(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
陰イオン性薬物および化学式１で表される陽イオン性脂質を含み、前記陰イオン性薬物と前記陽イオン性脂質が静電気的相互作用を通じて複合体を形成し、前記複合体がミセルまたはエマルジョン内部に封入されている薬剤学的組成物：
【化１】
0005836394.tif 000010
上記式中、
ｎとｍは、独立して０〜１２であり、ただし、２≦ｎ＋ｍ≦１２であり、
ａとｂは、独立して１〜６であり、および
Ｒ１とＲ２は、独立して炭素数１１〜２５個の飽和または不飽和炭化水素である。
【請求項２】
前記陰イオン性薬物と陽イオン性脂質の電荷量の比率は、０．１〜１２８であることを特徴とする、請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項３】
前記陽イオン性脂質は、全体組成物の０．００１〜１０重量％であることを特徴とする、請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項４】
陰イオン性薬物；化学式１の陽イオン性脂質；および両親媒性ブロック共重合体を含み、
前記陰イオン性薬物は、前記陽イオン性脂質と複合体を形成し、および前記複合体は、両親媒性ブロック共重合体のミセル構造内部に封入されていることを特徴とするミセル剤型を有する、請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項５】
陰イオン性薬物；化学式１の陽イオン性脂質；および界面活性剤を含み、
前記陰イオン性薬物は、前記陽イオン性脂質と複合体を形成し、および前記複合体は、界面活性剤のミセル構造内部に封入されていることを特徴とするミセル剤型を有する、請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項６】
陰イオン性薬物；化学式１の陽イオン性脂質；および界面活性剤を含み、
前記陰イオン性薬物は、前記陽イオン性脂質と複合体を形成し、および前記複合体は、エマルジョン内部に封入されていることを特徴とするエマルジョン剤型を有する、請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項７】
前記陽イオン性脂質が１，６−ジオレオイルトリエチレンテトラミド陽イオン性脂質である、請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項８】
前記陽イオン性脂質が１，８−ジリノレオイルテトラエチレンペンタミド、１，４−ジミリストレオイルジエチレントリアミド、１，１０−ジステアロイルペンタエチレンヘキサミドおよび１，１０−ジオレオイルペンタエチレンヘキサミドからなる群より選択される陽イオン性脂質である、請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項９】
ｎとｍは、独立して１〜９であり、２≦ｎ＋ｍ≦１０である、請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１０】
ａとｂは、独立して２〜４である、請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１１】
Ｒ１とＲ２は、独立して炭素数１３〜２１個の不飽和炭化水素である、請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１２】
Ｒ１とＲ２は、独立してラウリル、ミリスチル、パルミチル、ステアリル、アラキジル、ベヘニル、リグノセリル、ミリストレイル、パルミトレイル、サピエニル、オレイル、リノレイル、アラキドニル、エイコサペンタエニル、エルシル、ドコサヘキサエニルおよびセロチルからなる群より選択される、請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１３】
記陰イオン性薬物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、または短鎖干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、陽イオン性脂質を含む陰イオン性薬物伝達体およびその製造方法に関し、より詳しくは、陰イオン性薬物が本発明化学式１の陽イオン性脂質と複合体を形成する陰イオン性薬物伝達体およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
陰イオン性薬物、特に核酸物質を利用した治療において、安全で効率的な薬物伝達技術は長年にわたって研究されてきており、多様な伝達体および伝達技術が開発されてきた。特に、アデノウイルスやレトロウイルスなどを利用したウイルス性伝達体、および陽イオン性脂質、陽イオン性高分子などを利用した非ウイルス性伝達体を利用した伝達技術が開発されてきた。
【０００３】
しかし、ウイルスを利用した伝達体を利用する技術は、非特異的免疫反応などの危険性に露出されており、生産工程が複雑であることから、商用化に多くの問題点があると知られている。したがって、最近の研究方向は、陽イオン性脂質や陽イオン性高分子を利用する非ウイルス性伝達体を利用してその短所を改善する方向に進められている。このような非ウイルス性伝達体は、ウイルス性伝達体に比べて効率性が劣るが、生体内安全性の側面から副作用が少なく、経済性の側面から生産価格が低廉であるという長所を有している。
【０００４】
非ウイルス性伝達体の剤型のうち、核酸物質と静電気的結合により核酸−高分子複合体を形成するポリ陽イオン性（ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎ）高分子が使用されてきたが、多価陽イオン電荷に起因した細胞毒性があることから、実際の使用には問題点がある。
【０００５】
また、陽イオン性脂質を使用することができるが、核酸−陽イオン性脂質複合体の場合、血中安定性が低いため、実際の生体内における使用が難しい。また、陽イオン性脂質、中性脂質および溶解性脂質（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ）を含むイオン性リポソームは、全身伝達体として試みられてきたが、使用される陽イオン性脂質の合成方法が複雑で、細胞毒性が依然として存在し、細胞内における核酸伝達効率が低い。
【０００６】
陽イオン性脂質を利用してｓｉＲＮＡと複合体を形成させた後、これを両親媒性ブロック共重合体のミセル内部に封入する技術が知られている。しかし、これら技術で使用された陽イオン性コレステロール脂質は、合成と精製工程が複雑であるという短所がある。
【０００７】
一方、多くの疾病は様々な要因により疾病の遺伝子の発現が増加したり突然変異により非正常的な活性が現れることによって発生するようになる。ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）は、転写後工程において配列特異的に特定の遺伝子の発現を抑制するため、遺伝子治療剤として多大な関心が集中している。特に、ｓｉＲＮＡの高い活性と精密な遺伝子選択性により、既存のアンチセンスヌクレオチドやリボザイムなどの問題点を解決できる核酸治療剤として期待されている。ｓｉＲＮＡは、１５個以上３０個未満のヌクレオチドから構成された短い二重螺旋のＲＮＡ筋であって、これらと塩基配列が相補的な遺伝子のｍＲＮＡを切断することによって当該遺伝子の発現を抑制させる。
【０００８】
しかし、ｓｉＲＮＡは、血中で核酸分解酵素により急速に分解されるだけでなく、陰電荷を帯びて細胞膜を容易に通過できないため、ｓｉＲＮＡを治療剤として使用するためには、ｓｉＲＮＡを血液で安定的に長時間循環させながら標的細胞または臓器内部に効率的に伝達されるようにする伝達体が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明の一実施形態は、化学式１で表される陽イオン性脂質を含む、陰イオン性薬物を伝達するための薬物伝達体を提供することにその目的がある。
【００１０】
本発明の他の一実施形態は、脂肪酸のアシルハロゲン化合物とオリゴアルキレンアミンを反応させて化学式１の陽イオン性脂質を製造する方法を提供することにその目的がある。
【００１１】
本発明のさらに他の一実施形態は、陰イオン性薬物および化学式１で表される陽イオン性脂質を含み、前記陰イオン性薬物と前記陽イオン性脂質が複合体を形成する薬剤学的組成物を提供する。
【００１２】
本発明のさらに他の一実施形態は、陰イオン性薬物；化学式１の陽イオン性脂質；および両親媒性ブロック共重合体を含み、前記陰イオン性薬物は、前記陽イオン性脂質と複合体を形成し、および前記複合体は、両親媒性ブロック共重合体のミセル構造内部に封入されていることを特徴とするミセル組成物およびその製造方法を提供することにその目的がある。
【００１３】
本発明のさらに他の一実施形態は、陰イオン性薬物；化学式１の陽イオン性脂質；および細胞融合性リン脂質を含み、前記陰イオン性薬物は、陽イオン性脂質と複合体を形成し、および前記複合体は、細胞融合性リン脂質から構成されたリポソームに結合されていることを特徴とするリポソーム組成物を提供することにその目的がある。
【００１４】
本発明のさらに他の一実施形態は、陰イオン性薬物；化学式１の陽イオン性脂質；および界面活性剤を含み、前記陰イオン性薬物は、前記陽イオン性脂質と複合体を形成し、および前記複合体は、界面活性剤のミセル構造内部に封入されていることを特徴とするミセル組成物を提供することにその目的がある。
【００１５】
本発明のさらに他の一実施形態は、陰イオン性薬物；化学式１の陽イオン性脂質；および界面活性剤を含み、前記陰イオン性薬物は、前記陽イオン性脂質と複合体を形成し、および前記複合体は、エマルジョン内部に封入されていることを特徴とするエマルジョン組成物を提供することにその目的がある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明では、化学式１で表される陽イオン性脂質を含む、陰イオン性薬物を伝達するための薬物伝達体を提供する：
【００１７】
【化１】
0005836394.tif 000002
【００１８】
上記式中、
ｎとｍは、独立して０〜１２であり、ただし、２≦ｎ＋ｍ≦１２であり、ａとｂは、独立して１〜６であり、およびＲ１とＲ２は、独立して炭素数１１〜２５個の飽和または不飽和炭化水素である。
【００１９】
前記化学式１で表される陽イオン性脂質は、陽電荷を帯びるオリゴアルキレンアミンと疎水性である炭素数１２〜２６個の飽和または不飽和脂肪酸がアミド結合した形態である。本発明において、前記陽イオン性脂質は、陰イオン性薬物と静電気的相互作用を通じて結合して複合体を形成することができ、前記複合体の形成により陰イオン性薬物の生体内安定性を向上させ、細胞内に伝達させることができるようにする。
【００２０】
本発明の一実施形態において、好ましくは、ｎとｍは、独立して１〜９であり、２≦ｎ＋ｍ≦１０である。より好ましくは、ｎとｍは、独立して１〜３であり、３≦ｎ＋ｍ≦６である。前記オリゴアルキレンアミンは、脂肪酸の密度を高く維持し、陽イオンから誘発される細胞毒性を最少化するためにｎとｍは前記のような数値および範囲を有することが好ましい。
【００２１】
本発明でａとｂは、好ましくは、それぞれ２〜４であり、より好ましくは、ａとｂは２である。ａとｂが１より小さければアミン間の距離が過度に近くて陽イオン性脂質と陰イオン性薬物間の静電気的相互作用が低下する。また、６より大きければアミン間の距離が遠くなり陽イオンの密度が低くなって陰イオン性薬物との静電気的相互作用が低下するため、安定した複合体を形成することができない。
【００２２】
本発明のオリゴアルキレンアミンは、具体的には、オリゴエチレンアミンであり、より具体的には、ジエチレントリアミン（ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ）、トリエチレンテトラミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｍｉｎｅ）、テトラエチレンペンタミン（ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｅｎｅｐｅｎｔａｍｉｎｅ）、ペンタエチレンヘキサミン（ｐｅｎｔａｅｔｈｙｌｅｎｅｈｅｘａｍｉｎｅ）、ヘキサエチレンヘプタミン（ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｈｅｐｔａｍｉｎｅ）、ヘプタエチレンオクタミン（ｈｅｐｔａｅｔｈｙｌｅｎｅｏｃｔａｍｉｎｅ）、オクタエチレンノナミン（ｏｃｔａｅｔｈｙｌｅｎｅｎｏｎａｍｉｎｅ）、ノナエチレンデカミン（ｎｏｎａｅｔｈｙｌｅｎｅｄｅｃａｍｉｎｅ）、テカエチレンウンデカミン（ｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｕｎｄｅｃａｍｉｎｅ）、ウンデカエチレンドデカミン（ｕｎｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｄｏｄｅｃａｍｉｎｅ）、トデカエチレントリデカミン（ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉｄｅｃａｍｉｎｅ）およびトリデカエチレンテトラデカミン（ｔｒｉｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｄｅｃａｍｉｎｅ）からなる群より一つ以上が選択され得る。好ましくは、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミンおよびヘキサエチレンヘプタミンである。
【００２３】
前記Ｒ１とＲ２は、好ましくは、それぞれ炭素数１１〜２５個の飽和または不飽和炭化水素であり、より好ましくは、炭素数１３〜２１個の不飽和炭化水素であり得る。炭素数が１１より小さければ炭化水素鎖間の疎水性相互作用の減少により安定した剤型を形成することができない。反面、炭素数が２５より大きければ炭化水素間の疎水性相互作用の増加により過度に安定した剤型を形成して体内で陰イオン性薬物の解離低下による効能減少を誘発させる。また、シス（ｃｉｓ）二重結合の増加による炭化水素鎖の湾曲度の増加により密度が低い剤型を形成して剤型安定性が減少するようになる。
【００２４】
前記飽和炭化水素は、具体的には、ラウリル（ｌａｕｒｙｌ）、ミリスチル（ｍｙｒｉｓｔｙｌ）、パルミチル（ｐａｌｍｉｔｙｌ）、ステアリル（ｓｔｅａｒｙｌ）、アラキジル（ａｒａｃｈｉｄｙｌ）、ベヘニル（ｂｅｈｅｎｙｌ）、リグノセリル（ｌｉｇｎｏｃｅｒｙｌ）、セロチル（ｃｅｒｏｔｙｌ）基などが挙げられ、不飽和炭化水素は、シス結合を有することが好ましいが、具体的には、ミリストレイル（ｍｙｒｉｓｔｏｌｅｙｌ）、パルミトレイル（ｐａｌｍｉｔｏｌｅｙｌ）、サピエニル（ｓａｐｉｅｎｙｌ）、オレイル（ｏｌｅｙｌ）、リノレイル（ｌｉｎｏｌｅｙｌ）、アラキドニル（ａｒａｃｈｉｄｏｎｙｌ）、エイコサペンタエニル（ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｙｌ）、エルシル（ｅｒｕｃｙｌ）およびドコサヘキサエニル（ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｙｌ）などが挙げられる。
【００２５】
本発明はまた、下記化学式２のオリゴアルキレンアミンを下記化学式３の脂肪酸アシルハロゲン化合物および下記化学式４の脂肪酸のアシルハロゲン化合物と反応させて化学式１の陽イオン性脂質を製造する段階を含む薬物伝達体の製造方法を提供する。
【００２６】
【化２】
0005836394.tif 000003
【化３】
0005836394.tif 000004
【化４】
0005836394.tif 000005
【化５】
0005836394.tif 000006
【００２７】
前記化学式１〜化学式４中、
ｎとｍは、独立して０〜１２であり、ただし、２≦ｎ＋ｍ≦１２であり、
ａとｂは、独立して１〜６であり、
Ｒ１とＲ２は、独立して炭素数１１〜２５個の飽和または不飽和炭化水素であり、および
Ｘはハロゲンである。
【００２８】
本発明の一実施形態で、前記化学式１の物質に対応する脂肪酸のアシルハロゲン化合物とオリゴアルキレンアミンを反応させて化学式１の陽イオン性脂質を製造することができる。具体的には次のような反応を通じて製造することができる。
【化６】
0005836394.tif 000007
【００２９】
前記で、Ｒ１とＲ２、ａ、ｂ、ｎ、およびｍは、前記化学式１の定義と同意義であり、Ｘは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を含むハロゲンである。
【００３０】
つまり、本発明の陽イオン性脂質は、親水性のオリゴアルキレンアミンと疎水性の脂肪酸がアミド結合により結合された両新媒性化合物であって、触媒なしにオリゴエチレンアミン末端の１次アミン基（−ＮＨ２）と脂肪酸間にアミド結合を生成させることができる。
【００３１】
前記製法で、脂肪酸のアシルハロゲン化合物は、炭素数１２〜２６個の脂肪酸由来のアシルハロゲン化合物であり、飽和脂肪酸のアシルハロゲン化合物としては、好ましくはラウロイル（ｌａｕｒｏｙｌ）クロライド、ミリストイル（ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ）クロライド、パルミトイル（ｐａｌｍｉｔｏｙｌ）クロライド、ステアロイル（ｓｔｅａｒｏｙｌ）クロライド、アラキドイル（ａｒａｃｈｉｄｏｙｌ）クロライド、ベヘノイル（ｂｅｈｅｎｏｙｌ）クロライド、リグノセロイル（ｌｉｇｎｏｃｅｒｏｙｌ）クロライド、セロトイル（ｃｅｒｏｔｏｙｌ）クロライドなどであり、より好ましくはパルミトイル（ｐａｌｍｉｔｏｙｌ）クロライド、ステアロイル（ｓｔｅａｒｏｙｌ）クロライド、アラキドイル（ａｒａｃｈｉｄｏｙｌ）クロライド、ベヘノイル（ｂｅｈｅｎｏｙｌ）クロライドである。
【００３２】
また、不飽和脂肪酸のアシルクロライドは、シス（ｃｉｓ）二重結合を有することが好ましく、具体的には、ミリストレオイル（ｍｙｒｉｓｔｏｌｅｏｙｌ）クロライド、パルミトレオイル（ｐａｌｍｉｔｏｌｅｏｙｌ）クロライド、サピエノイル（Ｓａｐｉｅｎｏｙｌ）クロライド、オレオイル（ｏｌｅｏｙｌ）クロライド、リノレオイル（ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ）クロライド、アラキドノイル（ａｒａｃｈｉｄｏｎｏｙｌ）クロライド、エイコサペンタエノイル（ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｙｌ）クロライド、エルコイル（ｅｒｕｃｏｙｌ）クロライド、ドコサヘキサエノイル（ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｙｌ）クロライドなどであり、より好ましくは、ミリストレオイル（ｍｙｒｉｓｔｏｌｅｏｙｌ）クロライド、パルミトレオイル（ｐａｌｍｉｔｏｌｅｏｙｌ）クロライド、サピエノイル（Ｓａｐｉｅｎｏｙｌ）クロライド、オレオイル（ｏｌｅｏｙｌ）クロライド、リノレオイル（ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ）クロライド、アラキドノイル（ａｒａｃｈｉｄｏｎｏｙｌ）クロライド、エイコサペンタエノイル（ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｙｌ）クロライドである。
【００３３】
本発明の一実施形態は、陰イオン性薬物および化学式１で表される陽イオン性脂質を含み、前記陰イオン性薬物と前記陽イオン性脂質が複合体を形成する薬剤学的組成物を提供する。本発明の陰イオン性薬物および化学式１で表される陽イオン性脂質は、静電気的結合により複合体を形成して陰イオン性薬物の生体内安定性を向上させ、細胞内への伝達を媒介する役割を果たす。
【００３４】
本発明の一実施形態による陰イオン性薬物は、水溶液中で分子内に陰電荷を帯びる薬理学的活性を有するすべての物質を含む概念である。一実施形態で、前記陰イオン性は、カルボキシ基、ホスフェート基およびスルフェート基からなる群より選択される一つ以上の作用基から付与され得る。本発明の一実施形態で、陰イオン性薬物は、多重陰イオン性薬物または核酸であり得る。多重陰イオン性薬物の例としては、ヘパリン、カルシトニンなどが挙げられる。
【００３５】
前記核酸は、デオキシリボ核酸、リボ核酸、またはバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）、糖または塩基が化学的に変形したり核酸の末端が修飾されたポリヌクレオチド誘導体などの核酸薬物であり得、より具体的には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、アンチセンスＯＤＮ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、アンチセンスＲＮＡ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ）、リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）およびＤＮＡザイム（ＤＮＡｚｙｍｅ）からなる群より選択される一つ以上の核酸であり得る。また、前記核酸は、血中安定性を増加させたり免疫反応を弱化させるなどの目的のために、バックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）、糖または塩基が化学的に変形したり末端が修飾され得る。具体的には、核酸のホスホジエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ）結合の一部をホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）またはボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）結合に代替したり、一部リボースの２’−ＯＨ位置にメチル基、メトキシエチル基、フッ素などの多様な作用基が導入された修飾ヌクレオチドを１種以上含むことができる。
【００３６】
さらに他の一実施形態で、核酸の一つ以上の末端は、コレステロール、トコフェロールおよび炭素数１０〜２４個の脂肪酸からなる群より選択される一つ以上で修飾され得る。例えば、ｓｉＲＮＡの場合、センスおよび／またはアンチセンス鎖の５’末端、または３’末端、または両末端に修飾され、好ましくはセンス鎖の末端に修飾され得る。
【００３７】
前記コレステロール、トコフェロールおよび脂肪酸には、コレステロール、トコフェロールおよび脂肪酸の各類似体、誘導体、および代謝体が含まれる。
【００３８】
本発明の陰イオン性薬物は、全体組成物の重量を基準に、０．００１〜１０重量％、具体的には０．０１〜５重量％に含まれることが良い。前記陰イオン性薬物の含量が０．００１重量％未満であれば、薬物に比べて使用される伝達体の量が過度に多いため、伝達体による副作用があり得、１０重量％を超えれば、伝達体の安定性が低下したり大きさが過度に大きくなるため、フィルターの滅菌時に損失率が大きくなる恐れがある。
【００３９】
前記陽イオン性脂質と陰イオン性薬物は、静電気的相互作用を通じて結合して、陰イオン性薬物と陽イオン性脂質複合体を形成する。一実施形態で、前記陽イオン性脂質（Ｎ）と陰イオン性薬物（Ｐ）の電荷量の比率（Ｎ／Ｐ；陰イオン性薬物の陰イオン電荷に対する陽イオン性脂質の陽イオン電荷比率）は、０．１〜１２８であり、具体的には０．５〜３２であり、より具体的には１〜１６であることが良い。前記比率（Ｎ／Ｐ）が０．１未満である場合には、十分な量の陰イオン性薬物を含む複合体を形成しにくいため、０．１以上であってこそ十分な量の陰イオン薬物を含む複合体を形成することができるため有利である。反面、比率（Ｎ／Ｐ）が１２８超過時には、毒性を誘発する恐れがあるため、１２８以下にすることが良い。
【００４０】
本発明の具体的な例で、本発明の陽イオン性脂質を含む伝達体は、前記核酸の細胞内運搬および陰イオン性活性物質の生体内安定性の向上および伝達を媒介する。
【００４１】
本発明の薬剤学的組成物は、リポソーム、ミセル、エマルジョンおよびナノ粒子からなる群より選択される剤型であり得る。具体的には、前記陰イオン性薬物および前記陽イオン性脂質が複合体を形成し、前記複合体は、ミセル、リポソーム、エマルジョン、ナノ粒子内部に封入または表面に結合された形態であり得る。
【００４２】
前記剤型で、本発明の陰イオン性薬物は、全体組成物の重量を基準に、０．００１〜１０重量％、具体的には０．０１〜５重量％に含まれることが良い。前記陰イオン性薬物の含量が０．００１重量％未満であれば、薬物に比べて使用される伝達体の量が過度に多いため、伝達体による副作用があり得、１０重量％を超えれば、伝達体の安定性が低下したり大きさが過度に大きくなるため、フィルターの滅菌時に損失率が大きくなる恐れがある。
【００４３】
また、前記剤型で、前記陽イオン性脂質は、全体組成物の重量を基準に、０．０１〜５０重量％、具体的には０．１〜１０重量％に含まれ得る。前記陽イオン性脂質の含量が０．０１％未満であれば、陰イオン性薬物と複合体を形成することができる十分な量にならず、５０重量％を超えれば、伝達体の大きさが過度に大きくなるため、生体内安定性が低下し、フィルターの滅菌時に損失率が大きくなるばかりか、過量の陽イオンによる毒性を誘発する恐れがある。
【００４４】
本発明の他の具体的な例で、前記ミセル剤型は、陰イオン性薬物、陽イオン脂質複合体および両親媒性ブロック共重合体を含む。つまり、本発明は、陰イオン性薬物；化学式１の陽イオン性脂質；および細胞融合性リン脂質を含み、前記陰イオン性薬物は、陽イオン性脂質と複合体を形成し、および前記複合体は、細胞融合性リン脂質から構成されたリポソームに結合されていることを特徴とするリポソーム組成物およびその製造方法を提供する。
【００４５】
前記両親媒性ブロック共重合体は、親水性Ａブロックおよび疎水性Ｂブロックを含むＡ−Ｂ型ブロック共重合体であり得る。水溶液上で、前記両親媒性Ａ−Ｂ型ブロック共重合体は、水溶液に溶解されない疎水性Ｂブロックが内部に化合しながら陰イオン性薬物／陽イオン性脂質複合体が内部に封入されたコア（ｃｏｒｅ）を形成し、親水性Ａブロックがコア外部に露出したシェルを形成するコア−シェルタイプの高分子ミセルを形成する。
【００４６】
一実施形態で、前記親水性Ａブロックは、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミドおよびその誘導体からからなる群より選択される一つ以上であり得る。より好ましくは、親水性Ａブロックは、モノメトキシポリエチレングリコール、モノアセトキシポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリエチレンとプロピレングリコールの共重合体およびポリビニルピロリドンからなる群より選択される一つ以上であり得る。さらに他の一実施形態で、前記親水性Ａブロックは、数平均分子量が２００〜５０，０００ダルトン、より好ましくは１，０００〜２０，０００ダルトン、さらに好ましくは１，０００〜５，０００ダルトンであり得る。
【００４７】
また、必要に応じて親水性Ａブロックの末端に特定組織や細胞に到達できる作用基やリガンド、または細胞内伝達を促進できる作用基を化学的に結合させて高分子ミセル伝達体の体内分布を調節したり高分子ミセル伝達体が細胞内に伝達される効率を高めることができる。前記作用基やリガンドは、単糖類、多糖類、ビタミン、ペプチド、蛋白質および細胞表面受容体に対する抗体からなる群より選択された１種以上であり得る。より好ましくは、アニスアミド（ａｎｉｓａｍｉｄｅ）、ビタミンＢ９（葉酸）、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ガラクトース、ラクトース、マンノース、ヒアルロン酸、ＲＧＤペプチド、ＮＧＲペプチド、トランスフェリン、トランスフェリン受容体に対する抗体などからなる群より選択された１種以上であり得る。
【００４８】
前記疎水性Ｂブロックは、生体適合性生分解性に優れた高分子であって、一実施形態で、ポリエステル、ポリアンハイドライド、ポリアミノ酸、ポリオルトエステルおよびポリフォスファジンからなる群より選択される一つ以上であり得る。より好ましくは、前記疎水性Ｂブロックは、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリカプロラクトン、ポリジオキサン−２−オン、ポリラクチドとグリコリドの共重合体、ポリラクチドとポリジオキサン−２−オンの共重合体、ポリラクチドとポリカプロラクトンの共重合体およびポリグリコリドとポリカプロラクトンの共重合体からからなる群より選択される一つ以上であり得る。一実施形態で、前記疎水性Ｂブロックは、数平均分子量が５０〜５０，０００ダルトン、より具体的には２００〜２０，０００ダルトンであり、さらに好ましくは１，０００〜５，０００ダルトンであり得る。また、疎水性ブロックの疎水性を増加させてミセルの安定性を向上させるために、トコフェロール、コレステロール、または炭素数１０〜２６個の脂肪酸を疎水性ブロック末端のヒドロキシ基に化学的に結合させることができる。
【００４９】
前記親水性ブロック（Ａ）と疎水性ブロック（Ｂ）を含む両親媒性ブロック共重合体の含量は、組成物全体乾燥重量を基準に、４０〜９９．９８重量％であり、好ましくは８５〜９９．８重量％、より好ましくは９０〜９９．８重量％であることが良い。前記両親媒性ブロック共重合体の含量が４０重量％未満であれば、ミセルの大きさが過度に大きくなるため、ミセルの安定性が低下し、フィルターの滅菌時に損失率が大きくなる恐れがあり、含量が９９．９８重量％を超えれば、含入可能な陰イオン性薬物の含量が過度に少なくなる。
【００５０】
さらに他の一実施形態で、前記両親媒性ブロック共重合体において、親水性ブロック（Ａ）と疎水性ブロック（Ｂ）の組成比は、共重合体重量を基準に、親水性ブロック（Ａ）が４０〜７０重量％、好ましくは５０〜６０重量％範囲であり得る。親水性ブロック（Ａ）の比率が４０重量％未満であれば、高分子の水に対する溶解度が低くてミセルを形成しにくいため、共重合体がミセルを形成するのに十分な水に対する溶解度を有するために親水性ブロック（Ａ）の比率が４０重量％以上であることが良い一方、７０重量％を超えれば、親水性が過度に高くて高分子ミセルの安定性が低いため、陰イオン性薬物／陽イオン性脂質複合体の可溶化組成物で使用しにくいため、ミセル安定性を考慮して親水性ブロック（Ａ）の比率が７０重量％以下であることが良い。
【００５１】
一実施形態で、前記両親媒性ブロック共重合体は、水溶液上で陰イオン性薬物と陽イオン性脂質複合体をミセル構造内部に封入させるが、この時、両親媒性ブロック共重合体の重量（ｂ）に対する陰イオン性薬物および陽イオン性脂質複合体の重量（ａ）の比率［ａ／ｂ×１００；（陰イオン性薬物重量＋陽イオン性脂質重量）／両親媒性ブロック共重合体重量×１００］は、０．００１％〜１００％、具体的には０．０１〜５０％、より具体的には０．１〜１０％であり得る。前記重量比率が、０．００１重量％未満である場合には、陰イオン性薬物および陽イオン性脂質複合体の含量が低くなって陰イオン性薬物に対する有効含量を充足させにくく、反対に１００重量％超過時には、両親媒性ブロック共重合体の分子量と陰イオン性薬物および脂質複合体の量を考慮する時、適切な大きさのミセル構造を形成することができないためである。
【００５２】
また、本発明によるミセル組成物の製造方法は、
（ａ）陰イオン性薬物と化学式１の陽イオン性脂質を水混和性有機溶媒または水溶液と有機溶媒の混合溶媒で溶解して相分離させる段階；
（ｂ）前記（ａ）段階の有機溶媒層を分離する段階；
（ｃ）前記（ｂ）段階の有機溶媒層に両親媒性ブロック共重合体を混合し、有機溶媒を除去する段階；および
（ｄ）前記有機溶媒が除去された混合物に水溶液を添加してミセル化する段階を含む。
【００５３】
前記（ａ）段階で、水混和性有機溶媒、または水溶液と有機溶媒の混合溶媒で陰イオン性薬物と陽イオン性脂質を混合して複合体を形成する。具体的には、前記水混和性有機溶媒は、アセトン、エタノール、メタノールおよび酢酸からなる群より選択される一つ以上であり得、前記混合溶媒の有機溶媒は、酢酸エチル、アセトニトリル、メチレンクロライド、クロロホルムおよびジオキサンからなる群より選択される一つ以上であり得る。前記水溶液は、蒸溜水、注射用水、または緩衝液であり得る。前記溶媒に溶解した陰イオン性薬物と陽イオン性脂質の複合体の量は、使用した溶媒量の０．１〜１００重量％、好ましくは０．１〜１０重量％、より好ましくは０．１〜１重量％になるように使用することができる。もし、１００重量％以上であれば、下記（ｂ）段階で陰イオン性薬物と陽イオン性脂質の複合体を有機溶媒で抽出する時、収率が急激に落ちる短所がある。
【００５４】
前記（ｂ）段階で相分離を通じて陰イオン性薬物と陽イオン性脂質の複合体を回収する。前記段階（ａ）の溶媒に水溶液と有機溶媒を追加して相分離を誘導することができる。また、相分離時間を短縮させるために遠心分離段階を追加することができる。
【００５５】
前記（ｃ）段階で、抽出された有機溶媒に両親媒性ブロック共重合体を添加して混合した後、有機溶媒を蒸発させることによって除去する。
【００５６】
前記（ｄ）段階は、有機溶媒が蒸発して残った混合物を水溶液中に溶解することによって、陰イオン性薬物と陽イオン性脂質複合体を両親媒性ブロック共重合体のミセル構造内部に封入させるようになる。前記水溶液は、蒸溜水、注射用水、または緩衝液であり得、使用量は両親媒性ブロック共重合体の濃度が１０〜３００ｍｇ／ｍＬ程度になるようにできる。前記高分子の濃度が１０ｍｇ／ｍＬ未満であれば、水溶液の体積が大きくなって製造工程上の取り扱いに困難があり、３００ｍｇ／ｍＬを超えれば、水溶液の粘度が高くなって円滑なミセルの製造が難しい。融合性脂質を追加的に含む場合、融合性脂質は、両親媒性ブロック共重合体を添加する時に添加され得る。
【００５７】
本発明のさらに他の一実施形態で、陰イオン性薬物、化学式１の陽イオン性脂質および両親媒性ブロック共重合体を含む薬剤学的組成物を製造する方法は、
（ａ’）陰イオン性薬物、化学式１の陽イオン性脂質および両親媒性ブロック共重合体を水混和性有機溶媒または水溶液と有機溶媒の混合溶媒で溶解する段階；
（ｂ’）前記（ａ’）段階の有機溶媒層を除去する段階；
（ｃ’）前記（ｂ’）段階の有機溶媒が除去された混合物に水溶液を添加してミセル化する段階を含む。
【００５８】
前記（ａ’）段階で、水混和性有機溶媒または水溶液と有機溶媒の混合溶媒で陰イオン性薬物、陽イオン性脂質および両親媒性ブロック共重合体を混合して複合体を形成する。具体的には、前記水混和性有機溶媒は、アセトン、エタノール、メタノールおよび酢酸からなる群より選択される一つ以上であり得、前記混合溶媒の有機溶媒は、酢酸エチル、アセトニトリル、メチレンクロライド、クロロホルムおよびジオキサンからなる群より選択される一つ以上であり得る。前記水溶液は、蒸溜水、注射用水、または緩衝液であり得る。
【００５９】
前記（ｂ’）段階で、有機溶媒を蒸発させることによって除去する。
【００６０】
前記（ｃ’）段階は、有機溶媒が蒸発して残った混合物を水溶液中に溶解することによって、陰イオン性薬物と陽イオン性脂質との複合体を両親媒性ブロック共重合体のミセル構造内部に封入させる。前記水溶液、その使用量は上述したとおりである。融合性脂質を追加的に含む場合、融合性脂質は段階（ａ’）に添加され得る。
【００６１】
さらに他の一実施形態で、前記（ｄ）段階、または（ｃ’）段階の以降に、（ｅ）凍結乾燥補助剤を加えて凍結乾燥する段階をさらに含むことができる。
【００６２】
一実施形態で、本発明による製造方法は、前記（ｅ）段階の凍結乾燥の以前に（ｄ）段階、または（ｃ’）段階で得た高分子ミセル水溶液を滅菌フィルターで滅菌する段階を追加的に含むことができる。
【００６３】
一実施形態で、前記凍結乾燥補助剤は、ラクトース、マンニトール、ソルビトールおよびスクロースからなる群より選択される一つ以上であり得る。前記凍結乾燥補助剤は、凍結乾燥された組成物がケーキ形態を維持できるようにするために添加される。さらに他の一実施形態で、前記凍結乾燥補助剤の含量は、凍結乾燥組成物の全体乾燥重量を基準に、１〜９０重量％、より好ましくは１０〜６０重量％である。
【００６４】
本発明の他の具体的な例で、前記剤型は、前記陰イオン性薬物、前記陽イオン性脂質および界面活性剤を含有するミセル形態であり得る。つまり、本発明は、陰イオン性薬物；化学式１の陽イオン性脂質；および界面活性剤を含み、前記陰イオン性薬物は、前記陽イオン性脂質と複合体を形成し、および前記複合体は、界面活性剤のミセル構造内部に封入されていることを特徴とするミセル組成物を提供する。
【００６５】
前記界面活性剤は、例えば、ツイン−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）、ポリエチレングリコールモノオレイルエーテル（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｍｏｎｏｏｌｅｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、エチレングリコールモノドデシルエーテル（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｍｏｎｏｄｏｄｅｃｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、ジエチレングリコールモノヘキシルエーテル（ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｍｏｎｏｈｅｘｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、トリメチルヘキサデシルアンモニウムクロライド（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｈｅｘａｄｅｃｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（ｄｏｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）、シクロヘキシル β−Ｄ−マルトシド（ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｍｅｔｈｙｌ  β−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅ）、ペンタエリスリチルパルミテート（ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｔｙｌ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、ラウリルジメチルアミンオキシド（ｌａｕｒｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ−ｏｘｉｄｅ）、またはＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩（Ｎ−ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）などからなる群より選択された１種以上であり得る。
【００６６】
本発明の具体的な一実施形態で、前記リポソーム剤型は、前記陰イオン性薬物および陽イオン脂質の複合体および細胞融合性リン脂質を含むことができる。好ましくは、本発明の組成物は、陰イオン性薬物の細胞内伝達効率を増加させるために全体組成物の重量を基準に０．０１〜５０重量％、具体的には０．１〜１０重量％の細胞融合性リン脂質を追加的に含むことができる。前記複合体は、リポソームの内部または表面に結合された形態であり得る。
【００６７】
つまり、本発明は、陰イオン性薬物；化学式１の陽イオン性脂質；および細胞融合性リン脂質を含み、前記陰イオン性薬物は、陽イオン性脂質と複合体を形成し、および前記複合体は、細胞融合性リン脂質から構成されたリポソームに結合されていることを特徴とするリポソーム組成物を提供する。
【００６８】
前記細胞融合性リン脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ；ＤＯＰＥ）、 ジパルミトイルホスファチジルコリン （１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスホコリン（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ、ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、ＤＰＰＥ）などを例に挙げられる。前記細胞融合性脂質は、リポソームの体内安定性を向上させるために、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、多糖類およびその誘導体からなる群より選択される一つ以上の物質で修飾されたものであり得る。具体的には、前記修飾物質は、モノメトキシポリエチレングリコール、モノアセトキシポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリエチレンとプロピレングリコールの共重合体、ポリビニルピロリドンおよびデキストランからなる群より選択される一つ以上であり得る。
【００６９】
本発明の他の具体的な例で、前記剤型は、前記陰イオン性薬物および陽イオン性脂質の複合体および界面活性剤を含有するエマルジョン形態であり得る。つまり、本発明は、陰イオン性薬物；化学式１の陽イオン性脂質；および界面活性剤を含み、前記陰イオン性薬物は、前記陽イオン性脂質と複合体を形成し、および前記複合体は、エマルジョン内部に封入されていることを特徴とするエマルジョン組成物を提供する。
【００７０】
エマルジョン剤型に含まれる界面活性剤は、陽イオン性（ｃａｔｉｏｎｉｃ）、両性（ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ）、非イオン性（ｎｏｎｉｏｎｉｃ）が挙げられる。陽イオン性界面活性剤としては、例えばセチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ｃｅｔｙｌ  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ｈｅｘａｄｅｃｙｌ  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）などを使用することができ、両性界面活性剤としては、例えばドデシルベタイン（ｄｏｄｅｃｙｌ  ｂｅｔａｉｎｅ）、ドデシルジメチルアミンオキシド（ｄｏｄｅｃｙｌ  ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ  ｏｘｉｄｅ）、ジメチルパルミトイルアンモニオプロパンスルホネート（３−（Ｎ，Ｎ-ｄｉｍｅｔｈｙｌｐａｌｍｉｔｙｌａｍｍｏｎｉｏ）  ｐｒｏｐａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）などを使用することができ、非イオン性界面活性剤としては、例えばツイン−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）、ツイン−８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）、トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００）、ポリエチレングリコールモノオレイルエーテル（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｍｏｎｏｏｌｅｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、トリエチレングリコールモノドデシルエーテル（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｍｏｎｏｄｏｄｅｃｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、オクチルグルコシド（ｏｃｔｙｌ  ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）、ノナノイルメチルグルカミン（Ｎ−ｎｏｎａｎｏｙｌ−Ｎ-ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｎｅ）などを使用することができる。
【００７１】
陽イオン性リポソーム、ミセル、エマルジョンなどの剤型からなる本発明の陰イオン性薬物伝達体は、動物細胞内に目的とする陰イオン性薬物の輸送効率を顕著に増強させることができ、細胞に対する毒性も減少させる。
【００７２】
一実施形態で、本発明による薬剤学的組成物は、水溶液、粉末または錠剤の形態に製剤化され得る。他の一実施形態で、前記組成物は、注射用製剤であり得る。また、粉末の場合、注射用蒸溜水、０．９％生理食塩水、５％デキストロース水溶液などで再建して使用することができる。
【００７３】
本発明による製法を通じて形成された薬剤学的組成物は、血中で安定しており、粒子の大きさは１０〜２００ｎｍであり、より具体的には１０〜１５０ｎｍである。
【００７４】
本発明による陰イオン性薬物含有組成物は、静脈投与、筋肉内投与、皮下投与、口腔投与、骨髄内投与、経皮投与または局所投与などで投与することができ、溶液、懸濁注射剤、錠剤またはカプセル剤などの多様な形態に剤型化することができる。
【発明の効果】
【００７５】
本発明の陽イオン性脂質は、核酸または陰イオン性活性物質のような陰イオン性薬物複合体を形成して細胞内伝達が可能であり、また、追加組成物と共にリポソーム、ミセル、エマルジョンおよびナノ粒子を形成して陰イオン性薬物の血中または体液内安全性を高めることができる。また、前記伝達体は、陽イオン性脂質の陽電荷由来の細胞毒性を減少させるばかりか、核酸の細胞内伝達効能を顕著に増加させる。したがって、前記陽イオン性脂質は、核酸または陰イオン性活性物質の治療効能を増強させることができる伝達体の用途で有用に使用される。
【００７６】
また、前記化学式１の陽イオン性脂質は、低廉なオリゴアルキレンアミンを使用して脂肪酸誘導体と高い収率に容易に合成が可能であり、既存の脂質合成物と異なり精製工程が非常に簡単な長所がある。
【００７７】
特に、本発明の組成物が陰イオン性薬物として核酸を含む場合、病因性蛋白質の異常発現または過多発現が発病原因になる腫瘍、関節炎、心血管系、内分泌系疾患などの各種疾患治療のために細胞内に導入され得る。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】実施例１の１，６−ジオレオイルトリエチレンテトラミドの１Ｈ  ＮＭＲ測定結果を示したものである。
【図２】実施例２の１，８−ジリノレオイルテトラエチレンペンタミドの１Ｈ  ＮＭＲ測定結果を示したものである。
【図３】実施例３の１，４−ジミリストレオイルジエチレントリアミドの１Ｈ  ＮＭＲ測定結果を示したものである。
【図４】実施例４の１，１０−ジステアロイルペンタエチレンヘキサミドの１Ｈ  ＮＭＲ測定結果を示したものである。
【図５】実施例５の１，１０−ジオレオイルペンタエチレンヘキサミドの１Ｈ  ＮＭＲ測定結果を示したものである。
【図６】製造例１の合成されたｍＰＥＧ−ＰＬＡブロック共重合体に対する１Ｈ  ＮＭＲ測定結果である。
【図７】製造例２の合成されたｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールブロック共重合体に対する１Ｈ  ＮＭＲ測定結果である。
【図８】製造例３のＡＣ−コレステロールの１Ｈ  ＮＭＲ測定結果を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
以下、本発明を下記の実施例に基づいてより詳しく説明するが、これらは本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲はこれらによって如何なる方式でも制限されない。
【００８０】
〔実施例１〕１，６−ジオレオイルトリエチレンテトラミド（１，６−ｄｉｏｌｅｏｙｌ  ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｍｉｄｅ）の合成
トリエチレンテトラミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｍｉｎｅ）とオレオイル クロライド（ｏｌｅｏｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）間の親核性添加反応（ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｉｃ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）により次のとおり合成した。
【００８１】
１．１２ｇ（７．５ｍｍｏｌ）のトリエチレンテトラミンを２５ｍＬのジクロロメタンに入れて５℃氷水で湯煎して３０分間かけて攪拌しながら溶解した。別個の反応容器で２０ｍＬのジクロロメタンに溶解した２．００ｇ（６．０ｍｍｏｌ）のオレオイルクロライド溶液を前記溶液に徐々に滴下させながら５℃で３時間かけて反応させた。反応が進行されながら生成された塩化水素による未反応トリエチレンテトラミン塩化塩が析出された。反応終了前に上層液を取ってエタノール：クロロホルム（２：１）の移動床で薄膜層クロマトグラフィー法（ｔｈｉｎ  ｌａｙｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＴＬＣ）により反応の有無を確認した。反応確認後に紙フィルターを利用して析出物を除去した。
【００８２】
以降、ろ過された上層液を回転蒸留濃縮装置（ｒｏｔａｒｙ  ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）を用いて溶媒を除去し、コールドトラップ（ｃｏｌｄ  ｔｒａｐ）が装着された真空ポンプで乾燥させた。ここに３５ｍＬのジエチルエーテル（ｄｉｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｅｒ）を入れて溶解した後、分液漏斗で１０ｍＬの０．５ＭのＮａＯＨ溶液で２回抽出した。
【００８３】
以降、上部の有機溶媒層を蒸留濃縮装置で加温、減圧蒸留して溶媒を完全に除去した後、薄膜層クロマトグラフィー法を用いて精製の有無を確認した。最終的に得られた生成物の構造およびオレオイル基の導入程度を水素核磁気共鳴分光器（１Ｈ  ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）を用いて確認し、その結果は図１に示した。収率は８９．１％であり、２．１当量のオレオイル基がトリエチレンテトラミンに導入された。
【００８４】
〔実施例２〕１，８−ジリノレオイルテトラエチレンペンタミド（１，８−ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌ  ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｅｎｅｐｅｎｔａｍｉｄｅ）
トリエチレンテトラミンとオレオイルクロライドの代わりに、６．２ｍｍｏｌのリノレオイルクロライド（ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）を４．１ｍｍｏｌのテトラエチレンペンタミン（ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｅｎｅｐｅｎｔａｍｉｎｅ）に添加した以外は、実施例１と同様な方法を経て１，８−ジリノレオイルテトラエチレンペンタミドの合成および精製を行った。最終的に得られた生成物の構造およびリノレオイル基の導入程度を水素核磁気共鳴分光器を用いて確認し、その結果は図２に示した。収率は７８．９％であり、１．９当量のリノレオイル基がテトラエチレンペンタミンに導入された。
【００８５】
〔実施例３〕１，４−ジミリストレオイルジエチレントリアミド（１，４−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｌｅｏｙｌ  ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｄｅ）
トリエチレンテトラミンとオレオイルクロライドの代わりに、８．１ｍｍｏｌのミリストレオイルクロライド（ｍｙｒｉｓｔｏｌｅｏｌｉｎｏｌｅｏｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）を１３．５ｍｍｏｌのジエチレントリアミン（ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ）に添加した以外は、実施例１と同様な方法を経て１，４−ジミリストレオイルジエチレントリアミドの合成および精製を行った。最終的に得られた生成物の構造およびミリストレオイル基の導入程度を水素核磁気共鳴分光器を用いて確認し、その結果は図３に示した。収率は８０．４％であり、２．１当量のミリストレオイル基がジエチレントリアミンに導入された。
【００８６】
〔実施例４〕１，１０−ジステアロイルペンタエチレンヘキサミド（１，１０−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ  ｐｅｎｔａｅｔｈｙｌｅｎｅｈｅｘａｍｉｄｅ）
トリエチレンテトラミンとオレオイルクロライドの代わりに、４．２ｍｍｏｌのステアロイルクロライド（ｓｔｅａｒｏｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）を６．９ｍｍｏｌのペンタエチレンヘキサミン（ｐｅｎｔａｅｔｈｙｌｅｎｅｈｅｘａｍｉｎｅ）に添加した以外は、実施例１と同様な方法を経て１，１０−ジステアロイルペンタエチレンヘキサミドの合成および精製を行った。最終的に得られた生成物の構造およびステアロイル基の導入程度を水素核磁気共鳴分光器を用いて確認し、その結果は図４に示した。収率は８７．１％であり、２．０当量のステアロイル基がペンタエチレンヘキサミンに導入された。
【００８７】
〔実施例５〕１，１０−ジオレオイルペンタエチレンヘキサミド（１，１０−ｄｉｏｌｅｏｙｌ  ｐｅｎｔａｅｔｈｙｌｅｎｅｈｅｘａｍｉｄｅ）
トリエチレンテトラミンの代わりに、１０．０ｍｍｏｌのペンタエチレンヘキサミンを使用した以外は、実施例１と同様な方法を経て１，１０−ジオレオイルペンタエチレンヘキサミドの合成および精製を行った。最終的に得られた生成物の構造およびオレオイル基の導入程度を水素核磁気共鳴分光器を用いて確認し、その結果は図５に示した。収率は８８．２％であり、２．１当量のオレオイル基がペンタエチレンヘキサミンに導入された。
【００８８】
〔製造例１〕モノメトキシポリエチレングリコール−ポリラクチド（ｍＰＥＧ−ＰＬＡ）ブロック共重合体（Ａ−Ｂ）の重合（数平均分子量５，０００−４，０００ダルトン）
１０ｇのモノメトキシポリエチレングリコール（ｍｏｎｏｍｅｔｈｏｘｙ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、分子量５，０００ダルトン）を１００ｍＬの二口丸低フラスコに入れ、減圧（１ｍｍＨｇ）下で５時間かけて１２０℃で真空乾燥した。反応フラスコに乾燥窒素を満たし、５０％濃度にトルエンに溶解されているオクチル酸スズ（Ｓｎ（Ｏｃｔ）２）反応触媒を注射器でＤＬ−ラクチド（ＤＬ−ｌａｃｔｉｄｅ）の０．３ｗｔ％（３０ｍｇ）注入した。反応混合物を３０分間かけて攪拌し、１２０℃で１時間かけて１ｍｍＨｇに減圧してトルエンを除去した。８．４６ｇの精製されたラクチドを添加し、混合物を６時間かけて１３０℃で加熱した。前記過程を通じて得られたｍＰＥＧ−ＰＬＡの数平均分子量は５，０００−４，０００ダルトンであり、図６の１Ｈ−ＮＭＲによりＡ−Ｂタイプと確認された。
【００８９】
〔製造例２〕ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールの重合（分子量５，０００−４，０００−５３０ダルトン）
製造例１で合成したｍＰＥＧ−ＰＬＡの５ｇを１００ｍｌの二口丸底フラスコに入れ、減圧下で３時間かけて１２０℃で真空乾燥した。ここに３ｍＬのトルエンに溶解されている３５．５ｍｇ（６４５μｍｏｌ）のトコフェロールサクシニルクロライド（ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ  ｓｕｃｃｉｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）を投入して１００℃で８時間かけて減圧条件で反応させた。得られた高分子をジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）に溶かし、ヘプタンに沈殿させて精製を行った。精製された高分子は真空乾燥して、白色の粉粒子形態を得た。収率は９４．２％であり、図７の１Ｈ−ＮＭＲ分析で純度は９７．０％以上であり、トコフェロール導入率は９９．９％であった。
【００９０】
〔製造例３〕ＡＣ−コレステロール（３−ｂｅｔａ［Ｎ−（ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）ｃａｒｂａｍｏｙｌ］ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）の合成
本発明の陽イオン性脂質と細胞伝達効能を比較するために、公知となったＡＣ−コレステロール陽イオン性脂質を次のとおり合成した。
【００９１】
１ｇ（２．２３ｍｍｏｌ）のコレステリルクロロホメート（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）を２０ｍｌのクロロホルムに溶かした。コレステリルクロロホメート溶液を４℃の３０ｍｌのクロロホルムに希釈されている２０倍当量のエチレンジアミン溶液に徐々に入れた後、常温で３時間かけて反応させた。反応終了後に蒸留濃縮装置を用いて溶媒を除去し、再び少量のクロロホルムに溶かした後、ＮａＣｌ飽和溶液とＮａＣＯ３で抽出してクロロホルム層を回収した。
【００９２】
以降、蒸留濃縮装置で溶媒を除去し、クロロホルムに再溶解させた後、シリカゲルクロマトグラフィー（ｓｉｌｉｃａ−ｇｅｌ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で分離した。クロロホルム：メタノール＝９：１（ｖ／ｖ）で溶出した分画に塩酸溶液をコレステリルクロロホメートの５０倍当量で添加し、単一相が形成されるまでメタノールを少しずつ添加してＡＣ−コレステロール塩酸塩を形成した。
【００９３】
蒸留濃縮装置で溶媒を完全に除去して得たＡＣ−コレステロール塩酸塩を６０℃のメタノールに溶かした後、４℃に冷却して再結晶を得た。収率は５１％であった。水素核磁気共鳴分光器を用いてＡＣ−コレステロールの合成の有無を確認し、その結果は図８に示した。
【００９４】
〔実施例６〕１，６−ジオレオイルトリエチレンテトラミドを含有する陽イオン性リポソームの製造
【００９５】
〔実施例６−１〕陽イオン性脂質を含む陽イオン性リポソームの製造
実施例１で合成した陽イオン性脂質である１，６−ジオレオイルトリエチレンテトラミド１．３ｍｇと細胞融合性リン脂質であるＤＯＰＥ（Ａｖａｎｔｉ  ｐｏｌａｒ  ｌｉｐｉｄｓ）１．７ｍｇをそれぞれ１ｍＬのクロロホルムに溶かした後、一口丸底フラスコで混合した後、回転蒸留濃縮装置（ｒｏｔａｒｙ  ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）でクロロホルムを低速で除去して薄い脂質フィルムを製造した。得られた脂質フィルムにリン酸緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）１ｍＬを添加し、３７℃で３分間かけて攪拌して前記脂質からなるリポソームを製造した。得られたリポソーム溶液を空隙の大きさ０．２ｕｍのポリカーボネート膜が装着された押出機（ｅｘｔｒｕｄｅｒ）に数回反復通過させて粒子の大きさが均一なリポソームを製造した。このように製造された陽イオン性リポソームは使用する前まで４℃で保管した。
【００９６】
〔実施例６−２〕ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡの包含
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ血清培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１７．５μＬに実施例６−１で製造された陽イオン性リポソーム溶液０．５μＬを加えて混合した。前記リポソーム溶液にＳＴ  Ｐｈａｒｍ株式会社（韓国）で購入した下記の配列番号１および２のＧＦＰ  ｓｉＲＮＡの２μＬ（３４ｎｇ／μＬ）を加えて攪拌機で混合した。前記リポソーム剤型は２０分間室温で保管後、細胞株培養液に加えた。
ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ（ＳＴ  Ｐｈａｒｍ株式会社、韓国）：
センス鎖：５’−ＧＣＡＡＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵｄＴｄＴ−３’（配列番号１−ｄＴｄＴ）
アンチセンス鎖：５’−ＡＡＣＵＵＣＡＧＧＧＵＣＡＧＣＵＵＧＣｄＴｄＴ−３’（配列番号２−ｄＴｄＴ）
【００９７】
〔実施例７〕１，６−ジオレオイルトリエチレンテトラミドを含有するｍＰＥＧ−ＰＬＡミセルの製造
ｓｉＲＮＡの陰イオン電荷に対する陽イオン性脂質の陽イオン電荷比率（Ｎ／Ｐ比率）を６にして次のとおりｓｉＲＮＡ−陽イオン性脂質複合体を含有するミセルを製造した。
【００９８】
一口丸底フラスコで実施例１で製造した１，６−ジオレオイルトリエチレンテトラミド３３μｇにクロロホルム１００μＬおよびエタノール１００μＬを混合して室温で完全に溶かした後、実施例６−２の５μｇのｓｉＲＮＡを含む水溶液１００μＬを添加した。ここに蒸溜水１００μＬとクロロホルム１００μＬを加えて相分離させた。相分離の後、クロロホルム層のみを回収してｓｉＲＮＡ−陽イオン性脂質複合体を得た。
【００９９】
製造例１のｍＰＥＧ−ＰＬＡの９ｍｇとＤＯＰＥの３４μｇを入れて６０℃で５分間かけて攪拌した。この時、ｍＰＥＧ−ＰＬＡに対するｓｉＲＮＡ／１，６−ジオレオイルトリエチレンテトラミド複合体の比率が０．４２ｗｔ％になるようにした。混合物を蒸留濃縮装置で減圧蒸留して溶媒を除去した。フラスコに蒸溜水３００μＬを加えて、柔らかく振って溶かすことによって高分子ミセル伝達体を製造した。
【０１００】
〔実施例８〕１，６−ジオレオイルトリエチレンテトラミドを含有するｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールミセルの製造
実施例７と同様な方法を用い、ただし、ｍＰＥＧ−ＰＬＡの代わりに、製造例２のｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールを使用してｓｉＲＮＡ／１，６−ジオレオイルトリエチレンテトラミド／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールミセル伝達体を製造した。この時、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールに対するｓｉＲＮＡ／１，６−ジオレオイルトリエチレンテトラミド複合体の比率が０．４２ｗｔ％になるように混合した。この混合物を回転蒸留濃縮装置で減圧蒸留して溶媒を除去した。フラスコに蒸溜水３００μＬを加えて、柔らかく振って溶かすことによって高分子ミセル伝達体を製造した。
【０１０１】
〔比較例１〕ＡＣ−コレステロールを含有するｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールミセルの製造
本発明の陽イオン性脂質剤型と細胞伝達効能を比較するために、実施例６−２の５μｇのｓｉＲＮＡに対してＮ／Ｐ比率が６になるように製造例３で合成されたＡＣ−コレステロール４６μｇを使用して実施例７と同様な方法でｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールミセルを製造した。この時、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロールに対するｓｉＲＮＡ／ＡＣ−コレステロール複合体の比率が０．５７ｗｔ％になるように混合した。
【０１０２】
〔実施例９〕１，６−ジオレオイルトリエチレンテトラミドを含有する陽イオン性エマルジョンの製造
実施例１で製造した陽イオン性脂質である１，６−ジオレオイルトリエチレンテトラミド５．５ｍｇに０．１倍モル比率のＴｗｅｅｎ−８０の１．０ｍｇを混合した。ここにリン酸緩衝溶液１０ｍＬを添加し、均質器（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）を利用して常温で約２分間かけて均質化させて油相が水相内に分散した水中油型（Ｏ／Ｗ型）陽イオン性エマルジョンを製造した。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ血清培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１５．５μＬに前記陽イオン性エマルジョン溶液２．５μＬを加えて混合した。ここに実施例６−２のＧＦＰ  ｓｉＲＮＡの２μＬ（３４ｎｇ／μＬ）を加えて攪拌機で混合してエマルジョンを得た。前記エマルジョン剤型は、２０分間室温で保管後、細胞株培養液に加えた。
【０１０３】
〔実験例１〕蛋白質発現の確認を通じた陽イオン性脂質含有伝達体のｓｉＲＮＡ伝達効能の評価
実施例６〜９および比較例１で製造された剤型に対して次のとおり緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ、Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を安定的に発現するＡ５４９  ＧＦＰ細胞株に処理し、ＧＦＰ蛋白質の発現程度を確認した。
【０１０４】
９６ウェル細胞培養板にウェル当たり１×１０４個の細胞を分株し、２４時間後に各ウェルの細胞が６０〜７０％程度均一に成長したことを確認した後、ウェル内の培地を除去し最終体積１０％の血清を含有する新たな培地を８０μＬずつ添加した。ここに１５ｎＭの濃度にｓｉＲＮＡが含有されている実施例６〜９および比較例１の組成物２０μＬ溶液を前記細胞培養培地にそれぞれ加え、リン酸緩衝液のみを処理した対照群と共に３７℃の５％ＣＯ２培養器で２４時間かけて培養後、培地を交換した
【０１０５】
再び２４時間後に、各ウェルの細胞培養培地を除去後、リン酸緩衝溶液で３回洗浄した。各ＧＦＰ  ｓｉＲＮＡ伝達体によるＧＦＰ蛋白質の発現抑制程度を評価するためにマイクロプレート検出器（ＢｉｏＴｅｋ、Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ  Ｍｕｌｔｉ−ｍｏｄｅ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）を用いてＧＦＰ蛍光を測定（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ波長：４８５／２０ｎｍ、ｅｍｉｓｓｉｏｎ波長：５２８／２０ｎｍ）した。対照群としてリン酸緩衝液のみを処理したものを評価した。ＧＦＰ蛍光を測定した後に細胞酵素の活性度を測定するスルホローダミンＢ（ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ）試薬による方法（ＳＲＢ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙ）で処理後、５４０ｎｍでＵＶ吸光度を測定して細胞生存率を求めた。ＧＦＰ蛍光値を細胞生存率で割って補正した結果を下記表１に示した。また、商業的伝達体製品であるリポフェクタミン（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）と比較試験した。
【０１０６】
【表１】
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【０１０７】
前記表から、本発明の実施例で製造された剤型は非常に低いｓｉＲＮＡ投与濃度でもｓｉＲＮＡを効率的に細胞内に伝達して標的蛋白質であるＧＦＰの発現を３５〜５０％程度抑制したことが分かる。また、リポフェクタミンと類似するか、または向上した水準でＧＦＰ蛋白質の発現を抑制しながらも細胞生存率が一層高いことが分かる。これは本発明の組成物がリポフェクタミンよりも毒性対比活性が優秀なことを意味する。同時に、比較例１よりも約３０％のｓｉＲＮＡ伝達効能が向上したことが分かる。
【０１０８】
〔実験例２〕ｍＲＮＡ発現の確認を通じた陽イオン性脂質含有伝達体のｓｉＲＮＡ伝達効能の評価
本発明の実施例６〜９および比較例１の剤型に対して、細胞株に対するｓｉＲＮＡ伝達効能をｍＲＮＡ水準でそれぞれ確認した。各伝達体を実験例１と同様な条件で処理し、ｓｉＲＮＡ投与濃度を５ｎＭおよび１５ｎＭに異にしてｑＲＴ−ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を用いて次のような方法でＧＦＰ  ｍＲＮＡ発現量を測定した。
【０１０９】
細胞に各伝達体処理４８時間後、各ウェルの細胞培養メディアを除去した後、リン酸緩衝溶液で３回洗浄した。Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞内に存在する全体リボ核酸（ＲＮＡ）を分離し、分離されたＲＮＡは、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｃＤＮＡに逆転写（ＲＴ）した。逆転写されたｃＤＮＡを利用してＰＣＲを行った。これと共に、同様な方法で前記の分離されたＲＮＡからＧｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）  ｍＲＮＡを増幅してＧＦＰ  ｍＲＮＡの発現量を補正して定量した。対照群は、リン酸緩衝液のみを処理したものである。定量した結果を下記表２に示した。
【０１１０】
【表２】
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【０１１１】
表２に示されているように、本発明の実施例で製造された剤型は、ｓｉＲＮＡ投与量に比例してＧＦＰ  ｍＲＮＡの量が減少し、５ｎＭのような低いｓｉＲＮＡ濃度でも約５０％のＧＦＰ  ｍＲＮＡ発現抑制効能を示し、特に１５ｎＭではＧＦＰ  ｍＲＮＡを最大９５％以上抑制した。表２の結果から、本発明組成物の遺伝子発現抑制水準がリポフェクタミンと類似し、特に５ｎＭの低濃度ではリポフェクタミンよりも約２倍以上優秀なことが分かる。これは実施例の組成物がリポフェクタミンよりも効率的に標的ｍＲＮＡの発現を抑制させることを意味する。また、比較例１の結果と比較すると、５ｎＭのｓｉＲＮＡ低濃度では本発明の陽イオン性脂質を使用することによって、ｓｉＲＮＡ伝達効能が１０倍以上向上したことが分かる。したがって、本発明の陽イオン性脂質が既存の陽イオン性脂質よりも少量のｓｉＲＮＡを使用しても高いｓｉＲＮＡ伝達効能を得ることができることが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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