(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉｉ）脂質と混合された（ｉ）３０未満のアミノ酸を含む両親媒性ペプチドを含む粒子と、（ｂ）前記粒子と結合した少なくとも１つの免疫原性種とを含む、組成物であって、前記免疫原性種は親水性であり、
ここで、前記両親媒性ペプチドは、前記脂質を可溶化し、そして、前記脂質の周辺に集まる、組成物。
【請求項２】
前記粒子が脂質コアを有するディスク形状粒子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記両親媒性ペプチドが２０以下のアミノ酸を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記両親媒性ペプチドがクラスＡ両親媒性アルファらせんを形成する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記両親媒性ペプチドが以下、（ｉ）ＤＷＬＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＬＫＥＡＦＬＡ（配列番号１）、（ｉｉ）ＥＬＬＥＫＷＫＥＡＬＡＡＬＡＥＫＬＫ（配列番号２）、（ｉｉｉ）ＦＷＬＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＬＫＥＡＦ（配列番号３）、（ｉｖ）ＤＷＬＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＬＫＥＡＦＲＬＴＲＫＲＧＬＫＬＡ（配列番号４）、（ｖ）ＤＷＬＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＬＫＥＡＦ（配列番号５）およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記脂質がリン脂質である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記リン脂質が両性イオンリン脂質である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
両性イオンリン脂質が極性ホスホファチジルコリンヘッド基を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記リン脂質が、炭素１２〜２２個の長さの、０〜３個の２重結合を含有する１個以上のアルキルまたはアルケニルラジカルを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記免疫原性種が抗原である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗原が親油性アンカーに共有結合的または非共有結合的に結合している、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記親油性アンカーが親油性ペプチドである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記親油性アンカーが前記抗原に切断可能リンカーを介して結合されている、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記抗原がインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）またはその抗原結合断片である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
前記抗原が免疫原性タンパク質を発現するポリヌクレオチドである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物がカチオン性脂質をさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記免疫原性種が免疫アジュバントである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記免疫アジュバントが、抗菌ペプチド、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、１本鎖ＲＮＡ、ＩＣ３１、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記粒子の幅が５０ｎｍ未満である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記粒子の幅が５０ｎｍ〜１０，０００ｎｍに及ぶ、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記粒子がより小型の粒子の凝集体である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記免疫原性種がＤＮＡまたはＲＮＡを含み、組成物が捕集剤としてカチオン性脂質をさらに含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記組成物が抗原提示細胞を標的化するための標的化リガンドを含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
液体ビヒクル、張度調整剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、凍結保護剤およびそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上の追加成分を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記組成物が凍結乾燥組成物である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物が滅菌濾過されている、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
脊椎動物被験体において免疫応答を向上させるための、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
免疫原性組成物を形成する方法であって、前記方法は、（ｉｉ）脂質と混合された（ｉ）３０未満のアミノ酸を含む両親媒性ペプチドを含む粒子の存在下で免疫原性種を合成または修飾するステップを含み、
ここで、前記合成または修飾された免疫原性種は、親水性であり、前記合成または修飾ステップの結果として前記粒子と結合されるようになり、
ここで、前記両親媒性ペプチドは、前記脂質を可溶化し、そして、前記脂質の周辺に集まる、方法。
【請求項２９】
前記免疫原性種が、前記粒子の存在下で合成されるタンパク質である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記免疫原性種が、前記粒子の存在下で切断されるタンパク質である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
（ａ）（ｉｉ）脂質と混合された（ｉ）３０未満のアミノ酸を含む両親媒性ペプチドを含む粒子と、（ｂ）前記粒子と結合したアジュバントとを含む、組成物であって、前記粒子は、免疫細胞からのサイトカイン産生を増強し、
ここで、前記両親媒性ペプチドは、前記脂質を可溶化し、そして、前記脂質の周辺に集まる、組成物。
【請求項３２】
（ａ）（ｉｉ）脂質と混合された（ｉ）３０未満のアミノ酸を含む両親媒性ペプチドを含む粒子と、（ｂ）前記粒子と結合したアジュバントとを含む、組成物であって、前記アジュバントは、
トル様受容体（ＴＬＲ）；
ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン（ＮＯＤ）タンパク質；
スカベンジャー受容体、マンノース受容体、および、β−グルカン受容体からなる群より選択される貪食を誘導する受容体；ならびに、
それらの組み合わせからなる群より選択される受容体を活性化し、
ここで、前記両親媒性ペプチドは、前記脂質を可溶化し、そして、前記脂質の周辺に集まる、組成物。
【請求項３３】
前記アジュバントが、細菌リポ多糖、細菌リポタンパク質、抗菌ペプチド、サポニン、リポタイコ酸、スクアレン、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、１本鎖ＲＮＡ、合成リン脂質、ＭＦ５９、Ｅ６０２０、ＩＣ３１、リポペプチド、イミダゾキノリン化合物、ベンゾナフチリジン化合物、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３１または３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記両親媒性ペプチド対脂質のモル比が１：１〜１：１０である、請求項１〜２７および３１〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記両親媒性ペプチド対脂質のモル比が１：１．７５〜１：７である、請求項３４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本技術は、両親媒性ペプチド組成物ならびに免疫原性種の送達および運搬でのその使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ポリマー担体を含む粒子担体は、十分な免疫応答を誘発する試みで、吸着または捕捉された抗原およびアジュバントと共に使用されてきた。このような粒子担体は、選択した抗原またはアジュバントの複数のコピーを免疫系に提示し、ならびに、局所リンパ節での捕捉および保持を促進し得る。粒子はマクロファージなどの細胞によって貪食されることが可能であり、サイトカイン放出による抗原提示を増強することができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の簡潔な概要）
本発明は、免疫原性種の送達のための両親媒性ペプチドおよび脂質を含む免疫原性組成物に関する。
【０００４】
一実施形態において、組成物は、両親媒性ペプチド、脂質および少なくとも１つの免疫原性種を含む。
【０００５】
一実施形態において、免疫原性種は、適応免疫応答を刺激する種である。たとえば免疫原性種は、１つ以上の抗原を含み得る。抗原の例はとりわけ、ポリペプチド含有抗原、多糖含有抗原、およびポリヌクレオチド含有抗原を含む。抗原は、他にも供給源はあるが、たとえば腫瘍細胞から、およびウイルス、細菌、真菌および寄生生物などの病原性生物から得ることができる。
【０００６】
一実施形態において、免疫原性種は、自然免疫応答を刺激する種である。たとえば免疫原性種は、とりわけ以下の受容体：トル様受容体（ＴＬＲ）、ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン（ＮＯＤ）タンパク質、ならびに貪食を誘導する受容体、たとえばスカベンジャー受容体、マンノース受容体およびβ−グルカン受容体の１つ以上の活性化因子であり得る。
【０００７】
一実施形態において、免疫原性種は、その他多くの中でも、たとえば以下の免疫アジュバント：細菌リポ多糖を含むリポ多糖、ペプチドグリカン、細菌リポタンパク質、細菌フラゲリン、イミダゾキノリン化合物、リポペプチド、ベンゾナフチリジン化合物、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、１本鎖ＲＮＡ、サポニン、リポタイコ酸、ＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒誘導体、ポリホスファゼン、ムラミルペプチド、チオセミカルバゾン化合物、トリプタントリン化合物、および脂質Ａ誘導体の１つ以上から選択され得る。
【０００８】
本発明は、少なくとも１つの免疫原性種の送達のための担体として使用される両親媒性ペプチドおよび脂質を含む粒子、ならびにこのような粒子の凝集体をさらに具体化する。
【０００９】
本発明は、両親媒性ペプチド、脂質および少なくとも１つの免疫原性種を含む組成物を製造する方法も提供し、ここで、脂質、両親媒性ペプチドおよび免疫原性種は混合および処理されて粒子を形成する。たとえば脂質、両親媒性ペプチドおよび免疫原性種の混合物を含む溶液はフィルムに成形（ｃａｓｔ）されることがあり、フィルムが再水和されて、このような粒子を形成し得る。
【００１０】
本発明は、両親媒性ペプチド、脂質および少なくとも１つの免疫原性種を含む組成物を製造する方法も提供し、ここで、脂質は両親媒性ペプチドと混合され、処理されて粒子を形成し、粒子は少なくとも１つの免疫原性種と接触する。
【００１１】
本発明は、両親媒性ペプチド、脂質および少なくとも１つの免疫原性種を含む組成物を製造する方法も提供し、ここで、脂質は両親媒性ペプチドと混合され、処理されて粒子を形成し、少なくとも１つの免疫原性種はこのような粒子の存在下で形成または修飾される。
【００１２】
たとえばいくつかの実施形態において、免疫原性タンパク質は、このような粒子の存在下でアミノ酸から形成され得る。いくつかの実施形態において、免疫原性タンパク質はこのような粒子の存在下で、たとえば免疫原性タンパク質を切断して、免疫原性タンパク質をさらに疎水性にすることによって、および／または免疫原性タンパク質の疎水性部分を露出させることによって、修飾され得る。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
（ａ）（ｉ）３０未満のアミノ酸を含む両親媒性ペプチドおよび（ｉｉ）脂質を含む粒子と、（ｂ）前記粒子と結合した少なくとも１つの免疫原性種とを含む、組成物。
（項目２）
前記粒子が脂質コアを有するディスク形状粒子である、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記両親媒性ペプチドが２０以下のアミノ酸を含む、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記両親媒性ペプチドがクラスＡ両親媒性アルファらせんを形成する、項目１に記載の組成物。
（項目５）
前記両親媒性ペプチドがアポリポタンパク質Ａ１の特性を模倣する、項目１に記載の組成物。
（項目６）
前記両親媒性ペプチドがアポリポタンパク質Ａ１に対する配列相同性を示さない、項目５に記載の組成物。
（項目７）
前記両親媒性ペプチドが以下、（ｉ）ＤＷＬＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＬＫＥＡＦＬＡ（配列番号１）、（ｉｉ）ＥＬＬＥＫＷＫＥＡＬＡＡＬＡＥＫＬＫ（配列番号２）、（ｉｉｉ）ＦＷＬＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＬＫＥＡＦ（配列番号３）、（ｉｖ）ＤＷＬＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＬＫＥＡＦＲＬＴＲＫＲＧＬＫＬＡ（配列番号４）、および（ｖ）ＤＷＬＫＡＦＹＤＫＶＡＥＫＬＫＥＡＦ（配列番号５）から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１に記載の組成物。
（項目８）
前記脂質がリン脂質である、項目１に記載の組成物。
（項目９）
前記リン脂質が両性イオンリン脂質である、項目９に記載の組成物。
（項目１０）
両性イオンリン脂質が極性ホスホファチジルコリンヘッド基を含む、項目９に記載の組成物。
（項目１１）
前記リン脂質が、炭素１２〜２２個の長さの、０〜３個の２重結合を含有する１個以上のアルキルまたはアルケニルラジカルを含む、項目９に記載の組成物。
（項目１２）
前記免疫原性種が抗原である、項目１に記載の組成物。
（項目１３）
前記抗原が共有結合的または非共有結合的に結合した親油性アンカーを含む、項目１２に記載の組成物。
（項目１４）
前記親油性アンカーが前記抗原の天然膜固着領域である、項目１３に記載の組成物。
（項目１５）
前記親油性アンカーが切断可能リンカーを介して結合されている、項目１３に記載の組成物。
（項目１６）
前記抗原がインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）である、項目１２に記載の組成物。
（項目１７）
前記抗原が免疫原性タンパク質を発現するポリヌクレオチドである、項目１２に記載の組成物。
（項目１８）
前記組成物がカチオン性脂質をさらに含む、項目１７に記載の組成物。
（項目１９）
前記免疫原性種が免疫アジュバントである、項目１に記載の組成物。
（項目２０）
前記免疫アジュバントが、細菌リポ多糖、細菌リポタンパク質、抗菌ペプチド、サポニン、リポタイコ酸、スクアレン、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、１本鎖ＲＮＡ、合成リン脂質、ＭＦ５９、Ｅ６０２０、ＩＣ３１、リポペプチド、イミダゾキノリン化合物、およびベンゾナフチリジン化合物から選択される、項目１９に記載の組成物。
（項目２１）
前記粒子の幅が５０ｎｍ未満である、項目１に記載の組成物。
（項目２２）
前記粒子の幅が５０ｎｍ〜１０，０００ｎｍに及ぶ、項目１に記載の組成物。
（項目２３）
前記粒子がより小型の粒子の凝集体である、項目２２に記載の組成物。
（項目２４）
前記免疫原性種がＤＮＡまたはＲＮＡを含み、組成物が捕集剤としてカチオン性脂質をさらに含む、項目２２に記載の組成物。
（項目２５）
前記組成物が抗原提示細胞を標的化するための標的化リガンドを含む、項目１に記載の組成物。
（項目２６）
液体ビヒクル、張度調整剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤および凍結保護剤から選択される１つ以上の追加成分を含む、項目１に記載の組成物。
（項目２７）
前記組成物が凍結乾燥組成物である、項目１に記載の組成物。
（項目２８）
前記組成物が滅菌濾過されている、項目１に記載の組成物。
（項目２９）
脊椎動物被験体において免疫応答を向上させる方法であって、項目１に記載の免疫原性組成物を前記脊椎動物被験体に送達するステップを含む、方法。
（項目３０）
免疫原性組成物を形成する方法であって、前記方法は、（ｉ）３０未満のアミノ酸を含む両親媒性ペプチドおよび（ｉｉ）脂質を含む粒子の存在下で免疫原性種を合成または修飾するステップを含み、ここで、前記合成または修飾された免疫原性種は前記合成または修飾ステップの結果として前記粒子と結合されるようになる、方法。
（項目３１）
前記免疫原性種が、前記粒子の存在下で合成されるタンパク質である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記免疫原性種が、前記粒子の存在下で切断されるタンパク質である、項目３０に記載の方法。
【００１３】
本発明の他の目的、特色、利点、実施形態、および態様は、以下の説明および添付の特許請求の範囲から当業者に明らかとなる。しかし以下の説明、添付の特許請求の範囲、および詳細な実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものではあるが、例証のみを目的として与えられていることが理解されるべきである。開示した発明の精神および範囲内での各種の変更および修飾は、以下を読むことから当業者に容易に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、配列番号１のペプチドおよび脂質ＰＯＰＣを使用した、ペプチド対脂質モル比１：１．７５、１：３および１：７ならびに濃度２ｍｇ／ｍｌのペプチド単独で作製した粒子の、サイズ排除クロマトグラムのオーバーレイを示す。通常生理食塩水中の粒子約２００μｌを、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウムを溶出緩衝液（０．５ｍｌ／分）として使用して溶出容積４０ｍｌまでのランタイムでｓｕｐｅｒｐｏｓｅ  ６カラムに注入した。クロマトグラムは、溶出容積に対してプロットされた、２１５ｎｍでのＵＶ吸光度を示す。図１は、粒子のサイズが使用したペプチド対脂質モル比に応じて変化することを明示する。ペプチドに対して脂質が増加すると、粒子はより大きくなる。試験を行ったペプチド対脂質モル比のうち、１：１．７５によって、サイズが１０ｎｍ未満の最も小さい粒子が得られた。適切な標準が使用されるときに、それぞれのサイズ排除クロマトグラムによって、ストークス径を決定することもできる。粒子の直径を決定する代わりの方法は、動的光散乱であり、同じ傾向が観察される。
【図２】図２は、ペプチド対脂質モル比１：１．７５で配列番号１のペプチドおよび脂質ＰＯＰＣを使用して作製した粒子の、サイズ排除クロマトグラムを示す。ペプチド濃度８ｍｇ／ｍｌの粒子約２００μｌを、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウムを溶出緩衝液（０．５ｍｌ／分）として使用して溶出容積４０ｍｌまでのランタイムでｓｕｐｅｒｐｏｓｅ  ６カラムに注入した。各０．５ｍｌの画分を９６ウェルプレートに、操作の間の一連の列として収集して、クロマトグラムの２１５ｎｍにおける吸光度に対して溶出容積と共にプロットする。Ｃ９−Ｄ９からの画分をプールして、ポリスルホン製のＭｉｃｒｏＫｒｏｓ中空糸（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓ）を５０ＫＤカットオフで使用するタンジェンシャルフロー（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ）濾過によって濃縮した。
【図３】図３は、９０％ｖ／ｖ  Ｈ２Ｏおよび１０％ｖ／ｖ  Ｄ２Ｏで作製した５ｍＭリン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）緩衝液（ｐＨ６．２３、３７℃）において、ペプチド対脂質モル比１：１．７５で作製した粒子の、２次元ＮＭＲスペクトル（ＮＯＥＳＹ  Ｓｐｅｃｔｒａ）を示す。ペプチドを含む粒子（配列番号１のペプチドが２ｍｇ／ｍｌの濃度）を使用して、Ｂｒｕｋｅｒ−Ｂｉｏｓｐｉｎ  ＮＭＲで６００ＭＨｚにてデータを収集した。図５は、（左上隅の）図３の拡大部分を示す。
【図４】図４は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）による脂質ＰＯＰＣの構造およびプロトン帰属を示す。この目的のために、脂質フィルムを、メタノール中のＰＯＰＣストック溶液から過剰なメタノールを蒸発させることによって作製する。ＰＯＰＣの脂質溶液またはリポソームは、脂質フィルムを重水素化塩化メチレンによって１ｍｇ／ｍｌの濃度で水和することによって作製した。
【図５】図５は、配列番号１のペプチドおよび脂質ＰＯＰＣを使用して作製した粒子の２次元ＮＭＲスペクトル（ＮＯＥＳＹ  Ｓｐｅｃｔｒａ）を示す。図は、図３の左上隅の拡大図である。ｘ次元（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）（６〜９ｐｐｍ）は、芳香族アミノ酸のプロトンシグナルを表し、ｙ次元（０〜５ｐｐｍ）は、脂質および芳香族アミノ酸の側鎖のプロトンシグナルを表す。使用した粒子は、９０％ｖ／ｖ  Ｈ２Ｏおよび１０％ｖ／ｖ  Ｄ２Ｏで作製した５ｍＭリン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）緩衝液（ｐＨ６．２３、３７℃）中でペプチド対脂質モル比１：１．７５で作製した。濃度２ｍｇ／ｍｌでペプチドを含む粒子を使用して、Ｂｒｕｋｅｒ−Ｂｉｏｓｐｉｎ  ＮＭＲで６００ＭＨｚにてデータを収集した。
【００１５】
つまり図３〜図５は、ペプチドが本発明による粒子中でらせん状構造を有すること、らせん状ペプチドが定義された空間内で分子レベルで脂質と相互作用すること、および粒子が定義された構造を有することを明示する。
【図６Ａ】図６Ａ〜図６Ｃは、ヒトリポタンパク質と共に粒子のサイズ排除クロマトグラムを示す。配列番号１のペプチドおよび脂質ＰＯＰＣをペプチド対脂質モル比１：１．７５で用いた粒子を使用した。クロマトグラムは、（ａ）ペプチド濃度２ｍｇ／ｍｌの粒子、１ｍｇ／ｍｌの高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）ならびにＨＤＬおよび粒子（それぞれ０．５および１ｍｇ／ｍｌ）の混合物、（ｂ）ペプチド濃度２ｍｇ／ｍｌの粒子、１ｍｇ／ｍｌの低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）ならびにＬＤＬおよび粒子（それぞれ０．５および１ｍｇ／ｍｌ）の混合物、ならびに（ｃ）ペプチド濃度２ｍｇ／ｍｌの粒子、０．８７７ｍｇ／ｍｌの超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）ならびにＶＬＤＬおよび粒子（それぞれ０．４３８および１ｍｇ／ｍｌ）の混合物の注入オーバーレイを示す。図６Ａ〜図６Ｃは、この出願による粒子の著しい安定性を再度示している。本発明による粒子（ＮＬＰＰ−ナノ脂質ペプチド粒子（Ｎａｎｏ  Ｌｉｐｉｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ））を、ＨＤＬ、ＬＤＬおよびＶＬＤＬなどの天然リポタンパク質と（したがって天然リポタンパク質と）、混合するときでさえ、ＮＬＰＰは別個の一部分として残存する。ゆえに粒子は、試験を行った条件下では、天然リポタンパク質と相互作用せず、凝集体を形成せず、分解もしない。したがって粒子は、他のリポタンパク質の存在下で安定である。このことは製薬適用にとって重要な特徴であり、これにより効率的な標的化も可能となる。
【図６Ｂ】図６Ａ〜図６Ｃは、ヒトリポタンパク質と共に粒子のサイズ排除クロマトグラムを示す。配列番号１のペプチドおよび脂質ＰＯＰＣをペプチド対脂質モル比１：１．７５で用いた粒子を使用した。クロマトグラムは、（ａ）ペプチド濃度２ｍｇ／ｍｌの粒子、１ｍｇ／ｍｌの高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）ならびにＨＤＬおよび粒子（それぞれ０．５および１ｍｇ／ｍｌ）の混合物、（ｂ）ペプチド濃度２ｍｇ／ｍｌの粒子、１ｍｇ／ｍｌの低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）ならびにＬＤＬおよび粒子（それぞれ０．５および１ｍｇ／ｍｌ）の混合物、ならびに（ｃ）ペプチド濃度２ｍｇ／ｍｌの粒子、０．８７７ｍｇ／ｍｌの超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）ならびにＶＬＤＬおよび粒子（それぞれ０．４３８および１ｍｇ／ｍｌ）の混合物の注入オーバーレイを示す。図６Ａ〜図６Ｃは、この出願による粒子の著しい安定性を再度示している。本発明による粒子（ＮＬＰＰ−ナノ脂質ペプチド粒子（Ｎａｎｏ  Ｌｉｐｉｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ））を、ＨＤＬ、ＬＤＬおよびＶＬＤＬなどの天然リポタンパク質と（したがって天然リポタンパク質と）、混合するときでさえ、ＮＬＰＰは別個の一部分として残存する。ゆえに粒子は、試験を行った条件下では、天然リポタンパク質と相互作用せず、凝集体を形成せず、分解もしない。したがって粒子は、他のリポタンパク質の存在下で安定である。このことは製薬適用にとって重要な特徴であり、これにより効率的な標的化も可能となる。
【図６Ｃ】図６Ａ〜図６Ｃは、ヒトリポタンパク質と共に粒子のサイズ排除クロマトグラムを示す。配列番号１のペプチドおよび脂質ＰＯＰＣをペプチド対脂質モル比１：１．７５で用いた粒子を使用した。クロマトグラムは、（ａ）ペプチド濃度２ｍｇ／ｍｌの粒子、１ｍｇ／ｍｌの高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）ならびにＨＤＬおよび粒子（それぞれ０．５および１ｍｇ／ｍｌ）の混合物、（ｂ）ペプチド濃度２ｍｇ／ｍｌの粒子、１ｍｇ／ｍｌの低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）ならびにＬＤＬおよび粒子（それぞれ０．５および１ｍｇ／ｍｌ）の混合物、ならびに（ｃ）ペプチド濃度２ｍｇ／ｍｌの粒子、０．８７７ｍｇ／ｍｌの超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）ならびにＶＬＤＬおよび粒子（それぞれ０．４３８および１ｍｇ／ｍｌ）の混合物の注入オーバーレイを示す。図６Ａ〜図６Ｃは、この出願による粒子の著しい安定性を再度示している。本発明による粒子（ＮＬＰＰ−ナノ脂質ペプチド粒子（Ｎａｎｏ  Ｌｉｐｉｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ））を、ＨＤＬ、ＬＤＬおよびＶＬＤＬなどの天然リポタンパク質と（したがって天然リポタンパク質と）、混合するときでさえ、ＮＬＰＰは別個の一部分として残存する。ゆえに粒子は、試験を行った条件下では、天然リポタンパク質と相互作用せず、凝集体を形成せず、分解もしない。したがって粒子は、他のリポタンパク質の存在下で安定である。このことは製薬適用にとって重要な特徴であり、これにより効率的な標的化も可能となる。
【図７Ａ】図７Ａ〜図７Ｂは、ペプチドおよび粒子の示差走査熱量測定を示す。
【図７Ｂ】図７Ａ〜図７Ｂは、ペプチドおよび粒子の示差走査熱量測定を示す。
【図８】図８Ａ〜図８Ｃ、図９Ａ〜図９Ｂおよび図１０は、免疫原性種を両親媒性ペプチドおよび脂質で形成された粒子に結合させるための、所望の要素を組合せる各種の方法を模式的に図示する。
【図９】図８Ａ〜図８Ｃ、図９Ａ〜図９Ｂおよび図１０は、免疫原性種を両親媒性ペプチドおよび脂質で形成された粒子に結合させるための、所望の要素を組合せる各種の方法を模式的に図示する。
【図１０】図８Ａ〜図８Ｃ、図９Ａ〜図９Ｂおよび図１０は、免疫原性種を両親媒性ペプチドおよび脂質で形成された粒子に結合させるための、所望の要素を組合せる各種の方法を模式的に図示する。
【図１１】図１１は、本発明の両親媒性ペプチドを官能化する実施形態を図で示す。リシン側鎖があり、それゆえ化学修飾に利用しやすい、両親媒性ペプチドが示されている。リシン側鎖はアルキンによって修飾され、それゆえ標的化リガンドＴＬを結合するためのアンカー部位を与える。
【図１２】図１２は、粒子標的化に有用な各種の脂質付加（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）標的化モチーフを示す。
【図１３】図１３は、各種の形の空のＮＬＰＰ（リポペプチドなし）による、ＰＡＭ３ＣＳＫ４による、および超音波処理リポペプチドによる、ＨＥＫ２９３−ＮＦ−κＢｌｕｃ−ＦＬＡＧＴＬＲ２細胞の刺激を図示する。
【図１４】図１４は、ＮＬＰＰ含有リポペプチドによる、ＰＡＭ３ＣＳＫ４による、および超音波処理リポペプチドによる、ＨＥＫ２９３−ＮＦ−κＢｌｕｃ−ＦＬＡＧＴＬＲ２細胞の刺激を図示する。
【図１５】図１５は、ｅ２６９５  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｍｏｄｕｌｅ法を使用する、ＮＬＰＰ粒子のサイズ排除クロマトグラムを示す。
【図１６−１】図１６は、Ａｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ９００法を使用する、ＮＬＰＰ粒子のサイズ排除クロマトグラムを示す。
【図１６−２】図１６は、Ａｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ９００法を使用する、ＮＬＰＰ粒子のサイズ排除クロマトグラムを示す。
【図１６−３】図１６は、Ａｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ９００法を使用する、ＮＬＰＰ粒子のサイズ排除クロマトグラムを示す。
【図１６−４】図１６は、Ａｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ９００法を使用する、ＮＬＰＰ粒子のサイズ排除クロマトグラムを示す。
【図１６−５】図１６は、Ａｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ９００法を使用する、ＮＬＰＰ粒子のサイズ排除クロマトグラムを示す。
【図１７Ａ】図１７は、（ａ）脂質：ＤＭＰＣ比が１：２．５で、ＳＭＩＰを１．２ｍｇ／ｍＬの濃度で含有するＮＬＰＰ粒子のサイズ排除クロマトグラムおよび（ｂ）ＳＭＩＰおよびリン脂質含有量についてのサイズ排除クロマトグラフィー画分分析を図示する。
【図１７Ｂ】図１７は、（ａ）脂質：ＤＭＰＣ比が１：２．５で、ＳＭＩＰを１．２ｍｇ／ｍＬの濃度で含有するＮＬＰＰ粒子のサイズ排除クロマトグラムおよび（ｂ）ＳＭＩＰおよびリン脂質含有量についてのサイズ排除クロマトグラフィー画分分析を図示する。
【図１８】図１８は、シグナル配列またはシグナルペプチド（ＳＰ）、ｐ２７リンカー領域、融合ペプチド（ＦＰ）、ＨＲＡドメイン（ＨＲＡ）、ＨＲＢドメイン（ＨＲＢ）、膜貫通領域（ＴＭ）、および細胞質側末端（ＣＴ）を示す、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の概略図である。フューリン（ｆｕｒｉｎ）切断部位は、アミノ酸位置１０９および１３６に存在する。図１８は、ＲＳＶ  Ｆ（野生型）のアミノ酸１００−１５０のアミノ酸配列（配列番号６）およびフューリン切断部位が変異したタンパク質（配列番号７）も示す。図１８では、記号「−」は、その位置のアミノ酸が欠失していることを示す。
【図１９】図１９は、各種の形の空のＮＬＰＰ（ＬＩＰＯ１なし）による刺激の際のヒトＰＢＭＣによるＩＬ−６産生のプロットである。
【図２０】図２０は、各種の形の空のＮＬＰＰ（ＬＩＰＯ１なし）による刺激の際のマウス脾細胞によるＩＬ−８産生のプロットである。
【図２１】図２１は、Ｌｉｐｏ１リポペプチド含有ＮＬＰＰによる刺激の際のヒトＰＢＭＣによるＩＬ−６産生のプロットである。
【図２２】図２２は、Ｌｉｐｏ１リポペプチド含有ＮＬＰＰによる刺激の際のマウス脾細胞によるＩＬ−８産生のプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
（定義）
「アルケニル」という用語は、本明細書で使用する場合、少なくとも１つの炭素−炭素２重結合を有する部分不飽和分枝または直鎖炭化水素を指す。２重結合を中心に配向された原子は、シス（Ｚ）またはトランス（Ｅ）立体配座のどちらかにある。アルケニル基は場合により置換することができる。本明細書で使用する場合、「Ｃ２−Ｃ３アルケニル」、「Ｃ２−Ｃ４アルケニル」、「Ｃ２−Ｃ５アルケニル」、「Ｃ２−Ｃ６アルケニル」、「Ｃ２−Ｃ７アルケニル」、および「Ｃ２−Ｃ８アルケニル」という用語は、少なくとも２個のおよび最大３、４、５、６、７または８個の炭素原子をそれぞれ含有するアルケニル基を指す。別途規定しない場合、アルケニル基は一般に、Ｃ２−Ｃ６アルケニルである。アルケニル基の非制限的な例は、本明細書で使用する場合、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニルなどを含む。
【００１７】
「アルケニレン」という用語は、本明細書で使用する場合、アルケニル基に由来する部分不飽和分枝または直鎖２価炭化水素ラジカルを指す。アルケニレン基は場合により置換することができる。本明細書で使用する場合、「Ｃ２−Ｃ３アルケニレン」、「Ｃ２−Ｃ４アルケニレン」、「Ｃ２−Ｃ５アルケニレン」、「Ｃ２−Ｃ６アルケニレン」、「Ｃ２−Ｃ７アルケニレン」、および「Ｃ２−Ｃ８アルケニレン」という用語は、少なくとも２個のおよび最大で３、４、５、６、７または８個の炭素原子をそれぞれ含有するアルケニレン基を指す。別途規定しない場合、アルケニレン基は一般に、Ｃ１−Ｃ６アルケニレンである。アルケニレン基の非制限的な例は、本明細書で使用する場合、エテニレン、プロペニレン、ブテニレン、ペンテニレン、ヘキセニレン、ヘプテニレン、オクテニレン、ノネニレン、デセニレンなどを含む。
【００１８】
「アルキル」という用語は、本明細書で使用する場合、飽和分枝または直鎖炭化水素を指す。アルキル基は場合により置換することができる。本明細書で使用する場合、「Ｃ１−Ｃ３アルキル」、「Ｃ１−Ｃ４アルキル」、「Ｃ１−Ｃ５アルキル」、「Ｃ１−Ｃ６アルキル」、「Ｃ１−Ｃ７アルキル」および「Ｃ１−Ｃ８アルキル」という用語は、少なくとも１個のおよび最大３、４、５、６、７または８個の炭素原子をそれぞれ含有するアルキル基を指す。別途規定しない場合、アルキル基は一般に、Ｃ１−Ｃ６アルキルである。アルキル基の非制限的な例は、本明細書で使用する場合、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどを含む。
【００１９】
「アルキレン」という用語は、本明細書で使用する場合、アルキル基に由来する飽和分枝または直鎖２価炭化水素ラジカルを指す。アルキレン基は場合により置換することができる。本明細書で使用する場合、「Ｃ１−Ｃ３アルキレン」、「Ｃ１−Ｃ４アルキレン」、「Ｃ１−Ｃ５アルキレン」、「Ｃ１−Ｃ６アルキレン」、「Ｃ１−Ｃ７アルキレン」および「Ｃ１−Ｃ８アルキレン」という用語は、少なくとも１個のおよび最大３、４、５、６、７または８個の炭素原子をそれぞれ含有するアルキレン基を指す。別途規定しない場合、アルキレン基は一般に、Ｃ１−Ｃ６アルキレンである。アルキレン基の非制限的な例は、本明細書で使用する場合、メチレン、エチレン、ｎ−プロピレン、イソプロピレン、ｎ−ブチレン、イソブチレン、ｓｅｃ−ブチレン、ｔ−ブチレン、ｎ−ペンチレン、イソペンチレン、ヘキシレンなどを含む。
【００２０】
「アルキニル」という用語は、本明細書で使用する場合、少なくとも１個の炭素−炭素３重結合を有する部分不飽和分枝または直鎖炭化水素を指す。アルキニル基は場合により置換することができる。本明細書で使用する場合、「Ｃ２−Ｃ３アルキニル」、「Ｃ２−Ｃ４アルキニル」、「Ｃ２−Ｃ５アルキニル」、「Ｃ２−Ｃ６アルキニル」、「Ｃ２−Ｃ７アルキニル」、および「Ｃ２−Ｃ８アルキニル」という用語は、少なくとも２個のおよび最大３、４、５、６、７または８個の炭素原子をそれぞれ含有するアルキニル基を指す。別途規定しない場合、アルキニル基は一般に、Ｃ２−Ｃ６アルキニルである。アルキニル基の非制限的な例は、本明細書で使用する場合、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニルなどを含む。
【００２１】
「アルキニレン」という用語は、本明細書で使用する場合、アルキニル基に由来する部分不飽和分枝または直鎖２価炭化水素ラジカルを指す。アルキニレン基は場合により置換することができる。本明細書で使用する場合、「Ｃ２−Ｃ３アルキニレン」、「Ｃ２−Ｃ４アルキニレン」、「Ｃ２−Ｃ５アルキニレン」、「Ｃ２−Ｃ６アルキニレン」、「Ｃ２−Ｃ７アルキニレン」、および「Ｃ２−Ｃ８アルキニレン」という用語は、少なくとも２個のおよび最大３、４、５、６、７または８個の炭素原子をそれぞれ含有するアルキニレン基を指す。別途規定しない場合、アルキニレン基は一般に、Ｃ２−Ｃ６アルキニレンである。アルキニレン基の非制限的な例は、本明細書で使用する場合、エチニレン、プロピニレン、ブチニレン、ペンチニレン、ヘキシニレン、ヘプチニレン、オクチニレン、ノニニレン、デシニレンなどを含む。
【００２２】
「アルコキシ」という用語は、本明細書で使用する場合、基−ＯＲａを指し、Ｒａは、本明細書で定義するようなアルキル基である。アルコキシ基は場合により置換することができる。本明細書で使用する場合、「Ｃ１−Ｃ３アルコキシ」、「Ｃ１−Ｃ４アルコキシ」、「Ｃ１−Ｃ５アルコキシ」、「Ｃ１−Ｃ６アルコキシ」、「Ｃ１−Ｃ７アルコキシ」および「Ｃ１−Ｃ８アルコキシ」という用語は、アルキル部分が少なくとも１個のおよび最大３、４、５、６、７または８個の炭素原子を含有するアルコキシ基を指す。アルコキシ基の非制限的な例は、本明細書で使用する場合、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブチルオキシ、ｔ−ブチルオキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシなどを含む。
【００２３】
「アリール」という用語は、本明細書で使用する場合、系内の少なくとも１つの環が芳香族であり、系内の各環が３〜７個の環員を含有する、合計５〜１４個の環員を含有する単環式、２環式、および３環式環系を指す。アリール基は場合により置換することができる。アリール基の非制限的な例は、本明細書で使用する場合、フェニル、ナフチル、フルオレニル、インデニル、アズレニル、アントラセニルなどを含む。
【００２４】
「アリーレン」という用語は、使用する場合、アリール基に由来する２価ラジカルを意味する。アリーレン基は場合により置換することができる。
【００２５】
「シアノ」という用語は、本明細書で使用する場合、−ＣＮ基を指す。
【００２６】
「シクロアルキル」という用語は、本明細書で使用する場合、飽和または部分不飽和、単環式、縮合２環式、縮合３環式または架橋多環式環アセンブリを指す。本明細書で使用する場合、「Ｃ３−Ｃ５シクロアルキル」、「Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル」、「Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル」、「Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル」、「Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル」および「Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキル」という用語は、飽和または部分不飽和、単環式、縮合２環式または架橋多環式環アセンブリが少なくとも３個の、および最大５、６、７、８、９または１０個の炭素原子を含有するシクロアルキル基を指す。シクロアルキル基は場合により置換することができる。シクロアルキル基の非制限的な例は、本明細書で使用する場合、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、デカヒドロナフタレニル、２，３，４，５，６，７−ヘキサヒドロ−１Ｈ−インデニルなどを含む。
【００２７】
「ハロゲン」という用語は、本明細書で使用する場合、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、またはヨウ素（Ｉ）を指す。
【００２８】
「ハロ」という用語は、本明細書で使用する場合、ハロゲンラジカル：フルオロ（−Ｆ）、クロロ（−Ｃｌ）、ブロモ（−Ｂｒ）、およびヨード（−Ｉ）を指す。
【００２９】
「ハロアルキル」または「ハロ置換アルキル」という用語は、本明細書で使用する場合、同じかまたは異なる１個以上のハロゲン基によって置換された本明細書で定義するようなアルキル基を指す。ハロアルキル基は場合により置換することができる。このような分枝または直鎖ハロアルキル基の非制限的な例は、本明細書で使用する場合、これに限定されるわけではないが、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチルなどを含む、１個以上のハロゲン基によって置換された、ハロゲン基が同じかまたは異なる、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、イソブチルおよびｎ−ブチルを含む。
【００３０】
「ハロアルケニル」または「ハロ置換アルケニル」という用語は、本明細書で使用する場合、同じかまたは異なる１個以上のハロゲン基によって置換された、本明細書で定義するようなアルケニル基を指す。ハロアルケニル基は場合により置換することができる。このような分枝または直鎖ハロアルケニル基の非制限的な例は、本明細書で使用する場合、同じかまたは異なる１個以上のハロゲン基によって置換された、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニルなどを含む。
【００３１】
「ハロアルキニル」または「ハロ置換アルキニル」という用語は、本明細書で使用する場合、同じかまたは異なる１個以上のハロゲン基によって置換された、上で定義するようなアルキニル基を指す。ハロアルキニル基は場合により置換することができる。このような分枝または直鎖ハロアルキニル基の非制限的な例は、本明細書で使用する場合、同じかまたは異なる１個以上のハロゲン基によって置換された、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニルなどを含む。
【００３２】
「ハロアルコキシ」という用語は、本明細書で使用する場合、同じかまたは異なる１個以上のハロゲン基によって置換された、本明細書で定義するようなアルコキシ基を指す。ハロアルコキシ基は場合により置換することができる。このような分枝または直鎖ハロアルキニル基の非制限的な例は、本明細書で使用する場合、同じかまたは異なる１個以上のハロゲン基によって置換された、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブチルオキシ、ｔ−ブチルオキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシなどを含む。
【００３３】
「ヘテロアルキル」という用語は、本明細書で使用する場合、１個以上の炭素原子が独立して酸素、硫黄、窒素の１つ以上、またはその組合せによって置き換えられている、本明細書で定義するようなアルキル基を指す。
【００３４】
「ヘテロアリール」という用語は、本明細書で使用する場合、系内の少なくとも１個の環が芳香族であり、系内の少なくとも１個の環が窒素、酸素および硫黄から選択される１個以上のヘテロ原子を含有し、系内の各環が３〜７個の環員を含有する、合計５〜１４個の環員を含有する単環式、２環式、および３環式環系を指す。ヘテロアリール基は１個以上の置換基を含有し得る。ヘテロアリール基は場合により置換することができる。ヘテロアリール基の非制限的な例は、本明細書で使用する場合、ベンゾフラニル、ベンゾフラザニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾピラニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチエニル、ベンズアゼピニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチオピラニル、ベンゾ［１，３］ジオキソール、ベンゾ［ｂ］フリル、ベンゾ［ｂ］チエニル、シンノリニル、フラザニル、フリル、フロピリジニル、イミダゾリル、インドリル、インドリジニル、インドリン−２−オン、インダゾリル、イソインドリル、イソキノリニル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、１，８−ナフチリジニル、オキサゾリル、オキサインドリル、オキサジアゾリル、ピラゾリル、ピロリル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピリジル、ピリダジニル、ピラジニル、ピリミジニル、キノキサリニル、キノリニル、キナゾリニル、４Ｈ−キノリジニル、チアゾリル、チアジアゾリル、チエニル、トリアジニル、トリアゾリルおよびテトラゾリルを含む。
【００３５】
「ヘテロシクロアルキル」という用語は、本明細書で使用する場合、環炭素の１個以上が−Ｏ−、−Ｎ＝、−ＮＲ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−または−Ｓ（Ｏ）２−から選択される部分によって置き換えられ、Ｒが水素、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたは窒素保護基であり、前記基の環が２個の隣接するＯまたはＳ原子を含有しないという条件である、本明細書で定義するようなシクロアルキルを指す。ヘテロシクロアルキル基は場合により置換することができる。ヘテロシクロアルキル基の非制限的な例は、本明細書で使用する場合、モルホリノ、ピロリジニル、ピロリジニル−２−オン、ピペラジニル、ピペリジニル、ピペリジニルオン、１，４−ジオキサ−８−アザ−スピロ［４．５］デカ−８−イル、２Ｈ−ピロリル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、１，３−ジオキソラニル、２−イミダゾリニル、イミダゾリジニル、２−ピラゾリニル、ピラゾリジニル、１，４−ジオキサニル、１，４−ジチアニル、チオモルホリニル、アゼパニル、ヘキサヒドロ−１，４−ジアゼピニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、チオキサニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、オキセパニル、チエパニル、１，２，３，６−テトラヒドロピリジニル、２Ｈ−ピラニル、４Ｈ−ピラニル、ジオキサニル、１，３−ジオキソラニル、ジチアニル、ジチオラニル、ジヒドロピラニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロフラニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、３−アザビシクロ［３．１．０］へキサニル、および３−アザビシクロ［４．１．０］ヘプタニルを含む。
【００３６】
「ヘテロ原子」という用語は、本明細書で使用する場合、酸素、硫黄、窒素、リンまたはケイ素の１つ以上を指す。
【００３７】
「ヒドロキシル」という用語は、本明細書で使用する場合、基−ＯＨを指す。
【００３８】
「ヒドロキシアルキル」という用語は、本明細書で使用する場合、１個以上のヒドロキシル基によって置換された、本明細書で定義するようなアルキル基を指す。分枝または直鎖「Ｃ１−Ｃ６ヒドロキシアルキル」基の非制限的な例は、本明細書で使用する場合、１個以上のヒドロキシル基によって置換されたメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、イソブチルおよびｎ−ブチル基を含む。
【００３９】
「イソシアネート」という用語は、本明細書で使用する場合、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ基を指す。
【００４０】
「イソチオシアネート」という用語は、本明細書で使用する場合、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ基を指す。
【００４１】
「メルカプチル」という用語は、本明細書で使用する場合、（アルキル）Ｓ−基を指す。
【００４２】
「場合により置換された」という用語は、本明細書で使用する場合、言及された基がアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、メルカプチル、シアノ、ハロ、カルボニル、チオカルボニル、イソシアネート、チオシアネート、イソチオシアネート、ニトロ、パーハロアルキル、パーフルオロアルキル、ならびにモノおよびジ置換アミノ基を含むアミノおよびその保護誘導体から個別におよび独立して選択される１個以上のさらなる基によって置換されても、または置換されなくてもよいことを意味する。任意の置換基の非制限的な例は、ハロ、−ＣＮ、＝Ｏ、＝Ｎ−ＯＨ、＝Ｎ−ＯＲ、＝Ｎ−Ｒ、−ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨＲ、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＳＲ−、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−ＮＨＲ、−Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ、−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ、Ｓ（Ｏ）２ＮＨＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＳ（Ｏ）２ＮＲ２、−ＮＲＳ（Ｏ）２ＮＲ２、−ＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ、−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ８アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ハロ置換Ｃ１−Ｃ８アルキル、およびハロ置換Ｃ１−Ｃ８アルコキシを含み、各Ｒは独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ８アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ハロ置換Ｃ１−Ｃ８アルキル、およびハロ置換Ｃ１−Ｃ８アルコキシから選択される。このような置換基の配置および数は、各基の十分に理解された価数制限に従って行われ、たとえば＝Ｏは、アルキル基には好適な置換基であるが、アリール基には好適な置換基ではない。
【００４３】
「プロドラッグ」という用語は、本明細書で使用する場合、インビボで親ドラッグに変換される薬剤を指す。本明細書に記載する化合物のプロドラッグの非制限的な例は、エステルとして投与され、次に、細胞内に入ると代謝的に加水分解されて、活性実体であるカルボン酸となる、本明細書に記載する化合物である。プロドラッグのさらなる例は、酸基に結合された短ペプチドであり、このペプチドは代謝されて活性部分を呈する。
【００４４】
「溶媒和物」という用語は、本明細書で使用する場合、溶質（一例として、本明細書に記載するような、式（Ｉ）の化合物、またはその塩）および溶媒によって形成された可変化学量論の複合体を指す。溶媒の非制限的な例は、水、アセトン、メタノール、エタノールおよび酢酸である。
【００４５】
この出願の一実施形態により、（ａ）両親媒性ペプチド；（ｂ）脂質；および（ｃ）少なくとも１つの免疫原性種を含む組成物が提供される。
【００４６】
（Ａ．両親媒性ペプチドおよび脂質）
この出願の組成物を生成するのに使用される両親媒性ペプチドは、同じ種類であり得るか、または異なる種類の、たとえば異なるアミノ酸配列のペプチドを含み得る。ペプチドは、Ｌおよび／またはＤアミノ酸から成ることが可能であり、天然ならびに非天然のアミノ酸およびアミノ酸類似体を含み得る。ペプチドは、１００、５０、３５、３０、２５またはそれ未満のアミノ酸の、または２０またはそれ未満のアミノ酸のアミノ酸鎖長を有し得る。ある好ましい実施形態において、ペプチドは３０、２５または２０またはそれ未満のアミノ酸のアミノ酸鎖長を有する。このような短鎖ペプチドが免疫上の観点から所望であり得るのは、短鎖ペプチドが、より長鎖の両親媒性ペプチドと比べて適応免疫応答の低下を誘発し得る（または全く誘発しない場合がある）ためである。免疫応答は、特に３−ヨード−Ｌ−チロシンまたは５−ヒドロキシ−トリプトファンなどの非天然アミノ酸から両親媒性ペプチドを形成することによっても、低下／または排除され得る。
【００４７】
この出願の教示に従って使用される両親媒性ペプチドは、脂質を可溶化して、粒子を形成する。このように形成された粒子は脂質のコアを含むことがあり、ここでは両親媒性ペプチドのらせんが脂質コアの周囲に集まり（たとえばベルト様の方式で）、それにより脂質の疎水性部分を遮蔽する。粒子の形状は円板に似ていることがある。各粒子の両親媒性ペプチドおよび脂質は合成によって産生できるため、これらは定義された組成およびサイズであり得る。大量にスケールアップすることも、均一のサイズで産生することも可能であり、これにより天然リポタンパク質よりも著しい利点を示している。さらに広範囲に及ぶ実験において、この出願による粒子が非常に安定であり、精製および処理（たとえば滅菌濾過）が可能であることが示されている。これらは工業生産プロセスにとって重要な利点である。さらに、この出願による粒子がＨＤＬ、ＶＬＤＬまたはＬＤＬなどの天然リポタンパク質の存在下でも安定であることが示された。天然リポタンパク質との望ましくない凝集または相互作用が避けられるため、このことはインビボ適用にとって重要な利点である。
【００４８】
両親媒性ペプチドおよび脂質を含む各粒子は、免疫原性組成物を形成するために、少なくとも１つの免疫原性種を装填することができる。ゆえに各粒子は、免疫原性種の送達のための担体／ビヒクルとして好適である。各組成物は、少なくとも１つの免疫原性種をレシピエント、たとえば脊椎動物被験体（すなわちウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ、およびヒトなどの哺乳動物；イヌおよびネコなどの家畜；ならびにニワトリ、シチメンチョウおよび他の家禽を含む雄鳥および雌鳥などの、家禽、野鳥および猟鳥を含む鳥類を制限なく含む、脊索動物亜門（ｓｕｂｐｈｙｌｕｍ  ｃｏｒｄａｔａ）の任意のメンバー）および特にヒトに送達するために特に好適である。形成された各粒子は、ＨＤＬなどの公知のリポタンパク質の構造に似た合成構造を有する。天然ＨＤＬに優る重要な利点は、この出願による粒子を大規模に合成的に産生できることである。これらは定義された組成を有し、各種の条件下で安定でもある。その定義された組成および安定性プロフィールによって、この粒子は製薬適用に特に好適となっている。
【００４９】
アポリポタンパク質Ａ１の１つ以上の特性を模倣できる両親媒性ペプチドを使用することが好都合であることが見出された。アポリポタンパク質は、主要な６つのクラス（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＨ）および複数のサブクラスに分けられる脂質結合タンパク質である。リポタンパク質中のアポリポタンパク質は、交換型（アポＡ−Ｉ、Ａ−ＩＩ、Ａ−ＩＶ、Ｃ−Ｉ、Ｃ−ＩＩ、Ｃ−ＩＩＩおよびＥ）および非交換型アポリポタンパク質（アポＢ−１００およびＢ−４８）に分類される。アポリポタンパク質は肝臓および腸で合成される。交換型アポリポタンパク質は、脂質代謝の間に異なるリポタンパク質粒子の間で交換することができる。構造的には、これらの交換型アポリポタンパク質は異なるクラスの両親媒性らせん−クラスＡ（サブクラスＡ１、Ａ２およびＡ４）、クラスＹおよびクラスＧを含有して、これによりアポリポタンパク質に対する脂質親和性が賦与される。
【００５０】
両親媒性らせんは、極性面に親水性アミノ酸を、非極性面に疎水性アミノ酸を含有する。らせんの極性面における荷電アミノ酸残基の分布およびクラスター形成は、異なるクラスの両親媒性らせんの間での主な相違である。アポリポタンパク質Ａ１の特性を模倣することができる各ペプチドの設計および合成は先行技術で公知であり、たとえば、参照により本明細書に完全に組み入れられている、Ｍｉｓｈｒａら、“Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｌ  Ｃｌａｓｓ  Ａ１，Ｃｌａｓｓ  Ａ２，ａｎｄ  Ｃｌａｓｓ  Ｙ  Ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ  Ｈｅｌｉｃａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９６，Ａｕｇｕｓｔ  ２７；３５（３４）：１１２１０−２０を参照されたい。さらに、アポリポタンパク質の脂質結合およびレシチンコレステロールアセチルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）活性化特性を模倣できる各合成ペプチド類似体が公知である。最適なアルファらせん度（ｈｅｌｉｃｉｔｙ）、脂質結合およびＬＣＡＴ活性化のために、様々な長さの両親媒性ペプチドがいろいろな研究者によって設計されてきた。
【００５１】
本発明によって使用できる好適な両親媒性ペプチドは、たとえば、参照により本明細書に組み入れられている、Ｍｉｓｈｒａ  ＶＫ，Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｉａｈ  ＧＭ，Ｓｅｇｒｅｓｔ  ＪＰ，Ｐａｌｇｕｎａｃｈａｒｉ  ＭＮ，Ｃｈａｄｄｈａ  Ｍ，Ｓｈａｍ  ＳＷ，Ｋｒｉｓｈｎａ  ＮＲ．“Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｃｌａｓｓ  Ａ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ  ａｌｐｈａ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ｌｉｐｉｄ：ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＮＭＲ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｐｉｄ  ｄｉｓｃｏｉｄａｌ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００６  Ｍａｒ  １０；２８１（１０）：６５１１−９；Ｍｉｓｈｒａ  ＶＫ，Ｐａｌｇｕｎａｃｈａｒｉ  ＭＮ．“Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｄｅｌ  ｃｌａｓｓ  Ａ１，ｃｌａｓｓ  Ａ２，ａｎｄ  ｃｌａｓｓ  Ｙ  ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９６  Ａｕｇ  ２７；３５（３４）：１１２１０−２０；Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｉａｈ  ＧＭ．“Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｓ  ｏｆ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８６；１２８：６２７−４７；Ｎａｖａｂ  Ｍ，Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｉａｈ  ＧＭ，Ｒｅｄｄｙ  ＳＴ，Ｈａｍａ  Ｓ，Ｈｏｕｇｈ  Ｇ，Ｇｒｉｊａｌｖａ  ＶＲ，Ｙｕ  Ｎ，Ａｎｓｅｌｌ  ＢＪ，Ｄａｔｔａ  Ｇ，Ｇａｒｂｅｒ  ＤＷ，Ｆｏｇｅｌｍａｎ  ＡＭ．“Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｉ  ｍｉｍｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．”Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．２００５  Ｊｕｌ；２５（７）：１３２５−３１；Ｎａｖａｂら“Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｉ  ｍｉｍｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ａｔｈｅｒｅｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００６  Ｖｏｌ  ３  Ｎｏ．１０；に記載されている。
【００５２】
一実施形態により、本発明による組成物で使用される両親媒性ペプチドは、クラスＡ両親媒性アルファらせんを形成する。
【００５３】
この出願によって使用される両親媒性ペプチドは、以下のアミノ酸配列を含むペプチドの群より選択できる：
【００５４】
【化１−１】
0005781929.tif 000002
ｖｉ．クラスＡ両親媒性アルファらせんを形成することができる、ｉ〜ｖによるペプチドの機能性類似体または断片。
【００５５】
特に好都合なペプチドは、配列番号５または配列番号１を含むかあるいは配列番号５または配列番号１から成るペプチドである。
【００５６】
アポＡ−１のペプチドミメティック（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃ）は普通、アポＡ−１の配列に対するいずれの配列相同性も示さないが、アポＡ−１に似たクラスＡ両親媒性アルファらせんを形成することが可能であり、アポリポタンパク質に似たリポタンパク質結合特性も示す。各ペプチドは、脂質を可溶化する能力、脂質との粒子を形成する能力を有する。一実施形態により、両親媒性ペプチドは、アポＡ−１または他のリポタンパク質に対して配列相同性を示さない。
【００５７】
一実施形態により、ペプチドの少なくとも１つの末端基は、遮断されている（すなわちＮ端、Ｃ端、または両方が遮断されている）。たとえば、少なくとも１端は、アセチル化および／またはアミド化され得る。少なくとも１つの末端基の遮断によって、らせんマクロ双極子と荷電端との間の安定化相互作用が除去されて、ペプチドのらせん含有量が増加し得ることが示されている。一実施形態により、Ｎ末端はアセチル化され、Ｃ末端はアミド化される。一実施形態により、ペプチドＡｃ−配列番号１−ＮＨ２またはＡｃ−配列番号５−ＮＨ２が使用される。
【００５８】
さらにペプチドは、たとえば粒子の物理的および／または化学的特性を改変するために、他の方法で化学修飾することができる。このような修飾は、たとえば、他の効果の中でも、粒子を標的化するために、その安定性を向上させるために、粒子をインビトロもしくはインビボで可視化するために、またはその分布パターンを改変するために行うことができる。このような修飾は、所望の効果を達成するために、単独で、または他の１つ以上の修飾と組合せて使用できる。修飾の例は、これに限定されるわけではないが、抗体またはその断片などの結合分子のビオチン化、フッ素化およびコンジュゲーションを含む。
【００５９】
修飾基／種は、たとえばＣもしくはＮ端に、またはペプチドの長さに沿って（たとえばアミノ酸の側基、たとえばリシンおよびアルギニンの−ＮＨ２側基、グルタミン酸およびアスパラギン酸の−ＣＯＯＨ側基などに結合）、各種の長さおよび組成のリンカーを用いてまたは用いずに結合させることができる。アミノ酸の適切な側基を修飾することも、この出願の範囲内である。このような修飾基は、小型分子、ペプチド、炭水化物、抗体もしくはその断片、アプタマー、ポリマーまたは他の分子構造で構成される可能性がある。
【００６０】
これらの修飾の導入は、従来技術で公知の任意の方法によって行うことができる。たとえば先に形成されたペプチド鎖への結合に加えて、修飾アミノ酸はペプチド鎖の合成に使用される可能性がある。このような非天然アミノ酸は、全体的な所望の修飾、または官能基、たとえば、ジスルフィド結合の形成または不飽和系への付加で使用するための遊離または保護チオール基、環化付加化学反応で使用するためのアジドもしくはアルキン（たとえば１，２，３−トリアゾールを与えるためのアジドと末端または内部アルキンとの間の１，３−双極子環化付加である、アジド−アルキンヒュスゲン環化付加を介した）、または縮合反応で使用するためのさらなるアミノまたはカルボニル基を含有する可能性があり、そのいずれも合成において追加の官能基を後で導入するために使用できる。
【００６１】
修飾は、粒子の安定性を向上させるか、または物理的特性を改善するために、ペプチドに対しても行われ得る。このような修飾は、これに限定されるわけではないが、１個以上のペプチドの天然または非天然アミノ酸の側基を共に連結することによるペプチドの架橋、２個以上のペプチドの末端の１つを共に連結することによるペプチドモチーフの多量体化を含み得る。このような結合は、各種の長さおよび組成のリンカーによって行うことができる。ペプチドの多量体化は、ペプチド合成の一部として、または、ペプチドの官能基、たとえばアミノ側基（たとえばリシンの）、酸側基（たとえばグルタミン酸の）、アミノ末端、酸末端、または適切な官能基を含む非天然アミノ酸を２官能性または多官能性リンカー、たとえば活性化２酸、ジアミンまたは他の適合性官能基と反応させることによって達成できる。
【００６２】
本発明で使用する脂質は、同じかまたは異なる種類であることも可能である。この出願の組成物で使用される脂質は、以下の特徴の少なくとも１つを有し得る：（１）脂質は、トリグリセリド、リン脂質、コレステロールエステルおよびコレステロールから成る基より選択される；（２）脂質は中性脂質である；（３）脂質はリン脂質である；および／または（４）脂質は、ホスファチジルコリン、たとえばパルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、
【００６３】
【化１−２】
0005781929.tif 000003
およびパルミトイルリノレイルホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）ならびにスフィンゴミエリンから成る両性イオンリン脂質群より選択される。
【００６４】
脂質は、トリグリセリド、リン脂質、コレステロールエステルおよびコレステロールから成る群より選択され得る。各脂質は、ヒト血漿のリポタンパク質に見出される脂質からも選択され得る。リポタンパク質は、サイズおよび組成が異なる４つの主要なクラス−カイロミクロン、超低密度リポタンパク質、低密度リポタンパク質および高密度タンパク質に分けられ得る。トリグリセリド、リン脂質、コレステロールエステルおよびコレステロールは、各リポタンパク質中に存在する主要な脂質である。毒性を低下させるために内因性脂質を使用することが好都合であり得る。
【００６５】
中性脂質を使用することが好都合であり得る。両性イオンリン脂質、たとえば、長さが１２〜２２炭素（たとえば１２〜１４〜１６〜１８〜２０〜２２炭素）の１個以上のアルキルまたはアルケニルラジカルを含有するリン脂質（ラジカルは、たとえば０〜１〜２〜３個の２重結合を含有し得る）を含む、リン脂質を使用することも好都合であり得る。両性イオンリン脂質を使用することが好都合であり得る。脂質は、ＰＯＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＰＬＰＣおよびスフィンゴミエリンから成る群より選択され得る。他の脂質も、その脂質が両親媒性ペプチドとの粒子を形成することができる限り使用できる。
【００６６】
一実施形態により、粒子１個当り約１６個の両親媒性ペプチドが、約５４個の脂質を含む脂質コアの周囲に２重バンドを形成する。もちろん、粒子の成分およびサイズに応じて、量は変化し得る。
【００６７】
一実施形態により、ペプチド対脂質モル比は１：１〜１：１０に、さらに好都合には１：１．７５〜１：７にある。粒子のサイズが選択したペプチド対脂質モル比に応じて変化することが見出された。ペプチドに対して脂質がより多く使用されると、粒子がより大きくなる。約２５ｎｍ未満のサイズを有するやや小型の粒子を得るためには、１：２未満のペプチド対脂質モル比を使用することが好都合である。特に好都合な結果は、約１：１．７５の比によって達成された。
【００６８】
単分散または粒子凝集体の形のどちらかであり得る、両親媒性ペプチドおよび脂質によって形成された粒子が、３ｎｍ以下〜５ｎｍ〜１０ｎｍ〜２０ｎｍ〜２５ｎｍ〜３０ｎｍ〜３５ｎｍ〜５０ｎｍ〜１００ｎｍ〜２５０ｎｍ〜５００ｎｍ〜１０００ｎｍ以上に及ぶサイズ（すなわち幅）を有することが好都合である。
【００６９】
ある適用では、粒子が５０ｎｍ、３５ｎｍ、３０ｎｍ、２５ｎｍ、２０ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ未満の、またはさらに３ｎｍ未満のサイズを有することが好都合であり得る。２５ｎｍ未満またはさらに１０ｎｍ未満のサイズを有するやや小型の粒子を使用することが好都合であり得るのは、この粒子がすべての身体区画への良好な組織的な分散を示し、それゆえいくつかの実施形態において、標的特異的な取り込みも促進し得るためである。各粒子には、送達される少なくとも１つの免疫原性種を装填することができる。やや小型の粒子を使用することは、特定の身体区画または細胞または受容体への粒子の標的化が意図される場合にも好都合である。たとえば５０ｎｍ未満の、好ましくは２０ｎｍ未満のサイズを有する小型粒子を使用することによって、粒子のより効率的な標的化が可能になり得る。いくつかの実施形態において、小型粒子の凝集体、たとえば５０ｎｍ未満の、好ましくは２０ｎｍまたはさらに１０ｎｍ未満のサイズを有する小型粒子の凝集体が形成され得る。
【００７０】
上のサイズは、顕微鏡技法（この場合、サイズは最大粒子長を表す）によって、または動的光散乱もしくはサイズ排除クロマトグラフィーなどの技法（この場合、サイズは見かけの直径、特に流体力学的直径およびストークス径によってそれぞれ表される）によって測定されるようなサイズに相当し得る。
【００７１】
（Ｂ．免疫原性種）
送達される少なくとも１つの免疫原性種は、両親媒性ペプチドおよび脂質によって形成された各粒子と結合されている。各結合を達成するための複数の可能性がある。一実施形態により、免疫原性種は部分的または全体的に親油性であり、それゆえ免疫原性種の全部または一部を粒子の脂質コアに固着させることができる。
【００７２】
別の実施形態により、免疫原性種は親油性アンカーを備えている。親油性アンカーは免疫原性種に例えば直接、共有結合的に結合させることができるか、または親油性アンカーの結合を可能にするためにリンカーを使用することができる。親油性アンカーは粒子の脂質コア中に挿入されて、それにより、両親媒性ペプチドおよび脂質によって形成された粒子に親油性アンカーを介して免疫原性種を固着する。
【００７３】
別の実施形態により、免疫原性種は切断されて、より疎水性となるか、または免疫原性種の疎水性部分が露出される。
【００７４】
代わりの実施形態により、免疫原性種は電荷相互作用によって粒子と結合されている。
【００７５】
代わりの実施形態により、親水性免疫原性種は、両親媒性ペプチドの親水性面と結合され得る。
【００７６】
たとえば負に荷電した免疫原性種が送達されるとき、正に荷電した捕集剤を使用して、負に荷電した免疫原性種を捕集して粒子に結合させることができる。各捕集剤はたとえば親油性アンカーを含み得て、これにより、脂質コアに挿入される親油性アンカーを介して、捕集剤を粒子に固着させることができる。本実施形態による捕集剤は、カチオン性基を含み、たとえばカチオン性脂質であることができる。負に荷電した免疫原性種の例は、本明細書の別の箇所に記載した種から選択され得て、負に荷電した抗原、たとえば負に荷電したペプチド含有抗原、ポリヌクレオチド含有抗原（ポリペプチド含有抗原をインビボで発現する）、たとえばＲＮＡベクター構築物およびＤＮＡベクター構築物（たとえばプラスミドＤＮＡ）ならびに負に荷電した免疫アジュバント、たとえば免疫賦活性オリゴヌクレオチド（たとえばＣｐＧオリゴヌクレオチド、１本鎖ＲＮＡなど）を含み得る。捕集剤の荷電基は、捕集剤が親油性アンカーを介して粒子に固着されているときに、負に荷電した免疫原性種との相互作用に利用できる。それにより、免疫原性種と粒子との結合が達成される。
【００７７】
図８Ａは、本発明による両親媒性ペプチドによって安定化されているリン脂質を含む粒子を図で示す。図８Ｂは、疎水性領域を有する免疫原性種を図で示し、免疫原性種の疎水性領域（すなわち親油性アンカー）がリン脂質中に挿入され、それにより免疫原性種が粒子に固着される。図８Ｃは、両親媒性ペプチドの親水性面と結合された親水性免疫原性種を図で示す。
【００７８】
図９Ａは、負に荷電した免疫原性種を粒子と結合させるためにカチオン性脂質が捕集剤として使用される、代わりの実施形態を図で示す。カチオン性脂質は、親油性アンカーおよびカチオン性ヘッドを含む。図９Ｂは、正に荷電した免疫原性種を粒子と結合させるためにアニオン性脂質が捕集剤として使用される、代わりの実施形態を図で示す。アニオン性脂質は、親油性アンカーおよびアニオン性ヘッドを含む。
【００７９】
図１０は、本発明による両親媒性ペプチドによって安定化されたリン脂質を含む粒子ならびに（ａ）免疫原性種の疎水性領域がリン脂質中に挿入されている、疎水性領域を有する免疫原性種および（ｂ）免疫原性種およびアジュバントが粒子に固着されるように、リン脂質中に挿入された疎水性アジュバントを図で示す。
【００８０】
記載された異なる結合原理の組合せも、本発明の範囲内である。たとえば負に荷電した捕集剤は、正に荷電した免疫原性種を捕集して、粒子に結合させるために使用できる。
【００８１】
上からわかるように、本発明で使用するための免疫原性種は、いずれの性質（たとえば疎水性、親水性、部分疎水性および部分親水性、荷電など）でも可能であり、たとえばとりわけ本明細書の別の箇所で記載した種から選択することができる。
【００８２】
本明細書で使用する場合、「免疫原性種」は、免疫応答を誘発または修飾することができる化学種である。本発明で使用するための免疫原性種は、抗原および免疫アジュバントを含む。
【００８３】
「アジュバント」という用語は、これに限定されるわけではないが、抗原に対する免疫応答を向上および／または多様化させる免疫アジュバントを含む、医薬品の作用を補助または修飾する任意の物質を指す。ゆえに、免疫アジュバントは、抗原に対する免疫応答を増強することができる化合物を含む。免疫アジュバントは、体液および／または細胞免疫を増強することができる。自然免疫応答を刺激する物質は、本明細書の免疫アジュバントの定義の中に含まれる。免疫アジュバントは、本明細書では「免疫増強物質」とも呼ばれ得る。
【００８４】
本明細書で使用する場合、「抗原」は、免疫応答を誘発する１個以上のエピトープ（たとえば線形、立体配座または両方）を含有する分子を指す。本明細書で使用する場合、「エピトープ」は、免疫特異性を決定する所与の種（たとえば抗原性分子または抗原性複合体）のその部分である。エピトープは、抗原の本定義の範囲内である。普通、エピトープは、天然発生型抗原中のポリペプチドまたは多糖である。人工抗原において、エピトープは、アルサニル酸誘導体などの低分子量物質であることが可能である。
【００８５】
「抗原」という用語は、本明細書で使用する場合、両方のサブユニット抗原、すなわち抗原が本来結合されている生物全体とは分離され別個である抗原、ならびに死滅、弱毒化または不活性化された細菌、ウイルス、寄生生物もしくは他の病原体または腫瘍細胞を示す。抗イディオタイプ抗体などの抗体、またはその断片、および抗原または抗原決定基を模倣することができる合成ペプチドミモトープも、本明細書で使用する場合、抗原の定義の下に捕えられる。同様に、核酸免疫化適用などにおける、免疫原性タンパク質、または抗原決定基をインビボで発現するポリヌクレオチドも、本明細書での抗原の定義に含まれる。
【００８６】
免疫応答（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」または「免疫応答（ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」は、免疫原性種に対する体液および／または細胞免疫応答の被験体における発生である。
【００８７】
免疫応答は、自然および適応免疫応答を含む。自然免疫応答は、免疫系の防御の第１線を与える速効型応答である。対照的に、適応免疫は、所与の病原体または障害（たとえば腫瘍）からの抗原を認識し、体細胞性に再配列された受容体遺伝子（たとえばＴおよびＢ細胞受容体）を有する、免疫細胞の選択およびクローン増殖を使用し、これにより、特異性および免疫記憶が与えられる。自然免疫応答は、その多くの効果の中でも、炎症性サイトカインの急速なバーストならびにマクロファージおよび樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活性化をもたらす。病原体を自己成分から区別するために、自然免疫系は、病原体関連分子パターン、すなわちＰＡＭＰとして公知の、病原体からのサインを検出する、多様な比較的不変の受容体を使用する。実験用ワクチンへの微生物成分の添加によって堅調で耐久性の適応免疫応答の発生がもたらされることが公知である。免疫応答のこの増強の背後にある機構は、パターン認識受容体（ＰＲＲ）を含むことが報告されており、ＰＲＲは、好中球、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞を含む多様な免疫細胞ならびに上皮および内皮細胞などのいくつかの非免疫細胞で異なって発現される。ＰＲＲの関与により、これらの細胞のいくつかの活性化ならびにサイトカインおよびケモカインのその分泌、ならびに他の細胞の成熟および移動ももたらされる。同時に、これにより適応免疫応答の確立をもたらす炎症環境が生成される。ＰＲＲは、非食受容体、たとえばトル様受容体（ＴＬＲ）およびヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン（ＮＯＤ）タンパク質、ならびに貪食を誘導する受容体、たとえばスカベンジャー受容体、マンノース受容体およびβ−グルカン受容体を含む。報告されたＴＬＲ（本発明の各種の実施形態で免疫原性種として使用され得る、いくつかの報告されたリガンドの例と共に）は、とりわけ以下：ＴＬＲ１（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａからの細菌リポタンパク質）、ＴＬＲ２（ザイモサン酵母粒子、ペプチドグリカン、リポタンパク質、リポペプチド、糖脂質、リポ多糖）、ＴＬＲ３（ウイルス２本鎖ＲＮＡ、ポリ：ＩＣ）、ＴＬＲ４（細菌リポ多糖、植物生成物のタキソール）、ＴＬＲ５（細菌フラジェリン）、ＴＬＲ６（酵母ザイモサン粒子、リポタイコ酸（ｌｉｐｏｔｅｃｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）、マイコプラズマからのリポペプチド）、ＴＬＲ７（１本鎖ＲＮＡ、イミキモド、レシミキモド（ｒｅｓｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）、および他の合成化合物、たとえばロキソリビンおよびブロピリミン）、ＴＬＲ８（１本鎖ＲＮＡ、レシミキモド）およびＴＬＲ９（ＣｐＧオリゴヌクレオチド）を含む。樹状細胞は、ナイーブなＣＤ４＋ヘルパーＴ（ＴＨ）細胞のプライミングを開始するための、およびキラー細胞へのＣＤ８＋Ｔ細胞分化を誘導するための、最も重要な細胞タイプのいくつかとして認識される。ＴＬＲシグナル伝達は、たとえばこれらのヘルパーＴ細胞応答の品質を判定するのに重要な役割を果たすことが報告されており、ＴＬＲシグナルの性質は、観察されるＴＨ応答の特異的なタイプを判定する（たとえばＴＨ１対ＴＨ２応答）。抗体（体液）および細胞免疫の組合せは、ＴＨ１型応答の一部として産��されるのに対して、ＴＨ２型応答は主に抗体応答である。各種のＴＬＲリガンド、たとえばＣｐＧ  ＤＮＡ（ＴＬＲ９）およびイミダゾキノリン（ＴＬＲ７、ＴＬＲ８）は、インビトロでの免疫細胞からのサイトカイン産生を刺激することが記録されている。イミダゾキノリンは、ＴＬＲ作用物質であることが示された最初の小型の薬物様化合物である。さらなる情報については、たとえばＡ．Ｐａｓｈｉｎｅ，Ｎ．Ｍ．Ｖａｌｉａｎｔｅ  ａｎｄ  Ｊ．Ｂ．Ｕｌｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １１，Ｓ６３−Ｓ６８（２００５），Ｋ．Ｓ．Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ  ａｎｄ  Ｄ．Ｈ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３（８），８２１−８２９（２００６）、およびそこで引用された参考文献を参照。
【００８８】
本発明の目的のために、体液免疫応答は抗体分子によって媒介される免疫応答を指すが、細胞免疫応答はＴリンパ球および／または他の白血球によって媒介される免疫応答である。細胞免疫の重要な一態様は、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による抗原特異的応答を含む。ＣＴＬは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によってコードされ、細胞表面に発現されたタンパク質と結合して提示されるペプチド抗原に対して特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の細胞内破壊、またはこのような微生物に感染した細胞の溶解の誘導および促進を補助する。細胞免疫の別の態様は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を含む。ヘルパーＴ細胞は、その機能に対する刺激を補助するように作用して、その表面上のＭＨＣ分子と結合したペプチド抗原を提示する細胞に対する、非特異的エフェクタ細胞の活性に集中している。「細胞免疫応答」は、活性化Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものを含む他の白血球によって産生された、サイトカイン、ケモカインおよび他のこのような分子の産生も指す。
【００８９】
それゆえ細胞免疫応答を誘発する免疫原性組成物またはワクチンなどの組成物は、細胞表面でＭＨＣ分子と結合した抗原の提示によって、脊椎動物被験体を感作するように作用し得る。細胞媒介性免疫応答は、その表面に抗原を提示する細胞またはその付近に向けられる。さらに抗原特異的Ｔリンパ球は、免疫化された宿主を将来保護することができるように生成することができる。特定の抗原または組成物が細胞媒介性免疫応答を刺激する能力は、当分野で公知のいくつかのアッセイによって、たとえばリンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイによって、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイによって、感作された被験体における抗原に特異的なＴリンパ球をアッセイすることによって、または抗原による再刺激に対する応答でのＴ細胞によるサイトカイン産生の測定によって判定され得る。このようなアッセイは、当分野で周知である。たとえばＥｒｉｃｋｓｏｎら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：４１８９−４１９９；Ｄｏｅら（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２３６９−２３７６を参照。それゆえ免疫応答は、本明細書で使用する場合、ＣＴＬの産生および／またはヘルパーＴ細胞の産生もしくは活性化を刺激する免疫応答であり得る。興味のある抗原は、抗体媒介性免疫応答も誘発し得る。ゆえに免疫応答は、たとえば、とりわけ以下の効果の１つ以上：たとえばＢ細胞による抗体の産生；ならびに／または、興味のある組成物またはワクチン中に存在する抗原に対して特異的に向けられたサプレッサーＴ細胞および／またはγδＴ細胞の活性化を含み得る。これらの応答は、たとえば感染力を中和して、および／または抗体−補体、または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介して、免疫化された宿主に保護を与える役割を果たし得る。このような応答は、当分野で周知である標準免疫学的検定および中和アッセイを使用して判定することができる。
【００９０】
本発明による組成物が、（たとえば抗原が可溶性タンパク質として投与される）異なる組成物中の等量の抗原によって誘発された免疫応答よりも、免疫応答を誘発する高い能力を有するときに、本発明による組成物は所与の抗原に対する「向上した免疫原性」を提示する。それゆえ組成物が、向上した免疫原性を提示し得るのは、たとえば組成物がより強い免疫応答を生成するため、または抗原が投与される被験体において免疫応答を達成するために必要な抗原の用量がより少ないかもしくはより低頻度であるためである。このように向上した免疫原性は、たとえば本発明の組成物および抗原対照を動物に投与して、２つのアッセイ結果を比較することによって判定することができる。
【００９１】
（１．免疫アジュバント）
上記のように、本発明の組成物中に１つ以上の免疫アジュバントが提供され得る。免疫アジュバントは、両親媒性ペプチドおよび脂質によって形成された粒子の脂質コアに固着され得るか（たとえば免疫アジュバントに共有結合的にまたは非共有結合的に結合されている親油性アンカーによって）、または免疫アジュバントは、そうでなければ、粒子と組み合され得る（たとえば抗原が固着されている粒子と混合されるなど）。
【００９２】
本発明で使用するための免疫アジュバントは、これに限定されるわけではないが、以下の１つ以上を含む。
【００９３】
（Ａ．無機物含有組成物）
アジュバントとしての使用に好適な無機物含有組成物は、無機塩、たとえばアルミニウム塩およびカルシウム塩を含む。本発明は、無機塩、たとえば水酸化物（たとえばオキシ水酸化物）、リン酸塩（たとえばヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩など（たとえばＶａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．ｅｄｓ．）（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）１９９５，Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ８および９を参照）、または各種の無機化合物の混合物（たとえば場合により過剰なリン酸塩を含む、リン酸塩および水酸化物アジュバントの混合物）を含み、化合物は任意の好適な形（たとえばゲル、結晶性、アモルファスなど）を取り、塩への吸着が好ましい。無機物含有組成物は、金属塩の粒子としても処方され得る（ＷＯ００／２３１０５）。
【００９４】
アルミニウム塩は、Ａｌ３＋の用量が、用量当り０．２〜１．０ｍｇであるように、本発明のワクチンに含まれ得る。
【００９５】
一実施形態において、本発明で使用するためのアルミニウムベースアジュバントは、ミョウバン（硫酸アルミニウムカリウム（ＡｌＫ（ＳＯ４）２））、またはミョウバン誘導体であり、リン酸緩衝液中で抗原をミョウバンと混合して、続いての水酸化アンモニウムまたは水酸化ナトリウムなどの塩基による滴定および沈殿によってインサイチューで形成されたようなものである。
【００９６】
本発明のワクチン処方物で使用するための別のアルミニウムベースアジュバントは、約５００ｍ２／ｇの表面積を有する優れた吸着剤である、水酸化アルミニウムアジュバント（Ａｌ（ＯＨ）３）または結晶性オキシ水酸化アルミニウム（ＡｌＯＯＨ）である。別の実施形態において、アルミニウムベースアジュバントは、水酸化アルミニウムアジュバントのヒドロキシル基のいくつかまたは全部の代わりにリン酸基を含有する、リン酸アルミニウムアジュバント（ＡｌＰＯ４）またはヒドロキシリン酸アルミニウムである。本明細書で提供する好ましいリン酸アルミニウムアジュバントは、アモルファスであり、酸性、塩基性および中性媒体中で可溶性である。
【００９７】
別の実施形態において、アジュバントは、リン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムの両方を含む。そのさらに詳細な実施形態において、アジュバントは、リン酸アルミニウムの水酸化アルミニウムに対する重量比が２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１または９：１超などの、水酸化アルミニウムよりも多い量のリン酸アルミニウムを有する。別の実施形態において、ワクチン中のアルミニウム塩は、ワクチン用量当り０．４〜１．０ｍｇ、またはワクチン用量当り０．４〜０．８ｍｇ、またはワクチン用量当り０．５〜０．７ｍｇ、またはワクチン用量当り約０．６ｍｇで存在する。
【００９８】
一般に、好ましいアルミニウムベースアジュバント、またはリン酸アルミニウム対水酸化アルミニウムなどの複数のアルミニウムベースアジュバントの比は、所望のｐＨにおいて抗原がアジュバントと反対の電荷を持つような、分子間の静電引力の最適化によって選択される。たとえばリン酸アルミニウムアジュバント（ｉｅｐ＝４）は、ｐＨ７．４にてリゾチームを吸着するが、アルブミンは吸着しない。アルブミンが標的であるならば、水酸化アルミニウムアジュバントが選択されるであろう（ｉｅｐ  １１．４）。代わりに、水酸化アルミニウムのリン酸塩による前処理によってその等電点が低下して、水酸化アルミニウムはより塩基性の抗原にとって好ましいアジュバントとなる。
【００９９】
（Ｂ．油性エマルジョン）
アジュバントとしての使用に好適な油性エマルジョン組成物および処方物（ムラミルペプチドまたは細菌細胞壁成分などの他の特異的免疫賦活剤を含むかまたは含まない）は、スクアレン−水エマルジョン、たとえばＭＦ５９（マイクロフルダイザを使用してサブミクロン粒子に処方された、５％スクアレン、０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、および０．５％  Ｓｐａｎ  ８５）を含む。ＷＯ９０／１４８３７を参照。Ｐｏｄｄａ（２００１）Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：２６７３−２６８０；Ｆｒｅｙら（２００３）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１：４２３４−４２３７も参照。ＭＦ５９は、ＦＬＵＡＤＴＭインフルエンザウイルス３価サブユニットワクチン中でアジュバントとして使用される。
【０１００】
組成物で使用するための特に好ましい油性エマルジョンアジュバントは、サブミクロン水中油型エマルジョンである。本明細書で使用するための好ましいサブミクロン水中油型エマルジョンは、様々な量のＭＴＰ−ＰＥを場合により含有するスクアレン／水エマルジョン、たとえば４〜５％ｗ／ｖスクアレン、０．２５〜１．０％ｗ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ８０ＴＭ（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）、および／または０．２５〜１．０％  Ｓｐａｎ８５ＴＭ（ソルビタントリオレアート）、および場合によりＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル（ｉｓｏｇｌｕａｔｍｉｎｙｌ）−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ（ｈｕｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｐｈｏｒｙｌｏｘｙ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を含有するサブミクロン水中油型エマルジョン、たとえば「ＭＦ５９」として公知のサブミクロン水中油型エマルジョンである（ＷＯ９０／１４８３７；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，２９９，８８４；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，４５１，３２５；およびＯｔｔら、“ＭＦ５９−−Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｓａｆｅ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ”ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．ｅｄｓ．）（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）１９９５，ｐｐ．２７７−２９６）。ＭＦ５９は、４〜５％ｗ／ｖスクアレン（たとえば４．３％）、０．２５〜０．５％ｗ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ８０ＴＭおよび０．５％ｗ／ｖ  Ｓｐａｎ  ８５ＴＭを含有し、各種の量のＭＴＰ−ＰＥを場合により含有し、Ｍｏｄｅｌ  １１０Ｙマイクロフルダイザ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）などのマイクロフルダイザを使用してサブミクロン粒子に処方される。たとえばＭＴＰ−ＰＥは、約０〜５００μｇ／用量、さらに好ましくは０〜２５０μｇ／用量および最も好ましくは０〜１００μｇ／用量の量で存在し得る。本明細書で使用する場合、「ＭＦ５９−０」という用語は、ＭＴＰ−ＰＥを含まない上のサブミクロン水中油型エマルジョンを指すのに対して、ＭＦ５９−ＭＴＰという用語はＭＴＰ−ＰＥを含有する処方物を示す。たとえば「ＭＦ５９−１００」は、用量当りＭＴＰ−ＰＥ１００μｇを含有するなどである。本明細書で使用するための別のサブミクロン水中油型エマルジョンであるＭＦ６９は、４．３％ｗ／ｖスクアレン、０．２５％ｗ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ８０ＴＭ、および０．７５％ｗ／ｖ  Ｓｐａｎ  ８５ＴＭならびに場合により  ＭＴＰ−ＰＥを含有する。また別のサブミクロン水中油型エマルジョンは、１０％スクアレン、０．４％  Ｔｗｅｅｎ  ８０ＴＭ、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有する、ＳＡＦとしても公知のＭＦ７５であり、またサブミクロンエマルジョンにマイクロフルダイズされる。ＭＦ７５−ＭＴＰは、用量当りＭＴＰ−ＰＥ１００〜４００μｇなどのＭＴＰを含む、ＭＦ７５処方物である。
【０１０１】
上記組成物で使用するための、サブミクロン水中油型エマルジョン、その作製方法および免疫賦活剤、たとえばムラミルペプチドは、ＷＯ９０／１４８３７；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，２９９，８８４；およびＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，４５１，３２５に詳細に記載されている。
【０１０２】
フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）も、本発明でアジュバントとして使用され得る。
【０１０３】
（Ｃ．サポニン処方物）
サポニン処方物も、本発明のアジュバントとしての使用に好適である。サポニンは、広範囲の植物種の樹皮、葉、茎、根およびさらに花に見出されるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種間のグループである。Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａモリナの木の樹皮から単離されたサポニンは、アジュバントとして幅広く研究されてきた。サポニンは、Ｓｍｉｌａｘ  ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ））、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライズベール）、およびＳａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（ソープルート）からも商業的に得ることができる。サポニンアジュバント処方物は、精製処方物、たとえばＱＳ２１、ならびに脂質処方物、たとえばＩＳＣＯＭを含む。サポニンアジュバント処方物は、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（登録商標）アジュバント（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を含む。
【０１０４】
サポニン組成物は高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰ−ＴＬＣ）および逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いて精製されてきた。これらの技術を利用して、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃを含む特定の精製画分が同定されている。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の産生方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，０５７，５４０に開示されている。サポニン処方物は、ステロール、たとえばコレステロールも含み得る（ＷＯ９６／３３７３９を参照）。
【０１０５】
サポニンおよびコレステロールの組合せを使用して、免疫賦活複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる独自の粒子を形成することができる。ＩＳＣＯＭは通例、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスホファチジルコリンなどのリン脂質も含む。ＩＳＣＯＭには、いずれの公知のサポニンも使用できる。ＩＳＣＯＭは好ましくは、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＱＨＡおよびＱＨＣの１つ以上を含む。ＩＳＣＯＭは、ＥＰ  ０  １０９  ９４２、ＷＯ９６／１１７１１およびＷＯ９６／３３７３９にさらに記載されている。場合により、ＩＳＣＯＭは追加の洗浄剤を含まなくてもよい。ＷＯ００／０７６２１を参照。
【０１０６】
サポニンベースのアジュバントの開発についての総説は、Ｂａｒｒら、（１９９８）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．３２：２４７−２７１に見出すことができる。Ｓｊｏｌａｎｄｅｒら（１９９８）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．３２：３２１−３３８も参照。
【０１０７】
（Ｄ．ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ））
ビロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ）およびウイルス様粒子（ＶＬＰ）もアジュバントとして好適である。これらの構造は一般に、場合によりリン脂質と共に併用または処方される、ウイルスに由来する１つ以上のタンパク質を含有する。これらは一般に非病原性、非複製性であり、一般にいずれの天然（ｎａｔｉｖｅ）ウイルスゲノムも含有しない。ウイルスタンパク質は、組み換え産生され得るか、またはウイルス全体から単離され得る。ビロソームまたはＶＬＰでの使用に好適なこれらのウイルスタンパク質は、インフルエンザウイルス（たとえばＨＡまたはＮＡ）、Ｂ型肝炎ウイルス（たとえばコアまたはカプシドタンパク質）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡファージ、Ｑβファージ（たとえばコートタンパク質）、ＧＡファージ、ｆｒファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（たとえばレトロトランスポソンＴｙタンパク質ｐ１）に由来するタンパク質を含む。ＶＬＰは、ＷＯ０３／０２４４８０；ＷＯ０３／０２４４８１；Ｎｉｉｋｕｒａら（２００２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２９３：２７３−２８０；Ｌｅｎｚら（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６（９）：５３４６−５３５５；Ｐｉｎｔｏら（２００３）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８８：３２７−３３８；およびＧｅｒｂｅｒら（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（１０）：４７５２−４７６０でさらに議論されている。ビロソームは、たとえばＧｌｕｃｋら（２００２）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：Ｂ１０−Ｂ１６でさらに議論されている。免疫増強再構成インフルエンザビロソーム（ＩＲＩＶ）は、鼻内３価ＩＮＦＬＥＸＡＬＴＭ生成物（Ｍｉｓｃｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｔｃａｌｆｅ（２００２）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０  Ｓｕｐｐｌ  ５：Ｂ１７−Ｂ２３）およびＩＮＦＬＵＶＡＣ  ＰＬＵＳＴＭ生成物でサブユニット抗原送達系として使用されている。
【０１０８】
（Ｅ．細菌または微生物誘導体）
本発明での使用に好適なアジュバントは、以下のような細菌または微生物誘導体を含む。
【０１０９】
（１）腸内細菌リポ多糖（ＬＰＳ）の非毒性誘導体：このような誘導体は、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）を含む。３ｄＭＰＬは、３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡと４、５または６アシル化鎖との混合物である。３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい「小型粒子」形は、ＥＰ  ０  ６８９  ４５４に開示されている。３ｄＭＰＬのこのような「小型粒子」は、０．２２ミクロン膜を通じて滅菌濾過されるのに十分な小ささである（ＥＰ  ０  ６８９  ４５４を参照）。他の非毒性ＬＰＳ誘導体は、モノホスホリルリピドＡ模倣体、たとえばアミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体、たとえばＲＣ−５２９を含む。Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９９）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．９：２２７３−２２７８を参照。
【０１１０】
（２）脂質Ａ誘導体：脂質Ａ誘導体は、ＯＭ−１７４などのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからの脂質Ａの誘導体を含む。ＯＭ−１７４はたとえば、Ｍｅｒａｌｄｉら（２００３）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１：２４８５−２４９１；およびＰａｊａｋら（２００３）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１：８３６−８４２に記載されている。
【０１１１】
別の例示的なアジュバントは、グラム陰性細菌に由来する天然脂質Ａの多くの物理化学的および生物学的特性を模倣する、合成リン脂質２量体Ｅ６０２０（Ｅｉｓａｉ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．，東京、日本）である。
【０１１２】
（３）免疫賦活性オリゴヌクレオチド：本発明におけるアジュバントとしての使用に好適な免疫賦活性オリゴヌクレオチドまたはポリマー分子は、ＣｐＧモチーフを含有するヌクレオチド配列（非メチル化シトシンと続いてのグアノシンを含有して、リン酸結合によって連結された配列）を含む。パリンドロームまたはポリ（ｄＧ）配列を含有する細菌２本鎖ＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドも、免疫賦活性であることが示されている。ＣｐＧは、ホスホロチオエート修飾などのヌクレオチド修飾／ヌクレオチド類似体を含むことができ、２本鎖または１本鎖であることが可能である。場合により、グアノシンは、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンなどの類似体によって置き換えられ得る。考えられる類似体置換の例については、Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら（２００３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（９）：２３９３−２４００；ＷＯ０２／２６７５７；およびＷＯ９９／６２９２３を参照。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、Ｋｒｉｅｇ（２００３）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９（７）：８３１−８３５；ＭｃＣｌｕｓｋｉｅら（２００２）ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：１７９−１８５；ＷＯ９８／４０１００；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，２０７，６４６；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，２３９，１１６；およびＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，４２９，１９９でさらに議論されている。
【０１１３】
ＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９、たとえばモチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴに向けられ得る。Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３１（ｐａｒｔ  ３）：６５４−６５８を参照。ＣｐＧ配列は、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮのようにＴｈ１免疫応答の誘導に特異的であり得るか、ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮのようにＢ細胞応答の誘導により特異的であり得る。ＣｐＧ−ＡおよびＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌら（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０（８）：４０６１−４０６８；Ｋｒｉｅｇ（２００２）ＴＲＥＮＤＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３（２）：６４−６５；およびＷＯ０１／９５９３５で議論されている。好ましくは、ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮである。
【０１１４】
好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、受容体認識のために５’末端がアクセスできるように構築される。場合により、２個のＣｐＧオリゴヌクレオチド配列がその３’末端で結合されて「イムノマー」が形成され得る。たとえばＫａｎｄｉｍａｌｌａら（２００３）ＢＢＲＣ  ３０６：９４８−９５３；Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３１（ｐａｒｔ  ３）：６６４−６５８；Ｂｈａｇａｔら（２００３）ＢＢＲＣ  ３００：８５３−８６１；およびＷＯ０３／０３５８３６を参照。
【０１１５】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびポリマー分子は、これに限定されるわけではないが、ポリビニル主鎖（Ｐｉｔｈａら（１９７０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ２０４（１）：３９−４８；Ｐｉｔｈａら（１９７０）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ９（８）：９６５−９７７）、およびモルホリノ主鎖（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，１４２，０４７；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，１８５，４４４）などの代わりのポリマー主鎖構造も含む。多様な他の荷電および非荷電ポリヌクレオチド類似体が当分野で公知である。これに限定されるわけではないが、非荷電結合（たとえばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート）および荷電結合（たとえばホスホロチオエートおよびホスホロジチオエート）を含む、多くの主鎖修飾が当分野で公知である。
【０１１６】
アジュバント  ＩＣ３１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌ  ＡＧ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）は、抗菌ペプチドＫＬＫ、および免疫賦活性オリゴヌクレオチドＯＤＮ１ａを含有する合成処方物である。２成分溶液は抗原（たとえば抗原が結合された、本発明による粒子）と単純に混合され得て、コンジュゲーションは必要ない。
【０１１７】
（４）ＡＤＰリボシル化毒素およびその無毒化誘導体：細菌ＡＤＰリボシル化毒素およびその無毒化誘導体は、本発明でアジュバントとして使用され得る。好ましくは、タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ（すなわちＥ．ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）、または百日咳（「ＰＴ」）に由来する。無毒化ＡＤＰリボシル化毒素の、粘膜アジュバントとしての使用はＷＯ９５／１７２１１に、非経口アジュバントとしての使用はＷＯ９８／４２３７５に記載されている。好ましくは、アジュバントは、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴＲ１９２Ｇなどの無毒化ＬＴ変異体である。ＡＤＰリボシル化毒素およびその無毒化誘導体、特にＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２のアジュバントとしての使用は、以下の参考文献に見出すことができる：Ｂｅｉｇｎｏｎら（２００２）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７０（６）：３０１２−３０１９；Ｐｉｚｚａら（２００１）Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：２５３４−２５４１；Ｐｉｚｚａら（２０００）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９０（４−５）：４５５−４６１；Ｓｃｈａｒｔｏｎ−Ｋｅｒｓｔｅｎら（２０００）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８（９）：５３０６−５３１３；Ｒｙａｎら（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７（１２）：６２７０−６２８０；Ｐａｒｔｉｄｏｓら（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．６７（３）：２０９−２１６；Ｐｅｐｐｏｌｏｎｉら（２００３）Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ２（２）：２８５−２９３；およびＰｉｎｅら（２００２）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ８５（１−３）：２６３−２７０。アミノ酸置換の数値基準は好ましくは、Ｄｏｍｅｎｉｇｈｉｎｉら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５（６）：１１６５−１１６７に示されているＡＤＰリボシル化毒素のＡおよびＢサブユニットの配列比較に基づく。
【０１１８】
（Ｆ．生体接着剤および粘膜接着剤）
生体接着剤および粘膜接着剤もアジュバントとして使用され得る。好適な生体接着剤は、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア（Ｓｉｎｇｈら（２００１）Ｊ．Ｃｏｎｔ．Ｒｅｌｅａｓｅ  ７０：２６７−２７６）またはポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体などの粘膜接着剤を含む。キトサンおよびその誘導体も、本発明でアジュバントとして使用され得る（ＷＯ９９／２７９６０を参照）。
【０１１９】
（Ｇ．リポソーム）
アジュバントとしての使用に好適なリポソーム処方物の例は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，０９０，４０６；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，９１６，５８８；およびＥＰ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＥＰ  ０  ６２６  １６９に記載されている。
【０１２０】
（Ｈ．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル処方物）
本発明での使用に好適なアジュバントは、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルを含む（たとえばＷＯ９９／５２５４９を参照）。このような処方物は、オクトキシノールと組み合せたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１２０７）ならびにオクトキシノールなどの少なくとも１つの追加の非イオン性界面活性剤と組み合せたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１１５２）をさらに含む。
【０１２１】
好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の基：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステアリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン（ｔｈｅｙｌｅｎｅ）−８−ステアリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテルから選択される。
【０１２２】
（Ｉ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ））
アジュバントとしての使用に好適なＰＣＰＰ処方物はたとえば、Ａｎｄｒｉａｎｏｖら（１９９８）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １９（１−３）：１０９−１１５；およびＰａｙｎｅら（１９９８）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．３１（３）：１８５−１９６に記載されている。
【０１２３】
（Ｊ．ムラミルペプチド）
アジュバントとしての使用に好適なムラミルペプチドの例は、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−１−アラニル−ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−１−アラニル−ｄ−イソグルタミニル−１−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）を含む。
【０１２４】
（Ｋ．イミダゾキノリン化合物）
アジュバントとしての使用に好適なイミダゾキノリン化合物の例は、イミキモドおよびその類似体を含み、これはＳｔａｎｌｅｙ（２００２）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２７（７）：５７１−５７７；Ｊｏｎｅｓ（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ  ４（２）：２１４−２１８；およびＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．４，６８９，３３８；５，３８９，６４０；５，２６８，３７６；４，９２９，６２４；５，２６６，５７５；５，３５２，７８４；５，４９４，９１６；５，４８２，９３６；５，３４６，９０５；５，３９５，９３７；５，２３８，９４４；および５，５２５，６１２にさらに記載されている。
【０１２５】
本発明の実施のための好ましいイミダゾキノリンは、イミキモド、レシキモド、および      
【０１２６】
【化２】
0005781929.tif 000004
を含み、その後者は本明細書で「イミダゾキノリン０９０」とも呼ばれる。たとえばＶａｌｉａｎｔｅらへのＩｎｔ．Ｐｕｂ．Ｎｏｓ．ＷＯ２００６／０３１８７８およびＳｕｔｔｏｎらへのＷＯ２００７／１０９８１０を参照。このような化合物は、ＴＬＲ７作動薬であることが公知である。
【０１２７】
（ｌ．チオセミカルバゾン化合物）
アジュバントとしての使用に好適なチオセミカルバゾン化合物の例、ならびにこのような化合物の処方、製造、およびスクリーニングの方法は、ＷＯ０４／６０３０８に記載されているものを含む。チオセミカルバゾンは、サイトカイン、たとえばＴＮＦ−αの産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激で特に有効である。
【０１２８】
（ｍ．トリプタンスリン化合物）
アジュバントとしての使用に好適なトリプタンスリン化合物の例、ならびにこのような化合物の処方、製造、およびスクリーニングの方法は、ＷＯ０４／６４７５９に記載されているものを含む。トリプタンスリン化合物は、サイトカイン、たとえばＴＮＦ−αの産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激で特に有効である。
【０１２９】
（ｎ．ヒト免疫調節因子）
アジュバントとしての使用に好適なヒト免疫調節因子は、サイトカイン、たとえばインターロイキン（たとえばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（たとえばインターフェロンγ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む。
【０１３０】
（ｏ．リポペプチド）
リポペプチド（すなわち１個以上の脂肪酸残基および２個以上のアミノ酸残基を含む化合物）は、免疫賦活性特徴を有することも公知である。グリセリルシステインに基づくリポペプチドは、アジュバントとしての使用に特に好適である。このようなペプチドの具体的な例は、以下の式の化合物：
【０１３１】
【化３】
0005781929.tif 000005
を含み、式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、酸素官能基によって場合により置換された８〜３０個の、好ましくは１１〜２１個の炭素原子を有する、飽和または不飽和、脂肪族または混合脂肪族脂環式炭化水素ラジカルを表し、Ｒ３は、水素またはＲ１が上と同じ意味を有するラジカルＲ１−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ２−を表し、Ｘは、ペプチド結合によって結合され、遊離、エステル化もしくはアミド化カルボキシ基を有するアミノ酸、または末端カルボキシ基が遊離、エステル化もしくはアミド化形である２〜１０個のアミノ酸のアミノ酸配列を表す。ある実施形態において、アミノ酸配列はＤ−アミノ酸、たとえばＤ−グルタミン酸（Ｄ−Ｇｌｕ）またはＤ−ガンマ−カルボキシ−グルタミン酸（Ｄ−Ｇｌａ）を含む。
【０１３２】
細菌リポペプチドは一般に、ＴＬＲ６の関与を必要とせずに、ＴＬＲ２を認識する。（ＴＬＲは協同的に機能して各種のトリガーの特異的認識を提供し、ＴＬＲ２はＴＬＲ６と共にペプチドグリカンを認識するが、ＴＬＲ２はＴＬＲ６なしでリポペプチドを認識する。）これらは時々、天然リポペプチドおよび合成リポペプチドとして分類される。合成リポペプチドは、同様に挙動する傾向があり、主にＴＬＲ２によって認識される。
【０１３３】
アジュバントとしての使用に好適なリポペプチドは、式Ｉの化合物：
【０１３４】
【化４】
0005781929.tif 000006
（式中、＊で示したキラル中心および＊＊＊で示したキラル中心はどちらもＲ立体配置にあり；
＊＊で示したキラル中心は、ＲまたはＳ立体配置のどちらかにあり；
各Ｒ１ａおよびＲ１ｂは独立して、酸素官能基によって場合により置換された７〜２１個の炭素原子を有する脂肪族または脂環式脂肪族炭化水素基であるか、またはＲ１ａおよびＲ１ｂの両方ではなく一方がＨであり；
Ｒ２は、１〜２１個の炭素原子を有し、酸素官能基によって場合により置換された、脂肪族または脂環式炭化水素基であり；
ｎは、０または１であり；
Ａｓは、−Ｏ−Ｋｗ−ＣＯ−または−ＮＨ−Ｋｗ−ＣＯ−のどちらかを表し、ここでＫｗは、１〜１２個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基であり；
Ａｓ１は、Ｄ−またはＬ−アルファ−アミノ酸であり；
Ｚ１およびＺ２はそれぞれ独立して、−ＯＨまたはアミノ−（低級アルカン）−スルホン酸のＤ−もしくはＬ−アルファアミノ酸の、もしくはＤ−およびＬ−アルファアミノカルボン酸ならびにアミノ−低級アルキル−スルホン酸から選択される６個までのアミノ酸を有するペプチドの、Ｎ端ラジカルを表し；ならびに
Ｚ３は、Ｈまたは−ＣＯ−Ｚ４であり、Ｚ４は、−ＯＨまたはアミノ−（低級アルカン）−スルホン酸のＤ−もしくはＬ−アルファアミノ酸の、もしくはＤおよびＬ−アルファアミノカルボン酸ならびにアミノ−低級アルキル−スルホン酸から選択される６個までのアミノ酸を有するペプチドの、Ｎ端ラジカルである）
またはこのような化合物のカルボン酸から形成されたエステルもしくはアミドを含む。好適なアミドは、−ＮＨ２およびＮＨ（低級アルキル）を含み、好適なエステルは、Ｃ１−Ｃ４アルキルエステルを含む（低級アルキルまたは低級アルカンは、本明細書で使用する場合、Ｃ１−Ｃ６直鎖または分枝アルキルを指す）。
【０１３５】
このような化合物は、ＵＳ  ４，６６６，８８６でさらに詳細に記載されている。好ましい一実施形態において、リポペプチドは、以下の式：
【０１３６】
【化５】
0005781929.tif 000007
のリポペプチドである。
【０１３７】
リポペプチド種の別の例はＬＰ４０と呼ばれ、ＴＬＲ２の作用物質である。Ａｋｄｉｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３３：２７１７−２６（２００３）。
【０１３８】
これらはＥ．ｃｏｌｉによるリポペプチドの公知のクラスに関連しており、ムレインリポタンパク質と呼ばれる。ムレインリポペプチドと呼ばれるこれらのタンパク質のある部分分解生成物は、Ｈａｎｔｋｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３４：２８４−２９６（１９７３）に記載されている。これらはＮ−アセチルムラミン酸に連結されたペプチドを含み、それゆえ、Ｂａｓｃｈａｎｇら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４５（２０）：６３３１−６３６０（１９８９）に記載されているムラミルペプチドに関連している。
【０１３９】
（ｐ．ベンゾナフチリジン）
アジュバントとしての使用のために好適なベンゾナフチリジン化合物の例は、式（Ｉ）の構造を有する化合物、ならびにその製薬的に許容される塩、溶媒和物、Ｎ−オキシド、プロドラッグおよび異性体を含み：
【０１４０】
【化６】
0005781929.tif 000008
式中：
Ｒ３は、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケン、Ｃ２−Ｃ８アルキン、Ｃ１−Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、およびＣ３−Ｃ８ヘテロシクロアルキルであり、Ｒ３のＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシ、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、またはＣ３−Ｃ８ヘテロシクロアルキル基はそれぞれ、ハロゲン、−ＣＮ、−Ｒ７、−ＯＲ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ８、−Ｎ（Ｒ９）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ９）２および−ＮＲ９Ｓ（Ｏ）２Ｒ８から独立して選択される１〜３個の置換基によって場合により置換され；
Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ７、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１１Ｒ１２）、−Ｎ（Ｒ１１Ｒ１２）、−Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＨＮ（Ｒ９）２、−ＳＲ７、−（ＣＨ２）ｎＯＲ７、−（ＣＨ２）ｎＲ７、−ＬＲ８、−ＬＲ１０、−ＯＬＲ８、−ＯＬＲ１０、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケン、Ｃ２−Ｃ８アルキン、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、およびＣ３−Ｃ８ヘテロシクロアルキルから選択され、Ｒ４およびＲ５のＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケン、Ｃ２−Ｃ８アルキン、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、およびＣ３−Ｃ８ヘテロシクロアルキル基はそれぞれ、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｒ７、−ＯＲ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ８、−Ｎ（Ｒ９）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１０）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ１０）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ９）２、および−ＮＲ９Ｓ（Ｏ）２Ｒ８から独立して選択される１〜３個の置換基によって場合により置換され；
またはＲ３およびＲ４、もしくはＲ４およびＲ５は、隣接する環原子上にあるとき、場合により共に連結されて、Ｒ７によって場合により置換される５〜６員環を形成することが可能であり；
各Ｌは独立して、結合、−（Ｏ（ＣＨ２）ｍ）ｔ−、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニレンおよびＣ２−Ｃ６アルキニレンから選択され、ＬのＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニレンおよびＣ２−Ｃ６アルキニレンは、ハロゲン、−Ｒ８、−ＯＲ８、−Ｎ（Ｒ９）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１０）２、および−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ１０）２から独立して選択される１〜４個の置換基によってそれぞれ場合により置換され；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケン、Ｃ２−Ｃ８アルキン、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシ、およびＣ３−Ｃ８ヘテロシクロアルキルから選択され、Ｒ７のＣ１−Ｃ６アルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ１−Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケン、Ｃ２−Ｃ８アルキン、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシ、およびＣ３−Ｃ８ヘテロシクロアルキル基は、１〜３個のＲ１３基によってそれぞれ場合により置換され；
各Ｒ８は独立して、Ｈ、−ＣＨ（Ｒ１０）２、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケン、Ｃ２−Ｃ８アルキン、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ２−Ｃ８ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ６ヒドロキシアルキルおよびＣ１−Ｃ６ハロアルコキシから選択され、Ｒ８のＣ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケン、Ｃ２−Ｃ８アルキン、Ｃ１−Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ２−Ｃ８ヘテロシクロアルキル、Ｃ１−Ｃ６ヒドロキシアルキルおよびＣ１−Ｃ６ハロアルコキシ基は、−ＣＮ、Ｒ１１、−ＯＲ１１、−ＳＲ１１、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１１、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ１１、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１１、−ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒ１１、−ＮＲ９Ｒ１０、−ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｎ（Ｒ９）２、−ＯＲ９、−ＯＲ１０、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１１、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１１Ｒ１２、−ＮＲ１１Ｓ（Ｏ）２Ｒ１１、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１１）２、および−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ１１）２から独立して選択される１〜３個の置換基によってそれぞれ場合により置換され；
各Ｒ９は独立して、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１０、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１０、−Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６ヘテロアルキルおよびＣ３−Ｃ６シクロアルキルから選択され、または各Ｒ９は独立して、結合されたＮと共にＣ３−Ｃ８ヘテロシクロアルキルを形成するＣ１−Ｃ６アルキルであり、Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロアルキル環は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される追加のヘテロ原子を場合により含有し、Ｒ９のＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、またはＣ３−Ｃ８ヘテロシクロアルキル基は、−ＣＮ、Ｒ１１、−ＯＲ１１、−ＳＲ１１、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１１、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ１１、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１１、−ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１Ｒ１２、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１ＯＨ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ１１、−Ｓ（Ｏ）Ｒ１１、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１１Ｒ１２、−ＮＲ１１Ｓ（Ｏ）２Ｒ１１、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１１）２、および−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ１１）２から独立して選択される１〜３個の置換基によってそれぞれ場合により置換され；
各Ｒ１０は独立して、アリール、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロアルキルおよびヘテロアリールから選択され、アリール、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロアルキルおよびヘテロアリール基は、ハロゲン、−Ｒ８、−ＯＲ８、−ＬＲ９、−ＬＯＲ９、−Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＮＲ９ＣＯ２Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８および−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２から選択される１〜３個の置換基によって場合により置換され；
Ｒ１１およびＲ１２は独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、およびＣ３−Ｃ８ヘテロシクロアルキルから選択され、Ｒ１１およびＲ１２のＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル、およびＣ３−Ｃ８ヘテロシクロアルキル基は、ハロゲン、−ＣＮ、Ｒ８、−ＯＲ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ８、−Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ８Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＮＲ８Ｃ（Ｏ）ＯＲ８、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロアルキル、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルおよびＣ１−Ｃ６ハロアルコキシから独立して選択される１〜３個の置換基によってそれぞれ場合により置換され；
またはＲ１１およびＲ１２はそれぞれ独立してＣ１−Ｃ６アルキルであり、結合されているＮ原子とひとまとめにされて、Ｎ、ＯおよびＳから選択される追加のヘテロ原子を場合により含有する、場合により置換されたＣ３−Ｃ８ヘテロシクロアルキル環を形成し；
各Ｒ１３は独立して、ハロゲン、−ＣＮ、−ＬＲ９、−ＬＯＲ９、−ＯＬＲ９、−ＬＲ１０、−ＬＯＲ１０、−ＯＬＲ１０、−ＬＲ８、−ＬＯＲ８、−ＯＬＲ８、−ＬＳＲ８、−ＬＳＲ１０、−ＬＣ（Ｏ）Ｒ８、−ＯＬＣ（Ｏ）Ｒ８、−ＬＣ（Ｏ）ＯＲ８、−ＬＣ（Ｏ）Ｒ１０、−ＬＯＣ（Ｏ）ＯＲ８、−ＬＣ（Ｏ）ＮＲ９Ｒ１１、−ＬＣ（Ｏ）ＮＲ９Ｒ８、−ＬＮ（Ｒ９）２、−ＬＮＲ９Ｒ８、−ＬＮＲ９Ｒ１０、−Ｌ＝ＮＯＨ、−ＬＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−ＬＳ（Ｏ）２Ｒ８、−ＬＳ（Ｏ）Ｒ８、−ＬＣ（Ｏ）ＮＲ８ＯＨ、−ＬＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＬＮＲ９Ｃ（Ｏ）ＯＲ８、−ＬＳ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ９）２、−ＯＬＳ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ９）２、−ＬＮＲ９Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−ＬＣ（Ｏ）ＮＲ９ＬＮ（Ｒ９）２、−ＬＰ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−ＬＯＰ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−ＬＰ（Ｏ）（ＯＲ１０）２および−ＯＬＰ（Ｏ）（ＯＲ１０）２から選択され；
環Ａは、アリールまたはヘテロアリールであり、環Ａのアリールおよびヘテロアリール基は、１〜３個のＲＡ基によって場合により置換され、各ＲＡは独立して、ハロゲン、−Ｒ８、−Ｒ７、−ＯＲ７、−ＯＲ８、−Ｒ１０、−ＯＲ１０、−ＳＲ８、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＮＲ９Ｃ（Ｓ）Ｒ８、−ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９ＣＯ２Ｒ８、−ＮＲ９ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＮＲ９ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９ＮＲ９ＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−ＣＯ２Ｒ８、−（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（Ｓ）Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ９）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ９）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＯＲ８）Ｒ８、−Ｃ（ＮＯＲ８）Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）３Ｒ８、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ９）２、−Ｓ（Ｏ）Ｒ８、−ＮＲ９ＳＯ２Ｎ（Ｒ９）２、−ＮＲ９ＳＯ２Ｒ８、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ８）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１０）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ１０）２、−Ｎ（ＯＲ８）Ｒ８、−ＣＨ＝ＣＨＣＯ２Ｒ８、−Ｃ（＝ＮＨ）−Ｎ（Ｒ９）２、および−（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８から選択され；または環Ａの２個の隣接するＲＡ置換基は、環員として２個までのヘテロ原子を含有する５〜６員環を形成し；
ｎは、各出現時に独立して、０、１、２、３、４、５、６、７または８であり；
各ｍは独立して、１、２、３、４、５および６から選択され、ならびに
ｔは、１、２、３、４、５、６、７または８である。
【０１４１】
式（Ｉ）の化合物のある実施形態において、環Ａは、場合により置換されたＣ１−Ｃ４アルキルまたはＣ１−Ｃ４アルコキシを有する同じ置換基によって置換することができる、フェニル、ピリジル、またはピリミジニルなどの芳香環であり、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のそれぞれは、Ｈ、ハロ、または場合により置換されたＣ１−Ｃ４アルキルもしくは場合により置換されたＣ１−Ｃ４アルコキシ基を独立して表す。ある実施形態において、Ｒ３およびＲ５はそれぞれＨを表す。
【０１４２】
これらの化合物において、Ｒ４は通例、場合により置換されたＣ１−Ｃ４アルキルであり、いくつかの実施形態において、Ｒ４は、場合により置換されたフェニル環またはヘテロアリール環（たとえばピリジン、ピリミジン、インドール、チオフェン、フラン、オキサゾール、イソオキサゾール、ベンゾオキサゾール、ベンゾイミダゾールなど）によって置換されたＣ１−Ｃ４アルキルである。これらの実施形態のいくつかにおいて、Ｒ５はＨである。場合により置換されたフェニルまたはヘテロアリール（ｈｅｒｅｏａｒｙｌ）環は、Ｍｅ、ＣＮ、ＣＦ３、ハロ、ＯＭｅ、ＮＨ２、ＮＨＭｅ、ＮＭｅ２、および場合により置換されたＣ１−Ｃ４アルキルまたはＣ１−Ｃ４アルコキシから選択される３個までの置換基を有することができ、式（Ｉ）の場合により置換されたＣ１−Ｃ４アルキルまたはＣ１−Ｃ４アルコキシ基の置換基は、ハロ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、ＣＯＯＨ、−ＰＯ３Ｈ２、−ＯＰＯ３Ｈ２、ＮＨ２、ＮＭｅ２、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、アリール（好ましくはフェニルまたは置換フェニル）、Ｃ５−Ｃ６ヘテロシクリル（たとえばピペリジン、モルホリン、チオモルホリン、ピロリジン）から選択される；およびこれらの化合物の製薬的に許容される塩。
【０１４３】
アジュバントとしての使用のために好適なベンゾナフチリジン化合物の他の例は、式（ＩＩ）の化合物を含み：
【０１４４】
【化７】
0005781929.tif 000009
式中、各ＲＡは独立して、ハロ、ＣＮ、ＮＨ２、ＮＨＭｅ、ＮＭｅ２、または場合により置換されたＣ１−Ｃ４アルキルもしくは場合により置換されたＣ１−Ｃ４アルコキシであり；Ｘ４は、ＣＨまたはＮであり；
ならびにＲ４およびＲ５は、Ｈまたは場合により置換されたアルキル基もしくは場合により置換されたアルコキシ基を独立して表す。
【０１４５】
好ましくは、式（ＩＩ）の化合物には、０〜１個のＲＡ置換基が存在する。
【０１４６】
これらの化合物において、Ｒ４は通例、場合により置換されたＣ１−Ｃ４アルキルであり、いくつかの実施形態において、Ｒ４は、場合により置換されたフェニル環またはヘテロアリール環（たとえばピリジン、ピリミジン、インドール、チオフェン、フラン、オキサゾール、イソオキサゾール、ベンゾオキサゾール、ベンゾイミダゾールなど）によって置換されたＣ１−Ｃ４アルキルである。これらの実施形態のいくつかにおいて、Ｒ５はＨである。場合により置換されたフェニルまたはヘテロアリール（ｈｅｒｅｏａｒｙｌ）環は、Ｍｅ、ＣＮ、ＣＦ３、ハロ、ＯＭｅ、ＮＨ２、ＮＨＭｅ、ＮＭｅ２、および場合により置換されたＣ１−Ｃ４アルキルまたはＣ１−Ｃ４アルコキシから選択される３個までの置換基を有することができ、式（Ｘ）の場合により置換されたＣ１−Ｃ４アルキルまたはＣ１−Ｃ４アルコキシ基の置換基は、ハロ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、ＣＯＯＨ、−ＰＯ３Ｈ２、−ＯＰＯ３Ｈ２、ＮＨ２、ＮＭｅ２、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、アリール（好ましくはフェニルまたは置換フェニル）、Ｃ５−Ｃ６ヘテロシクリル（たとえばピペリジン、モルホリン、チオモルホリン、ピロリジン）から選択される；ならびにこれらの化合物の製薬的に許容される塩。
【０１４７】
アジュバントとしての使用のために好適なベンゾナフチリジン化合物の追加の例は：
【０１４８】
【化８】
0005781929.tif 000010
【０１４９】
【化９】
0005781929.tif 000011
を含む。
【０１５０】
アジュバントとしての使用のために好適なベンゾナフチリジン化合物の他の例、ならびに処方および製造の方法は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ２００９／３５５６３に記載されたものを含む。
【０１５１】
本発明は、上で明示したアジュバントの１つ以上の態様の組み合せも含み得る。たとえば、以下のアジュバント組成物が本発明で使用され得る：
（１）サポニンおよび水中油型エマルジョン（ＷＯ９９／１１２４１）；
（２）サポニン（たとえばＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（たとえば３ｄＭＰＬ）（ＷＯ９４／００１５３を参照）；
（３）サポニン（たとえばＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（たとえば３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；
（４）サポニン（たとえばＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（場合により＋ステロール）（ＷＯ９８／５７６５９）；
（５）３ｄＭＰＬと、たとえばＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンとの組み合せ（ＥＰ  ０  ８３５  ３１８；ＥＰ  ０  ７３５  ８９８；ＥＰ  ０  ７６１  ２３１を参照）；
（６）サブミクロンエマルジョンにするためのマイクロフルダイザ処理、またはより大きい粒子サイズのエマルジョンを生成するためのボルテックス処理のどちらかが行われた、１０％スクアラン、０．４％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ；
（７）２％スクアレン、０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、ならびにモノホスホリルリピド（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ）Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）から成る群からの１つ以上の細菌細胞壁成分を含有する、ＲｉｂｉＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）；
（８）１つ以上の無機塩（たとえばアルミニウム塩）＋ＬＰＳの非毒性誘導体（たとえば３ｄＰＭＬ）；
（９）１つ以上の無機塩（たとえばアルミニウム塩）＋免疫賦活性オリゴヌクレオチド（たとえばＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列）。
【０１５２】
（２．抗原）
上記のように、本明細書で提供される免疫原性組成物中に１つ以上の抗原が提供され得る。抗原は、両親媒性ペプチドおよび脂質によって形成された粒子の脂質コアに固着され得るか（たとえば抗原に共有結合的にまたは非共有結合的に結合されている親油性アンカーによって）、または抗原は、そうでなければ、粒子と組み合され得る（たとえば免疫アジュバントが固着されている粒子と混合されるなど）。親油性ペプチドアンカーは普通、とりわけグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびプロリンの残基などの疎水性アミノ酸残基が豊富である。
【０１５３】
ある実施形態において、天然形で少なくとも部分的に親油性である抗原が選択される（たとえば膜貫通タンパク質）。このような抗原の例は、膜固着領域がなお存在する抗原、または所定の位置にある上記領域を伴なって発現することができる抗原を含む。
【０１５４】
具体的な例は、多くの中でも、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）、ＲＳウイルス抗原（ＲＳＶ）ＦおよびＧタンパク質抗原、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質、コロナウイルスＳ、パラインフルエンザウイルスＦ、麻疹Ｆ、ムンプスＦ、麻疹Ｈ、ヒトメタニューモウイルスＦ、パラインフルエンザウイルスＨＮ、インフルエンザＮＡ、Ｃ型肝炎ウイルスＥ１およびＥ２、フラビウイルス（デング熱ウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルスなどを含む）Ｍ、ｐｒＭ、およびＥ、狂犬病ウイルスＧ、フィロウイルス（エボラおよびマルブルクウイルス）ＧＰ、単純疱疹ウイルスｇＢおよびｇＤ、ならびにヒトサイトメガロウイルスｇＢ、ｇＨ、ｇＬおよびｇＯを含む。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、抗原は切断されて、抗原がより疎水性となるか、またはタンパク質の疎水性部分が露出されるようになる。このような種は、本発明の両親媒性ペプチドおよび脂質によって形成された粒子の存在下で切断することができる。たとえば、下の実施例１３では、トリプシン切断を受けやすいＲＳＶ  Ｆ抗原変異が生成され、これは、融合ペプチドが露出された切断型抗原を生じる。理論に束縛されることを望むものではないが、疎水性融合ペプチドの露出によって、本発明の粒子の脂質コアへの固着の増強が生じると考えられる。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、タンパク質は、両親媒性ペプチドおよび脂質によって形成された粒子の存在下で合成される。たとえば下の実施例１５および１６において、Ｍ２ｅ−ＴＭ（モデルインフルエンザタンパク質）およびバクテリオロドプシンは、無細胞タンパク質発現キットを使用して粒子の存在下で形成される。これはたとえば、そうでなければ不溶性凝集体が形成され得る、疎水性または両親媒性免疫原性タンパク質が使用される場合に好都合であり得る。理論に束縛されることを望むものではないが、タンパク質は翻訳および発現されるときに粒子に取り込まれて、それにより不溶性凝集体の形成が防止されると考えられる。
【０１５７】
本明細書の免疫原性組成物と共に使用するための抗原は、これに限定されるわけではないが、下に示す以下の抗原の１つ以上、または下に示す病原体の１つ以上に由来する抗原をさらに含む。
【０１５８】
（細菌抗原）
本明細書の免疫原性組成物との使用に好適な細菌抗原は、これに限定されるわけではないが、細菌から単離、精製されたかまたは細菌に由来するタンパク質、多糖、リポ多糖、および外膜ベシクルを含む。ある実施形態において、細菌抗原は、細菌溶解物および不活性化細菌処方物を含む。ある実施形態において、細菌抗原は組み換え発現によって産生される。ある実施形態において、細菌抗原は、その生活環の少なくとも１つの段階の間に細菌表面に露出されるエピトープを含む。細菌抗原は、好ましくは、複数の血清型で保存される。ある実施形態において、細菌抗原は、下に示す細菌の１つ以上に由来する抗原ならびに下に明示する特異的抗原を含む。
【０１５９】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ：ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原は、これに限定されるわけではないが、Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、Ｙ、Ｘおよび／またはＢなどのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ血清群から精製されたか、またはこの血清群に由来するタンパク質、糖（多糖、オリゴ糖、リポオリゴ糖またはリポ多糖を含む）、または外膜ベシクルを含む。ある実施形態において、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓタンパク質抗原は、付着因子（ａｄｈｅｓｉｏｎ）、オートトランスポーター、毒素、鉄取り込みタンパク質、および膜結合タンパク質（好ましくは内在性外膜タンパク質）から選択される。
【０１６０】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原は、これに限定されるわけではないが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからの糖（多糖またはオリゴ糖を含む）および／またはタンパク質を含む。この糖は、細菌からの糖の精製の間に生じるサイズを有する多糖であり得るか、またはそのような多糖の断片化によって得られたオリゴ糖であり得る。たとえば７価ＰＲＥＶＮＡＲＴＭ生成物では、糖の６個が無傷の多糖として提示されるが、１個（１８Ｃ血清型）はオリゴ糖として提示される。ある実施形態において、糖抗原は、以下の肺炎球菌血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、および／または３３Ｆの１つ以上から選択される。免疫原性組成物は複数の血清型、たとえば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３またはそれ以上の血清型を含み得る。７価、９価、１０価、１１価および１３価コンジュゲート組み合せは、２３価非コンジュゲート組み合せと同様に、当分野ですでに公知である。たとえば１０価組み合せは血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆからの糖を含み得る。１１価組み合せは、血清型３からの糖をさらに含み得る。１２価組み合せは、１０価混合物に添加され得る：血清型６Ａおよび１９Ａ；６Ａおよび２２Ｆ；１９Ａおよび２２Ｆ；６Ａおよび１５Ｂ；１９Ａおよび１５Ｂ；ｒ２２Ｆおよび１５Ｂ；１３価組み合せは、１１価混合物に添加され得る：血清型１９Ａおよび２２Ｆ；８および１２Ｆ；８および１５Ｂ；８および１９Ａ；８および２２Ｆ；１２Ｆおよび１５Ｂ；１２Ｆおよび１９Ａ；１２Ｆおよび２２Ｆ；１５Ｂおよび１９Ａ；１５Ｂおよび２２Ｆなど。ある実施形態において、タンパク質抗原は、ＷＯ９８／１８９３１、ＷＯ９８／１８９３０、ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ６，６９９，７０３、ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ６，８００，７４４、ＷＯ９７／４３３０３、ＷＯ９７／３７０２６、ＷＯ０２／０７９２４１、ＷＯ０２／３４７７３、ＷＯ００／０６７３７、ＷＯ００／０６７３８、ＷＯ００／５８４７５、ＷＯ２００３／０８２１８３、ＷＯ００／３７１０５、ＷＯ０２／２２１６７、ＷＯ０２／２２１６８、ＷＯ２００３／１０４２７２、ＷＯ０２／０８４２６、ＷＯ０１／１２２１９、ＷＯ９９／５３９４０、ＷＯ０１／８１３８０、ＷＯ２００４／０９２２０９、ＷＯ００／７６５４０、ＷＯ２００７／１１６３２２、ＬｅＭｉｅｕｘら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍ．（２００６）７４：２４５３−２４５６，Ｈｏｓｋｉｎｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（２００１）１８３：５７０９−５７１７，Ａｄａｍｏｕら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（２００１）６９（２）：９４９−９５８，Ｂｒｉｌｅｓら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（２０００）１８２：１６９４−１７０１，Ｔａｌｋｉｎｇｔｏｎら、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．（１９９６）２１（１）：１７−２２，Ｂｅｔｈｅら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（２００��）２０５（１）：９９−１０４，Ｂｒｏｗｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（２００１）６９：６７０２−６７０６，Ｗｈａｌｅｎら、ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００５）４３：７３−８０，Ｊｏｍａａら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００６）２４（２４）：５１３３−５１３９に明示されているタンパク質から選択され得る。他の実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質は、ポリヒスチジントライアドファミリ（ＰｈｔＸ）、コリン結合タンパク質ファミリ（ＣｂｐＸ）、ＣｂｐＸ切断物、ＬｙｔＸファミリ、ＬｙｔＸ切断物、ＣｂｐＸ切断物−ＬｙｔＸ切断物キメラタンパク質、ニューモリシン（Ｐｌｙ）、ＰｓｐＡ、ＰｓａＡ、Ｓｐ１２８、ＳｐＩＯ１、Ｓｐ１３０、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１３３、肺炎球菌線毛サブユニットから選択され得る。
【０１６１】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群ストレプトコッカス）：Ａ群ストレプトコッカス抗原は、これに限定されるわけではないが、ＷＯ０２／３４７７１またはＷＯ２００５／０３２５８２に明示されたタンパク質（ＧＡＳ  ４０を含む）、ＧＡＳ  Ｍタンパク質の断片の融合物（ＷＯ０２／０９４８５１、およびＤａｌｅ，Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９９）１７：１９３−２００、およびＤａｌｅ，Ｖａｃｃｉｎｅ  １４（１０）：９４４−９４８に記載されているものを含む）、フィブロネクチン結合タンパク質（Ｓｆｂ１）、連鎖球菌ヘム結合タンパク質（Ｓｈｐ）、およびストレプトリシンＳ（ＳａｇＡ）を含む。
【０１６２】
Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ：モラクセラ抗原は、これに限定されるわけではないが、ＷＯ０２／１８５９５およびＷＯ９９／５８５６２に明示された抗原、外膜タンパク質抗原（ＨＭＷ−ＯＭＰ）、Ｃ−抗原、および／またはＬＰＳを含む。
【０１６３】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ：百日咳抗原は、これに限定されるわけではないが、Ｂ．  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓからの百日咳ホロ毒素（ＰＴ）および線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）を、場合によりペルタクチンならびに／または凝集原２および３との組み合せも含む。
【０１６４】
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ：バークホルデリア抗原は、これに限定されるわけではないが、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉおよびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａを含む。
【０１６５】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ：Ｓｔａｐｈ  ａｕｒｅｕｓ抗原は、これに限定されるわけではないが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓからの多糖および／またはタンパク質を含む。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ多糖は、これに限定されるわけではないが、非毒性組み換えＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａに場合によりコンジュゲートされた、５型および８型莢膜多糖（ＣＰ５およびＣＰ８）、たとえばＳｔａｐｈＶＡＸＴＭ、３３６型多糖（３３６ＰＳ）、多糖細胞間付着因子（ＰＩＡ、ＰＮＡＧとしても公知）を含む。Ｓ．ａｕｒｅｕｓタンパク質は、これに限定されるわけではないが、表面タンパク質に由来する抗原、インベーシン（ロイコシジン、キナーゼ、ヒアルロニダーゼ）、食細胞貪食を阻害する表面因子（莢膜、タンパク質Ａ）、カロテノイド、カタラーゼ産生、タンパク質Ａ、コアグラーゼ、凝固因子、および／または真核生物細胞膜を溶解させる膜傷害毒素（場合により無毒化）（溶血素、ロイコトキシン、ロイコシジン）を含む。ある実施形態において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ抗原は、ＷＯ０２／０９４８６８、ＷＯ２００８／０１９１６２、ＷＯ０２／０５９１４８、ＷＯ０２／１０２８２９、ＷＯ０３／０１１８９９、ＷＯ２００５／０７９３１５、ＷＯ０２／０７７１８３、ＷＯ９９／２７１０９、ＷＯ０１／７０９５５、ＷＯ００／１２６８９、ＷＯ００／１２１３１、ＷＯ２００６／０３２４７５、ＷＯ２００６／０３２４７２、ＷＯ２００６／０３２５００、ＷＯ２００７／１１３２２２、ＷＯ２００７／１１３２２３、ＷＯ２００７／１１３２２４に明示されているタンパク質から選択され得る。他の実施形態において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ抗原は、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＳａｓＦ、ＳａｓＤ、ＳａｓＨ（ＡｄｓＡ）、Ｓｐａ、ＥｓａＣ、ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、Ｅｍｐ、ＨｌａＨ３５Ｌ、ＣＰ５、ＣＰ８、ＰＮＡＧ、３３６ＰＳから選択され得る。
【０１６６】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ：Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ抗原は、これに限定されるわけではないが、粘液結合抗原（ＳＡＡ）を含む。
【０１６７】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ（破傷風）：破傷風抗原は、これに限定されるわけではないが、破傷風毒素（ＴＴ）を含む。ある実施形態において、このような抗原は、担体タンパク質として、本明細書で提供する免疫原性組成物と併せて／コンジュゲートして使用される。
【０１６８】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ：抗原は、これに限定されるわけではないが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎからのイプシロン毒素を含む。
【０１６９】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍｓ（ボツリヌス症）：ボツリヌス症抗原は、これに限定されるわけではないが、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍに由来するものを含む。
【０１７０】
Ｃｏｒｎｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（ジフテリア）：ジフテリア抗原は、これに限定されるわけではないが、好ましくは無毒化されたジフテリア毒素、たとえばＣＲＭ１９７を含む。ＡＤＰリボシル化を調節、阻害できる、またはＡＤＰリボシル化に関連する追加の抗原は、本明細書で提供する免疫原性組成物との組み合せ／共投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）／コンジュゲーションが考慮される。ある実施形態において、ジフテリアトキソイドは、担体タンパク質として使用される。
【０１７１】
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ（Ｈｉｂ）：Ｈｉｂ抗原は、これに限定されるわけではないが、Ｈｉｂ糖抗原を含む。
【０１７２】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ：シュードモナス抗原は、これに限定されるわけではないが、内毒素Ａ、Ｗｚｚタンパク質、Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＬＰＳ、ＰＡＯ１から単離されたＬＰＳ（Ｏ５血清型）、および／または外膜タンパク質Ｆ（ＯｐｒＦ）を含む外膜タンパク質を含む。
【０１７３】
Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ。Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａに由来する細菌抗原。
【０１７４】
Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ。Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉに由来する細菌抗原。
【０１７５】
Ｂｒｕｃｅｌｌａ。これに限定されるわけではないが、Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂ．ｃａｎｉｓ、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｎｅｏｔｏｍａｅ、Ｂ．ｏｖｉｓ、Ｂ．ｓｕｉｓおよびＢ．ｐｉｎｎｉｐｅｄｉａｅを含む、Ｂｒｕｃｅｌｌａに由来する細菌抗原。
【０１７６】
Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ。これに限定されるわけではないが、Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｆ．ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａおよびＦ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓを含む、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａに由来する細菌抗原。
【０１７７】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群ストレプトコッカス）：Ｂ群ストレプトコッカス抗原は、これに限定されるわけではないが、ＷＯ０２／３４７７１、ＷＯ０３／０９３３０６、ＷＯ０４／０４１１５７、またはＷＯ２００５／００２６１９に明示されたタンパク質または糖抗原を含む（タンパク質ＧＢＳ  ８０、ＧＢＳ  １０４、ＧＢＳ  ２７６およびＧＢＳ  ３２２を含み、血清型Ｉａ、Ｉｂ、Ｉａ／ｃ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩおよびＶＩＩＩに由来する糖抗原を含む）。
【０１７８】
Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ：Ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ抗原は、これに限定されるわけではないが、Ｐｏｒ（またはポリン）タンパク質、たとえばＰｏｒＢ（Ｚｈｕら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００４）２２：６６０−６６９を参照）、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）結合タンパク質、たとえばＴｂｐＡおよびＴｂｐＢ（Ｐｒｉｃｅら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００４）７１（１）：２７７−２８３を参照）、不透明（ｏｐａｃｉｔｙ）タンパク質（Ｏｐａなど）、還元修飾性タンパク質（Ｒｍｐ）、および外膜ベシクル（ＯＭＶ）調製物（Ｐｌａｎｔｅら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ（２０００）１８２：８４８−８５５を参照）を含み、たとえばＷＯ９９／２４５７８、ＷＯ９９／３６５４４、ＷＯ９９／５７２８０、ＷＯ０２／０７９２４３も参照。
【０１７９】
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ：Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ抗原は、これに限定されるわけではないが、血清型Ａ、Ｂ、ＢａおよびＣ（失明の原因である、トラコーマの因子）、血清型Ｌ１、Ｌ２＆Ｌ３（性病性リンパ肉芽腫に関連）、および血清型Ｄ−Ｋに由来する抗原を含む。ある実施形態において、クラミジアトラコーマ抗原は、これに限定されるわけではないが、ＰｅｐＡ（ＣＴ０４５）、ＬｃｒＥ（ＣＴ０８９）、ＡｒｔＪ（ＣＴ３８１）、ＤｎａＫ（ＣＴ３９６）、ＣＴ３９８、ＯｍｐＨ様（ＣＴ２４２）、Ｌ７／Ｌ１２（ＣＴ３１６）、ＯｍｃＡ（ＣＴ４４４）、ＡｔｏｓＳ（ＣＴ４６７）、ＣＴ５４７、Ｅｎｏ（ＣＴ５８７）、ＨｒｔＡ（ＣＴ８２３）、およびＭｕｒＧ（ＣＴ７６１）を含む、ＷＯ００／３７４９４、ＷＯ０３／０４９７６２、ＷＯ０３／０６８８１１、またはＷＯ０５／００２６１９に明示された抗原を含む。
【０１８０】
Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ（梅毒）：梅毒抗原は、これに限定されるわけではないが、ＴｍｐＡ抗原を含む。
【０１８１】
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ（軟性下疳を引き起こす）：デュクレイ抗原は、これに限定されるわけではないが、外膜タンパク質（ＤｓｒＡ）を含む。
【０１８２】
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓまたはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ：抗原は、これに限定されるわけではないが、３糖反復または他のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ由来抗原を含む。
【０１８３】
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ：Ｈ．ピロリ抗原は、これに限定されるわけではないが、Ｃａｇ、Ｖａｃ、Ｎａｐ、ＨｏｐＸ、ＨｏｐＹおよび／またはウレアーゼ抗原を含む。
【０１８４】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ：抗原は、これに限定されるわけではないが、Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ抗原の１６０ｋＤａ赤血球凝集素を含む。
【０１８５】
Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ  抗原は、これに限定されるわけではないが、ＬＰＳを含む。
【０１８６】
Ｅ．ｃｏｌｉ：Ｅ．ｃｏｌｉ抗原は、腸内毒素原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）、腸管凝集性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＡｇｇＥＣ）、分散接着性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＡＥＣ）、腸管病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、腸外病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥｘＰＥＣ）および／または腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）に由来し得る。ＥｘＰＥＣ抗原は、これに限定されるわけではないが、副コロニー形成因子（ｏｒｆ３５２６）、ｏｒｆ３５３、細菌Ｉｇ様ドメイン（１群）タンパク質（ｏｒｆ４０５）、ｏｒｆ１３６４、ＮｏｄＴファミリ外膜因子リポタンパク質排出輸送体（ｏｒｆ１７６７）、ｇｓｐＫ（ｏｒｆ３５１５）、ｇｓｐＪ（ｏｒｆ３５１６）、ｔｏｎＢ依存性シデロホア受容体（ｏｒｆ３５９７）、線毛タンパク質（ｏｒｆ３６１３）、ｕｐｅｃ−９４８、ｕｐｅｃ−１２３２、１型線毛タンパク質のＡ鎖前駆体（ｕｐｅｃ−１８７５）、ｙａｐ  Ｈホモログ（ｕｐｅｃ−２８２０）、および溶血素Ａ（ｒｅｃｐ−３７６８）を含む。
【０１８７】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭疽）：Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ抗原は、これに限定されるわけではないが、防御抗原（ＰＡ）として公知の共通のＢ成分をどちらも共有できる、Ａ成分（致死因子（ＬＦ）および浮腫因子（ＥＦ））を含む。ある実施形態において、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ抗原は、場合により無毒化される。
【０１８８】
Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ（ペスト）：ペスト抗原は、これに限定されるわけではないが、Ｆ１莢膜抗原、ＬＰＳ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓＶ抗原を含む。
【０１８９】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ：結核抗原は、これに限定されるわけではないが、リポタンパク質、ＬＰＳ、ＢＣＧ抗原、抗原８５Ｂ（Ａｇ８５Ｂ）の融合タンパク質、場合によりカチオン性脂質ベシクル中で処方されたＥＳＡＴ−６、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍｔｂ）イソクエン酸脱水素酵素関連抗原、およびＭＰＴ５１抗原を含む。
【０１９０】
Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ：抗原は、これに限定されるわけではないが、外膜タンパク質Ａおよび／またはＢ（ＯｍｐＢ）を含む外膜タンパク質、ＬＰＳ、ならびに表面タンパク質抗原（ＳＰＡ）を含む。
【０１９１】
Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ：細菌抗原は、これに限定されるわけではないが、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに由来するものを含む。
【０１９２】
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：抗原は、これに限定されるわけではないが、ＷＯ０２／０２６０６に明示されているものを含む。
【０１９３】
Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ：抗原は、これに限定されるわけではないが、プロテイナーゼ抗原、ＬＰＳ、特にＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  ＩＩのリポ多糖、Ｏ１  Ｉｎａｂａ  Ｏ特異的多糖、Ｖ．コレラＯ１３９、ＩＥＭ１０８ワクチンの抗原および閉鎖帯毒素（Ｚｏｔ）を含む。
【０１９４】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ（腸チフス）：抗原は、これに限定されるわけではないが、莢膜多糖、好ましくはコンジュゲート（Ｖｉ、すなわちｖａｘ−ＴｙＶｉ）を含む。
【０１９５】
Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（ライム病）：抗原は、これに限定されるわけではないが、リポタンパク質（たとえばＯｓｐＡ、ＯｓｐＢ、Ｏｓｐ  ＣおよびＯｓｐ  Ｄ）、他の表面タンパク質、たとえばＯｓｐＥ関連タンパク質（Ｅｒｐｓ）、デコリン結合タンパク質（ＤｂｐＡなど）、および抗原可変性ＶＩタンパク質、たとえばＰ３９およびＰ１３と結合した抗原（内在性膜タンパク質）、ＶｌｓＥ抗原変異タンパク質を含む。
【０１９６】
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ：抗原は、これに限定されるわけではないが、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ外膜タンパク質（ＯＭＰ）を含む。
【０１９７】
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ：抗原は、これに限定されるわけではないが、ＯＭＰ  Ａを含むＯＭＰ、または破傷風トキソイドに場合によりコンジュゲートされた多糖を含む。
【０１９８】
本明細書で提供する免疫原性組成物で使用する他の細菌抗原は、これに限定されるわけではないが、上のいずれかの莢膜抗原、多糖抗原またはタンパク質抗原を含む。本明細書で提供する免疫原性組成物で使用する他の細菌抗原は、これに限定されるわけではないが、外膜ベシクル（ＯＭＶ）調製物を含む。加えて、本明細書で提供する免疫原性組成物で使用する他の細菌抗原は、これに限定されるわけではないが、上述の細菌のいずれかの生の、弱毒化されたおよび／または精製されたものを含む。ある実施形態において、本明細書で提供する免疫原性組成物で使用する細菌抗原は、グラム陰性細菌に由来するが、他の実施形態では、細菌抗原はグラム陽性細菌に由来する。ある実施形態において、本明細書で提供する免疫原性組成物で使用する細菌抗原は好気性細菌に由来するが、他の実施形態において、細菌抗原は嫌気性細菌に由来する。
【０１９９】
ある実施形態において、上の細菌に由来する糖のいずれもが（多糖、ＬＰＳ、ＬＯＳまたはオリゴ糖）、別の薬剤または抗原、たとえば担体タンパク質（たとえばＣＲＭ１９７）にコンジュゲートされる。ある実施形態において、このようなコンジュゲーションは、糖のカルボニル部分の、タンパク質のアミノ基への還元的アミノ化によって行われる直接コンジュゲーションである。他の実施形態において、糖は、リンカーを通じて、たとえばスクシンアミドまたはＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９６およびＣＲＣ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，１９９３で提供された他の結合を用いてコンジュゲートされる。
【０２００】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ感染ならびに関連疾患および障害の処置または予防に有用なある実施形態において、本明細書で提供する免疫原性組成物での使用のためのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓからの組み換えタンパク質は、ＷＯ９９／２４５７８、ＷＯ９９／３６５４４、ＷＯ９９／５７２８０、ＷＯ００／２２４３０、ＷＯ９６／２９４１２、ＷＯ０１／６４９２０、ＷＯ０３／０２０７５６、ＷＯ２００４／０４８４０４、およびＷＯ２００４／０３２９５８に見出され得る。このような抗原は、単独でまたは組み合せて使用され得る。複数の精製されたタンパク質が組み合される場合、ここで１０以下（たとえば９、８、７、６、５、４、３、２）の精製抗原の混合物を使用することが役立つ。
【０２０１】
本明細書で提供する免疫原性組成物での使用のための特に有用な抗原の組み合せは、Ｇｉｕｌｉａｎｉら（２００６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３（２９）：１０８３４−９およびＷＯ２００４／０３２９５８に開示されており、そして免疫原性組成物は：（１）‘ＮａｄＡ’タンパク質（ａｋａ  ＧＮＡ１９９４およびＮＭＢ１９９４）；（２）‘ｆＨＢＰ’タンパク質（ａｋａ‘７４１’、ＬＰ２０８６、ＧＮＡ１８７０、およびＮＭＢ１８７０）；（３）‘９３６’タンパク質（ａｋａ  ＧＮＡ２０９１およびＮＭＢ２０９１）；（４）‘９５３’タンパク質（ａｋａ  ＧＮＡ１０３０およびＮＭＢ１０３０）；ならびに（５）‘２８７’タンパク質（ａｋａ  ＧＮＡ２１３２およびＮＭＢ２１３２）の１、２、３、４または５つを含み得る。考えられる他の抗原の組み合せは、トランスフェリン結合タンパク質（たとえばＴｂｐＡおよび／またはＴｂｐＢ）およびＨｓｆ抗原を含み得る。本明細書で提供する組成物での使用のための他の考えられる精製抗原は、以下のアミノ酸配列の１つを含むタンパク質：ＷＯ９９／２４５７８からの配列番号６５０；ＷＯ９９／２４５７８からの配列番号８７８；ＷＯ９９／２４５７８からの配列番号８８４；ＷＯ９９／３６５４４からの配列番号４；ＷＯ９９／５７２８０からの配列番号５９８；ＷＯ９９／５７２８０からの配列番号８１８；ＷＯ９９／５７２８０からの配列番号８６４；ＷＯ９９／５７２８０からの配列番号８６６；ＷＯ９９／５７２８０からの配列番号１１９６；ＷＯ９９／５７２８０からの配列番号１２７２；ＷＯ９９／５７２８０からの配列番号１２７４；ＷＯ９９／５７２８０からの配列番号１６４０；ＷＯ９９／５７２８０からの配列番号１７８８；ＷＯ９９／５７２８０からの配列番号２２８８；ＷＯ９９／５７２８０からの配列番号２４６６；ＷＯ９９／５７２８０からの配列番号２５５４；ＷＯ９９／５７２８０からの配列番号２５７６；ＷＯ９９／５７２８０からの配列番号２６０６；ＷＯ９９／５７２８０からの配列番号２６０８；ＷＯ９９／５７２８０からの配列番号２６１６；ＷＯ９９／５７２８０からの配列番号２６６８；ＷＯ９９／５７２８０からの配列番号２７８０；ＷＯ９９／５７２８０からの配列番号２９３２；ＷＯ９９／５７２８０からの配列番号２９５８；ＷＯ９９／５７２８０からの配列番号２９７０；ＷＯ９９／５７２８０からの配列番号２９８８（上述のアミノ酸配列それぞれは、引用した文書からの参照により本明細書に組み入れられている）、または：（ａ）前記配列に対して５０％以上の同一性（たとえば６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上）を有するアミノ酸配列；および／または（ｂ）前記配列からの少なくともｎ個の連続アミノ酸の断片を含み、ｎが７以上である（たとえば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）アミノ酸配列を含む、ポリペプチドを含む。（ｂ）に好ましい断片は、関連する配列からのエピトープを含む。１を超える（たとえば２、３、４、５、６の）これらのポリペプチドが免疫原性組成物に含まれ得る。
【０２０２】
ｆＨＢＰ抗原は、３つの別個の改変体に分類される（ＷＯ２００４／０４８４０４）。本明細書で開示する化合物の１つを使用する本明細書で開示する免疫原性組成物に基づくＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群ワクチンは、単一のｆＨＢＰ改変体を含み得るが、２または３つすべての改変体それぞれからのｆＨＢＰを有用に含む。それゆえ組成物は：（ａ）配列番号９に対して少なくともａ％の配列同一性を有するアミノ酸配列および／もしくは配列番号９からの少なくともｘ個の連続したアミノ酸の断片から成るアミノ酸配列を含む、第１のタンパク質；（ｂ）配列番号１０に対する少なくともｂ％の配列同一性を有するアミノ酸配列および／もしくは配列番号１０からの少なくともｙ個の連続するアミノ酸の断片から成るアミノ酸配列を含む、第２のタンパク質；ならびに／または（ｃ）配列番号１１に対する少なくともｃ％の配列同一性を有するアミノ酸配列および／もしくは配列番号１１からの少なくともｚ個の連続するアミノ酸の断片から成るアミノ酸配列を含む、第３のタンパク質から選択される、２または３つの異なる精製ｆＨＢＰの組み合せを含み得る。
【０２０３】
【化１０−１】
0005781929.tif 000012
ａの値は、少なくとも８５、たとえば８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５またはそれ以上である。ｂの値は、少なくとも８５、たとえば８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５またはそれ以上である。ｃの値は、少なくとも８５、たとえば８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５またはそれ以上である。ａ、ｂおよびｃの値は、本質的には相互に関連していない。
【０２０４】
ｘの値は、少なくとも７、たとえば８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０である。ｙの値は、少なくとも７、たとえば８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０である。ｚの値は、少なくとも７、たとえば８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０である。ｘ、ｙおよびｚの値は、本質的には相互に関連していない。
【０２０５】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示するような免疫原性組成物は、たとえばＮ端システインにて脂質付加されているｆＨＢＰタンパク質を含む。他の実施形態において、それらは脂質付加されない。
【０２０６】
（細菌ベシクル抗原）
本明細書で開示するような免疫原性組成物は、外膜ベシクルを含み得る。このような外膜ベシクルは、幅広い病原性細菌から得られ、本明細書で開示するような免疫原性組成物の抗原成分として使用され得る。このような免疫原性組成物の抗原成分としての使用のためのベシクルは、細菌外膜を破壊して外膜のタンパク質成分を含む細胞外膜からのベシクルを形成することによって得られる、任意のプロテオリポソームベシクルを含む。それゆえこの用語は、ＯＭＶ（時には「ブレブ」と呼ばれる）、マイクロベシクル（ＭＶ、たとえばＷＯ０２／０９６４３を参照）および「天然ＯＭＶ」（「ＮＯＭＶ」、たとえばＫａｔｉａｌら（２００２）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７０：７０２−７０７を参照）を含む。１つ以上の病原性細菌からのベシクルを含む本明細書で開示するような免疫原性（ｉｍｍｎｏｇｅｎｉｃ）組成物は、このような病原性細菌による感染ならびに関連疾患および障害の処置または予防に使用することができる。
【０２０７】
ＭＶおよびＮＯＭＶは、細菌増殖の間に自発的に形成される自然発生型膜ベシクルであり、培地中に放出される。ＭＶは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａなどの細菌をブロス培地中で培養して、ブロス培地中のより小型のＭＶから全細胞を分離し（たとえば濾過によって、またはより小型のベシクルではなく、細胞のみをペレット化する低速遠心分離によって）、次に細胞の枯渇した培地からＭＶを収集すること（たとえば濾過によって、ＭＶの沈殿差または凝集差によって、ＭＶをペレット化する高速遠心分離によって）によって得ることができる。ＭＶの産生で使用するための菌株は一般に、培地中で産生されるＭＶの量に基づいて選択できる（たとえば高ＭＶ産生のＮｅｉｓｓｅｒｉａを記載している、ＵＳ  ｐａｔｅｎｔ  ６，１８０，１１１およびＷＯ０１／３４６４２を参照）。
【０２０８】
ＯＭＶは、細菌から人工的に調製され、洗浄剤処理を使用して（たとえばデオキシコール酸塩による）、または非洗浄剤手段によって（たとえばＷＯ０４／０１９９７７を参照）調製され得る。好適なＯＭＶ調製物を得る方法は、当分野で周知である。ＯＭＶを形成する技法は、細菌を胆汁酸塩洗浄剤（たとえばリトコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、デオキシコール酸、コール酸、ウルソコール酸などの塩、ナイセリアの処理には、デオキシコール酸ナトリウムを用いるのが好ましい（ＥＰ００１１２４３およびＦｒｅｄｒｉｋｓｅｎら（１９９１）ＮＩＰＨ  Ａｎｎ．１４（２）：６７−８０））によって、洗浄剤を沈殿させないような十分に高いｐＨにおいて処理することを含む（たとえばＷＯ０１／９１７８８を参照）。超音波処理、ホモジナイゼーション、マイクロフルダイゼーション、キャビテーション、浸透圧ショック、粉砕、フレンチプレス、ブレンディングなどの技法を使用する、他の技法は、実質的に洗浄剤の非存在下で行われ得る（たとえばＷＯ０４／０１９９７７を参照）。洗浄剤を使用しないかまたは少量の洗剤を使用する方法は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌ  ＯＭＶ中のＮｓｐＡなどの有用な抗原を保持することができる。それゆえ方法は、約０．５％以下、たとえば約０．２％、約０．１％、０．０５％未満またはゼロのデオキシコール酸塩を含むＯＭＶ抽出緩衝液を使用し得る。
【０２０９】
ＯＭＶ調製物に有用なプロセスはＷＯ０５／００４９０８に記載されており、むしろ高速遠心分離の代わりに粗ＯＭＶの限外濾過を含む。プロセスは、限外濾過が行われた後に超遠心分離のステップを含み得る。
【０２１０】
ベシクルは、本発明で使用するためＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｉｎｉｇｔｉｄｉｓなどの任意の病原性株から調製することができる。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂからのベシクルは、任意の血清型（たとえば１、２ａ、２ｂ、４、１４、１５、１６など）、任意の血清亜型、および任意の免疫型（たとえばＬ１；Ｌ２；Ｌ３；Ｌ３，３，７；Ｌ１０；など）のベシクルであり得る。髄膜炎菌は、高侵襲性および高毒性系統を含む任意の好適な系統、たとえば以下の７つの高毒性系統：亜群Ｉ；亜群ＩＩＩ；亜群ＩＶ１；ＥＴ５複合体；ＥＴ３７複合体；Ａ４クラスタ；系統３のいずれかからであり得る。これらの系統は、多座位酵素電気泳動（ＭＬＥＥ）によって定義されてきたが、髄膜炎菌を分類するために多座位配列タイピング（ＭＬＳＴ）も使用されており、たとえばＥＴ３７複合体は、ＭＬＳＴによりＳＴ１１複合体であり、ＥＴ５複合体はＳＴ−３２（ＥＴ−５）であり、系統３はＳＴ４１／４４であるなどである。ベシクルは、以下の亜型：Ｐ１．２；Ｐ１．２，５；Ｐ１．４；Ｐ１．５；Ｐ１．５，２；Ｐ１．５，ｃ；Ｐ１．５ｃ，１０；Ｐ１．７，１６；Ｐ１．７，１６ｂ；Ｐ１．７ｈ，４；Ｐ１．９；Ｐ１．１５；Ｐ１．９，１５；Ｐ１．１２，１３；Ｐ１．１３；Ｐ１．１４；Ｐ１．２１，１６；Ｐ１．２２，１４の１つを有する株から調製できる。
【０２１１】
本明細書で開示する免疫原性組成物に含まれるベシクルは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株などの野生型病原性株または変異株から調製され得る。一例として、ＷＯ９８／５６９０１は、修飾ｆｕｒ遺伝子を有するＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓから得られたベシクルの調製物を開示している。ＷＯ０２／０９７４６は、ｎｓｐＡ発現が同時ｐｏｒＡおよびｃｐｓノックアウトによってアップレギュレートされるであろうことを教示している。ＯＭＶ産生のためのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓのさらなるノックアウト変異体は、ＷＯ０２／０９７４、ＷＯ０２／０６２３７８、およびＷＯ０４／０１４４１７に開示されている。ＷＯ０６／０８１２５９は、ｆＨＢＰがアップレギュレートされているベシクルを開示する。Ｃｌａａｓｓｅｎら（１９９６）１４（１０）：１００１−８は、６つの異なるＰｏｒＡ亜型を発現するように修飾された株からのベシクルの構築を開示する。ＬＰＳ生合成に関与する酵素のノックアウトによって達成された、内毒素レベルの低い変異Ｎｅｉｓｓｅｒｉａも使用され得る（たとえばＷＯ９９／１０４９７およびＳｔｅｅｇｈｓら（２００１）ｉ２０：６９３７−６９４５を参照）。これらまたは他の変異体はすべて、本発明によって使用することができる。
【０２１２】
それゆえ本明細書で開示する免疫原性組成物に含まれるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ株は、いくつかの実施形態において、１を超えるＰｏｒＡ亜型を発現し得る。６価および９価ＰｏｒＡ株は以前に構築されている。株は、ＰｏｒＡ亜型の２、３、４、５、６、７、８または９：Ｐ１．７，１６；Ｐ１．５−１，２−２；Ｐ１．１９，１５−１；Ｐ１．５−２，１０；Ｐ１．１２  １，１３；Ｐ１．７−２，４；Ｐ１．２２，１４；Ｐ１．７−１，１および／またはＰ１．１８−１，３，６を発現し得る。他の実施形態において、株はＰｏｒＡ発現についてダウンレギュレートされていることがあり、たとえばＰｏｒＡの量は、野生型レベルに比較して（たとえばＷＯ０３／１０５８９０に開示されているような株Ｈ４４／７６に比較して）、少なくとも２０％（たとえば＞３０％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％など）ダウンレギュレートされているか、またはノックアウトさえ行われている。
【０２１３】
いくつかの実施形態においてＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ株は、（対応する野生型株に対して）あるタンパク質を過剰発現し得る。たとえば株は、ＮｓｐＡ、タンパク質２８７（ＷＯ０１／５２８８５  −ＮＭＢ２１３２およびＧＮＡ２１３２とも呼ばれる）、１つ以上のｆＨＢＰ（ＷＯ０６／０８１２５９およびＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｐｕｂ．２００８／０２４８０６５−タンパク質７４１、ＮＭＢ１８７０およびＧＮＡ１８７０とも呼ばれる）、ＴｂｐＡおよび／またはＴｂｐＢ（ＷＯ００／２５８１１）、Ｃｕ，Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ（ＷＯ００／２５８１１）などを過剰発現し得る。
【０２１４】
いくつかの実施形態において、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ株は、ノックアウトおよび／または過剰発現（ｏｖｅｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）変異の１つ以上を含み得る。ダウンレギュレーションおよび／またはノックアウトに好ましい遺伝子は：（ａ）Ｃｐｓ、ＣｔｒＡ、ＣｔｒＢ、ＣｔｒＣ、ＣｔｒＤ、ＦｒｐＢ、ＧａｌＥ、ＨｔｒＢ／ＭｓｂＢ、ＬｂｐＡ、ＬｂｐＢ、ＬｐｘＫ、Ｏｐａ、Ｏｐｃ、ＰｉｌＣ、ＰｏｒＢ、ＳｉａＡ、ＳｉａＢ、ＳｉａＣ、ＳｉａＤ、ＴｂｐＡ、および／またはＴｂｐＢ（ＷＯ０１／０９３５０）；（ｂ）ＣｔｒＡ、ＣｔｒＢ、ＣｔｒＣ、ＣｔｒＤ、ＦｒｐＢ、ＧａｌＥ、ＨｔｒＢ／ＭｓｂＢ、ＬｂｐＡ、ＬｂｐＢ、ＬｐｘＫ、Ｏｐａ、Ｏｐｃ、ＰｈｏＰ、ＰｉｌＣ、ＰｍｒＥ、ＰｍｒＦ、ＳｉａＡ、ＳｉａＢ、ＳｉａＣ、ＳｉａＤ、ＴｂｐＡ、および／またはＴｂｐＢ（ＷＯ０２／０９７４６）；（ｃ）ＥｘｂＢ、ＥｘｂＤ、ｒｍｐＭ、ＣｔｒＡ、ＣｔｒＢ、ＣｔｒＤ、ＧａｌＥ、ＬｂｐＡ、ＬｐｂＢ、Ｏｐａ、Ｏｐｃ、ＰｉｌＣ、ＰｏｒＢ、ＳｉａＡ、ＳｉａＢ、ＳｉａＣ、ＳｉａＤ、ＴｂｐＡ、および／またはＴｂｐＢ（ＷＯ０２／０６２３７８）；ならびに（ｄ）ＣｔｒＡ、ＣｔｒＢ、ＣｔｒＤ、ＦｒｐＢ、ＯｐＡ、ＯｐＣ、ＰｉｌＣ、ＰｏｒＢ、ＳｉａＤ、ＳｙｎＡ、ＳｙｎＢ、および／またはＳｙｎＣ（ＷＯ０４／０１４４１７）を含む。
【０２１５】
変異株が使用される場合、いくつかの実施形態において、変異株は以下の特徴の１つ以上、またはすべてを有し得る：（ｉ）髄膜炎菌ＬＯＳを切断するためのダウンレギュレートまたはノックアウトされたＬｇｔＢおよび／またはＧａｌＥ；（ｉｉ）アップレギュレートされたＴｂｐＡ；（ｉｉｉ）アップレギュレートされたＨｓｆ；（ｉｖ）アップレギュレートされたＯｍｐ８５；（ｖ）アップレギュレートされたＬｂｐＡ；（ｖｉ）アップレギュレートされたＮｓｐＡ；（ｖｉｉ）ノックアウトされたＰｏｒＡ；（ｖｉｉｉ）ダウンレギュレートまたはノックアウトされたＦｒｐＢ；（ｉｘ）ダウンレギュレートまたはノックアウトされたＯｐａ；（ｘ）ダウンレギュレートまたはノックアウトされたＯｐｃ；（ｘｉｉ）欠失ｃｐｓ遺伝子複合体。切断型ＬＯＳは、シアリル−ラクト−Ｎ−ネオテトラオースエピトープを含まないＬＯＳであることが可能であり、たとえばそれはガラクトース欠失ＬＯＳであってもよい。ＬＯＳはα鎖を有さないことがある。
【０２１６】
ＬＯＳがベシクル中に存在する場合、ここでそのＬＯＳおよびタンパク質成分を結合させるようにベシクルを処理することが可能である（「ブレブ内」コンジュゲーション（ＷＯ０４／０１４４１７））。
【０２１７】
本明細書で開示するような免疫原性組成物は、異なる株からのベシクルの混合物を含み得る。一例として、ＷＯ０３／１０５８９０は、使用国で流行している血清亜型の髄膜炎菌株に由来する第１のベシクルと使用国で流行している（ｐｒｅｖｅｎｔ）血清亜型を必ずしも有していない株に由来する第２のベシクルとを含む、多価髄膜炎菌ベシクル組成物を含むワクチンを開示している。ＷＯ０６／０２４９４６は、異なるベシクルの有用な組み合せを開示している。Ｌ２およびＬ３免疫型それぞれの株からのベシクルの組み合せがいくつかの実施形態において使用され得る。
【０２１８】
ベシクルベース抗原は、血清群Ｂ以外のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群から調製することができる（たとえばＷＯ０１／９１７８８は、血清群Ａのプロセスを開示している）。したがって本明細書で開示する免疫原性組成物は、Ｂ以外の（たとえばＡ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹ）、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ以外の細菌病原体からのベシクル調製血清群を含むことができる。
【０２１９】
（ウイルス抗原）
本明細書で提供する免疫原性組成物での使用に好適なウイルス抗原は、これに限定されるわけではないが、不活性化（または死滅）ウイルス、弱毒化ウイルス、スプリットウイルス処方物、精製サブユニット処方物、ウイルスから単離されることも精製されることもまたはウイルスに由来することもあるウイルスタンパク質、ならびにウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む。ある実施形態において、ウイルス抗原は、細胞培養物または他の基質で増殖したウイルスに由来する。他の実施形態において、ウイルス抗原は組み換え発現される。ある実施形態において、ウイルス抗原は、好ましくは、その生活環の少なくとも１つの段階の間にウイルス表面に露出されるエピトープを含む。ウイルス抗原は、好ましくは、複数の血清型または単離物で保存される。本明細書で提供する免疫原性組成物での使用に適したウイルス抗原は、これに限定されるわけではないが、下に示すウイルスの１つ以上に由来する抗原、ならびに下で明示する特異的抗原の例を含む。
【０２２０】
オルソミクソウイルス：ウイルス抗原は、これに限定されるわけではないが、オルソミクソウイルス、たとえばインフルエンザＡ、ＢおよびＣに由来するものを含む。ある実施形態において、オルソミクソウイルス抗原は、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリクスタンパク質（Ｍ１）、膜タンパク質（Ｍ２）、転写酵素成分の１つ以上（ＰＢ１、ＰＢ２およびＰＡ）を含むウイルスタンパク質の１つ以上から選択される。ある実施形態において、ウイルス抗原はＨＡおよびＮＡを含む。ある実施形態において、インフルエンザ抗原はパンデミック間期（毎年）のインフルエンザ株に由来するが、他の実施形態において、インフルエンザ抗原は、パンデミックアウトブレイクを引き起こす可能性を有する株（すなわち現在流行している株の赤血球凝集素と比較して新たな赤血球凝集素を有するインフルエンザ株、またはトリ被験体において病原性であり、ヒト集団に水平感染する可能性を有するインフルエンザ株、またはヒトに病原性であるインフルエンザ株）に由来する。
【０２２１】
パラミクソウイルス科ウイルス：ウイルス抗原は、これに限定されるわけではないが、パラミクソウイルス科ウイルス、たとえばニューモウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（ＰＩＶ）、メタニューモウイルスおよびモルビリウイルス（麻疹）に由来するものを含む。
【０２２２】
ニューモウイルス：ウイルス抗原は、これに限定されるわけではないが、ニューモウイルス、たとえばＲＳウイルス（ＲＳＶ）、ウシＲＳウイルス、マウス肺炎ウイルス、およびシチメンチョウ鼻気管炎ウイルスに由来するものを含む。好ましくは、ニューモウイルスはＲＳＶである。ある実施形態において、ニューモウイルス抗原は、以下、表面タンパク質融合物（Ｆ）、糖タンパク質（Ｇ）および小型疎水性タンパク質（ＳＨ）、マトリクスタンパク質ＭおよびＭ２、ヌクレオカプシドタンパク質Ｎ、ＰおよびＬならびに非構造タンパク質ＮＳ１およびＮＳ２を含む、タンパク質の１つ以上から選択される。他の実施形態において、ニューモウイルス抗原は、Ｆ、ＧおよびＭを含む。ある実施形態において、ニューモウイルス抗原はまた、たとえば単に一例として、ＲＳＶおよびＰＩＶの両方の成分を含むキメラＲＳＶ／ＰＩＶウイルスなどのキメラウイルスに処方されるか、またはキメラウイルスに由来する。
【０２２３】
パラミクソウイルス：ウイルス抗原は、これに限定されるわけではないが、パラミクソウイルス、たとえばパラインフルエンザウイルス１〜４型（ＰＩＶ）、ムンプス、センダイウイルス、シミアンウイルス５、ウシパラインフルエンザウイルス、ニパーウイルス、ヘニパウイルスおよびニューカッスル病ウイルスに由来するものを含む。ある実施形態において、パラミクソウイルスはＰＩＶまたはムンプスである。ある実施形態において、パラミクソウイルス抗原は、以下のタンパク質の１つ以上から選択される：赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）、融合タンパク質Ｆ１およびＦ２、核タンパク質（ＮＰ）、ホスホタンパク質（Ｐ）、大型タンパク質（Ｌ）、およびマトリクスタンパク質（Ｍ）。他の実施形態において、パラミクソウイルスタンパク質はＨＮ、Ｆ１およびＦ２を含む。ある実施形態において、パラミクソウイルス抗原はまた、たとえば単に一例として、ＲＳＶおよびＰＩＶの両方の成分を含むキメラＲＳＶ／ＰＩＶウイルスなどのキメラウイルスに処方されるか、またはキメラウイルスに由来する。市販のムンプスワクチンは、１価形または麻疹および風疹ワクチン（ＭＭＲ）との組み合せのどちらかの、生弱毒化ムンプスウイルスを含む。他の実施形態において、パラミクソウイルスは、ニパーウイルスまたはヘニパウイルスであり、抗原は以下のタンパク質の１つ以上から選択される：融合（Ｆ）タンパク質、糖タンパク質（Ｇ）タンパク質、マトリクス（Ｍ）タンパク質、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、大型（Ｌ）タンパク質およびホスホタンパク質（Ｐ）。
【０２２４】
ポックスウイルス科：ウイルス抗原は、これに限定されるわけではないが、Ｖａｒｉｏｌａ  ｍａｊｏｒおよびＶａｒｉｏｌａ  ｍｉｎｏｒを含む（これに限定されるわけではないが）、Ｖａｒｉｏｌａ  ｖｅｒａなどのＯｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓに由来するものを含む。
【０２２５】
メタニューモウイルス：ウイルス抗原は、これに限定されるわけではないが、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）およびトリメタニューモウイルス（ａＭＰＶ）などのメタニューモウイルスを含む。ある実施形態において、メタニューモウイルス抗原は、以下の、表面タンパク質融合物（Ｆ）、糖タンパク質（Ｇ）および小型疎水性タンパク質（ＳＨ）、マトリクスタンパク質ＭおよびＭ２、ヌクレオカプシドタンパク質Ｎ、ＰおよびＬを含むタンパク質の１つ以上から選択される。他の実施形態において、メタニューモウイルス抗原は、Ｆ、ＧおよびＭを含む。ある実施形態において、メタニューモウイルス抗原はまた、キメラウイルスに処方されるか、またはキメラウイルスに由来する。
【０２２６】
モルビリウイルス：ウイルス抗原は、これに限定されるわけではないが、麻疹などのモルビリウイルスに由来するものを含む。ある実施形態において、モルビリウイルス抗原は、以下のタンパク質の１つ以上から選択される：赤血球凝集素（Ｈ）、糖タンパク質（Ｇ）、融合因子（Ｆ）、大型タンパク質（Ｌ）、核タンパク質（ＮＰ）、ポリメラーゼホスホタンパク質（Ｐ）、およびマトリクス（Ｍ）。市販の麻疹ワクチンは、通例ムンプスおよび風疹（ＭＭＲ）と組み合せた、生弱毒化麻疹ウイルスを含む。
【０２２７】
ピコルナウイルス：ウイルス抗原は、これに限定されるわけではないが、ピコルナウイルス、たとえばエンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパルナウイルス、パレコウイルス、カルジオウイルスおよびアフトウイルスに由来するものを含む。ある実施形態において、抗原はエンテロウイルスに由来するが、他の実施形態において、エンテロウイルスは、ポリオウイルスである。なお他の実施形態において、抗原はライノウイルスに由来する。ある実施形態において、抗原はウイルス様粒子（ＶＬＰ）に処方される。
【０２２８】
エンテロウイルス：ウイルス抗原は、これに限定されるわけではないが、エンテロウイルス、たとえばポリオウイルス１、２または３型、コクサッキーＡウイルス１〜２２および２４型、コクサッキーＢウイルス１〜６型、エコーウイルス（（ＥＣＨＯ）ウイルス）１〜９、１１〜２７および２９〜３４型ならびにエンテロウイルス６８〜７１に由来するものを含む。ある実施形態において、抗原はエンテロウイルスに由来するが、他の実施形態において、エンテロウイルスは、ポリオウイルスである。ある実施形態において、エンテロウイルス抗原は、以下のカプシドタンパク質：ＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４の１つ以上から選択される。市販のポリオワクチンは、不活性化ポリオワクチン（ＩＰＶ）および経口ポリオウイルスワクチン（ＯＰＶ）を含む。ある実施形態において、抗原はウイルス様粒子に処方される。
【０２２９】
ブンヤウイルス：ウイルス抗原は、これに限定されるわけではないが、Ｏｒｔｈｏｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ、たとえばカリフォルニア脳炎ウイルス、Ｐｈｌｅｂｏｖｉｒｕｓ、たとえばリフトバレー熱ウイルス、またはＮａｉｒｏｖｉｒｕｓ、たとえばＣｒｉｍｅａｎ−Ｃｏｎｇｏ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒウイルスに由来するものを含む。
【０２３０】
ライノウイルス：ウイルス抗原は、これに限定されるわけではないが、ライノウイルスに由来するものを含む。ある実施形態において、ライノウイルス抗原は、以下のカプシドタンパク質：ＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ２およびＶＰ４の１つ以上から選択される。ある実施形態において、抗原はウイルス様粒子（ＶＬＰ）に処方される。
【０２３１】
ヘパルナウイルス：ウイルス抗原は、これに限定されるわけではないが、単に一例としてＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）などのヘパルナウイルスに由来するものを含む。市販のＨＡＶワクチンは、不活性化ＨＡＶワクチンを含む。
【０２３２】
トガウイルス：ウイルス抗原は、これに限定されるわけではないが、トガウイルス、たとえばラビウイルス、アルファウイルスまたはアルテリウイルスに由来するものを含む。ある実施形態において、抗原は、単なる一例として、風疹ウイルスなどのルビウイルスに由来する。ある実施形態において、トガウイルス抗原は、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｃ、ＮＳＰ−１、ＮＳＰＯ−２、ＮＳＰ−３またはＮＳＰ−４から選択される。ある実施形態において、トガウイルス抗原は、Ｅ１、Ｅ２またはＥ３から選択される。市販の風疹ワクチンは、通例、ムンプスおよび麻疹ワクチン（ＭＭＲ）と組み合せた、生の低温適応ウイルスを含む。
【０２３３】
フラビウイルス：ウイルス抗原は、これに限定されるわけではないが、フラビウイルス、たとえばダニ媒介性脳炎（ＴＢＥ）ウイルス、デング（１、２、３または４型）ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林病ウイルス、西ナイル脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、ポワッサン脳炎ウイルスに由来するものを含む。ある実施形態において、フラビウイルス抗原は、ＰｒＭ、Ｍ、Ｃ、Ｅ、ＮＳ−１、ＮＳ−２ａ、ＮＳ２ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、およびＮＳ５から選択される。ある実施形態において、フラビウイルス抗原は、ＰｒＭ、ＭおよびＥから選択される。市販のＴＢＥワクチンは、不活性化ウイルスワクチンを含む。ある実施形態において、抗原はウイルス様粒子（ＶＬＰ）に処方される。
【０２３４】
ペスチウイルス：ウイルス抗原は、これに限定されるわけではないが、ペスチウイルス、たとえばウシウイルス性下痢症（ＢＶＤＶ）、豚コレラ（Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ（ＣＳＦＶ））またはボーダー病（ＢＤＶ）に由来するものを含む。
【０２３５】
ヘパドナウイルス：ウイルス抗原は、これに限定されるわけではないが、ヘパドナウイルス、たとえばＢ型肝炎ウイルスに由来するものを含む。ある実施形態において、ヘパドナウイルス抗原は、表面抗原（Ｌ、ＭおよびＳ）、コア抗原（ＨＢｃ、ＨＢｅ）から選択される。市販のＨＢＶワクチンは、表面抗原Ｓタンパク質を含むサブユニットワクチンを含む。
【０２３６】
Ｃ型肝炎ウイルス：ウイルス抗原は、これに限定されるわけではないが、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に由来するものを含む。ある実施形態において、ＨＣＶ抗原は、Ｅ１，Ｅ２，Ｅ１／Ｅ２，ＮＳ３４５ポリタンパク質、ＮＳ３４５コアポリタンパク質、コア、および／または非構造領域からのペプチドの１つ以上から選択される。ある実施形態において、Ｃ型肝炎ウイルス抗原は、以下の１つ以上：ＨＣＶ  Ｅ１およびもしくはＥ２タンパク質、Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー複合体、コアタンパク質および非構造タンパク質、またはこれらの抗原の断片を含み、非構造タンパク質は、場合により修飾され得る（酵素活性を除去し、しかし免疫原性を保持するため）。ある実施形態において、抗原はウイルス様粒子（ＶＬＰ）に処方される。
【０２３７】
ラブドウイルス：ウイルス抗原は、これに限定されるわけではないが、ラブドウイルス、たとえばリッサウイルス（狂犬病ウイルス）およびべシクロウイルス（ＶＳＶ）に由来するものを含む。ラブドウイルス抗原は、糖タンパク質（Ｇ）、核タンパク質（Ｎ）、大型タンパク質（Ｌ）、非構造タンパク質（ＮＳ）から選択され得る。市販の狂犬病ウイルスワクチンは、ヒト２倍体細胞または胎仔アカゲザル肺細胞で増殖させられた死菌ウイルスを含む。
【０２３８】
カリシウイルス科；ウイルス抗原は、これに限定されるわけではないが、カリシウイルス、たとえばノーウォークウイルス、およびノーウォーク様ウイルス、たとえばハワイウイルスおよびスノーマウンテンウイルスに由来するものを含む。ある実施形態において、抗原はウイルス様粒子（ＶＬＰ）に処方される。
【０２３９】
コロナウイルス：ウイルス抗原は、これに限定されるわけではないが、コロナウイルス、ＳＡＲＳ、ヒト呼吸器系コロナウイルス、トリ伝染性気管支炎（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、およびブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）に由来するものを含む。ある実施形態において、コロナウイルス抗原は、スパイク（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）、マトリクス（Ｍ）、ヌクレオカプシド（Ｎ）、および赤血球凝集素−エステラーゼ糖タンパク質（ＨＥ）から選択される。ある実施形態において、コロナウイルス抗原はＳＡＲＳウイルスに由来する。ある実施形態において、コロナウイルスは、ＷＯ０４／９２３６０に記載されているようなＳＡＲＳウイルス抗原に由来する。
【０２４０】
レトロウイルス：ウイルス抗原は、これに限定されるわけではないが、レトロウイルス、たとえばオンコウイルス、レンチウイルスまたはスプマウイルスに由来するものを含む。ある実施形態において、オンコウイルス抗原は、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２またはＨＴＬＶ−５に由来する。ある実施形態において、レンチウイルス抗原は、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に由来する。ある実施形態において、抗原は、これに限定されるわけではないが、ＨＩＶ−１亜型（またはクレード）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｏを含むＨＩＶ−１亜型（またはクレード）に由来する。他の実施形態において、抗原は、これに限定されるわけではないが、Ａ／Ｂ、Ａ／Ｅ、Ａ／Ｇ、Ａ／Ｇ／Ｉなどを含むＨＩＶ−１循環組み換え形（ＣＲＦ）に由来する。ある実施形態において、レトロウイルス抗原は、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｘ、ｔａｔ、ｒｅｘ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、およびｖｐｒから選択される。ある実施形態において、ＨＩＶ抗原は、ｇａｇ（ｐ２４ｇａｇおよびｐ５５ｇａｇ）、ｅｎｖ（ｇｐ１６０およびｇｐ４１）、ｐｏｌ、ｔａｔ、ｎｅｆ、ｒｅｖ  ｖｐｕミニタンパク質、（好ましくはｐ５５  ｇａｇおよびｇｐ１４０ｖ欠失）から選択される。ある実施形態において、ＨＩＶ抗原は、以下の株の１つ以上から選択される：ＨＩＶＩＩＩｂ、ＨＩＶＳＦ２、ＨＩＶＬＡＶ、ＨＩＶＬＡＩ、ＨＩＶＭＮ、ＨＩＶ−１ＣＭ２３５、ＨＩＶ−１ＵＳ４、ＨＩＶ−１ＳＦ１６２、ＨＩＶ−１ＴＶ１、ＨＩＶ−１ＭＪ４。ある実施形態において、抗原は、これに限定されるわけではないが、ＨＥＲＶ−Ｋ（「古い」ＨＥＲＶ−Ｋおよび「新しい」ＨＥＲＶ−Ｋ）を含む内因性ヒトレトロウイルスに由来する。
【０２４１】
レオウイルス：ウイルス抗原は、これに限定されるわけではないが、レオウイルス、たとえばオルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、またはコルチウイルスに由来するものを含む。ある実施形態において、レオウイルス抗原は、構造タンパク質λ１、λ２、λ３、μ１、μ２、σ１、σ２、もしくはσ３、または非構造タンパク質σＮＳ、μＮＳ、もしくはσ１ｓから選択される。ある実施形態において、レオウイルス抗原は、ロタウイルスに由来する。ある実施形態において、ロタウイルス抗原は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４（または切断生成物ＶＰ５およびＶＰ８）、ＮＳＰ１、ＶＰ６、ＮＳＰ３、ＮＳＰ２、ＶＰ７、ＮＳＰ４、またはＮＳＰ５から選択される。ある実施形態において、ロタウイルス抗原は、ＶＰ４（または切断生成物ＶＰ５およびＶＰ８）、およびＶＰ７を含む。
【０２４２】
パルボウイルス：ウイルス抗原は、これに限定されるわけではないが、ボカウイルスおよびパルボウイルス、たとえばパルボウイルスＢ１９に由来するものを含む。ある実施形態において、パルボウイルス抗原は、ＶＰ−１、ＶＰ−２、ＶＰ−３、ＮＳ−１およびＮＳ−２から選択される。ある実施形態において、パルボウイルス抗原は、カプシドタンパク質ＶＰ１またはＶＰ−２である。ある実施形態において、抗原はウイルス様粒子（ＶＬＰ）に処方される。
【０２４３】
デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）：ウイルス抗原は、これに限定されるわけではないが、ＨＤＶ、特にＨＤＶからのδ抗原に由来するものを含む。
【０２４４】
Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）：ウイルス抗原は、これに限定されるわけではないが、ＨＥＶに由来するものを含む。
【０２４５】
Ｇ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）：ウイルス抗原は、これに限定されるわけではないが、ＨＧＶに由来するものを含む。
【０２４６】
ヒトヘルペスウイルス：ウイルス抗原は、これに限定されるわけではないが、ヒトヘルペスウイルス、たとえば単なる一例として、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）、およびヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）に由来するものを含む。ある実施形態において、ヒトヘルペスウイルス抗原は、前初期タンパク質（α）、初期タンパク質（β）、および後期タンパク質（γ）から選択される。ある実施形態において、ＨＳＶ抗原は、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２株に由来する。ある実施形態において、ＨＳＶ抗原は、糖タンパク質ｇＢ、ｇＣ、ｇＤおよびｇＨ、融合タンパク質（ｇＢ）、または免疫回避タンパク質（ｇＣ、ｇＥ、またはｇＩ）から選択される。ある実施形態において、ＶＺＶ抗原は、コア、ヌクレオカプシド、外被、またはエンベロープタンパク質から選択される。生弱毒化ＶＺＶワクチンが市販されている。ある実施形態において、ＥＢＶ抗原は、初期抗原（ＥＡ）タンパク質、ウイルスカプシド抗原（ＶＣＡ）、および膜抗原（ＭＡ）の糖タンパク質から選択される。ある実施形態において、ＣＭＶ抗原は、カプシドタンパク質、エンベロープ糖タンパク質（たとえばｇＢおよびｇＨ）、および外被タンパク質から選択される。他の実施形態において、ＣＭＶ抗原は、以下のタンパク質：
【０２４７】
【化１０−２】
0005781929.tif 000013
の１つ以上から選択され得る。ＣＭＶ抗原は、１つ以上のＣＭＶタンパク質の融合物、たとえば単なる一例として、ｐｐ６５／ＩＥ１（Ｒｅａｐら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００７）２５：７４４１−７４４９）でもあり得る。ある実施形態において、抗原はウイルス様粒子（ＶＬＰ）に処方される。
【０２４８】
パポバウイルス：抗原は、これに限定されるわけではないが、パポバウイルス、たとえばパピローマウイルスおよびポリオーマウイルスに由来するものを含む。ある実施形態において、パピローマウイルスは、ＨＰＶ血清型１、２、４、５、６、８、１１、１３、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４１、４２、４７、５１、５７、５８、６３および６５を含む。ある実施形態において、ＨＰＶ抗原は、血清型６、１１、１６または１８に由来する。ある実施形態において、ＨＰＶ抗原は、カプシドタンパク質（Ｌ１）および（Ｌ２）、またはＥ１〜Ｅ７、またはその融合物から選択される。ある実施形態において、ＨＰＶ抗原はウイルス様粒子（ＶＬＰ）に処方される。ある実施形態において、ポリオーマウイルス（Ｐｏｌｙｏｍｙａｖｉｒｕｓ）ウイルスは、ＢＫウイルスおよびＪＫウイルスを含む。ある実施形態において、ポリオーマウイルス抗原は、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３から選択される。
【０２４９】
アデノウイルス：抗原は、アデノウイルスに由来するものを含む。ある実施形態において、アデノウイルス抗原は、アデノウイルス血清型３６（Ａｄ−３６）に由来する。ある実施形態において、抗原は、Ａｄ−３６コートタンパク質をコードするタンパク質配列もしくはペプチド配列またはその断片に由来する（ＷＯ２００７／１２０３６２）。
【０２５０】
アレナウイルス：ウイルス抗原は、これに限定されるわけではないが、アレナウイルスに由来するものを含む。
【０２５１】
本明細書で提供する免疫原性組成物と併せて考慮される、Ｖａｃｃｉｎｅｓ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｐｌｏｔｋｉｎ  ａｎｄ  Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｄ．２００４）；Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍｕｒｒａｙら、ｅｄ．２００２）；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ  ｅｄ．１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ．１９９１）に含まれる抗原、組成物、方法、および微生物がさらに提供される。
【０２５２】
（真菌抗原）
本明細書で提供する免疫原性組成物で使用する真菌抗原は、これに限定されるわけではないが、下に示す真菌の１つ以上に由来するものを含む。
【０２５３】
真菌抗原は：
【０２５４】
【化１１】
0005781929.tif 000014
を含む皮膚糸状菌に由来し；ならびに
真菌病原体は、
【０２５５】
【化１２−１】
0005781929.tif 000015
に由来して；あまり一般的でないものは、
【０２５６】
【化１２−２】
0005781929.tif 000016
マラセチア種、フォンセケア種、ワンギエラ種、スポロトリクス種、バシジオボラス種、コニディオボラス種、リゾープス種、ムコール種、アブシディア種、モルチエレラ種、カニングハメラ種、サクセネア種、アルタナリア種、カーブラリア種、ヘルミントスポリウム種、フザリウム種、アスペルギルス種、ペニシリウム種、モノリニア種、リゾクトニア種、ペシロマイセス種、ピソマイセス種、およびクラドスポリウム種である。
【０２５７】
ある実施形態において、真菌抗原を産生するプロセスは、細胞壁が実質的に除去されたかまたは少なくとも部分的に除去された真菌細胞から得られる不溶性画分から可溶化画分が抽出および分離される方法を含み、プロセスが：生真菌細胞を入手するステップと；細胞壁が実質的に除去されたかまたは少なくとも部分的に除去された真菌細胞を入手するステップと；細胞壁が実質的に除去されたかまたは少なくとも部分的に除去された真菌細胞を破裂させるステップと；不溶性画分を入手するステップと；不溶性画分から可溶化画分を抽出および分離するステップと；を含むことを特徴とする。
【０２５８】
（原生動物（ｐｒｏｔａｚｏａｎ）抗原／病原体）
本明細書で提供する免疫原性組成物で使用する原生動物（ｐｒｏｔａｚｏａｎ）抗原／病原体は、これに限定されるわけではないが、以下の原生動物：Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ，Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉ，Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ，Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ  ｃａｙａｔａｎｅｎｓｉｓおよびトキソプラズマの１つ以上に由来するものを含む。
【０２５９】
（植物抗原／病原体）
本明細書で提供する免疫原性組成物で使用する植物抗原／病原体は、これに限定されるわけではないが、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓに由来するものを含む。
【０２６０】
（ＳＴＤ抗原）
ある実施形態において、本明細書で提供する免疫原性組成物は、性感染症（ＳＴＤ）に由来する１つ以上の抗原を含む。ある実施形態において、このような抗原は、クラミジア、陰部ヘルペス、肝炎（ＨＣＶなど）、陰部疣贅、淋病、梅毒および／または軟性下疳などのＳＴＤに対する予防法を提供する。他の実施形態において、このような抗原は、クラミジア、陰部ヘルペス、肝炎（ＨＣＶなど）、陰部疣贅、淋病、梅毒および／または軟性下疳などのＳＴＤの治療法を提供する。このような抗原は、１つ以上のウイルス性または細菌性ＳＴＤに由来する。ある実施形態において、ウイルス性ＳＴＤ抗原は、ＨＩＶ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、および肝炎（ＨＣＶ）に由来する。ある実施形態において、細菌性ＳＴＤ抗原は、Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ，Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ，Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ，Ｅ．ｃｏｌｉ，およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅに由来する。これらの病原体に由来する特異的抗原の例は上に記載されている。
【０２６１】
（呼吸器抗原）
ある実施形態において、本明細書で提供する免疫原性組成物は、呼吸器疾患を引き起こす病原体に由来する１つ以上の抗原を含む。単なる一例として、このような呼吸器抗原は、オルソミクソウイルス（インフルエンザ）、ニューモウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（ＰＩＶ）、モルビリウイルス（麻疹）、トガウイルス（風疹）、ＶＺＶ、およびコロナウイルス（ＳＡＲＳ）などの呼吸器ウイルスに由来する。ある実施形態において、呼吸器抗原は、呼吸器疾患を引き起こす細菌、たとえば単なる一例として、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、およびＭｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓに由来する。これらの病原体に由来する特異的抗原の例は上に記載されている。
【０２６２】
（小児用ワクチン抗原）
ある実施形態において、本明細書で提供する免疫原性組成物は、小児被験体での使用に好適な１つ以上の抗原を含む。小児被験体は通例、約３歳未満、または約２歳未満、または約１歳未満である。小児用抗原は、６か月、１、２または３年の期間にわたって複数回投与される。小児用抗原は、小児集団を標的とし得るウイルスおよび／または小児集団が感染しやすいウイルスに由来する。小児用ウイルス抗原は、これに限定されるわけではないが、オルソミクソウイルス（インフルエンザ）、ニューモウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（ＰＩＶおよびムンプス）、モルビリウイルス（麻疹）、トガウイルス（風疹）、エンテロウイルス（ポリオ）、ＨＢＶ、コロナウイルス（ＳＡＲＳ）、および水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）の１つ以上に由来する抗原を含む。小児用細菌抗原は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群ストレプトコッカス）、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ（破傷風）、Ｃｏｒｎｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（ジフテリア）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ（Ｈｉｂ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群ストレプトコッカス）、およびＥ．ｃｏｌｉの１つ以上に由来する抗原を含む。これらの病原体に由来する特異的抗原の例は上に記載されている。
【０２６３】
（高齢者または免疫無防備状態の個体での使用に好適な抗原）
ある実施形態において、本明細書で提供する免疫原性組成物は、高齢者または免疫無防備状態の個体での使用に好適な１つ以上の抗原を含む。このような個体は、標的化抗原に対するその免疫応答を改善するために、より高用量で、またはアジュバント化処方物を用いて、より頻繁にワクチン接種する必要があり得る。高齢者または免疫無防備状態の個体での使用を標的とした抗原は、以下の病原体：Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群ストレプトコッカス）、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ（破傷風）、Ｃｏｒｎｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（ジフテリア）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ（Ｈｉｂ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群ストレプトコッカス）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、オルソミクソウイルス（インフルエンザ）、ニューモウイルス（ＲＳＶ）、パラミクソウイルス（ＰＩＶおよびムンプス）、モルビリウイルス（麻疹）、トガウイルス（風疹）、エンテロウイルス（ポリオ）、ＨＢＶ、コロナウイルス（ＳＡＲＳ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の１つ以上に由来する抗原を含む。これらの病原体に由来する特異的抗原の例は上に記載されている。
【０２６４】
（青年期用ワクチンでの使用に好適な抗原）
ある実施形態において、本明細書で提供する免疫原性組成物は、青年期被験体での使用に好適な１つ以上の抗原を含む。青年期には、以前に投与された小児用抗原の追加免疫が必要である。青年期での使用に好適である小児用抗原は上に記載されている。加えて青年期は、性行為の開始前に防御または治療免疫を確実にするために、ＳＴＤ病原体に由来する抗原を受容する標的とされる。青年期での使用に好適であるＳＴＤ抗原は上に記載されている。
【０２６５】
（腫瘍抗原）
ある実施形態において、腫瘍抗原またはがん抗原は、本明細書で提供する免疫原性組成物と併せて使用される。ある実施形態において、腫瘍抗原は、ペプチド含有腫瘍抗原、たとえばポリペプチド腫瘍抗原または糖タンパク質腫瘍抗原である。ある実施形態において、腫瘍抗原は、糖含有腫瘍抗原、たとえば糖脂質腫瘍抗原またはガングリオシド腫瘍抗原である。ある実施形態において、腫瘍抗原は、ポリペプチド含有腫瘍抗原、たとえばＲＮＡベクター構築物またはプラスミドＤＮＡなどのＤＮＡベクター構築物を発現する、ポリヌクレオチド含有腫瘍抗原である。
【０２６６】
本明細書で提供する免疫原性組成物と合せた使用に適切な腫瘍抗原は、多種多様の分子、たとえば（ａ）ポリペプチド（たとえば長さが８〜２０アミノ酸に及ぶことが可能であるが、この範囲外の長さも一般的である）、リポポリペプチドおよび糖タンパク質を含む、ポリペプチド含有腫瘍抗原、（ｂ）多糖、ムチン、ガングリオシド、糖脂質および糖タンパク質を含む、糖含有腫瘍抗原、ならびに（ｃ）抗原ポリペプチドを発現するポリヌクレオチドを含む。
【０２６７】
ある実施形態において、腫瘍抗原はたとえば、（ａ）がん細胞と結合された全長分子、（ｂ）欠失、付加および／または置換部分を有する分子を含む、そのホモログおよび修飾形、ならびに（ｃ）その断片である。ある実施形態において、腫瘍抗原は組み換え形で提供される。ある実施形態において、腫瘍抗原はたとえば、ＣＤ８＋リンパ球によって認識されるクラスＩ制限抗原またはＣＤ４＋リンパ球によって認識されるクラスＩＩ制限抗原を含む。
【０２６８】
ある実施形態において、腫瘍抗原は、これに限定されるわけではないが、（ａ）がん精巣抗原、たとえばＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ２、ＳＣＰ１ならびにＲＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥおよびＭＡＧＥファミリーポリペプチド、たとえばＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、およびＭＡＧＥ−１２（たとえば黒色腫、肺、頭頸部、ＮＳＣＬＣ、乳房、胃腸、および膀胱の腫瘍を処置するために使用することができる）、（ｂ）変異抗原、たとえばｐ５３（各種の固形腫瘍、たとえば結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がんに関連）、ｐ２１／Ｒａｓ（たとえば黒色腫、膵臓がんおよび結腸直腸がんに関連）、ＣＤＫ４（たとえば黒色腫に関連）、ＭＵＭ１（たとえば黒色腫に関連）、カスパーゼ−８（たとえば頭頸部がんに関連）、ＣＩＡ  ０２０５（たとえば膀胱がんに関連）、ＨＬＡ−Ａ２−Ｒ１７０１、ベータカテニン（たとえば黒色腫に関連）、ＴＣＲ（たとえばＴ細胞非ホジキンリンパ腫に関連）、ＢＣＲ−ａｂｌ（たとえば慢性骨髄性白血病に関連）、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ＫＩＡ  ０２０５、ＣＤＣ−２７、およびＬＤＬＲ−ＦＵＴ、（ｃ）過剰発現抗原、たとえばガレクチン４（たとえば結腸直腸がんに関連）、ガレクチン９（たとえばホジキン病に関連）、プロテイナーゼ３（たとえば慢性骨髄性白血病に関連）、ＷＴ  １（たとえば各種の白血病に関連）、炭酸脱水酵素（たとえば腎がんに関連）、アルドラーゼＡ（たとえば肺がんに関連）、ＰＲＡＭＥ（たとえば黒色腫に関連）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（たとえば乳がん、結腸がん、肺がんおよび卵巣がんに関連）、アルファ−フェトタンパク質（たとえば肝細胞腫に関連）、ＫＳＡ（たとえば結腸直腸がんに関連）、ガストリン（たとえば膵臓がんおよび胃がんに関連）、テロメラーゼ触媒タンパク質、ＭＵＣ−１（たとえば乳がんおよび卵巣がんに関連）、Ｇ−２５０（たとえば腎細胞癌腫に関連）、ｐ５３（たとえば乳がん、結腸がんに関連）、および癌胎児性抗原（たとえば乳がん、肺がん、および消化管のがん、たとえば結腸直腸がんに関連）、（ｄ）共通抗原、たとえば黒色腫−メラニン細胞分化抗原、たとえばＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ  Ａ、ｇｐ１００、ＭＣ１Ｒ、メラニン細胞刺激ホルモン受容体、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質−１／ＴＲＰ１およびチロシナーゼ関連タンパク質−２／ＴＲＰ２（たとえば黒色腫に関連）、（ｅ）前立腺関連抗原、たとえば前立腺がんに関連する、たとえばＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＨ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ２、（ｆ）免疫グロブリンイディオタイプ（たとえば骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫に関連）、ならびに（ｇ）他の腫瘍抗原、たとえば（ｉ）糖タンパク質、たとえばシアリルＴｎおよびシアリルＬｅｘ（たとえば乳がんおよび結腸直腸がんに関連）ならびに各種のムチン；糖タンパク質は担体タンパク質にカップリングされる（たとえばＭＵＣ−１はＫＬＨにカップリングされる）；（ｉｉ）リポポリペプチド（たとえば脂質部分に連結されたＭＵＣ−１）；（ｉｉｉ）担体タンパク質（たとえばＫＬＨ）にカップリングされた多糖（たとえばＧｌｏｂｏ  Ｈ合成６糖��、（ｉｖ）担体タンパク質（たとえばＫＬＨ）にカップリングされたガングリオシド、たとえばＧＭ２、ＧＭ１２、ＧＤ２、ＧＤ３（たとえば脳腫瘍、肺がん、黒色腫に関連）を含む、ポリペプチド含有抗原および糖含有抗原を含む。
【０２６９】
ある実施形態において、腫瘍抗原は、これに限定されるわけではないが、ｐ１５、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、Ｈ−Ｒａｓ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタインバーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、Ｅ６およびＥ７を含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルス抗原、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス抗原、ＴＳＰ−１８０、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｍｎ−２３Ｈ１、ＴＡＧ−７２−４、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  ７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、ｐ１６、ＴＡＧＥ、ＰＳＣＡ、ＣＴ７、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１  Ｔｇｐ７２、ベータ−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ  １２５、ＣＡ  １５−３（ＣＡ  ２７．２９／ＢＣＡＡ）、ＣＡ  １９５、ＣＡ  ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８／ＫＰ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０（Ｍａｃ−２結合タンパク質／シクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳなどを含む。
【０２７０】
本明細書で提供する免疫原性組成物と併せて使用するポリヌクレオチド含有抗原は、上に挙げた抗原などのポリペプチドがん抗原をコードするポリヌクレオチドを含む。ある実施形態において、ポリヌクレオチド含有抗原は、これに限定されるわけではないが、インビボでポリペプチドがん抗原を発現することができるＤＮＡまたはＲＮＡベクター構築物、たとえばプラスミドベクター（たとえばｐＣＭＶ）を含む。
【０２７１】
ある実施形態において腫瘍抗原は、変異または改変細胞成分に由来する。改変の後、細胞成分はその調節機能をもはや行わず、それゆえ細胞は制御されない増殖を経験し得る。改変細胞成分の代表的な例は、これに限定されるわけではないが、ｒａｓ、ｐ５３、Ｒｂ、ウィルムス腫瘍遺伝子によってコードされた改変タンパク質、ユビキチン、ムチン、ＤＣＣ、ＡＰＣ、およびＭＣＣ遺伝子によってコードされたタンパク質ならびに受容体または受容体様構造、たとえばｎｅｕ、甲状腺ホルモン受容体、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体、インスリン受容体、上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体、およびコロニー刺激因子（ＣＳＦ）受容体を含む。
【０２７２】
細菌およびウイルス抗原は、がんの処置のために、本発明の組成物と併せて使用され得る。特に担体タンパク質、たとえばＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ抗原は、がんの処置のために、本発明の化合物と併せて／コンジュゲーションして使用され得る。がん抗原併用療法は、既存の療法と比較して、効力および生物学的利用能の向上を示す。
【０２７３】
がんまたは腫瘍抗原に関する追加の情報は、たとえばＭｏｉｎｇｅｏｎ（２００１）Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：１３０５−１３２６；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：３８０−３８４；Ｄｅｒｍｉｎｅら（２００２）Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．６２：１４９−１６２；Ｅｓｐｉｎｏｚａ−Ｄｅｌｇａｄｏ（２００２）Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  ７（ｓｕｐｐｌ  ３）：２０−３３；Ｄａｖｉｓら（２００３）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．２３：３−２９；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｙｎｄｅら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：６７４−６８１；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １８：１７５−１８２；Ｏｆｆｒｉｎｇａら（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：５７６−５８２；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０：２８１−２８７；Ｓａｈｉｎら（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：７０９−７１６；Ｏｌｄら（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：１１６３−１１６７；Ｃｈａｕｘら（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：７６７−７７８；Ｇｏｌｄら（１９６５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２２：４６７−４６８；Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４５：１−６；Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４５：１０−１９；Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １８：１０５−１０７；Ｚｈａｏら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：６７−７４；Ｔｈｅｏｂａｌｄら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１１９９３−１１９９７；Ｇａｕｄｅｒｎａｃｋ（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２：３−９；ＷＯ９１／０２０６２；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，０１５，５６７；ＷＯ０１／０８６３６；ＷＯ９６／３０５１４；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，８４６，５３８；およびＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，８６９，４４５に見出すことができる。
【０２７４】
（Ｃ．標的化リガンド）
一実施形態により、両親媒性ペプチドおよび脂質によって形成された粒子は、標的、たとえば受容体または細胞マーカーなどの細胞表面構造などと結合することができる。たとえば、アポリポタンパク質Ａ１の特性を模倣することができる上述の両親媒性ペプチドは、ＳＲＢ−１受容体との相互作用が可能であり得て、それゆえＳＲＢ−１受容体を担持する細胞への標的化送達に好適である。
【０２７５】
しかし最適な標的（たとえば体区画、器官、細胞タイプまたは腫瘍）への組成物の標的化送達を提供できるようにするために、組成物が標的化リガンドを含むことが好都合である。各標的化リガンドによって、最適な標的、たとえば特異的な体区画、器官、組織または腫瘍への組成物の標的化送達が可能となる。さらに、標的化リガンドは、最適な細胞（たとえば抗原提示細胞、たとえば樹状細胞、単球、マクロファージなど）中への標的特異的取り込みを可能にし得る。これに限定されるわけではないが、各標的に対して特異的な抗体および抗体断片、アンチカリン、アプタマー、小型分子、天然および非天然炭水化物、ペプチドおよびポリペプチドなどの結合分子を標的化リガンドとして使用することを含む方法によって、たとえば葉酸およびアシアロ糖タンパク質受容体、グルコサミノグリカンおよび腫瘍細胞で発現される各種の受容体およびマーカーの標的化などの標的送達を提供するために、各種の方法を使用することができる。リンパ組織も標的化され得る。
【０２７６】
標的化リガンドが、両親媒性ペプチドおよび脂質によって形成された粒子と結合され得る複数の手法が使用され得る。
【０２７７】
一実施形態により、標的化リガンドは親油性アンカーを含む。標的化リガンドはそれゆえ、親油性アンカーが脂質コア中に挿入されるときに、各親油性アンカーを介して粒子に固着される。親油性アンカーは、標的化リガンドに直接、または適切なリンカー構造の使用によって連結することができる。図１２は、粒子標的化のために有用な、ある脂質付加標的化モチーフを示す。
【０２７８】
さらなる実施形態により、標的化リガンドは免疫原性種に連結される。これは直接結合／カップリングによってかまたは適切なリンカー基の使用によって行うことができる。非共有結合もこの出願の範囲内である。
【０２７９】
さらなる実施形態により、標的化リガンドは、両親媒性ペプチドの少なくとも１つと結合または会合される。これはたとえば非共有または共有結合によって行うことができる。再度、適切なリンカー基を使用することができる。
【０２８０】
たとえば図１１は、本発明の両親媒性ペプチドを官能化するための実施形態を図で示す。リシン側鎖があり、それゆえ化学修飾に利用しやすい、両親媒性ペプチドが示されている。リシン側鎖はアルキンによって修飾され、それゆえ標的化リガンドＴＬを結合するためのアンカー部位を与え、この場合、（たとえば１，２，３−トリアゾールを与えるためのアジドと末端または内部アルキンとの間の１，３−双極子環化付加である、アジド−アルキンヒュスゲン環化付加を介した）１，２，３−トリアゾールの形成を引き起こす、アジド官能基を有する標的化リガンドが示されている。
【０２８１】
上述の手法の組み合せも可能であり、本発明の範囲内である。
【０２８２】
（Ｄ．親油性アンカー）
上述のように標的化リガンド、捕集剤および／または、免疫原性種を両親媒性ペプチドおよび脂質によって形成された粒子と結合するために使用できる親油性アンカーは、たとえばとりわけ（ａ）コレステロール、（ｂ）疎水性脂肪酸および（ｃ）胆汁酸誘導体から成る群より選択することができる。
【０２８３】
各基は、本発明による粒子の脂質への固着を達成するために有用であることが示されている。コレステロールなどの脂質アンカーは、免疫原性種、標的化リガンドおよび／または捕集剤を粒子に固く固着させるために特に有用であることが示されている。疎水性脂肪酸が使用されるとき、親油性アンカーが強い疎水性であり、たとえば少なくとも１８個の炭素原子を有する、たとえば少なくとも１つの長鎖アルキルおよび／またはアルケニル鎖を有する場合、それは特に有用である。疎水性基を含む胆汁酸誘導体を使用することも可能である。たとえばステアロイル、ドコサニルおよびリトコレイック−オレオイルラジカルは、好適な親油性アンカーである。
【０２８４】
一実施形態により、親油性アンカーは、標的化リガンド、捕集剤および／または免疫原性種に、たとえばジスルフィド架橋を含む切断可能なリンカーを介して結合される。本実施形態は、免疫原性種を固着するのに特に有用である。好ましくは、酸切断可能性であるリンカーが使用される。親油性アンカーを介して粒子に結合された免疫原性種は、標的細胞に進入するときにエンドソーム中に含有されることが仮定される。酸切断可能性リンカーの使用は、リンカーがエンドソーム中での進入／処理時に切断されて、それにより免疫原性種を放出するという利点を有する。これにより担体粒子からの免疫原性種の放出が単純化される。本実施形態は、粒子の脂質に特に固く結合する親油性アンカーの使用も可能とする。固い固着によって、粒子からの免疫原性種の望ましくない／意図しない離脱が防止される。
【０２８５】
酸に不安定な生分解性リンカーの例は、化学基、たとえばアセタール、ケタール、オルトエステル、イミン、ヒドラゾン、オキシム、エステル、Ｎ−アルコキシベンジルイミダゾール、エノールエーテル、エノールエステル、エンアミド、カーボネート、マレアマートおよび当業者に公知のその他を含有するリンカーを含む。別の例は、プロテアーゼの基質であることが公知のペプチド配列を含有するリンカーである。
【０２８６】
（Ｅ．組成物および処方物）
少なくとも１つの免疫原性種の担体として使用するための、両親媒性ペプチドおよび脂質の粒子を含む組成物も、本発明によって提供される。各粒子は、少なくとも１つの免疫原性種を脊椎動物被験体、特にヒトに送達するために特に有用である。送達は好ましくは全身性または局所である。各粒子の詳細事項は両親媒性ペプチド、脂質の性質、ならびに標的化リガンドおよび固着部分の潜在的な使用を含めて上で詳細に記載されており、免疫原性種の運搬および送達に使用することができるこの出願による組成物にも適用される。送達／運搬のために、両親媒性ペプチドおよび脂質を含む粒子は、送達される免疫原性種も含む組成物を得るために、少なくとも１つの免疫原性種と混合される。
【０２８７】
本発明により、上で概説したような組成物（たとえば、免疫原性種が装填され得るか、または装填されない場合もある、両親媒性ペプチドおよび脂質の粒子を含む組成物）および１つ以上の多種多様の追加成分を含む製薬組成物も提供される。製薬組成物はそれゆえ、追加成分として、１つ以上の製薬的に許容される賦形剤を含み得る。たとえば液体ビヒクル、たとえば水、生理食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、エタノールなどが使用され得る。他の賦形剤、たとえば湿潤剤または乳化剤、張度調整剤、生物学的緩衝物質などが存在し得る。生物学的緩衝剤は、薬理学的に許容され、処方物に所望のｐＨ、すなわち生理学的範囲内のｐＨを与える、実質的にいずれの種でも可能である。緩衝系の例は、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ハンクス緩衝生理食塩水などを含む。最終投薬形によって、結合剤、崩壊剤、充填剤（希釈剤）、潤滑剤、滑剤（流動促進剤）、圧縮助剤、甘味料、着香料、保存料、懸濁化剤／分散剤、フィルム形成剤／コーティングなどを含む当分野で公知の他の賦形剤も導入することができる。
【０２８８】
ある実施形態において、本発明による製薬組成物は凍結乾燥される。
【０２８９】
ある実施形態において、本発明による製薬組成物は、少なくとも１つの界面活性剤、少なくとも１つの凍結保護剤、または両方を含む。凍結保護剤の例は、とりわけポリオール、炭水化物およびその組み合せを含む。界面活性剤の例は、とりわけ非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、および両性イオン界面活性剤を含む。たとえば粒子サイズの許容できない増大を伴わずに（たとえば望ましくない著しい凝集を伴わずに）凍結乾燥組成物を再懸濁させるために、界面活性剤および／または凍結保護剤が添加され得る。
【０２９０】
両親媒性ペプチド、脂質および少なくとも１つの免疫原性種を含む、この出願による組成物を産生する方法も提供される。
【０２９１】
たとえばメタノールなどの好適な溶媒で両親媒性ペプチドのストック溶液が調製され得る。脂質のストック溶液もメタノールなどの好適な溶媒で調製され得る。ペプチド対脂質の代表的な重量比は、他の値の中でも、１：０．５〜１：５、さらに通例は１：１〜１：２の範囲である。上で概説したように、脂質は、リポタンパク質構造を模倣すると考えられるペプチドを用いて粒子を形成する。脂質をペプチドと混合するために、脂質をペプチドと完全に混合する目的で混合物をボルテックス処理することができる。ペプチドおよび／または脂質がメタノールなどのアルコール中に含まれる場合、アルコールは成分を混合した後に蒸発されるだろう。ペプチドおよび脂質によって形成されたフィルムを乾燥させて、その後、両親媒性ペプチドおよび脂質を含む粒子を形成するために、好適な液体（たとえば生理食塩水または緩衝溶液、たとえばとりわけリン酸緩衝食塩水）によって水和させる。水和の後、ペプチド濃度は、他の値の中でも、有益には、２〜４ｍｇ／ｍｌに及ぶ。脂質濃度は通例、１〜２０ｍｇ／ｍｌに及び、この量は通例、ペプチド濃度およびペプチドの脂質に対する所望の重量比によって決定される。
【０２９２】
いくつかの実施形態において、（たとえば上の脂質および両親媒性ペプチドストック溶液で使用されるような溶媒、たとえばメタノール、またはメタノールと混和性である溶媒、たとえば塩化メチレンにおける）免疫原性種の溶液を脂質および両親媒性ペプチドストック溶液と混合して、乾燥させ、再水和して、本発明による両親媒性ペプチドおよび脂質を含む装填粒子を形成する。たとえば下の実施例１０および１３を参照。
【０２９３】
いくつかの実施形態において、免疫原性種は、本発明による両親媒性ペプチドおよび脂質を含む非装填粒子の存在下で、（たとえば免疫原性種をさらに疎水性にするために、または免疫原性種の疎水性部分を露出させるために）合成または修飾される。たとえば下の実施例１２、１４および１５を参照。
【０２９４】
他の実施形態において、免疫原性種を担持する最終粒子の結合を可能にするために、本発明による両親媒性ペプチドおよび脂質を含む非装填粒子を少なくとも１つの免疫原性種と接触させる。たとえば少なくとも１つの疎水性または両親媒性免疫原性種の溶液は、非装填粒子に（粒子がもはや免疫原性種を取り込まないことを示す）溶液が混濁を開始する時点まで添加され得る。
【０２９５】
免疫原性種がたとえば親油性アンカーを含む場合、各アンカーは一実施形態により、それぞれ修飾された化合物が粒子に接触させられる前に免疫原性種に結合させられる。アンカーの結合は、たとえば上述のような化学修飾によって遂行することができる。ある適用では、上述のような切断可能リンカーを使用することが好都合である。親油性アンカーを担持する少なくとも１つの免疫原性種を両親媒性ペプチドおよび脂質を含む粒子と混合するときに、少なくとも１つの免疫原性種の親油性アンカーが粒子の脂質コア中に挿入されて（たとえば自己集合プロセスによって）、それにより少なくとも１つの免疫原性種が粒子と結合する。
【０２９６】
別の実施形態において、免疫原性種は、両親媒性ペプチドおよび脂質を含む粒子への露出の前に、親油性アンカーと非共有的に結合される。たとえば、免疫原性種は、免疫原性種と結合するための親水性ヘッドおよび粒子の脂質コア中への挿入のために親油性アンカーを含む捕集剤と非共有的に結合されることができる。
【０２９７】
反対に、親油性アンカーは粒子内に提供され得る。たとえば粒子の脂質コア中に挿入される親油性アンカーおよび免疫原性種の捕捉のために続いて利用できる親水性ヘッドを含む捕集剤を含む粒子を形成することができる（または粒子は、粒子形成の後および免疫原性種への露出の前にこのような捕集剤に露出させることができる）。たとえば上記の捕集剤は、負に荷電した免疫原性種（たとえばＤＮＡ、ＲＮＡなど）を、それへの露出時に結合／捕捉するカチオン性脂質であり得る。免疫原性種についての上述した技法と類似して、たとえば捕集剤は、粒子形成時に存在し得るか、または前もって形成された粒子に導入され得る。
【０２９８】
ある実施形態において、カチオン性脂質（たとえばカチオン性両親媒性物質）は、とりわけ以下から選択され得る：塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）、塩化ベンゼトニウム、セトリミド（ｃｅｔｒａｍｉｄｅ）（テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドならびにおそらく少量のドデシル（ｄｅｄｅｃｙｌ）トリメチルアンモニウムブロミドおよびヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドを含有する）、セチルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）およびセチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）、１級アミン、２級アミン、３級アミン（これに限定されるわけではないがＮ，Ｎ’，Ｎ’−ポリオキシエチレン（１０）−Ｎ−タロウ−１，３−ジアミンプロパンを含む）、他の４級アミン塩（これに限定されるわけではないが、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチル−アンモニウムブロミド、混合アルキル−トリメチル−アンモニウムブロミド、ベンジルジメチルドデシルアンモニウムクロリド、ベンジルジメチルヘキサデシル−アンモニウムクロリド、ベンジルトリメチルアンモニウムメトキシド、セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、メチルベンゼトニウムクロリド、デカメトニウムクロリド、メチル混合トリアルキルアンモニウムクロリド、メチルトリオクチルアンモニウムクロリド）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［２（２−メチル−４−（１，１，３，３テトラメチルブチル）−フェノキシ］−エトキシ）エチル］−ベンゼンメタンアミニウムクロリド（ＤＥＢＤＡ）、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ，トリメチルアンモニウムクロリドを含む）、１，２−ジアシル−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（アシル基＝ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイルジオレオイル）、１，２−ジアシル−３（ジメチルアンモニオ）プロパン（アシル基＝ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル）、１，２−ジオレオイル−３−（４’−トリメチル−アンモニオ）ブタノイル−ｓｎ−グリセロール、１，２−ジオレオイル３−スクシニル−ｓｎ−グリセロールコリンエステル、コレステリル（４’−トリメチルアンモニオ）ブタノアート）、Ｎ−アルキルピリジニウム塩（たとえばセチルピリジニウムブロミドおよびセチルピリジニウムクロリド）、Ｎ−アルキルピペリジニウム塩、ジカチオン性ボラ型電解質（Ｃ１２Ｍｅ６；Ｃ１２Ｂｕ６）、ジアルキルグリセチルホスホリルコリン、リゾレシチン、Ｌ−ａジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、コレステロールヘミサクシネートコリンエステル、リポポリアミン（これに限定されるわけではないが、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノール−アミドスペルミン（ＤＰＰＥＳ）、リポポリ−Ｌ（またはＤ）−リシン（ＬＰＬＬ、ＬＰＤＬ）、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミンにコンジュゲートされたポリ（Ｌ（またはＤ）−リシンを含む）、ペンダントアミノ基を有するジドデシルグルタメートエステル（Ｃｌ２ＧｌｕＰｈＣｎＮ＋）、ペンダントアミノ基を有するジテトラデシルグルタメートエステル（Ｃｌ４ＧｌｕＣｎＮ＋）、これに限定されるわけではないが、コレステリル−３β−オキシスクシンアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル−３β−オキシスクシンアミドエチレンジメチルアミン、コレステリル−３β−カルボキシアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル−３β−カルボキシアミドエチレンジメチルアミン、および３ガンマ−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔａｎｅ）カルバモイル］コレステロール）（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）を含むコレステロールのカチオン誘導体。
【０２９９】
本発明で使用するための他のカチオン性脂質は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ２００８／００８５８７０（２００８年４月１０日）および２００８／００５７０８０（２００８年３月６日）に記載された化合物を含む。
【０３００】
反対に、捕集剤は、正に荷電した免疫原性種を、それへの露出時に結合／捕捉するアニオン性脂質であり得る。ある実施形態において、アニオン性脂質（たとえばアニオン性両親媒性物質）は、とりわけ以下から選択され得る：ホスファチジルセリンケノデオキシコール酸ナトリウム塩、デヒドロコール酸ナトリウム塩、デオキシコール酸、ドキュセートナトリウム塩、グリコール酸ナトリウム塩、グリコリトコール酸３−硫酸２ナトリウム塩、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、ドデシル硫酸リチウム、１−オクタンスルホン酸ナトリウム塩、１−デカンスルホン酸ナトリウム、１−ドデカンスルホン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、タウロケノデオキシコール酸ナトリウム塩、タウロリソコール酸３−硫酸２ナトリウム塩、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸ナトリウム塩、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸ナトリウム塩、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸ナトリウム塩、ドデカン酸ナトリウム塩およびオクタデカン酸ナトリウム塩。
【０３０１】
上からわかるように、本発明の各種の実施形態において、粒子形成に続いて１つ以上の追加の種が添加され得る。たとえば捕集剤、免疫原性種などの医薬品（たとえば、結合した親油性アンカー、捕集剤などを含むかまたは含まない抗原、免疫アジュバントなど）、張度および／またはｐＨを調整する薬剤、界面活性剤、凍結保護剤などは、粒子形成に続いて添加され得る。これらの追加の種は、粒子に水性溶液または分散物として添加されることが多い。得られた混合物は、いくつかの実施形態において、以前に記載したように凍結乾燥され得る。
【０３０２】
本発明のいくつかの実施形態による組成物は、粒子形成の前後の任意の時点に、たとえば粒子形成の後であるが、任意の追加の種の添加の前に、粒子形成の後および任意の追加の種の添加後などに、（たとえば２００ミクロンフィルタを使用して）滅菌濾過することができる。
【０３０３】
反対に荷電された種（たとえばＲＮＡ、ＤＮＡなどのポリヌクレオチドなど）が装填された粒子に荷電された捕集剤（たとえばカチオン性脂質など）を使用すると、たとえば、５０ｎｍ以下〜１００ｎｍ〜２５０ｎｍ〜５００ｎｍ〜１０００ｎｍ〜２５００ｎｍ〜５０００ｎｍ〜１０００ｎｍまたはそれ以上に及ぶ制御された凝集サイズ（すなわち凝集幅）を有する、粒子凝集を引き起こせることが観察されている。理論に束縛されることを望むものではないが、この効果は、（粒子に固着されている）荷電された捕集剤と反対に荷電された種との間の静電引力によるものであると考えられる。このような実施形態において、たとえば免疫原性種の符号に合せるために（捕集剤と比較して過剰な免疫原性種が使用される場合）または捕集剤の符号に合せるために（たとえば免疫原性種と比較して過剰な捕集剤が使用される場合）各凝集体の外面の電荷を修飾することができる。凝集サイズは、様々な一連のパラメータによって、特に他のパラメータの中でも、たとえば混合される溶液中での様々な塩濃度によって、混合される溶液中での種の様々な濃度によって、および溶液が混合される様々な条件（たとえば高速混合対低速混合）によって修飾され得る。
【０３０４】
（Ｆ．投与）
以前に示したように、本発明による組成物は、各種の疾患および障害（たとえば病原体感染、腫瘍など）の処置のために投与することができる。本明細書で使用する場合、「処置」は、以下のいずれかを指す：（ｉ）問題の病原体または障害の予防（たとえばがんまたは病原体感染、従来のワクチンと同様）、（ｉｉ）問題の病原体または障害に関連する症状の低減または排除、および（ｉｉｉ）問題の病原体または障害の実質的または完全な排除。それゆえ処置は、予防的に（問題の病原体または障害の出現前に）または治療的に（その出現後に）遂行され得る。
【０３０５】
本発明による組成物は通例、１回以上の用量で製薬的有効量が脊椎動物被験体に投与される。本発明による組成物の「有効量」は、興味のある疾患または障害を処置するための、組成物の十分な量を指す。必要とされる正確な量は、他の因子のなかでも、たとえば被験体の種、年齢、および全身状態；処置される状態の重症度；免疫応答の場合の、被験体の免疫系が、たとえば抗体を合成する能力、および所望の防御の程度；ならびに投与様式；に応じて被験体ごとに変化する。任意の個別の症例での適切な有効量は、当業者によって決定され得る。それゆえ有効量は通例、通常の試行によって決定できる比較的広い範囲に収まる。
【０３０６】
本発明による組成物は、非経口的に、たとえば（無針であり得る）注射によって投与することができる。組成物はたとえば皮下に、皮内に、筋肉内に、静脈内に、動脈内に、または腹腔内に注射することができる。他の投与様式は、鼻内、粘膜、眼内、経直腸、経膣、経口および経肺投与、ならびに経真皮または経皮適用を含む。
【０３０７】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、部位特異的標的化送達に使用することができる。たとえば組成物の静脈内投与は、肺、肝臓、脾臓、血液循環、または骨髄への標的化に使用することができる。
【０３０８】
処置は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールに従って行われ得る。複数回投与スケジュールは、たとえば１〜１０回の別個の用量と、それに続く治療応答を維持および／また強化するために選択されたその後の時間間隔で与えられる他の用量、たとえば１〜４ヶ月後に２回目の用量、必要な場合には、数ヵ月後にその後の用量とによって与えられ得る、１次投与過程におけるスケジュールである。投薬レジメンは、少なくとも一部は、被験体の必要性および医療実務者の判断によっても決定される。
【０３０９】
さらに疾患の予防が所望である場合、組成物は、興味のある感染または障害の１次発生の出現前に一般に投与される。他の形の処置、たとえば症状または再発の低減または排除が所望である場合、組成物は、興味のある感染または障害の１次発生の出現に続いて一般に投与される。
【０３１０】
以下の実施例は、本発明をさらに例証することを意図しており、本発明に対する制限として解釈されるべきではない。
【実施例】
【０３１１】
（実施例）
（実施例１−使用した物質）
ＰＯＰＣはＣｈｅｍｉ（Ｂａｓａｌｍｏ，Ｉｔａｌｙ）から、ＤＯＰＣ、ＤＭＰＣおよびＤＰＰＣはＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）から、ペプチド配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５はＡｍｅｒｉｃａｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｍｐａｎｙ  Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）からであり、メタノールＨＰＬＣグレードはＡｃｒｏｓ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）からであり、ＤｉＩは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からであり、ヒトＨＤＬ、ＬＤＬおよびＶＬＤＬはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）からである。
【０３１２】
（実施例２−粒子の調製）
ペプチドおよび脂質のストック溶液は、メタノールによって１０ｍｇ／ｍｌの濃度で作製する。ストック溶液の必要な一定分量をガラスバイアルに移し、１：０．８７７〜１：７（重量比４：１〜１：２）に及ぶペプチド対脂質モル比を得る。混合物にボルテックス処理を行い、メタノールを回転蒸発器（ｒｏｔｏｖａｐ）で蒸発させて、透明な脂質−ペプチドフィルムを得る。滅菌濾過通常生理食塩水を用いてペプチド濃度２ｍｇ／ｍｌでフィルムを水和することによって、粒子を得る。
【０３１３】
（実施例３−動的光散乱による粒子サイズの測定）
水和によって形成された粒子は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ  ＭＡ）での、後方散乱角度１７３°における動的光散乱により、粒子サイズを記述する。測定には非希釈粒子を使用する。
【０３１４】
配列番号１のペプチドを使用してペプチド対脂質モル比が１：１．７５、１：３および１：７の粒子を形成し、動的光散乱によってサイズを記述して、数平均をｎｍで、続いて多分散指数をカッコ内に報告する：（ａ）脂質ＰＯＰＣを用いてそれぞれ５．８０ｎｍ（０．１）、１５．８０ｎｍ（０．１５）および１９．９２ｎｍ（０．２７）、（ｂ）脂質ＤＯＰＣを用いてそれぞれ８．２８ｎｍ（０．４）、１１．２６ｎｍ（０．１６）および１．７２×１０４ｎｍ（１．０）、（ｃ）脂質ＤＰＰＣを用いてそれぞれ１０．０４ｎｍ（１．０）、１７．３４ｎｍ（０．７６）および４６．１４（０．６７）、ならびに（ｄ）脂質ＤＭＰＣを用いてそれぞれ、５．２４ｎｍ（０．１５）、５．５１ｎｍ（０．１６）および７．１２ｎｍ（０．０５）。
【０３１５】
他の両親媒性ペプチド（配列番号２、３および４）も、脂質ＰＯＰＣによる粒子形成について評価する。粒子をペプチド対脂質モル比１：１．７５、１：３および１：７で形成し、動的光散乱によって粒子サイズを記述して、数平均をｎｍで、続いて多分散指数をカッコ内に報告する：（ａ）ペプチド配列番号２を用いてそれぞれ、５．２１ｎｍ（０．７）、５．７０ｎｍ（０．６８）および２７．８２ｎｍ（０．６３）、（ｂ）ペプチド配列番号３を用いてそれぞれ、４．６７ｎｍ（０．１）、８．１８ｎｍ（０．１３）および５．９５×１０４ｎｍ（１．０）、ならびに（ｃ）ペプチド配列番号４を用いてそれぞれ、５．２４ｎｍ（０．２１）、６．２６ｎｍ（０．２３）および８．７４ｎｍ（０．５７）。
【０３１６】
（実施例４−サイズ排除クロマトグラフィー）
粒子は、Ａｋｔａ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ９００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でｓｕｐｅｒｐｏｓｅ−６カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してサイズ分けを行う。粒子は容積約４０ｍｌを、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウムによって流速０．５ｍｌ／分にて溶出する。溶出液の０．５ｍｌ画分を９６ウェルプレート（ＡからＨまでの８行および１から１２までの１２列を備えた）中に、Ａ１から開始してＡ１２まで、続いて行ＢからＨまでの行方式で収集する。データは２１５ｎｍ、２５４ｎｍおよび２８０ｎｍにて収集する。ストークス径が既知の低および高分子量ゲル濾過マーカーの混合物を同様の条件下で流す。粒子のサイズは、試料の溶出容積を標準の溶出容積と比較することによって決定する。
【０３１７】
ペプチド配列番号１および脂質ＰＯＰＣによる粒子をペプチド対脂質モル比１：１．７５、１：３および１：７で調製して、サイズ排除クロマトグラフィーによって記述する（図１を参照）。粒子の溶出ピーク画分（溶出容積（ｍｌ））およびストークス径（ｎｍ）は以下の通りである：（ａ）モル比１：１．７５にて粒子はＤ３（１９．３９ｍｌ）で溶出され、ストークス径２．９２ｎｍを有した、（ｂ）モル比１：３にて粒子はＣ１２〜Ｄ１（１８．１４ｍｌ）で溶出され、ストークス径４．７０ｎｍを有した、および（ｃ）モル比１：７にて粒子はＣ９（１６．３９ｍｌ）で溶出され、ストークス径７．２０ｎｍを有した。
【０３１８】
（実施例５−タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）による濃縮）
サイズ排除の後に、ＭｉｃｒｏＫｒｏｓ中空繊維（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓ）を使用して粒子を濃縮する。この目的のために、５０ＫＤカットオフＭｉｃｒｏｋｒｏｓモジュールを使用する。系内での試料の連続流のために、ルアーロック試料ポートを蠕動（ｐｅｒｉｓｔａｌｉｔｉｃ）ポンプに接続する。指定されたルアーロックを収集される濾液または廃液に接続する。系全体の空隙容量を減少させるために、最小直径の管を使用してすべての接続を行う。試料の容積が空隙容量と等しいかまたは空隙容量よりも小さいときに、濃縮プロセス全体は停止され、停止は系内への気泡の導入によって示される。ＭｉｃｒｏＫｒｏｓフィルタは使用前に通常生理食塩水によって予め濡らされている。
【０３１９】
ペプチド配列番号１および脂質ＰＯＰＣからモル比１：１．７５で作製した粒子を使用する。ペプチド濃度８ｍｇ／ｍｌの粒子約２００μｌをＳｕｐｅｒｏｓｅカラムに注入して、サイズ排除を行う（図２を参照）。ピーク画分Ｃ９〜Ｄ９を合せて６．５ｍｌとして、ＴＦＦによって２ｍｌまで濃縮する。プールした画分について動的光散乱によって粒子サイズを記述して、数平均をｎｍで、続いて多分散指数をカッコ内に５．６ｎｍ（０．２４２）として報告し、濃縮後には粒子のこれらのパラメータは、６．６９ｎｍ（０．４２４）であり、無処理粒子（サイズ排除クロマトグラフィー前）のこれらのパラメータ５．８０ｎｍ（０．１）に匹敵することを見出した。これらのデータは、粒子および特にそのサイズが、粒子が濃縮されたときに変化しないことを証明している。それゆえ粒子は非常に安定であり、先の条件下では実質的な量の凝集体または他の人工生成物を形成しない。粒子は滅菌濾過することができ、なお安定なままであることも示している。
【０３２０】
（実施例６−ペプチドおよび脂質含有量のためのＳＥＣ画分分析）
プール／濃縮された画分のペプチド含有量は、２１５ｎｍにおけるＵＶ吸光度によって分析する。脂質含有量は、リン脂質の判定のための比色酵素アッセイである、リン脂質Ｃ試薬（Ｗａｋｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、日本）を使用して推定する。色原体の吸光度は６００ｎｍにて測定する。
【０３２１】
ペプチド配列番号１および脂質ＰＯＰＣからモル比１：１．７５で作製した粒子約２００μｌをスーパーポーズカラムにペプチド濃度８ｍｇ／ｍｌで注入する（図２を参照）。サイズ排除の後、ピーク画分Ｃ９〜Ｄ９を合せて、ＴＦＦによって濃縮する。サイズ排除後に、プールされた画分は、ペプチド１．２７ｍｇおよび脂質０．３５ｍｇを有することが推定される。ＴＦＦの後に、残余分（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）はペプチド０．９２ｍｇおよび脂質０．３５ｍｇを含有しており、ペプチド０．０４ｍｇが濾過廃液中に見出される。
【０３２２】
（実施例７−ＮＭＲによる粒子の記述）
核オーバーハウザー効果分光法（ｎｕｃｌｅａｒ  ｏｖｅｒｈｏｕｓｅｒ  ｅｆｆｅｃｔ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＮＯＥＳＹ））、２−Ｄ  ＮＭＲを使用してペプチド−脂質相互作用を研究し、形成された粒子は１−Ｄ  ＮＭＲによって評価する。ペプチド−脂質フィルムを上述のように調製して、ｐＨ６．２３、３７℃の、９０％ｖ／ｖ  Ｈ２Ｏおよび１０％ｖ／ｖ  Ｄ２Ｏによる５ｍＭリン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）緩衝液を使用して水和させる。ペプチド配列番号１および脂質ＰＯＰＣ（モル比１：１．７５）から濃度２ｍｇ／ｍｌで形成された粒子を使用して、Ｂｒｕｋｅｒ−Ｂｉｏｓｐｉｎ  ＮＭＲで６００ＭＨｚにてデータを収集する。
【０３２３】
ＮＯＥＳＹはスピンの双極子相互作用を使用してプロトンを相関させ、この相関はプロトン間の距離に依存し、距離が５Å未満のときにのみＮＯＥシグナルが観察される。粒子のスペクトルは、ＮＨ−ＮＨ  ＮＯＥシグナルを有し、このシグナルによってα−プロトンのα−プロトンに対する相互作用が示され、ペプチドのらせん構造が確認される（図３を参照）。粒子の２−Ｄ  ＮＭＲでは、６〜９ｐｐｍからのｘ軸次元は芳香族環およびペプチド（Ｎ−Ｈ）主鎖からのプロトンを示し、０〜５ｐｐｍからのＹ軸次元は、脂質およびペプチドの側鎖のプロトンからのシグナルを示す。芳香族アミノ酸の、チロシン（Ｙ−６．９９、７．２２ｐｐｍ）、およびフェニルアラニン（Ｆ−７．３１ｐｐｍ）の、ならびに脂質の、残りから分離された４．５ｐｐｍにおける２重結合連結プロトンのプロトン帰属は、１−Ｄ  ＮＭＲから公知である（図４を参照）。６．９９、７．２２および７．３１ｐｐｍ（ｘ次元）の４．５ｐｐｍ（Ｙ次元）との交点におけるＮＯＥシグナルは、芳香族アミノ酸のプロトンと、脂質の２重結合連結プロトンとの間の相互作用を示す（図５を参照）。
【０３２４】
（実施例８−サイズ排除による粒子のインビトロ安定性）
粒子の安定性を研究するために、粒子をヒトリポタンパク質（ＨＤＬ、ＬＤＬおよびＶＬＤＬ）の存在下で共インキュベート（ｃｏ−ｉｎｃｕｂａｔｅ）して、サイズ排除クロマトグラフィーによって記述する。ペプチド対脂質モル比が１：１．７５の粒子を使用する。最終ペプチド濃度が１ｍｇ／ｍｌの粒子を個々のリポタンパク質０．５ｍｇ／ｍｌとインキュベートして、サイズ排除カラムに注入する。粒子はＨＤＬと共溶出（ｃｏ−ｅｌｕｔｅ）されることが見出されるが、ＬＤＬおよびＶＬＤＬと共に注入すると別個のピークとして存在することがわかる。どちらの場合でも、粒子ピークのわずかなシフトを観察する（図６Ａ〜６Ｃを参照）。
【０３２５】
（実施例９−示差走査熱量測定による粒子のインビトロ安定性）
示差走査熱量測定を使用して、ペプチドおよび粒子に関連するアンフォールディングイベントを研究する。この技法を使用して、試料および参照の温度を上昇させるために必要とされる熱の量を測定し、これは、より多くの熱が参照と同じ温度で維持するために試料によって必要とされる相転移温度でのピークを生じさせる。タンパク質の場合、タンパク質の半分が折り畳まれていない状態で存在する溶融温度が決定される。
【０３２６】
配列番号１のペプチドを使用してペプチド対脂質（ＰＯＰＣ）モル比１：１．７５、１：３および１：７の粒子を形成して、ペプチド濃度１．１１ｍｇ／ｍｌおよび脂質濃度０．５５ｍｇ／ｍｌの粒子を使用する。ペプチドのみおよび脂質のみを対照として使用して、試料を２０℃〜１３０℃まで走査する。
【０３２７】
図７Ａ〜７Ｂは、ペプチドおよび粒子の示差走査熱量測定を示す。プロットは、（ａ）１．１１ｍｇ／ｍｌにおける配列番号１のペプチドの、（ｂ）配列番号１のペプチドおよび脂質ＰＯＰＣからペプチド対脂質モル比１：１．７５、１：３および１：７、粒子中のペプチド濃度１．１１ｍｇ／ｍｌで作製した粒子の溶融曲線を示す。ペプチドおよび粒子の試料はすべて通常生理食塩水中で作製した。得られたＤＳＣ曲線は、５０℃におけるペプチド単独の相転移を示し、ペプチド対脂質モル比が１：１．７５の粒子では、１０５℃にて相転移を観察し、ペプチド対脂質モル比が１：３および１：７の粒子では、９３℃の相転移を観察する。それゆえこれらの図は、粒子が９０℃超のかなり高い融点を有することを示している。この安定性は、工業的な大規模生産および粒子の取り扱いにとって所望である。
【０３２８】
（実施例１０−ＮＬＰＰ中へのリポペプチドの組み込み）
脂質（ＰＯＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＭＰＣおよびＤＰＰＣ）をＳｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｔａｌｙ）から入手して、メタノールＨＰＬＣグレードをＳｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｔａｌｙ）から入手した。ペプチドは配列番号１に相当する。リポペプチド、パルミトイル−Ｃｙｓ（２［Ｒ］，３−ジラウロイルオキシ−プロピル）−Ａｂｕ−Ｄ−Ｇｌｕ−ＮＨ２を合成して、カルボン酸として提供した（ワックス状固体）：
【０３２９】
【化１３】
0005781929.tif 000017
式中、＊で示したキラル中心はＲ立体配置にあり、＊＊で示したキラル中心はＳ立体配置にある。このリポペプチドは本明細書でリポペプチド１（Ｌｉｐｏ１）と呼ばれ、その合成は、参照により本明細書に組み入れられている、ＢａｓｃｈａｎｇらへのＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，６６６，８８６の実施例１６に記載されている。
【０３３０】
ペプチドおよび脂質のストック溶液は、メタノール中で１０ｍｇ／ｍｌの濃度で作製した。リポペプチドストック溶液をメタノールによって３ｍｇ／ｍＬの濃度で作製した。ストック溶液の必要な一定分量をガラスバイアルに移し、所望のペプチド：脂質：リポペプチド重量比を得た。混合物にボルテックス処理を行い、メタノールを回転蒸発器で蒸発させて、透明な脂質−ペプチドフィルムを得た。約１０ｍＭに相当するリポペプチド濃度１ｍｇ／ｍｌを達成するために、添加した滅菌濾過通常生理食塩水を用いてフィルムを水和することによって、粒子を得た。
【０３３１】
水和によって形成された粒子は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ  ＭＡ）での、後方散乱角度１７３°における動的光散乱により、粒子サイズを記述した。測定には非希釈粒子を使用した。以下では、数平均サイズをｎｍで、続いて多分散指数をカッコ内に報告する：（ａ）脂質ＰＯＰＣを用いたペプチド：脂質：リポペプチド重量比１：０：１  サイズ１６．９ｎｍ（０．９）；（ｂ）脂質ＰＯＰＣを用いたペプチド：脂質：リポペプチド重量比１：０．５：１  サイズ１１．４０ｎｍ（０．６）（ｃ）脂質ＰＯＰＣを用いたペプチド：脂質：リポペプチド重量比１：０．７５：１  サイズ６３．８ｎｍ（１）；（ｄ）脂質ＤＭＰＣを用いたペプチド：脂質：リポペプチド重量比１：０．５：０．５  サイズ８９ｎｍ（０．６）；（ｅ）脂質ＤＯＰＣを用いたペプチド：脂質：リポペプチド重量比１：０．５：０．５  サイズ６００ｎｍ（０．２）；および（ｆ）脂質ＤＰＰＣを用いたペプチド：脂質：リポペプチド重量比１：０．５：０．５  サイズ５５７ｎｍ（０．４）。
【０３３２】
（実施例１１−ＴＬＲ２発現細胞でのインビトロ活性）
ルシフェラーゼ遺伝子がＮＦｋＢ依存性プロモータの制御下にあるレポーターベクターを安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３−ＮＦ−κＢＬｕｃ細胞）を次のように得た：ホタルルシフェラーゼ読み取り枠（ＯＲＦ）のｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、ｐＮＦｋＢリポーターベクター（Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）にサブクローニングしてｐＮＦｋＢ−ｌｕｃレポーターベクターを得た。ＨＥＫ２９３細胞をｐＮＦｋＢ−ｌｕｃリポーターベクターおよびｐＴＫ−ｐｕｒｏ発現ベクターで共トランスフェクト（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）して、選択抗生物質のピューロマイシン（５ｕｇ／ｍｌ）の存在下で培養した。個々の抵抗性クローンを選択して、増殖させて、正の刺激による刺激作用に対するルシフェラーゼ発現／活性について試験を行った。さらなる研究のためにクローンＬＰ５８を選択した。
【０３３３】
これらの細胞（クローンＬＰ５８）に、製造者の説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を使用して、ＮＨ２端にＦＬＡＧエピトープを含有するヒトＴＬＲ２および選択のためのハイグロマイシン耐性遺伝子をコードするｐｃＤＮＡ３．１−Ｈｙｄｒｏ−ＦＬＡＧ−ｈＴＬＲ２プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を選択抗生物質のハイグロマイシン（２５０μｇ／ｍｌ）の存在下で培養して、個々の耐性クローンを選択し、増殖させて、ＴＬＲ２特異的作用物質ＰＡＭ３ＣＳＫ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いた刺激作用へのルシフェラーゼの発現について試験した。さらなる研究のためにクローン６を選択した。ＨＥＫ２９３−ＦＬＡＧ−ＴＬＲ２−ＮＦ−κＢ−Ｌｕｃ細胞。
【０３３４】
細胞（クローン６）は、１０％熱不活性化ＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、５μｇ／ｍｌピューロマイシンおよび２５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンを添加した、４５００ｍｇ／ｌグルコースを含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。ルシフェラーゼアッセイでは、ＨＥＫ２９３トランスフェクタントをマイクロクリア９６ウェルプレートにおいて、選択抗生物質の非存在下の完全培地９０μｌ（２５×１０３細胞／ウェル）中に播種した。一晩インキュベーションした後、細胞を２連で異なる刺激（１０μｌ／ウェル）を用いて６時間刺激した。次に培地を捨て、細胞をＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）２０μｌによって室温にて２０分間溶解させた。ルシフェラーゼレベルは、１００μｌ／ウェルのルシフェラーゼアッセイ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加によって、ＬＭａｘ  ＩＩ３８４マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して測定した。各試料からの生の発光単位（ｒａｗ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔ（ＲＬＵ））（２個の平均）を対照試料（ＰＢＳ）のＲＬＵで割り、増加倍率（Ｆｏｌｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ（ＦＩ））で表す。ＰＢＳに溶解させたＰＡＭ３ＣＳＫ４をＴＬＲ２トランスフェクト細胞の活性化のための正の対照として使用した。ＰＡＭ３ＣＳＫ４は、（Ｓ）−［２，３−ビス（パルミトイルオキシ）−（２−ＲＳ）−プロピル］−Ｎ−パルミトイル−（Ｒ）−Ｃｙｓ−（Ｓ）−Ｓｅｒ−（Ｓ）−Ｌｙｓ４−ＯＨである。使用した形は、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎから入手可能な３塩酸塩の形である。これは、細菌リポタンパク質のアシル化アミノ端を模倣する合成トリパルミトイル化リポペプチドであり、ヒトおよびマウスＴＬＲ２の選択的作用物質である。Ｊ．Ｍｅｔｚｇｅｒら．；Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３７，４６（１９９１）およびＡ．Ｏ．Ａｌｉｐｒａｎｔｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５（５４２８）：７３６−７３９（１９９９）を参照。
【０３３５】
異なる種類の空のＮＬＰＰ（リポペプチドを含まない）で、ＴＬＲ２トランスフェクタントを刺激するその能力を試験して、図１３に示すようにＰＡＭ３ＣＳＫ４および超音波処理リポペプチドによる刺激作用と比較した。刺激作用は、高濃度のＰＯＰＣ含有ＮＬＰＰによってのみ観察できた。
【０３３６】
次にリポペプチドを含有する種々のＮＬＰＰに対するＴＬＲ２細胞の応答を評価した。図１４を参照。リポペプチドを含有するすべての形のＮＬＰＰで用量依存性応答を観察した。しかし最良の応答は、ＰＯＰＣを含有するＮＬＰＰによって誘導され、これは、超音波処理リポペプチドおよびＴＬＲ２ベンチマーク活性化因子のＰＡＭ３ＣＳＫ４の両方と比較して高い活性を示した。
【０３３７】
（実施例１２−ヒト末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）およびマウス脾細胞に対するインビトロ活性）
ヒトＰＢＭＣのための完全培地は次の通りである：１０％熱不活性化ＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭグルタミンを添加したＲＭＰＩ１６４０培地。マウス脾細胞のための完全培地は次の通りである：２−メルカプトエタノール５０ｕＭが追加された、２．５％熱不活性化ＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭグルタミンを添加したＲＭＰＩ１６４０培地。ヒトＰＢＭＣは、健康なドナーの血液からＦｉｃｏｌｌ勾配を使用して精製した。マウス脾細胞は、Ｂａｌｂ／ｃマウスの脾臓から次のように精製した：脾臓を粉砕して、細胞をセルストレーナー（ｓｔｒａｉｎｅｒ）で濾過した；細胞を完全培地で１回洗浄して、ＬＣＫ緩衝液（ＮＨ４Ｃｌ  １５５ｍＭ、ＫＨＣＯ３  １ｍＭ、ＥＤＴＡ−２Ｎａ  ０．１ｍＭ、ｐＨ７．４）で２分間再懸濁させて赤血球を溶解させ、洗浄して、完全培地で再懸濁させた。両方の種類の初代細胞を９６ウェル平底プレート（１×１０５／ウェル）の培地１８０μｌ中に播種して、２連で刺激した（２０μｌ／ウェル）。２０時間後、上清を収集して、Ｍｅｓｏｓｃａｌｅキットを製造者の説明書に従って使用して、分泌されたサイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）の多重測定を行った。ＰＢＳに溶解させたＰＡＭ３ＣＳＫ４を初代ヒトおよびマウス細胞の活性化のための正の対照として使用した。様々な種類の空のＮＬＰＰ（Ｌｉｐｏ１を含まない）を、ヒトＰＢＭＣ（図１９）およびマウス脾細胞（図２０）を刺激するその能力について試験して、それをＰＡＭ３ＣＳＫ４および超音波処理Ｌｉｐｏ１による刺激作用と比較した。刺激作用は、ＰＢＭＣ（図１９に示すＩＬ−６産生）およびマウス脾細胞（図２０に示すＩＬ−８産生）の両方で、高濃度のＰＯＰＣ含有ＮＬＰＰによってのみ観察できた。次にＬｉｐｏ１を含有する種々のＮＬＰＰに対する応答をヒトＰＢＭＣ（図２１）またはマウス脾細胞（図２２）で評価した。リポペプチドＬｉｐｏ１を含有するすべての形のＮＬＰＰについて、ヒトＰＢＭＣによるＩＬ−６産生で用量依存性応答が観察されたが、最良の応答をＮＬＰＰ−ＰＯＰＣによって誘導した（図２１）。リポペプチドＬｉｐｏ１を含有するＮＬＰＰ−ＰＯＰＣは、マウス脾細胞からのＩＬ−８放出を誘導することができたが、これらの細胞に対する効果を、リポペプチドＬｉｐｏ１を含有するその他すべての種類のＮＬＰＰでは観察しなかった（図２２）。
【０３３８】
（実施例１３−ＲＳＶ  ＦのＮＬＰＰ中への組み込み）
１：４比のペプチド：ＤＭＰＣ  ＮＬＰＰを上述のように調製した。すなわち１：４のペプチド：ＤＭＰＣ重量比、ＰＢＳによって、バルク粒子１０ｍｇ／ｍＬに相当する２ｍｇ／ｍＬペプチド濃度まで水和させて（実施例４を参照）、試料を水で５００マイクログラム／ｍｌまたは２００マイクログラム／ｍｌのどちらかまで希釈する。希釈した試料をグロー放電炭素被覆グリッド（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）上に装填して、グリッドを水で洗浄し、０．７５％ギ酸ウラニル（ｕｒｉｎａｌ  ｆｏｒｍａｔｅ）染料（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。画像は、ＪＯＥＬ  ＪＥＭ−１２００ＥＸ電子顕微鏡で電圧８０ｋＶおよび倍率約３０，０００×を用いて記録した。
【０３３９】
１：４のペプチド：ＤＭＣＰ比を含有するＮＬＰＰのＥＭ分析を行った。５００ｍｃｇｓ／ｍｌで装填したＮＬＰＰは、直線様式でのＮＬＰＰスタッキングを示した。ＮＬＰＰ試料を２００ｍｃｇｓ／ｍｌまで希釈したとき、ディスクはさらに分散されて、サイズは約１５〜２５ｎｍであった。
【０３４０】
フューリン切断部位が変異した膜貫通領域欠失６−ＨＩＳタグ融合ＲＳＶ  Ｆタンパク質（Ｄｅｌｐ２３  Ｆｕｒｄｅｌ）をＥｘｐｒｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のＨｉＦｉｖｅ昆虫細胞で発現させて、ＨｉＴｒａｐキレート化カラムおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐ２００  １６／６０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。さらに詳細には、バキュロウイルス形成のために、膜貫通ドメインが欠失して、その天然フューリン切断部位に変異を持つＨＩＳタグ化ＲＳＶ  Ｆ構築物（Ｄｅｌｐ２３  Ｆｕｒｄｅｌ）をｐＦａｓｔＢａｃプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングした。
【０３４１】
ヘキサヒスチジンタグを有するＲＳＶ  Ｆ  Ｄｅｌｐ２３  Ｆｕｒｄｅｌは、以下の配列を有する：
【０３４２】
【化１４】
0005781929.tif 000018
（記号「−」は、この位置のアミノ酸が欠失していることを示す）（配列番号８）。
【０３４３】
Ｓｆ９細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、バキュロウイルスストックを高力価まで増幅した。タンパク質はＨｉＦｉｖｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で発現され、継代数３のバキュロウイルスストック約１０ｍｌを２×１０６／ｍｌのＨｉＦｉｖｅ細胞１リットルごとに添加した。発現を約７２時間の間進行させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用の細胞／培地懸濁物の一定分量を採取した後に、細胞を３０００ｒ．ｐ．ｍ．で約３０分間遠心分離して培地から細胞をペレット化することによって、細胞を収集した。硫酸銅（ＩＩ）を最終濃度５００マイクロモルまで培地に添加して、銅を含む培地１リットルを約１５ｍｌのキレート化ＩＭＡＣ樹脂（ＢｉｏＲａｄ  Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ）に添加した。重力カラムを使用して、タンパク質結合樹脂を通過画分から分離した。樹脂を少なくとも樹脂の１０倍の容積の平衡緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌ）によって洗浄して、タンパク質を少なくとも樹脂の１０倍の容積の溶出緩衝液（２５ｍＭトリス  ｐＨ７．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール）によって溶出させた。溶出した試料をＥＤＴＡを含まない完全プロテアーゼ阻害剤（Ｐｉｅｒｃｅ）およびＥＤＴＡによって最終濃度１ｍＭまでスパイクした。溶出溶液を４℃にて１６倍の容積の平衡緩衝液に対して少なくとも２回透析した。Ｎｉ＋＋を事前に装填した１または２個のＨｉＴｒａｐキレート化カラムに溶出した試料を装填して（発現１０リットルには、通例１個の５ｍｌカラムで十分であった）、タンパク質を、以下の勾配プロフィール：（ａ）６０ｍｌにわたって０〜５％溶出緩衝液、（ｂ）１２０ｍｌにわたって５〜４０％溶出緩衝液および（ｃ）６０ｍｌにわたって４０〜１００％溶出緩衝液、を有する溶出緩衝液の勾配を送達することができる高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）を使用して溶出した（流速２ｍｌ／分）。ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含有する画分は、クマシーおよび／またはウェスタン染色を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を使用して同定した（通例、ＲＳＶ  Ｆは約１７０ｍｌ勾配中に溶出する）。物質を約０．５〜１ｍｇ／ｍｌまで濃縮して、ＥＤＴＡを最終濃度１ｍＭまで添加した。ＦＰＬＣを使用して（画分１ｍｌを収集する）、移動相として平衡緩衝液を用いた１６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、ＲＳＶ  Ｆ物質（保持容積約７５ｍｌ）を昆虫タンパク質混入物（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅ）（保持容積６０ｍｌ）から分離した。高純度ＲＳＶ  Ｆ  Ｄｅｌｐ２３  Ｆｕｒｄｅｌ物質を含有する画分をクマシー染色を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して同定して、関連画分をプールして、最終タンパク質濃度約１ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。
【０３４４】
Ｄｅｌｐ２３  Ｆｕｒｄｅｌ変異は、トリプシン切断を受けやすい、フューリン切断部位に残存するアルギニン残基を有する。結果は、組み換えＦ０種が、融合ペプチドの露出した天然ウイルスＦ１／Ｆ２種に変換されるということである。ＥＭ分析によって、関連する融合タンパク質で観察されているように、その融合ペプチドのためにこの切断がＲＳＶ  Ｆ融合後構築物にロゼットを形成させることを確認した。
【０３４５】
ウシ血清からの凍結乾燥トリプシン（Ｓｉｇｍａ）を懸濁させて、２５ｍＭトリス  ｐＨ７．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌで０．１ｍｇ／ｍｌの濃度まで希釈した。１ｍｇ／ｍｌ  ＲＳＶ  Ｆ  Ｄｅｌｐ２３  Ｆｕｒｄｅｌの溶液を等容積の０．１ｍｇ／ｍｌトリプシン溶液（比０．１：１  トリプシン：ＲＳＶ  Ｆ）で、３７Ｃにて１時間処理した。トリプシン切断前後のＲＳＶ  Ｆ  Ｄｅｌｐ２３  Ｆｕｒｄｅｌ構築物のＥＭ分析は、融合ペプチドの露出のために予想されたように、主に松葉杖形状のトリマーからロゼットへの変化を示す。
【０３４６】
ＮＬＰＰ中に組み込まれたＲＳＶ  Ｆタンパク質を産生するために、上の反応を反復するが、予め形成されたＮＬＰＰ試料をＲＳＶ  Ｆ  Ｄｅｌｐ２３  Ｆｕｒｄｅｌタンパク質に、０．１：１  ＮＬＰＰ：ＲＳＶ  Ｆの質量比で添加する。切断されたＲＳＶ  Ｆ試料を希釈緩衝液で約５０マイクログラム／ｍｌまで希釈して、グロー放電炭素被覆グリッド上に装填し、ＮＬＰＰ試料（上）で行ったようにギ酸ウラニルで染色した。
【０３４７】
予め形成したＮＬＰＰの存在下でＲＳＶ  Ｆ  Ｄｅｌｐ２３  Ｆｕｒｄｅｌをトリプシン消化したときに、いくつかのＲＳＶ  Ｆ分子は、その新たに露出された融合ペプチドのために、ＮＬＰＰの脂質面の中に組み込まれる。（ａ）ＮＬＰＰの非存在下で切断されたＲＳＶ  Ｆロゼットで観察されたもののような、円形に見える種、および（ｂ）ＲＳＶ  Ｆと一致する、細長ディスクの２つの面に結合した、複数の松葉杖形状の分子として出現する種を含む、多様な種の「ロゼット」を観察した。ディスクと結合した松葉杖の測定値は１４８オングストロームであり、ＲＳＶ  Ｆ融合後トリマーの予測長と一致した。ＲＳＶ  Ｆロゼットの中心ディスクの測定値は１６．９ｎｍであり、ＮＬＰＰディスクのみの観察されたサイズの範囲内に一致した。
【０３４８】
（実施例１４−小型分子免疫増強物質（ＳＭＩＰ）化合物を有する粒子の調製）
ペプチド（配列番号１、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）のストック溶液；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン脂質（ＤＭＰＣ，Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ，Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）、および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ，Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）をメタノール中でペプチド濃度１０ｍｇ／ｍＬおよび脂質濃度２０ｍｇ／ｍＬで調製した。ガラスシンチレーションバイアル内でペプチドおよび脂質のストック溶液を：１：０．５〜１：５の範囲のペプチド：ＤＭＰＣ重量比；１：０．５、１：１、および１：２のペプチド：ＰＯＰＣ重量比；ならびに１：０．５、１：１、および１：２のペプチド：ＤＯＰＣ重量比で合わせた。脂質およびペプチドの薄いフィルムを溶媒回転蒸発によって成形して、次に最終ペプチド濃度が２〜４ｍｇ／ｍＬに達する量のリン酸緩衝食塩水で水和させる。
【０３４９】
粒子サイズは、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏ−ＺＳ装置（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ  ＭＡ）を使用して動的光散乱によって決定した。ペプチド：ＤＭＰＣ重量比１：０．５、１：１、１：１．５、１：２、１：３、および１：４における粒子の、散乱強度によって決定されたｚ平均直径、および多分散性（カッコ内）はそれぞれ：７．５５６ｎｍ（０．２５１）、７．９５３ｎｍ（０．０９８）、８．８３９ｎｍ（０．０６７）、１０．１５ｎｍ（０．０８９）、１３．８４ｎｍ（０．１４２）、および３３．２３ｎｍ（０．１７７）であった。
【０３５０】
粒子サイズは、２つの異なる方法を使用して、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定した：（１）Ｓｕｐｅｒｏｓｅ−６  １０／３００  ＧＬクロマトグラフィーカラムを用いた、Ａｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ９００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）および（２）Ｂｉｏ−Ｓｉｌ  ２５０  ＳＥＣ  ＨＰＬＣカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いた、ｅ２６９５  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）。これらの両方の構成で、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度を検出した。
【０３５１】
Ａｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒクロマトグラフィー法では、粒子を移動相（５０ｍＭリン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭ塩化ナトリウム）によって、流速０．５ｍｌ／分で溶出させた。画分を９６ウェル深ブロックプレートに、２ｍＬ刻みで収集した。分子量およびストークス径が既知のタンパク質標準（ゲル濾過標準、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を同じ条件下で流して、試料の保持時間を標準タンパク質の保持時間と比較することによって、粒子サイズを決定した。ＮＬＰＰ粒子をペプチド：ＤＭＰＣ重量比１：３．４、１：３、１：２．５、１：２、１：１．７、１：１、および１：０．８で形成して、リン酸緩衝食塩水で４ｍｇ／ｍＬペプチド濃度まで水和させた。ゲル濾過タンパク質標準のクロマトグラムも参照のために含めている。図１６は、ｅ２６９５  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｍｏｄｕｌｅ法を使用した、ＮＬＰＰ粒子のサイズ排除クロマトグラムを示す。ペプチド：ＤＭＰＣ重量比１：３．４、１：３、１：２．５、１：２、１：１．７、１：１、および１：０．８で調製した粒子のストークス径をそれぞれ、２０．２ｎｍ、１１．０ｎｍ、９．９ｎｍ、９．０ｎｍ、８．３ｎｍ、６．５ｎｍ、および６．０ｎｍとして決定した。
【０３５２】
ｅ２６９５  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｍｏｄｕｌｅ法では、粒子をリン酸緩衝食塩水によって流速１ｍｌ／分にて溶出させた。分子量が既知のタンパク質標準を同じ条件下で流し、試料の保持時間を標準タンパク質の保持時間と比較することによって、粒子サイズを決定した。図１５は、ｅ２６９５  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｍｏｄｕｌｅ法を使用した、ＮＬＰＰ粒子のサイズ排除クロマトグラムを示す。ＮＬＰＰ粒子をペプチド：ＤＭＰＣ重量比１：３．４、１：３、１：２．５、１：２、１：１．７、１：１、および１：０．８で形成して、リン酸緩衝食塩水で４ｍｇ／ｍＬペプチド濃度まで水和させた。遊離ペプチドおよびゲル濾過タンパク質標準のクロマトグラムも参照のために含めている。ペプチド：ＤＭＰＣ重量比１：３．４、１：３、１：２．５、１：２、１：１．７、１：１、および１：０．８で調製した粒子はそれぞれ、カラムから６．８２９分、６．８９７分、７．１０９分、７．２９１分、７．３９４分、７．６２４分、および７．６３２分に溶出した。
【０３５３】
ＳＭＩＰを含有する粒子は、ＳＭＩＰ化合物のストック溶液を塩化メチレンによって濃度５ｕｇ／ｍＬで調製して、適切な容積のストック溶液をガラスドラムバイアル内で上記の脂質−ペプチドメタノール溶液と合せた（ペプチド：ＤＭＰＣ重量比２．５：１）。これらの実験で使用したモデルＳＭＩＰは、２−（４−（イソペンチルオキシ）−２−メチルフェネチル）−８−メチルベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−５−アミン
【０３５４】
【化１５】
0005781929.tif 000019
であった。
【０３５５】
脂質、ペプチドおよびＳＭＩＰを含む薄いフィルムを溶媒回転蒸発によって成形した。フィルムを滅菌リン酸緩衝食塩水１０ｍＬで水和して、ペプチドおよびＳＭＩＰの最終濃度、それぞれ４ｍｇ／ｍＬおよび２５０ｕｇ／ｍＬを達成した。得られた粒子懸濁物を次に、濃縮のためにＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５（１０，０００ＭＷＣＯ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）遠心分離フィルタデバイスの上部リザーバーに移した。デバイスを２，０００ｇで１５分間遠心分離して、残余分および濾液を回収して、次にＳＭＩＰ濃度を分析した。
【０３５６】
画分のＳＭＩＰ濃度をＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ８カラム（２．１×１００ｍｍ；Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）によって測定した。移動相は０〜１００％水−アセトニトリル勾配であり、３２５ｎｍにおける紫外線吸光度によって検出した。同じ方法を使用して、ＳＭＩＰ濃度が既知の標準を流した。
【０３５７】
残余分容積中のＳＭＩＰ濃度は１．２１７ｍｇ／ｍｌであり、検出可能なレベルのＳＭＩＰが濾液中に存在しないことを観察した；残余分中のリン脂質を１．２１７ｍｇ／ｍＬとして決定した。
【０３５８】
サイズ排除クロマトグラフィー画分を収集して（上述のＡｋｔａ  ９００  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ法を使用して）、次に脂質およびＳＭＩＰ含有量を分析した。ピーク画分は、番号５〜９の画分であった。図１７は以下を示す：（ａ）脂質：ＤＭＰＣ比１：２．５で、ＳＭＩＰを濃度１．２ｍｇ／ｍＬで含有するＮＬＰＰ粒子の、サイズ排除クロマトグラム。クロマトグラムピークは、画分５〜９で収集した。（ｂ）ＳＭＩＰおよびリン脂質含有量についてのサイズ排除クロマトグラフィー画分分析。リン脂質およびＳＭＩＰの両方のピーク濃度は同じ画分中に出現しており、これは、ペプチド、脂質、およびＳＭＩＰの共溶出を示している。
【０３５９】
リン脂質は、比色リン脂質Ｃアッセイ試薬キット（Ｗａｋｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、日本）を製造者の説明書に従って、さらなる変更を加えずに使用して定量した。画分５〜９のリン脂質濃度は、順番に：０．０２、０．１、０．２８、０．７６、および１．３ｍｇ／ｍＬであった。この範囲外のいずれの画分でも、リン脂質を検出しなかった（＜０．００１ｍｇ／ｍＬ）。ＳＭＩＰ濃度は、上述の超高速液体クロマトグラフィー法を使用して決定した。画分６〜９のＳＭＩＰ濃度は、順番に：それぞれ３．９、８．３、１４．１、および１８．９ｕｇ／ｍＬであった。画分５では検出可能なレベルのＳＭＩＰが見出されず、さらに他のいずれの画分でも見出されなかった。
【０３６０】
同様の手順を使用して、（ａ）２−（２，４−ジメチルフェネチル）ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−５−アミンが装填された粒子（ペプチド濃度４ｍｇ／ｍｌとＤＭＰＣ（３：１ｗ：ｗ  ＤＭＰＣ：ペプチド）を使用して形成された粒子およびＳＭＩＰ組み込み最大６８ｕｇ／ｍｌを使用）、ならびに（ｂ）イミキモドを装填した粒子（ペプチド濃度４ｍｇ／ｍｌとＤＭＰＣ（３：１ｗ：ｗ  ＤＭＰＣ：ペプチド）を使用して形成された粒子およびＳＭＩＰ組み込み最大６０ｕｇ／ｍｌを使用）を形成した。レシキモドを装填した粒子では、組み込みの程度を判定するのが困難であった。
【０３６１】
本明細書で化合物１（Ｃｐｄ１）とも呼ばれる、２−（４−（イソペンチルオキシ）−２−メチルフェネチル）−８−メチルベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−５−アミンは、次のように調製した。
【０３６２】
（ステップ１：ｔｅｒｔ−ブチル２−ブロモ−５−メチルフェニルカルバメート）
０℃、Ｎ２雰囲気下の２−ブロモ−５−メチルアニリン（１．０当量）のテトラヒドロフラン（０．２Ｍ）溶液に１Ｍ  ＮａＨＭＤＳ（２．５当量）を滴加した。反応物を０℃にて１５分間撹拌して、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネートのテトラヒドロフラン溶液を添加した。反応物を室温まで一晩加温した。溶媒を蒸発させて、得られた残留物を０．１Ｎ  ＨＣｌ水溶液によって反応停止させた。水性懸濁物を酢酸エチルによって２回抽出した。合せた有機層を塩水で洗浄して、無水ＭｇＳＯ４で脱水し、真空中で濃縮した。粗物質は、ヘキサン中０〜５％酢酸エチルを使用した、ＣＯＭＢＩＦＬＡＳＨ（登録商標）システム（ＩＳＣＯ）でのフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、生成物を淡黄色油として得た。
【０３６３】
（ステップ２：ｔｅｒｔ−ブチル５−メチル−２−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニルカルバメート）
ｔｅｒｔ−ブチル２−ブロモ−５−メチルフェニルカルバメート（１．０当量）、４，４，４’，４’，５，５，５’，５’−オクタメチル−２，２’−ビ（１，３，２−ジオキサボロラン）（１．５当量）、ジクロロ［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウム（ＩＩ）（５％）、および酢酸ナトリウム（４．５当量）を、Ｎ２雰囲気下でジオキサン（０．２Ｍ）中で混合した。反応物を１００℃まで加熱して、一晩撹拌した。得られた懸濁物を周囲温度まで冷却して、エーテルで希釈し、セライトで濾過して、濾液を真空中で濃縮した。粗物質は、ヘキサン中０〜８％エーテルを使用した、ＣＯＭＢＩＦＬＡＳＨ（登録商標）システム（ＩＳＣＯ）でのフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、ｔｅｒｔ−ブチル５−メチル−２−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニルカルバメートを得た。
【０３６４】
（ステップ３：３−クロロ−５−（（４−メトキシ−２−メチルフェニル）エチニル）ピコリノニトリル）
隔壁でキャップした丸底フラスコに、１−エチニル−４−メトキシ−２−メチルベンゼン（１．１当量）、３，５−ジクロロピコリノニトリル（１当量）、トリエチルアミン（５当量）、および無水ＤＭＦ（０．２Ｍ）を添加した。真空脱気および窒素洗浄を３回行った。ＣｕＩ（０．０５当量）およびビス（トリフェニルホスフィン）ジクロロ−パラジウム（ＩＩ）（０．０５当量）を添加した。隔壁を還流冷却器で置き換えて、フラスコを窒素雰囲気下で６０℃にて一晩加熱した。ＴＬＣによってモニターした反応の完了時に、フラスコの内容物をヘキサンで予め処理した大型シリカゲルカラムに装填した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ（１：４％））によって、生成物５−（（２−メチル−４−メトキシフェニル）エチニル）−３−クロロピコリノニトリルを得た。
【０３６５】
（ステップ４：２−（（４−メトキシ−２−メチルフェニル）エチニル）−８−メチルベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−５−アミン）
還流冷却器を備えた丸底フラスコに、５−（（２−メチル−４−メトキシフェニル）エチニル）−３−クロロピコリノニトリル（１当量）、ｔｅｒｔ−ブチル２−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニルカルバメート（１．２５当量）、Ｋ３ＰＯ４（２当量）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（０．０５当量）、および２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’，６’−ジメトキシビフェニル（０．１当量）を添加した。ｎ−ブタノールおよび水（５：２、０．２Ｍ）を添加して、内容物を３回脱気した（真空に続いて窒素洗浄）。反応混合物を油浴中、窒素下で１００℃にて一晩激しく撹拌した。内容物を冷却して、水２００ｍＬ中に取り、塩化メチレンによる抽出を続けた。合せた有機層を脱水（Ｎａ２ＳＯ４）して、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２中０〜５０％  ＥｔＯＡｃ）によって、生成物２−（（４−メトキシ−２−メチルフェニル）エチニル）−８−メチルベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−５−アミンを得た。
【０３６６】
（ステップ５：２−（４−メトキシ−２−メチルフェネチル）−８−メチルベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−５−アミン）
丸底フラスコに２−（（４−メトキシ−２−メチルフェニル）エチニル）−８−メチルベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−５−アミン（１当量）をスターリングバー（ｓｔｉｒｒｉｎｇ  ｂａｒ）と共に添加した。エタノールおよび塩化メチレン（１：２、０．２Ｍ）を添加し、続いて炭素担持パラジウム（活性粉末、湿潤、炭素担持１０％、０．１当量）を添加した。内容物に真空脱気と続いての水素洗浄を３回行った。反応混合物を水素バルーン下で室温にて一晩激しく撹拌した。その後、反応混合物をセライトパッドで濾過して、次に、濾液にＵＶ吸収がなくなるまで、セライトパッドを塩化メチレンおよびＥｔＯＡｃで洗浄した。合せた有機洗浄液を濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２中０〜５０％  ＥｔＯＡｃ）によって、生成物２−（４−メトキシ−２−メチルフェネチル）−８−メチルベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−５−アミンを黄色固体として得た。
【０３６７】
（ステップ６：４−（２−（５−アミノ−８−メチルベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−２−イル）エチル）−３−メチルフェノール）
氷浴中の２−（４−メトキシ−２−メチルフェネチル）−８−メチルベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−５−アミンの塩化メチレン（０．２Ｍ）による撹拌溶液に、ＢＢｒ３（２当量）のＣＨ２Ｃｌ２による１Ｎ溶液を滴加方式で添加した。３０分後に反応物をメタノールによって反応停止させて、真空中で濃縮して粗残留物を得た。粗物質は、ジクロロメタン中０〜２０％メタノールを使用した、ＣＯＭＢＩＦＬＡＳＨ（登録商標）システム（ＩＳＣＯ）でのフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、４−（２−（５−アミノ−８−メチルベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−２−イル）エチル）−３−メチルフェノールを白色固体として得た。
【０３６８】
（ステップ７：２−（４−（イソペンチルオキシ）−２−メチルフェネチル）−８−メチルベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−５−アミン）
４−（２−（５−アミノ−８−メチルベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−２−イル）エチル）−３−メチルフェノール（１．０当量）のジメチルホルムアミド（０．１０Ｍ）による溶液に、無水炭酸カリウム（１．５当量）を添加し、続いて１−ブロモ−３−メチルブタン（１．２当量）を添加した。得られた混合物を１００℃にて１８時間撹拌した。周囲温度まで冷却した後、混合物を酢酸エチルおよび水で希釈した。２相層を分離して、水層を酢酸エチルで２回洗浄した。合せた有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水して、揮発物を真空中で除去した。得られた残留物は、ヘキサン中０〜６０％酢酸エチルを使用した、ＣＯＭＢＩＦＬＡＳＨ（登録商標）システム（ＩＳＣＯ）によって精製して、２−（４−（イソペンチルオキシ）−２−メチルフェネチル）−８−メチルベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−５−アミンを得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （アセトン−  ｄ６）：  δ  ８．７５  （ｓ，  １Ｈ），  ８．７２  （ｓ，  １Ｈ），  ８．２９  （ｄ，  １Ｈ），  ７．４３  （ｓ，  １Ｈ），  ７．１７  （Ｄ，  １Ｈ），  ７．１０  （ｄ，  １Ｈ），  ６．７６  （ｄ，  １Ｈ），  ６．６８（ｄ，  １Ｈ），  ６．５６  （ｂｒ，  ２Ｈ），  ４．００  （ｔ，  ２Ｈ），  ３．１７  （ｔ，  ２Ｈ），  ３．０７  （ｔ，  ２Ｈ），  ２．４８  （ｓ，  ３Ｈ），  １．７６−１．９１  （ｍ，  １Ｈ），  １．６０−１．７１  （ｍ，  ２Ｈ），  ０．９６  （ｓ，  ６Ｈ）．  ＬＲＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＝４１４．２。
【０３６９】
２−（２，４−ジメチルフェネチル）ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−５−アミンを次のように調製した：
（ステップ１：（（２，４−ジメチルフェニル）エチニル）トリエチルシラン）
シンチレーションバイアルに１−ヨード−２，４−ジメチルベンゼン（市販）（１．１当量）、トリエチル（エチニル）シラン（１当量）、トリエチルアミン（５当量）、および無水ＤＭＦ（０．２Ｍ）を添加した。真空脱気および窒素洗浄を３回行った。ＣｕＩ（０．１当量）およびビス（トリフェニルホスフィン）ジクロロパラジウム（ＩＩ）（０．１当量）を添加した。バイアルを密閉して、６０℃にて一晩加熱した。ＴＬＣによってモニターした反応の完了時に、バイアルの内容物をヘキサンで予め処理したシリカゲルカラムに装填した。生成物を含有するすべての溶出液が収集されるまで、カラムをヘキサンおよびジエチルエーテルで洗浄した。回転蒸発器をわずかに加熱しながら用いて、ヘキサンおよびエーテルを慎重に蒸発させて、生成物（（２，４−ジメチルフェニル）エチニル）トリエチルシランを得て、これを次のステップで直接使用した。
【０３７０】
（ステップ２：１−エチニル−２，４−ジメチルベンゼン）
（（２，４−ジメチルフェニル）エチニル）トリエチルシラン（前のステップより）のＴＨＦ（０．２Ｍ）による０℃に冷却した撹拌溶液を、フッ化テトラブチルアンモニウムの溶液（０．５当量）によって滴加方式で処理した。反応混合物は黒く変色し、３０分間撹拌を継続すると、室温まで加温された。ＴＬＣによって完全に変換したことを示した。反応物を水によって反応停止させて、ジエチルエーテルによって抽出した。合せた有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水して、回転蒸発器をわずかに加熱しながら用いて濃縮した。クロマトグラフィー（シリカゲル、ジエチルエーテル）によって、生成物１−エチニル−２，４−ジメチルベンゼンを得た。
【０３７１】
（ステップ３：３−クロロ−５−（（２，４−ジメチルフェニル）エチニル）ピコリノニトリル）
隔壁でキャップした丸底フラスコに、１−エチニル−２，４−ジメチルベンゼン（前のステップより）（１．１当量）、３，５−ジクロロピコリノニトリル（１当量）、トリエチルアミン（５当量）、および無水ＤＭＦ（０．２Ｍ）を添加した。真空脱気および窒素洗浄を３回行った。ＣｕＩ（０．０５当量）およびビス（トリフェニルホスフィン）ジクロロパラジウム（ＩＩ）（０．０５当量）を添加した。隔壁を還流冷却器で置き換えて、フラスコを窒素雰囲気下で６０℃にて一晩加熱した。ＴＬＣによってモニターした反応の完了時に、フラスコの内容物をヘキサンで予め処理した大型シリカゲルカラムに装填した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ（１：４％））によって、生成物３−クロロ−５−（（２，４−ジメチルフェニル）エチニル）ピコリノニトリルを得た。
【０３７２】
（ステップ４：２−（（２，４−ジメチルフェニル）エチニル）ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−５−アミン）
還流冷却器を備えた丸底フラスコに、３−クロロ−５−（（２，４−ジメチルフェニル）エチニル）−ピコリノニトリル（前のステップより）（１当量）、ｔｅｒｔ−ブチル２−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニルカルバメート（１．２５当量）、Ｋ３ＰＯ４（２当量）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（０．０５当量）、および２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’，６’−ジメトキシビフェニル（０．１当量）を添加した。ｎ−ブタノールおよび水（５：２、０．２Ｍ）を添加して、内容物を３回脱気した（真空に続いて窒素洗浄）。反応混合物を油浴中、窒素下で１００℃にて一晩激しく撹拌した。内容物を冷却して、水２００ｍＬ中に取り、塩化メチレンによる抽出を続けた。合せた有機層を脱水（Ｎａ２ＳＯ４）して、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２中０〜５０％  ＥｔＯＡｃ）によって、生成物２−（（２，４−ジメチルフェニル）エチニル）ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−５−アミンを得た。
【０３７３】
（ステップ５：２−（２，４−ジメチルフェネチル）ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−５−アミン）
丸底フラスコに２−（（２，４−ジメチルフェニル）エチニル）ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−５−アミン（前のステップより）（１当量）をスターリングバーと共に添加した。エタノールおよび塩化メチレン（１：２、０．２Ｍ）を添加し、続いて炭素担持パラジウム（活性粉末、湿潤、炭素担持１０％、０．１当量）を添加した。内容物に真空脱気と続いての水素洗浄を３回行った。反応混合物を水素バルーン下で室温にて一晩激しく撹拌した。その後、反応混合物をセライトパッドで濾過して、次に、濾液にＵＶ吸収がなくなるまで、セライトパッドを塩化メチレンおよびＥｔＯＡｃで洗浄した。合せた有機洗浄液を濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２中０〜５０％  ＥｔＯＡｃ）によって、生成物２−（２，４−ジメチルフェネチル）ベンゾ［ｆ］［１，７］ナフチリジン−５−アミンを得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δ  ８．６０  （ｄ，  １Ｈ），  ８．３３  （ｄ，  １Ｈ），  ８．１４  （ｄ，  １Ｈ），  ７．６７  （ｄ，  １Ｈ），  ７．５４  （ｔ，  １Ｈ），  ７．３１  （ｔ，  １Ｈ），  ６．９６  -  ６．８６  （ｍ，  ３Ｈ），  ６．２９  （ｂｓ，  ２Ｈ），  ３．０４  -  ３．１０  （ｄｄ，  ２Ｈ），  ２．９７  -  ２．９１  （ｄｄ，  ２Ｈ），  ２．２４  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．２０  （ｓ，  ３Ｈ）．    ＬＲＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＝３２８．２。
【０３７４】
（実施例１５−無細胞タンパク質合成を使用する、粒子へのインフルエンザＭ２Ｅ−ＴＭ（Ｍ２細胞外ドメイン膜貫通タンパク質）のインサイチュー組み込み：ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの記述）
粒子の脂質２重層内へのモデルインフルエンザタンパク質Ｍ２ｅ−ＴＭのインサイチュー組み込みは、粒子をＳ３０タンパク質発現キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）と併せて使用することによって行った。この試薬キットは、Ｓ３０  Ｐｒｅｍｉｘ  ＰｌｕｓおよびＴ７  Ｓ３０  Ｅｘｔｒａｃｔ試薬を含有しており、発現キットのこれらの成分をさらなる修飾をせずに使用した。タンパク質合成反応を行うために、以下の成分を１．７ｍＬエッペンドルフ管内で合わせた：インフルエンザＭ２ｅ−ＴＭをコードするプラスミドＤＮＡ  １ｕｇ；各種の粒子処方物１０ｕＬ（たとえばペプチド濃度４ｍｇ／ｍｌの）；Ｓ３０  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｐｌｕｓ試薬２０ｕＬ；Ｔ７  Ｓ３０  Ｅｘｔｒａｃｔ  １８ｕＬ、および反応容積が全体で５０ｕＬに達するために、必要な場合には、ヌクレアーゼを含まない水を場合により添加。試料を激しく振とうしながら３７℃にて２時間インキュベートした。
【０３７５】
試料を回収して、氷上に１０分間置いた。全反応混合物の２０ｕＬの一定分量を清浄なエッペンドルフ微小遠心管に移し、変性ＰＡＧＥ電気泳動用に保存して、残りの混合物を微小遠心分離機で１６，０００ｇにて１０分間遠心分離して、タンパク質合成反応の可溶性部分を分離および回収した。
【０３７６】
電気泳動のために試料を処理するために、各試料５ｕＬをアセトンに沈殿させて、最終容積２０ｕＬのＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に再懸濁させた。これらの処理済み試料を７５℃で１０分間加熱して、各処理済み試料１０ｕＬをＮＵＰＡＧＥ  １２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ電気泳動ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に装填した。試料を１７５ボルトで１時間電気泳動した。タンパク質バンドを可視化するために、ゲルをＣｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理した。
【０３７７】
ＮＬＰＰと組み合せた無細胞合成反応におけるインフルエンザＭ２Ｅ−ＴＭタンパク質発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、以下に基づいていた：レーン（１）Ｍ２Ｅ−ＴＭのプラスミドＤＮＡが反応混合物に含まれていなかった負の対照反応を表し、タンパク質発現キットに内在するタンパク質のバックグラウンドレベルを示す。レーン２〜７は、以下のＮＬＰＰ粒子処方物の存在下での無細胞合成反応にそれぞれ相当する：（２）１：１  ペプチド：ＤＯＰＣ；（３）１：１．５  ペプチド：ＤＯＰＣ；（４）１：０．５  ペプチド：ＤＭＰＣ；（５）１：１  ペプチド：ＤＭＰＣ；（６）１：１．６  ペプチド：ＤＭＰＣ；（７）１：２  ペプチド：ＤＭＰＣ。インフルエンザＭ２Ｅ−ＴＭタンパク質の予想分子量は約９ｋＤである。興味のあるＭ２Ｅ−ＴＭタンパク質に相当するタンパク質バンドは、全反応レーン中レーン番号２〜７に出現し、このことは、これらの条件下でＮＬＰＰ粒子がタンパク質合成を阻害しないことを示唆する。可溶性タンパク質画分に相当する追加のゲルレーンでは、予想Ｍ２Ｅ−ＴＭタンパク質バンドは明らかではなく、このことは、いずれのタンパク質発現もタンパク質可視化技法の検出限界未満であり得ることを指摘する。
【０３７８】
（実施例１６−無細胞タンパク質合成を使用する、粒子へのバクテリオロドプシンのインサイチュー組み込み：ウェスタンブロットでの記述）
粒子の脂質２重層内へのバクテリオロドプシンのインサイチュー組み込みは、ＭｅｍｂｒａｎｅＭａｘタンパク質発現キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した無細胞合成反応にＮＬＰＰを含めることによって行った。発現キットの成分をさらなる修飾をせずに使用した。タンパク質合成反応を行うために、以下の成分を１．７ｍＬエッペンドルフ管内で合わせた：ｓｌｙＤ抽出物２０ｕＬ、ＩＶＰＳ反応緩衝液２０ｕＬ；５０ｍＭアミノ酸混合物１．２５ｕＬ；７５ｍＭメチオニン１ｕＬ；Ｔ７酵素１ｕＬ、ＮＬＰＰ粒子懸濁物４．７５ｕＬ（指示されたとき）；ＭｅｍｂｒａｎｅＭａｘ試薬２ｕＬ（指示されたとき）；および反応容積が全体で５０ｕＬに達するために、必要な場合には、ヌクレアーゼを含まない水を場合により添加した。試料を激しく振とうしながら３７℃にて３０分間インキュベートした。３０分間のインキュベーションの後、フィード緩衝液５０ｕＬを反応混合物に添加して、管を３７℃に戻し、さらに９０分間インキュベーションした。このフィード緩衝液は、２×ＩＶＰＳフィード緩衝液２５ｕＬ、アミノ酸１．２５ｕＬ、７５ｍＭメチオニン１ｕＬ；およびヌクレアーゼを含まない水２２．２５ｕＬで構成されていた。
【０３７９】
タンパク質発現反応管を次に回収して、氷上に１０分間置いた。全反応混合物の２０ｕＬの一定分量を清浄なエッペンドルフ微小遠心管に移し、変性ＰＡＧＥ電気泳動用に保存して、残りの混合物を微小遠心分離機で１６，０００ｇにて１０分間遠心分離して、タンパク質合成反応の可溶性部分を分離および回収した。
【０３８０】
電気泳動のために試料を処理するために、各試料５ｕＬをアセトンに沈殿させて、最終容積２０ｕＬのＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に再懸濁させた。これらの処理済み試料を７５℃で１０分間加熱して、各処理済み試料１０ｕＬをＮＵＰＡＧＥ  １２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ電気泳動ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に装填した。電気泳動の後、ゲルからのタンパク質をニトロセルロース膜に移し、抗ｈｉｓ６マウスＩｇＧ（１：５００希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１次抗体およびＡｌｅｘａ−６８０コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ２次抗体（１：１０，０００希釈、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で調べた。Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬｉＣｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）を使用して、タンパク質バンドの可視化を行った。
【０３８１】
ＮＬＰＰと組み合せた無細胞合成反応でのバクテリオロドプシン発現のウェスタンブロット検出は、以下に基づいていた：レーン（０）分子量標準マーカー；（１）プラスミドを含まない負の対照；（２）正の対照：Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｍａｘ試薬、全反応混合物；（３）正の対照：Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｍａｘ試薬、可溶性画分；（４）負の対照：Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｍａｘ試薬なし、全反応混合物；（５）負の対照：Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｍａｘ試薬なし、可溶性画分；（６）１：１  ペプチド：ＰＯＰＣ粒子、全反応混合物；（７）１：１  ペプチド：ＰＯＰＣ粒子、可溶性画分；（８）１：２  ペプチド：ＰＯＰＣ粒子、全反応混合物；（９）１：２  ペプチド：ＰＯＰＣ粒子、可溶性画分。バクテリオロドプシンタンパク質の予想分子量は約２４ｋＤである。２４ｋＤａを超えるタンパク質バンドは、内因性抗ｈｉｓ６交差反応性タンパク質が発現キットに存在することを示し、バックグラウンドと見なす。Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｍａｘ試薬の非存在下では（レーン４および５）、バクテリオロドプシンに対応するタンパク質バンドは全反応混合物で出現したが、可溶性画分では出現しなかった。バクテリオロドプシンに対応するタンパク質バンドは、レーン７および９に出現し（レーン９では、ごくかすかに出現した）、このことは、ペプチド：ＰＯＰＣ粒子の存在によって、バクテリオロドプシンを可溶化できることを示唆した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１６−５】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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