(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均粒子径が１０〜３，０００μｍの範囲にあるアルギン酸−キトサンゲルビーズからなる多孔質のマイクロカプセルであって、皮張り状の表面を有して内部全体が荒目のスポンジ状をなし、そのスポンジ状の空隙部にサッチ分解菌を含む内水相が充満してなるサッチ分解菌内包マイクロカプセル。
【請求項２】
サッチ分解菌がBacillus subtilis属菌である請求項１に記載のサッチ分解菌内包マイクロカプセル。
【請求項３】
前記請求項１又は２に記載のサッチ分解菌内包マイクロカプセルを芝生地に散布することを特徴とする芝生地の保全方法。
【請求項４】
酸成分及び塩化カルシウムを含むキトサン水溶液からなる連続相に、サッチ分解菌を含むアルギン酸塩水溶液を分散相として滴下混合することにより、サッチ分解菌を内包したアルギン酸−キトサンゲルビーズを生成させたのち、ろ過・洗浄して得られたゲルビーズを凍結乾燥することを特徴とするサッチ分解菌内包マイクロカプセルの製造方法。
【請求項５】
前記キトサン水溶液の粘度が１０ｍＰａ・ｓ以下である請求項４に記載のサッチ分解菌内包マイクロカプセルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、芝生地に堆積するサッチを分解除去するのに好適なサッチ分解菌内包マイクロカプセルと、このマイクロカプセルを用いた芝生地の保全方法、及び該マイクロカプセルの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、ゴルフ場のグリーン、サッカーや野球、競馬等の競技場、庭園等の芝生地では、芝丈を揃えるために定期的に芝刈りを行うが、その際に発生する刈りかすが芝草の間に蓄積してサッチ（thatch) を生じる。このサッチは芝草の前記刈りかすや枯れた葉、茎、根等の堆積層であるが、その堆積が多くなると、土中や芝草の根に対して空気や水が浸透しにくくなると共に、散布した肥料や農薬がサッチに吸収されて効きにくくなり、また病原菌や害虫の繁殖や腐敗による有毒ガスの発生を招き易く、芝草の生育不良や枯死の要因になる。従って、芝生地を健全に保つための手入れとして、サッチの堆積が多くなる前に除去する必要がある。
【０００３】
従来、サッチの除去手段として、ゴルフ場や競技場等の広い芝生地ではバーチカルモアと称される自走式又は牽引式の機械のブレードによってサッチを掻き取る方法が採用され、また庭園等の狭い芝生地ではレーキや熊手を用いて人手でサッチを掻き出すのが普通である（非特許文献１）。しかるに、機械的作業と手作業のいずれにしても、サッチ除去作業には非常に手間が掛かる上、その作業で芝草を痛める懸念も多分にあった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】http://www.takii.co.jp/green/howto/howto5.html(2009/9/11) 「芝・緑化・緑肥｜芝生なんでも百科．タキイ種苗」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、上述の事情に鑑みて、微生物を用いてサッチを分解・減容化する手段の可否について実験研究を重ねた結果、サッチ分解菌として高い活性を示す微生物が存在し、該微生物を一般的な培養手段によって容易に増殖でき、もって工業的規模での利用が充分に可能であることが判明した。しかるに、このようなサッチ分解菌を芝生地に直接に散布する方法では、日照、温度変化、降雨等の厳しい自然条件の影響を受けるため、該サッチ分解菌が芝生地に定着し難い上に短期間で失活し易く、安定したサッチ分解作用を長期にわたって発揮させることが困難であった。
【０００６】
そこで、本発明者らは、更なる実験研究の過程で、マイクロカプセルによる微生物の固定化に着目し、サッチ分解菌への応用について鋭意検討を重ねた。その結果、環境分解性ポリマーからなる多孔質のマイクロカプセルによれば、サッチ分解菌を安定的に担持させて芝生地に効率よく定着させることが可能であり、しかもサッチ分解菌を環境変化から保護できることに加え、マイクロカプセルの環境分解性ポリマーが食餌となるためにサッチ分解菌の失活が抑制され、散布した芝生地への環境負荷を与えることなく、その高いサッチ分解能力を長期間安定的に発揮させ得ることを見出し、本発明をなすに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
請求項１の発明に係るサッチ分解菌内包マイクロカプセルは、平均粒子径が１０〜３，０００μｍの範囲にあるアルギン酸−キトサンゲルビーズからなる多孔質のマイクロカプセルであって、皮張り状の表面を有して内部全体が荒目のスポンジ状をなし、そのスポンジ状の空隙部にサッチ分解菌を含む内水相が充満してなるものとしている。
【０００８】
そして、上記請求項１のサッチ分解菌内包マイクロカプセルの好適態様として、請求項２の発明はサッチ分解菌がBacillus subtilis属菌であること、を特定している。
【０００９】
また、請求項３の発明に係る芝生地の保全方法は、上記請求項１又は２のサッチ分解菌内包マイクロカプセルを芝生地に散布することを特徴としている。
【００１０】
一方、請求項４の発明に係るサッチ分解菌内包マイクロカプセルの製造方法は、酸成分及び塩化カルシウムを含むキトサン水溶液からなる連続相に、サッチ分解菌を含むアルギン酸塩水溶液を分散相として滴下混合することにより、サッチ分解菌を内包したアルギン酸−キトサンゲルビーズを生成させたのち、ろ過・洗浄して得られたゲルビーズを凍結乾燥することを特徴としている。
【００１１】
そして、上記請求項４のサッチ分解菌内包マイクロカプセルの製造方法の好適態様として、請求項５の発明はキトサン水溶液の粘度が１０ｍＰａ・ｓ以下であること、を特定している。
【発明の効果】
【００１２】
請求項１の発明に係るサッチ分解菌内包マイクロカプセルは、アルギン酸−キトサンゲルビーズからなる多孔質のマイクロカプセルであって、皮張り状の表面を有して内部全体が荒目のスポンジ状をなし、そのスポンジ状の空隙部にサッチ分解菌を含む内水相が充満してなるものであるから、芝生地に散布することで効率よく定着させることができると共に、日照、温度変化、降雨等の厳しい自然条件に晒されても内包されたサッチ分解菌は環境変化から保護され、加えてマイクロカプセルを構成するアルギン酸−キトサンゲルビーズがサッチ分解菌の食餌となるためにサッチ分解菌の失活が抑制される。従って、該マイクロカプセルを散布した芝生地においては、長期にわたってサッチ分解菌が安定的に放出されて高いサッチ分解能力を持続的に発揮するから、サッチが厚く堆積して土中や芝草の根に対して空気や水が浸透しにくくなったり、散布した肥料や農薬がサッチに吸収されて効きにくくなったりすることがなく、また病原菌や害虫の繁殖や腐敗による有毒ガスの発生も防止され、もって芝草が長期間健全な状態に保持される上、マイクロカプセルを構成するアルギン酸−キトサンゲルは環境分解性ポリマーであって自然環境下で経時的に分解されて最終的に消失するから、該マイクロカプセルの散布によって芝生地及びその周辺に環境負荷を与えることもない。加えて、マイクロカプセルの平均粒子径が特定範囲にあるため、芝生地に散布後、降雨や撒水によって流失しにくく、且つ芝草の植生状況や土壌状況を変化させることもない。
【００１３】
請求項２の発明によれば、上記マイクロカプセルに内包するサッチ分解菌が、高いサッチ分解作用を発揮すると共に、マイクロカプセル内包状態で失活しにくく、且つ比較的に培養し易く安価に入手できるという利点がある。
【００１４】
請求項３の発明に係る芝生地の保全方法によれば、上記のサッチ分解菌内包マイクロカプセルを芝生地に散布することから、長期にわたってサッチ分解菌が安定的に放出されて高いサッチ分解能力を持続的に発揮するから、サッチが厚く堆積して土中や芝草の根に対して空気や水が浸透しにくくなったり、散布した肥料や農薬がサッチに吸収されて効きにくくなったりすることがなく、また病原菌や害虫の繁殖や腐敗による有毒ガスの発生も防止され、もって芝草が長期間健全な状態に保持されると共に、散布された該マイクロカプセルによる環境負荷も生じない。
【００１５】
請求項４の発明に係る製造方法によれば、上記のサッチ分解菌を内包したアルギン酸−キトサンゲルビーズからなるマイクロカプセルを容易に製造できる。
【００１６】
請求項５の発明によれば、サッチ分解菌を内包した上記アルギン酸−キトサンゲルビーズとして特に高品位のものを確実に製出できるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】サッチ分解菌の培養時間と培地中制菌数及び培地中ｐＨとの関係を示し、（ａ）は培養１回目の相関特性図、（ｂ）は培養２回目の相関特性図である。
【図２】サッチ分解菌の活性評価試験における震とう時間とセルロース分解率の相関特性図である。
【図３】本発明の実施例１におけるアルギン酸−キトサンゲルビーズの調製試験で得られたゲルビーズを示す走査型電子顕微鏡写真図である。
【図４】同実施例１で調製したサッチ分解菌内包アルギン酸−キトサンゲルビーズとその断面、ならびに前記調製試験で得られた菌なしアルギン酸−キトサンゲルビーズの断面を示す走査型電子顕微鏡写真図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明のサッチ分解菌内包マイクロカプセルは、アルギン酸−キトサンゲルビーズからなる多孔質のマイクロカプセルであって、皮張り状の表面を有して内部全体が荒目のスポンジ状をなし、そのスポンジ状の空隙部にサッチ分解菌を含む内水相が充満しており、該内水槽のサッチ分解菌の放出によって高いサッチ分解能力を発揮する。従って、このサッチ分解菌内包マイクロカプセルを散布した芝生地では、サッチが厚く堆積して土中や芝草の根に対して空気や水が浸透しにくくなったり、散布した肥料や農薬がサッチに吸収されて効きにくくなったりすることがなく、また病原菌や害虫の繁殖や腐敗による有毒ガスの発生も防止される結果、芝草が健全な状態で長期間安定的に保持される。そして、マイクロカプセル自体は、サッチ分解菌の担持性及び棲息適性に優れることに加え、これを構成するアルギン酸−キトサンゲルがサッチ分解菌の食餌となり、内包されたサッチ分解菌が盛んに増殖するため、マイクロカプセル外への放出による減少分が常時確実に補充され、もって高いサッチ分解能力を長期にわたって安定的に発揮できる上、自然環境下で経時的に分解されて最終的に消失するから、散布した芝生地及びその周辺に環境負荷を与えることもない。
【００１９】
本発明で用いるサッチ分解菌としては、サッチ分解能力を備えるものであれば特に制約はないが、所謂枯草菌として知られるBacillus subtilis 属菌が好適である。すなわち、Bacillus subtilis 属菌は、サッチ分解能力が高く、且つマイクロカプセル内包状態で失活しにくいことに加え、比較的に培養し易く安価に入手できるという利点がある。
【００２０】
サッチ分解菌内包マイクロカプセルのサイズは、平均粒子径として１０〜３，０００μｍの範囲が好適であり、小さ過ぎては降雨や撒水によって流失し易く、逆に大き過ぎては芝草の植生状況や土壌状況を変化させる懸念がある。
【００２１】
このサッチ分解菌を内包したアルギン酸−キトサンゲルビーズからなる多孔質のマイクロカプセルを製造するには、キトサンを水に溶解させるための酸成分とアルギン酸のゲル化剤である塩化カルシウムとを含むキトサン水溶液からなる連続相に、サッチ分解菌を含むアルギン酸塩水溶液を分散相として滴下混合することにより、サッチ分解菌を内包したアルギン酸−キトサンゲルビーズを生成させたのち、ろ過・洗浄して得られるゲルビーズを凍結乾燥して回収すればよい。
【００２２】
この製造方法における上記連続相では、サッチ分解菌の活性を高めることと、アルギン酸とキトサンとの間の静電的相互作用による複合膜形成促進のために、水酸化ナトリウム等のアルカリ添加でｐＨを５〜５．５程度の弱酸性に調整することが望ましい。また、この連続相に分散相のサッチ分解菌を含むアルギン酸塩水溶液を滴下混合する際、サッチ分解菌を保護するのために液温を１〜２０℃適度の低温に設定することが望ましい。
【００２３】
なお、キトサンとしては、市販のキトサン水溶液を使用できるが、その粘度によって製出するアルギン酸−キトサンゲルビーズの性状に差異を生じる。因みに、キトサン水溶液の市販品として代表的な和光純薬工業社製の商品名キトサン５，キトサン５０，キトサン３００の３種では、その粘度及びｐＨが次のように異なっている。
粘度（ｍＰａ・ｓ）  ｐＨ（10ｇ／ｌ水浸液，25℃）
キトサン５    ・・・・  ０〜10  ・・・・・・8.0〜10.0
キトサン５０  ・・・・  10〜100 ・・・・・・7.0〜 9.0
キトサン３００・・・・ 100〜500 ・・・・・・6.0〜 8.0
しかして、これら３種のいずれのキトサンを用いてもアルギン酸−キトサンゲルビーズの調製は可能であるが、上記のアルカリ添加で連続相のｐＨを上げてゆくと、キトサン５０及びキトサン３００ではゲルビーズの生成と共に一部に凝集を生じ易いが、キトサン５ではｐＨ５．４まで上昇させても凝集を生じないという結果が得られている。従って、ｐＨを弱酸性に調整してサッチ分解菌の活性を高める上では、キトサン水溶液として粘度が１０ｍＰａ・ｓ以下のものを用いることが推奨される。
【実施例】
【００２４】
〔サッチ分解菌の培養〕
減菌処理した702 培地（蒸留水１００ｍｌに１ｇのポリペプトンと０．２ｇのYeast exract及び０．１ｇ のＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2Ｏを溶解、ＰＨ７．０）に、サッチ分解菌としてBacillus su-btilis ＮＢＲＣ１３７１９を添加し、インキュベーター内においてシェイカーで温度３０℃、攪拌速度１７０ｒｐｍの条件で所定日数の培養を行い、培養後の702 培地の液０．１ｍｌを採取して０．９重量％生理食塩水０．９ｍｌに混合し、その混合液の０．１ｍｌを採取して同様の生理食塩水０．９ｍｌに混合する操作を繰り返すことで702 培地を１億容積倍まで希釈し、この希釈液０．１ｍｌを802 寒天培地（蒸留水１００ｍｌに１ｇのポリペプトン、０．２ｇのYeast extract、０．１ｇ のＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2Ｏ、１．５ｇの寒天を溶解、ＰＨ７．０）に添加し、インキュベーターで３０℃にて静置し、１日、２日，３日後に形成したサッチ分解菌のコロニーをカウントして生菌数を計測すると共に、培地中のｐＨをｐＨメーターによって測定した。なお、この培養試験は、再現性を確認するために同一条件で２回行った。その結果、702 培地での培養時間（日数＝day ）と、１日〜３日の各カウント日における802 寒天培地中の生菌数（CFU/ml）及び培地中ｐＨとの関係は、１回目の試験では図１（ａ）、２回目の試験では図１（ｂ）に示す通りであった。
【００２５】
図１（ａ）（ｂ）で示すように、サッチ分解菌の生菌数は２〜３日の培養でピークに達し、培養時間が長くなるに伴って培地中ｐＨは上昇する傾向を示すが、やがてｐＨ９未満で略一定になることが確認された。
【００２６】
〔サッチ分解菌の活性評価〕
０．９重量％生理食塩水１０ｍｌにセルロース０．２５ｇを溶解させた試料液を試験管に収容して減菌処理し、その試料液中に前記培養試験（試験１回目の培養日数  日、寒天培地静置３日後）で得られたサッチ分解菌を湿潤重量で０．０９６７ｇ添加混合して試験管を密栓し、これを３０℃、１５０ｒｐｍで所定時間（０日、０．５日、１日、２日、３日、４日、５日 ）震とうさせたのち、混合液をろ過して回収したセルロースを凍結乾燥させ、その乾燥重量を測定した。そして、震とう０日と震とうｎ日後の乾燥重量の差をセルロースの重量減少量として、各震とう時間によるセルロース分解率を求めたところ、図２に示す結果が得られた。この図２より、震とう時間（日数）と共にセルロース分解率が上昇し、震とう４日でセルロース分解率５０％近くに達しており、このサッチ分解菌が高いサッチ分解能力を備えることが明らかである。
【００２７】
実施例１
既述キトサンの規格による３種のキトサンをそれぞれ用い、ウォータージャケットを備えた密閉式の攪拌槽内で、４ｇ／Ｌ濃度のキトサン水溶液１５０ｍｌに０．１重量％相当の塩酸０．４１７ｇと０．０５Ｍ相当の塩化カルシウム０．８３３ｇを添加混合して連続相を調製すると共に、１Ｍ−水溶液ナトリウム水溶液を加えてｐＨ調整を行い、この連続相を水冷によって液温４℃に維持しつつ、分散相として１．８ｗ／ｖ％のアルギン酸ナトリウム水溶液（粘度５００〜６００ｃｐ）２０ｍｌをシリンジによって滴下し、１２０ｒｐｍで緩やかに３０分間攪拌してアルギン酸−キトサンゲルビーズを生成させたのち、ろ過・洗浄して得られるゲルビーズを凍結乾燥して回収した。
【００２８】
このゲルビーズの回収量及び回収率とゲルビーズ生成状況を、使用したキトサンの粘度及び連続相ｐＨと共に表１に示す。また、図３に、キトサン種と連続相ｐＨが異なる各調製条件で得られたゲルビーズの走査型電子顕微鏡写真図を示す。なお、回収率は、〔回収したゲルビーズ（凝集物を含む）の重量×１００〕／（アルギン酸Ｎａ質量＋キトサン質量）として算出した。なお、ゲルビーズ生成状況は次の５段階で評価した。
◎・・・最も良好な生成状況で、乾燥後の状態もよい。
○・・・良好なゲルビースが生成している。
△・・・ゲルビーズが生成するが、一部に凝集がみられる。
▲・・・ゲルビーズが生成するが、柔らかく脆い。
×・・・ゲルビーズが生成していない。
【００２９】
【表１】
0005721240.tif 000002
【００３０】
図３の電子顕微鏡写真図で示すように、３種のキトサン用いて各々連続相のｐＨを２．２と５．４のいずれに設定した場合でもゲルビーズが生成している。また、表２で示すように、キトサン種及び連続相ｐＨの違いによるゲルビーズ回収量及び回収率の差は殆どない。しかるに、キトサン５０，３００を用いて水溶液ナトリウム水溶液による連続相のｐＨ調整を行った場合、ゲルビーズの生成と共に一部に凝集を生じている。これに対し、キトサン５を用いた場合では、連続相のｐＨを５．４まで上昇させても上記凝集を生じていない。この結果から、次のサッチ分解菌内包アルギン酸−キトサンゲルビーズの調製ではキトサン５を使用した。
【００３１】
＜サッチ分解菌内包アルギン酸−キトサンゲルビーズの調製＞
キトサンとしてキトサン５を用いると共に、分散相のアルギン酸ナトリウム水溶液にサッチ分解菌として前記の培養した Bacillus su-btilis ＮＢＲＣ１３７１９を湿潤重量で０．６５ｇ添加した以外は、前記アルギン酸−キトサンゲルビーズの調製試験と同様にしてサッチ分解菌内包アルギン酸−キトサンゲルビーズを調製した。
【００３２】
得られたサッチ分解菌内包ゲルビーズの回収量及び回収率を連続相ｐＨと共に表２に示す。また、図４に、連続相ｐＨが２．２及び５．４の場合の得られたサッチ分解菌内包ゲルビーズの走査型電子顕微鏡写真図（ａ）（ｂ）と、連続相ｐＨ２．２で得られたサッチ分解菌内包ゲルビーズの断面の走査型電子顕微鏡写真図（ｃ）と、前記調製試験でキトサン５を用いて連続相ｐＨ２．２の条件で調製した菌なしのゲルビーズの断面の走査型電子顕微鏡写真図（ｄ）を示す。なお、回収率は、〔回収したゲルビーズ（凝集物を含む）の重量×１００〕／（アルギン酸Ｎａ質量＋キトサン質量＋菌重量）として算出した。
【００３３】
【表２】
0005721240.tif 000003
【００３４】
図４の電子顕微鏡写真から、調製したサッチ分解菌内包アルギン酸−キトサンゲルビーズは、皮張り状の表面を有して内部全体が荒目のスポンジ状をなし、そのスポンジ状の空隙部にサッチ分解菌を含む内水相が充満したゲルビーズ形態であることが判る。また、表２の結果から、サッチ分解菌内包ゲルビーズの回収率が菌なしゲルビーズの回収率（表１参照）よりも若干低下している。これは、分散相のアルギン酸ナトリウム水溶液がサッチ分解菌を含むことで、連続相に対する分散性が低下する傾向を示している。
【００３５】
参考例
既述キトサンの規格による３種のキトサンをそれぞれ用い、その１ｗ／ｗ％濃度のキトサン水溶液１０ｍｌに１ｖ／ｖ％相当の酢酸を添加混合して分散相を調製すると共に、ウォータージャケットを備えた密閉式の攪拌槽内に４ｗ／ｗ濃度のポリリン酸水溶液１００ｍｌを収容し、１Ｍ−水溶液ナトリウム水溶液を加えてｐＨ調整を行い、この連続相を水冷によって液温４℃に維持しつつ、前記分散相のキトサン水溶液をシリンジによって滴下し、１２０ｒｐｍで緩やかに３０分間攪拌してポリリン酸−キトサンゲルビーズを生成させたのち、ろ過・洗浄して得られるゲルビーズを凍結乾燥して回収した。
【００３６】
このゲルビーズの回収量及び回収率とゲルビーズ生成状況を、使用したキトサンの粘度及び連続相ｐＨと共に表３に示す。なお、回収率（％）は、〔回収したゲルビーズ（凝集物を含む）の重量×１００〕／（ポリリン酸質量＋キトサン質量）として算出した。また、ゲルビーズ生成状況は前記アルギン酸−キトサンゲルビーズの場合と同じ５段階で評価した。
【００３７】
【表３】
0005721240.tif 000004
【００３８】
表３に示すように、キトサン５０，３００を用いて連続相のｐＨを５．４に調整した場合はゲルビーズが生成するが、キトサン５を用いた場合やキトサン５０，３００を用いても連続相のｐＨが未調整（ｐＨ２．２）である場合は良好なゲルビーズを生成できない。そこで、キトサン５０，３００を用いて連続相のｐＨを５．４に調整する条件で、分散相のキトサン水溶液にサッチ分解菌を添加混合し、前記同様にしてポリリン酸−キトサンゲルビーズを調製することを試みたが、連続相に分散相を分散させることが困難であり、良好なサッチ分解菌内包ゲルビーズを調製できなかった。
【図１】
0005721240.tif 000005
【図２】
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【図３】
0005721240.tif 000007
【図４】
0005721240.tif 000008