(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の性質（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）：
（ａ）芽胞が３７℃、ｐＨ３．０、０．０４％ペプシンの存在下において３時間以上生存し、
（ｂ）芽胞が３７℃、０．５％胆汁酸塩の存在下において生存し、
（ｃ）増殖過程において１００mg／Ｌ濃度のセロトニンを７２時間以内に７１．７mg／Ｌ以下に低減してセロトニン代謝産物としてＮ−［２−（５−ヒドロキシインドール−３−イル）エチル］コハク酸アミドを生成する、
を有し、下痢毒または嘔吐毒の産生能を有しないバチルス属菌（但し、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）Ｂ−１８（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８５８）株、バチルス・チューリンゲンシスＢ−２４（ＮＩＴＥ  Ｐ−８５７）株、及びバチルス・セレウス（Bacillus cereus）Ｂ−１６（ＮＩＴＥ  Ｐ−８５６）株を除く）。
【請求項２】
請求項１に記載のバチルス属菌と、薬剤又は食品として許容される担体とを含む医薬、動物薬、食品又は飼料用組成物。
【請求項３】
プレバイオティクスをさらに含む請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
錠剤、カプセル、粉末、ペースト、ゲル、液状製剤、食品サプリメント、食品、飼料または飼料添加物の形態である請求項２又は３に記載の組成物。
【請求項５】
医薬または動物薬の形態である請求項２〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
消化器障害またはその症状を予防および／または治療する医薬または動物薬の形態である請求項２〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
経口投与用である請求項２〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記消化器障害が過敏性腸症候群、炎症性腸疾患、下痢、腹痛、膨満、腹部痙攣または大腸がんである請求項６又は７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セロトニン代謝能を有する非病原性のバチルス属菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
下痢は現代社会において、クオリティー・オブ・ライフを低下させる大きな問題である。特に現代日本人においては自覚症状を訴えていないケースも含めると14.2%という高率で過敏性腸症候群（IBS）の発症が認められるなど大きな問題となっている（非特許文献１、２）。また、酪農畜産分野でも大きな問題で、特に哺乳期のウシ、ブタやふ化直後のニワトリなどでは下痢の発生が成長の阻害に直結することが多く、経済的にも問題である。
【０００３】
これらの対策としてヒト用、家畜用のバチルス属菌を用いた生菌剤が上市されている（非特許文献３）。しかしながら、その下痢抑制の作用メカニズムは必ずしも明らかにされておらず、その効果も十分とはいえなかった。
【０００４】
ところで、セロトニンは脳内では神経伝達物質として働いているが、腸では腸管運動を促進することが知られている（非特許文献４、５）。体内での分布からみると、セロトニンのおよそ90%は腸管に分布し、そのほとんどは腸クロム親和性細胞（EC細胞＝enterochromaffin cell）の顆粒内に局在していることが知られている。腸管セロトニンの遊離は自律神経系・体液性の制御機構以外にも消化管腔内の食物による物理的・化学的刺激によって複雑に調節されているが、遊離した場合、大部分は基底膜側に分泌され、腸管運動に関与する一方、一部は管腔側にも遊離される。セロトニンにはこのような作用があるため、マウスにセロトニンを皮下注射・腹腔注射すると数時間内に糞便量の増加・糞便中含水量の増加が起こる。また、この作用はセロトニン受容体ブロック薬の経口投与で緩和される（非特許文献６、７）。実際、この作用を利用して米国ではセロトニン受容体（5-HT3）受容体拮抗薬Alosetron（登録商標）が重症の過敏性腸症候群（IBS）女性患者用として実用化されている。
また、腸管微生物の増殖バランスが崩れると各種アミンが生成され、人体に悪影響を及ぼすことが指摘されている（非特許文献８）。
さらにセロトニンは大腸がんの肥大にも関与しているとする複数の報告がある（非特許文献９）。
これらのことから、腸管内のセロトニン濃度を低めることは下痢をはじめとする様々な疾患予防に対しても重要と考えられる。
また、セロトニン以外の生物由来アミンとしてチラミンは発酵食品や腐敗した食品中にしばしば含まれ、摂取するとアレルギー様食中毒の原因となることが知られている（非特許文献１０）。この点からは腸管内のチラミン濃度を低下させることもアレルギー様食中毒の予防に対して重要と考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Dig. Dis. Sci.(2004) 49:1049-1053
【非特許文献２】佐々木（編）2006.過敏性腸症候群（山中書店）
【非特許文献３】FEMS Microbiol Rev. (2005) 29:813-835
【非特許文献４】豊田隆謙（編）1991「消化管機能−自律神経と消化管ホルモン−」医薬ジャーナル社
【非特許文献５】日内会誌 (1970) 59：31−38
【非特許文献６】Jpn. J. Pharmacol. (2000) 82: 350-352.
【非特許文献７】Aliment. Pharmacol. Ther. 23: 1067-1076.
【非特許文献８】Med. Lab. Sci.(1977) 34: 131-143.
【非特許文献９】Oncol. Rep.(2005) 14:1593-1597.
【非特許文献１０】J.Toxicol.Clin.Toxicol.（1989）27：225-240.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在、市場に流通しているバチルス属生菌剤は、その下痢抑制の作用メカニズムは必ずしも明らかにされておらず、その効果も十分とはいえなかった。
従って、本発明の課題は、過剰な腸管運動の原因であるセロトニンの腸管内濃度を低下させ、整腸用の生菌剤として有用な新たなバチルス属菌を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、腸管への到達能力を有し、かつ腸管内のセロトニンを代謝する能力の高い新たな微生物を探索したところ、バチルス属に属する微生物の中にこの目的に合致する性質を有し、経口投与すると実際に下痢抑制作用が顕著なものを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、芽胞が低pH耐性能及び胆汁酸耐性能を有し、かつ増殖時にセロトニン代謝能を有するバチルス属菌を提供するものである。
また、本発明は、上記バチルス属菌と、薬剤又は食品として許容される担体とを含む、医薬、動物薬、食品又は飼料用組成物を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のバチルス属菌は、芽胞が低pH及び胆汁酸に対する耐性が強いため、胃及び十二指腸内で生存し、腸管まで到達し、かつ増殖時、すなわち腸管内においてセロトニンを代謝して腸管内セロトニン濃度を低下させる作用を有することから、腸管内セロトニン濃度上昇に起因する下痢、過敏性腸症候群、大腸がん等の疾患の予防及び治療に有用である。本発明のバチルス属細菌を含む組成物は、ヒトを含む動物用の医薬、食品及び飼料として有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書において、質量％とは(wt／vol)％を意味し、容量％とは(vol／vol)％を意味する。
【００１１】
本発明のバチルス属菌は、芽胞が低pH耐性能及び胆汁酸耐性能を有し、かつ増殖時にセロトニン代謝能を有する。
【００１２】
本発明における芽胞の低pH耐性能とは、芽胞が低pH条件でも生存することを意味し、pH３．０の条件でも３時間以上生存するのが好ましい。本発明のバチルス属菌は、pH３．０程度の条件で３時間以上生存するので、経口摂取した場合、胃及び十二指腸を通過し腸管に到達するまでの間、芽胞の状態で死滅せずに生存する。より好ましい低pH耐性能は、３７℃、pH３．８、０．０４％ペプシンの存在下において３時間以上生存する能力である。
【００１３】
本発明における芽胞の胆汁酸耐性能とは、芽胞が胆汁酸存在下で生存することを意味し、０．５％胆汁酸の存在下で生存するのが好ましい。本発明のバチルス属菌は、０．５％胆汁酸の存在下でも生存するので、経口摂取した場合、胃だけでなく十二指腸を通過し腸管に到達するまでの間、芽胞の状態で死滅せずに生存する。より好ましい胆汁酸耐性能は、３７℃、０．５％胆汁酸の存在下で生存する能力である。ここで胆汁酸にはコール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、ウルソデオキシコール酸が含まれる。
【００１４】
本発明のバチルス属菌は、増殖時にセロトニン代謝能を有する。すなわち、増殖時にセロトニンを代謝し、セロトニン活性のない物質に変換する能力を有する。当該セロトニン代謝能は、増殖過程において１００mg／Ｌ濃度のセロトニンを７２時間以内に７５mg／Ｌ以下まで低減するものが好ましく、特に６５mg／Ｌ以下まで低減するものが好ましい。
セロトニン代謝産物としては、代謝産物そのものにセロトニン活性がなく、かつ腸管内で再度代謝されることによってセロトニンに再変換されにくいＮ−［２-（５−ヒドロキシインドール−３−イル）エチル］コハク酸アミド（式１、ブホブタン酸、Bufobutanoic acid）に代謝するものが好ましい。
【００１５】
【化１】
0005769333.tif 000002
【００１６】
また、本発明のバチルス属菌の中には、増殖時にチラミン代謝能、すなわち、増殖時にチラミンを代謝し、チラミン活性のない物質に変換する能力を有するものもある。このため、食餌中チラミンの摂取によるアレルギー様食中毒も同時に予防したい場合には、チラミン代謝能も併せ持つ菌株を用いることが好ましい。
チラミン代謝産物としては、代謝産物そのものにチラミン活性がなく、かつ腸管内で再度代謝されることによってチラミンに再変換されにくいＮ−（４−ヒドロキシフェネチル）コハク酸アミド（式２）に代謝するものが好ましい。
【００１７】
【化２】
0005769333.tif 000003
【００１８】
また、本発明のバチルス属菌は、下痢毒または嘔吐毒といった食中毒関連毒素の産生能を有しないものが好ましい。下痢毒産生株かどうかについては、結紮腸管ループ試験、血管透過性亢進試験、免疫学的検出法である逆受身ラテックス凝集試験などによって検査することができるほか、検出用キット（ＣＲＥＴ−ＲＰＬＡ（登録商標）、デンカ生研製）なども用いることができる。また、嘔吐毒産生株かどうかについてはサルまたは処方したい対象動物への経口投与試験により確認することができる（近藤・渡辺（編著）１９９５『スポア実験マニュアル』技報堂出版）。
【００１９】
本発明のバチルス属菌のより好ましい態様は、下記の性質（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）：
（ａ）芽胞が３７℃、ｐＨ３．０、０．０４％ペプシンの存在下において３時間以上生存し、
（ｂ）芽胞が３７℃、０．５％胆汁酸塩の存在下において生存し、
（ｃ）増殖過程において１００mg／Ｌ濃度のセロトニンを７２時間以内に７５mg／Ｌ以下に低減する
を有し、下痢毒または嘔吐毒の産生能を有しないバチルス属菌である。
【００２０】
本発明のバチルス属菌としては、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、バチルス・アシディセラー（Bacillus acidiceler）、バチルス・アシディコーラ（Bacillus acidicola）、バチルス・アエオリウス（Bacillus aeolius）、バチルス・アエリウス（Bacillus aerius）、バチルス・アエロフィルス（Bacillus aerophilus）、バチルス・アガラドヘレンス（Bacillus agaradhaerens）、バチルス・アキバイ（Bacillus akibai）、バチルス・アルカリフィルス（Bacillus alcalophilus）、バチルス・アルギコーラ（Bacillus algicola）、バチルス・アルカリジアゾトロフィカス（Bacillus alkalidiazotrophicus）、バチルス・アルカリテルリス（Bacillus alkalitelluris）、バチルス・アルティチュジニス（Bacillus altitudinis）、バチルス・アルベアユエンシス（Bacillus alveayuensis）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・アンスラシス（Bacillus anthracis）、バチルス・アクイマリス（Bacillus aquimaris）、バチルス・アレノシイ（Bacillus arenosi）、バチルス・アルセニシセレナティス（Bacillus arseniciselenatis）、バチルス・アルセニカス（Bacillus arsenicus）、バチルス・アーヴァイ（Bacillus arvi）、バチルス・アサヒイ（Bacillus asahii）、バチルス・アトロファエウス（Bacillus atrophaeus）、バチルス・アウランティアカス（Bacillus aurantiacus）、バチルス・アキサクィエンシス（Bacillus axarquiensis）、バチルス・アゾトフォーマンス（Bacillus azotoformans）、バチルス・バディウス（Bacillus badius）、バチルス・バーバリカス（Bacillus barbaricus）、バチルス・バタビエンシス（Bacillus bataviensis）、バチルス・ベンゾボランス（Bacillus benzoevorans）、バチルス・ボゴリエンシス（Bacillus bogoriensis）、バチルス・ボロニフィルス（Bacillus boroniphilus）、バチルス・ブタノリボランス（Bacillus butanolivorans）、バチルス・カーボニフィルス（Bacillus carboniphilus）、バチルス・セセンベンシス（Bacillus cecembensis）、バチルス・セルロシリティカス（Bacillus cellulosilyticus）、バチルス・チャガノレンシス（Bacillus chagannorensis）、バチルス・シービー（Bacillus cibi）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・クラーキー（Bacillus clarkii）、バチルス・クラウシー（Bacillus clausii）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・コアウイレンシス（Bacillus coahuilensis）、バチルス・コーニー（Bacillus cohnii）、バチルス・デシシフロンディス（Bacillus decisifrondis）、バチルス・デコロラチオニス（Bacillus decolorationis）、バチルス・ドレンテンシス（Bacillus drentensis）、バチルス・エダフィカス（Bacillus edaphicus）、バチルス・エンドフィティカス（Bacillus endophyticus）、バチルス・ファラギニス（Bacillus farraginis）、バチルス・フォスティディオサス（Bacillus fastidiosus）、バチルス・ファルマス（Bacillus firmus）、バチルス・フレクサス（Bacillus flexus）、バチルス・ホラミニス（Bacillus foraminis）、バチルス・フォルディ（Bacillus fordii）、バチルス・フォルティス（Bacillus fortis）、バチルス・フマリオリィ（Bacillus fumarioli）、バチルス・フニクラス（Bacillus funiculus）、バチルス・ガラクトシディリティカス（Bacillus galactosidilyticus）、バチルス・ゲラティニ（Bacillus gelatini）、バチルス・ギブソニー（Bacillus gibsonii）、バチルス・ハルマパラス（Bacillus halmapalus）、バチルス・ハロデュランス（Bacillus halodurans）、バチルス・ハロフィルス（Bacillus halophilus）、バチルス・ヘミセルロシリティカス（Bacillus hemicellulosilyticus）、バチルス・ハーバーステイネンシス（Bacillus herbersteinensis）、バチルス・ホリコシー（Bacillus horikoshii）、バチルス・ホルティ（Bacillus horti）、バチルス・フミ（Bacillus humi）、バチルス・ファジンポエンシス（Bacillus hwajinpoensis）、バチルス・イドリエンシス（Bacillus idriensis）、バチルス・インディカス（Bacillus indicus）、バチルス・インファンティス（Bacillus infantis）、バチルス・インファーナス（Bacillus infernus）、バチルス・インソリタス（Bacillus insolitus）、バチルス・イサベリエ（Bacillus isabeliae）、バチルス・チョッカリ（Bacillus jeotgali）、バチルス・コリエンシス（Bacillus koreensis）、バチルス・クルーウィッチアエ（Bacillus krulwichiae）、バチルス・レヘンシス（Bacillus lehensis）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・リトラリス（Bacillus litoralis）、バチルス・ルシフェレンシス（Bacillus luciferensis）、バチルス・マカウエンシス（Bacillus macauensis）、バチルス・マキアエ（Bacillus macyae）、バチルス・マラシテンシス（Bacillus malacitensis）、バチルス・マンナニリティカス（Bacillus mannanilyticus）、バチルス・マリナス（Bacillus marinus）、バチルス・マリスフラビィ（Bacillus marisflavi）、バチルス・マシリエンシス（Bacillus massiliensis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・メタノリカス（Bacillus methanolicus）、バチルス・モジャベンシス（Bacillus mojavensis）、バチルス・ムシラギノサス（Bacillus mucilaginosus）、バチルス・ムラリス（Bacillus muralis）、バチルス・ムリマルティニ（Bacillus murimartini）、バチルス・ミコイデス（Bacillus mycoides）、バチルス・ネールソニー（Bacillus nealsonii）、バチルス・ニアベンシス（Bacillus niabensis）、バチルス・ニアシニ（Bacillus niacini）、バチルス・ノバリス（Bacillus novalis）、バチルス・オデッセイ（Bacillus odysseyi）、バチルス・オクヘンシス（Bacillus okhensis）、バチルス・オクヒデンシス（Bacillus okuhidensis）、バチルス・オレロニウス（Bacillus oleronius）、バチルス・オシメンシス（Bacillus oshimensis）、バチルス・パリダス（Bacillus pallidus）、バチルス・パナシテラエ（Bacillus panaciterrae）、バチルス・パタゴニエンシス（Bacillus patagoniensis）、バチルス・プラコルチディス（Bacillus plakortidis）、バチルス・ポチェオネンシス（Bacillus pocheonensis）、バチルス・ポリゴニ（Bacillus polygoni）、バチルス・シュードアルカリフィルス（Bacillus pseudalcaliphilus）、バチルス・シュードファーマス（Bacillus pseudofirmus）、バチルス・シュードミコイデス（Bacillus pseudomycoides）、バチルス・シクロデュランス（Bacillus psychrodurans）、バチルス・フィクロサッカロリティカス（Bacillus psychrosaccharolyticus）、バチルス・フィクロトレランス（Bacillus psychrotolerans）、バチルス・プミラス（Bacillus pumilus）、バチルス・ピクナス（Bacillus pycnus）、バチルス・キングダオネンシス（Bacillus qingdaonensis）、バチルス・ルリス（Bacillus ruris）、バチルス・サフェンシス（Bacillus safensis）、バチルス・サラリウス（Bacillus salarius）、バチルス・サリフィルス（Bacillus saliphilus）、バチルス・シュリジェリー（Bacillus schlegelii）、バチルス・セレナターセナティス（Bacillus selenatarsenatis）、バチルス・セレニティレドセンス（Bacillus selenitireducens）、バチルス・セオハエアネンシス（Bacillus seohaeanensis）、バチルス・サックレトニー（Bacillus shackletonii）、バチルス・シルベストリス（Bacillus silvestris）、バチルス・シンプレックス（Bacillus simplex）、バチルス・シラリス（Bacillus siralis）、バチルス・スミシー（Bacillus smithii）、バチルス・ソリ（Bacillus soli）、バチルス・ソノレンシス（Bacillus sonorensis）、バチルス・スフェリカス（Bacillus sphaericus）、バチルス・スポロサーモデュランス（Bacillus sporothermodurans）、バチルス・ストラトスフェリカス（Bacillus stratosphericus）、バチルス・サブテラネウス（Bacillus subterraneus）、バチルス・タエアネンシス（Bacillus taeanensis）、バチルス・テクィレンシス（Bacillus tequilensis）、バチルス・サーマンタルクティカス（Bacillus thermantarcticus）、バチルス・サーモアミロボランス（Bacillus thermoamylovorans）、バチルス・サーモクローカー（Bacillus thermocloacae）、バチルス・チオパランス（Bacillus thioparans）、バチルス・ツスシー（Bacillus tusciae）、バチルス・バリスモーチス（Bacillus vallismortis）、バチルス・ベデリ（Bacillus vedderi）、バチルス・ベレゼンシス（Bacillus velezensis）、バチルス・ビエトナメンシス（Bacillus vietnamensis）、バチルス・ビレティ（Bacillus vireti）、バチルス・ワコエンシス（Bacillus wakoensis）、バチルス・ヴェイヘンステファネンシス（Bacillus weihenstephanensis）に属するものが挙げられる。このうち、腸管への到達能力の点で、バチルス・セレウス、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・ズブチリスに属するものが特に好ましい。
【００２１】
本発明のバチルス属菌のうち好適な具体例としては、バチルス・チューリンゲンシスＢ−３（郵便番号２９２−０８１８  日本国  千葉県  木更津市  かずさ鎌足２−５−８（独）製品評価技術基板機構特許微生物寄託センター 受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６８９）株、バチルス・セレウスＢ−６（ＮＩＴＥ  ＡＰ−６９０）株、同ＣＡ−１５株、同ＣＢ−０１株、同ＣＢ−１５株等が挙げられ、セロトニン代謝能が高い点で、バチルス・セレウスＢ−１５株が特に好ましい。
上記のうち、バチルス・チューリンゲンシスＢ−３株及びバチルス・セレウスＢ−６株は土壌から分離されたものである。また、他の株は子牛糞便中から分離されたものである。
【００２２】
これらの微生物を培養し芽胞を得るには、通常のバチルス属微生物が増殖する条件で行えばよい。
培地には、バチルス属微生物の増殖に必要な炭素源、窒素源、ビタミン源、ミネラル源等を添加するのが好ましい。炭素源としては、グルコース、水飴、可溶性デンプンなどが用いられる。窒素源としては、トリプトン、ソイトン、酵母エキス、ペプトン、カゼイン、カゼイン消化物、肉エキス、コーンスチープリカー、アミノ酸液、大豆粕、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等を用いることができるが、芽胞形成を促進するにはグルコース濃度を通常の培養条件よりも低くした方がよいことはいうまでもない。
ミネラル源としては、マグネシウム塩、カリウム塩、リン酸塩、鉄塩、マンガン塩などを用いることができるが、芽胞形成を促進するにはマンガン塩を添加することが望ましい。
【００２３】
生菌および／または芽胞を得るための培養方法としては、液体培地を用いて、振盪培養、撹拌培養を行えばよい。
培養条件としては好気的条件で、８〜４５℃、pH３．２〜９．５が好ましい。培養時間は、４８〜７２０時間でよい。
【００２４】
得られた芽胞は、上述の培養液そのものを懸濁液状の生菌含有組成物（以下、生菌剤ということもある）とすることができる。また、培養液を濃縮することにより生菌含有組成物とすることもできる。濃縮は、ろ過法や遠心分離法等の公知の方法で行うことができる。また、培養液を希釈することにより生菌含有組成物とすることができる。希釈には、水、果汁、野菜等の搾汁、乳、乳製品、牧草や穀物などの熱水抽出後に加水して加熱殺菌した糟糠類分散物等を使用することができる。
【００２５】
また、培養液を遠心分離して菌体を採集し、滅菌した生理食塩水等で洗浄した後、通風乾燥、熱風乾燥、噴霧乾燥、流動層乾燥、真空凍結乾燥等の公知の方法により乾燥し、乾燥粉末の形態の生菌含有組成物とすることもできる。乾燥に先立って、菌株を基材に固定することもできる。基材は、当該バチルス属菌株の生存に影響を与えない限り、有機物でも無機物でも良く、多糖類、澱粉、炭酸カルシウム、スキムミルク等の乳製品の他、市販の豆乳等も使用することができる。基材への固定は、培養液やその濃縮物又は希釈物を基材に混合、塗布、被覆、浸透、又は噴霧すること等により行うことができる。
乾燥粉末は、公知の方法により、造粒しても良く、押出成形、打錠成形等によりペレット化しても良く、またマイクロカプセル化した生菌剤としても良い。カプセル化のためには、ゼラチン、レシチン、ステアレート類、アルギナート類、トラガカンス、アラビアゴム、変性澱粉、セルロース、パルミチン等を使用することができる。
また、生菌剤の製造と同様に、培養後、加熱等により殺菌した死菌体を生菌剤に混合して使用することもできる。
【００２６】
また、適宜加水後、加熱滅菌した大豆子実に当該菌株を接種し、上述の条件で培養すれば、当該菌株が増殖し、芽胞も形成するため、そのまま日本の伝統食品である納豆として製造することができる。
【００２７】
本発明のバチルス属菌は、優れた腸管到達能を有し、かつ腸管内でセロトニンを代謝しセロトニン濃度を低下させる作用を有するため、ヒトを含む動物の腸管内セロトニン濃度の上昇に起因する種々の疾患の予防及び／又は治療用の医薬、動物用薬、食品及び飼料として有用である。ここでセロトニン濃度の上昇に起因する疾患としては、消化器障害、例えば過敏性腸症候群、下痢、腹痛、大腸がん、炎症性腸疾患、膨満、腹部痙攣が挙げられる。
【００２８】
本発明において、動物とはヒトを含む脊椎動物を意味し、牛、馬、豚、羊、鶏等の家畜、サル、犬、猫、ハムスター、小鳥等の愛玩動物の他、魚等も含まれる。
本発明の組成物を給与するヒト以外の対象は、動物であれば、特に、種類や給与時期に制限はない。好ましい対象動物は、消化管の発達が十分に成熟していない幼動物であり、牛、豚、馬、羊等の哺乳類の幼動物が特に好ましい。更に、給与時期としては、乳成分主体の食餌を給与されている哺乳期が好ましい。中でも、野外で飼育する動物においては気温や気候変動の大きい場合など、下痢の発生しやすい条件での給与が好ましい。特に対象動物として、ルーメンが発達しておらず、ルーメンの影響による当該バチルス属菌の死滅がない点で、哺乳期の牛が好ましい。
また、本発明のバチルス属菌をヒトに投与又は給与する場合、その時期に制限はないが、精神的なストレスを感じる時、やむを得ず不衛生な食事・飲料を摂取する可能性のある時、旅行時、抗生物質使用時、大腸がん発生リスクの高まる壮年期から老齢期が好ましい。
【００２９】
本発明のバチルス属菌をヒトを含む動物に投与又は給与するには、バチルス属菌の芽胞又は菌体（両者をあわせて生菌ともいう）を直接投与又は給与してもよいが、これらの生菌に、他の有効成分、及び／又は薬剤又は食品に許容される担体を組み合せて、医薬、動物薬、食品又は飼料用組成物とすることができる。本発明のバチルス属菌は、芽胞として配合するのが安定性の点でより好ましい。
ここで他の有効成分としては、プレバイオティクス、プロバイオティクス、酵素等が挙げられる。
【００３０】
プレバイオティクスは、整腸作用を増強する目的で使用できる。プレバイオティクスの種類はヒトや動物の嗜好性、組成物の溶解性、流動性、保存安定性等に悪影響を与えない限り、特に限定されない。例えば、セロオリゴ糖（セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース等）、ゲンチオオリゴ糖、ラミナリオリゴ糖、フラクトオリゴ糖（１−ケストース、ニストース、フラクトシルニストース等）、トレハルロース、パラチノース、パラチノースオリゴ糖、グルコシルスクロース、ラクトスクロース、テアンデロース、ガラクトオリゴ糖、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ニゲロオリゴ糖、コージオリゴ糖、トレハロース、サイクロデキストリン、分岐サイクロデキスリン、キシロオリゴ糖、キチンオリゴ糖、キトサンオリゴ糖、スタキオース、ラフィノース、レバンオリゴ糖、マンノオリゴ糖、イヌロオリゴ糖、アガロオリゴ糖、ネオアガロオリゴ糖等のオリゴ糖を単独又はこれらを組み合わせて使用することができる。これらのオリゴ糖は公知の方法で製造して使用しても良いが、市販のものを使用することができる。また、公知の方法により、デンプン、セルロース、ヘミセルロース、グルカン、キチン、キトサン、マンナン、キシラン、ペクチン、寒天、グアガム、キサンタンガムなどを加水分解して得られるオリゴ糖、さらに、市販のオリゴ糖を酵素等により転移及び／又は重合させて得られる、未精製又は粗精製のオリゴ糖を使用しても良い。これらのオリゴ糖は、病原性細菌の利用性が低いオリゴ糖が好ましい。
【００３１】
プロバイオティクスとしては、乳酸菌等の細菌や酵母、例えば、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・ミリナス、ラクトバチルス・ペントサス、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ガッセリ、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ガリナラム、ラクトバチルス・ラムノーサス、ラクトバチルス・カゼイ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・ファシウム、クロストリジウム・ブチリカム、ビフィドバクテリウム・サーモフィルス、ビフィドバクテリウム・シュウドロンガム、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ペディオコッカス・アシディラクティシ、ストレプトコッカス・ボビス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトコッカス・インファンタリアス、サッカロミセス・セレビシエ、及びこれらの混合物等が挙げられる。これらの微生物を別々に培養した後、本発明バチルス属菌の芽胞と混合するか、又は、微生物同士の相性が良い場合には最初から混合培養することもできる。
【００３２】
使用可能な酵素としては、例えば、セルラーゼ、フィターゼ、β−グルコシダーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、β−グルカナーゼ、ペントサナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、プロテアーゼ、ペプチダーゼ及びこれらの混合物が挙げられる。
【００３３】
本発明の組成物には、医薬、食品添加物、飼料添加物等の形態、及び食品、動物配合飼料等の形態が含まれる。これらの形態にするに際しては、薬剤又は食品に許容される担体を含有させることができる。
【００３４】
ここで、医薬、食品添加物、飼料用添加物等の形態の配合に許容される担体としては、ヒトや動物の嗜好性に悪影響を与えたり、組成物の保存安定性や作業性の悪化や、乳成分と混合した際に、凝集、沈殿等の悪影響を与えないものであればよく、例えば、酸化防止剤（クエン酸、アスコルビン酸、ビタミンＥ等）、乳化剤（ショ糖脂肪酸エステル、レシチン等）、増粘剤（寒天、グルコマンナン、ゼラチン等）、ビタミン類（ビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ２等）、フレーバー（ハーブ、ベリー、オレンジ等）等の各種成分が挙げられる。
【００３５】
医薬、食品添加物、飼料用添加物は、適宜公知の方法で錠剤、カプセル、粉末、ペースト、液状製剤、食品サプリメント、食品、飼料または飼料添加物の形態に製剤化することが出来る。また、公知の方法により医薬または動物薬の形態に製剤化することも出来る。
本発明の医薬、食品添加物、飼料用添加物中のバチルス属菌の含有量は、嗜好性、組成物の溶解性、流動性、保存安定性等に悪影響を与えない範囲であれば、特に制限はない。当該バチルス属菌芽胞密度を確保し、より効率的に腸管内において維持又は増殖させるために、組成物の重量を基準として、当該芽胞が１０3ＣＦＵ／ｇ以上含有していることが好ましい。さらに、当該芽胞の含有量は、腸管内において維持又は増殖させるために、１０5〜１０12ＣＦＵ／ｇが好ましい。
【００３６】
本発明の食品または動物用配合飼料としては、例えば、生乳、代用乳、人工乳、ほ液等の食品や飼料に、本発明の前記食品添加物又は飼料用組成物を必要量添加した液状で給与する形態や、乾牧草、穀類、食品加工副産物、農産加工副産物、全粉乳、脱脂粉乳等に前記組成物を必要量添加した、粉状、ペレット状、練り状等の配合飼料の形態でも良い。
本発明の食品または動物用配合飼料に対する、本発明の食品添加物又は飼料用添加物の添加量は、本発明のバチルス属菌を動物の腸管内において維持又は増殖させる効果が得られる量であれば、特に制限はない。前記組成物の組成や給与する動物の種類によっても異なるが、効果とコスト面を考慮すると、食品または動物配合飼料の重量を基準として、０．００１〜１０重量％、又は１日に、対象動物の体重１ｋｇあたり、前記組成物を０．００１〜１００ｇ、好ましくは０．０１〜１０ｇ摂取するように、組成物の添加量を調節する。
【００３７】
本発明のバチルス属菌株を動物の腸管内において維持又は増殖させる方法は、当該菌株の芽胞を対象とする動物に給与すれば良く、その給与量は特に制限はない。当該菌株の生菌量を確保し、腸管内においてより高密度で維持又は増殖させるためには、１日に、対象動物の体重１ｋｇあたり、当該芽胞を１０2ＣＦＵ以上給与するのが好ましい。より高い効果とコスト面を考慮すると、１日、対象動物の体重１ｋｇあたり、当該芽胞を１０4〜１０9ＣＦＵ給与するのが好ましい。さらには１日、対象動物の体重１ｋｇあたり、当該芽胞を１０5〜１０9ＣＦＵ給与するのが好ましい。
【００３８】
これらの成分を同時に又は連続して給与することができれば、どのような方法で給与しても良く、すべての成分を食品または飼料に混合して給与しても、それぞれの成分を別々の組成物として給与しても良い。例えば、上記成分の所要量を混合して又は別々に水道水、ミネラル含有水、生乳、全粉乳、脱脂粉乳、乳清、代用乳、人工乳、ほ液、リキッドフィード等の飲水、液状食品または液状飼料に溶解又は分散させて、動物に飲用液として給与しても良い。また、上記成分の所要量を混合して又は別々に粉末、錠剤、ペレット、練り餌等の形態のサプリメントを調製して、給与しても良い。また、給与中の食品や飼料、ペットフードなどに振りかけたり、混合して給与しても良い。
畜産農家において、容易に本発明の方法を実施するために、本発明の組成物を使用して、上述の飲用液やサプリメントを調製したり、給与中の食品や飼料等に混合等して上記成分の所要量を動物に給与することが好ましい。
【実施例】
【００３９】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４０】
実施例１  セロトニン代謝能の評価
直径１８mm試験管にセロトニン塩酸塩100mg/L添加したＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ（ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製、以下ＮＢ）を各５ｍＬ準備し、オートクレーブ滅菌後、あらかじめＮＢで前培養したＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  Ｂ−３株（北海道別海町土壌由来、（独）製品評価技術基板機構特許微生物寄託センター受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６８９）、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓＢ−６株（北海道別海町由来、同受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−６９０）、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓＣＢ−０１株（哺乳期ホルスタイン糞便由来）、及びＢ． ｃｅｒｅｕｓＣＡ−１５株（哺乳期ホルスタイン糞便由来）のうちいずれかを接種し、３７℃で７２時間震盪培養を行った。また、比較対照として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＃４、哺乳期ホルスタイン糞便由来）を同様に培養した。培養２４時間後と７２時間後に培養液１mLを採取し、以下の通りセロトニンを定量した。培養液は１２，０００rpm、１０分間遠心分離し、上澄を細孔径０．４５μmのメンブランフィルターで濾過し、10％メタノールで10倍希釈した。ろ液はＨＰＬＣ（カラム、Ｐｕｒｅｓｉｌ  Ｃ１８内径４．６mm×長さ２５０mm（Ｗａｔｅｒｓ社製）；移動相、０．１容量％酢酸ナトリウム含有１０容量％メタノール（pH７．０）；流速、０．８mL／分）を用い、蛍光検出器（ＦＳ−８０１０、東ソー製；励起波長、２８０nm；検出波長、３７０nm）で分析した。ピークは９．９分に認められ、ピーク面積を標品のセロトニンによって作成した検量線と比較し、培養液中から得られたセロトニン濃度を算出した。結果は表１に示した。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
実施例２  セロトニン代謝産物の分析
ＮＢにセロトニン塩酸塩を１００mg／Ｌ添加し、pH６．８に調整した上で、５００mL容バッフル付き三角フラスコ２本に３００ｍＬずつ分注し、オートクレーブ滅菌後、あらかじめＮＢで前培養したＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  Ｂ−３株、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ  Ｂ−６株、及びＣＡ−１５株をそれぞれ接種した。培養温度は３７℃とし、回転数８０rpmで３日間振とう培養した。得られた培養液は６，５００rpm、３０分で遠心分離し、上澄みを塩酸でpH３．０に調整した。別途、スチレン−ジビニルベンゼン系合成吸着樹脂ダイヤイオンＨＰ−２０をメタノールで洗浄した後、カラム（内径２０mm×長さ３００mm）に充填し、pH３．０酢酸水を通液して調整した。本カラムに上記上澄み液を流し、培養液中有機化合物を吸着した。このカラムを１０容量％イソプロパノール５００mLで溶出したところ、蛍光検出器（励起波長、２８０nm；検出波長、３７０nm）で検出が可能であったため、濃縮し、水相をpH２．５に調整し、酢酸エチルで抽出を行った。その結果、酢酸エチル相にも上記と同様の蛍光検出可能な物質が存在したため、無水硫酸マグネシウムで脱水後、濃縮乾固し、少量の２０容量％メタノールに溶解し、別途メタノールで洗浄後、２０容量％メタノールを通液して調製したＳｅｐＰａｋ  ｔＣ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ社製）を通過させた。その結果、上記と同様の蛍光検出可能な物質が存在したため、ＨＰＬＣ（カラム、ＹＭＣ  Ｐｈｅ  内径１０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１容量％酢酸含有３０容量％メタノール；流速、３．０mL／分）を用いて精製し、蛍光検出されるピークの相当画分（保持時間１１〜１４分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、ＹＭＣ  ＯＤＳ−Ａ  内径１０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１容量％酢酸含有３０容量％メタノール；流速、３．０mL／分）を用いて精製し、蛍光検出されるピークの相当画分（保持時間９．５〜１２．５分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、ＯＤＳ−Ａ  内径１０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１容量％酢酸含有２０容量％アセトニトリル；流速、３．０ｍＬ／分）で分析したところ、ピークは９．５分に認められた。
【００４３】
これは後述の通り化学合成したＮ−［２−（５−ヒドロキシインドール−３−イル）エチル］コハク酸アミド（Ｂｕｆｏｂｕｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、以下ＢＢＡ）とほぼ一致した。また、ピークの吸光極大は２７９nmと化学合成したＢＢＡと一致しており、２３５〜４００nmの吸光スペクトルも化学合成したＢＢＡとほぼ一致した。なお、培地のみを同様に精製・分析したものからはＢＢＡは検出されなかった。
【００４４】
標品として使用したＢＢＡは下記の通り化学合成した。
無水コハク酸１．５５ｇにアセトン３０mLを加え、室温にて撹拌しながら、５−水酸化トリプタミン塩酸塩（セロトニン塩酸塩、シグマアルドリッチジャパン（株）社製）３ｇとトリエチルアミン１．９７mLをアセトン５０mLに溶解したものをゆっくりと加え、さらに３０分撹拌を続けた。反応後、溶媒は減圧下で留去し、残滓を５％炭酸水素ナトリウム水溶液と酢酸エチルとで溶解し、分液ロート中で分液した。酢酸エチル相を棄却した後、水相は濃塩酸を用いてpH２．５に調整し、酢酸エチルで抽出を行った。酢酸エチル相は無水硫酸マグネシウムを用いて脱水した後、溶媒を減圧下にて留去した。得られた合成物はＨＰＬＣ（カラム、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｃ８  内径２０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１容量％酢酸含有５０容量％メタノール；流速、６．０mL／分）を用いて精製し、保持時間１２〜１４分の溶出液を分取した。分取した画分は減圧乾固し、五酸化二燐共存下のデシケータ内で減圧乾燥し、１．１ｇのＢＢＡを得た。
以上の結果から、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  Ｂ−３株、及びＢ． ｃｅｒｅｕｓ  Ｂ−６株、ＣＡ−１５株はセロトニンをＢＢＡに代謝していることが確認された。
【００４５】
実施例３  チラミン代謝能の評価
直径１８mm試験管にチラミン塩酸塩100mg/L添加したＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ（ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製、以下ＮＢ）を各５ｍＬ準備し、オートクレーブ滅菌後、あらかじめＮＢで前培養したＢ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  Ｂ−３株、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓＢ−６株、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓＣＢ−０１株、及びＢ． ｃｅｒｅｕｓＣＡ−１５株のうちいずれかを接種し、３７℃で７２時間震盪培養を行った。培養７２時間後に培養液１mLを採取し、以下の通りチラミンを定量した。培養液は１２，０００rpm、１０分間遠心分離し、上澄を細孔径０．４５μmのメンブランフィルターで濾過した。ろ液はＨＰＬＣ（カラム、Ｐｕｒｅｓｉｌ  Ｃ１８内径４．６mm×長さ２５０mm（Ｗａｔｅｒｓ社製）；移動相、０．１容量％酢酸ナトリウム含有１０容量％メタノール（pH７．０）；流速、０．８mL／分）を用い、検出波長を２８０ｎｍとして分析した。ピークは６．７分に認められ、ピーク面積を標品のチラミン塩酸塩によって作成した検量線と比較し、培養液中から得られたチラミン濃度を算出した。結果は表２に示した。
【００４６】
【表２】
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【００４７】
実施例４  チラミン代謝産物の分析
ＮＢにチラミン塩酸塩を１００mg／Ｌ添加し、pH６．８に調整した上で、５００mL容バッフル付き三角フラスコ２本に３００ｍＬずつ分注し、オートクレーブ滅菌後、あらかじめＮＢで前培養したＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  Ｂ−３株、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ  Ｂ−６株、及びＣＡ−１５株をそれぞれ接種した。培養、ダイヤイオンＨＰ−２０カラムでの精製、溶媒抽出、ＳｅｐＰａｋ  ｔＣ１８カートリッジによる精製は実施例２と同様におこなった。得られた精製物をＨＰＬＣ（カラム、ＹＭＣ  ＯＤＳ-Ａ  内径１０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１容量％酢酸含有３０容量％メタノール；流速、３．０mL／分）を用いて精製したところ、チラミンと類似した２７７nmに紫外部吸光極大を示すピークが認められたため、相当画分（保持時間１３．５〜１６．５分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、Ｐｈｅ  内径１０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１容量％酢酸含有３０容量％メタノール；流速、３．０mL／分）を用いて精製し、同様の特徴を示すピークの相当画分（保持時間１０〜１２．５分）を分取した。さらに分取した画分はＨＰＬＣ（カラム、ＯＤＳ−Ａ  内径１０mm×長さ２５０mm（ＹＭＣ社製）；移動相、１容量％酢酸含有２０容量％アセトニトリル；流速、３．０ｍＬ／分）で分析したところ、対象とするピークは９．５分に認められた。
【００４８】
これは化学合成品のＮ-(４−ヒドロキシフェネチル)コハク酸アミド（Ｎ−（４−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｅｔｈｙｌ）ｓｕｃｃｉｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ、以下４ＨＰＥＳＡ）とほぼ一致し、ピークの吸光極大も２７７nmと化学合成品と一致しており、２３５〜４００nmの吸光スペクトルも化学合成品とほぼ一致した。なお、培地のみを同様に精製・分析したものからはこのピークは検出されなかった。この結果から、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  Ｂ−３株、及びＢ． ｃｅｒｅｕｓ  Ｂ−６株、ＣＡ−１５株はチラミンを４ＨＰＥＳＡに代謝していることが確認された。
【００４９】
実施例５  バチルス属菌芽胞の人工消化液中での生残性評価
バチルス属菌の代表株としてＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ  ＣＡ−１５株を用いて、乳製品と混合して経口投与したと想定した場合の人工消化液中での生残性について試験した。
【００５０】
１．芽胞懸濁液の調製
ＮＢ培地で継代培養したＣＡ−１５株を同培地で３７℃、７２時間培養した。培養物を遠心分離し、沈殿を生理食塩水で２回洗浄後、元の培養液の１／１０の容量の生理食塩水に再懸濁し、芽胞懸濁液を調製した。
【００５１】
２．人工胃液処理試験
１１％還元脱脂乳水溶液１００mLを１１５℃、２０分高圧滅菌処理したものに、４％ペプシン溶液（和光純薬社製）１mL、及び上記菌体懸濁液１mLを添加し、塩酸でpH３．０に調整した。これを３７℃、３時間処理することで人工胃液処理を行った（３反復）。結果を表２に示す。人工胃液処理によりＣＡ−１５株は有意に減少しなかった。得られた処理液を人工胃液処理液として、以下の試験に用いた。
【００５２】
３．人工腸液処理試験
１％胆汁粉末（ＳＩＧＭＡ社製）を含む１１％還元脱脂乳４８５mlを１１５℃、２０分高圧滅菌処理したものに、１％トリプシン溶液（和光純薬社製）５ｍｌ、１％パンクレアチン溶液（和光純薬社製）５mLを添加し、さらに、上記人工胃液処理液５mLを添加して混合し、水酸化ナトリウム溶液でpH７．０に調整した。
この混合物を１０本の８mL容量のねじ口試験管に５mL分注し、気相部分を炭酸ガスで置換して密封し、３７℃、２４時間処理することで、人工腸液処理とした（３反復）。
処理前後の生菌数をＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ（ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製、以下ＮＡ）培地を用いたプレートカウント法により測定した。プレートは３７℃、２日間培養し、コロニーをカウントした。結果を表３に示す。初発菌数に比べて、２４時間処理後において有意な減少は認めらなかった。
【００５３】
以上により、人工胃液処理・腸液処理においてＣＡ−１５株は減少しないことが判明した。このことは本菌株が経口投与した場合も腸管まで到達できることを示している。
【００５４】
【表３】
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【００５５】
実施例６  芽胞凍結乾燥品の調製
容量３Ｌのジャーファーメンターに、１／２濃度のＮＢを滅菌後注入し、Ｂ−６株またはＣＡ−１５株をそれぞれ接種し、３７℃の条件下で７２時間培養した。この培養液を高速冷却遠心機で遠心（３０００Ｇ、５℃、１０分）し、得られた沈殿を生理食塩水で洗浄し、１０％のスキムミルク水溶液１５０mLに懸濁させ、アルミトレイに分注した。これを真空凍結乾燥機（協和真空技術製ＲＬＥＩＩ−１０３）により、−５０℃に予備凍結後、最終棚温度２５℃で計４８時間乾燥し、約１５ｇの凍結乾燥品を得た。
生菌数を平板希釈法（ＮＡ培地）により生菌数を測定したところ、１０7ＣＦＵ／ｇであった。
【００５６】
実施例７  哺乳期の子牛への給与試験
当該バチルス属菌を幼動物に給与した際の効果について調べるため、哺乳期のホルスタイン種の子牛への給与試験を行った。
市場より導入直後の子牛１０個体を外観、体重、体調等の条件が統計学的に偏りないように、各５頭ずつ２群（投与群、対照群）に分け、代用乳（雪印種苗社製、「カーフミルクうしっこ」）、人工乳（雪印種苗社製「ハイパスフード４０」）を基礎飼料として、投与群には上記芽胞凍結乾燥物を１日に１ｇを２回に分けて、代用乳と混合して給与した。対照群には動物用飼料組成物を給与しない以外は投与群と同様にした。導入後２１日目までの基礎飼料給与プログラムを表４に示す。
【００５７】
【表４】
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【００５８】
給与開始後より毎日糞便を観察し、糞便スコア：下痢＝２、軟便＝１、正常＝０として評価した。結果を表５に示す。当該バチルス属菌芽胞を添加することにより、下痢の発生が抑制されることが明らかであった。
【００５９】
【表５】
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