(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
T細胞受容体(TCR)アルファまたはベータ鎖の可変領域をコードするDNAを単離する方法であって、(a)単一T細胞からゲノムDNAを単離するステップと、(b)TCRアルファまたはベータ鎖可変領域を包含する遺伝子セグメントを、富化増幅反応により増幅して、単一細胞からのTCRアルファまたはベータ鎖のVおよびJ領域を含む富化生成物を生成するステップとを含み、前記増幅反応が、単離されたゲノムDNAを、TCRアルファ鎖のV領域もしくはTCRベータ鎖のV領域のシグナル配列接合部の5〜40塩基対上流の配列にアニールすることができる第一の外側プライマー、および、TCRアルファ鎖のJ領域もしくはTCRベータ鎖のJ領域のエキソン/イントロン接合部の5〜40塩基対下流の配列にアニールすることができる第二の外側プライマーを含む外側プライマーのセットと共にインキュベートするステップを含む方法。
【請求項２】
富化生成物が、単離増幅反応においてさらに増幅されて単離生成物を生成し、単離増幅反応が、富化生成物を、TCRアルファ鎖またはTCRベータ鎖のVおよびJ領域の一つに相補的な少なくとも1つのプライマーを含む内側プライマーのセットと共にインキュベートするステップを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
単離生成物が、クローニング増幅反応においてさらに増幅されてクローニング生成物を生成し、クローニング増幅反応が、単離生成物を、TCRアルファ鎖またはTCRベータ鎖のVおよびJ領域の一つに相補的な少なくとも1つのプライマーを含むクローニングプライマーのセットと共にインキュベートするステップを含み、各クローニングプライマーが、ベクターに相同なベクター領域も含む、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
クローニング生成物が、相同増幅反応においてさらに増幅されて相同生成物を生成し、相同増幅反応が、クローニング生成物を、クローニングプライマーのベクター領域に相同な相同プライマーのセットと共にインキュベートするステップを含む、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
増幅反応が、PCR反応を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
PCR反応が、タッチダウンPCRプロトコールを利用する、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
単一T細胞からゲノムDNAを単離するステップが、全ゲノム増幅を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
ステップ(a)で得られた、単離されたゲノムDNAを、ステップ(b)の前に、T細胞受容体定常領域の存在についてスクリーニングするステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
内側プライマーのセットが、フォワードおよびリバース内側プライマー対を含み、プライマー対のフォワード内側プライマーが、アルファまたはベータV領域のシグナル配列の下流の1つ目のアミノ酸の開始の配列にアニールし、プライマー対のリバース内側プライマーが、アルファまたはベータJ領域の下流の末端の配列にアニールする、請求項2に記載の方法。
【請求項１０】
ベクター領域が、ベクターと15塩基の相同性を有する、請求項3に記載の方法。
【請求項１１】
単離生成物を配列決定するステップをさらに含む、請求項2に記載の方法。
【請求項１２】
クローニング生成物をベクターに挿入するステップをさらに含む、請求項3に記載の方法。
【請求項１３】
ベクターが、発現ベクターである、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
T細胞受容体(TCR)アルファまたはベータ鎖の可変領域を単離する方法であって、(a)単一T細胞を単離するステップと、(b)全ゲノム増幅を行って、T細胞のゲノムDNAを増幅するステップと、(c)増幅されたゲノムDNAを、外側プライマーのセットと共に、ゲノムTCRアルファ富化増幅反応またはゲノムTCRベータ富化増幅反応においてインキュベートして、富化生成物を生成するステップであって、前記外側プライマーのセットがTCRアルファ鎖もしくはTCRベータ鎖のV領域のシグナル配列接合部の5〜40塩基対上流の配列にアニールすることができる少なくとも一つの第一の外側プライマーおよびTCRアルファ鎖もしくはベータ鎖のJ領域のエキソン/イントロン接合部の5〜40塩基対下流の配列にアニールすることができる第二の外側プライマーを含むステップと、(d)富化生成物を、内側プライマーのセットと共に、TCRアルファ単離増幅反応またはTCRベータ単離増幅反応においてインキュベートして、単離生成物を生成するステップであって、内側プライマーのセットが、TCRアルファ鎖またはTCRベータ鎖のVおよびJ領域の一つに相補的な少なくとも1つの内側プライマーを含むステップとを含む方法。
【請求項１５】
(e)単離生成物を、クローニングプライマーのセットと共に、クローニング増幅反応においてインキュベートして、クローニング生成物を生成するステップであって、前記クローニングプライマーのセットが、TCRアルファ鎖またはTCRベータ鎖のVおよびJ領域の一つに相補的な少なくとも1つのクローニングプライマーを含むステップを含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
(f)クローニング生成物を、相同プライマーのセットと共に、相同増幅反応においてインキュベートするステップを含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
T細胞受容体(TCR)アルファ外側プライマーセットと、TCRベータ外側プライマーセットと、TCRアルファ内側プライマーセットと、TCRベータ内側プライマーセットとを含み、前記TCRアルファ外側プライマーのセットが、TCRアルファ鎖のV領域のシグナル配列接合部の5〜40塩基対上流の配列にアニールすることができる少なくとも一つの第一の外側プライマーおよびTCRアルファ鎖のJ領域のエキソン/イントロン接合部の5〜40塩基対下流の配列にアニールすることができる第二の外側プライマーを含み、前記TCRベータ外側プライマーのセットがTCRベータ鎖のV領域のシグナル配列接合部の5〜40塩基対上流の配列にアニールすることができる少なくとも一つの第一の外側プライマーおよびTCRベータ鎖のJ領域のエキソン/イントロン接合部の5〜40塩基対下流の配列にアニールすることができる第二の外側プライマーを含み、TCRアルファ内側プライマーセットが、TCRアルファ鎖のVおよびJ領域の一つに相補的な少なくとも1つのプライマーを含み、TCRベータ内側プライマーセットが、TCRベータ鎖のVおよびJ領域の一つに相補的な少なくとも1つのプライマーを含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法において使用するためのキット。
【請求項１８】
TCRアルファクローニングプライマーセットと、TCRベータクローニングプライマーセットとをさらに含み、TCRアルファおよびTCRベータクローニングプライマーセットにおけるプライマーのそれぞれが、対象のベクターに相同な領域を含む、請求項17に記載のキット。
【請求項１９】
対象のベクターをさらに含む、請求項18に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照により本明細書に組み込まれている、2009年6月29日に出願した、米国仮出願第61/221,505号の優先権を主張するものである。
【０００２】
配列表、表またはコンピュータプログラムリストの参照
本出願は、電子フォーマットの配列表と共に出願されている。配列表は、85,981バイトのサイズの、2010年6月24日に作成されたSequence_Listing-CALTE062A.txtとの表題のファイルとして提供される。電子フォーマットの配列表中の情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【背景技術】
【０００３】
ヒト免疫系は、体にとって外来の粒子を浄化する先天性および適応性の機構から構成されている。適応免疫応答は、Bリンパ球および抗体分泌を伴う体液性応答と、Tリンパ球を伴う細胞媒介応答とを含む。細胞媒介免疫応答は、病原体を破壊するようにふるまうマクロファージ、ナチュラルキラー細胞およびCD8+細胞傷害性Tリンパ球(CTL)と、体液性免疫応答を活性化するCD4+ヘルパーT細胞とを活性化することにより機能する。細胞媒介応答の特異性は、T細胞の表面上で見出されるT細胞受容体(TCR)に由来する。これらのTCRは、抗原と主要組織適合複合体(MHC)分子との特定の組合せを認識し、T細胞機能を誘発する。CD8+ CTL上のTCR認識は、標的細胞のアポトーシスの誘導と、CD4+ Tヘルパー細胞からの体液性免疫応答の開始とを導くことができる。
【０００４】
単一のTCRは、2つのユニークペプチド鎖(アルファおよびベータ)からなり、これらのそれぞれは、可変領域および連結領域(それぞれVおよびJ)として知られる2つのセグメントのゲノム組換えにより生成される。TCRは、44のアルファ可変(V)領域、76のアルファ連結(J)領域、54のベータV領域および14のベータJ領域のうちの1つを含む。よって、この領域の増幅は複雑であり、少なくとも188のユニークオリゴヌクレオチドを必要とする。3344の異なるアルファ鎖組合せと216のベータ組合せとが存在し、722,304の可能性のある鎖対形成を導く。この多様性は、RAG1-RAG2組換えプロセスの後のDNA修復から生じるさらなる突然変異誘発により大きく増幅される。その結果、異なるVおよびJ領域を単純に同定することは、機能的TCRを単離するための十分な情報ではない。
【０００５】
この複雑性および可変性は、細胞の不均質な集団から未知のTCRを単離することを困難にする。単一細胞からのTCRの単離は、アルファ-ベータ誤対形成の問題に対するハイスループット解決法として提案されている。しかし、形質細胞とは異なって、T細胞は、TCRの高い転写レベルを発現せず、信頼できる増幅のために十分なcDNA鋳型を単離することを困難にする。
【０００６】
722,304の可能性のある鎖対形成が存在するので、以前のプロトコールでは、188の全てのオリゴヌクレオチドを同時に用いて単一のPCR反応を用いてTCR配列を単離できない。代わりに、従来技術の方法は、それぞれの反応が異なる制限されたプライマープールを用いる数多くの同時PCR反応と、その後の、徐々に小さくなるプライマープールを用いるさらなる反復PCRとを利用している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Zhangら(1992). Proc Natl Acad Sci USA 89:5847〜51頁
【非特許文献２】Langmore, J.T.(2002).Genome Res. 14:901〜07頁
【非特許文献３】Telenius, Hら(1992). Genomics 13:718〜25頁
【非特許文献４】Deanら(2002). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5261〜66頁
【非特許文献５】Qiagen「REPLI-g(登録商標) Mini/Midi Handbook」2008年2月
【非特許文献６】Donら(1991). Nucleic Acids Res. 19:4008頁
【非特許文献７】Spits, C.ら(2006). Nature Protocols 1:1965〜70頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
単一T細胞からのT細胞受容体(TCR)のアルファおよび/またはベータ鎖の組換え領域の配列を単離し、同定するための方法および組成物が提供される。いくつかの実施形態において、増幅反応のシリーズを用いて、TCRのアルファまたはベータ鎖を単離する。
【０００９】
ある態様において、T細胞受容体(TCR)アルファまたはベータ鎖の可変領域をコードするDNAを単離する方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、単一T細胞からゲノムDNAを単離するステップと、次いで、TCRアルファまたはベータ鎖可変領域を包含する遺伝子セグメントを、富化増幅反応により増幅して、第1富化生成物を生成するステップとを含む。第1富化生成物は、単一細胞からのTCRアルファまたはベータ鎖のVおよびJ領域を含む。この増幅反応は、単離されたゲノムDNAを、TCRアルファ鎖またはベータ鎖のVおよびJ領域のそれぞれに相補的な少なくとも1つのプライマーを含む外側プライマーのセットと共にインキュベートするステップを含む。増幅反応は、タッチダウンPCR反応のようなPCR反応であってよい。
【００１０】
いくつかの実施形態において、第1富化生成物は、単離増幅反応においてさらに増幅して、第2単離生成物を生成する。単離増幅反応は、第1富化生成物を、TCRアルファ鎖またはベータ鎖のVおよびJ領域のそれぞれに相補的な少なくとも1つのプライマーを含む内側プライマーのセットと共にインキュベートするステップを含んでよい。単離生成物は、クローニング増幅反応においてさらに増幅して、ベクターへのクローニングを容易にすることができる。さらに、クローニング増幅反応の生成物は、相同増幅反応においてさらに増幅して、所望の生成物の収率を増加させることができる。
【００１１】
他の実施形態において、T細胞受容体(TCR)アルファまたはベータ鎖の可変領域を単離する方法は、(a)単一T細胞を単離するステップと、(b)全ゲノム増幅を行って、T細胞のゲノムDNAを増幅するステップと、(c)増幅されたゲノムDNAを、外側プライマーのセットと共に、ゲノムTCRアルファ富化増幅反応またはゲノムTCRベータ富化増幅反応においてインキュベートして、富化生成物を生成するステップであって、プライマーのセットがTCRアルファ鎖またはTCRベータ鎖の実質的にそれぞれVおよびJ領域に相補的な少なくとも1つの外側プライマーを含むステップと、(d)富化生成物を、内側プライマーのセットと共に、TCRアルファ単離増幅反応またはTCRベータ単離増幅反応においてインキュベートして、単離生成物を生成するステップであって、内側プライマーのセットが、TCRアルファ鎖またはTCRベータ鎖のVおよびJ領域のそれぞれに相補的な少なくとも1つの内側プライマーを含むステップとを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、この方法は、(e)単離生成物を、クローニングプライマーのセットと共に、クローニング増幅反応においてインキュベートして、クローニング生成物を生成するさらなるステップを含み、クローニングプライマーのセットは、TCRアルファ鎖またはTCRベータ鎖のVおよびJ領域のそれぞれに相補的な少なくとも1つのクローニングプライマーを含む。さらなる相同増幅反応を用いてもよい。
【００１３】
他の実施形態において、キットが提供される。例えば、キットは、T細胞受容体(TCR)アルファ外側プライマーセットと、TCRベータ外側プライマーセットと、TCRアルファ内側プライマーセットと、TCRベータ内側プライマーセットとを含んでよい。いくつかの実施形態において、TCRアルファ内側および外側プライマーセットのそれぞれは、TCRアルファ鎖のVおよびJ領域のそれぞれに相補的な少なくとも1つのプライマーを含み、TCRベータ内側および外側プライマーセットのそれぞれは、TCRベータ鎖のVおよびJ領域のそれぞれに相補的な少なくとも1つのプライマーを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】TCRアルファおよびベータ鎖をコードする遺伝子の構造の図である。外側、内側、クローニングおよび相同プライマーアニーリング部位の相対的な位置も示す。
【図２】WGAを用いるかまたは用いないJurkat細胞TCR特異的PCRの結果を示す。ゲノムDNAは、10,000細胞から単一細胞まで希釈したJurkat細胞から単離した。Jurkat TCRアルファ鎖特異的PCRは、WGAを用いるかまたは用いずに、試料について行った。アルファ鎖を、単一ゲノムから、これらのゲノムがWGAにより増幅される場合にのみ単離した。
【図３Ａ】ゲノム中の全てのアルファおよびベータVならびにJ領域に対するプライマーの設計および試験の結果を示す。図3aは、内側および外側プライマーの相対的な位置である。
【図３Ｂ】ゲノム中の全てのアルファおよびベータVならびにJ領域に対するプライマーの設計および試験の結果を示す。図3bは、3aからのオリゴヌクレオチドのそれぞれが、同一PCR条件下で機能する能力の試験である。
【図４Ａ】プール中の漸増数のオリゴヌクレオチドを用いるJurkat TCR PCRの結果を示す。図4aは、TCRアルファ鎖特異的PCRのための各プールにおけるフォワード/リバースプライマーの数を示す。
【図４Ｂ】プール中の漸増数のオリゴヌクレオチドを用いるJurkat TCR PCRの結果を示す。図4bは、TCRベータ鎖特異的PCRのための各プールにおけるフォワード/リバースプライマーの数を示す。
【図５】メラノーマ特異的T細胞の単離を示す。アルファ-ベータの3つの対を、8つのNY-ESO+ T細胞のストリップから単離した。細胞を患者試料から得て、NY-ESO特異的テトラマーを用いて染色した。
【図６】NA-17特異的T細胞の単離を示す。4つのアルファ鎖と5つのベータ鎖とを、8つのNA-17+ T細胞のストリップから単離した。細胞を患者試料から得て、NA-17特異的テトラマーを用いて染色した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
個別のT細胞からの特異的TCRのアルファおよびベータ鎖を同定するための方法および組成物が提供される。いくつかの実施形態において、単一T細胞が単離され、そのT細胞のゲノムDNAが、全ゲノム増幅(WGA)を用いて増幅される。任意選択のスクリーニングアッセイ、例えばPCRに基づくアッセイを用いて、WGAの生成物をスクリーニングし、T細胞受容体をコードするゲノムDNAが存在することを確認できる。このことは、例えば、T細胞受容体の定常領域を増幅することにより達成できる。適当なゲノムDNAが存在するならば、次いで、TCRのアルファおよびベータ鎖についての別の増幅反応を行う。以下に詳細に記載するようにして、異なるプライマーセットを用いて複数回のPCRを行って、TCRのアルファおよびベータ鎖をコードするDNAを単離して増幅してよい。一般的に、各回のPCRの生成物は、後続回のPCRのための鋳型として用いられる。
【００１６】
図1は、各回の増幅において用いることができるプライマーの種々のセットについてまとめる。第1回の増幅は富化の回であり、典型的には、増幅されたゲノムDNAに対して外側フォワードプライマーおよび外側リバースプライマーを用いて、TCRアルファまたはベータ鎖を包含するDNA配列を富化する。第2回のPCRは単離の回である。1回目の富化された生成物に対して内側フォワードプライマーおよび内側リバースプライマーを用いて、非特異的生成物からTCR配列を単離する。任意選択の第3回のPCRはクローニングの回である。内側プライマーとオーバーラップするクローニングプライマーを用いて、発現ベクターとしても機能し得るクローニングベクターと相同性を有する末端を含有するTCR配列を作製する。任意選択の第4回のPCRは相同「浄化」の回である。相同プライマーを用いて、非特異的生成物から、末端にベクター相同性を有するTCR配列を単離する。
【００１７】
単離の後に、増幅された核酸を配列決定して、単離された単一T細胞からのTCRのアルファおよびベータ鎖のアイデンティティーを決定する。さらに、これを、対象の細胞における後続の発現のための発現ベクターにクローニングできる。
【００１８】
T細胞の集団の分析
いくつかの実施形態において、TCR配列は、それ自体がT細胞の集団から単離された単一T細胞から単離される。T細胞の集団は、ある活性または活性のセットおよび集団中の1または複数の個別の細胞から単離されるTCRについて選択してよい。例えば、メラノーマ抗原(例えばMART1、NY-ESO、NA-17、GP-100またはチロシナーゼ)のような疾患抗原についての特異性を有するT細胞の集団は、これらの抗原についてのテトラマーを用いて染色した患者T細胞のFACsを用いて単離できる(実施例3を参照されたい)。いくつかの実施形態において、T細胞の集団は、ある活性を有するT細胞の亜集団である。この亜集団は、活性、マーカーおよび/またはマーカーのセットを用いて選択してよい。
【００１９】
個別のT細胞は、集団から単離され、個別のT細胞のTCRアルファおよびベータ鎖配列は、PCRにより別々に単離される。例えば、単一細胞は、組織から、体液からまたは細胞培養物から単離してよい。T細胞を単離するための方法の例は、蛍光活性化細胞選別(FACs)および系列希釈を含む。その他の方法は、当該技術において既知である。
【００２０】
全ゲノム増幅:
個別のT細胞が単離されると、TCRアルファおよびベータ鎖をコードするゲノムの少なくとも一部分が増幅される。例えば、全ゲノム増幅(WGA)を行ってよい。WGAは、多様な用途、例えば大規模遺伝子型解析(例えばSNP解析、RFLP解析)、比較ゲノムハイブリダイゼーション(例えばサザンブロッティング)および分子クローニングにおいて用いられている。いくつかの実施形態において、WGAは、単一の単離されたT細胞のゲノムDNAを増幅するために用いられる。
【００２１】
当業者は、任意の数のWGA方法またはキットを用いてWGAステップを行うことができることを認識している。いくつかの実施形態において、WGAのPCRに基づく方法を用いる(例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるZhangら(1992). Proc Natl Acad Sci USA 89:5847〜51頁を参照されたい)。他の実施形態において、WGAのOmniplex法を用いる(その全体が参照により本明細書に組み込まれるLangmore, J.T.(2002).Genome Res. 14:901〜07頁)。当該技術において既知のゲノムDNAの増幅のその他の方法を用いてよい。
【００２２】
いくつかの実施形態において、WGAの多重置換増幅(MDA)法を用いる。簡単に述べると、DNA合成を、反応を誘発するランダムヘキサマーをDNAに加えることにより開始する。Phi29ポリメラーゼを用いて、各ヘキサマーから伸長し、下流合成反応に到達するまで継続する。上流反応は、次いで、下流反応を置換して、複製および置換を継続する。さらなる誘発および合成は、分岐パターンの置換された鎖上で起こることができ、低レベルの鋳型からの多量の増幅を可能にする。Phi29は、高度に前進的な酵素であり、DNAの長いひと続き(100kbまで)を複製できる。このポリメラーゼは、3'から5'の校正機構も有し、Taqのような従来のPCR酵素よりも100倍正確にする(Telenius, Hら(1992). Genomics 13:718〜25頁)。Deanら((2002). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5261〜66頁、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)は、等温鎖置換反応を含むMDAの方法を開示し、これは、1〜10コピーのヒトゲノムDNAを増幅して、20〜30μgの生成物を生成できる。MDAは、粗製の供給源、例えば全血細胞または全組織培養細胞(同書物、5263頁)由来のDNAを増幅するために用いてよい。Deanらは、PCRに基づくWGA法と比べて、MDAは、ゲノムのカバー範囲を増加し、増幅の偏りを低減し、より長い生成物(MDAについて>10kbに対してPCRに基づく増幅について約1kb)を作製することを報告している(同書物、5265〜66頁)。
【００２３】
当業者は、いくつかの実施形態において、本発明が、PCR、MDAまたはOmniplex以外のWGAの方法を含み得ることを認識する。他の実施形態において、細胞のゲノムDNAの少なくとも関連する部分を増幅するその他の既知の方法が用いられる。
【００２４】
いくつかの実施形態において、単一T細胞を単離した後に、細胞を溶解する。溶解は、当該技術において既知の方法を用いて行う。例えば、各細胞を、1.5μlのアルカリ溶解緩衝液(ALB)に選別し、-20℃にて30分間インキュベートし、次いで、65℃にて10分間インキュベートして、細胞を溶解できる。溶解の後に、WGAのMDA法を含むQiagen Repli-g Midiキット(カタログ番号150043)のような商業的なキットを用いてWGAを行う(その全体が参照により本明細書に組み込まれるQiagen「REPLI-g(登録商標) Mini/Midi Handbook」2008年2月を参照されたい)。
【００２５】
WGA生成物のスクリーニング:
WGA、またはゲノムDNAのその他の増幅の後に、スクリーニングアッセイを増幅生成物について行って、適切なゲノムDNAが増幅され、反応物に混入がないことを確認する。例えば、このようなスクリーニングアッセイでは、WGA反応物中に細菌の混入がないことが確認できる。いくつかの実施形態において、スクリーニングアッセイは、PCR反応を含む。いくつかの実施形態において、PCRプライマーは、既知の再配列されていないヒト遺伝子、例えば血管拡張性失調症変異(ATM)に対するものである(実施例2を参照されたい)。他の実施形態において、スクリーニングPCRプライマーは、TCRのアルファおよびベータ鎖の定常領域に対するものである。例えば、スクリーニングプライマーは、表1に記載するプライマーを含むことができる。増幅されたゲノムDNA鋳型の存在下において、これらのプライマーにより作製されるアルファおよびベータ定常領域生成物のサイズは、それぞれ420bpおよび530bpである。その他のプライマー組合せを、TCR定常領域の存在を同定するために用いることもできる。
【００２６】
【表１】
0005829606.tif 000002
【００２７】
いくつかの実施形態において、他の技術を用いて、WGA増幅生成物についてのスクリーニングアッセイ、例えばマイクロアレイスクリーニングまたはサザンブロッティングのようなDNA比較ゲノムハイブリダイゼーションを行ってよい。
【００２８】
TCRアルファおよびベータ鎖を単離するためのプライマーの設計:
TCR受容体アルファまたはベータ鎖をコードする遺伝子の全般的な構造を、図1に示す。いくつかの実施形態において、TCRのアルファおよびベータ鎖を、ネステッドプライマーの2以上のセットを含む増幅反応のシリーズ、好ましくはPCR反応を用いて単離する。アルファ鎖およびベータ鎖の両方を同定するために、2シリーズの増幅(一方はアルファ鎖のためおよび他方はベータ鎖のため)を並行して行って、単一T細胞のTCRアルファおよびベータ鎖をコードする遺伝子を単離してよい。他の実施形態において、TCRアルファまたはベータ鎖は、個別にまたは連続して単離してよい。
【００２９】
いくつかの実施形態において、各シリーズの増幅は、2回の増幅反応を含む。まず、並行する富化反応を行って、TCRアルファおよびベータ鎖の可変領域を包含する配列について、以前に増幅されたゲノムDNAを富化する。TCRアルファおよびベータ領域の両方を同定するならば、プライマーを用いて1つの反応を行って、TCRアルファ鎖の可変領域をコードする配列を富化し、別の反応を行って、TCRベータ鎖の可変領域をコードする配列を富化する。これらは、それぞれTCRアルファ富化反応およびTCRベータ富化反応と呼ぶことができる。いくつかの実施形態において、これらの反応は、並行して行われる。いくつかの実施形態において、各富化反応は、TCRアルファまたはベータ鎖の実質的に全ての可変領域にアニールするフォワードおよびリバースプライマーを含む。つまり、各富化反応において、ゲノムDNAを、TCRアルファ鎖またはTCRベータ鎖のVおよびJ領域のそれぞれに相補的な少なくとも1つのプライマーを含むプライマーのセットと共にインキュベートする。他の実施形態において、プライマーのサブセットを利用する。このステップのためのプライマーは、外側プライマーと呼ばれ(図1)、以下により詳細に記載される。
【００３０】
次に、単離反応を、富化反応の生成物について行って、TCRアルファおよびベータ鎖の可変領域をコードする配列を単離する。これらの反応は、それぞれTCRアルファ単離反応およびTCRベータ単離反応と呼ぶことができる。富化反応と同様に、各単離反応は、TCRアルファまたはベータ鎖の実質的に全ての可変領域にアニールするプライマーのセットを用いて行ってよい。つまり、富化反応の生成物を、TCRアルファ鎖またはTCRベータ鎖のVおよびJ領域のそれぞれに相補的な少なくとも1つのプライマーを含むフォワードおよびリバースプライマーのセットと共にインキュベートしてよい。他の実施形態において、プライマーのサブセットを利用する。このステップのためのプライマーは、内側プライマーと呼ばれ(図1)、以下により詳細に記載される。
【００３１】
いくつかの実施形態において、増幅反応のシリーズは、クローニングベクターとの相同性を有する末端配列を、単離されたTCRアルファおよび/またはベータ鎖配列に付加する、PCR反応のような第3クローニング増幅反応も含む。これらの反応は、それぞれTCRアルファクローニング反応およびTCRベータクローニング反応と呼ぶことができる。富化および単離反応と同様に、各クローニング反応は、TCRアルファまたはベータ鎖の実質的に全ての可変領域にアニールするプライマーのセットを用いて行うことができる。つまり、単離反応の生成物を、TCRアルファ鎖またはTCRベータ鎖のVおよびJ領域のそれぞれに相補的な少なくとも1つのプライマーを含むフォワードおよびリバースプライマーのセットと共にインキュベートしてよく、ここで、プライマーは、クローニングベクターと相同性を有する配列をさらに含む。他の実施形態において、プライマーのサブセットを用いる。このステップのためのプライマーは、クローニングプライマーと呼ばれ(図1)、以下により詳細に記載される。
【００３２】
いくつかの実施形態において、増幅反応のシリーズは、第4のPCR反応のような第4相同増幅反応も含んで、クローニングベクターと相同な末端配列を含むDNAセグメントをさらに単離して増幅する。この反応は、相同反応と呼ぶことができる。相同反応において用いるプライマーは、好ましくは、クローニングベクター配列と相同である。クローニング反応の生成物を、これらのフォワードおよびリバースプライマーと共にインキュベートする。このステップのためのプライマーは、相同プライマーと呼ばれ(図1)、以下により詳細に記載される。
【００３３】
いくつかの実施形態において、内側プライマーを用いる単離の回の生成物を、直接配列決定する。いくつかの実施形態において、内側プライマーを用いる単離の回の生成物を、ベクター、例えばTOPO-TAまたはTOPO-Bluntにクローニングする。
【００３４】
他の実施形態において、クローニングプライマーを用いる増幅の生成物を、配列決定する。この生成物を、ベクター、例えば発現ベクターにクローニングしてよい。
【００３５】
他の実施形態において、相同プライマーを用いる増幅の生成物を、配列決定する。これを、ベクター、例えば発現ベクターにクローニングしてよい。
【００３６】
プライマーは、アルファ鎖のための内側および外側プライマーの各セットが、44の可能性のあるアルファ可変(「アルファV」)領域および76の可能性のあるアルファ連結(「アルファJ」)領域のそれぞれにアニールする少なくとも1つのプライマーを含有するように設計してよい。同様に、ベータ鎖のための内側および外側プライマーの各セットは、好ましくは、54の可能性のあるベータ可変(「ベータV」)領域および14の可能性のあるベータ連結(「ベータJ」)領域のそれぞれにアニールする少なくとも1つのプライマーを含有する。これらの実施形態のいくつかにおいて、1つのプライマーは、2以上の異なる可能性のある領域にアニールできる。いくつかの実施形態において、プライマーの配列を、TCR遺伝子内のゲノム配列へのそれらの予測されるアニーリング温度に基づいて選択する。
【００３７】
アルファ鎖プライマー。いくつかの実施形態において、TCRアルファ鎖をコードする配列を単離するためのプライマーセットは、本明細書に記載される外側プライマーと内側プライマーとを含む。他の実施形態において、プライマーセットは、本明細書に記載される外側プライマーと内側プライマーとクローニングプライマーとを含む。さらに他の実施形態において、プライマーセットは、本明細書に記載される外側プライマーと内側プライマーとクローニングプライマーと相同プライマーとを含む。
【００３８】
外側プライマー:外側プライマーは、VおよびJ領域を増幅するために、フォワードおよびリバース外側プライマーを含む(図1)。各外側フォワードプライマーは、アルファV領域のシグナル配列接合部の約5〜40塩基対上流の配列にアニールする。これらの実施形態において、外側プライマーセットは、44の可能性のあるアルファV領域のそれぞれにアニールする少なくとも1つのフォワードプライマーを含む。各外側リバースプライマーは、アルファJ領域のエキソン/イントロン接合部の約5〜40塩基対下流の配列にアニールする。これらの実施形態において、外側プライマーセットは、76の可能性のあるアルファJ領域のそれぞれにアニールする少なくとも1つのリバースプライマーを含む。例として、アルファ鎖外側プライマーのある可能性のあるセットを、Table 3-1および3-2(表2および3)に開示する。
【００３９】
内側プライマー:内側プライマーは、VおよびJ領域を増幅するために、フォワードおよびリバース内側プライマーを含む(図1)。好ましくは、TCRアルファ鎖のそれぞれVおよびJ領域に相補的な少なくとも1つのプライマーを含む内側プライマーのセットを用いる。各内側フォワードプライマーは、アルファV領域のシグナル配列の下流の1つ目のアミノ酸の開始の配列にアニールする。これらの実施形態において、フォワード内側プライマーセットは、44の可能性のあるアルファV領域のそれぞれにアニールする少なくとも1つの内側プライマーを含む。各内側リバースプライマーは、アルファJ領域の下流の末端のまたはその付近の配列にアニールする。これらの実施形態において、内側リバースプライマーセットは、76の可能性のあるアルファJ領域のそれぞれにアニールする少なくとも1つのリバースプライマーを含む。例として、アルファ鎖内側プライマーのある可能性のあるセットを、Table 3-5および3-6(表6および7)に開示する。
【００４０】
クローニングプライマー:クローニングプライマーは、VおよびJ領域を増幅するために、フォワードおよびリバースクローニングプライマーを含む(図1)。各クローニングフォワードプライマーは、内側フォワードプライマーの配列とオーバーラップする配列にアニールするように設計される。よって、TCRアルファ鎖のそれぞれVおよびJ領域に相補的な少なくとも1つのプライマーを含むクローニングプライマーのセットを用いる。好ましい実施形態において、各クローニングフォワードプライマーの5'末端は、所望のベクターへのクローニングを容易にするために、所望のベクターとの約10〜約50、より好ましくは約15塩基の相同性、「ベクター領域」も含む。例えば、これは、発現ベクター、例えばレンチウイルス発現ベクターのようなベクターへの直接の組換えによりクローニングを容易にすることができる。各クローニングフォワードプライマーは、ベクターに直接クローニングできる生成物を創出するように設計される。発現ベクターのために、プライマーは、シグナル配列の直後のアミノ酸で開始して、正しいリーディングフレーム内に生成物をクローニングできるように設計してよい。他の実施形態において、各クローニングフォワードプライマーの5'末端は、代わりに、発現ベクターのような所望のベクターへのライゲーションを可能にする制限部位を含む。いくつかの実施形態、例えばTCR配列が所望されるが、機能的TCRが発現する必要がない実施形態において、クローニングフォワードプライマーは、インフレーム生成物を必ずしも生成する必要はなく、ベクターは発現ベクターである必要はない。各クローニングリバースプライマーは、内側リバースプライマーの配列とオーバーラップする配列にアニールするように設計される。好ましい実施形態において、各クローニングリバースプライマーの5'末端は、ベクターへの挿入、例えば発現ベクター、例えばレンチウイルスベクターへの直接の組換えを容易にするために、約10〜約50、より好ましくは約15塩基の相同性も含む。他の実施形態において、各クローニングリバースプライマーの5'末端は、ベクター、例えば発現ベクターへのライゲーションを可能にする制限部位を含む。例として、アルファ鎖クローニングプライマーのある可能性のあるセットを、Table 3-9および3-10(表10お
よび11)に開示する。
【００４１】
相同プライマー:相同「浄化」プライマーは、クローニング反応の生成物のベクター領域にアニールするように設計される。つまり、相同プライマーは、選択したベクターに相同なクローニングプライマーの生成物の5'末端にアニールするように設計される。相同フォワードプライマーは、クローニングフォワード(V)プライマーからの相同領域にアニールする。相同リバースプライマーは、クローニングリバース(J)プライマーからの相同領域にアニールする。図1を参照されたい。好ましくは、相同プライマーは、クローニング生成物の末端の15塩基だけの相同性に特異的である。他の実施形態、例えばプライマーがベクターへのクローニングのための5'制限部位を含有する実施形態において、各相同プライマーは、クローニングプライマーにより付加された5'配列にアニールする。例として、相同プライマーのある可能性のあるセットを、Table 3-13(表14)に開示する。
【００４２】
ベータ鎖プライマー。いくつかの実施形態において、TCRベータ鎖をコードする配列を単離するためのプライマーセットは、本明細書に記載される外側プライマーと内側プライマーとを含む。他の実施形態において、プライマーセットは、本明細書に記載される外側プライマーと内側プライマーとクローニングプライマーとを含む。他の実施形態において、プライマーセットは、本明細書に記載される外側プライマーと内側プライマーとクローニングプライマーと相同プライマーとを含む。
【００４３】
外側プライマー:外側プライマーは、VおよびJ領域を増幅するために、フォワードおよびリバース外側プライマーを含む(図1)。各外側フォワードプライマーは、ベータV領域のシグナル配列接合部の約5〜40塩基対上流の配列にアニールする。これらの実施形態において、外側プライマーセットは、54の可能性のあるベータV領域のそれぞれにアニールする少なくとも1つのフォワードプライマーを含む。各外側リバースプライマーは、ベータJ領域のエキソン/イントロン接合部の約5〜40塩基対下流の配列にアニールする。これらの実施形態において、外側プライマーセットは、14の可能性のあるベータJ領域のそれぞれにアニールする少なくとも1つのリバースプライマーを含む。例として、ベータ鎖外側プライマーのある可能性のあるセットを、Table 3-3および3-4(表4および5)に開示する。
【００４４】
内側プライマー:内側プライマーは、VおよびJ領域を増幅するために、フォワードおよびリバース内側プライマーを含む(図1)。好ましくは、TCRベータ鎖のそれぞれVおよびJ領域に相補的な少なくとも1つのプライマーを含む内側プライマーのセットを用いる。各内側フォワードプライマーは、ベータV領域のシグナル配列の下流の1つ目のアミノ酸の開始の配列にアニールする。これらの実施形態において、フォワードプライマーセットは、54の可能性のあるベータV領域のそれぞれにアニールする少なくとも1つの内側プライマーを含む。各内側リバースプライマーは、ベータJ領域の下流末端のまたはその付近の配列にアニールする。これらの実施形態において、内側プライマーセットは、14の可能性のあるベータJ領域のそれぞれにアニールする少なくとも1つのリバースプライマーを含む。例として、ベータ鎖内側プライマーのある可能性のあるセットを、Table 3-7および3-8(表8および9)に開示する。
【００４５】
クローニングプライマー:クローニングプライマーは、フォワードおよびリバースクローニングプライマーを含む(図1)。各クローニングフォワードプライマーは、内側フォワードプライマーの配列とオーバーラップする配列にアニールするように設計される。よって、TCRベータ鎖のそれぞれVおよびJ領域に相補的な少なくとも1つのプライマーを含むクローニングプライマーのセットが用いられる。好ましい実施形態において、各クローニングフォワードプライマーの5'末端は、所望のベクターへのクローニングを容易にするために、所望のベクターとの約10〜約50、より好ましくは約15塩基の相同性、「ベクター領域」も含む。相同領域は、発現ベクター、例えばレンチウイルスベクターへの直接の組換えを容易にすることができる。各クローニングフォワードプライマーは、ベクターに直接クローニングできる生成物を創出するように設計する。発現ベクターのために、プライマーは、シグナル配列の直後のアミノ酸で開始して、正しいリーディングフレーム内に生成物をクローニングできるように設計してよい。他の実施形態において、各クローニングフォワードプライマーの5'末端は、代わりに、発現ベクターのような所望のベクターへのライゲーションを可能にする制限部位を含む。いくつかの実施形態、例えばTCR配列が所望されるが、機能的TCRが発現する必要がない実施形態において、クローニングフォワードプライマーは、インフレーム生成物を必ずしも生成する必要はなく、ベクターは発現ベクターである必要はない。各クローニングリバースプライマーは、内側リバースプライマーの配列とオーバーラップする配列にアニールするように設計される。好ましい実施形態において、各クローニングリバースプライマーの5'末端は、ベクターへの挿入、例えば発現ベクター、例えばレンチウイルスベクターへの直接の組換えを容易にするために、約10〜約50、より好ましくは約15塩基の相同性も含む。他の実施形態において、各クローニングリバースプライマーの5'末端は、発現ベクターのようなベクターへのライゲーションを可能にする制限部位を含む。例として、ベータ鎖クローニングプライマーのある可能性のあるセットを、Table 3-11および3-12(表12および13)に開示する。
【００４６】
相同プライマー。相同「浄化」プライマーは、クローニング領域の生成物のベクター領域にアニールするように設計される。つまり、相同プライマーは、選択したベクターに相同なクローニングプライマーの生成物の5'末端にアニールするように設計される。相同フォワードプライマーは、クローニングフォワード(V)プライマーからの相同領域にアニールする。相同リバースプライマーは、クローニングリバース(J)プライマーからの相同領域にアニールする。図1を参照されたい。他の実施形態、例えばプライマーが発現ベクターへのクローニングのための5'制限部位を含有する実施形態において、各相同プライマーは、クローニングプライマーにより付加された5'にアニールする。例として、相同プライマーのある可能性のあるセットを、Table 3-13(表14)に開示する。
【００４７】
TCR遺伝子の増幅:
いくつかの実施形態において、鋳型ゲノムDNAは、2回以上の増幅を受ける。一方がアルファ鎖のため、他方がベータ鎖のための2シリーズの増幅反応を並行して行ってよい。しかし、いくつかの実施形態において、アルファ鎖を同定するための反応だけ、またはベータ鎖を同定するための反応だけを行うことが可能である。
【００４８】
いくつかの実施形態において、2回のPCR反応のような増幅反応を行って、まず、TCRアルファまたはベータ鎖を包含する配列についてゲノム鋳型を富化し、次にTCRアルファまたはベータ鎖をコードする配列を単離する。いくつかの実施形態において、第3回のPCRのような増幅も行って、TCRアルファまたはベータ鎖をコードするDNAセグメントの末端に、クローニングベクターに相同な配列を付加する。いくつかの実施形態において、第4回のPCRのような増幅も行って、クローニングベクターに相同な末端配列を含有するDNAセグメントを単離する。
【００４９】
第1回(ゲノムTCR富化反応):いくつかの実施形態において、第1回の増幅を行って、全てのTCR遺伝子座についてゲノム鋳型を富化する。第1富化生成物が生成される。TCR鎖(アルファまたはベータ鎖)のための全ての外側フォワードおよび外側リバースプライマーをプールし、WGAの生成物を鋳型として加え、増幅を行う。
【００５０】
いくつかの実施形態において、増幅は、タッチダウンPCRプロトコールを用いて行う(タッチダウンPCRの説明については、その全体が参照により本明細書に組み込まれるDonら(1991). Nucleic Acids Res. 19:4008頁を参照されたい)。タッチダウンPCRプロトコールは、3ステップサイクルの複数の繰り返しを利用し、各サイクルは、第1に、融解温度(TM)、例えば95℃で鋳型DNAを融解することと、第2に、アニーリング温度にてプライマーがアニールすることを可能にすることと、第3に、伸長温度、例えば70℃にてポリメラーゼがDNAを伸長することを可能にすることとを含む。アニーリング温度は伸長温度と同じでよいか、またはアニーリング温度は伸長温度と異なってよい。第1サイクルにおいて、最高のアニーリング温度、例えば77℃を用いる。タッチダウンPCRの後続の各サイクルにおいて、アニーリング温度を、最適アニーリング温度またはそれよりわずかに低い最低アニーリング温度に到達するまで徐々に減少させる。いくつかの実施形態において、アニーリング温度は、最低アニーリング温度、例えば60℃に到達するまで各サイクルにおいて0.1未満、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0または5.0℃より高い増分で減少する。最低アニーリング温度に一旦到達すると、最低アニーリング温度を用いて1または複数のサイクルを行う。例としてのみ、第1回のための見本のタッチダウンPCRプロトコールをTable 3-14(表15)に記載する。
【００５１】
当業者は、いくつかのその他の増幅プロトコールを用いることができ、各回のプロトコールを、それらに限定されないがアニーリング温度、アニーリング時間、伸長温度、伸長時間、サイクル数、用いるポリメラーゼの種類および量、デオキシリボ核酸3リン酸(dNTP)の濃度、緩衝液組成、マグネシウム濃度、ならびにさらなる試薬の添加または除去、例えばベタイン、ウシ血清アルブミン(BSA)、ジメチルスルホキシド(DMSO)もしくはプレCES(添加物のカクテル)を含む異なるパラメータによって最適化してよいことを認識している。
【００５２】
第2回(TCR単離反応):いくつかの実施形態において、第2回の増幅を行って、富化されたゲノム鋳型から特異的アルファまたはベータ鎖配列を単離する。第2単離生成物が生成される。TCR鎖(アルファまたはベータ)のための内側フォワードプライマーおよび内側リバースプライマーを、第2回のためにプールし、TCR富化反応からの富化生成物を鋳型として加える。タッチダウンPCR反応のような増幅反応を、次いで行う。例としてのみ、第2回のための見本のタッチダウンPCRプロトコールをTable 3-14(表15)に記載する。当業者は、その他の増幅プロトコールを用いることができることを認識している。
【００５３】
いくつかの実施形態において、第2回のTCR単離の生成物を、DNA配列決定のための鋳型として用いる。他の実施形態において、第2回の生成物を、ベクターに直接クローニングする。他の実施形態において、第2回の生成物を、以下に記載するようなTCRクローニング反応の鋳型として用いる。
【００５４】
第3回(TCRクローニング反応):いくつかの実施形態において、第3回の増幅を用いて、クローニングベクターに相同な配列を、第2回で単離したDNAセグメント(単離生成物)の末端に付加する。TCR鎖(アルファまたはベータ)のためのクローニングフォワードおよびリバースプライマーを第3回のためにプールし、第2回の単離からの単離生成物を鋳型として加える。タッチダウンPCRプロトコールのような増幅反応を次いで行って、第3クローニング生成物が生成される。例としてのみ、第3回のための見本のタッチダウンPCRプロトコールをTable 3-14(表15)に記載する。当業者は、その他の増幅プロトコールを用いることができることを認識している。
【００５５】
第3回からの生成物は、直接配列決定してよい。これらは、所望のベクター、例えば発現ベクターにクローニングしてもよい。いくつかの実施形態において、第3回からの生成物を、例えばアガロースゲル上で当該技術において既知の技術を用いるゲル電気泳動により精製する。いくつかの実施形態において、所望のバンドは、約300〜400bpの長さである。
【００５６】
第4回(相同反応):好ましい実施形態において、第4増幅反応を行って、クローニングベクターに相同な末端配列を含有するDNAセグメントを単離して増幅する。相同フォワードおよびリバースプライマーを、第4回のためにプールする。第3回の増幅からのクローニング生成物を、第4回の増幅のための鋳型として用いて、第4の相同生成物を生成する。いくつかの実施形態において、PCRプロトコールを行う。PCRプロトコールは、第1に、融解温度(TM)、例えば95℃で鋳型DNAを融解することと、第2に、アニーリング温度、例えば65℃にてプライマーがアニールすることを可能にすることと、第3に、伸長温度、例えば70℃にてポリメラーゼがDNAを伸長することを可能にすることの3ステップサイクルの複数の繰り返しを含む。例としてのみ、第4回のための見本のPCRプロトコールをTable 3-14(表15)に記載する。他の実施形態において、タッチダウンPCRプロトコールを行ってよい。
【００５７】
第4回の増幅からの相同生成物は、直接配列決定してよい。いくつかの実施形態において、第4回からの生成物を、例えばアガロースゲル上で当該技術において既知の技術を用いるゲル電気泳動により精製する。いくつかの実施形態において、所望のバンドは、約300〜400bpの長さである。いくつかの実施形態において、各T細胞受容体について単離された遺伝子を、その後、ベクターにクローニングする。いくつかの実施形態において、ベクターは、発現ベクター、例えばレンチウイルス発現ベクターを含む。
【００５８】
キット
いくつかの実施形態において、本発明は、以下の物質の1または複数を含むキットを含む:オリゴヌクレオチドプライマー、例えばTCRアルファ鎖のためのフォワード外側プライマー、TCRアルファ鎖のためのリバース外側プライマー、TCRベータ鎖のためのフォワード外側プライマー、TCRベータ鎖のためのリバース外側プライマー、TCRアルファ鎖のためのフォワード内側プライマー、TCRアルファ鎖のためのリバース内側プライマー、TCRベータ鎖のためのフォワード内側プライマー、TCRベータ鎖のためのリバース内側プライマー、TCRアルファ鎖のためのフォワードクローニングプライマー、TCRアルファ鎖のためのリバースクローニングプライマー、TCRベータ鎖のためのフォワードクローニングプライマー、TCRベータ鎖のためのリバースクローニングプライマー、または相同プライマー(オリゴヌクレオチドプライマーの例についてTables 1-15も参照されたい);オリゴヌクレオチドプライマーの作業溶液;およびプールしたオリゴヌクレオチドプライマー、例えばTCRのアルファ鎖のためのプールした外側プライマー。
【００５９】
さらに、キットは、緩衝液;PCR酵素、例えばTaqポリメラーゼ;PCR添加物、例えばマグネシウム、ベタイン、ウシ血清アルブミン(BSA)、ジメチルスルホキシド(DMSO)またはプレCES;dNTP;PCRマスターミックス;ゲノムDNA;陽性対照DNA、例えばTCRアルファまたはベータ鎖をコードする配列;抗体、例えば抗CD3、抗CD4、抗VB14(いくつかの実施形態において、抗体は、蛍光体またはその他の検出分子とコンジュゲートしてよい);テトラマー、例えばMARTまたはNY-ESO VB14に対するテトラマー(いくつかの実施形態において、テトラマーは、蛍光体またはその他の検出分子とコンジュゲートしてよい);WGA試薬;溶解試薬;クローニングベクター;使用説明書;および/または参照物質を含んでよい。
【００６０】
いくつかの実施形態において、キットは、複数のプライマーの1または複数のプールを含む。いくつかの実施形態において、キットは、フォワードおよびリバースプライマーを含むTCRアルファ外側プライマーセットを含み、該外側プライマーセットは、TCRアルファ鎖のVおよびJ領域の実質的にそれぞれの共通バリアントに相補的な少なくとも1つのプライマーを含む。他の実施形態において、キットは、フォワードおよびリバースプライマーを含むTCRベータ外側プライマーセットを含み、該外側プライマーセットは、TCRベータ鎖のVおよびJ領域のそれぞれの共通バリアントに相補的な少なくとも1つのプライマーを含む。
【００６１】
他の実施形態において、キットは、フォワードおよびリバースプライマーを含むTCRアルファ内側プライマーセットを含み、該内側プライマーセットは、TCRアルファ鎖のVおよびJ領域の実質的にそれぞれの共通バリアントに相補的な少なくとも1つのプライマーを含む。他の実施形態において、キットは、フォワードおよびリバースプライマーを含むTCRベータ内側プライマーセットを含み、該内側プライマーセットは、TCRベータ鎖のVおよびJ領域の実質的にそれぞれの共通バリアントに相補的な少なくとも1つのプライマーを含む。
【００６２】
いくつかの実施形態において、キットは、TCRアルファ外側プライマーセットと、TCRベータ外側プライマーセットと、TCRアルファ内側プライマーセットと、TCRベータ内側プライマーセットとを含む。
【００６３】
いくつかの実施形態において、プライマーのプールは、V領域バリアントのための各プライマーセットがJ領域バリアントのための対応するプライマーセットとは別のプールにあること以外は、上記と同様である。
【００６４】
いくつかの実施形態において、キットは、クローニングプライマーのプールも含み、クローニングプライマーの各セットは、特定のベクターとの相同性を有するフォワードおよびリバースクローニングプライマーを含む。TCRアルファクローニングプライマーセットは、TCRアルファ鎖のVおよびJ領域の実質的にそれぞれの共通バリアントに相補的な少なくとも1つのプライマーを含む。他の実施形態において、TCRベータクローニングプライマーセットは、特定のベクターとの相同性を有するフォワードおよびリバースクローニングプライマーを含み、該TCRベータクローニングプライマーセットは、TCRベータ鎖のVおよびJ領域の実質的にそれぞれの共通バリアントに相補的な少なくとも1つのプライマーを含む。キットは、クローニングプライマーがそれに対して相同性を有するベクターをさらに含んでよい。いくつかの実施形態において、プライマーのプールは、V領域バリアントのための各プライマーセットがJ領域バリアントのための対応するプライマーセットとは別のプールにあること以外は、上記と同様である。
【００６５】
他の実施形態において、キットは、クローニングプライマーの一部分に相同な、そして特定のベクターに相同なフォワードおよびリバース相同プライマーを含む相同プライマーのプールを含む。
【００６６】
いくつかの実施形態において、キットは、TCRアルファ外側プライマーセットと、TCRベータ外側プライマーセットと、TCRアルファ内側プライマーセットと、TCRベータ内側プライマーセットと、TCRアルファクローニングプライマーセットと、TCRベータクローニングプライマーセットとを含む。キットは、相同プライマーセットをさらに含んでよい。
【実施例１】
【００６７】
よく特徴決定されたJurkat T細胞系統からの細胞を用いて、TCRアルファおよびベータ鎖配列を単離するためのプライマーセットおよびPCRプロトコールを確認した。細胞を、10000、1000、100、10および単一の細胞を含有するPBSの2セットのウェルに系列希釈した。両方のセットの細胞を溶解したが、一方のみをWGAを用いて増幅した。Jurkat特異的アルファ鎖に対して設計したオリゴヌクレオチドを用いるPCRを、両方のセットについて行った。WGAの非存在下では、TCRアルファ鎖のPCR増幅(標的サイズ約350bp)は、100細胞未満を含む鋳型について非常に低い収率をもたらした。WGAを用いて処理した試料のPCR増幅は、高い収率をもたらした(図2)。
【００６８】
アルファおよびベータ鎖の全ての可能な再配列をネステッドPCRにより単離するために、2セットのオリゴヌクレオチド(内側および外側)を、両方の鎖の188全てのVおよびJ領域に対して設計した。V領域内のフォワード内側オリゴヌクレオチドは、V領域シグナル配列およびイントロンの下流に設計した。プライマーが、発現ベクターへのクローニングを可能にする鋳型を創出し、シグナル配列の直後のアミノ酸で開始する正しいリーディングフレームを確実に維持するように注意を払った。J領域内のリバース内側オリゴヌクレオチドは、J領域の末端にて、これもまたリーディングフレームを維持するようにして設計した(図3a)。外側オリゴヌクレオチドは、それらの対応する内側オリゴヌクレオチドの20〜30塩基対上流で設計した。アルファおよびベータフォワードプライマーを、クローニングを容易にするために、末端にそれぞれBbvClおよびSbfl制限部位を含めて設計した。これらのオリゴヌクレオチドのそれぞれが同一のPCR条件下で機能する能力を確かめるために、対応するリバースプライマーを、それぞれVおよびJ領域について設計した。PCRを、再配列されていないゲノムDNAを鋳型として用いて、オリゴヌクレオチドの各対を用いて行った。全てのオリゴヌクレオチドは、同じPCR条件下で機能的であった(図3b)。
【００６９】
TCR増幅のために必要な反応の数を最小限にするために、増幅プロトコールを、VおよびJ内側プライマーの群にオリゴヌクレオチドをプールすることにより多重化した。試験を行って、単一TCRをまだ単離できる内側オリゴヌクレオチドのフォワードおよびリバースプールの最小数(各反応におけるオリゴヌクレオチドの最大数)を決定した。漸増数の内側プライマーを用いる多重PCRを、培養Jurkat細胞から単離した鋳型ゲノムDNAについて行って、TCRの増幅の成功をまだ許容するプライマーの最大数を決定した(図4a、4b)。10のフォワードおよびリバースアルファプライマー(fw/rv)のプールを、PCR反応に、アルファ遺伝子座に対する全てのプライマーが単一反応中に存在するまで加えた。例えば、50のフォワードプライマーと70のリバースプライマーとのプールは、単一アルファ鎖の単離を可能にした。Jurkatアルファ鎖は、単一反応に存在するアルファ遺伝子座に対する全てのプライマーを用いて単離できた(図4a)。10のフォワードおよびリバースベータプライマー(フォワード/リバース)のプールを、PCR反応に、ベータ遺伝子座に対する全てのプライマーが単一反応中に存在するまで加えた。Jurkatベータ鎖を、単一反応中の全てのプライマーを用いて単離した(図4b)。例えば、60のフォワードプライマーと14のリバースプライマーとのプールは、単一ベータ鎖の単離を可能にした。
【実施例２】
【００７０】
この実施例において、TCR配列を、T細胞の特定の集団であるCD25+調節性T細胞(T-reg)から単離した。T-regは、University of California、Los Angelesからの患者の血液試料から得て、単一細胞まで希釈した。これらの細胞を溶解し、WGAにより増幅し、PCRにより、既知の再配列されていないヒト遺伝子である血管拡張性失調症変異(ATM)について、ヒト遺伝物質を含有することを確かめた。TCR単離プロトコールを、これらの試料について行った。4つの異なるアルファ鎖および8つの異なるベータ鎖を同定した。増幅した鎖をTOPOシャトルクローニングベクターにクローニングし、当該技術において既知の技術を用いて配列決定した。これらは、aV9-2J33、aV17J33、aV2J3、aV26-2J33、bV18J2-2、bV6-J1-1、bV4-1J2-5、bV11-2J2-2、bV6-2J2-7、bV9J2-7、bV6-1J2-2、bV6-8J1-1であることが見出された。これらの配列を、ゲノムの特定のVおよびJ領域に対して整列させたが、これらは、VおよびJ領域の接合部でのN領域を除いて100%相同であった。
【実施例３】
【００７１】
NY-ESO TCR単離
この実施例において、TCR配列を、抗メラノーマ活性を有するT細胞の集団から単離した。CD25+調節性T細胞(T-reg)を単離した。臨床的抗メラノーマ活性を示す患者試料を、CD3、CD13、CD19、CD4、CD8に対する抗体を用いて染色した。CD3+患者T細胞を、NYSEO、MART1、NA-17、チロシナーゼおよびGP100を含むメラノーマ抗原特異的テトラマーを用いて染色した。7-AAD陰性の生細胞を、CD13- CD19- CD3+およびテトラマー陽性になるようにさらにゲーティングした(図5、6)。ゲーティング基準に合致する細胞を、1.5μlのアルカリ溶解緩衝液(ALB)中に個別に選別し、各細胞を96ウェルプレートの単一ウェルに加え、輸送のために-20℃にて凍結した。
【００７２】
WGAキットを、Qiagen(Repli-G)およびGE Healthcare Life Sciences(Illustra GenomiPhi V2 DNA増幅キット)から得て、増幅を、Spits, C.ら(2006). Nature Protocols 1:1965〜70頁に従って行った。簡単に述べると、細胞を、1.5μlのアルカリ溶解緩衝液(ALB)中に選別し、-20℃にて30分間インキュベートした。反応物を65℃にて10分間インキュベートして細胞を溶解した後に、9μlのGenomiPhi試料緩衝液、9μlのGenomiPhi反応緩衝液および1μlのPhi29酵素を加えた。反応を、30℃にて等温で2時間行い、65℃にて10分間不活性化した。生成物を、4℃にて貯蔵した。
【００７３】
TCR増幅のために必要な反応数を最小限にするために、PCR増幅を、VおよびJプライマーの群にオリゴヌクレオチドをプールすることにより多重化した。第1回のPCR反応を、1μlのWGA生成物;10μlのNovagen KODホットスタートマスターミックス;4μlのDEP-C処理H2O;4μlのプレCES添加物の5×溶液;0.5μlのプールしたフォワードプライマー;0.5μlのプールしたリバースプライマー(プライマーのプールは、各プライマーの5μlの100μM溶液を組み合わせ、20μlの分割量を創出することにより創出する)を含む20μlの反応で行った。アルファ鎖を増幅するために用いたプライマー対は、アルファV外側プライマー(Table 3-1(表2))およびアルファJ外側プライマー(Table 3-2(表3))であった。ベータ鎖を増幅するために用いたプライマー対は、ベータV外側プライマー(Table 3-3(表4))およびベータJ外側プライマー(Table 3-4(表5))であった。第1回のPCR増幅プロトコールを、Table 3-14(表15)にまとめる。当業者は、PCRプロトコールのパラメータ、例えばアニーリング温度およびインキュベーション時間は、プライマーのあるセットおよび/または鋳型についてプロトコールを最適化するために容易に変更できることを認識している。
【００７４】
第2回のPCRにおいて、第1回からの1μlの生成物を、アルファまたはベータ鎖のいずれかについての内側プライマーの全てを含むPCRカクテルに加えた。アルファ鎖を増幅するために用いたプライマー対は、アルファV内側プライマー(Table 3-5(表6))およびアルファJ内側プライマー(Table 3-6(表7))である。ベータ鎖を増幅するために用いたプライマー対は、ベータV内側プライマー(Table 3-7(表8))およびベータJ内側プライマー(Table 3-8(表9))である。PCRカクテルは、それ以外は、第1回に記載したものと同様である。第2回についてのPCR増幅プロトコールを、Table 3-14(表15)にまとめる。
【００７５】
第3回のPCRにおいて、第2回からの1μlの生成物を、アルファまたはベータ鎖のいずれかについてのクローニングプライマーの全てを含むPCRカクテルに加える。アルファ鎖を増幅するために用いたプライマー対は、アルファVクローニングプライマー(Table 3-9(表10))およびアルファJクローニングプライマー(Table 3-10(表11))である。ベータ鎖を増幅するために用いたプライマー対は、ベータVクローニングプライマー(Table 3-11(表12))およびベータJクローニングプライマー(Table 3-12(表13))である。PCRカクテルは、それ以外は、第1回に記載したものと同様である。第3回についてのPCR増幅プロトコールを、Table 3-14(表15)にまとめる。
【００７６】
第3回からの生成物を、相同プライマー(Table 3-13(表14))を含むカクテルに加え、Table 3-14(表15)に開示するプロトコールを用いて増幅した。3つの細胞がアルファおよびベータ鎖の両方を産生し、1つの細胞がアルファ鎖を産生した。対は、TRAV12-1J1、TRBV5-6J1-1;TRAV38-2DV8J53、TRBV5-6J1-2;およびTRAV8-3J44、TRBV5-6J1-1であった。対形成しなかったアルファ鎖は、TRAV21J47であった。配列解析により、全ての鎖が、それらの対応するゲノム領域と完全に整列され、接合部多様性の領域を容易に同定できたことが見出された。受容体TRAV38-2DV8J53、TRBV5-6J1-2は、オープンリーディングフレームを有さない非機能的再配列であることが見出された。単離したTCRのうちの2つが、共通の同一ベータ鎖(TRBV5-6J1-1)を有することが見出された。本発明をいずれの1つの理論で限定することなく、この結果は、ポジティブ選択により説明でき、ここでは、ベータ鎖がまず再配列され、プレT細胞受容体アルファ鎖(pTalpha)と共に表面上に発現される。ベータ鎖がポジティブに選択されるならば、後続のアルファ鎖は、再配列を受ける。
【００７７】
【表２】
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【００７８】
【表３Ａ】
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【００７９】
【表３Ｂ】
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【００８０】
【表４Ａ】
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【００８１】
【表４Ｂ】
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【００８２】
【表５】
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【００８３】
【表６】
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【００８４】
【表７Ａ】
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【００８５】
【表７Ｂ】
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【００８６】
【表８Ａ】
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【００８７】
【表８Ｂ】
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【００８８】
【表９】
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【００８９】
【表１０Ａ】
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【００９０】
【表１０Ｂ】
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【００９１】
【表１１Ａ】
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【００９２】
【表１１Ｂ】
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【００９３】
【表１１Ｃ】
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【００９４】
【表１２Ａ】
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【００９５】
【表１２Ｂ】
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【００９６】
【表１２Ｃ】
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【００９７】
【表１３】
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【００９８】
【表１４】
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【００９９】
【表１５Ａ】
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【０１００】
【表１５Ｂ】
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【０１０１】
【表１５Ｃ】
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【実施例４】
【０１０２】
NA-17 TCR単離
NA-17は、メラノーマ特異的抗原である。T細胞を、患者試料から得て、NY-ESO特異的テトラマーで染色した。8つのNA-17+ CD3+細胞からのゲノムDNAを増幅し、TCR単離プロトコールのための鋳型として用いた。これらの細胞は、4つの別個のアルファ鎖と、5つの別個のベータ鎖:TRAV12-1J11、TRAV12-3J9、TRAV16J28、TRAV17J10、TRBV12-3J1-6、TRBV27J1-2、TRBV27J1-6、TRBV5-5J1-3、TRBV5-6J1-1を産生した。いくつかの鎖は、複数の細胞で発現されることが見出された。いずれの1つの理論に当てはめることなく、これらの結果は、これらの細胞がクローン性であるか、または個別のウェルが複数の細胞を含有して、対形成を多義（ambiguous）にしたことを示し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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