(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（a）〜（d）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のポリヌクレオチド：
（a）配列番号46の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（b）配列番号47のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号47のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつアシル-CoAシンセターゼ活性、又は宿主細胞で発現させた場合に該宿主細胞が産生する脂肪酸の量を増加させる活性又は組成を変化させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（d）配列番号47のアミノ酸配列に対して、90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、かつアシル-CoAシンセターゼ活性、又は宿主細胞で発現させた場合に該宿主細胞が産生する脂肪酸の量を増加させる活性又は組成を変化させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
以下の（e）又は（f）のいずれかに記載の請求項1に記載のポリヌクレオチド：
（e）配列番号47のアミノ酸配列において1〜5個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつアシル-CoAシンセターゼ活性、又は宿主細胞で発現させた場合に該宿主細胞が産生する脂肪酸の量を増加させる活性又は組成を変化させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（f）配列番号47のアミノ酸配列に対して、95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、かつアシル-CoAシンセターゼ活性、又は宿主細胞で発現させた場合に該宿主細胞が産生する脂肪酸の量を増加させる活性又は組成を変化させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号46の塩基配列を含有する、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号47のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
DNAである、請求項1〜4のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項1〜5のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
【請求項７】
請求項1〜5のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項８】
請求項1〜5のいずれかに記載のポリヌクレオチド、又は請求項7に記載のベクターが導入された非ヒト形質転換体。
【請求項９】
請求項8に記載の形質転換体の培養物から、脂質又は脂肪酸組成物を採取することを特徴とする、脂質又は脂肪酸組成物の製造方法。
【請求項１０】
前記脂質が、トリアシルグリセロールである、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記脂肪酸が、炭素数18以上の高度不飽和脂肪酸である、請求項9に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アシル-CoAシンセターゼホモログをコードするポリヌクレオチド及びその利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
不飽和結合を2箇所以上含有する脂肪酸は、高度不飽和脂肪酸（PUFA：polyunsaturated）と総称され、アラキドン酸（ARA）やジホモγ-リノレン酸（DGLA）、エイコサペンタエン酸（EPA）、ドコサヘキサエン酸（DHA）などが知られている。高度不飽和脂肪酸には、動物体内で合成できないものも存在する。従って、そのような高度不飽和脂肪酸は、必須脂肪酸として食物から摂取する必要がある。【０００３】
高度不飽和脂肪酸は広く分布しており、例えば、アラキドン酸は動物の副腎腺及び肝臓より抽出した脂質から分離することができる。しかしながら、動物臓器に含まれる高度不飽和脂肪酸は少量であるため、動物臓器からの分離抽出だけでは、十分な供給を得ることができない。そのため、種々の微生物を培養することにより高度不飽和脂肪酸を生産する方法が開発されてきた。中でもモルティエレラ（Mortierella）属微生物は、アラキドン酸等の高度不飽和脂肪酸含有脂質を生産する微生物として広く知られている。【０００４】
また、植物体内で高度不飽和脂肪酸を生産させる試みもなされている。高度不飽和脂肪酸は、トリアシルグリセロールなどの貯蔵脂質を構成し、微生物の菌体内もしくは植物種子中に蓄積されることが知られている。【０００５】
アシル-CoAシンセターゼ（ACS）は、脂肪酸とコエンザイムA（CoA）をチオエステル化する酵素であり、以下の反応を触媒する。
脂肪酸 ＋ CoASH + ATP →  アシル-CoA + AMP + PPi
【０００６】
ACSにより生成するアシル-CoAは、脂質の生合成やリモデリング、β‐酸化によるエネルギー生産、タンパク質のアシル化、脂肪酸による発現調節等を含む様々な生命現象に関与している。また、ACSは、細胞外からの脂肪酸の取り込みや、細胞内の脂肪酸輸送などにも関与することが報告されている（非特許文献1及び2）。以上を鑑みるに、微生物や植物を利用して高度不飽和脂肪酸等を生産する場合には、ACSの活性をコントロールすることが重要であると考えられる。【０００７】
モデル真核生物である酵母（Saccharomyces cerevisiae）では、6つのアシル-CoAシンセターゼ遺伝子（ScFAA1、ScFAA2、ScFAA3、ScFAA4、ScFAT1、ScFAT2）が知られている（非特許文献1）。これらの遺伝子にコードされるタンパク質は、基質特異性、発現時期、細胞内での局在及び機能において異なっている。【０００８】
特許文献1には、シゾキトリウム属（Schizochytrium sp.）由来のアシル-CoAシンセターゼ遺伝子（ScACS）として、9つの遺伝子が記載されている。また、特許文献1には、シゾキトリウム属PUFAシンターゼ系をコードする遺伝子とScACSとを共発現させた場合、ScACSを共発現させない場合と比較してDPA（n-6）（ドコサペンタエン酸（n-6））やDHAの産生が増加したことが記載されている。【０００９】
そのほか、動物及び植物由来のアシル-CoAシンセターゼ遺伝子についても報告されている（非特許文献2及び特許文献2）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表JP2009-529890
【特許文献２】国際公開公報WO0209295
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】B. B. A. 1771, 286-298, 2007
【非特許文献２】Exp. Biol. Med., 233(5), 507-521, 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記のような状況下で、宿主細胞において発現させた際に該宿主細胞の脂肪酸の生産量を増加させ、あるいは産生される脂肪酸の組成を変化させる新たな遺伝子の単離が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、鋭意研究の結果、脂質生産菌であるMortierella alpina（以下において、「M. alpina」）のACSホモログ（MaACS）をコードする遺伝子をクローニングすることに成功し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下のポリヌクレオチド、タンパク質、発現ベクター、形質転換体、該形質転換体を用いる脂質又は脂肪酸組成物及び食品等の製造方法、並びにそのような製法によって製造された食品等を提供する。【００１４】
即ち、本発明は、以下のとおりである。
[1]  以下の（a）〜（e）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のポリヌクレオチド：
（a）配列番号1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51及び56に示す塩基配列からなる群より選択されるいずれか1つの塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（b）配列番号2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52及び57に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるいずれか1つのアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（c）配列番号2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52及び57に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるいずれか1つのアミノ酸配列において、1〜100個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつアシル-CoAシンセターゼ活性、宿主細胞で発現させた場合に該宿主細胞が産生する脂肪酸の量を増加させる活性又は組成を変化させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（d）配列番号2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52及び57に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるいずれか1つのアミノ酸配列に対して、60％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、かつアシル-CoAシンセターゼ活性、宿主細胞で発現させた場合に該宿主細胞が産生する脂肪酸の量を増加させる活性又は組成を変化させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（e）配列番号1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51及び56に示す塩基配列からなる群より選択されるいずれか1つの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつアシル-CoAシンセターゼ活性、宿主細胞で発現させた場合に該宿主細胞が産生する脂肪酸の量を増加させる活性又は組成を変化させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[2]  以下の（f）又は（g）のいずれかに記載の前記[1]に記載のポリヌクレオチド：
（f）配列番号2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52及び57に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるいずれか1つのアミノ酸配列において1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつアシル-CoAシンセターゼ活性、宿主細胞で発現させた場合に該宿主細胞が産生する脂肪酸の量を増加させる活性又は組成を変化させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（g）配列番号2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52及び57に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるいずれか1つのアミノ酸配列に対して、90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、かつアシル-CoAシンセターゼ活性、宿主細胞で発現させた場合に該宿主細胞が産生する脂肪酸の量を増加させる活性又は組成を変化させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[3]  配列番号1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51及び56に示す塩基配列からなる群より選択されるいずれか1つの塩基配列を含有する、前記[1]に記載のポリヌクレオチド。
[4]  配列番号2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52及び57に示すアミノ酸配列からなる群より選択されるいずれか1つのアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、前記[1]に記載のポリヌクレオチド。
[5]  DNAである、前記[1]〜[4]のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
[6]  前記[1]〜[5]のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
[7]  前記[1]〜[5]のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
[8]  前記[1]〜[5]のいずれかに記載のポリヌクレオチド又は前記[7]に記載のベクターが導入された非ヒト形質転換体。
[9]  前記[8]に記載の形質転換体の培養物から、脂質又は脂肪酸組成物を採取することを特徴とする、脂質又は脂肪酸組成物の製造方法。
[10]  前記脂質が、トリアシルグリセロールである、前記[9]に記載の方法。
[11]  前記脂肪酸が、炭素数18以上の高度不飽和脂肪酸である、前記[9]に記載の方法。
[12]  前記[9]に記載の製造方法により採取された脂質又は脂肪酸組成物を含有する食品、医薬品、化粧品又は石鹸。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のポリヌクレオチドは、適切な宿主細胞の形質転換に利用することができ、そのようにして得られる形質転換体は脂肪酸組成物、食品、化粧料、医薬、石鹸等の製造に利用することができる。【００１６】
より具体的には、本発明の形質転換体は、脂質及び脂肪酸の生産効率が極めて高い。したがって、本発明は、大量の脂質又は脂肪酸を必要とする医薬品あるいは健康食品の製造に有効に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】MaACS-1のcDNA配列と推定アミノ酸配列との対応を示す図である。
【図２Ａ】MaACS-1のゲノム配列とCDS配列のアライメントを示す図である。
【図２Ｂ】図2Aの続きを示す図である。
【図３Ａ】MaACS-2のcDNA配列と推定アミノ酸配列との対応を示す図である。
【図３Ｂ】図3Aの続きを示す図である。
【図４Ａ】MaACS-2のゲノム配列とCDS配列のアライメントを示す図である。
【図４Ｂ】図4Aの続きを示す図である。
【図４Ｃ】図4Bの続きを示す図である。
【図５】MaACS-3のcDNA配列と推定アミノ酸配列との対応を示す図である。
【図６Ａ】MaACS-3のゲノム配列とCDS配列のアライメントを示す図である。
【図６Ｂ】図6Aの続きを示す図である。
【図７Ａ】MaACS-4のcDNA配列と推定アミノ酸配列との対応を示す図である。
【図７Ｂ】図7Aの続きを示す図である。
【図８Ａ】MaACS-4のゲノム配列とCDS配列のアライメントを示す図である。
【図８Ｂ】図8Aの続きを示す図である。
【図８Ｃ】図8Bの続きを示す図である。
【図９Ａ】MaACS-5のcDNA配列と推定アミノ酸配列との対応を示す図である。
【図９Ｂ】図9Aの続きを示す図である。
【図１０Ａ】MaACS-5のゲノム配列とCDS配列のアライメントを示す図である。
【図１０Ｂ】図10Aの続きを示す図である。
【図１１Ａ】MaACS-6のcDNA配列と推定アミノ酸配列との対応を示す図である。
【図１１Ｂ】図11Aの続きを示す図である。
【図１２Ａ】MaACS-6のゲノム配列とCDS配列のアライメントを示す図である。
【図１２Ｂ】図12Aの続きを示す図である。
【図１３】MaACS-7のcDNA配列と推定アミノ酸配列との対応を示す図である。
【図１４Ａ】MaACS-7のゲノム配列とCDS配列のアライメントを示す図である。
【図１４Ｂ】図14Aの続きを示す図である。
【図１５Ａ】MaACS-8のcDNA配列と推定アミノ酸配列との対応を示す図である。
【図１５Ｂ】図15Aの続きを示す図である。
【図１６Ａ】MaACS-8のゲノム配列とCDS配列のアライメントを示す図である。
【図１６Ｂ】図16Aの続きを示す図である。
【図１６Ｃ】図16Bの続きを示す図である。
【図１７】MaACS-9のcDNA配列と推定アミノ酸配列との対応を示す図である。
【図１８Ａ】MaACS-9のゲノム配列とCDS配列のアライメントを示す図である。
【図１８Ｂ】図18Aの続きを示す図である。
【図１９Ａ】MaACS-10のcDNA配列と推定アミノ酸配列との対応を示す図である。
【図１９Ｂ】図19Aの続きを示す図である。
【図２０Ａ】MaACS-10のゲノム配列とCDS配列のアライメントを示す図である。
【図２０Ｂ】図20Aの続きを示す図である。
【図２０Ｃ】図20Bの続きを示す図である。
【図２１Ａ】MaACS-11のcDNA配列と推定アミノ酸配列との対応を示す図である。
【図２１Ｂ】図21Aの続きを示す図である。
【図２２Ａ】MaACS-11のゲノム配列とCDS配列のアライメントを示す図である。
【図２２Ｂ】図22Aの続きを示す図である。
【図２３Ａ】MaACS-12のcDNA配列と推定アミノ酸配列との対応を示す図である。
【図２３Ｂ】図23Aの続きを示す図である。
【図２４Ａ】MaACS-12のゲノム配列とCDS配列のアライメントを示す図である。
【図２４Ｂ】図24Aの続きを示す図である。
【図２５Ａ】S.cerevisiae由来のFAAタンパク質（FAA: Fatty Acid Activation）と比較的高いアミノ酸配列の相同性を有するMaACSと該FAAタンパク質とのアラインメントを示す図である。一重下線部はATP-AMPモチーフを示し、二重下線部はFACS/VLACS-FATPモチーフを示す。
【図２５Ｂ】図25Aの続きを示す図である。
【図２５Ｃ】図25Bの続きを示す図である。
【図２６Ａ】S.cerevisiae由来のFATタンパク質（FAT: Fatty Acid Transferase）と比較的高いアミノ酸配列の相同性を有するMaACSと該FATのタンパク質とのアラインメントを示す図である。一重下線部はATP-AMPモチーフを示し、二重下線部はFACS/VLACS-FATPモチーフを示す。
【図２６Ｂ】図26Aの続きを示す図である。
【図２７】MaACS-10を過剰発現させたM. alpinaにおける菌体当たりの脂質生産量（図27A）とアラキドン酸生産量（図27B）の経時変化を示す図である。
【図２８】MaACS-11を過剰発現させたM. alpinaにおける菌体当たりの脂質生産量（図28A）とアラキドン酸生産量（図28B）の経時変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、2010年2月1日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願2010-19967号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
【００１９】
本発明者らは、後述の実施例において詳細に記載するように、脂質生産菌であるM. alpina由来のACSホモログの遺伝子（MaACS-1〜12）の全長cDNAのクローニングに初めて成功した。また、本発明者らは、M. alpina由来のMaACS-1〜12のゲノムDNAの塩基配列、及び推定アミノ酸配列も同定した。MaACS1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及び12のORF配列、推定アミノ酸配列、CDS配列、cDNA配列及びゲノム配列は、それぞれ配列番号1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51及び56（以下、これらの配列をまとめて「MaACS-1〜12のORF配列」と呼ぶ）、配列番号2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52及び57（以下、これらの配列をまとめて「MaACS-1〜12のアミノ酸配列」と呼ぶ）、配列番号3、8、13、18、23、28、33、38、43、48、53及び58（以下、これらの配列をまとめて「MaACS-1〜12のCDS配列」と呼ぶ）、配列番号4、9、14、19、24、29、34、39、44、49、54及び59（以下、これらの配列をまとめて「MaACS-1〜12のcDNA配列」と呼ぶ）、並びに配列番号5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55及び60（以下、これらの配列をまとめて「MaACS-1〜12のゲノム配列」と呼ぶ）である。これらのポリヌクレオチド及びタンパク質は、後述の実施例に記載した手法、公知の遺伝子工学的手法、公知の合成手法等によって取得することが可能である。
【００２０】
1.  本発明のポリヌクレオチド
まず、本発明は、以下の（a）〜（g）よりなる群より選ばれるいずれかに記載のポリヌクレオチドを提供する：
（a）MaACS-1〜12のORF配列からなる群より選択されるいずれか1つの塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（b）MaACS-1〜12のcDNA配列からなる群より選択されるいずれか1つの塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
（c）MaACS-1〜12のアミノ酸配列からなる群より選択されるいずれか1つのアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（d）MaACS-1〜12のアミノ酸配列からなる群より選択されるいずれか1つのアミノ酸配列において、1〜100個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつアシル-CoAシンセターゼ活性、宿主細胞で発現させた場合に該宿主細胞が産生する脂肪酸の量を増加させる活性及び/又は組成を変化させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（e）MaACS-1〜12のアミノ酸配列からなる群より選択されるいずれか1つのアミノ酸配列に対して、60％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、かつアシル-CoAシンセターゼ活性、宿主細胞で発現させた場合に該宿主細胞が産生する脂肪酸の量を増加させる活性及び/又は組成を変化させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（f）MaACS-1〜12のORF配列からなる群より選択されるいずれか1つの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつアシル-CoAシンセターゼ活性、宿主細胞で発現させた場合に該宿主細胞が産生する脂肪酸の量を増加させる活性及び/又は組成を変化させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（g）MaACS-1〜12のcDNA配列からなる群より選択されるいずれか1つの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつアシル-CoAシンセターゼ活性、宿主細胞で発現させた場合に該宿主細胞が産生する脂肪酸の量を増加させる活性及び/又は組成を変化させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００２１】
本明細書中、「ポリヌクレオチド」とは、DNA又はRNAを意味する。
本明細書中、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、MaACS-1〜12のORF配列からなる群より選択されるいずれか1つの塩基配列若しくはMaACS-1〜12のcDNA配列からなる群より選択されるいずれか1つの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、又はMaACS-1〜12のアミノ酸配列からなる群より選択されるいずれか1つのアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、"Sambrook ＆ Russell，  Molecular Cloning： A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001"及び"Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons 1987-1997"などに記載されている方法を利用することができる。
【００２２】
本明細書中、「ストリンジェントな条件」とは、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃又は5 x SSC、1％ SDS、50 mM Tris-HCl（pH7.5）、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃又は0.2 x SSC、0.1％ SDS、65℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い同一性を有するDNAが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２３】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling and Detection System（GE Healthcare）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1％（w/v）SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたDNAを検出することができる。あるいは、MaACS-1〜12のORF配列からなる群より選択されるいずれか1つの塩基配列若しくはMaACS-1〜12のcDNA配列からなる群より選択されるいずれか1つの塩基配列と相補的な塩基配列、又はMaACS-1〜12のアミノ酸配列からなる群より選択されるいずれか1つのアミノ酸配列をコードする塩基配列の全部又は一部に基づいてプローブを作製する際に、市販の試薬（例えば、PCRラベリングミックス（Roche Diagnostics）等）を用いて該プローブをジゴキシゲニン（DIG）ラベルした場合には、DIG核酸検出キット（Roche Diagnostics）を用いてハイブリダイゼーションを検出することができる。
【００２４】
上記以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLAST等の相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、MaACS-1〜12のORF配列からなる群より選択されるいずれか1つの塩基配列若しくはMaACS-1〜12のcDNA配列からなる群より選択されるいずれか1つの塩基配列のDNA、又はMaACS-1〜12のアミノ酸配列からなる群より選択されるいずれか1つのアミノ酸配列をコードするDNAと50％以上、51％以上、52％以上、53％以上、54％以上、55％以上、56％以上、57％以上、58％以上、59％以上、60％以上、61％以上、62％以上、63％以上、64％以上、65％以上、66％以上、67％以上、68％以上、69％以上、70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、又は99.9％以上の同一性を有するDNAをあげることができる。
【００２５】
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、FASTA(Science 227 (4693): 1435-1441, (1985))や、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLAST (Basic Local Alignment Search Tool)（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたblastn、blastx、blastp、tblastnやtblastxと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）。blastnを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore = 100、wordlength = 12とする。また、blastpを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore = 50、wordlength = 3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００２６】
上記した本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法又は公知の合成手法によって取得することが可能である。
【００２７】
2.  本発明のタンパク質
本発明は、次に示すタンパク質を提供する。
（i）上記（a）〜（g）のいずれかのポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
（ii）MaACS-1〜12のアミノ酸配列からなる群より選択されるいずれか1つのアミノ酸配列を含むタンパク質。
（iii）MaACS-1〜12のアミノ酸配列からなる群より選択されるいずれか1つのアミノ酸配列における1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつアシル-CoAシンセターゼ活性、宿主細胞で発現させた場合に該宿主細胞が産生する脂肪酸の量を増加させる活性及び/又は組成を変化させる活性を有するタンパク質。
（iv）MaACS-1〜12のアミノ酸配列からなる群より選択されるいずれか1つのアミノ酸配列に対して90％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、かつアシル-CoAシンセターゼ活性、宿主細胞で発現させた場合に該宿主細胞が産生する脂肪酸の量を増加させる活性及び/又は組成を変化させる活性を有するタンパク質。
【００２８】
上記（iii）又は（iv）に記載のタンパク質は、代表的には、天然に存在するMaACS-1〜12のアミノ酸配列からなる群より選択されるいずれか1つのアミノ酸配列からなるタンパク質の変異体であるが、例えば、"Sambrook ＆ Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001"、"Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons 1987-1997"、"Nuc. Acids. Res., 10, 6487（1982）"、"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409（1982）"、"Gene, 34, 315 （1985）"、"Nuc.  Acids.  Res., 13, 4431（1985）"、"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488（1985）"等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、人為的に取得することができるものも含まれる。
【００２９】
本明細書中、「MaACS-1〜12のアミノ酸配列からなる群より選択されるいずれか1つのアミノ酸配列における1若しくは複数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつアシル-CoAシンセターゼ活性、宿主細胞で発現させた場合に該宿主細胞が産生する脂肪酸の量を増加させる活性及び/又は組成を変化させる活性を有するタンパク質」としては、MaACS-1〜12のアミノ酸配列からなる群より選択されるいずれか1つのアミノ酸配列において、例えば、1〜100個、1〜90個、1〜80個、1〜70個、1〜60個、1〜50個、1〜40個、1〜39個、1〜38個、1〜37個、1〜36個、1〜35個、1〜34個、1〜33個、1〜32個、1〜31個、1〜30個、1〜29個、1〜28個、1〜27個、1〜26個、1〜25個、1〜24個、1〜23個、1〜22個、1〜21個、1〜20個、1〜19個、1〜18個、1〜17個、1〜16個、1〜15個、1〜14個、1〜13個、1〜12個、1〜11個、1〜10個、1〜9個（1〜数個）、1〜8個、1〜7個、1〜6個、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、又は1個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつアシル-CoAシンセターゼ活性、宿主細胞で発現させた場合に該宿主細胞が産生する脂肪酸の量を増加させる活性及び/又は組成を変化させる活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加の数は、一般的には小さい程好ましい。
【００３０】
また、このようなタンパク質としては、MaACS-1〜12のアミノ酸配列からなる群より選択されるいずれか1つのアミノ酸配列と60％以上、61％以上、62％以上、63％以上、64％以上、65％以上、66％以上、67％以上、68％以上、69％以上、70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、又は99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアシル-CoAシンセターゼ活性、宿主細胞で発現させた場合に該宿主細胞が産生する脂肪酸の量を増加させる活性及び/又は組成を変化させる活性を有するタンパク質が挙げられる。上記同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。
【００３１】
本発明のタンパク質のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたとは、同一配列中の任意かつ1若しくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1若しくは複数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸；C群：アスパラギン、グルタミン；D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸；E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン；F群：セリン、スレオニン、ホモセリン；G群：フェニルアラニン、チロシン。
【００３２】
また、本発明のタンパク質は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、Advanced Automation Peptide Protein Technologies社製、Perkin Elmer社製、、Protein Technologies社製、PerSeptive社製、Applied Biosystems社製、SHIMADZU社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００３３】
本発明のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質又は本発明のタンパク質は、いずれもACSのホモログタンパク質であり、かつアシル-CoAシンセターゼ活性に重要なATP-AMPモチーフ及びFACS/VLACS-FATPモチーフが保存されているため、アシル-CoAシンセターゼ活性を有するものと考えられる。ここで、ATP、AMP、FACS、VLACS及びFATPは、それぞれAdenosine Triphosphate、Adenosine Monophosphate、Fatty Acyl CoA Synthetase、Very Long Chain Acyl-CoA Synthetase及びFatty Acid Transport Proteinを意味する。本発明のタンパク質に含まれるATP-AMPモチーフ及びFACS/VLACS-FATPモチーフの具体的なアミノ配列は、図25及び26のそれぞれ一重下線部分及び二重下線部分に示されている。ATP-AMPモチーフ及びFACS/VLACS-FATPモチーフの代表的なアミノ配列については、pfam（http://pfam.sanger.ac.uk/）等のデータベースで参照することができる。
【００３４】
ここで、「アシル-CoAシンセターゼ活性（ACS活性）」は、脂肪酸とコエンザイムAとの間にチオエステル結合を生じさせ、アシル-CoAを生成する反応（下記の化学反応式）を促進する活性を意味する。
脂肪酸 ＋ コエンザイムA → アシル-CoA ＋ H2O
アシル-CoAシンセターゼ活性は、例えば、本発明のポリペプチドを導入した宿主細胞を一定期間培養した後に該宿主細胞の細胞溶解物を調製し、該細胞溶解物と標識した脂肪酸（例えば、放射性同位体で標識した高度不飽和脂肪酸等）とコエンザイムAを混合して一定時間反応させ、その後、n-ヘプタンで遊離脂肪酸を抽出して除去し、水層に含まれる前記反応により生じた脂肪酸-CoAの量をシンチレーションカウンターによって放射能レベルとして測定することにより、定量的に確認することができる。、アシル-CoAシンセターゼ活性の確認方法の詳細については、Black PN et al.（J.B.C., 272 (8), 4896-4903, 1997）を参照することができる。あるいは、本願実施例2の「ACS活性の評価」に記載されるような、放射性ラベルを使用しない方法により、アシル-CoAシンセターゼ活性を測定することも可能である。
【００３５】
「宿主細胞で発現させた場合に該宿主細胞が産生する脂肪酸の量を増加させる活性」とは、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入（形質転換）して該宿主細胞内で発現させた場合に、前記宿主細胞と同一株由来であり、かつ前記ポリヌクレオチドを導入しなかった対照細胞（コントロール）と比べて脂肪酸の総生産量を増加させる活性を意味する。
【００３６】
また、「宿主細胞で発現させた場合に該宿主細胞が産生する脂肪酸の組成を変化させる活性」とは、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入（形質転換）して該宿主細胞内で発現させた場合に、前記宿主細胞と同一株由来であり、かつ前記ポリヌクレオチドを導入しなかった対照細胞（コントロール）と比べて細胞により産生される各種脂肪酸の量又は比率を変化させる活性を意味する。
【００３７】
本明細書中、「脂肪酸」とは、一般式RCOOH（Rはアルキル基）で表される脂肪族モノカルボン酸（カルボキシル基を一個有し、炭素原子が鎖状に連結したカルボン酸）のことをいう。脂肪酸には、炭化水素鎖中に二重結合を有さない飽和脂肪酸と、二重結合を含む不飽和脂肪酸とが含まれる。好ましくは、脂肪酸は、不飽和脂肪酸であり、さらに好ましくは、炭化水素鎖中に複数の二重結合を含む高度不飽和脂肪酸である。また、高度不飽和脂肪酸の好ましい例としては、炭素数18以上の不飽和脂肪酸、例えば、炭素数18又は20の不飽和脂肪酸であり、その例としては、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸（γ-リノレン酸及びジホモγ-リノレン酸等）、アラキドン酸等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。特に好ましくは、高度不飽和脂肪酸は、リノール酸、γ-リノレン酸、ジホモγ-リノレン酸及びアラキドン酸であり、より好ましくは、リノール酸、ジホモγ-リノレン酸及びアラキドン酸であり、最も好ましくは、ジホモγ-リノレン酸及びアラキドン酸である。
【００３８】
本発明において、「宿主細胞」とは、本発明のポリヌクレオチドを導入した際に該ポリヌクレオチドを発現できる細胞であれば特に限定されない。このような細胞には、哺乳動物（ヒトを除く）、昆虫、植物、真菌、細菌等に由来する細胞が含まれ、好ましくは、植物及び真菌に由来する細胞であり、特に好ましくは真菌に由来する細胞である。とりわけ脂質生産菌又は酵母が好ましい。
【００３９】
脂質生産菌の例としては、MYCOTAXON, Vol. XLIV, No. 2, pp. 257-265（1992）に記載されている脂質生産菌が挙げられるが、これに限定されるものではない。具体的な例としては、モルティエレラ属に属する微生物が挙げられる。モルティエレラ属に属する微生物の具体例としては、モルティエレラ・エロンガタ（Mortierella elongata）IFO8570、モルティエレラ・エキシグア（Mortierella exigua）IFO8571、モルティエレラ・ヒグロフィラ（Mortierella hygrophila）IFO5941、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS 219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS528.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等のモルティエレラ亜属（subgenus  Mortierella）に属する微生物、又はモルティエレラ・イザベリナ（Mortierella  isabellina）CBS194.28、IFO6336、IFO7824、IFO7873、IFO7874、IFO8286、IFO8308、IFO7884、モルティエレラ・ナナ（Mortierella nana）IFO8190、モルティエレラ・ラマニアナ（Mortierella ramanniana）IFO5426、IFO8186、CBS112.08、CBS212.72、IFO7825、IFO8184、IFO8185、IFO8287、モルティエレラ・ヴィナセア（Mortierella vinacea）CBS236.82等のマイクロムコール亜属（subgenus Micromucor）に属する微生物等を挙げることができる。とりわけ、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）が好ましい。
【００４０】
酵母の具体例としては、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、カンジダ属（Candida）、シゾサッカロマイセス属（Zygosaccharomyces）、ピキア属（Pichia）、ハンセヌラ属（Hansenula）が挙げられ、サッカロマイセス属（Saccharomyces）としては、好ましくは、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae)が挙げられる。しかし、サッカロマイセス・セレビシエ等の野生株酵母は、その細胞内において主に炭素数18以下の飽和脂肪酸又は1価不飽和脂肪酸は合成することができるが、高度不飽和脂肪酸は合成することはできない。そのため、サッカロマイセス・セレビシエ等の酵母を宿主細胞として用いる場合には、該酵母細胞は、遺伝子組み換え等によって高度不飽和脂肪酸を合成する能力が付与されていることが好ましい。このような高度不飽和脂肪酸を合成する能力は、既に高度不飽和脂肪酸を合成する能力を有する生物に由来するタンパク質であって、脂肪酸合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子を導入することによって付与することができる。
「既に高度不飽和脂肪酸を合成する能力を有する生物」の例としては、脂質生産菌が挙げられる。脂質生産菌の具体例は、先に述べた通りである。
【００４１】
また、既に高度不飽和脂肪酸を合成する能力を有する生物に由来するタンパク質であって、「脂肪酸合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子」の例としては、Δ12脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、Δ6脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、GLELO脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子及びΔ5脂肪酸不飽和化酵素遺伝子等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。Δ12脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、Δ6脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、GLELO脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子及びΔ5脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の塩基配列は、GenBank等のデータベースにアクセスすることにより入手することが可能であり、例えば、GenBankにおいては、それぞれNo.AB020033、No.AB020032、No.AB193123及びNo.AB188307のアクセッションナンバーを入力することにより各配列を入手することができる。
【００４２】
上記の脂肪酸合成関連タンパク質の遺伝子は、適切なベクター（例えば、pESC（Stratagene）又はpYES（Invitrogen）等）に挿入した後に、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929（1978））、酢酸リチウム法（J. Bacteriology, 153, p163（1983））、及びProc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 （1978）、Methods in yeast genetics, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等に記載の方法で酵母に導入することができる。
【００４３】
脂肪酸は、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドで形質転換した宿主細胞から以下のようにして抽出することができる。宿主細胞について、培養終了後、遠心分離法、ろ過等の常法に従って培養細胞を得る。細胞を十分水洗し、好ましくは乾燥する。乾燥は、凍結乾燥、風乾等によって行うことができる。乾燥細胞を、必要に応じて、ダイノミルや超音波等により破砕した後、好ましくは窒素気流下で有機溶媒によって抽出処理する。有機溶媒としてはエーテル、ヘキサン、メタノール、エタノール、クロロホルム、ジクロロメタン、石油エーテル等を用いることができ、又はメタノール及び石油エーテルの交互抽出又はクロロホルム-メタノール-水の一層系の溶媒を用いた抽出によっても良好な結果を得ることができる。抽出物から減圧下で有機溶媒を留去することにより、脂肪酸を含有する脂質を得ることができる。抽出した脂肪酸は、塩酸メタノール法等によってメチルエステル化してもよい。
【００４４】
また、各種脂肪酸の量又は比率は、上記のようにして抽出した脂肪酸を各種クロマトグラフィー法で分析することにより測定することができる。クロマトグラフィー法の例としては、高速液体クロマトグラフィー及びガスクロマトグラフィーが挙げられ、特に好ましい例としてガスクロマトグラフィーが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００４５】
3.  本発明のベクター及びこれを導入した形質転換体
本発明はまた、別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを提供する。
本発明のベクターは、通常、
（i）宿主細胞内で転写可能なプロモーター；
（ii）該プロモーターに結合した、上記（a）〜（g）のいずれかに記載のポリヌクレオチド；及び
（iii）RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセット
を含むように構成される。
このように構築されるベクターは、宿主細胞に導入される。本発明において使用される適切な宿主細胞の例は、先に述べた通りである。
【００４６】
本発明のベクターで形質転換されたこれらの宿主細胞は、本発明のベクターで形質転換されていない宿主細胞に比べて、ACS活性が増加しているか、より多くの脂肪酸を生産するか、又は細胞内に含有される各種脂肪酸の量若しくは比率が変化している。
脂質生産菌に導入する際に用いるベクターとしては、例えば、pDura5(Appl. Microbiol. Biotechnol., 65, 419-425, (2004))が利用可能であるが、これに限定されない。
【００４７】
酵母に導入する際に用いるベクターとしては、酵母細胞内でインサートを発現する活性を有するベクターであれば特に限定されないが、例としては、pYE22m（Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995）が挙げられる。
【００４８】
宿主細胞中での遺伝子発現を調節するためのプロモーター/ターミネーターとしては、宿主細胞中で機能する限り、任意の組み合わせでよい。例えば、脂質生産菌で利用する場合はhiston H4.1遺伝子のプロモーター、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター等を利用可能である。
形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、栄養要求性マーカー（ura5、niaD）、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ジェネチシン耐性遺伝子（G418r）、銅耐性遺伝子（CUP1）（Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984）、セルレニン耐性遺伝子（fas2m, PDR4）（それぞれ猪腰淳嗣ら, 生化学, 64, 660, 1992； Hussain et al., gene, 101, 149, 1991）等が利用可能である。
【００４９】
宿主細胞の形質転換方法としては、一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、脂質生産菌の場合、エレクトロポレーション法（Mackenxie D. A. et al. Appl. Environ. Microbiol., 66, 4655-4661, 2000）やパーティクルデリバリー法（特開2005-287403「脂質生産菌の育種方法」に記載の方法）が利用できる。また、酵母の場合は、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929（1978））、酢酸リチウム法（J. Bacteriology, 153, p163（1983））、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 （1978）、Methods in yeast genetics, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等に記載の方法で実施可能であるが、これらに限定されない。
【００５０】
その他、一般的なクローニング技術に関しては、"Sambrook ＆ Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001"、"Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual （Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY）"等を参照することができる。
【００５１】
4.  本発明の脂質又は脂肪酸組成物の製造方法
本発明はまた、別の実施形態において、上記の形質転換体を用いる脂質又は脂肪酸組成物の製造方法を提供する。
本明細書中、「脂質」とは、脂肪酸とアルコールとがエステル結合した化合物（例えば、グリセリド）又はその類似体（例えば、コレステロールエステル）等を含む単純脂質、単純脂質の一部にさらにリン酸、アミノ酸、糖等が結合した複合脂質、及び脂質の加水分解物で水に溶けない誘導脂質をいうものとする。
本明細書中、「油脂」とは、グリセロールと脂肪酸のエステル（グリセリド）のことをいう。
「脂肪酸」については、先に記載した通りである。
【００５２】
本発明の脂質又は脂肪酸組成物の抽出方法は、先に述べた脂肪酸の抽出方法と同様である。
【００５３】
脂肪酸を含有する脂質からの脂肪酸の分離は、混合脂肪酸又は混合脂肪酸エステルの状態で、常法（例えば、尿素付加法、冷却分離法、カラムクロマトグラフィー法等）により濃縮分離することにより行うことができる。
【００５４】
本発明の方法により製造される脂質は、好ましくは、不飽和脂肪酸であり、さらに好ましくは、高度不飽和脂肪酸を含む。高度不飽和脂肪酸の好ましい例としては、炭素数18以上の不飽和脂肪酸、例えば、炭素数18又は20の不飽和脂肪酸であり、その例としては、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸（γ-リノレン酸及びジホモγ-リノレン酸等）、アラキドン酸等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。特に好ましくは、高度不飽和脂肪酸は、リノール酸、γ-リノレン酸、ジホモγ-リノレン酸及びアラキドン酸であり、より好ましくは、リノール酸、ジホモγ-リノレン酸及びアラキドン酸であり、最も好ましくは、ジホモγ-リノレン酸及びアラキドン酸である。。
なお、本発明の方法により生成される脂質及び該脂質に含まれる脂肪酸の組成は、上記の脂質の抽出方法、脂肪酸の分離方法又はそれらの組合せによって確認することができる。
【００５５】
本発明の製造方法によって得られた脂質又は脂肪酸組成物は、常法に従って、例えば、油脂を含む食品、医薬品、工業原料（化粧料、石鹸等の原料）の製造等の用途に使用することができる。
【００５６】
本発明はまた、別の実施形態において、本発明の形質転換体を用いる食品、化粧料、医薬、石鹸等の製造方法を提供する。この方法は、本発明の形質転換体を用いて脂質又は脂肪酸を生成する工程を包含する。生成された脂質又は脂肪酸を含有する食品、化粧料、医薬、石鹸等の調製は、常法による。このように、本発明の製造方法によって製造された食品、化粧料、医薬、石鹸等は、本発明の形質転換体を用いて生成された脂質又は脂肪酸を含有する。本発明はさらに、そのような方法によって製造された食品、化粧料、医薬、石鹸等を提供する。
【００５７】
本発明の化粧品（組成物）又は医薬品（組成物）の剤型は、特に限定されず、溶液状、ペースト状、ゲル状、固体状、粉末状等任意の剤型をとることができる。また、本発明の化粧料組成物又は医薬組成物は、オイル、ローション、クリーム、乳液、ゲル、シャンプー、ヘアリンス、ヘアコンディショナー、エナメル、ファンデーション、リップスティック、おしろい、パック、軟膏、香水、パウダー、オーデコロン、歯磨、石鹸、エアロゾル、クレンジングフォーム等の化粧料若しくは皮膚外用薬の他、皮膚老化防止改善剤、皮膚炎症防止改善剤、浴用剤、養毛剤、皮膚美容液、日焼け防止剤あるいは、外傷、あかぎれ、ひびわれ等による肌荒れの防止改善剤等に用いることができる。
【００５８】
本発明の化粧料組成物は、必要に応じてさらに、その他の油脂、及び／又は色素、香料、防腐剤、界面活性剤、顔料、酸化防止剤等を適宜配合することができる。これらの配合比率は、目的に応じて当業者が適宜決定し得る（例えば、油脂は、組成物中に、1〜99.99重量％、好ましくは、5〜99.99重量％、より好ましくは、10〜99.95重量％含有され得る）。また、本発明の医薬組成物は、必要に応じてさらに、その他の医薬活性成分（例えば、消炎成分）又は補助成分（例えば、潤滑成分、担体成分）を含んでいても良い。例えば、化粧料あるいは皮膚外用薬におけるその他の常用成分としては、にきび用薬剤、ふけ・かゆみ防止剤、制汗防臭剤、熱傷用薬剤、抗ダニ・シラミ剤、角質軟化剤、乾皮症用薬剤、抗ウイルス剤、経皮吸収促進剤等が挙げられる。
【００５９】
本発明の食品の例としては、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、幼児用食品、乳児用調製乳、未熟児用調製乳、老人用食品等が挙げられる。本明細書中、食品は、固体、流動体、及び液体、並びにそれらの混合物であって、摂食可能なものの総称である。
栄養補助食品とは、特定の栄養成分が強化されている食品をいう。健康食品とは、健康的な又は健康によいとされる食品をいい、栄養補助食品、自然食品、ダイエット食品等を含む。機能性食品とは、体の調節機能を果たす栄養成分を補給するための食品をいい、特定保健用途食品と同義である。幼児用食品とは、約6歳までの子供に与えるための食品をいう。老人用食品とは、無処理の食品と比較して消化及び吸収が容易であるように処理された食品をいう。乳児用調製乳とは、約1歳までの子供に与えるための調製乳をいう。未熟児用調製乳とは、未熟児が生後約6ヶ月になるまで与えるための調製乳をいう。
【００６０】
これらの食品の形態の例としては、肉、魚、ナッツ等の天然食品（油脂で処理したもの）、中華料理、ラーメン、スープ等の調理時に油脂を加える食品、天ぷら、フライ、油揚げ、チャーハン、ドーナッツ、かりん糖等の熱媒体として油脂を用いた食品、バター、マーガリン、マヨネーズ、ドレッシング、チョコレート、即席ラーメン、キャラメル、ビスケット、クッキー、ケーキ、アイスクリーム等の油脂食品又は加工時に油脂を加えた加工食品、おかき、ハードビスケット、あんパン等の加工仕上げ時に油脂を噴霧又は塗布した食品等を挙げることができる。しかしながら、油脂を含む食品に限定されるわけではなく、例えば、パン、麺類、ごはん、菓子類（キャンデー、チューインガム、グミ、錠菓、和菓子）、豆腐及びその加工品等の農産食品、清酒、薬用酒、みりん、食酢、醤油、みそ等の発酵食品、ヨーグルト、ハム、ベーコン、ソーセージ等の畜産食品、かまぼこ、揚げ天、はんぺん等の水産食品、果汁飲料、清涼飲料、スポーツ飲料、アルコール飲料、茶等であってもよい。
【００６１】
本発明の食品はまた、カプセル等の医薬製剤の形態、又はタンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類、乳化剤、香料等に本発明の油脂が配合された自然流動食、半消化態栄養食、及び成分栄養食、ドリンク剤、経腸栄養剤等の加工形態であってもよい。
【００６２】
以上に記載するように、本発明のACSホモログの遺伝子を宿主細胞内で発現させることにより、効率的に脂肪酸を生成させることが可能である。
さらに、当該遺伝子の発現量を指標にして、脂肪酸生産を効率よく行うための培養条件の検討、培養管理、等にも利用できる。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって限定されない。【００６４】
[実施例1]Mortierella  alpinaのゲノム解析
M. alpina 1S-4株を100mlのGY2：1培地（2％グルコース、1％酵母エキス  pH6.0）に植菌し、28℃で2日間振とう培養した。濾過により菌体を集菌し、DNeasy (QIAGEN) を用いてゲノムDNAを調製した。上記ゲノムDNAの塩基配列を、 Roche 454 GS FLX Standard を用いて決定した。その際、フラグメントライブラリーの塩基配列決定を2ラン分、メイトペアライブラリーの塩基配列決定を3ラン分行った。得られた塩基配列をアッセンブリすることにより、300個のSuper Contigが得られた。
【００６５】
cDNAの合成とcDNAライブラリーの作製
M. alpina 1S-4株を100mlの培地（1.8％グルコース、1％酵母エキス、pH6.0）に植菌し、3日間28℃で前培養した。10L培養槽（Able Co.，東京）に5Lの培地（1.8％グルコース、1％大豆粉、0.1％オリーブ油、0.01％アデカノール、0.3％KH2PO4、0.1％ Na2SO4、0.05％ CaCl2・2H2O、0.05％ MgCl2・6H2O、pH6.0）を入れ、前培養物を全量植菌し、300rpm、1vvm、26℃の条件で8日間通気攪拌培養した。培養1、2、及び3日目に各々2％、2％、及び1.5％相当のグルコースを添加した。培養1、2、3、6、及び8日目の各ステージに菌体を回収し、塩酸グアニジン／CsCl法でtotal RNAを調製した。Oligotex-dT30 <Super> mRNA Purification Kit（Takara Bio Inc.）を用いて、total RNAからpoly（A）＋RNAの精製を行った。各ステージのcDNAライブラリーを、ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit (STRATAGENE) を用いて作製した。
【００６６】
ACSホモログの探索
酵母のACSであるScFAA1（YOR317W）、ScFAA2（YER015W）、ScFAA3（YIL009W）、ScFAA4（YMR246W）、ScFAT1（YBR041W）、ScFAT2（YBR222C）のアミノ酸配列をquery 配列として、M. alpina 1S-4のゲノム塩基配列に対しtblastn検索を行った。その結果、12種類の配列がヒットした。すなわち、配列番号5、配列番号10、配列番号15、配列番号20、配列番号25、配列番号30、配列番号35、配列番号40、配列番号45、配列番号50、配列番号55、配列番号60の配列を含むSuper Contigがヒットした。配列番号5、にかかる遺伝子をMaACS-1、配列番号10にかかる遺伝子をMaACS-2、配列番号15にかかる遺伝子をMaACS-3、配列番号20にかかる遺伝子をMaACS-4、配列番号25にかかる遺伝子をMaACS-5、配列番号30にかかる遺伝子をMaACS-6、配列番号35にかかる遺伝子をMaACS-7、配列番号40にかかる遺伝子をMaACS-8、配列番号45にかかる遺伝子をMaACS-9、配列番号50にかかる遺伝子をMaACS-10、配列番号55にかかる遺伝子をMaACS-11、配列番号60にかかる遺伝子をMaACS-12とした。
【００６７】
ACSホモログのクローニング
MaACS-1〜12の遺伝子に対応するcDNAをクローニングするために、上記cDNAライブラリーのスクリーニングを行った。なお、プローブのラベリングは、ExTaq（Takara Bio Inc.）を用いたPCRにより行った。すなわち、ExTaqに添付のdNTPミックスの代わりにPCRラベリングミックス（Roche Diagnositcs）を用いて、増幅されるDNAをジゴキシゲニン（DIG）ラベルしたプローブを作製した。
ハイブリダイゼーションの条件は、次のとおりである。
バッファー：5xSSC、1％SDS、50mM Tris-HCl（pH7.5）、50％ホルムアミド；
温度：42℃（一晩）；
洗浄条件：0.2x SSC、0.1％SDS溶液中（65℃）で、20分間×3回；
検出は、DIG核酸検出キット（Roche Diagnositcs）を用いて行った。スクリーニングによって得られたファージクローンから、in vivo エキシジョンによりプラスミドを切り出し、各プラスミドDNAを得た。
以下に、各遺伝子のスクリーニングに用いたプローブ作製用のプライマー、得られた各遺伝子のCDSの塩基数、CDSの塩基配列より導かれるアミノ酸配列のアミノ酸数、および、ゲノムDNA配列とCDS配列との比較によるエキソン、イントロンの数を記載する。
（1）MaACS-1プライマーACS-1-1F：5'-gtcggctccaagcttgcaatcc-3'（配列番号61）
プライマーACS-1-2R：5'-ggacagctccagcactgtggtaaag-3'（配列番号62）
cDNA（配列番号4）
CDS（配列番号3）：1857bp
ORF（配列番号1）：1854bp
アミノ酸配列（配列番号2）：618アミノ酸（図1参照）
エキソン数：5、イントロン数：4（図2参照）
（2）MaACS-2
プライマーACS-2-1F：5'-gaccacgggattccccaaggctgc-3'（配列番号63）
プライマーACS-2-2R：5'-cttggtcgcgcttgttcctggccac-3'（配列番号64）
cDNA（配列番号9）
CDS（配列番号8）：1929bp
ORF（配列番号6）：1926bp
アミノ酸配列（配列番号7）：642アミノ酸（図3参照）
エキソン数：8、イントロン数：7（図4参照）
（3）MaACS-3
プライマーACS-3-1F：5'-tacagctttgttgctgtccccatc-3'（配列番号65）
プライマーACS-3-2R：5'-gatgatgggtgtgcttgcaaagatc-3'（配列番号66）
cDNA（配列番号14）
CDS（配列番号13）：1653bp
ORF（配列番号11）：1650bp
アミノ酸配列（配列番号12）：550アミノ酸（図5参照）
エキソン数：9、イントロン数：8（図6参照）
（4）MaACS-4
プライマーACS-4-1F：5'-aacccaaagctgcgccaggctgtcc-3'（配列番号67）
プライマーACS-4-2R：5'-ttacagcttggattccttttgatgg-3'（配列番号68）
cDNA（配列番号19）
CDS（配列番号18）：2067bp
ORF（配列番号16）：2064bp
アミノ酸配列（配列番号17）：688アミノ酸（図7参照）
エキソン数：7、イントロン数：6（図8参照）
（5）MaACS-5
プライマーACS-5-1F：5'-gtcgtgcccgatgcggagacgc-3'（配列番号69）
プライマーACS-5-2R：5'-tcagtggatcccgttatacatcag-3'（配列番号70）
cDNA（配列番号24）
CDS（配列番号23）：1980bp
ORF（配列番号21）：1977bp
アミノ酸配列（配列番号22）：659アミノ酸（図9参照）
エキソン数：6、イントロン数：5（図10参照）
（6）MaACS-6
プライマーACS-6-1F：5'-gcgtccccctctatgatacattg-3'（配列番号71）
プライマーACS-6-2R：5'-gtgggatgcaggacggcaacatcg-3'（配列番号72）
cDNA（配列番号29）
CDS（配列番号28）：1980bp
ORF（配列番号26）：1977bp
アミノ酸配列（配列番号27）：659アミノ酸（図11参照）
イントロン数：少なくとも5つ（図12参照）
（7）MaACS-7
プライマーACS-7-1F：5'-ggatgccgaacaacagcgcgtgg-3'（配列番号73）
プライマーACS-7-2R：5'-gcaccctcctcagaaacagccctc-3'（配列番号74）
cDNA（配列番号34）
CDS（配列番号33）：1827bp
ORF（配列番号31）：1824bp
アミノ酸配列（配列番号32）：608アミノ酸（図13参照）
エキソン数：5、イントロン数：4（図14参照）
（8）MaACS-8
プライマーACS-8-1F：5'-cagtcgagtacattgtcaaccacg-3'（配列番号75）
プライマーACS-8-2R：5'-gcggttcaagaggcgaggcacagc-3'（配列番号76）
cDNA（配列番号39）
CDS（配列番号38）：2079bp
ORF（配列番号36）：2076bp
アミノ酸配列（配列番号37）：692アミノ酸（図15参照）
エキソン数：8、イントロン数：7（図16参照）
（9）MaACS-9
プライマーACS-9-1F：5'-gttcatcttctgctggctgggtctc-3'（配列番号77）
プライマーACS-9-2R：5'-gttgcgttgttcacgcggcaatcc-3'（配列番号78）
cDNA（配列番号44）
CDS（配列番号43）：1851bp
ORF（配列番号41）：1848bp
アミノ酸配列（配列番号42）：616アミノ酸（図17参照）
エキソン数：5、イントロン数：4（図18参照）
（10）MaACS-10
プライマーACS-10-1F：5'-atggaaaccttggttaacggaaag-3'（配列番号79）
プライマーACS-10-2R：5'-tcagcaaagatggccttgggctgg-3'（配列番号80）
cDNA（配列番号49）
CDS（配列番号48）：2076bp
ORF（配列番号46）：2073bp
アミノ酸配列（配列番号47）：691アミノ酸（図19参照）
エキソン数：8、イントロン数：7（図20参照）
（11）MaACS-11
プライマーACS-11-1F：5'-gtcaagggcgagactcgcatcc-3'（配列番号81）
プライマーACS-11-2R：5'-cggtgacgatggtcatggactgc-3'（配列番号82）
cDNA（配列番号54）
CDS（配列番号53）：2043bp
ORF（配列番号51）：2040bp
アミノ酸配列（配列番号52）：680アミノ酸（図21参照）
エキソン数：3、イントロン数：2（図22参照）
（12）MaACS-12
プライマーACS-12-1F：5'-gcgagacccgcatccgccgctcc-3'（配列番号83）
プライマーACS-12-2R：5'-gaccgtcctcgcccagggtgtcg-3'（配列番号84）
cDNA（配列番号59）
CDS（配列番号58）：2043bp
ORF（配列番号56）：2040bp
アミノ酸配列（配列番号57）：680アミノ酸（図23参照）
エキソン数：3、イントロン数：2（図24参照） 
【００６８】
配列解析
M. alpina由来の12種類のACSホモログのCDS塩基配列間の同一性を表1に、アミノ酸配列間の同一性を表2に示す。MaACS-11とMaACS-12は、塩基配列で80.2％、アミノ酸配列で84.3％と高い同一性を示した。【００６９】
【表１】
0005795267.tif 000002
【００７０】
【表２】
0005795267.tif 000003
MaACS-1〜12のCDS配列の推定アミノ酸配列をquery配列として、GenBankに登録されているアミノ酸配列に対して、BLASTp検索を行った。MaACS-1〜12の推定アミノ酸配列と最も高いスコアでヒットしたアミノ酸配列を有するタンパク質及び該タンパク質のアミノ酸配列とMaACS-1〜12の推定アミノ酸配列との同一性を表3に示す。また、S.cerevisiae由来のアシル‐CoAシンセターゼのアミノ酸配列に対するMaACS-1〜12の推定アミノ酸配列の同一性を表4に示す。
さらに、【００７１】
【表３】
0005795267.tif 000004
【００７２】
【表４】
0005795267.tif 000005
【００７３】
MaACS-1〜12のうち、S.cerevisiae由来のFAAタンパク質と比較的高いアミノ酸配列の相同性を有するMaACSと該FAAタンパク質とのアラインメントを図25に示す。またS.cerevisiae由来のFATタンパク質と比較的高いアミノ酸配列の相同性を有するACSホモログのアラインメントを図26に示す。図25及び26に示すいずれのグループのACSホモログもACS活性に重要なモチーフであるATP-AMPモチーフとFACS/VLACS-FATPモチーフの領域が高度に保存されている。【００７４】
発現ベクターの構築
酵母発現用ベクターpYE22m（Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995）を用いて、以下のようにMaACS-1、MaACS-10、MaACS-11、MaACS-6、MaACS-8、MaACS-9をそれぞれ酵母で発現させるためのベクターを構築した。【００７５】
MaACS-6をスクリーニングして得られた配列番号29を含むプラスミドを制限酵素BamHI及びXhoIで消化し、得られた約2.1kbpのDNA断片と、ベクターpYE22mを制限酵素BamHI及びSalIで消化したDNA断片とをligation high(TOYOBO)を用いて連結することによりプラスミドpYE-ACS-6を得た。【００７６】
MaACS-8のcDNAを含むプラスミドを鋳型として、以下のプライマーを使って、ExTaq(Takara Bio Inc.)を用いたPCR増幅により得られたDNA断片を、TOPO-TA  cloning Kit(Invitrogen)にて、クローン化した。
プライマーEcoRI-ACS-8-F：5'-GGATCCATGCCTTCCTTCAAAAAGTACAACC-3'（配列番号85）
プライマーSmaI-ACS-8-R：5'-CCCGGGCAAAGAGTTTTCTATCTACAGCTT-3'（配列番号86）
インサート部分の塩基配列を確認し、正しい塩基配列を有するプラスミドを制限酵素EcoRI及びSmaIで消化して得られた約2.1kbpのDNA断片と、ベクターpYE22mを制限酵素EcoRII及びSmaIで消化したDNA断片とをligation high(TOYOBO)を用いて連結することによりプラスミドpYE-ACS-8を得た。【００７７】
MaACS-9のcDNAを含むプラスミドを鋳型として、以下のプライマーを使って、ExTaq(Takara Bio Inc.)を用いたPCR増幅により得られたDNA断片を、TOPO-TA  cloning Kit(Invitrogen)にて、クローン化した。
プライマーEcoRI-ACS-9-F：5'-GAATTCATGGTTGCTCTCCCACTCG-3'（配列番号87）
プライマーBamHI-ACS-9-R：5'-GGATCCCTACTATAGCTTGGCCTTGCC-3'（配列番号88）
インサート部分の塩基配列を確認し、正しい塩基配列を有するプラスミドを制限酵素EcoRI及びBamHIで消化して得られた約2.0kbpのDNA断片と、ベクターpYE22mを制限酵素EcoRII及びBamHIで消化したDNA断片とをligation high(TOYOBO)を用いて連結することによりプラスミドpYE-ACS-9を得た。【００７８】
MaACS-1のcDNAを含むプラスミドを鋳型として、以下のプライマーを使って、ExTaq(Takara Bio Inc.)を用いたPCR増幅により得られたDNA断片を、TOPO-TA  cloning Kit(Invitrogen)にて、クローン化した。
プライマーEcoRI-ACS-1-F：5'-GGATCCATGTATGTCGGCTCCAAGCTTGC-3'（配列番号89）
プライマーSalI-ACS-1-R：5'-GTCGACTCAAAGCCTGGCTTTGCCGCTGACG-3'（配列番号90）
インサート部分の塩基配列を確認し、正しい塩基配列を有するプラスミドを制限酵素EcoRI及びSalIで消化して得られた約1.9kbpのDNA断片と、ベクターpYE22mを制限酵素EcoRI及びSalIで消化したDNA断片とをligation high(TOYOBO)を用いて連結することによりプラスミドpYE-ACS-1を得た。【００７９】
MaACS-10のcDNAを含むプラスミドを鋳型として、以下のプライマーを使って、ExTaq(Takara Bio Inc.)を用いたPCR増幅により得られたDNA断片を、TOPO-TA  cloning Kit(Invitrogen)にて、クローン化した。
プライマーACS-10-1F：5'- GGATCCatggaaaccttggttaacggaaag-3'（配列番号91）
プライマーKpnI-ACS-10-R：5'- GGTACCTAGAACTTCTTCCACATCTCCTC-3'（配列番号92）
インサート部分の塩基配列を確認し、正しい塩基配列を有するプラスミドを制限酵素EcoRI及びKpnIで消化して得られた約2.1kpbのDNA断片と、ベクターpYE22mを制限酵素EcoRI及びKpnIで消化したDNA断片とをligation high(TOYOBO)を用いて連結し、MaACS-10のCDSの5’側に、ベクターpYE22mのGAPDHプロモーターがある向きに連結されたものを選択することによりプラスミドpYE-ACS-10を得た。【００８０】
MaACS-11のcDNAを含むプラスミドを鋳型として、以下のプライマーを使って、ExTaq(Takara Bio Inc.)を用いたPCR増幅により得られたDNA断片を、TOPO-TA  cloning Kit(Invitrogen)にて、クローン化した。
プライマーSacI-ACS-11-F：5'-GAGCTCATGCCAAAGTGCTTTACCGTCAACG-3'（配列番号93）
プライマーBamHI-ACS-11-R：5'-GGATCCTTACTTGGAGCCATAGATCTGCTTG-3'（配列番号94）
インサート部分の塩基配列を確認し、正しい塩基配列を有するプラスミドを制限酵素SacI及びBamHIで消化して得られた約2.0kbpのDNA断片と、ベクターpYE22mを制限酵素SacI及びBamHIで消化したDNA断片とをligation high(TOYOBO)を用いて連結することによりプラスミドpYE-ACS-11を得た。【００８１】
酵母での発現
形質転換株の取得
プラスミドpYE22m、pYE-MaACS-6、pYE-MaACS-8、pYE-MaACS-9をそれぞれ用いて酢酸リチウム法により、酵母S. cerevisiae EH13-15株（trp1,MATα）（Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520, 1989）を形質転換した。形質転換株は、SC-Trp（1lあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO) 6.7g、グルコース20gアミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩1.25g、アルギニン0.6g、アスパラギン酸3g、グルタミン酸3g、ヒスチジン0.6g、ロイシン1.8g、リジン0.9g、メチオニン0.6g、フェニルアラニン1.5g、セリン11.25g、チロシン0.9g、バリン4.5g、スレオニン6g、ウラシル0.6gを混合したもの）1.3g、）寒天培地（2％アガー）上で生育することを基準に選抜した。【００８２】
酵母の培養
それぞれのプラスミドを用いて形質転換して得られた任意の1株ずつを、以下の培養実験に供した。
前培養として、SC-Trp培地10mlに酵母をプレートから1白金耳植菌し、30℃で1日間振とう培養を行った。本培養は、SC-Trp培地に前培養液を1ml添加し、30℃で1日間振とう培養を行った。【００８３】
菌体の脂肪酸分析
酵母の培養液を遠心分離することにより、菌体を回収した。10mlの滅菌水で洗浄し、遠心分離により再び菌体を回収し、凍結乾燥した。塩酸メタノール法により菌体の脂肪酸をメチルエステルに誘導した後、ヘキサンで抽出、ヘキサンを留去し、ガスクロマトグラフィーにより分析を行った。
培地あたりの脂肪酸生産量を表5に示した。pYE22mで形質転換したコントロールと比較して、ppYE-MaACS-6、pYE-MaACS-8またはpYE-MaACS-9で形質転換した株では培地あたりの脂肪酸生産量が上昇していた。【００８４】
【表５】
0005795267.tif 000006
【００８５】
アラキドン酸生産酵母での発現
（1）アラキドン酸酵母の育種
アラキドン酸生産酵母（S. cerevisiae）を育種するために、以下のプラスミドを構築した。
まず、M. alpina 1S-4株から調製したcDNAを鋳型として、以下のプライマーΔ12-f及びΔ12-r、Δ6-f及びΔ6-r、GLELO-f及びGLELO-r、又はΔ5-f及びΔ5-rの組み合わせにより、ExTaqを用いてPCRを行い、M. alpina 1S-4株のΔ12脂肪酸不飽和化酵素遺伝子(GenBank accession No.AB020033)(以下、「Δ12遺伝子」)、Δ6脂肪酸不飽和化酵素遺伝子(GenBank accession No.AB020032) (以下、「Δ6遺伝子」)、GLELO脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子(GenBank accession No.AB193123) (以下、「GLELO遺伝子」)及びΔ5脂肪酸不飽和化酵素遺伝子(GenBank accession No.AB188307) (以下、「Δ5遺伝子」)を増幅した。
Δ12-f：5'-TCTAGAatggcacctcccaacactattg-3'（配列番号95）
Δ12-r：5'-AAGCTTTTACTTCTTGAAAAAGACCACGTC-3'（配列番号96）
Δ6-f：5'-TCTAGAatggctgctgctcccagtgtgag-3'（配列番号97）
Δ6-r：5'-AAGCTTTTACTGTGCCTTGCCCATCTTGG-3'（配列番号98）
GLELO-f：5'-TCTAGAatggagtcgattgcgcaattcc-3'（配列番号99）
GLELO-r：5'-GAGCTCTTACTGCAACTTCCTTGCCTTCTC-3'（配列番号100）
Δ5-f：5'-TCTAGAatgggtgcggacacaggaaaaacc-3'（配列番号101）
Δ5-r：5'-AAGCTTTTACTCTTCCTTGGGACGAAGACC-3'（配列番号102）
これらをTOPO-TA-cloning Kitによりクローン化した。塩基配列を確認し、Δ12遺伝子、Δ6遺伝子、GLELO遺伝子及びΔ5遺伝子の塩基配列を含むクローンをそれぞれプラスミドpCR-MAΔ12DS（Δ12遺伝子の塩基配列を含む）、pCR-MAΔ6DS（Δ6遺伝子の塩基配列を含む）、pCR-MAGLELO（GLELO遺伝子の塩基配列を含む）、pCR-MAΔ5DS（Δ5遺伝子の塩基配列を含む）とした。【００８６】
一方、プラスミドpURA34（特開2001-120276）を制限酵素HindIIIで消化して得られた約1.2 kbのDNA断片を、ベクターpUC18（Takara Bio Inc.）を制限酵素EcoRIとSphIで消化したあと末端を平滑化し、セルフライゲーションして得られたベクターのHindIIIサイトに挿入し、ベクターのEcoRIサイト側がURA3の5’側であるクローンをpUC-URA3とした。また、YEp13を制限酵素SalIとXhoIで消化して得られた約2.2kbのDNA断片をベクターpUC18のSalIサイトに挿入し、ベクターのEcoRI側がLUE2の5’側であるクローンをpUC-LEU2とした。【００８７】
次に、プラスミドpCR-MAΔ12DSを制限酵素HindIIIで消化した後に末端を平滑化したものを制限酵素XbaIで消化して得られた約1.2 kbpのDNA断片と、ベクターpESC-URA（STRATAGENE）を制限酵素SacIで消化した後に末端を平滑化したものを制限酵素SpeIで消化した約6.6 kbpのDNA断片とを連結し、プラスミドpESC-U-Δ12を得た。プラスミドpCR-MAΔ6DSを制限酵素XbaIで消化した後に末端を平滑化したものを制限酵素HindIIIで消化して得られた約1.6 kbpのDNA断片と、プラスミドpESC-U-Δ12を制限酵素SalIで消化した後に末端を平滑化したものを制限酵素HindIIIで消化した約8 kbpのDNA断片とを連結し、プラスミドpESC-U-Δ12:Δ6を得た。これを制限酵素PvuIIで部分消化して得られた約4.2kbの断片をpUC-URA3のSmaIサイトに挿入し、プラスミドpUC-URA-Δ12:Δ6を得た。【００８８】
また、プラスミドpCR-MAGLELOを制限酵素XbaIとSacIで消化して得られた約0.95 kbpのDNA断片と、ベクターpESC-LEU（STRATAGENE）を制限酵素XbaIとSacIで消化して得られた約7.7 kbpのDNA断片とを連結し、プラスミドpESC-L-GLELOを得た。プラスミドpCR-MAΔ5DSを制限酵素XbaIで消化した後に末端を平滑化したものを制限酵素HindIIIで消化して得られた約1.3 kbpのDNA断片と、プラスミドpESC-L-GLELOを制限酵素ApaIで消化した後に末端を平滑化したものを制限酵素HindIIIで消化して得られた約8.7 kbpのDNA断片とを連結して、プラスミドpESC-L-GLELO:Δ5を得た。これを制限酵素PvuIIで消化して得られた約3.2 kbp断片をpUC-LEU2のSmaIサイトに挿入し、プラスミドpUC-LEU-GLELO:Δ5を得た。Saccharomyces cerevisiae YPH499株（STRATAGENE）をプラスミドpUC-URA-Δ12:Δ6とプラスミドpUC-LEU-GLELO:Δ5とでco-transformationした。形質転換株は、SC-Leu,Ura寒天培地上で生育することを基準に選抜した。こうして得られた株のうち、任意の一株をARA3-1株とした。この株は、ガラクトースを含む培地で培養することにより、GAL1/10プロモーターからΔ12脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、Δ6脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、GLELO遺伝子、Δ5脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を発現させることができる。【００８９】
（2）アラキドン酸生産酵母への形質転換と解析
ARA3-1株をプラスミドpYE22m、pYE-ACS-1、pYE-ACS-10、pYE-ACS-11でそれぞれ形質転換した。形質転換株は、SC-Trp,Leu,Ura（1 Lあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO)6.7 g、グルコース20 g、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩1.25 g、アルギニン0.6 g、アスパラギン酸3 g、グルタミン酸3 g、ヒスチジン0.6 g、リジン0.9 g、メチオニン0.6 g、フェニルアラニン1.5 g、セリン11.25 g、チロシン0.9 g、バリン4.5 g、スレオニン6 gを混合したもの）1.3 g）寒天培地（2％アガー）上で生育することを基準に選抜した。それぞれのプラスミド導入株の中から、任意の4株を以下の培養実験に使用した。【００９０】
これらの株を上記SC-Trp,Leu,Ura液体培地10 mlで30℃、1日間培養した。そのうち1 mlをSG-Trp,Leu,Ura（1 Lあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO)6.7 g、ガラクトース20 g、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩1.25 g、アルギニン0.6 g、アスパラギン酸3 g、グルタミン酸3 g、ヒスチジン0.6 g、リジン0.9 g、メチオニン0.6 g、フェニルアラニン1.5 g、セリン11.25 g、チロシン0.9 g、バリン4.5 g、スレオニン6 gを混合したもの）1.3 g）液体培地10 mlに植菌し、15℃、6日間培養した。集菌し、水洗した後、凍結乾燥した。塩酸メタノール法により乾燥菌体内の脂肪酸をメチルエステルに誘導し、ガスクロマトグラフィーにより、脂肪酸分析を行った。プラスミドpYE22mで形質転換したコントロール株、および、モルティエレラ由来の各ACSホモログで形質転換した株の総脂肪酸に対する各PUFAの組成比を表6に示す。【００９１】
【表６】
0005795267.tif 000007
【００９２】
表6に示すように、モルティエレラ由来のACSホモログを発現させることで、脂肪酸の組成を改変させることができた。特に、MaACS-11発現株では、コントロール株と比べてアラキドン酸の組成比が約1.8倍、リノール酸は約1.5倍、γ-リノレン酸は2.4倍に増加していた。また、MaACS-1発現株では、コントロール株と比べてアラキドン酸量は約1.5倍に増加していた。さらに、MaACS-10発現株では、コントロール株と比べてリノール酸は約2倍、γ-リノレン酸は約4倍に増加していた。【００９３】
[実施例2]発現ベクターの構築
酵母用発現ベクター
MaACS-12を酵母で発現させるためのベクターpYE-ACS-12を以下のように構築した。MaACS-12のcDNAを含むプラスミドを鋳型として、
プライマーEco-ACS-G-F：5’-GAATTCATGACAAAGTGCCTCACCGTCG-3’ 
（配列番号103）
プライマーSma-ACS-G-R：5’-CCCGGGACTTAGGCCGTTCCATAAAGCTG-3’
（配列番号104）
を使って、KOD-plus-（TOYOBO）を用いたPCRで増幅したDNA断片を、Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit（インビトロジェン）にてクローン化した。インサート部分の塩基配列を確認し、正しい塩基配列を有するプラスミドを制限酵素EcoRIとSmaIで消化して得られた約2 kbpのDNA断片と、ベクターpYE22mを制限酵素BamHIで消化した後Blunting Kit(TAKARAバイオ)を用いて末端を平滑化し、続いてEcoRIで消化したDNA断片を、Ligation High(TOYOBO)を用いて連結し、プラスミドpYE-ACS-12を得た。【００９４】
M. alpina用発現ベクター
MaACS-10とMaACS-11をM. alpinaで発現させるために、以下のとおり、ベクターを構築した。
まず、ベクターpUC18を制限酵素EcoRIとHindIIIで消化し、オリゴDNA MCS-for-pUC18-F2とMCS-for-pUC18-R2をアニーリングさせたアダプターを挿入し、プラスミドpUC18-RF2を構築した。
MCS-for-pUC18-F2：
5’-aattcataagaatgcggccgctaaactattctagactaggtcgacggcgcgcca-3’
（配列番号105）
MCS-for-pUC18-R2：
5’-agcttggcgcgccgtcgacctagtctagaatagtttagcggccgcattcttatg-3’
（配列番号106）【００９５】
M. alpinaのゲノムDNAを鋳型として、プライマーNot1-GAPDHt-FとプライマーEcoR1-Asc1-GAPDHt-Rを使って、KOD-plus-（TOYOBO）を用いたPCRで増幅した約0.5 kbpのDNA断片を、Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit（インビトロジェン）にてクローン化した。インサート部分の塩基配列を確認したあと、制限酵素NotIとEcoRIで消化して得られた約0.9 kbpのDNA断片をプラスミドpUC18-RF2のNotI及びEcoRIサイトに挿入し、プラスミドpDG-1を構築した。
Not1-GAPDHt-F：5’-agcggccgcataggggagatcgaacc-3’
（配列番号107）
EcoR1-Asc1-GAPDHt-R：5’-agaattcggcgcgccatgcacgggtccttctca-3’
（配列番号108）【００９６】
M. alpinaのゲノムを鋳型として、プライマーURA5g-F1とプライマーURA5g-R1を使って、KOD-plus-（TOYOBO）を用いたPCRで増幅したDNA断片を、Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit（インビトロジェン）にてクローン化した。インサート部分の塩基配列を確認したあと、制限酵素SalIで消化して得られた約2 kbpのDNA断片をプラスミドpDG-1のSalIサイトに挿入し、URA5遺伝子の5’側がベクターのEcoRI側になる向きで挿入されたものをプラスミドpDuraGとした。
URA5g-F1：5’-gtcgaccatgacaagtttgc-3’ （配列番号109）
URA5g-R1：5’-GTCGACTGGAAGACGAGCACG-3’ （配列番号110）【００９７】
続いて、M. alpinaのゲノムを鋳型プライマーhisHp+URA5-FとプライマーhisHp+MGt-Fを使って、KOD-plus-（TOYOBO）を用いたPCRで増幅した約1.0 kbpのDNA断片と、pDuraGを鋳型として、プライマーpDuraSC-GAPt-FとプライマーURA5gDNA-Fを使って、KOD-plus-（TOYOBO）を用いたPCRで増幅した約5.3 kbpのDNA断片を、In-Fusion（登録商標）Advantage PCR Cloning Kit（TAKARAバイオ）を使って連結し、プラスミドpDUra-RhGを得た。
hisHp+URA5-F：5’-GGCAAACTTGTCATGAAGCGAAAGAGAGATTATGAAAACAAGC-3’
（配列番号111）
hisHp+MGt-F：5’-CACTCCCTTTTCTTAATTGTTGAGAGAGTGTTGGGTGAGAGT-3’
（配列番号112）
pDuraSC-GAPt-F：5’-TAAGAAAAGGGAGTGAATCGCATAGGG-3’ （配列番号113）
URA5gDNA-F：5’-CATGACAAGTTTGCCAAGATGCG-3’ （配列番号114）【００９８】
プラスミドpDUra-RhGを鋳型として、プライマーpDuraSC-GAPt-FとプライマーpDurahG-hisp-Rを使って、KOD-plus-（TOYOBO）を用いたPCRで約6.3 kbpのDNA断片を増幅した。
pDurahG-hisp-R：5’-ATTGTTGAGAGAGTGTTGGGTGAGAGTG-3’ （配列番号115）【００９９】
MaACS-10のcDNAを含むプラスミドを鋳型として
プライマーACS-10+hisp-F：
5’-CACTCTCTCAACAATATGGAAACCTTGGTTAACGGAAAGT-3’ （配列番号116）
プライマーACS-10+MGt-R：
5’-CACTCCCTTTTCTTACTAGAACTTCTTCCACATCTCCTCAATATC-3’ （配列番号117）
を使って、KOD-plus-（TOYOBO）を用いたPCRで約2.1 kbpのDNA断片を増幅した。得られた断片を、上記6.3 kbpのDNA断片と、In-Fusion（登録商標）Advantage PCR Cloning Kit （タカラバイオ）を使って連結し、プラスミドpDUraRhG-ACS-10を得た。【０１００】
MaACS-11のcDNAを含むプラスミドを鋳型として、
プライマーACS-11+MGt-R：
5’-CACTCCCTTTTCTTATTACTTGGAGCCATAGATCTGCTTGA-3’ （配列番号118）
プライマーACS-11+hisp-F：
5’-CACTCTCTCAACAATATGCCAAAGTGCTTTACCGTCAAC-3’ （配列番号119）
を使って、KOD-plus-（TOYOBO）を用いたPCRで約2.1 kbpのDNA断片を増幅した。
得られた断片を、上記6.3 kbpのDNA断片と、In-Fusion（登録商標）Advantage PCR Cloning Kit （TAKARAバイオ）を使って連結し、プラスミドpDUraRhG-ACS-11を得た。【０１０１】
ACS活性の評価
プラスミドpYE22m、pYE-ACS-5、pYE-ACS-8、pYE-ACS-10、pYE-ACS-11、pYE-ACS-12、で、酵母EH13-15をそれぞれ形質転換して得られた任意の2株を以下のとおり培養した。前培養として、SC-Trp培地10 mlに菌体を1白金耳植菌し、30℃、1日振とう培養した。本培養として、SD-Trp培地100 mlに、前培養液を1％植菌し、28℃、で1日振とう培養した。【０１０２】
粗酵素液の調製は、以下のように行った。遠心分離にて、集菌後、水洗し、-80℃にて菌体を一時的に保存した。菌体をBuffer B（50 mM リン酸ナトリウムbuffer(pH6.0)、10％グリセロール、0.5 mM PMSF）5 mlに懸濁し、フレンチプレス（16 kPa、3回）にて、菌体を破砕した。1,500 xg、4℃にて10分間、遠心分離し、得られた上清を粗酵素液とした。【０１０３】
ACS活性の測定は、参考文献（J.B.C., 272(8), 1896-4903, 1997）の記載に沿って以下の手順で行った。反応液は、200 mM Tris-HCl(pH7.5)、2.5 mM ATP、8 mM MgCl2、2 mM EDTA、20 mM NaF、0.1％ TritonX-100、脂肪酸50 μg/ml、50 μM  CoA、粗酵素液（適当にbuffer Bで希釈）100 μlを含み、これを全量500 μlとして、28℃にて30分間反応させた。反応終了後、停止液（イソプロパノール：n-ヘプタン：1 M 硫酸（40：20：1））2.5 mlを添加し、よく攪拌した。さらに、n-ヘプタン 2 mlを添加し、よく攪拌後、遠心分離し、上層を回収した。下層にさらに2 mlのn-ヘプタンを加え、同様にして、上層を回収した。回収した上層をあわせ、遠心濃縮機で乾固させたあと、内部標準として、0.2 mg/mlのトリコサン酸（23：0）を50μl添加し、塩酸メタノール法により、脂肪酸をメチルエステルに誘導し、ガスクロマトグラフィーにより、脂肪酸分析を行った。検出された脂肪酸量から、アシル-CoAとなったために上記操作で下層に分配された脂肪酸量を算出した。以下の表に結果を示す。なお、ACS活性は、粗酵素液のタンパク質量当たりの、上記操作で下層に分配された脂肪酸量として示す。コントロールとはpYE22mで形質転換した株であり、そのほかは、それぞれの遺伝子の発現ベクターを導入した株である。【０１０４】
【表７】
0005795267.tif 000008
【０１０５】
パルミチン酸を基質にした場合、MaACS-5、MaACS-10、MaACS-11、MaACS-12は、コントロールの2〜4倍程度のACS活性を示した。【０１０６】
【表８】
0005795267.tif 000009
【０１０７】
オレイン酸を基質にした場合、MaACS-10、MaACS-11、MaACS-12は、コントロールの2倍程度のACS活性を示した。【０１０８】
【表９】
0005795267.tif 000010
【０１０９】
リノール酸を基質にした場合、MaACS-5、MaACS-8、MaACS-12はコントロールの数倍（それぞれ3倍、3倍、6倍程度）のACS活性を示したのに対し、MaACS-10とMaACS-11はコントロールの数10倍（それぞれ40倍、20倍程度）のACS活性を示した。【０１１０】
【表１０】
0005795267.tif 000011
【０１１１】
γ-リノレン酸を基質にした場合、MaACS-5、MaACS-8、MaACS-10、MaACS-11、MaACS-12は、いずれもコントロールの2〜10倍程度のACS活性を示した。【０１１２】
【表１１】
0005795267.tif 000012
【０１１３】
ジホモγ-リノレン酸を基質にした場合、MaACS-10、MaACS-11、MaACS-12はいずれも、コントロールの数10倍（それぞれ60倍、40倍、30倍）程度のACS活性を示した。【０１１４】
【表１２】
0005795267.tif 000013
【０１１５】
アラキドン酸を基質にした場合、MaACS-10、MaACS-11、MaACS-12は、数10倍（それぞれ90倍、30倍、10倍）程度の活性を示した。【０１１６】
このように、特にMaACS-10、MaACS-11、MaACS-12は、ジホモγ-リノレン酸やアラキドン酸といった、炭素数20の高度不飽和脂肪酸に対する活性が高かった。【０１１７】
ACSを発現させた酵母のアラキドン酸取り込み活性
プラスミドpYE22m、pYE -ACS-10、pYE -ACS-11、pYE -ACS-12で、酵母EH13-15をそれぞれ形質転換して得られた任意の2株を以下のように培養した。前培養として、SC−Trp 10 mlに1白金耳植菌し、30℃、1日間、振とう培養した。本培養として、SC-Trpに、50 μg/mlとなるようアラキドン酸を添加した培地10 mlに前培養の培養物を100 μl添加し、25℃、1日振とう培養した。集菌後、凍結乾燥し、脂肪酸分析し、添加したアラキドン酸のうち、菌体内に取り込まれたアラキドン酸の割合を求めた。結果を表14に示す。コントロールとはpYE22mで形質転換した株であり、そのほかは、それぞれの遺伝子の発現ベクターを導入した株である。【０１１８】
【表１３】
0005795267.tif 000014
【０１１９】
【表１４】
0005795267.tif 000015
【０１２０】
M. alpina形質転換株の取得
国際公開公報WO2005/019437（「脂質生産菌の育種方法」）に記載の方法にしたがってM. alpina 1S-4株より誘導したウラシル要求性株Δura−3を宿主としてパーティクルデリバリー法で、プラスミドpDUraRhG-ACS-10とpDUraRhG-ACS-11を用いて、それぞれ形質転換を行った。形質転換株の選択には、SC寒天培地（Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate（Difco）0.5％、硫酸アンモニウム0.17％、グルコース2％、アデニン0.002％、チロシン0.003％、メチオニン0.0001％、アルギニン0.0002％、ヒスチジン0.0002％、リジン0.0004％、トリプトファン0.0004％、スレオニン0.0005％、イソロイシン0.0006％、ロイシン0.0006％、フェニルアラニン0.0006％、寒天2％）を用いた。【０１２１】
形質転換M.alpinaの評価
得られた形質転換株を、GY培地4mlに植菌し、28℃で2日間振とう培養を行った。菌体をろ過により回収し、RNeasy plant kit（QIAGEN）を用いてRNAを抽出した。スーパースクリプトファーストストランドシステム for RT-PCR（インビトロジェン）によりcDNAを合成した。導入したコンストラクトからの各遺伝子の発現を確認するため、以下のプライマーの組み合わせでRT-PCRを行った。
ACS10-RT1：5’-GTCCCGAATGGTTCCT-3’ （配列番号120）
ACS10-RT2：5’-AGCGGTTTTCTACTTGC-3’ （配列番号121）
ACS11-RT1：5’-AACTACAACCGCGTCG-3’ （配列番号122）
ACS11-RT2：5’-CGGCATAAACGCAGAT-3’ （配列番号123）【０１２２】
過剰発現を確認できた株のうち、各1株について、GY培地（グルコース2％、酵母エキス1％）10 mlに植菌し、28oC、300 rpmで3日間振とう培養した。これをGY培地500 ml (2 L坂口フラスコ)に全量移し、28oC、120 rpmで振とう培養した。ここから3日後、7日後、10日後、12日後にそれぞれ5 ml、10 mlずつ分取し、これを濾過した。菌体を120℃で乾燥させ、塩酸メタノール法により、脂肪酸をメチルエステルに誘導し、ガスクロマトグラフィーにより、脂肪酸分析を行った。乾燥菌体あたりの脂肪酸生産量およびアラキドン酸生産量の経時変化を調べた。なお、形質転換の宿主であるΔura−3株をコントロールとした。結果を図27（MaACS-10）及び図28（MaACS-11）に示す。【０１２３】
図27及び28に示されるように、MaACS-10及びMaACS-11をM. alpinaで過剰発現させた場合、菌体あたりの脂肪酸量、アラキドン酸量ともに、コントロールに比べて増加していた。
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
本発明のポリヌクレオチドを適切な宿主細胞内で発現させることにより、脂肪酸、特に、高度不飽和脂肪酸を効率よく生成させることができる。本発明によって宿主細胞内で生成される脂肪酸は、食品、化粧料、医薬、石鹸等の製造に利用することができる。
【図１】
0005795267.tif 000016
【図２Ａ】
0005795267.tif 000017
【図２Ｂ】
0005795267.tif 000018
【図３Ａ】
0005795267.tif 000019
【図３Ｂ】
0005795267.tif 000020
【図４Ａ】
0005795267.tif 000021
【図４Ｂ】
0005795267.tif 000022
【図４Ｃ】
0005795267.tif 000023
【図５】
0005795267.tif 000024
【図６Ａ】
0005795267.tif 000025
【図６Ｂ】
0005795267.tif 000026
【図７Ａ】
0005795267.tif 000027
【図７Ｂ】
0005795267.tif 000028
【図８Ａ】
0005795267.tif 000029
【図８Ｂ】
0005795267.tif 000030
【図８Ｃ】
0005795267.tif 000031
【図９Ａ】
0005795267.tif 000032
【図９Ｂ】
0005795267.tif 000033
【図１０Ａ】
0005795267.tif 000034
【図１０Ｂ】
0005795267.tif 000035
【図１１Ａ】
0005795267.tif 000036
【図１１Ｂ】
0005795267.tif 000037
【図１２Ａ】
0005795267.tif 000038
【図１２Ｂ】
0005795267.tif 000039
【図１３】
0005795267.tif 000040
【図１４Ａ】
0005795267.tif 000041
【図１４Ｂ】
0005795267.tif 000042
【図１５Ａ】
0005795267.tif 000043
【図１５Ｂ】
0005795267.tif 000044
【図１６Ａ】
0005795267.tif 000045
【図１６Ｂ】
0005795267.tif 000046
【図１６Ｃ】
0005795267.tif 000047
【図１７】
0005795267.tif 000048
【図１８Ａ】
0005795267.tif 000049
【図１８Ｂ】
0005795267.tif 000050
【図１９Ａ】
0005795267.tif 000051
【図１９Ｂ】
0005795267.tif 000052
【図２０Ａ】
0005795267.tif 000053
【図２０Ｂ】
0005795267.tif 000054
【図２０Ｃ】
0005795267.tif 000055
【図２１Ａ】
0005795267.tif 000056
【図２１Ｂ】
0005795267.tif 000057
【図２２Ａ】
0005795267.tif 000058
【図２２Ｂ】
0005795267.tif 000059
【図２３Ａ】
0005795267.tif 000060
【図２３Ｂ】
0005795267.tif 000061
【図２４Ａ】
0005795267.tif 000062
【図２４Ｂ】
0005795267.tif 000063
【図２５Ａ】
0005795267.tif 000064
【図２５Ｂ】
0005795267.tif 000065
【図２５Ｃ】
0005795267.tif 000066
【図２６Ａ】
0005795267.tif 000067
【図２６Ｂ】
0005795267.tif 000068
【図２７】
0005795267.tif 000069
【図２８】
0005795267.tif 000070
【配列表】
0005795267000001.app