(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対流増進送達を介して中枢神経系に薬学的薬剤を投与するための改良された非ペグ化リポソーム送達媒体であって、少なくとも１種の飽和中性リン脂質および少なくとも１種の飽和陰イオンリン脂質を含むリポソーム製剤に被包された治療または診断薬剤を含み、当該薬剤と当該リポソーム製剤との比率が０．１〜０．５である、媒体。
【請求項２】
前記リポソーム製剤は、少なくとも１種の飽和中性リン脂質および少なくとも１種の飽和陰イオンリン脂質から成る、請求項１に記載の非ペグ化リポソーム送達媒体。
【請求項３】
ステロールをさらに含む、請求項１に記載の非ペグ化リポソーム送達媒体。
【請求項４】
前記リポソーム製剤は、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、及びコレステロールを含むか、またはそれらから成る、請求項３に記載の非ペグ化リポソーム送達媒体。
【請求項５】
前記リポソーム製剤は、７：２：１のモル比のジステアロイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、及びコレステロールから成る、請求項４に記載の非ペグ化リポソーム送達媒体。
【請求項６】
前記リポソーム送達媒体は、トポイソメラーゼ阻害剤を被包する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の非ペグ化リポソーム送達媒体を含む、治療用組成物。
【請求項７】
前記トポイソメラーゼ阻害剤は、トポテカンである、請求項６に記載の治療用組成物。
【請求項８】
前記薬剤と脂質との比率が０．３〜０．５である、請求項６に記載の治療用組成物。
【請求項９】
前記リポソーム送達媒体は、毒素を被包する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の非ペグ化リポソーム送達媒体を含む、治療用組成物。
【請求項１０】
前記毒素は、ω−コノトキシン、ボツリヌス毒素、μ−コノトキシン、およびα−コナントキンペプチドから成る群から選択される、請求項９に記載の治療用組成物。
【請求項１１】
前記タンパク質毒素は、コノトキシンである、請求項１０に記載の治療用組成物。
【請求項１２】
中枢神経系障害の治療を必要とする患者の中枢神経系障害を治療するための請求項６〜１１のいずれか１項に記載の治療用組成物。
【請求項１３】
前記中枢神経系障害は、中枢神経系腫瘍であり、前記治療薬剤は、トポイソメラーゼ阻害剤である、請求項１２に記載の治療用組成物。
【請求項１４】
前記中枢神経系障害は、てんかんであり、前記治療薬剤は、毒素である、請求項１２に記載の治療用組成物。
【請求項１５】
前記毒素は、コノトキシンである、請求項１４に記載の治療用組成物。
【請求項１６】
中枢神経系腫瘍の治療を必要としている患者において使用するための、請求項６〜８のいずれか１項に記載の治療用組成物。
【請求項１７】
てんかんの治療を必要としている患者において使用するための、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の治療用組成物。
【請求項１８】
前記リポソーム送達媒体は、ＭＲＩ磁石を被包する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の非ペグ化リポソーム送達媒体を含む、診断用組成物。
【請求項１９】
前記ＭＲＩ磁石は、ガドジアミドおよびローダミンから成る群から選択される、請求項１８に記載の診断用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対流増進送達によって送達可能であり、中枢神経系疾患の治療に有用なリポソーム製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳腫瘍のある患者の場合、治療薬の全身送達は、通常、全身性副作用と関連するが、中枢神経系（ＣＮＳ）では低い治療濃度が得られるに過ぎず、したがって、全身治療の有効性が限定される。認められる有効性の欠如は、主に、治療薬剤が血液脳関門を超えて浸透できないことに起因する。血液脳関門は、腫瘍の中心では破壊されており、全身送達される化学療法薬の腫瘍のほぼ不活性な中心への到達を可能にし得るが、血液脳関門は、通常、薬剤が最も必要とされる腫瘍境界では無傷なままである。
【０００３】
血液脳関門を回避する１種のアプローチは、ＣＮＳへの治療薬剤の直接注入である。しかしながら、脳に直接注入される薬剤は、拡散によって十分に分散しない。低分子薬物であっても注入部位から数ミリメートル移動させるために、高い濃度勾配が必要とされ、そのような濃度は、神経毒性である場合が多い。この問題を克服するために開発中の戦略は、対流増進送達（ＣＥＤ）と呼ばれる直接脳内注入アプローチである。ＣＥＤでは、陽圧を用いて、治療用巨大分子を含む薬剤を細胞外空間に分散させるための局所圧力勾配を生成する（Ｂｏｂｏ，Ｒ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：２０７６−８０、Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．９０：３１５  ２０）。ＣＥＤは、所定の標的組織内で再現性のある分散を提供し、分散容積（Ｖd）全体で均一な薬物濃度を得ることができる（Ｃｒｏｔｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、Ｌｏｎｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【０００４】
ＣＥＤによって局所的に送達される化学療法薬剤は、好ましい治療結果をもたらした（Ｂｒｕｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００、Ｄｅｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、Ｋａｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。しかしながら、神経系に直接送達される大部分の細胞毒性薬は、健康な細胞を損傷する能力を有する。したがって、脳腫瘍へのＣＥＤ投与に適した候補は、健康な神経細胞と比較して、腫瘍細胞に対して可能な限り最大の治療指数を有していなければならない。リポソーム薬物送達は、顕著な毒性と関連することが多い高い薬物濃度を回避できる可能性を提供し、ＣＥＤを介して付与されるリポソーム被包されたカンプトセシン薬物の臨床前試験は、薬物の持続放出においていくらかの改善を示した方で（Ｍｏｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、Ｎｏｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、ペグ化リポソームの使用が、組織結合部位の相互作用をマスクし、それによって、組織分散容積を増加させるために必須であると見なされた（Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０００５】
リポソーム／組織相互作用の克服におけるペグ化の成功にもかかわらず、最近では、ペグ化リポソームが、望ましくなく、かつ生命にかかわる可能性のある免疫応答を生成し得ることが示された（Ｓｚｅｂｅｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．１７：１０７−１１７、ｌｓｈｉｄａ  ａｎｄ  Ｋｉｗａｄａ（２００８）Ｉｎｔ  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．３５４−５６−６２  Ｅｐｕｂ  Ｎｏｖ  ９  ２００７）。ペグ化リポソームは、同一対象に２回投与された場合、血中クリアランスを加速させることに加えて、心肺障害の症状（例えば、呼吸困難、多呼吸、頻脈、胸痛、高血圧、および低血圧）を含む、非ＩｇＥ媒介性の過敏反応を引き起こす可能性がある（Ｉｓｈｉｄａ  ａｎｄ  Ｋｉｗａｄａ（２００８）、上記、Ｍｏｇｈｉｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２０  ２５９１−３  Ｅｐｕｂ  Ｏｃｔ  ２５，２００６）。
【０００６】
したがって、組織分散容積を増加させるが、ペグ化に伴う問題の免疫原性を回避する、対流増進送達のための改良されたリポソーム薬物製剤が必要とされる。
【発明の概要】
【０００７】
驚くべきことに、本発明者は、本明細書で記載および特許請求されるように、ペグ化の代わりに陰イオン脂質成分が製剤に用いられる場合、リポソームが中枢神経系の組織内で極めて対流的となり得ることを発見した。さらに、主題の製剤は、当該技術分野において用いられるペグ化製剤と比較可能な薬物動態プロファイルを呈する一方で、ペグ化に伴う問題の免疫原性を回避する。したがって、本明細書では、陰イオンリポソーム製剤の対流増進送達を介して、中枢神経系（ＣＮＳ）、例えば、限局性ＣＮＳ腫瘍の組織を分離するための改良された組成物および治療薬を投与する方法が提供される。
【０００８】
一態様において、本明細書では、ＣＮＳ障害、例えば、ＣＮＳにおける特定のニューロン集団の死滅および／または機能不全に伴う障害を治療するための方法が説明される。該方法は、ＣＮＳ障害のある患者に対して、治療上有効量の薬学的組成物を投与することを含み、該薬学的組成物は、対流増進送達によって特定のニューロン集団に対して局所的に送達され、薬学的組成物は、中性飽和リン脂質および少なくとも１種の陰イオン飽和脂質の混合物を含む、非ペグ化リポソームに被包された少なくとも１種の治療薬剤を含み、薬学的組成物の対流増進送達は、ＣＮＳ障害のある患者を治療する。
【０００９】
主題の発明において有利な用途が認められる治療薬剤には、例えば、抗腫瘍薬、放射性ヨウ化化合物、毒素（タンパク質毒素を含む）、細胞増殖抑制薬および細胞溶解薬物を含む細胞毒性薬、遺伝子およびウイルスベクター、ワクチン、合成ベクター、成長因子、神経栄養因子、抗ウイルス薬、抗生物質、神経伝達物質、サイトカイン、酵素、および特定部位の標的病変に対する薬剤が挙げられる。
【００１０】
本明細書で提供される組成物および方法によって治療できるＣＮＳ障害には、例えば、癌、感染症、頭部外傷、脊髄損傷、多発性硬化症、レヴィー小体認知症、ＡＬＳ、リソソーム蓄積障害、精神疾患、神経変性障害、脳卒中、てんかん、および他の急性および慢性ＣＮＳ障害が挙げられる。
【００１１】
一実施形態において、本明細書では、ＣＮＳ腫瘍の成長を阻害する、ＣＮＳ腫瘍を減少させる、１つ以上のＣＮＳ腫瘍細胞を死滅させる、および／またはＣＮＳ腫瘍のある患者を治療するための方法が提供される。本方法は、治療上有効量の薬学的組成物をＣＮＳ腫瘍のある患者に投与することを含み、本薬学的組成物は、対流増進送達によって、ＣＮＳ腫瘍に対して局所的に送達され、本薬学的組成物は、中性飽和リン脂質および少なくとも１種の陰イオン飽和脂質の混合物を含む、非ペグ化リポソームに被包された少なくとも１種の細胞毒性薬を含み、本薬学的組成物の対流増進送達は、ＣＮＳ腫瘍の成長を阻害し、ＣＮＳ腫瘍を減少させ、ＣＮＳ腫瘍細胞のうちの１つ以上を死滅させ、および／またはＣＮＳ腫瘍のある患者を治療する。
【００１２】
別の実施形態において、本明細書では、てんかんのある患者において、発作の回数または期間を阻止または減少させるための方法が提供される。本方法は、治療上有効量の薬学的組成物を、てんかんのある患者に投与することを含み、本薬学的組成物は、異常または過剰な過同期性放電を呈しているＣＮＳニューロンの集合体に対して、対流増進送達によって局所的に送達され、薬学的組成物は、中性飽和リン脂質および少なくとも１種の陰イオン飽和脂質の混合物を含む、非ペグ化リポソームに被包された少なくとも１種の治療薬剤を含み、薬学的組成物の対流増進送達は、てんかんのある患者において、発作の回数または期間を阻止または減少させる。一実施形態において、治療薬剤は毒素、例えば、ペプチド毒素である。一実施形態において、ペプチド毒素は、ω−コノトキシン、例えば、ω−コノトキシンＭＶＩＩＡまたはω−コノトキシン、ＧＶＩＡである。別の実施形態において、毒素はボツリヌス毒素、例えば、ボツリヌス毒素血清型Ａ（ＢＯＴＯＸ（登録商標）またはＤＹＳＰＯＲＴ（登録商標）等）、ボツリヌス毒素血清型Ｂ（ＭＹＯＢＬＯＣ（登録商標）等）である。別の実施形態において、毒素はμ−コノトキシンまたはα−コナントキンペプチドである。
【００１３】
一実施形態において、薬学的組成物は、類似の非ペグ化陰イオンリポソームに被包された少なくとも１種の診断薬をさらに含み（本明細書では「トレース剤」または「トレーサ」と称される場合がある）、ＣＥＤ中およびＣＥＤ後の治療薬剤の分散の可視化を可能にする。好適な実施形態において、治療薬剤を被包している非ペグ化リポソームは、治療薬剤を被包している非ペグ化リポソームと同一の脂質で構成される。したがって、一実施形態において、本明細書に記載される方法は、診断薬を検出するステップをさらに含む。
【００１４】
本明細書に記載されるように、非ペグ化リポソームは、治療薬を含有し得る。一実施形態において、治療薬は、不溶性の治療薬である。別の実施形態において、治療薬は、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、カンプトテシンおよびその誘導体）であり、トポイソメラーゼＩ／ＩＩ阻害剤が挙げられるが、これに限定されない。例えば、一実施形態において、治療薬は、９−アミノカンプトテシン、７−エチルカンプトテシン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン、１０，１１−メチレンジオキシカンプトテシン、９−アミノ−１０，１１−メチレンジオキシカンプトテシン９−クロロ−１０，１１−メチレンジオキシカンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、７−（４−メチルピペラジノメトリレン）−１０，１１−エチレンジオキシ−２０（Ｓ）−カンプトテシン、７−（４−メチルピペラジノメチレン）−１０，１１−メチレンジオキシ−２０（Ｓ）−カンプトテシン、および７−（２−（Ｎ−イソプロピルアミノ）エチル）−（２０Ｓ）−カンプトテシンから成る群から選択される、カンプトテシン誘導体である。別の実施形態において、カンプトテシン誘導体は、イリノテカン、トポテカン、（７−（４−メチルピペラジノメチレン）−１０，１１−エチレンジオキシ−２０（Ｓ）−カンプトテシン、７−（４−メチルピペラジノメチレン）−１０，１１−メチレンジオキシ−２０（Ｓ）−カンプトテシン、または７−（２−（Ｎ−イソプロピルアミノ）エチル）−（２０Ｓ）−カンプトテシンから成る群から選択される。別の実施形態において、カンプトテシンは、トポテカンである。
【００１５】
別の実施形態において、トポイソメラーゼ阻害剤は、トポイソメラーゼＩ／ＩＩ阻害剤、例えば、６−［［２−（ジメチルアミノ）−エチル］アミノ］−３−ヒドロキシ−７Ｈ−インデノ［２，１−ｃ］キノリン−７−オン二塩酸塩、アゾトキシン、または３−メトキシ−１１Ｈ−ピリド［３′，４′−４，５］ピロロ［３，２−ｃ］キノリン−１，４−ジオンである。
【００１６】
別の実施形態において、治療薬は毒素、例えば、タンパク質毒素であり、例えば、ω−コノトキシン（例えば、ω−コノトキシンＭＶＩＩＡまたはω−コノトキシン、ＧＶＩＡ）、ボツリヌス毒素（例えば、ボツリヌス毒素血清型Ａ（ＢＯＴＯＸ（登録商標）またはＤＹＳＰＯＲＴ（登録商標）等）、ボツリヌス毒素血清型Ｂ（ＭＹＯＢＬＯＣ（登録商標）等））、μ−コノトキシン、α−コナントキンペプチド等である。
【００１７】
一実施形態において、初期薬物濃度は、少なくとも約１００μｇ／ｍＬ、好ましくは、少なくとも約２００μｇ／ｍＬ、およびより好ましくは、少なくとも約３００μｇ／ｍＬである。別の実施形態において、初期薬物濃度は、約２ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬである。一実施形態において、治療薬および／または診断薬対脂質の比は、約０．１〜約０．５である。別の実施形態において、治療薬および／または診断薬対脂質の比は、約０．１である。別の実施形態において、治療薬および／または診断薬対脂質の比は、約０．３である。別の実施形態において、治療薬および／または診断薬対脂質の比は、約０．５である。
【００１８】
一態様において、非ペグ化リポソームは、診断薬を含有する。一実施形態において、診断薬は、ＭＲＩ磁石である。別の実施形態において、診断薬は、ガドリニウムキレートである。別の実施形態において、診断薬は、ガドジアミドおよびローダミンから成る群から選択される。別の実施形態において、診断薬はガドジアミドである。
【００１９】
本明細書に記載される方法は、少なくとも１種の中性飽和リン脂質および少なくとも１種の陰イオン飽和リン脂質の混合物で構成される非ペグ化リポソームに被包された少なくとも１種の治療薬剤および／または少なくとも１種の診断薬を含む、リポソーム製剤の対流増進送達を含む。一実施形態において、中性飽和リン脂質は、ホスファチジルコリンの誘導体およびその混合物、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、およびそれらの混合物から成る群から選択される。長鎖飽和脂質、例えば、Ｃ２０およびＣ２２を使用してもよい。一実施形態において、陰イオン飽和リン脂質は、ホスファチジルグリセロールの誘導体（例えば、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ））、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、およびそれらの混合物から成る群から選択される。
【００２０】
本明細書に記載されるリポソーム製剤は、他の脂質成分、例えば、ステロールおよび誘導体（例えば、コレステロール（ＣＨＯＬ）またはスフィンゴリピド（例えば、スフィンゴミエリンおよびグリコスフィンゴリピド、特にガングリオシド）も含有し得る。好適な実施形態において、リポソーム製剤は、少なくとも１種の中性飽和リン脂質、少なくとも１種の陰イオン飽和リン脂質、および安定剤、例えば、コレステロール等から本質的に成るか、またはそれらから成る。
【００２１】
一実施形態において、非ペグ化リポソームは、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）およびジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）の組み合わせで構成される。一実施形態において、非ペグ化リポソームは、約１０〜約９５モル％のＤＳＰＣを含む。一実施形態において、非ペグ化リポソームは、約５〜約９０モル％のＤＳＰＧを含む。一実施形態において、非ペグ化リポソームは、コレステロール（ＣＨＯＬ）、例えば、約５〜約４５モル％のコレステロールをさらに含む。好適な実施形態において、リポソームは、約６０〜約９０モル％のＤＳＰＣ、約５〜約１０モル％のコレステロール、および約５〜約３０モル％のＤＳＰＧを含むか、またはそれらから本質的に成る。好適な実施形態において、非ペグ化リポソームは、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＧ、およびＣＨＯＬを７：２：１のモル比で含むか、またはそれらから本質的に成る。別の実施形態において、非ペグ化リポソームは、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＧ、およびＣＨＯＬを６：２：２のモル比で含むか、またはそれらから本質的に成る。別の実施形態において、非ペグ化リポソームは、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＧ、およびＣＨＯＬを５：２：３のモル比で含むか、またはそれらから本質的に成る。
【００２２】
一実施形態において、本明細書に記載されるような非ペグ化リポソーム製剤の対流増進送達（ＣＥＤ）は、自由に投与される治療薬のそれぞれの組織分散、毒性、およびインビボ半減期と比較して、組織分散の増加、毒性の減少、および治療薬のインビボ半減期の増加をもたらす。
【００２３】
一態様において、本発明は、本明細書に記載されるリポソーム製剤、例えば、少なくとも１種の中性飽和リン脂質および少なくとも１種の陰イオン飽和リン脂質の混合物で構成される非ペグ化リポソームに被包された少なくとも１種の治療薬剤を含むリポソーム製剤を含むカニューレを提供し、製剤は、対流増進送達（ＣＥＤ）によって送達され得る。別の実施形態において、カニューレは、少なくとも１種の中性飽和リン脂質および少なくとも１種の陰イオン飽和リン脂質の混合物で構成される非ペグ化リポソームに被包された診断薬を含むリポソーム製剤をさらに含み、製剤は、ＣＥＤによって送達され得る。別の実施形態において、カニューレは、治療薬を含む第１のリポソームと、診断薬を含む第２のリポソームと、を含むリポソーム製剤を含み、第１のリポソームも第２のリポソームもペグ化されておらず、第１および第２のリポソームは、少なくとも１種の中性飽和リン脂質および少なくとも１種の陰イオン飽和リン脂質の混合物で構成され、製剤は、対流増進送達（ＣＥＤ）によって送達され得る。カニューレは、ＣＮＳへの対流増進送達と適合する。一実施形態において、カニューレは、逆流防止ステップ設計のカニューレである。
【００２４】
一態様において、本発明は、本明細書に記載されるリポソーム製剤を生成するための方法を提供する。一態様において、本発明は、ＣＮＳの癌の患者の治療に有用な医薬品を生成するための方法を提供し、医薬品は、本明細書に記載されるリポソーム製剤を含む。一実施形態において、該方法は、遠隔装薬、例えば、硫酸アンモニウム勾配によって、治療薬または診断薬をリポソーム内に取り込むことを含む。
【００２５】
本明細書に記載される装置および方法のさらなる目的、特徴、および利点は、本発明の例示的な実施形態を示す添付の図面と併せて考慮すれば、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】脂質組成物、薬物濃度、および薬物脂質比が、ペグ化リポソーム製剤および非ペグ化リポソーム製剤からのトポテカンの放出特性に及ぼす影響を比較する。
【図１Ｂ】脂質組成物、薬物濃度、および薬物脂質比が、ペグ化リポソーム製剤および非ペグ化リポソーム製剤からのトポテカンの放出特性に及ぼす影響を比較する。
【図１Ｃ】脂質組成物、薬物濃度、および薬物脂質比が、ペグ化リポソーム製剤および非ペグ化リポソーム製剤からのトポテカンの放出特性に及ぼす影響を比較する。
【図１Ｄ】脂質組成物、薬物濃度、および薬物脂質比が、ペグ化リポソーム製剤および非ペグ化リポソーム製剤からのトポテカンの放出特性に及ぼす影響を比較する。
【図１Ｅ】脂質組成物、薬物濃度、および薬物脂質比が、ペグ化リポソーム製剤および非ペグ化リポソーム製剤からのトポテカンの放出特性に及ぼす影響を比較する。
【図１Ｆ】脂質組成物、薬物濃度、および薬物脂質比が、ペグ化リポソーム製剤および非ペグ化リポソーム製剤からのトポテカンの放出特性に及ぼす影響を比較する。
【００２７】
【図２】正常な脳組織におけるＬｓ−ＴＰＴ製剤および遊離トポテカンの薬物動態を示す。
【００２８】
【図３】スクロースがローダミンリポソームの対流可能性に及ぼす影響を示す。
【００２９】
【図４】線条体への２０μＬ注入後のローダミン装薬リポソームの分散量（Ｖｄ）を示す。
【００３０】
【図５】治療群による動物の生存を示す。
【００３１】
【図６】合計治療群対第２群（０．５ｍｇ／ｍＬ二重投与）による動物の生存を示す。
【００３２】
【図７】腫瘍移植におけるＵ８７細胞負荷による全体生存を示す。
【００３３】
【図８】Ｕ８７ＭＧ細胞負荷の低い（６．８×１０3）動物における、合計治療群対第２群（０．５ｍｇ／ｍＬ二重投与）による動物の生存を示す。
【００３４】
【図９】Ｕ８７ＭＧ細胞負荷の高い（９．７×１０5）動物における、合計治療群対第２群（０．５ｍｇ／ｍＬ二重投与）による動物の生存を示す。
【００３５】
【図１０】無処置齧歯類脳組織における、Ｌｓ−Ｇｄ−ローダミン−ＰＥと混注される、Ｌｓ−ＴＰＴマリナブルーＤＨＰＥの分散量を示す。各製剤について、ｎ＝３であり、各半球に２０μＬを注入した。
【００３６】
【図１１】Ｕ８７ＭＧ異種移植齧歯類脳組織における、Ｌｓ−Ｇｄ−ローダミン−ＰＥと混注される、Ｌｓ−ＴＰＴマリナブルーＤＨＰＥの分散量を示す。各製剤の場合、ｎ＝４であり、各半球に２０μＬを注入した。
【００３７】
【図１２】治療群による動物の生存を示す（安楽死させた動物は、無検閲と見なされた）。
【００３８】
【図１３】治療群による動物の生存を示す（安楽死させた動物は、無検閲と見なされた）。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
定義
【００４０】
本明細書で使用される、「リポソーム」は、封入された含水量を含む脂質二層膜を意味する。リポソームは、単一の二層膜を有する単層ベシクルであり得るか、または水性層によって相互に分離された複数の二層膜を有する多層ベシクルであり得る。概して、リポソーム二重層は、疎水性「尾」領域および親和性「頭」領域を有する２つの脂質単層で構成される。二層膜の構造は、脂質単層の疎水性（非極性）の「尾」が、二重層の中心を向き、親水性（極性）の「頭」は、封入された水の容積または過リポソーム水性環境のいずれかに向かっている。一実施形態において、本発明のリポソームは、標的部分、例えば、抗体または他のリガンドを含む。
【００４１】
「リポソーム製剤」は、治療薬および／または診断薬の一部またはすべてが、リポソーム内に被包されるものであると理解される。リポソーム製剤に関して本明細書で使用される「〜から本質的に成る」は、引用される脂質成分のみを融資、追加の脂質成分を有しないリポソームを意味する。
【００４２】
「リン脂質」は、グリセロールの両親媒性誘導体を意味すると理解され、そのヒドロキシル基の１つが、リン酸でエステル化され、他の２つのヒドロキシル基が、相互に等しいか、または異なり得る長鎖脂肪酸でエステル化されている。
【００４３】
飽和リン脂質は、その脂肪酸が、単一の（複数ではない）共有炭素−炭素結合のみを有するものとなる。
【００４４】
中性リン脂質は、概して、別のリン酸ヒドロキシルが、極性基（通常、ヒドロキシルまたはアミン）によって置換されたアルコールによりエステル化され、その正味電荷は、生理的ｐＨにおいてゼロであるものである。
【００４５】
陰イオンリン脂質は、概して、別のリン酸ヒドロキシルが、極性基によって置換されたアルコールによってエステル化され、その正味電荷が、生理的ｐＨにおいて負であるものである。
【００４６】
「荷電飽和リン脂質」という表現、ならびに荷電飽和リン脂質を含むという意味は、正味電荷がゼロではない他の両親媒性化合物も含む。そのような両親媒性化合物は、極性基（例えば、アミン）によって置換された、長鎖炭化水素誘導体および脂肪酸の誘導体を含むが、これらに限定されない。
【００４７】
本明細書で使用される、「活性成分」または「治療薬剤」は、高分子量神経治療薬の形態でＣＮＳ標的組織に送達され得、そのように送達されると、標的ＣＮＳ組織において所望の反応をもたらす、任意の分子を意味する。治療薬剤は、抗腫瘍薬、放射性ヨウ化化合物、毒素（タンパク質毒素を含む）、細胞増殖抑制薬または細胞溶解薬を含む細胞毒性薬、遺伝子およびウイルスベクター、ワクチン、合成ベクター、成長因子、神経栄養因子、抗ウイルス薬、抗生物質、神経伝達物質、サイトカイン、酵素、および特定部位の標的病変に対する薬剤を含むが、これらに限定されない。治療薬剤は、核酸類似体を含む核酸、抗体を含むタンパク質、および低分子化学組成物を含むが、これらに限定されない。活性成分は、全身的に投与されると、毒性および望ましくない効果を呈する薬剤を含む。
【００４８】
本明細書で使用される、「ＣＮＳ障害」は、対象の中枢神経系の障害を意味する。障害は、ＣＮＳにおける特定のニューロン集団の死滅および／または機能不全と関連付けられ得る。障害は、ＣＮＳ内の細胞の異常成長と関連し得る。異常に成長するＣＮＳ細胞は、ＣＮＳに由来し得るか、または他の組織に由来し得る。ＣＮＳ障害には、癌、感染症、頭部外傷、脊椎損傷、多発性硬化症、レヴィー小体認知症、ＡＬＳ、リソソーム蓄積障害、精神疾患、神経変性障害、脳卒中、てんかん、および他の急性および慢性ＣＮＳ障害が挙げられる。
【００４９】
神経膠腫は、中枢神経系（ＣＮＳ）の最も一般的な原発腫瘍である。多形性神経膠腫（ＧＢＭ）は、最頻する最も悪性型の神経膠腫である。小児よりも成人において、ＧＢＭの発症率ははるかに高い。米国統計報告の中枢脳腫瘍レジストリによると、ＧＢＭは、米国における脳腫瘍の約２０％を占める（ＣＢＴＲＵＳ，１９９８−２００２）。ＣＮＳの他の腫瘍には、線維性（びまん性）星状細胞腫、毛様細胞性星状細胞腫、多形性黄色星状膠細胞腫等の星状細胞腫を含む他の神経膠腫、および脳幹神経膠腫、乏突起膠腫、および上衣腫、ならびに関連傍脳室腫瘤病変、ニューロン性腫瘍、髄芽腫を含む分化不良新生物、原発性脳リンパ腫を含む他の実質腫瘍、胚細胞腫瘍、および松果体実質腫瘍、髄膜腫、転移性腫瘍、腫瘍随伴症候群、神経鞘腫を含む末梢神経鞘腫瘍、神経繊維腫、および悪性末梢神経鞘腫瘍（悪性神経繊維腫）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
てんかんは、ＣＮＳにおける特定のニューロン集団の機能不全に伴う最も一般的な深刻なＣＮＳ障害である（Ｓｈｏｒｖｏｎ，Ｓ，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｎａｔｕｒａｌ  ｈｉｓｔｏｒｙ，ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｅｐｉｌｅｐｓｙ，Ｌａｎｃｅｔ  １９９０  Ｊｕｌ  １４，３３６（８７０７）９３−６，ＭｃＮａｍａｒａ  Ｊ．，Ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｅｐｉｌｅｐｓｙ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １９９２  Ｏｃｔｏｂｅｒ，１５（１０）３５７−９）。重度の穿通性頭部外傷は、最大５０％のてんかん誘発リスクと関連する。てんかんの他の原因は、脳卒中、感染症および遺伝的感受性を含む。発作は、神経学的機能不全であり、中枢神経系ニューロンの集合体からの異常、過剰な過同期性放電に起因する。発作は、（運動系が関与する場合）動作的に呈し得るか、または脳波的に呈し得る。てんかんは、人が、慢性の基礎疾患の経過に起因して、再発発作を有する状態である。臨床および病理学的特性が異なる様々なてんかん症候群が存在するが、共通の基礎病因は、ニューロンの過剰興奮である。したがって、てんかんは、脳波計および臨床所見に従って分類され得る、神経学的機能における慢性の再発性、発作性変化によって特徴付けられる、中枢神経系（ＣＮＳ）過剰興奮の障害を包含する（Ｄｉｃｈｔｅｒ  Ｍ．，Ｂａｓｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｅｐｉｌｅｐｓｙ：ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ，Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ１９９７；３８  Ｓｕｐｐｌ９：Ｓ２−６）。
【００５１】
てんかんの発作は、限局性（部分的）発作および全身性発作の２つの群に広く分類される。限局性発作は、脳の皮質または皮質下領域における限定されたニューロン群の異常活性から生じる。根本的な構造異常または病変は、出生時障害、頭部外傷、腫瘍、膿瘍、梗塞、血管形成不全、または遺伝疾患の結果として発生し得る（Ｄｉｃｈｔｅｒ  １９９７，Ｉｂｉｄ）。限局性活動の位置は、臨床発作所見によって識別することができるか、または潜在的であり得る。同様に、活性病巣は、病変自体が関与しないが、隣接または遠位（であるが結合した）ニューロン集団において生じ得、限局性過剰興奮を基礎とする可塑性シナプスの再組織化の仮説を支持する。（例えば、Ｐｒｉｎｃｅ  Ｄ．Ａ．，Ｅｐｉｌｅｐｔｏｇｅｎｉｃ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｎｄ  ｃｉｒｃｕｉｔｓ．Ｉｎ：Ｊａｓｐｅｒ′ｓ  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｐｉｌｅｐｓｉｅｓ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９９）、Ｄｅｌｇａｄｏ−Ｅｓｃｕｅｔａ  Ａ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ）、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ７９：６６５−６８４を参照）。
【００５２】
限局性発作は、意識に明らかな変化がない場合は「単純」と呼ばれ、そうでなければ、「複雑」と呼ばれる。複雑限局性発作には、側頭葉および辺縁系が関与し、成人におけるてんかんの最も一般的な兆候である。拡大して脳波的に両側性になる限局性発作は、同時に意識を喪失し、運動兆候の有無にかかわらず、二次的に全身性になると言われている。原発性全身性発作は、運動けいれんの有無にかかわらず、両側脳波活動、意識の喪失で開始する。限局性発作は、脳のほぼすべての部分が関与し得、通常は、局所病変の機能異常に起因する。限局性発作の現在の治療は、ＥＥＧの使用を含み、限局性てんかん発作を起こしやすい有機脳疾患の領域に由来する、異常なスパイク波を位置特定し、続いて、さらなる発作を防ぐために、病巣を外科的に切除する。
【００５３】
リポソーム製剤
【００５４】
本明細書に記載されるリポソーム製剤、例えば、そのような製剤を含む薬学的組成物は、能動的または受動的装薬方法を含む多様な方法で形成することができる。例えば、１種以上の治療薬および／または診断薬を、膜貫通ｐＨ勾配装薬法を使用して、被包してもよい。リポソームの二重層を越える膜貫通能力の使用によって、治療薬とともにリポソームを装薬するための一般的な方法は、当業者によく知られている（例えば、米国特許第５，１７１，５７８号明細書、米国特許第５，０７７，０５６号明細書、および米国特許第５，１９２，５４９号明細書）。
【００５５】
簡単に説明すると、例えば、最初に脂質が、有機溶媒、例えば、エタノール、ｔ−ブタノール、それらの混合物等に溶解され得、徐々に加熱され得る（例えば、６０℃〜７０℃）。非ペグ化リポソームを形成する際に使用される脂質成分は、通常、リン脂質およびステロールを含む、多様なベシクル形成脂質から選択され得る（例えば、米国特許第５，０５９，４２１号明細書、米国特許第５，１００，６６２号明細書）、例えば、卵黄、大豆、または他の野菜または動物組織、に由来するリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチド酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン等；それらの混合物、例えば、卵黄リン脂質、大豆リン脂質等；その水素化生成；および合成リン脂質、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルグリセロール等が使用され得る。
【００５６】
本明細書に記載されるように、主題の発明の非ペグ化陰イオンリポソームは、２種以上の非ペグ化脂質、例えば、中性リン脂質および陰イオンリン脂質の混合物である。一実施形態において、中性リン脂質は、ホスファチジルコリンの誘導体およびそれらの組み合わせ、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、およびそれらの組み合わせで構成される群から選択される。一実施形態において、陰イオンリン脂質は、ホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチド酸の誘導体およびそれらの組み合わせ、例えば、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）およびホスファチジルセリンエステルと異なる飽和脂肪酸（ＰＳ）の混合物で構成される群から選択される。リポソームの安定化および他の目的で、ステロール（例えば、コレステロール）、σ−トコフェロール、ジセチルリン酸、ステアリルアミン等を添加してもよい。
【００５７】
溶解した脂質に、予熱した水溶液を、激しく攪拌しながら添加してもよい。例えば、１５０〜３００ｍＭの緩衝液を含有する溶液を添加してもよい。使用され得る緩衝液には、硫酸アンモニウム、クエン酸、マレイン酸、およびグルタミン酸が挙げられるが、これらに限定されない。混合後に、得られた多層ベシクル（「ＭＬＶ」）を加熱し、押出装置を通じて押し出して、ＭＬＶを単層リポソームベシクルに変換してもよい。脂質を溶解するために最初に使用される有機溶媒は、透析、ダイアフィルタによるろ過等によって、リポソーム調製物から除去され得る。
【００５８】
１種以上の治療薬および／または診断薬は、膜貫通ｐＨ勾配装薬を使用して、リポソーム中に取り込まれ得る。リポソームの外部の溶液のｐＨを上昇させることによって、ｐＨ差がリポソーム二重層全体に存在することになる。したがって、膜貫通能力がリポソーム二重層全体で形成され、１種以上の治療薬および／または診断薬は、膜貫通能力によって、リポソーム中に装薬される。
【００５９】
一般に、治療薬および／または診断薬：脂質比は、約０．０１：約０．５（ｗｔ／ｗｔ）である。一実施形態において、治療薬および／または診断薬：脂質比は、約０．１である。別の実施形態において、治療薬および／または診断薬：脂質比は、約０．３である。一実施形態において、ベシクルは、膜貫通イオン勾配を用いて調製し、治療薬または診断薬の被包をもたらす条件下で、弱酸性または弱塩基性の治療薬および／または診断薬でインキュベートする。別の実施形態において、ベシクルは、治療薬および／または診断薬の存在下で調製され、非被包物質が、透析、イオン交換クロマトグラフィ、ゲルろ過クロマトグラフィ、またはダイアフィルタによるろ過によって除去される。
【００６０】
装薬するための好適な実施形態は、米国特許第５，１９２，５４９号明細書に基づき、外部媒体からアンモニアを除去することを含む。その結果、ｐＨ勾配を誘発する、膜貫通アンモニア濃度勾配が形成される。薬物をベシクルに添加し、高温でインキュベートした後、「遠隔」装薬される。
【００６１】
好適な実施形態において、本質的に膜不透過性である薬剤（例えば、ガドジアミド等の診断薬）を用いる場合、薬剤は、リポソームを形成するために使用される緩衝液中に存在し、ベシクル形成時に受動的に被包される。この好適な方法は、他の両性イオン薬剤、例えば、メトトレキセートにも適用する。対照的に、弱塩基（および弱酸）は、リポソームに遠隔装薬され得る。
【００６２】
本明細書に記載されるリポソーム製剤は、中枢神経系領域への対流増進送達に使用することができ、ＣＥＤは、ＣＮＳ内で高い組織分散量を達成することができる。したがって、リポソーム製剤は、ＣＮＳ障害の治療に使用され得る。そのようなＣＮＳ障害には、ＣＮＳ腫瘍、例えば、膠芽細胞腫、およびニューロン細胞の機能不全に伴う障害、例えば、てんかんが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
したがって、ＣＮＳ障害の治療に使用される様々な治療薬は、本明細書に記載されるリポソーム製剤内に取り込むことができ、本明細書に記載される方法において使用される。そのような治療薬には、抗腫瘍薬、毒素、生体生成物質（例えば、ドーパミン、セロトニン）、神経栄養因子（例えば、ＧＤＮＦ、ＣＤＮＦ、ＭＡＮＦ）等が挙げられる。
【００６４】
一実施形態において、トポイソメラーゼＩ阻害剤（トポイソメラーゼＩ／ＩＩ阻害剤が挙げられるが、これに限定されない）は、本明細書に記載されるリポソーム製剤内に含有される。一実施形態において、トポイソメラーゼ阻害剤は、カンプロテカンまたはその誘導体である。例えば、一実施形態において、治療薬は、９−アミノカンプトテシン、７−エチルカンプトテシン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン、１０，１１−メチレンジオキシカンプトテシン、９−アミノ−１０，１１−メチレンジオキシカンプトテシン９−クロロ−１０，１１−メチレンジオキシカンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、７−（４−メチルピペラジノメトリレン）−１０，１１−エチレンジオキシ−２０（Ｓ）−カンプトテシン、７−（４−メチルピペラジノメチレン）−１０，１１−メチレンジオキシ−２０（Ｓ）−カンプトテシン、および７−（２−（Ｎ−イソプロピルアミノ）エチル）−（２０Ｓ）−カンプトテシンから成る群から選択される、カンプトテシン誘導体である。別の実施形態において、カンプトテシン誘導体は、イリノテカン、トポテカン、（７−（４−メチルピペラジノメチレン）−１０，１１−エチレンジオキシ−２０（Ｓ）−カンプトテシン、７−（４−メチルピペラジノメチレン）−１０，１１−メチレンジオキシ−２０（Ｓ）−カンプトテシン、または７−（２−（Ｎ−イソプロピルアミノ）エチル）−（２０Ｓ）−カンプトテシンから成る群から選択される。別の実施形態において、カンプトテシンは、トポテカンである。別の実施形態において、カンプトテシンは、トポテカンである。所定の薬剤が例示的に説明されるが、多数の他の薬剤も、本発明のリポソーム組成物内で適していることは、当業者には明らかとなる。
【００６５】
毒素、例えば、μ−コノトキシン（例えば、μ−コノトキシンＧＩＩＩＡ、μ−コノトキシンＧＩＩＩＢ、μ−コノトキシンＧＩＩＩＣ、μ−コノトキシンＰＩＩＩＡ、μ−コノトキシンＳｍＩＩＩＡ、μ−コノトキシンＫＩＩＩＡ等）、ω−コノトキシン（例えば、ω−コノトキシンＧＶＩＡ（本明細書では、「ω−コノトキシンＧ」および「ω−ＣＴＸ−Ｇ」とも称される）、ω−コノトキシンＭＶＩＩＡ（本明細書では、「ω−コノトキシンＭ」および「ω−ＣＴＸ−Ｍ」とも称される）、ボツリヌス毒素（例えば、ボツリヌス毒素Ａ（本明細書では、ＢＴＸ−Ａとも称される）、ボツリヌス毒素Ｂ（本明細書では、「ＢＴＸ−Ｂ」とも称される、ボツリヌス毒素Ｃ１、ボツリヌス毒素Ｄ、ボツリヌス毒素Ｅ、ボツリヌス毒素Ｆ等）、コナントキンペプチド（例えば、コナントキンＧ、コナントキンＴ、コナントキンＬ、コナントキンＳ１、コナントキンＯｃ、コナントキンＧｍ、コナントキンＣａ２、コナントキンＣａ１、およびコナントキンＱｕ）、その誘導体、ならびにその薬学的に許容される塩を含む、タンパク質毒素も、本明細書における使用が検討される。
【００６６】
一実施形態において、イモガイの毒に由来するコノトキシンは、主題の製剤を使用して送達され得る。毒の活性成分は、小ペプチド毒素であり、通常、１０〜３０個のアミノ酸残基の長さであり、通常、それらの高密度のジスルフィド結合に起因して著しく制約される。毒成分は、電圧依存性のイオンチャネル、リガンド依存性のイオンチャネル、およびＧタンパク質結合受容体に作用する。コノトキシンの薬学的選択性は、少なくとも部分的に、ジスルフィドループ内の超可変アミノ酸と結合される、特定のジスルフィド結合フレームワークによって決定される。コノトキシンペプチドの高い能力および優れた選択性に起因して、ヒトの障害の治療用に評価されているものもあり、これらのω−コノトキシンＭＶＩＩＡ（ジコノチド）のうちの１種であるＮ型カルシウムチャネルブロッカは、現在、髄腔内空間に挿入されるカテーテルとともに、埋込可能かつプログラム可能なポンプによって、ヒト患者の疼痛治療に使用されている。
【００６７】
本発明の特定の実施形態において、抗てんかん薬製剤は、ω−コノトキシン、例えば、ω−コノトキシンＧＶＩＡ、ω−コノトキシンＭＶＩＩＡ、およびω−コノトキシンＣＶＩＤを含む。例えば、Ｇａｓｉｏｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３２３：４５８−６８（２００７）を参照されたい。代替実施形態において、抗てんかん薬製剤は、μ−コノトキシン、例えば、μ−コノトキシンＧＩＩＩＡ、μ−コノトキシンＧＩＩＩＢ、μ−コノトキシンＧＩＩＩＣ、μ−コノトキシンＰＩＩＩＡ、μ−コノトキシンＳｍＩＩＩＡ、μ−コノトキシンＫＩＩＩＡを含む。例えば、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２８２：３０６９９−３０７０６（２００７）を参照されたい。他の実施形態は、本明細書に記載されるように、コノトキシンの誘導体または薬学的に許容される塩を利用する。
【００６８】
本明細書において、ボツリヌス菌に由来するボツリヌス毒素の使用も検討される。７つの免疫学的に明確なボツリヌス神経毒素が特徴付けられており、これらは、それぞれボツリヌス神経毒素血清型Ａ、Ｂ、Ｃ１、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧであり、それぞれ型特異的抗体を用いて中性化することによって区別される。異なる血清型のボツリヌス毒素は、それらが作用する動物種において、それらが誘発する麻痺の重篤度および期間が異なる。例えば、ボツリヌス毒素Ａ型は、ボツリヌス毒素Ｂ型よりも、ラットにおいてもたらされる麻痺率で測定されるように、５００倍強力であることが判明している。さらに、ボツリヌス毒素Ｂ型は、霊長類において、４８０Ｕ／ｋｇの用量で、非毒性であることが判明しており、これは、ボツリヌス毒素Ａ型に対する霊長類ＬＤ５０の約１２倍である。したがって、非Ａ型ボツリヌス毒素血清型は、薬効が低い場合があり、および／またはボツリヌス毒素Ａ型と比較して、活性の期間が短い場合がある。
【００６９】
すべてのボツリヌス毒素血清型は、明らかに、神経筋接合部において、神経伝達物質の放出を阻害するが、それらは、異なる神経分泌タンパク質に作用し、および／または異なる部位においてこれらのタンパク質を開裂させることによってそれを行う。例えば、ボツリヌス型Ａとボツリヌス型Ｅとは、いずれも２５キロダルトン（ｋＤ）のシナプトソーム関連タンパク質（ＳＮＡＰ−２５）を開裂させるが、それらは、このタンパク質内の異なるアミノ酸配列を標的とする。ボツリヌス毒素型Ｂ、Ｄ、Ｆ、およびＧは、ベシクル関連タンパク質（ＶＡＭＰ、スナプトブレビンとも呼ばれる）に作用し、各血清型は、タンパク質を異なる部位で開裂させる。最後に、ボツリヌス毒素型Ｃ１は、シンタキシンおよびＳＮＡＰ−２５の両方を開裂させることが示された。作用機序におけるこれらの差異は、様々なボツリヌス毒素血清型の作用の相対能力および／または期間に作用し得る。
【００７０】
インビトロでの研究は、ボツリヌス毒素が、一次細胞培養および脳シナプトソーム調製物からの様々な神経伝達物質のカリウム誘導性放出を阻害することを示した。グルタミン酸は、脳におけるシナプス興奮の大部分に関与する神経伝達物質であり、発作性放電の生成および拡散に不可欠であると考えられている。ボツリヌス毒素は、脊椎ニューロンの初代培養においてグルタミン酸の誘発放出を阻害すること、および脳シナプトソーム調整物において、ボツリヌス毒素は、グルタミン酸および他の神経伝達物質の放出を阻害することが報告されている。
【００７１】
本発明の一部の実施形態において、抗てんかん薬は、ボツリヌス毒素Ａまたはボツリヌス毒素Ｂである。他の実施形態において、毒素は、親毒素の生物活性を有するボツリヌス毒素Ａまたはボツリヌス毒素Ｂの断片または類似体である。他の実施形態において、毒素は、脳ニューロン上の適切な標的に対して特異的に結合するように修飾される。一部の実施形態において、組み換え技術を使用して、クロストリジウム神経毒素またはそれらの断片あるいは類似体を生成する。
【００７２】
本発明では、コナントキンの使用も意図され、それらは、米国特許第６，１７２，０４１号明細書および、米国特許第６，３９９，５７４号明細書に記載されるものを含み、それらの開示は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【００７３】
診断薬は、本明細書に記載されるように、リポソーム内にも封入され得る。適切な薬剤には、ＭＲＩで使用するための常磁性イオンが挙げられ、本明細書において「ＭＲＩ磁石」と称される。適切な金属イオンには、原子番号２２〜２９（境界値も含む）、４２、４４および５８〜７０（境界値も含む）を有するものが挙げられ、＋２または＋３の酸化状態を有する。そのような金属イオンの実施例は、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、プラセオジム（ＩＩＩ）、ネオジミウム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、エルビウム（ＩＩＩ）およびイッテルビウム（ＩＩＩ）である。
【００７４】
Ｘ線画像診断（例えば、ＣＴ）を使用してＣＥＤを監視する実施形態において、診断薬は、Ｘ線不透過物質を含み得る。適切なＸ線不透過物質は、よく知られており、ヨード化合物、バリウム化合物、ガリウム化合物、タリウム化合物等が挙げられる。Ｘ線不透過物質の特定の例には、バリウム、ジアトリゾエート、ヨード化ケシ油エチルエステル、クエン酸ガリウム、イオカルミン酸、ヨーセタム酸、ヨーダミド、ヨージパミド、ヨードキサム酸、イオグラミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオパノン酸、イオプロセム酸、イオセファム酸、イオセル酸、イオスラミドメグルミン、イオスメト酸、ヨータサル、ヨートラン酸、イオタラム酸、イオトロクス酸、イオキソトリロン酸、イポダート、メグルミン、メタザミド、メタゾエート、プロピリオドン、および塩化タリウムが挙げられる。
【００７５】
本明細書に記載されるように、リポソーム製剤は、対流増進送達に適している。
【００７６】
対流増進送達
【００７７】
対流増進送達（ＣＥＤ）は、バルクフロー機序を利用して、巨大分子を臨床的に有意な容積の固体組織に送達および分散させるための直接脳内薬物送達法である。ＣＥＤは、単純拡散よりも大量の分散を提供し、治療薬を特定の標的部位に案内するように設計されている。例えば、米国特許第５，７２０，７２０号明細書を参照されたい。この開示は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。つまり、対流増進送達（ＣＥＤ）は、血液−脳関門を回避し、大分子量の物質、例えば、薬物装薬リポソームが、均等に制御された状態で脳の規定された領域内に投与されるのを可能にする（例えば、米国特許出願第１１／７４０，５４８号明細書を参照されたい。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＣＥＤは、カテーテルを組織に直接挿入し、所定の流速、例えば、約０．１μＬ／分〜約１２μＬ／分でカテーテルを通って間質腔に入る圧力下で、薬剤を投与することによって、直接対流間質注入を通して、所定の時間に渡って、液体薬物（例えば、リポソーム製剤）を固体組織（例えば、脳腫瘍）に投与するために使用され得る。
【００７８】
本明細書において詳述されるように、本出願人は、ＣＥＤが、治療薬および任意で、非ペグ化リポソーム製剤に被包される診断薬の送達に効果的に使用され得、製剤は、少なくとも１種の中性飽和リン脂質および少なくとも１種の陰イオン飽和脂質の混合物を含むか、または本質的にそれらから成ることを発見した。実施例の項で説明されるように、少なくとも１種の治療薬（例えば、トポテカン）および／または本明細書に記載されるような非ペグ化リポソーム製剤に被包される診断薬を含む組成物のＣＥＤは、治療薬の分散量を増加させ、その血清半減期を劇的に向上させる。
【００７９】
リポソーム製剤（例えば、薬学的組成物）の投与に使用され得る適切な装置は、リポソーム製剤を充填した容器を含む、ポンプ装置を備え得る。ポンプは、体外に配置されても、または体内に埋め込まれてもよい。ポンプは、カテーテルに接続されてもよく、カテーテルがＣＮＳ内の個々の組織に埋め込まれ得る。ポンプは、溶質を特定の組織内で対流させる圧力および流速で、リポソーム製剤を放出するように活性化され得る。
【００８０】
リポソーム製剤を、個々の組織を通して、個々の組織に隣接する領域に分散させるように、例えば、リポソーム製剤が脳脊髄液に入らないように、注入の期間および他のパラメータが調整され得る。個々の組織のサイズおよび形状に応じて、複数の埋め込まれた注入カテーテルを使用するか、または複数の溶液出口ポートを有する注入カテーテルを使用する必要があり得る。
【００８１】
ＣＥＤを使用して、リポソーム製剤は、微細カニューレを通して、陽圧下で間質腔にゆっくり注入することによって分散され得る。ポンプに由来する静水圧によって駆動されるバルクフローは、ＣＮＳの細胞外空間内でリポソーム製剤を分散させるように使用され得る。ＣＥＤの使用は、カニューレの先端を介して、神経組織内での直接リポソーム製剤の分散を可能にするため、血液−脳関門がバイパスされ、中枢神経系における個々の組織、例えば、癌性であると規定された個々の組織、または従来の手術前評価によって切除対象として識別された個々の組織、および複数の病巣を治療する必要がある場合は、異なる病巣における個々の組織が標的とされ得る。バルクフローの特性に基づいて、ＣＥＤは、様々な量のリポソーム製剤を確実、安全、かつ均等に分散させるために使用され得る。例えば、米国特許出願第１１／７４０，５０８号明細書を参照されたい。さらに、ＣＥＤは、注入された組織に対して構造的または機能的損傷をもたらさず、リポソーム製剤の分散に対する優れた制御を提供する。さらに、リポソーム製剤は、リポソーム製剤に含まれるリポソームの分子量に関係なく、注入量に比例する分散量を通して均等に分散され得る。
【００８２】
一実施形態において、超微細送達カテーテル（新規の「ステップ」設計で、ポリウレタンおよび溶融シリカで構成される）が、経皮ポートとともに恒久的に埋め込まれてもよい。新規のカテーテル設計は、急速に生体と一体化され得、内的に密閉およびろ過されて、細菌の侵入を回避し、さらなる安全性のためにキャップされ得る。リポソーム製剤は、必要に応じて、このカテーテルシステムのポートを通じて注入され得る。
【００８３】
本明細書に記載される一実施形態において、ＣＥＤは、注入ポンプを使用して、脳領域内に恒久的に埋め込まれた小径カテーテルにより適用され得る。投与されるリポソーム製剤は、等張水溶液、または他の適切な製剤として調製され得る。投与（例えば、注入）中に、リポソーム溶液は、細胞外空間内を流れ得、脳組織に対する損傷が最小限度に抑えられるか、または損傷をもたらさない。
【００８４】
一実施形態において、特に経皮ＣＥＤ送達用に設計された超微細（先端において０．２ｍｍＯＤ）、最小侵襲性カテーテルシステムを使用してもよい。カテーテルシステムは、ステップ設計を有し、カテーテルの側面に沿って、溶液のかん流を排除し得る。そのような溶液の漏出は、直線的な側面のカテーテルにとって大きな問題である。カテーテルシステムは、生体適合性が高く、ＭＲＩ信号を妨害しないように、ポリウレタンおよび溶融シリカ、またはＰｅｅｋ  Ｏｐｔｉｍａで構成され得る。ＣＮＳ障害の治療は、異なる間隔、例えば、週間隔、月間隔等で、リポソーム製剤の再投与を必要とし得る。例えば、米国特許出願第１１／７４０，１２４号明細書を参照されたい。この開示は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。経皮ポートは、間隔期間中に、キャップされたままであり得る。複数のカテーテル設計は、単一カテーテルを用いて可能なより広い領域の個々の組織をかん流させることが可能であり得る。ＣＥＤ注入後のリポソームの分散量は、注入された溶液量に線形相関することが判明した。
【００８５】
特に好適なカニューレは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｋｒａｕｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００５；１０３（５）９２３−９、ならびに参照によりその全体が本明細書に組み込まれる特許出願公開第ＵＳ２００７／００８８２９５  Ａ１号明細書、および参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００６／０１３５９４５  Ａ１号明細書に開示されている。
【００８６】
一実施形態において、ＣＥＤは、約０．１μＬ／分から約１０μＬ／分の間の注入速度を含む。別の実施形態において、ＣＥＤは、約０．１μＬ／分から約０．３μＬ／分の注入速度、例えば、約０．２μＬ／分、より好ましくは、約０．７μＬ／分超、より好ましくは、約１μＬ／分超、より好ましくは、約１．２μＬ／分超、より好ましくは、約１．５μＬ／分超、より好ましくは、約１．７μＬ／分超、より好ましくは、約２μＬ／分超、より好ましくは、約２．２μＬ／分超、より好ましくは、約２．５μＬ／分超、より好ましくは、約２．７μＬ／分超、より好ましくは、約３μＬ／分超、および好ましくは、約１２μＬ／分未満、より好ましくは、約１０μＬ／分未満を含む。
【００８７】
好適な実施形態において、ＣＥＤは、送達中に、「ステッピング」または増加適定（ｕｐ−ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）と称される流速の増分増加を含む。好ましくは、ステッピングは、約０．１μＬ／分および約１０μＬ／分の間の注入速度を含む。
【００８８】
好適な実施形態において、ステッピングは、約０．５μＬ／分超、より好ましくは、約０．７μＬ／分超、より好ましくは、約１ｍＬ／分超、より好ましくは、約１．２μＬ／分超、より好ましくは、約１．５μＬ／分超、より好ましくは、約１．７μＬ／分超、より好ましくは、約２μＬ／分超、より好ましくは、約２．２μＬ／分超、より好ましくは、約２．５μＬ／分超、より好ましくは、約２．７μＬ／分超、より好ましくは、約３μＬ／分超、および好ましくは、約１２μＬ／分未満、より好ましくは、約１０μＬ／分未満の注入速度を含む。
【００８９】
本明細書における治療方法は、好ましくは、標的の位置特定およびカニューレの誘導配置のための診断薬による神経画像診断、好ましくはＭＲＩも含む。好ましくは、診断薬の神経画像診断と併せて、定位固定ホルダを使用し、標的ニューロン集団、またはその近位にカニューレを誘導配置する。トレース剤は、好ましくは、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）またはＸ線コンピュータ断層撮影によって検出可能である。トレース剤の分散を監視し、高分子量神経治療薬の分散の間接的測定として使用する。この監視は、非標的組織への注入剤の望ましくない送達を検出し、高分子量神経治療薬が、標的組織に到達し、そこで有効濃度を達成していることを検証するために行う。
【００９０】
一実施形態において、診断薬は、治療薬とは異なる。診断薬は、治療薬の速度と相関する速度で分散するため、治療薬分散の間接的な指標である。好適な実施形態において、診断薬および治療薬は、個別に投与されるが、同一の非ペグ化陰イオンリポソーム製剤によって被包され、極めて類似した分散特性を付与する。別の実施形態において、診断薬および治療薬は、共投与される。
【００９１】
本明細書における治療方法は、好ましくは、注入剤の分散を監視するための神経画像診断も含む。好適な実施形態において、治療方法は、注入される本発明の薬学的組成物の分散を監視するためのＭＲＩの使用を含み、薬学的組成物は、ＭＲＩ磁石を含む。
【実施例】
【００９２】
実施例１  ＣＥＤ用のペグ化リポソーム製と非ペグ化リポソーム製剤との比較
【００９３】
実施例１．１  材料および方法
【００９４】
実施例１．１．１：ＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ（６０／４０モル比）
【００９５】
２６．１ｍｇのＤＳＰＣ（ＭＷ７９０、ロット＃Ｃ３Ｌ００６、実重量２６．２ｍｇ）＋８．５ｍｇのコレステロール（ＭＷ３８７、ロット＃ＣＨ１Ｓ００３、実重量８．８ｍｇ）を計量する。
【００９６】
０．５ｍＬのクロロホルムに溶解させ、ＥｔＯＨ中の７５μＬ  ５ｍｇ／ｍＬのＲｈＰＥ（０．２モル％のリン脂質）を添加する。
【００９７】
渦動させながら、試料を窒素下で乾燥させて薄膜を形成する。真空下で１時間、乾燥を完了させる。
【００９８】
１．５ｍＬのＨＢＳ（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−１４５ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０、０．１１９２ｇのＨＥＰＥＳ［ＭＷ２３８．３］＋０．８４７５ｇのＮａＣｌ［ＭＷ５８．４５］、ｐＨをＮａＯＨで調整し、量を１００ｍＬにする）中で脂質を６０℃で再水和し、ＭＬＶを形成する。
【００９９】
６０℃で２ｘ１００ｎｍのフィルタから押出して、ＬＵＶを得る（標的サイズ１００〜１２０ｎｍ）。
【０１００】
リン酸塩の測定−２０ｍＭ  リン脂質に希釈する。
【０１０１】
２．０ｍＬの血清バイアル（事前に脱発熱化）に入れる。
【０１０２】
実施例１．１．２：ＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ＰＥＧｚｏｏｏＤＳＰＥ（５９．５／４０／０．５モル比）
【０１０３】
２５．８ｍｇのＤＳＰＣ（ＭＷ７９０、ロット＃Ｃ３Ｌ００６、実重量２５．６ｍｇ）＋８．５ｍｇのコレステロール（ＭＷ３８７、ロット＃ＣＨ１  Ｓ００３、実重量８．７ｍｇ）＋０．７５ｍｇのＰＥＧ2000ＤＳＰＥ（ＭＷ２７７４、ロット＃ＰＰＥ２０１１８０９、実重量５０μＬの１５ｍｇ／ｍＬ  ＣＨＣｌ3溶液を計量し、１．２ｍＬ  ＣＨＣｌ3中で１８ｍｇ［実重量１７．９ｍｇ］を調製する。
【０１０４】
０．５ｍＬのクロロホルムに溶解させ、７５μＬのＲｈＰＥ（０．２モル％のリン脂質）を添加する。
【０１０５】
渦動させながら、試料を窒素下で乾燥させて薄膜を形成する。真空下で１時間、乾燥を完了させる。
【０１０６】
１．５ｍＬのＨＢＳ（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−１４５ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０）中で脂質を６０℃で再水和し、ＭＬＶを形成する。
【０１０７】
６０℃で２ｘ１００ｎｍのフィルタから押出して、ＬＵＶを得る（標的サイズ１００〜１２０ｎｍ）。
【０１０８】
リン酸塩の測定−２０ｍＭ  リン脂質に希釈する。２．０ｍＬの血清バイアル（事前に脱発熱化）に入れる。
【０１０９】
実施例１．１．３：ＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ＰＥＧ2000ＤＳＰＥ（５５／４０／５モル比）
【０１１０】
２３．９ｍｇのＤＳＰＣ（ＭＷ７９０、ロット＃Ｃ３Ｌ００６、実重量２３．８ｍｇ）＋８．５ｍｇのコレステロール（ＭＷ３８７、ロット＃ＣＨ１  Ｓ００３、実重量８．６ｍｇ）＋７．５ｍｇのＰＥＧ2000ＤＳＰＥ（ＭＷ２７７４、ロット＃ＰＰＥ２０１１８０９、実重量５００μＬの１５ｍｇ／ｍＬＣＨＣｌ3溶液）を計量する。
【０１１１】
０．５ｍＬのクロロホルムに溶解させ、７５μＬのＲｈＰＥ（０．２モル％のリン脂質）を添加する。
【０１１２】
渦動させながら、試料を窒素下で乾燥させて薄膜を形成する。真空下で１時間、乾燥を完了させる。
【０１１３】
２．０ｍＬのＨＢＳ（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−１４５ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０）中で脂質を６０℃で再水和し、ＭＬＶを形成する。
【０１１４】
６０℃で２ｘ１００ｎｍのフィルタから押出して、ＬＵＶを得る（標的サイズ１００〜１２０ｎｍ）。
【０１１５】
リン酸塩の測定−２０ｍＭ  リン脂質に希釈する。
【０１１６】
２．０ｍＬの血清バイアル（事前に脱発熱化）に入れる。
【０１１７】
実施例１．１．４：ＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ＮＧ−ＤＯＰＥ（５５／４０／５モル比）
【０１１８】
２３．９ｍｇのＤＳＰＣ（ＭＷ７９０、ロット＃Ｃ３Ｌ００６、実重量２４．２ｍｇ）＋８．５ｍｇのコレステロール（ＭＷ３８７、ロット＃ＣＨ１  Ｓ００３、実重量８．９ｍｇ）＋２．４ｍｇのＮＧ−ＤＯＰＥ（ＭＷ８８０  １３、ロット＃０５０３２８Ｌ、実重量２．４ｍｇ）を計量する。
【０１１９】
０．５ｍＬのクロロホルムに溶解させ、７５μＬのＲｈＰＥ（０．２モル％のリン脂質）を添加する。
【０１２０】
渦動させながら、試料を窒素下で乾燥させて薄膜を形成する。真空下で１時間、乾燥を完了させる。
【０１２１】
２．０ｍＬのＨＢＳ（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−１４５ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０）中で脂質を６０℃で再水和し、ＭＬＶを形成する。
【０１２２】
６０℃で２ｘ１００ｎｍのフィルタから押出して、ＬＵＶを得る（標的サイズ１００〜１２０ｎｍ）。
【０１２３】
リン酸塩の測定−２０ｍＭ  リン脂質に希釈する。
【０１２４】
２．０ｍＬの血清バイアル（事前に脱発熱化）に入れる。
【０１２５】
実施例１．１．５：ＤＳＰＣ／ＰＥＧ2000ＤＳＰＥ（９９／１モル比）
【０１２６】
２５．８ｍｇのＤＳＰＣ（ＭＷ７９０、ロット＃Ｃ３Ｌ００６、実重量２６．１ｍｇ）＋０．９ｍｇのＰＥＧ2000ＤＳＰＥ（ＭＷ２７７４、ロット＃ＰＰＥ２０１１８０９、実重量６０μＬの１５ｍｇ／ｍＬ  ＣＨＣｌ3溶液）を計量する。
【０１２７】
０．５ｍＬのクロロホルムに溶解させ、７５μＬのＲｈＰＥ（０．２モル％のリン脂質）を添加する。
【０１２８】
渦動させながら、試料を窒素下で乾燥させて薄膜を形成する。真空下で１時間、乾燥を完了させる。
【０１２９】
２．０ｍＬのＨＢＳ（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−１４５ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０）中で脂質を６０℃で再水和し、ＭＬＶを形成する。
【０１３０】
６０℃で２ｘ１００ｎｍのフィルタから押出して、ＬＵＶを得る（標的サイズ１００〜１２０ｎｍ）。
【０１３１】
リン酸塩の測定−２０ｍＭ  リン脂質に希釈する。
【０１３２】
２．０ｍＬの血清バイアル（事前に脱発熱化）に入れる。
【０１３３】
実施例１．１．６：ＤＳＰＣ／ＰＥＧ2000ＤＳＰＥ（９５／５モル比）
【０１３４】
２４．８ｍｇのＤＳＰＣ（ＭＷ７９０、ロット＃Ｃ３Ｌ００６、実重量２４．６ｍｇ）＋４．６ｍｇのＰＥＧ2000ＤＳＰＥ（ＭＷ２７７４、ロット＃ＰＰＥ２０１１８０９、実重量３０７μＬの１５ｍｇ／ｍＬ  ＣＨＣｌ3溶液）を計量する。
【０１３５】
０．５ｍＬのクロロホルムに溶解させ、７５μＬのＲｈＰＥ（０．２モル％のリン脂質）を添加する。
【０１３６】
渦動させながら、試料を窒素下で乾燥させて薄膜を形成する。真空下で１時間、乾燥を完了させる。
【０１３７】
１．５ｍＬのＨＢＳ（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−１４５ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０）中で脂質を６０℃で再水和し、ＭＬＶを形成する。
【０１３８】
６０℃で２ｘ１００ｎｍのフィルタから押出して、ＬＵＶを得る（標的サイズ１００〜１２０ｎｍ）。
【０１３９】
リン酸塩の測定−２０ｍＭ  リン脂質に希釈する。
【０１４０】
２．０ｍＬの血清バイアル（事前に脱発熱化）に入れる。
【０１４１】
実施例１．１．７：ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ（７０／３０モル比）
【０１４２】
１８．２ｍｇのＤＳＰＣ（ＭＷ７９０、ロット＃Ｃ３Ｌ００６、実重量１８．１ｍｇ）＋７．４ｍｇのＤＳＰＧ（ＭＷ７４５、ロット＃Ｇ３Ｌ００６、実重量７．６ｍｇ）を計量する。
【０１４３】
０．５ｍＬのクロロホルム／ＭｅＯＨ（９／１、ｖ／ｖ）に溶解させ、７５μＬのＲｈＰＥ（０．２モル％のリン脂質）を添加する。
【０１４４】
渦動させながら、試料を窒素下で乾燥させて薄膜を形成する。真空下で１時間、乾燥を完了させる。
【０１４５】
２．０ｍＬのＨＢＳ（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−１４５ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．５）中で脂質を６０℃で再水和し、ＭＬＶを形成する。
【０１４６】
６０℃で２ｘ１００ｎｍのフィルタから押出して、ＬＵＶを得る（標的サイズ１００〜１２０ｎｍ）。
【０１４７】
リン酸塩の測定−２０ｍＭ  リン脂質に希釈する。
【０１４８】
２．０ｍＬの血清バイアル（事前に脱発熱化）に入れる。
【０１４９】
実施例１．１．８：リン酸塩の測定
【０１５０】
試料１／５０（２０μＬ〜１．０ｍＬ）を水で希釈し、濃度を最大０．４ｍＭにする。
【０１５１】
各希釈試料を３×２００μＬに等分する。
【０１５２】
ＡＣＭ−０１０によるリン酸塩の測定
【０１５３】
実施例１．２：結果
【０１５４】
図１Ａ〜１Ｆを参照。
【０１５５】
実施例２：齧歯類の脳に脳内送達されるナノリポソーム化合物の薬理学評価
【０１５６】
実施例２．１：材料および方法
【０１５７】
実施例２．１．１：被検物質
【０１５８】
本実施例における実験は、リポソーム−トポテカン（Ｌｓ−ＴＰＴ）およびリポソームガドジアミド（Ｌｓ−ＧＤ）の両方の研究グレード材料を用いて行った。トポテカン製剤およびＬｓ−ＴＰＴ調製物用のトポテカン（ＴＰＴ）は、Ｈｉｓｕｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（中国浙江省台州市）から入手した。Ｌｓ−ＴＰＴは、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ  ｌｎｃ（カナダ国ブリティッシュコロンビア州バーナビー）により提供された。つまり、リポソームは、リポソームは、７：２：１のモル比のジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、およびコレステロールで、７５〜９０ｎｍ標的サイズで構成された。トポテカンは、それぞれ硫酸アンモニウム２５０ｍＭ  ｐＨ５．５およびヒスチジン５ｍＭ／ＮａＣｌ１４５ｍＭ  ｐＨ６．０から成る、内部および外部緩衝液を使用して、膜貫通ｐＨの勾配に応答して、リポソーム中に遠隔装薬した（能動的に被包された）。０．１および０．３（ｗ／ｗ）薬物脂質比を有する０．６７および２．０ｍｇ／ｍＬのトポテカン濃度は、それぞれ９０〜９５％の薬物被包効率を想定して目標を設定した。一定の総脂質濃度目標である６．７ｍｇ／ｍＬを、両方の製剤に維持した。製造工程は、実施例２．１．２．に詳述される。
【０１５９】
Ｌｓ−ＧＤ調製物用のガドジアミド（ＧＤ）は、Ｂｅｉｊｉｎｇ  ＳＨＬＨＴ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｒａｄｅ（中国北京）から入手した。Ｌｓ−ＧＤは、ガドジアミドがリポソームに受動的に被包されたことを除いて、Ｌｓ−ＴＰＴと同様に調製した。内部緩衝液は、２５０ｍＭの硫酸アンモニウムの代わりに、５２０ｍＭのガドジアミド、ｐＨ５．５で構成した。４〜６％の被包効率を想定して、ガドジアミド対脂質比０．３（ｗ／ｗ）および粒径７５〜１２０ｎｍに目標を設定した。最終製剤の脂質およびガドジアミド濃度は、それぞれ５１．１ｍｇ／ｍＬおよび１７．０ｍｇ／ｍＬであった。
【０１６０】
特に明記されない限り、Ｌｓ−ＴＰＴ被検物質は、冷凍保存した（−２０〜−３０℃）。投与溶液は、投与する日に新たに調製し、室温で保持した。５ｍＭ  ヒスチジン、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．０、３００ｍＭスクロース原液（Ｌｓ−ＴＰＴおよび遊離トポテカン）を用いて適切な希釈を行い、所望の濃度を得た。貯蔵被検物質溶液の新しいバイアルを、各投与日に使用した。
【０１６１】
実施例２．１．２：リポソーム製造工程
【０１６２】
バッチに必要とされる脂質の量を計算し、脂質粉末を計量ボートに計量した。ｔ−ブタノール、エタノール、および水（４５：４５：１０、ｖｏｌ／ｖｏｌ）から成る溶媒溶液を調製し、７０℃に加熱した。攪拌しながら、脂質粉末を溶媒溶液に添加した。溶媒を７０℃で維持し、すべての脂質が溶解するまで攪拌した（最長１時間）。溶液中の脂質濃度は、この時点で３２０ｍｇ／ｍＬであった。硫酸アンモニウムの２５０ｍＭ溶液を調製し（体積は脂質溶媒溶液の９倍）、７０℃に加熱した。硫酸アンモニウムが温度に到達した後、脂質溶液を、攪拌しながら硫酸アンモニウム溶液に注ぎ入れ、多重膜小胞（ＭＬＶ）を生成した。ＭＬＶを７０℃で維持し、８０ｎｍの孔の開いた４層ポリカーボネートフィルタから押出した。所望のサイズ（７５〜９０ｎｍの平均直径）の大きい単層小胞（ＬＵＶ）を生成するために、２回の通過が必要であった。リポソームのサイズは、押出器を通過する毎に、ＱＥＬＳによって測定した。ＬＵＶは、それらが所望のサイズに縮小されるまで７０℃で維持し、次に、ＬＵＶは、１０％溶媒において、最大５５℃の相転移温度以下で不安定であったため、ヒスチジン生理食塩水ｐＨ６．０緩衝液を用いて、５％溶媒濃度まで希釈した。次に、ＬＵＶを、限界ろ過によって最大５０ｍｇ／ｍＬの総脂質に再濃縮し、続いて、１０洗浄量の１０ｍＭヒスチジン、１４５ｍＭのＮａＣｌ緩衝液に対してダイアフィルタでろ過して溶媒を除去し、硫酸アンモニウムからの外部緩衝液を、ｐＨ６．０ヒスチジン緩衝液に交換した。この緩衝液交換は、膜貫通ｐＨ勾配を作りだし、これを使用して、トポテカンを事前形成されたリポソーム中に装薬した。次に、リン酸塩測定によって総脂質濃度を決定した。脂質の総量を決定した後、脂質の総質量にそれぞれ０．１および０．３を掛けることによって、０．１：１または０．３：１（ｗ／ｗ）薬物脂質比を達成するために必要なトポテカンの量を計算する。最終薬物脂質比０．１：１または０．３：１（ｗ／ｗ）を達成するために、９０％の装薬効率を想定した。必要とされるトポテカンの総量を計算した後、粉末を清潔なボトルに計量した。ＬＵＶ懸濁液を６０℃に加熱し、トポテカン粉末を添加した。薬物添加に続いて６０分間、トポテカンを装薬させて、リポソーム中への最適な装薬を保障した。薬物装薬に続いて、非被包トポテカンを、５洗浄量の５ｍＭヒスチジン、３００ｍＭスクロースｐＨ６．０緩衝液を用いて、ダイアフィルタによるろ過で除去した。このステップも、塩化ナトリウム溶液からの外部緩衝液を、抗凍結剤として機能させ、その物理特性を変えることなく製剤を凍結させることができるスクロースに交換するように作用した。推定脂質含有量は、この段階で、８．３ｍｇ／ｍＬであった（薬物脂質比が０．３：１の場合）。製剤を５０℃に加熱し、０．２μｍシリンジフィルタに通した。次に、生成物をバイアルに入れた。最後に、生成物を凍結させて、製造工程を完了する。
【０１６３】
実施例２．１．３：動物およびグループ分け
【０１６４】
体重２５０−３５０ｇの成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ，インディアナ州インディアナポリス）（バッチ１２０８０６および０１０５０７）を使用した。
【０１６５】
本実施例の製剤スクリーニング成分に対して、表１に概説されるようなＬｓ−ＴＰＴ製剤または遊離トポテカンに基づいて、動物を４つのグループに分割した。
【表１】
0005795537.tif 000002
Ｆ１：ＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ  ０．１  ＤＬ比  Ｌｓ−ＴＰＴ０．５ｍｇ／ｍＬ＋Ｌｓ−ＧＤ１．１５ｍｇ／ｍＬ
Ｆ２：ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／ＣＨＯＬ  ０．３  ＤＬ比  Ｌｓ−ＴＰＴ０．５ｍｇ／ｍＬ＋Ｌｓ−ＧＤ１．１５ｍｇ／ｍＬ
Ｆ３：ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／ＣＨＯＬ０．１  ＤＬ比  Ｌｓ−ＴＰＴ  ０．５ｍｇ／ｍＬ＋Ｌｓ−ＧＤ１．１５ｍｇ／ｍＬ
Ｆ４：遊離トポテカン０．５ｍｇ／ｍＬ
ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ＝ジステアロイルホスファチジルコリン／ジステアロイルホスファチジルグリセロール
Ｃｈｏｌ＝コレステロール
ＤＬ比＝薬物脂質比（ｗ／ｗ）
Ｌｓ−ＴＰＴ＝リポソームトポテカン
Ｌｓ−ＧＤ＝リポソームガドジアミド
【０１６６】
比較可能な群平均体重および標準偏差を達成するように、ラットを体重に基づいてグループ分けした。次に、該グループを、ランダムに治療および時点に割り当てた。
【０１６７】
実施例２．１．４：外科的処置
【０１６８】
イソフルラン（導入時は５％、手術中の維持の場合は２．５〜３．０％）吸入またはケタミン（６０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（８ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせの腹腔内注入のいずれかによって、ラットに麻酔をかけた。頭蓋の皮膚を剃毛し、動物を定位フレームに載置し、耳バーおよび切歯バーを使用して頭部を配置した。すべての外科的処置に対して無菌法を使用した。皮膚を７０％アルコール、続いてベタジン溶液で消毒した。頭蓋上部の皮膚を縦方向に切開し、鈍的切開を使用して、頭蓋を覆う結合組織を除去した。小型の歯科用電気ドリルを使用して、頭蓋骨切除術を行い、ブレグマから０．５ｍｍ前方、および３ｍｍ左と右に直径１ｍｍの穿頭孔を開けた。自動ポンプ（ＢＡＳｉ，Ｉｎｃ．，インディアナ州ウェストラフィエット）に接続された溶融シリカカニューレ（ＯＤ１６８μｍ、ＩＤ１０２μｍ）（ＰｏｌｙＭｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，アリゾナ州フェニックス）をＣＥＤに使用し、適切な背腹座標に低下させた（−３．３ｍｍで歯バーを用いて−４．５〜−５ｍｍ）。背腹座標は、軟膜表面から計算した。カニューレを、１０μＬのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジと接続された２７ゲージニードルに挿入し、強力瞬間接着剤で管に固定した。被検物質を両側で一度に各線条体に注入した。本研究では、漸進的注入速度の増分を使用して、半球当たり２０μＬ用量を０．２μＬ／分（１５分）、続いて０．５μＬ／分（１０分）および０．８μＬ／分（１５分）で達成した。注入完了後に、カニューレを所定の位置に５分間留置して、注入液の流出を最小限にした後、徐々に回収した。
【０１６９】
処置の終了後、ラットを通風のない環境内で維持し、加熱ランプまたは水ボトル、あるいは他の適切な加温方法で保温し、麻酔からの回復を監視した。ブプレノルフィンを、必要に応じて皮下投与した。ホームケージに戻す前に、ラットを処置室で回復させた。
【０１７０】
実施例２．１．５：組織の採取および処理
【０１７１】
所定の時点において、動物にイソフルラン（２．５％）で麻酔をかけ、０．９％生理食塩水で心臓内かん流を行った。
【０１７２】
試験中に死亡したか、または屠殺された（予定および予定外）すべての動物の完全な全身剖検を、剖体および筋肉／骨格系、すべての外表面および開口部、頭蓋腔および脳の外表面、関連器官および組織を伴う頸部、関連器官および組織を伴う胸部、腹部、および骨盤腔に対して行った。
【０１７３】
脳を除去して、氷上に置き、背面アプローチを使用して線条体を切除し、組織を液体窒素中で凍結させた。続いて、組織を等量の水（１：１ｖ／ｖ）で均質化し、次にメタノールで抽出して、後援者に出荷するまで−７０℃で保存した。本実施例の製剤組織および血漿薬物動態成分用に尾静脈血を採取した（１．０ｍＬ）。
【０１７４】
実施例２．１．６：ＨＰＬＣ
【０１７５】
脳組織および血漿中の総トポテカン（遊離およびリポソーム被包）の高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）が、等張逆相ＨＰＬＣ／ＵＶ法を使用して、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ  Ｉｎｃ．（カナダ国ブリティッシュコロンビア州バーナビー）によって行われた。方法の詳細は、以下のとおりである。簡単に説明すると、動物（ｎ＝３）を１時間および６時間、２日、４日、および７日目に屠殺した。脳を除去して、氷上に置き、背面アプローチを使用して線条体を切除し、組織を液体窒素中で凍結させた。等量の氷冷水（１：１ｗ／ｗ）を添加し、解凍した組織を機械的に２分間均質化して（Ｂｉｏｓｐｅｃ）、凍結させた。分析するために凍結ホモジネートをＮＬＩに出荷した。２００μＬの解凍ホモジネート試料を、８００μＬの冷メタノール（１：４）を含有するエッペンドルフ管に移し、１２，０００ｒｐｍで２〜５分間遠心分離した。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ  Ｉｎｃ（カナダ国ブリティッシュコロンビア州バーナビー）による有効な逆相ＨＰＬＣ法を使用して、上澄み液２００μＬを即時分析用、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）による分析用に自動サンプラーバイアルに入れる（または最長３ヶ月以内の分析まで−７０℃で保存される）。ＴＰＴの場合、ラクトン体にはメタノール：水：トリフルオロ酢酸（４０：６０：０．０２）を利用し、カルボン酸体には、２０ｍＭホウ酸塩緩衝剤メタノール（６０：４０）を利用して、標準物質を新たに調製した。分析は、Ｗａｔｅｒｓ２６９０／５  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅ  ａｎｄ  ＥｍｐｏｗｅｒソフトウェアＨＰＬＣシステム上で、Ｃ１８逆相シリカカラム［Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｉｎｃ  Ｌｕｎａ  Ｃ−１８（２）カラム、２５０ｍｍ  ｘ  ４６ｍｍ  内径、５μｍ粒径、周囲温度］を用いて、Ｃ１８セキュリティガードカートリッジ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｉｎｃ，４×３．０ｍｍ）によって行った。試料を自動サンプラートレイに５±３℃で置き、試料注入量３０〜５０μＬを使用し、カラムを流速１．０ｍＬ／分で、移動相Ａ３％トリエチルアミン酢酸緩衝液、ｐＨ５．５（ＴＥＡＡ）および移動相Ｂアセトニトリル３％ＴＥＡＡ（５０：５０）から成る移動相により溶出した。勾配溶出は、最初の５ｍｍにおいて７８：２２  Ａ：Ｂ〜５０：５０  Ａ：Ｂ、３ｍｍ保持されて、０．５ｍｍにおいて最初に戻り、実行時間の合計は１５分であった。トポテカンは、Ｗａｔｅｒｓ  ２４７５  Ｍｕｌｔｉ  λ蛍光検出器（誘起３８０ｎｍ、発光５２０ｎｍ）で検出された。トポテカンカルボン酸およびラクトン形態の典型的な保持時間は、それぞれ５．５および７．５ｍｍであった。この方法は、０．８ｎｇ／ｍＬ〜２４０ｎｇ／ｍＬの範囲に渡って、良好な感度および線形性を有する。ＴＰＴの抽出方法回復因子は０．９であった。
【０１７６】
実施例２．１．７：早期死亡／予定外の屠殺
【０１７７】
動物が試験時に死亡した場合、死亡時刻は、可能な限り厳密に推定および記録し、剖検を可能な限り早急に行った。剖検をすぐに行うことができなかった場合、動物を冷蔵して（冷凍ではない）、組織の自己消化を最小限に抑えた。剖検は、死後１２時間以内に行った。
【０１７８】
動物の健康状態が不良であるか、または死が近づいていると思われる場合は、安楽死させ得る。可能であれば、必要に応じて血液または他の標本を採取および分析して（例えば、臨床病理パラメータ用）、倦怠感／死亡の原因の解明を支援した。
【０１７９】
実施例２．１．８：統計的手法
【０１８０】
連続（Ｎ、平均および標準偏差）およびカテゴリ（Ｎ、％）データの記述統計学は、適切な場合、表形式および図式の両方で提示される。薬物（ｔ１／２）の組織半減期、クリアランス（ＣＬ）、脳内の平均滞留時間（ＭＲＴ）、および濃度対時間曲線（ＡＵＣ）下の領域を含む、薬物動態（ＰＫ）パラメータは、すべてＷｉｎＮｏｎｌｉｎ５．０（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，米国カリフォルニア州マウンテンビュー）を利用して、非コンパートメント薬物動態データ分析によって決定した。
【０１８１】
実施例２．１．９：動物の飼育
【０１８２】
各動物は、番号付き耳タグおよびケージカードによって識別した。試験施設に到着すると、試験処置の最低３日前に、試験動物を部屋に順化させた。試験中は、少なくとも１日１回、それらのケージ内で、飼育スタッフによる日常的な飼育中に動物を観察した。各動物は、全体的な健康状態の変化について観察した。何らかの疾患の兆候があれば、すぐに担当の獣医および研究主任に報告した。
【０１８３】
薬物注入に先立って体重を測定し、屠殺は、２、４、７、および１０日目に予定された。
【０１８４】
摂餌量は、飼育スタッフによって、各動物に対して、手術の前日に開始して屠殺するまで毎日評価した。摂餌量は、１日の飼料の残りを目視観測することによって評価した。飢餓または脱水の証拠は、担当獣医および研究担当者に報告し、適切な対応を行った。
【０１８５】
実施例２．２：結果
【０１８６】
実施例２．２．１：誘導体
【０１８７】
２つの動物バッチ（バッチ１２０８０６および０１０５０７）を試験に使用した。６時間、２日、４日、および７日後の時点で動物を屠殺し、全体剖検において、異なる時点で屠殺した数匹の動物における経心臓的かん流時に、心肥大を観察した。観察される心肥大が、被検物質または動物バッチ／株と関連したか否かを決定するために、異なる動物バッチ（バッチ０１０５０７）を１時間の時点で使用し、初期バッチ（バッチ１２０８０６）から１５匹の動物を対照として使用した。対照群は、外科的処置、または任意の被検物質を何も受けていなかった。
【０１８８】
実施例２．２．２：製剤スクリーニング薬物動態
【０１８９】
この試験コンポーネントに対して予定された数の動物（６０）を試験した。屠殺する前に体重を評価した時点で（２日、４日、７日）、ベースラインと屠殺との間に、有意な体重の喪失（４０％以上）は認められなかった。１時間の時点で、４匹の動物を交換する必要があった。２匹は麻酔により死亡し、１匹は被検物質（製剤３）の注入中に目覚めたため、安楽死させる必要があり、１匹は穿頭孔を開けている間に呼吸停止した。全体剖検において、いずれの動物も知見を示さなかった。６時間の時点における動物は、いずれも交換する必要がなかった。２日の時点における１匹の動物は、麻酔により死亡したため、交換する必要があった。４日の時点における１匹の動物は、対照動物として誤って屠殺したため、交換する必要があった（製剤３の注入後３日）。７日の時点における３匹の動物は、不正な製剤１の調製物を投与したため、交換する必要があり、したがって、分析に含めることができなかった。注入は、製剤４に割り当てられた１匹の動物を除いて順調であり、１時間の時点で、２７分から４０分注入後に注入システムの漏出が認められた。実施例２．２．１において説明されるように、合計１５匹の動物を対照として使用し、任意の介入を経なかった。動物処分の概要は、表３において見出すことができる。
【表２】
0005795537.tif 000003
Ｆ１：ＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ  ０．１Ｄ：Ｌ比  Ｌｓ−ＴＰＴ０．５ｍｇ／ｍＬ＋Ｌｓ−ＧＤ  １．１５ｍｇ／ｍＬ
Ｆ２：ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／ＣＨＯＬ  ０．３  Ｄ：Ｌ比  Ｌｓ−ＴＰＴ０．５ｍｇ／ｍＬ＋Ｌｓ−ＧＤ  １．１５ｍｇ／ｍＬ
Ｆ３：  ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／ＣＨＯＬ  ０．１  Ｄ：Ｌ比  Ｌｓ−ＴＰＴ０．５ｍｇ／ｍＬ＋Ｌｓ−ＧＤ  １．１５ｍｇ／ｍＬ
Ｆ４：遊離トポテカン０．５ｍｇ／ｍＬ
ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ＝ジステアロイルホスファチジルコリン／ジステロイルホスファチジルグリセロール
Ｃｈｏｌ＝コレステロール
Ｄ：Ｌ比＝薬物脂質比（ｗ／ｗ）
Ｌｓ−ＴＰＴ＝リポソームトポテカン
Ｌｓ−ＧＤ＝リポソームガドジアミド
（  ）は、交換された動物の数を示す
【０１９０】
実施例２．２．３：脳組織濃度
【０１９１】
トポテカン脳組織濃度は、遊離トポテカン群において、１時間および６時間の時点においてのみ測定可能であった（製剤４）。対照的に、Ｌｓ−ＴＰＴ群において、測定可能な脳組織濃度は、４８時間（製剤１）または９６時間（製剤２および３）を通しても見出可能であった。いずれの製剤も、７日目には検出可能なレベルを有しなかった。すべての時点において、製剤２は、製剤２および３が極めて低く、同様の濃度を有した９６時間の時点を除いて、最大の組織濃度を有した。遊離トポテカンの短い半減期を考えると、検出されたトポテカンレベルは、特に６時間を超えると、リポソーム製剤１、２、および３に対して、被包されたトポテカンを反映すると想定される。表４は、製剤および時点別のトポテカンの脳組織濃度の概要である。
【表３】
0005795537.tif 000004
Ｆ１：ＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ  ０．１Ｄ：Ｌ比  Ｌｓ−ＴＰＴ０．５ｍｇ／ｍＬ＋Ｌｓ−ＧＤ  １．１５ｍｇ／ｍＬ
Ｆ２：ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／ＣＨＯＬ  ０．３  Ｄ：Ｌ比  Ｌｓ−ＴＰＴ０．５ｍｇ／ｍＬ＋Ｌｓ−ＧＤ  １．１５ｍｇ／ｍＬ
Ｆ３：ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／ＣＨＯＬ  ０．１  Ｄ：Ｌ比  Ｌｓ−ＴＰＴ０．５ｍｇ／ｍＬ＋Ｌｓ−ＧＤ  １．１５ｍｇ／ｍＬ
Ｆ４：遊離トポテカン０．５ｍｇ／ｍＬ
ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ＝ジステアロイルホスファチジルコリン／ジステロイルホスファチジルグリセロール
ＣＨＯＬ＝コレステロール
Ｄ：Ｌ比＝薬物：脂質比（ｗ／ｗ）
Ｌｓ−ＴＰＴ＝リポソームトポテカン
Ｌｓ−ＧＤ＝リポソームガドジアミド
【０１９２】
実施例２．２．４  濃度−時間変数
【０１９３】
図２に示されるように、最大脳組織濃度は、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／ＣＨＯＬ  ０．３  Ｄ：Ｌ比トポテカンのナノリポソーム製剤により達成されたが、他の２つのリポソーム製剤は、遊離トポテカンと同様に機能した。最初の９６時間に渡る脳組織濃度の範囲１．２４〜１４６．４μＭは、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／ＣＨＯＬ  ０．３  Ｄ：Ｌ比ナノリポソーム製剤に対して決定した。各製剤の薬物の組織１／２、ＣＬ、脳内ＭＲＴ、およびＡＵＣを含む薬物動態（ＰＫ）パラメータは、表５において列挙される。回帰を適切に計算するには十分な濃度ポイントがないため（末端傾斜において少なくとも３つの濃度ＰＫパラメータの解釈は慎重に行う（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、別添）。データポイントの数が制限されているため（各データポイントで３匹の動物を屠殺する必要がある）、有意なＰＫ変数は、ＡＵＣを除外して計算することはできなかった。ＡＵＣ（Ｏ−最終）は、ＤＳＰＣ/ＣＨＯＬ０．１およびＤＳＰＣ/ＤＳＰＧ/ＣＨＯＬ０．１（それぞれ３８．２７および６８．２１μｇ・日／ｇ）、および遊離トポテカン（５．５μｇ・日／ｇ）と比較して、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／ＣＨＯＬ０．３  Ｄ：Ｌ比製剤（１５３．８μｇ・日／ｇ）に対して顕著に大きかった。すべてのナノリポソーム製剤は、１日の範囲で半減を生じたが、遊離トポテカンの半減期ははるかに短かった。これらの結果に基づいて、Ｌｓ−ＴＰＴ製剤２（ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／ＣＨＯＬ０．３  Ｄ：Ｌ比）を、その後の試験のために選択した。
【表４】
0005795537.tif 000005
【０１９４】
実施例２．３：考察
【０１９５】
本実施例２において提供される試験は、脳内ＣＥＤを介して送達される３つの新規Ｌｓ−ＴＰＴ製剤および遊離トポテカンと比較して、複合薬物送達アプローチのラットの正常脳組織における薬物動態プロファイルを評価したものである。評価された３種のナノリポソーム製剤の中で、薬物：脂質比が０．３であり、トポテカン濃度０．５ｍｇ／ｍＬである製剤２、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／ＣＨＯＬは、ＡＵＣ（Ｏ−最終）１５３．８μｇ−日／ｇおよび半減期が約１日である、最適な脳内薬物動態プロファイルをもたらすことが判明した。Ｌｓ−ＴＰＴ製剤２（ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／ＣＨＯＬ  ０．３  Ｄ：Ｌ比）のＡＵＣおよび半減期は、遊離トポテカンのそれをはるかに上回り、リポソームからの長い薬物放出動態、所望のＣＥＤ送達特性を示す。Ｌｓ−ＴＰＴ製剤２に対して認められる良好な薬物動態プロファイルは、活性薬物のリポソームからの放出が遅いという良好な放出特性に関連する可能性がある。
【０１９６】
Ｌｓ−ＴＰＴ製剤２の薬物動態プロファイルを大局的に見るために、当試験で見出されたトポテカンの濃度を、以前のインビトロ試験からのデータと比較した。６、４８、および９６時間における濃度（それぞれ１０８．８、３１．２５、および１．２４μＭ）は、様々な悪性グリオーマ細胞株のそれぞれ１、２４、７２および１２０時間に渡る曝露後に、２．４、０．０３８、０．２８および０．０２−>４μＭの５０％抑制濃度（ＩＣ５０）をはるかに上回った（Ｍａｒｃｈｅｓｉｎｉ  １９９６，Ｐｏｌｌｉｎａ  １９９８，Ｓｃｈｍｉｄｔ  ２００１）。したがって、Ｌｓ−ＴＰＴ製剤２は、少なくとも９６時間に渡って、インビボでトポテカンの十分な細胞毒性組織濃度を提供することを想定するための確固とした根拠がある。
【０１９７】
実施例２．４：結論
【０１９８】
薬物：脂質比が０．３であり、トポテカン濃度０．５ｍｇ／ｍＬであるＬｓ−ＴＰＴ製剤ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／ＣＨＯＬは、最適な脳内薬物動態プロファイルをもたらすことが判明した。
【０１９９】
実施例３：ＣＥＤによるヌードラットの線条体に送達されるローダミンリポソームの対流性
【０２００】
実施例３．１：材料および方法
【０２０１】
９匹のラットを本試験に使用した。ローダミンリポソーム（ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／Ｃｈｏｌ、７０：２０：１０モル比）を、０．５モル％ローダミンＰＥとともに、ＣＥＤ注入によってラットの線条体の両側に送達した。ローダミンリポソームの希釈液は、ヒスチジン／生理食塩水緩衝液を使用して調製し、スクロースを添加して、表７に記載される最終スクロース濃度３ｍＭ、１５ｍＭ、および５ｍＭを達成する。
【表５】
0005795537.tif 000006
【０２０２】
ＣＥＤの場合、シリコンカニューレを自動ポンプに接続して対流増進送達に使用し、適切な腹側座標まで下げた（ＡＰ＝＋０．５ｍｍ、ＭＬ＝３．０ｍｍ、ＤＶ＝−４．５〜−５ｍｍ、−３．３ｍｍにおいて歯バーを用いる）。被検物質は、各線条体中に一度に両側注射した。半球当たり２０μＬ用量を達成する本試験において使用される注入率は、０．２μＬ／分（１５分）＋０．５μＬ／分（１０分）＋０．８μＬ／分（１５分）であった。ラットは、ＣＥＤ送達後、すぐに屠殺した。脳を除去し、左右の半球に分割した。右半球は、−６０℃で、ドライアイス／イソペンタン中で凍結させ、組織学的分析に先立って、−８０℃で２４時間保存した。各動物の左半球は、Ｎｏｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃによる後分析用に−８０℃で凍結させた。ラットの一部において、分析用に線条体を左半球から除去した。
【０２０３】
各ラットの右半球は、２０μに分割し、線条体全体で１０ごとの切片をスライドに載置した。切片を撮影し、ＮＩＨ画像を使用して、線条体内の分散量を計算した。線条体の外側で発生しているローダミン蛍光は、分析に含まなかった。組織学的スライドは、Ｖｄ分析のためにＵＣＳＦに送付した。各ラットの左半球から得られた組織は、抽出効率の判定のために、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓに送付される。
【０２０４】
実施例３．２：結果
【０２０５】
ローダミン蛍光は、ＣＥＤ注入を受けているすべてのラットにおいて検出された。すべてのラットにおいて、標識は線条体内で分散した。一部のラットは、脳梁および内包線維トラックにおいて強い標識化を示した（データは図示せず）。表８は、３ｍＭ、１５ｍＭ、および７５ｍＭのスクロース濃度における、個別のラットの分散容積（Ｖｄ）を示す。ＣＥＤチューブに伴う技術的困難に起因して、３匹のラットに、２０μＬを各線条体に注入するのではなく、４０μＬのローダミンリポソームを各線条体（斜線部分）に両側注入した。これらのラットは、分析に含まなかった。７５ｍＭ群の動物は、手術中に（５分）死亡したため含まなかった。注入は、この動物に対して継続したが、リポソームは、動物の死後に部位から押出され、実質に分散しなかった。
【表６】
0005795537.tif 000007
【０２０６】
ローダミン蛍光は、４０μＬおよび２０μＬの両注入量のスクロース濃度に関係なく、ＣＥＤを受けているすべてのラットにおいて検出された（表９）。分散の平均容積は、すべての群において、１２．６ｍｍ3〜２４．９ｍｍ3の範囲であった。
【表７】
0005795537.tif 000008
【０２０７】
１５ｍＭ最終スクロース濃度は、３ｍＭ最終スクロース濃度と比較して、２倍多い分散量を示した（図３）。スクロース濃度群の統計比較は、群サイズが小さいため、本試験では決定しなかった。
【０２０８】
このデータは、リポソーム調製物中の異なるスクロース濃度は、ＣＥＤガリポソームをラットの実質に分散させる能力に作用しないことを示す。本試験における試料の数は、異なるスクロース濃度が、ローダミンリポソームをラットの線条体にＣＥＤ送達した後の分散量に及ぼす影響に関する統計分析を行うのに十分でなかった。
【０２０９】
異なる脂質組成物のローダミン装薬リポソームを使用する以前のデータ（図４）は、本試験において得られる範囲に類似する分散量を示した。
【０２１０】
本試験において、すべてのスクロース濃度において、半球当たり２０μＬのリポソームを受けたラットの中で、１１．７ｍｍ3〜２６．６ｍｍ3の範囲であった。図４に示されるデータは、製剤１および６に対する同様の範囲におけるＶｄを示す。図４におけるリポソーム製剤は、いずれも本試験において使用される製剤と同一ではなく、データは、注入処置の技術的側面に関連する可能性がある処置の変動性が高いことを示唆する。さらに、ラットの線条体に隣接する構造および近位の線維束に対するリポソームの分散は、線条体領域の外側のリポソーム分散が、Ｖｄ計算に含まれなかったため、両試験において認められる群内差異を説明し得る。
【表８】
0005795537.tif 000009
【０２１１】
このデータが、図４にプロットされている。最上列の数字は、それぞれ図４におけるバー１〜７に対応する。個別の動物は、「＃１−１２」として表される。実際の値は、異なる製剤で得られる分散量を表す。
【０２１２】
実施例４：無処置齧歯類の脳に脳内送達されるナノリポソーム化合物の薬物動態評価および成体無胸腺ラットにおける脳内異種移植腫瘍に送達されるナノリポソーム化合物の有効性
【０２１３】
実施例４．１：材料
【０２１４】
実施例４．１.１：被包物質
【０２１５】
Ｌｓ−ＴＰＴおよびＬｓ−ＧＤのＧＬＰグレードの物質は、いずれも実施例１．１および１．２に示したように調製した。
【０２１６】
実施例４．１．２：動物およびグループ分け
【０２１７】
６〜８週齢、体重２００〜３００ｇの成体雄無胸腺ラットｒｎｕ／ｒｎｕ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，マサチューセッツ州ウィルミントン，バッチ５２２６１５６／０３２６０７）を使用した。動物は、表１１において概説されるように、４つの群に分割した。
【表９】
0005795537.tif 000010
【０２１８】
体重に基づいて、同等の群平均体重および標準偏差を達成するように、ラットを群に割り当てた。次に、群を治療レジメンにランダムに割り当てた。単回治療は、腫瘍移植の８日後に予定され、二重治療は、腫瘍移植後８日目および１２日目に予定された。
【０２１９】
実施例４．１．３：外科的処置および治療
【０２２０】
実施例４．１．３．１：脳内腫瘍異種移植
【０２２１】
Ｕ８７ＭＧ腫瘍細胞（ヒト膠芽細胞腫、Ｐｅｒｒｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ，カリフォルニア州サンディエゴ，ロットＷ５０５１５０７Ｕ８７ＭＣ）の移植は、標準的な定位固定処置を使用して、右線条体において片側で行った。ラットは、イソフルランで麻酔をかけ（２．５％）、頭蓋の皮膚を剃毛した。ラットを定位フレームに載置し、耳バーおよび切歯バーの使用によって頭部を配置した。無菌法をすべての外科的処置に使用した。皮膚をベタジン溶液で除菌した。頭蓋骨上部の皮膚に縦方向の切開を行い、鈍的切開を使用して、頭蓋骨を覆う結合組織を除去した。小型の歯科用ドリルを使用して、頭蓋骨切除術を行い、ブレグマから０．５ｍｍ前方、および３ｍｍ左と右に穿頭孔を開けた。３０ゲージの２５μＬのハミルトンシリンジを使用して、Ｕ８７ＭＧ細胞を、軟膜表面から適切な背腹座標を使用して、線条体に定位的に注入した（−３．３ｍｍで歯バーを用いて−４．５〜−５ｍｍ）。合計約５．０ｘ１０5細胞を含有する総量１０μＬを、１０分の期間をかけて右線条体に注入した。予定される動物の数では、すべての介入を１日で行うことができなかったため、腫瘍移植は、異なる２日に行った。したがって、２つの個別の腫瘍懸濁液を調製した。
【０２２２】
接種後、皮膚をホチキス留めした。ラットは、麻酔からの回復中に監視した。処置を終了する前に、ブプレノルフィンを皮下（ＳＣ）投与した後、必要に応じて、ブプレノルフィンをＳＣ投与した。ラットは、腫瘍細胞移植後、１日２回監視した。移植後の生存時間は、約０〜６０日となることが予想され、そこで動物を安楽死させて脳を採取した。
【０２２３】
実施例４．１．３．２：治療
【０２２４】
麻酔は、イソフルラン（２．５％）を用いて行った。鈍的耳バーを有する定位フレームを使用して、以前に行った穿頭孔を通じてＣＥＤを行った。血栓のみを除去した。右線条体内の腫瘍移植部位に配置されたカニューレを使用して、ＣＥＤを解して用量を投与した。自動ポンプ（ＢＡＳｉ，Ｉｎｃ．，インディアナ州ウェストラフィエット）に接続された溶融シリカカニューレ（ＯＤ１６８μｍ、ＩＤ１０２μｍ）（ＰｏｌｙＭｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，アリゾナ州フェニックス）を使用し、適切な背腹座標に低下させた（−３．３ｍｍで歯バーを用いて−４．５〜−５ｍｍ）。背腹座標は、軟膜表面から計算した。カニューレを、２７ゲージニードルに挿入し、強力瞬間接着剤で管に固定した。動物は、１用量（２０μＬ）のＬｓ−ＴＰＴ／Ｌｓ−ＧＤ製剤を受ける。漸進的の注入速度増分を使用した。２０μＬ量を投与するために使用される注入速度は、０．２μＬ／分（１５分）、０．５μＬ／分（１０分）および０．８μＬ／分（１５分）であった。注入後に、カニューレを所定の位置に５分間留置して、注入液の流出を最小限にした後、徐々に回収した。
【０２２５】
処置の終了後、ラットを通風のない環境内で維持し、加熱ランプまたは水ボトル、あるいは他の適切な加温方法で保温し、麻酔からの回復を監視した。ブプレノルフィンを、必要に応じて皮下投与した。ホームケージに戻す前に、ラットを処置室で回復させた。
【０２２６】
実施例４．１．４：６０日より前の安楽死基準
【０２２７】
症状（鼻血／眼窩周囲の出血、不全まひ、脊柱後湾、不活性または食餌を摂取しないか、または毛づくろいしない、ベースライン体重の１５％超の体重減少）のうちの任意の１つまたは組み合わせが認められた場合、動物は鎮痛剤で処理した。ブプレノルフィンに加えて、メロキシカムまたはケトロラク等のＮＳＡＩＤも付与した。動物が４８時間以内に改善の兆候を示さなかった場合において、実施例４．１．５において概説されるように安楽死させた。
【０２２８】
実施例４．１．５：組織採取および処理
【０２２９】
それぞれの生存期間の最後または６０日目に、動物はイソフルランで麻酔吸入され（２．５％）、次いで、ＰＢＳの後に４％パラホルムアルデヒドにより心臓内かん流を受けた。
【０２３０】
試験中に死亡したか、または屠殺された（予定および予定外）すべての動物の完全な全身剖検を、剖体および筋肉／骨格系、すべての外表面および開口部、頭蓋腔および脳の外表面、関連器官および組織を伴う頸部、関連器官および組織を伴う胸部、腹部、および骨盤腔に対して行った。
【０２３１】
主要な器官を採取し、ホルマリン１０％中に保存した。脳を除去し、４％パラホルムアルデヒド中に一晩置いた後、３０％スクロース中で平衡化させた。次に、脳を凍結させて、−７０℃で保存した。
【０２３２】
実施例４．１．６：生存中の観察および測定
【０２３３】
臨床観察および測定は、順応および試験期間を通して、少なくとも１日１回行った。臨床観察および測定は、表１２において概説される。
【表１０】
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【０２３４】
実施例４．１．７：早期死亡／予定外の屠殺
【０２３５】
動物が試験時に死亡した場合、死亡時刻は、可能な限り厳密に推定および記録し、剖検を可能な限り早急に行った。剖検をすぐに行うことができなかった場合、動物を冷蔵して（冷凍ではない）、組織の自己消化を最小限に抑えた。剖検は、死後１２時間以内に行った。
【０２３６】
動物の健康状態が不良であるか、または死が近づいていると思われる場合は、安楽死させ得る。可能であれば、必要に応じて血液または他の標本を採取および分析して（例えば、臨床病理パラメータ用）、倦怠感／死亡の原因の解明を支援した。
【０２３７】
実施例４．１．８：統計的手法
【０２３８】
生存分析の目的で、動物を治療群別に分類した。さらに、最大トポテカン総用量群（第２群）の動物を、対照群を含む、すべての他の治療群の組み合わせと比較した。後者の分類も、以下に説明されるように、概算Ｕ８７ＭＧ細胞負荷群内で実行した。移植前細胞カウントなしに、２つの個別の腫瘍細胞懸濁液の調製物により、異なる２日で治療されたことにより、移植されたＵ８７ＭＧ細胞の数が変動する可能性があるため、治療群は、腫瘍細胞懸濁液によって分析され、したがって、移植後細胞カウントに基づいて、腫瘍移植における概算Ｕ８７ＭＧ細胞負荷によって間接的に分析される（実施例４．２．１を参照）。ログ−ランク試験を使用して、異なる群間の生存を比較した。
【０２３９】
実施例４．１．９：動物の飼育
【０２４０】
各動物は、番号の付いた耳タグによって識別した。さらに、各動物のケージは、動物識別番号、試験番号、群、動物の性別を列挙したケージカードによって識別した。
【０２４１】
動物は、個別にマイクロアイソレータケージに入れ、互いの創傷を害しないようにした。動物を入れた部屋は、試験記録に記録した。他の種は、同一の部屋に入れなかった。部屋は、１００％新鮮な空気で十分に換気した（１時間当たり１０回より多くの換気）（空気の再循環はしない）。血液採取または他の試験処置を行うために、消灯サイクル期間中に室内灯を点けなければならなかった場合を除いて、１２時間照明／１２時間消灯の光周期を維持した。室温は、１８〜２６℃の間で維持した。
【０２４２】
動物は、断食の期間を除いて、Ｐｒｏｌａｂ  ＲＭＨ  ２５００への自由なアクセスを有していた。本試験の結果を干渉し得るレベルの汚染物質は、食餌中に存在しなかった。水ボトルを介して、各動物は、塩化都市水道水を自由に摂取可能であった。年次水質検査の結果は、ＰＳＩアーカイブに維持されている。すべての試験動物は、試験手順に先立って、それらの指定住居に少なくとも３日間順応させた。
【０２４３】
実施例４．２  結果
【０２４４】
実施例４．２．１：プロトコル偏差
【０２４５】
移植後細胞カウントは、移植されたＵ８７ＭＧ腫瘍細胞の実数が、プロトコルによって明記されるよりも有意に高かった。また、腫瘍細胞密度は、調製した２つの懸濁液の間で顕著に異なった。具体的に、２つの懸濁液の移植後カウントは、プロトコル特定の数５．０ｘ１０5と比較して、６．８×１０5および９．７ｘ１０5細胞／１０μＬであった。認められた差異は、懸濁調製物と細胞カウントとの間の細胞成長に起因すると考えられる。考えられる限り、それぞれの移植前カウントは、したがって、より低く、差異は少ないが、それらがプロトコル特定の数に極めて近いとは考えられない。結果の分析において、これらの差異を説明するために、実施例４．１．８において説明されるように、移植後細胞カウントに基づいて、腫瘍移植におけるＵ８７ＭＧ腫瘍負荷によって、治療群を分析した。
【０２４６】
腫瘍移植した動物のうち４匹のみが、ケージ内で死亡したことが認められたため、部分的剖検を行ったか、または全体剖検を行わなかった。これらの動物のうちの３匹は、脳のみを検査したが、１匹はいずれの臓器も検査しなかった。
【０２４７】
実施例４．２．２：臨床観察および測定
【０２４８】
４匹の動物のうち２匹を第１群に割り当て、１匹を第３群、および恐らく処置のために行った麻酔に関連して、腫瘍移植前に死亡した１匹を第４群に割り当てた。腫瘍移植群（２９匹）の中で、４匹の動物が、試験の経過中に、ケージ内で死亡が認められた。１匹の動物は、第１群に割り当てられ、１匹は第２群、および２匹は第４群に割り当てられていた。第４群に割り当てられた２匹の動物は、高い移植腫瘍細胞負荷を有したが、その他の腫瘍細胞負荷は低かった。他の２５匹の動物は、状態不良と見なされたため安楽死させ、動物の大部分において、最も共通する兆候は、１５％以上の体重減少、倦怠感、脊柱後湾姿勢、運動障害、振戦、および呼吸困難であった。
【０２４９】
実施例４．２．３：有効性
【０２５０】
４匹が麻酔により死亡したため、５匹のみを治療した対照群を除いて、８匹の動物を各群において治療し、残りの動物は、各積極的治療群において、合計８匹の動物を有するように、治療群に再分配した。各動物の個別の生存および各治療群の生存期間の中央値は、表１３において概説される。
【表１１】
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【０２５１】
治療群別生存期間は、図５に示され、第２群（０．５ｍｇ／ｍＬ二重投与）において治療された動物の生存期間が長いことが明らかになったが、ログ−ランク検定によって、統計的に有意ではなかった（０．５ｍｇ／ｍＬ二重投与対対照、ｐ＝０．０７２４；０．５ｍｇ／ｍＬ二重投与対０．１ｍｇ／ｍＬ二重投与、ｐ＝０．０５９３；および０．５ｍｇ／ｍＬ二重投与対０．５ｍｇ／ｍＬ単一投与、ｐ＝０．０７４２）。第２群の生存期間の中央値は２１日であった。
【０２５２】
第２群（０．５ｍｇ／ｍＬ二重投与）と比較した合計治療群（１、３、４）の生存期間は、図６に示される。最大Ｌｓ−ＴＰＴ総トポテカン用量において、第２群で治療された動物の生存期間が、併用群と比較して長いことが認められ、これは、ログ−ランク検定によって統計的に有意であった（ｐ＝０．０１１２）。生存期間の中央値は、第２群では２１日、合計群１、３、および４では１７日であった。
【０２５３】
低（６．８×１０5細胞）および高（９．７×１０5細胞）Ｕ８７ＭＧ細胞負荷による生存期間（すべての治療群を併用）は、表１４において、各動物の個別の生存期間および移植細胞負荷群による生存期間の中央値として示され、図７において、全体生存プロットとして示される。生存期間は、腫瘍移植において高細胞負荷を受けた動物の生存期間は、生存期間の中央値が１６日であり、低細胞負荷を受けた動物の生存期間の中央値１９日に対して短いと考えられるが、（恐らく、少数であるため）生存曲線は、生存期間の最後に向かって収束した。
【表１２】
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【０２５４】
低Ｕ８７ＭＧ細胞負荷（６．８×１０5細胞）の動物において、第２群（０．５ｍｇ／ｍＬ二重投与）と比較した合計治療群（１、３、４）による生存期間は、図８に示される。併用群と比較して、最大のＬｓ−ＴＰＴ総トポテカン用量で、第２群において治療される動物の生存期間は長いことが認められるが、ログ−ランク検定によって統計的に有意ではない（ｐ＝０．０６４６）。
【０２５５】
高Ｕ８７ＭＧ細胞負荷（９．７×１０5細胞）の動物において、第２群（０．５ｍｇ／ｍＬ二重投与）と比較した合計治療群（１、３、４）による生存期間が、図９に示される。再度、併用群と比較して、最大のＬｓ−ＴＰＴ総トポテカン用量で、第２群において治療される動物の生存期間は長いことが認められるが、ログ−ランク検定によって統計的に有意ではない（ｐ＝０．１１７６）。
【０２５６】
実施例４．３：考察
【０２５７】
実施例４に開示される試験は、脳内ＣＥＤによって無胸腺ラットにおける脳内神経膠腫異種移植モデルに送達される新規のＬｓ−ＴＰＴ製剤を使用して、複合薬物送達アプローチの有効性を評価したものであった。この実施例は、２種の用量レベルを使用し、一方は、別のグループによって安全性が既に報告されている０．５ｍｇ／ｍＬ（Ｓａｉｔｏ  ２００６）であり、低い方は０．１ｍｇ／ｍＬである。さらに、２つの投与レジメンは、０．５ｍｇ／ｍＬの単一投与、および二重投与を評価し、これまでは単一用量のみが試験されていたため、両方の用量レベルは、４日空けて試験した。他の群と比較して、最大Ｌｓ−ＴＰＴ総トポテカン用量（０．５ｍｇ／ｍＬ二重投与）に対して、個別に（統計的に有意でない）または組み合わせで（統計的に有意）、長い全体および生存期間の中央値が認められた。用量レベルを占める総用量と投与回数とを比較すると、用量依存効果も認められた。
【０２５８】
実施例４．４：結論
【０２５９】
Ｕ８７ＭＧを使用するラット神経膠腫モデルにおけるこの探索的有効性試験の結果は、ＣＥＤによって投与されるＬｓ−ＴＰＴが、評価される最大用量レベルにおいて（０．５ｍｇ／ｍＬ二重投与）、延命効果をもたらすことを示唆する。
【０２６０】
実施例５：Ｕ８７ＭＧ細胞へのトポテカンおよびリポソームトポテカンの細胞毒性
【０２６１】
実施例５．１：材料および方法
【０２６２】
実施例５．１．１：被検物質：
【０２６３】
遊離トポテカン製剤は、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ（ノースカロライナ州Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ）およびＨｉｓｕｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（中国浙江省台州市）から入手した。
【０２６４】
ＧＬＰグレードＬｓ−ＴＰＴ製剤調製物用のトポテカンは、Ｈｉｓｕｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（中国浙江省台州市）から入手した。つまり、リポソームは、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、およびコレステロール７：２：１モル比で、７５〜９０ｎｍ標的サイズで構成される。トポテカンは、それぞれ硫酸アンモニウム２５０ｍＭ  ｐＨ５．５およびヒスチジン１０ｍＭ／ＮａＣｌ１４５ｍＭ  ｐＨ６．０から成る、内部および外部緩衝液を使用して、膜貫通ｐＨ勾配に応答して、リポソーム中に遠隔装薬される（能動的に被包される）。トポテカン濃度２．０ｍｇ／ｍＬおよび０．３（ｗ／ｗ）薬物：脂質比は、９０〜９５％の薬物被包効率を想定して目標を設定した。
【０２６５】
Ｌｓ−ＧＤ調製物用のガドジアミドは、Ｅｓｔｅｃｈ  Ｐｈａｒｍａ（韓国京畿道安山市）から入手した。ＧＬＰグレードＬｓ−ＧＤは、ＧＤがナノリポソームに受動的に被包されたことを除いて、ｔｏｐｏＣＥＤと同様に調製した。ダイアフィルタによるろ過によって、非被包ＧＤおよび溶媒を除去した後、最終ＧＤ被包率は、９０％より大であった。標的ＧＤ含有量は、５．０ｍｇ／ｍＬ±１０％であり、粒子サイズは７５〜１２０ｎｍの範囲であった。
【０２６６】
それぞれ、Ｌｓ−ＴＰＴの被検物質は凍結保存し（−２０〜−３０℃）、Ｌｓ−ＧＤは冷蔵保存して（２〜８℃）、光から保護した。被検物質溶液は、投与の日に新しく調製し、室温で保持した。５ｍＭヒスチジン、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．０、３００ｍＭスクロースまたは０．９％生理食塩水による被検物質原液の適切な希釈を行い、適切な濃度で、所望の試験量の試験溶液を産生した。
【０２６７】
実施例５．１．２：細胞株および培地
【０２６８】
Ｕ８７ＭＧヒト神経膠腫細胞株をすべての実験に使用した（ＵＣＳＦ培養施設、カリフォルニア州サンフランシスコ）。細胞は、Ｔ１７５  Ｆａｌｃｏｎフラスコ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，カリフォルニア州サンノゼ）において確立した。細胞は、１０％ウシ胎孔血清、非必須アミノ酸、および抗生物質（ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ、ペニシリン１００ＤＩｍＬ）を補充した、Ｅａｇｌｅの最小必須培地（ＭＥＭ）から成る、完全最小必須培地（ＣＭＥＭ）に維持した。すべての培地構成要素は、ＵＣＳＦ細胞培養施設から入手した。培地は、５％ＣＯ2の加湿したチャンバにおいて、３７℃で培養した。９５％の集密が達成されると、細胞を０．０５％トリプシン−０．０２％エチレンジアミンテトラ−酢酸（ＵＣＳＦ培養施設、カリフォルニア州サンフランシスコ）により簡潔にトリプシン化し、細胞を５００ｘｇで１０分間遠心分離した。上澄みを吸引した後、５ｍＬの完全細胞成長培地において（抗生物質および１０％ウシ胎孔血清を伴う）、細胞を直接再懸濁した。細胞カウントは、ヘマトサイターにおいてトリパンブルーにより行った（Ｈａｕｓｓｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ペンシルベニア州ホーシャム）。適切な量の完全細胞成長培地を添加して、１００μＬ中１００細胞の最終濃度１０，０００細胞を達成し、蛍光系細胞生死判別試験用に設計された９６ウェルプレートの各ウェルに移した（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ，ウィスコンシン州マディソン）。細胞は、被検物質に対する任意の曝露前に２４時間付着させることができた。１２マルチチャネルピペットを使用して、１００μＬの被検物質を添加する直前に、９６ウェルプレートから培地を除去した。被検物質に対する曝露後、２４、４８、および７２時間に、細胞毒性試験を行った。各被検物質および対照のすべての時点は、３倍で行った。
【０２６９】
実施例５．１．３：実験設計
【０２７０】
表１５は、対照とともに評価された異なる被検物質および濃度を概説する。
【表１３】
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【０２７１】
被検物質のすべての計算および希釈は、第２の調査者によって検証された。被検物質の希釈は、Ｕ８７ＭＧ培養に使用される培地を用いて行った。
【０２７２】
実施例５．１．４：生死判別試験
【０２７３】
試験は、熱安定型ルシフェラーゼを使用して、代謝的に活性な細胞の指標として存在するＡＴＰの定量に基づく。ルシフェラーゼは、ルシフェリン、酸素、およびＡＴＰを、基質として、オキシルシフェリンを生成し、光の形態でエネルギーを放出する反応において使用する。生成される光の量は、存在するＡＴＰの量に比例し、生存細胞の数を反映する。所定の時点で、２０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生死判別試験試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，ウィスコンシン州マディソン）を、該時点に使用される各ウェルに添加した。プレートを優しく扇動した後、それらを培養器に１時間戻した。次に、ＦＬｘ８００  Ｍｕｌｔｉ−Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ，バーモント州ウィヌースキ）を使用して、プレートの発光を読んだ。各ウェルに対して得られる相対光単位（ＲＬＵ）を、標準曲線に基づいて、生存細胞の数に変換した。細胞生存率およびＩＣ５０値は、グラフィック外挿に由来した（Ｇｅｎ５  データ分析ソフトウェア、Ｂｉｏｔｅｋ，バーモント州ウィヌースキ）。
【０２７４】
実施例５．１．５：統計的手法
【０２７５】
すべての細胞毒性試験は３回実行し、すべての濃度および時点における平均値が報告されている。他の統計は適用しなかった。
【０２７６】
実施例５．２：結果
【０２７７】
遊離トポテカン（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅおよびＨｉｓｕｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）およびリポソームトポテカンの細胞毒性および異なる発生源および製剤の能力は、同程度の濃度（０．０１、０．１、１．０、および１０μＭ）および時点（２４、４８、および７２時間）で極めて類似し、Ｌｓ−ＴＰＴ製剤の潜在的な有効性を支持していると思われる。Ｌｓ−ＧＤ単独またはＬｓ−ＴＰＴとの共注入は、２００μＭという極めて高い濃度においても細胞毒性をもたらさず、結果として、Ｌｓ−ＴＰＴの擬似イメージングトレーサの良好な候補であると考えられる（データ図示せず）。本試験において、遊離トポテカンとリポソームトポテカンとの間の差異が全体的に存在しないことは、リポソームからのトポテカンの急速放出をもたらす環境のインビトロ性質によって説明することができ、リポソーム製剤の薬物動態的利点は、インビボでより明らかとなる。
【０２７８】
実施例６：脳内対流増進送達によって成体無胸腺ラットに投与されたリポソームトポテカンおよびリポソームガドジアミドの異なる製剤の正常な脳および異種移植Ｕ８７ＭＧ腫瘍における対流プロファイルおよび組織分散
【０２７９】
実施例６．１
【０２８０】
実施例６．１．１：被検物質
【０２８１】
ＧＬＰグレード物質Ｌｓ−ＴＰＴおよびＬｓ−ＧＤを、実施例２．１．１および２．１．２に記載のとおり調製した。Ｌｓ−ＧＤ製剤のガドジアミドは、Ｅｓｔｅｃｈ  Ｐｈａｒｍａ（韓国京畿道安山市）から入手した。Ｌｓ−ＧＤは、ＧＤがナノリポソームに能動的に被包されたことを除いて、トポＣＥＤと同様に調製した。非被包ＧＤおよび溶媒をダイアフィルタによるろ過によって除去した後、最終ＧＤ被包率は９０％以上であった。標的ＧＤ含有量は、５．０ｍｇ／ｍＬ±１０％であり、粒径は７５〜１２０ｎｍの範囲であった。
【０２８２】
異なるフルオロフォアを使用して、顕微鏡蛍光／発光を可能にするように、Ｌｓ−ＴＰＴおよびＬｓ−ＧＤを標識した（Ｌｓ−ＴＰＴの場合は、マリナブルー−ＤＨＰＥ（１，２−デヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州カールズバッド）およびＬｓ−ＧＤの場合はローダミン−ＰＥ（ホスホエタノールアミン）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州カールズバッド）。マリナブルー−ＤＨＰＥおよびローダミン−ＰＥ標識リポソームは、ＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：コレステロール：フルオロフォアモル比６９．７：２０：１０：０．３に基づいて、溶媒溶液と同時に、脂質粉末にフルオロフォアを添加して、それぞれＬｓ−ＴＰＴおよびＬｓ−ＧＤと同様に調製した。
【０２８３】
それぞれ、Ｌｓ−ＴＰＴの被検物質は凍結保存し（−２０〜−３０℃）、Ｌｓ−ＧＤは冷蔵保存して（２〜８℃）、光から保護した。投与液は、投与の日に新しく調製し、室温で保持した。０．９％生理食塩水による被検物質原液の適切な希釈を行い、適切な濃度を産生した。被検物質原液の新鮮なバイアルは、各投与日に使用した。対照物質は、本試験において使用しなかった。
【０２８４】
実施例６．１．２：動物およびグループ分け
【０２８５】
６〜８週齢、体重２００〜２７５ｇの成体雄無胸腺ラットｒｎｕ／ｒｕ（Ｔａｃｏｎｉｃ，ニューヨーク州ジャーマンタウン）（バッチ０７１００７および０７３１０７）を使用した。動物は、表１６において概説されるように、４つの群に分類した。
【表１４】
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第１群：無処置脳組織−ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／ＣＨＯＬ  Ｄ：Ｌ０．１＋Ｌｓ−ＴＰＴ０．３８ｍｇ／ｍＬ＋Ｌｓ−ＧＤ１．１５ｍｇ／ｍＬ
第２群：無処置脳組織−ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／ＣＨＯＬ  Ｄ：Ｌ０．３＋Ｌｓ−ＴＰＴ１．０２ｍｇ／ｍＬ＋Ｌｓ−ＧＤ１．１５ｍｇ／ｍＬ
第３群：腫瘍組織−ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／ＣＨＯＬ  Ｄ：Ｌ０．１＋Ｌｓ−ＴＰＴ０．３８ｍｇ／ｍＬ＋Ｌｓ−ＧＤ１．１５ｍｇ／ｍＬ
第４群：腫瘍組織−ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／ＣＨＯＬ  Ｄ：Ｌ０．３＋Ｌｓ−ＴＰＴ１．０２ｍｇ／ｍＬ＋Ｌｓ−ＧＤ１．１５ｍｇ／ｍＬ
ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ＝ジステアロイルホスファチジルコリン／ジステアロイルホスファチジルグリセロール
ＣＨＯＬ＝コレステロール
Ｄ：Ｌ比＝薬物：脂質比（ｗ／ｗ）
Ｌｓ−ＴＰＴ＝リポソームトポテカン
Ｌｓ−ＧＤ＝リポソームガドジアミド
【０２８６】
試験の開始時に、体重に基づいて、同等の群平均体重および標準偏差を達成するように、ラットを製剤群と組織群とに割り当てた。両方の製剤群における動物は、無処置脳組織群に割り当てられると、１日目にＣＥＤ注入を受け、腫瘍組織群に割り当てられると、１０日目にＣＥＤ注入を受けた。
【０２８７】
実施例６．１．３：外科的処置および治療
【０２８８】
実施例６．１．３．１：脳内腫瘍異種移植
【０２８９】
この処置は、腫瘍組織群に割り当てられたラットに対して行った。ヒト神経膠腫細胞（Ｕ８７ＭＧ）は、凍結細胞ストック（Ｐｅｒｒｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ，カリフォルニア州サンディエゴ）から、予定の接種の２週間前に入手した。細胞は、腫瘍接種術の日に採取し、密度を５０，０００〜１００，０００細胞／μＬに調整した。接種の日（０日目）に、各ラットに合計５００，０００個のＵ８７ＭＧ腫瘍細胞を、５−１０μＬの懸濁液を使用して、右線条体に片側移植した。定位固定技術およびイソフルラン（２．５％）による麻酔を使用した。ラットは、定位フレームに載置し、耳バーおよび切歯バーを使用して頭部を配置した。すべての外科的処置に対して無菌法を使用した。皮膚を７０％アルコール、続いてベタジン溶液で消毒した。頭蓋上部の皮膚を縦方向に切開し、鈍的切開を使用して、頭蓋を覆う結合組織を除去した。小型の歯科用電気ドリルを使用して、頭蓋骨切除術を行い、ブレグマから０．５ｍｍ前方、および３ｍｍ左と右に穿頭孔を開けた。３０ゲージの２５μＬのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用し、軟膜表面から適切な背腹座標を使用して（−３．３ｍｍで歯バーを使用して、−４．５〜−５ｍｍ）、Ｕ８７ＭＧ細胞を定位的に線条体に注入した。Ｕ８７ＭＧ懸濁液の最終細胞濃度に依存して、注入量を５〜１０μＬの間で調整し、合計５００，０００±２５，０００細胞が、１０分間に渡って送達されるようにした。
【０２９０】
接種後、皮膚をホチキス留めした。ラットは、麻酔からの回復中に監視した。処置を終了する前に、ブプレノルフィンを皮下（ＳＣ）投与した後、必要に応じて、ブプレノルフィンをＳＣ投与した。
【０２９１】
実施例６．１．３．２：治療
【０２９２】
被検物質は、ＣＥＤ注入を介して、試験１日目に、無処置脳組織群に割り当てられたラットに投与し、１０日目に、腫瘍組織群に割り当てられたラットに投与した。用量は、ＣＥＤを介して、無処置組織群において、ラットの背腹線条体に対して両側に投与し、腫瘍組織群において、腫瘍移植に使用される座標と同一の座標を使用して、ラットに腫瘍内的に投与した。すべての群全体で同様に、投与時間を分散させる、組織的な順序でラットに投与した。麻酔は、イソフルラン（２．５％）またはケタミン（９０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１２ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせのいずれかによって、腹腔内注射を介して行った。鈍的耳バーを有する定位フレームを使用して、ＣＥＤを行った。無処置脳組織群に割り当てられたラットにおいて、第５．３．１項に概説されるように、両側穿頭孔を形成した。腫瘍組織群に割り当てられたラットにおいて、頭皮切開部を再度開いて、既に形成された穿頭孔を可視化した。血栓のみを除去した。自動ポンプ（ＢＡＳｉ，Ｉｎｃ，インディアナ州ウェストラフィエット）に接続される、溶融シリカカニューレ（ＯＤ１６８μｍ、ＩＤ１０２μｍ）（ＰｏｌｙＭｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，アリゾナ州フェニックス）をＣＥＤに使用し、適切な背腹座標に低下させた（−３．３ｍｍで歯バーを使用して、−４．５〜−５ｍｍ）。背腹座標は、軟膜表面から計算した。カニューレは、２７ゲージニードルに挿入し、強力瞬間接着剤で管に固定した。漸進的注入速度増分を使用した。本試験において、治療当たり２０μＬの総注入量（Ｖｉ）を達成するために使用される注入速度は、０．２μＬ／分（１５分）、０．５μＬ／分（１０分）および０．８μＬ／分（１５分）であった。注入後に、カニューレを所定の位置に５分間留置して、注入液の流出を最小限にした後、徐々に回収した。処置の終了後、ラットを通風のない環境内で維持し、加熱ランプまたは水ボトル、あるいは他の適切な加温方法で保温し、麻酔からの回復を監視した。ブプレノルフィンを、必要に応じて皮下投与した。
【０２９３】
実施例６．１．３．３：安楽死
【０２９４】
被検物質のＣＥＤ注入から１時間後、１日目（無処置脳組織群）または１０日後（腫瘍組織群）に、すべての群におけるすべてのラットを安楽死させ、組織学的分析のために脳を除去した。安楽死の際に、動物は、イソフルラン（２．５％）によって深麻酔をかけた後、０．９％生理食塩水（１００ｍＬ）に続いて４％パラホルムアルデヒド（３００ｍＬ）による心内かん流を受けた。
【０２９５】
実施例６．１．３．４：組織採取および処理
【０２９６】
試験中に死亡したか、または屠殺された（予定および予定外）すべての動物の完全な全身剖検を、剖体および筋肉／骨格系、すべての外表面および開口部、頭蓋腔および脳の外表面、関連器官および組織を伴う頸部、関連器官および組織を伴う胸部、腹部、および骨盤腔に対して行った。
【０２９７】
脳を除去し、４％パラホルムアルデヒド中で最大２４時間培養した後、３０％スクロース中で平衡化させた。スクロース平衡化後に、組織をドライアイスおよびイソペンタンの混合物中、−６０℃で凍結させ、後の処理のために−７０℃で保管した。心臓、肺、肝臓、腎臓、すい臓（またはその一部）も、存在する場合は採取および保存した。これらの組織は、中性緩衝化した１０％ホルマリン中で固定した。ホルマリン固定した臓器は、次に肉眼視され、必要に応じて、後の組織病理学的分析用にパラフィンブロックに処理された。
【０２９８】
実施例６．１．３．５：組織病理学的分析および分散量の評価
【０２９９】
脳は、２０ミクロンで低温切開し、４つおきの切片をガラススライド上に収集し、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇでカバースリップした。Ｌｓ−ＴＰＴおよびＬｓ−ＧＤ両方の対流プロファイルおよび組織分散は、蛍光顕微鏡、ＳＰＯＴカメラ、ＳＰＯＴソフトウェア、およびＭａｃｉｎｔｏｓｈ（登録商標）  Ｇ４コンピュータを使用して撮影された画像によって決定し、切片におけるマリナブルー−ＤＨＰＥおよびローダミン−ＰＥフルオロフォアの両方の分散量（Ｖｄ）は、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ（登録商標）系の画像分析システムを使用して計算した［ＩｍａｇｅＪ，国立保健研究所（ＮＩＨ）、メリーランド州ベセスダ］。関心領域（ＲＯＩ）は、ＮＩＨ画像ソフトウェアを使用して描き、分散データは、エクセルスプレッドシートに移行させた。分散量（ｍｍ3）は、平均ＲＯＩ領域（ｍｍ2）および分散距離（ｍｍ）を掛けることによって計算した。残りの切片は、４℃で保管し、追加の免疫組織化学分析に使用することができる。
【０３００】
実施例６．１．３．６：生存中の観察および測定
【０３０１】
臨床観察および測定は、順応および試験期間を通して、少なくとも１日１回行った。ケージサイド観察の記録は、第１回投与の少なくとも３日前に開始し、終了まで継続する。各動物は、全体的な外観および挙動の変化について観察した。
【０３０２】
実施例６．１．３．７：早期死亡／予定外の屠殺
【０３０３】
Ｕ８７ＭＧ腫瘍細胞の脳内注入を受けているラットは、通常、１７〜２５日の寿命を有し、死亡する直前まで無症候のままである。本試験において、１０日目に早期屠殺する可能性は低いが、症状（鼻血／眼窩周囲の出血、不全まひ、脊柱後湾、不活性または食餌を摂取しないか、または毛づくろいしない、ベースライン体重の１５％超の体重減少）のうちの任意の１つまたは組み合わせが認められた場合、動物を安楽死させ得る。可能な場合、血液または他の標本を採取し、必要に応じて分析して（例えば、臨床病理パラメータ用）、倦怠感／死亡の原因の解明を支援した。
【０３０４】
動物が試験時に死亡した場合、死亡時刻は、可能な限り厳密に推定および記録し、剖検を可能な限り早急に行った。剖検をすぐに行うことができなかった場合、動物を冷蔵して（冷凍ではない）、組織の自己消化を最小限に抑えた。剖検は、死後１２時間以内に行った。
【０３０５】
実施例６．１．３．８：統計的手法
【０３０６】
記述統計学（平均および標準偏差）を使用して、データを要約し、それらを図で示した。
【０３０７】
実施例６．１．４：動物の飼育
【０３０８】
各動物は、番号の付いた耳タグによって識別した。さらに、各動物のケージは、該動物の動物識別番号、試験番号、群、入手元、到着日、種／株、誕生日、および性別到着日を列挙したケージカードによって識別した。
【０３０９】
動物は、個別に隔離ケージに入れた。寝床材料は、広葉樹チップ（Ｓａｎｉｃｈｉｐｓ，Ｈａｒｌａｎ，カリフォルニア州）を削り、週に１回交換した。室温は、主に１８〜２６℃（６４〜７９Ｆ）に維持され、相対湿度は、３０〜７０％であった。温度および湿度は、連続的に監視し、最小値および最大値を記録した。試験手順を行うために、（消灯サイクル中に）室内灯を点ける必要があった場合を除いて、１２時間点灯／１２時間消灯の周期的照明期間を維持した。
【０３１０】
ラットは、試験期間を通して、照射Ｔｅｋｌａｄ  Ｇｌｏｂａｌ  １８％  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ（齧歯類用プロテイン食餌）（Ｈａｒｌａｎ，米国カリフォルニア州サンディエゴ）および自治体の水道水を自由に摂取させた。食餌または水中に、試験の結果に有害な作用を及ぼすレベルの汚染物質は存在しないことが分かった。年次水質検査の記録は、ＰＳＩアーカイブにおいて維持されている。
【０３１１】
所定の住居に到着すると、初期健康診断後に受領のため受け入れたすべてのラットを、任意の動物関連試験手順の最小３日前に、住環境（主要柵および部屋）に順応させる。順応期間中に、ラットの全体的な健康を毎日監視した。良好な臨床状態（すなわち、体重仕様内）であることが視認されたラットのみを試験に登録した。異常が認められ、不良な健康の兆候（すなわち、フリルコート、有意に低い体重）を呈した任意のラットは、試験から除外した。
【０３１２】
実施例６．２：結果
【０３１３】
実施例６．２．１：プロトコル偏差
【０３１４】
腫瘍組織群に割り当てられた動物は、片側腫瘍移植を受けたが、被検物質のＣＥＤは、（左半球無処置脳組織および右半球腫瘍組織において）両側で行った。脳標本の断片厚は、すべての動物で２０μｍから３０μｍに変更し、蛍光信号を増加させるために、４つごとの切片ではなく、５つおきの切片を収集した。
【０３１５】
実施例６．２．２：臨床観察および測定
【０３１６】
本試験では、いずれの動物も交換する必要がなかった。いずれの動物も、死亡が認められず、すべて予定通りに屠殺が行われた。屠殺前試験は、無処置脳組織および腫瘍組織群両方のすべての動物において正常であった。
【０３１７】
実施例６．２．３：対流プロファイルおよび組織分散
【０３１８】
１４匹の動物を、治療スケジュールに従って治療し、予定された数の動物を各群において治療した。平均および標準偏差を伴う個別の分散量（Ｖｄ）、および第１群および第２群（無処置脳組織）のＬｓ−ＴＰＴ−マリナブルーＤＨＰＥとＬｓ−Ｇｄ−ローダミン−ＰＥの相関係数が表１７に示され、図１０に図示され、第３群および第４群（腫瘍組織）が、表１８に示され、図１１に図示される。統計分析システム（ＳＡＳ）におけるＣＯＲＲ手順を使用して、ピアソンの相関係数を生成した。
【表１５】
0005795537.tif 000016
＃動物７６４３の右半球において、Ｌｓ−ＴＰＴおよびＬｓ−ＧＤの両方で蛍光信号は見られなかったか、またはごくわずかに見られ、これは恐らく、注入機能不全または操作者のエラーに起因する。
第１群：無処置脳組織−ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／ＣＨＯＬ  Ｄ：Ｌ  ０．１＋Ｌｓ−ＴＰＴ  ０．３８ｍｇ／ｍＬ＋Ｌｓ−ＧＤ  １．１５ｍｇ／ｍＬ
第２群：無処置脳組織−ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／ＣＨＯＬ  Ｄ：Ｌ  ０．３＋Ｌｓ−ＴＰＴ  １．０２ｍｇ／ｍＬ＋Ｌｓ−ＧＤ  １．１５ｍｇ／ｍＬ
【表１６】
0005795537.tif 000017
【０３１９】
両製剤のＬｓ−ＴＰＴ−マリナブルーＤＨＰＥのＶｄ値は、無処置脳組織群において狭い範囲内であり（Ｄ：Ｌが０．１：１および０．３：１の場合、それぞれ平均３９．０±３．０および３８．５±５．６ｍｍ3）、対応するＶｄ：Ｖｉ比は１．９：２．０であった。対照的に、Ｖｄ値は顕著に小さく、概して、腫瘍組織群において変動性が高く、無処置脳組織における２つのＬｓ−ＴＰＴ製剤の場合は平均２５．８ｍｍ3＋１０．６および２１．４±１１．９であり、腫瘍組織において平均２６．８±２．５および３１．２±８．０ｍｍ3であった。対応するＶｄ：Ｖｉ比は、無処置脳組織において１：１〜１：３であり、腫瘍組織において１：３〜１：６であった。腫瘍組織群における２つのＬｓ−ＴＰＴ製剤間にわずかな差異があったが、一貫しておらず（Ｄ：Ｌ  ０．１：１のＶｄ値は、無処置脳組織において、Ｄ：Ｌ０．３：１よりも名目上高いが、腫瘍組織において名目上低い）、統計的に有意ではない。
【０３２０】
Ｌｓ−Ｇｄ−ローダミン−ＰＥの結果は、Ｌｓ−ＴＰＴ−マリナブルーＤＨＰＥと顕著に一致した。特に、平均Ｖｄ値は、無処置脳組織群において、３９．０±４．２および３９．３±５．３ｍｍ3であり、対応するＶｄ：Ｖｉ比は１．９〜２．０であった。腫瘍組織群において、平均Ｖｄ値は、無処置脳組織において、２４．０±１１．２および２２．３±９．２ｍｍ3であり、腫瘍組織において、２４．１±４．５および３２．２±８．１ｍｍ3であった。対応するＶｄ：Ｖｉ比は、無処置脳組織において１．１〜１．２であり、腫瘍組織において１．２〜１．６であった。
【０３２１】
個別の分散結果と一致して、Ｌｓ−ＴＰＴ−マリナブルーＤＨＰＥおよびＬｓ−Ｇｄ−ローダミン−ＰＥの平均Ｖｄ値間の相関は、すべての治療群において優れ（０．９５〜０．９９の範囲）、組織型間（無処置脳対腫瘍組織）の相関において顕著な差異はなかった。
【０３２２】
ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／ＣＨＯＬ  Ｄ：Ｌ０．１製剤を受容している３匹の動物すべてにおいて、半球の一方におけるＬｓ−ＴＰＴ−マリナブルーＤＨＰＥとＬｓ−Ｇｄ−ローダミン−ＰＥの両方で認められる蛍光信号はないか、または最小であった。これらの動物のうちの１匹は、無処置脳組織群（ラット＃７６４３）であり、他の２匹の動物は、Ｕ８７腫瘍異種移植を受け（腫瘍組織群）、１つの例は、腫瘍異種移植側で発生したが（ラット＃７６０７）、他の例は、非移植側で発生した（ラット＃７６３３）。すべての奨励は、注入障害または操作者のエラーによる可能性があった。
【０３２３】
実施例６．３：考察
【０３２４】
この実施例６は、異なるフルオロフォアを使用して、治療用ナノリポソーム化合物の２つの製剤、Ｌｓ−ＴＰＴ、およびＬｓ−ＴＰＴ、Ｌｓ−Ｇｄの代理画像トレーサの対流プロファイルおよび分散量を評価し、任意の差動組織分散を示すために、これらのリポソームを共標識した。
【０３２５】
非ペグ化ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／ＣＨＯＬリポソーム（７：２：１モル比）に被包されたトポテカンおよびガドジアミドのいずれも、無処置ラット脳組織内で確実に一定して対流した。認められたＶｄ：Ｖｉ比１．９〜２．０は、ペグ化リポソーム製剤による公開済みデータに基づく説明と一致した（Ｓａｉｔｏ２００４）。重要なことに、Ｌｓ−ＴＰＴおよびＬｓ−ＧＤの分散は、極めて密接に相関し、Ｌｓ−ＴＰＴ製剤の薬物：脂質比によって顕著に左右されなかった。これは、リポソーム担体が、その薬物装薬から独立して、化合物の分散特性を決定することを示唆すると考えられる。
【０３２６】
腫瘍組織におけるＬｓ−ＴＰＴおよびＬｓ−Ｇｄの分散は、無処置脳組織の場合と同様に密接に相関するが、実際の分散量および対応するＶｄ：Ｖｉ比は、顕著に小さい。これは、脳内圧力および腫瘍組織の微小構造に起因するＣＥＤ動態の改変によって部分的に説明され得る。しかしながら、腫瘍担持ラットの非移植半球の無処置脳組織におけるＬｓ−ＴＰＴおよびＬｓ−ＧＤの分散は、いずれも無腫瘍動物と比較して障害された。したがって、過剰な腫瘍成長に起因する組織圧縮による脳内圧力の増加が、腫瘍移植動物の腫瘍組織および無処置脳組織の両方における薬物分散の低下の根底にある最も重要な因子であり得る。これは、以前の研究において、質量効果を伴うカニューレ追跡を通じて、腫瘍異種移植および腫瘍突出と同側の半球拡大を伴う巨大腫瘍成長が見つかっていることから支持される（実施例４を参照）。
【０３２７】
一般に、薬物分散は、無処置脳組織群よりも、腫瘍組織群において変動性が高い。この場合も、これは、高い脳内圧力と関連する、変化した流体力学挙動によって説明され得る。腫瘍移植した動物における２つのＬｓ−ＴＰＴ製剤間のわずかな分散差異は、一定ではなく（Ｖｄ値は、無処置脳組織においてＤ：Ｌ０．３：１よりも名目上高いＤ：Ｌ０．１：１を有するが、名目上は腫瘍組織よりも低い）、２つの腫瘍組織群間のＬｓ−ＧＤに対して認められた、極めて類似した差異とよく似ている。このため、差異がリポソーム製剤に関連する可能性は低い。
【０３２８】
３匹の動物の無処置脳または腫瘍組織のいずれかにおける蛍光の欠如または最小の蛍光は、ポンプの機能不全、またはカニューレの亜最適配置による、くも膜下空間への注入液の漏出に起因する。
【０３２９】
実施例６．４：結論
【０３３０】
この試験は、Ｌｓ−ＴＰＴおよびＬｓ−ＧＤのＣＥＤが無処置ラット脳および腫瘍組織の両方において、確実で一定した薬物分散をもたらすことを示した。ＣＥＤ流体力学、脳内圧力によって影響を受けると考えられ、高い脳内圧力は、薬物分散の不全をもたらす過剰な腫瘍成長に起因する。試験したＬｓ−ＴＰＴの２つの製剤間に相対的な差異はなく（Ｄ：Ｌ０．１：１およびＤ：Ｌ０．３：１）、両製剤は、共投与されるＬｓ−ＧＤと良好に共対流し、ＣＥＤ後のＬｓ−ＴＰＴ薬物分散のリポソームトレーサとして、Ｌｓ−ＧＤの適切性を確認する。
【０３３１】
実施例７：脳内対流増進送達によって成体無胸腺ラットに投与されるリポソームトポテカンおよびリポソームガドジアミドのパイロット毒物性評価
【０３３２】
実施例７．１：材料および方法
【０３３３】
実施例７．１．１：被検物質
【０３３４】
Ｌｓ−ＴＰＴおよびＬｓ−ＧＤのＧＬＰグレード物質を、いずれも実施例６．１．１において記載されるように調製した。
【０３３５】
実施例７．１．２：動物およびグループ分け
【０３３６】
体重２００〜２７０ｇの成体雄無胸腺ラット（ｒｎｕ／ｒｎｕ）（Ｔａｃｏｎｉｃ，ニューヨーク州ジャーマンタウン）（バッチ０６１２０７）を使用した。動物は、表１９に概説されるように、ナノリポソームトポテカン濃度に基づいて、２つの群に分割した。
【表１７】
0005795537.tif 000018
【０３３７】
ラットは、同等の群平均体重および標準偏差を達成するように、体重に基づいて群に割り当てた。
【０３３８】
実施例７．１．３：外科的処置
【０３３９】
試験の１日目および４日目に、ＣＥＤを使用して、ラットは、各半球の線条体に定位的に被検物質の投与を受けた。この反復投与レジメンにおいて、両治療に同一の座標を使用した。ラットは、両群全体に同様に投与時間を分散する、組織的な順序で投薬された。イソフルラン（導入時は５％、手術中の維持の場合は２．５〜３．０％）吸入またはケタミン（９０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１２ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせの腹腔内注入のいずれかによって、ラットに麻酔をかけた。頭蓋の皮膚を剃毛し、動物を定位フレームに載置し、耳バーおよび切歯バーを使用して頭部を配置した。すべての外科的処置に対して無菌法を使用した。皮膚を７０％アルコール、続いてベタジン溶液で消毒した。頭蓋上部の皮膚を縦方向に切開し、鈍的切開を使用して、頭蓋を覆う結合組織を除去した。小型の歯科用電気ドリルを使用して、頭蓋骨切除術を行い、ブレグマから０．５ｍｍ前方、および３ｍｍ左と右に直径１ｍｍの穿頭孔を２つ開けた。自動ポンプ（ＢＡＳｉ，Ｉｎｃ．，インディアナ州ウェストラフィエット）に接続された溶融シリカカニューレ（ＯＤ１６８μｍ、ＩＤ１０２μｍ）（ＰｏｌｙＭｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，アリゾナ州フェニックス）を各半球においてＣＥＤに使用し、適切な背腹座標に低下させた（−３．３ｍｍで歯バーを用いて−４．５〜−５ｍｍ）。背腹座標は、軟膜表面から計算した。カニューレを、２７ゲージニードルに挿入し、強力瞬間接着剤で管に固定した。被検物質を両側で一度に各線条体に注入した。漸進的注入速度の増分を使用した。半球当たり２０μＬ用量を投与するために使用される注入速度は、０．２μＬ／分（１５分）、０．５μＬ／分（１０分）および０．８μＬ／分（１５分）であった。注入完了後に、カニューレを所定の位置に５分間留置して、注入液の流出を最小限にした後、徐々に回収した。
【０３４０】
処置の終了後、ラットを通風のない環境内で維持し、加熱ランプまたは水ボトル、あるいは他の適切な加温方法で保温し、麻酔からの回復を監視した。ブプレノルフィンを、必要に応じて皮下投与した。ホームケージに戻す前に、ラットを処置室で回復させた。
【０３４１】
実施例７．１．４：組織採取および処理
【０３４２】
安楽死は、１１日目に行った。イソフルラン（２．５％）またはＣＯ２吸入によりラットに麻酔をかけた。動物は、トポテカン血漿レベルの決定および必要に応じて他の試験用に経心臓的血液試料を採取された。続いて、動物は、１００ｍＬのヘパリン化生理食塩水に続いて、３００ｍＬの４％パラホルムアルデヒドによる経心臓的かん流を経て、すぐに剖検された。
【０３４３】
試験中に死亡したか、または屠殺された（予定および予定外）すべての動物の完全な全身剖検を、剖体および筋肉／骨格系、すべての外表面および開口部、頭蓋腔および脳の外表面、関連器官および組織を伴う頸部、関連器官および組織を伴う胸部、腹部、および骨盤腔に対して行った。
【０３４４】
脳を除去し、３０％スクロース中で平衡化した後、ドライアイスおよびイソペンタンの混合物中、６０℃で凍結させた。脳は、後の処理のために−７０℃で保管した。心臓、肺、肝臓、腎臓、すい臓（またはその一部）も、存在する場合は、死亡または屠殺された任意の動物から採取および保存した。これらの組織は、すべて中性緩衝化した１０％ホルマリン中で固定した。
【０３４５】
ホルマリン固定した臓器は、必要に応じて、後の組織病理学的分析用にパラフィンブロックに処理された。試験における２つの群のそれぞれから得たすべての脳を３０μｍ厚に切断し、浮遊切片をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）およびアジ化ナトリウム０．２％中で収集した。４つごとの切片をガラススライド上に収集し、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、ヘマトキシリン／エオシン染色用に処理した。残りの切片は、４℃で保管し、追加の免疫組織化学分析に使用し得た。
【０３４６】
血漿トポテカンおよびガドジアミド抽出および測定用の血液試料を遠心分離して、血漿を分離した。動物当たり４００μＬの血漿を得た。２．０ｍＬエッペンドルフ管中の冷メタノール１．６ｍＬを氷上に保持し、血漿を管に添加した後、攪拌した。飼料は、その時点ですべての動物が処理されるまで氷上に維持した。管をパラフィンで密閉し、蓋が誤って開かないようにし、凍結保存した。試料は、ドライアイス上でＮｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ  ｌｎｃ（カナダ国ブリティッシュコロンビア州バーナビー）に出荷した。蛍光検出を用いる高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によってガドジアミド血漿レベルを、誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）によって決定した。
【０３４７】
実施例７．１．５：早期死亡／予定外の屠殺
【０３４８】
動物が試験時に死亡した場合、死亡時刻は、可能な限り厳密に推定および記録し、剖検を可能な限り早急に行った。剖検をすぐに行うことができなかった場合、動物を冷蔵して（冷凍ではない）、組織の自己消化を最小限に抑えた。剖検は、死後１２時間以内に行った。
【０３４９】
動物の健康状態が不良であるか、または死が近づいていると思われる場合は、安楽死させ得る。可能であれば、必要に応じて血液または他の標本を採取および分析して（例えば、臨床病理パラメータ用）、倦怠感／死亡の原因の解明を支援した。
【０３５０】
実施例７．１．６：動物の飼育
【０３５１】
各動物は、番号の付いた耳タグによって識別した。さらに、各動物のケージは、動物識別番号、試験番号、種／株、性別、誕生日、入手元、および到着日を列挙したケージカードによって識別した。
【０３５２】
動物は、個別に隔離ケージに入れた。寝床材料は、広葉樹チップ（Ｓａｎｉｃｈｉｐｓ，Ｈａｒｌａｎ，カリフォルニア州）を削り、週に１回交換した。室温は、主に１８〜２６℃（６４〜７９Ｆ）に維持され、相対湿度は、３０〜７０％であった。温度および湿度は、連続的に監視し、最小値および最大値を記録した。試験手順を行うために、（消灯サイクル中に）室内灯を点ける必要があった場合を除いて、１２時間点灯／１２時間消灯の周期的照明期間を維持した。ラットは、試験期間を通して、照射Ｔｅｋｌａｄ  Ｇｌｏｂａｌ  １８％  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ（齧歯類用プロテイン食餌）（Ｈａｒｌａｎ，米国カリフォルニア州サンディエゴ）および自治体の水道水を自由に摂取させた。食餌または水中に、試験の結果に有害な作用を及ぼすレベルの汚染物質は存在しないことが分かった。年次水質検査の記録は、ＰＳＩアーカイブにおいて維持されている。
【０３５３】
所定の住居に到着すると、初期健康診断後に受領のため受け入れたすべてのラットを、任意の動物関連試験手順の最小３日前に、住環境（主要柵および部屋）に順応させる。順応期間中に、ラットの全体的な健康を毎日監視した。良好な臨床状態（すなわち、体重仕様内）であることが視認されたラットのみを試験に登録した。異常が認められ、不良な健康の兆候（すなわち、フリルコート、有意に低い体重）を呈した任意のラットは、試験から除外した。
【０３５４】
臨床観察および測定は、順応および試験期間を通して、少なくとも１日１回行った。ケージサイド観察の記録は、第１回投与の少なくとも３日前に開始し、終了まで継続する。各動物は、全体的な外観および挙動の変化について観察した。到着後、被検物質投与前、および剖検の日にラットの体重を測定し、体重を記録した。
【０３５５】
実施例７．２：結果
【０３５６】
実施例７．２．１：臨床観察および測定
【０３５７】
本試験では、いずれの動物も交換する必要がなかった。いずれの動物も死亡が認められず、すべて予定通りに屠殺が行われた。屠殺前試験は、すべての動物において正常であった。
【０３５８】
実施例７．２．２：トポテカン血漿レベルの測定
【０３５９】
１１日目の血漿抽出測定（最後の治療から７日後）は、トポテカン（ラクトン形態のみが検出された）およびガドジアミドレベルが、いずれも非存在であったか、または表２０に示されるように、定量の下限以下であったことを明らかにした。トポテカンカルボキシレートの形態は認められなかったか、または極めて低く、血漿からの干渉ピークと重複した。トポテカンラクトンの形態の保持時間におけるピークは、動物番号７２１４において見出される最大ピークとともに、各試料に対して認められた。このピークがトポテカンであるか、または血漿ブランクに起因するか否かは、決定することができなかった。
【表１８】
0005795537.tif 000019
【０３６０】
実施例７．３：考察
【０３６１】
本試験は、脳内ＣＥＤにより送達されるラットの正常な脳組織において、固定濃度のＬｓ−ＧＤと共注入される、２つの濃度のＬｓ−ＴＰＴの安全性および毒性を評価したものである。Ｌｓ−ＴＰＴの濃度１．０および１．６ｍｇ／ｍＬは、安全（０．５ｍｇ／ｍＬ）と毒性（５．０ｍｇ／ｍＬ）との中間である。Ｌｓ−ＴＰＴ濃度は、以前に確立されている。
【０３６２】
このいずれの濃度も、被検物質に起因する肉眼または顕微鏡変化がなく、等しく安全であると考えられる。急性出血の領域は、カニューレ管に沿って大部分が局在化され、実験手順および薬物送達システムに関連すると推定される。カニューレ挿入およびＣＥＤを含む送達法に関連する肉眼および顕微鏡変化については既に説明されており、本試験で認められる変化は、用いられる送達法と一致する（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  １９９５，Ｌｏｎｓｅｒ  ２００２）。評価したいずれの濃度も被検物質に起因し得る毒性をもたらさなかったため、観察可能な副作用レベルがないこと（ＮＯＡＥＬ）は、本試験において確証されなかった。
【０３６３】
最後の治療後７日目の血漿抽出測定は、トポテカンおよびガドジアミドレベルの両方が、非存在であるか、または定量の下限以下であったことを明らかにした。すべての試料に存在したトポテカンラクトン形態の保持時間における最大分数は、トポテカンまたは血漿に明らかに起因し得なかった。しかしながら、顕著な血漿レベルは、血液−脳関門をバイパスする局所領域送達方法、および最後の治療と試料採取との間の時間を考えると、ある程度予想外となる。脳は、組織病理学的分析用に切断されたため、本試験において、脳組織濃度は測定しなかった。したがって、血漿における上記ピークが、脳の実質レベルの維持と関連するか否かを結論することは不可能である。別個の試験において、脳内トポテカンは、トポテカン濃度０．５μｇ／ｍＬで、両半球において、Ｌｓ−ＴＰＴによる単一治療後７日目に検出された（実施例２）。
【０３６４】
実施例７．４：結論
【０３６５】
１．０および１．６ｍｇ／ｍＬの濃度で、Ｌｓ−ＧＤと共注入されるＬｓ−ＴＰＴは、ラットの無処置脳組織において、被検物質に起因する変化の証拠がなく、安全であると考えられる。トポテカンおよびガドジアミド血漿レベルは、送達方法および薬物特性と一致する試験の低レベルの定量以下であった。
【０３６６】
実施例８：成体無胸腺ラットにおける脳内異種移植Ｕ８７ＭＧ腫瘍に対するリポソームトポテカンおよびリポソームガドジアミドの対流増進送達
【０３６７】
実施例８．１：材料および方法
【０３６８】
実施例８．１．１：被検物質
【０３６９】
Ｌｓ−ＴＰＴおよびＬｓ−ＧＤの両方のＧＬＰグレード物質を、実施例６．１．１において記載されるように調製した。
【０３７０】
実施例８．１．２：動物およびグループ分け
【０３７１】
６〜８週齢、体重２００〜２７５ｇの成体雄無胸腺ラットｒｎｕ／ｒｎｕ（Ｔａｃｏｎｉｃ，ニューヨーク州ジャーマンタウン，バッチ０４／３０／２００７−１５０５０１）を使用した。動物は、表２１に概説されるように、３つの群に分類した。
【表１９】
0005795537.tif 000020
【０３７２】
腫瘍接種は、２日かけて行った（ｎ＝１５ラット／日）。各治療群の５匹の動物に、連日、Ｕ８７ＭＧ腫瘍細胞を接種した。実際の治療割り当ては、腫瘍移植後、２移植日のそれぞれにおいて、腫瘍移植後に行い、同等の群平均体重および標準偏差を狙った。
【０３７３】
実施例８．１．３  外科的処置および治療
【０３７４】
実施例８．１．３．１：脳内腫瘍異種移植
【０３７５】
ヒト神経膠腫細胞（Ｕ８７ＭＧ）は、予定接種の２週間前に、凍結細胞ストック（Ｐｅｒｒｙ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ，カリフォルニア州サンディエゴ）から入手した。細胞を腫瘍接種術の日に採取し、５０，０００〜１００，０００細胞／μＬの濃度に調整した。接種の日（０日目）に、各ラットに合計５００，０００のＵ８７ＭＧ腫瘍細胞を、５〜１０μＬ懸濁液を使用して、右線条体に片側移植した。定位技法およびイソフルラン（２．５％）による麻酔を使用した。ラットを定位フレームに載置し、耳バーおよび切歯バーの使用によって頭部を配置した。無菌法をすべての外科的処置に使用した。皮膚を７０％アルコールに続いて、ベタジン溶液で除菌した。頭蓋骨上部の皮膚に縦方向の切開を行い、鈍的切開を使用して、頭蓋骨を覆う結合組織を除去した。ブレグマから０．５ｍｍ前方、および３ｍｍ左と右に穿頭孔を開けた。３０ゲージの２５μＬのハミルトンシリンジを使用して、Ｕ８７ＭＧ細胞を、軟膜表面から適切な背腹座標を使用して、線条体に定位的に注入した（−３．３ｍｍで歯バーを用いて−４．５〜−５ｍｍ）。Ｕ８７ＭＧ懸濁液の最終細胞濃度に基づいて、注入量を５〜１０μＬの間で調整して、合計５００，０００±２５，０００細胞が１０分かけて送達されるようにした。
【０３７６】
接種後、皮膚をホチキス留めした。ラットは、麻酔からの回復中に監視した。処置を終了する前に、ブプレノルフィンを皮下（ＳＣ）投与した後、必要に応じて、ブプレノルフィンをＳＣ投与した。ラットは、腫瘍細胞移植後、１日２回監視した。移植後の生存時間は、約０〜６０日となることが予想され、そこで動物を安楽死させて脳を採取した。
【０３７７】
実施例８．１．３．２：治療
【０３７８】
５日目と８日目の両日に、積極的に治療されたラット（第１群および第２群）は、線条体内の腫瘍移植に使用された同一座標を使用して、ＣＥＤによって脳内腫瘍に送達される被検物質を受容する。対照ラットは、未治療のままで疑似手術を受けなかった。ラットは、すべての群に同様に投与時間を分散させる、組織的な順序で投薬された。麻酔は、イソフルラン（２．５％）またはケタミン（９０ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（１２ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせのいずれかで、腹腔内注射により行った。鈍的耳バーを有する定位フレームを使用して、以前に開けられた穿頭孔を通じてＣＥＤを行った。血栓のみを除去した。自動ポンプ（ＢＡＳｉ，Ｉｎｃ．，インディアナ州ウェストラフィエット）に接続された溶融シリカカニューレ（ＯＤ１６８μｍ、ＩＤ１０２μｍ）（ＰｏｌｙＭｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，アリゾナ州フェニックス）をＣＥＤに使用し、適切な背腹座標に低下させた（−３．３ｍｍで歯バーを用いて−４．５〜−５ｍｍ）。背腹座標は、軟膜表面から計算した。カニューレを、１０μＬのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジと接続された２７ゲージニードルに挿入し、強力瞬間接着剤で管に固定した。漸進的注入速度の増分を使用した。治療当たり２０μＬ量を達成するために本試験で使用される注入速度は、０．２μＬ／分（１５分）、０．５μＬ／分（１０分）および０．８μＬ／分（１５分）であった。注入後に、カニューレを所定の位置に５分間留置して、注入液の流出を最小限にした後、徐々に回収した。
【０３７９】
処置の終了後、ラットを通風のない環境内で維持し、加熱ランプまたは水ボトル、あるいは他の適切な加温方法で保温し、麻酔からの回復を監視した。ブプレノルフィンを、必要に応じて皮下投与した。ホームケージに戻す前に、ラットを処置室で回復させた。
【０３８０】
実施例８．１．３．３：６０日前の安楽死基準
【０３８１】
症状（鼻血／眼窩周囲の出血、不全まひ、脊柱後湾、不活性または食餌を摂取しないか、または毛づくろいしない、ベースライン体重の１５％超の体重減少）のうちの任意の１つまたは組み合わせが認められた場合、動物を安楽死させ得る。可能な場合、血液または他の標本を採取し、必要に応じて分析して（例えば、臨床病理パラメータ用）、倦怠感／死亡の原因の解明を支援した。安楽死の際に、動物は、イソフルラン（２．５％）によって深麻酔をかけた後、０．９％生理食塩水（１００ｍＬ）に続いて４％パラホルムアルデヒド（３００ｍＬ）による心内かん流を受けた。
【０３８２】
実施例８．１．３．４：組織収集および処理
【０３８３】
試験中に死亡したか、または屠殺された（予定および予定外）すべての動物の完全な全身剖検を、剖体および筋肉／骨格系、すべての外表面および開口部、頭蓋腔および脳の外表面、関連器官および組織を伴う頸部、関連器官および組織を伴う胸部、腹部、および骨盤腔に対して行った。
【０３８４】
脳を除去し、４％パラホルムアルデヒド中で最大２４時間培養した後、３０％スクロース中で平衡化させた。スクロース平衡化後に、組織を凍結させて、低温切開するまで−７０℃で保管した。心臓、肺、肝臓、腎臓、すい臓（またはその一部）も、存在する場合は採取および保存した。これらの組織は、中性緩衝化した１０％ホルマリン中で固定した。ホルマリン固定した臓器は、次に肉眼視され、必要に応じて、後の組織病理学的分析用にパラフィンブロックに処理された。
【０３８５】
実施例８．１．３．５：組織病理学的分析
【０３８６】
３つの治療群のそれぞれにおいて、６０日目に生存体および非生存体から少なくとも３つのランダムに選択した脳を、２０μｍ厚に切断し、４つごとの切片をガラススライド上に収集し、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、ヘマトキシリン／エオシン染色用に処理して、腫瘍塊のサイズおよび組織学を評価した。残りの切片は、４℃で保管し、追加の免疫組織化学分析に使用し得た。
【０３８７】
実施例８．１．３．６：生存中の観察および測定
【０３８８】
臨床観察および測定は、順応および試験期間を通して、少なくとも１日１回行った。ケージサイド観察の記録は、第１回投与の少なくとも３日前に開始し、終了まで継続する。各動物は、全体的な外観および挙動の変化について観察した。臨床観察および測定は、表２２において概説される。
【表２０】
0005795537.tif 000021
【０３８９】
実施例８．１．３．７：早期脂肪／予定外の屠殺
【０３９０】
動物が試験時に死亡した場合、死亡時刻は、可能な限り厳密に推定および記録し、剖検を可能な限り早急に行った。剖検をすぐに行うことができなかった場合、動物を冷蔵して（冷凍ではない）、組織の自己消化を最小限に抑えた。剖検は、死後１２時間以内に行った。
【０３９１】
動物の健康状態が不良であるか、または死が近づいていると思われる場合は、安楽死させ得る。可能であれば、必要に応じて血液または他の標本を採取および分析して（例えば、臨床病理パラメータ用）、倦怠感／死亡の原因の解明を支援した。
【０３９２】
実施例８．１．３．８：：統計的手法
【０３９３】
生存期間分析の目的で、動物を治療群別に分類した。比較目的でログランク統計を使用して、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存期間分析を行った。生存期間の中央値は、ＫＭ曲線に基づいて示した。生存期間の個別の分析は、安楽死させた動物で行い、無検閲（死亡）および検閲（生存）のいずれかとして意図される。
【０３９４】
実施例８．１．４：動物の飼育
【０３９５】
各動物は、番号の付いた耳タグによって識別した。さらに、各動物のケージは、該動物の動物識別番号、試験番号、群、入手元、到着日、種／株、誕生日、および性別を列挙したケージカードによって識別した。
【０３９６】
動物は、個別に隔離ケージに入れた。寝床材料は、広葉樹チップ（Ｓａｎｉｃｈｉｐｓ，Ｈａｒｌａｎ，カリフォルニア州）を削り、週に１回交換した。室温は、主に１８〜２６℃（６４〜７９Ｆ）に維持され、相対湿度は、３０〜７０％であった。温度および湿度は、連続的に監視し、最小値および最大値を記録した。試験手順を行うために、（消灯サイクル中に）室内灯を点ける必要があった場合を除いて、１２時間点灯／１２時間消灯の周期的照明期間を維持した。
【０３９７】
ラットは、試験期間を通して、照射Ｔｅｋｌａｄ  Ｇｌｏｂａｌ  １８％  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ（齧歯類用プロテイン食餌）（Ｈａｒｌａｎ，米国カリフォルニア州サンディエゴ）および自治体の水道水を自由に摂取させた。食餌または水中に、試験の結果に有害な作用を及ぼすレベルの汚染物質は存在しないことが分かった。年次水質検査の記録は、ＰＳＩアーカイブにおいて維持されている。
【０３９８】
指定の住居に到着すると、初期健康診断後に受領のため受け入れたすべてのラットを、任意の動物関連試験手順の最小３日前に、住環境（主要柵および部屋）に順応させる。順応期間中に、ラットの全体的な健康を毎日監視した。良好な臨床状態（すなわち、体重仕様内）であることが視認されたラットのみを試験に登録した。異常が認められ、不良な健康の兆候（すなわち、フリルコート、有意に低い体重）を呈した任意のラットは、試験から除外した。
【０３９９】
実施例８．２：結果
【０４００】
実施例８．２．１：臨床観察および測定
【０４０１】
いずれの動物も交換する必要はなかった。８匹の動物が、それらのケージ内で死亡が認められた（第１群において５匹、第２群において１匹、および第３群において３匹）。２１匹の動物は、状態不良と見なされたため安楽死させる必要があり（第１群において５匹、第２群において９匹、および第３群において７匹）、最も一般的な兆候は、１５％以上の体重の喪失、倦怠感、脊椎後湾、および運動障害である（例えば、立ち直り反射の変化、片側に横たわる等）。
【０４０２】
実施例８．２．２：：有効性
【０４０３】
１０匹の動物を、予定通り各群で治療した。主な有効性分析は、安楽死させた動物を無検閲（死亡）として考慮した。結果として、示される生存期間は、死亡するまでの時間を表す。各動物の個別の生存期間、ならびに治療群別の生存期間の中央値および平均を表２３に示す。治療群別の生存期間曲線は、図１２に表される。
【表２１】
0005795537.tif 000022
【０４０４】
このデータは、高いトポテカン総用量および濃度の第２群で治療された動物だけでなく、それぞれ生存期間の中央値が３３．０（９５％ＣＩ、３１〜４０）、２９．５（９５％ＣＩ、２７〜３３）および２０．０（９５％ＣＩ、１９〜２１）である対照（第３群）と比較して、低いトポテカン総用量および濃度の第１群においても生存期間が長いことを明らかにした。これらの差異は、対照と比較すると、すべて統計的に有意であった（１．０ｍｇ／ｍＬ対対照、ｐ＜０．０００１および０．５ｍｇ／ｍＬ対対照、ｐ＜０．０００１）。組み合わされた積極的治療群（第１群および第２群）の生存期間の中央値は、３１．５（９５％ＣＩ、３０〜３６）日であり、対照と比較すると、統計的に有意であった（ｐ＜０．０００１）。用量／濃度応答傾向は、ハザード比０．５６７（９５％ＣＩ、０．２３〜１．３８）で認められるが、２つの積極的治療群間の差異は、統計的有意のレベルに到達しない（０．５ｍｇ／ｍＬ対１．０ｍｇ／ｍＬ、ｐ＝０．２１５）。
【０４０５】
二次有効性分析は、安楽死させた動物を検閲済として考慮して行った。治療群別の生存期間の中央値は表２４に示され、治療群別の生存曲線は、図１３に表される。
【表２２】
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【０４０６】
本分析は、安楽死させた動物を無検閲として考慮する分析と一致しこれを支持し、高いトポテカン総用量および濃度の第２群で治療された動物だけでなく、それぞれ生存期間の中央値が４８．０（９５％ＣＩ、未決定）、３３．０（９５％ＣＩ、３０．０〜４８．０）および２３．０（９５％ＣＩ、２０．０〜２３．０）である対照（第３群）と比較して、低いトポテカン総用量および濃度の第１群においても生存期間が長いことを明らかにした。これらの差異は、対照と比較すると、すべて統計的に有意であった（１．０ｍｇ／ｍＬ対対照、ｐ＜０．００１４および０．５ｍｇ／ｍＬ対対照、ｐ＜０．０００１）。組み合わされた積極的治療群（第１群および第２群）の生存期間の中央値は、４８．０（９５％ＣＩ、３６．０〜４８．０）日であり、対照と比較すると、統計的に有意であった（ｐ＜０．０００１）。
【０４０７】
この確認的有効性試験は、脳内ＣＥＤによって、無胸腺ラットの腹腔内神経膠腫異種移植モデルに送達される、新規リポソームトポテカン製剤を２つの濃度で使用して、複合薬物送達アプローチの有効性を評価したものである。ガドジアミドを装薬したリポソームは、リポソームトポテカンの潜在的な画像トレーサ代理として共投与される。試験用に選択されるトポテカン濃度には、前述の探索的有効性試験（実施例４）において試験される０．５ｍｇ／ｍＬ、および前述のパイロット毒物学試験（実施例７）において定義されるような非毒性範囲内である１．０ｍｇ／ｍＬが挙げられる。実施例４の知見に基づいて、本試験では、二重投与方法を使用し、腫瘍異種移植後の治療の開始を５日目まで繰り上げて（実施例４における８日目に対して）、過剰な腫瘍負荷を回避し、結果として、分散量による腫瘍被覆を最適化するようにした。また異種移植におけるＵ８７ＭＧ腫瘍細胞負荷は、すべての群に渡って、同様に５×１０5腫瘍細胞に維持され、すべての動物に対して同様の腫瘍負荷が得られるようにした（実施例４に開示される試験において、腫瘍細胞負荷は、６．８〜９．７×１０5に変動した）。
【０４０８】
積極的治療群の両方に対して、長い全体生存期間および生存期間の中央値が認められた。対照と比較すると、高いＬｓ−ＴＰＴ濃度（１．０ｍｇ／ｍＬ）は、全体生存期間において、極めて統計的に有意な増加をもたらし（ｐ＜０．０００１）、中央値および平均生存期間は、それぞれ６５％および７６％増加した。低いＬｓ−ＴＰＴ濃度（０．５ｍｇ／ｍＬ）も、対照と比較すると、全体生存期間において、極めて統計的に有意な増加をもたらしたが（ｐ＜０．０００１）、効果の大きさは、高いＬｓ−ＴＰＴ濃度を用いる場合よりもわずかに中程度であり、したがって、用量／濃度依存の効果を示唆する。対照に関連する中間値および平均生存期間の増加は、それぞれ４８％および５６％であり、Ｌｓ−ＴＰＴ濃度は低い。検閲済として考慮される安楽死させた動物で生存期間分析を行った場合に、同様の知見が認められ、これは、Ｌｓ−ＴＰＴの真の効果の大きさに関する任意の潜在的な過大評価を回避する、より保守的な評価方法であるが、その効果を過小評価する可能性がある。該二次有効性分析の結果は、依然として統計的に有意であり、安楽死させた動物が無検閲として考慮される、一次有効性分析の知見を強力に支持する。
【０４０９】
この確認的有効性試験において説明される実験の全体知見は、実施例４において開示される試験で報告されるものとは異なる。０．５または１．０ｍｇ／ｍＬの濃度でＬｓ−ＴＰＴを受容している動物に対して認められる長い中央値および全体生存期間は、異種移植、腫瘍異種移植後の早期治療タイミング、および二重治療（５日目および８日目）における、わずかに低く一定した腫瘍細胞負荷の使用と一致する。生存期間に対する腫瘍細胞負荷の重要性は、本試験において、対照動物の長い生存期間の中央値（２０日）によって示され、これは、Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓａｉｔｏ  ２００６）によって報告される値に極めて類似し、実施例４に開示される試験よりも長い（１７日）。
【０４１０】
実施例８．４：結論
【０４１１】
Ｕ８７ＭＧを使用して、ラット神経膠腫モデルにおいてＣＥＤにより投与されるＬｓ−ＴＰＴは、未治療の対照と比較して、明確かつ一定した延命効果をもたらす。
【０４１２】
実施例９：キンドリングしたラットに対するリポソームω−コノトキシンの対流増進送達
【０４１３】
合成ω−ＣＴＸ−Ｇ（２７アミノ酸、分子量３０３７）、ω−ＣＴＸ−Ｍ（２５アミノ酸、分子量２６３９）、およびカルバマゼピンを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）から入手した。それぞれを、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、およびコレステロール（例えば、実施例２．１．２を参照）から成る、リポソームに装薬する。リポソームω−ＣＴＸ−Ｇ、リポソームω−ＣＴＸ−Ｍ、天然ω−ＣＴＸ−Ｇ、天然ω−ＣＴＸ−Ｍ、および天然カルバマゼピンが、キンドリングしたラットに及ぼす影響は、対流増進送達およびＧａｓｉｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ３２３：４５８−６８において説明されているものと実質的に類似するプロトコルを使用して決定する。
【０４１４】
つまり、カニューレ−双極性刺激電極アセンブリを各ラットに慢性的に移植し、電極の先端が、定位座標において、右へんとう体の基底外側核中に配置されるようにする（ブレグマから測定して、ＡＰ：−２．８ｍｍ、ＭＬ：５．０ｍｍ、ＤＶ：−８．７ｍｍ）（Ｐａｘｉｎｏｓ  Ｇ  ａｎｄ  Ｗａｔｓｏｎ  Ｃ（１９９８）Ｔｈｅ  ｒａｔ  ｂｒａｉｎ  ｉｎ  ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ，４ｔｈ  ｅｄ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓｙｄｎｅｙ）。歯科用アクリルセメント（Ｌａｎｇ  Ｄｅｎｔａｌ，イリノイ州ホイーリング）および固定用ステンレススチールネジ（Ｐｌａｓｔｉｃｓ  Ｏｎｅ）を使用して、カニューレ−電極アセンブリを頭蓋骨に固定し、術後少なくとも１０日間回復させた。キンドリングは、３つの相（１）ＡＤ閾値のキンドリング前決定、（２）キンドリング開発、および（３）ＡＤ閾値のキンドリング後再決定で構成される（Ｐｉｎｅｌ，Ｊ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ  １７：１９７−２０６，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｆ  Ｇ  ａｎｄ  Ｊａｒｖｉｓ，Ｍ  Ｆ（１９８１）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｕｌｌ  ７：６２９−３３，Ｇａｓｉｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ３２３：４５８−６８）。キンドリング中、ラットは、直径２９ｃｍのＰｌｅｘｉｇｌａｓシリンダ内で、カスタムメードの刺激装置（国立衛生研究所、研究サービス部門，メリーランド州ベセスダ）を用いて、チャンバ内で自由に移動できるスイベルアタッチメントを介して、個別に刺激される。
【０４１５】
対流増進送達システムは、Ｇａｓｉｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７、上記）において実質的に説明されている。対流増進送達の場合、各ラットは拘束され、注入カニューレは、ガイドカニューレを通じて、脳にゆっくり挿入される。注入カニューレの先端は、刺激電極ワイヤの先端から上に０．５ｍｍの深さに伸長し、カニューレの上部の可塑性止め具によって、適切な深さで維持される。ラットを開放し、全体注入のために可塑性シリンダに入れる。すべての注入は、意識があり、拘束されていない動物で行う。注入カニューレ挿入後、脳組織は、注入の開始前数分間、カニューレの周囲を密閉される。漸進的注入速度の増分を使用する。半球当たり２０μＬ用量を投与するために使用される注入速度は、０．２μＬ／分（１５分）、０．５μＬ／分（１０分）および０．８μＬ／分（１５分）である。注入完了後に、カニューレを所定の位置に５分間留置して、注入液の流出を最小限にした後、徐々に回収した。被検物質が、完全にキンドリングしたラットにおける発作感度に及ぼす影響は、ＡＤ閾値を確立し、ＡＤ期間、発作段階、および行動発作期間を測定することによって評価する。被検物質のＣＥＤ注入に続いて、動物を刺激し、キンドリング測定値は、注入後２０分、ならびにその後は、注入後２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、４週間、および８週間に決定する。各ラットは、振戦の発生（四肢、頭部、および体幹の律動的な振動運動、または他の神経学的兆候について、被検物質の注入中、注入後少なくとも１時間、および後のそれぞれの刺激セッション前に観察する。
【０４１６】
キンドリング方法に対する毒性効果を特徴付ける試験の最後に、完全にキンドリングしたラットをランダムに選択し、ＶｅｒｓａＭａｘ  Ａｎｉｍａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡｃｃｕＳｃａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，オハイオ州コロンバス）を使用して、運動活性試験を行った。つまり、各ラットを、運動−活動チャンバ（Ｇａｓｉｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）、上記）に６０分間、連続５日間曝露して馴化させる。５日間をかけて安定したベースラインに向かう水平および垂直活動傾向、馴化期間の最後の２日における試験セッション中の活動カウントの平均は、注入試験のベースラインとする。５日の馴化期間の完了後に、各ラットは、被検物質の注入を受ける。注入のパラメータおよび動物の取扱いおよび外部キューを含む他の因子は、キンドリング発作実験におけるそれらと同一である。水平および垂直ビームの遮断は、６０分の期間で決定し、注入後２０分から始まり、その後は、注入後２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、４週間、および８週間に決定する。
【０４１７】
試験の完了後、選択した動物を、４％パラホルムアルデヒドにより経心臓的にかん流させて、切断およびクレシルバイオレットおよびシルバー染色用に脳を除去して、カニューレの配置およびニューロン損傷の証拠を評価する。各薬物治療の効果は、以下の式、１００Ｘ［（治療前の値）−（治療後の値）］／（治療前の値）を使用して計算される、ベースラインからの変化（パーセント）として表される。各ラットのベースラインに関する治療効果を、個別に計算した後、群の平均を出す。キンドリングおよび運動活性試験から得たデータの統計分析は、一方向（群内）および二方向（群間）反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって、逆正弦−ルート変換を使用して、パーセンテージ変化データを変換した後に行う。必要に応じて、ダネット検定またはターキー検定を使用して、事後解析を行う。振戦データは、フィッシャーの直接確率法によって分析された頻度として表される。
【０４１８】
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１．Ｓｔｕｐｐ  Ｒ，  Ｍａｓｏｎ  ＷＰ，  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｎｔ  ＭＪ  ｅｔ  ａｌ．  Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ｐｌｕｓ  ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ  ｆｏｒ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５２：９８７−９９６，  ２００５
２．Ｂｏｂｏ  ＲＨ，  Ｌａｓｋｅ  ＤＷ，  Ａｋｂａｓａｋ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎＣＥＤ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：２０７６−２０８０，  １９９４
３．Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ＤＭ，  Ｌａｓｋｅ  ＤＷ，  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＰＦ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎＣＥＤ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  ｇｒａｙ  ｍａｔｔｅｒ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｄｒｕｇ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  ８２：１０２１−１０２９，  １９９５
４．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＰＦ，  Ｌａｓｋｅ  ＤＷ，  Ｂｏｂｏ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｉｇｈ−ｆｌｏｗ  ｍｉｃｒｏｉｎｆｕｓｉｏｎ：  ｔｉｓｓｕｅ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２６６：Ｒ２９２−３０５，  １９９４
５．Ｃｒｏｔｅａｕ  Ｄ，  Ｗａｌｂｒｉｄｇｅ  Ｓ，  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＰＦ，  Ｂｕｔｍａｎ  ＪＡ，  Ｖｏｒｔｍｅｙｅｒ  ＡＯ  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｎｖｅｃｔｉｖｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌｏｗ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｗｅｉｇｈｔ  ｔｒａｃｅｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  １０２：９０−９７，  ２００５
６．Ｌｏｎｓｅｒ  ＲＲ，  Ｗａｌｂｒｉｄｇｅ  Ｓ，  Ｇａｒｍｅｓｔａｎｉ  Ｋ，  Ｂｕｔｍａｎ  ＪＡ，  Ｗａｌｔｅｒｓ  ＨＡ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｕｃｃｅｓｆｕｌ  ａｎｄ  ｓａｆｅ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｂｒａｉｎｓｔｅｍ：  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  ９７：９０５−９１３，  ２００２
７．Ｓａｍｐｓｏｎ  ＪＨ，  Ｂｒａｄｙ  ＭＬ，  Ｐｅｔｒｙ  ＮＡ，  Ｃｒｏｔｅａｕ，  Ｄ，  Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＡＨ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ  ｍｆｕｓａｔｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎＣＥＤ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ  ｗｉｔｈ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａｓ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ａｎａｔｏｍｙ  ａｎｄ  ｃａｔｈｅｔｅｒ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ６０  ［ＯＮＳ  Ｓｕｐｐｌ  １］：８９−９８，  ２００７
８．Ｍｏｏｇ  Ｒ，  Ｂｕｒｇｅｒ  ＡＭ，  Ｂｒａｎｄｌ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ｕｐｏｎ  ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｇｅｌｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４９：３５６−３６６，  ２００２
９．Ｓａｉｔｏ  Ｒ，  Ｋｒａｕｚｅ  ＭＴ，  Ｎｏｂｌｅ  ＣＯ，  Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ＤＣ，  Ｋｉｒｐｏｔｉｎ  ＤＢ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−  ｅｎｈａｎＣＥＤ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｌｓ−ＴＰＴ  ｅｎａｂｌｅｓ  ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ，  ｃｏｎｔｉｎｏｕｓ，  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｄｅｌ．  Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌ  ８：２０５−２１４，  ２００６
１０．Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｆ，  Ｒｉｅｇｅｒ  Ｊ，  Ｗｉｓｃｈｈｕｓｅｎ  Ｊ，  Ｎａｕｍａｎｎ  Ｕ，  Ｗｅｌｌｅｒ  Ｍ．  Ｇｌｉｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｔｏｐｏｔｅｃａｎ：  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐ５３  ａｎｄ  ｔｏｐｏｔｅｃａｎ−ｉｎｄｕＣＥＤ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４１２：２１−２５，  ２００１
１１．Ｋａｉｓｅｒ  ＭＧ，  Ｐａｒｓａ  ＡＴ，  Ｆｉｎｅ  ＲＬ，  Ｈａｌｌ  ＪＳ，  Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｉｓｓｕｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｏｐｏｔｅｃａｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ  ｃｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｇｌｉｏｍａ  ｍｏｄｅｌ．  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  ４７：  １３９１−１３９８，  ２０００
１２．Ｐｏｌｌｉｎａ  Ｊ，  Ｐｌｕｎｋｅｔｔ  ＲＪ，  Ｃｉｅｓｉｅｌｓｋｉ  ＭＪ，  ＬＩｓ  Ａ，  Ｂａｒｏｎｅ  ＴＡ  ｅｔ  ａｌ．  ｌｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｐｏｔｅｃａｎ  ｐｒｏｌｏｎｇｓ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｕｄｅ  ｒａｔ  ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ  Ｕ８７  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｍａ  ｍｏｄｅｌ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏ−  Ｏｎｃ  ３９：２１７−２２５，  １９９８
１３．Ｌｏｎｓｅｒ  ＲＲ，  Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ  Ｒ，  Ｒｏｂｉｓｏｎ  ＲＡ，  Ｂｕｔｍａｎ  ＪＡ，  Ｑｕｅｚａｄｏ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍａｇｅ−ｇｕｉｄｅｄ，  ｄｉｒｅｃｔ  ｃｏｎｖｅｃｔｉｖｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｎｏｐａｔｈｉｃ  Ｇａｕｃｈｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ６８：２５４−２６１  ，  ２００７
１４．Ｍｕｒａｄ  ＧＪ，  Ｗａｌｂｒｉｄｇｅ  Ｓ，  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＰＦ，  Ｇａｒｍｅｓｔａｎｉ  Ｋ，  Ｄｅｇｅｎ  ＪＷ  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ，  ｉｍａｇｅ−ｇｕｉｄｅｄ，  ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎＣＥＤ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １３  ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １２（１０）：３１４５−３１５１，  ２００６
１５．Ｓａｉｔｏ  Ｒ，  Ｂｒｉｎｇａｓ  ＪＲ，  ＭｃＫｎｉｇｈｔ  ＴＲ，  Ｗｅｎｄｌａｎｄ  ＭＦ，  Ｍａｍｏｔ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎｔｏ  ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  ｒａｔ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌｓ  ｂｙ  ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎＣＥＤ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４：２５７２−７９，  ２００４
１６．Ｓａｉｔｏ  Ｒ，  Ｋｒａｕｚｅ  ＭＴ，  Ｂｒｉｎｇａｓ  ＪＲ，  Ｎｏｂｌｅ  Ｃ，  ＭｃＫｎｉｇｈｔ  ＴＲ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇａｄｏｌｉｎｉｕｍ−ｌｏａｄｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ａｌｌｏｗ  ｆｏｒ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎＣＥＤ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｂｒａｉｎ．  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  １９６（２）：３８１−３８９，  ２００５
【０４１９】
すべての引用文献は、参照により、それら全体が明示的に本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
0005795537.tif 000024
【図１Ｂ】
0005795537.tif 000025
【図１Ｃ】
0005795537.tif 000026
【図１Ｄ】
0005795537.tif 000027
【図１Ｅ】
0005795537.tif 000028
【図１Ｆ】
0005795537.tif 000029
【図２】
0005795537.tif 000030
【図３】
0005795537.tif 000031
【図４】
0005795537.tif 000032
【図５】
0005795537.tif 000033
【図６】
0005795537.tif 000034
【図７】
0005795537.tif 000035
【図８】
0005795537.tif 000036
【図９】
0005795537.tif 000037
【図１０】
0005795537.tif 000038
【図１１】
0005795537.tif 000039
【図１２】
0005795537.tif 000040
【図１３】
0005795537.tif 000041