(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素法による糖化ヘモグロビンの定量分析の前処理工程で使用される溶血試薬組成物であって、以下の化学式1で表される両性イオン界面活性剤と、亜硝酸化合物とを含有する、溶血試薬組成物：
0005829766.tif 000017
式中、R1およびR2は、独立して、それぞれ直鎖または分岐C1-5アルキルであり；
nは、1〜6の整数であり；
Xは、単結合または
0005829766.tif 000018
であり；
ここで、Xが
0005829766.tif 000019
である場合、mは1〜3の整数であり、R3はC13直鎖または分岐アルキルであり、Xが単結合である場合、mは1であり、R3はC13直鎖または分岐アルキルである。
【請求項２】
R1およびR2が、独立して、それぞれC1-3直鎖または分岐アルキルであり；
nが、1〜4の整数であり；
Xが、単結合または
0005829766.tif 000020
であり；
ここで、Xが
0005829766.tif 000021
である場合、mは1〜3の整数であり、R3はC13直鎖または分岐アルキルであり、Xが単結合である場合、mは1であり、R3はC13直鎖または分岐アルキルである、請求項1に記載の溶血試薬組成物。
【請求項３】
化学式1で表される両性イオン界面活性剤が、3-（ジメチル（3-テトラデカンアミドプロピル）アンモニオ）プロパン-1-スルホナート、4-（ジメチル（3-テトラデカンアミドプロピル）アンモニオ）ブタン-1-スルホナート、または3-（ジメチル（テトラデシル）アンモニオ）プロパン-1-スルホナートである、請求項1に記載の溶血試薬組成物。
【請求項４】
亜硝酸化合物が、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム、亜硝酸マグネシウム、および亜硝酸カルシウムからなる群より選択される少なくとも1つである、請求項1に記載の溶血試薬組成物。
【請求項５】
請求項1に記載の溶血試薬組成物を用いて赤血球を溶血する工程（工程1）；
工程1で赤血球の溶血により放出されたヘモグロビンの総量を測定する工程（工程2）；
プロテアーゼを用いて、工程1で赤血球の溶血により放出された糖化ヘモグロビンのN末端β鎖の「糖-Val-His-」部分のみを選択的に切断することによって、単量体のフルクトシルアミノ酸を得る工程（工程3）；
工程3で得られたフルクトシルアミノ酸とFPOX（フルクトシルペプチドオキシダーゼ）とを反応させて過酸化水素を生成する工程（工程4）；
POD（ペルオキシダーゼ）と反応させることによって、工程4で生成された過酸化水素を酸化する工程（工程5）；
工程5で酸化された過酸化水素と基質による酸化還元反応により誘導された発色の量を測定する工程（工程6）；および
工程2で測定されたヘモグロビンの総量と工程6での糖化ヘモグロビンの量を比較することにより、血液サンプル中の糖化ヘモグロビンの濃度を定量する工程（工程7）
を含む、糖化ヘモグロビンの定量分析のための方法。
【請求項６】
前記プロテアーゼが、バシラス属菌種（Bacillus sp.）、アスペルギルス属菌種（Aspergillus sp.）、ストレプトミセス属菌種（Streptomyces sp.）、およびこれらの遺伝子組換え体に由来するプロテアーゼからなる群より選択される少なくとも1つである、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
工程2でのヘモグロビンの総量と工程6での糖化ヘモグロビンの量が光学的に測定される、請求項5に記載の方法。
【請求項８】
化学式1で表される両性イオン界面活性剤が、赤血球の溶血速度を加速し、かつ酵素活性を向上させる、請求項5に記載の方法。
【請求項９】
亜硝酸化合物が、ヘモグロビンのタンパク質構造を柔軟にすることによってプロテアーゼ活性を向上させる、請求項5に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、酵素法を用いた糖化ヘモグロビンの定量分析のための新規な溶血試薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近では、糖尿病を診断し予防するための血糖値の定期検査の必要性への関心が高まってきている。血糖値は、携帯用血糖監視装置を用いて、特に個人ごとのストリップ型バイオセンサーを用いて、容易に測定することができる。
【０００３】
しかし、それは、患者が食事をとったか否かに応じて血糖測定の結果が異なるため、使用するのに不便であり、その測定値は検査日における患者の身体状態、例えば、ストレス、飲酒、疲労などによって変化することがある。
【０００４】
対照的に、糖尿病患者が糖化ヘモグロビン（HbA1c）を利用して測定され管理される場合、その結果は、患者の身体状態または患者が食事をとったか否かなどの要因によって影響されない。HbA1c値は約3〜4ヶ月間の平均血糖値を反映しており、したがって、患者の血糖値管理方法の有効性を評価するための指標として使用できることが一般に認められている。それは、血液中に存在するグルコースが、血液を構成するタンパク質のヘモグロビンと長期間にわたって反応し、アマドリ転位（Amadori rearrangement）を受けて、ヘモグロビン-グルコースの修飾タンパク質、いわゆる糖化ヘモグロビン（HbA1c）を形成するためである。HbA1cの構造を以下に示す。
0005829766.tif 000002
【０００５】
このように形成されたHbA1cの寿命は90〜120日程度であるので、それは、3〜4ヶ月間の平均血糖値に基づいた患者の糖尿病診断または患者による血糖管理の有効性に関する非常に重要なデータを提供することができる。
【０００６】
HbA1cの臨床評価は、パーセンテージを単位として、総ヘモグロビン濃度に対するHbA1cの相対比率により測定される。6.0％以下のHbA1c値が正常とみなされる。HbA1c値は、糖尿病の合併症を管理する上で非常に重要な因子である。報告によると、例えば、HbA1c値が1％低下する場合、それは心筋梗塞のリスクを14％、白内障を19％、細小血管障害を37％、末梢動脈疾患を43％、糖尿病による死亡を21％減少させるなどの効果がある。
【０００７】
患者の血糖値の日常的な測定は、患者の日々の健康状態をチェックし、それに応じて患者に適切な治療を提供するために重要であるが、患者の長期的な血糖管理状態を判断し、合併症を予防し、かつ患者に適した治療を提供するために、患者の糖化タンパク質またはHbA1c値を測定することが依然として必要である。
【０００８】
血糖管理の重要な指標として役立つ、血中のHbA1cレベルを測定する標準的な方法は、以下の工程を含むことができる：採取された血液サンプルを適切な試薬、例えばTX-100などの界面活性剤と混合することにより溶血させる工程；それを、ボロン酸誘導体の機能性表面を有するビーズ/ゲルを充填したHPLCイオン交換またはアフィニティーカラムに通す工程；正常なタンパク質から離れて可視光を介してそこから分離されたタンパク質の特定の波長を測定し、それによって、糖化タンパク質の比率を計算する工程。
【０００９】
しかしながら、上記の標準的方法は、訓練を受けた臨床専門家によって十分に設備の整った主要な臨床検査室または病院の中央検査室で行うことができるにすぎず、特に少数の検査を受けた場合には操作・維持が比較的高価である、という欠点を有する。さらに、血中HbA1c値は、HbA1c抗体を用いて測定され得る。ところが、その供給品の量は、それを製造する会社が足りないため、非常に限られており、また、その装置は反応-分離工程を必要として非常に複雑である。
【００１０】
米国特許第5,541,117号（特許文献1）は、抗体が結合されたパッドを調製し、血液サンプルを溶血させて該パッド上に導入した後、反射光度測定法によりヘモグロビン含有量を測定するための方法を開示している。しかし、その欠点として、高コストの抗体を使用すること、および多孔質パッドの不均一性のため均一な品質のセンサーを製造するのが困難であることが挙げられる。さらに、糖化タンパク質の相対量は、抗体で修飾された固相を介してサンプル中のタンパク質を分離した後、マーカー化合物を使用して電気化学的に測定される。しかし、糖化タンパク質と糖化タンパク質-マーカー複合体は電極表面の周りに競合的に集まり、マーカーと注入された基質との電気化学反応からのシグナルが大幅に抑制される。したがって、糖化タンパク質の測定が損なわれ、かつ再現性に関する性能が弱体化する。
【００１１】
別法として、HbA1cなどの糖化タンパク質の濃度を測定するために、酵素法を使用することができる。酵素法は、所定のサンプルの糖化タンパク質にプロテアーゼを導入し、前処理を行って糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸を放出させることを含み、この糖化ペプチドまたは糖化アミノ酸は以下の反応のための基質として使用され、この場合、分離された基質に糖化ペプチド特異的酵素または糖化アミノ酸特異的酵素（例えば、フルクトシルペプチドオキシダーゼまたはフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ）を作用させて中間生成物（例えば、過酸化水素）を生成させ、その後、適切な発色剤、例えば検出可能な製品を用いるシグナル発生ペルオキシダーゼ-過酸化水素反応が続く。
【００１２】
日本国特許出願公開第H5-192193号（特許文献2）は、フルクトサミンに存在するケトアミン構造を特異的に認識することによるフルクトサミンの特異的定量化方法を開示しており、さまざまな微生物から、ケトアミン構造の酸化を触媒する新規酵素である、ケトアミンオキシダーゼを分離し、プロテアーゼにより前処理されたフルクトサミンのみをケトアミンオキシダーゼの存在下で酸化し、その結果得られた生成物、すなわちグルコソンまたは過酸化水素を測定する。
【００１３】
日本国特許出願公開第2001-95598号（特許文献3）は、糖化タンパク質含有サンプルをプロテアーゼで処理し、糖化タンパク質から糖化ペプチド、好ましくはα-糖化ペプチド、より好ましくはα-糖化ジペプチドを分離し、その後分離した糖化ペプチドにオキシダーゼを作用させることによって形成された過酸化水素を測定する方法、または分離した糖化ペプチドをHPLCにより測定する方法を開示しており、また、所定のサンプル中の糖化ペプチドを測定する方法、および酵素法で測定するための試薬キットを開示している。
【００１４】
HbA1cは、グルコースがヘモグロビンA（HbA）（α2β2）のN末端β鎖のバリン残基に結合した化合物であり、糖化の程度は、総ヘモグロビン濃度（モル）に対するHbA1c濃度のパーセンテージ（％）またはミリモル（mmol）の単位で示される。本発明の酵素法によれば、グルコースが結合したヘモグロビンのN末端β鎖をタンパク質消化プロテアーゼによりフルクトシルアミノ酸の単量体物質に変換する必要がある。このようにして形成されたフルクトシルアミノ酸を、酸化酵素であるFPOX（フルクトシルペプチドオキシダーゼ）と反応させて過酸化水素を生成させ、この生成された過酸化水素をPOD（ペルオキシダーゼ）により酸化し、この酸化により放出された電子が引き起こす還元を介した基質の発色の度合いを分光光度計で分析することによって、HbA1cの濃度を測定する。
【００１５】
上述したような各種の酵素を用いる酵素法は、他の方法と比較して、酵素の選択性の特性のためより正確な結果を提供できるという利点を有するが、長い反応時間を必要とし、かつ精巧な反応条件が原因でその反応感度が低いという欠点を有する。
【００１６】
本発明の発明者らは、HbA1cを定量化するための酵素法において反応速度および反応感度を向上させる方法を見つけようと努めている時に、以下のことを見出して、本発明を完成するに至った：すなわち、両性イオン界面活性剤および亜硝酸化合物を含有する試薬組成物を溶血試薬に添加する場合、それは、溶血速度をかなり加速し、かつ溶血により放出されたヘモグロビンのN末端β鎖をヘモグロビン分子の外側に露出されるように誘導して、より多数の分子の関与を支援し、それによって、HbA1cの反応感度および反応速度を向上させること、ならびに亜硝酸化合物は、ヘモグロビンのN末端β鎖のアミノ酸配列が容易に切断されるように、ヘモグロビンのタンパク質構造を柔軟にし、それによって、測定に要する全時間を著しく短縮し、かつ測定精度を向上させること。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】米国特許第5,541,117号
【特許文献２】日本国特許出願公開第H5-192193号
【特許文献３】日本国特許出願公開第2001-95598号
【発明の概要】
【００１８】
発明の開示
技術的課題
本発明の一つの課題は、従来の酵素法を用いてHbA1cの濃度を測定する方法において、反応速度を加速することにより、測定に要する時間を短縮し、また、反応シグナルを最大にすることにより、反応感度を高めることができる、溶血試薬組成物を提供することである。
【００１９】
本発明のもう一つの課題は、前記溶血試薬組成物を使用してHbA1cを定量分析するための方法を提供することである。
【００２０】
技術的解決法
前記課題を解決するために、本発明は、酵素法によるHbA1cの定量分析の前処理工程で使用される溶血試薬組成物を提供し、該組成物は、以下の化学式1で表される両性イオン界面活性剤と、亜硝酸化合物とを含有する：
0005829766.tif 000003
式中、R1およびR2は、独立して、それぞれ直鎖または分岐C1-5アルキルであり；
nは、1〜6の整数であり；
Xは、単結合または
0005829766.tif 000004
であり；
ここで、Xが
0005829766.tif 000005
である場合、mは1〜3の整数であり、R3はC13直鎖または分岐アルキルであり、Xが単結合である場合、mは1であり、R3はC13直鎖または分岐アルキルである。
【００２１】
本発明はまた、以下の工程を含むHbA1cを定量分析するための方法を提供する：
請求項1に記載の溶血試薬組成物を用いて赤血球を溶血する工程（工程1）；
工程1で赤血球の溶血により放出されたヘモグロビンの総量を測定する工程（工程2）；
プロテアーゼを用いて、工程1で赤血球の溶血により放出されたHbA1cのN末端β鎖の「糖-Val-His-」部分のみを選択的に切断することによって、単量体フルクトシルアミノ酸を得る工程（工程3）；
工程3で得られたフルクトシルアミノ酸とFPOX（フルクトシルペプチドオキシダーゼ）とを反応させて過酸化水素を生成する工程（工程4）；
POD（ペルオキシダーゼ）と反応させることによって、工程4で生成された過酸化水素を酸化する工程（工程5）；
工程5で酸化された過酸化水素と基質による酸化還元反応により誘導された発色の量を測定する工程（工程6）；および
工程2で測定されたヘモグロビンの総量と工程6でのHbA1cの量を比較することにより、血液サンプル中のHbA1cの濃度を定量する工程（工程7）。
【００２２】
有利な効果
両性イオン界面活性剤および亜硝酸化合物を含有する本発明の溶血試薬組成物は、両性イオン界面活性剤の存在により溶血速度をかなり加速し、かつ溶血により放出されたヘモグロビンのN末端β鎖をヘモグロビン分子の外側に露出されるように誘導して、より多数の分子の関与を支援し、それによって、HbA1cの反応感度および反応速度を向上させ、かつ亜硝酸化合物は、ヘモグロビンのN末端β鎖のアミノ酸配列が容易に切断されるように、ヘモグロビンのタンパク質構造を柔軟にし、それによって、測定に要する全時間を著しく短縮し、かつ測定精度を向上させる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の実施例1〜3および比較例1〜3で調製した溶血試薬組成物による時間の経過にわたる赤血球の溶血を表すグラフを示す（図1において、時間の経過にわたる勾配の変化は、赤血球の溶血が継続中であることを示し、勾配の変化がない領域は、溶血が終了している期間を示す）。
【図２】本発明の比較例4〜8で調製した溶血試薬組成物による時間の経過にわたる赤血球の溶血を表すグラフを示す（図2において、時間の経過にわたる勾配の変化は、赤血球の溶血が継続中であることを示し、勾配の変化がない領域は、溶血が終了している期間を示す）。
【図３】本発明の実施例1〜3および比較例1〜3で調製した溶血試薬組成物の総ヘモグロビンに対する反応感度を表すグラフを示す（図3において、勾配が大きいほど、総ヘモグロビンに対する反応感度が大きい）。
【図４】本発明の比較例4〜5および8で調製した溶血試薬組成物の総ヘモグロビンに対する反応感度を表すグラフを示す（図3において、勾配が大きいほど、総ヘモグロビンに対する反応感度が大きい）。
【図５】本発明の実施例1〜3および比較例1で調製した溶血試薬組成物のHbA1cに対する反応感度を表すグラフを示す（図5において、勾配が大きいほど、HbA1cに対する反応感度および反応速度が大きい）。
【図６】本発明の比較例2、4、5および8で調製した溶血試薬組成物のHbA1cに対する反応感度を表すグラフを示す（図6において、勾配が大きいほど、HbA1cに対する反応感度および反応速度が大きい）。
【図７】本発明の実施例1および比較例10で調製した溶血試薬組成物のHbA1cに対する反応感度を表すグラフを示す（図7において、勾配が大きいほど、HbA1cに対する反応感度が大きい）。
【図８】本発明の実施例1および比較例1で調製した溶血試薬組成物のHbA1cに対する反応感度を表すグラフを示す（図8において、勾配が大きいほど、HbA1cに対する反応感度が大きい）。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明を実施するための最良の形態
本発明は、総ヘモグロビンの濃度を基準にしてHbA1cの相対濃度を測定することに関する。特に、本発明は、改善された溶血試薬組成物を使用して、総ヘモグロビンおよびHbA1cを測定する感度を向上させ、また、測定に要する時間を短縮することを目的としている。
【００２５】
相対濃度の測定には、総ヘモグロビン値とHbA1c値の両方を測定することが不可欠である。ここでは、ヘモグロビン値は、酵素法によるHbA1cの定量化のための前処理として実施された溶血の間に赤血球から放出されたヘモグロビンが、530nm付近の領域に特徴的な分光ピークを示すことを考慮して、UV/Visなどの分光装置を用いて測定することができる。さらに、背景技術に記載したように、HbA1c値は、溶血がなされた血液サンプルを、プロテアーゼ、FPOX、PODおよび基質を利用する酵素反応に供することによって測定することができる。
【００２６】
本発明は、以下でより詳細に説明される。
【００２７】
本発明は、酵素法による糖化ヘモグロビンの定量分析の前処理工程で使用される、以下の化学式1で表される両性イオン界面活性剤と、亜硝酸化合物とを含有する溶血試薬組成物を提供する：
0005829766.tif 000006
式中、R1およびR2は、独立して、それぞれ直鎖または分岐C1-5アルキルであり；
nは、1〜6の整数であり；
Xは、単結合または
0005829766.tif 000007
であり；
ここで、Xが
0005829766.tif 000008
である場合、mは1〜3の整数であり、R3はC13直鎖または分岐アルキルであり、Xが単結合である場合、mは1であり、R3はC13直鎖または分岐アルキルである。
【００２８】
好ましくは、
R1およびR2は、独立して、それぞれ直鎖または分岐C1-3アルキルであり；
nは、1〜4の整数であり；
Xは、単結合または
0005829766.tif 000009
であり；
ここで、Xが
0005829766.tif 000010
である場合、mは1〜3の整数であり、R3はC13直鎖または分岐アルキルであり、Xが単結合である場合、mは1であり、R3はC13直鎖または分岐アルキルである。
【００２９】
より好ましくは、
化学式1で表される両性イオン界面活性剤は、以下のとおりである：
3-（ジメチル（3-テトラデカンアミドプロピル）アンモニオ）プロパン-1-スルホナート；
4-（ジメチル（3-テトラデカンアミドプロピル）アンモニオ）ブタン-1-スルホナート；または
3-（ジメチル（テトラデシル）アンモニオ）プロパン-1-スルホナート。
【００３０】
本発明による試薬組成物に関して、化学式1で表される両性イオン界面活性剤は、溶血速度を加速し、ヘモグロビンの構造を柔らかくし、かつ前処理後の酵素反応の活性を高める働きをする。前処理後の酵素反応は、以下に示す酵素法を用いたHbA1cの定量分析法において説明する。
【００３１】
好ましくは、両性イオン界面活性剤は0.5〜1.0重量％の量で添加される。両性イオン界面活性剤が0.5重量％より少なく添加される場合には、溶血反応の速度が低下するか、溶血がまったく起こらない可能性がある。対照的に、両性イオン界面活性剤が1.0重量％より多く添加される場合には、溶血反応の感度が低下する。
【００３２】
本発明の試薬組成物に関して、亜硝酸化合物は、従来の技術で知られているように、総ヘモグロビンの簡易分析を仲介するだけでなく、ヘモグロビンの構造を柔軟にし、したがって、プロテアーゼがN末端β鎖の「糖-Val-His-」部分のみを選択的に切断し、それによって前処理後に単量体のフルクトシルアミノ酸を得るのに役立つ。
【００３３】
亜硝酸化合物としては、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム、亜硝酸マグネシウム、亜硝酸カルシウムなどを単独でまたは組み合わせて使用することができる。
【００３４】
好ましくは、亜硝酸化合物は、1〜5mMの範囲になるように添加される。亜硝酸化合物の濃度が1mM未満であると、ヘモグロビンの構造は柔軟な構造へと十分に改変されないことがあるのに対して、亜硝酸化合物の濃度が5mMを超えると、総ヘモグロビンの濃度を測定する時に散乱が生じる可能性がある。
【００３５】
さらに、本発明はまた、以下の工程を含むHbA1cを定量分析するための方法を提供する：
前記溶血試薬組成物を用いて赤血球を溶血する工程（工程1）；
工程1で赤血球の溶血により放出されたヘモグロビンの総量を測定する工程（工程2）；
プロテアーゼを用いて、工程1で赤血球の溶血時に放出されたHbA1cのN末端β鎖の「糖-Val-His-」部分のみを選択的に切断することによって、単量体のフルクトシルアミノ酸を得る工程（工程3）；
工程3で得られたフルクトシルアミノ酸とFPOX（フルクトシルペプチドオキシダーゼ）とを反応させて過酸化水素を生成する工程（工程4）；
POD（ペルオキシダーゼ）と反応させることによって、工程4で生成された過酸化水素を酸化する工程（工程5）；
工程5で酸化された過酸化水素と基質による酸化還元反応により誘導された発色の量を測定する工程（工程6）；および
工程2で測定されたヘモグロビンの総量と工程6での糖化ヘモグロビンの量を比較することにより、血液サンプル中の糖化ヘモグロビンの濃度を定量する工程（工程7）。
【００３６】
酵素法を用いてHbA1cを定量分析するための本発明の方法を、段階的に、以下で詳細に説明する。
【００３７】
本発明の定量分析において、工程1は、赤血球が化学式1で表される両性イオン界面活性剤と亜硝酸化合物とを含有する溶血試薬組成物を用いて溶血される、前処理工程に関する。
【００３８】
特に、化学式1で表される両性イオン界面活性剤は、ヘモグロビンの構造を柔軟にすると同時に、工程1の後の酵素反応の活性を向上させる。
【００３９】
好ましくは、両性イオン界面活性剤は0.5〜1.0重量％の範囲で添加される。両性イオン界面活性剤が0.5重量％より少なく添加される場合には、溶血反応の速度が低下するか、溶血がまったく起こらない可能性がある。これに対して、両性イオン界面活性剤が1.0重量％より多く添加される場合には、溶血反応の感度が低下する。
【００４０】
亜硝酸化合物は、従来の技術で知られているように、総ヘモグロビンの簡易分析を仲介するだけでなく、ヘモグロビンの構造を柔軟にし、したがって、プロテアーゼがN末端β鎖の「糖-Val-His-」部分のみを選択的に切断し、それによって、前処理後に単量体のフルクトシルアミノ酸を得るのに役立つ。
【００４１】
亜硝酸化合物としては、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム、亜硝酸マグネシウム、亜硝酸カルシウムなどを単独でまたは組み合わせて使用することができる。
【００４２】
好ましくは、亜硝酸化合物は、1〜5mMの範囲になるように添加される。亜硝酸化合物の濃度が1mM未満であると、ヘモグロビンの構造は柔軟な構造へと十分に改変されないことがあるのに対して、亜硝酸化合物の濃度が5mMを超えると、総ヘモグロビンの濃度を測定する時に散乱が生じる可能性がある。
【００４３】
本発明の定量分析において、工程2は、上記工程1の溶血の間に赤血球から放出された総ヘモグロビンの量を測定することに関する。
【００４４】
具体的には、ヘモグロビン値は、酵素法によるHbA1cの定量化のための前処理として実施された工程1の溶血の間に赤血球から放出されたヘモグロビンが、530nm付近の領域に特徴的な分光ピークを示すことを考慮して、UV/Visなどの分光装置を用いて測定することができる。
【００４５】
本発明の定量分析において、工程3は、プロテアーゼを用いて、工程1で赤血球の溶血の間に放出されたHbA1cのN末端β鎖の「糖-Val-His-」部分のみを選択的に切断することによって、単量体のフルクトシルアミノ酸を得ることに関する。
【００４６】
使用されるプロテアーゼには、バシラス属菌種（Bacillus sp.）、アスペルギルス属菌種（Aspergillus sp.）、ストレプトミセス属菌種（Streptomyces sp.）、およびこれらの遺伝子組換え体に由来するものが含まれ、これらを単独でまたは組み合わせて使用することができる。
【００４７】
好ましくは、プロテアーゼは、500〜1000 U/mLの範囲で使用することができる。プロテアーゼが500 U/mLより少なく使用される場合には、反応全体の感度が小さくなるのに対して、プロテアーゼが1000 U/mLより多く使用される場合には、それと共に使用される酵素をも分解し、ひいてはその反応性を低下させる。
【００４８】
本発明の定量分析において、工程4は、工程3で得られたフルクトシルアミノ酸をFPOX（フルクトシルペプチドオキシダーゼ）と反応させることにより、過酸化水素（H2O2）を生成させることに関する。
【００４９】
好ましくは、FPOXは1.0 U/mL以上の範囲で添加される。FPOXが1.0 U/mLより低い範囲で添加される場合には、この反応全体の感度が小さくなる。
【００５０】
本発明の定量分析において、工程5は、工程4で得られた過酸化水素をPOD（ペルオキシダーゼ）と反応させることにより、過酸化水素を酸化することに関する。
【００５１】
好ましくは、PODは5〜20 U/mLの範囲で添加される。PODが5 U/mLより少なく添加される場合には、反応全体の感度が小さくなる一方で、PODが20 U/mLより多く添加される場合には、その色がヘモグロビンの色に類似するため、HbA1c濃度の測定を妨げる。
【００５２】
本発明の定量分析において、工程6は、工程5で酸化された過酸化水素と基質による酸化還元反応を介して誘導された発色の量を測定することに関する。
【００５３】
ここで、基質は、酸化還元反応を介してPODにより生成された酸化された過酸化水素と、DA-67およびDA-64などの色素とによる発色を誘導するのに役立つ。
【００５４】
好ましくは、基質は0.12mM以下の範囲で添加される。基質が0.12mMを超えて添加されると、自然発生的な変色が起こり、それゆえ、分光測定におけるエラーの原因となる。基質は外部環境および温度に応じて自然にその色を変える不安定な物質であるので、基質は使用中に特別な注意を要する。
【００５５】
本発明の定量分析において、工程7は、工程2で測定された総ヘモグロビン量と、工程6で測定されたHbA1c量との相対比較による、血液サンプル中のHbA1c濃度の定量化に関する。
【００５６】
具体的には、HbA1cの量は、計算によりパーセンテージで示すことができる。
【００５７】
ここで、工程2での総ヘモグロビンの量および工程6でのHbA1cの量は、UV/Visなどの分光装置によって測定することができる。
【００５８】
上述したように、両性イオン界面活性剤および亜硝酸化合物を含有する本発明の溶血試薬組成物は、両性イオン界面活性剤の存在のために溶血速度をかなり加速し、かつ溶血により放出されたヘモグロビンのN末端β鎖をヘモグロビン分子の外側に露出されるように誘導して、より多数の分子の関与を支援し、それによって、HbA1cの反応感度および反応速度を向上させ、亜硝酸化合物は、ヘモグロビンのN末端β鎖のアミノ酸配列が容易に切断されるように、ヘモグロビンのタンパク質構造を柔軟にし、それによって、測定に要する全時間を著しく短縮し、かつ測定精度を向上させる。
【実施例】
【００５９】
本発明を実施するための形態
本発明は、以下の実施例を参照して、さらに詳細に説明される。しかし、それらは例示のために以下に示されるのであって、本発明を限定するためのものではない。
【００６０】
＜調製例1＞ HbA1cの定量分析の前処理後に使用される酵素反応組成物の調製
HbA1cの定量化のための溶血としての前処理の後に使用される酵素反応用の組成物は、800 U/mLの微生物由来のプロテアーゼ、1 U/mLのFPOX（フルクトシルペプチドオキシダーゼ）、10 U/mLのPOD（ペルオキシダーゼ）、および基質としての0.12mMのDA-67（色素）を、100mM MES緩衝液に添加することにより調製した。
【００６１】
＜実施例1＞ HbA1cの定量分析の前処理に使用される溶血試薬組成物の調製1
溶血試薬組成物1は、界面活性剤としての0.75mg/mLの3-（ジメチル（3-テトラデカンアミドプロピル）アンモニオ）プロパン-1-スルホナート、および亜硝酸化合物としての2mM NaNO2を、100mM MES緩衝液に添加することにより調製した。
【００６２】
＜実施例2＞ HbA1cの定量分析の前処理に使用される溶血試薬組成物の調製2
溶血試薬組成物2は、実施例1で使用した界面活性剤の代わりに0.75mg/mLの4-（ジメチル（3-テトラデカンアミドプロピル）アンモニオ）ブタン-1-スルホナートを使用したことを除いて、実施例1と同様に調製した。
【００６３】
＜実施例3＞ HbA1cの定量分析の前処理に使用される溶血試薬組成物の調製3
溶血試薬組成物3は、実施例1で使用した界面活性剤の代わりに0.75mg/mLの3-（ジメチル（テトラデシル）アンモニオ）プロパン-1-スルホナートを使用したことを除いて、実施例1と同様に調製した。
【００６４】
＜比較例1＞ HbA1cの定量分析の前処理に使用される溶血試薬組成物の調製4
溶血試薬組成物4は、実施例1で使用した界面活性剤の代わりに蒸留水を使用したことを除いて、実施例1と同様に調製した。
【００６５】
＜比較例2＞ HbA1cの定量分析の前処理に使用される溶血試薬組成物の調製5
溶血試薬組成物5は、実施例1で使用した界面活性剤の代わりに0.75mg/mLの2-（6-（ドデシルオキシ）-4,5-ジヒドロキシ-2-（ジヒドロキシルメチル）-テトラヒドロ-2H-ピラン-3-イルオキシ）-6-（ヒドロキシメチル）-テトラヒドロ-2H-ピラン-3,4,5-トリオールを使用したことを除いて、実施例1と同様に調製した。
【００６６】
＜比較例3＞ HbA1cの定量分析の前処理に使用される溶血試薬組成物の調製6
溶血試薬組成物6は、実施例1で使用した界面活性剤の代わりに0.75mg/mLの4-（ドデシルジメチルアンモニオ）ブタノアートを使用したことを除いて、実施例1と同様に調製した。
【００６７】
＜比較例4＞ HbA1cの定量分析の前処理に使用される溶血試薬組成物の調製7
溶血試薬組成物7は、実施例1で使用した界面活性剤の代わりに0.75mg/mLの3-（（3-（4-ヘプチルフェニル）-3-ヒドロキシプロピル）ジメチルアンモニオ）プロパン-1-スルホナートを使用したことを除いて、実施例1と同様に調製した。
【００６８】
＜比較例5＞ HbA1cの定量分析の前処理に使用される溶血試薬組成物の調製8
溶血試薬組成物8は、実施例1で使用した界面活性剤の代わりに0.75mg/mLの3-（ジメチル（3-パルミトアミドプロピル）アンモニオ）プロパン-1-スルホナートを使用したことを除いて、実施例1と同様に調製した。
【００６９】
＜比較例6＞ HbA1cの定量分析の前処理に使用される溶血試薬組成物の調製9
溶血試薬組成物9は、実施例1で使用した界面活性剤の代わりに0.75mg/mLの3-（ジメチル（オクチル）アンモニオ）プロパン-1-スルホナートを使用したことを除いて、実施例1と同様に調製した。
【００７０】
＜比較例7＞ HbA1cの定量分析の前処理に使用される溶血試薬組成物の調製10
溶血試薬組成物10は、実施例1で使用した界面活性剤の代わりに0.75mg/mLの3-（デシルジメチルアンモニオ）プロパン-1-スルホナートを使用したことを除いて、実施例1と同様に調製した。
【００７１】
＜比較例8＞ HbA1cの定量分析の前処理に使用される溶血試薬組成物の調製11
溶血試薬組成物11は、実施例1で使用した界面活性剤の代わりに0.75mg/mLの3-（ドデシルジメチルアンモニオ）プロパン-1-スルホナートを使用したことを除いて、実施例1と同様に調製した。
【００７２】
＜比較例9＞ HbA1cの定量分析の前処理に使用される溶血試薬組成物の調製12
溶血試薬組成物12は、実施例1で使用した界面活性剤の代わりに0.75mg/mLの3-（ヘキサデシルジメチルアンモニオ）プロパン-1-スルホナートを使用したことを除いて、実施例1と同様に調製した。
【００７３】
＜比較例10＞ HbA1cの定量分析の前処理に使用される溶血試薬組成物の調製13
溶血試薬組成物13は、亜硝酸化合物の2mM NaNO2を使用しなかったことを除いて、実施例1と同様に調製した。
【００７４】
実施例1〜3および比較例1〜9で使用した両性イオン界面活性剤の化学構造を以下の表1に示す。
【００７５】
【表１】
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0005829766.tif 000012
【００７６】
＜実験例1＞ 界面活性剤の溶解性の評価
界面活性剤を使用するためには、サンプル自体の溶解性が優れていることが不可欠である。まず第一に、サンプルが溶解しない場合は、それを全く使用することができないので、前提条件として界面活性剤の溶解性を評価した。
【００７７】
具体的には、実施例1〜3および比較例1〜9で使用した界面活性剤の溶解性は、0.75mg/mLの濃度になるように蒸留水に溶解して、それらの溶解性を判定した。結果を以下の表2に示す。
【００７８】
【表２】
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【００７９】
表2に示すように、比較例9のものを除いて全ての界面活性剤は、0.75mg/mLの濃度で溶解したので、試薬組成物中で使用するのに適していることが確認された。
【００８０】
上記の実験結果に従って、比較例9で調製した溶血試薬組成物は、後続の実験のための候補群から除外した。
【００８１】
＜実験例2＞ 溶血速度の評価
実施例1〜3および比較例1〜8で調製した溶血試薬組成物の溶血速度は、以下に記載する実験によって得られた。
【００８２】
具体的には、実施例1〜3および比較例1〜8で調製した溶血試薬組成物を血液と1：400（血液：溶血試薬）の比で混合することにより、それらを5分間反応させた。
【００８３】
0〜5分の間の530nmでの吸光度の変化を、UV/Vis装置（モデル：島津製作所製UV-1800）を用いて測定し、その結果を図1、図2、および以下の表3に示す。
【００８４】
以下の表3に示した値は、1分での値から30秒での値を減算することによって得られた絶対値である。溶血を0.5〜1分以内で十分に完了することができるほどに溶血速度が速い場合、その値は0に近くなり、その反応が遅い場合には、その値が比較的大きくなる。
【００８５】
【表３】
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【００８６】
図1は、本発明の実施例1〜3および比較例1〜3で調製した溶血試薬組成物による時間の経過にわたる赤血球の溶血を表すグラフを示す（図1において、時間の経過にわたる勾配の変化は、赤血球の溶血が継続中であることを示し、勾配の変化がない領域は、溶血が終了している期間を示す）。
【００８７】
図2は、本発明の比較例4〜8で調製した溶血試薬組成物による時間の経過にわたる赤血球の溶血を表すグラフを示す（図2において、時間の経過にわたる勾配の変化は、赤血球の溶血が継続中であることを示し、勾配の変化がない領域は、溶血が終了している期間を示す）。
【００８８】
表3および図1〜2に示すように、実施例1〜3で調製した溶血試薬組成物は1分未満の迅速な溶血速度を示し、時間の経過に伴う勾配の変化は赤血球の溶血過程の継続を示すことを考慮して、これらの組成物は勾配の変化がほとんどない安定したシグナルを示すことが確認された。特に、実施例3で調製した溶血試薬組成物は、最速の溶血速度を示した。
【００８９】
上記の実験結果に従って、比較例6〜7で調製した溶血試薬組成物は、後続の実験のための候補群から除外した。
【００９０】
＜実験例3＞ 総ヘモグロビンの反応感度の評価
酵素法によってHbA1cの相対濃度を測定するためには、総ヘモグロビンの濃度を一緒に測定することが不可欠である。そのためには、総ヘモグロビンの反応感度を得ることが重要である。
【００９１】
総ヘモグロビンの反応感度に対する本発明で調製した溶血試薬組成物の効果を調べるために、実験を次のように実施した。
【００９２】
具体的には、異なる総ヘモグロビン濃度（10.5g/dL、13.4g/dL、および15.6g/dL）を有する3つの血液サンプルを調製し、血液サンプルのそれぞれを、実施例1〜3、比較例1〜5、および8で調製した溶血試薬組成物と、1：400（血液：溶血試薬）の比で混合することにより、それらを1分間それぞれ反応させて、実験例2に記載のものと同じUV/Vis装置を用いて530nmでのそれらの吸光度を測定した。その結果を図3〜4に示す。さらに、図3〜4における総ヘモグロビンの反応感度を示すグラフの勾配を以下の表4に示す。
【００９３】
【表４】
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【００９４】
図3は、本発明の実施例1〜3および比較例1〜3で調製した溶血試薬組成物の総ヘモグロビンに対する反応感度を表すグラフを示す（図3において、勾配が大きいほど、総ヘモグロビンに対する反応感度が大きい）。
【００９５】
図4は、本発明の比較例4〜5および8で調製した溶血試薬組成物の総ヘモグロビンに対する反応感度を表すグラフを示す（図4において、勾配が大きいほど、総ヘモグロビンに対する反応感度が大きい）。
【００９６】
表4と図3および4に示すように、比較例1で調製した溶血試薬組成物は、総ヘモグロビンに対して比較的低い反応感度を示した。対照的に、実施例1〜3と、比較例5および8で調製した溶血試薬組成物は、総ヘモグロビンに対して優れた反応感度を示した。
【００９７】
＜実験例4＞ 界面活性剤と基質の間の反応性の評価
一般的に、基質の正確な定量化は、基質が酵素反応の結果として生成された過酸化水素とペルオキシダーゼとの反応によって発色するときに得ることができる。したがって、界面活性剤と基質との間の発色は、定量分析においてエラーを引き起こす可能性がある。この点に関して、界面活性剤と基質との反応性を、以下のように実施した実験で調べた。
【００９８】
具体的には、溶血試薬を血液サンプルと反応させるのではなく、実施例1〜3および比較例1、2、4、5および8で調製した溶血試薬の吸光度を、実施例2で用いたUV/Vis装置により分析した。
【００９９】
その結果、実施例1〜3および比較例1、2、4、5および8で調製した溶血試薬に含まれる全ての界面活性剤は、基質と反応しないことが明らかになり、かくして、それらは定量分析での使用に適していることが確認された。
【０１００】
＜実験例5＞ HbA1cの反応感度および反応速度の評価
酵素法によりHbA1cの定量化を行うには、HbA1cに対する反応感度が優れていることが重要である。この点に関して、HbA1cの反応感度および溶血反応の速度に対する本発明に従って調製した溶血試薬組成物の効果を、以下に記載する実験で調べた。
【０１０１】
具体的には、反応感度に関して、異なるHbA1c濃度（72μM、120μM、152μM、および264μM）を有する4つの血液サンプルを調製し、血液サンプルのそれぞれを、実施例1〜3および比較例1、2、4、5、8で調製した溶血試薬組成物と、1：400（血液：溶血試薬）の比で混合することにより、それらを1分間それぞれ反応させ、続いて調製例1で調製した酵素反応用の組成物と2〜3分間反応させて、それらのHbA1c値を測定した。
【０１０２】
HbA1c値は、調製例1で調製した酵素反応組成物中で基質として用いたDA-67（和光社製）が特定の波長を発する633nmで、実施例2で使用した同じUV/Vis装置を用いて測定し、その結果を以下の表5および6に示す。さらに、図5および6におけるHbA1c測定の反応感度を示すグラフの勾配を以下の表5に示す。
【０１０３】
【表５】
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【０１０４】
図5は、本発明の実施例1〜3および比較例1で調製した溶血試薬組成物のHbA1cに対する反応感度を表すグラフを示す（図5において、勾配が大きいほど、HbA1cに対する反応感度および反応速度が大きい）。
【０１０５】
図6は、本発明の比較例2、4、5および8で調製した溶血試薬組成物のHbA1cに対する反応感度を表すグラフを示す（図6において、勾配が大きいほど、HbA1c測定に対する反応感度および反応速度が大きい）。
【０１０６】
さらに、HbA1cアッセイにおける溶血試薬組成物の反応速度を、以下に記載する実験で調べた。
【０１０７】
具体的には、反応速度は単位時間あたりの反応感度によって比較された。反応速度は、全反応時間を3分とそれぞれ設定して、溶血試薬のそれぞれの勾配に基づいて比較した。図5および6において勾配を反応速度と見なすことができるという根拠は、溶血と酵素反応の2つの反応のいずれか1つの場合でさえ反応全体が遅いため、反応勾配は小さくなる、ということにある。
【０１０８】
表5と図5および6に示すように、比較例1で調製した溶血試薬組成物は、3分以内にHbA1cに対する反応感度をほとんど示さなかった。対照的に、実施例1〜3で調製した溶血試薬組成物は、検量線で0.09〜0.1の範囲の値を示して、比較的大きな勾配を示した。特に、実施例1〜3で使用した界面活性剤はすべて、14個の炭素からなる尾鎖に共通の分子構造を示した。したがって、尾鎖が14個の炭素からなる界面活性剤は、HbA1cと酵素との間の容易な反応を媒介することができると考えられる。
【０１０９】
＜実験例6＞ HbA1cの反応感度に対する亜硝酸化合物の効果の評価
一般に、亜硝酸化合物は、総ヘモグロビンの量を測定するために使用される物質として知られている。しかし、本発明でのHbA1c値を測定するための酵素法では、亜硝酸化合物が、酸化剤としてのその役割に加えて、溶血されたHbA1cのタンパク質構造を柔軟に改変することによって、プロテアーゼによる溶血HbA1cのタンパク質構造の配列の切断を媒介する補助作用に関与しているかどうかを確認するために、以下に記載する実験で亜硝酸化合物の役割を調べた。
【０１１０】
具体的には、異なるHbA1c濃度（52μM、98μM、および125μM）を有する3つの血液サンプルを調製し、次に実施例1および比較例10（実施例1の組成物では亜硝酸化合物を除いた）で調製した溶血試薬組成物のそれぞれと、1：400（血液：溶血試薬）の比で混合することにより、それらを1分間それぞれ反応させ、続いて調製例1で調製した酵素反応用の組成物と3分間反応させて、それらのHbA1cレベルを測定した。
【０１１１】
HbA1cレベルは、調製例1で調製した酵素反応組成物中で基質として用いたDA-67（和光社製）が特定の波長を発する633nmで、実施例2で使用した同じUV/Vis装置を用いて測定し、その結果を図7に示す。
【０１１２】
図7は、本発明の実施例1および比較例10で調製した溶血試薬組成物のHbA1cに対する反応感度を表すグラフを示す（図7において、勾配が大きいほど、HbA1cに対する反応感度が大きい）。
【０１１３】
図7に示すように、実施例1で調製した溶血試薬組成物は、HbA1cに対するその反応感度（検量線の勾配）を0.10386として示し、一方比較例10で調製した溶血試薬は、HbA1cに対するその反応感度を0.02169として示し、したがって、実施例1の溶血試薬組成物は、比較例10のそれよりも約5倍大きい反応感度をもつことが確認された。ヘモグロビンのタンパク質構造は亜硝酸化合物によって柔軟に改変され、それによって、プロテアーゼによるN末端β鎖のアミノ酸配列の切断を媒介すると推測される。
【０１１４】
＜実験例7＞ HbA1cの反応感度に対する界面活性剤の効果の評価
溶血により放出されたヘモグロビンのN末端β鎖をヘモグロビン分子の外側に露出されるように誘導して、反応へのより多数の分子の関与を支援することによる、HbA1cの反応感度に対する本発明の界面活性剤の効果を調べるために、実験を下記のように行った。
【０１１５】
具体的には、異なるHbA1c濃度（72μM、120μM、152μM、および264μM）を有する4つの血液サンプルを調製し、次に実施例1および比較例1（実施例1の組成物では界面活性剤を除いた）で調製した溶血試薬組成物のそれぞれと、1：400（血液：溶血試薬）の比で混合することにより、それらを1分間それぞれ反応させ、続いて調製例1で調製した酵素反応用の組成物と3分間反応させて、それらのHbA1cレベルを測定した。
【０１１６】
HbA1cレベルは、調製例1で調製した酵素反応組成物中で基質として用いたDA-67（和光社製）が特定の波長を発する633nmで、実施例2で使用した同じUV/Vis装置を用いて測定し、その結果を図8に示す。
【０１１７】
図8は、本発明の実施例1および比較例1で調製した溶血試薬組成物のHbA1cに対する反応感度を表すグラフを示す（図8において、勾配が大きいほど、HbA1cに対する反応感度は大きい）。
【０１１８】
図8に示すように、実施例1で調製した溶血試薬組成物は、HbA1cに対するその反応感度（検量線の勾配）を0.13209として示し、一方比較例10で調製した溶血試薬は、HbA1cに対するその反応感度を0.00459として示し、したがって、実施例1の溶血試薬組成物は、比較例1のそれよりも約30倍大きい反応感度をもつことが確認された。これらの結果は、両性イオン界面活性剤が、溶血により放出されたヘモグロビンのN末端β鎖をヘモグロビン分子の外側に露出されるように誘導して、反応へのより多数の分子の関与を支援するためであると推測される。
【０１１９】
産業上の利用可能性
両性イオン界面活性剤と亜硝酸化合物を含有する本発明の溶血試薬組成物は、両性イオン界面活性剤の存在のために溶血速度をかなり加速し、かつ溶血により放出されたヘモグロビンのN末端β鎖をヘモグロビン分子の外側に露出されるように誘導して、反応へのより多数の分子の関与を支援し、それによって、HbA1cの反応感度および反応速度を向上させ、かつ亜硝酸化合物は、ヘモグロビンのN末端β鎖のアミノ酸配列が容易に切断されるように、ヘモグロビンのタンパク質構造を柔軟に改変させ、それによって、測定に要する全時間を著しく短縮し、かつ測定精度を向上させ、したがって、HbA1cの定量分析のための溶血試薬組成物として使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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