(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
（ａ）ＳＮＡＲＥタンパク質を切断することが可能である非細胞毒性プロテアーゼ；
（ｂ）該非細胞毒性プロテアーゼを、哺乳動物細胞のエンドソーム内から、そのエンドソーム膜を横断し、哺乳動物細胞のサイトゾル中にトランスロケーションさせることが可能であるトランスロケーションペプチド；及び
（ｃ）上皮増殖因子（ＥＧＦ）ムテイン、それにおいて、
該ＥＧＦムテインは、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９５%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして該ＥＧＦムテインは、ＥＧＦ受容体に結合する配列番号１１の結合親和性を維持している、
を含むポリペプチド。
【請求項２】
ポリペプチドが、配列番号３７、６４、６６及び６８からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９０%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列同一性が、少なくとも９５％である、請求項２記載のポリペプチド。
【請求項４】
非細胞毒性プロテアーゼが、クロストリジウム神経毒プロテアーゼ又はナイセリアＩｇＡプロテアーゼを含む、請求項１〜３のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項５】
トランスロケーションペプチドが、クロストリジウム神経毒トランスロケーションドメインを含む、請求項１〜４のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項６】
ポリペプチドが、二鎖ポリペプチドとして存在し、非細胞毒性プロテアーゼが、ジスルフィド結合によりトランスロケーションペプチドに連結される、請求項１〜５のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項８】
宿主細胞において、請求項７記載の核酸を発現させることを含む、請求項１〜６のいずれか一項記載のポリペプチドを調製するための方法。
【請求項９】
宿主細胞が、大腸菌である、ポリペプチドを調製するための請求項８記載の方法。
【請求項１０】
炎症を抑制する際での使用のための、請求項１〜６のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１１】
患者において粘液分泌過多及び／又は粘液分泌過多に関連する状態もしくは障害を抑制する際での使用のための、請求項１〜６のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１２】
内分泌新生物及び／又は神経内分泌障害を抑制する際での使用のための、請求項１〜６のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１３】
神経内分泌腫瘍を抑制する際での使用のための、及び／又は結腸直腸癌、前立腺癌、乳癌、又は肺癌を抑制する際での使用のための、請求項１〜６のいずれか一項記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非細胞毒性融合タンパク質、ならびに粘液分泌過多、炎症、神経内分泌障害、及び神経内分泌腫瘍などの状態を抑制するための治療法としてのその使用に関連する。
【０００２】
非細胞毒性プロテアーゼは、プロテアーゼの別個の群であり、細胞機能を無能力にすることにより標的細胞に作用する。重要なことに、非細胞毒性プロテアーゼは、それらが作用する標的細胞を殺さない。非細胞毒性プロテアーゼの最もよく知られている例の一部は、クロストリジウム神経毒及びＩｇＡプロテアーゼを含む。
【０００３】
非細胞毒性プロテアーゼが、ＳＮＡＲＥタンパク質（例、ＳＮＡＰ−２５、ＶＡＭＰ、又はシンタキシン）として公知の細胞内輸送タンパク質をタンパク分解性に切断することにより作用する。Gerald K (2002) "Cell and Molecular Biology" (4th edition) John Wiley & Sons, Inc.を参照のこと。頭字語ＳＮＡＲＥは用語Soluble NSF Attachment Receptor（可溶性ＮＳＦ付着受容体）に由来し、ここでＮＳＦはN-ethylmaleimide-Sensitive Factor（Ｎエチルマレイミド感受性因子）を意味する。ＳＮＡＲＥタンパク質は、細胞内小胞形成、ひいては細胞からの小胞輸送を介した分子の分泌に不可欠である。したがって、一旦所望の標的細胞に送達されると、非細胞毒性プロテアーゼは標的細胞からの細胞分泌を阻害することが可能である。
【０００４】
ＳＮＡＲＥタンパク質の遍在性の性質に照らして、非細胞毒性プロテアーゼは、広範囲の治療において成功裏に用いられてきた。例えば：「疼痛の処置」（ＷＯ９６／３３２７４を参照のこと）；粘液分泌過多状態、例えばＣＯＰＤ、喘息などの処置（ＷＯ００／１０５９８を参照のこと）；非神経性状態、例えば内分泌状態、外分泌状態、免疫学的状態、心臓血管状態、骨状態などの処置（ＷＯ０１／２１２１３を参照のこと）；神経学的障害、例えばパーキンソン病などの処置（ＵＳ  ６，６２０，４１５、ＵＳ  ６，３０６，４０３を参照のこと）；神経精神障害の処置（ＵＳ２００４／０１８００６１、ＵＳ２００３／０２１１１２１を参照のこと）；内分泌障害の処置（ＵＳ  ６，８２７，９３１を参照のこと）；甲状腺障害の処置（ＵＳ  ６，７４０，３２１を参照のこと）；糖尿病の処置（ＵＳ  ６，３３７，０７５、ＵＳ  ６，４１６，７６５を参照のこと）；及び膵臓障害の処置（ＵＳ  ６，２６１，５７２、ＵＳ  ６，１４３，３０６を参照のこと）など。上記の刊行物の各々が、その参照によりその全体において本明細書に組み入れられる。
【０００５】
一般的に、非細胞毒性プロテアーゼの投与は、十分に許容される。しかし、一部の用途における投与は、有益な効果を得るために要求されるより大きな用量のために困難でありうる。より大きな用量によって、非所望の抗原応答の可能性が増加しうる。同様に、より大きな用量は製造コストの増加に関連する。
【０００６】
任意の他の薬物物質と共通して、治療投与範囲が存在し、それによって安全で、効果的な治療の下限及び上限が特定される。しばしば、上限は、薬物処置の非所望の（例、潜在的に有害な）副作用を招くオフターゲット効果の増加する有意性により決定される。非細胞毒性プロテアーゼの場合において、これは、オフターゲット細胞における細胞分泌の麻痺を招き、それは次に致死的でありうる。
【０００７】
ヒト及び他の哺乳動物の治療的処置における非細胞毒性プロテアーゼ分子の使用には、ますます関心が集まっている。これに関して、関心が集中する１つの分野は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）再標的化非細胞毒性プロテアーゼの使用にある。これらの治療法が、粘液分泌（ＷＯ００／１０５９８を参照のこと）及び炎症（ＵＳ１１／８０６，６４８を参照のこと）を低下させる際に有用であることが示されている。本発明者らは、また、ＥＧＦ再標的化非細胞毒性プロテアーゼが、神経内分泌障害、及び神経内分泌腫瘍を抑制する際に有用であることを見い出している。
【０００８】
しかし、ＥＧＦベースの非細胞毒性プロテアーゼの治療用途に関連する１つの問題は、有効性には比較的高い投与量レベルの使用が要求されうることである。上記の通り、これは、増加する製造コストの不足及び／又は潜在的な免疫原性問題のために望ましくない。
【０００９】
このように、当技術分野において、非細胞毒性プロテアーゼの効力を維持しながら、投与量サイズを低下させる及び／又は非所望の抗原応答を低下させるための手段を開発するニーズがある。このニーズは、非細胞毒性プロテアーゼの増大する使用により悪化され、それによって代替物及び／又は改善された治療用分子を開発するための医薬品産業の部分に対する絶え間なく増加するニーズが置かれる。
【００１０】
本発明は、上記のニーズに対処し、上記の問題の１つ又は複数を解決する。より詳細には、本発明は、代替物及び／又は改善されたＥＧＦ再標的化非細胞毒性プロテアーゼを提供し、それらは、種々の臨床的及び治療的用途、特に、炎症、粘液分泌関連障害、例えば喘息及びＣＯＰＤなど、ならびに神経内分泌障害、及び神経内分泌腫瘍を処置するために有用である。
【００１１】
より詳細には、本発明の第１の局面は、以下：
ａ．ＳＮＡＲＥタンパク質を切断することが可能である非細胞毒性プロテアーゼ；
ｂ．前記非細胞毒性プロテアーゼを、哺乳動物細胞のエンドソームから、そのエンドソーム膜を横断し、哺乳動物細胞のサイトゾル中にトランスロケーションさせることが可能であるトランスロケーションペプチド；及び
ｃ．上皮増殖因子（ＥＧＦ）ムテイン、それにおいて、
（ｉ）前記ＥＧＦムテインは、天然に存在するヒトＥＧＦのアミノ酸配列（配列番号１）と少なくとも６５%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び、それにおいて、前記ＥＧＦムテインのアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸位置１５〜１７又は４８〜５１より選択される位置での少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、又は置換により配列番号１のアミノ酸配列とは異なる；ならびに
（ｉｉ）前記ＥＧＦムテインのアミノ酸配列は、配列番号１における位置６、１４、２０、３１、３３、及び４２に出現する全て６つのシステインアミノ酸残基を保持するアミノ酸配列骨格を有する
を含むポリペプチドを提供する。
【００１２】
任意の理論に拘泥することを望まないが、本発明者らは、ＥＧＦが、結合反応を介してその天然受容体（即ち、ＥＧＦ受容体；ＥｒｂＢ１としても公知）に結合し、それは、ＥＧＦ分子上に存在する２つの異なる結合界面、即ち、配列番号１の位置３１〜４０でのアミノ酸残基の配列により提供される第１の結合界面（即ち、結合界面１）、及び配列番号１の位置４１〜４５でのアミノ酸残基の配列により提供される第２の結合界面（即ち、結合界面２）を含むと考える。これら２つの結合界面は、開裂のいずれかの側に結合すると考えられ、それは、ＥＧＦ受容体中に存在し、その中にＥＧＦ分子の小さな部分（前縁（Ｌｅａｄｉｎｇ  Ｅｄｇｅ）という）が次に挿入される。前縁は、配列番号１の位置４８〜５１でのアミノ酸残基の配列により提供され、配列番号１の位置１５〜１７により提供される足場支持配列を含む。この結合配置を図２に例示し、それにおいて受容体のＵ型開裂が図２の上側及び左手側に、開裂点の「オープン」フェイスを図２の中央に向かって位置付ける。
【００１３】
より詳細には、本発明者らは、ＥＧＦの前縁（配列番号１の位置１５〜１７及び４８〜５１）内に存在する「巨大（ｂｕｌｋｙ）」アミノ酸残基によって、ＥＧＦベースの非細胞毒性融合分子のＥＧＦ受容体活性化能力が低下する。このように、前縁内に存在するアミノ酸残基の全サイズを低下させることにより、本発明者らは新たなＥＧＦムテインを提供しており、それは、対応する野生型ＥＧＦ融合物と比較した場合、本発明のＥＧＦ非細胞毒性融合分子に対する改善された活性化特性を与える。
【００１４】
一実施態様において、ＥＧＦムテインを、前縁に存在する１つ又は複数の「巨大」アミノ酸残基の置換又は欠失により改変し（配列番号１と比較し）、それにおいて、前記「巨大」アミノ酸残基は、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、又はチロシン（Ｙ）より選択される。例として、適した置換基を以下からなる群より選択してもよい：ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、及びメチオニン（Ｍ）。好ましい実施態様において、前記置換又は欠失は、位置４８〜５１、好ましくは位置４９及び／又は位置５０である（配列番号１と比較して）。これに関して、位置４９を、好ましくは、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、又はバリン（Ｖ）に、好ましくはロイシン（Ｌ）に置換し（配列番号１と比較して）；及び／又は位置５０を、好ましくは、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、又はメチオニン（Ｍ）に、好ましくはアラニン（Ａ）に置換する（配列番号１と比較して）。
【００１５】
一実施態様において、ＥＧＦムテインを、前縁の位置１５〜１７に存在する１つ又は複数のアミノ酸残基の置換又は欠失により別々に又はさらに改変してもよい（配列番号１と比較して）。この領域内での改変は、例えば、１つ又は複数の追加の分子間又は分子内水素結合の導入により、前縁の安定性を増加させると考えられる。例として、適した置換基を以下からなる群より選択してもよい：アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、及びチロシン（Ｙ）。これに関して、位置１６を、好ましくは、アスパラギン（Ｎ）又はグルタミン（Ｑ）に置換する（配列番号１と比較して）。
【００１６】
上記の前縁改変に加えて、ＥＧＦムテインを、位置２３〜２９に存在する１つ又は複数のアミノ酸残基の置換又は欠失によりさらに改変してもよい（配列番号１と比較して）。これらの位置は結合界面１（上で考察する）に近く、ＥＧＦムテインに追加の安定性を提供する助けとなる。例として、適した置換基を以下からなる群より選択してもよい：グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、メチオニン（Ｍ）、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、及びヒスチジン（Ｈ）。これに関して、好ましい置換基を位置２４〜２８の１つ又は複数に導入する。例えば、位置２４を、好ましくは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、又はメチオニン（Ｍ）に、好ましくはグリシン（Ｇ）に置換する（配列番号１と比較して）；及び／又は、位置２５を、好ましくは、スレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、又はメチオニン（Ｍ）に、好ましくはスレオニン（Ｔ）に置換する（配列番号１と比較して）；及び／又は、位置２８を、好ましくは、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、又はヒスチジン（Ｈ）に、好ましくはアルギニン（Ｒ）に置換する（配列番号１と比較して）。
【００１７】
上記の前縁改変に加えて、及び、場合により、位置２３〜２９での上記の改変に加えて、ＥＧＦムテインを、位置３〜５に存在する１つ又は複数のアミノ酸残基の置換又は欠失によりさらに改変してもよい（配列番号１と比較して）。これらの位置は、ＥＧＦムテインが、典型的に、融合タンパク質のより大きな体に融合される場所に近く、ＥＧＦムテインに追加の安定性を提供する助けとなる。例として、適した置換基を以下からなる群より選択してもよい：プロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、及びヒスチジン（Ｈ）。これに関して、位置４を、好ましくは、プロリン（Ｐ）に置換し（配列番号１と比較して）、及び／又は位置５を、好ましくは、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、又はヒスチジン（Ｈ）に、好ましくはリジン（Ｋ）に置換する（配列番号１と比較して）。上記の前縁改変に加えて、及び、場合により、位置２３〜２９及び／又は位置３〜５での上記の改変に加えて、ＥＧＦムテインを、位置１０〜１２に存在する１つ又は複数のアミノ酸残基の置換又は欠失によりさらに改変してもよい（配列番号１と比較して）。これらの位置は、ＥＧＦムテインが、典型的に、融合タンパク質のより大きな体に融合される場所に近く、ＥＧＦムテインに追加の安定性を提供する助けとなる。例として、適した置換基を以下からなる群より選択してもよい：グルタミン酸（Ｅ）及びアスパラギン酸（Ｄ）。これに関して、位置１１を、好ましくは、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）に、好ましくはグルタミン酸に置換する（配列番号１と比較して）。上記の前縁改変に加えて、及び、場合により、位置２３〜２９及び／又は位置３〜５及び／又は位置１０〜１２での上記の改変に加えて、ＥＧＦムテインを、位置３７〜３９に存在する１つ又は複数のアミノ酸残基の置換又は欠失によりさらに改変してもよい（配列番号１と比較して）。これらの位置は、結合界面１及び結合界面２（上で考察する）の両方に近く、ＥＧＦムテインに追加の安定性を提供する助けとなる。例として、適した置換基を以下からなる群より選択してもよい：バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、及びイソロイシン（Ｉ）。これに関して、位置３８を、好ましくは、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、又はイソロイシン（Ｉ）に、好ましくはバリン（Ｖ）に置換する（配列番号１と比較して）。
【００１８】
本発明者らは、ＥＧＦ分子の活性化能力（その天然ＥＧＦ受容体について）が、ＥＧＦ分子がずっとより大きな融合タンパク質の部分として存在する場合、そのような分子を非細胞毒性融合タンパク質における標的成分として使用した場合と同様に、有意に低下することに注目してきた。この問題は、本発明により、１つ又は複数の突然変異の導入により取り組まれ、それによって、それがより大きな非細胞毒性融合タンパク質の部分として存在する場合、前記ＥＧＦ分子の活性化能力が増加する。これは、次に、本発明のポリペプチドの細胞標的効率を改善させ、より低い投与量計画を用いてもよいことを意味する。後者によって、製造コストが低下し、本発明のポリペプチドに対する非所望の患者関連の抗原効果が最小限となる。
【００１９】
本発明のＥＧＦムテインが、ＥＧＦ（例、ＥｒｂＢ）受容体について改善された活性化能力を有することを確認することがルーチンである。例として、本発明者らは実施例４＆５を参照する。
【００２０】
一実施態様において、本発明のＥＧＦ融合物によって、４もしくは２nMより大きい、又は０．４もしくは０．２nMより大きい、又は０．０４もしくは０．０２nMより大きいＥＧＦ受容体（例、ＥｒｂＢ１）に対する結合親和性が実証される。
【００２１】
別の実施態様において、本発明のＥＧＦ融合物によって、６  ｐＥＣ５０より大きい、又は７  ｐＥＣ５０より大きい、又は８  ｐＥＣ５０より大きいＥＧＦ受容体（例、ＥｒｂＢ１）の結合活性化が実証される。適したアッセイの例を実施例９及び１０に提供する。
【００２２】
ＥＧＦムテインは、天然に存在するヒトＥＧＦ（配列番号１）に対して少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換、又は挿入を含む（天然に存在するヒトＥＧＦの６つのシステインアミノ酸残基のいずれもそのように変化されないという条件で）。好ましい実施態様において、ＥＧＦムテインは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５のそのような欠失、置換、又は挿入を含む。前記改変の内、置換が最も好ましい。なぜなら、それらは二次又は三次構造に対してより少ない効果を有するからである。欠失又は挿入の場合において、ＥＧＦムテインは、好ましくは、最大４又は５、より好ましくは最大２又は３、特に好ましくは最大１のそのような欠失及び／又は挿入を有する。
【００２３】
一実施態様において、ＥＧＦムテインは、天然に存在するヒトＥＧＦ（配列番号１）に対してわずか１５、１４、又は１３、好ましくはわずか１２、１１、又は１０のアミノ酸の欠失、置換、又は挿入を含む。前記改変の内、置換が最も好ましい。なぜなら、それらは二次又は三次構造に対してより少ない効果を有するからである。欠失又は挿入の場合において、ＥＧＦムテインは、好ましくは、最大４又は５、より好ましくは最大２又は３、特に好ましくは最大１のそのような欠失及び／又は挿入を有する。
【００２４】
一実施態様において、ＥＧＦムテインは少なくとも３７のアミノ酸残基を含む（又はからなる）。例えば、この長さを含むＥＧＦムテインは、天然に存在するｈＥＧＦ（例、配列番号１）の６つのシステインコンセンサス配列骨格を厳密に模倣する一次アミノ酸配列を有する。そのような３７アミノ酸配列は、位置１、９、１５、２６、２８、及び３７（Ｎ末端からＣ末端の方向における）でのシステイン残基により特徴付けられる。別の実施態様において（好ましくは、上で定義する骨格配列を含む）、ＥＧＦムテインは、少なくとも３９又は４１、好ましくは少なくとも４３又は４５、より好ましくは少なくとも４７又は４９の連続アミノ酸残基を含む。別の実施態様において、ＥＧＦムテインは、少なくとも５１、５２、又は５３のアミノ酸残基を含む。
【００２５】
一実施態様において、ＥＧＦムテインは、それが、位置：Ｄ３Ｓ４Ｅ５、Ｐ７Ｌ８Ｓ９、Ｇ１２Ｙ１３、Ｌ１５Ｈ１６、Ｍ２１Ｙ２２Ｉ２３Ｅ２４Ａ２５、Ｉ３８Ｇ３９Ｅ４０Ｒ４１、Ｑ４３Ｙ４４Ｒ４５Ｄ４６Ｌ４７Ｋ４８Ｗ４９Ｗ５０Ｅ５１Ｌ５２（位置及び文字は、天然に存在するヒトＥＧＦ（配列番号１）の１文字アミノ酸コードを指す）のいずれかに少なくとも１つ（又は複数、上で詳述する通り）の欠失、置換、又は挿入を含む点で、天然に存在するヒトＥＧＦとは異なる。
【００２６】
例えば：Ｄ３を、Ｇ、Ｎ、Ｙ、Ａ、又はＦを用いて置換できる；Ｓ４を、Ｔ、Ｐ、Ｆ、Ｑ、又はＲを用いて置換できる；Ｅ５を、Ｇ、Ｋ、又はＱを用いて置換でき、Ｐ７を、Ｓを用いて置換でき、Ｌ８を、Ｐ、Ｓ、Ｒ、又はＱを用いて置換できる；Ｓ９を、Ｐにより置換できる；Ｇ１２を、Ｅ、Ｄ、又はＱを用いて置換できる；Ｙ１３を、Ｈ又はＷを用いて置換できる；Ｌ１５を、Ａ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、又はＶにより置換できる；Ｈ１６を、Ｑ、Ｎ、Ａ、Ｅ、Ｄ、又はＹを用いて置換でき、Ｍ２１を、Ｖ、Ｒ、又はＫを用いて置換できる；Ｙ２２を、Ｈを用いて置換でき、Ｉ２３を、Ｖ又はＬを用いて置換できる；Ｅ２４を、Ｋ、Ｇ、又はＶを用いて置換できる；Ａ２５を、Ｓ、Ｔ、又はＱを用いて置換できる；Ｉ３８を、Ｔ、Ｓ、Ａ、Ｎ、Ｌ、又はＶを用いて置換できる；Ｇ３９を、Ｅ、Ｑ、Ｋ、Ｄ、Ｉ、Ｌ、又はＦを用いて置換できる；Ｅ４０を、Ｄを用いて置換できる；Ｒ４１を、Ｄにより置換できる；Ｑ４３を、Ｅを用いて置換できる；Ｙ４４を、Ｈ又はＴを用いて置換できる；Ｒ４５を、Ｇ、Ｑ、又はＰにより置換できる；Ｒ４６を、Ｇにより置換できる；Ｌ４７を、Ｇ、Ｄ、又はＲにより置換できる；Ｋ４８を、Ｒ、Ｔ、又はＤを用いて置換できる；Ｗ４９を、Ｒにより置換できる；Ｗ５０を、Ｌにより置換できる；Ｅ５１を、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｋ、又はＹにより置換できる；及び／又は、Ｌ５２を、Ｐ、Ｒ、又はＴにより置換できる。
【００２７】
加えて又は別々に、Ｑ１８を、Ｅ、Ｑ、Ｋ、Ｆ、又はＬを用いて置換できる；及び／又は、Ｖ３５を、Ｅを用いて置換できる；Ｄ１７を、Ｇにより置換できる；Ｖ１９を、Ａにより置換できる。
【００２８】
加えて又は別々に、Ｎ１を、Ｓ、Ｋ、Ｙ、Ｔ、又はＨにより置換できる；Ｓ２を、Ｇ又はＲにより置換できる；Ｅ５を、Ｇ又はＫにより置換できる；Ｈ１０を、Ｙにより置換できる；Ｄ１１を、Ｎ、Ｓ、又はＥにより置換できる；Ｌ２６を、Ｖにより置換できる；Ｋ２８を、Ｒ、Ｓ、又はＴにより置換できる；Ａ３０を、Ｖにより置換できる；Ｎ３２を、Ｓにより置換できる；Ｖ３４を、Ａにより置換できる；Ｖ３５を、Ａにより置換できる。
【００２９】
一実施態様において、ＥＧＦムテインは、それが、位置Ｇ１２Ｙ１３、Ｈ１６（位置及び文字は、天然に存在するヒトＥＧＦ（配列番号１）の１文字アミノ酸コードを指す）のいずれかに少なくとも１つ（又は複数、上で詳述する通り）の欠失、置換、又は挿入を含む点で、天然に存在するヒトＥＧＦとは異なる。例として、Ｇ１２を、アミノ酸残基、例えばグルタミン（Ｑ）又はアスパラギン（Ｎ）などにより置換してもよい。同様に、Ｙ１３を、残基、例えばトリプトファン（Ｗ）又はフェニルアラニン（Ｆ）などにより置換してもよく、Ｈ１６を、残基、例えばアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、又はスレオニン（Ｔ）などにより置換してもよい。
【００３０】
一実施態様において、ＥＧＦムテインは、配列番号６〜３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４９、５０、５２、５４、５６、５８、及び６０のいずれかに記載されるアミン酸配列を含む。この実施態様は、それと少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、又は少なくとも９７%の配列同一性を有するそのバリアントを包含する。ただし、前記バリアントが、常に、野生型ヒトＥＧＦ（配列番号１）と比較した場合、前記配列番号において例示される特定のアミノ酸置換を保持する。この実施態様は、また、それと少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、又は少なくとも９７%の配列同一性を有するそのバリアントを包含する。ただし、前記バリアントが、常に、野生型ヒトＥＧＦ（配列番号１）と比較した場合、前記配列番号において例示される特定のアミノ酸置換の保存的アミノ酸置換を保持する。
【００３１】
本発明のポリペプチドの生物学的活性成分は、非細胞毒性プロテアーゼである。非細胞毒性プロテアーゼは、種々の植物により、及び種々の微生物、例えばクロストリジウム種（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｓｐ．）及びナイセリア種（ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌ  ｓｐ．）（例、Ｎゴノレア（Ｎ．  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ））などにより産生される。
【００３２】
好ましい実施態様において、本発明の非細胞毒性プロテアーゼは、クロストリジウム神経毒プロテアーゼ又はナイセリアＩｇＡプロテアーゼである。
【００３３】
ここで本発明のトランスロケーションペプチド（トランスロケーションドメインともいう）を見ると、この成分は、非細胞毒性プロテアーゼを、エンドソーム膜を横断し、標的細胞のサイトゾル中にトランスロケーションさせるために役立ち、ここで、プロテアーゼ成分は次にＳＮＡＲＥタンパク質に対してそのタンパク質分解効果を発揮しうる。トランスロケーションペプチドは当技術分野において周知であり、種々の植物及び微生物により産生される。
【００３４】
好ましい実施態様において、本発明のトランスロケーションペプチドは、クロストリジウム神経毒トランスロケーションペプチド（クロストリジウムトランスロケーションドメイン、又はＨＮとしても公知である）である。
【００３５】
本発明のポリペプチドは改変ＥＧＦ分子を含み、それは、例えば、粘液分泌細胞上のＥＧＦ受容体への結合により、ポリペプチドを選択された標的細胞に向かわせるための標的成分（ＴＭ）として作用する。好ましい実施態様において、ＥＧＦ受容体はＥｒｂＢ受容体、好ましくはＥｒｂＢ１受容体である。
【００３６】
本発明の第２の局面によると、広範囲の医学的状態及び疾患を標的とする際での使用のための非細胞毒性ポリペプチド（上で定義する）を提供する。
【００３７】
一実施態様において、本発明は、粘液分泌過多、特に、粘液分泌過多が原因要素である状態又は疾患、例えば（慢性）気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及び喘息などの抑制のための前記非細胞毒性ポリペプチドの使用及び対応する方法を提供する。
【００３８】
一実施態様において、本発明は、炎症の抑制のための使用及び対応する方法を提供する。
【００３９】
別の実施態様において、本発明は、内分泌新生物、例えばＭＥＮ、甲状腺中毒症など、ならびに神経内分泌障害、例えばクッシング病、末端肥大症、高アンドロゲン症、慢性無排卵症、多嚢胞卵巣症候群、カルチノイド症候群、低血糖性症候群、壊死性遊走性紅斑、ゾリンジャー−エリソン症候群、及びバーナー−モリソン症候群などの抑制のための使用及び対応する方法を提供する。
【００４０】
一実施態様において、本発明は、神経内分泌腫瘍、例えば非カルチノイド胃腸膵管系神経内分泌腫瘍、カルチノイド腫瘍、下垂体腫瘍、及び褐色細胞腫などの抑制のため、ならびに、癌、例えば結腸直腸癌、前立腺癌、乳癌、及び肺癌などを抑制するための使用及び対応する方法を提供する。
【００４１】
使用において、本発明のポリペプチドが、ＥＧＦ（例、ＥｒｂＢ）受容体（結合部位）に結合し、それは標的細胞に存在する、好ましくはその特徴となる。このように、粘液適用との関連で、ＥＧＦ  ＴＭは粘液分泌細胞（例、上皮杯細胞、又は粘膜下腺粘液分泌細胞）に結合する。抗炎症性用途との関連で、ＥＧＦ  ＴＭは炎症性白血球細胞（例、好中球）に結合する。神経内分泌状態との関連で、ＥＧＦ  ＴＭは、腫瘍細胞自体に、又は成育ホルモン分泌細胞（例、下垂体細胞）に結合しうる。結合に続き、本発明のポリペプチド（少なくともその非細胞毒性プロテアーゼ成分）は、小胞中にエンドサイトーシスされ、そしてトランスロケーション成分は、次に、エンドソーム膜を横断した非細胞毒性プロテアーゼの輸送を標的細胞のサイトゾル中に向ける。一旦標的細胞内に入ると、非細胞毒性プロテアーゼ成分は、細胞の細胞外融合プロセスを阻害し、それにより標的細胞からの放出／分泌を阻害する。
【００４２】
ポリペプチド調製
本発明のポリペプチドは３つの主成分を含む：「弾頭（warhead）」（即ち、非細胞毒性プロテアーゼ）；ＥＧＦムテインＴＭ；及びトランスロケーションドメイン。そのような融合タンパク質の調製に関連する一般的な技術を、しばしば、再標的化毒素技術という。例示として、本発明者らは以下を参照する：ＷＯ９４／２１３００；ＷＯ９６／３３２７３；ＷＯ９８／０７８６４；ＷＯ００／１０５９８；ＷＯ０１／２１２１３；ＷＯ０６／０５９０９３；ＷＯ００／６２８１４；ＷＯ００／０４９２６；ＷＯ９３／１５７６６；ＷＯ００／６１１９２；及びＷＯ９９／５８５７１。これらの刊行物の全てが、その参照により本明細書に組み入れられる。
【００４３】
より詳細には、本発明のＴＭ成分は、本発明のプロテアーゼ成分又はトランスロケーション成分のいずれかに融合させてもよい。前記融合は、好ましくは、共有結合、例えば、直接的な共有結合又はスペーサー／リンカー分子を介することのいずれかによる。プロテアーゼ成分及びトランスロケーション成分は、好ましくは、共有結合を介して、例えば、直接的な共有結合又はスペーサー／リンカー分子を介することのいずれかにより一緒に連結される。適したスペーサー／リンカー分子は、当技術分野において周知であり、典型的には、５〜４０の間の、好ましくは１０〜３０の間のアミノ酸残基長のアミノ酸ベースの配列を含む。
【００４４】
使用において、ポリペプチドは二鎖（di-chain）立体構造を有し、それにおいて、プロテアーゼ成分及びトランスロケーション成分は、好ましくはジスルフィド結合を介して一緒に連結される。
【００４５】
本発明のポリペプチドは、当業者に周知である従来の化学的抱合技術により調製される。例として、Hermanson, G. T. (1996), Bioconjugate techniques, Academic Press, and to Wong, S. S. (1991), Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Pressを参照のこと。
【００４６】
あるいは、ポリペプチドは、単一のポリペプチド融合タンパク質の組換え調製により調製してもよい（例えば、ＷＯ９８／０７８６４を参照のこと）。この技術は、天然クロストリジウム神経毒（即ち、ホロ毒素）が調製されるインビボでの細菌機構に基づいており、以下の「単純化」構造配置を有する融合タンパク質をもたらす：
ＮＨ２−［プロテアーゼ成分］−［トランスロケーション成分］−［ＥＧＦ  ＴＭ］−ＣＯＯＨ
【００４７】
ＷＯ９８／０７８６４によると、ＴＭは、融合タンパク質のＣ末端に向かって置かれる。融合タンパク質を、次に、プロテアーゼを用いた処理により活性化させ、それによってプロテアーゼ成分とトランスロケーション成分との間の部位で切断される。二鎖タンパク質をこのように産生し、プロテアーゼ成分を、トランスロケーション成分＋ＴＭを含む別の単一ポリペプチド鎖に（ジスルフィド架橋を介して）共有結合的に付着させた単一ポリペプチド鎖として含む。
【００４８】
あるいは、本発明の融合タンパク質が、ＷＯ０６／０５０９３に従い、ＴＭが、標的細胞上の結合部位との相互作用について「遊離」であるＮ末端ドメインを有するように調製されうる。このシステムにおいて、融合タンパク質のＴＭ成分は、線形融合タンパク質配列の中央に向かい、プロテアーゼ切断部位とトランスロケーション成分の間に位置付けられる。プロテアーゼ切断部位での続く切断によって、ＴＭのＮ末端部分が露出され、二鎖ポリペプチド融合タンパク質が提供される。
【００４９】
上記のプロテアーゼ切断配列を、従来の手段、例えば部位特異的突然変異誘発などによりＤＮＡレベルで導入してもよい（及び／又は任意の固有の切断配列を除去する）。切断配列の存在を確認するためのスクリーニングを、手動で又はコンピュータソフトウェア（例、DNASTAR, Inc.によるMapDrawプログラム）の補助を用いて実施してもよい。任意のプロテアーゼ切断部位を用いてよく（即ち、クロストリジウム又は非クロストリジウム）、以下が好ましい：
エンテロキナーゼ                      (DDDDK↓)
第Ｘａ因子                            (IEGR↓ / IDGR↓)
ＴＥＶ（タバコエッチウイルス）        (ENLYFQ↓G)
トロンビン                            (LVPR↓GS)
PreScission                           (LEVLFQ↓GP).
CleanCut                              (WELQ↓X)
（Ｘは、プロリンを除く、任意のアミノ酸を示す）
【００５０】
また、プロテアーゼ切断部位という用語によりインテインが包含され、それは自己切断配列である。自己スプライシング反応は、例えば、存在する還元剤の濃度を変動させることにより制御可能である。上記の「活性化」切断部位を用いてもよい。なぜなら、「破壊的」切断部位（以下で考察する）を、本発明のポリペプチド中に組み入れるべきであるからである。
【００５１】
好ましい実施態様において、本発明の融合タンパク質は、１つ又は複数のＮ末端及び／又はＣ末端位置付けられる精製タグを含みうる。任意の精製タグを用いてよく、以下：
Ｈｉｓタグ（例、６×ヒスチジン）、好ましくはＣ末端及び／又はＮ末端タグとして
ＭＢＰタグ（マルトース結合タンパク質）、好ましくはＮ末端タグとして
ＧＳＴタグ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、好ましくはＮ末端タグとして
Ｈｉｓ−ＭＢＰタグ、好ましくはＮ末端タグとして
ＧＳＴ−ＭＢＰタグ、好ましくはＮ末端タグとして
チオレドキシンタグ、好ましくはＮ末端タグとして
ＣＢＤタグ（キチン結合ドメイン）、好ましくはＮ末端タグとして
が好ましい。
【００５２】
１つ又は複数のペプチドスペーサー／リンカー分子を、融合タンパク質に含めてもよい。例えば、ペプチドスペーサーを、精製タグと融合タンパク質分子の残りの間に用いてもよい。
【００５３】
このように、本発明の第３の局面は、上に記載するポリペプチドをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を提供する。
【００５４】
前記核酸を、ベクターの形態、例えばプラスミドなどに含めてよく、それは、場合により、１つ又は複数の複製開始点、核酸組込み部位、プロモーター、ターミネーター、及びリボソーム結合部位を含みうる。
【００５５】
本発明は、また、上記の核酸配列（即ち、本発明の第３の局面）を、宿主細胞、特にＥ．  ｃｏｌｉにおいて発現させるための方法を含む。
【００５６】
本発明は、また、本発明のポリペプチドを活性化するための方法を含み、前記方法は、ポリペプチドを、非細胞毒性プロテアーゼ成分とトランスロケーション成分の間に位置付けられる認識部位（切断部位）でポリペプチドを切断するプロテアーゼと接触させることを含み、それにより、ポリペプチドを二鎖ポリペプチドに変換させ、それにおいて、非細胞毒性プロテアーゼ成分及びトランスロケーション成分がジスルフィド結合により一緒に連結される。好ましい実施態様において、認識部位は、天然に存在するクロストリジウム神経毒及び／又は天然に存在するＩｇＡプロテアーゼに対して天然ではない。
【００５７】
本発明のポリペプチドをさらに改変し、非標的化部位中への分散に関連する不要な副作用が低下又は防止されうる。この実施態様によると、ポリペプチドは破壊的な切断部位を含む。破壊的な切断部位は、「活性化」部位（即ち、二鎖形成）とは異なり、第２のプロテアーゼにより切断可能であり、非細胞毒性プロテアーゼにより切断可能ではない。さらに、第２のプロテアーゼにより破壊的な切断部位でそのように切断された場合、ポリペプチドは低下した効力（例、意図する標的細胞に対する低下した結合能力、低下したトランスロケーション活性、及び／又は低下した非細胞毒性プロテアーゼ活性）を有する。完全性のために、本発明の「破壊的」な切断部位のいずれかを、本発明のポリペプチドにおいて「活性化」部位として別々に用いてもよい。
【００５８】
このように、この実施態様によると、本発明は、部位外で制御可能に不活性化及び／又は破壊されうるポリペプチドを提供する。
【００５９】
好ましい実施態様において、破壊的な切断部位は、循環プロテアーゼ（例、細胞外プロテアーゼ、例えば血清プロテアーゼ又は血液凝固カスケードのプロテアーゼなど）、組織関連プロテアーゼ（例、マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、例えば筋肉のＭＭＰなど）、及び細胞内プロテアーゼ（好ましくは、標的細胞が存在しないプロテアーゼ）より選択される第２のプロテアーゼ（即ち、破壊的プロテアーゼ）により認識及び切断される。
【００６０】
このように、使用において、本発明のポリペプチドが、その意図する標的細胞から離れて分散される及び／又は非標的細胞により取り込まれる場合、ポリペプチドは、破壊的な切断部位の切断（第２のプロテアーゼによる）により不活性化される。
【００６１】
一実施態様において、破壊的な切断部位は、部位外の細胞型内に存在する第２のプロテアーゼにより認識及び切断される。この実施態様において、部位外の細胞及び標的細胞は、好ましくは、異なる細胞型である。あるいは（又は加えて）、破壊的な切断部位は、部位外の位置に存在する（例、標的細胞から遠位の）第２のプロテアーゼにより認識及び切断される。したがって、破壊的な切断が細胞外で生じる場合、標的細胞及び部位外の細胞は、同じ又は異なる細胞型でありうる。これに関して、標的細胞及び部位外の細胞は、本発明の同じポリペプチドが結合する受容体を各々保有しうる。
【００６２】
本発明の破壊的な切断部位は、ポリペプチドが部位外の位置内又は位置にある場合、ポリペプチドの不活性化及び／又は破壊を提供する。これに関して、破壊的な切断部位での切断によって、ポリペプチドの効力が最小限になる（同じ破壊的な切断部位を欠く、又は同じ破壊的部位を保有するが、しかし、非切断形態である同一のポリペプチドと比較した場合）。例として、低下した効力は以下を含む：低下した結合（哺乳動物細胞の受容体に対する）及び／又は低下したトランスロケーション（サイトゾルの方向での哺乳動物細胞のエンドソーム膜を横断する）、及び／又は低下したＳＮＡＲＥタンパク質切断。
【００６３】
本発明に関連する破壊的な切断部位を選択する場合、破壊的な切断部位が、その製造プロセスの部分として、本発明のポリペプチドの翻訳後修飾のために別々に使用されうる任意のプロテアーゼのための基質ではないことが好ましい。これに関して、本発明の非細胞毒性プロテアーゼは、典型的には、プロテアーゼ活性化事象を用いる（別々の「活性化」プロテアーゼ切断部位を介し、それは、本発明の破壊的な切断部位とは構造的に異なる）。活性化切断部位の目的は、非細胞毒性プロテアーゼと本発明のポリペプチドのトランスロケーション成分又は結合成分との間のペプチド結合を切断することであり、それにより「活性化」二鎖ポリペプチドを提供し、それにおいて、前記２つの成分がジスルフィド結合を介して一緒に連結される。
【００６４】
このように、本発明のポリペプチドの破壊的な切断部位が、「活性化」切断部位及び続くジスルフィド結合形成に悪影響を及ぼさないことを確実とすることを助けるために、前者は、好ましくは、「活性化」切断部位から少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、及び好ましくは少なくとも６０超、少なくとも７０、少なくとも８０の（連続）アミノ酸残基の離れた位置で本発明のポリペプチド中に導入される。
【００６５】
破壊的な切断部位及び活性化切断部位は、好ましくは、ポリペプチドの天然成分に関して、外因性である（即ち、操作されている／人工である）。換言すると、前記切断部位は、好ましくは、ポリペプチドの対応する天然成分に固有である。例として、ＢｏＮＴ／Ａ  Ｌ鎖又はＨ鎖に（それぞれ）基づくプロテアーゼ又はトランスロケーション成分は、本発明に従って操作され、切断部位を含みうる。前記切断部位は、しかし、対応するＢｏＮＴ天然Ｌ鎖又はＨ鎖中に存在しないであろう。同様に、ポリペプチドの標的成分が操作され、プロテアーゼ切断部位を含む場合、前記切断部位は、対応する標的成分の対応する天然配列中に存在しないであろう。
【００６６】
本発明の好ましい実施態様において、破壊的な切断部位及び「活性化」切断部位は、同じプロテアーゼにより切断されない。一実施態様において、２つの切断部位は、それぞれの認識配列内の許容されるアミノ酸の少なくとも１つ、より好ましくは少なくとも２つ、特に好ましくは少なくとも３つ、最も好ましくは少なくとも４つが異なる点で互いに異なる。
【００６７】
例として、クロストリジウムＬ鎖とＨＮ成分との間の第Ｘａ因子「活性化」部位を含むポリペプチドキメラの場合において、第Ｘａ因子以外の部位である破壊的な切断部位を用いることが好ましく、それは、Ｌ鎖及び／又はＨＮ及び／又はＴＭ成分中の他の場所に挿入されうる。このシナリオにおいて、ポリペプチドを改変し、Ｌ鎖とＨＮ成分の間に代わりの「活性化」部位を収容させてもよく（例えば、エンテロキナーゼ切断部位）、その場合において、別々の第Ｘａ因子切断部位を、破壊的な切断部位として、ポリペプチド中の他の場所に組み入れてもよい。あるいは、Ｌ鎖とＨＮ成分との間の既存の第Ｘａ因子「活性化」部位を保持させ、代わりの切断部位、例えばトロンビン切断部位などを、破壊的な切断部位として組み入れてもよい。
【００６８】
切断部位の包含のために、本発明の成分のいずれかの一次配列内で適した部位を特定する場合、挿入すべき、提示された切断部位と厳密に一致する一次配列を選択することが好ましい。そのようにすることにより、最小限の構造変化をポリペプチド中に導入する。例として、切断部位は、典型的に、少なくとも３つの連続アミノ酸残基を含む。このように、好ましい実施態様において、新たな切断部位を導入するために要求されるアミノ酸残基の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つを（正確な位置に）既に保有する切断部位を選択する。例として、一実施態様において、カスパーゼ３切断部位（ＤＭＱＤ）を導入してもよい。これに関して、例えば、以下より選択される一次配列を既に含む、好ましい挿入位置を特定する：Ｄｘｘｘ、ｘＭｘｘ、ｘｘＱｘ、ｘｘｘＤ、ＤＭｘｘ、ＤｘＱｘ、ＤｘｘＤ、ｘＭＱｘ、ｘＭｘＤ、ｘｘＱＤ、ＤＭＱｘ、ｘＭＱＤ、ＤｘＱＤ、及びＤＭｘＤ。
【００６９】
同様に、切断部位を、表面暴露領域中に導入することが好ましい。表面暴露領域内では、既存のループ領域が好ましい。
【００７０】
本発明の好ましい実施態様において、破壊的な切断部位を以下の位置の１つ又は複数に導入し、それはＢｏＮＴ／Ａの一次アミノ酸配列に基づく。挿入位置をＢｏＮＴ／Ａの参照により（便宜上）特定し、代わりのプロテアーゼドメイン及び／又はトランスロケーションドメインの一次アミノ酸配列が、前記のＢｏＮＴ／Ａ位置を用いて容易に整列されうる。
【００７１】
プロテアーゼ成分については、以下の位置の１つ又は複数が好ましい：２７−３１、５６−６３、７３−７５、７８−８１、９９−１０５、１２０−１２４、１３７−１４４、１６１−１６５、１６９−１７３、１８７−１９４、２０２−２１４、２３７−２４１、２４３−２５０、３００−３０４、３２３−３３５、３７５−３８２、３９１−４００、及び４１３−４２３上のナンバリングは、好ましくは、本発明のプロテアーゼ成分のＮ末端より開始する。
【００７２】
好ましい実施態様において、破壊的な切断部位は、プロテアーゼ成分のＮ末端より、８アミノ酸残基より大きい、好ましくは１０アミノ酸残基より大きい、より好ましくは２５アミノ酸残基より大きい、特に好ましくは５０アミノ酸残基より大きい位置に位置付けられる。
【００７３】
同様に、好ましい実施態様において、破壊的な切断部位は、プロテアーゼ成分のＣ末端より、２０アミノ酸残基より大きい、好ましくは３０アミノ酸残基より大きい、より好ましくは４０アミノ酸残基より大きい、特に好ましくは５０アミノ酸残基より大きい位置に位置付けられる。
【００７４】
トランスロケーション成分について、以下の位置の１つ又は複数が好ましい：４７４−４７９、４８３−４９５、５０７−５４３、５５７−５６７、５７６−５８０、６１８−６３１、６４３−６５０、６６９−６７７、７５１−７６７、８２３−８３４、８４５−８５９。上のナンバリングは、好ましくは、本発明のトランスロケーションドメイン成分のＮ末端について４４９の開始位置、及びトランスロケーションドメイン成分のＣ末端について８７１の終了位置を認める。
【００７５】
好ましい実施態様において、破壊的な切断部位は、トランスロケーション成分のＮ末端より、１０アミノ酸残基より大きい、好ましくは２５アミノ酸残基より大きい、より好ましくは４０アミノ酸残基より大きい、特に好ましくは５０アミノ酸残基より大きい位置に位置付けられる。同様に、好ましい実施態様において、破壊的な切断部位は、トランスロケーション成分のＣ末端より、２０アミノ酸残基より大きい、好ましくは３０アミノ酸残基より大きい、より好ましくは４０アミノ酸残基より大きい、特に好ましくは５０アミノ酸残基より大きい位置に位置付けられる。
【００７６】
好ましい実施態様において、破壊的な切断部位は、ＴＭ成分のＮ末端より、１０アミノ酸残基より大きい、好ましくは２５アミノ酸残基より大きい、より好ましくは４０アミノ酸残基より大きい、特に好ましくは５０アミノ酸残基より大きい位置に位置付けられる。同様に、好ましい実施態様において、破壊的な切断部位は、ＴＭ成分のＣ末端より、１０アミノ酸残基より大きい、好ましくは２５アミノ酸残基より大きい、より好ましくは４０アミノ酸残基より大きい、特に好ましくは５０アミノ酸残基より大きい位置に位置付けられる。
【００７７】
本発明のポリペプチドは、１つ又は複数の（例、２、３、４、５又はそれ以上）の破壊的な切断部位を含みうる。１を上回る破壊的な切断部位が含まれる場合、各々の切断部位は同じ又は異なりうる。これに関して、１を上回る破壊的な切断部位の使用によって、改善された部位外の活性化が提供される。同様に、２つ又はそれ以上の破壊的な切断部位の使用によって、追加の設計柔軟性が提供される。
【００７８】
破壊的な切断部位を、ポリペプチドの以下の成分のいずれかに操作してもよい：非細胞毒性プロテアーゼ成分；トランスロケーション成分；標的成分；又はスペーサーペプチド（存在する場合）。これに関して、破壊的な切断部位を、ポリペプチドの効力に対する最小限の有害効果を確実とするように選び（例えば、標的／結合領域及び／又はトランスロケーションドメイン、及び／又は非細胞毒性プロテアーゼドメインに対する最小限の効果を有することによる）、ポリペプチドが、その標的部位／標的細胞から離れて不安定であることを確実とする。
【００７９】
好ましい破壊的な切断部位（さらに対応する第２のプロテアーゼ）を、真下の表に列挙する。列挙した切断部位は、純粋に例示的であり、本発明を限定することを意図しない。
【００８０】
【表１】
0005658152.tif 000002
0005658152.tif 000003
【００８１】
マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）が、本発明に関連する破壊的なプロテアーゼの好ましい群である。この群内では、ＡＤＡＭ１７（ＥＣ  ３．４．２４．８６、ＴＡＣＥとしても公知）が好ましく、種々の膜固定細胞表面タンパク質を切断し、細胞外ドメインを「落とす」。加えて、好ましいＭＭＰは、アダマリシン（adamalysin）、セラリシン（serralysin）、及びアスタシン（astacin）を含む。
【００８２】
好ましい破壊的プロテアーゼの別の群は、哺乳動物血液プロテアーゼ、例えばトロンビン、凝集第ＶＩＩａ因子、凝集第ＩＸａ因子、凝集第Ｘａ因子、凝集第ＸＩａ因子、凝集第ＸＩＩａ因子、カリクレイン、プロテインＣ、及びＭＢＰ関連セリンプロテアーゼなどである。
【００８３】
本発明の一実施態様において、前記破壊的な切断部位は、少なくとも３又は４、好ましくは５又は６、より好ましくは６又は７、特に好ましくは少なくとも８の連続アミノ酸残基を有する認識配列を含む。これに関して、認識配列が長くなるほど（連続アミノ酸残基の点で）、破壊的部位の非特異的切断が、意図しない第２のプロテアーゼを介して生じる可能性が低くなる。
【００８４】
本発明の破壊的な切断部位を、プロテアーゼ成分及び／又は標的成分中に、及び／又はトランスロケーション成分中に、及び／又はスペーサーペプチド中に導入する。これらの４つの成分の内、プロテアーゼ成分が好ましい。したがって、ポリペプチドは、非細胞毒性プロテアーゼ及び／又は結合成分及び／又はトランスロケーション成分の直接的な破壊により迅速に不活性化されうる。
【００８５】
ポリペプチド送達
使用においては、本発明では、ポリペプチドを、医薬的に許容可能な担体、賦形剤、アジュバント、噴霧剤、及び／又は塩より選択される少なくとも１つの成分と一緒に含む医薬的組成物を用いる。
【００８６】
本発明のポリペプチドは、経口、非経口、連続注入、吸入、又は局所適用のために製剤化してもよい。注射に適した組成物は、溶剤、懸濁剤もしくは乳剤、又は使用前に適した賦形剤中に溶解又は懸濁される乾燥粉末の形態でありうる。
【００８７】
局所的に送達すべきポリペプチドの場合において、ポリペプチドは、クリームとして（例、局所適用のため）、又は皮下注射用に製剤化されうる。
【００８８】
局所的な送達手段は、エアゾル、又は他の噴霧剤（例、ネブライザー）を含みうる。これに関して、ポリペプチドのエアゾル製剤は、肺及び／又は他の鼻及び／又は気管支又は気道の通路への送達を可能にする。
【００８９】
１つの投与経路は、腹腔鏡及び／又は局所注射を介する。あるいは（又は加えて）、送達は、全身的であり、例えば静脈内投与などを介しうる。
【００９０】
注射用の製剤の場合において、投与部位からのポリペプチドの保持を補助する、又は除去を低下させるための医薬的に活性な物質を含むことは任意である。そのような医薬的に活性な物質の１つの例が、血管収縮剤、例えばアドレナリンなどである。そのような製剤は、投与に続くポリペプチドの滞留時間を増加させ、ひいてはその効果を増加及び／又は増強させる利点を与える。
【００９１】
本発明のポリペプチドは、罹患臓器の神経支配に関与する脊髄分節のレベルでの脊柱における髄腔内又は硬膜外注射により患者に投与してもよい。
【００９２】
本発明のポリペプチドの投与のための投与量範囲は、所望の治療効果を産生する投与量である。要求される投与量範囲が、ポリペプチド又は組成物の正確な性質、投与経路、製剤の性質、患者の年齢、患者の状態の性質、程度、又は重症度、禁忌（有る場合）、及び主治医の判断に依存することが理解されるであろう。これらの投与量レベルにおける変動を、最適化のために、標準的な経験的ルーチンを使用して調整することができる。
【００９３】
適した１日投与量（患者の体重１kg当たり）は、０．００００〜１ng/kg、好ましくは０．００００〜０．５ng/kg、より好ましくは０．００２〜０．５ng/kg、及び特に好ましくは０．００４〜０．５ng/kgの範囲にある。単位投与量は、１ピコグラム未満〜３０ngまで変動しうるが、しかし、典型的には、１用量当たり０．０１〜１ngの範囲であり、それを毎日又は好ましくはより少ない頻度で（例えば週１回又は１ヶ月に６回など）投与してもよい。
【００９４】
特に好ましい投与計画は、１×用量として２．５ngのポリペプチドに基づく。これ関して、好ましい投与量は、１×〜１００×（即ち、２．５〜２５０ng）の範囲にある。
【００９５】
液体投与形態は、典型的には、ポリペプチド及び発熱物質不含滅菌賦形剤を利用して調製する。ポリペプチドは、使用される賦形剤及び濃度に依存して、賦形剤中に溶解又は懸濁することができる。溶液を調製する際、ポリペプチドを賦形剤中に溶解させることができ、溶液は、必要な場合、塩化ナトリウムの添加により等張にし、適した滅菌バイアル又はアンプル中に充填し、密封する前に、無菌技術を使用し、滅菌フィルターを通したろ過により滅菌する。あるいは、溶液安定性が適切である場合、その密封された容器中の溶液をオートクレーブにより滅菌してもよい。有利には、添加剤、例えば緩衝剤、可溶化剤、安定剤、保存剤又は殺菌剤、懸濁剤又は乳化剤、及び／又は局所麻酔剤を、賦形剤中に溶解させてもよい。
【００９６】
乾燥粉末は、使用前に適した賦形剤中に溶解又は懸濁させ、無菌場所において無菌技術を使用し、前滅菌された成分を無菌容器中に充填することにより調製してもよい。あるいは、成分を、滅菌場所において無菌技術を使用し、適した容器中に溶解させてもよい。産物を次に凍結乾燥させ、容器を無菌的に密封する。
【００９７】
筋肉内、皮下、又は皮内注射に適した非経口懸濁剤は、滅菌成分を、溶解させる代わりに、滅菌賦形剤中に懸濁させ、滅菌がろ過により達成できないことを除き、実質的に同じ様式で調製される。成分は滅菌状態で単離されうる。あるいは、単離後に、例えば、ガンマ線照射により滅菌されうる。
【００９８】
有利には、懸濁剤、例えば、ポリビニルピロリドンが組成物中に含まれ、成分の一様な分布を促進する。
【００９９】
本発明の投与では、微小粒子封入、ウイルス送達系、又は高圧エアゾル衝突を含む種々の送達技術を利用してもよい。
【０１００】
定義のセクション
標的成分（ＴＭ）は、結合部位と機能的に相互作用し、本発明のポリペプチドと標的細胞（典型的には、哺乳動物細胞、特にヒト細胞）の表面の間で物理的会合を起こす任意の化学的構造を意味する。ＴＭという用語は、標的細胞上の結合部位に結合することが可能である任意の分子（即ち、天然に存在する分子、又は化学的／物理的に修飾されたそのバリアント）を包含し、その結合部位は内在化が可能である（例、エンドソーム形成）−受容体媒介エンドサイトーシスともいう。ＴＭはエンドソーム膜トランスロケーション機能を保有しうるが、その場合おいて別々のＴＭ及びトランスロケーションドメイン成分が本発明の薬剤中に存在する必要はない。本明細書を通じて、特定のＴＭが、例えば、配列番号の参照により記載される。前記ＴＭの参照は単に例示的であり、本発明はその全てのバリアント及び派生物を包含し、それらは例示されるＴＭの基本的な結合（即ち、標的化）能力を保持する。
【０１０１】
本発明のＴＭは、問題の標的細胞に結合する（好ましくは、特異的に結合する）。「特異的に結合する」という用語は、所与のＴＭ（例、追加の融合タンパク質成分、例えばトランスロケーション成分及び／又はエンドペプチダーゼ成分を伴う）が、結合親和性（Ｋａ）１０８M-1又はそれ以上、好ましくは１０９M-1又はそれ以上、より好ましくは１０１０M-1又はそれ以上、最も好ましくは１０１１M-1又はそれ以上を伴い標的細胞に結合することを意味する。
【０１０２】
本明細書におけるＴＭの参照によって、そのフラグメント及びバリアントが包含され、それらは問題の標的細胞及び／又はＥＧＦ（例、ＥｒｂＢ）受容体に結合する能力を保持する。例として、バリアントは、少なくとも７０%もしくは７５%、又は少なくとも８０%もしくは８５%、又は少なくとも９０%もしくは９５%のアミノ酸配列相同性を、参照ＴＭと有しうる（例、配列番号１、及び／又はその６システイン骨格を含むその３７のアミノ酸配列）。バリアントは、アミノ酸の１つ又は複数のアナログ（例、非天然アミノ酸）、又は置換された連結を含みうる。また、例として、フラグメントという用語は、ＴＭとの関連で使用された場合、参照ＴＭの少なくとも３７、又は少なくとも４０、又は少なくとも４５、又は少なくとも５０のアミノ酸残基を有するペプチドを意味する。フラグメントという用語は、また、上記のバリアントに関連する。このように、例として、本発明のフラグメントは、少なくとも３７、４０、４５、又は５０のアミノ酸を有するペプチド配列を含みうる。それにおいて、ペプチド配列は、参照ペプチドの対応するペプチド配列（の連続）アミノ酸にわたり少なくとも８０%配列相同性を有する。本発明のＥＧＦ  ＴＭは、９９%又はそれ以下、９７%又はそれ以下、９５%又はそれ以下、９３%又はそれ以下、９１%又はそれ以下、８９%又はそれ以下、８７%又はそれ以下、８５%又はそれ以下、８３%又はそれ以下、８１%又はそれ以下、７９%又はそれ以下、７７%又はそれ以下、７５%又はそれ以下、７３%又はそれ以下、７１%又はそれ以下の配列同一性を、天然に存在するヒトＥＧＦと有する（例、配列番号１、及び／又はその６システイン骨格を含むその３７のアミノ酸配列）。
【０１０３】
ＴＭが、選択された標的細胞と結合することを確認することがルーチンである。例えば、単純な放射性置換実験を用いてもよく、それにおいて標的細胞（例、粘液分泌細胞、又は炎症細胞）を代表する組織又は細胞を、過剰な未標識ＴＭの存在において、標識（例、滴定された）ＴＭに暴露させる。そのような実験において、非特異的結合と特異的結合の相対的な割合を評価してもよく、それによりＴＭが標的細胞に結合することの確認が可能になる。場合により、アッセイは１つ又は複数の結合アンタゴニストを含み、アッセイはＴＭ結合の喪失の観察をさらに含みうる。この型の実験の例を、Hulme, E. C. (1990), Receptor-binding studies, a brief outline, pp.303-311, In Receptor biochemistry, A Practical Approach, Ed. E. C. Hulme, Oxford University Pressにおいて見出すことができる。
【０１０４】
本発明のポリペプチドは、クロストリジウム神経毒の機能的なＨＣドメインを欠きうる。したがって、前記ポリペプチドは、Shone et al. (1985) Eur. J. Biochem. 151, 75-82に記載される結合アッセイにおいてラットシナプトゾーム膜に（クロストリジウムＨＣ成分を介して）結合することができない。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、好ましくは、クロストリジウム神経毒ホロ毒素の最後の５０のＣ末端アミノ酸を欠く。別の実施態様において、ポリペプチドは、好ましくは、クロストリジウム神経毒ホロ毒素の最後の１００、好ましくは最後の１５０、より好ましくは最後の２００、特に好ましくは最後の２５０、最も好ましくは最後の３００のＣ末端アミノ酸残基を欠く。あるいは、Ｈｃ結合活性を、突然変異誘発により無効にしてもよい／低下させてもよい。例として、便宜上、ＢｏＮＴ／Ａを参照すること。ガングリオシド結合ポケット中の１つ又は２つのアミノ酸残基突然変異（Ｗ１２６６からＬ及びＹ１２６７からＦ）の改変によって、ＨＣ領域がその受容体結合機能を喪失する。類似の突然変異を、非血清型Ａクロストリジウムペプチド成分に作製してもよい。例えば、突然変異を伴うボツリヌスＢ（Ｗ１２６２からＬ及びＹ１２６３からＦ）又はボツリヌスＥ（Ｗ１２２４からＬ及びＹ１２２５からＦ）に基づく構築物。活性部位に対する他の突然変異によって、ＨＣ受容体結合活性の同じ消失が達成される（例、ボツリヌスＡ型におけるＹ１２６７Ｓ及び他のクロストリジウム神経毒における対応する高度に保存された残基）。これ及び他の突然変異の詳細は、Rummel et al. (2004) (Molecular Microbiol. 51: 631-634)に記載され、その参照により本明細書により組み入れられる。
【０１０５】
天然クロストリジウム神経毒のＨＣペプチドは、約４００〜４４０のアミノ酸残基を含み、各々が約２５kDaの２つの機能的に異なるドメイン、即ち、Ｎ末端領域（一般的に、ＨＣＮペプチド又はドメインという）及びＣ末端領域（一般的に、ＨＣＣペプチド又はドメインという）からなる。この事実は、以下の刊行物により確認され、その各々が、その参照によりその全体において本明細書に組み入れられる：Umland TC (1997) Nat. Struct. Biol. 4: 788-792; Herreros J (2000) Biochem. J. 347: 199-204; Halpern J (1993) J. Biol. Chem. 268: 15, pp.11188-11192; Rummel A (2007) PNAS 104: 359-364; Lacey DB (1998) Nat. Struct. Biol. 5: 898-902; Knapp (1998) Am. Cryst. Assoc. Abstract Papers 25: 90; Swaminathan and Eswaramoorthy (2000) Nat. Struct. Biol. 7: 1751-1759；及びRummel A (2004) Mol. Microbiol. 51(3), 631-643。さらに、Ｃ末端領域（ＨＣＣ）が、Ｃ末端の１６０〜２００アミノ酸残基を構成し、クロストリジウム神経毒のその天然細胞受容体（即ち神経筋接合部の神経終末）への結合に関与することが十分に記録されている。この事実は、また、上の刊行物により確認される。このように、本明細書を通じて、機能的な重鎖ＨＣペプチド（又はドメイン）を欠き、重鎖が、天然クロストリジウム神経毒が結合する細胞表面受容体に結合することが不可能であるクロストリジウム重鎖の参照は、クロストリジウム重鎖が、単純に、機能的なＨＣＣペプチドを欠くことを意味する。換言すると、ＨＣＣペプチド領域は、部分的又は全体的に欠失され、そうでなければ改変され（例、従来の化学的又はタンパク質分解処理を通じて）、神経筋接合部の神経終末についてのその天然結合能力を不活性化する。
【０１０６】
このように、一実施態様において、本発明のクロストリジウムＮＨペプチドは、クロストリジウム神経毒のＣ末端ペプチド部分（ＨＣＣ）の部分を欠き、ひいては天然クロストリジウム神経毒のＨＣ結合機能を欠く。例として、一実施態様において、Ｃ末端が伸長したクロストリジウムＨＮペプチドは、クロストリジウム神経毒重鎖のＣ末端の４０アミノ酸残基、又はＣ末端の６０アミノ酸残基、又はＣ末端の８０アミノ酸残基、又はＣ末端の１００アミノ酸残基、又はＣ末端の１２０アミノ酸残基、又はＣ末端の１４０アミノ酸残基、又はＣ末端の１５０アミノ酸残基、又はＣ末端の１６０アミノ酸残基を欠く。別の実施態様において、本発明のクロストリジウムＨＮペプチドは、クロストリジウム神経毒の全Ｃ末端ペプチド部分（ＨＣＣ）を欠き、ひいては天然クロストリジウム神経毒のＨＣ結合機能を欠く。例として、一実施態様において、クロストリジウムＨＮペプチドは、クロストリジウム神経毒重鎖のＣ末端の１６５アミノ酸残基、又はＣ末端の１７０アミノ酸残基、又はＣ末端の１７５アミノ酸残基、又はＣ末端の１８０アミノ酸残基、又はＣ末端の１８５アミノ酸残基、又はＣ末端の１９０アミノ酸残基、又はＣ末端の１９５アミノ酸残基を欠く。さらなる例として、本発明のクロストリジウムＨＮペプチドは、以下：
ボツリヌスＡ型神経毒  −  アミノ酸残基（Ｙ１１１１−Ｌ１２９６）
ボツリヌスＢ型神経毒  −  アミノ酸残基（Ｙ１０９８−Ｅ１２９１）
ボツリヌスＣ型神経毒  −  アミノ酸残基（Ｙ１１１２−Ｅ１２９１）
ボツリヌスＤ型神経毒  −  アミノ酸残基（Ｙ１０９９−Ｅ１２７６）
ボツリヌスＥ型神経毒  −  アミノ酸残基（Ｙ１０８６−Ｋ１２５２）
ボツリヌスＦ型神経毒  −  アミノ酸残基（Ｙ１１０６−Ｅ１２７４）
ボツリヌスＧ型神経毒  −  アミノ酸残基（Ｙ１１０６−Ｅ１２９７）
破傷風神経毒  −  アミノ酸残基（Ｙ１１２８−Ｄ１３１５）
からなる群より選択されるクロストリジウムＨＣＣ参照配列を欠く。
【０１０７】
上で特定された参照配列をガイドと見なすべきである。なぜなら、わずかな変動が血清亜型に従って生じうるからである。
【０１０８】
本発明のプロテアーゼは、真核細胞の細胞外融合装置の１つ又は複数のＳＮＡＲＥタンパク質を切断することが可能である全ての非細胞毒性プロテアーゼを包含する。
【０１０９】
本発明のプロテアーゼは、好ましくは、細菌プロテアーゼ（又はそのフラグメント）である。より好ましくは、細菌プロテアーゼは、クロストリジウム属より選択される（例、クロストリジウムＬ鎖）。本発明のプロテアーゼは、好ましくは、セリン又はメタロプロテイナーゼ活性（例、エンドペプチダーゼ活性）を示す。
【０１１０】
本発明は、また、バリアント非細胞毒性プロテアーゼ（即ち、天然に存在するプロテアーゼ分子のバリアント）を、バリアントプロテアーゼが依然として必須のプロテアーゼ活性を示す限り、包含する。例として、バリアントは、少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、より好ましくは少なくとも９０%、最も好ましくは少なくとも９５%又は少なくとも９８%のアミノ酸配列相同性を、参照プロテアーゼ配列と有しうる。このように、バリアントという用語は、増強した（減少した）エンドペプチダーゼ活性を有する非細胞毒性プロテアーゼを含む。特に、本明細書においては、ＢｏＮＴ／Ａ突然変異体Ｑ１６１Ａ、Ｅ５４Ａ、及びＫ１６５Ｌの増加したＫｃａｔ／Ｋｍに言及する。Ahmed, S.A. (2008) Protein J. DOI 10.1007/s10930-007-9118-8を参照のこと。それはその参照により組み入れられる。フラグメントという用語は、プロテアーゼに関連して使用される場合、典型的には、参照プロテアーゼの少なくとも１５０、好ましくは少なくとも２００、より好ましくは少なくとも２５０、最も好ましくは少なくとも３００のアミノ酸残基を有するペプチドを意味する。ＴＭ「フラグメント」成分と同様に（上で考察する）、本発明のプロテアーゼ「フラグメント」は、参照配列に基づくバリアントプロテアーゼのフラグメントを包含する。
【０１１１】
特に、神経毒のプロテアーゼドメイン、例えば、細菌神経毒のプロテアーゼドメインに言及する。このように、本発明は、天然で生じる神経毒ドメイン、ならびに、天然に存在する前記神経毒の組換え調製バージョンの使用を包含する。
【０１１２】
例示的な神経毒はクロストリジウムにより産生され、クロストリジウム神経毒という用語は、Ｃ．  ｔｅｔａｎｉ（ＴｅＮＴ）により、及びＣ．  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ（ＢｏＮＴ）血清型Ａ〜Ｇにより産生される神経毒、ならびにＣ．  ｂａｒａｔｉｉ及びＣ．  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍにより産生される厳密に関連するＢｏＮＴ様神経毒を包含する。上記の略語を、本明細書を通じて使用する。例えば、命名法ＢｏＮＴ／Ａは、ＢｏＮＴ（血清型Ａ）としての神経毒の供給源を示す。対応する命名法は、他のＢｏＮＴ血清型に適用される。
【０１１３】
ＢｏＮＴは公知の最も強力な毒素であり、マウスでの致死量の中央値（ＬＤ５０）は、血清型に依存して、０．５〜５ng/kgの範囲である。ＢｏＮＴは胃腸管において吸収され、全身循環に入った後、コリン作動性神経末端のシナプス前膜に結合し、それらの神経伝達物質アセチルコリンの放出を防止する。
【０１１４】
ＢｏＮＴは共通の構造を共有し、〜１５０kDaの二鎖タンパク質は、単一のジスルフィド結合により〜５０kDaの軽鎖（Ｌ鎖）に共有結合された〜１００kDaの重鎖（Ｈ鎖）からなる。Ｈ鎖は２つのドメインからなり、各々は〜５０kDaである。Ｃ末端ドメイン（ＨＣ）が高親和性神経結合のために要求されるのに対し、Ｎ末端ドメイン（ＨＮ）は、膜トランスロケーションに関与することが提示されている。Ｌ鎖は、基質ＳＮＡＲＥタンパク質の切断に関与する亜鉛依存性メタロプロテイナーゼである。
【０１１５】
Ｌ鎖フラグメントという用語は、神経毒のＬ鎖の成分を意味し、そのフラグメントはメタロプロテイナーゼ活性を示し、非神経ＳＮＡＲＥタンパク質をタンパク質分解的に切断することが可能である。
【０１１６】
適したプロテアーゼ（参照）配列の例は、以下：
ボツリヌスＡ型神経毒  −  アミノ酸残基（１−４４８）
ボツリヌスＢ型神経毒  −  アミノ酸残基（１−４４０）
ボツリヌスＣ型神経毒  −  アミノ酸残基（１−４４１）
ボツリヌスＤ型神経毒  −  アミノ酸残基（１−４４５）
ボツリヌスＥ型神経毒  −  アミノ酸残基（１−４２２）
ボツリヌスＦ型神経毒  −  アミノ酸残基（１−４３９）
ボツリヌスＧ型神経毒  −  アミノ酸残基（１−４４１）
破傷風神経毒  −  アミノ酸残基（１−４５７）
を含む。
【０１１７】
上で特定された参照配列をガイドと見なすべきである。なぜなら、わずかな変動が血清亜型に従って生じうるからである。例として、ＵＳ  ２００７／０１６６３３２（その参照により本明細書により組み入れられる）では、わずかに異なるクロストリジウム配列：
ボツリヌスＡ型神経毒  −  アミノ酸残基（Ｍ１−Ｋ４４８）
ボツリヌスＢ型神経毒  −  アミノ酸残基（Ｍ１−Ｋ４４１）
ボツリヌスＣ型神経毒  −  アミノ酸残基（Ｍ１−Ｋ４４９）
ボツリヌスＤ型神経毒  −  アミノ酸残基（Ｍ１−Ｒ４４５）
ボツリヌスＥ型神経毒  −  アミノ酸残基（Ｍ１−Ｒ４２２）
ボツリヌスＦ型神経毒  −  アミノ酸残基（Ｍ１−Ｋ４３９）
ボツリヌスＧ型神経毒  −  アミノ酸残基（Ｍ１−Ｋ４４６）
破傷風神経毒  −  アミノ酸残基（Ｍ１−Ａ４５７）
に言及する。
【０１１８】
軽鎖を含む種々のクロストリジウム毒素フラグメントが、本発明の局面において有用でありうる（これらの軽鎖フラグメントが、神経伝達物質放出装置のコア成分を特異的に標的化し、ひいては全細胞機構の実行に関与することができ、それによりクロストリジウム毒素が基質をタンパク質分解的に切断するという条件で）。クロストリジウム毒素の軽鎖は、約４２０〜４６０アミノ酸長であり、酵素ドメインを含む。研究によって、クロストリジウム毒素軽鎖の全長が、酵素ドメインの酵素活性に必要ではないことが示されている。非限定的な例として、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖の最初の８つのアミノ酸は、酵素活性のために要求されない。別の非限定的な例として、ＴｅＮＴ軽鎖の最初の８つのアミノ酸は、酵素活性のために要求されない。同様に、軽鎖のカルボキシ末端は、活性のために必要ではない。非限定的な例として、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖の最後の３２のアミノ酸（残基４１７〜４４８）は、酵素活性のために要求されない。別の非限定的な例として、ＴｅＮＴ軽鎖の最後の３１のアミノ酸（残基４２７〜４５７）は、酵素活性のために要求されない。このように、この実施態様の局面は、例えば、少なくとも３５０のアミノ酸、少なくとも３７５のアミノ酸、少なくとも４００のアミノ酸、少なくとも４２５のアミノ酸、少なくとも４５０のアミノ酸の長さを有する酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素軽鎖を含みうる。この実施態様の他の局面は、例えば、最大３５０のアミノ酸、最大３７５のアミノ酸、最大４００のアミノ酸、最大４２５のアミノ酸、最大４５０のアミノ酸の長さを有する酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素軽鎖を含みうる。
【０１１９】
本発明の非細胞毒性プロテアーゼ成分は、好ましくは、ＢｏＮＴ／Ａ、Ｃ、又はＤ血清型Ｌ鎖（又はそのフラグメントもしくはバリアント）を含む。
【０１２０】
本発明のポリペプチド、特にそのプロテアーゼ成分をペグ化してもよい。これによって、安定性、例えば、プロテアーゼ成分の作用の持続時間の増加が助けられうる。ペグ化は、特に、プロテアーゼがＢｏＮＴ／Ｅプロテアーゼを含む場合に好ましい。ペグ化は、好ましくは、プロテアーゼ成分のＮ末端へのＰＥＧの付加を含む。例として、プロテアーゼのＮ末端を、同じ又は異なりうる１つ又は複数のアミノ酸（例、システイン）残基を用いて伸長してもよい。１つ又は複数の前記アミノ酸残基は、それに付着された（例、共有結合的に付着された）それ自体のＰＥＧ分子を有してもよい。この技術の例をＷＯ２００７／１０４５６７に記載し、その参照によりその全体において本明細書に組み入れられる。
【０１２１】
本発明のポリペプチドは、１つ又は複数の「二次改変部位」に突然変異及び／又は欠失を含みうる。これらの部位が標的化され、酵素（例えば細胞内酵素）により作用され、それによって本発明のポリペプチドの生物学的持続性が変化する。そのような突然変異／欠失は、前記の１つ又は複数の二次改変部位の部分又は全部の突然変異又は欠失を含みうる。生物学的持続性におけるそのような増加は、本発明の非細胞毒性プロテアーゼ成分の作用の長寿命が望ましい場合に特に望ましい。あるいは、本発明のポリペプチドは、１つ又は複数の二次改変部位の追加を含んでもよい。
【０１２２】
本発明のポリペプチドにおいて見出される二次改変部位の部分もしくは全部の突然変異もしくは欠失、又は本発明のポリペプチドへの二次改変部位の追加によって、ポリペプチドの増強された生物学的持続性がもたらされうる。一般用語において、ポリペプチドの生物学的持続性は、二次改変部位への任意の構造的改変の非存在においてより、約２０%〜約３００%大きくなりうる。このように、標的細胞からの分泌の阻害は、約２０%〜約３００%増加する。
【０１２３】
増強された生物学的持続性は、ポリペプチドの増加された生物学的半減期の形態を取りうる。ポリペプチドの生物学的半減期は、好ましくは、約１０%増加する；より好ましくは、ポリペプチドの生物学的半減期は約１００%増加する。
【０１２４】
例として、ボツリヌス神経毒Ａ及びボツリヌス神経毒Ｅは、それぞれ表Ａ及びＢに示す、以下の潜在的な二次改変部位を有する。これらの部位は、部位の全て又は部分の突然変異又は欠失のために標的化されうる。
【０１２５】
表Ａ
Ｎグリコシル化：１７３−ＮＬＴＲ；３８２−ＮＹＴＩ；４１１−ＮＦＴＫ；４１７−ＮＦＴＧ
カゼインキナーゼＩＩ（ＣＫ−２）リン酸化部位：５１−ＴＮＰＥ；７０−ＳＹＹＤ；７９−ＴＤＮＥ；１２０−ＳＴＩＤ；２５３−ＳＧＬＥ；２５８−ＳＦＥＥ；２７５−ＳＬＱＥ；３８４−ＴＩＹＤ
Ｎ末端ミリスチル化部位：１５−ＧＶＤＩＡＹ；１４１−ＧＳＹＲＳＥ；２５４−ＧＬＥＶＳＦ
プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）リン酸化部位：１４２−Ｓｙｒ；３２７−ＳＧＫ；４３５−ＴＳＫ
チロシンリン酸化部位：９２−ＫＬＦＥＲＩＹ；３３４−ＫＬＫＦＤＫＬＹ
Ｎグリコシル化：９７−ＮＬＳＧ；１３８−ＮＧＳＧ；１６１−ＮＳＳＮ；１６４−ＮＩＳＬ；３６５−ＮＤＳＩ；３７０−ＮＩＳＥ
【０１２６】
表Ｂ
カゼインキナーゼＩＩ（ＣＫ−２）リン酸化部位：５１−ＴＰＱＤ；６７−ＳＹＹＤ；７６−ＳＤＥＥ；１３０−ＳＡＶＥ；１９８−ＳＭＮＥ；２４７−ＴＮＩＥ；３３３−ＳＦＴＥ；３３５−ＴＥＦＤ
Ｎ末端ミリスチル化部位：２２０−ＧＬＹＧＡＫ；２５７−ＧＴＤＬＮＩ；３８６−ＧＱＮＡＮＬ
プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）リン酸化部位：６０−ＳＬＫ；１６６−ＳＬＲ；１９１−ＳＦＲ；２２８−ＴＴＫ；２３４−ＴＱＫ；４００−ＴＧＲ；４１７−ＳＶＫ
チロシンキナーゼリン酸化部位：６２−ＫＮＧＤＳＳＹ；３００−ＫＤＶＦＥＡＫＹ
【０１２７】
さらなる例は、本発明のポリペプチドへのカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位（例えばＴＤＮＥなど）の追加である。
【０１２８】
さらなる詳細をＷＯ  ２００２／４０５０６に記載し、その参照によりその全体において本明細書に組み入れられる。
【０１２９】
本発明のポリペプチドは、既に存在する任意の天然に存在するチロシンリン酸化部位に加えて、１つ又は複数のチロシンリン酸化部位を含みうる。１つ又は複数の追加のチロシンリン酸化部位が、ポリペプチドの非細胞毒性プロテアーゼ成分中に、ポリペプチドのトランスロケーションドメイン中に、又はポリペプチドの標的ドメイン中に存在しうる。そのような部位を、ポリペプチド配列への追加としてポリペプチドに加えてもよく、又はポリペプチド配列中に置換してもよい。例として、チロシンリン酸化部位によって、非細胞毒性プロテアーゼ成分の約１〜８又は約１〜４の連続アミノ酸を置換してもよい。
【０１３０】
そのような部位の追加の存在によって、ポリペプチドの生物学的持続性が増加しうる。これに関して、増加した生物学的持続性は、ポリペプチドの作用の増加した持続時間、又はポリペプチドの増加した半減期、又はその両方をもたらしうる。任意のチロシンリン酸化部位は、本発明のポリペプチドにおける使用に適する。例として、適したチロシンリン酸化部位は、ＫＬＦＥＲＩＹ及びＫＬＫＦＤＫＬＹを含む。
【０１３１】
さらなる詳細をＵＳ  ７２２３５７７に提供し、その参照によりその全体において本明細書に組み入れられる。
【０１３２】
本発明のポリペプチドは、また、ポリペプチド内でのロイシンベースのモチーフの存在により増強されたそれらの生物学的持続性を有しうる。ロイシンベースのモチーフを、ポリペプチド配列に加えて付加する、又は置換として含んでもよい。
【０１３３】
ロイシンベースのモチーフは、７つの連続アミノ酸を含みうる。これらは、さらに、５つのアミノ酸の群（五重）及び２つのアミノ酸の直接隣接する群（二重）からなると記載してもよい。二重のアミノ酸は、ロイシンベースのモチーフのＮ末端又はＣ末端のいずれかに位置付けてもよい。
【０１３４】
五重のアミノ酸は、グルタミン酸及びアスパラギン酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸を含みうる。
【０１３５】
二重のアミノ酸は、少なくとも１つの疎水性酸を含む；そのような疎水性アミノ酸の例は、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、アラニン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、及びチロシンを含む。二重のアミノ酸は、好ましくは、ロイシン−ロイシン、ロイシン−イソロイシン、イソロイシン−ロイシン、イソロイシン−イソロイシン、又はロイシン−メチオニンである。二重のアミノ酸は、さらにより好ましくは、ロイシン−ロイシンである。
【０１３６】
五重のアミノ酸は、ヒドロキシル基を含む少なくとも１つのアミノ酸を含んでもよい；そのようなアミノ酸の例は、セリン、スレオニン、及びチロシンを含む。ヒドロキシ含有アミノ酸は、好ましくは、リン酸化される。さらにより好ましくは、ヒドロキシル含有アミノ酸はセリンであり、それはリン酸化され、アダプタータンパク質の結合を可能にすることができる。
【０１３７】
上記のロイシンベースのモチーフは、また、修飾アミノ酸を含んでもよい。例として、ロイシンベースのモチーフは、ハロゲン化ロイシン、好ましくは、フッ化ロイシンを含んでもよい。
【０１３８】
適したロイシンベースのモチーフの例は、ｘＤｘｘｘＬＬ、ｘＥｘｘｘＬＬ、ｘＤｘｘｘＬＩ、ｘＤｘｘｘＬＭ、ｘＥｘｘｘＬＩ、ｘＥｘｘｘＩＬ、ｘＥｘｘｘＬＭを含む（ここでｘは任意のアミノ酸である）。適したロイシンベースのモチーフのさらなる例は、フェニルアラニン−グルタミン酸−フェニルアラニン−チロシン−リジン−ロイシン−ロイシンである。
【０１３９】
ロイシンベースのモチーフ（種々の種に由来する）の追加の例は、本発明のポリペプチドにおける使用に適しており、以下の表において見出される。
【０１４０】
種                        配列
ボツリヌスＡ型            FEFYKLL
ラットＶＭＡＴ１          EEKRAIL
ラットＶＭＡＴ２          EEKMAIL
ラットＶＡＣｈＴ          SERDVLL
ラットδ                  VDTQVLL
マウスδ                  AEVQALL
カエルγ／δ              SDKQNLL
鶏γ／δ                  SDRQNLI
ヒツジδ                  ADTQVLM
ヒトＣＤ３γ              SDKQTLL
ヒトＣＤ４                SQIKRLL
ヒトδ                    ADTQALL
S. cerevisiae Vam3p       NEQSPLL
【０１４１】
ＶＭＡＴ：小胞モノアミントランスポーターＶＡＣｈＴ：小胞アセチルコリントランスポーターＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｖａｍ３ｐ：シナプトブレビンの酵母ホモログ下線を引いたセリン残基は、リン酸化の潜在的部位である。
【０１４２】
上に記載するロイシンベースのモチーフの使用に加えて、本発明のポリペプチドは、また、チロシンベースのモチーフを含んでもよい。チロシンベースのモチーフの存在が作用し、ポリペプチドの生物学的持続性を増加させうる。本発明における使用に適したチロシンベースのモチーフは、配列Ｙ−Ｘ−Ｘ−Ｈｙを含み、それにおいてＹはチロシンであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｈｙは疎水性アミノ酸である。ＵＳ  ７２２３５７７に記載されるそのようなチロシンベースのモチーフの例は、ＹＫＬＬである。
【０１４３】
さらなる詳細をＷＯ  ２００５０６８４９４に提供し、その参照によりその全体において本明細書に組み入れられる。
【０１４４】
トランスロケーションドメインは、プロテアーゼ活性の機能的発現が標的細胞のサイトゾル内で生じるように、標的細胞中へのプロテアーゼのトランスロケーションを可能にする分子である。任意の分子（例、タンパク質又はペプチド）が、本発明の必須のトランスロケーション機能を保有するか否かは、多数の従来アッセイのいずれか１つにより確認されうる。
【０１４５】
例えば、Shone C. (1987)は、リポソームを用いたインビトロアッセイを記載し、それは試験分子と一緒にチャレンジされる。必須のトランスロケーション機能の存在は、リポソームからのＫ＋及び／又は標識ＮＡＤの放出により確認され、それは容易にモニターされうる［Shone C. (1987) Eur. J. Biochem; vol. 167(1): pp.175-180を参照のこと］。
【０１４６】
さらなる例がBlaustein R. (1987)により提供され、それは平面リン脂質二重膜を用いた単純なインビトロアッセイを記載する。膜を、試験分子を用いて攻撃し、必須のトランスロケーション機能が、前記膜を横切る伝導性における増加により確認される［Blaustein (1987) FEBS Letts; vol. 226, no. 1: pp.115-120を参照のこと］。
【０１４７】
膜融合の評価ひいては本発明における使用に適したトランスロケーションドメインの特定を可能にする追加の方法論が、Methods in Enzymology Vol 220 and 221, Membrane Fusion Techniques, Parts A and B, Academic Press 1993により提供される。
【０１４８】
本発明は、また、バリアントドメインが依然として必須のトランスロケーション活性を示す限り、バリアントトランスロケーションドメインを包含する。例として、バリアントは、少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、より好ましくは少なくとも９０%、最も好ましくは少なくとも９５%又は少なくとも９８%のアミノ酸配列相同性を、参照トランスロケーションドメインと有しうる。フラグメントという用語は、トランスロケーションドメインと関連して使用される場合、参照トランスロケーションドメインの少なくとも２０、好ましくは少なくとも４０、より好ましくは少なくとも８０、最も好ましくは少なくとも１００のアミノ酸残基を有するペプチドを意味する。クロストリジウムトランスロケーションドメインの場合において、フラグメントは、好ましくは、参照トランスロケーションドメイン（例、ＨＮドメイン）の少なくとも１００、好ましくは少なくとも１５０、より好ましくは少なくとも２００、最も好ましくは少なくとも２５０のアミノ酸残基を有する。ＴＭ「フラグメント」成分（上で考察する）と同様に、本発明のトランスロケーション「フラグメント」は、参照配列に基づくバリアントトランスロケーションドメインのフラグメントを包含する。
【０１４９】
トランスロケーションドメインは、好ましくは、低ｐＨの条件下で、脂質膜におけるイオン透過性ポアの形成が可能である。好ましくは、エンドソーム膜内でポア形成が可能であるタンパク質分子のそれらの部分だけが使用されることが見出されている。
【０１５０】
トランスロケーションドメインは、微生物タンパク質供給源、特に細菌又はウイルスタンパク質供給源から得てもよい。故に、一実施態様において、トランスロケーションドメインは、酵素のトランスロケーションドメイン、例えば細菌毒素又はウイルスタンパク質などである。
【０１５１】
細菌毒素分子の特定のドメインが、そのようなポアを形成することが可能であることが、十分に記録されている。また、ウイルスが発現する膜融合タンパク質の特定のトランスロケーションドメインが、そのようなポアを形成することが可能であることが公知である。そのようなドメインを本発明において用いてもよい。
【０１５２】
トランスロケーションドメインは、クロストリジウム由来、例えばＨＮドメイン（又はその機能的成分）などでありうる。ＨＮは、Ｈ鎖のアミノ末端半分とほぼ等価であるクロストリジウム神経毒のＨ鎖の部分もしくはフラグメント、又はインタクトなＨ鎖におけるそのフラグメントに対応するドメインを意味する。Ｈ鎖は、Ｈ鎖のＨＣ成分の天然結合機能を欠く。これに関して、ＨＣ機能を、ＨＣアミノ酸配列の欠失により除去してもよい（ＤＮＡ合成レベル、又はヌクレアーゼもしくはプロテアーゼ処理による合成後レベルのいずれかで）。あるいは、ＨＣ機能を、化学的又は生物学的処理により不活性化してもよい。このように、Ｈ鎖は、天然クロストリジウム神経毒（即ち、ホロ毒素）が結合する標的細胞上の結合部位への結合が不可能である。
【０１５３】
適した（参照）トランスロケーションドメインの例は、以下：
ボツリヌスＡ型神経毒  −  アミノ酸残基（４４９−８７１）
ボツリヌスＢ型神経毒  −  アミノ酸残基（４４１−８５８）
ボツリヌスＣ型神経毒  −  アミノ酸残基（４４２−８６６）
ボツリヌスＤ型神経毒  −  アミノ酸残基（４４６−８６２）
ボツリヌスＥ型神経毒  −  アミノ酸残基（４２３−８４５）
ボツリヌスＦ型神経毒  −  アミノ酸残基（４４０−８６４）
ボツリヌスＧ型神経毒  −  アミノ酸残基（４４２−８６３）
破傷風神経毒  −  アミノ酸残基（４５８−８７９）
を含む。
【０１５４】
上で特定された参照配列をガイドと見なすべきである。なぜなら、わずかな変動が血清亜型に従って生じうるからである。例として、ＵＳ  ２００７／０１６６３３２（その参照により本明細書により組み入れられる）では、わずかに異なるクロストリジウム配列：
ボツリヌスＡ型神経毒  −  アミノ酸残基（Ａ４４９−Ｋ８７１）
ボツリヌスＢ型神経毒  −  アミノ酸残基（Ａ４４２−Ｓ８５８）
ボツリヌスＣ型神経毒  −  アミノ酸残基（Ｔ４５０−Ｎ８６６）
ボツリヌスＤ型神経毒  −  アミノ酸残基（Ｄ４４６−Ｎ８６２）
ボツリヌスＥ型神経毒  −  アミノ酸残基（Ｋ４２３−Ｋ８４５）
ボツリヌスＦ型神経毒  −  アミノ酸残基（Ａ４４０−Ｋ８６４）
ボツリヌスＧ型神経毒  −  アミノ酸残基（Ｓ４４７−Ｓ８６３）
破傷風神経毒  −  アミノ酸残基（Ｓ４５８−Ｖ８７９）
に言及する。
【０１５５】
本発明に関連して、トランスロケーションドメインを含む種々のクロストリジウム毒素ＨＮ領域が、本発明の局面において有用でありうる（これらの活性フラグメントは、細胞内小胞から標的細胞の細胞質中への非細胞毒性プロテアーゼ（例、クロストリジウムＬ鎖）の放出を促進させ、ひいては全細胞機構の実行に関与することができ、それによりクロストリジウム毒素がタンパク質分解的に基質を切断する）。クロストリジウム毒素の重鎖からのＨＮ領域は、約４１０〜４３０アミノ酸長であり、トランスロケーションドメインを含む。研究によって、クロストリジウム毒素重鎖からのＨＮ領域の全長が、トランスロケーションドメインのトランスロケーション活性に必要ではないことが示されている。このように、この実施態様の局面は、例えば、少なくとも３５０のアミノ酸、少なくとも３７５のアミノ酸、少なくとも４００のアミノ酸、少なくとも４２５のアミノ酸の長さを有するトランスロケーションドメインを含むクロストリジウム毒素ＨＮ領域を含むことができる。この実施態様の他の局面は、例えば、最大３５０のアミノ酸、最大３７５のアミノ酸、最大４００のアミノ酸、最大４２５のアミノ酸の長さを有するトランスロケーションドメインを含むクロストリジウム毒素ＨＮ領域を含むことができる。
【０１５６】
クロストリジウム・ボツリヌス及びＣ．  ｔｅｔａｎｉにおける毒素産生の遺伝的基礎に関するさらなる詳細について、本発明者らは、Henderson et al. (1997), The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis, Academic pressを参照する。
【０１５７】
ＨＮという用語は、天然に存在する神経毒ＨＮ部分、及び、改変ＨＮ部分が依然として上記のトランスロケーション機能を示す限り、天然において生じないアミノ酸配列及び／又は合成アミノ酸残基を有する改変ＨＮ部分を包含する。
【０１５８】
あるいは、トランスロケーションドメインは、非クロストリジウム由来でありうる。非クロストリジウム（参照）トランスロケーションドメイン由来の例は、制限はされないが、ジフテリア毒素のトランスロケーションドメイン［O=Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89, 6202-6206; Silverman et al., J. Biol. Chem. (1993) 269, 22524-22532; London, E. (1992) Biochem. Biophys. Acta., 1112, pp.25-51］、シュードモナス外毒素Ａ型のトランスロケーションドメイン［Prior et al., Biochemistry (1992) 31, 3555-3559］、炭疽毒素のトランスロケーションドメイン［Blanke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 8437-8442］、トランスロケーション機能の種々の融合ペプチド又は疎水性ペプチド［Plank et al., J. Biol. Chem. (1994) 269, 12918-12924; Wagner et al., (1992) PNAS, 89, pp.7934-7938］、及び両親媒性ペプチド［Murata et al., (1992) Biochem., 31, pp.1986-1992］を含む。トランスロケーションドメインは、天然に存在するタンパク質中に存在するトランスロケーションドメインを映しうる、又は、変異がトランスロケーションドメインのトランスロケーション能力を破壊しない限り、アミノ酸変異を含みうる。
【０１５９】
本発明における使用に適したウイルス（参照）トランスロケーションドメインの特定の例は、ウイルスにより発現される膜融合タンパク質の特定のトランスロケーションドメインを含む。例えば、Wagner et al.(1992)及びMurata et al.(1992)は、インフルエンザウイルスヘマグルチニンのＮ末端領域に由来する多数の融合ペプチド及び両親媒性ペプチドのトランスロケーション（即ち、膜融合及び小胞化）機能を記載している。所望のトランスロケーション活性を有することが公知である他のウイルスにより発現される膜融合タンパク質は、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）の融合ペプチドのトランスロケーションドメイン、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）糖タンパク質Ｇのトランスロケーションドメイン、ＳＥＲウイルスＦタンパク質のトランスロケーションドメイン、及び泡沫状ウイルスエンベロープ糖タンパク質のトランスロケーションドメインである。ウイルスによりコードされるＡｓｐｉｋｅタンパク質は、本発明に関連して特定の用途を有し、例えば、ＳＦＶのＥ１タンパク質及びＶＳＶのＧタンパク質のＧタンパク質。
【０１６０】
表（以下）に列挙する（参照）トランスロケーションドメインの使用は、その配列バリアントの使用を含む。バリアントは、１つ又は複数の保存核酸置換及び／又は核酸欠失もしくは挿入を含んでもよい（バリアントが必須のトランスロケーション機能を保有するという条件で）。バリアントは、また、バリアントが必須のトランスロケーション機能を保有する限り、１つ又は複数のアミノ酸置換及び／又はアミノ酸欠失もしくは挿入を含んでもよい。
【０１６１】
【表２】
0005658152.tif 000004
【０１６２】
本発明のポリペプチドは、さらに、トランスロケーション促進ドメインを含んでもよい。前記ドメインによって、標的細胞のサイトゾル中への非細胞毒性プロテアーゼの送達が促進され、例えば、ＷＯ  ０８／００８８０３及びＷＯ  ０８／００８８０５に記載されており、それらの各々が、その参照により本明細書に組み入れられる。
【０１６３】
例として、適したトランスロケーション促進ドメインはエンベロープウイルス融合ペプチドドメインを含み、例えば、適した融合ペプチドドメインは、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン（例、２３アミノ酸のインフルエンザＡウイルス融合ペプチドドメイン）、アルファウイルス融合ペプチドドメイン（例、２６アミノ酸のセムリキ森林ウイルス融合ペプチドドメイン）、ベジクロウイルス融合ペプチドドメイン（例、２１アミノ酸の水疱性口内炎ウイルス融合ペプチドドメイン）、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン（例、２５アミノ酸のセンダイウイルス融合ペプチドドメイン）、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン（例、２５アミノ酸のイヌジステンパーウイルス融合ペプチドドメイン）、アブラウイルス融合ペプチドドメイン（例、２５アミノ酸のニューカッスル病ウイルス融合ペプチドドメイン）、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン（例、２５アミノ酸のヘンドラウイルス融合ペプチドドメイン）、メタニューモウイルス融合ペプチドドメイン（例、２５アミノ酸のヒトメタニューモウイルス融合ペプチドドメイン）、又はスプーマウイルス融合ペプチドドメイン、例えばサル泡沫状ウイルス融合ペプチドドメイン；又はそのフラグメントもしくはバリアントを含む。
【０１６４】
さらなる例として、トランスロケーション促進ドメインは、クロストリジウム毒素ＨＣＮドメイン又はそのフラグメントもしくはバリアントを含んでもよい。より詳細には、クロストリジウム毒素ＨＣＮトランスロケーション促進ドメインは、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２５アミノ酸、少なくとも２５０アミノ酸、少なくとも２７５アミノ酸の長さを有してもよい。これに関して、クロストリジウム毒素ＨＣＮトランスロケーション促進ドメインは、好ましくは、最大２００アミノ酸、最大２２５アミノ酸、最大２５０アミノ酸、最大２７５アミノ酸の長さを有する。特定の（参照）例は以下：
ボツリヌスＡ型神経毒  −  アミノ酸残基（８７２−１１１０）
ボツリヌスＢ型神経毒  −  アミノ酸残基（８５９−１０９７）
ボツリヌスＣ型神経毒  −  アミノ酸残基（８６７−１１１１）
ボツリヌスＤ型神経毒  −  アミノ酸残基（８６３−１０９８）
ボツリヌスＥ型神経毒  −  アミノ酸残基（８４６−１０８５）
ボツリヌスＦ型神経毒  −  アミノ酸残基（８６５−１１０５）
ボツリヌスＧ型神経毒  −  アミノ酸残基（８６４−１１０５）
破傷風神経毒  −  アミノ酸残基（８８０−１１２７）
を含む。
【０１６５】
上の配列位置は、血清型／亜型に従って少し変動しうる。適した（参照）クロストリジウム毒素ＨＣＮのさらなる例は、以下：
ボツリヌスＡ型神経毒  −  アミノ酸残基（８７４−１１１０）
ボツリヌスＢ型神経毒  −  アミノ酸残基（８６１−１０９７）
ボツリヌスＣ型神経毒  −  アミノ酸残基（８６９−１１１１）
ボツリヌスＤ型神経毒  −  アミノ酸残基（８６５−１０９８）
ボツリヌスＥ型神経毒  −  アミノ酸残基（８４８−１０８５）
ボツリヌスＦ型神経毒  −  アミノ酸残基（８６７−１１０５）
ボツリヌスＧ型神経毒  −  アミノ酸残基（８６６−１１０５）
破傷風神経毒  −  アミノ酸残基（８８２−１１２７）
を含む。
【０１６６】
上記の促進ドメインのいずれかを、本発明における使用に適した先に記載したトランスロケーションドメインペプチドのいずれかと組み合わせてもよい。このように、例として、非クロストリジウム促進ドメインを、非クロストリジウムトランスロケーションドメインペプチドと、又はクロストリジウムトランスロケーションドメインペプチドと組み合わせてもよい。あるいは、クロストリジウム毒素ＨＣＮトランスロケーション促進ドメインを、非クロストリジウムトランスロケーションドメインペプチドと組み合わせてもよい。あるいは、クロストリジウム毒素ＨＣＮ促進ドメインを、クロストリジウムトランスロケーションドメインペプチドと組み合わせてもよい。その例は以下：
ボツリヌスＡ型神経毒  −  アミノ酸残基（４４９−１１１０）
ボツリヌスＢ型神経毒  −  アミノ酸残基（４４２−１０９７）
ボツリヌスＣ型神経毒  −  アミノ酸残基（４５０−１１１１）
ボツリヌスＤ型神経毒  −  アミノ酸残基（４４６−１０９８）
ボツリヌスＥ型神経毒  −  アミノ酸残基（４２３−１０８５）
ボツリヌスＦ型神経毒  −  アミノ酸残基（４４０−１１０５）
ボツリヌスＧ型神経毒  −  アミノ酸残基（４４７−１１０５）
破傷風神経毒  −  アミノ酸残基（４５８−１１２７）
を含む。
【０１６７】
配列相同性：種々の配列アラインメント方法のいずれかを使用して、パーセント配列同一性を決定することができる。限定はされないが、包括的方法、局所的方法、及びハイブリッド方法、例えば、セグメントアプローチ方法を含む。パーセント同一性を決定するためのプロトコールは、当業者の範囲内ではルーチン手順である。包括的方法では、配列を、分子の最初から終わりまで整列させ、個々の残基対のスコアを加えることにより、及び、ギャップペナルティを課すことにより最善のアラインメントを決定する。非限定的な方法は以下を含む：例、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ、例、Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position- Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994)を参照のこと；及び反復改良、例、Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996)を参照のこと。局所的方法では、インプット配列の全部により共有される１つ又は複数の保存モチーフを特定することにより配列を整列させる。非限定的な方法は、例、Ｍａｔｃｈ−ｂｏｘ、例、Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501-509 (1992)を参照のこと；Ｇｉｂｂｓ  ｓａｍｐｌｉｎｇ、例、C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131) Science 208-214 (1993)を参照のこと；Ａｌｉｇｎ−Ｍ、例、Ivo Van Walle et al., Align-M-A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics: 1428-1435 (2004)を参照のこと。
【０１６８】
このように、パーセント配列同一性を従来方法により決定する。例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986及びHenikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-19, 1992を参照のこと。簡単には、２つのアミノ酸配列を整列させ、以下に示す通り、ギャップオープニングペナルティ１０、ギャップエクステンションペナルティー１、及びHenikoff and Henikoff(ibid.)の「ｂｌｏｓｕｍ  ６２」スコアリングマトリクスを使用してアラインメントスコアを最適化する（アミノ酸を標準的な１文字コードにより示す）。
【０１６９】
配列同一性を決定するためのアラインメントスコア
【０１７０】
【表３】
0005658152.tif 000005
【０１７１】
配列同一性を次に計算する：
【数１】
0005658152.tif 000006
【０１７２】
実質的に相同なポリペプチドは、１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失、又は付加を有するとして特徴付けられる。これらの変化は、好ましくは、小さな性質であり、それは、ポリペプチドの折り畳み又は活性に有意な影響を与えない保存的アミノ酸置換（以下を参照のこと）及び他の置換である；小さな欠失は、典型的には１〜約３０アミノ酸まで；及び小さなアミノ末端又はカルボキシ末端伸長、例えばアミノ末端メチオニン残基、約２０〜２５残基までの小さなリンカーペプチド、又は親和性タグなど。
【０１７３】
保存的アミノ酸置換
塩基性：        アルギニン
リジン
ヒスチジン
酸性：          グルタミン酸
アスパラギン酸
極性：          グルタミン
アスパラギン
疎水性：        ロイシン
イソロイシン
バリン
芳香族：        フェニルアラニン
トリプトファン
チロシン
小さい：        グリシン
アラニン
セリン
スレオニン
メチオニン
【０１７４】
２０の標準アミノ酸に加えて、非標準アミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン、６−Ｎ−メチルリジン、２−アミノイソ酪酸、イソバリン、及びα−メチルセリンなど）を、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基について置換してもよい。限定された数の非保存的アミノ酸、遺伝コードによりコードされないアミノ酸、及び非天然アミノ酸を、クロストリジウムのポリペプチドアミノ酸残基について置換してもよい。本発明のポリペプチドは、また、天然に存在しないアミノ酸残基を含むことができる。
【０１７５】
天然に存在しないアミノ酸は、限定はされないが、トランス−３−メチルプロリン、２，４−メタノ−プロリン、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシ−プロリン、Ｎ−メチルグリシン、アロ−スレオニン、メチル−スレオニン、ヒドロキシ−エチルシステイン、ヒドロキシエチルホモ−システイン、ニトロ−グルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、tert−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニル−アラニン、４−アザフェニル−アラニン、及び４−フルオロフェニルアラニンを含む。いくつかの方法が、天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質中に取り込ませるために公知である。例えば、インビトロシステムを用いることができ、それにおいて、ナンセンス突然変異を、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを使用して抑制する。アミノ酸を合成し、ｔＲＮＡをアミノアシル化するための方法が、当技術分野において公知である。ナンセンス突然変異を含むプラスミドの転写及び翻訳を、Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｓ３０抽出物ならびに市販の酵素及び他の試薬を含む無細胞系において行う。タンパク質をクロマトグラフィーにより精製する。例えば、Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 2722, 1991; Ellman et al., Methods Enzymol. 202: 301, 1991; Chung et al., Science 259: 806-9, 1993; and Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10145-9, 1993を参照のこと。第２の方法において、翻訳を、突然変異したｍＲＮＡ及び化学的にアミノアシル化したサプレッサーｔＲＮＡのマイクロインジェクションによりＸｅｎｏｐｕｓ卵母細胞において行う（Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271: 19991-8, 1996）。第３の方法内において、Ｅ．  ｃｏｌｉ細胞を、置換すべき天然アミノ酸（例、フェニルアラニン）の非存在において、及び、所望の天然に存在しないアミノ酸（例、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、又は４−フルオロフェニルアラニン）の存在において培養する。天然に存在しないアミノ酸は、その天然対応物の場所においてポリペプチド中に取り込まれる。Koide et al., Biochem. 33: 7470-6, 1994を参照のこと。天然に存在するアミノ酸残基を、インビトロ化学改変により天然に存在しない種に変換することができる。化学的改変を部位特異的突然変異誘発と組み合わせ、置換の範囲をさらに拡大させることができる（Wynn and Richards, Protein Sci. 2: 395-403, 1993）。
【０１７６】
限定された数の非保存的アミノ酸、遺伝コードによりコード化されないアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、及び非天然アミノ酸を、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基について置換してもよい。
【０１７７】
本発明のポリペプチドにおける必須アミノ酸を、当技術分野において公知の手順（例えば部位特異的突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発など）に従い特定することができる（Cunningham and Wells, Science 244: 1081-5, 1989）。生物学的相互作用の部位を、構造の物理分析により決定することもでき、推定接触部位アミノ酸の突然変異と併せた、核磁気共鳴、結晶学、電子回折、又は光親和性標識などの技術により決定される通りである。例えば、de Vos et al., Science 255: 306-12, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992を参照のこと。必須アミノ酸の同一性を、本発明のポリペプチドの関連成分（例、トランスロケーション成分又はプロテアーゼ成分）との相同性の分析から推測することもできる。
【０１７８】
複数のアミノ酸置換を、突然変異誘発及びスクリーニングの公知の方法、例えば、Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241: 53-7, 1988)又はBowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-6, 1989)により開示される方法などを使用して作製及び試験することができる。簡単には、これらの著者は、ポリペプチド中の２つ又はそれ以上の位置を同時に無作為化し、機能的ポリペプチドについて選択し、次に、突然変異誘発されたポリペプチドをシークエンシングして各位置での許容可能な置換のスペクトルを決定するための方法を開示する。使用できる他の方法は、ファージディスプレイ（例、Lowman et al., Biochem. 30: 10832-7, 1991; Ladner et al., U.S. Patent No. 5,223,409; Huse, WIPO Publication WO 92/06204）及び領域特異的突然変異誘発（Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7: 127, 1988）を含む。
【０１７９】
複数のアミノ酸置換を、突然変異誘発及びスクリーニングの公知の方法、例えば、Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241: 53-7, 1988)又はBowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-6, 1989)により開示される方法などを使用して作製及び試験することができる。簡単には、これらの著者は、ポリペプチド中の２つ又はそれ以上の位置を同時に無作為化し、機能的ポリペプチドについて選択し、次に、突然変異誘発されたポリペプチドをシークエンシングして各位置での許容可能な置換のスペクトルを決定するための方法を開示する。使用できる他の方法は、ファージディスプレイ（例、Lowman et al., Biochem. 30: 10832-7, 1991; Ladner et al., U.S. Patent No. 5,223,409; Huse, WIPO Publication WO 92/06204）及び領域特異的突然変異誘発（Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7: 127, 1988）を含む。
【０１８０】
実施例の要約
実施例１．ＬＨＡ骨格構築物の調製
実施例２．ＬＨＮ／Ａ−ＥＧＦｖ１融合タンパク質の構築
実施例３．ＬＨＮ／Ａ−ＣＴ−ＥＧＦ  ｖ１融合タンパク質の発現及び精製
実施例４．ＥＧＦ結合親和性アッセイ
実施例５．ＥＧＦ結合親和性アッセイ
実施例６．慢性気管支炎を患う患者の処置
実施例７．ソマトスタチンアナログに対して抵抗性のある末端肥大症患者を処置するための方法
実施例８．神経内分泌腫瘍細胞を抑制するための方法
実施例９．ＥＧＦ受容体活性化アッセイにおけるＥＧＦ及びＥＧＦ融合タンパク質の比較
実施例１０．ＥＧＦ受容体活性化アッセイにおけるＥＧＦ、ＥＧＦムテイン、及びＥＧＦムテイン融合タンパク質の比較
実施例１１．鼻炎を患う患者の処置
実施例１２．喘息を患う患者の処置
実施例１３．ＣＯＰＤを患う患者の処置
実施例１４．喘息を患う患者の処置
実施例１５．大腸癌を患う患者の処置
実施例１６．乾癬を患う患者の処置
実施例１７．湿疹を患う患者の処置
実施例１８．結腸直腸癌を患う患者の処置
実施例１９．前立腺癌を患う患者の処置
実施例２０．肺非小細胞癌を患う患者の処置
実施例２１．乳癌を患う患者の処置
【０１８１】
配列番号の要約
配列番号１．天然に存在するヒト上皮増殖因子（ＥＧＦ）についてのアミノ酸配列
配列番号２．ＬＨＡのＤＮＡ配列
配列番号３．ＬＨＢのＤＮＡ配列
配列番号４．ＬＨＣのＤＮＡ配列
配列番号５．ＬＨＤのＤＮＡ配列
配列番号６．ＥＧＦバリアントＨ１６Ｎのタンパク質配列
配列番号７．ＥＧＦバリアントｖ１のタンパク質配列
配列番号８．ＥＧＦバリアントＨ１６Ｑのタンパク質配列
配列番号９．ＥＧＦバリアントｖ２のタンパク質配列
配列番号１０．ＥＧＦバリアントＷ４９Ｌのタンパク質配列
配列番号１１．ＥＧＦバリアントｖ３のタンパク質配列
配列番号１２．ＥＧＦバリアントＷ４９Ｉのタンパク質配列
配列番号１３．ＥＧＦバリアントｖ４のタンパク質配列
配列番号１４．ＥＧＦバリアントＷ４９Ｖのタンパク質配列
配列番号１５．ＥＧＦバリアントｖ５のタンパク質配列
配列番号１６．ＥＧＦバリアントＷ４９Ａのタンパク質配列
配列番号１７．ＥＧＦバリアントｖ６（Ｇ１２Ｑ）のタンパク質配列
配列番号１８．ＥＧＦバリアントＷ４９Ｇのタンパク質配列
配列番号１９．ＥＧＦバリアントｖ７（Ｈ１６Ｄ）のタンパク質配列
配列番号２０．ＥＧＦバリアントＷ４９Ｓのタンパク質配列
配列番号２１．ＥＧＦバリアントｖ８（Ｙ１３Ｗ）のタンパク質配列
配列番号２２．ＥＧＦバリアントＷ４９Ｔのタンパク質配列
配列番号２３．ＥＧＦバリアントｖ９（Ｑ４３Ａ）のタンパク質配列
配列番号２４．ＥＧＦバリアントＷ４９Ｎのタンパク質配列
配列番号２５．ＥＧＦバリアントｖ１０（Ｈ１６Ａ）のタンパク質配列
配列番号２６．ＥＧＦバリアントＷ４９Ｑのタンパク質配列
配列番号２７．ＥＧＦバリアントｖ１１（Ｌ１５Ａ）のタンパク質配列
配列番号２８．ＥＧＦバリアントＨ１６Ｎ＿Ｗ４９Ｌのタンパク質配列
配列番号２９．ＥＧＦバリアントｖ１２（Ｖ１９Ｅ）のタンパク質配列
配列番号３０．ＥＧＦバリアントＨ１６Ｑ＿Ｗ４９Ｌのタンパク質配列
配列番号３１．ＥＧＦバリアントｖ１３（Ｖ３４Ｄ）のタンパク質配列
配列番号３２．ＥＧＦバリアントＨ１６Ｎ＿Ｗ４９Ｉのタンパク質配列
配列番号３３．ＬＨＡ−ＥＧＦｖ１（Ｘａ活性化）のタンパク質配列
配列番号３４．ＥＧＦバリアントＨ１６Ｑ＿Ｗ４９Ｉのタンパク質配列
配列番号３５．ＬＨＡ−ＥＧＦｖ２（Ｘａ活性化）のタンパク質配列
配列番号３６．ＥＧＦバリアントＨ１６Ｎ＿Ｗ５０Ａのタンパク質配列
配列番号３７．ＬＨＡ−ＥＧＦｖ３のタンパク質配列
配列番号３８．ＥＧＦバリアントＨ１６Ｑ＿Ｗ５０Ａのタンパク質配列
配列番号３９．ＬＨＡ−ＥＧＦｖ４のタンパク質配列
配列番号４０．ＥＧＦバリアントＨ１６Ｎ＿Ｗ４９Ｌ＿Ｗ５０Ａのタンパク質配列
配列番号４１．ＬＨＡ−ＥＧＦｖ５のタンパク質配列
配列番号４２．ＥＧＦバリアントＨ１６Ｑ＿Ｗ４９Ｌ＿Ｗ５０Ａのタンパク質配列
配列番号４３．ＬＨＡ−ＥＧＦｖ６のタンパク質配列
配列番号４４．ＥＧＦバリアントＨ１６Ｎ＿Ｗ４９Ｉ＿Ｗ５０Ａのタンパク質配列
配列番号４５．ＬＨＣ−ＥＧＦｖ７のタンパク質配列
配列番号４６．ＥＧＦバリアントＨ１６Ｑ＿Ｗ４９Ｉ＿Ｗ５０Ａのタンパク質配列
配列番号４７．ＬＨＣ−ＥＧＦｖ８のタンパク質配列
配列番号４８．ＥＧＦバリアントＨ１６Ｎ＿Ｗ４９Ｌ＿Ｗ５０Ａ＿Ｅ２４Ｇのタンパク質配列
配列番号４９．ＬＨＣ−ＥＧＦｖ９のタンパク質配列
配列番号５０．ＥＧＦバリアントＨ１６Ｎ＿Ｗ４９Ｌ＿Ｗ５０Ａ＿Ｅ２４Ｇ＿Ａ２５Ｔのタンパク質配列
配列番号５１．ＬＨＣ−ＥＧＦｖ１０のタンパク質配列
配列番号５２．ＥＧＦバリアントＨ１６Ｎ＿Ｗ４９Ｌ＿Ｗ５０Ａ＿Ｅ２４Ｇ＿Ａ２５Ｓのタンパク質配列
配列番号５３．ＬＨＣ−ＥＧＦｖ１１のタンパク質配列
配列番号５４．ＥＧＦバリアントＨ１６Ｎ＿Ｗ４９Ｌ＿Ｗ５０Ａ＿Ｅ２４Ｇ＿Ａ２５Ｔ＿Ｋ２８Ｒのタンパク質配列
配列番号５５．ＬＨＣ−ＥＧＦｖ１２のタンパク質配列
配列番号５６．ＥＧＦバリアントＨ１６Ｎ＿Ｗ４９Ｌ＿Ｗ５０Ａ＿Ｅ２４Ｇ＿Ａ２５Ｔ＿  Ｋ２８Ｒ＿Ｓ４Ｐのタンパク質配列
配列番号５７．ＬＨＣ−ＥＧＦｖ１３のタンパク質配列
配列番号５８．ＥＧＦバリアントＨ１６Ｎ＿Ｗ４９Ｌ＿Ｗ５０Ａ＿Ｅ２４Ｇ＿Ａ２５Ｔ＿  Ｋ２８Ｒ＿Ｓ４Ｐ＿Ｅ５Ｋのタンパク質配列
配列番号５９．ＬＨＢ−ＥＧＦｖ１のタンパク質配列
配列番号６０．ＥＧＦバリアントｖ３のタンパク質配列
配列番号６１．ＬＨＢ−ＥＧＦｖ５のタンパク質配列
配列番号６２．破傷風ＬＨＮ−ＥＧＦｖ１のタンパク質配列
配列番号６３．ＬＨＤ−ＥＧＦｖ６（プロテアーゼ感受性部位）のタンパク質配列
配列番号６４．ＬＨＤ−ＥＧＦｖ３のタンパク質配列
配列番号６５．ＬＨＤ−ＥＧＦｖ１１のタンパク質配列
配列番号６６．Ｍ２６−ＩｇＡ１−ＨＣ−ＥＧＦｖ３のタンパク質配列
配列番号６７．Ｍ２６−ＩｇＡ１−ＨＣ−ＥＧＦｖ１１のタンパク質配列
配列番号６８．破傷風ＬＨＮ−ＥＧＦｖ３のタンパク質配列
配列番号６９．ＬＨＡ−ＣＰ−ＥＧＦｖ２  のタンパク質配列
配列番号７０．ＬＨＤ−ＥＧＦｖ２のタンパク質配列
配列番号７１．ＬＨＣ−ＣＰ−ＥＧＦｖ２のタンパク質配列
配列番号７２．ＬＨＣ−ＥＧＦｖ３のタンパク質配列
配列番号７３．ＥＧＦバリアントｖ３のタンパク質配列
【図面の簡単な説明】
【０１８２】
【図１】図１は、実施例１０において生成されたデータを例示しており、それにおいてＥＧＦ、ＥＧＦムテイン、又はＥＧＦ融合タンパク質が、ＥＧＦ受容体を活性化するその能力について（増加濃度で）試験されている。低いｐＥＣ５０値は、比較的弱い受容体活性化を示す。
【図２】図２は、ＥＧＦ−ＥＧＦＲ結合の３Ｄモデルを例示しており、それにおいて結合界面１（ＥＧＦの残基３１〜４０）、結合界面２（ＥＧＦの残基４１〜４５）、及び前縁（ＥＧＦの残基４８〜５１と１５〜１７との組み合わせ）が確認される。
【０１８３】
実施例１．ＬＨＡ骨格構築物の調製
以下の手順によって、マルチドメインタンパク質発現のための発現骨格としての使用のためのクローンが作製される。この実施例は、血清型Ａベースのクローン（配列番号２）の調製に基づくが、手順及び方法は、他のＬＨＮ血清型、例えば血清型Ｂ（配列番号３）、血清型Ｃ（配列番号４）、及び血清型Ｄ（配列番号５）などに等しく適用可能である。
【０１８４】
クローニングベクター及び発現ベクターの調製
ｐＣＲ  ４（Invitrogen）は、  簡単な構築物確認のためのベクター内の制限配列及び隣接シークエンシングプライマー部位の欠如のため選ばれた、選ばれた標準クローニングプライマーである。発現ベクターは、構築物の挿入のために正確な方向でマルチクローニングサイト内に所望の制限配列（ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ−ＰｓｔＩ−ＳｐｅＩ−ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ）を有するｐＥＴ（Novagen）発現ベクターに基づく。発現ベクターのフラグメントを除去し、非可動性プラスミドを作製しており、種々の異なる融合タグが挿入され、精製の選択肢を増加させている。
【０１８５】
ＬｃＡの調製
ＤＮＡ配列を、種々の逆翻訳ソフトウェアツール（例えば、Backtranslationツールv2.0（Entelechon））の１つを使用し、ＬＣ／Ａアミノ酸配列（無償で利用可能なデータベース供給源、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＰ１０８４５などから得られる）の戻し翻訳により設計する。ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ認識配列を、正確なリーディングフレームを保持する配列のそれぞれ５’及び３’末端に組み入れる。ＤＮＡ配列を、戻し翻訳の間に組み入れられた制限酵素切断配列についてスクリーニングする（ソフトウェア、例えばSeqBuilder, DNASTAR Inc.などを使用する）。クローニングシステムにより要供されるものに共通して見出される任意の切断配列を、Backtranslationツールにより、提示されたコード配列から除去し、Ｅ．  ｃｏｌｉコドン使用が保持されることを確実とする。Ｅ．  ｃｏｌｉコドン使用を、ソフトウェアプログラム、例えばGraphical Codon Usage Analyser（Geneart）などの参照により評価し、%ＧＣ含量及びコドン使用率を、公開されたコドン使用表（例えば、GenBank Release 143, September 13 2004）の参照により評価する。ＬＣ／Ａオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むこの最適化されたＤＮＡ配列を、次に、商業的に合成し（例えば、Entelechon、Geneart、又はSigma-Genosysによる）、ｐＣＲ  ４ベクター中に提供する。
【０１８６】
ＨＮ／Ａインサートの調製
ＤＮＡ配列を、種々の逆翻訳ソフトウェアツール（例えば、Backtranslationツールv2.0（Entelechon））の１つを使用し、ＨＮ／Ａアミノ酸配列（無償で利用可能なデータベース供給源、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＰ１０８４５などから得られる）の戻し翻訳により設計する。Ｎ末端にＰｓｔＩ制限配列及びＣ末端にＸｂａＩ−終止コドン−ＨｉｎｄＩＩＩを付加し、正確なリーディングフレームが保持されることを確実とする。ＤＮＡ配列を、戻し翻訳の間に組み入れられた制限酵素切断配列についてスクリーニングする（ソフトウェア、例えばSeqBuilder, DNASTAR Inc.などを使用する）。クローニングシステムにより要供されるものに共通して見出される任意の配列を、Backtranslationツールにより、提示されたコード配列から除去し、Ｅ．  ｃｏｌｉコドン使用が保持されることを確実とする。Ｅ．  ｃｏｌｉコドン使用を、ソフトウェアプログラム、例えばGraphical Codon Usage Analyser（Geneart）などの参照により評価し、%ＧＣ含量及びコドン使用率を、公開されたコドン使用表（例えば、GenBank Release 143, September 13 2004）の参照により評価する。この最適化されたＤＮＡ配列を、次に、商業的に合成し（例えば、Entelechon、Geneart、又はSigma-Genosysによる）、ｐＣＲ  ４ベクター中に提供する。
【０１８７】
ドメイン間（ＬＣ−ＨＮリンカー）の調製
ＬＣ−ＨＮリンカーを、第１の原理から、リンカー用の既存の配列情報をテンプレートとして使用して設計することができる。例えば、血清型Ａリンカー（この場合において、ＬＣとＨＮとの間のジスルフィド架橋のシステイン間に存在するドメイン間ポリペプチド領域と定義される）は、配列ＶＲＧＩＩＰＦＫＴＫＳＬＤＥＧＹＮＫＡＬＮＤＬを有する。この配列情報は、利用可能なデータベース供給源、例えばＧｅｎＢａｎｋ（アクセッションナンバーＰ１０８４５）などから無償で利用可能である。代替リンカーを使用することができ、例えば、グリシン−セリンリンカー（ＧＧＧＧＳ３）で構成される。特定のプロテアーゼ切断部位の生成のために、第Ｘａ因子（ＩＥＧＲ又はＩＤＧＲ）のための天然認識配列を、例えば、改変配列
【表４】
0005658152.tif 000007
において使用することができ、エンテロキナーゼ（ＤＤＤＤＫ）の軽鎖のための認識配列を、例えば、活性化ループ中に挿入し、配列
【表５】
0005658152.tif 000008
を生成することができる。
【０１８８】
種々の逆翻訳ソフトウェアツール（例えば、Backtranslationツールv2.0（Entelechon））の１つを使用し、リンカー領域をコードするＤＮＡ配列を決定する。ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ及びＰｓｔＩ／ＸｂａＩ／終止コドン／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素配列を、正確なリーディングフレームにおいていずれかの端に組み入れる。ＤＮＡ配列を、戻し翻訳の間に組み入れられた制限酵素切断配列についてスクリーニングする（ソフトウェア、例えばSeqBuilder, DNASTAR Inc.などを使用する）。クローニングシステムにより要供されるものに共通して見出される任意の配列を、Backtranslationツールにより、提示されたコード配列から除去し、Ｅ．  ｃｏｌｉコドン使用が保持されることを確実とする。Ｅ．  ｃｏｌｉコドン使用を、ソフトウェアプログラム、例えばGraphical Codon Usage Analyser（Geneart）などの参照により評価し、%ＧＣ含量及びコドン使用率を、公開されたコドン使用表（例えば、GenBank Release 143, September 13 2004）の参照により評価する。この最適化されたＤＮＡ配列を、次に、商業的に合成し（例えば、Entelechon、Geneart、又はSigma-Genosysによる）、ｐＣＲ  ４ベクター中に提供する。ｐＣＲ  ４ベクターからリンカーをクローニングすることが望ましい場合、ベクターをＢａｍＨＩ  ＋  ＳａｌＩ又はＰｓｔＩ  ＋  ＸｂａＩのいずれかの組み合わせ制限酵素を用いて切断する。この切断されたベクターは、次に、（配列番号２）からのＬＣ  ＤＮＡ（ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩを用いて切断）又はＨＮ  ＤＮＡ（ＰｓｔＩ／ＸｂａＩを用いて切断）のいずれかの挿入及びライゲーションのためのレシピエントベクターとしての役割を果たす。一旦、ＤＮＡをコードするＬＣ又はＨＮが、リンカーＤＮＡの上流又は下流に挿入されれば、全ＬＣリンカー又はリンカーＨＮ  ＤＮＡフラグメントを単離し、骨格クローンに移すことができる。
【０１８９】
骨格クローンの組み立て及び確認
ＬＣリンカー又はリンカーＨＮを、それぞれＢａｍＨＩ／Ｐｓｔ１もしくはＳａｌ１／Ｘｂａ１制限酵素又はＸｈｏＩ／ＮｏｔＩを使用してｐＣＲ  ４クローニングベクターから切り出す。ＬＨＮ／Ａ（配列番号２）を含むｐＥＴ発現ベクターを、同じ酵素を用いて消化し、しかし、また、追加の注意として南極ホスファターゼを用いて処置し、再環状化を防止する。ＬＣリンカー又はリンカーＨＮ領域及びｐＥＴベクター骨格をゲル精製する。精製されたインサート及びベクター骨格を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用して一緒にライゲーションし、産物を、ＴＯＰ１０細胞を用いて形質転換し、それを、次に、ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ又はＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ又はＸｈｏｉ／ＮｏｔＩ制限酵素を使用してＬＣリンカー又はリンカーＨＮ挿入についてスクリーニングし、最終的な骨格が正しいことを確実とする。ＯＲＦ  ＤＮＡの完全性をシークエンシングにより確かめる。
【０１９０】
実施例２．ＬＨＮ／Ａ−ＥＧＦｖ３発現ベクターの構築
以下の手順によって、マルチドメイン融合発現のための発現構築物としての使用のためのクローンを作製する。この実施例は、ＥＧＦｖ３融合タンパク質（例、配列番号３７）の調製に基づくが、手順及び方法は、本発明の全てのＥＧＦバリアント、ならびに本発明の他のＬＨＮ血清型、例えば血清型Ｂ（配列番号３）、血清型Ｃ（配列番号４）、及び血清型Ｄ（配列番号５）などに等しく適用可能である。
【０１９１】
スペーサー−ＥＧＦｖ３インサートの調製
活性化スペーサー
ＨＮドメインのＣ末端でのＥＧＦバリアント配列の提示のために、ＤＮＡ配列を、スペーサー及び標的成分（ＴＭ）に隣接するように設計し、骨格クローン（配列番号１）の取り込みを可能にする。ＤＮＡ配列をＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ−ＰｓｔＩ−ＸｂａＩ−スペーサー−ＥＧＦｖ３−終止コドン−ＨｉｎｄＩＩＩとして配置することができる。ＤＮＡ配列を、種々の逆翻訳ソフトウェアツール（例えば、EditSeqベストＥ．  ｃｏｌｉ逆翻訳（DNASTAR Inc.）、又はBacktranslationツールv2.0（Entelechon））の１つを使用して設計することができる。一旦ＴＭ  ＤＮＡが設計されれば、好ましいスペーサーをコードするために要求される追加のＤＮＡをインシリコで作製する。正確なリーディングフレームがスペーサー、ＥＧＦｖ３、及び制限配列のために保持されること、ＸｂａＩ配列が塩基ＴＣ（ＤＡＭメチル化をもたらしうる）により先行されないことを確実とすることが重要である。ＤＮＡ配列を、組み入れられた制限配列についてスクリーニングし、任意の追加の配列を残りの配列から手動で除去し、共通のＥ．  ｃｏｌｉコドン使用が保持されることを確実とする。Ｅ．  ｃｏｌｉコドン使用を、ソフトウェアプログラム、例えばGraphical Codon Usage Analyser（Geneart）などの参照により評価し、%ＧＣ含量及びコドン使用率を、公開されたコドン使用表（例えば、GenBank Release 143, September 13 2004）の参照により評価する。この最適化されたＤＮＡ配列を、次に、商業的に合成し（例えば、Entelechon、Geneart、又はSigma-Genosysによる）、ｐＣＲ  ４ベクター中に提供する。
【０１９２】
骨格中へのスペーサーＥＧＦｖ３の挿入
骨格構築物（配列番号１）を使用したＬＣ−リンカー−ＨＮ−スペーサー−ＥＧＦｖ３及びＥＧＦｖ３  ＴＭ（配列番号７３）をコードする新たに合成されたｐＣＲ  ４−スペーサー−ＴＭベクターを作製するために、以下の２ステップ方法を用いる。最初に、ＨＮドメインを、制限酵素ＰｓｔＩ及びＸｂａＩを使用して骨格クローンから切り取り、同様に消化されたｐＣＲ  ４−スペーサー−ＥＧＦｖ３ベクター中にライゲーションする。これによってｐＣＲ  ４においてＨＮ−スペーサー−ＥＧＦｖ３  ＯＲＦを作製し、それは、制限酵素ＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを使用し、同様に切断された骨格又は発現構築物中への続くライゲーションのためにベクターから切り取ることができる。最終的な構築物は、発現用の発現ベクター中へのトランスファーのためにＬＣ−リンカー−ＨＮ−スペーサー−ＥＧＦｖ３  ＯＲＦを含み、配列（例、配列番号３７）の融合タンパク質をもたらす。
【０１９３】
制限酵素を用いたスクリーニングは、最終的な骨格が正確であることを確実とするために十分である。なぜなら、全ての成分が、合成中又はＰＣＲ増幅後のいずれかに、既にシークエンシングされて確認されているからである。しかし、一部の成分の骨格中へのサブクローニングの間に、そこでは同様のサイズフラグメントが除去及び挿入され、正確な挿入を確認するために小さな領域のシークエンシングが要求される。
【０１９４】
実施例３．ＬＨＮ／Ａ−ＣＴ−ＥＧＦ  ｖ３融合タンパク質の発現及び精製
この実施例は、第Ｘａ因子により活性化されるＣＴ−ＥＧＦ−Ａ融合物の調製に基づくが、手順及び方法は、本発明の任意の他の融合タンパク質に等しく適用可能である。
【０１９５】
ＬＨＮ／Ａ−ＣＴ−ＥＧＦ  ｖ３融合タンパク質の発現
第Ｘａ因子タンパク質により活性化されるＣＴ−ＥＧＦ  ｖ３−Ａ融合物の発現は、以下のプロトコールを使用して達成される。２５０mlフラスコ中の０．２%グルコサミン及び３０μg/mlカナマイシンを含む１００mlの改変ＴＢに、ＣＴ−ＥＧＦ  ｖ３−Ａ融合物からの単一コロニーを用いて接種する。培養物を３７℃、２２５rpmで１６時間にわたり増殖させる。２Ｌフラスコ中の０．２%グルコサミン及び３０μg/mlカナマイシンを含む１Ｌの改変ＴＢに、１０mlの一晩培養物を用いて接種する。培養物を、３７℃で、ＯＤ６００nmが約０．５に達するまで増殖させ、この時点で温度を１６℃まで低下させる。１時間後、培養物を、１mM  ＩＰＴＧを用いて誘導させ、さらに１６時間にわたり１６℃で増殖させる。
【０１９６】
ＣＴ−ＥＧＦ  ｖ３−Ａ融合物の精製
３５mlの５０mM  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．２、２００mM  ＮａＣｌ、及び約１０gのＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞ペーストを含むファルコンチューブを解凍する。細胞ペーストを、氷上で、３０秒間オン、３０秒間オフの１０サイクル、パワー２２ミクロンで超音波処理し、サンプルを冷却したままにすることを確実とする。溶解した細胞を１８  ０００rpm、４℃、３０秒間にわたりスピンする。上清を、５０mM  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．２、２００mM  ＮａＣｌを用いて平衡化した０．１M  ＮｉＳＯ４充填キレートカラム（２０〜３０mlカラムが十分である）  上にロードする。４０及び１００mMイミダゾールの段階勾配を使用し、非特異的に結合したタンパク質を洗い流し、２００mMイミダゾールを用いて融合タンパク質を溶出する。溶出した融合タンパク質を、５Ｌの５０mM  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．２、２００mM  ＮａＣｌに対して４℃で一晩透析し、透析した融合タンパク質のＯＤを測定する。１mg当たり１０mgの第Ｘａ因子を加え、２５℃で静置して一晩インキュベートする。５０mM  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．２、２００mM  ＮａＣｌを用いて平衡化した０．１Ｍ  ＮｉＳＯ４充填キレートカラム（２０〜３０mlカラムが十分である）  上に負荷する。カラムをベースラインまで５０mM  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．２、２００mM  ＮａＣｌを用いて洗浄する。４０及び１００mMイミダゾールの段階勾配を使用し、非特異的に結合したタンパク質を洗い流し、２００mMイミダゾールを用いて融合タンパク質を溶出する。溶出した融合タンパク質を、５Lの５０mM  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．２、２００mM  ＮａＣｌに対して４℃で一晩透析し、融合物を約２mg/mlまで濃縮させ、サンプルを分注し、−２０℃で凍結させる。精製タンパク質を、ＯＤ、ＢＣＡ、及び精製分析を使用して試験する。
【０１９７】
実施例４．ＥＧＦ結合親和性アッセイ
ＥＧＦバリアントの結合親和性をｗｔＥＧＦと比較するために、内因性ＥＧＦ受容体（ＥｒｂＢ：−  ＥＧＦＲ）を欠く細胞（ＮＲ６、マウス３Ｔ３由来線維芽細胞株；ＷＴ−ＥＧＦ）を、野生型ヒトＥＧＦＲを用いて安定的にトランスフェクトし、ＷＴ＋ＥＧＦを生成する。結合アッセイの前に、コンフルエントＷＴ−ＥＧＦ細胞を、ヴェルセンを用いて組織培養プレートから剥離させた。ＥＧＦ競合結合を２つの方法で測定し、平衡に達したことを保証した：５×１０４個のＮＲ６  ＷＴ細胞を、Ａｌｅｘａ−４８８標識ＥＧＦ野生型と３０分間にわたり４℃でインキュベートした。増加濃度の非標識ＥＧＦ野生型又は突然変異体を加え、サンプルを追加の６時間にわたり４℃で、一定で混合しながらインキュベートした。あるいは、増加濃度の非標識ＥＧＦ野生型及び突然変異体を、最初に細胞に３０分間にわたり４℃で加え、Ａｌｅｘａ−４８８  ＥＧＦ野生型を追加の６時間にわたり４℃で加えた。細胞表面Ａｌｅｘａ−４８８  ＥＧＦ野生型標識の蛍光強度を、フローサイトメトリーにより測定した。結合アッセイを、１mg/ml  ＢＳＡ（ｐＨ  ７．４）を添加したＰＢＳ中で、リガンド欠乏を無視可能な条件下で実施した。競合結合曲線を、４点結合等式を使用して適合した。標準偏差は、少なくとも３回、異なる日に、２つの異なるタンパク質調製物を使用して実施された反復した結合実験を表わす。
【０１９８】
実施例５．ＥＧＦ結合親和性アッセイ
ＥＧＦ受容体についてＥＧＦバリアントの結合親和性を比較するために、親和性を、パラホルムアルデヒド固定Ａ４３１細胞への結合について１２５Ｉ−ｒＥＧＦ（組換えＥＧＦ）とのその競合を測定することにより決定する。リガンドと受容体内在化プロセスをこのように阻害するシステムである。純粋なｒＥＧＦをスタンダードとして使用した。Ａ４３１細胞を、コンフルエントまで９６ウェルプレート中で増殖させ、次に、アッセイの日にＰＢＳ中の３%パラホルムアルデヒドを用いて固定した。ＥＧＦバリアント及びｒＥＧＦを、０．１%  ＢＳＡを含むＰＢＳ中の１．０nM  １２５Ｉ−ｒＥＧＦを用いて連続希釈した。インキュベーションを、次に、各ウェルを、０．１５mg/ml  ＢＳＡを含むＰＢＳを用いて３回洗浄する前に、３７℃で２時間にわたり行った。最後に、ウェルを折って離し、ガンマカウンターで直接的にカウントした。
【０１９９】
実施例６．慢性気管支炎を患う患者の処置
慢性気管支炎を患う６２歳の男性（ＦＥＶ１が正常な予測値の８０%まで低下；１日の喀痰容積３０ml）が、彼のＧＰで呈した。吸入ステロイドを用いた処置にもかかわらず、患者は、持続的な息切れのため、日常の仕事を実施する際に困難を呈した。ＧＰは、６ヶ月治療単位で、本発明のＥＧＦムテイン融合タンパク質をネブライザー形態で処方し、８０μgを月１回摂取させた。医師との話し合いに続き、患者は、広範な適したデバイスから、彼らの個人的な状況のために最も適切なネブライザーを選択する。ＥＧＦベースの融合タンパク質の１回投与後、低下した喀痰容積（〜１５ml）及びＦＥＶ１における改善（〜９０%）を経験する。
【０２００】
実施例７．ソマトスタチンアナログに対して抵抗性のある末端肥大症患者を処置するための方法
ソマトスタチンアナログ（ＳＳＡ）による循環ＧＨ及びＩＧＦ−１の６年間の成功裏の制御後、６０歳の末端肥大症の催事会場タロット占い師が、多汗症の結果として、増加する明らかな油性肌及びまた顕著な体臭を報告する。彼女は、グルコース不耐性であり、上昇した循環ＩＧＦ−１レベルを有したことが見出され、ＳＳＡ投与量を高めることによってこれらは制御されない。彼女は、本発明のＥＧＦムテイン融合タンパク質の局所注射により処置される。１４日間以内に、患者は発汗における有意な低下を報告する。続く１ヶ月にわたり、彼女の油性肌は正常に戻り、この時に、彼女のＧＨ及びＩＧＦ−１レベルは両方とも正常の範囲内にある。この状況は次の５年間にわたり残る。
【０２０１】
実施例８．神経内分泌腫瘍細胞を抑制するための方法
地域のバドミントンチームの３５歳の男性メンバーが、腰痛のために脊椎Ｘ線を受ける。コンサルタントは異常な骨増殖に気付き、質問時に、男性は、睡眠時無呼吸の増加する発生及びまた増加する油性肌を報告する。医師は、循環ＩＧＦ−１の測定を勧め、これらは上昇していることが見出される。続く試験によって、また、正常以上のＧＨレベルが示され、頭蓋ＭＲＩスキャンを行う。これは、９mm直径の下垂体腫瘍を示す。患者を、注射により本発明のＥＧＦムテイン融合タンパク質を用いて処置する。１週間の間隔で、循環ＩＧＦ−１レベルを測定し、最初の測定ではより低く、続く６週間にわたり正常の１５%超まで着実に低下することが分かる。循環ＧＨのレベルが、この時点で正常であることが見出される。週２回のＩＧＦ−１測定を伴う投薬でのさらなる用量は、このホルモンが正常の上限で安定化したことを示す。第２の処置から６週間後、頭蓋ＭＲＩスキャンによって腫瘍の６ｍｍまでの収縮が明らかにされる。治療を、低下させた投与量で、２ヶ月間間隔で継続し、ＩＧＦ−１及びＧＨレベルを７週目に測定する。これらは両方とも正常の範囲において安定しており、睡眠時無呼吸及び油性肌は、現在は存在しない。第１の処置に続く１年目での脊椎Ｘ線によって、最初の所見から増加した骨サイズは示されない。
【０２０２】
実施例９．ＥＧＦ受容体活性化アッセイにおけるＥＧＦ及びＥＧＦ融合タンパク質の比較
Ａ４３１細胞（１×１０５）を、増加濃度のＥＧＦ、ＳＸＮ１００５１６（ＬＨＮ／Ａ−ＥＧＦ）、ＳＸＮ１００９８８（ＬＨＮ／Ｂ−ＥＧＦ）、又はＳＸＮ１００５０１（ＬＨＮ／Ｃ−ＥＧＦ）を用いて２０分間にわたり３７℃でインキュベートした。
【０２０３】
細胞を、氷冷ＰＢＳを用いて洗浄し、溶解させた。溶解物を、リン酸化ＥｒｂＢ１受容体をサンドイッチイムノアッセイ及びＭＳＤプラットフォームを使用して測定する前に、１：１０希釈した。
【０２０４】
【表６】
0005658152.tif 000009
【０２０５】
実施例１０．ＥＧＦ受容体活性化アッセイにおけるＥＧＦ、ＥＧＦムテイン、及びＥＧＦムテイン融合タンパク質の比較
Ａ４３１細胞（１×１０５）を、増加濃度のシンタキシンＥＧＦムテイン融合物又はＥＧＦを用いて、２０分間にわたり３７℃で３通りのエッペンドルフチューブ中でインキュベートした。洗浄後、細胞を溶解させ、溶解物を、ＥＧＦ受容体のリン酸Ｙ１０６８に特異的な捕捉抗体を用いてコーティングされたＭＳＤ  ９６ウェルプレートに加えた。
【０２０６】
インキュベーションに続き、プレートを洗浄し、電気化学発光MSD SULFO-TAGを用いて標識された抗リン酸ＥＧＦ受容体抗体とインキュベートした。ＭＳＤリード緩衝液をプレートに加え、プレート（ＲＬＵ）の各ウェルから放出された光をMSD sector imager 6000上で測定した。
【０２０７】
試験された分子及びシンタキシン
【表７】
0005658152.tif 000010
結果（図１を参照）
【表８】
0005658152.tif 000011
【０２０８】
ＳＸＮ１０１１８１のｐＥＣ５０において、ＥＧＦと比較し、有意差はない（ｐ＞０．０５、ｔ検定）。
【０２０９】
効力（ｐＥＣ５０）における対数単位差を、ＥＧＦ（８．７４±０．０４）とＥＧＦｖ３（７．６１）の間で観察した。
【０２１０】
実施例１１．鼻炎を患う患者の処置
年１回、典型的な季節性アレルギー性鼻炎の症状を呈する２４歳の女性を、本発明のＥＧＦムテイン融合タンパク質を用いた局所投与により（点鼻薬により）処置する。２〜７日以内に、患者は症状の鎮静を報告する。効果は、アレルギー季節の残りにわたり持続する。
【０２１１】
実施例１２．喘息を患う患者の処置
慢性喘息のため低下したクオリティ・オブ・ライフを伴う４３歳の女性を、本発明のＥＧＦムテイン融合タンパク質の全身注射を用いて処置する。３〜７日以内に、患者の症状がなくなり、患者はより自由に呼吸できるようになる。効果は２〜３ヶ月間にわたり持続し、その時、処置を繰り返し、患者のクオリティ・オブ・ライフに対する改善が持続する。
【０２１２】
実施例１３．ＣＯＰＤを患う患者の処置
効果的に呼吸することができないため低下したクオリティ・オブ・ライフを有する慢性閉塞性肺疾患を伴う６４歳の男性を、本発明のＥＧＦムテイン融合タンパク質の局所投与により（エアロゾルにより）処置する。２〜５日以内に、患者の過剰な気道粘液の大部分がなくなり、より自由に呼吸できるようになる。効果は２〜３ヶ月間にわたり持続し、そこで処置を繰り返し、患者のクオリティ・オブ・ライフに対する改善が持続する。
【０２１３】
実施例１４．喘息を患う患者の処置
ライノウイルス感染症のため喘息症状の重度の悪化を伴う２５歳の男性を、本発明のＥＧＦムテイン融合タンパク質を用いた局所投与（エアロゾルによる吸入）により処置する。２〜５日以内に、患者は低下した気道粘液を報告し、悪化が鎮まる。
【０２１４】
実施例１５．大腸癌を患う患者の処置
黄疸を伴う３２歳の男性が、大腸まで広がった進行性の肝細胞癌と診断される。患者を、本発明のＥＧＦムテイン融合タンパク質の全身注射を用いて処置する。２〜３週間以内に、転移した腫瘍の増殖が止まっている。処置から２ヶ月後、腫瘍のサイズが減少し、黄疸がなくなっている。第２の処置の適用によって、腫瘍サイズの減少が継続し、症状の軽減が維持される。
【０２１５】
実施例１６．乾癬を患う患者の処置
乾癬と診断され、彼の背中及び腕の罹患部位の掻痒及び引っ掻きから有意な身体的な不快感を経験している３２歳の男性患者を、本発明のＥＧＦムテイン融合タンパク質を用いた局所投与により処置する。２〜７日以内に、症状が緩和され、効果が１〜２ヶ月間にわたり続く。第２の処置の適用によって、症状の軽減が維持される。
【０２１６】
実施例１７．湿疹を患う患者の処置
湿疹と診断され、彼の臀部及び脚の罹患部位の掻痒及び引っ掻きから有意な身体的な不快感を経験している４５歳の男性患者を、本発明のＥＧＦムテイン融合タンパク質を用いた局所投与により処置する。２〜７日以内に、症状が緩和され、効果が１〜２ヶ月間にわたり続く。第２の処置の適用によって、症状の軽減が維持される。
【０２１７】
実施例１８．結腸直腸癌を患う患者の処置
７０歳の男性患者が（ステージＩＶ）の結腸直腸癌と診断される。手術は勧められない。本発明のＥＧＦムテイン融合タンパク質の全身注射を用いた処置後、転移した腫瘍はサイズにおける増加を止めている。１ヶ月以内に、腫瘍のサイズが減少しており、患者は気分が良くなったと報告している。第２の処置の適用によって、腫瘍サイズがさらに低下し、症状の軽減が維持される。
【０２１８】
実施例１９．前立腺癌を患う患者の処置
４６歳の男性患者が、椎骨まで転移している前立腺癌と診断される。彼は、脊椎及び骨盤における疼痛を訴える。手術は不適切であるため、患者を、本発明のＥＧＦムテイン融合タンパク質の全身注射を用いて処置する。２週間以内に、腫瘍のサイズが減少しており、患者はより少ない疼痛を報告する。第２の処置の適用によって、腫瘍サイズの減少が継続し、症状の軽減が維持される。
【０２１９】
実施例２０．肺非小細胞癌を患う患者の処置
４６歳の女性患者が、（ステージＩＶ）の肺非小細胞癌と診断され、予後診断では２年間生存する可能性は２%である。患者を、本発明のＥＧＦムテイン融合タンパク質の全身注射を用いて処置する。２週間以内に、転移した腫瘍の増殖速度が止まっている。処置から２ヶ月後、腫瘍のサイズが減少し、患者の気分が良くなっている。第２の処置の適用によって、腫瘍サイズの減少が継続し、症状の軽減が維持される。患者の２年を超える生存期間の可能性が増加する。
【０２２０】
実施例２１．乳癌を患う患者の処置
黄疸を伴う３６歳の女性患者が、肝臓まで広がった進行性の乳癌と診断される。患者を、本発明のＥＧＦムテイン融合タンパク質の全身注射を用いて処置する。２週間以内に、転移した腫瘍の増殖速度が止まっている。処置から２ヶ月後、腫瘍のサイズが減少し、黄疸がなくなっている。第２の処置の適用によって、腫瘍サイズの減少が継続し、症状の軽減が維持される。
【０２２１】
配列番号
配列番号１．天然に存在するヒト上皮増殖因子（ＥＧＦ）についてのアミノ酸配列
【表９】
0005658152.tif 000012
【０２２２】
配列番号２．ＬＨＡのＤＮＡ配列
【表１０】
0005658152.tif 000013
0005658152.tif 000014
【０２２３】
配列番号３．ＬＨＢのＤＮＡ配列
【表１１】
0005658152.tif 000015
0005658152.tif 000016
【０２２４】
配列番号４．ＬＨＣのＤＮＡ配列
【表１２】
0005658152.tif 000017
0005658152.tif 000018
【０２２５】
配列番号５．ＬＨＤのＤＮＡ配列
【表１３】
0005658152.tif 000019
0005658152.tif 000020
【０２２６】
配列番号６．ＥＧＦＨ１６Ｎ
【表１４】
0005658152.tif 000021
【０２２７】
配列番号７．ＥＧＦバリアント標的成分ｖ１のタンパク質配列
【表１５】
0005658152.tif 000022
【０２２８】
配列番号８．ＥＧＦＨ１６Ｑ
【表１６】
0005658152.tif 000023
【０２２９】
配列番号９．ＥＧＦバリアント標的成分ｖ２のタンパク質配列
【表１７】
0005658152.tif 000024
【０２３０】
配列番号１０．ＥＧＦＷ４９Ｌ
【表１８】
0005658152.tif 000025
【０２３１】
配列番号１１．ＥＧＦバリアント標的成分ｖ３のタンパク質配列
【表１９】
0005658152.tif 000026
【０２３２】
配列番号１２．ＥＧＦＷ４９Ｉ
【表２０】
0005658152.tif 000027
【０２３３】
配列番号１３．ＥＧＦバリアント標的成分ｖ４のタンパク質配列
【表２１】
0005658152.tif 000028
【０２３４】
配列番号１４．ＥＧＦＷ４９Ｖ
【表２２】
0005658152.tif 000029
【０２３５】
配列番号１５．ＥＧＦバリアント標的成分ｖ５のタンパク質配列
【表２３】
0005658152.tif 000030
【０２３６】
配列番号１６．ＥＧＦＷ４９Ａ
【表２４】
0005658152.tif 000031
【０２３７】
配列番号１７．ＥＧＦバリアント標的成分ｖ６（Ｇ１２Ｑ）のタンパク質配列
【表２５】
0005658152.tif 000032
【０２３８】
配列番号１８．ＥＧＦＷ４９Ｇ
【表２６】
0005658152.tif 000033
【０２３９】
配列番号１９．ＥＧＦバリアント標的成分ｖ７（Ｈ１６Ｄ）のタンパク質配列
【表２７】
0005658152.tif 000034
【０２４０】
配列番号２０．ＥＧＦＷ４９Ｓ
【表２８】
0005658152.tif 000035
【０２４１】
配列番号２１．ＥＧＦバリアント標的成分ｖ８（Ｙ１３Ｗ）のタンパク質配列
【表２９】
0005658152.tif 000036
【０２４２】
配列番号２２．ＥＧＦＷ４９Ｔ
【表３０】
0005658152.tif 000037
【０２４３】
配列番号２３．ＥＧＦバリアント標的成分ｖ９（Ｑ４３Ａ）のタンパク質配列
【表３１】
0005658152.tif 000038
【０２４４】
配列番号２４．ＥＧＦＷ４９Ｎ
【表３２】
0005658152.tif 000039
【０２４５】
配列番号２５．ＥＧＦバリアント標的成分ｖ１０（Ｈ１６Ａ）のタンパク質配列
【表３３】
0005658152.tif 000040
【０２４６】
配列番号２６．ＥＧＦ＿Ｗ４９Ｑ
【表３４】
0005658152.tif 000041
【０２４７】
配列番号２７．ＥＧＦバリアント標的成分ｖ１１（Ｌ１５Ａ）のタンパク質配列
【表３５】
0005658152.tif 000042
【０２４８】
配列番号２８．ＥＧＦ＿Ｈ１６Ｎ＿Ｗ４９Ｌ
【表３６】
0005658152.tif 000043
【０２４９】
配列番号２９．ＥＧＦバリアント標的成分ｖ１２（Ｖ１９Ｅ）のタンパク質配列
【表３７】
0005658152.tif 000044
【０２５０】
配列番号３０．ＥＧＦ＿Ｈ１６Ｑ＿Ｗ４９Ｌ
【表３８】
0005658152.tif 000045
【０２５１】
配列番号３１．ＥＧＦバリアント標的成分ｖ１３（Ｖ３４Ｄ）のタンパク質配列
【表３９】
0005658152.tif 000046
【０２５２】
配列番号３２．ＥＧＦ＿Ｈ１６Ｎ＿Ｗ４９Ｉ
【表４０】
0005658152.tif 000047
【０２５３】
配列番号３３．ＬＨＡ−ＥＧＦｖ１のタンパク質配列（Ｘａ活性化）
【表４１】
0005658152.tif 000048
【０２５４】
配列番号３４．ＥＧＦ＿Ｈ１６Ｑ＿Ｗ４９Ｉ
【表４２】
0005658152.tif 000049
【０２５５】
配列番号３５．ＬＨＡ−ＥＧＦｖ２のタンパク質配列（Ｘａ活性化）
【表４３】
0005658152.tif 000050
【０２５６】
配列番号３６．ＥＧＦ＿Ｈ１６Ｎ＿Ｗ５０Ａ
【表４４】
0005658152.tif 000051
【０２５７】
配列番号３７．ＬＨＡ−ＥＧＦｖ３のタンパク質配列（増強された突然変異）
【表４５】
0005658152.tif 000052
【０２５８】
配列番号３８．ＥＧＦ＿Ｈ１６Ｑ＿Ｗ５０Ａ
【表４６】
0005658152.tif 000053
【０２５９】
配列番号３９．ＬＨＡ−ＥＧＦｖ４のタンパク質配列
【表４７】
0005658152.tif 000054
【０２６０】
配列番号４０．ＥＧＦ＿Ｈ１６Ｎ＿Ｗ４９Ｌ＿Ｗ５０Ａ
【表４８】
0005658152.tif 000055
【０２６１】
配列番号４１．ＬＨＡ−ＥＧＦｖ５のタンパク質配列
【表４９】
0005658152.tif 000056
【０２６２】
配列番号４２．ＥＧＦ＿Ｈ１６Ｑ＿Ｗ４９Ｌ＿Ｗ５０Ａ
【表５０】
0005658152.tif 000057
【０２６３】
配列番号４３．ＬＨＡ−ＥＧＦｖ６のタンパク質配列
【表５１】
0005658152.tif 000058
【０２６４】
配列番号４４．ＥＧＦ＿Ｈ１６Ｎ＿Ｗ４９Ｉ＿Ｗ５０Ａ
【表５２】
0005658152.tif 000059
【０２６５】
配列番号４５．ＬＨＣ−ＥＧＦｖ７のタンパク質配列
【表５３】
0005658152.tif 000060
【０２６６】
配列番号４６．ＥＧＦ＿Ｈ１６Ｑ＿Ｗ４９Ｉ＿Ｗ５０Ａ
【表５４】
0005658152.tif 000061
【０２６７】
配列番号４７．ＬＨＣ−ＥＧＦｖ８のタンパク質配列
【表５５】
0005658152.tif 000062
【０２６８】
配列番号４８．ＥＧＦ＿Ｈ１６Ｎ＿Ｗ４９Ｌ＿Ｗ５０Ａ＿Ｅ２４Ｇ
【表５６】
0005658152.tif 000063
【０２６９】
配列番号４９．ＬＨＣ−ＥＧＦｖ９のタンパク質配列
【表５７】
0005658152.tif 000064
【０２７０】
配列番号５０．ＥＧＦ＿Ｈ１６Ｎ＿Ｗ４９Ｌ＿Ｗ５０Ａ＿Ｅ２４Ｇ＿Ａ２５Ｔ
【表５８】
0005658152.tif 000065
【０２７１】
配列番号５１．ＬＨＣ−ＥＧＦｖ１０のタンパク質配列
【表５９】
0005658152.tif 000066
【０２７２】
配列番号５２．ＥＧＦ＿Ｈ１６Ｎ＿Ｗ４９Ｌ＿Ｗ５０Ａ＿Ｅ２４Ｇ＿Ａ２５Ｓ
【表６０】
0005658152.tif 000067
【０２７３】
配列番号５３．ＬＨＣ−ＥＧＦｖ１１のタンパク質配列
【表６１】
0005658152.tif 000068
【０２７４】
配列番号５４．ＥＧＦ＿Ｈ１６Ｎ＿Ｗ４９Ｌ＿Ｗ５０Ａ＿Ｅ２４Ｇ＿Ａ２５Ｔ＿Ｋ２８Ｒ
【表６２】
0005658152.tif 000069
【０２７５】
配列番号５５．ＬＨＣ−ＥＧＦｖ１２のタンパク質配列
【表６３】
0005658152.tif 000070
【０２７６】
配列番号５６．ＥＧＦ＿Ｈ１６Ｎ＿Ｗ４９Ｌ＿Ｗ５０Ａ＿Ｅ２４Ｇ＿Ａ２５Ｔ＿Ｋ２８Ｒ＿Ｓ４Ｐ
【表６４】
0005658152.tif 000071
【０２７７】
配列番号５７．ＬＨＣ−ＥＧＦｖ１３のタンパク質配列
【表６５】
0005658152.tif 000072
【０２７８】
配列番号５８．ＥＧＦ＿Ｈ１６Ｎ＿Ｗ４９Ｌ＿Ｗ５０Ａ＿Ｅ２４Ｇ＿Ａ２５Ｔ＿Ｋ２８Ｒ＿Ｓ４Ｐ＿Ｅ５Ｋ
【表６６】
0005658152.tif 000073
【０２７９】
配列番号５９．ＬＨＢ−ＥＧＦｖ１のタンパク質配列
【表６７】
0005658152.tif 000074
【０２８０】
配列番号６０．ＥＧＦｖ３
【表６８】
0005658152.tif 000075
【０２８１】
配列番号６１．ＬＨＢ−ＥＧＦｖ５のタンパク質配列
【表６９】
0005658152.tif 000076
【０２８２】
配列番号６２．破傷風ＬＨＮ−ＥＧＦｖ１のタンパク質配列
【表７０】
0005658152.tif 000077
【０２８３】
配列番号６３．ＬＨＤ−ＥＧＦｖ６のタンパク質配列（プロテアーゼ感受性部位）
【表７１】
0005658152.tif 000078
【０２８４】
配列番号６４．ＬＨＤ−ＥＧＦｖ３のタンパク質配列
【表７２】
0005658152.tif 000079
【０２８５】
配列番号６５．ＬＨＤ−ＥＧＦｖ１１のタンパク質配列
【表７３】
0005658152.tif 000080
【０２８６】
配列番号６６．Ｍ２６−ＩｇＡ１−ＨＣ−ＥＧＦｖ３のタンパク質配列
【表７４】
0005658152.tif 000081
【０２８７】
配列番号６７．Ｍ２６−ＩｇＡ１−ＨＣ−ＥＧＦｖ１１のタンパク質配列
【表７５】
0005658152.tif 000082
【０２８８】
配列番号６８．破傷風ＬＨＮ−ＥＧＦｖ３のタンパク質配列
【表７６】
0005658152.tif 000083
【０２８９】
配列番号６９．ＬＨＡ−ＣＰ−ＥＧＦｖ２のタンパク質配列
【表７７】
0005658152.tif 000084
【０２９０】
配列番号７０．ＬＨＤ−ＥＧＦｖ２のタンパク質配列
【表７８】
0005658152.tif 000085
【０２９１】
配列番号７１．ＬＨＣ−ＣＰ−ＥＧＦｖ２のタンパク質配列
【表７９】
0005658152.tif 000086
【０２９２】
配列番号７２．ＬＨＣ−ＥＧＦｖ３のタンパク質配列
【表８０】
0005658152.tif 000087
【０２９３】
配列番号７３．ＥＧＦバリアント標的成分ｖ３のＤＮＡ配列
【表８１】
0005658152.tif 000088
【図１】
0005658152.tif 000089
【図２】
0005658152.tif 000090
【配列表】
0005658152000001.app