的換気群間に差異はなかった（データは示さず）。
【０１３７】
Ｓ２＋ＳＳＣは、肺機能または構造に影響しなかった：保護的換気後、肺機能または構造に対してＳ２＋ＳＳＣ療法の影響はなかった（表１２）。
【０１３８】
【表１２】
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【０１３９】
Ｓ２＋ＳＳＣは、炎症を生じなかった：保護的換気後、肺構造における炎症応答に対してＳ２＋ＳＳＣ療法の影響はなかった（表１３）。
【０１４０】
【表１３】
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【０１４１】
「非損傷」パラメーターに対する影響：動脈ｐＨ、ＰＣＯ２、重炭酸イオン、塩基過剰、乳酸または平均動脈圧のいずれに対しても、Ｓ２＋ＳＳＣまたは未分化ｈＳＳＣの影響はなかった（表１４）。
【０１４２】
【表１４】
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【０１４３】
（結論）
本発明のＳ２＋ＳＳＣは、肺胞気−動脈血酸素勾配の減少、呼吸器系静的コンプライアンスにおける有意な改善（ｐ＜０．０１）、および肺微小血管透過性の改善によって示されるように、ＶＩＬＩ後の肺機能および構造を回復した。また、それらは、ＶＩＬＩ後の肺構造の回復を促進した。これらの細胞は、ＶＩＬＩ後の炎症を調節し、ＢＡＬ液中の総炎症細胞数を減少させ、そして肺好中球蓄積を実質的に軽減した（ｐ＜０．００１）。保護的換気後、肺機能または構造に対して、または炎症応答に対して、Ｓ２＋ＳＳＣ療法の影響はなかった。これらの知見は、本発明の細胞がこのモデルにおいて十分に許容されることを示唆する。
【０１４４】
それゆえ、本発明は、確定した間質幹細胞集団を得る方法およびその使用を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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