(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オートファジー阻害剤を含む、哺乳類の鳥インフルエンザの予防および／または処置のための医薬組成物であって、該阻害剤が、３−メチルアデニンから選択される、医薬組成物。
【請求項２】
哺乳類がヒトである、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
哺乳類の鳥インフルエンザが、鳥インフルエンザウイルスによって誘発される哺乳類の肺損傷を含む、請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記肺損傷が急性呼吸窮迫症候群を含む、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記鳥インフルエンザウイルスが、Ｈ５Ｎ１型、Ｈ５Ｎ２型またはＨ９Ｎ２型ウイルスである、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項６】
３−メチルアデニンが、ＰＩ３ＫクラスＩＩＩのシグナル伝達経路の阻害剤である、オートファジー阻害剤である、請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項７】
哺乳類の鳥インフルエンザの予防および／または処置用薬剤の製造のためのオートファジー阻害剤の使用であって、該阻害剤が、３−メチルアデニンから選択される、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）阻害剤の使用に関する。具体的には、本発明は、哺乳類の鳥インフルエンザを予防および／または処置するための医薬を調製するための、オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）阻害剤、例えば、３−メチルアデニン、ＳＢ２０３５８０、ＬＹ２９４００２またはウォルトマンニンの使用に関する。本発明はまた、ナノメートル物質によって誘発される肺損傷を予防および／または処置するためのオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）阻害剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスは、ＲＮＡウイルスに属する、インフルエンザを誘発する病原性ウイルスであり、多数の合併症、例えば、急性呼吸器感染症、心筋炎、肺炎、気管支炎をもたらしうる。インフルエンザウイルスは伝染性が高いため、全世界範囲でさえ極めて容易に広まる。１９１７−１９１９年の間にヨーロッパで発生したインフルエンザは、歴史上最も重篤なインフルエンザであり、２０００万人の人々に死をもたらした。最近になって、Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスは、家禽および渡り鳥を介して全世界に広まっている。報告によれば、Ｈ５Ｎ１型ウイルスによって感染した患者の死亡率は約５０％であり、それはＨ５Ｎ１型鳥インフルエンザが全世界に広がりうることを意味する（Ｐｅｔｅｒ  Ｓ．Ｔａｎｇ，Ｍａｒｃｏ  Ｍｕｒａ，Ｒａｓｈｍｉ  Ｓｅｔｈら．Ａｃｕｔｅ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ：ｈｏｗ  ｍａｎｙ  ｗａｙｓ  ｃａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｅ？  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９４：Ｌ６３２−Ｌ６４１（２００８））。
【０００３】
インフルエンザウイルスによって誘発される急性呼吸器疾患は、死亡の主な原因であり、その主な特徴は、急性肺損傷である。炎症因子によって誘発されるサイトカインの「ストーム」は、インフルエンザウイルスの主な病因メカニズムを構成する。最近になって、病原性遺伝子によって誘発される細胞死は、肺損傷の原因となっている別の重大なメカニズムであると考えられている（Ｐｅｔｅｒ  Ｓ．Ｔａｎｇ，Ｍａｒｃｏ  Ｍｕｒａ，Ｒａｓｈｍｉ  Ｓｅｔｈら．Ａｃｕｔｅ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ：ｈｏｗ  ｍａｎｙ  ｗａｙｓ  ｃａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｅ？  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９４：Ｌ６３２−Ｌ６４１（２００８））。
【０００４】
鳥インフルエンザは、鳥類インフルエンザの略称であり、インフルエンザＡ型ウイルスの亜型(鳥インフルエンザウイルスとも称される)によって引き起こされる伝染病である。種々の病原性遺伝子にしたがって、鳥インフルエンザは、以下の３種類に分類されうる：高病原性、低病原性および非病原性鳥インフルエンザ。現在までのところ、全ての高病原性鳥インフルエンザの発症は、Ｈ５亜型およびＨ７亜型ウイルスによって引き起こされる。鳥インフルエンザは、トリ、ブタ、ウマ、アザラシ、クジラおよびヒトなどを含む、種々の動物に感染しうる。従来、鳥インフルエンザの病因メカニズムは明確ではなく、予防および処置のための有効な医薬はなかった。そのため、鳥インフルエンザを予防および処置するための有効な医薬を研究および探索することが重要である。
【０００５】
細胞死の形態は、主に以下の２つのタイプに分類される：プログラム細胞死（ＰＣＤ）および壊死。プログラム細胞死は、長期の生物の進化の間に発達した細胞自殺メカニズムであり、消耗した細胞、過剰な細胞または癌性細胞を排除し、生物の内部環境のホメオスタシスを保持する態様にて重要な役割を果たしている。近年は、プログラム細胞死の新しい形態、すなわち、自己貪食性プログラム細胞死が、細胞生物学者にますます注目されている。オートファジーは、ＩＩ型プログラム細胞死として称され、その細胞死は、主に細胞質および細胞小器官を包含する豊富な液胞の発現、ならびにリソソームを介する液胞内の成分の分解にて特徴付けられる（Ｂｅｔｈ  ＬｅｖｉｎｅおよびＪｕｎｙｉｎｇ  Ｙｕａｎ，Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ：ａｎ  ｉｎｎｏｃｅｎｔ  ｃｏｎｖｉｃｔ？  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：２６７９−２６８８（２００５）．）。
【０００６】
オートファジーの原因となっているメカニズムは、多数のシグナル伝達系に関与しており、ｍＴＯＲ（哺乳類ラパマイシン標的タンパク質）シグナル伝達経路が徐々に証明されてきている。ＴＯＲキナーゼは、アミノ酸、ＡＴＰおよびホルモンのセンサーであり、細胞増殖の調節に重要な役割を果たしている。ＴＯＲキナーゼは、オートファジーの発生を阻害し、負の調節因子として機能し、「ゲートキーパー」としての役割を果たしている。哺乳類細胞中に局在するリボソームタンパク質Ｓ６（ｐ７０Ｓ６）は、オートファジーの発生を阻害する。それは、ＴＯＲシグナル経路の下流に位置し、その活性はｍＴＯＲによって調節される（Ｋｌｉｏｎｓｋｙ  ＤＪ，Ｍｅｉｊｅｒ  ＡＪ，Ｃｏｄｏｇｎｏ  Ｐら．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ａｎｄ  Ｐ７０Ｓ６  ｋｉｎａｓｅ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  １（１）：０５９−０６１．（２００５））。従来、ラパマイシンは、ｐ７０Ｓ６の活性の阻害およびｍＴＯＲの活性の阻害を介するオートファジーの発生の誘発に対して効果を発揮していた。
【０００７】
新規物質として、ナノメートル物質は、科学研究、美容、衣類および製造などに広く用いられている。ナノメートル物質に関する研究は、徐々に注目の話題になっており、いくつかのナノメートル物質がオートファジー性細胞死を誘発しうることが報告されている（Ｚａｂｉｒｎｙｋ  Ｏ，Ｙｅｚｈｅｌｙｅｖ  Ｍ，Ｓｅｌｅｖｅｒｓｔｏｖ  Ｏ．Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ．２００７  Ｍａｙ−Ｊｕｎ；３（３）：２７８−８１．）。いくつかのナノメートル物質は、肺損傷を誘発しうる（Ｂｙｒｎｅ  ＪＤ，Ｂａμｇｈ  ＪＡ．Ｔｈｅ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｍｃｇｉｌｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００８  Ｊａｎ；１１（１）：４３−５０．）。しかしながら、ナノメートル物質と細胞死の間の相互関係の原因となっている特別なメカニズムは明確ではなく、オートファジー性細胞死を介してナノメートル物質によって誘発される肺損傷の原因となっているメカニズムは報告されていない。そのため、ナノメートル物質によって誘発される肺損傷を予防および／または処置するための有効な医薬を提供する必要性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｐｅｔｅｒ  Ｓ．Ｔａｎｇ，Ｍａｒｃｏ  Ｍｕｒａ，Ｒａｓｈｍｉ  Ｓｅｔｈら．Ａｃｕｔｅ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ：ｈｏｗ  ｍａｎｙ  ｗａｙｓ  ｃａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｅ？  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９４：Ｌ６３２−Ｌ６４１（２００８）
【非特許文献２】Ｂｅｔｈ  ＬｅｖｉｎｅおよびＪｕｎｙｉｎｇ  Ｙｕａｎ，Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ：ａｎ  ｉｎｎｏｃｅｎｔ  ｃｏｎｖｉｃｔ？  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：２６７９−２６８８（２００５）．
【非特許文献３】Ｋｌｉｏｎｓｋｙ  ＤＪ，Ｍｅｉｊｅｒ  ＡＪ，Ｃｏｄｏｇｎｏ  Ｐら．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ａｎｄ  Ｐ７０Ｓ６  ｋｉｎａｓｅ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  １（１）：０５９−０６１．（２００５）
【非特許文献４】Ｚａｂｉｒｎｙｋ  Ｏ，Ｙｅｚｈｅｌｙｅｖ  Ｍ，Ｓｅｌｅｖｅｒｓｔｏｖ  Ｏ．Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ．２００７  Ｍａｙ−Ｊｕｎ；３（３）：２７８−８１．
【非特許文献５】Ｂｙｒｎｅ  ＪＤ，Ｂａμｇｈ  ＪＡ．Ｔｈｅ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｍｃｇｉｌｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００８  Ｊａｎ；１１（１）：４３−５０．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一の態様において、本発明は、哺乳類のインフルエンザ、好ましくは哺乳類の鳥インフルエンザを予防および／または処置するための医薬の調製における、オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）阻害剤の使用を提供する。好ましくは、該阻害剤は、３−メチルアデニン、ＳＢ２０３５８０、ＬＹ２９４００２またはウォルトマンニンから選択される。より好ましくは、該阻害剤は、３−メチルアデニンである。好ましくは、本発明は、インフルエンザ、好ましくは鳥インフルエンザを予防するための医薬の調製における、３−メチルアデニンの使用を提供する。
【００１０】
本発明の一の実施態様において、哺乳類はヒトである。
【００１１】
別の実施態様において、本発明は、インフルエンザウイルス、好ましくは鳥インフルエンザウイルスによって誘発される哺乳類の肺損傷を予防および／または処置するためのオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）阻害剤の使用を提供する。
【００１２】
本発明の一の実施態様において、肺損傷は急性呼吸窮迫症候群である。
【００１３】
本発明の一の実施態様において、鳥インフルエンザは、Ｈ５Ｎ１型、Ｈ５Ｎ２型およびＨ９Ｎ２型の鳥インフルエンザウイルスによって引き起こされる。
【００１４】
本発明の一の実施態様において、３−メチルアデニンは、オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）阻害剤であり、ＰＩ３ＫクラスＩＩＩのシグナル伝達経路の阻害剤である。
【００１５】
別の態様において、本発明は、ナノメートル物質によって誘発される哺乳類の肺損傷を予防および／または処置するための医薬の調製における、オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）阻害剤の使用を提供する。そして、該阻害剤は、３−メチルアデニン、ＳＢ２０３５８０、ＬＹ２９４００２またはウォルトマンニンから選択される。
【００１６】
本発明の一の実施態様において、哺乳類はヒトである。
【００１７】
本発明のナノメートル物質には、ＰＡＭＡＭ  Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、Ｇ５．５、Ｇ６、Ｇ７およびＧ８などが含まれる。
【００１８】
本発明の一の実施態様において、３−メチルアデニンは、オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）阻害剤であり、ＰＩ３ＫクラスＩＩＩのシグナル伝達経路の阻害剤である。
【００１９】
本発明の一の実施態様において、肺損傷は急性呼吸窮迫症候群である。
【００２０】
本発明において、オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）阻害剤は、細胞のシグナル伝達経路の阻害剤であってもよく、細胞のシグナル伝達経路には、ＴＳＣ１／２、ＬＣ３、Ａｔｇ５−Ａｔｇ１２、Ｐ３８、ＴＳＣ１／２およびＰＩ３Ｋのシグナル伝達経路が含まれる。好ましくは、該シグナル伝達経路は、Ａｔｇ５−Ａｔｇ１２−ＬＣ３細胞のシグナル伝達経路である。
【００２１】
本発明において、オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）阻害剤は、細胞のシグナル伝達経路のアゴニストとして用いられうる、ここで、該細胞のシグナル伝達経路には、ＡＫＴおよびｍＴＯＲのシグナル伝達経路が含まれる。好ましくは、シグナル伝達経路は、ｍＴＯＲ−ＴＳＣ１／２−ＡＫＴのシグナル伝達経路である。
【００２２】
本発明者は、オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）阻害剤が鳥インフルエンザの予防および／または処置に対して有意な効果を有し、特にその予防効果が予期せぬものであることを見出した。
【００２３】
鳥インフルエンザには、限定されるものではないが、Ｈ５Ｎ１型、Ｈ９Ｎ２型、Ｈ５Ｎ２型鳥インフルエンザウイルスまたはその不活性ウイルスまたはその表面タンパク質によって誘発される鳥インフルエンザが含まれる。
【００２４】
本発明者はまた、オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）阻害剤がナノメートル物質によって誘発されるかまたは悪化する肺損傷の予防および／または処置に対して有意な効果を有し、特にその予防効果は予期せぬものであることを見出した。
【００２５】
該オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）阻害剤には、限定されるものではないが、３−メチルアデニン、ＳＢ２０３５８０、ＬＹ２９４００２またはウォルトマンニンが含まれる。
【００２６】
本発明は、オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）阻害剤の予防および／または処置効果が有意であり、細胞死、特に哺乳類の肺上皮細胞の死を大幅に減少させるためにオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）の発生を明らかに予防しうることを証明している：実験結果は、最初にオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）阻害剤で処置し、次いで、不活化Ｈ５Ｎ１型ウイルスで処置した細胞の生存率と不活化Ｈ５Ｎ１型ウイルスのみで処置した細胞の生存率の間に有意な違いがあることを証明している。オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）阻害剤の予防および処置効果は、インビボ実験、例えば、マウスの病理写真、炎症細胞計数、肺湿／乾比、肺弾性の変化および死亡率などによってさらに証明されうる。オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）阻害剤が、鳥インフルエンザを予防および処置するために肺組織の損傷を明らかに減少させることも証明されている。さらに、オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）阻害剤が、同一のインビボおよびインビトロ実験を介してナノメートル物質によって誘発されるかまたは悪化する肺損傷を予防および処置することも証明されている。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、Ｈ５遺伝子が挿入された発現ベクターＰｅａｋ１３  ＣＤ５Ｌ  ＴＥＶヒトＩｇＧを制限消化酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離した結果を示す。ライン１、２および３は、それぞれ、λ−ＨｉｎｄＩＩＩマーカー、Ｐｅａｋ１３  ＣＤ５Ｌ  Ｈ５  ＴＥＶヒトＩｇＧ、Ｄ２０００マーカーを示す。λ−ＨｉｎｄＩＩＩマーカーの大きさは、小さいものから大きい（下から上の）順に、５６４ｂｐ（図から識別することが困難）、２０２７ｂｐ、２３２２ｂｐ、４３６１ｂｐ、６５５７ｂｐ、９４１６ｂｐおよび２３１３０ｂｐである；Ｄ２０００マーカーの大きさは、小さいものから大きい（下から上の）順に、１００ｂｐ、２５０ｂｐ、５００ｂｐ、７５０ｂｐ、１０００ｂｐおよび２０００ｂｐである。プラスミドをＮｈｅ  Ｉ／ＢａｍＨＩ酵素で切断して１．５６Ｋｂフラグメントが得られ、それはＨ５遺伝子が発現ベクターに挿入されていることを証明している。
【図２】図２は、ウエスタンブロット法で測定した２９３ＥＴ細胞で発現した融合タンパク質Ｈ５Ｆｃの発現結果を示す。それは、融合タンパク質Ｈ５Ｆｃが宿主細胞で良好に発現され、発現タンパク質の分子量が約１１０ＫＤおよび６０ＫＤであることを証明している。Ｈ５タンパク質は、宿主内の酵素によって切断され、２つのバンドを形成している。
【図３】図３は、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）によって染色された、精製Ｈ５Ｆｃ融合タンパク質およびＨ５タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。それは、十分に精製された融合タンパク質Ｈ５ＦｃおよびＨ５タンパク質が得られうることを証明している。精製されたＨ５Ｆｃタンパク質をＴＥＶ酵素で切断し、次いで、アフィニティークロマトグラフィーに付して、約８０ＫＤの分子量を有する精製されたＨ５タンパク質が得られうる。
【図４】図４は、異なる方法で処置したＨｅｌａ細胞の電子顕微鏡写真（２００００倍）および電子顕微鏡下にて観察されたオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴う細胞％の棒グラフを示す。図Ａは、４時間アジュバントで処置したＨｅｌａ細胞の電子顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザ不活化ウイルスで処置したＨｅｌａ細胞の電子顕微鏡写真を示し、矢印はオートファゴソームを示す。図Ｃは、上記２つの条件下でのオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴うＨｅｌａ細胞％の棒グラフを示す。それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスの効果でＨｅｌａ細胞のオートファジーが起こることを証明している。
【図５】図５は、異なる方法で処置したＨｅｌａ細胞の電子顕微鏡写真（２００００倍）および電子顕微鏡下にて観察されたオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴う細胞％の棒グラフを示す。図Ａは、４時間アジュバントで処置したＨｅｌａ細胞の電子顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間不活化Ｈ５Ｎ２型鳥インフルエンザウイルスで処置したＨｅｌａ細胞の電子顕微鏡写真を示し、矢印はオートファゴソームを示す。図Ｃは、上記２つの条件下でのオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴うＨｅｌａ細胞％の棒グラフを示す。それは、不活化Ｈ５Ｎ２型鳥インフルエンザウイルスの効果でＨｅｌａ細胞のオートファジーが起こることを証明している。
【図６】図６は、異なる方法で処置したＨｅｌａ細胞の電子顕微鏡写真（２００００倍）および電子顕微鏡下にて観察されたオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴う細胞％の棒グラフを示す。図Ａは、４時間アジュバントで処置したＨｅｌａ細胞の電子顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間不活化Ｈ９Ｎ２型鳥インフルエンザウイルスで処置したＨｅｌａ細胞の電子顕微鏡写真を示し、矢印はオートファゴソームを示す。図Ｃは、上記２つの条件下でのオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴うＨｅｌａ細胞％の棒グラフを示す。それは、不活化Ｈ９Ｎ２型鳥インフルエンザウイルスの効果でＨｅｌａ細胞のオートファジーが起こることを証明している。
【図７】図７は、異なる方法で処置したＨｅｌａ細胞の電子顕微鏡写真（２００００倍）および電子顕微鏡下にて観察されたオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴う細胞％の棒グラフを示す。図Ａは、４時間ＢＳＡタンパク質で処置したＨｅｌａ細胞の電子顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間Ｈ５タンパク質で処置したＨｅｌａ細胞の電子顕微鏡写真を示し、矢印はオートファゴソームを示す。図Ｃは、上記の２つの条件下でのオートファジー（ＩＩ型ＰＣＤ）を伴うＨｅｌａ細胞％の棒グラフを示す。それは、Ｈ５タンパク質の効果でＨｅｌａ細胞のオートファジーが起こることを証明し、また、発現したＨ５タンパク質が生物活性を有することを証明している。
【図８】図８は、異なる方法で処置したＨｅｌａ細胞の電子顕微鏡写真（２００００倍）および電子顕微鏡下にて観察されたオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴う細胞％の棒グラフを示す。図Ａは、４時間ＤＭＳＯで処置したＨｅｌａ細胞の電子顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間５μＭラパマイシンで処置したＨｅｌａ細胞の電子顕微鏡写真を示し、矢印はオートファゴソームを示す。図Ｃは、上記の２つの条件下でのオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴うＨｅｌａ細胞％の棒グラフを示す。ラパマイシンがオートファジーの発生をもたらすことは文献から既知でありうるので、陽性対照としてラパマイシンを用いる、実験方法は正確かつ有効なものであることが証明される。
【図９】図９は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真（２００００倍）および電子顕微鏡下にて観察されたオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴う細胞％の棒グラフを示す。図Ａは、４時間トリ將尿液で処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真を示し、矢印はオートファゴソームを示す。図Ｃは、上記の２つの条件下でのオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴うＡ５４９細胞％の棒グラフを示す。それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスの効果でＡ５４９細胞のオートファジーが起こることを証明している。
【図１０】図１０は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真（２００００倍）および電子顕微鏡下にて観察されたオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴う細胞％の棒グラフを示す。図Ａは、４時間ＢＳＡで処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間Ｈ５タンパク質で処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真を示し、矢印はオートファゴソームを示す。図Ｃは、上記の２つの条件下でのオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴うＡ５４９細胞％の棒グラフを示す。それは、Ｈ５タンパク質の効果でＡ５４９細胞のオートファジーが起こることを証明し、また、発現したＨ５タンパク質が生物活性を有することを証明している。
【図１１】図１１は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真（２００００倍）および電子顕微鏡下にて観察されたオートファジー（ＩＩ型細胞）を伴う細胞％の棒グラフを示す。図Ａは、４時間ＤＭＳＯで処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間５μＭラパマイシンで処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真を示し、矢印はオートファゴソームを示す。図Ｃは、上記の２つの条件下でのオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）のＡ５４９細胞の％の棒グラフを示す。ラパマイシンがオートファジーの発生をもたらすことは文献から既知でありうるので、陽性対照としてラパマイシンを用いる、実験方法は正確かつ有効なものであることが証明される。
【図１２】図１２は、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトし、異なる方法で処置したＨｅｌａ細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真（１０００倍）およびＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴う細胞％の棒グラフを示す。図Ａは、４時間アジュバントで処置したＨｅｌａ細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＨｅｌａ細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真を示す。図Ｃは、上記の２つの条件下でのＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴うＨｅｌａ細胞％の棒グラフを示す。オートファジーの発生後の細胞の典型的な特徴は、ＬＣ３（ＡＴＧ８）分子が凝集して、オートファゴソームを形成することである。細胞でオートファジーが起こると、ＥＧＦＰで標識化されたＬＣ３分子が凝集し、強く放出された緑色発光が共焦点顕微鏡で観察されうる；一方、オートファジーを伴わない細胞については、緑色発光が分散するかまたはほんの少しだけ凝集しうる。それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスの効果でＨｅｌａ細胞のオートファジーが起こることを証明している。
【図１３】図１３は、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトし、異なる方法で処置したＨｅｌａ細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真（１０００倍）およびＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴う細胞％の棒グラフを示す。図Ａは、４時間アジュバントで処置したＨｅｌａ細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間不活化Ｈ５Ｎ２型鳥インフルエンザウイルスで処置したＨｅｌａ細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真を示し、図Ｃは、上記の２つの条件下でのＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴うＨｅｌａ細胞％の棒グラフを示す。それは、不活化Ｈ５Ｎ２型鳥インフルエンザウイルスの効果でＨｅｌａ細胞のオートファジーが起こることを証明している。
【図１４】図１４は、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトし、異なる方法で処置したＨｅｌａ細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真（１０００倍）およびＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴う細胞％の棒グラフを示す。図Ａは、４時間アジュバントで処置したＨｅｌａ細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間不活化Ｈ９Ｎ２型鳥インフルエンザウイルスで処置したＨｅｌａ細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真を示す。図Ｃは、上記の２つの条件下でのＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴う細胞％の棒グラフを示す。それは、不活化Ｈ９Ｎ２型鳥インフルエンザウイルスの効果でＨｅｌａ細胞のオートファジーが起こることを証明している。
【図１５】図１５は、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトし、次いで、異なる方法で処置したＨｅｌａ細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真（１０００倍）およびＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴う細胞％の棒グラフを示す。図Ａは、４時間ＢＳＡタンパク質で処置したＨｅｌａ細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間Ｈ５タンパク質で処置したＨｅｌａ細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。図Ｃは、上記の２つの条件下でのＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴うＨｅｌａ細胞％の棒グラフを示す。それは、Ｈ５タンパク質の効果でＨｅｌａ細胞のオートファジーが起こることを証明し、また、発現したＨ５タンパク質が生物活性を有することを証明している。
【図１６】図１６は、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトし、次いで、異なる方法で処置したＨｅｌａ細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真（１０００倍）およびＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴う細胞％の棒グラフを示す。図Ａは、４時間ＤＭＳＯで処置したＨｅｌａ細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間ラパマイシンで処置したＨｅｌａ細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。図Ｃは、上記の２つの条件下でのＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴うＨｅｌａ細胞％の棒グラフを示す。ラパマイシンがオートファジーの発生をもたらすことは文献から既知であるので、陽性対照としてラパマイシンを用いる、実験方法は正確かつ有効なものであることが証明される。
【図１７】図１７は、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトし、次いで、異なる方法で処置したＡ５４９細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真（１０００倍）およびＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴うＨｅｌａ細胞％の棒グラフを示す。図Ａは、４時間陰性対照、トリ將尿液で処置したＡ５４９細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。図Ｃは、上記の２つの条件下でのＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴うＡ５４９細胞％の棒グラフを示す。それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスの効果でＡ５４９細胞のオートファジーが起こることを証明している。
【図１８】図１８は、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトし、次いで、異なる方法で処置したＡ５４９細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真（１０００倍）およびＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴うＨｅｌａ細胞％の棒グラフを示す。図Ａは、４時間ＢＳＡで処置したＡ５４９細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間Ｈ５タンパク質で処置したＡ５４９細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。図Ｃは、上記の２つの条件下でのＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴うＡ５４９細胞％の棒グラフを示す。それは、Ｈ５タンパク質の効果でＡ５４９細胞のオートファジーが起こることを証明し、また、発現したＨ５タンパク質が生理活性を有することを証明している。
【図１９】図１９は、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトし、次いで、異なる方法で処置したＡ５４９細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真（１０００倍）およびＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴うＨｅｌａ細胞％の棒グラフを示す。図Ａは、４時間ＤＭＳＯで処置したＡ５４９細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間ラパマイシンで処置したＡ５４９細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。図Ｃは、上記の２つの条件下でのＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴うＡ５４９細胞％の棒グラフを示す。ラパマイシンがオートファジーの発生をもたらすことは文献から既知であるので、陽性対照としてラパマイシンを用いる、実験方法は正確かつ有効なものであることが証明される。
【図２０】図２０は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験の結果を示す。左側の第１ラインは、１．５時間陰性対照で処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルであり、第２ラインは、１．５時間不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルである；抗体は、それぞれ（上から下へ）、ＬＣ３およびアクチン抗体である。ＬＣ３ＩＩの相対的発現レベルは増大しており、それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスがＬＣ３シグナル経路を活性化し、オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を誘発することを証明している。
【図２１】図２１は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅ−４．６．３のソフトウェアを用いて図２２に示される繰り返されたウエスタンブロット実験から得られたバンドの濃度を定量化した相対比の棒グラフを示す。左図は、ウエスタンブロット実験にて陰性対照で処置したＡ５４９細胞におけるＬＣ３ＩＩ対アクチン相対比を示し、右図は、ウエスタンブロット実験にて不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞におけるＬＣ３ＩＩ対アクチンの相対比を示す、比率の値を１に調整。それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスがＬＣ３シグナル経路を活性化し、オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を誘発することを証明している。
【図２２】図２２は、棒グラフとして異なる方法で処置したＡ５４９細胞の生存率を示す。Ａ５４９細胞は、対照ｓｉＲＮＡおよびＡｔｇ１２  ｓｉＲＮＡがそれぞれトランスフェクトされ、次いで、対照試薬または不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置されている。細胞生存率の結果はＭＴＴキットで測定される。それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスが細胞の生存率を著しく減少させるのに対し、Ａｔｇ１２  ｓｉＲＮＡが不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスの効果を軽減することを証明している。すなわち、オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）に対する抑制効果は、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスによって誘発される細胞死を軽減する。
【図２３】図２３は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験の結果を示す。左側ラインは、対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、次いで、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルであり、右側ラインは、対照Ａｔｇ１２  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、次いで、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルである；抗体は、それぞれ（上から下へ）、Ａｔｇ１２およびアクチン抗体である。Ａｔｇ５およびＡｔｇ１２は細胞内で複合体を形成してオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を誘発するため、検出された結果は、アクチンに対するＡｔｇ５およびＡｔｇ１２の複合体の相対量で示す。それは、Ａｔｇ１２  ｓｉＲＮＡがＡｔｇ５およびＡｔｇ１２の複合体の相対量を効果的に減少させることを証明している。
【図２４】図２４は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅ−４．６．３のソフトウェアを用いて図２５に示される繰り返されたウエスタンブロット実験から得られたバンドの濃度を定量化した相対比の棒グラフを示す。左図は、対照ｓｉＲＮＡをトランクフェクトしたＡ５４９細胞におけるに対するＡｔｇ５およびＡｔｇ１２の複合体対アクチンの相対比を示す、該値を１に調整。右図は、対照Ａｔｇ１２  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＡ５４９細胞におけるＡｔｇ５およびＡｔｇ１２の複合体対アクチン相対比を示す。それは、Ａｔｇ１２  ｓｉＲＮＡがＡｔｇ５およびＡｔｇ１２の複合体の相対量を効果的に減少させることを証明されている。
【図２５】図２５は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験の結果を示す。左側ラインは、陰性対照でＡ５４９細胞の溶解サンプルであり、右側ラインは不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルである；抗体は、それぞれ（上から下へ）、リン酸化Ｓ６、Ｓ６およびアクチン抗体である。Ｓ６はｍＴＯＲの基質であり、リン酸化Ｓ６の相対的減少は、ｍＴＯＲ経路の活性を阻害したことを示しており、それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスがｍＴＯＲシグナル経路を阻害し、さらに、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスがｍＴＯＲシグナル経路を介してオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を誘発することを証明している。
【図２６】図２６は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅ−４．６．３のソフトウェアを用いて繰り返されたウエスタンブロット実験から得られたバンドの濃度を定量化した相対比の棒グラフを示す。左図は、ウエスタンブロット実験にて陰性対照で処置したＡ５４９細胞におけるリン酸化Ｓ６対Ｓ６の相対比を示す、該値を１に調整。右図は、ウエスタンブロット実験にて不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞におけるリン酸化Ｓ６対Ｓ６の相対比を示す。それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスがｍＴＯＲシグナル経路を阻害し、さらに、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスがｍＴＯＲシグナル経路の阻害を介してオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を誘発することを証明している。
【図２７】図２７は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験の結果を示す。左側ラインは、陰性対照で処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルであり、右側ラインは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルである；抗体は、それぞれ（上から下へ）、リン酸化ｍＴＯＲおよびｍＴＯＲ抗体である。リン酸化ｍＴＯＲの量は相対的に減少しており、それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスがｍＴＯＲシグナル経路を阻害することおよび不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスがｍＴＯＲシグナル経路の阻害を介してオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を誘発することを証明している。
【図２８】図２８は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅ−４．６．３のソフトウェアを用いて繰り返されたウエスタンブロット実験から得られたバンドの濃度を定量化した相対比の棒グラフを示す。左図は、ウエスタンブロット実験にて陰性対照で処置したＡ５４９細胞のリン酸化ｍＴＯＲ対ｍＴＯＲの相対比を示す、該値を１に調整。右図は、ウエスタンブロット実験にて不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞におけるリン酸化ｍＴＯＲ対ｍＴＯＲの相対比を示す。それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスがｍＴＯＲシグナル経路を阻害することおよび不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスがｍＴＯＲシグナル経路の阻害を介してオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を誘発することを証明している。
【図２９】図２９は、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトし、次いで、異なる方法で処置したＡ５４９細胞の共焦点レーザー顕微鏡下写真（１０００倍）を示す。図Ａは、陰性対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、次いで、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。図Ｂは、ＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、次いで、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。ＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした後、ＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴う細胞は減少し、それは、ＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡが不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスによって誘発されるオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を阻害することを証明している。
【図３０】図３０は、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトし、次いで、異なる方法で処置したＡ５４９細胞中のＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴う細胞％の棒グラフを示す。左図は、陰性対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、次いで、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞におけるＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴う細胞％を示し、右図は、ＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、次いで、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞におけるＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴う細胞％を示す。それは、ＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡが不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスによって誘発されるオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を阻害することを証明している。
【図３１】図３１は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験の結果を示す。対照ｓｉＲＮＡおよびＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡをそれぞれトランスフェクトしたＡ５４９細胞のサンプルは、トランスフェクションの４８時間後に溶解した；抗体は、それぞれ（上から下へ）、ＴＳＣ２およびアクチン抗体である。それは、ＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡがＴＳＣ２の発現レベルを有意に減少しうることを証明している。
【図３２】図３２は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅ−４．６．３のソフトウェアを用いて図２５に示される繰り返されたウエスタンブロット実験から得られたバンドの濃度を定量化した相対比の棒グラフを示す。左図は、対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＡ５４９細胞におけるＴＳＣ２対アクチンの相対比を示す、該比率の値を１に調整。右図は、ＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＡ５４９細胞におけるＴＳＣ２対アクチンの相対比を示す。それは、ＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡがＴＳＣ２の発現レベルを有意に減少しうることを証明している。
【図３３】図３３は、棒グラフとして異なる方法で処置したＡ５４９細胞の生存率を示す。Ａ５４９細胞は、対照ｓｉＲＮＡおよびＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡがそれぞれトランクフェクトされ、次いで、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置されている。細胞生存率の結果はＭＴＴキットで測定される。細胞生存率は、ＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡのトランスフェクションを介して増加する。それは、ＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡが不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスによって誘発される細胞死を遅延しうることを証明している。
【図３４】図３４は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験の結果を示す。左側ラインは、陰性対照で処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルであって、右側ラインは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルである；抗体は、それぞれ（上から下へ）、リン酸化ＡｋｔおよびＡｋｔ抗体である。リン酸化Ａｋｔの相対量の減少は、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスがＡｋｔシグナル経路を阻害しうることを示す。
【図３５】図３５は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅ−４．６．３のソフトウェアを用いて繰り返されたウエスタンブロット実験から得られたバンドの濃度を定量化した相対比の棒グラフを示す。左図は、ウエスタンブロット結果における陰性対照で処置したＡ５４９細胞におけるリン酸化Ａｋｔ対Ａｋｔの相対比を示す、該比率の値を１に調整。右図は、ウエスタンブロット結果における不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞におけるリン酸化Ａｋｔ対Ａｋｔの相対比を示す。それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスがＡｋｔシグナル経路を阻害しうることを証明している。
【図３６】図３６は、トリ將尿液または不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを注入したマウスの肺組織の電子顕微鏡写真を示す。図Ａは、トリ將尿液を注入した肺組織の電子顕微鏡写真を示す；図Ｂは、Ａの白線ボックスに示される位置の部分的に拡大した図を示す。より完全な細胞が観察されたが、オートファゴソームは観察されなかった；図Ｃは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを注入した肺組織の電子顕微鏡写真を示す；図Ｄは、Ａの白線ボックスに示される位置の部分的に拡大した図を示す。より完全な細胞が観察された。細胞中のオートファゴソームが観察された（矢印によって表される）。それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスが肺組織のオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を誘発しうることを証明している。
【図３７】図３７は、細胞シグナル経路の略図を示す。上記の実験結果から、本発明者らは、略図に示される結論を得ることができた：鳥インフルエンザウイルスは、ＡＫＴからＴＳＣ１／２、次いで、ｍＴＯＲ、そして、オートファジーの経路を介してオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を誘発しうる。鳥インフルエンザウイルスはＡＫＴを阻害し、ＡＫＴはＴＳＣ１／２を阻害し、ＴＳＣ１／２はｍＴＯＲ経路を阻害し、ｍＴＯＲ経路はオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を阻害する；オートファジー経路は、Ａｔｇ５−Ａｔｇ１２からＬＣ３の経路を介して作用して、オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を誘発する。
【図３８】図３８は、棒グラフとして異なる方法で処置したＡ５４９細胞の生存率を示す。陰性対照、３ＭＡまたは不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置した後、Ａ５４９細胞の生存率は、ＭＴＴキットで測定された。それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスが細胞の生存率を著しく減少させるのに対し、３ＭＡが不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスによって誘発される細胞死を減少することを証明している。
【図３９】図３９は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの肺の病理切片の写真（２００倍）を示す。図Ａは、対照（トリ將尿液）を気管注入し、その６時間後に肺を摘出して得られたマウスの病理切片の写真を示し、図Ｂは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを気管注入し、その６時間後に肺を摘出して得られたマウスの病理切片の写真を示し、図Ｃは、３−ＭＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、その３０分後に不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを気管注入し、その６時間後に肺を摘出して得られたマウスの病理切片の写真を示す。それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスが重篤な肺損傷をもたらしうるのに対し、３−ＭＡが不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスによって誘発される肺損傷をある程度改善することを証明している。
【図４０】図４０は、棒グラフとして油浸レンズ（１０００倍）下の肺組織の病理切片に局在する炎症細胞数を示す。左から右に、それぞれ、対照（トリ將尿液）を気管注入した６時間後のマウスの肺病理切片数、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを気管注入した６時間後のマウスの肺病理切片数、３−ＭＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、３０分後、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザを注入した６時間後のマウスの肺病理切片数を示す。炎症細胞浸潤は、最も重要な指標の一つである。不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスの注入は非常に浸潤した炎症細胞をもたらしたのに対し、３−ＭＡは不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスによって誘発される炎症細胞数を減少させた。結果は、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスが重篤な肺損傷をもたらすのに対し、３−ＭＡが不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスによって誘発される肺損傷をある程度改善することを証明している。
【図４１】図４１は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの肺組織ＬＣ３のウエスタンブロットの結果を示す。第１ラインは、２時間対照（トリ將尿液）を気管注入したマウスの均質化肺組織から抽出された全タンパク質のサンプルを示す；第２ラインは、２時間不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを気管注入したマウスの均質化肺組織から抽出された全タンパク質のサンプルを示し、第３ラインは、３−ＭＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、３０分後、２時間不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを気管注入したマウスの均質化肺組織から抽出された全タンパク質のサンプルを示す。抗体は、ＬＣ３およびβ−アクチンである。それは、マウスの肺組織中のＬＣ３  ＩＩ含量が不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスの刺激によって増加してオートファジーが起こるのに対し、３−ＭＡがオートファジーの発生を軽減することを証明している。
【図４２】図４２は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅ−４．６．３のソフトウェアを用いて繰り返されたウエスタンブロット実験から得られたバンドの濃度を定量化した相対比の棒グラフを示す。ＬＣ３  ＩＩ対β−アクチンの相対比は、図４２に示されるバンドの濃度に相当する。それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルス刺激によってマウスの肺組織におけるＬＣ３  ＩＩ含量が増加してオートファジーを引き起こすのに対し、３−ＭＡはオートファジーの発生を軽減することを証明している。
【図４３】図４３は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの肺組織の弾性の結果を示す。それは、それぞれ、対照（トリ將尿液）を気管注入したマウスの、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを気管注入したマウスの、そして、最初に３−ＭＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、３０分後に不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを注入したマウスからの、肺組織の弾性の変化を示す。自発呼吸するマウスの肺弾性の変化を、４時間３０分ごとに測定した。肺弾性は、肺機能を測定するための重要な指標である。不活化鳥インフルエンザウイルスの気管注入はマウスの肺のコンプライアンスを著しく減少させるのに対し、３−ＭＡは誘発された損傷の軽減および肺の保護機能に一定の効果を有する。
【図４４】図４４は、棒グラフとしてＢａｌｂ／ｃマウスの肺湿／乾比を示す。それは、左から右に、対照（トリ將尿液）を気管注入した６時間後のマウスの肺湿／乾比、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを気管注入した６時間後のマウスの肺湿／乾比、３−ＭＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、３０分後、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを気管注入した６時間後のマウスの肺湿／乾比、およびウォルトマンニン（１．５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、３０分後、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを気管注入した６時間後のマウスの肺湿／乾比を示す。肺湿／乾比は、肺損傷の重要な指標の一つであり、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスの注入は、湿／乾比を著しく増加するのに対し、３−ＭＡおよびウォルトマンニンは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスによってもたらされた湿／乾比の増加を減少させる。結果は、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスが重篤な肺損傷を引き起こすのに対し、３−ＭＡおよびウォルトマンニンが不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスによって誘発される肺損傷をある程度改善することを証明している。
【図４５】図４５は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの生存曲線を示す。不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスの気管注入の８時間前、２時間前およびその気管注入の３０分後に、３−ＭＡ（１５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射して、１５分ごとに生存状況を観察した。それは、３−ＭＡがマウスの死の遅延に対して効果を有することを証明している。
【図４６】図４６は、マウスの肺組織のリアルタイムＰＣＲの結果を示す。マウスに対照ｓｉＲＮＡおよびＡｔｇ５  ｓｉＲＮＡをそれぞれ注入して、２４時間後、肺組織を均質化し、ＲＮＡを抽出して、リアルタイムＰＣＲを行った。それは、Ａｔｇ５  ｓｉＲＮＡの気管注入がＡｔｇ５  ｍＲＮＡレベルの低下を効果的にもたらすことを証明している。
【図４７】図４７は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの肺組織の弾性の結果を示す。対照ｓｉＲＮＡおよびＡｔｇ５  ｓｉＲＮＡをそれぞれ注入し、２４時間後、対照（トリ將尿液）および不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスをそれぞれ注入した、マウスの肺組織の弾性を３０分ごとに測定した。自発呼吸するマウスの肺弾性の変化の測定を４時間行った。不活化鳥インフルエンザウイルスの気管注入はマウスの肺のコンプライアンスを著しく減少させるのに対し、Ａｔｇ５  ｓｉＲＮＡはＡｔｇ５タンパク質の発現の阻害を介して肺損傷をある程度軽減することから、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスがオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を活性化して肺損傷の発生を誘発することを示唆する。
【図４８】図４８は、棒グラフとしてＢａｌｂ／ｃマウスの肺湿／乾比を示す。対照ｓｉＲＮＡおよびＡｔｇ５  ｓｉＲＮＡをそれぞれ注入し、２４時間後、対照（トリ將尿液）および不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスをそれぞれ注入した、４時間後のマウスの肺組織の湿／乾比の結果である。肺湿／乾比は、肺損傷の重要な指標の一つであり、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスの注入は著しく湿／乾比を増加するのに対し、Ａｔｇ５  ｓｉＲＮＡはＡｔｇ５タンパク質の発現を阻害して肺損傷をある程度軽減することから、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスがオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を活性化して肺損傷の発生を誘発することを示唆する。
【図４９】図４９は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの肺の病理切片の写真（２００倍）を示す。図Ａは、酸吸引後Ｆｃタンパク質を気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの病理切片の写真を示す。図Ｂは、酸吸引後Ｈ５Ｆｃタンパク質を気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの病理切片の写真を示す。図Ｃは、酸吸引後３−ＭＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、３０分後、Ｈ５Ｆｃタンパク質を気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの病理切片の写真を示す。それは、酸吸引後のＨ５Ｆｃタンパク質が肺損傷を悪化させるのに対し、３−ＭＡは酸吸引後のＨ５Ｆｃタンパク質によって誘発された肺損傷をある程度改善することを証明している。
【図５０】図５０は、棒グラフとして油浸レンズ（１０００倍）下にて肺組織の病理切片に局在する炎症細胞数を示す。左から右に、それぞれ、酸吸引後Ｆｃタンパク質を気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの肺病理切片数、酸吸引後Ｈ５Ｆｃタンパク質を気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの肺病理切片数、および酸吸引後３−ＭＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、３０分後、Ｈ５Ｆｃタンパク質を気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの肺病理切片数を示す。炎症細胞浸潤は、重要な指標の一つである。Ｈ５Ｆｃタンパク質の注入は浸潤した炎症細胞数を増加させるのに対し、３−ＭＡはＨ５Ｆｃタンパク質によって誘発される炎症細胞数の増加を減少させる。結果は、酸吸引後のＨ５Ｆｃタンパク質が肺損傷を悪化させるのに対し、３−ＭＡが酸吸引後のＨ５Ｆｃタンパク質によって誘発される肺損傷をある程度改善することを証明している。
【図５１】図５１は、棒グラフとしてＢａｌｂ／ｃマウスの肺湿／乾比を示す。左から右に、それぞれ、酸吸引後Ｆｃタンパク質を気管注入した６時間後のマウスの肺湿／乾比、酸吸引後Ｈ５Ｆｃタンパク質を気管注入した６時間後のマウスの肺湿／乾比、酸吸引後３−ＭＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、３０分後、Ｈ５Ｆｃタンパク質を気管注入した６時間後のマウスの肺湿／乾比、酸吸引後ＬＹ２９４００２（０．２５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、３０分後、Ｈ５Ｆｃタンパク質を気管注入した６時間後のマウスの肺湿／乾比である。肺湿／乾比は、肺損傷の重要な指標の一つである。酸吸引後のＨ５Ｆｃタンパク質の気管注入は湿／乾比を著しく増加させるのに対し、３−ＭＡおよびＬＹ２９４００２は酸吸引後のＨ５Ｆｃタンパク質によって誘発される湿／乾比の増加を減少させた。結果は、酸吸引後のＨ５Ｆｃタンパク質が重篤な肺損傷を引き起こすのに対し、３−ＭＡおよびＬＹ２９４００２が酸吸引後のＨ５Ｆｃタンパク質によって誘発される肺損傷をある程度改善することを証明している。
【図５２】図５２は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真（２００００倍）を示す。図Ａの最初の写真は、４時間アジュバントで処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真を示し、図Ｃは、１時間Ｐ３８経路の特異的阻害薬、ＳＢ２０３５８０で前処置し、次いで、４時間不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真を示す。それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスの効果でＡ５４９細胞のオートファジーが起こったのに対し、Ｐ３８経路の特異的阻害薬、ＳＢ２０３５８０がオートファジーを減少させたことを証明している。
【図５３】図５３は、電子顕微鏡下にて観察された種々の処置を行ったオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴うＡ５４９細胞％の棒グラフを示す。左側の第一グラフは、４時間アジュバントで処置したオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴うＡ５４９細胞％を示し、第２グラフは、４時間不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴うＡ５４９細胞％を示し、第３グラフは、１時間Ｐ３８経路の特異的阻害薬、ＳＢ２０３５８０で処置し、次いで、４時間不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴うＡ５４９細胞％を示す。結果は、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスのみで処置したオートファジーを伴うＡ５４９細胞の比率が２４．３％であることを示す；Ｐ３８経路の阻害薬、ＳＢ２０３５８０で処置した後に不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置すると、オートファジーを伴うＡ５４９細胞の比率は７．７３％である。２つのケースの間には有意な違いがある。結果は、Ｐ３８経路の阻害薬、ＳＢ２０３５８０が不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスによって誘発されるオートファジーの発生を効果的に阻害しうることを証明している。
【図５４】図５４は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞におけるウエスタンブロット実験の結果を示す。左側の第１ラインは、４時間アジュバントで処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルを示し、第２ラインは、４時間不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルを示す；抗体は、それぞれ（上から下へ）、リン酸化Ｐ３８、Ｐ３８およびアクチン抗体である。それは、サンプル量がほとんど同量である（アクチンが同量のサンプルを確保するための内部パラメーターとして用いられる）場合に、リン酸化Ｐ３８の発現レベルが著しく増加する、すなわち、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスがＰ３８シグナル経路を活性化しうることを証明している。
【図５５】図５５は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの肺の病理切片の写真（２００倍）を示す。図Ａは、対照（トリ將尿液）を気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの病理切片の写真を示す。図Ｂは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの病理切片の写真を示す。図Ｃは、ＳＢ２０３５８０（１６ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、３０分後、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られた病理切片の写真を示す。それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスが重篤な肺損傷を引き起こすのに対し、ＳＢ２０３５８０が不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスによって誘発される肺損傷をある程度改善することを証明している。それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスがｐ３８シグナル経路を介して肺損傷を誘発することを示す。
【図５６】図５６は、棒グラフとして油浸レンズ（１０００倍）下の肺組織の病理切片に局在する炎症細胞数を示す。左から右に、それぞれ、対照（トリ將尿液）を気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの肺病理切片数、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの肺病理切片数、マウスにＳＢ２０３５８０（１６ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、３０分後、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザを気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの肺病理切片数を示す。炎症細胞浸潤は、肺損傷の重要な指標の一つである。不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスの注入は、非常に浸潤した炎症細胞をもたらすのに対し、ＳＢ２０３５８０は不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスによって誘発される浸潤した炎症細胞数を減少させる。結果は、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスが重篤な肺損傷を引き起こすのに対し、ＳＢ２０３５８０が不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスによって誘発される肺損傷をある程度改善することを証明している。
【図５７】図５７は、棒グラフとしてＢａｌｂ／ｃマウスの肺湿／乾比を示す。それは、左から右に、対照（トリ將尿液）を気管注入した６時間後のマウスの肺湿／乾比、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを気管注入した６時間後のマウスの肺湿／乾比、ＳＢ２０３５８０（１６ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、１時間後、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを気管注入した６時間後のマウスの肺湿／乾比を示す。肺湿／乾比は、肺損傷の重要な指標の一つである。不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスの注入は湿／乾比を著しく増加させたのに対し、ＳＢ２０３５８０は不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスによって誘発される湿／乾比の増加を減少させた。結果は、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスが重篤な肺損傷を引き起こすのに対し、ＳＢ２０３５８０が不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスによって誘発される肺損傷をある程度改善することを証明している。
【図５８】図５８は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの肺病理切片の写真（２００倍）を示す。左図は、酸吸引後Ｆｃタンパク質を気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの病理切片の写真である。中央図は、酸吸引後Ｈ５Ｆｃタンパク質を気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの病理切片の写真である。右図は、酸吸引後ＳＢ２０３５８０（１６ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、３０分後、Ｈ５Ｆｃタンパク質を気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの病理切片の写真である。酸吸入後のＨ５Ｆｃタンパク質の注入は肺損傷を悪化させるのに対し、ＳＢ２０３５８０は酸吸引後のＨ５Ｆｃタンパク質によって誘発される肺損傷をある程度改善することを証明している。
【図５９】図５９は、油浸レンズ（１０００倍）下の肺組織の病理切片に局在する炎症細胞数を示す。図Ａは、酸吸引後Ｆｃタンパク質を気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの肺病理切片数を示す。図Ｂは、酸吸引後Ｈ５Ｆｃタンパク質を気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの肺病理切片数を示す。図Ｃは、酸吸引後ＳＢ２０３５８０（１６ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、３０分後、Ｈ５Ｆｃタンパク質を気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの肺病理切片数を示す。炎症細胞浸潤は、肺損傷の重要な指標の一つである。Ｈ５Ｆｃタンパク質の注入は浸潤した炎症細胞数を増加させたのに対し、ｐＳＢ２０３５８０はＨ５Ｆｃタンパク質によって誘発される浸潤した炎症細胞の増加を減少させた。結果は、酸吸引後のＨ５Ｆｃタンパク質が肺損傷を悪化させるのに対し、ＳＢ２０３５８０が酸吸引後のＨ５Ｆｃタンパク質によって誘発される肺損傷をある程度改善することを証明している。
【図６０】図６０は、棒グラフとしてＢａｌｂ／ｃマウスの肺湿／乾比を示す。左から右に、それぞれ、酸吸引後Ｆｃタンパク質を気管注入した６時間後のマウスの肺湿／乾比、酸吸引後Ｈ５Ｆｃタンパク質を気管注入した６時間後のマウスの肺湿／乾比、酸吸引後ＳＢ２０３５８０（１６ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、３０分後、Ｈ５Ｆｃタンパク質を気管注入した６時間後のマウスの肺湿／乾比を示す。肺湿／乾比は、肺損傷の重要な指標の一つであり、酸吸引後のＨ５Ｆｃタンパク質の気管注入は肺湿／乾比を著しく増加させたのに対して、ＳＢ２０３５８０は酸吸引後のＨ５Ｆｃタンパク質によって誘発される肺湿／乾比の増加を減少させた。結果は、酸吸引後のＨ５Ｆｃタンパク質が重篤な肺損傷を引き起こすのに対し、ＳＢ２０３５８０が酸吸引後のＨ５Ｆｃタンパク質によって誘発される肺損傷をある程度改善することを証明している。
【図６１】図６１は、種々の処置をしたＡ５４９細胞の生存率を示す。Ａ５４９細胞を種々のナノメートル物質（ＰＡＭＡＭ）で処置し、２４時間後、Ａ５４９細胞の生存率をＭＴＴ法で測定した。
【図６２】図６２は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のゲノム電気泳動図を示す。Ａ５４９細胞を、対照、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、６％ｖ／ｖ）およびナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置した後、細胞を回収し、細胞のゲノムＤＮＡをゲノム抽出用キットで単離し、アガロースゲル電気泳動を行った。ジメチルスルホキシドは、アポトーシス誘導剤として用いた。
【図６３】図６３は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のカスパーゼ−３活性の結果を示す。Ａ５４９細胞を、対照、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、６％ｖ／ｖ）、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ５．５およびＰＡＭＡＭ  Ｇ３種でそれぞれ処置し。２４時間後、細胞のカスパーゼ−３活性をカスパーゼ−３活性試験キットで測定した。
【図６４】図６４は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真（２００００倍）を示す。図Ａは、２４時間対照で処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真を示す。図Ｂは、２４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ５．５（１００μｇ／ｍＬ）で処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真を示す。図Ｃは、２４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真を示す。図Ｄは、１時間３−ＭＡ（１０ｍＭ）で処置し、次いで、２４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真を示す。Ａナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ５の効果で５４９細胞のオートファジーが起こり、オートファジーによって誘発される細胞死は３−ＭＡによって軽減されうることを証明している。
【図６５】図６５は、オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴うＡ５４９細胞％の棒グラフを示す。オートファジーの発生後の細胞の典型的な特徴は、オートファゴソームの出現である。１００個のランダム細胞当たり２以上のオートファゴソームを有する細胞％を算出した。３−ＭＡがナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３によって誘発されるオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴う細胞％を減少させたことは明らかである。すなわち、３−ＭＡはオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を処置または軽減しうる。
【図６６】図６６は、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトし、次いで、異なる方法で処置したＡ５４９細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真（１０００倍）を示す。図Ａは、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトし、次いで、２４時間対照で処置したＡ５４９細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。図Ｂは、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトし、次いで、２４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ５．５（１００μｇ／ｍＬ）で処置したＡ５４９細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。図Ｃは、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトし、次いで、２４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置したＡ５４９細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。図Ｄは、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトし、３−ＭＡ（１０ｍＭ）で処置し、次いで、２４時間ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置したＡ５４９細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。
【図６７】図６７は、上記の条件下でのＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴う細胞％の棒グラフを示す。オートファジーの発生後の細胞の典型的な特徴は、ＬＣ３（ＡＴＧ８）分子を凝集してオートファゴソームを形成することである。ＬＣ３分子をＥＧＦＰで標識化した。細胞にオートファジーが起こった場合には、ＬＣ３分子が凝集して、強く発光する緑色蛍光が共焦点顕微鏡下にて観察されうる。しかしながら、細胞にオートファジーが起こらなかった場合には、緑色蛍光は分散するかまたはほんの少しだけ凝集する。それは、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３の効果でＡ５４９細胞のオートファジーが起こり、オートファジーによって誘発される細胞死が３−ＭＡによって軽減されうることを証明している。
【図６８】図６８は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験の結果を示す。左側の第１ラインは、４時間対照で処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルを示し、第２ラインは、４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ５．５（１００μｇ／ｍＬ）で処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルを示し、第３ラインは、４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルを示す；抗体は、それぞれ（上から下へ）、ＬＣ３Ｂおよびアクチン抗体である。それは、ＬＣ３Ｂ−ＩＩタンパク質の発現レベルが有意に増加したことを証明している。すなわち、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３はオートファジーを誘発する。
【図６９】図６９は、異なる処置をしたＡ５４９細胞の生存率を示す。Ａ５４９細胞を、１時間対照、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ５．５、ＰＡＭＡＭ  Ｇ３、３−ＭＡでそれぞれ前処理し、次いで、２４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３および薬物対照３−ＭＡで処置した。細胞の生存率の結果をＭＴＴ法で測定した。それは、３−ＭＡがナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３によって誘発される細胞死を有意に減少しうることを示す。
【図７０】図７０は、異なる処置をしたＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験の結果を示す。サンプルは、２４時間対照ｓｉＲＮＡまたはＡＴＧ６  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＡ５４９細胞の溶解サンプルである。抗体は、それぞれ（上から下へ）、ＡＴＧ６およびアクチン抗体である。ウエスタンブロット実験の結果は、ＡＴＧ６  ｓｉＲＮＡがＡＴＧ６遺伝子の発現を有効に阻害することを示す。
【図７１】図７１は、種々の処置をしたＡ５４９細胞の生存率を示す。Ａ５４９細胞に、対照ｓｉＲＮＡおよびＡＴＧ６  ｓｉＲＮＡをそれぞれトランスフェクトした。次いで、２４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置した。細胞の生存率をＭＴＴ法で測定した。それは、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３がＡＴＧ６遺伝子の発現を調節することによって細胞死を誘発して、オートファジーを形成することを証明している。
【図７２】図７２は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験の結果を示す。Ａ５４９細胞は、４時間異なる種類のナノメートル物質（ＰＡＭＡＭ）で処置した。次いで、細胞中のＬＣ３−ＩＩの発現レベルをウエスタンブロット法で検出した。それは、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ４、Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７、Ｇ８すべてが細胞中のＬＣ３−ＩＩの発現レベルを増加させたことを示し、全てのこれらのナノメートル物質が細胞死を引き起こすためにオートファジーを誘発しうることを示唆する。
【図７３】図７３は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅ−４．６．３のソフトウェアを用いて図７５に示されるウエスタンブロット実験から得られたバンドの濃度で定量化した相対比の棒グラフを示す。それらは、連続して、陰性対照、Ｇ５．５、Ｇ４、Ｇ６、Ｇ７およびＧ８で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験におけるＬＣ３ＩＩ対アクチンの相対比を示す、対照値を１に調整。他のグループの値は、対照値で割った。それは、Ｇ４、Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７およびＧ８がＬＣ３シグナル経路を活性化し、オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を誘発しうることを証明している。
【図７４】図７４は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット法の結果を示す。Ａ５４９細胞は、２４時間異なる種類のナノメートル物質（ＰＡＭＡＭ）で処置し、細胞の生存率の結果をＭＴＴ法で測定した。それは、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ４、Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７およびＧ８すべてが細胞死を誘発しうることを証明している。
【図７５】図７５は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験の結果を示す。第１ラインは、２４時間対照で処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルを示し、第２ラインは、２４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ５．５で処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルを示し、第３ラインは、２４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３で処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルを示す；抗体は、それぞれ（上から下へ）、２４８１位リン酸化ｍＴＯＲ抗体および全ｍＴＯＲ抗体である。それは、リン酸化ｍＴＯＲタンパク質の発現レベルが有意に減少したことを証明している。すなわち、ｍＴＯＲ経路を阻害する。
【図７６】図７６は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅ−４．６．３のソフトウェアを用いて図７８に示されるウエスタンブロット実験から得られたバンドの濃度を定量化した相対比の棒グラフを示す。それは、連続して、対照、Ｇ５．５（１００μｇ／ｍＬ）、およびＧ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験におけるリン酸化ｍＴＯＲ対ｍＴＯＲタンパク質の相対比を示す、対照値を１に調整。他のグループの値は、対照値で割った。それは、Ｇ３がｍＴＯＲシグナル経路を阻害し、オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を誘発しうることを証明している。
【図７７】図７７は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験の結果を示す。第１ラインは、２４時間対照で処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルを示し、第２ラインは、２４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ５．５（１００μｇ／ｍＬ）で処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルを示し、第３ラインは、２４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルを示す；抗体は、それぞれ（上から下へ）、リン酸化Ｓ６抗体および全Ｓ６抗体である。それは、リン酸化Ｓ６タンパク質の発現レベルが有意に減少し、Ｓ６経路が阻害されることを証明している。すなわち、ｍＴＯＲ経路を阻害する。
【図７８】図７８は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅ−４．６．３のソフトウェアを用いて図８０に示されるウエスタンブロット実験から得られたバンドの濃度を定量化した相対比の棒グラフを示す。それらは、連続して、陰性対照、Ｇ５．５（１００μｇ／ｍＬ）、およびＧ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験におけるリン酸化Ｓ６対Ｓ６タンパク質の相対比を示す、対照値を１に調整。他のグループの値は、対照値で割った。それは、Ｇ３がＳ６の活性化を阻害しうる、すなわち、Ｇ３がｍＴＯＲシグナル経路を阻害し、オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を引き起こしうることを証明している。
【図７９】図７９は、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトし、次いで、異なる方法で処置したＡ５４９細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真（１０００倍）を示す。図Ａは、２４時間対照ｓｉＲＮＡで処置し、次いで、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置した細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。図Ｂは、２４時間ＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡで処置し、次いで、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置した細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。
【図８０】図８０は、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトしたＡ５４９細胞を異なる方法で処置した後の、ＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴う細胞％を示す。図Ａは、Ａ５４９細胞に陰性対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、次いで、ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置した後の、ＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴う細胞％を示し、図Ｂは、Ａ５４９細胞にＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、次いで、ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）を処置した後の、ＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴う細胞％を示す。それは、ＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡがＰＡＭＡＭ  Ｇ（１００μｇ／ｍＬ）によって誘発されるオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を阻害しうることを証明している。
【図８１】図８１は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験の結果を示す。Ａ５４９細胞に対照ｓｉＲＮＡおよびＴＳＣ  ２  ｓｉＲＮＡをそれぞれトランスフェクトし、次いで、２４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置して、細胞の生存率をＭＴＴ法で測定した。それは、ＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡがＴＳＣ２遺伝子の発現を有効に阻害することを示す。
【図８２】図８２は、種々の処置したＡ５４９細胞の生存率を示す。Ａ５４９細胞に対照ｓｉＲＮＡおよびＴＳＣ  ２  ｓｉＲＮＡをそれぞれトランスフェクトし、次いで、２４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置して、細胞の生存率をＭＴＴ法で測定した。それは、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３がＴＳＣ  ２遺伝子の発現を調節することによって細胞死を誘発して、オートファジーを形成することを立証している。
【図８３】図８３は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロットおよび定量分析の結果を示す。第１ラインは、２４時間対照で処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルを示し、第２ラインは、２４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ５．５（１００μｇ／ｍＬ）で処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルを示し、第３ラインは、２４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルを示す；抗体は、それぞれ（上から下へ）、リン酸化Ａｋｔ抗体および全Ａｋｔ抗体である。それは、リン酸化Ａｋｔタンパク質の発現レベルが有意に減少することでＡｋｔ経路を阻害することを証明している。
【図８４】図８４は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅ−４．６．３のソフトウェアを用いて図８６に示されるウエスタンブロット実験から得られるバンドの濃度を定量化した相対比の棒グラフを示す。それらは、連続して、陰性対照、Ｇ５．５（１００μｇ／ｍＬ）、およびＧ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験におけるリン酸化ａｋｔ対ａｋｔタンパク質の相対比を示す、対照値を１に調整。他のグループの値は対照値で割った。それは、Ｇ３がａｋｔシグナル経路の活性化を阻害しうることを証明している。
【図８５】図８５は、細胞シグナル経路の略図を示す。上記の実験結果から、本発明者らは略図に示されるように結論づけることができる：ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３がＡｋｔ−ＴＳＣ１／２−ｍＴＯＲ−オートファジーの経路を活性化しうる。ｍＴＯＲの活性化は、オートファジーの発生を阻害しうる；ＴＳＣ１／２の活性化は、オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を促進するためにｍＴＯＲの活性化を阻害しうる。
【図８６】図８６は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの肺病理切片の写真（２００倍）を示す。図Ａは、対照を気管注入し、４時間後、肺を摘出して得られたマウスの病理切片の写真を示す。図Ｂは、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ５．５（１００μｇ／ｍＬ）を気管注入し、４時間後、肺を摘出して得られたマウスの病理切片の写真を示す。図Ｃは、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）を気管注入し、４時間後、肺を摘出して得られたマウスの病理切片の写真を示す。それは、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３が重篤な肺損傷を引き起こすことを証明している。
【図８７】図８７は、棒グラフとしてＢａｌｂ／ｃマウスの肺湿／乾比を示す。それらは、左から右に、対照を気管注入した１６時間後のマウスの肺湿／乾比、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ５．５（１００μｇ／ｍＬ）を気管注入した１６時間後のマウスの肺湿／乾比、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）を気管注入した１６時間後のマウスの肺湿／乾比、３−ＭＡを腹腔内注射し、１時間後、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３を気管注入した１６時間後のマウスの肺湿／乾比、および３−ＭＡ（１５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した１７時間後のマウスの肺湿／乾比を示す。肺湿／乾比は、肺損傷の重要な指標の一つである。ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３の気管注入は肺組織の湿／乾比を増加させるのに対し、３−ＭＡはナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３によって誘発されるマウスの肺湿／乾比の増加を軽減する。結果は、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３が重篤な肺損傷を引き起こすのに対し、３−ＭＡがナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３によって誘発される肺損傷をある程度改善することを証明している。
【図８８】図８８は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの肺弾性の変化の略図を示す。左から右に、連続して、対照を気管注入したＢａｌｂ／ｃマウスの肺弾性の変化、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ５．５（５０ｍｇ／ｋｇ）を気管注入したマウスの肺弾性の変化、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（５０ｍｇ／ｋｇ）を注入したマウスの肺弾性の変化、３−ＭＡ（１５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、１時間後、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３を注入したマウスの肺弾性の変化を示す。肺弾性は、肺損傷の重要な指標の一つである。ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３はマウスの肺弾性の変化を引き起こすのに対し、３−ＭＡはナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３によって誘発されるマウスの肺弾性の変化を軽減する。結果は、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３が重篤な肺損傷を引き起こすのに対し、３−ＭＡがナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３によって誘発される肺損傷をある程度改善することを証明している。
【図８９】図８９は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの生存曲線を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスは以下のように処置された：対照を気管注入した；ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ５．５（５０ｍｇ／ｋｇ）を気管注入した；ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（５０ｍｇ／ｋｇ）を気管注入した；３−ＭＡ（１５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、１時間後、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（５０ｍｇ／ｋｇ）を気管注入した；および３−ＭＡ（１５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。マウスを継続して２４時間観察した。１時間おきに生存しているマウス数を計測して、統計解析を行った。結果：ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３はマウスの死亡率を増加させるのに対し、３−ＭＡはナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３によって誘発されるマウスの死亡を有意に軽減しうる。
【図９０】図９０は、ウォルトマンニンの構造式を示す。ＣＡＳ番号は１９５４５−２６−７であり、分子式はＣ２３Ｈ２４Ｏ８であり、分子量は４２８．４３である。
【図９１】図９１は、ＬＹ−２９４，００２の構造式を示す。ＣＡＳ番号は９３４３８９−８８−５であり、分子式はＣ１９Ｈ１７ＮＯ３・ＨＣｌであり、分子量は３４３．８０である。
【図９２】図９２は、３−メチルアデニンの構造を示す。ＣＡＳ番号は１５１４２−２３−４であり、分子式はＣ６Ｈ７Ｎ５であり、分子量は１４９．１５である。
【図９３】図９３は、ＳＢ  ２０３５８０の構造を示す。ＣＡＳ番号は１５２１２１−４７−６であり、分子式はＣ２１Ｈ１６ＦＮ３ＯＳであり、分子量は３７７．４３である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
用語の説明
本発明における「オートファジー性プログラム細胞死」なる語はまた、ＩＩ型プログラム細胞死（オートファジー）と称される。かかる種類の細胞死は、大量の液胞を含む細胞質および細胞質における細胞小器官の出現, ならびにリソソームによる液胞内の成分の分解を主に特徴とする。オートファジーは、細胞の増殖、発達および疾患に重要な役割を果たす。オートファジーとは、主に、分解した細胞内の損傷細胞構造、老化細胞小器官および不必要な生体高分子を除去することである。オートファジーはまた、消化と同時に細胞中の細胞小器官の構築のための原料を提供する、すなわち、細胞構造をリサイクルする。
【００２９】
「ＳＢ２０３５８０」なる語は、当業者にてＳＢ  ２０３５８０またはＳＢ−２０３５８０とも称され、一般的なｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤の一種である。ＳＢ２０３５８０は、細胞を透過し、ｐ３８  ＭＡＰＫ（ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ）を阻害し、フォローアップＭＡＰＫＡＰキナーゼ−２およびＭＡＰＫＡＰキナーゼ−３の活性化を阻害しうる。ＳＢ２０３５８０は、ｐ３８  ＭＡＰＫの阻害を介してある炎症因子（ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αなど）によって誘発されるシグナル伝達の一部を効果的に阻害しうる。ＳＢ２０３５８０はｐ３８  ＭＡＰＫを選択的に阻害し、ＩＣ５０は６００ｎＭである；それは、ＪＮＫ／ＳＡＰＫおよびｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（すなわち、Ｅｒｋ１／２）に対する顕著な阻害効果を有しておらず、ＩＣ５０は１００μＭのみである。ＳＢ２０３５８０の分子量は３７７．４３であり、分子式はＣ２１Ｈ１６ＦＮ３ＯＳであり、ＣＡＳ番号は１５２１２１−４７−６である。一般的に、生成物の純度は９９％以上である。
【００３０】
「３−ＭＡ」または「３ＭＡ」なる語は、３−メチルアデニンの略称である。３−ＭＡは、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼの阻害剤であり、それは、オートファジーにおける自己貪食空胞およびリソソームの融合を特異的に阻害することができ、オートファジーの阻害剤として広く用いられている（Ｐｅｒ  Ｏ  ＳｅｇｌｅｎおよびＰａｕｌ  Ｂ  Ｇｏｒｄｏｎ．（１９８２）  ３−Ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｉｎｅ：ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ／ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｒａｔ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７９（６）：１８８９−１８９２）。
【００３１】
「ＬＹ２９４００２」なる語は、当業者にてＬＹ−２９４，００２、ＬＹ−２９４００２またはＬＹ  ２９４００２とも称され、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ細胞シグナル伝達経路を阻害しうる一般的なプロテインキナーゼ阻害薬の一種である。ＬＹ２９４００２は、細胞を透過し、ＰＩ３Ｋを特異的に阻害し、Ａｋｔのリン酸化の一般的阻害を含む、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔのシグナル伝達経路を阻害しうる。精製されたＰＩ３Ｋに対するＬＹ２９４００２のＩＣ５０は、１．４μＭである。ＬＹ２９４００２の分子量は３０７．３であり、分子式はＣ１９Ｈ１７ＮＯ３であり、ＣＡＳ番号は１５４４４７−３６−６である。一般的には、生成物の純度は９８％以上である。
【００３２】
バフィロマイシンＡ１はまた、オートファジー阻害剤として用いられうる。
【００３３】
急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）は、肺内および肺外疾患の発症、例えば、重症感染症、外傷、ショックによって誘発される肺胞毛細血管損傷によって主に特徴付けられる臨床症候群であり、重篤な段階または種類の急性肺損傷（ＡＬＩ）に属する。ＡＲＤＳの臨床的特徴には、頻呼吸および呼吸困難、進行性低酸素症、Ｘ線で示されるびまん性肺胞浸潤が含まれる。
【実施例】
【００３４】
実施例１
発現宿主においてほとんど用いられないＨ１５タンパク質をコードするコドンを、コドン最適化およびヒト型化の遺伝子最適化方法によって発現宿主において高頻度で用いられるコドンで置き換えた。野生型Ｈ５Ｎ１型ウイルスのＨ５タンパク質に相当するアミノ酸配列（Ａ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／４（ＳＰ−５２８）／２００４（Ｈ５Ｎ１））をＮＣＢＩで探索した。Ｈ５タンパク質をコードする多数の最適化遺伝子配列を得るために、前記アミノ酸配列をコードするコドンを、発現宿主において高頻度で用いられものに置き換えた。複合体二次構造を形成しうる配列をＤＮＡＭＡＮのソフトウェアを用いて取り除き、膜貫通領域をコードする配列を含まない最適化Ｈ５遺伝子を抽出した。遺伝子を、プラスミド構築のための標的遺伝子として用いるためにＱｉｎｇｋｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｏ．，ＬＴＤで合成した。
合成配列は配列番号１に示されている。
【００３５】
実施例２
プラスミドの構築および検出（実験方法は「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、第３版参照）
ベクター：Ｐｅａｋ１３  ＣＤ５Ｌ  ＴＥＶヒトＩｇＧ（発明者の実験室に保存）
挿入フラグメント：膜貫通配列を含まない最適化Ｈ５遺伝子
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇに示される酵素消化、電気泳動、精製、ライゲーションおよび形質転換のプロセス後に、挿入されたフラグメントを同定した。さらなる確認のために、酵素（Ｎｈｅ  Ｉ／ＢａｍＨＩ）消化によって正しい試験プラスミドの配列を決定した（Ｑｉｎｇｋｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｏ．，ＬＴＤ）。
【００３６】
実験結果は図１に示される。ライン１、２および３は、それぞれ、λ−ＨｉｎｄＩＩＩマーカー、Ｐｅａｋ１３  ＣＤ５Ｌ  Ｈ５  ＴＥＶヒトＩｇＧ、Ｄ２０００マーカーを示す。λ−ＨｉｎｄＩＩＩマーカーの大きさは、小さいものから大きい（下から上の）順に、５６４ｂｐ（図から識別することが困難）、２０２７ｂｐ、２３２２ｂｐ、４３６１ｂｐ、６５５７ｂｐ、９４１６ｂｐおよび２３１３０ｂｐである；Ｄ２０００マーカーの大きさは、小さいものから大きい（下から上の）順に、１００ｂｐ、２５０ｂｐ、５００ｂｐ、７５０ｂｐ、１０００ｂｐおよび２０００ｂｐである。プラスミドをＮｈｅ  Ｉ／ＢａｍＨＩ酵素で切断して１．５６Ｋｂフラグメントが得られ、それはＨ５遺伝子が発現ベクターに挿入されていることを証明している。
【００３７】
実施例３  プラスミドの大量抽出
ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離法によって、大量の組換えプラスミドを抽出した（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、第３版参照）。
【００３８】
実施例４  トランスフェクション
２ｘ１０５細胞を６ウェル細胞培養プレートの各ウェルに分注し、２４時間後、Ｈ５遺伝子を含有する構築した組換えプラスミドをリポソーム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）から入手可能なｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００）を用いてトランクフェクトした。一定期間インキュベートした後、培養細胞を回収した。融合タンパク質の分子量をウエスタンブロット法で決定した。
【００３９】
実施例５  ウエスタンブロット法での不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスの作用によるＡ５４９細胞におけるタンパク質の発現レベルの変化の測定
１）対数増殖期のＡ５４９細胞を６ウェルプレートに分注した。
２）２４時間後、感染多重度（Ｍ．Ｏ．Ｉ．）が２である、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスはまたは同量のトリ將尿液を加えた。
３）１．５時間後、溶解した細胞を回収した。ＬＣ３の変化をウエスタンブロット法によって測定し、アクチンをローディング量の内部パラメーターとして用いた；あるいは、４時間後、溶解した細胞を回収し、リン酸化ｍＴＯＲ、リン酸化Ｓ６、およびリン酸化Ａｋｔの発現レベルの変化をウエスタンブロット法によって測定し、対応する全タンパク質をローディング量の内部パラメーターとして用いた。
【００４０】
タンパク質の分子量を、当業者に既知のウエスタンブロット法によって測定した。あるタンパク質のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを決定するために、半定量測定もまた行った（ウエスタンブロット法の具体的な実験方法は「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、第３版参照）。
【００４１】
実験にて用いられる一次抗体、抗ｍＴＯＲ、抗リン酸化ｍＴＯＲ（Ｓｅｒ２４８１）、抗ＡＫＴ、抗リン酸化ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）はすべて、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した；一次抗体、抗ＬＣ３ＢはＡｂｃａｍから購入した；抗ＴＳＣ２、抗ＡＴＧ５および抗ＡＴＧ１２の一次抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した；抗β−アクチンの一次抗体は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した；西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識された二次抗体もウエスタンブロット用キットもＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した；３−メチルアデニンおよびラパマイシンをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【００４２】
実験結果は、図２、２０、２３、２５、２７、３１、３４、４１、５４、６８、７０、７２、７５、７７、８１および８３に示される。
【００４３】
図２は、ウエスタンブロット法で測定した２９３ＥＴ細胞で発現した融合タンパク質Ｈ５Ｆｃの発現結果を示す。それは、融合タンパク質Ｈ５Ｆｃが宿主細胞で良好に発現され、発現タンパク質の分子量が約１１０ＫＤおよび６０ＫＤであることを証明している。Ｈ５タンパク質は、宿主内の酵素によって切断され、２つのバンドを形成している。
【００４４】
図２０は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験の結果を示す。左側の第１ラインは、１．５時間陰性対照で処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルであり、第２ラインは、１．５時間不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルである；抗体は、それぞれ（上から下へ）、ＬＣ３およびアクチンである。ＬＣ３ＩＩの相対的発現レベルは増大しており、それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスがＬＣ３シグナル経路を活性化し、オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を誘発することを証明している。
【００４５】
図２３は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験の結果を示す。左側ラインは、対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、次いで、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルであり、右側ラインは、対照Ａｔｇ１２  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、次いで、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルである；抗体は、それぞれ（上から下へ）、Ａｔｇ１２およびアクチン抗体である。Ａｔｇ５およびＡｔｇ１２は細胞内で複合体を形成してオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を誘発するため、検出された結果は、アクチンに対するＡｔｇ５およびＡｔｇ１２の複合体の相対量で示す。それは、Ａｔｇ１２  ｓｉＲＮＡがＡｔｇ５およびＡｔｇ１２の複合体の相対量を効果的に減少させることを証明している。
【００４６】
図２５は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験の結果を示す。左側ラインは、陰性対照でＡ５４９細胞の溶解サンプルであり、右側ラインは不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルである；抗体は、それぞれ（上から下へ）、リン酸化Ｓ６、Ｓ６およびアクチン抗体である。Ｓ６はｍＴＯＲの基質であり、リン酸化Ｓ６の相対的減少は、ｍＴＯＲ経路の活性を阻害したことを示しており、それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスがｍＴＯＲシグナル経路を阻害し、さらに、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスがｍＴＯＲシグナル経路を介してオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を誘発することを証明している。
【００４７】
図２７は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験の結果を示す。左側ラインは、陰性対照で処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルであり、右側ラインは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルである；抗体は、それぞれ（上から下へ）、リン酸化ｍＴＯＲおよびｍＴＯＲ抗体である。リン酸化ｍＴＯＲの量は相対的に減少しており、それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスがｍＴＯＲシグナル経路を阻害することおよび不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスがｍＴＯＲシグナル経路の阻害を介してオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を誘発することを証明している。
【００４８】
図３１は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験の結果を示す。対照ｓｉＲＮＡおよびＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡをそれぞれトランスフェクトしたＡ５４９細胞のサンプルは、トランスフェクションの４８時間後に溶解した；抗体は、それぞれ（上から下へ）、ＴＳＣ２およびアクチン抗体である。それは、ＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡがＴＳＣ２の発現レベルを有意に減少しうることを証明している。
【００４９】
図３４は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験の結果を示す。左側ラインは、陰性対照で処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルであって、右側ラインは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルである；抗体は、それぞれ（上から下へ）、リン酸化ＡｋｔおよびＡｋｔ抗体である。リン酸化Ａｋｔの相対量の減少は、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスがＡｋｔシグナル経路を阻害しうることを示す。
【００５０】
図４１は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの肺組織ＬＣ３のウエスタンブロットの結果を示す。第１ラインは、２時間対照（トリ將尿液）を気管注入したマウスの均質化肺組織から抽出された全タンパク質のサンプルを示す；第２ラインは、２時間不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを気管注入したマウスの均質化肺組織から抽出された全タンパク質のサンプルを示し、第３ラインは、３−ＭＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、３０分後、２時間不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを気管注入したマウスの均質化肺組織から抽出された全タンパク質のサンプルを示す。抗体は、ＬＣ３およびβ−アクチンである。それは、マウスの肺組織中のＬＣ３  ＩＩ含量が不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスの刺激によって増加してオートファジーが起こるのに対し、３−ＭＡがオートファジーの発生を軽減することを証明している。
【００５１】
図５４は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞におけるウエスタンブロット実験の結果を示す。左側の第１ラインは、４時間アジュバントで処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルを示し、第２ラインは、４時間不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルを示す；抗体は、それぞれ（上から下へ）、リン酸化Ｐ３８、Ｐ３８およびアクチン抗体である。それは、サンプル量がほとんど同量である（アクチンが同量のサンプルを確保するための内部パラメーターとして用いられる）場合に、リン酸化Ｐ３８の発現レベルが著しく増加する、すなわち、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスがＰ３８シグナル経路を活性化しうることを証明している。
【００５２】
図６８は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験の結果を示す。左側の第１ラインは、４時間対照で処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルを示し、第２ラインは、４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ５．５（１００μｇ／ｍＬ）で処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルを示し、第３ラインは、４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルを示す；抗体は、それぞれ（上から下へ）、ＬＣ３Ｂおよびアクチン抗体である。それは、ＬＣ３Ｂ−ＩＩタンパク質の発現レベルが有意に増加したことを証明している。すなわち、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３はオートファジーを誘発する。
【００５３】
図７０は、異なる処置をしたＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験の結果を示す。サンプルは、２４時間対照ｓｉＲＮＡまたはＡＴＧ６  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＡ５４９細胞の溶解サンプルである。抗体は、それぞれ（上から下へ）、ＡＴＧ６およびアクチン抗体である。ウエスタンブロット実験の結果は、ＡＴＧ６  ｓｉＲＮＡがＡＴＧ６遺伝子の発現を有効に阻害することを示す。
【００５４】
図７２は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験の結果を示す。Ａ５４９細胞は、４時間異なる種類のナノメートル物質（ＰＡＭＡＭ）で処置した。次いで、細胞中のＬＣ３−ＩＩの発現レベルをウエスタンブロット法で検出した。それは、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ４、Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７、Ｇ８すべてが細胞中のＬＣ３−ＩＩの発現レベルを増加させたことを示し、全てのこれらのナノメートル物質が細胞死を引き起こすためにオートファジーを誘発しうることを示唆する。
【００５５】
図７５は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験の結果を示す。第１ラインは、２４時間対照で処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルを示し、第２ラインは、２４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ５．５で処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルを示し、第３ラインは、２４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３で処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルを示す；抗体は、それぞれ（上から下へ）、２４８１位リン酸化ｍＴＯＲ抗体および全ｍＴＯＲ抗体である。それは、リン酸化ｍＴＯＲタンパク質の発現レベルが有意に減少したことを証明している。すなわち、ｍＴＯＲ経路を阻害する。
【００５６】
図７７は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験の結果を示す。第１ラインは、２４時間対照で処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルを示し、第２ラインは、２４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ５．５（１００μｇ／ｍＬ）で処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルを示し、第３ラインは、２４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルを示す；抗体は、それぞれ（上から下へ）、リン酸化Ｓ６抗体および全Ｓ６抗体である。それは、リン酸化Ｓ６タンパク質の発現レベルが有意に減少し、Ｓ６経路が阻害されることを証明している。すなわち、ｍＴＯＲ経路を阻害する。
【００５７】
図８１は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験の結果を示す。Ａ５４９細胞に対照ｓｉＲＮＡおよびＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡをそれぞれトランスフェクトし、次いで、２４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置して、細胞の生存率をＭＴＴ法で測定した。それは、ＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡがＴＳＣ２遺伝子の発現を有効に阻害することを示す。
【００５８】
図８３は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロットおよび定量分析の結果を示す。第１ラインは、２４時間対照で処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルを示し、第２ラインは、２４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ５．５（１００μｇ／ｍＬ）で処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルを示し、第３ラインは、２４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルを示す；抗体は、それぞれ（上から下へ）、リン酸化Ａｋｔ抗体および全Ａｋｔ抗体である。それは、リン酸化Ａｋｔタンパク質の発現レベルが有意に減少することでＡｋｔ経路を阻害することを証明している。
【００５９】
実施例６  ウエスタンブロットの定量分析
１）ウエスタンブロットの結果をスキャンした。
２）Ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅ−４．６．３のソフトウェアによってウエスタンブロット実験で読み込む必要があるバンドの濃度を定量化した。
３）比較する必要があるバンドの比率を計算した。
４）他の相対値を得るために対照値を１に調整した。
【００６０】
実験結果は、図２１、２４、２６、２８、３２、３５、４２、７３、７６、７８および８４に示される。
【００６１】
図２１は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅ−４．６．３のソフトウェアを用いて図２２に示される繰り返されたウエスタンブロット実験から得られたバンドの濃度を定量化した相対比の棒グラフを示す。左図は、ウエスタンブロット実験にて陰性対照で処置したＡ５４９細胞におけるＬＣ３ＩＩ対アクチン相対比を示し、右図は、ウエスタンブロット実験にて不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞におけるＬＣ３ＩＩ対アクチンの相対比を示す、比率の値を１に調整。それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスがＬＣ３シグナル経路を活性化し、オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を誘発することを証明している。
【００６２】
図２４は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅ−４．６．３のソフトウェアを用いて図２５に示される繰り返されたウエスタンブロット実験から得られたバンドの濃度を定量化した相対比の棒グラフを示す。左図は、対照ｓｉＲＮＡをトランクフェクトしたＡ５４９細胞におけるに対するＡｔｇ５およびＡｔｇ１２の複合体対アクチンの相対比を示す、該値を１に調整。右図は、対照Ａｔｇ１２  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＡ５４９細胞におけるＡｔｇ５およびＡｔｇ１２の複合体対アクチン相対比を示す。それは、Ａｔｇ１２  ｓｉＲＮＡがＡｔｇ５およびＡｔｇ１２の複合体の相対量を効果的に減少させることを証明されている。
【００６３】
図２６は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅ−４．６．３のソフトウェアを用いて繰り返されたウエスタンブロット実験から得られたバンドの濃度を定量化した相対比の棒グラフを示す。左図は、ウエスタンブロット実験にて陰性対照で処置したＡ５４９細胞におけるリン酸化Ｓ６対Ｓ６の相対比を示す、該値を１に調整。右図は、ウエスタンブロット実験にて不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞におけるリン酸化Ｓ６対Ｓ６の相対比を示す。それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスがｍＴＯＲシグナル経路を阻害し、さらに、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスがｍＴＯＲシグナル経路の阻害を介してオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を誘発することを証明している。
【００６４】
図２８は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅ−４．６．３のソフトウェアを用いて繰り返されたウエスタンブロット実験から得られたバンドの濃度を定量化した相対比の棒グラフを示す。左図は、ウエスタンブロット実験にて陰性対照で処置したＡ５４９細胞のリン酸化ｍＴＯＲ対ｍＴＯＲの相対比を示す、該値を１に調整。右図は、ウエスタンブロット実験にて不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞におけるリン酸化ｍＴＯＲ対ｍＴＯＲの相対比を示す。それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスがｍＴＯＲシグナル経路を阻害することおよび不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスがｍＴＯＲシグナル経路の阻害を介してオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を誘発することを証明している。
【００６５】
図３２は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅ−４．６．３のソフトウェアを用いて図２５に示される繰り返されたウエスタンブロット実験から得られたバンドの濃度を定量化した相対比の棒グラフを示す。左図は、対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＡ５４９細胞におけるＴＳＣ２対アクチンの相対比を示す、該比率の値を１に調整。右図は、ＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＡ５４９細胞におけるＴＳＣ２対アクチンの相対比を示す。それは、ＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡがＴＳＣ２の発現レベルを有意に減少しうることを証明している。
【００６６】
図３５は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅ−４．６．３のソフトウェアを用いて繰り返されたウエスタンブロット実験から得られたバンドの濃度を定量化した相対比の棒グラフを示す。左図は、ウエスタンブロット結果における陰性対照で処置したＡ５４９細胞におけるリン酸化Ａｋｔ対Ａｋｔの相対比を示す、該比率の値を１に調整。右図は、ウエスタンブロット結果における不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞におけるリン酸化Ａｋｔ対Ａｋｔの相対比を示す。それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスがＡｋｔシグナル経路を阻害しうることを証明している。
【００６７】
図４２は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅ−４．６．３のソフトウェアを用いて繰り返されたウエスタンブロット実験から得られたバンドの濃度を定量化した相対比の棒グラフを示す。ＬＣ３  ＩＩ対β−アクチンの相対比は、図４２に示されるバンドの濃度に相当する。それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルス刺激によってマウスの肺組織におけるＬＣ３  ＩＩ含量が増加してオートファジーを引き起こすのに対し、３−ＭＡはオートファジーの発生を軽減することを証明している。
【００６８】
図７３は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅ−４．６．３のソフトウェアを用いて図７５に示されるウエスタンブロット実験から得られたバンドの濃度で定量化した相対比の棒グラフを示す。それらは、連続して、陰性対照、Ｇ５．５、Ｇ４、Ｇ６、Ｇ７およびＧ８で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験におけるＬＣ３ＩＩ対アクチンの相対比を示す、対照値を１に調整。他のグループの値は、対照値で割った。それは、Ｇ４、Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７およびＧ８がＬＣ３シグナル経路を活性化し、オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を誘発しうることを証明している。
【００６９】
図７６は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅ−４．６．３のソフトウェアを用いて図７８に示されるウエスタンブロット実験から得られたバンドの濃度を定量化した相対比の棒グラフを示す。それは、連続して、対照、Ｇ５．５（１００μｇ／ｍＬ）、およびＧ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験におけるリン酸化ｍＴＯＲ対ｍＴＯＲタンパク質の相対比を示す、対照値を１に調整。他のグループの値は、対照値で割った。それは、Ｇ３がｍＴＯＲシグナル経路を阻害し、オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を誘発しうることを証明している。
【００７０】
図７８は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅ−４．６．３のソフトウェアを用いて図８０に示されるウエスタンブロット実験から得られたバンドの濃度を定量化した相対比の棒グラフを示す。それらは、連続して、陰性対照、Ｇ５．５（１００μｇ／ｍＬ）、およびＧ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験におけるリン酸化Ｓ６対Ｓ６タンパク質の相対比を示す、対照値を１に調整。他のグループの値は対照値で割った。それは、Ｇ３がＳ６の活性化を阻害しうる、すなわち、Ｇ３がｍＴＯＲシグナル経路を阻害し、オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を引き起こしうることを証明している。
【００７１】
図８４は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅ−４．６．３のソフトウェアを用いて図８６に示されるウエスタンブロット実験から得られるバンドの濃度を定量化した相対比の棒グラフを示す。それらは、連続して、陰性対照、Ｇ５．５（１００μｇ／ｍＬ）、およびＧ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験におけるリン酸化ａｋｔ対ａｋｔタンパク質の相対比を示す、対照値を１に調整。他のグループの値は対照値で割った。それは、Ｇ３がａｋｔシグナル経路の活性化を阻害しうることを証明している。
【００７２】
実施例７  一定の発現細胞株の構築
（１）約１０μｇの組換えプラスミドを制限エンドヌクレアーゼＡｖｒＩＩ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ（登録商標）  Ｉｎｃ，ＵＳＡから購入）で消化した。プラスミドを完全に消化したことを測定するために、少量の酵素消化された生成物を電気泳動に付した。残存した酵素消化された生成物を精製用キット（Ｖ−Ｇｅｎｅから購入）によって精製し、ＤＮＡを回収し、その中の酵素およびタンパク質などを除去した。
（２）細胞をトリプシンで消化し、培地にトランスフェクトし、単細胞に分注した。２ｘ１０５細胞を６ウェル細胞培養プレートの各ウェルに分注した。
（３）２４時間後、キットによって提供される操作方法にしたがってリポソーム（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＴＭから購入）を用いて、水（陰性対照）および０．５μｇの精製されたＤＮＡをそれぞれ、プラスミドにトランスフェクトした。
（４）４８時間後、細胞を１２ウェル細胞培養プレートに分注し（６ウェル細胞培養プレートの各ウェルの細胞を、１２ウェル細胞培養プレートの４つのウェルに同等に分注し）、異なる濃度の薬物（プロマイシン）（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標）  ＣＬＯＮＴＥＣＨから購入）をスクリーニングのために濃度にしたがって加え、挿入されたＤＮＡを含まない細胞を殺した。
（５）７２時間後、いくつかのウェルの細胞（適当な濃度の薬物に相当）を、すべての陰性対照細胞を殺し、まだ生存していたＤＮＡをトランスフェクトした細胞の中から、選択した。ウェル中の個々の細胞を、制限された希釈法によって９６ウェル細胞培養プレートに分注した。
（６）約１０日後、細胞クローンを得、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット法によって測定した。
【００７３】
遺伝子の正確な発現を測定するために、分子量をウエスタンブロット法によって測定した。タンパク質の濃度をＥＬＩＳＡキットによって測定し、高度に発現した細胞株を選択した。
【００７４】
実施例８  ＥＬＩＳＡ法による融合タンパク質の発現レベルの測定
タンパク質の濃度をＥＬＩＳＡ法によって測定した。ＥＬＩＳＡに用いられる物質は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入したＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標）  ＥＬＩＳＡキットであった。
【００７５】
実施例９  タンパク質の精製
Ｈ５Ｆｃタンパク質を、ＡｍｅｒｓｈａｍのプロテインＡタンパク質カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ；ＣＡＴ番号：１７−０４０２０−０３）によって精製した。
一定の発現細胞株を回収し、培養した。
【００７６】
透析：回収した培地を透析した。透析液の成分：１１．５４ｍＭ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、８．４６ｍＭ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ，Ｃｈｉｎａ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｕ．Ｓ．Ａ）、ｐＨ７．０。一般的には、透析時間は８時間以上であり、透析液の容量は上清の少なくとも２０倍であった。
濾過：透析液を濾過した。用いた濾膜はＭｉｌｌｉｐｏｒｅによって製造された０．４５μｍのＤｕｒａｐｏｒｅメンブレンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｒｅｌａｎｄ；ＣＡＴ番号：ＨＶＬＰ０４７００）であった。
精製：Ａｍｅｒｓｈａｍが提供する生成物説明書のプロトコールにしたがって精製工程を行い、用いたデバイスはＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ）によって製造されたＥｃｏｎｏ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｐｕｍｐ  Ｋｉｔであった。
【００７７】
精製されたタンパク質サンプルを、ウエスタンブロットおよびクマシーブリリアントブルーのＳＤＳポリアクリルアミドゲル染色によって同定した。タンパク質濃度をローリー法によって測定した（ローリーキットはＴｉａｎｘｉａｎｇ  Ｂｏｎｄｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能、ＣＡＴ番号：ＴＢ０９０−１）。
【００７８】
精製して得られたＨ５Ｆｃタンパク質をＴＥＶ酵素で消化し、精製されたＨ５タンパク質を得るために再度プロテインＡカラムに通した。
【００７９】
実験結果は図３に示される。
図３は、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）によって染色された、精製Ｈ５Ｆｃ融合タンパク質およびＨ５タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。それは、十分に精製された融合タンパク質Ｈ５ＦｃおよびＨ５タンパク質が得られうることを証明している。精製されたＨ５Ｆｃタンパク質をＴＥＶ酵素で切断し、次いで、アフィニティークロマトグラフィーに付して、約８０ＫＤの分子量を有する精製されたＨ５タンパク質が得られうる。
【００８０】
実施例１０  電子顕微鏡試料の調製および観察
１．Ｈｅｌａ細胞およびＡ５４９細胞のオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）の誘発に対する不活化鳥インフルエンザウイルスの効果
１）細胞数が２×１０５以上である、対数増殖期のＨｅｌａ細胞およびＡ５４９細胞を、６ｃｍ−プレート上に別々に分注した。
２）２４時間後、ＭＯＩ１０のウイルス力価を有する不活化鳥インフルエンザウイルスを加えた。同量の免疫学的アジュバントは陰性対照として用いた。
３）ウイルス効果の４時間後、消化された細胞をＥＰ管に回収した。細胞を一時静止し、次いで、８００ｇで５分間遠心分離した。
４）上清をできるだけ除去し、次いで、新たに調製された２．５％グルタルアルデヒドを管壁に沿って徐々に加え、４℃にて保存した。
５）リン酸バッファーで３回繰り返し洗浄した。
６）１％オスミウム酸（ＯｓＯ４）溶液で１時間固定した。
７）ｄｄＨ２Ｏで３回洗浄した。
８）勾配アセトン（５０％、７０％、８０％、９０％および１００％で１回、各１０分間、次いで、１００％アセトンで２回処理、各１時間）で脱水した。
９）１：１の８１２樹脂およびアセトン包埋剤で２時間包埋し、浸透させ、次いで、１００％８１２樹脂で４時間浸透させた。
１０）３７℃にて１２時間、４５℃にて１２時間、および６０℃にて２４時間重合した。
１１）そのブロックを修復し、配置して、次いで、切片にスライスした。
１２）染色：酢酸ナトリウムエトキシドで５〜１０分間染色し、クエン酸鉛で１０分間染色した。
１３）観察および撮影した。
１４）観察および計数のために少なくとも１００細胞を無作為に選択した。細胞中に典型的なオートファゴソームがないかまたは一つのみである場合には、オートファジー陰性と定義した；細胞中にオートファゴソームが２つ以上ある場合には、オートファジー陽性と定義した。
【００８１】
実験結果は、図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、９Ａ、９Ｂおよび９Ｃに示される。
【００８２】
図４は、異なる方法で処置したＨｅｌａ細胞の電子顕微鏡写真（２００００倍）および電子顕微鏡下にて観察されたオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴う細胞％の棒グラフを示す。図Ａは、４時間アジュバントで処置したＨｅｌａ細胞の電子顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザ不活化ウイルスで処置したＨｅｌａ細胞の電子顕微鏡写真を示し、矢印はオートファゴソームを示す。図Ｃは、上記２つの条件下でのオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴うＨｅｌａ細胞％の棒グラフを示す。それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスの効果でＨｅｌａ細胞のオートファジーが起こることを証明している。
【００８３】
図５は、異なる方法で処置したＨｅｌａ細胞の電子顕微鏡写真（２００００倍）および電子顕微鏡下にて観察されたオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴う細胞％の棒グラフを示す。図Ａは、４時間アジュバントで処置したＨｅｌａ細胞の電子顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間不活化Ｈ５Ｎ２型鳥インフルエンザウイルスで処置したＨｅｌａ細胞の電子顕微鏡写真を示し、矢印はオートファゴソームを示す。図Ｃは、上記２つの条件下でのオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴うＨｅｌａ細胞％の棒グラフを示す。それは、不活化Ｈ５Ｎ２型鳥インフルエンザウイルスの効果でＨｅｌａ細胞のオートファジーが起こることを証明している。
【００８４】
図６は、異なる方法で処置したＨｅｌａ細胞の電子顕微鏡写真（２００００倍）および電子顕微鏡下にて観察されたオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴う細胞％の棒グラフを示す。図Ａは、４時間アジュバントで処置したＨｅｌａ細胞の電子顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間不活化Ｈ９Ｎ２型鳥インフルエンザウイルスで処置したＨｅｌａ細胞の電子顕微鏡写真を示し、矢印はオートファゴソームを示す。図Ｃは、上記２つの条件下でのオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴うＨｅｌａ細胞％の棒グラフを示す。それは、不活化Ｈ９Ｎ２型鳥インフルエンザウイルスの効果でＨｅｌａ細胞のオートファジーが起こることを証明している。
【００８５】
図９は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真（２００００倍）および電子顕微鏡下にて観察されたオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴う細胞％の棒グラフを示す。図Ａは、４時間トリ將尿液で処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真を示し、矢印はオートファゴソームを示す。図Ｃは、上記の２つの条件下でのオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴うＡ５４９細胞％の棒グラフを示す。それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスの効果でＡ５４９細胞のオートファジーが起こることを証明している。
【００８６】
２．Ｈｅｌａ細胞およびＡ５４９細胞のオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）の誘発に対する組換えＨ５タンパク質の効果
１）細胞数が２×１０５以上である、対数増殖期のＨｅｌａ細胞およびＡ５４９細胞を６ｃｍ−プレートに別々に分注した。
２）２４時間後、０．５ｍＭ  Ｈ５タンパク質を加えた。同量のＢＳＡを陰性対照として用いた。
３）処置の４時間後、消化された細胞をＥＰ管に回収した。細胞を一時静止し、次いで、８００ｇで５分間遠心分離した。
４）上清をできるだけ除去し、次いで、新たに調製された２．５％グルタルアルデヒドを管壁に沿って徐々に加え、４℃にて保存した。
５）リン酸バッファーで３回繰り返し洗浄した。
６）１％オスミウム酸（ＯｓＯ４）溶液で１時間固定した。
７）ｄｄＨ２Ｏで３回洗浄した。
８）勾配アセトン（５０％、７０％、８０％、９０％および１００％で１回、各１０分間、次いで、１００％アセトンで２回処理、各１時間）で脱水した。
９）１：１の８１２樹脂およびアセトン包埋剤で２時間包埋し、浸透させ、次いで、１００％８１２樹脂で４時間浸透させた。
１０）３７℃にて１２時間、４５℃にて１２時間、および６０℃にて２４時間重合した。
１１）そのブロックを修復し、配置して、次いで、切片にスライスした。
１２）染色：酢酸ナトリウムエトキシドで５〜１０分間染色し、クエン酸鉛で１０分間染色した。
１３）観察および撮影した。
１４）観察および計数のために少なくとも１００細胞を無作為に選択した。細胞中に典型的なオートファゴソームがないかまたは一つのみである場合には、オートファジー陰性と定義した；細胞中にオートファゴソームが２つ以上ある場合には、オートファジー陽性と定義した。
【００８７】
実験結果は、図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃに示される
【００８８】
図７は、異なる方法で処置したＨｅｌａ細胞の電子顕微鏡写真（２００００倍）および電子顕微鏡下にて観察されたオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴う細胞％の棒グラフを示す。図Ａは、４時間ＢＳＡタンパク質で処置したＨｅｌａ細胞の電子顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間Ｈ５タンパク質で処置したＨｅｌａ細胞の電子顕微鏡写真を示し、矢印はオートファゴソームを示す。図Ｃは、上記の２つの条件下でのオートファジー（ＩＩ型ＰＣＤ）を伴うＨｅｌａ細胞％の棒グラフを示す。それは、Ｈ５タンパク質の効果でＨｅｌａ細胞のオートファジーが起こることを証明し、また、発現したＨ５タンパク質が生物活性を有することを証明している。
【００８９】
図１０は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真（２００００倍）および電子顕微鏡下にて観察されたオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴う細胞％の棒グラフを示す。図Ａは、４時間ＢＳＡで処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間Ｈ５タンパク質で処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真を示し、矢印はオートファゴソームを示す。図Ｃは、上記の２つの条件下でのオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴うＡ５４９細胞％の棒グラフを示す。それは、Ｈ５タンパク質の効果でＡ５４９細胞のオートファジーが起こることを証明し、また、発現したＨ５タンパク質が生物活性を有することを証明している。
【００９０】
３．Ｈｅｌａ細胞およびＡ５４９細胞のオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）の誘発に対する陽性対照の効果
１）細胞数が２×１０５以上である、対数増殖期のＨｅｌａ細胞およびＡ５４９細胞を６ｃｍ−プレートに別々に分注した。
２）２４時間後、５μＭラパマイシンを加えた。同量のＤＭＳＯを陰性対照として用いた。
３）処置の４時間後、消化された細胞をＥＰ管に回収した。細胞を一時静止し、次いで、８００ｇで５分間遠心分離した。
４）上清をできるだけ除去し、次いで、新たに調製された２．５％グルタルアルデヒドを管壁に沿って徐々に加え、４℃にて保存した。
５）リン酸バッファーで３回繰り返し洗浄した。
６）１％オスミウム酸（ＯｓＯ４）溶液で１時間固定した。
７）ｄｄＨ２Ｏで３回洗浄した。
８）勾配アセトン（５０％、７０％、８０％、９０％および１００％で１回、各１０分間、次いで、１００％アセトンで２回処理、各１時間）で脱水した。
９）１：１の８１２樹脂およびアセトン包埋剤で２時間包埋し、浸透させ、次いで、１００％８１２樹脂で４時間浸透させた。
１０）３７℃にて１２時間、４５℃にて１２時間、および６０℃にて２４時間重合した。
１１）そのブロックを修復し、配置して、次いで、切片にスライスした。
１２）染色：酢酸ナトリウムエトキシドで５〜１０分間染色し、クエン酸鉛で１０分間染色した。
１３）観察および撮影した。
１４）観察および計数のために少なくとも１００細胞を無作為に選択した。細胞中に典型的なオートファゴソームがないかまたは一つのみである場合には、オートファジー陰性と定義した；細胞中にオートファゴソームが２つ以上ある場合には、オートファジー陽性と定義した。
【００９１】
実験結果は、図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、１１Ａ、１１Ｂおよび１１Ｃに示される。
【００９２】
図８は、異なる方法で処置したＨｅｌａ細胞の電子顕微鏡写真（２００００倍）および電子顕微鏡下にて観察されたオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴う細胞％の棒グラフを示す。図Ａは、４時間ＤＭＳＯで処置したＨｅｌａ細胞の電子顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間５μＭラパマイシンで処置したＨｅｌａ細胞の電子顕微鏡写真を示し、矢印はオートファゴソームを示す。図Ｃは、上記の２つの条件下でのオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴うＨｅｌａ細胞％の棒グラフを示す。ラパマイシンがオートファジーの発生をもたらすことは文献から既知でありうるので、陽性対照としてラパマイシンを用いる、実験方法は正確かつ有効なものであることが証明される。
【００９３】
図１１は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真（２００００倍）および電子顕微鏡下にて観察されたオートファジー（ＩＩ型細胞）を伴う細胞％の棒グラフを示す。図Ａは、４時間ＤＭＳＯで処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間５μＭラパマイシンで処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真を示し、矢印はオートファゴソームを示す。図Ｃは、上記の２つの条件下でのオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）のＡ５４９細胞の％の棒グラフを示す。ラパマイシンがオートファジーの発生をもたらすことは文献から既知でありうるので、陽性対照としてラパマイシンを用いる、実験方法は正確かつ有効なものであることが証明される。
【００９４】
４．鳥インフルエンザウイルスによって誘発されるオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）に対する薬物の予防効果および処置効果の測定
１）細胞数が２×１０５以上である、対数増殖期のＡ５４９細胞を６ｃｍ−プレートに別々に分注した。
２）２４時間後、薬物ＳＢ２０３５８０を加え、１時間処置した。
３）ＭＯＩ１０のウイルス力価を有する不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを加え、同量のトリ將尿液を陰性対照として用いた。
４）ウイルス効果の４時間後、消化された細胞をＥＰ管に回収した。細胞を一時静止し、次いで、８００ｇで５分間遠心分離した。
５）上清をできるだけ除去し、次いで、新たに調製された２．５％グルタルアルデヒドを管壁に沿って徐々に加え、４℃にて保存した。
６）リン酸バッファーで３回繰り返し洗浄した。
７）１％オスミウム酸（ＯｓＯ４）溶液で１時間固定した。
８）ｄｄＨ２Ｏで３回洗浄した。
９）勾配アセトン（５０％、７０％、８０％、９０％および１００％で１回、各１０分間、次いで、１００％アセトンで２回処理、各１時間）で脱水した。
１０）１：１の８１２樹脂およびアセトン包埋剤で２時間包埋し、浸透させ、次いで、１００％８１２樹脂で４時間浸透させた。
１１）３７℃にて１２時間、４５℃にて１２時間、および６０℃にて２４時間重合した。
１２）そのブロックを修復し、配置して、次いで、切片にスライスした。
１３）染色：酢酸ナトリウムエトキシドで５〜１０分間染色し、クエン酸鉛で１０分間染色した。
１４）観察および撮影した。
１５）観察および計数のために少なくとも１００細胞を無作為に選択した。細胞中に典型的なオートファゴソームがないかまたは一つのみである場合には、オートファジー陰性と定義した；細胞中にオートファゴソームが２つ以上ある場合には、オートファジー陽性と定義した。
【００９５】
実験結果は、図５２、５２Ｂ、５２Ｃおよび５３に示される。
【００９６】
図５２は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真（２００００倍）を示す。図Ａの最初の写真は、４時間アジュバントで処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真を示し、図Ｃは、１時間Ｐ３８経路の特異的阻害薬、ＳＢ２０３５８０で前処置し、次いで、４時間不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真を示す。それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスの効果でＡ５４９細胞のオートファジーが起こったのに対し、Ｐ３８経路の特異的阻害薬、ＳＢ２０３５８０がオートファジーを減少させたことを証明している。
【００９７】
図５３は、電子顕微鏡下にて観察された種々の処置を行ったオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴うＡ５４９細胞％の棒グラフを示す。左側の第一グラフは、４時間アジュバントで処置したオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴うＡ５４９細胞％を示し、第２グラフは、４時間不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴うＡ５４９細胞％を示し、第３グラフは、１時間Ｐ３８経路の特異的阻害薬、ＳＢ２０３５８０で処置し、次いで、４時間不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴うＡ５４９細胞％を示す。結果は、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスのみで処置したオートファジーを伴うＡ５４９細胞の比率が２４．３％であることを示す；Ｐ３８経路の阻害薬、ＳＢ２０３５８０で処置した後に不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置すると、オートファジーを伴うＡ５４９細胞の比率は７．７３％である。２つのケースの間には有意な違いがある。結果は、Ｐ３８経路の阻害薬、ＳＢ２０３５８０が不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスによって誘発されるオートファジーの発生を効果的に阻害しうることを証明している。
【００９８】
４．ナノメートル物質によって誘発されるオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）に対する薬物の予防効果および処置効果の測定
１）細胞数が２×１０５以上である、対数増殖期のＡ５４９細胞を６ｃｍ−プレートに別々に分注した。
２）２４時間後、薬物３−ＭＡを加え、１時間処置した。
３）ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）、ＰＡＭＡＭ  Ｇ５．５（１００μｇ／ｍＬ）および陰性対照として機能する溶媒ＰＢＳを加えた。
４）作用の２４時間後、消化された細胞をＥＰ管に回収した。細胞を一時静止し、次いで、８００ｇで５分間遠心分離した。
５）上清をできるだけ除去し、次いで、新たに調製された２．５％グルタルアルデヒドを管壁に沿って徐々に加え、４℃にて保存した。
６）リン酸バッファーで３回繰り返し洗浄した。
７）１％オスミウム酸（ＯｓＯ４）溶液で１時間固定した。
８）ｄｄＨ２Ｏで３回洗浄した。
９）勾配アセトン（５０％、７０％、８０％、９０％および１００％で１回、各１０分間、次いで、１００％アセトンで２回処理、各１時間）で脱水した。
１０）１：１の８１２樹脂およびアセトン包埋剤で２時間包埋し、浸透させ、次いで、１００％８１２樹脂で４時間浸透させた。
１１）３７℃にて１２時間、４５℃にて１２時間、および６０℃にて２４時間重合した。
１２）そのブロックを修復し、配置して、次いで、切片にスライスした。
１３）染色：酢酸ナトリウムエトキシドで５〜１０分間染色し、クエン酸鉛で１０分間染色した。
１４）観察および撮影した。
１５）観察および計数のために少なくとも１００細胞を無作為に選択した。細胞中に典型的なオートファゴソームがないかまたは一つのみである場合には、オートファジー陰性と定義した；細胞中にオートファゴソームが２つ以上ある場合には、オートファジー陽性と定義した。
【００９９】
実験結果は、図６４Ａ、６４Ｂ、６４Ｃ、６４Ｄおよび６５に示される。
【０１００】
図６４は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真（２００００倍）を示す。図Ａは、２４時間対照で処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真を示す。図Ｂは、２４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ５．５（１００μｇ／ｍＬ）で処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真を示す。図Ｃは、２４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真を示す。図Ｄは、１時間３−ＭＡ（１０ｍＭ）で処置し、次いで、２４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置したＡ５４９細胞の電子顕微鏡写真を示す。Ａナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ５の効果で５４９細胞のオートファジーが起こり、オートファジーによって誘発される細胞死は３−ＭＡによって軽減されうることを証明している。
【０１０１】
図６５は、オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴うＡ５４９細胞％の棒グラフを示す。オートファジーの発生後の細胞の典型的な特徴は、オートファゴソームの出現である。１００個のランダム細胞当たり２以上のオートファゴソームを有する細胞％を算出した。３−ＭＡがナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３によって誘発されるオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を伴う細胞％を減少させたことは明らかである。すなわち、３−ＭＡはオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を処置または軽減しうる。
【０１０２】
５．マウスの肺上皮細胞のオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）の誘発に対する不活化鳥インフルエンザウイルスの効果
１）４−６週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを選択し、無作為に分類した。１％ペントバルビタールナトリウムでマウスを麻酔した。
２）マウスの気管カニューレの手術を行った。
３）マウスにトリ將尿液または不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを気管注入した。
４）ウイルス作用の２時間後、マウスを殺し、肺を摘出した。
５）ＰＢＳで洗浄し、すぐに新たに調製された２．５％グルタルアルデヒドを肺に加え、肺を保存した。
６）リン酸バッファーで３回繰り返し洗浄した。
７）１％オスミウム酸（ＯｓＯ４）溶液で１時間固定した。
８）ｄｄＨ２Ｏで３回洗浄した。
９）勾配アセトン（５０％、７０％、８０％、９０％および１００％で１回、各１０分間、次いで、１００％アセトンで２回処理、各１時間）で脱水した。
１０）１：１の８１２樹脂およびアセトン包埋剤で２時間包埋し、浸透させ、次いで、１００％８１２樹脂で４時間浸透させた。
１１）３７℃にて１２時間、４５℃にて１２時間、および６０℃にて２４時間重合した。
１２）そのブロックを修復し、配置して、次いで、切片にスライスした。
１３）染色：酢酸ナトリウムエトキシドで５〜１０分間染色し、クエン酸鉛で１０分間染色した。
１４）観察および撮影した。
１５）観察および計数のために少なくとも１００細胞を無作為に選択した。細胞中に典型的なオートファゴソームがないかまたは一つのみである場合には、オートファジー陰性と定義した；細胞中にオートファゴソームが２つ以上ある場合には、オートファジー陽性と定義した。
【０１０３】
実験結果は、図３６Ａ、３６Ｂ、３６Ｃおよび３６Ｄに示される。
【０１０４】
図３６は、トリ將尿液または不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを注入したマウスの肺組織の電子顕微鏡写真を示す。図Ａは、トリ將尿液を注入した肺組織の電子顕微鏡写真を示す；図Ｂは、Ａの白線ボックスに示される位置の部分的に拡大した図を示す。より完全な細胞が観察されたが、オートファゴソームは観察されなかった；図Ｃは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを注入した肺組織の電子顕微鏡写真を示す；図Ｄは、Ａの白線ボックスに示される位置の部分的に拡大した図を示す。より完全な細胞が観察された。細胞中のオートファゴソームが観察された（矢印によって表される）。それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスが肺組織のオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を誘発しうることを証明している。
【０１０５】
実施例１１  共焦点レーザー顕微鏡試料の調製および観察
１．鳥インフルエンザウイルスによって誘発されるＬＣ３凝集
Ｈｅｌａ細胞またはＡ５４９細胞を、不活化Ｈ５Ｎ１型、Ｈ５Ｎ２型、Ｈ９Ｎ２型鳥インフルエンザウイルス、Ｈ５タンパク質および陽性薬物ラパマイシンで４時間処置した。ＬＣ３凝集の変化を観察した。
【０１０６】
１）２４ウェル細胞培養プレートに殺菌カバーガラムを配置し、次いで、対数増殖期のＨｅｌａ細胞またはＡ５４９細胞を注入した。
２）２４時間後、リポソームと一緒にＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトした。
３）７２時間後、不活化Ｈ５Ｎ１型、Ｈ５Ｎ２型、Ｈ９Ｎ２型鳥インフルエンザウイルス、Ｈ５タンパク質および対応する陰性対照ならびに陽性対照（５μＭラパマイシン）を加えた。
４）３７℃にて４時間インキュベートした後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、カバーガラスを取り出し、それをシール剤が剥がれたスライドガラスに配置した。細胞を共焦点レーザー顕微鏡下にて観察した（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＰＳ２）。
５）観察するために１００個の細胞を無作為に選択した。２０以上の鮮緑色スポットを有する細胞を陽性と定義し、２０未満の鮮緑色スポットを有する細胞を陰性と定義した。
【０１０７】
実験結果は、図１２、１３、１４、１６、１７、１８および１９に示される。
【０１０８】
図１２は、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトし、異なる方法で処置したＨｅｌａ細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真（１０００倍）およびＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴う細胞％の棒グラフを示す。図Ａは、４時間アジュバントで処置したＨｅｌａ細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＨｅｌａ細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真を示す。図Ｃは、上記の２つの条件下でのＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴うＨｅｌａ細胞％の棒グラフを示す。オートファジーの発生後の細胞の典型的な特徴は、ＬＣ３（ＡＴＧ８）分子が凝集して、オートファゴソームを形成することである。細胞でオートファジーが起こると、ＥＧＦＰで標識化されたＬＣ３分子が凝集し、強く放出された緑色発光が共焦点顕微鏡で観察されうる；一方、オートファジーを伴わない細胞については、緑色発光が分散するかまたはほんの少しだけ凝集しうる。それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスの効果でＨｅｌａ細胞のオートファジーが起こることを証明している。
【０１０９】
図１３は、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトし、異なる方法で処置したＨｅｌａ細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真（１０００倍）およびＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴う細胞％の棒グラフを示す。図Ａは、４時間アジュバントで処置したＨｅｌａ細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間不活化Ｈ５Ｎ２型鳥インフルエンザウイルスで処置したＨｅｌａ細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真を示し、図Ｃは、上記の２つの条件下でのＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴うＨｅｌａ細胞％の棒グラフを示す。それは、不活化Ｈ５Ｎ２型鳥インフルエンザウイルスの効果でＨｅｌａ細胞のオートファジーが起こることを証明している。
【０１１０】
図１４は、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトし、異なる方法で処置したＨｅｌａ細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真（１０００倍）およびＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴う細胞％の棒グラフを示す。図Ａは、４時間アジュバントで処置したＨｅｌａ細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間不活化Ｈ９Ｎ２型鳥インフルエンザウイルスで処置したＨｅｌａ細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真を示す。図Ｃは、上記の２つの条件下でのＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴う細胞％の棒グラフを示す。それは、不活化Ｈ９Ｎ２型鳥インフルエンザウイルスの効果でＨｅｌａ細胞のオートファジーが起こることを証明している。
【０１１１】
図１６は、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトし、次いで、異なる方法で処置したＨｅｌａ細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真（１０００倍）およびＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴う細胞％の棒グラフを示す。図Ａは、４時間ＤＭＳＯで処置したＨｅｌａ細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間ラパマイシンで処置したＨｅｌａ細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。図Ｃは、上記の２つの条件下でのＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴うＨｅｌａ細胞％の棒グラフを示す。ラパマイシンがオートファジーの発生をもたらすことは文献から既知であるので、陽性対照としてラパマイシンを用いる、実験方法は正確かつ有効なものであることが証明される。
【０１１２】
図１７は、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトし、次いで、異なる方法で処置したＡ５４９細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真（１０００倍）およびＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴うＨｅｌａ細胞％の棒グラフを示す。図Ａは、４時間陰性対照、トリ將尿液で処置したＡ５４９細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。図Ｃは、上記の２つの条件下でのＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴うＡ５４９細胞％の棒グラフを示す。それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスの効果でＡ５４９細胞のオートファジーが起こることを証明している。
【０１１３】
図１８は、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトし、次いで、異なる方法で処置したＡ５４９細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真（１０００倍）およびＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴うＨｅｌａ細胞％の棒グラフを示す。図Ａは、４時間ＢＳＡで処置したＡ５４９細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間Ｈ５タンパク質で処置したＡ５４９細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。図Ｃは、上記の２つの条件下でのＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴うＡ５４９細胞％の棒グラフを示す。それは、Ｈ５タンパク質の効果でＡ５４９細胞のオートファジーが起こることを証明し、また、発現したＨ５タンパク質が生理活性を有することを証明している。
【０１１４】
図１９は、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトし、次いで、異なる方法で処置したＡ５４９細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真（１０００倍）およびＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴うＨｅｌａ細胞％の棒グラフを示す。図Ａは、４時間ＤＭＳＯで処置したＡ５４９細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。図Ｂは、４時間ラパマイシンで処置したＡ５４９細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。図Ｃは、上記の２つの条件下でのＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴うＡ５４９細胞％の棒グラフを示す。ラパマイシンがオートファジーの発生をもたらすことは文献から既知であるので、陽性対照としてラパマイシンを用いる、実験方法は正確かつ有効なものであることが証明される。
【０１１５】
２．鳥インフルエンザウイルスまたはナノメートル物質ＰＡＭＡＭによって誘発されるＬＣ３凝集の阻害に対するＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡの効果
１）２４ウェル細胞培養プレートに殺菌カバーガラムを配置し、次いで、対数増殖期のＨｅｌａ細胞またはＡ５４９細胞を注入した。
２）２４時間後、リポソームにＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミド、ＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡおよび対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。
３）４８時間後、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスまたはナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）を加えた。
４）３７℃にて４時間（不活化鳥インフルエンザウイルス）または２４時間（物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３）インキュベートした後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、カバーガラムを取り出し、それをシール剤が剥がれたスライドガラスに配置した。細胞を共焦点レーザー顕微鏡下にて観察した（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＰＳ２）。
５）観察するために１００個の細胞を無作為に選択した。２０以上の鮮緑色スポットを有する細胞を陽性と定義し、２０未満の鮮緑色スポットを有する細胞を陰性と定義した。
【０１１６】
実験結果は、図２９Ａ、２９Ｂ、３０、７９Ａ、７９Ｂおよび８０に示される。
【０１１７】
図２９は、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトし、次いで、異なる方法で処置したＡ５４９細胞の共焦点レーザー顕微鏡下写真（１０００倍）を示す。図Ａは、陰性対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、次いで、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。図Ｂは、ＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、次いで、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。ＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした後、ＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴う細胞は減少し、それは、ＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡが不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスによって誘発されるオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を阻害することを証明している。
【０１１８】
図３０は、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトし、次いで、異なる方法で処置したＡ５４９細胞中のＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴う細胞％の棒グラフを示す。左図は、陰性対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、次いで、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞におけるＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴う細胞％を示し、右図は、ＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、次いで、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞におけるＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴う細胞％を示す。それは、ＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡが不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスによって誘発されるオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を阻害することを証明している。
【０１１９】
図７９は、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトし、次いで、異なる方法で処置したＡ５４９細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真（１０００倍）を示す。図Ａは、２４時間対照ｓｉＲＮＡで処置し、次いで、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置した細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。図Ｂは、２４時間ＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡで処置し、次いで、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置した細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。
【０１２０】
図８０は、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトしたＡ５４９細胞を異なる方法で処置した後の、ＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴う細胞％を示す。図Ａは、Ａ５４９細胞に陰性対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、次いで、ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置した後の、ＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴う細胞％を示し、図Ｂは、Ａ５４９細胞にＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、次いで、ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）を処置した後の、ＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴う細胞％を示す。それは、ＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡがＰＡＭＡＭ  Ｇ（１００μｇ／ｍＬ）によって誘発されるオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を阻害しうることを証明している。
【０１２１】
３．ナノメートル物質ＰＡＭＡＭによって誘発されるＬＣ３凝集の阻害に対する３−ＭＡの効果
１）２４ウェル細胞培養プレートに殺菌カバーガラムを配置し、次いで、対数増殖期のＨｅｌａ細胞またはＡ５４９細胞を注入した。
２）２４時間後、リポソームにＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミド、ＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡおよび対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。
３）４８時間後、陰性対照、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ５．５（１００μｇ／ｍＬ）を加え、１時間３−ＭＡ（１０ｍＭ）で前処理した後にナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）を加えた。
４）３７℃にて４時間インキュベートした後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、カバーガラムを取り出し、それをシール剤が剥がれたスライドガラスに配置した。細胞を共焦点レーザー顕微鏡下にて観察した（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＰＳ２）。
５）観察するために１００個の細胞を無作為に選択した。２０以上の鮮緑色スポットを有する細胞を陽性と定義し、２０未満の鮮緑色スポットを有する細胞を陰性と定義した。
【０１２２】
実験結果は、図６６Ａ、６６Ｂ、６６Ｃ、６６Ｄおよび６７に示される。
【０１２３】
図６６は、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトし、次いで、異なる方法で処置したＡ５４９細胞の共焦点レーザー顕微鏡写真（１０００倍）を示す。図Ａは、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトし、次いで、２４時間対照で処置したＡ５４９細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。図Ｂは、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトし、次いで、２４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ５．５（１００μｇ／ｍＬ）で処置したＡ５４９細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。図Ｃは、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトし、次いで、２４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置したＡ５４９細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。図Ｄは、ＥＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドをトランスフェクトし、３−ＭＡ（１０ｍＭ）で処置し、次いで、２４時間ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置したＡ５４９細胞のレーザー共焦点顕微鏡写真を示す。
【０１２４】
図６７は、上記の条件下でのＥＧＦＰ−ＬＣ３凝集を伴う細胞％の棒グラフを示す。オートファジーの発生後の細胞の典型的な特徴は、ＬＣ３（ＡＴＧ８）分子を凝集してオートファゴソームを形成することである。ＬＣ３分子をＥＧＦＰで標識化した。細胞にオートファジーが起こった場合には、ＬＣ３分子が凝集して、強く発光する緑色蛍光が共焦点顕微鏡下にて観察されうる。しかしながら、細胞にオートファジーが起こらなかった場合には、緑色蛍光は分散するかまたはほんの少しだけ凝集する。それは、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３の効果でＡ５４９細胞のオートファジーが起こり、オートファジーによって誘発される細胞死が３−ＭＡによって軽減されうることを証明している。
【０１２５】
実施例１２  ｓｉＲＮＡの合成
実験結果で用いられたｓｉＲＮＡを、ＲｉＢｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって合成した。
【０１２６】
図２９、３０、３１、３２および３３に示される実験結果で用いられたｓｉＲＮＡの配列は以下のとおりである：
ＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡ：５’  ＧＧＧＡＣＡＵＵＣＵＧＣＵＧＡＡＣＡＵ  ｄＴｄＴ  ３’／３’  ｄＴｄＴ  ＣＣＣＵＧＵＡＡＧＡＣＧＡＣＵＵＧＵＡ  ５’（配列番号：２、３）
【０１２７】
図４６、４７および４８に示される実験結果で用いられたｓｉＲＮＡの配列は以下のとおりである：
Ａｔｇ５  ｓｉＲＮＡ：５’  ＡＣＣＧＧＡＡＡＣＵＣＡＵＧＧＡＡＵＡ  ｄＴｄＴ  ３’／３’  ｄＴｄＴ  ＵＧＧＣＣＵＵＵＧＡＧＵＡＣＣＵＵＡＵ  ５’（配列番号：４、５）
【０１２８】
図７０および７１に示される実験結果で用いられたｓｉＲＮＡの配列は以下のとおりである：
Ａｔｇ６  ｓｉＲＮＡ：５’  ＣＡＧＵＵＵＧＧＣＡＣＡＡＵＣＡＡＵＡ  ｄＴｄＴ  ３’／３’  ｄＴｄＴ  ＧＵＣＡＡＡＣＣＧＵＧＵＵＡＧＵＵＡＵ  ５’（配列番号：６、７）
【０１２９】
図２２、２３および２４に示される実験結果で用いられたｓｉＲＮＡの配列は以下のとおりである：
ＡＴＧ１２  ｓｉＲＮＡ：５’  ＧＣＡＧＵＡＧＡＧＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡ  ｄＴｄＴ  ３’／３’  ｄＴｄＴ  ＣＧＵＣＡＵＣＵＣＧＣＵＵＧＵＧＣＵＵ  ５’（配列番号：８、９）
【０１３０】
図８１および８２に示される実験結果で用いられたｓｉＲＮＡの配列は以下のとおりである：
ＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡ：５’  ＣＣＡＵＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＵＵＣＡＡ  ｄＴｄＴ  ３’／３’  ｄＴｄＴ  ＧＧＵＡＧＵＵＣＣＣＧＧＵＣＡＡＧＵＵ  ５’（配列番号：１０、１１）
【０１３１】
図７９および８０の実験結果で用いられたｓｉＲＮＡは、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。
【０１３２】
実施例１３  細胞の遺伝子発現におけるｓｉＲＮＡの障害
Ａ５４９細胞は、対応する遺伝子の発現を阻害するために異なる遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。
１）対数増殖期のＡ５４９細胞を２４ウェルプレートに分注した。
２）２４時間後、Ａ５４９細胞にｓｉＲＮＡ（５０ｎＭ）をトランスフェクトした。
３）４８時間後、Ａ５４９細胞を不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスまたはナノメートル物質で処置した。
４）２〜８時間後、細胞を溶解し、ウエスタンブロットによって溶解を測定した。
【０１３３】
実験結果は、図２３、３１、７０および８１に示される。
【０１３４】
図２３は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験の結果を示す。左側ラインは、対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、次いで、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルであり、右側ラインは、対照Ａｔｇ１２  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、次いで、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置したＡ５４９細胞の溶解サンプルである；抗体は、それぞれ（上から下へ）、Ａｔｇ１２およびアクチン抗体である。Ａｔｇ５およびＡｔｇ１２は細胞内で複合体を形成してオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を誘発するため、検出された結果は、アクチンに対するＡｔｇ５およびＡｔｇ１２の複合体の相対量で示す。それは、Ａｔｇ１２  ｓｉＲＮＡがＡｔｇ５およびＡｔｇ１２の複合体の相対量を効果的に減少させることを証明している。
【０１３５】
図３１は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験の結果を示す。対照ｓｉＲＮＡおよびＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡをそれぞれトランスフェクトしたＡ５４９細胞のサンプルは、トランスフェクションの４８時間後に溶解した；抗体は、それぞれ（上から下へ）、ＴＳＣ２およびアクチン抗体である。それは、ＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡがＴＳＣ２の発現レベルを有意に減少しうることを証明している。
【０１３６】
図７０は、異なる処置をしたＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験の結果を示す。サンプルは、２４時間対照ｓｉＲＮＡまたはＡＴＧ６  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＡ５４９細胞の溶解サンプルである。抗体は、それぞれ（上から下へ）、ＡＴＧ６およびアクチン抗体である。ウエスタンブロット実験の結果は、ＡＴＧ６  ｓｉＲＮＡがＡＴＧ６遺伝子の発現を有効に阻害することを示す。
【０１３７】
図８１は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット実験の結果を示す。Ａ５４９細胞に対照ｓｉＲＮＡおよびＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡをそれぞれトランスフェクトし、次いで、２４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置して、細胞の生存率をＭＴＴ法で測定した。それは、ＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡがＴＳＣ２遺伝子の発現を有効に阻害することを示す。
【０１３８】
実施例１４  リアルタイム−ＰＣＲ
１）指示書にしたがって全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（ｖｉｔｒｏｇｅｎ）で抽出し、ＲＮＡの濃度およびＯＤ２８０／ＯＤ２６０比を測定した。
２）ＲＮＡを電気泳動によって完全に同定した後、一本鎖ＤＮＡを生成するために１０μｇ逆転写用ＲＮＡ（ＡＢＩ逆転写キット）を利用した。
３）ＢＩＯ−ＲＡＤ  ＩＱ５リアルタイム−ＰＣＲで増幅した。
４）増幅条件は以下のとおりであった：９５℃にて１０分間予め変性させ、９５℃にて１５秒変性させ、アニーリングし、６０℃にて１分間伸長させる、全体で４０サイクル。
５）反応後、コンピューターから自動的に各試料のＡｔｇ５およびβ−アクチンのＣｔ値を得、β−アクチンを基準として用いた。ΔＣｔ＝Ｃｔ（Ａｔｇ５）−Ｃｔ（β−ａｃｔｉｎ）、ΔΔＣｔ＝ΔＣｔ（実験群）−ΔＣｔ（ブランク群）、２−ΔΔＣｔはＡｔｇ５遺伝子の相対量を示す。
【０１３９】
プライマー：
Ａｔｇ５のフォワードプライマー：５’  ＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＧＣＴＧＣＡＣＡＣＡＣＴ  ３’（配列番号１２）、
リバースプライマー：５’  ＧＧＣＴＣＴＡＴＣＣＣＧＴＧＡＡＴＣＡＴＣＡ  ３’（配列番号１３）、
β−アクチンフォワードプライマー：５’  ＡＧＴＧＴＧＡＣＧＴＴＧＡＣＡＴＣＣＧＴＡ  ３’（配列番号：１４）、
リバースプライマー：５’  ＧＣＣＡＧＡＧＣＡＧＴＡＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴ  ３’（配列番号１５）。
【０１４０】
上記のプライマーは、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｓａｎｇｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．によって合成された。
【０１４１】
実験結果は図４６に示される。
図４６は、マウスの肺組織のリアルタイムＰＣＲの結果を示す。マウスに対照ｓｉＲＮＡおよびＡｔｇ５  ｓｉＲＮＡをそれぞれ注入して、２４時間後、肺組織を均質化し、ＲＮＡを抽出して、リアルタイムＰＣＲを行った。それは、Ａｔｇ５  ｓｉＲＮＡの気管注入がＡｔｇ５  ｍＲＮＡレベルの低下を効果的にもたらすことを証明している。
【０１４２】
実施例１５  ＭＴＴ実験による細胞の生存率の測定
１．ＭＴＴ実験による３−ＭＡ処置細胞の生存率における３−ＭＡの効果の測定
１）単細胞懸濁液に対数増殖期のＡ５４９細胞を消化させ、９６ウェルプレートに各ウェル当たり２００μｌ量を分注した。
２）３７℃にて２４時間培養するためにＣＯ２インキュベーターに移した。
３）２４時間後、細胞を前処理するために３ｍＭ  ３ＭＡ（または対照溶媒）を加えた。
４）１時間後、ＭＯＩ２のウイルス力価を有する不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを加えるか、または同量のトリ將尿液を加えるか；あるいは、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭを加えた。
５）４時間（鳥インフルエンザ不活化ウイルス）または２４時間（ナノメートル物質）の作用後、３７℃にて１〜２時間培養するために２０μｌ  ＭＴＳ試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ，Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに加えた。
６）ＥＬＩＳＡリーダー４９０ｎｍによって測定した。
７）結果を解析し、グループの平均値および標準偏差を算出し、グラフを作製した。
【０１４３】
実験結果は図３８、６９および７４に示される。
【０１４４】
図３８は、棒グラフとして異なる方法で処置したＡ５４９細胞の生存率を示す。陰性対照、３ＭＡまたは不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置した後、Ａ５４９細胞の生存率は、ＭＴＴキットで測定された。それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスが細胞の生存率を著しく減少させるのに対し、３ＭＡが不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスによって誘発される細胞死を減少することを証明している。
【０１４５】
図６９は、異なる処置をしたＡ５４９細胞の生存率を示す。Ａ５４９細胞を、１時間対照、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ５．５、ＰＡＭＡＭ  Ｇ３、３−ＭＡでそれぞれ前処理し、次いで、２４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３および薬物対照３−ＭＡで処置した。細胞の生存率の結果をＭＴＴ法で測定した。それは、３−ＭＡがナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３によって誘発される細胞死を有意に減少しうることを示す。
【０１４６】
図７４は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のウエスタンブロット法の結果を示す。Ａ５４９細胞は、２４時間異なる種類のナノメートル物質（ＰＡＭＡＭ）で処置し、細胞の生存率の結果をＭＴＴ法で測定した。それは、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ４、Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７およびＧ８すべてが細胞死を誘発しうることを証明している。
【０１４７】
２．ＭＴＴ実験によるｓｉＲＮＡで処置した細胞の生存率の測定
１）単細胞懸濁液に対数増殖期のＡ５４９細胞を消化させ、９６ウェルプレートに各ウェル当たり２００μｌ量を分注した。
２）３７℃にて２４時間培養するためにＣＯ２インキュベーターに移した。
３）２４時間後、対応するｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。
４）４８時間後、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスまたはナノメートル物質ＰＡＭＡＭを加えた。
５）４時間（鳥インフルエンザ不活化ウイルス）または２４時間（ナノメートル物質）の作用後、３７℃にて１〜２時間培養するために２０μｌ  ＭＴＳ試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ，Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに加えた。
６）ＥＬＩＳＡリーダー４９０ｎｍによって測定した。
７）結果を解析し、グループの平均値および標準偏差を算出し、グラフを作製した。
【０１４８】
実験結果は図２２、３３、７１および８２に示される。
【０１４９】
図２２は、棒グラフとして異なる方法で処置したＡ５４９細胞の生存率を示す。Ａ５４９細胞は、対照ｓｉＲＮＡおよびＡｔｇ１２  ｓｉＲＮＡがそれぞれトランスフェクトされ、次いで、対照試薬または不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置されている。細胞生存率の結果はＭＴＴキットで測定される。それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスが細胞の生存率を著しく減少させるのに対し、Ａｔｇ１２  ｓｉＲＮＡが不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスの効果を軽減することを証明している。すなわち、オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）に対する抑制効果は、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスによって誘発される細胞死を軽減する。
【０１５０】
図３３は、棒グラフとして異なる方法で処置したＡ５４９細胞の生存率を示す。Ａ５４９細胞は、対照ｓｉＲＮＡおよびＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡがそれぞれトランクフェクトされ、次いで、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスで処置されている。細胞生存率の結果はＭＴＴキットで測定される。細胞生存率は、ＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡのトランスフェクションを介して増加する。それは、ＴＳＣ２  ｓｉＲＮＡが不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスによって誘発される細胞死を遅延しうることを証明している。
【０１５１】
図７１は、種々の処置をしたＡ５４９細胞の生存率を示す。Ａ５４９細胞に、対照ｓｉＲＮＡおよびＡＴＧ６  ｓｉＲＮＡをそれぞれトランスフェクトした。次いで、２４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置した。細胞の生存率をＭＴＴ法で測定した。それは、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３がＡＴＧ６遺伝子の発現を調節することによって細胞死を誘発して、オートファジーを形成することを証明している。
【０１５２】
図８２は、種々の処置したＡ５４９細胞の生存率を示す。Ａ５４９細胞に対照ｓｉＲＮＡおよびＴＳＣ  ２  ｓｉＲＮＡをそれぞれトランスフェクトし、次いで、２４時間ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置して、細胞の生存率をＭＴＴ法で測定した。それは、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３がＴＳＣ  ２遺伝子の発現を調節することによって細胞死を誘発して、オートファジーを形成することを証明している。
【０１５３】
３．ＭＴＴ実験によってナノメートル物質で処置した細胞の生存率の測定
１）単細胞懸濁液に対数増殖期のＡ５４９細胞を消化させ、９６ウェルプレートに各ウェル当たり２００μｌ量を分注した。
２）３７℃にて２４時間培養するためにＣＯ２インキュベーターに移した。
３）２４時間後、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭを加えた。
４）４時間の作用後、３７℃にて１〜２時間培養するために２０μｌ  ＭＴＳ試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ，Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに加えた。
５）ＥＬＩＳＡリーダー４９０ｎｍによって測定した。
６）結果を解析し、グループの平均値および標準偏差を算出し、グラフを作製した。
【０１５４】
実験結果は図６１に示される。
図６１は、種々の処置をしたＡ５４９細胞の生存率を示す。Ａ５４９細胞を種々のナノメートル物質（ＰＡＭＡＭ）で処置し、２４時間後、Ａ５４９細胞の生存率をＭＴＴ法で測定した。
【０１５５】
実施例１６  病理切片の調製
１．病理切片の調製
１）ブラッドフォード法によってＨ５Ｎ１型不活化ウイルスのタンパク質濃度を測定した。
２）各グループ当たり４−６匹になるように、マウスをグループに無作為に分類した。
３）１グループに、１時間前に３ＭＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）またはＳＢ２０３５８０（１６ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。
４）トリ將尿液を気管注入した対照グループ、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルス（１０μｇ／ｇ）またはナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（５０μｇ／ｇ）、Ｇ５．５（５０μｇ／ｇ）を気管注入した実験グループのマウスの気管を単離した。
５）注入後、マウスはレスピレータ（ＨＸ−２００動物レスピレータ、Ｃｈｅｎｇｄｕ  Ｔａｉｍｅｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，ＬＴＤ）で機械的に換気し、５分後に人工呼吸器を停止した。６時間自発呼吸した後に肺を取り出した。
６）左肺を摘出し、１３％ホルマリン固定液で固定した。
７）４８時間後、ブロックを修復し、脱水し、ワックスをかけ、包理し、スライスし、病理組織切片を染色した。
【０１５６】
実験結果は図３９、５５および８６に示される。
【０１５７】
図３９は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの肺の病理切片の写真（２００倍）を示す。図Ａは、対照（トリ將尿液）を気管注入し、その６時間後に肺を摘出して得られたマウスの病理切片の写真を示し、図Ｂは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを気管注入し、その６時間後に肺を摘出して得られたマウスの病理切片の写真を示し、図Ｃは、３−ＭＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、その３０分後に不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを気管注入し、その６時間後に肺を摘出して得られたマウスの病理切片の写真を示す。それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスが重篤な肺損傷をもたらしうるのに対し、３−ＭＡが不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスによって誘発される肺損傷をある程度改善することを証明している。
【０１５８】
図５５は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの肺の病理切片の写真（２００倍）を示す。図Ａは、対照（トリ將尿液）を気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの病理切片の写真を示す。図Ｂは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの病理切片の写真を示す。図Ｃは、ＳＢ２０３５８０（１６ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、３０分後、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られた病理切片の写真を示す。それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスが重篤な肺損傷を引き起こすのに対し、ＳＢ２０３５８０が不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスによって誘発される肺損傷をある程度改善することを証明している。それは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスがｐ３８シグナル経路を介して肺損傷を誘発することを示す。
【０１５９】
図８６は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの肺病理切片の写真（２００倍）を示す。図Ａは、対照を気管注入し、４時間後、肺を摘出して得られたマウスの病理切片の写真を示す。図Ｂは、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ５．５（１００μｇ／ｍＬ）を気管注入し、４時間後、肺を摘出して得られたマウスの病理切片の写真を示す。図Ｃは、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）を気管注入し、４時間後、肺を摘出して得られたマウスの病理切片の写真を示す。それは、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３が重篤な肺損傷を引き起こすことを証明している。
【０１６０】
２．病理切片の調製
１）各グループ当たり４−６匹になるように、マウスを４グループに無作為に分類した。
２）各グループへの１Ｍ  ＨＣｌ（０．５ｕＬ／ｇ）の気管注入の３０分後に、マウス肺損傷のモデルを構築した。
３）２グループを選択し、ＨＣｌ投与の３０分前に、１５ｍｇ／ｋｇ  ３ＭＡおよび０．２５ｍｇ／ｋｇ  ＳＢ２０３５８０をそれぞれ、腹腔内注射および気管注入した。
４）Ｆｃ（４×１０−１２ｍｏｌ／ｇ）を気管注入した対照グループ、それぞれ、Ｈ５Ｆｃ（４×１０−１２ｍｏｌ／ｇ）を気管注入した他の３グループのマウスの気管を単離した。
５）６時間の自発呼吸後に肺を摘出した。
６）左肺を摘出し、１３％ホルマリン固定液で固定した。
７）４８時間後、ブロックを修復し、脱水し、ワックスをかけ、包理し、スライスし、病理組織切片を染色した。
【０１６１】
実験結果は図４９および５８に示される。
【０１６２】
図４９は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの肺の病理切片の写真（２００倍）を示す。図Ａは、酸吸引後Ｆｃタンパク質を気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの病理切片の写真を示す。図Ｂは、酸吸引後Ｈ５Ｆｃタンパク質を気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの病理切片の写真を示す。図Ｃは、酸吸引後３−ＭＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、３０分後、Ｈ５Ｆｃタンパク質を気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの病理切片の写真を示す。それは、酸吸引後のＨ５Ｆｃタンパク質が肺損傷を悪化させるのに対し、３−ＭＡは酸吸引後のＨ５Ｆｃタンパク質によって誘発された肺損傷をある程度改善することを証明している。
【０１６３】
図５８は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの肺病理切片の写真（２００倍）を示す。左図は、酸吸引後Ｆｃタンパク質を気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの病理切片の写真である。中央図は、酸吸引後Ｈ５Ｆｃタンパク質を気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの病理切片の写真である。右図は、酸吸引後ＳＢ２０３５８０（１６ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、３０分後、Ｈ５Ｆｃタンパク質を気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの病理切片の写真である。酸吸入後のＨ５Ｆｃタンパク質の注入は肺損傷を悪化させるのに対し、ＳＢ２０３５８０は酸吸引後のＨ５Ｆｃタンパク質によって誘発される肺損傷をある程度改善することを証明している。
【０１６４】
実施例１７  炎症細胞の計数
実施例１６から得られたマウスの肺病理切片を、顕微鏡下にて観察した。１０００倍まで増大した視界を無作為に選択し、視界内の肺組織に浸潤した多核細胞およびマクロファージをカウントした。
１００の視界を各実験グループから無作為にカウントした。
各グループの各視界にて浸潤した多核細胞およびマクロファージの平均値および標準偏差を算出した。
【０１６５】
実験結果は図４０、５０、５６および５９に示される。
【０１６６】
図４０は、棒グラフとして油浸レンズ（１０００倍）下の肺組織の病理切片に局在する炎症細胞数を示す。左から右に、それぞれ、対照（トリ將尿液）を気管注入した６時間後のマウスの肺病理切片数、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを気管注入した６時間後のマウスの肺病理切片数、３−ＭＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、３０分後、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザを注入した６時間後のマウスの肺病理切片数を示す。炎症細胞浸潤は、最も重要な指標の一つである。不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスの注入は非常に浸潤した炎症細胞をもたらしたのに対し、３−ＭＡは不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスによって誘発される炎症細胞数を減少させた。結果は、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスが重篤な肺損傷をもたらすのに対し、３−ＭＡが不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスによって誘発される肺損傷をある程度改善することを証明している。
【０１６７】
図５０は、棒グラフとして油浸レンズ（１０００倍）下にて肺組織の病理切片に局在する炎症細胞数を示す。左から右に、それぞれ、酸吸引後Ｆｃタンパク質を気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの肺病理切片数、酸吸引後Ｈ５Ｆｃタンパク質を気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの肺病理切片数、および酸吸引後３−ＭＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、３０分後、Ｈ５Ｆｃタンパク質を気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの肺病理切片数を示す。炎症細胞浸潤は、重要な指標の一つである。Ｈ５Ｆｃタンパク質の注入は浸潤した炎症細胞数を増加させるのに対し、３−ＭＡはＨ５Ｆｃタンパク質によって誘発される炎症細胞数の増加を減少させる。結果は、酸吸引後のＨ５Ｆｃタンパク質が肺損傷を悪化させるのに対し、３−ＭＡが酸吸引後のＨ５Ｆｃタンパク質によって誘発される肺損傷をある程度改善することを証明している。
【０１６８】
図５６は、棒グラフとして油浸レンズ（１０００倍）下の肺組織の病理切片に局在する炎症細胞数を示す。左から右に、それぞれ、対照（トリ將尿液）を気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの肺病理切片数、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの肺病理切片数、マウスにＳＢ２０３５８０（１６ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、３０分後、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザを気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの肺病理切片数を示す。炎症細胞浸潤は、肺損傷の重要な指標の一つである。不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスの注入は、非常に浸潤した炎症細胞をもたらすのに対し、ＳＢ２０３５８０は不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスによって誘発される浸潤した炎症細胞数を減少させる。結果は、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスが重篤な肺損傷を引き起こすのに対し、ＳＢ２０３５８０が不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスによって誘発される肺損傷をある程度改善することを証明している。
【０１６９】
図５９は、油浸レンズ（１０００倍）下の肺組織の病理切片に局在する炎症細胞数を示す。図Ａは、酸吸引後Ｆｃタンパク質を気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの肺病理切片数を示す。図Ｂは、酸吸引後Ｈ５Ｆｃタンパク質を気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの肺病理切片数を示す。図Ｃは、酸吸引後ＳＢ２０３５８０（１６ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、３０分後、Ｈ５Ｆｃタンパク質を気管注入し、６時間後に肺を摘出して得られたマウスの肺病理切片数を示す。炎症細胞浸潤は、肺損傷の重要な指標の一つである。Ｈ５Ｆｃタンパク質の注入は浸潤した炎症細胞数を増加させたのに対し、ｐＳＢ２０３５８０はＨ５Ｆｃタンパク質によって誘発される浸潤した炎症細胞の増加を減少させた。結果は、酸吸引後のＨ５Ｆｃタンパク質が肺損傷を悪化させるのに対し、ＳＢ２０３５８０が酸吸引後のＨ５Ｆｃタンパク質によって誘発される肺損傷をある程度改善することを証明している。
【０１７０】
実施例１８  肺湿／乾比の測定
１．鳥インフルエンザによって誘発される肺湿／乾比の変化に対する薬物の効果の測定
１）ブラッドフォード法によってＨ５Ｎ１型不活化ウイルスタンパク質の濃度を測定した。
２）各グループ当たり４〜６匹になるように、マウスを５グループに無作為に分類した。
３）３０分および１時間前に、３ＭＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）、ＳＢ２０３５８０（１６ｍｇ／ｋｇ）およびウォルトマンニン（１．５ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ腹腔内注射した、２グループのマウスを選択した。
４）トリ將尿液を気管注入した対照グループおよび不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルス（１０μｇ／ｇ）を気管注入した、他の３グループのマウスの気管をそれぞれ単離した。
５）注入後、マウスはレスピレータ（ＨＸ−２００動物レスピレータ、Ｃｈｅｎｇｄｕ  Ｔａｉｍｅｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，ＬＴＤ）で機械的に換気し、５分後に人工呼吸器を停止した。６時間自発呼吸した後に肺を取り出した。
６）右肺を摘出し、その湿重量を測定した。
７）６８℃にて２４時間乾燥させた後に乾重量を測定した。
８）湿重量を乾重量で割って湿／乾比を得た。湿／乾比は、肺水腫の程度を評価するために用いられうる。
【０１７１】
実験結果は図４４および５７に示される。
【０１７２】
図４４は、棒グラフとしてＢａｌｂ／ｃマウスの肺湿／乾比を示す。それは、左から右に、対照（トリ將尿液）を気管注入した６時間後のマウスの肺湿／乾比、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを気管注入した６時間後のマウスの肺湿／乾比、３−ＭＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、３０分後、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを気管注入した６時間後のマウスの肺湿／乾比、およびウォルトマンニン（１．５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、３０分後、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを気管注入した６時間後のマウスの肺湿／乾比を示す。肺湿／乾比は、肺損傷の重要な指標の一つであり、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスの注入は、湿／乾比を著しく増加するのに対し、３−ＭＡおよびウォルトマンニンは、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスによってもたらされた湿／乾比の増加を減少させる。結果は、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスが重篤な肺損傷を引き起こすのに対し、３−ＭＡおよびウォルトマンニンが不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスによって誘発される肺損傷をある程度改善することを証明している。
【０１７３】
図５７は、棒グラフとしてＢａｌｂ／ｃマウスの肺湿／乾比を示す。それは、左から右に、対照（トリ將尿液）を気管注入した６時間後のマウスの肺湿／乾比、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを気管注入した６時間後のマウスの肺湿／乾比、ＳＢ２０３５８０（１６ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、１時間後、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを気管注入した６時間後のマウスの肺湿／乾比を示す。肺湿／乾比は、肺損傷の重要な指標の一つである。不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスの注入は湿／乾比を著しく増加させたのに対し、ＳＢ２０３５８０は不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスによって誘発される湿／乾比の増加を減少させた。結果は、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスが重篤な肺損傷を引き起こすのに対し、ＳＢ２０３５８０が不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスによって誘発される肺損傷をある程度改善することを証明している。
【０１７４】
２．ナノメートル物質によって誘発される肺湿／乾比の変化に対する薬物の効果の測定
１）各グループ当たり４〜６匹になるように、マウスを５グループに無作為に分類した。
２）２グループを選択し、１時間前にマウスに３ＭＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。
３）ＰＢＳを気管注入した、対照グループおよび３ＭＡを腹腔内注射した１グループのマウス、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（５０μｇ／ｇ）を気管注入した、３ＭＡを腹腔内注射した他の１グループのマウス、ならびにナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（５０μｇ／ｇ）およびＧ５．５（５０μｇ／ｇ）を気管注入した他の２グループのマウスの気管をそれぞれ単離した。
４）注入後、マウスはレスピレータ（ＨＸ−２００動物レスピレータ、Ｃｈｅｎｇｄｕ  Ｔａｉｍｅｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，ＬＴＤ）で機械的に換気し、５分後に人工呼吸器を停止した。６時間自発呼吸した後に肺を取り出した。
５）右肺を摘出し、その湿重量を測定した。
６）６８℃にて２４時間乾燥させた後に乾重量を測定した。
７）湿重量を乾重量で割って湿／乾比を得た。湿／乾比は、肺水腫の程度を評価するために用いられうる。
【０１７５】
実験結果は図８７に示される。
図８７は、棒グラフとしてＢａｌｂ／ｃマウスの肺湿／乾比を示す。それらは、左から右に、対照を気管注入した１６時間後のマウスの肺湿／乾比、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ５．５（１００μｇ／ｍＬ）を気管注入した１６時間後のマウスの肺湿／乾比、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）を気管注入した１６時間後のマウスの肺湿／乾比、３−ＭＡを腹腔内注射し、１時間後、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３を気管注入した１６時間後のマウスの肺湿／乾比、および３−ＭＡ（１５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した１７時間後のマウスの肺湿／乾比を示す。肺湿／乾比は、肺損傷の重要な指標の一つである。ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３の気管注入は肺組織の湿／乾比を増加させるのに対し、３−ＭＡはナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３によって誘発されるマウスの肺湿／乾比の増加を軽減する。結果は、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３が重篤な肺損傷を引き起こすのに対し、３−ＭＡがナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３によって誘発される肺損傷をある程度改善することを証明している。
【０１７６】
３．鳥インフルエンザ表面タンパク質によって誘発される肺湿／乾比の変化に対する薬物の効果の測定
１）各グループ当たり４〜６匹になるように、マウスを５グループに無作為に分類した。
２）各グループへの１Ｍ  ＨＣｌ（０．５ｕＬ／ｇ）の気管注入の３０分後に、マウスの肺損傷モデルを構築した。
３）３グループを選択し、ＨＣｌ投与の３０分前に、１５ｍｇ／ｋｇ  ３ＭＡ、０．２５ｍｇ／ｋｇ  ＳＢ２０３５８０および０．２５ｍｇ／ｋｇ  ＬＹ２９４００２を、それぞれ、腹腔内注射および気管注入した。
４）Ｆｃ（４×１０−１２ｍｏｌ／ｇ）を気管注入した対照グループのマウス、Ｈ５Ｆｃ（４×１０−１２ｍｏｌ／ｇ）を気管注入した３グループのマウスの気管をそれぞれ単離した。
５）６時間自発呼吸した後に肺を取り出した。
６）右肺の湿重量を測定した。
７）６８℃にて２４時間乾燥させた後に乾重量を測定した。
８）湿重量を乾重量で割って湿／乾比を得た。湿／乾比は、肺水腫の程度を評価するために用いられうる。
【０１７７】
実験結果は図５１および６０に示される。
【０１７８】
図５１は、棒グラフとしてＢａｌｂ／ｃマウスの肺湿／乾比を示す。左から右に、それぞれ、酸吸引後Ｆｃタンパク質を気管注入した６時間後のマウスの肺湿／乾比、酸吸引後Ｈ５Ｆｃタンパク質を気管注入した６時間後のマウスの肺湿／乾比、酸吸引後３−ＭＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、３０分後、Ｈ５Ｆｃタンパク質を気管注入した６時間後のマウスの肺湿／乾比、酸吸引後ＬＹ２９４００２（０．２５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、３０分後、Ｈ５Ｆｃタンパク質を気管注入した６時間後のマウスの肺湿／乾比である。肺湿／乾比は、肺損傷の重要な指標の一つである。酸吸引後のＨ５Ｆｃタンパク質の気管注入は湿／乾比を著しく増加させるのに対し、３−ＭＡおよびＬＹ２９４００２は酸吸引後のＨ５Ｆｃタンパク質によって誘発される湿／乾比の増加を減少させた。結果は、酸吸引後のＨ５Ｆｃタンパク質が重篤な肺損傷を引き起こすのに対し、３−ＭＡおよびＬＹ２９４００２が酸吸引後のＨ５Ｆｃタンパク質によって誘発される肺損傷をある程度改善することを証明している。
【０１７９】
図６０は、棒グラフとしてＢａｌｂ／ｃマウスの肺湿／乾比を示す。左から右に、それぞれ、酸吸引後Ｆｃタンパク質を気管注入した６時間後のマウスの肺湿／乾比、酸吸引後Ｈ５Ｆｃタンパク質を気管注入した６時間後のマウスの肺湿／乾比、酸吸引後ＳＢ２０３５８０（１６ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、３０分後、Ｈ５Ｆｃタンパク質を気管注入した６時間後のマウスの肺湿／乾比を示す。肺湿／乾比は、肺損傷の重要な指標の一つであり、酸吸引後のＨ５Ｆｃタンパク質の気管注入は肺湿／乾比を著しく増加させたのに対して、ＳＢ２０３５８０は酸吸引後のＨ５Ｆｃタンパク質によって誘発される肺湿／乾比の増加を減少させた。結果は、酸吸引後のＨ５Ｆｃタンパク質が重篤な肺損傷を引き起こすのに対し、ＳＢ２０３５８０が酸吸引後のＨ５Ｆｃタンパク質によって誘発される肺損傷をある程度改善することを証明している。
【０１８０】
４．鳥インフルエンザによって誘発される肺湿／乾比の変化に対する薬物の効果の測定
１）ブラッドフォード法によってＨ５Ｎ１型不活化ウイルスタンパク質の濃度を決定した。
２）各グループ当たり４〜６匹になるように、マウスを４グループに無作為に分類した。
３）対照ｓｉＲＮＡ（１００μｇ）およびＡｔｇ５ｓｉＲＮＡ（１００μｇ）を、それぞれ、２グループごとに注入した。
４）２４時間後、対照ｓｉＲＮＡ群におけるマウスにトリ將尿液および不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルス（１０μｇ／ｇ）をそれぞれ気管注入し、Ａｔｇ５ｓｉＲＮＡ群におけるマウスに、トリ將尿液および不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルス（１０μｇ／ｇ）をそれぞれ気管注入した。
５）注入後、マウスはレスピレータ（ＨＸ−２００動物レスピレータ、Ｃｈｅｎｇｄｕ  Ｔａｉｍｅｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，ＬＴＤ）で機械的に換気し、５分後に人工呼吸器を停止した。６時間自発呼吸した後に肺を取り出した。
６）右肺の湿重量を測定した。
７）６８℃にて２４時間乾燥させた後に乾重量を測定した。
８）湿重量を乾重量で割って湿／乾比を得た。湿／乾比は、肺水腫の程度を評価するために用いられうる。
【０１８１】
実験結果は図４８に示される。
図４８は、棒グラフとしてＢａｌｂ／ｃマウスの肺湿／乾比を示す。対照ｓｉＲＮＡおよびＡｔｇ５  ｓｉＲＮＡをそれぞれ注入し、２４時間後、対照（トリ將尿液）および不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスをそれぞれ注入した、４時間後のマウスの肺組織の湿／乾比の結果である。肺湿／乾比は、肺損傷の重要な指標の一つであり、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスの注入は著しく湿／乾比を増加するのに対し、Ａｔｇ５  ｓｉＲＮＡはＡｔｇ５タンパク質の発現を阻害して肺損傷をある程度軽減することから、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスがオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を活性化して肺損傷の発生を誘発することを示唆する。
【０１８２】
実施例１９  肺弾性の実験方法
１．鳥インフルエンザウイルスによって誘発される肺弾性の変化に対する薬物の効果
１）８−１０週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを選択し、マウスをグループに無作為に分類した。３ＭＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）およびＰＢＳを、それぞれ、３０分前に腹腔内注射した。
２）マウスを１％ペントバルビタールで麻酔した。
３）マウスの気管カニューレの手術を行った。
４）マウスを深く麻酔した後、ＢＵＸＣＯ  ＰＦＴによって０時間のマウスの肺組織のＣｃｈｏｒｄ（０−１０ｃｍＨ２Ｏ  肺組織適合性）を測定し、Ｅ（肺弾性）＝１／Ｃｃｈｏｒｄを算出した。
５）ピペットで気管カニューレに正確に將尿液またはＨ５Ｎ１型不活化ウイルス（２００μｇ）を注入し、注入時間を記録した。
６）動物レスピレータでマウスを換気した、ｆ（頻度）＝１５０回／分、ｐ（圧力）＝３０ｃｍＨ２Ｏ  ３秒、ｐ＝２５ｃｍＨ２Ｏ  ２分。
７）マウスの自発呼吸を保持した。
８）投与の１時間半後、ＢＵＸＣＯ  ＰＦＴによってマウスの肺組織のＣｃｈｏｒｄを測定し、Ｅ＝１／１時間半ごとのＣｃｈｏｒｄを得た。
９）１時間半ごとの肺組織の弾性の変化率を算出し、曲線を作製した。
【０１８３】
実験結果は図４３に示される。
図４３は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの肺組織の弾性の結果を示す。それは、それぞれ、対照（トリ將尿液）を気管注入したマウスの、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを気管注入したマウスの、そして、最初に３−ＭＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、３０分後に不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスを注入したマウスからの、肺組織の弾性の変化を示す。自発呼吸するマウスの肺弾性の変化を、４時間３０分ごとに測定した。肺弾性は、肺機能を測定するための重要な指標である。不活化鳥インフルエンザウイルスの気管注入はマウスの肺のコンプライアンスを著しく減少させるのに対し、３−ＭＡは誘発された損傷の軽減および肺の保護機能に一定の効果を有する。
【０１８４】
２．鳥インフルエンザウイルスによって誘発される肺弾性の変化に対するｓｉＲＮＡの効果
１）８−１０週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを選択し、マウスをグループに無作為に分類した。マウスを１％ペントバルビタールナトリウムで麻酔した。
２）マイクロシリンジでｓｉＲＮＡ対照１００ｕＬ（１００μｇ）およびｓｉＲＮＡ  Ａｔｇ５  １００ｕＬ（１００μｇ）を気管注入した。
３）２４時間後、マウスを１％ペントバルビタールナトリウムで麻酔した。
４）マウスの気管カニューレの手術を行った。
５）マウスを深く麻酔した後、ＢＵＸＣＯ  ＰＦＴによって０時間のマウスの肺組織のＣｃｈｏｒｄ（０−１０ｃｍＨ２Ｏ  肺組織適合性）を測定し、Ｅ（肺弾性）＝１／Ｃｃｈｏｒｄを算出した。
６）ピペットで気管カニューレに正確に將尿液またはＨ５Ｎ１型不活化ウイルス（２００μｇ）を注入し、注入時間を記録した。
７）動物レスピレータでマウスを換気した、ｆ（頻度）＝１５０回／分、ｐ（圧力）＝３０ｃｍＨ２Ｏ  ３秒、ｐ＝２５ｃｍＨ２Ｏ  ２分。
８）マウスの自発呼吸を保持した。
９）投与の１時間半後、ＢＵＸＣＯ  ＰＦＴによってマウスの肺組織のＣｃｈｏｒｄを測定して、Ｅ＝１／１時間半ごとのＣｃｈｏｒｄを得た。
１０）１時間半ごとの肺組織の弾性の変化率を算出し、曲線を作製した。
【０１８５】
実験結果は図４７に示される。
図４７は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの肺組織の弾性の結果を示す。対照ｓｉＲＮＡおよびＡｔｇ５  ｓｉＲＮＡをそれぞれ注入し、２４時間後、対照（トリ將尿液）および不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスをそれぞれ注入した、マウスの肺組織の弾性を３０分ごとに測定した。自発呼吸するマウスの肺弾性の変化の測定を４時間行った。不活化鳥インフルエンザウイルスの気管注入はマウスの肺のコンプライアンスを著しく減少させるのに対し、Ａｔｇ５  ｓｉＲＮＡはＡｔｇ５タンパク質の発現の阻害を介して肺損傷をある程度軽減することから、不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスがオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を活性化して肺損傷の発生を誘発することを示唆する。
【０１８６】
３．ナノメートル物質によって誘発される肺弾性の変化に対する薬物の効果
１）８−１０週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを選択し、マウスをグループに無作為に分類した。３ＭＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）およびＰＢＳを、それぞれ、３０分前に腹腔内注射した。
２）マウスを１％ペントバルビタールナトリウムで麻酔した。
３）マウスの気管カニューレの手術を行った。
４）マウスを深く麻酔した後、ＢＵＸＣＯ  ＰＦＴによって０時間のマウスの肺組織のＣｃｈｏｒｄ（０−１０ｃｍＨ２Ｏ  肺組織適合性）を測定し、Ｅ（肺弾性）＝１／Ｃｃｈｏｒｄを算出した。
５）ピペットで気管カニューレに正確にＰＢＳまたはナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１２．５μｇ／ｇ）およびＧ５．５（１２．５μｇ／ｇ）不活化ウイルスを注入し、注入時間を記録した。
６）動物レスピレータでマウスを換気した、ｆ（頻度）＝１５０回／分、ｐ（圧力）＝３０ｃｍＨ２Ｏ  ３秒、ｐ＝２５ｃｍＨ２Ｏ  ２分。
７）マウスの自発呼吸を保持した。
８）投与の１時間半後、ＢＵＸＣＯ  ＰＦＴによってマウスの肺組織のＣｃｈｏｒｄを測定して、Ｅ＝１／１時間半ごとのＣｃｈｏｒｄを得た。
９）１時間半ごとの肺組織の弾性の変化率を算出し、曲線を作製した。
【０１８７】
実験結果は図８８に示される。
図８８は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの肺弾性の変化の略図を示す。左から右に、連続して、対照を気管注入したＢａｌｂ／ｃマウスの肺弾性の変化、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ５．５（５０ｍｇ／ｋｇ）を気管注入したマウスの肺弾性の変化、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（５０ｍｇ／ｋｇ）を注入したマウスの肺弾性の変化、３−ＭＡ（１５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、１時間後、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３を注入したマウスの肺弾性の変化を示す。肺弾性は、肺損傷の重要な指標の一つである。ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３はマウスの肺弾性の変化を引き起こすのに対し、３−ＭＡはナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３によって誘発されるマウスの肺弾性の変化を軽減する。結果は、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３が重篤な肺損傷を引き起こすのに対し、３−ＭＡがナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３によって誘発される肺損傷をある程度改善することを証明している。
【０１８８】
実施例２０  生存率の実験
１．鳥インフルエンザウイルスによって誘発される生存率に対する薬物の効果
１）ブラッドフォード法によってＨ５Ｎ１型不活化ウイルスタンパク質の濃度を測定した。
２）各グループ当たり６〜８匹になるように、マウスを４グループに無作為に分類した。
３）Ｈ５Ｎ１型不活化ウイルスの注入の８時間および２時間前ならびに注入の０．５時間後に、それぞれ、３ＭＡ（１５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した、２グループのマウスを選択した。
４）トリ將尿液を気管注入した、対照グループのマウスおよび３ＭＡの１グループのマウスならびに不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルス（１０μｇ／ｇ）を気管注入した他の２グループのマウスの気管をそれぞれ単離した。
５）注入後、マウスはレスピレータ（ＨＸ−２００動物レスピレータ、Ｃｈｅｎｇｄｕ  Ｔａｉｍｅｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，ＬＴＤ）で機械的に換気し、５分後に人工呼吸器を停止した。マウスの自発呼吸は保持した。
６）半時間ごとにマウスの生存状況を記録した。
７）ＳＰＳＳによって最終結果を統計解析し、生存率の曲線を作製した。
【０１８９】
実験結果は図４５に示される。
図４５は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの生存曲線を示す。不活化Ｈ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスの気管注入の８時間前、２時間前およびその気管注入の３０分後に、３−ＭＡ（１５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射して、１５分ごとに生存状況を観察した。それは、３−ＭＡがマウスの死の遅延に対して効果を有することを証明している。
【０１９０】
２．ナノメートル物質ＰＡＭＡＭによって誘発される生存率に対する薬物の効果
１）ブラッドフォード法によってＨ５Ｎ１型不活化ウイルスタンパク質の濃度を測定した。
２）各グループ当たり６〜８匹になるように、マウスを４グループに無作為に分類した。
３）ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（５０μｇ／ｇ）の気管注入の１２時間および３時間前ならびに注入の０．５時間後に、それぞれ、３ＭＡ（１５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した、２グループのマウスを選択した。
４）ＰＢＳを気管注入した、対照グループのマウスおよび３ＭＡの１グループのマウスならびにナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（５０μｇ／ｇ）を気管注入した他の２グループのマウスの気管をそれぞれ単離した。
５）半時間ごとにマウスの生存状況を記録した。
６）ＳＰＳＳによって最終結果を統計解析し、生存率の曲線を作製した。
【０１９１】
実験結果は図８９に示される。
【０１９２】
図８９は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの生存曲線を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスは以下のように処置された：対照を気管注入した；ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ５．５（５０ｍｇ／ｋｇ）を気管注入した；ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（５０ｍｇ／ｋｇ）を気管注入した；３−ＭＡ（１５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、１時間後、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（５０ｍｇ／ｋｇ）を気管注入した；および３−ＭＡ（１５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。マウスを継続して２４時間観察した。１時間おきに生存しているマウス数を計測して、統計解析を行った。結果：ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３はマウスの死亡率を増加させるのに対し、３−ＭＡはナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３によって誘発されるマウスの死亡を有意に軽減しうる。
【０１９３】
図９０は、ウォルトマンニンの構造式を示す。ＣＡＳ番号は１９５４５−２６−７であり、分子式はＣ２３Ｈ２４Ｏ８であり、分子量は４２８．４３である。
【０１９４】
実施例２１  細胞内シグナル経路の作図
細胞内シグナル経路をフォトショップのソフトウェアによって作図し、シグナル経路における異なる分子または細胞小器官または組織を示すために特定の形式を用いた。矢印は上流のシグナル分子が下流のシグナル分子を活性化するかまたは特定の効果をもたらすことを示し、「Ｔ」型は阻害効果を示す。
【０１９５】
実験結果は図３７および８５に示される。
【０１９６】
図３７は、細胞シグナル経路の略図を示す。上記の実験結果から、本発明者らは、略図に示される結論を得ることができた：鳥インフルエンザウイルスは、ＡＫＴからＴＳＣ１／２、次いで、ｍＴＯＲ、そして、オートファジーの経路を介してオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を誘発しうる。鳥インフルエンザウイルスはＡＫＴを阻害し、ＡＫＴはＴＳＣ１／２を阻害し、ＴＳＣ１／２はｍＴＯＲ経路を阻害し、ｍＴＯＲ経路はオートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を阻害する；オートファジー経路は、Ａｔｇ５−Ａｔｇ１２からＬＣ３の経路を介して作用して、オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を誘発する。
【０１９７】
図８５は、細胞シグナル経路の略図を示す。上記の実験結果から、本発明者らは略図に示されるように結論づけることができる：ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３がＡｋｔ−ＴＳＣ１／２−ｍＴＯＲ−オートファジーの経路を活性化しうる。ｍＴＯＲの活性化は、オートファジーの発生を阻害しうる；ＴＳＣ１／２の活性化は、オートファジー（ＩＩ型細胞アポトーシス）を促進するためにｍＴＯＲの活性化を阻害しうる。
【０１９８】
実施例２２  ＤＮＡラダー測定
１）単細胞懸濁液に対数増殖期のＡ５４９細胞を消化させ、６ｃｍディッシュに分注した。
２）３７℃にて２４時間培養するためにＣＯ２インキュベーターに移した。
３）各ディッシュに陰性対照としてＰＢＳを加え、陽性対照として６％ＤＭＳＯを加え、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３を別々に加えた。
４）２４時間後、すべての細胞を回収した。
５）Ｑｉａｇｅｎ全ゲノム抽出キットによって細胞のゲノムＤＮＡを抽出した。
６）２時間６０Ｖでアガロースゲル電気泳動を行った。
７）ＵＶ下で観察し、撮影した。
【０１９９】
実験結果は図６２に示される。
図６２は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のゲノム電気泳動図を示す。Ａ５４９細胞を、対照、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、６％ｖ／ｖ）およびナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３（１００μｇ／ｍＬ）で処置した後、細胞を回収し、細胞のゲノムＤＮＡをゲノム抽出用キットで単離し、アガロースゲル電気泳動を行った。ジメチルスルホキシドは、アポトーシス誘導剤として用いた。
【０２００】
実施例２３  カスパーゼ−３活性の蛍光測定
１）単細胞懸濁液に対数増殖期のＡ５４９細胞を消化させ、６ｃｍディッシュに分注した。
２）３７℃にて２４時間培養するためにＣＯ２インキュベーターに移した。
３）各ディッシュに陰性対照としてＰＢＳを加え、陽性対照として６％ＤＭＳＯを加え、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ３およびＧ５．５を別々に加えた。
４）２４時間後、細胞を溶解した。
５）遠心分離し、上清を除去し、カスパーゼ−３活性蛍光検出キット（ＣＥＰＲＥＩ）で検出した。
６）蛍光強度を測定した。
【０２０１】
実験結果は図６３に示される。
図６３は、異なる方法で処置したＡ５４９細胞のカスパーゼ−３活性の結果を示す。Ａ５４９細胞を、対照、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、６％ｖ／ｖ）、ナノメートル物質ＰＡＭＡＭ  Ｇ５．５およびＰＡＭＡＭ  Ｇ３種でそれぞれ処置し。２４時間後、細胞のカスパーゼ−３活性をカスパーゼ−３活性試験キットで測定した。
【０２０２】
実施例２４  化学式
化合物の構造は、化学分野に一般的に用いられる標準規則にしたがって示される。
【０２０３】
実験結果は、図９０、９１、９２および９３に示される。
図９０は、ウォルトマンニンの構造式を示す。ＣＡＳ番号は１９５４５−２６−７であり、分子式はＣ２３Ｈ２４Ｏ８であり、分子量は４２８．４３である。
図９１は、ＬＹ−２９４，００２の構造式を示す。ＣＡＳ番号は９３４３８９−８８−５であり、分子式はＣ１９Ｈ１７ＮＯ３・ＨＣｌであり、分子量は３４３．８０である。
図９２は、３−メチルアデニンの構造を示す。ＣＡＳ番号は１５１４２−２３−４であり、分子式はＣ６Ｈ７Ｎ５であり、分子量は１４９．１５である。
図９３は、ＳＢ  ２０３５８０の構造を示す。ＣＡＳ番号は１５２１２１−４７−６であり、分子式はＣ２１Ｈ１６ＦＮ３ＯＳであり、分子量は３７７．４３である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６Ａ−３６Ｂ】
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【図３６Ｃ−３６Ｄ】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図３９Ｃ】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図４９Ｃ】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５Ａ】
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【図５５Ｂ】
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【図５５Ｃ】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８Ａ】
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【図５８Ｂ】
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【図５８Ｃ】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４Ａ】
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【図６４Ｂ】
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【図６４Ｃ】
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【図６４Ｄ】
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【図６５】
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【図６６Ａ】
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【図６６Ｂ】
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【図６６Ｃ】
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【図６６Ｄ】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９Ａ】
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【図７９Ｂ】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
0005658741.tif 000151
【図８６Ａ】
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【図８６Ｂ】
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【図８６Ｃ】
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【図８７】
0005658741.tif 000155
【図８８】
0005658741.tif 000156
【図８９】
0005658741.tif 000157
【図９０】
0005658741.tif 000158
【図９１】
0005658741.tif 000159
【図９２】
0005658741.tif 000160
【図９３】
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【配列表】
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