(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機微小物体を含む試料流体を分析する方法であって、前記方法は、
総時間Ｔ１において、第１フィルタを用いて前記微小物体から前記試料流体の体積Ｖ１を除去することによって前記微小物体を高濃度化するステップと、
前記微小物体を輸送流体に浸すステップ、又は、前記試料流体の残留部分に前記微小物体を残すステップであって、その場合前記試料流体の前記残留部分が前記輸送流体を提供する、ステップと、
総時間Ｔ３において、前記輸送流体の体積Ｖ３を第２フィルタによってろ過し、それによって前記第２フィルタ上に前記微小物体を蓄積するステップと、
前記第２フィルタ上に蓄積した前記微小物体の画像を生成するステップとを有し、
前記高濃度化するステップのスループットＶ１／Ｔ１が前記ろ過するステップのスループットＶ３／Ｔ３よりも大きく、
前記第１フィルタが前記第２フィルタよりも大きい面積を持ち、
前記第１フィルタが前記微小物体を染色するための染料を有し、前記染料を前記試料流体又は前記輸送流体に放出する、方法。
【請求項２】
前記高濃度化するステップ、浸すステップ、ろ過するステップ、及び前記画像を生成するステップにかかる時間が、前記第２フィルタによって前記全試料流体をろ過し、その第２フィルタ上の前記微小物体を画像化するステップにかかる時間よりも短い、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｖ３が０．２＊Ｖ１未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試料流体をプレフィルタによって前ろ過するステップであって、前記プレフィルタが前記微小物体の最大でもわずかな画分を保持する、ステップを有し、前記前ろ過するステップが前記ろ過するステップの前に実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記高濃度化するステップによって前記微小物体を前記第１フィルタ上に蓄積するステップと、
前記第１フィルタを溶解するステップとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記浸すステップが、
前記輸送流体が前記第１フィルタに沿って流れるステップ、又は、
前記試料流体の一部が前記第１フィルタを通って逆流するステップを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記高濃度化するステップが、
前記試料流体を蒸発させるステップ、及び／又は
前記微小物体を収集域に引き付けるステップ、及び／又は
前記試料流体を遠心分離するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記画像を生成するステップが、
前記微小物体の光学像を生成するステップ、又は、
前記微小物体を走査するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
有機微小物体を含む試料流体を分析するための装置又はシステムであって、前記装置又はシステムは、
総時間Ｔ１において、前記微小物体から前記試料流体の体積Ｖ１を除去することによって前記微小物体を高濃度化するための手段と、
前記微小物体を輸送流体に浸すため、又は、前記試料流体の残留部分に前記微小物体を残すための手段であって、その場合前記試料流体の前記残留部分が前記輸送流体を提供する、手段と、
フィルタ上に前記微小物体を蓄積するために、総時間Ｔ３において、前記輸送流体の体積Ｖ３をろ過するためのフィルタと、
前記フィルタ上に蓄積した前記微小物体の画像を生成するための手段とを有し、
前記高濃度化するための手段のスループットＶ１／Ｔ１が前記フィルタのスループットＶ３／Ｔ３よりも大きく、
前記フィルタが第２フィルタであり、前記高濃度化するための手段が前記微小物体を保持するための第１フィルタを有し、前記第１フィルタが前記第２フィルタよりも大きい面積を持ち、
前記第１フィルタが前記微小物体を染色するための染料を有する、システム又は装置。
【請求項１０】
前記第１フィルタが前記第２フィルタよりも高い最大スループットを持つ、請求項９に記載のシステム又は装置。
【請求項１１】
前記第１フィルタが、穴のあいたアルミホイル、又は有機溶媒に溶解する有機高分子を有する、請求項９又は１０に記載のシステム又は装置。
【請求項１２】
前記フィルタを有するマイクロ流体チップを有する、請求項９に記載のシステム又は装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
第１の態様において、本発明は有機微小物体を含む試料流体を分析する方法に関する。
【０００２】
第２の態様において、本発明は有機微小物体を含む試料流体を分析するための装置又はシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明は微生物学分野に関し、特に流体試料の微生物分析に関する。一般に、こうした分析は試料中の特定有機微小物体の有無を決定すること、その数又は濃度を定量化すること、及び場合によっては未知の微生物を様々な詳細度まで同定することを目的とする。"有機微小物体"という語は、多種多様な生体起源の微視的物体の任意の物体、特に微生物及び細胞をあらわし得る。微生物は細菌、菌類、古細菌、原生生物、緑藻類、プランクトン、プラナリア及びアメーバなどの動物を含む。細胞は、細菌以外に、植物細胞及び哺乳類細胞、例えば血液細胞及び組織細胞を含む。喀痰又は他の体液の検査などの臨床診断に加えて、微生物分析は例えば食品及び飲料、薬物、パーソナルケア製品、及び環境部門において重要な工業用途を持つ。現在の標準試験方法は細胞培養に基づき、試料及び微生物の種類に応じて数日から数週間のｔｉｍｅ  ｔｏ  ｒｅｓｕｌｔｓ（結果を得るまでの時間）がかかる。スループットが向上した微生物分析が必要である。
【０００４】
こうした迅速な方法の一例はＡＥＳ  Ｃｈｅｍｕｎｅｘ（ｗｗｗ.ａｅｓｃｈｅｍｕｎｅｘ.ｃｏｍ）によって提案されるものである。そのＦＤＡに認可されたＳｃａｎＲＤＩ（登録商標）‐システムは、試料から結果まで９０分のスループットを提供し、ろ過産物のレーザー走査サイトメトリによる分析を実行する。この方法のステップは、流体試料をろ過するステップ、存在する可能性がある微生物学的汚染物質を蛍光染料で染色するステップ、存在する可能性がある微生物学的汚染物質を検出するために大きなレーザースポット（５‐１０μｍ）でフィルタの表面を光学的に走査するステップ、及び自動ステージを持つ高解像度（０．５μｍ）顕微鏡で汚染物質周辺を画像化するステップである。この技術はＪ．‐Ｌ．Ｄｒｏｃｏｕｒｔ，Ｐ．Ｄｅｓｆｅｔｅｓ，Ｊ．Ｓａｎｇｈｅｒａ，Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｂｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，ＥＰ  ０７１３０８７  Ｂ１（１９９４）に記載されている。
【０００５】
改良されたろ過技術はｆｌｕＸＸｉｏｎ（ｗｗｗ．ｆｌｕｘｘｉｏｎ．ｃｏｍ）によって提供される。この技術はリソグラフィで規定される微細ふるいに基づき、これは単一の明確に規定される細孔径（０．２μｍまで）を持ち、光学的に平面であり（これは後続する光学的走査ステップの観点から有利であり、また減少した後方散乱をもたらす）、低い流れ抵抗をもたらすように薄く、従ってセルロース、ナイロン、ポリ塩化ビニル、ポリスルホン、ポリカーボネート、及びポリエステルなどの多孔質材料から作られる従来の膜フィルタと比較して高いろ過スループットをもたらすようになっている。
【０００６】
低解像度イメージング（レーザースポット走査による）及び高解像度イメージング（顕微鏡による）の２段階の代案は、高解像度で全フィルタ面積を画像化することである。ろ過にとって妥当なスループットを得るためには、フィルタ面積は所要解像度を持つ標準顕微鏡対物レンズの視野よりもかなり大きいということになる。例えば、０．５μｍの解像度は典型的には０．５ｍｍの直径を持つ視野を持つ４０Ｘ／ＮＡ０．６５対物レンズを必要とする。典型的なフィルタは数ｍｍの直径を持つので、顕微鏡対物レンズよりも約１桁大きい。明らかに、これはフィルタ面積を走査することを必要とし、これは時間がかかり高精度の複雑な機構を必要とする。
【０００７】
関連する文脈において、病原体の迅速検出及び抗生物質耐性／感受性検査は、感染症患者の適切な治療にとって極めて重要である可能性がある。患者試料を用いる伝統的な培養技術は、典型的には試料採取から最終結果まで数日かかり、大きな中央微生物学研究室で実行されなければならない。この間、患者は通常、重篤な結果に悩まされることなく治療しないまま放置されることができず、これは開業医を広域抗菌スペクトルを用いる推測ゲームに制限する。これは経済的にコストがかかるだけでなく、病院環境において抗生物質耐性菌株の問題も増加させる。
【０００８】
マイクロ流体装置に対して自動化及び統合された試験を使用することによって、速度が加速されることができ、コストが削減され得る。少ない試薬量を実現し、使い捨てプラスチックカートリッジの使用を可能にするためにマイクロ流体装置のサイズを縮小することによって、速度がさらに加速され得、コストがさらに削減され得る。マイクロ流体システムは一般的に、中に試料が注入されることができる流体システムを有する。これはさらに細菌を濃縮しそれらをヒト細胞から分離するための手段を含み得る。ヒト細胞はさもなければ細菌分析を妨げることになる方法で別々に検査され得る。一部のマイクロ流体装置はウイルス遺伝子の存在について哺乳類細胞をスクリーニングするのに適している。こうした装置はあらゆる既知の種類の微視的病原体を検出できる可能性がある。マイクロ流体技術は、例えばリアルタイムＰＣＲを用いて遺伝子プロファイルを調べることによって、又はマイクロ流体装置における培養及び単一細菌分裂の分析を通して、感染症の迅速診断に大きな可能性を持つ。
【０００９】
ヒト細胞から細菌を分離するための様々なマイクロ流体技術がある。例は、電気泳動（Ａ．Ｋ．Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｋ．Ａ．Ｓｏｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃａｐｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｒｏｍ  ｐｏｔａｂｌｅ  ｗａｔｅｒ，Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ，ｖｏｌ．７，ｐｐ．１３１５‐１３２１，２００７参照）、誘電泳動（Ｌ．Ｊ．Ｙａｎｇ，Ｐ．Ｐ．Ｂａｎａｄａ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｉｃｒｏ‐ｆｌｕｉｄｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｍｍｕｎｏ‐ｃａｐｔｕｒｅ  ｏｆ  ｌｏｗ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ，Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ，ｖｏｌ．６，ｐｐ．８９６‐９０５，２００６参照）、及び磁気ビーズ分離（Ｙ．Ｋ．Ｃｈｏ，Ｊ．Ｇ．Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｅ‐ｓｔｅｐ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ  ｏｎ  ａ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｅｖｉｃｅ，Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ，ｖｏｌ．７，ｐｐ．５６５‐５７３，２００７参照）を含む。
【００１０】
しかしながら、マイクロ流体装置は一般的に、典型的にはおよそ数μｌ／分で非常に限られた試料スループットを持つ。そのため、例えば１ｍｌの液体中に１００以下の関連細菌しか含まないことが多い、例えば口腔又は鼻腔スワブからの実際の患者試料、又は、数ｍｌの液体（典型的には５‐１０ｍｌ）及びたった数個の浮遊細菌しか含まない血液サンプルとの重大な不一致がある。典型的には、実際の患者試料は１乃至５ｍｌの試料液体中に全部で１０乃至１００の関連細菌しか含まない。従って試料のごく一部のみを使用するという選択肢はない。しかしながら、ｍｌ体積は通常はマイクロ流体装置に収まらない。従ってマイクロ流体試料体積とマイクロ流体システムとの間の接続が必要である。
【００１１】
上述のμｌ体積で細菌とヒト細胞を分離するためのマイクロ流体技術に加えて、これを実験台上で行う多くの方法もまた存在する。簡単な方法は例えばＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ（ｗｗｗ.ｓａｒｔｏｒｉｕｓ‐ｓｔｅｄｉｍ．ｃｏｍ）、Ｗｈａｔｍａｎ（ｗｗｗ.ｗｈａｔｍａｎ．ｃｏｍ）又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（ｗｗｗ.ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ）からのシリンジフィルタ又は遠心分離フィルタを使用することである。大きな孔径はヒト細胞を捕らえ、より小さな孔は病原体を捕らえる。
【００１２】
Ｗｉｅｇｕｍと共働者ら（Ｓ．Ｅ．Ｗｅｉｇｕｍ，Ｐ．Ｎ．Ｆｌｏｒｉａｎｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ‐ｂａｓｅｄ  ｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ＥＧＦＲ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｏｒａｌ  ｃａｎｃｅｒ，Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ，ｖｏｌ．７，ｐｐ．９９５‐１００３，２００７参照）は、フィルタをＰＭＭＡカートリッジに組み込み、細胞をろ過して取り除き、そしてこれらは膜上で分析された。ここで、流速はかなり高く、２５０μｌ／分‐７５０μｌ／分であるが、フィルタ膜上で捕らえられる細胞はさらなる分析のために別の液体体積に移されない。
【００１３】
ＷｕとＫａｄｏは試料中の細菌ＤＮＡを濃縮するためにフィルタを使用した（Ｓ．Ｊ．Ｗｕ  ａｎｄ  Ｃ．Ｉ．Ｋａｄｏ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｌｋ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｆｏｒ  ＰＣＲ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｒａｐｉｄ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．９６，ｐｐ．１３４２‐１３４６，２００４）。著者らは乳試料から細菌を捕らえるために０．４μｍ孔径のフィルタを使用した。そして細菌を伴う膜は溶解（ｌｙｓｉｓ）バッファで処理され、ＤＮＡはその後ＰＣＲのために使用される。この非常に単純な技術は１ｍｌ乳あたり約１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）の感度を持つ。ＤＮＡ解析のために、ＳＩＲＳ‐Ｌａｂ（ｗｗｗ．ｓｉｒｓ‐ｌａｂ．ｃｏｍ）が提供している細菌とヒトＤＮＡを分離する特殊遠心分離フィルタもある。しかしながら、実験台上では有効であっても、上記の技術のいずれもマイクロ流体チップに直接接続されていなかった。
【００１４】
他の分析方法は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）又は磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を含み、ここで細菌は特異株に対する抗体で標識され、そして選別される。ＦＡＣＳマシンは十分に高いスループットを持つことができるが、大きく複雑な機器であり、抗体での特異的標識化を必要とする。例えばシリカ磁気ビーズに結合した標識細胞又はＤＮＡのいずれかの磁気分離は、漏斗構造内のずっと小さな体積に病原体又は病原体ＤＮＡを移すために使用されることができる。それでもやはり、ビーズと試料の培養は大きな体積で起こらなければならず、これは時間がかかる。また、細胞又はＤＮＡに結合した磁気ビーズ自体の輸送もまた、マイクロ流体システム内で問題となり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、試料流体中に最初に含まれる有機微小物体を画像化するために必要な総時間を削減することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の第１の態様によれば、試料流体を分析する方法は、
‐総時間Ｔ１において、微小物体から試料流体の体積Ｖ１を除去することによって微小物体を高濃度化する（ｕｐ‐ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇ）ステップ、
‐輸送流体に微小物体を浸すステップ、又は微小物体を試料流体の残留部分に残すステップであって、その場合は試料流体の残留部分が輸送流体を提供するステップ、
‐総時間Ｔ３において、輸送流体の体積Ｖ３をフィルタによってろ過し、それによってフィルタ上に微小物体を蓄積するステップ、及び、
‐フィルタ上に蓄積した微小物体の画像を生成するステップを有し、
高濃度化するステップのスループットＶ１／Ｔ１はろ過するステップのスループットＶ３／Ｔ３よりも大きい。従って高濃度化するステップはろ過するステップと比較して速い。従って本発明は２段階方法を提案し、その中で試料流体の一部は微小物体がフィルタ上に収集される前に高速技術を用いて微小物体から除去される。勿論、２段階方法は追加ステップを含むように拡張されることができる。体積Ｖ１は試料流体又はその一部の総体積であり得る。同様に、体積Ｖ３は輸送流体又はその一部の総体積であり得る。スループットＶ１／Ｔ１及びスループットＶ３／Ｔ３は平均スループットであり、これらはそれぞれ時間Ｔ１及びＴ３にわたって瞬間変化率を平均化することによって、それぞれ試料流体及び輸送流体と関連する瞬間スループットから（すなわち瞬間容積変化率から）計算され得る。各瞬間スループットは、必ずしもそうでなければならないわけではないが、それぞれ高濃度化するステップ及びろ過するステップ中に実質的に一定であり得る。スループットＶ１／Ｔ１はスループットＶ３／Ｔ３よりも例えば３，１０，３０，１００，３００，１０００，又は３０００倍以上大きい。浸すステップにかかる時間Ｔ２は高濃度化するステップと比較して無視できるほどであり得る。例えば、浸すステップにかかる時間Ｔ２は高濃度化するステップにかかる時間Ｔ１の１０％，３％，又は１％未満であり得る。従って、全試料流体をフィルタを通してろ過することによって実質的に全試料流体が微小物体から除去される従来の方法と比較して、手順の総時間が削減されることができる。同等に言えば、フィルタは従来の方法で使用されるフィルタと比較して低いスループットを持ち得るが、低いスループットは、フィルタを通過する必要がある試料流体の量が少ないことによって相殺される。従って同じ時間を考えると、例えば光学顕微鏡の視野に収まるようにフィルタはより小さくなることができ、フィルタを走査する必要がなく、従って総時間をさらに削減する。輸送流体は試料流体の初期体積の２０％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満の体積を持ち得る。除去するステップにおいて、試料流体の７０％以上、９０％以上、９５％以上、又は９９％以上が微小物体から除去され得る。従って微小物体の濃度はろ過するステップの前に大幅に増加する。
【００１７】
高濃度化するステップ、浸すステップ、ろ過するステップ、画像を生成するステップにかかる時間Ｔ１＋Ｔ２＋Ｔ３＋Ｔ４は、フィルタによって全試料流体をろ過し、そのフィルタ上の微小物体を画像化するステップにかかる時間よりも短くなり得る。本明細書では同じイメージング法が使用されることが理解される。
【００１８】
フィルタによってろ過される輸送液体の体積Ｖ３は微小物体から除去される体積Ｖ１よりも著しく小さくなり得る。例えば、Ｖ３は以下のうちの１つよりも小さくなり得る：０．３＊Ｖ１，０．１＊Ｖ１，０．０３＊Ｖ１，０．０１＊Ｖ１，０．００３＊Ｖ１，及び０．００１＊Ｖ１。従って方法の総時間Ｔ１＋Ｔ２＋Ｔ３＋Ｔ４は大幅に削減され得る。実際に、高速高濃度化ステップにおいて除去される試料流体の画分が大きいほど、手順の総時間は短くなることが予想され得る。
【００１９】
方法は、
‐プレフィルタによって試料流体を前ろ過（ｐｒｅｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）するステップを有し、プレフィルタは最大でも微小物体のわずかな画分を保持する。
前ろ過するステップはろ過するステップの前に実行される。従って、関心のある微小物体（例えば細菌）よりも大きい物体（例えば哺乳類細胞）は予めろ過して取り除かれ得、その後の分析を容易にする。
【００２０】
フィルタは第２フィルタであり得、高濃度化するステップは、
‐第１フィルタによって試料流体をろ過し、それによって第１フィルタ上に微小物体を蓄積するステップを含み得る。
【００２１】
この実施形態によれば、高濃度化するステップもまたろ過するステップによって実行される。第２フィルタは小体積をろ過するのに特に適し得るが、第１フィルタは大体積をろ過するのに特に適し得る。例えば、第１フィルタは第２フィルタよりも大きくなり得る。
【００２２】
方法はさらに、
‐第１フィルタを溶解するステップを有し得る。
【００２３】
一旦第１フィルタが溶解されると、微小物体はより容易に第２フィルタへ輸送され得る。第１フィルタは例えば輸送流体によって溶解され得る。
【００２４】
浸すステップは、
‐輸送流体が第１フィルタに沿って流れるステップ、又は、
‐試料流体の一部が第１フィルタを通って逆流するステップを含み得る。
【００２５】
後者の場合、すなわち試料流体の一部が第１フィルタを通って逆流する場合、輸送流体は試料流体によって提供される。両方の場合において輸送流体は微小物体を一緒に運ぶ。そして輸送流体は第２フィルタへ供給され得る。
【００２６】
高濃度化するステップは、
‐試料流体の体積Ｖ１を蒸発させるステップ、及び／又は
‐収集域に微小物体を引き付けるステップ、及び／又は
‐試料流体を遠心分離するステップを含み得る。
【００２７】
このように、微小物体を濃縮する代替方法が提供される。
【００２８】
画像を生成するステップは、
‐微小物体の光学像を生成するステップ、又は、
‐微小物体を走査するステップを含み得る。
【００２９】
これは例えば上記のＡＥＳ  Ｃｈｅｍｕｎｅｘによる方法を用いて、当該技術分野で既知の任意の方法によってなされることができる。
【００３０】
方法はさらに、
‐試料流体又は輸送流体に染料を放出するステップを有し得る。
【００３１】
従って微小物体は高濃度化過程の前、最中、又は後に染色されることができる。特に第１フィルタが溶解される場合、染料は第１フィルタに埋め込まれ得る。代替的に、染料は第１フィルタのコーティングに含まれ得る。代替的に、これはプレフィルタ（もしあれば）又は第２フィルタに含まれることができ、或いは他の方法で放出されることができる。方法はさらに、
‐染料を失活させるための不活性化剤を試料流体又は輸送流体に放出するステップを有し得る。不活性化剤は第１フィルタ又は第２フィルタに埋め込まれ得るか、或いは他の方法で放出されることができる。
【００３２】
本発明の第２の態様にかかる装置又はシステムは、
総時間Ｔ１において、微小物体から試料流体の体積Ｖ１を除去することによって微小物体を高濃度化するための手段、
微小物体を輸送流体に浸すため、又は、試料流体の残留部分に微小物体を残すための手段であって、その場合試料流体の残留部分が輸送流体を提供する、手段、
フィルタ上に微小物体を蓄積するために、総時間Ｔ３において、輸送流体の体積Ｖ３をフィルタによってろ過するための手段、及び、
フィルタ上に蓄積した微小物体の画像を生成するための手段を有し、
高濃度化するための手段のスループットＶ１／Ｔ１はフィルタのスループットＶ３／Ｔ３よりも大きい。従って、総分析時間が削減され得る。システム又は装置はフィルタ上に蓄積した微小物体の光学像を生成するための光学顕微鏡を有し得る。
【００３３】
フィルタは第２フィルタであり得、高濃度化するための手段は微小物体を保持するための第１フィルタを有し、第１フィルタは第２フィルタよりも大きい面積を持つ。この文脈において、"面積"という語は当該技術分野において与えられる通常の意味を持ち、すなわちこれはフィルタに入る流体にさらされるフィルタの表面の部分をあらわす。流入する流体にさらされないフィルタの表面の部分はフィルタの面積に寄与しない。例えば、第１フィルタの面積は第２フィルタの面積より３，１０，３０，１００，３００，１０００，３０００，又は１００００倍以上大きくなり得る。従って第１フィルタは第２フィルタよりも大幅に大きい最大可能スループットを持ち得る。第１フィルタと第２フィルタは同じ孔径及び／又は同じ孔構造、例えば同じ孔形状を持ち得る。例えば、第１フィルタと第２フィルタは同じ種類の材料から作られ得る。第１フィルタと第２フィルタは実質的にその面積のみが異なる膜フィルタであり得、第１フィルタは第２フィルタよりも大きい面積を持つ。第１フィルタと第２フィルタはその直径のみが異なる円形膜フィルタであり得、第１フィルタは第２フィルタよりも大きい直径を持つ。
【００３４】
フィルタは第２フィルタであり得、高濃度化するための手段は微小物体を保持するための第１フィルタを有し、第１フィルタは第２フィルタよりも高い最大スループットを持つ。例えば、第１フィルタは第２フィルタよりも大きい有効ろ過面積を持ち得る。代替的に又は付加的に、高濃度化するための手段は、例えば試料流体を遠心分離するための遠心分離機、又は試料流体の少なくとも大部分を蒸発させるための蒸発器、又は微小物体を収集域に引き付けるためのアトラクタを有し得る。
【００３５】
第１フィルタは微小物体を染色するための染料を有し得る。染料はフィルタのコーティングに含まれ得る。分析されるべき液体にフィルタをさらすと、染料は液体中に放出され得る。可溶性フィルタの場合、染料はフィルタに埋め込まれることができる。これはフィルタが溶解するときに放出され得る。さらに、染料は可溶性フィルタのコーティングに含まれ得、フィルタはフィルタに埋め込まれた染料を失活させるための物質を含み得る。
【００３６】
第１フィルタは穴のあいたアルミホイル、又は有機溶媒に溶解する有機高分子を有し得る。従って第１フィルタは微小物体がその上に蓄積した後で溶解されることができる。
【００３７】
システム又は装置はフィルタを有するマイクロ流体チップを有し得る。マイクロ流体チップはそれを通して微小物体が画像化されることができる光学窓を持つことができる。これはさらに、微小物体に対する他の分析、例えば化学分析を実行するのに適することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】第１フィルタとシリンジを用いて微小物体を蓄積するステップを概略的に図示する。
【図２】蒸発を用いて微小物体を蓄積するステップを概略的に図示する。
【図３】表面に向かって微小物体を引き付けることによって微小物体を蓄積するステップを概略的に図示する。
【図４】第２フィルタ上の微小物体を画像化するためのセットアップを概略的に示す。
【図５】有機微小物体を含む試料流体を分析する方法のフローチャートである。
【図６】微小物体を濃縮し、それらを別の装置に輸送するための装置を概略的に図示する。
【図７】微小物体を濃縮し、それらを別の装置に輸送するための別の装置を概略的に図示する。
【図８】微小物体を濃縮し、それらを別の装置に輸送するための別の装置を概略的に図示する。
【図９】微小物体を濃縮し、それらを別の装置に輸送するための別の装置を概略的に図示する。
【図１０】微小物体を濃縮し、それらを別の装置に輸送するための別の装置を概略的に図示する。
【図１１】微小物体を濃縮し、それらを別の装置に輸送するための別の装置を概略的に図示する。
【図１２】実験的に決定された細菌の数と濃度を示す。
【図１３】異なるフィルタで収集されたＤＮＡの量を示す。
【図１４】細菌とヒト細胞を分離するための方法を概略的に図示する。
【図１５】ろ過過程中の異なる段階における黄色ブドウ球菌のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を示す。
【図１６】ろ過過程中の異なる段階における黄色ブドウ球菌のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
他に特に規定しない限り、異なる図にあらわれる同一又は同様の参照数字は同一又は同様の構成要素をあらわす。
【００４０】
本発明の好適な実施形態によれば、迅速微生物分析のための方法は、試料を調製するためのステップ、高濃度化のためのステップ、微生物を（蛍光）染料で染色するためのステップ、顕微鏡イメージングのためのステップ、及び画像解析のためのステップを有し、ここで高濃度化のためのステップは、大面積フィルタでろ過するための第１ステップと、小面積上にフィルタ残留物（存在する可能性がある微生物を含む）を収集するための第２ステップとを有し、この小面積が顕微鏡イメージングのための所要解像度を持つ顕微鏡対物レンズ（例えば０．５ｍｍの視野を持ち、０．５μｍの解像度でのイメージングを可能にする４０Ｘ／ＮＡ０．６５対物レンズ）の視野に一致するようになっている。方法は、シングルキャプチャ（露出）での顕微鏡イメージングを可能にするので、走査の必要がなく、一方でそれと同時に大面積フィルタでの第１ろ過ステップのために全スループットは高い（ろ過時間はろ過面積に反比例する）。言い換えれば、第１フィルタの大きな表面積のおかげで大きな体積の試料流体が迅速にろ過され、その後第２ろ過もまた、試料の体積が第１ろ過ステップ（高濃度化）で削減されているため、第２フィルタの小さい面積にもかかわらず迅速である。
【００４１】
第１の実施形態において、大面積フィルタは可溶性物質から作られ、第２ステップにおいて細菌に影響を及ぼさない溶媒がフィルタを溶解するために使用される。より正確には、大面積フィルタは検査される流体（通常は水性）に溶けないが他の溶媒に溶ける物質から作られる。好適には、物質は（染色された）細菌に影響を及ぼさない。一例は穴のあいたアルミホイルであり得る。ホイルは水に溶けないが酢（希酢酸）に溶ける。酢は細菌を溶解しない。他の例は、有機溶媒によって影響を受ける有機高分子、例えば有機溶媒に接触すると分解する有機高分子から作られるフィルタであり得る。第１ステップにおいて流体試料は大面積フィルタでろ過され、第２ステップにおいて細菌を含むフィルタが第２流体に溶解される。得られる液体試料は元の試料よりも体積が小さく、従って比較的短い期間に第２流体に溶けない小面積フィルタ（例えばセラミックフィルタ）でろ過されることができる。
【００４２】
第２の実施形態において、第１ろ過ステップ後にポンプ方向が反転され、流体のごく一部と全残留微生物は小面積フィルタの方へ向けられる。
【００４３】
第３の実施形態において、フィルタ残留物がフィルタの部分領域上に収集されるように第１ろ過ステップ後に側方流動が誘導される。
【００４４】
これらの実施形態全てにおいて、微生物がろ過ステップ中に染色されるように、染料、特に蛍光染料がろ過中に流体に加えられ得る。これの好適な実施形態はフィルタの少なくとも１つに染料を含めることである。これを行うための複数の方法がある。
（ａ）染料をフィルタにコーティングとして加える。分析される液体にフィルタをさらすと染料は液体中に放出される。
（ｂ）可溶性フィルタの場合（実施形態１）、染料はフィルタに埋め込まれることができる。従ってこれはフィルタが溶解されると放出される。
（ｃ）（ａ）のようにコーティングとして染料を加え、（ｂ）のように可溶性フィルタに埋め込まれる染料を失活させる物質を加える。利点は、第１ろ過ステップ後に到着する細菌性汚染物質が染色されないように、フィルタが溶解されると染料（細菌に取り込まれる染料を除く）が失活することである。これは非無菌第２ろ過経路を可能にする。
【００４５】
図１に示されるのは試料流体１０に含まれる有機微小物体１２を濃縮するための装置２０である。巨視的体積の試料流体１０は図１ａに示される通り装置２０のチャンバに含まれる。シリンジピストン１４を第１フィルタ１６の方へ押すことによって、試料流体１０又は少なくともその大部分（例えば少なくとも５０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％）がフィルタ１６を通して押し出される。微小物体１２は第１フィルタ１６によって保持され、第１フィルタ１６の表面１８上に蓄積する（図１ｂ参照）。それによって試料流体１０の少なくとも５０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９９％が微小物体１２から除去される。試料流体１０は、フィルタ１６を通過するかもしれない図には示されないわずかな微小物体を含むかもしれないことが留意され得る。後続ステップ（図示せず）において、微小物体１２は試料流体１０よりも少ない体積を持つ輸送流体に浸される。そして輸送流体は第２フィルタ３２（図４にあらわされる）によってろ過され、微小物体１２を第２フィルタ３２の表面３４上に蓄積する。輸送流体は第１フィルタ１６を通って流れた試料流体１０の一部によって、又は別の流体によって、又は試料流体１０と別の流体の混合物によって、提供され得る。微小物体１２を第２フィルタ３２（図４参照）上に蓄積した後、これらは任意の適切な方法によって、例えば走査顕微鏡によって検出又は画像化され得る。第１フィルタ１６は、微小物体から試料流体１０の半分より多くを高濃度化するステップが、第２フィルタ３２によって輸送流体をろ過するステップより時間をかけないように設計され得る。これは例えば十分に大きい第１フィルタ１６を選ぶことによって実現され得る。
【００４６】
ここで図２を参照すると、試料流体１０が液体である場合に、微小物体１２から試料流体１０の全部又は大部分を除去する代替方法が図示される。装置２０は側壁２２と底板２４を持つ槽（ｂａｓｉｎ）を有する。図２ａに示される通り、微小物体１２を含む試料液体１０は槽２０に導入される。試料液体１０は試料液体１０と空気又は真空又は別のガスとの界面を成す表面２６を持つ。表面２６（蒸発表面）において、試料液体１０が蒸発する。蒸発過程を加速するために試料液体１０は加熱され得る。代替的に又は付加的に、蒸発表面２６において試料液体１０を含む空気／ガスが加熱され得るか、又は蒸発表面２６に沿って高温空気／ガス流が生成され得る。図２ｂに示される通り、試料液体１０が蒸発すると微小物体１２が槽２０の底板２４上に蓄積する。後続ステップにおいて、既に図１を参照して上述したが、微小物体１２が図４に示される第２フィルタ３２へ輸送され、画像化される。再度、提案される方法は第２フィルタ３２によって全試料液体１０をろ過するのと比較して少ない総時間を必要とし得る。
【００４７】
図３は試料流体１０が液体である場合に微小物体１２から試料液体１０の全部又は大部分を除去する別の方法を図示する。試料液体１０は透明底板２４を持つ槽に含まれる。図３ａに図示される通り、底板２４を介して槽に光を発するために底板２４の下に光源２８が配置される。図３ｂに示される通り、光は感光性微小物体１２を底板２４の方へ引き付け、これらはそこで蓄積する。代替的に、光源を使用する代わりに、帯電した微小物体、例えば負に帯電した細菌を底板２４へ引き付けるために試料液体１０に電場が印加され得る。図３ｃに示される後続ステップにおいて、試料流体１０はマクロ流体出口３０を通して放出され、底板２４上に微小物体が後に残る。後続ステップにおいて、既に図１を参照して上述したが、微小物体１２が図４に示される第２フィルタ３２へ輸送され、画像化される。再度、提案される方法は第２フィルタ３２によって全試料液体１０をろ過するのと比較して少ない総時間を必要とし得る。
【００４８】
図４に示されるのは第２フィルタ３２の表面３４上に蓄積した微小物体１２を画像化するための結像系の例の簡単な表現である。第２フィルタ３２全体は、図に単レンズとして示されるが通常はレンズ系を有する顕微鏡対物レンズ３６の視野に収まる。顕微鏡対物レンズ３６は画像センサ３８上に微小物体１２の光学像を生成する。画像センサ３８は例えば電荷結合素子（ＣＣＤ）を有し得る。画像センサ３８は、画像センサ３８によって供給される出力信号を処理するための例えばパーソナルコンピュータなどの情報処理装置（図示せず）に結合される。
【００４９】
図５は有機微小物体を含む試料流体を分析する方法のフローチャートをあらわす。方法は以下の連続ステップを有する。
‐総時間Ｔ１において、微小物体１２から試料流体１０の体積Ｖ１を除去することによって微小物体を高濃度化するステップ（Ｓ１）
‐微小物体を輸送流体に浸すステップ、又は試料流体の残留部分に微小物体を残すステップ、その場合試料流体の残留部分が輸送流体を提供する（Ｓ２）
‐総時間Ｔ３において、フィルタ３２によって輸送流体の体積Ｖ３をろ過し、それによってフィルタ上に微小物体を蓄積するステップ（Ｓ３）
‐第２フィルタ上に蓄積した微小物体の画像を生成するステップ（Ｓ４）
【００５０】
方法において、高濃度化ステップＳ１のスループットＶ１／Ｔ１はろ過ステップＳ３のスループットＶ３／Ｔ３よりも大きい。高濃度化するステップＳ１、浸すステップＳ２、ろ過するステップＳ３、及び画像を生成するステップＳ４にかかる時間はそれぞれＴ１，Ｔ２，Ｔ３，及びＴ４である。高濃度化するステップＳ１、浸すステップＳ２、ろ過するステップＳ３、及び画像を生成するステップＳ４にかかる総時間Ｔ１＋Ｔ２＋Ｔ３＋Ｔ４は、フィルタ３２によって全試料流体１０をろ過するステップ及びそのフィルタ３２上の微小物体１２を画像化するステップにかかるであろう総時間Ｔ３'＋Ｔ４'よりもかなり短くなることができることに留意されたい。
【００５１】
ここで図６から１１を参照すると、これらの図は、病原体の初期量を含んだまま、さらにマイクロ流体システムに輸送されることができる微視的体積（μｌ）に巨視的（ｍｌ）試料体積を減らすための装置の異なる設計を図示する。試料体積が減少すると病原体の濃度は大いに増加する。下流の分析過程を促進し、細菌及び哺乳類分析の両方から最大量の関連データを得るために、試料がマイクロ流体チップに入る前にヒト細胞を分離するようにプレフィルタが配置され得る。プレフィルタは特にその後のオンチップ分析の感度を増加し得る。さらに、巨視的物理フィルタ又は異なる孔径の膜をマイクロ流体システムと組み合わせることが提案される。
【００５２】
特に、大きな体積から細菌、菌類又は酵母を採取し、マイクロ流体体積に溶出し、それによってさらなる処理のために上述の病原体の濃度を濃縮して試料体積を減少させるために、１つ以上のマクロ流体フィルタをマイクロ流体システムと組み合わせることが提案される。好適には、本発明は少なくとも２つのフィルタから成り、第１フィルタは例えば関心のある細菌は通過させながら下流分析のために必要ないヒト細胞をろ過して除去するために大きな孔径を持ち、第２フィルタは関心のある細菌のサイズよりも小さい孔径を持つ。
【００５３】
ここで図６を参照すると、微小物体から流体の最大部分を除去することによって有機微小物体を含む試料流体の体積を減らすためのマクロ・マイクロ流体フィルタ装置２０が示される。装置２０はシリンジロック又はカバー板４６、シリンジピストン１４、入口５８、プレフィルタ４０（上部フィルタ）、第１リング４８、第１フィルタ１６（下部フィルタ）、第２リング５０、出口３０、底板又はプラグ５２、マイクロ流体入口４２、及びマイクロ流体出口４４を有する。マイクロ流体出口４４はプレフィルタ４０の下流及び下部フィルタ１６の上流の空間に接続する。マイクロ流体入口４２は下部フィルタ１６の下流空間に接続する。装置２０は次のように操作される。約０．１ｍｌ乃至１０ｍｌの体積を持つ試料流体が入口５８を介してプレフィルタ４０の上流空間に導入される。そしてピストン１４が押し下げられ、プレフィルタ４０を通して、そして下部フィルタ１６を通して試料流体を押し流す。プレフィルタ４０は例えば大きな哺乳類細胞を分離する。下部フィルタ１６は例えば細菌を捕らえる。下部フィルタ１６はその全体に及ぶ孔を持つ。従って例えば細菌は、例えば膜マトリクスの場合に起こり得るように詰まることがない。下部フィルタ１６は、例えばｆｌｕＸＸｉｏｎによって製造されている、例えばポリカーボネート（"Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ"）フィルタ又はシリコン膜フィルタであり得る。後続する第２ステップにおいて、マクロ流体出口３０を閉じるためにプラグ５２が第２リング５０に挿入される。同時に、マイクロ流体入口４２を通り、下部フィルタ１６に沿って、マイクロ流体出口４４を通るマイクロ流体チャネルが開かれる。そして下部フィルタ１６上の細菌が、例えばピストン（図示せず）によってマイクロ流体チャネルを通して押し流されるマイクロ流体体積（例えば１００μｌ）の輸送液体に溶出される。全細菌がさらなる処理のために溶出されることができ、又はＤＮＡのみが輸送液体とともに輸送されることができる。後者の場合、輸送液体（溶出バッファ）は溶解バッファであることもでき、又は溶解は、例えばＷｈａｔｍａｎ  ＥＬＵＴＥ  ｌｙｓｉｓペーパーなどで、熱若しくは超音波を用いて、何か他の機構によって起こることができる。マイクロ流体及びマクロ流体チャネルは例えば弁（機械的に、熱的に又は他の方法で駆動される）を介して、又は図に図示される通りプラグ５２を除去若しくは挿入することによって、開閉されることができる。
【００５４】
図７ａは図６を参照して上述したものと同様の装置２０の略図である。約１乃至５ｍｌの体積を持つ液体試料１０はシリンジ（図示せず）を用いて装置２０を通して押し出され、プレフィルタ４０（上部フィルタ）と第１フィルタ１６（下部フィルタ）を含む巨視的通路５８，４０，１６，３０を通って流れる。巨視的通路を閉じた後、下部フィルタ１６上に詰まった病原体は、マイクロ流体入口４２を介して装置２０の中へ流れ、下部フィルタ１６に沿って、マイクロ流体出口４４を介して装置２０から外へ流れる輸送液体（溶出バッファ）に浸される。示された例において、カバー板４６（図７ｂに区別して示される）、上部リング４８（図７ｃに区別して示される）、及び下部リング５０（図７ｄに区別して示される）が両面接着テープを用いて実現される。この場合、マクロ流体通路の終端は、マクロ流体液体（すなわち流体試料）が送り出された後に固体基板にテープを接着することによって閉じられる。テープあたり１つよりも多くの流体接続が組み込まれることもできる。代替的に、プレフィルタ４０と第１フィルタ１６を含み、筐体を提供する装置２０の部分は、例えばプラスチックから作られることができる。
【００５５】
図８にあらわされる別の実施形態によれば、第１フィルタ１６を通過した試料液体１０の一部によって輸送流体が提供される。微小物体を第１フィルタ１６上に蓄積した後、試料液体１０の上記部分、すなわち輸送流体は第１フィルタ１６を通って逆流させられる（図の上方向）。これは例えば水、空気又は油を含むチャンバ５４を圧縮することによって得られる（図８ｂ参照）。従って前に第１フィルタ１６上に蓄積した微小物体は輸送流体に浸される。輸送流体の体積は、最初に装置２０に導入された試料液体１０の体積よりも約１桁小さい。従ってマイクロ流体出口４４を介して装置２０から出る輸送流体はより高い濃度の微小物体を持つ。輸送流体はさらに下流で、例えばマイクロ流体出口４４に接続されるマイクロ流体チップにおいて、処理されることができる。微小物体が蓄積される第１フィルタ１６上の空間と圧縮性チャンバ５４との間に弁（図示せず）が配置され得る。弁と圧縮性チャンバの両方は例えば温度で制御されることができる。
【００５６】
図９に簡単な方法で図示されるこのスキームの異なるバージョンにおいて、第１フィルタ１６の上又は中に捕らえられている細菌又はＤＮＡなどの帯電又は双極性微小物体は、ＤＣ又はＡＣ（誘電泳動）電場を介して第１フィルタ１６から小チャンバ５６へ輸送される。細菌は一般的に負電荷を持つことが留意される。電場は第１フィルタ１６とチャンバ５６の間に電圧を印加することによって生成されることができる。示された実施例において、第１フィルタはゼロ電位（接地）に設定され、一方チャンバは正電位（Ｖ）に設定される。チャンバ５６はマイクロ流体チップに接続されることができる。第１フィルタ１６はゲル材料、例えば多孔質ゲルを有し得る。従って、第１フィルタ１６に沿って又はそれを通って横（図中では水平）方向における例えば細菌又はＤＮＡなどの微小物体の運動が促進され得る。
【００５７】
図１０に概略的にあらわされるのは別の実施形態にかかる装置２０である。装置２０の操作原理は図９を参照して上述されたものと同様であり、微小物体１２はプレフィルタ４０（上部フィルタ）を通過後に小チャンバ５６へ輸送される。しかしながら、本実施形態によれば、第１フィルタ１６が存在しない。電場が試料流体１０の主流（図中下方向）から微小物体（例えば細菌）を分離し、それらをチャンバ５６へ輸送する。巨視的な流れ（すなわち試料流体１０の流れ）がチャンバ５６にひろがるのを防ぐために小さなゲルプラグが設けられ得る。
【００５８】
図１１はさらに別の実施形態を図示する。第１フィルタ１６、例えば膜は、酸性（高ｐＨ）又は熱い（高温）環境値において分解するフィルタ材又はゲルから作られる。高ｐＨにおいて溶解するゲルの例は、（ポリ）アクリル酸及び（ポリ）メタクリル酸などのポリアニオンである（Ｙ．Ｑｉｕ  ａｎｄ  Ｋ．Ｐａｒｋ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ‐ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，ｖｏｌ．５３，ｐｐ．３２１‐３３９，２００１）。温度感受性ゲルは（ポリ）エチレンオキシドと（ポリ）プロピレンオキシドの共重合体を含む（ＱｉｕとＰａｒｋによる引用論文を参照）。図１１ａに図示される第１ステップにおいて、巨視的体積の試料流体１０は、入口５８、プレフィルタ４０、第１フィルタ１６、及びマクロ流体出口３０を有する巨視的チャネル５８，４０，１６，３０に沿って装置２０を通って押し出されるか又は吸い込まれる。同時に、マイクロ流体出口４４は例えば弁（図示せず）を用いて閉じられたままである。第２ステップにおいて、少量のＮａＯＨが入口５８を介して装置へ導入される。ＮａＯＨは単独で又は熱と組み合わせてｐＨを増加し、それによって第１フィルタ１６を分解する。加えて、ＮａＯＨは例えばＤＮＡを放出するために第１フィルタ１６上に蓄積した例えば細菌などの微小物体を溶解し得る。図１１ｂに示される第３ステップにおいて、マイクロ流体出口４４が上述の弁を用いて又は別の弁（図示せず）を用いて開かれる。マクロ流体出口３０とマイクロ流体出口４４の両方をしばらく塞ぐことによって、一定の培養時間がもたらされ得る。
【００５９】
マイクロ流体試料がマクロ流体試料から調製された実験が以下に記載される。
【００６０】
プレフィルタと第１フィルタを用いるヒト細胞と細菌の分離：大腸菌（Ｅ  ｃｏｌｉ）をブレインハートインフュージョン培地で一晩培養し、ＢａｃＬｉｇｈｔ  ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色で染色した。ＴＨＰ‐１細胞を蛍光マーカーで染色した。この場合細胞増殖培地を遠心分離ステップにおいてＰＢＳと交換した。５００μｌの細菌懸濁液をＰＢＳにおいて５００μｌのヒトＴＨＰ‐１細胞と混合した。１ｍｌの細胞＋細菌液体を最初にＷｈａｔｍａｎ  ５μｍ孔径ポリカーボネートフィルタを通してろ過した。フィルタから液体を除去するために２ｍｌの空気を使用した。ろ過懸濁液とフィルタを蛍光顕微鏡を用いて分析した。そして５００μｌのろ過懸濁液を０．２２ミリポアフィルタを通して２回目にろ過した。５ｘ対物レンズでは単球のみが検出されたが、Ｅ  ｃｏｌｉは２０ｘではっきりと見られた。予想通り、これらの試料において細菌の濃度はＴＨＰ‐１細胞の濃度よりもかなり高い（およそ１０９ｖｓ．１０６細胞／ｍｌ）。Ｅ  ｃｏｌｉは数え切れないほど多かったが単球は５ｘの倍率で平均２６±４細胞／フレーム（３フレーム）であった。５ｘ対物レンズ及び２０ｘ対物レンズからのフレームは、５μｍポリカーボネートフィルタ（プレフィルタ）を通すろ過後の懸濁液を示した。プレフィルタは単球のほとんど又は全部を除去し、細菌を通過させた。しかしながら、Ｗｈａｔｍａｎフィルタホルダ内の死容積はかなり大きく、従って試料の約半分がそこで失われた。５ｘ対物レンズで、単球の数は全フレーム（４フレーム）において０であった。プレーティング実験から、５μｍフィルタを通して低濃度の細菌（＜５００ＣＦＵ／ｍｌ）をろ過するとき、おおよそ細菌の１００％が通過することがわかり、これはたとえあったとしてもわずかな細菌しかポリカーボネートフィルタにくっつかないことを示す。０．２２μｍフィルタを通す最終ろ過後、試料液体中にもう細胞は見られなかった。
【００６１】
実験台上で０．２２μｍフィルタを溶出することによる細菌の高濃度化：次のステップにおいて、０．２２μｍフィルタ上に捕らえられている細菌がその後濃度を増すためにより小さな体積に溶出される実験も行った。この実験を三回行い、よく似た結果が得られた。Ｅ  ｃｏｌｉを用いて５００μｌの細菌懸濁液を０．２２μｍフィルタを通してろ過した。そしてフィルタを５０μｌ  ＰＢＳバッファ中に置き、ボルテックスした。５分後、フィルタを除去して懸濁液を培養した。開始懸濁液は〜２００ＣＦＵ／ｍｌ（５０μｌ中１００ＣＦＵ）を含み、フィルタからの溶出は〜１０００ＣＦＵ／ｍｌ（５０μｌ中５０ＣＦＵ）であり、これは５ｘ高濃度化を意味する。黄色ブドウ球菌（Ｓ  ａｕｒｅｕｓ）も同様にろ過し、溶出した（より小さな体積でボルテックス＋５分待機）。これらの実験において、それぞれ１６０及び９８ＣＦＵ／ｍｌの懸濁液１ｍｌを０．２２μｍフィルタを通してろ過した。そして細菌を１００μｌのＴＢＳ増殖培地に溶出し、培養した。１００μｌ培地中のＳ  ａｕｒｅｕｓの数はこの場合それぞれ８４（'８４０ＣＦＵ／ｍｌ'）及び７８（'７８０ＣＦＵ／ｍｌ'）であった。従って、これらの実験後の終濃度は開始濃度の５２５％及び７９５％であった。ろ液（フィルタを通過する溶液）もコントロールとして培養し、上記実験全てにおいて０コロニーであった。結果は図１２に要約される。
【００６２】
実験台上でのＮａＯＨ溶解及び溶出：上記と同様の実験において、９８ＣＦＵ／ｍｌを含む１ｍｌの細菌懸濁液からＳ  ａｕｒｅｕｓを捕らえたフィルタを１００μｌ  ＮａＯＨ中に置き、ボルテックスして５分間培養した。その後、フィルタを除去してＮａＯＨ中のＤＮＡをエタノール沈殿で抽出した。図１３は対応するｑＰＣＲ結果を要約する。０．２２μｍフィルタ上に捕らえられた細菌は同時にＮａＯＨで溶解及び溶出された。ＳＡフィルタ‐試料からわかる通り、かなりの量のＳ  ａｕｒｅｕｓ  ＤＮＡが溶出された。１ｍｌあたりわずか９８の細菌からはじめて、細菌を捕らえるはずの両フィルタ（'ＳＡフィルタＮａＯＨ２５Ｃ'及び'ＳＡフィルタＮａＯＨ９５Ｃ'）からかなりの量（０．０１ｎｇ基準に近い）のＳ  ａｕｒｅｕｓ  ＤＮＡが回収された。ＴＢＳ培地のみで使用した１つのフィルタ（'ＴＢＳフィルタ２５Ｃ'）は別として、全てのネガティブコントロールとろ液はＤＮＡ含量をほとんど又は全く示さなかった。
【００６３】
細菌の高濃度化及びヒト細胞からの分離：図１４は第２フィルタ上での濃縮が後に続く、細菌とヒト細胞を分離する実験スキームを図示する。２つのフィルタ（５μｍ及び０．２２μｍ）を用いる対応するろ過実験において、入力液体は１００００  Ｕ９３７ヒト細胞／ｍｌと２２  Ｓ  ａｕｒｅｕｓ／ｍｌの混合溶液であった。２ｍｌの混合試料溶液を５μｍフィルタを通してろ過した。このろ液１ｍｌを続いて０．２２μｍフィルタを通してろ過した。両フィルタから１００μｌ培地において５分間細菌を溶出した。ろ過手順の全段階からの試料を培養を通して分析した。実験結果は図１５と１６に示される。使用されたフィルタホルダの"死容積"のために、第１フィルタを通過した全液体が第２フィルタを通過できたわけではない。しかしながら、第１フィルタ上で失われた細菌はほとんどなく、第２フィルタからの溶出は入力試料と比較して著しく高い濃度のＳ  ａｕｒｅｕｓを有した。総合すれば、上記実験は、ヒト細胞から細菌を分離し、試料体積を減らすことによって細菌濃度を増加するために、フィルタの組み合わせが使用されることができることを証明する。
【００６４】
図１５はろ過過程の各段階におけるＳ  ａｕｒｅｕｓの絶対数を示す。フィルタ１からのろ液の半分のみがフィルタ２への入力液体として使用されることに留意されたい。このろ液の１００μｌが分析のために培養されたが、１ｍｌがフィルタ２を通してろ過された。フィルタ２のろ液中に細菌は検出されなかった。
【００６５】
図１６はろ過過程の各段階におけるＳ  ａｕｒｅｕｓの濃度を示す。'パスフィルタ１'における濃度は入力濃度以下であるはずである。わずかに過大評価された値は濃度がたった１００μｌの分析から計算されるためである（この場合平均３細菌を含む）。フィルタ２のろ液中に細菌は検出されなかった。
【００６６】
要約すると、さらなる分析のためにかなりの数の細菌を失うことなく、ｍｌからμｌへ初期試料体積を減らすための特定の技術が提案される。こうして得られるｍｌ体積は、低濃度の細菌が"大きな"体積の試料液体で開始することを要するときは特に、マイクロ流体ｌａｂ‐ｏｎ‐ａ‐ｃｈｉｐシステムを用いてさらに分析されるか、又は、光学顕微鏡によるシングルキャプチャにおいて画像化されることができる。
【００６７】
本発明は臨床応用だけでなく工業用途（食品加工、薬物、パーソナルケア製品、飲料、環境、及び工業工程部門）にとっても迅速な微生物分析に応用され得る。提案される方法は微生物を検出し数えるために特によく適し得る。さらに、特異染色（例えば免疫標識）の使用は選択的検出及び同定への道を提供し得る。本発明の特定用途は、感染症を引き起こす細菌のオンチップ検出及び抗生物質感受性のスクリーニングであり得る。他の応用は例えば食品及び水質検査並びに哺乳類細胞におけるウイルスの検出である。
【００６８】
本発明は研究プロジェクト"Ｘｙａｌｌ：Ｄｉｇｉｔａｌ  ｃｅｌｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｆｏｒ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ"のフレームワーク内で提案され、ｔｈｅ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒにおけるｔｈｅ  Ｒａｐｉｄ  ＭｉｃｒｏＢｉｏｌｏｇｙベンチャーに関連する。
【００６９】
本発明は図面と前述の説明において詳細に図示され記載されているが、図面と説明は例であって限定とはみなされないものとする。本発明は開示された実施形態に限定されない。上述されていない均等物、組み合わせ、及び変更もまた、本発明の範囲から逸脱することなく実現され得る。
【００７０】
"有する"という動詞とその派生語は、"有する"が言及する事柄における他のステップ又は要素の存在を除外しない。不定冠詞"ａ"又は"ａｎ"はその冠詞が言及する主語の複数を除外しない。特に、"微小物体"という語は他の微小物体の存在を除外しない。例えば、試料流体１０は請求項１において言及される微小物体に加えて、第２フィルタ３２に輸送されない又は工程中に失われる微小物体を有し得る。
【００７１】
請求項において言及される複数の手段の機能を単一ユニットが提供し得ることもまた留意される。特定の特徴が相互に異なる従属請求項に列挙されているという単なる事実は、これらの特徴の組み合わせが有利に使用できないことを示さない。請求項における任意の参照符号はその範囲を限定するものと解釈されてはならない。
【図１ａ】
0005753839.tif 000002
【図１ｂ】
0005753839.tif 000003
【図２ａ】
0005753839.tif 000004
【図２ｂ】
0005753839.tif 000005
【図３ａ】
0005753839.tif 000006
【図３ｂ】
0005753839.tif 000007
【図３ｃ】
0005753839.tif 000008
【図４】
0005753839.tif 000009
【図５】
0005753839.tif 000010
【図６ａ】
0005753839.tif 000011
【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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