(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィターゼと脂肪分解酵素とを含む飼料用サプリメントであって、前記脂肪分解酵素が、ｐＨ１.５〜ｐＨ３.５の範囲のｐＨでリパーゼ活性を有する、飼料用サプリメント。
【請求項２】
前記脂肪分解酵素が、配列番号７または配列番号８の配列を有するポリペプチドまたはこれに対する同一性が少なくとも７０％であるポリペプチドを含むか；または配列番号９または１０の配列；または遺伝暗号の縮重がゆえに配列番号９または１０とは異なる配列；または配列番号９または１０に対する同一性が少なくとも７０％である配列を含むヌクレオチド配列の発現によって産生されるポリペプチドを含み、そしてここで前記フィターゼが、配列番号１３の配列を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）フィターゼおよび／または配列番号１〜６のいずれか１つの配列を有するブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼまたはこれに対する同一性が少なくとも７０％であるポリペプチドを含むか、または配列番号１１あるいは、配列番号１４のヌクレオチド２５３〜１４８３の配列、または遺伝暗号の縮重がゆえに配列番号１１あるいは、配列番号１４のヌクレオチド２５３〜１４８３とは異なる配列；または配列番号１１あるいは、配列番号１４のヌクレオチド２５３〜１４８３に対する同一性が少なくとも７０％である配列を含むヌクレオチド配列の発現によって産生されるポリペプチドを含む、請求項１に記載の飼料用サプリメント。
【請求項３】
前記脂肪分解酵素が、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞で産生される、請求項１または２に記載の飼料用サプリメント。
【請求項４】
前記フィターゼが、ｐＨ２.５〜ｐＨ５.５の範囲のｐＨでフィターゼ活性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の飼料用サプリメント。
【請求項５】
前記フィターゼの比活性レベルが少なくとも１００ＦＴＵ／ｍｇである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の飼料用サプリメント。
【請求項６】
前記脂肪分解酵素の比活性レベルが少なくとも１００ＬＩＰＵ／ｍｇである、請求項１
〜５のいずれか一項に記載の飼料用サプリメント。
【請求項７】
脂肪分解酵素対フィターゼの比が１：３〜１２：１の範囲にある、請求項１〜６のいずれか一項に記載の飼料用サプリメント。
【請求項８】
少なくとも１種類の生理学的に許容されるキャリアをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の飼料用サプリメント。
【請求項９】
前記生理学的に許容されるキャリアが、マルトデキストリン、石灰石（炭酸カルシウム）、シクロデキストリン、コムギまたはコムギ成分、スクロース、デンプン、アンチフォーム、Ｎａ2ＳＯ4、タルク、ＰＶＡおよびこれらの混合物のうちの少なくとも１つから選択される、請求項８に記載の飼料用サプリメント。
【請求項１０】
前記飼料用サプリメントが少なくとも１種類の別の酵素を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の飼料用サプリメント。
【請求項１１】
前記少なくとも１種類の別の飼料酵素が、デンプン代謝、繊維の分解、脂質代謝に関与するもの、グリコーゲン代謝に関与する酵素、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ（βグルコシダーゼを含む）、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノ−ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ（Ｄ−ヘキソース：Ｏ2−オキシドレダクターゼ、ＥＣ  １．１．３．５）β−グルカナーゼ、α−アミラーゼ
、ペクチナーゼ、セロビオヒドロラーゼおよび／または酸性ホスファターゼまたはこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１０に記載の飼料用サプリメント。
【請求項１２】
少なくとも１種類のキシラナーゼおよび／または少なくとも１種類のアミラーゼを含む、請求項１０または１１に記載の飼料用サプリメント。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の飼料用サプリメントを含む、飼料原料。
【請求項１４】
以下の（ａ）〜（ｅ）
〔（ａ）小粒穀物（コムギ、オオムギ、ライムギ、カラスムギおよびこれらの組み合わせなど）および／またはトウモロコシまたはソルガムなどの大粒型穀物などの穀類；
（ｂ）コーングルテンミール、トウモロコシ蒸留粕（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  Ｄｒｉｅｄ  Ｇｒａｉｎ  Ｓｏｌｕｂｌｅｓ）（ＤＤＧＳ）、コムギフスマ、コムギミドリング、コムギシヨーツ、米糠、籾殻、カラスムギ外皮、パーム核、シトラスパルプなどの穀類からの副産物；
（ｃ）ダイズ、ヒマワリ、ラッカセイ、ルピナス、エンドウマメ、ソラマメ、ワタ、セイヨウアブラナ、魚粉、乾燥血漿タンパク質、肉および骨粉、ジャガイモタンパク質、ホエー、コプラ、ゴマなどの起源から得られるタンパク質；
（ｄ）野菜および動物起源から得られる油および脂肪；
（ｅ）ミネラルおよびビタミン〕
の飼料材料を含む群から選択される１種又はそれ以上の飼料材料を含む、請求項１３に記載の飼料原料。
【請求項１５】
低繊維食品を提供するために、トウモロコシ、コムギ、動物副産物粉またはダイズおよび／または少なくとも１種類の低繊維飼料材料の少なくとも１種類の副産物からなる群から選択される少なくとも１種類の低繊維飼料材料を含む、請求項１３に記載の飼料原料。
【請求項１６】
２００ＦＴＵ／ｋｇ〜１５,０００ＦＴＵ／ｋｇのレベルでフィターゼを含む、請求項
１３〜１５のいずれか１項に記載の飼料原料。
【請求項１７】
１２５ＬＩＰＵ／ｋｇ〜４５,０００ＬＩＰＵ／ｋｇのレベルで脂肪分解酵素を含む、
請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の飼料原料。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の飼料用サプリメントを飼料材料に添加することを含む、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の飼料原料を生成する方法。
【請求項１９】
少なくとも１種類の脂肪分解酵素と少なくとも１種類のフィターゼとを混合することを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の飼料用サプリメントを生成する方法。
【請求項２０】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の飼料用サプリメントを飼料材料に添加することを含む、飼料材料からの少なくとも１種類の食餌用栄養塩の利用率を増加および／または見かけの代謝エネルギー（ＡＭＥ）を増加させるための方法。
【請求項２１】
請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の飼料原料の有効量を動物に給餌することを含む、動物の成長率を高める方法。
【請求項２２】
飼料原料を製造するにあたって、飼料材料からの少なくとも１種類の栄養塩の利用率を高めるおよび／または利用可能な代謝エネルギを増やすために少なくとも１種類のフィターゼおよび少なくとも１種類のリパーゼを含む飼料用サプリメントを用いる使用法であって、
ここで前記脂肪分解酵素が、ｐＨ１.５〜ｐＨ３.５の範囲のｐＨでリパーゼ活性を有し、そして
前記使用法が、前記飼料用サプリメントを飼料材料に添加する工程を含む、
前記使用法。
【請求項２３】
前記少なくとも１種類の栄養塩が、亜リン酸、カルシウム、アミノ酸、脂肪および／またはデンプンから選択される、請求項２２に記載の使用法。
【請求項２４】
少なくとも１種類の脂肪分解酵素および少なくとも１種類のフィターゼを含む飼料原料であって、前記脂肪分解酵素が、ｐＨ１.５〜ｐＨ３.５の範囲のｐＨでリパーゼ活性を有する、飼料原料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、飼料用サプリメントに関する。特に、本発明は、動物用飼料原料の消化促進に使用可能なフィターゼおよび脂肪分解酵素を含む飼料用サプリメントならびに、この飼料用サプリメントを含む飼料原料に関する。
【背景技術】
【０００２】
穀類およびマメ科植物におけるリンの主要な貯蔵形態に、フィチン酸塩がある。しかしながら、ブタ、家禽類、魚などの単胃動物はフィチン酸塩（またはフィチン酸）を代謝または吸収できないため、これがそのまま排泄され、家畜生産が盛んな地域での亜リン酸汚染につながっている。さらに、フィチン酸は、カルシウム、銅、亜鉛などの金属物質との間でキレートを形成して、単胃動物における反栄養物質としても作用する。
【０００３】
これらの動物が成長して健康でいられるだけのリン酸塩を提供するために、食餌に無機リン酸塩を添加している。このような添加には、コストがかさみ、汚染の問題をさらに大きくする可能性がある。
【０００４】
通常、フィチン酸塩はフィターゼの作用によって加水分解され、これより低級のイノシトール−リン酸塩と無機リン酸塩になる。フィターゼは、動物用飼料への添加剤として有用であり、動物に対する有機リンの利用率を高めて環境のリン酸塩汚染を低減する（非特許文献１）。
【０００５】
フィターゼをブロイラーの飼料に添加すると、見かけの代謝エネルギ（ＡＭＥ）、窒素およびアミノ酸の利用率が増加することが示されている（非特許文献２）。
【０００６】
真菌（非特許文献３〜５）および細菌（非特許文献６〜１１）由来の多数のフィターゼが、文献に記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｗｏｄｚｉｎｓｋｉ  ＲＪ，  Ｕｌｌａｈ  ＡＨ．  Ａｄｖ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４２，  ２６３〜３０２（１９９６）
【非特許文献２】Ｒａｖｉｎｄｒａｎ，  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｒｉｔ．  Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｓｃｉ．  ４１，  １９３〜２００（２０００）
【非特許文献３】Ｗｙｓｓ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６５（２），  ３６７〜３７３（１９９９）
【非特許文献４】Ｂｅｒｋａ  Ｒ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６４（１１），  ４４２３〜４４２７（１９９８）
【非特許文献５】Ｌａｓｓｅｎ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６７（１０），  ４７０１〜４７０７（２００１）
【非特許文献６】Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ３０３（１），  １０７〜１１３（１９９３）
【非特許文献７】Ｋｅｒｏｖｕｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６４（６），  ２０７９〜２０８５（１９９８）
【非特許文献８】Ｋｉｍ  Ｈ．Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  ２５，  １２３１〜１２３４（２００３）
【非特許文献９】Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ３４１（２），  ２０１〜２０６（１９９７）
【非特許文献１０】Ｙｏｏｎ  Ｓ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌ．  １８，  ４４９〜４５４（１９９６）
【非特許文献１１】Ｚｉｎｉｎ  Ｎ．Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  ２３６，  ２８３〜２９０（２００４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、真菌のフィターゼがタンパク質分解的に不安定になりがち（Ｉｇｂａｓａｎ  Ｆ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｒｃｈ．  Ａｎｉｍ．  Ｎｕｔｒ．  ５３，３５３〜３７３（２０００））で分解されやすいのに対し、いくつかの細菌のフィターゼはフィチン酸塩だけに狭い基質特異性を持ち、リン酸化の中間過程であるリン酸イノシトールをほとんど分解しない（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ３０３（１），  １０７〜１１３（１９９３）；  Ｋｅｒｏｖｕｏ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３５２，  ６２３〜６２８（２０００））。
【０００９】
さらに、Ｃａ−フィチン酸錯体を形成するためのカルシウムとフィチン酸塩との相互作用が、フィターゼ活性に有害であることも周知である（Ｓｅｌｌｅ，  Ｐ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １２４，  １２６〜１４１（２００９））。これらのＣａ−フィチン酸錯体のカルシウムは、フィターゼでは対処できないフィチン酸塩を形成するか、酵素の活性部位に対して非錯体フィチン酸塩と競合すると仮定されている（Ｌｏｎｇ，  Ｃ．，  Ｐｈｙｔａｓｅ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，  ＮＹ，  Ｖａｎ  Ｎｏｓｔｒａｎｄ−Ｒｅｉｎｈｏｌｄ（１９６１）；  Ｗｉｓｅ，  Ａ．，  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ＆  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  ５３，  ７９１〜８０６（１９８３））。
【００１０】
フィターゼを添加すると、高フィチン酸食餌のＡＭＥが増加することが示された。また、カルシウムフィチン酸錯体は脂肪酸と反応して腸管内腔で不溶性の石鹸を形成するため、脂肪の消化率が下がることを、Ｒａｖｉｎｄｒａｎらが示唆している（Ｂｒ．  Ｐｏｕｌｔ．  Ｓｃｉ．，  ２０００，  ４１，  １９３〜２００）。フィターゼを添加すると、これらの石鹸の濃度が低下する旨が示唆されている。この仮説の裏付けとして、トウモロコシにおけるフィチン酸塩と脂質との相互作用を示す証拠がある（Ｃｏｓｇｒｏｖｅ，  １９６６，  Ｒｅｖ．  Ｐｕｒｅ  Ａｐｐ．  Ｃｈｅｍ．  １６：２０９〜２２４）。これらの「リポフィチン」は、Ｃａ／Ｍｇ−フィチン酸塩と脂質とペプチドとの複合体として説明されている（Ｃｏｓｇｒｏｖｅ，  １９６６，  Ｒｅｖ．  Ｐｕｒｅ  Ａｐｐ．  Ｃｈｅｍ．  １６：２０９〜２２４）。他の報告でも、食餌におけるＣａ、脂肪、フィチン酸塩の相互作用が示唆されている。たとえば、Ｍａｔｙｋａら（１９９０）（Ａｎｉｍ．  Ｆｅｅｄ．  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ３１：２２３〜２３０）が、食餌用獣脂によって若齢ニワトリでのフィチン酸塩Ｐの利用が減り、石鹸脂肪酸として排泄される脂肪の割合が増加することを見出した。
【００１１】
外来性のリパーゼを添加する方法では、脂質およびミネラルの消化改善という観点での成功率に限度がある。しかしながら、これは、Ｃａおよびフィチン酸塩に結合する遊離脂肪酸の複合体が形成され（Ｃｏｓｇｒｏｖｅ，  １９６６、上掲）、それが胃腸管内で不溶性で、ほとんど吸収されない（Ｍａｔｙｋａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９０、上掲）がゆえの限界の可能性がある。
【００１２】
動物用飼料に外来性のリパーゼを用いることは、動物による脂肪の消化を改善する目的で以前から提案されている。リパーゼは、それがない場合よりも短時間で、吸収可能な遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を遊離するため、リパーゼが消化を改善するのではないかとする仮説がある。しかしながら、外来性のリパーゼを用いて動物の能力または消化率の改善を示そうとする試みは、せいぜいよくても矛盾しており、リパーゼが作用していないことを示すものも多い。ＤｉｅｒｉｃｋおよびＤｅｃｕｙｐｅｒｅ（２００４）（Ｊ．  Ｓｃｉ．  Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．  ８４：１４４３〜１４５０）が、微生物のリパーゼをブタの食餌に添加しても脂肪消化率に改善は見られないことを示した。また、Ｈｕｒｔａｄｏら（２０００）（Ｒｅｖ．  Ｂｒａｓ．  Ｚｏｏｔｅｃ．  ２９：７９４〜８０２）が、外来性のリパーゼを仔ブタに用いることによる体重増加、飼料効率、エネルギ消化率の増大を検出しようとして失敗した。彼らは、このようなリパーゼをアミラーゼやプロテアーゼと組み合わせても、前述のパラメータのいずれにも何ら別の効果はないことも報告した。Ｏｆｆｉｃｅｒ（１９９５）（Ａｎｉｍ．  Ｆｅｅｄ  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ５６：５５〜６５）の報告では、彼らがリパーゼ、プロテイナーゼ、Ｂ−グルカナーゼ、アミラーゼ、セルロースと、リパーゼ、Ｂ−グルカナーゼ、ヘミ−セルラーゼ、ペントサナーゼ、セルロース、アミラーゼ、プロテイナーゼであると説明している外来性の酵素の２つの組み合わせを用いることで、仔ブタの飼料摂取の体重増加に有意な変化は認められなかった。
【００１３】
ブロイラー鶏では、Ｍｅｎｇら（２００４）（Ｐｏｕｌｔ．  Ｓｃｉ．  ８３：１７１８〜１７２７）が、コムギを主成分とする食餌に細菌のリパーゼを用いた場合に、脂肪、デンプン、窒素およびＮＳＰの見かけの消化率ならびにＡＭＥに対するリパーゼの作用を検出しようとして失敗した。また、彼らは、カルボヒドラーゼ（キシラナーゼ、グルカナーゼ、セルラーゼを含む）をリパーゼにのせて組み合わせると、消化管内容物の粘度が下がって脂肪の消化と吸収が増し、栄養塩消化率に対するリパーゼの作用が高まるという仮説を否定した。
【００１４】
Ａｌ−ＭａｒｚｏｏｑｉおよびＬｅｅｓｏｎ（１９９９）は、動物由来のリパーゼと膵臓抽出物とを試験した。彼らは、これらの添加剤を食餌に用いた場合の糞便レベルでの脂肪消化率の改善と石鹸濃度の低下を示すことはできたが、食欲不振の作用（飼料摂取量の低下）も報告し、それについてこのタイプの抽出物にコレシストキニンが混入している可能性がゆえのことではないかと説明していた。この事実によって、その動物用飼料での利用と、動物の成長または動物における飼料効率の改善の可能性が制限されることになる。
【００１５】
本発明の一目的は、飼料材料からの少なくとも１種類の栄養塩の利用率を改善あるいは見かけの代謝エネルギを改善する、飼料用サプリメントを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、少なくとも１種類の特定の脂肪分解酵素と少なくとも１種類の特定のフィターゼとを含む飼料用サプリメントを飼料原料に添加すると、この酵素を個々に用いる場合と比較して、少なくとも１種類の栄養塩およびまたはミネラルの取り込みが改善されるという、驚くべき発見に基づくものである。
【００１７】
本発明の最も広い態様によれば、
ｉ．少なくとも１種類の脂肪分解酵素と、
ｉｉ．少なくとも１種類のフィターゼと、
を含む、飼料用サプリメントが得られる。
【００１８】
本発明者らは、驚くべきことに、既存の報告（Ｍｕｌｙａｎｔｉｎｉ，  Ｎ．Ｇ．Ａ．
ｅｔ  ａｌ  Ａｕｓｔ．  Ｐｏｕｌｔ．  Ｓｃｉ．  Ｓｙｍｐ，  １７，  ３０５〜３０７（２００５））とは逆に、少なくとも１種類の特定のフィターゼと少なくとも１種類の特定の脂肪分解酵素とを含む飼料用サプリメントを飼料材料に添加して飼料原料を生成すると、少なくとも１種類の栄養塩の利用率の増加および／または見かけの代謝エネルギ（ＡＭＥ）の増加が生じることを発見した。
【００１９】
理論に拘泥されることを望むものではないが、本発明者らは、この驚くべき発見が、ｐＨが酸性である消化の早い段階で遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を遊離する脂肪分解酵素の作用によるものではないかという仮説を立てた。これらのＦＦＡは、余分なカルシウムと結合して腸管に石鹸を形成することがある。その結果、フィチン酸塩との結合に利用できる遊離カルシウムが減り、それによって、フィチン酸およびカルシウムがフィターゼ耐性錯体を形成しやすい胃腸管（ＧＩＴ）領域でのフィターゼ活性が促進される。これは、リン酸塩の遊離および吸収量の増加につながる。遊離脂肪酸カルシウム錯体のほうがＧＩＴで後から溶解されるため、脂肪およびカルシウムの吸収が増加および／またはＡＭＥが増加する。
【００２０】
本発明のもうひとつの態様によれば、少なくとも１種類の脂肪分解酵素と少なくとも１種類のフィターゼとを混合することを含む、飼料用サプリメントを生成する方法が得られる。
【００２１】
本発明のもうひとつの態様によれば、飼料材料と、本発明による飼料用サプリメントまたは少なくとも１種類の脂肪分解酵素および少なくとも１種類のフィターゼとを含む、飼料原料が得られる。
【００２２】
本発明の別の態様によれば、本発明による飼料用サプリメントまたは少なくとも１種類の脂肪分解酵素および少なくとも１種類のフィターゼを、飼料材料に添加することを含む、飼料原料を生成する方法が得られる。
【００２３】
本発明の別の態様によれば、少なくとも１種類の脂肪分解酵素と少なくとも１種類のフィターゼとの組み合わせを含む飼料用サプリメントを飼料材料に添加するか、あるいは少なくとも１種類の脂肪分解酵素および少なくとも１種類のフィターゼを飼料材料に添加することを含む、飼料材料からの少なくとも１種類の食餌用栄養塩の利用率を増加および／または見かけの代謝エネルギ（ＡＭＥ）を増加させるための方法が得られる。
【００２４】
本発明の別の態様によれば、本発明による飼料原料の有効量を動物に給餌することを含む、動物の成長率を高める方法が得られる。
【００２５】
本発明の別の態様によれば、飼料原料を製造するにあたって、飼料材料からの少なくとも１種類の栄養塩の利用率を高めるおよび／または利用可能な代謝エネルギを増やすために少なくとも１種類のフィターゼおよび少なくとも１種類のリパーゼを用いる、使用法が得られる。
【００２６】
本明細書に開示した好ましい特徴のいずれも、そうでないことを明示的に示した場合を除いて、上述した態様のいずれに対しても等しく適用可能であるとみなされることは理解できよう。好ましい特徴はいずれも、本明細書で開示した他の好ましい特徴との組み合わせで開示されるともみなされる。
【００２７】
動物用飼料用の酵素添加剤として効率的にするために、フィターゼは多数の異なる特性を兼ね備えたものでなければならない。フィチン酸を動物の胃の酸性環境で分解できるようにするには、低いｐＨ、好ましくは広い範囲のｐＨ値で活性でなければならない。また、高い比活性を持つものでなければならず、好ましくは、飼料ペレットなどの飼料原料の調製で一般に用いられる高温にタンパク質が耐えられるだけの高い熱安定性を持つ。
【００２８】
また、酵素がフィチン酸塩だけでなく、五リン酸イノシトール、四リン酸イノシトールおよび三リン酸イノシトールなどのフィチン酸塩分解の中間生成物も加水分解できるように、酵素が広い基質特異性を持つことも重要である。ブタにおけるフィチン酸塩の分解に関する研究で、これらのオリゴリン酸イノシトールは、ほとんどが小腸および大腸で不溶性のまま残り、腸管ミクロフローラおよび動物が産生するアルカリホスファターゼを利用できないことがわかっている（Ｓｃｈｌｅｍｍｅｒ  Ｕ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｒｃｈ．  Ａｎｉｍ．  Ｎｕｔｒ．  ５５，  ２５５〜２８０（２００１））。異なる酵素の基質特異性の特性のばらつきも同定した。たとえば、フィターゼによってバチルス・サブティリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から生成した三リン酸イノシトールは、基本的にこの酵素によるさらなる加水分解に対して耐性である［Ｋｅｒｏｖｕｏ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ３５２，  ６２３〜６２８（２０００）］。
【００２９】
好ましい実施形態では、フィターゼが、好ましくはＤａｎｉｓｃｏ  Ａ／ＳからＰｈｙｚｙｍｅ  ＸＰ（商標）の名称で販売されている大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）フィターゼである。あるいは、フィターゼは、国際公開第２００６／０４３１７８号パンフレット、同第２００８／０９７６１９号パンフレット、同第２００８／０９２９０１号パンフレット、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４１０１１号（いずれも本明細書に援用する）に教示されたフィターゼ酵素などのブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼであってもよい。
【００３０】
最も好ましい実施形態では、フィターゼが、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）フィターゼおよび／またはブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）ｓｐ．フィターゼを含む。一層好ましくは、フィターゼが、配列番号１〜６または配列番号１３のうちのいずれか１つに示すようなアミノ酸配列を含むポリペプチド；または配列番号１〜６または配列番号１３のうちのいずれか１つと比較した場合に１つまたは複数のアミノ酸付加、欠失および／または置換を含むポリペプチド；または配列番号１〜６または配列番号１３のうちのいずれか１つに対する同一性が少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％であるポリペプチドを含むか；または配列番号１１；あるいは配列番号１４のヌクレオチド２５３〜１４８３の配列または遺伝暗号の縮重がゆえに配列番号１１あるいは、配列番号１４のヌクレオチド２５３〜１４８３とは異なる配列；または配列番号１１；あるいは配列番号１４のヌクレオチド２５３〜１４８３の配列と比較した場合に１つまたは複数のヌクレオチド付加、欠失および／または置換を含む配列；または配列番号１１あるいは、配列番号１４のヌクレオチド２５３〜１４８３に対する同一性が少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％である配列を含むヌクレオチド配列の発現によって産生されるポリペプチドを含む。
【００３１】
好ましい一実施形態では、フィターゼが、少なくともｐＨ約２．５〜ｐＨ約５．５の範囲のｐＨでフィターゼ活性を有する。一層好ましくは、フィターゼが、下記の材料および方法のセクションに開示するフィターゼアッセイで測定した場合に少なくともｐＨ約２．５〜ｐＨ約３．５の範囲、またｐＨ約５〜ｐＨ約５．５の範囲のｐＨで、フィターゼ活性を有する。
【００３２】
好ましくは、フィターゼの比活性レベルが、少なくとも酵素１００ＦＴＵ／ｍｇである。一層好ましくは、少なくとも、２００、３００、４００、５００、７００、１０００ＦＴＵ／ｍｇである。
【００３３】
本明細書で使用する場合、１ＦＴＵ（フィターゼ単位）とは、本明細書の材料および方法のセクションに記載のｐＨ５．５でのフィターゼアッセイで定義する反応条件下で、１分間に１μｍｏｌの無機オルトリン酸塩を基質から放出するのに必要な酵素の量として定義される点は理解できよう。
【００３４】
好ましい実施形態では、本発明で使用するフィターゼは、ｐＨ範囲２．０〜５．５の最大活性の少なくとも５０％を保持するおよび／または３００ＦＴＵ／ｍｇを超える比活性を有するｐＨ最適値がｐＨ２〜５．５、好ましくは４．０〜４．５の範囲である。
【００３５】
好ましくは、本発明で使用する脂肪分解酵素は、下記の材料および方法のセクションに記載のリパーゼアッセイで測定した場合に、ｐＨ約１．５〜ｐＨ約５．５の範囲のｐＨでリパーゼ活性を有する。一層好ましくは、脂肪分解酵素は、ｐＨ約１．５〜ｐＨ約３．５またはｐＨ約２．０〜ｐＨ約３．５の範囲のｐＨでリパーゼ活性を有する。
【００３６】
本発明で使用する脂肪分解酵素は、本明細書で定義するアッセイを使用して、脂肪分解酵素活性を示す好適な脂肪分解酵素であれば、どのようなものであってもよいことは理解できよう。好ましくは、脂肪分解酵素は、活性レベルが少なくとも酵素１００ＬＩＰＵ／ｍｇである。一層好ましくは、少なくとも、２００、３００、４００、５００、７００、１０００ＬＩＰＵ／ｍｇである。
【００３７】
本明細書で使用する場合、１ＬＩＰＵ（リパーゼ単位）とは、後述の材料および方法のセクションに記載のリパーゼアッセイで説明する条件下で、１分間に１μｍｏｌのＨ+を放出する酵素の量として定義される。
【００３８】
好ましい一実施形態では、本発明で使用する脂肪分解酵素は、国際公開第９８／４５４５３号パンフレットに記載されているような糸状菌類である、アスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）由来のものである。
【００３９】
好ましくは、脂肪分解酵素が、配列番号７または８に示すようなアミノ酸配列を含むポリペプチド；または配列番号７または８と比較した場合に１つまたは複数のアミノ酸付加、欠失および／または置換を含むポリペプチド；またはこれに対する同一性が少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％であるポリペプチドを含むか；または配列番号９または１０の配列；または遺伝暗号の縮重がゆえに配列番号９または１０とは異なる配列；または配列番号９または１０の配列と比較した場合に１つまたは複数のヌクレオチド付加、欠失および／または置換を含む配列または配列番号９または１０に対する同一性が少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％である配列を含むヌクレオチド配列の発現によって産生されるポリペプチドを含む。
【００４０】
あるいは、リパーゼは、シュードモナス・ゲッサーディイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｇｅｓｓａｒｄｉｉ）由来の酸性リパーゼ（Ｒａｍａｎｉ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｉｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１０）  ３７：５３１〜５３５）、リゾプス・アリズス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ）由来の酸性リパーゼ（Ｋｕｍａｒ，  ＫＫ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｈｉｎｄｕｓｔａｎ  Ａｎｔｉｂｉｏｔ  Ｂｕｌｌ．  １９９３  Ｆｅｂ−Ｍａｙ；３５（１−２）：３３〜４２）（配列番号３２、３３）、ペニシリウム・シンプリシッシム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ）由来の酸性リパーゼ（Ｇｕｔａｒｒａ  Ｍ．Ｌ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １００（２００９）  ５２４９〜５２５４）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）  ＮＣＩＭ  １２０７由来の酸性リパーゼ（Ｍｈｅｔｒａｓ  Ｎ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １００（２００９）  １４８６〜１４９０，  Ｐｅｌ，Ｈ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２５（２），  ２２１〜２３１（２００７））（配列番号２７）、たとえばヒト（配列番号１７、１８）、ウシ（配列番号１９、２０）、マウス（配列番号２１、２２）、ラット（配列番号２３、２４）、イヌ（配列番号２５、２６）由来の哺乳類胃リパーゼ（Ｃｈａｈｉｎｉａｎ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００６，  ４５，  ９９３〜１００１）、トウゴマ由来の酸リパーゼ（Ｅａｓｔｍｏｎｄ，  Ｐ．Ｊ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２７９（２００４）；  ４５５４０〜４５５４５）（配列番号２８、２９）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来のＬＩＰ２リパーゼ（Ａｌｏｕｌｏｕ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １７７１（２００７）  ２２８〜２３７）（配列番号３０、３１）からなる群から選択されるものであってもよい。
【００４１】
上述したように、本発明者らは、本発明による飼料用サプリメントの性能改善が、消化の早い段階で遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を遊離する脂肪分解酵素の作用によるものであることを発見した。これによってカルシウム石鹸が形成され、それに伴い、カルシウム−フィチン酸錯体が低減される。
【００４２】
別の好ましい実施形態では、本発明で使用する脂肪分解酵素が、たとえば、トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）宿主細胞における配列番号９または配列番号１０の配列を有するヌクレオチドの発現によって、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞で産生される。
【００４３】
別の好ましい実施形態では、本発明による飼料用サプリメントが、
ｉ）以下の特徴すなわち、
ａ）本明細書で開示するリパーゼアッセイで測定した場合に、ｐＨ約１．５〜ｐＨ約３．５の範囲のｐＨでリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素、
ｂ）配列番号７または８に示すようなアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはこれに対する同一性が少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％であるポリペプチドを含む脂肪分解酵素、
ｃ）配列番号９または１０の配列；または遺伝暗号の縮重がゆえに配列番号９または１０とは異なる配列；または配列番号９または１０に対する同一性が少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％である配列を含むヌクレオチド配列の発現によって産生される脂肪分解酵素、
のうちの少なくとも１つを特徴とする脂肪分解酵素である脂肪分解酵素と、
ｉｉ）以下の特徴すなわち
ｄ）細菌のフィターゼ、
ｅ）ｐＨ約２．５〜ｐＨ約３．５の範囲のｐＨで、本明細書で後述するフィターゼアッセイで測定した場合に、フィターゼ活性を有するフィターゼ、
ｆ）配列番号１〜６または配列番号１３のいずれか１つに示すようなアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはこれに対する同一性が少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％であるポリペプチドを含むフィターゼ、
ｇ）配列番号１１あるいは、配列番号１４のヌクレオチド２５３〜１４８３の配列；または遺伝暗号の縮重がゆえに配列番号１１あるいは、配列番号１４のヌクレオチド２５３〜１４８３とは異なる配列；または配列番号１１、あるいは配列番号１４のヌクレオチド２５３〜１４８３に対する同一性が少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％である配列を含むヌクレオチド配列の発現によって産生されるフィターゼのうちの少なくとも１つを特徴とするフィターゼと、を含む。
【００４４】
別の好ましい実施形態では、飼料用サプリメントが、脂肪分解酵素と、リパーゼ活性（リパーゼ単位（ＬＩＰＵ）として測定）対フィターゼ活性（フィターゼ単位（ＦＴＵ）として測定）の比が、本明細書において後述するようなｐＨ５．５でのリパーゼアッセイおよびフィターゼアッセイで定義した場合に、約１：５〜約１２：１の範囲、好ましくは約１：３〜約３：１の比、一層好ましくは約１：１〜約３：１の比にあるフィターゼとを含む。
【００４５】
好ましくは、利用率が高まる少なくとも１種類の食餌用栄養塩が、亜リン酸；カルシウム；アミノ酸、脂肪および／またはデンプンを含む群から選択される。好ましくは、利用率がともに回腸および／または全胃腸管で改善される。
【００４６】
本発明で用いられる脂肪分解酵素およびフィターゼが、液体または固体／粒状組成物として独立に提供できるものであることは、当業者であれば理解できよう。
【００４７】
好ましくは、前記酵素が液体形態の場合、前記酵素は当該酵素を含む細胞の培養後に前記酵素が分泌された培地中にある。好ましくは、前記培地が無細胞（すなわち、細胞が培地から分離されている）である。好ましくは、前記培地が濃縮されている。培地を顆粒化して固体の酵素組成物を提供可能であることは理解できよう。
【００４８】
さらに、用途および／または適用モードおよび／または投与モードに応じて、本発明による飼料用サプリメントまたは少なくとも１種類の脂肪分解酵素および少なくとも１種類のフィターゼを、溶液の形態または固体として提供してもよい旨は理解できよう。
【００４９】
一実施形態では、本発明による飼料用サプリメントまたは少なくとも１種類の脂肪分解酵素および少なくとも１種類のフィターゼが、消費に適した液体配合物であり、好ましくはこのような液体組成物が、緩衝液、塩、ソルビトールおよび／またはグリセロールのいずれかを含有する。
【００５０】
別の実施形態では、本発明による飼料用サプリメントまたは少なくとも１種類の脂肪分解酵素および少なくとも１種類のフィターゼを、前記脂肪分解酵素および／またはフィターゼを含む１つ以上の細胞として提供してもよい。
【００５１】
一実施形態では、飼料用サプリメントが、顆粒化または他の酵素と同時顆粒化される。
【００５２】
好ましくは、飼料用サプリメントが、少なくとも１種類の生理学的に許容されるキャリアをさらに含む。
【００５３】
生理学的に許容されるキャリアは、好ましくは、マルトデキストリン、石灰石（炭酸カルシウム）、シクロデキストリン、コムギまたはコムギ成分、スクロース、デンプン、アンチフォーム、Ｎａ2ＳＯ4、タルク、ＰＶＡおよびこれらの混合物のうちの少なくとも１つから選択される。
【００５４】
一実施形態では、フィターゼおよび／または脂肪分解酵素を、生理学的に許容されるキャリアで乾燥させる。
【００５５】
好ましい実施形態では、飼料用サプリメントが、少なくとも１種類の別の酵素を含むものであってもよい。好ましい実施形態では、少なくとも１種類の別の飼料酵素が、デンプン代謝、繊維の分解、脂質代謝に関与するもの、グリコーゲン代謝に関与するタンパク質または酵素、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、−ガラクトシダーゼ、−グルカナーゼ、グルカンリサーゼ、エンド−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、−グルコシダーゼ（βグルコシダーゼを含む）、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノ−ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ（Ｄ−ヘキソース：Ｏ2−オキシドレダクターゼ、ＥＣ  １．１．３．５）β−グルカナーゼ、α−アミラーゼ、ペクチナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、酸性ホスファターゼおよび／または他のものまたはこれらの組み合わせからなる群から選択される。これには、たとえば、飼料の粘度を調節する酵素を含む。
【００５６】
一層好ましい実施形態では、飼料用サプリメントが、フィターゼ、脂肪分解酵素、キシランゼおよび／またはアミラーゼを含む。最も好ましい実施形態では、飼料用サプリメントが、フィターゼ、脂肪分解酵素、キシランゼおよびアミラーゼを含む。
【００５７】
好ましくは、アミラーゼが、飼料１０Ｕ／ｋｇ〜１００００Ｕ／ｋｇ、一層好ましくは、１００Ｕ／ｋｇ〜７５００Ｕ／ｋｇ、なお一層好ましくは、５００Ｕ／ｋｇ〜５０００Ｕ／ｋｇの範囲で存在する。１アミラーゼＵとは、ｐＨ６．５および３７℃で水不溶性の架橋デンプンポリマー基質から１分あたり１ｍｍｏｌのグルコシドリンケージを放出する酵素の量である旨は、理解できよう。
【００５８】
好ましくは、キシランゼが、飼料１００Ｕ／ｋｇ〜１００００Ｕ／ｋｇ、一層好ましくは、２５０Ｕ／ｋｇ〜７５００Ｕ／ｋｇ、なお一層好ましくは、５００Ｕ／ｋｇ〜５０００Ｕ／ｋｇの範囲で存在する。１キシランゼＵとは、ｐＨ５．３および５０℃でオート麦スペルトキシラン基質から１分あたり０．５μｍｏｌの還元糖等価物（ＤＮＳ  ［４］によるキシロースとして）還元糖方法）を放出する酵素の量である旨は、理解できよう。（Ｂａｉｌｅｙ，  Ｍ．Ｊ．  Ｂｉｅｌｙ，  Ｐ．  ａｎｄ  Ｐｏｕｔａｎｅｎ，  Ｋ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ２３，（３），  Ｍａｙ  １９９２，  ２５７〜２７０）。
【００５９】
飼料用サプリメントは、どのような好適な動物用であってもよい旨は理解できよう。好ましくは、動物が、単胃動物、たとえば家禽類またはブタである。
【００６０】
飼料用サプリメントは、少なくとも１種類のフィターゼおよび少なくとも１種類の脂肪分解酵素を、どのような好適な量で含有するものであってもよいことは、明らかであろう。好ましくは、飼料用サプリメントが、個々にまたは合計のパーセンテージとして、少なくとも０．１重量％の脂肪分解酵素およびフィターゼを含有する。一層好ましくは、飼料用サプリメントが、個々にまたは合計のパーセンテージとして、少なくとも０．５重量％；少なくとも１重量％；少なくとも２重量％；少なくとも３重量％；または少なくとも４、５、６、７、８、９または１０重量％の脂肪分解酵素およびフィターゼを含むものであってもよい。
【００６１】
本発明による飼料用サプリメントまたは少なくとも１種類の脂肪分解酵素および少なくとも１種類のフィターゼは、安定化剤および／またはバルク剤および／または他の酵素などの他の成分を含むものであってもよいことは、当業者には自明であろう。
【００６２】
好ましくは、本発明による飼料用サプリメントまたは少なくとも１種類の脂肪分解酵素および少なくとも１種類のフィターゼが、最大約７０℃；最大約８５℃；または最大約９５℃の熱処理に対して熱的に安定することになる。この熱処理については、最大約１分間；最大約５分間；最大約１０分間；最大約３０分間；最大約６０分間実施すればよい。熱的に安定したという表現は、指定温度への加熱前に添加剤中に存在した／活性であった酵素成分の少なくとも約７５％が、これを室温まで冷却した後にも依然として存在する／活性であることを意味する。好ましくは、指定温度への加熱前に添加剤中に存在し、活性であった酵素成分の少なくとも約８０％が、これを室温まで冷却した後にも依然として存在し、活性である。
【００６３】
本発明による飼料用サプリメントまたは少なくとも１種類の脂肪分解酵素および少なくとも１種類のフィターゼは、保存寿命が約３０週間を超える；約４０週間を超える；約５０週間を超える；約１年間を超える；約１．５年間を超える。保存寿命とは、調製時に添加剤中に存在し、活性であった酵素成分の少なくとも約８０％が、依然として存在し、活性であることを意味する。
【００６４】
好ましくは、本発明による飼料用サプリメントを生成する方法が、少なくとも１種類のフィターゼおよび少なくとも１種類の脂肪分解酵素を、任意に少なくとも１種類の生理学的に許容されるキャリアと混合することを含む混合ステップを含む。
【００６５】
特に好ましい実施形態では、飼料用サプリメントを均質化して、粉末を生成する。
【００６６】
別の好ましい実施形態では、国際公開第２００７／０４４９６８号パンフレットに記載されているように、飼料用サプリメントを顆粒に配合する（ＴＰＴ顆粒と呼ぶ）。
【００６７】
もうひとつの好ましい実施形態では、飼料用サプリメントを顆粒に配合する場合、この顆粒が、タンパク質コアに被覆された水和したバリア塩を含む。このような塩コーティングの利点として、熱許容性の改善、保存安定性の改善ならびに、これがなければ酵素に有害な作用を持つ他の飼料添加剤に対する保護がある。
【００６８】
好ましくは、塩コーティングに用いられる塩は、２０℃で水分活性が０．２５超または恒湿が６０％超である。
【００６９】
好ましくは、塩コーティングがＮａ2ＳＯ4を含む。
【００７０】
飼料用サプリメントを調製する方法は、粉末をペレット化する別のステップを含むものであってもよい。この粉末を、従来技術において周知の他の成分と混合してもよい。この粉末、あるいはこの粉末を含む混合物を強制的にダイに通し、得られるストランドを、さまざまな長さの好適なペレットに切断してもよい。
【００７１】
任意に、ペレット化するステップが、ペレットの形成前に、スチーム処理またはコンディショニング段階を含むものであってもよい。この粉末を含む混合物を、水蒸気圧入でミキサなどのコンディショナに入れてもよい。混合物をコンディショナ内で、６０〜１００℃などの指定温度まで加熱するが、一般的な温度は７０℃、８５℃、９０℃または９５℃であろう。滞留時間については、数秒から数分、さらには数時間にすらも可変にできる。５秒間、１０秒間、１５秒間、３０秒間、１分間２分間、５分間、１０分間、１５分間、３０分間、１時間など。
【００７２】
本発明による飼料用サプリメントが、適当な任意の飼料材料への添加に適していることは、理解できよう。
【００７３】
本明細書で使用する場合、飼料材料という用語は、動物が消費する基本的な飼料材料を示す。これには、たとえば、少なくとも１種類以上の未加工穀物粒および／または大豆粕または骨粉などの加工植物および／または動物材料を含んでもよいことは、さらに理解できよう。
【００７４】
いくつかの実施形態では、飼料材料が、以下の成分すなわち、ａ）小穀物（コムギ、オオムギ、ライムギ、カラスムギおよびこれらの組み合わせなど）および／またはトウモロコシ（ｍａｉｚｅ）またはソルガムなどの大型穀物などの穀類；ｂ）コーングルテンミール、トウモロコシ蒸留粕（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  Ｄｒｉｅｄ  Ｇｒａｉｎ  Ｓｏｌｕｂｌｅｓ）（ＤＤＧＳ）、コムギフスマ、コムギミドリング、コムギ小ブスマ、米糠、籾殻、カラスムギ外皮、パーム核、柑橘パルプなどの穀類からの副産物；ｃ）ダイズ、ヒマワリ、ラッカセイ、ルピナス、エンドウマメ、ソラマメ、ワタ、セイヨウアブラナ、魚粉、乾燥血漿タンパク質、肉および骨粉、ジャガイモタンパク質、ホエー、コプラ、ゴマなどの起源から得られるタンパク質；ｄ）野菜および動物起源から得られる油および脂肪；ｅ）ミネラルおよびビタミンのうちの１種類以上を含むことになる。
【００７５】
本発明による飼料用サプリメントが、高フィチン酸塩飼料材料に添加すると特に好都合であることは、さらに明らかであろう。
【００７６】
本明細書で使用する場合、飼料原料という用語は、１種類以上の飼料用サプリメントが添加された飼料材料を示す。
【００７７】
動物が異なれば必要な飼料原料が異なり、同じ動物であってもその動物の肥育目的に応じて異なる飼料原料を必要とする場合もあることは、当業者であれば理解できよう。開始時の飼料材料に応じて、飼料原料が高繊維飼料原料であっても低繊維飼料原料であってもよいことも、さらに理解できよう。
【００７８】
好ましくは、飼料原料が、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）またはトウモロコシ（ｃｏｒｎ）、コムギ、オオムギ、ライコムギ、ライムギ、コメ、タピオカ、ソルガム、および／または副産物のいずれかならびに、大豆粕、ナタネ種子粕、ナタネ粕、綿実油粕、ヒマワリ種子粕、動物副産物粉などのタンパク質を豊富に含む成分、これらの混合物を含む飼料材料を含むものであってもよい。一層好ましくは、飼料原料が、動物脂肪および／または野菜油を含むものであってもよい。
【００７９】
任意に、飼料原料は、たとえば、カルシウムなどの別のミネラルおよび／または別のビタミンを含有するものであってもよい。
【００８０】
本発明による飼料用サプリメントが、カルシウム含有量の多い飼料原料に用いると特に有益になることは、当業者には明らかであろう。特に、カルシウム含有量が高くフィチン酸塩含有量も高い飼料原料。
【００８１】
高カルシウム食餌を示すカルシウムのレベルが動物のタイプに応じて、なおかつ動物を肥育する用途にすらも応じて変化してもよいことは、当業者には明らかであろう。たとえば、産卵鶏の場合、＞３％の食餌で高Ｃａ食餌となろう。ブロイラーおよびすべてのシチメンチョウでは、＞１％Ｃａの食餌で高Ｃａ食餌となろう。本発明の目的で、高カルシウム食餌は、少なくとも１〜２％のカルシウムを含む食餌とみなされる。
【００８２】
高フィチン酸塩食餌が、重量で＞０．９０％のフィチン酸を含む食餌であることは、当業者にはさらに明らかであろう。
【００８３】
本明細書で定義するように、低繊維飼料原料は、水不溶性細胞壁の最大含有量約２５％および／または可溶性非デンプン多糖の最大含有量約４％を含有する、１種類以上の飼料材料を含む飼料原料である。一層好ましくは、水不溶性細胞壁の最大含有量約２２．５％、約２０％、約１７．５％、約１５％、約１２．５％；および／または可溶性非デンプン多糖の最大含有量約３％、約２．５％、約２％、約１．７５％、約１．５％、約１．２５％。
【００８４】
好ましい実施形態では、本発明による飼料用サプリメントまたは少なくとも１種類の脂肪分解酵素および少なくとも１種類のフィターゼを、少なくとも１種類の低繊維飼料材料、たとえば、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）、コムギ、動物副産物粉またはダイズおよび／または副産物のいずれかと混合し、低繊維飼料原料を提供する。
【００８５】
好ましくは、飼料原料がトウモロコシ（ｃｏｒｎ）と大豆粕とのミックスである。
【００８６】
好ましくは、飼料材料が脱脂米糠ではない。
【００８７】
好ましい実施形態では、飼料原料が、飼料原料約２５０ＦＴＵ／ｋｇ〜約１５，０００ＦＴＵ／ｋｇ（２５０〜１０，０００ＦＴＵ／ｋｇ、４００〜７，５００ＦＴＵ／ｋｇ、また５００〜５０００ＦＴＵ／ｋｇなど）のレベルでフィターゼを含む。
【００８８】
別の好ましい実施形態では、飼料原料が、飼料原料約１２５ＬＩＰＵ／ｋｇ〜約４５，０００ＬＩＰＵ／ｋｇ（５００〜３０，０００ＬＩＰＵ／ｋｇ、１０００〜２００００ＬＩＰＵ／ｋｇ、また３０００〜１００００ＬＩＰＵ／ｋｇなど）のレベルで脂肪分解酵素を含む。
【００８９】
権利請求した利点を本発明による飼料用サプリメントで提供するには、飼料材料または飼料原料中にフィチン酸塩が存在しなければならないことは、当業者には容易に明らかであろう。また、このフィチン酸塩は、飼料材料の構成成分として自然に存在してもよいし、所望のレベルで別のサプリメントとして添加してもよいものであることも容易に明らかであろう。
【００９０】
もうひとつの態様では、飼料原料を生成するための方法が得られる。飼料原料は一般に、原材料をまず好適な粒度まで粉砕した後、適切な添加剤と混合する飼料用ミルで生成される。その後、飼料原料をマッシュまたはペレットとして生成してもよい。後者の場合は一般に、温度を標的レベルまで上昇させた後、飼料をダイに通して特定サイズのペレットを生成する方法を必要とする。このペレットを、そのまま冷却する。その後、脂肪および酵素などの液体添加剤を加えてもよい。飼料原料の生成には、特に少なくとも蒸気の使用を含んでもよい好適な技術によって、ペレット化の前に押出または膨張を含む追加のステップを伴うこともある。
【００９１】
飼料原料は、家禽類（たとえば、ブロイラー、卵を産む鶏、ブロイラー育種業者、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、水鳥）、ブタ（あらゆる年齢カテゴリ）、ペット（たとえばイヌ、ネコ）または魚などの単胃動物用の飼料原料であってもよい。
【００９２】
任意に、飼料原料は、別の添加剤を含むものであってもよい。たとえば、飼料原料に、任意の好適な量でカルシウムを添加して、動物の食餌を補うおよび／またはバルク剤としてもよい。カルシウムは、有機（緑色葉野菜など）形態であっても無機（石灰石／炭酸カルシウムなど）カルシウムであってもよい。好ましくは、カルシウムサプリメントの添加後、飼料原料が、少なくとも約０．５％のカルシウムを含む。一層好ましくは、少なくとも約０．８％、少なくとも約１．０％、少なくとも約２．０％、少なくとも約３％のカルシウム。
【００９３】
飼料原料は、少なくとも０．０００１重量％の飼料用サプリメントを含むものであってもよい。好適には、飼料原料は、少なくとも０．０００５重量％；少なくとも０．００１０重量％；少なくとも０．００２０重量％；少なくとも０．００２５重量％；少なくとも０．００５０重量％；少なくとも０．０１００重量％；少なくとも０．０２０重量％；少なくとも０．１００重量％；少なくとも０．２００重量％；少なくとも０．２５０重量％；少なくとも０．５００重量％の飼料用サプリメントを含むものであってもよい。
【００９４】
別の態様では、飼料原料を製造するにあたって、飼料材料からの少なくとも１種類の栄養塩の利用率を高めるおよび／または利用可能な代謝エネルギを増やすために少なくとも１種類のフィターゼおよび少なくとも１種類の脂肪分解酵素を用いる使用法が得られる。
【００９５】
好ましくは、少なくとも１種類のフィターゼおよび少なくとも１種類の脂肪分解酵素が、飼料用サプリメントとして配合される。一層好ましくは、飼料用サプリメントが、本発明による飼料用サプリメントである。
【００９６】
好ましい実施形態では、少なくとも１種類の栄養塩が、亜リン酸、カルシウム、総脂肪および／またはアミノ酸から選択される。
【００９７】
本明細書で使用する場合、「少なくとも１種類の栄養塩の利用率を高めるおよび／または利用可能な代謝エネルギを増やす」という表現は、フィターゼおよび脂肪分解酵素または飼料用サプリメントを加えていない単位重量の飼料材料から得られる栄養塩またはエネルギの利用率と比較した場合に、単位重量の飼料原料を消費する動物が利用できる栄養塩の量またはエネルギの量が増加することを意味する。
【００９８】
別の好ましい実施形態では、飼料材料が、高レベルのフィチン酸塩および／またはカルシウムを含む飼料材料である。
【００９９】
本発明について、以下の図面を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】野生型ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼのアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図２】ＢＰ−１１２で表示した変異体ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３】野生型ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼおよび４つの変異体ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼ（配列番号１〜５）のアミノ酸アライメントを示す。
【図４】ＢＰ−１１で表示した別の変異体ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼのアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図５】アスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）由来の脂肪分解酵素のアミノ酸配列（配列番号７）を示し、内在性シグナルペプチドをボールドで示してある。
【図６】内在性シグナルペプチドを除去したこと以外は配列番号７と同一である、アスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）由来の脂肪分解酵素のアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
【図７】シグナル配列を含むアスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）脂肪分解酵素（配列番号７に示す）をコードするヌクレオチド配列を示す−このヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ配列（および配列番号９で表示した）である。シグナル配列をボールドで示し、イントロンを小文字で示す。
【図８】シグナル配列を含まないアスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）脂肪分解酵素（配列番号８に示す）をコードするヌクレオチド配列を示す−ヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ配列（および配列番号１０で表示した）である。イントロンを小文字で示す。
【図９】ペプシンの濃度を上げた場合のブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）、変異体ＢＰ−１７、ＢＰ−１１０、ＢＰ−１１１、ＢＰ−１１２由来のフィターゼならびに、Ｐｈｙｚｙｍｅ  ＸＰ、Ｎａｔｕｐｈｏｓ、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐの耐性を示す。
【図１０】ＫｏｌｄｉｎｇのＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにおけるペレット化ユニットの概略図である。
【図１１】本発明に用いる３つのＰｈｙｔａｓｅ  Ｂ変異体でのペレット化試験の相対残留活性を示す。
【図１２】Ｐｈｙｚｙｍｅ  ＸＰすなわち大腸菌（Ｅ  ｃｏｌｉ）フィターゼを全粒小麦粉に配合した場合の相対残留活性を示す。
【図１３】被覆されたＲｏｎｏｚｙｍｅ製品からフィターゼを抽出して全粒小麦粉に配合し、保護のない状態でフィターゼ分子の熱安定性を研究した試験の結果を示す。
【図１４】さまざまなｐＨでのフィチン酸塩に対する本発明に用いるフィターゼおよび対照の活性を示す。
【図１５】さまざまなｐＨでのフィチン酸塩に対する本発明に用いるフィターゼおよび対照の活性を示す。
【図１６】さまざまなｐＨでのフィチン酸塩に対する本発明に用いるフィターゼおよび対照の活性を示す。
【図１７】さまざまなｐＨでのフィチン酸塩に対する本発明に用いるフィターゼおよび対照の活性を示す。
【図１８】ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）変異体由来のフィターゼが８５℃を超える温度でフィチン酸の加水分解を触媒したことを明らかに示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１９】ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）変異体由来のフィターゼが８５℃を超える温度でフィチン酸の加水分解を触媒したことを明らかに示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２０】アスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）リパーゼ３ゲノムＤＮＡを含有するｐＤＯＮＲ２２１：：ｌｉｐ  ３を示す。
【図２１】最終リパーゼ発現コンストラクトＡＴｌｉｐａｓｅ３Ｔｒｅｘを示す。
【図２２】野生型ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す。
【図２３】Ａはカニューレ処置したブタの回腸でのエネルギ消化係数を示す（ＳＥＭ＝０．０００９）。文字の異なるバーはＰ＜０．０５レベルが異なる。Ｂはカニューレ処置したブタの回腸での粗タンパク質消化係数を示す（ＳＥＭ＝０．０００９）。文字の異なるバーはＰ＜０．０５レベルが異なる。
【図２４】ブタの全消化管で消化可能なエネルギ係数を示す（ＳＥＭ＝０．００９）。文字の異なるバーはＰ＜０．０５レベルが異なる。
【図２５】Ａはブタの全消化管カルシウム貯留を示す（ＳＥＭ＝０．０２７）。文字の異なるバーはＰ＜０．０５レベルが異なる。Ｂはブタの全消化管リン貯留を示す（ＳＥＭ＝０．０３０）。文字の異なるバーはＰ＜０．０５レベルが異なる。
【図２６】シグナル配列（配列番号１２）を含む野生型大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）フィターゼのアミノ酸配列を示す。
【図２７】成熟野生型大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）フィターゼ（配列番号１３）のアミノ酸配列を示す。
【図２８】野生型大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）フィターゼ（配列番号１４）をコードするヌクレオチド配列を示す。
【図２９】さまざまな脂肪分解酵素／フィターゼの組み合わせと一緒にインキュベートした場合のトウモロコシ（ｃｏｒｎ）−ダイズ飼料からの遊離脂肪酸の生成を示す。
【図３０】フィチン酸とカルシウムとのフィターゼ耐性錯体の生成ならびに、遊離脂肪酸を加えることによる反転を示す。図３０Ａは、ＣａＣｌ2濃度を高めることによるフィターゼ活性に対する影響を示す。図３０Ｂは、遊離脂肪酸を、１５ｍＭを含有する反応混合物に加えることによるフィターゼ活性に対する影響を示す。
【図３１】フィチン酸とカルシウムとのフィターゼ耐性錯体の生成ならびに、リパーゼを含むリパーゼ反応混合物を加えることによる反転を示す。図３１Ａは、ＣａＣｌ2濃度を高めることによるフィターゼ活性に対する影響を示す。図３１Ｂは、リパーゼ反応混合物を、３０ｍＭのＣａＣｌ2を含有するフィターゼ反応混合物に加えることによるフィターゼ活性に対する影響を示す。
【図３２】トウモロコシ（ｃｏｒｎ）−ダイズ食餌で測定したリパーゼ３および膵リパーゼのｐＨ特性を示す。
【図３３】ブロイラー鶏におけるリンの回腸での消化係数を示す。文字の異なるバーはＰ＜０．０５レベルが異なる。
【図３４】ブロイラー鶏におけるカルシウムの回腸での消化係数を示す。文字の異なるバーはＰ＜０．０５レベルが異なる。
【図３５】ブロイラー鶏におけるリンの全消化管での貯留係数を示す。文字の異なるバーはＰ＜０．０５レベルが異なる。
【図３６】ブロイラー鶏を用いる２つの実験でのカルシウムの全消化管での貯留係数。文字の異なるバーはＰ＜０．０５レベルが異なる。
【図３７】家禽類の消化管でのリパーゼとフィターゼとの相互作用に関与する機序についての本発明者らの仮説を示す。図は、リパーゼとフィターゼとの間に観察された相乗効果の裏にある考えられる機序の略図を示している。酸性条件下でのリパーゼ３の作用がゆえに、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）がリパーゼ３のない状況よりも消化の早い段階で遊離する。これらのＦＦＡは、余分なカルシウム（Ｃａ）と結合して石鹸を形成することがある。その結果、フィチン酸（ＩＰ６）と結合してフィターゼ耐性錯体を形成するのに利用できる遊離Ｃａが減る。最終的に、リパーゼ３を添加しない状況よりも多くのＩＰ６がフィターゼによって分解される。これによって、動物によるリン酸塩（Ｐ）の遊離と以後の吸収量が増加する。ＦＦＡ−Ｃａ錯体のほうが消化管で後から溶解されることがあり、脂肪およびＣａの吸収が増加する。ＩＰ６を加水分解するフィターゼが存在しないと、これがＦＦＡ−Ｃａ石鹸と錯体を形成して不溶性の非分解可能なＩＰ６−Ｃａ−ＦＦＡ石鹸となり、脂肪、Ｃａ、Ｐの吸収が低下する。
【発明を実施するための形態】
【０１０１】
発明の詳細な開示
特に定義しないかぎり、本明細書で用いる科学技術用語はいずれも、本開示が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，
ｅｔ  ａｌ．，  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  ２０  ＥＤ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）およびＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，  ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，  ＮＹ  （１９９１）が、本開示で用いる用語の多くについての当業者向けの汎用的な辞書となる。
【０１０２】
本開示は、本明細書に開示した例示的な方法および材料に限定されるものではなく、本開示の実施形態を実施または試験するにあたっては、本明細書に記載したものと類似または等価な任意の方法および材料を使用することが可能である。数値の範囲は、その範囲を規定する数字を包含する。特に明記しないかぎり、核酸配列は左から右に５’から３’の方向に、アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシの方向に記載される。
【０１０３】
本明細書に記載の見出しは、明細書を全体として参照することにより得られる本開示のさまざまな態様または実施形態を限定するものではない。よって、すぐ下で定義する用語は、明細書を全体として参照することにより一層完全に定義される。
【０１０４】
アミノ酸は、本明細書では、アミノ酸の名称、３文字の略語または１文字の略語を用いて示される。
【０１０５】
本明細書で使用する場合、「相同体」という用語は、該当アミノ酸配列および該当ヌクレオチド配列に対して一定の相同性を有する実体を意味する。ここで、「相同性」という用語は、「同一性」と等価に扱うことができるものである。好適には、この文脈での「相同的」は、詳細については後述するアライメントアルゴリズムを用いて、２種類の酵素の配列を比較した後のこれらの酵素の配列同一性のパーセンテージを示す。
【０１０６】
本文脈において、相同的アミノ酸配列とは、該当配列に対して、少なくとも７５、８０、８１、８５または９０％同一、好ましくは少なくとも９５、９６、９７、９８または９９％同一であってもよいアミノ酸配列を含むものとする。一般に、相同体は、対象アミノ酸配列のように、同一の活性部位などを含む。相同性を類似性（すなわち、同様の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）の観点から考慮することも可能であるが、本発明の文脈では、相同性を配列同一性の観点から表現するのが好ましい。
【０１０７】
「機能的フラグメント」とは、そのポリペプチドのその特徴的な特性を保持したポリペプチドのフラグメントを意味するものである。本発明の文脈において、フィターゼ酵素の機能的フラグメントは、このタンパク質全体のフィチン酸からリン酸塩を放出する機能を保持したフラグメントである。
【０１０８】
アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の場合、目視によって、あるいはより一般的に、容易に利用可能な配列比較プログラムの助けを借りて相同性の比較を実施可能である。これらの市販のコンピュータプログラムでは、２つ以上の配列間の相同率（％）を計算することができる。
【０１０９】
相同率（％）は、隣接配列について計算可能なものである。すなわち、一方の配列を他方の配列と整列させ、一方の配列に含まれるアミノ酸をそれぞれ他方の配列に含まれる対応するアミノ酸と一度に一残基ずつ直接比較する。これは、「ギャップのない」アラインメントと呼ばれる。一般に、このようなギャップのないアラインメントは、比較的数の少ない残基についてのみ実施される。
【０１１０】
これは極めて単純で着実な方法ではあるが、たとえば、同一の配列対で１つの挿入または欠失が生じると、これが原因で以後のアミノ酸残基がアラインメントから除外され、全体のアラインメントを実施したときに相同率（％）が大幅に低下する可能性があることを考慮していない。その結果、ほとんどの配列比較方法は、全体の相同性スコアを極端に損なわない程度に、起こり得る挿入および欠失を考慮した最適なアラインメントを得るよう設計されている。これは、配列アラインメントに「ギャップ」を挿入して、局所的な相同性を最大にするようにして達成される。
【０１１１】
しかしながら、こうした一層複雑な方法では、アラインメントに生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てているため、同じ数の同一のアミノ酸であれば、ギャップの少ない配列アラインメントほど（比較対象となる２つの配列間の関連性がより高いことを反映して）ギャップの多い配列アラインメントより高いスコアが得られる。ギャップの存在に対してはコストを比較的高くして、このギャップで以後に表れる残基ではペナルティを減少させる「アフィンギャップコスト」が一般に用いられている。これは、最も一般に用いられるギャップスコアリングシステムである。ギャップペナルティが高いと、ギャップの少ない最適なアラインメントを得られることは言うまでもない。ほとんどのアラインメントプログラムでは、ギャップペナルティを変更できるようになっている。しかしながら、このようなソフトウェアを配列比較に用いる場合は、デフォルト値を使用するのが好ましい。たとえば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列のデフォルトのギャップペナルティは、ギャップについて−１２、各伸長部分については−４である。
【０１１２】
したがって、最大相同率（％）を計算するには、まずはギャップペナルティを考慮して最適なアラインメントを作成する必要がある。このようなアラインメントを実行するのに適したコンピュータプログラムにＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ  １９８４  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２  ｐ３８７）がある。配列比較を実施できる他のソフトウェアの例として、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ４th  Ｅｄ  −  Ｃｈａｐｔｅｒ  １８を参照のこと）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４０３−４１０）、ＧＥＮＥＷＯＲＫＳスイートの比較ツールがあげられるが、これに限定されるものではない。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡのどちらもオフラインとオンラインの検索で利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ７−５８ページから７−６０ページを参照のこと）。
【０１１３】
しかしながら、いくつかの用途では、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを用いると好ましい。タンパク質およびヌクレオチド配列の比較には、ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる新しいツールも利用できる（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９  １７４（２）：  ２４７〜５０；  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９  １７７（１）：  １８７〜８およびｔａｔｉａｎａ＠ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと）。
【０１１４】
最終的な相同率（％）は同一性の観点から測定可能なものであるが、アラインメントプロセス自体は一般に、一かゼロかのペアワイズ比較に基づくものではない。むしろ、化学的な類似性または進化距離に基づいて、それぞれのペアワイズ比較にスコアを割り当てるスケールド類似性スコア行列が一般に使用される。普通に用いられるこのような行列の一例に、ＢＬＡＳＴスイートプログラムのデフォルト行列であるＢＬＯＳＵＭ６２行列がある。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムでは通常、一般公開されたデフォルト値またはカスタムシンボル比較表が供給される場合にはそれのいずれかを用いる（詳細については、ユーザーマニュアルを参照のこと）。用途によっては、ＧＣＧパッケージ用の一般公開されたデフォルトの値、他のソフトウェアの場合はＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルトの行列を用いるのが好ましい。
【０１１５】
あるいは、ＣＬＵＳＴＡＬ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧ  ＆  Ｓｈａｒｐ  ＰＭ  （１９８８），  Ｇｅｎｅ  ７３（１），  ２３７〜２４４）に似たアルゴリズムに基づいて、ＤＮＡＳＩＳ（商標）（日立ソフトウェア）のマルチプルアライメント機能を用いて相同性のパーセンテージを計算してもよい。
【０１１６】
このソフトウェアで最適なアラインメントを生成した後、相同率（％）、好ましくは配列同一率（％）を計算できる。このソフトウェアは一般に、配列比較の一部としてこれを実行し、数値としての結果を生成する。
【０１１７】
本発明の好ましい態様では、配列相同性／同一性のパーセンテージを計算するのに以下のソフトウェアと設定を使用する。アミノ酸配列の場合、同一性（相同性）のパーセンテージすなわち「陽性」を、それぞれの考え得るアミノ酸配列対について、ＡｌｉｇｎＸ
ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ  （Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ａｄｖａｎｃｅ  ９．１  ｆｒｏｍ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  ＵＳＡ）で計算する。設定はデフォルトのパラメータ（ギャップオープニングペナルティ−１０、ギャップ伸長ペナルティ０．１）とする。
【０１１８】
核酸配列の場合、同一性（相同性）のパーセンテージすなわち「陽性」を、それぞれの考え得る核酸配列対について、Ｉｎｆｏｒｍａｘ  Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）から入手したＡｌｉｇｎＸ  ＶｅｃｔｏｒＮＴＩプログラムで計算する。設定はＤＮＡのデフォルト設定であり、ギャップオープニングペナルティ：１５およびギャップ伸長ペナルティ：６．６６である。（マルチプルアライメントも同じ設定）。
【０１１９】
好ましくは、全長アミノ酸配列で、あるいはそれぞれの全長アミノ酸配列をコードする対応のポリヌクレオチドに対する核酸について、アミノ酸の同一性（相同性）を計算する。
【０１２０】
サイレントな変化を生じて機能的に等価な物質が得られるアミノ酸残基の欠失、挿入または置換が配列に含まれることもある。アミノ酸の特性（残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性）における類似性に基づいて、意図的なアミノ酸置換を作製してもよい。このため、アミノ酸を官能基でグループ化すると有用である。アミノ酸は、その側鎖だけの特性に基づいてグループ化可能であるが、変異データも含むようにすると一層有用である。このようにして誘導されるアミノ酸のセットが、その構造的な理由で保存されると思われる。これらのセットは、Ｖｅｎｎダイアグラムとして描画可能である（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ  Ｃ．Ｄ．  ａｎｄ  Ｂａｒｔｏｎ  Ｇ．Ｊ．（１９９３）  “Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ：  ａ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ”  Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ．  ９：  ７４５〜７５６）（Ｔａｙｌｏｒ  Ｗ．Ｒ．（１９８６）  “Ｔｈｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ”  Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．  １１９；  ２０５〜２１８）。保存的な置換を、たとえば、一般に許容されるＶｅｎｎダイアグラムによるアミノ酸のグループ化を表す以下の表に沿って作製してもよい。
【０１２１】
【表１】
0005829603.tif 000002
【０１２２】
本発明は、起こり得る相同的置換（置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）および置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）はどちらも、本明細書では既存のアミノ酸残基と別の残基との相互の入れ替えを意味するものとして用いられる）すなわち、塩基と塩基、酸と酸、極性と極性といった具合などの同じようなもの同士の置換も包含する。また、非相同的置換すなわち、あるクラスの残基から別のクラスの残基への置換、あるいは、オルニチン（以下、Ｚとする）、ジアミノ酪酸オルニチン（以下、Ｂとする）、ノルロイシンオルニチン（以下、Ｏとする）、ピリジルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、フェニルグリシンなど、非天然のアミノ酸を含ませることを伴う置換も起こり得る。
【０１２３】
置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）は、非天然のアミノ酸によってなされるものであってもよい。
【０１２４】
「タンパク質」という用語は、本明細書で使用する場合、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドを含む。
【０１２５】
「〜と等価なアミノ酸残基」、「〜に対応するアミノ酸」という表現ならびに文法的にこれと等価の表現は、本明細書では、特定のタンパク質の特定のアミノ酸配列で示されるものと同様の位置および作用を有するタンパク質のアミノ酸残基を示すものとして用いられる。当業者であれば、同等のタンパク質における特定残基の等価性を識別できるであろう。
【０１２６】
「特性」またはポリペプチドに関する文脈で文法的にこれと等価の表現は、本明細書で使用する場合、検出または選択可能なポリペプチドの特徴または属性を意味する。これらの特性として酸化安定性、基質特異性、触媒活性、熱安定性、温度および／またはｐＨ活性特性、飼料加工安定性、分泌される機能があげられるが、これに限定されるものではない。
【０１２７】
本明細書で使用する場合、「アミノ酸配列」という用語は、「ポリペプチド」という用語および／または「タンパク質」という用語と同義である。いくつかの場合には、「アミノ酸配列」という用語が、「ペプチド」という用語と同義である。いくつかの場合には、「アミノ酸配列」という用語が、「酵素」という用語と同義である。
【０１２８】
アミノ酸配列は、好適な起源から調製／単離されるものであってもよいし、合成的に作られたものでもよく、組換えＤＮＡ技術を用いて調製されるものであってもよい。
【０１２９】
「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書では同義に用いられる。本開示および特許請求の範囲では、アミノ酸残基に従来から用いられている１文字および３文字のコードを使用する。ＩＵＰＡＣＩＵＢ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ＪＣＢＮ）に準拠して定義されるようなアミノ酸の３文字のコード。また、遺伝暗号の縮重がゆえに、ポリペプチドが２つ以上のヌクレオチド配列でコードされることもある旨は、理解できよう。
【０１３０】
「シグナル配列」または「シグナルペプチド」という用語は、タンパク質の成熟または前駆体形態の分泌に関与する場合があるヌクレオチドおよび／またはアミノ酸の任意の配列を示す。このシグナル配列の定義は機能的なものであり、タンパク質遺伝子のＮ末端部分によってコードされ、タンパク質の分泌がなされることに関与するすべてのアミノ酸配列を含むことを意図している。これらは、タンパク質のＮ末端部分または前駆体タンパク質のＮ末端部分に結合していることが多いが、常にそうだというわけではない。
【０１３１】
「機能的フラグメント」とは、ポリペプチドのフラグメントであって、そのポリペプチドの特徴的な特性を保持しているフラグメントを意味する。本発明の文脈において、フィターゼまたは脂肪分解酵素の機能的フラグメントは、このタンパク質全体のフィターゼまたは脂肪分解酵素切断能を保持しているフラグメントである。
【０１３２】
「単離された」、「回収された」または「精製された」という表現は、それがもともとあった環境から取り出された材料を示す。「実質的に精製された」という表現は、その材
料が少なくとも有意な程度に精製されていることを意味する。
【０１３３】
一態様では、好ましくは、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列が、単離された形態である。「単離された」という表現は、配列が、天然の状態でこの配列と関連し、天然に見られるものとしての少なくとも１種類の他の成分を、少なくとも実質的に含まないことを意味する。
【０１３４】
明細書全体をとおして、用語の他の定義が出てくることもある。例示的な実施形態を一層詳細に説明する前に、本開示はここに記載の特定の実施形態に限定されるものではなく、もちろんそれ自体も変化し得る旨を理解するものとする。また、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものであるから、本明細書で用いる専門用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、限定を意図したものではない旨も理解するものとする。
【０１３５】
値の範囲が示される場合、文脈からそうでないことが明らかな場合を除いて、その範囲の上限と下限との間にあるそれぞれの中間の値が、下限の単位の十分の一まで具体的に開示されていると理解するものとする。表記の範囲内の表記の値または中間値と、その表記の範囲内の他の表記の値または中間値との間の小さいほうの範囲も各々、本開示に包含される。これらの小さいほうの範囲の上限および下限は、その範囲に独立に含まれていてもよいし、除外されていてもよく、表記の範囲で具体的に除外された限界値次第で、その小さいほうの範囲に一方の限界値が含まれる、どちらの限界値も含まれない、あるいは両方の限界値が含まれる各範囲も本開示に包含される。表記の範囲が一方または両方の限界値を含む場合、これら含まれる限界値の一方または両方を除外する範囲も本開示に含まれる。
【０１３６】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないことが明らかである場合を除いて、同じ対象の複数形も含む点に注意されたい。よって、たとえば、「遺伝子（単数形）」といえば複数のこのような候補剤を含み、「細胞」といえば１種類以上の細胞ならびに当業者間で周知のその等価物を含むといった具合である。
【０１３７】
本明細書に引用した刊行物は、本出願の出願日前に開示されているというだけのものである。本明細書のいずれも、このような刊行物が本明細書に添付の特許請求の範囲に対する先行技術をなすことを認めるものであると解釈されるものではない。
【０１３８】
本発明で用いる酵素は、回分、流加、連続流加プロセスをはじめとして、固体または液体培養のいずれかによって産生可能なものである。培養は、水性ミネラル塩培地、有機成長因子、炭素およびエネルギ源材料、分子酸素、そしてもちろん、使用する１種類以上の特定の微生物種の開始接種材料を含む成長培地で達成される。
【０１３９】
炭素およびエネルギ源、酸素、同化可能な窒素、微生物の接種材料に加えて、適切な割合で好適な量のミネラル栄養塩を供給し、微生物を適切に成長させるとともに、微生物変換プロセスにおける細胞による炭素およびエネルギ源の同化を最大限にし、発酵培地にて最大細胞密度で最大細胞収率を達成する必要がある。
【０１４０】
従来技術において周知のように、水性ミネラル培地の組成は、ある程度は使用する微生物および基質に応じて広範囲にわたって変更可能である。ミネラル培地には、窒素に加えて、好適な量のリン、マグネシウム、カルシウム、カリウム、イオウ、ナトリウムを、同化可能で好適な可溶性イオン混合形態で含むものとし、好ましくは、従来技術において周知のように、銅、マンガン、モリブデン、亜鉛、鉄、ホウ素、ヨウ素などの特定の微量元素が、同じく同化可能で好適な可溶性形態で存在するものとする。
【０１４１】
発酵反応は、発酵槽の中身を、微生物種が活発に成長するのを助ける上で効果的な適した酸素分圧に維持するための空気、酸素の豊富な空気など、あるいは、実質的に純粋な分子酸素のことすらある分子酸素含有ガスによって必要な分子酸素が供給される好気的なプロセスである。実際、酸素化した炭化水素基質を用いることで、微生物成長のための酸素要求量が少なくなる。それにもかかわらず、成長用の分子酸素を供給しなければならない。これは、基質の同化と、これに対応する微生物の成長が、ある程度は燃焼プロセスであるためである。
【０１４２】
曝気速度はかなり広い範囲にわたって変更可能であるが、曝気は通常、（使用する圧力および２５℃で）発酵槽の液体容量あたりの酸素含有ガスの概算容量で毎分約０．５〜１０、好ましくは約０．５〜７の範囲の速度で実施される。この量は、普通の酸素含有量の空気がリアクタに供給されている前提でのものであり、純粋な酸素に関しては、それぞれの範囲が、（使用する圧力および２５℃で）発酵槽の液体容量あたりの酸素の容量で１分あたり約０．１〜１．７または好ましくは約０．１〜１．３になる。
【０１４３】
微生物変換プロセスに使用する圧力は、広い範囲を取り得る。圧力は通常、約０〜５０ｐｓｉｇの範囲内であり、設備および運用コストと達成される酸素溶解性とのバランスとして、現段階で好ましくは約０〜３０ｐｓｉｇ、一層好ましくは大気圧を少なくともわずかに超える圧力である。大気圧を超えることには、このような圧力だと水性発酵物中の溶存酸素濃度が高くなりやすく、ひいては細胞の成長率を増す一助となり得るという利点がある。同時に、これは大気圧が高いと設備および運用コストが上がるという事実とバランスが保たれている。
【０１４４】
発酵温度は、ある程度は変更可能であるが、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）などの糸状菌類の場合、選択する微生物株に応じて、温度は通常、約２０℃〜４０℃の範囲内であり、通常好ましくは、約２５℃〜３４℃の範囲内である。
【０１４５】
微生物は、同化可能な窒素源も必要とする。同化可能な窒素源は、微生物による代謝利用に適した形態で窒素を放出できるものであれば、どのような窒素含有化合物であってもよい。タンパク質加水分解物などの多岐にわたる有機窒素源化合物を採用できるが、通常はアンモニア、水酸化アンモニウム、尿素、さまざまなアンモニウム塩（リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、ピロリン酸アンモニウム、塩化アンモニウムなど）またはさまざまな他のアンモニウム化合物などの安価な窒素含有化合物を利用できる。アンモニアガス自体も、大規模な運用には便利であり、好適な量で水性発酵物（発酵培地）に気泡を通して採用できるものである。同時に、このようなアンモニアを、ｐＨ制御を助ける目的で用いることも可能である。
【０１４６】
水性微生物発酵物（発酵混合物）のｐＨ範囲は、約２．０〜８．０の例示的な範囲にあるものとする。糸状菌類では、ｐＨは普通、約２．５〜８．０の範囲内である。トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）では、ｐＨは普通、約３．０〜７．０の範囲内である。特定の微生物にとってのｐＨ範囲の好みは、ある程度までは使用する培地とその微生物自体に左右されるため、当業者によって容易に判断可能なように、変更には若干培地の変更を伴う。
【０１４７】
発酵槽中における発酵混合物の平均保持時間には、ある程度使用する発酵温度と培養次第で相当な幅を持たせることができるが、通常は約２４〜５００時間の範囲内、好ましくは現段階で約２４〜４００時間である。好ましくは、炭素含有基質を律速因子として制御することで、炭素含有基質から細胞への良好な変換を提供しつつ、相当量の未変換基質による細胞の汚染を回避可能であるような形で、発酵を実施する。水溶性基質の場合は、微量に残っている物質を容易に洗い流せるため、後者が問題になることはない。しかしながら、非水溶性基質の場合は、これが問題となり、好適な洗浄ステップなどの生成物を処理する追加のステップが必要とされることもある。上述したように、このレベルに達するまでの時間は重要ではなく、特定の微生物および実施する発酵プロセスで変更してもよい。しかしながら、発酵培地における炭素源濃度と、所望のレベルの炭素源が達成されたか否かをどのように判断するかは従来技術において周知である。
【０１４８】
発酵については、回分または連続運用して実施可能であるが、流加回分での運用に、制御の容易さ、一定量の生成物の生成、あらゆる設備の最も経済的な使用など、好ましい点が多くある。必要があれば、水性ミネラル培地を発酵槽に供給する前に、炭素およびエネルギ源材料の一部または全部および／またはアンモニアなどの同化可能な窒素源の一部を、水性ミネラル培地に加えることが可能である。リアクタに導入される各々の流れは、好ましくはあらかじめ定められた速度で制御されるか、または炭素の濃度およびエネルギ基質、ｐＨ、溶存酸素、発酵槽からのオフガス中の酸素または二酸化炭素、光線透過性によって測定可能な細胞密度などを監視することで判断可能な需要に応答して制御される。さまざまな材料の供給速度については、できるだけ高速な細胞成長速度を得て、炭素およびエネルギ源の効率的な利用と整合し、仕込んだ基質に比してできるだけ高い微生物細胞収率を得られるように、変更可能である。
【０１４９】
回分または好ましい流加回分運用のいずれかで、すべての設備、リアクタまたは発酵手段、槽または容器、配管、付帯する循環または冷却装置などは、通常は約１２１℃などの蒸気を利用して少なくとも約１５分間かけて、最初から滅菌してある。その後、滅菌済みのリアクタに、酸素および炭素含有基質を含む必要なすべての栄養塩の存在下、選択した微生物の培養を接種する。用いる発酵槽のタイプは重要ではないが、現段階で好ましいのは、１５Ｌ  Ｂｉｏｌａｆｉｔｔｅ（Ｓａｉｎｔ−Ｇｅｒｍａｉｎ−ｅｎ−Ｌａｙｅ，  Ｆｒａｎｃｅ）での運用である。
【０１５０】
本発明による酵素を発酵ブロスから回収して精製する作業を、それ自体は従来技術において周知の手法を用いて実施することも可能である。発酵ブロスは通常、細胞残屑（細胞を含む）、さまざまな懸濁固体および他のバイオマス汚染物質ならびに、本発明による所望の酵素産物（好ましくは従来技術において周知の手段によって発酵ブロスから取り出される）を含有する。これを取り出すための好適なプロセスとして、遠心分離、濾過、透析、精密濾過、回転真空濾過、あるいは他の周知のプロセスなど、無細胞濾液を生成するための従来の固液分離技術があげられる。限外濾過、蒸発または沈殿などの技術を用いて、発酵ブロスまたは無細胞濾液をさらに濃縮すると好ましいこともある。上清または濾液のタンパク質成分の沈殿は、硫酸アンモニウムなどの塩によって達成してもよい。また、任意に、結晶化あるいは、イオン交換クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィなどのなどの多岐にわたるクロマトグラフによる手法または同様の従来技術で認識されている手法によって、さらに精製を実施してもよい。
【０１５１】
フィターゼ。
フィチン酸（ｍｙｏ−イノシトールヘキサキスリン酸塩）は、穀類、マメ科植物、油糧種子作物における重要な構成成分のひとつである。塩形態でのフィチン酸塩は、これらの植物での亜リン酸の主要な貯蔵形態である。
【０１５２】
本明細書で使用する場合、「フィターゼ」または「フィターゼ活性」という用語は、フィチン酸塩の加水分解を触媒して、（１）ｍｙｏ−イノシトールおよび／または（２）そのモノ−、ジ−、トリ−、テトラ−および／またはペンタ−リン酸塩、（３）無機リン酸塩を生成できるタンパク質またはポリペプチドを示す。たとえば、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ＥＣのＥＣ番号３．１．３．８またはＥＣ番号３．１．３．２６に定義された触媒活性を有する酵素。
【０１５３】
フィチン酸塩だけでなく、いくつかのフィターゼも、リン酸化の中間過程であるイノシトール−リン酸塩を少なくともいくつか加水分解可能である。
【０１５４】
「フィターゼ変異体」または「変異体」または「修飾された形態」という表現は、親フィターゼのアミノ酸配列由来のアミノ酸配列を有し、１つ以上のアミノ酸置換、挿入および／または欠失（これらをまとめて「突然変異」と呼ぶ）を有するフィターゼ酵素を示す。
【０１５５】
「親フィターゼ」または「親酵素」という用語は、フィターゼ変異体の誘導元であるフィターゼ酵素を示す。親フィターゼは野生型フィターゼであってもよいし、別のフィターゼ変異体であっても構わない。特に、本発明では、「親フィターゼ」は、国際公開第９９／０８５３９号パンフレット、米国特許第５８７６９９７号明細書、同第６１９０８９７号明細書、オーストラリア特許第７３５３７１号明細書、欧州特許第１００３３７９号明細書、特開２００１−５１４８６９号公報（いずれも本明細書に援用する）に記載されているようなブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）ｓｐ．または大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）由来のものであってもよい。好適には、「親フィターゼ」は、国際公開第２００６／０４３１７８号パンフレットに記載されているような、受託番号ＮＣＩＭＢ４１２４８で寄託されたブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）株Ｐ１−２９由来のものである。
【０１５６】
「大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）フィターゼ」および「ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）ｓｐ．フィターゼ」という用語は、この酵素が、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）またはブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）ｓｐ．の起源から得られたものである必要はないことを意味する。そうではなく、この酵素は、好ましくは、大腸菌（Ｅ．
ｃｏｌｉ）またはブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）ｓｐ．フィターゼと同じ機能的な特徴または配列を有するべきものである。たとえば、ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）ｓｐ．フィターゼは、ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）ｓｐ．由来の変異体であってもよいが、これは天然にはブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）種に存在するものではない。
【０１５７】
「ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）」という用語は、腸内細菌科の通性嫌気的なグラム陰性細菌属を示し、ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）ｓｐｐは、ブティアウクセラ・アグレスライス（Ｂ．  ａｇｒｅｓｔｉｓ）、ブティアウクセラ・ブレンネラーゼ（Ｂ．  ｂｒｅｎｎｅｒａｓｅ）、ブティアウクセラ・フェラグティアエ（Ｂ．ｆｅｒｒａｇｕｔｉａｅ）、ブティアウクセラ・ガビニアエ（Ｂ．  ｇａｖｉｎｉａｅ）、ブティアウクセラ・イザルディイ（Ｂ．  ｉｚａｒｄｉｉ）、ブティアウクセラ・ノアキアエ（Ｂ．  ｎｏａｃｋｉａｅ）、ブティアウクセラ・ワームボールディアエ（Ｂ．  ｗａｒｍｂｏｌｄｉａｅ）を含む。ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）種の株は、たとえば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）およびＤＳＭＺ、Ｇｅｒｍａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌから入手可能である。
【０１５８】
ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼは、好ましくは、国際公開第２００６／０４３１７８号パンフレットに記載の方法によって、ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）ｓｐｐから同定される。
【０１５９】
別の実施形態では、親フィターゼまたはフィターゼが、国際公開第２００６／０３８０６２号パンフレットに記載されているようなシトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐ．由来のものであってもよい。
【０１６０】
「野生型フィターゼ」または「野生型」という用語は、本明細書で使用する場合、天然に見られるアミノ酸配列を有するフィターゼ酵素についていうものである。特に、野生型ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼは、配列番号１として示すものである。野生型大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）フィターゼは、配列番号１３（図２７）として示すものである。
【０１６１】
「フィターゼ変異体」という用語は、本明細書で使用する場合、配列番号１または配列番号１３のフィターゼのアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入および／または欠失が異なるアミノ酸配列を有するフィターゼ酵素を意味する。「変異体」および「変異」という用語は、本明細書で使用する場合、単にフィターゼ変異体のアミノ酸配列と配列番号１または１３のアミノ酸配列との間に配列差があることを意味するだけであり、配列番号１または１３のアミノ酸配列または他のフィターゼが何らかの形で開始材料として機能するおよび／または変異体を得るために物理的に改変、突然変異、修飾またはその他の変更を加えられたこと意味するものではない。簡単に言うと、本発明に用いるフィターゼ変異体は、任意の方法で調製すればよいものであり、当業者であれば多数の方法（そのうちのいくつかを本明細書で説明する）に容易になじんでフィターゼ変異体を生成できよう。
【０１６２】
本発明に用いる変異体フィターゼ（変異体ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）ｓｐ．フィターゼなど）の実施形態が、国際公開第２００６／０４３１７８号パンフレット、同第２００８／０９７６１９号パンフレット、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４１０１１号（いずれも具体的に本明細書に援用する）に開示され、そこでは親ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）ｓｐ．から得られるまたは誘導されるフィターゼならびに、ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）ｓｐ．フィターゼ酵素に対応するフィターゼについて説明されている。具体的には、国際公開第２００６／０４３１７８号パンフレットには、そこに配列番号３として開示された配列を有する野生型フィターゼ酵素の突然変異誘発が記載されている。国際公開第２００６／０４３１７８号パンフレットには、多数の好ましい突然変異が教示されている。国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４１０１１号は、さらに好ましい突然変異を教示している。具体的な好ましい突然変異が、そこには配列番号２〜６として開示され、その内容は以下のとおりである。
フィターゼＢＰ−１１（ＢＰ  １１とも呼ばれることがある）−これは、少なくとも国際公開第２００６／０４３１７８号パンフレットに記載されたフィターゼであり、Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓから入手してもよいものである。このアミノ酸配列を、本明細書では配列番号６として説明する。フィターゼＢＰ−１７（ＢＰ  １７とも呼ばれることがある）−これは、少なくとも国際公開第２００８／０９７６１９号パンフレットに記載され、Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓから入手してもよいフィターゼである。このアミノ酸配列を、本明細書では配列番号３として説明する。
【０１６３】
ＢＰ−１１０（ＢＰ  １７  ｖａｒ．  １１０とも呼ばれることがあり、あるいはＢＰ１７−１１０またはＢＰ１７  １１０とも呼ばれることもある）−これは、少なくともＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４１０１１号に記載されたフィターゼである。このアミノ酸配列を、本明細書では配列番号４として説明する。
【０１６４】
ＢＰ−１１１（ＢＰ  １７  ｖａｒ．  １１１と呼ばれることがあり、あるいはＢＰ１７−１１１またはＢＰ１７  １１１と呼ばれることもある）−これは、少なくともＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４１０１１号に記載されたフィターゼである。このアミノ酸配列を、本明細書では配列番号５として説明する。
【０１６５】
ＢＰ−１１２（ＢＰ  １７  ｖａｒ．  １１２と呼ばれることがあり、あるいはＢＰ１７−１１２またはＢＰ１７  １１２と呼ばれることもある）−これは、少なくともＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４１０１１号に記載されたフィターゼである。このアミノ酸配列を、本明細書では配列番号２として説明する。
【０１６６】
ＢＰ−１１（配列番号６）、ＢＰ−１７（配列番号３）、ＢＰ−１１０（配列番号４）、ＢＰ−１１１（配列番号５）、ＢＰ−１１２（配列番号２）のアミノ酸配列を図３に示す。
【０１６７】
配列番号１〜６と、配列番号１〜６を含むポリペプチドとを参照すると、これは発現時に、たとえばシグナルペプチド切断によって同時翻訳または翻訳後処理されたポリペプチドも示すことが想定される。翻訳後の切断は、Ｃ末端でも起こり得る。したがって、好ましい実施形態では、その有効フラグメント（その機能的フラグメントとも呼ばれる）が、天然の宿主または好適で適切な発現宿主によって産生された成熟ポリペプチドである。
【０１６８】
もうひとつの実施形態では、フィターゼが、国際公開第２００６／０４３１７８号パンフレットに記載されているような、受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１２４８で寄託されたブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）ｓｐ．株Ｐ１−２９由来のものであることを特徴とする。
【０１６９】
本発明による飼料用サプリメントは、親フィターゼのアミノ酸配列の１種類以上のアミノ酸残基が修飾された結果として親フィターゼの特徴が改善されたフィターゼを含むものであってもよい。
【０１７０】
本発明に用いる改善されたフィターゼ酵素は、好ましくは、配列番号３またはその有効フラグメントに対する同一性が７５％を超え、好ましくは８０％を超え、一層好ましくは９０％を超え、一層好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％を超え、好ましくは９９％を超える。しかしながら、変異体が配列番号３に対して異種（すなわち相同的ではない）であってもよいことも想定される。たとえば、エキソ型（ｅｘｏ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）組換えまたはファミリーシャフリングなどの組換え技術によって産生される変異体が、変異体を生んでもよいが、親フィターゼを用いて調製すると相同率７５％未満のこともある。
【０１７１】
好適には、変異体が、以下のうちのいずれか１つに関して向上した安定性の特徴を示す。熱安定性、熱活性、ｐＨ範囲、ペプシン安定性、比活性、基質特異性、一層広い基質特異性。これらの特徴を判断するための好適な方法を、本明細書で開示する。
【０１７２】
高めの温度、低めのｐＨなどでの安定性といった特性に関する文脈での「向上した安定性」という表現は、ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）の場合は配列番号１などの指定された別のフィターゼと比較して、経時的に保持された酵素活性が高いことを示す。別のフィターゼを具体的に指定しないかぎり、本明細書で使用する「向上した安定性」という表現は、配列番号１のフィターゼよりも経時的に保持された酵素活性が高いことを示す。
【０１７３】
「熱的に安定した」および「熱安定性の」とは、上昇した温度への曝露後に規定量の酵素活性を保持する本開示のフィターゼを示す。本開示によるフィターゼ変異体は、緩衝液中にてｐＨ５．５で、規定の温度に１０分間曝露した後に酵素がその活性の５０％より多くを保持する場合に、規定の温度で熱安定性であるとみなされる。
【０１７４】
「向上した熱活性」という用語は、本開示のフィターゼ変異体に関するものであるため、フィターゼ変異体が、配列番号１などのもうひとつの指定されたフィターゼのフィターゼ酵素活性と比較して、上昇した温度で、フィターゼ酵素活性の量が同一または増えていることを意味する。別のフィターゼを具体的に指定しないかぎり、本明細書で使用する「改善された熱活性」という表現は、配列番号１のフィターゼの熱活性と比較した本開示のフィターゼ変異体の熱活性を示す。
【０１７５】
国際公開第２００６／０４３１７８号パンフレット、同第２００８／０９７６１９号パンフレット、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４１０１１号（これらの開示を本明細書に援用する）に記載されたような本開示の変異体について、以下の命名法で記載する。［配列番号１の元のアミノ酸残基／配列番号１における元のアミノ酸残基の位置／置換後のアミノ酸残基］。たとえば、配列番号２では、配列番号１の８９位における元のアラニン（Ａ）がトレオニン（Ｔ）で置換されたものを、Ａ８９Ｔで表す。具体的なアミノ酸を提案することなく本明細書で置換に適した位置を指定する場合、その位置に存在するアミノ酸残基をどのアミノ酸残基でも置換できることを理解されたい。変異体フィターゼが他のフィターゼと比較して欠失を含む場合、この欠失を「*」で示す。たとえば、配列番号１のＡ８９位の欠失をＡ８９*で表す。２つ以上の連続したアミノ酸の欠失は、たとえば、（８９〜９１）*のように示される。
【０１７６】
「〜由来の」および「〜から得られる」という表現は、対象となる生物体の株によって産生されるか産生可能なフィターゼだけでなく、このような株から単離されたＤＮＡ配列によってコードされ、当該ＤＮＡ配列を含む宿主生物で産生されるフィターゼも示す。また、これらの表現は、合成および／またはｃＤＮＡ由来のＤＮＡ配列によってコードされ、対象となるフィターゼの識別的な特徴を有するフィターゼも示す。したがって、別のフィターゼ「由来の」および別のフィターゼ「から得られる」フィターゼは、そのフィターゼが第２のフィターゼに物理的に由来または第２のフィターゼから物理的に得られることを必ずしも意味するものではなく、対象となるフィターゼが、第２のフィターゼについての知識に由来する知識またはアイディアを用いて調製されたことを意味し得る。
【０１７７】
特に、フィターゼの特徴の改善は、改善された変異体を飼料用サプリメントとして用いるのに特に適したものにする、食品および飼料加工条件下での酵素の安定性、胃部通過時の酵素の安定性、ヒトまたは動物の胃および／または胃腸管における酵素活性および安定性に関連する。よって、このような改善は、他のパラメータの中に、上昇した温度、好ましくは６５℃を超える温度での安定性の増加、タンパク質分解消化、好ましくはペプシンなどの消化管のプロテアーゼに対する安定性の増加、低ｐＨでの触媒活性、好ましくはｐＨ５．５未満の触媒活性の増加、フィチン酸塩からリン酸塩基、好ましくはさらにリン酸イノシトールを放出する全体的な効率を含む。
【０１７８】
このため、いくつかの実施形態では、本発明は、親フィターゼと比較した場合に、国際公開第２００６／０４３１７８号パンフレット、同第２００８／０９７６１９号パンフレット、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４１０１１号に開示された位置および／または配列番号１のアミノ酸配列に示すようなフィターゼと相同的なフィターゼにおける対応する位置の１つ以上に変異を含む、特徴が改善されたフィターゼ変異体を含む飼料用サプリメントに関する。これらの位置は、これらの位置の突然変異誘発によって酵素の特徴が改善されることを特徴とする。
【０１７９】
熱安定性（熱安定性差）が一層高い変異体は、好ましくは、国際公開第２００６／０４３１７８号パンフレットに開示された方法で判断される。
【０１８０】
本発明に用いる変異体フィターゼ酵素は、好ましくは、熱安定性差（Ｔ．Ｄ）が少なくとも１．５、一層好ましくは２、２．５、３、３．５、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、最も好ましくは少なくとも２０である。
【０１８１】
タンパク質分解安定性が一層高い変異体は、好ましくは、国際公開第２００６／０４３１７８号パンフレットに開示された方法で判断される。
【０１８２】
好ましくは、本発明に用いるフィターゼ酵素変異体は、タンパク質分解安定性（残留活性）が少なくとも４５％、好ましくは５０％、５５％、一層好ましくは少なくとも６０％または６５％、最も好ましくは少なくとも７０％である。
【０１８３】
好ましくは、本発明に用いるフィターゼ変異体は、比活性がｐＨ４．０でのｗｔ活性の１００％を超え、好ましくは１０５％、１１０％を超え、一層好ましくは１１４％を超える。
【０１８４】
一態様では、好ましくは、アミノ酸配列が精製された形態である。「精製された」という用語は、その配列が比較的純粋な状態にあり、少なくとも１％、５％純粋または１０％純粋、一層好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％純粋であることを意味する。好ましい実施形態では、ポリペプチドについて言う場合、先に定義したような純度を、他のポリペプチドからＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で精製されるものとして判断する。
【０１８５】
変異体／誘導体
本発明は、酵素あるいは、このような酵素をコードするヌクレオチド配列の任意のアミノ酸配列の変異体、相同体および誘導体の使用を包含する。
【０１８６】
変異体アミノ酸配列は、グリシンまたはβ−アラニン残基などのアミノ酸スペーサに加えて、メチル、エチルまたはプロピル基などのアルキル基を含む配列の任意の２つのアミノ酸残基間に挿入できる好適なスペーサ基を含むものであってもよい。別の形態のバリエーションでは、ペプトイド形態での１種類以上のアミノ酸残基の存在が必要である旨が、当業者によって十分に理解されるであろう。誤解を避けるために、「ペプトイド形態」は、α−炭素置換基が(−炭素ではなく残基の窒素原子上にある変異体アミノ酸残基を示すものとして用いられる。ペプトイド形態のペプチドを調製するためのプロセスが、従来技術において周知である。たとえばＳｉｍｏｎ  ＲＪ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ（１９９２）  ８９（２０），  ９３６７〜９３７１およびＨｏｒｗｅｌｌ  ＤＣ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）  １３（４），  １３２〜１３４。
【０１８７】
他の成分
本発明による飼料用サプリメントを、他の成分またはキャリアと組み合わせで使用してもよい。
【０１８８】
飼料酵素に適したキャリアとしては、マルトデキストリン、石灰石（炭酸カルシウム）、シクロデキストリン、コムギまたはコムギ成分、スクロース、デンプン、アンチフォーム、Ｎａ2ＳＯ4、タルク、ＰＶＡ、これらの混合物があげられる。加えて、脂肪／ワックス被覆、植物ゴムの添加などをベースにした含む多数の封入技術がある。
【０１８９】
他の成分の例として、増粘剤、ゲル化剤、乳化剤、バインダー、結晶改質剤、甘味料（人工甘味料を含む）、レオロジー改質剤、安定剤、酸化防止剤、色素、酵素、キャリア、ビヒクル、賦形剤、希釈剤、潤滑剤、香味料、着色料、懸濁剤、崩壊剤、造粒バインダーなどのうちの１種類以上があげられる。これらの他の成分は、天然のものであってもよい。これらの他の成分は、化学的および／または酵素的な技術を用いて調製されるものであってもよい。
【０１９０】
本明細書で使用する場合、「増粘剤またはゲル化剤」という用語は、本明細書で使用する場合、不混和性液体の液滴、空気または不溶性固体の粒子の移動を遅くするか防止して、分離を防ぐ生成物を意味する。
【０１９１】
ここで使用する「安定剤」という用語は、生成物（食品など）が経時的に変化しないようにする成分または成分同士の組み合わせとして定義される。
【０１９２】
「乳化剤」という用語は、本明細書で使用する場合、エマルションの分離を防止する成分（食品製品の成分など）を示す。
【０１９３】
本明細書で使用する場合、「バインダー」という用語は、生成物を物理反応または化学反応によって一緒に結合する成分（食品成分など）を示す。
【０１９４】
「結晶改質剤」という用語は、本明細書で使用する場合、脂肪または水の結晶化に影響する成分（食品成分など）を示す。
【０１９５】
「キャリア」または「ビヒクル」とは、化合物の投与に適した材料を意味し、たとえば、液体、ゲル、溶媒、液体希釈剤、可溶化剤など（非毒性かつ、組成物の成分と有害な形では相互作用しない）など、従来技術において周知のこのような材料を含む。
【０１９６】
栄養的に許容されるキャリアの例として、たとえば、穀物粒、水、塩溶液、アルコール、シリコーン、ワックス、ワセリン、野菜油などがあげられる。
【０１９７】
賦形剤の例として、微結晶セルロースおよび他のセルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、グリシン、デンプン、乳糖、高分子量ポリエチレングリコールのうちの１種類以上があげられる。
【０１９８】
崩壊剤の例として、デンプン（好ましくはトウモロコシ（ｃｏｒｎ）、ジャガイモまたはタピオカデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウムおよび特定のケイ酸塩複合体のうちの１種類以上があげられる。
【０１９９】
造粒バインダーの例として、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、マルトース、ゼラチン、アカシアのうちの１種類以上があげられる。
【０２００】
潤滑剤の例として、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、タルクのうちの１種類以上があげられる。
【０２０１】
希釈剤の例として、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、これらの組み合わせのうちの１種類以上があげられる。
【０２０２】
他の成分を、同時に（たとえば、一緒に混合物中に含めるか、異なる経路で送達される場合であってもよい）使用してもよいし、逐次的に（たとえば、異なる経路で送達してもよい）使用してもよい。
【０２０３】
本明細書で使用する場合、「動物またはヒトでの消費に適した成分」という表現は、本発明の組成物であるか、栄養面での利点があり、繊維の代用品で、あるいは消費者に対して概して有益な作用があってもよいサプリメントとして本発明の組成物に添加可能な化合物を意味する。
【０２０４】
一例として、この成分は、アルギン酸塩、キサンタン、ペクチン、ローカストビーンガム（ＬＢＧ）、イヌリン、グアーガム、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、フルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ラクトスクロース、ダイズオリゴ糖、パラチノース、イソマルトオリゴ糖、グルコオリゴ糖、キシロオリゴ糖などのプレバイオティクスであってもよい。
【０２０５】
脂肪分解酵素
アシルグリセロールの加水分解を触媒するカルボキシエステラーゼとして定義可能な脂肪分解酵素（ＥＣ  ３．１．１．３）は、アミラーゼおよびプロテアーゼと一緒に、３つの主要な消化酵素のうちの１つとして生理学的に極めて重要な酵素である。この酵素は、脂質をグリセロールと脂肪酸に加水分解するが、エステル化またはトランスエステル化反応においても機能し得る。
【０２０６】
好ましい実施形態では、本発明で使用する脂肪分解酵素は、国際公開第９８／４５４５３号パンフレットに開示され、ブタペスト条約に準拠して１９９７年２月２４日にＮＣＩＭＢに対して、受託番号４０８６３で寄託されているような、糸状菌類アスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）由来の脂肪分解酵素である。脂肪分解酵素は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来のものであってもよいし、大腸菌（Ｅ．  Ｃｏｌｉ）などのもうひとつの生物体において組換え的に産生されるものであってもよい旨は、理解できよう。
【０２０７】
好ましくは、脂肪分解酵素が、配列番号７または８に示すようなアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはこれに対する同一性が少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％であるポリペプチド；または配列番号９または１０の配列；または遺伝暗号の縮重がゆえに配列番号９または１０とは異なる配列；または配列番号９または１０に対する同一性が少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％である配列を含むヌクレオチド配列の発現によって産生されるポリペプチドを含む。
【０２０８】
フィターゼに関して開示される特徴の一般的な定義は脂肪分解酵素にも等しく適用可能であり、簡潔にする目的で、本明細書では繰り返していない旨は理解できよう。
【０２０９】
別の好ましい実施形態では、本発明で使用する脂肪分解酵素が、本明細書で開示するように、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞で産生される。
【０２１０】
脂肪分解酵素を産生する方法は、
（ｉ）
ａ）配列番号７または配列番号８として示されるアミノ酸配列または配列番号７または８に対する配列同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を含む、脂肪分解酵素をコードする少なくとも１種類の異種のヌクレオチド配列；および／または
ｂ）ヌクレオチド配列が、配列番号９または配列番号１０または配列番号９または配列番号１０に対する配列同一性が少なくとも７０％であるヌクレオチド配列として示されるヌクレオチド配列を含む、脂肪分解酵素をコードする少なくとも１種類の異種のヌクレオチド配列；および／または
ｃ）ヌクレオチド配列が、ストリンジェントな条件下で、配列番号９または配列番号１０または配列番号９または配列番号１０に対する配列同一性が少なくとも７０％であるヌクレオチド配列またはこれらの相補体とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、脂肪分解酵素をコードする少なくとも１種類の異種のヌクレオチド配列；および／または
ｄ）ヌクレオチド配列が、遺伝暗号の縮重以外は配列番号９または配列番号１０として示されるものとヌクレオチド配列と同一である、脂肪分解酵素をコードする少なくとも１種類の異種のヌクレオチド配列；
を含むトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞を提供するステップと、
（ｉｉ）前記脂肪分解酵素をコードする前記異種のヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下で細胞を培養するステップと、を含む。
【０２１１】
本明細書で定義するように、ストリンジェントな条件という表現は、５０℃および０．２×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５ＭのＮａ３クエン酸塩ｐＨ７．０｝での洗浄を示すことは理解できよう。
【０２１２】
これらの条件も、本明細書では６５℃および０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５ＭのＮａ３クエン酸塩ｐＨ７．０｝での洗浄として定義される高ストリンジェントな条件であってもよいことは、理解できよう。
【０２１３】
あるいは、
（ｉ）トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞を、
ａ）配列番号７または配列番号８として示されるアミノ酸配列または配列番号７または８に対する配列同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を含む、脂肪分解酵素をコードする少なくとも１種類の異種のヌクレオチド配列；および／または
ｂ）ヌクレオチド配列が、配列番号９または配列番号１０または配列番号９または配列番号１０に対する配列同一性が少なくとも７０％であるヌクレオチド配列として示されるヌクレオチド配列を含む、脂肪分解酵素をコードする少なくとも１種類の異種のヌクレオチド配列；および／または
ｃ）ヌクレオチド配列が、ストリンジェントな条件下で、配列番号９または配列番号１０または配列番号９または配列番号１０に対する配列同一性が少なくとも７０％であるヌクレオチド配列またはこれらの相補体とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、脂肪分解酵素をコードする少なくとも１種類の異種のヌクレオチド配列；および／または
ｄ）ヌクレオチド配列が、遺伝暗号の縮重以外は配列番号９または配列番号１０として示されるものとヌクレオチド配列と同一である、脂肪分解酵素をコードする少なくとも１種類の異種のヌクレオチド配列；
とトランスフェクトまたはトランスフォームするステップと、
（ｉｉ）前記脂肪分解酵素をコードする前記異種のヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下で細胞を培養するステップと、を含む、脂肪分解酵素を産生する方法が得られる。
【０２１４】
さらに、
（ｉ）トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞を、
ａ）配列番号７または配列番号８として示されるアミノ酸配列または配列番号７または８に対する配列同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を含む、脂肪分解酵素をコードする少なくとも１種類の異種のヌクレオチド配列；および／または
ｂ）ヌクレオチド配列が、配列番号９または配列番号１０または配列番号９または配列番号１０に対する配列同一性が少なくとも７０％であるヌクレオチド配列として示されるヌクレオチド配列を含む、脂肪分解酵素をコードする少なくとも１種類の異種のヌクレオチド配列；および／または
ｃ）ヌクレオチド配列が、ストリンジェントな条件下で、配列番号９または配列番号１０または配列番号９または配列番号１０に対する配列同一性が少なくとも７０％であるヌクレオチド配列またはこれらの相補体とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、脂肪分解酵素をコードする少なくとも１種類の異種のヌクレオチド配列；および／または
ｄ）ヌクレオチド配列が、遺伝暗号の縮重以外は配列番号９または配列番号１０として示されるものとヌクレオチド配列と同一である、脂肪分解酵素をコードする少なくとも１種類の異種のヌクレオチド配列；
とトランスフェクトまたはトランスフォームするステップと、
（ｉｉ）細胞でステップ（ｉ）を繰り返し、この細胞を、（ｉ）（ａ）、（ｉ）（ｂ）または（ｉ）（ｃ）に定義されたような少なくとも１種類の別の異種のヌクレオチド配列（配列番号７または配列番号８として示されるアミノ酸配列あるいは、配列番号７または８に対する配列同一性が少なくとも４０％であるアミノ酸配列を含む脂肪分解酵素をコードする異種のヌクレオチド配列など）と逐次的にトランスフェクトまたはトランスフォームするステップと、
（ｉｉｉ）前記脂肪分解酵素をコードする前記異種のヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下で細胞を培養するステップと、を含む、脂肪分解酵素を産生する方法が得られる。
【０２１５】
トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）は、脂肪分解酵素を有意に高収率で産生できる。
【０２１６】
さらに、本明細書に開示される方法で産生される脂肪分解酵素は、過剰にグリコシル化されておらず、良好な酵素活性を有する。
【０２１７】
Ｂｒａｄｎｅｒらは（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ４４：  ２２４−２３０，  （２００３）において）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）を、かつて知られていない脂肪分解酵素の探索で、発現宿主生物として使用した。ペニシリウム・アリー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ａｌｌｉｉ）の南極単離物からの脂肪分解酵素をクローンし、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）で発現させた。Ｂｒａｄｎｅｒらは、そこに記載の方法が、潜在的に新規な脂肪分解酵素遺伝子を調査するには有用であろうと結論付けたが、トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）をタンパク質の過発現に使用可能であるという提案はしていなかった。
【０２１８】
また、もうひとつの態様で開示されるのが、
（ｉ）脂肪分解酵素をコードする少なくとも１種類の異種のヌクレオチド配列を含む、トランスフォームまたはトランスフェクトされたトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞を提供するステップと、
（ｉｉ）前記脂肪分解酵素をコードする前記異種のヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下で、ｐＨ４〜ｐＨ５．５で細胞を培養するステップと、
（ｉｉｉ）ｐＨ５．５〜ｐＨ６．５の培地にて、酵素を単離、精製または濃縮するステップと、を含む、脂肪分解酵素を産生する方法。
【０２１９】
この態様では、好ましくは、脂肪分解酵素が、
ａ）配列番号７または配列番号８として示されるアミノ酸配列を含むまたは配列番号７または８に対する配列同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を含む；および／または
ｂ）配列番号９または配列番号１０として示される配列を含むか、配列番号９または配列番号１０に対する配列同一性が少なくとも７０％であるヌクレオチド配列を含むヌクレオチドによってコードされる；および／または
ｃ）ストリンジェントな条件下で、配列番号９または配列番号１０とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むか、配列番号９または配列番号１０に対する配列同一性が少なくとも７０％であるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列またはこれらの相補体によってコードされる；および／または
ｄ）ヌクレオチド配列が、遺伝暗号の縮重以外は配列番号９または配列番号１０として示されるものとヌクレオチド配列と同一である、脂肪分解酵素をコードする少なくとも１種類の異種のヌクレオチド配列である。
【０２２０】
好適には、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞で、脂肪分解酵素をコードする少なくとも１種類の異種のヌクレオチド配列があってもよい。トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞で、本発明による脂肪分解酵素をコードするそのまたは各々の異種のヌクレオチド配列の２つ以上のコピー（すなわち複数のコピー）があってもよい。各異種のヌクレオチド配列が、プロモーターと関連し、プロモーターの制御下にある。好適には各異種のヌクレオチド配列が、これと関連し、このプロモーターの制御下にある別のプロモーターを有する。プロモーターは、同一であっても異なっていてもよい。
【０２２１】
よって、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞は、脂肪分解酵素をコードする少なくとも２種類の異種のヌクレオチド配列を含むあるいは、これでトランスフェクトまたはトランスフォームされるものであってもよい。
【０２２２】
好適には、その（または各）異種のヌクレオチド配列が、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むものであってもよく、この前記シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列が、前記脂肪分解酵素をコードする前記ヌクレオチド配列と作動的に結合されている。複数の異種のヌクレオチド配列があり、２つ以上がこれと関連したシグナル配列を有する場合、これらのシグナル配列は同一であっても異なっていてもよい。
【０２２３】
好適には、脂肪分解酵素は、内在性のシグナルペプチドを含むものであっても、外来性のシグナルペプチドを含むものであってもよい。シグナルペプチドが内在性である場合−これは、シグナルペプチドが天然に産生されるときに脂肪分解酵素と天然でリンクしていることを意味する。たとえば、シグナルペプチドは、アスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）で見出される場合、脂肪分解酵素と天然でリンクしているアスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）のシグナルペプチドであってもよい。
【０２２４】
「異種の」という用語は、本明細書で使用する場合、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞では天然には起こらないことを意味する。言葉をかえると、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞にとっては外来性である。たとえば、「異種のヌクレオチド配列」という用語は、本明細書で使用する場合、ヌクレオチド配列がトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞で天然には起こらないことを意味する。言葉を変えると、このヌクレオチド配列は、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞にとって外来性である。この用語は、このような別の複数のコピーが異種であろうことから、天然に生じる配列の複数のコピーも含む。
【０２２５】
異種のヌクレオチド配列は、微生物、特に真菌から得られるまたは取得可能なものであってもよい。
【０２２６】
異種のヌクレオチド配列は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、特にアスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）から得られるまたは取得可能なものであってもよい。
【０２２７】
上記の態様の好ましい実施形態では、前記トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞が、抑制された非脂肪分解酵素をコードする少なくとも２つの遺伝子を有する。
【０２２８】
さらに提供されるのが、本発明の方法で取得可能な脂肪分解酵素である。
【０２２９】
また、提供されるのが、
ａ）配列番号７または８に対する配列同一性が少なくとも７０％である、脂肪分解酵素タンパク質をコードする少なくとも１種類の異種のヌクレオチド配列；および／または
ｂ）ヌクレオチド配列が、配列番号９または配列番号１０または配列番号９または配列番号１０に対する配列同一性が少なくとも７０％であるヌクレオチド配列として示されるヌクレオチド配列を含む、脂肪分解酵素をコードする少なくとも１種類の異種のヌクレオチド配列；および／または
ｃ）ヌクレオチド配列が、ストリンジェントな条件下で、配列番号９または配列番号１０とハイブリダイズされるヌクレオチド配列あるいは、配列番号９または配列番号１０に対する配列同一性が少なくとも７０％であるヌクレオチド配列あるいは、これらの相補体を含む脂肪分解酵素をコードする少なくとも１種類の異種のヌクレオチド配列；および／または
ｄ）ヌクレオチド配列が、遺伝暗号の縮重以外は配列番号９または配列番号１０として示されるものとヌクレオチド配列と同一である、脂肪分解酵素をコードする少なくとも１種類の異種のヌクレオチド配列を含む、トランスフォームまたはトランスフェクトされたトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞であって、
前記トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞が、抑制される非脂肪分解酵素をコードする少なくとも２つの遺伝子を有する。
【０２３０】
好ましくは、前述のいずれかの態様による前記トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞が、抑制される非脂肪分解酵素をコードする少なくとも３つの遺伝子を有する。
【０２３１】
好ましくは、前述のいずれかの態様による前記トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞が、抑制される非脂肪分解酵素をコードする少なくとも４つの遺伝子を有する。
【０２３２】
「抑制される」とは、細胞が関連の非脂肪分解酵素をトランスフォームされていない／トランスフェクトされていない細胞とは同じレベルでは発現しないことを意味する。いくつかの実施形態では、「抑制された」とは、細胞が関連の非脂肪分解酵素を発現しないことを意味する。抑制は、欠失などの従来技術において周知の技術によって生じ得るものである。
【０２３３】
好ましくは、抑制された非脂肪分解酵素をコードする遺伝子のうちの少なくとも１つがセルラーゼ遺伝子である。
【０２３４】
好ましくは、抑制された非脂肪分解酵素をコードする遺伝子のうちの少なくとも２つがセルラーゼ遺伝子である。
【０２３５】
抑制された非脂肪分解酵素をコードする遺伝子のうちの少なくとも１つの一例が、セロビオヒドロラーゼをコードする遺伝子（ＣＢＨＩまたはＣＢＨＩＩなど）である。
【０２３６】
抑制された非脂肪分解酵素をコードする遺伝子のうちの少なくとも１つのもうひとつの例が、エンドグルカナーゼをコードする遺伝子（ＥＧＩおよびＥＧＩＩなど）である。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞が、セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩ）の一方または両方および／またはエンドグルカナーゼ（ＥＧＩおよびＥＧＩＩ）の一方または両方をコードする内在性遺伝子が欠失または破壊された細胞である。好適には、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞は、非ＧＭＭ細胞またはその誘導体、たとえば株ＲＬ−Ｐ３７の誘導体であってもよい。好適には、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞が、実施例７に記載の方法を用いて産生される株ＲＬ−Ｐ３７の誘導体であってもよい。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、異種のヌクレオチド配列が、配列番号７または配列番号８に対する配列同一性が少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％であるアミノ酸配列を含む脂肪分解酵素をコードするものであってもよい。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、異種のヌクレオチド配列が、脂肪分解酵素をコードするものであってもよく、配列番号９または配列番号１０に対する配列同一性が少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％であるヌクレオチド配列を含む。
【０２４０】
好ましくは、異種のヌクレオチド配列が、配列番号７または配列番号８に対する配列同一性が少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％であるアミノ酸配列を含む脂肪分解酵素をコードする。
【０２４１】
好ましくは、異種のヌクレオチド配列が、脂肪分解酵素をコードし、配列番号９または配列番号１０に対する配列同一性が少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％であるヌクレオチド配列を含む。
【０２４２】
配列番号９（本明細書ではリパーゼ３とも呼ぶ）由来の配列を有するアスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）由来の脂肪分解酵素に対する多数の脂肪分解酵素のアミノ酸配列同一性を、以下の表１に示す。
【０２４３】
【表２】
0005829603.tif 000003
【０２４４】
トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）宿主細胞は、どのようなトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞であってもよい。この細胞は、野生型トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞とみなされるものであってもよい。トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞は、１つ以上の分泌されるセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨＩまたはＣＢＨＩＩ）をコードする遺伝子が、発現しないように欠失または破壊されたものであってもよい。好適には、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞は、非遺伝子組換え細胞またはその誘導体、たとえば株ＲＬ−Ｐ３７の誘導体であってもよい。好適には、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞が、実施例１０に記載の方法を用いて産生される株ＲＬ−Ｐ３７の誘導体であってもよい。
【０２４５】
酵素は、約３リットル〜約２０リットルの培養液を含むものであってもよい発酵槽で産生されるものであってもよい。もうひとつの実施形態では、本発明が、１０〜１６リットル、好ましくは１４リットル規模の発酵で実施される。一実施形態では、好ましくは、１２リットルを超え、好ましくは約１４リットルを超える量で発酵が実施される。
【０２４６】
トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）宿主細胞は、好ましくは、大規模発酵で使用するのに適している。
【０２４７】
好ましい実施形態では、脂肪分解酵素の生成を業務規模で実施する。この観点で、発酵は、約５０，０００リットルを超える規模、好ましくは約８０，０００リットルを超える規模、好ましくは約２００，０００リットルを超える規模の発酵で実施される。
【０２４８】
一実施形態では、この方法で生成される全タンパク質が、約２０ｇ／リットルを十分に上回る。
【０２４９】
生成される全タンパク質のうち、大半が所望の脂肪分解酵素である。一実施形態では、生成される全分泌タンパク質が、所望の脂肪分解酵素の少なくとも５０％をなす。一実施形態では、生成される全分泌タンパク質が、所望の脂肪分解酵素の少なくとも６０％をなす。一実施形態では、生成される全分泌タンパク質が、所望の脂肪分解酵素の少なくとも７０％をなす。一実施形態では、生成される全分泌タンパク質が、所望の脂肪分解酵素の少なくとも８０％をなす。
【０２５０】
好適には、この方法は、脂肪分解酵素の生成についてスクリーニングされた形質転換体（所望の酵素が優先的に選択される高産生体）の選択肢を含むものであってもよい。
【０２５１】
一実施形態では、好適に、この方法は、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞を、本明細書に定義する脂肪分解酵素をコードする少なくとも１種類の異種のヌクレオチド配列でトランスフォームする第１のトランスフォーメーションステップを含むものであってもよく、脂肪分解酵素の生成についてスクリーニングされた形質転換体（所望の酵素が優先的に選択される高産生体）の選択ならびに、選択された形質転換体を、本明細書に定義する脂肪分解酵素をコードする少なくとも１種類の異種のヌクレオチド配列で第２のトランスフォーメーションステップ（すなわち再トランスフォーメーションステップ）した後、脂肪分解酵素の生成についてスクリーニングされた新たな形質転換体（所望の酵素が優先的に選択される高産生体）をさらに選択する。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、本発明で使用する脂肪分解酵素が、グリコシル化されたものであってもよい。いくつかの実施形態では、脂肪分解酵素が、Ｎ３２（配列番号８を用いて番号付けをした場合）または本発明による他の脂肪分解酵素では等価な位置でＮグリコシル化されたものであってもよい。この態様は、酵素の活性が酵素のグリコシル化によって破壊または低減されないという点で大きな利点をもたらし得るものである。理論に拘泥することを望まずに、脂肪分解酵素がアスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａ．  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）などの他の宿主で産生される際に、その活性の低下を確認でき、これは少なくともＮ２４２部位での酵素の過剰なグリコシル化によるものと思われる。
【０２５３】
したがって、本明細書で開示する方法で産生される脂肪分解酵素は、特にＮ３２部位での酵素のグリコシル化の度合いがゆえに、アスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａ．  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）などの他の宿主で産生される脂肪分解酵素と区別できる。本発明のいくつかの実施形態では、酵素が、少なくともＮ３２部位でグリコシル化を有する。
【０２５４】
好適には、脂肪分解酵素はシグナルペプチドを用いて産生されるものであってもよい。言葉をかえると、本発明に用いられる異種のヌクレオチド配列が、シグナルペプチドをコードするその一部を含む。
【０２５５】
シグナルペプチドを、特定の細胞膜を介しての脂肪分解酵素の分泌の指令に用いてもよい。シグナルペプチド配列は、脂肪分解酵素コード配列に対して内在性であっても外来性であってもよい。たとえば、シグナルペプチドは、脂肪分解酵素に対して内在性のシグナルペプチドであってもよく、アスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）である。あるいは、シグナルペプチドのコード配列を、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）のセロビオヒドロラーゼ遺伝子から取得してもよい（または取得可能であってもよい）。
【０２５６】
しかしながら、選択したトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞の分泌経路に発現された脂肪分解酵素を送ることのできるシグナルペプチドコード配列であれば、どのようなものを使用してもよい。
【０２５７】
本発明者らが、脂肪分解酵素の発現、脂肪分解酵素のグリコシル化、酵素活性および／または収率のうち１つ以上を改善することに言及する場合、これはこの脂肪分解酵素を発現する従来の方法と比較される。たとえば、もうひとつの宿主生物（すなわち、トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）以外の宿主生物）における脂肪分解酵素の産生と比較して、脂肪分解酵素の発現、脂肪分解酵素のグリコシル化、酵素活性および／または収率が改善される。特に、アスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）細胞（たとえば、本明細書に援用するような国際公開第９８／４５４５３号パンフレットに教示されているものなど）における同じ脂肪分解酵素の発現と比較して、本発明による脂肪分解酵素（すなわちトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞で産生）の脂肪分解酵素の発現、脂肪分解酵素のグリコシル化、酵素活性および／または収率が改善される。
【０２５８】
「改善されたグリコシル化」という表現は、本明細書で使用する場合、好ましくは、グリコシル化がＮ３２（配列番号８を用いて番号付けをする場合）で生じることを意味する。理論に拘泥することを望まずに、状況によっては、トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）以外の（特にアスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓにおいて）（国際公開第９８／４５４５３号パンフレットに教示されているものなど））宿主細胞で産生される脂肪分解酵素を、特にＮ２４２でグリコシル化（または過剰にグリコシル化）してもよい。よって、トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）以外の宿主細胞、特にアスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）（国際公開第９８／４５４５３号パンフレットに教示されているものなど）で産生される脂肪分解酵素を、Ｎ３２およびＮ２４２部位の両方でグリコシル化してもよい。しかしながら、理論に拘泥することを望まずに、Ｎ２４２部位は、活性部位残基のうちの１つすなわち、配列番号８のＨｉｓ２５８の近傍にある。よって、Ｎ２４２部位でのグリコシル化（または過剰なグリコシル化）が、酵素の活性（すなわちリパーゼ活性）の低下につながり得ると考えられている。本発明の脂肪分解酵素では、活性が低下しない。本発明の脂肪分解酵素のグリコシル化は、Ｈｉｓ２５８などの活性部位残基から離れたＮ３２部位で起こり得る。
【０２５９】
「改善された酵素活性」という表現は、本明細書で使用する場合、活性が、天然ではアスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）によって産生される脂肪分解酵素のリパーゼ活性と同じかこれよりも大きいことを意味する。
【０２６０】
酵素活性によって、本発明者らは少なくともリパーゼ活性を意味する。酵素活性（リパーゼ活性など）については、実施例のセクションで後述する関連のプロトコールを用いて測定可能である。
【０２６１】
驚くべきことに、本明細書で開示した方法に基づいて産生される脂肪分解酵素は、高い発現レベルが得られるときに、これが排泄された培地−すなわち、培養（発酵）ブロス−からの単離が容易であることが見出された。
【０２６２】
よって、この方法は、細胞の培養後に脂肪分解酵素が分泌された培地に対して、以下のステップのうちの１つ以上を必要とするものであってもよい。培地を（好ましくは水で）希釈する；細胞を培地から分離する；培地（好ましく前記培地が無細胞である）を濃縮する；前記培地（好ましくは前記培地は無細胞である）を顆粒化する。
【０２６３】
この方法は、細胞の培養後に酵素が分泌された培地に対して、以下のステップを必要とするものであってもよい。培地を（好ましくは水で）希釈する；細胞を培地から分離する；培地（好ましく前記培地が無細胞である）を濃縮する；任意に前記培地（好ましくは前記培地は無細胞である）を顆粒化する。
【０２６４】
この方法は、細胞の培養後に任意に、酵素が分泌された培地に対して以下のステップの実施を必要とする。培地を（好ましくは水で）希釈する；細胞を培地から分離する；培地（好ましく前記培地が無細胞である）を濃縮する；前記培地（好ましくは前記培地は無細胞である）を顆粒化する。
【０２６５】
好ましくは、この方法は、細胞の培養後に、酵素が分泌された培地に対して以下のステップを必要とする。培地を水で希釈する；細胞を培地から分離する；本明細書では培地が無細胞である前記培地を濃縮する；任意に本明細書では前記培地が無細胞である前記培地を顆粒化する。
【０２６６】
好ましい態様では、この方法は、細胞の培養後に、酵素が分泌された培地に対して以下のステップを必要とする。培地を水で希釈する；細胞を培地から分離する；本明細書では培地が無細胞である前記培地を濃縮する；本明細書では前記培地が無細胞である前記培地を顆粒化する。
【０２６７】
好ましくは、脂肪分解酵素が発酵ブロスの溶液から析出する。好ましくは、脂肪分解酵素沈殿物をｐＨ調整によって再溶解させる。好ましくは、発酵ブロスのｐＨを超えるｐＨまでｐＨを調整する。
【０２６８】
上述した利点に加えて、方法によって産生される酵素のもうひとつの利点に、脂肪分解酵素の商業規模での生成が可能だということがある。この方法は、脂肪分解酵素を高収率で産生できるようにするものである。
【０２６９】
本明細書に開示される脂肪分解酵素の一つの利点に、トランスフォーメーションおよびスクリーニングステップ（すなわち、マイクロタイタープレートからのｓａｙ）から直接的に大規模発酵（少なくとも１４リットル発酵など）に直接的に行くことができる旨が、驚くべきことに見出されたことがある。驚くべきことに、スクリーニングステップ（特にマイクロタイタープレートの結果）は、大規模発酵における良好な結果の高い前兆となるため、これが可能である。これは、大きめの規模の発酵に移す前に株をフラスコ内で培養することが頻繁に必要になる従来の方法とは対照的である）。これには、生成時間の短縮および／または全体としての手法の単純化および／またはコスト削減に大きな利点がある。
【０２７０】
別の利点として、本明細書に記載の方法を用いると、脂肪分解酵素を発現する従来の方法と比較して、この脂肪分解酵素の発現の増大／増加および／または収率の改善がなされることがあげられる。たとえば、別の宿主生物（すなわちトリコデルマ・リーセイ（Ｔ．
ｒｅｅｓｅｉ）以外の宿主生物）における脂肪分解酵素の生成と比較して、脂肪分解酵素の発現の増大／増加および／または収率の改善が得られる。特に、アスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）細胞（たとえば、本明細書に援用する国際公開第９８／４５４５３号パンフレットに教示されているようなもの）における脂肪分解酵素の発現と比較して、同じ脂肪分解酵素（すなわちトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞で産生）の発現の増加および／または収率の改善が得られる。
【０２７１】
別の利点に、本明細書で開示した方法で産生される脂肪分解酵素が、容易に産生および単離および／または精製および／または濃縮されることがある。
【０２７２】
別の利点に、ここに開示の方法で産生される脂肪分解酵素が、容易に再可溶化されることがある。
【０２７３】
別の利点に、ここに開示の方法で産生される脂肪分解酵素を、顆粒または溶液として使用してもよいことがある。
【０２７４】
脂肪分解酵素
「脂肪分解酵素」という用語は、本明細書で使用する場合、トリアシルグリセロール加水分解活性（Ｅ．Ｃ．  ３．１．１．３として分類）を有する酵素を意味する。
【０２７５】
好適には、本発明で使用する脂肪分解酵素は、以下の追加の活性のうち１つ以上を呈するものであってもよい。グリコリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．  ３．１．１．２６）、ホスホリパーゼＡ２活性（Ｅ．Ｃ．  ３．１．１．４）、ホスホリパーゼＡ１活性（Ｅ．Ｃ．  ３．１．１．３２）またはホスホリパーゼＢ活性（Ｅ．Ｃ．  ３．１．１．５）。「グリコリパーゼ活性」という用語は、本明細書で使用する場合、「ガラクトリパーゼ活性」を包含する。
【０２７６】
単離された
一態様では、好ましくは、本発明で使用する脂肪分解酵素が、単離された形態である。「単離された」という表現は、脂肪分解酵素が天然で自然に関連し、天然に見られるものとしての少なくとも１種類の他の成分を、脂肪分解酵素が少なくとも実質的に含まないことを意味する。「単離された」という表現は、脂肪分解酵素が産生される培養液中の少なくとも１種類の他の成分を、脂肪分解酵素が少なくとも実質的に含まないことを意味することもある。本発明の脂肪分解酵素は、そうでなければこの物質が関連しているまたは、それを用いて酵素が産生される１種類以上の汚染物質を実質的に含まない形態で提供できるものである。
【０２７７】
よって、たとえば、細胞または１種類以上の潜在的に汚染性のポリペプチドおよび／または核酸分子を実質的に含まないものであってもよい。脂肪分解酵素を単離するには、発酵中または発酵後に、脂肪分解酵素がブロスに残るように細胞をブロスから分離すればよい。発酵ブロスに真空濾過で細胞分離をほどこして、脂肪分解酵素を単離してもよい。
【０２７８】
精製された
一態様では、好ましくは、本発明で使用する脂肪分解酵素が、精製された形態である。「精製された」という表現は、特定の成分が高いレベルで存在することを意味する。この成分は、望ましくは組成物中に存在する主な成分である。好ましくは、これは少なくとも約６０％または少なくとも約６５％または少なくとも約７０％または少なくとも約７５％または少なくとも約８０％のレベルで存在し、前記レベルは、考慮対象となる全組成物に対して乾燥重量／乾燥重量ベースで判断される。いくつかの実施形態では、量が少なくとも約８５％であり、前記レベルは、考慮対象となる全組成物に対して乾燥重量／乾燥重量ベースで判断される。
【０２７９】
濃縮物
一態様では、好ましくは、本発明で使用する脂肪分解酵素を濃縮物として用いる。濃縮物は、酵素が排泄される培地の濃縮された形態であってもよい。好ましくは、濃縮物は、酵素が分泌される培地の濃縮された形態で、細胞が除去されているものであってもよい。
【０２８０】
材料および方法
１．  ｐＨ５．５でのリパーゼアッセイ
本明細書で使用する場合、１ＬＩＰＵ（リパーゼ単位）とは、本明細書で後述する条件下で、１分間に１μｍｏｌのＨ+を放出する酵素の量として定義される。
【０２８１】
１５．００ｍｌのトリブチリン、５０．００ｍｌの乳化剤および２３５ｍｌの蒸留水を２０秒間ホモジナイザで混合することで、５％（ｖ／ｖ）トリブチリン基質を調製する。０．５ＭのＮａＯＨを用いて、基質のｐＨを約５．４まで調整する。
【０２８２】
１７．９ｇのＮａＣｌと、０．４１ｇのＫＨ2ＰＯ4と、４００ｍｌの蒸留水と、４５０ｍｌのグリセロールとを２０００ｍｌ容のビーカーで混合して、乳化剤を調製する。強く攪拌しながら、６．０ｇのアラビアゴムを加え、アラビアゴムが完全に溶解されるまで攪拌を続ける。この溶液を１０００ｍｌ容のメスフラスコに移し、印まで蒸留水を満たす。
【０２８３】
乾燥試料の場合：メスフラスコに、最終希釈の半分で最終溶液が約３．５ＬＩＰＵ／ｍｌになるように計算した量の酵素を溶解させ、２０分間磁気攪拌した。
【０２８４】
攪拌後、蒸留水で最終希釈に調節した。以後の希釈は蒸留水を用いて行うものとする。溶液中の試料を直接的に蒸留水で希釈しする。
【０２８５】
基質２５．００ｍＬを３０．０℃に調整する。
【０２８６】
ＮａＯＨ／ＨＣｌを用いて基質のｐＨを５．５０に調整する。
【０２８７】
攪拌しながら、２．００ｍＬの試料を加え、すぐにｐＨ−ｓｔａｔ滴定装置で開始する。
【０２８８】
６分後に滴定を停止する。
【０２８９】
滴定曲線の勾配を計算する。滴定曲線の勾配を３〜６分間のデータから計算する。勾配は、間隔０．１〜０．２ｍＬ／分でなければならない。
【０２９０】
酵素の活性（ＬＩＰＵ／ｇ）については、以下の式を用いて求める。
【数１】
0005829603.tif 000004
【０２９１】
２．ｐＨ３．５でのリパーゼアッセイ
１ＬＰＬＵ（低ｐＨリパーゼ単位）は、本明細書で後述する条件下で、１分間で１マイクロ当量の遊離脂肪酸を産生する酵素の量として定義される。
【０２９２】
トリオクタン酸塩基質：０．１５％のトリオクタン酸塩グリセロール、１３％のＴｒｉ
ｔｏｎ  Ｘ−１００、０．３％のＮａＣｌ、１２０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ３．５。すべての成分を混合した後、１時間攪拌して、基質を調製した。
【０２９３】
酵素試料溶液を５０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ３．５中で希釈する。
【０２９４】
Ｋｏｎｅｌａｂ分析ロボット（Ｔｈｅｒｍｏ，  Ｖａｎｔａａ，  Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いてアッセイを実施する。５０μｌのトリオクタン酸塩基質を３０℃で３分間平衡化した上で１０μｌの酵素試料溶液と混合し、３０℃で６分間インキュベーションする。ＮＥＦＡ−ＨＲ（２）キット（ＷＡＫＯ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＧｍｂＨ）を用いて反応混合物中の遊離脂肪酸を測定した。１１０μｌのＮＥＦＡ試薬Ｒ１を反応混合物に加え、５５μｌのＮＥＦＡ試薬Ｒ２を加えるまで３０℃で３分間インキュベートする。インキュベーションを３０℃でさらに４．５分間継続した上で、ＯＤ520nmを測定する。遊離脂肪酸の含有量を、ＮＥＦＡ標準（ＷＡＫＯ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＧｍｂＨ）から作製した標準曲線から計算する。
【０２９５】
１ＬＰＬＵは、アスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）リパーゼ（図５、配列番号７）の０．２４ＬＩＰＵに対応する。
【０２９６】
２．  フィターゼアッセイ
本明細書で使用する場合、１ＦＴＵ（フィターゼ単位）とは、本明細書で定義した反応条件下で、１分間に１μｍｏｌの無機オルトリン酸塩を基質から放出するのに必要な酵素の量として定義される
【０２９７】
原理：
フィターゼをフィチン酸ナトリウムと一緒にインキュベートすると、無機リン酸塩が放出される。無機リン酸塩は、モリブデン酸塩−バナジン酸塩試薬との間で色のついた錯体を形成し、これによって黄色に変わる。錯体の黄色の色を分光光度計にて４１５ｎｍで測定する。
【０２９８】
リン酸塩の標準曲線を用いる絶対法によって活性を定量化する。
【０２９９】
試薬：
１．１  酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）  ０．２５Ｍ  １０００ｍＬ
溶解：
３０．０２ｇのナトリウム酢酸塩−三水和物（１８，１０ｇナトリウム酢酸塩−無水物）、
０．１４７ｇの塩化カルシウム−二水和物、
約９００ｍＬの水中、１．７６ｇの１００％酢酸（＝１．６７７ｍＬ、密度＝１．０４９８ｇ／ｍＬ）
４Ｍの酢酸（１００．０ｍＬの脱イオン水中、２２．９ｍＬの濃酢酸）を用いてｐＨを５．５に調整し、溶液を１０００ｍＬ容のメスフラスコに移す。
【０３００】
１ｍＬの１０％Ｔｗｅｅｎ  ２０を加え、脱イオン水を加えて溶液を１０００ｍＬに調整する。
【０３０１】
１．２  リン酸二水素カリウム１８ｍＭ  １０００ｍＬ
標準曲線で用いる溶液をストックする
加熱用の戸棚中、６０℃で一晩、ＫＨ2ＰＯ4を乾燥させる。
【０３０２】
２．４５ｇの乾燥ＫＨ2ＰＯ4を秤量し、酢酸緩衝液（１．１）中で希釈する。１０００．０ｍＬに調整する。
【０３０３】
１．３  フィチン酸塩溶液（基質）  ７．５ｍＭ     ２５０ｍＬ
溶解：
２００ｍＬの酢酸緩衝液中、２．１０ｇ（±０．０５ｇ）のフィチン酸ナトリウム、十水和物（フィチン酸）。
【０３０４】
水浴中、溶液を３７℃までサーモスタット処理する。
【０３０５】
３７℃で、４Ｍの酢酸（２４ｇ＝１００．０ｍＬの脱イオン水中２２．９ｍＬ濃酢酸）を加えて、ｐＨをｐＨ５．５に調整する。
【０３０６】
酢酸緩衝液を添加したことで、２５０．０ｍＬまで調整する。
【０３０７】
フィチン酸のもうひとつのロットに変更するときに、基質補正因子が必要な場合もある。
【０３０８】
フィチン酸Ｓｉｇｍａ  Ｐ０１０９、回分０５７Ｋ００４９を、補正因子を１，００に定義する。
【０３０９】
１．４硝酸溶液２４．５％  ２００ｍＬ
（バナジウム酸アンモニウム溶液の場合）
７５ｍＬの硝酸６５％を連続攪拌下で１００ｍＬの水に加える。
【０３１０】
この溶液を２００ｍＬ容のメスフラスコに移し、脱イオン水で調整する。
【０３１１】
１．５  アンモニウム溶液２５％       ５０ｍＬ
（ヘプタモリブデン酸アンモニウム溶液の場合）
４０ｍＬの３２％アンモニウム溶液を水で５０ｍＬに調整する。
【０３１２】
１．６  ヘプタモリブデン酸アンモニウム溶液  １０％  ２５０ｍＬ
（着色／停止試薬の場合）
溶解：
２２５ｍＬの水中、２５ｇのヘプタモリブデン酸アンモニウム−五水和物。この溶液では、アンモニウム溶液を加える前に、ヘプタモリブデン酸アンモニウムを溶解させるのに加熱が必要である。
【０３１３】
２．５ｍＬのアンモニウム溶液（２５％）（１．５参照）を加え、熱を切り、攪拌機にて完全に溶解するまで放置する。
【０３１４】
冷却時、溶液を２５０ｍＬ容のメスフラスコに移し、脱イオン水で調整し、混合する。
【０３１５】
１．７  バナジウム酸アンモニウム溶液  ０．２４％  ２５０ｍＬ
（着色／停止試薬の場合）
０．５８７５ｇのバナジウム酸アンモニウムを、６０℃まで事前に加熱した１００ｍＬの水に溶解させる）。５ｍＬの２４．５％硝酸溶液を連続攪拌下でゆっくりと加える。
【０３１６】
冷却時、溶液を２５０ｍＬ容のメスフラスコに移し、脱イオン水で調整し、混合する。
【０３１７】
１．８  着色／停止試薬  ２００ｍＬ
使用する直前に調製すべきである。
【０３１８】
５０ｍＬのヘプタモリブデン酸アンモニウム溶液（１０％）を２００ｍＬ容のメスフラスコに分注した後、５０ｍＬのバナジウム酸アンモニウム溶液（０．２４％）を分注する。３３ｍＬの６５％硝酸を連続攪拌下で分注する。脱イオン水を加えて２００．０ｍＬに調整し、混合する。
【０３１９】
【表３】
0005829603.tif 000005
【０３２０】
リン酸塩標準曲線の作製（絶対法）
ＫＨ2ＰＯ4緩衝液（１．２）を用いる標準曲線を作製する。標準を酢酸緩衝液で希釈する。
【０３２１】
Ｃ希釈＝０．０ｍＭ、０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、１．５ｍＭ、２．０ｍＭ、２．５ｍＭ、３．０ｍＭ、４．０ｍＭ
以下の式を使用する：Ｃストック溶液＊Ｖストック溶液＝Ｃ希釈＊Ｖ希釈
Ｖストック溶液＝（Ｃ希釈＊Ｖ希釈）／Ｃストック溶液
式中、Ｃ＝濃度、Ｖ＝容量である。
【０３２２】
【表４】
0005829603.tif 000006
【０３２３】
１．００ｍＬの標準曲線試料を２．００ｍＬの着色／停止試薬と混合した後、２．００ｍＬのフィチン酸塩溶液と混合する。試料を室温で５〜１０分間インキュベートし、（インキュベーション後に試料で実施するものと同様に）ＯＤを測定する。
【０３２４】
試料の調製：
１Ａ：液体生成物（約５５００ＦＴＵ／ｇ）：１ｇの試料を１００ｍＬ容のメスフラスコで秤量し、重量を書き取り、メスフラスコを酢酸緩衝液で一杯にする。
【０３２５】
１Ｂ：乾燥生成物（コムギ／デンプンキャリアだけを用いて配合したフィターゼ）：１ｇの生成物をガラスビーカーに秤量する。ディスペンサまたは計量用ガラスを用いて１００ｍＬの酢酸緩衝液を加える。試料をマグネチックスターラーで２０分間攪拌する。抽出物をガラスフィルタで濾過する。
【０３２６】
１Ｃ：乾燥生成物（疎水性の外層を有する被覆顆粒）：乾燥生成物：１ｇの生成物をガラスビーカーに秤量する。ディスペンサまたは計量用ガラスを用いて１００ｍＬの酢酸緩衝液を加える。試料をマグネチックスターラーで２０分間攪拌する。抽出物を沈殿させ、被覆生成物をガラスフィルタで濾過しないようにする。
【０３２７】
２：試料のさらなる希釈物を調製する。好ましいＯＤ範囲は０．４〜１．６である。試料の濃度がわからない場合、活性をアッセイ用の範囲にする一般的な希釈レベルを以下に示す。
【０３２８】
試料の活性は約０．０３００Ｕ／ｍＬでなければならない。
【０３２９】
希釈物は判定の直前に調製するものとする。
【０３３０】
活性の判定：
すべての試料を同時に分析する−対照、ブランク、試料。アッセイの試行は連続流にしておかなければならない。
【０３３１】
すべての判定を二重または三重の判定で実施する。
【０３３２】
各シリーズの最初にブランクを含める。
【０３３３】
各シリーズの管に対照を含める（フィターゼ対照または活性が知られているＰｈｙｚｙｍｅ  ＸＰ試料）。
【０３３４】
盲検試料：各試料１．００ｍＬを２．００ｍＬの着色／停止試薬と混合した後、２．００ｍＬのフィチン酸塩溶液を混合する。試料を室温にて６０分間インキュベートし、遠心処理し、残りの試料を用いて測定する。
【０３３５】
試料：
１．  １．００ｍＬの希釈試料または対照をプラスチック管で２倍または３倍に描く。ブランクについては、１．００ｍＬの酢酸緩衝液を描く。
２．  ３７℃に平衡化するまでフィチン酸塩溶液（基質）を３７．０℃で最低５分間水浴中におく
３．  ３７．０℃で厳密に５分間、水浴中で試料をインキュベートする。
４．  厳密に５秒間の時間間隔で２．００ｍＬの平衡化フィチン酸塩溶液を試料に加える。
５．  水浴中にて３７．０℃で厳密に６０分間インキュベートする。
６．  再び時間間隔５秒間で２．００ｍＬの着色／停止試薬を加え、蓋をして、上下を５回逆さまにする。
７．  ３５００ｒｐｍで１０分間遠心処理する。
８．  ４１５ｎｍで測定する。脱塩水を用いて分光光度計をゼロに調節する。
【０３３６】
活性の計算
ブランクのＯＤは≦０．１３でなければならない。そうでない場合、分析を繰り返す必要がある。
データをＥｘｃｅｌシートに記入する
標準曲線および傾向線をＥｘｃｅｌで作成する。
ａ）ｙ軸＝ＯＤ415
ｂ）ｘ軸＝ｍＭリン酸塩
ｃ）勾配（α）は０．３６〜０．３８で書かなければならない
ｄ）切片（β）は｜０．０２｜を超えてはならない
ｅ）相関係数（Ｒ2）は≧０．９９とする
フィターゼ活性を以下のようにして計算する。
【数２】
0005829603.tif 000007
ＯＤ試料＝酵素試料の平均吸光度
ＯＤブランク＝酵素ブランクの平均吸光度
ＤＦ＝試料の希釈係数
インキュベーション時間＝６０分間
Ｗ試料＝試料または対照の重量
α＝標準曲線の勾配
β＝標準曲線の切片
【０３３７】
ｐＨ３．５でのフィターゼアッセイ：
これは、以下の点を変更した以外、ｐＨ５．５でのフィターゼアッセイと同じである。１．１アッセイ緩衝液、グリシン−ＨＣＬ緩衝液ｐＨ３．５（１．１酢酸緩衝液ｐＨ５．５の代わりに使用）：
０．２Ｍのグリシン２５０ｍｌを０．２ＭのＨＣｌ１３０ｍＬおよび約５００ｍＬの脱イオン水と混合する。０．５ＭのＨＣｌまたは０．５ＭのＮａＯＨを用いてｐＨを３．５に調整する。この溶液を１０００ｍＬ容のメスフラスコに移し、溶液を脱イオン水を加えて１０００ｍＬまで調整する。
【０３３８】
１．３  フィチン酸塩溶液（基質）７．５ｍＭ（合計２５０ｍｌ）：
２．１０ｇ（±０．０５ｇ）のフィチン酸ナトリウム、十水和物（フィチン酸）を２００ｍＬのアッセイ緩衝液（グリシンＨＣｌ緩衝液ｐＨ３．５）に溶解させる。
【０３３９】
水浴中、溶液を３７℃までサーモスタット処理する。
【０３４０】
３７℃で、４ＭのＨＣｌまたは４ＭのＮａＯＨを加えて、ｐＨをｐＨ３．５に調整する。
【０３４１】
アッセイ緩衝液（ｐＨ３．５）を添加することで、２５０．０ｍＬまで調整する。溶液の入った瓶をホイルで包んでおく必要がある。
【０３４２】
保管寿命：２週間
フィチン酸のもうひとつのロットに変更するときに、基質補正因子が必要な場合もある。
【０３４３】
フィチン酸回分１２８Ｈ１２３４（Ｓｉｇｍａ  Ｐ−３１６８）の補正因子を１，００に規定する。
【０３４４】
この方法での酵素およびリン酸塩の希釈はいずれも、酢酸緩衝液ｐＨ５．５ではなくグリシン−ＨＣｌアッセイ緩衝液ｐＨ３．５で行う。
【実施例】
【０３４５】
実施例１−緒言
食品または動物用飼料用の酵素添加剤として効率的にするために、フィターゼは多数の異なる特性を兼ね備えたものでなければならない。フィチン酸を動物の胃の酸性環境で分解できるようにするには、低いｐＨ、好ましくは広い範囲のｐＨ値で活性でなければならない。また、高い比活性を持つものでなければならず、好ましくは、飼料ペレットなどの飼料原料の調製で一般に用いられる高温にタンパク質が耐えられるだけの高い熱安定性を持つものでなければならない。
【０３４６】
また、酵素がフィチン酸塩だけでなく、五リン酸イノシトール、四リン酸イノシトールおよび三リン酸イノシトールなどのフィチン酸塩分解の中間生成物も加水分解できるように、酵素が広い基質特異性を持つことも重要である。ブタにおけるフィチン酸塩の分解に関する研究で、これらのオリゴリン酸イノシトールは、ほとんどが小腸および大腸で不溶性のまま残り、腸管ミクロフローラおよび動物が産生するアルカリホスファターゼを利用できないことがわかっている。異なる酵素の基質特異性の特性のばらつきも同定した。たとえば、フィターゼによってバチルス・サブティリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から生成した三リン酸イノシトールは、基本的にこの酵素によるさらなる加水分解に対して耐性である。
【０３４７】
好適には、これらの変異体では、温度安定性、ｐＨ範囲、ペプシン安定性、比活性、基質特異性、広めの基質特異性のうちのいずれか１つに関して、特徴の改善が認められる。これらの特徴を判断するための好適な方法を本明細書で開示する。
【０３４８】
特に、フィターゼの特徴の改善は、改善された変異体を飼料用サプリメントとして用いるのに特に適したものにする、食品および飼料加工条件下での酵素の安定性、胃部通過時の酵素の安定性、ヒトまたは動物の胃および／または胃腸管における酵素活性および安定性に関連する。よって、このような改善は、他のパラメータの中に、上昇した温度、好ましくは６５℃を超える温度での安定性の増加、タンパク質分解消化、好ましくはペプシンなどの消化管のプロテアーゼに対する安定性の増加、低ｐＨでの触媒活性、好ましくはｐＨ５．５未満の触媒活性の増加、フィチン酸塩からリン酸塩基、好ましくはさらにリン酸イノシトールを放出する全体的な効率を含む。
【０３４９】
フィターゼの特徴の改善は、食品および飼料加工における用途ならびに、食品および飼料生成物用の添加剤として使用することにも関連する。特に、この改善は、食品および飼料加工条件下での安定性、胃部通過時の安定性、ヒトまたは動物の胃および／または胃腸管における活性および安定性に関連する。このような改善は、他のパラメータの中に、上昇した温度、好ましくは６５℃を超える温度での安定性の増加、タンパク質分解消化、好ましくは消化管のプロテアーゼに対する安定性の増加、低ｐＨでの触媒活性、好ましくはｐＨ５．５未満の触媒活性の増加、フィチン酸塩からリン酸塩基を放出する全体的な効率を含む。
【０３５０】
上昇した温度での安定性の増加は、酵素の不活性化温度によって定量化される。不活性化温度は、特定時間のインキュベーションならびに以後の室温までの冷却後のフィターゼ酵素の残留活性が、同じ時間、同じ条件下で室温にてインキュベートした同じフィターゼ酵素の残留活性の５０％である温度として定義される。熱安定性差は、２つの酵素の不活性化温度間の℃での差である。
【０３５１】
実施例２．ペプシン安定性
Ｎａｔｕｐｈｏｓ（ＢＡＳＦ）およびＲｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ／ＤＳＭ）と比較した、ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）由来のフィターゼ、変異体ＢＰ−１７、ＢＰ−１１０、ＢＰ−１１１、ＢＰ−１１２、Ｐｈｙｚｙｍｅ  ＸＰのｐＨ２でのペプシン耐性。
【０３５２】
材料および方法
緩衝液：
ペプシンインキュベーション緩衝液：０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．０、３ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、２．９ｍｇの塩化ナトリウム無水／ｍＬ、０．７３ｍｇの塩化カルシウム／ｍＬ。ペプシンを含む溶液では、５００、１０００、３０００、６０００または１００００Ｕ／ｍｌのペプシン（Ｓｉｇｍａ  Ｐ−７０００、１００００Ｕ／ｍｇが２７ｍｇ／ｍｌに相当）をそれぞれ含有するように、インキュベーション緩衝液を調製する。１ペプシン単位は、基質としてヘモグロビン（Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｄｅｘ）を用いてＴＣＡ−可溶性産物で測定した場合に、ｐＨ２．０、３７℃で１分間のΔＯＤ280が０．００１になる酵素の量として定義される。
【０３５３】
フィターゼアッセイ緩衝液：酢酸緩衝液２５０ｍＭ、ｐＨ５．５
ＢＳＡを含むフィターゼアッセイ緩衝液：酢酸緩衝液２５０ｍＭ、ｐＨ５．５に３ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む。
【０３５４】
ペプシン濃度を上げた場合の耐性：
すべての酵素のセットアップを同一にした：酵素を含む６つの試料を調製した（二重）：緩衝液（ｐＨ２）中のペプシンの量を増やした４つの試料、ペプシンを含まないがインキュベーション緩衝液（ｐＨ２）中の１つの試料、ＢＳＡを含むアッセイ緩衝液（ｐＨ５．５）中に酵素も含む１つの陽性対照試料。
【０３５５】
各試料で、ペプシンの量を変えないか増やした９００μｌのインキュベーション緩衝液あるいは、９００μｌのアッセイ緩衝液を、１００μｌの酵素溶液と混合した後、４０℃でインキュベーションした。１２０分間のインキュベーション後、１００μｌを抜き取り、９００μｌのアッセイ緩衝液と混合した。ＩＳＯドラフト国際標準ＩＳＯ／ＤＩＳ  ３００２４に記載されているように、ｐＨ５．５で、リン酸塩標準曲線に対して試料のフィターゼをすみやかに分析した。
【０３５６】
結果
ペプシン耐性
ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）変異体はいずれも、ペプシンに対してｐＨ２で優れた安定性を示した。対照的に、Ｎａｔｕｐｈｏｓの活性は、ペプシン濃度５００Ｕ／ｍｌですでに劇的に低下し、さらに活性が低下すると、ペプシン濃度３０００Ｕ／ｍｌで約４５％回復するプラトーが見られた。Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐの回復はさらに悪く、ペプシン濃度わずか５００Ｕ／ｍｇで回復の低下が２０％未満であった（図９Ａ）。
【０３５７】
図９は、ペプシンの濃度を上げた場合のブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）、変異体ＢＰ−１７、ＢＰ−１１０、ＢＰ−１１１、ＢＰ−１１２由来のフィターゼならびに、Ｐｈｙｚｙｍｅ  ＸＰ、Ｎａｔｕｐｈｏｓ、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐの耐性を示す。データは、ペプシンのないｐＨ２でのインキュベーションと関連している。Ａ：すべてのデータ点、Ｂ：同じデータであるが、７０％を超えた回復のみを示す。
【０３５８】
【表５】
0005829603.tif 000008
【０３５９】
ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）変異体間にわずかな差があり、変異体ＢＰ−１７  ｖａｒ．１１０が、最高ペプシン濃度１００００Ｕ／ｍＬで２時間のインキュベーション後に９５％の活性が残る最もよい安定性を示している（図９Ｂ）。対照的に、ＢＰ−１７は２時間のインキュベーション後に８５％前後の回復を見せた。
【０３６０】
ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼは、優れた酸安定性も示した。ｐＨ２またはｐＨ５．５のいずれかで２時間のインキュベーション後にｐＨ５．５で測定した活性を比較すると、ｐＨ２で２時間のインキュベーション時には４つのブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼすべてで活性が失われなかったことが示されたが、Ｐｈｙｚｙｍｅ  ＸＰ、Ｎａｔｕｐｈｏｓ、新たなＲｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐでは、活性のわずかな低下から有意な低下（表２）が認められた。
【０３６１】
【表６】
0005829603.tif 000009
【０３６２】
データの概要
本発明によるブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼ変異体は、同じ条件下で、ペプシンは存在させずにインキュベートした試料の活性と比較して、ｐＨ２、３７℃、１００００Ｕ／ｍｌのペプシンで２時間のインキュベーション後に７５％を超える回復を示す。
【０３６３】
実施例３．酵素活性の回復
酵素活性の回復の評価
材料および方法
ここで、本発明者らは、コムギ配合酵素のペレット化後の酵素活性の回復を評価する。酵素を顆粒状のコムギに噴霧し、乾燥させた上で飼料と混合し、ペレット化のプロセスを実施する。
【０３６４】
全粒小麦粉に液体酵素を配合し、乾燥物質含有量約９０％まで乾燥させた。ＫｏｌｄｉｎｇのＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにて、ペレット化ユニットを用いて、ペレット化プロセスにおける熱ストレスによる酵素の不活性化を試験した（図１０に概略的に示す）。被検試料を１０ｋｇのプレミックスに加え、１０分間混合する。次に、１０ｋｇのプレミックスを１５０ｋｇの飼料（大型の水平ミキサ）に加え、１５分間混合した上で、コンディショニング／スチーム処理した。飼料を９０℃／９５℃で３０秒間処理した上で、ペレット化する。カスケードミキサの流出口で温度を測定する。ペレット化プレスを出た直後に、ペレットを室温まで冷却する。
【０３６５】
本明細書に列挙した方法でフィターゼ活性を測定した。
【０３６６】
フィターゼ活性は、ペレット化前のマッシュ飼料１グラムあたり５単位である。
【０３６７】
結果
結果を図１１〜１３に示す。
【０３６８】
図１１に、本発明による３つのＰｈｙｔａｓｅ  Ｂ変異体のペレット化試験の結果を開示する。これらの酵素を全粒小麦粉に配合し、水分含有量が約１０％になるまで乾燥させた。ここで、ＢＰ  １７  ｖａｒ  １１１のペレット化後のフィターゼ活性の回復は、９０℃において９０％であり、これに対しＢＰ  １７の９０℃における回復は１９％であった。
【０３６９】
比較用として、Ｐｈｙｚｙｍｅ  ＸＰすなわち大腸菌（Ｅ  ｃｏｌｉ）フィターゼを全粒小麦粉に配合した。結果を図１２に示す。ここで、Ｐｈｙｚｙｍｅ  ＸＰを全粒小麦粉に配合した３つのバッチでは、９０℃でペレット化後のフィターゼ活性の回復は４７％である。
【０３７０】
Ｒｏｎｏｚｙｍｅも試験した。この製品は、ペレット化工程の熱から酵素を保護するために被覆された状態で販売されている。この試験では、被覆された製品からフィターゼを抽出して全粒小麦粉に配合し、保護のない状態でフィターゼ分子の熱安定性を研究した。結果を図１３に示す。
【０３７１】
データの概要
コムギに配合した本発明のブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼ変異体は、９０℃でのペレット化後に７０％を超える回復を示す。
【０３７２】
実施例４．フィチン酸の分解
フィターゼによるフィチン酸分解についての試験の結果
溶液
インキュベーションには３種類の緩衝液を用いた。これらの緩衝液は以下のとおりとした。
２５０ｍＭの酢酸塩  ｐＨ５．５；
２５０ｍＭの酢酸塩Ｍ  ｐＨ３．５；
２５０ｍＭのＨＣｌグリシン  ｐＨ２．５。
【０３７３】
インキュベーションに用いたすべてのフィターゼを、酵素濃度が１Ｕ／ｍｌになるまでアッセイ緩衝液で希釈した。
【０３７４】
インキュベーションに使用したフィチン酸塩基質溶液は、フィチン酸塩１％（１ｇ／１００ｍｌ緩衝液）である。
【０３７５】
この基質を、反応時のｐＨを一定に保つために、フィターゼの希釈に用いたものと同じ緩衝液で調製する。
【０３７６】
反応を、１ＭのＨＣｌによって停止させる。
【０３７７】
インキュベーション
インキュベーション容量：１．５または３．０ｍｌのフィチン酸塩＋０．２５ｍｌの酵素＋３．２５または１．７５ｍｌの緩衝液、３７℃で、全容量５．０ｍｌ。
【０３７８】
異なる時点（０分、３０分、６０分、９０分）に０．５ｍｌのサブ試料を採取する。
【０３７９】
サブサンプリングの前に、各サブ試料について、１ＭのＨＣｌを０．２ｍｌ用いてエッペンドルフ管を準備する。インキュベーションで得たサブ試料にＨＣｌを混ぜることで、反応を停止させる。ＨＰＬＣ分析まで、サブ試料０．７ｍｌをそれぞれ４℃で保管する。
【０３８０】
ＨＰＬＣ法
フィチン酸塩およびイノシトール異性体の高速イオンクロマトグラフィ（ＨＰＩＣ）による分析。この方法は、ＳｋｏｇｌｕｎｄおよびＣａｒｌｓｓｏｎら（Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．
Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，  ４５（１９９７），  ４５１〜４３６  ５．  Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，  ４６  （１９９８），  １８７７〜１８８２；およびＪ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，  ４９（２００１），  １１６９５〜１７０１に記載されている。使用したカラムは、４×５０ｍｍのプレカラムを有する、Ｄｉｏｎｅｘから入手した強アニオン交換体（４×２５０ｍｍ）であった。溶媒ＡはＭｉｌｌｉＱ水、溶媒Ｂは１ＮのＨＣｌを水に入れて調製したものである。勾配は、３０分間でＢを２．５％から４９％に続いて、流量０．８ｍｌ／分で５０％でのアイソクラティック３分間、２．５％でのアイソクラティック２分間である。それぞれの試行を３５分間にする。フィターゼは理論的に可能なＩＰ異性体をそれほど多くは生成しないため、試行を合計２５分間に短縮することもできる。溶離液を、流量０．４ｍｌ／分で、０．１％のＦｅ（ＮＯ3）3・９ＨＯ2と２％の過塩素酸（ＨＣｌＯ4）とを含有する水溶液を用いて、インラインで誘導体化した。フィチン酸塩およびＩＰ異性体を、２９０ｎｍでポジティブピークとして検出した。これは、フィチン酸塩−Ｆｅ3+−ＣｌＯ4-錯体が形成されることによるものである。６０％過塩素酸溶液は、Ｓｉｇｍａから購入した。
【０３８１】
結果
結果を図１４〜１７に示す。
【０３８２】
データの概要
本発明のすべての酵素が好ましい特徴を示した。
【０３８３】
本発明のフィターゼは、試験した全ｐＨレベルでフィチン酸塩を分解した。
【０３８４】
本発明の酵素はｐＨ５．５において非常に高い活性を示す。
【０３８５】
ＢＰ  １１０およびＢＰ  １１１は、ｐＨ２．５および３．５において同様の活性を示す。
【０３８６】
ＢＰ  １１０およびＢＰ  １１１は、ｐＨ２．５および３．５のどちらでも、インキュベーションに添加されたすべてのフィチン酸塩を９０分後に分解する。
【０３８７】
ＢＰ１１２は、ｐＨ２．５および３．５のどちらでも、インキュベーションに添加されたフィチン酸塩の７５％を９０分後に分解する。
【０３８８】
本発明の酵素は、ｐＨ２．５でＲｏｎｏｚｙｍｅおよびＮａｔｕｐｈｏｓよりも優れた特徴を示す（少なくとも図１７参照）。（図１４〜１６で見られるよりも酵素濃度が高いため、ここでブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）ＢＰ１７を参照用に示す。）
【０３８９】
実施例５．液化物におけるフィチン酸の加水分解
フィチン酸の判定：
フィチン酸含有量：５％スラリー（乾燥試料の場合）のｐＨをｐＨ１０に調整することで、試料からフィチン酸を抽出した後、イオン交換カラムを用いるＨＰＬＣ法で測定した。ＮａＯＨ勾配系を用いて、フィチン酸をカラムから溶出させた。液体中のフィチン酸含有量を、フィチン酸の標準と比較して計算した。
【０３９０】
結果
異なる熱安定性ＢＰ変異体フィターゼ、すなわちＢＰ１１０、ＢＰ１１１、ＢＰ１１２によって、従来の乾燥粉末液化プロセス（ソース：Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｅｎｅｒｇｙ、Ｍｏｎｒｏｅ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）から得た全粒トウモロコシ（ｃｏｒｎ）液化物のフィチン酸の加水分解に対して温度がおよぼす影響を調べた。３２％  ｄｓ（「乾燥固体」）全粒トウモロコシ（ｃｏｒｎ）ｄｓ．トウモロコシ（ｃｏｒｎ）液化物のｐＨをｐＨ５．０に調整し、８５℃から８９℃に保たれた水浴に入れた。温度の平衡後、ＢＰ−フィターゼを４．０ＦＴＵ／ｇｄｓ．トウモロコシ（ｃｏｒｎ）となるように添加した。次に、２０分の時点で試料を採取し、１０ｍＭの水酸化ナトリウム（１〜１０倍に希釈）を添加して酵素反応を停止させた。続いて希釈試料を濾過し、ＨＰＬＣを用いてそのフィチン酸塩誘導体特性（ＩＰ１〜ＩＰ６）を分析した。図１８および図１９のＨＰＬＣクロマトグラムに、３種類の変異体から得たフィターゼはいずれも、８５℃より高い温度でフィチン酸の加水分解を触媒することが明らかに示された。全粒トウモロコシ（ｃｏｒｎ）液化物のフィチン酸含有量（フィチン酸（ＩＰ６）および中間体のＩＰ１〜ＩＰ５）は１．７％ｄｓ．トウモロコシ（ｃｏｒｎ）であり、図１８のデータは、９５％を超えるフィチン酸が、現状の液化条件下で熱安定性フィターゼによって加水分解されたことを示した。有意に、８９℃でインキュベートした試料のＨＰＬＣ特性から、ＢＰ−１１１フィターゼ変異体が他の２種類の変異体由来のフィターゼよりも高い熱安定性を呈することが示された（図１９のＢＰ−１１０およびＢＰ−１１２を参照のこと）。
【０３９１】
実施例６
トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）におけるアスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）リパーゼ３の発現
１．トランスフォーメーションに使用する発現コンストラクト＆株
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手したｐＤＯＮＲ（商標）２２１プラスミドＤＮＡ（カタログ番号１２５３６−０１７）をドナーベクターとして使用した。アスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）リパーゼ３ゲノムＤＮＡ含有ｐＤＯＮＲ２２１：：ｌｉｐ  ３（図２０）をトリコデルマ・リーセイ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）ゲートウェイ目的ベクターｐＴｒｅｘ３Ｇ（国際公開第０５／００１０３６号パンフレットに詳細に記載されている）に組み変え、最終的な発現コンストラクトＡＴｌｉｐａｓｅ３Ｔｒｅｘ（図２１）を得た。
【０３９２】
発現カセットは、トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼ１（ｃｂｈ１）遺伝子のプロモーターおよびターミネーター領域を含んでいた。また、これは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、ａｍｄＳ遺伝子を、トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）のトランスフォーメーション用の選択可能なマーカーとして含んでいた。
【０３９３】
アスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）リパーゼ３ゲノムＤＮＡは、配列番号７に示すアミノ酸配列を有するリパーゼ３脂肪分解酵素をコードする。
【０３９４】
本明細書で使用する「リパーゼ３」という用語は、配列番号７に示すアミノ酸配列など、配列番号８に示すアミノ酸配列を含む脂肪分解酵素を示す。配列番号７は、シグナルｓｅｑを含有し、配列番号８はシグナル配列を持たない成熟リパーゼタンパク質である。
【０３９５】
トランスフォーメーションには、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）すなわち、２つの分泌されるセロビオヒドロラーゼであるＣＢＨＩおよびＣＢＨＩＩと、２つの分泌されるエンドグルカナーゼであるＥＧＩおよびＥＧＩＩとをコードする遺伝子を欠失させた非ＧＭＭ株ＲＬ−Ｐ３７の誘導体株を使用した。
【０３９６】
発現ベクターｐＴｒｅｘ３ｇ．
以下、本発明による遺伝子の発現に使用できるベクターｐＴｒｅｘ３ｇの構築につて説明する。
【０３９７】
このベクターは、６４のヘキサマー制限酵素認識配列を含有する伸長させたマルチプルクローニング部位を有するｐＵＣ１１８ファージミドベースのベクター（Ｂｒｏｓｉｕｓ，  Ｊ．（１９８９）ＤＮＡ  ８：７５９）である大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ベクターｐＳＬ１１８０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ，ＵＳＡ）をベースにしたものである。これは、トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈｌ遺伝子のプロモーター・ターミネーター領域間の所望のオープンリーディングフレームのＧａｔｅｗａｙ技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた挿入を可能にするためのＧａｔｅｗａｙ目的ベクター（Ｈａｒｔｌｅｙ，  Ｊ．Ｌ．，  Ｔｅｍｐｌｅ，  Ｇ．Ｆ．  ａｎｄ  Ｂｒａｓｃｈ，  Ｍ．Ａ．（２０００）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０：１７８８〜１７９５）として設計された。また、トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）のトランスフォーメーション時に選択可能なマーカーとして用いられるアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ遺伝子も含有する。
【０３９８】
ｐＴｒｅｘ３ｇの詳細は以下のとおりである。このベクターは、大きさが１０．３ｋｂである。
【０３９９】
ｐＳＬ１１８０のポリリンカー領域に挿入したのは、以下のＤＮＡセグメントである。
１．トリコデルマ・リーセイ（Ｔ  ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ１遺伝子のプロモーター領域由来のＤＮＡの２．２ｂｐのセグメント
２．クロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣｍＲ）およびｃｃｄＢ遺伝子をフランキングするいずれかの末端にａｔｔＲｌおよびａｔｔＲ２組換え部位を含むＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから取得した１．７ｋｂのＧａｔｅｗａｙリーディングフレームＡカセット
３．トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ１遺伝子のターミネーター領域由来のＤＮＡの３３６ｂｐのセグメント
４．天然のプロモーターおよびターミネーター領域とともにアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ遺伝子を含有するＤＮＡの２．７ｋｂのフラグメント。
【０４００】
２．トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）の４遺伝子欠失宿主株のトランスフォーメーション
アスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａ．  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）リパーゼ３遺伝子を含有する発現コンストラクトＡＴｌｉｐａｓｅ３Ｔｒｅｘを、ＰＤＳ−１０００ヘリウムシステム（ＢｉｏＲａｄカタログ番号１６５−０２２５７）を用いる粒子ボンバードメントによる遺伝子銃でのトランスフォーメーションまたは電気穿孔を使用して、トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）株にトランスフォームした。真菌ＤＮＡのみまたは全発現プラスミドを含むＰＣＲ産物を、遺伝子銃でのトランスフォーメーションおよび電気穿孔による形質転換体の生成に使用した。
【０４０１】
Ａ．電気穿孔によるトランスフォーメーション
トランスフォーム対象となるトリコデルマ・リーセイ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）宿主株を、ＰＤＡプレート上で５日間、完全に胞子形成されるまで成長させた。２つのプレートからの胞子を１．２Ｍのソルビトールで収集し、ミラクロスで濾過して寒天を除去した。胞子を５０ｍｌのファルコンチューブに移し、５０ｍｌの水を用いて５〜６回繰り返し遠心処理して洗浄した。１．２Ｍのソルビトール溶液を用いて、胞子を少量（２×ペレット容量未満）に再懸濁させた。次に、この胞子懸濁液を氷上に保持した。９０ｕｌの胞子懸濁液のアリコートを電気穿孔キュベット（Ｅ−ｓｈｏｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの０．１ｃｍの標準電気穿孔キュベット）に取った。１０〜２０ｕｌのＤＮＡコンストラクト（プラスミド図４またはＰＣＲ産物）を胞子懸濁液に加え、電気穿孔を１６ｋＶ／ｃｍ、２５μＦ、５０Ωに設定した。電気穿孔後、胞子懸濁液を氷上に残し、１．０Ｍのソルビトール５部およびＹＥＰＤ１部に再懸濁させ、２５０ｒｐｍで振盪しながら２８Ｃで一晩インキュベーションして発芽させた。翌日、胞子発芽体をアセトアミド含有寒天板に蒔いた。形質転換体を採取し、個々にアセトアミド寒天板に移した。
【０４０２】
Ｂ．粒子ボンバードメントによるトランスフォーメーション（遺伝子銃でのトランスフォーメーション）
トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）の４遺伝子が欠失した株の胞子の懸濁液を調製した。２００ｕｌの胞子の懸濁液を最少培地（ＭＭ）アセトアミドプレートの中心に広げた。（ＭＭアセトアミドプレートは、以下の組成であった。０．６ｇ／ｌアセトアミド；１．６８ｇ／ｌ  ＣｓＣｌ；２０ｇ／ｌグルコース；２０ｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．６ｇ／ｌ  ＣａＣｌ２  ２Ｈ２０；１ｍｌ／ｌ  １０００×微量元素溶液；２０ｇ／ｌ  Ｎｏｂｌｅ寒天、ｐＨ５．５。１０００×微量元素溶液は、５．０ｇ／ｌ  ＦｅＳＯ４  ７Ｈ２Ｏ；１．６ｇ／ｌ  ＭｎＳＯ４；１．４ｇ／ｌ  ＺｎＳＯ４  ７Ｈ２Ｏおよび１．０ｇ／ｌ  ＣｏＣｌ２  ６Ｈ２Ｏを含有していた。胞子懸濁液を滅菌フードにてＭＭアセトアミド培地の表面で１時間乾燥させた。トランスフォーメーションについては、製造業者の指示に従った。６０ｍｇのタングステン粒子を微量遠心管に入れた。１ｍｌのエタノールを加え、１５秒間静置した。エタノールを除去し、粒子を滅菌ｄＨ2Ｏで３度洗浄した上で、２５０ｕｌの５０％（ｖ／ｖ）滅菌グリセロールを加えた。２５ｕｌのタングステン粒子懸濁液を微量遠心管に入れた。連続的に攪拌しながら、プラスミドＤＮＡを５ｕｌ（１００〜２００ｎｇ／ｕｌ）と、２．５ＭのＣａＣｌ２を２５ｕｌと、０．１Ｍのスペルミジンを１０ｕｌとを加えた。この粒子を３秒間遠心処理した。上清を除去し、粒子を２００ｕｌの１００％エタノールで洗浄し、３秒間遠心処理した。上清を除去した。２４ｕｌの１００％エタノールを加えてピペットで混合し、粒子のアリコート８ｕｌを取り出して、デシケーターに保持したマイクロキャリアディスクの中心に乗せた。このタングステン／ＤＮＡ溶液が乾燥したら、マイクロキャリアディスクを、胞子を含むＭＭアセトアミドのプレートと一緒にボンバードメントチャンバに設置した。ボンバードメントのプロセスについては、製造業者の指示どおり実施した。タングステンＤＮＡ粒子でプレート上の胞子にＤＮＡを導入した後、プレートを２８℃でインキュベートした。トランスフォームされたコロニーをＭＭアセトアミド培地の新鮮なプレートに移し、２８℃でインキュベートした。
【０４０３】
３．マイクロタイタープレートでの形質転換体の成長
ＭＭアセトアミドプレートでの５日間の成長後、電気穿孔または遺伝子銃によるトランスフォーメーションで得られ、安定した形態を示している形質転換体を、９６ウェルのマイクロタイタープレートでグルコース／ソホロースを含む２００ｕｌの限定培地に接種した。グルコース／ソホロース（１リットルあたり）を含む限定培地は、ＮＨ4２ＳＯ4を５ｇと、ＰＩＰＰＳ緩衝液を３３ｇと、Ｃａｓアミノ酸を９ｇと、ＫＨ2ＰＯ4を４．５ｇと、ＣａＣｌ2（無水）を１ｇと、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏを１ｇとで構成され、ｍｉｌｌｉ−Ｑ  Ｈ２Ｏを用いて５０％ＮａＯＨでｐＨを５．５０に調整して９６６．５ｍＬにしたものであった。滅菌後、Ｍａｚｕ  ５ｍＬ、グルコース／ソホロース６０％を２６ｍＬと４００×トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）微量金属を２．５ｍＬとを加えた。マイクロタイタープレートを酸素成長チャンバにて２８℃で５日間インキュベートした。
【０４０４】
実施例７
本発明に用いるのに適した発現宿主細胞は、セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ、Ｃｅｌ７ａ）、セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨＩＩ、Ｃｅｌ６ａ）、エンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ、Ｃｅｌ７ｂ）、エンドグルカナーゼＩＩ（ＥＧＩＩ、Ｃｅｌ５ａ）をコードする遺伝子が、分子遺伝子技術での欠失または破壊によって失活したトリコデルマ・リーセイ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）の株であってもよい。この株（４遺伝子欠失株）は、他のトリコデルマ・リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）分泌タンパク質をコードする遺伝子の過発現の宿主として有用である。
【０４０５】
好ましくは、本発明に用いるのに適した宿主細胞は、国際公開第２００５／００１０３６号パンフレットおよ米国特許出願公開第２８０２６３７６  Ａ１号明細書に記載の方法を用いて、株ＲＬ−Ｐ３７のトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞由来のものであってもよい。
【０４０６】
本発明に用いるのに適したトリコデルマ・リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株は、トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＲＬ−Ｐ３７の公に利用可能な株由来のものであってもよい。トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株ＲＬ−Ｐ３７は、国際公開第０５／００１０３６号パンフレットに記載されているように、修飾されてトリコデルマ・リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株１Ａ５２を形成してもよい。トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株１Ａ５２は、米国特許出願公開第２００８００２６３７６号明細書に記載されているように修飾され、本発明において使用可能なトリコデルマ・リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞を形成してもよい。
【０４０７】
ＲＬ−Ｐ３７は、後述するように修飾されてトリコデルマ・リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株１Ａ５２を形成するものであってもよい。
【０４０８】
使用するトリコデルマ・リーセイ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）宿主株は、以前はＧｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃによって市販のセルラーゼ調製物の製造に用いられていた公に利用可能な株ＲＬ−Ｐ３７由来のものであってもよい。この株の誘導および特徴付けについては、すでに刊行物に記載されている（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ，  Ｇ．およびＭｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ，  Ｂ．Ｓ．  （１  ９８４）  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０：４６〜５３；米国特許第４，７９７，３６１号明細書）。これは、いくつかの突然変異誘発ステップの結果として野生型株（ＱＭ６ａ）から得られたセルラーゼ過産生突然変異体株である。
【０４０９】
１）ｐｙｒ４突然変異体株の単離
プラスミドＤＮＡでのトランスフォーメーション用の株ＲＬ−Ｐ３７を調製するために、ｐｙｒ４遺伝子にｎｕｌｌ変異を有する誘導体を単離する必要があった。
【０４１０】
ｐｙｒ４遺伝子は、ウリジンの生合成に必要な酵素であるオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼをコードする。有毒なインヒビターである５−フルオロオロト酸（ＦＯＡ）が、野生型細胞によってウリジンに取り込まれ、細胞を汚染する。しかしながら、ｐｙｒ４遺伝子のない細胞はこのインヒビターに耐性であるが、成長にウリジンを必要とする。したがって、ＦＯＡを用いてｐｙｒ４突然変異体株を選択することが可能である。実用上、トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）株ＲＬ−Ｐ３７の胞子を２ｍｇ／ｍｌのウリジンと１．２ｍｇ／ｍｌのＦＯＡとを含有する固体培地の表面に広げる。自然発生的なＦＯＡ耐性コロニーが３〜４日以内で表れた。成長にウリジンを必要とするＦＯＡ耐性突然変異体を同定した。特異的に欠陥ｐｙｒ４遺伝子を有する突然変異体を同定するために、プロトプラストを生成し、野生型ｐｙｒ４遺伝子を含むプラスミドでトランスフォームした（Ｓｍｉｔｈ，  Ｊ．Ｌ．，  Ｂａｙｌｉｓｓ，  Ｆ．Ｔ．  ａｎｄ  Ｗａｒｄ，  Ｍ．（１９９１）  Ｃｕｒｒ．  Ｇｅｎｅｔ．  １９：２７〜３３）。トランスフォーメーション後、ウリジンを含まない培地にプロトプラストを播種した。トランスフォームされたコロニーの以後の成長には、プラスミドを持つｐｙｒ４遺伝子による欠陥ｐｙｒ４遺伝子の補完が見られた。このようにして、株ＧＣ６９を株ＲＬ−Ｐ３７のｐｙｒ４突然変異体として同定した。
【０４１１】
２）ＣＢＨｌコード遺伝子を欠失するよう設計されたプラスミドの構築
ＣＢＨＩタンパク質をコードするｃｂｈｌ遺伝子を、株ＲＬ−Ｐ３７のゲノムＤＮＡから、この遺伝子用に公開配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションによってクローニングした（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，  Ｓ．，  Ｓｃｈｗｅｉｃｋａｒｔ，  Ｖ．，  Ｌａｄｎｅｒ，  Ｍ．，  Ｇｅｌｆａｎｄ，  Ｄ．，  Ｋｗｏｋ，  Ｓ．，  Ｍｙａｍｂｏ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｉｎｎｉｓ，  Ｍ．（１９８３）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １：６９１〜６９６）。ｃｂｈｌ遺伝子は、６．５ｋｂＰｓｔｌフラグメントにあり、このベクターのカナマイシン耐性遺伝子を置き換えてｐＵＣ４ＫのＰｓｔｌ部位に挿入された（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ，  ＵＳＡ）。得られたプラスミドであるｐＵＣ４Ｋ：：ｃｂｈ１をＨｉｎｄｌｌｌで切断し、大きいほうのフラグメントを単離して再ライゲートし、ｐＵＣ４Ｋ：：ｃｂｈ１ΔＨ／Ｈを得た。この手法では、ｃｂｈｌコード配列全体と約１．２ｋｂの５’フランキング配列および１．５ｋｂの３’フランキング配列を除去した。元のＰｓｔｌフラグメントの両端から約１ｋｂのフランキングＤＮＡが残った。トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ４遺伝子を、ｐＵＣｌ８におけるゲノムＤＮＡの６．５ｋｂのＨｉｎｄｌｌｌフラグメントとしてクローニングし、ｐＴｐｙｒ２を形成した（Ｓｍｉｔｈ，  Ｊ．Ｌ．，  Ｂａｙｌｉｓｓ，  Ｆ．Ｔ．およびＷａｒｄ，  Ｍ．（１９９１）  Ｃｕｒｒ．  Ｇｅｎｅｔ．  １９：２７〜３３）。プラスミドｐＵＣ４Ｋ：：ｃｂｈ１ΔＨ／ＨをＨｉｎｄｌｌｌで切断し、末端を仔ウシ腸管粘膜由来アルカリホスファターゼで脱リン酸化した。このＤＮＡを、ｐｙｒ４遺伝子を含有する６．５ｋｂのＨｉｎｄｌｌｌフラグメントでライゲートして、ｐΔＣＢＨｌｐｙｒ４を得た。
【０４１２】
ＥｃｏＲｌでｐΔＣＢＨｌｐｙｒ４が消化されると、いずれかの末端でｃｂｈ１ローカスのフランキング領域からなる大きなフラグメントが遊離し、中央ではｐｙｒ４遺伝子がｃｂｈ１コード配列を置き換えた。このフラグメントのトリコデルマ・リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）由来ではない唯一のＤＮＡは、ｐＵＣ４Ｋのマルチプルクローニング部位由来の２１ｂｐのフラグメントであった。
【０４１３】
３）トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のｃｂｈｌ遺伝子の欠失
Ｓｍｉｔｈら、（１９９１）が概説した方法で、株ＧＣ６９の菌糸から単離されたプロトプラストをＥｃｏＲｌ消化プラスミドｐΔＣＢＨｌｐｙｒ４でトランスフォームした。安定した形質転換体を得て、ｃｂｈ１遺伝子が欠失したものを後述するようにして同定した。
【０４１４】
形質転換体から全ＤＮＡを単離し、Ｐｓｔｌで消化し、アガロースゲル電気泳動を実施して、膜フィルタにブロットした。次に、Ｐ32標識ｐΔＣＢＨｌｐｙｒ４を用いてフィルタをハイブリダイズし、オートラジオグラフィによってハイブリダイゼーションを観察した。このプローブが、トランスフォームされていない株の天然のｃｂｈ１およびｐｙｒ４遺伝子とハイブリダイズされた。一形質転換体（株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩ）において、ダブルクロスオーバー統合イベントが発生した場合、予測されるハイブリダイゼーションのパターンを観察した。すなわち、ｐΔＣＢＨｌｐｙｒ４から株ＲＬ−Ｐ３７のｃｂｈｌローカスで得られた単一コピーの大きなＥｃｏＲｌフラグメントの統合により、ｃｂｈ１遺伝子が欠失した。
【０４１５】
使用したプローブが放射線標識したｐｌｎｔＣＢＨＩであること以外は、上述のようにしてサザン解析を実施した。このプラスミドは、ｐＵＣ４Ｋ：：ｃｂｈ１ΔＨ／Ｈで欠失した領域内にｃｂｈ１ローカス由来の２ｋｂのＢｇｌｌｌフラグメントを含むｐＵＣベクターで構成される。このプラスミドは、株ＧＣ６９のｃｂｈ１ローカスにハイブリダイズされたが、株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩ由来のＤＮＡにはハイブリダイズされなかった。このことから、ｃｂｈ１遺伝子が欠失し、ｐΔＣＢＨｌｐｙｒ４からのｐＵＣ  ＤＮＡフラグメントが欠失株によって取り込まれなかったことが確認される。
【０４１６】
等電点電気泳動ゲルでの分泌されるタンパク質の分離による解析で、ＣＢＨｌタンパク質が株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩによって産生されなかったことが示された。
【０４１７】
４）Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩのｐｙｒ４  ｎｕｌｌ突然変異体の生成  ｃｂｈｌ遺伝子を欠いた形質転換体（Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩ）の胞子を、ＦＯＡ含有培地に広げた。次に、上記のセクションで説明した方法を用いて、この形質転換体のｐｙｒ４欠失誘導体を得た。このｐｙｒ４欠損株を、Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩＰｙｒ-２６とした。サザン解析によって、株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩＰｙｒ-２６を選択すると自然発生的な欠失が起こることが示された。この欠失は、株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩのｃｂｈ１ローカスで統合されたｐｙｒ４遺伝子ならびに、フランキングＤＮＡを、ゲノムＤＮＡの６．５ｋｂのＰｓｔｌフラグメントの部分を超えてもともとクローニングされたｃｂｈ１ローカスから完全に除去した。
【０４１８】
５）ｃｂｈ２遺伝子を欠失するよう設計されたベクターの構築  ＣＢＨｌｌタンパク質をコードするトリコデルマ・リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のｃｂｈ２遺伝子を、ゲノムＤＮＡの４．１ｋｂのＥｃｏＲｌフラグメントとしてクローニングした（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：２７４〜２７８）。この４．１ｋｂのフラグメントをｐＵＣ４ＸＬのＥｃｏＲｌ部位間に挿入した。後者のプラスミドは、制限エンドヌクレアーゼ部位がここに示した順序の対称パターンで配置されたマルチプルクローニング部位を含むｐＵＣ誘導体（Ｒ．  Ｍ．  Ｂｅｒｋａ、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．によって作製）である。ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、Ｓａｃｌ、Ｓｍａｌ、Ｈｉｎｄｌｌｌ、Ｘｈｏｌ、Ｂｇｌｌｌ、Ｃｌａｌ、Ｂｇｌｌｌ、Ｘｈｏｌ、ＨｉｎｄｌｌＩ、Ｓｍａｌ、Ｓａｃｌ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ。プラスミドｐＰΔＣＢＨｌｌが作製され、Ｈｉｎｄｌｌｌ部位（ＣＢＨｌｌ翻訳開始部位の３’の７４ｂｐ）およびＣｌａＩ部位（ＣＢＨＩＩの最終コドンの３’の２６５ｂｐ）間のｃｂｈ２クローンの１．７ｋｂの中央領域が除去され、以下のようにして得られるトリコデルマ・リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ４遺伝子を含む１．６ｋｂのＨｉｎｄｌｌｌ−Ｃｌａｌ  ＤＮＡフラグメントと置き換えられた。トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ４遺伝子を１．６ｋｂのＮｈｅｌ−ＳｐｈｌフラグメントのｐＴｐｙｒ２から切除し、ｐＵＣ２１９（マルチプルクローニング部位を伸長させてＢｇｌｌｌ、ＣｌａｌおよびＸｈｏｌの制限部位を含むようにしたｐＵＣ１１９由来；Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９，  Ｇｅｎｅ  ７７：６９  ７８）のＳｐｈｌとＸｂａｌ部位との間に挿入して、ｐ２１９Ｍを生成した（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｃｕｒｒ．  Ｇｅｎｅｔ．  １９：２７〜３３）。一方の末端に７ｂｐのＤＮＡを有し、他方の末端に６ｂｐのＤＮＡを有する、ｐＵＣ２１９マルチプルクローニング部位由来のＨｉｎｄｌｌｌ−Ｃｌａｌフラグメントとしてｐｙｒ４遺伝子を除去し、ｃｂｈ２遺伝子のＨｉｎｄｌｌｌおよびＣｌａｌ部位に挿入してプラスミドｐＰΔＣＢＨＩＩを形成した。
【０４１９】
このプラスミドをＥｃｏＲｌで消化すると、一方の末端でｃｂｈ２ローカスから０．７ｋｂのフランキングＤＮＡを有するフラグメント、他方の末端ではｃｂｈ２ローカスから１．７ｋｂのフランキングＤＮＡが遊離して、真ん中ではトリコデルマ・リーセイ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ４遺伝子が遊離した。トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）由来ではないこのフラグメントのＤＮＡだけが、ｐｙｒ４遺伝子のいずれかの末端でのｐＵＣ２１９マルチプルクローニング部位の６ｂｐおよび７ｂｐのフラグメントであった。
【０４２０】
６）株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩＰｙｒ-２６からのｃｂｈ２遺伝子の欠失
上記の３で概説した方法で、株Ｐ３７ＰΔＣＢＨＩＰｙｒ-２６のプロトプラストを生成し、ＥｃｏＲｌ消化ｐＰΔＣＢＨＩＩでトランスフォームした。安定した形質転換体を振盪フラスコで培養し、培養上清中のタンパク質を等電点電気泳動によって調べた。どのＣＢＨｌｌ（ＣＢＨＩも）タンパク質をも産生しなかったひとつの形質転換体（Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７で表記）を同定した。
【０４２１】
株Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７からＤＮＡを抽出し、ＥｃｏＲｌおよびＡｓｐ７１８で消化し、アガロースゲル電気泳動を実施した。このゲルからのＤＮＡを膜フィルタにブロットし、32Ｐ標識したｐＰΔＣＢＨＩＩとハイブリダイズした。野生型ｃｂｈ２遺伝子を含有する４．１ｋｂのＥｃｏＲｌフラグメントが、トランスフォームしていない対照株由来のＤＮＡに観察された。対照的に、株Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７では、単一の４．１ｋｂのバンドが除去され、約０．９および３．１ｋｂの２つのバンドに置き換わった。これは、ｐＰΔＣＢＨｌｌからの大きめのＥｃｏＲｌフラグメントの単一のコピーが厳密にｃｂｈ２ローカスに統合され、ｃｂｈ２遺伝子を欠失したのであれば、想定されたパターンである。
【０４２２】
同じＤＮＡ試料をＥｃｏＲｌで消化し、上記のようにサザン解析を実施した。この例では、プローブは32Ｐ標識されたｐｌｎｔＣＢＨＩＩであった。このプラスミドは、プラスミドｐＰΔＣＢＨＩＩで欠失した、ｃｂｈ２  ＤＮＡのそのセグメントの中からのｃｂｈ２遺伝子コード配列の一部を含有する。株Ｐ３７ＰΔＣＢＨ６７由来のＤＮＡとのハイブリダイゼーションは見られないことから、ｃｂｈ２遺伝子が欠失し、ｐＰΔＣＢＨｌＩのｐＵＣプラスミドフラグメントがこの株を取り込んでいないことを確認するものである。
【０４２３】
７）株Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７のｐｙｒ４  ｎｕｌｌ突然変異体の選択  ｃｂｈｌ遺伝子およびｃｂｈ２遺伝子の両方が欠失した形質転換体（Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７）の胞子を、ＦＯＡを含有する培地に広げた。次に、上記のセクション１で説明した方法を用いて、この形質転換体のｐｙｒ４欠損誘導体を得た。このｐｙｒ４欠損株をＰ３７ＰΔΔＣＢＨ６７Ｐｙｒ-１と示す。サザン解析では、株Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７Ｐｙｒ-１を選択したときに自然発生的な欠失が生じたことが示された。この欠失では、もともとクローニングされたゲノムＤＮＡの４．１ｋｂのＥｃｏＲｌフラグメントの範囲をこえて、株Ｐ３７ＰΔＣＢＨ６７のｃｂｈ２ローカスで統合されていたｐｙｒ４遺伝子とｃｂｈ２ローカスからのフランキングＤＮＡが完全に除去されことが示された。ｐｙｒ４遺伝子のいずれかの末端に存在するｐＵＣ２１９マルチプルクローニング部位由来のＤＮＡの短い（６ｂｐおよび７ｂｐ）フラグメントもこの欠失のゲノムからは除去されていた。
【０４２４】
８）ｅｇｌ２遺伝子を破壊するよう設計されたプラスミドの構築
ＥＧｌｌ（以前はＥＧｌｌｌとも呼ばれていた）をコードするｅｇｌ２遺伝子が、トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）からクローニングされ、そのＤＮＡ配列が公開されている（Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｇｅｎｅ  ６３：ｌｌ〜２１）。本発明者らは、ｐＵＣ２１９のＰｓｔｌ部位とＸｈｏｌ部位との間に挿入されたゲノムＤＮＡの約４ｋｂのＰｓｔｌ−Ｘｈｏｌフラグメントとして、株ＲＬ−Ｐ３７から遺伝子を得た。ｐＴｐｙｒ２から得たゲノムＤＮＡの２．７ｋｂのＳａｌＩフラグメントに存在するトリコデルマ・リーセイ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）  ｐｙｒ４遺伝子を、ＥＧｌｌコード配列内のＳａｌｌ部位に挿入し、プラスミドｐＥＧＩＩ：：Ｐ−１を作製した。これによって、ＥＧｌｌコード配列が破壊されたが、配列の欠失は生じなかった。プラスミドｐＥＧＩＩ：：Ｐ−１をＨｉｎｄｌｌｌおよびＢａｍＨｌで消化して、一方の末端の５ｂｐと他方の末端の１６ｂｐ（いずれもｐＵＣ２１９のマルチプルクローニング部位由来である）以外はトリコデルマ・リーセイ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）だけから誘導されるＤＮＡの線形フラグメントを得ることが可能である。
【０４２５】
９）株Ｐ３７ＰΔＣＢＨ６７Ｐｙｒ-１のｅｇｌ２遺伝子の破壊
株Ｐ３７ＰΔΔＣＢＨ６７Ｐｙｒ-１を、事前にＨｉｎｄｌｌｌおよびＢａｍＨｌで消化しておいたｐＥＧＩＩ：：Ｐ−１でトランスフォームし、安定した形質転換体を選択した。この形質転換体から全ＤＮＡを単離し、サザン解析を用いて株を同定した。この株では、ｐｙｒ４およびｅｇｌ２遺伝子を含むプラスミドＤＮＡのフラグメントが、ｅｇｌ２ローカスで統合され、結果としてＥＧｌｌコード配列を破壊していた。プローブとして、ｅｇｌ２遺伝子を含むトリコデルマ・リーセイ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）ＤＮＡの約４ｋｂのＰｓｔｌフラグメントを用いて、サザン解析を実施した。株Ｐ３７ＰΔΔ６７Ｐ-１から単離したＤＮＡをサザン解析用にＰｓｔｌで消化したら、オートラジオグラフ上に単一の４ｋｂのバンドとしてｅｇｌ２ローカスが可視化された。しかしながら、ｅｇｌ２遺伝子が破壊された形質転換体の場合、このバンドが失われ、予想どおり２つの新たなバンドに置き換わった。ＤＮＡをＢｇｌｌｌまたはＥｃｏＲＶで消化すると、ｅｇｌ２遺伝子に対応するバンドのサイズが、トランスフォームされていないＰ３７ＰΔΔ６７Ｐ-１株と、ｅｇｌ２が破壊された形質転換体との間で約２．７ｋｂ（挿入されたｐｙｒ４フラグメントのサイズ）だけ大きくなった。この後者の形質転換体は、この時点でｃｂｈｌ、ｃｂｈ２、ｅｇｌ２遺伝子が欠失しており、これを株Ｂ３１と表記した。さらにサザン解析を実施したところ、ｐＥＧＩＩ：：Ｐ−１のｐＵＣ  ＤＮＡフラグメントがこの株に取り入れられていないことが確認された。
【０４２６】
１０）株Ｂ３１のｐｙｒ４  ｎｕｌｌ突然変異体の選択
ｃｂｈｌ、ｃｂｈ２、ｅｇｌ２遺伝子が欠失した形質転換体（Ｂ３１）の胞子を、ＦＯＡ含有培地に広げた。次に、上記のセクション１で説明した方法を用いて、この形質転換体のｐｙｒ４欠損誘導体を得た。このｐｙｒ４欠損株をＢ３１  Ｐ６と表記した。サザン解析を実施したところ、株Ｂ３１Ｐ６を選択したときに自然発生的な欠失が生じたことが明らかになった。この欠失は、株Ｂ３１のｅｇｌ２ローカスで統合されていた大部分のｐｙｒ４遺伝子を除去したが、ｅｇｌ２ローカスのフランキングＤＮＡに伸長しなかった。
【０４２７】
１１）ｅｇｌ１遺伝子を欠失するために消化されるプラスミドの構築
トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）のｅｇｌ１遺伝子がクローニングされ、その遺伝子のＤＮＡ配列が公開されている（Ｐｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  Ｇｅｎｅ  ４５；２５３〜２６３；  ｖａｎ  Ａｒｓｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：６０〜６４）。本発明者らは、ｐＵＣ１００（オリゴヌクレオチドがマルチプルクローニング部位に挿入されて、Ｂｇｌｌｌ、Ｃｌａｌ、Ｘｈｏｌの制限部位を付加しているｐＵＣ１８の誘導体）のＨｉｎｄｌｌｌ部位で挿入されたゲノムＤＮＡの４．２ｋｂのＨｉｎｄｌｌｌフラグメントとして、トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）株ＲＬ−Ｐ３７からこの遺伝子を得て、ｐＵＣＥＧＩを得た。ＥＧＩコード配列の中央に近い位置からコード配列の３’末端を越える位置まで伸長している約１ｋｂのＥｃｏＲＶフラグメントを除去し、ｐＴｐｙｒ２から得たｐｙｒ４遺伝子を含むトリコデルマ・リーセイ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）ＤＮＡの３．５ｋｂのＳｃａｌフラグメントで置き換えた。得られるプラスミドをｐＰΔＥＧＩと呼んだ。
【０４２８】
プラスミドｐＰΔＥＧｌをＨｉｎｄｌｌｌで消化して、いずれかの末端にｅｇｌ１遺伝子のセグメントを有するトリコデルマ・リーセイ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）ゲノムＤＮＡだけを含み、ＥＧＩコード配列の一部を置き換えるｐｙｒ４遺伝子を中央に有するＤＮＡフラグメントを放出させることが可能であった。
【０４２９】
１２）株Ｂ３１Ｐ６におけるｅａｌ１遺伝子の欠失
ｅｇｌ１フランキング領域に対してｐｙｒ４遺伝子の向きだけが異なる２つの形態のｐＰΔＥＧｌを構築した。株Ｂ３１Ｐ６を、両形態のプラスミドをＨｉｎｄｌｌｌで消化した後にその混合物でトランスフォームした。安定した形質転換体から全ＤＮＡを抽出し、Ｈｉｎｄｌｌｌで消化し、サザン解析を実施した。使用したプローブは放射線標識したｐＵＣＥＧＩであった。欠失されていないｅｇｌ１遺伝子を表す株Ｂ３１Ｐ６からＤＮＡの４．２ｋｂのフラグメントへのハイブリダイゼーションを観察した。形質転換体（株１Ａ５２）を同定したところ、そこにはこの４．２ｋｂが存在せず、約６．８ｋｂのフラグメントに置き換わっていた。これは、ＥＧＩコード配列の一部の欠失と、この位置でのｐｙｒ４の挿入につながるｅｇｌ１ローカスで予測されたように、ｐＰΔＥＧＩからの大きめのＨｉｎｄｌｌｌフラグメントを正確に統合した場合に想定されるパターンである。ｐＵＣプラスミドをサザン解析のプローブとして使用して、ｐＰΔＥＧＩのｐＵＣ  ＤＮＡフラグメントが株１Ａ５２に取り込まれていないことを確認した。
【０４３０】
トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株１Ａ５２を修飾して、本発明で使用可能なトリコデルマ・リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞を形成してもよい。
【０４３１】
実施例８  フィターゼとリパーゼとの組み合わせをアミラーゼおよびキシラナーゼと一緒に補充した食餌のカニューレ処置した仔ブタでの栄養塩消化率。
【０４３２】
この試験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、ＵＳＡで実施した。
【０４３３】
材料および方法
外科的にカニューレ処置した仔ブタにおける、組み合わせでフィターゼ、アミラーゼ、キシラナーゼの上にリパーゼを補ったトウモロコシ（ｃｏｒｎ）／大豆粕ベースの食餌の回腸エネルギおよびタンパク質消化率、全消化管エネルギ消化率、全消化管ＣａおよびＰ貯留を評価した。処置の構成は以下のとおりとした。
・陽性対照。栄養塩が適切な食餌。
・陰性対照。陽性対照と比べて、飼料のＤＥ／ｋｇを１５０ｋｃａｌ、カルシウム０．１５％、利用可能なＰを０．１２％に抑えた。
・フィターゼ（５００ＦＴＵ／ｋｇ）。
・フィターゼ（５００ＦＴＵ／ｋｇ）、アミラーゼ（１８００ｕ／ｋｇ）およびキシラナーゼ（２０００ｕ／ｋｇ）。
・フィターゼ（５００ＦＴＵ／ｋｇ）、アミラーゼ（１８００ｕ／ｋｇ）、キシラナーゼ（２０００ｕ／ｋｇ）およびリパーゼ（３０００ＬＩＰＵ／ｋｇ）。
【０４３４】
１方格あたり食餌が６回、間隔が６回で、二組の６×６のラテン方格に１２頭の去勢ブタを無作為に割り当てた。個々のブタを耳タグで識別した。
【０４３５】
陽性対照および陰性対照の食餌配合物と計算で得た組成を表３に示す。トウモロコシ（ｃｏｒｎ）デンプンを犠牲にして、陰性対照（ＮＣ）に酵素産物を補って食餌を混合した。基本的な食餌は、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）、大豆粕、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）ＤＤＧＳを主成分とするものであった。０．４％の酸化クロムを消化できないマーカーとして食餌に加えた。
【０４３６】
【表７】
0005829603.tif 000010
【０４３７】
この研究で使用したすべてのブタは、系統３３７の成熟オスとＣ２２のメスとを交尾させて得たものであった（Ｐｉｇ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｆｒａｎｋｌｉｎ，  ＫＹ）。平均初期体重１２．５ｋｇ（ＳＤ＝２．１５）の去勢ブタを使用した。ブタの遠位回腸に外科的にＴ−カニューレを取り付けた。手術後、ブタをそれぞれの小屋に収容した。動物には実験開始まで従来の離乳後食餌を与えた。飼料は、エネルギ要
求量（すなわち１０６ｋｃａｌ  ＭＥ／ｋｇ  ＢＷ0.75）を維持できると想定して、１日３回毎日与えた。ブタのＢＷを記録する際、各期間の最初に飼料の許容量を調整した。
【０４３８】
酵素産物を食餌と混合して、それぞれの期間に７日間経口投与した：順応に４日間、糞便回収に１日間、回腸消化管内容物回収に２日間。回腸消化管内容物試料を６日目と７日目に８時間回収した。簡単に説明すると、ケーブルの束でビニール袋をカニューレの筒に取り付け、袋に流入する消化管内容物を回収した。袋が消化管内容物で一杯になるか、３０分ごとに少なくとも１回、袋を取り外した。回収した試料を−２０℃で保存して、消化管内容物におけるアミノ酸の細菌の分解を防いだ。実験終了時、冷凍した回腸試料を室温で自然解凍し、動物および食餌内で混合し、サブ試料を回収して化学分析を実施した。回腸消化管内容物試料を凍結乾燥させ、微粉砕してから化学分析した。
【０４３９】
回腸試料の乾燥物質を分析した（手順９３０．１５；ＡＯＡＣ、２００５）。回腸試料の総エネルギ濃度をボンベ熱量計で測定した（Ｐａｒｒ  ６３００熱量計、Ｐａｒｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏ．，  Ｍｏｌｉｎｅ，  ＩＬ）。硝酸−過塩素酸湿潤灰試料調製（手順９６８．０８８Ｄ；ＡＯＡＣ、２００５）後に食餌のおよび回腸消化管内容物試料のＣｒ含有量をＩＣＰ法（手順９９０．０８；ＡＯＡＣ、２００５）で測定した。これらの値を用いて、回腸消化係数を計算した。強制空気オーブンで糞便試料を乾燥させ、微粉砕した上で分析した。これらの試料を、ＤＭ、総エネルギ、粗タンパク質、Ｃａ、Ｐについて分析した。
【０４４０】
ＳＡＳのＰＲＯＣ  ＭＩＸＥＤ法（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，  Ｃａｒｙ，  ＮＣ）を用いてラテン方格法としてデータを分析した。モデルには、食餌処置、動物期間、ブロックを含めた。ペアにしたｔ検定を用いて平均を分けた。それぞれの囲いで、すべての計算の実験単位を考慮した。統計的有意性の判断にはαレベル０．０５を使用した。
【０４４１】
結果
フィターゼを添加しても、陰性対照と比較して回腸エネルギ消化率（図２３Ａ）は増えなかったが、フィターゼ＋キシラナーゼ＋アミラーゼおよびフィターゼ＋キシラナーゼ＋アミラーゼ＋リパーゼを添加すると、それぞれ２．９５％および９．２８％増えた。これらの変化は、フィターゼ＋キシラナーゼ＋アミラーゼバックグラウンドに対する純粋にリパーゼの添加だけによる６．３％の効果を示している。同様に、粗タンパク質の回腸消化率は、フィターゼを補充しても陰性対照の食餌と比較して増えなかった（図２３Ｂ）が、フィターゼ＋キシラナーゼ＋アミラーゼを補充すると、陰性対照（＋５．６％）およびフィターゼを補充した場合（＋４．０％）と比較して粗タンパク質消化率が有意に増加した。フィターゼ＋キシラナーゼ＋アミラーゼの上にリパーゼを追加で補充すると、陰性対照（＋１０．７％）、フィターゼ補充（＋９．１％）、フィターゼ＋キシラナーゼ＋アミラーゼ（＋４．９％）の場合と比較して粗タンパク質消化率がさらに高まった。
【０４４２】
全消化管レベル（図２４）では、フィターゼを含めてもフィターゼ＋キシラナーゼ＋アミラーゼでも、エネルギ消化率には影響しなかった。フィターゼ＋キシラナーゼ＋アミラーゼを含めた場合に回腸から糞便レベルに差が小さくなったのは驚くべきことではなかった。なぜなら、大腸の微生物活性によってブタにおけるエネルギ消化率の最初の差が解消されることが多いためである。対照的に、この組み合わせにリパーゼを添加すると、他の処理よりも糞便エネルギ消化係数が大きくなったことから、大腸の微生物によってすら、これがなければ消化されなかったであろう栄養塩の放出および吸収が示唆される。フィターゼ＋キシラナーゼ＋アミラーゼ＋リパーゼの組み合わせで、陰性対照飼料と比較して全消化管エネルギ消化率が４．７％増加した。
【０４４３】
フィターゼ（＋３２％および＋２９３％）、フィターゼ＋キシラナーゼ＋アミラーゼ（＋３６％および＋３２３％）、フィターゼ＋キシラナーゼ＋アミラーゼ＋リパーゼ（＋４５％および３３４％）での食餌の全Ｃａ（図２５Ａ）およびＰ貯留（図２５Ｂ）の相対的な増分も、陰性対照の食餌と比較して現段階での研究ではっきりしていた。フィターゼを含めることによるＣａおよびＰの消化率の変化は想定されたが、キシラナーゼ＋アミラーゼ＋リパーゼを添加するとさらに改善されたことから、フィターゼ、アミラーゼおよびキシラナーゼを含む食餌のＣａおよびＰの貯留を高めるにあたってのリパーゼの主な役割が示された。これらの増分は、対照飼料およびフィターゼそれ自体よりも有意に大きかった。これは、リパーゼがＣａおよびＰ貯留に対しておよぼすさらなる効果を示すものである。
【０４４４】
まとめると、フィターゼ＋アミラーゼ＋キシラナーゼの上にリパーゼを添加することで、陰性対照、フィターゼ添加およびフィターゼ＋アミラーゼ＋キシラナーゼ添加と比較して、回腸レベルでのエネルギおよびタンパク質消化率が増加し、全消化管レベルでのエネルギ消化率も増加した。同様に、フィターゼ＋アミラーゼ＋キシラナーゼの上にリパーゼを添加すると、陰性対照ならびに、フィターゼを添加した食餌と比較して、全消化管ＣａおよびＰ貯留が増加した。本特許に含まれるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの例は、リパーゼを添加することで生じたこれらの消化率の増分が、主に食餌用カルシウムに対するリパーゼの競合によって促進されるフィターゼ活性の増加によるものであることを示している。
【０４４５】
実施例９．酸性条件でのトウモロコシ（ｃｏｒｎ）−ダイズ食餌での遊離脂肪酸生成
リパーゼによるトウモロコシ（ｃｏｒｎ）−ダイズ食餌における遊離脂肪酸生成の研究で得られた結果
ｐＨ約２．８で、異なる組み合わせのリパーゼおよびフィターゼを用いて、飼料試料を４０℃でインキュベートする。
【０４４６】
試薬：
適切な試薬およびその濃度は以下のとおりとした。フィターゼアッセイ緩衝液：０．２５Ｍの酢酸ナトリウム、１ｍＭのＣａＣｌ2、０．０１％のＴｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ５．５。ペプシン溶液：２０００Ｕ／ｍｌのペプシン（Ｓｉｇｍａ  Ｐ７０００）を含有する０．７５ＭのＨＣｌ。飼料試料には、６０．０１％のトウモロコシ（ｃｏｒｎ）、３１．５２％の大豆粕、４８、４％のダイズ油、０．４％の塩、０．２％のＤＬメチオニン、１．１６％の石灰石、１．４６％のリン酸二カルシウム、１．２５％のＶＩＴ／ＭＩＮ混合物を含む基本的なトウモロコシ（ｃｏｒｎ）−ダイズ食餌を使用した。
【０４４７】
酵素：
本明細書に記載したようなリパーゼ３。本明細書に記載したようなＰｈｙｚｙｍｅ。ＴｆｕＩＩＩリパーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓで発現されるＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ  （Ｔｆｕ＿０８８３；ＮＣＢＩ受託番号ＹＰ＿２８８９４４．１）由来の細菌クチナーゼである。材料および方法で説明したようにして、リパーゼアッセイを用いてＴｆｕＩＩＩを分析した。さらに、同じアッセイを用いて酵素を分析したが、ｐＨ条件をｐＨ５．５ではなくｐＨ７．０に変更した。ｐＨ７．０で測定したリパーゼ活性を、材料および方法のリパーゼアッセイで説明したものと同じ定義を用いて、ＬＩＰ７Ｕと表記する。ｐＨ５．５で測定したリパーゼ活性（ＬＩＰＵ）とｐＨ７．０で測定したリパーゼ活性（ＬＩＰ７Ｕ）との比は、１：１．４であった。
【０４４８】
Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐ−ＣＴおよびＮａｔｕｐｈｏｓは、市販の真菌フィターゼである。試料を乾燥生成物として得た。試料１ｇを最初に５０ｍｌのフィターゼアッセイ緩衝液に再懸濁させ、マグネチックスターラーを用いて２０分間抽出した。抽出混合物を最終的に１００ｍｌになるまでフィターゼアッセイ緩衝液で満たし、ガラス繊維フィルタで濾過した。材料および方法で説明したフィターゼアッセイに従って、最終抽出物のフィターゼ活性を測定した。
【０４４９】
リパーゼ試料をＨ2Ｏに入れ、リパーゼ３は酵素活性３０ＬＩＰＵ／ｍｌ、ＴｆｕＩＩＩは３０ＬＩＰＵ／ｍｌまで希釈した。
【０４５０】
フィターゼ試料をフィターゼアッセイ緩衝液に入れて酵素活性５ＦＴＵ／ｍｌまで希釈した。
【０４５１】
酸性ｐＨでのｉｎ  ｖｉｔｒｏインキュベーション：
以下の酵素の組み合わせをｉｎ  ｖｉｔｒｏインキュベーションで評価した。リパーゼ３、リパーゼ３＋Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐ、リパーゼ３＋Ｎａｔｕｐｈｏｓ、リパーゼ３＋Ｐｈｙｚｙｍｅ、ＴｆｕＩＩＩ、ＴｆｕＩＩＩ＋Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐ、ＴｆｕＩＩＩ＋Ｎａｔｕｐｈｏｓ、ＴｆｕＩＩＩ＋Ｐｈｙｚｙｍｅ、リパーゼまたはフィターゼなし。
【０４５２】
各インキュベーションについて、飼料試料１ｇを５０ｍｌ容のネジ蓋式の管に秤量した。それぞれの酵素溶液１００μｌずつにＨ2Ｏを加えて合計１ｍｌにしたものを、それぞれの管に加えた。次に、ペプシン溶液０．５ｍｌを各管に加え、内容物を慎重に混合した。５つのガラスのビー玉を加えた上で、振盪した水浴中で試料を４０℃で４５分間インキュベートした。インキュベーション後、管を３５００ｒｐｍで１０分間遠心処理した。「リパーゼなし、かつフィターゼなし」でのインキュベーションの上清のｐＨを測定した。最後に、試料を液体窒素中で冷凍し、凍結乾燥機に一晩入れておいた。すべてのインキュベーションを二重に実施した。
【０４５３】
遊離脂肪酸測定：
インキュベーション時に生成された遊離脂肪酸の量を、ＮＥＦＡ−ＨＲ（２）キット（ＷＡＫＯ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＧｍｂＨ）を用いて測定した。試料を室温に置き、９６％エタノール２０ｍｌを加えた。試料を手作業で再懸濁させた上で、ロータリーホイールで室温にて１時間混合した。混合後、試料を３５００ｒｐｍで１０分間遠心処理した。上清を９６％エタノールで５倍に希釈した上で、試料中の遊離脂肪酸を測定した。１１０μｌのＮＥＦＡ試薬Ｒ１を３７℃で５分間平衡化した上で、１５μｌの希釈試料を加え、反応混合物を３７℃で１０分間インキュベートした。５５μｌのＮＥＦＡ試薬Ｒ２を加え、３７℃でさらに１０分間インキュベーションを継続した。その後、ＯＤ520nmを測定した。ＮＥＦＡ標準（ＷＡＫＯ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＧｍｂＨ）から作製した標準曲線を用いて、遊離脂肪酸の含有量を計算した。
【０４５４】
結果：
遊離脂肪酸測定の結果を図２９に示す。この図は、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）−ダイズ食餌における遊離脂肪酸生成を示している。産生された遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の量を、リパーゼまたはフィターゼを加えていないブランク値に合わせて補正する。リパーゼなし、かつフィターゼなしのインキュベーションのｐＨを測定したところｐＨ２．８であったため、本例でのすべてのインキュベーションの代表的なものであると仮定した。これは、インキュベーションが極めて酸性度の高い条件で実施されたことを示している。リパーゼ３単独またはＰｈｙｚｙｍｅ、ＮａｔｕｐｈｏｓまたはＲｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐとの組み合わせで、ＴｆｕＩＩＩを単独またはＰｈｙｚｙｍｅ、ＮａｔｕｐｈｏｓまたはＲｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐとの組み合わせで含むすべての試料と比較して、ＦＦＡの有意な放出が示される。これは、リパーゼ３がブタの胃またはニワトリの砂嚢の酸性環境での脂肪の加水分解において極めて効果的であろうことを明らかに示すものである。
【０４５５】
実施例１０．アッセイ混合物にカルシウムを加えることがフィターゼ活性に対しておよぼす影響ならびに、ＣａＣｌ2含有アッセイに遊離脂肪酸を加えることによる影響
カルシウムの濃度を上げてのフィチン酸−カルシウム錯体形成の研究で得られた結果ならびに、遊離脂肪酸を加えることによるフィターゼ活性の反転。
【０４５６】
背景：
フィチン酸は、カルシウムなどの二価のミネラルとの間で、容易にキレート形成可能である。このフィチン酸塩−ミネラル錯体は、不溶性沈殿物として存在することもあれば、可溶性錯体として存在することもあり、フィターゼによる加水分解に対して潜在的に耐性である。遊離脂肪酸は、フィチン酸のフィターゼ耐性形態の形成量の減少ならびに、これに伴う放出されるフィチン酸塩−Ｐの増加につながるＣａ−石鹸を形成することで、競合的キレート剤として潜在的に機能することがある。
【０４５７】
試薬：
適切な試薬およびその濃度は以下のとおりとした。アッセイ緩衝液：０．２５Ｍの酢酸ナトリウム、３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ｗ／ｖ）、ｐＨ５．５。フィチン酸塩溶液：アッセイ緩衝液中の９．１ｍＭのフィチン酸ナトリウム塩水和物（Ｓｉｇｍａ  Ｐ０１０９）。ＣａＣｌ2溶液：アッセイ緩衝液中の０．３ＭのＣａＣｌ2。ＦＦＡ溶液：９６％エタノールに溶解させた４０．８ｍｇ／ｍｌパルミチン酸−ステアリン酸混合物（Ｓｉｇｍａ  ０９５８６）。エタノール：９６％エタノール。
【０４５８】
酵素：
本明細書に記載したようなＰｈｙｚｙｍｅ。Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐ−ＣＴおよびＮａｔｕｐｈｏｓは、市販の真菌フィターゼである。本明細書に記載したようなＢＰ１７。試料を乾燥生成物として得た。試料１ｇを最初に０．２５Ｍの酢酸ナトリウム、１ｍＭのＣａＣｌ2、０．０１％のＴｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ５．５に再懸濁させ、マグネチックスターラーを用いて２０分間抽出した。抽出混合物を最終的に１００ｍｌになるまで０．２５Ｍの酢酸ナトリウム、１ｍＭのＣａＣｌ2、０．０１％のＴｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ５．５で満たし、ガラス繊維フィルタで濾過した。材料および方法で説明したフィターゼアッセイに従って、最終抽出物のフィターゼ活性を測定した。
【０４５９】
フィターゼ試料を、０．２５Ｍの酢酸ナトリウム、１ｍＭのＣａＣｌ2、０．０１％のＴｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ５．５に入れ、酵素活性０．３ＦＴＵ／ｍｌまで希釈した。
【０４６０】
フィターゼによるフィチン酸加水分解：
０．５ｍｌのエタノールを、１２ｍｌ容の試験管で、１．４ｍｌのアッセイ緩衝液および１ｍｌのフィチン酸塩溶液と混合した。混合物を３７℃で５分間水浴中で平衡化した上で、０．１ｍｌのフィターゼ溶液を添加して反応を開始した。ブランク測定のために、フィターゼ溶液の代わりに０．１ｍｌのアッセイ緩衝液を加えた。３７℃で１時間のインキュベーション後、２．５ＭのＨＣｌを０．７５ｍｌ添加して、反応を停止させた。すべてのインキュベーションを二重に実施した。
【０４６１】
ＣａＣｌ2濃度を上げてのフィターゼによるフィチン酸加水分解：
適切な容量のＣａＣｌ2溶液を、１２ｍｌ容の試験管で、最終アッセイ容量が３ｍｌになるまで０．５ｍｌのエタノール、１ｍｌのフィチン酸塩溶液およびアッセイ緩衝液と混合した。混合物を３７℃で５分間水浴中で平衡化した上で、０．１ｍｌのフィターゼ溶液を添加して反応を開始した。ブランク測定のために、フィターゼ溶液の代わりに０．１ｍｌのアッセイ緩衝液を加えた。３７℃で１時間のインキュベーション後、２．５ＭのＨＣｌを０．７５ｍｌ添加して、反応を停止させた。すべてのインキュベーションを二重に実施した。
【０４６２】
１５ｍＭのＣａＣｌ2の存在下、ＦＦＡ濃度を上げてのフィターゼによるフィチン酸の加水分解：
適切な容量のＦＦＡ溶液を、１２ｍｌ容の試験管で、容量が０．５ｍｌｍになるまでエタノールと混合した。最終アッセイ容量が３ｍｌになるまで、０．１５ｍｌのカルシウム溶液、１ｍｌのフィチン酸塩溶液およびアッセイ緩衝液を加えた。混合物を３７℃で５分間水浴中で平衡化した上で、０．１ｍｌのフィターゼ溶液を添加して反応を開始した。ブランク測定のために、フィターゼ溶液の代わりに０．１ｍｌのアッセイ緩衝液を加えた。３７℃で１時間のインキュベーション後、２．５ＭのＨＣｌを０．７５ｍｌ添加して、反応を停止させた。すべてのインキュベーションを二重に実施した。
【０４６３】
フィターゼ活性の測定：
Ｋｏｎｅｌａｂ分析装置にて、リン試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、加水分解試料中の無機リン酸塩濃度を測定した。１８０μｌのリン試薬を５μｌの試料と混合し、３７℃で４分間インキュベートした上で、ＯＤ340nmを測定した。ｓＣａｌ  Ｋｏｎｅｌａｂ  ＣａｌｉｂｒａｔｏｒおよびＮｏｒｔｒｏｌ  Ｋｏｎｅｌａｂ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、リン酸塩の含有量を計算した。ブランク測定を結果から減算することで、放出された無機リン酸塩としてフィターゼ活性を計算した。すべての活性をＣａＣｌ2が存在しない試料に対する相対値として計算した。
【０４６４】
結果
図３０は、フィチン酸とカルシウムとのフィターゼ耐性錯体の生成ならびに、遊離脂肪酸を加えることによる反転を示す。図３０Ａは、ＣａＣｌ2濃度を高めることによるフィターゼ活性に対する影響を示す。図３０Ｂは、遊離脂肪酸を、１５ｍＭを含有する反応混合物に加えることによるフィターゼ活性に対する影響を示す。
【０４６５】
ＣａＣｌ2濃度を上げたときのフィチン酸加水分解での結果を図３０Ａに示す。４４種類のフィターゼすべてについて、ＣａＣｌ2濃度が上がるにつれてフィターゼ活性の低下が観察される。Ｐｈｙｚｙｍｅ、ＢＰ１７、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐでは、活性低下が５ｍＭのＣａＣｌ2で開始されるのに対し、Ｎａｔｕｐｈｏｓは５ｍＭで活性が増加し、１５ｍＭのＣａＣｌ2で活性低下が開始される。２０ｍＭのＣａＣｌ2では、Ｐｈｙｚｙｍｅ、ＢＰ１７、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐにフィターゼ活性は観察されず、２０ｍＭを超えるＣａＣｌ2濃度では、すべてのフィチン酸が、少なくともＰｈｙｚｙｍｅ、ＢＰ１７、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐの加水分解に対して錯体耐性で結合されることが示される。Ｎａｔｕｐｈｏｓの場合、３０ｍＭのＣａＣｌ2でフィターゼ活性の有意な低下が観察されるのに対し、６０ｍＭのＣａＣｌ2濃度は、Ｎａｔｕｐｈｏｓ加水分解に対する錯体耐性ですべてのフィチン酸を結合するのに必要であるように見える。遊離脂肪酸を、１５ｍＭのＣａＣｌ2を含有する反応混合物に加えることによる、Ｐｈｙｚｙｍｅ、ＢＰ１７、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  Ｐのフィターゼ活性に対する影響を、図３０Ｂに示す。１５ｍＭのＣａＣｌ2を含有する反応混合物に遊離脂肪酸を加えると、遊離脂肪酸の量が増えるにつれてフィターゼは次第に活性を取り戻す。遊離脂肪酸濃度に応答した３種類のフィターゼ間の小さな差が観察されるが、３種類すべてが２５ｍＭの遊離脂肪酸で１００％活性を取り戻す。これは、遊離脂肪酸がカルシウムを競合的に結合することで、フィターゼ耐性フィチン酸−カルシウム錯体の形成を防ぐ機能を有し得ることを明らかに示すものである。遊離脂肪酸は、本明細書で例示したように単一の成分として加えてもよいし、トリグリセリド基質に対するリパーゼの作用によって形成することも可能である。
【０４６６】
実施例１１  リパーゼインキュベーションに続くフィターゼアッセイ−アッセイ混合物にカルシウムを加えることがフィターゼ活性に対しておよぼす影響ならびに、ＣａＣｌ２含有アッセイにリパーゼ反応ミックスを加えることによる影響
カルシウムの濃度を上げてのフィチン酸−カルシウム錯体形成の研究で得られた結果ならびに、リパーゼ３によって産生される遊離脂肪酸を加えることによるフィターゼ活性の反転。
【０４６７】
背景：
実施例１１では、１５ｍＭのＣａＣｌ2を含有するフィターゼ反応混合物に遊離脂肪酸を加えることによるフィターゼ活性に対する影響について説明した。この例では、同様の実験を実施するが、遊離脂肪酸はリパーゼ３によって産生される。トリグリセリドエマルションをリパーゼ３とともにインキュベートし、この混合物の画分を後に３０ｍＭのＣａＣｌ2を含有するフィターゼ反応混合物に加え、フィターゼ活性に対する影響を観察する。
【０４６８】
試薬：
適切な試薬およびその濃度は以下のとおりとした。リパーゼ試料緩衝液：５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０、０．１％のＢＳＡ（ｗ／ｖ）、１．２％のＮａＣｌ（ｗ／ｖ）。トリグリセリド基質：２％のトリオクタン酸グリセリル（ｖ／ｖ）、０．３％のＮａＣｌ（ｗ／ｖ）、１３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ｗ／ｖ）、１２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０。フィターゼアッセイ緩衝液：  ０．２５Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５。フィチン酸塩溶液：アッセイ緩衝液中９．１ｍＭのフィチン酸ナトリウム塩水和物（Ｓｉｇｍａ  Ｐ０１０９）。ＣａＣｌ2溶液：アッセイ緩衝液中０．３ＭのＣａＣｌ2。エタノール：９６％エタノール。
【０４６９】
酵素：
本明細書に記載したようなリパーゼ３およびＰｈｙｚｙｍｅ。リパーゼ３試料をリパーゼ試料緩衝液に入れ、酵素活性１０ＬＩＰＵ／ｍｌまで希釈した。フィターゼ試料を、０．２５Ｍの酢酸ナトリウム、１ｍＭのＣａＣｌ2、０．０１％のＴｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ５．５に入れ、酵素活性０．３ＦＴＵ／ｍｌまで希釈した。
【０４７０】
リパーゼ反応混合物：
５ｍｌのトリグリセリド基質を、１２ｍｌ容の試験管で、１．０ｍｌのリパーゼ溶液と混合した。ブランク混合物用に、リパーゼ溶液の代わりに１．０ｍｌのリパーゼ試料緩衝液を加えた。混合物を連続的に攪拌しながら３０℃で１２０分間水浴中でインキュベートした。以後のフィターゼアッセイで、混合物をそれぞれリパーゼ反応混合物またはブランク反応混合物として直接使用した。
【０４７１】
ブランク反応混合物を含む、ＣａＣｌ2濃度を上げてのフィターゼによるフィチン酸加水分解：
適切な容量のＣａＣｌ2溶液を、１２ｍｌ容の試験管で、最終アッセイ容量が３ｍｌになるまで１．３ｍｌのブランク反応混合物、１ｍｌのフィチン酸塩溶液およびアッセイ緩衝液と混合した。混合物を３７℃で５分間水浴中で平衡化した上で、０．１ｍｌのフィターゼ溶液を添加して反応を開始した。ブランク測定のために、フィターゼ溶液の代わりに０．１ｍＬのアッセイ緩衝液を加えた。３７℃で１時間のインキュベーション後、２．５ＭのＨＣｌを０．７５ｍｌ添加して、反応を停止させた。
【０４７２】
３０ｍＭのＣａＣｌ2およびリパーゼ反応混合物の存在下、フィターゼによるフィチン酸加水分解：
１．３ｍｌのブランク反応混合物またはリパーゼ反応混合物を、１２ｍｌ容の試験管で、最終アッセイ容量が３ｍｌになるまで０．３ｍｌのカルシウム溶液、１ｍｌのフィチン酸塩溶液およびアッセイ緩衝液と混合した。混合物を３７℃で５分間水浴中で平衡化した上で、０．１ｍｌのフィターゼ溶液を添加して反応を開始した。３７℃で１時間のインキュベーション後、２．５ＭのＨＣｌを０．７５ｍｌ添加して、反応を停止させた。
【０４７３】
フィターゼ活性の測定：
Ｋｏｎｅｌａｂ分析装置にて、リン試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、加水分解試料中の無機リン酸塩濃度を測定した。１８０μｌのリン試薬を５μｌの試料と混合し、３７℃で４分間インキュベートした上で、ＯＤ340nmを測定した。ｓＣａｌ  Ｋｏｎｅｌａｂ  ＣａｌｉｂｒａｔｏｒおよびＮｏｒｔｒｏｌ  Ｋｏｎｅｌａｂ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、リン酸塩の含有量を計算した。ブランク測定を結果から減算することで、放出された無機リン酸塩としてフィターゼ活性を計算した。すべての活性をＣａＣｌ2が存在しない試料に対する相対値として計算した。
【０４７４】
結果
図３１は、フィチン酸とカルシウムとのフィターゼ耐性錯体の生成ならびに、リパーゼを含むリパーゼ反応混合物を加えることによる反転を示す。図３１Ａは、ＣａＣｌ2濃度を高めることによるフィターゼ活性に対する影響を示す。図３１Ｂは、リパーゼ反応混合物を、３０ｍＭのＣａＣｌ2を含有するフィターゼ反応混合物に加えることによるフィターゼ活性に対する影響を示す。
【０４７５】
ブランクリパーゼ反応混合物の存在下（リパーゼ存在せず）でＣａＣｌ2濃度を上げたときのフィチン酸加水分解での結果を図３１Ａに示す。ＣａＣｌ2濃度が上がるにつれてフィターゼ活性の低下が観察され、３０ｍＭのＣａＣｌ2でフィターゼ活性が有意に低下し、４０ｍＭのＣａＣｌ2での残りの活性はない。このカルシウム阻害特性は、実施例１１で示す対応の曲線とは異なる。理由は、リパーゼ反応混合物でトリグリセリド基質を乳化するために適用したＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の量であり、これが実施例１１で説明した実験と比較した場合にフィターゼ反応混合物のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が２倍多くなることにつながる。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度の変化によって、フィチン酸とカルシウムとの間で錯体形成の特性が変化する。
【０４７６】
リパーゼ反応混合物を、３０ｍＭのＣａＣｌ2を含有するフィターゼ反応混合物に加えることによる結果を図３１Ｂに示す。リパーゼを含むリパーゼ反応混合物を加えると、リパーゼを加えていない試料に比してフィターゼ活性が有意に増加する。
【０４７７】
これは、トリグリセリド基質でのリパーゼ活性によって産生される遊離脂肪酸がカルシウムを競合的に結合することで、フィターゼ耐性フィチン酸−カルシウム錯体の形成を防ぐ機能を有し得ることを明らかに示すものである。フィチン酸−カルシウム錯体が形成されなければ、さらに多くの量のフィチン酸をフィターゼによる分解に一層容易に利用でき、フィターゼ活性の増加につながる。
【０４７８】
動物では、リパーゼ活性の結果としてのフィターゼ活性の増加が、ＰおよびＣａ貯留量の増加ならびに見かけ上のアミノ酸消化率の増加につながる（Ｒａｖｉｎｄｒａｎ，  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｒ．  Ｐｏｕｌｔ．  Ｓｃｉ．，  ４１，  １９３〜２００（２０００）およびＳｅｌｌｅ，  Ｐ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １２４，  １２６〜１４１（２００９））。これによって、フィターゼの上にリパーゼを補充していない動物と比較した場合に、ＰおよびＣａ貯留量が増加するとともにエネルギ代謝率が増加し、見かけ上のアミノ酸消化率も増える。
【０４７９】
実施例１２  飼料におけるリパーゼのｐＨ特性
飼料におけるリパーゼ３および膵リパーゼのｐＨ特性についての研究で得られた結果
リパーゼ３および膵リパーゼのｐＨ特性を遅くするために、ｐＨの異なる緩衝液を使用して、飼料試料をリパーゼ３および膵リパーゼとともに４０℃でインキュベートする。
【０４８０】
酵素：
本明細書に記載したようなリパーゼ３。ブタ膵臓からのパンクレアチンのような膵リパーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ７５４５）。リパーゼ３試料をＨ2Ｏに入れ、酵素活性３００ＬＩＰＵ／ｍｌまで希釈した。パンクレアチン試料をＨ2Ｏに入れ、濃度２ｍｇ／ｍｌまで希釈した。
【０４８１】
試薬：
適切な緩衝液およびその濃度は以下のとおりとした。０．２５ＭのＨＣｌ；０．５Ｍのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．５；０．５Ｍのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ３．５；０．５Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５；０．５Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５；０．５ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５；１ＭのＮａＨＣＯ3、ｐＨ１０。他の試薬は以下のとおりとした。ＴＤＣ溶液：タウロデオキシコール酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｔ０８７５）をＨ2Ｏに入れて８０ｍＭまで希釈した。飼料試料には、６０．０１％のトウモロコシ（ｃｏｒｎ）、３１．５２％の大豆粕、４８、４％のダイズ油、０．４％の塩、０．２％のＤＬメチオニン、１．１６％の石灰石、１．４６％のリン酸二カルシウム、１．２５％のＶＩＴ／ＭＩＮ混合物を含む基本的なトウモロコシ（ｃｏｒｎ）−ダイズ食餌を使用した。
【０４８２】
ｐＨが異なる緩衝液でのｉｎ  ｖｉｔｒｏインキュベーション：
各インキュベーションについて、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）−ダイズ飼料試料１ｇを５０ｍｌ容のネジ蓋式の管に秤量した。０．１ｍｌの酵素溶液に続いて、０．１ｍｌのＴＤＣ溶液およびそれぞれの緩衝液１．８ｍｌを、それぞれの管に加えた。５つのガラスのビー玉を加えた上で、振盪した水浴中で試料を４０℃で１２０分間インキュベートした。インキュベーション後、管を３５００ｒｐｍで１０分間遠心処理し、上清のｐＨを測定した。その後、試料を液体窒素中で冷凍し、凍結乾燥機に一晩入れておいた。すべてのインキュベーションを二重に実施した。
【０４８３】
遊離脂肪酸測定：
インキュベーション時に生成された遊離脂肪酸の量を、ＮＥＦＡ−ＨＲ（２）キット（ＷＡＫＯ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＧｍｂＨ）を用いて測定した。試料を室温に置き、９６％エタノール２０ｍｌを加えた。試料を手作業で再懸濁させた上で、ロータリーホイールで室温にて１時間混合した。混合後、試料を３５００ｒｐｍで１０分間遠心処理した。上清を９６％エタノールで５倍に希釈した上で、試料中の遊離脂肪酸を測定した。１１０μｌのＮＥＦＡ試薬Ｒ１を３７℃で５分間平衡化した上で、１５μｌの希釈試料を加え、反応混合物を３７℃で１０分間インキュベートした。５５μｌのＮＥＦＡ試薬Ｒ２を加え、３７℃でさらに１０分間インキュベーションを継続した。その後、ＯＤ520nmを測定した。ＮＥＦＡ標準（ＷＡＫＯ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＧｍｂＨ）から作製した標準曲線を用いて、遊離脂肪酸の含有量を計算した。
【０４８４】
結果：
図３２は、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）−ダイズ食餌で測定したリパーゼ３および膵リパーゼのｐＨ特性を示す。リパーゼ３の濃度は飼料３０ＬＩＰＵ／ｇであり、膵リパーゼの濃度は飼料０．２ｍｇ／ｍｌであった。活性を、産生された遊離脂肪酸の測定最大量に対する相対値として示す。
【０４８５】
異なる緩衝液のｐＨは、リパーゼ３および膵リパーゼのそれぞれについて、以下のとおりとした。０．２５ＭのＨＣｌでｐＨ３．４１およびｐＨ３．０２を提供；０．５Ｍのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．５でｐＨ３．９９およびｐＨ３．７６を提供；０．５Ｍのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ３．５でｐＨ４．９３およびｐＨ５．１８を提供；０．５Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５でｐＨ６．４５およびｐＨ６．４５を提供；０．５Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５でｐＨ７．２６およびｐＨ７．２２を提供；０．５ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５でｐＨ８．３３およびｐＨ８．１８を提供；１ＭのＮａＨＣＯ3、ｐＨ１０でｐＨ９．９５およびｐＨ１０．０７を提供。リパーゼ３の場合、飼料のｐＨ最適値は、低めと高めの両方のｐＨで活性が低下するｐＨ４．０に見られる。ｐＨ３．４が評価した最低ｐＨで、ｐＨをさらに下げれば活性はおそらく低下しつづける。膵リパーゼの場合、飼料のｐＨ最適値は低めと高めの両方のｐＨで活性が低下するｐＨ８．２に見られる。結論として、リパーゼ３のｐＨ特性は、膵リパーゼのｐＨ特性とは極めて異なる。さらに、リパーゼ３のｐＨ特性は、リパーゼ３がブタの胃またはニワトリの砂嚢の酸性環境での脂肪の加水分解において極めて効果的であろうことを示している。
【０４８６】
実施例１３  リパーゼ、フィターゼ、リパーゼ＋フィターゼの組み合わせを補った食餌ｖｓ．対照食餌のブロイラー鶏におけるリンおよびカルシウムの回腸消化率および全消化管貯留。
【０４８７】
材料および方法
リパーゼまたはフィターゼ自体、リパーゼおよびフィターゼの組み合わせを補った食餌ｖｓ．陰性対照の食餌を与えたブロイラー鶏におけるＰおよびＣａの回腸消化率ならびに、全消化管貯留を評価するための実験を実施した。食餌（表４）は、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）および大豆粕を主成分にしたもので、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）ＤＤＧＳ、コーングルテンミール、ダイズ油を含有していた。
【０４８８】
【表８】
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【０４８９】
実験での設計は、６つの複製ケージ（１ケージあたり８羽）に以下のようにして各々無作為に割り当てて、６回の食餌処置で構成した
１．陰性対照（ＮＣ）
２．ＮＣ＋リパーゼ（１，０００ＬＩＰＵ／ｋｇ）
３．ＮＣ＋リパーゼ（３，０００ＬＩＰＵ／ｋｇ）
４．ＮＣ＋フィターゼ（５００ＦＴＵ／ｋｇ）
５．ＮＣ＋フィターゼ（５００ＦＴＵ／ｋｇ）＋リパーゼ（１，０００ＬＩＰＵ／ｋｇ）６．ＮＣ＋フィターゼ（５００ＦＴＵ／ｋｇ）＋リパーゼ（３，０００ＬＩＰＵ／ｋｇ）
【０４９０】
環境制御した部屋で、電気加熱した電池式の育雛器に１日齢のブロイラーのヒヨコを無作為に割り当てた。ヒヨコに一定の蛍光照明を当て、食餌および水を自由に摂取できるようにしておいた。これらの鳥に、１４日目まではプレスターターの食餌を与えた。この日齢で、体重を元にして鳥に食餌処置を割り当て、飼育ケージに移した。鳥には１４日目から２１日目まで実験食餌を与えた。第１週目は温度を３１℃に維持した後、次第に下げて３週目までに２２℃にした。
【０４９１】
孵化後１７日目から２０日目まで飼料の摂取と各ケージの全排泄物を測定した。各ケージの排泄物を貯め、ブレンダーで混合し、サブサンプリングした。各サブ試料を凍結乾燥させ、０．５ｍｍのふるいに通るように粉砕して、分析するまで気密性のプラスチック容器で−４℃で保管した。食餌および排泄物試料を、乾燥物質（ＤＭ）、カルシウム（Ｃａ）、亜リン酸（Ｐ）について分析した。
【０４９２】
２１日目、各複製ケージから２羽の鳥を選び、ペントバルビタールナトリウムを心臓内注射して安楽死させた。小腸をすみやかに露出させ、蒸留水でプラスチック容器の中に静かにフラッシュして回腸の下半分の内容物を回収した。回腸は、臍卵黄管憩室から回盲結合部分に４０ｍｍ近い点まで延在する小腸の一部分であると定義した。消化管内容物をケージの中に貯め、凍結乾燥させ、０．５ｍｍのふるいに通るように粉砕し、ＤＭ、チタン、Ｃａ、Ｐについて実験室で分析するまで気密性の容器に入れて−４℃で保管した。
【０４９３】
ＳＡＳ（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，  Ｃａｒｙ，  ＮＣ）のＰＲＯＣ  ＭＩＸＥＤ法を用いて、ＡＮＯＶＡでデータを分析した。モデルには、食餌処理の固定作用とブロックのランダムな作用とを含めた。ペアにしたｔ検定を用いて平均を分けた。それぞれの囲いで、すべての計算の実験単位を考慮した。統計的有意性の判断にはαレベル０．０５を使用した。
【０４９４】
結果
図３３は、フィターゼが陰性対照と比較してリン回腸消化率を有意に高めなかったが、予想どおり６．０％の数字の増分を生じたことを示す。リパーゼは、１，０００および３，０００ＬＩＰＵ／ｋｇの両方で、陰性対照と比較して回腸リン消化率に何ら効果を生まなかった。対照的に、リパーゼ＋フィターゼの組み合わせでは、陰性対照に比して回腸リン消化率を、リパーゼ包含量１，０００ＬＩＰＵ／ｋｇで１４．３％、３，０００Ｕ／ｋｇで１０．６％と有意に高めることが可能であった。リパーゼ＋フィターゼの組み合わせは、リパーゼを１，０００ｕ／ｋｇで含ませた場合にのみ、フィターゼ処置と比較して、回腸リン消化率を７．８％の差で有意に高めるものである。
【０４９５】
図３４は、どの酵素処置でも、陰性対照の食餌と比較して回腸カルシウム消化率に有意な効果がないことを示す。それにもかかわらず、フィターゼ＋リパーゼの組み合わせで数字的に最高のＣａ消化率値が観察され、リパーゼを１，０００ｕ／ｋｇおよび３，０００ｕ／ｋｇで含ませたときに、それぞれ陰性対照の食餌で得られた値の１１８．３％および１１５．６％という値を呈した。
【０４９６】
図３５は、リパーゼを含ませてもフィターゼを含ませても、陰性対照と比較して全消化管リン貯留の有意な差につながらなかったことを示す。それにもかかわらず、フィターゼで、陰性対照と比較してリン貯留の数字に９．７％の増分を生じた。リパーゼ＋フィターゼの組み合わせは、陰性対照と比較して、リパーゼを１，０００および３，０００ＬＩＰＵ／ｋｇで補ったときにそれぞれリン貯留を１３．４％および１６．０％と有意に増加させた。
【０４９７】
図３６は、リパーゼを含ませてもフィターゼを含ませても、陰性対照と比較して全消化管カルシウム貯留の有意な差につながらなかったことを示す。しかしながら、フィターゼと３，０００ＬＩＰＵ／ｋｇとの組み合わせで、陰性対照と比較してＣａ貯留が有意に１７．７％増加した。
【０４９８】
合成時、現時点の研究では、リパーゼとフィターゼのどちらもＰおよびＣａ消化率に対して有意な効果を生じなかった。しかしながら、フィターゼと１，０００ＬＩＰＵ／ｋｇのリパーゼとを組み合わせると、陰性対照と比較して回腸および全消化管リン貯留が増加し、フィターゼを含ませた場合と比較して回腸リン消化率が増加した。フィターゼと３，０００ＬＩＰＵ／ｋｇのリパーゼとを組み合わせると、陰性対照と比較して、回腸および全消化管リン貯留が増加し、全消化管Ｃａ貯留も増加した。カルシウムおよびリンの吸収および利用時におけるこれらのフィターゼの上にあるリパーゼの増分的な効果は、主に胃腸管でのリパーゼによる遊離脂肪酸の生成と関連しているようにみえる。これは、本明細書に記載のｉｎ−ｖｉｔｒｏの実施例で確認したように、カルシウムとの競合を促進し、フィターゼ活性を改善するものである。
【０４９９】
【表９】
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【０５００】
【表１０】
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【０５０１】
【表１１】
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【０５０２】
【表１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【配列表】
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