(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的化リガンドに結合体化したビス−アミノエタンチオール（ＢＡＴ）四配座キレート化リガンドを含む、組織を標的化するための組成物であって、ここで、該標的化リガンドは、グルコサミンおよびアミノグリコシドから選択されるグルコースを模倣する因子であり、かつ該ＢＡＴキレート化リガンドが、エチレンジシステインである、前記組成物。
【請求項２】
放射性核種標識をさらに含み、ここで、前記キレート化リガンドが、該放射性核種標識とＮ２Ｓ２キレートを形成する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記標的化リガンドが、前記キレート化リガンドと、該キレート化リガンドの片方または両方の酸アームで結合体化し得る、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記放射性核種が、９９ｍＴｃ、１８８Ｒｅ、１８６Ｒｅ、１８３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、８９Ｓｒ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ、１８３Ｇｄ、５９Ｆｅ、２２５Ａｃ、２１２Ｂｉ、２１１Ａｔ、６４Ｃｕまたは６２Ｃｕである、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記放射性核種が９９ｍＴｃである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
アミノグリコシドが、ネオマイシン、カナマイシン、ゲンタマインシン、パロマイシン、アミカシン、トブラマイシン、ネチルマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、リビドマイシン、ジベカシン、イセパマイシン、またはアストロマイシンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシンとしてさらに規定される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
９９ｍＴｃ−ＥＣ−カナマイシンとしてさらに規定される、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
９９ｍＴｃ−ＥＣ−アミノグリコシドとしてさらに規定される、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
９９ｍＴｃ−ＥＣ−ゲンタマイシンとしてさらに規定される、請求項６に記載の組成物。
【請求項１１】
９９ｍＴｃ−ＥＣ−トブラマイシンとしてさらに規定される、請求項６に記載の組成物。
【請求項１２】
前記キレート化リガンドを前記標的化リガンドに結合体化するリンカーをさらに含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項１３】
前記リンカーが、水溶性ペプチド、アミノ酸、ポリアミノ酸、グルタミン酸、ポリ−グルタミン酸、アスパラギン酸、ポリ−アスパラギン酸、ブロモ酢酸エチル、エチレンジアミンまたはリジンである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
組織を標的化するためのビス−アミノエタンチオール（ＢＡＴ）四配座キレート化リガンドを合成する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）標的化リガンドを得る工程；
ｂ）該リガンドをＢＡＴキレート化リガンドと混合して、ＢＡＴキレート化リガンド−標的化リガンド結合体を得る工程；ならびに
ｃ）該ＢＡＴキレート化リガンド−標的化リガンド結合体を、放射性核種および還元剤と混合して、放射性核種標識されたビス−アミノエタンチオール（ＢＡＴ）キレート化リガンド−標的化リガンド結合体を得る工程であって、ここで、該ＢＡＴ部分が、該放射性核種とＮ２Ｓ２キレートを形成する、工程、
を包含し、
ここで、該標的化リガンドが、グルコサミンおよびアミノグリコシドから選択されるグルコースを模倣する因子であり、かつ
該ＢＡＴキレート化リガンドが、エチレンジシステインである、前記方法。
【請求項１５】
前記還元剤が、亜ジチオン酸イオン、第一スズイオン、または第一鉄イオンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
組織を標的化するための医薬の製造のための、放射性核種標識されたＢＡＴキレート化リガンド−標的化リガンド結合体を含む組成物の使用であって、
該標的化リガンドが、グルコサミンおよびアミノグリコシドから選択されるグルコースを模倣する因子であり、かつ
該ＢＡＴキレート化リガンドが、エチレンジシステインである、前記使用。
【請求項１７】
前記部位が腫瘍である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記部位が感染である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１９】
前記部位が、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮内膜、心臓、肺、脳、肝臓、ホレート（＋）癌、ＥＲ（＋）癌、脾臓、膵臓、または腸である、請求項１７に記載の使用。
【請求項２０】
前記放射性核種が９９ｍＴｃである、請求項１６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
政府は、本発明の権利を所有しない。
【０００２】
（１．発明の分野）
本発明は、一般に、標識、放射画像化（ｒａｄｉｏｉｍａｇｉｎｇ）および化学合成の分野に関する。より詳細には、本発明は、標的化リガンドを放射画像化するための戦略に関する。本発明は、さらに、腫瘍の画像化および組織特異的障害の画像化において、これらの放射性標識したリガンドを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（２．関連技術の説明）
シンチグラフ腫瘍画像化の改善は、さらなる腫瘍特異的放射性医薬品の開発によって、広範囲にわたって決定される。より高い腫瘍特異性に起因して、放射性標識したリガンドおよび放射性標識した抗体は、腫瘍のシンチグラグ検出の新しい時代を開き、そして広範囲の前臨床試験の開発および評価を受けている（非特許文献１〜３（Ｍａｔｈｉａｓら、１９９６、１９９７ａ、１９９７ｂ））。放射性核種画像化様式（陽子射出放出断層撮影、ＰＥＴ；単一光子放射型コンピュータ断層撮影、ＳＰＥＣＴ）は、放射性核種標識された放射性トレーサーの位置および密度をマッピングする診断用断層画像化技術である。ＣＴおよびＭＲＩは、腫瘍の位置および範囲に関するかなりの解剖的な情報を提供するが、これらの画像化様式は、浮腫、放射線壊死、グレーディング（ｇｒａｄｉｎｇ）または神経膠症由来の侵襲性損傷を十分に区別し得ない。ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴは、代謝活性を測定することによって、腫瘍を局在化および特徴付けするために使用され得る。
【０００４】
新しい腫瘍低酸素剤の開発は、一次性損傷および転移性損傷を検出するため、ならびに放射線応答性および再発までの時間を予測するために、臨床的に所望されている。現代の画像化様式のどれも、低酸素症を正確に測定しない。なぜならば、この腫瘍低酸素症の診断は、病理学的試験を必要とするからである。処置される各腫瘍において、少なくとも低酸素症のベースラインを知ることなく、低酸素腫瘍のための治療の成果を予測することは、しばしば困難である。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆポーラログラフ酸素微小電極は、腫瘍中の酸素電圧を測定し得るが、この技術は、侵襲性であり、かつ熟練した操作者を必要とする。さらに、この技術は、アクセス可能な腫瘍（例えば、頭部および首（頚部））でのみ使用され得、そして複数の読み取りが必要とされる。従って、腫瘍低酸素症を測定するための正確かつ容易な方法は、患者選択のために有用である。しかし、正常な組織に対する腫瘍の取込み比は、使用される放射性医薬品に依存して変化する。従って、新しい放射性医薬品を臨床的な実施に導入する場合に、低酸素症の標準的なＥｐｐｅｎｄｏｒｆ金電極測定を用いて、正常組織に対する腫瘍の取込み比を補正することが合理的である。
【０００５】
［１８Ｆ］ＦＭＩＳＯは、頭部および頚部の腫瘍、心筋梗塞、炎症および脳虚血を診断するために使用されている（Ｍａｒｔｉｎら、１９９２；Ｙｅｈら、１９９４；Ｙｅｔら、１９９６；Ｌｉｕら、１９９４）。正常組織に対する腫瘍の取込み比は、腫瘍低酸素症を評価するためのベースラインとして使用された（Ｙｅｈら、１９９６）。［１８Ｆ］ＦＭＩＳＯを使用する腫瘍低酸素症は明確に実証されたが、新しい画像化剤を臨床的な実施に導入することは、容易に利用可能であることおよび同位体の費用などのいくつかの他の因子に依存する。［１８Ｆ］ＦＤＧを使用する腫瘍代謝性画像化は明確に実証されたが、分子画像化剤を臨床的な実施に導入することは、容易に利用可能であることおよび同位体の費用などのいくつかの他の因子に依存する。［１８Ｆ］フルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ）は、腫瘍、心筋梗塞、および神経学的疾患を診断するために使用されている。さらに、ＰＥＴ放射性合成は、ポジトロン同位体の半減期が短いので、迅速でなければならない。１８Ｆ化学もまた、複雑である。この１８Ｆ化学は、異なる分子において再現不可能である。従って、種々の薬物に結合体化し得るキレート剤を開発することが、理想的である。好ましい同位体は、低い費用（１８Ｆの＄５０／ｍＣｉに対して＄０．２１／ｍＣｉ）および低いエネルギー（１８Ｆの５７１Ｋｅｖに対して１４０Ｋｅｖ）に起因して９９ｍＴｃである。９９ｍＴｃは、９９Ｍｏ発生器から容易に得られる。望ましい物理学的特性およびかなり低い値段に起因して、９９ｍＴｃは、放射性医薬品を標識するのに好ましい。
【０００６】
いくつかの化合物は、窒素キレート剤および硫黄キレート剤を使用して、９９ｍＴｃで標識されている（Ｂｌｏｎｄｅａｕら、１９６７；Ｄａｖｉｓｏｎら、１９８０）。ビス−アミノエタンチオール四座配位子リガンド（これはまた、ジアミノジチオール化合物とも呼ばれる）は、２個のチオール硫酸原子および２個のアミン窒素原子に対するオキソテクネチウム基の効率的な結合に基づいて、非常に安定なＴｃ（Ｖ）Ｏ錯体を形成することで公知である。９９ｍＴｃ−Ｌ，Ｌ−エチレンジシステイン（９９ｍＴｃ−ＥＣ）は、Ｎ２Ｓ２キレートの最近、かつ有用な例である。ＥＣは、放射性化学的に高い純度および安定性を有する、９９ｍＴｃで容易におよび効率的に標識され得、そして活性な管状輸送体によって腎臓を介して排出される（Ｓｕｒｍａら、１９９４；Ｖａｎ  Ｎｅｒｏｍら、１９９０、１９９３；Ｖｅｒｂｒｕｇｇｅｎら、１９９０、１９９２）。他のＥＣの適用は、ＰＥＴ用のガリウム−６８（ポジトロン放出、ｔ１／２＝６８分）およびガドリニウム、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）用の鉄もしくはマンガンでキレート化される。９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシンおよび９９ｍＴｃ−ＥＣ−デオキシグルコースが開発され、そして腫瘍の特徴付けにおけるそれらの潜在的な使用が評価された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍａｔｈｉａｓら，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ，３７：１００３−１００８，１９９６
【非特許文献２】Ｍａｔｈｉａｓら，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ，（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）３８：８７Ｐ，１９９７ａ
【非特許文献３】Ｍａｔｈｉａｓら，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ，（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）３８：１３３Ｐ，１９９７ｂ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
画像化用に組織を標的化するための新しい放射性標識の戦略を提供することによって、先行技術のこれらの欠点および他の欠点を克服すること。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、画像化用に組織を標的化するための新しい放射性標識の戦略を提供することによって、先行技術のこれらの欠点および他の欠点を克服する。本発明は、放射性標識した組織特異的リガンド、ならびにこの放射性標識したリガンドを作製するための方法および組織特異的疾患を画像化するためにこの放射性標識したリガンドを使用するための方法を提供する。
本発明は、組織特異的疾患画像化のための組成物を提供する。本発明のこの画像化組成物は、一般に、エチレンジシステインおよび酸アーム（ａｃｉｄ  ａｒｍ）の一方または両方上のエチレンジシステインに結合体化された組織特異的リガンドでキレート化された放射性核種標識を含む。このエチレンジシステインは、放射性核種標識を有するＮ２Ｓ２キレートを形成する。当然、このキレート化した化合物は、放射性核種とキレート化号物との間にイオン結合を含む。用語「ＥＣ−組織特異的リガンド結合体」、「ＥＣ−誘導体」および「ＥＣ−薬物結合体」は、標識されていないエチレンジシステイン−組織特異的リガンド化合物をいうために、本明細書中で交換可能に使用される。本明細書中で使用される場合、用語「結合体」は、共有結合した化合物をいう。
【００１０】
エチレンジシステインは、ビス−アミノエタンチオール（ＢＡＴ）四座配位子である（これはまた、ジアミノジチオール（ＤＡＤＴ）化合物としても公知である）。このような化合物は、２個のチオール硫酸原子および２個のアミン窒素原子に対するオキソテクネチウム基の効率的な結合に基づいて、非常に安定なＴｃ（Ｖ）Ｏ錯体を形成することで公知である。この９９ｍＴｃ標識化ジエチルエステル（９９ｍＴｃ−Ｌ，Ｌ−ＥＣＤ）は、脳内物質（ｂｒａｉｎ  ａｇｅｎｔ）として公知である。９９ｍＴｃ−Ｌ，Ｌ−エチレンジシステイン（９９ｍＴｃ−Ｌ，Ｌ−ＥＣ）は、最も極性のある代謝物であり、尿中に迅速かつ効率的に排出されることが発見された。従って、９９ｍＴｃ−Ｌ，Ｌ−ＥＣは、腎機能剤として使用されてきた（Ｖｅｒｂｒｕｇｇｅｎら、１９９２）。
【００１１】
組織特異的リガンドは、哺乳動物または患者の体内に導入された場合、組織の特定の型に特異的に結合する化合物である。本発明の組成物は、実質的に任意の公知の組織特異的化合物を含み得ることが、想定される。好ましくは、本発明と組み合わせて使用される組織特異的リガンドには、抗癌剤、ＤＮＡトポイソメラーゼインヒビター、抗代謝剤、腫瘍マーカー、ホレート（ｆｏｌａｔｅ）レセプター標的化リガンド、腫瘍アポトーシス細胞標的化リガンド、腫瘍低酸素症標的化リガンド、ＤＮＡインターカレーター（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）、レセプターマーカー、ペプチド、ヌクレオチド、器官特異的リガンド、抗菌剤（例えば、抗生物質もしくは抗真菌剤）、グルタメートペンタペプチド、またはグルコースを模倣する薬剤がある。このグルコースを模倣する薬剤はまた、「糖（ｓｕｇａｒ）」とも呼ばれ得る。
【００１２】
好ましい抗癌剤としては、メトトレキセート、ドキソルビシン、タモキシフェン、パクリタキセル、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、ＬＨＲＨ、マイトマイシンＣ、エトポシド、トムデックス（ｔｏｍｕｄｅｘ）、ポドフィロトキシン、ミトザントロン、カプトセシン（ｃａｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、コルヒチン、エンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、フルダラビンおよびゲムシタビンが挙げられる。好ましい腫瘍マーカーとしては、ＰＳＡ、ＥＲ、ＰＲ、ＡＦＰ、ＣＡ−１２５、ＣＡ−１９９、ＣＥＡ、インターフェロン、ＢＲＣＡ１、シトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ）、ｐ５３、ＶＥＧＦ、インテグリン、エンドスタチン、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、アンチセンスマーカーまたはモノクローナル抗体が挙げられる。任意の他の公知の腫瘍マーカーまたは任意のモノクローナル抗体が本発明と組み合わせた使用に効果的であることを想定する。好ましいホレートレセプター標的化リガンドとしては、ホレート、メトトレキセートおよびトムデクスが挙げられる。好ましい腫瘍アポトーシス細胞標的化リガンドまたは腫瘍低酸素症標的化リガンドとしては、アネキシンＶ、コルヒチン、ニトロイミダゾール、マイトマイシンまたはメトロニダゾルが挙げられる。好ましい抗菌剤としては、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌に対して、アンピシリン、アモキシリン、ペニシリン、セファロスポリン、クリダマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ピマリシン（ｎａｔａｍｙｃｉｎ）、ナフシリン、リファンピン、テトラサイクリン、バンコマイシン、ブレオマイシン、およびドキシサイクリン、ならびに真菌に対して、アンホテリシンＢ、アマンタジン、ナイスタチン、ケトコナゾール、ポリミキシン（ｐｏｌｙｍｙｃｉｎ）、アシクロビル、およびガンシクロビルが挙げられる。グルコースまたは糖を模倣する好ましい薬剤としては、ネオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、プロマイシン（ｐａｒｏｍｙｃｉｎ）、アミカシン、トブラマイシン、ネチルマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、ミクロマイシン、リビドマイシン、ジベカシン（ｄｉｂｅｋａｃｉｎ）、イセパマイシン（ｉｓｅｐａｍｉｃｉｎ）、アストロマイシン、アミノグリコシド、グルコースまたはグルコサミンが挙げられる。
【００１３】
特定の実施形態において、エチレンジシステインと組織特異的リガンドとの間にリンカーを含むことが必要である。リンカーは、代表的に、薬物の水溶液中の水溶性を増加させるため、および薬物の親和性の変化を最小にするために使用される。この組成物の水溶性を増加させる任意のリンカーは、実質的に、本発明と組み合わせて使用するために想定されるが、このリンカーは、一般に、ポリアミノ酸、水溶性ペプチド、または単一のアミノ酸のいずれかである。例えば、組織特異的リガンド上の官能基、または薬物が、エストラジオール、トポテカン、パクリタキセルまたはラロキシフェンエトポシドのような脂肪族ＯＨまたはフェノールＯＨである場合、このリンカーは、ポリグルタミン酸（ＭＷ  約７５０〜約１５，０００）、ポリアスパラギン酸（ＭＷ  約２，０００〜約１５，０００）、ブロモエチルアセテート、グルタミン酸、またはアスパラギン酸である得る。この薬物の官能基は、脂肪族ＮＨ２もしくは芳香族ＮＨ２またはペプチド（例えば、ドキソルビシン、マイトマイシン  Ｃ、エンドスタチン、アネキシン  Ｖ、ＬＨＲＨ、オクトレオチド，およびＶＩＰ）である場合、このリンカーは、ポリグルタミン酸（ＭＷ  約７５０〜約１５，０００）、ポリアスパラギン酸（ＭＷ  約２，０００〜約１５，０００）、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり得る。この薬物の官能基が、カルボン酸またはペプチド（例えば、メトトレキセートまたは葉酸）である場合、このリンカーは、エチレンジアミン、またはリジンであり得る。
【００１４】
画像化のための好ましい放射性核種は、９９ｍＴｃであるが、他の放射性核種が、特に治療剤としての使用のために、ＥＣ組織特異的リガンド結合体または本発明のＥＣ薬物結合体にキレート化され得ることが想定される。例えば、他の有用な放射性核種には、１８８Ｒｅ、１８６Ｒｅ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、８９Ｓｒ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ、１５３Ｇｄ、および５９Ｆｅがある。これらの組成物は、体内の特定の損傷部（例えば、乳癌、卵巣癌、前立腺癌（例えば、ｌ８６／ｌ８８Ｒｅ−ＥＣ−ホレートを使用する）ならびに頭部および頚部の癌（例えば、１８６／１８８Ｒｅ−ＥＣ−ニトロイミダゾールを使用する））に治療放射性核種を送達するために使用される。
【００１５】
本発明の特定の実施形態としては、９９ｍＴｃ−ＥＣ−アネキシン  Ｖ、９９ｍＴｃ−ＥＣ−コルヒチン、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ニトロイミダゾール、９９ｍＴｃ−ＥＣ−グルタメートペンタペプチド、９９ｍＴｃ−ＥＣ−メトロニダゾル、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ホレート、９９ｍＴｃ−ＥＣ−メトトレキセート、９９ｍＴｃ−ＥＣ−トムデクス、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシン、９９ｍＴｃ−ＥＣ−カナマイシン、９９ｍＴｃ−ＥＣ−アミノグリコシド、（グルコサミン、ＥＣ−デオキシグルコース）、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ゲンタマイシン、および９９ｍＴｃ−ＥＣ−トブラマイシンが挙げられる。
【００１６】
本発明は、さらに、画像化または治療用途のために、放射性標識したエチレンジシステイン薬物結合体またはエチレンジシステイン薬物誘導体を合成するための方法を提供する。この方法は、組織特異的リガンドを得る工程、このリガンドをエチレンジシステイン（ＥＣ）と混合して、ＥＣ組織特異的リガンド誘導体を得る工程、ならびに放射性核種および還元剤と共にＥＣ組織特異的リガンド誘導体を混合して、放射性核種標識されたＥＣ組織特異的リガンド誘導体を得る工程を包含する。この放射性核種は、Ｎ２Ｓ２キレートを介してＥＣにキレート化される。この組織特異的リガンドは、上記のように直接的またはリンカーを介してのいずれかで、ＥＣの酸アームの一方または両方のに結合体化される。この還元剤は、好ましくは、ジチオナイト（ｄｉｔｈｉｏｎｉｔｅ）イオン、スズイオンまたは鉄（ＩＩ）イオンである。
【００１７】
本発明は、さらに、画像化、治療用途のため、または診断用途もしくは予後用途のために組織特異的リガンドを標識するための方法を提供する。この標識方法は、組織特異的リガンドを得る工程、エチレンジシステイン（ＥＣ）と共に組織特異的リガンドを混合して、ＥＣ−リガンド薬物結合体を得る工程、および還元剤の存在下で、薬物結合体を９９ｍＴｃと反応させて、エチレンジシステインとこの９９ｍＴｃとの間にＮ２Ｓ２キレートを形成する工程を包含する。
【００１８】
この実施形態の目的のために、組織特異的リガンドは、上記または本明細書中で議論されるいずれかのリガンドであり得る。還元剤は、任意の公知の還元剤であり得るが、好ましくは、ジチオナイトイオン、スズイオンまたは鉄（ＩＩ）イオンである。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、哺乳動物の体内のある部位を画像化する方法を提供する。この画像化方法は、９９ｍＴｃ標識されたエチレンジシステイン組織特異的リガンド結合体を含む組成物の診断有効量を投与する工程、およびその部位に局在化された９９ｍＴｃからの放射能シグナルを検出する工程を包含する。この検出する工程は、代表的に、哺乳動物の体内にこの組成物を導入した約１０分〜約４時間後に実施される。より好ましくは、この検出する工程は、哺乳動物の体内にこの組成物を注入した約１時間後に実施される。
【００２０】
特定の好ましい実施形態において、この部位は、感染、腫瘍、心臓、肺、脳、肝臓、脾臓、膵臓、腸または任意の他の器官である。腫瘍または感染は、哺乳動物の体内のどこかに局在化され得るが、一般に、胸部、卵巣、前立腺、子宮内膜、肺、脳、または肝臓である。この部位は、ホレート陽性癌またはエストロゲン陽性癌であり得る。
【００２１】
本発明はまた、放射性薬学的調製物を調製するためのキットを提供する。このキットは、一般に、予め決められた量のエチレンジシステイン組織特異的リガンド結合体組成物およびこの結合体を９９ｍＴｃで標識するために十分な量の還元剤を含む、密閉されたバックまたは他の任意の種の適切な容器を含む。特定の場合において、このエチレンジシステイン組織特異的リガンド結合体組成物はまた、このエチレンジシステインと組織特異的リガンドとの間にリンカーを含む。この組織特異的リガンドは、任意の特異的な組織型（例えば、本明細書中で議論される組織型）に特異的に結合する任意のリガンドであり得る。リンカーがこの組成物中に含まれる場合、このリンカーは、本明細書中で記載されるようなリンカーであり得る。
【００２２】
このキット成分は、任意の適切な形態（例えば、液体形態、凍結形態または乾燥形態）であり得る。好ましい実施形態において、このキット成分は、凍結乾燥形態で提供される。このキットはまた、抗酸化剤および／または捕捉剤を含み得る。この抗酸化剤は、公知の任意の抗酸化剤であるが、好ましくは、ビタミンＣであり得る。捕捉剤はまた、残りの放射性核種を結合するために存在し得る。最も市販されているキットは、捕捉剤としてグルコヘプトネートを含む。しかし、グルコへプトネートは、約１０〜１５％を残したまま、代表的なキット成分と完全には反応しない。この残りのグルコへプトネートは腫瘍に達し、そして画像化結果をゆがめる。従って、本発明は、より安価で、かつより完全に反応するように、捕捉剤としてＥＤＴＡを使用することが好ましい。
【００２３】
本発明の別の局面は、特定の腫瘍の治療のために、候補化合物の潜在的な有用性を決定するための予後方法である。現在、ほとんどの腫瘍は、数ヶ月および数千ドルを費やすまで、この薬物が特定の腫瘍に対して実際に有用であるどうかのいずれの指標もなく、化学療法において「通常の選択された薬物」で処置される。本発明の画像化組成物は、標識化されたＥＣ薬物結合体の形態で、特定の薬物を腫瘍部位に送達すること、次いで特定の薬物かどうかを決定するために数時間内で部位を画像化することに有用である。
【００２４】
このことに関連して、本発明の予後方法は、哺乳動物の体内の腫瘍の部位を決定する工程、腫瘍特異的な癌化学療法薬物候補物に結合体化されるＥＣにキレート化された放射性核種を含む画像化組成物を得る工程、この組成物を哺乳動物の体内に投与する工程、ならびにこの腫瘍に対するこの候補薬物の有効性を決定するためにこの部位を画像化する工程を包含する。代表的に、この画像化工程は、哺乳動物の体内に組成物を注入した約１０分〜約４時間後以内で実施される。好ましくは、この画像化工程は、哺乳動物の体内に組成物を注入した約１時間後以内に実施される。
【００２５】
予後組成物中のＥＣに結合体化されたこの癌化学療法薬物候補物は、公知の癌化学療法薬物から選択され得る。このような薬物は、表２にある。癌の特定の型に特異的であることが公知の多くの抗癌剤が存在する。しかし、癌の特定の型に対する全ての抗癌剤が、あらゆる患者に有用とは限らない。従って、本発明は、処置に莫大な時間とお金を費やす前に、候補薬物の潜在的な有用性を決定する方法を初めて提供する。
【００２６】
本発明のなお別の実施形態は、シンチグラフ画像化剤を調製するための試薬である。本発明の試薬は、組織特異的リガンドを含み、この組織特異的リガンドは、シンチグラフで検出可能な画像を提供するのに十分なインビボの標識部位に対する親和性を有し、９９ｍＴｃ結合部分に共有結合する。９９ｍＴｃ結合部分は、上記のように、この組織特異的リガンドに直接的に結合されるか、またはリンカーを介してリガンドに結合されるかのいずれかである。この９９ｍＴｃ結合部分は、好ましくは、＋４酸化状態の９９ｍＴｃとエチレンジシステイン（ＥＣ）との間のＮ２Ｓ２キレートである。この組織特異的リガンドは、上記のように直接的またはリンカーを介してのいずれかで、ＥＣの酸アームの一方または両方に共有結合される。この組織特異的リガンドは、上記のようなリガンドのいずれかであり得る。
【発明の効果】
【００２７】
本発明により、例えば、以下が提供される：
（項目１）  画像化のための組成物であって、以下：
放射線核種標識；
エチレンジシステイン；および
該エチレンジシステインに結合体化した組織特異的リガンド；を含み、ここで、該エチレンジシステインが、該放射線核種標識とＮ２Ｓ２キレートを形成する、組成物。
（項目２）  前記組織特異的リガンドが、前記エチレンジシステインの１つまたは両方の酸アームで該エチレンジシステインと結合体化し得る、項目１に記載の組成物。  （項目３）  前記放射線核種が、９９ｍＴｃ、１８８Ｒｅ、１８６Ｒｅ、１８３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、８９Ｓｒ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ、１８３Ｇｄ、５９Ｆｅ、２２５Ａｃ、２１２Ｂｉ、２１１Ａｔ、６４Ｃｕまたは６２Ｃｕである、項目１に記載の組成物。
（項目４）  前記放射線核種が９９ｍＴｃである、項目３に記載の組成物。  （項目５）  前記組織特異的リガンドが、抗癌剤、ＤＮＡトポイソメラーゼインヒビター、代謝拮抗剤、腫瘍マーカー、ホレートレセプター標的化リガンド、腫瘍アポトーシス細胞標的化リガンド、腫瘍低酸素標的化リガンド、ＤＮＡインターカレーター、レセプターマーカー、ペプチド、ヌクレオチド、器官特異的リガンド、抗生物質、抗真菌剤、抗体、グルタミン酸ペンタペプチドまたはグルコースを模倣する因子である、項目１に記載の組成物。
（項目６）  前記組織特異的リガンドが、抗癌剤である、項目５に記載の組成物。  （項目７）  前記抗癌剤が、メトトレキセート、ドキソルビシン、タモキシフェン、パクリタキセル、トポテカン、ＬＨＲＨ、マイトマイシンＣ、エトポシドトムデックス、ポドフィロトキシン、ミトザントロン、カンプトセシン、コルヒチン、エンドスタチン、フルダラビン、ゲムシタビンおよびトムデックスからなる群より選択され得る、項目６に記載の組成物。
（項目８）  前記組織特異的リガンドが腫瘍マーカーである、項目５に記載の組成物。  （項目９）  前記腫瘍マーカーが、ＰＳＡ、ＥＲ、ＰＲ、ＣＡ−１２５、ＣＡ−１９９、ＣＥＡ  ＡＦＰ、インターフェロン、ＢＲＣＡ１、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、シトキサン、ｐ５３、エンドスタチンまたはモノクローナル抗体（例えば、アンチセンス）である、項目８に記載の組成物。
（項目１０）  前記組織特異的リガンドが、ホレートレセプター標的化リガンドである、項目５に記載の組成物。
（項目１１）  前記ホレートレセプター標的化リガンドが、ホレート、メトトレキセートまたはトムデックスである、項目１０に記載の組成物。
（項目１２）  ９９ｍＴｃ−ＥＣ−ホレートとしてさらに規定される、項目１１に記載の組成物。
（項目１３）  ９９ｍＴｃ−ＥＣ−メトトレキセートとしてさらに規定される、項目１１に記載の組成物。
（項目１４）  ９９ｍＴｃ−ＥＣ−トムデックスとしてさらに規定される、項目１１に記載の組成物。
（項目１５）  前記組織特異的リガンドが、腫瘍アポトーシス細胞標的化リガンドまたは腫瘍低酸素標的化リガンドである、項目５に記載の組成物。
（項目１６）  前記組織特異的リガンドが、アネキシンＶ、コルヒチン、ニトロイミダゾール、マイトマイシンまたはメトロニダゾルである、項目１５に記載の組成物。  （項目１７）  ９９ｍＴｃ−ＥＣ−アネキシンＶとしてさらに規定される、項目１６に記載の組成物。
（項目１８）  ９９ｍＴｃ−ＥＣ−コルヒチンとしてさらに規定される、項目１６に記載の組成物。
（項目１９）  ９９ｍＴｃ−ＥＣ−ニトロイミダゾールとしてさらに規定される、項目１６に記載の組成物。
（項目２０）  ９９ｍＴＣ−ＥＣ−メトロニダゾールとしてさらに規定される、項目１６に記載の組成物。
（項目２１）  前記組織特異的リガンドが、グルタミン酸ペンタペプチド（分子量７５０〜１５，０００）である、項目５に記載の組成物。
（項目２２）  ９９ｍＴｃ−ＥＣ−グルタミン酸ペンタペプチドとしてさらに規定される、項目２１に記載の組成物。
（項目２３）  前記組織特異的リガンドが、グルコースを模倣する因子である、項目５に記載の組成物。
（項目２４）  グルコースを模倣する前記因子が、ネオマイシン、カナマイシン、ゲンタマインシン、パロマイシン、アミカシン、トブラマイシン、ネチルマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、ミクロマイシン、リビドマイシン、ジベカシン、イセパマイシン、アストロマイシン、またはアミノグルコシドである、項目２３に記載の組成物。  （項目２５）  ９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシンとしてさらに規定される、項目２４に記載の組成物。
（項目２６）  ９９ｍＴｃ−ＥＣ−カナマイシンとしてさらに規定される、項目２４に記載の組成物。
（項目２７）  ９９ｍＴｃ−ＥＣ−アミノグリコシドとしてさらに規定される、項目２４に記載の組成物。
（項目２８）  ９９ｍＴｃ−ＥＣ−ゲンタマイシンとしてさらに規定される、項目２４に記載の組成物。
（項目２９）  ９９ｍＴｃ−ＥＣ−トブラマイシンとしてさらに規定される、項目２４に記載の組成物。
（項目３０）  ＥＣを前記組織特異的リガンドに結合体化するリンカーをさらに含む。項目２に記載の組成物。
（項目３１）  前記リンカーが、水溶性ペプチド、グルタミン酸、アスパラギン酸、ブロモ酢酸エチル、エチレンジアミンまたはリジンである、項目３０に記載の組成物。  （項目３２）  前記組織特異的リガンドが、エストラジオール、トポテカン、パクリタキセル、ラロキシフェン、エトポシド、ドキソルビシン、マイトマイシンＣ、エンドスタチン、アネキシンＶ、ＬＨＲＨ、オクトレオチド、ＶＩＰ、メトトレキセートまたは葉酸である、項目３１に記載の組成物。
（項目３３）  画像化のための放射標識されたエチレンジシステイン誘導体を合成する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）組織特異的リガンドを得る工程；
ｂ）該リガンドをエチレンジシステイン（ＥＣ）と混合して、ＥＣ−組織特異的リガンド誘導体を得る工程；ならびに
ｃ）該ＥＣ−組織特異的リガンド誘導体を、放射線核種および還元剤と混合して、放射線核種標識されたＥＣ−組織特異的リガンド誘導体を得る工程であって、ここで、該ＥＣが、該放射線核種とＮ２Ｓ２キレートを形成する、工程、を包含する、方法。
（項目３４）  前記還元剤が、亜ジチオン酸イオン、第一スズイオン、または第一鉄イオンである、項目３３に記載の方法。
（項目３５）  画像化のために組織特異的リガンドを標識化する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）組織特異的リガンドを得る工程；
ｂ）該組織特異的リガンドをエチレンジシステイン（ＥＣ）と混合して、ＥＣ−リガンド薬物結合体を得る工程；ならびに
ｃ）該薬物結合体を、還元剤の存在下で９９ｍＴｃと反応させて、該エチレンジシステイン（リンカーありまたはリンカーなし）と該９９ｍＴｃとの間にＮ２Ｓ２キレートを形成する工程、
を包含する、方法。
（項目３６）  前記組織特異的リガンドが、抗癌剤、ＤＮＡトポイソメラーゼインヒビター、代謝拮抗剤、腫瘍マーカー、ホレートレセプター標的化リガンド、腫瘍アポトーシス細胞標的化リガンド、腫瘍低酸素標的化リガンド、ＤＮＡインターカレーター、レセプターマーカー、ペプチド、器官特異的リガンド、抗生物質、抗真菌剤、グルタミン酸ペンタペプチドまたはグルコースを模倣する因子である、項目３５に記載の方法。  （項目３７）  前記還元剤が、亜ジチオン酸イオン、第一スズイオン、または第一鉄イオンである、項目３６に記載の方法。
（項目３８）  哺乳動物身体内の部位を画像化する方法であって、９９ｍＴｃ標識されたエチレンジシステイン−組織特異的リガンド結合体を含む診断有効量の組成物を投与する工程、および該部位に局在する９９ｍＴｃからの放射活性シグナルを検出する工程、を包含する、方法。
（項目３９）  前記部位が腫瘍である、項目３８に記載の方法。  （項目４０）  前記部位が感染である、項目３８に記載の方法。  （項目４１）  前記部位が、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮内膜、心臓、肺、脳、肝臓、ホレート（＋）癌、ＥＲ（＋）癌、脾臓、膵臓、または腸である、項目３８に記載の方法。
（項目４２）  放射性薬学的調製物を調製するためのキットであって、該キットは、所定量のエチレンジシステイン−組織特異的リガンド結合体組成物および９９ｍＴｃを用いて該結合体を標識するために十分量の還元剤を含むシールされた容器を備える、キット。  （項目４３）  前記エチレンジシステイン−組織特異的リガンド結合体組成物が、該エチレンジシステインと該組織特異的リガンドとの間にさらにリンカーを含む、項目４２に記載のキット。
（項目４４）  前記組織特異的リガンドが、抗癌剤、ＤＮＡトポイソメラーゼインヒビター、代謝拮抗剤、腫瘍マーカー、ホレートレセプター標的化リガンド、  腫瘍アポトーシス細胞標的化リガンド、腫瘍低酸素標的化リガンド、ＤＮＡインターカレーター、レセプターマーカー、ペプチド、器官リガンド、抗生物質、抗真菌剤、グルタミン酸ペンタペプチドまたはグルコースを模倣する因子である、項目４２に記載のキット。  （項目４５）  前記組織特異的リガンドが、エストラジオール、トポテカン、パクリタキセル、ラロキシフェン、エトポシド、ドキソルビシン、マイトマイシンＣ、エンドスタチン、アネキシンＶ、ＬＨＲＨ、オクトレオチド、ＶＩＰ、メトトレキセートまたは葉酸である、項目４３に記載のキット。
（項目４６）  前記リンカーが、水溶性ペプチド、グルタミン酸、ポリグルタミン酸、アスパラギン酸、ポリアスパラギン酸、ブロモ酢酸エチル、エチレンジアミンまたはリジンである、項目４５に記載のキット。
（項目４７）  シンチグラフィー画像化剤を調製するための試薬であって、９９ｍＴｃ結合部位に共有結合した組織特異的リガンドを含む、試薬。
（項目４８）  前記９９ｍＴｃ結合部分が、エチレンジシステインである、項目４７に記載の試薬。
（項目４９）  前記組織特異的リガンドが、抗癌剤、ＤＮＡトポイソメラーゼインヒビター、代謝拮抗剤、腫瘍マーカー、ホレートレセプター標的化リガンド、腫瘍アポトーシス細胞標的化リガンド、腫瘍低酸素標的化リガンド、ＤＮＡインターカレーター、レセプターマーカー、ペプチド、器官特異的リガンド、抗生物質、抗真菌剤、グルタミン酸ペンタペプチドまたはグルコースを模倣する因子である、項目４８に記載の試薬。  （項目５０）  前記組織特異的リガンドと前記９９ｍＴｃ結合部位との間にさらにリンカーを含む、項目４８に記載の試薬。
（項目５１）  腫瘍に対する候補薬物の有効性を決定する方法であって、該方法は、以下：
ａ）候補薬物を得る工程；
ｂ）該候補薬物をエチレンジシステイン（ＥＣ）と結合体化して、ＥＣ−候補薬物結合体を生成する工程；
ｃ）該候補薬物結合体を、９９ｍＴｃを用いてキレート化して、９９ｍＴｃ−ＥＣ−候補薬物結合体を生成する工程；
ｄ）該９９ｍＴｃ−ＥＣ−候補薬物結合体を、腫瘍を有する患者に導入する工程；および
ｅ）該患者を画像化して、該腫瘍に対する該候補薬物の有効性を決定する工程、を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ホレートの合成スキームである。
【図２】図２は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＴＸ（メトトレキサート）の合成スキームである。
【図３】図３は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＴＤＸ（トムデクス（ｔｏｍｕｄｅｘ））の合成スキームである。
【図４】図４は、９９ｍＴｃ−ＥＣおよび９９ｍＴｃ−ＥＣ−ホレートの生体分布研究である。
【図５】図５は、９９ｍＴｃ−ＥＣホレートを用いた腫瘍／筋肉カウント比および腫瘍／血液カウント比についてのブロッキング研究である。
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは、９９ｍＴｃ−ＥＣ注射群と比較した、９９ｍＴｃ−ＥＣホレート注射群における腫瘍のシンチグラフィ画像である。
【図７】図７は、ＥＣ−ＭＮ（メトロニダゾール）の合成スキームである。
【図８Ａ】図８Ａは、ＥＣ−ＮＩＭについての合成スキームを示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＥＣ−ＮＩＭについての構造の１Ｈ−ＮＭＲ確認を示す。
【図９】図９は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＮ、［１８Ｆ］ＦＭＩＳＯおよび［１３１Ｉ］ＩＭＩＳＯについての生体分布研究（腫瘍／血液比）である。
【図１０】図１０は、９９ｍＴｃ−ＥＣ、［１８Ｆ］ＦＭＩＳＯおよび［１３１Ｉ］ＩＭＩＳＯについての生体分布研究（腫瘍／筋肉比）である。
【図１１】図１１Ａは、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＮ注射群の腫瘍のシンチグラフィ画像であり、図１１Ｂは、９９ｍＴｃ−ＥＣ注射群の腫瘍のシンチグラフィ画像である。
【図１２】図１２は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＮでの注射の１時間後において実施したオートラジオグラムである。
【図１３】図１３は、イヌ血清サンプル中の９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＮの安定性を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ラットにおける９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＮ  対  ９９ｍＴｃ−ＥＣの胸部腫瘍取り込みを示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、コントロールと比較した、パクリタキセルで処理したラットにおける９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＮ  対  ９９ｍＴｃ−ＥＣの胸部腫瘍取り込みを示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、ラットにおける９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＮＩＭ  対  ９９ｍＴｃ−ＥＣの卵巣腫瘍取り込みを示す。パクリタキセルを用いて処理したラットにおける腫瘍取り込み（図１５Ｂ）は、パクリタキセルで処理していないラットにおける腫瘍取り込み（図１５Ａ）よりも少ない。肉腫を有するラットにおける９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＮＩＭの腫瘍取り込みもまた示す。図１５Ｃは、パクリタキセルで処理した肉腫保有ラットにおける腫瘍取り込みを示し、一方、図１５Ｄは、パクリタキセルで処理していないラットにおける腫瘍取り込みを示す。パクリタキセルで処理した後に、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＮＩＭの取り込みの減少したが存在した。
【図１５Ｂ】図１５Ａは、ラットにおける９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＮＩＭ  対  ９９ｍＴｃ−ＥＣの卵巣腫瘍取り込みを示す。パクリタキセルを用いて処理したラットにおける腫瘍取り込み（図１５Ｂ）は、パクリタキセルで処理していないラットにおける腫瘍取り込み（図１５Ａ）よりも少ない。肉腫を有するラットにおける９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＮＩＭの腫瘍取り込みもまた示す。図１５Ｃは、パクリタキセルで処理した肉腫保有ラットにおける腫瘍取り込みを示し、一方、図１５Ｄは、パクリタキセルで処理していないラットにおける腫瘍取り込みを示す。パクリタキセルで処理した後に、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＮＩＭの取り込みの減少したが存在した。
【図１５Ｃ】図１５Ａは、ラットにおける９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＮＩＭ  対  ９９ｍＴｃ−ＥＣの卵巣腫瘍取り込みを示す。パクリタキセルを用いて処理したラットにおける腫瘍取り込み（図１５Ｂ）は、パクリタキセルで処理していないラットにおける腫瘍取り込み（図１５Ａ）よりも少ない。肉腫を有するラットにおける９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＮＩＭの腫瘍取り込みもまた示す。図１５Ｃは、パクリタキセルで処理した肉腫保有ラットにおける腫瘍取り込みを示し、一方、図１５Ｄは、パクリタキセルで処理していないラットにおける腫瘍取り込みを示す。パクリタキセルで処理した後に、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＮＩＭの取り込みの減少したが存在した。
【図１５Ｄ】図１５Ａは、ラットにおける９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＮＩＭ  対  ９９ｍＴｃ−ＥＣの卵巣腫瘍取り込みを示す。パクリタキセルを用いて処理したラットにおける腫瘍取り込み（図１５Ｂ）は、パクリタキセルで処理していないラットにおける腫瘍取り込み（図１５Ａ）よりも少ない。肉腫を有するラットにおける９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＮＩＭの腫瘍取り込みもまた示す。図１５Ｃは、パクリタキセルで処理した肉腫保有ラットにおける腫瘍取り込みを示し、一方、図１５Ｄは、パクリタキセルで処理していないラットにおける腫瘍取り込みを示す。パクリタキセルで処理した後に、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＮＩＭの取り込みの減少したが存在した。
【図１６】図１６は、ＥＣ−ＧＡＰ（ペンタグルタメート）の合成スキームである。
【図１７】図１７は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＧＡＰ注射群における胸部腫瘍のシンチグラフィー画像である。
【図１８】図１８は、異なる時間間隔での、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＡＮＮＥＸ  Ｖ注射群における胸部腫瘍のシンチグラフィー画像である。
【図１９Ａ】図１９Ａおよび図１９Ｂは、卵巣腫瘍保有群におけるパクリタキセル処理前（図１９Ａ）とパクリタキセル処理後（図１９Ｂ）との間の、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＡＮＮＥＸ  Ｖの取り込み差異の比較である。
【図１９Ｂ】図１９Ａおよび図１９Ｂは、卵巣腫瘍保有群におけるパクリタキセル処理前（図１９Ａ）とパクリタキセル処理後（図１９Ｂ）との間の、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＡＮＮＥＸ  Ｖの取り込み差異の比較である。
【図２０Ａ】図２０Ａおよび図２０Ｂは、肉腫腫瘍保有群におけるパクリタキセル処理前（図２０Ａ）とパクリタキセル処理後（図２０Ｂ）との間の、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＡＮＮＥＸ  Ｖの取り込み差異の比較である。
【図２０Ｂ】図２０Ａおよび図２０Ｂは、肉腫腫瘍保有群におけるパクリタキセル処理前（図２０Ａ）とパクリタキセル処理後（図２０Ｂ）との間の、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＡＮＮＥＸ  Ｖの取り込み差異の比較である。
【図２１】図２１は、ＥＣ−ＣＯＬ（コルヒチン）の合成スキームである。
【図２２】図２２は、ＥＣ−ＣＯＬ合成において分解生成物が観察されなかったことを示す。
【図２３】図２３は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＣＯＬについての、時間関数としての腫瘍  対  筋肉比および腫瘍  対  血液比である。
【図２４】図２４は、９９ｍＴｃ−ＥＣについての、時間関数としての腫瘍  対  筋肉比および腫瘍  対  血液比である。
【図２５】図２５は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＣＯＬを用いた胸部腫瘍保有ラットにおけるインビボ画像研究である。
【図２６】図２６は、９９ｍＴｃ−ＥＣを用いた胸部腫瘍保有ラットにおけるインビボ画像研究である。
【図２７】図２７は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＣＯＬ  対  ９９ｍＴｃ−ＥＣの、注射後のコンピューターで輪郭をとった目的の領域である。
【図２８】図２８は、発作に罹患した５９歳の男性患者の９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＮを用いたＳＰＥＣＴである。画像は、注射１時間後に撮影した。
【図２９】図２９は、図２８と同じ患者のＭＲＩ  Ｔ１重み付け画像である。
【図３０】図３０は、発作１日後の７３歳の男性患者の、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＮを用いた注射の１時間後でのＳＰＥＣＴである。
【図３１】図３１は、発作１２日後の図３０で画像化した同じ７３歳の男性患者の、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＮを用いた注射の１時間後でのＳＰＥＣＴである。
【図３２】図３２は、発作１日後の図３０で画像化した同じ７３歳の男性発作患者のＣＴである。
【図３３】図３３は、発作１２日後の図３２で画像化した同じ７３歳の男性発作患者のＣＴである。画像化にＣＴを用いた１日目と１２日目との間に顕著な差がないことに注意する。
【図３４】図３４は、発作に罹患した７２歳の男性患者の９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＮを用いた注射の１時間後でのＳＰＥＣＴである。
【図３５】図３５は、図３４で画像化した同じ７２歳の男性発作患者のＣＴである。ＣＴがいかに病変サイズを誇張しているかに注意すること。
【図３６】図３６は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシンの合成スキームである。
【図３７Ａ】９９ｍＴｃ−ＥＣおよび９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシン（１００μＣｉ／ラット、静脈内）の投与後の胸部腫瘍保有ラットのシンチグラフィー画像は、この腫瘍が注射後０．５〜４時間で良好に可視化され得ることを示す。
【図３７Ｂ】図３７Ｂは、乳癌患者の９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシン（３０ｍＣｉ、静脈内）を用いたシンチマンモグラフィである。画像は、注射２時間後に撮影した。
【図３８Ａ】図３８Ａは、ＥＣの１Ｈ−ＮＭＲである。
【図３８Ｂ】図３８Ｂは、ネオマイシンの１Ｈ−ＮＭＲである。
【図３８Ｃ】図３８Ｃは、ＥＣ−ネオマイシンの１Ｈ−ＮＭＲである。
【図３９】図３９Ａおよび図３９Ｂは、ＥＣ−ネオマイシンの質量分析である（Ｍ＋１１１２．５５）。
【図４０Ａ】図４０Ａは、ＥＣのＵＶ波長スキャンである。
【図４０Ｂ】図４０Ｂは、ネオマイシンのＵＶ波長スキャンである。
【図４０Ｃ】図４０Ｃは、ＥＣ−ネオマイシンのＵＶ波長スキャンである。
【図４１】図４１は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシンのラジオ−ＴＬＣ分析である。
【図４２】図４２は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシンのＨＰＬＣ分析である（放射能検出器）。
【図４３】図４３は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシンのＨＰＬＣ分析である（ＵＶ  ２５４ｎｍ）。
【図４４】図４４は、１８Ｆ−ＦＤＧのＨＰＬＣ分析である（放射能検出器）。
【図４５】図４５は、１８Ｆ−ＦＤＧのＨＰＬＣ分析である（ＵＶ  ２５４ｎｍ）。
【図４６】図４６は、肺癌細胞株における一連の９９ｍＴｃ−ＥＣ薬物結合体のインビトロ細胞取り込みアッセイである。９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシンは、試験した薬剤において最も高い取り込みを示した。
【図４７】図４７は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシンおよび１８Ｆ−ＦＤＧの細胞（Ａ５４９）取り込みに対するグルコースの影響を示す。
【図４８Ａ】図４８Ａは、薬物取り込み（％）として示され、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシンおよび１８Ｆ−ＦＤＧの細胞（Ｈ１２９９）取り込みに対するグルコースの影響を示す。
【図４８Ｂ】図４８Ｂは、グルコース充填に伴なう変化（％）として示され、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシンおよび１８Ｆ−ＦＤＧの細胞（Ｈ１２９９）取り込みに対するグルコースの影響を示す。
【図４９】図４９は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−グルコサミンの合成スキームである。
【図５０】図５０は、グルコースのヘキソキナーゼアッセイである。
【図５１】図５１は、グルコサミンのヘキソキナーゼアッセイである。
【図５２】図５２は、ＥＣ−グルコサミンのヘキソキナーゼアッセイである。
【図５３】図５３は、ＥＣ−ＧＡＰ−グルコサミンのヘキソキナーゼアッセイである。
【図５４】図５４は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＧＡＰ−グルコサミンの合成スキームである。
【図５５Ａ】図５５Ａ〜図５５Ｃは、肺癌細胞株（Ａ５４９）における９９ｍＴｃ−ＥＣ（図５５Ａ）、９９ｍＴｃ−ＥＣ−デオキシグルコース−ＧＡＰ（図５５Ｂ）、および１８Ｆ−ＦＤＧ（図５５Ｃ）のインビトロ細胞取り込みアッセイである。９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＤＧは、１８Ｆ−ＦＤＧと比較して類似の取り込みを示した。
【図５５Ｂ】図５５Ａ〜図５５Ｃは、肺癌細胞株（Ａ５４９）における９９ｍＴｃ−ＥＣ（図５５Ａ）、９９ｍＴｃ−ＥＣ−デオキシグルコース−ＧＡＰ（図５５Ｂ）、および１８Ｆ−ＦＤＧ（図５５Ｃ）のインビトロ細胞取り込みアッセイである。９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＤＧは、１８Ｆ−ＦＤＧと比較して類似の取り込みを示した。
【図５５Ｃ】図５５Ａ〜図５５Ｃは、肺癌細胞株（Ａ５４９）における９９ｍＴｃ−ＥＣ（図５５Ａ）、９９ｍＴｃ−ＥＣ−デオキシグルコース−ＧＡＰ（図５５Ｂ）、および１８Ｆ−ＦＤＧ（図５５Ｃ）のインビトロ細胞取り込みアッセイである。９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＤＧは、１８Ｆ−ＦＤＧと比較して類似の取り込みを示した。
【図５６】図５６は、胸部腫瘍保有ラットにおける９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＧＡＰの腫瘍  対  組織カウント密度比である。
【図５７】図５７は、乳癌細胞株（１３７６２）における注射２時間後の、グルコース充填を伴なう１８ＦＤＧのインビトロ細胞取り込みである。
【図５８】図５８は、胸部腫瘍保有マウスにおける９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシンのインビボ組織取り込みである。
【図５９】図５９は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−デオキシグルコースの合成スキームである。
【図６０】図６０は、ＥＣ−デオキシグルコースの質量分析である。
【図６１】図６１は、ＥＣ−デオキシグルコース（ＥＣ−ＤＧ）の１Ｈ−ＮＭＲである。
【図６２】図６２は、グルコサミンの１Ｈ−ＮＭＲである。
【図６３】図６３は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＤＧのラジオ−ＴＬＣ分析である。
【図６４】図６４は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−デオキシグルコースおよび９９ｍＴｃ−ＥＣのＨＰＬＣ分析である（放射能検出器）。
【図６５】図６５は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−デオキシグルコースおよび９９ｍＴｃ−ＥＣのＨＰＬＣ分析である（放射能検出器、混合）。
【図６６】図６６は、グルコースのヘキソキナーゼアッセイである。
【図６７】図６７は、ＦＤＧのヘキソキナーゼアッセイである。
【図６８】図６８は、ＥＣ−ＤＧのヘキソキナーゼアッセイである。
【図６９】図６９は、肺癌細胞株（Ａ５４９）における９９ｍＴｃ−ＥＣ−デオキシグルコース、９９ｍＴｃ−ＥＣおよび１８Ｆ−ＦＤＧのインビトロ細胞取り込みアッセイである。９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＤＧは、１８Ｆ−ＦＤＧと比較して類似した取り込みを示した。
【図７０】図７０は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＤＧの胸部細胞（１３７６２細胞株）取り込みに対するｄ−グルコースおよびｌ−グルコースの影響である。
【図７１】図７１は、１８Ｆ−ＦＤＧの胸部細胞（１３７６２細胞株）取り込みに対するｄ−グルコースおよびｌ−グルコースの影響である。
【図７２】図７２は、１８Ｆ−ＦＤＧの肺細胞（Ａ５４９細胞株）取り込みに対するｄ−グルコースおよびｌ−グルコースの影響である。
【図７３】図７３は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＤＧの肺細胞（Ａ５４９細胞株）取り込みに対するｄ−グルコースおよびｌ−グルコースの影響である。
【図７４】図７４は、グルコサミンおよびＥＣ−ＤＧ（１．２ｍｍｏｌ／ｋｇ、静脈内）によって誘導されたインビボ血中グルコースレベルの影響である。
【図７５】図７５は、ＦＤＧ（１．２ｍｍｏｌ／ｋｇおよび１．９ｍｍｏｌ／ｋｇ、静脈内）およびインスリンによって誘導されたインビボ血中グルコースレベルの影響である。
【図７６】図７６は、胸部腫瘍保有ラットにおける９９ｍＴｃ−ＥＣ−デオキシグルコースの腫瘍  対  組織カウント密度比である。
【図７７】図７７は、胸部腫瘍保有ラットにおける９９ｍＴｃ−ＥＣ−デオキシグルコースのインビボ生体分布である。
【図７８】図７８は、肺腫瘍保有マウスにおける９９ｍＴｃ−ＥＣ−デオキシグルコースのインビボ組織取り込みである。
【図７９】図７９は、肺腫瘍保有マウスにおける９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシンのインビボ組織取り込みである。
【図８０】図８０は、肺腫瘍保有マウスにおける１８Ｆ−ＦＤＧのインビボ組織取り込みである。
【図８１】９９ｍＴｃ−ＥＣおよび９９ｍＴｃ−ＥＣ−デオキシグルコース（１００μＣｉ／ラット、静脈内）投与後の胸部腫瘍保有ラットの平面画像は、この腫瘍が、注射後０．５〜４時間で良好に可視化され得ることを示した。
【図８２Ａ】図８２Ａは、悪性神経膠星状細胞腫を有する患者のＭＲＩである。
【図８２Ｂ】図８２Ｂは、悪性神経膠星状細胞腫を有する患者の９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＤＧを用いたＳＰＥＣＴである。
【図８３Ａ】図８３Ａは、出血性神経膠星状細胞腫を有する患者のＭＲＩである。
【図８３Ｂ】図８３Ｂは、悪性神経膠星状細胞腫を有する患者の９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＤＧを用いたＳＰＥＣＴである。
【図８４Ａ】図８４Ａは、良性髄膜腫を有する患者のＭＲＩである。
【図８４Ｂ】良性髄膜腫を有する患者の９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＤＧを用いたＳＰＥＣＴは、焦点が強調された取り込みを示さなかった。
【図８５Ａ】図８５Ａは、肺におけるＴＢを有する患者のＣＴである。
【図８５Ｂ】ＴＢを有する患者の９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＤＧを用いたＳＰＥＣＴは、焦点が強調された取り込みを示さなかった。
【図８６Ａ】図８６Ａは、肺癌を有する患者のＣＴである。
【図８６Ｂ】図８６Ｂは、肺癌を有する患者の９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＤＧを用いた全身画像である。
【図８６Ｃ】図８６Ｃは、肺癌を有する患者の９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＤＧを用いたＳＰＥＣＴであり、腫瘍は、焦点が強調された取り込みを示した。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
（例示的な実施形態の説明）
核医学の分野において、特定の病理的状態は、局在化するか、またはそれらの程度が、少量の内部投与される放射性標識されたトレーサ化合物（放射性トレーサまたは放射性薬品と呼ばれる）の分布を検出することによって評価される。これらの放射性薬品を検出するための方法は、画像化法または放射性画像化法として一般的に公知である。
【００３０】
放射性画像化において、放射性標識は、γ線放射放射性核種であり、そして放射性トレーサは、γ線検出カメラを使用して位置決めされる（このプロセスは、しばしば、γシンチグラフィと呼ばれる）。画像化部位は、検出可能である。なぜなら、放射性トレーサは、病理学的部位に局在化する（陽性コントラストと呼ばれる）か、あるいは、放射性トレーサがこのような病理学的部位に特異的に局在化しないように選択される（陰性コントラストと呼ばれる）かのいずれかであるからである。
【００３１】
種々の放射性核種（６７Ｇａ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１６９Ｙｂまたは１８６Ｒｅを含む）は、放射性画像化に有用であることが公知である。より良い画像化特性および低価格に起因して、可能な場合、１２３Ｉ、１３１Ｉ、６７Ｇａおよび１１１Ｉｎ標識された化合物を、対応する９９ｍＴｃ標識化合物に置き換える試みがなされている。好ましい物理的特質および非常に低い価格（１ｍＣｉ当たり０．２１ドル）に起因して、９９ｍＴｃは、放射性薬品を標識するのに好ましかった。ＤＴＰＡ薬物結合体が９９ｍＴｃで効果的に標識され得ることが報告された（Ｍａｔｈｉａｓら、１９９７）が、ＤＴＰＡ部分は、１１１Ｉｎほど安定には９９ｍＴｃにキレート化しない（Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ、１９９７）。
【００３２】
ヒトにおける最適な放射線画像化のために、多くの因子が考慮されなければならない。検出の効率を最大にするために、１００〜２００ｋｅＶの範囲でγエネルギーを放射する放射性核種が好ましい。患者に対する吸収される放射線量を最小にするために、放射性核種の物理的半減期は、画像化手順が可能である限り短くあるべきである。検査が任意の日にそしてその日の任意の時間で行われ得るために、臨床場所においていつでも利用可能な放射性核種の供給源を有することが有利である。９９ｍＴｃは、１４０ｋｅＶでγ線を放射し、６時間の物理的半減期を有し、そしてモリブデン−９９／テクネチウム−９９ｍ発生器を使用して、現場で容易に利用可能であるので、好ましい放射性核種である。
【００３３】
ビスアミノエタンチオール４座配位リガンド（ジアミノジチオール化合物とも呼ばれる）は、２つのチオール硫黄および２つの窒素原子に対するオキソテクネチウム基の効率的な結合に基づいて、非常に安定なＴｃ（Ｖ）Ｏ−錯体を形成することが公知である（Ｄａｖｉｓｏｎら、１９８０；１９８１；Ｖｅｒｂｒｕｇｇｅｎら、１９９２）。９９ｍＴｃ−Ｌ，Ｌ−エチレンジシステイン（９９ｍＴｃ−ＥＣ）は、最近成功したＮ２Ｓ２キレートの例である（Ｖｅｒｂｒｕｇｇｅｎら、１９９２；Ｖａｎ  Ｎｅｒｏｍら、１９９３；Ｓｕｒｍａら、１９９４）。ＥＣ（新規な腎臓画像化剤）は、９９ｍＴｃで容易に標識化され得、そして高い放射化学純度および安定性で効率的に標識され得、そして活性な管輸送によって腎臓を通って排出され得る（Ｖｅｒｂｒｕｇｇｅｎら、１９９２；Ｖａｎ  Ｎｅｒｏｍら、１９９３；Ｓｕｒｍａら、１９９４；Ｖｅｒｂｒｕｇｇｅｎら、１９９０；Ｖａｎ  Ｎｅｒｏｍら、１９９０；Ｊａｍａｒら、１９９３）。ＥＣの他の用途は、ＰＥＴのためのガリウム−６８（陽電子放射体、ｔ１／２＝６８分）および磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）のためのガドリニウム、鉄またはマンガンとキレート化される。
【００３４】
本発明は、画像化のために、リガンドを特定の組織型に標的化させるための標識剤として９９ｍＴｃ−ＥＣを利用する。ＥＣを組織標的リガンドに結合する利点は、組織標的リガンドの特異的結合特性が目的の領域上で放射性シグナルを濃縮することである。標識化戦略としての９９ｍＴｃ−ＥＣの使用が、実質的に任意の型の化合物で効果的であり得ることが考慮されるが、いくつかの提案される好ましいリガンドは、例示の目的のために本明細書中において提供される。本発明の９９ｍＴｃ−ＥＣ薬物結合体が腫瘍だけでなく、他の組織特異的状態（例えば、感染、低酸素組織（発作）、心筋梗塞、アポトーシス細胞、アルツハイマー病および子宮内膜症）をも画像化するのに有用であり得る。
【００３５】
放射標識タンパク質およびペプチドは、先行技術において報告されている（Ｅｇｅら、米国特許第４，８３２，９４０号、Ａｂｒａｍｓら、１９９０；Ｂａｋｋｅｒら、１９９０；Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈら、１９９５，１９９７；Ｏｌｅｘａら、１９８２；Ｒａｎｂｙら、１９８８；Ｈａｄｌｅｙら、１９８８；Ｌｅｅｓら、１９８９；Ｓｏｂｅｌら、１９８９；Ｓｔｕｔｔｌｅ、１９９０；Ｍａｒａｇａｎｏｒｅら、１９９１；Ｒｏｄｗｅｌｌら、１９９１；Ｔｕｂｉｓら、１９６８；Ｓａｎｄｒｅｈａｇｅｎ  １９８３）。しかし、９９ｍＴｃ−ＥＣは、本発明の前に、任意のリガンド（ジエチルエステル以外）と組み合わせて使用されなかった（Ｋａｂａｓａｋａｌ、２０００）。ＥＣのジエチルエステルは、脳血流剤として使用された（Ｋｉｋｕｋａｗａら、２０００）。
【００３６】
放射性画像化について最適ではあるが、９９ｍＴｃの化学は、他の元素の化学ほど完全には研究されておらず、このため、９９ｍＴｃでの放射標識の方法は、豊富ではない。９９ｍＴｃは、通常、モリブデン−９９／テクネチウム−９９ｍ発生器から、９９ｍＴｃペルテクネテート（ＴｃＯ４−；＋７の酸化状態のテクネチウム）として通常得られる。しかし、ペルテクネテートは、他の化合物と十分結合しない。従って、化合物を放射標識するために、９９ｍＴｃペルテクネテートは、別の形態に変換されなければならない。テクネチウムが水溶液において安定なイオンを形成しないので、分解を妨げ、９９ｍＴｃの不溶性の二酸化テクネチウムへの変換も、ペルテクネテートへ戻る変換も生じることを妨げるのに十分な動力学的および熱力学的安定性を有する配位錯体の形態でこのような溶液中で保持されなければならない。
【００３７】
放射標識化のために、９９ｍＴｃ錯体が、テクネチウムイオンの周りのドナー基のすべてが単一のキレートリガンドによって提供される（この場合、エチレンジシステイン）であるキレートとして形成されることが特に有利である。これによって、キレート化された９９ｍＴｃが、エチレンジシステインとリガンドとの間で直接かまたは単一のリンカーを介してのいずれかで、組織特異的リガンドに共有結合され得る。
【００３８】
テクネチウムは、多くの酸化状態（＋１、＋２、＋４、＋５、＋６および＋７）を有する。＋１の酸化状態である場合、Ｔｃ  ＭＩＢＩと呼ばれる。Ｔｃ  ＭＩＢＩは、熱反応を用いて作製されなければならない（Ｓｅａｂｏｌｄら、１９９９）。本発明の目的のために、Ｔｃが＋４の酸化状態であることが重要である。この酸化状態は、ＥＣを用いるＮ２Ｓ２キレートを形成するのに理想的である。従って、本発明の薬物結合体と放射性テクネチウムとの錯体の形成において、テクネチウム錯体（好ましくは、９９ｍＴｃペルテクネテートの塩）は、還元剤の存在下で、本発明の薬物結合体と反応する。
【００３９】
本発明における使用のための好ましい還元剤は、Ｔｃをその＋４の酸化状態に還元するための塩化スズ（ＳｎＣｌ２）の形態のスズイオンである。しかし、他の還元剤（例えば、ジチオネートイオンまたは鉄（ＩＩ）イオン）が本発明と組み合わせて有用であり得る。還元剤が固相還元剤であり得ることも意図される。還元剤の量は、重要であり得る。なぜなら、コロイドの形成を避けることが必要であるからである。例えば、約１００〜約３００ｍＣｉのＴｃペルテクネテート当たり、約１０〜約１００μｇのＳｎＣｌ２を使用することが好ましい。最も好ましい量は、約２００ｍＣｉのＴｃペルテクネテートおよび約２ｍｌの生理食塩水当たり、約０．１ｍｇのＳｎＣｌ２である。これは、代表的には、５人の患者における使用に十分なＴｃ−ＥＣ組織特異的リガンド結合体を作製する。
【００４０】
エチレンジシステインの酸化を防ぐために、組成物中に酸化防止剤を含むこともしばしば重要である。本発明と組み合わせた使用に好ましい酸化防止剤は、ビタミンＣ（アスコルビン酸）である。しかし、他の酸化防止剤（例えば、トコフェロール、ピリドキシン、チアミンまたはルチン）もまた有用であり得ることが意図される。
【００４１】
一般的に、本発明と組み合わせた使用のためのリガンドは、酸のアームのいずれかまたは両方でＥＣに結合し得るアミノ基またはヒドロキシ基のいずれかを有する。アミノ基またはヒドロキシル基が利用可能でない場合（例えば、酸官能基）、所望のリガンドは、リンカー（例えば、エチレンジアミン、アミノプロパノール、ジエチレントリアミン、アスパラギン酸、ポリアスパラギン酸、グルタミン酸、ポリグルタミン酸、またはリジン）を加えることによって本発明の方法を使用して、なおＥＣに結合し、そして９９ｍＴｃで標識される。本発明における使用に意図されるリガンドとしては、限定しないが、新脈管形成／抗新脈管形成リガンド、ＤＮＡトポイソメラーゼインヒビター、解糖マーカー、抗代謝リガンド、アポトーシス／低酸素リガンド、ＤＮＡインターカレーター、レセプターマーカー、ペプチド、ヌクレオチド、抗菌剤（例えば、抗生物質または抗真菌剤）、器官特異的リガンドおよび糖または薬剤（グルコースを模倣する）が挙げられる。
【００４２】
ＥＣ自体は、水溶性である。本発明のＥＣ−薬物結合体もまた水溶性であることが必要である。本発明と組み合わせて使用されるリガンドの多くは、水溶性であるか、またはＥＣと結合した場合に水溶性化合物を形成する。しかし、組織特異的リガンドが水溶性でない場合、リガンドの溶解性を増加するリンカーが使用され得る。リンカーは、脂肪族アルコールまたは芳香族アルコール、アミンまたはペプチドにあるいはカルボキシルおよびまたはペプチドに結合し得る。リンカーは、ポリアミノ酸（ペプチド）またはアミノ酸（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸またはリジン）のいずれかであり得る。表１は、特異的薬物官能基に対する所望のリンカーを示す。
【００４３】
【表１】
0005781026.tif 000002
例：
Ａ．エストラジオール、トポテカン、パクリタキセル、ラロキシルフェン（ｒａｌｏｘｆｅｎ）エトポシド
Ｂ．ドキソルビシン、マイトマイシンＣ、エンドスタチン、アネキシンＶ．ＬＨＲＨ、オクトレオチド、ＶＩＰ
Ｃ．メトトレキサート、葉酸
本発明のＥＣ組織特異的リガンド薬物結合体が他の放射性核種にキレート化し得、放射性核種療法に使用され得ることも想定される。一般的に、実質的に任意のα，β−放射体、γ−放射体、またはβ，γ−放射体が、本発明とともに使用され得ることが考えられる。好ましいβ，γ−放射体としては、１６６Ｈｏ、１８８Ｒｅ、１８６Ｒｅ、１５３Ｓｍ、および８９Ｓｒが挙げられる。好ましいβ−放射体としては、９０Ｙおよび２２５Ａｃが挙げられる。好ましいγ−放射体としては、６７Ｇａ、６８Ｇａ、６４Ｃｕ、６２Ｃｕおよび１１１Ｉｎが挙げられる。好ましいα−放射体としては、２１１Ａｔおよび２１２Ｂｉが挙げられる。常磁性物質（例えば、Ｇｄ、ＭｎおよびＦｅ）が、本発明と組み合わせた使用のためにＥＣとキレート化され得ることも想定される。
【００４４】
錯体およびこのような錯体を調製するための手段は、標識される本発明のＥＣ−組織特異的リガンドの所定量および９９ｍＴｃで結合体を標識するのに十分な量の還元剤を含む密封バイアルを備えるキット形態で便利に提供される。本発明に従う９９ｍＴｃ標識シンチグラフィ画像化剤は、ＥＣ−組織特異的結合体および還元剤を含むバイアルへの適切な量の９９ｍＴｃまたは９９ｍＴｃ錯体の添加、および本明細書中、以下の実施例１に記載される条件下での反応によって調製され得る。キットはまた、例えば、浸透圧を調節するための薬学的に受容可能な塩、緩衝液、保存剤、酸化防止剤などのような従来の薬学的補助物質を含み得る。キットの成分は、液体形態、凍結形態または乾燥形態であり得る。好ましい実施形態において、キット成分は、凍結乾燥形態で提供される。
【００４５】
本発明によって提供される放射性標識試薬または結合体は、適切な量の放射能を有して提供される。９９ｍＴｃ放射性錯体を形成する際に、１ｍＬ当たり約０．０１ミリキュリー（ｍＣｉ）〜約３００ｍＣｉの濃度で放射能を含む溶液で放射性錯体を形成することが一般的に好ましい。
【００４６】
本発明によって提供される９９ｍＴｃ標識シンチグラフィ画像化剤は、哺乳動物の身体における部位を視覚化するために使用され得る。本発明に従って、９９ｍＴｃ標識シンチグラフィ画像化剤は、単一の単位注射可能線量で投与される。当業者に公知の任意の通常のキャリア（例えば、滅菌生理食塩水溶液または血漿）は、本発明に従って、種々の器官、腫瘍などを診断的に画像化するための注射可能溶液を調製するための放射標識の後に、利用され得る。一般的に、投与される単位線量は、約０．０１ｍＣｉ〜約３００ｍＣｉ、好ましくは１０ｍＣｉ〜約２００ｍＣｉの放射能を有する。単位投薬量で注入される溶液は、約０．０１ｍＬ〜約１０ｍＬである。静脈内投与の後に、器官または腫瘍のインビボでの画像化は、所望である場合、放射標識試薬が、患者に導入された後の数時間でまたはそれより長くにおいて行われ得る。大部分の場合、十分な量の投与線量が、シンチフォトグラフをとることを可能にするように約０．１時間以内に画像化される領域に蓄積する。診断目的または予後判定目的のためのシンチグラフィ画像化の任意の従来の方法が、本発明に従って利用され得る。
【００４７】
本発明の９９ｍＴｃ−ＥＣ標識戦略はまた、予後判定の目的のために使用され得る。ＥＣが癌化学療法のために選択した公知の薬物（例えば、表２に列挙されるもの）に結合され得ることが想定される。次いで、これらのＥＣ−薬物結合体は、９９ｍＴｃで放射標識され得、そして腫瘍を有する患者に投与され得る。標識ＥＣ−薬物結合体は、腫瘍に特異的に結合する。画像化は、特定の患者の特定の腫瘍に対する癌化学療法薬物の効力を決定するために実行され得る。この方法において、医師は、続行するどの処置様式がもっとも有効か、どの化学療法薬物がもっとも有効かを迅速に決定し得る。これは、薬物を選択する工程および１回の化学療法を施す工程を包含する現在の方法に対して劇的な改善を表す。これは、薬物の効果が決定され得る前の、数か月の患者の時間および数千ドルに関係する。
【００４８】
本発明によって提供される９９ｍＴｃ標識ＥＣ−組織特異的リガンド結合体および錯体は、水性生理食塩水媒体のような静脈内注射のための任意の従来の媒体で、または血漿媒体において静脈内で投与され得る。このような媒体はまた、例えば、浸透圧を調節するための薬学的に受容可能な塩、緩衝液、保存剤、酸化防止剤などのような従来の薬学的補助物質を含み得る。好ましい媒体には、ノーマルセーラインおよび血漿がある。
【００４９】
特定の好ましい標的化戦略は、さらに詳細に以下に議論される。
【００５０】
（腫瘍葉酸レセプター標的化）
放射標識リガンド（例えば、ペンテトレオチド（ｐｅｎｔｅｔｒｅｏｔｉｄｅ）および血管作用性腸ペプチド）は、細胞レセプターに結合し、これらのうちのいくつかは、腫瘍細胞において過剰発現される（ＢｒｉｔｔｏｎおよびＧｒａｎｏｗｓｋａ、１９９６；Ｋｒｅｎｎｉｎｇら、１９９５；Ｒｅｕｂｉら、１９９２；Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈら、１９９５；Ｖｉｒｇｏｌｉｎｉら、１９９４）。これらのリガンドが免疫原性でなく、そして血漿から迅速に排除されるので、レセプター画像化は、抗体画像化と比較してより見込みがあるようである。
【００５１】
葉酸および葉酸代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート）が、古典的な還元型葉酸キャリアシステムに加えて、高い親和性の葉酸レセプター（グリコシルホスファチジルイノシトール結合膜葉酸結合タンパク質）を介して、細胞に入る（Ｗｅｓｔｅｒｈｏｆら、１９９１；Ｏｒｒら、１９９５；ＨｓｕｅｈおよびＤｏｌｎｉｃｋ、１９９３）。葉酸レセプター（ＦＲ）は、多くの新生物細胞型（例えば、肺癌、乳房癌、卵巣癌、頚部癌、結腸直腸癌、鼻咽頭癌、腎腺癌、悪性黒色腫および上衣細胞腫）において過剰発現されるが、主に、いくつかの正常な分化組織（例えば、脈絡叢、胎盤、甲状腺および腎臓）において発現される（Ｏｒｒら、１９９５；Ｗｅｉｔｍａｎら、１９９２ａ；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９９１；Ｗｅｉｔｍａｎら、１９９２ｂ；Ｈｏｌｍら、１９９４；Ｒｏｓｓら、１９９４；Ｆｒａｎｋｌｉｎら、１９９４；Ｗｅｉｔｍａｎら、１９９４）。ＦＲは、葉酸結合タンパク質毒素、薬物／アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリポソームを、葉酸レセプターを過剰発現する腫瘍細胞に送達するために使用された（Ｇｉｎｏｂｂｉら、１９９７；ＬｅａｍｏｎおよびＬｏｗ、１９９１；ＬｅａｍｏｎおよびＬｏｗ、１９９２；Ｌｅａｍｏｎら、１９９３；ＬｅｅおよびＬｏｗ、１９９４）。さらに、抗Ｔ細胞レセプター抗体に結合される抗ＦＲ抗体を含む二特異的抗体は、Ｔ細胞をＦＲ陽性腫瘍に標的化するために使用されており、現在、卵巣癌について臨床試験にある（Ｃａｎｅｖａｒｉら、１９９３；Ｂｏｌｈｕｉｓら、１９９２；Ｐａｔｒｉｃｋら、１９９７；Ｃｏｎｅｙら、１９９４；Ｋｒａｎｚら、１９９５）。同様に、この性質は、放射標識葉酸結合体（例えば、葉酸レセプター陽性腫瘍の画像化のための、６７Ｇａデフェロキサミン−葉酸および１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡ−葉酸）を開発するために鼓舞された（Ｍａｔｈｉａｓら、１９９６；Ｗａｎｇら、１９９７；Ｗａｎｇら、１９９６；Ｍａｔｈｉａｓら、１９９７ｂ）。これらの薬剤を用いた限定されたインビトロおよびインビボ研究の結果は、葉酸レセプターが、腫瘍画像化のための潜在的な標的であり得ることを示唆する。本発明において、本発明者らは、一連の新規な葉酸レセプターリガンドを開発した。これらのリガンドは、９９ｍＴｃ−ＥＣ−葉酸、９９ｍＴｃ−ＥＣ−メトトレキセート（９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＴＸ）、９９ｍＴｃ−ＥＣ−トムデックス（ｔｏｍｕｄｅｘ）（９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＴＤＸ）である。
【００５２】
（腫瘍低酸素標的化）
腫瘍細胞は、酸素の非存在化におけるよりも酸素の存在下において従来の照射により感受性である；腫瘍内の少ない割合の低酸素細胞でさえ、放射線に対する応答を制限し得る（Ｈａｌｌ、１９８８；Ｂｕｓｈら、１９７８；Ｇｒａｙら、１９５３）。低酸素放射線抵抗性は、多くの動物腫瘍において示されたが、ヒトにおいては少しの腫瘍型のみで示された（Ｄｉｓｃｈｅ、１９９１；Ｇａｔｅｎｂｙら、１９８８；Ｎｏｒｄｓｍａｒｋら、１９９６）。ヒト腫瘍における低酸素の発生は、大部分において、組織学的知見および動物腫瘍研究から推論された。低酸素のインビボ実証は、酸素電極を用いた組織測定を必要とし、そしてこれらの技術の侵襲性は、それらの臨床的適用を限定している。
【００５３】
ミソニダゾール（ＭＩＳＯ）は、低酸素細胞増感剤であり、そして異なる放射性同位体（例えば、１８Ｆ、１２３Ｉ、９９ｍＴｃ）でのＭＩＳＯの標識は、ＰＥＴまたは平面（ｐｌａｎａｒ）シンチグラフィによる十分に酸素化された活性腫瘍から、低酸素だか代謝的に活性な腫瘍を区別するのに有用であり得る。［１８Ｆ］フルオロソニダゾール（ＦＭＩＳＯ）は、腫瘍低酸素を評価するためにＰＥＴとともに使用される。最近の研究は、ＰＥＴ（［１８Ｆ］ＦＭＩＳＯによる細胞酸素含有量をモニターするその能力を有する）が、放射線に対する腫瘍応答を推測するための高い可能性を有することを示した（Ｋｏｈら、１９９２；Ｖａｌｋら、１９９２；Ｍａｒｔｉｎら、１９８９；Ｒａｓｅｙら、１９８９；Ｒａｓｅｙｅｔａｌら、１９９０；Ｙａｎｇら、１９９５）。ＰＥＴは、視準なしで高い分解能を提供するが、臨床設定においてＰＥＴ同位体を使用するコストは、ひどく高い。ヨウ素でのＭＩＳＯの標識化が選択されたが、甲状腺組織における高い取り込みが観測された。従って、同位体があまり高価でなく、そして大部分の主用な医療設備において容易に入手可能である平面シンチグラフィのための化合物を開発することが望ましい。本発明において、発明者らは、９９ｍＴｃ−ＥＣ−２−ニトロイミダゾールおよび９９ｍＴｃ−ＥＣ−メトロニダゾールの合成を提供し、そして腫瘍低酸素マーカーとしてそれらの潜在的な使用を示す。
【００５４】
（癌のペプチド画像化）
ペプチドおよびアミノ酸は、種々の型の腫瘍の画像化において首尾よく使用されてきた（Ｗｅｓｔｅｒら、１９９９；ＣｏｅｎｅｎおよびＳｔｏｃｋｌｉｎ、１９８８；Ｒａｄｅｒｅｒら、１９９６；Ｌａｍｂｅｒｔら、１９９０；Ｂａｋｋｅｒら、１９９０；ＳｔｅｌｌａおよびＭａｔｈｅｗ、１９９０；Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄら、１９９８；Ｐｉｐｅｒら、１９８３；Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉら、ＤｉｃｋｉｎｓｏｎおよびＨｉｌｔｎｅｒ、１９８１）。グルタミン酸ベースのペプチドは、癌処置のための薬物キャリアとして使用されてきた（ＳｔｅｌｌａおよびＭａｔｈｅｗ、１９９０；Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄら、１９９８；Ｐｉｐｅｒら、１９８３；Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉら、１９８５；ＤｉｃｋｉｎｓｏｎおよびＨｉｌｔｎｅｒ、１９８１）。ホレートのグルタメート部分が分解し、そしてインビボでポリグルタメートを形成することは公知である。次いで、このポリグルタメートは、ホレートに再結合されて、ホリルポリグルタメートを形成し、このホリルポリグルタメートは、グルコース代謝に関係する。グルタミン酸ペプチドを標識することは、腫瘍の悪性度を区別する際に有用であり得る。本発明において、本発明者らは、ＥＣ−グルタミン酸ペンタペプチドの合成を報告し、そして腫瘍の画像化におけるその潜在的な使用を評価する。
【００５５】
（腫瘍アポトーシス細胞の画像化）
アポトーシスは、化学療法および放射線を用いる癌の処置の間に生じる（Ｌｅｎｎｏｎら、１９９１；Ａｂｒａｍｓら、１９９０；Ｂｌａｋｅｎｂｅｒｇら、１９９８；Ｂｌａｋｅｎｂｅｒｇら、１９９９；ＴａｉｔおよびＳｍｉｔｈ、１９９１）。アネキシンＶは、ホスホチジルセリンに結合することが知られており、このホスホチジルセリンは、腫瘍アポトーシス細胞によって過剰発現される（Ｂｌａｋｅｎｂｅｒｇら、１９９９；ＴａｉｔおよびＳｍｉｔｈ、１９９１）。アネキシンＶによるアポトーシスの評価は、治療の効力（例えば、疾患の進行または後退）を評価するために有用である。本発明において、本発明者らは、９９ｍＴｃ−ＥＣ−アネキシンＶ（ＥＣ−ＡＮＮＥＸ）を合成し、そして腫瘍画像化におけるその潜在的な使用を評価する。
【００５６】
（腫瘍新脈管形成の画像化）
新脈管形成は、部分的に、腫瘍増殖および転移の発生の原因である。抗有糸分裂性化合物は、抗脈管形成性であり、そして抗癌薬物としてのそれらの潜在的な使用について知られている。これらの化合物は、細胞サイクルの分裂期の間の細胞分裂を阻害する。細胞機能の生化学的プロセス（例えば、細胞分裂、細胞運動性、分泌、線毛運動およびべん毛運動、細胞内輸送、ならびに細胞の形態の維持）の間に、微小管が関係する。抗有糸分裂性化合物は、高い親和性で、微小管タンパク質（チューブリン）に結合し、微小管アセンブリを乱し、そして増幅細胞の有糸分裂の停止を引き起こすことが知られている。従って、抗有糸分裂性化合物は、微小管インヒビターとして、または紡錘体毒として、みなされる（Ｌｕ、１９９５）。
【００５７】
多くの型の抗有糸分裂性化合物は、チューブリンに結合することによって、微小管アセンブリ−ディスアセンブリを制御する（Ｌｕ、１９９５；Ｇｏｈら、１９９８；Ｗａｎｇら、１９９８；Ｒｏｗｉｎｓｋｙら、１９９０；Ｉｍｂｅｒｔ、１９９８）。コルヒチノイド（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｏｉｄ）のような化合物は、コルヒチン結合部位上のチューブリンと相互作用し、そしてチューブリンの構築を阻害する（Ｌｕ、１９９５；Ｇｏｈら、１９９８；Ｗａｎｇら、１９９８）。コルヒチノイドの中で、コルヒチンは、急性痛風の予防を処置するために使用される有効な抗炎症性薬物である。コルヒチンはまた、慢性骨髄性白血病において使用され得る。コルヒチノイドは、特定の型の腫瘍増殖に対して強力であるが、臨床的な治療可能性は、治療的効果および毒性効果を分離することが不可能であるために、制限される（Ｌｕ、１９９５）。しかし、コルヒチンは、細胞機能を評価するための生化学的ツールとして有用である。本発明のおいて、本発明者らは、チューブンリン機能に対する生化学的プロセスの評価のために、９９ｍＴｃ−ＥＣ−コルヒチン（ＥＣ−ＣＯＬ）を開発した。
【００５８】
（腫瘍アポトーシス細胞の画像化）
アポトーシスは、化学療法および放射線を用いる癌の処置の間に生じる。アネキシンＶは、ホスホチジルセリンに結合することが知られており、このホスホチジルセリンは、腫瘍アポトーシス細胞によって過剰発現される。アネキシンＶによるアポトーシスの評価は、治療の効力（例えば、疾患の進行または後退）を評価するために有用である。従って、９９ｍＴｃ−ＥＣ−アネキシンＶ（ＥＣ−ＡＮＮＥＸ）を開発した。
【００５９】
（腫瘍低酸素症の画像化）
放射線治療の前の、画像化様式による腫瘍低酸素症の評価により、放射線増感剤または生体還元薬剤（ｂｉｏｒｅｄｕｃｔｉｖｅ  ｄｒｕｇ）（例えば、チラパザミン（ｔｉｒａｐａｚａｍｉｎｅ）、マイトマイシンＣ）での処置のための患者を選択する合理的な手段が提供される。このような患者の選択は、低酸素症性腫瘍を有する患者のより正確な処置を可能にする。さらに、腫瘍サプレッサ遺伝子（Ｐ５３）は、多重薬物耐性に関係する。化学療法の前後の組織病理学により画像化の知見とＰ５３の過剰発現とを相関付けることは、後の腫瘍処置応答において有用である。９９ｍＴｃ−ＥＣ−２−ニトロイミダゾールおよび９９ｍＴｃ−ＥＣ−メトロニダゾルを開発した。
【００６０】
（腫瘍新脈管形成の画像化）
新脈管形成は、部分的に、腫瘍増殖および転移の発生の原因である。抗有糸分裂性化合物は、抗脈管形成性であり、そして抗癌薬物としてのそれらの潜在的な使用について知られている。これらの化合物は、細胞サイクルの分裂期の間の細胞分裂を阻害する。細胞機能の生化学的プロセス（例えば、細胞分裂、細胞運動性、分泌、線毛運動およびべん毛運動、細胞内輸送、ならびに細胞の形態の維持）の間に、微小管が関係する。抗有糸分裂性化合物は、高い親和性で、微小管タンパク質（チューブリン）に結合し、微小管アセンブリを乱し、そして増幅細胞の有糸分裂の停止を引き起こすことが知られている。従って、抗有糸分裂性化合物は、微小管インヒビターとして、または紡錘体毒として、見なされる。コルヒチン（これは、強力な抗脈管形成薬剤である）は、微小管重合および中期での細胞停止を阻害することが知られている。コルヒチン（ＣＯＬ）は、細胞機能を評価するための生化学的ツールとして有用であり得る。次いで、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＣＯＬを開発した。
【００６１】
（発作に起因する低酸素症の画像化）
腫瘍細胞は、多少低酸素症的であるが、それは、酸素プローブが、圧力を測定することを必要とする。低酸素症的な条件を模倣するために、本発明者らは、発作を経験した１１人の患者を、９９ｍＴｃ−ＥＣ−メトロニダゾル（９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＮ）を使用して、画像化した。メトロニダゾルは、腫瘍低酸素症マーカーである。発作の範囲の組織は、酸素の欠乏に起因して、低酸素症的となる。このＳＰＥＣＴ画像を、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＮの注射の１時間後と３時間後に行った。全てのこれらの画像化研究は、積極的に、病変を局在化させた。ＣＴは、非常に十分にまたは正確に、病変を示さなかった。いくつかの場合におけるＭＲＩおよびＣＴは、病変のサイズを誇張した。以下は、３人の患者から選択されたケースである。
【００６２】
ケース１．  ５９歳の男性患者は、左脳幹神経節に発作を患った。ＳＰＥＣＴ
９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＮは、注入後１時間で病変を同定し（図２８）、これは、ＭＲＩ
Ｔ１負荷画像に対応する（図２９）。
【００６３】
ケース２．  ７３歳の男性患者は、左中大脳動脈（ＭＣＡ）領域において、発作を患った。ＳＰＥＣＴ  ９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＮを、注入後１時間で、１日目および１２日目（図３０および３１）で得た。これらの病変は、１２日目での有意な増加した取り込みを示した。ＣＴは、病変における広範な脳出血を示した。１日目と１２日目との間に、顕著な差異は、観察されなかった（図３２および図３３）。これらの発見は、組織生存度に起因して、患者の症状（無酸素症から低酸素症へ）を改善したことを示す。ＳＰＥＣＴ  ９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＮにより、ＣＴ画像化よりも良好な機能的情報が提供される。
【００６４】
ケース３．  ７２歳の男性患者が、右ＭＣＡおよびＰＣＡ領域における発作を患った。ＳＰＥＣＴ  ９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＮは、注入後１時間での病変を同定した（図３４）。ＣＴは、病変のサイズを誇張した（図３５）。
【００６５】
（腫瘍解糖標的化）
放射性標識リガンド（例えば、多糖（ネオマイシン、カナマイシン、トブラマイシン）および単糖（例えば、グルコサミン））は、細胞グルコーストランスポータ（腫瘍細胞で過剰発現される）に結合し、続いて、リン酸化される（Ｒｏｇｅｒｓら、１９６８；Ｆａｎｃｉｕｌｌｉら、１９９４；Ｐｏｐｏｖｉｃｉら、１９７１；Ｊｏｎｅｓら、１９７３；Ｈｅｒｍａｎｎら、２０００）。多糖（ネオマイシン、カナマイシン、トブラマイシン）および単糖（グルコサミン）によって誘導されるグルコースレベルは、インスリンによって抑制され得る（Ｈａｒａｄａら、１９９５；Ｍｏｌｌｅｒら、１９９１；Ｏｆｆｉｅｌｄら、１９９６；Ｓｈａｎｋａｒら、１９９８；Ｙｏｓｈｉｎｏら、１９９９；Ｖｉｌｌｅｖａｌｏｉｓ−Ｃａｍら、２０００）。これらのリガンドは、免疫原性ではなく、そして細胞質から迅速に浄化されるので、代謝画像化は、抗体画像化と比較して、有望であるようである。
【００６６】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を例示することが意図される。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者らによって発見された技術を表し、従って、その実施のための好ましい様式を構成すると考えられ得ることが、当業者によって理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示の観点から、多くの改変が、開示される特定の実施形態においてなされ得、そしてなおも本発明の意図および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることを、理解する。
【実施例】
【００６７】
（実施例１：腫瘍ホレートレセプター標的化）
（ＥＣの合成）
ＥＣを、以前に記載された方法（ＲａｔｎｅｒおよびＣｌａｒｋｅ、１９３７；Ｂｌｏｎｄｅａｕら、１９６７；各々は、本明細書中に参考として援用される）に従って、２工程合成で調製した。前駆体Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸を、合成した（ｍ．ｐ．１９５℃、報告値１９６−１９７℃）。次いで、ＥＣを、調製した（ｍ．ｐ．２３７℃、報告値２５１−２５３℃）。この構造を、１Ｈ−ＮＭＲおよび高速原子ボンバードメント質量分析法（ＦＡＢ−ＭＳ）によって確認した。
【００６８】
（メトトレキサートのアミノエチルアミドアナログ（ＭＴＸ−ＮＨ２）の合成）
ＭＩＸ（２２７ｍａ、０．５ｍｍｏｌ）を、１ｍｌのＨＣｌ溶液（２Ｎ）に溶解した。ｐＨ値を、＜３とした。この攪拌溶液に、２ｍｌの水および４ｍｌのＮ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ、メタノール中６．６０９％、１ｍｍｏｌ）を、室温で添加した。エチレンジアミン（ＥＤＡ、０．６  ｍｌ、１０ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。この反応混合物を、一晩攪拌し、そして溶媒を減圧下でエバポレートした。未処理の固体物質を、ジエチルエーテル（１０ｍｌ）、アセトニトリル（１０ｍｌ）および９５％エチルアルコール（５０ｍｌ）で洗浄して、未反応のＥＥＤＱおよびＥＤＡを除去した。次いで、生成物は、凍結乾燥によって乾燥し、そしてさらに精製することなく使用した。この生成物を、２１０ｍｇ（８４．７％）であり、黄色粉末であった。生成物の融点：１９５−１９８℃（分解、ＭＩＸ）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ  ２．９８−３．０４（ｄ，８Ｈ，−（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ（ＣＨ０）２ＮＨ２），４．１６−４．７１（ｍ，６Ｈ，−ＣＨ２−プテリジニル，芳香族−ＮＣＨ３，ＮＨ−ＣＨ−ＣＯＯＨグルタメート），６．６３−６．６４（ｄ，２Ｈ，芳香族−ＣＯ），７．５１−７５３（ｄ，２Ｈ．芳香族−Ｎ），８．３６（ｓ，１Ｈ，プテリジニル）。ＦＡＢ  ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｃ２２Ｈ２８，Ｎ１０，Ｏ４（Ｍ）＋についての計算値４９６．５１５，実測値４９６．８３５。
【００６９】
（ホレートのアミノエチルアミドアナログ（ホレート−ＮＨ２）の合成）
葉酸二水和物（１ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を、１０ｍｌの水の添加した。ｐＨ値を、ＨＣｌ（２Ｎ）を使用して、２に調節した。この攪拌溶液に、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ、１０ｍｌメタノール中１ｇ、４．０ｍｍｏｌ）およびエチレンジアミン（ＥＤＡ、１．３ｍｌ、１８ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。この反応混合物を、室温で一晩攪拌した。溶媒を、減圧下でエバポレートした。生成物を、メタノール（５０ｍｌ）中で沈澱させ、そしてさらに、アセトン（１００ｍｌ）で洗浄して、未反応のＥＥＤＱおよびＥＤＩＴを除去した。次いで、この生成物を、凍結乾燥し、そしてさらに精製することなく使用した。ニンヒドリン（メタノール中２％）スプレーは、陽性のアミノ基を示した。この生成物は、０．６ｇ（収率６０％）であり、黄色粉末であった。生成物の融点：２５０℃（分解）。１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ  １．９７−２．２７（ｍ，２Ｈ，ホレートの−ＣＨ２グルタメート），３．０５−３．４０（ｄ，６Ｈ，−ＣＨ２ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ２），４．２７−４．８４（ｍ，３Ｈ，−ＣＨ２−プテリジニル，ＮＨ−ＣＨ−ＣＯＯＨグルタメート），６．６８−６．７０（ｄ，２Ｈ，芳香族−ＣＯ）、７．６０−７．６２（ｄ，２Ｈ，芳香族−Ｎ），８．４４（ｓ，１Ｈ，プテリジニル）。ＦＡＢ  ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｃ２１Ｈ２５Ｎ９，Ｏ５（Ｍ）＋のついての計算値：４８３，実測値４８３．２１。
【００７０】
（エチレンジシステイン−ホレート（ＥＣ−ホレート）の合成）
ＥＣを溶解するために、ＮａＯＨ（２Ｎ、０．１ｍｌ）を、水（１．５ｍｌ）中のＥＣ（１１４ｍａ、０．４２５ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に添加した。この無色の溶液に、スルホ−ＮＨＳ（９２．３ｍｇ、０．４２５ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（８１．５ｍｇ、０．４２５ｍｍｏｌ）を添加した。ホレート−ＮＨ２（２０５ｍｇ、０．４２５ｍｍｏｌ）を、次いで、添加した。この混合物を、室温で２４時間攪拌した。この混合物を、５００の分子カットオフを有するＳｐｅｃｔｒａ／ＰＯＲ分子多孔性膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を使用して、４８時間透析した。透析の後、生成物を凍結乾燥した。この生成物は、１１６ｍｇ（収率３５％）であった。ｍ．ｐ．１９５℃（分解）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ  １．９８−２．２８（ｍ，２Ｈ，ホレートの−ＣＨ２グルタメート），２．６０−２．９５（ｍ，４ＨおよびＥＣの−ＣＨ２−ＳＨ），３．２４−３．３４（ｍ，１０Ｈ，−ＣＨ２−ＣＯ，ホレートのエチレンジアミンおよびＥＣのエチレンジアミン），４．２７−４．７７（ｍ，５Ｈ，−ＣＨ−プテリジニル，ホレートのＮＨ−ＣＨ−ＣＯＯＨグルタメートおよびＥＣのＮＨ−ＣＨ−ＣＯＯＨ），６．６０−６．６２（ｄ，２Ｈ，芳香族−ＣＯ），７．５８−７．５９（ｄ，２Ｈ．芳香族−Ｎ），８．５９（ｓ，１Ｈ，プテリジニル）。Ｃ２９Ｈ３７Ｎ１１Ｓ２Ｏ８Ｎａ２（８Ｈ２Ｏ）についての分析計算値，ＦＡＢ  ＭＳ  ｍ／ｚ（Ｍ）＋７７７．３（水なし）。Ｃ，３７．７９；Ｈ，５．７５；Ｎ，１６．７２；Ｓ，６．９５。実測値：ｍ／ｚ  （Ｍ）＋７７７．７（２０），４８９．４（１００）。Ｃ，３７．４０；Ｈ，５．４２；Ｎ．１５．４３；Ｓ，７．５８。
【００７１】
（ＥＣ−ホレートおよびＥＣの９９ｍＴｃでの放射標識化）
９９ｍＴｃ−ＥＣ−ホレートの放射合成（ｒａｄｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を、必要とされる量の９９ｍＴｃ−過テクネチウム酸を、自家製キット（ＥＣ−ホレートの凍結乾燥残渣（３ｍｇ）、ＳｎＣｌ２（１００μｇ）、Ｎａ２ＨＰＯ４（１３．５ｍｇ）、アスコルビン酸（０．５ｍｇ）およびＮａＥＤＴＡ（０．５ｍｇ）を含む）に添加することによって達成した。調製物の最終ｐＨは、７．４であった。９９ｍＴｃ−ＥＣをまた、ＥＣの凍結乾燥残渣（３ｍｇ）、ＳｎＣｌ２（１００μｇ）、Ｎａ２ＨＰＯ４（１３．５ｍｇ）、アスコルビン酸（０．５ｍｇ）およびｐＨ１０のＮａＥＤＴＡ（０．５ｍｇ）を含む自家製キットを使用することによって、得た。次いで、調製物のｐＨを７．４に調節した。放射化学純度を、各々、アセトン（系Ａ）および酢酸アンモニウム（水中１Ｍ）：メタノール（４：１）（系Ｂ）で溶出するＴＬＣ（ＩＴＬＣ  ＳＧ，Ｇｅｌｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）によって、決定した。ｒａｄｉｏ−ＴＬＣ  （Ｂｉｏｓｃａｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）分析から、放射化学純度は、両方の放射性医薬品について、＞９５％であった。Ｒａｄｉｏ−ＴＬＣデータを表２に要約する。９９ｍＴｃ−ＥＣ−ホレートの合成を、図１に示す。
【００７２】
（表２）
（癌化学療法のための選択された薬物）
以下の表は、ＵＳＡおよびカナダにおける癌の治療のために使用される薬物およびそれらの主要な有害な影響を列挙する。列挙する選択された薬物は、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｅｔｔｅｒコンサルタントの意見に基づいた。いくつかの薬物を、それらが、米国食品医薬品庁によって承認されていない指標について列挙する。抗癌薬物およびそれらの有害な影響については、以下の通りである。本発明の目的のために、これらの列挙は、例示を意味し、全てを網羅するものではないことを意味する。
【００７３】
【表２】
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＊  化学療法は、中程度の活性のみを有する。
＊＊  化学療法は、少ない活性のみを有する。
１  化学療法を伴うかまたは伴わないタモキシフェンは、一般に、閉経後エストロゲン−レセプター陽性の、モード陽性患者に対して推奨され、そしてタモキシフェンを伴うかまたは伴わない化学療法が、閉経前のモード陽性な患者に対して一般に推奨される。化学療法および／またはタモフェキシンを伴うアジュバント処置が、より大きな腫瘍または他の有害な予後指標を有するモード陰性患者に対して推奨される。
２  メゲストロールおよび他のホルモン剤は、タモキシフェンが作用しないいくらかの患者において有用であり得る。
３  高用量化学療法の後（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｅｔｔｅｒ，３４：７９，１９８２）。
４  直腸癌について、フルオロウラシル単独での処置の前後に、フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｔａｃｉｌ）および放射線を用いる手術後アジュバント処置。
５  手術切除、放射線治療、または両方と組合された場合にのみ、薬物が主要な活性を有する。
６  ビタミンＡアナログである、ラクトラチノル（ｌａｃｔｒａｔｉｎｏｌｎ）（Ａｃｇｕｔａｎａ）は、前腫瘍性病変（白斑症（ｌｅｕｋｏｐｌａｋｌａ））を制御し得、そして第二の原発性腫瘍の割合を減少し得る（ＳＥ  Ｂａｎｎｅｒら、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ，８８：１４０  １９９４）。
†  調査用途のためにＵＳＡのみで利用可能。
７  高リスク患者（例えば、高カウント、細胞遺伝異常、成人）は、誘導、維持および「強化」（寛解の達成後のさらなる薬物の使用）のためのさらなる薬物を必要とし得る。さらなる薬物としては、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄａ）、ミトキサトロンおよびチオグアニン（ｔｈｌｏｇｕａｎｉｎｅ）が挙げられる。イギリスにおける１つの大きな制御された試行の結果は、強化が、ＡＬＬの全ての子供の生存率を改善し得ることを示唆する（ＪＭ  Ｃｈａｓｓｅｌｌｅら、Ｌａｎｃｅｔ，３４Ｂ：１４３，Ｊａｎ  ２１，１９９５）。
８  初めに悪い予後を有する患者または寛解後に再発した患者。
９  急性前骨髄球白血病を有する何人かの患者は、トラチノイン（ｔｒａｔｉｎｏｉｎ）に対する完全な応答を有した。このような処置は、主に発熱および呼吸困難により特徴付けられる有毒な症状を引き起こし得る（ＲＰ  Ｗａｒｒｅｌｌ，Ｊｒら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３２８：１７７，１９９３）。
１０  同種異系ＨＬＡ同一同胞骨髄移植は、慢性期のＣＭＬの患者の４０％〜７０％、加速期のＣＭＬの患者の１８％〜２８％、急性転化の患者の１５％未満を治癒し得る。骨髄移植後の疾患を有さない生存率は、５０歳より大きい年齢、診断から３年より長い疾患の持続時間、および１抗原不適合または適合無関係のドナーの骨髄の使用により悪影響を受けた。インターフェロンαはまた、慢性期のＣＭＬを有する患者（この患者は完全な細胞遺伝的応答（約１０％）を達成する）において治癒的であり得；これは、新しく慢性期ＣＭＬと診断された８０歳を越える年齢の患者、および同種異系骨髄移植の候補ではない全ての患者のために選択される処置である。化学治療単独は待機的である。
１１  これらの組み合わせのいずれかを用いて第２の慢性期が達成される場合、同種異系骨髄移植が考慮されるべきである。第２の慢性期における骨髄移植は、ＣＭＬの患者の３０％〜３５％に対して治癒的であり得る。
１２  極限段階のホジキン病（１段階および２段階）は、放射線治療によって治癒可能である。播種性疾患（３ｂ段階および４段階）は、化学治療を必要とする。いくつかの中間段階および選択された臨床的状況が、この両方から利益を受ける。
【００７４】
【表２−２】
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†  研究用途のためのみにＵＳＡで利用可能。
‡  用量制限効果は太字である。皮膚反応（時折、重篤）、色素過剰、および眼毒性は、実質的に全ての非ホルモン性抗癌剤で報告された。他の薬物との悪い相互作用については、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｅｔｔｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｄｒｕｇ
Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，１９９５を参照のこと。
１．  研究用途のためのみにＵＳＡで利用可能。
２．  メゲストロールおよび他のホルモン剤は、タモキシフェンで失敗した場合の患者において有効であり得る。
３．  高用量化学治療後（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｅｔｔｅｒ，３４：７８，１９９２）。
４．  直腸癌について、フルオロウラシルのみを用いる処置の前および後の、フルオロウラシル＋放射線を用いる手術後のアジュバント処置。
５．  薬物は、外科的切除、放射線治療またはその両方と組み合わせた場合にのみ、主な活性を有する。
６．  ビタミンＡアナログのイソトレチノイン（Ａｃｃｕｔａｎｅ）は、新生物発生前のイシオン（ｉｓｉｏｎ）（白斑症）を制御し、そしてラットの第１の一次腫瘍を減少させ得る（ＳＥ  Ｓｅｎｎｅｒら、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８８：１４０，１９９４）。
７．  高リスク患者（例えば、高カウント、細胞遺伝異常、成人）は、誘導、維持および「強化」（寛解の達成後のさらなる薬物の使用）のためのさらなる薬物を必要とし得る。さらなる薬物としては、シクロホスファミド、ミトキサトロンおよびチオグアニンが挙げられる。イギリスにおける１つの大きな制御された試行の結果は、強化がＡＬＬの全ての子供の生存率を改善し得ることを示唆する（ＪＭ  Ｃｈａｓｓｅｌｌａら、Ｌａｎｃｅｔ，３４８：１４３，Ｊａｎ  ２１，１９９８）。
８．  初めに悪い予後を有する患者または寛解後に再発した患者。
９．  急性前骨髄球白血病を有する何人かの患者は、トレチノインに対する完全な応答を有した。このような処置は、主に発熱および呼吸困難により特徴付けられる有毒な症状を引き起こし得る（ＲＰ  Ｗａｒｒｅｌｌ，Ｊｒら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３２９：１７７，１９９３）。
１０．  同種異系ＨＬＡ同一同胞骨髄移植は、慢性期のＣＭＬの患者の４０％〜７０％、加速期のＣＭＬの患者の１５％〜２５％、急性転化の患者の１５％未満を治癒し得る。骨髄移植後の疾患を有さない生存率は、５０歳より大きい年齢、診断から３年より長い疾患の持続時間、および１抗原不適合または適合無関係のドナーの骨髄の使用により悪影響を受けた。インターフェロンαはまた、慢性期のＣＭＬを有する患者（この患者は完全な細胞遺伝的応答（約１０％）を達成する）において治癒的であり得；これは、新しく慢性期ＣＭＬと診断された５０歳を越える年齢の患者、および同種異系骨髄移植の候補ではない全ての患者のために選択される処置である。化学治療単独は待機的である。
【００７５】
（９９ｍＴｃでのＣＥ−ＭＴＸおよびＥＣ−ＴＤＸの放射標識）
ＥＣ−ホレートの合成について記載された同じ方法を使用して、ＥＣ−ＭＴＸおよびＥＣ−ＴＤＸを調製した。標識手順は、ＥＣ−ＭＴＸおよびＥＣ−ＴＤＸを使用したこと以外は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ホレートの調製について記載された手順と同じである。９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＴＸおよび９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＴＤＸの合成を、図２および図３に示す。
【００７６】
（９９ｍＴｃ−ＥＣ−ホレート、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＴＸおよび９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＴＤＸの安定性アッセイ）
９９ｍＴｃ−ＥＣ−ホレート、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＴＸおよび９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＴＤＸの安定性を、血清サンプル中で試験した。簡単には、７４０ＫＢｑの１ｍｇの９９ｍＴｃ−ＥＣ−ホレート、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＴＸおよび９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＴＤＸを、イヌ血清（２００μｌ）中で、３７℃で４時間インキュベートした。この血清サンプルを、水中５０％メタノールで希釈し、そして放射性ＴＬＣを、上記のように、０．５時間、２時間および４時間で繰り返した。
【００７７】
（組織分布研究）
雌性Ｆｉｓｃｈｅｒ  ３４４ラット（１５０±２５ｇ）（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に、０．１ｍｌの乳癌細胞を、２５ゲージ針を使用して、０１３７６２腫瘍細胞株懸濁液（１０６細胞／ラット、Ｆｉｘｃｈｅｒラットに特異的な腫瘍細胞株）から後脚に皮下接種した。腫瘍の直径が約１ｃｍに達した場合、移植後１４〜１７日間研究を実施した。各手順の前に、動物をケタミン（１０〜１５ｍｇ／ラット、腹腔内）で麻酔した。
【００７８】
組織分布研究において、各動物に、３７０〜５５０ＫＢｑの９９ｍＴｃ−ＥＣ−ホレートまたは９９ｍＴｃ−ＥＣを静脈内注射した（ｎ＝３／時点）。各リガンドの注入質量は、１０μｇ／ラットであった。放射性医薬の投与後２０分、１時間、２時間および４時間において、麻酔した動物を屠殺し、そして腫瘍および選択した組織を切除し、計量し、そしてγ線計数器（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｄｏｗｎｅｒｓ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）で放射能をカウントした。各サンプル中のトレーサーの体内分布を、組織の湿潤重量１ｇあたりの注射用量の割合（％ＩＤ／ｇ）として算出した。元の注射液の希釈サンプルのカウントを、参照のために使用した。腫瘍／非標的組織の計数密度比を、対応する％ＩＤ／ｇ値から算出した。スチューデントｔ検定を使用して、２つの群間の差違の有意性を評価した。
【００７９】
別の研究において、ブロッキング研究を行って、レセプター媒介型プロセスを決定した。ブロッキング研究において、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ホレートを、腫瘍保有マウスに、５０および１５０μｍｏｌ／ｋｇの葉酸と同時投与（ｉ．ｖ．）した（ｎ＝３／群）。注射の１時間後に動物を殺し、そしてデータを収集した。
【００８０】
（シンチグラフィー画像化およびオートラジオグラフィー研究）
シンチグラフィー画像を、低エネルギー平行穴型コリメーターを備えるγ線カメラ（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｅｓｔａｔｅｓ，ＩＬ）を使用して、１８．５ＭＢｑの９９ｍＴｃ標識放射性トレーサーの静脈内注射後０．５時間、２時間および４時間で得た。
【００８１】
全身オートラジオグラフィーを、定量用画像分析器（Ｃｙｃｌｏｎｅ  Ｓｔｏｒａｇｅ
Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐａｃｋａｒｄ，Ｍｅｒｉｄｉａｎ，ＣＩ．）によって得た。３７ＭＢｑの９９ｍＴｃ−ＥＣ−ホレートの静脈内注射後１時間で動物を殺し、そして死体をカルボキシメチルセルロース（４％）中に固定した。冷凍した死体をクリオスタット（ＬＫＢ  ２２５０クリオマイクロトーム）中におき、そして１００μｍの冠状切片に切断した。各切片を解凍し、そしてスライドに取り付けた。次いで、このスライドを汎用リン光ストレージスクリーン（ＭＰ，７００１４８０）に接触して配置し、そして１５時間９９ｍＴｃ標識に暴露した。このリン光スクリーンを赤色レーザー光で励起し、そして以前に吸収されたエネルギーに比例する得られる青色光を記録した。
【００８２】
（結果）
（９９ｍＴｃ−ＥＣ−ホレートの化学および安定性）
単純であり、高速かつ高収率のホレートのアミノエチルアミドおよびＥＣアナログ、ＭＴＸおよびＴＤＸを開発した。これらのアナログの構造を、ＮＭＲおよび質量分光分析により確認した。ＥＣ−ホレートの９９ｍＴｃでの放射性合成を、高い（＞９５％）放射化学的純度で達成した。９９ｍＴｃ−ＥＣホレートは、イヌ血清サンプル中で、２０分、１時間、２時間および４時間において安定であることが見出された。
【００８３】
（９９ｍＴｃ−ＥＣ−ホレートの体内分布）
体内分布研究により、２０分〜４時間における腫瘍／血液計数密度比は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ホレートについて、徐々に増加し、一方、これらの値は、同じ時間における９９ｍＴｃ−ＥＣについて減少することが示された（図４）。９９ｍＴＣ−ＥＣ−ホレートおよび９９ｍＴｃ−ＥＣの％ＩＤ／ｇ取込み値、腫瘍／血液比、および腫瘍／筋肉比を、それぞれ、表３および４に示した。
【００８４】
（表３）
乳房腫瘍保有ラットにおける９９ｍＴｃ−ＥＣ−ホレートの体内分布
【００８５】
【表３】
0005781026.tif 000015
示される値は、３匹の動物のデーターの平均±標準偏差を表す。
【００８６】
（シンチグラフィー画像化およびオートラジオグラフィー研究）
異なる時点において得られたシンチグラフィー画像は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−葉酸を注射した群における腫瘍の可視化を示した。対照的に、９９ｍＴｃ−ＥＣを注射した群においては、明らかな腫瘍取り込みが存在しなかった（図６）。両方の放射性トレーサーは、全ての画像における明らかな腎臓取込みを示した。９９ｍＴｃ−ＥＣ−葉酸の注射の１時間後に実施したオートラジオグラムは、腫瘍の活性を明らかに示した。
【００８７】
（実施例２：腫瘍低酸素症標的化）
（２−（２−メチル−５−ニトロ−１Ｈイミダゾリル）エチルアミン（メトロニダゾルのアミノアナログＭＮ−ＮＨ２）の合成）
メトロニダゾルのアミノアナログを、以前に記載された方法に従って合成した（Ｈａｙら、１９９４）。簡単に言えば、メトロニダゾルをメシル化アナログ（ｍ．ｐ．１４９〜１５０℃、報告値１５３〜１５４℃、ＴＬＣ：酢酸エチル、Ｒｆ＝０．４５）に転換し、７５％を得た。次いで、メシル化メトロニダゾルをアジ化ナトリウムと反応させて、アジドアナログ（ＴＬＣ：酢酸エチル、Ｒｆ＝０．５２）を、収率８０％で得た。このアジドアナログを、トリフェニルホスフィンによって還元し、そして所望のアミノアナログ（ｍ．ｐ．１９０〜１９２℃、報告値１９４〜１９５℃、ＴＬＣ：酢酸エチル、Ｒｆ＝０．１５）を得た（６０％）。ニンヒドリン（メタノール中２％）のスプレーは、ＭＮ−ＮＨ２のアミノ基の陽性を示した。構造を、１Ｈ−ＮＭＲおよび質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）ｍ／ｚ  １７１（Ｍ＋Ｈ，１００）によって確認した。
【００８８】
（エチレンジシステイン−メトロニダゾル（ＥＣ−ＭＮ）の合成）
水酸化ナトリウム（２Ｎ、０．２ｍｌ）を、水（５ｍｌ）中ＥＣ（１３４ｍａ、０．５０ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に添加した。この無色の溶液に、スルホ−ＮＨＳ（２１７ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）および１〜）Ｃ（１９２ｍａ．１．０ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、ＭＮ−ＮＨ：二塩酸塩（３４０ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を添加した。この材料（ｍａｔｕｒｅ）を室温で２４時間攪拌した。この混合物を、５００でのカットオフを有するＳｐｅｃｔｒａ／ＰＯＲ分子多孔質膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ＭｅｄｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を使用して、４８時間透析した。透析後、生成物を、凍結乾燥機（Ｌａｂｃｏｎｃｏ，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，ＭＯ）を使用してフリーズドライした。生成物の重量は、３１５ｍｇであった（収率５５％）。１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ２．９３（ｓ、６Ｈ、ニトロイミダゾール−ＣＨ３）、２．６０〜２．９５（ｍ，４ＨおよびＥＣの−ＣＨ２−ＳＨ）、３．３０〜３．６６（ｍ、８Ｈ、ＥＣのエチレンジアミンおよびニトロイミダゾール−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２）、３．７０〜３．９９（ｔ、２Ｈ、ＥＣのＮＨ−ＣＨ−ＣＯ）、５．０５（ｔ、４Ｈ、メトロニダゾル−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２）、（ｓ、２Ｈ、ニトロイミダゾールＣ＝ＣＨ）。ＦＡＢ  ＭＳ  ｍ／ｚ
５７２（Ｍ＋，２０）。ＥＣ−ＭＮの合成スキームを、図７に示す。
【００８９】
（３−（２−ニトロ−１Ｈ−イミダゾリル）プロピルアミン（ニトロイミダゾールのアミノアナログＮＩＭ−ＮＨ２）の合成）
２−ニトロイミダゾール（１ｇ、８．３４ｍｍｏｌ）およびＳｃ２ＣＯ３（２．９ｇ，８．９０ｍｍｏｌ）を含むジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、５０ｍｌ）中の攪拌溶液に、１，３−ジトシルプロパン（３．８４ｇ、９．９９ｍｍｏｌ）を添加した。この反応物を８０℃で３時間加熱した。溶媒を減圧下でエバポレートし、そして残渣を酢酸エチル中に懸濁させた。固体を濾過し、溶媒を濃縮し、シリカゲルを充填したカラムに装填し、そして、ヘキサン：酢酸エチル（１：１）で溶出した。生成物である、３−トシルプロピル−（２−ニトロイミダゾール）を、ｍ．ｐ．１０８〜１１１℃で単離した（１．６７ｇ、収率５７．５％）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ２．２３（ｍ、２Ｈ）、２．４８（Ｓ、３Ｈ）、４．０６（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝５．７Ｈｚ）、４．５２（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６．８Ｈｚ）、７．０９（Ｓ、１Ｈ）、７．２４（Ｓ、１Ｈ）、７．４０（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．２Ｈｚ）、７．７７（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．２Ｈｚ）。
【００９０】
次いで、トシル化２−ニトロイミダゾール（１．３３ｇ、４．０８ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１０ｍｌ）中アジ化ナトリウム（Ｑ２９ｇ、４．４９ｍｍｏｌ）と、１００℃で３時間反応させた。冷却後、水（２０ｍｌ）を添加し、そして生成物を酢酸エチル（３×２０ｍｌ）から抽出した。溶媒を、ＭｇＳＯ４で乾燥し、そして乾固するまでエバポレートして、アジドアナログ（０．６ｇ、７５％、ＴＬＣ：ヘキサン：酢酸エチル；１：１、Ｒｆ＝０．４２）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ２．１４（ｍ、２Ｈ）、３．４１（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６．２Ｈｚ）、４．５４（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６．９Ｈｚ）、７．１７（Ｓ、２Ｈ）。
【００９１】
このアジドアナログ（０．５７ｇ、２．９０ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン（ＰＨＩ；）中のトリフェニル（ｔａｐｈｅｎｙｌ）ホスフィン（１．１４ｇ、４．３５ｍｍｏｌ）によって、室温で４時間還元した。濃ＨＣｌ（１２ｍｌ）を添加し、そしてさらに５時間加熱した。生成物を、酢酸エチルと水との混合物から抽出した。この酢酸エチルをＭｇＳＯ４で乾燥し、そして乾固するまでエバポレートして、アミン塩酸塩アナログを得た（３６０ｍａ、６０％）。ニンヒドリン（メタノール中２％）のスプレーは、ＮＩＭ−ＮＨのアミノ基の陽性を示した。１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ２．２９（ｍ、２Ｈ）、３．１３（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７．８Ｈｚ）、３．６０（ｂｒ、２Ｈ）、４．３５（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７．４Ｈｚ）、７．５０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．１Ｈｚ）、７．６３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．１Ｈｚ）。
【００９２】
（エチレンジシステイン−ニトロイミダゾール（ＥＣ−ＮＩＭ）の合成）
水酸化ナトリウム（２Ｎ、０．６ｍｌ）を、ＥＣ（１３４ｍａ、０．５０ｍｍｏｌ）の水（２ｍｌ）中の攪拌溶液に添加した。この無色の溶液に、スルホ−ＮＨＳ（２６０．６ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２３０ｍａ、１．２ｍｍｏｌ）および水酸化ナトリウム（２Ｎ、１ｍｌ）を添加した。次いでＮＩＭ−ＮＨ２塩酸塩（２０６．６ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を室温で２４時間攪拌した。この混合物を、５００でのカットオフを有するＳｐｅｃｔｒａ／ＰＯＲ分子多孔質膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を使用して、４８時間透析した。透析後、生成物を、凍結乾燥機（Ｌａｂｃｏｎｃｏ，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，ＭＯ）を使用してフリーズドライした。生成物の重量は、５９４．８ｍｇであった（収率９８％）。ＥＣ−ＮＩＭの合成スキームを、図８Ａに示す。構造を、１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）によって確認する（図８Ｂ）。
【００９３】
（ＥＣ−ＭＮおよびＥＣ−ＮＩＭの、９９ｍＴｃでの放射性同位元素標識）
９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＮおよび９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＮＩＭの放射線合成を、必要量の過テクネチウム酸を、ＥＣ−ＭＮまたはＥＣ−ＮＩＭの凍結乾燥した残渣（３ｍｇ）、ＳｎＣｌ２（１００μｇ）、Ｎａ２ＨＰＯ４（１３．５ｍｇ）、アスコルビン酸（０．５ｍｇ）およびＮａＥＤＴＡ（０．５ｍｇ）を含む自家製のキットに添加することによって、達成した。調製物の最終ｐＨは、７．４であった。放射化学的純度を、それぞれアセトン（系Ａ）および酢酸アンモニウム（水中１Ｍ）：メタノール（４：１）（系Ｂ）で溶出するＴＬＣ（ＩＴＬＡＣ  ＳＧ、Ｇｅｌｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）によって決定した。放射線ＴＬＣ（Ｂｉｏｓｃａｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）分析から、両方の放射線トレースに対して放射化学的純度は９６％より高かった。
【００９４】
（［１８Ｆ］ＦＭＩＳＯおよび［１３１Ｉ］ＩＭＩＳＯの合成）
［Ｆ］フッ素を、小容量の銀標的において富化された１８Ｏ−水のプロトン照射を使用するサイクロトロンによって、生成した。トシルＭＩＳＯ（Ｈａｙら、１９９４）（２０ｍｇ）を、アセトニトリル（１．５ｍｌ）に溶解し、クリプトフィックス−フッ化物錯体に添加した。加熱後、加水分解およびカラム精製により、２５〜４０％の収率（崩壊を補正した）の純粋な生成物を、６０分のボンバードメントの終了（ＥＯＢ）において、単離した。ＨＰＬＣを、Ｃ−１８  ＯＤＳ−２０Ｔカラム（４．６×２５ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ）において、水／アセトニトリル（８０／２０）を用いて、１ｍｌ／分の流速を使用して実施した。キャリアが添加されていない生成物は、類似の条件下での非標識ＦＭＩＳＯの保持時間（６．１２分）に対応した。放射化学的純度は、９９％より高かった。ＵＶ検出器（３１０ｎｍ）のもとで、他の不純物は存在しなかった。決定した［１８Ｆ］ＦＭＩＳＯの比活性は、既知の質量および放射能のサンプルのＵＶおよび放射能検出に基づいて、１Ｃｉ／μｍｏｌであった。
【００９５】
［１３Ｉ］ＩＭＩＳＯを、同じ手順を使用して調製した（Ｃｈｅｒｉｆら、１９９４）。簡単に言えば、５ｍｇのトシルＭＩＳＯをアセトニトリル（１ｍｌ）に溶解し、そしてＮａ１３１Ｉ（０．１ｍｌの１Ｎ  ＮａＯＨ中１ｍＣｉ）（Ｄｕｐｏｎｔ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ．ＭＡ）を添加した。加熱および精製の後、生成物（収率６０〜７０％）を得た。放射線ＴＬＣは、溶出液としてクロロホルムメタノール（７：３）を使用して、最終生成物に対して０．０１のＲｆ値を示した。
【００９６】
（９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＮおよび９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＮＩＭの安定性アッセイ）
標識された９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＮおよび９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＮＩＭの安定性を、血清サンプルにおいて試験した。簡単に言えば、７４０ＫＢｑの１ｍｇの９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＮおよび９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＮＩＭを、イヌ血清（２００μｌ）中３７℃で４時間インキュベートした。これらの血清サンプルを、水中５０％メタノールで希釈し、そして放射線ＴＬＣを、上記のように、０．５時間、２時間および４時間において繰り返した。
【００９７】
（９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＮの組織分布研究）
雌性Ｆｉｓｃｈｅｒ３４４ラット（１５０±２５ｇ）（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に、１３７６２腫瘍細胞株懸濁液（１０６細胞／ラット、Ｆｉｓｃｈｅｒラットに対して特異的な腫瘍細胞株）由来の０．１ｍｌの哺乳動物腫瘍細胞を、２５ゲージの針を使用して後肢に皮下接種した。研究を、移植の１４〜１７日後に、腫瘍がおおよそ１ｃｍの直径に達したときに実施した。ラットをケタミン（１０〜１５ｍｇ／ラット、腹腔内）で麻酔し、その後、それぞれの手順を行った。
【００９８】
組織分布研究において、各動物に、３７０〜５５０ＫＢｑの９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＮまたは９９ｍＴｃ−ＥＣ（ｎ＝３／時点）を静脈内注射した。９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＮの注射した質量は、１匹のラットあたり１０μｇであった。放射線トレーサーの投与の０．５時間後、２時間後および４時間後に、これらのラットを屠殺し、そして選択した組織を切除し、秤量し、そして放射能を計数した。各サンプルにおけるトレーサーの生体分布を、組織含水重量１グラムあたりの注射用量の百分率（％ＩＤ／ｇ）として、算出した。腫瘍／非標的組織の計数密度比を、対応する％ＩＤ／ｇ値から算出した。このデータを、同じ動物モデルを使用して［１８Ｆ］ＦＭＩＳＯおよび［１３１Ｉ］ＩＭＩＳＯと比較した。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して、群間の差異の有意性を評価した。
【００９９】
（シンチグラフィー画像化およびオートラジオグラフィー研究）
低エネルギーの平行穴コリメータを備えるγ線カメラ（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｅｓｔａｔｅｓ，ＩＬ）を使用するシンチグラフィー画像を、１８．５ＭＢｑの各放射線トレーサーの静脈内注射の０．５時間後、２時間後および４時間後に得た。
【０１００】
全身のオートラジオグラムを、定量的画像分析器（Ｃｙｃｌｏｎｅ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐａｃｋａｒｄ，Ｍｅｒｉｄｉａｎ，ＣＴ）によって得た。３７ＭＢｑの９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＮの静脈内注射に続いて、これらの動物を１時間で殺傷し、そしてその身体をカルボキシメチルセルロース（４％）に、以前に記載されたように固定した（Ｙａｎｇら、１９９５）。凍結させた身体を低温槽（ＬＫＢ  ２２５０クリオミクロトーム）に設置し、そして１００μｍの冠状切片に切断した。各切片を解凍し、そしてスライドに載せた。次いで、このスライドを多目的リン貯蔵スクリーン（ＭＰ、７００１４８０）と接触させ、そして１５時間露光した。
【０１０１】
９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＮＩＭが化学療法に対する腫瘍応答をモニタリングし得るか否かを確認するために、腫瘍容量１．５ｃｍを有するラットおよび卵巣腫瘍保有マウスの群を、パクリタキセル（４０ｍｇ／ｋｇ／ラット、８０ｍｇ／ｋｇ／マウス、静脈内）で、単一用量で処置した。画像を、パクリタキセル処置の４日後に撮像した。処置ありまたは処置なしでの、１グラムの腫瘍重量あたりの注射された用量の百分率を、決定した。
【０１０２】
（ポーラログラフィー酸素微小電極によるｐＯ２測定）
腫瘍の低酸素症を確認するために、腫瘍内のｐＯ２測定を、エッペンドルフコンピュータ化ヒストグラムシステムを使用して、実施した。２〜３の直線軌道の各々に沿った、２０〜２５のｐＯ２測定を各腫瘍において０．４ｍｍの間隔で実施した（合計４０〜７５の測定）。腫瘍ｐＯ測定を、３匹の腫瘍保有ラットにおいて実施した。オンラインコンピュータシステムを使用して、各軌道のポット測定を、この軌道に沿った測定点の位置に対して絶対的な値として表現し、そして２．５ｍｍのクラス幅の０ｍｍＨｇと１００ｍｍＨｇとの間のｐＯ２ヒストグラムの相対頻度として、表した。
【０１０３】
（結果）
（９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＮおよび９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＮＩＭの放射線合成および安定性）
ＥＣ−ＭＮおよびＥＣ−ＮＩＭの、９９ｍＴｃでの放射線合成を、高い放射化学的純度（９５％より高い）で達成し、放射化学的収率は１００％であった。９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＮおよび９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＮＩＭ（図１３）は、イヌ血清サンプルにおいて、０．５時間、２時間および４時間安定であることが見出された。分解生成物は、観察されなかった。ＭＩＳＯの放射性フッ素化および放射性ヨウ素化は、同じ前駆体を使用して、容易に達成された。両方の標識されたＭＩＳＯアナログにおいて、放射化学的純度は、９９％より高かった。
【０１０４】
（インビボ組織分布研究）
９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＮおよび９９ｍＴｃ−ＥＣの、腫瘍保有ラットにおける組織分布を、表４および５に示す。イオン性９９ｍＴｃに対する高い親和性に起因して、有意な一貫した甲状腺取り込みは存在せず、インビボでの９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＮの安定性を示唆する（表５）。
【０１０５】
【表４】
0005781026.tif 000016
示される値は、３匹の動物からのデータの平均±標準偏差を表す。
【０１０６】
ブロッキング研究において、腫瘍／筋肉および腫瘍／血液の計数密度比は、葉酸の同時投与によって、有意に低下した（ｐ＜０．０１）（図５）。
【０１０７】
【表５】
0005781026.tif 000017
１．各ラットが、９９ｍＴｃ−ＥＣ−メトロニダゾル（１０μＣｉ、静脈内）を受容した。各値は、１グラムの重量あたりの注射用量（ｎ＝３）／時間間隔の百分率である。各データは、標準偏差を伴う３回の測定の平均を表す。
【０１０８】
生体分布研究は、０．５４時間における腫瘍／血液および腫瘍／筋肉の計数密度比が、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＮＭ、［１８Ｆ］ＦＭＩＳＯおよび［１３１Ｉ］ＩＭＩＳＯにおいては次第に増加し、一方でこれらの値は、同じ時間において、９９ｍＴｃ−ＥＣについては変化しないことを示した（図９および図１０）。［１８Ｆ］ＦＭＩＳＯは、注射後３０分、２時間および４時間において、［１３１Ｉ］ＩＭＩＳＯおよび９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＮの取り込み比と比較して、最も高い腫瘍対血液の取り込み比を示した。注射後２時間および４時間における９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＮおよび［１３１Ｉ］ＩＭＩＳＯについての、腫瘍／血液および腫瘍／筋肉の比は、有意には異ならなかった（ｐ＜０．０５）。
【０１０９】
（シンチグラフ画像化およびオートラジオグラフィー研究）
異なる時点において得られたシンチグラフィー画像は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＮおよび９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＮＩＭ群における腫瘍の可視化を示した。対照的に、９９ｍＴｃ−ＥＣを注射した群においては、明らかな腫瘍の取り込みが存在しなかった（図１１）。９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＭＮの注射の１時間後に実施したオートラジオグラムは、明らかに、腫瘍活性を示した（図１２）。９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＮＭと比較して、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＮＩＭは、より高い腫瘍対バックグラウンドの比に起因して、より良好なシンチグラフィー画像を提供するようであった。乳房腫瘍保有ラットにおいて、腫瘍の取り込みは、９９ｍＴｃ−ＥＣと比較して、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＮＩＭ群において顕著に高かった（図１４Ａ）。１グラムの腫瘍の重量あたりの９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＮＩＭの注射用量の百分率から得たれたデータは、コントロール群と比較した場合に、パクリタキセルで処置したラットにおいて、２５％が取り込みを低下したことを示した（図１４Ｂ）。
【０１１０】
卵巣癌保有マウスにおいて、パクリタキセルで処置したマウスにおける低下した腫瘍取り込みが存在した（図１５Ａおよび図１５Ｂ）。類似の結果が、肉腫保有において観察された（図１５Ｃおよび図１５Ｄ）。従って、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＮＩＭは、パクリタキセル処置に対する腫瘍応答を評価するために、使用され得る。
【０１１１】
（ポーラログラフィー酸素微小電極によるｐＯ２測定）
腫瘍の腫瘍内ＰＯ２測定は、腫瘍の酸素圧力が、正常筋肉の３５±１０ｍｍＨｇと比較して、４．６±４．１ｍｍＨｇの範囲であることを示した。このデータは、腫瘍が低酸素症であることを示す。
【０１１２】
（実施例３：癌のペプチド画像化）
（エチレンジシステイン−ペンタグルタミン酸（ＥＣ−ＧＡＰ）の合成）
水酸化ナトリウム（１Ｎ，１ｍｌ）を、水（１０ｍｌ）中のＥＣ（２００ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に添加した。この無色溶液に、スルホＮＨＳ（１６２ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（１４３ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）を添加した。次いでペンタグルタミン酸ナトリウム塩（Ｍ．Ｗ．７５０〜１５００、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（５００ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２４時間室温で撹拌した。混合物を、５００のカットオフを有するＳｐｅｃｔｒａ／ＰＯＲ分子多孔膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を使用して４８時間透析した。透析後、生成物を、凍結乾燥機（Ｌａｂｃｏｎｃｏ，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，ＭＯ）を使用して凍結乾燥した。塩形態の生成物は、０．９５ｇの重さであった。ＥＣ−ＧＡＰの合成スキームは、図１６に示す。
【０１１３】
（９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＧＡＰの安定性アッセイ）
９９ｍＴｃでのＥＣ−ＧＡＰの放射性標識を、以前に記載されたのと同じ手順を使用して達成した。放射化学純度は、１００％であった。９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＧＡＰの安定性を、血清サンプル中で試験した。手短にいうと、７４０ＫＢｑの１ｍｇ９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＧＡＰを、３７℃で４時間、イヌ血清（２００μｌ）中でインキュベートした。血清サンプルを、水中５０％メタノールで希釈し、そして放射性ＴＬＣを、上記のように、０．５時間、２時間、および４時間で繰り返した。
【０１１４】
（シンチグラフィー画像化研究）
低エネルギーの、平行な穴のコリメータを備えたγカメラを使用して、シンチグラフィー画像を、１８．５ＭＢｑの各放射性トレーサーの静脈内注射の０．５時間、２時間および４時間後に得た。
【０１１５】
（結果）
（９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＧＡＰの安定性アッセイ）
９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＧＡＰは、イヌ血清サンプル中で、０．５時間、２時間および４時間で安定であることが見出された。分解産物は、観察されなかった。
【０１１６】
（シンチグラフィー画像化研究）
異なる時点で得られたシンチグラフィー画像は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＧＡＰ群において腫瘍の可視化を示した。最適な取り込みは、投与後３０分〜１時間である（図１７）。
【０１１７】
（実施例４：腫瘍アポトーシス細胞の画像化）
（エチレンジシステイン−アネキシンＶ（ＥＣ−ＡＮＮＥＸ）の合成）
炭酸水素ナトリウム（１Ｎ、１ｍｌ）を、ＥＣ（５ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に添加した。この無色溶液に、スルホＮＨＳ（４ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（４ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ）を添加した。次いでアネキシンＶ（Ｍ．Ｗ．３３ｋＤ、ヒト、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（０．３ｍｇ）を添加した。混合物を２４時間室温で撹拌した。混合物を、１０，０００のカットオフを有するＳｐｅｃｔｒａ／ＰＯＲ分子多孔膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を使用して４８時間透析した。透析後、生成物を、凍結乾燥機（Ｌａｂｃｏｎｃｏ，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，ＭＯ）を使用して凍結乾燥した。塩形態の生成物は、１２ｍｇの重さであった。
【０１１８】
（９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＡＮＮＥＸの安定性アッセイ）
９９ｍＴｃでのＥＣ−ＡＮＮＥＸの放射性標識を、ＥＣ−ＧＡＰにおいて記載されたのと同じ手順を使用して達成した。放射化学純度は、１００％であった。標識した９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＡＮＮＥＸの安定性を、血清サンプル中で試験した。手短にいうと、７４０ＫＢｑの１ｍｇ９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＡＮＮＥＸを、３７℃で４時間、イヌ血清（２００μｌ）中でインキュベートした。血清サンプルを、水中５０％メタノールで希釈し、そして放射性ＴＬＣを、上記のように、０．５時間、２時間、および４時間で繰り返した。
【０１１９】
（シンチグラフィー画像化研究）
低エネルギーの、平行な穴のコリメータを備えたγカメラを使用して、シンチグラフィー画像を、１８．５ＭＢｑの各放射性トレーサーの静脈内注射の０．５時間、２時間および４時間後に得た。使用した動物モデルは、乳房、卵巣および肉腫であった。乳房腫瘍および卵巣腫瘍を有する両方のラットは、高いアポトーシス性の細胞を過剰発現することが知られている。画像化研究を、腫瘍細胞接種後１４日で行なった。腫瘍処置応答を確かめるために、画像化前のマウスを、パクリタキセル投与し（８０ｍｇ／Ｋｇ、静脈内注射、１４日目）、そして画像を１８日目に取った。
【０１２０】
（結果）
（９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＡＮＮＥＸの安定性アッセイ）
９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＡＮＮＥＸは、イヌ血清サンプル中で、０．５時間、２時間および４時間で安定であることが見出された。分解産物は、観察されなかった。
【０１２１】
（シンチグラフィー画像化研究）
異なる時点で得られたシンチグラフィー画像は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＡＮＮＥＸ群において腫瘍の可視化を示した（図１８〜２０）。画像は、高度にアポトーシス性の細胞が、より多くの９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＡＮＮＥＸの取り込みを有することを示した。高いアポトーシス（卵巣腫瘍保有）群（図１９Ａおよび図１９Ｂ）および低アポトーシス（肉腫腫瘍保有）群（図２０Ａおよび図２０Ｂ）におけるパクリタキセル処理前とパクリタキセル処理後との間に、腫瘍取り込みの顕著な差異は、存在しなかった。
【０１２２】
（実施例５：腫瘍新脈管形成の画像化）
（（コルヒチンのアミノアナログ、ＣＯＬ−ＮＨ２）の合成）
コルヒチンの脱メチル化アミノアナログおよび脱メチル化ヒドロキシアナログを以前に記載された方法（Ｏｒｒら、１９９５）に従って合成した。手短にいうと、コルヒチン（４ｇ）を、２５％硫酸を含む１００ｍｌの水中に溶解した。反応混合物を、１００℃で５時間加熱した。混合物を、炭酸ナトリウムを用いて中和した。生成物をろ過し、そして、凍結乾燥機で乾燥し、２．４ｇ（７０％）の所望のアミノアナログ（融点１５３〜１５５℃、１５５〜１５７℃と報告されている）を生じた。ニンヒドリン（メタノール中２％）噴霧は、ＣＯＬ−ＮＨ２のアミノ基の陽性を示した。構造を、１Ｈ−ＮＭＲおよび質量分析法（ＦＡＢ−ＭＳ）によって確かめた。
【０１２３】
【数１】
0005781026.tif 000018
（エチレンジシステイン−コルヒチン（ＥＣ−ＣＯＬ）の合成）
水酸化ナトリウム（２Ｎ，０．２ｍｌ）を、水（５ｍｌ）中のＥＣ（１３４ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に添加した。この無色溶液に、スルホＮＨＳ（２１７ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（１９２ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を添加した。次いでＣＯＬ−ＮＨ２（３４０ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２４時間室温で撹拌した。混合物を、５００のカットオフを有するＳｐｅｃｔｒａ／ＰＯＲ分子多孔膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を使用して４８時間透析した。透析後、生成物を、凍結乾燥機（Ｌａｂｃｏｎｃｏ，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，ＭＯ）を使用して凍結乾燥した。塩形態の生成物は、３１５ｍｇの重さであった（収率５５％）。
【０１２４】
【数２】
0005781026.tif 000019
ＥＣ−ＣＯＬの合成スキームを、図２１に示す。
【０１２５】
（ＥＣ−ＣＯＬおよびＥＣの９９ｍＴｃを用いる放射性標識）
９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＣＯＬの放射性合成を、ＥＣ−ＣＯＬの凍結乾燥残渣（５ｍｇ）、ＳｎＣｌ２（１００μｇ）、Ｎａ２ＨＰＯ４（１３．５ｍｇ）、アスコルビン酸（０．５ｍｇ）およびＮａＥＤＴＡ（０．５ｍｇ）を含む自家製キットへ必要な量の９９ｍＴｃ−過テクネチウム酸を添加することによって達成した。調製物の最終ｐＨは、７．４であった。９９ｍＴｃ−ＥＣはまた、ｐＨ１０で、ＥＣの凍結乾燥残渣（５ｍｇ）、ＳｎＣｌ２（１００μｇ）、Ｎａ２ＨＰＯ４（１３．５ｍｇ）、アスコルビン酸（０．５ｍｇ）およびＮａＥＤＴＡ（０．５ｍｇ）を含む自家製キットを使用することによって得た。次いで、調製物の最終ｐＨを７．４に調整した。放射化学純度を、酢酸アンモニウム（水中１Ｍ）：メタノール（４：１）を用いて溶出するＴＬＣ（ＩＴＬＣ  ＳＧ，Ｇｅｌｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）によって決定した。放射線−薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ，Ｂｉｏｓｃａｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）を使用して、両方の放射線トレーサについての放射化学純度を分析した。
【０１２６】
（９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＣＯＬの安定性アッセイ）
標識された９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＣＯＬの安定性を、血清サンプル中で試験した。手短にいうと、７４０ＫＢｑの５ｍｇ９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＣＯＬを、３７℃で４時間、ウサギ（ｒａｂｂｉｎａｔｅ）血清（５００μｌ）中でインキュベートした。血清サンプルを、水中５０％メタノールで希釈し、そして放射性ＴＬＣを、上記のように、０．５時間、２時間、および４時間で繰り返した。
【０１２７】
（組織分布研究）
雌性Ｆｉｓｃｈｅｒ３４４ラット（１５０±２５ｇ）（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を、２５ゲージ針を使用して後肢に、１３７６２腫瘍細胞株懸濁液（１０細胞／ラット、Ｆｉｓｃｈｅｒラットに特異的な腫瘍細胞株）由来の０．１ｍｌの乳房腫瘍細胞で皮下接種した。研究を、腫瘍が直径約１ｃｍに達した、移植後１４〜１７日で行なった。ラットを、各手順の前に、ケタミン（１０〜１５ｍｇ／ラット、腹腔内）で麻酔した。
【０１２８】
組織分布研究において、各動物を、３７０〜５５０ＫＢｑの９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＣＯＬまたは９９ｍＴｃ−ＥＣで静脈内注射した（ｎ＝３／時点）。９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＣＯＬの注射された質量は、１匹のラット当り１０μｇであった。放射線トレーサの投与０．５時間、２時間および４時間後、ラットを屠殺し、そして選択した組織を切り出し、秤量し、そして放射能についてカウントした。各サンプルにおけるトレーサーの体内分布を、１ｇの組織湿重量当りの注射された用量の割合として計算した（％ＩＤ／ｇ）。腫瘍／非標的組織カウント密度比を、対応する％ＩＤ／ｇ値から計算した。スチューデントｔ検定を使用して、群の間の差異の有意性を評価した。
【０１２９】
（シンチグラフィー画像化研究）
低エネルギーの、平行な穴のコリメータを備えたγカメラ（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｅｓｔａｔｅｓ，ＩＬ）を使用して、シンチグラフィー画像を、３００μＣｉの９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＣＯＬおよび９９ｍＴｃ−ＥＣの静脈内注射の０．５時間、２時間および４時間後に得た。コンピューターで概略した目的の領域（ＲＯＩ）を使用して、腫瘍取り込み対正常筋肉取り込みを定量する（１画素当りのカウント）。
【０１３０】
（結果）
（９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＣＯＬの放射性合成および安定性）
９９ｍＴｃでのＥＣ−ＣＯＬの放射性合成を、高い（＞９５％）放射化学的純度で達成した（図２１）。９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＣＯＬは、は、ウサギ血清サンプル中で、０．５時間、２時間および４時間で安定であることが見出された。分解産物は、観察されなかった（図２２）。
【０１３１】
（インビボ体内分布）
乳房腫瘍保有ラットにおける９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＣＯＬおよび９９ｍＴｃ−ＥＣのインビボ体内分布を、表４および６に示す。０．５時間、２時間および４時間における９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＣＯＬの腫瘍取り込み値（％ＩＤ／ｇ）は、０．４３６±０．０８９、０．３９５±０．１５４および０．２２１±０．００６であったが（表６）、９９ｍＴｃ−ＥＣについての体内分布は、それぞれ０．３４２±０．１６３、０．１１５±０．００２および０．０９７±０．００５であった（表４）。時間の関数としての増加した腫瘍対血液比（０．５２±０．１２から０．７２±０．０７）および腫瘍対筋肉比（３．４７±０．４０から７．９７±０．９３）は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＣＯＬ群において観察された（図２３）。逆に、腫瘍対血液値および腫瘍対筋肉値は、同じ期間における９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＣＯＬ群と比較した場合、９９ｍＴｃ−ＥＣでの時間依存性の減少を示した（図２４）。
【０１３２】
【表６】
0005781026.tif 000020
＊各ラットは、９９ｍＴｃ−ＥＣ−コルヒチン（１０μＣｉ、静脈内）を受けた。各値は、時間間隔あたり１グラム組織重量（ｎ＝３）当りの注射された用量のパーセントである。各データは、標準偏差を有する３つの測定値の平均値を示す。
【０１３３】
【表７】
0005781026.tif 000021
（乳房腫瘍保有ラットにおける９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＣＯＬのγシンチグラフィー画像化）
投与後１時間での３匹の乳房腫瘍保有ラットにおけるインビトロ画像化研究は、腫瘍が９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＣＯＬ群で十分に可視化され得ることを示したが（図２５）、９９ｍＴｃ−ＥＣ群においてより少ない腫瘍取り込みが観察された（図２６）。コンピューターで概略した目的の領域（ＲＯＩ）は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＣＯＬ群における腫瘍／バックグラウンド比が、９９ｍＴｃ−ＥＣ群よりも有意に高いことを示した（図２７）。
【０１３４】
（腫瘍解糖標的化）
（実施例６：９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシンの開発）
（ＥＣの合成）
ＥＣを、以前に記載された方法（ＲａｔｎｅｒおよびＣｌａｒｋｅ，１９３７；Ｂｌｏｎｄｅａｕら、１９６７）に従って、２工程合成で調製した。前駆体（Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸）を合成した（融点１９５°、１９６〜１９７°と報告されている）。次いでＥＣを調製した（融点２３７°、２５１〜２５３°と報告されている）。構造を、１Ｈ−ＮＭＲおよび高速原子衝撃質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）によって確認した。
【０１３５】
（エチレンジシステイン−ネオマイシン（ＥＣ−ネオマイシン）の合成）
水酸化ナトリウム（２Ｎ、０．２ｍｌ）を、水中（５ｍｌ）のＥＣ（１３４ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）の攪拌した溶液に添加した。この無色の溶液に、スルホ−ＮＨＳ（２１７ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（１９２ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、ネオマイシントリスルフェート塩（９０９ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を、室温にて２４時間攪拌した。この混合物を、５００のカットオフ値を有するＳｐｅｃｔｒａ／ＰＯＲ分子多孔性膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を使用して４８時間透析した。透析後、生成物を、凍結乾燥器（Ｌａｂｃｏｎｃｏ，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，ＭＯ）を使用して凍結乾燥した。生成物の重量は、７２０ｍｇ（収率８３％）であった。ＥＣ−ネオマイシンの合成スキームを図３６に示す。この構造を、１Ｈ−ＮＭＲ（図３８Ａ〜Ｂ）、質量分析計（図３９Ａ〜Ｂ）および元素分析（Ｇａｌｂｒａｉｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ，ＴＮ）によって確かめる。元素分析Ｃ３９Ｈ７５Ｎ１０Ｓ４Ｏ１９・１５Ｈ２Ｏ（Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｓ）、計算値  Ｃ：３３．７７、Ｈ：７．５８、Ｎ：１０．１１、Ｓ：９．２３；実測値  Ｃ：３２．４４、Ｈ：５．９０、Ｎ：１０．４７、Ｓ：１０．５８．ＥＣ−ネオマイシンのＵＶ波長は、ＥＣおよびネオマイシンと比較した場合に、２７０．５ｎｍシフトした（図４０Ａ〜Ｃ）。
【０１３６】
（９９ｍＴｃでのＥＣ−ＭＮおよびＥＣ−ネオマイシンの放射標識）
９９ｍＴｃ−ＥＣおよび９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシンの放射合成（ｒａｄｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を、ＥＣまたはＥＣ−ネオマイシンの凍結乾燥化残渣（１０ｍｇ）、ＳｎＣｌ２（１００μｇ）、Ｎａ２ＨＰＯ４（１３．５ｍｇ）およびアスコルビン酸（０．５ｍｇ）を含む手製のキットに、必要量の９９ｍＴｃ−パラテクネテート（ｐｅｒｔｅｃｈｎｅｔａｔｅ）を添加することによって達成した。次いで、０．１ｍｌ水中のＮａＥＤＴＡ（０．５ｍｇ）を添加した。調製物の最終ｐＨは、７．４であった。放射化学的純度を、酢酸アンモニウム（水中１Ｍ）：メタノール（４：１）で溶出されるＴＬＣ（ＩＴＬＣ  ＳＧ，Ｇｅｌｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）によって決定した。放射ＴＬＣ（Ｂｉｏｓｃａｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）分析（図４１）およびＨＰＬＣ分析（図４２〜４５）から、放射化学的純度は、両方の放射性トレーサーについて９５％を超えた。
【０１３７】
（９９ｍＴｃ−ＥＣおよび９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシンの安定性アッセイ）
標識した９９ｍＴｃ−ＥＣおよび９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシンの安定性を、イヌ血清サンプル中で試験した。手短に言うと、７４０ＫＢｑの１ｍｇの９９ｍＴｃ−ＥＣおよび９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシンを、イヌ血清中（２００μｌ）で３７℃にて４時間インキュベートした。この血清サンプルを、水中の５０％メタノールで希釈し、そして放射−ＴＬＣを、上記のように０．５時間、２時間および４時間で繰り返した。
【０１３８】
（９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシンの組織分布研究）
雌性Ｆｉｓｈｃｅｒ  ３４４ラット（１５０±２５ｇ）（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に、２５ゲージ針を用いて、１３７６２腫瘍細胞株懸濁液由来の０．１ｍｌの乳房腫瘍細胞（１０６細胞／ラット、Ｆｉｓｃｈｅｒラットに特異的な腫瘍細胞株）を後脚に皮下接種した。腫瘍が約１ｃｍ直径に到達する移植後１４〜１７日に、研究を行った。ラットを、各手順の前にケタミン（１０〜１５ｍｇ／ラット、腹腔内）で麻酔した。
【０１３９】
組織分布研究において、各動物に、１０〜２０μＣｉの９９ｍＴｃ−ＥＣまたは９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシン（ｎ＝３／時点）を静脈内注射した。９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシンの注射した量は、２００μｇ／ラットであった。これらの放射トレーサーの投与後０．５時間、２時間および４時間で、ラットを屠殺し、そして選択した組織を切り出し、重さを量り、そして放射活性を計数した。各サンプル中のトレーサーの体内分布を、１ｇ組織湿重量あたりの注射用量のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）として計算した。腫瘍／非標的組織の計数密度比を、対応する％ＩＤ／ｇ値から計算した。９９ｍＴｃ−ＥＣ（表４）および遊離テクネチウム（表９）と比較した場合、腫瘍対組織比は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシン群において時間の関数として増加した（表８）。
【０１４０】
（シンチグラフィー画像化研究）
低エネルギーの平行穴コリメーターを備えたγカメラ（Ｓｉｍｅｎｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｅｓｔａｔｅｓ，ＩＬ）を使用して、シンチグラフィー画像を、１００μＣｉの各放射トレーサーの静脈内注射後０．５時間、２時間および４時間で得た。９９ｍＴｃ−ＥＣと比較して、腫瘍中の高い取り込みが観察された（図３７Ａ）。予備的な臨床画像化研究を、乳癌を有する患者において行った。腫瘍は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシンの投与後２時間で十分に可視化された（図３７Ｂ）。
【０１４１】
（表８）
（乳房腫瘍保有ラットにおける９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシンの体内分布）
【０１４２】
【表８】
0005781026.tif 000022
示された値は、３匹の動物からのデータの平均±標準偏差を表す。
【０１４３】
（表９）
（乳房腫瘍保有ラットにおける９９ｍＴｃパーテクネテートの体内分布）
【０１４４】
【表９】
0005781026.tif 000023
示された値は、３匹の動物からのデータの平均±標準偏差を表す。
【０１４５】
（９９ｍＴｃ−ＥＣ−薬物結合体のインビトロ細胞取り込み）
９９ｍＴｃ−ＥＣ−薬物結合体の細胞取り込みを評価するために、８０，０００個の細胞（Ａ５４９肺癌細胞株）を含む各ウェルに、２μＣｉの９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシンおよび１８Ｆ−ＦＤＧを添加した。インキュベーション後０．５〜４時間で、細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水で３回洗浄し、次いで、トリプシンによって細胞を死なせた。次いで、細胞を、γカウンターによって計数した。９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシンは、ヒト肺癌細胞株中で試験した薬剤中で最も高い取り込みを示した（図４６）。
【０１４６】
（９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシンおよび１８Ｆ−ＦＤＧの細胞取り込みに対するグルコースの効果）
ネオマイシンは、グルコース吸収に影響を及ぼすことが知られている（Ｒｏｇｅｒｓら、１９６８；Ｆａｎｃｉｕｌｌｉら、１９９４）。先の実験は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシンが、ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）中で１８Ｆ−ＦＤＧよりも高い取り込みを有することを示した。９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシンの取り込みがグルコース関連機構を介して媒介されるか否かを決定するために、グルコース（０．１ｍｇ〜２．０ｍｇ）を、５０，０００個の（乳房）細胞または８０，０００個の（肺）細胞のいずれかを含有する各ウェルに、２μＣｉの９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシンおよび１８Ｆ−ＦＤＧと共に添加した。インキュベーション後、細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水で３回洗浄し、次いで、トリプシンによって細胞を死なせた。次いで、細胞を、γカウンターによって計数した。
【０１４７】
０．１〜２．０ｍｇ／ウェルの濃度でグルコースを添加することによって、２つの肺癌細胞株および１つの乳房細胞株における９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシンの取り込みの減少が観察された。類似の結果が、１８Ｆ−ＦＤＧ群において観察された。９９ｍＴｃ−ＥＣ（コントロール）は、取り込みを全く示さなかった。これらの知見は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ネオマイシンの細胞取り込みが、グルコース関連機構を介して媒介され得ることを示唆する（図４７、４８Ａおよび４８Ｂ）。
【０１４８】
（実施例７：９９ｍＴｃ−ＥＣ−デオキシグルコースでの腫瘍の代謝画像化）
（ＥＣ−デオキシグルコース（ＥＣ−ＤＣ）の合成）
水酸化ナトリウム（１Ｎ、１ｍｌ）を、水中（５ｍｌ）のＥＣ（１１０ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）の攪拌した溶液に添加した。この無色の溶液に、スルホ−ＮＨＳ（２４１．６ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（２１８．８ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、Ｄ−グルコサミン塩酸塩（３５６．８ｍｇ、１．６５ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を、室温にて２４時間攪拌した。この混合物を、５００のカットオフ値を有するＳｐｅｃｔｒａ／ＰＯＲ分子多孔性膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を使用して４８時間透析した。透析後、生成物を、凍結乾燥器（Ｌａｂｃｏｎｃｏ，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，ＭＯ）を使用して凍結乾燥した。塩形態の生成物の重量は、５６８．８ｍｇであった。この合成スキームを図５９に示す。この構造を、質量分析計（図６０）およびプロトンＮＭＲ（図６１および６２）で確かめた。９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＤＣの放射化学的純度は、放射−ＴＬＣ（図６３）およびＨＰＬＣ（図６４および６５）分析によって決定した場合１００％であった。
【０１４９】
（ヘキソキナーゼアッセイ）
ＥＣ−ＤＧがグルコースリン酸化を模倣するか否かを決定するために、ヘキソキナーゼアッセイを行った。既製のキット（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を使用して、ＥＣ−ＤＧ、グルコサミンおよびグルコース（標準）を、ＵＶ波長３４０ｎｍでアッセイした。グルコース、ＥＣ−ＤＧおよびグルコサミンは、陽性ヘキソキナーゼアッセイを示した（図６６〜６８）。
【０１５０】
（インビトロ細胞取り込みアッセイ）
インビトロ細胞取り込みアッセイを、ヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）を使用することによって行った。２μＣｉの９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＤＧおよび１８Ｆ−ＦＤＧを、各８０，０００個の細胞を含有するウェルに添加した。インキュベーション後０．５〜４時間で、細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水で３回洗浄し、次いで、トリプシンによって細胞を死なせた。次いで、細胞を、γカウンターによって計数した。９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＤＧの取り込みは、ＦＤＧに匹敵した（図６９）。
【０１５１】
（９９ｍＴｃ−ＥＣ−デオキシグルコースおよび１８Ｆ−ＦＤＧの細胞取り込みに対するｄ−グルコースおよびｌ−グルコースの効果）
９９ｍＴｃ−ＥＣ−デオキシグルコースの取り込みがｄ−グルコース関連機構を介して媒介されるか否かを評価するために、ｄ−グルコースおよびｌ−グルコース（１ｍｇおよび２．０ｍｇ）を、乳癌細胞または肺癌細胞（５０，０００個／０．５ｍｌ／ウェル）のいずれかを含有する各ウェルに、２μＣｉの９９ｍＴｃ−ＥＣ−デオキシグルコースおよび１８Ｆ−ＦＤＧと共に添加した。２時間のインキュベーション後、細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水で３回洗浄し、次いで、トリプシンによって細胞を死なせた。細胞を、γカウンターによって計数した。
【０１５２】
１〜２．０ｍｇ／ウェルの濃度でグルコースを添加することによって、乳癌細胞および肺癌細胞における９９ｍＴｃ−ＥＣ−デオキシグルコースおよび１８Ｆ−ＦＤＧの取り込みの減少が観察された。しかし、ｌ−グルコースによる両薬剤に対する影響は存在しなかった（図７０〜７３）。これらの知見は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−デオキシグルコースの細胞取り込みが、ｄ−グルコース機構を介して媒介されることを示唆する。
【０１５３】
（正常ラットにおける血中グルコースレベルに対するＥＣ−デオキシグルコース負荷の効果）
先の実験は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−デオキシグルコースの細胞取り込みが、ＦＤＧに類似することを示した。例えば、ヘキソキナーゼアッセイ（グルコースリン酸化）は、陽性であった。９９ｍＴｃ−ＥＣ−デオキシグルコースの取り込みは、ｄ−グルコース機構を介して媒介される。この研究は、血中グルコースレベルがＦＤＧまたはＥＣ−デオキシグルコースのいずれかによって誘導され得、そしてインスリンによって抑制され得るか否かを決定することである。
【０１５４】
正常な健常Ｆｉｓｃｈｅｒ  ３４４ラット（重量１４５〜１５５ｇ）を、実験前に一晩絶食させた。調製した塩酸グルコサミン、ＦＤＧおよびＥＣ−デオキシグルコースの濃度は、６０％および１６４％（ｍｇ／ｍｌ）であった。血中グルコースレベル（ｍｇ／ｄｌ）を、グルコースメーター（Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ  ＤＥＸ、Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）によって測定した。この研究の前に、血中グルコースレベルのベースラインを得た。各ラット（ｎ＝３／群）に、１．２ｍｍｏｌ／ｋｇのグルコサミン、ＦＤＧおよびＥＣ−デオキシグルコースを投与した。別の実験において、１群のラットに、ＥＣ−デオキシグルコースおよびＦＤＧを投与した。インスリン（５ユニット）を、３０分後に投与した。血液サンプルを、尾静脈から３０分毎に投与後６時間まで収集した。
【０１５５】
血中グルコースレベルは、グルコサミン、ＦＤＧおよびＥＣ−デオキシグルコースのボーラス静脈内投与によって誘導された。この血中グルコースレベルの増加は、ＥＣ−デオキシグルコースまたはＦＤＧおよびインスリンの投与によって抑制され得た（図７４および７５）。
【０１５６】
（９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＤＧの組織分布研究）
乳房腫瘍保有動物モデルについて、雌性Ｆｉｓｈｃｅｒ  ３４４ラット（１５０±２５ｇ）（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に、２５ゲージ針を用いて、１３７６２腫瘍細胞株懸濁液由来の０．１ｍｌの乳房腫瘍細胞（１０６細胞／ラット、Ｆｉｓｃｈｅｒラットに特異的な腫瘍細胞株）を後脚に皮下接種した。腫瘍が約１ｃｍ直径に到達する移植後１４〜１７日に、研究を行った。ラットを、各手順の前にケタミン（１０〜１５ｍｇ／ラット、腹腔内）で麻酔した。
【０１５７】
肺腫瘍保有動物モデルについて、各胸腺欠損ヌードマウス（２０〜２５ｇ）に、２５ゲージ針を用いて、Ａ５４９腫瘍細胞株懸濁液由来の０．１ｍｌのヒト肺腫瘍細胞（１０６細胞／マウス）を後脚に皮下接種した。腫瘍が約０．６ｃｍ直径に到達する移植後１７〜２１日に、研究を行った。
【０１５８】
組織分布研究において、各動物に、１０〜２０μＣｉ（１匹のラットあたり）または１〜２μＣｉ（１匹のマウスあたり）の９９ｍＴｃ−ＥＣまたは９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＤＧ（ｎ＝３／時点）を静脈内注射した。９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＤＧの注射した量は、１ｍｇ／ラットであった。これらの放射トレーサーの投与後０．５時間、２時間および４時間で、これらの齧歯動物を屠殺し、そして選択した組織を切り出し、重さを量り、そして放射活性を計数した。各サンプル中のトレーサーの体内分布を、１ｇ組織湿重量あたりの注射用量のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）として計算した。腫瘍／非標的組織の計数密度比を、対応する％ＩＤ／ｇ値から計算した。９９ｍＴｃ−ＥＣ（表４）および遊離テクネチウム（表９）と比較した場合、腫瘍対組織比は、９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＤＧ群において、時間の関数として増加した（図７６〜８０）。
【０１５９】
（シンチグラフィー画像化研究）
低エネルギーの平行穴コリメーターを備えたγカメラを使用して、シンチグラフィー画像を、１００μＣｉの放射トレーサーの静脈内注射後０．５時間、２時間および４時間で得た。使用した動物モデルは、乳房腫瘍保有ラットであった。９９ｍＴｃ−ＥＣ（コントロール群）と比較した場合、腫瘍は十分に可視化され得た（図８１）。予備的な臨床画像化研究を、５人の患者（３人の脳腫瘍および２人肺疾患患者）において行った。画像を、投与後１〜２時間で得た。９９ｍＴｃ−ＥＣ−ＤＧは、良性腫瘍を悪性腫瘍に対して区別し得た。例えば、悪性星状細胞腫は、高い取り込みを示した（図８２Ａ，８２Ｂ、８３Ａおよび８３Ｂ）。良性髄膜腫は、悪性髄膜腫と比較して乏しい取り込みを示した（図８４ＡおよびＢ）。乏しい取り込みは、ＴＢを有する患者において観察されたが（図８５Ａおよび図８５Ｂ）、高い取り込みが、肺腫瘍において観察された（図８６Ａ，図８６Ｂ、および図８６Ｃ）。
【０１６０】
本明細書中に開示されそして特許請求される全ての組成物および／または方法は、本開示を考慮して過度の実験を伴うことなく作製および実行される。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態について記載されたが、これらの組成物および／または方法に対して、および本明細書中に記載される方法の工程または工程の順序において、本発明の概念、精神および範囲を逸脱することなく改変が適用され得ることは、当業者に明らかである。より詳細には、化学的および生理学的の両方で関連する特定の薬剤が、本明細書中に記載される薬剤と置換され得、同じかまたは類似の結果が達成されることが、明らかである。当業者に明らかな全てのこのような類似の置換物および改変物は、添付の特許請求の範囲に規定されるように、本発明の精神、範囲および概念内にあるとみなされる。
【０１６１】
（参考文献）
以下の参考文献は、これらが本明細書中に記載されるものに対して補助的な、例示的手順または他の詳細を提供する程度まで、本明細書中に参考として詳細に援用される。
【０１６２】
【表１０】
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以下の図面は、本明細書の一部を形成し、そして本発明の特定の局面をさらに示すために含まれる。本発明は、本明細書中に示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面のうちの１つ以上を参照することによって良好に理解され得る。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３９】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５Ａ】
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【図５５Ｂ】
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【図５５Ｃ】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２Ａ】
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【図８２Ｂ】
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【図８３Ａ】
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【図８３Ｂ】
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【図８４Ａ】
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【図８４Ｂ】
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【図８５Ａ】
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【図８５Ｂ】
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【図８６Ａ】
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【図８６Ｂ】
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【図８６Ｃ】
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【図１】
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【図２】
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