(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライマー依存ＤＮＡ増幅反応用の反応混合物であって、少なくとも１つのプライマー対、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、少なくとも１つの標的配列、および少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤を含み、前記少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤は、６〜５０のヌクレオチド長の長さのハイブリッドを有し、３２℃で少なくとも５０％が二本鎖であり、その鎖のそれぞれに末端領域を有し、かつそれぞれ異なる末端領域に共有結合的に結合される、１〜４つの修飾基を含み、前記修飾基は、ダブシル（Ｄａｂｃｙｌ）、ジゴキシゲニン、クマリン、およびＱＳＹ２１から選択される、添加剤であり、前記少なくとも１つの添加剤は、前記少なくとも１つの標的配列のためのプライマーまたはプローブではなく、前記少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤は、ミスプライミングの抑制、完全に相補的でない陥凹３’末端配列を有するハイブリッドに対するポリメラーゼ選択性の増加、ＡＴ豊富の陥凹３’末端配列を有するハイブリッドに対するポリメラーゼ選択性の増加、反復反応間のばらつきの減少、ポリメラーゼ５’エキソヌクレアーゼ活性の阻害、およびポリメラーゼ活性の阻害の機能のうちの少なくとも１つについて効果的である、前記ＤＮＡポリメラーゼの濃度に対する濃度で含まれる、反応混合物。
【請求項２】
前記少なくとも１つの修飾基は、２〜４つの修飾基である、請求項１に記載の増幅反応混合物。
【請求項３】
前記修飾基は、前記少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤の末端ヌクレオチドに共有結合的に連結される、請求項１または２に記載の増幅反応混合物。
【請求項４】
前記修飾基は、ダブシル（Ｄａｂｃｙｌ）である、請求項１〜３のいずれかに記載の増幅反応混合物。
【請求項５】
前記少なくとも１つの添加剤は、２つの添加剤の混合物である、請求項２に記載の増幅反応混合物。
【請求項６】
前記混合物は、３本の鎖から成る、請求項５に記載の増幅反応混合物。
【請求項７】
前記少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤は、天然のヌクレオチドから成る、請求項１〜６のいずれかに記載の増幅反応混合物。
【請求項８】
前記少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤は、ＤＮＡである、請求項１〜６のいずれかに記載の増幅反応混合物。
【請求項９】
前記少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤の前記濃度は、１０００ｎＭ以下である、請求項１〜８のいずれかに記載の増幅反応混合物。
【請求項１０】
逆転写酵素をさらに含む、請求項１〜８のいずれかに記載の増幅反応混合物。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの二本鎖添加剤は、１〜４つの一本鎖オーバーハングを含む、請求項１に記載の増幅反応混合物。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの二本鎖添加剤は、ハイブリッド形成されない時、ステムループ構造を形成する少なくとも１本の鎖を含む、請求項１１に記載の増幅反応混合物。
【請求項１３】
少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を増幅するための方法であって、プライマーアニーリング温度およびプライマー伸長温度を有するプライマー依存ＤＮＡ増幅反応に、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の増幅反応混合物を供すること、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願の相互参照
本出願は、Ｚｈａｎｇへの、２００９年３月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／２０２，５６５号の利益を主張するものとし、参照によりその全体が本明細書に援用される。
技術分野
リアルタイムおよびエンドポイントの両方の、均質ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）単一および多重増幅アッセイを含む、核酸増幅反応およびアッセイを提供する。
【背景技術】
【０００２】
核酸標的配列の増幅および検出のために、ＤＮＡプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを使用する増幅および増幅アッセイは、周知である。指数関数的増幅の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、およびローリングサークル型増幅（ＲＣＡ）を含む。ＰＣＲ等の特定のこれらのプライマー依存増幅法は、熱サイクルを含み、一方、ＮＡＳＢＡ等の他の増幅は、等温である。多くのＤＮＡポリメラーゼの中で通常使用されるものは、好熱菌ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）および逆転写酵素である。直鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド増幅プライマーの設計は、一般的に、その目的のために設計されたコンピュータプログラムの補助により達成される。入手可能なプログラムの中で利用することができるものは、ＰＲＩＤＥ（Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：３００６−３０１２  １９９８）、ＯＬＩＧＯ（Ｒｙｃｈｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ１７（２１）：８５４３−５１  １９８９）、ＯＳＰ（Ｈｉｌｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＯＳＰ：ａ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｃｈｏｏｓｉｎｇ  ＰＣＲ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒｓ．ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．１（２）：１２４−１２８  １９９１）、Ｐｒｉｍｏ（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４０（３）：４７６−８５  １９９７）、およびＰｒｉｍｅｒ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｐｒｏｕｔｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ１２（３）：２５３−５  １９９６）である。
【０００３】
ＰＣＲを利用する核酸増幅は、周知であり、ＰＣＲ増幅を含むアッセイも同様である。米国特許第４，６８３，２０２号、第４，６８３，１９５号および第４，９６５，１８８号、ならびに一般的に、ＰＣＲ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（ＵＳＡ）１９９０）を参照のこと。未結合検出素子試薬またはプローブを除去するための洗浄を必要とせず、したがって、増幅反応槽の開口なしに実施することができる均質ＰＣＲアッセイも、周知である。均質ＰＣＲアッセイは、増幅された産物が、増幅反応の終了時に検出されるエンドポイントアッセイと、反応が進行するにつれ、増幅された産物が、幾つかの、または全ての熱サイクル中に検出されるリアルタイムアッセイとの両方を含む。米国特許第５，９９４，０５６号、第５，４８７，９７２号、第５，９２５，５１７号、および第６，１５０，０９７号を参照のこと。
【０００４】
ＰＣＲ増幅反応は、上に参照する他の増幅法と同様に、一般的に、対称であるように設計される、つまり、「一致する」順方向プライマーおよび逆プライマーを利用することにより、二本鎖アンプリコンを作製する、つまり、これらは、可能な限り近い融解温度を有し、等モル濃度で反応物に添加される。ＰＣＲ反応で、直接一本鎖ＤＮＡを作製するための限られた用途を見出す技法は、「非対称ＰＣＲ」である。Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ  ａｎｄ  Ｅｒｌｉｃｈ，“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＬＡ−ＤＱＡ  Ｌｏｃｕｓ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：７６５２−７６５６（１９８８）、および米国特許第５，０６６，５８４号。非対称ＰＣＲは、プライマーの１つが、限定量、典型的には、他方のプライマーの濃度の１〜２０パーセントで添加されるという点で、対称ＰＣＲと異なる。
【０００５】
最近開発された非対称ＰＣＲ増幅法は、「指数後直線的（Ｌｉｎｅａｒ−Ａｆｔｅｒ−Ｔｈｅ−Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ）」ＰＣＲ、または略して「ＬＡＴＥ−ＰＣＲ」として知られる。Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）ＰＮＡＳ１０１：１９３３−１９３８，Ｐｉｅｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）ＰＮＡＳ１０２：８６０９−８６１４、および参照によりその全体が本明細書に援用される、公開された国際特許出願第ＷＯ０３／０５４２３３号（２００３年７月３日）を参照のこと。ＬＡＴＥ−ＰＣＲは、Ｔｍ［０］と称される、増幅の開始時の、実際の濃度調節されたＰＣＲプライマーの融解温度を考慮する。Ｔｍ［０］は、非天然ヌクレオチドが使用される時に必要である際に、経験的に決定されるか、または計算することができる。種々の蛍光プローブが、ＬＡＴＥ−ＰＣＲで使用することができ、特に、標的に結合しない時に接近し、よって一端にフルオロフォア、そしてもう一端にクエンチャーを相互に近くに持ってくることができるステムループ構造を形成することができる一本鎖である分子指標；一端にフルオロフォア、そしてもう一端にクエンチャーを有する直鎖一本鎖プローブ；標的配列上で隣接的にハイブリッド形成する２つの標識された一本鎖プローブであり、ＦＲＥＴによる、それらの標識にプローブ間でのエネルギーの通過を可能にするＦＲＥＴプローブ対；ＤＮＡ色素とＦＲＥＴする、フルオロフォア標識された直鎖状プローブ；およびフルオロフォアが、標的に結合する鎖上にあり、クエンチャーが、標的の不在下で対応するＴｍのプローブに結合する相補鎖上にある、直鎖二本鎖プローブを含む。
【０００６】
望ましくない対称ＰＣＲ増幅の特色は、増幅の対数期後、リアルタイムでの反復増幅を監視することにより得られる蛍光曲線が、分散し、異なるレベルで平坦域に達することである。ばらつきは、反復が、同じ反応効率を有さず、検出精度を低下させることを示す。これは、一般的に、ＰＣＲアッセイにおいて問題であるが、エンドポイントアッセイの場合において、特に望ましくない。反復間でのばらつきは、かなり減少するが、両方とも、対数期および線形位相を有する、ＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイおよび非対称ＰＣＲアッセイにおいて、それでも存在する。線形位相でのばらつきは、ある程度、制限プライマーがなくなった時の指数関数的増幅の終了時の平坦域のばらつきを反映する。
【０００７】
ＰＣＲ増幅を含む、プライマー依存増幅反応での別の重大な問題は、ミスプライミングであり、我々は、それが幾つかの個別のタイプにより表されると考える：タイプ１は、増幅の開始前の反応混合物の調製中に生じるミスプライミング、タイプ２は、温度（ＰＣＲ増幅において、任意の熱サイクルでの温度を意味する）が、何らかの理由で、プライマーの融解温度未満に低下した場合、増幅中に生じるミスプライミング、およびタイプ３は、高濃度のアンプリコンが作製された後に継続される、ＰＣＲ増幅を含む、増幅の後期に生じるミスプライミングである。タイプ３のミスプライミングが、ＬＡＴＥ−ＰＣＲおよび非対称反応で生じる時、一本鎖アンプリコンの３’端は、別のｓｓ−ＤＮＡ分子上でプライミングされ、これによってｓｓ−ＤＮＡをｄｓ−ＤＮＡに変換する。反応中のミスプライミングも、反復実感反応間でのばらつきをもたらす。ミスプライミングは、プライマー−ダイマー形成を含み、これは、増幅のあらゆる段階中に生じ得る。
【０００８】
タイプ１のミスプライミングに対処するために、幾つかのアプローチが使用されている。アプローチの１つは、９５℃等の高温に加熱されるまで不活性であるように、ポリメラーゼを化学的に修飾することである。米国特許第５，６７７，１５２号および第５，７７３，２５８号を参照のこと。別のアプローチは、抗体をポリメラーゼに結合して、反応が９５℃等の高温に加熱されて、抗体を不可逆的に変性させるまで、ポリメラーゼを阻害することである。米国特許第５，３３８，６７１号を参照のこと。化学的に修飾され、抗体結合されたＤＮＡポリメラーゼは、通常、「温態始動」ＤＮＡポリメラーゼと称される。さらに別の「温態始動」アプローチは、反応混合物にアプタマーを含むことである。Ｄｏｕｇ  ａｎｄ  Ｊａｙａｓｅｎａ（１９９６），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６４：２６８−２７８、および米国特許第６，０２０，１３０号を参照のこと。アプタマーは、ポリメラーゼに結合し、低温で陥凹３’端を伸長するその能力を阻害する、長さが約３０のヌクレオチドである、一本鎖オリゴヌクレオチドである。アプタマーは、ＰＣＲサイクルにおいて典型的な高温である９５℃で、不可逆的に変性されない。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ−５Ｐｒｉｍｅ，Ｉｎｃ．は、温度依存様式でＴａｑポリメラーゼに結合し、約５０℃より低い温度で、二本鎖ＤＮＡへのその結合を阻害すると言われる特許リガンドを市販する。これらの多くの試みにも関わらず、ミスプライミングは、なお、ＰＣＲ増幅で問題となっている。
【０００９】
ＰＣＲ増幅を含む、プライマー依存増幅反応中の別のタイプのミスプライミングは、プライマー−ダイマー形成およびプライマー−ダイマー増幅として知られる。この現象によると、１つのプライマーは、他のプライマーまたはそれ自体の別のコピーとハイブリッド形成し、その後、３’端の伸長を受けて、小さい二本鎖アンプリコンを生成し、これは、次いで、さらに増幅するか、または多量体化し、さらに増幅することができる。プライマー−ダイマー形成は、標的の不在下で生じる。
【００１０】
ＰＣＲ増幅を含む、増幅反応の定量分析は、リアルタイム検出法により可能になった。ＰＣＲ増幅において、蛍光シグナルが、反応の閾値サイクル、またはＣＴ以上で可視になるＰＣＲサイクルは、開始標的濃度を示す。エンドポイント分析は、反応が指数関数的増幅を出ると、反復間である程度分散するため、せいぜい半定量的である。二本鎖アンプリコンの電気泳動分析は、半定量的であり、蛍光的に標識されたプライマーを利用してもよい。対立遺伝子識別プローブまたはミスマッチ寛容性プローブのいずれかの蛍光的に標識されたプローブを利用するエンドポイント分析も、せいぜい半定量的である。ばらつきを低減し、一本鎖産物を産生することにより、ＬＡＴＥ−ＰＣＲは、エンドポイント分析において、顕著な改善を提供するが、反復間のばらつきは、多くの場合、完全に排除されず、所望より定量的および多重検出の精度が低く、問題を残す。
【００１１】
単一反応におけるプライマーの複数対の使用は、幾何学的に、多数の意図しないプライマーおよび標的配列、または存在するかもしれない他のＤＮＡ鎖の相互作用の可能性を増大させるため、多重ＰＣＲアッセイの設計および構築は、多くの場合、ミスプライミングの問題に遭遇する。実際、対称多重ＰＣＲアッセイにおいて、同じ融解温度を有するように、全てのプライマー対を設計すること、また、非対称またはＬＡＴＥ−ＰＣＲ多重ＰＣＲアッセイにおいて、単一の融解温度を有するように制限プライマーの全てを、および単一融解温度を有するように過剰プライマーの全てを設計することは、非常に困難である。したがって、多重ＰＣＲアッセイにおいて、１つ以上の熱サイクルに使用される特定のアニーリング温度が、プライマーの全ての対に最適である可能性は高くないということになる。ＰＣＲサイクルのプライマーアニーリングステップが、最低Ｔｍプライマーのハイブリッド形成を可能にするように設定される場合、反応は、より高いＴｍではプライマーの厳密性を低下させ、これは、ミスプライミングが生じる確率を増加させる。その上、ＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイにおいて、使用される制限プライマー（単一または多重に関わらず）は、典型的に、過剰プライマーの融解温度よりも５℃以上高い融解温度を有し、ここでも、単一プライマーのアニーリング温度を両方のプライマーの融解温度に一致させることは不可能となる。
【００１２】
ＰＣＲ増幅を含む、プライマー依存増幅におけるＤＮＡポリメラーゼの１つの性質は、選択性の公称量、具体的には、プライマーに完全に相補的である標的配列と、プライマーの３’末端ヌクレオチドでのミスマッチを除き、完全に相補的である配列とを識別する公称能力である。変異を受ける標的ヌクレオチドに相補的であるそれらの３’末端ヌクレオチドを有するプライマーを設計することにより、単一ヌクレオチド変異またはＳＮＰを検出するために、この公称選択性を利用することが試されている。増幅不応性変異システム（ＡＲＭＳ）として知られる増幅アッセイ法は、これを行うための試みである（Ｎｅｗｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７，２５０３−２５１６（１９８９）、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：２７５７−２７６０（１９８９））。ＡＲＭＳアッセイは、ミスプライミングおよびプライマー−ダイマー形成により、偽陽性シグナルを生成する傾向がある。特定のミスプライミング事象は、３’ミスマッチのヌクレオチドが存在するという、不適切にハイブリッド形成されるプライマーを含む場合がある。プライマー−ダイマー形成も、ミスマッチの３’ヌクレオチドを含む場合がある。ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の最後の段階において、反応混合物中の別の一本鎖上の一本鎖アンプリコンのミスプライミングも、ミスマッチの３’ヌクレオチドを含む場合がある。したがって、３’末端ミスマッチに対するポリメラーゼの識別の強化は、その他の作用の中でも、ミスプライミングを低減させることができる。増幅プライマー自体をより選択的にすることにより、前述の公称選択性以上に増幅中の選択性を改善するための試みがなされている。例えば、Ｔｙａｇｉらは、プライマーの３’端に相補的な配列をプライマーの５’端に付加して、ループとステムの３’部分が標的鎖に相補的であるステムループ構造を形成した（米国特許第６，２７７，６０７号）。このアプローチは、上述の、多重アッセイのプライマーを設計する困難さを低減しないようである。プライマーをより選択的にすることは、言うまでもなく、ＤＮＡポリメラーゼの選択性を改善しない。
【００１３】
選択性を改善するための、プライマー修飾の代替案は、ＤＮＡポリメラーゼ自体に影響を与えることである。米国特許出願第ＵＳ１１／２４２，５０６号は、ＰＣＲ増幅反応における産物特異性をある程度改善し、ミスプライミングの作用を大きく低下させる、または幾つかの場合において、事実上それを排除する試薬添加剤のクラスを記載している。このクラスの試薬は、温度がステムの融解温度以下に低下する時、ステムおよびループを有するヘアピン構造の中に折り畳むことができる、単一オリゴヌクレオチド分子から成る。二本鎖ステムは閉鎖されるが、３’端および５’端のヌクレオチドは、ほどかれる傾向がある。したがって、これらの添加試薬は、端を閉鎖したままとするように、それらの３’端および５’端の両方で、化学的に修飾される。本方式での端閉鎖は、ステムの融解温度を効果的に上昇させる。閉鎖構造において、これらの試薬添加剤は、選択性を改善するように、ＤＮＡポリメラーゼと相互作用する。閉鎖構造において、これらは、ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性も阻害する。これらの添加剤は、全種類のＰＣＲにおいて、既存の「温態始動」方法より優れており、多数のサイクル（典型的に６０サイクル以上）を有する反応の早期およびＬＡＴＥ−ＰＣＲ反応中の両方で、プライマー−ダイマーおよびミスプライミングされたアンプリコンを含む、望まない産物の蓄積を防ぐために使用することができるが、これらは、それらが単一オリゴヌクレオチドから成ることに由来するそれらの制限がある。具体的には、ステムの長さは、約１２ヌクレオチド以上であってはならない、なぜなら、それ以上であり、かつその端で化学的に修飾もされる場合、融解温度が非常に高くなり、ＰＣＲが伸長温度に加熱される時、容易に開放しないためである。低濃度で添加される時でさえ、長いステムおよび高Ｔｍを有するヘアピン分子は、反応を阻害する傾向がある。これらの添加剤に由来するさらに別の問題は、これらが、直線的に対称ではないことである、すなわち、閉鎖ヘアピンの一端が開放であり、一方、もう一端がループである。米国特許出願第ＵＳ１１／２４２，５０６号に記載されるように、３〜２２のヌクレオチドから成るループを有する分子は、ループが三炭素または六炭素リンカーの使用により形成される分子より、容易に増幅を阻害する傾向がある。構造的に端から端まで対称である試薬を有することが望ましいであろう。
【００１４】
Ｋａｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２８：２７８−２８２は、長さが１６〜２１のヌクレオチドを有するＤＮＡ断片、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、対称ＰＣＲ反応の最適なアニーリング温度で、またはそのちょうど下で生じるミスプライミングを阻害し、それにより非特異的産物の増幅を阻止できることを報告した。ＤＮＡオリゴマーは、ＰＣＲサイクルの融解ステップ中に、可逆的に変性される。全ての場合において、Ｋａｉｎｚらが利用したアッセイは、温度が、９５℃での第１の融解事象後、最適なアニーリング温度に低下する時に起こるミスプライミングの存在、およびその阻害を明らかにした。これは、Ｋａｉｎｚらが認めるように、タイプ１のミスプライミングに対処せず、これらのデータは、タイプ１のミスプライミングが生じる時（つまり、反応のアニーリング温度より５℃を超えて低い融解温度で）にのみ二本鎖である二本鎖断片が、ミスプライミングを阻止できないことを明らかにする。Ｋａｉｎｚらから、上に説明するように、プライマーの全ての対において、アニーリング温度を同時に最適化することができないため、これらの方法が、多重反応において、さらに不確かである可能性があるだろうと推測する。Ｋａｉｎｚらは、彼らの特定の実験では観察しなかったが、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、反応で、１つ以上のプライマーのハイブリッド形成の標的になる場合、ミスプライミングを引き起こす場合があることも認めた。
【発明の概要】
【００１５】
一実施形態は、プライマー依存ＤＮＡ増幅反応、好ましくは、ＰＣＲ増幅反応の反応混合物であり、少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を増幅するためのＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長を含み、該反応混合物は、少なくとも１つのプライマー対、熱的に安定したＤＮＡポリメラーゼ、およびｄＮＴＰを含み、改善点は、その鎖のそれぞれに末端領域を有し、６〜５０のヌクレオチド長の長さのハイブリッドを有し、３２℃で少なくとも５０％が二本鎖であり、かつそれぞれ異なる末端領域、好ましくは、末端ヌクレオチドに共有結合的に結合される、１〜４つの修飾基、好ましくは、２つ、３つ、または４つの修飾基を含み、該修飾基は、非平面の巨大部分を有さない多環式部分である、少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤を、増幅の開始前の反応混合物に含めることを含み、該少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤は、ミスプライミングの抑制、完全に相補的でない陥凹３’末端配列を有するハイブリッドに対するポリメラーゼ選択性の増加、ＡＴ豊富の陥凹３’末端配列を有するハイブリッドに対するポリメラーゼ選択性の増加、反復反応間のばらつきの減少、ポリメラーゼ５’エキソヌクレアーゼ活性の阻害、およびポリメラーゼ活性の阻害の機能のうちの少なくとも１つについて効果的である濃度で含まれるが、ただし、添加剤が、任意の標的配列のプライマーまたは検出プローブである場合、少なくとも３つの修飾基を含むものとする。
【００１６】
別の実施形態は、２つのこのような二本鎖添加剤の混合物を含む、前の段落に記載するような反応混合物である。
【００１７】
別の実施形態は、添加剤が、該少なくとも１つの標的配列のためのプライマーまたはプローブである第１の鎖と、第１の鎖に部分的に相補的である逆相補体鎖とを含み、添加剤が、記載される修飾基のうちの３つを含む、上に記載するような反応混合物である。
【００１８】
別の実施形態は、上に記載される反応混合物を使用する、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）標的のプライマー依存増幅、好ましくは、ＰＣＲ増幅であり、必要に応じて、ＲＮＡを逆転写して、増幅されるＤＮＡ標的配列を得る。
【００１９】
別の実施形態は、リアルタイムアッセイおよびエンドポイントアッセイの両方の均質検出アッセイであり、これは、増幅産物のこのようなプライマー依存増幅に加え蛍光検出を含む。
【００２０】
別の実施形態は、上述のように、少なくとも１つのＤＮＡ標的配列、ｄＮＴＰ、熱的に安定したＤＮＡポリメラーゼ、および少なくとも１つの修飾された二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤のためのプライマーを含む試薬キットである。
【００２１】
別の実施形態は、均質に増幅反応産物を検出するための、少なくとも１つの蛍光検出試薬も含むそのような試薬キットである。
【００２２】
別の実施形態は、それらの鎖のそれぞれに末端領域を有し、６〜５０のヌクレオチド長の長さのハイブリッドを有し、好ましくは４０℃であるが、少なくとも３２℃で少なくとも５０％が二本鎖であり、かつそれぞれ異なる末端領域に、好ましくは、末端ヌクレオチドに共有結合的に結合される、２〜４つの修飾基を含み、該修飾基は、非平面の巨大部分を有さない多環式部分であり、該修飾されたオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼドメインに結合することができる、修飾された二本鎖オリゴヌクレオチドである。
【００２３】
別の実施形態は、少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を増幅するためのＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長を含む、プライマー依存ＤＮＡ増幅反応混合物であり、該反応混合物は、少なくとも１つのプライマー対、ＤＮＡポリメラーゼ、およびｄＮＴＰを含み、改善点は、６〜５０のヌクレオチド長の長さのハイブリッドを有し、３２℃で少なくとも５０％が二本鎖であり、その鎖のそれぞれに末端領域を有し、かつそれぞれ異なる末端領域に共有結合的に結合される、１〜４つの修飾基を含み、該修飾基は、非平面の巨大部分を有さない多環式部分である、少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤を、増幅の開始前の反応混合物に含めることを含み、該少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤は、ミスプライミングの抑制、完全に相補的でない陥凹３’末端配列を有するハイブリッドに対するポリメラーゼ選択性の増加、ＡＴ豊富の陥凹３’末端配列を有するハイブリッドに対するポリメラーゼ選択性の増加、反復反応間のばらつきの減少、ポリメラーゼ５’エキソヌクレアーゼ活性の阻害、およびポリメラーゼ活性の阻害の機能のうちの少なくとも１つについて効果的である、該ＤＮＡポリメラーゼの濃度に対する濃度で含まれるが、ただし、添加剤が、任意の標的配列のプライマーまたは検出プローブである場合、少なくとも３つの修飾基を含むものとする。
【００２４】
別の実施形態は、増幅中にリアルタイムで、もしくは増幅後のエンドポイントのいずれかでの、反応の一本鎖産物、反応の二本鎖産物、または両方の、増幅および蛍光検出を含む増幅アッセイであり、反応の二本鎖産物は、蛍光ＤＮＡ色素によって検出される、反応の一本鎖産物は、少なくとも１つの蛍光的に標識されたハイブリッド形成プローブによって検出される、または両方である。
【００２５】
別の実施形態は、その鎖のそれぞれに末端領域を有し、６〜５０のヌクレオチド長の長さのハイブリッドを有し、３２℃で少なくとも５０％が二本鎖であり、かつそれぞれ異なる末端領域に共有結合的に結合される、２〜４つの修飾基を含み、該修飾基は、非平面の巨大部分を有さない多環式部分であり、該修飾されたオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼドメインを阻害することができる、修飾された二本鎖オリゴヌクレオチドである。修飾された二本鎖オリゴヌクレオチドは、１〜４つの一本鎖オーバーハングを有してもよく、二本鎖オリゴヌクレオチド構造でハイブリッド形成されない時、ステムループ（ヘアピン）構造を形成する１または２つのいずれかの一本鎖を含んでもよく、この場合、ステムは、６もしくはそれより少ない塩基対長である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】３００ｎＭの濃度の添加剤１６ｍｅｒＡを利用する、実施例１に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の反復の融解曲線を表す。
【００２７】
【図２】３００ｎＭの濃度の添加剤１６ｍｅｒＢを利用する、実施例１に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の反復の融解曲線を表す。
【００２８】
【図３】６００ｎＭの濃度の添加剤ＥＰ０４９を利用する、実施例１に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の反復の融解曲線を表す。
【００２９】
【図４】１００ｎＭの濃度の添加剤ＥＰ０２７を利用する、実施例１に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の反復の融解曲線を表す。
【００３０】
【図５】１００、３００、６００、および１０００ｎＭの濃度の添加剤ＥＰ０２７を利用する、実施例１に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の反復に対する、増幅サイクル数の関数としてのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ蛍光のグラフである。
【００３１】
【図６】１００ｎＭの濃度の添加剤２２ｍｅｒＡおよび１００ｎＭの濃度の添加剤ＥＰ００３を利用する、実施例２に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の反復の融解曲線を表す。
【００３２】
【図７Ａ】６００ｎＭの全濃度および２５／６００／５７５ｎＭの鎖濃度の三本鎖添加剤混合物ＥＰ０４３を利用する、実施例４に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の反復に対する、増幅サイクル数の関数としての、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ蛍光のグラフである。
【００３３】
【図７Ｂ】６００ｎＭの全濃度および５０／６００／５５０ｎＭの鎖濃度の三本鎖添加剤混合物ＥＰ０４３を利用する、実施例４に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の反復に対する、増幅サイクル数の関数としての、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ蛍光のグラフである。
【００３４】
【図７Ｃ】６００ｎＭの全濃度および７５／６００／５２５ｎＭの鎖濃度の三本鎖添加剤混合物ＥＰ０４３を利用する、実施例４に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の反復に対する、増幅サイクル数の関数としての、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ蛍光のグラフである。
【００３５】
【図７Ｄ】６００ｎＭの全濃度および１００／６００／５００ｎＭの鎖濃度の三本鎖添加剤混合物ＥＰ０４３を利用する、実施例４に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の反復に対する、増幅サイクル数の関数としての、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ蛍光のグラフである。
【００３６】
【図８Ａ】６００ｎＭの全濃度および２５／６００／５７５ｎＭの鎖濃度の三本鎖添加剤混合物ＥＰ０４５を利用する、実施例４に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の反復に対する、増幅サイクル数の関数としての、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ蛍光のグラフである。
【００３７】
【図８Ｂ】６００ｎＭの全濃度および５０／６００／５５０ｎＭの鎖濃度の三本鎖添加剤混合物ＥＰ０４５を利用する、実施例４に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の反復に対する、増幅サイクル数の関数としての、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ蛍光のグラフである。
【００３８】
【図８Ｃ】６００ｎＭの全濃度および７５／６００／５２５ｎＭの鎖濃度の三本鎖添加剤混合物ＥＰ０４５を利用する、実施例４に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の反復に対する、増幅サイクル数の関数としての、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ蛍光のグラフである。
【００３９】
【図８Ｄ】６００ｎＭの全濃度および１００／６００／５００ｎＭの鎖濃度の三本鎖添加剤混合物ＥＰ０４６を利用する、実施例４に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の反復に対する増幅サイクル数の関数としての、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ蛍光のグラフである。
【００４０】
【図９Ａ】添加剤なし、および６５℃のアニーリング温度を利用する、実施例５に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲ二重増幅の反復に対する、増幅サイクル数の関数としての、２つのプローブからの蛍光のグラフである。
【００４１】
【図９Ｂ】４００ｎＭの濃度の添加剤ＥＰ０２０および６５℃のアニーリング温度を利用する、実施例５に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲ二重増幅の反復に対する、増幅サイクル数の関数としての、２つのプローブからの蛍光のグラフである。
【００４２】
【図９Ｃ】４００ｎＭの濃度の添加剤ＥＰ０２０および６０．７℃のアニーリング温度を利用する、実施例５に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲ二重増幅の反復に対する、増幅サイクル数の関数としての、２つのプローブからの蛍光のグラフである。
【００４３】
【図９Ｄ】３００ｎＭの濃度の添加剤ＥＰ０１３および６６℃のアニーリング温度を利用する、実施例５に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲ二重増幅の反復に対する、増幅サイクル数の関数としての、２つのプローブからの蛍光のグラフである。
【００４４】
【図９Ｅ】３００ｎＭの濃度の添加剤ＥＰ０１３および６４．２℃のアニーリング温度を利用する、実施例５に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲ二重増幅の反復に対する、増幅サイクル数の関数としての、２つのプローブからの蛍光のグラフである。
【００４５】
【図９Ｆ】３００ｎＭの濃度の添加剤ＥＰ０１３および６０．７℃のアニーリング温度を利用する、実施例５に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲ二重増幅の反復に対する、増幅サイクル数の関数としての、２つのプローブからの蛍光のグラフである。
【００４６】
【図１０】幾つかの添加剤のいずれかを利用した、または添加剤なしの、実施例６に記載されるプライマー依存プローブ切断アッセイに対する、温度周期的変動サイクルの数の関数としてのプローブ蛍光のグラフである。
【００４７】
【図１１Ａ】添加剤なしの実施例７に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の反復から得られたプローブ−アンプリコンハイブリッド、およびプローブ単独の融解曲線を表す。
【００４８】
【図１１Ｂ】６００ｎＭ濃度の添加剤ＥＰ０１３を用いた実施例７に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の反復から得られたプローブ−アンプリコンハイブリッド、およびプローブ単独の融解曲線を表す。
【００４９】
【図１２】添加剤なし、３００ｎＭの濃度の添加剤ＥＰ０１１、および６００ｎＭの濃度の添加剤ＥＰ０１１を用いた１０００コピーのミトコンドリアゲノムＤＮＡ（標的配列）から開始する、実施例８に記載される１２の多重ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の産物を示す、電気泳動ゲルである。
【００５０】
【図１３】添加剤なしのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、添加剤なしのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび抗体、６００ｎＭの濃度の添加剤ＥＰ０４６を用いたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに６００ｎＭの濃度の添加剤ＥＰ０４６を用いたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび抗体を利用する、実施例９に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の反復に対する、増幅サイクル数の関数としての、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ蛍光のグラフである。
【００５１】
【図１４Ａ】１０００、１００、および１０コピーの標的から開始する、６００ｎＭの濃度の添加剤ＥＰ０１０を利用する実施例１０に記載される低温度検出ステップを用いた、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の反復に対する、増幅サイクル数の関数としてのプローブからの蛍光のグラフである。
【００５２】
【図１４Ｂ】１０００、１００、および１０コピーの標的から開始する、６００ｎＭの濃度の添加剤ＥＰ０１０を利用する、実施例１０に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲ冷却停止増幅の４０サイクル後のプローブ−アンプリコンハイブリッドの融解曲線を表す。
【００５３】
【図１４Ｃ】１０００、１００、および１０コピーの標的から開始する、６００ｎＭの濃度の添加剤ＥＰ０１０を利用する、実施例１０に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲ冷却停止増幅の７０サイクル後のプローブ−アンプリコンハイブリッドの融解曲線を表す。
【００５４】
【図１５Ａ】尾状でないプライマーおよび尾状のプライマーを用いた、６００ｎＭの全濃度および５０／６００／５５０ｎＭの鎖濃度の添加剤混合物ＥＰ０４３を利用する、実施例１３に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の反復に対する、増幅サイクル数の関数としての、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ蛍光のグラフである。
【図１５Ｂ】添加剤ＥＰ０４３を用いた６つの増幅産物の融解曲線を示し、下方矢印は、適切な二本鎖ＤＮＡ産物の融解温度８６℃を示す。丸１５３は、図１５Ａの産物進化（平らな平坦域）のない適切なピークを示した、尾状でないプライマーを用いた１つの反復を特定し、丸１５４は、同じく図１５Ａの産物進化（平らな平坦域）を示さなかった尾状のプライマーを用いた２つの反復を特定する。
【００５５】
【図１６Ａ】５’−ダブシル化プライマーを利用するが、逆相補体配列用いない、実施例１４に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の反復の融解曲線を表す。
【００５６】
【図１６Ｂ】５’−ダブシル化プライマーに加え、１００ｎＭの濃度の逆相補体配列を利用する、実施例１４に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の反復の融解曲線を表す。
【００５７】
【図１６Ｃ】５’−ダブシル化プライマーに加え、２００ｎＭの濃度の逆相補体配列を利用する、実施例１４に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の反復の融解曲線を表す。
【００５８】
【図１６Ｄ】５’−ダブシル化プライマーに加え、３００ｎＭの濃度の逆相補体配列を利用する、実施例１４に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の反復の融解曲線を表す。
【００５９】
【図１７Ａ】２０００ｎＭの濃度の添加剤ＥＰ０２０を利用する、実施例１５に記載されるＲＮＡ標的用の逆転写を用いた、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の反復に対する、サイクル数の関するとしてのプローブ蛍光のグラフである。
【００６０】
【図１７Ｂ】２００ｎＭの濃度の添加剤ＥＰ０１０を利用する、実施例１５に記載されるＲＮＡ標的用の逆転写を用いた、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の反復に対する、サイクル数の関数としてのプローブ蛍光のグラフである。
【００６１】
【図１７Ｃ】４００ｎＭの濃度の添加剤ＥＰ００３を利用する、実施例１５に記載されるＲＮＡ標的用の逆転写を用いた、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の反復に対する、サイクル数の関数としてのプローブ蛍光のグラフである。
【００６２】
【図１７Ｄ】４００ｎＭの濃度の添加剤ＥＰ０１０と１０００ｎＭの濃度の添加剤ＥＰ０２０との混合物を利用する、実施例１５に記載されるＲＮＡ標的用の逆転写を用いた、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の反復に対する、サイクル数の関数としてのプローブ蛍光のグラフである。
【００６３】
【図１７Ｅ】４００ｎＭの濃度の添加剤ＥＰ００３と１０００ｎＭの濃度の添加剤ＥＰ０２０との混合物を利用する、実施例１５に記載されるＲＮＡ標的用の逆転写を用いた、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の反復に対する、サイクル数の関数としてのプローブ蛍光のグラフである。
【００６４】
【図１７Ｆ】添加剤を利用しない、実施例１５に記載されるＲＮＡ標的用の逆転写を用いた、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の反復に対する、サイクル数の関数としてのプローブ蛍光のグラフである。
【図１８Ａ】２つの直鎖状（ランダムコイル）オリゴヌクレオチドから形成され、一本鎖オーバーハングを有する、本発明に従う修飾された二本鎖添加剤の概略図である。
【図１８Ｂ】図１８Ａの通りであるが、１つの直鎖状オリゴヌクレオチドおよび１つのヘアピン形成オリゴヌクレオチドから形成される、修飾された二本鎖添加剤の概略図である。
【図１８Ｃ】図１８Ａの通りであるが、２つのヘアピン形成オリゴヌクレオチドから形成される、修飾された二本鎖添加剤の概略図である。
【図１９Ａ】実施例１６に記載する通り、添加剤ＳＬ０４を有する、または添加剤なしのＴａｑポリメラーゼに加えて抗体を用いた、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の産物の融解曲線を表す。
【図１９Ｂ】実施例１６に記載する通り、添加剤ＳＬ０７を有する、または添加剤なしのＴａｑポリメラーゼに加えて抗体を用いた、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の産物の融解曲線を表す。
【図１９Ｃ】実施例１６に記載する通り、添加剤ＳＬ０８を有する、または添加剤なしのＴａｑポリメラーゼに加えて抗体を用いた、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の産物の融解曲線を表す。
【図１９Ｄ】実施例１６に記載する通り、添加剤ＳＬ０９を有する、または添加剤なしのＴａｑポリメラーゼに加えて抗体を用いた、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の産物の融解曲線を表す。
【図２０】異なる濃度の添加剤ＳＬ０６を利用する、実施例１８に記載されるプライマー依存プローブ切断アッセイの温度周期的変動に対する、サイクルの数の関数としてのプローブ蛍光のグラフである。
【図２１】制限プライマーと、そのプライマーが完全に相補的である標的との間に、３’末端ミスマッチを作製する、ブロッカーオリゴヌクレオチドの作用を示す図式的描写である。
【図２２Ａ】実施例１９に記載される、ブロッカーなしの増幅の希釈系列の標的の開始濃度（コピー数）に対する閾値サイクル（ＣＴ）のグラフである。
【図２２Ｂ】実施例１９に記載される、ブロッカーを用いた増幅の希釈系列における、標的の開始濃度（コピー数）に対する閾値サイクル（ＣＴ）のグラフである。
【図２３Ａ】実施例２０に記載される増幅における抗体の効果を示す、増幅サイクル数に対するＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ蛍光のグラフである。
【図２３Ｂ】実施例２０に記載する増幅における添加物ＥＰ０１０の効果を示す、増幅サイクル数に対するＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ蛍光のグラフである。
【図２３Ｃ】ＤＮＡポリメラーゼのみで作製された実施例２０に記載される産物と、抗体がアッセイの第１のインキュベーションステップ後に添加されて作製された産物の融解曲線である。
【図２３Ｄ】抗体がアッセイの第１のインキュベーションステップ前に添加されて作製された、実施例２０に記載される産物の融解曲線である。
【図２３Ｅ】添加剤ＥＰ０１０がアッセイの第１のインキュベーションステップの前と後に添加されて作製された、実施例２０に記載される産物の融解曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
二本鎖添加剤、プライマー、およびプローブの融解温度（Ｔｍ）について言及する。定義によると、Ｔｍは、二本鎖オリゴヌクレオチドの５０％が二本鎖であり、５０％が一本鎖である温度を意味する。添加剤については、Ｔｍは、いかなる置換基修飾因子の効果をも考慮せずに、計算された二本鎖オリゴヌクレオチドのＴｍを意味する。本明細書に説明される二本鎖添加剤のＴｍは、Ｍａｒｋｈａｎ  ａｎｄ  Ｚｕｋｅｒ（２００５）ＤＩＮＡＭＥＬＴ  ｗｅｂ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：Ｗ５７７−Ｗ５８１、およびＭａｒｋｈａｍ  ａｎｄ  Ｚｕｋｅｒ（２００８）ＵＮＡＦＯＬＤ：ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｉｎ  Ｋｅｉｔｈ，Ｊ．Ｍ．，ｅｄ．，ＢＩＯＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ，ｖｏｌ．ＩＩ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｏ．４５３  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．１，ｐａｇｅｓ３−３１（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ．ＩＳＢＮ  ９７８−１−６０３２７−４２８−９に従い計算された。参照ウェブサーバーを利用するにあたり、以下の入力がなされた：実施例に報告されるように、μＭでの各鎖の濃度；塩濃度７０ｍＭ；およびマグネシウム濃度３ｍＭ。増幅の開始時における、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅反応のプローブおよびプライマーのＴｍは、Ｔｍ［０］と称される。Ｔｍ［０］は、構造プローブが使用される時に必要であるように、経験的に決定されるか、または塩濃度調節を使用する「最近接」法に従い計算することができ（Ｓａｎｔａ  Ｌｕｃｉａ，Ｊ．（１９９８）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：１４６０−１４６５、およびＡｌｌａｗｉ，Ｈ．Ｔ．  ａｎｄ  Ｓａｎｔａ  Ｌｕｃｉａ，Ｊ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６：１０５８１−１０５９４）、参照によりその全体が本明細書に援用される。我々の研究において、他の濃度を使用することができるが、我々は、０．０７Ｍの一価塩濃度を使用する。
【００６６】
末端領域オリゴヌクレオチド鎖上に位置する修飾基について言及する。「末端領域」とは、末端５’もしくは３’ヌクレオチド、または５’もしくは３’端から、５つ以下、３つ以下、または２つ以下のヌクレオチドの内部ヌクレオチドに結合されることを意味する。幾つかの実施形態において、末端修飾因子は、５’または３’末端ヌクレオチドに結合される。
【００６７】
選択性について言及する。「選択性」とは、一般的に、特定の条件が満たされる時に、陥凹３’端を伸長するためのＤＮＡポリメラーゼの優先度を意味する。一般的に言うと、標的配列に結合される陥凹３’端は、熱力学的に不安定である、つまり、これらは、それらは、ハイブリッド形成される鎖に結合し、それから部分的にほどかれることが交互に発生する。これらの端は、標的への結合が、より多くの水素結合の形成により支持される時に安定であり、それらがより少ない水素結合を形成する時に不安定であるといえる。この見解によると、それらの標的に完全に相補的である陥凹３’端は、それらの標的に完全に相補的でない陥凹３’端より安定している。同様に、ＧＣ豊富の陥凹３’端は、一般的に、ＡＴ豊富の陥凹３’端より安定している。なぜならＧＣジヌクレオチド対は、３つの水素結合を形成し、一方、ＡＴジヌクレオチド対は、２つの水素結合を形成するからである。
【００６８】
この見解に従い、選択性の１タイプは、陥凹３’端の３’端領域、具体的には末端３’ヌクレオチドを含む３’端領域が、完全に相補的である時、つまり、ミスマッチがなくハイブリッド形成される時の、ハイブリッドの陥凹３’端を伸長するためのＤＮＡポリメラーゼの優先度である。別の言い方をすれば、このタイプの選択性は、その標的に完全に一致しない３’端プライミング配列に対する選択性である。３’端領域ミスマッチに対する選択性は、例えば、３’末端ヌクレオチドでミスマッチを有するプライマー−標的ハイブリッドよりプライマーの３’端で完全に相補的であるプライマー−標的ハイブリッドのポリメラーゼの優先度を示す、プライマー−標的ハイブリッドに適用される。３’末端領域ミスマッチに対する選択性は、より一般的には、１つのアンプリコン鎖が、別のアンプリコン鎖とハイブリッド形成する時（つまり、その上でプライミングされる）に生じる場合がある等の、増幅反応混合物中の任意の２つのＤＮＡ鎖により形成される、陥凹の、伸長可能な３’端を有するハイブリッドにも適用される。
【００６９】
選択性の第２のタイプは、ＡＴ豊富ではなく、ＧＣ豊富である３’末端領域を有するプライマー（またはプライミング鎖）のＤＮＡポリメラーゼの優先度であり、別の言い方をすれば、末端領域がＡＴ豊富であるプライマーまたは他のプライミング鎖に対する選択性である。
【００７０】
いずれのタイプの選択性においても、選択性の測定値は、好ましくないハイブリッド、例えば、プライマーおよびミスマッチ標的により形成されたハイブリッドの増幅からのシグナルの閾値サイクル（ＣＴ）と、好適なハイブリッド、例えば、プライマーおよび一致する標的により形成されたハイブリッドの増幅からのシグナルのＣＴとの間の差（ＤＣＴ）である。添加剤の使用による選択性の改善は、いかなる添加剤をも使用しないΔＣＴを、添加剤を用いて得られるΔＣＴから差し引くことにより得られる、純ＣＴ差である。
【００７１】
ミスプライミングを低減する、ＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害する、いずれかのタイプのＤＮＡポリメラーゼ選択性を増加させる、ＤＮＡポリメラーゼエキソヌクレアーゼ活性を阻害する、もしくは反復反応間のばらつきを減少させる添加剤、またはプライマー依存ＤＮＡ増幅反応における前述の任意の組み合わせ、ならびにＰＣＲ増幅反応およびＰＣＲ増幅アッセイを含む、このような反応を利用する核酸検出アッセイを含むことができる。
【００７２】
ＤＮＡ増幅緩衝剤に可溶性であり、修飾基、または略して修飾因子と称される、１〜４つ、または２〜４つの共有結合的に結合される部分を含む化学試薬は、ミスプライミングを抑制し、プライマーと完全に相補的な標的配列との間のハイブリッドのポリメラーゼ選択性を強化する。共有結合的に結合される修飾基は、多環式（芳香族を含むが、これに限定されない）部分であり、巨大である場合、平面であり、ミスプライミングを抑制し、プライマーと完全に相補的な標的配列との間のハイブリッドのポリメラーゼ選択性を強化するように、エキソヌクレアーゼドメインを有するＤＮＡポリメラーゼ（活性または不活性）に結合するように構成することができる。
【００７３】
幾つかの実施形態において、クエンチャーであるダブシルは、これらの試薬の修飾基として使用することができる。
【００７４】
これらの多環式部分は、これらを二本鎖オリゴヌクレオチドに結合することにより可溶化することができる。上述の１〜４つの多環式部分を有する特定の二本鎖オリゴヌクレオチドは、ミスプライミングを低減する、ＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害する、ＤＮＡポリメラーゼ選択性を増加させる、ＤＮＡポリメラーゼエキソヌクレアーゼ活性を阻害する、反復間のばらつきを減少させる、またはプライマー依存ＤＮＡ増幅反応における前述の任意の組み合わせ、ならびにＰＣＲ増幅反応およびＰＣＲ増幅アッセイを含む、このような反応を利用する核酸検出アッセイのための添加剤として有用であり得る。修飾された二本鎖オリゴヌクレオチドは、天然のヌクレオチドを含んでもよい、つまり、これらは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡの混合物を含んでもよい。修飾された二本鎖オリゴヌクレオチドは、非天然のヌクレオチド、例えば、ＬＮＡおよび２’Ｏ−メチルリボヌクレオチドも含んでもよい。増幅反応は、非対称ＰＣＲ増幅反応、好ましくは、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ反応を含む、対称または非対称であってもよい。
【００７５】
添加剤は、相補的核酸鎖の長さが６〜５０、好ましくは、１２〜３０、より好ましくは、１６〜２６のヌクレオチドである、修飾された直鎖状二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドであり得る。修飾された二本鎖オリゴヌクレオチドは、平滑末端であるか、または１端または両端上に、１〜８つのヌクレオチド、好ましくは、１〜５つのヌクレオチドの短いオーバーハングを含んでもよい。図１８Ａ〜１８Ｃは、添加剤の二本鎖領域の１端または両端の鎖に非相補的末端領域を有する、幾つかの異なる実施形態を示す。図示説明の目的のために、全ての構成は、特定の配置を有する３つの修飾基Ｍを用いて示されるが、これらのような実施形態が、示される配置、または３つの修飾因子群の含有に制限されないことを理解するであろう。図１８Ａは、二本鎖添加剤１８３を形成するようにハイブリッド形成される、２つの部分的に相補的なランダムコイルオリゴヌクレオチド１８１、１８２を示し、これは、二本鎖領域１８４および一本鎖オーバーハング１８５、１８６を含む。ハイブリッド１８４の融解温度Ｔｍは、その長さおよびＧＣ含量を変更することにより調節することができる。図１８Ｂは、同様に、二本鎖添加剤１８９を形成するようにハイブリッド形成される、２つの部分的に相補的なオリゴヌクレオチド１８７、１８８を示し、これは、二本鎖領域１９０および一本鎖オーバーハング１９１、１９２を含む。オーバーハング１９１、１９２は、低温度でも相互とハイブリッド形成しない配列を含んでもよい。代替的に、オーバーハングは、低温度（相補性およびＧＣ含量の程度により決定される、二本鎖領域１８４のＴｍより低いＴｍ）でのみ、相互とハイブリッド形成する配列を含んでもよい。図１８Ｂに示される実施形態は、１つのオリゴヌクレオチド、すなわち、オリゴヌクレオチド１８７が、オリゴヌクレオチド１８８とハイブリッド形成しない時、長さが最大６つのヌクレオチドの二本鎖ステム１９３を含むヘアピン構造の形態をとるという点で、図１８Ａに示す実施形態と異なる。図１８Ｃは、同様に、二本鎖添加剤１９６を形成するようにハイブリッド形成される、２つの部分的に相補的なオリゴヌクレオチド１９４、１９５を示し、これは、二本鎖領域１９７および一本鎖オーバーハング１９８〜２０１を含む。図１８Ｃに示される実施形態において、オリゴヌクレオチド１９４および１９５の両方は、相互とハイブリッド形成しない時、それぞれ、ステム２０２および２０３を含むヘアピン構造の形態をとる。実施例１６および１７は、図１８Ｃに示される構造を利用する。いずれか、または両方の鎖が、ヘアピンまたはステムループの構造を形成する添加剤において、各ステムのＴｍは、使用中のヘアピン形成を確実にするように、二本鎖領域のＴｍより高いが、反応の温度が使用中に低下する時、適切な時間期間、添加剤の二本鎖の立体構造を妨げるほど高くない。いずれのオリゴヌクレオチド鎖も、増幅プライマーまたはプローブとして作用しない、幾つかの実施形態において、両方の３’端は遮断され、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長を妨げる。遮断は、修飾基を鎖の３’末端ヌクレオチドに共有結合的に連結することにより達成されるか、または例えば、３’末端リン酸基を含むことによって伸長を遮断してもよい。添加剤は、３２℃で少なくとも５０％が二本鎖である、二本鎖オリゴヌクレオチドを含むことができ、この温度は、増幅反応混合物の組み立て中に遭遇する可能性がある温度と同じ高さである。
【００７６】
１〜４つの修飾基、好ましくは、２つ、３つ、または４つの基が、直鎖二本鎖オリゴヌクレオチドに含まれる。修飾因子は、それらの末端領域の添加剤の鎖に、つまり、末端ヌクレオチド、または末端ヌクレオチドから５つ以下、好ましくは、２つ以下のヌクレオチドであるヌクレオチドで、共有結合的に結合される。幾つかの実施形態は、二本鎖オリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドに結合される修飾因子を利用する。修飾因子は、オリゴヌクレオチド鎖に共有結合的に連結することができる。修飾基の共有結合連結は、例えば、フルオロフォアおよびクエンチャーの組み込みの分野において周知である。
【００７７】
修飾基は、多芳香族を含むが、これに限定されない多環式、および巨大である場合、全平面様態を有する部分であり得る。例としては、植物ステロイドであるジゴキシゲニン、二環式芳香族であるクマリン、平面ではないクエンチャーとして使用される小型多芳香族化合物であるＱＳＹ−２１が挙げられる。フルボ酸およびフミン酸が、含まれると考えられる。幾つかの実施形態において、修飾基は、よく知られたクエンチャーであるダブシルであり、これは、多芳香族で、巨大であり、平面状である。したがって、修飾基は、非平面の巨大部分を有さない多環式部分であり、好ましくは、多芳香族であり得る。
【００７８】
添加剤は、１つ、２つ、３つ、および４つの修飾基の種々の可能な構造を有する、直鎖二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含むことができる。１つの末端修飾基で可能な構造が４つある：修飾因子は、いずれかの鎖の３’または５’末端ヌクレオチドに結合することができる。２つの末端修飾基で、可能な構造は６つあり、３つの末端修飾基で、可能な構造は４つあり、４つの修飾基では、可能な構造は１つしかない。末端領域の内部ヌクレオチドへの修飾因子の結合は、さらなる可能な構造を作製する。鎖がプライマーではなく、修飾基が鎖の３’末端ヌクレオチドに結合しない全ての場合において、そのヌクレオチドは、それ以外は、リン酸基によって等で遮断される（実施例の配列で、「ｐ」として認識される）。
【００７９】
特定の実施形態において、１つの鎖がプライマーとして機能し、その３’末端は遮断されない。特定の他の実施形態において、１つの鎖が検出プローブとして機能し、この場合、その３’端は、例えば、末端修飾基、末端フルオロフォア、または末端リン酸基によって遮断することができる。プライマーの実施形態において、一本鎖増幅プライマーは、プライマーと二本鎖ハイブリッドを形成するように、プライマーに相補的である一本鎖オリゴヌクレオチドを含むことによって、添加剤に変換することができ、我々は、これを逆相補体配列と呼ぶ。ハイブリッドは、二本鎖である時、添加剤として機能することができる。ハイブリッドは、ダブシル基等の、３つの修飾因子を含むことができる。プライマー鎖に対する逆相補体配列のＴｍは、その増幅標的配列に対するプライマー鎖のＴｍより５〜３０℃、好ましくは、１５〜２５℃低いように設計することができる。Ｔｍの差を達成するために、１つ以上のヌクレオチドでプライマー鎖を短くするか、もしくはミスマッチにするか、またはその両方を行うことにより、プライマー鎖に部分的な相補性を逆相補体配列に付与することができる。プローブの実施形態において、標識された一本鎖ハイブリッド形成プローブは、プライマーの変換と同様に、添加剤に変換され、同様に、プローブ−標的ハイブリッドのＴｍより低いＴｍを有することができる。好適なプローブ実施形態は、フルオロフォアおよびクエンチャーを有するプローブ鎖と、２つの末端クエンチャーを有する逆相補体配列とを含む。
【００８０】
少なくとも１つのＤＮＡまたはｃＤＮＡ標的を増幅するためのプライマー依存増幅反応混合物を含むことができる。反応混合物は、前述の添加剤の少なくとも１つならびに標的核酸およびプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼと、ｄＮＴＰと、一般的に増幅緩衝剤とを含む増幅試薬を含む。増幅混合物が、二本鎖増幅産物、一本鎖増幅産物、もしくは両方の増幅および均質検出の両方を含む増幅アッセイ用である場合、反応混合物は、産物検出、好ましくは、蛍光検出用の少なくとも１つの試薬を含むことができる。二本鎖増幅産物を検出するための好適な試薬は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ等のＤＮＡ色素である。一本鎖産物を検出するための好適な試薬は、一本鎖産物とのハイブリッド形成が、検出可能な蛍光シグナルの変化を生じるか、または増幅中の一本鎖産物とのハイブリッド形成が、検出可能な蛍光シグナルの変更をもたらす、蛍光的に標識された検出プローブである。多くの均質検出試薬が、当該分野において知られており、任意の適切な検出試薬、または複数の検出試薬を使用することができる。他の試薬も使用することができる。含まれる標的核酸がＲＮＡ標的配列である場合、反応混合物は、逆転写酵素を含むであろう。
【００８１】
反応混合物は、複数の増幅およびアッセイ用の複数の標的のために、複数のプライマー対を含むことができる。実施例５は、各増幅された産物のために、２つのプライマー対と、蛍光プローブとを含む、２つの標的配列のための二重ＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイ用の反応混合物を説明する。実施例８は、１２の異なる標的のために１２のプライマー対を含む、高度に多重な増幅である１２の多重用の反応混合物を説明する。添加剤が、プライマー鎖の１つを含む場合、反応混合物は、適切な逆相補体配列をさらに含むことができる。反応混合物は、ＰＣＲ反応混合物であり得、幾つかの実施形態において、ＬＡＴＥ−反応混合物であり得る。反応混合物は、２つの添加剤の組み合わせ、または混合物を含んでもよい。このような混合物は、４本の鎖、または２つの添加剤が共通の鎖を共有する場合、３本の鎖を含んでもよい。反応混合物は、最大２０００ｎＭ、好ましくは、最大１０００ｎＭ、より好ましくは、最大６００ｎＭの全濃度で、少なくとも１つの修飾された、二本鎖添加剤を含むことができる。反応混合物が添加剤の混合物を含む場合、添加剤の全濃度は、記載の通りのままである。
【００８２】
上述の反応混合物を利用する、１つ以上のＤＮＡまたはｃＤＮＡ標的配列のプライマー依存増幅、および増幅産物の均質検出を伴う１つ以上のＤＮＡまたはｃＤＮＡ標的配列のプライマー依存増幅（つまり、均質検出を用いた増幅アッセイ）のための方法を提供する。増幅法および増幅アッセイ法は、等温増幅反応または熱サイクル増幅反応を含んでもよい。一実施形態において、増幅法は、ＰＣＲ、幾つかの実施形態において、ＬＡＴＥ−ＰＣＲであり得る。特定の増幅または増幅アッセイに使用されるように選択される添加剤または添加剤の組み合わせ、およびその、またはそれらの量は、所望の効果、および増幅中に利用される温度に依存する。等温増幅は、反応混合物調製温度のみ、典型的には、室温、続いて、単一反応温度、例えば、３７℃での等温増幅反応を含み得る。ＰＣＲおよび他の熱サイクル増幅法は、反応混合物調製温度、続いて、プライマーアニーリング温度（アニーリング温度）、プライマー伸長温度（伸長温度）、および鎖変性温度（融解温度）を含む、多数の熱サイクルを含む。アニーリング温度と伸長温度は、同じであってもよいが、アニーリング温度が伸長温度より摂氏５〜２０度（℃）低いのが、より一般的である。ＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイは、幾つかの、または全ての熱サイクルに低温度検出ステップをさらに含んでもよく、その間、低温度プローブがそれらの標的配列と結合できるように、反応混合物の温度をアニーリング温度以下に低下させる。低温度（アニーリング温度以下）を含み得る、ある操作を実施するための中間点で、増幅反応を中断してもよく、その後で、増幅反応を再開することができる。増幅は、ミスプライミングを低減する他の方式を利用してもよい。例えば、使用されるＤＮＡポリメラーゼは、温態始動ポリメラーゼであってもよい。さらに、使用されるプライマーは、必要な場合、伸長を添加することを含む、ＡＴ豊富な５’端を有するように設計することができる。加えて、または代替的に、プライマーの３’端は、増幅および増幅アッセイにおいて、ポリメラーゼ阻害を変更するように、ＧＣ豊富またはＡＴ豊富のいずれかであるように設計することができる。増幅反応の産物は、ジデオキシ配列決定を含むが、これに限定されない配列決定に適している。
【００８３】
増幅アッセイは、ＤＮＡ標的配列の増幅中、例えば、ＰＣＲ増幅反応の幾つかの、または全てのサイクル中の複数の時で、一本鎖産物、二本鎖産物、またはその両方のリアルタイム均質検出を含んでもよい。上に述べた通り、蛍光検出を使用することができる。代替的に、増幅アッセイは、増幅反応の完了後、エンドポインドでの均質検出を含んでもよい。検出は、増幅産物の融解、および温度の関数としての蛍光変化の検出を含み得る。検出は、定性的、または定量的であってもよい。ＲＮＡである標的において、アッセイは、逆転写を含むことができる。
【００８４】
増幅および増幅アッセイを実施するための試薬キットを提供する。そのようなキットは、上述の、少なくとも１つの標的配列、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、および少なくとも１つの修飾された二本鎖添加剤のためのプライマーを含む、反応混合物を調製するために必要な試薬を含むことができる。増幅アッセイ用のキットは、ＤＮＡ蛍光色素または蛍光的に標識されたハイブリッド形成プローブ等の、少なくとも１つの検出試薬も含むことができる。増幅キットおよび増幅アッセイキットは、試料調製用の試薬、例えば、細胞溶解試薬、核酸単離用の試薬、および逆転写酵素も含んでもよい。増幅アッセイキットは、それらの増幅用の制御標的配列およびプライマーを含んでもよい。
【００８５】
添加剤または添加剤の混合物の選択においては、ＤＮＡポリメラーゼ阻害、３’末端プライマーミスマッチに対する選択性、ＡＴ豊富プライマーの３’末端領域に対する選択性、ポリメラーゼエキソヌクレアーゼ活性の阻害、ミスプライミング抑制、および反復間のばらつきの低減のそれらの性質を考慮することができる。添加剤の効果は、次いで、添加剤の固有特性、その濃度、その融解温度、およびその濃度に依存する。例えば、固有のポリメラーゼ阻害は、添加剤に含まれる修飾因子の数により増加する傾向があり、添加剤による効果的な阻害は、その濃度により増加する。３’末端プライマーミスマッチに対する選択性は、その活性を有する、または少なくともエキソヌクレアーゼ部位を有するＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性の遮断と相関することが分かった。これは、添加剤により、酵素のエキソヌクレアーゼ部位を遮断することによる可能性がある。
【００８６】
添加剤は、ミスプライミングの抑制、完全に相補的でない陥凹３’末端配列を有するハイブリッドに対するポリメラーゼ選択性の増加、ＡＴ豊富の陥凹３’末端配列を有するハイブリッドに対するポリメラーゼ選択性の増加、反復反応間のばらつきの減少、ポリメラーゼ５’エキソヌクレアーゼ活性の阻害、およびポリメラーゼ活性の阻害の機能の１つ以上に有効である濃度で、増幅反応混合物に添加することができる。添加剤は、ＤＮＡポリメラーゼと相互作用するため、必要とされる濃度は、増幅反応混合物に含まれるＤＮＡポリメラーゼの濃度によって変動する。前述の機能の１つ以上に有効であるように、必要とされる添加剤の濃度の決定ならびに最適な濃度の決定は、以下の実施形態で例証される、添加剤が意図される増幅反応または増幅アッセイで、幾つかの濃度を試すことにより日常的に決定することができる。例えば、実施例３は、好適な添加剤の選択を補助するように種々の濃度で添加剤の効果を決定するために、有効濃度を確定するために、および特定のＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイの特定の目的のために、最適な濃度を決定するために、幾つかの濃度で、幾つかの添加剤の実験的試みを報告する。増幅反応および増幅アッセイに最も一般的に使用されるポリメラーゼであるＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼにおいて、典型的なポリメラーゼ濃度は、２５マイクロリットル（μｌ０ｒ  ｕｌ）の反応混合物で、１．２５ユニットであり得る。幾つかの実施形態においては、多くて２０００ナノモル（ｎＭ）の添加剤が必要とされ、幾つかの実施形態においては、１０００ｎＭ以下が必要とされ、幾つかの実施形態においては、６００ｎＭ以下が必要とされる。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼより高い濃度で反応混合物に含まれ得るＴｆｉ  ＤＮＡポリメラーゼにおいて、同じ濃度の添加剤が、一般的に有効である。
【００８７】
添加剤が「温態始動」試薬として機能するためには、等温増幅の反応温度以下、かつＰＣＲ等の熱サイクル反応のアニーリング温度以下の温度で使用されるポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性をほぼ、または完全に阻害する添加剤が好ましい。本目的において、添加剤は、ポリメラーゼ活性に高い阻害作用と、少なくとも３２℃であり、等温反応温度もしくはＰＣＲと等しい、またはそれ以下、好ましくは、それより１〜１５℃低い、より好ましくは、それより１〜５℃低く、かつポリメラーゼ活性を完全に、または少なくとも実質的に阻害するのに十分に高い濃度である融解温度（Ｔｍ）とを有することができる。添加剤は、それらのＴｍ以上の温度で融解されて離れることによって不可逆的に変性されないため、添加剤は、温度が添加剤にとって二本鎖になるのに十分に低くなるたびに、ＰＣＲ熱サイクルの等温反応中、例えば、ＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイで時折使用される、低温度検出ステップ中に機能する。
【００８８】
添加剤は、等温増幅の反応温度で、またはＰＣＲ増幅のアニーリング温度以上の温度で、特に、伸長温度で、ミスプライミングを低減し、ポリメラーゼ選択性を増加するようにも機能することができる。本目的において、添加剤は、ポリメラーゼ活性に低から中程度の阻害作用と、等温反応温度またはＰＣＲ伸長温度より２℃より低くなることはなく、好ましくは、少なくともそれと等しい、より好ましくは、それ以上であり、かつ反応の効率を過度に阻害することなく、所望の作用を達成するのにちょうど必要な高さの濃度である融解温度とを有することができる。ここでも、添加剤は、ＰＣＲサイクルの鎖融解ステップ中に不可逆的に変性されないため、添加剤は、鎖融解温度において、アニーリング温度またはそれ以下に低くなると、各ＰＣＲサイクル中、ポリメラーゼ選択性を増加するように機能することができる。
【００８９】
添加剤は、単独で、または組み合わせて使用することができる。２つの修飾された二本鎖オリゴヌクレオチドの混合物は、４本の鎖、または２つの添加剤が共通の鎖を共有する場合、３本の鎖を含んでもよい。三本鎖混合物は、１本少ない鎖を反応混合物の中に挿入するが、これは、添加剤が、増幅反応混合物において、任意の標的配列のためのプライマーまたはプローブのいずれでもない実施形態において、有利であり得る。組み合わせでの添加剤の使用は、設計に柔軟性を付与する。例えば、タイプＩのミスプライミングを抑制するために、その固有の性質であるＴｍおよび温度により、増幅反応のプライマーアニーリング温度以下でポリメラーゼ活性を非常に阻害するが、重合反応を阻害しないように増幅中は一本鎖である、第１の添加剤を含んでもよい。このような添加剤との組み合わせにおいて、増幅中のタイプＩＩのミスプライミング、および適用可能な場合、タイプＩＩＩのミスプライミングを抑制するために、プライマーアニーリング中は二本鎖であるが、プライマー伸長中はポリメラーゼ活性を最小に阻害する添加剤を含んでもよい。
【００９０】
ＰＣＲ反応等の、等温ＤＮＡ増幅反応または熱サイクルＤＮＡ増幅反応のいずれかで使用されるＤＮＡポリメラーゼ酵素と直接相互作用する、オリゴヌクレオチド試薬を提供する。オリゴヌクレオチド試薬は、それらが二本鎖である全てのステップ中の増幅反応で作動することができる。これらは、ミスプライミングの抑制とポリメラーゼ選択性の増加の両方の作用を有することができ、これは、これらがハイブリッド形成される鎖に不完全に相補的である陥凹３’端と比較して、これらがハイブリッド形成される鎖に完全に相補的である陥凹３’端を伸長するための、ＤＮＡポリメラーゼの優先度を含む。ミスプライミングは、異なるタイプにより、考慮することができる。タイプＩは、反応混合物の温度がプライマーアニーリング温度以下である時に必ず生じるミスプライミングである。増幅の開始前の反応混合物の調製中に生じる。温度がプライマーアニーリング温度以下に低下する場合、増幅中にも生じる場合がある。タイプＩＩは、反応混合物の温度がプライマーアニーリング温度、またはそれ以上であるが、存在するプライマーの融解温度以下である時に必ず、増幅中に生じるミスプライミングである。タイプＩＩＩは、高濃度の増幅産物（アンプリコン）が作製された後に継続する増幅中に生じるミスプライミングである。さらに別のミスプライミングの徴候は、プライマー−ダイマー形成であり、そこでは１つのプライマーが別のプライマー、またはそれ自体とハイブリッド形成し、次いで伸長を受け、短い二本鎖アンプリコンを生成し、これは、次いで、さらに増幅するか、または多量体化さえし、さらに増幅し得る。増幅反応を段階に分割し、ミスプライミングの可能性を考慮することが有用である。ミスプライミングは、増幅産物を作製するため、増幅反応の初期に生じるミスプライミングは、ほぼ標的分子であるかのように増幅されるであろう。以下の概要は、ＰＣＲ反応についてであるが、当業者は、その用途を他の増幅反応に認めるであろう。ＰＣＲの本概要は、単に図示の目的のためであり、使用することができる増幅反応の種類を制限するものではない。
【００９１】
予備段階：試薬を調製し、２５℃またはそれ以下（例えば、氷上）で混合する。プライマーの濃度は、予備段階で最高であるが、これは、典型的に数分間持続する。通常、標的の数は、予備段階中は低いか、または非常に低く、これらの標的の幾つか、または全ては、どのように試料が調製されたか、そしてｃＤＮＡであるかないかにより、一本鎖であり得る。実際、逆転写酵素等の酵素を使用するｃＤＮＡの合成は、ｃＤＮＡ合成に使用される反応混合物が、プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼも含む時、予備段階の一部でもある、なぜなら、反応混合物のこれらの構成要素は、ｃＤＮＡ合成に必要とされる条件下、典型的には、４０〜６０℃の範囲の温度で５〜３０分で、ミスプライミングするからである。予備段階は、反応混合物中の全ての二本鎖ＤＮＡを変性するために、高温、例えば、９５℃に加熱することにより終了する。ＤＮＡポリメラーゼが不活性形態、例えば、抗体結合ＤＮＡポリメラーゼの形態で添加された場合、本加熱ステップは、ポリメラーゼを活性化し、これは、「温態始動」として知られるプロセスである。
【００９２】
タイプＩミスプライミングは、予備段階中に生じる。ＤＮＡポリメラーゼが温態始動酵素でない場合、および他のポリメラーゼ活性の阻害剤が反応混合物に含まれない場合、タイプＩのミスプライミングの可能性が増加する。また、ポリメラーゼの温態始動の修飾、またはポリメラーゼ活性を遮断するために使用される追加の阻害剤が、そうすることに完全に失敗した場合、タイプＩのミスプライミングが生じる。プライマー−ダイマー形成およびタイプＩのミスプライミングの両方は、温度が低いため、予備段階中で発生しやすい条件である。予備段階のミスプライミングの産物が増幅される。
【００９３】
初期段階：反応の本段階は、典型的に、ＰＣＲ増幅のうちの１０〜１５熱サイクルである。３ステップＰＣＲの各サイクルの熱プロファイルは、鎖−融解温度、プライマーアニーリング温度、およびプライマー伸長温度を含む。２ステップＰＣＲにおいて、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長が、同じ温度で実施される。熱サイクルの各ステップに割り当てられる時間量は、典型的には、数秒間である。第１および第２の熱サイクル中、プライマーは、完全長標的内のそれらの標的配列と最初にアニーリングし、完全に相補的な標的配列の時のみに選択的に伸長するように意図される。プライマーは、標的の両方の鎖とアニーリングし、それらに伸長し、全てが完全に行われると、定義された長さの２つの相補的鎖を生成し、次いで、指数関数的に増幅する。相互とハイブリッド形成する産物鎖の傾向は、それらの濃度が低いため、低い。
【００９４】
タイプＩＩのミスプライミングは、プライマーが、それらが完全に相補的でない対立遺伝子標的に伸長する場合、初期段階中に生じ得る。プライマーが、アニーリング温度より数度、またはそれ以上のＴｍを有することは、まれではなく、これはタイプＩＩのミスプライミングを招く。短いアニーリング時間および高いアニーリング温度（プライマーのＴｍに対して）は、長いアニーリング時間および低いアニーリング温度より厳密であり、したがって、タイプＩＩのミスプライミングを低減し、ポリメラーゼ選択性を増加させる。タイプＩＩのミスプライミングの産物は、増幅の残余中に増幅され得る。高温への最初の加熱は、温態始動抗体または酵素アルキル化を不可逆的に不活化するため、温態始動ポリメラーゼ修飾は、ここでは適用されない。ここに記載するものを含む、熱的に安定した阻害剤は、それらが高温により不可逆的に変性されないため、第１および後続のアニーリングステップ中は機能的である。
【００９５】
中期段階：ＰＣＲ反応の本段階は、典型的に、１０〜２５の熱サイクルから成り、融解、プライマーアニーリング、およびプライマー伸長を含む。熱サイクルの各ステップに割り当てられる時間量は、典型的に、数秒間である。プライマーは、標的の両鎖とアニーリングし、それらに伸長し、最適な条件下で、プライマー対により決定される、定義された長さの２つの相補的な鎖を生成し、次いで、それらを指数関数的に増幅する。
【００９６】
リアルタイム対称ＰＣＲアッセイの場合において、中間段階は、典型的に、反応のアニーリングステップまたは伸長ステップのいずれか中に、産物検出を含む。ＬＡＴＥ−ＰＣＲ反応の場合において、中間段階は、アニーリング温度より低い温度で産物検出を含んでもよく、伸長ステップ後に生じる。ハイブリッド形成プローブを使用する蛍光シグナルは、典型的に、対称およびＬＡＴＥ−ＰＣＲの両方の対数期の終わりで検出可能となる。
【００９７】
対称ＰＣＲの中期段階の終わり頃、指数関数的に蓄積する産物鎖の濃度は、プライマー−アニーリングステップ中、産物鎖のハイブリッド形成に十分に高くなる。ポリメラーゼが反応の二本鎖産物に結合すると考えられるため、指数関数的増幅は低下し、平坦になる。ＬＡＴＥ−ＰＣＲの場合において、制限プライマーはなくなり、産物鎖の濃度が反応を遅くするのに十分に高くなる前に、反応の対数期を終了する。
【００９８】
低温度検出ステップを含むＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅において、タイプＩおよびタイプＩＩのミスプライミングが、ちょうど初期段階のように、中間段階で生じ得る。これは、リアルタイムＬＡＴＥ−ＰＣＲの低温検出ステップ中は、特に危険である。タイプＩＩＩのミスプライミングも、産物鎖の濃度が上昇すると、中間段階中に生じ得る。前段階、初期段階、または中間段階に関わらず、任意のタイプのミスプライミングは、反復反応間のばらつきを生じ、これは、指数関数的増幅が低下すると、特に明白である。
【００９９】
後期段階：増幅の後期段階は、対称ＰＣＲが平坦域に達し、本段階で終了するため、一般的に、ＬＡＴＥ−ＰＣＲでのみ見られる。ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の本段階は、典型的に、融解、プライマーアニーリング（過剰プライマーのみ）、およびプライマー伸長（過剰プライマーのみ）のステップを含む、１０〜２５の熱サイクルから成る。熱サイクルの各ステップに割り当てられる時間量は、典型的に数秒間である。各過剰プライマーは、その対応する制限プライマー（その制限プライマー鎖）の伸長により作製された伸長産物とアニーリングされ、それに伸長し、全てが完全に行われる場合、過剰プライマー鎖を効率的に生成し、これは、過剰プライマー自体を上回り始めるまで、直鎖状に蓄積される。したがって、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ反応は低下するが、対称ＰＣＲ反応のように平坦にならない。
【０１００】
リアルタイムＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイの場合において、本段階は、プライマーアニーリング温度で、またはアニーリング温度より低い温度で産物検出を含んでもよく、伸長段階後に生じる。ハイブリッド形成プローブを使用する蛍光シグナルは、典型的に、本段階中に、ほぼ線形動態で増加する。
【０１０１】
過剰プライマー鎖の３’端は、過剰プライマー鎖の別の分子に沿ってどこででもミスプライミングし得るため、タイプＩＩＩのミスプライミングは、多数の線形サイクル後の後期段階中に生じ得る。したがって、１）一本鎖産物の濃度が増加する、２）多重反応において異なる一本鎖産物の数が増加する、３）反応温度が低下する、４）過剰プライマー鎖の３’端またはその３’端付近の塩基が、ＧＣ豊富であり、より容易にハイブリッド形成（ミスプライミング）すると、タイプＩＩＩのミスプライミングの確率が増加する。タイプＩＩＩのミスプライミングは、一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換し戻すことにより生じ、これは、（産物は、不完全または異常であるが）「産物進化」と称される。産物進化は、二本鎖産物を検出する色素を使用する蛍光の突然の遅延増加（平坦域後のスロープの増加）、または一本鎖ＤＮＡを検出するプローブからの蛍光の突然の減少のように明白である。したがって、タイプＩＩＩのミスプライミングは、エラーがアニーリング温度以上で生じ得るという点で、タイプＩＩのミスプライミングと類似するが、タイプＩＩＩのミスプライミングは、エラーがアニーリング温度より低い温度で生じ得るという点で、タイプＩのミスプライミングとも類似する。タイプＩＩのミスプライミングは、確かに、本段階中に生じ得、また低温度ステップが含まれる場合、タイプＩのミスプライミングも生じ得る。
【０１０２】
最終段階：ＬＡＴＥ−ＰＣＲにおける最終段階は、二本鎖産物が、もはや溶解して離れないため、さらなる増幅に関与しない。最終段階は、ある操作が実行される、増幅後段階である。最も一般的には、プローブ標的ハイブリッド形成を可能にするために、温度をアニーリング温度以下に低下させ（シグナル生成＝アニーリングシグナル）、その後、プローブ−標的複合体を融解して離すために、時間をかけて温度を上昇させる（シグナルの損失＝融解）。我々は、これを「プローブアニーリング−融解分析（Ｐｒｏｂｅ  Ａｎｎｅａｌ−Ｍｅｌｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）」と称する。最終段階でのプローブアニーリング−融解分析は、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅中、リアルタイム分析を用いて、または用いずに実行することができる。１０〜１５サイクルの最終段階後の典型的なプローブアニーリング−融解分析は、反応の開始時に存在する標的コピーの数についての定量的な情報を生成する。
【０１０３】
典型的に、ミスプライミングは、最終段階中に生じないが、生じた場合、ミスプライミングの産物を可視状態にさせるために必要とされる追加増幅は続いて行われない。そして、実施例１０に示されるように、最終段階中にプローブアニーリング−融解分析を実行し、その後、プローブアニーリング−融解分析を繰り返すことができる最終段階に到達するまで、追加サイクルの増幅を再開するための「冷却停止」プロトコルを使用することが可能である。実施例１０に示されるように、タイプＩＩＩのミスプライミングの頻度は、各熱サイクルにおける検出ステップの省略により低減されるため、プローブアニーリング融解分析前にリアルタイム分析が使用されない時、反復間のばらつきは少ない。
【０１０４】
何らかの理論に拘束されることを意図するものではないが、我々は、本明細書に記載されるように、修飾された二本鎖オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡポリメラーゼと直接相互作用し、全タイプのミスプライミング、つまり、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ、およびプライマー−ダイマーを抑制するという論理を立てる。我々は、添加剤は、二本鎖の時、ＤＮＡポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼドメインに優先的に結合するが、５’エキソヌクレアーゼドメインを飽和する以上の十分な濃度で添加される場合、ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼドメインにも結合すると確信している。実験的に、２５μＬ反応容量での１．２５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ当り３００〜６００ｎＭ濃度の添加剤は、５’ヌクレアーゼドメインおよびポリメラーゼドメインの両方を飽和するのに十分であり得る。
【０１０５】
何らかの理論に拘束されることを意図するものではないが、我々は、プライマーアニーリング温度より低い温度で、両方のドメインを飽和することにより、本明細書に記載されるように、添加剤は、修飾基による質量作用および結合の組み合わせによってポリメラーゼを効果的に中断することにより、タイプＩのミスプライミングを妨げるという理論を立てる。プライマーアニーリング温度より高い温度で、添加剤は、５’エキソヌクレアーゼドメインおよびポリメラーゼドメインの両方を飽和しない濃度で使用することができる。これらの温度で、添加剤は、適切にハイブリッド形成されたプライマーの伸長を実行するために、ポリメラーゼドメインの大部分を解放した状態で残す一方で、５’エキソヌクレアーゼドメインに優先的に結合し、かつその活性を選択的に阻害する。５’エキソヌクレアーゼドメインに選択的に結合することにより、添加剤は、アロステリック効果によるポリメラーゼドメインの選択性を増加させる。
【０１０６】
何らかの理論に拘束されることを意図するものではないが、我々は、修飾基、例えば、ダブシル基が、特定の目的のために、１つ以上の添加剤の選択に使用することができる方式で、添加剤の機能に貢献するという理論を立てる。１つの３’末端修飾基でさえ、添加剤自体によって生じる可能性があるミスプライミングを抑制することができる。しかしながら、３’末端修飾基は、二本鎖オリゴヌクレオチド上に１つまたは２つに関わらず、プライマーの３’末端でのミスマッチに対して、ポリメラーゼの選択性を増加するように機能しない。一方、５’末端修飾基、特に、２つの５’修飾基は、そのポリメラーゼの選択性を有意に強化することができる。二本鎖オリゴヌクレオチドの１端の両方の鎖上に修飾因子を含むことは（つまり、５’修飾因子１つと、３’修飾因子１つ）、二本鎖オリゴヌクレオチドが平滑末端でない場合でも、その選択性を有意に強化することができる。二本鎖オリゴヌクレオチドの両端上に２つの修飾因子を有することは、選択性の強化において、単に１端上に２つの修飾因子を有するより良好であり得るが、４つの修飾基を有する二本鎖オリゴヌクレオチドは、１つ、２つ、または３つの修飾基を有する二本鎖オリゴヌクレオチドより、重合反応の効率を低下させる傾向がある。我々は、この原因は、４つの修飾基を有する添加剤が、より少ない修飾基を有する添加剤より、ポリメラーゼドメインをより効率的に結合するという理論を立てる。
タイプＩミスプライミングの抑制
【０１０７】
添加剤は、鎖の末端で、またはその付近で、つまり、鎖の末端領域で、１つ、２つ、３つ、または４つの修飾基、例えば、ダブシル修飾基の付加により修飾される二本鎖オリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態においては、２〜４つのこのような基が存在し、幾つかの実施形態においては、基は、末端ヌクレオチドに共有結合的に結合される。実施例において、本明細書に記載されるような添加剤は、単一添加剤または混合物に関わらず、比較目的で記載される他の添加剤とそれらを区別するために、接頭辞「ＥＰ」により表示される。実施例１は、添加剤が、さらなるミスプライミングを生じずに、タイプＩのミスプライミングを抑制することを例証する。本実施例において、不適切な産物（融解分析によって決定される、プライマー対により定義される以外の産物）を産生したＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅が、使用された。誤った産物の産生は、タイプＩのミスプライミングを示す。同じ長さ（１６ヌクレオチド）を有するが、異なる配列の未修飾の二本鎖オリゴヌクレオチドを含む、２つの異なる添加剤が、本増幅の対照添加剤として試された。少なくとも３００ｎＭの濃度で添加された１つである１６ｍｅｒＡは、適切な産物を産生する反応をもたらした（図１）。もう一方の１６ｍｅｒＢ（図２）は、６００ｎＭまたは１０００ｎＭの濃度で添加された時でさえ、適切な産物の産生をもたらさず、実際、ミスプライミングを生じた。この不一致は、二本鎖オリゴヌクレオチドは、ミスプライミングを抑制することができるか、またはミスプライミングを生じることができるという、Ｋａｉｎｚらの教示に一致する。ミスプライミングを生じたオリゴヌクレオチドの修正版である添加剤１６ｍｅｒＢで、アッセイを繰り返し、修正版は、１つまたは２つのいずれかの末端ダブシル修飾因子を含む。６００ｎＭ濃度での単一ダブシル修飾因子、添加剤ＥＰ０４８（図３）または添加剤ＥＯ０４９を含むと、１６ｍｅｒＢ（図２）と比較して、未修飾オリゴマーによって生じたミスプライミングを含むミスプライミングを抑制した。２つのダブシル修飾因子、添加剤ＥＰ０２７を含むと、３００ｎＭ濃度でのみミスプライミングを抑制し、僅か１００ｎＭ濃度で添加された時に、かなり改善された（図４）。異なる濃度の添加剤ＥＰ０２７を含む反応の動態分析によって示されるように（図５）、３００ｎＭ濃度の添加剤ＥＰ０２７は、反復間のばらつきを排除し、３００ｎＭが、本アッセイにおいて最適な濃度であると判断された。
【０１０８】
１２〜３０のヌクレオチドの長さを有する、幾つかの他の未修飾二本鎖オリゴヌクレオチドを用いて、実施例１のアッセイを繰り返した。実施例１に報告される結果は、未修飾オリゴヌクレオチドが、タイプＩのミスプライミングの抑制または原因に関して不一致であることを立証した。実施例１に報告されるように、８〜２２クレオチドの範囲の長さを有し、ダブシルである２つの修飾因子、ジゴキシゲニンである２つの修飾因子、ダブシルである４つの修飾因子、またはジゴキシゲニンである４つの修飾因子を有する、多数の二本鎖オリゴヌクレオチドを用いたアッセイも繰り返した。結果は、本明細書に記載されるように、添加剤がタイプＩのミスプライミングを抑制したことを立証した。これらの結果は、添加剤におけるＴｍの影響も例証する。（本用途において、添加剤のＴｍは、上に定義するように、その未修飾の二本鎖配列の計算されたＴｍを意味する。修飾因子は、読取機を考慮に入れることができるが、実際のＴｍを僅かに、おそらく、１〜２℃増加させる傾向がある。）タイプＩのミスプライミングを抑制するために、添加剤は、二本鎖の最大、または最大付近のプライマーアニーリング温度およびプライマーＴｍに留まることが好ましい。実施例１において、最初の１０サイクルのプライマーアニーリング温度は、５５℃であった。実施例１において、３７℃〜６３℃の範囲のＴｍを有する添加剤を用いた、６００ｎＭ濃度での全ての場合で良好な結果が得られたが、最低Ｔｍを有する添加剤である添加剤ＥＰ０２１のみが、３００ｎＭでも良好な結果が得られなかった。１００ｎＭおよび５０ｎＭの濃度で最も良く機能した添加剤は、少なくとも６０℃のＴｍであった。ＰＣＲ増幅反応におけるタイプＩのミスプライミングの抑制において、添加剤は、少なくとも３２℃、より典型的には、少なくとも５０℃、より好ましくは、少なくとも６０℃のＴｍを有することができる。
【０１０９】
本明細書に記載される添加剤が、タイプＩのミスプライミングを抑制する一貫性のさらなるチェックとして、我々は、異なるプライマーを使用して、異なる標的配列についてＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイを実施した。本アッセイにおいて、実施例２に報告されるように、我々は、実施例１の最初の部分で良く機能した、未修飾の二本鎖オリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチド２２ｍｅｒＡと、１２の添加剤を比較した。添加剤は全て、２２ヌクレオチドの長さ、幾つかの異なる配列、および２つ、３つ、または４つの末端ダブシル修飾因子である幾つかの異なる構造を有した。全てが、３００ｎＭ濃度でのミスプライミング抑制において、添加剤２２ｍｅｒＡと少なくとも同じくらい良好であり、ほぼ半分が、僅か１００ｎＭの低濃度でそうであった。図６は、添加剤ＥＰ００３および添加剤２２ｍｅｒＡの融解曲線であり、１００ｎＭ濃度でミスプライミングを抑制したのは、本添加剤のみであったことを示す。
【０１１０】
実施例９は、第１の熱サイクル前のＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性を測定するための、定量的ＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイを示す。これと同じアッセイは、添加剤のＤＮＡポリメラーゼ阻害能力を定量化し、比較するために使用することができ、これは、広範な濃度、温度、およびインキュベーション時間に渡ってアッセイすることができる。初期の反応混合物は、長さが２７の塩基対であり、６０℃の計算されたＴｍを有するハイブリッドを形成するように、それらの３’端で相互とアニーリングすることができる、高濃度の２つのオリゴヌクレオチド（それぞれ、６２および７５塩基対）を含む。これらは、それらの５’端でプライミング部位も有する。増幅プライマーは、初期の反応混合物に含まれない。反応の熱プロファイルは、１０分間、５０℃での等温浸漬で始まる。本ステップ中、重複するオリゴヌクレオチドは、それら自身をプライミングすることがきる、つまり、ハイブリッド形成され、活性ＤＮＡポリメラーゼにより伸長される。これが生じる限り、プライマー用の二本鎖標的のコピーが作製され、これは、熱サイクル前に反応混合物に添加される。５０℃での長期インキュベーション中のポリメラーゼ活性の活性の阻害は、本ステップ中に形成された標的のコピーの数を減少させるであろう。
【０１１１】
５０℃での長期インキュベーションの後、高Ｔｍプライマーを添加し、標的が作製されたものは何でも増幅するために、２段階のＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅を実施する。さらなる二本鎖標的が生成されないように、増幅に使用するプライマーアニーリング温度（７２℃）は、重複するヌクレオチドのＴｍをはるかに上回る。本アッセイにおいて、検出可能なレベルの産物を生成するために必要なサイクルの数（過剰プライマー鎖に対するＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎまたはプローブのいずれかで観察された）は、いくつの完全長鎖が、部分的に相補オリゴマーの初期の等温インキュベーション中に生成されたかに依存する。これは、同時に、あらゆる潜在的な酵素阻害剤の存在／不在によって、等温インキュベーション中にＤＮＡポリメラーゼがどれだけ活性であるかに依存し、既知の組成物および濃度のこのような阻害剤が、反応混合物に添加された。
【０１１２】
我々は、本定量的アッセイにおいて、添加剤を試験し、これは、５０℃のインキュベーション温度での、またはそれ以下のＴｍを有する添加剤（ＥＰ０２０、Ｔｍ５０℃；ＥＰ０２２、Ｔｍ４５℃）、および実質的にインキュベーション温度以上のＴｍを有する添加剤（ＥＰ０４６、Ｔｍ６７℃）を含む。低Ｔｍを有する添加剤は、５０℃のインキュベーション中、少なくとも実質的に一本鎖を有し、一方、高Ｔｍ添加剤ＥＰ０４６は、二本鎖を有したであろう。低Ｔｍ添加剤の反応混合物への組み込みは、ＣＴの遅延をもたらさないが、６００ｎＭの濃度でのＥＰ０４６の組み込みは、ポリメラーゼが、Ｔａｑまたは抗体付加Ｔａｑであるかに関わらず、ＣＴを遅延した。添加剤ＥＰ０４６の動態曲線を図１３に示す。図１３は、任意のＤＮＡポリメラーゼ阻害剤の不在において、重複するオリゴヌクレオチドの３’端が、相互とハイブリッド形成し、伸長したことを明らかにする。温態始動のポリメラーゼを有する抗体の添加は、約１０００倍、タイプＩのミスプライミングを部分的に阻害したが、６００ｎＭのＥＰ０４６のさらなる添加は、さらに１０倍、タイプＩのミスプライミングを阻害した。
実施例１６は、長さが６ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングおよび２２の塩基対の二本鎖領域を有する添加剤を用いた、同様の試験を報告する。添加剤は、全て、同じ鎖配列を含むが、修飾因子の数と配置が異なり、これは、実施例において、ダブシル基であった。両方の個々の鎖は、図１８Ｃに図示するヘアピン形成であった。試験の方法は、１分間（実施例９の１０分間ではなく）、５０℃での等温浸漬、その後、氷上でのインキュベーション、次いで、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅を含んだ。融解曲線分析は、２つの修飾因子（図１９Ａ）および３つの修飾因子（図１９Ｂ、１９Ｃ）を有する添加剤が、不適切な産物の生成を低減し、４つの修飾因子（図１９Ｄ）を有する添加剤が、その生成を完全に抑制したことを示した。
実施例２０は、前段階中にタイプＩのミスプライミングをより厳密に単離する、実施例９に従う試験を報告する。ＰＣＲアニーリング／伸長温度で一本鎖になる添加剤を使用することにより、可能なタイプＩＩミスプライミングが排除される。実施例２０に報告された結果に基づき、我々は、ａ）温態始動抗体が、ＤＮＡ合成を完全に抑制せず、抗体の存在下で生成された大半の産物は、タイプＩのミスプライミングに起因する、ｂ）氷上でのインキュベーション中に合成された産物は、大部分は、タイプＩのミスプライミングに起因する、ｃ）添加剤ＥＰ０１０は、氷上の産物伸長の特異性を増加するように機能し、氷上で生成された大半の産物は、タイプＩのミスプライミングに起因するため、ＥＰ０１０は、氷上での大半のプライマー伸長事象を阻害すると結論づける。添加剤ＥＰ０１０を含む増幅された産物の融解曲線（図２３Ｅ）は、プライマーアニーリングおよび伸長が増幅中に実行された温度である７２℃で、二本鎖形態がもはや存在せず、実施例２０で観察されたＥＰ０１０の作用は、完全に、増幅の開始前の、５０℃および氷上でのインキュベーション中のＥＰ０１０の活性によるものであることを示す。実施例９に使用された添加剤の同様の分析は、これらが、ＥＰＯ１０より高い融解ピーク（図示せず）を有し、したがって、実施例９における添加剤の作用は、増幅前のステップだけでなく、増幅中のステップにもよるものでもあることを明らかにした。
ＰＣＲ反応におけるタイプＩＩミスプライミングの抑制およびポリメラーゼ選択性の増加
【０１１３】
添加剤は、タイプＩＩのミスプライミングを抑制し、プライマーのハイブリッド形成された３’末端ヌクレオチドのＤＮＡポリメラーゼの選択性を増加することができる。ＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイにおける増幅中の制限プライマーの３’末端ヌクレオチドでのミスマッチに対する選択性を決定するために、我々は、両方のプライマー（一致する標的）に完全に相補的である標的を増幅し、また、我々は、過剰プライマーに完全に相補的であるが、制限プライマーの３’末端ヌクレオチドにミスマッチを１つ含む標的を個別に増幅する。代替的に、以下に記載するように、または実施例１９で例証するように、３’末端ミスマッチは、ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用により作製することができる。我々は、ＤＮＡ色素により二本鎖産物を検出する。「選択性」は、ミスマッチ標的の増幅からのシグナルのＣＴと、一致した標的の増幅からのシグナルのＣＴとの間の差（ΔＣＴ）である。添加剤を含まない試料で実施される時、このアッセイは、プライマー／ミスマッチ標的に対するプライマー／一致する標的についてのポリメラーゼの塩基選択性、ならびにプライマー／一致する標的の増幅の塩基効率を例証することができる。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼにおいて、ΔＣＴは、２増幅サイクル未満であり得る。添加剤によりもたらされる選択性の改善は、増幅反応混合物中の添加剤の含有に起因するΔＣＴにおける増加である。
【０１１４】
我々は、本選択性アッセイで、未修飾の二本鎖オリゴヌクレオチドおよび多数の添加剤を試験した。３回行われたアッセイの結果を実施例３に報告する。報告されたＣＴ差（ΔＣＴ）は、３つの反復の平均に基づく選択性の改善である。アッセイのプライマーアニーリング温度より僅かに上のＴｍを有するにも関わらず、未修飾二本鎖オリゴヌクレオチド２２ｍｅｒＡは、最大３００ｎＭの濃度の２ＣＴユニット未満で、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ自体の塩基選択性を改善した。我々は、２つ、３つ、または４つのダブシル修飾因子の種々の構造の、同じ２２ヌクレオチドの長さを有する多くの添加剤を試験した。実施例３に報告されるように、２つ、３つ、または４つのダブシル修飾因子の多くの構造は、実質的に、ポリメラーゼの選択性を改善し、これにより、タイプＩＩのミスプライミングのその傾向を低減した。実施例３にさらに報告されるように、我々は、添加剤の修飾基としては有用ではないが、添加剤およびフルオロセイン（ＦＡＭ）に有用な、３つの他の修飾因子も試験した。少なくとも幾つかの二本鎖オリゴヌクレオチドにおいて、修飾因子のジゴキシゲニン、クマリン、およびクエンチャーＱＳＹ２１のそれぞれは、添加剤２２ｍｅｒＡと比較して、また、４つのＦＡＭ修飾因子を有する２２ヌクレオチド長オリゴヌクレオチドと比較して、選択性を有意に改善した。
実施例１７に報告されるように、我々は、２２の塩基対の二本鎖領域および長さが６ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する、種々の量の３つの添加剤を用いて、増幅を同様に試験した。添加剤の配列を実施例１６に示す。図１８Ｃに示すように、添加剤は、ヘアピン形成である２本の鎖を含んだ。修飾因子として２つ、および３つのダブシル基を有するこのような添加剤は、３ＣＴユニットを超える選択性（ΔＣＴ）において、中程度の改善を示した。選択性における最大の増加は、修飾因子として４つのダブシル基を有する、つまり、６ＣＴユニットを超える添加剤で達成された。
【０１１５】
添加剤は、従来の対称ＰＣＲ増幅において、タイプＩＩのミスプライミングを抑制し、ポリメラーゼ選択性を増加させることもできる。実施例１１は、１つが両方のプライマーに完全に相補的であり、１つが、１つのプライマーに完全に相補的であるが、他のプライマーの３’末端ヌクレオチドの反対にミスマッチを含む、２つの標的配列用の対称ＰＣＲアッセイを報告する。アッセイは、反応混合物中に添加剤を用いずに、および反応混合物中に２つの添加剤の組み合わせを用いて行われた。ＥＰ０４３と命名されるその組み合わせは、３００ｎＭの混合濃度で、ダブシル修飾因子を有する２つの二本鎖オリゴヌクレオチドを含んだ。実施例１１のアッセイにおいて、プラチナＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、温態始動ＤＮＡポリメラーゼ、および高度識別対立遺伝子特異的プライマー対の組み合わせは、ミスマッチ標的と比較して、７．８４ＣＴ値で、一致する標的を優先的に増幅した。この検出特異性は、両方のＤＮＡ標的の理論上の混合母集団における過剰の２２９のミスマッチ標的（すなわち、０．４３％の意図する標的）中、１つの一致する標的の検出に相当するであろう。相対的に、添加剤ＥＰ０４３の同じ対称ＰＣＲアッセイへの添加は、さらに４．７５ＣＴ値から１２．５９ＣＴ値で、一致する標的を選んで特異性を増加させ、これは、検出特異性において、２６．７倍の増加に相当する、過剰の６，６１５のミスマッチ標的（すなわち、０．０２％）中、１つの一致する標的の検出に相当するであろう。
【０１１６】
実施例５に報告される実験において、我々は、添加剤なし、低Ｔｍ添加剤ＥＰ０２０（Ｔｍ  ５１℃）、および高Ｔｍ添加剤ＥＰ０１３（Ｔｍ  ６２℃）を用いて、一連のＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅を実施した。実験は、高度な厳密条件下（高アニーリング温度）、中程度の厳密な条件下、およびむしろ厳密でない条件下（プライマーのＴｍと比較して低アニーリング温度）での、増幅反応を試験するために、異なるプライマーアニーリング温度の使用を含んだ。ミスプライミングの問題点は、典型的に、厳密性が低減されると悪化する。アッセイは、２つの標的配列のため、二重アッセイであり、それぞれ、その独自のプライマー対およびその独自の検出プローブを有した。
【０１１７】
プローブは、アンプリコンを修正するために、ハイブリッド形成時に蛍光を発する分子指標プローブであった。最初の５０サイクルに対するプローブ蛍光の動態曲線を図９Ａ〜９Ｆに報告する。
【０１１８】
図９Ａは、本増幅反応において、プラチナＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、温態始動ポリメラーゼが、厳密な条件下（全てのサイクルにおいて、６５℃のアニーリング温度）でさえ、タイプＩおよびタイプＩＩのミスプライミングを抑制することができなかったことを示す。逆に、両方の添加剤は、使用された濃度でそうすることができた（図９Ｂおよび９Ｄ）。最初の２０サイクル中の低い厳密性（アニーリング温度６０．７℃）で、アニーリング温度で二本鎖ではない低Ｔｍ添加剤ＥＰ０２０は、増幅中、タイプＩＩのミスプライミングを抑制しなかったが（図９Ｃ）、高いＴｍ添加剤ＥＰ０１３は抑制した（図９Ｆ）。これは、特定の温度で生じるミスプライミングの種類を抑制するために、添加剤は、その温度で二本鎖でなければならないことを示す。図９Ｄ〜９Ｆの比較は、添加剤ＥＰ０１３で、反復間の最少ばらつきが、最初の２０サイクルに最も厳密なアニーリング条件（６６．５℃）を使用することにより達成され、ばらつきは、中程度の厳密性（６４．２℃）より、最も厳密でない条件（６０．７℃）で少なかったことを示す。後者の結果は、添加剤の機能的濃度である二本鎖の濃度が、低アニーリング温度で高かったという事実により説明され、添加剤濃度とプライマーアニーリング温度との間の相互関連を例示する。添加剤ＥＰ０１３で、１つの標的配列が、反応において、他の産物配列より非常に効率悪く増幅したことが、図９Ｄ〜９Ｆから認められるであろう。我々は、本相違が、効率が悪い増幅において、５０ｎＭから１００ｎＭに制限プライマー濃度を増加させることにより、非常に減少し得ることを認めた。
タイプＩＩＩミスプライミングの抑制
【０１１９】
添加剤は、タイプＩＩＩのミスプライミングを抑制することができる。実施例１３は、タイプＩＩＩのミスプライミングが生じ、別のアンプリコン鎖によって、１つのアンプリコン鎖のプライミングから得られる長い二本鎖産物を生成するのに十分に長い、６５サイクルまでＬＡＴＥ−ＰＣＲ反応が実行された実験を報告する。我々は、添加剤なしの増幅、５８℃のプライマーアニーリング温度に非常に近いＴｍを有する添加剤を用いた増幅（添加剤ＥＰ０４７、Ｔｍ５９．１℃）、および我々が添加剤ＥＰ０４７の僅か約１０分の１の少量をアニーリング温度以上の温度で二本鎖である添加剤と交換した添加剤の混合物を用いて試験した。本実施例において、我々は、実質的にアニーリング温度以上のＴｍ（６７．４℃）を有する高Ｔｍ添加剤を使用した。添加剤なしの３つの反復増幅の融解曲線は、増幅の６５サイクル後、検出された産物が、意図する産物より高いＴｍを有したことを示し、産物進化が生じたことを示す。動態曲線は、平坦位相の間、ＳＹＢＲシグナルの上昇が生じたことを示し、同じく、産物進化が生じたことを示す。制限プライマーの５’端が、１対のＡ−ヌクレオチドの付加により修飾された時、結果は同じであった：融解曲線は、所望のアンプリコンより高いＴｍを有する産物を示した。非修飾の制限プライマーを用いた６００ｎＭ濃度のＥＰ０４７を含むことは、少しの補助となった：産物進化を数サイクル遅延し、３つの反復の２つにおいて、幾つかの検出された産物は、適切なＴｍであった。６００ｎＭのＥＰ０４７を含み、かつ修飾された制限プライマーを使用すると、産物進化を有意に低減し、３つの反復の１つで完全にそれを妨げた。未修飾の制限プライマーとともに使用される時に、６００ｎＭの全濃度で添加剤混合物ＥＰ０４３を含むことにより、産物進化を有意に低減し、３つの反復の１つで完全にそれを妨げた。６００ｎＭのＥＰ０４３を含み、かつ修飾された制限プライマーを使用すると、産物進化を有意に低減し、３つの反復の２つで完全にそれを妨げた。したがって、プライマーアニーリング温度以上のＴｍを有するように設計される低濃度の添加剤は、タイプＩＩＩのミスプライミングを抑制することができる。さらに、アンプリコン鎖の３’端が、必要に応じ、制限プライマーの５’端の修飾により達成することができる、ＡＴヌクレオチド豊富にされる場合、効果を強化することができる。
【０１２０】
実施例１５は、重度のタイプＩＩＩミスプライミングを示したＲＮＡ標的配列用の、添加剤なし対照増幅アッセイを含む。二本鎖オリゴヌクレオチドおよび二本鎖オリゴヌクレオチドの４本鎖混合物の両方の添加剤を含むと、対照に認められるタイプＩＩＩのミスプライミングを抑制することができることも示す。実施例１５は、添加剤、反応混合物、および方法が、ＲＮＡ標的をｃＤＮＡ標的に変換するために使用される逆転写酵素を阻害しないことを例証する。
多重化
【０１２１】
添加剤は、多くのプライマー対を有する多くの標的配列について高度な多重反応を可能にすることができる。実施例８は、１２の多重反応、つまり、単一反応混合物で１２のプライマー対を使用する、１２の標的配列の多重増幅を報告する。増幅反応は、６５サイクルのＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅であった。標的配列は、ヒトミトコンドリアゲノムＤＮＡとして含まれ、これは、１０００、１００、および１０の開始コピー数の反応混合物に含まれた。添加剤なしの対照増幅に加え、３００ｎＭおよび６００ｎＭの濃度で、添加剤ＥＰ０１１を反応混合物に含んだ。増幅後、１２の意図する産物が作製されたかどうかを確かめるために、反応混合物に、電気泳動分離を行った。加えて、アンプリコンを評価するために、ジデオキシ配列決定を実施した。図１２の電気泳動ゲルの写真は、添加剤なしの、１０００コピーで開始する増幅が、意図する一連の１２の産物の産生に失敗したが、３００ｎＭおよび６００ｎＭ濃度の添加剤ＥＰ０１１付加の１０００コピーで開始する増幅は、１２の産物を産生した。ゲルは、本反応において、軽量の産物のバンドにより証明されるように、３００ｎＭ濃度のＥＰ０１１が、ミスプライミングを完全に抑制しなかったことを明らかにした。添加剤ＥＰ０１１が６００ｎＭ濃度で反応混合物に含まれる時、ミスプライミング産物は、ゲルに見られなかった。この最後の産物に対するさらなる分析として、配列決定を行った。配列決定の結果は、十分な量の１２のアンプリコンのそれぞれが生成され、単純化されたＤｉｌｕｔｅ’Ｎ’Ｇｏプロトコルによるジデオキシ配列決定を可能にしたことを示した。標的の開始数が１００および１０コピーに低減された時の場合には、それは認められなかった。１０００コピーのミトコンドリアＤＮＡの結果は、ミスプライミングが、増幅前と増幅中の両方で、うまく抑制されたことを示す。
添加剤混合物
【０１２２】
添加剤の混合物である添加剤混合物ＥＰ０４３を、実施例１３と関連して上で論じた。混合物を使用する理由は、例えば、実施例１を参照することにより理解することができる。結果は、タイプＩのミスプライミングの抑制が、典型的に、中高度の濃度の添加剤を必要とすることを示す。しかしながら、図５の動態曲線は、有意にプライマーアニーリング温度以上のＴｍを有する添加物の濃度を上げると、重合反応の効率が低下する傾向にあることを示す。さらに実施例１３は、タイプＩＩＩのミスプライミングを抑制するために、高Ｔｍ添加剤が必要であり得ることを示す。添加剤の混合物は、増幅の効率の低下を最小にしながら、両方のタイプのミスプライミングを抑制するように設計することができる。一実施形態において、アニーリング温度に近いＴｍを有する高濃度（３００ｎＭから１００ｎＭ）の添加剤と、アニーリング温度より高い温度で二本鎖である低濃度（２５ｎＭから３００ｎＭ）の添加剤、具体的には、アニーリング温度より数度高い（または２つが反応で使用される場合、より高いアニーリング温度）Ｔｍを有する添加物とを含む混合物の使用は、両方のタイプのミスプライミングを抑制するために使用することができる。添加剤の混合物は、４つの異なる鎖、つまり、共通の鎖を共有しない２つの二本鎖添加剤を含んでもよい。代替的に、添加剤の混合物は、３本の鎖、つまり、共通の鎖を共有する２つの二本鎖添加剤を含んでもよい。後者のアプローチは、増幅混合物に含まれる異なる鎖の数を低減する。
【０１２３】
我々は、実施例３に記載されるポリメラーゼ選択性アッセイで、未修飾の二本鎖オリゴヌクレオチドの混合物と添加剤の混合物の両方の、添加剤の混合物を試験した。実験結果を実施例４に報告する。試験された混合物は、全て、２つの添加剤が共通の鎖を共有する、３本鎖混合物であった。混合物は、全て、本実験では６２℃であったプライマーアニーリング温度より数度上の、６７．４℃のＴｍを有する高Ｔｍ添加剤と、５７．４〜５９．１℃の範囲、つまり、アニーリング温度より僅かに下のＴｍを有する低Ｔｍ添加剤とを含んだ。混合物のうちの２つである添加剤０４１および添加剤０４２は、未修飾の二本鎖オリゴヌクレオチドを含んだ。未修飾のオリゴヌクレオチドを有する両方の混合物は、高いＴｍハイブリッドについては７５ｎＭ、そして低いＴｍハイブリッドについては３２５ｎＭの濃度で添加された時、相対的に僅かに２増幅サイクル未満のみ、ポリメラーゼの選択性を改善した。我々は、４つの添加剤の混合物も試験した。２つ（ＥＰ０４１、ＥＰ０４２）において、両方の二本鎖オリゴヌクレオチドは、３つのダブシル修飾因子を含み、１つ（ＥＰ０４３）において、高Ｔｍオリゴヌクレオチドは、３つのダブシルを含み、一方、低Ｔｍオリゴヌクレオチドは、４つのダブシルを含み、１つ（ＥＰ０４５）において、両方のオリゴヌクレオチドは、４つのダブシルを含んだ。４つの全ての混合物は、添加剤０４１および０４２より選択性を改善した。図７Ａ〜７Ｄおよび８Ａ〜８Ｄは、それぞれ、同じ６００ｎＭの全濃度であるが、高Ｔｍハイブリッドの量が２５ｎＭから１００ｎＭまで変動する、混合物ＥＰ０４３およびＥＰ０４５の動態曲線である。これらの曲線は、添加剤によりもたらされた阻害、および反復間のばらつきも明らかにする。ΔＣＴ結果および動態曲線を統合すると、各混合物において、混合物中での高Ｔｍハイブリッドの最適量が存在する場合があることを示す。混合物ＥＰ０４３において、（ａ）高Ｔｍ構成要素の最低濃度（２５ｎＭ）でさえ、ポリメラーゼ選択性を増加させる、（ｂ）ポリメラーゼ選択性は、最大１００ｎＭまで高Ｔｍ構成要素の比率を増加することによっては、さらに増加されない。および（ｃ）どの調合物も、その一致する標的に対するプライマーの増幅の効率を有意に阻害しない。混合物ＥＰ０４５において、（ａ）高Ｔｍ構成要素の最低濃度（２５ｎＭ）でさえ、ＥＰ０４３より大幅にポリメラーゼ選択性を増加させる、（ｂ）ポリメラーゼ選択性は、高Ｔｍ構成要素の濃度比率に比例して増加する、（ｃ）全ての調合物は、その一致する標的に対するプライマーの増幅の効率を阻害する、および（ｄ）阻害の程度は、高Ｔｍ構成要素の比率とともに増加する。これらの調合物は、反復間のばらつきが少なかったため、我々は、混合物ＥＰ０４３の最適な調合は、７５／６００／５２５ｎＭであると判断し、また、我々は、混合物ＥＰ０４５の最適な調合は、５０／６００／５５０ｎＭであると判断した。
我々は、実施例１９において、３’末端ミスマッチがブロッカーオリゴヌクレオチドの使用により作製されるアッセイで、添加剤混合物ＥＰ０４３も試験した。そのアッセイのスキームを、図２１Ａおよび図２１Ｂに一般的に図示する。図２１Ａ、２１Ｂは、２つの二本鎖標的２３１、２３２を表すが、これらは、矢印２３３の制限プライマーの結合部位から僅かに下流の１つの塩基対（過剰プライマー鎖のＧまたはＡのいずれか）が異なる。過剰プライマーの結合部位、矢印２３４も、２つの標的間に保存される。オリゴヌクレオチドブロッカー２３５は、標的２３１に相補的であり、それに結合し（図２１Ａ）、これは、選択される「ミスマッチ」標的である。ブロッカー２３５は、対立遺伝子識別であり、標的２３２に対してミスマッチであり（図２１Ｂ）、それに結合しない。したがって、プライマー２３３は、標的２３２に完全に結合し、伸長されるが、プライマー２３３の３’末端は、標的２３１に結合することができず、伸長を妨げる。図２１Ａにおいて、点線２４２は、プライマー２３３が伸長した時に作製されるであろう制限プライマー鎖である。図２１Ｂにおいて、点線２４３は、プライマー２３３の伸長により作製された制限プライマー鎖である。ブロッカー２３５は、末端フルオロフォア２３６および末端クエンチャー２３７で示されるが、ブロッカー２３５は、増幅中、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長可能にならないように、遮断された３’末端ヌクレオチドを有することが唯一必要とされる。図２１Ａ、２１Ｂに示される特定の実施形態において、標的２３１、２３２は、ブロッカー２３５から下流であり、また過剰プライマー２３４から下流の別の塩基対（図２１Ａの過剰プライマー鎖のＧ、または図２１Ｂの過剰プライマー鎖プライマー鎖２４４のＣのいずれか）が異なるように示される。フルオロフォア２３９およびクエンチャー２４０で標識される、配列特異的プローブ２３８は、標的２３１の増幅の産物（「ミスマッチ」標的）と結合するが、標的２３２の増幅、およびハイブリッド形成時のシグナルの産物に結合しない。プローブ２３８は、ポリメラーゼ選択性を強化するために使用されないという意味では、随意である。例えば、増幅産物の融解分析用に使用することができる。実施例１９は、誘発されたタイプＩＩのミスプライミングの場合において、添加剤が増幅の効率を低下させる時、増幅は熱サイクル依存様式で遅延され、添加物の存在による選択性の強化の規模も、熱サイクル依存である時、熱サイクル依存において修正される必要がある選択性の見かけ強化は、効率が低下することを示す。添加剤の存在／不在を付加したブロッカーの存在下で、一連の標的希釈反応を使用するその修正を行う方法を、実施例１９に例証する。
【０１２４】
我々は、十分な量の１２の全ての産物が配列決定のために生成され得るかどうかを見るために、上述の実施例８の１２多重の添加剤混合物ＥＰ０４３を利用した。これらの実験において、我々は、ＡＴ豊富な尾を追加することにより制限プライマーを修飾し、また、我々は、６５サイクルから８０〜９０サイクルに、増幅反応を延長した。これらの修飾で、添加剤混合物ＥＰ０４３が、５０／６００／５５０ｎＭの鎖濃度で含まれ、ゲノムミトコンドリアＤＮＡの開始量が、１００コピーまたは１０コピーのみであった時、１２全ての意図される産物は、配列決定に必要な量でうまく作製された。伸長した長さの増幅が、タイプＩＩＩのミスプライミングの抑制のための厳密な試験で存在したという事実にも関わらず、これらの結果は、ミスプライミングが、増幅前と増幅中にうまく防止されたことを示す。
【０１２５】
実施例１２において、我々は、制限プライマーの３’端で異なるＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅反応で、６００ｎＭの全濃度で混合物ＥＰ０４３を試験した。反応の１つは、ＧＣ豊富な３’端（ＧＧＣ）を有する制限プライマーを含んだ。他の反応は、ＡＴ豊富な３’端（ＡＡＧ）を有する制限プライマーを含んだ。添加剤なしの対照と比較して、ＧＣ豊富な３’端を有するプライマーを用いた増幅での添加剤ＥＰ０１３（３つのダブシル修飾因子、Ｔｍ６０℃）の含有は、相対的に、重合の効率をほとんど低下させなかった（４サイクルのＣＴ遅延）。しかしながら、添加剤なしの対照と比較して、ＡＴ豊富な３’端を有するプライマーを用いた、同じ濃度での同じ添加剤の含有は、効率を有意に大きく低下させた（１１サイクルのＣＴ遅延）。７０サイクル続けられた両方の反応において、添加剤ＥＰ０１３は、添加剤なしの対照と比較して、４つの反復間のばらつきを有意に減少させた。
冷却停止プロトコルおよび全タイプのミスプライミング
【０１２６】
タイプＩＩのミスプライミングの可能性は、リアルタイム検出のＰＣＲサイクルに低温度検出ステップを含むことにより強化される。タイプＩＩＩのミスプライミングは、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅を長くし、一本鎖産物を生成することにより強化される。我々は、リアルタイムの低温度検出の代わりとして、低温度ステップを含んでもよい操作を実施するために、増幅反応が１つ、または幾つかの中間点で中断される、我々が「冷却停止」と呼ぶプロトコルを試験した。実施例１０は、操作が融解分析である、「冷却停止」プロトコルを図示する。実施例１０の増幅は、蛍光検出のためにハイブリッド形成プローブを使用する、７０サイクルの２段階ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅である。６００ｎＭ濃度で、添加剤ＥＰ０１０を試験した。比較目的のため、増幅はリアルタイム検出で実施された。リアルタイム検出において、増幅サイクルの各アニーリング／伸長ステップ後に、低温度検出ステップ（６０℃）を追加した。熱サイクルの関数としてのプローブ蛍光を図１４Ａに示すが、これは、１０００、１００、および１０コピーの標的配列で開始する増幅の反復間の適度のばらつきを示す。図１４Ａは、サイクル７０で集束し始める初期標的の３つの量の曲線も示す。リアルタイム低温度検出を含むと、タイプＩＩのミスプライミングの確率が上昇した。我々は、３つ全ての開始コピー数について、リアルタイム低温度検出を用いないが、４５℃で始まる融解を実施するために、４０サイクル後の中断を伴う増幅を繰り返した。その後、我々は、７０サイクル後、終結まで増幅を再開し、そこでは第２の融解が実施された。第１融解の融解曲線を図１４Ｂに示す。３つの異なる開始量の標的の反復は、明らかに識別可能であり、ほとんどばらつきを示さない。第２融解の融解曲線を１４Ｃに示す。サイクル７０までに、初期標的量の３つのレベルの曲線が集束し、ばらつきは、ほとんど検出されない。
【０１２７】
図１４Ｂおよび１４Ｃに示される結果を説明するために、以下を記載する。ミスプライミングが低温度の中断により起こる場合、一本鎖ＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡに変換され、一本鎖産物の量は、サイクル４０から７０の間で減少する。これは、起こらなかった。ミスプライミングが４０サイクル後の中断中に生じる場合、反復間のばらつきは、サイクル４０から７０の間で増加する。これは、起こらなかった。ミスプライミングが中断中に生じる場合、異なる量の初期標的から生成される一本鎖産物の量は、７０サイクル後に等しくならないであろう。これは、起こらなかった。図１４Ａ、図１４Ｂ、および図１４Ｃの比較は、添加剤ＥＰ０４６が、本「冷却停止」増幅で、全てのタイプのミスプライミングを完全に抑制したことを示す。１回の中断を伴う「冷却停止」プロトコルは、サイクル４０前とサイクル４１後のあらゆる低温度ステップを排除する。これは、サイクル４１以外の全てのサイクル中のタイプＩＩおよびタイプＩＩＩのミスプライミングの確率を低下させる。第１融解は、プライマーアニーリング温度以下の温度での長い時間を含み（本実施例において、約１５分）、したがって、他のサイクルで低温度ステップを排除する代わりに、融解中のミスプライミングの可能性（ミスプライミングされた３’端の伸長を１つ含むであろう）を増加させる。この交換は、反復間のばらつきの低減を補助してもよい。「冷却停止」プロトコルは、ミスプライミングのそれらの作用について、添加物の組成物および濃度をスクリーニングするために使用することができることが理解されるであろう。
ＤＮＡポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性の阻害
【０１２８】
添加剤は、例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＴｆｉ（＋）ＤＮＡポリメラーゼ等の、その活性を保有するＤＮＡポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性を阻害するのに効果的であり得る。（本効果は、５’エキソヌクレアーゼドメインを保有しないクレノー断片、およびそれに不活性を付与するように修飾される５’エキソヌクレアーゼドメインを含むＴｆｉ（−）ＤＮＡポリメラーゼ等の、その活性を有さないＤＮＡポリメラーゼには適用されない。）我々は、ＤＮＡポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性に対する添加剤の阻害作用を測定するためのプライマーに依存しない依存手段として、実施例６に報告されるアッセイを開発した。そのアッセイにおいて、フルオロフォアとクエンチャーで二重標識された伸長不可能なプローブは、プライマーを反応混合物に含まずに標的とハイブリッド形成される。次いで、反応混合物は、プローブ蛍光がリアルタイムで検出される間、温度が４５℃から６０℃の間で、４５回繰り返される、熱の周期的変動を受ける。プローブ切断は、ポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性を示す蛍光の増加をもたらす。３００ｎＭの濃度で、幾つかの添加剤を本アッセイで試験し、プローブを含むが、標的を含まない対照アッセイと比較した。対照アッセイにおいて、ハイブリッドが形成されず、プローブは切断されなかった。プローブおよび標的を含むが、添加剤を含まないアッセイにおいて、蛍光の大幅な増加が生じた。プローブ、標的、および添加剤を含むアッセイにおいて蛍光の増加は、標的を有するが、添加剤を用いないアッセイと比較して、著しく減少し、５’ヌクレアーゼ活性の顕著な阻害を示す。それぞれ３つおよび４つの共有結合的に連結されたダブシル基を有する添加剤ＥＰ００４およびＥＰ００１は、プローブのプライマー依存５’エキソヌクレアーゼ切断を完全に阻害した。その５’ヌクレオチドのそれぞれに、共有結合的に連結されたダブシル基を有する添加剤ＥＰ００８は、本アッセイにおいて、プライマー依存５’エキソヌクレアーゼ活性も完全に阻害した。それと比較して、３’ヌクレオチドのそれぞれに共有結合的に連結されたダブシル基を有する添加剤ＥＰ００９は、本アッセイにおいて、プライマー依存５’エキソヌクレアーゼ活性を部分的にしか阻害しなかった。結果は、二本鎖オリゴヌクレオチド上のダブシル修飾因子基が、位置依存様式で５’エキソヌクレアーゼ活性の阻害を強化することができることを示す。添加剤の両方の５’端上にダブシル基が好ましく、３つおよび４つのダブシル基が２つのダブシル基より好ましい。さらなる実験は、Ｔｆｉ（＋）ＤＮＡポリメラーゼについて一貫性のある結果を示した。
実施例１８に報告するように、我々は、２２の塩基対の一本鎖領域および長さが６ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する、種々の量の３つの添加剤を用いて、実施例６の温度周期的変動アッセイを実施した。添加剤の配列を実施例１６に示す。図１８Ｃに示すように、添加剤は、ヘアピン形成である２本の鎖を含んだ。このような添加剤は、修飾因子として、２つ、３つ、または４つのダブシル基を含んだ。図２０に示すように、２つのダブシル修飾因子を有する添加剤は、濃度依存様式で、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのプライマー依存５’エキソヌクレアーゼ活性を阻害し、２００ｎＭおよび４００ｎＭの濃度では、活性を大きく阻害し、６００ｎＭの濃度では、ほぼ完全に活性を阻害した。３つおよび４つの修飾因子を有する試験された添加剤も、濃度依存様式で、ポリメラーゼのプライマー依存５’エキソヌクレアーゼ活性を阻害したが、図２０に示される結果より幾分小幅であった。
【０１２９】
ＰＣＲ増幅中の５’ヌクレアーゼ活性の阻害を測定するために、我々は、実施例５に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅から得られたプローブおよびアンプリコンを、ハイブリッド形成条件に供した後、融解分析を行った。プローブ単独の反応混合物も、融解分析を受けた。実験を実施例７に報告し、融解曲線を図１１Ａおよび１１Ｂに示す。図１１Ａのプローブ単独と添加剤なしの増幅からの蛍光の比較は、幾つかのプローブ分子が切断されたことを示す：増幅反応からの蛍光は、融解が完了した後のプローブ蛍光のレベルまで低下しなかった。図１１Ｂは、増幅反応混合物が６００ｎＭの濃度で添加剤ＥＰ０１３を含む時、ポリメラーゼ（この場合、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）の５’ヌクレアーゼ活性によるプローブ切断が阻害されたことを示す：増幅反応からの蛍光は、融解が完了した後のプローブ蛍光のレベルに低下した。
ＰＣＲプライマーとしての添加剤
【０１３０】
実施例１４は、ＣＲプライマーの形態で添加剤を例証する。ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅の典型的な過剰プライマーを、タイプＩのミスプライミングを抑制する添加剤に変換するために、以下の２つのことが行われた：最初に、修飾基、この場合、ダブシル基をプライマーの５’末端に添加した；第２に、過剰プライマーに部分的に相補的であり、５’末端ダブシル基と３’末端ダブシル基の両方を有した逆相補体鎖が、１００、２００、または３００ｎＭの濃度で、反応混合物に含まれた。幾つかのミスマッチを逆相補体鎖に導入することによって、過剰プライマーと標的配列により形成されたハイブリッドのＴｍと比較して、過剰プライマーおよび逆相補体鎖により形成されたハイブリッドのＴｍを低くした（代替的に、逆相補体鎖の長さを縮小することができる）。過剰プライマーおよび逆相補体鎖により形成されたハイブリッドは、３つの修飾基を含んだ。二本鎖増幅産物の融解分析は、２００ｎＭまたは３００ｎＭの濃度で反応混合物中に逆相補体配列を含むと、少量から全く他の産物を有さない、予想されたアンプリコンをもたらしたことを示した。逆に、反応混合物に逆相補体配列を用いない増幅は、意図されたアンプリコンと低Ｔｍ産物の混合物をもたらし、融解曲線は、反復間でばらつきを示した。
【０１３１】
前述の実施例は、それに合うように、添加剤、反応混合物、および方法の特定の好適な実施形態を図示することを意図し、包括的または限定的であるものと解釈されるべきでない。多くの変形が可能であり、当業者には明らかであろう。例えば、ＰＣＲ以外の増幅法が利用されてもよく、添加剤は、二本鎖ＤＮＡ分子以外の修飾された型の分子であってもよい。他の変形は、当業者に明らかであろう。
実施例
実施例１タイプＩミスプライミングの抑制
【０１３２】
二本鎖および一本鎖アンプリコンを生成するために、一対のプライマーと単一標的を使用して、ＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイを実施した。増幅の終わりに、融解分析により二本鎖産物を特徴付けた。二本鎖オリゴヌクレオチド以外の反応構成要素および反応条件は、以下の通りである。
制限プライマー  ５’ＣＣＴＧＧＡＴＴＡＴＧＣＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴ（配列番号１）
過剰プライマー  ５’ＣＣＴＴＧＡＴＧＡＣＧＣＴＴＣＴＧＴＡＴＣＴＡ（配列番号２）
標的  ５’ＣＣＴＧＧＡＴＴＡＴＧＣＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＴＡＡＡＧＡＡＡＡＴＡＴＣＡＴＣＴＴＴＧＧＴ
ＧＴＴＴＣＣＴＡＴＧＡＴＧＡＡＴＡＴＡＧＡＴＡＣＡＧＡＡＧＣＧＴＣＡＴＣＡＡＡＧ（配列番号３）
【０１３３】
１Ｘ  ＰＣＲ緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５０ｎＭ  ｄＮＴＰ、５０ｎＭの制限プライマー、１０００ｎＭの過剰プライマー、０．２４Ｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、約１０００ゲノムのヒトゲノムＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を有する１．２５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から成る２５μｌ容量で、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅を実施した。添加剤なしの反応に加えて、５０、１００、３００、６００、および１０００ｎＭの濃度の添加剤を利用して、各添加剤について、３重の、増幅反応を行った。
【０１３４】
これらの反応の熱プロファイル条件は、以下の通りである：１０サイクルにおいては、９５℃／１０ｓ−５５℃／３０ｓ−７０℃／３０ｓ、その後、４０サイクルにおいては、９５℃／１０秒−５０℃／３０秒−７０℃／３０秒、その後、９７℃まで３０秒間隔で１℃ずつ上昇しながら、５５℃で融解開始。
【０１３５】
二本鎖ＤＮＡ産物のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ蛍光（−ｄＦ／ｄＴ，ＳＹＢＲ）の第１導関数を使用して、融解曲線分析により、５０サイクルの終わりに反応を分析した。加えて、特定の反応について、二本鎖産物の産生動態（熱サイクルの関数としてＳＹＢＲ強度読み取り）を分析した。
【０１３６】
Ａ．１６ｍｅｒｓ
【０１３７】
１６ヌクレオチド長である以下の添加剤のそれぞれが、開始反応混合物（末端ブロッカーＣ３は、三炭素リンカー鎖である）に含まれた。
１６ｍｅｒＡ．  ５’ＣＡＣＧＡＣＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣ（Ｃ３）
（Ｃ３）ＧＴＧＣＴＧＧＡＧＣＧＧＣＴＧＧ  ５’（配列番号４）
１６ｍｅｒＢ．  ５’ＣＡＣＧＡＣＣＴＣＧＣＴＧＡＣＣ（Ｃ３）
（Ｃ３）ＧＴＧＣＴＧＧＡＧＣＧＡＣＴＧＧ  ５’（配列番号５）
ＥＰ０４８：上部鎖の３’端に１つのダブシルを有する１６ｍｅｒＢ（配列番号６）
ＥＰ０４９：底部鎖の３’端に１つのダブシルを有する１６ｍｅｒＢ（配列番号７）
ＥＰ０２７：各鎖の３’端に１つずつ、２つのダブシルを有する１６ｍｅｒＢ（配列番号８）
【０１３８】
添加剤なしで、増幅は、「適切な」産物以外、つまり、プライマーにより定義される二本鎖産物（アンプリコン）以外の産物を生成した。意図される産物が下方矢印で特定される、３００ｎＭ濃度の添加剤１６ｍｅｒＡを含む３つの反復増幅反応の融解曲線を図１に示す。丸１１は、３つの反復の曲線である。（１）適切な産物は、不適切な産物を全体的に除いて作製された、および（２）３つの反復は非常に一致（重複曲線）していたため、この増幅は、非常に良好であると判断された。同様の結果が、高濃度の１６ｍｅｒＡで得られた。低濃度（５０ｎＭ、１００ｎＭ）で、大量の不適切な産物が確認され、３つの反復は一致しなかった。
【０１３９】
３００ｎＭ濃度の添加剤１６ｍｅｒＢの融解曲線を図２に示す。丸２１は、３つの反復の曲線である。大量の不適切な産物が確認され、３つの反復が一致していなかったため、この増幅は、非常に不適切であると判断された。利用された濃度のいずれにおいても、増幅は、不適切な産物を全体的に除いて適切な産物を生成しないことが確認され、いずれにおいても、反復は、高度に一致しなかった。不適切な産物は、添加剤なしで得られた不適切な産物とは非常に異なり、これは、添加剤１６ｍｅｒＢがミスプライミングを引き起こすことを示した。
【０１４０】
意図される産物が下方矢印で特定される、６００ｎＭ濃度の添加剤ＥＰ０４９の融解曲線を図３に示す。丸３１は、３つの反復の曲線である。（１）適切な産物は、不適切な産物を全体的に除いて作製された、および（２）３つの反復は非常に一致（重複曲線）していたため、この増幅は、非常に良好であると判断された。同様の結果が、高濃度で得られたが、低濃度は、反復間で一致しなく、不適切な産物をもたらした。添加剤ＥＰ０４８は、１００および６００ｎＭの濃度で、より一致した産生を示し、両方の鎖がミスプライミングする可能性があることを示した。
【０１４１】
意図される産物が下方矢印で特定される、１００ｎＭ濃度の添加剤ＥＰ０２７の融解曲線を図４に示す。丸４１は、３つの反復の曲線である。（１）適切な産物は、不適切な産物を全体的に除いて作製された、および（２）３つの反復は、曲線間において多少のばらつきを伴うが、適度に一致（重複曲線）していたため、この増幅は、非常に良好ではなく、良好であると判断された。３つの反復は非常に一致していたため、本添加剤の高濃度で、結果は、非常に良好であると判断された。しかしながら、５０ｎＭで、著しく不適切な産物が作製され、反復は、一致しなかった。
【０１４２】
ＥＰ０２７を用いた増幅の動態分析を図５に示す。丸５１は、１００ｎＭの濃度での３つの反復であり、丸５２は、３００ｎＭの濃度での３つの反復であり、丸５３は、６００ｎＭの濃度での３つの反復であり、丸５４は、１０００ｎＭの濃度での３つの反復である。１００ｎＭ濃度で、平坦域に３つの反復間でばらつきがある。３００ｎＭを含む３つの反応は、６００または１０００ｎＭを含む反応より、完全に重複した動態を有し、高効率であった。したがって、３００ｎＭのＥＰ０２７は、本アッセイにおいて、最適な量であった。
Ｂ．他の添加剤
【０１４３】
追加の修飾因子を用いない二本鎖オリゴヌクレオチドから成り、１２、１８、２０、２２、および２４の長さのヌクレオチドの幾つかの添加剤を、５０、１００、３００、６００、および１０００ｎＭの濃度で、本実施例のアッセイで試験した。Ａ部に説明される１６ｍｅｒｓに関して、結果は、一致しなかった。例えば、試験された３つの異なる１２ｍｅｒのうち、１つは、全濃度で適切な産物を産生せず、１つは、１０００ｎＭ濃度でのみ、適切な産物を生成し、１つは、６００ｎＭ以上の濃度で適切な産物を産生した。試験された８つ長いオリゴヌクレオチドのうち、半分は、６００および１０００ｎＭの最高濃度でさえ大量の不適切な産物を産生した。３つのみが、３００ｎＭ濃度で全体的に不適切な産物を除いて適切な産物を生成し、低濃度では、いずれもそうではなかった。我々は、添加剤２２ｍｅｒＡが本アッセイで最良であると判断した（末端ブロッカーｐは、リン酸である）。
２２ｍｅｒＡ．  ５’ＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡｐ
ｐＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴ  ５’（配列番号９）
【０１４４】
２つまたは４つのいずれかの末端修飾因子を含み、８、１１、および２２の長さのヌクレオチドである二本鎖オリゴヌクレオチドから成る幾つかの添加剤も試験した。修飾因子は、ダブシル、またはジゴキシゲニン（ＤＩＧ）のいずれかであった：
添加剤ＥＰ０１０．  ５’ダブシルＧＧＴＣＡＧＡＴＧＡＡＡＡＴＧＡＴＡＣＧＴＧダブシル
ダブシルＣＣＡＧＴＣＴＡＣＴＴＴＴＡＣＴＡＴＧＣＡＣダブシル５’
（配列番号１０）
添加剤ＥＰ０１８．  ５’ＧＧＴＣＡＧＡＴＧＡＡＡＡＴＧＡＴＡＣＧＴＧダブシル
ダブシルＣＣＡＧＴＣＴＡＣＴＴＴＴＡＣＴＡＴＧＣＡＣ５’
（配列番号１１）
添加剤ＥＰ０２０．  ５’ダブシルＧＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡダブシル
ダブシルＣＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴダブシル５’
（配列番号１２）
添加剤ＥＰ０２１．  ５’ダブシルＣＡＧＣＣＧＧＣダブシル
ダブシルＧＴＣＧＧＣＣＧダブシル５’（配列番号１３）
添加剤ＥＰ０２２．  ５’ダブシルＣＣＧＣＣＧＧＣダブシル
ダブシルＧＧＣＧＧＣＣＧダブシル５’（配列番号１４）
添加剤ＥＰ０２３    ５’ダブシルＧＣＧＴＡＣＧＣＡＧＧダブシル
ダブシルＣＧＣＡＴＧＣＧＴＣＣダブシル５’（配列番号１５）
添加剤ＥＰ０２４．  ５’ダブシルＧＣＧＴＡＣＧＡＡＧＧダブシル
ダブシルＣＧＣＡＴＧＣＴＴＣＣダブシル５’（配列番号１６）
添加剤ＥＰ０２６．  ５’ＤＩＧ  ＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡ  ＤＩＧ
ＤＩＧ  ＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴ  ＤＩＧ５’
（配列番号１７）
添加剤ＥＰ０２８．  ５’ダブシルＴＧＡＧＡＧＡＴＧＡＡＡＡＴＧＡＴＣＧＡＧＴダブシル
ダブシルＡＣＴＣＴＣＴＡＣＴＴＴＴＡＣＴＡＧＣＴＣＡダブシル５’
（配列番号１８）
添加剤ＥＰ０２９．  ５’ＧＧＴＣＡＧＡＴＧＡＡＡＡＴＧＡＴＡＣＧＴＧ  ＤＩＧ
ＤＩＧ  ＣＣＡＧＴＣＴＡＣＴＴＴＴＡＣＴＡＴＧＣＡＣ５’
（配列番号１９）
【０１４５】
本群の添加剤の全ては、６００ｎＭと等しい、またはそれ未満の濃度で、全体的に他の産物を除いて適切な産物を生成した。１つ（ＥＰ０２１）を除く全てが、３００ｎＭかまたはそれ未満の濃度でそうであった。添加剤ＥＰ０２８は、１００ｎＭの濃度でそうであり、添加剤ＥＰ０１０は、５０ｎＭの濃度でそうであった。
実施例２．タイプＩミスプライミングの抑制
【０１４６】
異なるプライマーを有する異なる標的用に、実施例１で最良の未修飾添加剤であると判断された、未修飾の二本鎖オリゴヌクレオチド２２ｍｅｒＡ、および幾つかのダブシル修飾オリゴヌクレオチドを本アッセイに使用した。１００および３００ｎＭの濃度で、増幅の開始前に、各添加剤をＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅反応混合物に個別に添加した。二本鎖ＤＮＡ産物のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ蛍光（−ｄＦ／ｄＴ，Ｓｙｂｒ）の第１導関数を使用して、融解分析により、反応を５０サイクルの終わりに分析した。加えて、特定の反応について、二本鎖産物の産生動態（熱サイクルの関数としてＳｙｂｒ強度読み取り）を分析した。二本鎖オリゴヌクレオチド以外の反応構成要素および反応条件は、以下の通りである。
制限プライマー  ５’ＡＡＡＴＴＧＣＧＴＣＡＴＴＧＴＴＴＣＡＣＡＧＧＧＣＣＡ
（配列番号２０）
過剰プライマー  ５’ＡＡＴＣＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡＴＡＣ（配列番号２１）
標的  ５’ＡＡＴＣＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡＴＡＣＡＧＧＴＣＡＴＣＡＣＴＧＴＡＡＡＡＴＴＣＴＴＴＧＡ
ＡＣＴＴＴＴＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴＣＴＴＴＧＡＡＡＡＴＴＴＴＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＴＧＴＴＧＧ
ＡＡＡＡＣＴＴＡＡＡＡＧＧＣＴＧＴＴＧＣＴＴＴＧＣＴＣＡＴＡＴＴＧＧＣＧＧＴＡＣＡＴＡＴ
ＡＣＡＡＡＡＧＴＧＧＡＡＡＧＧＡＴＧＡＧＡＴＴＧＡＴＴＧＧＣＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＧＡＡ
ＡＣＡＡＴＧＡＣＧＣＡＡＴＴＴ（配列番号２２）
【０１４７】
１Ｘ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５０ｎＭ  ｄＮＴＰ、５０ｎＭの制限プライマー、１０００ｎＭの過剰プライマー、０．２４Ｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、約１０００ゲノムのヒトゲノムＤＮＡを有する１．２５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から成る２５μｌ容量で、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅を実施した。これらの反応の熱プロファイル条件は、以下の通りである：３０分間、２５ｏＣ、その後、５０サイクルにおいては、９５℃／１０ｓ−６２℃／２０ｓ−７０℃／２０ｓ、その後、４２サイクルにおいては、１℃ずつ上昇しながら５５℃／３０ｓで融解開始。（２０ｓに見られる略語「ｓ」は、「秒」である。）全ての反応は、二本鎖ＤＮＡ産物のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ蛍光の第１導関数を使用して、５０サイクルの終わりで分析された。
【０１４８】
以下の添加剤を試験した。
添加剤２２ｍｅｒＡ．  ５’ＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡｐ
ｐＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴ５’
（配列番号９）
添加剤ＥＰ００１．    ５’ダブシルＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡダブシル
ダブシルＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴダブシル５’
（配列番号２３）
添加剤ＥＰ００２．    ５’ダブシルＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡダブシル
ｐＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴダブシル５’
（配列番号２４）
添加剤ＥＰ００３．    ５’ＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡダブシル
ダブシルＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴダブシル５’
（配列番号２５）
添加剤ＥＰ００４．    ５’ダブシルＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡｐ
ダブシルＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴダブシル５’
（配列番号２６）
添加剤ＥＰ００５．  ５’ダブシルＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡダブシル
添加剤ＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴ５’
（配列番号２７）
添加剤ＥＰ００６．  ５’ダブシルＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡｐ
添加剤ＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴ５’
（配列番号２８）
添加剤ＥＰ００７．  ５’ＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡダブシル
ｐＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴダブシル５’
（配列番号２９）
添加剤ＥＰ００８．  ５’ダブシルＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡｐ
ｐＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴダブシル５’
（配列番号３０）
添加剤ＥＰ００９．  ５’ＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡダブシル
添加剤ＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴ５’
（配列番号３１）
添加剤ＥＰ０２０．  ５’ダブシルＧＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡダブシル
ダブシルＣＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴダブシル５’
（配列番号１２）
添加剤ＥＰ０５２．  ５’ダブシルＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡダブシル
ｐＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴ５’
（配列番号３２）
添加剤ＥＰ０５３．  ５’ＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡｐ
ダブシルＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴダブシル５’
（配列番号３３）
【０１４９】
（１）適切な産物は、全体的に不適切な産物を除いて作製された、および（２）３つの反復試験は非常に一致（重複曲線）していたため、３００ｎＭ濃度の二本鎖オリゴヌクレオチド２２ｍｅｒＡは、非常に良好であると判断された。しかしながら、反復の１つが、全体的に不適切な産物を排除しなかったため、１００ｎＭ濃度の２２ｍｅｒＡの場合においてはそうではなかった。ダブシル含有添加剤の全ては、３００ｎＭでも非常に良好であると判断された。これらのうちの５つ（ＥＰ００１、ＥＰ００２、ＥＰ００３、ＥＰ００４、およびＥＰ００５）も、１００ｎＭ濃度で非常に良好であると判断された。図６は、１００ｎＭの添加剤ＥＰ００３および添加剤２２ｍｅｒＡを用いた３つの反復反応についての融解曲線を示す。丸６１は、添加剤２２ｍｅｒＡの３つの反復の曲線である。丸６２は、添加剤ＥＰ００３の３つの反復の曲線である。
実施例３．タイプＩＩのミスプライミングおよびポリメラーゼ選択性
【０１５０】
我々は、両方のプライマー（一致する標的）に相補的であった標的を増幅し、また、我々が、過剰プライマーに相補的であったが、制限プライマーの３’末端ヌクレオチドにミスマッチを１つ含む標的を個別に増幅した、ＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイを我々は実施した。我々は、ＤＮＡ色素、この場合、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎで、リアルタイムで、つまり、ＰＣＲサイクル毎のプライマーアニーリング部分中に、二本鎖産物を検出した。任意の濃度の添加剤の存在下での３’末端ミスマッチに対する選択性は、ミスマッチ標的の増幅からのシグナルの閾値サイクル（ＣＴ）と、一致する標的の増幅からのシグナルのＣＴとの間の差（ΔＣＴ）である。増幅反応を３重で行った。ＣＴ差は、３つの反復の平均を使用して計算される。ＤＮＡポリメラーゼの選択性を改善するための添加剤の効果は、添加剤を用いたＣＴ差から添加剤なしのＣＴ差を引いたものである。本実施例および後続の実施例の「選択性」の表題下で、我々は、ＣＴユニット、つまり、ΔＣＴとして、添加剤の使用に起因するＣＴ差の改善を報告する。
【０１５１】
プライマーおよび一本鎖標的の配列は、以下の通りである。
制限プライマー  ５’ＣＧＴＡＡＧＡＴＴＡＣＡＡＴＧＧＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＴ
（配列番号３４）
過剰プライマー  ５’ＧＣＣＣＡＡＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＣＴＴＣＴＣＡ
（配列番号３５）
一致する標的（Ａ）．  ５’ＣＧＴＡＡＧＡＴＴＡＣＡＡＴＧＧＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＡＡＧＧＴＴＣＴＡＡ
ＧＴＧＣＣＡＴＧＡＴＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＡＴＴＡＣＴＡＡＧＴＡＴＧＣ
ＴＧＡＧＡＡ  ＧＡＡＣＧＡＴＡＡＡＡＣＴＴＧＧＧ（配列番号３６）
ミスマッチ標的（Ｔ）．５’ＣＧＴＡＡＧＡＴＴＡＣＡＡＴＧＧＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＴＡＧＧＴＴＣＴＡ  ＡＧＴＧＣＣＡＴＧＡＴＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＡＴＴＡＣＴＡＡＧＴＡＴＧＣＴＧ
ＡＧＡＡＧＡＡＣＧＡＴＡＡＡＡＣＴＴＧＧＧＣＡＡ（配列番号３７）
【０１５２】
下線付きおよび太字ヌクレオチドは、過剰プライマー鎖の相補体が、制限プライマーの３’末端ヌクレオチドに一致またはミスマッチのいずれかであるヌクレオチドである。
【０１５３】
１Ｘ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＰＣＲ緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５０ｎＭ  ｄＮＴＰ、５０ｎＭの制限プライマー、１０００ｎＭの過剰プライマー、０．２４Ｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、約１０００の一本鎖標的Ａ（一致）または（ミスマッチ）を有する１．２５ユニットのプラチナＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から成る２５μｌ容量で、３重で、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅を実施した。これらの反応の熱プロファイル条件は、３分間、９５℃、その後、６０サイクルにおいては、９５℃／５ｓ−６２℃／２０ｓ−７２℃／３０ｓであった。両方の標的の開始コピー数が同じであること、この場合、両方の標的のＣＴが同じであることを確実にするために、２つの標的を含む本アッセイおよび他のアッセイにおいて、我々は、両方の標的に完全に相補的である過剰プライマー、および同様に、両方の標的に完全に相補的である対照制限プライマーを使用して、対照増幅を行った。（対照増幅が、開始コピー数が同じでないことを認めた場合、２つの選択股がある：再調合するか、または本明細書に報告される全ての実施例の場合のように、ＣＴ差が僅かの場合、差に合わせて観察されたＣＴ値を修正する。）
【０１５４】
Ｔｍが報告される場合には、それは、修飾因子を有さない二本鎖添加剤の計算された融解温度である。本明細書に示される二本鎖添加剤のＴｍは、Ｍａｒｋｈａｎ  ａｎｄ  Ｚｕｋｅｒ（２００５）ＤＩＮＡＭＥＬＴ  ｗｅｂ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：Ｗ５７７−Ｗ５８１、およびＭａｒｋｈａｍ  ａｎｄ  Ｚｕｋｅｒ（２００８）ＵＮＡＦＯＬＤ：ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｉｎ  Ｋｅｉｔｈ，Ｊ．Ｍ．，ｅｄ．，ＢＩＯＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ，ｖｏｌ．ＩＩ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｏ．４５３  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．１，ｐａｇｅｓ３−３１（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ．ＩＳＢＮ９７８−１−６０３２７−４２８−９に従い計算された。
Ａ．添加剤なし
【０１５５】
本アッセイは、添加剤なしで行われた。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎシグナルは、リアルタイム、つまり、全ＰＣＲサイクルのプライマーアニーリング部分中に検出された。増幅サイクル数の関数としての蛍光強度読み取りは、酵素が、一致する標的について適度に固有の選択性を有することを示す。添加剤が本アッセイで試験された時、添加剤なしの対照も含まれ、添加剤なし対照の一致する標的配列とミスマッチの標的配列との間のＣＴ差は、添加剤の一致する標的配列とミスマッチの標的配列との間のＣＴ差から差し引かれ、存在する選択性改善数（ΔＣＴ）に達する。
Ｂ．修飾因子を有さない二本鎖添加剤
【０１５６】
各鎖の３’末端がリン酸（ｐ）で覆われ、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長を防止する、「２２ｍｅｒＡ」と命名される以下の２２ヌクレオチド長の二本鎖オリゴヌクレオチドは、３つの異なる濃度で、添加剤として利用された。
２２ｍｅｒ  Ａ．    ５’ＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡｐ
ｐＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴ５’
（配列番号９）
【０１５７】
選択性の結果（ミスマッチの標的のＣＴから一致する標的のＣＴを引く）を表１に示す。
【表１】
0005757885.tif 000002
Ｃ．２つのダブシル修飾因子を有する二本鎖添加剤
【０１５８】
実施例１に記載される二本鎖オリゴヌクレオチド１６ｍｅｒＢ（配列番号５）は、上部鎖の５’端にダブシル、および底部鎖の３’端にダブシルを配置することにより（添加剤ＥＰ０５０、配列番号３８）、ならびに上部鎖の３’端にダブシル、および底部鎖の５’端にダブシルを配置することにより（添加剤ＥＰ０５１、配列番号３９）、２つのダブシルで修飾された。上のＢ部に記載される二本鎖オリゴヌクレオチド２２ｍｅｒＡ（配列番号９）は、上部鎖の５’端上にダブシルおよび底部鎖の３’端上にダブシルを配置することにより、（添加剤ＥＰ００６、配列番号２８）、上部鎖の３’端上にダブシルおよび底部鎖の５’端上にダブシルを配置することにより（添加剤ＥＰ００７、配列番号２９）、各鎖の５’端上にダブシルを配置することにより（添加剤ＥＰ００８、配列番号３０）、各鎖の３’端上にダブシルを配置することにより（添加剤ＥＰ００９、配列番号３１）、上部鎖の各端上にダブシルを配置することにより（添加剤ＥＰ０５２、配列番号３２）、ならびに底部鎖の各端上にダブシルを配置することにより（添加剤ＥＰ０５３、配列番号３３）修飾された。これらの添加剤の配列を以下に示し、選択性の結果を表２に示す。
添加剤ＥＰ０５０．  ５’ダブシルＣＡＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣ（Ｃ３）
ダブシルＧＴＧＣＴＧＧＡＧＣＧＡＣＴＧＧ５’（配列番号３８）
添加剤ＥＰ０５１．  ５’ＣＡＣＧＡＣＣＴＣＧＣＴＧＡＣＣダブシル
ｐＧＴＧＣＴＧＧＡＧＣＧＡＣＴＧＧダブシル５’（配列番号３９）
添加剤ＥＰ００６．  ５’ダブシルＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡｐ
ダブシルＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴ５’
（配列番号２８）
添加剤ＥＰ００７．  ５’ＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡダブシル
ｐＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴダブシル５’
（配列番号２９）
添加剤ＥＰ００８．  ５’ダブシルＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡｐ
ｐＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴダブシル５’
（配列番号３０）
添加剤ＥＰ００９．  ５’ＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡダブシル
ダブシルＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴ５’
（配列番号３１）
添加剤ＥＰ０５２．  ５’ダブシルＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡダブシル
ｐＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴ５’
（配列番号３２）
添加剤ＥＰ０５３．  ５’ＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡｐ
ダブシルＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴダブシル
（配列番号３３）
【表２】
0005757885.tif 000003
Ｄ．３つのダブシル修飾因子を有する添加剤
【０１５９】
上のＢ部に記載される二本鎖オリゴヌクレオチド２２ｍｅｒＡ（配列番号９）は、上部鎖の各端上および底部鎖の５’端上にダブシルを配置することにより（添加剤ＥＰ００２、配列番号２４）、上部鎖の３’端上および底部鎖の各端上にダブシルを配置することにより（添加剤ＥＰ００３、配列番号２５）、上部鎖の５’端上および底部の各端上にダブシルを配置することにより（添加剤ＥＰ００４、配列番号２６）、ならびに上部鎖の各端上および底部鎖の３’端上にダブシルを配置することにより（添加剤ＥＰ００５、配列番号２７）修飾された。添加剤の配列を以下に示し、結果を表３に示す。
添加剤ＥＰ００２．  ５’ダブシルＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡダブシル
ｐＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴダブシル５’
（配列番号２４）
添加剤ＥＰ００３．  ５’ＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡダブシル
ダブシルＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴダブシル５’
（配列番号２５）
添加剤ＥＰ００４．  ５’ダブシルＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡｐ
ダブシルＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴダブシル５’
（配列番号２６）
添加剤ＥＰ００５．  ５’ダブシルＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡダブシル
ダブシルＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴ５’（配列番号２７）
【表３】
0005757885.tif 000004
Ｅ．４つのダブシル修飾因子を有する添加剤
【０１６０】
幾つかの二本鎖オリゴヌクレオチドを４つの末端ダブシル修飾因子で修飾した。
添加剤ＥＰ０２２．  ５’ダブシルＣＧＣＣＧＣＧＣダブシル
ダブシルＧＣＧＧＣＧＣＧダブシル５’（配列番号１４）
添加剤ＥＰ０２０．  ５’ダブシルＧＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡダブシル
ダブシルＣＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴダブシル５’
（配列番号１２）
添加剤ＥＰ００１．  ５’ダブシルＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡダブシル
ダブシルＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴダブシル５’
（配列番号２３）
添加剤ＥＰ０２８．５’ダブシルＴＧＡＧＡＧＡＴＧＡＡＡＡＴＣＡＴＣＧＡＧＴダブシル
ダブシルＡＣＴＣＴＣＡＣＴＴＴＴＴＡＣＴＡＧＣＴＣＡダブシル５’
（配列番号１８）
【０１６１】
結果を表４に示す。
【表４】
0005757885.tif 000005
Ｆ．異なる修飾因子を有する添加剤
【０１６２】
幾つかの二本鎖オリゴヌクレオチドをダブシル以外の修飾因子で修飾した。ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、クマリン（ＣＭＮ）、ＱＳＹ２１（ＱＳＹ）の３つの修飾因子は、添加剤で有用であり、フルオロセイン（ＦＡＭ）はそうでないことが示された。オリゴヌクレオチドの配列は、以下の通りであった。
添加剤ＥＰ０２６．  ５’ＤＩＧ  ＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡ  ＤＩＧ
ＤＩＧ  ＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴ  ＤＩＧ５’
（配列番号１７）
添加剤ＥＰ０２９．  ５’ＧＧＴＣＡＧＡＴＧＡＡＡＡＴＧＡＴＡＣＧＴＧ  ＤＩＧ
ＤＩＧ  ＣＣＡＧＴＣＴＡＣＴＴＴＴＡＣＴＡＴＧＣＡＣ５’
（配列番号４０）
添加剤ＥＰ０３１．  ５’ＣＭＮ  ＧＧＴＣＡＧＡＴＧＡＡＡＡＴＧＡＴＡＣＧＴＧ  ＣＭＮ
ＣＭＮ  ＣＣＡＧＴＣＴＡＣＴＴＴＴＡＣＴＡＴＧＣＡＣ  ＣＭＮ５’
（配列番号４１）
添加剤ＥＰ０３３．  ５’ＱＳＹ  ＧＧＴＣＡＧＡＴＧＡＡＡＡＴＧＡＴＡＣＧＴＧ  ＱＳＹ
ＱＳＹ  ＣＣＡＧＴＣＴＡＣＴＴＴＴＡＣＴＡＴＧＣＡＣ  ＱＳＹ５’
（配列番号４２）
添加剤Ｆ０３２．    ５’ＦＡＭ  ＧＧＴＣＡＧＡＴＧＡＡＡＡＴＧＡＴＡＣＧＴＧ  ＦＡＭ
ＦＡＭ  ＣＣＡＧＴＣＴＡＣＴＴＴＴＡＣＴＡＴＧＣＡＣ  ＦＡＭ５’
（配列番号４３）
【０１６３】
結果を表５に示す。
【表５】
0005757885.tif 000006
実施例４．添加剤混合物を用いたタイプＩＩのミスプライミングおよびポリメラーゼ選択性
【０１６４】
２つの添加剤の組み合わせは、４本鎖、つまり、２つの異なる二本鎖オリゴヌクレオチドの混合物として、反応混合物に添加することができる。代替的に、２つの添加剤は、共通の鎖を共有することができ、したがって、３本鎖として反応混合物に添加することができる。本実施例は、修飾因子を有さない対照混合物を含む、３本鎖型の混合物を使用して、実施例３に報告されるアッセイで得られた結果を報告する。共通の鎖を共有する２つの添加剤において、我々は、共通の鎖を中央に、中央鎖とのハイブリッドが高融解温度を有する鎖を上部に、そして中央鎖とのハイブリッドが低融解温度を有する鎖を底部に書く。我々は、上部／中央／底部のように、鎖濃度をｎＭで書く。我々は、上方／下方のように、２つのハイブリッドのＴｍ（℃）を書く。底部鎖を短くするか、またはミスマッチを底部鎖（ミスマッチのヌクレオチドは下線付きである）に導入するかのいずれかにより、融解温度を調節した。試験された添加剤は、
添加剤０４１．  ｐＣＣＴＣＧＴＣＴＧＡＴＣＧＴＧＡＣＴＣＣＡＴ５’
５’ＧＧＡＧＣＡＧＡＣＴＡＧＣＡＣＴＧＡＧＧＴＡｐ
ｐＴＣＴＧＡＴＣＧＴＧＡＣＴＣＣＡＴ５’
（配列番号４４）
添加剤ＥＰ０４１．  ダブシルＣＣＴＣＧＴＣＴＧＡＴＣＧＴＧＡＣＴＣＣＡＴダブシル５’
５’ＧＧＡＧＣＡＧＡＣＴＡＧＣＡＣＴＧＡＧＧＴＡダブシル
ダブシルＴＣＴＧＡＴＣＧＴＧＡＣＴＣＣＡＴダブシル５’
（配列番号４５）
添加剤０４２．  ｐＣＣＴＣＧＴＣＴＧＡＴＣＧＴＧＡＣＴＣＣＡＴ５’
５’ＧＧＡＧＣＡＧＡＣＴＡＧＣＡＣＴＧＡＧＧＴＡｐ
ｐＣＣＴＧＧＴＣＴＧＡＴＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＴ５’
（配列番号４６）
添加剤ＥＰ０４２．  ダブシルＣＣＴＣＧＴＣＴＧＡＴＣＧＴＧＡＣＴＣＣＡＴダブシル５’
５’ＧＧＡＧＣＡＧＡＣＴＡＧＣＡＣＴＧＡＧＧＴＡダブシル
ダブシルＣＣＴＧＧＴＣＴＧＡＴＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＴダブシル５’
（配列番号４７）
添加剤ＥＰ０４３．  ５’ＧＧＡＧＣＡＧＡＣＴＡＧＣＡＣＴＧＡＧＧＴＡダブシル
ダブシルＣＣＴＣＧＴＣＴＧＡＴＣＧＴＧＡＣＴＣＣＡＴダブシル５’
５’ダブシルＡＧＡＣＴＡＧＣＡＣＴＧＡＧＧＴＡダブシル
（配列番号４８）
添加剤ＥＰ０４５．  ５’ダブシルＧＧＡＧＣＡＧＡＣＴＡＧＣＡＣＴＧＡＧＧＴＡダブシル
ダブシルＣＣＴＣＧＴＣＴＧＡＴＣＧＴＧＡＣＴＣＣＡＴダブシル５’
５’ダブシルＡＧＡＣＴＡＧＣＡＣＴＧＡＧＧＴＡダブシル
（配列番号４９）
【０１６５】
上方の２本の鎖と下方の２本の鎖の未修飾のハイブリッドの鎖濃度およびＴｍとともに、結果を表６に示す。添加剤なし対照（rＣＴ）に対する選択性の改善の数を、実施例３に記載されるように計算した。
【表６】
0005757885.tif 000007
0005757885.tif 000008
【０１６６】
添加剤ＥＰ０４３およびＥＰ０４５を用いた増幅反応の動態分析を、それぞれ、図７Ａ〜７Ｄおよび図８Ａ〜８Ｄに示す。これらの図は、異なる濃度の添加剤のＬＡＴＥ−ＰＣＲサイクル数の関数としての、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ色素からの蛍光強度読み取りを表す。図７Ａは、２５／６００／５７５ｎＭの鎖濃度（上方／中央／下方鎖）を有する添加剤ＥＰ０４３の結果を表す。図７Ａにおいて、丸７１は、一致する標的についての３つの反復であり、丸７２は、ミスマッチ標的についての３つの反復である。図７Ｂは、５０／６００／５５０ｎＭの鎖濃度（上方／中央／下方鎖）を有する添加剤ＥＰ０４３の結果を表す。図７Ｂにおいて、丸７３は、一致する標的についての３つの反復であり、丸７４は、ミスマッチ標的についての３つの反復である。図７Ｃは、７５／６００／５２５ｎＭの鎖濃度（上方／中央／下方鎖）を有する添加剤ＥＰ０４３の結果を表す。図７Ｃにおいて、丸７５は、一致する標的についての３つの反復であり、丸７６は、ミスマッチ標的についての３つの反復である。図７Ｄは、１００／６００／５００ｎＭの鎖濃度（上方／中央／下方鎖）を有する添加剤ＥＰ０４３の結果を表す。図７Ｄにおいて、丸７７は、一致する標的についての３つの反復であり、丸７８は、ミスマッチ標的についての３つの反復である。
【０１６７】
図８Ａは、２５／６００／５７５ｎＭの鎖濃度（上方／中央／下方鎖）を有する添加剤ＥＰ０４５の結果を表す。図８Ａにおいて、丸８１は、一致する標的についての３つの反復であり、丸８２は、ミスマッチ標的についての３つの反復である。図８Ｂは、５０／６００／５５０ｎＭの鎖濃度（上方／中央／下方鎖）を有する添加剤ＥＰ０４５の結果を表す。図８Ｂにおいて、丸８３は、一致する標的についての３つの反復であり、丸８４は、ミスマッチ標的についての３つの反復である。図８Ｃは、７５／６００／５２５ｎＭの鎖濃度（上方／中央／下方鎖）を有する添加剤ＥＰ０４５の結果を表す。図８Ｃにおいて、丸８５は、一致する標的についての３つの反復であり、丸８６は、ミスマッチ標的についての３つの反復である。図８Ｄは、１００／６００／５００ｎＭの鎖濃度（上方／中央／下方鎖）を有する添加剤ＥＰ０４５の結果を表す。図８Ｄにおいて、丸８７は、一致する標的についての３つの反復であり、丸８８は、ミスマッチ標的についての３つの反復である。
実施例５．二重反応におけるタイプＩおよびタイプＩＩＩのミスプライミングの抑制
【０１６８】
二重ＬＡＴＥ−ＰＣＲ反応を、２つのＤＮＡ標的、各標的にプライマー対、および各標的に分子指標ハイブリッド形成プローブを用いて、３重に、行われた。各反応混合物は、以下のプライマーおよびプローブを含んだ。
第１の標的配列用
過剰プライマー  ５’ＴＧＴＣＡＴＣＴＴＣＴＧＴＣＣＣＴＴＣＣＣＡＧＡＡＡ
（配列番号５０）
制限プライマー  ５’ＡＣＴＧＴＣＣＣＡＧＡＡＴＧＣＡＡＧＡＡＧＣＣＣＡＧＡＣＧ
（配列番号５１）
第１のアンプリコン用プローブ５’ＢＨＱ−１ＣＣＧＴＡＧＣＴＧＣＣＣＴＧＧ’  Ｃａｌ  Ｒｅｄ６１０
（配列番号５２）
第２の標的配列用
過剰プライマー  ５’ＧＣＡＣＡＧＴＴＡＣＡＧＴＡＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＣＴＣＡ
（配列番号５３）
制限プライマー  ５’ＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＴＡＧＴＧＧＴＧＧＣ
（配列番号５４）
第２のアンプリコン用プローブ  ５’ＢＨＱ−２  ＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＴＡＧＡ  Ｑｕａｓａｒ６７０
（配列番号５５）
【０１６９】
ＬＡＴＥ−ＰＣＲ反応混合物は、２５μｌの容量で、１ＸプラチナＴａｑ緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２５ｎＭ  ｄＮＴＰ、各５０ｎＭの制限プライマー、各１０００ｎＭの過剰プライマー、および各５００ｎＭの検出プローブ、１．２５ユニットのプラチナＴａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ならびにヒトＤＮＡの１０００ゲノムに相等するものを含んだ。異なる反応混合物は、添加剤なし、４００ｎＭ濃度の添加剤ＥＰ０２０、または３００ｎＭ濃度の添加剤ＥＰ０１３を含んだ。
【０１７０】
ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅反応熱プロファイル条件は、９５℃／１０ｓ、以下に指定される温度でアニーリングを１０ｓ間、および７２℃／１０ｓの２０サイクル、その後、９５℃／１０ｓ、６５℃／１０ｓ、７２℃／１０ｓ、および５４℃／２０ｓで蛍光シグナル検出の５０サイクルであった。増幅は、異なるアニーリング温度が同じ機器で行える、多重増幅温度プロファイルを可能にする温度勾配機能を使用して、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＩＱ−５多色リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で実施された。
添加剤ＥＰ０２０．  ５’ダブシルＧＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡダブシル
ダブシルＣＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴダブシル５’
（配列番号１２）
添加剤ＥＰ０１３．  ５’ダブシルＧＧＴＣＡＧＡＴＧＡＡＡＡＴＧＡＴＡＣＧＴＧｐ
ダブシルＣＣＡＧＴＣＴＡＣＴＴＴＴＡＣＴＡＴＧＣＡＣダブシル５’
（配列番号５６）
【０１７１】
６つのアッセイを行った。これらは、以下の添加剤および初期のアニーリング温度（最初の２０サイクル）であった。
反応１：添加剤なし、アニーリング温度：６５℃
反応２：添加剤ＥＰ０２０、アニーリング温度：６５℃
反応３：添加剤ＥＰ０２０、アニーリング温度：６０．７℃
反応４：添加剤ＥＰ０１３、アニーリング温度：６６．５℃
反応５：添加剤ＥＰ０１３、アニーリング温度：６４．２℃
反応６：添加剤ＥＰ０１３、アニーリング温度：６０．７℃
【０１７２】
図９は、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ熱サイクル数の関数としてプローブからの蛍光読み取りを表す。図９Ａは、反応１からの読み取りを示し、丸９１１は、第１標的の増幅の４つの反復における第１プローブからの読み取りであり、丸９１２は、第２標的の増幅の４つの反復における第２プローブからの読み取りである。図９Ｂは、反応２からの読み取りを示し、丸９１３は、第１標的の増幅の４つの反復における第１プローブからの読み取りであり、丸９１４は、第２標的の増幅の４つの反復における第２プローブからの読み取りである。図９Ｃは、反応３からの読み取りを示し、丸９１５は、第１標的の増幅の４つの反復における第１プローブからの読み取りであり、丸９１６は、第２標的の増幅の４つの反復における第２プローブからの読み取りである。図９Ｄは、反応４からの読み取りを示し、丸９１７は、第１標的の増幅の４つの反復における第１プローブからの読み取りであり、丸９１８は、第２標的の増幅の４つの反復における第２プローブからの読み取りである。図９Ｅは、反応５からの読み取りを示し、丸９１９は、第１標的の増幅の４つの反復における第１プローブからの読み取りであり、丸９２０は、第２標的の増幅の４つの反復における第２プローブからの読み取りである。図９Ｆは、反応６からの読み取りを示し、丸９２１は、第１標的の増幅の４つの反復における第１プローブからの読み取りであり、丸９２２は、第２標的の増幅の４つの反復における第２プローブからの読み取りである。
実施例６．５’エキソヌクレアーゼ活性の阻害を評価するためのプライマーに依存しない温度変動アッセイ
【０１７３】
ＴａｑおよびＴｆｉ（＋）を含む多くのＤＮＡポリメラーゼは、その標的鎖とハイブリッド形成する、オリゴヌクレオチドプローブの５’端上の蛍光的に標識されたヌクレオチドを切断する能力を有する。この５’エキソヌクレアーゼ切断は、上流プライマーの伸長の不在下の、等温条件下でも生じる。したがって、標準５’ヌクレアーゼ増幅反応で起こるプライマー依存切断とは対照的に、プライマーに依存しない切断である。プライマーに依存しない依存５’エキソヌクレアーゼ切断の比率は、プローブ／標的ハイブリッドのＴｍ以上および以下の限定的な温度範囲を超えて、反応混合物の温度を変動することにより増加することができる。
【０１７４】
周期的変動反応は、１Ｘ  ＰＣＲ緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００ｎＭ  ｄＮＴＰ、１．２５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、５’ＦＡＭおよび３’Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ１（ＢＨＱ１）を有する２００ｎＭのプローブ、ならびに１００ｎＭの相補的４１ヌクレオチド標的から成る２５μｌ容量で実施された。本反応混合物は、任意の添加剤を用いて、および用いずに、ならびに３００ｎＭの濃度の、以下に特定されるそれぞれの添加剤を用いて使用された。反応混合物中に唯一のオリゴヌクレオチドとしてのプローブを用いて、対照反応を行った。添加剤は、ステムループ構造を形成する（ステムを形成する相補的ヌクレオチドは、下線付きである）一本鎖添加剤であるＰＳ０６０、ならびに二本鎖添加剤を含んだ。反応混合物は、以下の熱プロファイルを使用して変動させた：４５サイクルにおいては、４５℃／２０ｓ、６０℃／１０ｓ、その後、３０サイクルにおいては、１℃ずつ上昇しながら、４５℃／３０秒で融解開始。熱プロファイルの４５℃／１０ｓ区域中、ＦＡＭ蛍光を取得した。プローブ、標的、および添加剤の配列は、
プローブ  ５’ＦＡＭ  ＣＣＡＴＧＡＴＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣ  ＢＨＱ１（配列番号５７）
標的      ５’ＡＣＴＴＡＧＴＡＡＴＴＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＴＡＴＣＡＴＧＧＣＡＣＴＴＡＧＡＡＣＣＴ
（配列番号５８）
添加剤ＥＰ００１．  ５’ダブシルＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡダブシル
ダブシルＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴダブシル５’
（配列番号２３）
添加剤ＥＰ００４．  ５’ダブシルＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡｐ
ダブシルＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴダブシル５’
（配列番号２６）
添加剤ＥＰ００８．  ５’ダブシルＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡｐ
ｐＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴダブシル５’
（配列番号３０）
添加剤ＥＰ００９．  ５’ＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡダブシル
ダブシルＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴ５’
（配列番号３１）
添加剤ＰＳ０６０．  ５’ＣＧＣＧＧＣＧＴＣＡＧＧＣＡＴＡＴＡＧＧＡＴＡＣＣＧＧＧＡＣＡＧＡＣ
ＧＣＣＧＣＧ（配列番号５９）
である。
【０１７５】
エキソヌクレアーゼ切断活性は、プローブからプローブのフルオロフォアを単離し、これによって、蛍光（ＦＡＭ）の増加をもたらす。結果を図１０に報告する。図１０において、プローブのみの反応の曲線１０１は、標的の不在下において、プローブは切断されないことを示す。プローブおよび標的を含むが、添加剤を含まない反応の曲線１０２は、最も高いプローブ切断を示す。ＰＳ０６０の曲線１０３は、添加剤の曲線、つまり、ＥＰ００９の曲線１０４；ＥＰ００４およびＥＰ００８において同じ曲線である曲線１０５；およびＥＰ００１の曲線１０６より高いプローブ切断を示す。
実施例７．ＰＣＲ中の５’エキソヌクレアーゼ活性の阻害
【０１７６】
実施例５に記載されるように、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅後、第１標的用の検出プローブは、１分間、５０℃で、その相補的増幅産物とハイブリッド形成された。プローブ−標的ハイブリッドは、次いで、プローブがアンプリコンから融解されると、５０℃から８０℃の間で、それぞれ３０秒の１℃間隔でプローブ蛍光強度を監視することにより、融解曲線分析を受けた。プローブのみを含む、テンプレートなし対照も、融解レジメンを受けた（フルオロフォアからの蛍光強度は温度依存性であるため、蛍光は、プローブ切断の不在下で、温度とともに僅かに増加する）。２つの試料は、融解を受けた：１つは添加剤を含まず、もう１つは、６００ｎＭ濃度の添加剤ＥＰ０１３（配列番号４７）を含んだ。
【０１７７】
結果を図１１Ａおよび１１Ｂに示す。図１１Ａにおいて、曲線１１１は、プローブ単独についてであり、曲線１１２は、添加剤を含まない反応の増幅産物についてである。図１１Ｂにおいて、曲線１１３は、プローブ単独についてであり、曲線１１４は、添加剤ＥＰ０１３を含む増幅産物についてである。プライマー依存Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ５’エキソヌクレアーゼ活性の阻害は、融解が完了した時に、プローブのみを含む対照試料の蛍光シグナルと一致する増幅標的を溶融したプローブからの蛍光シグナルにより明白となった。
実施例８．大規模な多重反応
【０１７８】
それぞれがヒトミトコンドリアゲノムの遺伝子内の異なる配列用である１２のプライマー組を、１２の異なる標的配列の多重増幅のために、単一の多重増幅混合物の中に混合した。２５μｌの反応混合物は、添加剤なし、３００ｎＭ濃度の添加剤ＥＰ０１１、または６００ｎＭ濃度の添加剤ＥＰ０１１のいずれかとともに、１ｘＰＣＲ緩衝剤、４００ｎＭ  ｄＮＴＰ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２４ｘＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ、５０ｎＭの制限プライマー、１０００ｎＭの過剰プライマー、および３．７５ユニットのＴｆｉ（−）ＤＮＡポリメラーゼを含んだ。
【０１７９】
反応混合物は、以下のＬＡＴＥ−ＰＣＲ熱サイクルプロトコルを受けた：３分間、９５℃、その後、９５℃／５ｓ、５８℃／２０ｓ、および６８℃／２ｍの６５サイクル、その後、９５℃まで３０ｓ間隔で１℃ずつ上昇しながら４５℃で融解開始。二本鎖ＤＮＡ産物のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ蛍光（−ｄＦ／ｄＴ，ＳＹＢＲ）の第１導関数を使用して、融解曲線分析により、６５サイクルの終わりで反応を分析した。加えて、反応について、二本鎖産物の産生動態（熱サイクルの関数としてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ強度読み取り）を分析した。
【０１８０】
添加剤ＥＰ０１１の配列、１２の標的の配列、およびそれぞれを増幅するために使用されたプライマーは、以下の通りである。
添加剤ＥＰ０１１．５’ダブシルＧＧＴＣＡＧＡＴＧＡＡＡＡＴＧＡＴＡＣＧＴＧダブシル
ｐＣＣＡＧＴＣＴＡＣＴＴＴＴＡＣＴＡＴＧＣＡＣダブシル５’
（配列番号６０）
標的ＨＶ１．５’ＧＣＣＣＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＧＡＧＴＡＧＣＡＣＴＣＴＴＧＴＧＣＧＧＧＡＴＡＴＴＧＡ
ＴＴＴＣＡＣＧＧＡＧＧＡＴＧＧＴＧＧＴＣＡＡＧＧＧＡＣＣＣＣＴＡＴＣＴＧＡＧＧＧＧ
ＧＧＴＣＡＴＣＣＡＴＧＧＧＧＡＣＧＡＧＡＡＧＧＧＡＴＴＴＧＡＣＴＧＴＡＡＴ  ＧＴＧＣ
ＴＡＴＧＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＴＴＴＡＴＧＴＡＣＴＡＴＧＴＡＣＴＧＴＴＡＡＧＧＧ
ＴＧＧＧＴＡＧＧＴＴＴＧＴＴＧＧＴＡＴＣＣＴＡＧＴＧＧＧＴＧＡＧＧＧＧＴＧＧＣＴＴ
ＴＧＧＡＧＴＴＧＣＡＧＴＴＧＡＴＧＴＧＴＧＡＴＡＧＴＴＧＡＧＧＧＴＴＧＡＴＴＧＣＴ
ＧＴＡＣＴＴＧＣＴＴＧＴＡＡＧＣＡＴＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＴＴＴＴＧＡＴＧＴＧ  ＧＡＴ
ＴＧＧＧＴＴＴＴＴＡＴＧＴＡＣＴＡＣＡＧＧＴＧＧＴＣＡＡＧＴＡＴＴＴＡＴＧＧＴＡＣ
ＣＧＴＡＣＡＡＴＡＴＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣＴＧＧＣＡＧＴＡＡＴＧＴＡＣＧＡＡＡＴＡ
ＣＡＴＡＧＣＧＧＴＴＧＴＴＧＡＴＧＧＧＴＧＡＧＴＣＡＡＴＡＣＴＴＧＧＧＴＧＧＴＡＣ
ＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＴＴＣＣＣＣＡＴＧＡＡＡＧＡＡＣＡＧＡＧＡＡＴＡＧＴＴＴＡＡ
ＡＴＴＡＧＡＡＴＣＴＴＡＧＣＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴＡＡＴＧＧＴＧＧＡＧＴＴＡＡＡＧＡＣＴ
ＴＴＴＴＣＴＣＴＧＡＴＴＴＧＴＣＣＴＴＧＧＡＡＡＡＡＧＧＴＴＴＴＣＡＴＣＴＣＣＧＧＴ
ＴＴＡＣＡＡＧＡＣＴＧＧＴＧ（配列番号６１）
制限プライマー  ５’ＧＣＣＣＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＧＡＧＴＡＧＣＡＣＴＣＴＴＧ
（配列番号６２）
過剰プライマー  ５’ＣＡＣＣＡＧＴＣＴＴＧＴＡＡＡＣＣＧＧＡＧＡＴＧＡＡ
（配列番号６３）
標的ＨＶ２．  ５’ＡＣＡＧＧＴＣＴＡＴＣＡＣＣＣＴＡＴＴＡＡＣＣＡＣＴＣＡＣＧＧＧＡＧＣＴＣＴＣＣ
ＡＴＧＣＡＴＴＴＧＧＴＡＴＴＴＴＣＧＴＣＴＧＧＧＧＧＧＴＡＴＧＣＡＣＧＣＧＡＴＡＧＣ
ＡＴＴＧＣＧＡＧＡＣＧＣＴＧＧＡＧＣＣＧＧＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＧＴＣＧＣＡＧＴＡＴ
ＣＴＧＴＣＴＴＴＧＡＴＴＣＣＴＧＣＣＴＣＡＴＣＣＴＡＴＴＡＴＴＴＡＴＣＧＣＡＣＣＴＡ
ＣＧＴＴＣＡＡＴＡＴＴＡＣＡＧＧＣＧＡＡＣＡＴＡＣＴＴＡＣＴＡＡＡＧＴＧＴＧＴＴＡ
ＡＴＴＡＡＴＴＡＡＴＧＣＴＴＧＴＡＧＧＡＣＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＣＡＡＴＴＧＡＡＴ
ＧＴＣＴＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＴＴＴＣＣＡＣＡＣＡＧＡＣＡＴＣＡＴＡＡＣＡＡＡＡＡ
ＡＴＴＴＣＣＡＣＣＡＡＡＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＣＴＴＣＴＧＧＣＣＡＣＡＧＣＡ
ＣＴＴＡＡＡＣＡＣＡＴＣＴＣＴＧＣＣＡＡＡＣＣＣＣＡＡＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＣＣＣ
ＴＡＡＣＡＣＣＡＧＣＣＴＡＡＣＣＡＧＡＴＴＴＣＡＡＡＴＴＴＴＡＴＣＴＴＴＴＧＧＣＧ
ＧＴＡＴＧＣＡＣＴＴＴＴＡＡＣＡＧＴＣＡＣＣＣＣＣＣＡＡＣＴＡＡＣＡＣＡＴＴＡＴＴ
ＴＴＣＣＣＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＣＡＴＡＣＴＡＣＴＡＡＴＣＴＣＡＴＣＡＡＴＡＣＡＡＣ
ＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＣＣＴＡＣＣＣＡＧＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＣＧＣＴＧ
（配列番号６４）
制限プライマー  ５’ＡＧＣＧＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＣＴＧＧＧＴＡＧＧＡＴ
（配列番号６５）
過剰プライマー  ５’ＡＣＡＧＧＴＣＴＡＴＣＡＣＣＣＴＡＴＴＡＡＣＣＡＣＴＣＡ
（配列番号６６）
標的ＣＯ１−１．  ５’ＡＧＧＴＴＧＣＧＧＴＣＴＧＴＴＡＧＴＡＧＴＡＴＡＧＴＧＡＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴ
ＡＧＧＡＣＴＧＧＧＡＧＡＧＡＴＡＧＧＡＧＡＡＧＴＡＧＧＡＣＴＧＣＴＧＴＧＡＴＴ
ＡＧＧＡＣＧＧＡＴＣＡＧＡＣＧＡＡＧＡＧＧＧＧＣＧＴＴＴＧＧＴＡＴＴＧＧＧＴＴＡ
ＴＧＧＣＡＧＧＧＧＧＴＴＴＴＡＴＡＴＴＧＡＴＡＡＴＴＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＡＡＴＴＧ
ＡＴＧＧＣＣＣＣＴＡＡＧＡＴＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＣＴＧＣＴＡＧＧＴＧＴＡＡＧＧ
ＡＧＡＡＧＡＴＧＧＴＴＡＧＧＴＣＴＡＣＧＧＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＴＧＧＧＡＧＴ
ＡＧＴＴＣＣＣＴＧＣＴＡＡＧＧＧＡＧＧＧＴＡＧＡＣＴＧＴＴＣＡＡＣＣＴＧＴＴＣＣＴ
ＧＣＴＣＣＧＧＣＣＴＣＣＡＣＴＡＴＡＧＣＡＧＡＴＧＣＧＡＧＣＡＧＧＡＧＴＡＧＧ
ＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＴＡＡＧＡＧＴＣＡＧＡＡＧＣＴＴＡＴＧＴＴＧＴＴＴＡＴＧＣ
ＧＧＧＧＡＡＡＣＧＣＣＡＴＡＴＣＧＧＧＧＧＣＡＣＣＧＡＴＴＡＴＴＡＧＧＧＧＡＡＣ
ＴＡＧＴＣＡＧＴＴＧＣＣＡＡＡＧＣＣＴＣＣＧＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＧＴＡＴＴＡＣＴ
ＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＴＡＴＴＡＣＡＡＡＴＧＣＡＴＧＧＧＣＴＧＴＧＡＣＧＡＴＡＡ
ＣＧＴＴＧＴＡＧＡＴＧＴＧＧＴＣＧＴＴＡＣＣＴＡＧＡＡＧＧＴＴＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧ
ＣＣＣＡＧＣＴＣＧＧＣＴＣＧＡＡＴＡＡＧＧＡＧＧＣＴＴＡＧＡＧＣＴＧＴＧＣＣＴＡ
ＧＧＡＣＴＣＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＧＣＣＧＡＡＴＡＡＴＡＧＧＴＡＴＡＧＴＧＴＴＣＣＡ
ＡＴＧＴＣＴＴＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＡＧＡＧＡＡＴＡＧＴＣＡＡＣＧＧＴ
（配列番号６７）
制限プライマー  ５’ＡＧＧＴＴＧＣＧＧＴＣＴＧＴＴＡＧＴＡＧＴＡＴＡＧＴＧＡＴＧＣＣＡＧＣＡ  （配列番号６８）
過剰プライマー  ５’ＡＣＣＧＴＴＧＡＣＴＡＴＴＣＴＣＴＡＣＡＡＡＣＣＡＣＡ
（配列番号６９）
標的ＣＯ１−２．  ５’ＡＴＧＧＡＧＧＧＴＴＣＴＴＣＴＡＣＴＡＴＴＡＧＧＡＣＴＴＴＴＣＧＣＴＴＣＧＡＡＧ
ＣＧＡＡＧＧＣＴＴＣＴＣＡＡＡＴＣＡＴＧＡＡＡＡＴＴＡＴＴＡＡＴＡＴＴＡＣＴＧＣＴ
ＧＴＴＡＧＡＧＡＡＡＴＧＡＡＴＧＡＧＣＣＴＡＣＡＧＡＴＧＡＴＡＧＧＡＴＧＴＴＴＣ
ＡＴＧＴＧＧＴＧＴＡＴＧＣＡＴＣＧＧＧＧＴＡＧＴＣＣＧＡＧＴＡＡＣＧＴＣＧＧＧＧ
ＣＡＴＴＣＣＧＧＡＴＡＧＧＣＣＧＡＧＡＡＡＧＴＧＴＴＧＴＧＧＧＡＡＧＡＡＡＧＴＴ
ＡＧＡＴＴＴＡＣＧＣＣＧＡＴＧＡＡＴＡＴＧＡＴＡＧＴＧＡＡＡＴＧＧＡＴＴＴＴＧＧＣ
ＧＴＡＧＧＴＴＴＧＧＴＣＴＡＧＧＧＴＧＴＡＧＣＣＴＧＡＧＡＡＴＡＧＧＧＧＡＡＡＴＣ
ＡＧＴＧＡＡＴＧＡＡＧＣＣＴＣＣＴＡＴＧＡＴＧＧＣＡＡＡＴＡＣＡＧＣＴＣＣＴＡＴ
ＴＧＡＴＡＧＧＡＣＡＴＡＧＴＧＧＡＡＧＴＧＧＧＣＴＡＣＡＡＣＧＴＡＧＴＡＣＧＴＧ
ＴＣＧＴＧＴＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＣＴＡＧＴＧＡＴＧＡＧＴＴＴＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＴ
ＧＣＣＡＧＴＣＡＧＧＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＴＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＴＧＡＡＴＣＣ
ＴＡＧＧＧＣＴＣＡＧＡＧＣＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＴＣＡＴＴＴＣＡＴＡＴＴＧＣＴＴＣ
ＣＧＴＧＧＡＧＴＧＴＧＧＣＧＡＧＴＣＡＧＣＴＡＡＡＴＡＣＴＴＴＧＡＣＧＣＣＧＧＴ
ＧＧＧＧＡＴＡＧＣＧＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＡＧＣＧＧＡＧＧＴＧＡＡＡＴＡＴＧＣＴ
ＣＧＴＧＴＧＴＣＴＡＣＧＴＣＴＡＴＴＣＣＴＡＣＴＧＴＡＡＡＴＡＴＡＴＧＧＴＧＴＧＣ
ＴＣＡＣＡＣＧＡＴＡＡＡＣＣＣＴＡＧＧＡＡＧＣＣＡＡＴＴＧＡＴＡＴＣＡＴＡＧＣＴ
ＣＡＧＡＣＣＡＴＡＣＣＴＡＴＧＴＡＴＣＣＡＡＡＴＧＧＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＣＣＧＧＡ
ＧＴＡＧＴＡＡＧＴＴＡＣＡＡＴＡＴＧＧＧＡＧＡＴＴＡＴＴＣＣＧＡＡＧＣＣＴＧＧ
ＴＡＧＧＡＴ（配列番号７０）
制限プライマー    ５’ＡＴＧＧＡＧＧＧＴＴＣＴＴＣＴＡＣＴＡＴＴＡＧＧＡＣＴＴＴＴＣＧＣＴ
（配列番号７１）
過剰プライマー    ５’ＡＴＣＣＴＡＣＣＡＧＧＣＴＴＣＧＧＡＡＴＡＡＴＣＴＣ
（配列番号７２）
標的ＣＯ２．      ５’ＡＧＧＧＴＡＡＡＴＡＣＧＧＧＣＣＣＴＡＴＴＴＣＡＡＡＧＡＴＴＴＴＴＡＧＧＧＧ
ＡＡＴＴＡＡＴＴＣＴＡＧＧＡＣＧＡＴＧＧＧＣＡＴＧＡＡＡＣＴＧＴＧＧＴＴＴＧＣＴＣ
ＣＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＧＡＧＣＡＴＴＧＡＣＣＧＴＡＧＴＡＴＡＣＣＣＣＣＧＧＴＣＧ
ＴＧＴＡＧＣＧＧＴＧＡＡＡＧＴＧＧＴＴＴＧＧＴＴＴＡＧＡＣＧＴＣＣＧＧＧＡＡＴＴＧ
ＣＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＡＡＧＣＣＴＡＡＴＧＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣＴＣＡＴＧＡＧＴＧＣＡ
ＡＧＡＣＧＴＣＴＴＧＴＧＡＴＧＴＡＡＴＴＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＴＧＧＧＧＧＣＴＴＣＡ
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ＧＴＴＧＡＡＧＡＴＴＡＧＴＣＣＧＣＣＧＴＡＧＴＣＧＧＴＧＴＡＣＴＣＧＴＡＧＧＴＴＣ
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ＧＧＡＣＴＡＧＧＡＡＧＣＡＧＡＴＡＡＧＧＡ（配列番号７３）
制限プライマー    ５’ＡＧＧＧＴＡＡＡＴＡＣＧＧＧＣＣＣＴＡＴＴＴＣＡＡＡＧＡＴＴＴＴＴＡＧＧＧＧＡ  （配列番号７４）
過剰プライマー    ５’ＴＣＣＴＴＡＴＣＴＧＣＴＴＣＣＴＡＧＴＣＣＴＧＴＡＴＧＣ
（配列番号７５）
標的１２ｓｒＲＮＡ．  ５’ＣＣＴＣＴＡＡＡＴＣＡＣＣＡＣＧＡＴＣＡＡＡＡＧＧＡＡＣＡＡＧＣＡＴＣＡＡ
ＧＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＡＡＡＣＧＣＴＴＡＧＣＣＴＡＧＣＣＡ
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ＴＡＴＡＴＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＴＧＧＴＡＡＧＴＧＴ
ＡＣＴＧＧＡ（配列番号７６）
制限プライマー５’ＴＣＣＡＧＴＡＣＡＣＴＴＡＣＣＡＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴＧＴＣＴＣＣＴＣＴＡ  （配列番号７７）
過剰プライマー  ５’ＣＣＴＣＴＡＡＡＴＣＡＣＣＡＣＧＡＴＣＡＡＡＡＧＧＡＡＣ
（配列番号７８）
標的Ｃｙｔｂ−１．  ５’ＴＧＴＧＡＧＧＧＴＧＧＧＡＣＴＧＴＣＴＡＣＴＧＡＧＴＡＧＣＣＴＣＣＴＣＡＧＡＴ
ＴＣＡＴＴＧＡＡＣＴＡＧＧＴＣＴＧＴＣＣＣＡＡＴＧＴＡＴＧＧＧＡＴＧＧＣＧＧＡＴＡ
ＧＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡＡＴＴＡＣＴＧＴＧＧＣＣＣＣＴＣＡＧＡＡＴＧＡＴＡＴＴＴＧＧ
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ＴＧＡＴＧＴＧＧＧＣＧＡＴＴＧＡＴＧＡＡＡＡＧＧＣＧＧＴＴＧＡＧＧＣＧＴＣＴＧＧ
ＴＧＡＧＴＡＧＴＧＣＡＴＧＧＣＴＡＧＧＡＡＴＡＧＴＣＣＴＧＴＧＧＴＧＡＴＴＴＧＧ
ＡＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＧＧＣＧＣＣＡＡＧＧＡＧＴＧＡＧＣＣＧＡＡＧＴＴＴＣ
ＡＴＣＡＴＧＣＧＧＡ（配列番号７９）
制限プライマー  ５’ＴＧＴＧＡＧＧＧＴＧＧＧＡＣＴＧＴＣＴＡＣＴＧＡＧＴＡＧＣＣ
（配列番号８０）
過剰プライマー  ５’ＴＣＣＧＣＡＴＧＡＴＧＡＡＡＣＴＴＣＧＧＣＴＣ（配列番号８１）
標的Ｃｙｔｂ−２．  ５’ＡＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＴＡＴＴＣＴＴＧＣＡＣＧＡＡＡＣＧＧＧＡＴＣＡＡＡＣＡＡ
ＣＣＣＣＣＴＡＧＧＡＡＴＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＡＡＡＡＴＣＡＣＣＴＴＣＣ
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ＴＣＣＴＴＣＴＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＡＣＡＴＴＡＡＣＡＣＴＡＴＴＣＴＣＡＣＣＡＧＡＣ
ＣＴＣＣＴＡＧＧＣＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＡＴＴＡＴＡＣＣＣＴＡＧＣＣＡＡＣＣＣＣＴ
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ＧＡＧＧＣＧＴＣＣＴＴＧＣＣＣＴＡＴＴＡＣＴＡＴＣＣＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＡＧＣＡ
ＡＴＡＡＴＣＣＣＣＡＴＣＣＴＣＣＡＴＡＴＡＴＣＣＡＡＡＣＡＡＣＡＡＡＧＣＡＴＡＡＴ
ＡＴＴＴＣＧＣＣＣＡＣＴＡＡＧＣＣＡＡＴＣＡＣＴＴＴＡＴＴＧＡＣＴＣＣＴＡＧＣＣＧ
ＣＡＧＡＣＣＴＣＣＴＣＡＴＴＣＴＡＡＣＣＴＧＡＡＴＣＧ（配列番号８２）
制限プライマー  ５’ＣＧＡＴＴＣＡＧＧＴＴＡＧＡＡＴＧＡＧＧＡＧＧＴＣＴＧＣＧＧＣＴＡＧ  （配列番号８３）
過剰プライマー  ５’ＡＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＴＡＴＴＣＴＴＧＣＡＣＧＡ（配列番号８４）
標的ＮＤ１．  ５’ＣＡＴＡＡＧＡＡＣＡＧＧＧＡＧＧＴＴＡＧＡＡＧＴＡＧＧＧＴＣＴＴＧＧＴＧＡＣＡＡ
ＡＡＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＡＧＡＧＴＴＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＣＧＴＣＡＴＡＴＧＴ
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ＧＡＴＧＧＣＡＧＧＡＧＴＡＡＴＣＡＧＡＧＧＴＧＴＴＣＴＴＧＴＧＴＴＧＴＧＡＴＡＡ
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ＴＧＴＡＧＡＧＧＧＴＧＡＴＧＧＴＡＧＡＴＧＴＧＧＣＧＧＧＴＴＴＴＡＧＧＧＧ  （配列番号８５）
制限プライマー  ５’ＣＡＴＡＡＧＡＡＣＡＧＧＧＡＧＧＴＴＡＧＡＡＧＴＡＧＧＧＴＣＴＴＧＧＴ  （配列番号８６）
過剰プライマー  ５’ＣＣＣＣＴＡＡＡＡＣＣＣＧＣＣＡＣＡＴ（配列番号８７）
標的ＮＤ２．  ５’ＡＧＴＧＴＧＡＴＴＧＡＧＧＴＧＧＡＧＴＡＧＡＴＴＡＧＧＣＧＴＡＧＧＴＡＧＡＡ
ＧＴＡＧＡＧＧＴＴＡＡＧＧＡＧＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＣＴＡＴＧＡＴＧＧＴＧＧＧＧ
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ＧＴＴＡＧＣＴＴＧＴＴＴＣＡＧＧＴＧＣＧＡＧＡＴＡＧＴＡＧＴＡＧＧＧＴＣＧＴＧＧＴ
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ＧＣＧＣＴＧＴＧＡＴＧＡＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＡ（配列番号８８）
制限プライマー  ５’ＡＧＴＧＴＧＡＴＴＧＡＧＧＴＧＧＡＧＴＡＧＡＴＴＡＧＧＣＧＴＡＧＧＴ
ＡＧＡＡＧＴ（配列番号８９）
過剰プライマー  ５’ＴＧＣＡＧＧＣＡＣＡＣＴＣＡＴＣＡＣＡＧＣＧＣＴＡＡＧＣＴ
（配列番号９０）
標的ＮＤ４−１．  ５’ＡＡＣＡＣＡＡＣＣＡＣＣＣＡＣＡＧＣＣＴＡＡＴＴＡＴＴＡＧＣＡＴＣＡＴＣＣＣＴＣ
ＴＡＣＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＣＣＡＡＡＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＣＴＡＴＴＴＡＧＣＴＧＴＴ
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ＡＴＡＣＴＡＡＣＴＡＣＣＴＧＡＣＴＣＣＴＡＣＣＣＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＴＧＧＣＡＡＧ
ＣＣＡＡＣＧＣＣＡＣＴＴＡＴＣＣＡＧＴＧＡＡＣＣＡＣＴＡＴＣＡＣＧＡＡＡＡＡＡＡ
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ＡＴＡＡＣＡＴＴＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＧＡＡＣＴＡＡＴＣＡＴＡＴＴＴＴＡＴＡＴＣＴＴ
ＣＴＴＣＧＡＡＡＣＣＡＣＡＣＴＴＡＴＣＣＣＣＡＣＣＴＴＧＧＣＴＡＴＣＡＴＣＡＣＣＣ
ＧＡＴＧＡＧＧＣＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＡＡＣＧＣＣＴＧＡＡＣＧＣＡＧＧＣＡＣＡＴＡ
ＣＴＴＣＣＴＡＴＴＣＴＡＣＡＣＣＣＴＡＧＴＡＧＧＣＴＣＣＣＴＴＣＣＣＣＴＡＣＴＣＡＴ
ＣＧＣＡＣＴＡＡＴＴＴＡＣＡＣＴＣＡＣＡＡＣＡＣＣＣＴＡＧＧＣＴＣＡＣＴＡＡＡＣＡ
ＴＴＣＴＡＣＴＡＣＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＣＴＡＴＣＡＡ
ＡＣＴＣＣＴＧＡＧＣ（配列番号９１）
制限プライマー  ５’ＧＣＴＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＡＧＴＴＣＴＴＧＧＧＣＡＧＴＧＡＧＡＧ
（配列番号９２）
過剰プライマー５’ＡＡＣＡＣＡＡＣＣＡＣＣＣＡＣＡＧＣＣＴＡＡＴＴＡＴＴＡＧ
（配列番号９３）
標的ＮＤ４−２．  ５’ＧＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＧＴＧＡＧＣＣＣＣＡＴＴＧＴＧＴＴＧＴＧＧＴＡＡＡＴＡＴ
ＧＴＡＧＡＧＧＧＡＧＴＡＴＡＧＧＧＣＴＧＴＧＡＣＴＡＧＴＡＴＧＴＴＧＡＧＴＣＣＴ
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ＴＧＡＧＡＡＴＧＡＣＴＧＣＧＣＣＧＧＴＧＡＡＧＣＴＴＣＡＧＧＧＧＧＴＴＴＧＧＡＴ
ＧＡＧＡＡＴＧＧＣＴＧＴＴＡＣＴＡＣＧＡＧＧＧＣＴＡＴＧＴＧＧＣＴＧＡＴＴＧＡＡ
ＧＡＧＴＡＴＧＣＡＡＴＧＡＧＣＧＡＴＴＴＴＡＧＧＴＣＴＧＴＴＴＧＴＣＧＴＡＧＧＣＡ
ＧＡＴＧＧＡＧＣＴＴＧＴＴＡＴＡＡＴＴＡＴＧＣＣＴＣＡＴＡＧＧＧＡＴＡＧＴＡＣＡ
ＡＧＧＡＡＧＧＧＧＴＡＧ（配列番号９４）
制限プライマー  ５’ＧＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＧＴＧＡＧＣＣＣＣＡＴＴＧＴＧＴ
（配列番号９５）
過剰プライマー  ５’ＣＴＡＣＣＣＣＴＴＣＣＴＴＧＴＡＣＴＡＴＣＣＣＴＡＴＧＡＧ
（配列番号９６）
【０１８１】
その後、１ｕｌの負荷色素と混合した１μｌのＰＣＲ産物で充填した５％ポリアクリルアミドゲルを使用して、増幅した産物を分析した。４℃で、３０ボルトで、８時間、ゲルを走行させた。ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄを使用して、１０分間、ゲルを発達させた。ゲルの写真を図１２に示す。最初の列は、添加剤なしの反応である。２番目の列は、３００ｎＭ濃度の添加剤ＥＰ０１１を用いた反応である。３番目の列は、６００ｎＭ濃度の添加剤ＥＰ０１１を用いた反応である。図１２から分かるように、添加剤なしの反応は、予測される１２の産物一式を生成しない。列２から、３００ｎＭの添加剤ＥＰ０１１が、大半のミスプライミングを抑制したことが分かる（軽量産物の１バンドが、底部に認められる）。列３から、６００ｎＭ濃度の添加剤ＥＰ０１１が、全てのミスプライミングを抑制したことが分かる。
【０１８２】
６００ｎＭの添加剤ＥＰ０１１を含む反応物は、Ｄｉｌｕｔｅ−‘Ｎ’−Ｇｏ法として知られる配列決定試料調製を受けた。Ｒｉｃｅ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｍｏｎｏｐｌｅｘ／Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｌｉｎｅａｒ−Ａｆｔｅｒ−Ｔｈｅ−Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ＰＣＲ  Ａｓｓａｙ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  ＰｒｉｍｅＳａｆｅ  ａｎｄ  Ｄｉｌｕｔｅ−‘Ｎ’−Ｇｏ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ２：２４２９−２４３８を参照のこと。調製された試料は、１２のアリコートに分割され、各アリコートは、配列決定プライマーとして１２の制限プライマーの１つを利用して、ジデオキシ配列決定を受けた。配列決定の結果は、増幅反応が、各アンプリコンに十分な一本鎖ＤＮＡを生成し、Ｄｉｌｕｔｅ’Ｎ’Ｇｏジデオキシ配列決定プロトコルを介して、単一反応から１２の異なる制限プライマー鎖のそれぞれの配列決定を可能にしたことを例証した。
【０１８３】
上記の結果は、各反応に１０００コピーのミトコンドリアゲノムＤＮＡを使用して得られた。本実験のさらなる試料（結果は示さず）は、各反応が、１００または１０コピーのミトコンドリアゲノムＤＮＡしか含まない時、全１２の産物の完全な増幅が得られなかったことを例証した。これは、タイプ１およびタイプ３のミスプライミングが、標的の数の減少とともに増加するという事実と一致する。
【０１８４】
しかし、１００および１０コピーのミトコンドリアゲノムＤＮＡは、以下の調節を行った後、上記の多重反応でうまく増幅され得る：１）５０／６００／５５０ｎＭでの鎖の組み合わせでＥＰ０４３を使用する；２）８０−９０に増幅サイクル数を増加する；および３）実施例１４に従い、少なくとも２つのミスマッチのＡまたはＴをそれらの５’端へ追加することにより（下線付きによって示される）、以下の標的の制限プライマーを変更する。
標的ＨＶ１用：
制限プライマー  ５’ＴＡＡＡＧＣＣＣＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＧＡＧＴＡＧＣＡＣＴＣＴＴＧ
（配列番号９７）
標的ＨＶ２用：
制限プライマー  ５’ＡＡＡＧＣＧＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＣＴＧＧＧＴＡＧＧＡＴ
（配列番号９８）
標的ＣＯ１−１用：
制限プライマー  ５’ＡＡＡＧＧＴＴＧＣＧＧＴＣＴＧＴＴＡＧＴＡＧＴＡＴＡＧＴＧＡＴＧＣＣＡＧＣＡ  （配列番号９９）
標的ＣＯ１−２用：
制限プライマー  ５’ＡＡＡＴＧＧＡＧＧＧＴＴＣＴＴＣＴＡＣＴＡＴＴＡＧＧＡＣＴＴＴＴＣＧＣＴ  （配列番号１００）
標的ＣＯ２用：
制限プライマー  ５’ＴＡＡＧＧＧＴＡＡＡＴＡＣＧＧＧＣＣＣＴＡＴＴＴＣＡＡＡＧＡＴＴＴＴＴ
ＡＧＧＧＧＡ（配列番号１０１）
標的１２ｓｒＲＮＡ用：
制限プライマー  ５’ＡＡＴＣＣＡＧＴＡＣＡＣＴＴＡＣＣＡＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴＧＴＣＴＣＣＴＣＴＡ  （配列番号１０２）
標的Ｃｙｔｂ−１用：
制限プライマー  ５’ＡＡＴＧＴＧＡＧＧＧＴＧＧＧＡＣＴＧＴＣＴＡＣＴＧＡＧＴＡＧＣＣ
（配列番号１０３）
標的Ｃｙｔｂ−２用：
制限プライマー  ５’ＡＡＣＧＡＴＴＣＡＧＧＴＴＡＧＡＡＴＧＡＧＧＡＧＧＴＣＴＧＣＧＧＣＴＡＧ  （配列番号１０４）
標的ＮＤ１用：
限定：５’ＡＡＣＡＴＡＡＧＡＡＣＡＧＧＧＡＧＧＴＴＡＧＡＡＧＴＡＧＧＧＴＣＴＴＧＧＴ
（配列番号１０５）
標的ＮＤ２用：
制限プライマー  ５’ＡＡＡＧＴＧＴＧＡＴＴＧＡＧＧＴＧＧＡＧＴＡＧＡＴＴＡＧＧＣＧＴ
ＡＧＧＴＡＧＡＡＧＴ（配列番号１０６）
標的ＮＤ４−１用：
制限プライマー  ５’ＡＡＧＣＴＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＴＡＧＴＴＣＴＴＧＧＧＣＡＧＴＧＡＧＡＧ  （配列番号１０７）
標的ＮＤ４−２用：
制限プライマー  ５’ＴＡＧＴＧＧＴＧＧＧＴＧＡＧＴＧＡＧＣＣＣＣＡＴＴＧＴＧＴ
（配列番号１０８）
実施例９．タイプ１のミスプライミング抑制の直接的な定量的測定
【０１８５】
本実施例に報告されるアッセイは、タイプＩのミスプライミングならびにタイプＩのミスプライミングの抑制における添加剤および温態始動試薬の効果を測定するために開発された。本アッセイにおいて、アニーリングおよび伸長できる２つの重複するオリゴヌクレオチドが、長期間（１０分）、ＬＡＴＥ−ＰＣＲアニーリング温度以下の温度（５０℃）で、最初にインキュベーションされる。伸長が生じる場合、一対のＬＡＴＥ−ＰＣＲプライマーに対するプライミング部位が作製される、つまり、伸長した重複するヌクレオチドは、プライミング部位を含むが、オリゴヌクレオチド自体は、プライミング部位の相補体のみを含む。反応混合物は、その後、プライマー対を使用して、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅を受けた。これらの条件下において、検出可能なレベルの産物を生成するために必要なサイクルの数（過剰プライマー鎖に対するＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎまたはプローブのいずれかで観察された）は、いくつの伸長した（または完全長）鎖が、部分的に相補的なオリゴマーの初期の等温インキュベーション中に生成されたかに依存するであろう。これは、次いで、等温インキュベーション中にＤＮＡポリメラーゼがどれだけ活性であるかに依存するだろう。阻害剤を用いた反応の閾値サイクル（ＣＴ）を阻害剤なしの反応と比較することにより、初期の、等温伸長の抑制における阻害剤の効果の定量的測定値を得、これは、本アッセイにおいて、ミスプライミングの事象であると考えられる。最低のＣＴ値は、初期に存在する全てのオリゴマーが、初回の増幅前に完全に伸長される時に観察される。ＣＴ値が高くなるほど、ＤＮＡポリメラーゼの阻害が大きくなることが観察される。反応のそれぞれの組み合わせが混合された後と、５０℃での等温インキュベーション前、全ての反応は、それぞれ、約１００，０００コピーで添加された、重複オリゴヌクレオチド１および２を有した。
【０１８６】
以下のオリゴヌクレオチドを使用した。重複するオリゴヌクレオチドについて、プライミング部位に相補的な配列は、下線付きであり、重複する配列は、イタリック体である。
重複するオリゴヌクレオチド１：
５’ＴＴＧＣＡＣＧＡＧＡＧＣＣＡＧＣＴＣＧＴＣＡＧＧＴＡＧＴＣＡＣＣＡＧＴＡＣＡＧＴＣＣＧＣＴ
ＴＧＴＧＴＣＡＡＧＡＣＡＧＣＡＣＧ（配列番号１０９）
重複するオリゴヌクレオチド２
５’ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＣＡＧＴＧＣＡＣＴＣＧＴＣＡＣＴＣＡＣＴＡＡＣＣＧＣＴＡＴＴＣＧＡＧＴＴ
ＣＧＣＧＴＧＣＴＧＴＣＴＴＧＡＣＡＣＡＡＧＣＧＧＡＣＴＧＴ（配列番号１１０）
制限プライマー：５’ＴＴＧＣＡＣＧＡＧＡＧＣＣＡＧＣＴＣＧＴＣＡＧＧＴＡＧＴＣＡＣＣＡＧＴ
（配列番号１１１）
過剰プライマー：５’ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＣＡＧＴＧＣＡＣＴＣＧＴＣＡＣ（配列番号１１２）
添加剤ＥＰ０４６．  ５’ダブシルＧＧＡＧＣＡＧＡＣＴＡＧＣＡＣＴＧＡＧＧＴＡダブシル
ダブシルＣＣＴＣＧＴＣＴＧＡＴＣＧＴＧＡＣＴＣＣＡＴダブシル５’
（配列番号１１３）
添加剤ＥＰ０２０．  ５’ダブシルＧＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡダブシル
ダブシルＣＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴダブシル５’
（配列番号１２）
添加剤ＥＰ０２２．  ５’ダブシルＣＣＧＣＣＧＧＣダブシル
ダブシルＧＧＣＧＧＣＣＧダブシル５’
（配列番号１４）
【０１８７】
各反応は、２５μｌの反応で、３重で、実施された。各反応混合物は、１ＸＰＣＲ緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５０ｎＭ  ｄＮＴＰ、０．２４ＸＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、および１．２５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含んだ。１つの反応混合物はＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのみを含んだ。第２の反応混合物は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび６００ｎＭ濃度の添加剤ＥＰ０４６を含んだ。第３の反応混合物は、抗体を有する「温態始動」Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含んだ。第４の反応混合物は、抗体および６００ｎＭ濃度の添加剤ＥＰ０４６を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含んだ。反応成分のそれぞれの組み合わせが混合された後と、５０℃での等温インキュベーション前、全ての反応は、それぞれ、約１００，０００コピーで添加された、重複するオリゴヌクレオチド１および２を有した。
【０１８８】
これらの反応の熱プロファイル条件は、以下の通りである：１０分間、５０℃、その後、プライマーを添加するのに十分長い間、氷上でインキュベーション、その後、９８℃に急速加熱、その後、９８℃／１０ｓおよび７２℃／４０ｓで６０サイクル。重複するオリゴヌクレオチドによって形成されたハイブリッドの融解温度は、約６０℃、つまり、初期の１０分のインキュベーションの温度よりはるかに上であった。２ステップＰＣＲプロトコルのアニーリング／伸長温度は、制限プライマーおよび過剰プライマーの濃度調節融解温度より低く、これは、それぞれ、７５．１℃および７３．６℃であり、実施例１に示される方法に従い計算された。試料のそれぞれは、リアルタイムで、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ蛍光により分析され、操作の終わりに、反応が、増幅反応の二本鎖産物について予測される８８℃の単一産物ピークを生成したことを確認するために、それぞれ、融解曲線分析を受けた（図示せず）。
【０１８９】
増幅サイクルの関数としてのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ蛍光を図１３に示すが、ここで、丸１３１は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのみを有する試料からの反復を特定し、丸１３２は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび添加剤ＥＰ０４６を有する試料からの反復を特定し、丸１３３は、抗体付加Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを有する試料からの反復を特定し、丸１３４は、抗体付加Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび添加剤ＥＰ０４６を有する試料からの反復を特定する。
実施例１０．ミスプライミングおよび「冷却停止」検出
【０１９０】
ある低温操作を実施するために、ＰＣＲ増幅を中断することが可能であるかを決定する。そうすることについてのミスプライミングの作用を決定する必要がある。我々は、その目的のために、本実施例に報告されるアッセイを開発した。アッセイは、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅アッセイであり、我々は、以下の標的鎖、プライマー、およびハイブリッド形成プローブ（一端をフルオロフォアＱｕａｓａｒ６７０（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）で、もう一端をクエンチャーＢＨＱ２（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）で標識した）を利用した。
制限プライマー  ５’ＣＴＣＣＡＧＣＣＣＧＧＣＡＣＧＣＴＣＡＣＧＴＧＡＣＡＧＡＣＣＧ
（配列番号１１４）
過剰プライマー  ５’ＣＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＣＧＡＴＣＡＡＧＧＡＧ
（配列番号１１５）
プローブ  ５’Ｑｕａｓａｒ６７０  ＧＣＧＧＧＴＴＧＴＴＣＴＧＧＴＣＣＡＴＧＡ  ＢＨＱ２  （配列番号１１６）
標的  ５’ＣＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＣＧＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＡＧＣＣＡ
ＧＣＴＧＡＧＣＣＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＣＣＣＧＣＴＧＴＣＧＧＧＧ
ＴＴＧＡＣＣＣＡＣＡＡＧＣＧＣＣＧＡＣＴＧＴＣＧＧＣＧＣＴＧＧＧＧＣＣＣＧＧＣＧ
ＧＴＣＴＧＴＣＡＣＧＴＧＡＧＣＧＴＧＣＣＧＧＧＣＴＧＧＡＧ（配列番号１１７）
【０１９１】
反応混合物は、１ＸＰＣＲ緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００ｎＭ  ｄＮＴＰ、５０ｎＭの制限プライマー、１０００ｎＭの過剰プライマー、２００ｎＭのプローブ、１．２５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、および試験される添加剤、この場合、６００ｎＭの添加剤ＥＰ０１０を含んだ。加えて、各反応は、１０００万コピーのヒトゲノムＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含んだ。試験された添加剤の配列は、
添加剤ＥＰ０１０．  ５’ダブシルＧＧＴＣＡＧＡＴＧＡＡＡＡＴＧＡＴＡＣＧＴＧダブシル
ダブシルＣＣＡＧＴＣＴＡＣＴＴＴＴＡＣＴＡＴＧＣＡＣダブシル５’
（配列番号１０）であった。
【０１９２】
中断されないプロトコルが、感度が高く、堅固であることを確立するために、反応混合物に含まれる試験添加剤を用いるが、いかなる熱サイクルのプロトコルの中断なしに、３つの対照アッセイを最初に実施した。増幅反応混合物に１０００、１００、および１０コピーの標的鎖を用いて、対照アッセイを開始した。熱サイクルレジメンは、３分間、９８℃、その後、６０℃で蛍光読み取りを行う、９８℃／１０ｓ７５℃／４０ｓ、６０℃／３０ｓの７０サイクルであった。図１４Ａは、ＰＣＲサイクル数の関数としてのプローブからの蛍光読み取りを表し、丸１４１は、１０００コピーの標的を有する試料の４つの反復増幅からの読み取りであり、丸１４２（点線）は、１００コピーの標的を有する試料の反復からの読み取りであり、丸１４３は、１０コピーの標的を有する試料の反復からである。
【０１９３】
個別の反応混合物は、中断された熱サイクルプロトコルを受けた。熱プロファイルは、９８℃で１分間、その後、９８℃／１０ｓ、７５℃／４０ｓの４０サイクル、その後、４０ステップにおいて、融解が４５℃で開始し、３０秒毎に１℃のステップで増加し（各ステップにおいてデータ取得）、その後、融解が繰り返される終結で、さらに９８℃／１０ｓ、７５℃／４０ｓの３０サイクルであった。
【０１９４】
２つの融解からの結果を図１４Ｂおよび図１４Ｃに示す。これらの図は、各温度での蛍光値が、プローブが一本鎖に結合しない温度である７５℃での蛍光値で割られることにより基準化される、融解曲線を表す。基準化された融解は、増幅の終結後（図１４Ｃ）、４０増幅サイクル後（図１４Ｂ）および７０サイクル後に決定された。図１４Ｂにおいて、丸１４４は、１０００コピーの標的についての反復であり、丸１４５は、１００コピーの標的を有する試料の反復であり、丸１４６は、１０コピーの標的を有する試料の反復である。同様に、図１４Ｃにおいて、丸１４７（黒い実線）は、１０００コピーの標的を有する試料の３つの反復増幅であり、丸１４８（点線）は、１００コピーの標的を有する試料の反復であり、丸１４９（灰色の実線）は、１０コピーの標的を有する試料の反復である。
実施例１１．対称ＰＣＲ反応におけるタイプＩＩのミスプライミング
【０１９５】
従来の対称ＰＣＲ、対立遺伝子識別プライマーの特異性に対する添加剤の作用を例証するために、以下のアッセイを実施した。１つのプライマーが、これらのＤＮＡがＤＮＡを標的とするもの（「一致する標的」と称する）に対して特異的である（対立遺伝子特異的プライマー）プライマー対を使用して、添加剤ＥＰ０４３（配列番号４５）の存在下、または不在下の対称ＰＣＲ条件下で、並行して、単一ヌクレオチド位置で異なる等濃度の２つのＤＮＡ標的配列を増幅した。文献（Ｎｅｗｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｙ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＤＮＡ．Ｔｈｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＡＲＭＳ）．１９８９，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２５０３−２５１６）に提案されるように、一致する標的の優先的増幅のための一対の対称ＰＣＲプライマーは、プライマーの１つの３’端が、意図されるＤＮＡ標的に固有のヌクレオチドに相補的であり、最後から２番目の３’端位置が、意図される、および意図されないＤＮＡ標的の両方に不一致であるように構築された。したがって、意図される標的に特異的なプライマーは、意図されるＤＮＡ標的にその３’端で１回のみ不一致であるが、ミスマッチ標的にその３’端で２回不一致である。本プライマー設計は、一致する標的の優先的増幅をもたらす。本実験前に、標的ゲノム濃度の差におけるデータを基準化するために、一致する、およびミスマッチの標的を含むゲノムＤＮＡ試料を、両方の標的に完全に相補的であるプライマーを用いて定量化した。この場合、ミスマッチの標的のＣＴは、一致する標的のＣＴより１．５２低く、したがって、対立遺伝子特異的プライマーを使用するアッセイにおいて、ミスマッチの標的のＣＴのあらゆる記載される遅延は、標的濃度差を説明するために、観察されたrＣＴに１．５２を足すことにより修正されなければならなかった。
【０１９６】
優先的増幅の標的およびプライマーの配列、ならびに添加剤の配列は、
対立遺伝子特異的プライマー  ５’ＴＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣＧＣＣＴＴ  （配列番号１１８）
共通プライマー  ５’ＧＴＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴＡＧＴＧＴＡＴＴＡＡＣＣ  （配列番号１１９）
一致する標的  ５’ＧＴＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴＡＧＴＧＴＡＴＴＡＡＣＣＴＴＡＴＧＴＧＴ
ＧＡＣＡＴＧＴＴＣＴＡＡＴＡＴＡＧＴＣＡＣＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡ
ＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴ
ＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＡ
（配列番号１２０）
ミスマッチ標的  ５’ＧＴＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴＡＧＴＧＴＡＴＴＡＡＣＣＴＴＡＴＧＴ
ＧＴＧＡＣＡＴＧＴＴＣＴＡＡＴＡＴＡＧＴＣＡＣＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＴＴＴＴＴ
ＡＴＴＡＴＡＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴ
ＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧＣ
ＣＴＴＧＡＣＧＡＴＡ（配列番号１２１）
添加剤ＥＰ０４３．  ５’ＧＧＡＧＣＡＧＡＣＴＡＧＣＡＣＴＧＡＧＧＴＡダブシル
ダブシルＣＣＴＣＧＴＣＴＧＡＴＣＧＴＧＡＣＴＣＣＡＴダブシル５’
５’ダブシルＡＧＡＣＴＡＧＣＡＣＴＧＡＧＧＴＡダブシル
（配列番号４８）
であった。
【０１９７】
対称ＰＣＲ増幅を、１ＸプラチナＴａｑ緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１ｕＭのプライマー対、０．２４Ｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１ユニットのプラチナＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、および２５μｌの最終反応容量で、一致する、またはミスマッチの標的配列のいずれかを含む１０００ゲノム等量のヒトＤＮＡで実施した。反応混合物は、添加剤なしか、または１００ｎＭ濃度の上部鎖、３００ｎＭ濃度の中央鎖、および２００ｎＭ濃度の底部鎖を有する３００ｎＭの全濃度の添加剤ＥＰ０４３を含むかのいずれかであった。
【０１９８】
増幅条件は、５分間、９４℃、その後、７２℃ステップでのデータ取得を伴う９４℃／１分（ｍ）、６４℃／１分、７２℃／１分の６０サイクル、および７２℃／１０ｍの最終伸長ステップであった。増幅は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＩＱ−５多色リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で実施された。
【０１９９】
ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎリアルタイム蛍光シグナルから、添加剤を含まないアッセイにおいて、ミスマッチの標的からのシグナルは、一致する標的からのシグナルと比較して遅かったと判断され、７．８４の修正されたrＣＴをもたらした。同様に、３００ｎＭ濃度の全濃度の添加剤ＥＰ０４３を含むアッセイにおいて、ミスマッチの標的からのシグナルは、一致する標的からのシグナルと比較してさらに遅く、１２．５９の修正されたrＣＴをもたらした。したがって、ＥＰ０４３の存在による増加したポリメラーゼ特異性は、４．７５サイクルであった。
実施例１２．Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ活性の阻害および制限プライマー３’端のＡＴ含量
【０２００】
その３’端で制限プライマーＧＣ豊富、およびその３’端で制限プライマーＡＴ豊富を利用するＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイを、本明細書に記載される添加剤の存在により生じる遅延について比較した。４つの増幅反応を実施した：１つは、ＧＣ豊富３’端を有するプライマーを使用するが添加剤なし、第２は、同じプライマーと添加剤ＥＰ０１３とを使用し、第３は、ＡＴ豊富３’端を有するプライマーを使用するが添加剤なし、第４は、同じプライマーと添加剤ＥＰ０１３とを使用する。
【０２０１】
各２５μｌ増幅反応混合物は、１ＸプラチナＴａｑ緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５０ｎＭ  ｄＮＴＰ、１．２５ユニットのプラチナＴａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１０００ゲノム等量のヒトＤＮＡ、１０００ｎＭ濃度の過剰プライマー、５０ｎＭ濃度の制限プライマー、および５００ｎＭ濃度の検出プローブを含んだ。添加剤ＥＰ０１３（配列番号４７）を含んだ２つのアッセイにおいては、６００ｎＭ濃度で反応混合物に含まれた。
【０２０２】
熱サイクルレジメンは、２０サイクルについては、１０秒間９５℃、１０秒間６６．５℃、および１０秒間７２℃、その後、１０秒間９５℃、１０秒間６５℃、１０秒間７２℃、および５４℃で２０秒間の蛍光シグナル検出の５０サイクルであった。その標的に結合された時の各プローブからの蛍光検出は、ＰＣＲサイクルのアニーリング段階中に測定された。
【０２０３】
ＧＣ豊富３’端を有する限定プライマーを用いたアッセイで利用された標的、プライマー、およびプローブの配列は、
過剰プライマー  ５’ＧＣＡＣＡＧＴＴＡＣＡＧＴＡＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＣＴＣＡ
（配列番号１２２）
制限プライマー  ５’ＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＴＡＧＴＧＧＴＧＧＣ
（配列番号１２３）
ＧＣ豊富プライマーの標的  ５’ＧＣＡＣＡＧＴＴＡＣＡＧＴＡＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＣＴＣＡＡＡＴ
ＡＣＡＡＧＡＡＣＣＴＡＣＴＧＣＴＡＡＴＧＣＣＡＣＣＡＣＴＡＣ
ＣＡＣＴＧＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡ（配列番号１２４）
検出プローブ  ５’ＢＨＱ−２ＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＴＡＧＡ  Ｑｕａｓａｒ６７０
（配列番号１２５）
であった。
【０２０４】
ＡＴ豊富３’端を有する限定プライマーを用いたアッセイで利用された標的、プライマー、およびプローブの配列は、
過剰プライマー  ５’ＣＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＧＡＧＧＴＧＡＧＣ
（配列番号１２６）
制限プライマー  ５’ＧＧＴＧＣＧＴＧＧＧＴＣＣＣＡＧＴＣＴＧＣＡＧＴＴＡＡＧ
（配列番号１２７）
ＡＴ豊富プライマーの標的  ５’ＧＧＴＧＣＧＴＧＧＧＴＣＣＣＡＧＴＣＴＧＣＡＧＴＴＡＡＧＧＧ
ＧＧＣＡＧＧＡＧＴＧＧＣＧＣＴＧＣＴＣＡＣＣＴＣＴＧＧ
ＴＧＣＣＡＡＡＧ（配列番号１２８）
検出プローブ  ５’ＢＨＱ−２ＧＣＡＧＧＡＧＴＧＧＣＧＣＴ  Ｑｕａｓａｒ６７０
（配列番号１２９）
であった。
【０２０５】
添加剤ＥＰ０１３の配列は、以下の通りであった。
添加剤ＥＰ０１３．  ５’ダブシルＧＧＴＣＡＧＡＴＧＡＡＡＡＴＧＡＴＡＣＧＴＧｐ
ダブシルＣＣＡＧＴＣＴＡＣＴＴＴＴＡＣＴＡＴＧＣＡＣダブシル５’
（配列番号５６）
【０２０６】
ＧＣ豊富３’端を有する制限プライマーを使用するアッセイにおいて、添加剤ＥＰ０１３の６００ｎＭ濃度の反応混合物への添加は、添加剤なしの増幅と比較して、閾値サイクル（ＣＴ）に４サイクルの遅延をもたらした。ＡＴ豊富３’端を有する制限プライマーを使用するアッセイにおいて、添加剤ＥＰ０１３の６００ｎＭ濃度の反応混合物への添加は、１１サイクルのＣＴ遅延をもたらした。
実施例１３．プライマーの５’端の修飾およびタイプＩＩＩのミスプライミング
【０２０７】
我々は、さらなるヌクレオチドを使用し、ＰＣＲ増幅プライマーの１つの５’端上に非相補的な尾を形成した。本実施例において、我々は、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅を使用し、我々は、制限プライマーを修飾した。我々は、修飾されたプライマーと未修飾のプライマーを比較し、完全結合３’端と部分的結合３’端とを区別した。ヒトミトコンドリアシトクロームｂ遺伝子（下線付き塩基として表示される）を増幅するために使用される制限プライマーの５’端に、２つのアデニンを添加した。我々は、２つの添加剤を試験し（添加剤ＥＰ０４７、標的、プライマー）、添加剤の配列は、以下の通りである。
標的Ｃｙｔｂ−１．  ５’ＴＧＴＧＡＧＧＧＴＧＧＧＡＣＴＧＴＣＴＡＣＴＧＡＧＴＡＧＣＣＴＣＣＴＣＡＧＡＴ
ＴＣＡＴＴＧＡＡＣＴＡＧＧＴＣＴＧＴＣＣＣＡＡＴＧＴＡＴＧＧＧＡＴＧＧＣＧＧＡＴＡ
ＧＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡＡＴＴＡＣＴＧＴＧＧＣＣＣＣＴＣＡＧＡＡＴＧＡＴＡＴＴＴＧＧ
ＣＣＴＣＡＣＧＧＧＡＧＧＡＣＡＴＡＧＣＣＴＡＴＧＡＡＧＧＣＴＧＴＴＧＣＴＡＴＡＧ
ＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＴＴＴＣＴＧＡ
ＧＴＡＧＡＧＡＡＡＴＧＡＴＣＣＧＴＡＡＴＡＴＡＧＧＣＣＴＣＧＣＣＣＧＡＴＧＴＧＴ
ＡＧＧＡＡＧＡＧＧＣＡＧＡＴＡＡＡＧＡＡＴＡＴＴＧＡＧＧＣＧＣＣＡＴＴＧＧＣＧ
ＴＧＡＡＧＧＴＡＧＣＧＧＡＴＧＡＴＴＣＡＧＣＣＡＴＡＡＴＴＴＡＣＧＴＣＴＣＧＡＧ
ＴＧＡＴＧＴＧＧＧＣＧＡＴＴＧＡＴＧＡＡＡＡＧＧＣＧＧＴＴＧＡＧＧＣＧＴＣＴＧＧ
ＴＧＡＧＴＡＧＴＧＣＡＴＧＧＣＴＡＧＧＡＡＴＡＧＴＣＣＴＧＴＧＧＴＧＡＴＴＴＧＧ
ＡＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＧＧＣＧＣＣＡＡＧＧＡＧＴＧＡＧＣＣＧＡＡＧＴＴＴＣ
ＡＴＣＡＴＧＣＧＧＡ（配列番号７９）
制限プライマー  ５’ＴＧＴＧＡＧＧＧＴＧＧＧＡＣＴＧＴＣＴＡＣＴＧＡＧＴＡＧＣＣ
（配列番号８０）
過剰プライマー  ５’ＴＣＣＧＣＡＴＧＡＴＧＡＡＡＣＴＴＣＧＧＣＴＣ（配列番号８１）
修飾された制限プライマー  ５’ＡＡＴＧＴＧＡＧＧＧＴＧＧＧＡＣＴＧＴＣＴＡＣＴＧＡＧＴＡＧＣＣ
（配列番号１３０）
添加剤ＥＰ０４７  ダブシルＣＣＴＣＧＴＣＴＧＡＴＣＧＴＧＡＣＴＣＣＡＴダブシル５’
５’ダブシルＡＧＡＣＴＡＧＣＡＣＴＧＡＧＧＴＡ
（配列番号１３１）
添加剤ＥＰ０４３．  ５’ＧＧＡＧＣＡＧＡＣＴＡＧＣＡＣＴＧＡＧＧＴＡダブシル
ダブシルＣＣＴＣＧＴＣＴＧＡＴＣＧＴＧＡＣＴＣＣＡＴダブシル５’
５’ダブシルＡＧＡＣＴＡＧＣＡＣＴＧＡＧＧＴＡダブシル
（配列番号４８）
【０２０８】
添加剤ＥＰ０４７は、２２ヌクレオチド長の鎖と、１７ヌクレオチド長である二本鎖領域を形成する１７ヌクレオチド長の鎖とを含み、４つの末端ダブシル修飾因子を有する。添加剤ＥＰ０４７のＴｍは、５９．１℃である。添加剤ＥＰ０４３は、添加剤の混合物である。構成要素の１つとして添加剤ＩＥＰ０４７（２つの底部鎖を含む）を含み、これは、５５０ｎＭの濃度で本試験に含まれる。混合物ＥＰ０４３も、上部２つ鎖として示される別の二本鎖オリゴヌクレオチドを含む。この２番目のオリゴマーは、２２ヌクレオチド長である２つの相補的鎖を含み、３つの末端ダブシル修飾因子を有する。それは、６７．４℃のＴｍを有し、５０ｎＭの濃度で本試験に含まれた。混合物中の２つの添加剤は、共通の鎖を共有するため、鎖濃度は、上部／中央／底部鎖において、５０／６００／５５０であった。
【０２０９】
ＬＡＴＥ−ＰＣＲ反応混合物は、２５μｌの容量で、１ｘＰＣＲ緩衝剤、２５０ｎＭ  ｄＮＴＰ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２４ｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ、５０ｎＭの制限プライマー、１０００ｎＭの過剰プライマー、１０００コピーのヒトミトコンドリアＤＮＡ、および抗体結合の５’エキソヌクレアーゼ（−）ポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣａｒｌｓｂａｄＣＡ）である２．５ユニットのＴＦｉ（−）ＤＮＡポリメラーゼを含んだ。反応混合物中に以下の添加剤および制限プライマーを用いて、６つのアッセイを実施した。
（１）添加剤なし、尾状でない制限プライマー（配列番号８０）
（２）添加剤なし、尾状制限プライマー（配列番号１３３）
（３）６００ｎＭ濃度の添加剤ＥＰ０４７、尾状でない制限プライマー
（４）６００ｎＭ濃度の添加剤ＥＰ０４７、尾状プライマー
（５）５０／６００／５５０の鎖濃度の３本鎖添加剤混合物ＥＰ０４３、尾状でないプライマー
（６）５０／６００／５５０の鎖濃度の３本鎖添加剤混合物ＥＰ０４３、尾状のプライマー
【０２１０】
６つの反応混合物を以下の条件で増幅した：３分間、９５℃、その後、９５℃／５ｓ、５８℃／２０ｓ、および６８℃／２ｍの６５サイクル。次いで、４５℃から開始し、９５℃まで、３０秒間隔で１℃ずつ上昇させながら、産物の融解分析を実施した。ＰＣＲ増幅ならびに融解分析をＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを使用して監視した。
【０２１１】
添加剤なしの反応において、産物進化は、どの制限プライマーを使用しても、所望の産物のＴｍより高いＴｍを有する増幅をもたらした。反応混合物に添加剤ＥＰ０４７を含むと、数増幅サイクルで、検出可能な産物進化の開始を遅延し、増幅産物の一部に適切な産物を生じた。添加剤ＥＰ０４７に関して、より適切な産物は、尾状でないプライマーを使用して作製されるより、尾状のプライマーを使用して作製された。添加剤ＥＰ０４７は、５９．１℃のその未修飾鎖に基づく計算されたＴｍを有する。反応混合物に添加剤ＥＰ０４３を含むと、検出可能な産物進化の開始も遅延し、最も適切な産物の生成をもたらした。添加剤ＥＰ０４３では、より適切な産物は、尾状でないプライマーを使用して作製されるより、尾状のプライマーを使用して作製された。添加剤ＥＰ０４３は、６７．４℃および５９．１℃の未修飾鎖に基づく計算されたＴｍを有する混合物である。
【０２１２】
添加剤ＥＰ０４３、尾状制限プライマー、および尾状でない制限プライマーを用いた、６つの反復のリアルタイム動態曲線を１５Ａに示す。図１５Ａにおいて、丸１５１（灰色の線）は、尾状でないプライマーを用いた３つの反復の曲線を特定し、丸１５２（黒色の線）は、尾状のプライマーを用いた反復の曲線を特定する。添加剤ＥＰ０４３を用いた６つの増幅産物の融解曲線を図１５Ｂに示し、下方矢印は、適切な二本鎖ＤＮＡ産物の融解温度８６℃を示す。図１５Ｂにおいて、丸１５３は、図１５Ａの産物進化（平らな平坦域）のない適切なピークを示した、尾状でないプライマーを用いた１つの反復を特定し、丸１５４は、同じく、図１５Ａの産物進化（平らな平坦域）を示さなかった尾状のプライマーを用いた２つの反復を特定した。
実施例１４：ミスプライミングを抑制するためのプライマーとしての添加剤
【０２１３】
添加剤であるプライマーは、１本の鎖が伸長可能な３’端を有する増幅プライマーである、二本鎖オリゴヌクレオチドである。その５’端は、変更置換基を有する。我々が逆相補体配列として称するもう一方の鎖は、２つを有し、その３’端は、伸長不可能である。本実施例の増幅アッセイは、制限プライマーが非常に低濃度で反応混合物に含まれるＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイであるため、過剰プライマーのみが添加剤として使用される。遊離型３’端を有する鎖は、その標的鎖とハイブリッド形成し、そこに伸長する時に、増幅プライマーとして作用し、その修飾された相補的鎖とハイブリッド形成される時、ミスプライミングの阻害剤として作用する。本実施例において、プライマー−逆相補体配列添加剤は、３つの末端ダブシル修飾因子を有する。プライマー鎖は、修飾基、ここでは、ダブシル基のその５’末端ヌクレオチドへの共有結合により修飾される。逆相補体配列は、修飾基、ここでは、ダブシル基のその５’端および３’端のそれぞれへの共有結合により修飾される。プライマー鎖に対する逆相補体配列のＴｍは、その増幅標的配列に対するプライマー鎖のＴｍより５〜３０℃、好ましくは、１５〜２５℃低いように設計される。Ｔｍの差を達成するために、１つ以上のヌクレオチドでプライマー鎖を短くするか、またはミスマッチにするかにより、プライマー鎖に部分的な相補性を逆相補体配列に付与することができる。本実施例において、幾つかのミスマッチのヌクレオチドが含まれた。１対以上のプライマーを有する多重反応において、少なくとも１つのプライマーは、その対応する部分的に相補的逆相補体配列を有する添加剤に変換される。単一および多重反応の両方において、該少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの濃度は、反復反応間でばらつきが少ない、ミスプライミングの抑制を達成するように、経験的に滴定され、最適化される。典型的に、該最適濃度は、ミスプライミングを抑制するために同反応に添加されるプライマーではない、二本鎖添加剤のそれに近い。当業者に理解されるように、添加剤−プライマーを利用する反応は、プライマーではない添加剤でさらに補てんすることができるが、ただし、後者は、前者とクロスハイブリッド形成しないものとする。
【０２１４】
ＬＡＴＥ−ＰＣＲ反応は、以下の配列を使用して、３重で、実施された。
制限プライマー  ５’ＴＣＣＡＧＴＡＣＡＣＴＴＡＣＣＡＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴＧＴＣＴＣＣＴＣＴＡ
（配列番号１３２）
過剰プライマー  ５’ダブシルＡＧＴＴＣＡＣＣＣＴＣＴＡＡＡＴＣＡＣＣＡＣＧＡＴ
（配列番号１３３）
逆相補体配列
５’ダブシルＡＴＣＧＴＴＧＴＧＧＴＡＴＡＧＡＧＧＧＴＧＡＡＣＴ−ダブシル
（配列番号１３４）
標的５’ＡＧＴＴＣＡＣＣＣＴＣＴＡＡＡＴＣＡＣＣＡＣＧＡＴＣＡＡＡＡＧＧＡＡＣＡＡＧＣ
ＡＴＣＡＡＧＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＡＡＡＣＧＣＴＴＡＧＣＣＴＡＧＣＣＡ
ＣＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＧＴＧＡＴＴＡＡＣＣＴＴＴＡＧＣＡＡＴＡＡＡＣ
ＧＡＡＡＧＴＴＴＡＡＣＴＡＡＧＣＴＡＴＡＣＴＡＡＣＣＣＣＡＧＧＧＴＴＧＧＴＣＡＡＴＴＴＣＧ
ＴＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＧＣＧＧＴＣＡＣＡＣＧＡＴＴＡＡＣＣＣＡＡＧＴＣＡＡＴＡＧＡＡＧＣ
ＣＧＧＣＧＴＡＡＡＧＡＧＴＧＴＴＴＴＡＧＡＴＣＡＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＡＴＡＡＡＧＣＴＡ
ＡＡＡＣＴＣＡＣＣＴＧＡＧＴＴＧＴＡＡＡＡＡＡＣＴＣＣＡＧＴＴＧＡＣＡＣＡＡＡＡＴＡＧＡ
ＣＴＡＣＧＡＡＡＧＴＧＧＣＴＴＴＡＡＣＡＴＡＴＣＴＧＡＡＣＡＣＡＣＡＡＴＡＧＣＴＡＡＧＡ
ＣＣＣＡＡＡＣＴＧＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＣＡＣＴＡＴＧＣＴＴＡＧＣＣＣＴＡＡＡＣＣＴ
ＣＡＡＣＡＧＴＴＡＡＡＴＣＡＡＣＡＡＡＡＣＴＧＣＴＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＴＡＣＧＡＧＣ
ＣＡＣＡＧＣＴＴＡＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＣＣＴＧＧＣＧＧＴＧＣＴＴＣＡＴＡＴＣＣＣＴＣ
ＴＡＧＡＧＧＡＧＣＣＴＧＴＴＣＴＧＴＡＡＴＣＧＡＴＡＡＡＣＣＣＣＧＡＴＣＡＡＣＣＴＣＡＣ
ＣＡＣＣＴＣＴＴＧＣＴＣＡＧＣＣＴＡＴＡＴＡＣＣＧＣＣＡＴＣＴＴＣＡＧＣＡＡＡＣＣＣＴＧＡ
ＴＧＡＡＧＧＣＴＡＣＡＡＡＧＴＡＡＧＣＧＣＡＡＧＴＡＣＣＣＡＣＧＴＡＡＡＧＡＣＧＴＴＡＧ
ＧＴＣＡＡＧＧＴＧＴＡＧＣＣＣＡＴＧＡＧＧＴＧＧＣＡＡＧＡＡＡＴＧＧＧＣＴＡＣＡＴＴＴＴＣ
ＴＡＣＣＣＣＡＧＡＡＡＡＣＴＡＣＧＡＴＡＧＣＣＣＴＴＡＴＧＡＡＡＣＴＴＡＡＧＧＧＴＣＧＡ
ＡＧＧＴＧＧＡＴＴＴＡＧＣＡＧＴＡＡＡＣＴＡＡＧＡＧＴＡＧＡＧＴＧＣＴＴＡＧＴＴＧＡＡＣ
ＡＧＧＧＣＣＣＴＧＡＡＧＣＧＣＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＡＡＧＴ
ＡＴＡＣＴＴＣＡＡＡＧＧＡＣＡＴＴＴＡＡＣＴＡＡＡＡＣＣＣＣＴＡＣＧＣＡＴＴＴＡＴＡＴＡ
ＧＡＧＧＡＧＡＣＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＴＧＧＴＡＡＧＴＧＴＡＣＴＧＧ
（配列番号１３５）
【０２１５】
１ＸプラチナＴｆｉ（−）緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５０ｎＭ  ｄＮＴＰ、５０ｎＭの制限プライマー、１０００ｎＭの過剰プライマー、０．２４Ｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ヒトゲノムＤＮＡから約１０００ゲノムを有する２．５ユニットのプラチナＴｆｉ（−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から成る２５μｌ容量で、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅を実施した。添加剤を作製した逆相補体の濃度は、１００、２００、および３００ｎＭであった。この場合において、我々は、ミスマッチを逆相補体鎖に導入することによって（ミスマッチのヌクレオチドは下線付きである）、プライマー−標的ハイブリッドと比較して、プライマー−逆相補体ハイブリッドのＴｍを低くした。
【０２１６】
これらの反応の熱プロファイル条件は、以下の通りである：３分間、９５℃、その後、６０サイクルについては、９５℃／５ｓ−５８℃／２０ｓ−６８℃／２ｍ、その後、５１サイクルについては、１℃ずつ上昇させながら、４５℃／４５ｓで融解開始。全ての反応は、熱サイクルの伸長段階（６８℃）中に、リアルタイムで分析された。６０サイクルの終わりで、二本鎖ＤＮＡ産物のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ蛍光の第１導関数を使用して（融解曲線分析）、増幅産物を分析した。
【０２１７】
融解曲線を図１６Ａ〜１６Ｄに示す。図１６Ａは、逆相補体配列を有さない、３つの反復の融解曲線である。曲線１６１は、相補オリゴヌクレオチドの不在下において、３つの反復の１つのみが、８６℃の融解温度を有する予測された産物を生成した（矢印）ことを示す。図１６Ｂは、１００ｎＭ濃度の逆相補体配列を含んだ３つの反復の融解曲線である。曲線１６２は、３つの反応の２つが予測された産物を生成したことを示す。図１６Ｃおよび１６Ｄは、それぞれ、２００ｎＭおよび３００ｎＭの濃度の逆相補体配列を用いた反復の融解曲線である。曲線１６３および１６４は、各一連の反応での３つの反復の全てが、適切な産物を生成したことを示す（８６℃の融解ピークの存在により判断された）。
実施例１５：ＲＮＡ標的でのミスプライミング
【０２１８】
本実施例は、開始標的配列がＤＮＡではなくＲＮＡである一連のＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイを説明する、したがって、初期の反応混合物は逆転写酵素を含み、プロトコルは、ｃＤＮＡの増幅前に、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換するための初期のインキュベーションを含んだ。本シリーズで利用されたＲＮＡは、エンテロウイルスＲＮＡからの５’未翻訳領域（ＵＴＲ）の一部を含む、エンテロウイルス補強されたＲＮＡ（ＥＶ，Ａｓｕｒａｇｅｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡのカタログ＃４２０５０）内の配列であった。試料は、ＥＶおよび口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）の両方のプライマー対を含んだが、ＦＭＤＶ標的は本実施例において含まれなかった。増幅反応は、フルオロフォア（Ｃａｌ  Ｒｅｄ  ６１０）およびクエンチャー（Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  Ｎｏ．２）を有する分子指標プローブの使用により、リアルタイムで追跡された。全反応の全セットは、３重で行われ、産物は、エンドポイントで、融解曲線分析を介して分析された。
【０２１９】
混合物を含む幾つかの添加剤を、添加剤なし対照と比較した。ＥＶプライマー、ＥＶプローブ、および添加剤の配列は、以下の通りである。
ＥＶ制限プライマー  ５’ＧＡＣＴＴＧＣＧＣＧＴＴＡＣＧＡＣＡＧＧＣＣＡＡＴＣ
（配列番号１３６）
ＥＶ過剰プライマー  ５’ＴＧＡＡＴＧＣＧＧＣＴＡＡＴＣＣＣＡＡＣ（配列番号１３７）
ＥＶプローブ        ５’Ｃａｌ  Ｒｅｄ  ６１０−ＡＡＣＣＡＣＣＴＧＣＣＣＣＴＴ−ＢＨＱ２
（配列番号１３８）
添加剤ＥＰ０２０．  ５’ダブシルＧＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡダブシル
ダブシルＣＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴダブシル５’
（配列番号１２）
添加剤ＥＰ０１０．  ５’ダブシルＧＧＴＣＡＧＡＴＧＡＡＡＡＴＧＡＴＡＣＧＴＧダブシル
ダブシルＣＣＡＧＴＣＴＡＣＴＴＴＴＡＣＴＡＴＧＣＡＣダブシル５’
（配列番号１０）
添加剤ＥＰ００３．  ５’ＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡダブシル
ダブシルＣＣＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＴダブシル５’
（配列番号２５）
【０２２０】
ＥＶ補強されたＲＮＡを１０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８．３で、μｌ当り約２５，０００粒子に希釈し、７５℃で３分間加熱し、外殻タンパク質を変性し、ＲＮＡを解放した。ＲＮＡ（試料当り２μｌ）を、濃縮プライマー（試料当り３μｌ）を含む溶液と混合し、５分間、室温でインキュベーションした後、濃縮試薬混合物を添加し、試料当り２５μｌの最終容量の以下の濃縮物を得た：３ｍＭの塩化マグネシウム、それぞれ４００ｎＭのデオキシヌクレオチド、それぞれ５００ｎＭのプローブ、それぞれ５０ｎＭの制限プライマー、それぞれ５００ｎＭの過剰プライマー、１ＸＴｆｉ（ｅｘｏ−）反応緩衝剤、試料当り２ユニットのＴｆｉ（ｅｘｏ−）ポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．６０６８４−０５０）、および試料当り１００ユニットのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１８０８０−０４４）。ＥＶ  ＲＮＡは、試料当り約５０，０００コピーであった。添加剤は、以下の濃度で含まれた。
反応Ａ−２０００ｎＭの添加剤ＥＰ０２０
反応Ｂ−２００ｎＭの添加剤ＥＰ０１０
反応Ｃ−４００ｎＭの添加剤ＥＰ００３
反応Ｄ−４００ｎＭの添加剤ＥＰ０１０および１０００ｎＭの添加剤ＥＰ０２０
反応Ｅ−４００ｎＭの添加剤ＥＰ００３および１０００ｎＭの添加剤ＥＰ０２０
反応Ｆ−添加剤なしの対照
【０２２１】
試料をＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＭＸ３００５Ｐ熱サイクルに設置し、６分間５０℃、１分間９５℃、その後、、９５℃／１０ｓ、６４℃／１０ｓ、および６８℃／２０ｓの２５サイクル、その後、５０℃でプローブの蛍光検出を伴う９５℃／１０ｓ、６４℃／１０ｓ、６８℃／２０ｓ、および５０℃／３０ｓの３５サイクルでインキュベーションした。
【０２２２】
図１７Ａ〜１７Ｆは、サイクル２６〜６０の低温（５０℃）検出ステップ中の、プローブ蛍光のリアルタイム結果を示す。図１７Ａにおいて、丸１７１は、反応Ａの３つの反復の曲線である。図１７Ｂにおいて、丸１７２は、反応Ｂの３つの反復の曲線である。図１７Ｃにおいて、丸１７３は、反応Ｃの３つの反復の曲線である。図１７Ｄにおいて、丸１７４は、反応Ｄの３つの反復の曲線である。図１７Ｅにおいて、丸１７５は、反応Ｅの３つの反復の曲線である。図１７Ｆにおいて、丸１７６は、反応Ｆの３つの反復の曲線である。
【０２２３】
丸１７６の曲線は、添加剤なし対照が、タイプＩＩＩのミスプライミング（幾つかの産物進化）を示したことを示すが、これは、後期増幅サイクル（おおよそサイクル４２〜６０）における一本鎖産物の減少により示される。非常に高濃度で、低Ｔｍ添加剤（Ｔｍ４７．７℃、これは、アニーリング温度より約１６℃低く、低温検出温度より２．３℃低かった）を含んだ反応Ａにおける丸１７１の曲線は、タイプＩのミスプライミングの抑制を示したが、６０サイクルまで反復間で高いばらつきを伴なって、タイプＩＩＩのミスプライミングを一部抑制したのみであった。非常に低い濃度で、幾分高いＴｍ（Ｔｍ６０℃、これは、アニーリング温度より４℃低く、低温検出温度以上であった）を有する添加剤を含んだ反応Ｂにおける丸１７２の曲線は、タイプＩのミスプライミングを完全に抑制し、タイプＩＩＩのミスプライミングは部分的に抑制したのみだが（３つの反復のうち２つは、サイクル６０までにプローブシグナルにおいて、いくらかの減少を示した）、それにもかかわらず、サイクル６０でばらつきが著しく減少した。添加剤を含んだ反応Ｃ、Ｄ、およびＥの全ては、サイクル６０までの間中、プローブシグナルにおいて、減少を示さなかった。丸１７４の曲線は、高シグナルでタイプＩＩＩのミスプライミングの抑制を示し、反応の効率において、最小限の低下を示すため、反応Ｄは、本一連の反応とって最適であると判断された。
実施例１６．オーバーハングを有する添加剤によるタイプＩのミスプライミング抑制の直接的な定量的測定
ここで報告されるアッセイは、以下を除き、実施例９に記載される通りに実施された：（ａ）Ｔａｑポリメラーゼ抗体は、５０℃のインキュベーションステップ中、全ての試料に存在した、（ｂ）５０℃でのインキュベーションステップは、１分間であった。
各添加剤は、ダブシル部分の添加により修飾される１つ、２つ、３つ、または４端を伴う、図１８Ｃに示されるオリゴマー１９４、１９５の構造を有する、同じ２つのヘアピン形成３４ヌクレオチド長一本鎖オリゴマーから成った。３’端がクエンチャーによって遮断されなかった全てのオリゴは、伸長を妨げるために、リン酸（Ｐ）または三炭素修飾因子（Ｃ３）のいずれかにより遮断された。各一本鎖オリゴマーの５’端および３’端上の６つのヌクレオチドは、これらの端が相互とハイブリッド形成した時、これらが６塩基対ステムおよび２２ヌクレオチドループ構造を形成するように、相補的であった。図１８Ｃを参照すると、該添加剤の２つの２２ヌクレオチドループは、相互とハイブリッド形成する時、４つの非相補的一本鎖６塩基対長の端１９８、１９９、２００、２０１を伴う、２２塩基対長二本鎖部分１９７を有する添加剤１９６を形成するように、相補的であった。一本鎖オリゴマーの配列は、ランダムに指定されなかったが、設計における固有の相補性のため、慎重な考察が必要とされた。本考察は、ループが結合される温度で、オリゴマーに他の構造を形成させないこと、特に、アーム配列が相互に解放されたままの状態を防ぐこと、ならびにいずれかのオリゴヌクレオチドの相補的ループ配列のどれにも結合しないことである。これらの添加剤配列は、温度範囲を超えて事前設計された立体構造に留まる能力を有する。
構成要素オリゴヌクレオチド鎖の１つまたは両方が、ステムループ構造を形成する能力を有する添加剤の場合において（図１８Ｂ、１８Ｃを参照）、該ステムの融解温度（Ｔｍ）は、添加剤の二本鎖の融解温度より高いが、反応の温度を低下する時に、適切な時間期間、添加剤の二本鎖立体構造の形成を妨げる程高くないことが望ましい。この場合、添加剤の二本鎖部分の計算されたＴｍは、５９℃であり、ステムヌクレオチドの計算されたＴｍは、６５℃であった。これらの計算は、５０℃での７０ｍＭ  Ｎａ＋、３ｍＭ  Ｍｇ＋＋の試薬濃度に基づく。二本鎖部分については、ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｄｉｎａｍｅｌｔ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｒｐｉ．ｅｄｕ／ｔｗｏｓｔａｔｅ．ｐｈｐ）を使用し、ステムについては、ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｎｔｅｎｄ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｒｐｉ．ｅｄｕ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｍｆｏｌｄ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｄｎａ−ｆｏｒｍ１．ｃｇｉ）を使用した。実践において、実際のＴｍは、相互作用するダブシルの数に依存し、約４℃まで、計算されたＴｍから上昇させることができる。
以下の添加剤を使用し、相補的である配列は下線付きである。
添加剤ＳＬ０２．
５’ＧＣＧＣＣＴＣＡＣＧＴＡＴＣＡＴＴＴＴＣＡＴＣＴＧＡＣＣＡＧＧＣＧＣ（Ｐ）
３’ダブシルＧＣＣＴＣＣＧＴＧＣＡＴＡＧＴＡＡＡＡＧＴＡＧＡＣＴＧＧＧＧＡＧＧＣ
（配列番号１３９）
添加剤ＳＬ０３．
５’ＧＣＧＣＣＴＣＡＣＧＴＡＴＣＡＴＴＴＴＣＡＴＣＴＧＡＣＣＡＧＧＣＧＣ（Ｐ）
３’（Ｐ）ＧＣＣＴＣＣＧＴＧＣＡＴＡＧＴＡＡＡＡＧＴＡＧＡＣＴＧＧＧＧＡＧＧＣダブシル
（配列番号１４０）
添加剤ＳＬ０４．
５’ダブシルＧＣＧＣＣＴＣＡＣＧＴＡＴＣＡＴＴＴＴＣＡＴＣＴＧＡＣＣＡＧＧＣＧＣ（Ｐ）
３’（Ｐ）ＧＣＣＴＣＣＧＴＧＣＡＴＡＧＴＡＡＡＡＧＴＡＧＡＣＴＧＧＧＧＡＧＧＣダブシル
（配列番号１４１）
添加剤ＳＬ０５．
５’ＧＣＧＣＣＴＣＡＣＧＴＡＴＣＡＴＴＴＴＣＡＴＣＴＧＡＣＣＡＧＧＣＧＣダブシル
３’ダブシルＧＣＣＴＣＣＧＴＧＣＡＴＡＧＴＡＡＡＡＧＴＡＧＡＣＴＧＧＧＧＡＧＧＣ
（配列番号１４２）
添加剤ＳＬ０６．
５’ダブシルＧＣＧＣＣＴＣＡＣＧＴＡＴＣＡＴＴＴＴＣＡＴＣＴＧＡＣＣＡＧＧＣＧＣ（Ｐ）
３’ダブシルＧＣＣＴＣＣＧＴＧＣＡＴＡＧＴＡＡＡＡＧＴＡＧＡＣＴＧＧＧＧＡＧＧＣ
（配列番号１４３）
添加剤ＳＬ０７．
５’ダブシルＧＣＧＣＣＴＣＡＣＧＴＡＴＣＡＴＴＴＴＣＡＴＣＴＧＡＣＣＡＧＧＣＧＣダブシル
３’ダブシルＧＣＣＴＣＣＧＴＧＣＡＴＡＧＴＡＡＡＡＧＴＡＧＡＣＴＧＧＧＡＧＧＣ
（配列番号１４４）
添加剤ＳＬ０８．
５’ダブシルＧＣＧＣＣＴＣＡＣＧＴＡＴＣＡＴＴＴＴＣＡＴＣＴＧＡＣＣＡＧＧＣＧＣ（Ｃ３）
３’ダブシルＧＣＣＴＣＣＧＴＧＣＡＴＡＧＴＡＡＡＡＧＴＡＧＡＣＴＧＧＧＧＡＧＧＣダブシル
（配列番号１４５）
添加剤ＳＬ０９．
５’ダブシルＧＣＧＣＣＴＣＡＣＧＴＡＴＣＡＴＴＴＴＣＡＴＣＴＧＡＣＣＡＧＧＣＧＣダブシル
３’ダブシルＧＣＣＴＣＣＧＴＧＣＡＴＡＧＴＡＡＡＡＧＴＡＧＡＣＴＧＧＧＧＡＧＧＣダブシル
（配列番号１４６）
各反応を、３重で、２５μｌ容量で実施した。最終反応混合物は、１Ｘ  ＰＣＲ緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｎＭ  ｄＮＴＰ、０．２４Ｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１．２５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の両方を含んだ。個別の反応混合物は、３００ｎＭの各添加剤を含んだ、および添加剤を含まなかった。反応成分のそれぞれの組み合わせが混合された後と、５０℃での等温インキュベーション前に、全ての反応は、それぞれ、約１００，０００コピーで添加された、重複するオリゴヌクレオチド１および２（実施例９）を有した。
これらの反応の熱プロファイル条件は、以下の通りである：１分間、５０℃、その後、氷上でのインキュベーション後、５０ｎＭの制限プライマーおよび１μＭの過剰プライマーの最終濃度のために、全反応混合物にプライマーを添加。この後、３分間、９５℃に急速加熱した後、９８℃／１０ｓおよび７２℃／４０ｓで５０サイクルが続いた。試料のそれぞれは、リアルタイムで、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ蛍光により分析され、操作の終わりに、反応が、増幅反応の二本鎖産物について予測される８８℃の単一産物ピークを生成したことを確認するために、それぞれ、融解曲線分析を受けた。
添加剤ＳＬ０４、ＳＬ０７、ＳＬ０８、およびＳＬ０９の融解曲線分析を図１９Ａ〜１９Ｄに示す。各図の丸２１０で特定される線は、抗体付加Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた試料からの反復である。丸２１１、２１２、２１３、および２１４により特定される線は、それぞれ、添加剤ＳＬ０４、ＳＬ０７、ＳＬ０８、およびＳＬ０９を用いた反復である。
結果（図１９Ａを参照）は、２つのピーク、低融解ピーク（すなわち、不適切な産物、８５℃）、および高ピーク（８８℃）で適切な産物が存在するため、抗体（丸２１０）が、ミスプライミングを低減しなかったことを裏付ける。添加剤ＳＬ０４、ＳＬ０５、ＳＬ０７、およびＳＬ０８の結果は、各添加剤が、不適切な産物量を大幅に低減したが、完全にそれを抑制しなかったことを示す。図１９Ｄは、４つのダブシルを有する添加剤ＳＬ０９が、不適切な産物の産生を完全に抑制することができたことを示す。
実施例１７．オーバーハングを有する添加剤を用いたタイプＩＩのミスプライミングおよびポリメラーゼ選択性
我々は、２００ｎＭ、４００ｎＭ、および６００ｎＭ濃度の添加剤ＳＬ０６、ＳＬ０７、およびＳＬ０９（実施例１６）を使用して、実施例３に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイを実施した。これらの添加剤は、それぞれ、２つ、３つ、または４つのダブシル修飾因子を含む。
ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅は、１Ｘ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＰＣＲ緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５０ｎＭ  ｄＮＴＰ、５０ｎＭの制限プライマー、１０００ｎＭの過剰プライマー、０．２４Ｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、約１０００の一本鎖標的Ａ（一致）またはＴ（ミスマッチ）を有する１．２５ユニットのプラチナＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から成る２５μｌ容量で、３重で、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅を実施した。これらの反応の熱プロファイル条件は、３分間、９５℃、その後、６０サイクルにおいては、９５℃／５ｓ−６２℃／２０ｓ−７２℃／３０ｓであった。両方の標的の開始コピー数が同じであること、この場合、両方の標的のＣＴが同じであることを確実にするために、２つの標的を含む本アッセイおよび他のアッセイにおいて、両方の標的に完全に相補的である過剰プライマー、および同様に、両方の標的に完全に相補的である対照制限プライマーを使用して、対照増幅を行った。（対照増幅が、開始コピー数が同じでないことを認めた場合、２つの選択股がある：再調合するか、または本明細書に報告される全ての実施例の場合のように、ＣＴ差が僅かの場合、差に合わせて観察されたＣＴ値を修正する。）
選択性の結果（rＣＴは、ミスマッチの標的のＣＴから一致する標的のＣＴを引いたものに等しい）を表７に示す。
【表７】
0005757885.tif 000009
実施例１８．オーバーハングを有する添加剤によるプライマー依存５’エキソヌクレアーゼ活性の阻害
図１８Ｃに示されるタイプの一本鎖オーバーハングを有する添加剤を使用して、ＤＮＡ  Ｔａｑポリメラーゼのプライマー依存５’エキソヌクレアーゼ活性の阻害の有効性を決定するために、我々は、実施例６に記載されるＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイを実施した。
周期変動反応は、１Ｘ  ＰＣＲ緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００ｎＭ  ｄＮＴＰ、１．２５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、２００ｎＭのプローブ（実施例６）、および１００ｎＭの標的（実施例６）から成る２５μｌ容量で実施された。本反応混合物は、どの添加剤も用いずに、および２００ｎＭ、４００ｎＭ、および６００ｎＭの濃度の各添加剤を用いて使用された。反応混合物中に唯一のオリゴヌクレオチドとしてのプローブを用いて、対照反応を行った。添加剤（実施例１６を参照）は、２つのダブシルを有するＳＬ０６、３つのダブシルを有するＳＬ０７、および４つのダブシルを有するＳＬ０９を含んだ。反応混合物は、以下の熱プロファイルを使用して変動させた：４５サイクルで、４５℃／２０ｓ、６０℃／１０ｓ、その後、２５サイクルで、１℃ずつ上昇しながら、４５℃／３０秒で融解開始。サイクル中、熱プロファイルの６０℃／１０ｓ区間中で、ＦＡＭ蛍光を取得した。
エキソヌクレアーゼ切断活性は、プローブからプローブのフルオロフォアを単離し、これによって、蛍光（ＦＡＭ）の増加をもたらす。添加剤ＳＬ０６の結果を図２０に報告するが、ここで、丸２２０は、プローブのみの対照を特定し、丸２２１は、プローブおよび標的を用いるが、添加剤なしの試料を特定し、丸２２２は、プローブ、標的、および２００ｎＭ濃度の添加剤ＳＬ０６を用いた試料を特定し、丸２２３は、プローブ、標的、および４００ｎＭ濃度の添加剤ＳＬ０６を用いた試料を特定し、丸２２４は、プローブ、標的、６００ｎＭ濃度の添加剤ＳＬ０６を用いた試料を特定する。
実施例１９．３’末端ミスマッチを作製するためのブロッカーの使用
上の実施例４は、制限プライマーの３’末端ヌクレオチドで単一塩基対ミスマッチを含むミスマッチの標的と反対に、制限プライマーに完全に相補的である標的配列のＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅における、タイプＩＩのミスプライミングおよびポリメラーゼ選択性に対する添加剤混合物の効果を例証する。本実施例は、ミスマッチのヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドが、制限プライマー結合部位から下流である時、制限プライマーの３’末端がミスマッチの標的、つまり、選択される標的と考えられる標的とハイブリッド形成することを妨げるために、「ブロッカー」と称されるオリゴヌクレオチドの使用を例証する。アッセイの種類における標的、プライマー、およびブロッカーを、概略的に、図２１Ａ、２１Ｂに示す。
二本鎖第１標的の鎖に完全に相補的であり、同じく、二本鎖第２標的の鎖に完全に相補的である制限プライマーおよび過剰プライマーを使用して、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅を実施した。第２標的が第１標的に対して選択的に増幅されることが望ましかった。第２標的は、第１標的と異なる２つの塩基対を含んだ。第１塩基対の相違は、制限プライマー結合部位の下流であり、３’末端ミスマッチを作製するために利用されたブロッカーオリゴヌクレオチドの結合部位に含まれた。第２塩基対の相違は、制限プライマー結合部位およびブロッカー結合部位の両方の下流、ならびに過剰プライマー結合部位の下流であり、プロービングのために使用された。図２１Ａに示されるように、ブロッカー結合部位は、制限プライマーの３’端の制限プライマー結合部位と重複した。
標的間の第１塩基対の相違のため、第２標的（図２１Ｂ）ではなく、制限プライマーがハイブリッド形成する（図２１Ａを参照）第１標的の鎖と優先的にハイブリッド形成するように、ＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイに使用されたブロッカーは、対立遺伝子特異的であった。ブロッカーの５’端および制限プライマーの３’端は、両方とも第１標的鎖上の同じ塩基に相補的であったが、該鎖に対するブロッカーの融解温度Ｔｍ（Ｂ）は、反応温度が増幅中に低下すると最初に結合するように高く、プライマーの３’末端が第１標的とハイブリッド形成するのを防ぎ、完全に相補的なプライマーと３’末端ミスマッチを形成する。ブロッカーの３’端は、それ自体、増幅中の伸長を妨げるために遮断された。この場合、ブロッカーは、その５’端上のフルオロフォア（Ｃａｌ  Ｏｒａｎｇｅ５６０）およびその３’端上のダブシルクエンチャーで二重標識された。
両方のＬＡＴＥ−ＰＣＲアッセイは、該第２標的Ｔｍ（Ｐ２）から生成される過剰プライマー鎖とハイブリッド形成される時より高い融解温度Ｔｍ（Ｐ１）で、該第１標的から生成される過剰プライマー鎖（このような鎖が生成される限り）とハイブリッド形成する対立遺伝子特異的プローブも含んだ。この場合、プローブは、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ２（ＢＨＱ２）を有するその５’端上、およびフルオロフォア（Ｑｕａｓａｒ６７０）を有するその３’端上に標識された分子指標プローブであった。
制限プライマー、対立遺伝子特異的ブロッカー、および対立遺伝子特異的プローブの該第１および第２の標的の両方への結合を、概略的に、図２１Ａおよび２１Ｂに図示する。制限プライマーの結合および伸長を効率的に遮断するために、ブロッカーは、プライマーの３’端で少なくとも１つのヌクレオチド分重複しなければならない。ブロッカーの５’端は、ブロッカーが制限プライマーより高い温度で結合する限り、標的に完全に一致する必要はない。
反応構成要素および反応条件は、以下の通りである。
制限プライマー：５’ＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣＧＣＣ（配列番号１４７）
過剰プライマー：５’ＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴＡＧＴＧ（配列番号１４８）
対立遺伝子特異的ブロッカー：５’Ｃａｌ  Ｏｒｇ５６０−ＧＣＣＴＡＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ−ダブシル
（配列番号１４９）
分子指標プローブ：５’ＢＨＱ２−ＣＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＣＡＣＡＣＡＴＡＡＴＧ−Ｑｕａｓａｒ６７０
（配列番号１５０）
該第１標的の過剰プライマー鎖：
５’ＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴＡＧＴＧＴＡＴＴＡＡＣＣＴＴＡＴＧＴＧＴＧＡＣＡＴ
ＧＴＴＣＴＡＡＴＡＴＡＧＴＣＡＣＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧＣ（配列番号１５１）
第２標的の過剰プライマー鎖（ブロッカー結合部位での変化である、第１塩基対の変化は、下線付きである；プローブ結合部位での変化である、第２塩基対の変化は、太字である：
５’ＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴＡＧＴＧＴＡＴＴＡＡＣＣＴＴＡＴＧＴＧＴＣＡＣＡＴ
ＧＴＴＣＴＡＡＴＡＴＡＧＴＣＡＣＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧＣ（配列番号１５２）

ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅は、１Ｘ  ＰＣＲ緩衝剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００ｎＭ  ｄＮＴＰ、５０ｎＭの制限プライマー、１０００ｎＭの過剰プライマー、０．２４Ｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、２００ｎＭのプローブ、段階希釈により得られる１００〜１０６の範囲の開始コピー数をもたらす異なる濃度のプラスミドＤＮＡ（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ，Ｓｕｇａｒ  Ｌａｎｄ，ＴＸ）を有する２ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から成る２５μｌ容量で実施された。増幅反応は、５００ｎＭのブロッカーの存在下、または不在下で、添加剤なし、または鎖濃度（上部／中央／底部）が３３．３ｎＭ、２００ｎＭおよび１６６．７ｎＭである添加剤ＥＰ０４３（実施例４）のいずれかを用いて、各条件について２回実施された。
これらの反応の熱プロファイル条件は、以下の通りである：３分間、９５℃、その後、９５℃／１０ｓ、７０℃／３０ｓ、６２℃／１０ｓ、７２℃／２０ｓの７０サイクル、その後、９０℃まで３０ｓ間隔で１℃ずつ上昇しながら、３０℃で融解開始。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎシグナルは、全ＰＣＲサイクルのプライマー伸長部分中、リアルタイムで検出され、ＣＴ値が決定された。アッセイは、２重で行われたため、標的の各濃度での２つのＣＴ値を平均化した。図２２Ａは、ＥＰ０４３添加剤を用いた、または用いない両方の、ブロッカーなしで実施されたアッセイの標的濃度の関数としてのＣＴ値を表す。図２２Ｂは、添加剤を用いた、または用いない両方の、ブロッカーを用いて実施されたアッセイの標的濃度の関数としてのＣＴ値を表す。
図２２Ａを参照すると、塗りつぶされた矩形は、開始標的（コピー数）の種々の濃度の第１標的（ブロッカーの操作を通して識別される）を用いた、ブロッカーなし、および添加剤なしの試料のＣＴ値であり、ＣＴ値は、線２５０で結ばれ、塗りつぶされた三角形は、第２標的（ブロッカーと一致しないため、優先的に増幅される）を用いた、ブロッカーなし、および添加剤なしの試料のＣＴ値であり、ＣＴ値は、線２５１で結ばれる。同様に、図２２Ａにおいて、塗りつぶされていない矩形は、第１標的および添加剤を用いるが、ブロッカーなしの試料のＣＴ値であり、ＣＴ値は、線２５２で結ばれ、塗りつぶされていない三角形は、第１標的および添加剤を用いるが、ブロッカーなしの試料のＣＴ値であり、ＣＴ値は、線２５３で結ばれる。
図２２Ｂを参照すると、塗りつぶされた矩形は、第１標的およびブロッカーを用いるが、添加剤なしの試料のＣＴ値であり、ＣＴ値は、線２５４で結ばれ（低コピー数に外挿される）、塗りつぶされていない矩形は、第２標的およびブロッカーを用いるが、添加剤なしの試料のＣＴ値であり、ＣＴ値は、線２５５で結ばれる（低コピー数に外挿される）。また図２２Ｂにおいて、塗りつぶされた丸は、第１標的、ブロッカーおよび添加剤を用いた試料のＣＴ値であり、ＣＴ値は、線２５６で結ばれ（外挿される）、塗りつぶされていない丸は、第２標的、ブロッカーおよび添加剤を用いた試料のＣＴ値であり、ＣＴ値は、線２５７で結ばれる（外挿される）。
添加剤、この場合、添加剤ＥＰ０４３の不在下で作製された３’末端ミスマッチに対する選択性は、第１濃度での該第１標的の増幅からのシグナルの閾値サイクル（ＣＴ）と、該第１濃度での該第２標的の増幅からの信号のＣＴとの間の差であり、（ΔＣＴＢ）と表記される。添加剤ＥＰ０４３による選択性は、二倍のＣＴ差であり、（ΔΔＣＴ）と明示され、ΔＣＴＡ−ΔＣＴＢとして計算され、ΔＣＴＡは、添加剤およびブロッカーの両方の存在下の第２の濃度での該第１標的と該第２標的のＣＴ値間の差として測定され、該第２標的のＣＴ値は、該第１濃度のブロッカーのみを含む反応、および該第２濃度でのブロッカーおよび添加剤の両方を含む反応において、同じである。
図２２Ａは、我々が予測したように、制限プライマーといずれかの標的との間の３’末端ミスマッチの欠損により、ブロッカーなしで、いずれの標的についての選択性は存在しないことを示す。線２５０および２５１の両方が、約３．５のスロープを有するため、データは、添加剤ＥＰ０４３なしで、アッセイは効率的であることを示す。しかしながら、添加剤ＥＰ０４３を用いた、線２５２および２５３のスロープは、両方とも約３．９であり、したがって、ＥＰ０４３が、両方の標的においてＰＣＲ増幅を低減したことを例証する。
選択性に対する添加剤の効果について、図２２Ｂを参照する。対立遺伝子特異的ブロッカーを用いるが、添加剤なしで、制限プライマーのミスマッチの３’端は、該第１標的に対して作製され、これは、該第１標的のＣＴと、該第２標的のＣＴとの間のΔＣＴとして示す第１の選択性をもたらす。線２５４、２５５で示されるように、本ΔＣＴは、標的の濃度の関数である。ブロッカーおよび添加剤ＥＰ０４３の両方を用いると、添加剤による別の選択性が存在する。ＥＰ０４３によるＰＣＲ増幅反応の阻害のため、ＥＰ０４３の存在下での第１標的と第２標的との間のＣＴ差は、実際には２つの要因を含む：１）ＥＰ０４３による選択性と相まった、対立遺伝子特異性ブロッカーによる選択性、および２）ＰＣＲのＥＰ０４３阻害による効率の漸進的低下。
これらの２つの要因の寄与を区別し、定量化するために、我々は、図２２Ｂの情報を用いて、以下を行った。特定の標的濃度（コピー数）で、第２標的、ブロッカー、および添加剤を用いた試料のＣＴは、線２５７上に点Ａの値を有し、第１標的、ブロッカー、および添加剤を用いた試料のＣＴは、線２５６上に点Ｄの値を有する。これらのＣＴ値は、それぞれ、３５および６２であり、試料に２７のΔＣＴＡが生じる。しかしながら、点ＡのＣＴ値は、線２５５上の点ＢのＣＴ値である（同じ標的、つまり、添加剤ＥＰ０４３なしの第２標的）。点Ｂでの第２標的の濃度は、その増幅の阻害のため、ＥＰ０４３の存在下において有効な標的濃度である。点Ｂの濃度で、ΔＣＴＢは、１７の区域ＢＣである。添加剤ＥＰ０４３なしで、該第１標的と該第２標的との間の本選択性は、対立遺伝子特異的ブロッカーによる。ΔＣＴＡから添加剤ＥＰ０４３の阻害作用を除去するために、該標的の第１濃度でのΔＣＴＢ、１７は、該標的の第２濃度でのΔＣＴＡ、２７から差し引かれる。これは、１０のΔΔＣＴを生じる。１０のΔΔＣＴは、点Ａの標的濃度での誘発されたタイプＩＩのミスプライミングの存在下における、添加剤ＥＰ０４３の選択性作用である。図２２Ｂから分かるように、線２５４、２５５、２５６、２５７が相互に平行ではないため、添加剤ＥＰ０４３の選択性作用の規模は、標的濃度に依存する。標的濃度が低くなるほど、添加剤の選択性作用は大きくなる。より多くの熱サイクルが産物を検出するために必要とされるため、これは、この例である。
実施例２０．増幅前の氷上でのタイプＩミスプライミングの抑制
ここで報告されるアッセイは、以下を除いて、実施例９に記載される通りに実施された：（ａ）５０℃でのインキュベーションステップは、１分間であった、（ｂ）増幅サイクルの数は、５０に削減された、（ｃ）実施例１０に記載されるＥＰ０１０が、添加剤として使用された、（ｄ）添加剤の濃度は、３００ｎＭであった。
これらの増幅反応で生成された二本鎖産物のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ蛍光を図２３Ａに示すが、丸２６０は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのみを用いた試料からの反復を特定し、丸２６１は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび等温伸長ステップ直後に添加された抗体を用いた試料からの反復を特定し、丸２６２は、等温伸長ステップ中に存在する、抗体付加Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた試料からの反復を特定する。
図２３Ａは、重複するオリゴヌクレオチドの伸長に対する抗体の作用を示す。いずれの抗体も用いない反復試料（丸２６０）は、２２のＣＴ値を有し、したがって、重複するテンプレートの伸長は、効率的であった。逆に、重複するテンプレートの伸長は、添加剤が５０℃のインキュベーションステップ前に添加される時、広範囲に渡って阻害される（丸２６２）。抗体の添加が、５０℃のインキュベーションの終わりまで遅延される時（丸２６１）、ＣＴは、添加剤なしの例より高い（丸２６０）。これは、可能な重複するテンプレートの大半であるが、全てではない５０℃での１分のインキュベーション中に伸長されたとことを意味する。さならる重複するテンプレートは、氷上での後続のインキュベーション中に伸長される。
図２３Ｂは、重複するオリゴヌクレオチドの伸長に対する添加剤ＥＰ０１０の作用を示す。ＥＰ１０を用いた反復（丸２６３）は、５０℃でのインキュベーション前、または５０℃でのインキュベーション後のいずれかで、添加剤ＥＰ０１０を与えられた。ＥＰ０１０がインキュベーションステップの前または後に添加される時、結果（丸２６３として組み合わされる）は、増幅において相違を示さない。これは、ＥＰ０１０が、５０℃ステップのインキュベーション中、重合を阻害しないことを例証する。しかしながら、ＣＴ値は、５０℃ステップの終わりで抗体を与えられたＣＴ反復より僅かに高い（丸２６１）。これは、氷上での重複するオリゴヌクレオチドの伸長の阻害において、添加剤ＥＰ０１０の添加が、抗体より僅かに有効であることを例証する。
図２３Ｃは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのみを用いた反復（丸２６４）、ならびにＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび伸長ステップ直後に添加された抗体を用いた反復（丸２６５）で生成された二本鎖産物のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ融解曲線を示す。図２３Ｄは、伸長ステップ中に、抗体付加Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた反復で生成された二本鎖産物のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ融解曲線を示す（丸２６６）。図２３Ｅは、５０℃でのインキュベーション前（丸２６７）、または５０℃でのインキュベーション後（丸２６８、１つは失ったため、２つの反復のみ）のいずれかで添加剤を与えられた反復で生成された二本鎖産物のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ融解曲線（丸２６７）を示す。
図２３Ｃは、完全な添加剤の排除（丸２６４）または５０℃でのテンプレートのインキュベーション中の抗体の除外（丸２６５）が、８８℃で融解する、比較的純粋な産物の伸長および後続の増幅をもたらすことを例証する。図２３Ｄは、逆に、５０℃でのインキュベーション中に抗体を含むと（丸２６６）、８８℃および８５℃でピークを有する産物の混合物をもたらすことを例証する。図２３Ｅは、５０℃ステップの前または後のいずれかでＥＰ０１０添加剤を添加すると、８８℃で、鋭い融解ピークを有する純粋な二本鎖産物の増幅を生じることを例証する。図２３Ｅの融解曲線も、６７〜７１℃で、小さい広範なピークの存在を示す。このピークは、ＥＰ０１０の二本鎖形態の融解による。二本鎖形態は、伸長がこれらの反応の増幅段階中、および実施例９で実施される温度である７２℃で、もはや存在しないことを示す。逆に、実施例９で使用された添加剤は、ＥＰＯ１０より高い融解ピーク（図示せず）を有することが認められた。
【０２２４】
上述の特定の実施形態は、包括的ではなく、特許請求の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。これらの実施形態の種々の修正は、本明細書に記載される概念から逸脱することなく行うことができる。このような修正は、本特許請求の範囲内に含まれるものとする。

本発明は、以下の態様を含み得る。
［１］  少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を増幅するためのＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長を含む、プライマー依存ＤＮＡ増幅反応用の反応混合物において、前記反応混合物は、少なくとも１つのプライマー対、ＤＮＡポリメラーゼ、およびｄＮＴＰを含み、改善点は、６〜５０のヌクレオチド長の長さのハイブリッドを有し、３２℃で少なくとも５０％が二本鎖であり、その鎖のそれぞれに末端領域を有し、かつそれぞれ異なる末端領域に共有結合的に結合される、１〜４つの修飾基を含み、前記修飾基は、非平面の巨大部分を有さない多環式部分である、少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤を、増幅の開始前の前記反応混合物に含めることを含み、前記少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤は、ミスプライミングの抑制、完全に相補的でない陥凹３’末端配列を有するハイブリッドに対するポリメラーゼ選択性の増加、ＡＴ豊富の陥凹３’末端配列を有するハイブリッドに対するポリメラーゼ選択性の増加、反復反応間のばらつきの減少、ポリメラーゼ５’エキソヌクレアーゼ活性の阻害、およびポリメラーゼ活性の阻害の機能のうちの少なくとも１つについて効果的である、前記ＤＮＡポリメラーゼの濃度に対する濃度で含まれるが、ただし、前記添加剤が、任意の標的配列のプライマーまたは検出プローブである場合、少なくとも３つの修飾基を含むものとする、反応混合物。
［２］  前記少なくとも１つの修飾基は、２〜４つの修飾基である、上記［１］に記載の増幅反応混合物。
［３］  前記２〜４つの修飾基は、３つの修飾基である、上記［２］に記載の増幅反応混合物。
［４］  前記添加剤は、前記少なくとも１つの標的配列のためのプライマーまたはプローブである第１の鎖と、前記第１の鎖に部分的に相補的である逆相補体鎖と、を含む、上記［３］に記載の増幅反応混合物。
［５］  前記２〜４つの修飾基は、４つの修飾基である、上記［２］に記載の増幅反応混合物。
［６］  前記修飾基は、前記少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤の末端ヌクレオチドに共有結合的に連結される、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の増幅反応混合物。
［７］  前記修飾基は、ダブシル（Ｄａｂｃｙｌ）である、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の増幅反応混合物。
［８］  前記少なくとも１つの添加剤は、２つの添加剤の混合物である、上記［２］に記載の増幅反応混合物。
［９］  前記混合物は、３本の鎖から成る、上記［８］に記載の増幅反応混合物。
［１０］  前記少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤は、天然のヌクレオチドから成る、上記［１］〜［９］のいずれかに記載の増幅反応混合物。
［１１］  前記少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤は、ＤＮＡである、上記［１］〜［９］のいずれかに記載の増幅反応混合物。
［１２］  前記少なくとも１つの添加剤は、前記少なくとも１つの標的配列のためのプライマーまたはプローブではない、上記［１］〜［３］および［５］〜［１１］のいずれかに記載の増幅反応混合物。
［１３］  前記少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤の前記濃度は、１０００ｎＭ以下である、上記［１］〜［１２］のいずれかに記載の増幅反応混合物。
［１４］  逆転写酵素をさらに含む、上記［１］〜［１３］のいずれかに記載の増幅反応混合物。
［１５］  前記少なくとも１つの二本鎖添加剤は、１〜４つの一本鎖オーバーハングを含む、上記［１］に記載の増幅反応混合物。
［１６］  前記少なくとも１つの二本鎖添加剤は、ハイブリッド形成されない時、ステムループ構造を形成する少なくとも１本の鎖を含む、上記［１５］に記載の増幅反応混合物。
［１７］  少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を増幅するための方法であって、前記少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を上記［１］に記載の増幅反応混合物と接触させることと、プライマーアニーリング温度およびプライマー伸長温度を有するプライマー依存ＤＮＡ増幅反応に、前記反応混合物を供することと、を含む、方法。
［１８］  前記少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を前記反応混合物と接触させることは、一本鎖形態の前記少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を前記反応混合物に添加することから成る、上記［１７］に記載の方法。
［１９］  前記少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を得るために、逆転写ＲＮＡを含む、上記［１７］に記載の方法。
［２０］  前記少なくとも１つの修飾因子は、２〜４つの修飾因子である、上記［１７］に記載の方法。
［２１］  前記二本鎖オリゴヌクレオチドは、前記プライマーアニーリング温度から、前記プライマーアニーリング温度より多くても５℃低い温度までの範囲にある融解温度（Ｔｍ）を有する、上記［２０］に記載の方法。
［２２］  前記二本鎖オリゴヌクレオチドは、前記アニーリング温度より高い融解温度（Ｔｍ）を有する、上記［２０］に記載の方法。
［２３］  前記添加剤は、３つの修飾基を有し、前記少なくとも１つの標的配列のためのプライマーまたはプローブである第１の鎖と、前記第１の鎖に部分的に相補的である逆相補体鎖とを含む、上記［１７］に記載の方法。
［２４］  前記少なくとも１つの添加剤は、２つの添加剤の混合物である、上記［２０］に記載の方法。
［２５］  前記混合物は、前記プライマーアニーリング温度から、前記プライマーアニーリング温度より多くても５℃低い温度までの範囲にあるＴｍを有する、二本鎖オリゴヌクレオチドを有する第１の添加剤と、前記プライマーアニーリング温度より高いＴｍを有する、二本鎖オリゴヌクレオチドを有する第２の添加剤と、を含む、上記［２２］に記載の方法。
［２６］  各添加剤は、３〜４つの修飾基を含む、上記［２５］に記載の方法。
［２７］  前記プライマー依存増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応である、上記［１７］〜［２６］のいずれかに記載の方法。
［２８］  前記プライマー依存増幅は、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅反応である、上記［１７］〜［２６］のいずれかに記載の方法。
［２９］  前記少なくとも１つのＤＮＡ標的配列は、ＲＮＡ標的配列から逆転写される、上記［１７］〜［２８］のいずれかに記載の方法。
［３０］  上記［１７］〜［２９］のいずれかに記載の増幅と、増幅中にリアルタイムで、もしくは増幅後のエンドポイントのいずれかでの、前記反応の一本鎖産物、前記反応の二本鎖産物、または両方の蛍光検出とを含む増幅アッセイであって、前記反応の二本鎖産物は、蛍光ＤＮＡ色素によって検出されるか、前記反応の一本鎖産物は、少なくとも１つの蛍光的に標識されたハイブリッド形成プローブによって検出されるか、または両方である、増幅アッセイ。
［３１］  少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を増幅する試薬のキットであって、上記［１］〜［１６］のいずれかに記載の反応混合物のための前記試薬を含む、キット。
［３２］  逆転写酵素をさらに含む、上記［３１］に記載のキット。
［３３］  ＤＮＡ色素をさらに含む、上記［３１］または上記［３２］に記載のキット。
［３４］  前記少なくとも１つの標的配列のための蛍光的に標識された検出プローブをさらに含む、上記［３１］〜［３３］のいずれかに記載のキット。
［３５］  鎖のそれぞれに末端領域を有し、６〜５０のヌクレオチド長の長さのハイブリッドを有し、３２℃で少なくとも５０％が二本鎖であり、かつそれぞれ異なる末端領域に共有結合的に結合される、２〜４つの修飾基を含む、修飾された二本鎖オリゴヌクレオチドであって、前記修飾基は、非平面の巨大部分を有さない多環式部分であり、前記修飾されたオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼドメインを阻害することができる、修飾された二本鎖オリゴヌクレオチド。
［３６］  前記二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡである、上記［３５］に記載の修飾されたオリゴヌクレオチド。
［３７］  前記修飾基は、末端ヌクレオチドに結合される、上記［３５］または上記［３６］に記載の修飾されたオリゴヌクレオチド。
［３８］  上記［３５］〜［３７］のいずれかに記載の２つの修飾された二本鎖オリゴヌクレオチドの混合物。
［３９］  前記２つの二本鎖オリゴヌクレオチドは、３本の鎖を含む、上記［３８］に記載の混合物。
［４０］  前記ＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性である、上記［１］に記載の増幅反応混合物。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図１２】
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【配列表】
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