(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）少なくとも１つのリン脂質；
ｂ）少なくとも１つの不飽和脂質、ここで該不飽和脂質は不飽和ステロールエステル、不飽和コレステロールエステル、またはオレイン酸コレステリルであり；および
ｃ）少なくとも１つの両親媒性αらせんを形成可能なアミノ酸配列を含む少なくとも１つのペプチドであって、ここで該ペプチドは６〜３０アミノ酸の間の長さであるか、８〜２８アミノ酸の間の長さであるか、１０〜２４アミノ酸の間の長さであるか、１１〜２２アミノ酸の間の長さであるか、１４〜２１アミノ酸の間の長さであるか、１６〜２０アミノ酸の間の長さであるか、または１８アミノ酸の長さである；
を含み、
構成要素ａ）、ｂ）およびｃ）が会合して、ターゲット細胞上のＳＲ−Ｂ１に結合するペプチド−リン脂質ナノ足場を形成する、非天然存在ペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項２】
ｄ）少なくとも１つのホーミング分子
をさらに含む、請求項１のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項３】
少なくとも１つのホーミング分子が、少なくとも１つのリン脂質に共有結合している、請求項２のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項４】
少なくとも１つのホーミング分子が少なくとも１つのペプチドに共有結合している、請求項２のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項５】
少なくとも１つのホーミング分子が、両親媒性αらせんの親水性面および疎水性面の間の移行部分またはその近傍のアミノ酸で、ペプチドに結合している、請求項４のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項６】
ホーミング分子に結合するペプチドのアミノ酸が、リジン、システイン、スレオニンおよびセリンからなる群より選択される、請求項５のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項７】
少なくとも１つのホーミング分子が、少なくとも１つの活性細胞表面受容体リガンドである、請求項２のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項８】
ｅ）少なくとも１つの活性剤をさらに含む、請求項１〜請求項７のいずれか１項のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項９】
ペプチドが、両親媒性αらせんの類似体である、請求項１〜請求項８のいずれか１項のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項１０】
ペプチドが、２Ｆ、４Ｆ、２Ｆの逆配列および４Ｆの逆配列からなる群より選択される、請求項９のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項１１】
ペプチドが、ＦＡＥＫＦＫＥＡＶＫＤＹＦＡＫＦＷＤ（−４Ｆ）のアミノ酸配列を含む、請求項１〜請求項１０のいずれか１項のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項１２】
リン脂質が、ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトールおよび前述のものの組み合わせからなる群より選択される、請求項８のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項１３】
ホスファチジルコリンが、ＤＭＰＣ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＰＯＰＣ（１−パルミトイル−１−オレオイル−ホスファチジルコリン）、ＥＹＰＣ（卵黄ホスファチジルコリン）および前述のものの組み合わせからなる群より選択される、請求項１２のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項１４】
ナノ足場が直径５〜５０ｎｍの間であるか、直径５〜４０ｎｍの間であるか、直径５〜３０ｎｍの間であるか、直径５〜２５ｎｍの間であるか、直径５〜２０ｎｍの間であるか、または直径１０〜１５ｎｍの間である、請求項８のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項１５】
少なくとも１つの活性剤が、オレイン酸コレステロール部分、ラウリン酸コレステリル部分、フィトール部分、ならびにオレイン酸部分および不飽和コレステロール−エステル部分からなる群より選択される少なくとも１つの脂質アンカーに結合している、請求項８のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項１６】
少なくとも１つの活性剤が、エステル結合によって、少なくとも１つの脂質アンカーに結合している、請求項１５のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項１７】
細胞表面受容体リガンドが、癌細胞において過剰発現される受容体のリガンドである、請求項８のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項１８】
細胞表面受容体リガンドが、心臓血管斑において過剰発現される受容体のリガンドである、請求項８のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項１９】
細胞表面受容体リガンドが、葉酸、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、インテグリン、ＥＧＦＲ、メタスチン、ＥｒｂＢ、ｃ−Ｋｉｔ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＸＲ４、ＣＣＲ７、エンドセリン−Ａ、ＰＰＡＲ−デルタ、ＰＤＧＦＲ  Ａ、ＢＡＧ−ｉ、およびＴＧＦベータからなる群より選択される受容体のリガンドである、請求項１７のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項２０】
ホーミング分子が、ペプチド、アプタマー、抗体および抗体断片からなる群より選択される、請求項８のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項２１】
細胞表面受容体リガンドが抗体断片であり、そしてＦａｂ領域を含む、請求項２０のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項２２】
活性剤が親油性化合物である、請求項８のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項２３】
親油性化合物が、アセトアニリド、アニリド、アミノキノリン、ベンズヒドリル化合物、ベンゾジアゼピン、ベンゾフラン、カンナビノイド、環状ペプチド、ジベンザゼピン、ジギタリスグリコシド、麦角アルカロイド、フラボノイド、イミダゾール、キノリン、マクロライド、ナフタレン、オピエート、オキサジン、オキサゾール、フェニルアルキルアミン、ピペリジン、ポリ環状芳香族炭化水素、ピロリジン、ピロリジノン、スチルベン、スルホニル尿素、スルホン、トリアゾール、トロパン、およびビンカアルカロイドからなる群より選択される、請求項２２のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項２４】
活性剤が、親油性および親水性構成要素を含む分子である、請求項８のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項２５】
活性剤が、診断剤、画像化剤または療法剤である、請求項８のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項２６】
活性剤が診断剤である、請求項２５のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項２７】
活性剤が療法剤である、請求項２５のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項２８】
１以上のトリアシルグリセロール、ステロール、ステロールエステル、またはその組み合わせをさらに含む、請求項１のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項２９】
ａ）少なくとも１つのリン脂質；
ｂ）少なくとも１つの不飽和脂質、ここで該不飽和脂質は不飽和ステロールエステル、不飽和コレステロールエステル、またはオレイン酸コレステリルであり；
ｃ）少なくとも１つの両親媒性αらせんを形成可能なアミノ酸配列を含む少なくとも１つのペプチドであって、ここで該ペプチドは６〜３０アミノ酸の間の長さであるか、８〜２８アミノ酸の間の長さであるか、１０〜２４アミノ酸の間の長さであるか、１１〜２２アミノ酸の間の長さであるか、１４〜２１アミノ酸の間の長さであるか、１６〜２０アミノ酸の間の長さであるか、または１８アミノ酸の長さである；および
ｄ）二本鎖ＲＮＡを含む少なくとも１つの活性剤
を含み、
ペプチド−リン脂質ナノ足場がターゲット細胞上のＳＲ−Ｂ１に結合し、前記ナノ微粒子がＳＲ−Ｂ１へ結合した後に、前記活性化剤が前記ターゲット細胞のサイトゾル中へ放出される、非天然存在ペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項３０】
二本鎖ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項２９のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項３１】
二本鎖ＲＮＡが、オレイン酸コレステロール部分、ラウリン酸コレステリル部分、フィトール部分、ならびにオレイン酸部分および不飽和コレステロール−エステル部分からなる群より選択される少なくとも１つの脂質アンカーに結合している、請求項３０のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項３２】
少なくとも１つのペプチドが天然存在アポタンパク質の断片ではない、請求項２９〜３１のいずれか一項のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項３３】
細胞表面受容体リガンドがＨＩＶ感染細胞において発現される受容体のリガンドである、請求項８のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項３４】
活性剤がｓｉＲＮＡである、請求項３３のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項３５】
疾患を防止するかまたは治療するための請求項２７のペプチド−脂質ナノ足場であって、該ペプチド−脂質ナノ足場が療法量で投与され、該疾患が、該療法剤で防止可能または治療可能である、前記ペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項３６】
疾患を防止するかまたは治療するために使用される請求項２７のペプチド−脂質ナノ足場であって、該疾患が該療法剤で防止可能または治療可能である、前記ペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項３７】
疾患を防止するかまたは治療するための薬剤調製における、請求項２７のペプチド−脂質ナノ足場の使用であって、該疾患が該療法剤で防止可能または治療可能である、前記使用。
【請求項３８】
被験体において疾患を診断するための請求項２６のペプチド−脂質ナノ足場であって、該ペプチド−脂質ナノ足場が被験体に投与される、前記ペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項３９】
被験体において疾患を診断するために使用される、請求項２６のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項４０】
ＳＲ−Ｂ１受容体の過剰発現と関連する疾患を防止するかまたは治療するための請求項１のペプチド−脂質ナノ足場であって、該ペプチド−脂質ナノ足場がさらに療法剤を含み、そして該疾患が該療法剤で防止可能または治療可能である、前記ペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項４１】
疾患が癌である、請求項４０のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項４２】
疾患が乳癌である、請求項４１のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項４３】
ＳＲ−Ｂ１受容体の発現と関連する疾患を防止するかまたは治療するために使用される請求項１のペプチド−脂質ナノ足場であって、該ペプチド−脂質ナノ足場がさらに療法剤を含み、そして該疾患が該療法剤で防止可能または治療可能である、前記ペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項４４】
ＳＲ−Ｂ１受容体の過剰発現と関連する疾患を防止するかまたは治療するための薬剤製造における、請求項１のペプチド−脂質ナノ足場の使用であって、該ペプチド−脂質ナノ足場がさらに療法剤を含み、そして該疾患が該療法剤で防止可能または治療可能である、前記使用。
【請求項４５】
疾患が癌である、請求項４３のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項４６】
疾患が乳癌である、請求項４５のペプチド−脂質ナノ足場。
【請求項４７】
疾患が癌である、請求項４４の使用。
【請求項４８】
疾患が乳癌である、請求項４７の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌および他の疾患の検出および治療のための活性剤のターゲティング化送達を可能にする、ペプチドを安定化させる極小ナノ粒子に基づく薬剤送達系に関する。活性剤は、ナノプラットフォームのコアまたは表面に位置してもよく、一方、細胞表面受容体リガンドは、ナノプラットフォームの表面に付着している。
【背景技術】
【０００２】
ナノプラットフォーム
ナノプラットフォームは、多機能診断および療法デバイスの多様なセットを生成する一般的なプラットフォームとして設計されたナノスケール構造である。こうしたナノスケールデバイスは、典型的には、１００ｎｍより小さい寸法を有し、そしてしたがってそのサイズは他の生物学的実体に匹敵する。これらはヒト細胞（ヒト細胞は直径１０，０００〜２０，０００ｎｍである）および細胞小器官より小さく、そしてそのサイズは酵素および受容体などの大きな生物学的巨大分子と類似である。ヘモグロビンは、例えば、直径およそ５ｎｍであり、一方、細胞を取り巻く脂質二重層は約６ｎｍ厚である。５０ｎｍより小さいナノスケールデバイスは、大部分の細胞に容易に進入可能であり、一方、２０ｎｍより小さいものは、血管の外に通過可能である（ＮＩＨ／ＮＣＩ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ  ０４−５４８９（２００４））。その結果、ナノデバイスは、しばしば、細胞表面上および細胞内の両方の生体分子の振る舞いおよび生化学的特性を改変しない方式で、これらの分子と容易に相互作用可能である。したがって、ナノデバイスは、基本的な生物学的経路およびプロセスを見て、そして操作する、完全にユニークな見晴らしのよい点を提供する。これまでに報告された多機能ナノプラットフォームの大部分は、デンドリマー（球状分枝ポリマー）（Ｑｕｉｎｔａｎａ，  Ａ．ら  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ．  ２００３  １２５（２６）：７８６０−５）、ポリマー性（Ｘｕ，  Η．，  Ａｙｌｏｔｔ，  Ｊ．Ｗ．およびＫｏｐｅｌｍａｎ，  Ｒ．  Ａｎａｌｙｓｔ．  ２００２  Ｎｏｖ；１２７（１１）：１４７１−７、Ｐａｎ，  Ｄ．，  Ｔｕｒｎｅｒ，  Ｊ．Ｌ．およびＷｏｏｌｅｙ，  Ｋ．Ｌ．  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，  ２４００−２４０１（２００３））およびセラミック（Ｋａｓｉｌｉ，  Ｐ．Ｍ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ．  ２００４  １２６（９）：２７９９−８０６、Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，  Ｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．  ２００２；２（２）：９７−８）ナノ粒子、パーフルオロカーボン・エマルジョン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｓ．Ａ．ら，  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  ２０００  Ｓｅｐ；４４（３）：４３３−９）ならびに架橋リポソーム（Ｈｏｏｄ，  Ｊ．Ｄ．ら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２００２；２９６（５５７７）：２４０４−７、Ｌｉ，  Ｌ．ら，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｐｈｙｓｉｃｓ．  ２００４  １５；５８（４）：１２１５−２７）などの合成ナノ構造で作製されている。
【０００３】
これらの合成ナノプラットフォーム設計の中の１つの一般的な懸念は、生体適合性の問題であり、これは短期および長期毒性と緊密に関連する。天然ナノ構造は、この生体適合性問題に対する解決法を提供しうる。しかし、天然存在ナノ構造で作製されるナノプラットフォームは稀である。
【０００４】
理想的なナノプラットフォームのいくつかの特徴は以下の通りである：１）均一なサイズ分布（＜１００ｎｍ）；２）大きなペイロード；３）高い結合アフィニティのための多価；４）モジュール方式および多官能性を介したプラットフォーム技術；５）安定でそして長い循環時間；ならびに６）生体適合性、生物分解性および非毒性。現存する合成ナノプラットフォームのいくつかはこれらの基準のいくつかを満たすが、これらのナノプラットフォーム設計の中の１つの一般的な懸念は生体適合性の問題であり、これは短期および長期毒性と緊密に関連する。天然ナノ構造は、この生体適合性問題に対する解決法を提供しうる。しかし、天然存在ナノ構造で作製されるナノプラットフォームは稀である。１つの例において、ササゲ（ｃｏｗｐｅａ）モザイクウイルスおよびフロックハウスウイルス由来の空のＲＮＡウイルス莢膜が、潜在的なナノデバイスとして働いた（Ｒａｊａ  Ｋ．  Ｓ．ら，  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００３；４（３）：４７２−６）。６０コピーのコートタンパク質が組み立てられて、機能するウイルス莢膜になり、該コートタンパク質が、ホーミング分子、例えばモノクローナル抗体または癌細胞特異的受容体アンタゴニスト、およびレポーター分子、例えば磁気共鳴画像（ＭＲＩ）造影剤を莢膜表面に付着させ、そして療法剤を莢膜内部に装填するのに使用可能な、広範囲の化学的官能性を提供することが前提である。ヒトの体は植物起源のウイルスには非常に耐性を示すが；不運なことに、これらのナノデバイスに関連する免疫学的影響は望ましくない。
【０００５】
別の例では、リポタンパク質ナノプラットフォームを、活性剤のターゲティング化送達に用いる（ＰＣＴ出願公報第ＷＯ  ２００６／０７３４１９号（公開日：２００６年７月１３日））。
【０００６】
ターゲティング化送達
特定の病変の影響は、しばしば、罹患したヒトの体全体に現れるが、一般的に、根底にある病変は、単一の臓器または組織のみに影響しうる。しかし、薬剤または他の治療が、疾患臓器または組織のみをターゲティングすることは稀である。より一般的には、治療は、例えば患者の体全体への全身毒性効果のため、望ましくない副作用を生じる。例えばターゲット臓器または組織と関連する疾患の治療のため、臓器または組織を選択的にターゲティングすることが望ましい。正常な組織に対して、体の癌性組織を選択的にターゲティングすることもまた望ましい。
【０００７】
大部分の療法物質は、循環を通じてターゲット臓器または組織に送達される。血管の内部表面を裏打ちする内皮は、ターゲット臓器または組織中を療法物質が循環することによって出会う最初の細胞種である。これらの細胞は、臓器または組織に、療法を選択的に導くためのターゲットを提供する。
【０００８】
内皮は、異なる組織において、別個の形態および生化学的マーカーを有しうる。リンパ系の血管は、例えば、リンパ球ホーミングを導くように働く多様な接着タンパク質を発現する。例えば、リンパ節中に存在する内皮細胞は、Ｌ−セレクチンに対するリガンドである細胞表面マーカーを発現し、そしてパイエル板細静脈中の内皮細胞は、α４β７インテグリンに対するリガンドを発現する。これらのリガンドは、それぞれのリンパ臓器への特定のリンパ球ホーミングに関与する。したがって、Ｌ−セレクチンまたはα４β７インテグリンに薬剤を連結すると、これらの分子がかなりの数の他の臓器または組織中に存在する類似のリガンドに結合しない限り、薬剤を、それぞれ、疾患リンパ節またはパイエル板にターゲティングするための手段が提供されうる。リンパ球循環のある観察によって、臓器および組織特異的内皮マーカーが存在することが示唆される。同様に、腫瘍細胞の特定のタイプの、特定の臓器または組織へのホーミングまたは転移によって、臓器および組織特異的マーカーが存在することが示唆される。
【０００９】
癌性組織を含む特定の組織へのターゲティング化送達は、非特異的な送達に関連する望ましくない副作用を排除するために必要である。
【００１０】
所望の組織を特異的にターゲティングする送達ビヒクルが緊急に必要とされることを認識して、本出願の発明者らは、多用途性であることから多様な適用に有用である、ペプチドを安定化させる極小ナノ粒子に基づくユニークな薬剤送達系を開発した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＰＣＴ出願公報第ＷＯ  ２００６／０７３４１９号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】ＮＩＨ／ＮＣＩ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  ＮＺＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ  ０４−５４８９（２００４）
【非特許文献２】Ｑｕｉｎｔａｎａ，  Ａ．ら  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ．  ２００３  １２５（２６）：７８６０−５
【非特許文献３】Ｘｕ，  Η．，  Ａｙｌｏｔｔ，  Ｊ．Ｗ．およびＫｏｐｅｌｍａｎ，  Ｒ．  Ａｎａｌｙｓｔ．  ２００２  Ｎｏｖ；  １２７（１１）：１４７１−７
【非特許文献４】Ｐａｎ，  Ｄ．，  Ｔｕｒｎｅｒ，  Ｊ．Ｌ．およびＷｏｏｌｅｙ，  Ｋ．Ｌ．  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，  ２４００−２４０１（２００３）
【非特許文献５】Ｋａｓｉｌｉ，  Ｐ．Ｍ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ．  ２００４  １２６（９）：２７９９−８０６
【非特許文献６】Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，  Ｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．  ２００２；２（２）：９７−８
【非特許文献７】Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｓ．Ａ．ら，  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  ２０００  Ｓｅｐ；４４（３）：４３３−９
【非特許文献８】Ｈｏｏｄ，  Ｊ．Ｄ．ら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２００２；２９６（５５７７）：２４０４−７
【非特許文献９】Ｌｉ，  Ｌ．ら，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｐｈｙｓｉｃｓ．  ２００４  １５；５８（４）：１２１５−２７
【非特許文献１０】Ｒａｊａ  Ｋ．  Ｓ．ら，  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００３；  ４（３）：４７２−６
【発明の概要】
【００１３】
１つの側面にしたがって、少なくとも１つのリン脂質、少なくとも１つの不飽和脂質（好ましくは不飽和ステロールエステル、さらに好ましくは不飽和コレステロールエステル、さらに好ましくはオレイン酸コレステリル）、および少なくとも１つの両親媒性αらせんを形成可能なアミノ酸配列を含む、少なくとも１つのペプチドを含み；前述の構成要素が会合して、ペプチド−リン脂質ナノ足場（ｎａｎｏ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）を形成する、非天然存在ペプチド−脂質ナノ足場を提供する。特定の態様において、ペプチドは、クラスＡ、Ｈ、ＬおよびＭ両親媒性αらせん、その断片、ならびにクラスＡ、Ｈ、ＬおよびＭ両親媒性αらせんまたはその断片の逆ペプチド配列を含むペプチドからなる群より選択される。
【００１４】
好ましくは、ペプチド−脂質ナノ足場は、少なくとも１つのホーミング分子をさらに含む。１つの側面において、ホーミング分子は、少なくとも１つのペプチドに（好ましくは、アミノ酸、特にリジンで、あるいは両親媒性αらせんの親水性面および疎水性面の間の移行部分またはその近傍のアミノ酸で）および少なくとも１つの脂質の１つに、共有結合していてもよい。別の側面において、ペプチド−脂質ナノ足場は、少なくとも１つの活性剤を含む。
【００１５】
１つの側面において、少なくとも１つのホーミング分子は、少なくとも１つの活性細胞表面受容体リガンドである。
【００１６】
さらなる側面にしたがって、本明細書に記載する非天然存在ペプチド−脂質を含む薬学的配合物を提供する。
【００１７】
さらなる側面にしたがって、本明細書に記載する非天然存在ペプチド−脂質ナノ足場を作製する方法であって、ペプチド−脂質ナノ足場を形成するのに適した条件下で、その構成要素を合わせる工程を含む、前記方法を提供する。
【００１８】
さらなる側面にしたがって、少なくとも１つのリン脂質、少なくとも１つの不飽和ステロールエステル（好ましくは不飽和コレステロールエステル、さらに好ましくはオレイン酸コレステリル）、少なくとも１つのペプチド、少なくとも１つのホーミング分子、および二本鎖ＲＮＡを含む少なくとも１つの活性剤を含み；活性細胞表面受容体リガンドが、少なくとも１つのペプチドに共有結合し、そして前述の構成要素が会合してペプチド−リン脂質ナノ足場を形成する、非天然存在ペプチド−脂質ナノ足場を提供する。１つの側面において、二本鎖ＲＮＡはｓｉＲＮＡである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ペプチドを安定化させる極小ナノ粒子に基づく本発明の薬剤送達系の態様の概略図。
【図２】診断および／または療法的適用のため、ＨＰＰＳナノ粒子内に取り込まれるために用いられる化合物。
【図３】ＥＧＦｐ−（ＤｉＲ−ＢＯＡ）−ＨＰＰＳ（１型ＥＧＦＲターゲティング化ＨＰＰＳ）の調製のための合成プロトコル。
【図４】（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ（２型ＥＧＦＲターゲティング化ＨＰＰＳ）の調製のための合成プロトコル。
【図５】非ターゲティング化ＤｉＲ−ＢＯＡ装填ＨＰＰＳのＦＰＬＣ、ＤＬＳおよびＣＤ。
【図６】ＥＧＦｐ（ＤＩＲ−ＢＯＡ）−ＨＰＰＳのＦＰＬＣプロフィールおよびＴＥＭ。
【図７】ＨＰＰＳサイズに対するＤｉＲ−ＢＯＡ装填の影響。Ａ：調製＃１および＃２のＦＰＬＣプロフィール；  Ｂ：  ＦＰＬＣから収集された分画。Ｃ：  ＨＰＰＳサイズおよびカーゴ・ペイロードの間の相関（Ｒ＝０．９１）。
【図８】４Ｆおよび−４Ｆで形成される（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの（ａ）ＦＰＬＣプロフィールおよび（ｂ）ＴＥＭ。
【図９】ＥＧＦｐ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）−ＨＰＰＳの共焦点画像化研究。
【図１０】フローサイトメトリーによるＥＧＦｐ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）−ＨＰＰＳの時間依存性取り込み。
【図１１】ＥＧＦｐ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの阻害研究。
【図１２】ＥＧＦｐ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）−ＨＰＰＳのｉｎ  ｖｉｖｏ画像化研究。
【図１３】フローサイトメトリーによるＡ５４９対Ｈ５２０細胞におけるＥＧＦｐ−脂質（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの時間依存性取り込み。
【図１４】異なるレベルのＥＧＦＲ発現を伴う細胞株における、ＥＧＦｐ−脂質（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの時間依存性取り込みのフローサイトメトリー研究。
【図１５】ＥＧＦｐによるＥＧＦｐ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳおよびＥＧＦｐ−脂質（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの取り込み阻害のフローサイトメトリー研究。
【図１６】ＭＴＴおよびフローサイトメトリーによって研究したＥＧＦｐ−脂質（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの予備的毒性研究。ａ）ＨＰＰＳ対照（すべての先のｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究で用いられる標準的用量）の６倍であっても毒性がないことを示す、ＭＴＴアッセイによる細胞生存度；ｂ）ＨＰＰＳ対照の６倍で毒性がないことを示す、フローサイトメトリーによって研究された細胞生存度；ｃ）ＨＰＰＳ対照（標準的用量）の２倍で取り込み飽和を示す、フローサイトメトリーによって研究されたＨＰＰＳ細胞取り込み。
【図１７】ＥＧＦｐ−脂質（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ（ｉ．ｖ．）でのＭＴ１腫瘍異種移植片のｉｎ  ｖｉｖｏ画像化。矢印は腫瘍を示す。
【図１８】ＥＧＦＲターゲティング特異性を立証する、ヒト肺原発性腫瘍異種移植片を持つマウスにおける、ＥＧＦｐ−脂質（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳのｉｎ  ｖｉｖｏ画像化。
【図１９】ＫＢ（葉酸受容体陽性）およびＨＴ１０８０（葉酸受容体陰性）癌細胞における、葉酸受容体ターゲティング化ＨＰＰＳを用いた共焦点画像化研究。注：緑色はＤｉＲ−ＢＯＡ蛍光由来であり、そして青色はＤＡＰＩ核染色由来である。
【図２０】多構成要素蛍光標識。ＨＰＰＳ粒子の各構成要素（ペプチド、リン脂質、コア・カーゴ）を、詳細な粒子性質決定および粒子分解の評価のため、蛍光標識でタグ化してもよい。
【図２１】（ａ）ｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１）およびＬｄＬＡ７細胞のＳＲ−Ｂ１受容体含量のウェスタンブロット分析。  （ｂ）ＳＲ−Ｂ１受容体の（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの特異性。共焦点画像は、ＳＲ−Ｂ１陽性細胞（ｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１））においては（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの強い取り込みがあるが、ＳＲ−Ｂ１陰性細胞（ＬＤＬＡ７）にはないことを示す。さらに、過剰なＨＤＬは、ｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１）細胞において（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳを効果的に阻害するが、ＬＤＬＡ７における取り込みには影響がない。
【図２２】ＦＩＴＣ−脂質（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳおよびＦＩＴＣ−（−４Ｆ）（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳおよびｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１）細胞を用いた共焦点画像化研究。
【図２３】ＦＩＴＣ−（−４Ｆ）（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳおよびｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１）細胞を用いた共焦点画像化研究。
【図２４】フローサイトメトリー研究を用いて、ＳＲ−Ｂ１＋およびＳＲ−Ｂ１−細胞株における（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ取り込みを評価した。
【図２５】フローサイトメトリー研究を用いて、ＳＲ−Ｂ１＋細胞株における（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの濃度依存性取り込みを評価した。
【図２６】フローサイトメトリー研究を用いて、ＳＲ−Ｂ１＋細胞株における（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ取り込みのＨＤＬ濃度依存性阻害を評価した。
【図２７】フローサイトメトリー研究を用いて、ＳＲ−Ｂ１＋およびＳＲ−Ｂ１−細胞株における（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの示差取り込み、ならびにＳＲ−Ｂ１＋細胞株におけるＨＤＬによる（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ取り込みの阻害を評価した。
【図２８】フローサイトメトリーを用いて、ｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１）細胞による、（−４Ｆ）（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ対（４Ｆ）（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの取り込みを評価した。
【図２９】ヒトＫＢ（ＳＲ−ＢＩ＋）腫瘍異種移植片を所持するヌードマウスに対して、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化を実行して、−４Ｆ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの局在を研究した。
【図３０】（ａ）共焦点研究を実行して、Ａ５４９およびＨ５２０細胞における、（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳおよび（−４Ｆ）（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの示差取り込みを評価した。  （ｂ）Ａ５４９およびＨ５２０細胞の表面受容体プロフィールのウェスタンブロット分析。
【図３１】フローサイトメトリーを用いて、Ｈ５２０、Ａ５４９およびＥＧＦＲ−ＧＦＰ−Ａ５４９細胞による（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳおよびＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ（１．０μＭ）の取り込みを評価した。
【図３２】ＥＧＦＲ−緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の融合遺伝子でトランスフェクションしたＬＤＬＡ７細胞において、ＥＧＦ−ＨＰＰＳ研究を行った。この実験は、ＥＧＦ−ＨＰＰＳの細胞取り込みにＳＲ−Ｂ１が行いうるいかなる寄与も除去する。（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳと３時間インキュベーションした後、ＥＧＦＲ−ＧＦＰ−ＬＤＬＡ７細胞は、サイトゾル内にＤｉＲ−ＢＯＡの強いシグナルを示し、ＥＧＦＲを通じたＥＧＦ−ＨＰＰＳの貪欲な取り込みが示された。ＥＧＦＲのＧＦＰシグナルは、外部形質膜上で視覚化された。
【図３３】共焦点研究を実行して、ＥＧＦＲ−ＧＦＰ−ＬＤＬＡ７細胞における、（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの取り込みに対するＨＤＬの影響を評価した。
【図３４】ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳとインキュベーションしたＥＧＦＲ−ＧＦＰ−Ａ５４９およびＨ５２０細胞の共焦点画像化。
【図３５】共焦点研究を行って、Ａ５４９およびＨ５２０細胞における（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの取り込みに対するＨＤＬの影響を評価した。
【図３６】二重腫瘍（Ａ５４９およびＨ５２０）を所持するヌードマウスに対して、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化を行って、（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳのターゲティング能を決定した。
【図３７】（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳのｉｎ  ｖｉｖｏ検証。ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化（Ａ）および生体分布（Ｂ）によって、ＨＰＰＳの改善された送達特異性および有効性が示される。Ｃ）ＨＰＰＳは、ＨＤＬの長い循環時間（ｔ１／２〜１４時間）にマッチする。Ｄ）腫瘍組織におけるＨＰＰＳ蛍光シグナル（ＤｉＲＢＯＡ）の集積は、腫瘍細胞蛍光（赤色蛍光タンパク質でトランスフェクションされる）とマッチする。
【図３８】ＫＢ腫瘍およびＨ５２０腫瘍における（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの細胞性取り込み。白色バーは組織ｍｇあたりの蛍光単位を示し、そして黒色バーは百万細胞あたりの蛍光単位を示す。データは、２匹の腫瘍所持マウスからの平均を反映する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
図１は、本発明の態様を示す。具体的には、図１は、癌および他の疾患の検出および治療のための活性剤のターゲティング化送達を可能にする、ペプチドを安定化させる極小ナノ粒子に基づく、「ＨＰＰＳ」（高密度リポタンパク質様ペプチド−リン脂質足場）と呼ばれる薬剤送達系を例示する。ＨＰＰＳナノ粒子は、３つの構成要素：１）極小ナノキャリア（５〜２５ｎｍ）を形成する特異的両親媒性サイズ制御ペプチド（ｓｃＰｅｐ）およびリン脂質、２）ナノキャリア上のｓｃＰｅｐに直接コンジュゲート化され、ナノキャリアの表面リン脂質にコンジュゲート化されていてもよい、疾患特異的ターゲティングリガンド、あるいはｓｃＰｅｐまたはリン脂質にコンジュゲート化されることなく、ナノキャリア内に取り込まれていてもよい、タンパク質またはその断片などの疾患特異的ターゲティングリガンド（図１には示されていない）、および３）ナノキャリアコア内に装填されるか、またはナノキャリア表面上にディスプレイされるようにナノキャリア内に取り込まれている、診断剤または療法剤を含む。好ましい球状ナノ粒子を形成するため、不飽和ステロールエステルもまたこれらと組み合わせる。ペプチド表面上に曝露された、Ｌｙｓ残基などのコンジュゲート化可能アミノ酸に、腫瘍ホーミング分子（例えば葉酸）などの特定のターゲティングリガンドをコンジュゲート化することによって、多様なターゲティングを達成可能である。したがって、ＨＰＰＳナノ粒子は、癌および／または特定の組織の所望の細胞表面マーカー、すなわち癌細胞または組織の多様なタイプで選択的に過剰発現されている分子に向けられる。特定の態様において、ＨＰＰＳナノ粒子は、限定されるわけではないが、診断剤、画像化剤および／または療法剤を含む活性剤のターゲティング化送達を提供する。
【００２１】
こうした剤には、限定されるわけではないが、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）剤、近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）プローブおよび光線力学療法（ＰＤＴ）剤が含まれる。
【００２２】
特定の態様において、ＨＰＰＳ脂質コア内部のコレステロールエステルは、親油性剤と交換される。さらなる態様において、活性剤は、本発明のＨＰＰＳナノ粒子の表面に付着される。
【００２３】
したがって、ターゲット細胞中のＭＲＩ／ＮＩＲＦプローブの集積は、ＭＲＩ／ＮＩＲＦ検出可能シグナルの増幅のための容易な機構を提供し、そしてＭＲＩ（高解像度／解剖学的）およびＮＩＲＦ（高感度）の両方の力を組み合わせる機会を提供する一方、これらの経路を介した、腫瘍へのＰＤＴ剤の選択的送達もまた、検出および治療の間の容易な移行を提供する。最後に、ＨＰＰＳナノ粒子は、免疫原性であるとは予期されず、そして細網内皮系による認識を回避するはずであり、したがってＨＰＰＳプラットフォームは、大部分の合成ナノデバイスに関連する一般的な問題、すなわち生体適合性および毒性に対する解決策を提供する。
【００２４】
用語「ナノ粒子」、「ナノプラットフォーム」および「ナノ足場」は、本明細書において、交換可能に用いられる。
【００２５】
本発明は、ホスファチジルコリン（例えばＤＭＰＣ（好ましくは１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＰＯＰＣ（１−パルミトイル−１−オレオイル−ホスファチジルコリン）およびＥＹＰＣ（卵黄ホスファチジルコリン））、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジル−エタノールアミン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジルイノシトールなどの脂質を含むＨＰＰＳナノ粒子を提供する。
【００２６】
天然存在リポタンパク質粒子は、各々、特徴的なアポタンパク質、ならびにある割合のタンパク質、トリアシルグリセロール、リン脂質およびコレステロールを有する。ＶＬＤＬ粒子は、約１０％のタンパク質、約６０％のトリアシルグリセロール、約１８％のリン脂質および約１５％のコレステロールを含有してもよい。ＬＤＬ粒子は、約２５％のタンパク質、約１０％のトリアシルグリセロール、約２２％のリン脂質および約４５％のコレステロールを含有してもよい。ＨＤＬ粒子は、約５０％のタンパク質、約３％のトリアシルグリセロール、約３０％のリン脂質および約１８％のコレステロールを含有してもよい。同様に、本発明のＨＰＰＳナノ粒子は、異なる割合の上記構成要素を含有する。ＨＰＰＳナノ粒子はまた、１以上のトリアシルグリセロールも含有してもよい。ＨＰＰＳナノ粒子は、さらに、ステロール、ステロールエステル、またはその組み合わせを含有してもよい。他の態様において、ステロールまたはステロールエステルは、コレステロール、オレイン酸コレステロールおよび不飽和コレステロールエステルからなる群より選択される。
【００２７】
特定の態様において、本発明のＨＰＰＳナノ粒子は、癌細胞において過剰発現される受容体をターゲティングする、細胞表面受容体リガンドを含有する。他の態様において、本発明のＨＰＰＳナノ粒子は、心臓血管斑において過剰発現される受容体に対するリガンドである細胞表面受容体リガンドを含有する。
【００２８】
さらなる態様において、本発明のＨＰＰＳナノ粒子は、特定の組織上の受容体をターゲティングする細胞表面受容体リガンドを含有する。
【００２９】
特定の態様において、本発明のＨＰＰＳナノ粒子は、ＨＰＰＳナノ粒子のコア中の親油性化合物を含有する。
【００３０】
特定の態様において、本発明のＨＰＰＳナノ粒子は、ＨＰＰＳナノ粒子の表面上に（部分的に）位置する親油性および親水性構成要素を含む分子である活性剤を含有する。
【００３１】
特定の態様において、本発明のＨＰＰＳナノ粒子は、診断剤、画像化剤または療法剤である活性剤を含有する。好ましくは、画像化剤または診断剤は、造影剤、放射性標識および／または蛍光標識である。
【００３２】
特定の態様において、本発明のＨＰＰＳナノ粒子は抗癌剤を含有する。こうした活性剤は、化学療法剤、光線力学的療法剤、ホウ素中性子捕獲療法剤または放射線療法用の放射性核種であってもよい。態様において、抗癌剤は、アルキル化剤、アントラサイクリン、抗生物質、アロマターゼ阻害剤、ビスホスホネート、シクロ−オキシゲナーゼ阻害剤、エストロゲン受容体調節剤、葉酸アンタゴニスト、無機ヒ酸塩、微小管阻害剤、修飾剤、ニトロソ尿素、ヌクレオシド類似体、破骨細胞阻害剤、白金含有化合物、レチノイド、トポイソメラーゼ１阻害剤、キナーゼ阻害剤（例えば限定されるわけではないが、チロシンキナーゼ阻害剤）、抗血管形成剤、上皮増殖因子阻害剤およびヒストン脱アセチル化酵素阻害剤からなる群より選択される。
【００３３】
さらなる態様において、本発明のＨＰＰＳナノ粒子は、抗緑内障薬剤、抗血餅剤、抗炎症薬剤、抗喘息剤、抗生物質、抗真菌または抗ウイルス薬剤からなる群より選択される療法剤を含有する。
【００３４】
さらなる態様において、本発明のＨＰＰＳナノ粒子は、限定されるわけではないが、鎮痛剤、麻酔剤、抗狭心症剤、抗関節炎剤、抗不整脈剤、抗喘息剤、抗細菌剤、抗ＢＰＨ剤、抗癌剤、抗コリン剤、抗凝固剤、抗痙攣剤、抗鬱剤、抗糖尿病剤、止痢剤、抗癲癇剤、抗真菌剤、抗痛風剤、抗蠕虫剤、抗ヒスタミン剤、抗高血圧剤、抗炎症剤、抗マラリア剤、抗偏頭痛剤、抗ムスカリン剤、制嘔吐剤、抗新生物剤、抗肥満剤、抗骨粗鬆剤、抗パーキンソン病剤、抗原生動物剤、抗掻痒剤、抗精神病剤、解熱剤、鎮痙剤、抗甲状腺剤、抗結核剤、鎮咳剤、抗潰瘍剤、抗尿失禁剤、抗ウイルス剤、抗不安剤、食欲抑制剤、注意欠陥障害（ＡＤＤ）および注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）薬剤、カルシウムチャネルブロッカー、心臓変力剤、ベータ−ブロッカー、細胞接着阻害剤、中枢神経系刺激剤、認知増進剤、コルチコステロイド、ＣＯＸ−２阻害剤、サイトカイン受容体活性調節剤、鬱血除去剤、利尿剤、勃起不全改善剤、必須脂肪酸、胃腸剤、遺伝物質、ヒスタミン受容体アンタゴニスト、抗ホルモン剤（ｈｏｒｍｏｎｏｌｙｔｉｃｓ）、催眠剤、血糖降下剤、免疫抑制剤、角質溶解剤、ロイコトリエン阻害剤、脂質制御剤、マクロライド、有糸分裂阻害剤、筋弛緩剤、麻薬アンタゴニスト、神経遮断剤、ニコチン、硝酸塩、非必須脂肪酸、非ステロイド抗喘息剤、栄養油、オピオイド鎮痛剤、副交感神経遮断剤、鎮静剤、性ホルモン、刺激剤、交感神経模倣剤、精神安定剤、血管拡張剤、ビタミン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される療法剤を含有する。
【００３５】
本発明はまた、本発明のＨＰＰＳナノ粒子を含む薬学的配合物も提供する。
【００３６】
本発明はさらに、ＨＰＰＳナノ粒子を作製する方法を提供する。
【００３７】
リポタンパク質粒子
リポタンパク質粒子は、天然存在ナノ構造の一種である。コレステロールおよびトリアシルグリセロールは、リポタンパク質粒子の形で、体液中で、輸送される。各粒子は、さらなる極性脂質およびタンパク質のシェルによって囲まれた、疎水性脂質のコアからなる。これらの巨大分子凝集物のタンパク質構成要素は、２つの役割を有する：これらは疎水性脂質を可溶化し、そして細胞ターゲティングシグナルを含有する。リポタンパク質粒子は、密度増加にしたがって分類される：カイロミクロン、カイロミクロンレムナント、極低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）（表１を参照されたい）。したがって、これらは各々、サイズが異なり、そしてこれらの大部分は、カイロミクロンおよびカイロミクロンレムナントを例外として、ナノ構造（＜１００ｎｍ）を有する。
【００３８】
表１．リポタンパク質のサイズおよびクラス
【００３９】
【表１】
0005658568.tif 000002
【００４０】
低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）粒子
ＬＤＬは、ヒト血漿中のコレステロールの主なキャリアであり、そしてＬＤＬＲ（低密度リポタンパク質受容体）を介したエンドサイトーシスによって、外因性コレステロールを細胞に送達する。ＬＤＬ粒子は、典型的には〜２２ｎｍの直径を持つ天然存在ナノ構造である。該粒子は、約１５００のエステル化コレステロール分子およびトリグリセリドの脂質コアを含有する。リン脂質および非エステル化コレステロールのシェルがこの非常に疎水性のコアを取り巻く。シェルはまた、ＬＤＬＲによって認識されるアポＢ−１００（分子量５５０ｋＤａ）の単一コピーも含有する。
【００４１】
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）粒子
血漿ＨＤＬは、小さな球状の高密度リポタンパク質複合体であり、およそ半分が脂質であり、そして半分がタンパク質である。脂質構成要素は、リン脂質、遊離コレステロール、コレステリルエステル、およびトリグリセリドからなる。タンパク質構成要素には、アポＡ−Ｉ（分子量、２８，０００ダルトン）およびアポＡ−ＩＩ（分子量１７，０００ダルトン）が含まれる。他の少ないが重要なタンパク質は、アポＥ、ならびにアポＣ−Ｉ、アポＣ−ＩＩ、およびアポＣ−ＩＩＩを含む、アポＣである。
【００４２】
ＨＤＬ粒子は不均質である。これらは、より大きくより低密度のＨＤＬ２またはより小さいより高密度のＨＤＬ３と分類可能である。通常、血漿ＨＤＬの大部分はＨＤＬ３に見られる。ＨＤＬは、粒子あたり４つのアポリポタンパク質で構成される。ＨＤＬは、アポＡ−ＩおよびアポＡ−ＩＩの両方で、またはアポＡ−Ｉのみで構成されてもよい。ＨＤＬ２は主にアポＡ−Ｉのみであり、そしてＨＤＬ３はアポＡ−ＩおよびアポＡ−ＩＩの両方で作製される。ＨＤＬ２より低密度のＨＤＬ粒子にはアポＥが豊富である。
【００４３】
ＨＰＰＳナノ粒子
したがって、本発明は、多様な異なるペプチド足場から作製可能な、異なるサイズの一連のナノプラットフォームを提供する。ＨＰＰＳナノ粒子の産生に適したペプチド構成要素を以下に記載する。
【００４４】
ＨＰＰＳナノ粒子は、多様な受容体にターゲティング化可能である。さらに、特定の態様において、ＨＰＰＳ疎水性コアおよびリン脂質単層の両方を修飾して、診断剤および／または療法剤の多量のペイロードを運搬させて、非常に優れた多機能ナノプラットフォームとすることも可能である。特定の態様において、本発明のＨＰＰＳナノ粒子は、１以上のホーミング分子を含有する。ＨＰＰＳナノ粒子はまた、１以上の活性剤のペイロードを運搬してもよい。ＨＰＰＳナノ粒子はまた、細胞死センサーも含有してもよく、したがってこうしたＨＰＰＳナノ粒子は、診断、治療ならびに療法応答監視機能を同時に実行可能である。
【００４５】
本発明は、以下に記載するような特定の特性を有する、ペプチドに基づく非天然存在ナノプラットフォームを提供する。用語「非天然存在」は、ヒト体内に生得的には存在しないナノプラットフォームを指す。こうした非天然存在ＨＰＰＳナノ粒子は、天然存在リポタンパク質粒子の１以上の構成要素を含有してもよい。例えば、天然存在ＬＤＬおよびＨＤＬ粒子のコア中に存在するコレステロールエステルを、活性剤と交換してもよい。同様に、天然存在リポタンパク質粒子中で見られるようなコアは、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）ままでもよく、活性剤をＨＰＰＳナノ粒子表面に付着させる。
【００４６】
いくつかの態様において、ターゲティング化送達にＨＰＰＳナノ粒子を用いるといくつかの別個の利点がある。いくつかの態様において、本発明のＨＰＰＳナノ粒子の１つの利点は、これらが宿主免疫系と完全に適合すると予期され、そしてこれらがまた生体分解性であることである。これらはまた、受容体が仲介するエンドサイトーシスを利用する、ターゲット細胞への多量の診断剤または療法剤の集積のためのリサイクリング系も提供する。本発明のＨＰＰＳナノ粒子は、免疫原性であるとは予期されず、そして細網内皮系（ＲＥＳ）による認識を回避するはずである。
【００４７】
他の利点には：１）本発明のＨＰＰＳナノ粒子は、理想的なサイズ範囲を有する点で、生理学的キャリアーに対して類似点を所持し、このサイズは、腎クリアランスを回避するのに十分に大きいが、細網内皮系（ＲＥＳ）取り込みを軽減するのに十分に小さく、したがって、薬剤／プローブの血清半減期は、これらのナノ粒子内への取り込みによって延長されうる；２）脂質コア空間における薬剤／プローブ隔絶は、血清酵素および水からの保護を提供する；３）ＨＰＰＳナノ粒子のアレイが入手可能であることから、５ｎｍ〜８０ｎｍのサイズ範囲の一連のナノプラットフォームが提供される。
【００４８】
好ましくは、本発明の非天然存在ＨＰＰＳナノ粒子は、（増加する好ましさで）直径５ｎｍ〜５０ｎｍ、直径５ｎｍ〜４０ｎｍ、直径５ｎｍ〜３０ｎｍ、直径５ｎｍ〜２５ｎｍ、直径５ｎｍ〜２０ｎｍ、および直径１０ｎｍ〜１５ｎｍである。
【００４９】
ＨＰＰＳナノ粒子の出発物質はまた、例えば粒子の外層上にある、少なくとも１つの脂質も含有する。本発明のＨＰＰＳナノ粒子で有用な脂質には、限定されるわけではないが、両親媒性脂質が含まれる。本発明で有用なリン脂質には、限定されるわけではないが、ホスファチジルコリン（好ましくはＤＭＰＣ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＰＯＰＣ（１−パルミトイル−１−オレオイル−ホスファチジルコリン）およびＥＹＰＣ（卵黄ホスファチジルコリン））、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトールおよび前述のものの組み合わせが含まれる。
【００５０】
足場ペプチド
ＨＰＰＳナノ粒子を形成する際に使用するのに適した足場ペプチドは、少なくとも１つの両親媒性αらせんを形成可能なアミノ酸配列を含む。
【００５１】
好ましい態様において、両親媒性αらせんまたはペプチドは、（増加する好ましさで）６〜３０アミノ酸、８〜２８アミノ酸、１０〜２４アミノ酸、１１〜２２アミノ酸、４〜２１アミノ酸、１６〜２０アミノ酸および１８アミノ酸の範囲の長さである。
【００５２】
推定上の両親媒性らせん構造を持つタンパク質ドメインを検出し、そして性質決定するための方法が、その内容が本明細書に援用される、Ｓｅｇｒｅｓｔ，  Ｊ．  Ｐ．ら    ＰＲＯＴＥＩＮＳ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９０）  ８：１０３−１１７中に示される。Ｓｅｇｒｅｓｔらは７つの異なるクラスの両親媒性らせんを同定し、そして各クラスと関連するペプチド／タンパク質を同定した。７つの異なるクラスの内、４つの脂質会合両親媒性らせんクラス（Ａ、Ｈ、Ｌ、およびＭ）がある。これらのうち、クラスＡはアポリポタンパク質クラスと称され、リン脂質に基づく粒子を形成するのに最適な特性を所持する。
【００５３】
クラスＡ、Ｈ、ＬおよびＭ  αらせんまたはその断片からなる群より、適切な足場ペプチドを選択してもよい。適切な足場ペプチドはまた、クラスＡ、Ｈ、ＬおよびＭ両親媒性αらせんまたはその断片の逆ペプチド配列も含んでもよく、これは、両親媒性αらせんを形成する特性が、ペプチド配列内のアミノ酸残基の相対的な位置によって決定されるためである。
【００５４】
１つの態様において、足場ペプチドは、好ましくはアポＢ−１００、アポＢ−４８、アポＣ、アポＥおよびアポＡからなる群より選択されるアポタンパク質の連続アミノ酸を含む、アミノ酸配列を有する。
【００５５】
本発明で用いられる「アミノ酸」、ならびに明細書および請求項で用いられるようなこの用語には、一般的な三文字略語および一文字略語によって称される、既知の天然存在タンパク質アミノ酸が含まれる。一般的には、１１〜２４ページに示される本文および表を含めて、本明細書にその解説が援用される、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，  Ｇ  Ａ  Ｇｒａｎｔ監修，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９２を参照されたい。上述のように、用語「アミノ酸」にはまた、天然存在タンパク質アミノ酸の立体異性体および修飾、非タンパク質アミノ酸、翻訳後修飾アミノ酸、酵素的に合成されたアミノ酸、誘導体化アミノ酸、アミノ酸を模倣するように設計された構築物または構造等も含まれる。修飾されたおよび普通でないアミノ酸は、そのすべての解説が本明細書に援用される、上記に引用するＳｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ；  Ｈｒｕｂｙ  Ｖ  Ｊ，  Ａｌ−ｏｂｅｉｄｉ  ＦおよびＫａｚｍｉｅｒｓｋｉ  Ｗ：  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２６８：２４９−２６２，１９９０；ならびにＴｏｎｉｏｌｏ  Ｃ：  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ  ３５：２８７−３００，１９９０に一般的に記載される。
【００５６】
「アルファらせん」は、本明細書において、タンパク質の二次構造中の一般的なモチーフを指す。アルファらせん（αらせん）は、コイルを巻いた、バネに似たコンホメーションであり、この中で、すべての主鎖Ｎ−Ｈ基は、４残基前のアミノ酸の主鎖Ｃ＝Ｏ基に水素結合を与える。典型的には、天然存在アミノ酸から作製されるアルファらせんは右巻きであるが、左巻きコンホメーションもまた知られる。
【００５７】
「両親媒性」は、親水性および疎水性特性の両方を所持する化学的化合物を記述する用語である。両親媒性アルファらせんは、生物学的活性ペプチドおよびタンパク質にしばしば見られる二次構造モチーフであり、そしてらせんの長軸に沿って配向される、向かい合った極性面および非極性面を含むアルファらせんを指す。
【００５８】
アポＡ〜Ｉの脂質結合特性の多くを所持する小さい両親媒性らせんペプチドの例には、２つのフェニルアラニンアミノ酸残基を含む１８アミノ酸ペプチド配列である２Ｆが含まれる（Ｄ−Ｗ−Ｌ−Ｋ−Ａ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｋ−Ｖ−Ａ−Ｅ−Ｋ−Ｌ−Ｋ−Ｅ−Ａ−Ｆ）（配列番号１）（Ａｎａｎｔｈａａｒａｍａｉａｈら  ＪＢＣ．  １９８５；  ２６０：１０２４８−１０２５５）。各研究は、この配列が強い脂質会合を示し、そして安定な円盤状のリン脂質粒子を形成可能であることを示した。続いて、２つのさらなるＦ残基を取り込むと（全部で４Ｆ；  Ｄ−Ｗ−Ｆ−Ｋ−Ａ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｋ−Ｖ−Ａ−Ｅ−Ｋ−Ｆ−Ｋ−Ｅ−Ａ−Ｆ）（配列番号２）、ペプチドの脂質会合特性がさらに増進することを示す実験が行われた（Ａｎａｎｔｈａａｒａｍａｉａｈら  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．  ２００５；  ２５：１３２５−１３３１）。
【００５９】
ホーミング分子
本明細書において、用語「ホーミングする」または「選択的にホーミングする」は、特定の分子が、被験体への投与後、特定の臓器または組織中に存在する分子に、比較的特異的に結合することを意味する。一般的に、選択的ホーミングは、部分的に、対照臓器または組織と比較した際、臓器または組織への分子の少なくとも２倍大きい選択的結合が検出されることによって特徴付けられる。特定の態様において、選択的結合は、対照臓器または組織に比較した際、少なくとも３倍または４倍大きい。
【００６０】
腫瘍ホーミング分子の場合、こうした分子は、特定の癌組織中に選択的に過剰発現される受容体に結合する。過剰発現によって、正常な組織に比較して腫瘍組織において、少なくとも１．５倍高発現であることを意味する。態様において、発現は、非腫瘍に比較した際、腫瘍において少なくとも５倍高い。
【００６１】
本発明の態様において、ホーミング分子は、本発明のＨＰＰＳナノ粒子のペプチドに付着し、これが特定の組織および腫瘍をターゲティングする。「ホーミング分子」は、本発明の組成物とともにｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで組織および／または受容体のターゲティングを促進可能な任意の材料または物質を指す。ターゲティング部分は、合成、半合成、または天然存在であってもよい。ターゲティング部分は、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、または他の有機分子であってもよい。１つの態様において、ターゲティング部分は、細胞表面受容体に対する内因性リガンド（またはその部分）であってもよい。ターゲティング部分は、抗体であってもよい（この用語は、結合領域または超可変領域を保持する抗体断片および一本鎖抗体を含む）。ターゲティング部分として働きうる材料または物質には、限定されるわけではないが、表２に列挙される物質が含まれる：
表２
【００６２】
【表２−１】
0005658568.tif 000003
【００６３】
【表２−２】
0005658568.tif 000004
【００６４】
【表２−３】
0005658568.tif 000005
【００６５】
腫瘍ホーミング分子
腫瘍ホーミング分子は、同じタイプの正常組織に対して腫瘍組織に選択的に結合する。こうした分子は一般に、腫瘍組織において過剰発現される細胞表面受容体のリガンドである。正常組織に対して癌組織で過剰発現される細胞表面受容体には、限定されるわけではないが、組織非形成性甲状腺癌、結腸直腸癌、頭部および頸部の癌、卵巣癌、腎細胞癌、ならびに乳房および肺腫瘍で過剰発現される上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、乳頭状甲状腺癌で過剰発現されるメタスチン、乳癌のかなりのサブセットで過剰発現されるＥｒｂＢファミリー受容体チロシンキナーゼ、乳癌で過剰発現されるヒト上皮増殖因子受容体−２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、肉腫様腎癌で過剰発現されるチロシンキナーゼ受容体（ｃ−Ｋｉｔ）、食道腺癌で過剰発現されるＨＧＦ受容体ｃ−Ｍｅｔ、乳癌で過剰発現されるＣＸＣＲ４およびＣＣＲ７、前立腺癌で過剰発現されるエンドセリン−Ａ受容体、大部分の結腸直腸癌腫瘍で過剰発現されるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体デルタ（ＰＰＡＲ−デルタ）、卵巣癌で過剰発現されるＰＤＧＦＲ  Ａ、多様な肺癌で過剰発現されるＢＡＧ−１、膵臓癌で過剰発現される可溶性ＩＩ型ＴＧＦベータ受容体、葉酸、ならびにインテグリン（例えばαｖβ３）が含まれる。
【００６６】
葉酸受容体は、ビタミン、葉酸に高アフィニティを持つ、グリコシルホスファチジルイノシトール係留糖タンパク質である（Ｋｄ〜１０−９Ｍ）（Ｌｅａｍｏｎ，  Ｃ．Ｐ．ら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ．  １９９３  Ｍａｙ  １；  ２９１（Ｐｔ．  ３）：８５５−６０）。葉酸受容体は、卵巣、結腸直腸、および乳癌などの上皮悪性腫瘍上の正常組織に比較して、上昇したレベルで発現される腫瘍マーカーと同定されてきている（Ｗａｎｇ，  Ｓ．ら，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ．  １９９８  Ａｐｒ  ３０；５３（ｌ−３）：３９−４８）。葉酸がそのｇ−カルボキシル部分を介して単一分子または分子の集まりのいずれかに共有結合している場合、細胞表面受容体へのアフィニティは、本質的に改変されないことが示されてきている。エンドサイトーシスおよび小胞輸送後、多くの物質は細胞質内に放出される。次いで、非連結型葉酸受容体は細胞表面にリサイクルされ；こうした各葉酸受容体は、多くの葉酸コンジュゲートを細胞内に持ち込みうる。
【００６７】
臓器または組織ホーミング分子
本発明は、肺、皮膚、血液、膵臓、網膜、前立腺、卵巣、リンパ節、副腎、肝臓、乳房、消化器系または腎組織を含む、多様な臓器または組織に選択的にホーミングする分子の使用を提供する。例えば、本発明は、ペプチドＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣおよびＣＧＦＥＬＥＴＣを含む、ＧＦＥモチーフを含有するものなどの肺ホーミングペプチド；  ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣなどの皮膚ホーミングペプチド；ペプチドＳＷＣＥＰＧＷＣＲなどの膵臓ホーミングペプチド；ならびに、ペプチドＣＳＣＦＲＤＶＣＣ（配列番号４３）およびＣＲＤＶＶＳＶＩＣ（配列番号４４）を含む、ＲＤＶモチーフを含有するものなどの網膜ホーミングペプチドの使用を提供する。
【００６８】
本発明はまた、本発明の臓器ホーミング分子を用いて、病変を有するかまたは有すると推測される被験体の選択される臓器または組織にホーミングする分子を含むＨＰＰＳを投与することによって、肺、皮膚、膵臓、網膜、前立腺、卵巣、リンパ節、副腎、肝臓または腸の病変を診断するかまたは治療する方法も提供する。例えば、肺、皮膚、膵臓、網膜、前立腺、卵巣、リンパ節、副腎、肝臓または腸の病変は、療法剤に連結された適切な臓器ホーミング分子を含むＨＰＰＳナノ粒子を、病変を有する被験体に投与することによって、治療可能である。同様に、検出可能剤に連結された適切な臓器ホーミング分子を含むＨＰＰＳナノ粒子を、被験体に投与することによって、選択される臓器または組織を同定するか、あるいは選択される臓器における病変を診断する方法を提供する。
【００６９】
本発明のＨＰＰＳナノ粒子を、選択される臓器または組織に部分をターゲティングする、臓器および組織ホーミング分子とともに用いてもよい。本発明で使用するホーミング分子には、肺、皮膚、膵臓、網膜、前立腺、卵巣、リンパ節、副腎、肝臓または腸を含む多様な正常臓器または組織に、そして肺腫瘍を所持する肺および膵臓腫瘍を所持する膵臓を含めて、腫瘍を所持する臓器に、ホーミングするペプチドが含まれる。例えば、本発明には、各々、３ペプチドＧＦＥモチーフを含有する、ペプチドＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣおよびＣＧＦＥＬＥＴＣ、ならびにペプチドＧＩＧＥＶＥＶＣ（配列番号４５）を含む肺ホーミングペプチドの使用が含まれる。本発明にはまた、ペプチドＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣなどの皮膚ホーミングペプチド；ペプチドＳＷＣＥＰＧＷＣＲなどの膵臓ホーミングペプチド、ならびに、各々、３ペプチドＲＤＶモチーフを含有するペプチドＣＳＣＦＲＤＶＣＣおよびＣＲＤＶＶＳＶＩＣなどの網膜ホーミングペプチドの使用も含まれる。前立腺、卵巣、リンパ節、副腎、肝臓および腸にホーミングするペプチドの例もまた提供される（以下の表３を参照されたい）。１つの態様において、ホーミング分子は、全長ＥＧＦタンパク質（ＥＧＦ）またはその断片などのＥＧＦＲ特異的ペプチドであってもよい。
【００７０】
便宜上、用語「ペプチド」は、本明細書において、広く、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質およびタンパク質の断片を意味するように用いられ、そして例えば一本鎖ペプチドを含む。本発明で有用な他の分子には、ペプトイド、ペプチド模倣体等が含まれる。本発明の臓器または組織ホーミングペプチドに関して、化学的に修飾されたペプチド、非天然存在アミノ酸を含有するペプチド様分子、ペプトイド等を含むペプチド模倣体は、ペプチド模倣体が由来する臓器ホーミングペプチドの結合活性を有する（例えば、本明細書に援用される、「Ｂｕｒｇｅｒ’ｓ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」  第５版，  第１巻〜第３巻（Ｍ．  Ｅ．  Ｗｏｌｆｆ監修；  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５）を参照されたい）。ペプチド模倣体は、ペプチドに勝る多様な利点を提供し、これには、ペプチド模倣体が、被験体に投与された際、例えば消化管の通過中、安定なままであり、そしてしたがって経口投与に有用である可能性もあることが含まれる。
【００７１】
ペプチド模倣体を同定するための方法が当該技術分野に周知であり、そしてこれには、例えば、潜在的なペプチド模倣体のライブラリーを含有するデータベースのスクリーニングが含まれる。例えば、ケンブリッジ構造データベースは、既知の結晶構造を有する３００，０００を超える化合物のコレクションを含有する（Ａｌｌｅｎら，  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｂ，  ３５：２３３１（１９７９））。この構造保管所は、新規結晶構造が決定されると同時に連続してアップデートされ、そして例えば、臓器または組織ホーミング分子と同じ形状、ならびに臓器または組織ホーミングペプチドによって結合されるターゲット分子への潜在的な幾何学的および化学的相補性を有する化合物に関してスクリーニング可能である。ホーミングペプチド、あるいは臓器または組織ホーミング分子が結合するターゲット分子の結晶構造が入手不能な場合、例えばプログラムＣＯＮＣＯＲＤ（Ｒｕｓｉｎｋｏら，  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｆ．  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｓｃｉ．  ２９：２５１（１９８９））を用いて構造を生成してもよい。別のデータベース、利用可能化学薬品ディレクトリ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；カリフォルニア州サンリーンドロ）は、商業的に入手可能な約１００，０００の化合物を含有し、そしてこれを検索して、臓器または組織ホーミング分子の潜在的なペプチド模倣体を同定することもまた可能である。
【００７２】
選択される臓器または組織への分子の選択的ホーミングは、該分子による、臓器または組織中の細胞上に存在する細胞表面タンパク質などの特定の細胞ターゲット分子の選択的認識によってもよい。ホーミングの選択性は、分子が１つまたは少数の臓器または組織をホーミングするように、１つまたは少数の異なる細胞種上にのみ発現される特定のターゲット分子に依存する。これに関連して、大部分の異なる細胞種、特に臓器または組織に特有の細胞種が、ユニークなターゲット分子を発現しうる。
【００７３】
特定の臓器または組織へのホーミングに有用であると同定されているペプチドモチーフの例には、表３に列挙するものが含まれる。
【００７４】
表３
【００７５】
【表３−１】
0005658568.tif 000006
【００７６】
【表３−２】
0005658568.tif 000007
【００７７】
本発明には、ＧＦＥモチーフを共有するＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣおよびＣＧＦＥＬＥＴＣ；  ＣＴＬＲＤＲＮＣ；およびＣＧＦＥＬＥＴＣ中に存在するＥＬＥモチーフと類似のＥＶＥモチーフを含有するＣＩＧＥＶＥＶＣ（配列番号４６）などの肺ホーミングペプチドの使用が含まれる。
【００７８】
好ましくは、本発明はまた、ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣなどの皮膚ホーミングペプチドも使用してもよい。本発明はさらに、ＳＷＣＥＰＧＷＣＲなどの膵臓ホーミングペプチドを含むＨＰＰＳナノ粒子を提供する。ＣＳＣＦＲＤＶＣＣおよびＣＲＤＶＶＳＶＩＣなどの網膜ホーミングペプチドもまた、本発明のＨＰＰＳナノ粒子と組み合わせて使用可能である。ＳＭＳＩＡＲＬおよびＶＳＦＬＥＹＲなどの前立腺ホーミングペプチドもまた、本発明のＨＰＰＳナノ粒子と組み合わせて使用可能である。ＲＶＧＬＶＡＲおよびＥＶＲＳＲＬＳなどの卵巣ホーミングペプチドもまた提供する。本発明はまた、ＬＰＲモチーフを共有するＬＭＬＰＲＡＤおよびＬＰＲＹＬＬＳ、またはモチーフＬＡＧＧを共有するＲ（Ｙ／Ｆ）ＬＬＡＧＧ（配列番号４７）およびＲＹＰＬＡＧＧ（配列番号４８）などの副腎ホーミングペプチドも使用可能である。さらに、ＡＧＣＳＶＴＶＣＧ（配列番号４９）などのリンパ節ホーミングペプチドが、本発明と組み合わせて使用可能である。本発明はまた、ＹＳＧＫＷＧＫおよびＹＳＧＫＷＧＷ（配列番号５０）などの腸ホーミングペプチドも使用可能である。
【００７９】
心臓血管斑ホーミング分子
アテローム性動脈硬化症斑は、ＣＸ３ＣＬ１などの特定の受容体を過剰発現することが知られる。本発明には、したがって、こうした斑上で過剰発現される受容体のリガンドが含まれる。
【００８０】
感染組織ホーミング分子
ウイルス、寄生虫、および／または細菌（例えばＨＩＶ、マラリア等）などの多様な感染性病原体に感染した組織は、典型的には、細胞表面マーカー／受容体（例えばタンパク質）を発現する（または過剰発現する）。したがって、本発明のホーミング分子には、こうした感染組織上に発現される前記細胞表面マーカー／受容体のリガンドが含まれる。
【００８１】
活性剤
活性剤を修飾し、そしてＬＤＬ内にパッケージングする方法が、これに関連してその内容が本明細書に援用される、Ｋｒｉｅｇｅｒ，  Ｍ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２８：６０８−１３に記載される。本発明と組み合わせて同様の方法を使用可能である。
【００８２】
親油性化合物
本発明のＨＰＰＳナノ粒子を介して、多様な活性剤が送達可能である。態様において、活性剤は、一般的には親油性であるＨＰＰＳナノ粒子のコア中に位置付けられる。したがって、親油性化合物は、本発明のＨＰＰＳナノ粒子を介して送達可能である。本発明のＨＰＰＳナノ粒子を、本質的に親油性である活性剤とともに用いてもよいし、または以下により詳細に論じる化学的修飾によって、親油性にしてもよい。
【００８３】
用語「親油性化合物」または「親油性薬剤」は、非イオン化型で、水よりも脂質または脂肪中でより可溶性である化合物または薬剤と定義される。親油性化合物の例には、限定されるわけではないが、アセトアニリド、アニリド、アミノキノリン、ベンズヒドリル化合物、ベンゾジアゼピン、ベンゾフラン、カンナビノイド、環状ペプチド、ジベンザゼピン、ジギタリスグリコシド、麦角アルカロイド、フラボノイド、イミダゾール、キノリン、マクロライド、ナフタレン、オピエート（またはモルフィナン）、オキサジン、オキサゾール、フェニルアルキルアミン、ピペリジン、ポリ環状芳香族炭化水素、ピロリジン、ピロリジノン、スチルベン、スルホニル尿素、スルホン、トリアゾール、トロパン、およびビンカアルカロイドが含まれる。
【００８４】
多様な試験を用いて、親油性を決定してもよい。一般的な試験プロトコルは、オクタノール−水分配係数（ＰＯＷ、ＫＯＷ）の測定であり、これは、オクタン−１−オールおよび水の間の平衡分布の決定による親油性の評価基準である。親油性薬剤は、好ましくは、オクタノール構成要素に分配される薬剤である。
【００８５】
本発明のターゲティング化薬剤送達複合体に取り込まれてもよい薬学的活性親油性薬剤には、癌および緑内障の治療のための薬剤、免疫活性剤、抗新生物剤、抗コリン剤およびコリン作用剤、抗ムスカリン剤およびムスカリン剤、抗アドレナリン剤および抗不整脈剤、抗高血圧剤、抗炎症薬剤、抗生物質薬剤、抗真菌薬剤、ステロイド、抗ヒスタミン剤、抗喘息剤、鎮静剤、抗癲癇剤、麻酔剤、催眠剤、抗精神病剤、神経遮断剤、抗鬱剤、抗不安剤、抗痙攣剤、ニューロン遮断剤、麻薬アンタゴニスト、鎮痛剤、抗増殖剤、抗ウイルス薬剤、ホルモン、および栄養剤が含まれる。
【００８６】
抗癌薬剤の例には、限定されるわけではないが、パクリタキセル、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）−パクリタキセル・コンジュゲート、シクロホスホラミド、ベツリン酸、およびドキソルビシンが含まれる（例えば、Ｓｔｒｅｌｃｈｅｎｏｋに対する米国特許第６，１９７，８０９号を参照されたい）。
【００８７】
抗緑内障薬剤の例には、限定されるわけではないが、チモロールに基づくもの、ベタキソロール、アテノロール、レボブノロール（ｌｉｖｏｂｕｎｏｌｏｌ）などのβ−ブロッカー、エピネフリン、ジピバリル、オキソノロール、アセタゾラミドに基づくものおよびメタゾラミド（ｍｅｔｈｚｏｌａｍｉｄｅ）が含まれる。
【００８８】
抗炎症薬剤の例には、限定されるわけではないが、コルチゾンおよびデキサメタゾンなどのステロイド性薬剤、ならびにピロキシカム、インドメタシン、ナプロキセン、フェニルブタゾン、イブプロフェンおよびジクロフェナク酸などの非ステロイド性抗炎症薬剤（ＮＳＡＩＤ）が含まれる。抗喘息剤には、限定されるわけではないが、プレドニゾロンおよびプレドニゾンが含まれる（米国特許第６，０５７，３４７号もまた参照されたい）。
【００８９】
抗生物質薬剤の例には、限定されるわけではないが、クロラムフェニコールが含まれる。抗真菌薬剤の例には、限定されるわけではないが、ニスタチン、アンホテリシンＢ、およびミコナゾールが含まれる。抗ウイルス薬剤の例には、限定されるわけではないが、ＡｃｙｃｌｏｖｉｒＴＭ（Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ、英国）が含まれる。
【００９０】
ステロイドの例には、限定されるわけではないが、テストステロン、エストロゲン、およびプロゲステロンが含まれる。抗アレルギー薬剤の例には、限定されるわけではないが、フェニラミド誘導体が含まれる。鎮静剤の例には、限定されるわけではないが、ジアゼパムおよびプロポフォールが含まれる。
【００９１】
通常は親油性でない送達すべき化合物を、１以上の親油性分子と融合させるかまたは共有結合させて、両親媒性化合物を生じることによって、こうした化合物を本発明で使用することも可能である。こうした親油性分子は、好ましくは、例えば、シス二重結合によって屈曲しているか、または少なくとも１つの側鎖によって分枝しているかいずれかの、少なくとも１つの炭化水素長鎖（＞Ｃ１０）を含有する。こうした分子には、限定されるわけではないが、オレイン酸コレステロール、オレイン酸塩、ラウリン酸コレステロールまたはフィトールが含まれる。ステロールおよび脂肪酸もまた使用可能である。
【００９２】
核酸と陽イオン性脂質を複合体化して、次いで粒子コア内に取り込み可能であるか、または本発明のリン脂質と別の方式で会合可能である、親油性複合体を形成することによって、ｓｉＲＮＡなどの核酸、ならびに核酸およびペプチドアプタマーの両方を、「親油性」化合物として送達してもよい。また、以下に記載するように、脂質アンカーへの共有結合を介して、核酸をＨＰＰＳナノ粒子内に取り込んでもよい。
【００９３】
脂質アンカーを含む剤
親油性であり、そして本発明のＨＰＰＳナノ粒子のコア内に装填可能である活性剤に加えて、本発明にはまた、本発明のＨＰＰＳの表面上に装填可能な活性剤も含まれる。こうした活性剤は、脂質アンカーを伴って親水性であってもよい。また、本発明のＨＰＰＳナノ粒子を修飾して、親油性キレート剤を含むようにしてもよく、こうした親油性キレート剤が周知である。例えば、標準的技術を用いて、親油性キレート剤、ＤＴＰＡ  Ｂｉｓ（ステアリルアミン）をＨＰＰＳナノ粒子内に取り込んでもよい。同様に、ＬＤＬリン脂質単層内に介入することが知られる脂質係留カルボシアニンに基づく光学プローブとして、１，１−ジオクタデシル−３，３，３，３−テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩（ＤｉＩ）を用いてもよく、そして本発明のＨＰＰＳナノ粒子中で用いてもよい。
【００９４】
同様に、近赤外（「ＮＩＲ」）蛍光体であるトリカルボシアニン色素などのＮＩＲプローブを修飾して、こうしたプローブが本発明のＨＰＰＳナノ粒子に係留されることを可能にする脂質−キレートアンカーを含ませてもよい。任意のこうした脂質−キレートアンカーを用いてもよく、例えば、ラウリン酸コレステリル部分をＮＩＲプローブに付着させて、これらを本発明のＨＰＰＳナノ粒子に係留してもよい（Ｚｈｅｎｇら，  Ｂｉｏｏｒｇ．  ＆  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．  １２：１４８５−１４８８（２００２））。
【００９５】
上述のように、やはり、コレステロール部分を用いて、ｓｉＲＮＡ（およびさらにアプタマー）および他の活性剤をＨＰＰＳナノ粒子のコア内に係留してもよい。コレステロール・コンジュゲート化ｓｉＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子発現をサイレンシングすることも可能であり、そしてこれらのコンジュゲートがＬＤＬおよびＨＤＬ粒子に結合することが確立されてきている（Ｗｏｌｆｒｕｍ，  Ｃ．ら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  オンラインで２００７年９月１６日に公開）。活性剤に適したアンカーには、オレイン酸および不飽和コレステロールエステル部分が含まれる。当業者に知られる合成法を用いて、こうしたアンカーを活性剤に共有結合させてもよい。１つの態様において、エステル連結を介して、アンカーを活性剤に共有結合させてもよい。
【００９６】
画像化剤／診断剤
１つの態様において、活性剤は、放射性核種または画像化剤などの検出可能な剤であってもよく、これは、選択される臓器または組織の検出または視覚化を可能にする。したがって、本発明は、肺、皮膚、血液、膵臓、網膜、前立腺、卵巣、リンパ節、副腎、肝臓または腸ホーミング分子を含むＨＰＰＳナノ粒子を提供する。選択される検出可能剤のタイプは、適用に応じるであろう。例えば、被験体におけるｉｎ  ｖｉｖｏの肺の診断画像化研究のため、被験体に投与した際に、被験体外部から検出可能である剤を含むＨＰＰＳナノ粒子に、肺ホーミング分子を連結してもよい。こうした内部臓器または組織、例えば前立腺の検出のため、インジウム−１１３、インジウム−１１５またはテクネチウム−９９などのガンマ線放出放射性核種を、前立腺ホーミング分子に連結されたＨＰＰＳナノ粒子とコンジュゲート化してもよく、そして被験体への投与後、固体シンチレーション検出装置を用いて視覚化可能である。あるいは、被験体の外表面または外表面近くの臓器または組織、例えば網膜に関しては、検眼鏡および適切な光学系を用いて、網膜の内皮構造が視覚化可能であるように、フルオレセイン標識網膜ホーミング分子を用いてもよい。
【００９７】
臓器または組織における病理学的病変に選択的にホーミングする分子を本発明のＨＰＰＳナノ粒子中で用いて、病変のサイズおよび分布を視覚化可能であるように、適切な検出可能剤を送達してもよい。例えば、臓器または組織ホーミング分子が、正常な臓器または組織にホーミングするが、臓器または組織中の病理学的病変にホーミングしない場合、病理学的病変の存在を、臓器または組織の異常なまたは典型的でない画像、例えば病変領域における検出可能な剤の非存在を同定することによって、検出してもよい。
【００９８】
検出可能な剤はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの検出を容易にする剤であってもよい。例えば、ホーミング分子、および例えば適切な基質が存在する場合、可視シグナルを生じる酵素を含むＨＰＰＳナノ粒子は、ホーミング分子が向けられている臓器または組織または細胞の存在を検出可能である。例えば、アルカリホスファターゼまたはルシフェラーゼ等を含んでもよいこうしたＨＰＰＳナノ粒子は、免疫組織化学などの方法において有用でありうる。また、こうしたＨＰＰＳナノ粒子を用いて、例えばターゲット分子の精製中、試料中で臓器ホーミング分子が結合するターゲット分子の存在を検出してもよい。
【００９９】
さらなる診断剤には、造影剤、放射性標識および蛍光標識が含まれる。好ましい造影剤は光学造影剤、ＭＲＩ造影剤、超音波造影剤、Ｘ線造影剤および放射性核種である。
【０１００】
療法剤
療法剤は、選択される臓器または組織の部位でその機能を発揮する任意の生物学的に有用な剤、例えば先に言及した活性剤および親油性化合物であってもよい。例えば、療法剤は小さい有機分子であってもよく、該分子は、連結された臓器ホーミング分子によってターゲット細胞に結合した際、その機能を発揮しうる細胞によって内部移行される。療法剤は、選択される臓器または組織において、望ましいように、細胞生存、細胞増殖または細胞死の刺激または阻害に関与するタンパク質をコードする核酸分子であってもよい。例えば、アポトーシスを阻害するＢｃｌ−２などのタンパク質をコードする核酸分子は、細胞生存を促進するのに使用可能であり、一方、アポトーシスを刺激するＢａｘなどのタンパク質をコードする核酸分子は、ターゲット細胞の細胞死を促進するのに使用可能である。
【０１０１】
細胞死を刺激する特に有用な療法剤はリシンであり、これを本発明の臓器ホーミング分子を含むＨＰＰＳに連結すると、過剰増殖障害、例えば癌を治療するのに有用でありうる。本発明の臓器ホーミング分子、および例えばアンピシリンなどの抗生物質またはリバビリンなどの抗ウイルス剤を含むＨＰＰＳナノ粒子は、選択される臓器または組織において、細菌またはウイルス感染を治療するのに有用でありうる。
【０１０２】
療法剤はまた、発現または不全が病変と関連する生物学的分子の産生または活性を阻害するかまたは促進することも可能である。したがって、プロテアーゼ阻害剤は、臓器ホーミング分子を含むＨＰＰＳに連結された際、選択される臓器または組織、例えば膵臓で、プロテアーゼ活性を阻害しうる療法剤でありうる。選択される臓器または組織において、タンパク質の産生を補充するかまたは回復しうるｃＤＮＡなどの遺伝子またはその機能的同等物もまた、病変の重症度を改善するのに有用な療法剤でありうる。療法剤はまた、その発現が有害なタンパク質の産生を阻害するアンチセンス核酸分子であってもよいし、あるいは有害なタンパク質の活性を阻害しうるドミナントネガティブタンパク質またはその断片をコードする核酸分子であってもよい。上述のように、核酸、ならびに核酸およびペプチドアプタマーは、核酸を陽イオン性脂質と複合体化して、次いで粒子コア内に取り込み可能であるか、または本発明のリン脂質と別の方式で会合可能である、親油性複合体を形成することによって、核酸、ならびに核酸およびペプチドアプタマーを、「親油性」化合物として送達してもよい。また、コレステロール部分または他の脂質アンカーを用いて、これらおよび他の活性剤をＨＰＰＳナノ粒子のコア内に係留してもよい。
【０１０３】
光線力学的療法（ＰＤＴ）剤
ＰＤＴは、光および光増感剤の組み合わせを伴う、有望な癌治療である。各因子はそれ自体では無害であるが、一緒に組み合わせると、これらは、腫瘍細胞を殺傷する致死性反応性酸素種を生じる（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，  Ｔ．Ｊ．ら  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．  ９０，  ８８９−９０５（１９９８））。一重項酸素（１Ｏ２）は、強力でかなり無差別なオキシダントであり、多様な生物学的分子および集合体と反応する。１Ｏ２は、ＰＤＴが誘導する腫瘍壊死の重要な剤であることが一般的に認識されている（Ｎｉｅｄｒｅ，  Ｍ．ら  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ．  ７５，  ３８２−３９１（２００２））。１Ｏ２の拡散範囲は、細胞培地中、およそ４５ｎｍに制限される（Ｍｏａｎ，  Ｊ．  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．  ５３，  ５４９−５５３（１９９１））。したがって、Ｏ２の主な生成部位は、どの細胞内構造がアクセスされそして攻撃されうるかを決定する。言い換えると、光増感剤が腫瘍細胞中に優先的に局在するならば、ＰＤＴが誘導する細胞損傷は、非常に腫瘍特異的である。
【０１０４】
好ましい光線力学的療法剤は、ポルフィリン、ポルフィリン異性体、および拡張ポルフィリンである。
【０１０５】
態様において、光線力学療法剤は、ｔｅｒｔ−ブチルシリコンナフタロシアニンビソレエート（ＳｉＮｃ−ＢＯＡ）、ｔｅｒｔ−ブチルシリコンフタロシアニンビソレエート（ＳｉＰｃ−ＢＯＡ）、およびピロフェオホルビド−コレステロールエステル（Ｐｙｒｏ−ＣＥ）からなる群より選択される。ＳｉＮｃ−ＢＯＡ、ＳｉＰｃ−ＢＯＡ、およびＰｙｒｏ−ＣＥは、光線力学療法のための毒性酸素種を生じる光増感化合物である。
【０１０６】
蛍光画像化剤およびＰＤＴ剤用の近赤外（ＮＩＲ）色素
ＮＩＲ蛍光画像化（ＮＩＲＦ）は、非放射性で高感度であり、そして安価な癌検出様式であり（Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ，  Ｒ．ら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９，  １２３−１２８（２００３），  Ｆｒａｎｇｉｏｎｉ，  Ｊ．Ｖ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７，  ６２６−６３４（２００３））、蛍光の相違に基づいて、腫瘍および健康な組織の非侵襲性区別を可能にする。ＮＩＲ色素は、現在、癌検出のためのＮＩＲＦプローブとして、そしてＰＤＴによる癌治療のための光増感剤として、かなりの興味を集めている。ＮＩＲ色素の魅力は、６００ｎｍ〜９００ｎｍの間のスペクトルウィンドウにある、組織光学特性にある。こうした波長のため、組織吸収計数は比較的低く；したがって、光の伝播は主に、散乱事象によって支配され、そして数センチの浸透深度が達成可能である。したがって、ＮＩＲ色素のユニークな能力によって、乳癌を含む表面下の腫瘍の蛍光画像化およびＰＤＴ治療が可能になる。
【０１０７】
ＮＩＲＦおよびＰＤＴ様式両方の現在の制限は、ＮＩＲＦでは偽陰性につながり、そしてＰＤＴでは不適切な腫瘍対正常組織療法比につながる、腫瘍への色素の送達の比較的非特異的な性質のため、これらが十分な腫瘍対組織の対比を欠くことである。したがって、「癌サイン」、すなわち癌細胞において選択的に集積する分子をターゲティングする剤が特に魅力的である。本発明は、より高いプローブ／タンパク質モル比および腫瘍特異性が達成されるように、コア内にＮＩＲＦ／ＰＤＴ剤をロックする腫瘍ターゲティングＨＰＰＳナノ粒子を提供する。
【０１０８】
磁気共鳴画像化剤
ＭＲＩは、現在、利用可能な多様な診断方式の中の傑出した方法論であり、これはｉｎ  ｖｉｖｏで水プロトンの量、流れ、および環境をサンプリングすることによって、柔組織における構造および機能をマッピングする強力な方法を提供するためであることが現在、よく確立されている。本来備わっている対比は、造影剤の使用によって増大しうる。ターゲティング化ＭＲＩ剤は、概念的には非常に魅力的であるが、いくつかの潜在的に有用な例にのみ存在する。感度が限定されるため、効率的な認識には、単純なターゲティング化Ｇｄ（ガドリニウム）キレートで見られるのに十分な量で存在する、フィブリンのような非常に大容量のターゲット、あるいはＧｄクラスター、ポリマーまたは鉄粒子と結合可能な、血流にアクセス可能なターゲットを必要とする。これは、現在、非常に限定されるターゲットセットである。さらに、ＭＲＩ検出限界に必要なＭＲＩ剤の最少濃度は、細胞外ターゲティング閾値（４０μｌＶ１）よりはるかに高い（〜１ｍＭ）ため、細胞内ＭＲＩ画像化は、特に困難である（Ａｉｍｅ，  Ｓ．ら  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ．  ２００２  １６（４）：３９４−４０６、Ｎｕｎｎ，  Ａ．Ｄ．ら  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  １９９７  ４１（２）：１５５−６２）。１つの重要な試みが、Ｗｉｅｎｅｒらによって１９９５年に報告された（Ｗｉｅｎｅｒ，  Ｅ．Ｃ．ら  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ．  １９９７  Ｄｅｃ，−３２（１２）：７４８−５４）。葉酸コンジュゲート化ＤＴＰＡに基づくデンドリマーを用いて、Ｗｉｅｎｅｒらは、葉酸受容体の存在に関連する腫瘍細胞による取り込みを達成した。Ｗｉｅｎｅｒらはまた、注射２４時間後、１７％のＭＲＩ対比増進も得た。本発明は、ＭＲＩおよびＮＩＲＦ／ＰＤＴ剤両方を送達するＨＰＰＳナノ粒子を提供する。
【０１０９】
本発明の特定の態様において、ＭＲＩ造影剤は、酸化鉄およびランタニドに基づくもの、例えばガドリニウム（Ｇｄ３＋）金属である。
【０１１０】
神経系において活性である剤
神経系に対して活性である薬剤もまた、本発明のＨＰＰＳナノ粒子を介して送達してもよい。こうした薬剤には、抗精神病剤、刺激剤、鎮静剤、麻酔剤、オピエート、精神安定剤、抗鬱剤、例えばＭＡＯ阻害剤、三環系および四環系、選択的セロトニン再取り込み阻害剤およびブプロピオン（ｂｕｒｐｒｏｐｉｏｎ）が含まれる。神経系において活性である薬剤にはまた神経ペプチドも含まれる。ペプチド薬剤の送達は、代謝安定性が低く、肝臓によるクリアランスが高く、そして血液脳関門が存在するため、脳への生物学的利用能が劣っていることによって限定される。本発明のＨＰＰＳナノ粒子は、中枢神経系へのこうした薬剤の送達を可能にする。
【０１１１】
薬学的組成物
被験体に投与される際、本発明のナノプラットフォームは、例えばＨＰＰＳナノ粒子および薬学的に許容されうるキャリアーを含有する薬学的組成物として投与される。薬学的に許容されうるキャリアーは当該技術分野に周知であり、そしてこれには、例えば、水または生理学的緩衝生理食塩水などの水溶液、あるいはグリコール、グリセロールなどの他の溶媒またはビヒクル、オリーブ油などの油または注射可能有機エステルが含まれる。
【０１１２】
薬学的に許容されうるキャリアーは、例えば複合体を安定化するかまたはその吸収を増加させるよう作用する、生理学的に許容されうる化合物を含有しうる。こうした生理学的に許容されうる化合物には、例えば、炭水化物、例えばグルコース、スクロースまたはデキストラン、酸化防止剤、例えばアスコルビン酸またはグルタチオン、キレート剤、低分子量タンパク質あるいは他の安定化剤または賦形剤が含まれる。当業者は、その中の任意の生理学的に許容されうる化合物を含めて、薬学的に許容されうるキャリアの選択が、例えば、薬学的組成物の投与経路に応じることを知っている。薬学的組成物はまた、癌療法剤、または親油性化合物、脂質アンカーを含む剤、画像化剤／診断剤、療法剤、光線力学療法（ＰＤＴ）剤、蛍光画像化剤およびＰＤＴ剤用の近赤外（ＮＩＲ）色素、磁気共鳴画像化剤、ならびに神経系において活性である剤を含む、望ましいような他の活性剤をさらに含むＨＰＰＳナノ粒子も含有してもよい。
【０１１３】
上述のように、本発明のナノプラットフォームを生理学的または薬学的に許容されうるキャリア中で提供してもよいし、あるいは続く使用のために凍結乾燥型で提供してもよい。組成物は、非経口投与等が意図される際には、場合によって無菌であるが、いくつかの局所適用が意図される際には、常に無菌である必要はない。限定されるわけではないが、水性キャリアを含む、任意の薬学的に許容されうるキャリアを用いてもよい。非経口注射のための水性キャリアには、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁物が含まれ、生理食塩水および緩衝媒体が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲル・デキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、液体および栄養補充剤、電解質補充剤（リンゲル・デキストロースに基づくものなど）等が含まれる。保存剤および他の添加物、例えば抗微生物剤、酸化防止剤、キレート剤、および不活性ガス等もまた存在してもよい。
【０１１４】
当業者は、例えば経口または非経口的、例えば静脈内を含む多様な経路によって、本発明のＨＰＰＳナノ粒子を含有する薬学的組成物を、被験体に投与してもよいことを知っている。注射によってまたは挿管によって薬学的組成物を投与してもよい。
【０１１５】
本明細書に開示するような診断法、画像化法または療法を実行する際、本発明のＨＰＰＳナノ粒子の療法的に有効な量を被験体に投与しなければならない。「療法的に有効な量」は、所望の効果を生じるＨＰＰＳナノ粒子の量である。有効な量は、例えば、活性剤および意図される使用に応じるであろう。例えば、細胞死が望ましい療法目的のために投与される放射標識分子の量に比較して、画像化に関しては、より少ない量の放射標識ＨＰＰＳナノ粒子しか必要でない可能性もある。特定の目的のための特定のＨＰＰＳナノ粒子の療法的有効量は、当業者に周知の方法を用いて決定可能である。
【０１１６】
原則として、本発明のＨＰＰＳナノ粒子の一部としての臓器ホーミング分子は、該分子の投与が直接の生物学的効果を提供するように、生得的な生物学的特性を有しうる。例えば、臓器ホーミング分子は、天然リガンドの活性を模倣するのに十分に、ターゲット分子の天然存在リガンドに類似であってもよい。こうした臓器ホーミング分子は、天然リガンドの活性を有する療法剤として有用でありうる。例えば、臓器ホーミング分子が、選択される臓器または組織によって発現される受容体に結合する増殖因子の活性を模倣する場合、例えば上皮増殖因子の活性を模倣する皮膚ホーミング分子などの場合、臓器ホーミング分子の投与は、臓器または組織における細胞増殖を生じうる。本発明の臓器ホーミング分子のこうした生得的な生物学的活性は、選択される臓器または組織の細胞とホーミング分子を接触させ、そして生物学的効果の証拠、例えば細胞増殖、または生得的な活性が毒性効果である場合は細胞死に関して細胞を調べることによって、同定可能である。
【０１１７】
さらに、本発明のＨＰＰＳナノ粒子の一部としての臓器ホーミング分子は、対応するリガンドが受容体に結合不能であるように、特定のターゲット分子に結合する生得的な活性を有してもよい。例えば、多様なタイプの癌細胞が特定の臓器または組織に転移することが知られ、これは、癌細胞が、転移する臓器中のターゲット分子に結合するリガンドを発現することを示す。したがって、肺ホーミング分子の、例えば肺に転移している腫瘍を有する被験体への投与は、潜在的に転移性である癌細胞が肺に確立されることを防止する手段も提供しうる。しかし、一般的に、本発明の臓器ホーミング分子は、選択される臓器または組織にＨＰＰＰＳナノ粒子をターゲティングするのに特に有用である。したがって、本発明は、病変を有する被験体に、本発明のＨＰＰＳナノ粒子を投与することによって、選択される臓器または組織における病変を治療する方法を提供する。
【０１１８】
例えば、肺ホーミング分子および療法剤を含むＨＰＰＳナノ粒子を被験体に投与することによって、肺の特定の障害を治療してもよい。肺ホーミング分子は肺の毛細血管および肺胞に局在可能であるため、これらの領域と関連する障害は、肺ホーミング分子を含むコンジュゲートでの治療に特に受け入れられる。例えば、細菌性肺炎は、しばしば、肺の肺胞および毛細血管で生じる（ＲｕｂｉｎおよびＦａｒｂｅｒ，  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  第２版，  （Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，  １９９４））。したがって、肺ホーミング分子および適切な抗生物質を含むＨＰＰＳナノ粒子を被験体に投与して、本発明のＨＰＰＳナノ粒子を介して肺炎を治療してもよい。同様に、嚢胞性線維症は、ＣＦＴＲにおける欠陥のため、肺に病理学的病変を引き起こしうる。したがって、肺ホーミング分子およびＣＦＴＲをコードする核酸分子を含むＨＰＰＳナノ粒子の投与によって、ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子療法治療法として、肺に核酸分子を導くための手段が提供される。
【０１１９】
本発明はまた、皮膚ホーミング分子および療法剤を含むＨＰＰＳナノ粒子を、病変を有する被験体に投与することによって、皮膚の病変を治療する方法も提供する。例えば、やけど被害者に、皮膚ホーミング分子および上皮増殖因子または血小板由来増殖因子を含むＨＰＰＳナノ粒子を投与して、増殖因子が皮膚に局在し、そこで上皮およびその下の真皮の再生または修復を加速しうるようにしてもよい。さらに、本発明の方法は、細菌感染、特に皮下組織および真皮を通じて広がるまたはこれらの領域に局在する感染によって引き起こされる皮膚病変を、皮膚ホーミング分子および抗生物質を含むＨＰＰＳナノ粒子を被験体に投与することによって、治療するのに有用でありうる。
【０１２０】
本発明はまた、膵臓ホーミング分子および療法剤を含むＨＰＰＳナノ粒子を、病変を有する被験体に投与することによって、膵臓の病変を治療する方法も提供する。特に、本発明の膵臓ホーミング分子は、膵外分泌部に局在可能であるため、膵外分泌部に関連する病変を治療可能であり、そしていくつかの場合、膵内分泌部に不都合に影響を及ぼさない可能性もある。本発明の方法は、分泌されるプロテアーゼが臓器を損傷することによって引き起こされる膵外分泌部の炎症状態である、急性膵炎を治療するのに特に有用でありうる。膵臓ホーミング分子およびプロテアーゼ阻害剤を含むＨＰＰＳナノ粒子を用いて、プロテアーゼが仲介する組織の破壊を阻害し、したがって病変の重症度を減少させることも可能である。こうしたＨＰＰＳナノ粒子で有用な適切なプロテアーゼ阻害剤は、例えば、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼおよび膵臓リパーゼの阻害剤を含む、膵炎に関連する酵素を阻害するものである。また、本発明の方法を用いて、膵臓にホーミングする分子に連結された療法剤を含むＨＰＰＳナノ粒子を被験体に投与することによって、膵臓癌、例えば膵管腺癌を有する被験体を治療してもよい。
【０１２１】
また、本発明の方法を用いて、病変を有する被験体に、網膜ホーミング分子および療法剤を含むＨＰＰＳナノ粒子を投与することによって、目、特に網膜の病変を治療してもよい。例えば、増殖性網膜疾患は、例えば糖尿病による網膜虚血症に反応した網膜の新血管形成と関連する。したがって、アポトーシスを刺激する遺伝子、例えばＢａｘに連結された網膜ホーミング分子を含むコンジュゲートの投与を用いて、増殖性網膜疾患を治療してもよい。同様に、本発明の方法を用い、本明細書に開示するような適切な臓器または組織ホーミング分子を用いて、前立腺、血管、卵巣、乳房、リンパ節、副腎、肝臓、または腸病変を診断するかまたは治療してもよい。
【０１２２】
本発明はさらに、ウイルス、寄生虫、および／または細菌（例えばＨＩＶ、マラリア等）などの多様な感染性病原体に感染した組織を治療するための方法を提供する。ＨＰＰＳナノ足場で用いられるホーミング分子には、典型的には、感染組織で発現される（または過剰発現される）細胞表面マーカー／受容体（例えばタンパク質）に対するリガンドが含まれるであろう。
【０１２３】
本発明は、被験体、ターゲット組織または臓器に、親油性化合物、診断剤または薬剤を送達する方法であって、本発明の方法にしたがった前記親油性薬剤と複合体を形成するのに十分な量の脂質と会合した親油性薬剤を含むＨＰＰＳの薬学的配合物を調製し、そして前記ターゲット組織に薬学的配合物の療法的有効量を投与する工程を含む、前記方法をさらに提供する。本発明の薬学的配合物を、静脈内、動脈内、鼻内、例えばエアロゾル投与、噴霧化、吸入、または吹送によって、気管内、関節内、経口、経皮、皮下、直腸、または局所投与してもよい。
【０１２４】
「有効」または「療法的に有効」な量は、患者において疾患または状態の１以上の症状を軽減する（ある程度まで）量を意味する。さらに、「療法的に有効な量」は、状態と関連するかまたは状態の原因となる、生理学的または生化学的パラメーターを、部分的にまたは完全にのいずれかで正常に戻す量を意味する。さらに、有効量は、いくつかの他の意図される目的、例えば臓器または組織への放射性画像化剤または他の診断剤の送達を達成するのに十分なものであってもよい。
【０１２５】
さらに、本発明は、選択される臓器または組織を同定するか、あるいは選択される臓器または組織において、病変を診断する方法であって、本発明の方法にしたがって、適切なターゲティング部分、および診断剤と粒子を形成するのに十分な量の脂質と会合した前記診断剤を含むＨＰＰＳの薬学的配合物を調製し、そして被験体の前記ターゲット臓器または組織に薬学的配合物を投与する工程を含む、前記方法を提供する。
【０１２６】
「診断剤」は、患者の内部領域を画像化し、そして／または患者における疾患の存在または非存在を診断するための方法と関連して使用可能な任意の剤を指す。例示的な診断剤には、例えば、患者の超音波画像化、磁気共鳴画像化またはコンピュータ断層撮影画像化と関連して使用するための、放射性および蛍光標識、ならびに造影剤が含まれる。診断剤にはまた、画像化方法論が使用されていてもまたはいなくても、患者における疾患または他の状態の診断を促進するのに有用な任意の他の剤も含まれてもよい。
【０１２７】
本発明はまた、本発明の方法にしたがった任意の組成物が、局所適用によってこうした治療が必要な被験体に投与される、皮膚癌、乾癬、座瘡、湿疹、酒さ、日光角化症、脂漏性皮膚炎、および先天性角化障害からなる群より選択される障害を患う被験体を治療する方法も提供する。
【０１２８】
本発明のＨＰＰＳナノ粒子は、上述のように、局所適用に使用可能である。したがって、本発明は、乾燥肌、光線性皮膚障害、年齢による染み、加齢皮膚、角質層柔軟性の増加、しわ、細い線、光線性の染み、皮膚変色（ｄｙｓｃｈｒｏｍｉａｓ）、および魚鱗癬からなる群より選択される皮膚の１以上の状態を治療する方法であって、前記の１以上の状態を有する皮膚に、本発明の方法にしたがった任意の組成物を適用する工程を含み、送達される化合物がこうした状態を治療するための既知の化合物であり、そしてこうした状態を治療するための既知の量で送達される方法をさらに提供する。用語「局所適用」は、本明細書において、皮膚表面上に、本発明の組成物を適用するかまたは広げることを意味する。
【０１２９】
本発明の局所組成物中で送達される化合物は、皮膚活性成分を含んでもよい。こうした皮膚活性成分の限定されない例には、本明細書にその全体が援用される、Ｏｂｌｏｎｇらに対する１９９７年１０月３０日公表のＰＣＴ出願ＷＯ  ９７／３９７３３に記載されるものなどのビタミンＢ３化合物；フラボノイド化合物；サリチル酸などのヒドロキシ酸；双性イオン性界面活性剤などの剥離または落屑（ｄｅｓｑｕａｍａｔｏｒｙ）剤；２−エチルヘキシル−ｐ−メトキシシンナメート、４，４’−ｔ−ブチルメトキシジベンゾイル−メタン、オクトクリレン、フェニルベンズイミダゾールスルホン酸などの日焼け止め；酸化亜鉛および二酸化チタンなどの日焼け止めクリーム；抗炎症剤；トコフェロールおよびそのエステルなどの酸化防止剤／ラジカルスカベンジャー；金属キレート剤、特に鉄キレート剤；レチノール、パルミチン酸レチニル、酢酸レチニル、プロピオン酸レチニル、およびレチナールなどのレチノイド；Ｎ−アセチル−Ｌ−システインおよびその誘導体；グリコール酸などのヒドロキシ酸；ピルビン酸などのケト酸；ベンゾフラン誘導体；脱毛剤（例えばスルフィドリル化合物）；皮膚美白剤（例えばアルブチン、コウジ酸、ヒドロキノン、アスコルビン酸およびリン酸アスコルビル塩などの誘導体、胎盤抽出物等）；抗セルライト剤（例えばカフェイン、テオフィリン）；湿潤剤；抗微生物剤；抗アンドロゲン剤；および皮膚保護剤が含まれる。任意の上述の皮膚活性剤の混合物もまた用いてもよい。これらの活性成分のより詳細な説明は、Ｂｌａｎｋらに対する米国特許第５，６０５，８９４号に見られる。好ましい皮膚活性成分には、サリチル酸などのヒドロキシ酸、日焼け止め、酸化防止剤およびその混合物などが含まれる。何らかの美容的、予防的、療法的または他の利点のため、皮膚上に放置することが意図される、スキンローション、クリーム、ジェル、エマルジョン、スプレー、コンディショナー、化粧品、リップスティック、爪磨き等の形で、本発明の組成物を適用することによって、局所適用を実行してもよい。
【０１３０】
本発明のＨＰＰＳナノ粒子を作製する方法
ナノプラットフォームコア装填
本発明は、本発明のＨＰＰＳナノ粒子を作製する方法を提供する。ＬＤＬおよびＨＤＬ粒子内に剤を取り込むための先行技術の方法は、その内容が本明細書に援用される、Ｚｈｅｎｇらに対するＰＣＴ出願公報第ＷＯ  ２００６／０７３４１９号（公開日：  ２００６年７月１３日；  ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１１２８９号）に概略される。
【０１３１】
好ましい態様において、ＨＰＰＳナノ粒子は、例えばトルエン、ベンゼン、ジクロロメタン、および好ましくはクロロホルムなどの有機溶媒中の不飽和コレステロール−エステルと適切なリン脂質を合わせ、その後、溶媒を蒸発させて、そして真空乾燥させることによって、調製される。緩衝液を添加した後、約４０〜６０℃で超音波処理すると、エマルジョンが生じる。上述のような適切な足場ペプチドをエマルジョンに添加すると、球状ＨＰＰＳナノ粒子の好ましい形成が生じる。ＨＰＰＳナノ粒子のコア装填が望ましい場合、コア内に装填すべき剤をまず、リン脂質およびオレイン酸コレステロールと合わせ、そして同じ方法を続ける。
【０１３２】
細胞表面受容体リガンドの付着
ＨＰＰＳナノ粒子コアに活性剤を装填した後、ＨＰＰＳナノ粒子の表面を修飾して、細胞表面受容体リガンドを付着させてもよい。あるいは、活性剤を装填するのと同時に細胞表面受容体リガンドもまた取り込んでもよい。いくつかの態様において、細胞表面受容体リガンドを本発明のＨＰＰＳナノ粒子の足場ペプチドに共有結合させる。
【０１３３】
本発明のＨＰＰＳナノ粒子への細胞表面受容体リガンドの付着は、標準的技術を介して起こりうる。ＨＰＰＳナノ粒子の足場ペプチドは、リジン、システイン、スレオニンなどのコンジュゲート化可能アミノ酸残基を含有してもよい。１つの態様において、リジン残基が存在し、そして既知の化学反応を用いて、細胞表面受容体リガンドにカップリングされる。例えば、緩衝液、すなわちＮａＨ２ＰＯ４／Ｈ３ＢＯ３緩衝液に対してＨＰＰＳナノ粒子を透析することによってｐＨを増加させることで、リジン含有足場ペプチドを有するＨＰＰＳナノ粒子に、リガンド、葉酸を付着させてもよい。次いで、葉酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをＨＰＰＳナノ粒子と室温で１０時間反応させる。反応完了の際、混合物を遠心分離して、いかなる分解ＨＰＰＳナノ粒子も取り除く。最終工程において、未精製ＨＰＰＳ−ＦＡをＥＤＴＡ緩衝液に対して透析して、ｐＨを７．４に調整してもよい。
【０１３４】
驚くべきことに、葉酸およびＥＧＦＲ特異的ペプチドなどの細胞表面受容体リガンドをＨＰＰＳナノ粒子の足場ペプチドにコンジュゲート化しても、リン脂質と会合し、そしてナノキャリアを形成する能力には影響がなかった。また、好ましくは、足場ペプチドのリジン残基に葉酸およびＥＧＦＲ特異的ペプチドをコンジュゲート化すると、ホーミング分子は、両親媒性αらせんの親水性面および疎水性面の間の移行部分またはその近傍に配置される。
【０１３５】
別の態様において、ＨＰＰＳナノ粒子の足場ペプチドへの細胞表面受容体リガンドの共有結合に加えて、細胞表面受容体リガンドはまた、ＨＰＰＳナノ粒子のリン脂質単層内に取り込まれる脂質にこれらの細胞表面受容体リガンドを係留することを介して、ＨＰＰＳナノ粒子の表面上にディスプレイされてもよい。１つの態様において、脂質アンカーは、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［葉酸（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）；  Ａｖａｎｔｉ）であってもよい。
【０１３６】
別の態様において、ＨＰＰＳナノ粒子は、ＳＲ−Ｂ１受容体が仲介する経路を通じて細胞に取り込まれる。ＨＤＬはＳＲ−Ｂ１（１型スカベンジャー受容体、ＨＤＬ受容体としても知られる）をターゲティングし、そして理論によって束縛されることなく、ＨＰＰＳはＨＤＬのＳＲ−Ｂ１特異性を模倣すると考えられる。特定のタイプの癌（例えば乳癌）は、ＳＲ−Ｂ１受容体を有意に過剰発現するため、ＨＰＰＳは悪性細胞を選択的にターゲティングする潜在能力を有する。さらに、ＨＰＰＳナノ粒子を用いて、ＨＤＬに基づくＧｄ−ＭＲＩプローブと同じ方式で、脆弱な斑を画像化してもよい（Ｆａｙａｄ  ｇｒｏｕｐ，  Ｍｔ．  Ｓｉｎａｉ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｆｒｉａｓら  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２００４；  １２６：１６３１６−７；  Ｆｒｉａｓら  Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．  ２００６；  ６：２２０−４）。
【０１３７】
以下の実施例は、ＳＲ−Ｂ１が仲介する経路を通じて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方での、細胞によるＨＰＰＳナノ粒子の取り込みを例示する。ＨＰＰＳ内部移行を伴わないカーゴ輸送の最初の証拠によって、ＨＰＰＳナノキャリアが癌診断剤および療法剤の直接サイトゾル送達に特に有用であることが示唆される。
【０１３８】
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明する。以下の調製および実施例は、当業者が本発明をより明確に理解し、そして実行することを可能にするために提示される。しかし、本発明は、本発明の単一の側面の例示としてのみ意図される、例示態様によって範囲を限定されず、そして機能的に同等である方法が本発明の範囲内である。実際、本明細書に記載するものに加えて、本発明の多様な修飾が、以下の説明および付随する図から、当業者には明らかとなるであろう。こうした修飾は、付随する請求項の範囲内に属すると意図される。
【０１３９】
本明細書に引用する参考文献は各々、その全体が本明細書に援用される。
【実施例】
【０１４０】
実施例１
出発物質の調製
１）サイズ制御ペプチド（ｓｃＰｅｐ）
商業的に入手可能なＮ−α−Ｆｍｏｃ保護アミノ酸、固体支持体としてのＳｉｅｂｅｒアミド樹脂、およびカルボキシル基活性化剤としてのＨＢＴＵ／ＨＯＢｔを用いて、Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）プロトコル（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｇ．ａｓｐ？ｆ＝ＮＢＣ／  ｐｅｐｔｉｄｅｒｅｓ．ｈｔｍ）を用いることによって、Ａｃ−ＤＷＬＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＬＫＥＡＦ（「２Ｆ」）、Ａｃ−ＤＷＦＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＦＫＥＡＦ（「４Ｆ」、本明細書において、「＋４Ｆ」ともまた称される））、およびＡｃ−ＦＡＥＫＦＫＥＡＶＫＤＹＦＡＫＦＷＤ（−４Ｆ）（配列番号５１）を、ペプチド合成装置ＰＳ−３（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）上で合成した。保護された配列の合成後、ペプチド−樹脂のＮ末端Ｆｍｏｃを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％ピペリジンで除去して、末端アミンを曝露させた。次いで、１０％無水酢酸を含むテトラヒドロフラン中の１０％ピリジンで、ＮＨ２−ペプチド−樹脂をキャッピングした。Ａｃ−ペプチド−樹脂を、９５％トリフルオロ酢酸および５％トリイソプロピルシランによってさらに処理して、ペプチド配列上の保護基を除去し、そして固体支持体を切断した。切断した固体樹脂をろ過によって取り除いた後、ろ過物を濃縮し、そして無水エーテルを添加することによって沈殿させてｓｃＰｅｐを得た。トリプトファン（Ｗ）の蛍光を用いて、ＨＰＰＳのｓｃＰｅｐ含量を決定した。当業者に知られる他の方法、例えばアミノ酸分析を用いて、ＨＰＰＳのペプチド含量を決定してもよい。ターゲティングリガンドをコンジュゲート化するため、未結合側鎖アミン基を有するリジン（Ｋ）を用いた。
【０１４１】
２）ＥＧＦＲに対するターゲティングリガンドとしてのＥＧＦＲ特異的ペプチド（ＥＧＦｐ）
ペプチド配列、Ｆｍｏｃ−ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩを合成した。最後のＦｍｏｃ除去後、Ｎ末端ＮＨ２基を含むペプチド、ＮＨ２−ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩを固体支持体から切断した。次いで、３モル当量のスベリン酸ビス−（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）をＤＭＳＯ中のＥＧＦｐのＮ末端にコンジュゲート化して、ＥＧＦｐ−ＮＨＳを形成した。
【０１４２】
３）リン脂質にコンジュゲート化されたＥＧＦｐ（ＥＧＦｐ−脂質）。
【０１４３】
最初のＥＧＦｐを、ＤＩＰＥＡの存在下、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中、１：５のモル比で、スベリン酸ビス（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）と反応させて、ＥＧＦｐ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＧＦｐ−ＮＨＳ）を産生した。次いで、産物ＥＧＦｐ−ＮＨＳを、ＤＭＳＯ中、１：２のモル比で、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］アミン（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）アミン、Ａｖａｎｔｉ）とインキュベーションした。室温で穏やかに混合しながら６時間インキュベーションした後、試料を過剰なジエチルエーテルで洗浄した。沈殿物をさらに３回、ジエチルエーテルで洗浄して、いかなる未反応ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）アミンも除去した。最終産物を含有する沈殿物を乾燥させて、そしてメタノール中で再懸濁した。
【０１４４】
４）診断および／または療法適用のため、ＨＰＰＳナノ粒子内に取り込むのに適した化合物を図２に示し、そしてこれには近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）画像化プローブＤｉＲ−ＢＯＡ（１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドトリカルボシアニンヨウ化物ビス−オレエート）およびＤＩＲ（１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドトリカルボシアニンヨウ化物）が含まれる。ＤｉＲ−ＢＯＡおよびＤＩＲを、ＨＰＰＳのため、それぞれコア装填および表面装填ＮＩＲＦプローブとして合成してもよい。これらの２つの色素は、類似の吸収および放出波長励起を有する（励起７４８ｎｍ、放出７８２ｎｍ）。
【０１４５】
５）リン脂質
ＨＰＰＳ調製に適したリン脂質には、限定されるわけではないが、ＤＭＰＣ（ｌ，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＰＯＰＣ（１−パルミトイル−１−オレオイル−ホスファチジルコリン）およびＥＹＰＣ（卵黄ホスファチジルコリン）が含まれる。すべてのリン脂質をＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ  Ｉｎｃ．（米国アラバマ州アラバスター）より購入した。
【０１４６】
実施例２
ＨＰＰＳナノ粒子調製法
ＨＰＰＳは、ｔｒｉｓ−生理食塩水（１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）などの水性緩衝液中で完全に可溶性である巨大分子複合体である。以下に概略する実験すべてにおいて、ＨＰＰＳの溶媒として、Ｔｒｉｓ−生理食塩水緩衝液を用いた。
【０１４７】
１）ＨＰＰＳ：  試験管中、０．５ｍＬのクロロホルム中に、３μｍｏｌのＤＭＰＣおよび０．３μｍｏｌのオレイン酸コレステリルを溶解した。Ｎ２を用いて、溶媒をゆっくりと蒸発させ、そして高真空によってさらに乾燥させた。その後、１ｍＬの緩衝液（０．１Ｍ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を、乾燥した試験管に添加し、そして５０℃で１時間超音波処理して、エマルジョンを形成した。ｓｃＰｅｐ  ０．８μｍｏｌを溶液に添加して、ＨＰＰＳ粒子を形成した。次いで、迅速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によって粒子を精製した。ＦＰＬＣ法を以下に記載する。
【０１４８】
２）ＤｉＲ−ＢＯＡコア装填ＨＰＰＳ（（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ）：  試験管中、０．５ｍＬのクロロホルム中に、３μｍｏｌのＤＭＰＣおよび０．３μｍｏｌのオレイン酸コレステリルおよび０．２５μｍｏｌのＤｉＲ−ＢＯＡを溶解した。Ｎ２を用いて、溶媒をゆっくりと蒸発させることによって、溶媒を除去し、そして高真空によってさらに乾燥させた。次いで、１ｍＬの緩衝液（０．１Ｍ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を、乾燥した試験管に添加し、そして５０℃で１時間超音波処理して、エマルジョンを形成した。ｓｃＰｅｐ  ０．８μｍｏｌを溶液に添加して、（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ粒子を組み立てた。次いで、ＦＰＬＣによって粒子を精製した。
【０１４９】
３）ＤｉＲ表面標識ＨＰＰＳ（ＤｉＲ−ＨＰＰＳ）：  Ｐｉｔａｓら［Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １９８５，  １００，  １０３−１１７］に記載される元来の方法に基づく修飾法を用いて、ＨＰＰＳを、親油性近赤外色素ＤｉＲ（１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドトリカルボシアニンヨウ化物）（励起７４８ｎｍ、放出７８２ｎｍ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．、オレゴン州ユージーン）で標識した。簡潔には、１ｍＬジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に３ｍｇ（３．２μｍｏｌ）のＤｉＲを溶解することによってＤｉＲのストック溶液を調製し；  ０．１ｍＬのストックを０．５ｍＬのＨＰＰＳ溶液（３０μＭ）に添加して、４０のＤｉＲ対１の粒子の最終モル比を得た。この混合物を暗所、３７℃で１８時間インキュベーションした後、超遠心（４９，０００ｒｐｍ、２０時間、４℃、Ｂｅｃｋｍａｎ  ５０Ｔｉローター）によって、ＤｉＲ表面標識ＨＰＰＳ（ＤｉＲ−ＨＰＰＳ）を単離し、０．０１％ＥＤＴＡを含有する生理食塩水に対して透析し、そしてろ過滅菌した（０．４５μｍ、Ｗａｔｅｒ  Ｍｉｌｌｅｘ  ＨＶ装置）。ＨＰＰＳ濃度（３２０ｎｍでのトリプトファン蛍光に基づくペプチド濃度）およびＤｉＲ濃度（７８２ｎｍでのＤｉＲ蛍光に基づく）をチェックすることによって、ＤｉＲ−ＨＰＰＳ中のＤｉＲ装填を決定した。
【０１５０】
４）（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ用のターゲティングリガンドとしてのＥＧＦｐコンジュゲート化ｓｃＰｅｐ、ＥＧＦｐ−（ＤｉＲ−ＢＯＡ）−ＨＰＰＳ（１型ＥＧＦＲターゲティング化ＨＰＰＳ）：  図３に示すプロトコルにしたがって、ＥＧＦｐコンジュゲート化ＤｉＲ−ＢＯＡコア装填ＨＰＰＳ（（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ）を合成した。簡潔には、３μｍｏｌのＤＭＰＣ、０．２μｍｏｌのオレイン酸コレステリルおよび０．４０μｍｏｌのＤｉＲ−ＢＯＡを試験管中のクロロホルム中に溶解した。Ｎ２でゆっくりと蒸発させることによって溶媒を除去し、そしてさらに高真空で乾燥させた。その後、１ｍＬの緩衝液を、乾燥した試験管に添加し、そして５０℃で１時間超音波処理して、エマルジョンを形成した。次いで、ｓｃＰｅｐを溶液に添加して、（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ粒子を組み立てた。４℃で、それぞれ、０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．１Ｍ  Ｈ３ＢＯ３緩衝液、ｐＨ＝９．０、１０．０、１０．９に対して透析することによって、この粒子溶液のｐＨを８．０から１０．９に段階的に増加させた。次いで、活性リガンド分子（１．８μｍｏｌ）、例えば無水ＤＭＳＯ中のＥＧＦｐ−ＮＨＳまたはＦＡ−ＮＨＳを粒子溶液に添加して、そして反応混合物を室温で振盪装置上に置いた。６時間反応させた後、混合物を４℃、５００ｒｐｍで遠心分離して、いかなる沈殿物も除去しそして続いてＥＤＴＡ緩衝液（０．３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に対して４℃で一晩透析した。透析の経過に渡って、ＥＧＦｐ−（ＤｉＲ−ＢＯＡ）−ＨＰＰＳのｐＨを７．４に戻し、そして未反応リガンド出発物質を除去した。分光光学的に検出可能な遊離リガンドが存在しなくなるまで、この透析法を反復した。次いで、粒子をＦＰＬＣによって精製した（ＦＰＬＣ法を以下に説明する）。
【０１５１】
５）（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ用のターゲティングリガンドとしてのＥＧＦｐ−脂質、ＥＧＦｐ−脂質（ＤｉＲ−ＢＯＡ）−ＨＰＰＳ（２型ＥＧＦＲターゲティング化ＨＰＰＳ）：  図４に示すように、ＥＧＦｐ−脂質（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳを調製する方法は、（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳのものと類似である。唯一の違いは、ナノ粒子配合物中、０．１８μｍｏｌのＥＧＦｐ−脂質（ＥＧＦペプチドコンジュゲート化リン脂質）を３μｍｏｌのＤＭＰＣに添加することであった。
【０１５２】
６）（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ用のターゲティングリガンドとしての葉酸コンジュゲート化ｓｃＰｅｐ、ＦＡ−（ＤｉＲ−ＢＯＡ）−ＨＰＰＳ（１型ＦＲターゲティング化ＨＰＰＳ）：  図３に記載するプロトコル（ＥＧＦｐを葉酸−ＮＨＳと交換する）にしたがって、ＦＡ−（ＤｉＲ−ＢＯＡ）−ＨＰＰＳを合成した。
【０１５３】
７）（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ用のターゲティングリガンドとしての葉酸−脂質、ＦＡ−脂質（ＤｉＲ−ＢＯＡ）−ＨＰＰＳ（２型ＦＲターゲティング化ＨＰＰＳ）：  図４に記載するプロトコル（ＥＧＦｐ−脂質を葉酸−脂質と交換する）にしたがって、ＦＡ−脂質（ＤｉＲ−ＢＯＡ）−ＨＰＰＳを合成した。
【０１５４】
８）（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ用のターゲティングリガンドとしての全長ＥＧＦ、（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ：  全長組換えヒトＥＧＦをＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．（米国ミネソタ州ミネアポリス）から購入した。１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］マレイミド（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）マレイミド）としてリン脂質含量３０％で、ＨＰＰＳを上述のように配合した。ＥＧＦをＴｒａｕｔ試薬（２−イミノチオラン塩酸）（Ｓｉｇｍａ）とｐＨ９．０でインキュベーションして、ＥＧＦに反応性スルフィドリル基を導入した。次いで、スルフィドリル−ＥＧＦ（１６ｎｍｏｌ）をＨＰＰＳ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）マレイミド）（０．１μｍｏｌ）と、反応体積１ｍＬ中、室温で２４時間反応させた。インキュベーション期間後、ＥＧＦ−ＨＰＰＳをＦＰＬＣによって精製した。
【０１５５】
実施例３
４Ｆを用いて調製されたＨＰＰＳナノ粒子の性質決定
１．粒子およびペイロード安定性：  粒子およびペイロード安定性は、ナノ粒子に基づくすべての薬剤送達系に必須である。慣用的な脂質に基づくナノキャリア（例えばリポソームおよび脂質エマルジョン）は、極小サイズ（＜２５ｎｍ）では安定性を維持しえない。本発明のＨＰＰＳナノキャリア系は、驚くべき安定性を示す。表４に示すように、動的光散乱（以下を参照されたい）および蛍光分光測定によって決定すると、１ヶ月に渡って、ＨＰＰＳはそのサイズおよびＤｉＲ−ＢＯＡペイロードを維持する。４℃で保存した後、ペイロード漏洩は観察されなかった。以下の表中のパーセントは、示すサイズを有するナノ粒子集団の比率を示すことに注目されたい。
【０１５６】
表４．粒子安定性
【０１５７】
【表４】
0005658568.tif 000008
【０１５８】
注：表は、平均サイズ、組成パーセントおよびＤｉＲ−ＢＯＡ蛍光強度を示す。
【０１５９】
ＥＧＦペプチド、全長ＥＧＦ、およびＦＡをターゲティングリガンドとして用いた際、３つの配合物すべての安定性は、１ヶ月に渡って同程度であるようであった。
【０１６０】
２．粒子性質決定：４つの方法を用いて、ＨＰＰＳナノキャリアを性質決定した：１）迅速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、２）動的光散乱（ＤＬＳ）（ナノサイズ決定装置）、３）透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）および４）円二色性（ＣＤ）。
【０１６１】
方法
電子顕微鏡研究。デジタル画像獲得系を装備した最新のＨｉｔａｃｈｉ  Ｈ−７０００透過型電子顕微鏡を用いて、ＨＰＰＳナノ粒子の水性分散の形態およびサイズを決定した。５マイクロリットルのＨＰＰＳナノ粒子懸濁物を炭素コーティング２００メッシュ銅グリッド上に置き、そして５分間放置した。過剰な試料をレンズペーパーで取り除き、そして５μＬの２％飽和水性酢酸ウラニルを適用し、そして２０秒間放置した。次いで、ろ紙で染色剤を吸い取り、そしてグリッドを空気乾燥した後、デジタル画像を撮影した。すべての電子顕微鏡サプライを、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ペンシルバニア州フォートワシントン）より購入した。
【０１６２】
動的光散乱。６３３ｎｍおよび９０°の検出装置角度で稼働する４．０ｍＷ  Ｈｅ−Ｎｅレーザーを利用して、光散乱光子相関分光法（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−ＺＳ９０；  Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英国マルバーン）によって、ＨＰＰＳ粒子の粒子サイズ分布を測定した。球状粒子がブラウン運動を経ると仮定して、データをモデリングした。
【０１６３】
迅速タンパク質液体クロマトグラフィー。粒子形成後、Ａｋｔａ迅速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）系（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ペンシルバニア州ピッツバーグ）とともにＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（６０ｘ１６ｃｍ）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーによって、所望のサイズのＨＰＰＳ粒子を精製した。流速１ｍＬ／分のＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を用いて粒子を溶出させた。その保持時間を、既知の直径を持つタンパク質：サイログロブリン（１７．０ｎｍ）、アポフェリチン（１２．２ｎｍ）、カタラーゼ（１０．４ｎｍ）、ウシ血清アルブミン（７．１ｎｍ）、アルファ−キモトリプシン（４．２ｎｍ）、およびリボヌクレアーゼＡ（３．８ｎｍ）の保持時間と比較することによって、溶出粒子サイズを決定した。
【０１６４】
円二色性（ＣＤ）分光法。Ｊａｓｃｏ  Ｊ−８１５  ＣＤ分光計を用いて、ＨＰＰＳ粒子の遠紫外ＣＤスペクトルを記録した。２６０〜１９０ｎｍまで、１ｎｍ段階サイズ、２５℃でＣＤスペクトルを記録した。連続５スキャンに渡ってデータを収集し、そして平均した。２２２ｎｍの楕円率の変化によって、ＳｃＰｅｐのアルファらせん二次構造を監視した。
【０１６５】
図５は、４Ｆを用いて調製した非ターゲティング化ＤｉＲ−ＢＯＡ装填ＨＰＰＳのＦＰＬＣ、ＤＬＳおよびＣＤを示す。ＦＰＬＣ（図５Ａ）から、図５Ｂに示すように、ＨＰＰＳ粒子の異なる集団を収集してもよい。ＦＰＬＣ分画のＣＤ分析によって、ｓｃＰｅｐ（アルファらせんサインの存在）の強い関連が明らかになる。より小さい粒子に関しては、アルファらせんがより高い含量に向かう傾向があることがわかる。図６は、ＦＰＬＣ測定がＴＥＭと一致することを示す。ＴＥＭは、粒子が６０分で溶出することを示す。ＦＰＬＣは、狭い分布の高収量の粒子を示す。ＴＥＭは、ＨＰＰＳ粒子が、単分散球状形態を有することを確認する。ＦＰＬＣ、ＴＥＭおよびＤＬＳデータ（未提示）によって、ＥＧＦｐコンジュゲート化ＨＰＰＳ粒子が、直径１１〜１４ｎｍの範囲であることが示される。
【０１６６】
３．  ＨＰＰＳサイズに対するＤｉＲ−ＢＯＡ装填およびターゲティングリガンドの影響：  ＨＰＰＳのサイズをＤｉＲ−ＢＯＡペイロードによって調節可能であることが見出された。ここに例を挙げる：２つのＨＰＰＳ配合物を以下に示すように調製した。
【０１６７】
【表５】
0005658568.tif 000009
【０１６８】
図７に示すように、各調製に関して、ＦＰＬＣプロフィールの個々の分画を収集した。ＤＩＲ−ＢＯＡがより低い装填で含まれる配合物（＃１）は、より小さいＨＰＰＳ粒子をより均一な分布で生じた。配合物＃２は、より高いＤｉＲ−ＢＯＡペイロード（収集された分画のより強い青色着色によって示されるもの）および粒子のより不均一な集団を有する。これらのＨＰＰＳ粒子のサイズは、配合物＃１のものより大きかった。これらの発見によって、ＨＰＰＳ粒子のサイズをカーゴ（ＤＩＲ−ＢＯＡ）装填によって調節／調整可能であることが示唆される。
【０１６９】
粒子をより高い用量のＤｉＲ−ＢＯＡと配合すると、ＨＰＰＳ粒子サイズが増加することを考慮すれば、配合物に添加するコア構成要素（ＤｉＲ−ＢＯＡおよびコレステロール−エステル）の量を調節することによって、ＨＰＰＳ「最終産物」のサイズに対して、ある程度の制御を達成可能である。したがって、コア構成要素の用量を増加／減少させると、ＨＰＰＳ粒子のサイズ増加／減少が生じるであろう。これは図７Ｃに立証される。ＨＰＰＳのサイズおよびそのＤｉＲＢＯＡペイロード間には、強い陽性相関係数が決定される（Ｒ＝０．９１）。
【０１７０】
ＨＰＰＳのターゲティングリガンドとしてＥＧＦペプチドおよび全長ＥＧＦを用いた場合、形成されるＨＰＰＳ粒子は、ＦＡで調製されるものよりわずかにより小さかった（３〜５ｎｍ）。該ペプチドおよび全長ＥＧＦは、ＨＰＰＳのサイズを収縮するようであった。
【０１７１】
４．  ４Ｆおよび−４Ｆで形成される（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの比較：
上述のように、３．０μｍｏｌ  ＤＭＰＣ、０．２μｍｏｌオレイン酸コレステリル、０．２μｍｏｌ  ＤｉＲ−ＢＯＡ、および２ｍｇの４Ｆまたは−４Ｆのいずれかを用いて、（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳナノ粒子を調製した。
【０１７２】
図８（ａ）に示すように、ＦＰＬＣプロフィールは、−４Ｆ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳに関しては１つのピークのみ、そして４Ｆ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳに関しては２つのピークを示す。したがって、４Ｆおよび−４Ｆはどちらも、均一なナノ粒子を形成するのに使用可能である。
【０１７３】
図８（ｂ）に示すように、ＴＥＭ画像化によって、−４Ｆで形成される（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの球状形状が４Ｆで形成される（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳよりもより均質であることが明らかになる。
【０１７４】
実施例４
ＨＰＰＳのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ評価
別に示さない限り、これらの研究で用いるｓｃＰｅｐは、４Ｆであった。
【０１７５】
ＨＰＰＳの濃度を以下に記載する場合、これらは、ＨＰＰＳによって運搬されるＤｉＲ−ＢＯＡの濃度を指す。［ＤｉＲ−ＢＯＡ］を決定するため、ＤｉＲ−ＢＯＡ濃度に対してＤｉＲ−ＢＯＡ蛍光の標準曲線をプロットした。クロロホルム−メタノール（２：１、ｖ：ｖ）で、ＨＰＰＳ粒子からＤｉＲ−ＢＯＡを抽出した。抽出を２回反復し、そしてクロロホルム層をプールして、そして高速真空で乾燥させた。残渣を１ｍＬのクロロホルム−メタノール（２：１、ｖ：ｖ）に再懸濁し、そして蛍光計上で蛍光を読み取った。蛍光読み取りから、ＨＰＰＳ粒子中のＤｉＲ−ＢＯＡ濃度を標準曲線より決定可能であった。
【０１７６】
また、ペプチド濃度に基づいて、ＨＰＰＳ濃度を決定してもよい。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ハーキュルス）によって、ＨＰＰＳのペプチド濃度を決定してもよい。こうした計算において、各ＨＰＰＳ粒子が２２ペプチドを含有すると仮定された。
【０１７７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験に関しては、ＨＰＰＳを投与するのに用いた緩衝液はｔｒｉｓ−生理食塩水であった。注射体積は典型的には２５０〜３５０μＬであった。
【０１７８】
実験動物および異所性腫瘍の誘導。多様な腫瘍異種移植モデルを以下に記載する。ここで、本発明者らは、腫瘍異種移植片を所持するマウスを用意するのに用いる一般的な方法を提示する。成体雌ヌードマウス（８〜１２週齢）には、研究期間中、自由に食物および水へのアクセスを与えた。癌細胞（典型的にはＰＢＳ中、３ｘ１０６）をヌードマウスの右脇腹内に皮下接種した。腫瘍接種１〜３週間後、マウス（およそ５ｍｍの腫瘍サイズを持つ）を、指定された研究に用いた。
【０１７９】
Ａ．  ＥＧＦｐ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ（１型ＥＧＦＲターゲティング化ＨＰＰＳ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究：  異なるＥＧＦＲ発現レベルを持つ癌細胞（Ａ５４９およびＭＴ１：高発現、ＨｅｐＧ２：中程度の発現、Ｈ５２０：低発現）に対して、共焦点顕微鏡研究を用いて、ＥＧＦｐ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳのＥＧＦＲターゲティング特異性を調べた。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１０００レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて、共焦点研究を行った。Ａ５４９、ＭＴ１およびＨ５２０細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ  １６４０細胞培地０．２ｍＬ中、３μＭのＥＧＦｐ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ（ここに提示する濃度、ならびに以下のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ実験中の濃度は、ＤｉＲの濃度である）とインキュベーションした。図９に示すように、５時間および２４時間のインキュベーション後、Ａ５４９およびＭＴ１細胞は、Ｈ５２０細胞より、より高いＥＧＦｐ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ取り込みを有することが示され、ＨＰＰＳのＥＧＦＲターゲティング特異性が示される。
【０１８０】
フローサイトメトリー研究を用いて、ＥＧＦｐ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳのＥＧＦＲ特異性をさらに確認した。これらの研究において、細胞をＥＧＦｐ（ＤｉＲＢＯＡ）ＨＰＰＳと３〜２４時間インキュベーションし、そして次いで、ＦＶ５００フローサイトメーター上で分析した。図１０は、１．１μＭのＥＧＦｐ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳとインキュベーションした後、Ｈ５２０細胞に対してＭＴ−１細胞でＨＰＰＳ取り込みがより高いことを示す。図１１は、競合的阻害剤として過剰なＥＧＦｐ（１０μＭ）を用いると、ＭＴ−１細胞におけるＨＰＰＳの取り込みが減少したことを例示する。
【０１８１】
Ｂ．  ＥＧＦｐ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳのｉｎ  ｖｉｖｏ研究
ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＮＩＲ蛍光画像化。ＥＧＦｐ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳを、２５０μＬ  ｔｒｉｓ−生理食塩水中、５．２ｎｍｏｌの濃度で、尾静脈注射によって、マウスに投与した。注射前、注射１時間後、５時間後、および２４時間後に、ｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光画像化を行った。蛍光画像は、ＣＲＩ  ＭａｅｓｔｒｏＴＭ  ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化系で得られた。マウスをケタミン／アセプロマジン（５０／５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）で麻酔し、そしてＭａｅｓｔｒｏイメージャーの光を通さないチャンバー内にうつぶせに入れた。深紅のフィルター（励起＝６７１〜７０５ｎｍ、放出＝７５０ｎｍ長光路（１０ｎｍ段階で７３０〜９５０））および１５０ｍ秒の曝露時間で蛍光画像を得た。代表的な画像を図１２に示す。２４時間までに、ＭＴ１腫瘍内の蛍光強度は、明らかに可視であり、ＥＧＦＲ発現腫瘍によってＨＰＰＳが優先的に取り込まれることが示される。
【０１８２】
生体分布研究のため、マウス（ＥＧＦｐ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの注射２４時間後）の臓器／組織（ＭＴ−１腫瘍、肝臓、脾臓、心臓、筋肉、腎臓および副腎）を採取し、重量測定し、そしてＰＢＳ中でホモジナイズした。次いで、ホモジネートを、３倍過剰のＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ（２：１）混合物と合わせ、そして２分間ボルテックスした。続いて、溶液を３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。Ｈｏｒｉｂａ  ＪｏｂｉｎＹｖｏｎ  Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ−４分光蛍光計を用いて、多様な試料の蛍光強度を測定した（励起７４８ｎｍ；放出７８２ｎｍ）。試料重量に対して蛍光シグナルを標準化し、そして筋肉および腫瘍組織に対して比を示す（図１２を参照されたい）。
【０１８３】
Ｃ．  ＥＧＦｐ−脂質（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ（２型ＥＧＦＲターゲティング化ＨＰＰＳ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究：  Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ  ５００シリーズ・フローサイトメトリー系（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｉｎｃ．、カナダ・オンタリオ州ミソソーガ）で一連のフローサイトメトリー実験を行って、ＥＧＦｐ−脂質（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳのＥＧＦＲ特異性を評価した。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０細胞培地０．２ｍＬ中で細胞培養実験を行った。まず、図１３に示すように、１．１μＭのＥＧＦｐ−脂質（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳと３時間インキュベーションした後、Ａ５４９細胞は、Ｈ５２０細胞に比較して、ＨＰＰＳのはるかにより高い取り込みを有した。これらの結果によって、Ａ５４９細胞におけるＥＧＦｐ−脂質（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳのＥＧＦＲ特異的集積が示唆される。異なるＥＧＦＲ発現レベルを含む細胞株におけるＨＰＰＳの時間依存性取り込みを示す図１４において、ＥＧＦＲ特異性がさらに立証された。
【０１８４】
ＥＧＦｐ−脂質（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳのＥＧＦＲ特異性のさらなる証拠を図１５に示した。９倍過剰のＥＧＦｐを使用すると、高レベルまたは中程度のレベルのＥＧＦＲを発現している細胞において、この２型ＥＧＦＲターゲティング化ＨＰＰＳの取り込みが明らかに阻害され（右）、これは、１型ＥＧＦＲターゲティング化ＨＰＰＳから得られる結果（左）と一致する。
【０１８５】
Ｄ．  ＥＧＦｐ−脂質（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳのｉｎ  ｖｉｔｒｏ予備的毒性研究：  これらの生体適合性ナノキャリアが実際に非毒性であることを確認するため、ＭＴＴおよびフローサイトメトリーアッセイを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性研究を行った。毒性を評価するため、フローサイトメトリーによって、Ａ５４９細胞における濃度依存性ＨＰＰＳ取り込みを研究した。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ  １６４０細胞培地０．２ｍＬ中で、細胞培養実験を行った。すべての先の研究で用いたＥＧＦｐ−脂質（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの標準的薬剤用量は１．１μＭであるため、薬剤用量を増加させることによって、ＥＧＦｐ−脂質（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの細胞内取り込みを調べた。図１６ｃに示すように、標準的用量の２倍（２．２μＭ）で取り込み飽和が生じた。したがって、毒性評価のため、６倍用量（６．６μＭ）までを用いることが決定された。図１６ａ（ＭＴＴアッセイ）および１５ｂ（フローサイトメトリーアッセイ）で見られうるように、ＭＴＴおよびフローサイトメトリー実験の両方で毒性はまったく観察されなかった。
【０１８６】
Ｅ．  ＥＧＦｐ−脂質（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳのｉｎ  ｖｉｖｏ研究：  ＥＧＦｐ−脂質（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳのｉｎ  ｖｉｖｏ性能を評価するため、いくつかの腫瘍モデルを調べた。
【０１８７】
１）ＭＴ１腫瘍異種移植：  １．８ｎｍｏｌ（２５０μｌ  ｔｒｉｓ−生理食塩水）のＥＧＦｐ−脂質（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの静脈内注射後のいくつかの時点で、ＣＲＩ  ＭａｅｓｔｒｏＴＭイメージャーによって、ＭＴ１腫瘍を持つ雌ヌードマウスを調べた（図１７）。画像化法に関しては、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＥＧＦｐ（ＤＩＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ研究セクション４Ｂを参照されたい。時間経過に渡って、ＭＴ１腫瘍異種移植片において、ナノ粒子が優先的に集積することが示され、２４〜４８時間で最大に達した。７２時間で、ＨＰＰＳは腫瘍領域から一掃され始めた。
【０１８８】
２）ヒト肺初代腫瘍異種移植：  ＥＧＦＲを発現する初代腫瘍異種移植片において、ＥＧＦｐ−脂質（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ（１．８ｎｍｏｌ）のｉｎ  ｖｉｖｏ性能もまた評価した。図１８に示すように、上列は、腎臓上の初代腫瘍を示し、一方、下列は、胸部上の初代腫瘍を示した。ｉｎ  ｖｉｖｏリアルタイムＮＩＲ蛍光画像化を用いると、ＨＰＰＳ粒子は、注射後２４時間の期間に渡って、両方の初代腫瘍部位に集積することが明らかである。切除組織および腫瘍を画像化することによってもまた結果を検証した。全動物画像化に類似の方式で、ｅｘ  ｖｉｖｏ組織／腫瘍画像化を行った（深紅のフィルター（励起＝６７１〜７０５ｎｍ、放出＝７５０ｎｍ長光路（１０ｎｍ段階で７３０〜９５０））および１５０ｍ秒の曝露時間を用いて、Ｍａｅｓｔｒｏイメージャー上で蛍光画像を獲得した）。
【０１８９】
Ｆ．  ＦＡ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳのｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究：  ＦＡ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの葉酸受容体（ＦＲ）ターゲティングを検証するため、ＨＰＰＳを、ＦＲを発現する細胞（ＫＢ細胞、ヒト類表皮癌細胞）およびＦＲを欠く細胞（ＨＴ−１０８０細胞、ヒト線維肉腫細胞）とインキュベーションした。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ  １６４０細胞培地０．２ｍＬ中で細胞培養実験を行った。共焦点画像化研究（図１９）によって、ＦＡ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ（１１００ｎｇ／ｍＬ）と４時間インキュベーションした後、ＫＢ細胞細胞質全体に強いＤｉＲ−ＢＯＡ蛍光が見られ、ＦＲターゲティング化ＨＰＰＳナノ粒子の高い取り込みが示された（上列）。ＦＲが仲介するＦＡ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの取り込みを、さらなる対照実験によって確認した。まず、ＫＢ細胞を過剰なＦＡと一緒にＦＡ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳとインキュベーションすると、ＦＡ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの取り込みは、ＦＡによって競合的に阻害された（中列）。第二に、ＨＴ−１０８０細胞（ＦＲ陰性）には有意な蛍光は存在せず、ＦＡ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの貪欲な取り込みは、ＦＲが仲介するプロセスに依存すると示唆される（下列）。総合すると、これらの知見は、ＦＡ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳがＦＲに有効にターゲティングされた強い証拠を提供する。
【０１９０】
Ｇ．  −４Ｆで形成される（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ（「（−４Ｆ）（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ」）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究：  ＨＤＬは、ＳＲ−Ｂ１（１型スカベンジャー受容体、ＨＤＬ受容体としても知られる）をターゲティングし、そしてこれに結合する。ＨＰＰＳがＨＤＬのＳＲ−Ｂ１特異性を模倣可能であり、そしてＨＰＰＳのコア構成要素は、ＳＲ−Ｂ１受容体が仲介する経路によって細胞に取り込まれうると考えられた。
【０１９１】
（−４Ｆ）（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳナノ粒子を、実施例３、パート４に示すように調製した。２つの細胞株：  ｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１）として知られるＳＲ−Ｂ１＋細胞株およびＬＤＬＡ７（Ｋｒｉｅｇｅｒ、ＭＩＴ）として知られるＳＲ−Ｂ１−細胞株を用いて、ＨＰＰＳのコア物質（ＤｉＲＢＯＡ）がＳＲ−Ｂ１経路を通じて細胞によって取り込まれるという仮説を検証した。カルボキシフルオレセイン標識リン脂質（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＦ）（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［ポリ（エチレングリコール）２０００−Ｎ’−カルボキシフルオレセイン］）を用いて、ＳＲ−Ｂ１に結合した後のＨＰＰＳのリン脂質構成要素の運命を追跡した。同様に、フルオレセイン標識４Ｆペプチドを用いて、ペプチド構成要素の運命を追跡した（図２０）。
【０１９２】
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＦをＡｖａｎｔｉ  Ｌｉｐｉｄｓから購入した。製造者の指示によって示唆されるように、ＨＰＰＳのフルオレセイン標識を行った。簡潔には、上述のようにＨＰＰＳを調製し、そして０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９に対して透析した。ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）を１ｍｇ／ｍＬの濃度で無水ＤＭＳＯに溶解した。次いで、ＦＩＴＣを１：１（ＦＩＴＣ：ＨＰＰＳペプチド）のモル比でＨＰＰＳに添加した。ＨＰＰＳ溶液を穏やかにそして連続して攪拌しながら、ＦＩＴＣを非常にゆっくり添加した。ＨＰＰＳ−ＦＩＴＣ溶液を暗所でインキュベーションして、そして反応を４℃で８時間続けた。この反応期間後、ＨＰＰＳをＴｒｉｓ緩衝生理食塩水に対して透析し、そしてＦＰＬＣによって未結合ＦＩＴＣを除去した。
【０１９３】
その間に、カーゴの運命を追跡するため、オレイン酸コレステリルを含むＨＰＰＳ内に近赤外蛍光プローブＤＩＲ−ＢＯＡをコア装填した。ＨＤＬに基づく競合的阻害を用いて、フローサイトメトリーによって、ＳＲ−Ｂ１＋細胞によるＨＰＰＳカーゴの特異的取り込みを定量化した。共焦点画像化によって、各ＨＰＰＳ構成要素の細胞内運命を視覚化した。共焦点顕微鏡によって生成された三次元画像は、各標識構成要素が細胞の表面上にあってもまたは内部（細胞内区画）にあっても、その運命を位置決定することを可能にする。
【０１９４】
図２１は、ＳＲ−Ｂ１受容体の（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの特異性を立証する。簡潔には、ＳＲ−Ｂ１陽性および陰性細胞（それぞれ、ｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１）およびＬＤＬＡ７）、各々２０，０００を、ＬＤＬＡ７に関してはＨａｍｓ  Ｆ−１２培地（１％Ｐｅｎｎ／ｓｔｒｅｐ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび５％ＦＢＳ）中で、そしてｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１）に関してはＨａｍｓ  Ｆ−１２および＋３００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８中で培養した。次いで、これらの細胞を（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ粒子（１１００ｎｇ／ｍＬ）と３時間インキュベーションした。さらなる阻害実験において、細胞を（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳおよびＨＤＬ（５０モル濃度過剰；４００μｇ；２．２ｘ１０−４Ｍ）に曝露した。３時間インキュベーションした後、共焦点画像は、ＳＲ−Ｂ１陽性細胞（ｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１））中で（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの強い取り込みを示すが、ＳＲ−Ｂ１陰性細胞（ＬＤＬＡ７）中では示さない。さらに、過剰なＨＤＬは、ｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１）細胞における（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ取り込みを有効に阻害する。
【０１９５】
図２２は、ＳＲ−Ｂ１に結合した後のＨＰＰＳの各構成要素の運命を例示する。同様に、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ  １６４０細胞培地中で２０，０００細胞（ｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１））を培養した。ＦＩＴＣ−脂質またはＦＩＴＣ−（−４Ｆ）（ＤｉＲＢＯＡ）ＨＰＰＳ（１１００ｎｇ／ｍＬ）を細胞と１時間インキュベーションした。
【０１９６】
その後、共焦点画像化を用いて、ｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１）細胞とのインキュベーション後のＦＩＴＣ−脂質（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳおよびＦＩＴＣ−（−４Ｆ）（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの各構成要素の細胞内局在を同定した。ＨＰＰＳは、ＳＲ−Ｂ１と結合可能であり、そしてサイトゾル内にＤｉＲ−ＢＯＡを直接放出する一方、大部分の標識−４Ｆペプチドおよびリン脂質は、細胞表面上にあるままであることが見出された。
【０１９７】
ＨＰＰＳナノ粒子からのＤｉＲ−ＢＯＡの放出を図２３にさらに示す。ｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１）と（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳを３時間インキュベーションした後、ＤｉＲ−ＢＯＡからの蛍光シグナルは、未洗浄細胞のサイトゾル内でのみ観察可能である。ＤｉＲ−ＢＯＡはＨＰＰＳの小さいコア中で自己消光効果を経験するため、細胞外ではほとんどまたはまったくＤｉＲ−ＢＯＡシグナルは見られない。（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳがひとたびＳＲ−Ｂ１に結合して、そしてターゲット細胞においてＤｉＲ−ＢＯＡを放出したならば、ＤｉＲ−ＢＯＡシグナルのシグナル強度が増加する。細胞の細胞内体積がはるかに大きいため、ＤＩＲ−ＢＯＡ分子がサイトゾル全体に分散することが可能になり、そしてしたがって、自己消光効果が克服される。
【０１９８】
フローサイトメトリー研究を用いて、ＳＲ−Ｂ１＋およびＳＲ−Ｂ１−細胞株における（−４Ｆ）（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ取り込みを評価した。５ｘ１０５細胞／ウェルを１２ウェルプレート中で２〜３日間培養した。１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０培地を細胞培地として用いた。多様な条件下で細胞を５時間処理した。ＦＣ５００を用いて、細胞蛍光強度を測定した。
【０１９９】
粒子の取り込みに対する−４Ｆペプチドの影響を研究するため、ＳＲ−Ｂ１＋およびＳＲ−Ｂ１−細胞株において、ＤｉＲ−ＢＯＡ、ＤＭＰＣおよび−４Ｆから作製されるＨＰＰＳを、ＤｉＲ−ＢＯＡおよびＤＭＰＣから作製されるエマルジョンと比較した。ＤｉＲ−ＢＯＡの最終濃度は１，１００ｎｇ／ｍＬであった。
【０２００】
図２４は、（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ粒子の効率的な細胞取り込みのため、−４Ｆが必要であることを示す。（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの１１００ｎｇ／ｍＬ溶液およびＤｉＲ−ＢＯＡのペプチド不含エマルジョンをｌｄｌＡ（ＳＲ−Ｂ１）およびＬＤＬＡ７細胞に３時間曝露した。ＬＤＬＡ７に関してはＨａｍｓ  Ｆ−１２培地（１％Ｐｅｎｎ／ｓｔｒｅｐ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび５％ＦＢＳ）中で、そしてｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１）に関してはＨａｍｓ  Ｆ−１２および＋３００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８中で、細胞培養実験を行った。インキュベーション期間後、フローサイトメトリーによって細胞を調べた。ＳＲ−Ｂ１陽性細胞（ｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１））は、ＤｉＲ−ＢＯＡエマルジョンよりはるかに高いレベルの（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ（３．５ｘ）を内部移行した。ＬＤＬＡ７（ＳＲ−Ｂ１陰性細胞）は、（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳまたはエマルジョンのいずれでも最小限の量しか取り込まなかった。
【０２０１】
図２５は、ｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１）細胞における−４Ｆ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの濃度依存取り込みを示す。ｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１）に関して、０．２ｍＬのＨａｍｓ  Ｆ−１２および＋３００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８中で細胞培養実験を行った。ＳＲ−Ｂ１陽性細胞（ｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１））を、１３．８〜１１００ｎｇ／ｍＬの範囲の多様な濃度の−４Ｆ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳと３時間インキュベーションした。フローサイトメトリー分析によって、−４Ｆ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの取り込みは、粒子のインキュベーション用量に比例することが明らかになった。増加する量の−４Ｆ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳは、ｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１）細胞で増加する量のＤｉＲ−ＢＯＡを生じた。ｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１）細胞における−４Ｆ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの取り込み飽和は、４４０ｎｇ／ｍＬで起こった。
【０２０２】
ＨＤＬは、（−４Ｆ）（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの取り込みを用量依存方式で阻害する（図２６）。ｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１）に関して、０．２ｍＬのＨａｍｓ  Ｆ−１２および＋３００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８中で細胞培養実験を行った。ｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１）細胞をＨＤＬおよび（−４Ｆ）（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ（０：１〜５０：１の範囲のモル比；  ＨＤＬ濃度は９．０ｘ１０−７〜２．２ｘ１０−４モル濃度の範囲であった）と３時間インキュベーションした。増加する濃度のＨＤＬは、増加する有効性で、ｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１）細胞における（−４Ｆ）（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ取り込みを阻害した。ＨＤＬの５０：１モル濃度過剰で（−４Ｆ）（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ細胞取り込みのほぼ完全な阻害が観察された。これらの結果は、（−４Ｆ）（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの取り込みをＳＲ−Ｂ１が仲介することをさらに確認する。
【０２０３】
図２７は、ＳＲ−Ｂ１＋細胞における（−４Ｆ）（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの選択的取り込みならびにＨＤＬによるこの取り込みの阻害をさらに例示する。２ｘ１０４細胞／ウェルのＳＲ−Ｂ１＋およびＳＲ−Ｂ１−細胞を、８ウェルカバースライドチャンバー中で２〜３日間培養した。１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０培地を細胞培地として用いた。共焦点研究の１日前、細胞培地を、ＦＢＳを含まないＲＰＭＩ  １６４０培地に交換した。多様な条件下で細胞を５時間処理した。
【０２０４】
走査型共焦点顕微鏡もまた用いて、細胞における（−４Ｆ）（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの取り込みを評価した（図２７）。ＬＤＬＡ７に関してはＨａｍｓ  Ｆ−１２培地（１％Ｐｅｎｎ／ｓｔｒｅｐ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび５％ＦＢＳ）中で、そしてｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１）に関してはＨａｍｓ  Ｆ−１２および＋３００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８中で、細胞培養実験を行った。簡潔には、２．３９μｇ／ｍＬの（−４Ｆ）（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳをｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１）およびＬＤＬＡ７細胞と３時間インキュベーションした。インキュベーション期間後、顕著な蛍光シグナルがｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１）では観察されたが、ＬＤＬＡ７では観察されなかった。同様の阻害研究において、ＨＤＬ（５０倍過剰；２．２ｘ１０−４Ｍ）を（−４Ｆ）（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳと一緒にインキュベーションした。３時間インキュベーションした後、ｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１）において蛍光は検出されず、ＨＤＬがｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１）において（−４Ｆ）（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの取り込みを完全に遮断したことを示した。ＬＤＬＡ７細胞では蛍光はまったく検出されなかった。
【０２０５】
図２８は、ｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１）細胞における（４Ｆおよび−４Ｆ）（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ取り込みの有効性を示す。ｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１）に関して、０．２ｍＬのＨａｍｓ  Ｆ−１２および＋３００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８中で、細胞培養実験を行った。１４〜２２０ｎｇ／ｍＬの（４Ｆおよび−４Ｆ）（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳをｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１）細胞と３時間インキュベーションした。フローサイトメトリーによって、ＨＰＰＳのどちらの配合物も、用量依存方式で、ｌｄｌＡ（ｍＳＲ−Ｂ１）細胞に取り込まれることが明らかになった。（−４Ｆ）（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳは、その４Ｆ対応物に比較して、わずかにより高い細胞取り込みを示した。
【０２０６】
Ｈ．  −４Ｆで形成された（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ（「（−４Ｆ）（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ」）のｉｎ  ｖｉｖｏ研究：  ヒトＫＢ（ＳＲ−ＢＩ＋）腫瘍異種移植片を所持するヌードマウスに対して、Ｍａｅｓｔｒｏ系を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ画像化を行った（図２９）。−４Ｆ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ（５．２ｎｍｏｌ；  ３５０μＬ  ｔｒｉｓ−生理食塩水）の注射７２時間後まで、光学画像を収集した。ＤｉＲ−ＢＯＡ蛍光シグナルは、早くも注射８時間後にＫＢ腫瘍異種移植片中に選択的に局在することを見出すことが可能である。切除された臓器の蛍光画像もまた示す。
【０２０７】
Ｉ．  （−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ（ターゲティングリガンドとしての全長ＥＧＦ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究：  異なるＥＧＦＲ発現レベルを持つ癌細胞（Ａ５４９：高発現、Ｈ５２０：低発現）に対して、共焦点顕微鏡研究を用いて、（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳのＥＧＦＲターゲティング特異性を調べた。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ  １６４０細胞培地０．２ｍＬ中で細胞培養実験を行った。簡潔には、１．０μＭの（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳとインキュベーションしたＡ５４９およびＨ５２０細胞に対して共焦点研究を行った（ここに提示する濃度、ならびに以下のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ実験中の濃度はＤｉＲ濃度である）。図３０（ａ）は、Ａ５４９細胞が、Ｈ５２０細胞よりも高い（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ取り込みを有することを示す。しかし、（−４Ｆ）（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの取り込みもまた、Ｈ５２０細胞よりもＡ５４９細胞で高かったことに注目すべきである。Ａ５４９およびＨ５２０の多様な表面受容体タンパク質のウェスタンブロット分析を行った（図３０ｂ）。ＥＧＦＲは、Ｈ５２０細胞に比較して、Ａ５４９細胞で過剰発現されていた。ＳＲ−Ｂ１発現は２つの細胞株間で同程度である一方、葉酸受容体レベルは、Ａ５４９に比較してＨ５２０で過剰発現されているようである。
【０２０８】
（−４Ｆ）（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳおよび（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ（１．０μＭ）を、Ｈ５２０、Ａ５４９およびＥＧＦＲ−ＧＦＰ−Ａ５４９細胞と３時間インキュベーションした。先に記載するように、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ  １６４０細胞培地０．２ｍＬ中で、細胞培養実験を行った。フローサイトメトリーデータによって、（−４Ｆ）（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳは、３つの細胞すべてに同等に取り込まれたことが示される。ＨＤＬ（４００μｇ）はまた、これらの細胞におけるこれらの粒子の取り込みを同等に阻害した（図３１を参照されたい）。Ａ５４９およびＥＧＦＲ−ＧＦＰ−Ａ５４９における（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの取り込みは、Ｈ５２０のものを非常に上回っていた。ＨＤＬの存在は、３つの細胞株において、（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの取り込みを減少させたが排除はしなかった。Ａ５４９およびＥＧＦＲ−ＧＦＰ−Ａ５４９細胞における（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの残りの取り込みは、ＥＧＦＲ／ＳＲ−Ｂ１陽性細胞において、ＥＧＦＲが仲介するこの粒子の取り込みを反映する。
【０２０９】
ＳＲ−Ｂ１の役割がＥＧＦ−ＨＰＰＳの取り込みにどのように寄与しているのかを決定するため、ＳＲ−Ｂ１陰性細胞、ＬＤＬＡ７をＥＧＦＲおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子で同時トランスフェクションした。この実験は、ＳＲ−Ｂ１がＥＧＦ−ＨＰＰＳの細胞取り込みに与えうるいかなる寄与も取り除く。先に記載するように、Ｈａｍｓ  Ｆ−１２培地（１％Ｐｅｎｎ／ｓｔｒｅｐ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび５％ＦＢＳ）中で、細胞培養実験を行った。（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ（１．０μＭ）と３時間インキュベーションした後、ＥＧＦＲ−ＧＦＰ−ＬＤＬＡ７細胞は、サイトゾル内でＤｉＲ−ＢＯＡの強いシグナルを示す一方、ＥＧＦＲのＧＦＰシグナルは、外部形質膜上に視覚化された（図３２）。共焦点研究を行って、ＥＧＦＲ−ＧＦＰ−ＬＤＬＡ７細胞における（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの取り込みに対するＨＤＬの効果を評価した（図３３）。ＧＦＰチャネルで見られるように、ＥＧＦＲおよびＧＦＰのトランスフェクションに成功したＬＤＬＡ７細胞は、恒常的に蛍光を発現する。（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ（１．０μＭ）で処理した後、ＤｉＲＢＯＡシグナルは細胞内で検出可能である（ＤｉＲチャネル）。（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳでの処理中、過剰なＨＤＬ（４００μｇ）を添加した際、ＤｉＲＢＯＡ由来の蛍光シグナルはなお、処理細胞全体で見られうる。ＥＧＦＲ−ＧＦＰ−ＬＤＬＡ７細胞における（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ取り込みの度合いは、ＨＤＬ競合を伴うものおよび伴わないもので類似である。したがって、ＨＤＬは、ＥＧＦＲ−ＧＦＰ−ＬＤＬＡ７細胞における（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの取り込みに影響がない。これらの知見は、ＥＧＦＲ−ＧＦＰ−ＬＤＬＡ７細胞における（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳのＥＧＦＲが仲介する特異的な取り込みを立証する。
【０２１０】
ＥＧＦＲ−ＧＦＰ−Ａ５４９およびＨ５２０細胞を１．０μＭの（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳと３時間インキュベーションした。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ  １６４０細胞培地０．２ｍＬ中で細胞培養実験を行った。３時間のインキュベーション期間後、共焦点画像化は、ＥＧＦＲ−ＧＦＰ−Ａ５４９細胞において強い蛍光を示した（図３４）。過剰なＨＤＬの存在は、これらの細胞において、蛍光シグナルをわずかに減少させた。過剰なＨＤＬおよびＥＧＦの組み合わせは、ＥＧＦＲ−ＧＦＰ−Ａ５４９細胞における蛍光シグナルを、細胞のみの対照で見られるものと類似のレベルまで顕著に減少させた。Ｈ５２０処理群はいずれもＤｉＲ−ＢＯＡ蛍光を示さなかった。これは、Ｈ５２０がいかなる（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳも取り込まなかったことを示す。
【０２１１】
図３５において、（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ（１．０μＭ）をＡ５４９およびＨ５２０細胞とインキュベーションした。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ  １６４０細胞培地０．２ｍＬ中、細胞培養実験を行った。このインキュベーション期間中にＨＤＬ（４００μｇ）もまた添加して、ＳＲ−Ｂ１が有しうる、取り込みプロセスに対するいかなる寄与も無効にした。ＨＰＰＳ曝露１時間、３時間および６時間後、細胞を監視した。ＨＤＬの存在下で、Ａ５４９はＨ５２０よりもはるかに高い（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの取り込みを示したが、ＨＤＬの非存在下では（挿入図）、Ａ５４９およびＨ５２０の間の蛍光シグナルの相違は顕著に減少した。これらの知見によって、ＳＲ−Ｂ１は、ＳＲ−Ｂ１／ＥＧＦＲ陽性細胞における（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの取り込みに寄与することが示唆される。
【０２１２】
Ｊ．  （−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ（ターゲティングリガンドとしての全長ＥＧＦ）のｉｎ  ｖｉｖｏ研究：  図３６は、（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ（ｔｒｉｓ−生理食塩水中、５．２ｎｍｏｌ）静脈内注射後の多様な時点で、Ａ５４９およびＨ５２０腫瘍異種移植片を所持するヌードマウスのｉｎ  ｖｉｖｏ光学画像を示す。初期の注射後期間には、蛍光シグナルは動物全体で見られる。２２時間までに、Ａ５４９およびＨ５２０で局所的なシグナルが見られ、一方、体の残りの蛍光シグナルは非常に減少する。この強い蛍光シグナルは、研究期間全体でＡ５４９腫瘍で保持される；しかし、第３日までに、Ｈ５２０腫瘍中のシグナルは洗い流された。これらの結果によって、Ａ５４９腫瘍におけるＥＧＦＲが、（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳを集積させ、そして保持する一方、Ｈ５２０における取り込みは非特異的であり、そして一過性であったことが示唆される。
【０２１３】
Ｋ．  ＫＢ腫瘍異種移植片における（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳのｉｎ  ｖｉｖｏ研究：  図３７Ａは、（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ（ｔｒｉｓ−生理食塩水中、５．２ｎｍｏｌ）のｉ．ｖ．注射後、多様な時点での、ＫＢ腫瘍異種移植片を所持するヌードマウスのｉｎ  ｖｉｖｏ光学画像を示す。腫瘍組織のみがＤｉＲ−ＢＯＡ蛍光によって増進され、４８時間で最大に到達する。図３７Ｂにおいて、（−４Ｆ）（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ（ＨＰＰＳ）（ｔｒｉｓ−生理食塩水中、５．２ｎｍｏｌ）、（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ（ＥＧＦ−ＨＰＰＳ）（ｔｒｉｓ−生理食塩水中、５．２ｎｍｏｌ）およびＥＧＦ−ＨＰＰＳ＋ＨＤＬ（ｔｒｉｓ−生理食塩水中、５．２ｎｍｏｌおよび０．１４μｍｏｌ）粒子の生体分布を、ＫＢ異種移植片を所持するマウスにおいて評価した。生体分布プロフィールは、すべて、肝臓を除くすべての他の正常臓器に勝る、腫瘍におけるＤｉＲ−ＢＯＡの高い取り込みを示す。ＥＧＦ−ＨＰＰＳの腫瘍取り込みは、ＨＰＰＳまたはＥＧＦ−ＨＰＰＳ＋ＨＤＬのものより大きかった。図３７Ｃにおいて、ＨＰＰＳ、（−４Ｆ）ＰＥＧ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ（ＰＥＧ−ＨＰＰＳ）（ＰＥＧ−ＨＰＰＳは、図３に記載するプロトコルにしたがって合成された（ＥＧＦｐを１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）と交換した））およびＥＧＦ−ＨＰＰＳを正常ヌードマウスにおいて決定した。すべての動物は、ｔｒｉｓ−生理食塩水中のそれぞれのナノ粒子５．２ｎｍｏｌを静脈内注射された。ナノ粒子注射前および注射後の多様な時点で、血液試料を収集した。ＤｉＲ−ＢＯＡを血液試料から抽出し、そしてその蛍光を蛍光計上で決定した。循環半減期はおよそ１４時間と決定され、現在の最適に設計されたナノキャリアと匹敵した。最後に、図３７Ｄは、赤色蛍光タンパク質で安定にトランスフェクションされた二重ＫＢ腫瘍異種移植片を所持するマウスを示す。ＥＧＦ−ＨＰＰＳ（ｔｒｉｓ−生理食塩水中、５．２ｎｍｏｌ）の注射後、ＤｉＲ−ＢＯＡの蛍光が赤色蛍光タンパク質のシグナルと緊密に重なることがわかる。これらの結果は、ＥＧＦ−ＨＰＰＳナノ粒子が、ＥＧＦＲを発現する腫瘍を有効にターゲティング可能であることを示す。
【０２１４】
Ｌ．  非特異的組織集積に対する、（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳのＥＧＦＲが仲介する特異的細胞取り込みのｉｎ  ｖｉｖｏ検証。
【０２１５】
ＫＢ（ＥＧＦＲ＋）およびＨ５２０（ＥＧＦＲ−）腫瘍異種移植片を所持するヌードマウスに、天然ＨＤＬ（ｔｒｉｓ−生理食塩水中、０．１４μｍｏｌ）、その直後に（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ（ｔｒｉｓ−生理食塩水中、５．２ｎｍｏｌ）を、静脈内同時注射した。注射４８時間後、マウスを屠殺し、そして腫瘍を切除した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で組織を洗浄し、そして次いで、４０ｍｇの各組織を続いて、「組織分析」に用いた。同様に、１５０ｍｇの各組織を「細胞分析」に用いた。
【０２１６】
組織分析。セクションＢ（「ＥＧＦｐ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳのｉｎ  ｖｉｖｏ研究」）に上述するように、組織試料をＰＢＳ中でホモジナイズし、その後、クロロホルム：メタノール抽出した。抽出物の組織蛍光を測定し、そして単位（ｍｇ）組織あたりの蛍光として提示した。
【０２１７】
細胞分析。ホモジナイズ後、ナイロンメッシュ（孔サイズ７０μｍ）で試料をろ過して破片を取り除いた。次いで、ろ過試料（遊離細胞）をＰＢＳで２回洗浄し、そして赤血球溶解緩衝液（０．１％重炭酸カリウム、０．８％塩化アンモニウム、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で１０分間処理して、赤血球を除去した。倒立顕微鏡を用いて、血球計数板で細胞を計数した。その後、細胞をクロロホルム：メタノールで抽出した（上述のとおり）。細胞抽出物の蛍光を測定し、そして百万細胞あたりの蛍光として提示した。
【０２１８】
組織および細胞レベルでの（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳ取り込みの比較を図３８に提示する。組織レベルから見ると、ＫＢおよびＨ５２０腫瘍異種移植片は、（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳを同等の度合いまで集積する。逆に、細胞レベルで調べると、ＫＢ細胞は、（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳをＨ５２０より高い度合いで（２ｘ）取り込む。
【０２１９】
（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳの組織集積は、浸透性の増進および保持機構による粒子の細胞外捕捉、ならびに上皮細胞における粒子の細胞内取り込みの複合を反映する。細胞を単離し、そして細胞外因子からの寄与を取り除くと、異なる知見が現れる。ＥＧＦＲが仲介するＨＰＰＳの取り込みのより明らかな概念が現れる。さらに、天然ＨＤＬの同時注射によって、ＨＰＰＳ取り込みに対するＳＲＢＩの寄与もまた最小限になる。総合すると、これらの知見は、（−４Ｆ）ＥＧＦ（ＤｉＲ−ＢＯＡ）ＨＰＰＳナノ粒子のＥＧＦＲターゲティング特異性を立証する。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１０】
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【図１３】
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【図１４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図３８】
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【図１】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【配列表】
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