(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
European Collection of Cell Cultures（ＥＣＡＣＣ）にアクセッションナンバーECACC 11012501またはアクセッションナンバーECACC 11012502で寄託された株の、ヨーロッパ型ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）。
【請求項２】
細胞培養で少なくとも３６回継代することによってウイルスが弱毒化されることにより、ＰＲＲＳＶに易感染性のブタまたは他の哺乳動物にその改変ウイルスが投与されたときに、それがＰＲＲＳＶ疾患の臨床徴候を引き起こすことなく、その哺乳動物に病原型ＰＲＲＳＶに対する免疫をつける免疫応答を誘導することができる、請求項１記載のＰＲＲＳＶ。
【請求項３】
ＭＡ１０４で成長させたヨーロッパ型ＰＲＲＳＶを非ＭＡ１０４哺乳動物細胞に順応させることを含む、請求項１記載の弱毒化生ＰＲＲＳＶの調製方法。
【請求項４】
請求項１記載の弱毒化生ＰＲＲＳＶおよび薬学的に許容されうる担体を含む、ブタをＰＲＲＳＶ感染から防御するためのワクチン。
【請求項５】
さらに、一つもしくは複数の非ＰＲＲＳＶ性の弱毒化病原体もしくは不活化病原体またはその抗原性物質を含む、請求項４記載のワクチン。
【請求項６】
非ＰＲＲＳＶ性の病原体が、仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、大腸菌、エリシペロ・ルシオパチエ、ボルデテラ・ブロンチセプチカ、サルモネラ・コレラスイス、ヘモフィルス・パラスイス、パスツレラ・ムルトシダ、ストレプトコッカス・スイス、ミコプラスマ・ヒオニューモニアエおよびアクチノバチルス・プルーロニューモニアエより選択される、請求項５記載のワクチン。
【請求項７】
さらに、アクセッションナンバーECACC 04102703、ECACC 04102702、ECACC 04102704、ATCC VR2332、VR2385、VR2386、VR2429、VR2474、およびVR2402；CNCM I-1102で寄託された株から成る群より選択される一つまたは複数の追加的なＰＲＲＳＶ株を含む、請求項４記載のワクチン。
【請求項８】
皮内または筋肉内適用に適した担体を含む、請求項４記載のワクチン。
【請求項９】
凍結乾燥形態である、請求項４記載のワクチン。
【請求項１０】
少なくとも約１０７個のウイルス粒子を含む、請求項４記載のワクチン。
【請求項１１】
請求項１記載の弱毒化生ＰＲＲＳＶを薬学的に許容されうる担体と混合することを含む、ＰＲＲＳと闘うための弱毒化生ワクチンの調製方法。
【請求項１２】
弱毒化生ＰＲＲＳＶが、さらに、アクセッションナンバーECACC 04102703、ECACC 04102702、ECACC 04102704で寄託されたＰＲＲＳＶ株から成る群より選択される一つまたは複数の追加的なヨーロッパ型ＰＲＲＳＶ株を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
弱毒化生ＲＲＳＶが、さらにアジュバントを含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
薬理学的に適合性の担体薬剤と混合されたブタ繁殖・呼吸障害症候群生ウイルスを含むワクチン組成物をブタに投与する工程を含む、ブタにブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）に対する免疫をつける方法であって、該ウイルスが、ウイルスを改変するために細胞培養で少なくとも３６回継代されたＰＲＲＳ ９４８８１ウイルスを含むことにより、ＰＲＲＳ易発性のブタまたは他の哺乳動物に改変ウイルスが投与されたときに、それがＰＲＲＳ疾患の臨床徴候を引き起こすのではなく、その哺乳動物に病原型ＰＲＲＳに対する免疫をつける免疫応答を誘導することができる、方法。
【請求項１５】
ブタが、ワクチン接種後に肺病変を示さない、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ブタが、ワクチン接種後に、Porcilisワクチンを用いたワクチン接種よりも少ない肺病変を示す、請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヨーロッパ型ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の弱毒化生株、そのような株の製造方法、それに基づくワクチンおよびそのようなワクチンの製造方法およびブタの処置におけるその使用に関する。
【０００２】
発明の背景
ブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）は、多くの人によって、現在世界中の養豚産業に影響を及ぼしている最も重要な疾患と見られている。この症候群は、１９８７年に米国で「ブタミステリー病」として初めて記載され、急速に世界中に広まった。この症候群は、重症の繁殖不全（reproduction loss）を引き起こし、二次感染による死亡率増加に関連し、飼料効率および平均１日増体重の低下につながる。不幸なことに、ＰＲＲＳを引き起こすウイルスのコントロールは困難であることが証明されてきた。
【０００３】
ＰＲＲＳウイルス（ＰＲＲＳＶ）は、科Arteriviridae（Cavanaugh, 1997）に分類されるエンベロープ型１本鎖ＲＮＡウイルスである。このウイルスは、１９８７年に米国で「ブタミステリー病」として初めて記載された、蔓延しているブタ疾患を引き起こす（Hill, 1990）。この疾患は全ての齢群のブタに呼吸器疾患として現れ、一部の若齢ブタでの死亡および繁殖適齢のメスでの重大な繁殖の問題につながる。
【０００４】
ＰＲＲＳＶの伝染は、感染ブタと感受性ブタの間の直接接触により起こるおそれがあり、起こることが多い。非常に短い距離の空気伝染または精液を介した伝染も起こるおそれがある。ウイルスは、いったん感染したならば、成体の血中に約２週間、感染したブタでは１〜２ヶ月以上残留することがある。感染した種雄ブタ（boar）は、ウイルスを精液中に１００日よりも長く排出するおそれがある。この長期間のウイルス血症は、伝染の確率を顕著に増加させる。加えて、ＰＲＲＳウイルスは、妊娠の第３トリメスターに胎盤を通過して子宮内で子ブタに感染し、死産または虚弱子ブタの原因となりうる。
【０００５】
高い健康状態もしくは普通の健康状態の群れまたは屋内もしくは屋外ユニットの両方からの群れなどの、全ての種類および大きさの群れが、ＰＲＲＳウイルスに感染する可能性がある。感染した群れは、重症の繁殖不全および成長不良を伴う離乳後肺炎のレベル増加を経験しうる。繁殖相（reproductive phase）は、典型的には２〜３ヶ月間持続するが、離乳後の問題は地方病的流行になることが多い。繁殖疾患は、妊娠後期に母ブタ（sow）および未経産雌ブタ（gilt）の両方を冒す流産の激増によって特徴づけられる。妊娠１０９〜１１２日付近で未熟分娩が起こる。死産および虚弱子ブタの数が増加し、離乳前死亡率のかなりの増加を招く。
【０００６】
呼吸相（respiratory phase）は、従来、育成豚舎内で、特にコンティニュアスフロー（continuous flow）の育成豚舎内で見られてきた。しかし、ＰＲＲＳウイルスによって起こる呼吸器の問題は、また、肥育豚舎内でブタ呼吸器複合感染症（ＰＲＤＣ）の一部として見られることがある。成長速度の減少、販売不可能なブタのパーセンテージの増加、および離乳後死亡率の増大が起こるおそれがある。診断所見は高レベルの肺炎を示し、その肺炎は、二次感染病原体として通例見なされる多種多様な他の微生物と共にＰＲＲＳウイルスに関連している。細菌単離株には、とりわけ、Streptococcus suis、Haemophilus suis、Actinobacillus pleuropneumoniae、Actinobacillus suis、Mycoplasma hyopneumoniae、およびPasteurella multocidaが含まれうる。一般に関係するウイルス感染病原体には、ブタインフルエンザウイルスおよびブタ呼吸器コロナウイルスが含まれる。罹患したブタは、高レベルの薬物療法に応答することがまれであり、オールイン／オールアウトシステムは、この疾患のコントロールに失敗した。
【０００７】
ＰＲＲＳＶウイルスは、約５０％の配列相同性を共有する「ＵＳ」および「ＥＵ」型と呼ばれる２種類の遺伝子型として存在する（Dea S et al. (2000). Arch Virol 145:659-88）。これら２種類の遺伝子型は、また、それらの免疫学的性質によって区別することができる。様々な単離株に関する配列情報の大部分は、構造タンパク質、すなわちウイルスゲノムの約４％だけを占めるエンベロープタンパク質ＧＰ５に基づき、一方で非構造タンパク質（ｎｓｐ）に関してはほとんど知られていない。ＰＲＲＳＶの単離およびワクチンの製造は、いくつかの公報（国際公開公報第９２／２１３７５号、国際公開公報第９３／０６２１１号、国際公開公報第９３／０３７６０号、国際公開公報第９３／０７８９８号、国際公開公報第９６／３６３５６号、EP0676467、EP0732340、EP0835930）に記載されている。
【０００８】
ＰＲＲＳ感染から回復したブタは、通常の状況で同じウイルス株による再度の感染から自己を防御する免疫応答を発生するので、ワクチン接種がＰＲＲＳの負荷を軽減するための主要な方法である。しかし、ＰＲＲＳウイルスは、（突然変異または組換えによって）変化する能力を有し、したがって、新規ウイルス株が発生するおそれがある。そのような場合、株間に交差防御が存在しないおそれがあり、以前に感染した農場に新しい大発生が観察されるおそれがある。したがって、追加的なワクチンの必要性が引き続きある。
【０００９】
発明の簡潔な概要
本発明は、改良されたヨーロッパ遺伝子型改変生ＰＲＲＳワクチンおよびそのようなワクチンの製造のために使用することができる新規ＰＲＲＳＶ株に関する。特に本発明は、それぞれ２０１１年１月２５日にブダペスト条約の条項にしたがって、European Collection of Cell Cultures（ＥＣＡＣＣ）にアクセッションナンバーECACC 11012501およびECACC 11012502で寄託された改良型ＰＲＲＳウイルス株、または前記株の一つの任意の子孫または後代を提供する。
【００１０】
特定の態様では、本発明は、European Collection of Cell Cultures（ＥＣＡＣＣ）にアクセッションナンバーECACC 11012501またはアクセッションナンバーECACC 11012502で寄託された株のヨーロッパ型ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）を記載する。
【００１１】
そのＰＲＲＳＶは、細胞培養で少なくとも３６回継代することによってウイルスが弱毒化されることにより、ＰＲＲＳＶに易感染性のブタまたは他の哺乳動物にその改変ウイルスが投与されたときに、それがＰＲＲＳＶ疾患の臨床徴候を引き起こすのではなく、その哺乳動物に病原型ＰＲＲＳＶに対する免疫をつける免疫応答を誘導することができることを特徴とする。
【００１２】
European Collection of Cell Cultures（ＥＣＡＣＣ）にアクセッションナンバーECACC 11012502で寄託された弱毒化生ＰＲＲＳＶまたはアクセッションナンバーECACC11012501で寄託された親株から弱毒化されたＰＲＲＳＶの調製方法であって、ＭＡ１０４細胞で成長されたヨーロッパ型ＰＲＲＳＶを非ＭＡ１０４哺乳動物細胞に順化させることを含む方法も考えられている。
【００１３】
本発明の別の局面は、ブタをＰＲＲＳＶ感染から防御するためのワクチンであって、European Collection of Cell Cultures（ＥＣＡＣＣ）にアクセッションナンバーECACC 11012502で寄託された弱毒化生ＰＲＲＳＶまたはアクセッションナンバーECACC 11012501で寄託された親株から弱毒化されたＰＲＲＳＶおよび薬学的に許容されうる担体を含むワクチンを考えている。そのようなワクチンは、有利には、さらに一つもしくは複数の非ＰＲＲＳＶ性の弱毒化病原体もしくは不活化病原体またはその抗原性物質を含みうる。例えば、非ＰＲＲＳＶ性の病原体は、仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、大腸菌（Escherichia coli）、エリシペロ・ルシオパチエ（Erysipelo rhusiopathiae）、ボルデテラ・ブロンチセプチカ（Bordetella bronchiseptica）、サルモネラ・コレラスイス（Salmonella cholerasuis）、ヘモフィルス・パラスイス（Haemophilus parasuis）、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）、ストレプトコッカス・スイス（Streptococcus suis）、ミコプラスマ・ヒオニューモニアエ（Mycoplasma hyopneumoniae）およびアクチノバチルス・プルーロニューモニアエ（Actinobacillus pleuropneumoniae）より選択することができる。
【００１４】
他の態様では、ワクチンは、さらにアクセッションナンバーLelystadウイルス株（Lelystad感染病原体（CDI-NL-2.91）で寄託されたＰＲＲＳＶ株、またはアクセッションナンバーECACC 04102703、ECACC 04102702、ECACC 04102704、ＣＮＣＭアクセッションナンバーI-1140、ＣＮＣＭアクセッションナンバーI-1387、ＣＮＣＭアクセッションナンバーI-1388、ATCC VR 2332、VR 2385、VR 2386、VR 2429、VR 2474、およびVR 2402；CNCM I-1102、CNCM I-1140、CNCM I-1387、CNCM I-1388、もしくはECACC V93070108で寄託された株などの他の株から成る群より選択される一つまたは複数の追加的なヨーロッパ型ＰＲＲＳＶ株を含みうるか、あるいは実際に北米型ＰＲＲＳウイルス、pT7P129A；ＡＴＣＣ寄託株VR-2332、ＡＴＣＣ寄託株VR-2368；ATCC VR-2495；ATCC VR2385、ATCC VR2386、ATCC VR2429、ATCC VR2474、およびATCC VR2402などのＵＳ型株でありうる。
【００１５】
ワクチンは、皮内または筋肉内適用に適した担体を含みうることが考えられている。いくつかの態様では、ワクチンは、凍結乾燥形態である。特定の態様では、ワクチンは、少なくとも約１０７個のウイルス粒子を含む。
【００１６】
本発明の別の局面は、ＰＲＲＳと闘うための弱毒化生ワクチンの調製方法であって、European Collection of Cell Cultures（ＥＣＡＣＣ）にアクセッションナンバーECACC 11012502で寄託された弱毒化生ＰＲＲＳＶウイルスまたはアクセッションナンバーECACC 11012501で寄託された親株から弱毒化されたＰＲＲＳＶを薬学的に許容されうる担体と混合することを含む方法に関する。そのような方法では、弱毒化生ＰＲＲＳＶは、好ましくはさらに、アクセッションナンバーECACC 04102703、ECACC 04102702、ECACC 04102704、ＣＮＣＭアクセッションナンバーI-1140、ＣＮＣＭアクセッションナンバーI-1387、およびＣＮＣＭアクセッションナンバーI-1388で寄託されたＰＲＲＳＶ株から成る群より選択される一つまたは複数の追加的なヨーロッパ型ＰＲＲＳＶ株を含みうる。
【００１７】
いくつかの態様では、弱毒化生ＰＲＲＳＶは、さらにアジュバントを含みうる。
【００１８】
薬理学的に適合性の担体薬剤と混合されたブタ繁殖・呼吸障害症候群生ウイルスを含むワクチン組成物をブタに投与する段階を含む、ブタにブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）に対する免疫をつける方法であって、そのウイルスが、ウイルスを改変するために細胞培養で少なくとも３６回継代されたＰＲＲＳ ９４８８１ウイルスを含むことにより、ＰＲＲＳ易発性のブタまたは他の哺乳動物にその改変ウイルスが投与されたときに、それがＰＲＲＳ疾患の臨床徴候を引き起こすのではなく、その哺乳動物に病原型ＰＲＲＳに対する免疫をつける免疫応答を誘導できる方法も考えられている。
【００１９】
いくつかの態様では、ブタがワクチン接種後に肺病変を示さない方法が行われる。他の態様では、ブタは、ワクチン接種後に、Porcilisワクチンを用いたワクチン接種よりも少ない肺病変を示す。
【００２０】
本発明の別の局面は、配列番号１または配列番号１０のいずれかに示される配列と少なくとも９５％相同なヌクレオチド配列を有するＰＲＲＳウイルスに関する。
【００２１】
配列番号２〜９または配列番号１１〜配列番号１８に示される任意の配列と少なくとも９８％同一のタンパク質をコードする少なくとも１個のＯＲＦを含むＰＲＲＳウイルスも考えられている。
【００２２】
配列番号１もしくは配列番号１０のヌクレオチド配列または配列番号１もしくは配列番号２のいずれかのフラグメントを有するＰＲＲＳウイルスも考えられており、ここで、そのフラグメントは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８から成る群より選択されるＯＲＦをコードする。
【００２３】
本発明は、さらに、ブタ動物をワクチン接種するためのサブユニットワクチンであって、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８から成る群より選択されるＯＲＦをコードするヌクレオチドから成る群より選択される一つまたは複数のヌクレオチドを含むワクチンに関する。
【００２４】
本発明の別の局面は、ブタ動物をワクチン接種するためのサブユニットワクチンであって、配列番号１９；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３０；配列番号３１；配列番号３２；配列番号３３；および配列番号３４から成る群より選択される一つまたは複数のヌクレオチドを含むワクチンに関する。
【００２５】
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８の配列を有するタンパク質から成る群より選択される一つまたは複数のタンパク質を含む組成物も考えられている。
【００２６】
配列番号１９；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３０；配列番号３１；配列番号３２；配列番号３３；配列番号３４から成る群より選択される配列を含む、単離された核酸も考えられている。
【００２７】
本発明は、さらに、リコンビナント発現ベクターおよび／またはそのような発現ベクターを含むワクチンに関し、ここで、該ベクターは、プロモーターに作動可能に連結された、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８から成る群より選択される、ＰＲＲＳＶの一つまたは複数のＯＲＦをコードする核酸配列を含む。そのような態様では、ＯＲＦをコードする核酸は、好ましくは、配列番号１９；配列番号２０；配列番号２１；配列番号２２；配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７；配列番号２８；配列番号２９；配列番号３０；配列番号３１；配列番号３２；配列番号３３；および配列番号３４から成る群より選択されうる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】ヨーロッパ型攻撃株を用いた呼吸攻撃モデルでの咳嗽スコアの臨床観察を示す図である。
【図１Ｂ】ヨーロッパ型攻撃株を用いた呼吸攻撃モデルでの合計臨床スコアの臨床観察を示す図である。
【図２】ヨーロッパ型攻撃株を用いた呼吸攻撃モデルでの直腸温度測定値を示す図である。
【図３】ヨーロッパ型攻撃株を用いた呼吸攻撃モデルでの１日増体重の測定値の平均を示す図である。
【図４】ヨーロッパ型攻撃株を用いた呼吸攻撃モデルで定量ＰＣＲにより示されるＰＲＲＳウイルス血症を示す図である。
【図５】ヨーロッパ型攻撃株を用いた呼吸攻撃モデルでＥＬＩＳＡによって示されるＰＲＳＳ血清検査結果を示す図である。
【図６】ヨーロッパ型攻撃株を用いた呼吸攻撃モデルでの肺病変の肉眼検査を示す図である。
【図７Ａ】組織病理測定結果を示す図である。図７Ａに、肉眼的肺病変を示し；図７Ｂに、対照動物の病理組織を示し；図７Ｂに、ＰＲＲＳに感染した動物の病理組織を示す。
【図７Ｂ】組織病理測定結果を示す図である。図７Ａに、肉眼的肺病変を示し；図７Ｂに、対照動物の病理組織を示し；図７Ｂに、ＰＲＲＳに感染した動物の病理組織を示す。
【図７Ｃ】組織病理測定結果を示す図である。図７Ａに、肉眼的肺病変を示し；図７Ｂに、対照動物の病理組織を示し；図７Ｂに、ＰＲＲＳに感染した動物の病理組織を示す。
【図８】ＥＵ型ＰＲＲＳ ９４８８１をワクチン接種された動物でのウイルス血症％を示すＲＴ−ＰＣＴのタイムＰＣＲの結果を示す図である。
【図９】ＥＵ型ＰＲＲＳ ９４８８１の大規模生産のための並行プロセスを示す図である。
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明は、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）感染を処置するまたはその重症度を軽減する方法、およびＰＲＲＳＶ感染を予防する方法を提供する。一般に、その方法は、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）感染を処置する、またはその重症度もしくは発生率を軽減するためのものである。「処置するまたは重症度もしくは発生率を軽減する」は、感染に通常関連する臨床徴候、症状、および／または病理学的徴候の重症度の軽減を表し、その軽減は、任意のそのような徴候または症状の予防まで（予防を含む）の範囲である。「病理学的徴候」は、肉眼または剖検で見出された感染の証拠を表す（例えば肺病変）。
【００３０】
その方法は、一般に、所定の齢または齢範囲のブタに治療量のＰＲＲＳＶ抗原を投与する段階を含む。例えば、本発明の一局面では、ある治療量のＰＲＲＳＶ抗原を約３週齢以下の子ブタに投与することができ、異なる治療量の抗原を約３週齢から４週齢の間のブタに投与することができる。同様に、異なる治療量を、約４週齢から１６週齢の間（もしくはこの範囲内の任意の齢、例えば５週齢〜６週齢、９週齢〜１５週齢、７週齢〜１０週齢など）のブタまたは成体の母ブタなどの１６週齢よりも高齢のブタに投与することさえできよう。
【００３１】
特定の態様では、本発明は、この新たに発見された定型ＰＲＲＳＶ株に対して有効な免疫を付与する、弱毒化非定型ＰＲＲＳＶ株および対応する改良型改変生ワクチンに関する。「有効な免疫」は、疾患の実質的な臨床徴候を生じる、非定型ＰＲＲＳＶ感染を含めたブタＰＲＲＳＶ感染を、ワクチンが予防する能力を表す。免疫されたブタがＰＲＲＳＶ血清陽性である場合も陽性でない場合もあるが、そのブタが実質的な臨床症状を全く示さないことを理解されたい。
【００３２】
好ましい形態では、本発明のワクチンは、毒性が弱毒化された生きたヨーロッパ型ＰＲＲＳ生ウイルスを含む。生じた弱毒化ウイルスは、攻撃された対照ホスト動物試験で無毒性であることおよび有効な免疫を付与することが示された。この特定株のＥＵ型ＰＲＲＳは、他の株ほどは毒性でないことから、ワクチン候補として魅力的な選択肢である。ＰＲＲＳＶ ９４８８１親株は、妊娠した母ブタに重症の非定型ＰＲＲＳ疾患を引き起こさず、若齢ブタに重症の肺病変も引き起こさない。この株は、最初に、ドイツのノルトライン・ウェストファーレン州で重症呼吸器障害の３週齢子ブタから単離された。続いてこの株は、ＭＡ１０４細胞で連続継代することにより弱毒化された。弱毒化株は、２０１１年１月２５日にBioscreen GmbH（Mendelstrasse 11, 48149, Muenster, Germany）によってEuropean Collection of Cell Cultures（ＥＣＡＣＣ）（Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, Great Britain）に寄託され、アクセッションナンバー11012502を与えられた。この弱毒化ウイルスは、好ましいマスター種ウイルス（ＭＳＶ）であり、これが続いて継代されて、有効なＰＲＲＳＶワクチンとして開発された。９４８８１と名付けられた毒性の親株も、ブダペスト条約にしたがって、２０１１年１月２５日にBioscreen GmbH（Mendelstrasse 11, 48149, Muenster, Germany）によってEuropean Collection of Cell Cultures（ＥＣＡＣＣ）（Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, Great Britain）に寄託され、アクセッションナンバー11012501を与えられた。
【００３３】
ある例示的な態様では、改変ウイルス生ワクチンは、ブタについて１mlの用量で、そして母ブタについて２mlの用量で筋肉内注射により試験され、防御免疫の生成に有効であることが示された。
【００３４】
弱毒化へのウイルスの継代は、古典的なウイルス学的方法を用いて達成された。具体的には、親単離株ＰＲＲＳ ９４８８１をＭＡ１０４細胞で連続的に継代することによりin vitroで弱毒化して、初回単離から最大１０８回の継代を達成した。簡潔には、その材料は、Ｔ−２５cm2またはＴ−７５cm2フラスコ中で１週間に約１〜２回、合計１０８回継代された。６％ウシ胎子血清（ＦＢＳ）を補充された最小必須培地（ＭＥＭ）約１２〜３０mLを用いた集密状態のＭＡ１０４細胞培養物にウイルス１００〜３００μlを接種した。ＣＯ２が４〜６％の加湿チャンバー型インキュベーター内で培養物を３７℃で３〜７日間インキュベーションした。培養物が＞２５％細胞変性効果（ＣＰＥ）に達したならば、上清を抽出することによってフラスコから回収した。一部の上清を新しいフラスコに継代し、回収液の２mLを小分けして、−６０℃〜−８０℃での保存に供した。
【００３５】
標準的な技法を用いる当業者は、弱毒化ウイルスの基礎をなす核酸配列がＥＣＡＣＣにアクセッションナンバー11012502で寄託されていることを確認することができよう。したがって、本発明は、さらに、ＥＣＡＣＣにアクセッションナンバー11012502で寄託された弱毒化ＰＲＲＳＶ ９４４８１に特異的な核酸配列を包含する。好ましくは、本発明は、さらに、配列番号１または配列番号１０の配列と少なくとも９５％の配列相同性を有するＰＲＲＳウイルス核酸配列を包含する。というのは、そのような相同配列を含有する弱毒化ウイルスをワクチン接種された動物に免疫を付与することに、そのようなウイルスが有効な見込みがありうるからである。配列番号１に示された配列は、弱毒化ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＳＶの完全長配列であり、１４８４３bpの完全長配列を有する。この配列について、ＯＲＦＳ１〜７は、以下のようにアノテーションされている：
【００３６】
【表１】
0005788027.tif 000002
【００３７】
配列番号１０に示される配列は、親ＰＲＲＳＶ ９４８８１株の継代５回目の完全長配列であり、１４８４３bpの完全長配列を有する。この配列について、ＯＲＦ１〜７は、以下のようにアノテーションされている：
【００３８】
【表２】
0005788027.tif 000003
【００３９】
この新規弱毒化ヨーロッパ型ＰＲＲＳウイルス株を単離することで、現在当技術分野で見出される毒性ＰＲＲＳ株を反映する最新のＰＲＲＳ株を含有する改良型ＰＲＲＳワクチンを製造することが可能である。特に、新規弱毒化ヨーロッパ型ＰＲＲＳウイルスは、改変生ワクチン（ＭＬＶ）を調製するために使用することができる。改変生ワクチンは、ブタで複製できる生ウイルスを含有するが、ＰＲＲＳの臨床疾患を発生しないことを特徴とする。さらに、このワクチンは、投与したときにブタに免疫応答を誘導し、その免疫応答は、一般に、その後の病原性ＰＲＲＳウイルス感染に対して顕著な程度の防御をもたらす。そのような特徴を示しているウイルスは、通常、弱毒化ウイルスと呼ばれる。加えて、本発明は、ＰＲＲＳＶ ９４８８１の親株および弱毒化株の両方のＯＲＦ配列の詳細を提供する。したがって、当業者が本明細書に示される任意の一つまたは複数のＯＲＦ配列をサブユニットワクチンに採用しうることが、考えられている。
【００４０】
上述のように、一般にウイルスの弱毒化は、病原性ウイルス単離株から、そのウイルスが所望の性質を示すまでそのウイルスに許容性の適切なホスト細胞で繰り返し継代することによって発生させることができる（国際公開公報第９２／２１３７５号、国際公開公報第９３／０６２１１号、国際公開公報第９３／０３７６０号、国際公開公報第９３／０７８９８号、国際公開公報第９６／３６３５６号、EP0676467、EP0732340、EP0835930）。または、ウイルスの弱毒化は、感染性クローン、通常はウイルスゲノムの完全長相補的ＤＮＡ転写物の使用による遺伝子再操作によって発生させることができる（国際公開公報第９８／１８９３３号、EP1018557、国際公開公報第０３／０６２４０７号、Nielsen et al, J Virol 2003, 77:3702-3711）。好ましい一態様では、本発明は、ＥＣＡＣＣにアクセッションナンバー11012501で寄託された親ウイルスから弱毒化されたヨーロッパ型遺伝子型９４４８１の弱毒化ＰＲＲＳウイルスを含有するＭＬＶに関する。好ましいＭＬＶは、ＥＣＡＣＣにアクセッションナンバー11012502で寄託された本発明の弱毒化ウイルスを含有する。
【００４１】
別の局面では、本発明は、２０１１年１月２５日にEuropean Collection of Cell Cultures（ＥＣＡＣＣ）（Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, Great Britain）にアクセッションナンバーECACC 11012502（ＭＬＶの弱毒化株）および11012501（親株）で寄託されたＰＰＲＳウイルスの後代または子孫の調製および単離を考えている。したがって、本発明は、寄託された株から同一形態または分岐形態での増殖（propagation）または倍加（multiplication）により得られるＰＲＲＳウイルス株、特に寄託された株の不可欠な特徴を有する子孫に及ぶ。継続して増殖すると、それらの株は突然変異を獲得する可能性があるが、突然変異の大部分は、これらの株の性質を顕著には変化させない。
【００４２】
また、本発明の株をさらに改変して、それらにさらなる所望の性質を与えることができる。これは、弱毒化表現型を延長する（extend）ための適切なホスト細胞での連続増殖のような、古典的な増殖技法および選択技法により達成することができる。または、それらの株は、適切な遺伝子操作技法によりこれらの株のゲノムの核酸配列を特異的突然変異させることにより、遺伝的に改変することができる。ＰＲＲＳＶのゲノムは、完全または部分的に配列決定されたが（Conzelmann et al., 1993；Meulenberg et al., 1993a、Murtaugh et al, 1995）、そのゲノムは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＯＲＦ１ａおよび１ｂ）以外に、ＧＰ２（ＯＲＦ２）、ＧＰ３（ＯＲＦ３）、ＧＰ４（ＯＲＦ４）およびＧＰ５（ＯＲＦ５）と名付けられた４種のエンベロープ糖タンパク質、非グリコシル化膜タンパク質Ｍ（ＯＲＦ６）およびヌクレオカプシドタンパク質Ｎ（ＯＲＦ７）の６種の構造タンパク質をコードする（Meulenberg et al. 1995, 1996; van Nieuwstadt et al., 1996）。ＰＲＲＳＶのヨーロッパ型株およびＵＳ型株の免疫学的特徴づけおよびヌクレオチド配列決定は、ウイルス構造タンパク質に局在する抗原の差がＰＲＲＳＶの株間で小さいことを確認した（Nelson et al., 1993; Wensvoort et al., 1992; Murtaugh et al., 1995）。本発明のＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＳＶは、ヨーロッパ型参照ウイルス株Lelystadウイルス（ＬＶ）と比較され、８種の異なるウイルス遺伝子のヌクレオチド相同性が８５．４０〜９５．０９パーセントの範囲であり、両方のウイルス株の間のアミノ酸同一性が８６．３９〜９７．２７パーセントであることが明らかとなった。ＬＶに比べて、９４８８１ ＭＳＶのＯＲＦ１ａから２個の欠失を同定することができた。例えば、９４８８１ ＭＳＶのＯＲＦ１ａは、Lelystadウイルスと８５．４０％のヌクレオチド相同性を有し、８６．３９％のアミノ酸同一性を生じ；９４８８１ ＭＳＶのＯＲＦ１ｂは、Lelystadウイルスと９２．１２％のヌクレオチド相同性を有し、９７．２７％のアミノ酸同一性を生じ；９４８８１ ＭＳＶのＯＲＦ２は、Lelystadウイルスと９１．０７％のヌクレオチド相同性を有し、９０．７６％のアミノ酸同一性を生じ；９４８８１ ＭＳＶのＯＲＦ３は、Lelystadウイルスと９０．９８％のヌクレオチド相同性を有し、８９．４３％のアミノ酸同一性を生じ；９４８８１ ＭＳＶのＯＲＦ４は、Lelystadウイルスと９０．５８％のヌクレオチド相同性を有し、８７．４３％のアミノ酸同一性を生じ；９４８８１ ＭＳＶのＯＲＦ５は、Lelystadウイルスと９０．４３％のヌクレオチド相同性を有し、８８．５６％のアミノ酸同一性を生じ；９４８８１ ＭＳＶのＯＲＦ６は、Lelystadウイルスと９５．０２％のヌクレオチド相同性を有し、９７．１１％のアミノ酸同一性を生じ；９４８８１ ＭＳＶのＯＲＦ７は、Lelystadウイルスと９５．０９％のヌクレオチド相同性を有し、９２．９７％のアミノ酸同一性を生じる。
【００４３】
実際、本発明のＰＲＲＳ ９４８８１ウイルスから、キメラウイルスを作り上げることができ、ここで、ＥＣＡＣＣアクセッションナンバー11012502のＰＲＲＳウイルスまたは実際にＥＣＡＣＣアクセッションナンバー11012501で寄託された親株のバックボーンは、改変されて、ＯＲＦ１ａ、ＯＲＦ１ｂ、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６、またはＯＲＦ７の一つまたは複数の内因性配列が異なる株のＰＲＲＳウイルス由来の対応するＯＲＦに置換される。例えば、異なる株のＰＲＲＳウイルスは、Lelystadウイルス株（Lelystad病原体（CDI-NL-2.91）、またはアクセッションナンバーECACC 04102703、ECACC 04102702、ECACC 04102704、ＣＮＣＭアクセッションナンバーI-1140、ＣＮＣＭアクセッションナンバーI-1387、ＣＮＣＭアクセッションナンバーI-1388、ATCC VR2332、VR2385、VR2386、VR2429、VR2474、およびVR2402；CNCM I-1102、CNCM I-1140、CNCM I-1387、CNCM I-1388、もしくはECACC V93070108で寄託された株などの他の株などの異なるヨーロッパ型株の場合があり、または実際に北米型ＰＲＲＳウイルス、ｐＴ７Ｐ１２９Ａ；ＡＴＣＣ寄託株VR-2332、ＡＴＣＣ寄託株VR-2368；ATCC VR-2495；ATCC VR2385、ATCC VR2386、ATCC VR2429、ATCC VR2474、およびATCC VR2402などのＵＳ型株でありうる。
【００４４】
改変配列を調製するためのリコンビナント技法は、当業者に周知であり、通常、ウイルスゲノムの完全長相補的ＤＮＡコピー（感染性クローン）の構築を採用し、そのコピーを次にＤＮＡ組換えおよび操作法（部位特異的突然変異誘発などのような）により改変することができる。このようにして、例えばウイルスタンパク質の抗原性部位または酵素的性質を改変することができる。ヨーロッパおよび北米遺伝子型のＰＲＲＳウイルス株の感染性クローンは、文献に報告されている。
【００４５】
本発明のワクチンに適した本発明のＰＲＲＳウイルス株は、当技術分野で公知の方法により、例えばサル細胞系ＭＡ−１０４、Ｖｅｒｏ細胞、またはブタ肺胞マクロファージのような適切なホスト細胞中で増殖させることにより、成長および回収することができる。ＰＲＲＳＶは、優先的に肺胞肺マクロファージ中で成長する（Wensvoort et al., 1991）。ＣＬ２６２１などの少数の細胞系およびサル腎細胞系ＭＡ−１０４からクローニングされた他の細胞系（Benfield et al., 1992；Collins et al., 1992；Kim et al., 1993）もウイルスに感受性である。
【００４６】
したがって、ＥＣＡＣＣアクセッションナンバー11012501、11012501アクセッションナンバーECACC 04102703、ECACC 04102702、ECACC 04102704、ＣＮＣＭアクセッションナンバーI-1140、ＣＮＣＭアクセッションナンバーI-1387、およびＣＮＣＭアクセッションナンバーI-1388のＰＲＲＳＶ株ＰＲＲＳウイルスの任意の一つ、ならびにこれらの株またはそれらの子孫の任意の組合せを含むワクチンは、本発明の好ましい態様である。特定の態様では、ＰＲＲＳウイルス９４８８１は、図９に示すようにウイルスおよびホスト細胞が同じ日に一緒にバイオリアクター中に同時接種される工程で成長される。ＰＲＲＳウイルス９４８８１の製造方法の追加的な特徴は、本出願と同時に出願番号６１／４４４，０７１で出願された、「ＰＲＲＳＶの工業規模の製造方法（A Commercial scale process for production of PRRSV）」という名称の米国仮出願として本出願と同時に出願されたものに記載された通りでありうる。これはＰＲＲＳＶ ９４８８１を成長させる一方法であるものの、ウイルスが当業者に公知の任意の従来方法にしたがって増殖されうることを理解されたい。
【００４７】
好ましくは、本発明によるワクチンは、一つまたは複数のこれらの生存株を適切な担体中に含む改変生ワクチンであるが、不活化ウイルスを用いて死菌ワクチン（ＫＶ）を調製することもできる。ＭＬＶは、典型的には、１用量１０１〜１０７個のウイルス粒子、好ましくは１用量１０３〜１０５個の粒子、より好ましくは１用量１０４〜１０５個の粒子（４．０〜５．０log10TCID50）の投与を可能にするように製剤化される。ＫＶは、１用量１０３〜１０１０個のウイルス粒子という不活化前力価に基づき製剤化することができる。ワクチンは、薬学的に許容されうる担体、例えば生理的食塩水を含みうる。
【００４８】
ブタは、口鼻経路によりＰＲＲＳＶに感染させることができる。肺内ウイルスは、肺胞マクロファージによって取り込まれ、これらの細胞でＰＲＲＳＶの複製は９時間以内に完了する。ＰＲＲＳＶは、１２時間以内に肺から肺リンパ節に、３日以内に末梢リンパ節、骨髄および脾臓に移動する。これらの部位で、少数の細胞だけがウイルス抗原に陽性染色する。ウイルスは、少なくとも２１日間、多くの場合にそれよりもずっと長く血中に存在する。７日後、ＰＲＲＳＶに対する抗体が血中から見出される。ＰＲＲＳ感染ブタでのウイルスおよび抗体の合同した存在は、抗体が存在するにも関わらず、ウイルス感染がたとえ低レベルでも長時間持続しうることを示している。少なくとも７週間、肺胞細胞集団は正常なＳＰＦ肺と異なる。
【００４９】
本発明によるワクチンは、溶媒で再構成して注射液を生成するための凍結乾燥生ウイルス調製物の形態で存在しうる。溶媒は、例えば水、生理食塩水、または緩衝液、またはアジュバント作用溶媒でありうる。溶媒は、アジュバントを含有しうる。次に、再構成されたワクチンを、ブタに、例えば頸部への筋肉内または皮内注射として注射することができる。筋肉内注射について、体積２mlを適用することができ、皮内注射について、体積は典型的には０．２mlである。したがってさらなる局面では、本発明は、別々の容器内にウイルスの凍結乾燥組成物および再構成用溶媒を含むワクチン製品であって、場合によりさらに、使用説明書を含むリーフレットまたはラベルが入っているワクチン製品である。
【００５０】
本発明によるワクチンは、上述の株の一つまたは複数を含みうるだけでなく、ＰＲＲＳ、またはブタサーコウイルスもしくはブタコレラウイルスのような他のブタウイルス疾患もしくは細菌疾患に対して活性なさらなる成分を含みうる。したがって本発明は、さらに、ＰＲＲＳではないブタ疾患に対して活性な少なくとも１種のさらなる抗原を含有することを特徴とする、既述のワクチンに関する。例えば、そのようなさらなる抗原には、Mycoplasma hyopneumoniae、ＰＣＶ２、ＳＩＶ、H. parasuis、E. rhusiopathiae、S. suis、A. suis、Leptospira sp.、パルボウイルスなどが含まれうる。加えて、ワクチンは、ある種の薬学的または獣医学的に許容されうるアジュバントを含みうる。本発明は、新規ワクチン組成物を提供し、特に、ワクチン単独の投与よりもアジュバントとワクチンとの組合せの投与の方が良好な臨床的応答／結果が見られるように、ワクチンの有効性を高めるアジュバントをさらに含む、ＰＲＲＳＶ ９４８８１を含むＰＲＲＳウイルスワクチンを提供する。例えば、本発明のワクチン組成物は、ＰＲＲＳＶ ９４８８１ウイルスワクチンと、ＭＣＰ−１、α−トコフェロール（例えば、酢酸α−トコフェロール、その例示的なバージョンはDiluvac Forte（登録商標）として販売されている）、Haemophilus sonmus画分、カーボポールおよびその組合せから成る群より選択されるアジュバントとを含みうる。いくつかの態様では、ＰＲＲＳ ９４８８１ウイルスワクチンを含むウイルスワクチンは、リコンビナントサブユニットワクチンのことがあり、または弱毒化生ウイルスワクチンでありうる。存在する例示的な生ワクチンは、Ingelvac（登録商標）ＰＲＲＳ ＭＬＶであり、ＰＲＲＳ ９４８８１は、Ingelvac（登録商標）ＰＲＲＳ ＭＬＶに類似の方法で製剤化することができる。
【００５１】
上記に加えて、本発明の免疫原性組成物は、他の成分がアジュバントまたは基礎をなすウイルスワクチンを妨害しない限り、他の成分を含有しうる。そのような他の成分には、例えば、結合剤、着色剤、乾燥剤、防腐剤、湿潤剤、安定化剤、賦形剤、接着剤、可塑剤、粘着性付与剤、増粘剤、パッチ材料、軟膏基剤、ケラチンリムーバー、塩基性物質、吸収促進剤、脂肪酸、脂肪酸エステル、高級アルコール、界面活性剤、水、および緩衝剤が含まれる。好ましい他の成分には、緩衝剤、軟膏基剤、脂肪酸、防腐剤、塩基性物質、または界面活性剤が含まれる。
【００５２】
本発明に使用されるアジュバントの含量または量は、変動することがあり、例えば、使用されるＰＲＲＳウイルスワクチンの性質および投与剤形を考慮することにより決定することができる。アジュバントは、例えば１〜１００重量％を構成しうる。本発明のＰＲＲＳＶ ９４８８１に基づく組成物は、アジュバント成分とウイルスワクチン成分とを一緒に、どちらも単独で、または様々な他の成分と共に、混合することにより製造される。組成物は、ウイルスワクチンおよびアジュバントが一つの製剤として提供されるか、またはアジュバントおよびワクチンが、同時または連続的に投与できる別個の製剤の形で提供されるような組成物でありうる。
【００５３】
したがって、本発明の免疫原性組成物のアジュバント成分は、生物への投与にウイルスワクチンと別々に投与することができる。または、本発明によるアジュバントは、ウイルスワクチンと一緒に、単一のワクチン組成物として投与することができる。ウイルスワクチンは、任意のウイルスワクチンでありうる。より具体的な態様は、ＰＲＲＳＶ ９４８８１を含むＰＲＲＳウイルスワクチンの使用を考えている。加えて、そのようなワクチンは、Ingelvac（登録商標）ＰＲＲＳ ＭＬＶおよび／またはPorcilis（登録商標）などの他のワクチンと組合せてもよい。これは、ＰＲＲＳウイルス組合せワクチンの単なる一例であり、他のそのようなワクチンの組合せは、容易に調製することができる。
【００５４】
本明細書記載の免疫原性組成物は、ＰＲＲＳウイルスに対する抗体応答の生成誘導に特に有利である。好ましくは、ワクチンの投与は、ＰＲＲＳＶ感染に関連する、肺病変、食欲不振、皮膚変色、嗜眠、呼吸徴候、ミイラ化子ブタ、咳嗽、下痢およびその組合せなどの、一つまたは複数の臨床症状の重症度を軽減する。
【００５５】
したがって、組成物は、罹患動物での臨床転帰を、ＰＲＲＳウイルスワクチンの単独投与からの転帰に比べて特に向上する。特定の態様では、向上した臨床転帰は、免疫原性組成物を該アジュバントと組合せて投与されていない動物に比べて、肺病変パーセンテージの少なくとも５０％の減少である。他の態様では、向上した臨床転帰は、免疫原性組成物を該アジュバントと組合せて投与されていない動物に比べて、動物でのウイルス血症の少なくとも４５％の減少である。
【００５６】
したがって一局面では、本発明は、改良されたワクチン、より詳しくは改良されたＰＲＲＳウイルスワクチンに関し、ここで、改良は、ウイルスワクチンと、ＭＣＰ−１、Haemophilus sonmus画分、カーバポール（carbapol）およびその組合せから成る群より選択されるアジュバントとを混合することを含む。本発明のワクチン組成物は、さらに、薬学的に許容されうる担体を含みうる。
【００５７】
本発明のワクチン組成物は、製剤化の技術分野で公知の任意の方法により、例えば、液体製剤、懸濁剤、軟膏、散剤、ローション剤、Ｗ／Ｏ乳剤、Ｏ／Ｗ乳剤、乳剤、クリーム剤、パップ剤、貼付剤、およびゲル剤に製剤化することができ、好ましくは医薬として使用される。したがって、本発明の別の局面によると、上記ワクチン組成物を含む薬学的組成物が提供される。本発明によるワクチン組成物は、経皮投与されると、抗体産生を顕著に誘導することができる。それゆえに、本発明の別の好ましい態様では、ワクチン組成物は経皮製剤として提供することができる。
【００５８】
さらに、上記のように、本発明でのウイルスおよびアジュバントは、単一のワクチン組成物として一緒に、またはワクチンの抗原性ＰＲＲＳウイルス成分と分離した別個のアジュバント調製物として、生物に投与することができ、ここで、ＰＲＲＳウイルスワクチンに応答して生物中に産生される抗体の量が、ＰＲＲＳウイルスワクチン単独の投与よりも有意に増加することができるように、アジュバントは作用する。
【００５９】
アジュバントおよびＰＲＲＳウイルスワクチンが生物に投与される場合、動物の臨床転帰は向上する。有効量のアジュバントおよび免疫学的有効量のＰＲＲＳウイルスワクチンは、例えば、抗原性物質の種類および性質、生物の種、齢、体重、疾患の重症度、疾患の種類、投与時間、および投与方法を考慮することにより、ならびにさらに、生物中で抗原性物質に対して産生された抗体の量を指標として使用することにより、当業者が容易に決定することができる。
【００６０】
ＰＲＲＳウイルスワクチン、アジュバント、またはその組合せは、例えば、動物の状態および疾患の性質に応じて選択された任意の適切な方法により生物に投与することができる。そのような方法の例には、腹腔内投与、皮膚投与、例えば皮下注射、筋肉内注射、皮内注射、および貼付、経鼻投与、経口投与、粘膜投与（例えば直腸投与、膣投与、および角膜投与）が含まれる。それらの中で、筋肉内投与が好ましい。
【００６１】
ＰＲＲＳＶ  ＭＬＶの例示的な治療用量は、約２mLである。当業者は、薬用量が品種、大きさ、および個別の対象の他の身体的要因、ならびに特定のＰＲＲＳＶ ＭＬＶ製剤および投与経路に基づき変動しうることを認識している。好ましくは、ＰＲＲＳＶ ＭＬＶは、１回投与されるが、追加的な投与が有用でありうる。そのうえ、当業者は、本発明を通して、投与量および投与回数が対象ブタの齢および身体状態によって、ならびに業界に一般的な他の考慮事項およびＰＲＲＳＶ ＭＬＶが投与される特定条件によって影響されることを認識している。
【００６２】
ある他の態様では、ワクチンは、２種類以上のＰＲＲＳウイルスを含む多価ワクチンであって、ＰＲＲＳウイルスの少なくとも１種類がＥＣＡＣＣアクセッションナンバー11012502で寄託された弱毒化９４８８１ウイルスである多価ワクチンでありうる。他のＰＲＲＳウイルスは、ＰＲＲＳＶ株Lelystadウイルス（Lelystad病原体（CDI-NL-2.91）、またはアクセッションナンバーECACC 04102703、ECACC 04102702、ECACC 04102704、ＣＮＣＭアクセッションナンバーI-1140、ＣＮＣＭアクセッションナンバーI-1387、ＣＮＣＭアクセッションナンバーI-1388、ATCC VR2332、VR2385、VR2386、VR2429、VR2474、およびVR2402；CNCM I-1102、CNCM I-1140、CNCM I-1387、CNCM I-1388、もしくはECACC V93070108で寄託された株などの他の株から成る群より選択される１種または複数であってもよく、あるいは実際に北米ＰＲＲＳウイルス、pT7P129A；ＡＴＣＣ寄託株VR-2332、ＡＴＣＣ寄託株VR-2368；ATCC VR-2495；ATCC VR2385、ATCC VR2386、ATCC VR2429、ATCC VR2474、およびATCC VR2402などのＵＳ型株でありうる。
【００６３】
ＰＲＲＳウイルスに基づくワクチンは、子ブタおよび母ブタの両方にワクチン接種するために使用することができる。本発明の一局面では、ブタの齢および投与のために選択された抗原に基づき、特定の用法が選択される。これは、任意の齢のブタが最も有効な投薬を受けることを可能にする。好ましい一方法では、ＰＲＲＳＶ ９４８８１ ＭＬＶの治療量が、約２週齢〜５日齢のブタまたは子ブタに投与される。選択された量は、ブタの齢に応じて変動する。または、そのようなＭＬＶの異なる治療量が、約３週齢よりも高齢のブタまたは子ブタに投与され、この量も、そのような投与を受けているブタが加齢又は老化すると共に変化する。それゆえに、約４週齢、６週齢、８週齢、１０週齢、１２週齢、１４週齢、１６週齢のブタ、未経産雌ブタ（gilt）、または母ブタは、全て異なる量を投与される。使用される治療用量は、当技術分野で最適化され、典型的には臨床試験で決定され、その臨床試験では、最小免疫用量が感受性ブタでの毒性異種ＰＲＲＳＶの攻撃に対する防御に基づき定義される。好ましくは、本明細書記載の方法により製造されたＰＲＲＳＶ ＭＬＶは、筋肉内投与で投与されるが、しかしながら、当技術分野で周知であり、かつ使用される皮内、鼻腔内、網膜内、経口、皮下などの他の投与方法を使用してもよい。
【００６４】
当業者は、ワクチン接種法が、ＰＲＲＳＶに対するワクチンをブタに接種するために妥当なタイミングおよび投薬量を決定することを含みうることを認識している。そのような方法は、一般に、ブタの齢、健康状態、自然免疫レベルおよび能動免疫レベルから成る群より選択される少なくとも一つの変数を決定する段階、ならびにこれらの変数を説明するために標準薬用量レベルを調整する段階を含む。一般に、自然免疫レベルおよび能動免疫レベルは、類似の齢および健康状態のブタ集団からの平均レベルで構成される標準を参照することにより決定される。特に好ましい一方法では、全ての変数は、最適な薬用量レベルおよび投与タイミングを決定する前に考慮される。
【００６５】
好ましい態様では、本発明は、また、ＥＣＡＣＣアクセッションナンバー11012502で寄託された弱毒化９４８８１ウイルスおよびＥＣＡＣＣアクセッションナンバー11012501で寄託された毒性９４８８１親ウイルスの特異的オープンリーディングフレームをコードする、単離された核酸に関する。例えば、ＥＣＡＣＣアクセッションナンバー11012502で寄託された弱毒化９４８８１ウイルスの完全ヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９のＯＲＦ１ａ、ＯＲＦ１ｂ、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７タンパク質配列をコードする配列番号１の配列を有する。ＥＣＡＣＣアクセッションナンバー11012501で寄託された毒性９４８８１親ウイルスの完全ヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８のＯＲＦ１ａ、ＯＲＦ１ｂ、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７タンパク質配列をコードする配列番号１０の配列を有する。
【００６６】
ＰＲＲＳＶ ９４８８１ワクチンは、任意の従来様式で投与することができ、いくつかの好ましい方法では、投与は筋肉内である。投与されたＰＲＲＳＶワクチンは、Ingelvac（登録商標）のように、単回投与後にＰＲＲＳＶ感染を処置する、またはその重症度もしくは発生率を低下させるというその利点を提供することが好ましいが、しかし、他の抗原または組合せワクチンまたは多価ワクチンが選択されるならば、初回投与後に１回または複数回のブースター投与を含みうるそれらの従来様式でそれらを投与できることを理解されたい。当業者は、選択されたＰＲＲＳＶワクチンおよび抗原が投与される動物の齢範囲に基づき適切な投薬レベルを決定できる。
【００６７】
本明細書下記に提示された具体例では、子ブタに再現性よく呼吸器疾患を発生することができるＰＲＲＳＶ新規ヨーロッパ型由来株でブタおよび母ブタを攻撃した。従来、ヨーロッパ型由来ＰＲＲＳＶ株は、子ブタモデルで呼吸器疾患を再現することができず、したがって、呼吸攻撃モデルは、非ヨーロッパ型株の感染に依存した。高い遺伝的多様性のせいで、ヨーロッパではヨーロッパ型株に基づく新規ワクチンの需要がある。追加的な例では、未経産雌ブタ／母ブタ攻撃モデルに繁殖障害（reproductive failure）を引き起こした株で動物を攻撃した。ＥＣＡＣＣアクセッションナンバー11012502で寄託された弱毒化９４８８１ウイルス、またはこの株もしくはＥＣＡＣＣアクセッションナンバー11012501で寄託された親株から調製された任意のウイルスに基づくＭＬＶワクチンの有効性が、多様な攻撃モデルを用いて示すことができることが見出された。というのは、この株が、ＰＲＲＳウイルス誘導型呼吸不全または繁殖障害の他のモデルでも有効なことによる。
【００６８】
実施例
例１：ＰＲＲＳＶ呼吸器攻撃モデルの説明
上述のように、従来、ＥＵ型由来ＰＲＲＳＶ株は、子ブタモデルで呼吸器疾患を再現することができない。高い遺伝的多様性のせいで、ヨーロッパではヨーロッパ型株に基づく新規ワクチンの需要があり、毒性ヨーロッパ型由来ＰＲＲＳＶ株を利用する、再現性のよい呼吸器攻撃モデルが、試験の実施に必要である。以下の実施例で、本発明者らは、低継代回数ヨーロッパ型攻撃株（継代４回）を用いたブタの攻撃が確実に呼吸器症状を引き起こしたことを示す。
【００６９】
この試験では、割り当て時に３週齢で、攻撃時に約１０週齢の動物１２匹の３群を使用した：
群１：対照群
群２：攻撃群（ＳＤ３５）
群３：Porcilis（登録商標）ＰＲＲＳＶ（ＳＤ０）をワクチン接種し、次に攻撃（ＳＤ３５）。
【００７０】
この試験は、５６日間にわたり行った。攻撃の１０日後に各群から６匹の動物の剖検を測定し；残りの全ての動物の剖検は攻撃の２１日後に行った。毎日調査したパラメーターには、直腸温度、呼吸徴候および他の臨床徴候が含まれた。調査されたさらなるパラメーターには、体重、死亡率、ウイルス血症、セロコンバージョン、肺の病理学的および組織学的検査が含まれた。
【００７１】
試験−７日目にブタの群を各群に割り当てた。試験０日目に、群３にPorcilis（登録商標）ＰＲＲＳＶワクチンを接種した。試験３５日目に群２および群３をヨーロッパ型攻撃株で攻撃した。４５日目に各群からの動物６匹を安楽死させた。残りの動物を５６日目に安楽死させた。
【００７２】
図１Ａに、動物および週あたりの平均スコアとしての咳嗽の測定値を示す。攻撃単独（群２）およびPorcilis群（群３）の両方で攻撃後に咳嗽の増加があったことが認められた。図１Ｂに、呼吸困難、咳嗽、鼻漏、目やにおよび行動から得られた合計臨床スコアを示す。これらのデータは、攻撃群およびPorcilis群で攻撃後の合計臨床スコアに全体的な増加があったことを示した。動物の直腸温度を攻撃の前後でモニターしたが、その温度は、攻撃後に攻撃群およびPorcilis群で直腸温度の増加があったことを示している（ＳＤ＞３５、群１〜２、ｐ≦０．００１；群１〜３、ｐ≦０．００１）（図２）。
【００７３】
平均１日体重の測定（図３）は、攻撃から１回目の剖検および２回目の剖検までの期間に、攻撃群（ＳＤ３５〜４４、ｐ≦０．００１およびＳＤ３５〜５６、ｐ≦０．０１）およびPorcilisワクチン接種群（ＳＤ３５〜４４、ｐ≦０．０５およびＳＤ３５〜５６、ｐ≦０．０５）においてＡＤＷが有意に小さかったことを示した。
【００７４】
ウイルス血症は、ＰＣＲ（図４）およびＥＬＩＳＡアッセイ（図５）を用いてモニターした。ＰＣＲは、群１で対照群からの全ての動物が陰性のままであったことを示した。群２で、攻撃後に全ての動物がＰＲＲＳＶ陽性であり、群３で、ワクチン接種後に全ての動物がＰＲＲＳＶ陽性であったことを示した。ＥＬＩＳＡは、群１で、全ての動物が陰性のままであったこと、群２で全ての動物が攻撃後にＰＲＲＳＶ ＡＢ陽性であったこと、群３で全ての動物がワクチン接種後にＰＲＲＳＶ ＡＢ陽性であったことを明らかにした。
【００７５】
肺の肉眼検査も行い（図６）、そこで黄褐色斑状領域および硬化領域について肺を評価した。攻撃群およびPorcilis群で、対照群に比べて有意な肉眼的変化を観察することができた（群１〜２、ｐ≦０．００１；群１〜３、ｐ≦０．０５）。組織病理検査でも、データは、ワクチン接種の有効性を示した（図７Ａ〜７Ｃ）。平均肺病変スコアは、攻撃群およびPorcilis群の方が対照群よりも有意に高値であった（群１〜２、ｐ≦０．００１；群１〜３、ｐ≦０．００１）。顕微鏡的病変は感染１０日後の方が強烈であった。
【００７６】
要約すると、咳嗽、合計臨床スコアおよび直腸温度は、攻撃対照群およびPorcilisワクチン接種群で攻撃後に増加した。体重は、陰性対照群よりも攻撃対照群およびPorcilis群の方が有意に低値であった（ｐ＜０．０５）。Porcilis群の全ての動物は、ワクチン接種後にＰＲＲＳウイルスおよび抗体陽性であった。攻撃対照からの全ての動物は、攻撃後にＰＲＲＳウイルスおよび抗体陽性であった。肺の肉眼的および組織学的分析は、陰性対照群よりも攻撃対照およびPorcilis群の方が重度の肉眼的および顕微鏡的肺病変を示した。
【００７７】
したがって、この試験は、使用されたヨーロッパ型攻撃株が、陰性対照群に比べて有意な（ｐ＜０．０５）疾患、すなわち発熱、咳嗽、体重減少ならびに重度の肉眼的および顕微鏡的肺病変を実際に誘導することを示した。
【００７８】
加えて、ヨーロッパ型攻撃株が、ブタ攻撃モデルで一貫して再現性のあるＰＲＲＳＶ特異的呼吸器疾患をうまく示したことから、この株は、将来的な効力試験で攻撃ウイルスとして使用するために適している。Porcilis PRRSは、この試験のパラメーター内でヨーロッパ型攻撃株に対して有効性の欠如を示す。
【００７９】
例２：異種ヨーロッパ型ＰＲＲＳ単離株で攻撃後の感受性２週齢子ブタにおける弱毒化ＰＲＲＳウイルス９４８８１の最小免疫用量の評価
ＰＲＲＳの異種ヨーロッパ型単離株で攻撃後の肺病変に適切な軽減を提供する最小免疫用量（ＭＩＤ）を評価するために、約１４日齢のブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）感受性子ブタに三つの異なる力価レベルでブタ繁殖・呼吸障害症候群ワクチンヨーロッパ型由来単離株９４８８１改変生ウイルス（ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶ）を投与する、ワクチン接種−攻撃試験を行った。１５匹の子ブタを各ワクチン接種群（群１〜３）および攻撃対照群（群４）に組み込んだ。１０匹の子ブタを陰性対照群（群５）に組み込んだ。
【００８０】
攻撃後ウイルス血症、ワクチン接種後臨床判定、ＰＲＲＳ血清検査結果、ワクチン接種後ウイルス血症、攻撃後臨床観察、平均１日増体重（ＡＤＷＧ）、直腸温度および肺内ＰＲＲＳウイルス検出を含むいくつかのパラメーターについて、ワクチン群および攻撃対照群をモニターした。試験期間にわたり生物安全性が破られなかったことを実証することによる試験の妥当性検証目的のために、攻撃されなかった陰性対照群（群５）も試験に組み込んだ。
【００８１】
攻撃対照および陰性対照群は、攻撃日（Ｄ２８）までＰＲＲＳ陰性であり、陰性対照群は、試験の残存期間にＰＲＲＳ陰性のままであり（Ｄ３８）、したがって試験の妥当性が検証された。
【００８２】
攻撃はワクチン接種の４週間後であった。この時点で低力価ワクチン群の動物２匹だけ、中力価ワクチン群の動物１匹および高力価ワクチン群の動物３匹が、ｑＰＣＲ血清中ＰＲＲＳ陽性であった。
【００８３】
攻撃対照群は、ＰＲＲＳ攻撃後に典型的な顕著な肺病変を示した。攻撃後、低、中および高力価ワクチン群は、それぞれ合計肺病変スコアの中央値が０．１３％、０．５５％、および０．４０％であり、一方、攻撃対照群は、合計肺病変スコアの中央値が３３．４０％であった。三つのワクチン力価群についての合計肺病変スコアの中央値は、攻撃対照群よりも有意に低かった（ｐ＜０．０００１）。合計肺病変スコアについて、ワクチン力価群間に統計的な差はなかった（ｐ≧０．１４８４）。陰性対照群は、合計肺病変スコアの中央値０．００％を有した。
【００８４】
攻撃後期間の試験３１、３５および３８日目に、三つのワクチン力価群は、攻撃対照群よりも有意に軽度のウイルス血症を有した（ｐ≦０．００９３）。Ｄ３５を除き、攻撃後ウイルス血症についてワクチン力価群間に統計的な差はないものの、高力価ワクチン群は、中力価ワクチン群よりも有意に軽度のウイルス血症を示した（ｐ＝０．０４４２）。陰性対照子ブタは、Ｄ３１、Ｄ３５およびＤ３８にウイルス血症陰性であった。
【００８５】
臨床的に、咳嗽の重症度（ｐ≦０．００８２）および頻度（ｐ≦０．０２６８）は、攻撃後期間（２９日目〜３８日目）に攻撃対照群よりも三つのワクチン力価群の方が低値であった。発熱は、攻撃後に三つのワクチン力価群よりも攻撃対照群の方が顕著であった。ＡＤＷＧは、攻撃対照群よりも三つのワクチン力価群の方が有意に高値であった（ｐ≦０．００２７）。
【００８６】
この試験で決定されたＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶのＭＩＤは、低力価ワクチンレベル１×１０２．７７TCID50/mLに関連するが、それは、毒性異種ヨーロッパ型由来ＰＲＲＳ攻撃を受けた後に、三つの全ての力価レベルについて全体的肺病変が攻撃対照に比べて適切に軽減したことに基づく。二次パラメーターを検査すると、全ての三つのワクチン力価レベルが有効性に関連し、力価群間の明らかな差異は明白でなかった。
【００８７】
一般試験デザイン
これは、０日目（Ｄ０）に１４〜１６日齢の７０匹の離乳したＰＲＲＳ感受性子ブタで行った盲検化ランダム化デザイン試験であった。処置群の説明を下記の表２．１に示す。
【００８８】
【表３】
0005788027.tif 000004
【００８９】
８３匹の子ブタが、試験組み込み基準に合致し、そのうち最初から７０番までを、生物統計学者がＤ−３に５群の一つにランダムに割り当てた。子ブタは、群１〜４に１群１５匹を、群５に１０匹を割り当てた。８３匹の子ブタは全てＰＲＲＳ血清陰性であった。
【００９０】
ワクチン接種後の臨床判定のために、Ｄ−１〜Ｄ２６に子ブタを観察し、観察結果を臨床判定記録フォームに記録する。
【００９１】
血清検査：静脈全血をＤ０、Ｄ７、Ｄ１４、Ｄ２１、Ｄ２８に子ブタから採取した。試料の採取を記録した。血液試料を遠心沈殿し、各チューブから血清を回収し、分割し、適切にラベルを付けたチューブに移した。１セットの血清試料を２〜８℃に保ち、他のセットの血清試料を−７０±１０℃に保った。０、７、１４、２１、２８および３８日目に採取され２〜８℃に保たれた血清試料のセットをＰＲＲＳ抗体について検査した。結果を陰性（ＥＬＩＳＡ、Ｓ／Ｐ比＜０．４）または陽性（ＥＬＩＳＡ、Ｓ／Ｐ比≧０．４）として報告した。
【００９２】
ＰＲＲＳウイルス血症：０、７、１４、２１、２８、３１、３５、および３８日目に採取され、−７０±１０℃に保たれた血清試料のセットをｑＰＣＲによってＰＲＲＳｖ ＲＮＡについて検査した（追補１、添付７）。結果を、ｎ．ｄ．（不検出）、陽性（ＥＵ  ＰＲＲＳｖが検出されたが、定量不能、GE/mL（ゲノム当量）≦３．３log）または報告値（log GE/mL）として報告した。統計目的のために、「不検出」に０log GE/mLの値を、「陽性」値に３．０log GE/mLの値を割り当てた。
【００９３】
平均１日増体重（ＡＤＷＧ）：各ブタを目盛り付き秤で重量測定し、個別の体重を記録した。Ｄ０〜Ｄ２８およびＤ２８〜Ｄ３８に平均１日増量を決定した。
【００９４】
攻撃後の臨床観察：試験担当検査員または被指名人がＤ２７〜Ｄ３８に疾患の臨床徴候について子ブタを観察し、臨床観察記録フォームに記録した。観察には、下表２．２に示すような臨床観察採点システムに基づく呼吸、行動および咳嗽が含まれた。
【００９５】
【表４】
0005788027.tif 000005
【００９６】
各子ブタについての１日合計臨床観察スコアを、その１日呼吸スコア、行動スコアおよび咳嗽スコアの総和によって決定した。
【００９７】
直腸温度をＤ２７〜Ｄ３８に収集した。
【００９８】
合計肺病変スコア：Ｄ３８前に死亡した全ての子ブタおよびＤ３８に安楽死させた残りの子ブタを剖検した。あらゆる肉眼的肺病状を求めて、そして各肺葉の病状％を決定するために、肺の各セットを検査した。他の器官の病状を認めた場合、これらを同様に記載し、書き留めた。
【００９９】
ＰＲＲＳＶについての肺ｑＰＣＲ：肺の各セットについて、左および右尖葉、左および右心葉、左および右横隔葉ならびに中間葉から２試料を確保した。肺試料の１セットについて、左側からの３試料全てを１個の容器中で一緒にし、一方、右側からの３試料全ておよび肺中間葉試料を別の容器中で一緒にした。各容器に十分な量の１０％ホルマリン溶液を満たした。もう一方のセットの肺試料について、左側からの３個の肺試料全てを１個のWhirlpak（登録商標）中で一緒にし、一方で右側からの３試料全ておよび肺中間葉試料を別のWhirlpak（登録商標）中で一緒にした。
【０１００】
さらなる分析まで凍結肺組織試料を−７０±１０℃に保った。各子ブタについて、全ての左肺試料を均質化し、混合した単一試料として検査し、全ての右肺試料および肺中間葉試料を均質化し、混合した単一試料として検査した。結果を、左および右肺試料についてｎ．ｄ．（不検出）、陽性（ＥＵ型ＰＲＲＳｖが検出されたが、定量不能、GE/mL（ゲノム当量）≦３．３log）または検査値（log GE/mL）として報告した。各子ブタについての解析目的のために、左および右肺試料のｑＰＣＲ結果の平均を書き留めた。統計目的のために、「不検出」に０log GE/mLの値を、「陽性」値に３．０log GE/mLの値を割り当てた。
【０１０１】
結果
攻撃後の合計肺病変スコア：群の最小値、最大値、中央値、９５％信頼区間、Ｑ範囲および合計肺病変スコアの平均のまとめは、低、中および高力価ワクチン群の合計肺病変スコアの中央値が、それぞれ０．１３％、０．５５％、および０．４０％であり、一方、攻撃対照群の合計肺病変スコアの中央値が３３．４０％であったことを示した。三つのワクチン力価群についての合計肺病変スコアの中央値は、攻撃対照群よりも有意に低かった（ｐ＜０．０００１）。合計肺病変スコアについてワクチン力価群の間に統計的な差はなかった（ｐ≧０．１４８４）。陰性対照群の合計肺病変スコアの中央値は、０．００％であった。
【０１０２】
１匹の動物について（高力価ワクチン群）、大量の膿の線維素性化膿性胸膜炎を伴う、組織学的に軽度の化膿性間質性肺炎を認めた。気道および肺胞は点在する好中球を除いて比較的異常がなかった（unremarkable）。肺組織は、M. hyo抗原、ＰＣＶ２抗原、ＰＲＲＳｖ抗原およびＳＩＶ抗原についてＩＨＣ陰性であった。肺病変は、全般に細菌病原体に関連する漿膜炎と一致した（追補１２；アクセッション2009030254）。肺組織からいくつかの純細菌培養物を単離し、Bordetella bronchisepticaおよびコアグラーゼ陰性Staphylococcusと同定した。２種類の細菌が肺組織から単離されたが、この子ブタを群３の合計肺病変スコアの解析から排除しなかった。
【０１０３】
陰性対照子ブタ１０匹中２匹は、非常に軽微な肺病変を示した（１７６７番は０．５５％；１７８９番は０．６１％）。これらの病変は重要でなく、ＰＲＲＳを示さないと見なされた。陰性対照子ブタ１０匹中２匹は、非常に軽微な肺病変を示した（１７６７番は０．５５％；１７８９番は０．６１％）。これらの病変は重要でなく、ＰＲＲＳを示さないと見なされた。
【０１０４】
攻撃後のＰＲＲＳウイルス血症：攻撃後の個別のＰＲＲＳウイルス血症の結果（Ｄ３１〜Ｄ３８）を表にしたところ、三つのワクチン力価群および攻撃対照群で全ての子ブタが攻撃後にウイルス血症であったことが見出された。攻撃後の３時点全てで、三つのワクチン力価群は、攻撃対照群よりもウイルス血症が有意に低値であった（ｐ≦０．００９３）。Ｄ３５を除き、攻撃後のウイルス血症についてワクチン力価群の間に差はないものの高力価ワクチン群が中力価ワクチン群よりも低い平均ウイルス血症を示した（ｐ＝０．０４４２）。陰性対照子ブタは、Ｄ３１、Ｄ３５およびＤ３８にウイルス血症陰性であった。曲線下面積（ＡＵＣ）は、ウイルス負荷の量および期間の両方を表し、ウイルス血症を検査するための優れた判定ツールである。同様に、Ｄ２８〜Ｄ３８（ｐ≦０．０１６２）およびＤ３１〜Ｄ３８（ｐ＜０．０００１）の両方で、ＡＵＣに関して三つのワクチン力価群と攻撃対照群との間に有意差が検出された。両方の期間でＡＵＣに関してワクチン力価群の間に差は検出されなかった（ｐ≧０．３６６９）。
【０１０５】
Ｄ３１〜Ｄ２８についてウイルス血症陽性子ブタの群内頻度もまとめ、表２．３に示す。全てのワクチンおよび攻撃対照子ブタが攻撃後にウイルス血症陽性であったので、ウイルス血症陽性の子ブタの頻度は各時点で各群１００％であった。したがって、攻撃後のウイルス血症の頻度に関して解析は行わなかった。
【０１０６】
【表５】
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【０１０７】
肺ｑＰＣＲの結果：攻撃後の個別の肺ウイルス単離の結果を、ｑＰＣＲ陽性肺試料の頻度の検査結果（ｐ値）と同じく、群間差についてまとめた。三つの全てのワクチン力価群および攻撃対照群の子ブタからの肺組織は、攻撃後にＰＲＲＳｖについてｑＰＣＲ陽性であった。ワクチン力価群と攻撃対照群との間に有意差は検出されなかった（ｐ＝１．００００）。全てのワクチン力価の子ブタがＰＲＲＳｖについてｑＰＣＲ陽性であったので、ワクチン力価群の間で検定を行わなかった。
【０１０８】
ｑＰＣＲ陽性肺組織の頻度についてワクチン力価群と攻撃対照群との間に差が検出されなかったが、肺組織中のウイルス負荷について差は明白であった。実際、低、中および高力価ワクチン群は、肺ｑＰＣＲ値の中央値がそれぞれ６．８８、６．８０および６．８１log10GE/mLであり、一方、攻撃対照群は、肺ｑＰＣＲ値の中央値が８．１３log10GE/mLであった。ワクチン力価群と攻撃対照群の間の差は有意であった（ｐ≦０．０００１）。逆に、肺ｑＰＣＲ値の中央値についてワクチン力価群の間に差は検出されなかった（ｐ≧０．７３７９）。
【０１０９】
攻撃後の臨床観察スコア：全５群について最大臨床スコアの中央値が０（スコア０は正常呼吸または正常行動を表した）であることから実証されるように、攻撃後の異常呼吸および異常行動は重度ではなかった。加えて、異常呼吸および異常行動の両方について、ワクチン力価群と攻撃対照群との間に有意差は検出されなかった（ｐ≧０．０９９６）。
【０１１０】
咳嗽は三つ全てのワクチン力価群および攻撃対照で認められたが、攻撃対照群の方が重症であった。三つのワクチン力価群について、各群は、最大咳嗽スコアが１（軽い咳嗽または間欠型の咳嗽を表した）で、最大咳嗽スコア中央値が０であった。逆に、攻撃対照群は最大咳嗽スコアが２（喘鳴または重症の繰り返す咳嗽を表した）で、最大咳嗽スコアの中央値が１であった。三つのワクチン力価群は、咳嗽の重症度が攻撃対照群よりも有意に低かった（ｐ≦０．００８２）。陰性対照群で咳嗽は認められなかった。
【０１１１】
三つの全てのワクチン力価群は、最大合計スコアが１で、最大スコアの中央値が０であった。逆に、攻撃対照群は、最大合計スコアが４で、最大スコアの中央値が１であった。三つのワクチン群は、最大合計臨床スコアが攻撃対照群よりも有意に低値であった（ｐ≦０．００４７）。今回も、陰性対照群は、最大合計臨床スコアが０で、最大合計臨床スコアの中央値が０であった。
【０１１２】
Ｄ２９〜Ｄ３８の少なくとも１日間についての異常呼吸または異常行動の頻度は、全群で低かった。実際に、Ｄ２９〜Ｄ３８に低および中ワクチン力価群で異常呼吸は認められなかった。高力価ワクチン群は、１５匹中１匹（７％）の子ブタが、攻撃対照群は、１４匹中３匹（２１％）の子ブタが異常呼吸を有した。異常行動は、どのワクチン力価群にも認められず、一方、１４匹中２匹（１４％）の攻撃対照子ブタが、攻撃後の少なくとも１日間異常行動を示した。異常呼吸または異常行動の頻度について、攻撃後の少なくとも１日間にワクチン力価群と攻撃対照群との間に有意差は検出されなかった（ｐ≧０．０９９６）。異常呼吸または異常行動は、陰性対照群で認められなかった。
【０１１３】
咳嗽の頻度は、三つのワクチン力価群よりも攻撃対照の方がずっと高値であった。実際に、低、中および高力価ワクチン群について、咳嗽の頻度は、攻撃後の少なくとも１日間、それぞれ１４％、１３％および２７％であった。逆に、攻撃対照群について、咳嗽の頻度は、攻撃後の少なくとも１日間、７１％であった。三つのワクチン力価群は、咳嗽の頻度が、攻撃対照群よりも有意に低値であった（ｐ≦０．０２６８）。
【０１１４】
合計臨床スコア＞０によって表される、攻撃後の任意の臨床徴候の頻度は、三つのワクチン力価群よりも攻撃対照群の方が高値であった。咳嗽の頻度に類似して、任意の臨床徴候の頻度は、低、中および高力価ワクチン群について攻撃後の少なくとも１日間それぞれ１４％、１３％、および３３％であり、一方、攻撃対照群の子ブタの７９％が、攻撃後に最小で一つの臨床徴候を有した。三つのワクチン群は、攻撃後に任意の臨床徴候の頻度が攻撃対照群よりも有意に低値であった（ｐ≦０．０２５３）。同じ期間に陰性対照群で臨床徴候は認められなかった。
【０１１５】
Ｄ２９〜Ｄ３８の異常呼吸または異常行動についての平均スコアは、全群で低値であった。実際、低および中ワクチン力価群は平均呼吸スコアが０．００（正常）であり、高力価ワクチンは平均呼吸スコアが０．０１であり、攻撃対照は平均呼吸スコアが０．０３であった。行動についての平均スコアは、三つ全てのワクチン力価群について０．００である一方で、攻撃対照は平均行動スコアが０．０１であった。平均呼吸スコアおよび平均行動スコアについて、ワクチン力価群と攻撃対照群との間に有意差は検出されなかった（ｐ≧０．０９９６）。陰性対照群についての呼吸平均スコアおよび行動平均スコアは０．００であった。
【０１１６】
攻撃対照群は、平均咳嗽スコアが三つのワクチン力価群よりも高値であった。実際、平均咳嗽スコアは、低、中および高力価ワクチン群についてそれぞれ０．０１、０．０１および０．０４であった。逆に、攻撃対照群は平均咳嗽スコアが０．２８であった。三つのワクチン力価群は、平均咳嗽スコアが攻撃対照群よりも有意に低値であった（ｐ≦０．００７７）。
【０１１７】
平均合計スコアは、三つのワクチン力価群よりも攻撃対照群の方が高値であった。平均咳嗽スコアに類似して、平均合計スコアは、低、中、および高力価ワクチン群について攻撃後にそれぞれ０．０１、０．０１、および０．０４であり、一方、攻撃対照群についての平均合計スコアは０．３２であった。三つのワクチン群は、平均合計スコアが攻撃対照群よりも有意に低値であった（ｐ≦０．００２５）。
【０１１８】
攻撃後の直腸温度：Ｄ２９からＤ３８の間の低、中、および高力価ワクチン群についての群内平均直腸温度の最大値は、それぞれ４０．２０℃（Ｄ３３）、４０．３３℃（Ｄ３５）、および４０．２０℃（Ｄ３７）であった。Ｄ２９からＤ３８の間の攻撃対照群および陰性対照群についての群内平均直腸温度の最大値は、それぞれ４０．５１℃（Ｄ３３）および３９．９５℃（Ｄ３３）であった。
【０１１９】
低力価ワクチン群は、Ｄ２９（３９．４７対３９．９０℃）、Ｄ３１（３９．８５対４０．２０℃）、Ｄ３５（３９．８０対４０．２２℃）およびＤ３８（３９．８６対４０．３２℃）に攻撃対照群よりも直腸温度が有意に低値であり（ｐ≦０．０３１７）、一方、低力価ワクチンは、Ｄ３０で直腸温度が攻撃対照群よりも有意に高値であった（４０．０８対３９．５８℃；ｐ＝０．０００３）。Ｄ３２〜Ｄ３４およびＤ３６〜Ｄ３７に低力価ワクチン群と攻撃対照群との間に有意差は検出されなかった（ｐ≧０．０５４５）。
【０１２０】
中力価ワクチン群は、Ｄ３１（３９．６２対４０．２０℃）、Ｄ３３（４０．１５対４０．５１℃）、およびＤ３８（３９．５８対４０．３２℃）に直腸温度が攻撃対照群よりも有意に低値であった（ｐ≦０．０２２７）。Ｄ２９〜Ｄ３０、Ｄ３２、およびＤ３４〜Ｄ３７に中力価ワクチン群と攻撃対照群との間に有意差は検出されなかった（ｐ≧０．０５８０）。
【０１２１】
高力価ワクチン群は、Ｄ３３（４０．１２対４０．５１℃）、Ｄ３５（３９．７９対４０．２２℃）、およびＤ３８（３９．５５対４０．３２℃）に直腸温度が攻撃対照群よりも有意に低値であり（ｐ≦０．０１４７）、一方、高力価ワクチン群は、Ｄ３２（４０．３１対３９．９０℃；ｐ＝０．００６３）に直腸温度が攻撃対照群よりも有意に高値であった。Ｄ２９〜Ｄ３１、Ｄ３４およびＤ３６〜３７に高力価ワクチン群と攻撃対照群との間に有意差は検出されなかった（ｐ≧０．０７０８）。
【０１２２】
攻撃対照群に比べて三つのワクチン力価群の方が攻撃後の発熱の頻度が低値であった。発熱の頻度は、全体にわたり低く、ワクチン力価群間で類似していた。
【０１２３】
平均１日増体重（ＡＤＷＧ）：低、中および高力価ワクチン群についてのＤ０〜Ｄ２８の最小二乗平均ＡＤＷＧは、それぞれ０．４、０．３、および０．４kg/日であった。攻撃対照群についてのこの同じ期間中の最小二乗平均ＡＤＷＧは、０．３kg/日であった。低力価ワクチン群は、Ｄ０〜Ｄ２８に最小二乗平均ＡＤＷＧが攻撃対照群よりも有意に高値であり（ｐ＝０．０２９２）、一方、最小二乗平均ＡＤＷＧについて、ワクチン力価群と攻撃対照群との間（ｐ≧０．１２６２）またはワクチン力価群間に（ｐ≧０．１２９３）他の有意差は検出されなかった。この同じ期間に、陰性対照群は平均ＡＤＷＧが０．５kg/日であった。
【０１２４】
低、中および高力価ワクチン群についてのＤ２８〜Ｄ３８の最小二乗平均ＡＤＷＧは、それぞれ０．５、０．５および０．４kg/日であった。攻撃対照群についての同じ期間の最小二乗平均ＡＤＷＧは０．３kg/日であった。三つのワクチン力価群は、攻撃後に攻撃対照群よりも有意に高くなった（ｐ≦０．００２７）。同じ期間に、陰性対照群は、平均ＡＤＷＧが０．６kg/日であった。
【０１２５】
ワクチン接種後の臨床判定：低力価ワクチン群では、１匹の子ブタ（１７３５番）がＤ０〜Ｄ１０に痩せていると認められた。加えて、１匹の子ブタが、Ｄ６から１６日間痩せていることが認められ、咳嗽を２日間、沈うつを９日間示し、健康障害が原因で動物福祉の理由からＤ２１に安楽死された。子ブタ１７２７番は、合計肺病変スコアが１０．８％であった。この値は、攻撃前に決定されたので、これを攻撃後の合計肺病変解析には組み込まなかった。加えて、肺の頭腹側領域に赤／紫色の硬化領域が認められ、肝臓は蒼白で、腎臓は腎盂に複数の赤／紫色領域を有した。病理学者は、負のエネルギーバランスおよび結果として生じる脂肪分解の場合に通常見られる脂肪浸潤を、肝臓の中心葉に認めた。肝臓、腎臓および肺の切片に他の病変は観察されなかった。肺組織は、ＰＣＲによりＥＵ型ＰＲＲＳ陽性であった。日常的な細菌培養に関して成長は不検出であった。
【０１２６】
中力価ワクチン群では、健康障害が原因で１匹の子ブタを処置前のＤ０に試験から除外し、別の子ブタに交換した。２匹の子ブタは、Ｄ１２からそれぞれ１および３日間咳嗽を示した。４匹の子ブタが、Ｄ２、Ｄ３またはＤ２とＤ３の両日に痩せていると認められた。
【０１２７】
高力価ワクチン群では、１匹の子ブタ（１７２８）がＤ７〜Ｄ２６に片足の跛行、または跛行および腫脹を示した。ワクチン接種の１８日後から、１匹の子ブタは６日間痩せていると認められ、その子ブタは、咳嗽を１日間および粗い被毛を４日間示した。別の子ブタは、Ｄ２に痩せていると認められた。２匹の子ブタは、Ｄ９からそれぞれ２日間および１日間咳嗽を示した。１匹の子ブタは１日間下痢を示した（Ｄ１４）。
【０１２８】
攻撃対照群では、６匹の子ブタが、１匹目の子ブタでＤ７に始まり３匹の子ブタでＤ２１日に終わる、累積１〜６日間の周期性咳嗽を示した。２匹の子ブタは、それぞれ２および１１日間、これらの子ブタの１匹ではＤ１から、痩せていると認められた。これらの２匹の子ブタの２匹目は、また、沈うつおよび粗い被毛を４日間、脚弱症を１日間示し、Ｄ１５に死亡して発見された。この子ブタについての剖検で、肺病変は確認されず（肺病変スコア０％）、胃内に飼料がなく、腹部脂肪がなく、死因として飢餓と診断された。この肺病変スコアは攻撃前に決定されたので、攻撃後の肺病変解析には組み込まなかった。
【０１２９】
群検定の結果（ｐ値）を、Ｄ１〜Ｄ２６の少なくとも１日間のあらゆる異常臨床判定についてまとめた。ワクチン力価群と攻撃対照群との間にも（ｐ≧０．０５０２）、ワクチン力価群の間にも（ｐ≧０．３８９８）、有意差は検出されなかった。陰性対照群の子ブタは、Ｄ−１〜Ｄ２６に異常な臨床判定を示さなかった。
【０１３０】
ＰＲＲＳの血清検査：個別の子ブタのＰＲＲＳ ＥＬＩＳＡ血清検査の結果をまとめた。陰性対照群の子ブタは、試験にわたりＰＲＲＳ血清陰性のままであった。セロコンバージョンは、ワクチン接種の１４日後までに三つのワクチン力価群で観察することができ、一方、攻撃対照群は、攻撃後までＰＲＲＳ血清陰性のままであった。攻撃の１０日後（Ｄ３８）に、低および高力価ワクチン群ならびに攻撃対照群の全ての子ブタがＰＲＲＳ血清陽性であり、一方、中力価ワクチン群の子ブタ１５匹中１４匹がＰＲＲＳ血清陽性であった。
【０１３１】
ＰＲＲＳ ＥＬＩＳＡで陽性の血清検査の結果（ｐ値）を群間差について判定した。Ｄ１４、Ｄ２１およびＤ２８に、三つのワクチン力価群は、ＰＲＲＳ ＥＬＩＳＡで陽性の子ブタの頻度が攻撃対照群よりも有意に高値であった（ｐ＜０．０００１）。Ｄ３８に三つのワクチン力価群と攻撃対照との間（ｐ＝１．００００または検定を行わず）にも、任意の時点の三つのワクチン力価群の間にも（ｐ＝１．００００または検定を行わず）、有意差は検出されなかった。
【０１３２】
ワクチン接種後のＰＲＲＳウイルス血症：ワクチン接種後の個別のＰＲＲＳウイルス血症の結果を決定した。統計目的のために、「不検出」の結果に０log GE/mLの値を、「陽性」値に３．０log GE/mLの値を割り当てた。全ての群は、Ｄ０にＰＲＲＳウイルス血症陰性であった。群内ウイルス血症（ｑＰＣＲ）について、Ｄ７〜Ｄ２８のワクチン接種後の力価（log GE/mL）データを判定した。三つのワクチン力価群の子ブタはＤ７に平均ウイルス血症のピークに到達し、その後、３群全ての力価レベルは、攻撃前のレベルにゆっくりと減少した（ＳＤ２８）。逆に、攻撃対照群および陰性対照群は、攻撃前の試験期間にウイルス血症が陰性のままであった。Ｄ７、Ｄ１４、Ｄ２１およびＤ２８のｑＰＣＲの結果についての群検定の結果（ｐ値）から、三つのワクチン力価群全てで、ｑＰＣＲ値の中央値がＤ７〜Ｄ２８に攻撃対照群よりも有意に高値であったことが分かった（ｐ≦０．０１５９）。中ワクチン力価群は、ｑＰＣＲ値の中央値が低力価ワクチン群よりも有意に高値であり（ｐ＝０．０１９３）、その他の点では、攻撃前のワクチン群間でｑＰＣＲの中央値に差は検出されなかった（ｐ≧０．０５９４）。
【０１３３】
ワクチン接種の４週間後に、ウイルス血症の頻度は三つのワクチン力価群で低値であった。
【０１３４】
これらの試験結果に基づき、以下の結論を下すことができる：
・  試験中の生物安全性が全く破られなかったこと、およびＰＲＲＳに対する子ブタの感受性が確認されたことから、試験の妥当性検証が確認され、試験が解釈に適することが確認された。
・  攻撃対照群で実質的なＰＲＲＳ臨床疾患が明白であったことから、ＰＲＲＳワクチンの有効性を、より具体的にはＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶのＭＩＤを評価するために妥当な検査室ツールとして、この攻撃モデルが検証された。
・  ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶの三つの用量レベルの全ては、肺病変の有意な軽減、ならびに攻撃後のウイルス血症、肺組織でのウイルス負荷、咳嗽、合計臨床観察スコア、発熱およびＡＤＷＧの有意な減少と関連した。
・  毒性異種ヨーロッパ型由来ＰＲＲＳ攻撃を受けた後に、三つの力価レベルの全てについて全体的肺病変が攻撃対照に比べて適切に減少したことに基づくと、この試験で決定されたＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶのＭＩＤは、低力価ワクチンレベル１×１０２．７７TCID50/mLに関連する。
【０１３５】
結果のさらなる表示
臨床観察を毎日行った。血液、口腔、糞、および鼻腔スワブからの試料ならびに肺洗浄液について、ＰＲＲＳＶヨーロッパ型特異的プライマーを用いた定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。
【０１３６】
これらの試験から、データは、脚の不自由な少数のブタを除き、子ブタが正常な健康状態を示したことを示した。死後、１〜２匹の動物が鼠径リンパ節の軽度な腫脹の徴候を示したことを除き、剖検に異常はなかった。重要なことに、ワクチン接種群に肺病変が観察されなかったことが認められた。
【０１３７】
図８に、ＥＣＡＣＣアクセッションナンバー11012502で寄託された弱毒化ＰＲＲＳウイルス株を含有する組成物をワクチン接種された群に比べた、センチネル群でのウイルス血症動物のパーセンテージを示す。この図は、ワクチン接種された動物からセンチネルへのワクチン株の拡散を示している。定量ＲＴ−ＰＣＲで検出されたＰＲＲＳウイルス血症のピーク（ＳＤ２１）で、ウイルス負荷は、ワクチン接種された動物（平均ウイルス負荷４．０１４GE/ml）よりもセンチネル感染ブタ（平均ウイルス負荷３．３４７GE/ml）の方が７８．４７％低値であった。ＰＲＲＳナイーブな母ブタが、ワクチン接種されたその子孫と混合飼育された部屋では、８匹中３匹の母ブタだけがＲＴ−ＰＣＲにより血中ＰＲＲＳＶ陽性と検査され、したがって、ナイーブ成動物へのＰＲＲＳ ＭＬＶワクチン曝露が限定的で無効であることが確認された。ワクチンのウイルス９４８８１ ＭＬＶは、この試験で主に糞中に排泄された。実際に、ワクチン接種の１〜２１日後に糞中からウイルスを検出することができた。ワクチン接種の５日後に、ワクチン接種された動物のほぼ３０％がウイルスを糞中に排泄した。ＰＲＲＳウイルスは鼻汁から不検出であり、少数の動物にだけ口腔分泌液により検出された（ワクチン接種の５日後に試料採取された動物５６匹中２匹）。
【０１３８】
例３：一例としてPorcilis（登録商標）ＰＲＲＳを用いたワクチン有効性の検査に使用するための例示的な材料および方法
ＰＲＲＳＶ陰性確認済みの群れ（ウイルス検査および血清検査）から選択された数の、例えば１４匹の、健康な妊娠した母ブタをこの試験に使用した。母ブタは、１回目または２回目の分娩を経験し、妊娠９４日目のワクチン接種／攻撃感染時に妊娠していることが確認された。母ブタを三つの処置群に分けた。第１の群は、少なくとも１０４．０TCID50を含有する市販のPorcilis（商標）ＰＲＲＳの１回２mlを妊娠９４日目に筋肉内投与することで処置した。攻撃対照群（群２）は、細胞培養培地２ml中の１０４．７２TCID50の病原性ヨーロッパ型野外単離株（継代４回目）の鼻腔内投与を１回受けた。群３は、２０１１年１月２５日にＥＣＡＣＣアクセッションナンバー11012502で寄託された弱毒化ＰＲＲＳ株を含有するＰＲＲＳ ＭＬＶを１０７．６TCID50含有する２mlを１回i.m.投与することでワクチン接種し、７日後に精液注入し、妊娠９４日目にヨーロッパ型野外単離株（継代４回目）で攻撃した（細胞培養培地２ml中に１０４．７２TCID50、i.n.）。
【０１３９】
群１からの動物を分娩５日後までモニターした。群２および３からの動物を分娩２８日後までモニターした。
【０１４０】
動物相：全ての母ブタは、ワクチン接種の１週間前に動物飼育施設に慣れさせた。検査員が毎日、母ブタおよび子ブタをその全身の健康状態について観察した。死亡または安楽死された各動物を死後検査およびその後の検査室分析に供した。
【０１４１】
妊娠は超音波検査で確認した。ＰＣＲおよびＥＬＩＳＡ検査のために、試験０、７、１４日目および分娩時に母ブタから血清を得た。流産に関連した任意の材料を検査室検査に供した。
【０１４２】
日常的な肉眼的病理検査を全ての死産の子ブタに行った。全ての肺葉からの肺組織試料を死産の子ブタおよびミイラから収集した。ＰＣＲ検査用試料を−７０℃で保存した。各子ブタから初乳前血液２mlを出生の日に採取した。血清を調製し、分割量を−７０℃で保存した。血清をウイルス血症の検査に使用して経胎盤感染を評価した。５日目まで生存した群１の全ての子ブタを５日齢で安楽死させた。
【０１４３】
臨床パラメーターおよび繁殖成績パラメーター：以下の基準は、検査されうる例示的な基準である（優先順）：一腹あたりの生存産子ブタの数、一腹あたりの死産子ブタの数、一腹あたりのミイラ化胎子の数、およびそれぞれ５または２８日齢まで生存した子ブタの数。ウイルス血症で生まれた子ブタの数は、初乳前血清を用いて決定した。母ブタおよび／または子ブタからのＰＣＲ陽性血液試料および組織試料の頻度を検査して、疫学および感染経路を評価した。
【０１４４】
野外試料：この試験で検査した野外試料は、日常のＰＲＲＳＶ診断から取得したものであり、ヨーロッパ諸国からの血液、血清および様々な器官材料、主に肺およびリンパ節から成った。試料を−２０℃で最大３日間保存し、その後ＲＮＡを調製し、続いて残った材料を長期保存のために−７０℃に移動した。ＲＮＡおよびＲＴ−ＰＣＲ産物を−２０℃で保存した。
【０１４５】
細胞培養：ＭＡ１０４細胞（クローンＣＬ２６２１）は、１０％ＦＣＳおよび抗生物質を補充したＭＥＭ（Dulbecco, Germany）中で成長させた。
【０１４６】
ブタ肺胞マクロファージは、Wensvoortら（Wensvoort, G. et al. Vet. Quat. 1991, 13:121-130）によって記載され、以下のように改変された方法を用いて回収した：各肺葉にＰＢＳを５０〜１００ml注入し、続いて３〜５分間マッサージした。次に、この液体を肺葉から回収し、ガーゼのフィルターを通過させた。洗浄液が透明になるまでこの手順を繰り返した。貯留した洗浄液を５００ｇで１５分間室温にて遠心分離した。ペレットをＰＢＳ中で洗浄し、５０％ＲＰＭＩ１６４０（Biochrom）、４０％ＦＣＳおよび１０％ＤＭＳＯ中に細胞１×１０７個となるよう分注したものを−１９６℃で凍結した。さらなる使用のために、１０％ＦＣＳおよび抗生物質を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中でＰＡＭを培養した。
【０１４７】
細胞培養でウイルスを単離するための器官材料の調製：組織材料約０．５cm3を、スチール製ホモジナイザー用バレット１個が入っているチューブに入れた無菌ＰＢＳ １．８ml中に移した。器官材料が均質化するまでこのチューブを１０分間撹拌した。４５０ｇおよび室温で２分間遠心分離することによって細胞片をペレットにした。上清を孔径０．４５μmの滅菌フィルターに通過させ、−７０℃で保存した。２４ウェルマイクロタイタープレートを用いて１個の半集密細胞培養単層に接種するために３０μl分量を使用した。
【０１４８】
ＲＮＡの単離：器官材料由来のＲＮＡは、RNeasy Mini Kitを用いて、血清、血漿、細胞培養上清およびワクチン溶液からは、QTAamp Viral RNA Mini Kit（どちらもQiagen）を用いて、製造業者の助言にしたがって、調製毎にそれぞれ器官材料約１００mgおよび液体材料１４０μlを使用して抽出した。ＲＮＡは、製造業者が助言したように、最終的に緩衝液６５μl中に溶出させた。
【０１４９】
ウイルスのプラーク精製：４８時間前に１０cm細胞培養皿に接種したＭａ１０４細胞の集密単層に１０−１〜１０−４の１０倍希釈系列のウイルスをそれぞれ感染させた。細胞をウイルス希釈物と共に１時間インキュベーションし、次にウイルス希釈物を除去し、５％メチルセルロース（Sigma）を含有するＭａ１０４培地３０mlを細胞に重層した。５〜７日後にプラークを釣り上げ、２４ウェルプレート中のＭａ１０４単層に移した。これらのプレートからのウイルスを約５０％ＣＰＥで回収し、さらなる分析に供した。
【０１５０】
免疫蛍光アッセイ：氷冷アセトン：メタノール（１：１）を用いて細胞を−２０℃で１５分間固定し、その後風乾した。ＰＢＳ中で再水和後、ＰＲＲＳＶ特異的モノクローナル抗体ＳＤＯＷ１７（Rural Technologies Inc., USA）をＰＢＳ中に１：１０００になるように希釈した液と共に細胞を１時間インキュベーションした。ＰＢＳで３回洗浄後、細胞をヤギ抗マウスＦＩＴＣ結合二次抗体（Dianova, Hamburg, Germany）（ＰＢＳ中に１：１５０）と共にもう１時間インキュベーションした。ＰＢＳで３回最終洗浄後、細胞にグリセリン：ＰＢＳ溶液（１：１）を重層し、免疫蛍光顕微鏡検査に供した。
【０１５１】
診断ｎＲＴ−ＰＣＲ：診断ＲＴ−ｎＰＣＲを実施して、ＰＲＲＳＶ−ＥＵウイルスの存在について試料をチェックすることができる。
【０１５２】
診断ＲＴ−ｎＰＣＲの一例は、Titan One Tube Kit（Roche Molecular Biochemicals）を以下のように用いて実施することができる：［総ＲＮＡ調製物５μl、１×ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液、０．４mM ｄＮＴＰ、２０pmolのプライマーＰＬＳおよびＰＬＲ、５mMジチオスレイトール、１mM ＭｇＣｌ２、２．５〜５Ｕ ＲＮａｓｉｎ（Promega Ltd)、１〜２．５Ｕ酵素混合物、ＤＥＰＣ処理蒸留水で終体積２５μlに調整］。使用した日常的なサクリング条件は、４５℃１時間、９４℃２分間、ならびに９４℃３０秒、５８℃４５秒および６８℃４５秒を３０サイクル、６８℃で５分間の最終伸長ステップでありうる。ネステッドＰＣＲ反応は、Qiagen Taq（Qiagen AG）を用いて以下のように実施した：［1μl ＲＴ−ＰＣＲ産物、１×ＰＣＲ緩衝液、１０μl Ｑ溶液、３．５mM ＭｇＣｌ２、０．３mM ｄＮＴＰ、２０pmolの各ＥＵ−７−ｎ−ｓプライマーおよびＥＵ−７−ｎ−ａｓプライマー、２．５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ、蒸留水で最終体積５０μlに調整］。サイクリング条件は以下の通りであった：９４℃１分間、５８℃１分間および７２℃１分間を７サイクル、続いて９４℃１分間および７０℃１．５分間を３０サイクル（アニーリングステップなし）、７０℃で５分間の最終伸長ステップ。
【０１５３】
ヌクレオチド配列決定：ヌクレオチド配列決定は、Ｍ１３タグを含有するプライマーを用いて生成したネステッドＰＣＲ産物に関して、ＰＣＲ反応から直接、またはアガロースゲルから切り出してJETsorbゲル抽出キット（Genomed）で精製したＰＣＲ産物からのいずれかで行うことができる。配列決定は、自動シークエンサーLI-COR製ＤＮＡ分析装置GENE READIR 4200（登録商標）（LI-COR Inc., Lincoln, Nebr., USA）を使用して行った。ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列は、AlignIR（登録商標）、vs1.1（LI-COR Inc., Lincoln, Nebr., USA）およびDNASIS.RTM. 2.6ソフトウェアパッケージ（Hitachi Software Genetic Systems Inc., San Francisco, USA）で解析することができる。
【０１５４】
例４：完全長ゲノム配列ＰＲＲＳＶ ９４８８１の決定
この実施例に、弱毒化９４８８１株およびその親株９４８８１継代５回目の完全長ゲノムヌクレオチド配列の決定を示す。これらの配列は、不明確なヌクレオチド位置を全く示さず、これは、均一なウイルス内容物が存在することを示している。９４８８１マスター種ウイルスとヨーロッパ型参照ウイルス株であるLelystadウイルス（ＬＶ）との比較は、８個の異なるウイルス遺伝子に８５．４０〜９５．０９％の範囲のヌクレオチド相同性があり、両ウイルス株の間に８６．３９〜９７．２７％のアミノ酸同一性があることを明らかにした。ＬＶに比べて９４８８１ ＭＳＶのＯＲＦ１ａに２個の欠失を確認することができた。９４８８１マスター種ウイルスとその親株、継代５回目との間の比較により、両者の間に合計１４個のアミノ酸交換数をもたらす、２６個のヌクレオチド交換が示された。
【０１５５】
９４８８１マスター種ウイルスの完全長ゲノム配列の決定のために、合計１回の逆転写、１７回の外部ＰＣＲおよび５８回の内部ＰＣＲを行い、４０種のＰＣＲ産物を生成させ、それを配列決定のために使用した。９４８８１、継代５回目の場合、１回の逆転写、１７回の外部ＰＣＲおよび６７回の内部ＰＣＲを行い、４０種のＰＣＲ産物を生成させ、それも配列決定のために使用した。
【０１５６】
重複配列のアライメント解析は、両ウイルス単離株について完全なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）１ａ〜７をそれぞれ含む、１４８４３個のヌクレオチドの完全長配列をもたらした。追加的に、５’非翻訳領域（５’ＮＴＲ）の１７７個のヌクレオチドおよび３’非翻訳領域（３’ＮＴＲ）の４３個のヌクレオチドをそれぞれ決定することができた。ヨーロッパ型ＰＲＲＳＶ参照ウイルス単離株であるLelystad（ＬＶ）（GenBankアクセッションナンバーM96262）に比べ、５’ＮＴＲの４４個のヌクレオチドおよび３’ＮＴＲの８３個のヌクレオチドを判定することができなかった。それは、それらの領域がプライマーアニーリング領域のために使用されたからである。
【０１５７】
配列決定反応は、両ウイルス株について、ゆらぎも混合配列に関する他の徴候もない明白なヌクレオチド配列をもたらした。アミノ酸に翻訳後、疑わしいアミノ酸を全く有さない明白なアミノ酸配列が、９４８８１ ＭＳＶとＬＶとの、および親株９４８８１、継代５回目との配列比較で入手できた。９４８８１ ＭＳＶとLelystadウイルスの間のヌクレオチド配列のアライメントおよび比較を行ったところ、ヌクレオチドおよびアミノ酸レベルで実質的な差があることが示された。９４８８１ ＭＳＶとその親株、継代５回目との間でもアライメントを行った。
【０１５８】
ＬＶとの配列比較は、８個の異なるウイルス遺伝子で８５．４０〜９５．０９％のヌクレオチド相同性および両ウイルス株の間で８６．３９〜９７．２７％のアミノ酸同一性をもたらした。ＬＶに比べて９４８８１ ＭＳＶのＯＲＦ１ａに２個の欠失を同定することができる。ヌクレオチド１３８個の１個の欠失は、ＬＶの位置２１５４〜２２９２にあり、４６個のアミノ酸欠損を生じる。位置２６８６〜２６８８でさらなるトリプレットが欠失し、アミノ酸フェニルアラニンの欠損が生じる。ＬＶと両９４８８１株との間の全てのヌクレオチド相同性およびアミノ酸同一性の配置を表４．１に示す。
【０１５９】
【表６】
0005788027.tif 000007
【０１６０】
９４８８１マスター種ウイルスおよび９４８８１親株、継代５回目の完全長ヌクレオチド配列の配列比較は、両者の間で合計２６個のヌクレオチド交換を明らかにした。ヌクレオチド交換は、以下のように分布した：ＯＲＦ１ａに１５個、ＯＲＦ１ｂに４個、ＯＲＦ２に２個、ＯＲＦ３に０個、ＯＲＦ４に１個、ＯＲＦ５に３個、ＯＲＦ６に１個およびＯＲＦ７に０個。これらのヌクレオチド交換は、以下のように分布した合計１４個のアミノ酸交換をもたらした：ポリタンパク質１ａに８個、ポリタンパク質１ｂに１個、糖タンパク質２に１個、糖タンパク質３に０個、糖タンパク質４に１個、糖タンパク質５に２個およびマトリックスタンパク質に１個。両株は、Lelystadウイルスに比べてＯＲＦ１ａに同じ欠失を示した。ウイルスの遺伝子および対応するタンパク質での位置を含む、全てのヌクレオチド交換および生じたアミノ酸交換の表を、表４．２に詳細に示す。
【０１６１】
例５  −  寄託されたウイルスおよびＭＳＶの培養
上記のように、親株（低継代回数）９４８８１は、European Collection of Cell Cultures（ＥＣＡＣＣ）にアクセッションナンバーECACC 11012501で、９４８８１マスター種ウイルス（ＭＳＶ）はEuropean Collection of Cell Cultures（ＥＣＡＣＣ）にアクセッションナンバーECACC 11012502で寄託されている。親ウイルスおよびＭＳＶの成長および培養条件をこの実施例に提供する。
【０１６２】
親株９４８８１：これは遺伝子型がＰＲＲＳＶ１型のウイルスであり、したがって、ヨーロッパ型遺伝子型ＰＲＲＳＶである。このウイルスのホストはブタである。11012501で寄託された親ウイルスは、５．８１Log10 TCID50/mLの力価で寄託された。ウイルス増殖用のホスト細胞はＭＡ１０４細胞である。これらの細胞を３．７g/L重炭酸ナトリウムを有する６％照射ウシ胎子血清含有最小必須培地（ＭＥＭ）中に入れて３７±１℃で培養する。細胞を、播種密度２×１０４〜２×１０５個/cm2でＴフラスコ（７５cm2）中に蒔き、１００％集密になるまで３〜７日間培養し、その後継代する。ウイルスの成長のために、ウイルスを０．００１〜０．０１のＭＯＩでＴフラスコ中の細胞に加える。細胞の感染は約８０〜１００％集密時に、典型的には細胞植え付けの１〜３日後である。感染した細胞を、感染後３７±１℃で３〜１０日間培養し、次に、ウイルスを回収する。単層細胞が感染の３〜１０日後に約８０〜１００％の細胞変性効果（ＣＰＥ）を示した場合に回収を行う。感染したＭＡ１０４組織培養物の上清（８０〜１００％ＣＰＥを有する培養物からの使用済み培地＋ＰＲＲＳＶ）を回収するが、その上清は増殖したウイルスを含有する。この上清は、使用まで−７０℃／−８０℃で数ヶ月間保存することができる。SpearmanとKaerberの計算式でウイルスのＴＣＩＤ５０について判定し、試料のlog10 TCID50/mLを決定する。
【０１６３】
ワクチン（高継代回数）９４８８１マスター種ウイルス（ＭＳＶ）：これは、遺伝子型がＰＲＲＳＶ１型のウイルスであり、したがって、ヨーロッパ型遺伝子型のＰＲＲＳＶである。このウイルスのホストはブタである。１１０１２５０２で寄託されたＭＳＶは、力価６．４３Log10 TCID50/mLで寄託された。ＭＳＶの増殖のために使用されるホスト細胞はＭＡ１０４細胞である。これらの細胞を１．４g/L重炭酸ナトリウムを有する１０％照射ウシ胎子血清含有最小必須培地（ＭＥＭ）中に入れて３６±２℃で培養する。Ｔフラスコ（７５〜１５０cm2）または８５０cm2ローラーボトル中に植え付け密度１×１０４〜１×１０５個/cm2で細胞を蒔き、１００％集密になるまで３〜７日間培養し、その後継代する。ウイルスの成長のために、ウイルスを０．００１〜０．０１のＭＯＩでＴフラスコまたはローラーボトル中の細胞に加える。細胞の感染は約８０〜１００％集密時、典型的には細胞植え付けの１〜３日後である。感染した細胞を、感染後３６±２℃で３〜１４日間培養し、次に、ウイルスを回収する。単層細胞が感染の３〜１４日後に約８０〜１００％の細胞変性効果（ＣＰＥ）を示した場合に回収を行う。感染したＭＡ１０４組織培養物の上清（８０〜１００％ＣＰＥを有する培養物からの使用済み培地＋ＰＲＲＳ）を回収するが、その上清は増殖したウイルスを含有する。この上清は、使用まで２〜８℃で５〜１０日間、−７０℃で数ヶ月間保存することができる。ReedとMuenchの計算式でＭＳＶのＴＣＩＤ５０について判定し、試料のlog10 TCID50/mLを決定する。
【０１６４】
【表７】
0005788027.tif 000008
【０１６５】
例６：ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶの未経産雌ブタＭＩＤ試験
【０１６６】
概要
このワクチン接種−攻撃試験の目的は、未経産雌ブタにおけるブタ繁殖・呼吸障害症候群ワクチン用ヨーロッパ型由来単離株９４８８１改変生ウイルス、コード１９Ｔ１．Ｕ＿（ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶ）の最小免疫用量（ＭＩＤ）を評価することであった。交配の約２８日前（０日目；Ｄ０）に、ＰＲＲＳ血清陰性未経産雌ブタに、異なる２力価レベルを投与し、妊娠約９０日目（Ｄ１１８）に、未経産雌ブタをＰＲＲＳｖの異種ヨーロッパ型単離株で攻撃し、生存産子ブタの合計数または生存産子ブタおよび２０日齢での離乳子ブタのパーセンテージについて未経産雌ブタを評価してＭＩＤを決定した。１１８日目（Ｄ１１８）の攻撃時に、攻撃対照群は、８匹の妊娠している未経産雌ブタ（群１、プラセボ）から成り、低力価群は、８匹の妊娠している未経産雌ブタ（群２、１×１０２．４３TCID50/用量）から成り、高力価群は、８匹の妊娠している未経産雌ブタ（群３、１×１０３．９０TCID50/用量）から成り、陰性対照群は、５匹の妊娠している未経産雌ブタ（群４、プラセボ、攻撃せず）から成った。
【０１６７】
攻撃対照群に比べて、低力価群および高力価群の両方が、分娩時に一腹あたりの生存子ブタのパーセンテージが高いこと（Ｐ≦０．０４５５）ならびに離乳時に一腹あたりの生存子ブタのパーセンテージおよび数が高いこと（Ｐ≦０．０２０３）と関連していた。
【０１６８】
補助有効性パラメーターに関して、高用量群は、攻撃対照群に比べて、分娩時に未経産雌ブタ１匹あたりの健康な子ブタのパーセンテージおよび数が高いこと（Ｐ≦０．０２１１）、虚弱な胎子およびミイラ化胎子のパーセンテージおよび数が低いこと（Ｐ≦０．００９０）、攻撃後の未経産雌ブタにおいてＤ１２５、ＤＯＦ０およびＤＯＦ＋１３にｑＰＣＲ陽性未経産雌ブタのパーセンテージが低いことおよびウイルス負荷が低いこと（Ｐ≦０．０１５５）、未経産雌ブタ１匹あたりのｑＰＣＲ陽性子ブタのパーセンテージが低いこと、およびＤＯＦ０に子ブタのウイルス負荷が低いこと（Ｐ≦０．００３０）、未経産雌ブタ１匹あたりの臨床疾患を有する子ブタのパーセンテージが低いこと（Ｐ＜０．０００１）、ならびにＤＯＦ＋２０およびＡＤＷＧに子ブタの体重が高いこと（Ｐ＜０．００１３）に関連した。
【０１６９】
低用量群は、攻撃対照群に比べて、分娩時に未経産雌ブタ１匹あたりの健康な子ブタのパーセンテージが高いこと（Ｐ＝０．０１３８）、ミイラ化胎子のパーセンテージおよび数が低いこと（Ｐ≦０．０１９０）、攻撃後の未経産雌ブタにおいてＤ１２５、Ｄ１３２、ＤＯＦ０およびＤＯＦ＋１３にｑＰＣＲ陽性未経産雌ブタのパーセンテージが低いことおよびウイルス負荷が低いこと（Ｐ≦０．０２９０）、ＤＯＦ０に未経産雌ブタ１匹あたりのｑＰＣＲ陽性子ブタのパーセンテージが低いこと（Ｐ＝０．０３８１）、未経産雌ブタ１匹あたり臨床疾患を有する子ブタのパーセンテージが低いこと（Ｐ＜０．０００１）、ならびにＤＯＦ＋２０およびＡＤＷＧに子ブタの体重が高いこと（Ｐ＜０．００２８）に関連した。
【０１７０】
結論として、この試験の目的は達成され、この試験のデータは、未経産雌ブタでのＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶのＭＩＤを１×１０２．４３TCID50/２mlとして確認するものである。加えて、この研究は、未経産雌ブタで約４ヶ月の免疫期間（ＤＯＩ）を確認するものである。
【０１７１】
試験の目的（一つまたは複数）／ねらい
このワクチン接種−攻撃試験の目的は、交配前に異なる２力価レベル（群２、低力価；群３、高力価）でＰＲＲＳ血清陰性未経産雌ブタに投与されたブタ繁殖・呼吸障害症候群ワクチン用ヨーロッパ型由来単離株９４８８１改変生ウイルス、コード１９Ｔ１．Ｕ＿（ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶ）が、妊娠約９０日目に未経産雌ブタをブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳｖ）の異種ヨーロッパ型単離株で攻撃後に、高いパーセンテージの生存産子ブタおよび２１日齢での離乳子ブタを提供する、最小免疫用量（ＭＩＤ）を評価することであった。この目的を満たす主要基準は、一方または両方のワクチン群が、攻撃対照群（群１）よりも関連的に高いパーセンテージまたは数の生存産子ブタおよび２０日齢（ＤＯＦ＋２０）での離乳子ブタを示さなければならないことであった。
【０１７２】
ワクチン群と攻撃対照群との間で解析された他のパラメーターには、ワクチン接種後の未経産雌ブタの臨床判定、未経産雌ブタのＰＲＲＳ血清検査結果、未経産雌ブタのウイルス血症、未経産雌ブタの臨床観察結果、子ブタのウイルス血症、一腹あたりの合計子ブタ数、一腹あたりの健康な生存子ブタ、一腹あたりの虚弱な生存子ブタ、一腹あたりのミイラ、一腹あたりの死産、一腹あたりの圧死した（crushed/mortalities）子ブタ、子ブタの臨床観察、および子ブタ平均１日増体重（ＡＤＷＧ）が含まれた。これらのパラメーターを補助パラメーターとして解析し、試験の目的を満たす主パラメーターとして役立てなかった。
【０１７３】
イベントのスケジュール
【０１７４】
【表８】
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【０１７５】
【表９】
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【０１７６】
試験デザイン
【０１７７】
【表１０】
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【０１７８】
結合基準
試験担当検査員および被指名人は、群１〜４に割り当てられた未経産雌ブタに関して盲検化されていた。試験担当検査員および被指名人の盲検化を維持するために、データを収集していない人物が、Ｄ０に、割当て済み未経産雌ブタにＩＶＰおよびＣＰを投与した。検査室の職員は、彼らのそれぞれの職務を行う間、各未経産雌ブタが受けた処置に関して盲検化されていた。
【０１７９】
材料
治験動物薬（ＩＶＰ）および対照薬（ＣＰ）
【０１８０】
【表１１】
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【０１８１】
【表１２】
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【０１８２】
攻撃材料
【０１８３】
【表１３】
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【０１８４】
追加的な処置
Ｄ８〜Ｄ２１に各未経産雌ブタの飼料中にMatrix(商標)（６．８mL; Alternogest; Intervet/Schering Plough Animal Health）を投与して発情周期を同期化した。
【０１８５】
分娩開始のためではなく、未経産雌ブタの分娩を援助するために、オキシトシン（VetTek）を出産時に投与した。出生直後の鉄欠乏性貧血を予防するために、分娩時に全ての生存子ブタの右腿に鉄注射液（PhoenixまたはDurvet）１．０mLをＩＭ投与した。追加的に、出生直後の伝染性下痢症予防薬として全ての生存子ブタにゲンタマイシン（SparHawk Laboratories Inc）を投与した。全ての処置を生物学・薬学処置記録フォームに記録した。
【０１８６】
処置
投薬の正当化
各ＩＶＰを、割り当てられた未経産雌ブタに２．０mL用量として投与してＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶのＭＩＤを評価した。群１および４に割り当てられた未経産雌ブタに２．０mL用量のＣＰを投与した。
【０１８７】
用法
Ｄ０に、試験データを収集していない人物が、各ＩＶＰまたはＣＰをそれぞれの該当する未経産雌ブタの右頸部領域に無菌３．０mLルアーロック注射器および無菌１８ｇ×１インチ（２．５４cm）針を使用してＩＭ投与した。用法を下の表６．８に示す。
【０１８８】
【表１４】
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【０１８９】
試験職員のための方法および予防措置
ＩＶＰ、ＣＰおよび攻撃材料を投与する職員は、安全予防措置に忠実であり、特定の試験サイトに概要を述べたような身体保護具を着用した。
【０１９０】
動物の情報
被験動物の詳細
【０１９１】
【表１５】
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【０１９２】
組み込み／排除基準
この試験に登録された全ての未経産雌ブタはＰＲＲＳ  ＥＬＩＳＡ陰性、未交配であり、観察による判定でワクチン接種時に健康であった。
【０１９３】
未経産雌ブタの組み込み後の除去
群１の未経産雌ブタ５匹（５、１５、３４、３５および５２番）、群２の未経産雌ブタ２匹（７７および９４番）、群３の未経産雌ブタ３匹（２、２５、および３０番）および群４の未経産雌ブタ１匹（２０番）は、発情を表さなかったので、続いて交配されなかった。これらの未経産雌ブタをＤ４７までに試験から除去した。
【０１９４】
跛行、妊娠せず、または遅い交配が原因で、群１の未経産雌ブタ２匹（１０９および１１０番）、群２の未経産雌ブタ９匹（５６、５９、６０、６９、７３、７５、７６、７８、および１０３番）、群３の未経産雌ブタ４匹（２２、２８、５１および５３番）および群４の未経産雌ブタ１匹（２１番）をＤ８９までに試験から除去した。
【０１９５】
試験プロトコールには、攻撃前に、群１〜３について１群あたり１６匹よりも多い妊娠した未経産雌ブタが、まだ試験に入っている場合、余分な未経産雌ブタをランダムに選択して、研究から除去することで、群１〜３について１群あたり１６匹の妊娠した未経産雌ブタを残すと述べてあった。統計学者による無作為化または試験外の人物による選択に基づき、群１の未経産雌ブタ５匹（３、８、３９、９０および１０１番）、群２の未経産雌ブタ１匹（７０番）および群３の未経産雌ブタ５匹（４２、８０、８６、９１、および１０５番）をＤ１０４までに試験から除去し、群１〜３についての群の大きさを１６匹の未経産雌ブタに減らした。
【０１９６】
場所の制約が原因で、試験担当検査員は、群４の大きさを８匹から５匹に減らす要求をした。統計学者は、試験から除去するために未経産雌ブタ３匹（１０、２４および２９番）を無作為に選択し、Ｄ１０９にそれらを除去した。
【０１９７】
動物の管理と収容
動物の収容
試験が完了するまで、低ＩＶＰ力価の未経産雌ブタをVRI-CambridgeのＣＢ棟の部屋１および２に収容し、高ＩＶＰ力価の未経産雌ブタを部屋３および４に収容した。攻撃対照群および陰性対照群に割り当てられた未経産雌ブタを、Ｄ−１〜Ｄ８５までVRI-Risdalの１匹部屋に収容した。Ｄ８５に、攻撃対照群および陰性対照群の残りの未経産雌ブタをVRI-Cambridgeに移した。残りの試験の間、攻撃対照未経産雌ブタ１６匹をＣＢ棟の部屋５〜８に収容し、陰性対照未経産雌ブタ８匹をＣＡ棟部屋１２に収容した。Ｄ８５以降、各部屋は、１列あたり４個の分娩クレートを２列備える同一のレイアウトであった。各クレートに未経産雌ブタ１匹およびその後代を入れた。各クレートは約５フィート×７フィートの大きさであり、床から一段高くなっており、側方に金属棒のパネルおよび床板用にプラスチック製メッシュを備える。隣接するクレートの間で鼻同士が接触することはなかった。各クレートの床を少なくとも１日１回洗浄して、排泄物および廃棄物を除去した。各部屋は別々の暖房および換気を有し、部屋同士の空気の交差汚染を予防した。この試験に使用する前に各部屋を清掃および消毒した。動物の世話をするスタッフは、各部屋に入る前にシャワーを浴び、清潔な衣服を着用した。
【０１９８】
ＰＲＲＳｖがエアロゾル化などの様々なメカニズムによってブタからブタに容易に蔓延することが科学界で周知であることから、この試験で処置群の隔離が必要であった。これには、無毒性ＰＲＲＳ生ワクチンが含まれる。それは、これらの生物薬が、疾患を引き起こす可能性を有さずに毒性野生型ＰＲＲＳの特徴を模倣する弱毒化ウイルス粒子を含むからである。生物安全性が維持されていること、およびワクチン接種された動物が、ワクチン接種されていないＰＲＲＳｖナイーブな陰性対照動物を偶発的に交差汚染しなかったことを保証するために、適切な方法が整っていた。
【０１９９】
施設内の各部屋は、十分な空気循環と暖房を支援するために、換気扇と暖房器具を有する。換気システムは、各部屋で独立しているが、同一であるため、空気は部屋同士の間で共有されない。固形飼料は、害虫のいない袋の中に保存した。水は、動物施設に位置する井戸から自由に与えた。未経産雌ブタに、その大きさ、齢および状態に適切な、市販の調製済みで薬物無添加の妊娠期または授乳期用飼料（Heart of Iowa Cooperative, Roland, IA）を給餌した。
【０２００】
試験担当検査員が判定したように、未経産雌ブタは、試験の開始前に良好な健康および栄養状態であった。試験の間、未経産雌ブタ２匹が軽度の跛行を有すると観察され、未経産雌ブタ１匹が左頸部領域に腫脹を有すると観察された。試験担当検査員は、これらの全てが、閉じ込められて収容された未経産雌ブタの群に通常発生する非特異的状態と見なした。試験担当検査員は、この試験の間にどの動物にも付随処置が必要ないと判断した。
【０２０１】
群１〜３に割り当てられた全ての未経産雌ブタおよびその子ブタは、安楽死後に商業的焼却により廃棄した。群４に割り当てられた未経産雌ブタは、安楽死後にレンダリングにより廃棄した。群４子ブタは安楽死および廃棄をせず、別のＢＩＶＩプロジェクトに割り当てた。この試験に登録された動物からの食品がヒトの食物チェーンに入ることはなかった。
【０２０２】
有効性の判定
ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶのＭＩＤを判定するために、低力価群（群２）および高力価群（群３）をＤ１１８に攻撃し、繁殖成績および攻撃後の離乳子ブタを評価した。この目的を満たす主要基準は、一方または両方のワクチン群が、攻撃対照群（群１）よりも統計的に高いパーセンテージまたは数の生存産子ブタおよび２０日齢（ＤＯＦ＋２０）での離乳子ブタを示さなければならないということであった。
【０２０３】
ワクチン群と攻撃対照群との間の有効性を支持するために解析された他のパラメーターには、ワクチン接種後の未経産雌ブタの臨床判定、未経産雌ブタのＰＲＲＳ血清検査結果、未経産雌ブタのウイルス血症、未経産雌ブタの攻撃後臨床観察、分娩時の子ブタのウイルス血症、一腹あたりの子ブタの合計数、一腹あたりの健康な生存子ブタ、一腹あたりの虚弱な生存子ブタ、一腹あたりのミイラ、一腹あたりの死産、一腹あたりの圧死した子ブタ、子ブタの臨床観察、および子ブタのＡＤＷＧが含まれた。
【０２０４】
妥当性検定（valid test）のための基準
どの解析にも陰性対照群（群４）は含まれなかった。陰性対照群は、残りの３群が攻撃された時点で元の未経産雌ブタがＰＲＲＳ陰性であったことを実証するために、試験に組み込んだ。さらに、野外ＰＲＲＳｖを導入した可能性または攻撃群からの偶発的な交差汚染を除外するために、試験の完了まで陰性対照群はＰＲＲＳ陰性のままでなければならなかった。
【０２０５】
購入前血清試料およびＤ０の血清試料は、全て、ＰＲＲＳ抗体陰性である必要があった。試験が妥当であるためには、群１および４から攻撃日まで、ならびに群４から試験の完了まで、採取された血清試料が無ＰＲＲＳ抗体でなければならなかった。
【０２０６】
主要転帰パラメーター
統計的評価のための主要有効性変数は、出生時の未経産雌ブタ１匹あたりの生存子ブタ（平均数およびパーセンテージ）およびＤＯＦ＋２０での一腹あたりの生存子ブタ（平均数およびパーセンテージ）であった。
【０２０７】
９．２．１  未経産雌ブタ１匹あたりの出生時生存子ブタのパーセンテージ
試験の間、各未経産雌ブタについて分娩データを記録した。各未経産雌ブタについての分娩日（ＤＯＦ）を、最初の子ブタが生まれた日と定義した。分娩時に、各子ブタを、下の表６．１０に挙げた５種類の一つに分類した。出生時に生存していた子ブタを、健康な生存子ブタ、虚弱生存子ブタまたは圧死子ブタ（圧迫による死亡は、下記の剖検で確認した）として出生時に観察評価を行った任意の子ブタとして定義した。試験担当検査員または被指名人が観察を行い、観察を分娩／出産経過記録フォームに記録した。
【０２０８】
【表１６】
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【０２０９】
ＤＯＦ＋２０での一腹あたりの生存子ブタ
ＤＯＦ＋１〜ＤＯＦ＋２０に、下の表６．１１に概要したような疾患の臨床徴候について子ブタを観察した。試験担当検査員または被指名人が観察を行い、臨床観察記録フォームに観察を記録した。
【０２１０】
【表１７】
0005788027.tif 000018
【０２１１】
統計学者が、ＳＡＳプログラムを使用して、１日合計臨床観察スコアを呼吸、行動および咳嗽スコアの合計として決定した。ＤＯＦ＋２０に０〜８の臨床スコアを得ている任意の子ブタをＤＯＦ＋２０に生存として評価した。
【０２１２】
補助パラメーター
ワクチン群と攻撃対照群との間で解析された他のパラメーターには、ワクチン接種後の未経産雌ブタの臨床判定、未経産雌ブタのＰＲＲＳ血清検査結果、未経産雌ブタのウイルス血症、未経産雌ブタの臨床観察、子ブタのウイルス血症、一腹あたりの合計子ブタ、一腹あたりの健康な生存子ブタ、一腹あたりの虚弱生存子ブタ、一腹あたりのミイラ、一腹あたりの死産、一腹あたりの圧死した子ブタ、子ブタの臨床観察、および子ブタ平均１日増体重（ＡＤＷＧ）が含まれた。
【０２１３】
未経産雌ブタの毎日の判定
ワクチン接種後の毎日の判定のために、試験担当検査員または被指名人が、Ｄ−１〜Ｄ２１に１日１回、およびＤ２２〜１１５に１週間に少なくとも３回、全ての未経産雌ブタを観察した。観察を１日判定記録フォームに記録した。
【０２１４】
未経産雌ブタのＰＲＲＳ血清検査
購入前ならびにＤ０、Ｄ７、Ｄ１４、Ｄ２１、Ｄ５６、Ｄ８４、Ｄ１１８、Ｄ１２５、Ｄ１３２、ＤＯＦ０、ＤＯＦ＋７、ＤＯＦ＋１３およびＤＯＦ＋２０に未経産雌ブタから静脈全血を採取した。分娩／流産（ＤＯＦ０）の時点での未経産雌ブタからの採血は、分娩／流産直後に行うか、または分娩／流産後の８時間までに完了した。
【０２１５】
簡潔には、血液約１０mLを各未経産雌ブタから適切な大きさの血清セパレーターチューブ（一つまたは複数）（ＳＳＴ）中に採取した。試料の採取を、試料採取記録フォームに記録した。ＳＳＴ中の血液を室温で凝固させた。平日に採取した血液試料は、採取日にBIVI-Amesに配達した。週末に採取した血液試料は、VRIの職員が採取日に処理した。VRIでは血清試料を２〜８℃に保った。BIVI-AmesまたはVRIのいずれかで、血液試料を遠心沈殿し、血清を回収し、分割し、適切なチューブに移した。各チューブに未経産雌ブタのＩＤ番号、試験番号、採取日、試験日および試料の種類を記載したラベルを付けた。VRIでの血清試料は最も早期の好都合な時にBIVI-Amesに配達した。完成した検体配達記録フォームを各発送に添付した。BIVI-Amesで、１セットの血清試料を２〜８℃に保ち、もう一方のセットの血清試料を−７０±１０℃に保った。
【０２１６】
２〜８℃に保たれた未経産雌ブタの血清試料のセットをBIVI-AmesがＰＲＲＳ抗体について検査した。結果を陰性（ＥＬＩＳＡ Ｓ／Ｐ比＜０．４）または陽性（ＥＬＩＳＡ Ｓ／Ｐ比≧０．４）として報告した。
【０２１７】
攻撃後の未経産雌ブタの臨床観察
Ｄ１１６〜ＤＯＦ＋２０に疾患の臨床徴候について未経産雌ブタを観察した。試験担当検査員または被指名人が観察を行った。上の表６．１１に概要した臨床観察採点システムに基づいて、呼吸、行動および咳嗽について未経産雌ブタを毎日観察した。
【０２１８】
９例の子ブタのＰＲＲＳウイルス血症
ＤＯＦ０、ＤＯＦ＋７、ＤＯＦ＋１３およびＤＯＦ＋２０に、または子ブタの死亡を発見したときに、子ブタから静脈全血を採取した。新生子ブタからは、初乳前の採血が好ましかったが、必須ではなかった。初乳前の血液を採取できなかった場合、分娩から１２時間以内の周産期血液が許容できた。最初の吸乳前に採取されなかった試料は「周産期」としてラベルを貼り、初乳前試料と別に保存した。
【０２１９】
簡潔には、各生存子ブタから血液約２．０〜２．５mLを適切な大きさの血清セパレーターチューブ（一つまたは複数）（ＳＳＴ）に採取した。最小５．０mLの血液をＤＯＦ＋２０の安楽死直前に各子ブタから採取した。血液を各ミイラまたは死産から採取するか、または死亡した胎子から血液を採取できなかった場合、胸水または腹水を採取した。試料の採取は、試料採取記録フォームに記録した。
【０２２０】
子ブタの平均１日増体重
試験担当検査員または被指名人が、ＤＯＦ０およびＤＯＦ＋２０に、または子ブタの死亡が発見された日に、個別の子ブタを体重測定した。ＤＯＦ０での個別の体重を分娩／出産経過記録フォームに記録し、ＤＯＦ０後の体重を体重記録フォームに記録した。
【０２２１】
肺組織中のＰＲＲＳウイルスの定量
分娩時に死亡していた、またはＤＯＦ＋２０前に瀕死であった全ての子ブタを試験担当検査員が剖検した。剖検の結果および診断を剖検記録フォームに記録した。２個の肺試料を剖検された各子ブタから採取した。１個の試料を独立したWhirlpak（登録商標）容器に入れ、別の試料を、十分な体積の１０％ホルマリンを満たした適切な容器に入れた。試料の採取を剖検記録フォームに記録した。
【０２２２】
Whirlpaks（登録商標）およびホルマリン容器に、動物番号、試験番号、試料採取日、試験日、試料の種類および試料が左側、右側または両方からかを記載したラベルを適切に付けた。Whirlpaks（登録商標）中の試料を−７０±１０℃で保存し、１０％ホルマリン中の試料を、BIVI-Amesに配達するまで室温で保存した。記入した検体発送記録フォームを各試料発送物に添付した。BIVI-Amesで、Whirlpaks（登録商標）中の試料は、BIVI-Amesからドイツに輸送するまで−７０±１０℃で保存し、ホルマリン固定試料は、BIVI-Amesで室温にて保存した。
【０２２３】
試験が完了した後、Whirlpaks（登録商標）中の凍結組織試料を輸送し、上記のように検査した。
【０２２４】
パラフィンブロック中に包埋するために、ホルマリン固定組織試料を採取から１週間以内にISU VDLに提出した）。パラフィンブロック中の組織をBIVIに戻し、現在は、BIVI-Amesが将来的な検査の可能性のために室温で保存している。これらの試料を保存するか、またはそれらを廃棄するかは、試験の報告書が完成した後に、試験依頼者および監督者が決定する。
【０２２５】
有害事象
この試験の間に、ＩＶＰに起因する有害事象は報告されなかった。有害事象に関するさらなる情報については、１２．６節のワクチン接種後の未経産雌ブタの判定を参照されたい。
【０２２６】
統計的方法
実験単位
この試験において、非ワクチン接種群へのＰＲＲＳｖ生ワクチンの伝染を避けるために、処置群を別々の部屋に収容しなければならなかった。したがって、部屋が実験単位であった。しかし、この解析のために、「部屋」および「処置」の交絡効果によるバイアスの可能性を無視し、未経産雌ブタおよびそれに対応する同腹仔を実験単位として解析した。
【０２２７】
無作為化
検定に的確な未経産雌ブタ１０７匹のプールから９４匹のＰＲＲＳ血清陰性未経産雌ブタをＤ０の前に４群の一つに無作為に割り当てた。群１〜３は、それぞれ２８匹の未経産雌ブタから成った。群４は、１０匹の未経産雌ブタから成った。群１について、農場管理者は、発送前に４５番および５５番を健康上の理由から除外し、それぞれ２匹の余分の未経産雌ブタ１５番および１８番と交換した。群３について、農場管理者は、発送前に未経産雌ブタ４４番を健康上の理由から除外し、余分の未経産雌ブタ２５と交換した。
【０２２８】
攻撃時の場所の制約が原因で、群１〜３を１群１６匹の未経産雌ブタに制限し、群５を５〜８匹の未経産雌ブタに制限した。Ｄ８５に、群１〜３について試験に残すために１群あたり１６匹の未経産雌ブタを無作為に選択した。Ｄ８５に群４が８匹の未経産雌ブタから成ったので、この群に無作為化によるさらなる減少を行わなかった。その後、試験担当検査員は、群４を８匹の未経産雌ブタから５匹の未経産雌ブタに減らすように要請した。Ｄ１０９に、群４について５匹の未経産雌ブタを試験に残すために無作為に選択した。
【０２２９】
全ての無作為化手順は生物統計学者が行った。
【０２３０】
解析
統計解析およびデータのまとめは、林学博士Martin Vanselow（Biometrie & Statistik, Zum Siemenshop 21, 30539 Hannover, Germany, +49(0) 511 606 777 650, m.vanselow@t-online.de）が行った。
【０２３１】
統計解析の主目的は、二つのＰＲＲＳ ９４８８１ＭＬＶワクチン群（群２および３）と、ワクチン接種されていない攻撃対照群（群１）との比較であった。全てのデータは、管理および評価のためにＳＡＳにインポートした。データは、検証されたＳＡＳデータセットの形式で試験依頼者から受け取った。試験から中止された例を、除外日までのそれぞれの解析パラメーターについて考慮した。全てのデータを、変数の種類に基づき記述的にまとめた（ｎ、最小値、最大値、平均、中央値、標準偏差、四分位数間範囲、または頻度分布、信頼区間）。統計解析は、ＳＡＳソフトウェア・リリース８．２（SAS, 2001, Cary, North Carolina, USA: SAS Institute Inc.）を使用して行った。
【０２３２】
試験の統計的評価のための変数：
主要変数
分娩／流産時（ＤＯＦ＋０）の生存子ブタの比率
２０日齢（ＤＯＦ＋２０）での生存子ブタの比率
補助変数
ワクチン接種後の未経産雌ブタの臨床判定
未経産雌ブタのＰＲＲＳ血清検査
未経産雌ブタのウイルス血症
未経産雌ブタの臨床観察
子ブタのウイルス血症
繁殖成績
子ブタの臨床観察
子ブタの平均１日増体重（ＡＤＷＧ）
【０２３３】
検定されるべき仮説および行った仮定：
非攻撃の陰性対照群（群４）を統計検定から除外した。低力価群および高力価群（それぞれ群２および３）を攻撃対照群（群１）と比較した。群間の全ての検定は、差に関する両側検定として計画した。全ての検定の場合、Ｐ≦０．０５の場合のみ差を統計的に有意と見なした。生存産子ブタのパーセンテージまたは数およびＤＯＦ＋２０での離乳子ブタのパーセンテージまたは数が、攻撃された対照群よりも一方または両方のワクチン群の方が有意に高値であった場合、有効性が実証された。
【０２３４】
データの操作および評価に関する詳細：
ワクチン接種後の未経産雌ブタの臨床判定
試験１日目と２１日目との間、および試験１日目と１１３日目との間に少なくとも一つの陽性結果を有する動物の度数分布表を作成した。攻撃対照群とワクチン群との差をFisherの直接確率検定により検定した。
【０２３５】
攻撃後の未経産雌ブタの臨床観察
試験日１１６とＤＯＦ＋２０の間に少なくとも一つの陽性結果を有する動物の度数分布表を作成した。攻撃対照群とワクチン群との間の差をFisherの直接確率検定により検定した。
【０２３６】
未経産雌ブタの血清検査
試験日７、１４、２１、５６、８４、１１８、１２５、１３２（分娩前）ならびにＤＯＦ＋０、ＤＯＦ＋７、ＤＯＦ＋１３およびＤＯＦ＋２０でのＥＬＩＳＡの「陽性」結果の度数分布表を作成した。攻撃対照群とワクチン群との間の差をFisherの直接確率検定により検定した。
【０２３７】
未経産雌ブタのウイルス血症
ウイルス血症のデータは、各調査日に別々に評価した（分娩前の試験日７、１４、２１、５６、８４、１１８、１２５、１３２ならびにＤＯＦ＋０、ＤＯＦ＋７、ＤＯＦ＋１３およびＤＯＦ＋２０）。ｑＰＣＲデータの定性的評価のために、分析結果「不検出」（「n.d.」）および「陰性」を「陰性」と分類し、分析結果「陽性」および測定値を「陽性」と分類した。定量的評価のために、「不検出」（「n.d.」)および「陰性」をlog10GE/mL値０．０に置き換え、「陽性」を３．０に置き換えた。Wilcoxon Mann-Whitney検定を使用した攻撃対照群（群１）と処置群２および３との間の比較のために、定量ＰＣＲのデータ（ＰＲＲＳウイルス負荷［log10GE/mL］）を使用した。ｑＰＣＲの「陽性」結果の度数分布表を作成した。攻撃対照群とワクチン群の間の差をFisherの直接確率検定により検定した。
【０２３８】
繁殖成績
未経産雌ブタの合計数あたりの、生存、健康、虚弱、死産、死亡子ブタおよびＤＯＦ＋２０での生存子ブタの絶対頻度を決定し、群間比較のための単一値として使用した。未経産雌ブタ１匹あたりの生存、健康、虚弱、死産および死亡子ブタの相対頻度を、分娩時の子ブタの合計数に対して計算し、群間比較のための単一値として使用した。ＤＯＦ＋２０での一腹あたりの生存子ブタのパーセンテージを、分娩時の生存子ブタ数から圧死子ブタ数を差し引いた数に関して計算した。攻撃対照群とワクチン群との間の差をWilcoxon Mann-Whitney検定により検定した。
【０２３９】
子ブタのウイルス血症
ウイルス血症のデータは、各調査日（ＤＯＦ＋０、ＤＯＦ＋７、ＤＯＦ＋１３およびＤＯＦ＋２０）について別々に評価した。ｑＰＣＲデータの定性的評価のために、分析結果「不検出」（「n.d.」）および「陰性」を「陰性」と分類し、分析結果「陽性」および測定値を「陽性」と分類した。一腹あたりの「陽性」子ブタのパーセンテージを計算し、Wilcoxon Mann-Whitney検定による群間比較のための単一値として使用した。定量的評価のために、「不検出」（「n.d.」）および「陰性」をlog10GE/mL値０．０に置き換え、「陽性」を３．０に置き換えた。一腹あたりのｑＰＣＲ値の中央値を計算し、Wilcoxon Mann-Whitney検定による群間比較のための単一値として使用した。要約統計量のために、個別のｑＰＣＲデータを使用した。肺試料中のウイルス負荷は、記述的評価のみを行った。
【０２４０】
子ブタの体重および平均１日増体重
ＤＯＦ＋０からＤＯＦ＋２０の間の期間について個別の平均１日増体重（ＡＤＷＧ）を計算した。処置群間の差は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続くｔ検定により検定した。群の最小二乗平均および９５％信頼区間を伴う最小二乗平均間の差をＡＮＯＶＡから得た。ＤＯＦ＋２０およびＡＤＷＧについての解析を、共変量としてＤＯＦ＋０の体重で繰り返した。未経産雌ブタ１匹あたりの子ブタの体重データを記述的にまとめた。
【０２４１】
子ブタの臨床観察
試験日ＤＯＦ＋１からＤＯＦ＋２０の間に少なくとも一つの陽性結果を有する、一腹あたりの子ブタのパーセンテージを計算し、Wilcoxon Mann-Whitney検定による群間比較のための単一値として使用した。完全無作為デザイン構造を仮定してデータを解析した。
【０２４２】
結果
未経産雌ブタの繁殖成績
分娩時の一腹あたりの生存子ブタの平均パーセンテージ（健康＋虚弱＋圧死）は、攻撃対照、低力価、高力価、および陰性対照群についてそれぞれ５４．４％、７５．１％、７２．３％、および９３．０％であった。低力価および高力価群は、分娩時に一腹あたりの生存子ブタのパーセンテージが攻撃対照群よりも有意に高値であった（Ｐ≦０．０４５５）。分娩時の一腹あたりの生存子ブタの平均数は、攻撃対照、低力価、高力価、および陰性対照群についてそれぞれ６．５、８．３、８．６および１０．８であった。分娩時の一腹あたりの生存子ブタの数について群間に有意差は検出されなかった（Ｐ≧０．１０３９）。
【０２４３】
一腹あたりの健康な生存子ブタの平均パーセンテージは、攻撃対照、低力価、高力価、および陰性対照群についてそれぞれ４１．４％、６５．８％、６７．９％、および９３．０％であった。低力価および高力価群は、分娩時に一腹あたりの健康な生存子ブタのパーセンテージが攻撃対照群よりも有意に高値であった（Ｐ≦０．０１３８）。分娩時に一腹あたりの健康な生存子ブタの平均数は、攻撃対照、低力価、高力価、および陰性対照群についてそれぞれ４．９、７．２、８．１および１０．８であった。攻撃対照群に比べて、高力価群は、分娩時に一腹あたりの健康な生存子ブタの数が有意に高かったが（Ｐ＝０．０２１１）、低力価群について差は検出されなかった（Ｐ＝０．０６４０）。
【０２４４】
分娩時に一腹あたりの虚弱な生存子ブタの平均パーセンテージは、攻撃対照、低力価、高力価、および陰性対照群についてそれぞれ７．４％、７．１％、０．４％、および０．０％であった。分娩時に一腹あたりの虚弱な生存子ブタの平均数は、攻撃対照、低力価、高力価、および陰性対照群についてそれぞれ０．９、０．８、０．１および０．０であった。高力価群は、分娩時に一腹あたりの虚弱な生存子ブタのパーセンテージおよび数が攻撃対照群よりも有意に低値であった（Ｐ≦０．００９０）。逆に、分娩時に虚弱な生存子ブタのパーセンテージおよび数について、低力価群と攻撃対照群との間に差は検出されなかった（Ｐ≧０．８５６９）。
【０２４５】
分娩時に一腹あたりのミイラの平均パーセンテージは、攻撃対照、低力価、高力価、および陰性対照群についてそれぞれ２８．１％、１４．１％、８．７％、および０．０％であった。分娩時に一腹あたりのミイラの平均数は、攻撃対照、低力価、高力価、および陰性対照群についてそれぞれ３．１、１．６、０．９、および０．０であった。低力価群および高力価群の両方は、分娩時に一腹あたりのミイラのパーセンテージおよび数が攻撃対照群よりも有意に低値であった（Ｐ≦０．０１９０）。
【０２４６】
分娩時に一腹あたりの死産または圧死子ブタのパーセンテージまたは数について二つのワクチン力価群と攻撃対照群との間に有意差は検出されなかった（Ｐ≧０．１６８１）。
【０２４７】
ＤＯＦでの群内繁殖成績結果のまとめ（一腹あたりの子ブタの％および一腹あたりの子ブタの数）を下の表６．１２および６．１３に示す。
【０２４８】
【表１８】
0005788027.tif 000019
【０２４９】
【表１９】
0005788027.tif 000020
【０２５０】
ＤＯＦ＋２０での生存子ブタ
これらのスコアは、離乳時（２０日齢）の生存子ブタの数を強調している。ＤＯＦ＋２０での一腹あたりの生存子ブタの群内パーセンテージおよび数のまとめを上の表６．１２および６．１３に示す。
【０２５１】
離乳時（ＤＯＦ＋２０）での一腹あたりの生存子ブタの平均パーセンテージは、攻撃対照、低力価、高力価、および陰性対照群についてそれぞれ４３．６％、７３．８％、８３．８％、および１００．０％であった。離乳時での一腹あたりの生存子ブタの平均数は、攻撃対照、低力価、高力価、および陰性対照群についてそれぞれ２．９、６．２、６．９および１０．８であった。低力価群および高力価群の両方は、離乳時（ＤＯＦ＋２０）に一腹あたりの生存子ブタのパーセンテージおよび数が攻撃対照群よりも有意に高値であった（Ｐ≦０．０２０３）。
【０２５２】
未経産雌ブタのウイルス血症のｑＰＣＲ
全ての未経産雌ブタは、Ｄ０でＰＲＲＳｖ ＲＮＡについてｑＰＣＲ陰性であった。全ての攻撃対照未経産雌ブタおよび陰性対照未経産雌ブタは、攻撃日（Ｄ１１８）以前にＰＲＲＳｖ ＲＮＡについてｑＰＣＲ陰性のままであった。陰性対照群は、ＤＯＦ＋７に「陽性」であった未経産雌ブタ１０８番を除き、試験の残余期間にｑＰＣＲ陰性のままであった。未経産雌ブタ１０８番は、ｑＰＣＲ検査によりＰＲＲＳｖ ＲＮＡについて他の時点で陰性であった。
【０２５３】
ワクチン接種後、Ｄ７に低力価および高力価未経産雌ブタのそれぞれ５０％および３６％がＰＲＲＳｖ ＲＮＡについてｑＰＣＲ陽性であった（Ｐ≦０．０００７）。Ｄ１４〜Ｄ５６に、低力価未経産雌ブタの４％だけがｑＰＣＲ陽性のままであり、一方、高力価未経産雌ブタの最大４％が、この観察期間で断続的にｑＰＣＲ陽性であった。ＰＲＲＳｖ ＲＮＡがｑＰＣＲ陽性の未経産雌ブタのパーセンテージについて、Ｄ１４〜Ｄ５６にワクチン群と攻撃対照群との間に差は検出されなかった（Ｐ＝１．００００または検定を行わず）。全てのワクチン接種された未経産雌ブタは、Ｄ８４およびＤ１１８（攻撃日）にＰＲＲＳｖ ＲＮＡについてｑＰＣＲ陰性であった。
【０２５４】
攻撃後、１２５日目、ＤＯＦ０、およびＤＯＦ＋１３に、低力価群および高力価群は、ＰＲＲＳｖ  ＲＮＡについてｑＰＣＲ陽性の未経産雌ブタのパーセンテージが攻撃対照群よりも統計的に低値であった（Ｐ≦０．０１５５）。Ｄ１３２に、低力価群は、ＰＲＲＳｖ  ＲＮＡについてｑＰＣＲ陽性の未経産雌ブタのパーセンテージが有意に低値であり、（Ｐ＝０．０２９０）；一方、高力価群と攻撃対照群との間に統計的な差は検出されなかった（Ｐ＝０．１５５６）。ＰＲＲＳｖ ＲＮＡについてｑＰＣＲ陽性の未経産雌ブタのパーセンテージについてＤＯＦ＋７およびＤＯＦ＋２０にワクチン群と攻撃対照群との間に有意差は検出されなかった（Ｐ≧０．１７１９）。
【０２５５】
Ｄ７〜ＤＯＦ＋２０にＰＲＲＳｖ ＲＮＡについてｑＰＣＲ陽性の未経産雌ブタの群内パーセンテージのまとめを下の表６．１４および６．１５に示す。
【０２５６】
【表２０】
0005788027.tif 000021
【０２５７】
【表２１】
0005788027.tif 000022
【０２５８】
両方のワクチン群は、Ｄ７にウイルス負荷の中央値が攻撃対照群よりも有意に高値であった（Ｐ≦０．０００７）。Ｄ１４〜Ｄ５６にワクチン群と攻撃対照群との間にウイルス負荷について差は検出されなかった（Ｐ＝１．００００）。全てのワクチン接種された未経産雌ブタは、Ｄ８４およびＤ１１８（攻撃日）にウイルス負荷がゼロであった。
【０２５９】
攻撃後、Ｄ１２５、ＤＯＦ０、およびＤＯＦ＋１３に低力価群および高力価群は、ウイルス負荷の中央値が攻撃対照群よりも統計的に低値であった（Ｐ≦０．０１５５）。Ｄ１３２に、低力価群は、ウイルス負荷の中央値が有意に低値であり（Ｐ＝０．０２３０）；一方、高力価群と攻撃対照群との間に統計的な差は検出されなかった（それぞれ０．９４および１．９７log10GE/mL；Ｐ＝０．１１４４）。ＤＯＦ＋７およびＤＯＦ＋２０にワクチン群と攻撃対照群との間にウイルス負荷についての有意差は検出されなかった（Ｐ≧０．１７１９）。
【０２６０】
Ｄ７〜ＤＯＦ＋２０の未経産雌ブタｑＰＣＲ GE/mLの群内平均の結果のまとめを下の表６．１６および６．１７に示す。
【０２６１】
【表２２】
0005788027.tif 000023
【０２６２】
【表２３】
0005788027.tif 000024
【０２６３】
攻撃後の未経産雌ブタの臨床観察スコア
Ｄ１１６〜ＤＯＦ＋２０に、攻撃対照、低力価、高力価および陰性対照未経産雌ブタのそれぞれ２５％、２５％、３８％および６０％が、Ｄ１１６〜ＤＯＦ＋２０の少なくとも１日間に臨床疾患を示した。Ｄ１１６〜ＤＯＦ＋２０に臨床疾患陽性の未経産雌ブタの頻度について、ワクチン群と攻撃対照群との間に有意差は検出されなかった（Ｐ≧０．７０４３）。
【０２６４】
Ｄ１１６〜ＤＯＦ＋２０の少なくとも１日間に臨床疾患陽性（臨床観察スコア＞０）であった未経産雌ブタの群内パーセンテージのまとめを、下の表６．１８に示す。
【０２６５】
【表２４】
0005788027.tif 000025
【０２６６】
未経産雌ブタのＰＲＲＳ ＥＬＩＳＡ血清検査
全ての未経産雌ブタは、Ｄ０およびＤ７にＰＲＲＳ血清陰性であった。全ての攻撃対照未経産雌ブタおよび陰性対照未経産雌ブタは、攻撃日（Ｄ１１８）以前はＰＲＲＳ血清陰性のままであり；一方、陰性対照群は、試験の残りの期間（ＤＯＦ＋２０）にＰＲＲＳ血清陰性のままであった。
【０２６７】
Ｄ１４に、低力価および高力価未経産雌ブタのそれぞれ１８％および２１％がＰＲＲＳ血清陽性であった。高力価群は、Ｄ１４にＰＲＲＳ血清陽性未経産雌ブタのパーセンテージが有意に高値であり（Ｐ＝０．０２３２）、一方、低力価群と攻撃対照群との差は検出されなかった（ｐ＝０．０５１５）。これらのパーセンテージは、Ｄ５６に低力価群および高力価群についてそれぞれ６５％および６０％の群内高値に達した（Ｐ＜０．０００１）。攻撃日（Ｄ１１８）に、低力価および高力価未経産雌ブタの５６％および５０％はＰＲＲＳ血清陽性であった（Ｐ≦０．００２４）。Ｄ１２５に、攻撃対照、低力価および高力価未経産雌ブタのそれぞれ６％、８８％、および１００％がＰＲＲＳ血清陽性であり；ワクチン群と攻撃対照群との間の差が有意であった（Ｐ＜０．０００１）。Ｄ１２５後に、残っている全ての攻撃対照、低力価および高力価未経産雌ブタは、試験の残りの期間にＰＲＲＳ血清陽性であった（検定は行わず）。
【０２６８】
Ｄ１４〜ＤＯＦ＋２０のＰＲＲＳ ＥＬＩＳＡ血清検査の群内結果のまとめを下の表６．１９および６．２０に示す。
【０２６９】
【表２５】
0005788027.tif 000026
【０２７０】
【表２６】
0005788027.tif 000027
【０２７１】
ワクチン接種後の未経産雌ブタの判定
Ｄ１〜２１にどの群からも異常な判定は検出されなかったので、検定を行わなかった。Ｄ１〜Ｄ１１３に、攻撃対照、低力価、高力価および陰性対照未経産雌ブタのそれぞれ４％、４％、０％および１０％は、Ｄ１〜Ｄ１１３の少なくとも１日間に異常な判定を示した。Ｄ１〜Ｄ１１３に、ワクチン群と攻撃対照群との間に異常判定について有意差は検出されなかった（Ｐ＝１．００００）。
【０２７２】
個別には、１０９番（攻撃対照群）は、Ｄ８５に右後肢の跛行を示し、１２番（低力価群）は、Ｄ７８〜Ｄ８９に左頸部領域に腫脹を示し、２１番（陰性対照群）は、Ｄ８１〜Ｄ８３に跛行を示した。
【０２７３】
Ｄ１〜Ｄ２１およびＤ１〜Ｄ１１３の少なくとも１日間に異常な判定を示した未経産雌ブタの群内パーセンテージのまとめを下の表６．２１に示す。
【０２７４】
【表２７】
0005788027.tif 000028
【０２７５】
子ブタの臨床観察スコア
ＤＯＦ＋１〜ＤＯＦ＋２０の少なくとも１日間に臨床疾患について陽性（臨床観察スコア＞０）の、一腹あたりの子ブタの平均パーセンテージは、攻撃対照、低力価、高力価、および陰性対照群についてそれぞれ９１．６％、３２．５％、３３．４％および３．２％であった。低力価群および高力価群は、ＤＯＦ＋１〜ＤＯＦ＋２０の少なくとも１日間に臨床疾患陽性の、一腹あたりの子ブタのパーセンテージが攻撃対照群よりも有意に低かった（ｐ≦０．０００１）。
【０２７６】
ＤＯＦ＋１〜ＤＯＦ＋２０の少なくとも１日間に臨床疾患陽性（臨床観察スコア＞０）の、一腹あたりの子ブタの群内パーセンテージのまとめを下の表６．２２に示す。
【０２７７】
【表２８】
0005788027.tif 000029
【０２７８】
子ブタ血清／体液のｑＰＣＲの結果
攻撃対照、低力価、高力価および陰性対照群について、それぞれ一腹あたり平均８６．３％、５８．１％、５５．０％および０％の子ブタが、ＤＯＦ０にＰＲＲＳｖ ＲＮＡについてｑＰＣＲ陽性であった。ＤＯＦ０に、低力価および高力価群は、ＰＲＲＳｖ ＲＮＡついて一腹あたりのｑＰＣＲ陽性の子ブタのパーセンテージが攻撃対照群よりも統計的に低値であった（Ｐ≦０．０３８１）。ＤＯＦ＋７にも、低力価群および高力価群は、ＰＲＲＳｖ ＲＮＡについてｑＰＣＲ陽性の、一腹あたりの子ブタのパーセンテージが攻撃対照群よりも有意に低値であった（Ｐ≦０．０２９３）。ＤＯＦ＋１３に、低力価群だけが一腹あたりのｑＰＣＲ陽性子ブタのパーセンテージが有意に低値であり（Ｐ＝０．０２１６）；一方、一腹あたりのｑＰＣＲ陽性子ブタのパーセンテージについて、高力価群および攻撃対照で有意差は検出されなかった（Ｐ＝０．０８６０）。ＤＯＦ＋２０に群間で有意差は検出されなかった（Ｐ≧０．０６１４）。
【０２７９】
未経産雌ブタ１匹あたりの血清／体液ｑＰＣＲ ＰＲＲＳｖ陽性子ブタの群内パーセンテージのまとめを下の表６．２３に示す。
【０２８０】
【表２９】
0005788027.tif 000030
【０２８１】
高力価群は、ＤＯＦ０にｑＰＣＲの結果の中央値が攻撃対照群よりも有意に低かったが（Ｐ＝０．００３０）；一方、低力価群と攻撃対照群との間に差は検出されなかった（Ｐ＝０．０６２０）。ＤＯＦ＋７、ＤＯＦ＋１３およびＤＯＦ＋２０に、両ワクチン群は、ｑＰＣＲ値の中央値が攻撃対照群よりも有意に低かった（ｐ≦０．０１２２）。
【０２８２】
未経産雌ブタ１匹あたりの子ブタ血清／体液のｑＰＣＲ GE/mLの群内結果のまとめを下の表6.24に示す。
【０２８３】
【表３０】
0005788027.tif 000031
【０２８４】
子ブタのＡＤＷＧ
ＤＯＦ０にＬＳ平均体重について群間で差は検出されなかった（Ｐ≧０．２９７２）。ＤＯＦ０の体重を共変量として解析の因子に含めた場合も含めない場合も、両方のワクチン群は、ＤＯＦ＋２０に最小二乗平均体重が攻撃対照群よりも高値であった（Ｐ＜０．００２８）。
【０２８５】
ＤＯＦ０〜ＤＯＦ＋２０の平均ＡＤＷＧは、攻撃対照、低力価、高力価、および陰性対照群についてそれぞれ０．１kg/日、０．２kg/日、０．２kg/日および０．２kg/日であった。ＤＯＦ０の体重を共変量として解析の因子に含めた場合も含めない場合も、両方のワクチン群は、ＡＤＷＧが攻撃対照群よりも有意に高値であった（Ｐ＜０．００２８）。
【０２８６】
ＤＯＦ０およびＤＯＦ＋２０での子ブタの群内体重ならびにＤＯＦ０〜ＤＯＦ＋２０のＡＤＷＧ（kg/日）のまとめを下の表６．２５および６．２６に示す。
【０２８７】
【表３１】
0005788027.tif 000032
【０２８８】
【表３２】
0005788027.tif 000033
【０２８９】
子ブタの剖検観察および診断
分娩時に死産、ミイラまたは圧死と収載された胎子は、８匹を除き正しく分類されたことが剖検で確認された。２匹の攻撃対照胎子が死産と収載されたが（４０−Ｓ１、６６−Ｓ１）、剖検の結果から、拡張した肺が明らかとなり、それらの胎子が出生時に生存していたことが示された。２匹の攻撃対照胎子が圧死と収載されたが（１−Ｃ１、７９−Ｃ２）、剖検の結果から、両方の胎子について拡張していない肺が明らかとなり、それらの胎子が呼吸していなかったことを示していた。低力価の胎子１匹が死産として収載されたが（８５−Ｓ２）、剖検の結果から、拡張した肺が明らかとなり、その子ブタが出生時に生存していたことが示された。３匹の高力価子ブタが圧死と収載されたが（３６−Ｃ１、３６−Ｃ２、６５−Ｃ１）、剖検の結果から、どの胎子も拡張していない肺が明らかとなり、それらの胎子が呼吸していなかったことが示された。分娩時に不正確に収載された胎子が少数であったことから、未経産雌ブタの成績解析に変更を加えなかった。
【０２９０】
１匹の攻撃対照子ブタ１０２−４２８は、採血後に死亡し、そのことを剖検により確認した。
【０２９１】
子ブタ肺のｑＰＣＲの結果
剖検された胎子および死亡子ブタの肺ｑＰＣＲの結果の平均は、攻撃対照、低力価、高力価、および陰性対照群についてそれぞれ４．６８、４．０９、３．５５および０．０log10GE/mLであった。これらのデータに関して統計解析は行わなかった。
【０２９２】
肺ＰＲＲＳｖ ｑＰＣＲの群内結果（log10GE/mL）のまとめを下の表６．２７に示す。
【０２９３】
【表３３】
0005788027.tif 000034
【０２９４】
考察／結論
試験の目的を達成するために、以下の４群のＰＲＲＳ感受性未経産雌ブタをＤ０での試験デザインに組み込んだ：対照薬を投与された攻撃対照群（群１）；１×１０２．４３TCID50のＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶを投与された低力価ワクチン群（ＩＶＰ１、群２）；１×１０３．９０TCID50のＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶを投与された高力価ワクチン群（ＩＶＰ２、群３）；および同じく対照薬を投与された陰性対照群（群４）。交配（Ｄ０）の約２８日前に、２．０mL用量のＩＭとして各処置を施した。
【０２９５】
ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶの最小免疫用量を決定するために、二つのワクチン力価群および攻撃対照群をＤ１１８（妊娠約９０日）にＰＲＲＳｖの異種ヨーロッパ型単離株（単離株１９０１３６）で攻撃し、攻撃後に、一腹あたりの出生時（分娩日、ＤＯＦ）生存子ブタのパーセンテージおよび数ならびに２１日齢（ＤＯＦ＋２１）での一腹あたりの生存子ブタのパーセンテージおよび数について評価した。
【０２９６】
試験の検証（陰性対照群４）
元の未経産雌ブタがＰＲＲＳｖを有さないことおよび外来ＰＲＲＳｖの曝露または処置群と対照群の間の交差汚染が試験の間に起こらなかったことを確認するために、陰性対照群（群４）を試験デザインに組み込んだ。陰性対照の未経産雌ブタは試験全体でＰＲＲＳ抗体陰性であった。加えて、この群の未経産雌ブタおよびその後代もまた、ＤＯＦ＋７の１０８番を除いて全ての被験時点でＰＲＲＳｖウイルス血症（ｑＰＣＲ）陰性であった。未経産雌ブタ１０８番は、ＤＯＦ＋７に「陽性」であったが、他の全ての時点でｑＰＣＲ陰性であり、その子ブタも同様にＰＲＲＳｖ ＲＮＡ陰性であった。この結果は、ＰＲＲＳｖ感染が原因でなく、試料の汚染によるエラーと見なされた。これらの結果は、陰性対照群が試験の間じゅうＰＲＲＳ無感染のままであったことを裏付けており、この試験の結果を検証するものである。
【０２９７】
ＰＲＲＳｖ繁殖攻撃モデルの検証（攻撃対照群１）
十分で再現性のあるＰＲＲＳ臨床疾患を誘導するＰＲＲＳｖ毒性ＥＵ型由来株を伴う攻撃モデルが、検査室の設定でＰＲＲＳワクチンの有効性を適切に評価するために必要である。ヨーロッパ型ＰＲＲＳ単離株１９０１３６（１×１０６．３０TCID50/６mL）を接種後に、攻撃対照群は、出生時に一腹あたりわずか５４．４％の生存子ブタ（陰性対照群では９３．０％）、一腹あたりそれぞれ１７．５％および２８．１％の死産およびミイラ（陰性対照群ではそれぞれ７．０％および０．０％）を示し、一腹あたり９１．６％の子ブタが、ＤＯＦ＋１〜ＤＯＦ＋２０に少なくとも一日間（陰性対照群では一腹あたり３．２％の子ブタ）が臨床疾患を示し、２０日齢で一腹あたり平均２．９匹の子ブタ（陰性対照群では平均１０．８匹）が生存しており、一腹あたり８６．３％の子ブタが出生時にウイルス血症（陰性対照群では０％）であった。これらの結果は、重症のＰＲＲＳ特異的臨床疾患が、ワクチン未接種の攻撃対照群の未経産雌ブタおよびその後代に誘導されたことを強調しており、したがって、ＰＲＲＳワクチンの有効性を、より具体的には未経産雌ブタでのＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶのＭＩＤを評価するために妥当な臨床検査室ツールとしてこの攻撃モデルの妥当性を検証している。
【０２９８】
未経産雌ブタでのＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶの最小免疫用量の決定（低および高力価ワクチン用量；群２〜３）
未経産雌ブタでのＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶのＭＩＤの決定は、出生時に一腹あたりの生存子ブタのパーセンテージまたは数が攻撃対照群よりも高く、攻撃後の２０日齢で一腹あたりの生存子ブタの数のパーセンテージが高い、最低力価のワクチンを投与されたワクチン群に基づいた。
【０２９９】
分娩時の一腹あたりの生存子ブタ（パーセントまたは数）を、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶのＭＩＤを決定するための二つの主要基準の一つとして選択した。最初の主要基準は、妊娠した未経産雌ブタおよび母ブタでのＰＲＲＳｖ感染が、典型的には死産およびミイラを生じ、分娩時の生存子ブタの数が少なくなるという事実に基づいた。出生時の一腹あたりの生存子ブタは、分娩時の健康生存子ブタ、虚弱生存子ブタおよび圧死子ブタの総和として定義した。圧死として収載された子ブタを「生存」の分類に含めたのは、剖検所見からこれらの子ブタが出生時に生存しており、その後すぐに外傷が原因で死亡したことが確認されたからである。低力価群および高力価群の両方が、分娩時に、攻撃対照よりも有意に高い、一腹あたりの生存子ブタのパーセンテージを示し（Ｐ≦０．０４５５）、したがって、ワクチン有効性についてのこの基準は満たされた。分娩時の一腹あたりの生存子ブタの平均数に関して、低力価および高力価ワクチン群と攻撃対照群との間に有意差は検出されなかったが（Ｐ≧０．１８５７）、低力価群および高力価群は、分娩時に攻撃対照群（一腹あたり平均６．５匹の子ブタ）よりもかなり高い、一腹あたりの生存子ブタの平均数を確かに示したので（それぞれ一腹あたり平均８．３匹および８．６匹の子ブタ）、攻撃後にこれらの動物からワクチン処置の有益効果が観察されたというさらなる証拠および裏付けを提供していた。
【０３００】
２０日齢での一腹あたりの生存子ブタ（パーセントまたは数のいずれか）は、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶのＭＩＤを決定するための第二の基準であった。それは、未経産雌ブタのＰＲＲＳ免疫が子ブタの子宮内（in utero）感染に、そして未経産雌ブタから生存子ブタへのウイルス排出に影響するからである。ＰＲＲＳに子宮内感染し、生存して出生した子ブタまたは未経産雌ブタからの排出により分娩後に毒性ＰＲＲＳに感染した子ブタは、通常、ＰＲＲＳに二次的に離乳前に死亡する。この試験では、攻撃対照、低力価、高力価および陰性対照群は、２０日齢で一腹あたりそれぞれ４３．６％、７３．８％、８３．８％および１００％の生存子ブタを示した（Ｐ≦０．０２０３）。同様に、攻撃対照、低力価、高力価および陰性対照群は、２０日齢で一腹あたり子ブタの平均数がそれぞれ２．９、６．２、６．９および１０．８匹であった（Ｐ≦０．００６３）。両方のワクチン群は、離乳時に生存子ブタのパーセンテージおよび数が有意に高く（Ｐ≦０．０２０３）、したがって、試験目的のこの基準は満たされた。
【０３０１】
分娩データのさらなる分析は、ＰＲＲＳｖ攻撃後のワクチン有効性を支持するより多くの情報を、特に高力価群に関して明らかにした。高力価群は、出生時に、攻撃対照群よりも統計的に高いパーセンテージおよび高い平均数の健康子ブタを示したが（Ｐ≦０．０２１１）；一方、有意に低いパーセンテージおよび平均数の虚弱胎子およびミイラ化胎子を示した（Ｐ≦０．００９０）。これらのデータは、高いワクチン用量が毒性異種ＰＲＲＳｖ攻撃株に対する防御免疫を誘導したことを裏付けている。より高いパーセンテージの、一腹あたりの健康な生存子ブタ（Ｐ＝０．０１３８）および有意に低いパーセンテージおよび平均数のミイラ化胎子（Ｐ≦０．０１９０）によって明らかなように、低力価群も分娩時にワクチンの有効性を示した。逆に、分娩時の死産胎子または圧死のパーセンテージまたは数について群間で差は検出されなかった（Ｐ≧０．１６８１）。
【０３０２】
攻撃の７日後（Ｄ１２５）に、低力価群および高力価群は、ｑＰＣＲ検査によりＰＲＲＳｖ ＲＮＡ陽性の未経産雌ブタのパーセンテージが攻撃対照群よりも有意に低く、同様に両群に関するウイルス負荷が有意に低値であった（Ｐ≦０．０００１）。これらのデータは、さらに、両方のワクチン用量レベルが、攻撃後のウイルス複製を有意に低下させるために十分な免疫を未経産雌ブタに誘導したことを裏付けている。同様に、低力価群および高力価群は、ＤＯＦ０およびＤＯＦ＋１３にｑＰＣＲ陽性の未経産雌ブタのパーセンテージが有意に低く、同様にこれらの試験日で両群のウイルス負荷が有意に低値であった（Ｐ≦０．０１５５）。低力価群は、ｑＰＣＲ陽性未経産雌ブタのパーセンテージが有意に低く、Ｄ１３２でのウイルス負荷が低値であったが（Ｐ≦０．０２９０）；一方、同じパラメーターのセットについて高力価と攻撃対照群との間に統計的な差は検出されなかった（Ｐ≧０．１１４４）。ＤＯＦ＋７およびＤＯＦ＋２０でのｑＰＣＲ陽性未経産雌ブタのパーセンテージまたはウイルス負荷について、ワクチン群と攻撃対照群の間に統計的な差は検出されなかった（Ｐ≧０．１７１９）。
【０３０３】
典型的には、ＰＲＲＳｖは、未経産雌ブタおよび母ブタに流産以外の臨床疾患を誘導しない。この試験では、攻撃対照、低力価、高力価および陰性対照の未経産雌ブタのそれぞれ２５％、２５％、３８％および６０％が、攻撃後の少なくとも１日間、臨床疾患を示した（臨床観察スコア＞０を得た）。Ｄ１１６〜ＤＯＦ＋２０の少なくとも１日間に臨床疾患を有した未経産雌ブタのパーセンテージに関して、ワクチン群と攻撃対照群との間に有意差は検出されなかった（Ｐ≧０．７０４３）。いくつかの形態の臨床疾患を示した未経産雌ブタは、攻撃直後ではなく、周産期に臨床疾患を示した。臨床疾患を示した陰性対照未経産雌ブタの高いパーセンテージ（６０％）および臨床疾患がこの試験の全ての群で主に周産期に確認されたという事実は、臨床疾患がＰＲＲＳ疾患に起因せず、むしろ分娩に関連する生理学的変化に起因することを裏付けている。
【０３０４】
試験での全ての未経産雌ブタは、Ｄ０でＰＲＲＳ ＥＬＩＳＡ血清陰性であり、したがって試験に加わる被験動物についての組み込み基準の確認を提供していた。同様に、全ての未経産雌ブタは、Ｄ７にＰＲＲＳ ＥＬＩＳＡで血清陰性であった。ワクチン接種された未経産雌ブタは、Ｄ１４にＰＲＲＳ ＥＬＩＳＡで血清陽性の結果を示し始め、低用量群および高用量群は、Ｄ５６にそれぞれ６５％および６０％というそれらの最高セロコンバージョン率を示した（Ｐ＜０．０００１）。逆に、攻撃対照群は、攻撃７日後（Ｄ１２５）までＰＲＲＳ  ＥＬＩＳＡ血清陰性のままであった。Ｄ１３２から試験終結まで、全ての低力価、高力価および攻撃対照の未経産雌ブタがＰＲＲＳ ＥＬＩＳＡで血清陽性であった。ワクチン接種後にウイルス血症陽性の未経産雌ブタのパーセンテージは、低力価群および高力価群についてそれぞれ５０％および３６％によって実証されるように、両方のワクチン群でＤ７にピークに達した（Ｐ≦０．０００７）。ウイルス血症は、Ｄ１４に低力価および高力価群についてそれぞれ４％（２８匹中１匹、６４番）および０％（２８匹中０匹）まで急激に減少した（Ｐ＝１．００００または検定を行わず）。ウイルス血症は、Ｄ２１に低力価（２８匹中１匹、５６番）および高力価群（２８匹中１匹、９１番）について４％であった。Ｄ５６に、２６匹中１匹（４％、８９番）の低力価未経産雌ブタおよび２５匹中１匹（４％、６６番）の高力価未経産雌ブタは、ウイルス血症陽性であった。全ての未経産雌ブタは、Ｄ８４およびＤ１１８にウイルス血症陰性であった。
【０３０５】
ワクチン接種後にＤ１〜Ｄ１１３の少なくとも１日間に異常な臨床判定を受けた未経産雌ブタの１群あたりのパーセンテージに関して、両方のワクチン力価群と攻撃対照群との間に有意差は検出されなかった（Ｐ＝１．００００）。個別に、３匹の未経産雌ブタだけがこの時間枠内で何らかの異常判定を示した。２匹の未経産雌ブタは、跛行（１匹の攻撃対照未経産雌ブタおよび１匹の陰性対照未経産雌ブタ）を示し、１匹の低力価未経産雌ブタは、左頸部領域に腫脹を示した。ワクチンは右頸部領域に投与されたので、このワクチンに関連する有害事象は確認されなかった。
【０３０６】
ＤＯＦでの子ブタＰＲＲＳウイルス血症の結果は、子ブタの経胎盤感染の予防における未経産雌ブタでの防御レベルにさらなる洞察を与えた。ＤＯＦに、低力価および高力価群で、未経産雌ブタあたりそれぞれ平均５８．１％および５５．０％の子ブタがｑＰＣＲ陽性であった。逆に、攻撃対照群では未経産雌ブタ１匹あたり平均８６．３％の子ブタの血清／体液がｑＰＣＲ陽性であり、それは、両方のワクチン群よりも有意に高値であった（Ｐ≦０．０３８１）。ＤＯＦ０での子ブタのウイルス負荷を調査した場合、高力価の子ブタは、攻撃対照子ブタよりもウイルス負荷が有意に低く（Ｐ＝０．００３０）；一方、低力価子ブタと攻撃対照子ブタとの間にウイルス負荷についての差は検出されなかった（Ｐ＝０．０６２０）。ウイルス血症陽性の未経産雌ブタ１匹あたりの子ブタのパーセンテージの有意な減少（Ｐ≦０．０５）は、ワクチン接種された未経産雌ブタから、いずれかの用量のＥＵ型ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶを免疫された子孫への毒性ＰＲＲＳｖの垂直伝染が減少したことを示している。加えて、高力価群は、ＤＯＦに未経産雌ブタ１匹あたりの子ブタのｑＰＣＲ値の中央値が３．００log10GE/mLであり；一方、攻撃対照群は、血清／体液中の未経産雌ブタ１匹あたりの子ブタのｑＰＣＲ値の中央値が６．４０log10GE/mLであった（Ｐ＝０．００３０）。ＤＯＦでの子ブタのウイルス負荷について低用量群と攻撃対照群との間に有意差は検出されなかった（Ｐ＝０．０６２０）。このデータは、さらに、未経産雌ブタおよび母ブタに投与したときの高用量ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶの有効性を裏付けている。
【０３０７】
低力価群および高力価群は、ＤＯＦ＋１〜ＤＯＦ＋２０の少なくとも１日間に、一腹あたりの臨床疾患を有する（臨床観察スコア＞０）子ブタについて、それぞれ平均３２．５％および３３．４％を示した。これらの結果は、同じパラメーターについて一腹あたりの平均９１．６％の子ブタを示した攻撃対照群よりも有意に低く（Ｐ≦０．０００１）、両方の用量レベルについてワクチンの有効性をさらに裏付けている。
【０３０８】
ＤＯＦ０での子ブタの平均体重について、群間に有意差は検出されず（Ｐ≧０．２９７２）；一方、両方のワクチン群は、ＤＯＦ＋２０での体重およびＤＯＦ０〜ＤＯＦ＋２０のＡＤＷＧが有意に高値であった（Ｐ≦０．００２８）。今回も、これらの結果も両方の用量のＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶの有効性を裏付けている。
【０３０９】
剖検の結果から、分娩時にほとんど全ての胎子が正しく分類されたことを確認した。分娩時に正しく分類された胎子の全体数に比べて、圧死と収載され、実際は死産であった胎子および実際は分娩時に圧死した死産の数が非常に少ないせいで、解析前に未経産雌ブタの成績データに変更を加えなかった。１匹の攻撃対照子ブタが採血後に死亡した。攻撃対照群の多数の全体数の子ブタに対して１匹の子ブタだけがこの状況に巻き込まれたので、この子ブタを解析から除外しなかった。
【０３１０】
肺試料は、攻撃対照、低力価、高力価、および陰性対照群からそれぞれ１４１、７９、７５および４匹の死亡胎児／子ブタから採取した。攻撃対照、低力価、高力価および陰性対照群についてそれぞれ平均肺ｑＰＣＲ値４．６８、４．１０、３．５５および０．００log10GE/mLを決定した。２０日齢で生存している子ブタを剖検しなかったので、これらのデータに解析を行わなかったが、これらの結果は、毒性ＰＲＲＳｖで攻撃した場合、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶをワクチン接種された未経産雌ブタの方が、子ブタの肺内ウイルス負荷が低くなったことを強調している。
【０３１１】
結論として、この試験の結果は、両方のワクチン群について、分娩時の一腹あたりの生存子ブタのパーセンテージが攻撃対照群よりも有意に高く（Ｐ≦０．０４５５）、離乳時の一腹あたりの子ブタのパーセンテージおよび数が高い（Ｐ≦０．０２０３）ことを実証した。したがって、この試験の目的は満たされ、この研究のデータから、未経産雌ブタでのＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶのＭＩＤが１×１０２．４３TCID50/２mLと確証される。これらの結果は、ワクチン接種の１１８日後に達成され、このことは、加えて、未経産雌ブタで免疫期間（ＤＯＩ）が約４ヶ月であることを確証している。
【０３１２】
補助データを調査すると、高用量のＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶ（１×１０３．９０TCID50/２mL)は、分娩時に未経産雌ブタ１匹あたりの健康な子ブタのパーセンテージおよび数が高いこと（Ｐ≦０．０２１１）、虚弱胎子およびミイラ化胎子のパーセンテージおよび数が低いこと（Ｐ≦０．００９０）、攻撃後のＤ１２５、ＤＯＦ０およびＤＯＦ＋１３にｑＰＣＲ陽性未経産雌ブタのパーセンテージが低いことおよび未経産雌ブタでのウイルス負荷が低いこと（Ｐ≦０．０１５５）、ＤＯＦ０に未経産雌ブタ１匹あたりのｑＰＣＲ陽性子ブタのパーセンテージが低いことおよび子ブタのウイルス負荷が低いこと（Ｐ≦０．００３０）、未経産雌ブタ１匹あたりの臨床疾患を有する子ブタのパーセンテージが低いこと（Ｐ＜０．０００１）、ならびにＤＯＦ＋２０に子ブタの体重およびＡＤＷＧが高いこと（Ｐ＜０．００１３）に関連した。
【０３１３】
低用量群は、分娩時に未経産雌ブタ１匹あたりの健康な子ブタのパーセンテージが高いこと（Ｐ＝０．０１３８）、ミイラ化胎児のパーセンテージおよび数が低いこと（Ｐ≦０．０１９０）、攻撃後のＤ１２５、Ｄ１３２、ＤＯＦ０およびＤＯＦ＋１３にｑＰＣＲ陽性未経産雌ブタのパーセンテージが低いことおよび未経産雌ブタでのウイルス負荷が低いこと（Ｐ≦０．０２９０）、ＤＯＦ０に未経産雌ブタ１匹あたりのｑＰＣＲ陽性子ブタのパーセンテージが低いこと（Ｐ＝０．０３８１）、未経産雌ブタ１匹あたりの臨床疾患を有する子ブタのパーセンテージが低いこと（Ｐ＜０．０００１）、ならびにＤＯＦ＋２０に子ブタの体重およびＡＤＷＧが高いこと（Ｐ＜０．００２８）に関連した。
【０３１４】
例７  ワクチン接種の２週間後にＰＲＲＳの異種ヨーロッパ型単離株で攻撃後の感受性子ブタでのＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶ免疫の開始の評価
このワクチン接種−攻撃試験の目的は、１４±３日齢の感受性子ブタにワクチン候補ブタ繁殖・呼吸障害症候群ヨーロッパ型由来単離株９４８８１改変生ウイルス（ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶ）を投与してから２週間後に、免疫の開始（ＯＯＩ）を判定することであった。ワクチン接種の２週間後のＯＯＩを満足する主要有効性基準は、ワクチン接種群（群１）が、攻撃後の肺病変について、ワクチン未接種の攻撃対照群（群２）との有意差（ｐ≦０．０５）を示したかどうかであった。二次パラメーターには、ワクチン接種後の臨床判定、攻撃後の臨床観察、直腸温度、平均１日増体重、ＰＲＲＳ抗体の判定および血清試料中のウイルス血症、ならびに剖検で採取された肺試料中のＰＲＲＳウイルスの定量が含まれた。
【０３１５】
子ブタを群１（１×１０３．８２TCID50/mLを含有するＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶ−ワクチン＋攻撃；ｎ＝２０）、群２（プラセボワクチン＋攻撃；ｎ＝２０）または群３（プラセボワクチン＋攻撃なし；ｎ＝１０）のいずれかに無作為に割り当てた。子ブタを床が一段高くなったプラスチック製ペンに収容した（ｎ＝５／ペン）。各処置群を異なる部屋に収容して、エアロゾル化などの機械的経路を介してＰＲＲＳｖが伝染することを回避した。
【０３１６】
この試験に割当てられた全ての動物が試験を完了した。この試験の間に、有害事象は報告されなかった。Ｄ２４での平均肺病変スコアは、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタおよび攻撃対照についてそれぞれ２７．４％および５４．８％であった。ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタについての平均肺病変スコアは、攻撃対照よりも有意に低く（ｐ＝０．０００２）、したがって、主要有効性変数が満たされたので、ＯＯＩを単回ワクチン接種後の２週間に制定した。Ｄ１４、Ｄ１７およびＤ２１に陽性のＰＲＲＳ抗体力価を有するＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタの比率は、攻撃対照よりも有意に高値であった（ｐ≦０．００１２）。攻撃後のＤ１７〜Ｄ２４のウイルス血症についての平均ＡＵＣは、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種されたブタの方が攻撃対照よりも有意に低値であった（それぞれ５０．７２log10GE/mLおよび５４．６１log10GE/mL；ｐ＝０．００３９）。ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種されたブタは、攻撃後に嗜眠の徴候を示さなかった（０％）（攻撃対照ブタの４５％と比較）（ｐ＝０．００１２）。ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種されたブタは、試験の攻撃後の時期（ＳＤ１４〜ＳＤ２４）に攻撃対照よりも大きな増体重を示した（それぞれ０．３および０．１kg；ｐ＝０．０００３）。
【０３１７】
肺病変、臨床徴候、攻撃後の血中および肺でのウイルス複製の有意な低減（ｐ≦０．０５）、ならびにワクチン接種された動物での成長能力の改善は、攻撃がワクチン接種の２週間後に行われたときの毒性ＰＲＲＳｖに対するワクチンの有効性を実証している。したがって、このことは、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶをワクチン接種した少なくとも２週間後に免疫が開始したことの実証を裏付けている。
【０３１８】
試験の目的／ねらい
このワクチン接種−攻撃試験の目的は、ワクチン候補であるブタ繁殖・呼吸障害症候群ヨーロッパ型由来単離株９４８８１改変生ウイルス（ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶ）を１４±３日齢の感受性子ブタに投与した２週間後に免疫開始（ＯＯＩ）を判定することであった。ワクチン接種の２週間後のＯＯＩを満足すべき主要有効性基準は、攻撃後の肺病変の軽減について、ワクチン接種群（群１）がワクチン接種なしの攻撃対照群（群２）との有意差（ｐ≦０．０５）を示したかどうかであった。
【０３１９】
ワクチン群と攻撃対照群との間で解析された二次有効性パラメーターには、ワクチン接種後の臨床判定、ＰＲＲＳ血清検査結果、攻撃後のＰＲＲＳウイルス血症、攻撃後の臨床観察、平均１日増体重（ＡＤＷＧ）、直腸温度および肺ＰＲＲＳｖの定量が含まれた。
【０３２０】
ワクチン接種も攻撃もされなかった陰性対照群（群３）を試験に組み込んで、元の群れが試験期間にわたりＰＲＲＳｖ感染を有さず、生物安全性がこの試験の間に破られなかったことを実証した。
【０３２１】
イベントのスケジュール
【０３２２】
【表３４】
0005788027.tif 000035
【０３２３】
試験デザイン
【０３２４】
【表３５】
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【０３２５】
盲検化基準
試験担当検査員および被指名人は、試験の生存期にわたり、割り当てられた処置群に関して盲検化されていた。この盲検化を維持するために、ブタの判定（すなわち臨床判定、臨床観察または剖検）に関与しなかった人物が、無作為化を行い、割り当てられたＩＶＰ処置およびＣＰ処置をＤ０に施した。BIVI検査室の職員は、それぞれの職務を行う間、各ブタが受けた処置に関して盲検化されていた。
【０３２６】
材料
治験動物薬（ＩＶＰ）および対照薬（ＣＰ）
【０３２７】
【表３６】
0005788027.tif 000037
【０３２８】
【表３７】
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【０３２９】
攻撃材料
【表３８】
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【０３３０】
処置
投薬の正当化
ワクチン接種の２週間後にＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶのＯＯＩを評価するために、ＩＶＰを１．０mL用量として、割り当てられたブタに投与した。ＣＰを１．０mL用量として、プラセボワクチンとして群２および３に投与した。
【０３３１】
用法
Ｄ０に無菌３．０mLルアーロック注射器および無菌２０ｇ×１インチ（２．５４cm）または１８ｇ×３／４インチ（１．９１cm）針を使用して、試験データを収集していない人物が、割り当てられたブタの右頸部領域にＩＶＰまたはＣＰをＩＭ投与した。用法を下の表７．６に示す。
【０３３２】
【表３９】
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【０３３３】
動物の情報
試験動物の詳細
【０３３４】
【表４０】
0005788027.tif 000041
【０３３５】
組み込み／排除基準
この試験に登録された全ての子ブタはＰＲＲＳ ＥＬＩＳＡ陰性であり、観察によって判定されたように、ワクチン接種時に健康であった。
【０３３６】
組み込み後の除外基準
ブタは試験から除外されなかった。
【０３３７】
動物の管理および収容
動物の収容
試験の期間中、子ブタをVeterinary Resources, Inc.（VRI）（Cambridge, IA）に収容した。均一であるが別々の部屋で群１、２および３を収容して生物安全性を確保した。子ブタを各室内の複数のペン（５匹／ペン）中に収容した。群１を部屋５の４個のペンに収容し、群２を部屋６の４個のペンに収容し、群３を部屋４の２個のペンに収容した。ペンは、プラスチック小割り板の床張りを備える、一段高いスタンド上のプラスチック製タブから成った。各ペンには、プラスチック製６穴給餌器およびニップル式給水器（nipple waterer）が入っていた。各隔離室は他の部屋と同じ構造であり、全てがバイオハザードレベル２（ＢＬ２）に準拠し、ヘパフィルター処理、サーモスタット調節の温度コントロールを備える人工換気であった。
【０３３８】
ＰＲＲＳｖがエアロゾル化を含む様々なメカニズムによってブタからブタに容易に蔓延することが科学界で周知であることから、この試験で処置群の隔離が必要であった。これには、無毒性ＰＲＲＳ生ワクチンが含まれる。それは、これらの生物薬が、疾患を引き起こす可能性を有さずに毒性野生型ＰＲＲＳの特徴を模倣する弱毒化ウイルス粒子を含むからである。生物安全性が維持されたこと、およびワクチン接種された動物が、ワクチン接種されていないＰＲＲＳｖナイーブな陰性対照動物を偶発的に交差汚染しなかったことを保証するために、適切な方法が整っていた。この試験に部屋を使用する前に各部屋を適切に清掃および消毒するために、検査施設の職員が適切な対策を取った。
【０３３９】
施設内の各部屋は、十分な空気循環および暖房を援助するために換気扇および暖房器具を有する。換気システムは各部屋で別々であるが、同一であるので、空気は部屋同士で共有されない。
【０３４０】
固形飼料は害虫のいない袋の中に保存した。水は自由に与えた。その地域に許容されうる畜産の慣例にしたがって、子ブタの大きさ、齢、および状態に適切なチアムリン（３５g/トン）およびクロルテトラサイクリン（４００g/トン）を添加した市販の飼料（Lean Metrics Infant, Purina Mills, St. Louis, MO）を子ブタに自由に与えた。
【０３４１】
試験担当検査員が判定したように、ブタは、試験の開始前に良好な健康および栄養状態であった。
【０３４２】
試験の間に、身体状態の軽度の不調、粗い被毛の外観、腫脹した関節および様々な程度の跛行を有する、選択された動物を観察した。試験担当検査員は、これらの全てが、閉じ込められたブタの群に通常起こる非特異的状態であると見なした。咳嗽、くしゃみ、速い呼吸、呼吸困難および軽度〜中度の嗜眠も、攻撃後の選択されたブタから認められ、それらは、病因については非特異的であるものの、肺炎に関連する典型的な臨床徴候と見なされた。試験担当検査員は、この試験の間にどの動物にも付随処置が必要ないと判断した。
【０３４３】
この試験に割り当てられた全てのブタは、Ｄ２４に安楽死および剖検後に商業的焼却により廃棄された。この試験に登録された動物からの食品がヒトの食物チェーンに入ることはなかった。
【０３４４】
有効性の判定
ワクチン接種の２週間後にＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶのＯＯＩを判定するために、Ｄ１４に群１および２を攻撃し、攻撃後の肺病変を評価した。群１（ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶの最小免疫用量）が攻撃後に攻撃対照群（群２）よりも有意に減少した（ｐ≦０．０５）肺病状を示した場合、ワクチン接種の２週間後にＯＯＩが達成されたことになる。
【０３４５】
ワクチン群と攻撃対照群との間で解析された二次有効性パラメーターには、ワクチン接種後の臨床判定、攻撃後の臨床観察、直腸温度、体重および平均１日増体重（ＡＤＷＧ）、血清試料中のＰＲＲＳ抗体およびウイルス血症の判定、ならびに剖検時に採取された肺試料中のＰＲＲＳウイルスの定量が含まれた。
【０３４６】
元の群れがＰＲＲＳ感染を有さなかったこと、および生物安全性が試験の間に維持されたことを実証するために、攻撃されなかった陰性対照群（群３）を試験に組み込んだ。
【０３４７】
妥当性検定のための基準
購入前およびＤ０の血清試料は、全て、ＰＲＲＳ抗体陰性の必要があった。
【０３４８】
攻撃日まで群２および３から、ならびに試験の完了まで群３から、採取された血清試料は、試験が妥当であるために、ＰＲＲＳ抗体不含でなければならなかった。
【０３４９】
主要転帰パラメーター
統計的評価のための主要有効性変数は、試験のＤ２４での合計肺病変スコアであった。
【０３５０】
合計肺病変スコア
２４日目にデータおよび試料を採取および記録した後に、全ての被験ブタをVRI SOP PRC1027（追補１、添付８）にしたがって安楽死させた。VRI SOP PRC 1028にしたがって各ブタを剖検した。被指名人が胸腔を露出させ、心臓および肺を取り出した。試験担当検査員が肺の各セットを検査し、認められたあらゆる肉眼的病状を記載し、各肺葉の病状％を決定した。観察結果およびデータを剖検報告記録フォームに記録した。ＥＰフォームを使用することによって合計肺病変スコアを各ブタについて決定した。
【０３５１】
補助パラメーター
群１と群２の間で解析されるべき他のパラメーターには、ワクチン接種後の臨床判定、ＰＲＲＳ血清検査結果、ワクチン接種後のウイルス血症、攻撃後の臨床観察、ＡＤＷＧ、直腸温度および攻撃後の肺ウイルス定量が含まれた。これらのパラメーターは、補助パラメーターとして解析され、試験の目的を満たすための主パラメーターとして役立たなかった。
【０３５２】
臨床判定
試験担当検査員または被指名人が、表７．１に要約された日にワクチン接種後の臨床判定について全てのブタを観察した。観察は、臨床判定記録フォームに記録した。
【０３５３】
ＰＲＲＳ血清検査
静脈全血を表３に要約された日に採取した。簡潔には、血液約２〜５mLを各子ブタから適切な大きさの血清セパレーターチューブ（ＳＳＴ）内に採取した。試料の採取は、試料採取記録フォームに記録した。ＳＳＴ中の血液を室温で凝固させた。血液試料を採取日にBIVI-Amesに配達し、検体配達記録フォームに記入した。血液試料をBIVI-Amesが遠心沈殿し、血清を回収し、分割し、適切なチューブに移した。各チューブに子ブタのＩＤ番号、試験番号、採取日、試験日および試料の種類を記載したラベルを付けた。BIVI-Amesで、１セットの血清試料を２〜８℃で保存し、他のセットの血清試料を−７０±１０℃で保存した。
【０３５４】
０、７、１４、１７、２１および２４日目に採取され、２〜８℃で保存された血清試料をBIVI-AmesがＰＲＲＳ抗体について検査した。結果を陰性（ＥＬＩＳＡ Ｓ／Ｐ比＜０．４）または陽性（ＥＬＩＳＡ Ｓ／Ｐ比≧０．４）として報告した。
【０３５５】
ＰＲＲＳウイルス血症
０、７、１４、１７、２１および２４日目に採取された他のセットの血清試料は、試験の生存相が完了するまでBIVI-Amesで−７０±１０℃で保存された。
【０３５６】
記入された検体配達記録フォームを発送品に添付した。bioScreenがｑＰＣＲによってＰＲＲＳｖ ＲＮＡについて血清試料を検査した。結果をゲノム当量/mL（logGE/mL）として報告した。
【０３５７】
攻撃後の臨床観察
表７．１に要約した日に、疾患の臨床徴候について子ブタを観察した。観察は、試験担当検査員または被指名人が行い、それを臨床観察記録フォームに記録した。下の表７．８に要約した臨床観察採点システムに基づいて、呼吸、行動および咳嗽について毎日子ブタを観察した。
【０３５８】
【表４１】
0005788027.tif 000042
【０３５９】
平均１日増体重（ＡＤＷＧ）
個別の体重を表３に要約した日に収集した。試験担当検査員または被指名人が較正済みの秤で各ブタを秤量した。結果をkg単位で体重記録フォームに記録した。Ｄ０〜Ｄ１４の、およびＤ１４〜Ｄ２４の平均１日増体重を決定した。
【０３６０】
直腸温度
表６．１に要約された日に試験担当検査員または被指名人が直腸温度を収集した。直腸温度を℃単位で臨床観察記録フォームに記録した。
【０３６１】
肺組織中のＰＲＲＳウイルスの定量
肺の各セットについて、左および右尖葉、左および右心葉、左および右横隔葉ならびに中間葉からの２試料を確保した。各肺試料は、約１インチ（２．５４cm）×１インチ（２．５４cm）であった。肺試料の１セットについて、左側からの３試料全てを１個の容器中で一緒にし、一方で右側からの３試料全ておよび肺中間葉試料を別の容器中で一緒にした。各容器に十分な量の１０％ホルマリン溶液を満たした。他のセットの肺試料について、左側からの３個の肺試料全てを１個のWhirlpak（登録商標）中で一緒にし、一方で右側からの３試料全ておよび肺中間葉試料を別のWhirlpak（登録商標）中で一緒にした。全ての容器およびWhirlpaks（登録商標）に、動物番号、試験番号、試料採取日、試験日、試料の種類および試料が左側または右側からかを記載したラベルを適切に付けた。Whirlpak（登録商標）中の肺試料をBIVI-Amesに輸送するまでドライアイス上で保存し、一方、ホルマリン中の試料を室温で保存した。試料の採取を剖検報告記録フォームに記録した。ホルマリン固定肺組織試料およびWhirlpak（登録商標）肺試料をBIVI-Amesに配達した。記入した検体配達記録フォームを各発送物に添付した。
【０３６２】
記入した検体配達記録フォームを各発送物に添付した。bioScreenがｑＰＣＲによって肺試料をＰＲＲＳｖ ＲＮＡについて検査した（追補１、添付７）。左肺組織を均質化して検査した。右肺組織および肺中間葉試料を均質化して検査した。結果を左および右肺試料についてのゲノム当量（log GE/mL）として報告した。
【０３６３】
有害事象
この試験の間に、有害事象は報告されなかった。
【０３６４】
統計的方法
実験単位
この試験において、非ワクチン接種群へのＰＲＲＳｖの伝染を避けるために、処置群を別々の部屋に収容しなければならなかった。したがって、部屋が実験単位であった。しかし、この解析のために、「部屋」および「処置」の交絡効果によるバイアスの可能性を無視し、子ブタを実験単位として使用した。
【０３６５】
無作為化
５０匹の子ブタを体重によりブロック化した（ｎ＝５匹／ブロック）。Excelの乱数関数を使用して、各ブタに乱数を割り当てた。各体重ブロック内で、割り当てられた乱数の昇順にブタを順位付けした。次に、処置群をこの番号順にブタに割り当てた：最も小さい乱数から二つを群１に割り当て、次の二つの番号を群２に割り当て、最大の番号を群３に割り当てた。群１および２は、それぞれ２０匹の豚を含み、群３は１０匹の豚を含んだ。
【０３６６】
解析
統計解析およびデータのまとめは、林学博士Martin Vanselow（Biometrie & Statistik, Zum Siemenshop 21, 30539 Hannover, Germany, +49(0) 511 606 777 650, m.vanselow@t-online.de.）が行った。
【０３６７】
完全無作為計画構造を仮定してデータを解析した。統計解析は、ＳＡＳソフトウェア・リリース８．２（SAS, Cary, USA/North Carolina, SAS Institute Inc）を使用して行った。差に関する全ての検定は、α＝５％での両側検定として計画した。
【０３６８】
合計肺病変スコア
剖検日（Ｄ２４）の合計肺病変スコアは、ブタ流行性肺炎（Porcine Enzootic Pneumonia）ワクチン（不活化）研究書草稿に推奨された重み付け式にしたがって計算された肺波及のパーセンテージとして測定した。この式は、７個の肺葉それぞれの相対重量を考慮に入れる。典型的な病変を有する肺葉領域の判定されたパーセンテージに、肺葉毎に該当する係数を乗じ、合計重み付き肺病変スコアを得る。肺葉毎の係数を表７．９に示す。
【０３６９】
【表４２】
0005788027.tif 000043
【０３７０】
Wilcoxon Mann-Whitney検定を用いて、差について処置群を比較した。
【０３７１】
ワクチン接種後の臨床判定
Ｄ１とＤ１２の間に少なくとも一つの陽性結果を有する動物の度数分布表を作成した。処置群の間の差をFisherの直接確率検定により検定した。
【０３７２】
ＰＲＲＳ血清検査
陽性のＥＬＩＳＡ結果の度数分布表を作成した。処置群の間の差をFisherの直接確立検定により検定した。
【０３７３】
ＰＲＲＳウイルス血症
ウイルス血症のデータは、各調査日に別々に評価した。追加的に、ウイルス負荷について、Ｄ１４からＤ２４の間（ＡＵＣ Ｄ１４−Ｄ２４）およびＤ１７からＤ２４の間（ＡＵＣ Ｄ１７−Ｄ２４）の個別の反応曲線下面積を解析した。
【０３７４】
Wilcoxon Mann-Whitney検定による処置群間の比較のために、定量ＰＣＲのデータ（ＰＲＲＳウイルス負荷［log10GE/mL］）を使用した。計算前に、分析結果「不検出」をlog10GE/mL値０．０に置き換え、「陽性」を３．０に置き換えた。Wilcoxon Mann-Whitney検定を用いて、処置群を差について検定した。
【０３７５】
攻撃後の臨床観察
Ｄ１５からＤ２４の間に少なくとも一つの陽性結果を有する動物の度数分布表を作成した。処置群間の差をFisherの直接確率検定により検定した。
【０３７６】
Ｄ１５〜Ｄ２４の呼吸、行動、咳嗽について、および三つ全ての総和（合計）について動物１匹あたりの最大スコアおよび平均スコアを統計学的評価のために使用した。Wilcoxon Mann-Whitney検定により、処置群間の差を検定した。
【０３７７】
体重および平均１日増体重
個別の１日増体重を、Ｄ０からＤ１４の間およびＤ１４からＤ２４の間の期間について計算した。各調査日について、および各期間について、記述統計量を計算した。処置群間の差は、分散分析およびそれに続くｔ検定を用いて検定した。群の最小二乗平均および９５％信頼区間を伴う最小二乗平均間の差を、分散分析から計算した。
【０３７８】
直腸温度
本来の温度データに関する処置群間の差は、分散分析およびそれに続くｔ検定を用いて検定した。群の最小二乗平均および９５％信頼区間を伴う最小二乗平均間の差を、分散分析から計算した。
【０３７９】
肺組織中のＰＲＲＳウイルスの定量
Wilcoxon Mann-Whitney検定による処置群間の比較のために、Ｄ２４に採取された肺からの定量ＰＣＲデータ（ＰＲＲＳウイルス負荷［log10GE/mL］）を使用した。左および右肺ｑＰＣＲの結果の平均（log10GE/mL）を、評価のために使用した。計算前に、分析結果「不検出」を０．０log10GE/mLに置き換え、「陽性」を３．０に置き換えた。
【０３８０】
陽性ｑＰＣＲ結果の度数分布表を作成した。処置群間の差をFisherの直接確率検定により検定した。
【０３８１】
結果
合計肺病変スコア
群内の肺病変スコアの合計および関連するｐ値のまとめを下の表７．１０に示す。
【０３８２】
【表４３】
0005788027.tif 000044
【０３８３】
子ブタのＤ２４での合計肺病変スコアの平均は、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群および攻撃対照についてそれぞれ２７．３６８％および５４．８４１％であった。ＰＲＲＳワクチン接種ブタについての病変スコアは、攻撃対照についての平均病変スコアよりも有意に低かった（ｐ＝０．０００２）。
【０３８４】
ＰＲＲＳウイルス血症
ｑＰＣＲデータにより血清中から検出されたＰＲＲＳｖ ＲＮＡのまとめを下の表７．１１に示す。
【０３８５】
【表４４】
0005788027.tif 000045
【０３８６】
Ｄ０にＰＲＲＳｖ ＲＮＡは、どの子ブタの血清中からも不検出であった。ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタは、Ｄ７およびＤ１４に平均値がそれぞれ３．１７および３．３０log10GE/mLであった。これらの日の両方で、値は攻撃対照よりも有意に高値であったが（ｐ＜０．０００１）、それは、攻撃対照はＤ１７までＰＲＲＳｖ ＲＮＡが全く検出されなかったからである。その日に、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種子ブタおよび攻撃対照について、平均値は、それぞれ６．７８および８．００log10GE/mLであった。攻撃対照についてのＤ１７値は、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種子ブタよりも有意に高値であった（ｐ＜０．０００１）。Ｄ２１およびＤ２４にＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタについての平均値は、Ｄ２１およびＤ２４にそれぞれ７．５１および７．２６log10GE/mLであり、対照的に、同日の攻撃対照については、７．８８および７．３４log10GE/mLであった。Ｄ２１または２４に、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタの間に有意差はなかった（ｐ≧０．０５６５）。この試験の間に任意の陰性対照ブタからの血清中からＰＲＲＳｖ ＲＮＡは検出されなかった。
【０３８７】
ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタおよび攻撃対照ブタについてのＡＵＣ１４−２４の間に差はなかった（それぞれ６５．８４および６６．６１；ｐ＝０．４９４５）。ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタは、攻撃対照よりもＤ１７−Ｄ２４についてのＡＵＣが有意に低値であった（それぞれ５０．７２および５４．６１；ｐ＝０．００３９）。
【０３８８】
肺組織中のＰＲＲＳウイルスの定量
Ｄ２４の剖検時に採取された肺組織からの個別のＰＲＲＳｖ ｑＰＣＲの結果を追補１、表３０に示す。ｑＰＣＲデータにより肺組織中から検出されたＰＲＲＳｖ ＲＮＡのまとめを、下の表７．１２に示し、剖検時にｑＰＣＲ陽性であった動物の頻度のまとめを、下の表７．１３に示す。
【０３８９】
【表４５】
0005788027.tif 000046
【０３９０】
【表４６】
0005788027.tif 000047
【０３９１】
両方のＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群の全ての子ブタおよび攻撃対照群の全ての子ブタの肺組織中からＰＲＲＳｖ ＲＮＡを検出した。これらの群の間に差はなかった。ＰＲＲＳｖ ＲＮＡは、どの陰性対照子ブタの肺試料からも不検出であった。
【０３９２】
攻撃後の臨床観察
攻撃後期間（Ｄ１５〜Ｄ２４）に少なくとも一つの陽性臨床判定スコアを有した子ブタの頻度を下の表７．１４に示す。
【０３９３】
【表４７】
0005788027.tif 000048
【０３９４】
ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群（１０％）および攻撃対照群（３０％）の両方に異常呼吸が観察されたが、これらの値に有意差はなかった（ｐ＝０．２３５１）。
【０３９５】
異常行動は、攻撃対照群（４５％）だけに観察され、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群（０％）では観察されなかった。ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群は、異常行動の発生率が攻撃対照よりも有意に低値であった（ｐ＝０．００１２）。
【０３９６】
ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群（３０％）および攻撃対照群（５５％）の両方で咳嗽が観察された。これらの値に有意差はなかった（ｐ＝０．２００３）。
【０３９７】
合計臨床スコア＞０を有する子ブタのパーセンテージは、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群および攻撃対照群についてそれぞれ３０％および６５％であった。これらの値に有意差はなかった（ｐ＝０．０５６２）。
【０３９８】
攻撃後の任意の時間に陰性対照群から臨床徴候は観察されなかった。
【０３９９】
攻撃後の期間の群内最大臨床観察スコア（Ｄ１５〜Ｄ２４）のまとめを表７．１５に示す。
【０４００】
【表４８】
0005788027.tif 000049
【０４０１】
攻撃を施した後に、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群および攻撃対照の両方で、それぞれ最大スコア１（浅速呼吸／呼吸促迫）および２（呼吸困難）の異常呼吸が観察された。これらの呼吸スコアの間に有意差はなかった（ｐ＝０．１８７２）。両方の群について、最大呼吸スコアの中央値は０であった。
【０４０２】
攻撃後の期間にＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群から異常行動は観察されなかった（最大スコア＝０）。対照的に、攻撃対照群は、最大行動スコアが１（軽度〜中度の嗜眠；ｐ＝０．００１２）であったが、この群についての中央値スコアは０であった。ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群についての最大スコアは、攻撃対照群についてのスコアよりも有意に低値であった（ｐ＝０．００１２）。最大行動スコアの中央値は、両群について０であった。
【０４０３】
攻撃後に、咳嗽が、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群および攻撃対照群の両方で観察された。ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種および攻撃対照群について、最大スコアは、それぞれ１（軽度〜中度の咳嗽）および２（喘鳴または重症の繰り返す咳嗽）であり、中央値スコアは０および１であった。これらの群の間に有意差はなかった（ｐ＝０．１１２９）。ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群および攻撃対照群について、最大咳嗽スコアの中央値は、それぞれ０および１であった。
【０４０４】
ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群および攻撃対照群について、最大合計スコアは、それぞれ１および４であり、合計スコアの中央値は０および１であった。ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群についての最大スコアは、攻撃対照群についてのスコアよりも有意に低値であった（ｐ＝０．００７２）。ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群および攻撃対照群についての合計スコアの中央値は、それぞれ０および１であった。
【０４０５】
試験の間に、攻撃されていない陰性対照群からＤ１５〜Ｄ２４に臨床徴候は観察されなかった。この群は、各パラメーターについて最大スコアが０であった。
【０４０６】
攻撃後期間（Ｄ１５〜Ｄ２４）の群内平均臨床観察スコアのまとめを、下の表７．１６に示す。
【０４０７】
【表４９】
0005788027.tif 000050
【０４０８】
平均臨床観察スコアは、最大臨床スコアに類似したパターンをたどり、平均行動スコア（ｐ＝０．００１２）および平均合計スコア（ｐ＝０．０１０３）について、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群および攻撃対照群の間にのみ有意差が観察された。
【０４０９】
平均呼吸スコアは、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群および攻撃対照群についてそれぞれ０．０２および０．０７であった。平均行動スコアは、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群および攻撃対照群について、それぞれ０．００および０．１２であった。平均咳嗽スコアは、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群ぉよび攻撃対照群について、それぞれ０．０７および０．１７であった。平均総スコアは、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群および攻撃対照群について、それぞれ０．０８および０．３５であった。
【０４１０】
この試験の間に、攻撃されていない陰性対照からＤ１５〜Ｄ２４に臨床徴候は観察されなかった。この群は、各パラメーターについて平均スコアが０であった。
【０４１１】
体重および平均１日増体重
Ｄ０、Ｄ１４およびＤ２４での体重ならびにＤ０〜Ｄ１４およびＤ１４〜Ｄ２４のＡＤＷＧのまとめを下の表７．１７に示す。
【０４１２】
【表５０】
0005788027.tif 000051
【０４１３】
Ｄ０での平均体重は、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群および攻撃対照群について、それぞれ４．１および４．２kgであった。平均体重は、Ｄ１４までに、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群および攻撃対照群について、それぞれ７．６および７．４kgであった。平均体重は、Ｄ２４に、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群および攻撃対照群について、それぞれ１０．３および８．９kgであった。ワクチン接種期間（Ｄ０〜Ｄ１４）の平均１日増体重（ＡＤＷＧ）は、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群および攻撃対照群についてそれぞれ０．２５および０．２３kg/dであった。攻撃期間（Ｄ１４〜Ｄ２４）のＡＤＷＧは、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群および攻撃対照群についてそれぞれ０．２６および０．１５kg/dであった。陰性対照についてのＡＤＷＧは、Ｄ０〜Ｄ１４およびＤ１４〜Ｄ２４にそれぞれ０．２３および０．３４kg/dであった。
【０４１４】
陰性対照子ブタは、Ｄ０、Ｄ１４およびＤ２８に、平均体重がそれぞれ４．１、７．２および１０．６kgであった。
【０４１５】
ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群および攻撃対照群についての体重およびＡＤＷＧのＬＳ平均および統計解析のまとめを、下の表７．１８に示す。
【０４１６】
【表５１】
0005788027.tif 000052
【０４１７】
０日目のＬＳ平均体重は、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種された子ブタおよび攻撃対照群についてそれぞれ４．１４および４．１７kgであった。その差は−０．０３kgであり、有意差はなかった（ｐ＝０．８７４３）。Ｄ１４に、ＬＳ平均体重は、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群および攻撃対照群についてそれぞれ７．６４および７．３９kgであった。その差は０．２５kgであり、これも有意差はなかった（ｐ＝０．４２９７）。Ｄ２４に、ＬＳ平均体重はＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群および攻撃対照群についてそれぞれ１０．２６および８．８７であった。この日の差は１．３９kgであり、ワクチン接種群の重量は攻撃対照群よりも有意に高値であった（ｐ＝０．００６３）。
【０４１８】
ワクチン接種期間（Ｄ０〜Ｄ１４）についてのＬＳ平均ＡＤＷＧは、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群および攻撃対照群についてそれぞれ０．２５および０．２３kg/dであった。これらの値に有意差はなかった（ｐ＝０．１８８９）。攻撃後期間（Ｄ１４〜Ｄ２４）のＬＳ平均ＡＤＷＧは、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群および攻撃対照群についてそれぞれ０．２６および０．１５であった。ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群についてのＡＤＷＧは、攻撃対照群についてのＡＤＷＧよりも有意に高値であった（ｐ＝０．０００３）。
【０４１９】
直腸温度
直腸温度のまとめを下の表７．１９および７．２０に示す。ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群および攻撃対照群についての直腸温度のＬＳ平均および統計解析のまとめを下の表７．２１および７．２２に示す。
【０４２０】
【表５２】
0005788027.tif 000053
【０４２１】
【表５３】
0005788027.tif 000054
【０４２２】
【表５４】
0005788027.tif 000055
【０４２３】
【表５５】
0005788027.tif 000056
【０４２４】
ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種子ブタについての平均およびＬＳ平均直腸温度は、攻撃前日に３９．７７℃であり、攻撃後は、３９．６９℃（Ｄ１５）から４０．６８℃（Ｄ１６）の範囲であった。攻撃対照についての平均およびＬＳ平均直腸温度は、攻撃前日に３９．３９℃であり、攻撃後は、３９．７７℃（Ｄ１６）〜４０．６１℃（Ｄ２０）の範囲であった。最小二乗平均直腸温度は、攻撃を施す前（Ｄ１３およびＤ１４）および攻撃後のＤ１６に、ＰＰＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種子ブタよりも攻撃対照の方が有意に低値であった（ｐ＜０．０００１）。この試験では、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタと攻撃対照との間で直腸温度に他の有意差はなかった（ｐ≧０．０５２８）。陰性対照についての平均およびＬＳ平均直腸温度は、試験にわたり≦３９．６８℃を維持した。
【０４２５】
ワクチン接種後の臨床判定
Ｄ１〜Ｄ１２に少なくとも一つの陽性判定を受けた子ブタのパーセンテージのまとめを下の表７．２３に示す。
【０４２６】
【表５６】
0005788027.tif 000057
【０４２７】
ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群および陰性対照のどちらの子ブタも、ワクチン接種期間Ｄ−１〜Ｄ１２に臨床判定の所見を有さなかった。攻撃対照群の子ブタ１１０番で、Ｄ９から右前肢尾側のただれが観察された。このパラメーターについてＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種子ブタと攻撃対照の間に有意差はなかった（ｐ＝１．００００）。
【０４２８】
ＰＲＲＳ血清検査
陽性ＰＲＲＳ抗体力価を有する子ブタの頻度のまとめを下の表７．２４に示す。
【０４２９】
【表５７】
0005788027.tif 000058
【０４３０】
全ての処置群の全ての子ブタは、Ｄ０およびＤ７にＰＲＲＳ抗体陰性であった。Ｄ１４までに、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタの８５％がＰＲＲＳ抗体力価陽性であった。この数は、Ｄ１７に９５％に増加し、Ｄ２１およびＤ２４の両方で１００％であった。Ｄ２１（攻撃施行の７日後）（５５％のブタが力価陽性であった）まで、攻撃対照群のブタでＰＲＲＳ抗体力価陽性となったブタはいなかった。この値は、Ｄ２４までに９５％に増加した。Ｄ１４、Ｄ１７およびＤ２１に、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタは、ＰＲＲＳ抗体力価陽性のブタの比率が攻撃対照群よりも有意に高値であった（ｐ≦０．００１２）。この試験の間に、陰性対照群のどのブタもＰＲＲＳ抗体力価を生じなかった。
【０４３１】
考察／結論
試験の目的を達成するために、Ｄ０に以下の３群を試験デザインに組み込んだ：１×１０３．８２TCID50のＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶを投与されたワクチン群（群１）；対照薬を投与された攻撃対照群（群２）および同様に対照薬を投与された陰性対照群（群３）。
【０４３２】
健康で、ＰＲＲＳ感受性で血清陰性の約１４日齢の子ブタ２０匹に、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶ １mLをＩＭ接種した。ＰＲＲＳ感受性で血清陰性の約１４日齢の子ブタ３０匹（攻撃対照群の子ブタ２０匹および陰性対照群の子ブタ１０匹）に対照薬１mLをＩＭ接種した。
【０４３３】
ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶについて２週間で免疫開始が達成されたかどうかを判定するために、ワクチン群および攻撃対照群をワクチン接種の１４日後にＰＲＲＳｖ異種ヨーロッパ型単離株（単離株２０５８１７）で攻撃し、攻撃後に肺病変の関連する軽減について評価した。
【０４３４】
試験の妥当性検証（陰性対照群３）
元の子ブタがＰＲＲＳｖを有さないこと、および試験の間に外来ＰＲＲＳｖの曝露も、処置群および対照群の間で交差汚染も起こらなかったことを確認するために、陰性対照群（群３）を試験デザインに組み込んだ。陰性対照群の子ブタは、試験全体にわたりＰＲＲＳｖ（ウイルス血症；ｑＰＣＲ）およびＰＲＲＳ抗体について陰性であり、したがってこの試験を検証していた。
【０４３５】
攻撃モデルの妥当性検証（攻撃対照群２）
十分なＰＲＲＳ臨床疾患を誘導する攻撃モデルが、検査室の状況でＰＲＲＳワクチンの免疫開始を適切に評価するために必要である。前述の方法によりヨーロッパ型ＰＲＲＳ単離株２０５８１７を接種後に、攻撃対照群は、Ｄ１９、Ｄ２０、Ｄ２３およびＤ２４に≧４０．５０℃の平均直腸温度（同日に陰性対照群は≦３９．６８℃）を示し、Ｄ１４〜Ｄ２４に陰性対照群についての０．３４kg/日という平均ＡＤＷＧに比べて、０．１５kg/日という平均ＡＤＷＧ、異常行動、咳嗽、および肺病変スコアの中央値５５．２％（陰性対照群は０．００％）を示した。これらの結果は、攻撃ウイルスの力価がターゲット用量よりもわずかに低かったにしても、攻撃対照群で重症のＰＲＲＳ特異的臨床疾患が誘導されたことを強調しており、したがって、ＰＲＲＳワクチンの有効性を、より具体的にはＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶのＯＯＩを評価するために適切な臨床検査室ツールとして、この攻撃モデルの妥当性を検証している。
【０４３６】
ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶの２週間の免疫開始の判定（群１）
ワクチン接種の２週間後のＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶについての免疫開始（ＯＯＩ）の判定は、ワクチン群が攻撃後の肺病変に攻撃対照群よりも有意な軽減を示していること（ｐ≦０．０５）に基づいた。
【０４３７】
ブタにおいてＰＲＲＳ呼吸器攻撃モデルの範囲内で新しいワクチンを評価する場合、肺病変が、最も臨床的に関連する、説得力のある有効性の証拠を提供することから、２週間ＯＯＩを判定するための主パラメーターとして、このパラメーターを選択した。肺病変の発生は、ブタでのＰＲＲＳ呼吸器疾患の特徴の一つである。肺病変は、臨床徴候、発熱、ＡＤＷＧ減少などの、ＰＲＲＳｖ疾患の後続の二次的特徴出現に付随することが多い。
【０４３８】
ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群は、合計肺病変スコアの中央値２７．６％によって証明されるように、合計肺病変スコアの中央値５５．２％を示した攻撃対照群よりも、攻撃後の肉眼的肺病状の有意な軽減を示した（ｐ＝０．０００２）。したがって、１×１０３．８２TCID50用量のＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶについての２週間のＯＯＩは、攻撃後肺病変の有意な軽減という主パラメーターに基づき確立された。この結果は、最小免疫用量１×１０４．５TCID50/用量よりも有意に低いワクチン用量で達成された。
【０４３９】
攻撃後のウイルス血症は、曝露時にホスト動物の範囲内で起こるウイルス複製および残留のレベルを表すことから、これを最も重要な二次パラメーターとして選択した。ウイルス血症の有意な減少（ｐ≦０．０５）は、ホスト内でＰＲＲＳ病状を制限するために十分な免疫を誘導するＰＲＲＳワクチンに対応するであろう。攻撃３日後（Ｄ１７）に、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群は、攻撃対照群よりも有意に減少したウイルス血症の中央値（ｑＰＣＲ）に関連した（６．７２GE/mL対８．１８GE/mL；ｐ≦０．０００１）。攻撃後のウイルス血症を群間でさらに評価するために、「曲線下面積」またはＡＵＣとして表される、攻撃後の特定期間にわたるウイルス負荷量を計算した。ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群は、Ｄ１７〜Ｄ２４にＡＵＣ値の中央値が４９．５２GE/mL/日であり；一方、攻撃対照群はＡＵＣ値の中央値が５４．３５GE/mL/日であった。ＡＵＣ値の中央値は、Ｄ１７〜Ｄ２４に、攻撃対照群よりもワクチン群の方が有意に低値であった（ｐ＝０．００３９）。ウイルス血症が攻撃の３日後に検査されようと、攻撃後期間にわたり検査されようと、ＰＲＲＳの毒性異種ヨーロッパ型株で攻撃する２週間前に投与されたＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶは、攻撃接種後のウイルス血症を有意に減少させた（ｐ≦０．０５）。
【０４４０】
攻撃後のＰＲＲＳウイルス血症の減少に関連して、肺組織でのウイルス負荷の有意な減少（ｐ≦０．０５）は、ＰＲＲＳワクチン免疫の観点からも非常に重要であろう。肺組織中のウイルス負荷の減少は、ホスト内でのウイルスの安定性、複製および残留の減少に関連する可能性があり、二次的に他のブタへのＰＲＲＳｖの排出減少につながる可能性がある。この試験で、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群の肺組織は、攻撃の１０日後（Ｄ２４）に肺ｑＰＣＲの結果の中央値が７．４６log10GE/mLであり、一方で、攻撃対照群は肺ｑＰＣＲの結果の中央値が７．８８log10GE/mLであった。ワクチン群と攻撃対照群の間の差は有意であり（ｐ＝０．０１０１）、したがって、２週間のＯＯＩをさらに裏付けている。
【０４４１】
子ブタでの攻撃後の臨床徴候の重症度および頻度の顕著な減少も、ＰＲＲＳワクチンの有効性およびＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶについて２週間のＯＯＩ樹立を裏付けているであろう。十分な重症度および頻度の異常呼吸は、攻撃後にどちらの群からも認められず、差は検出されなかった（ｐ≧０．１３９４）。逆に、咳嗽の重症度および頻度は、群間でほぼ等しく、差は検出されなかった（ｐ≧０．０８３５）。攻撃後の異常行動（嗜眠）の重症度および回数については群間で差が検出された。ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種された子ブタおよび攻撃対照子ブタの、それぞれ２０匹中０匹（０％）および２０匹中９匹（４５％）が、攻撃後に少なくとも１日間異常行動を示した（ｐ＝０．００１２）。同様に、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群は、攻撃後に、攻撃対照群よりも低い最大異常臨床スコアおよび平均異常臨床スコアを示した（ｐ＝０．００１２）。Ｄ１５〜Ｄ２４の最大スコアおよび平均スコアを解析したとき、合計臨床スコア（呼吸スコア、行動スコアおよび咳嗽スコアの総和）は、群間で有意差があった。合計スコアに及ぼす異常行動スコアの影響のせいで、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群は、攻撃対照群よりも最大合計スコアが有意に低く、平均合計スコアが低値であった（ｐ≦０．０１０３）。異常行動の重症度および頻度についての群間差は、ワクチン接種の２週間後のＯＯＩをさらに裏付けている。
【０４４２】
攻撃前に、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群は、Ｄ１３（それぞれ３９．７７℃対３９．３９℃；ｐ＜０．０００１）およびＤ１４（それぞれ３９．７６℃対３９．３７℃；ｐ＜０．０００１）に平均直腸温度が攻撃対照群よりもわずかに高値であった。攻撃前に群間で有意差（ｐ≦０．０５）が検出されたものの、これらの差は生物学的に関連しなかった。攻撃後に、平均直腸温度について群間で有意差（ｐ≦０．０５）が検出された唯一の日はＤ１６（攻撃２日後）であった。Ｄ１６に、ワクチン接種群および攻撃対照群は、平均直腸温度がそれぞれ４０．６８℃および３９．７７℃であり、群間差は有意であった（ｐ＜０．０００１）。攻撃の４〜５日後に、両群について平均直腸温度は４０℃を上回って上昇し、試験の終了まで４０℃を超えたままであった。
【０４４３】
攻撃対照群でのＰＲＲＳによる顕著な異常行動、ウイルス血症、肺病状および肺組織中のウイルス負荷の存在は、攻撃後のＡＤＷＧについて有意な群間差（ｐ≦０．０５）を招いた。この試験では、ワクチン接種群および攻撃対照群のＤ１４〜Ｄ２４の平均ＡＤＷＧは、それぞれ０．３kg/日および０．１kg/日であり、群間差は有意であった（ｐ＝０．０００３）。攻撃後のＡＤＷＧについての有意な群間差（ｐ≦０．０５）は、さらに、ワクチン接種２週間後のＯＯＩ樹立を裏付けている。
【０４４４】
この試験で検討されたワクチン接種後パラメーター
接種後の子ブタから、Ｄ０にＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種または対照薬に関係する異常な臨床判定は観察されなかった。攻撃対照子ブタ１匹が、Ｄ９から右前肢尾側のただれを示したが、それは、対照薬の投与に関連しないと思われた。
【０４４５】
全ての子ブタは、Ｄ０にＰＲＲＳ ＥＬＩＳＡ血清陰性であり、したがって、全ての子ブタが試験に登録時にＰＲＲＳ陰性であるという組み込み基準を満たしたことを確認した。ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶを投与された大部分の子ブタがＤ１４までにＰＲＲＳのセロコンバージョンし、全てのＰＲＲＳワクチン接種された子ブタが、攻撃７日後（Ｄ２１）までに血清陽性であった。逆に、攻撃対照は、この群がＰＲＲＳのセロコンバージョンを示し始めた攻撃７日後まで血清陰性のままであった。陰性対照群は、試験全体にわたりＰＲＲＳ血清陰性のままであった。
【０４４６】
ワクチン接種の７および１４日後に、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群は、それぞれ３．１７および３．３０log10GE/mLというｑＰＣＲの結果の平均を示した。これらの結果は、１×１０３．８２TCID50用量のＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶがワクチン接種から２週間以内にＭＬＶの十分な複製を誘導したことを強調した。ＭＬＶの十分な複製は、すでにワクチン接種の２週間後に防御免疫を構築するためにしばしば必要とされる。逆に、攻撃対照群および陰性対照群は、Ｄ０〜Ｄ１４にＰＲＲＳｖウイルス血症陰性であった。
【０４４７】
結論
攻撃後の肺病変、臨床徴候、血中および肺中のウイルス複製の有意な減少（ｐ≦０．０５）ならびに成長能力の改善が、約１４日齢の子ブタにＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶを１×１０３．８２TCID50/mL単回ワクチン接種後の２週間のＯＯＩ樹立を裏付けている。
【０４４８】
例８  ワクチン接種の２６週間後時点に感受性２週齢ブタをＰＲＲＳの異種ヨーロッパ型単離株で攻撃後のＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶの免疫持続期間の評価
このワクチン接種−攻撃試験の目的は、ワクチン候補であるブタ繁殖・呼吸障害症候群ヨーロッパ型由来単離株９４８８１改変生ウイルス（ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶ）を１４±３日齢のＰＲＲＳ血清陰性ブタに投与後２６週間という免疫持続期間（ＤＯＩ）を評価することであった。ワクチン接種後２６週間というＤＯＩを満足する主要有効性基準は、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群（群１）における攻撃後の肺病変スコア（肉眼または組織学的）の、攻撃対照群（群２）に比べた有意な減少（ｐ＜０．０５）であった。
【０４４９】
０日目（Ｄ０）に、２２匹のブタを、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶ（１×１０４．２７TCID50）１．０mLをＩＭ投与するワクチン接種群（群１）に割り当て、２２匹のブタを、対照薬１．０mLをＩＭ投与する攻撃対照群（ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶ不含の対応プラセボ薬、群２）に割り当て、１２匹のブタを、同じく対照薬１．０mLをＩＭ投与する陰性対照群に割り当てた（群３）。群１および２をＤ１７９（攻撃後｛ＤＰＣ｝０日）にヨーロッパ型ＰＲＲＳｖ毒性株で攻撃し、ブタを攻撃後１０日間臨床徴候、平均１日増体重、およびウイルス血症についてモニターした。Ｄ１８９（ＤＰＣ１０）にブタを剖検し、肉眼的および組織学的肺病変、ならびに肺ウイルス負荷を決定した。
【０４５０】
Ｄ１８９（ＤＰＣ１０）での肉眼的肺病変スコアの中央値は、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタおよび攻撃対照についてそれぞれ０．１％および１３．８％であった（ｐ＜０．０００１）。ＤＰＣ１０での組織学的肺病変スコアの中央値は、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタおよび攻撃対照についてそれぞれ６．０および１９．５であった（ｐ＜０．０００１）。ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタは、攻撃の３、７および１０日後に攻撃対照よりも血清ウイルス負荷が有意に低値であった（ｐ≦０．０００１）。ＤＰＣ０〜ＤＰＣ１０およびＤＰＣ３〜ＤＰＣ１０のウイルス血症についての攻撃後の曲線下面積（ＡＵＣ）解析も、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタ（それぞれ１５．５４および８．８８log10GE/mL/日）の方が攻撃対照群（それぞれ４４．７７および３６．４３log10GE/mL/日、ｐ＜０．０００１）よりも有意に低値であった。剖検時に採取された肺組織についてのｑＰＣＲ値の中央値は、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタおよび攻撃対照についてそれぞれ３．６９および６．２５log10GE/mLであった（ｐ＜０．０００１）。攻撃後の臨床徴候に有意差はなかった（ｐ≧０．４８７８）。
【０４５１】
攻撃対照に比べた、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタについて剖検時に採取された肺組織での肉学的および組織学的肺病変、ウイルス負荷、ならびに攻撃後ウイルス血症の有意な減少（ｐ≦０．０５）は、ワクチン接種の２６週間後に攻撃されたときの、毒性ＰＲＲＳｖに対するワクチンの有効性を裏付けた。この試験の結果は、２週齢でＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶをワクチン接種されたブタでのワクチン接種後免疫の２６週間の持続を確定している。これらの結果は、この治験動物薬の最小免疫用量（１×１０４．５TCID50/mL）をわずかに下回ったワクチン用量１×１０４．２７TCID50/mLで達成された。
【０４５２】
試験の目的／ねらい
このワクチン接種−攻撃試験の目的は、１４±３日齢のＰＲＲＳ血清陰性ブタに投与されたブタ繁殖・呼吸障害症候群ヨーロッパ型由来単離株９４８８１改変生ウイルス、コード１９Ｓ１．Ｕ（ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶ）の、ワクチン接種の２６週間後時点でのＰＰＲＳの異種ヨーロッパ型単離株を用いた毒性攻撃に対する免疫持続期間（ＤＯＩ）を評価することであった。ワクチン接種の２６週間後のＤＯＩを満たすための主要有効性基準は、攻撃対照群（群２）に比べた、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群（群１）での攻撃後肺病変スコア（肉眼的または組織学的）の有意な減少（ｐ＜０．０５）であった。
【０４５３】
二次有効性パラメーターには、ワクチン接種後および攻撃後のウイルス血症、ワクチン接種後の臨床判定、ＰＲＲＳ血清検査結果、攻撃後の臨床観察、平均１日増体重（ＡＤＷＧ）、直腸温度ならびに肺ＰＲＲＳｖ定量が含まれた。攻撃後のウイルス血症は、目的の定量可能なパラメーターであることから、最も重要な二次パラメーターと見なされた。次に、ＤＯＩの定義過程において直腸温度および臨床観察が補助パラメーターと見なされた。最後に、成長能力、血清検査結果および肺でのウイルス検出を、試験の目的を満たすことにおける主パラメーターに対する補助パラメーターとして使用した。
【０４５４】
イベントのスケジュール
【０４５５】
【表５８】
0005788027.tif 000059
【０４５６】
試験デザイン
これは、０日目（Ｄ０）に１４±３日齢の離乳したＰＲＲＳ血清陰性ブタ５６匹で行った盲検化ワクチン接種−攻撃有効性試験であった。この試験のまとめを表８．２に提供する。
【０４５７】
【表５９】
0005788027.tif 000060
【０４５８】
盲検化基準
試験担当検査員および被指名人は、試験の生存期にわたり、割り当てられた処置群に関して盲検化されていた。この盲検化を維持するために、BIVIのモニターが無作為化を行い、ブタの判定（すなわち臨床判定、臨床観察または剖検）に参加しなかった人物が、Ｄ０に、割り当てられたＩＶＰ処置およびＣＰ処置を施した。BIVI検査室の職員は、彼らそれぞれの職務を行う間、各ブタが受けた処置に関して盲検化されていた。
【０４５９】
材料
治験動物薬（ＩＶＰ）および対照薬（ＣＰ）
【０４６０】
【表６０】
0005788027.tif 000061
【０４６１】
【表６１】
0005788027.tif 000062
【０４６２】
攻撃材料
【０４６３】
【表６２】
0005788027.tif 000063
【０４６４】
処置
投薬の正当化
ＩＶＰは、割り当てられたブタに１．０mL用量として投与し、ワクチン接種の２６週間後のＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶのＤＯＩを評価した。ＣＰは、群２および３にプラセボワクチンとして１．０mL用量を投与した。
【０４６５】
用法
Ｄ０に無菌３．０mLルアーロック注射器および無菌２０ｇ×１インチ（２．５４cm）針を使用して、試験データを収集していない人物が、割り当てられたブタの右頸部領域にＩＶＰまたはＣＰをＩＭ投与した。用法を下の表８．６に示す。
【０４６６】
【表６３】
0005788027.tif 000064
【０４６７】
付随処置
数匹の豚が、細菌感染に続いて、試験の早期に死亡して見つかったという事実が原因で、調査員および試験モニターは、全ての被験動物に以下の追加的な付随処置の施行について合意した（１５．１０節）：
２０日目：Mu-Se（登録商標）（ビタミンＥ／セレン、Intervet/Schering Plough Animal Health, USA）、０．１mLを右大腿にＩＭ、
２１日目：EXCEDE（登録商標）（セフチオフル、Pfizer Animal Health, USA）、０．５mLを左大腿に、
３５日目：EXCEDE（登録商標）（セフチオフル、Pfizer Animal Health, USA）、１．０mLを右大腿に、
４２日目：EXCEDE（登録商標）（セフチオフル、Pfizer Animal Health, USA）、１．０mLを左大腿に、
４７日目：BAYTRIL 100（登録商標）（エンロフロキサシン、Bayer Animal Health, USA）、１．５mLを左頸部にＳＣ。
【０４６８】
ビタミンＥ／セレンを、マルベリーハート病の予防のために投与し、細菌感染の治療／予防のために抗生物質処置を施した。
【０４６９】
動物の情報
動物試験の詳細
【０４７０】
【表６４】
0005788027.tif 000065
【０４７１】
組み込み／排除基準
観察によって判定されたように、この試験に登録された全ての子ブタは、ＰＲＲＳ ＥＬＩＳＡ陰性（ＥＬＩＳＡ Ｓ／Ｐ比＜０．４）であり、ワクチン接種時（Ｄ０）に健康であった。
【０４７２】
組み込み後の除外基準
ブタは試験から除外されなかった。３匹のブタが攻撃施行前に死亡して見出された。これらの３匹のブタに関するさらなる結果を１２．８節に示す。
【０４７３】
動物の管理および収容
試験の期間中、ブタをVeterinary Resources, Inc.（VRI）（Cambridge, IA）に収容した。ブタを複数のペン（１１または１２匹／ペン）の各部屋内に収容し、均一であるが別々の部屋でワクチン接種動物（群１）および対照動物（群２および３）を収容して生物安全性を確保した。ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶブタをＤ７８まで部屋ＣＢ８に、次にＤ１０５までＣＣ１に、次に残りの試験期間はＣＣ３に収容した。攻撃対照ブタは、試験全体にわたり部屋ＣＣ２内に収容した。陰性対照ブタは、Ｄ７３まで部屋ＣＢ６に、次に残りの試験期間はＣＢ７に収容した。動物用ペンは、プラスチック小割り板の床張りを備えて一段高くなっており、齢に適切な給餌器およびニップル式カップ式給水器（nipple cup drinker）を備えていた。各隔離室は他の部屋と同一の構造であり、全てがバイオハザードレベル２（ＢＬ２）に準拠し、ヘパフィルター処理され、サーモスタット調節の温度コントロールを備える人工換気であった。
【０４７４】
ＰＲＲＳｖがエアロゾル化を含む様々なメカニズムによってブタからブタに容易に蔓延することが科学界で周知であることから、この試験で処置群の隔離が必要であった。これには、無毒性ＰＲＲＳ生ワクチンが含まれる。それは、これらの生物薬が、疾患を引き起こす可能性を有さずに毒性野生型ＰＲＲＳの特徴を模倣する弱毒化ウイルス粒子を含むからである。生物安全性が維持されたこと、およびワクチン接種された動物が、ワクチン接種されていないＰＲＲＳｖナイーブな陰性対照動物を偶発的に交差汚染しなかったことを保証するために、適切な方法が整っていた。
【０４７５】
この試験に部屋を使用する前に、各部屋を適切に清掃および消毒するために、検査施設の職員が適切な対策を取った。
【０４７６】
施設内の各部屋は、十分な空気循環および暖房を援助するために換気扇および暖房器具を有した。換気システムは各部屋で別々であったが、同一であったので、空気は部屋同士で共有されなかった。
【０４７７】
飼料は害虫のいない袋の中に保存した。飼料および水は自由に与えた。到着からＤ５までLean Metrics Infant Medicated飼料（Purina Mills LLC, St. Louis, MO）をブタに給餌し、Ｄ５にLean Metrics Senior Medicated飼料（Purina Mills LLC, St. Louis, MO）に切り替えた。Ｄ６４にブタをLean Metrics Complete 85飼料に切り替え（Purina Mills LLC, St. Louis, MO）、Ｄ８２にブタをLean Metrics Complete CE85、T40（Purina Mills LLC, St. Louis, MO）に切り替え、この飼料を試験の残りの期間に給餌した。試験全体にわたり、提供された飼料は、その地域に許容されうる畜産の慣例にしたがって、ブタの大きさ、齢、および状態に適していた。
【０４７８】
試験担当検査員が判定したように、ブタは、試験の開始前に良好な健康および栄養状態であった。試験の間に、痩せ、咳嗽、腫脹、粗い被毛、沈うつ、膿瘍、および体調不良などの他の状態を有する、選択された動物を観察した。試験担当検査員は、これらの状態の全てが、収容された成長／成熟途中ブタの群に典型的であると見なした。これらの状態は一過性または重要でないと見なされ、処置されなかった。
【０４７９】
有効性の判定
ワクチン接種の２６週間後でのＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶのＤＯＩを判定するために、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶ群および攻撃対照群をＤ１７９（ＤＰＣ０）に攻撃し、攻撃後の肺病変を１０日後（ＤＰＣ１０）に評価した。ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶ群が攻撃対照群よりも攻撃後の肺病状（肉眼または組織学的）が有意に軽減したならば（ｐ≦０．０５）、ワクチン接種後２６週間というＤＯＩが達成された。
【０４８０】
ワクチン群と攻撃対照群との間で解析された二次有効性パラメーターには、ワクチン接種後および攻撃後のウイルス血症、攻撃後の臨床観察、攻撃後の直腸温度、ワクチン接種後の臨床判定、平均１日増体重（ＡＤＷＧ）およびＰＲＲＳ血清検査結果が含まれた。攻撃後のウイルス血症は、目的の定量可能なパラメーターであることから、最も重要な二次パラメーターと見なされた。次に、直腸温度および臨床観察が、ＤＯＩの定義過程で補助的と見なされた。最後に、成長能力、血清検査結果および肺でのウイルス検出を、試験の目的を満たすことへの主パラメーターに対する補助パラメーターとして使用した。
【０４８１】
妥当性検定についての基準
全てのブタは購入前スクリーニングおよびＤ０にＰＲＲＳ ＥＬＩＳＡ陰性（ＥＬＩＳＡ Ｓ／Ｐ比＜０．４）である必要があった。攻撃対照ブタは、攻撃までＰＲＲＳ抗体陰性の必要があり、陰性対照群は、試験全体にわたりＰＲＲＳ抗体陰性の必要があった。
【０４８２】
主要転帰パラメーター
一次有効性転帰変数は、試験のＤ１８９（ＤＰＣ１０）での肺病変（肉眼的および組織学的病変）であった。
【０４８３】
肉眼的肺病変スコア
Ｄ１８９に、試料およびデータを収集および記録した後に、全ての残りの被験ブタをVRI SOP PRC1027（１５．１節）にしたがって安楽死させた。各ブタを、VRI SOP PRC1028（１５．１節）にしたがって剖検した。被指名人が各ブタの胸腔を露出させ、心臓および肺を取り出した。試験担当検査員が肺の各セットを検査し、あらゆる肉眼的病状も記載し、各肺葉について病変のパーセンテージを決定した。観察結果およびデータを剖検報告記録フォームに記録した。
【０４８４】
組織学的肺病変スコア
肺の各セットについて、左および右尖葉、左および右心葉、左および右横隔葉および中間葉からの２試料を確保した。各肺試料は、約１インチ（２．５４cm）×１インチ（２．５４cm）であった。肺試料の１セットについて、左側からの３試料全てを１個の容器中で一緒にし、一方で右側からの３試料全ておよび肺中間葉試料を別の容器中で一緒にした。各容器に十分な量の１０％ホルマリン溶液を満たした。もう一方のセットの肺試料について、左側からの３個の肺試料全てを１個のWhirlpak（登録商標）中で一緒にし、一方、右側からの３試料全ておよび肺中間葉試料を別のWhirlpak（登録商標）中で一緒にした。全ての容器およびWhirlpaks（登録商標）に、動物番号、試験番号、試料採取日、試験日、試料の種類および試料が左側または右側からかを記載したラベルを適切に付けた。ホルマリン中の肺試料を室温で保存し、一方、Whirlpak（登録商標）中の肺試料をBIVI-Amesに輸送するまでドライアイス上で保存した。試料の採取を剖検報告フォームに記録した。ホルマリン固定肺組織試料およびWhirlpak（登録商標）肺試料をBIVI-Amesに配達した。記入した検体配達記録フォームを各発送物に添付した。
【０４８５】
BIVI-Amesがホルマリン固定肺組織試料をIowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory（ISU VDL）に提出するまで、BIVI-Amesはその試料を室温で保存した。ISU VDLの職員がISU VDLの手順にしたがって剖検から１週間以内に肺試料を処理および加工した。各ブタについて、７個の切片（全部で７個の肺葉から１個ずつ）を含む１枚のスライドを作製した。各Ｈ＆Ｅスライドは固有の識別コードで識別した。ISU VDLは、試験番号、識別コードおよび関連するブタ組織を含むコンピュータ記録を提供した。
【０４８６】
１日１回、組織病理学的性質について試験スライドを読み取る日に、ISU VDLの病理学者（K. Schwartz）が最初にＥＵ型ＰＲＲＳ陽性スライドおよび陰性対照スライドを読み取った。その後、病理学者が肺細胞の肥大および過形成、単核細胞の中隔浸潤、壊死組織片、炎症細胞の肺胞内蓄積および炎症細胞の血管周囲蓄積についてＨ＆Ｅ染色肺スライドを読み取った。結果をExcelスプレッドシートに記録した。肺組織病理採点システムを下の表８．８に示す。
【０４８７】
【表６５】
0005788027.tif 000066
【０４８８】
全てのスライドの読み取りを完了後、スライドを試験依頼者代表に戻したが、スライドは最終報告の完了時にBoehringer Ingelheim Vetmedica, Inc., St. Joseph, MOに保管される。
【０４８９】
二次パラメーター
二次変数には、ワクチン接種後および攻撃後のウイルス血症、攻撃後の臨床観察、攻撃後の直腸温度、平均１日増体重（ＡＤＷＧ）、肺ＰＲＲＳｖの定量、ワクチン接種後の臨床判定、ならびにＰＲＲＳ血清検査結果が含まれた。
【０４９０】
血清ＰＲＲＳのｑＰＣＲ
購入前ならびに０、７、１４、２１、２８、５６、８４、１１２、１４０、１６８、１７９（ＤＰＣ０）、１８２（ＤＰＣ３）、１８６（ＤＰＣ７）、および１８９（ＤＰＣ１０）日目に静脈全血を採取した。簡潔には、血液約２〜５mLを各ブタから適切な大きさの血清セパレーターチューブ（ＳＳＴ）中に採取した。試料の採取を、試料採取記録フォームに記録した。ＳＳＴ中の血液を室温で凝固させた。血液試料を採取日にBIVI-Amesに配達し、検体配達記録フォームに記入した。BIVI-Amesは血液試料を遠心沈殿し、血清を回収し、分割し、適切なチューブに移した。各チューブにブタのＩＤ番号、試験番号、採取日、試験日および試料の種類を記載したラベルを付けた。BIVI-Amesで、１セットの血清試料を２〜８℃に保ち、他方のセットの血清試料を−７０±１０℃に保った。
【０４９１】
攻撃後の臨床観察
Ｄ１７８（ＤＰＣ−１）〜Ｄ１８９（ＤＰＣ１０）に疾患の臨床徴候についてブタを観察した。試験担当検査員または被指名人が観察を行い、臨床観察記録フォームに記録した。下の表８．９にまとめた臨床観察採点システムに基づいて、呼吸、行動および咳嗽についてブタを毎日観察した。
【０４９２】
【表６６】
0005788027.tif 000067
【０４９３】
直腸温度
試験担当検査員または被指名人がＤ１７８（ＤＰＣ−１）〜Ｄ１８９（ＤＰＣ１０）に直腸温度を収集した。直腸温度を℃単位で臨床観察記録フォームに記録した。
【０４９４】
体重および平均１日増体重
Ｄ０、Ｄ１７９（ＤＰＣ０）およびＤ１８８（ＤＰＣ９）に個別の体重を収集した。試験担当検査員または被指名人が較正済みの秤で各ブタを秤量した。結果をｋｇ単位で体重記録フォームに記録した。Ｄ１７９（ＤＰＣ０）〜Ｄ１８８（ＤＰＣ９）の平均１日増体重を決定した。
【０４９５】
肺ＰＲＲＳのｑＰＣＲ
９．３．１節に収載した住所に発送するまで、Whirlpaks（登録商標）中の肺組織試料をBIVI-Amesで−７０±１０℃で保存した。記入された検体配達記録フォームを発送物に添付した。bioScreenがｑＰＣＲ（１５．１節）によりＰＲＲＳｖ ＲＮＡについて肺試料を検査した。左肺組織を均質化して検査した。右肺組織および肺中間葉試料を均質化し、検査した。結果を左および右肺試料についてのゲノム当量（log10GE/mL）として報告した。統計学者がＳＡＳプログラムを使用して右および左GE/mL値の幾何平均力価を各ブタについて計算する。
【０４９６】
ワクチン接種後の臨床判定
試験担当検査員または被指名人が、ワクチン接種後の臨床判定について全てのブタを観察した。Ｄ−１〜Ｄ２１は毎日、次にＤ２２〜Ｄ１７７は１週間に少なくとも３回、観察を行った。臨床判定記録フォームに観察結果を記録した。
【０４９７】
ＰＲＲＳ血清検査
購入前ならびに０、７、１４、２１、２８、５６、８４、１１２、１４０、１６８、１７９（ＤＰＣ０）、１８２（ＤＰＣ３）、１８６（ＤＰＣ７）、および１８９日目（ＤＰＣ１０）に採取され、２〜８℃に保存された血清試料をＢＩＶＩ−ＡｍｅｓがＰＲＲＳ抗体について検査した（１５．１節）。結果を陰性（ＥＬＩＳＡ Ｓ／Ｐ比＜０．４）または陽性（ＥＬＩＳＡ Ｓ／Ｐ比≧０．４）として報告した。
【０４９８】
有害事象
この試験でＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶに起因する有害事象は認められなかった。
【０４９９】
統計的方法
実験単位
非ワクチン接種群へのＰＲＲＳｖの伝染を避けるために、この試験において、処置群を別々の部屋に収容した。したがって、部屋が実験単位であった。しかし、解析のために、「部屋」および「処置」の交絡効果によるバイアスの可能性を無視し、ブタを実験単位として使用した。
【０５００】
無作為化
５６匹のブタを３群の一つに無作為に割り当てた。ＢＩＶＩが無作為化を行った。発送時に１４０および１４３番（攻撃対照群）、ならびに１６８番（ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶ群）を間引いた。組み込み基準を満たす５匹の余分なブタのプールから１７８番を無作為に選択して１４０番と置き換え、１７７番を無作為に選択して１４３番と置き換え、１７９番を無作為に選択して１６８番と置き換えた。
【０５０１】
解析
統計解析およびデータのまとめは、林学博士Martin Vanselow（Biometrie & Statistik, Zum Siemenshop 21, 30539 Hannover, Germany, +49(0) 511 606 777 650, m.vanselow@t-online.de）が行った。完全に無作為計画構造を仮定してデータを解析した。統計解析は、ＳＡＳソフトウェア・リリース８．２以上（SAS, 2001, Cary, USA/North Carolina, SAS Institute Inc.）を使用して行った。ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶブタ１７９番ならびに攻撃対照ブタ１２４および１６１番は、攻撃前に死亡したので、攻撃後の解析から除外した。差に関する全ての検定を、α＝５％での両側検定として計画した。統計学者の報告を１５．９節に示す。
【０５０２】
肉眼的肺病変スコア
下の表８．１０に示された係数に特異的肺葉についての病状％を乗じたものを使用して、各ブタについての肉眼的肺病変スコアを計算した。ＳＡＳプログラムを使用して計算を行った。
【０５０３】
【表６７】
0005788027.tif 000068
【０５０４】
Wilcoxon Mann-Whitney検定を用いて、差について処置群を比較した。
【０５０５】
組織学的肺病変スコア
肺試料の個別の組織学的スコアを肺葉および動物あたりで累積させた。この合計スコアを動物１匹あたりの被験肺葉数で除算した。処置群間の比較のために、結果を単一値として使用した。Wilcoxon Mann-Whitney検定を用いて、差について処置群を検定した。
【０５０６】
肺ＰＲＲＳのｑＰＣＲ
Wilcoxon Mann-Whitney検定により処置群間で比較するために、Ｄ１８９に採取された肺からの定量ＰＣＲデータ（ＰＲＲＳウイルス負荷［log10GE/mL］）を使用した。左および右肺のｑＰＣＲ結果の平均（log10GE/mL）を評価のために使用した。計算前に、分析結果「不検出」を０．０log10GE/mLに置き換え、「陽性」を３．０に置き換えた。
【０５０７】
陽性ｑＰＣＲ結果の度数分布表を作成した。処置群間の差をFisherの直接確率検定により検定した。
【０５０８】
血清ＰＲＲＳのｑＰＣＲ
検査日毎に別々にウイルス血症のデータを評価した。追加的に、ウイルス負荷について、Ｄ１７９からＤ１８９の間（ＡＵＣ０−１０）およびＤ１８２からＤ１８９の間（ＡＵＣ３−１０）の個別応答の曲線下面積を解析した。
【０５０９】
Wilcoxon Mann-Whitney検定による処置群間の比較のために、定量ＰＣＲのデータ（ＰＲＲＳウイルス負荷［log10GE/mL］）を使用した。計算前に、分析結果「不検出」を０．０log10GE/mLに置き換え、「陽性」を３．０に置き換えた。Wilcoxon Mann-Whitney検定を用いて、差について処置群を検定した。
【０５１０】
陽性ｑＰＣＲ結果の度数分布表を作成した。処置群間の差をFisherの直接確率検定により検定した。
【０５１１】
攻撃後の臨床観察
Ｄ１８０からＤ１８９の間に少なくとも一つの陽性結果を有する動物の度数分布表を作成した。合計スコアは、呼吸スコア＋行動スコア＋咳嗽スコアの総和であった。ＳＡＳプログラムを使用して計算を行った。処置群間の差をFisherの直接確率検定により検定した。
【０５１２】
呼吸、行動、咳嗽および三つ全ての総和（合計）についてのＤ１８０〜Ｄ１８９の動物１匹あたりの最大スコアおよび平均スコアを統計評価のために使用した。Wilcoxon Mann-Whitney検定によって、処置群間の差を検定した。
【０５１３】
体重および平均１日増体重
Ｄ１７９〜Ｄ１８８の期間について個別の１日増体重を計算した。各検査日および期間について、記述的統計量を計算した。分散分析およびそれに続くｔ検定を用いて、処置群間の差を検定した。群の最小二乗平均および９５％信頼区間を伴う最小二乗平均間の差を、分散分析から計算した。
【０５１４】
直腸温度
本来の温度データに関する処置群間の差は、分散分析およびそれに続くｔ検定を用いて検定した。群の最小二乗平均および９５％信頼区間を伴う最小二乗平均間の差を、分散分析から計算した。
【０５１５】
ワクチン接種後の臨床判定
Ｄ１からＤ２１の間に少なくとも一つの陽性結果を有する動物の度数分布表を作成した。処置群間の差をFisherの直接確率検定により検定した。
【０５１６】
ＰＲＲＳ血清検査
各時点についての陽性のＥＬＩＳＡ結果の度数分布表を作成した。処置群間の差をFisherの直接確率検定により検定した。
【０５１７】
結果
肉眼的肺病変スコア
Ｄ１８９（ＤＰＣ１０）の肉眼的肺病変スコアの中央値は、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群および攻撃対照についてそれぞれ０．１％および１３．８％であった。ＰＲＲＳワクチン接種ブタについての肉眼的肺病変スコアの中央値は、攻撃対照の肉眼的肺病変スコアの中央値よりも有意に低値であった（ｐ＜０．０００１）。陰性対照群についての肉眼的肺病変スコアの中央値は、０．０％であった。
【０５１８】
汎発性胸膜炎および癒着により、１２３番（攻撃対照群）は、Ｄ１８９に肺病変について採点することができなかった。Moraxella osloensis、Staphylococcus warneri、Staphyloccous hyicusおよびPseudomonas種が、剖検後にこのブタの肺組織から単離された。
【０５１９】
群内の肉眼的肺病変スコアおよび関連するｐ値のまとめを下の表８．１１に示す。
【０５２０】
【表６８】
0005788027.tif 000069
【０５２１】
組織学的肺病変スコア
組織学的肺病変スコアの中央値は、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群および攻撃対照についてそれぞれ６．０および１９．５であった。ＰＲＲＳワクチン接種群についての組織学的肺病変スコアの中央値は、攻撃対照についての組織学的肺病変スコアの中央値よりも有意に低値であった（ｐ＜０．０００１）。陰性対照群についての組織学的肺病変スコアの中央値は、９．０であった。
【０５２２】
群の組織学的肺病変スコアおよび関連するｐ値のまとめを下の表８．１２に示す。
【０５２３】
【表６９】
0005788027.tif 000070
【０５２４】
肺ＰＲＲＳのｑＰＣＲ
肺組織からの肺ｑＰＣＲ値の中央値は、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタおよび攻撃対照について、それぞれ３．６９および６．２５log10GE/mLであった。ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタについてのｑＰＣＲ値の中央値は、攻撃対照についてのｑＰＣＲ値の中央値よりも有意に低値であった（ｐ＜０．０００１）。どの陰性対照ブタの肺試料からもＰＲＲＳｖ ＲＮＡは検出されなかった。
【０５２５】
群内の肺ｑＰＣＲ値および検査結果（ｐ値）のまとめは、下の表８．１３にある。
【０５２６】
【表７０】
0005788027.tif 000071
【０５２７】
ＰＲＲＳｖ ＲＮＡは、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタおよび攻撃対照ブタのそれぞれ９０％および１００％の肺組織から検出された。ワクチン接種群と攻撃対照との間に統計的な差はなかった（ｐ＝０．４８７８）。
【０５２８】
剖検時でのブタからのＰＲＲＳ ｑＰＣＲ陽性肺組織の群内頻度のまとめを下の表８．１４に示す。
【０５２９】
【表７１】
0005788027.tif 000072
【０５３０】
血清ＰＲＲＳ ｑＰＣＲ
ＰＲＲＳｖ ＲＮＡは、Ｄ０にどのブタの血清からも不検出であった。ワクチン接種後、Ｄ７、Ｄ１４、Ｄ２１、Ｄ２８、Ｄ５６、Ｄ８４、Ｄ１１２、Ｄ１４０およびＤ１６８にＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタは、中央値がそれぞれ３．００、０、０、３．００、０、０、０、０および０log10GE/mLであった。攻撃対照はＤ１８２（ＤＰＣ３）までＰＲＲＳｖ ＲＮＡが全く検出されなかったので、これらの中央値は、Ｄ７、Ｄ１４、Ｄ２１およびＤ２８に攻撃対照よりも有意に高値であった（ｐ≦０．００１３）。
【０５３１】
ＰＲＲＳｖ ＲＮＡは、Ｄ１７９（ＤＰＣ０）にどのブタの血清からも不検出であった。攻撃後に、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタは、Ｄ１８２（ＤＰＣ３）、Ｄ１８６（ＤＰＣ７）、およびＤ１８９（ＤＰＣ１０）の中央値が、それぞれ４．４４、０および０log10GE/mLであり、同日の攻撃対照についての５．８８、５．３０および４．２４log10GE/mLと比較された。攻撃対照についての中央値は、全ての攻撃後日でＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶ群よりも高値であった（ｐ≦０．０００１）。
【０５３２】
この試験の間にどの陰性対照ブタの血清からもＰＲＲＳｖ ＲＮＡは検出されなかった。
【０５３３】
ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタについてのＡＵＣ値の中央値は、ＤＰＣ０〜ＤＰＣ１０およびＤＰＣ３〜ＤＰＣ１０にそれぞれ１５．５４および８．８８log10GE/mL/日であった。対照的に、攻撃対照についてのＡＵＣ値の中央値は、ＤＰＣ０〜ＤＰＣ１０およびＤＰＣ３〜ＤＰＣ１０にそれぞれ４４．７７および３６．４３log10GE/mL/日であった。ＰＲＲＳ ＭＬＶ群についての中央値は、両方の期間に、攻撃対照についての中央値よりも有意に低値であった（ｐ＜０．０００１）。
【０５３４】
血清ＰＲＲＳ ｑＰＣＲデータのまとめを下の表８．１５および８．１６に示す。
【０５３５】
【表７２】
0005788027.tif 000073
【０５３６】
【表７３】
0005788027.tif 000074
【０５３７】
ワクチン接種後、Ｄ７、Ｄ１４、Ｄ２１およびＤ２８にＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶ群のｑＰＣＲ陽性ブタは、攻撃対照群よりも有意に高比率であった（ｐ≦０．００１３）。Ｄ５６にｑＰＣＲ陽性ブタの比率について群間で有意差は検出されなかった（ｐ＝０．１０６９）。
【０５３８】
Ｄ１８２（ＤＰＣ３）に、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶおよび攻撃対照群のブタの１００％がｑＰＣＲ陽性であった（検定は行わず）。Ｄ１８６（ＤＰＣ７）およびＤ１８９（ＤＰＣ１０）に、ＰＲＲＳ ＭＬＶ群は、ｑＰＣＲ陽性ブタが攻撃対照群よりも有意に低比率であった（＜０．０００１）。
【０５３９】
ｑＰＣＲ陽性データの群比率のまとめを、下の表８．１７および８．１８に示す。
【０５４０】
【表７４】
0005788027.tif 000075
【０５４１】
【表７５】
0005788027.tif 000076
【０５４２】
攻撃後の臨床観察
Ｄ１８５（ＤＰＣ６）にスコア「１」を示した攻撃対照ブタ（１４９番）１匹に比べて、攻撃後のどのＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタからも異常呼吸は観察されなかった。攻撃後に少なくとも１日間異常呼吸を示したブタのパーセンテージについて、群間で差は検出されなかった（ｐ＝０．４８７８）。
【０５４３】
どのＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタまたは攻撃対照ブタからも、攻撃後に異常行動および咳嗽は観察されなかった。
【０５４４】
攻撃後に少なくとも１日間、合計臨床スコア＞０であったブタのパーセンテージは、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群および攻撃対照群についてそれぞれ０％および５％であった。これらの値に有意差はなかった（ｐ＝０．４８７８）。
【０５４５】
Ｄ１７９〜Ｄ１８９に陰性対照群から臨床徴候は観察されなかった。
【０５４６】
攻撃後期間に少なくとも一つの陽性臨床観察スコアを有するブタの群内頻度のまとめを下の表８．１９に示す。
【０５４７】
【表７６】
0005788027.tif 000077
【０５４８】
攻撃後の最大呼吸スコアまたは最大合計スコアについて群間差はなかった（ｐ＝０．４８７８）。
【０５４９】
攻撃後期間（ＤＰＣ１〜ＤＰＣ１０）の群内最大臨床観察スコアのまとめを下の表８．２０に示す。
【０５５０】
【表７７】
0005788027.tif 000078
【０５５１】
平均臨床観察スコアは、陽性臨床スコアを有するブタのパーセンテージに類似したパターンにしたがった。ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群と攻撃対照群の間に有意差はなかった（ｐ≧０．４８７８）。
【０５５２】
攻撃後期間（ＤＰＣ１〜ＤＰＣ１０）の群内平均臨床観察スコアのまとめを下の表８．２１に示す。
【０５５３】
【表７８】
0005788027.tif 000079
【０５５４】
体重および平均１日増体重
群間差は有意でなかった（ｐ＝０．２３８９）。Ｄ１７９（ＤＰＣ０）に、平均およびＬＳ平均体重は、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶ群および攻撃対照群についてそれぞれ１３４．６および１２８．２kgであった。差に有意差はなかった（ｐ＝０．１０９０）。Ｄ１８８（ＤＰＣ９）に、平均およびＬＳ平均体重は、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶ群および攻撃対照群についてそれぞれ１３８．３および１３０．３kgであった。ワクチン接種群についての体重は、Ｄ１８８に攻撃対照群よりも有意に高値であった（ｐ＝０．０４５５）。
【０５５５】
攻撃期間（ＤＰＣ０〜ＤＰＣ９）のＬＳ平均ＡＤＷＧは、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶ群および攻撃対照群についてそれぞれ０．４および０．２kg/dであった。これらの値に有意差はなかった（ｐ＝０．１０４１）。
【０５５６】
陰性対照ブタは、Ｄ０、Ｄ１７９およびＤ１８８に平均体重がそれぞれ２．７、１１７．２および１２０．０kgであった。Ｄ１７９〜Ｄ１８８の陰性対照群についてのＡＤＷＧは０．５kg/dであった。
【０５５７】
Ｄ０、Ｄ１７９（ＤＰＣ０）およびＤ１８８（ＤＰＣ９）の群内平均体重およびＤＰＣ０〜ＤＰＣ９のＡＤＷＧのまとめを、下の表８．２２に示す。ＬＳ平均ならびにＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶ群および攻撃対照群についての体重およびＡＤＷＧの統計解析のまとめを、下の表８．２３に示す。
【０５５８】
【表７９】
0005788027.tif 000080
【０５５９】
【表８０】
0005788027.tif 000081
【０５６０】
直腸温度
ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶ群についての平均直腸温度は、攻撃日（Ｄ１７９）に３９．３℃であり、攻撃後、平均は３９．１℃（Ｄ１８９、ＤＰＣ１０）〜３９．８℃（Ｄ１８１、ＤＰＣ２）の範囲であった。攻撃対照群についての平均直腸温度は、攻撃日に３９．１℃であり、攻撃後、平均は３９．１℃（Ｄ１８３、ＤＰＣ４）〜３９．９℃（Ｄ１８２、ＤＰＣ３）の範囲であった。陰性対照群についての平均直腸温度は、同じ期間にわたり≦３９．３℃のままであった。
【０５６１】
群内の直腸温度のまとめを、下の表８．２４に示す。
【０５６２】
【表８１】
0005788027.tif 000082
【０５６３】
ＤＰＣ０（ｐ＝０．０２８１）、ＤＰＣ２（ｐ＝０．００９５）、ＤＰＣ４（ｐ＝０．００３４）およびＤＰＣ５（ｐ＜０．０００１）に、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタについての最小二乗平均直腸温度は、攻撃対照よりも有意に高値であった。ＤＰＣ８（ｐ＝０．０１８３）およびＤＰＣ１０（ｐ＝０．０００１）に、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタについての最小二乗平均直腸温度は、攻撃対照よりも有意に低値であった。攻撃後の残りの試験日に群間で有意差は検出されなかった（ｐ≧０．０６４２）。群のＬＳ平均および直腸温度の統計解析のまとめを、下の表８．２５に示す。
【０５６４】
【表８２】
0005788027.tif 000083
【０５６５】
２１匹中３匹（１４％）のＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタおよび２０匹中５匹（２５％）の攻撃対照は、攻撃後の少なくとも１日間、直腸温度が≧４０．５℃であった。攻撃後の少なくとも１日間、直腸温度≧４０．５℃を示したブタの比率について群間差は検出されなかった（ｐ＝０．４５３７）。攻撃後に少なくとも１日間、発熱（≧４０．５℃）を有したブタの群内比率のまとめを、下の表８．２６に示す。
【０５６６】
【表８３】
0005788027.tif 000084
【０５６７】
ワクチン接種後の臨床判定
２２匹中４匹（１８％）のＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶブタ、２２匹中８匹（３６％）の攻撃対照ブタ、および１２匹中２匹（１７％）の陰性対照ブタが、Ｄ１〜Ｄ２１の少なくとも１日間、異常な臨床判定を示した。このパラメーターについて群間に有意差はなかった（ｐ＝０．３１０２）。
【０５６８】
Ｄ１〜Ｄ２１に少なくとも一つの異常な臨床判定を有したブタの群内パーセンテージのまとめを、下の表８．２７に示す。
【０５６９】
【表８４】
0005788027.tif 000085
【０５７０】
全体的に見て、７匹のＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶブタが、Ｄ１〜Ｄ１７７の少なくとも１日間、異常な臨床判定を示した。
【０５７１】
ブタ１２１番は、Ｄ６１〜Ｄ１４６に腹の腫脹、Ｄ１４７〜Ｄ１６７に包皮の腫脹（swollen sheath）、Ｄ１６８に腹の腫脹、Ｄ１６９〜１７２に包皮の腫脹および１７３〜１７７に腹の腫脹を示した。ブタ１４１番は、Ｄ４〜Ｄ１０に痩せており、Ｄ４〜Ｄ６に沈うつしており、Ｄ５に粗い被毛であった。ブタ１４４番は、Ｄ２６に咳嗽を示した。ブタ１４６番は、Ｄ８２に胸骨に腫脹を示した。ブタ１４７番は、Ｄ８４〜Ｄ８６に脚弱症であり、Ｄ８４に震えていた。ブタ１５４番は、Ｄ４〜Ｄ６に痩せていた。ブタ１７９番は、Ｄ２〜Ｄ５に痩せており、Ｄ５に粗い被毛を示し、Ｄ６に死亡して発見された。攻撃対照群のブタ１３匹は、Ｄ１〜Ｄ１７７の少なくとも１日間、異常な臨床判定を示し：ブタ１２４番は、Ｄ２０に震えおよび振戦を示し、Ｄ２１に死亡して発見された。ブタ１３４番は、Ｄ４６〜Ｄ６８に包皮の腫脹、Ｄ６９〜Ｄ１４３に腹の腫脹、Ｄ１４４に臍ヘルニア、およびＤ１４５〜Ｄ１７７に腹の腫脹を示した。ブタ１３７番は、Ｄ１０８〜Ｄ１４３に包皮の腫脹を示した。ブタ１３８番は、Ｄ１１５〜Ｄ１４３に包皮の腫脹を示した。ブタ１４８番は、Ｄ１６〜２０に跛行または脚の腫脹およびＤ３５に咳嗽を示した。ブタ１４９番は、Ｄ５〜Ｄ９およびＤ１２に痩せており、Ｄ１２〜Ｄ１５に粗い被毛を示した。ブタ１５０番は、Ｄ４〜Ｄ９およびＤ１３に痩せており、Ｄ１０〜Ｄ１２に体調不良を示し、Ｄ１１に沈うつしていた。ブタ１６１番は、Ｄ４〜Ｄ９に痩せており、Ｄ９に粗い被毛および中枢神経系の徴候を示し、Ｄ１０に死亡して発見された。ブタ１６７番は、Ｄ１１７〜Ｄ１４３に包皮の腫脹を示した。ブタ１７０番は、Ｄ４〜Ｄ７に痩せており、Ｄ７に沈うつを示した。ブタ１７２番は、Ｄ１２０〜Ｄ１４３に偽蹄のただれまたは腫脹を示した。ブタ１７７番は、Ｄ１９に沈うつを示し、Ｄ１５６〜Ｄ１５９に頸部の腫脹を示した。ブタ１７８番は、Ｄ５、Ｄ１７〜２０、およびＤ２８〜Ｄ３６に沈うつを示し、Ｄ１５〜Ｄ４７に跛行、および／または脚の腫脹を示し、Ｄ１６〜Ｄ１８に痩せており、Ｄ３９〜Ｄ４７に脚が硬直していた。陰性対照のブタ６匹は、Ｄ１〜Ｄ１７７の少なくとも１日間、異常な臨床判定を示した。ブタ１２０番は、Ｄ５〜７およびＤ１２に咳嗽を示した。ブタ１２６番はＤ２〜１８に痩せており、Ｄ４〜Ｄ５、Ｄ１０、およびＤ１７〜Ｄ１９に沈うつ、Ｄ５に粗い被毛、およびＤ１８〜Ｄ２２に努力呼吸を示した。ブタ１３２番は、Ｄ４９〜Ｄ５６に膿瘍を示した。ブタ１４５番は、Ｄ３７〜Ｄ４３およびＤ４６〜Ｄ７４に包皮の腫脹、ならびにＤ７５〜Ｄ８３およびＤ８５〜Ｄ８７に包皮のただれを示した。ブタ１５１番は、Ｄ７８〜Ｄ８３およびＤ８５に跛行および脚の腫脹を示した。ブタ１５５番は、Ｄ６９〜Ｄ７７に膿瘍を示した。
【０５７２】
攻撃前に３匹の死亡が発生した。ブタ１７９番（ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶ、Ｄ６）：剖検から、最小の病変（痩せ、体調不良）が明らかになった。検査室検査は、軽度のマクロファージ間質性肺炎を示した。免疫組織化学検査はＰＲＲＳ陰性であった。腸試料は自己分解されていたが、重度の壊死または重度の炎症の証拠を示さなかった。スムース型Escherichia coliおよびEnterococcus sppが単離された（１５．９節）。ブタ１２４番（攻撃対照、Ｄ２１）：剖検で肉眼的病変は確認されなかった。検査室検査から、化膿性血管周囲炎を伴う重度の化膿性〜化膿性肉芽腫性の髄膜脳炎が明らかとなった。顕著な肺および肝臓うっ血も明らかであった。診断は、Streptococcus suis感染髄膜脳炎であった。ブタ１６１番（攻撃対照、Ｄ１０）：剖検で最小の病変が明らかとなった（痩せ、体調不良）。Bordetella bronchiseptica、α溶血性StreptococcusおよびStaphylococcus auricularisが肺組織から単離された。
【０５７３】
ＰＲＲＳ血清検査
全てのブタは、Ｄ０およびＤ７にＰＲＲＳ ＥＬＩＳＡ陰性であった。Ｄ１４までに、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタの９０％は、ＰＲＲＳ ＥＬＩＳＡ力価が陽性であった。この数はＤ２１に９５％に増加し、Ｄ２８、Ｄ５６、Ｄ８４、Ｄ１１２、Ｄ１４０およびＤ１６８にそれぞれ１００％、１００％、１００％、９０％、１００％および９５％であった。この試験のワクチン接種期間およびＤ１４〜Ｄ１６８に、どの攻撃対照ブタもＰＲＲＳ抗体力価を生成せず、攻撃対照よりも有意に高いパーセンテージのＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタがＰＲＲＳ抗体力価陽性であった（ｐ＜０．０００１）。
【０５７４】
試験の攻撃期の間に、ＰＲＲＳ ＥＬＩＳＡ力価が陽性のＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタのパーセンテージは、ＤＰＣ０、ＤＰＣ３、ＤＰＣ７およびＤＰＣ１０にそれぞれ９５％、９５％、１００％および１００％であった。対照的に、攻撃対照ブタは、３０％が力価を有したＤＰＣ７まで、ＰＲＲＳ抗体力価を生成しなかった。これは、ＤＰＣ１０に８０％に増加した。ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタの方が、試験の攻撃期にわたり、ＰＲＲＳ抗体力価陽性動物のパーセンテージが高値であった（ｐ≦０．０４７８）。
【０５７５】
陰性対照群のブタは、Ｄ１１２でのブタ２匹を除き、試験にわたりＰＲＲＳ ＥＬＩＳＡ血清陰性であった。１１６および１２０番は、Ｄ１１２にＰＲＲＳ ＥＬＩＳＡ血清陽性であった。
【０５７６】
攻撃前にＰＲＲＳ抗体力価が陽性のブタの群内パーセンテージのまとめを、下の表８．２８に示す。試験の攻撃部分からのデータを、下の表８．２９に示す。
【０５７７】
【表８５】
0005788027.tif 000086
【０５７８】
【表８６】
0005788027.tif 000087
【０５７９】
考察／結論
試験の目的を果たすために、健康な、ＰＲＲＳ感受性で血清陰性のブタ２２匹に、約１４日齢時点でＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶ １mLをＩＭ接種した。ＰＲＲＳ感受性で血清陰性のブタ３４匹（攻撃対照群２２匹および陰性対照群１２匹）に約１４日齢時点で対照薬１mLをＩＭ接種した。
【０５８０】
試験および攻撃モデルの妥当性検証
陰性対照群のブタは試験にわたりＰＲＲＳｖ（ウイルス血症；ｑＰＣＲ）陰性のままであった。陰性対照群のブタ２匹（１１６および１２０番）はＤ１１２にＥＬＩＳＡ力価が陽性であり、一方、この群についての他の全てのＥＬＩＳＡ結果は陰性であった。これらのブタまたは全体としてこの群からウイルス血症が検出されなかったこと、同様に全ての他の血清試料がＥＬＩＳＡ陰性であったことを考慮して、Ｄ１１２でのこれらのブタ２匹についての結果は、おそらく原因が突き止められない検査室エラーによる偽陽性と見なされた。したがって、これは妥当な試験であった。妥当な試験の確立とは無関係に、陰性対照群は、組織学的肺病変スコアの中央値がＤ１８９に９．０であり、これは、肉眼的病変スコアの中央値０．０％と対照的であった。これらのデータは、普通のブタ畜産条件で長期間収容されたブタが、特定の病原体とは無関係の取るに足らない小さな肺病変を発生することを強調している。
【０５８１】
前記方法によりヨーロッパ型ＰＲＲＳ単離株２０５８１７を接種後に、攻撃対照群は、ＤＰＣ０〜ＤＰＣ９に平均ＡＤＷＧ０．２kg/日（陰性対照群について平均ＡＤＷＧは０．５kg/日）、肉眼的肺病変スコアの中央値１３．８％（陰性対照群については０．０％）、組織学的肺病変スコアの中央値１９．５（陰性対照群について９．０）および肺組織でのＰＲＲＳｖ ＲＮＡ検出についての中央値６．２５log10GE/mL（陰性対照群についての中央値は０．０log10GE/mL）を示した。これらの結果は、攻撃対照群においてＰＲＲＳ特異的臨床疾患が誘導されたことを強調しており、したがって、ＰＲＲＳワクチンの有効性を、より具体的にはＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶの免疫が２６週間持続することを評価するために適切な臨床検査室ツールとしてこの攻撃モデルの妥当性を検証している。
【０５８２】
ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶ免疫の２６週間持続の判定
ワクチン接種後２６週間という、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶについてのＤＯＩの判定は、ワクチン群が、攻撃対照群よりも攻撃後肺病変（肉眼的または組織学的）の有意な軽減（ｐ≦０．０５）を示していることに基づいた。
【０５８３】
肉眼的および組織学的肺病変を、２６週間というＤＯＩを判定するための主パラメーターとして選択した。それは、ブタにおけるＰＲＲＳ呼吸器攻撃モデルの範囲内で新規ワクチンを評価する場合、このパラメーターが、最も臨床的に関連する、説得力のある有効性の証拠を提供するからである。肺病変の発生は、ブタでのＰＲＲＳ呼吸器疾患の特徴の一つであり、その後に発現する臨床徴候、発熱、ＡＤＷＧ減少などのＰＲＲＳｖ疾患の二次的特徴の全症状の起源と見なすことができる。
【０５８４】
肉眼的肺病変スコアの中央値１３．８％を示した攻撃対照群に比べて、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶ群は、肉眼的肺病変スコアの中央値０．１％によって実証されるように、攻撃後の肉眼的肺病変の有意な軽減を示した（ｐ＜０．０００１）。加えて、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶ群についての組織学的肺病変スコアの中央値６．０によって実証されるように、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶ群は、攻撃対照群についての組織学的肺病変スコアの中央値１９．５に比べて、組織学的肺病変スコアの有意な減少を示した（ｐ＜０．０００１）。したがって、用量１×１０４．２７TCID50のＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶについての２６週間というＤＯＩが、攻撃後の肺病変についての有意な軽減の主パラメーターに基づき確立された。この結果は、ターゲット最小免疫用量１×１０４．５TCID50/mLよりもやや低いワクチン用量で達成された。攻撃対照ブタ１匹（１２３番）は、細菌感染による胸膜炎および癒着が原因で肉眼的肺病変について採点することができず、組織学的肺病変について採点された。攻撃対照群の肉眼的肺病変スコアの解析からこのブタを脱落させることは、この試験の転帰に影響しなかった。
【０５８５】
攻撃後のウイルス血症は、曝露時にホスト動物中に存在するウイルスの複製および残留のレベルを表すことから、これを最も重要な二次パラメーターとして選択された。ウイルス血症の有意な減少（ｐ≦０．０５）は、ホスト内でＰＲＲＳ病原性を制限するために十分な免疫を誘導するＰＲＲＳワクチンに対応する。攻撃の３、７および１０日後に、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群は、攻撃対照群（ｐ＜０．０００１）よりも有意に減少したウイルス血症（ｑＰＣＲ）を示した。攻撃後ウイルス血症を群間でさらに評価するために、「曲線下面積」またはＡＵＣとして表されるように、攻撃後の特異的持続期間にわたるウイルス負荷の量を計算した。ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群は、ＤＰＣ０〜ＤＰＣ１０のＡＵＣ値の中央値が１５．５４log10GE/mL/日であり；一方、攻撃対照群は、ＡＵＣ値の中央値が４４．７７log10GE/mL/日（ｐ＜０．０００１）であった。加えて、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群は、ＤＰＣ３〜ＤＰＣ１０のＡＵＣ値の中央値が８．８８log10GE/mL/日であり；一方、攻撃対照群は、この期間のＡＵＣ値の中央値が３６．４３log10GE/mL/日（ｐ＜０．０００１）であった。ウイルス血症が攻撃後の特定時点で検査されようと、または攻撃後期間の経過にわたり検査されようと、ＰＲＲＳの毒性異種ヨーロッパ型株で攻撃する２６週間前に投与されたＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶは、攻撃接種後にウイルス血症を有意に減少させた（ｐ≦０．０５）。
【０５８６】
攻撃後のＰＲＲＳウイルス血症の減少に関連して、肺組織中のウイルス負荷の有意な（ｐ≦０．０５）減少も、ＰＲＲＳワクチン免疫の観点から非常に重要であろう。肺組織中のウイルス負荷の減少は、ホスト内のウイルスの安定性、複製および持続の減少に関連しうるし、二次的に他のブタへのＰＲＲＳｖ排出減少につながりうる。この試験では、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶ群からの肺組織は、攻撃１０日後（ＤＰＣ１０）の肺ｑＰＣＲ結果の中央値が３．６９log10GE/mLであり、一方、攻撃対照群は、肺ｑＰＣＲ結果の中央値が６．２５log10GE/mLであった。ワクチン群と攻撃対照群の間の差は有意であり（ｐ＜０．０００１）、したがって、２６週間という免疫の持続期間をさらに裏付けている。
【０５８７】
ブタでの攻撃後の臨床徴候の重症度および頻度の顕著な減少も、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶについてのＰＲＲＳワクチンの有効性および２６週間というＤＯＩの確率を裏付けている。１匹のブタだけが攻撃後に臨床徴候を示し：ブタ１４９番（攻撃対照）は、Ｄ１８５に呼吸スコアが「１」（浅速呼吸／呼吸促迫）であった。ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群のどのブタも、この試験の攻撃後期の間に臨床徴候を示さず、ワクチン接種群と攻撃対照群の間に統計的な差はなかった（ｐ＝０．４８７８または検定を行わず）。攻撃後の臨床徴候は、この試験でＤＯＩを判定できるほど強力ではなかった。
【０５８８】
群間の発熱は、攻撃後に様々であった。ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種ブタは、攻撃対照ブタよりも、二つの試験日（ＤＰＣ８およびＤＰＣ１０；（ｐ≦０．０１８３）に有意に低いＬＳ平均直腸温度および四つの試験日（ＤＰＣ０、ＤＰＣ２、ＤＰＣ４およびＤＰＣ５；ｐ≦０．０２８１）に高いＬＳ平均直腸温度を示した。その他の点で、攻撃後の群間に有意差は検出されなかった（ｐ≧０．０６４２）。攻撃後に群間に統計的な差が検出されたが、全ての群について平均直腸温度が≦３９．９℃（攻撃対照群、Ｄ１８２）を維持したことを考慮すると、これらの差は生物学的に意味のあるものではなかった。攻撃後に少なくとも１日間発熱したブタの比率に関して、群間で差は検出されなかった（ｐ＝０．４５３７）。
【０５８９】
攻撃対照群においてＰＲＲＳにより顕著なウイルス血症、肺症状および肺組織中のウイルス負荷が存在する結果、ＤＰＣ９に体重について群間に有意差（ｐ≦０．０５）が生じた。この試験では、ワクチン接種群および攻撃対照群は、ＬＳ平均体重がＤＰＣ９にそれぞれ１３８．３kgおよび１３０．３kgであった（ｐ＝０．０４５５）。ＤＰＣ０〜ＤＰＣ９のＬＳ平均ＡＤＷＧは、ワクチン接種群および攻撃群についてそれぞれ０．４kg/日および０．２kg/日であった。この差は、統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．１０４１）。
【０５９０】
この試験で検討されたワクチン接種後のパラメーター
３匹のブタが、この試験のワクチン接種期の間に死亡して発見された。ブタ１７９番（ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種）は、スムース型Escherichia coliおよびEnterococcus spp.感染に関連してＤ６に死亡して発見された。ブタ１６１番（攻撃対照群）は、Bordetella bronchiseptica、α溶血性StreptococcusおよびStaphylococcus auricularis感染に関連してＤ１０に死亡して発見された。ブタ１２４番（攻撃対照群）は、髄膜脳炎につながるStreptococcus suis感染に関連してＤ２１に死亡して発見された。それ以上の死亡をコントロールおよび予防するために、注射用ビタミンおよび抗生物質でブタを集団処置した。処置後に、それ以上死亡は発生しなかった。両方の処置群に死亡が起こったので、ＩＶＰ自体は感染に関連しなかったと仮定することができる。おそらく、ブタが、これらの感染症の住みかとなる研究施設に到着したのであろう。入手可能な場合、これらのブタについてのデータを収録した。これらのブタが攻撃施行前に死亡したので、これらのブタからの肉眼的および組織学的肺病変スコアを肺病変の解析から除外した。ワクチン接種から攻撃までの長期間に、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶブタ１匹および攻撃対照ブタ２匹が欠如したことは、試験の結果に影響しなかった。
【０５９１】
ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種または対照薬に関係する異常な臨床判定は、Ｄ０に接種後のブタから観察されなかった。ワクチン接種後に、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群のブタ７匹が、異常の判定を受け；一方、攻撃対照のブタ１３匹が異常の判定を受けた。細菌感染により死亡したブタ３匹を除外して、これらの異常判定には、様々な時点の痩せ、咳嗽、腫脹、粗い被毛、沈うつ、膿瘍および体調不良が含まれ、そのどれも長期間持続しなかった。著者の意見によれば、これらの結果はどちらの実験薬の投与にも関係せず、むしろ長期間群飼状況での成長／成熟途中のブタにおける典型的な結果である。
【０５９２】
全てのブタは、Ｄ０でＰＲＲＳ ＥＬＩＳＡ血清検査陰性であり、したがって、全てのブタが試験の登録時にＰＲＲＳ血清陰性であるという組み込み基準を満たしたことを確認した。ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶを投与されているブタの大部分（９０％）は、Ｄ１４までにＰＲＲＳに対してセロコンバージョンし、全てのＰＲＲＳワクチン接種ブタがＤ２８までに血清陽性であった。逆に、攻撃対照ブタは、攻撃の７日後まで血清陰性のままであり、攻撃７日後にこの群はＰＲＲＳセロコンバージョンを示し始めた。前記に報告したように、陰性対照ブタ２匹は、Ｄ１１２にＰＲＲＳ ＥＬＩＳＡ血清陽性であり、それは、おそらく原因が突き止められない検査室エラーによる偶発的結果と見なされた。
【０５９３】
ワクチン接種の７、１４、２１および２８日後に、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶワクチン接種群は、それぞれ３．００、０、０および３．００log10GE/mLというｑＰＣＲの結果の中央値を示した。これらの結果は、ワクチン接種から４週間以内に、用量１×１０４．２７TCID50のＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶが、既にワクチン接種の４週間後に防御免疫を形成するためにしばしば必要とされる、十分なＭＬＶの複製を誘導したことを強調している。逆に、攻撃対照群は、攻撃の３日後までＰＲＲＳウイルス血症陰性であった。
【０５９４】
結論
２週齢でワクチン接種し、ワクチン接種の２６週間後に攻撃したとき、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶ群について、剖検での肉眼的および組織学的肺病変、剖検での肺組織中のウイルス負荷、ならびに攻撃後のウイルス血症が攻撃対照群に比べて有意に減少したこと（ｐ≦０．０５）により、毒性ＰＲＲＳｖに対するワクチンの有効性が実証された。したがって、この試験の結果は、ＰＲＲＳ ９４８８１ ＭＬＶをワクチン接種後に２６週間という免疫持続期間が実証されたことを裏付けている。これらの結果は、ワクチン用量１×１０４．２７TCID50/mLで達成され、これは、最小免疫用量（１×１０４．５TCID50/mL）よりもわずかに低値であった。
【０５９５】
ＰＲＲＳＶ ９４８８１弱毒化株および親株の配列は、以下の通り：
配列番号１  ＰＲＲＳマスター種ウイルス９４８８１の完全長ヌクレオチド配列
【０５９６】
【化１】
0005788027.tif 000088
0005788027.tif 000089
0005788027.tif 000090
0005788027.tif 000091
0005788027.tif 000092
【０５９７】
配列番号２  配列番号１のヌクレオチド１７８から７２２７の間の配列によってコードされる９４８８１ ＭＳＶのＯＲＦ１ａ
【０５９８】
【化２】
0005788027.tif 000093
【０５９９】
配列番号３  配列番号１のヌクレオチド７２０９から１１６００の間の配列によってコードされる９４８８１ ＭＳＶのＯＲＦ１Ｂ
【０６００】
【化３】
0005788027.tif 000094
【０６０１】
配列番号４  配列番号１のヌクレオチド１１６１１から１２３６０の間の配列によりコードされる９４８８１ ＭＳＶのＯＲＦ２
【０６０２】
【化４】
0005788027.tif 000095
【０６０３】
配列番号５  配列番号１のヌクレオチド１２２１９から１３０１６の間の配列によりコードされる９４８８１ ＭＳＶのＯＲＦ３
【０６０４】
【化５】
0005788027.tif 000096
【０６０５】
配列番号６  配列番号１のヌクレオチド１２７６１〜１３３１２の間の配列によりコードされる９４８８１ ＭＳＶのＯＲＦ４
【０６０６】
【化６】
0005788027.tif 000097
【０６０７】
配列番号７  配列番号１のヌクレオチド１３３０９から１３９１４の間の配列によりコードされる９４８８１ ＭＳＶのＯＲＦ５
【０６０８】
【化７】
0005788027.tif 000098
【０６０９】
配列番号８  配列番号１のヌクレオチド１３９０２〜１４４２３の間の配列によりコードされる９４８８１ ＭＳＶのＯＲＦ６
【０６１０】
【化８】
0005788027.tif 000099
【０６１１】
配列番号９  配列番号１のヌクレオチド１４４１３〜１４７９９の配列によりコードされる９４８８１ ＭＳＶのＯＲＦ７
【０６１２】
【化９】
0005788027.tif 000100
【０６１３】
配列番号１０  親ＰＲＲＳ株９４８８１の完全長ヌクレオチド配列
【０６１４】
【化１０】
0005788027.tif 000101
0005788027.tif 000102
0005788027.tif 000103
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【０６１５】
配列番号１１  配列番号１０のヌクレオチド１７８から７２２７の間の配列によりコードされる親ＰＲＲＳＶ株９４８８１のＯＲＦ１ａ
【０６１６】
【化１１】
0005788027.tif 000106
【０６１７】
配列番号１２  配列番号１０のヌクレオチド７２０９から１１６００の間の配列によりコードされる親ＰＲＲＳＶ株９４８８１のＯＲＦ１Ｂ
【０６１８】
【化１２】
0005788027.tif 000107
【０６１９】
配列番号１３  配列番号１０のヌクレオチド１１６１１から１２３６０の間の配列によりコードされる親ＰＲＲＳＶ株９４８８１のＯＲＦ２
【０６２０】
【化１３】
0005788027.tif 000108
【０６２１】
配列番号１４  配列番号１０のヌクレオチド１２２１９から１３０１６の間の配列によりコードされる親ＰＲＲＳＶ株９４８８１のＯＲＦ３
【０６２２】
【化１４】
0005788027.tif 000109
【０６２３】
配列番号１５  配列番号１０のヌクレオチド１２７６１から１３３１２の間の配列によりコードされる親ＰＲＲＳＶ株９４８８１のＯＲＦ４
【０６２４】
【化１５】
0005788027.tif 000110
【０６２５】
配列番号１６  配列番号１０のヌクレオチド１３３０９から１３９１４の間の配列によりコードされる親ＰＲＲＳＶ株９４８８１のＯＲＦ５
【０６２６】
【化１６】
0005788027.tif 000111
【０６２７】
配列番号１７  配列番号１０のヌクレオチド１３９０２から１４４２３の間の配列によりコードされる親ＰＲＲＳＶ株９４８８１のＯＲＦ６
【０６２８】
【化１７】
0005788027.tif 000112
【０６２９】
配列番号１８  配列番号１０のヌクレオチド１４４１３から１４７９９の間の配列によりコードされる親ＰＲＲＳＶ株９４８８１のＯＲＦ７
【０６３０】
【化１８】
0005788027.tif 000113
【０６３１】
配列番号１９  弱毒化ＰＲＲＳ ９４８８１のＯＲＦ１Ａをコードするヌクレオチド
【０６３２】
【化１９】
0005788027.tif 000114
0005788027.tif 000115
0005788027.tif 000116
【０６３３】
配列番号２０  弱毒化ＰＲＲＳ ９４８８１のＯＲＦ１Ｂをコードするヌクレオチド
【０６３４】
【化２０】
0005788027.tif 000117
0005788027.tif 000118
【０６３５】
配列番号２１  弱毒化ＰＲＲＳＶ ９４８８１のＯＲＦ２をコードするヌクレオチド
【０６３６】
【化２１】
0005788027.tif 000119
【０６３７】
配列番号２２  弱毒化ＰＲＲＳＶ ９４８８１のＯＲＦ３をコードするヌクレオチド
【０６３８】
【化２２】
0005788027.tif 000120
【０６３９】
配列番号２３  弱毒化ＰＲＲＳＶ ９４８８１のＯＲＦ４をコードするヌクレオチド
【０６４０】
【化２３】
0005788027.tif 000121
【０６４１】
配列番号２４  弱毒化ＰＲＲＳＶ ９４８８１のＯＲＦ５をコードするヌクレオチド
【０６４２】
【化２４】
0005788027.tif 000122
【０６４３】
配列番号２５  弱毒化ＰＲＲＳＶ ９４８８１のＯＲＦ６をコードするヌクレオチド
【０６４４】
【化２５】
0005788027.tif 000123
【０６４５】
配列番号２６  弱毒化ＰＲＲＳＶ ９４８８１のＯＲＦ７をコードするヌクレオチド
【０６４６】
【化２６】
0005788027.tif 000124
【０６４７】
配列番号２７  親ＰＲＲＳＶ ９４８８１のＯＲＦ１ａをコードするヌクレオチド
【０６４８】
【化２７】
0005788027.tif 000125
0005788027.tif 000126
0005788027.tif 000127
【０６４９】
配列番号２８  親ＰＲＲＳＶ ９４８８１のＯＲＦ１ｂをコードするヌクレオチド
【０６５０】
【化２８】
0005788027.tif 000128
0005788027.tif 000129
【０６５１】
配列番号２９  親ＰＲＲＳＶ ９４８８１のＯＲＦ２をコードするヌクレオチド
【０６５２】
【化２９】
0005788027.tif 000130
【０６５３】
配列番号３０  親ＰＲＲＳＶ ９４８８１のＯＲＦ３をコードするヌクレオチド
【０６５４】
【化３０】
0005788027.tif 000131
【０６５５】
配列番号３１  親ＰＲＲＳＶ ９４８８１のＯＲＦ４をコードするヌクレオチド
【０６５６】
【化３１】
0005788027.tif 000132
【０６５７】
配列番号３２  親ＰＲＲＳＶ ９４８８１のＯＲＦ５をコードするヌクレオチド
【０６５８】
【化３２】
0005788027.tif 000133
【０６５９】
配列番号３３  親ＰＲＲＳＶ ９４８８１のＯＲＦ６をコードするヌクレオチド
【０６６０】
【化３３】
0005788027.tif 000134
【０６６１】
配列番号３４  親ＰＲＲＳＶ ９４８８１のＯＲＦ７をコードするヌクレオチド
【０６６２】
【化３４】
0005788027.tif 000135
【図１Ａ】
0005788027.tif 000136
【図１Ｂ】
0005788027.tif 000137
【図２】
0005788027.tif 000138
【図３】
0005788027.tif 000139
【図４】
0005788027.tif 000140
【図５】
0005788027.tif 000141
【図６】
0005788027.tif 000142
【図７Ａ】
0005788027.tif 000143
【図７Ｂ】
0005788027.tif 000144
【図７Ｃ】
0005788027.tif 000145
【図８】
0005788027.tif 000146
【図９】
0005788027.tif 000147
【配列表】
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